hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
黄色ブドウ球菌の血球崩壊毒素の膜孔形成と標的細胞認識機構の解明

黄色ブドウ球菌が人間を含む動物に重篤な疾患を引き起こす原因は、MRSAなどの多剤耐性菌の出現、並びに細胞崩壊毒素による宿主細胞の崩壊にある。黄色ブドウ球菌はシステイン残基を持たない2成分蛋白質から成る白血球崩壊毒素ロイコシジン(LukFとLukS蛋白質から成る)並びに赤血球崩壊毒素γヘモリジン(LukFとHlg2蛋白質から成る)を大量に産生する。先に研究代表者等は米国コロンビア大学・Eric Gouaux博士との共同研究でLukFの3次元構造を解析し、水可溶性モノマーとして分泌される毒素成分が標的細胞膜上で水不溶性分子へ構造変化を起こす機構を解明した。LukFの結晶3次元構造解析の成果は、膜孔の精密構造解析を可能にしたばかりでなく、毒素2成分のそれぞれへの立体構造を考慮した1システイン残基の導入変異株並びにシステイン残基へのドナー/アクセプター蛍光色素(TRM/IC5)標識誘導体の作製を可能にした。本研究では、モーター分子の運動メカニズムの解明に多大な貢献をした、世界に類をみない独創的技術である「1分子測定技術」を駆使して、標的細胞膜上で起こる時々刻々の構造変化を可視化追跡し、毒素2成分の標的細胞間及び毒素成分間のナノレベルでの相互作用、膜孔形成過程、並びに『超チャネル』形成機序の全貌を解明した。2成分から構成されるヘテロ7量体膜孔超分子の発見は世界初であると共に、本膜孔形成過程の追跡は2成分毒素であるからこそ可能であり、1成分から成る7量体膜孔毒素αヘモリジンでは決して解明できない、極めて独創的で世界に類を見ない研究成果を樹立した。本研究の成果は本毒素にとどまらず、広く生物由来の膜孔毒素の作用機構に新概念を植え付ける重要なものとなるばかりでなく、細胞膜上における水可溶性蛋白質分子のダイナミックな構造変化を伴う不溶性膜孔『超チャネル』形成機構の理解に大きな示唆を与え、"膜における蛋白質のナノ構造の変化を1分子で追跡する"新研究分野の創設となった。1)LukFとHlg2モノマーの三次元構造解析:LukSの結晶化を進めている。結晶条件を検討した結果、微小結晶を得ることができた。現在、より高い純度の精製標品の大量精製を進めている。2)複合体膜孔の結晶機構解析:LukFのN-末端にHisタグを付加した変異体を作製した。3)中間体の証明:システイン変異LukFを用いて膜孔中間体の電子顕微鏡下で直接観察に成功した。4)1分子技術を用いたLukFとLukS成分のナノ構造のダイナミクス:TM-ローダミン並びにCy5蛍光標識したLukF並びにHlg2を用い、赤血球膜との結合定数、膜上での拡散定数を算出した。また、蛍光色素間のエネルギー伝達の解析から、膜孔における各成分間の距離、及び膜孔を形成するタイミングの解析を行っている。5)新規膜結合型プロテインキナーゼの発見:S.intermediusの産生するロイコシジンのバリアントのS型成分のリン酸化を確認した。リン酸化部位はLukSとは位置が異なるが、推定される立体構造上の位置は血球膜表層接するステムの基部に当っていたことから、LukSと同様の新規プロテインキナーゼが関与していると考えられる。

6)ロイコシジンの血球膜におけるレセプターの同定:酵母の2・ハイブリッド系を用いてLukSと相互作用するタンパク質をコードするcDNAの単離を試みた。現在、レセプター候補が絞り込まれており、さらに解析を行っている。7)γヘモリジンの赤血球膜におけるレセプターの同定:ウェストウェスタンによりHlg2と反応するレセプター候補の絞り込みを行っている。現在、6),7),8)と共通の実験系として、ホスファチジルコリンからなるリポソームに、血球膜タンパク質を埋め込む系を確立中である。γヘモリジン膜孔の分子的実体の解明と膜孔中間体が発見された。(1)γヘモリジン膜孔の分子的実体の解明:膜孔の生化学的分析並びに電子顕微鏡による画像解析から、以下の4事実を明らかにした。すなわち,(i)毒素超チヤネルは2成分が交互に配置し、成分比は3:4または4:3であるへテロ7量体構造をとる。(ii)ヘテロ7量体毒素複合体は赤血球膜上でクラスター化し溶血を促進する。(iii)LukFのリム領域に存在するY72残基がヒト赤血球への初発の結合に重要なアミノ酸残基である。(2)膜孔中間体の発見:LukF, LukS及びHlg2には、システイン残基が存在しない。従って任意の残基のシステイン残基置換体を作出できる。20種類の変異体の内で、LukFのV12(Capドメイン)とT137(ステムドメイン)の両残基をシステイン残基に置換した変異体(Cys12,Cys137)は、Hlg2存在下でヘモリジン活性を持たなかった(実証1)。ところが、グルタチオンを反応系に入れると野性株と同等のヘモリジン活性を回復した(実証2)。実証1及び2は、変異株がCys12とCys137間でS-S結合をとり,プレステムがCapドメインからの切り離しが不可能になり、標的細胞膜に突き刺されないが、還元剤存在下で-S-S-が-SHに戻り、ステムがCapドメインからの切り離しが可能になったことを意味する。また、V45とT137は、最も近接した状態にあることを意味する。さらに、IC5標識LukFを用いて、「一分子測定技術」を駆使して、蛍光顕微鏡下でプレステムがCapドメインから切り離されるタイミングを可視化することに成功した。また、LukFの標的細胞膜フォスファチジールコリンへの結合が、ステムの形成に重要であることを明らかにした。
日本文化がTQCの誕生に及ぼした影響の研究

各種文献から得られた知識に加えて、生産現場での経験を持つ人々へのインタ-ビュ-の結果をも分析し、次の知見を得た。すなわち、TQCにおいて中心的な役割を担うQCサ-クル活動は、日本文化の一つの重要な特色をなす母性原理の多大に貢献のもとに成立した。その貢献の様相は、多面的であり、複雑であるが、おおむね次のようにまとめることができる。1.父性原理に従う欧米人はスペシャリストによるTQCを考案したが、母性原理に従う日本人は、社長から末端の従業員に至る全員の自主的参加によるTQCを生み出した。2.レヴィ=ストロ-スの言う「野生の思考」と母性原理の間には強い関係がある。そして日本人の平均的思考は著しく野生の思考に偏っている。また、その思考は初等教育の効果を高める。したがって母性原理が支配的地位を持つ日本には低学歴者が比較的高い能力を持つ社会が実現し、QCサ-クル活動の成功に好適な条件が現れた。3.父性原理に従う欧米人は、労働を人間の尊厳に対立するものと見做し、人間存在と労働の間に侵し難い一線を引く。これに対して母性原理に従う日本人は、人間存在と労働が渾然一体となった状態を実現し、柔軟な思考を必要とするQCサ-クル活動を成功に導いた。4.母性原理に基づく日本人の意識の構造(河合隼雄『無意識の構造』中公新書参照)は、個人によって提供される情報のコストを、欧米人の場合に比べて著しく低いものにする。これは、QCサ-クル活動の成功の一つの重要な条件であった。
GVHDマウスを用いたシェーグレン症候群の病態の解析

