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近世歌舞伎の演劇空間-歌舞伎図像と音楽、空間表現との比較分析を手がかりとして-

2012年11月から2013年の11月までイギリス・大英博物館において和本コレクションのデジタル撮影を行った。特に2013年6月から8月の中旬までの6週間、現地の大学院生、及びMA修了生5名による博物館インターンシップを行い、博物館絵本コレクションを中心とした和本のレクチャーとハンドリングのワークショップ及び、コレクションのデジタル撮影を指導し、690点撮影した。以上の計画の実施に伴い、2013年度の段階でほぼ95パーセントの資料撮影は終了させることができた。他にデジタル撮影に関しては、オランダの個人浮世絵コレクション約100点、安田文庫の新規購入分大坂役割番付約1600点の撮影を行った。さらに、大英博物館出張期間中は2013年10月5日から開催された国際展覧会「Shunga : sex and pleasure in Japanese art」の図録執筆、特別論文集への論文寄稿、シンポジウム準備に携わっており、以上の研究を遂行するためにヨーロッパ・日本の個人コレクションを中心に春画、春本の資料調査も実施した。以上の資料調査、撮影によって、当初の目的である歌舞伎の図像を中心とした近世浮世絵、絵本の画題研究の基礎的な資料を蓄積することはできた。画題、図像の研究は用例をたくさん集め、それを分析し、その図様の意味と変遷とを考えるものであるが、浮世絵でもタイトルをもたないものや、どの絵本に何が描かれているのかを基礎的なものからきちんと目録化されているわけではない。特に歌舞伎の図様と関連がありながらもその指摘がなされていないものが多数あり、博物館での資料整理に携わりながら全体をみることで、事例研究をすすめ、論文、口頭発表として成果報告することができた。さらに、博物館の作業を進めていく上で、浮世絵、絵本だけではなく、根付や鍔などの立体物と版本との図様の面での交流についていくっか確認することができたことは、予想以上の成果であった。(抄録なし)本研究は、国内外の浮世絵・版本コレクションのデジタル撮影、オンラインカタログの公開をすすめながら、大量に蓄積された絵画資料を比較して、それらが表象装置としての劇空間の中でいかに機能したかを考究し、さらには、舞台空間の多様性を包括的に研究するために、絵画資料と地芝居の舞台機構、身体表現との比較分析を行うことを目的としている。本年度は、The Freer and Sackler Galleries(US)所蔵Pulvererコレクションにある660点の版本コレクションのデジタル撮影をすすめ、書誌データを構築した。撮影した画像は近く解説付きの絵本カタログとして博物館のHPから公開される予定となっている。また、大英博物館(UK)所蔵・浮世絵、版本コレクションの整理を実施し、タイトルの誤りを指摘して、博物館のデータを訂正し検索しやすくなるよう提案をした。以上の調査によって、近世期に出版された歌舞伎役者の似顔絵本をとりあげ、その出版史の歴史的変遷について論じた。そこから発展して、役者の似顔に関連する春本をとりあげ、浮世絵と比較することによって、登場する役者の様相を明かにし、役者似顔春本の出版の意義について論じた。さらに、両機関所蔵の漆器コレクションと、浮世絵・近世期絵入本との関連を考察し、近江八景図像の画題が浮世絵、絵本の中で変化し、それらが漆器のデザインに取り上げられていく過程を明らかにした。また、国内においては安田文吉氏所蔵の近世江戸、上方、名古屋の歌舞伎番付のデジタル化をすすめた。安田氏の番付(興行記録)コレクションはおよそ2000点以上あり、現在まだ知られていない興行の番付も数点ある。撮影した全画像は立命館大学アート・リサーチセンターから公開される予定であり、さらに詳細な演劇の興行年表となっていくことが期待されている。地芝居調査に関しては、11月に行われた地芝居サミットに参加し、5月、10月、12月と地芝居団体の公演の記録撮影を行った。本年度は前半昨年よりひきつづき、安田コレクションの番付資料についてのデジタル化をすすめ、上方の歌舞伎番付である絵尽についてはほぼすべての撮影を終えることができた。現在は撮影した画像についての画像処理作業及び、一点一点のデータ入力をすすめている。また、11月より大英博物館日本セクションに出張しており、博物館の和本コレクション全1900点のデジタル化をすすめている。撮影した画像については、規定の画像処理をした後、すべて博物館に寄贈され、順次博物館のホームページから公開される予定となる。撮影だけでなく、撮影の準備にあたって、書誌情報を再度整理し、博物館データベースのメタデータについても必要なものは順次改定、更新する作業にも関わっている。以上のような、画像蓄積作業をすすめながら、近世視覚文化を読み解く研究会を企画、運営し、月1回の研究会を行った。研究会の目的は、蓄積された画像資料を有効に活用しながら、近世絵画における画題の本来の意味をさぐり、その用例がどのようなものであったかを考えることで、絵画の構図の歴史的変遷を考究しようとするものである。研究会の成果については、mediawikiのシステムを用いたweb型画題事典として公開していく予定であり、また同様の内容を順次学術雑誌として発表、刊行していくことを企画しており、現在準備をすすめている。Web型の画題事典の公開にあたっては大英博物館や昨年撮影し終えたThe Freer and Sackler Galleries(US)所蔵Pulvererコレクションのような公開型の博物館、美術館データベース画像をリンクさせることで絵画の用例の提示が著作権等の問題なく公開することが可能となる。

