hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新たな脂肪細胞機能制御分子としての脂肪細胞内eNOSの役割の解明

本研究の目的は、脂肪細胞内に発現するeNOSの発現調機構ならびに脂肪細胞機能制御における役割を、分子、細胞、組織、個体レベルにて明らかにすることである。培養脂肪細胞においてeNOSがその分化とともに発現することを見出した。また、eNOSを阻害することで脂肪細胞における脂肪分解が亢進することから、脂肪細胞内のeNOSが脂肪分解に対し抑制的に作用することを明らかにした。マウスの脂肪組織においてもeNOSが発現していること、高脂肪食負荷を加えた肥満マウスの脂肪組織においてeNOSの発現はむしろ低下すること、また高脂肪食負荷による肥満マウスに対し、通常食に戻したところ、肥満、代謝異常の改善とともに、脂肪組織eNOSの発現が回復することを見いだした。脂肪組織内eNOS発現レベルと肝臓内トリグリセリドレベルが負の相関を示すことを示した。eNOSノックアウトマウスに、高脂肪食を負荷したところ、wild-typeマウスにくらべて、体重と総脂肪量の増加がみとめられ、血液中のインスリン濃度もより増加しており、個体レベルのインスリン抵抗性が悪化していることが示唆された。また、eNOSノックアウトマウスにおいて肝重量の増加、肝臓内トリグリセリド濃度の増加、肝臓でのインスリンに対する反応性の低下が認められた。また、組織学的検討により高度の脂肪沈着、線維化、炎症細胞の浸潤も認められ、NASH様の組織をていしていた。eNOSの発現はwild-typeマウスの肝臓においてもともと認められず、血中遊離脂肪酸の基礎濃度およびイソプロテレノール負荷による血中遊離脂肪酸の上昇の程度は、eNOSノックアウトマウスにおいて有意に高かったことから、eNOSノックアウトマウスでは、脂肪組織における脂肪分解能が亢進しこのことがNASHの形成に寄与しているものと考えられた。さらに、培養細胞を用いた研究において、脂肪細胞内eNOSの発現が、PPAR-gamma阻害薬により、強く増強することを見出した。PPAR-gamma阻害薬を高脂肪食負荷マウスに投与したところ脂肪組織において、eNOSの発現の増強が確認されるとともに肝における脂肪蓄積の程度がPPAR-gamma阻害薬により軽減した。以上、脂肪内eNOSは脂肪分解能を負に制御しており、eNOSノックアウトマウスは、脂肪分解能が亢進し遊離脂肪酸の分泌が上昇しており、このことがNASHの形成に寄与しているものと考えられた。これらの結果は、代謝性老年疾患の新たな治療戦略に対する実験的エビデンスになりうると考えられる。老年疾患や個体の老化の基盤にある病態として、骨格筋量の低下とともに脂肪組織の相対的増大、機能障害、それに伴うインスリン抵抗性が重要であるが、その発症機序は不明である。本研究の目的は、脂肪細胞内に発現するeNOSの発現調節機構ならびに脂肪細胞機能制御における役割を、分子、細胞、組織、個体レベルにて明らかにすることである。我々は、培養脂肪細胞においてeNOSがその分化とともに発現することを見出した。一方で、nNOS、iNOSの発現はみとめ認められなかった。

続いてeNOSを阻害することで脂肪細胞からの遊離脂肪酸の分泌が亢進することから、脂肪細胞内のeNOSが脂肪分解に対し抑制的に作用することを明らかにした。個体レベルにおいても検討を加えた。マウスの脂肪組織においてもeNOSが発現していること、高脂肪食負荷を加えた肥満マウスの脂肪組織においてeNOSの発現はむしろ低下すること、また高脂肪食負荷による肥満マウスに対し、通常食に戻したところ、肥満、代謝異常の改善とともに、脂肪組織eNOSの発現が回復することを見いだした。また肝臓におけるトリグリセリドの貯蓄量は、内臓脂肪組織からの遊離脂肪酸の分泌量と相関することが知られているが、脂肪組織内eNOS発現レベルと肝臓内トリグリセリドレベルが負の相関を示すこと、すなわち個体レベルにおいても脂肪組織内eNOSが脂肪分解に対し抑制的に作用することを示した。来年度はeNOSノックアウトマウスを用いて、脂肪細胞内eNOSの役割を検討する予定である。本研究を進めることにより、老年疾患に対する新たな治療標的を提供することが可能となると考えられる。本研究の目的は、脂肪細胞内に発現するeNOSの発現調機構ならびに脂肪細胞機能制御における役割を、分子、細胞、組織、個体レベルにて明らかにすることである。平成22年度は、脂肪細胞においてその発現が認められたeNOSがどのような役割をはたしているかを主にeNOSノックアウトマウスをもちいて検討した。eNOSノックアウトマウスに、高脂肪食を負荷したところ、wild-typeマウスにくらべて、体重と総脂肪量の増加がみとめられたが、興味深いことに内臓脂肪量はむしろ低下していた。血液中のインスリン濃度もより増加しており、個体レベルのインスリン抵抗性が悪化していることが示唆された。インスリン抵抗性にかかわる臓器として肝臓をしらべたところ、eNOSノックアウトマウスにおいて肝重量の増加、肝臓内トリグリセリド濃度の増加、肝臓でのインスリンに対する反応性の低下が認められた。また、組織学的検討により高度の脂肪沈着、線維化、炎症細胞の浸潤も認められ、NASH様の組織をていしていた。eNOSの発現はwild-typeマウスの肝臓においてもともと認められなかった。血中遊離脂肪酸の基礎濃度およびイソプロテレノール負荷による血中遊離脂肪酸の上昇の程度は、eNOSノックアウトマウスにおいて有意に高かったことから、eNOSノックアウトマウスの脂肪組織における脂肪分解能の低下しているものと考えられた。以上の結果より、脂肪内eNOSは脂肪分解能を負に制御しており、eNOSノックアウトマウスは、脂肪分解能が亢進し遊離脂肪酸の分泌が上昇しており、このことがNASHの形成に寄与しているものと考えられた。本研究を進めることにより、代謝性老年疾患に対する新たな治療標的を提供することが可能となると考えられる。われわれは、本研究において、昨年までに、培養脂肪細胞においてeNOSがその分化とともに発現すること、脂肪細胞内のeNOSが脂肪分解に対し抑制的に作用することを明らかにした。
血管の老化と平滑筋増殖を制御する遺伝子の同定

