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Ficus属樹木(絞め殺し木)の締め付け力発生に関する組織力学的調査

熱帯生Ficus属(F.benjamina,F.elastica)の根の締め付け力について研究し,その力の発現が今までに明らかにされてきた樹幹木部の成長応力発現のメカニズムで説明できるかどうかを検討することを目的とした。表面成長応力解放ひずみの測定から,樹木の場合と同様に繊維方向に引張,接線方向に圧縮の応力が発生していることが示された.樹木の樹幹と最も異なっていた点はゼラチン繊維分布の様子である.広葉樹の場合,傾斜して成育する樹幹の上側にゼラチン繊維が分布するが,Ficusの木根では髄付近に同心円状に形成・分布し,とくに直径の小さい気根では二次木部全体に分布する.これにより,細い気根では横断面全体に引張応力が発現していたと考えられる.肥大成長して太くなると髄付近を除いてゼラチン繊維が形成されなくなることから,引張応力は気根の肥大とともに小さくなっていくようである.実際,細い気根の方が表面成長応力解放ひずみの値は大きく,太くなると小さくなる傾向にあった.しかしながら,気根が締め付ける力は直径が大きくなるほど大きくなった.Ficus属の気根の締め付けに必要な軸方向応力は,ゼラチン繊維を形成することによって発生し,樹木の場合と同様にセルロースミクロフィブリルの軸方向への大きな引張応力発現が原因であるものと結論した.ただし樹木の場合は,傾斜樹幹を上に向ける(すなわち負重力屈性発現)ための成長応力であるが,Ficus属の気根の場合は,気根の軸方向の締め付け力を発生させる機能を発現するためと考えられる.熱帯生Ficus属(F.benjamina,F.elastica)の根の締め付け力について研究し,その力の発現が今までに明らかにされてきた樹幹木部の成長応力発現のメカニズムで説明できるかどうかを検討することを目的とした。表面成長応力解放ひずみの測定から,樹木の場合と同様に繊維方向に引張,接線方向に圧縮の応力が発生していることが示された.樹木の樹幹と最も異なっていた点はゼラチン繊維分布の様子である.広葉樹の場合,傾斜して成育する樹幹の上側にゼラチン繊維が分布するが,Ficusの木根では髄付近に同心円状に形成・分布し,とくに直径の小さい気根では二次木部全体に分布する.これにより,細い気根では横断面全体に引張応力が発現していたと考えられる.肥大成長して太くなると髄付近を除いてゼラチン繊維が形成されなくなることから,引張応力は気根の肥大とともに小さくなっていくようである.実際,細い気根の方が表面成長応力解放ひずみの値は大きく,太くなると小さくなる傾向にあった.しかしながら,気根が締め付ける力は直径が大きくなるほど大きくなった.Ficus属の気根の締め付けに必要な軸方向応力は,ゼラチン繊維を形成することによって発生し,樹木の場合と同様にセルロースミクロフィブリルの軸方向への大きな引張応力発現が原因であるものと結論した.ただし樹木の場合は,傾斜樹幹を上に向ける(すなわち負重力屈性発現)ための成長応力であるが,Ficus属の気根の場合は,気根の軸方向の締め付け力を発生させる機能を発現するためと考えられる.熱帯生のクワ科FICUS属の多くは、樹木(ホスト樹木)に寄生し、鳥、サルによって運ばれた実がホスト樹木の樹上で発芽し、気根を垂らして成長する。その気根は互いに癒合し、ホスト樹木を絞め殺す、そのため絞め殺し植物(Strangler)とよばれ、植物学的にはよく知られている。この研究では、熱帯生FICUS属の生存戦略としてホスト樹木を絞め殺すメカニズムを組織力学的に説明することを試みるものである。今年度は、フィリッピン大学に自生するFicus elasticaを試験樹木に選定した。平成15年8月15日22日に現地で選木し、各種成長段階(気根直径、気根同士の癒合状況)が異なる気根にストレインゲージを貼付し、応力解放時のひずみを測定した。ひずみ測定部位の試料を名古屋大学に持ち帰り、組織観察と、X線回折によるセルロースミクロフィブリル傾斜角度、ヤング係数を測定し、気根の発生応力の推定と、気根の細胞壁構造の応力発生への寄与について考察した。その結果以下の知見が得られた。1、気根同士を癒合する過程にある直径0.8cm以下の細い気根は、大きな軸方向引張応力を発現している。解法ひずみにして0.3%にも達した。この値は、一般広葉樹の引張あて材部に発現している成長応力と比べても大きい値である。ヤング率と断面積から計算される細い気根の発生力は23Kgになることがわかった。一方、直径が1cm以上になると解法ひずみは0.1%以下と小さくなるが、断面が大きくなるため締め付け力は20-30Kgと大きくなる。2、以上の大きな応力はゼラチン繊維の発現によって発生する。気根の直径が小さい(0.8cm以下)では、MFAが小さいゼラチン繊維が気根断面に同心円状に発達し大きな軸方向引張応力を発現する。気根断面が大きくなるにつれて正常な木部繊維が形成され通常の大きさの軸方向引張応力を発現している。絞め殺し木のFicusの種は、鳥の糞に混じりホストとなる樹木の枝などに着く。その後、発芽して細い気根を地面へのばしていく。気根は地面やホスト木に到着すると、肥大成長を促進させて、ホスト木を締め付けるようになる。

つまり、気根が締め付けている。この研究の目的は、Ficus属樹木(絞め殺し木)の締め付け力の発生について組織的、力学的に調査し、この力の発生機構を解明することである。ホスト木を絞め殺すような大きな力の発生メカニズムを知るために、まず、地面に接地している気根の組織的な違いを調べた。その結果、横断面において、引張あて材の分布に特徴があった。それは、髄付近は正常材が存在し、その周囲に引張あて材が全方位にわたり形成され、さらにその周りには、再び正常材が形成されている、というものであった。接地していない気根では、引張あて材は形成されておらず、髄付近の正常材が形成されているところだと分かった。成長応力を接地前の気根と接地した細い気根について測定したところ、接地前の気根に比べて、接地した細い気根では大きな引張の成長応力が発生していた。締め付けの力は、引張あて材によって発生していると分かった。以上の結果から、締め付け力は次のように発生していると結論づける。(1)ホスト木に付いた種から気根が地面へと伸びていく。(2)気根が地面と接地したりホスト木と接触したら、気根は肥大成長を促進し、引張あて材を全方位に形成して引張の成長応力を大きくする。これによって、地面やホスト木を支えとして、成長に十分なしっかりとした足場を作る。この過程で、ホスト木が絞め殺されることになる。(3)肥大した気根は複数のものが、やがて融合していき、我々が目にする絞め殺し木が形作られる。これまでに,絞め殺し植物(Strangler plants)として知られる熱帯性Ficus属樹木の支柱根が,ホスト樹木(宿主)を締め付ける力を現地で実測し,試験体を持ち帰ったが,その組織力学的考察から,樹木二次木部における成長応力発生による絞め殺し植物の生存競争の多様性を,力学的戦略という観点から検討した.Ficuselastica, Ficusbenjaminaの個体を対象に調査を行なって来たが,細い気根に発生する大きな軸方向引張り応力が,ゼラチン繊維の出現率,およびゼラチン層発達率(厚さ,形態)と強い正の相関関係にあることから,G層(G繊維)の形成が大きな軸方向引張応力の発生に関わっているものと結論された.なお支柱根の直径が大きくなるにつれて発生する引張応力も減少するが,それは茎の肥大成長とともにG繊維形成が停止するためであることを突き止めた.細い茎(支柱根)はその張力を利用して相互の気根同士を束ね、さらに癒合を促進するものと推察される。径が太くなり、直径15cm内外に達し,主幹の成長応力と同程度になるころには癒合は完全に停止することも確かめられた.さらに,ミクロフィブリル傾角の測定、化学成分分析、セルロース結晶化度の測定を実施し、細胞壁力学モデルによるシミュレーションをも併用して、支柱根における引張応力発生機構を検討した.その結果,支柱根に出現するG繊維は双子葉樹木が形成する"引張あて材"そのものであり,成長応力発生のメカニズム自体は,セルロース引張応力仮説で説明可能であることが明確となったが,通常の樹木シュート(枝,幹)の場合とは異なり,負重力屈性発現を目的としなくても,顕著な,しかもバイオメカニックス的な目的性を持って"引張あて材"が形成されるという事実は極めて興味深い発見である.
環境低負荷型有害金属除去システムの開発