大規模な画像資料データベースを構築しながら、それぞれの画題の解説を充実化させていくことで、相互に発展していく計画であり、それぞれの段階的な作業進行は非常に順調であるといえる。2012年11月から2013年の11月までイギリス・大英博物館において和本コレクションのデジタル撮影を行った。特に2013年6月から8月の中旬までの6週間、現地の大学院生、及びMA修了生5名による博物館インターンシップを行い、博物館絵本コレクションを中心とした和本のレクチャーとハンドリングのワークショップ及び、コレクションのデジタル撮影を指導し、690点撮影した。以上の計画の実施に伴い、2013年度の段階でほぼ95パーセントの資料撮影は終了させることができた。他にデジタル撮影に関しては、オランダの個人浮世絵コレクション約100点、安田文庫の新規購入分大坂役割番付約1600点の撮影を行った。さらに、大英博物館出張期間中は2013年10月5日から開催された国際展覧会「Shunga : sex and pleasure in Japanese art」の図録執筆、特別論文集への論文寄稿、シンポジウム準備に携わっており、以上の研究を遂行するためにヨーロッパ・日本の個人コレクションを中心に春画、春本の資料調査も実施した。以上の資料調査、撮影によって、当初の目的である歌舞伎の図像を中心とした近世浮世絵、絵本の画題研究の基礎的な資料を蓄積することはできた。画題、図像の研究は用例をたくさん集め、それを分析し、その図様の意味と変遷とを考えるものであるが、浮世絵でもタイトルをもたないものや、どの絵本に何が描かれているのかを基礎的なものからきちんと目録化されているわけではない。特に歌舞伎の図様と関連がありながらもその指摘がなされていないものが多数あり、博物館での資料整理に携わりながら全体をみることで、事例研究をすすめ、論文、口頭発表として成果報告することができた。さらに、博物館の作業を進めていく上で、浮世絵、絵本だけではなく、根付や鍔などの立体物と版本との図様の面での交流についていくっか確認することができたことは、予想以上の成果であった。計画していた海外諸機関の調査に加えて、安田文吉氏所蔵の番付コレクション整理に着手することに成功し、演劇研究だけでなく役者絵考証の基礎資料となる興行資料の整理が充実した。さらに、海外諸機関での浮世絵、版本の調査においても単に資料整理だけでなく、そこから近世視覚文化の分析というかたちで、その成果を論文、口頭発表で公表することができ、外部からの反応を得ることで当初の研究計画より大幅に進展させることができた。前述したように、画像資料の蓄積をすすめながら、それを用いた成果を研究会というかたちで、他の研究者とも協力しながらすすめており、相互の作業進行については、ほぼ計画通りであるといえる。研究会の内容の成果については主に最終年度にわたって、雑誌刊行、web型画題事典として公開してはじめて成果となることが予測されるために、当初の計画以上という評価にはならなかったが、その段階的な準備は十分になしえたと思われる。
1細胞蛍光検出技術を用いた腫瘍内がん特異的免疫細胞の遺伝子スクリーニング法の開発

平成20年度は,これまでに行ってきた1細胞レベルでの免疫細胞の検出および免疫関連遺伝子クローニング技術の精度と効率を向上させることを目的とした技術的な改良を継続して行っている。1個のB細胞から遺伝子クローニングを行う場合、特異的なIgG抗体を持つB細胞を同定する染色法の精度とPCR法による1細胞遺伝子増幅の効率に問題点があった。最初のB細胞の染色同定の精度については、GST標識組換えタンパク+Alexa標識抗GST抗体およびPE標識抗ヒトIgG抗体の使用にて改善された。次に1細胞遺伝子増幅の効率については、RTの簡略化、2段階(nested)PCR法などの工夫により、PCR増幅の効率が改善された。抗体遺伝子は、IgH(IgG)鎖遺伝子のPCR増幅に成功した同一の1細胞より同様にIgL(IgG)鎖遺伝子の増幅を行った。当初Primary B細胞の抗体遺伝子の増幅は従来法では困難であったが、この技術改良により不死化をしていない通常のB細胞1個からも抗体遺伝子クローニングが可能となった。IgG抗体遺伝子のコピー数を評価できるリアルタイム定量PCR法では、EBウイルスにて不死化したB細胞においてIgG抗体遺伝子は、通常のB細胞に比べて10倍以上のコピー数の増幅(平均110/細胞)が確認された。Primary B細胞の1細胞あたりの抗体遺伝子コピー数は、10個以下と考えられた。さらに本年度は、抗体遺伝子を取得する症例を選別するため、抗原特異的な血清抗体価を定量・標準化する測定技術を開発し、あらかじめ標的となる抗原に対する抗体価の高い症例由来のB細胞を利用することが可能となっている。これらの基盤技術を活用し、得られたヒト抗体遺伝子配列より組み換え抗体を作製し、抗体の機能的な評価を行う予定である。平成19年度は,主としてex vivoにて増幅した抗原特異的な細胞障害性T細胞(CTL)やin vitroでEB-virusにて不死化したB細胞株を使用して,1細胞レベルでの免疫細胞の検出および免疫関連遺伝子クローニング技術の精度と効率を向上させるため技術的な改良を行っている。これまでの1個のB細胞から遺伝子クローニングを行う場合,特異的なIgG抗体を持つB細胞を同定する染色法の精度とPCR法による1細胞遺伝子増幅の効率に問題点があった。まずB細胞の染色法に関しては,GST標識した組換えタンパク(全長)を抗原どしてB細胞と反応させ,その後Alexa標識抗GST抗体およびPE標識抗ヒトIgG抗体にて染色することにより,抗原特異的なヒトIgG抗体を膜表面に発現したB細胞を精度良く検出することが可能となった。次に1細胞の遺伝子増幅効率を評価する指標としてIgG抗体のFcセグメントの保存領域を標的に1細胞あたりのIgG抗体遺伝子のコピー数をリアルタイムPCR法にて定量するアッセイ系を開発した。不死化したB細胞においてIgG抗体遺伝子は,不死化していない通常のB細胞に比べて10倍以上のコピー数の増幅が確認された。これらの結果より不死化したB細胞株は,IgG抗体遺伝子クローニングに適したリソースと考えられた。東京農工大のグループでは,上記細胞障害性T細胞やB細胞の分離・解析を行うためのデバイス作製を行っている。本年度は,1万個の微細孔を持つマイクロメッシュ基板備えたマイクロ流体デバイスを作製し,細胞分離における評価を行った。Raji細胞を用いて捕捉効率を検討した結果,最大で導入した細胞数の85%を効率的に基板上に捕捉することが可能であった。さらに,基板上に捕捉された1細胞をセルピッカーによって分離し,ハウスキーピング遺伝子(GAPDH,β-actin)を指標としてリアルタイムRT-PCRを行った。その結果,1細胞に含まれるGAPDH,及びβ-actin遺伝子のコピー数は,それぞれ約2900,1000であった。この値は既知の報告とほぼ一致しており,分離された細胞が1細胞由来であることが強く示唆された。さらに本手法を用いて,免疫関連遺伝子のコピー数を求める予定である。

これらの基盤技術を活用し、得られたヒト抗体遺伝子配列より組み換え抗体を作製し、抗体の機能的な評価を行う予定である。
磁気光学効果を利用した超高速空間光位相変調器に関する研究

