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[NiFe]ヒドロゲナーゼにおける水素活性化機構の構造化学的研究

[NiFe]ヒドロゲナーゼ活性部位には`酸化炭素分子(CO)が配位し,水素の競争阻害剤になることが知られている.CO分子は酵素の本来の活性部位(水素結合部位)に結合すると予想される.またCO分子は可視光の照射によっても活性部位から遊離することが分光学的に確認されている.本研究では,還元型酵素の活性部位にCO分子を結合させたCO結合型およびこれを光照射により遊離させた光解離型の超高分解能X線結晶解析を行い水素の結合位置および初期反応機構を準動的X線結晶解析法にてトラップすることを目指し,これに成功した.3つのCO結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼ結晶(A, B, C)において様々な条件「光・結晶周りのガス雰囲気」で回折データを測定し(100K),CO分子の結合・遊離の構造変化を準動的超精密X線結晶解析法(1.1-1.2Å分解能)により解析した.その結果,阻害剤・CO分子はFe原子ではなく,Ni原子に結合することが分り.またその結合の様式は,ヘムタンパク質等で見いだされている「直線配位型」ではなく「曲がった配位型」であることが明らかになった.さらに水素結合型と遊離型の結晶回折データから計算した差の電子密度図(Fo-Foマップ)によるとCO分子の結合と遊離の過程でNi原子とひとつのシステイン(Cys546)S原子の電子密度分布が大きく変化していることが分った.Fe原子およびその2原子分子配位子の電子密度はほとんど変化していなかった.これらのことから分子状水素の解離にはNiとこのCys546のS原子が大きく関与していることを明らかにした.[NiFe]ヒドロゲナーゼ活性部位には`酸化炭素分子(CO)が配位し,水素の競争阻害剤になることが知られている.CO分子は酵素の本来の活性部位(水素結合部位)に結合すると予想される.またCO分子は可視光の照射によっても活性部位から遊離することが分光学的に確認されている.本研究では,還元型酵素の活性部位にCO分子を結合させたCO結合型およびこれを光照射により遊離させた光解離型の超高分解能X線結晶解析を行い水素の結合位置および初期反応機構を準動的X線結晶解析法にてトラップすることを目指し,これに成功した.3つのCO結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼ結晶(A, B, C)において様々な条件「光・結晶周りのガス雰囲気」で回折データを測定し(100K),CO分子の結合・遊離の構造変化を準動的超精密X線結晶解析法(1.1-1.2Å分解能)により解析した.その結果,阻害剤・CO分子はFe原子ではなく,Ni原子に結合することが分り.またその結合の様式は,ヘムタンパク質等で見いだされている「直線配位型」ではなく「曲がった配位型」であることが明らかになった.さらに水素結合型と遊離型の結晶回折データから計算した差の電子密度図(Fo-Foマップ)によるとCO分子の結合と遊離の過程でNi原子とひとつのシステイン(Cys546)S原子の電子密度分布が大きく変化していることが分った.Fe原子およびその2原子分子配位子の電子密度はほとんど変化していなかった.これらのことから分子状水素の解離にはNiとこのCys546のS原子が大きく関与していることを明らかにした.ヒドロゲナーゼの活性阻害剤・CO分子結合型の超高分解能X線結晶解析に成功した.結晶構造解析は1.4Aを越える超高分解能・超高精度解析となった.構造精密化は低分子化合物の解析用に開発されたプログラム・SHELXを用いて行った.結晶構造はR因子12%まで精密化された.外部から導入したCO分子はNi-Fe活性中心のFe原子ではなくNi原子に結合していた.これはDFT・理論化学計算から予想された結果とは異るものであった.生体高分子中のNi原子とCO分子の結合状態をX線結晶解析で示したのは本研究が最初である.また共鳴ラマン分光法によりNi原子とCO分子との結合による特徴的と思われるスペクトルの取得に成功した.共鳴ラマン法の結果はCO分子はNi原子に対して少し曲がった配位角度で配位していることを示していたが,結晶構造かっらもそれが確認された.Ni原子とCO分子の配位結合距離は1.7Aであった.CO結合型ヒドロゲナーゼの電子密度図を詳細に調べた結果,Ni原子に結合したCO分子とNi原子のもともとのアミノ酸配位子・システイン残基のイオウ原子との間に余分の電子密度を確認することができた.この余分の電子密度は反応途中の水素分子が阻害剤・CO分子の導入により偶然活性部位にトラップされたものである可能性が高い.また,このシステインのイオウ配位子は他のイオウ配位子と比べて極めて大きな温度因子を示しており、水素活性化のメカニズムで重要であることが明らかになった.今年度は,[NiFe]ヒドロゲナーゼの活性部位に結合するとCO分子の結合遊離の過程は可視光の照射によって制御し,それをX線結晶学的に確認することを目標とした.昨年度ひとつのCO結合型[NlFe]ヒドロゲナーゼの立体構造を解明し,CO分子とCys546の間に何かの原子種がトラップされていることを見出した.これにより,このCys546の重要性が示唆された.昨年度以降3つのCO結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼ結晶(A, B, C)において様々な条件

「光・結晶周りのガス雰囲気」で回折データを測定し(100K),CO分子の結合・遊離の構造変化を準動的超精密X線結晶解析法(1.1-1.2Å分解能)により解析した.その結果,阻害剤・CO分子はFe原子ではなく,Ni原子に結合することが分り,またその結合の様式は,ヘムタンパク質等で見いだされている「直線配位型」ではなく,「曲がった配位型」であることを3つの全ての結晶について確認した.さらに水素結合型と遊離型の結晶回折データから計算した差の電子密度図(Fo-Foマップ)によるとCO分子の結合と遊離の過程でNi原子とひとつのシステイン(Cys546)S原子の電子密度分布が大きく変化していることが分った.Fe原子およびその2原子分子配位子の電子密度はほとんど変化していなかった.これらのことから分子状水素の解離にはNiとこのCys546のS原子が大きく関与していることを明らかにした.
分子歪みが誘起する新たな結晶素構造と固体物性に関する研究

