hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト血管内皮細胞播種型人工血管を目的とするin vitro研究

しかし,サイトカインの刺激によって血管内皮細胞は向凝固性に傾くことが知られている.ELISAおよび日立蛍光分光光度計F-2000型(平成6年度交付)を用いてtPAについて検討した.培養4日間では,一般に初期の1日目の方がtPA遊離量が高かった.培養液中のtPA活性は殆ど検出できなかったが,これは恐らく,tPAはその疎外タンパク質であるPAHと共に遊離し,複合体を形成しているためと考えられる.一方,細胞成分を集めPAHを失活させると,tPA活性はかなり長期にわたって認められた.このように,血管内皮細胞から分泌される血小板凝集阻止剤(プロスタサイクリン)とは異なり,tPA遊離(tPA抗原として測定)は持続的であり,また継代数が比較的高くても血管内皮細胞から遊離するのが認められた.培養血管内皮細胞から遊離したtPAとPAH量比は,用いた種々の人工材料および細胞外マトリックスタンパク質の影響を受けた.例えば,ガラス上では,血管内皮細胞の増殖は悪くなかった,一般的に細胞接着タンパク質を介する場合に較べてtPA/PAH比は低値であった.これは血栓溶解能の低下を意味し,ガラス表面が培養血管内皮細胞にとって刺激を与え,細胞が向凝固性になると考えられる.結局,血管内皮細胞の血栓溶解系にも人工材料および細胞外マトリックスタンパク質の影響が認められた.
レーザー光電界加工による金属表面機能性付与の安定制御

本研究では、赤外短パルスレーザーの光電界加工により固体表面に自己形成する微細な構造体の「サイズ」とその「結晶」を同時に制御し、新しい機能性付与金属表面加工の基盤を確立することを目的としている。特に、新しい結晶(非晶質など)を付与した微細構造体を作成し金属について材料種と短パルスレーザーの照射条件に関する基礎データから短パルスレーザーによる自己形成微細構造体のサイズとその結晶の関係を明らかにするとともに微細構造体形成機構の解明を試み安定した結晶制御金属微細構造体作成のための加工技術を構築する事にある。この目的を達成するため最終年度は、(1)結晶制御金属微細構造体作成の基盤構築、(2)機能性付与加工金属の新しい機能探索に取り組んだ。(1)の課題では構築したレーザー照射装置を利用しサイズと結晶性の関係を明らかにした。特に微細周期構造形成には引張応力が関係していることがわかった。これにより微細構造体作成の基盤が構築された。(2)の課題では、照射レーザーのエネルギーを精密に制御するため、新たに高感度エネルギーメーターを導入し、機能性探索ができうるサイズ(mmサイズ)の大面積に機能性付与加工を行えるように改良した。結晶構造変化に適したスーパーガウス形状のレーザー強度分布へ改善した。新しい機能探索では、ドット着色、周期性の高い微細周期構造形成、超解像加工などの新しい知見を得ることに成功した。これらの知見はこれまでにない新しい応用のみならず基礎物理解明に役立つものである。特に、新しい結晶(非晶質)を付与した微細構造体を作成し、従来法において非晶質が実現されなかった銅、金、銀、白金といった実用上最も重要な金属に対して、材料種と短パルスレーザーの照射条件に関する基礎データから短パルスレーザーによる自己形成微細構造体のサイズとその結晶の関係を明らかにするとともに微細構造体形成機構の解明を試み安定した非晶質金属微細構造体作成のための加工技術を構築する事にある。この目的を達成するため初年度は、1)赤外短パルスレーザー光電界加工による金属表面の微細構造体形成、2)金属微細構造体の結晶評価、3)赤外短パルスレーザー光電界加工による金属微細構造体の結晶制御、に取り組み金属及び半導体表面に波長よりも短い周期の微細構造体が組織的に形成できることを確認した。結晶性評価ではレーザーフルーエンスを制御することで非晶質化させたり結晶性を保持できる事が明らかになった。また、ダブルパルスビーム照射する事でこれまで達成できなかった微細構造体の周期性を保持したまま加工深さを制御する事に成功した。これらの成果はレーザー波長以下のサイズの微細構造体を固体表面に形成する有効な加工手法となりうるものである。表面機能性付与加工による微細構造の安定形成のためには、その形成機構を明らかにしなければならない。この課題を解決するため、表面にできる「かたち」についてはFISCOF2(Particle in Cellシミュレーション)を用いて考察し、表面に形成される低密度プラズマ密度(固体密度の約1/10程度)が、そのサイズを決定する上で重要な役割を果たしていることを見出した。一方、構造体の「結晶性」の制御については、レーザー照射された固体より飛散する高エネルギー荷電粒子の成分が寄与していることをSRIM2010(モンテカルロシミュレーション)により明らかにした。これらの知見は実験結果と対比することで得られたもので、材料が変わった時にも適用できる有用な成果である。当初計画していた研究成果を得ており概ね順調に進んでいる。この目的を達成するため2年目は、1)非晶質化した金属微細構造体の組成分析、2)赤外短パルスレーザー光電界加工により金属表面から放出する荷電粒子のエネルギー評価に取り組み、非晶質化している表層には金属の他に水素イオンが注入されている可能性があることを考察した。また放出される金属イオンのエネルギーは、測定装置が実験室内から一時的に退去する必要が生じ測定できなかったが表面構造とレーザーとの相互作用についてシミュレーションすることで考察した。計算により得られたイオンエネルギーから、予想される表面の非晶質化層の厚みを考察した。原子数層の極表層が非晶質化している可能性が高い。イオンのエネルギーを議論する上で重要なアブレーション閾値フルーエンスについて我々の成果に加え、これまで報告されている金属について編纂した。アブレーション閾値フルーエンスは金属の仕事関数に関係があることを明らかにしイオン放出を考察する上で重要なデータベースが構築できた。今年度予定していた2課題のうち1課題については実験装置の一時的な移動により実験は実施できなかったが表面の微細構造の形からシミュレーションを実施することで考察した。