多結晶磁性ガーネット膜の磁化が、応力により変化する機構を詳細に調べた。本研究で利用している多結晶磁性ガーネット膜は、残留磁化が大きく、外部磁界、応力に対してほぼ直線的に磁化が変化するというMOSLMに適した性質を有している。しかし、なぜそのような性質のガーネット膜が得られるかについては明らかになっていなかった。この性質が多結晶構造に由来するものと考え、磁化特性と粒径との関係を詳細に調べた。その結果、ガーネット粒子間の磁気的結合が極めて弱い場合、孤立粒子の集合体として振舞うため、大きな残留磁化と直線的な磁化変化を実現できることが分かった。このことにより、MOSLMに適したガーネット膜を作成する上での明確な指針を得られた。上記モデルに基づくシミュレーションより、従来はMOSLMに不適としていたビスマス置換ガドリニウム鉄ガーネットを検討し、磁性フォトニック結晶(Magneto-Photonic Crystal: MPC)にした際のKerr回転角、反射率、応力による磁化変調量を調べた。その結果、Kerr回転角25度(変調量50度)・反射率10%・保磁力変化量700eであり、今まで検討した材料中最高の性能指数(Kerr回転角・反射率・磁化変調量の積)を示した。64×64画素規模のパッシブマトリクス型デバイスを試作した。ガーネット膜のピクセル化、スパッタによる薄膜PZTの作成、マトリクス型電極の作成に際し、MPCのKerr回転角が大きく減少した。これは本デバイスのコンセプトが応力によるKerr回転角変調であり、これに適した組成のガーネットを用いているため、MPCのKerr回転角が成膜応力等の影響を非常に受けやすいためであると考えている。スパッタ電力や熱処理プロセスの最適化によりデバイスにかかる応力を緩和することで、MPCの性能への影響が少ないプロセスを開発する必要がある。試作したデバイスにおいては、0.1度(飽和Kerr回転角3度)のKerr回転角変調を確認した。新しいモデルに基づくシミュレーションから、ビスマス置換ガドリニウム鉄ガーネットを用いたMPCを開発し、目的にあるKerr回転角変調量45度を達成可能であることを示した。また、64×64画素規模のパッシブマトリクス型デバイスを試作したことで、デバイスにする際の課題が明らかになった。原理実証、及び作成指針の検討は終了しており、今後はデバイス作成プロセスの開発が必要となる。特に、PZT薄膜をデバイスに利用するに当たり、結晶化アニールに伴って大きな成膜応力が発生し、MPCのKerr回転角低下や電極・PZT膜の剥離が起こっているため、結晶化アニール等の最適化を行う。また、最終的にはTFT駆動のデバイスを作成する予定であるが、MPC、PZT層に影響を与えない低温ポリシリコンプロセスによるTFT作成を行う。
ペア型免疫受容体分子群の免疫制御機構における役割

新規ペア型受容体として当研究グループは近年MAIR-I、MAIR-IIを同定し、これまでに報告している。最近このMAIR分子は9つの遺伝子によりファミリーを形成している事が明らかとなり、申請者は新たなMAIR分子、MAIR-IVについて解析を行っている。これまでに、MAIR-IVのアダプター分子がFcRγ鎖である事を明らかにしたが、FcRγ鎖遺伝子欠損マウス由来の腹腔滲出細胞においてもMAIR-IVシグナルが伝達される事も明らかとなり、MAIR-IVはFcRγ鎖非依存的にも活性化シグナルを伝達する事が示唆された。平成19年度はMAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路について以下のような解析データを得た。MAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路が新たなITAMを持つアダプター分子を介したものかを検証するために、Syk(ITAMのリン酸化を行う酵素。欠損するとITAMシグナルが伝達されない)遺伝子欠損マウスの細胞を用いて刺激実験を行った。その結果、Syk遺伝子欠損マウス由来細胞においても活性化シグナルが伝達される事が明らかとなり、MAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路はSyk、つまりITAM非依存性の経路である事が示唆された。2.MAIR-IVはMyD88依存的に活性化シグナルを伝達する。MyD88遺伝子欠損マウスより誘導したマクロファージではMAIR-IVによる活性化刺激が顕著に減少した。また、抗体へのエンドトキシンの混入の可能性はTLR4遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ刺激実験で否定された。このことから、MAIR-IVはMyD88と直接的または間接的に会合し、細胞に活性化刺激を伝達する事が示唆された。現在はMAIR-IVとMyD88間のシグナル相互作用がどのように行われているのか、解析を進めている。新規ペア型受容体として当研究グループは近年、MAIR-I, IIを同定し、これまでに報告している。最近、このMAIR分子は9つの遺伝子によりファミリーを形成している事が明らかになり、申請者は新たなMAIR分子、MAIR-VIIについて解析を行なっている。MAIR-VIIの分子機能の解析に先立ち、抗MAIR-VIIモノクローナル抗体の作製及び、種々のトランスフェクタントの作製を行なった。以下はそれらを用いて得られたデータである。様々な種のセルラインでトランスフェクタントを作製したところ、いずれのラインでもMAIR-VIIは遺伝子導入効率依存的な細胞表面上への発現を認めた。通常、MAIR-VIIのように膜貫通領域に荷電アミノ酸を持つ受容体は、アダプター分子と会合する事で初めて細胞表面上に発現する事が可能となり、受容体のみの遺伝子導入では発現を認める事ができない。このことから、MAIR-VIIはアダプター非依存的に細胞表面上に発現する事ができる、他の免疫受容体とは異なる発現様式を持つ受容体である事が示唆された。抗MAIR-VIIモノクローナル抗体にてマウス細胞を染色し、FACSにて解析を行なったところ、脾臓中のマクロファージおよび樹状細胞、腹腔滲出細胞(PEC)中のマクロファージおよび顆粒球においてMAIR-VIIの発現が認められた。MAIR-VIIはMAIR-IMAIR-IIと同じく骨髄球系の細胞に発現し、生体内で何らかの役割を果たしているものと考えられる。MAIR-VIIの発現がPECマクロファージ上で認められた事から、この細胞を抗MAIR-VII抗体にて刺激し、反応性を解析した。抗MAIR-VII抗体によるプレートコート刺激下で48時間培養したところ、培養上清中に炎症性サイトカインであるTNFαの産生を認めた。この事から、MAIR-VIIは生体において活性化シグナルを伝える受容体として寄与している事が示唆された。以上のデータを踏まえ、現在はMAIR-VIIの下流分子の探索を中心に研究を進めている。平成17年度中に、MAIR-IVはマウスの好中球およびマクロファージ、樹状細胞上に発現し、抗MAIR-IV抗体刺激によりTNF-αらの炎症性サイトカインを産生させる事を明らかにした。1.アダプター分子MAIR-IV自身は細胞内領域にシグナルモチーフを持たない事から、活性のシグナルモチーフであるITAMを持つDAP12やFcRγ鎖等のアダプター分子と会合する事で活性化シグナルを伝達していると推測された。MAIR-IVがいずれのアダプター分子と会合するか、トランスフェクタントを用いて共免疫沈降法により解析したところ、MAIR-IVはFcRγ鎖のみと会合する事が明らかとなった。この会合はトランスフェクタントだけでなく、マウスの好中球およびマクロファージにおいても確認され、FcRγ鎖がMAIR-IVのアダプター分子であると示された。2.シグナル経路FcRγ鎖がアダプターであると示された事から、MAIR-IVシグナルがFcRγ鎖依存性であるかを解析した。FcRγ鎖遺伝子欠損マウスと野生型マウスの腹腔滲出細胞を採取し、抗MAIR-IV抗体で刺激したところ、FcRγ鎖遺伝子欠損マウス由来の細胞においてもコントロール抗体に比べて有意なTNF-α及びIL-6の産生亢進が認められた。