同じ分子から構成される固体であっても、分子配列の違いにより固体の光学的性質が大きく異なる事がある。近赤外吸収(GaAsAlレーザーの発振波長)を有するチタニルフタロシアニンやチオピロロピロールはこの典型的な例である。本研究では、分子がペアをなす新規な素構造("レンガ塀のレンガ"構造)が如何に形成されるかという問題と、この構造を取ると何故、近赤外域が出現するかと言う2点を検討課題とした。その結果、結晶の構成分子が対称中心を持つ場合でも、励起準位が縮退しているか否かにより分子歪みの効果が大きく異なる事がわかった。構成分子が対称中心をもち、しかも励起状態が2重に縮退しているチタニルフタロシアニンでは、溶液から固体に移行する際に分子の歪みが起こり、対称性が降下(C_<4V>→C_1)する。出現した双極子モーメントにより分子はペア構造をとり、"レンガ塀のレンガ"のように積層する事が判った。この時、2重に縮退していた励起準位は分子歪みにより大きく分裂し、短波長側と長波長側に2つのバンドを与える。長波長のバンドが近赤外吸収に相当する。分子の励起準位が縮退していない例はチオピロロピロールである。この場合も先と同様に、分子歪み(C_i→C_2)が双極子モーメントを誘起して、"レンガ塀のレンガ"構造が形成される。分子がこのような配列を取ると、遷移モーメント間の相互作用(励起子結合効果)が長波長シフトに有利に作用し、光学吸収が近赤外域まで延びる事が明らかになった。以上の結果から、分子の結晶化に伴う分子歪みは"レンガ塀のレンガ"構造の形成には不可欠であり、出現する双極子モーメントが素構造の駆動力と考えられる。また、近赤外吸収の機構には縮退準位の分裂によるものと励起子結合に基づく2つのメカニズムがある事がわかった。
キノボリトカゲのフェロモン受容機構に関する研究

本研究ではオキナワキノボリトカゲのフェロモン受容器と考えられる鋤鼻器の形態学的特徴や、鋤鼻器とその投射先である副嗅球における糖鎖発現、および嗅覚受容体に共役するGタンパク質の発現を明らかにした。さらに、フェロモン産生部位と推測される肛門腺にオス特有な細胞内顆粒が存在し、季節変化することを見出した。また、フェロモン産生の調節に関わると思われる精巣について、細胞骨格タンパクの局在を指標に機能評価を試みた。フェロモンは同種他個体に作用し、生理的変化や特定の行動を引き起こす物質であるが、その分子的実体やフェロモンの受容機構については良く分かっていない。本研究は、神経細胞の活性化によって発現が誘導されるc-Fosタンパクと、フェロモンを受容する鋤鼻受容体遺伝子の転写産物との二重染色により、キノボリトカゲの肛門腺に含まれるフェロモンの受容体を同定し、爬虫類フェロモンの実体と鋤鼻系を介した情報伝達機構の解明につなげることを目的としている。平成25年度はキノボリトカゲの生体を用いて、オスとメスを1匹ずつ、あるいはオス同士、メス同士の組み合わせでケージに入れる行動観察実験を行った。キノボリトカゲは実験に使用するまでの間、1個体ずつ分けて小ケージ(縦15センチメートル×横20センチメートル×高さ15センチメートル)に入れておいた。観察用ケージには縦20センチメートル×横35センチメートル×高さ30センチメートルの透明プラスチックケースを、実験が終了する度にエタノールを浸み込ませた脱脂綿で拭いて使用した。使い捨てポリエチレン手袋をはめてキノボリトカゲを観察用ケージに移し、体色の変化や行動を約10分間記録した。一連の行動観察実験が終了した個体は、麻酔の後、パラホルムアルデヒドを潅流して固定し、免疫組織化学ならびにin situハイブリダイゼーション用試料とした。また、一部の個体からはRNAとDNAを採取し、RT-PCRならびにPCR用試料とした。本研究では、神経細胞の活性化によって発現が誘導されるc-Fosタンパクと、フェロモンを受容する鋤鼻受容体遺伝子の転写産物との二重染色により、キノボリトカゲの肛門腺に含まれるフェロモンの受容体を同定し、爬虫類フェロモンの実体と鋤鼻系を介した情報伝達機構の解明につなげることを目的とする。平成24年度はまず、肛門腺フェロモンの分離・抽出を試みた。雄のキノボリトカゲから肛門腺を採取して抽出液を調製し、それをしみ込ませた綿でトカゲの鼻先に触れ、神経活性化の指標であるc-Fosタンパクの発現が鋤鼻器において誘導されるかを免疫組織化学によって調べた。実験にはトカゲの活動が活発な春から夏にかけて採取した肛門腺抽出液を使用し、トカゲの活動性が低下し、肛門腺に含まれるフェロモンの量も少ないと予想される秋から冬にかけて採取した肛門腺の抽出液を陰性対照とした。さらに、鋤鼻受容体遺伝子のクローニングを試みた。脊椎動物の鋤鼻受容体にはN末端の細胞外ドメインが短い1型(V1R)と長い2型(V2R)の2タイプがあり、それぞれ別の遺伝子ファミリーによってコードされている。V1R遺伝子については、キノボリトカゲのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うため、他の動物の遺伝子との間で比較的保存性の高い領域からプライマーを設計した。V2R遺伝子については、V1R遺伝子と異なりイントロンを持つため、キノボリトカゲ鋤鼻器のmRNAから出発してRT-PCRを行うためのプライマーを設計した。オキナワキノボリトカゲはアガマ科に属するトカゲの仲間で、主に琉球列島に生息しているが、鹿児島県指宿市と宮崎県日南市にも定着が確認されており、国内外来種として近年注目されている。オキナワキノボリトカゲの雄は縄張りをもつことが知られ、この社会性にはいわゆる「フェロモン」と呼ばれる様々な腺の分泌物が関与していると推測される。本研究ではオキナワキノボリトカゲ排泄腔腺の組織構造を調べて、その雌雄差や季節による変化の有無について検討した。実験には宮崎県日南市で捕獲された雌雄合計15個体(雄10個体、雌5個体)を用いた。ペントバルビタールの腹腔内注射によって安楽殺した後、排泄腔腺を含む組織を切り出し、常法に従ってパラフィン切片を作製した。雄は、7月から8月にかけて捕獲されたものを繁殖期の個体、10月から11月にかけて捕獲されたものを非繁殖期の個体とした。雌は繁殖期に捕獲された個体のみ実験に用いた。排泄腔腺は雌雄両方に存在したが、雄の排泄腔腺は雌のものに比べて大きな終末部を持っていた。雄の排泄腔腺をHE染色した切片で観察したところ、繁殖期には、非繁殖期のものに比べて背の高い腺細胞が認められた。