本提案は環境に負荷を与えない事を考慮した有害金属イオン除去のシステムを開発する事を目的としている。平成18年度には、二酸化チタンおよび炭酸カリウムを原料として、フラックス(モリブデン酸カリウム)法により層状構造結晶質四チタン酸カリウム繊維の合成を試みた。この繊維の物理的性質を確認した後にカリウムイオンを水素イオンに組成変換し、イオン交換体として使用した。対象金属イオンとしてアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、二価遷移金属イオンを選択し、バッチ法でのイオン交換能を検討した。その結果、いずれの金属イオンでも高いイオン交換能を示した。平成19年度には、アルカリ金属イオン群(リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン)、アルカリ土類金属イオン群(マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン)、および遷移金属イオン群(銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン)を選択し、無機イオン交換体として合成した結晶質四チタン酸繊維へのバッチ法でのデータに基づいて、カラム法でのイオン交換分離を試みた。その結果、カラム中に充填した結晶質四チタン酸のイオン交換能を活用するための流入液の水素イオン濃度を調整することにより、2種類の同族金属イオン間の分離を実現させた。以上の研究結果から、高レベル放射性溶液中に含まれる長寿命核種のセシウムイオンやストロンチウムイオンの分離、遷移金属イオン中のニッケルイオンの単離等が可能となり、廃棄物の減容化の目的が達成された。即ち、環境に負荷を与える有害金属イオンの分離が可能となった。平成18年度は、二酸化チタンおよび炭酸カリウムを原料として、フラックス法(モリブデン酸カリウムを使用)を用いて、層状構造を有する結晶質チタン酸カリウム繊維の合成を試みた。その繊維を酸処理し過剰の酸を洗浄した後、粉末X線回折法及び走査型電子顕微鏡で層状四チタン酸繊維が合成された事を確認した。この繊維は層間水を保持しているが、乾燥時の脱水はイオン交換能を減少することが確認出来、その保管方法も確立した。次に金属イオン分離への適応性を確認するため、アルカリ金属イオン(リチウム-セシウム)に対するイオン交換挙動をバッチ法により検討し、その繊維のイオン交換能を確認した。次にアルカリ金属イオン間の分離能を検討するため、セシウムイオン分離を目的に同族元素であるリチウムイオンとの分離能発現を目指しカラム法を用いて行った。その結果、種々の条件(カラム中のイオン交換体量、反応温度、金属イオン濃度、カラムへの流入速度、流出速度、イオン交換及び脱離時の水溶液中の水素イオン濃度など)を調整することにより、両金属イオンを定量的に分離することが出来た。本分離結果は放射性廃棄物中に存在する長寿命核種であるセシウムイオンの分離にも応用可能との結論を得た。本法を利用することにより、放射性廃棄物量の減容化に繋がり、長期間保存する場所を有効に利用することが出来る。二価遷移金属イオンに対するイオン交換反応は、チタン酸中の層間に存在する2個の水素イオンと1個の遷移金属イオンの交換反応であるため、その交換速度は減少し、同じ二価であるアルカリ土類金属イオンとの交換速度とほぼ同程度である事を確認した。アルカリ金属イオンに対する結晶質四チタン酸繊維のイオン交換挙動を基礎データとして、二価遷移金属イオンに対するバッチ法での検討によりそのイオン交換反応が進行する事を確認し、カラム法への適用条件を確立した。本提案では、無機イオン交換体として結晶質四チタン酸繊維を用いて遷移金属イオン間およびアルカリ土類金属イオン間の分離を試みるものである。昨年度求めた基礎データとしてイオン交換到達時間、再現性、反応pH領域、交換体の安定性をもとめ、イオン交換反応到達速度をアルカリ土類金属イオンの反応と比較した後、結晶質四チタン酸繊維をイオン交換体としたバッチ法による遷移金属イオンのおよびアルカリ土類金属イオンの交換挙動を調べた。遷移金属イオンとして銅、亜鉛およびニッケルの3種類を、アルカリ土類金属イオンとしてバリウム、ストロンチウム、カルシウム、およびマグネシウムを選択した。

アルカリ土類金属イオン間の交換特性に関しては、分離能の高いバリウムーストロンチウム間に関しては結晶質四チタン酸繊維のイオン交換能を利用して分離し、ストロンチウムー他のアルカリ土類金属イオンに関しては大環状化合物の分離能を利用してストロンチウムイオンを他のアルカリ土類金属イオンと分離した。一方遷移金属イオン間の結晶質四チタン酸繊維による分離に関しては、銅イオン-亜鉛イオン間および亜鉛イオン-ニッケルイオン間で分配係数値がそれぞれ100以上の差を示し、それら3種類の金属イオンを完全に分離することが可能であるとの結論を得た。また、遷移金属イオン間の分離に関しては、イオン対抽出系に関しても高分離が得られた。それらの金属イオン同士の分離能に関しては、銅イオンとニッケルイオンをカラム中に流入して結晶質四チタン酸上にイオン交換させた後、弱酸溶液を流入することによりニッケルイオンのみを流出させ、両金属イオンを分離することが出来た。次にカラム中に流入させる溶液の酸濃度を高くすることにより、イオン交換体中に留まっていた銅イオンも回収することが出来た。本手法を用いることにより、類似の性質を有する金属イオン間の分離を可能とした。
植物生体膜の亜鉛輸送システムの解析

