hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
香港経済発展の計量分析とデータベース構築-政治経済学的アプローチによる定量分析-

本研究は、香港経済発展における香港政庁の役割を明らかにし、それを定量的に評価するための試論である。前年度の研究成果に加えて、平成10年度では、(1)香港レッセフェールの政治経済学的背景(2)都市計画の経済発展促進効果(3)香港教育制度の経済学的分析、の3点に関して研究が進められた。そこでは、香港に特有な政策体系を定量化し、以下の諸点が明らかとなった。第1に、香港政庁の経済政策は、いわゆる開発志向的国家とは大きく性質を異にする点が示唆された。すなわち、香港政庁は地場資本、外資とならぶ利益追求の主体であり、3者でプラスサムを引き起こすゲーム論的な状況が、香港の経済発展を引き起こしたと解釈すべきである。第2に、香港において集約的に展開される都市計画が、狭隘な土地利用を効率化させ、結果的に香港域内の生産性向上をもたらした点が明らかにされた。本研究では、土地落札価格にヘドニック・アプローチを適用して、インフラ建設と土地利用の効率性の程度を定量的に明らかにしている。第3に、香港における各教育機関の収益率を計測することに成功した。興味深い事実は、中等教育(後期)の収益率が、高等教育のそれをほぼ計測全期間を通じて上回っていることである。また、収益率そのものは、他の途上国と比較してかなり低い事実も発見された。総論で言えば、上記3分野に関して、香港経済独特の政治経済システムを明示的にモデルに取り入れ、その経済構造の定量化にある程度成功したと言える。なお、上記(1)(レッセフェール主義)に関する研究成果は、平成10年10月の日中経済学術交流会議で報告・議論され、(3)(香港教育制度)については、他のアジアNIES諸国との比較研究を行った上で、英文にて論文を執筆の予定である。また、統計データベースについては、その成果の一部を成果報告書末に掲載している。本研究は、香港経済発展における香港政庁の役割を明らかにしようとするものである。平成9年度中には、(1)港湾開発の含意(2)都市計画の経済発展促進効果、の2点に関して重点的に研究が進められた。(1)に関しては、香港経済発展のプロセスにおける港湾開発の位置付け、ならびにその経済効果が歴史的、定量的に分析され、次のような事実が明らかにされた。第1に、香港政庁は、コンテナターミナル建設に際して一切の支援を行わず、民間ターミナル業者が開発権益を得て、建設が進められた事実が確認された。第2に、香港政庁のターミナル建設の計画性は、経済性からみて妥当なものではなかった点が検証された。すなわち、政庁は、コンテナターミナルを地場輸出推進、東南アジア諸国とのハブ港化への意図を持ったのであるが、コンテナターミナル開発の成功は、結果的に中国の改革開放政策によってもたらされたからである。第3に、民間主体の開発方式による、香港コンテナ港の寡占状況の経済効果も分析された。第4に、香港に特徴的なバ-ジ業者が演じる独特の経済効果、すなわち、超過需要の安全弁、オペレーター独占力の抑止などが、「港湾レッセフェーリズム」の脈絡の中で評価された、などである。総論で言えば、港湾開発は、香港政庁の自由放任主義が典型的に現出している領域であり、香港的経済発展モデルの優位性と問題点を端的に示している事実が確認されたと言えよう。なお、上記(2)(都市計画)に関する研究成果は、平成9年10月の第56回国際経済学会全国大会で報告・議論され、現在英文にて論文を執筆中である。
ポストモンゴル期におけるアジア諸帝国に関する総合的研究

従来、ティムール朝、ムガル朝、ジャライル朝、カラ・コユンル朝、アク・コユンル朝、サファヴィ朝、オスマン朝、その他ポスト・モンゴル期の諸国家に関する研究は圧倒的に西アジア史、中央アジア史、イスラム史の立場からなされてきたため、これら諸国家の中核を構成するテュルク系、モンゴル系支配社葬の様相やその国家構造が極めて曖昧なまま放置され続けることとなった。ペルシア語史料その他西アジア諸語史料の字面の奥深くを刳り出して精査することにより、これら諸国家が基本的には匈奴、突厥、モンゴル帝国の系列上に連なる中央ユーラシア史上の遊牧国家とその継承国家であることが明らかにされる。1.研究代表者・分担者が所属する各機関が既に蒐集したペルシア語写本マイクロフィルムを焼き付け、焼付本と大量のコピーを作成し、各自が分担した史料中に翻訳・意訳・音訳されて出てくる遊牧国家特有の述語を大型カードに大量に抜き出した。2.古来、中央ユーラシアに成立した幾多の遊牧帝国の支配者層は、自らの言語であるモンゴル語、トルコ語で自らの国家についてのまとまった記録をほとんど残さなかった。これら諸帝国についてペルシア語その他の西アジア諸語史料を用いてなされてきた従来の研究は、「野蛮で未開の遊牧民と、彼らを指導、補佐する開化した定住民」という、事実とは全く逆の前提のもとに、西アジア諸語史料の字面を西アジア定住民の常識で読みとっただけのものであった。こうした根本的に誤った研究を糺し、遊牧支配者層の姿や、遊牧帝国の国家構造を判然とさせるためには、西アジア諸語史料の字面の奥深くに潜む遊牧国家固有の要素を逐一刳り出し、研究を一からやり直していく以外に手がないことを一同再確認した。3.こうした基礎作業の積み重ねにより、ポストモンゴル期の諸帝国についても、モンゴル帝国の場合と同様、従来の研究が大きく覆され、一新されることが予想される。「野蛮で未開の遊牧民」という誤った、独善的な前提を排し、ペルシア語史料、漢文史料の字面の奥深くを刳り出し、以下のことを確認した。1.北アジアに興ったトルコ系・モンゴル系遊牧・狩猟騎射戦士達の不断の南下と西進が中央ユーラシア史を展開させ、中国、中央アジア、西アジアに幾多の政権を成立させた。こうした騎射戦士達の活動の頂点に立つモンゴル帝国のユーラシア大陸東西に跨る支配は時代を大きく画し、ポストモンゴル期の諸国家を経て現在に直結する国家形成を促した。2.従来の定説とは異り、遊牧民は極めて開化した存在であった。中国を支配した歴代王朝の支配者層の大部分が遊牧、狩猟騎射戦士とその後裔達であり、また、モンゴル帝国の支配者層は世界の歴史、地理に精通しており、大航海時代以後の知見とされる多くの事柄を既に熟知していた。3.モンゴル帝国は王族チンギス・カン一門と麾下の遊牧諸部族の「御家人」達が連合した部族連合国家であり、チンギス一門とその擬制家族(姻族・義父・師父・養子・乳兄弟・譜代の家人)を輩出する特定部族が政権の中核を占め、一般部族と連合していた。モンゴル帝国の各王家(ウルス)の中核となる支配者層の構成は基本的には同様のものあった。4.ポストモンゴル期の諸国家の多くが部族連合国家であり、モンゴル帝国を構成した諸部族や治下の諸部族が統廃合・再編されて部族連合を形成していた。モンゴル帝国時代の諸制度も数多く継承されていた。ティムール朝、ムガル朝、オスマン朝、シャイバーン朝以下のウズベク諸王朝、ジャライル朝、カラ・コユンル朝、アク・コユンル朝、サファヴィ朝等、ポスト・モンゴル期の諸王朝についてはペルシア語史料をはじめとする西アジア諸語史料が数多く存在する。従来、これら諸資料は西アジア史、中央アジア史の立場から西アジア、イスラムの常識でその字面が読まれ、各王朝史が研究されてきた。こうした諸研究の批判の上に立ち、本年度の研究で以下のことが明確にされた。1.ポスト・モンゴル期の諸王朝はモンゴル系・チュルク系王族と魔下の遊牧諸部族を支配者とする部族連合国家とその継承国家であり、まず、中央ユーラシア遊牧国家史の立場から西アジア諸語史料の字面の奥を刳り出してかからねばならない。従来の研究は根本的に検証しなおさねばならない。2.これら諸王朝の中核を構成したのは開化、開明した王族と王族の姻族をはじめとする擬制家族である。3.モンゴル帝国の諸制度はポスト・モンゴル期の諸王朝に数多く継承された。モンゴル帝国が採用した命令文、行政文書システムは直接、間接にポスト・モンゴル期の諸王朝に受け継がれている。
ステロイド代謝膜酵素の新しい反応機構とその生理学的意義の解析

