hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超伝導電流トランスと極小精密検出コイルを利用した実用高温超伝導導体の通電特性評価

試料線材としてはBi-2223テープ線材を用い、これを5枚積層したものを2本作製し往復導体にして高温超伝導電流トランスと接続した。この電流トランスと往復試料導体で形成される閉回路に対し、交流通電時における試料導体の電流分布特性とインダクタンスや接続部の抵抗などの回路パラメータとの関係について詳細に調べた。電流トランスの電流比を測定した結果、通電電流の増加に伴い閉回路のインダクタンスが増加することがわかった。また、電流分布特性の測定結果より、通電電流の増加に伴い、試料導体断面内の電流分布が導体両端部から導体中央部に多く流れる領域が変化していく様子が観測できた。さらに、この通電電流の増加に伴うインダクタンスの増加は、導体断面内の電流分布特性の変化により説明できることを数値計算により示すことができた。なお、通電電流の増加に伴う接続抵抗の変化は観測されなかった。一方、ポインチングベクトル法を用いた導体の通電損失特性も首尾よく測定でき、高温超伝導導体の電流分布特性と通電損失特性を同時に測定できる測定システムを完成させることができた。
組換え発現リケッチア抗原タンパク質の作製と臨床応用に関する研究

リケッチアはグラム陰性の偏性細胞内寄生細菌であり、ダニ等の媒介によって人に感染し、四肢や体幹に発疹を伴うリケッチア症とよばれる熱性疾病の原因菌である。我が国のリケッチア症の一つである日本紅斑熱の原因菌であるRickettsia japonica (R. japonica)由来タンパク質を大腸菌発現システムにて作製し、作製したタンパク質を抗原としてマウスに接種し、抗血清を作製する。抗血清のR. japonicaに対する感染能の阻害を観察し、作製した抗原タンパク質のワクチンへの応用を目指す。目的のタンパク質の作製に時間がかかってしまい、その後のマウスを用いた感染実験を行えなかった。R. japonicaのマウスに対する感染実験を行い、致死的感染量を検討、また肝臓、肺等の器官における感染を観察する。作製したR. japonicaをマウスに接種し、得られた抗血清でR. japonicaの感染能の阻害効果を観察する。リケッチアはグラム陰性の偏性細胞内寄生細菌であり、ダニ等の媒介によってヒトに感染し、四肢や体幹に紅斑や発疹を伴うリケッチア症とよばれる熱性疾病の原因菌である。わが国におけるリケッチア症は国内で定められた四類感染症に属し、診断後は直ちに届出が必要な疾病で国内では主に日本紅斑熱とつつが虫病である。その他にも海外渡航者の中で外来性Rickettsia spp.を起因とする輸入感染症としてのリケッチア症も存在する。R. japonicaについて、免疫原性に関する基礎的な知見について未だ不明な点が多く、さらにこれに対するワクチンは未だ確立されていない。リケッチア症は野外で長時間作業する農業や林業の従事者に多く、また発病者自身がダニに刺された自覚のない場合やその症状がインフルエンザ様と似ているため早期診断の遅れや誤診をまねくことがあり、その結果、重篤化および死亡につながってしまう。このため感染予防の観点からリケッチア症対策を考えることは重要であり、そのための有効な手段としてワクチンの開発は重要な課題である。本研究では欧米の紅斑熱リケッチア由来のタンパク質について過去に作製が報告されている部分ついて日本紅斑熱リケッチア(Rickettsia japonica、以下R. japonica)で相当する部分を公開されている遺伝子情報をもとにPCRサブクローニングの系を用いてタンパク質発現プラスミドを作製した。作製した抗原タンパク質は未だ不明な点の多いリケッチア症の免疫学的特性を解明するためのツールとして応用できる可能性もあり、ワクチン開発につながることが期待できることから、本研究が大きなチャレンジ性を持つと考える。本研究の基金支給の開始が通常より遅れたことと、目的のタンパク質を発現するプラスミドの作製を終え、薬剤誘導下で発現させ精製を試みたが、尿素溶解でしか可溶化せず、その後の尿素液交換の条件検討で遅れが生じた。リケッチア菌体をマウスに感染させ、そこから得られた抗血清の組換えタンパク質に対する反応性を検討する。また、組換えタンパク質をマウスに感染させ、同様に得られた抗血清についても、リケッチア感染防御能の検討を行う。本基金の支給採用決定が、7月と通例より遅れたことと、マウス感染実験の実施が遅れたため、マウスの購入予算を次年度にあてざるを得なかったため。研究の進捗が遅れたため、予定より少ない支出額になった。来年度はマウスの購入などを控えているため、使用額を最大限使用する予定である。
mPGES-1 発現阻害薬のリード化合物探索とターゲット分子同定