この事から、MAIR-IVはFcRγ鎖以外にも活性化シグナルを伝達する経路を用いている事が示唆された。現在はこのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路がどのような分子に依存しているのか解析中である。新規ペア型受容体として当研究グループは近年MAIR-I、MAIR-IIを同定し、これまでに報告している。最近このMAIR分子は9つの遺伝子によりファミリーを形成している事が明らかとなり、申請者は新たなMAIR分子、MAIR-IVについて解析を行っている。これまでに、MAIR-IVのアダプター分子がFcRγ鎖である事を明らかにしたが、FcRγ鎖遺伝子欠損マウス由来の腹腔滲出細胞においてもMAIR-IVシグナルが伝達される事も明らかとなり、MAIR-IVはFcRγ鎖非依存的にも活性化シグナルを伝達する事が示唆された。平成19年度はMAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路について以下のような解析データを得た。MAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路が新たなITAMを持つアダプター分子を介したものかを検証するために、Syk(ITAMのリン酸化を行う酵素。欠損するとITAMシグナルが伝達されない)遺伝子欠損マウスの細胞を用いて刺激実験を行った。その結果、Syk遺伝子欠損マウス由来細胞においても活性化シグナルが伝達される事が明らかとなり、MAIR-IVのFcRγ鎖非依存性のシグナル経路はSyk、つまりITAM非依存性の経路である事が示唆された。2.MAIR-IVはMyD88依存的に活性化シグナルを伝達する。MyD88遺伝子欠損マウスより誘導したマクロファージではMAIR-IVによる活性化刺激が顕著に減少した。また、抗体へのエンドトキシンの混入の可能性はTLR4遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ刺激実験で否定された。このことから、MAIR-IVはMyD88と直接的または間接的に会合し、細胞に活性化刺激を伝達する事が示唆された。現在はMAIR-IVとMyD88間のシグナル相互作用がどのように行われているのか、解析を進めている。
ネフロン各部における発現遺伝子のインデックス化によるセグメント特異的遺伝子の同定

大阪大学細胞生体工学センターの大久保らが、各組織・細胞のmRNAから岡山/Bergの方法により直接プラスミドベクターにクローニング後、自動DNAシークエンス装置を用い約1000クローンのDNA配列をpoly A tailより上流約250bpまで同定し、遺伝子データベース内の既知の配列と比較することにより未知の遺伝子を含む遺伝子発現をインデックス化し同定する方法を開発した。本方法を用い現在までにmicro dissection法によりマウス腎臓から近位尿細管、inner medullary collecting duct (IMCD)を集め解析を終えている。解析した1000クローン中、近位尿細管において646種類また、IMCDにおいては960種類のmRNA発現を同定し、その相対的な発現量を決定した。Gene Bank等の遺伝子情報データベースを用いた検討の結果、近位尿細管では204種類が、IMCDでは194種類が既知のDNA配列と考えられた。他は現在までのところ未知の遺伝子である。また近位尿細管で特異的に発現しかつ、最も発現量が多いクローンは近位尿細管全mRNAの約2%を占めている事が明らかとなった。大久保らにより構築された他臓器あるいは細胞の同様のデータベースと比較することによりコンピュータ上でサブトラクションを行い、先ず近位尿細管に特異的に発現していると考えられる遺伝子群を同定した。複数種類について、Northern Blot法により腎臓特異的な発現を、in situ Hybridization法により腎皮質髄質外層における局在を確認した。ついで、マウス腎皮質mRNAより作成したcDNAライブラリーを用いてクローニングを行い、腎臓に主に発現する新しい遺伝子を同定した。
1980年代以降の開発途上国における就学率の停滞要因に関する理論的・実証的研究

各種統計データを収集分析し、1980年代以降、Education for Allといった国際的な教育普及の取組にもかかわらず、就学率(とくに初頭教育)の停滞を見た諸国の特徴として、1.経済活動の崩壊や停滞、およびその結果構造調整を受け入れざるを得なかった場合。2.中東諸国に見られるように、経済停滞と同時に、イスラム教などの宗教的・文化的要因が教育に大きな影響を受けた場合。このように、マイヤーらが提唱した教育拡大の制度化論的説明は、1950年-1970年の時代の教育拡大現象の説明には有効であったが、国際意的な取組として教育の価値は世界的により一層共有されるようになった1980年代以降では、かえってその説明力に疑問が呈せられる状況となった。マイヤーらは、1955年から1970年の期間に、先進国、開発途上国を含めて一様に急激な就学率の成長が生じた現象を、「教育=善」という価値が世界的に共有された帰結であると解釈し、彼らの教育システム拡大に関する「制度的説明」を一つのパラダイムまで昇華させた。しかし、1980年代にはいると、多くの開発途上国では、就学率の停滞あるいは後退が顕著になってきた。教育の価値は世界的に共有されているにもかかわらず、このような停滞現象が生じた背景には、多くの途上国にお債務超過とそれへの処方箋としてIMFなどの支援機閑から示された構造調整プログラムによって、教育を含む公共部門への公的支出が大幅に削減され、その結果、開発途上国の教育機会が現象し、また教育の資が低下したためである。そこで、1990年にタイのジョムチェンで開催された「万人のための国際会議」では、改めて教育、とりわけ基礎教育の価値を再確認し、国際社会が一丸となって2000年までに基礎教育を普遍化するという目標を設定し、そのために莫大な資源が投入されることとなった。しかし、目標達成にはほど遠いものがあった。この現状を踏まえて2000年にダカールで開かれた国際会議において、教育の重要な価値の再確認がなされるとともに、2015年までに世界中の全ての子供が良質の基礎教育を修了できるよう、国際社会が協力する枠組みが確認された。しかし、最新のデータによれば、2015年までに目標を達成できる国は対象の155カ国のうち、69カ国に過ぎないと推定される。マイヤーが指摘する教育の持つ価値に、全世界はコミットしているにもかかわらず目標達成を阻害する要因は何なのか?いくつかの研究が示唆するところによれば、開発途上国における教育への予算配分の少なさ、教育予算の非効率的執行などが指摘されている。今後は、今年度収集した各種データをもとにして、再び経済的要因が果たして教育拡大に影響を及ぼしているかどうかを、実証的に分析する課題を追求する。本研究は、1980年から2000年までの20年間について、主として開発途上国の教育拡大の現状と、社会経済的要因との関係を明らかにしようとするものである。マイヤーらの制度論アプローチによれば、1950年から1970年代にかけては世界的に教育爆発が起きた時代であり、それは個々の国々の社会経済状況にかかわらず、世界文化(規範)として学校教育が普及した時代であった。しかし、1990年のタイのジョムチェンで開催された「万人のための教育」会議及び2000年のダカール行動宣言において、2015年までの基礎教育の完全普及が世界的に合意され、基礎教育の普遍的価値が全世界に受け入れられたにもかかわらず(基礎教育の制度化)、一部の地域、特にサブサハラアフリカや南アジアでは、むしろ就学率の停滞や低下が顕著である。そこで、本研究は、さまざまなデータソースを用いて基礎教育の普及状況と社会経済状況の関連を今一度検証し、マイヤーらの制度論に代わりうる新たな理論構築を試みるものである。これまでの分析によれば、就学率の停滞をもたらす主な要因は、構造調整などによる経済的停滞と人口増加である。
プラナリアの無性・有性生殖様式の季節転換 －現象の記載と分子機構の解明－