(1)平滑筋形質変換の分子機構を探るため、胎児平滑筋型ミオシンであるSMemb遺伝子に結合して転写活性を亢進する転写因子BTEB2の機能を解析した。BTEB2は同遺伝子の転写を約6倍に亢進した。またBTEB2と同一の転写因子群(Kruppel family)に属するLKLFもSMemb遺伝子プロモーター活性を約10倍に亢進した。さらにBTEB2は肥厚内膜の平滑筋で著明に発現していた。以上からKruppel family遺伝子は平滑筋の形質変換に基本的な役割を担っていると考えられた。一方、ホメオ蛋白Hexも同様に強いSMemb遺伝子転写活性をもつことが示された。(2)Na/H逆輸送担体を過剰発現するトランスジェニックマウスの開発中に、偶然、導入遺伝子がマウスの未知遺伝子をノックアウトした老化モデルマウスを樹立した。老化マウスは生後約4週で成長が停止し、寿命はオス7.9週、メス9.5週である。また動脈硬化・僧帽弁輪石灰化・骨粗鬆症などが認められた。A)肺:野生型マウスと比較して気腫性変化が強く肺気腫の所見であった。さらにホモ個体では、野生型と比較して動肺コンプライアンスが有意に大きかった。B)血管:ホモ個体では、中膜石灰化と内膜肥厚が全身の様々な血管で生じていた。ヘテロ個体においてLNAME非存在下では、ノルエピネフリンに対する収縮反応が有意に亢進していた。また、アセチルコリンによる弛緩反応も有意に低下していた。すなわち、この老化マウスでは血管内皮細胞におけるNO産生障害が存在すると結論された。C)膵内分泌機能:老化マウス群の膵臓インスリン含量は、各週令とも対照群と比較し有意に低かったが、グルカゴン含量には差を認めなかった。老化マウスの原因遺伝子はすでに単離され、腎臓に大量に発現する未知の遺伝子である。すなわち腎臓では老化抑制機能をもつ生理活性物質が産生されている。その生理機能と発現調節は今後の課題である。
難治性消化器癌患者血清中の自己抗体検出用プロテインチップの開発

難治性消化器癌患者血清中の自己抗体検出用プロテインチップの開発を目指して以下の実験を行った。ただし、今回は難治性消化器癌のうち、肝癌にターゲットを絞って自己抗体検出用プロテインチップを開発した。下記に目的、方法、結果を記載する。これまでC型肝炎ウイルス(HCV)感染後に発癌(HCC)した患者(HCV-HCC)の癌部組織と非癌部組織のプロテオーム解析を行い報告してきた。しかしながら、腫瘍マーカーを目的とした患者血清中の特異的タンパク質の同定はできていない。そこで、腫瘍マーカーとして期待できる患者血清中の自己抗体検出を目的として、B型肝炎ウイルス(HBV)もしくはHCV感染後に発癌した15例の患者からの癌切除手術の際に入手した癌部と非癌部の組織から抽出したタンパク質を二次元電気泳動で展開した後にPVDF膜に転写して、それぞれのHCC患者自身の血清、もしくは20例の健常者血清を用いてウェスタンブロットを行った結果、健常者血清に比べてHCC患者血清に強く認識されるタンパク質スポットが4スポット検出された。これら4スポットに対応するCBBR-250によって染色したゲル上のスポットをLC-MS/MSを用いた質量分析により同定した結果、Peroxiredoxin、HSP70.1、Mn-SODの3つが同定できた。質量分析結果の確認のためにリコンビナントタンパク質のPeroxiredoxin、HSP70.1、Mn-SODを用いて血清のウエスタンブロットを行ったところ、健常者血清に比べ有意にHCC患者血清中のPeroxiredoxin、HSP70.1、Mn-SODに対する自己抗体の増強が確認できた。さらに、HCC患者血清中のHSP70.1に対する自己抗体の抗体価を検証するために、血清を希釈してHSP70.1リコンビナントタンパク質に対してウエスタンブロットを行ったところ、1000倍希釈まで検出可能であることが明らかになった。これら3種類の自己抗体に認識される抗原タンパク質をダイヤモンド様コーティング金属基板に強固に貼付けたプロテインチップを開発した。我々はこれまでC型肝炎ウイルス(HCV)感染後に発癌(HCC)した患者(HCV-HCC)の癌部組織と非癌部組織のプロテオーム解析を行い報告してきた。そこで、腫瘍マーカーとして期待できる患者血清中の自己抗体検出を試みた。B型肝炎ウイルス(HBV)もしくはHCV感染後に発癌した15例の患者からの癌切除手術の際に入手した癌部と非癌部の組織から抽出したタンパク質を二次元電気泳動で展開した後にPVDF膜に転写して、それぞれのHCC患者自身の血清、もしくは20例の健常者血清を用いてウェスタンブロットを行った結果、健常者血清に比べてHCC患者血清に強く認識されるタンパク質スポットが4スポット検出された。現在これら3種類の自己抗体に認識される抗原タンパク質をダイヤモンド様コーティング金属基板に強固に貼付けたプロテインチップを開発中である。

さらに、HCC患者血清中のHSP70.1に対する自己抗体の抗体価を検証するために、血清を希釈してHSP70.1リコンビナントタンパク質に対してウエスタンブロットを行ったところ、1000倍希釈まで検出可能であることが明らかになった。これら3種類の自己抗体に認識される抗原タンパク質をダイヤモンド様コーティング金属基板に強固に貼付けたプロテインチップを開発した。
応力場交差相関機能を有する新規マルチフェロイックス系の開拓