我々は、細胞性粘菌が分泌する低分子化合物DIFが、膜結合型プロスタグランジンE2合成酵素-1 (mPGES-1)の遺伝子発現を強力に抑制することを見出した。本研究では、天然化合物ライブラリーからDIF以外の新たなmPGES-1発現阻害物質をスクリーニングし、その作用機序の解明を試みることを目的とした。スクリーニングにより、mPGES-1プロモーター活性をDIF以上に強力に抑制する物質niclosamideが見出されたため、DIFとniclosamideで共通して変動し、炎症に関与する遺伝子をDNAマイクロアレイにより解析した。しかし、共通に増加もしくは減少する炎症関連遺伝子は、現時点では見出されていない。我々は、細胞性粘菌が分泌する低分子化合物DIFが、膜結合型プロスタグランジンE2合成酵素-1(mPGES-1)の遺伝子発現を強力に抑制することを見出した(特許出願2009-238935)。mPGES-1は炎症反応において重要な役割を担っており、心筋梗塞など心血管イベントの発生率を上昇させるという重大な副作用を有することが明らかとなったシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)をターゲットとするCOX-2選択的抗炎症薬に代わる新規抗炎症薬の創薬ターゲットとして注目されている。そこで本研究では、天然化合物ライブラリーからDIF以外の新たなmPGES-1発現阻害物質をスクリーニングし、全く新しい機序の抗炎症薬を開発するためのリード化合物を探索し、そのターゲット分子を含む作用機序の解明を試みることを目的とした。本年度は、理化学研究所から提供を受けた天然化合物ライブラリーを用いた検討からmPGES-1プロモーター活性をDIF以上に強力に抑制することを昨年度見出したniclosamideの作用機序について検討を行った。DIFはWntシグナル伝達経路の抑制作用を有することから、niclosamideがこの情報伝達経路に及ぼす作用について検討したところ、DIFとは異なりniclosamideにはこの経路への特異的な抑制作用は認められなかった。また、DIFおよびniclosamideで刺激した細胞からmRNAを抽出し、DNAマイクロアレイによる解析を行ったところ、炎症に関与する遺伝子で共通に増加もしくは減少している遺伝子は見いだせなかった。我々は、細胞性粘菌が合成・分泌する低分子化合物differentiation-inducing factor(DIF)が、膜結合型プロスタグランジンE2合成酵素-1(mPGES-1)の遺伝子発現を強力に抑制することを発見した(特許出願2009-238935)。mPGES-1は炎症反応において重要な役割を担っており、心筋梗塞など心血管イベントの発生率を上昇させるという重大な有害反応を有するシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)をターゲットとする既存抗炎症薬に代わる、新規抗炎症薬の創薬ターゲットとして注目されている。本研究では、天然化合物ライブラリーからDIF以外の新たなmPGES-1発現阻害物質をスクリーニングし、全く新しい機序の抗炎症薬を開発するためのリード化合物を探索して、そのターゲット分子の同定を含む作用機序の解明を試みることを目的としている。そこで、本年度は、理化学研究所から提供を受けた天然化合物ライブラリーを用いて、新たなmPGES-1発現阻害物質のスクリーニングを行った。96穴プレートにHeLa細胞を培養し、ヒトmPGES-1プロモーター活性に対する天然化合物の影響をルシフェラーゼアッセイにより評価した。現在までに、80種類の天然化合物について評価を行ったが、そのうち2種類の有力な新規mPGES-1発現阻害物質を見出した。現在、それらの物質がmPGES-1タンパク質発現量に及ぼす影響、並びにmPGES-1のプロダクトであり炎症惹起物質であるPGE2の産生量に及ぼす影響を検討している。当初の研究計画では、平成23年度に、(1)ルシフェラーゼアッセイによるmPGES-1発現阻害物質のスクリーニング(2) DNAマイクロアレイを用いたmPGES-1発現制御に係る遺伝子群の同定を行う予定としていた。(1)では、理化学研究所の天然化合物バンクを利用し、24,700種類におよぶ化合物のスクリーニングを行う予定であった。スクリーニングを効率よく行うため、新しく96穴プレートを用いたmPGES-1プロモーター活性測定システムの構築が必要となった。ヒト子宮頚癌由来細胞株HeLaを96穴プレートにて培養し、これにヒトmPGES-1プロモーターを組み込んだルシフェラーゼアッセイベクターを導入するというものであるが、実験を開始した時点では、期待するほどのプロモーター活性値が得られなかった。これを改良すべく、細胞数や培養時間等の培養条件や、ベクターの濃度、導入用試薬の分量等の導入条件など、種々の実験条件の検討を行った。このように、活性測定系の構築に予想以上の時間がかかったため、当初の実験計画ではもう少し早い時期からスクリーニングが実施できる見込みであったが、計画よりも遅れている。(2)については、mPGES-

1発現抑制物質によって制御を受ける遺伝子群を同定するために、当該物質を投与した培養細胞の発現プロファイルをマイクロアレイにて経時的に測定し、全ゲノムを対象とした網羅的な探索と、時間軸に沿った発現変動遺伝子群の解析を行う予定であったが、(1)のスクリーニングが進んでおらずmPGES-1発現抑制物質の同定が終了していないので、実施していない。本研究では、mPGES-1発現阻害という新しい作用機序を有し、副作用の少ない抗炎症薬を開発するためのリード化合物と創薬ターゲット分子の同定を目指している。平成24年度は、当初平成23年度に計画していた(1)mPGES-1の遺伝子発現を抑制する化学物質(天然化合物)のスクリーニングを終了し、そこから絞り込んだmPGES-1発現阻害物質を用いて、(2)mPGES-1遺伝子発現抑制と連動する遺伝子群のDNAマイクロアレイによる網羅的解析を行う予定である。(1)に関しては、mPGES-1プロモーター活性測定系がほぼ確立できたので、今後は天然化合物のスクリーニングが順調に実施できると見込まれる。一方、現在までに80種類の天然化合物についての評価を行い、2種類の有力な新規mPGES-1発現阻害物質を見出したので、それらがmPGES-1蛋白質発現に及ぼす影響とmPGES-1のプロダクトであり炎症惹起物質であるPGE2産生量に及ぼす影響の検討も同時に進める予定である。(2)に関しては、mPGES-1の蛋白質発現を低下させうる複数の有力な候補化合物を見出した後、これらのmPGES-1発現抑制物質によって制御を受ける遺伝子群を同定するために、当該物質を投与した培養細胞の発現プロファイルをマイクロアレイにて経時的に測定し、時間軸に沿ったmRNAの網羅的な発現変動の解析を行う予定である。最終的には、新規抗炎症薬のターゲット分子となるタンパク質を同定し、スクリーニングにより見出された化合物をリード化合物とした新規抗炎症薬の開発を目指す。主に消耗品費に用いる予定。
ヒトの滑り感覚情報処理機構のアルゴリズム化に関する研究