自然界では多くの生物が環境等に応じて無性・有性の生殖様式を転換しているが、その制御機構はいまだ不明な点が多い。本研究ではプラナリアを用いてその理解に挑んだ。用いたDugesia ryukyuensis種は同種内に先天的無性・有性・転換の3系統が共存するほか、投餌による人為的な有性化誘導法が確立している。有性化過程のトランスクリプトームを解析し、有性化関連遺伝子群の同定を試みた。また年周期での生殖様式の転換現象について、季節毎の生殖様式を野外定点調査し、生殖様式転換過程の生殖器官を組織観察した。さらに生殖器官退縮過程での細胞死や幹細胞増殖の全身における変化について検出した。自然界では多くの生物が環境等に応じて無性・有性の生殖様式を転換し、相異なる利点を享受しているが、その制御機構は後生動物においていまだ不明である。そこで野外において生殖様式の季節転換を行い、さらに人為的な有性化誘導実験系も確立している淡水棲プラナリアDugesia ryukyuensis種を用いてその転換現象の理解、分子機構の解明に挑む。本研究にはD. ryukyuensis種を用いているが、本種は同種内に先天的無性・有性・転換の3系統が共存するほか、投餌による人為的な有性化誘導法が確立している点で他種にはない独創的な実験対象である。プラナリアにおいてはSchmidtea mediterranea種が最も研究の進んだ種であるが、染色体転座により先天的に生殖様式が固定しているため、そもそも生殖様式転換の実験対象とはなり得ない。そこで本研究によりD. ryukyuensis種を用いないと知り得ない知見が期待できる。また生殖様式の季節転換現象において数週間で生殖器官が消えて無くなる、あるいは形成されるというダイナミックな変化について分子機構の全貌に迫ることは、成体における器官形成に伴う細胞分化、細胞死の制御について新たな知見をもたらし得る。当該年度は、まず自然界での転換現象にアプローチする前段階として人為的な有性化現象を対象とし、無性から有性までの6ステージにおけるトランスクリプトームを解析し、有性化の進行と共に発現が変化する遺伝子群に加え、新たに生殖様式転換の制御遺伝子候補としてエピジェネティックな遺伝子発現制御に関わる分子やホルモン関連の遺伝子に着目し、候補となるコンティグを抽出した。人為的有性化過程において発現変動が見られる遺伝子群をトランスクリプトームデータベースより抽出し、有性化関与候補遺伝子とした。そのコンティグ構築の確認と発現量の詳細な定量のため、トランスクリプトームデータベース構築時に用いた試料を鋳型としてリアルタイムPCR法を行ったが、増幅が見られなかったり、実験結果の再現性が低かったりして、その原因究明に時間を費やした。結局、当該年度の直前に大学を異動した際に運搬した研究試料が劣化していたことが原因と判明し、新たに生殖様式転換過程の各段階の個体の準備とそこからの試料調製をやり直すこととなった。そこで野外において生殖様式の季節転換を行う淡水棲プラナリアDugesia ryukyuensis種を用いてその転換現象の理解、分子機構の解明に挑んだ。本種は同種内に先天的無性・有性・転換の3系統が共存するほか、投餌による人為的な有性化誘導法が確立している点で他種にはない独創的な実験対象である。当該年度は、投餌により無性生殖から有性生殖まで段階的に進行する有性化過程の6ステージにおけるトランスクリプトームを解析し、有性化の進行と共に発現が変化する遺伝子群に加え、新たに生殖様式転換の制御遺伝子候補としてエピジェネティックな遺伝子発現制御に関わる分子やホルモン関連の遺伝子にも着目し、候補遺伝子を抽出した。候補遺伝子についてリアルタイムPCRによる発現量変動を解析し、候補を絞り込んだのちに発現部位解析やノックダウンによる表現型解析、人為的有性化刺激と並行したノックダウン表現型解析を行い、有性化過程で働く遺伝子群の同定を試みた。季節毎の生殖様式の野外定点調査については、年周期での転換現象について生殖様式転換過程で形成・退縮中の生殖器官のHE染色組織切片を観察・記載した。さらに生殖器官退縮過程での細胞死や幹細胞増殖の全身における変化について、TUNEL法によるアポトーシス細胞検出やin situ hybridization法による幹細胞neoblastの増殖・集合の観察を行った。

研究試料の劣化により研究遂行に支障が出ていたが、原因が判明し、既に生殖様式転換過程の各段階の個体の準備とそこからの試料調製を行いつつある。また試料調製の間に再度トランスクリプトームデータベースを精査し、当初ターゲットとしていた発現変動遺伝子群に加え、エピジェネティックな遺伝子発現制御やホルモン等に関与する遺伝子群も新たに生殖様式制御遺伝子候補として見出した。今後は抽出した候補遺伝子群について、人為的有性化過程での発現変動を、新たに調製したRNAソースを用いてリアルタイムPCR解析し、確かめる。さらに体内における発現部位をin situ hybridization法により特定する。ノックダウンによる表現型解析や人為的有性化刺激と並行したノックダウン表現型解析を行い、有性化過程に機能する遺伝子群を同定する。さらに人為的な有性化に関与する候補遺伝子について、自然界での生殖様式転換に関与するかを調べるため、自然界での季節ごとの発現変動を調べる。また自然界での転換現象を制御する遺伝子を探索するため、各時季に採集した個体群の分子的な比較を行う。さらに野外における生殖様式転換過程の組織形態の記載を行うため、季節ごとに定点採集した個体について、HE染色組織切片を作成する。生殖器官の形成・退縮に伴う幹細胞増殖や細胞死について分子レベルで解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。生殖生物学28年度が最終年度であるため、記入しない。
炭素骨格標識法を基軸としたホルボールエステル類生合成経路の解明

