hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クロマチン構造を介した転写とDSB修復の共役のメカニズムの解明

特に転写活性化の修飾として、ヒストンのアセチル化、ユビキチン化、メチル化の解析を、抑制の修飾としてメチル化の解析を行った。今回、いくつかのユビキチン化、アセチル化、メチル化と今までの報告にない新たな因子がDSBが関与することを明らかになった。以上の研究結果より、転写とDSB修復の共役のメカニズムに関わる修飾や因子の候補が得られた。ゲノム安定性維持機構に転写とDSB修復の共役機構が重要であることを解明するために、引き続き、ATMシグナル経路の下流に位置すると考えられるENL/PRC1のユビキチン化経路と、RNF8/RNF168ユビキチンのユビキチン化経路によるヒストンH2Aのユビキチン化を明らかにする。また、RNF8/RNF168ユビキチン経路の下流には、乳がん原因遺伝子のBRCA1や53BB1が機能しているとの報告があるが、ENL/PRC1のユビキチン化経路がこれら両因子BRCA1と53BP1のDSBにおける機能にどのような影響を与えるのかを明らかにする。次年度使用額が生じた理由は、当初の予定より物品が安く購入できたためである。次年度使用額とH30年度分を合わせて、CO2インキュベーター、安全キャビネット、消耗品(細胞培養の為のプラスチック製品、培地、タンパク質解析試薬)の購入を計画している。
シロイヌナズナのHis-Aspリン酸リレー型シグナル伝達が支配する環境応答機構

His-Aspリン酸リレーがARR1を介してどのようなサイトカイニン応答現象へとつながるのかを調べるため、ARR1が標的とする遺伝子の同定を行った。その結果、サイトカイニン初発応答遺伝子であることが知られている10個のタイプAレスポンスレギュレーター遺伝子は全てARR1により認識制御され得ることが判つた。また、サイトカイニン初期応答遺伝子についてもそれらの多くのものがサイトカイニン初発応答遺伝子であり、ARR1によって認識制御され得ることが明らかになった。さらに、定量性に優れた遺伝子発現解析手法であるHiCEP法を用いた網羅的検索の結果、幾つかの標的遺伝子が同定された。これら標的遺伝子がコードするタンパク質には転写因子、サイトカイニン代謝酵素、病害応答性タンパク質など多種多様なものが含まれる。このことはサイトカイニンの初期応答の大部分がARR1および同様の性質を持つ転写因子型(タイプB)レスポンスレギュレーターを介して制御されていることを示唆するものである。サイトカイニン受容体遺伝子の一つであるCRE1/AHK4の変異体wooden legでは根の維管束における細胞増殖および分化に異常を持つため、根の伸長が著しく阻害される。この変異体内で構成的転写活性化能を持つ改変ARR1タンパク質遺伝子をCRE1/AHK4プロモーターを用いて発現させたところ、完全ではないが、維管束細胞の増殖分化および根の伸長を回復させることができた。このことはCRE1下流のサイトカイニンシグナル伝達のおそらく大部分がARR1および同様の性質を持つ転写因子型(タイプB)レスポンスレギュレーターを介した経路で行われていることを示唆するものである。His・Aspリン酸リレー系がどのような形で植物の細胞内情報伝達経路に組み込まれているのかを知るため、我々はこれまでにシロイヌナズナのレスポンスレギュレーター遺伝子の単離を試み、ARR1およびARR2を得ている。1次構造解析の結果、これらがコードするタンパク質はレシーバードメイン以外にMyb型のDNA結合ドメインを有することが判った。このことは、これらのタンパク質が転写因子としての機能を有することを示唆するものなので、それを検証する実験を行った。まず、GUSとの融合タンパク質を用いたトランジェント発現および形質転換植物の実験においてARR1およびARR2はレシーバードメインへのシグナル非依存的に核に局在すること、およびGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質を用いたトランジェント発現実験においてC末に存在するグルタミンに富んだ領域が転写活性化ドメインとして働くことが判明した。また、in vitroにおけるタンパク質機能解析から、これらのタンパク質のMybドメインは5ユーAGATT-3ユをコンセンサスとするDNA塩基配列に特異的に結合することが判った。さらに、トランジェント発現実験において、ARR1およびARR2はそのコンセンサス配列を含むプロモーターからの転写を活性化した。このことにより、植物のHis・Aspリン酸リレー系の少なくとも一部は原核生物の場合と同様に遺伝子の転写調節へと直接つながっていることが証明された。ARR1およびARR2はシロイヌナズナのHis・Aspリン酸リレー系を構成するレスポンスレギュレーターである。我々はこれまでに、ARR1およびARR2がMyb型DNA結合ドメインを有する転写活性化因子として働くことを示してきた。今年度においては、それらの植物体内でのシグナル伝達および転写調節機構への関わりを調べるため、ARR1およびその改変タンパク質を異所的に過剰発現する形質転換植物体を作成し、それらが植物に与える影響を解析した。その結果、レシーバードメインを除いたARR1改変タンパク質を過剰発現させた植物体では緑色のカルスや異所的なシュート形成が観察された。また、ARR1の過剰発現固体ではサイトカイニンに対する感受性が高まっていることが判った。それに対してARR1欠質型突然変異体ではサイトカイニンに対する感受性が低下していた。さらに、誘導系を用いた実験から、ARR1はサイトカイニンの初期応答遺伝子の一つであるARR6を直接認識し、その転写を活性化できることが明らかになった。これらのことから、ARR1はサイトカイニン受容体であるCRE1/AHK4から始まるHis・Aspリン酸リレーの構成因子として働き、初期応答遺伝子の転写を活性化すると結論付けられた。本研究では、シロイヌナズナの転写因子型レスポンスレギュレーターARR1およびARR2の機能解析を通して、高等植物におけるリン酸リレー型情報伝達系が細胞外刺激応答の制御にどのように関わっているのかを解明することを目的としている。これまでにARR1遺伝子の機能欠失型突然変異体(arr1-1)が得られている。その突然変異体では、通常の成育条件において表現型は見られないが、緑色カルス誘導実験および根の伸長阻害実験においてサイトカイニンに対する感受性の低下が観察されている。ARR1と非常に類似性の高い遺伝子であるARR2に関して、機能欠失をもたらすトランスポゾンの挿入を有する株を入手し、その挿入をホモに持つ系統(arr2-1)を確立した。さらに、arr1-1とarr2-1を掛け合わせることにより、両遺伝子の機能を欠失した二重突然変異体を作成した。これらの変異体に対する解析を行っているが、arr1-1の場合と同様に通常の成育条件において表現型は見られていない。形質転換シロイヌナズナにおいて、ARR1タンパク質の転写活性化因子としての機能をグルココルチコイド依存的に誘導できる系が確立されており、これまでにその系を用いて複数のtype-A ARR遺伝子がARR1転写因子の直接の標的であることが判明している。この形質転換シロイヌナズナにおいてグルココルチコイド誘導的に転写活性化が起こる遺伝子を、cDNAマイクロアレイをスクリーニングすることにより検索し、ARR1の標的遺伝子の候補とした。