特にレーザー照射により金属表面から放出されるイオンエネルギーは本研究で目的としている「かたち」と「機能」との関係を明らかにするうえで重要な要素の一つであるが、微細構造物の平均的な形から放出イオンエネルギーを計算により予想し非晶質化への寄与を考察した。これらの成果より研究はおおむね順調に進んでいると考えている。本研究では、赤外短パルスレーザーの光電界加工により固体表面に自己形成する微細な構造体の「サイズ」とその「結晶」を同時に制御し、新しい機能性付与金属表面加工の基盤を確立することを目的としている。特に、新しい結晶(非晶質など)を付与した微細構造体を作成し金属について材料種と短パルスレーザーの照射条件に関する基礎データから短パルスレーザーによる自己形成微細構造体のサイズとその結晶の関係を明らかにするとともに微細構造体形成機構の解明を試み安定した結晶制御金属微細構造体作成のための加工技術を構築する事にある。この目的を達成するため最終年度は、(1)結晶制御金属微細構造体作成の基盤構築、(2)機能性付与加工金属の新しい機能探索に取り組んだ。(1)の課題では構築したレーザー照射装置を利用しサイズと結晶性の関係を明らかにした。特に微細周期構造形成には引張応力が関係していることがわかった。これにより微細構造体作成の基盤が構築された。(2)の課題では、照射レーザーのエネルギーを精密に制御するため、新たに高感度エネルギーメーターを導入し、機能性探索ができうるサイズ(mmサイズ)の大面積に機能性付与加工を行えるように改良した。結晶構造変化に適したスーパーガウス形状のレーザー強度分布へ改善した。新しい機能探索では、ドット着色、周期性の高い微細周期構造形成、超解像加工などの新しい知見を得ることに成功した。これらの知見はこれまでにない新しい応用のみならず基礎物理解明に役立つものである。次年度以降は、表面機能性付与加工による微細構造形成について提案した物理機構の妥当性を検証し、種々の材料に対して安定形成を実現するため以下の課題を実施する予定である。1非晶質化した金属微細構造体の組成分析、2赤外短パルスレーザー光電界加工により金属表面から放出する荷電粒子のエネルギー測定、3非晶質金属微細構造体作成の基盤構築、4機能性付与加工金属の新しい機能探索、これらの成果から種々の材料に対して表面機能付与加工の基盤を構築する予定である。3非晶質金属微細構造体作成の基盤構築、4機能性付与加工金属の新しい機能探索、これらの成果から種々の材料に対して表面機能付与加工の基盤を構築する予定である。
連鎖不平衡解析による総合失調症(精神分裂病)関連遺伝子群の解明

精神分裂病(統合失調症)の疾患感受性遺伝子を同定することを目的とし、グルタミン酸受容体異常仮説に基づき、グルタミン酸受容体遺伝子群を候補とした包括的な解析を行った。本年度はAMPA型グルタミン酸受容体3型遺伝子(GRIA3)、代謝型グルタミン酸受容体1型遺伝子(GRM1)について解析を行った。本遺伝子の全領域を含む340kbから既知のSNPをデータベースより8個選択し、罹患群199検体(男性116検体、女性83検体)、健常群220検体(男性129検体、女性91検体)を用い、これら8個のSNPのタイピングを行った。その結果、個々のSNPの遺伝子型頻度、アレル頻度において罹患群、健常群との間に有意差は認められなかった。また、全てのSNPの2つの組み合わせにおいてハプロタイプを構築し関連解析を行ったが、疾患との関連は見いだされなかった。現在、以上の結果について論文を準備中である。本遺伝子の全領域を含む460kbから既知のSNPをデータベースより10個選択し、罹患群、健常群それぞれ100検体を用い、GRIA3と同様の解析を行った。その結果、個々のSNPの遺伝子型頻度、アレル頻度ともに罹患群、健常群との間に有意差は認められなかった。しかし、ハプロタイプ解析の結果、SNP4-SNP5、SNP4-SNP6の組み合わせにおいて疾患との有意な関連が観察された。疾患感受性遺伝子を同定することを目的とし、グルタミン酸伝達異常仮説に基づきグルタミン酸受容体遺伝子を候補とした系統的な解析を行っている。本年度は、代謝型グルタミン酸5型遺伝。(GRM5)、8型遺伝子(GRM8)について解析を行った。本遺伝子の全体をカバーするように既知のSNPを14個選択し(SNP1-SNP14)、罹患群・健常群各100例のタイピングを行った。その結果、SNP5の遺伝子型頻度、アレル頻度において、罹患群と健常群との間に有意差が認められたが、Bonferroni補正によりこの有意差は消失した。またハプロタイプ解析の結果、SNP1-SNP3のハプロタイプ頻度において、有意水準を下回るP値が得られ、これはBonferroni補正をおこなっても消失しなかった。さらに、2次サンプルを用いて、SNP1-SNP3のハプロタイプについて関連解析を行ったところ、いずれも有意な関連は認められなかった。以上のことから、GRM5の統合失調症への主要な関与はないものと結論された。本遺伝子の全体をカバーするように、既知のSNPを22個選択し(SNP1-SNP22)、GRM5と同様の解析を行った。その結果SNP18とSNP19において遺伝子型頻度、アレル頻度ともに有意差が認められたが、Bonferroni補正によりこの有意差は消失した。また、ハプロタイプ解析の結果、SNP5-SNP6、SNP4-SNP5-SNP6、SNP5-SNP6-SNP7の3つの組み合わせにおいて、ハプロタイプと疾患の有意な関連が観察された。以上より統合失調症感受性遺伝子座がGRM8の近傍または、遺伝子領域内に位置することが示唆された。この結果は論文として発表した。現在、2次サンプルを用いた解析が進行中である。
国際共修カリキュラムのための「共通語としての日本語・英語」使用実態・意識の調査