<新規亜鉛輸送体の機能解析>酵母の亜鉛輸送体ZRT3は液胞膜に局在し、液胞内の亜鉛を細胞質に輸送することで、亜鉛欠乏耐性に重要な役割を果たしている事が報告されている。しかし植物では液胞から細胞質へ亜鉛を輸送する亜鉛輸送隊は同定されていない。そこで、Arabidopsis thalianaの中でZRT3と相同性の高いZIPタイプの輸送隊At3g20870(ZTP29)とAt3g08650(ZIP13)を液胞膜型亜鉛供給輸送隊の候補として研究を行ってきた。しかしこれまでの研究でZIP13はERに局在する事が明らかになった。また他の研究グループからZTP29もERに局在すること、そして、ZTP29は塩耐性に関わりT-DNA挿入欠損株は塩感受性になるとの報告がされた。そこでZIP13のT-DNA挿入株の塩耐性試験を行ったが、野生株よりも顕著な塩耐性の低下は見られなかった。しかし、GUSを用いたプロモーター解析では、125mM NaCl存在下でZIP13の発現が通常条件よりも増加している事が観察された。今後、ZIP13とZTP29の二重欠損株を用いてさらに解析を進める予定である。<液胞膜型亜鉛輸送体AtMTP1の機能解析>これまでの変異導入解析で基質選択性に関わるアミノ酸残基、活性調節に関わるアミノ酸残基が明らかになった。これらのアミノ酸残基を複数箇所同時に変異導入した変異型MTP1を作成して、酵母異種発現系をもちいてZn,Cd,Co,Fe,Mn耐性試験を行った。一カ所に変異を加えたときと同程度の金属耐性を示し、複数箇所に変異を加えたことにより酵母の金属耐性が顕著に増加する事はなかった。今後は、変異型MTP1を発現させた酵母から液胞膜を調整して、金属の輸送速度、親和性を測定することでより詳細に解析を進める。平成24年度分辞退酵母ではZIPファミリーの一つであるZRT3が液胞膜に局在し、液胞内の亜鉛を細胞質に再供給して亜鉛欠乏時の亜鉛恒常性に重要な役割を果たしている事が分かっている。しかし植物においてはこれまでに液胞から細胞質へ亜鉛を供給する輸送体は同定されていない。そこでシロイヌナズナの中で酵母ZRT3と相同性の高い輸送体At3g20870とAt3g08650を液胞膜型亜鉛供給輸送体の候補として、その機能解析を進めた。At3g08650については奈良先端大学の深尾陽一郎準教授よりAt3g08650内在性プロモーターにGUSレポーター遺伝子を融合させた遺伝子形質転換体を分与して頂き、亜鉛濃度の異なる培地で生育した植物のGUS染色を行った。At3908650は根と葉脈で発現しており、過剰亜鉛条件で発現量が増加することが明らかとなった。T-DNA挿入遺伝子欠損株を用いた解析より、At3g08650遺伝子欠損株は亜鉛過剰条件で根の伸長が野生株よりも短く、根の生重量も野生株よりも少なかった。At3g20870遺伝子欠損株はいずれの条件下でも根の伸長、生重量に野生株との有為差は見られなかった。クロロフィル含量は、At3g08650遺伝子欠損株とAt3g08650遺伝子欠損株の両者とも、亜鉛欠乏条件下で野生株よりも顕著に高いことが明らかになった。これらの結果はAt3g20870とAt3g08650が亜鉛恒常性に何らかの役割を果たしている事を示唆している。また、シロイヌナズナ液胞膜亜鉛輸送体AtMTP1の変異導入解析より、N末端領域、His-rich loop、Leuzipperモチーフなどが基質選択性に関わること、N末端領域とHis-rich loopが輸送活性調節に関わる事も新たに解明した。なお、本成果はドイツのルール大学ボーフムにおいてUte Kraemer教授と共同研究によるものである。

これらのアミノ酸残基を複数箇所同時に変異導入した変異型MTP1を作成して、酵母異種発現系をもちいてZn,Cd,Co,Fe,Mn耐性試験を行った。一カ所に変異を加えたときと同程度の金属耐性を示し、複数箇所に変異を加えたことにより酵母の金属耐性が顕著に増加する事はなかった。今後は、変異型MTP1を発現させた酵母から液胞膜を調整して、金属の輸送速度、親和性を測定することでより詳細に解析を進める。平成24年度分辞退
肺癌の新たな個別化治療の確立を目指したＮａｍｐｔ遺伝子の変異解析とその機能解析

