hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高血圧における交感神経系異常に関する中枢内Rho-Kinaseの役割

近年の研究により低分子量であるRhoおよびその標的蛋白であるRho-kinaseが細胞骨格の整合性、血管平滑筋細胞収縮など様々な細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。このRho/Rho-kinase系は中枢神経系にも存在し、スパインの維持や軸索の成長、神経伝達物質の放出に関与していることが示されている。我々は、中枢性血圧調節機序にこの系が関与していることを示した。正常血圧ラット(WKY)および自然発症高血圧ラット(SHR)の脳幹部延髄孤束核(NTS)に特異的Rho-kinase阻害薬であるY-27632を微量注入すると降圧、心拍数減少、交感神経活動の減少を観察した。これらの低下の程度はSHRにおいてWKYに比べると有意に大きかった。また、無麻酔覚醒下における慢性実験としてアデノウイルスをベクターとしてdominant-negative Rho-kinase遺伝子をNTS内へ感染させると、やはり降圧、心拍数減少、尿中ノルエピネフリン排泄量の減少を観察した。この低下の程度もSHRにおいてWKYに比べて大きかった。さらに、RhoA膜分画およびRho-kinaseの活性はWKYに比べSHRで亢進していた。以上の成績は、NTSにおけるRho/Rho-kinase系が交感神経系を介して血圧調節に関与していること、この系の活性化が高血圧の中枢性機序に関与している可能性を示唆するものである(2002年国際高血圧学会で発表、論文投稿中)。さらに、我々は別の高血圧モデルである慢性的に一酸化窒素合成酵素を阻害したラットにおいてもRho/Rho-kinase系の活性化が血圧上昇に関与している成績も得た(2002年アメリカ心臓協会学術集会で発表)。また、動脈圧受容器反射による心拍数の調節におけるNTS内Rho/Rho-kinase系の重要性も観察している。すなわち、Rho-kinaseを抑制すると動脈圧受容器反射による心拍数調節のゲインが大きくなり、高血圧モデルでは減弱しているこの調節系が改善することを見い出している。Rho/Rho-kinase系はさまざまな細胞機能に重要な役割を果たしていることが解明されつつある。特に、アクチン細胞骨格の変化を介する血管平滑筋細胞収縮に関する研究報告は多い。我々は、高血圧症におけるRho/Rho-kinase系の活性化が高血圧における過剰な血管収縮に関与していることを自然発症高血圧ラット(SHR)において示した。さらに、ヒト高血圧患者において現在ヒトに使用しうるRho-kinase阻害薬であるfasudilを上腕動脈内に注入することにより前腕血管拡張が生じるが、正常血圧者では認められないことを報告した(発表論文参照)。このRho/Rho-kinase系は脳内にも豊富に存在することが知られているが、中枢性血圧調節におけるこの系の役割については全く不明である。我々は、脳幹部の延髄孤束核(NTS)におけるRho/Rho-kinase系が血圧調節に重要な役割を果たしていることを示した。すなわち、正常血圧ラット(WKY)およびSHRの両者において、選択的Rho-kinase阻害薬のNTS内への微量注入やdominant-negative Rho-kinaseを組み込んだアデノウイルスベクターをNTS内へ遺伝子導入することにより、降圧および心拍数低下反応が生じることを観察した。この降圧および心拍数低下反応の大きさの程度はWKYに比べSHRにおいて有意に大きかった。

さらに、NTSにおけるRhoA発現およびRho-kinase活性はWKYに比べSHRにおいて亢進していた。以上の成績は、脳幹部NTSにおけるRho/Rho-kinase系は交感神経系を介する血圧調節に関与していること、この系の活性化が高血圧の中枢性機序に関与しているかも知れないことを示すものである(日本高血圧学会で一部成績を発表、論文投稿中)。我々は、本研究を実施する上での前段階として、in vivoでのアデノイウルスベクターを用いた脳内局所への遺伝子導入法は確立し、高血圧モデルにおける検討も可能とした(発表論文参照)。近年の研究により低分子量であるRhoおよびその標的蛋白であるRho-kinaseが細胞骨格の整合性、血管平滑筋細胞収縮など様々な細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかにされつつある。このRho/Rho-kinase系は中枢神経系にも存在し、スパインの維持や軸索の成長、神経伝達物質の放出に関与していることが示されている。我々は、中枢性血圧調節機序にこの系が関与していることを示した。正常血圧ラット(WKY)および自然発症高血圧ラット(SHR)の脳幹部延髄孤束核(NTS)に特異的Rho-kinase阻害薬であるY-27632を微量注入すると降圧、心拍数減少、交感神経活動の減少を観察した。これらの低下の程度はSHRにおいてWKYに比べると有意に大きかった。また、無麻酔覚醒下における慢性実験としてアデノウイルスをベクターとしてdominant-negative Rho-kinase遺伝子をNTS内へ感染させると、やはり降圧、心拍数減少、尿中ノルエピネフリン排泄量の減少を観察した。この低下の程度もSHRにおいてWKYに比べて大きかった。さらに、RhoA膜分画およびRho-kinaseの活性はWKYに比べSHRで亢進していた。以上の成績は、NTSにおけるRho/Rho-kinase系が交感神経系を介して血圧調節に関与していること、この系の活性化が高血圧の中枢性機序に関与している可能性を示唆するものである(2002年国際高血圧学会で発表、論文投稿中)。さらに、我々は別の高血圧モデルである慢性的に一酸化窒素合成酵素を阻害したラットにおいてもRho/Rho-kinase系の活性化が血圧上昇に関与している成績も得た(2002年アメリカ心臓協会学術集会で発表)。また、動脈圧受容器反射による心拍数の調節におけるNTS内Rho/Rho-kinase系の重要性も観察している。すなわち、Rho-kinaseを抑制すると動脈圧受容器反射による心拍数調節のゲインが大きくなり、高血圧モデルでは減弱しているこの調節系が改善することを見い出している。
ロドプシン類の機能進化におけるリガンドとの共有結合の役割