K_2NiF_4型の構造原型相を有する有機化合物(AA)_2TX_4(AA:アルキルアンモニウム, T:遷移金属, X:ハロゲン)の物質開拓では,研究当初での成長速度の10倍以上早くFe, Ma, Co, Cu, Znの10種類の単結晶を育成できる条件を確立した。EACuCでは26Kと37Kで誘電秩序があることを初めて見出し,当該物質が磁気・誘電のマルチフェロであることが証明した。EAFeCの構造相について,これまで報告がなかった部分を全て決定するとともに磁気転移と同時に構造相転移することを見出した。EACuCではこれまで未決定の構造相を決定するとともに,これまでの報告を覆して正しい構造相の提案を行った。希土類化合物における応力場交差相関機能マルチフェロイックの展開として, PrIr_2Zn_<20>に着目して弾性率を用いた歪み応答実験を行いf電子基底状態Γ_32重項の反強的4極子秩序であることを始めて実証し,4極子揺らぎが当該物質の維新期超伝導発言に関与していることを指摘した。応力場による超伝導制御の可能性も期待できる。本課題申請前において,研究代表者は,K_2NiF_4型の構造原型相を有する有機化合物について,全く新しい「多重強秩序系(マルチフェロイックス系)」の可能性について追求していた。その結果,強誘電/強磁性相関による一般的にマルチフェロイソクにとどまらず,強弾性をも併せ持っ「応力場交差相関機能を有する新規マルチフェロイックス系の開拓」に関する具体的研究を行うめどが付いたため,本研究を開始した。すなわち,網羅的(AA)_2TX_4系単結晶の育成と複合極端条件下物性測定により,「ME効果」,「磁気転移同時構造相転移」,「巨大色変化」の機構解明と並行して,応力場交差相関機能を有する新規マルチフェロイックス系の開拓を行うものである。具体的手法の概要は以下の通りである。(1)遷移金属TだけでなくAAの炭素数も網羅的に変化させ,TX_2面間距離を制御することによってT-T間の異方的磁気相互作用を制御した,網羅的単結晶育成と,単結晶促成法の開発。(2)単結晶X線構造解析,磁化,磁化率,分極,誘電率,歪み,弾性率,比熱,AC伝導率等の応力下測定。応力場中の磁気・誘電特性,磁場中の構造・誘電特性,電場中の構造・磁性の測定。(3)格子及び磁気的カイラリティー情報の把握と構成原子間の電荷移動状態把握。(4)バンド計算及び磁性理論による機構解明及び物質設計に関するサポート。1.ブリルアンゾーン境界X点のフォノンクエンチによりプロトタイプ構造相14/mmmから,応力場によって空間群のAbmaとBmabのスイッチが可能な強弾性相への構造相転移を起こすアルキルアミン遷移金属ハロゲン化物の単結晶育成を行った。メチルアミンおよびエチルアミンの塩化物についてFe,Ma,Co,Cu,Znの10種類の単結晶育成条件を決定した。得られた単結晶に対し,多重極限下(低温,強地場,高圧)で熱力学量,輸送特性を測定した。2.エチルアミン銅塩化物において,誘電率の温度依存性を測定したところ,26Kと37Kで誘電秩序があることを初めて見出した。37Kの誘電異常は,電場をc面内に印可した場合に観測されるのに対し,26Kの誘電異常は電場をc軸に平行に印可した場合に観測される。緩和法による比熱測定を行ったところ,37Kでは明確な不連続を観測したが26Kでは想定制度の範囲内で以上を見いだせなかった。緩和法では潜熱の開放を観測しづらい。この点を勘案すると,37Kは2次相転移,26Kは1次相転移と推測した。これを確かめるため,鹿児島大学伊藤准教授との共同研究において断熱法により比熱測定を行ったところ,断熱法でも26Kに異常が見られなかった。誘電異常は分極のクロスオーバー的秩序によるものと考えられる。詳細な原因は今後も追求する。3、単結晶X線構造解析を行った。

計画調書でも述べたとおり,予備的実験において,メチルアミンおよびエチルアミン鉄塩素化合物において,磁気秩序と同時に構造相転移が起きると推測していたが,P4_2/ncmからPccnへの相転移は間違いないことを確認した。引き続き,この二重相転移の起源を追求するとともに,本年度購入した顕微鏡用極低温クライオスタットを用い,応力場依存性についてもその場観察を行う。概要:昨年度と同様に,ブリルアンゾーン境界X点のフォノンクエンチによりプロトタイプ構造相I4/mmmから,応力場によって空間群のAbmaとBmabのスイッチが可能な強弾性相への構造相転移を起こすアルキルアミン遷移金属ハロゲン化物の単結晶育成を行い,メチルアミンおよびエチルアミンの塩化物についてFe, Ma, Co, Cu, Znの10種類の単結晶育成条件を決定し,得られた単結晶に対し,多重極限下(低温,強地場,高圧)で勢力学量,輸送特性を測定した。本年度は,良質の大型単結晶育成技術を確立したので,この試料を用いて弾性率および熱膨張の測定も行った。1.昨年度発見したEACuCの二つの誘電異常温度(26Kおよび37K)において弾性率C_<55>およびc事項方向熱膨張を測定した結果,37Kにおいて明確な異常を示した。誘電秩序に伴う構造変化が明確になった。相転移に伴う歪みはe_<zx>の可能性が高い。弾性率は,ステップ型のソフト化を示していることから相転移に関わるランダウ型自由エネルギーにおける秩序変数・歪み結合項は歪み1次・秩序変数2次型となるものと推測される。さらに,EACuCの磁気秩序温度において顕著なc軸方向熱膨張の増大を観測した。EAFeCと同様の磁気秩序に伴う構造相転移の可能性を見出した。これらの結果は,EACuCにおける3者相関を期待させる。2.本年度は,EAMnCについて行った誘電率測定および熱膨張測定の結果,225KにおけるAbma-Pbca相転移点において,誘電率の急激な減少と熱膨張率の巨大異常を観測した。この結果は,EAMnCにおいても歪みと誘電率における相関が存在することを示唆する初めての報告である。3. EAMnCについては,磁場中における誘電率の測定から,磁化曲線の傾きが変化する磁場において誘電率の著しい変化を初めて観測した。来年度は,交差相関についてさらに詳細な検討を行う。引き続き,ブリルアンゾーン境界X点のフォノンクエンチによりプロトタイプ構造相I4/mmmから,応力場によって空間群のAbmaとBmabのスイッチが可能な強弾性相への構造相転移を起こすアルキルアミン遷移金属ハロゲン化物の単結晶育成を行い,メチルアミンおよびエチルアミンの塩化物についてFe,Ma,Co,Cu,Znの10種類の単結晶育成条件を決定し,得られた単結晶に対し,多重極限下(低温,強地場,高圧)で熱力学量,輸送特性を測定した。取り分け昨年度の実績報告で明示した本年度の課題「交差相関の検証」を目指した。そのためには,構造が未決定の相について空間群を決める必要があり単結晶X線回折実験も精力的に行った。以上の結果,次のような成果が得られた。(EACuC,EAFeCを重点的に研究した。紙面の都合上EACuCとEAFeCの結果のみ箇条書きする。)1)V相の空間群を決定した。IV-V相転移はJahn-Teller機構が関与する。3)VII相の空間群を初めて決定した。この相は中心対称性を持たず,誘電異常と整合する。4)3)の結果は変位型誘電相転移を示唆する。5)VIII相の空間群を初めて決定した。
可視化システムを用いた膵癌幹細胞の特異的分子同定と臨床病理学的解析