その結果、標的遺伝子候補として幾つかのtype-A ARR遺伝子が検出され、この検索系が有効であることが判明した。さらに得られている多数の候補に対して、個別の遺伝子をプローブとしたノーザン解析により吟味し、type-A ARR遺伝子以外のARR1標的遺伝子の同定を進めている。これまでの当研究において、シロイヌナズナのHis-Aspリン酸リレー型シグナル伝達に関与する転写因子型レスポンスレギュレーターであるARR1およびARR2がサイトカイニンの細胞内シグナル伝達に関わり、サイトカイニンに対する初発応答遺伝子の転写活性化を行うことが示されている。平成15年度においては、これらの転写因子が直接転写調節を行う標的遺伝子を明らかにすることにより、初発応答遺伝子からサイトカイニン応答現象に至る経路を解明しようとした。その結果、これまでに初発応答遺伝子であると報告されていた非転写因子型レスポンスレギュレーター遺伝子はすべてARR1の標的遺伝子になり得ることが明らかになった。その他サイトカイニンに対する早期応答遺伝子であると報告されているものに関して解析を行った結果、それらを初発応答遺伝子と2次的な応答遺伝子とに分別することができ、さらに初発応答遺伝子をARR1が直接制御するものとそうでないものに分別できた。これらのことから、サイトカイニンに対する初発応答遺伝子の転写制御には、ARR1やその類似タンパク質以外にも他の転写因子が関与することが示唆された。また、ARR1が植物体内において、サイトカイニン受容体であるWOL/CRE1からの情報伝達の下流に位置するかどうかを検討するため、wol突然変異体の表現型をARR1による標的遺伝子の転写活性化が相補できるかどうか調べた。その結果、構成的転写活性化能を有する変異型ARR1をWOL/CRE1のプロモーターの制御下で発現させたとき、wol突然変異体の根における表現型が部分的に回復することが示された。このことは、少なくとも根においてARR1がWOL/CRE1の下流で働いていることを示す。His-Aspリン酸リレーがARR1を介してどのようなサイトカイニン応答現象へとつながるのかを調べるため、ARR1が標的とする遺伝子の同定を行った。その結果、サイトカイニン初発応答遺伝子であることが知られている10個のタイプAレスポンスレギュレーター遺伝子は全てARR1により認識制御され得ることが判つた。また、サイトカイニン初期応答遺伝子についてもそれらの多くのものがサイトカイニン初発応答遺伝子であり、ARR1によって認識制御され得ることが明らかになった。さらに、定量性に優れた遺伝子発現解析手法であるHiCEP法を用いた網羅的検索の結果、幾つかの標的遺伝子が同定された。
融合プロテオミクスによるがん診断の新戦略

がん研究におけるプロテオミクス解析の最も有効なストラテジーを構築するため、最先端の高感度・分解能・解析速度をもつプロテオミクス解析技術のがん研究への応用と方法論の確立を行っている。本年度は脳神経系腫瘍の薬剤治療標的となりうる分子シグナルを検索するため、病態組織細胞サンプルを用いた統合プロテオミクスの方法論確立を試みた。分子発現差異解析法であるiTRAQ(8Plex)法、2D-DIGE法、およびDNA arrayを融合的に用いて同一サンプル群を同時に解析し、得られたすべての情報を統合マイニングすることによって、病態において異常に制御されたシグナル伝達経路を特異的に抽出する方法論を検討した。全てのデータを統合マイニングし、重要分子シグナル群を抽出するための統合マイニング解析プログラム[MANGO (Mol.Cell.Proteomics 2009), iPEACH(特願2010-81525)]を考案し、さらに抽出重要分子群の迅速検証法、siRNA、阻害剤、活性化剤等を用いた生物学的機能解析法などを検討することによって、スタンダードとなりうる一連の統合的方法論の開発を行った。特に悪性グリオーマの薬剤感受性に関わる分子群の解析、および検証に応用し、新規の抗がん剤感受性低下に関わるシグナルVimentin activation loopを見出した(特願2010-81524)。又、如何に融合技術によって大量に得られたプロテオームデータを迅速に処理し、重要機能分子群を抽出して検証する方法論が重要かつ有用であるか、創薬の観点から考察した。これらの方法論はすべての疾患・病態の解析はもとより、細胞生物学における基礎的な分子メカニズム情報を得るためのアプローチにも応用でき、蓄積されたデータベースを活用することによって、新しい病態メカニズムの解明や診断や治療のマーカー・創薬開発に重要な基礎情報を得る方法論として有用であると考えられる。昨年度に引き続き各種脳腫瘍の解析とそれらのProteome Data Baseの開発に加え、方法論を他の癌腫へ応用すると共に、プロトコールの最適化と迅速な検証法および定量化の検討を行った。特に、悪性glioma組織細胞、胆管がん細胞、褐色細胞腫、神経系腫瘍細胞等を用いて、各種蛍光/安定同位体標識差異解析法を中心に検討し、fatmolのレベルの組織由来蛋白質の同定と、定量的差異解析を可能とする技術(主にiTRAQ法、2D-DIGE法)の高感度定量化を検討し、約5000個の蛋白質の定量的同定に成功した。又、同じサンプルを用いてトランスクリプトーム解析を行い、mRNA発現解析データとプロテミクスのデータを統合マイニングする技術をソフト化し、様々なdifferential解析に応用することによってglioma発現蛋白質合計14000個の中から多数の新規分子群の同定を可能とした。Glioma, Cholangiocarcinoma, Pheochromocytomaの形成進行に関連して変化する蛋白質群の中から、gliomaに関しては抗癌剤耐性に関連するシグナル分子群(EGFR-MAPK, PI3K-AKT,血管透過性、細胞周期、細胞接着因子、核レセプター関連等)、胆管がんにおいては未分化型特異的分子群(MetAP2,Galectin3等)、Pheochromocytomaに於いては神経系分化に関わる分子群(CRMP2, 14-3-3, TCTP, PAIRBP1, ThyA1, NRAGE等)の抽出に成功した。又、これら同定分子群の抗体ライブラリーの作成と高感度auto2D-Western-Blottingによる迅速な検証法と細胞生物学的検証法、および再現性のある定量法を検討し、同定蛋白質群の経時的な発現変動の有意性を確認するとともに、本法論の有用性を証明した。