ロドプシンは脊椎動物の眼で光受容を担う代表的なオプシン・タンパク質である。光を効率的に受容するためロドプシンは分子内に光を吸収し構造変化を起こすレチナールと共有結合していることが知られている。興味深いことにロドプシンは拡散性のリガンド分子を受容しGタンパク質を介してシグナル伝達機構を駆動するGPCR(Gタンパク質共役型受容体)類に属することが系統解析によって明らかにされている。ロドプシン中のレチナールはGPCRのリガンドの結合部位に位置し、ロドプシンのリガンドであると考えることができる。ロドプシンは拡散性のリガンドを結合するGPCRから進化したと考えられが、共有結合したレチナールリガンドをもつ光受容体と拡散性のリガンドを結合する受容体はどのように異なるのか、光受容体そしてGタンパク質共役型受容体の機能を考える上で重要である。共有結合したレチナールリガンドがロドプシン中でどのような機能を果たしているのか調べるためレチナールの結合部位が欠損しているロドプシンの変異体(K296G)を用いて分光学的解析を行った。フーリエ変換赤外振動分光法によってこの変異体を解析した結果、基底状態では共有結合の寄与は少なく、受容体は野生型と同様な相互作用を用いて構造を安定化していることが明らかになった。また光反応初期の中間体も変異体と野生型で似たような相互作用をしているこどが明らかになった。つまり基底状態そして反応初期においてレチナールは共有結合ではなく近傍のアミノ酸との相互作用によってレセプターに留められ、不活性状態を安定化していることを示した。ロドプシンはこれまでG蛋白質共役型受容体(GPCR)スーパーファミリーAの典型的な受容体として注目されており、GPCRの一般的な活性化機構を研究するためのモデルとして研究されてきた。しかしロドプシンは光受容体として特化したため、拡散性のリガンドを結合する一般的なGPCRとは違ってリガンドがレセプターと共有結合している。ロドプシンは拡散性のリガンドを結合するGPCRから進化したと考えられるため、リガンドとの共有結合はロドブシン類の進化を考える上でも重要なイベントだと考えられる。したがって共有結合したレチナールリガンドがロドプシン中でどのような機能を果たしているのか調べることは興味ある研究対象である。そのためレチナールの結合部位が欠損しているロドプシンの変異体を用いて生化学的・分光学的解析を行った。その結果、レチナールリガンドの効率的な光異性化反応には共有結合は必要ではないが活性状態の生成・安定化に必要であることが分かった。特に、共有結合を欠損したロドプシン変異体の活性状態は不安定で、リガンドをすぐに放出することが分かった。以上のことから、共有結合はこの低アフィニティーリガンドを無理矢理レセプターに留めておき活性状態を維持することによってロドプシンの高活性化能に寄与していると考えられる。またこの変異体はリガンド非結合状態でGタンパク質を構成的に活性化するため、野生型と比較することによってリガンド依存的な活性状態と構成的な活性状態の違いを調べることができる、その結果、野生型と変異体にはそれぞれ特徴的な応答特性があることが分かり、リガンド依存的な僧性状態と構成的な活性状態の分子特性が明らかになった以上の研究から、ロドプシン類の特徴であろレチナールリガントの生理的意義そしてその分子機構が明らかになった。
黄色ブドウ球菌性熱湯様皮膚症候群における疾患感受性の解析

本年度は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素(ET)の標的物質について遺伝子解析を中心に行なった。A型ETはヒト血漿由来フィブロネクチンを切断する活性を有し、切断アミノ酸配列からコドン第三位をイノシンに置換したDNAプライマーを作製し、他方のプライマーにカセットプライマーを用いてPCR法で増幅できた280bpのDNA断片はβ-catenin mRNAの3'-非翻訳領域であった事を昨年度に報告した。β-cateninはCadherinの作用を活性化する働きがあることとdesmosomeに存在するplakoglobinと構造が似ているので両者の塩基配列を比較して、僅かに違う部分を選んで各プライマーを作製した。新産仔マウスの表皮からRNAを抽出して、リバーストランスクリプターゼを用いてcDNAを作製した。前述のプライマーを用いてcDNAをPCRで反応させた。その結果、新産仔マウスからのcDNAにおいてβ-cateninとplakoglobinの増幅を認めたが、生後10日以上のマウスからのcDNAではplakoglobinが僅かに増幅されたが、β-cateninの増幅は全く認められなかった。このことは、ETAが生後4日以内の新産仔マウスで表皮剥脱が認められ、それより成長すると同じETA量では表皮剥脱が鈍感になる現象に対応している。従って、ETAの標的物質は新産仔マウスの期間に産生される物質であると考えられる。本研究では主に細胞内の遺伝子解析によってETAの標的物質を絞り込む事ができたが、具体的にETAが切断する物質を証明できなかった。これまでに得られた実験結果を基に、さらに具体的な物質を追求したいと考えている。今年度の研究日標は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素血清型A(ETA)の標的物質の解析に重点をおいた。ETAによってin vitroで切断されたヒト血漿由来フィブロネクチン(FN)、分子量460kDaをゼラチンセファロースカラムによるアフィニティークロマトによって分画し、0.05M酢酸ナトリウムpH5.0で溶出される分画をSDS-7.5%PAGEにかけた後、セミドライ法でクリアブロット-P膜に転写し、coomassie brilliant blue G-250染色によって検出した90kDa、70kDa、50kDa分別帯のうち、70kDa分別帯のN末端アミノ酸配列を決定した。この70kDa断片のN末端アミノ酸配列は、FNのN末端から1439残基目の後流の配列に相当していた。70kDaのN末端アミノ酸配列を基にして24merのオリゴヌクレオチドプライマー(ETA5)を作製した。新産仔マウスならびに生後10日のマウスからmRNAを分離し、各々のcDNAライブラリーを調整した。これらのcDNAをBamH Iで消化し、LA PCR in vitro Cloning(TAKARA)を用いてSau3AIカセットを連結し、カセットプライマーC1およびETA5をプライマーとしてPCRを行った結果、分子サイズは280bpのバンドを得た。これをpUC19に連結して大腸菌に導入し、そのtransformantからrecombinant plasmidを調整した。これを鋳型としてsequencing primer(M13 primer M4,RV)を用いてPCRを行い、280bp断片が増幅される複数のrecombinant plasmidが得られた。これらのrecombinant plasmidを精製し、現在、塩基配列の解析を進めている。なお、次年度にはETAの標的物質(基質)を決めて、それに対する抗体を作製する予定である。本年度は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素(ET)の標的物質の解析を行った。