また、繁殖期と非繁殖期両方の個体で、排泄腔腺を構成する腺細胞には酸好性の細胞質顆粒が認められ、これらの顆粒はPAS染色やアルシアンプルー染色に陽性を示した。一方、雌ではこのような顆粒がほとんど観察されなかった。排泄腔腺の組織構造には雌雄左があることや、雄で季節による変化が見られたことから、排泄腔腺の機能は繁殖に関わっていることが示唆された。本分泌腺がオキナワキノボリトカゲの繁殖や社会性に与える影響については、さらに詳細な調査が必要である。農学オキナワキノボリトカゲにおけるフェロモン受容器と考えられる鋤鼻器を電子顕微鏡によって観察し、明らかになった細胞の微細形態学的特徴を、第156回日本獣医学会学術集会において発表した。さらに、季節繁殖動物であるオキナワキノボリトカゲにおける肛門腺フェロモンの産生にとって、特に重要と思われる精巣の機能を評価するため、指標となる細胞骨格タンパクの局在を免疫組織化学的手法によって明らかにし、第19回日本野生動物医学会において発表した。これらの研究成果については、学術雑誌へ投稿準備中である。本研究課題の研究計画がほぼ予定通りに実施されているだけでなく、本研究課題の目的であるフェロモン受容機構の解明にとって、特に重要と思われる基礎的なデータの取得にも成功した。すなわち、オキナワキノボリトカゲの鋤鼻器を電子顕微鏡で観察することによって、細胞の微細形態学的特徴が明らかになった。さらに、オキナワキノボリトカゲの鋤鼻器と嗅球をレクチン組織化学的および免疫組織化学的に解析し、それらの組織における糖鎖発現や、嗅覚受容体と共役するGタンパクの発現が明らかになった。これらの成果の一部については既に学会発表を行い、学術雑誌へ投稿準備中である。クローニングに成功し、鋤鼻器における発現が確認できた全ての鋤鼻受容体遺伝子についてin situハイブリダイゼーションとc-Fosタンパクの二重染色を行い、キノボリトカゲの肛門腺に含まれるフェロモンが、どの鋤鼻受容体を発現した細胞で受容されているかを絞り込む。肛門腺フェロモンの受容に関わる鋤鼻受容体遺伝子を発現した細胞ならば、フェロモンを含んだ肛門腺抽出液で刺激した時にのみ活性化してc-Fos陽性となり、フェロモンを含まない抽出液の時はc-Fos陰性のはずである。フェロモン特異的な鋤鼻受容体遺伝子が絞り込めたら、その遺伝子産物に対する抗体を作製し、免疫組織化学によって鋤鼻器における受容体発現細胞の分布や、その細胞が軸索を副嗅球のどこに投射しているかを調べる。該当なし
マイクロポストを用いた細胞の形態制御と力学伝達経路の解明

細胞の力学情報伝達は細胞の生理・病理に深く関わることからそのメカニズムを知ることは重要であるが,力学刺激が実際に細胞内でどのように伝達されているか,またそれによって機能がどのように修飾を受けるのかに関しては未知の部分が多い.本研究では,微細加工技術により細胞底面に発生する力を計測できる実験系を構築し,基質形状により細胞の形態を制御すること,さらに力学刺激が細胞骨格を伝達する経路を求めることを目的とする.微細加工技術を用いて細胞を培養するマトリックス上にPDMSによるマイクロピラーアレイ(高さ10μm,直径3μm,ピラー間ピッチ8μm)を形成し,マイクロピラーのたわみから細胞底面で発生する牽引力を計測するものである.本年度においては,前年度に引き続き細胞形態制御実験,マイクロピペットによる力学環境操作実験,細胞骨格の破壊実験を行い,データの蓄積を試みた.細胞形態制御実験では,ピラー間ピッチを6, 8, 10μmと変化させ,細胞はピラー間ピッチに依存して牽引力を変化させることを示した.マイクロピペットによる力学環境操作実験ではより精度良くマイクロピラーによる局所力学刺激負荷を行うため磁気駆動式マイクロピラーの製作にとりかかっているところである.細胞骨格の破壊実験では,アクチンフィラメント,微小管,中間径フィラメントそれぞれの破壊により牽引力が経時的に変化していく様子を詳細に追跡することができた.以上の実験を通して,マイクロピラー基質を用いた実験系により,細胞外力学環境と細胞内力学環境の定量的相関関係について重要な知見を得ることができた.細胞の力学情報伝達は細胞・組織の生理・病理に深く関わることからそのメカニズムを知ることは非常に重要であるが,力学刺激が実際に細胞内でどのように伝達されているか,またそれによって細胞の機能がどのように修飾を受けるのかに関しては未知の部分が多い.本研究では,マイクロマシニング技術により細胞底面に発生する力を直接計測できる実験系を構築し,これを用いて力学刺激が細胞骨格を伝達する経路およびその大きさを定量的に求めることを目的とする.具体的にはマイクロマシニング技術を用いて細胞を培養するマトリックスにマイクロポストを形成し,このマトリックス上で細胞の形態を制御しながら細胞を培養する技術を開発する.マイクロポストの寸法や形成する領域を工夫することで細胞の形態を制御することができる.本年度においては,マトリックスデバイスの作製,マトリックス上での細胞培養実験を主として行いその技術を確立した.試料として平滑筋細胞を用いた.まず,マイクロポストの作製として,フォトリソグラフィー技術によりシリコン基板にパターンを形成した.その後,PDMSを流し込み加温硬化させ,マイクロポストを有する細胞培養用マトリックスを作製した.ポストの高さは10μm,直径3μm,ポスト間ピッチは8μmであった.続いて,マイクロポスト上で細胞培養実験を行った.細胞をマイクロポスト上に播種すると,細胞の牽引力によるマイクロポストのたわみが観察された.マイクロポストのたわみから焦点接着斑に発生する力を画像処理により推定した.同時に行ったアクチンフィラメント構造の観察から,アクチンフィラメントの分布と牽引力の大きさ,方向には有意な相関があることが示唆された.次年度は,マイクロポストの直径やピッチ間距離,マイクロポストの作製面積などマトリックスデザインを工夫することで細胞の接着面,接着状態を制御し牽引力実験を行う予定である.細胞の力学情報伝達は細胞の生理・病理に深く関わることからそのメカニズムを知ることは重要であるが,力学刺激が実際に細胞内でどのように伝達されているか,またそれによって機能がどのように修飾を受けるのかに関しては未知の部分が多い.本研究では,微細加工技術により細胞底面に発生する力を計測できる実験系を構築し,基質形状により細胞の形態を制御すること,さらに力学刺激が細胞骨格を伝達する経路を求めることを目的とする.微細加工技術を用いて細胞を培養するマトリックス上にPDMSによるマイクロピラーアレイ(高さ10μm,直径3μm,ピラー間ピッチ8μm)を形成し,マイクロピラーのたわみから細胞底面で発生する牽引力を計測するものである.本年度においては,マイクロピラーを30μm×30μmの領域に制限して作成したところマイクロピラーの島上のみに細胞形態を制御することに成功した.また,先端径が23μm程度のガラスのマイクロピペットをマイクロマニピュレータで操作し,特定のマイクロピラーを強制的にたわませる実験を行った.その結果,たわませたマイクロピラーに接続しているストレスファイバの他端のマイクロピラーが連動してたわむ様子が観察された.すなわち,ストレスファイバを通して一つの焦点接着斑からもう一つの焦点接着斑に力学刺激が伝達されていることが明らかとなった.また,ノコダゾール処理により微小管を破壊したところ牽引力は有意に増大した.ストレスファイバ内のミオシン軽鎖がリン酸化されていたことから,微小管はIngberらの提案するtensegrityモデルにおける構造的役割のみでなく生化学的にもストレスファイバの収縮性に関与していることが示された.以上の通り,マイクロピラー基質を用いた実験系により,細胞内力学バランスに果たす骨格構造の役割に関して重要な知見を得ることができた.細胞の力学情報伝達は細胞の生理・病理に深く関わることからそのメカニズムを知ることは重要であるが,力学刺激が実際に細胞内でどのように伝達されているか,またそれによって機能がどのように修飾を受けるのかに関しては未知の部分が多い.