ウシのP45017αはプリグネノロンとプロゲステロンを基質とし、17α水酸化反応を触媒するとともに、プリグネノロンを連続的水酸化反応によりデヒドロエヒアンドロステロン(DHEA)に変換するが、プロゲステロンを基質にした場合、アンドロゲンへの連続的水酸化は起こらない.この原因を反応速度論的に解析した.その結果プロゲステロンを基貢とするとウシのP45017αからの17α水酸化プロゲステロン解離が非常に速いため連続的反応が起こらないことが判明した(山崎ら、Biochemistry37,2800,1998).P45011βはデオキシコルチコステロン(DOC)を基質としてコルチコステロン(cortico)とアルドステロン(Aldo)を合成する.コルチコステロンは重要な糖質コルチコイドであるため、P45011βはアルドステロンを合成する連続反応とともに11β水酸化のみで反応が止まる経路も存在するはずである.この研究の結果P45011βはDOCをまず11β水酸化してコルチコステロンを合成し、そこで酵素から解離しなかった中間体がアルドステロンまで連続的に水酸化されるということが反応速度論的解析より判明した.また、P450sccはP45011βに結合すると中間体であるコルチコステロンの酵素からの解離を促進する事も明らかとなった(今井ら、Biochemistry37,8097,1998).脳下垂体から送られた副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)は副賢皮質細胞の表面にある受容体に結合し、その刺激は細胞内刺激として細胞内のセカンドメッセンジャーの濃度を増大し、ステロイドホルモン生合成の活性化を促す.短期的効果(15分以内)ではセカンドメッセンジャーが主に出発基質であるコレステロールのミトコンドリア内膜への輸送を活発化する.副腎皮質内のACTH刺激に対応するセカンドメッセンジャーとしてCaイオン、15-HPETE,cAMPなどの役割が明らかとなった(山崎ら、Endocrinology,139,1998).脳で合成されるニューロステロイドの作用とその合成箇所を調べるため、P450sccの抗体などを用いて調べたところプルキンエ細胞等に局在する事が明らかとなった.また、連続的水酸化反応として興味深い一酸化窒素合成酵素の反応機構がP450の反応機構と同じであることも明らかにした.ウシのP45017αはプリグネノロンとプロゲステロンを基質とし、17α水酸化反応を触媒するとともに、プリグネノロンを連続的水酸化反応によりデヒドロエヒアンドロステロン(DHEA)に変換するが、プロゲステロンを基質にした場合、アンドロゲンへの連続的水酸化は起こらない.この原因を反応速度論的に解析した.その結果プロゲステロンを基貢とするとウシのP45017αからの17α水酸化プロゲステロン解離が非常に速いため連続的反応が起こらないことが判明した(山崎ら、Biochemistry37,2800,1998).P45011βはデオキシコルチコステロン(DOC)を基質としてコルチコステロン(cortico)とアルドステロン(Aldo)を合成する.コルチコステロンは重要な糖質コルチコイドであるため、P45011βはアルドステロンを合成する連続反応とともに11β水酸化のみで反応が止まる経路も存在するはずである.この研究の結果P45011βはDOCをまず11β水酸化してコルチコステロンを合成し、そこで酵素から解離しなかった中間体がアルドステロンまで連続的に水酸化されるということが反応速度論的解析より判明した.また、P450sccはP45011βに結合すると中間体であるコルチコステロンの酵素からの解離を促進する事も明らかとなった(今井ら、Biochemistry37,8097,1998).脳下垂体から送られた副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)は副賢皮質細胞の表面にある受容体に結合し、その刺激は細胞内刺激として細胞内のセカンドメッセンジャーの濃度を増大し、ステロイドホルモン生合成の活性化を促す.短期的効果(15分以内)ではセカンドメッセンジャーが主に出発基質であるコレステロールのミトコンドリア内膜への輸送を活発化する.副腎皮質内のACTH刺激に対応するセカンドメッセンジャーとしてCaイオン、15-HPETE,cAMPなどの役割が明らかとなった(山崎ら、Endocrinology,139,1998).脳で合成されるニューロステロイドの作用とその合成箇所を調べるため、P450sccの抗体などを用いて調べたところプルキンエ細胞等に局在する事が明らかとなった.また、連続的水酸化反応として興味深い一酸化窒素合成酵素の反応機構がP450の反応機構と同じであることも明らかにした.高等動物の副腎皮質におけるステロイド産生反応系に関与する膜酵素、P450scc,P45017α,P45011βおよび3βHSDは数段階の連続反応を触媒するが、その連続反応において最終生成物は酵素より解離しない中間体から生成されるという特徴がある。本研究では(1)P45011βと(2)P45017αの連続反応の反応機構の解明に焦点を絞った。(1)P45011βはデオキシコルチコステロン(DOC)からアルドステロン(ALDO)への3段階の連続する水酸化反応を触媒する。