Graft-Versus-Host Disease(以下GVHD)を誘発させたマウスにおいて、これまで唾液腺の分泌低下と同組織へのリンパ球の浸潤の報告がなされており、臨床的にシェーグレン症候群との類似性が指摘されている。この動物モデルにおける角結膜の臨床所見と涙腺を含めた病理学的所見の確認を行ない、眼科領域においてもシェーグレン症候群のモデルとして妥当かどうか検討した。DBA/2Crj(H-2^<d/d>)マウスの脾臓細胞を溶血洗浄後、ホストである(C57BL/6NCrj×DBA/2Crj)F1(BDF1)(H-2^<b/d>)マウスに1x10^8個/移入した。GVHDの発症は尿蛋白の陽性化で判定した。経時的に涙液分泌能の測定を行なうとともに角結膜障害の観察を行なった。細胞移入5週後に50%、10週後で80%のBDF1マウスでGVHDの発症を確認した。涙液分泌能を臨床におけるシルマー試験と同様に行なったところ、7週目よりコントロールと比較して有意に低下しており、角膜の上皮障害も認められるようになった。組織学的には腎臓の糸球体基底膜の肥厚、尿細管周囲のリンパ球浸潤をみとめた。涙腺では導管周囲のリンパ球の浸潤を認めた。本モデルの発症機序として、糸球体基底膜および尿細管上皮に対する自己抗体の関与が報告されており、シェーグレン症候群に臨床的にも組織学的にも近い病態と考えられた。平成13年度はシェーグレン症候群の動物モデルとしてGraft-Versus-Host Disease(以下GVHD)を誘発させたマウスの臨床所見と病理学的所見の確認を行なった。DBA/2Crj (H-2^<d/d>)マウスの脾臓細胞を溶血洗浄後、ホストである(C57BL/6NCrj×DBA/2Crj)F1(BDF1)(H-2^<b/d>)マウスに1x10^8個/移入した。今後本モデルを用いて、浸潤リンパ球の表面マーカーを用いた同定、導管基底膜等における接着因子等の検討を行なう予定である。また、ステロイド、サイクロスポリン等による治療実験も準備中である。
高次元長期記憶時系列に対する統計的分析法とその応用に関する研究

本研究は長期の時間的な相関を有する高次元・多変量長期記憶時系列に対するセミパラメトリックな統計的分析法の提案を主目的としている。前年度までに,まず,定常長期記憶過程に従う高次元時系列を描写できるよう因子モデルを拡張し,第1段階として主成分分析から共通因子を推定,第2段階では各系列独自の記憶パラメータを局所Whittle法で推定,とする2段階セミパラメトリック法を考案した。通常では困難な高次元ケースも数値シミュレーションの結果から十分に扱えることが示され,因子推定量の理論的な性質の考察から2段階局所Whittle推定量が単変量の場合と同等の漸近分布を有することを見出した。次に,非定常長期記憶過程を含む多変量時系列を対象として,効率的Taperを用いた新たな多変量局所Whittle法を構築し,記憶パラメータ推定量の漸近的性質の導出,数値シミュレーションによる推定精度の確認,為替レートデータ分析への応用を行った。本年度では,これまでのモデル化で浮上した制約的な側面を取り除くために共通因子に定常長期記憶性を導入した一般化を行うことで,より広範な高次元時系列を取り扱える2段階セミパラメトリック法という新たな展開がもたらされた。とくに,共通因子の長期記憶性が時間方向の相関について支配的となることを踏まえ,第2段階において複数存在しうる共通因子の推定量からそれらに含まれる記憶パラメータを多変量局所Whittle法で推定するアプローチを構築するに至った。数値シミュレーションにより長期記憶性を有する共通因子の主成分分析による推定や共通因子と各系列独自の記憶パラメータの局所Whittle推定が上手く機能することが分かり,さらに,仮定を大きく緩めた影響を考慮しつつ前年度までに積み重ねられた成果を進展させることで,一般化した2段階セミパラメトリック法による各推定量の理論的な性質を導出した。本研究は高次元な長期記憶時系列データを対象として取り上げ,長期記憶パラメータのセミパラメトリックな統計的推測法の提案とその経済データ分析への応用を目的としている.本年度は長期記憶性を有するデータに対する分析手法を高次元・多変量時系列へと拡張する上で基盤となる研究を主に行った。まず,定常な長期記憶過程に従う高次元時系列を表現しうる因子モデルの拡張・モデル化に取り組み,加えて,既存研究における仮定を検討することで,理論的な性質の導出が見込めることを見出した。それによって,記憶パラメータのセミパラメトリック推定法と組み合わせることで,高次元長期記憶時系列の統計的分析におけるセミパラメトリックなアプローチへの進展が期待できる。次に,効率的Taperを用いたピリオドグラムを多変量局所Whittle法に組み込むことを検討し,新たな多変量非定常長期記憶時系列に対する効率的なセミパラメトリック推定法を考案した。記憶パラメータ推定量の一致性や漸近正規性の導出にはまだ取り組んでいる状況ではあるが,数値シミュレーションを行うことによって,既存のTaperを用いた推定法よりもパフォーマンスが良好であることを確認している。また,研究成果の一つとして,本研究の基礎部分を成している,すでに構築している周期性を有する単変量長期記憶時系列における記憶パラメータのセミパラメトリック推定量に関して,理論的成果や数値シミュレーション含め発展させたものを研究論文として発表した。今年度に計画をしていた,本研究の根幹となる分析法の数値シミュレーションや理論的性質の整備が想定していたほどは進展しておらず,ある程度の目処が付けられなかったためであるが,当初の予定にはなかった多変量非定常長期記憶時系列に対するセミパラメトリック推定法の考案といった研究課題に関わる重要な内容へも展開しており,それ程消極的な理由による遅れではないと思われる。本年度は,主に昨年度から引き続き取り組んでいる研究内容を進展させることに注力した。まず,高次元長期記憶時系列に対しては,定常過程の下で因子によるモデル化の拡張を第一段階として,その理論的性質の導出を吟味しつつ,第二段階において既存の単変量セミパラメトリック推定法を組み合わせて用いる際に必要となる仮定との整合性や漸近的性質への影響の検討を行った。さらに,構築された2段階セミパラメトリック推定法を実装し,その推定パフォーマンスを検証すべく,数値シミュレーションに取り掛かった。次に,多変量長期記憶時系列に関して,これまでに考案している,ピリオドグラムに効率的Taperを取り入れることで定常過程のみならず非定常過程をも含むように一般化した,記憶パラメータの多変量局所Whittle法について,推定量の漸近的性質の確立に向けておおよその目処を付けることができた。加えて,定常・非定常長期記憶時系列が混在するケースや定数項・トレンド項が含まれるケースといった多様なデータ生成過程を想定した数値シミュレーションを実施することで,パラメータ推定に際して安定したパフォーマンスを発揮することを確認した。主要各国の月次為替レートデータの対数値を多変量時系列と見なしたデータ分析へと応用し,各系列の記憶パラメータを多変量の枠組みでセミパラメトリック推定することにも取り組んだ。一部を除くこれらの成果をとりまとめ,学会において研究発表を行った。当初の計画通りには進展していないためであるが,高次元時系列に対するセミパラメトリック推定法に関しては一定の進捗を見せており,予想外の展開として,密接に関連する多変量長期記憶時系列に対する局所Whittle法を非定常過程をも含む形へと一般化する方法の成果も得られている。前年度から継続して二つの内容を推し進めることに本年度は取り組んだ。