本研究では,ヒトの巧みな把握力制御を模倣して,ロボットに適用することを目的としている.そこで,ロボットハンドの把握制御に関連の深い滑り覚のための機械受容単位に着目して,その情報処理機構の解明に必要となる基礎データの蓄積を行う.まず,被検者に既知の滑り力を呈示できる実験装置を製作した.また,被験者の判定結果から閾値や主観的等価値などのデータを得ることのできる心理物理実験法に基づいて実験法を構築した.本研究では,効率良く閾値を求めることのできるPEST法(Parameter Estimation Sequential Testing)を採用して,そのアルゴリズムをプログラム化した.心理物理実験では,アクリル板と精密研磨紙(砥粒径:12μmと30μm)を把握面として採用した.20代の男性8人を被験者とし,滑り力の標準刺激として,2,2.75,3.5,4.25,5Nを採用した.これらの標準刺激に対して閾値を求めたところ,把握面がアクリル板の場合に低荷重領域ではWeber比(標準刺激に対する閾値の比)が0.14となり,標準刺激の増加に伴って減少する傾向があった.これは,滑り力が小さい方が滑り力の検出制度が低下することを意味しており,刺激に対する閾値のふるまいとしては視聴覚などの他の感覚と類似の傾向である.次に,把握面の状態が閾値に及ぼす影響を検討した.その結果,アクリル板の平滑面に対して研磨紙のように摩擦係数の高い面の方が,閾値が低下することがわかった.これは,把握面と指の滑りを発生しないようにするためには,摩擦係数の低い面の方が把握力を増加しなければならないため,圧力を検出する機械受容単位の興奮がノイズとなって滑り覚の機械受容単位の判断に影響を与えているものと思われる.最後に,筋電位と把握の関係を調べた.その結果,把握力と筋電位の間に相関係数0.9以上の相関があった.したがって,今後の把握解析で力センサを用いることが困難な場合には,筋電位をセンサの出力として取り扱うことが可能であることがわかった.本研究では,ヒトの巧みな把握力制御を模倣して,ロボットに適用することを目的としている.そこで,ロボットハンドの把握制御に関連の深い滑り覚のための機械受容単位に着目して,その情報処理機構の解明に必要となる基礎データの蓄積を行う.まず,被検者に既知の滑り力を呈示できる実験装置を製作した.また,被験者の判定結果から閾値や主観的等価値などのデータを得ることのできる心理物理実験法に基づいて実験法を構築した.本研究では,効率良く閾値を求めることのできるPEST法(Parameter Estimation Sequential Testing)を採用して,そのアルゴリズムをプログラム化した.心理物理実験では,アクリル板と精密研磨紙(砥粒径:12μmと30μm)を把握面として採用した.20代の男性8人を被験者とし,滑り力の標準刺激として,2,2.75,3.5,4.25,5Nを採用した.これらの標準刺激に対して閾値を求めたところ,把握面がアクリル板の場合に低荷重領域ではWeber比(標準刺激に対する閾値の比)が0.14となり,標準刺激の増加に伴って減少する傾向があった.これは,滑り力が小さい方が滑り力の検出制度が低下することを意味しており,刺激に対する閾値のふるまいとしては視聴覚などの他の感覚と類似の傾向である.次に,把握面の状態が閾値に及ぼす影響を検討した.その結果,アクリル板の平滑面に対して研磨紙のように摩擦係数の高い面の方が,閾値が低下することがわかった.これは,把握面と指の滑りを発生しないようにするためには,摩擦係数の低い面の方が把握力を増加しなければならないため,圧力を検出する機械受容単位の興奮がノイズとなって滑り覚の機械受容単位の判断に影響を与えているものと思われる.最後に,筋電位と把握の関係を調べた.その結果,把握力と筋電位の間に相関係数0.9以上の相関があった.したがって,今後の把握解析で力センサを用いることが困難な場合には,筋電位をセンサの出力として取り扱うことが可能であることがわかった.研究代表者らは,ヒトの巧みな感覚情報処理を模型化してロボット・メカトロ機器へ応用する研究を進めてきた.特に,ヒトの滑りの感覚情報処理は,ロボットのそれと比較して遅いため,ヒトの滑りの覚情報処理機構を解明しアルゴリズムとして実現できれば,処理速度の比較的遅い計測制御系を用いても把握力の動的制御が可能となると期待される.そこで本研究では,ヒトの滑り覚認識機構の解明を目的として,滑り覚呈示装置と筋電図計を用いて一連の心理物理実験を行った.実験では,被験者が把持するプローブの表面状態に対する閾値の依存性,並びに滑り力,筋電位,把持力の間の関係を調査した.本年度の成果を以下に要約する.(1)モータドライブのXステージと力覚センサにより一定の滑り力を発生する装置を開発するとともに,PEST法により滑り覚の閾値を計測する実験方法を確立した.(2) 6人の被験者に対し滑り覚認識実験を繰り返し実施し,Weber比を求めた結果,滑り力が2Nの時は0.1とやや大きいが,十分大きい滑り力では0.07近傍で一定となった.(3)プローブ表面の摩擦係数が大きいほど,被験者の滑り力の判別精度が向上したことから,滑り覚の受容器はせん断応力を獲得しているものと推測した.

(4)筋電位と把持力の関係を調査した結果,両者に線形関係があることから,今後把持力が計測できない場合に筋電位から把持力を同定できることがわかった.ヒトの触覚情報処理の機構を解明してソフトウェアとしてロボットの計測制御系に組み入れることができれば,ロボットのパフォーマンスを飛躍的に向上することができる.本研究では,ロボット把握力制御を向上するために,ヒトの滑り感覚の認識機構を解明することを目的としている.昨年度では,一定の滑り力を呈示できる滑り覚呈示装置の開発と,滑り覚の閾値を計測するためのソフトウェアを開発した.昨年度に引き続き本年度では,滑り覚呈示装置が呈示する滑り力の制御方式を改良するとともに,把握面の種類を三種類に増加するなど実験精度を向上させた.本年度の成果を以下に要約する.(1)昨年度開発した装置では,滑り方向の力だけでなく,モーメントまでプローブに発生していたため,呈示された滑り力を被験者は正確に判定できなかった.これを改良するために,力覚センサの取り付け部分に新しく板バネを取り付ける改良を施した.(2)重力と摩擦力に影響を受けない力制御を実現するために,力覚センサが検出した滑り力にしたがってDCサーボモータの速度司令値を調整する制御方式を採用するよう改良した.(3)被験者の人数を6人から8人に増加してより精度の高い実験を行った結果,滑り力が2N5Nの範囲ではWeber比は一定とならず,滑り力の増加にともなって減少することがわかった.このため,この範囲の滑り力では十分大きいとはいえないことがわかった.(4)12μmの研磨粉を塗布した研磨紙,30μmの研磨粉を塗布した研磨紙,平滑面の三種類を把握させる実験を行った結果,12μmと30μmの研磨紙のWeber比はほぼ一致した.また,平滑面のWeber比と研磨紙のWeber比を比較したところ,平滑面の方が大きいWeber比を得た.これらの事実により,平面の摩擦係数が小さい方が滑り力の認識精度が向上するものの,摩擦係数があるレベル以上になると認識精度は飽和することがわかった.
メカニカルストレスに対する歯根膜細胞の応答性について