平成24年度は、マウス肺癌転移モデルにおいて、プロスタサイクリンアナログの経口投与は、ぺリサイトの機能を向上することで、腫瘍血管の成熟を促し、肺転移を抑制していることを示し、追加実験によって、この腫瘍血管の成熟が腫瘍内の低酸素状態を改善している可能性を示した。この研究の成果は、研究グループの大学院生の医学博士学位論文に結びつき、2013年にアメリカ癌学会で発表した。平成25年度は、転移の抑制が腫瘍内低酸素の改善による事を示そうと試みた。この研究の成果は、2014年4月にアメリカ癌学会で発表した。マウス肺癌培養細胞の肺転移モデルを用いて、プロスタサイクリンアナログの腫瘍血管に対する効果を検討した。マウス肺転移モデルは、ルイス肺癌細胞の尾静脈注射により作成した。準備的な実験として、培養ルイス肺癌細胞の培養液中にプロスタサイクリンアナログを添加しても、培養肺癌細胞の増殖には影響を与えなかった。マウスの肺転移モデルマウスにおいて、対象マウスにプロスタサイクリンアナログを皮下に持続的に投与すると、肺転移病巣数は有意に減少した。このことは、プロスタサイクリンアナログの投与は、肺癌細胞の増殖に影響を与えなかったことから、肺転移病巣での間質環境の変化が影響している可能性を示唆した。この結果により、プロスタサイクリンアナログを投与したマウスと、投与しないマウスでの新生腫瘍血管の形態と機能を検討した。その結果、プロスタサイクリンアナログを投与したマウスの新生腫瘍血管は、投与しないマウスの腫瘍新生血管よりも成熟していることを見いだした。このプロスタサイクリンアナログによる腫瘍血管の成熟は、血管内皮に結合するペリサイトの数によって規定されていることを見いだした。すなわち、マウス肺癌肺転移モデルにおいて、プロスタサイクリンアナログの経口投与は、ペリサイトの機能を向上することで、腫瘍血管の成熟をうながし、肺転移を抑制していると考えられた。追加実験によって、この腫瘍血管の成熟が腫瘍内の低酸素状態を改善している可能性を示した。本研究の成果は、研究グループの大学院生の医学博士学位論文に結びつき、2013年にアメリカ癌学会で発表した。我々が行った研究により、KRAS遺伝子変異を有する肺癌に対してNampt阻害剤が高い抗腫瘍効果を有する可能性をつきとめた。まず、肺癌細胞株のパネルを用いた検討により、Nampt阻害剤の感受性が高い肺癌細胞を検出する作業を行った。異なる遺伝子変異を持つ肺癌細胞株のパネルを用いて、Cell viability assayの1つであるacid phosphatase assayを行い、Nampt阻害剤の効果を検証した。その結果、KRAS遺伝子変異を有する肺癌がnampt阻害剤に対して高い感受性(抗腫瘍効果)を持つ可能性を見出した。また、KRAS遺伝子変異を有する肺癌細胞株のなかでも、Nampt阻害剤に高感受性の株と比較的低感受性の株に分別された。そのメカニズムを検証するため、Nampt阻害剤に高感受性のKRAS肺癌細胞株を用いて、ウエスタンブロットによる細胞内シグナル変化の解析を行った。その結果、増殖シグナル系列の1つであるMAPK・PI3K/AKTシグナルの変化や、アポトーシスの変化は乏しいことが判明した。一方で、アポトーシス以外の細胞死メカニズムの1つであるオートファジーに関連するタンパクの発現量の変化が確認された。なかでもAt7というオートファジー関連タンパクが、Nampt阻害剤を投与したKRAS肺癌で抑制されていることを確かめた。以上の成果・研究結果をさらに発展させるべく、本テーマに関連した新たな研究計画を設けた。今後、Nampt阻害剤に高感受性のKRAS肺癌を用いて、Reverse Phase Protein Arrayを行い、がん増殖シグナル変化とそのパスウェイ解析を実施する。In vitro実験で、それらのシグナル変化とオートファジータンパクとの関連性を突き止め、さらには肺癌病理組織検体を用いて、Namptタンパク・遺伝子発現量と、同定された候補タンパク・遺伝子発現の関連を評価する予定である。呼吸器学平成24年度は、計画した目標を達成している他、新たな研究課題を見出すことができた。さらに、研究に用いたプロスタサイクリンアナログが腫瘍血管の成熟を通じて肺転移を抑制したことから、同様の機序をもつ化合物が抗癌剤として使用できるポテンシャルを持つことが示され、新しい観点からの抗癌剤の開発に結び付く結果が得られた。新薬の開発に一つの方向性を示すことができ、当初の計画以上に進展していると考えた。平成25年度は、平成24年度の成績を確保するために、低酸素との関連を検討し、一定の知見を得ることができた。計画した目標を達成している他、新たな研究課題を見いだすことができた。さらに、研究に用いたプロスタサイクリンアナログが腫瘍血管の成熟を通じて肺転移を抑制したことから、同様の機序をもつ化合物が抗癌剤としてしようできるポテンシャルを持つことが示されたことから、新しい観点からの抗癌剤の開発に結びつく結果がえられた。新薬の開発にひとつの方向性を示すことができたことが、当初の計画以上に進展していると考えた理由である。本研究に用いたプロスタサイクリンアナログは、肺癌以外の疾患で既に臨床に使用されている薬剤である。今後は、腫瘍血管の成熟化を通じて、癌転移を抑制するのに最適な薬剤と、その投与法を検討していく必要がある。今後は、この方向に強く研究を推進していく予定である。平成26年度は、研究成果のまとめの予算を計上しているので、成果の発表に努めたい。

本研究に用いたプロスタサイクリンアナログは、肺癌以外の疾患ですでに臨床に使用されている薬剤である。今後は、腫瘍血管の成熟化を通じて、癌転移を抑制するのに最適な薬剤と、その投与法を検討していく必要がある。今後は、この方向に強く研究を推進してく予定である。年度を越えて納入する試薬等が発生したため。次年度に繰り越して使用する。プロスタサイクリンアナログが骨髄由来の腫瘍血管前駆細胞に作用して血管の成熟に関与していることを確認する研究を展開するために、プロスタサイクリン受容体欠損マウスの骨髄を、レシピエントマウスに移植した実験動物を作成して、このプロスタサイクリン受容体欠損骨髄をもったマウスでプロスタサイクリンアナログが同様の作用を示すか検討を加えたい。さらに、他のプロスタサイクリンアナログ、他の腫瘍転移モデルを用いて、今回の研究で見いだした結果の普遍性を検証したい.
文章理解における読み手の方略的活動と文章構造の関連

昨年度に続き今年度は,読み手の方略的活動と文章構造との関連を実証的に検討した。第1に,日本心理学会第67回大会において発表した,論説文読解における方略活動と論説文固有の構造の関連についての研究をもとに論文を執筆し英語雑誌に投稿した。この研究を遂行するため,補助金を心理学の文献,パソコン周辺機器,英文校閲料,ソフトウェアの購入に用いた。第2に,説明的文章読解における文章の全体構造の影響を検討し,研究の成果を日本心理学会第69回大会において発表した。具体的には,段落構造が明確である文章の場合,読み手はそこから細部にわたる正確な理解を得ることができるが,段落構造が明確でない文章を読んだ読み手は,文章の主旨は理解できるものの正確さに欠けること,ただし明確な文章の場合よりも,書かれていないことを推論できる読み手も多く見られ,個人差が顕著になることが明らかになった。この研究を遂行するため,教育心理学の図書,言語学の文献を購入した。第3に,複数テキストの読解に関する研究を行った。まず,結論が対立する2つのテキストにおいて,テキストの理解,方略的活動,2つのテキスト間の矛盾の発見の関連を検討し,研究の成果を日本読書学会研究発表会において発表した。また,この発表をもとに論文を執筆し投稿した。次に,相補的な内容の2つのテキストにおいて,テキストの理解と方略的活動の関連を検討し,論文を投稿した。これらの論文作成のための諸経費,学会での研究発表のための国内旅費に補助金をあてた。論説文の読解において,読み手の方略的活動,論説文固有の構造,読み手の既有知識・認識論的信念の関連を実証的に検討し,批判的な読みを促すにはどのような援助が必要か考察するため,今年度は特に方略的活動と論説文固有の構造の関連を検討した。研究の成果は学会発表および紀要において発表した。第1に,論説文読解における方略的活動と論説文固有の構造の関連について,日本心理学会第67回大会において発表した。この研究ではまず,論説文固有の構造要因の一つである「結論文(文章の主たる結論を述べた文)」を文章中に挿入することが,結論自体の理解や,結論と根拠との関連づけに効果があることを示した。しかし一方で,結論文の挿入が結論以外の部分を詳細に読むことを抑制する可能性もあることを指摘した。なお,この研究を行うため,今年度の補助金を用いて心理学および教育学の文献を購入した。また,データ処理と解析のため,パソコンおよび周辺機器を購入した。第2に,批判的読み(critical reading)に対する文章の構造的側面の役割に関して,先行研究を整理したレビュー論文を「東京大学教育学研究科紀要」に発表した。論文では,まず(1)広い意味での批判的読みが,少なくとも3側面(理解モニタリング・論証構造の理解・考えの生成)からとらえられることを提案し,次に(2)文章の構造的側面の重要性は3側面で異なることを指摘した。最後に今後の課題として,(3)3側面の時間的順序,読解中のオンラインのプロセス,既有知識と構造的側面の影響の交互作用,を明らかにする必要を述べた。この論文を執筆するため,補助金を心理学および論理学の文献の購入に当てた。昨年度に続き,今年度は,文章理解において読み手の方略的活動が果たす役割を検討し,高次の方略的活動すなわち能動的な読みの育成への手がかりを得ることを目的とした。第1に,方略的活動のうち特に「推論活動」を取り上げ,いかなる条件の下で推論活動が生ずるか,推論活動が談話理解において果たす役割について文献研究を中心に検討し,研究の成果は「児童心理学の進歩」において発表する予定である。具体的には,「談話」という視点から,国内および海外でなされている推論活動に関する議論を整理したレビュー論文を「児童心理学の進歩」に寄稿した(印刷中,2005)。論文では,まず推論を,問題としてのテキスト・会話の理解における推論と,問題解決のための推論とに分けてとらえた。前者の推論はinference,後者はreasoningにあたる。先行研究から,問題の一貫した理解のために推論活動が重要な役割を果たしていること,さらに論証や協同的問題解決過程は推論の過程そのものであることを明らかにした。最後に談話における推論とは対話性の上になりたつことを指摘し,対話性を軸にした研究の発展を今後の課題とした。この研究を行うため,今年度の補助金を用いて教育心理学,言語学,談話研究の文献,およびプリンター,パソコン周辺機器を購入した。さらに論文作成のための諸経費,研究うち合わせのための国内旅費に補助金を当てた。第2に,日本心理学会第67回大会において発表した,論説文読解における方略的活動と論説文固有の構造の関連についての研究をもとに論文を執筆し近く投稿する予定である。この研究を遂行するため,補助金を心理学,教育学の文献,およびデータ処理と解析に必要とされるソフトウェアを購入した。