高次元長期記憶時系列の各要素が因子表現で構築されるモデルにおいて,とくに第二段階における記憶パラメータのセミパラメトリック推定に関して,数値シミュレーションによる比較から局所Whittle法を採用すると良好であることが示され,さらに,2段階局所Whittle推定量の挙動を調べるための詳細な数値シミュレーションも行い,推定パフォーマンスが時間方向のサイズに依存するものの,通常では扱えないかなり高次元なケースでも問題なく機能することを確認できた。一方で,得られる推定量の理論的な性質を模索していく中で,因子表現モデルに基づく2段階推定法はやや制約的な仮定を必要とすることになり,描写できるデータ生成過程が限定的となりうる点を見出した。また,非定常長期記憶時系列を念頭に置いた,効率的Taperを取り入れたピリオドグラムによる多変量局所Whittle法に関して,過剰差分モデルを精緻化することで,幅広い非定常過程に加えて差分次数に応じた多項式トレンドが各要素に潜在的に存在しても不変となることが分かり,さらに,記憶パラメータ推定量の一致性や漸近正規性といった性質のみならず,Taper次数をバンド幅に依存して増加させることで大幅に効率性を改善できることも示せた。前年度までの数値シミュレーションや主要為替レートへと応用した分析を再度吟味し改良した結果と併せて研究論文として取りまとめた。予定にはなかった,本研究と非常に強く関わる効率的Taperを用いた多変量局所Whittle法の提案とその成果の取りまとめを行うことで計画に変更が生じたためである。高次元長期記憶時系列に対する2段階セミパラメトリック推定法についても着実な進展はあるものの,当初の予定からは遅れている。本研究は長期の時間的な相関を有する高次元・多変量長期記憶時系列に対するセミパラメトリックな統計的分析法の提案を主目的としている。前年度までに,まず,定常長期記憶過程に従う高次元時系列を描写できるよう因子モデルを拡張し,第1段階として主成分分析から共通因子を推定,第2段階では各系列独自の記憶パラメータを局所Whittle法で推定,とする2段階セミパラメトリック法を考案した。通常では困難な高次元ケースも数値シミュレーションの結果から十分に扱えることが示され,因子推定量の理論的な性質の考察から2段階局所Whittle推定量が単変量の場合と同等の漸近分布を有することを見出した。次に,非定常長期記憶過程を含む多変量時系列を対象として,効率的Taperを用いた新たな多変量局所Whittle法を構築し,記憶パラメータ推定量の漸近的性質の導出,数値シミュレーションによる推定精度の確認,為替レートデータ分析への応用を行った。本年度では,これまでのモデル化で浮上した制約的な側面を取り除くために共通因子に定常長期記憶性を導入した一般化を行うことで,より広範な高次元時系列を取り扱える2段階セミパラメトリック法という新たな展開がもたらされた。とくに,共通因子の長期記憶性が時間方向の相関について支配的となることを踏まえ,第2段階において複数存在しうる共通因子の推定量からそれらに含まれる記憶パラメータを多変量局所Whittle法で推定するアプローチを構築するに至った。数値シミュレーションにより長期記憶性を有する共通因子の主成分分析による推定や共通因子と各系列独自の記憶パラメータの局所
糖尿病性腎症モデルの作製と治療法の開発

糖尿病性腎症は慢性腎不全に陥る原困の中で最も重要な病変である。その原因を解明し、発病を抑制することは医学上および社会上の急務である。糖尿病の合併症は高血糖状態で生じる非酵素的糖化終末産物(AGE)と密接に関連しており、腎症発症に重要な役割を果たしている。本研究代表者は腎症のモデルとして糸球体硬化症をきたすアポリポ蛋白EのKnockoutマウスを見いだし、その病変を解析した。又、糖尿病腎症の原因として、メサンギウム細胞がAGEに特異的な受容体を有し、AGEに反応し細胞外基質産生亢進を示すことを明らかにした。この病変解析では細胞外基質の中で最も中心の物質であるIV型コラーゲンの増加の原因を明らかにすることが重要であり、その産生調節および合成・分泌の機序をメサンギウム細胞において検討した。AGE刺激によりIV型コラーゲンのプロモーターに結合するタンパクの質的・量的な変化を認め、そのDNA結合タンバタのひとつであるA1-p145が著減していた。その蛋白はDNA複製因子Cなど多機能を有していることが明白となり、それはnegative因子として働く転写因子であることも証明した。まず糸球体硬化症モデルにおけるA1-p145の役割を明らかにした。AGEの反応は受容体を介しており、この受容体に対するハンマーヘッド型リボザイムを用いて受容体の発現抑制系を確立し、IV型コラーゲン産生に必須である事を明らかにした。さらに糸球体病変においてIV型コラーゲンの合成・分泌に必須であるシャペロン蛋白(Heat Shock Protein47)の役割を解明した。そのアンチセンスをin vivoで導入し、病変抑制効果を明らかにした。本研究は糖尿病性腎症に最も重要である糸球体硬化症のモデル作製を樹立し、発症および進展における機序を解明し、治療法開発に新たな展開をもたらす事が期待できるものである。又AGEとその受容体、IV型コラーゲンの制御およびシャペロン蛋白の意義を明らかにし、腎障害のモデル、治療にとって鍵になると考えられる。糖尿病性腎症は慢性腎不全に陥る原因の中で重要な病変である。その原因を解明し、発病を仰止する事は医学上および社会上の急務である。本代表者は腎症の病変の中心部位であるメサンギウム細胞がAGEに特異的な受容体を有し、AGEに反応して細胞外基質の産生を亢進している事を見いだした。本研究においてはラットAGE受容体のクローニングに成功し、メタロサイオニン-Iのプロモーターを有する発現ベクターを作製した。現在、本ベクターの細胞における導入実験を施行中である。その強発現した細胞の形質変化を検討する予定である。発現に関してはcDNAとゲノムDNAではPCR法でサイズの違いがあり、鑑別は容易である。さらにRT-PCR法による高感度の検出法を用いてメサンギウム細胞のみならず糸球体上皮細胞や内皮細胞においてもAGE受容体が存在する事が明かとなった。その意義についての検討も行っている。本研究の特色は糖尿病性腎症発症に最も重要であると考えられているAGEとその受容体という、生理学的及び病理学的に存在する物質の反応であり、現在よく用いられている種々の糸球体硬化症モデルのように実際には存在しない物質や手技を用いるのとは異なる。