A型ET(ETA)によって切断される物質としてヒト血漿由来フィブロネクチン(FN)を見出し得たので、切断されたFNをゼラチンセファロースカラムによるアフィニティークロマトで分画し、0.05M酢酸ナトリウムで溶出される分画をSDS・PAGEにかけた後、セミドライ法でクリアプロット-P膜に転写し、クマジーブリリアントブルーG-250染色によって検出した70kDa蛋白のN末端アミノ酸配列を解析した。このアミノ酸配列をもとに24merのオリゴヌクレオチドプライマー(ETA5)を作製した。ETAに強い感受性を示す新産仔マウスの皮膚よりmRNAを分離し、リバーストランスクリプターゼでcDNAを作製した。これをBam HIで消化しSau3AIカセットを連結しカセットプライマーClおよびETA5プライマーを用いてPCRを行った。PCR産物は1本のバンドとして増幅され、その分子サイズは280bpであった。この増幅断片の塩基配列を分析してホモロジーサーチを行った結果、β-catenin RNA遺伝子の一部である可能性が高くなった。すなわち、β-catenin mRNAの3'-非翻訳領域である結果を得た。カテニンは細胞間の重要な接着分子のカドヘリンと結合している分子で、カドドヘリンが接着分子として働くために必須であるとされている。今後は、これらの物質を中心に黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素の標的物質を追求する予定である。本年度は黄色ブドウ球菌性表皮剥脱素(ET)の標的物質について遺伝子解析を中心に行なった。A型ETはヒト血漿由来フィブロネクチンを切断する活性を有し、切断アミノ酸配列からコドン第三位をイノシンに置換したDNAプライマーを作製し、他方のプライマーにカセットプライマーを用いてPCR法で増幅できた280bpのDNA断片はβ-catenin mRNAの3'-非翻訳領域であったことを昨年度に報告した。β-cateninはCadherinの作用を活性化する働きがあることとdesmosomeに存在するplakoglobinと構造が似ているので両者の塩基配列を比較して、僅かに違う部分を選んで各プライマーを作製した。新産仔マウスと生後10日以上のマウスの表皮からRNAを抽出して、リバーストランスクリプターゼを用いてcDNAを作製した。前述のプライマーを用いてcDNAをPCRで反応させた。その結果、新産仔マウスからのcDNAにおいてβ-cateninとplakoglobinの増幅を認めたが、生後10日以上のマウスからのcDNAではplakoglobinが僅かに増幅されたが、β-cateninの増幅は全く認められなかった。このことは、ETAが生後4日以内の新産仔マウスで表皮剥脱が認められ、それより成長すると同じETA量では表皮剥脱が鈍感になる現象に対応している。従って、ETAの標的物質は新産仔マウスの期間に産生される物質であると考えられる。本研究では主に細胞内の遺伝子解析によってETAの標的物質を絞り込み事ができたが、具体的にETAが切断する物資を証明できなかった。これまでに得られた実験結果を基に、さらに具体的な物質を追求したいと考えている。
20世紀中国における知識人集団の思想と行動--胡適新文化集団の思想と行動

本研究は、20世紀という歴史変動期における中国知識人集団の思想と行動を、胡適新文化集団という個別事例を通じて明らかにする試みである。その際、191751年、195178年、1978年現在、という3つの時代区分を設け、それぞれの時代における胡適新文化集団の思想と行動に関する分析によって、3時代の知識人集団の共通点と相違点を明らかにすることに重点を置く。第1年度は、胡適新文化集団そのものの理解を深めるための基礎作りを目指して、基礎的なデータベースを試みた。第2年度(最終年)は、胡適新文化集団そのものの実態究明を目指した第1年目の成果の上に、胡適新文化集団の3時代における社会的・文化的・思想的役割に関する総括を行うことができた。その主な成果は以下の通りである。1 20世紀中国における知識人の思想胡適の中国思想史とアメリカ・プラグマティズムとの相関関係について、1910年代から胡適の最晩年の60年代までを通観し、その受容・発展・普及の実態を明らかにした。2胡適新文化集団の研究胡適新文化集団が目指した近代的教育制度について、主に歴史的観点よりする分析を行った。3胡適新文化集団と現代中国胡適に提唱した自由主義の、現代中国における受容・反発・再提起の過程を研究した。特に改革開放期後半の1990年代以後における展開を重視した。以上の研究により、胡適新文化集団の20世紀中国における思想的・文化的・社会的な位置付けがより明確になったと考える。研究の第1年度に当たる本年は、胡適新文化集団そのものの理解を深めるための基礎作りを目指して、以下の3つのテーマの下に調査・研究を進めた。1胡適新文化集団の個人データのデータベース化と定量分析を行った。同集団の構成員と考えられる約300名について、その氏名、生年、没年、出身地、学歴、勤務大学・学会、胡適書簡の登場する時期、回数についての情報を整理した。2胡適の著作・翻訳・書簡の整理・補充を行った。中国大陸の安徽人民出版社から『胡適全集』全40巻が刊行されたのを受け、同全集に新たに収録された資料と『胡適遺稿及秘蔵書信』所収の「胡適档案」との対応関係を整理した。また、『全集』刊行以前に3種類の資料集に分散収録されていた胡適関連書簡を、新『全集』に基づいて、胡適新文化集団の構成員ごとに編纂し直した。3胡適新文化集団に関する著作目録、胡適関連の研究文献目録の作成を行った。同集団の構成員については、徐志摩、張東〓、陶行知、銭玄同、顧頡剛についてその著作を整理した。胡適関連の研究文献目録については、『胡適研究叢刊』に依拠しながら、そこから漏れたものの収集に努めた。以上の基礎作業の上に、胡適新文化集団の思想と行動に関する考察を、数編の論考にまとめた。本格的な研究と総括は次年度に予定している。本研究は、20世紀という歴史変動期における中国知識人集団の思想と行動を、胡適新文化集団という個別事例を通じて明らかにしようとする試みである。

その際、1917年51年、195178年、1978現在、という3つの時代区分を設定し、それぞれの時代における胡適新文化集団の思想と行動に関する分析によって、3時代の知識人集団の共通点と相違点を明らかにすることに重点を置いた。研究の第2年(最終年)に当たる本年は、胡適新文化集団そのものの実態究明を目指した第1年目の成果の上に、胡適新文化集団の3時代における社会的・文化的・思想的役割に関する総括を行うことが出来た。その主な成果は以下の通りある。1「哲学の運命--胡適のデューイ」において、胡適の中国哲学史のアメリカ・プラグマティズムとの相関関係について、1910年代から胡適の最晩年の60年代までを通観し、その受容・発展・普及の実態を明らかにした。2「中国現代思想19912003」において、胡適に提唱した自由主義の、現代中国における受容・反発・再提起の有様を解明した。特に改革開放期後半の1990年代以後における展開を重視した。3「書院の公共性をいかに復権するか」において、胡適が目指した書院教育と近代的教育制度の調和モデルの可能性について、主に歴史的観点よりする分析を行った。4「現代中国における国家と社会」において、上記の2の観点をさらに発展させ、現代中国における胡適新文化集団出自の自由主義の持つ政治思想的な意味付けについて、市民社会論の観点よりする総括を行った。以上の研究により、胡適新文化集団の20世紀中国における思想的・文化的・社会的な位置付けがより明確になったと考える。
加齢による声帯粘膜固有層の線維化に対する新たな治療法の開発