本研究では,微細加工技術により細胞底面に発生する力を計測できる実験系を構築し,基質形状により細胞の形態を制御すること,さらに力学刺激が細胞骨格を伝達する経路を求めることを目的とする.微細加工技術を用いて細胞を培養するマトリックス上にPDMSによるマイクロピラーアレイ(高さ10μm,直径3μm,ピラー間ピッチ8μm)を形成し,マイクロピラーのたわみから細胞底面で発生する牽引力を計測するものである.本年度においては,前年度に引き続き細胞形態制御実験,マイクロピペットによる力学環境操作実験,細胞骨格の破壊実験を行い,データの蓄積を試みた.細胞形態制御実験では,ピラー間ピッチを6, 8, 10μmと変化させ,細胞はピラー間ピッチに依存して牽引力を変化させることを示した.マイクロピペットによる力学環境操作実験ではより精度良くマイクロピラーによる局所力学刺激負荷を行うため磁気駆動式マイクロピラーの製作にとりかかっているところである.細胞骨格の破壊実験では,アクチンフィラメント,微小管,中間径フィラメントそれぞれの破壊により牽引力が経時的に変化していく様子を詳細に追跡することができた.以上の実験を通して,マイクロピラー基質を用いた実験系により,細胞外力学環境と細胞内力学環境の定量的相関関係について重要な知見を得ることができた.
中学年の小学校外国語活動へのポートフォリオの適応可能性とCLIL型活動の効果

2020年度から小学校中学年で外国語活活動の必修化が決定している。同活動において1教授ツール、評価ツールとしてのポートフォリオの適用が可能か、2CLIL型の英語学習プログラムの効果を確認することが本研究の目的であった。ポートフォリオの適用は、授業者の丁寧な支援があれば可能であること、カンファレンスを重視すれば自律的態度の養成や自分の学習の内省に教授ツールとして効果があること、自らのアルファベットの大文字・小文字や簡単な英単語を書いたものを収集することで、自分の成長を確認でき、評価ツールとして効果があることがわかった。また、CLIL型活動も児童の関心を十分に高めることができることがわかった。平成27年度は小学校中学年4年生の外国語活動において、ポートフォリオの適用可能性を検討した。平成27年10月から平成28年2月まで、30分モジュールで計10回の外国語活動を出張授業の形で実施した。授業の内容は、アルファベットに加えて英単語を書くこと、フォニックスルールを用いて英単語を読むことというものであった。全10回のうち、第8時から10時にかけて、ポートフォリオの重要な要素であるカンファレンスを実施し、全10回の出張授業を通して児童がこれから生かせそうなこと、やってみたいことをカンファレンスシートに記入し、グループごとに発表した。自分が発表しないときは、発表者の発表を聞いてコメントを付箋紙に書き、発表者に渡すようにした。事後アンケートけっかについて直接確率計算により検定した結果から、このカンファレンスにおいて、児童は自分の学習を振り返ることができ、友人のいいところを見つけることができ、発表を聞いて自分も頑張ろうと思ったという意見がそれ以外の意見より多いことが分かった。ここから、カンファレンスは小学校中学年4年生にとっても、事前の丁寧な説明があれば、英語の文字学習にとって適用が可能であることが示された。CLIL(内容言語統合型学習)については、ヨーロッパが発生の地であるので、平成27年度には9月にドイツのベルリン市とブランデンブルグ州の学校や文部省、教員研修所を訪問し、その実施状況を調査した。その結果、ベルリンのギムナジウムではbilingual educationという名前で一般的に実施されているが、小学校ではそれほど一般的ではないことがわかった。ただし、教員研修では扱われていることもわかった。CLILは準備に時間がかかるため、今年度は中学年の外国語活動で実施可能であると思われるいくつかのプログラムを作成し、実施の上検討を行った。小学校中学年へのポートフォリオの適用可能性を4年生で検討し、CLILのプログラムについても中学年対象のものを実施することにより適用が可能であるかどうかを検討できたため。2016年10月から2017年1月にかけて、教員養成大学附属小学校4年生47名を対象にフォニックスを活用した文字指導を中心とし、ポートフォリオ作成方法を復習の形で行うという工夫をする外国語活動プログラムを設計し、その効果を検討した。その結果、活動内容とポートフォリオ作成は参加者に好意的に捉えられていた。また、フォニックスに対する児童の気づきや理解を促す活動を行ったことから、単語テストのすべてにおいて事前テストより事後テストの平均が向上していた。また、活動の最後の時間に、CLILの活動として、種・球根・木の英語表現を知り、それを使ってコミュニケーション活動ができるという活動を行った。その後、実際にペーパークロマトグラフィーという色の分離実験を応用した活動に進み、ペンを花の種として、児童が思い思いの色を選び、ろ紙に種まきをし、水やりをして、花を咲かせるという内容であった。児童からは、肯定的な反応が得られた。平成27年度の研究結果を基に,筆者の勤務校である大学の附属小学校4年生を対象とし、ポートフォリオが適用できるのかどうかをさらに検討した。また、CLILのプログラムについても同4年生対象のものを考案、作成し、中学年においてもCLILのアプローチが可能であることを確認できたため。さらに、最終の平成29年度において予定していた、一般の小学校においてもCLILのアプローチが可能であることも一部確認できたため。2020年度から小学校高学年において英語が教科化され、中学年において外国語学童が必修化となる。また、現在中学年からの外国語活動の必修化に伴う、学外の塾頭での英語学習の有無による英語格差が指摘されている。高学年5年生児童の英語学習への動機づけの低下についても指摘されている。現在までの外国語活動の内容が児童の発達に合致していないことから、児童の知的好奇心を刺激する活動内容が必要であることも指摘されて久しい。以上の状況の下、中学年児童の英語力格差の縮小を念頭に、英語学習の動機づけの向上のための手立てとして、1文字指導、2ポートフォリオ作成、3CLIL型活動を組み合わせた学習プログラムを構築し、その効果を確認した。まず、文字指導であるが、以前から取り組んでいる、アルファベットや英単語、簡単な英文を書くことを積極的に取り入れ、フォニックスによりアルファベットの大文字・小文字、簡単な英単語を読み書きできる文字指導の学習プログラムをさらに改良し、実施した結果、児童から文字学習に対し肯定的な評価が得られた。次に、ポートフォリオ作成であるが、高学年児童に対してこの活動が効果的であることを確認済みであったが、中学年児童を対象とした場合も自立学習への態度養成に効果があり、教授ツールとしての効果が期待できることがわかった。さらに、自分が書いたものを収集し、振り返ることができることから評価ツールとしての効果も期待できることが明らかになった。ただし、高学年児童を対象とした場合より、授業者による、より丁寧な支援が必要であることと、カンファレンスの実施が特に効果を上げるうえで重要になることが明らかになった。