2015年度(平成27年度)から2016年度(平成28年度)にかけて収集および整備を行った「プロジェクト型国際共修授業を模した課題遂行型の3人会話データ」について、引き続き、日本語教育・英語教育の現場に関わる研究分担者および(海外の)研究協力者と情報・意見交換を行うとともに、多様な言語学的・教育的視点からの分析結果の報告発表を行った。収集した第三者言語接触場面、相手言語接触場面、母語場面における会話データを、各自の分析目的に合わせた組み合わせで相互に比較しながら、それぞれの特徴や傾向の抽出を試みた。主として、2017年度(平成29年度)に行ったパネル発表(効果的な国際共修カリキュラム構築のための「共通語としての日本語」話者の言語行動の分析)を土台として、(1)スピーチスタイル、(2)文末表現(疑問表現)、(3)発話連鎖、などの特徴についてさらに発展させた分析結果をカナダや米国における日本語教育関係の学会(CAJLE, AATJ)で発表することができた。さらに、会話データの収集と同時に行ったフォローアップインタビュー調査の結果を活用し、その内容的分析と会話データの数量的分析結果との連関について考察した結果を発表した。加えて、日本の大学における国際共修という実践的教育環境の視点からの発表も行うことができた。本研究課題の最終年度にあたり、目標であったデータ分析結果から得られる教育的示唆を国際共修カリキュラムの実践の場へ還元するための方策を検討する素地を提供することができたと考えているが、より実践的な検討については次の課題研究に託したい。また、「共通語としての日本語(JLF)」データの分析が中心的となったが、収集済みの「共通語としての英語(ELF)」データの分析や両者の比較、相互作用性の検討についても、今後の課題としたい。日本国内の研究分担者および国外の研究協力者のうち計5名が平成27年8月の国際会議(Canadian Association for Japanese Language Education Annual Conference 2015)参加の機会を利用して会合を持ち、研究計画全般について打ち合わせを行うとともに、その後のメール通信などにより、データ収集(予備調査)のためのJLF、ELF接触場面(擬似的言語使用場面)の設計とそれに必要となる被験者へ説明書・同意書(日本語版・英語版)の作成を行った。これにもとづく予備調査の実施については、平成28年度前半に持ち越すこととなった。平成27年度の研究計画はデータ収集場面の設計と予備調査であったが、JLF、ELF接触場面(擬似的言語使用場面)の設計および被験者への説明書・同意書の作成までを終了することができた。説明書・同意書にもとづく被験者の募集・予備調査の実施については、平成28年度の5月6月まで延期することとなった。研究発表については、データが未収集のため分析結果にもとづく研究には至ることができなかったが、本研究課題の分析の基盤となる言語学的分析研究を他のデータ(書き言葉)にもとづいて行ったものや、リンガフランカに関する研究、背景となる国際共修カリキュラムの策定に向けての試みについての報告などを行った。平成27年度に完了したデータ収集(予備調査)のためのJLF、ELF接触場面(擬似的言語使用場面)の設計とそれに必要となる被験者へ説明書・同意書(日本語版・英語版)の作成を受けて、平成28年度の前半にはデータ収集が完了した。データは、JLF接触場面3グループ、ELF接触場面3グループ、および内的(母語)場面1グループの計7グループの課題遂行型作業中の会話である。データは音声データ(ICレコーダーによる録音)と映像データ(ミーティングレコーダーによる4方向撮影および固定ビデオカメラによる全体像撮影)である。また、JLF, ELF接触場面グループの被験者である計18名(3名×6グループ)に対する事後インタビュー(ICレコーダーによる録音)が完了した。音声・映像データの書き起こし(会話分析)、インタビューデータの書き起こしが委託業者によって完了している。会話分析書き起こしについては、今後の分析に備えて編集・加工を行った。これらのデータについては、国内の研究分担者および国外の研究協力者で共有し、それぞれの視点から分析が始まっているところである。当初の計画では、データ収集場面の設計と予備調査(平成27年度)、データ収集ー本調査(平成28年度)、データ分析(平成29年度)の予定であったが、ほぼ1年ずつ遅れており、予備調査の結果を受けての本調査の実施ができていない。幸いなことに、予備調査の収集場面の設計が適切であったと思えるデータを得ることができたことから、本調査は実施せず、予備調査データを活用して分析を進めることとした。予備調査データの分析にもとづいた研究発表は、3件行うことができた。加えて、関連する談話分析やELFに関する発表、国際共修カリキュラムの延長線となる課外活動に関する発表などを行った。2015年度(平成27年度)に収集が完了した会話データ(JLF接触場面3グループ、ELF接触場面3グループ、および内的(母語)場面1グループの計7グループ分)に加えて、JLF接触場面1グループと内的(母語)場面1グループのデータ収集を行った。すなわち、日本語データについては、第三者言語接触場面、相手言語接触場面、内的(母語)場面について各2グループの計6グループ分がそろったこととなる。2015年度(平成27年度)と2016年度(平成28年度)は、やや遅れ気味であったが、予備調査を本調査と置き換えて進める決定をしたことで、計画の調整を図ることができた。