本研究では膵神経内分泌腫瘍(PNET)のがん幹細胞性の分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。PNETで遺伝子変異の頻度が高く、変異群で予後が悪いことが報告されているエピゲノム構成因子Xについて、PNET細胞株に遺伝子Xのノックダウン、ノックアウトを行ってin vitro、in vivoで幹細胞性との関連性を調べた。XはPNETにおいて腫瘍抑制的に機能し、X/H3.3複合体はH3K9me3を亢進させることで標的遺伝子Yの発現を抑制していた。Xの低発現と標的遺伝子Yの高発現の組み合わせはPNETの有用なバイオマーカーとなり、治療の標的になりうると考えられた。癌難治性の原因の一つはその多様性にある。癌組織にも幹細胞性を示す細胞群の内在が示されheterogeneityの根源となることが報告されているものの、その動態や局在には不明な点が多い。本研究では、膵癌と膵神経内分泌腫瘍(以下PNET)の幹細胞性の分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。我々はユビキチン非依存のプロテアソーム標的部位であるODC-C末端37アミノ酸(degron sequence)と蛍光蛋白(ZsGreen)の融合遺伝子をウイルスベクターを用いてヒト膵癌細胞株に導入した。セルソーターによりZsGreen陽性細胞(以下CSChigh)を抽出することで様々な実験への応用が可能となった(Gastroenterology 2012)。膵癌のCSChighとCSClow細胞で遺伝子発現とDNAメチル化およびヒストン修飾変化の解析を進めており、DCLK1遺伝子の発現がCSChighで高いことを報告した(PLoS One 2016)。既に両細胞群でメチル化を網羅的に調べており、発現との比較検討を進めている。同様の可視化システムをPNET細胞株にも導入し、PNETの癌幹細胞モデルとしてCSChighを抽出した。またPNETで遺伝子変異の頻度が高く、変異群で予後が悪いことが報告されているエピゲノム構成因子X(Gastroenterology 2014)について、幹細胞性との関連性を調べることとした。当科の臨床検体において遺伝子Xの変異症例を複数認めた。現在、PNET細胞株を用いてsiRNA導入による遺伝子Xのノックダウンを行い、機能解析を進めている。ノックダウン株にてスフェア形成能が増加し、遺伝子Xが癌幹細胞性に関わる可能性が示唆された。ノックダウン株とコントロール株でのDNAマイクロアレイを行いて網羅的遺伝子発現解析を行い、遺伝子変動を同定した。膵癌幹細胞解析については発現とメチル化の統合解析を進めている。PNETの癌幹細胞モデルに関してはCSChighを樹立出来たことで、膵癌の癌幹細胞モデルと同様にIn vitro, In vivo解析での検証が可能となった。遺伝子Xの機能解析においては、遺伝子XをsiRNAでノックダウンすると、スフェア形成能が増加し、遺伝子Xが癌幹細胞性に関わる可能性が示唆された。ノックダウン株とコントロール株でのDNAマイクロアレイを行いて網羅的遺伝子発現解析を行い、遺伝子変動を同定出来たことで遺伝子Xの機能解析に向けたさらなる検証が可能となった。進捗状況としては予定通りであると考える。本研究では膵癌と膵神経内分泌腫瘍(以下PNET)のがん幹細胞性の分子メカニズムを明らかにすることを目的とした。ユビキチン非依存のプロテアソーム標的部位と蛍光蛋白(ZsGreen)の融合遺伝子をヒト膵癌細胞株、PNET細胞株に導入し、セルソーターによりZsGreen陽性細胞(以下CSChigh)を抽出した。CSChighとCSClow細胞で両細胞群で発現とメチル化を網羅的に調べた。またPNETで遺伝子変異の頻度が高く、変異群で予後が悪いことが報告されているエピゲノム構成因子X(Gastroenterology 2014)について、幹細胞性との関連性を調べた。PNET細胞株を用いてsiRNA導入による遺伝子Xのノックダウン(X-KD)、CRSPR/Cas9システムによるノックアウト(X-KO)を行った。臨床病理学的にはX低発現症例は有意に非機能性腫瘍に多く、Ki67指数が高く、WHO病期が進んでいた。X低発現症例の一部に遺伝子変異が認められた。X-KD/KOのマイクロアレー解析とX、ヒストンH3.3、H3K9me3複合体のクロマチン免疫沈降(ChIP)により、Xによって直接転写抑制される標的遺伝子群を同定した。中でも遺伝子Yを含む複数遺伝子はX/H3.3/H3K9me3経路によって抑制されていた。X-KD/KOによりスフェア造成能が増加し、Y-KDにより抑制された。動物皮下腫瘍モデルでは、腫瘍造成能がX-KO腫瘍で増加し、Yも高発現していた。臨床的には、X低発現かつY高発現症例で再発率が高かった。以上よりXはPNETにおいて腫瘍抑制的に機能し、X/H3.3複合体はH3K9me3を亢進させることで標的遺伝子の発現を抑制していた。Xの低発現と標的遺伝子Yの高発現の組み合わせはPNETの有用なバイオマーカーとなり、治療の標的になりうるかもしれないことがわかった。

XはPNETにおいて腫瘍抑制的に機能し、X/H3.3複合体はH3K9me3を亢進させることで標的遺伝子Yの発現を抑制していた。Xの低発現と標的遺伝子Yの高発現の組み合わせはPNETの有用なバイオマーカーとなり、治療の標的になりうると考えられた。膵癌幹細胞では、遺伝子発現とメチル化の統合解析を進める。既にDCLK1発現がCSChighで高いことが明らかになったので、メチル化との関与も検討する。PNETの癌幹細胞モデルに関してはIn vitroでCSChighとCSClowに対して、膵癌の実験系同様に遺伝子発現やDNAのメチル化解析を行う。結果を統合し、PNETの幹細胞特異的遺伝子候補を抽出し、Western blottingおよび免疫細胞染色によって蛋白発現および局在を解析し特異的分子群を同定する。In vivoではNODSCIDマウスにCSChigh細胞を接種し、膵腫瘍モデルを作成する。CSChigh細胞とCSClow細胞での腫瘍造成能力を比較検討する。遺伝子Xの機能解析に関しては、DNAマイクロアレイを用いたノックダウン株とコントロール株での網羅的遺伝子発現解析で同定出来た遺伝子変動につき、エピゲノムの観点からその制御機構の解明を進める。更に、CRSPR/Cas9によるゲノム編集を行うことで、遺伝子Xのノックアウト株を作成する。ノックダウンおよびノックアウト株を用いてクロマチン免疫沈降を行い、遺伝子Xの下流標的遺伝子の発現変動におけるヒストン修飾の関与を検討する。またIn vivoでNOD/SCIDマウスに遺伝子Xノックアウト細胞を接種し、膵腫瘍モデルを作成する。ノックアウト細胞と野生型細胞での腫瘍造成能力を比較検討する。現在研究成果を論文投稿準備中です。肝胆膵領域の悪性疾患本研究で用いるセルソーティングや、今後使用しうる生体内蛍光イメージング、マイクロCTは所属機関に整備されているものや共同研究施設のものを使用出来る。RNAーseqやメチル化などのゲノム・エピゲノム解析機器は非常に高価であるため、購入は考えていない。当初外部委託する予定であったDNAマイクロアレイを本研究室で行えたため、次年度使用額が生じた。自施設において不可能な作業工程やデーター解析に関しては外部委託で行うため費用が必要である。また特異抗体などの分子生物学試薬、細胞や組織の分子生物学的解析に必要なプラスチックウェア、癌幹細胞群の培養や生体ニッチ解析に必要な細胞培養試薬、実験用動物等のために主に消耗品費が必要である。
遺跡出土の建築部材に関する総合的研究