これらの方法論はすべての疾患・病態の解析はもとより、細胞生物学における基礎的な分子メカニズム情報を得るためのアプローチにも応用でき、蓄積されたデータベースを活用することによって、新しい病態メカニズムの解明や診断や治療のマーカー・創薬開発に重要な基礎情報を得る方法論として有用であると考えられる。
資本勘定の動向とアジア金融危機

理論的に言えば、外部要因(例えば国際利子率低下)によって資本が流出した場合、資本流出は国内利子率を国際水準まで低下させる。しかしながら、アジア通貨危機の打撃を受けた国々(本論では、インドネシア、韓国、マレーシアとタイとする。)は、1990年から1996年にかけて巨額の資本流入がありながらも国内の利子は高水準値であり続け、かつ為替レートは安定し続けた。本論では、この国内の高利子水準のことを「利子プレミアム・パズル」と呼ぶ。本研究は、アジア通貨危機の打撃を受けた国々(本論では、インドネシア、韓国、マレーシアとタイとする。)において危機以前の多量の資本流入時期における利子プレミアムパズルの可能な説明を模索した。そして、本論ではで国内高利子率をもたらす多量の資本流入と不胎化政策という定型化された事実を紹介する。そして、マンデル=フレミングIS-LM-BPという一つの理論的フレームワークを導入し、そして高利子率の説明としての金融当局の行動を指摘しつつ、本論ではアジア通貨危機の国々における危機前の高利子率が超大量資本流入に対する政策的対応だということを導く。そして、BernankeとBlinderのCC-LMモデルを用いと資産価値の高騰を導きながら金融当局が貸付経路を通じて国内利子率にどのように影響を与えるかを検証する。更に、本論では利子プレミアム・パズルを説明しうるミクロ経済学的モデルを用いて金融市場構造の問題と国際金融市場自由化の結果も検討する。民間資本移動とアジア金融危機-実証的分析本研究は、アジア金融危機の原因を実証的に検討したものである。危機に陥ったインドネシア、韓国、マレーシア、タイの各国には1990年代前半に巨額の民間資金が流入した。この巨額の民間資金が、経常収支を悪化、国内銀行部門の脆弱性、実質為替レートの切り上げを招き、アジア危機の原因をつくったと考えられている。本研究では、グレンジャー因果テストを用いて、民間資金の流入が他の経済諸変数に影響を与えたことを確認している。この結果、民間資本流入が、(1)マネーサプライ増と銀行部門の貸し出しブーム、(2)物価上昇と実質為替レートの切り上げ、の原因であることが実証的にも確認された。さらに本研究では、民間資本流入がどのように経常収支悪化をもたらしたかを経常収支を決定する諸要因に分解することによって明らかにしている。経常収支を悪化させた要因は、消費を中心とする国内アブソープションの増加と、実質為替切り上げによる国際競争力の低下である。巨額の資金流入に対して、各国の中央銀行は不胎化政策を実行したが、それは国内金利を高水準に維持し、さらなる資金の流入を招き、その結果銀行部門の脆弱性を増大させることになった。この関係は、金利裁定式を計測することによって確認できる。各国の国内金利とカバーなしの(uncovered)裁定金利の差を計測すると、危機直前の1990年代前半には、1980年代と比べて、その差が拡大していることがわかる。スタンダードなIS-LMモデルに則して考えると、金利水準は(1)中央銀行による資本流入の不胎化、(2)中央銀行による国内安定化政策、の2つの帰結である。Vector error correction model分析によると、危機に陥ったアジア各国においてもこれらの政策が高金利水準に強い影響を与えていたことが確認できる。これらの点から、巨額の資金流入は中央銀行の不胎化政策の結果である可能性が指摘される。すなわち、資金流入に対してとられた金融政策がむしろ危機の原因になった可能性があると考えられるのである。
薬物モデルを用いた精神分裂病症状の発現に関する脳内神経回路の研究

精神分裂病(分裂病)の症状発現に関与する脳内の神経回路を明らかにする目的で、分裂病様症状発現薬であるmethamphetamine(MAP),cocaineあるいはphencyclidine(PCP)を投与したラットにおいて、神経活動の変化を反映すると考えられる最初期遺伝子c-fosの発現パターンや、ドーパミン(DA)代謝の変化を検討した。成熟期では、MAP急性投与によってc-Fos様免疫反応陽性細胞が脳の広い範囲にわたって出現し、この作用はDA受容体アンタゴニストの前処置によって抑制された。幼若期(生後8日以降)にMAPを投与すると、大脳旧皮質や皮質下の組織におけるc-Fos陽性細胞の分布パターンは成熟期と類似しているが、大脳新皮質においては著しい差異が認められた。この幼若期のパターンは、分裂病の再発の一モデルと考えられる逆耐性現象が形成され始める生後3週頃に成熟期のパターンに近づいた。大脳皮質におけるMAP誘導性c-fos発現の発達による変化は、ノーザンブロット分析によっても確認された。MAP急性投与のc-Fos陽性細胞の分布パターンは、幼若期、成熟期双方ともに、cocaineやDA受容体アゴニストであるapomorphineと類似していた。PCP投与後のc-Fos陽性細胞の分布も発達に伴って変化したが、MAP、cocaineとは異なり、NMDA受容体アンタゴニストdizocilpineと同様のパターンを示した。また、成熟期のラットにおけるPCP投与後の細胞外液中DA量の増加は、前頭葉で著しく線条体では軽度であり、神経インパルスフローに依存性であったのに対し、MAPによる増加は双方の脳部位で著しく、インパルスフローには依存しなかった。以上のように、MAPおよびcocaineは、PCPとは異なる脳内神経活動の変化を引き起こすことがわかり、これらの薬物による臨床症状の違いを反映すると考えられた。また、c-fos遺伝子発現の生後発達による変化は、薬物による分裂病様症状あるいは逆耐性現象の発現が、大脳新皮質の神経回路の発達と関係する可能性を示唆している。一方、抗PCPおよび抗MAP作用を示すD-セリンが、ラットばかりでなくヒトやマウスにおいても内在性物質であることや、脳選択的でNMDA受容体と類似した分布を示すことを明らかにした。D-セリンはNMDA受容体のグリシン部位に選択的なアゴニストとして作用することから、これらの所見は、D-セリンが哺乳類の脳でグリシン部位の内在性リガンドとして機能し、神経精神機能の調節にも関与する可能性を示唆している。免疫組織化学法、in situハイブリダイゼイション法およびノーザンブロット解析法などを用い、分裂病様症状惹起薬物を投与したラットの脳に発現する最初期遺伝子c-fosの分布パターンとその発達による変化を調べ、分裂病の再発や発症のモデルと考えられる、これらの薬物による逆耐性現象との関連を検討した。