最後のCLIL(Content Language Integrated Learning:内容言語統合型学習)型の活動も作成し実施したが、児童から公的的な評価が得られた。2020年度から小学校中学年で外国語活活動の必修化が決定している。同活動において1教授ツール、評価ツールとしてのポートフォリオの適用が可能か、2CLIL型の英語学習プログラムの効果を確認することが本研究の目的であった。ポートフォリオの適用は、授業者の丁寧な支援があれば可能であること、カンファレンスを重視すれば自律的態度の養成や自分の学習の内省に教授ツールとして効果があること、自らのアルファベットの大文字・小文字や簡単な英単語を書いたものを収集することで、自分の成長を確認でき、評価ツールとして効果があることがわかった。また、CLIL型活動も児童の関心を十分に高めることができることがわかった。平成28年度は、今年度試行したポートフォリオの適用可能性をさらに検討する。可能であれば、4年生ばかりでなく、3年生を対象にして検討する。外国語活動内容としては、近い将来教科化が予定されている英語科で導入されると予想される、文字指導を扱う。また、CLILについては、ヨーロッパ一国(現在検討中)を訪問し、その先行事例を調査する予定である。昨年度の成果の一部は、平成28年度の関連諸学会で発表する予定である。平成29年度は、今年度まで試行してきた4年生対象のポートフォリオの適用可能性をさらに検討し、適用できるポートフォリオのモデルを作成する。CLILについては、チェコのプラハの公立小学校を訪問し、先行事例を調査する。昨年度の成果の一部は,平成29年度の関連諸学会において発表する予定である。教育工学、小学校英語当初、先行研究を多く収集する予定であったが、そのための時間を十分に取れず予算を消化しきれなかった。また、小学校外国語活動の出張授業に必要な物品が、在庫として使用可能なもの(文法具、画用紙、印刷用トナーなど)があったため、補充する必要がなかった。昨年度はCLILがヨーロッパ発生の地であるため、チェコ国プラハの公立小学校を訪問する予定であったが、ヨーロッパ各地でテロ事件が起こり、安全性が確認できなかったことから、プラハの訪問を見合わせた。今年度は、文献を十分に収集していく予定である。さらに、出張授業畏必要な物品についても今年度は新たに補充していく予定である。また、旅費についても、成果の一部を発表するため、研究協力者に提供していく予定である。プラハにあるカレル大学の大学教員に安全を確認し、公立小学校への訪問をアレンジしていただけたため、今年度は早い時期にプラハの公立小学校を訪問し、英語教育事情とCLILの導入がおっこなわれているかどうかを調査する予定である。
衛星と小型無人機を併用した泥炭地火災モニタリング技術の構築

最終年度である今年度は、主に成果の取りまとめを行った。土壌温度分布の把握については、回転翼のマルチコプターにサーモグラフィーカメラを搭載することで、数ヘクタール程度の範囲であれば高頻度にモニタリングが可能であることが示され、その成果は国際誌に掲載された。また、比較的広域にモニタリングを実施するためには、固定翼を利用することが有効であることが確認され、可視画像については数百ヘクタールの範囲を定期的にモニタリングする技術が確立できた。一方で、固定翼では飛行速度が速すぎるため、サーモグラフィーカメラを使うとオルソ画像を作成するための十分な画像オーバラップ率が取れないという課題も明らかになった。研究期間を通じて定期的に論文投稿や学会発表などを行えたため、研究成果の公表については一定の成果を上げることができた。平成28年度は、1)現地調査許可申請の手続き、2)火災モニタリング用SUAVの開発、3)ひまわり8号やALOS-2などの衛星画像を用いたホットスポット発見手法の検討を予定していた。それぞれの進行状況は、以下のとおりである。現地調査許可申請については、インドネシア側カウンターパートとの調整の結果、本年度は申請を見送った。理由は、今年度の活動が、カウンターパートとの打ち合わせやカウンターパートが同行しての予備調査であったので、必ずしも必要なかったためである。火災モニタリング用SUAVの開発については、航続距離の長い固定翼タイプのSUAVの開発に着手した。しかし、日本の電波法の問題で海外部品の一部が使用できず、電波関連部分の開発が遅れる原因となった。一方、当初は固定翼タイプのSUAVを観測に使用することは想定していなかったが、急速な技術発展によって固定翼と相性の良い熱赤外線カメラが出現したため、これら機材を組み合わせて国内での飛行試験を実施した。飛行試験の結果は良好で、現場投入できる段階まで到達することができた。衛星画像解析については、複数枚のALOS-2画像を入手し、解析手法の検討に着手した。今年度は、火災の発生頻度と面積が限られていたため、時系列的な分析を行なうことは難しかったが、一部の火災発生場所においては、衛星画像でも判読できることが確認された。その他、本研究の関連論文2本を執筆した。昨年度の火災頻度および範囲が限られていたため、衛星画像が入手できる場所も限られてしまったため、解析手法の検討が遅れている。他方、SUAVについては、回転翼タイプの機体にサーモグラフィーカメラを搭載することで、100m上空から8cmの発熱体を発見することができるシステムを作ることができ、順調に研究が進んでいる。また、成果公開についても、講演会での発表や論文執筆などを通じて積極的に行なっており、順調に進んでいる。平成29年度は、1)火災モニタリング用UAVの実運用、2)観測データの取得と解析、3)衛星画像を用いたホットスポット発見手法の検討を目的として研究を進めた。火災モニタリング用UAVの運用については、機体およびサーモグラフィーカメラの選定が終了し、現地で実際に運用できる体制が整った。機体は、広域的な調査を目的とした固定翼機と、定点観測が可能な回転翼機の両者を現地で準備することができた。また、定期的にモニタリングできる場所も確保することがてきた。これによって、現地での観測態勢が確立し、観測データが取得できるようになった。観測データの取得と解析については、サーモグラフィーカメラを搭載したUAVを森林が伐採された乾燥泥炭地上空で飛行させて、地上の熱環境マップを作成することに成功した。観測は、早朝・昼間・夜間を連続して複数日に渡って行ない、土壌温度の経時的変化の特徴を捉えることができた。得られた結果については、英文誌へ投稿する準備を進めている。加えて、熱画像と比較するための可視画像の効果的な取得方法についても検討し、その結果は国内学会誌で受領された。衛星画像を用いたホットスポット発見手法の検討については、昨年から引き続いて定期的なデータを収集し、時系列的変化を整理している。UAVにより観測態勢も構築されたことで、より具体的なデータ解析へと移行できると考えている。火災モニタリング用UAVの開発が完了し、現地での機体の運用とモニタリング体制が構築できたことで、具体的なデータの取得と解析が可能となった。そのため、本研究の目的達成に必要不可欠であった衛星画像解析用のグランドトゥルースデータの取得が容易に出来るようになった。得られたデータの解析も進み、論文の執筆もできた。研究が遅れている衛星画像解析に関する部分について、重点的に研究を行なう。この研究を進めるため、グランドトゥルースデータの取得を目的とした現地調査を行なう。