本研究の目的はトウダイグサ科植物の生産するホルボールエステル類の生体内合成経路を明らかにすることである。ホルボールエステル類は強力な発がん活性,抗腫瘍活性や抗ウイルス活性など様々な生理活性を持つことが知られ,ホルボールエステル類に共通するチグリアン骨格の形成酵素遺伝子を明らかとすれば,有用ホルボールエステル類の発酵生産などにつながる。本研究の特色は生合成遺伝子の迅速かつ精確な機能解析法,すなわち酵素合成法と安定同位体標識化・NMR分析を組み合わせた手法にあり,チグリアン骨格形成酵素の探索に取り組んだ。本年度はまずチグリアン骨格形成酵素遺伝子候補の選出を行った。ホルボールエステル類生産植物ナンヨウアブラギリ(Jatropha curcas)を栽培し遺伝子情報ソース・遺伝子のクローニング材料とした。次世代シークエンサーにより取得した葉の発現遺伝子データ(RNAseqデータ)・公開されているゲノムやRNAseqデータをもとに候補遺伝子を探索した。3つの既知植物テルペン環化酵素配列をもとに相同性検索を行い54候補を得た。54候補に潰え系統樹解析を行い,機能の予測を行った。さらにRNAseqデータなどから発現している候補遺伝子の絞り込みを行った。その結果, 8つの候補遺伝子が発現していることが示唆された。これらについてcDNAライブラリーからクローニングを行い,機能解析を行った。現在うち1つに関しては機能解析が終了した。組換え酵素を作製し酵素生成物を機器分析したところ, ent-kaurene合成酵素(KS)遺伝子であることが明らかとなった。KSは植物ホルモンジベレリンの生合成に関与する酵素である。目的の酵素遺伝子ではなかったが,ナンヨウアブラギリはバイオ燃料原料として期待されている植物でもあり,収量への関与が予想されるジベレリンの生合成に関与する遺伝子を明らかにすることができた。現在,他の候補に関しても解析を進めている。申請者らは,酵素合成によるテルペノイドの完全13C標識化技術を確立し,これを応用したテルペノイド生合成酵素の迅速かつ精確な機能解析法に取り組んでいる。今年度は特にこの技術のさらなる展開を目指し,植物由来ジテルペン類骨格合成酵素の機能解析法の確立,そして3-6-7-5員環という特異な骨格:チグリアン骨格を形成する生合成酵素の同定に取り組むことを目的としていた。本年度は当該手法により2つの植物由来ジテルペン環化酵素の機能解析を行い,完全13C標識化技術による機能解析法について広く応用が可能であることを示した。ホルボールエステル類生合成についても,生産植物ナンヨウアブラギリについて人工環境下で安定的に栽培し,また発現遺伝子の探索に用いるRNAやcDNAライブラリーを調製することができた。得られた配列情報や既に公開されているナンヨウアブラギリ遺伝子データから目的の候補遺伝子を探索し,最終的に8個まで候補を絞り込むことができた。以上により,今年度の目標の前半は十分に達成されたと言える。候補遺伝子の機能解析については,すべての候補遺伝子について機能解析を行うことはできなかったが,一部については機能解析を行うことができた。得られた結果は目的のホルボールエステル類生合成に関わる酵素遺伝子ではなかったものの,植物の成長調節に重要な役割を果たすことが予想される遺伝子であった。また,ナンヨウアブラギリ由来テルペン環化酵素について初めて機能解析の例をしめし,残る候補遺伝子について解析を進める端緒となった。本年度目的の後半である候補遺伝子の機能解析についても一定の成果を得た。当初の計画以上ではなかったが,本年度の目標をおおむね達成したため,達成後区分はおおむね順調とした。今後の研究方策として当初の予定通り,ホルボールエステル類生合成に関わる遺伝子候補8遺伝子のさらなる機能解析を進める。また,ホルボールエステル類生合成の全容を解明に向け,再度次世代シークエンサーを用いた解析も進める。また,これらと同時に機器分析(LC-MS)によるホルボールエステル類分析条件の検討も進め,植物体におけるホルボールエステル類関連化合物の分析を行っていきたいと考えている。次世代シークエンサーによる解析に関しては,既に実験に取り組み始めた。以前取得したデータは植物体全体を用いていたものであったので,これに加え,植物体の部位を限定したデータを得ることを目的としている。栽培したナンヨウアブラギリより新たにRNAを抽出し,解析を進めている。また,トウダイグサ科植物は広くホルボールエステル類やその関連化合物を合成することが知られており,ナンヨウアブラギリの他にも解析材料を得ることで,広くトウダイグサ科に共通する特徴的なジテルペノイド生合成系の解析が可能になる可能性がある。機器分析によるホルボールエステル類の分析が可能となれば,各種植物体を用いて標識化合物を出発物質とした代謝実験なども容易になると考え,以上を計画した。