加齢によって生じる嗄声の要因の一つに、声帯の粘膜固有層に生じる線維化があげられる。具体的にはコラーゲンやファイブロネクチンが増加し、ヒアルロン酸が低下することで声帯の粘弾性が低下して嗄声を生じると考えられている。本研究では、加齢によって声帯に生じる線維化を、抗線維化作用を有する薬剤(ピルフェニドン)を使用することで回復させることができないか検討した。生後8週齢(若年モデル)と生後18ヶ月齢(高齢モデル)のSDラットを用いた。喉頭を摘出して声帯から組織を採取し、筋線維芽細胞の培養を行った。培養した筋線維芽細胞を用いて、瘢痕収縮抑制効果の指標となるコラーゲンゲル収縮アッセイと、コラーゲンタイプ1、αsmooth-muscle actin(αSMA)を用いた免疫染色を行った。コラーゲンゲル収縮アッセイでは、ピルフェニドンを添加していない高齢モデルに比べてピルフェニドンを添加した高齢モデルではゲルの収縮が軽度であった。加齢によっておこるコラーゲンの増生がピエルフェニドンを添加することで抑えられ、ゲルの収縮が軽度にとどまった可能性が示唆された。しかし、ピルフェニドン非添加群の中にも収縮があまり見られないものもあった。加齢による線維化だけではゲルの収縮がそれほど顕著ではなく、そのためこの方法のみで加齢によるコラーゲンの増生へのピルフェニドンの抑制効果を判断するのは困難であると思われた。免疫染色では、コラーゲンタイプ1、αSMAの発現のピルフェニドン添加の有無による差はほとんど目立たなかった。以上の結果からは、今回の結果だけでは加齢によって声帯粘膜固有層に生じる線維化がピルフェニドン投与によって改善するかどうかを判断するのは困難であると思われた。今後は、PCRやELISAといった方法や、in vivoでの摘出喉頭を用いた声帯の粘弾性の検討などを用いてさらに検討する必要があると思われた。加齢による粘膜固有層の線維化への対応が本研究のテーマであるが、加齢のモデルとなるラットは生後18ヶ月齢の高齢ラットを用いることとしており、現在、業者に飼育を依頼している状況である。18ヶ月になった時点で納入の予定であるが、それまでの間は実験手技の確立のために、高齢ラットの比較対象となる8週齢の若年ラットを用いて実験を行っている。まず初めにin vitro実験を行っている。安楽死させたラットの喉頭を摘出し、摘出喉頭から顕微鏡下に声帯粘膜固有層のみを採取する。採取した組織はそのままシャーレに入れて、線維芽細胞を培養するという一連の操作を繰り返し行った。当初は培養細胞が十分に増殖しないことも多かったが、手技を工夫することで徐々に安定して培養できるようになってきた。その後、分離培養した線維芽細胞の免疫染色、real time (RT) PCRを行った。コラーゲンやヒアルロン酸、筋線維芽細胞の細胞マーカーであるαsmooth-muscle actin、線維化促進作用を有するTGFβ1などの検討を行ったが、まだ実験回数が少なく、充分な評価はできていない状態である。培養した線維芽細胞は多数を凍結保存している状態であり、引き続き細胞培養と並行して上記免疫染色などを進めていきたい。また、今後は免疫染色やRT-PCRに加えてコラーゲンゲル収縮アッセイでの瘢痕収縮抑制効果の検討も行っていく予定である。今年度には高齢ラットが納入されるため、高齢ラットを用いて現在行っている若年ラットと同様の実験を行っていく予定である。当初購入を予定していた動物飼育・販売業者で動物の感染症が発生したために購入が一切できなくなった。このため、別の業者に飼育・販売を依頼することになり、高齢ラットの納入が当初の予定よりも遅くなった。今年度の上旬の予定である。また、地震の影響で実験室や実験器具が使用できない状況が数か月続き、遅れの原因となった。実験内容としては採取した声帯粘膜固有層からの細胞培養がうまくいかず、試行錯誤したため時間を要している。左右の声帯を別々に培養していたが、それでは採取できる組織量が非常に少ないことが原因と考えられた。1個体の両側の声帯を一緒に培養することで安定して細胞が増殖するようになった。加齢によって声帯の粘膜固有層に生じる線維化を、抗線維化作用を有する薬剤(ピルフェニドン)を使用することで回復させることができるかどうかを検討している。これまで、生後8週齢(若年モデル)と生後18ヶ月齢(高齢モデル)のウイスター系ラットを用い、喉頭を摘出して声帯から組織を採取し、筋線維芽細胞の培養を行った。若年モデル12匹、高齢モデル24匹の組織を採取し培養した。培養細胞を用いてコラーゲンやヒアルロン酸、αSMAの免疫染色を行った。当初は細胞培養がなかなかうまくいかず、評価できている数は充分ではないが、加齢によってコラーゲンが増加し、ヒアルロン酸が低下する結果が得られている。これはこれまでに報告されているものと同様の結果であり、現在のモデルは本研究のモデルとして充分であると考えている。今後は数を増やして統計学的にその変化を検討したい。また、real time PCRやコラーゲンゲル収縮アッセイも行い、多角的に細胞外基質の変化を評価する。平衡して、in vitro実験としてピルフェニドンを培養細胞に添加し、細胞外基質の変化について同様に免疫染色やreal time PCR、コラーゲンゲル収縮アッセイを用いて検討していく。

その後は、in vivo実験としてピルフェニドンを添加した飼料を高齢モデルに4週間投与し、ピルフェニドン投与の有無での声帯の組織像の変化を免疫染色を用いて比較検討する予定である。地震による研究機材の故障によるの入れ替えや実験室の改修、変更による実験環境の変化などによってこれまでできていた実験がスムーズにできなくなり、実験結果にもそれが反映される結果となった。細胞培養でうまく細胞が増殖せず、当初の研究計画よりも実験がかなり遅れている状態である。ようやく培養細胞が安定して増殖するようになり、増殖した細胞は凍結保存している。また、一部の細胞を用いて、コラーゲンやヒアルロン酸、αSMAの免疫染色を行い、手技の確立に努めた。real time PCRやコラーゲンゲル収縮アッセイも行い、安定してきちんとした結果が得られるようになってきている。加齢によって生じる嗄声の要因の一つに、声帯の粘膜固有層に生じる線維化があげられる。具体的にはコラーゲンやファイブロネクチンが増加し、ヒアルロン酸が低下することで声帯の粘弾性が低下して嗄声を生じると考えられている。本研究では、加齢によって声帯に生じる線維化を、抗線維化作用を有する薬剤(ピルフェニドン)を使用することで回復させることができないか検討した。生後8週齢(若年モデル)と生後18ヶ月齢(高齢モデル)のSDラットを用いた。喉頭を摘出して声帯から組織を採取し、筋線維芽細胞の培養を行った。培養した筋線維芽細胞を用いて、瘢痕収縮抑制効果の指標となるコラーゲンゲル収縮アッセイと、コラーゲンタイプ1、αsmooth-muscle actin(αSMA)を用いた免疫染色を行った。コラーゲンゲル収縮アッセイでは、ピルフェニドンを添加していない高齢モデルに比べてピルフェニドンを添加した高齢モデルではゲルの収縮が軽度であった。加齢によっておこるコラーゲンの増生がピエルフェニドンを添加することで抑えられ、ゲルの収縮が軽度にとどまった可能性が示唆された。しかし、ピルフェニドン非添加群の中にも収縮があまり見られないものもあった。加齢による線維化だけではゲルの収縮がそれほど顕著ではなく、そのためこの方法のみで加齢によるコラーゲンの増生へのピルフェニドンの抑制効果を判断するのは困難であると思われた。免疫染色では、コラーゲンタイプ1、αSMAの発現のピルフェニドン添加の有無による差はほとんど目立たなかった。以上の結果からは、今回の結果だけでは加齢によって声帯粘膜固有層に生じる線維化がピルフェニドン投与によって改善するかどうかを判断するのは困難であると思われた。今後は、PCRやELISAといった方法や、in vivoでの摘出喉頭を用いた声帯の粘弾性の検討などを用いてさらに検討する必要があると思われた。高齢ラットが今年度上旬に順次納入されるため、高齢ラットでも同様に摘出喉頭から声帯粘膜固有層を採取して細胞培養を行う。組織の採取から細胞培養までは安定して行えるようになってきているため、効率よく実験が進められると考えている。若年、高齢ともに培養した線維芽細胞を用いて免疫染色やRT-PCR、ゲル収縮アッセイなどの予定している検査を行い、比較検討していく予定である。また、in vivoの実験として、若年ラット、高齢ラットそれぞれに対してピルフェニドン含有の飼料と通常の飼料を別々に与える。
高集光液体シンチレータ検出器による二重ベータ崩壊の研究