UAVについては、第三国輸出規制対象の部品が含まれているため、経産省へ届け出を行ないインドネシアへ持ち込む手続きを行なう。この手続きを今年の乾期までに終え、観測態勢を整える。本年度は、現地調査を頻繁に実施し、観測データを蓄積させていく。同時に、衛星画像の取得も継続し、本研究の目的を達成させる。本年度は、調査許可証を取得する必要が無かったため、そのために計上していた旅費および謝金が次年度へ持ち越しとなった。今年度は、2回を予定していた海外調査が1回になったことと、論文の英文校閲を来年度に回したために、次年度使用額が生じた。次年度は、海外調査を2回実施すると共に、論文投稿のための英文校閲にこの予算を使用する計画である。調査許可証の取得とグランドトゥルースデータ取得のための現地調査費用として、使用する。
集積化チップを用いた有機光反応の革新的手法の開拓

有機光反応に適した集積化マイクロフローセンサチップを設計・構築し、その特長を活かした光反応の革新的手法の開拓を目的に、今年度は、まず、マイクロフローリアクター装置を購入、シクロペンテンテンとのジアステレオ選択的[2+2]光付加環化反応を検討した。その結果、光路長が極めて短いことによる光の高い透過性の利点が十分に活かせ、365nmのLEDランプを用いた光照射では769mMの濃厚溶液でも72%転化率を達成した。また、1-ニトロナフタレンの存在下、15分の光照射時間では、バッチ型反応器では本反応は進行しないのに対し、マイクロリアクター装置では15分で50%の転化率を示し、添加物光反応系で最も高い選択性で光付加体が得られることを見出した。昨年度から継続して行っているエチレンとの気液ジアステレオ選択的[2+2]光反応では、バッチ型反応管では光反応が完結するのに15分要するのに対し、チューブを高圧水銀灯に巻きつけたキャピラリーフローリアクターでは1分間で完結した。さらに本システムの出口での反応結果を同時分析するために、マイクロ計測技術の専門家である連携研究員との共同で、CMOSセンサチップを用いて旋光度と吸光度のリアルタイム計測ユニットを構築した。エチレンガスの滞留によるセンサ誤差を最小限にするために、様々な検討を行い、市販の旋光度計と同等の値を示す小型化計測ユニットの製作に成功した。また、光反応の集積化の観点から、有機無機ハイブリッドのシルセスキオキサンの8角に、スペーサーを介してキラルメントール次いで基質のエノンを集積化し、エチレンとの不斉光反応を行った。これまでと同様に光反応がスムーズに進行し、高収率および良好な選択性で付加体を与えた。さらに、光マイクロリアクター装置を光脱保護反応に応用した結果、15分間の光照射により、定量的に反応が進行することも明らかにした。有機光反応に適した集積化マイクロフローセンサチップを設計・構築し、その特長を活かした光反応の革新的手法の開拓を目的に、今年度は、まず、すでに見出している高ジアステレオ選択的[2+2]光付加環化反応の不斉発現のメカニズムを明らかにするとともに、エナンチオ選択的[2+2]光反応も含めて他の新しい不斉有機光反応の創出をはかった。さらに光反応用マイクロリアクターを用いて、メントール補助基を有するシクロヘキセノンとオレフィンとのジアステレオ選択的[2+2]光反応を行い、反応効率だけでなく選択性も、通常の反応管を用いた光反応に比較して、向上することを見出した。マイクロチューブを光源に巻きつけたフローシステムでは、エチレンと基質とのプラグフローよるジアステレオ選択的[2+2]光反応を行い、反応時間が極めて短縮されることを明らかにした。このフロー系でのジアステレオ選択的[2+2]光反応で得られる光学活性生成物の旋光度をリアルタイムで測定するために、高精度で偏光分析が可能なオンチップCMOSイメージセンサを設計・試作した。さらにフロー系での測定可能なシステムを構築した。予備実験として、濃度の異なる光学活性化合物(スクロースやメントール)の光学純度を変えた溶液をフローさせて旋光度のリアルタイム計測を行った結果、濃度の違いに応じて旋光度が直線的に変化し、一定の光学純度では、旋光度も一定値を示すことを明らかにした。
コンピュータビジョンと拡張現実感を利用した少人数対面会議支援システム