Methamphetamine(MAP)あるいはcocaineを成熟ラットに投与すると、脳の広汎な部位でc-Fos蛋白様免疫反応性(免疫組織化学:投与後4時間)およびc-fos-mRNAのシグナル(in situハイブリダイゼイション:投与後1時間)が認められ、特に大脳旧皮質や大脳新皮質のIIからVI層(深部を除く)で分布密度が高い特徴があった。逆耐性が生じない幼若ラットにおけるMAP急性投与後のc-Fos陽性細胞の分布は、大脳旧皮質や皮質下の組織では成熟期と類似しているのに対して、大脳新皮質では全く異なり第VI層の深部に限局することがわかった。この幼若期のパターンは、逆耐性形成の臨界期である生後21-25日頃に、成熟期のパターンに近づいた。ノーザンブロット解析では、成熟ラットの大脳旧皮質、大脳新皮質、線条体などで、MAP急性投与後(1時間)に明らかなc-fos-mRNAの発現が認められたが、海馬ではシグナルはほとんど検出できなかった。各組織におけるMAP投与後のc-fos-mRNAの発現量は、生後発達に伴って増加する傾向が見られた。このうち、大脳新皮質の変化が最も大きく、生後21日頃に成熟期とほぼ同等の発現量を示した。これらの所見は、免疫組織化学の結果と一致した。c-fos遺伝子の発現は、一定の刺激による脳局所の活動性変化を反映すると考えられている。したがって本研究の結果は、発達の一定段階から出現する大脳新皮質の神経回路と逆耐性現象との関連を示唆している。初年度に引き続いて、分裂病様症状惹起薬を投与したラットの脳における最初期遺伝子c-fosの発現パターンとその発達に伴う変化を調べた。一部の実験では、ドーパミン(DA)代謝の変化もあわせて検討した。成熟期では、metham phetamine(MAP)とcocaineの急性投与によってc-Fos様免疫反応陽性細胞が脳の広い範囲にわたって出現するが、そのパターンは、DA受容体アゴニストであるapomorphineと類似していた。Phencyclidine(PCP)はこれらとは異なり、NMDA受容体アンタゴニストdizocilpineと同様のパターンを示すことがわかった。また、MAP投与後のc-Fosの発現は、DA受容体アンタゴニストの前処置によって抑制された。MAP、cocaineおよびPCPによる脳内c-fos遺伝子の発現パターンは、生後発達に伴って変化し、特に大脳新皮質における変化がもっとも著しかった。生後8日の幼若ラットにおける発現パターンを比較すると、MAPとcocaineはapomorphineに類似し、PCPはdizocilpineに類似していた。一方、成熟期のラットにおけるPCP投与後の細胞外液中DA量の増加は、前頭葉で著しく線条体では軽度であり、神経インパルスフローに依存性であったのに対し、MAPによる増加は双方の脳部位で著しく、インパルスフローには依存しなかった。以上の結果から、c-fos遺伝子の発現を指標として、MAPおよびcocaineは、PCPとは異なる脳内神経活動の変化を引き起こすことがわかり、これらの薬物による臨床症状の違いを反映すると考えられた。また、c-fos遺伝子発現の生後発達の研究は、薬物による分裂病様症状の発現が、大脳新皮質の神経回路の発達と関係する可能性を示唆している。さらに、DA遊離の実験でも、MAPとPCPとの間に作用差が認められ、
仔稚魚消化生理の個体発生:消化管ホルモンの産生動態による解明

昨年成功したニシンCCKのクローニングならびに脳や消化管におけるCCKmRNAの発現状況を論文としてまとめている。また、昨年に引き続き、クローニングにより得られたニシンCCKプローブを用いてin situ hybridizationを行った。当初はクリオスタットによる凍結切片を用いてin situ hybridizationを行ったが、ニシン仔魚の場合、凍結切片では組織がぼろぼろになりがちできれいな組織切片を得るのが難しかったため、パラフィン切片をin situ hybridizationに使えるように方法の改善を行った。その後、個体発生を追ったサンプル(ふ化後0日から43日)を用いてCCKの発現時期や部位をin situ hybridizationで調べた。さらに異なる発育段階において1日から3日間絶食した個体を用いて、CCKの分布様式に違いがあるかについても調べた。以上の結果を論文にまとめているところである。なおこの結果を、2004年5月にタイ国プーケットで開かれるThe Eleventh International Symposium on Nutrition & Feeding in Fishにおいて発表する予定である。今までに受理された大西洋オヒョウ、クロマグロ、アユの免疫染色によるCCKの発現時期と発現部位についての論文と、さらにクローニング、in situ hybridizationで調べたニシンCCKに関する知見をあわせて、異なる消化管形態を持つ仔稚魚におけるCCKの分布様式、ならびにCCKのターゲットとする膵臓や胆のうの発現時期や配置などの消化生理について論文にまとめる予定である。昨年から行っているニシンCCKのクローニングが進み、4月には3'RACE,そして5月には5'RACEの結果を得ることができ、それを元に作った新しいプライマーでCCKの全長を6月に明らかにすることができた。また、昨年作成したニシンCCKプローブを用いて稚魚の脳や消化管をin situ hybridizationで染め、CCKの発現箇所を確認した。以上の結果を元に論文としてまとめているところである。さらには、ニシン仔魚の個体発生を追って得たサンプルを用いて、CCKの発現時期や箇所をin situで調べているところである。SARSIAに投稿中であったクロマグロにおけるCCKの発現時期と発現部位についての論文が、4月に受理された。7月下旬にはベルゲンで開かれたLarval Fish Conferenceに参加した。CCKを免疫染色で調べた私のデータと、CCKを放射線同位体を用いて定量した共同研究者であるベルゲン大学のC.R.Rojas-Garcia氏のデータをまとめてポスター発表を行った。CCKのクローニングを大西洋オヒョウと大西洋マダラでも行うことになり、まずはオヒョウでのクローニングを10月より進めた。種間でもあまり違いのない保存された領域を元に作成したプライマーを用いてオヒョウでもCCK断片を得ることができ、さらに3'RACE,5'RACEに取り組んでいる。既存のアユにおけるCCKの発現時期と発現部位のデータに、共同研究者である養殖研の黒川忠英先生が行ったトリプシンの免疫染色のデータを加えて論文にまとめ、General and Comparative Endocrynologyに現在投稿中である。
遺伝子組み替えヒトBMPを用いた能動的骨欠損補填法