従ってヒトの糖尿病性腎症発症のモデルとして最適のものになり得ると考えられ、研究を進めている。糖尿病性腎症は慢性腎不全に陥る原因の中で重要な病変である。その原因を解明し、発病を抑止する事は医学上および社会上の急務である。糖尿病の合併症は高血糖状態で生じる非酵素的糖化終末産物(AGE)と密接に関連しており、腎症発症に重要な役割を果たしている。本代表者は腎症の病変の中心部位であるメサンギウム細胞がAGEに特異的な受容体を有し、AGEに反応して細胞外基質の産生を亢進している事を見いだした。我々は細胞外基質の中で最も重要なIV型コラーゲンのプロモーターに結合する転写因子を検討し、この転写因子のひとつであるMSWの発現がAGE刺激により著明に減少する事を見いだした。MSWはDNA複製因子Cと相同性がありPCNAとともに働きDNA複製にとって重要な因子であり、糸球体硬化症における役割を解析した。ラットAGE受容体のクローニングに成功し、メタロサイオニン-Iのプロモーターを有する発現ベクターを作製した。細胞における導入実験ではその受容体蛋白発現増強を認めた。この遺伝子を用いたin vivoにおける強発現系とantisenseを用いた抑制系により病変解析を行っている。本研究の特色は糖尿病性腎症発症に最も重要であると考えられているAGEとその受容体という、生理学的及び病理学的に存在する物質の反応であり、現在よく用いられている種々の糸球体硬化症モデルのように実際には存在しない物質や手技を用いるのとは異なる。従ってヒトの糖尿病性腎症発症の解析には最適のものになり得ると考えられ、研究を進めている。糖尿病性腎症は慢性腎不全に陥る原因の中で最も重要な病変である。その原因を解明し、発病を抑止することは医学上および社会上の急務である。本研究代表者は腎症の病変の中心部位であるメサンギウム細胞がAGEに特異的な受容体を有し、AGEに反応し細胞外基質産生亢進を示すことを明らかにした。この病変では細胞外基質の中でIV型コラーゲンの増加の原因を明らかにすることが重要である。その産生調節および合成・分泌の機序をメサンギウム細胞において検討した。AGE刺激によりIV型コラーゲンのプロモーターに結合する蛋白の質的・量的な変化を認めた。そのDNA結合蛋白のひとつであるA1-p145が著減しており、その蛋白はDNA複製因子Cなど多機能を有していることが明白となった。この蛋白はnegative因子として働く転写因子であることも証明した。これらのAGEの反応は受容体を介しており、この受容体に対するハンマーヘッド型リボザイムを用いて受容体の発現抑制系を確立した。さらに糸球体病変においてIV型コラーゲンの合成・分泌に必須であるシャペロン蛋白(HSP47)の役割を解明した。そのアンチセンスをin vivoで導入すると病変抑制を認めた。本研究は糖尿病性腎症に最も大切なAGEとその受容体、およびIV型コラーゲンの制御を明らかにするものであり、腎障害のモデル、治療にとって鍵になると考えられる。
甲状腺ホルモン検査値に影響する非特異反応を検出するための基準設定に関する研究

【目的】免疫学的測定法では、異好抗体により非特異反応をおこし偽高値を示すことがある。甲状腺ホルモンの場合、甲状腺ホルモン高値でもフィードバックがかからず、甲状腺刺激ホルモン(TSH)の分泌を認める。この事を利用しTSH値に対する遊離サイロキシン(FT4)値、または、遊離トリヨードサイロニン(FT3)値より、非特異反応の有無を検出するPEG沈殿法を行う基準の決定と出現頻度を推定することを目的とする。【方法】2009年7月から2010年6月までの1年間で甲状腺ホルモン測定の依頼のあった18歳以上の患者検体を抽出し、TSH値0.1以上の明らかに分泌を認める5428検体(2551名)よりFT3、FT4値の上限を超える検体を抽出し、PEG沈殿法を施行し非特異反応の有無を確認する。【成果】FT4値が、基準範囲上限を超える1.8以上、かつ、FT3正常な検体は、212検体(119名)と多く存在した。しかし、約7割の患者が、測定に用いている抗T4抗体と反応するT4製剤であるチラージンSを服用しており、薬剤によりFT4が高値を示したと考えられ、PEG沈殿法を施行する必要がないことが判明した。よって、基準としてFT4値を用いることは困難であると思われた。FT3値が基準範囲上限の4.0を超えた57検体(32名)を用いてPEG沈殿法を施行したところ、7検体(2名)に、非特異反応を認めた。頻度は、TSHが分泌されている検体の0.13%であった。TSH分泌を認める患者の0.08%と少なかったが、非特異反応を示す検体が、存在することが明らかになった。非特異反応により偽高値を示す症例が存在することを認識する必要がある。また、PEG沈殿法を施行するのは、TSH 0.1以上、FT3 4.0を超えた検体を全て行う必要はなく、1患者1検を行えば十分であり、1年間32検体とPEG沈殿法を行うことが可能な検体数であった。
先天性に骨・軟骨形成異常を示すラットの病因，病態解析

コレステロール代謝系遺伝子異常が原因であるX連鎖優性Conradi-Hunermann型点状軟骨異形成症(CDPX2)と極めて類似している全身症状(自然発症型短顔,脊椎湾曲,白内障,脱毛,皮膚の過角化)を示すラットの原因遺伝子,遺伝形式,病態を発生学的に解析し,骨軟骨形成異常とコレステロール合成代謝系との関係を明らかにする。
急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響に関する研究