矯正学的歯の移動に伴う歯周組織改造現象の分子機構を明らかにするために、培養ヒト歯根膜細胞に対して、一軸性培養細胞伸展装置による周期的伸展力を付与し、DNAマイクロアレイを用いて発現遺伝子の変動をスクリーニングした。DNAマイクロアレイは、258種類のサイトカインやサイトカイン受容体のcDNAがスポットされているメンブレンタイプのものを用いた。ヒト歯根膜細胞は、小臼歯の歯根膜組織からoutgrowthした細胞を継代培養して実験に用いた。ヒト歯根膜細胞はアクチンの脱重合に重要な役割を担うthymosin-beta 10などいくつかの興味深い遺伝子の発現が高かった。また、周期的伸展力に反応して上昇および減少するいくつかの遺伝子を同定した。さらに、RT-PCR法で上昇している遺伝子の検討を行い、確実に上昇が確認された4遺伝子について現在詳細に検討中である。その中の一つとして、血管内皮細胞の増殖に重要な役割を担うvascular endothelial growthfactor(VEGF)が含まれていた。近年、VEGFは骨吸収に重要な役割を担うことが明らかにされているため、矯正学的歯の移動に伴う歯周組織改造現象に深く関与していることが示唆された。また、その他いくつかの力学的刺激に応答すると考えられる遺伝子を同定したため、現在in situ hybridizationにより同定した遺伝子のin vivoでの発現について検討を行っている。矯正学的歯の移動時には広範なリモデリングが生じ、牽引側には骨添加、圧迫側には骨吸収が観察される。その過程は、メカニカルストレスに応答する歯根膜細胞を中心とした一連の遺伝子発現により厳密に調節されていると考えられている。本研究では、メカニカルストレスにより歯根膜細胞で応答する遺伝子のスクリーニングをDNAマイクロアレイを用いて行うことを目的としている。ヒト抜去歯の歯根膜からアウトグロースした細胞を実験に用いた。得られた細胞を位相差顕微鏡で観察したところ線維芽細胞に特徴的な紡錘状の形態を示していた。また、歯根膜や骨膜に特異的に発現することが知られているペリオスチンの発現をRT-PCRにて検討したところその発現が認められた。従って、得られた細胞を歯根膜線維が細胞とし、Type Iコラーゲンでコーティングしたシリコンチャンバー上で培養を行い、一軸性培養細胞伸展システムにて圧迫力を付与した。ローダミン-ファロイジン染色により歯根膜線維芽細胞のストレスファイバーは、圧迫力により消失し、細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた。これらの細胞からPolyARNAを抽出後、32P標識cDNAを調整し、268個のサイトカインおよびサイトカイン受容体がスポットされているメンブレン型のDNAマイクロアレイとハイブリダイズしたところ、メカニカルストレスにより約3倍以上の発現上昇がみられた遺伝子約20を同定した。現在RT-PCRにより、その発現上昇について検討中である。
肝細胞キメラマウス作製系における移植肝細胞モニタリングとGVHD応答の解析

本研究では、重症の急性・慢性肝不全などに対する肝細胞あるいは幹細胞由来肝様細胞移植のモデルとして肝細胞キメラマウスを作製し、移植肝細胞に対する免疫拒絶に関しての検討を試みた。ヒト単純ヘルペスウイルス(HSV)のチミジンキナーゼ遺伝子(TK)を肝細胞において発現するトランスジェニックマウス、HSVtk-tgではガンシクロビル(GCV)投与によりTKを発現する自己肝細胞が死滅し、他個体からの肝細胞移植が可能となる。我々はC57BL/6、Balb/cと遺伝的背景の異なるHSVtk-tgに対し、C57BL/6由来のGFP発現トランスジェニックマウス(GFP-tg)から分離した肝細胞を移植することで、同系(Auto)、異系(Allo)条件下でのGFP発現肝細胞移植モデルを作製した。移植8週後のAutoモデルでは、18.2%から73.2%の肝細胞がGFP陽性となり置換率の高いマウスほど、体重増加、移植後のALT値の低下が明らかな傾向がみられた。また、GFP陽性肝細胞の周囲に炎症細胞浸潤を認め、GFPに対する免疫応答が誘導されていることが示唆された。移植811週後のAlloモデルではGFP陽性細胞は認めず、体重増加、ALT値の低下も認めなかった。肝組織像では、GCV単独投与(Sham)モデルと類似した変性肝細胞が主体であった。ただし、AlloではShamにはない大血管周囲の線維化像を認め、生着後のアロ肝細胞に対する拒絶応答の結果と考えらえた。Alloから分離した脾細胞と、GFP-tg脾細胞などドナー側の細胞との混合培養によるリンパ球混合培養反応(MLR)を実施し、レシピエントの免疫系によるアロ抗原、外来抗原に対する免疫応答が惹起されていることが確認された。肝細胞キメラマウス作製系は、肝細胞移植治療における免疫拒絶の機序の解明、治療法の構築に有用なモデルとなり得ることが確認された。現存のHSVtk-tg(BL/6交配、F45)において、ガンシクロビル(GCV)投与後にBL/6から分離した肝細胞の移植実験を実施しており、肝細胞置換が良好に起こることを非移植マウスとの比較で確認している。現在は、GCV投与量、投与時期、移植細胞の投与ルート(脾注あるいは門脈注射)についての検討を進めている。なお、門脈注射の手技についてはすでに修得済みである。これらの様々な条件での肝細胞移植を可能にしておくことが、GVHDの病勢をコントロールすること、免疫寛容の誘導が可能な条件を見出すこと、量子ドット(QD)での肝細胞ラベル時にQDのセンシング感度以下まで細胞分裂が起こらないような条件を見出すことに繋がると考えている。移植用肝細胞のQDによるラベル化効率が良好であることはフローサイトメーター(FCM)により確認しているが、移植後の細胞分裂が進行した場合も細胞内に取込まれたQDが検出感度以下にならないようにするため、さらに細胞内取込み効率の向上が得られるようなラベル化条件についても検討を進めている。また、GFP-tg(BL/6バックグラウンド, H-2b)から分離の肝細胞移植に際しては、GFPに対する免疫応答の有無も問題となるため、まずは、正常BL/6とGFP-tg由来の脾細胞を用いたMLRなどによりその免疫原性の評価を進めている。移植用肝細胞のQDによるラベル化効率は想定内であったものの、移植後の細胞分裂による希釈が起きた場合には、in vivoでのQDシグナルの検出が可能なほどの蛍光強度は達成されていないと考えられた。よって、QDの細胞内取込み効率向上のためのラベル化条件の検討を追加している。また、代替として用意したGFP-tgについてもGFP自体の免疫原性についての評価が必要と考えられたため、それに関する実験を追加することとした。以上の理由により、研究計画には若干の遅れが生じた。TK-NOGマウス(H-2bあるいはH-2d)を同系の野生型マウス(C57BL/6, H-2bあるいはBalb/c, H-2d)へのバッククロスを繰り返すことで、正常な免疫機構を持ちC57BL/6あるいはBalb/cと同じバックグラウンドを持つHSVtkを作製した。HSVtkではガンシクロビル(GCV)投与により自己の肝細胞が死滅し、その後に他のマウスから分離した肝細胞を移植することで肝細胞キメラマウスの作製が可能となる。この系ではGCVによる自己肝細胞の死滅の程度が、肝細胞移植によるキメラ化効率(肝細胞置換率)の規定因子となる。しかし、GCVによる肝細胞死滅効果はマウスの系統ごとに差を認めるため、まず作成したHSVtkにおいてGCV投与の至適条件を決定した。当初、移植する肝細胞を量子ドット(QD)にてラベル化することを計画していたが、肝灌流により分離した肝細胞の生存率は80%程度であり、さらに浮遊培養の状態でのQDラベルで生存率の低下がみられたため、現時点では同系のGFPトランスジェニックマウス(GFPtg)から分離した肝細胞を用い、主にGFPの免疫染色で移植後(脾注)の局在を解析している。脾注後、GFPtg由来肝細胞は肝臓に局在するものの、肺、心臓、脾臓、腎臓などへの局在は認めていない。なお、ex vivoでの蛍光イメージングでも、肝臓のみでGFPシグナルの検出が可能であることを確認できている。また、HSVtkにアロ肝細胞を移植した場合には移植肝細胞の排除を認め、免疫拒絶の評価が可能なモデルであることを確認している。