次世代シークエンサーにより取得した葉の発現遺伝子データ(RNAseqデータ)・公開されているゲノムやRNAseqデータをもとに候補遺伝子を探索した。3つの既知植物テルペン環化酵素配列をもとに相同性検索を行い54候補を得た。54候補に潰え系統樹解析を行い,機能の予測を行った。さらにRNAseqデータなどから発現している候補遺伝子の絞り込みを行った。その結果, 8つの候補遺伝子が発現していることが示唆された。これらについてcDNAライブラリーからクローニングを行い,機能解析を行った。現在うち1つに関しては機能解析が終了した。組換え酵素を作製し酵素生成物を機器分析したところ, ent-kaurene合成酵素(KS)遺伝子であることが明らかとなった。KSは植物ホルモンジベレリンの生合成に関与する酵素である。目的の酵素遺伝子ではなかったが,ナンヨウアブラギリはバイオ燃料原料として期待されている植物でもあり,収量への関与が予想されるジベレリンの生合成に関与する遺伝子を明らかにすることができた。現在,他の候補に関しても解析を進めている。申請者らは,酵素合成によるテルペノイドの完全13C標識化技術を確立し,これを応用したテルペノイド生合成酵素の迅速かつ精確な機能解析法に取り組んでいる。今年度は特にこの技術のさらなる展開を目指し,植物由来ジテルペン類骨格合成酵素の機能解析法の確立,そして3-6-7-5員環という特異な骨格:チグリアン骨格を形成する生合成酵素の同定に取り組むことを目的としていた。本年度は当該手法により2つの植物由来ジテルペン環化酵素の機能解析を行い,完全13C標識化技術による機能解析法について広く応用が可能であることを示した。ホルボールエステル類生合成についても,生産植物ナンヨウアブラギリについて人工環境下で安定的に栽培し,また発現遺伝子の探索に用いるRNAやcDNAライブラリーを調製することができた。得られた配列情報や既に公開されているナンヨウアブラギリ遺伝子データから目的の候補遺伝子を探索し,最終的に8個まで候補を絞り込むことができた。以上により,今年度の目標の前半は十分に達成されたと言える。候補遺伝子の機能解析については,すべての候補遺伝子について機能解析を行うことはできなかったが,一部については機能解析を行うことができた。得られた結果は目的のホルボールエステル類生合成に関わる酵素遺伝子ではなかったものの,植物の成長調節に重要な役割を果たすことが予想される遺伝子であった。また,ナンヨウアブラギリ由来テルペン環化酵素について初めて機能解析の例をしめし,残る候補遺伝子について解析を進める端緒となった。本年度目的の後半である候補遺伝子の機能解析についても一定の成果を得た。当初の計画以上ではなかったが,本年度の目標をおおむね達成したため,達成後区分はおおむね順調とした。
脳血管拡張術後の再狭窄に対する薬剤・遺伝子コーティングステントの開発

1)小動物における薬剤徐放樹脂・ベクターの毒性確認実験:まずスクリーニング実験としてステントを使わない状態でまず各薬剤と遺伝子の比較を行った。具体的にはラット頚動脈を露出し、外頚動脈からバルーンを挿入し総頚動脈を擦過した。次に擦過部にステントの留置を行ったが、その前にコーティング樹脂や薬剤でも毒性のチェックを行った。コーティング樹脂では明らかな毒性を認めなかったが、軽度炎症反応を認めた。2)大動物におけるステント留置の実験大動物にステントを留置し、その安全性について基礎実験を行った。ステントは大腿動脈からのアプローチにて総頚動脈に血管造影装置を用いながら留置した。留置後1ヶ月で頚動脈を摘出し、その病理学的検討を行った。同時に脳を摘出し、遠位塞栓症の有無について解析を行った。解析の結果、ステントは1ヶ月で内皮に覆われており、遠位塞栓症は認めなかった。1)ステントのデザインまず今回の実験に使用するステントとそのカバーする素材についてのデザインを行った。実際に留置する場合にはバルーンカテーテルを用いることとなるため、それにマウント可能な形のステントカバーをデザインした。ステント自体のデザインも行い、試作中の段階である。2)デザインしたステントの留置実際にステントカバーを試作し、犬の頚動脈に留置する実験を行った。当初小動物でこの毒性実験を行う予定であったが、ステントのサイズが小動物に合うものが作成不可能であったため、まず犬を用いた実験を行うこととなった。このステントを留置した頚動脈を1ヶ月後に摘出し、組織学的検討を行うべく準備中である。次にコーティング樹脂や薬剤(免疫抑制剤、抗癌剤など)の毒性のチェックを行う予定である。今後、ラット頚動脈擦過後、薬剤・遺伝子を併用し再狭窄予防効果と毒性について検討する。摘出した血管について狭窄度の測定を行い、効果を確認する。また免疫染色、ウエスタンブロッテング法にて分子レベルの検討を加える。
色覚オプシンの種内多様性と環境適応

視覚オプシンの遺伝子重複と重複オプシン遺伝子間の吸収波長の分化及び発現パターンの分化は視覚系進化の重要なステップである。しかし、発現パターンの分化のメカニズムの理解は吸収波長の分化のメカニズムに比べて非常に遅れている。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は2つの赤型錐体オプシン遺伝子LWS-1とLWS-2を持つ。これらはゲノム中で順方向に隣接して並んでおり、共に網膜の複錐体長形細胞(long member of double cones(LDCs))に特異的に発現している。網膜の中央から背側と後方にかけてLWS-2が発現し、網膜の周縁、特に腹側と前方の広い領域でLWS-1が発現するという発現の空間分化が生じている。そこで我々はこれら2つの遺伝子の発現分化に関わるシス制御因子の同定を試みた。LWS-1とLWS-2を含むゼブラフィッシュのゲノム領域約100kbのP1-artificial chromosome(PAC)クローンを公共遺伝子バンクから取得し、これらのPACクローンとGFP等の蛍光レポーター遺伝子を活用してゼブラフィッシュ生体への遺伝子導入レポーターアッセイを行なった。その結果、両方の遺伝子の発現制御に関わる約0.6kbの領域をLWS-1上流に見出し、"LWS-activating region"(LAR)と命名した。LARはLWS-1とLWS-2の双方の発現を増強させるエンハンサーとして機能しており、2つの遺伝子のプロモーターとLARとの相互作用は2つの遺伝子間で競合的であり、その競合のパターンは確率的ではなく発生段階でプログラムされていると考えられた。色覚に種内変異があることが明確にわかっているのは、中南米に生息する霊長類である新世界ザル類、当の我々ヒト自身、そして魚類のグッピー(Poecilia reticulata)のみである。これらは共通にM/LWSタイプのオプシンに遺伝的多型が存在するが、特にヒトとグッピーに関してはその種内変異の程度、起源、自然選択との関係などに関して未解明な点が多く残されている。私は本州日本人、アイヌ民族、狩猟採集民であるフィリピンネグリト集団、ヨーロッパ系、アフリカ系、先住アメリカ人についてゲノムDNAの集団サンプルを分与あるいは購入により入手した。本州日本人、ネグリト集団、ハウザ(アフリカ)人、デンマーク人を対象として、L及びMオプシン遺伝子のイントロンを含む部分塩基配列を解析した。その結果どの集団にもLとMのキメラ遺伝子を確認した。興味深いことにアフリカ、ヨーロッパ、アジアの集団間で同一のキメラ遺伝子配列が共有されており、現生人類がアフリカを出て地球全域に拡散する以前にLMキメラ遺伝子が起源すると考えられる。今後解析対象個体数を増やし、詳細な検討を行なっていく必要がある。グッピーの赤-緑型錐体視細胞には吸収波長の異なるサブタイプが存在し、その持ち方は個体によって異なる、すなわち光感受性の多型があることが90年代初頭に報告された。しかし、視細胞の多型性の元になる遺伝子レベルの多型性の実体は不明であった。そこで、グッピーの視覚オプシン遺伝子をすべて明らかにし、それらにどのような集団内多様性があるかを調べることにした。これまでに原産国トリニダード島で収集された複数集団及び日本で野生化した集団のゲノムDNAの分与を受け、グッピーに4つものM/LWSタイプオプシン遺伝子座位があり、このうち2座位に高度な多型性があることを見出した。
高温高圧合成条件の最適化のための新しい小型プレス開発