この反応では第1段階目に11βの水酸化が起こる経路(経路1)と、18位の水酸化が起こる経路(経路2)の2つの経路が考えられていた。人工膜リポソームに組み込んだP45011βを用い反応迅速停止法によりその中間代謝物の消長を測定したところ、DOCの急速な減少に伴い11β水酸化物であるコルチコステロン(COR)の増加が観測され、その後CORの減少に伴ってそれに続く代謝反応が起こりALDOが生成されることが判明した。この結果は明らかに経路1によりALDOが生成されることを示している。P45011βにP450sccが結合すると定常状態におけるCORの合成反応速度は約10倍速くなるが、それに続く18位水酸化反応は完全に阻害される。この原因は、両酵素の複合体形成によりCORのP45011βからの解離速度が速くなるためであると速度論的解析から判明した。(2)ウシのP45017αはプリグネノロン(PREG)から17αOHプリグネノロン(17αOH-PREG)を経てデヒドロエピアンドロステロン(DHEA)に至る2段階の水酸化反応を触媒するが、プロゲステロン(PROG)を2段階反応でアンドロステンジオン(AND)に変換できない。その原因を調べるためウシのP45017αを大腸菌で発現させて精製し人工膜リポソームに組み込み反応速度を測定したところ、中間代謝物である17αOH-PROGの酵素からの解離速度が、17αOH-PREG場合より約10倍速いことが分かった。この速い中間代謝物の解離が次の水酸化反応に進むことを阻止していると結論できた。ウシのP45017αはプリグネノロンとプロゲステロンを基質とし、17α水酸化反応を触媒するとともに、プリグネノロンを連続的水酸化反応によりデヒドロエヒアンドロステロン(DHEA)に変換するが、プロゲステロンを基質にした場合、アンドロゲンへの連続的水酸化は起こらない。この原因を反応速度論的に解析した。その結果プロゲステロンを基質とするウシのP45017αからの17α水酸化プロゲステロン解離が非常に速いため連続的反応が起こらないことが判明した(山崎ら、Biochemistry 37,2800,1998)。P45011βはデオキシコルチコステロン(DOC)を基質としてコルチコステロン(Cortico)とアルドステロン(Aldo)を合成する。コルチコステロンは重要な糖質コルチコイドであるため、P45011βはアルドステロンを合成する連続反応とともに11β水酸化のみで反応が止まる経路も存在するはずである。この研究の結果P45011βはDOCをまず11β水酸化してコルチコステロンを合成し、そこで酵素から解離しなかった中間体がアルドステロンまで連続的に水酸化されるということが反応速度論的解析より判明した。また、P450sccはP45011βに結合すると中間体であるコルチコステロンの酵素からの解離を促進する事も明らかとなった(今井ら、Biochemistry 37,8097,1998)。脳下垂体から送られた副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)は副腎皮質細胞の表面にある受容体に結合し、その刺激は細胞内刺激として細胞内のセカンドメッセンジャーの濃度を増大し、ステロイドホルモン生合成の活性化を促す。短期的効果(15分以内)ではセカンドメッセンジャーが主に出発基質であるコレステロールのミトコンドリア内膜への輸送を活発化する。
光散乱による単分散性グラフト共重合体の一次構造と溶液物性

本研究では次の3つの単分散性グラフト共重合体の合成とその溶液物性の研究を行った。(1)幹と枝とが化学的性質の同じものから成るグラフト共重合体のモデルとして、1本の腕を部分的に重水素化して標識した星型ポリスチレン、(2)幹と枝とが異種の分子種からできた星型グラフト共重合体、(3)幹の中央付近に多数の異種高分子鎖をグラフトした共重合体、の3つである。(1)については、化学的同種の標識であるので小角中性子散乱を用い、二硫化炭素中で、腕鎖の星型中心部付近を標識したもの、外部付近を標識したもの、の散乱強度を測定した。その結果、腕鎖は中心に近いところで外部末端部分に比べて2倍程度に膨張していること、またセグメント対相関はガウス鎖近似と大きく異なることが示唆された。(2)を合成した目的は、(1)に対応して光散乱測定が可能な星型グラフトを得ることである。腕1本をポリ(2-ビニルナフタレン)、他の腕をポリスチレンとするものである。まず、ポリ(2-ビニルナフタレン)と結合剤部分となるポリ(4-ビニルフェニルジメチルビニルシラン)とのブロック共重合体を合成、それに腕ポリマ-となるリビングポリスチレンをカップリング反応でグラフトした。この方法で目的物の合成に成功した。(3)では、幹がポリスチレン、枝がポリエチレングリコ-ルから成るグラフト共重合体を用い、それが1-メチルシクロヘキサノ-ル中で形成するミセルの構造を光散乱法により調べた。臨界ミセル濃度は3045°C付近で温度に大きく依存すること、また、会合体の形状は充填された球状ではなく、大きな拡がりを示し、見掛けの分子量、慣性半径、流体力学的半径、そして散乱関数から、ミセル形成初期では棒または紐状、十分成長したミセルでは、中空球又は円板状をしていることが示唆された。本研究は組成分布、鎖長分布の狭いグラフト共重合体を合成し、その一次構造と溶液物性を明らかにすることを目的としている。まず、房型グラフト共重合体の極限としての同一分子種によるグラフト共重合体すなわち星型高分子を合成した。具体的には枝鎖の広がりを中性子散乱で調べるために、重水素化したポリスチレンの末端に低分子量ポリ-4-ビニルフェニルジメチルビニルシランを幹鎖として結合させた後、これにリビングエンドをもつポリスチレンをカップルして標識鎖をもつ星型ポリスチレンを合成した。目的の生成物を分離精製するために分取型高速液体クロマトグラフを用いた。大量の溶媒(クロロホルム)の精製・補給法、注入溶液の濃度、流量、採取のタイミングなどについて検討し、上記分画に必要な分取法を確立した。その結果、未反応の直鎖状ポリスチレンを含まず、かつ枝の数の分布が狭い星型高分子試料を得ることができた。この手法を用い、本研究主眼の房型のグラフト共重合体の合成を行っていく予定である。一方、これと並行し、光散乱の予備的な実験として、すでに合成されている房型グラフト共重合体について、静的及び動的光散乱を行い溶液中での見掛けの慣性半径Rgappと流体力学的半径Rhを求めた。用いた試料は、A-B-A型ブロック共重合体(A:ポリスチレンMw=4.0×10^4;B:ポリヒドロキシスチレンM_n=3.0×10^4)のB部分にポリエチレンオキシド鎖(M_n=3.6×10^2)を125本グラフトしたものである。

四塩化炭素を溶媒としたときの30°CにおけるRgapp、Rhは、それぞれ51.8mm、52.8mm(拡散係数にして5.00×10^<-8>m/s)であり、その大きさ、及びRgappとRhの比から判断して、溶液中(0.52%)では会合ミセルをつくっていることが明らかとなった。グラフト共重合体の一次構造・溶液物性の研究には、溶媒の選択が重要であり、今後この点に注意して研究を進めていく。房型グラフト共重合体の極限としての星型高分子とB部分にグラフト鎖をもつA-B-A型グラフト共重合体について研究し以下のような成果が得られた。1.星型グラフト高分子:幹と枝が化学的に同一分子種から成るグラフト共重合体のモデルとして腕鎖の1本を部分的に重水素化で標識した星型ポリスチレンについてCS_2溶液の小角中性子散乱を測定した。その結果、腕鎖は中心に近いところで末端部分に比べ2倍程度に膨張していること、またセグメント対相関はガウス鎖近似では表わせないことが示唆された。これと対応し、光散乱測定が可能となる幹と枝の分子種が異なるグラフト共重合体としての星型高分子の合成を試みた。すなわち星型ポリスチレンの腕1本をポリビニルナフタレンとしたグラフト共重合体を合成した。この時、前年度と同様の合成手法を用いたが、ポリビニルナフタレンのリビングアニオンは中心部のビニルシランの重合を開始することができず、逆にポリビニルシランアニオンによってビニルナフタレンの重合を開始する必要があることがわかった。2.A-B-A型グラフト共重合体:A-B-A型ブロック共重合体(A:ポリスチレンMw=4.0×10^4;B:ポリヒドロキシスチレンMw=3.0×10^4)のB部分にポリエチレンオキシド(PEO)鎖(Mw=3.6×10^2)を125本グラフトした共重合体がPEOと等屈折率である1-メチル4-シクロヘキサノ-ル中でミセルを形成することを見出した。臨界ミセル濃度は、35°Cで約3×10^<-4>g/g-solution、45°Cで9×10^<-4>g/g-solutionでありそのミセルの大きさは温度・濃度に強く依存する。見かけの分子量、慣性半径、流体力学的半径より、棒または紐状ミセルであることが示唆された。
極性をもつ網膜色素上皮細胞を用いた加齢黄斑変性の病態解明