我々は従来行われてきた人工生体材料による顎骨欠損補填ではなく,遺伝子組み替え型ヒト骨形成因子(rhBMP-2)を加えることで骨誘導能を用いた顎骨欠損の補填を考え,これを能動的骨欠損補填法と提唱し,研究成果を報告してきた.この方法を用いると,歯周組織より大きな口腔外科領域の骨欠損でも確実に骨組織を再生させることが可能であり,再現性のある動物実験の結果がこれまでに十分得られてきた.さらに我々は,このようにして再生された骨組織は顎骨の形態の回復のみならず咀嚼機能をも同時に回復することが望まれると考え,再生した骨組織にデンタルインプラントを植立し,再生した骨組織が咀嚼機能を果たすことができるかどうかを検討した。イヌの下顎臼歯部に幅20mmの区域切除を行い,作成した顎提欠損に対して遺伝子組み替え型ヒト骨形成因子を用いて骨組織を再生させた.顎骨切除から16週後にこの新生した骨組織にデンタルインプラントを植立した.インプラント植立後,経時的にエックス線学的ならびに病理組織学的に検索したところ,4週後でも骨接合が観察されており,これは経時的に増加しており,さらにインプラント体周囲の新生骨についても,組織学的に成熟していくことが観察された.我々は,このデンタルインプラントに上部構造を装着し実際に咬合させることを試みており,再生させた骨組織でも十分に骨組織としての機能をもち,我々の提唱する能動的骨欠損補填法を用いることにより,顎骨の形態の回復のみならず咀嚼機能をも同時に回復することが分った。一方,骨形成因子(rhBMP-2)の投与を考える上では,担体についての研究,他の成長因子との相互作用などについて基礎的な研究も不可欠であり,それらの成果についても随時発表してきた.我々のこれまでの研究成果では,能動的骨欠損補填法は臨床的に十分応用可能であることが示唆されており,さらに研究を進め,より安全,簡便で確実な骨組織の再生法を目指す。これまで我々はイヌ下顎骨に顎骨嚢胞を想定した顎骨欠損を作製し、ポリ乳酸ポリグリコール酸の共重合体を担体としてrhBMP-2を適用し、骨欠損の補填に有用であることを見いだし、学会などで報告してきた。この流れから、口腔外科の臨床に即したより大きな顎骨欠損を作製し顎骨の再建まで可能であるかどうかをイヌを用いて実験を試みた。まず抜歯後のイヌ下顎骨に15×8×7mmの辺縁切除を行い、ここにスポンジ状の担体(PGS)のみ、あるいはBMPを含む担体を填入して骨組織の再生について検討した。続いて下顎骨に幅20mmの区域切除を行い、ここにチタンミニプレートを併用してBMPを用い顎骨再建を行った。その結果骨組織の新生は術後2週目頃より経時的に増加し、顎骨切除後約8週ではX線的にはほとんど骨欠損部は不透過像で占められた。3次元CTの所見では、術後8週頃までは形成された新生骨で欠損部周囲の骨の表面は凹凸があり不正であるが、術後16週頃になると骨のリモデリングが進み骨の表面は滑らかになり、本来の下顎骨の形態に近づくことが観察された。さらにpQCTを用いて形成された骨組織の性質を調べたところ、辺縁切除では術後12週、区域切除では術後16週でほぼ再生された骨組織の骨密度は本来の母床骨(皮質骨)の骨密度に等しくなった。

以上のことより、BMPは顎骨切除のような口腔内の大きな骨欠損でも術後12週-16週で本来の組織にかなり近い骨組織を再生することが確認された。現在はイヌ下顎骨に再生された骨組織に人工歯根を植立することができるかどうか検索するとともに、より大きな動物(サル)での実験にもとりかかっている。我々は従来行われてきた人工生体材料にょる顎骨欠損補填ではなく,遺伝子組み替え型ヒト骨形成因子(rhBMP-2)を加えることで骨誘導能を用いた顎骨欠損の補填を考え,これを能動的骨欠損補填法と提唱し,研究成果を報告してきた.この方法を用いると,歯周組織より大きな口腔外科領域の骨欠損でも確実に骨組織を再生させることが可能であり,再現性のある動物実験の結果がこれまでに十分得られてきた.さらに我々は,このようにして再生された骨組織は顎骨の形態の回復のみならず咀嚼機能をも同時に回復することが望まれると考え,再生した骨組織にデンタルインプラントを植立し,再生した骨組織が咀嚼機能を果たすことができるがどうかを検討した.イヌの下顎臼歯部に幅20mmの区域切除を行い,作成した顎提欠損に対して遺伝子組み替え型ヒト骨形成因子を用いて骨組織を再生させた.顎骨切除から16週後にこの新生した骨組織にデンタルインプラントを植立した.インプラント植立後,経時的にエックス線学的ならびに病理組織学的に検索したところ,4週後でも骨接合が観察されており,これは経時的に増加しており,さらにインプラント体周囲の新生骨についても,組織学的に成熟していくことが観察された.我々は,このデンタルインプラントに上部構造を装着し実際に咬合させることを試みており,再生させた骨組織でも十分に骨組織としての機能をもち,我々の提唱する能動的骨欠損補填法を用いることにより,顎骨の形態の回復のみならず咀嚼機能をも同時に回復することが分った。一方,骨形成因子(rhBMP-2)の投与を考える上では,担体についての研究,他の成長因子との相互作用などについて基礎的な研究も不可欠であり,それらの成果についても随時発表してきた.我々のこれまでの研究成果では,能動的骨欠損補填法は臨床的に十分応用可能であることが示唆されており,さらに研究を進め,より安全,簡便で確実な骨組織の再生法を目指す。
プリオン蛋白質は耐性ウイルスを誘導しない夢のインフルエンザ薬のターゲットである