全国の遺跡から出土する建築部材について、総合的な把握をおこない、その調査研究方法を構築し、全国的な視点で、出土建築部材について考察したものである。第一に、出土建築部材の研究環境整備を目的とし、出土建築部材データベースの構築をおこない、その調査研究方法を検討し、マニュアルおよび事例集を作成した。また、代表的な出土事例について、その資料化および研究をおこなった。(1)現段階で全国から出土している出土建築部材について、既刊の報告書をもとにデータベースを作成し、公開する。(2)建築部材の調査の視点、図化・写真撮影等の調査手法を検討し、全国の研究者と議論の上、調査マニュアルの作成をめざす。(3)調査・研マニュアルとして利用可能な事例集を作成する。(4)奈良をはじめとして、主として未発表の出土建築部材の調査をおこない、資料化・公開をおこなう。(5)日本の建築技法の参考事例をとして、韓国・中国の事例調査をおこなう。(6)研究会の開催全国の遺跡から出土する建築部材について、総合的な把握をおこない、その調査研究方法を構築し、全国的な視点で、出土建築部材について考察したものである。1.出土部材データベースの作成既刊の全国の発掘調査報告書を悉皆的に通読し、出土部材に関する報告をデータ化した。その対象は、建築部材と明確に示されているもの以外でも、柱根・大型木材も拾い出し、木工技術の参考事例として井戸枠などもその対象とした。作業は近畿地方を手始めに、奈良・京都・大阪と進み、作業は次年度以降も継続する。2.調査手法の検討現在各地でおこなわれている出土部材の調査方法についての調査をおこなうとともに、出土部材実測作業のなかで、簡便かつ有効な調査手法を検討した。3.先行研究の整理今年度は、出土部材に関する論考および、出土部材による復原的研究など、出土部材そのものおよび出土部材を基礎資料とした研究論考を抽出し、データ化をおこなった。4.出土建築部材の調査今年度は、当機関が保管する主として飛鳥・藤原地区出土の建築部材の実測および詳細な観察をおこなった。この作業は次年度以降も継続するが、詳細な観察のなかで、柱根に記された墨線等、新たな発見もみられ、7世紀代の建築技術の解明に貢献するものと考える。その他では、秋田県において、地元と協力して、10世紀に十和田火山の火砕流によって一瞬のうちに埋没した家屋遺構の調査をおこなった。これらは、過去に発掘され保管されていたものであるが、建築史的な評価が定まっておらず、今年度および次年度の調査を通して、建築史的な評価を定め、10世紀代の地方における家屋の具体的な姿およびその建築技術をあきらかにしてゆく。5.焼失家屋の研究建築部材が土中から出土する事例として焼失家屋がある。これら事例を収集・検討することにより、竪穴住居の具体的な建築技術をあきらかにしてゆく。今年度は、その事例収集をおこないデータ化するとともに、発掘担当者等を招聘して研究会を開催して、今後の研究の可能性を検討した。6.海外事例の調査今年度は海外のうち、韓国について、実見可能なものについては調査をおこない、韓国における出土建築部材についての研究情況を研究者等からヒアリングするとともに、今後研究に対して協力を要請した。作業は近畿地方を手始めに、奈良・京都・大阪がほぼ完成した。なお、研究会において、全国の研究者および発掘担当者から得た様々な要望・意見をふまえ、次年度以降はこれまでの内容を若干改定してデータベース作成を継続する。3.出土建築部材の調査今年度は、当機関が保管する主として飛鳥・藤原地区出土の建築部材の実測および詳細な観察をおこなった。これらは、過去に発掘され保管されていたものであるが、建築史的な評価が定まっておらず、調査の結果として当該部材の建築史的な評価を定め、10世紀代の地方における家屋の具体的な姿およびその建築技術をあきらかにした。4.焼失竪穴建物の研究建築部材が土中から出土する事例として焼失竪穴建物がある。これら事例を収集・検討することにより、竪穴住居の具体的な建築技術をあきらかにするとともに、今後研究の可能性を検討した。収集した事例をデータ化するとともに、その解析結果を、「日本各地・各時代の焼失・竪穴建物跡・本文編・表紙編」として冊子を作成し、全国の研究者および、発掘担当者に配布した。5.研究会の開催本年度は、出土建築部材の調査方法と研究方法をテーマに研究会を開催した。研究者および全国の発掘担当者が参加し、意見交換をおこなった。

討議の結果、基礎的なデータベースの作成と同時に、調査現場に資するような類例索引的な事例集の作成が急務であることが明確となった。調査方法については、考古学・建築学それぞれの視点から意見が出され、今後、調査マニュアル的なものの作成を目指すこととなった。1.出土部材データベースの作成既刊の全国の発掘調査報告書を悉皆的に通読し、出土部材に関する報告をデータ化した。建築部材以外でも、柱根・大型木材も拾い出し、木工技術の参考事例とした。昨年度までに、奈良・京都・大阪がほぼ完成し、今年度は北海道から静岡までほぼ完成した。次年度も作業を継続し、全国データベースを完成させる予定である。2.調査手法の検討観察手法の検討と、新たな実測・観察手法を検討した。3.事例集の作成準備調査手法の検討にもとづき、出土部材の典型事例を検討した。4.全国出土建築部材の調査本年度は、奈良県内のものとして、飛鳥地域および藤原京・宮出土の建築部材を中心に実測および観察をおこなったまた、平城宮・京出土の柱根について、その出土位置、形状の検討をおこなった。また、県外のものとしては、徳島県観音寺遺跡および鹿児島県中津野遺跡の出土建築部材の調査をおこなった。また、次年度以降の調査対象として想定している静岡県山木遺跡の部材調査について協議をおこなった。5.海外事例調査として、韓国山城から出土している、木槨墓の調査をおこなった。また、掘立柱建物技術の事例調査として、中国雲南の民家の建築技法の調査をおこなった。6.研究会の開催調査手法の検討および、典型事例の検討にもとづき、マニュアル的な事例集の原案を作成し、全国の発掘技術者・建築史研究者による研究会を開催し、調査マニュアルの作成方針について協議した。なお、前年度のおこなったシンポジウムの記録は、『「出土建築部材の調査方法と視点」の記録』として印刷し、配布した。1.昨年度に引き続き、出土建築部材データベースの作成をおこなった。発掘報告書を基礎資料として、全国から出土している建築部材および、それに類する部材についてのデータベースを完成させた。そのデータについては、CDとして、全国の研究者・発掘関係者に配布した。これにより、これまであまり活用されていなっかた遺跡出土建築部材が、考古学・建築学の両分野で活用されることとなり、今後の新たな研究の展開が期待される。2・3.調査手法の検討・調査マニュアルおよび事例集の作成観察手法の検討と、新たな実測・観察手法を検討した。その上で、調査マニュアルを作成するとともに、調査マニュアルと連動した事例集を作成し、『出土建築部材における調査手法についての研究報告』と題する印刷物として配布した。これにより、全国でおこなわれている発掘調査における出土部材の調査が均一化されるとともに、今後は、出土建築部材が積極的に報告され、さらには、それら報告にもとづいた研究が展開するものと思われる。4.全国出土建築部材の調査本年度は、奈良県内のものとして、飛鳥地域および藤原京・宮出土の建築部材を中心に実測および観察をおこなった。なかでも、坂田寺出土および本薬師寺出土の建築部材について、調査が完了した。
高齢尿失禁患者の排尿パターンの把握と、排尿ケアプログラムの開発