データ分析が当初の予定通りに、2017年度(平成29年度)の前半までに完了することができたことから、分析結果の発表をパネルの形で実現することができた。加えて、同データを用いた発話とジェスチャーの関係に焦点を当てた発表を1件、国際共修(ELF)に関する学会発表を2件行うことができた。2015年度(平成27年度)から2016年度(平成28年度)にかけて収集および整備を行った「プロジェクト型国際共修授業を模した課題遂行型の3人会話データ」について、引き続き、日本語教育・英語教育の現場に関わる研究分担者および(海外の)研究協力者と情報・意見交換を行うとともに、多様な言語学的・教育的視点からの分析結果の報告発表を行った。収集した第三者言語接触場面、相手言語接触場面、母語場面における会話データを、各自の分析目的に合わせた組み合わせで相互に比較しながら、それぞれの特徴や傾向の抽出を試みた。主として、2017年度(平成29年度)に行ったパネル発表(効果的な国際共修カリキュラム構築のための「共通語としての日本語」話者の言語行動の分析)を土台として、(1)スピーチスタイル、(2)文末表現(疑問表現)、(3)発話連鎖、などの特徴についてさらに発展させた分析結果をカナダや米国における日本語教育関係の学会(CAJLE, AATJ)で発表することができた。さらに、会話データの収集と同時に行ったフォローアップインタビュー調査の結果を活用し、その内容的分析と会話データの数量的分析結果との連関について考察した結果を発表した。加えて、日本の大学における国際共修という実践的教育環境の視点からの発表も行うことができた。本研究課題の最終年度にあたり、目標であったデータ分析結果から得られる教育的示唆を国際共修カリキュラムの実践の場へ還元するための方策を検討する素地を提供することができたと考えているが、より実践的な検討については次の課題研究に託したい。また、「共通語としての日本語(JLF)」データの分析が中心的となったが、収集済みの「共通語としての英語(ELF)」データの分析や両者の比較、相互作用性の検討についても、今後の課題としたい。平成28年4月に研究代表者の所属大学に着任した教員(留学生教育担当)2名を新たに研究分担者に加え、データ収集および分析に参画することで、予備調査および本調査の加速化を試みる。留学生教育(日本語など)に直接関わる教員の関与により、被験者との調整および現場に密接した調査設計などの点において効率化が図れると期待する。また、予備調査を実施することで、その実施データに基づく中間発表および分析結果の発表を、研究代表者、分担者、協力者の共同で行っていく予定である。今後の分析の対象となる予備調査の音声、映像、書き起こし(会話分析)、インタビューデータの整理および研究者間での共有が完了したので、それぞれの研究視点からの分析を本格的に開始する。それに先立って、2017年4月には国内の研究分担者が集い、合同データ観察会を行った。ともに映像を視聴しながら意見交換、議論をすることで、各グループの特徴の抽出とデータが示唆するポイントの整理がある程度できたため、今後の個別分析を促進することができると考える。
ダウン症候群合併骨髄性白血病の治療反応の多様性解明の研究

本研究は、ダウン症候群に発症した新生児一過性白血病(TAM)、急性骨髄性白血病(ML-DS)の発症時、寛解導入不能時ならびに再発時の白血病細胞の薬剤感受性試験を行い、これらの疾患に有用な薬剤を模索することが最終目的である。研究2年目の平成31年度は、当初の予定から変更したCell Titer Groによる測定を実際に行い、評価ならびに問題点に対する対応が課題であった。まず凍結検体を用いたCell Titer Gro法によるアッセイ法の有用性を検討するために、本学附属病院で診療し本研究への同意が得られた6名の白血病患者(急性リンパ性白血病5例、急性骨髄性白血病1例)の7つの凍結検体(1名は急性リンパ性白血病患者の初発時と再発時)を神奈川県立こども医療センターに新たに導入された分注器を使用し検討した。従来行われていたWST8法と同等の結果が得られ、また少量の細胞、凍結細胞でもアッセイ可能なことが示された。さらに、神奈川県立こども医療センターで診療され本研究への同意が得られたTAM5症例の薬剤感受性の検討もCell Titer Gro法で行った。従来の報告にあるようにTAMの病的細胞においては抗白血病薬として実臨床で用いられているcytarabineやetoposideに高感受性がみられたが、MEK阻害薬trametinibに高感受性を有するものとそうでない症例があった。新規薬剤として有望な薬剤であるとともに、これらの症例がそののちML-DSを発症したか、その予後はどうだったかが興味深い。残念ながら、最大の目的であるML-DS症例の検討は、自施設で該当症例がなく、また本邦での多施設共同の臨床試験が始まっていないことから検体収集が難しく、実施できなかった。研究の遅延は、研究費申請時に行うアッセイ方法を、WST8法からプロメガ社のCell Titer Groによる測定に変更したことによる。しかしながらCell Titer Gro法は、少量の細胞、また凍結細胞でもアッセイ可能であることがわかり、検体採取が困難な該当症例群の薬剤感受性測定に有用であることが示された。このCell Titer Gro法を用いた凍結検体でTAMにおいて従来から知られているcytarabineやetoposideに加え、分子標的薬であるMEK阻害薬trametinibに高感受性を有する症例がみられたことは新たな知見である。一方、最大の目的であるML-DSの初発ならびに再発例での検討ができなかった。ML-DSは希少疾患である上に臨床研究が現在行われておらず検体収集が困難でありやむを得ない部分もあるが、全く検討できなかったのは想定外であった。Cell Titer Gro法によるアッセイの測定機器であるGloMaxが高価で本学での購入は困難であること、凍結検体によるアッセイで信頼性のある結果が得られることから、今後も引き続き、神奈川県立小児医療センターに測定試薬などの物品ならびに凍結検体を持参して、該当症例(TAM,初発ならびに再発MLーDS)の白血病細胞の測定を行う。すでに測定を行ったTAM 5例については、今後ML-DSを発症する可能性があり、その場合には連続的に薬剤感受性試験を行い、経時的変化を検討する。TAM症例については遺伝子解析なども追加検討したのち、学会発表、論文化も検討する。さらにTAMならびにML-DSの全国的な前方視的臨床試験がまもなく開始されることから、それらの参加施設とも連携をとり、余剰検体を利用するなど検体収集し、測定を行い本研究の目的を達成したい。本研究は、ダウン症候群に発症した新生児一過性白血病、急性骨髄性白血病の発症時、寛解導入不能時ならびに再発時の白血病細胞を経時的に採取し、WST8法で薬剤感受性試験を行うことが最終目的である。初年度である平成29年度は、「自験例を中心に最適なアッセイ方法を決定する」ことが目的で、ダウン症候群以外の白血病も含めた自施設での診断症例の白血病細胞の薬剤感受性の検討を行う、細胞株や凍結細胞などでも検討し、最適な方法を確立する、というものであった。本研究実施にあたり、類似疾患での薬剤感受性試験の研究実績がある神奈川県立小児医療センター血液腫瘍科後藤裕明科長とメールなどで情報交換、さらに平成29年6月30日には研究代表者の多賀崇が同センターに出張し、試験の具体的実施方法、問題点につき見学ならびに研究方法などについて討論、意見交換した。本研究費申請の段階では、WST-8アッセイ法にて研究を行う予定であったが、WST-8アッセイ法では多くの細胞数が必要であり、小児白血病、特にダウン症を伴う急性骨髄性白血病では検体採取が困難な場合が多いことから、アッセイが十分できない可能性があり、より少量の細胞数でアッセイ可能なプロメガ社のCell Titer Groによる測定に切り替えることになった。これらを踏まえて当初の研究計画書を書き直し、滋賀医科大学の倫理委員会に申請、2017年10月承認を得た。その後、試験参加患者のリクルートに努めたが、期間内に該当患者はなかった。研究費申請の段階では、WST-8アッセイ法にて試験を行う予定であったが、この方法ではアッセイに多くの細胞数が必要であり、小児白血病、特にダウン症を伴う急性骨髄性白血病では細胞採取が困難であることから、より少量の細胞でアッセイ可能なプロメガ社のCell Titer Groによる測定に切り替える方針となった。これらを踏まえて研究計画書を書き直し、滋賀医科大学の倫理委員会に申請、2017年10月承認を得た。研究の方法の見直しへの対応を行ったことと該当患者がいなかったことが研究遂行遅延につながった。