現時点での肝細胞置換効率は最大で30%程度であり、以後の解析を容易にするために、GCVによる肝細胞死滅効果の安定化、肝灌流による肝細胞分離効率の向上などによる、HSVtkでの肝細胞置換効率の向上に向けた検討も同時に行っている。肝細胞キメラマウス作製系において鍵となるGCVによる肝細胞死滅効果、および移植用肝細胞分離の効率の2点において、当初想定していた結果が得られなかったことが現時点での遅れの原因である。GCV投与で十分な肝細胞死滅効果が得られなかったことで、肝細胞置換率がやや低値に留まったが、現時点ではGCV投与量の至適化が進んでいる。また、GCV投与ルートの変更(経口投与)による効果も同時に検討しており、今後はさらに改善が見込まれる。肝細胞分離については、肝灌流時のdigestion mediumの変更などにより、当初、1×10-6個/匹程度の肝細胞回収率だったものが10-7個/匹レベルまで改善してきており、これも解決の方向にある。本研究では、重症の急性・慢性肝不全などに対する肝細胞あるいは幹細胞由来肝様細胞移植のモデルとして肝細胞キメラマウスを作製し、移植肝細胞に対する免疫拒絶に関しての検討を試みた。ヒト単純ヘルペスウイルス(HSV)のチミジンキナーゼ遺伝子(TK)を肝細胞において発現するトランスジェニックマウス、HSVtk-tgではガンシクロビル(GCV)投与によりTKを発現する自己肝細胞が死滅し、他個体からの肝細胞移植が可能となる。我々はC57BL/6、Balb/cと遺伝的背景の異なるHSVtk-tgに対し、C57BL/6由来のGFP発現トランスジェニックマウス(GFP-tg)から分離した肝細胞を移植することで、同系(Auto)、異系(Allo)条件下でのGFP発現肝細胞移植モデルを作製した。移植8週後のAutoモデルでは、18.2%から73.2%の肝細胞がGFP陽性となり置換率の高いマウスほど、体重増加、移植後のALT値の低下が明らかな傾向がみられた。また、GFP陽性肝細胞の周囲に炎症細胞浸潤を認め、GFPに対する免疫応答が誘導されていることが示唆された。移植811週後のAlloモデルではGFP陽性細胞は認めず、体重増加、ALT値の低下も認めなかった。肝組織像では、GCV単独投与(Sham)モデルと類似した変性肝細胞が主体であった。ただし、AlloではShamにはない大血管周囲の線維化像を認め、生着後のアロ肝細胞に対する拒絶応答の結果と考えらえた。Alloから分離した脾細胞と、GFP-tg脾細胞などドナー側の細胞との混合培養によるリンパ球混合培養反応(MLR)を実施し、レシピエントの免疫系によるアロ抗原、外来抗原に対する免疫応答が惹起されていることが確認された。肝細胞キメラマウス作製系は、肝細胞移植治療における免疫拒絶の機序の解明、治療法の構築に有用なモデルとなり得ることが確認された。移植用肝細胞の蛍光強度の確保、GFPの免疫原性の問題は生じたが、基本的に当初の研究計画に沿って研究を進める。QDによる細胞ラベル化効率の向上が目標に達しない場合は、GFP-tgを中心とした解析に切り替えて実施する。GFPの免疫原性については、トレランス誘導により解決可能と考えている。研究分担者の伊藤により、すでにHSV-tkへのHBs抗原発現肝細胞の移植により肝障害が誘導されることが確認されており、GVHDモデルの作製は可能と考えている。
全国代表サンプルによるストレス対処力SOCを規定する社会的要因に関する実証研究

本研究は、日本国民を対象とした国民代表サンプルデータ、並びに、スコットランド、カナダの二次データを用いストレス対処力sense of coherence(SOC)について検討した。第1にSOC-13スケールの標準化が行われ国民標準得点を得た。SOCはスコットランド、カナダより低い得点となっていた。第2に、過去の家族との経験、社会経済的要因とSOCの関連性が明らかになった。第3に、ソーシャルキャピタル、心理社会的な環境評価とSOCとの関連性、並びに、スコットランドにおいても同様の関連性が見られた。本研究は全国代表サンプル調査を実施し、以下3点を明らかにすることを目的としている。すなわち、1.sense of coherence(SOC)スケール13項目7件法版の標準化を行い、日本国民標準値を得ること、2.SOCを左右している社会的要因について明らかにすること、3.他国で実施されている全国代表サンプル調査結果と1,2について国際比較を実施すること、である。平成25年度においては、全国代表サンプル調査を実施しデータを得るに至った。その経緯は以下のようであった。46月期(調査計画策定):調査実施計画について分担研究者・研究協力者らと打ち合わせを行い、調査デザイン、サンプリング方法、実査の実施方法についての検討を行った。79月期(調査準備):立案した調査計画に基づいて調査計画書を作成し、調査実施業者の選定を実施した。回収率は50%を目標とした。1012月期(調査票策定・サンプリング):選定された業者と連絡を取りながら、調査票策定を行った。調査票については先行研究および国際比較実施を念頭におき他国における先行調査の調査票を参考に実施した。また、日本語訳化においては順翻訳ならびに逆翻訳を実施し、専門家および原作者との連絡を密にして実施した。サンプリングについては、本調査の目的に沿った形で、層化2段抽出とし、第2段抽出においても生年齢層別に層化して住民基本台帳よりサンプリングを行った。13月期(実査・データクリーニング):1月下旬より実査を実施した。実査は郵送配布訪問回収法で実施し、4000票を配布し2067票(回収率51.7%)と目標を達成した。回収した調査票はデータ入力し、3月中にデータクリーニングを実施した。平成26年度の実施内容は、大きく2点である。第1に、平成25年度末に実施した全国調査データについて、データクリーニング及び基礎分析を実施した。データクリーニングについては分担研究者4名で実施した。基礎分析については、研究目的の一つである、SOCー13スコアの標準化を視野に入れ、性年齢別、居住地別にスコア分布を算出した。また、下位3尺度別の使用についても検討を行った。その結果、平均得点(SD)は59.0(12.2)点であり、男女間で有意差は見られなかった。また、年齢階層間では、2534歳代と45歳以上、3544歳代と55歳以上とで有意差が生じており、年齢が上昇するほど高いスコアである傾向が示された。地域別の検討においては全国11区分で年齢調整平均値を比較したところ、有意差は見られなかった。下位3尺度別の使用については、因子的妥当性は確認されたが、クロンバックα係数は.63.72であった。また、有意味感では、性差がみられており、男<女の結果であった。第2に、国際比較分析を実施するために、スコットランド及びカナダにおける全国調査の個票データ入手作業を両国のデータアーカイブより実施した。データについては個票データレベルで使用できるよう調整作業を行った。以上についてSOC尺度の標準化が行われたことにより比較可能性が高まったといえる。また、国際比較データ取得およびその調整については、今後比較分析を進める上で極めて重要な作業成果となったといえる。本年度は以下3点の成果が見られた。第1に研究目的のうち2つ目に相当する社会経済的地位および生育背景とSOCとの関係に関する分析が進み、SOCと社会経済的地位との関係がより明確になったほか、15歳時の心理的社会的家庭環境要因と成人後のSOCとの関係を明らかにするに至った。第3に国際比較データを使用したデータ解析について一部検討を進めた。一つは社会経済的地位との関係の比較、もう1点はソーシャルキャピタルとの関係の比較についてである。当初の予定であったデータ解析について順調に進められているため。以下4点について成果を出すことができた。第1に、首尾一貫感覚sense of coherenceの尺度である13項目版のSOCスケールSOC-13の基準値の設定並びに性年齢別基準値の一覧を作成し、SOC-13スケールがアウトカム指標としての使用可能である点について明らかにした。第2に、SOC-13と過去の家族ならびに家庭における経験、学歴、職業、収入といった社会経済的地位、ソーシャルサポート、ソーシャルキャピタルといった社会関係との関連性について、詳細を明らかにした。これによって、SOCの形成・発達要因としてのこれらの位置づけが明確となり、経験やライフコース、社会経済的地位、社会関係に対する健康生成論的なアプローチの必要性とその糸口を明らかにした。第3に、SOCの類似概念とされる統御感、ヘルスリテラシーとの関連性の実証的検討とそれを踏まえた理論的関連性について考察を進めることができた。