第2に,説明的文章読解における文章の全体構造の影響を検討し,研究の成果を日本心理学会第69回大会において発表した。具体的には,段落構造が明確である文章の場合,読み手はそこから細部にわたる正確な理解を得ることができるが,段落構造が明確でない文章を読んだ読み手は,文章の主旨は理解できるものの正確さに欠けること,ただし明確な文章の場合よりも,書かれていないことを推論できる読み手も多く見られ,個人差が顕著になることが明らかになった。この研究を遂行するため,教育心理学の図書,言語学の文献を購入した。第3に,複数テキストの読解に関する研究を行った。まず,結論が対立する2つのテキストにおいて,テキストの理解,方略的活動,2つのテキスト間の矛盾の発見の関連を検討し,研究の成果を日本読書学会研究発表会において発表した。また,この発表をもとに論文を執筆し投稿した。次に,相補的な内容の2つのテキストにおいて,テキストの理解と方略的活動の関連を検討し,論文を投稿した。これらの論文作成のための諸経費,学会での研究発表のための国内旅費に補助金をあてた。
人工呼吸器関連肺障害に対する二酸化炭素血症の保護作用機序解明と新規治療薬の開発

人工呼吸器関連肺障害予防のための高二酸化炭素血症による肺保護作用の機序を解明するために、マウスを使った人工呼吸器関連肺障害モデルを作成した。この人工呼吸関連肺障害モデルで高二酸化炭素血症による肺保護作用が確認できた。各種サイトカインを測定したところ、高二酸化炭素血症による肺保護作用に対して、インターロイキン6(IL-6)が重要な役割を担っていると考えられた。IL-6の細胞内シグナルのうち、JAK-STAT経路が何らかの関連を示唆する結果が得られた。1.当研究の動物実験計画は名古屋市立大学医学研究科動物実験委員会に申請し承認されている。2.平成24年度は各種機材のトラブルのため実験開始が12月になってしまい、平成24年度の計画の「1.マウス人工呼吸器関連肺障害モデルの確立」の開始が遅れた。その後、以前確立したモデルから、人工呼吸器の変更、麻酔薬の変更が必要であったため、安定したマウス人工呼吸器関連肺障害モデルの確立に時間を要したが最終的には安定したモデルを確立した。肺損傷は肺胞洗浄液中のBCAプロテインアッセイ法で測定されるたんぱく量とMPOアッセイ法にて測定される好中球の肺組織内浸潤を用いて評価した。また、肺組織標本での評価も同時に行った。3.平成24年度の計画の「2.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける肺胞洗浄液中のサイトカインの測定」を平成25年度に行った。IL-1、TNF-a、IL-6、KC、MIP-2などの各種サイトカインが継時的に、損傷依存的に上昇した。4.平成24年度の計画の「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」は各種タンパク質発現の測定に必要なPCR法、ウエスタンブロット法、ゲルシフトアッセイ法については予備実験を行い、測定可能であることが確認された。モデルにおける測定は「4.マウス人工呼吸関連肺障害モデルに対する高炭酸ガスの肺保護作用の確認」を行ってから施行する予定である。5.「4.マウス人工呼吸関連肺障害モデルに対する高炭酸ガスの肺保護作用の確認」を平成25年度に行った。肺保護作用は炭酸ガス濃度と酸素濃度によって左右されることがわかった。現在各種条件を変更しながら肺保護作用の確認を行っているが、安定した保護作用が得られるモデルの条件設定に難渋している。2.各種機材を購入したが、マウス用人工呼吸器のトラブルのため実験開始が12月になってしまった。3.平成24年度の計画の「1.マウス人工呼吸器関連肺障害モデルの確立」に関しては、以前確立したモデルから、人工呼吸器の変更、麻酔薬の変更が必要であったためモデルの確立に難渋した。人工呼吸器の変更に伴い、呼吸回路内に作られる陽圧の評価に時間を必要としたことがモデルの確立に難渋した原因であると思われた。人工呼吸の条件を様々に変更し、麻酔薬の濃度を様々に変更し、安定したマウス人工呼吸器関連肺障害モデルを作成することができた。保護的人工呼吸は一回換気量7.5ml/kg、肺を損傷する人工呼吸は一回換気量15ml/kgに決定した。4.平成24年度の計画の「2.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける肺胞洗浄液中のサイトカインの測定」を現在取り組んでいるところである。5.平成24年度の計画の「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」は平成25年度に施行予定である。各種タンパク質の測定に必要なウエスタンブロット法、ゲルシフトアッセイ法については現在予備実験を行っているところである。1.各種機材のトラブルの為実験開始が遅れ、平成24年度計画の「1.マウス人工呼吸器関連肺障害モデルの確立」は平成25年度に達成した。2.平成24年度の計画の「2.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける肺胞洗浄液中のサイトカインの測定」は平成25年度に達成した。3.平成25年度の計画の「4.マウス人工呼吸関連肺障害モデルに対する高炭酸ガスの肺保護作用の確認」を平成25、26年度に行い、ある程度安定した保護作用が得られるモデルの条件を決めた。また、高炭酸ガスによりIL-6が抑制されることも確認した。4.現在平成24年度の計画の「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」をPCR法、ウエスタンブロット法、ゲルシフトアッセイ法で行っている。5.平成26年度の計画の「5.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける各種阻害薬の肺保護作用の効果の確認」および平成26年度の計画の「6.ヒトにおける肺保護作用の確認」は残念ながら着手していない。麻酔学