本研究は、ダウン症候群に発症した新生児一過性白血病(TAM)、急性骨髄性白血病(ML-DS)の発症時、寛解導入不能時ならびに再発時の白血病細胞の薬剤感受性試験を行い、これらの疾患に有用な薬剤を模索することが最終目的である。研究2年目の平成31年度は、当初の予定から変更したCell Titer Groによる測定を実際に行い、評価ならびに問題点に対する対応が課題であった。まず凍結検体を用いたCell Titer Gro法によるアッセイ法の有用性を検討するために、本学附属病院で診療し本研究への同意が得られた6名の白血病患者(急性リンパ性白血病5例、急性骨髄性白血病1例)の7つの凍結検体(1名は急性リンパ性白血病患者の初発時と再発時)を神奈川県立こども医療センターに新たに導入された分注器を使用し検討した。従来行われていたWST8法と同等の結果が得られ、また少量の細胞、凍結細胞でもアッセイ可能なことが示された。さらに、神奈川県立こども医療センターで診療され本研究への同意が得られたTAM5症例の薬剤感受性の検討もCell Titer Gro法で行った。従来の報告にあるようにTAMの病的細胞においては抗白血病薬として実臨床で用いられているcytarabineやetoposideに高感受性がみられたが、MEK阻害薬trametinibに高感受性を有するものとそうでない症例があった。新規薬剤として有望な薬剤であるとともに、これらの症例がそののちML-DSを発症したか、その予後はどうだったかが興味深い。残念ながら、最大の目的であるML-DS症例の検討は、自施設で該当症例がなく、また本邦での多施設共同の臨床試験が始まっていないことから検体収集が難しく、実施できなかった。研究の遅延は、研究費申請時に行うアッセイ方法を、WST8法からプロメガ社のCell Titer Groによる測定に変更したことによる。しかしながらCell Titer Gro法は、少量の細胞、また凍結細胞でもアッセイ可能であることがわかり、検体採取が困難な該当症例群の薬剤感受性測定に有用であることが示された。このCell Titer Gro法を用いた凍結検体でTAMにおいて従来から知られているcytarabineやetoposideに加え、分子標的薬であるMEK阻害薬trametinibに高感受性を有する症例がみられたことは新たな知見である。一方、最大の目的であるML-DSの初発ならびに再発例での検討ができなかった。ML-DSは希少疾患である上に臨床研究が現在行われておらず検体収集が困難でありやむを得ない部分もあるが、全く検討できなかったのは想定外であった。本アッセイの測定機器であるGloMaxが本学にはなく、同機器は大変高価で購入困難であること、また代替え機での測定も検討したが不可能であることなどから、同機器のレンタルによる測定もしくは同機器を有する神奈川県立小児医療センターなどにサンプルを持参して測定を行うことを検討中である。該当症例があり、本研究の同意が得られた場合に、白血病細胞を凍結保存するなど、ある程度まとめて測定を行う予定である。軌道に乗れば他施設の症例も検討していきたい。
遺伝子改変マーモセット作成のための革新的胚操作システムの開発