我々は、プリオン蛋白質欠損マウスがA型インフルエンザウイルス感染に対して高感受性で、高い死亡率で死亡するという我々の発見に基づき、本研究ではプリオン蛋白質がA型インフルエンザウイルス感染に対して防御的に機能するメカニズムを解明することにした。我々は、本研究において、プリオン蛋白質は銅イオンと結合し結合した銅イオンを活性酸素種(ROS)の不活化酵素である銅/亜鉛依存性スーパーオキサイドジスムターゼに受け渡し、スーパーオキサイドジスムターゼが活性化することを見出した。また、スーパーオキサイドジスムターゼの活性化により、A型インフルエンザウイルス感染により生じたROSが不活化され、その結果肺上皮細胞のアポトーシスが抑制されることも見いだした。これらの結果は、プリオン蛋白質が抗酸化機能を有し、その結果A型インフルエンザウイルス感染に対して防御的に機能することを示唆した。次に我々は、プリオン蛋白質がA型インフルエンザウイルス感染の治療ターゲット分子となり得るのか調べた。我々は、抗プリオン蛋白質抗体をマウスに投与すると、A型インフルエンザウイルス感染による死亡率が著名に改善することを見出した。また我々は、マクロファージに発現するSrcファミリーキナーゼが抗プリオン蛋白質抗体により活性化されることが、抗プリオン蛋白質抗体による抗インフルエンザ活性に重要であることを見出した。これらの結果は、抗プリオン蛋白質抗体がマクロファージのプリオンタンパク質に結合しSrcファミリーキナーゼを活性化し、その結果マクロファージが活性化され抗インフルエンザ活性が発揮される可能性を示した。またこれらの結果は、プリオン蛋白質がA型インフルエンザウイルス感染の治療ターゲット分子となり得る可能性も示した。本研究では、宿主タンパク質であるプリオンタンパク質がA型インフルエンザウイルス感染に対してどのような役割を担っているのか明らかにするとともに、そのメカニズムを解明する事を目的としている。我々は、プリオンタンパク質が1型および2型の肺上皮細胞やクララ細胞に発現する事を明らかにし、またプリオンタンパク質欠損マウスがA型インフルエンザウイルスの鼻腔内感染に対して脆弱で、コントロールの野生型マウスと比べて、著名な肺炎像を呈し、高い死亡率で死亡する事を明らかにした。これらの結果は、プリオンタンパク質がA型インフルエンザウイルス感染による肺炎を抑制し、A型インフルエンザウイルス感染に対し防御的に機能する事を示した。また我々は、銅結合領域であるヒスチジン豊富な領域(オクタペプチドリピート領域)を欠いたプリオンタンパク質には、A型インフルエンザウイルス感染に対する防御的な機能がない事を明らかにし、銅の結合がプリオンタンパク質のA型インフルエンザウイルス感染に対する防御機能に重要である可能性を示した。実際、プリオンタンパク質欠損マウスやオクタペプチドリピート領域を欠いたプリオンタンパク質発現マウスの肺内では、銅の含有量が低下していた。また、コントロールの野生型マウスと比べて、プリオンタンパク質欠損マウスの肺内では銅依存性のスーパーオキシドジスムターゼの酵素活性が低下し、A型インフルエンザウイルス感染後の活性酸素種の量が増加していた。さらに、活性酸素種のキレート剤をプリオンタンパク質欠損マウスに投与すると、A型インフルエンザウイルス感染に対する脆弱性が回復された。以上の結果は、プリオンタンパク質が銅に結合し、その銅を銅依存性のスーパーオキシドジスムターゼに受け渡しその酵素活性を調節し、A型インフルエンザウイルス感染により産生される活性酸素種を抑制し、最終的に防御的に機能する可能性を示している。プリオンタンパク質によるA型インフルエンザウイルス感染に対する防御メカニズムを明らかにすることができた。また、これらの研究成果をまため、論文を投稿した。現在、その論文はPLOS Pathogens, in revisionである。今後、プリオンタンパク質のA型インフルエンザウイルス感染に対する防御機能を活性化し、A型インフルエンザウイルス感染を治療する方法を開発する。一つ目として、プリオンタンパク質に対する抗体がA型インフルエンザウイルス感染に対する防御機能を活性化するのか調べる。さらに、これらの抗体がA型インフルエンザウイルス感染に対して治療効果を発揮するのか、マウスモデルを用いて解析する。また、これらの抗体に治療効果が認められれば、そのメカニズムも明らかにする。

二つ目は、プリオンタンパク質に結合し、プリオンタンパク質のA型インフルエンザウイルス感染に対する防御機能を活性化する化合物を同定する。同定した化合物については、A型インフルエンザウイルス感染に対して治療効果を発揮するのか、マウスモデルを用いて解析する。現在投稿している論文がin revisionであるために、論文が受理されれば、その論文の掲載費と校正費に使用する。
中堅期教師の国語科実践的知識の研究