臨床で用いられている3種類の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)阻害薬(Bevacizumab/Ranibizumab/Aflibercept)の極性をもつ網膜色素上皮細胞(RPE)に対する影響を調べた。各薬剤ともに極性RPEに対して細胞毒性を持たず、バリア機能に影響しないことが分かった。その一方で、VEGF抑制作用や細胞の透過性には薬剤間で違いがあることが分かった。今回の結果から、臨床所見に応じて抗VEGF薬を使い分けることでより良い治療効果が得られる可能性が示唆された。まずは、臨床で用いられている3種類の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)阻害薬(Bevacizumab/Ranibizumab/Aflibercept)の極性をもつ網膜色素上皮細胞(RPE)に対する細胞毒性をTUNEL染色とMTT試験を用いて調べた。その結果、各薬剤共に極性RPEに対して細胞毒性を持たないことが分かった。次に、RPEの重要な機能の一つであるバリア機能に各薬剤が与える影響を調べた。RPEのバリア機能に重要な分子であるZO-1の発現を免疫染色で比較したところ、ZO-1の発現パターンはコントロール群、薬剤投与群で差を認めなかった。更に、バリア機能を反映している経上皮電気抵抗値(TER)を比較したがコントロール群と薬剤投与群でTERに差を認めなかった。これらの結果から、今回の条件では抗VEGF薬はRPEのバリア機能に影響しないことが示唆された。次に、抗VEGF薬が極性RPEから分泌されるVEGFに与える影響を調べた。RPEの上方に分泌されたVEGF(生体内では感覚網膜側に分泌されたVEGFに相当)はいずれのVEGF阻害剤でもほぼ完全に抑制された。一方で、RPEの下方に分泌されたVEGF(生体内では脈絡膜毛細血管側に分泌されたVEGFに相当)は、その抑制作用が薬剤によって異なり、BevacizumabよりもAfliberceptとRanibizumabの方が強力であった。更にこれらの抗VEGF薬の極性RPEの透過率をエライザ法で検証し比較した。その結果、RanibizumabがBevacizumabよりも極性RPEを約1.7倍多く透過すること、AfliberceptがBevacizumabよりも極性RPEを3割程度透過しにくいことが分かった。平成27年度実験計画に掲げていた実験の大部分(抗VEGF薬の極性RPEに対する細胞毒性の検討、バリア機能に与える影響の検討、極性RPEが分泌するVEGFに与える影響の検証など)は計画通り施行できており、再現性のある結果を得ることができた。初年度には、臨床で用いられている3種類の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)阻害薬(Bevacizumab/Ranibizumab/Aflibercept)の極性をもつ網膜色素上皮細胞(RPE)に対する細胞毒性、バリア機能について研究し、影響がないことが分かった。次に、各薬剤の極性RPEが分泌するVEGFの抑制作用を比較し、RPEの上方に分泌されたVEGF(生体内では感覚網膜側に分泌されたVEGFに相当)はいずれのVEGF阻害剤でもほぼ完全に抑制されたが、RPEの下方に分泌されたVEGF(生体内では脈絡膜毛細血管側に分泌されたVEGFに相当)は、その抑制作用が薬剤によって異なり、BevacizumabよりもAfliberceptとRanibizumabの方が強力であることが分かった。更にこれらの抗VEGF薬の極性RPEの透過率をエライザ法で検証し比較した結果、RanibizumabがBevacizumabよりも極性RPEを約1.7倍多く透過することとAfliberceptがBevacizumabよりも極性RPEを3割程度透過しにくいことが分かった。本年度は、上記の結果を確認するためにVEGFエライザ法の再現性・精度の評価を行った。具体的には抗VEGF薬が結合したVEGFが生理活性を失っていることを確認するために、ヒト血管内皮細胞を1)VEGF2)各抗VEGF薬+VEGFのいずれかで共培養し、細胞増殖能を調べた。その結果、抗VEGF薬が結合したVEGFでは、確かに細胞増殖能、遊走能が低下していることが分かった。つまり、初年度行った結果は信頼性が高いということが分かった。本研究では、AMDの治療で用いられている抗VEGF薬のRPEの透過性に違いがあることを初めて発見し、報告することができた。現在の所、本研究はほぼ計画通りに進んでいるので、平成28年度も当初の研究通りに進める予定である。具体的には、平成27年度に行った極性RPEを用いて行った研究と同様の内容を、炎症性サイトカインに暴露させた極性RPEを用いて行う。腫瘍壊死因子(TNF-a)などに暴露させた極性RPEはそのバリア機能が低下していると思われるので、抗VEGF薬の細胞毒性や透過性が正常なRPEと比較して変化している可能性が考えられる。眼科学
伝統的鍛冶製品、種子鋏の製作工程・技術および材料工学的研究