近年ゲノム編集技術の発展により比較的容易に遺伝子改変が様々な動物で行えるようになってきた。しかし、実際に遺伝子改変モデルマーモセットを作出するためには多くの受精卵の獲得が必須である。また、体外受精のため、精子の保存法の確立も望まれている。そこで私たちは、霊長研の中村克樹教授から分与して頂いた、安楽死されたマーモセットの卵巣および精巣上体をもちいてマーモセット卵子および受精卵を効率的に作出することと精子の凍結保存法の確立を行った。<方法>以下の実験は、主に京大霊長研の中村克樹教授より提供された試料を用いた。マーモセット卵巣の異種間移植(1)マーモセット卵巣を細切した。移植しない場合は液体窒素にて凍結保存した。(2)免疫不全マウスの卵巣を切除後、左右の腎被膜下に卵巣片を移植した。凍結保存した卵巣は融解後に使用した。(3)移植から10日以降、卵胞刺激ホルモン(FSH)を9日間毎日または2日毎に投与した。(4)FSHの投与開始から9日後に左右腎臓を採材した。(5)卵巣から採卵できた卵子を26時間培養した。(6)培養後MII期となった卵子を顕微授精した。卵黄糖液による精子の凍結保存(1)輸送後の精巣上体尾部を卵黄糖液内にて細切した。(2)精子懸濁液を作製し、室温から4°Cまで2時間かけて冷却した。(3)精子懸濁液と同量の耐凍剤入り保存液を添加した。(4)プラスチックストローに封入後、液体窒素液面上に静置し凍結した。<結果>冷蔵輸送後および凍結融解後のマーモセット卵巣は腎被膜下に生着し、GV期の卵子を得ることが出来た。GV期の卵子は成熟培養後、MII期に進み、顕微授精後、前核期受精卵まで発生させることが出来た。冷蔵輸送後の精巣上体尾部より運動性を有する精子を回収することができ、それら精子の凍結保存を行った。本研究の成果は、これまで未利用であったマーモセット卵巣をヌードマウスに移植し、ホルモン投与によりその体内で卵子が成熟し、採取できることの発見である。この卵子は人工授精により受精卵が得られることを確認している。移植した卵巣からの成熟卵の取得方法に関する先行研究はなく、マーモセット新生児卵巣にはヒトに比べ、未熟な卵原細胞が多数存在するという報告や(Fereydouni et al. Reproduction 2014)、ヌードマウスに移植したマーモセット卵巣の成熟卵胞の成長・卵胞プールの維持についてSonntagらの報告(Fertil Steril 2011他)がある。また、広島大学の外丸らは、卵巣刺激法及び未成熟卵子の体外成熟法を検討しているが、マーモセットの未成熟卵子ホルモン誘発による過排卵の方法は確立されていない。したがってこの手法を精緻化し、大量の成熟卵子や受精卵を安定的に生産する手法が確立できれば、経費と動物福祉の問題を避けて、成熟卵子や受精卵を供給する道が拓ける。これまでに京大霊長研の中村克樹教授をはじめとして複数施設から提供された卵巣を用いて、新潟大学脳研究所までの試料の冷蔵輸送の方法、ヌードマウスへの移植の方法、卵胞刺激ホルモン(FSH)の投与プロトコール、移植した卵巣からの卵子採取の方法、体外受精の方法について種々の条件を検討して、良好な成績を示す方法が明らかになってきた。併せて、オスのマーモセットの精巣上体尾部の試料取得後の冷蔵輸送の方法、精巣上体尾部から運動性を有する精子の採取の方法、精子の凍結保存の方法などの条件検討を行い、同様に良好な成績を示す方法が明らかになった。第1は、飼育中の死亡個体や実験目的で安楽死させた個体の卵巣を免疫不全マウスに移植し、マウス体内でホルモン投与により成熟させた卵子を体外受精させ、受精卵として利用する手法の確立である。併せて、この方法により野生型および遺伝子改変マーモセット卵巣より、卵子を採取し受精卵を得て、効率的に個体を作出する方法としても確立する。第2は、取得した受精卵に遺伝子編集法で変異導入後に仮親に移植し、脳高次機能解析に利用可能な疾患モデルマーモセット個体を作出する。この過程で胚操作に熟達した人材育成にも努める。第3は、胚盤胞補完法による遺伝子改変マーモセット精子取得法の確立である。現在、進展している遺伝子編集技術であるが、長鎖のDNA断片挿入などの複雑な遺伝子改変の効率は低く、産子の少ない動物胚に適用するのは現実的ではない。この問題を解決するため、複雑な遺伝子改変はES/iPS細胞でおこない、これら細胞を精巣形成不全かつ免疫不全のマウス胚に移植し、胚盤胞補完法により当該細胞由来の精子を得る。この精子を用いれば、顕微授精法により少数の未受精卵から産子の取得が可能になる。これまで作製されてきた遺伝子改変マーモセットは、トランスジェニック法や遺伝子編集法によりなされてきたが、これらの技術はいずれも多数の胚を必要とし、その取得に経済的にも倫理的にも問題があった。安楽死動物からの卵巣を用いた本技術が実現できれば、倫理的な問題を避け、経済的に多数の受精卵が確保できる道が拓ける。さらに、胚盤胞補完法を用いた遺伝子改変生殖細胞の確保は、遺伝子改変マーモセット作製の大きなブレークスルーになる。

本研究課題により、確実かつ低コストで遺伝子改変マーモセットを作出できるように努め、多様な発想で研究する多くの研究者へリソースとして供与して研究発展に大きく寄与したい。近年ゲノム編集技術の発展により比較的容易に遺伝子改変が様々な動物で行えるようになってきた。しかし、実際に遺伝子改変モデルマーモセットを作出するためには多くの受精卵の獲得が必須である。また、体外受精のため、精子の保存法の確立も望まれている。そこで私たちは、霊長研の中村克樹教授から分与して頂いた、安楽死されたマーモセットの卵巣および精巣上体をもちいてマーモセット卵子および受精卵を効率的に作出することと精子の凍結保存法の確立を行った。<方法>以下の実験は、主に京大霊長研の中村克樹教授より提供された試料を用いた。マーモセット卵巣の異種間移植(1)マーモセット卵巣を細切した。移植しない場合は液体窒素にて凍結保存した。(2)免疫不全マウスの卵巣を切除後、左右の腎被膜下に卵巣片を移植した。凍結保存した卵巣は融解後に使用した。(3)移植から10日以降、卵胞刺激ホルモン(FSH)を9日間毎日または2日毎に投与した。(4)FSHの投与開始から9日後に左右腎臓を採材した。(5)卵巣から採卵できた卵子を26時間培養した。(6)培養後MII期となった卵子を顕微授精した。卵黄糖液による精子の凍結保存(1)輸送後の精巣上体尾部を卵黄糖液内にて細切した。(2)精子懸濁液を作製し、室温から4°Cまで2時間かけて冷却した。(3)精子懸濁液と同量の耐凍剤入り保存液を添加した。(4)プラスチックストローに封入後、液体窒素液面上に静置し凍結した。<結果>冷蔵輸送後および凍結融解後のマーモセット卵巣は腎被膜下に生着し、GV期の卵子を得ることが出来た。GV期の卵子は成熟培養後、MII期に進み、顕微授精後、前核期受精卵まで発生させることが出来た。冷蔵輸送後の精巣上体尾部より運動性を有する精子を回収することができ、それら精子の凍結保存を行った。本研究の成果は、これまで未利用であったマーモセット卵巣をヌードマウスに移植し、ホルモン投与によりその体内で卵子が成熟し、採取できることの発見である。この卵子は人工授精により受精卵が得られることを確認している。移植した卵巣からの成熟卵の取得方法に関する先行研究はなく、マーモセット新生児卵巣にはヒトに比べ、未熟な卵原細胞が多数存在するという報告や(Fereydouni et al. Reproduction 2014)、ヌードマウスに移植したマーモセット卵巣の成熟卵胞の成長・卵胞プールの維持についてSonntagらの報告(Fertil Steril 2011他)がある。また、広島大学の外丸らは、卵巣刺激法及び未成熟卵子の体外成熟法を検討しているが、マーモセットの未成熟卵子ホルモン誘発による過排卵の方法は確立されていない。したがってこの手法を精緻化し、大量の成熟卵子や受精卵を安定的に生産する手法が確立できれば、経費と動物福祉の問題を避けて、成熟卵子や受精卵を供給する道が拓ける。これまでに京大霊長研の中村克樹教授をはじめとして複数施設から提供された卵巣を用いて、新潟大学脳研究所までの試料の冷蔵輸送の方法、ヌードマウスへの移植の方法、卵胞刺激ホルモン(FSH)の投与
生命進化的手法によるコンプライアンスチャンバレス拍動式補助人工心臓システムの研究