初任期の教師が、同僚メンターとしてのベテラン教師に学びながら実践的知識を成長させ、中堅期の教師になっていく過程を観察データやインタビューによって記述し、分析した。その事例研究の結果、実践的知識を成長させる契機として、四点を明らかにした。また、初任期教師を中堅期教師に育てていくメンターとしての教師自身が、養成時代から入職後の約十年間で、どのように中堅期教師として自らを成長させていったのかを事例研究した。その結果、実践的知識の成長の契機として、五点を明らかにした。教師は、初任期のおよそ十年前後を経て、中堅期に入ってくる。優れた教育実践が展開できるようになるかどうかは、初任期から中堅期へと移行する時期にかかっている。現在、20代の初任期の教師が大量採用され、初任期から中堅期へと移行する彼らを職場で育てていくことがきわめて重要であるが、そのための知見が解明されているとは言い難い。教師教育の観点からは、この時期の研究が切望されている。そこで本研究は、教師の中堅期における国語科授業に的を絞って、教師生活の転機における実践的知識の成長を分析し、また同僚性を発揮して相互の成長を図る様相を分析して、中堅期の教師が反省的実践家として国語科における実践的知識を形成していく具体相を明らかにする目的で行われている。研究の2年目である2012年度は、以下の4つの取り組みを行った。1)文献による先行研究や関連研究の検討。2)初任期から中堅期に移行する時期の小学校教師Aさんの実践のデータ収集とインタビューデータの収集。3)教師Aさんを支え育てた、熟達期の教師Bさんへのインタビューデータの収集。4)上記データの分析と理論的仮説の析出。これらの結果、教師が反省的実践家として国語科における実践的知識を形成していく過程として、以下のような中間的な成果が得られた。1児童になってみて、児童の側からの見えを体感するという方法で暗黙知を理解しようとしている。2「脱文脈化」されている実践の表象を「再文脈化」し、自分の授業スタイルになじませていっている。3他の教科学習での成功事例を国語科にも応用していく。4ベテランのメンターが持つ価値観が埋め込まれた学校文化に参加することによって、省察を繰り返して学んでいく。1なってみることで暗黙知を理解する。2なじませていき「はまりどころをみつける」。3たとえて広げる。4学校文化の中で省察する。1基底となる本質的な知識の重要性。2充実したメンタリング体験。3乗り越え経験。4子どもから教えられる。5同僚性とその継承。教師の初任期は、入職後のおよそ十年間である。思い描いていたものとは異なる現実にショックを受けながらも、試行錯誤しながら無我夢中で実践を行い、次第に自己の実践課題が明確となる時期である。こうした初任期のおよそ十年前後を経て、中堅期に入ってくる。教師になって三年から五年前後で、教師としてのおよその基本的な力量は形成される。その後、優れた教育実践が展開できるようになるかどうかは、初任期から中堅期へと移行する時期にかかっている。研究の初年度である2011年度は、以下の2つの具体的な取り組みをした。(1)文献研究による先行研究と分析枠組みの確認。(2)実践のデータ収集。初任期から中堅期に移行する時期の小学校教師の授業実践を記録すること、教師にインタビューして、教職経験の具体を聞くこと。これらの結果、以下のような中間的な成果が得られた。(1)初任期教師が、児童に仮想的になってみることで、ベテラン教師の暗黙知を理解することができる。(2)ベテラン教師の実践的知識を初任期教師は試行錯誤しながら我がものとしてなじませていく時期がある。

(3)初任期教師は、我がものとした実践的知識をたとえて広げることで、他教科・他学年に拡張していく。(4)教師は、実践的知識を学校文化の中で省察することで身体化していく。ほぼ順調に進んでいる。研究2年目の2012年度は、およそ2つの取り組みを行う計画であった。1文献研究による分析枠組みの修整2データの分析・解釈の深化と補足1に関しては、関連分野の研究に学びながら、分析枠組みの修整を行うことができた。とりわけ、「暗黙知」に関して深めることができた。2のデータの分析・解釈の深化と補足は、1年目に集めた初任期から中堅期へ移行する時期の教師Aさん(年齢的には二〇歳代後半)のデータに加えて、さらにもう1人の小学校教師のデータを収集することができた。こちらは、教師Aさんを支え育てた、熟達期の教師Bさんである。Aさんのデータだけではなく、Aさんを支えたベテランのメンターとしてのBさんのデータを得ることによって、同僚性についてさらに分析と解釈を深化させることができた。おおむね順調に進んでいる。初年度は、(1)文献研究による先行研究と分析枠組みの確認と(2)実践のデータ収集が主な研究計画であった。(1)に関しては、先行研究の確認や分析枠組みの創設は、ほぼ出来た。(2)の実践データの収集は、初任期から中堅期にかけての教師1人分は確保できた。授業実践記録、教師へのインタビューデータは、蓄積できている。研究3年目の2013年度は、およそ2つの取り組みを行う。1文献研究による分析枠組みの最終的な修整と深化拡充研究3年目は、1・2年目のデータと解釈を基礎にしながら、文献研究によって、分析枠組みの最終的な修整と深化拡充を行いたい。2データの補足と分析・解釈の深化研究1・2年目に集めた初任期から中堅期へ移行する時期の若手教師Aさんのデータと、教師Aさんを支え育てた熟達期の教師Bさんのデータで、不足している分はさらにインタビュー等を行って、補足する。その上で、全てのデータを最終的な分析枠組みによって分析し解釈する作業を深化させる。研究2年目の2012年度は、およそ2つの取り組みを行う。(1)文献研究による分析枠組みの修整2年目は、1年目のデータと解釈を基礎にしながら、分析枠組みを修整し確固たるものにしていく。(2)データの分析・解釈の深化と補足1年目に集めた初任期から中堅期へ移行する時期の教師(年齢的には二〇歳代後半)のデータに加えて、さらにもう1人の小学校教師のデータを収集する。こちらは中堅期に入ってベテランの域に達しようとしている四〇歳代の教師を対象とする。これらを分析し解釈する作業を深化させる。該当なし直接経費800,000円、間接経費240,000円が交付予定額である。直接経費では、(1)研究枠組みを修正したり、教師の実践を理解していくための本やデータ保存していくための機器などの「物品費」を500,000円、(2)学会で情報収集したり、研究成果を発表するために「旅費」を150,000円、(3)インタビューデータなどのテープ起こし代金など「その他」の費目を150,000円、使用する予定である。
包括的アプローチによる分位数回帰の有効推測とその応用