結論としては、統御感とSOCとは完全に別概念であるものの、統御感が持っている環境を操作する能力の部分について、資源の動員力であり、資源により経験を享受し向上するという、SOCの特質と相似形を持っており比較的高い相関係数値になっていることがわかった。ヘルスリテラシーとの高い相関関係については、ヘルスリテラシーが資源である一方で資源の動員力であるとする機能も有している点でSOCと極めて類似した概念である可能性がうかがわれた。第4にSOCとその関連要因の国際比較である。SOC得点は、比較したカナダ、スコットランド両国よりも低い値となっていた。しかし心理測定において文化的要因(個人主義傾向vs集団主義傾向)が絡むことから得点そのものの比較には慎重である必要性が明らかになった。関連要因については洋の東西で共通した要素が多く発見された。本研究は、日本国民を対象とした国民代表サンプルデータ、並びに、スコットランド、カナダの二次データを用いストレス対処力sense of coherence(SOC)について検討した。第1にSOC-13スケールの標準化が行われ国民標準得点を得た。SOCはスコットランド、カナダより低い得点となっていた。第2に、過去の家族との経験、社会経済的要因とSOCの関連性が明らかになった。第3に、ソーシャルキャピタル、心理社会的な環境評価とSOCとの関連性、並びに、スコットランドにおいても同様の関連性が見られた。初年度である平成25年度に調査実施が終了したことから、2年目の平成26年度は、当初の予定であった、全国調査のデータクリーニングおよび、データ取得作業は順調に終了し、分析および公表作業についても進んでいる。国際比較についての分析をより深化させていくことが必要である。第1に社会経済的状況およびストレス状況とSOCとの関係に関する日英比較、第2にソーシャルキャピタルおよびソーシャルサポートとSOCとの関係に関する日英加3国間の比較、第3にSOCスコアそのものの国際比較と文化的要因に関する検討の3点が挙げられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。健康社会学大きく3点の方向で研究実施を行っていきたい。第1に、論文公表作業についてである。昨年度までに実施した分析成果について投稿論文化を行っていく。第2に、社会的要因(社会経済的地位、幼少期の家族背景、社会関係、ソーシャルキャピタル的変数)とSOCとの関連性の検討に関する分析を行っていく。第3に、国際比較データを用いて、カナダ、スコットランド両国との比較分析を実施していく。本年度は実査を実施しデータを取得することを当初の目的としていた。順調にサンプリング、実査を遂行するにいたり、年度末までにデータを取得することができたため。データ分析について余地がある点、国際比較についてデータセットを作成した各国との比較だけでなく、データ連結不可能であるが、代表サンプル調査を実施した国における成果との比較についての検討の余地がある点の2点で、次年度に引き続き検討を進めることとしたため。海外論文公表における掲載料分について、複数論文で、年度内での掲載決定に至らなかったため次年度繰越としている。国際比較データの分析および公表、スコアの国際比較における作業、および公表において使用する。
映画の表現教育カリキュラムの開発とプログラムの研究

本年度は映画教育に必要な実践内容を提示するために、具体的な実践から学習者の反応を記録し、その記録に対して考察を深め論文化を行った。また、映画における学習効果に関する研究を行った。映画制作を用いた教育実践を行う上で、実践者が留意しなければならない事はその実践に見込まれる学習効果である。しかしながら映画制作は基本的に協同的な作業であるため、個別の学習者について学習効果を測定する事が難しい。映画制作を用いた教育の有用性が認識されているものの、手法に多くのバリエーションが存在しないのは、この学習効果の見込みや測定の困難さが原因の一つである。つまり、学習の目的を明確にしづらいため映画を用いた教育をデザインしにくいのである。そこから、本年度は学習者が映画制作を体験学習し、その学習から受けた影響がどのようなものであるかについて作品の分析を通じて行った。そのために、映画制作内でのそれぞれの学習者の役割を明確にし、個別の学習者と作品に反映された表現の関係性が明確になるように実践を行った。分析はショット単位で行い、結果として自ら映画言語を獲得しようとする創意工夫、すなわち学習者個人の映画的な表現が見られた。映画制作を通じた教育実践には協同学習的な教育的価値、映像情報形成の仕組みを知るためのメディア・リテラシー的教育的価値などが存在し、これらの観点から学習的な意味が問われる研究が広く行われているが、本研究では映画を通じた芸術教育の可能性を提示する事ができた。実験的実践や研究の論文化など、おおむね計画通りに進行している。今後は教具の研究や教育者への教育の方法を研究する必要があると考えられる。教具の調査と研究には教具そのものの開発が必要であり、膨大な予算が必要となる。これに関しては調査終了後、具体的に開発を行う段階で科研費の申請を行う事を検討している。本年度は光学機器を用いた教育的手法について引き続き研究を行い、それらの研究の発表とガジェットとして扱われている映像機器の表現性の確認、教育的手法の実践などを行なった。まず、教育的手法の研究についてはコンテンツ教育として行なわれている実践を調査し、それらのカリキュラムのフローから見えてくるそれぞれに共通する構造や効果と問題点について検証を行なった。この検証に関しては学会にて発表を行なった。また、ガジェットとして扱われる携帯電話の付加機能である動画撮影機能についての表現性の可能性を実験した。ガジェットは学習者が映像制作に対する親和性を高める事と、操作の簡易性から教具としての適性が見込まれるからである。ただし、この機能を用いて表現が行なえる事が実証されなければ、教具として適切であると判断する事は困難である。この点をふまえて、携帯電話の動画機能を用いてどのような表現スタイルが可能であるのか、また、客観的に表現性が認められる作品を制作する事が可能であるのかなどの検証を実験により行なった。この検証によって制作された作品はフランスのForumdes imagesの主催する国際映画祭で入賞し、表現性を立証する事ができた。これらの研究と実験をもとに、教育の実践をワークショップ形式で行なった。この実践は映像の表現性について遊びが学びのきっかけとなるようにし、自発的かつ体験的に理解する事を軸に設計した。また、実際に映像制作体験を用いた教育の実践で発生しやすいいくつかの問題点について、デザイン的な視点を取り入れることによって解消に取り組み成功した。この実践は高い評価を得て、キッズワークショップアワードでは審査員特別賞を受賞した。
LOX-1結合分子群による病的血管機能誘導メカニズムの解明