本研究ではUbiquitous環境を考慮に入れ、コンピュータビジョンと拡張現実感を利用した少人数対面会議支援システムに関する研究を行った.・システム本体は,小型CCDカメラ,小型LCDプロジェクタ,PCを1ユニットとする情報入力/出力ユニットと会議テーブルから構成される.・ユーザの手指を実時間認識し,上記円形領域を回転させるジェスチャをすることで,投影されている電子ファイルも同期して回転する.・手指のジェスチャにより,電子ファイルの選択,移動,メニュー表示を可能とした.・円形領域に大量の電子ファイルを表示するために,数種類のレイアウト手法を実現した.・本システムを実回転テーブルに拡張し,実回転テーブルの回転操作に応じて電子ファイルの表示が変更されるシステムをも開発した.・ユーザ評価実験を行い,両手法の比較を行った.テーブルを囲んだ少人数の会議において効果的に電子ファイルを表示し,検索し,閲覧する,対面会議支援システムを開発した.本研究ではUbiquitous環境を考慮に入れ、コンピュータビジョンと拡張現実感を利用した少人数対面会議支援システムに関する研究を行った.・システム本体は,小型CCDカメラ,小型LCDプロジェクタ,PCを1ユニットとする情報入力/出力ユニットと会議テーブルから構成される.・ユーザの手指を実時間認識し,上記円形領域を回転させるジェスチャをすることで,投影されている電子ファイルも同期して回転する.・手指のジェスチャにより,電子ファイルの選択,移動,メニュー表示を可能とした.・円形領域に大量の電子ファイルを表示するために,数種類のレイアウト手法を実現した.・本システムを実回転テーブルに拡張し,実回転テーブルの回転操作に応じて電子ファイルの表示が変更されるシステムをも開発した.・ユーザ評価実験を行い,両手法の比較を行った.テーブルを囲んだ少人数の会議において効果的に電子ファイルを表示し,検索し,閲覧する,対面会議支援システムを開発した.本年度は基本ユニットの制作とソフトウェアの開発を行った.1.基本ユニットの制作IEEE1394接続のCCDカメラと小型LCDプロジェクタを一体化させたコンパクトなユニットを開発した.このユニットはIEEE1394とRGBケーブルでPCに接続される.2.手指自動認識手法のOpenCVへの移植平成11年度科研費補助金で開発した,赤外線カメラ映像をアナログで高速画像処理ボードに入力し処理する手指認識手法を,Intel OpenCVライブラリへの移植を行った.この結果,高価な赤外線カメラや特殊な画像処理ボードを使用しなくても,実時間処理が可能となった.3.投影領域の自動認識と歪み補正投影Hough変換を用いて机上の四角形領域を認識し,その位置姿勢を計算した後,この領域に出力画像を歪み補正して投影するシステムを開発した.4.手指認識の多人数対応2で移植した手指認識手法を多人数に対応させた.原理的には3名以上でも処理は可能であるが,実時間性を考慮した場合,現在のPCの処理性能では2人が実用的な処理速度である.本年度は平成16年度に開発した基本システム上において,会議支援を行うための機能を開発した.(1)共有領域の実装机中央に円形の共有領域を投影し,この領域内での大量のデータ視覚化手法の実装,および手指による直感的なインタフェースを開発した.視覚化手法としては,線形視覚化,分類型視覚化,らせん型視覚化を実装した.ユーザが共有領域を回転させるジェスチャを行うと,大量のデータが連続的に表示される.また両手ジェスチャを用いる事でメニュー操作を実現した.評価実験を行い,それぞれの視覚化手法の利点,欠点を調べるとともに,手指認識手法の最適化を行った.(2)ジェスチャによる紙書類電子化機能の実現テーブル上に置かれた紙書類を両手で囲むジェスチャをすることで,画像ファイル(JPEG形式)として保存する機能を実現した.(3)指先位置共有機能の実現会議参加者が同じ書類を見ている場合に,指先位置を共有する機能を実現した.具体的には,ユーザの指先位置の書類に対する相対位置を求め,これを各ユーザの書類上に投影した.本研究ではUbiquitous環境を考慮に入れ、コンピュータビジョンと拡張現実感を利用した少人数対面会議支援システムに関する研究を行った.平成18年度は前年度までに開発したシステム上でのアプリケーション開発,およびシステムの評価を行った.(1)アプリケーショシ開発机上に投影された共有領域を利用した画像ブラウザを開発した.サーバ内に格納された画像ファイルを共有領域上に視覚化する手法と,この共有領域をジェスチャを用いて仮想的に回転させるジェスチャを利用した対話的な画像ブラウザを開発した.画像ファイルはユーザの指定に応じて,作成時間順,画像特徴順などに配置された.また,指差しジェスチャ等で画像ファイルの拡大が可能とした.(2)実回転卓への拡張さらに本年度は回転角度を計測するセンサを搭載した実回転卓を設計,実装し,回転卓を実際に回転させることで,机上に投影されたファイル群をブラウズする機能を実装した.(3)システム評価上記仮想回転卓と実回転卓の画像ブラウザを用いて画像の検索実験を行い,その評価を行った.
表現論の観点からの量子群の研究

量子群はDrinfeldらにより1985年ごろ導入された新しい数学的対象で,その研究は今日多くの関心を集めている.本研究では量子群を代表群の非可換化として把握し,ホップ代数の手法を活用して表現論に関連する諸問題を研究した.最も基本的な線形代数群である一般及び特殊線形群の量子化GL_9(n)とSL_9(n)は量子群のプロトタイプをなす.これらの量子群の表現論は,Schur代数の量子化である9-Schur代数の表現論と等価になる.一方9-Schur代数の表現は,9が素数の巾の場合有限群GL(n,F_9)のユニポテント表現と結びつくことがDipper-Jamesにより示された.本研究では,このDipper-James対応の理論的根拠を解明し,より初等的かつ簡潔な手法によりこの対応を再構成し,他の型の量子群へも一般化する道を拓いた.一方でDrinfeld doubleといわれる非可換ホップ代数の構成が量子群において重要な役割を果すが,これの表現論を土井と共同研究し,様々の興味深い結果を得た.その他にSL_9(2)の超代数の表現論的研究,ホップ代数の手法による量子群の商空間の研究などを行なった.量子群はDrinfeldらにより1985年ごろ導入された新しい数学的対象で,その研究は今日多くの関心を集めている.本研究では量子群を代表群の非可換化として把握し,ホップ代数の手法を活用して表現論に関連する諸問題を研究した.最も基本的な線形代数群である一般及び特殊線形群の量子化GL_9(n)とSL_9(n)は量子群のプロトタイプをなす.これらの量子群の表現論は,Schur代数の量子化である9-Schur代数の表現論と等価になる.一方9-Schur代数の表現は,9が素数の巾の場合有限群GL(n,F_9)のユニポテント表現と結びつくことがDipper-Jamesにより示された.本研究では,このDipper-James対応の理論的根拠を解明し,より初等的かつ簡潔な手法によりこの対応を再構成し,他の型の量子群へも一般化する道を拓いた.一方でDrinfeld doubleといわれる非可換ホップ代数の構成が量子群において重要な役割を果すが,これの表現論を土井と共同研究し,様々の興味深い結果を得た.その他にSL_9(2)の超代数の表現論的研究,ホップ代数の手法による量子群の商空間の研究などを行なった.
骨再生開始の核として働く人工石灰化球の創製