1.一般健常成人に対する急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響に関する研究高所に赴く一般健常成人男女11人に対し急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングを週当たり2回、9週にわたり実施し,トレーニングの前後及び帰国後の血中脂質を検討した。HDLは、トレーニング後に有意に増加した。LDLは帰国後に有意な低下を示した。これらの結果より、低圧シミュレーターを用いた急性低圧低酸素環境下での持久的トレーニングは、HDLの増大をもたらし、脂質代謝の改善に顕著な効果をもたらすことが認められた。2.低圧低酸素環境への亜急性暴露(4時間滞在)が脂質代謝に及ぼす影響に関する研究:一般男子学生6人を性低圧低酸素環環境(1000m、2000m及び3000m相当高度)へ4時間滞在させた時の血中脂質に及ぼす影響について検討した。中性脂肪は滞在中に漸減した。遊離脂肪酸は、高所滞在中に漸増し、低圧環境滞在時のエネルギー基質として遊離脂肪酸の動員が促進されたものと考えられ低圧環境での運動時の脂質代謝亢進の可能性が示唆された。3.チョモランマ峰登山隊員に対する急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響に関する研究チョモランマ峰登山隊員9人に対して、急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングを行い、脂質代謝に及ぼす影響を検討した。3500mから6500m相当高度までの7高度条件で8週間にわたりトレーニングを行った。トレーニング後に,総コレステロールとLDLが減少し、常圧下の同様なトレーニングよりも、より少ないトレーニング回数および時間で脂質代謝を改善する可能性のあることが示唆された。4.急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響に関する研究-特に、トレーニング高度の差異に着目して-急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響を検討した。被検者を0m群、1000m群および2000m相当高度トレーニング群に5人ずつの3群に分け、計10回トレーニングを行った。HDLは各高度とも有意な変化を示さなかったが、2000m相当高度トレーニング群におけるLDLは、トレーニング後に著明に減少した。同様にVLDLも有意に低下し、同高度における脂質代謝改善の可能性が示唆される結果であった。平成6年度には、急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングが脂質代謝に及ぼす影響を検討するために、5、000m級の高所を目指す一般健康成人を対象にした持久的トレーニングを急性低圧低酸素環境下において実施した。これは、本申請人が先に行った急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングで観察した顕著なHDLコレステロールの増加の追試を目的とした実験であった。被検者は、九州大学可可西里(中国)学術探検隊員11名(男子10名、女子1名:2065歳)であった。トレーニングは、低圧シミュレーター内を用いた急性低圧低酸素環境下における自転車エルゴメーター運動であった。暴露高度は、3、000mから5、500mまでの各相当高度であり、暴露頻度は週1回であり、計9回のトレーニングを行った。

一回当たりの運動時間は3060分であり、また、トレーニング強度は常圧下で測定した最大酸素摂取量の50%相当強度の心拍数になるよう負荷が設定された。トレーニング前、後及び帰国後に血液生化学分析のための採血を行い、一般血球(RBC,WBC,Ht)及び脂質代謝関連(HDL,LDLコレステロール,TG,TC)の各測定を行った。このトレーニングの結果、本申請人が先に観察したと同様なHDLコレステロールの有意な増加(45mg/dl v.s. 50mg/dl)やTGの有意な減少が認められ、急性低圧低酸素環境内での持久的運動が脂質代謝に特異的な効果をもたらすことが認められた。これらの結果は、常圧下で行った持久的トレーニングで観察された脂質代謝における改善効果と比較し、急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングでは、特に、そのトレーニング回数において、有意に少ないトレーニング回数でも顕著な改善効果をもたらすことを示唆する結果であった。次年度においては、脂質代謝関連の測定をより詳細に行い、この特異的効果のメカニズムに迫りたい。平成6年度においては、急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニングにより脂質代謝の改善が観察され、特に、HDLコレストロールの有意な増加を報告した。本研究の最終年度である平成7年度は、トレーニング高度の違いが脂質代謝に及ぼす影響に焦点を絞り、以下の実験を行った。被検者は一般健康成人男子15人とし、5人ずつ以下の3高度条件に分けてトレーニングを行わせ、トレーニング高度の違いが脂質代謝の及ぼす影響を検討した。すなわち、(1)常圧下(0m)トレーニング群(A群:5人)、(2)2、000m相当高度トレーニング群(B群:5人)及び(3)3、000m相当高度トレーニング群(C群:5人)であった。トレーニング強度は、常圧下で測定した最大酸素摂取量の50%相当強度、運動は自転車エルゴメーター運動で一回当たり30分、トレーニング頻度は週2回、また、期間は5週間とし、総トレーニング回数は10回であった。血液生化学的分析項目は、一般血球値、および脂質代謝関連項目として、HDLコレステロール、HDLの各分画、アポ蛋白A-1、アポA-11、LDL、VLDL、総コレステロール、TG、遊離脂肪酸、リポ蛋白リパーゼ等の測定を行った。採血は、トレーニング開始前及びトレーニング終了後(10回目)の安静時に計2回行った。これらの結果は、現在、試料分析及び検討中であるが、本研究結果を詳細に検討することにより、急性低圧低酸素環境下における持久的トレーニング後に観察される顕著な脂質代謝の改善は、常圧下で観察される脂質代謝改善のメカニズムと急性低圧低酸素環境(ハイポキシア)がもたらす相乗効果であるとの本申請人の仮説を検証したい。
全胸腺ストロマ細胞の分子理解にもとづくT細胞分化機構の解明

胸腺は、免疫系の司令塔であるT細胞が成熟する「場」となる臓器であり、ユニークな三次元ネットワーク構造をなす微小環境をもつ。本研究では、胸腺微小環境を構成する様々なストロマ細胞を網羅的に同定し、その機能を理解することをめざす。特に、胸腺に存在する固有の線維芽細胞がT細胞の抗原認識と自己免疫の防止に重要な役割を果たすという仮説を検証する。本研究の成果は、T細胞を中心とする免疫系の基本原理の理解を通して、自己免疫の抑止や抗腫瘍免疫の向上に必要な基盤情報を提供し、医学の発展に大きく寄与する。
持続的注視によるパターン認知の機能の低下と回復過程に関する研究