LOX-1とGPCRとの複合体形成について、アンジオテンシン受容体AT1のほかに、あるGPCR-Xとも複合体を形成することを見出した。酸化LDLがLOX-1に結合すると、AT1同様にGPCR-Xを介した細胞内シグナル伝達が起きた。また、SHRSPにAT1拮抗薬を投与すると、血圧が変化しない用量でも高脂肪食による動脈壁脂質沈着が有意に抑制された。さらに、凝固因子がLOX-1と複合体を形成することにより、LOX-1および凝固因子濃度依存的にトロンビン活性化が生じることも見出した。これらの研究により、LOX-1と様々な分子が相互作用し、想定以上の多彩な生命現象を引き起こすことが明らかとなった。申請者らが同定した(酸化)変性LDL受容体LOX-1は、内皮機能障害や動脈硬化のみならず心筋梗塞、血管再狭窄、炎症といった様々な病態を悪化させる分子であることが明らかとなっている。そこで、脂質代謝にとらわれず、LOX-1分子の機能解析を行った結果、C-reactive protein、アンジオテンシン受容体AT1、血液凝固因子といった様々な分子との相互作用が明らかとなってきた。これに基づき本研究では、(1)凝固因子-LOX-1結合の血液凝固や炎症における意義、(2) LOX-1-AT1結合のシグナル伝達や血管機能調節における意義、さらに(3) LOX-1結合分子群のクロストークの病態生理学的意義の解析を行っている。(1) LOX-1への凝固因子の結合様式を解析するとともに、この結合により、血症に凝固因子が供給され、血液凝固が促進することを確認した。すなわち、凝固因子とLOX-1の結合は、理屈上は凝固因子の活性を抑制する方向で働く可能性もあったが、実際には凝固反応を促進する形で相互作用することがわかった。さらに血漿への添加ではなく、LOX-1およびLOX-1と結合する凝固因子、そして、その下流にある凝固反応に必要な分子群だけを添加した再構成系で、凝固系におけるトロンビンの活性化までの反応を促進することができることが明らかとなった。(2) in vitroの実験で、細胞膜上で分子が極めて近接して存在することを検出するin situ PLA法により、LOX-1とAT1が近接して存在すること、LOX-1の対照として、ホモロジーの最も高い分子であるDectin-1では、それが起こらないことがわかった。さらに、LOX-1とDectin-1のキメラ分子を作製し、LOX-1の細胞膜以下の部分がAT-1との複合体形成に重要であることを明らかにした。我々が同定した変性LDL受容体LOX-1は、内皮機能障害や動脈硬化のみならず心筋梗塞、血管再狭窄、炎症といった様々な病態を悪化させることが明らかとなっている。このようなさまざな役割をLOX-1結合分子群との関係の解析を通じて明らかにすることを本研究では目指している。(1)血液凝固因子-LOX-1結合の意義について、LOX-1KOマウスを利用してin vivoでの血栓・凝固反応におけるLOX-1の意義を調べた。まず塩化鉄による血栓誘導モデルや、エンドトキシンによるDICモデルで解析を行った。他の抗凝固薬がどのような状況でも血栓・凝固反応を抑制するのと異なり、LOX-1機能抑制の場合はLOX-1の発現が高まるDICのような病態においてのみ、血栓凝固反応を抑制することを明らかにした。すなわち、LOX-1を抑制しても生体に必要な通常の止血反応は抑制されないと考えられた。これは、LOX-1のような固相にある蛋白質が凝固反応を制御することと、局所での凝固反応誘導のメカニズムを明らかにしたものである。(2)細胞膜上で、LOX-1がアンジオテンシンII受容体のAT1と複合体形成をすることがわかってきた。これについて、in vitroの実験により、酸化LDLによるLOX-1刺激がAT1を介して、シグナルトランスダクションを引き起こし、転写因子の活性化を介して、エンドセリンや接着分子の発現を促進することを明らかにした。さらに組織レベルで、酸化LDL刺激による内皮機能異常誘導にLOX-1と同時にAT1が関与していることを明らかにした。これにより、LOX-1の様な1回膜貫通型の受容体刺激が、AT1のようなG蛋白質共役型受容体を介してシグナル伝達を引き起こすことを初めて明らかにすることができた。我々が同定した変性LDL受容体LOX-1は、多様な役割をもつが、それをLOX-1とLOX-1結合分子群との関係の解析を通じて明らかにすることを本研究では目指した。1我々が以前にLOX-1への結合を報告したCRPは、他の物質例えば酸化LDLや微生物由来の物質と結合し、そのエンドサイトーシスを促進するといわれている。本研究では、LOX-1に結合することがわかった凝固因子がアダプターとなってやはり他の物質のエンドサイトーシスを促進する現象を見出した。その生理的意義はいまだ明らかではないが、今後の研究により明らかにしていきたい。2これまでの研究により、LOX-1とGPCRであるAT1の複合体形成と、酸化LDLのLOX-1への結合により、AT1がそれを感知してシグナル伝達を引き起こすことを見出した。今年度は、AT1に加えてPAF受容体がやはりLOX-1と複合体を形成し、酸化LDLのLOX-1への結合を感知して、AT1同様にシグナル伝達を引き起こすことを見出した。