拍動型人工心臓の課題であるコンプライアンスチャンバーの削減および運動変換機構の非接触化をめざし,inflowカニューレ一体型コンプライアンスチャンバー及び磁気カム式人工心臓に関する研究を行った.その結果,inflowカニューレ一体型コンプライアンスチャンバーは通常のコンプライアンスチャンバによる患者負担を大幅に削減できることを示し,磁気カム式人工心臓は非接触にモータ一方向回転で左右の血液ポンプを稼働することをin vitro実験で明らかにした.拍動型人工心臓の課題であるコンプライアンスチャンバーの削減および運動変換機構の非接触化をめざし,inflowカニューレ一体型コンプライアンスチャンバー及び磁気カム式人工心臓に関する研究を行った.その結果,inflowカニューレ一体型コンプライアンスチャンバーは通常のコンプライアンスチャンバによる患者負担を大幅に削減できることを示し,磁気カム式人工心臓は非接触にモータ一方向回転で左右の血液ポンプを稼働することをin vitro実験で明らかにした.本年度は、1)拍動式補助人工心臓の能動的血液吸引によるコンプライアンスチャンバレス駆動に関する研究、2)磁気浮上型動式補助心臓のための磁気浮上式カムの基礎開発の、以上2点の研究を行った.コンプライアンスチャンバーレス駆動に関する研究は、プッシャープレート型血液ポンプのプッシャープレートに鉄板を接着し、人工心臓アクチュエータ側に直径5mm、厚み1.5mmの円筒型ネオジウムー鉄磁石を8個取り付け、血液ポンプとプッシャープレート間の時期吸引力による能動的血液吸引により血液ポンプの拡張収縮に伴う空気部分体積変化を空気拡張により補償する方法である.In vitro実験の結果、血液流入期にアクチュエータ内圧が-200mmHg、ポンプ拡張期消費電力が1Aから3Aへと増えたが通常通りのポンプ特性を出し駆動することができた.磁気浮上式カムは、外径8mm、内径2mm、厚み2.5mmのリング状のネオジウム鉄磁石を**個用い、外径70mm、内径50mm、180度で4mmの高さ変化するカム(outer)と、外径48mm、内径28mm、180度で4mmの高さ変化を与えるカム(inner)をモータ側と血液ポンプ側に装着し、モータの回転運動をプッシャープレートの4mmの直線往復運動に変換するものである.試作した磁気浮上式カムにブラシレスDCモータとプッシャープレートを組み合わせ、磁気浮上能力を検証した.プッシャープレートに重りをの磁気浮上カムを回転させたところ、動脈圧100mmHgに対応する5.8kgの負荷に対し磁気浮上を維持でき、4mmのストロークでプレートが稼働することを確認した.今後は、ポンプストローク8mmの磁気浮上式カムの開発とともに、磁気浮上式補助人工心臓を設計開発しin vitro実験による評価を行っていく予定である.今年度は,磁気浮上式拍動型補助人工心臓の試作,及びcompliance chamberless化のための移動空気量とポンプ特性の関係について研究を行った磁気浮上式拍動型補助人工心臓の試作では, Innerリングカムにネオジウム鉄磁石を20対, outerリングカムに同磁石34対を配置した同心2重構造の螺旋レール状磁気反発カム(磁気浮上力7.6kg)により動脈圧120mmHgに抗しモータの回転運動をプッシャープレートの直線往復運動(ストローク8mm)に変換する磁気浮上カム式人工心臓を開発した(体積421ml). in vitro実験の結果,磁気浮上力は設計通りに得られたが,ポンプ拡張期に磁気反発力に抗してプッシャープレートが拡張末期位置まで戻るのに十分な力を得ることができず,改良型磁気浮上式人工心臓の考案が必要となった。Compliance chamberless化に関する研究は,昨年度に考案したネオジウム鉄磁石を利用した能動的血液吸引によるポンプ駆動時,異なる容量のcompliance chamberを作成・接続し,体外模擬循環回路を用いたin vitro実験でアクチュエータ側空気移動量のポンプ特性に与える影響を調べた.その結果,動脈圧100mmHg,拍動数92bpmポンプ1回拍出量66mlにおいて,66mlのcompliance chamber装着時でポンプ拍出量5.9L/分に対し,空気移動量をその約50%の37mlとした場合ポンプ拍出量は5.3L/分となり,空気移動量10mlでポンプ拍出量は3.2L/分となった,従って,ポンプ性能を大きく損なわずcompliance chamberを削減するには,ポンプ1回拍出量の50%のアクチュエータ側空気を移動させればよいことが分かった.次世代型拍動式人工心臓の開発の基礎研究を目的に,拍動式人工心臓で課題となっているコンプライアンスチャンバーの削減と運動変換機構の非接触化を目的に,1)in flowカニューレー体型コンプライアンスチャンバーおよび2)磁気カム式人工心臓の開発を行ったので報告する.Inflowカニューレー体型コンプライアンスチャンバーは,血液ポンプ流入部に空気待機場所を設置し拍動型ポンプの稼働に伴う人工心臓アクチュエータ内の空気を血液ポンプ流入カニューラに移動させその体積変化は血液流路側に起こさせ,血液ポンプと別にコンプライアンスチャンバーを設置する必要はない.昨年度の研究成果をもとにin flowカニューラ部コンプライアンス容量をポンプ一回拍出量の約60%とする40mlとしたところ,外側ハードシェル外径50mm,内側ソフトシェル外径20mm,長さ80mmの葉巻型となった.外側ハードシェルをエポキシ樹脂,内側ソフトシェルをシリコーンチューブで作成しin vitro実験で評価した.その結果,大気解放で駆動時のポンプ拍出量4.3L/分に対し,in flowカニューラー体型コンプライアンスチャンバー使用時は1L/分と大幅に減少した.