老人病院入院患者の、個別の排尿誘導時間を設定する指標を見いだすため、以下のように個別の排尿パターンを把握する調査を行なった。茨城県結城市「結城第2病院」に入院中の機能性尿失禁患者10名に、尿漏れセンサーを24時間装着してもらい、排尿時刻、排尿量などを観察・記録した。その他に入院期間、診断名、排尿状態・排尿動作、失禁に関連する要因および、カッツのADL評価、長谷川式痴呆審査スケール得点などをカルテなどから得た。調査期間は平成9年2月2日から2月4日までの3日間である。結果:1日の平均排尿回数は10回、最少6回、10回以上の頻尿が4名の男性患者がおり、特に臥床でのオムツ交換の際に失禁が集中する傾向がみられた。1日の平均排尿量は1440ml、測定できた範囲で最大1750ml、最少で993mlであり、正常範囲内であることが確認された。平均1回排尿量は147mlであった。0時から8時間ごとに3区分した時間帯での比較では、合計排尿回数の多い順に、16時から23時59分までが106回、8時から15時59分までが99回、0時から7時59分までが88回であった。合計尿量では多い順に、16時から23時59分14985ml、0時から7時59分14679ml、8時から15時59分13546mlであった。これを1回あたりの平均尿量に換算すると、多い順に0時から7時59分167ml、16時から23時59分141ml、8時から15時59分137mlであった。今回、排尿のタイミングを正確に測定しようとしたが、尿漏れセンサーの扱いに慣れていないためか、全体として正確に把握することができず、今後の検討課題である。しかし3日間を通して個別に観察すると頻尿の2名を除いて他の8名は尿意を訴えてきたり、自発的にトイレに行こうとする行動が見られ、援助によっては排尿自立の可能性のあることが示唆された。
リン脂質フリッパーゼによる生体膜の局所的な動態制御がもたらす新たな生理機能の解明

生体膜のホスファチジルセリン(PS)フリッパーゼであるATP11Cの二つのアイソフォーム間の異なる制御機構を解明するにあたり、H29年度までに、ATP11C(a)がカルシウム依存性のPKCの活性化に伴い、細胞膜からエンドサイトーシスにより排除されることでダウンレギュレーションされ、細胞膜でのPSフリッパーゼ活性が低下し、PSがより露出しやすい環境になることを明らかにし、論文として発表した(Nat Commun. 8(1): 1423 : 2017)。H30年度には、もう一つのアイソフォームであるATP11C(b)が極性を持った細胞で特徴的な局在を示すことを見出し、その極性局在をもたらすアミノ酸配列を同定するに至った。また、これらの研究過程で、新たなアイソフォームATP11C(c)がマウス脳にだけ特異的に高発現していることも明らかにした。ここまでの成果をまとめて現在、論文として投稿中である。さらに、ATP11C(b)のC末端と結合するタンパク質を酵母Two-Hybrid Systemでスクリーニングしたところ、Ezrinを同定した。Ezrinは、活性化型がATP11C(b)とよく似た極性局在を示し、細胞膜タンパク質とアクチン骨格を架橋し、様々な生理機能を有するタンパク質として知られている。ATP11C(b)の極性局在とその機能を考察する上で、Ezrinの特異的な結合の発見は重要であると考えられる。本研究の目的として示した5項目のうち3つ(ATP11C(a)および(b)の基本的性質の明示、ATP11C(a)のC末領域におけるPKC感受性の要因の究明、ATP11C(b)の極性に関する研究)を明確に達成することができた。また、研究が新しい方向にも派生し、新たな展開をしつつある。しかしながら、その一方で、残りの2項目(2つのアイソフォームに起因した局所でのホスファチジルセリン露出の実証、2つのアイソフォームのバランス操作がもたらすPS露出の生理作用の解明)は、漸進しつつある状態である。具体的には、Ba/F3細胞およびMDA-MB-231細胞においてCRISPR/Cas9systemを用いてATP11Cノックアウト細胞を樹立した。それに続いてアイソフォームATP11C(a)もしくは(b)の単独発現細胞を樹立し、各々の機能を明確にするために、諸条件でのPS露出を始めとする様々な実験を行った。現在も鋭意進行中である。これまでのところPS露出の実証実験については明快な結果を得られていない。PSフリッパーゼ活性の低下が本当にPS露出につながるのかどうかを是非明らかにしていきたいと考えている。また一方、ATP11Cの二つのアイソフォームの違いに焦点を当て、その制御機能の違いを明確に示していきたいと考えている。これまでの研究成果からATP11C(b)が極性をもった局在を示すこと、そのC末領域にEzrinが特異的に結合すること、が新たに分かった。Ezrinは細胞膜タンパク質をアクチン骨格を架橋することで、その機能を発揮することから、極性局在と細胞運動の関係性を重点的に探っていきたいと考えている。ATP11Cノックアウト細胞をもとにしたATP11C(a)もしくは(b)単独発現細胞は樹立できているので、今後、その細胞を用いた解析を進めていきたいと考えている。生体膜のホスファチジルセリン(PS)フリッパーゼであるATP11Cの二つのアイソフォーム間の異なる制御機構を解明するにあたり、H29年度はATP11C(a)の活性調節機構を解明することができた。ATP11C(a)は、カルシウム依存性のPKCの活性化に伴い、細胞膜からエンドサイトーシスにより排除されることでダウンレギュレーションされ、細胞膜でのPSフリッパーゼ活性が低下し、PSがより露出しやすい環境になることが明らかとなった。このPKCによるフリッパーゼの活性制御は、ATP11C(a)のC末領域の存在するジロイシンモチーフ様の配列が重要であることも突き止めることができた。さらにGPCRをセロトニンやヒスタミンなどのリガンドで刺激し細胞内のカルシウム濃度を上昇させることでもATP11C(a)のダウンレギュレーションが起こることも示し、フリッパーゼの細胞での活性制御が、より生理的な条件でも起きていることを初めて証明できた。ここまでの研究成果を論文として発表した(Nat Commun. 8(1): 1423.doi: 10.1038/s41467-017-01338-1.)。さらには、ATP11C(a)のC末領域こそ、もう一つのアイソフォームであるATP11C(b)とは異なる領域であるため、二つのアイソフォーム間の異なる制御はこの領域に起因するものであることが強く示唆された。ATP11C(b)に関する研究にも大いなる進展が見られたが、その詳細な内容に関しては現時点では非公表としたい。本研究の目的として示した5項目のうち2つ(ATP11C(a)および(b)の基本的性質の明示、ATP11C(a)のC末領域におけるPKC感受性の要因の究明)を明確に達成することができた。