本研究では、持続的注視により、パターン認知にどのような機能低下がどのような要因によりもたらされるか、また回復を促進する要因は何かについて、心理物理実験による精密な分析を行った。1.持続的注視によるテクスチャーの消失と再現過程の分析については、種々のテクスチャーパターンを様々な偏心度で提示し、消失までの時間を測定した。偏心度の増加に比例して消失時間は短くなった。消失した領域には、外領域と同じ要素が補充されるが、これには、領域の境界を処理する系(BCS)と領域内の特徴を処理する系(FCS)を仮定するGrossbergの理論が適用できる見通しがえられた。2.漢字パターンのゲシュタルト崩壊と回復を規定する要因の分析では、持続的注視後には、同一漢字のみならず、同一構造をもつ漢字にも認知時間の遅延がみられ、その効果は、注視後、15秒以上持続した。漢字の大きさや傾きなどを変化させ、同様な実験を行い、漢字の脳内表現について考察した。この研究成果の一部は「心理学研究」誌に掲載され、「基礎心理学会」誌にも現在投稿中である。3.顔パターンの持続的注視が表現認知にあたえる影響の分析については、例えば、笑い顔を持続的注視した後、中性顔や悲しみ顔を見た場合のように、順応パターンやテストパターンの表情を様々に変化させ、表現の認知時間を測定した。特に、快・不快次元に関連のある表現を持続的注視した後で、認知時間に遅延がみられた。これらの結果より、表情認知を司る系には、主に快・不快次元に関わる表情処理系と、主に覚醒・鎮静次元に関わる表情処理系があり、もっぱら前者の処理系においてだけ、持続的注視による順応効果があらわれると測定することができた。この知見はATRで開催された国際研究会で発表され、「心理学研究」誌にも投稿中である。1.テクスチャーの消失と再現過程の分析については、種々のテクスチャーパターンを様々な偏心度で提示し消失までの時間を測定した。偏心度の増加に比例して消失時間は短くなったが、ランダムドットのテクスチャーより、線分テクストンからなるテクスチャーのほうが偏心度の影響を受けにくかった。持続的注視により消失した領域には、外領域と同じ要素が補充されるように知覚されるが、これには、領域の境界を処理する系(BCSと領域内の特徴を処理する系(FCS)を仮定するGrossbergの理論が適用できる見通しがえられた。2.漢字パターンのゲシュタルト崩壊と回復を規定する要因の分析では、ある漢字パターンを持続的注視(約25秒程度)させた後、それと同一構造をもつ漢字パターン、同一部分をもつもの、異構造・異部分をもつものを認知するまでの反応時間を測定し、短時間注視の場合との比較を行った。持続的注視後には、同一漢字のみならず、同一構造をもつ漢字にも認知時間の遅延がみられ、その効果は、注視後、15秒以内持続した。漢字の大きさや傾き、字体などを変化させ、同様な実験を行えば、漢字が脳内でどのように表現されているかについて、重要な示唆がもたらされるものと期待できる。この研究成果の一部は「心理学研究」誌に掲載予定である。3.顔パターンの持続的注視が表現認知にあたえる影響の分析については、例えば、笑い顔を持続的注視した後、中性顔や悲しみ顔を見た場合のように、順応パターンやテストパターンの表情を様々に変化させ、表情の認知時間を測定した。特に、快・不快次元に関連のある表情を持続的注視した後で、認知時間に遅延がみられた。

表情認知を司る系には、主に快・不快次元に関わる表情処理系と、主に覚醒・鎮静次元に関わる表情処理系があり、もっぱら前者の処理系においてだけ、持続的注視による順応効果があらわれると想定することができた。本研究では、持続的注視により、パターン認知にどのような機能低下がどのような要因によりもたらされるか、また回復を促進する要因は何かについて、心理物理実験による精密な分析を行った。1.持続的注視によるテクスチャーの消失と再現過程の分析については、種々のテクスチャーパターンを様々な偏心度で提示し、消失までの時間を測定した。偏心度の増加に比例して消失時間は短くなった。消失した領域には、外領域と同じ要素が補充されるが、これには、領域の境界を処理する系(BCS)と領域内の特徴を処理する系(FCS)を仮定するGrossbergの理論が適用できる見通しがえられた。2.漢字パターンのゲシュタルト崩壊と回復を規定する要因の分析では、持続的注視後には、同一漢字のみならず、同一構造をもつ漢字にも認知時間の遅延がみられ、その効果は、注視後、15秒異常持続した。漢字の大きさや傾きなどを変化させ、同様な実験を行い、漢字の脳内表現について考察した。この研究成果の一部は「心理学研究」誌に掲載され、「基礎心理学会」誌にも現在投稿中である。3.顔パターンの持続的注視が表情認知にあたえる影響の分析については、例えば、笑い顔を持続的注視した後、中性顔や悲しみ顔を見た場合のように、順応パターンやテストパターンの表情を様々に変化させ、表情の認知時間を測定した。特に、快・不快次元に関連のある表情を持続的注視した後で、認知時間に遅延がみられた。これらの結果より、表情認知を司る系には、主に快・不快次元に関わる表情処理系と、主に覚醒・鎮静次元に関わる表情処理系があり、もっぱら前者の処理系においてだけ、持続的注視による順応効果があらわれると想定することができた。この知見はATRで開催された国際研究会で発表され、「心理学研究」誌にも投稿中である。
上皮性ナトリウムチャンネルの分子構造-機能相関の研究

平成9年度は、腎髄質内層(IMCD)におけるラット上皮性ナトリウムチャネル(rENaC)のナトリウム輸送機構としての可能性を探るため、低ナトリウム食の影響をノザンブロット法にて検討した結果、IMCDにおいてαサブユニットのmRNA発現はコントロール食に比べ有意に(2.2倍)増加した。一方、β、γ各サブユニットのmRNA発現量には変化を認めなかった。同様なモデルで、各サブユニットのmRNA発現調節を臓器(肺、大腸、腎臓)ごとに検討したところ臓器間で各サブユニットのmRNA発現に差が認められた(S.Ono et al,Pflugers Arch-Eur J Physiol 434:756-763,1997)ため、各臓器から採取したRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、機能を^<22>Na uptakeで測定し、臓器間でのメッセージ-機能の相関を検討したが、有意差は得られなかった。平成10年度は、メッセージ-機能相関の解析を引き続き検討中である。同時に各サブユニットのミュテーションを作り、そのcDNAから作成したcRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、特異的な抗体を用いチャンネルタンパクが膜にソーティングされる機構を検討するため、2つを同時進行させた。(1)rENaCの各サブユニットのミュテーションの作成。(2)各サブユニットの抗体作成。各サブユニットのペプチド(アミノ酸で15-20個)を合成し、ウサギに免疫し、採取した血清をアフィニティカラムを用いて抗体精製した。各抗体の特性に関しては現在検討中であるが、少なくとも、β,γサブユニットの抗体に関してはimmunohistochemistoryで特定の遠位尿細管が染色されており、その特性をさらに検討中である。抗体のcharacterizationの後、引き続き、プロジェクトを遂行予定である。平成9年度の研究では、腎髄質内層におけるラット上皮性ナトリウムチャネル(rENaC)のナトリウム輸送機構としての可能性を探るため、腎髄質内層にrENaCのmRNAが発現しているかどうか、また、その発現調節を低ナトリウム食で飼育し血中のアルドステロン濃度が上昇したモデルを用いて検討した。RT-PCR法を用いて腎髄質内層にrENaCのα、β、γ各サブユニットのmRNAを検出した。そこで、さらにα、β、γ各サブユニットの全長cDNAをプローブとしてα、β、γ各サブユニットのmRNA発現に対する低ナトリウム食の影響をノザンブロット法にて検討した。腎髄質内層においてαサブユニットのmRNA発現はコントロール食に比べ低ナトリウム食により有意に(2.2倍)増加した。これらの結果から、rENaCは腎髄質内層に存在しナトリウム輸送に重要な役割を演じていることが示唆された。さらに、同様な低ナトリウム食モデルを用いて、α、β、γサブユニットのmRNA発現調節を各臓器(肺、大腸、腎臓)ごとに検討し、特に腎臓においては組織を皮質、髄質外層、髄質内層に分割し検討をおこなった。各臓器間で各α、β、γサブユニットのmRNA発現に差が認められた(S.Ono et al,Pflugers Arch-Eur J Physiol 434:756-763,1997)ため、各臓器から採取したtotal RNAもしくはpoly(A)^+RNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入しチャンネルタンパクを発現させ、チャンネルの機能を^<22>Na uptakeで測定し、臓器間でのメッセージ-機能の相関を検討したが、データのばらつきが多く有意差のある結果は得られなかった。平成10年度の研究では、前年度の臓器間でのメッセージ-機能相関の解析をアフリカツメガエルの卵母細胞系を用いて引き続き検討中である。