低温高圧実験用に開発された装置をもとに、4GPa,500°Cの高温高圧発生が可能な小型高温高圧発生装置を開発した。4.5GPaで高圧セルをクランプした状態で、300°Cまでの加熱による圧力減少は観察されなかった。本装置を用いて、エネルギー分散および角度分散法による高温高圧放射光その場観察が可能になった。本研究の目的は高圧合成のための放射光その場観察に最適化した、小型高温高圧発生装置の開発である。大容量で安定した高温高圧発生が可能なDIA型プレスは高温高圧合成に最適な装置である。放射光その場観察技術との組み合わせることにより、合成条件の最適化が迅速に行える。高温高圧では試料の粒成長が頻繁に起きる。粒成長した試料に対しては、従来のその場観察システムでは原理的に測定が困難であった。本研究では軽量小型化を最優先した新しいプレスを開発することによって、プレス本体ごと試料を振動可能なシステムを構築する。高温高圧下での巨大結晶粒のその場観察を可能とし、高温高圧合成研究の加速を図ることを目的とする。プレス金型および本体は、すでに報告されている上床らの小型プレスをもとに開発を行った。X線透過能の高い立方晶BNを圧力発生に用いる角度分散式その場観察実験では、プレス金型に回折線を通すための窓の確保が必要になる。従来の大型のプレスを用いた実験では、金型およびサイドブロックに切り込みを入れることで対応していたが、これらの方法が強度的に適応可能であるかを調べた。現時点で約2GPa程度の圧力発生が可能であることを確認した。開口角は水平方向に15°、垂直方向に30°確保されている。この幾何学的配置の場合には40keVのエネルギーの単色X線を使った実験で、d1.2Aまでの逆格子空間が測定可能である。また約2GPaの高圧下で高温テスト実験を行い、260°Cまでの加熱に成功した。金属金型の測温も併せて行い、さらに高温(約500°C程度)が発生可能である事が明らかになった。本研究は高圧合成のための放射光その場観察に最適化した、小型高温高圧発生装置の開発を行うものである。大容量で安定した高温高圧発生が可能なDIA型プレスは、放射光その場観察技術との組み合わせることにより、高温高圧下での物質構造研究に欠かせない装置の一つとなっている。また高温高圧合成研究においても、合成条件を効率的に決定する上できわめて有効な装置である。一方で高温高圧では試料の粒成長が頻繁に起きるが、この粒成長した試料や単結晶育成を行う試料に対しては、原理的に測定が困難であるという問題がある。本研究は軽量小型化を最優先した新しいプレスを開発することによって、プレス本体ごと試料を振動可能なシステムを構築し、高温高圧下での巨大結晶粒のその場観察を可能とし、高温高圧合成研究の加速を図ることを目的とするものである。パームキュービックプレスは小型であるため、通常のDIA型プレスの実験でグラファイトヒータを使用する際に用いる大電流ケーブルを取り回すことが困難である。ここではグラファイトに比べ高抵抗であるEBNをヒータ材として用いることで、低電流での高温発生を試みた。パームキュービックアンビルセルに40tonの加重を加えた後にクランプし、通電・測温用の配線を接続して加熱実験を行った。六方晶窒化ホウ素で希釈したNaClを試料とし、高温高圧下での放射光その場観察による圧力測定を行った。金型が小型であるために、主に金型の加熱変形による高温下での圧力低下が予想されたが、今回測定した4GPa,300°C以下の温度圧力範囲では圧力低下はほとんど起きなかった。なお試料位置を250°Cまで加熱した際の金型の温度は約40°C程度であった。今回の実験結果から、本システムにより最低でも約500°C程度までの加熱実験が可能であると推察される。また立方晶窒化ホウ素のアンビルを用いた角度分散実験も行い、4GPa,500°Cで粒成長した試料のその場観察に成功した。
アルコールをケトン体へ酸化する新規P450のcDNAクローニングと反応機構解析

当研究室において、Δ^8-tetrahydrocannabinol(Δ^8-THC)の代謝物である7-OH-Δ^8-THC(第2級アルコール)が、分子状酸素とNADPHを必要とするミクロソーム中の酵素により、7-oxo-Δ^8-THC(ケトン体)に酸化されることを見い出した。さらに、このような反応を触媒する酵素をMicrosomal Alcohol Oxygenase(MALCO)と命名、その高い活性を有するモルモット肝ミクロソームより、主要な酵素として3A subfamilyに属すると推定される新規なP450(P450GPF-B)を精製した。そこで、本研究においてはモルモット以外の動物種について同様に明らかにすると共に、先にcDNAをクローニングしたMicrosomal Aldehyde Oxygenase(MALDO)と比較、それらの性質及び構造を明らかにすることを目的として検討を行った。その結果、マウス及びサル肝のHALCO活性も抗P450G PH-B抗体により顕著に阻害された。また、マウスのHALCO_2活性は、デキサメサゾン及びフェノバルビタール処理により有意に誘導された。そこで、デキサメサゾン処理マウス及び未処理ニホンザルの各肝ミクロソームより、抗P450GPF-B抗体との交差性を指標に精製し、その主要な酵素としてP450MDX-B及びP450JM-Eを得た。これらP450の酵素化学的性質及びN末端アミノ酸配列の比較より、いずれも3A subfamilyに属するP450であることが示唆された。また、^<18>O_2気相下ミクロソーム系による7-oxo-Δ^8-THCへの^<18>Oの取り込みに、光学異性体である7α-と7β-OH-Δ^8-THCでは明らかな違いが認められることから、複数の分子種の寄与があるものと考えていた。しかし、両精製酵素を用いた再構成系においても7α-OH-Δ^8-THCを基質とした場合には7-oxo-Δ^8-THCへの^<18>Oの取り込みが認められたのに対し、7β-OH-Δ^8-THCではほとんど取り込まれなかったことから、1つの分子種が立体選択的な機構により酸化することが示唆された。また、マウスのcDNAライブラリーよりP450MDX-Bと推定されるcDNAをクローニングし、その一次構造を決定した。その結果、本P450は3A subfamilyに属する分子種であると共に、HALDの主要な酵素であるCYP2との相同性は低いことが明らかとなった。