生体膜のホスファチジルセリン(PS)フリッパーゼであるATP11Cの二つのアイソフォーム間の異なる制御機構を解明するにあたり、H29年度までに、ATP11C(a)がカルシウム依存性のPKCの活性化に伴い、細胞膜からエンドサイトーシスにより排除されることでダウンレギュレーションされ、細胞膜でのPSフリッパーゼ活性が低下し、PSがより露出しやすい環境になることを明らかにし、論文として発表した(Nat Commun. 8(1): 1423 : 2017)。H30年度には、もう一つのアイソフォームであるATP11C(b)が極性を持った細胞で特徴的な局在を示すことを見出し、その極性局在をもたらすアミノ酸配列を同定するに至った。また、これらの研究過程で、新たなアイソフォームATP11C(c)がマウス脳にだけ特異的に高発現していることも明らかにした。ここまでの成果をまとめて現在、論文として投稿中である。さらに、ATP11C(b)のC末端と結合するタンパク質を酵母Two-Hybrid Systemでスクリーニングしたところ、Ezrinを同定した。Ezrinは、活性化型がATP11C(b)とよく似た極性局在を示し、細胞膜タンパク質とアクチン骨格を架橋し、様々な生理機能を有するタンパク質として知られている。ATP11C(b)の極性局在とその機能を考察する上で、Ezrinの特異的な結合の発見は重要であると考えられる。本研究の目的として示した5項目のうち3つ(ATP11C(a)および(b)の基本的性質の明示、ATP11C(a)のC末領域におけるPKC感受性の要因の究明、ATP11C(b)の極性に関する研究)を明確に達成することができた。また、研究が新しい方向にも派生し、新たな展開をしつつある。しかしながら、その一方で、残りの2項目(2つのアイソフォームに起因した局所でのホスファチジルセリン露出の実証、2つのアイソフォームのバランス操作がもたらすPS露出の生理作用の解明)は、漸進しつつある状態である。具体的には、Ba/F3細胞およびMDA-MB-231細胞においてCRISPR/Cas9systemを用いてATP11Cノックアウト細胞を樹立した。それに続いてアイソフォームATP11C(a)もしくは(b)の単独発現細胞を樹立し、各々の機能を明確にするために、諸条件でのPS露出を始めとする様々な実験を行った。現在も鋭意進行中である。当初の研究目的として示していたPS露出の実証実験に関してもトライしてきたが、これまでのところ実証するに至っていない。PSフリッパーゼ活性の低下が本当にPS露出につながるのかどうかを是非明らかにしていきたいと考えている。さらに今年度はATP11Cの二つのアイソフォームの違いに焦点を当て、その制御機能の違いを明確に示していきたいと考えている。これまでの研究成果からATP11C(b)は極性をもった局在を示すことが分かっていることから、そのC末領域に何らかの因子が結合することでその極性を獲得しているのではないかと推察された。そこで新たな方策として、ATP11C(b)のC末領域に特異的に結合する因子の同定を試みていきたいと考えている。これまでのところPS露出の実証実験については明快な結果を得られていない。また一方、ATP11Cの二つのアイソフォームの違いに焦点を当て、その制御機能の違いを明確に示していきたいと考えている。これまでの研究成果からATP11C(b)が極性をもった局在を示すこと、そのC末領域にEzrinが特異的に結合すること、が新たに分かった。
流入型神経端側縫合による筋肉の脱神経性萎縮防止法の研究

流入型神経縫合により脱神経性筋委縮を予防することが可能か否かを検討するために実験を行った。ラットを用いて、頬枝に流入型端側縫合にて頬骨枝を移行し吻合した。頬枝には端側縫合部より中枢にて一ヵ所、あるいは二ヵ所の神経縫合を行ってrecipient nerveにおける軸索再生状態を変化させた。一定の期間を経て、移行した頬骨枝を切断すること(donor release)により、端側縫合部前後における再生軸索の変化を調べた。その結果、一ヵ所再縫合ではどの検体においても、distalでproximalより神経軸索数が少なくなっていた。二ヵ所再縫合ではどの検体においては逆に、distalでproximalより神経軸索数が多くなっていた。したがって、donorreleaseを伴う端側型神経縫合による神経吻合は、損傷が強く回復程度の低い神経に対しては末梢部への神経再生を増加させることになり推奨されるが、損傷程度の小さい神経に対しては安易に行うべきではないと考えられた。ラットの顔面神経頬骨枝と頬枝を剥離露出し、頬骨枝を耳前部で切離し直ちに再縫合した。同時に頬枝を末梢側で切離し、その中枢端を端側型で先の切離部より末梢の頬骨枝に端側型で縫合した。対側では頬骨枝の切離・縫合は同様に行うが、頬枝は切離した後反転させて頚部の皮下に埋没し、コントロールとした。その後、1ヵ月の待機期間を経た時点で、実験側において端側型に植え込んだ頬枝を切断し、反転して頚部の皮下に埋没させた。対照側では実験側と同じ範囲の皮下剥離のみを行った。(評価)1ヵ月後に以下の検査を行った。1)電気生理学的検査頬骨枝が支配する顔面表情筋に同心型針電極を刺入し、顔面神経本幹を電気刺激し、誘発筋電図を記録した。2)組織学的検索頬骨枝を採取し、エポン包埋を施し、トルイジンブルーによる染色標本を作成した。これに対し、神経数、神経直径の計測を行った。(結果)表情筋筋電図において誘発電位の振幅、潜時に関して、コントロール側と有意差は認められなかった。また、組織学的検査においても両側の頬骨神経の有髄神経数、神経直径に関して差は見られなかった。(結論)「神経端側縫合による神経再生の増強」(いわゆる「babysitter効果」)は今回の結果からは確認できなかった。神経再生の増強は、本来の神経からの再生軸索が筋肉に達するまでの間に端側縫合からの外来神経が筋肉の委縮を防止することを期待した仮説である。今後、待機期間を変化させて、また、頬骨枝の切離部を2か所にしたモデルを作成し、さらに検討を行う予定である。