本研究では「分位数回帰モデルの有効推定」を起点として、その応用について取り組んでいる。起点としている有効推定では、分位数回帰モデルの母数は関数として捉える必要があることに着目して、関数空間での考察を与えている。具体的には混合分布モデル(mixture model)とZ推定量の理論から捉え直すことで、より包括的な枠組みの下で統計的推測の有効性を求めた。本年度は、昨年度から引き続き「large p, small n」という高次元小標本データの分析への応用に取り組んだ。ただし、一般的な状況下での結果というよりは、特定の設定下での金融分野での数理計画問題に限定して、その解の統計的な改善を試みた。すなわち、いわゆるコヒーレント性を持つリスク尺度で測ったポートフォリオの構成をより効率的に行う手法を提案した。この導出に際しては、既存の経験確率過程の結果を援用するため、分位数回帰モデルと双対な関係にある回帰順位スコア(regression rank score)を用いるアプローチという形を取ることができる。そのような手法から当該ポートフォリオ問題にアプローチし、バンクーバーでの「JSM 2018」に参加した。JSMでの情報収集などを基に、いくつか残されている課題をクリアして、より一般的な応用ができる形に改善していく予定である。またそこで、本研究の基礎となっている初年度に得た結果について、より簡明な表現と一般化ができることも判明したので、その方向でこれまでの結果も含めて再調整している所である。正確を期するために幾つか精査すべき箇所はあるが、応用などと並行して進められる性質のものであるので、全体としては予定通りの進展と言える。基礎となる結果の整理および雑誌投稿も進めて、高次元小標本データに関する結果についてもより一般的な応用ができる形に改善していく予定である。並行して「研究実施計画」に記載した他の応用についても進めていく予定である。一般の分位数回帰モデルに従う確率変数は一様確率変数を引数とするランダム係数(random coefficient)表現を持つが、まずはこれを一種の混合分布モデル(mixture model)とみなすことにより包括的な枠組みの下で統計的推測の有効性を求めた。元来、分位数回帰モデルが系列の値ではなくその分布的性質を説明するため、母数は関数として考える方が自然である。それは説明変数で張られる空間に観測値の“分布を"分配することになり、関数空間での考察を要する。これについて、ひとまず出たと思われる結果をシアトルでの「JSM 2015」において口頭発表をした。そこでのフィードバックなどを踏まえて現在は雑誌投稿に向けて準備中である。上記の結果を応用する形で、今は確率的検閲(random censoring)されたデータの分析を対象にしている。それは生存時間分析において見られるような、実験対象が期間中にランダムなタイミングで退場してしまう設定である。何も情報が無い状況においては既存の推定量が持つ良い性質が知られているが、分位数回帰モデルとの関連は比較的新しい話題である。この文脈に沿って、本研究が与える推測手法が説明変数の持つ情報を最も有効に反映することが期待される。他に平成27年度には、分布の定義域が両端で繋がっている点が特徴である方向統計学での研究にも携わった。これらは共同研究への参加という形であるが、富山県でのシンポジウムやロンドンでの「CMStatistics 2015」で発表されている。そこでは記述するマルコフ過程によって系列を扱っており、推移確率の時間的発展を円周分布に留める橋渡し(binding)をする関数にも円周分布を使用している。将来的にはその関数の分位数回帰や母数の有効推定を考えて、系列の時間的進展の記述・制御を実現したいと考えている。本研究の基礎となる分位数回帰の有効性を示す際の計算において見直しを要する箇所が判明し、その修正するのに若干想定以上の時間が掛かった。本研究では、新しい視点から得る「分位数回帰モデルの有効推定」とその応用について取り組んでいる。ここで言う“新しい視点"とは、分位数回帰モデルの母数は関数として捉える必要があることに着目して、関数空間での考察を与えている点である。具体的には混合モデル(mixture model)とZ推定量の理論から捉え直している。そこで本年度はその結果の応用として、確率的検閲(random censoring)されたデータの分析を対象とした。それは生存時間分析において見られるような、実験対象が期間中にランダムなタイミングで退場してしまう状況である。何も情報が無い状況においては経験分布に基づいた既存の推定量が持つ良い性質が知られているが、経験分布(の逆関数)が分位数回帰によって説明されているという追加的な情報は推定量の改善を可能にする。ここへ分位数回帰に関する自身の結果を応用することで更なる改善が可能であることをシカゴでの「JSM 2016」において口頭発表をした。さらに別の応用先として、いわゆる「large p, small n」という高次元小標本データの分析を対象に取り組んでいる。そのようなデータの分位数について何らかの条件が課されたり期待できたりするとき、本研究が与える推測手法はその条件付き数理計画問題の解を統計的な意味で改善する。これについては高次元小標本データに関する既存の経験確率過程の結果を援用して実現する予定である。他に平成28年度には、昨年度から共同研究という形で参加している方向統計学での研究が論文として掲載された。

将来的にはそこで扱った橋渡し(binding)関数の分位数回帰や母数の有効推定を考えて、系列の時間的進展の記述・制御を実現したいと考えている。正確を期するために幾つか精査すべき箇所はあるが、応用などと並行して進められる性質のものであるので、全体としては予定通りの進展と言える。本研究では「分位数回帰モデルの有効推定」を起点として、その応用について取り組んでいる。起点としている有効推定では、分位数回帰モデルの母数は関数として捉える必要があることに着目して、関数空間での考察を与えている。具体的には混合分布モデル(mixture model)とZ推定量の理論から捉え直すことで、より包括的な枠組みの下で統計的推測の有効性を求めた。そこで本年度はその結果の応用として、いわゆる「large p, small n」という高次元小標本データの分析を対象に取り組んだ。そのようなデータの分位数について何らかの条件が課されていたり、満たすべき関係が見出されるとき、本研究が与える推測手法はその条件付き数理計画問題の解を統計的な意味で改善する。この“データの分位数に関する制約"というものは、例えば金融分野での応用ではコヒーレント性を持つリスク尺度で測ったポートフォリオの構成などにおいて、間接的ではあれ自ずと生じていることが見られる。そこで、高次元小標本データに関する既存の経験確率過程の結果を援用することで上記の統計的な改善を試みて、ボルチモアでの「JSM 2017」に参加した。ただ、このアプローチではいくつか新しい課題を解決しなければならないことも既に判明していたので、JSMでの情報収集などを基に解決していく予定である。具体的には、分位数回帰モデルと双対問題という近い関係にある回帰順位スコア(regression rank score)からアプローチすることで当該問題点を回避することが期待されるので、これまでの結果をその方向で調整して前進させている所である。本年度は、昨年度から引き続き「large p, small n」という高次元小標本データの分析への応用に取り組んだ。ただし、一般的な状況下での結果というよりは、特定の設定下での金融分野での数理計画問題に限定して、その解の統計的な改善を試みた。すなわち、いわゆるコヒーレント性を持つリスク尺度で測ったポートフォリオの構成をより効率的に行う手法を提案した。