本研究では骨形成の開始場所を模倣して非コラーゲン性タンパク質に親和性がある新規リン酸カルシウム結晶の作製とそのタンパク質吸着特性の検討,また骨欠損充填のための埋入可能な形態の成型を天然高分子ゲル作製により検討した.F含有リン酸カルシウムはF導入法に依存して異なる物理化学的性質を示し,F共存下で得たF含有リン酸カルシウムは比較的高い溶解性を示すとともにアルブミンなどモデルタンパク質に対して高い親和性を示した.天然高分子ゲルによる水和ゲル形成を検討し骨欠損への埋入可能性が確認できた.平成24年度は人工石灰化球に導入する細胞のin vitroにおける成長因子の効果を調べるとともに,アルギン酸ゲルに細胞および結晶の導入を行い,人工石灰化球の操作性,細胞のアクティビティーを調べた.また導入する結晶の作製を試み,Fを導入したHAの前駆体の溶解性を持ち,かつHAの構造を持つF含有リン酸カルシウム機能性粒子の開発に成功した.骨芽細胞様細胞(マウス骨髄由来間質細胞)に成長因子としてリポタンパク等を加え通法による培養後に骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を測定した.成長因子の添加では分化が抑制されなかったことから石灰化球への導入の候補物質であると考えられた.アルギン酸ゲルをCa溶液内へガス流入によりバルブ経由で吐出し,球状ゲルを作製した.種々のサイズの球状ゲルの作製が可能であった.また,リン酸カルシウム粒子のゲルへの導入も可能であり,リン酸カルシウム粒子が含有されてもゲルの形態が球状に近い状態に保たれた.一方,球状ゲルへ骨芽細胞様細胞およびリン酸カルシウム粒子を導入し,細胞の増殖を調べたところ,良好な生存性が保たれることがわかった.本研究から所期に設定した人工石化化球のプロトタイプが作製できることがあきらかとなった.今回の成果に基づいて,ゲルに含有させる細胞の種類,成長因子の種類,およびそれらの濃度,リン酸カルシウム粒子の混合条件を検討する次のステップの開発を立案する計画である.本研究では骨形成の開始場所を模倣して非コラーゲン性タンパク質に親和性がある新規リン酸カルシウム結晶の作製とそのタンパク質吸着特性の検討,また骨欠損充填のための埋入可能な形態の成型を天然高分子ゲル作製により検討した.F含有リン酸カルシウムはF導入法に依存して異なる物理化学的性質を示し,F共存下で得たF含有リン酸カルシウムは比較的高い溶解性を示すとともにアルブミンなどモデルタンパク質に対して高い親和性を示した.天然高分子ゲルによる水和ゲル形成を検討し骨欠損への埋入可能性が確認できた.平成23年度は人工石灰化球の材料学的な基盤の確立を目標とした.石灰化球のマトリクスとして球状アルギン酸の作製を検討した.アルギン酸ゲルのCa溶液内への吐出手段として吹き出しバルブを用意して,種々の操作条件で検討したところ,所望の球状ゲルの作製が可能であることがわかった.球状ゲルにはリン酸カルシウム粒子,細胞,成長因子を導入する計画である.そこで,概に確立している合成方法に基づき(Suzuki et al. Tohoku J Exp Med 164:37,1991),Caおよびリン酸を温度,pHを一定として,OCP,DCPDに関して過飽和となるように調節して析出させたリン酸カルシウムの乾燥沈殿物を一定のサイズに整粒してゲルと混合し,同様の球状ゲル作製を試みている.まだ粒子径を制御できていないが,アルギン酸ゲルとリン酸カルシウム粒子から成る球状ゲルは作製可能であることがわかった.また,球状だけでなく,リン酸カルシウム粒子を混合した状態にて種々の形態のゲルが得られることが確認できた.最終的な生体親和性の確認において最良のゲル形態を決めていく上で重要な所見が得られていると考えられた.一方,細胞をゲルに導入する前に,成長因子の候補と考えている骨芽細胞活性化因子と成り得るリポタンパク質が及ぼす骨芽細胞の応答性をin vitroで検討した.骨芽細胞様細胞であるマウス骨髄由来ST-2細胞の予備的検討によると,リポタンパク質の添加効果が明確ではなかった.培養条件や細胞の種類について条件を詰める予定である.基盤となる材料であるアルギン酸の球状ゲルの試作が可能となったことから,予備検討ながら結晶と細胞導入に向け,おおむね順調に進展していると判断した.アルギン酸は細胞の維持には有効であるが,細胞の活性向上には寄与しない材料であると認識されている.球状アルギン酸にMSCを導入して生化学的に評価し,活性向上の程度を見極め,場合によっては成長因子との組合せも検討する予定である.同時にin vitroにおける生体親和性も早めに見極め,開発コンセプトの有効性を早期に判断し開発方向性の修正に反映できるように務める.平成24年度は人工石灰化球のin vitroおよびin vivoの評価を行う.MSCを播種した人工石灰化球を3週まで分化培地にて培養後に,骨芽細胞の増殖および関連遺伝子のmRNA発現を検討し分化を検討する.検索遺伝子として骨芽細胞の初期分化マーカであるアルカリフォスファターゼ(ALP),後期マーカーのosteocalcin,転写因子であるosterixをRT-PCRにて解析する.ラット(12週齢)の頭蓋冠に自己修復しない9mm径の欠損を作製し,人工石灰化球を埋入し,対照群は欠損のみとする.試料埋入後,4および12週のラット各5匹を検索する.実験期間終了後に頭蓋冠を摘出し,X線学的・組織学的・組織形態学的検討を行う.

標本を10 % EDTAで脱灰した後,パラフィン包埋し前頭断方向で薄切の後,ヘマトキシリン・エオジン染色を行い,組織学的に骨形成について検索するとともに,欠損部内に占める残存移植体および新生骨の割合を,画像解析を用いて組織定量学的に分析する.平成23年度の検討でリポタンパク質の有効性がin vitroの骨芽細胞様細胞のセルラインでは十分に確認できなかった.このことから,細胞をラット骨髄由来のMSCにて検討を加える.本研究においては,OCP単独で認められた材料表面からの骨再生開始が促進されることを期待するものであるが,HAの前駆体の選択やリポタンパク質吸着の最適化を適時検討して所期の目的を達成する.平成24年度は材料作製,培養細胞回収用ラット,培養消耗品,細胞の遺伝子レベルでの解析試薬,プラスチック製品,人工石灰化球の埋入用ラット等の消耗品経費,成果発表旅費,外国語論文の校閲費,研究成果投稿料等に充当予定である.以上の研究を通じて,人工石灰化球について得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.