日本における刃物製品は貴重な鉄で製作されてきたと同時に、経済性、機能性や耐久性などが要求されることから、軟鋼に高炭素鋼をつけるツケハガネ(鍛接)といわれる伝統的な製作方法が用いられている。そのことによって鉄に柔軟性と強靭性を与え、優れた刃物製品を製作することができたのである。本研究で取り上げた種子鋏は、伝統的な鍛冶技能を有した刀鍛冶師が多く居住し、良質の砂鉄が豊富に産出していた種子島において製作が始められたツケハガネによる道具である。現在、種子島において全て手打ちで製作している牧瀬氏が製作する種子鋏は、伝統的な鍛冶技術で製作さているのが特徴的であり、優れた切れ味とともに品質も高く美しい形態をしている。本研究および調査結果の概要は次のとおりである。(1)種子鋏製作における作業環境や道具の調査を詳細に行って、牧瀬氏が製作した独特な道具と特徴を持った鋏の形態や機能の関係を考察した。(2)映像によって製作工程の記録を行うと同時に、伝統的なツケハガネ方法で製作された種子鋏の構造と機能的な特徴を解明した。(3)製品おける鋼の組織や硬度など顕微鏡観察によって材料工学的な解析を行うと同時に、他産地の製品と熱処理による硬さの比較検討を行った。その結果、種子鋏独自の性質を出現させていることが分かった。これらは徒弟制度の中で牧瀬氏が勘と経験によって修得したものであり、伝承されてきた種子鋏製作技術や伝統的な鍛冶技術の保存という点で貴重な資料となった。また、種子島における砂鉄の調査や技術の伝承方法の推察も予備的に行った。日本の刃物は極軟鋼と鋼の組み合わせによるものが多く、その接合方法も現在では貴重な技術となった。それは日本において貴重とされていた鉄の存在があったとは言え、強靭であり且つ柔軟な性質を生む構造、形態の微調整、刃の研ぎ出しなど多くのメリットがある。本研究の目的は伝統鍛冶技術で製作された種子鋏を取り上げ、その伝統的鍛冶技術を詳細に記録・保存するとともに、工学的な考察を加えることにある。本研究の対象である種子鋏製作者牧瀬氏は、それらの特徴を包括していた刀鍛冶と鉄砲鍛冶の伝統技術を伝承した職人である。16年度の調査は、(1)牧瀬氏の使用している鍛冶道具の調査・記録。(2)種子鋏の製作工程の内、特に鍛接・火造りなどの鍛造工程をデジタルビデオによってシャッタースピードの操作を加えた記録。(3)熱処理における温度管理を熱電対およびサーモトレイサーによる記録。(4)同様の製作方法を有する博多鋏の製作工程のデジタルビデオによる記録。これらの記録によって、職人の微妙な手技が伝統技術に裏付けられた技能であることが確認され、今まで職人同士でしか伝承できなかった鍛冶技術が解明できる手ごたえを得ることができた。例えば、鍛冶職人は「柿が熟した色」などの口伝で焼入れを行うタイミングをはかっていた。そのような親方のやり方を学び取り、自らの経験と勘によって行っていた工程の数値化を行うことができたことは一つの成果として挙げられる。また、昌國利器工匠博物館をはじめ産地の図書館や博物館を訪問し、時代背景や鋏に関する所蔵品や文献を視察・検索したことは、種子鋏の総合的な視点から考察する上で貴重な資料となった。これらの調査結果にもとづく資料の考察を現在進めており、次年度に公表する予定である。日本刀をはじめとする日本の伝統的な刃物製作は、極軟鋼と高炭素鋼の鍛接によるものが多く、現在では貴重な技術となった。その技術で製作された製品は、刃先が硬くて相対的に強靭な性質を持ち、優れた切断が可能でありながらも形態の微妙な調整や刃の研ぎ出し易さなど、多くのメリットを持ち合わせている。

本研究の目的はこのような伝統的鍛冶技術で製作された種子鋏を取り上げ、その道具や技術を詳細に記録・保存するとともに、工学的な考察を加えることにある。種子鋏の製作者である牧瀬氏は種子島に在住し、刀鍛冶と鉄砲鍛冶の伝統技術を継承し、種子鋏を全て手作りで行う数少ない職人である。本研究に際して種子鋏製作技術とその製品の提供者である。17年度の調査は、16年度の調査・記録をさらに進めた詳細なデータの記録および他産地の製品や技法との比較検討を行い、材料工学的な視点からも考察を加えて種子鋏の特徴を明確にした。具体的には(1)種子鋏の詳細な製作工程の調査(2)鍛造工程における加熱温度の測定(サーモトレーサーによる)(3)焼入れにおける加熱温度と温度変化の測定および結晶組織と硬度(4)種子島の砂鉄に関する調査および分析(4)種子島鍛冶の環境や歴史的背景に関する文献資料と住民の聞き取り調査を行った。これらの調査結果から単なる技術保存にとどまらない、種子鋏の全貌を明確にすることができた。特に材料工学的な解析と考察は、徒弟制度で伝承されてきた伝統的な職人の技術とその内容を多くのデータとともに記録、保存することができたことが大きな成果であった。
単一分子蛍光分光法による孤立電荷移動錯体及び電荷移動錯体ナノ結晶の研究

単一分子分光法により、高分子薄膜中の孤立単一電荷移動(Charge-transfer=CT)錯体の蛍光強度・寿命の経時変化を同時測定した。電子供与性分子の化学構造と高分子の種類を変え、それらのCT蛍光挙動に与える影響について検討した。その経時変化には3種のパターンが観測されたが、電子供与性分子や高分子によりそのパターンの出現する割合が変化した。その結果について議論した。また、励起状態でのみ錯体を形成するエキシプレックス系、更にCTナノ結晶についても単一分子蛍光分光法を適用し、幾つかの知見を得た。電子供与体として用いる二量体系Cz化合物を合成し、高純度に精製した。ホスト高分子として、メタクリレート系高分子を選択した。モノマーを最終的には真空蒸留により高純度に精製し、そのまま封管・熱重合した。得られた高分子は、電荷移動(CT)錯体の励起波長の光の照射で全く発光を示さず、使用可能な無蛍光性であった。またポリカーボネイトの高純度物を入手できた。電子受容体としてはテトラシアノベンゼン(TCNB)を精製後使用した。置換基の異なるいくつかのCz化合物とTCNB系の、孤立した単一CT錯体の蛍光を蛍光の時間分解測定が可能な共焦点顕微鏡で、その蛍光強度・蛍光寿命の経時変化を測定し解析した。蛍光イメージのCz化合物の濃度依存性と蛍光が一段階で消滅することから、単一のCT錯体蛍光を観測できていることを確認した。単一CT錯体の蛍光強度の経時変化のトレースに観測された1秒以上のoff-timeは、その出現頻度がC環の置換基のバルキーさに依存していることから、過渡的なCT錯体の解離あるいはCT錯体周囲の環境の揺らぎに依ると判断した。ホスト高分子として、3種のメタクリレート系およびポリカーボネイトを用いて、更に検討を進めている。CT錯体ナノ結晶の生成は原子間力顕微鏡でサイズを確認できた。単一CTナノ結晶の蛍光挙動はおおよそ3種に大別できることが分かったが、大きなサイズの結晶のそれと異なる挙動を示した。Cz化合物とTCNBの濃度比を変えるなどして検討しているが、説明に苦慮している。Cz系でのエキシプレックス蛍光の観測は、電子受容体の選択や励起波長に限りがあり、また検知器の波長範囲の問題から困難であると結論した。電子供与体をCz化合物からピラゾリン系化合物に変更したが困難であった。現在、デュレンとジシアノアントラセン系で観測を試みている。観測できれば、基底状態で相互作用の無い2つの分子を単一分子蛍光分光法で観測する最初の例になる。ホスト高分子として無極性のものが望ましく、ポリスチレンを目指した。スチレンを最終的には真空蒸留により高純度に精製し、脱気封管後、熱重合した。得られたポリスチレンは使用可能なものであった。ホスト高分子として3種のメタクリレート系高分子を用いて、Cz化合物とTCNB系の、孤立した単一CT錯体の蛍光を単一分子蛍光分光法により、その蛍光強度・蛍光寿命の経時変化を測定し解析した。どの高分子中でも3種のパターンが観測されたが、ホスト高分子によりそのパターンの出現する割合が変化した。また、ホスト高分子のガラス転移温度が小さく自由体積が大きい程、測定中にCT蛍光はOff-stateを示し易いことなどが分かった。従って、Off-stateは、CT錯体が高分子の空隙内でより多くの電子受容体(A)と電子供与体(D)相対配置をとり、錯体の一時的な解離、または無蛍光性のCT錯体の相対配置を生成したことによると考えられることが分かった。今後、無極性ポリスチレンを用いて研究を進める。CT錯体ナノ結晶の蛍光挙動は3種に大別できること、またその挙動は大きなサイズの結晶のそれと異なることを報告した。Cz化合物とTCNBの濃度比を変えるなどして検討したが、その説明に苦慮していた。最近、励起光により結晶がダメージを受け、その受け方が結晶のサイズに依存するとして説明が可能であると思われ、その証明を他のCT錯体系に系を広げ、検討を進めている。昨年度、Cz系でのエキシプレックス蛍光の観測は、励起波長や検知器の観測可能波長範囲の問題から困難であると結論した。本年度、デュレンとジシアノアントラセン系のエキシプレックス蛍光の観測に成功した。これは、基底状態で相互作用の無い2つの分子を単一分子蛍光分光法で観測できた最初の例と思われる。個々のエキシプレックス蛍光の寿命は、CT錯体蛍光系と比べ分布の幅が広く、エキシプレックスのAとD問の相対的な構造は、CT錯体のそれに比べ、よりルーズであることが分かった。1.無蛍光性高分子マトリックス中の孤立単一電荷移動(Charge-transfer : CT)錯体に単一分子蛍光分光法を適用してきた。