同位体濃縮キセノンを用いた0ν二重ベータ崩壊の高感度観測のための装置開発を行った。成型したPETフィルムにアルミ蒸着することで大型液体シンチレータ検出器(KamLAND)に特化した形状の集光ミラーを製作し、遠距離から飛来するシンチレーション光に対する集光率の増加を実測によって確認した。同時に、リニアアルキルベンゼンを溶媒とした液体シンチレータの光学性能を高めるため蒸留法と吸着法を組み合わせた不純物除去を行い、現行の液体シンチレータ以上の性能が得られることを確認した。本研究によって、逆階層型までのニュートリノ質量の検証を実現する0ν二重ベータ崩壊探索実験の具体的な検討が可能となった。KamLAND-Zen実験では、同位体濃縮キセノン(136Xe)を液体シンチレータに溶かし込み、ニュートリノ放出を伴わない二重ベータ崩壊を探索している。今年度発表した最初の結果では、ニュートリノの有効質量に対して0.3-0.6eVの上限値を得てトップクラスの感度を達成したが、今後さらに液体シンチレータの不純物を除去することで縮退型質量(60meV以上)までの感度が見込まれる。本研究では、検出器を改良してエネルギー分解能を向上させることで、逆階層型質量(20meV以上)の検証を目標とする。エネルギー分解能を高めるためには、シンチレーション光の集光量を増加させる必要がある。そこで、Winstone-Cone(放物線型回転体)型の高集光ミラーを光電子増倍管の前面に取り付けることで、検出器全体で2倍の集光効率の増加を目指す。光電子増倍管はパラフィンオイル中で用いるため、液中での反射率測定によるミラーの選定を行った。その結果、PETフィルムをベースにアルミ蒸着(厚み40nm)した反射材において85%程度の目標値に近い反射率が得られることが分かった。空気中との比較により液中での2%の反射率減少、高入射角での反射率増加などが確認されたが、集光率に対する影響は十分に小さい。この反射率をインプットとした光シミュレーションでは検出器全体での集光率は1.51.7倍となったが、高入射角での反射率増加を考慮した場合では、若干の増加が期待される。逆階層型質量の検証では、5年間の継続的な観測が必要であるため、ミラーの長期安定性の確認も重要である。反射率については、50°Cでの加速試験(約8倍速度)において8ヶ月相当の安定性が保証された。また、PETやアルミによるパラフィンオイルに対する影響についても考慮する必要があるが、吸光光度計による測定で光透過率が減少することは無いことが分かった。これらの結果から、PETベースのアルミ反射材は有力な集光ミラーの候補であると評価できる。KamLAND-Zen実験は、同位体濃縮したキセノンを液体シンチレータ中に溶かし込むことで、ニュートリノ放出を伴わない二重ベータ崩壊探索を行うことを目的としている。昨年度発表した結果では、ニュートリノの有効質量に対して160-330meVの上限値を得て既に世界最高感度を達成した。さらに純化作業によって主なバックグラウンド源となっていた液体シンチレータ中の放射性不純物を10分の1以下に抑えることに成功した。その一方で、低エネルギーに分布するニュートリノ放出を伴う二重ベータ崩壊によるバックグラウンドが主要なバックグラウンドとなりつつあり、エネルギー分解能の向上が望まれる。本研究では、検出器を改良してエネルギー分解能を向上させることで、逆階層型質量(20 meV以上)の検証を目標とする。検出器のエネルギー分解能改善を実現するため、高発光量液体シンチレータの開発と集光ミラーの開発を行った。液体シンチレータの開発は、リニアアルキルベンゼンを溶媒とした液体シンチレータの光学性能を高めるため蒸留法による不純物除去を行い、デスクトップ型の小型装置で透過率の向上を確認した。検出器サイズ(約6.5 m)での相対光量に換算すると、約1.6倍程度の増加であった。また、外部ガンマ線を遮蔽するための発光しないバッファーオイルの開発を行い、LAB+DMP(5 g/l)の溶媒が極低発光量・高透過率・同密度の要求を満たすことを確認した。集光ミラーの開発では、Winstone-Cone型高集光ミラーの試作品を16個製作し、検出器サイズの距離から到来するシンチレーション光に対する集光率が1.71.9倍程度まで増加することを空気中において実測した。実際の検出器では0度40度までの範囲の集光が必要であるが、光の入射角度による集光率の低下はほとんど無いことが確認できた。KamLAND-Zen実験は、同位体濃縮したキセノンを液体シンチレータ中に溶かし込むことで、高感度な二重ベータ崩壊探索を行うことを目的としている。

今年度発表した結果では、ニュートリノの有効質量に対して160-330meVの上限値を得て既に世界最高感度を達成し、今後さらに液体シンチレータの不純物を除去することで縮退型質量(60meV以上)までの感度が見込まれる。本研究よって検出器のエネルギー分解能の改善が実現した場合、20meVまでの感度を達成することができるため、ニュートリノのマヨラナ性を発見するか、もしくはニュートリノの質量階層を決定するかのどちらか確実な成果が得られることになる。現在の検出器のエネルギー分解能を高めるため、本年度は集光率増加のための集光ミラーの開発と発光量増加のための液体シンチレータの開発を並行して進めた。集光ミラーの開発では、前年度のデザインを基にした試作品を製作した。PETにアルミを真空蒸着した平板のサンプル(保護膜なし)は、期待通り広い波長域において90%以上の反射率が得られた。また、実物大の曲面を持つ集光ミラーにおいても同等の性能が得られるか試験するため、厚みの異なるPETの成形品を30個試作した。液体シンチレータの開発は、発光量と透過率が高いことで知られているリニアアルキルベンゼン(LAB)を中心に進めた。アルキル化の手法が異なる2つの製法(HF法,Detal法)で生成されたLABに対して発光材を溶かしこみ、液体シンチレータを作成した。発光量はプソイドクメンベースの液体シンチレータの0.8倍、400nmにおける光の減衰長は10m以上となった。このままでも大容量の液体シンチレータ検出器に用いることができる性能が得られているが、さらに不純物の化学吸着・蒸留除去などの純化を行い、発光量と透過率に対して一定の効果が得られることを確認した。KamLAND-Zen実験では、同位体濃縮キセノン(136Xe)を液体シンチレータに溶かし込み、ニュートリノ放出を伴わない二重ベータ崩壊の探索において世界最高の感度を達成した。昨年度は純化作業によって液体シンチレータの放射性不純物を10分の1以下に低減することに成功した。その一方で、低エネルギーに分布するニュートリノ放出を伴う二重ベータ崩壊によるバックグラウンドが主要なバックグラウンドとなりつつあり、エネルギー分解能の向上が望まれる。本研究では、検出器を改良してエネルギー分解能を向上させることで、逆階層型質量(20 meV以上)の検証を目標とする。検出器のエネルギー分解能改善を実現するため、高発光量液体シンチレータの開発と集光ミラーの開発を行った。液体シンチレータの開発では、リニアアルキルベンゼンを溶媒とした液体シンチレータの光学性能を高めるため新たに蒸留法と吸着法を組み合わせた不純物除去を行い、現行の液体シンチレータ以上の透過率が達成できることを確認した。両者とも大容量の溶媒を精製するのに工業的に実用化されている技術であり、現在の小型装置のスケールアップが比較的容易であると考えられる。また、波形弁別による粒子識別性能の評価を行い、バックグラウンドの削減に貢献することを確認した。集光ミラーの開発では、前年度に製作したWinstone-Cone型高集光ミラーを変形させた場合の集光性能への影響を評価した。実際の検出器では0度40度までの範囲の集光が必要であるが、全ての角度から到来するシンチレーション光に対する集光量の増加率は1.71.9倍程度を維持しており、変形の影響は小さいことを実測によって確認した。
二枚貝殻の地球化学組成を用いた東京湾の沿岸貧酸素水塊の遡及的モニタリング