1.マウス用人工呼吸器のトラブルのため実験開始が平成24年12月になってしまったから。2.人工呼吸器の変更、麻酔薬の変更が必要であったためマウス人工呼吸器関連肺障害モデルモデルの確立に難渋したから。3.安定した高炭酸ガスの肺保護作用が得られる条件設定に難渋しているから。1.マウス用人工呼吸器のトラブルのため実験開始が12月になってしまったため。2.人工呼吸器の変更、麻酔薬の変更が必要であったためモデルの確立に難渋したため。1.「4.マウス人工呼吸関連肺障害モデルに対する高炭酸ガスの肺保護作用の確認」のための安定したモデル作成を継続する。2.安定した肺保護作用を示すモデルが作成されたら「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」を行う。各種タンパク質発現の測定に必要なPCR法、ウエスタンブロット法、ゲルシフトアッセイ法の予備実験はすでに終了している。3.「5.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける各種阻害薬の肺保護効果の確認」、「6.ヒトにおける肺保護効果の確認」は上記研究が終了次第検討する。1.平成24年度の計画の「2.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける肺胞洗浄液中のサイトカインの測定」を継続する。肺胞洗浄液中の炎症性サイトカインの測定を行う。IL-1、TNF-a、IL-6、KC、MIP-2を測定する予定である。2.平成24年度の計画の「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」は平成25年度に施行予定である。摘出肺におけるJAC-STAT経路の各蛋白の量、活性は各蛋白質に対する抗体、リン酸化蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法、転写因子に対してはゲルシフトアッセイ法を用いて測定する。3.平成24年度以降の計画の「4.マウス人工呼吸関連肺障害モデルに対する高炭酸ガスの肺保護作用の確認」は当初の計画のように実施する予定である。上記で確立したマウス人工呼吸関連肺障害モデルを用い、高二酸化炭素血症の条件を決定し、安定した肺保護作用が得られる状態を確立する。吸入ガスは混合ガスボンベを用いて吸入ガスを調整する。保護効果については、肺胞洗浄液中の炎症性サイトカイン濃度の測定とJAC-STAT経路に関与を検討する。さらには、組織学的な検討も行う。4.平成25年度以降の計画の「5.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおける各種阻害薬の肺保護効果の確認」は当初の計画のように実施する予定である。マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおいて、抗IL-6レセプターモノクローナル抗体やJAC-STAT経路の各種阻害薬の保護効果を確認する。また、高二酸化炭素血症と薬剤との組み合わせによる、副作用に少ない方法を模索する。実験が計画より遅れており、次年度に今年度予定した実験を行うため。「3.マウス人工呼吸関連肺障害モデルにおけるJAC-STAT経路の関与の解明」を行うための各種タンパク質発現の測定に必要なPCR法、ウエスタンブロット法、ゲルシフトアッセイ法の実験試薬の購入にあてる。
民博衣類標本データベース支援ツールの開発

1.目的国立民族学博物館の衣類標本は、MCD研究グループが、衣類専門の分析コード表に基づいて、データベース化を行ってきた。本研究の目的は、今後の分析継続やデータ公開に備えて、具体的な標本事例をあげつつ、コード表を解説するツールを作成することである。2.方法と結果2.画像の加工各コードの解説に必要な事例を撮影し、PhotoCDに加工した。Adobe社のPhotoshopを用いて、写真のサイズ、背景、色調などを修正、トリミング、矢印などの指示記号を加えるなどの加工をした。3.完成後の利用環境分析支援ツールはApple社のMacintosh8500/132と21inchディスプレイをスタンドアロンで使用する前提とした。検索支援ツールは、汎用のブラウザによって不特定多数の利用を可能にした。3.課題以下の点について留意しつつ、事例の追加差し替えを行って、支援ツールを完成したい。1.形態を示すため、現地撮影の画像を標本と照合する2.布地特性については特に多くの事例を盛り込む3.布地特性の製作技法を示す動画を加える4.専門用語については、用語データベースへの参照をつける1.目的国立民族学博物館の衣類標本は、MCD研究グループが、衣類専門の分析コード表に基づいて、データベース化を行ってきた。1.形態を示すため、現地撮影の画像を標本と照合する2.布地特性については特に多くの事例を盛り込む3.布地特性の製作技法を示す動画を加える4.専門用語については、用語データベースへの参照をつける
ラメラ幅の異なる親水/疎水型相分離構造表面に対応する細胞膜官能基分布の解析

生体適合性材料の分子設計の作業理論を構築するために、自己/非自己の選択性に優れるリンパ球を用いて、PHEMA-PSt-PHEMA ABA型ブロック共重合体(以下HSB)表面の生体適合性の発現にとって最適なラメラ幅について評価することを目的とした。8nm、16nm及び43nmの3種類の異なるラメラ幅のHSBを調製した。対照群として、ポリスチレン(以下PSt)及びPHEMA-PStランダム重合体(以下HSR)表面を用いた。リンパ球と材料表面との相互作用はマイクロスフィアカラム法を用いて行った。一定時間浸せき後、HSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質の官能基を透過型電子顕微鏡(以下TEM)を用いて解析した。さらにその直径について画像処理解析装置を用いて定量的に評価した。とりわけ、形質膜外層部分に位置するアミノ基(以下NH_2基)、形質膜内層部分に位置するスルフヒドリル基(以下SH基)の直径について計測した。ラメラ幅16nmのHSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質のNH_2基及びSH基の直径は正常リンパ球のそれらの直径との間に有意差は認められなかった。一方、ラメラ幅8nmと43nmのHSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質のNH_2基及びSH基の直径は正常リンパ球のそれらの直径との間に有意差が認められた。ラメラ幅8nmと43nmのHSB表面でのNH_2基及びSH基は部分的にCappingを形成して観察された。興味深いことに、ラメラ幅8nmでのSH基の直径はラメラ幅43nmでのその直径と同様であったのに対して、ラメラ幅8nmでのNH_2基の直径はラメラ幅43nmでのその直径に比べて大きい値を示した。PSt及びHSR表面に粘着したリンパ球は壊死で壊れていたため、形質膜内球状蛋白質の官能基のTEM解析は出来なかった。以上のことから、HSB表面のラメラ幅のサイズは、優れた生体適合性の発現にとってとりわけ重要であることが結論づけられた。また、HSB表面のラメラ幅16nmはリンパ球形質膜の流動性を抑制することが示唆された。これまでラメラ幅16nmで親水/疎水型のミクロドメイン構造表面を有するポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(PHEMA)-ポリスチレン(PSt)-PHEMA ABA型ブロック共重合体(HSB)は接触及び粘着リンパ球の壊死を抑制することを明らかにしてきた。平成12年度は、より高度な血液適合性材料の分子設計作業理論の構築を目的として、HSBの8nm、16nm、43nmの異なるラメラ幅を有するミクロドメイン構造表面に対応する粘着リンパ球の形質膜内蛋白質のアミノ基を透過型電子顕微鏡(TEM)にて解析した。さらに、そのTEM像に対して画像処理解析を行いアミノ基の分布状態を定量的に評価した。疎水性の均一表面のPSt、親水性PHEMAと疎水性PStとが均一に分散している構造表面を有するPHEMA-PStランダム重合体(HSR)を対照群のポリマーとして用いた。ポリマー表面とリンパ球との相互作用はマイクロスフィアカラム法を用いて行った。