本年度は、ホスト高分子として無極性のポリスチレン(PS)を用い、単量体Cz化合物とTCNB系孤立単一CT錯体の蛍光の強度・寿命の経時変化を測定し解析した。その結果を、PSに比べ少し極性を有する3種のメタクリレート系高分子系の結果と比較した。どの高分子中でも3種のパターンが観測されたが、ホスト高分子によりそのパターンの出現する割合が変化した。PS中での特徴は、CT蛍光のOff-stateの観測される割合がPMMA中に比べ大きく、また蛍光のサバイバルタイムが短いことが分かった。これらは、PSフィルムの自由体積がPMMAに比べ大きいことで説明でき、極性とは大きな相関は無いと考えられる。結局、Off-stateは、CT錯体が高分子の空隙内で電子受容体と電子供与体が多くの相対配置をとり、錯体の一時的な解離または無蛍光性のCT錯体の相対配置を生成したことによると考えられることが分かった。孤立単一CT錯体蛍光挙動に対するホスト高分子効果として論文が学術雑誌に掲載された。2.CT錯体ナノ結晶の蛍光は、励起光により結晶がダメージを受け、その受け方がバルク結晶に比べ著しく小さいことが分かった。二量体Cz化合物系でも同様であった。ダメージの受け方は、CTナノ結晶のサイズに依存しているようであり、またダメージを受けたCTナノ結晶を暗所に放置するとダメージが回復する現象を見出した。この回復現象は、既報のバルク状態では報告されておらず、興味深い現象であり、光によるダメージの起源を明らかにする為にも、今後の検討が必要と考えられる。3.昨年度、PMMA中でデュレンとジシアノアントラセン系のエキシプレックス蛍光の観測に成功した。本年度はPSをホスト高分子とした。蛍光寿命の解析は、5000光子の積算ごとに行っているが、PS中の場合、5000光子の積算の間にエキシプレックス蛍光とジシアノアントラセン蛍光が入れ替わり発光する現象を見出した。これは、PMMA中では観測されなかった。PSの自由体積がPMMAに比べ大きいとして説明できた。
単一細胞を用いた細胞時計統合機構の解明

地球の自転による周期的な環境変化に適応する機構の一つとして、大半の生物は概日時計を持っている。植物では個々の細胞が概日時計を有しており、細胞時計が統合されることで植物個体として環境に適応していると考えられている。維管束から葉肉細胞、茎頂から根など他の器官への時間情報の伝達が報告された。細胞間における時間情報伝達の存在が示唆されている一方で、時間情報伝達を含む細胞間相互作用が存在していない状況における細胞時計の性質が調べられていないため、細胞間相互作用の影響を正確に評価することが困難であった。本研究は単離した単一細胞を用いることで植物細胞間・組織間における時間情報伝達機構の解明を目指している。
卑金属ナノ粒子触媒の創成を基軸とする新規触媒反応の開発

芳香族ニトリル化合物は、医薬品や機能性材料を構成する重要な有機化合物であり、効率的な合成法の開発が求められている。従来の芳香族ニトリル化合物の合成法は、高い毒性を有する無機シアン化合物や、毒性を持つトリメチルシリルシアニドを用いる方法が一般的であった。一方、アセトニトリルは安価かつ豊富に存在するニトリル源であり、高毒性なニトリル源に代わる安全性の高い反応試薬として注目されている。しかし、芳香族ハロゲン化物を原料に、芳香族ニトリル化合物を合成するためにはアセトニトリルの強固な炭素ー炭素結合を切断する必要がある。この困難さからこれまで報告例では120°Cから160°Cの高温が必要であった。私は、当研究室で高い還元能力を見出した有機ケイ素化合物とニッケル錯体触媒を組み合わせた反応系において、80°Cというより温和な条件下でアセトニトリルをニトリル源とする芳香族臭化物のシアノ化反応を達成した。従来の反応系に比べ温和な条件で反応が進行する要因は、有機ケイ素化合物の添加によって従来とは異なる触媒活性種が生成している点にあり、アセトニトリルの炭素炭素結合の切断過程が促進されていることを明らかにした。本反応に適用することができる基質は20種類以上と多く、インドール、カルバゾール、ピリミジン、フランなどのヘテロ環芳香族を高い収率でニトリル化することが可能であった。また保護基を有するフェノールもしくはアニリン誘導体においても目的物であるニトリル化合物を得ることに成功した。また、反応条件に若干の変更を加えることにより、芳香族塩化物、芳香族トリフラートからも対応する芳香族ニトリル化合物が高収率で得られた。本研究成果は、速報論文としてChemical Science誌に受理され、本研究成果に関して報告した日本化学会第98春季年会において口頭講演賞を受賞し、二つの国際学会においてポスター賞を受賞した。新しい触媒反応として、コバルト触媒による高立体選択的エンイン合成法を開発した。エンインは、天然物や有機材料中の重要骨格や、有用な合成中間体として知られており、その効率的合成法が求められている。本申請者は、1,10ーフェナントロリン配位子を母骨格に有する非常に嵩高い配位子を用いて遷移金属錯体を立体的に覆うことにより、多か立体選択性が発現するだけでなく、研究内容である低原子価の遷移金属錯体が高い触媒活性を実現しており、本年度での取り組みによりその詳細を明らかにする計画をしている。二つのアルキンのクロスカップリング反応による触媒的エンイン合成反応について、適用可能な原料アルキンの徹底的かる系統的なスクリーニングを行う。また、添加剤を加えるなど、反応系を微調整することにより位置選択性や立体選択性を変更することが可能かについて検討する。本反応は従来系と比較して優れた反応性と位置選択性を発現するため、反応機構についてより詳細な知見を得ることを目的に中間体の単離、反応速度論、理論計算を行う計画をしている。アセトニトリルは安価かつ低毒性であり、青酸カリウム(KCN)やシアン化銅(CuCN)といった高毒性なニトリル源に代わる芳香族ハロゲン化物のニトリル化剤として注目されている。アセトニトリルを用いて芳香族ニトリル化合物を合成するためにはアセトニトリルの強固な炭素ー炭素結合を切断する必要がある。この困難さからこれまで報告例は3例に留まり、かつ120°Cから160°Cの高温が必要であった。私はより温和な条件での反応進行を目的に、強固な結合切断に有効であることが知られている低原子価ニッケル種に着目した。私は、当研究室で高い還元能力を見出した有機ケイ素化合物が高活性な低原子価ニッケル種を与える知見を既に得ていたため、ニッケル錯体触媒に有機ケイ素化合物を加え、芳香族ハロゲン化物のニトリル化反応を試みたところ、10%と低収率ではあるが、目的とする芳香族ニトリル化合物が得られることが明らかとなった。本反応においては、ニッケル触媒の構造と、添加する配位子の構造のどちらも極めて重要であり、種々スクリーニングの結果、触媒としてカチオン性テトラフルオロホウ酸ニッケル錯体、配位子として1,10-フェナントロリンを加えた触媒系が最も効率的に芳香族ハロゲン化物をニトリル化し、対応する芳香族ニトリル化合物を90%近い収率で得られることを見出した。本反応に適用することができる基質は20種類以上と多く、一置換や多置換アレーン類、インドール、カルバゾール、ピリミジン、フランなどのヘテロ環芳香族を高い収率でニトリル化することが可能であった。また保護基を有するフェノールもしくはアニリン誘導体においても中程度から高収率で目的物であるニトリル化合物を得ることに成功した。最も効率的にニトリル化される原料は芳香族臭化物であるが、芳香族塩化物、芳香族トリフラートでも中程度の収率で反応が進行した。当初計画していた、有機ケイ素化合物還元剤を作用させることで得られる低原子価卑金属化合物を触媒とする有機分子変換反応の開発に精力的に取り組んだ結果、有機ケイ素化合物還元剤が従来の金属還元剤とは質的に異なり、特に、ニッケル触媒と組み合わせることで複数の特異的反応性が発現することを見出した。具体的には、ニッケル錯体を触媒、有機ケイ素化合物を還元剤に用いることで、アセトニトリルの炭素ー炭素結合が切断され、芳香族ハロゲン化物のニトリル化反応が効率的に進行する触媒系を開発した。