同時に、α,β,γサブユニットのミュテーションを作り、そのcDNAから作成したcRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、特異的な抗体を用いチャンネルタンパクが膜にソーティングされる機構を各α,β,γサブユニットのミューテーションごとに検討するため、2つの作業を同時進行させた。(1)ナトリウムチャネルのα,β,γサブユニットのミュテーション(C末端-proline-rich region、N末端の各々の変異)の作成。(2)チャネルタンパクの抗体作成。各々α,β,γサブユニットのペプチド(αはN-末端近く、βはC-末端近く、γはC-末端近く)を合成し、各々ウサギ2羽にアジュバンドとともに注射免疫し、ポリクローナルな抗体を作成、採取した血清を免疫した合成ペプチドを付着させたアフィニティカラムを用いて精製した。各抗体の特異性に関しては現在検討中であるが、少なくとも、β,γサブユニットの抗体に関してはimmunohistochemistoryで特定の遠位尿細管が染色されており、その特性をさらに検討中である。抗体のcharacterizationの後、引き続き、プロジェクトを遂行予定である。
In vitroで歯根膜細胞を根面に増殖させた歯牙の自家移植に関する研究

重度歯周疾患に罹患した歯に歯周組織を再生させる新しい治療法の開発の第1段階として、抜去歯に残存する歯根膜を露出歯根面上へin vitroで培養して、後に再植する方法の開発を目指した。抜去した後に、部分的にルートプレーニングした歯根面への残存歯根膜細胞の遊走増殖を経時的に観察し検討した。実験には成ネコ7頭を用い、それぞれの犬歯を抜去して歯根側1/2の歯根膜を保存し、歯冠側1/2を露出根面とした。培養期間は、0、2、4、6週間とし、歯根膜由来細胞の観察と遊走増殖距離を計測した。細胞の遊走増殖距離は、2週では0.8mm、4週では4.6mmであった。露出歯根面と歯根膜保存根面付近で細胞密度が高く、歯冠側に向かって細胞密度が低くなる傾向があった。6週では5.2mmで、露出歯根面をほぼ全面被覆し、高い細胞密度の部分の拡大が観察された。歯根膜の残存部分では表層部分の細胞がしだいに増加し歯根膜の歯根面側の細胞は減少する傾向を示した。アルカリフォスファターゼ活性は、6週で残存歯根膜全面と歯根膜保存面と除去面の界面から2mm程度の部分までの増殖歯根膜部分に陽性反応が認められた。増殖核抗原陽性細胞は、残存歯根膜の表層と、露出した歯根表面に増殖した細胞の表層全面に認められた。これらの結果から、歯根膜が一部残存している歯根の歯根膜組織をin vitroで培養しすることによって、ルートプレーニングした歯根面上に残存歯根膜を遊走増殖させることが可能であり、これらの細胞で露出した歯根面を被覆することが可能であることが確認された。さらにこれらの培養細胞は歯根膜細胞の特性を維持しており、培養後に再植を行うことで効果的な歯周治療を行うことができる可能であると考えられた。
イオンチャネルの分子内構造変化と分子間相互作用の光学的新手法による解析の試み

分子内構造の変化を光学的に解析するためには、目的とする場所に特異的に蛍光ラベルを導入することが鍵となる。そこで、本研究においては、その第一歩として、この点についての検討を進めた。蛍光ラベルの導入法として、分子生物学的にGFP蛋白との融合蛋白を作る方法と、Cys残基に反応する化学合成された蛍光ラベルを用いる方法がある。クローン化された内向き整流性K+チャネルIRK1を対象として、まず、前者を試したところ、ポア領域等の厳密な構造が機能に要求される領域においては、GFPの「かさばり」が、機能の重篤な障害となることが明らかとなったので、この方法はポア領域の構造変化の研究には用いないことにした。後者の、点変異により導入したCys残基を利用した方法によりラベルを試みたところ、IRK1チャネルのCys149といったポアの外側入り口に、チャネル機能を障害することなく導入することができた。この際、発現系に内因的に存在する他の膜蛋白へのラベルの導入がバックグラウンドとして起きたが、IRK1チャネルをpCXN2高発現ベクターに組み入れHEK293T細胞に導入することにより、チャネルの発現密度を飛躍的に高めたところ、他の蛋白によるバックグラウンドと識別することができた。今後、チャネルの状態変化に伴う導入した蛍光強度の変化について定量的な解析を進め、さらに、2種の蛍光色素をラベルしてエネルギー転移の評価による構造変化の解析を行う。
天然物をリ-ド化合物としたDNAインタ-カレ-タ-の合成、および生物化学的研究