室温にて一定時間浸せきした後、ポリマービーズをカラムから取り出し、粘着リンパ球の形質膜内蛋白質のアミノ基の検出のためにHydroquinon-Tetranitro Blue Tetrazolium処理を行った。その結果、HSBの8nm、43nmのラメラ幅のミクロドメイン構造表面に対応するリンパ球粘着面の形質膜内蛋白質のアミノ基は部分的にCappingを形成していた。それに対して、ラメラ幅16nmのミクロドメイン構造表面に対応するリンパ球粘着面の形質膜内蛋白質の分布状態は正常リンパ球のそれと同様の分布状態であった。また、対照群ポリマー表面に粘着したリンパ球は壊死を呈していたため、形質膜のアミノ基の解析はできなかった。以上のことから、HSBにはリンパ球の形質膜流動性を抑制する最適なラメラ幅が存在することが明らかになった。生体適合性材料の分子設計の作業理論を構築するために、自己/非自己の選択性に優れているリンパ球を用いて、PHEMA-PSt-PHEMA ABA型ブロック共重合体(HSB)表面の生体適合性発現にとって最適なラメラ幅について評価することを目的とした。ラメラ幅が8nm、16nm、43nmのHSB表面を調整し実験に供した。対照群として、PSt及びPHEMA-PStランダム共重合体表面を用いた。本年度は、ラメラ幅の異なるHSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質のC末端付近にあるスルフヒドリル基(-SH基)を透過型電子顕微鏡(TEM)にて観察した。さらに、TEMネガフィルムを元にして、その-SH基の分布幅について、画像処理解析装置を用いて定量的に評価した。リンパ球と高分子材料表面との相互作用はマイクロスフィアカラム法を用いて行った。ラメラ幅16nmのHSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質の-SH基は粒子状として観察された。その分布幅は未刺激リンパ球のその-SH基の分布幅と同様であり有意差は認められなかった。一方、ラメラ幅が8nm、43nmのHSB表面に対するリンパ球粘着面の形質膜内球状蛋白質の-SH基は部分的にCapping状を形成して観察された。これらの分布幅と未刺激リンパ球のその-SH基の分布幅との間に有意差が認められた。興味深いことに、ラメラ幅が8nmと43nmのHSB表面における-SH基の分布幅は、NH^<2>基の分布幅の場合とは異なり、有意差は認められなかった。また、PSt及びPHEMA-PStランダム共重合体表面に対する粘着リンパ球は壊死を呈しており、形質膜内球状蛋白質の-SH基のTEM解析はできなかった。以上のことから、ラメラ幅が16nmのHSB表面はリンパ球の形質膜流動性を抑制することが細胞膜内側部分の解析からも示唆された。
微生物の特殊機能の解析とバイオレメディエーションへの応用

トリクロロエチレン、ダイオキシン、芳香族炭化水素などによる深刻な環境汚染問題が現在社会問題化していることは周知の事実である。申請者らは、土壌微生物の総合的理解に立脚した実用化可能な土壌環境修復技術の確立を究極的な目標として、主として応用微生物、土壌微生物学分野の研究者によって構成される特定領域研究を組織することを計画した。本研究は、その準備を進めるにあたって、土壌におけるコンソーシア研究の現状、問題点、将来に向けての方向性等に関して調査と総合化を行うことを目的として組織したものである。平成9年6月7日に第一回の班会議を開催し、関連分野の研究状況を把握するとともに特定領域研究において取り上げる研究課題の提案を行った。また、平成9年6月27日には、バイオレメディエーションに関連する世界最先端のの研究状況を認識するため、外国人5名と日本人4名の研究者による国際シンポジウムを開催した。その後も、班員間で密接な情報交換と議論を重ね、微生物の環境汚染物質の分解能を分子レベルで解明するとともに環境汚染物質分解系酵素の構造生物学的解析・分子改変、環境浄化の場における環境汚染物質分解菌の動態解析等を行う研究プロジェクトを設立することが社会的にもきわめて緊急性が高いことを改めて認識した。そして、最終的に平成10年度発足の科学研究費補助金特定領域研究(B)「微生物による地球環境浄化の分子基盤」を企画立案するに至った。
筋ジストロフィーマウスを用いた循環系のメカノセンサー機構に関わる分子薬理的研究

組織血流の筋原性の自己調節機構や血管攣縮・高血圧などの脈管病変との関連性が深い心脈管系への動力学的刺激により発生する収縮機能発現過程におけるメカノセンサー機構を明らかにする目的で、ラット、ウサギから摘出した脳動脈、肺動脈に内腔圧上昇や伸展刺激を与えて発現する筋収縮反応を薬理学的手法により解析して以下の新知見を得た。1.ア-テリオグラフを利用して抽出フラット脳動脈への内腔圧上昇により発生する血管収縮反応を解析し、外液Ca^<2+>依存性の筋原性収縮に対し、ストレッチチャネルを抑制することが知られているアミロライドが、脱分極性および薬物受容体を介した収縮反応に比較してより選択的に抑制することを見い出し、平滑筋細胞膜上に存在するアミロライド感受性のイオンチャネルが内腔圧上昇もしくは伸展刺激の受容部位である可能性を示唆した。この成績は、「抵抗血管に関する第4回国際シンポジウム」(バ-モント、米国、1994年1月)で発表し、英語論文として公表するための準備を進めている。2.ウサギより抽出した肺動脈標本への伸展刺激による反応は、インドメタシン、アスピリンにより消失することから、シクロオキシゲナーゼ代謝物が産生・遊離することにより発生すること、また、内皮細胞が存在する場合にのみ収縮反応が発現することを見い出し、内皮細胞がこの刺激の受容部位である可能性を明らかにした。現在、内皮細胞の細胞内Ca^<2+>シグナルの測定や糖鎖処理などを行い、刺激受容部位の特定を行っている。以上、脈管系では、動力学的刺激を感知する機構に多様性が存在する可能性を示した。現在、メカノセンサー部位の一つであると想定されているジストロフィンが欠損しているmdxマウスを用いて血管への伸展・脱分極性・薬物受容体刺激を介する反応性の変動について基本的検討を行うとともに、パッチクランプを用いたイオンチャネルの活性化変動を検討するための準備を進めている。
カンジダ感染における留置カテーテルの影響に関する遺伝子機能解析