本反応の目的物である芳香族ニトリル化合物は、当初、別反応の検討時に副生成物として得られたものであったが、徹底的に検討を行った結果、高収率で目的物である芳香族ニトリル化合物が得られる条件を見出すに至った。本反応は従来の金属還元剤(亜鉛やマンガン粉末など)および、他の有機還元剤(テトラキス(ジメチルアミノ)エチレンなど)存在下では進行せず、有機ケイ素還元剤を用いたときのみ特異的に進行するため、独自性の高い反応である。本反応における主たる発見は、現在までの有機金属化学の知見に基づいても、最も切断が困難といわれる炭素ー炭素結合が、80°Cという温和な条件で切断できる点である。結合切断が容易に進行する要因は、有機ケイ素化合物がアセトニトリルを活性化している点に由来する。即ち、有機ケイ素化合物とアセトニトリルは平衡反応においてより活性の高い化学種を系中発生させることが可能である。ニッケル錯体はこの一瞬発生した活性種と反応することにより、アセトニトリルの炭素ー炭素結合が切断される。上記したメカニズムは各種コントロール実験、触媒サイクルの中間体の単離と合成、その反応性の検討結果から導き出されたものであり、今後さらなる追加実験により実験的証拠を集めた暁には、本研究成果を論文として上梓する計画をしている。芳香族ニトリル化合物は、医薬品や機能性材料を構成する重要な有機化合物であり、効率的な合成法の開発が求められている。従来の芳香族ニトリル化合物の合成法は、高い毒性を有する無機シアン化合物や、毒性を持つトリメチルシリルシアニドを用いる方法が一般的であった。一方、アセトニトリルは安価かつ豊富に存在するニトリル源であり、高毒性なニトリル源に代わる安全性の高い反応試薬として注目されている。しかし、芳香族ハロゲン化物を原料に、芳香族ニトリル化合物を合成するためにはアセトニトリルの強固な炭素ー炭素結合を切断する必要がある。この困難さからこれまで報告例では120°Cから160°Cの高温が必要であった。私は、当研究室で高い還元能力を見出した有機ケイ素化合物とニッケル錯体触媒を組み合わせた反応系において、80°Cというより温和な条件下でアセトニトリルをニトリル源とする芳香族臭化物のシアノ化反応を達成した。従来の反応系に比べ温和な条件で反応が進行する要因は、有機ケイ素化合物の添加によって従来とは異なる触媒活性種が生成している点にあり、アセトニトリルの炭素炭素結合の切断過程が促進されていることを明らかにした。本反応に適用することができる基質は20種類以上と多く、インドール、カルバゾール、ピリミジン、フランなどのヘテロ環芳香族を高い収率でニトリル化することが可能であった。また保護基を有するフェノールもしくはアニリン誘導体においても目的物であるニトリル化合物を得ることに成功した。また、反応条件に若干の変更を加えることにより、芳香族塩化物、芳香族トリフラートからも対応する芳香族ニトリル化合物が高収率で得られた。本研究成果は、速報論文としてChemical Science誌に受理され、本研究成果に関して報告した日本化学会第98春季年会において口頭講演賞を受賞し、二つの国際学会においてポスター賞を受賞した。新しい触媒反応として、コバルト触媒による高立体選択的エンイン合成法を開発した。エンインは、天然物や有機材料中の重要骨格や、有用な合成中間体として知られており、その効率的合成法が求められている。
歯周病菌の歯周組織内への定着を制御する分子基盤の解明