今後、待機期間を変化させて、また、頬骨枝の切離部を2か所にしたモデルを作成し、さらに検討を行う予定である。実験動物としてはSprague-Dawley ratのオスを用いた。ラットをネンブタールの腹腔内注入により麻酔し、腹臥位にて固定。顔面の下顎縁に皮膚切開を加え、顔面神経の頬骨枝と頬枝を剥離露出した。耳介下方から口角にかけての皮切を行い、顔面神経頬骨枝と頬枝を露出した。ラットの顔面神経頬骨枝を一側は1カ所、対側は2カ所切断後ただちに10-0ナイロンにて顕微鏡下に再縫合し、再縫合部の遠位に頬枝を用いた流入型端側神経縫合を行った。1ヶ月後に頬枝を切離してdonor releaseを行い、その後さらに2.5ヶ月後に神経標本を採取した。採取した神経を中央で切断して、末梢側と中枢側に分け、エポン包埋を経てトルイジンブルー染色を行った。作成したプレパラートの顕微鏡画像をデジタル化して、画像解析ソフトで有樋神経の数と短径を計測した。(結果)1ヵ所再縫合ではどの検体においても、distalでproximalより神経軸索数が少なくなっていた。2ヵ所再縫合ではどの検体においては逆に、distalでproximalより神経軸索数が多くなっていた。recipientの神経損傷程度が大きい場合には、donor releaseを伴う流入型神経端側縫合を行う事でrecipientの神経再生軸索が増加し、一方、それほど神経障害の程度が大きくない場合は、同じ操作が逆に神経再生軸数の減少を引き起こす可能性が示唆された。一方、神経軸索短径の比較では、1ヵ所再縫合と2ヵ所再縫合で有意差を認めなかった。(考察)神経軸索数が1ヵ所縫合では減少し、2ヵ所縫合では増加している現象を同時に説明できる仮説としては次のようなことが考えられる。すなわち、端側縫合により神経上膜の中に再生した軸索はそのまま生着するのではなく、何%かは機能不全に陥り、すると1ヵ所縫合では、多少減少することになり、一方2ヵ所縫合では多数の軸索が端側縫合から流入してくるため、その一部が機能不全に陥ってもrecipientnerve側の再生軸索がすくないため結果として再生軸索数は増加する。
近代の橋本における製材と外材の流入

近代の橋本市中心市街地における町家と機械製材を受けた木材や外材の流入を明らかとするため文献資料及び調査資料の検討を実施した。その結果、大正時代末以後の米材導入により二階軒高さが一層の伸張を示すことを明示した。背景として米材は材質が弱く、梁材などに用いる場合、内地材に対して1.3倍の材寸が要求された。つまり、二階軒高さがこの時代において一段と伸張した要因として米材の導入が強く影響したことを明らかである。平成24(2012)年度には、再開発事業の進捗に伴い解体除去の実施された牲川家住宅(主屋:宝暦4・1754)年、上田家住宅(主屋東棟:昭和38・1963年上棟)において建築調査を実施した。また、当該地域において、山本家住宅(主屋:18世紀中期頃)、周辺地域において中山家住宅(主屋:昭和6・1931年)、豊島家住宅(主屋:天明3・1783年)、松山製材所(昭和32・1957年、倉庫:昭和32・1957年、ウエノソウコ:昭和46・1971年)などの調査を実施した。また、近代の橋本における町家の形成における機械製材を受けた木材と外材の流入を明らかとするため、これまでにおける一連の建築調査を通じて発見された建築資料の文献調査を平行して行った。橋本市中心市街地の所在した木村家住宅、稲葉家住宅、池永家住宅、上田家住宅の近代における建築資料の読解を通して、橋本の中心市街地における機械製材の導入は大正時代初期頃から、米材の使用は大正時代末頃からであることを再確認した。更に、これまでの調査資料などから当該地域における主屋を中心とする建物の桁高さの変遷を調査した。軒高さは遺構の残る江戸時代中期以後、緩やかに高くなる傾向を確認したが、特に大正時代後期以後、桁材を中心に米材が使われるようになると建築物の軒高さが従来よりも一段と高くなる傾向のあることを明らかとした。また、橋本地域に隣接する東家地区においては地区内における環境物件調査を継続して実施し、同地区の構成及び橋本地区との比較を実施した。平成25(2013)年度は、橋本市の中心市街地における再開発事業の進捗に伴って実施された建築物の解体除去などに併せて、辻本ー山内家住宅(主屋:18世紀後期)、小林家住宅(土蔵:大正11・1922)、山本家住宅(主屋:18世紀中期頃)、周辺地域については一色家住宅(離れ座敷:明治時代前期、オクノクラ:大正時代初期、蛭本家住宅、マエグラ:大正7・1918)、蛭本家(主屋:明治33・1900)などの調査を実施し、建築年代をはじめとして近代に及ぶ建築活動のあり方を検討した。なお、一連の調査においては小林家住宅土蔵から、建築資料が見出されたため、これらの翻刻、内容の考察を行い、近代における建築生産のあり方を検討した。また、各建物おいて上棟時に設置されたと考えられる幣串の調査、記録、内容検討にも行った。一方、これまでの建築調査において蓄積された情報などに基づいて、近代における橋本市中心市街地における町家の建築と、機械製材を受けた木材や外材の流入を明らかとするため文献資料及び調査資料の検討を継続的に実施した。一連の資料における検討結果から、大正時代以後における米材導入以後において、2階軒高さが一段の伸張を示すことは明らかであった。その背景として米材の材質を検討すると、これらは一般に材質が強靱ではなく、梁材などに用いる場合はいわゆる内地材に対して1.25倍の材寸が要求されたこと等が明らかとした。つまり、経年における2階軒高さがこの時代、一段と伸張した要因として米材の導入が強く影響したことを明らかとした。平成23(2011)年度においては先ず、全体の研究における準備・予備調査として、橋本市中心市街地における再開発計画進捗の確認を行い、今後の計画を立案した。以後、当該年度においては、再開発事業の進捗に伴い解体除去の決まった西村家住宅(主屋:18世紀後期、離れ座敷:昭和4・1929年)、津守家住宅(長屋:明治時代後期)、火伏家住宅(主屋:享保6・1721年、病院棟:大正時代、離れ座敷:昭和2・1927年)、大谷家住宅(主屋:大正15・1926年、:倉庫:大正13・1924年)、池永家住宅(主屋:昭和11・1936年、離れ座敷:大正9・1920年)において建築調査を実施した。一方、近代の橋本における町家の形成における機械製材を受けた木材と外材の流入を明らかとするため、建築調査を通じて発見された建築資料の文献調査を平行して行った。木村家住宅、稲葉家住宅、池永家住宅、上田家住宅の近代における建築資料の読解を通して、橋本の中心市街地における機械製材の導入は大正時代初期頃から、米材の使用は大正時代末頃からであることを確認した。

なお、資料に記される和歌山市の材木店における聞き取り調査も加えて実施した。調査において、当該の材木店は現在は欄間の制作に特化するものの、戦前期においては銘木の販売も行ったことを確認した。また、橋本地域に隣接する東家地区においては地区内における環境物件調査を実施し、同地区の構成及び橋本地区との比較を実施した。橋本市中心市街地においては、再開発事業は予定よりやや遅れて進んでいるものの、当該地域における予定建物の除去は着実に進んでいる。そのため申請者らにとっては必ずしも本意ではないものの、建物の除去に伴う建築調査の機会が巡ることで、分析の対象となる建築物の戸数は着実に増加している。また、機械製材及び米材の橋本における導入時期を明らかにした上で、それらが建築の造形に及ぼした影響を具体的に示すことをができ、当所の目的は計画通り研究は進んでいるものと判断できる。引き続き、当該地域において除去対象の建築調査を継続的に実施する。また、米材の導入が造形に与えた影響を検討する、その理由を明らかとする。また、米材の導入が造形に与えた影響を検討する。現地における建築調査に対する旅費、調査補助者に対する謝礼が多くを占めることとなる。