貧酸素水塊は生態系や水産資源に深刻な被害をもたらす環境問題であるが,そのモニタリング・発生予測・メカニズムの理解などは十分だとは言えず,従来のフィールド調査や環境モニタリングでは限界がある.本研究は付加成長する二枚貝,特に東京湾のムラサキイガイに着目し,その殻に記録された貧酸素水塊による環境変化を微量元素組成や安定同位体組成などを分析する事により過去にさかのぼって経時的に復元する事で,貧酸素水塊の新たな研究手法を確立する事を目的としている.平成30年度は,平成29年度に得られたムラサキイガイの殻皮の炭素同位体比と殻の炭素同位体比の結果について追加分析を行い,殻皮と殻の炭素同位体比が陸源の有機物流入の指標としての有用性をより強固なものにした.複数地点・複数個体の分析により再現性を担保し,成長方向の分析により時系列の履歴復元に成功した.それらの結果を論文としてまとめ投稿した.また,殻皮の炭素同位体比を分析したのと同一の試料について,殻の酸素同位体比による塩分履歴の復元について取り組んだ.塩分は空間的に不均質に分布するが,連続モニタリングは水温と比較した場合非常に手間とコストがかかり,面的な時系列データを得ることは難しい.塩分を規定するのは陸源の淡水の拡散であり,貧酸素水塊の発生と密接な関連がある.そこで,ムラサキイガイの殻の酸素同位体比が水温と塩分の両方を反映することに着目して,塩分の遡及的なモニタリング手法を開発した.殻の酸素同位体比を分析した結果,塩分の空間分布と季節変動を精度良く反映していた.また,殻の酸素同位体比から復元した塩分は,モデルで得られた塩分の気候値の変動パターンと整合的な傾向を示した.それらの結果より,ムラサキイガイの殻の酸素同位体比の分析から,塩分を過去に遡って復元する手法を確立した.これらの結果についても論文を投稿し,既に受理された.当初の計画内容とは若干の方針修正があるものの,それにより良い成果に結びついたため,おおむね順調に進展していると言える.手法の確立は環境データが揃っている大槌湾をフィールドとして実施した.手法の確立は大部分完了しつつあるので,今後は東京湾から得られたサンプルにその手法を応用することで,貧酸素水塊の消長について実際に適用可能かどうか研究を進める.平成29年度は大槌湾の複数箇所から季節ごとに採取されたムラサキイガイの筋肉・殻皮および海藻の炭素窒素安定同位体組成の分析を実施した.その結果,湾内で淡水の影響を受けやすい湾奥域から採取されたムラサキイガイの炭素同位体組成がそれ以外の場所から採取された個体と比較して低い組成を示し,さらに淡水の影響の強い夏期のサンプルでその傾向が顕著であることが明らかとなった.これは筋肉の炭素同位体比が陸源物質流入の良い指標となることを示している.また,窒素同位体比組成についても地理的な勾配や季節周期的な変動パターンが見られたが,炭素同位体比ほど顕著な傾向は見られなかった.また,ムラサキイガイの殻皮の安定同位体組成を分析するための基礎実験を行いプロトコルを確立した.特に炭素同位体比については微量に混入してしまう炭酸塩殻の影響を強く受けることが明らかとなり,塩酸で脱灰処理をすることで殻皮の安定同位体組成が得られることが明らかとなった.殻皮と筋肉の炭素・窒素安定同位体組成については非常に良い直線関係を示すことが明らかとなった.殻皮は空の表面に付着している有機物であり,二枚貝殻同様に付加成長をする.このことは,殻皮は筋肉の同位体組成の経時変遷を時系列で保存していることを示しており,殻皮を縁辺部から蝶番部にかけて付加成長方向に遡って分析することで分析することで陸源物質流入の経時変遷を復元可能であることを示している.来日後しばらくは様々な手続きに時間を費やす必要があり,研究を本格的に開始できたのは1ヶ月以上経った後であったが,短期間で非常に効率的に研究成果が得られており,研究は順調に進んでいるといえる.貧酸素水塊は生態系や水産資源に深刻な被害をもたらす環境問題であるが,そのモニタリング・発生予測・メカニズムの理解などは十分だとは言えず,従来のフィールド調査や環境モニタリングでは限界がある.本研究は付加成長する二枚貝,特に東京湾のムラサキイガイに着目し,その殻に記録された貧酸素水塊による環境変化を微量元素組成や安定同位体組成などを分析する事により過去にさかのぼって経時的に復元する事で,貧酸素水塊の新たな研究手法を確立する事を目的としている.平成30年度は,平成29年度に得られたムラサキイガイの殻皮の炭素同位体比と殻の炭素同位体比の結果について追加分析を行い,殻皮と殻の炭素同位体比が陸源の有機物流入の指標としての有用性をより強固なものにした.複数地点・複数個体の分析により再現性を担保し,成長方向の分析により時系列の履歴復元に成功した.それらの結果を論文としてまとめ投稿した.また,殻皮の炭素同位体比を分析したのと同一の試料について,殻の酸素同位体比による塩分履歴の復元について取り組んだ.塩分は空間的に不均質に分布するが,連続モニタリングは水温と比較した場合非常に手間とコストがかかり,面的な時系列データを得ることは難しい.塩分を規定するのは陸源の淡水の拡散であり,貧酸素水塊の発生と密接な関連がある.