歯肉を覆う上皮細胞が形成する上皮バリアは、宿主が歯周病菌と拮抗状態を維持するために重要な役割を果たしている。重篤な歯周病を併発する先天性症候群の責任遺伝子は歯肉上皮の免疫機能に重要な役割を果たしている可能性があるが、その機能は不明な点が多い。そこで平成30年度は、これら症候群の責任遺伝子をノックダウン・ノックアウトしたヒト歯肉上皮細胞株をshRNA安定発現とCrisper/Cas9システムを用い作製した。また、各細胞の細胞内小器官の局在に焦点を当て、共焦点顕微鏡を用い各遺伝子欠失の表現型を形態学的に解析した。その結果、Leukocyte adhesion deficiency-1の責任遺伝子であるITGB2のノックダウンにより、後期エンドソームのマーカーであるCD63の各近傍への集積を認めた。また、Cohen症候群の責任遺伝子であるVPS13Bのノックダウンにより細胞内分解の場であるリソソームのマーカーであるLAMP1の各近傍への集積を認めた。歯周病を随伴する症候群の責任遺伝子のうち上記2つが、歯肉上皮細胞の細胞内輸送に影響することが示唆された。予備実験において、P. gingivalisの感染を受けた歯肉上皮細胞ではポリアミン生合成経路に大きな変動が生じた。そこで、同菌のポリアミン代謝に関連する3つの酵素をそれぞれノックアウトした変異株(アルギニン分解酵素変異株、ポリアミン産生酵素変異株、ポリアミン不活性化酵素変異株)を用いて、P. gingivalisのこれらの酵素群が培養上清中の代謝物質プロファイルに及ぼす影響について検討したところ、アルギニン代謝経路上のメタボライト(アルギニン、シトルリン、オルニチン)とその下流に位置するポリアミン産生経路上のメタボライト(アグマチン、プトレッシン、アセチルプトレッシン、スペルミジン、アセチルスペルミジン)について、それぞれの酵素の不活性化により、野生株とは異なるプロファイルを示すことが確認された。短期目標は、歯周病を随伴する症候群の責任遺伝子の欠失による歯肉上皮細胞の表現型を形態学的に観察することである。その結果、本研究計画の初年度に、2つ症候群の責任遺伝子の欠失につき確認することができた。初年度の目標は、本研究課題の達成のために必要であり、困難度も適切であった。今回の目標管理を通じ、各症候群の責任遺伝子をノックダウン・ノックアウトする方法、各遺伝子を欠失させた細胞の維持・管理、および細胞内小器官を共焦点顕微鏡で形態学的に観察するための方法を飛躍的に改善できた。ついで、Porphyromonas gingivalisの感染が歯肉上皮細胞の代謝プロファイルにどのような影響を与えるのかを明らかにするための基礎的な知見として、同菌の野生株およびアルギニンーポリアミン代謝関連遺伝子変異株(アルギニン脱イミノ化酵素変異株、カルボキシノルスペルミジン脱炭酸酵素変異株、ジアミンNーアセチル化酵素変異株)が、環境(培養上清)中の代謝物質プロファイルに及ぼす影響についての異同を確認することができた。現在、それぞれの変異株の菌体内代謝プロファイルについても詳細な検討を実施しており、アルギニンのポリアミン代謝がPorphyromonas gingivalisのエネルギー代謝や糖新生におよぼす影響についても解析を進めている2019度は、歯周病を随伴する症候群のうち他の責任遺伝子を欠失させた歯肉上皮細胞を作成する。また、歯肉上皮細胞、線維芽細胞、および血管内皮細胞を用いた三次元歯肉上皮組織モデルを作成するため、培養に用いる細胞間基質の選定、培養条件の最適化、組織染色の条件検討、および共焦点顕微鏡での画像撮影条件の最適化等を行う。さらに、作成した歯肉上皮組織へ歯周病菌Porphyromonas gingivlaisを感染させ、組織内侵入の過程を三次元的に観察する。昨年度のエクソ-メタボローム解析により、感染後に環境(宿主細胞)中のアルギニンのポリアミン代謝プロファイルに異なる変動を来す能力を有することが示唆されたPorphyromonas gingivlaisのアルギニンのポリアミン代謝関連遺伝子変異株(アルギニン分解酵素変異株、ポリアミン産生酵素変異株、ポリアミン不活性化酵素変異株)と野生株を用いて感染実験を行い、ヒト歯肉上皮細胞にどのような変化を及ぼすかを検証し、細菌由来のポリアミンによる細胞傷害機構の全貌を示す。2019年度は、●Porphyromonas gingivlaisの細胞内局在の変化、●歯肉上皮細胞の細胞周期、細胞増殖、細胞死、栄養取込能、遊走能の変化、●オートファジー発現量の変化、について検討を加える。研究が順調に進捗した場合、2020度以降には、感染細胞における代謝プロファイルの変動と代謝関連酵素の遺伝子/タンパク発現状態を、アルギニンのポリアミン代謝経路近傍を中心として詳細に検討する。この際、ポリアミン産生経路のみならず、ポリアミンを不活性化/分解する経路や、トランスポーターの発現状態についても詳細に検討する。

その結果、Leukocyte adhesion deficiency-1の責任遺伝子であるITGB2のノックダウンにより、後期エンドソームのマーカーであるCD63の各近傍への集積を認めた。また、Cohen症候群の責任遺伝子であるVPS13Bのノックダウンにより細胞内分解の場であるリソソームのマーカーであるLAMP1の各近傍への集積を認めた。歯周病を随伴する症候群の責任遺伝子のうち上記2つが、歯肉上皮細胞の細胞内輸送に影響することが示唆された。予備実験において、P. gingivalisの感染を受けた歯肉上皮細胞ではポリアミン生合成経路に大きな変動が生じた。そこで、同菌のポリアミン代謝に関連する3つの酵素をそれぞれノックアウトした変異株(アルギニン分解酵素変異株、ポリアミン産生酵素変異株、ポリアミン不活性化酵素変異株)を用いて、P. gingivalisのこれらの酵素群が培養上清中の代謝物質プロファイルに及ぼす影響について検討したところ、アルギニン代謝経路上のメタボライト(アルギニン、シトルリン、オルニチン)とその下流に位置するポリアミン産生経路上のメタボライト(アグマチン、プトレッシン、アセチルプトレッシン、スペルミジン、アセチルスペルミジン)について、それぞれの酵素の不活性化により、野生株とは異なるプロファイルを示すことが確認された。短期目標は、歯周病を随伴する症候群の責任遺伝子の欠失による歯肉上皮細胞の表現型を形態学的に観察することである。その結果、本研究計画の初年度に、2つ症候群の責任遺伝子の欠失につき確認することができた。初年度の目標は、本研究課題の達成のために必要であり、困難度も適切であった。今回の目標管理を通じ、各症候群の責任遺伝子をノックダウン・ノックアウトする方法、各遺伝子を欠失させた細胞の維持・管理、および細胞内小器官を共焦点顕微鏡で形態学的に観察するための方法を飛躍的に改善できた。ついで、Porphyromonas gingivalisの感染が歯肉上皮細胞の代謝プロファイルにどのような影響を与えるのかを明らかにするための基礎的な知見として、同菌の野生株およびアルギニンーポリアミン代謝関連遺伝子変異株(アルギニン脱イミノ化酵素変異株、カルボキシノルスペルミジン脱炭酸酵素変異株、ジアミンNーアセチル化酵素変異株)が、環境(培養上清)中の代謝物質プロファイルに及ぼす影響についての異同を確認することができた。現在、それぞれの変異株の菌体内代謝プロファイルについても詳細な検討を実施しており、アルギニンのポリアミン代謝がPorphyromonas gingivalisのエネルギー代謝や糖新生におよぼす影響についても解析を進めている2019度は、歯周病を随伴する症候群のうち他の責任遺伝子を欠失させた歯肉上皮細胞を作成する。また、歯肉上皮細胞、線維芽細胞、および血管内皮細胞を用いた三次元歯肉上皮組織モデルを作成するため、培養に用いる細胞間基質の選定、培養条件の最適化、組織染色の条件検討、および共焦点顕微鏡での画像撮影条件の最適化等を行う。さらに、作成した歯肉上皮組織へ歯周病菌Porphyromonas gingivlaisを感染させ、組織内侵入の過程を三次元的に観察する。