カンジダグラブラータの病原性には複数の因子が関与すると考えられているが、未解明な点が多い。最近の研究において、危険因子の中で特に問題となっているが留置カテーテルである。そこで、本研究では留置カテーテルの付着に関与すると考えられるβ-グルカン、マンノプロテイン、レクチンなど細胞表層を構成する成分や加水分解酵素などの分泌酵素、さらにバイオフィルムの形成に関する成分などをコードする遺伝子などを中心中心に遺伝子欠損株を作成し研究を進めた。病原性カンジダ属真菌は、人常在菌である一方、易感染患者における血流感染原因菌のうち第4位(7-8%)を占め、致死率20-50%に達する重篤な日和見感染症を起こす。カンジダ症の危険因子は多数存在し感染部位も多様であるため、病原性には複数の因子が関与すると考えられているが、未解明な点が多い。我々はカンジダ属真菌のうち一倍体ゲノムを有し、分子生物学的取り扱いが最も簡便なカンジダ・グラブラータを用いて研究を進めている。カンジダ・グラブラータは、糖尿病患者において特に症例数が多く、抗真菌薬の第一選択薬でアゾール系抗真菌薬に対して低感受性あるいは耐性を示す問題点が生じている。そこで、本菌を用いた病原因子の網羅的な遺伝子機能解析を進め、表皮から内臓に至るカンジダの感染経路を研究し、病原性の理解を目指している。本研究課題では、危険因子の中で、最近特に問題となっている留置カテーテルの影響に焦点を絞り、カテーテルを利用したカンジダ・グラブラータの病原性(生存戦略)の解析を進めている。平成24年度には、平成23年度に作製した細胞表層の構成成分に関与すると予測される107遺伝子の一遺伝子欠損株を用いて研究を進めた。107株について培地上での生育状態等を確認し、生育に影響の見られない46株を選出し、これらの株を用いてカイコ幼虫を用いた感染実験を行った。その結果、カイコの致死率に影響を与える5株を選出することができた。カンジダの病原性には複数の因子が関与すると考えられているものの、未解明な点が多く、未発見の病原因子が存在すると考えられている。近年病原性カンジダ属のゲノムシークエンスが次々と発表されており、ゲノムワイドな解析によってカンジダ感染の全体像を明らかにする研究が進められている。カンジダ属病原真菌の多くは二倍体あるいは異数体であるため遺伝子操作が複雑であるが、我々は一倍体ゲノムを有し分子生物学的取り扱いが最も簡便なカンジダ・グラブラータを用いて研究を進めている。本菌を用いた病原因子の網羅的な遺伝子機能解析を進め、病原性のメカニズムの解明を目指している。本研究課題では、危険因子の中で、近年、特に問題となっている留置カテーテルの感染への影響に焦点を絞り解析を進めている。カンジダはバイオフィルムを構成し留置カテーテルに付着しているケースが多い。そこで、β-グルカンの構成に関与する30遺伝子、マンノプロテインの構成に関与する24遺伝子、レクチンの構成に関与する8遺伝子など細胞表層を構成する成分や加水分解酵素28遺伝子などの分泌酵素類36遺伝子などを中心に遺伝子欠損株を作成し研究を進めた。これらの遺伝子改変株を用いて、カイコ幼虫やショウジョウバエに対して感染実験を行い。殺傷力に影響する遺伝子が6遺伝子見つかった。今後、これらの遺伝子機能解析を添えて報告する予定である。申請者らはカンジダ・グラブラータを用いた病原因子の網羅的な遺伝子機能解析を進め、表皮から内臓に至るカンジダの感染経路を研究し、病原性の理解を目指している。平成23年度は、カンジダ・グラブラータのゲノムから細胞表層の構成成分に関与すると予測される107遺伝子について欠損株の構築、確認、整備を行った。各遺伝子の組換え体を用いた解析では、統計処理を行うために通常最低2株ずつ用意する必要がある。今回、各遺伝子組換え体を最低3株ずつ構築した。次に遺伝子組換え操作に用いたベクターのみを導入した比較対象株の構築も行った。株構築の最終課程では、株(107株)の各株に該当するORFの欠損をPCR法によって確認した。

これらの株のうち、24株を用いて牛胎児血清10%を含む培地におけるポリウレタンプレートへの付着能の有無を調べたが、これまでのところ比較対象株に比較して有意に付着能に差が確認された組換え体は見出していない。24年度は、次世代シーケンサーを用いてハイスループットで解析を進める予定であったが、本シーケンサーから安定した結果を得るに至っていない。そのため、遺伝子の絞り込みが困難となった。そこで、培地上での解析によって感染に影響する可能性があり、感染実験の結果が単純に菌体の生育活性に影響を受けることを避けるために、遺伝子の絞りこみを進め、さらに多検体の感染実験を処理することが可能なカイコ幼虫を用いて感染実験を行った。その修正によって遺伝子の絞り込みはほぼ予定通り進行している。今年度は宿主との接点である細胞表層に焦点を絞り107の遺伝子について各遺伝子欠損株を構築し、カテーテルの素材であるポリウレタンプレートへの付着能をin vitroで調べた。当初、次世代シーケンサーを用いてハイスループットで解析を進める予定であったが、本シーケンサーから安定した結果を得るに至っていない。そこで、in vitroでの解析によって可能性の高い遺伝子の絞りこみを進めている。その修正によって研究やほぼ予定通り進行している。カイコ幼虫を用いた感染実験によって絞り込みを行った5株について、マウスを用いた感染実験を進める予定である。マウスの感染実験は、尾静脈より菌体を感染させ、2週間後マウスより菌体を回収し、寒天培地に塗抹することにより、菌体のCFUを測定する。その際、血液、腎臓、肝臓などの臓器を採取し、同様に菌体のCFUを測定する。カテーテルの有無による血流、各種臓器などへの播種感染への影響を調べる。研究費は主にマウス研究補助員雇用費と関連する消耗品の購入に使用する。107種類の組換え体全てについて、マウスに直接感染実験を施すこと効率的ではないと考え、まず、in vitroにおける遺伝子の絞り込みを進めている。平成24年度は遺伝子の絞り込みを重点的に行う。平成24年度は、当初の計画より多くの遺伝子組換え体の作製に取組んだために、マウスを用いた感染実験は次年度に実施することになった。また研究に専念するため成果報告のための学会発表も控えた。これらの理由により物品費と旅費の実施額が当初の予定より減少した。その分を25年度に繰り越し使用する。物品費:BALB/cマウス(1300円)50頭、その他に感染実験用器具等合計13万円旅費:学会等における成果発表の国内旅費3回分として158,220円人件費:研究補助員を1名96,000円×12ヶ月として115万円その他:論文投稿費等15万円研究補助員雇用費として80万円、関連する消耗品の購入に50万円、旅費として20万円を使用する。