そこで,ムラサキイガイの殻の酸素同位体比が水温と塩分の両方を反映することに着目して,塩分の遡及的なモニタリング手法を開発した.殻の酸素同位体比を分析した結果,塩分の空間分布と季節変動を精度良く反映していた.また,殻の酸素同位体比から復元した塩分は,モデルで得られた塩分の気候値の変動パターンと整合的な傾向を示した.それらの結果より,ムラサキイガイの殻の酸素同位体比の分析から,塩分を過去に遡って復元する手法を確立した.これらの結果についても論文を投稿し,既に受理された.当初の計画内容とは若干の方針修正があるものの,それにより良い成果に結びついたため,おおむね順調に進展していると言える.今後は殻皮を用いた過去の物質循環の復元,および殻の微量元素組成の分析による過去の貧酸素水塊履歴の復元手法を確立する.大槌湾と東京湾から採取され保管されているムラサキイガイについて軟体部・殻皮の炭素・窒素・硫黄同位体比の分析を実施する.殻に含まれる微量元素組成についてレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法による微量元素組成分析および酸素炭素安定同位体比分析を行う.また,基礎データとなる環境水の化学・同位体組成の分析も行う.それらにより得られたデータの共変化と環境パラメータについて解析することで,ムラサキイガイ殻の貧酸素水塊の遡及的モニタリング手法の確立を目指す.手法の確立は環境データが揃っている大槌湾をフィールドとして実施した.手法の確立は大部分完了しつつあるので,今後は東京湾から得られたサンプルにその手法を応用することで,貧酸素水塊の消長について実際に適用可能かどうか研究を進める.
悪臭分解活性を有する微生物の分離とその応用

鹿児島県および三重県の養豚場に使われている特殊な飼料および床土から嫌気性菌を17株、好気性菌を17株、計34種類分離した。これらの試料は屎尿の脱臭、分解を効率よく行なうことが知られており、土中に生息する微生物によって様々な臭い物質や有機酸などの有機物が生産された後にそれらが分解されていると考えられる。そこでまず、これらの微生物が臭い物質を生産するかどうかを栄養培地に接種して調べた。その結果、通常大腸菌等の培養で発生するインドールやスカトールなどの悪臭をほとんど生産しない菌種が34種類中9種類存在することが確認された。残りの菌についてはほとんどが悪臭物質を生産していた。さらに、悪臭をほとんど生産しない菌種より染色体DNAを抽出し、遺伝子増幅法(PCR法)によって16SリボソームRNAの塩基配列の一部を決定した。得られた塩基配列をもとに相同性検索システムを利用して菌の同定を行なった。その結果、これらの菌はPseudomonas属が2種類、Bacillus属が5種類、Verrucomicrobium属が1種類、残りの一つは未同定のものであると推測された。現在、これらの菌がどの程度の悪臭分解を示すのか、また、大腸菌などの悪臭物質を生産する菌と共培養を行い臭い物質がどの程度分解されるかを検討中である。
妊娠中毒症の病因としての血管感受性増加因子に関する研究

妊娠中毒症の高血圧発症について血管の昇圧物質に対する感受性の上昇が近年注目されている。本態性高血圧の病因としてNaの体内貯留が挙げられ、その昇圧機構にNa利尿因子が関係している。本来それは貯留Naの排泄のために働き、その作用は細胞膜に存在する【Na^+】-【K^+】ATPaseの活性を阻害することにあり、その結果腎からの【Na^+】排泄が促進される。しかし他方血管壁筋細胞のATPaseも阻害されるため細胞内に【Na^+】が貯留し、さらに【Na^+】-【Ca^(++)】交換現象が起きて細胞内の【Ca^(++)】濃度が上り、昇圧物質に対する感受性が上昇すると考えられている。妊娠時はNa貯留が起りやすい状態にあり、そのためNa利尿因子の増加が起り、それが妊娠中毒症発症の一因となりうる。我々はHamlynらの方法を用い、正常と妊娠中毒症妊婦の血中【Na^+】-【K^+】ATPase阻害因子活性を測定した。その結果母体血中の同因子活性は妊娠中毒症妊娠では正常妊婦に比し有意に(P<0.05)亢進していた。同阻害因子活性と平均血圧の間には有意に(P<0.05)負の相関が得られた。臍帯動脈血中には臍帯静脈血中より同阻害因子活性が亢進している傾向があり、胎盤での同阻害因子の産生が示唆された。PG【I_2】は血管平滑筋の弛緩作用をもち降圧因子として働き、そのため血管内皮細胞での産生低下は昇圧物質の作用を増強させ血圧を上昇させることになる。妊娠中毒症の血管内皮細胞でのPG【I_2】産生能を検討し、軽度中毒症では代償的にPG【I_2】の産生が上昇して昇圧機構に対するnegative feed-backが働きhomeostasisを保とうとするが、重症中毒症ではPG【I_2】の産生がむしろ低下してさらに高血圧が悪化することを明らかにした。
原子の飽和吸収分光を用いた半導体レ-ザの高速変調時における波長安定化

本年度はルビジュウムの吸収線を波長の基準とし、周波数変調時における800nm帯の半導体レ-ザの発振波長の安定化と周波数確度の測定を行った。今回用いたピ-クホ-ルド方式は昭和63年度までに無変調時よりも高い安定度が達成されているので、本年度は変調パルス信号の周波数シフト量とデュティレシオを変えたときの安定化を行い、より一般的な変調条件での安定度の検討を行った。1.デュティレシオ50%の時、周波数シフト量を変化させた場合の制御信号について、理論と実験の両面で検討を加え、ピ-クホ-ルド回路を用いた場合、従来方式に比べ常に安定度が改善されいること。またピ-クホ-ルド方式で最高の安定度が得られた周波数シフト量の設定値が、当初理論で予想されていた値と等しいことを確認した。2.デュティレシオを変化させても、ピ-クホ-ルド方式では従来方式に比べ、安定度への影響は小さく、より一般的な変調条件でもピ-クホ-ルド方式の有効性が確認された。3.安定化の波長基準は変調を印加することにより変化する可能性が従来方式では存在する。そこでこの点に関しても実験を行い、ピ-クホ-ルド方式ではより確かな安定化点への安定化が実現できていることを確認した。今回は、ピ-クホ-ルド方式の検討を優先させた為、飽和吸収分光を用いた安定化は行なえなかった。しかし、新しい安定化の方式を開発できたことは大きな成果であったと考える。今後は更に変調周波数を高くするとともに安定度の向上を目指し、当初計画していた飽和吸収分光を用いた安定化を行う。更に、1.5nm帯へピ-クホ-ルド方式を発展させる研究を進める予定である。本年度は主としてルビジゥムの吸収線を波長の基準とし、変調時における800nm帯の半導体レーザの発振波長の安定化を行った。無変調時においてはすでに高安定度が達成されているので、本年度は主として変調パルス信号のON-OFF比を変えたときの安定度の検討を行った。(1)まず、ルビジウムの吸収線に半導体レーザの発振波長を合わせるため駆動電流、温度を調整し最良、条件を見出した。(2)高速変調信号を半導体レーザに印加し、半導体レーザの発振波長への影響を理論と実測とで比較検討し、変調により発振波長の幅が広がり吸収線の波形が鈍化してくるのを確認した。(3)高速変調されたレーザ光と吸収線との差を示す信号を測定し、波長安定化のためのフィードバック回路の最適定数の検討を行い、値を決定した。(4)以上の結果を総合して、変調時の安定度が最良になるように回路を構成し、1MHzの繰り返しパルス信号により半導体レーザを変調し、ON-OFFのパルス幅比をパラメータとして安定度の測定を行った。その結果、安定度はパルス幅比50%のときが最も悪く平均時間1秒のときのアラン分散値σは約10^<-10>であった。パルス幅比を40%、30%、20%と小さくするに従い安定度はそれぞれ1.2、1.5、2.7倍と向上し、無変調時の安定度に近付いていくのが確認された。今後はさらに変調周波数を高くするとともに安定度の向上をはかり、1.5nm帯へ発展させる予定である。