さらに、AT1とPAF受容体が同時に存在すると、LOX-1からのシグナル伝達は強くなり、AT1とPAF受容体は相加的、あるいは相乗的に機能していると考えられた。3酸化LDLとは異なる、我々が新しく見出したLOX-1結合分子群が、細胞膜内でのLOX-1結合分子すなわち、上述のGPCRを介してシグナル伝達を引き起こすことを見出し、2で見ているシグナル伝達が必ずしも酸化LDLに限らず、幅広いLOX-1のリガンドで機能する可能性が明らかになりつつある。LOX-1のような1回膜貫通型受容体が、GPCRのような7回膜貫通型受容体を介してシグナルを伝えることはこれまで報告されていなかったが、ある程度一般性を持つ現象である可能性がある。LOX-1とGPCRとの複合体形成について、アンジオテンシン受容体AT1のほかに、あるGPCR-Xとも複合体を形成することを見出した。酸化LDLがLOX-1に結合すると、AT1同様にGPCR-Xを介した細胞内シグナル伝達が起きた。また、SHRSPにAT1拮抗薬を投与すると、血圧が変化しない用量でも高脂肪食による動脈壁脂質沈着が有意に抑制された。さらに、凝固因子がLOX-1と複合体を形成することにより、LOX-1および凝固因子濃度依存的にトロンビン活性化が生じることも見出した。これらの研究により、LOX-1と様々な分子が相互作用し、想定以上の多彩な生命現象を引き起こすことが明らかとなった。年度途中での異動があったが、異動前の組織である程度研究を継続して行うことができた。これにより、ほぼ当初の予定どおり、LOX-1の凝固系における意義とAT1との複合体形成の意義を明らかにすることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。薬理学1血液凝固因子-LOX-1結合の血栓・凝固における意義が明らかになりつつあるが、これをさらに発展させ、LOX-1への結合により血栓・凝固以外の機能的意義を持つ可能性を検討する。例えば、LOX-1は酸化LDL結合以外に死細胞や老化細胞を貪食する働きがある。このような細胞と細胞との相互作用において、この結合が機能している可能性が考えられるので、このような点についても解析を行い、これまでと全く異なる視点を提供したい。2細胞膜上では、LOX-1がAT1と複合体形成をすることがわかった。これは、LOX-1のような1回膜貫通型の分子がGPCRを介して作用する初めての例であるが、この知見をさらに発展させ、他のGPCRでAT1のようにLOX-1とカップリングするものがないかを探索する。具体的には、LOX-1とGPCRの共発現細胞株を用い、細胞膜状での結合、遺伝子発現制御、シグナルトランスダクション、リガンドの種類による反応の違いなどを検討する。また、そのGPCRがLOX-1とカップリングする意義、そして、AT1とそのGPCR、そしてLOX-1が一体となって機能する可能性についても検討する。3LOX-1結合分子群のクロストークを明らかにする。LOX-1結合分子群が明らかになったことで、LOX-1の種々のリガンドが、酸化LDLによって惹起される細胞の変化と同様な変化を、新しいメカニズムを通じて引き起こす可能性がある。このような可能性について引き続き検討し、さらに新しいメカニズムを明らかにしたい。ほぼ予定通り、3つに分けたテーマのうち最初に進める2つが進行し、その結果を踏まえて行う3つ目のテーマを26年度以降に進める準備もできた。
細胞内オルガネラ膜トランスポーター活性の定量的可視化による薬物の細胞毒性評価

本研究では細胞内での医薬品動態を解析するために、蛍光プローブを用いた可視化によるin vitro評価系の樹立を試みた。医薬品の多くは胆汁中に排泄されるがその過程には肝胆管腔側細胞膜に複数のABCトランスポーターが介在する。医薬品ならびにその抱合代謝物の胆汁中排泄にはMRP2(ABCC2)が介在するため、併用薬物や病態などによるその活性変動は医薬品の肝動態変化に伴う肝蓄積性など悪影響を及ぼす可能性がある。そこで昨年度に引き続き、細胞内のエステラーゼによりMRP2の蛍光基質のCDFへ変換されるエステル体CDFDAを用いた解析を進めた。細胞接着部分に胆管腔を形成するサンドイッチ培養ラット肝細胞(SCRH)を利用し、肝実質細胞内から胆管腔へのCDF移行を蛍光顕微鏡下で経時的に観察する方法論の樹立を行った。その結果、蛍光顕微鏡観察下、CDFの胆管腔内への蓄積性を時間依存的に検出し、しかもその活性を定量化することに成功し、Drug Metab.Disps.誌にその成果が受理されるに至った。さらに、胆汁うっ滞等毒性と関連する可能性のある胆汁酸排泄に働くトランスポーターBSEPについても同様な解析をすべく、新しいBSEP輸送解析プローブ基質の探索ならびに新規合成を進めた。その結果、dihydrofluorescein diacetateがラットBsep機能解析を上記と同様な手法で進めることが可能であることを見いだした。しかし、ヒトBSEP解析には不充分なため、新たなプローブ基質の探索と新規合成を展開している。本研究で樹立した手法により、胆管側膜ABCトランスポーダーの活性を定量的に解析することが可能になり、今後は各トランスポーター選択的プローブ基質探索・合成により細胞内で機能する多様なトランスポーターの輪送活性評価への応用の可能性を示すことができた。現在トランスポーター活性は遺伝子発現細胞や単離された膜ベシクル画分を用いて解析される。これらの実験系で輸送活性を評価するためには、一定時間における使用した細胞などへ移行した試験化合物を抽出して、みかけの移行量を分析することになる。そのため、細胞膜表面への吸着や結合などもみかけ上膜輸送として定量値に入る可能性も高く、真に膜輸送による取り込みと区別することは困難である。特に、細胞内オルガネラ膜における輸送など、細胞内の局在性も加味した解析はできない。そこで本研究では化合物の細胞内での動態を蛍光標識することによりモニターし、さらに簡便で定量的に解析する手法の樹立を試みた。今年度は以下を対象とした検討を進めた。肝胆管側膜トランスポーターの活性評価にはトランスポーター発現膜ベシクルが利用されるが、肝実質細胞内に基質認識部位を有するMRP2等の肝胆管側膜トランスポーターは細胞内から管腔への移行であり、細胞内環境下での活性を反映させることは容易ではない。そこで対象トランスポーターとしてMRP2に着目し、細胞内のエステラーゼによりMRP2の蛍光基質のCDFへ変換されるエステル体CDFDAを用いた。評価系としては、細胞接着部分に胆管腔を形成し、BEIによって胆汁中移行性評価法が樹立されているサンドイッチ培養ラット肝細胞(SCRH)を利用し、肝実質細胞内から胆管腔へのCDF移行を蛍光顕微鏡下で経時的に観察することにより、Mrp2活性を定量的に可視化して評価する方法論の提唱を試みた。その結果、蛍光顕微鏡観察下、CDFの胆管腔内への蓄積を高い精度と確度で見積もることができることが示唆できた。本手法によって細胞内特定オルガネラ部位で機能するトランスポーターの輸送活性評価への応用の可能性を示すことができた。今後は肺胞細胞や消化管上皮細胞なども毒性面で問題であり、応用を試みる。