種々のミカン科植物の成分を検索し、新しい化合物の構造研究を行うと共に、これらをリ-ド化合物として、DNAインタ-カレ-タ-を合成、その生物化学的性質を明らかにすることを目的とした。1.次のミカン科植物の成分検索を行った:(1)Glycosmis属植物1種。(2)Murraya属植物3種。(3)Citrus属植物14種。2.次のように分類される新規化合物60種を単離、構造決定した:(1)アクリドンアルカロイド。(2)二量体アクリドンアルカロイド。(3)ホモアクリドンアルカロイド。(4)アクリドン・クマリン二量体。(5)カルバゾ-ルアルカロイド。(6)カルバゾ-ルキノン。(7)二量体カルバゾ-ル。(8)インド-ルアルカロイド。(9)クマリン。(10)二量体クマリン。(11)フラボノイド。(12)その他。3.DNAにインタ-カレ-トする化合物として、1,3ージメトキシ-9ー置換アミノアクリジン誘導体5種を合成。4.カルバゾ-ルアルカロイド「ムコナ-ル」をリ-ド化合物として、5ーメトキシー7ーメチルー7Hーピリド[4,3-c]カルバゾ-ル誘導体24種を合成。5.これら誘導体の変異原性試験(エイムステスト)の結果、アミノアルカン側鎖の導入が、活性を増大させることを見出だした。6.アクリドンアルカロイド28種についての抗ウィルス活性試験ではシトルシニンーIに、また抗マラリア活性試験では、アタラフィリニンに強い活性を認めた。7.合成したピリドカルバゾ-ル類は、UVおよびNMRスペクトルによる検討の結果、強い自己スタッキング能を持つとともに、DNA塩基とも強くスタッキングすることが明らかとなった。(9)クマリン。(12)その他。1。ミカン科植物Glycosmis citrifoliaから新二量体アクリドンアルカロイドを単離、構造を決定した。二量体アクリドンとしては、天然から4番目の例である。2。ミカン科ミカン属植物舟床、清美×イヨ、テング、キクダイダイの成分を検索し、新しい二量体クマリンを初め新化合物13種を単離、構造決定した。これらの内、ビスオステノンと命名した化合物は四員環をもつ二量体クマリンでスペクトル法、X線結晶解析により構造を決定すると共に、オステノンの光反応によっても合成した。また構造未決定ではあるが、七員環をもつアクリドン類似のアルカロイドも単離し、構造研究を実施中である。3。ミカン科ゲツキツ属植物Murraya paniculataおよびMurraya exoticaから新しい二量体カルバゾールアルカロイド、およびクマリンを単離、構造決定した。ゲツキツ属植物は、種の違いによりその含有成分に特徴的な相違があり、フィトケミカルな面からも興味がある。4。天然からのカルバゾールアルカロイドムコナールをリード化合物とし、ピリドカルバゾール骨格のインターカレーター22種を合成した。これらについてエイムス法による変異原性テストを実施した。インターカレーションなどによるフレームシフト型の変異原性をしめすと考えられるTA-98、およびDNAとの共有結合などによる塩基対置換型の変異原性を示すと考えられるTA-100のいずれにおいても、アミノメチレン側鎖の導入は活性を増すことが認められた。5。

28種のアクリドンアルカロイドについて、抗ウィルス活性および抗マラリア活性を調べた結果、シトルシニン-Iに抗ウィルス活性を、グリコシトリン-I、デス-N-メチルアクロニシン、アタラフイリニンに強い抗マラリア活性を認めた。1.ミカン科ミカン属植物Citrus funadoko(舟床)より、新しいアクリドン-クマリン二量体7種を単離、アクリマリンAFと名付け構造決定した。アクリドン-クマリン二量体の天然からの単離はこれが最初である。2.ミカン属植物C.hassakuを接ぎ木したカラタチ根より、二量体クマリン2種を単離、構造決定した。3.数種のミカン属植物より、七員環をもつホモアクリドンアルカロイドを単離、シトロポンA,B,Cと名付け、NMRを初めとするスペクトル解析、あるいはX-線結晶構造解析により、その構造を明らかにした。天然よりホモアクリドンアルカロイドの単離はこれが最初の例である。4.ゲツキツ属植物Murraya euchrestifoliaより、更に、新規二量体カルバゾ-ルアルカロイド8種、モノカルバゾ-ルアルカロイド5種を単離、構造決定した。5.26個のメチレンで隔てた1-アミノ置換5-メトキシ-7-メチル-7H-ピリド〔4,3-c〕カルバゾ-ル二量体を合成。UV,NMRスペクトルを検討の結果、この化合物は強い自己スタッキング能を持つことを見出だした。6.上記の7H-ピリドカルバゾ-ル骨核に、適当な長さのメチレンスペ-サ-により核酸塩基類を結合した化合物を合成し、そのUV,NMRスペクトルを検討の結果、この7H-ピリドカルバゾ-ル分子は、核酸塩基類とも強くスタッキングすることが明らかとなった。
組み換え近交系マウスを用いた肺腫瘍抵抗遺伝子の研究

肺腫瘍高感受性のA/Jと低感受性のSM/J系の間で26系統からなる組み換え近交系SMXAを樹立し、ウレタン誘発肺腫瘍発生率を調べたところ、その1系SMXA24は既知の4つの感受性遺伝子が感受性アレルをもつにも関わらず、強い抵抗性を示した。A/Jへの戻し交配系にウレタンを投与し、発生した肺腫瘍数を定量的形質バラメターとして遺伝解析を行った結果、第11、第12染色体上にそれぞれ有意のQTLを検出した。これらはいずれもSM/J由来アレルが優性で肺腫瘍敷を抑制した。染色体位置から第11染色体上のQTLはDraganiが報告したPar1と同じとみなされたが、第12染色体上のQTLは未報告の抵抗遺伝子でPar3と命名された。マップ位置からPar3の侯補遺伝子はnPKCηである。nPKCηは肺、皮膚で特異的に発現され、肺腫瘍で抑制されることがわかっているが、これまでの検索ではその発現、PCR産物の構造等についてみるべき異常はみつかっていない。ヒトの肺腺癌材料薬50例についてPar1,Par3の相同染色体部位のLOHを検索したところ、informative caseのうち、前者で50%、後者で30%の頻度でLOHが検出された。比較遺伝学的はヒト固形癌の遺伝的異常を検索するひとつのアプローチである。
精子形成におけるPGP9.5の役割に関する研究

本年度、霊長類精子形成の律速段階である精祖細胞の調節にPGP9.5が深く関わっていることを明らかにした。動物はニホンザル(Macaca fuscata)を用い、免疫組織化学とコンピューターによる定量解析を行った。PGP9.5免疫反応性は未分化型精祖細胞にのみ認められ、細胞増殖能の指標となるPCNAとの二重免疫染色の結果からPGP9.5陽性細胞は細胞周期のG0期にあることが分かった。PGP9.5はユビキチンC末端水解酵素活性を持つことが報告されていて、ユビキチンを介するextra-lysozomal protein degradationの調節に関与する。そこで私が本年度開発し、既に報告した新しい免疫電顕法を用いてPGP9.5の細胞内局在を検討した。その結果精祖細胞内におけるPGP9.5は細胞質基質に存在し、ユビキチン系調節に関与していることを裏付けた。さらに細胞周期の違いによってPGP9.5の細胞内局在が大きく変化することも明らかに出来た。G0期にある精祖細胞は細胞質に多量にPGP9.5を含む。それに対してS期以降の細胞はそのPGP9.5が核内に局在するようになる。このように細胞内を移動して様々な機能に関与する分子はほとんどが細胞内骨格線維上に存在しているので、その移動は細胞内イオン濃度に依存していると考えられる。そこでカリウムイオンチャンネルに着目し、予備的実験として中枢神経系においてその免疫電顕を行い発表した。