今回用いたピ-クホ-ルド方式は昭和63年度までに無変調時よりも高い安定度が達成されているので、本年度は変調パルス信号の周波数シフト量とデュティレシオを変えたときの安定化を行い、より一般的な変調条件での安定度の検討を行った。1.デュティレシオ50%の時、周波数シフト量を変化させた場合の制御信号について、理論と実験の両面で検討を加え、ピ-クホ-ルド回路を用いた場合、従来方式に比べ常に安定度が改善されていること。またピ-クホ-ルド方式で最高の安定度が得られた周波数シフト量の設定値が、当初理論で予想されていた値と等しいことを確認した。2.デュティレシオを変化させても、ピ-クホ-ルド方式では従来方式に比べ、安定度への影響は小さく、より一般的な変調条件でもピ-クホ-ルド方式の有効性が確認された。3.安定化の波長基準は変調を印加することにより変化する可能性が従来方式では存在する。そこでこの点に関しても実験を行い、ピ-クホ-ルド方式ではより確かな安定化点への安定化が実現できていることを確認した。今回は、ピ-クホ-ルド方式の検討を優先させた為、飽和吸収分光を用いた安定化は行なえなかった。しかし、新しい安定化の方式を開発できたことは大きな成果であったと考える。今後は更に変調周波数を高くするとともに安定度の向上を目指し、当初計画していた飽和吸収分光を用いた安定化を行う。更に、1.5nm帯へピ-クホ-ルド方式を発展させる研究を進める予定である。
アルギン酸ナトリウムを用いた自己硬化型GBR膜に関する研究

本研究は、骨欠損部にアルギン酸ナトリウム水溶液を充填し、塩化カルシウム溶液を滴下するという極めて簡便な手法で骨欠損部表面に形成されるアルジネート膜がGuided Bone Regenerationにおける細胞遮断膜(GBR)膜として機能するかどうか、また、その特性向上を検討したものである。実験動物(ラット)頚骨にバイコロチカルに骨欠損を形成し、同部にアルギン酸ナトリウム水溶液を充填し、塩化カルシウム溶液を滴下した結果、骨欠損部表面には無色透明で弾力性を示すアルジネート膜が形成された。アルジネート膜は骨と付着しており、骨欠損部内部は未反応のアルギン酸ナトリウム水溶液で満たされていた。4週後に実験動物を当該試料を摘出、脱灰標本を病理組織学的に検討した結果、骨欠損を形成しただけの対処群は結合性組織による修復が行われていたが、アルギン酸ナトリウムを用いて自己硬化型GBR膜を設置した群においては皮質骨の再生が確認され、アルギン酸ナトリウムを用いた自己硬化型GBR膜がGuided Bone Regenerationにおける細胞遮断膜として有用に機能することが明らかになった。アルギン酸ナトリウムの濃度が0.5%、1.0%の場合は再生骨が凹状となり、形成されるアルジネート膜の力学的機能が不十分であることがわかった。アルギン酸ナトリウム水溶液と塩化カルシウム水溶液の反応で形成されるアルジネート膜には骨伝導性が期待できない。そこで、アルジネートに骨伝導性を付与し骨再生期間を短縮する目的でアルギン酸ナトリウム水溶液にリン酸水素ナトリウムを添加した系の検討も併せて行った。リン酸水素ナトリウム添加アルギン酸ナトリウム水溶液に塩化カルシウム水溶液を滴下すると、アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムの反応で白色のアルジネート膜が形成された。これはアルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムの反応でアルジネート膜が形成されるとともに、リン酸水素ナトリウムと塩化カルシウムの反応でリン酸カルシウムが形成され結果と考えられる。形成されたリン酸カルシウムは粉末X線回折および赤外分光スペクトルの測定結果から非晶質リン酸カルシウムであることがわかった。非晶質リン酸カルシウムの形成は骨伝導性の付与の観点から好ましいが、アルジネート膜の機械的特性が低下することがわかった。これは架橋反応が塩効果により阻害されているためであると考えられる。アルジネート濃度、リン酸水素ナトリウム濃度を最適化し、自己硬化型GBR膜の機能をさらに多面的に検討する必要があると結論した。本研究はGTRやGBR術式中において、簡便かつ緊密に欠損部を被覆する自己硬化型の細胞遮断膜を開発する第一段階として、アルギン酸ナトリウム水溶液と塩化カルシウム水溶液の接触で形成されるアルジネート膜が有用であるかどうかを検討することを目的としている。本年度はアルギン酸ナトリウム水溶液濃度、塩化カルシウム水溶液濃度が形成されるアルジネート膜に及ぼす影響を検討するとともに、実験動物を用いてアルジネート膜の短期有用性を検討した。形成されるアルジネート膜の厚さはアルギン酸ナトリウム水溶液濃度が2%までの範囲でほぼ直線的に増大した。また塩化カルシウム濃度(110%)はアルギン酸ナトリウム水溶液濃度が0.8%以下の場合にはほとんど影響を及ぼさないが、それ以上の場合には塩化カルシウム濃度の増大に伴い、アルジネート膜厚が増大することがわかった。得られるアルジネート膜厚はアルギン酸ナトリウム水溶液濃度が1.5%、塩化カルシウム水溶液濃度が3%の場合で約0. 3mmであった。次に実験動物を用いてアルジネート膜の有用性を検討した。ラット脛骨にラウンドバーで骨欠損を形成し、1.5%のアルギン酸ナトリウム水溶液を充填し、その後、塩化カルシウム水溶液を滴下してアルジネート膜を形成した。なお、対象群には骨欠損形成のみを行った。4週後に当該組織を周囲組織と一塊に摘出、HE染色を行い、組織学的に観察を行った。対象群においては骨欠損部が繊維性に修復されており、本実験において形成した骨欠損がクリティカルサイズ以上であることがわかった。一方、アルジネート膜を設置した群においては骨再生が認められた。またアルジネート膜周囲には炎症性所見は認められなかった。したがって、アルジネート膜はGTRやGBRにおける細胞遮断膜として有用に機能する可能性が示唆された。