この原因はシリコーンチューブ内径が体積変化に対し不十分であったためであり,内側ソフトシェルデザインを改良デザインすることで拍出量の減少はお幅な改善が期待でき,In flowカニューレ一体型コンプライアンスチャンバーは拍動型人工心臓の課題であるコンプライアンスチャンバーの削減に大きく貢献できる技術であると思われる.磁気カム式人工心臓は,カムローラの代わりにネオジム鉄磁石の反発力を応用したもので,モータの一方向回転運動を非接触に直線往復運動に変換するものである.位相が180度異なる磁気カムを超音波モータの両モータ軸端に固定しその外側に左右の血液ポンプを設置した.その結果,モーター方向回転で左右の磁気カムが交互に動作することで左右の液ポンプを稼働する完全人工心臓が実現できる.力学モデル上では動脈圧54mmHgまで稼働であったのに対し,実際に磁気カム式完全人工心臓を製作してin vitro実験で評価したところ,40mmHgの動脈圧までポンプは稼働可能であった.しかし同じ磁気カムの寸法であっても使用するネオジム鉄磁石の形状を変更し磁石部面積を1.6倍に増やすことで最高動脈圧100mmHgまで理論的には可能であることがわかり,モーター回転で非接触に運動変換して左右ポンプを稼働する新しい人工心臓アクチュエータとして期待できることが明らかになった.
新規2次元胃上皮細胞培養系を用いた疾患特異的ピロリ菌病原因子の追及

1)一部のヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)感染者だけが疾患を発症し、しかも人によって発症する疾患に違いがでるのはなぜだろう?2)胃癌発症率に地域差が生じるのはなぜだろう?という2つの「問い」に答えるため、我々が確立した2次元化したオルガノイド(胃ではガストロイドと呼ぶ)とT細胞を共培養する系を用いて、既知の病原因子の真の機能の探求、さらに、菌の全ゲノム解析を行い、疾患の発症に関与する新規病原因子の発見を目指す研究を展開する。
水道水源に混入する農薬の生物分解除去の研究

農薬は一般に微生物によって好気分解されにくいといわれている。しかし、わが国の水道水源は表流水の場合ほとんど例外なく農薬に微量ではあるが汚染されている。現在の浄水法では除去できない。そこで困難を前提に好気生物分解の研究をスタートした。予備実験的にビーカーラストレベルで検討の結果、予想以上に容易に分解され、生成物の確認さらに分解菌の単離にも成功した。ただ、農薬の場合、分解されても生成物の毒性が分解される前より低減されなければ効果があったとは言えない。そこで、研究を大別して、分解研究と毒性評価の研究に二分して進めた。まず、後者の毒性評価についてはCHL(チャイニーズハムスター肺細胞の染色体異常テスト法を開発であったので、その成果を継続した。顕微鏡写真をテレビカメラで入力し画像処理装置(ル-ゼック社製)で自動処理の上、検出する方法である。分解研究ではその後長期にわたり分解能力が極めて小さくなり、結局水中のpHに大きく依存し、アルカリ側の狭い限られた範囲で分解されることをつきとめた。先の予備実験では偶然この狭い範囲で実験したものであった。ひきつづき、生成物の分離、分解菌の単離にも成功したが、物質名、菌名の同定など引き続き実施している。生成物の毒性についてはあまり成果が上らず、今後に課題を残した。農薬のうち、水道水質基準に新たに取り上げられたシマジン(CAT)と混入の可能性の高いCNPについて、琵琶湖表流水中に生息する微生物で分解除去する実験を室内実験スケール、プラントスケールで共に実施した。CATの分解菌生成物質の確認も完了した。一方、微生物が生息する自然泥の親和性が分解速度を支配することをも見い出し、泥の親和性を制御するという新たな研究にも入ることができた。目下はpHはCa,Mgを用いてその制御効果を明らかにしている。農薬CATとCNPの好気性分解を中心に研究を続けてきたが、びわ湖水中にこれらを分解する微生物が存在することは研究着手後、容易に明らかとなった。しかし、その能力が不安定(日によって大きく変動)であること、その能力が実用的には小さいことが徐々に判明し、研究は困難をきわめた。その後、生物分解能がpH値によって大きく支配され、酸性、中性域で能力は小さく、アルカリ域で比較的高い能力を発揮することを明らかにすることができた。以後、実験条件を整えることによって分解菌2種を単離するとともに、分解生成物を2種確認した。その分解生成物の毒性については目下文献的考察を急いでいる。
炎症反応を制御する相補性ぺプチドの研究

補体反応の過程で生成されるアナフィラトキシンC5aは極めて強力な起炎因子であり、好中球や血管内皮細胞を刺激活性化してサイトカインを放出させ、サイトカインストームを引き起こす。アナフィラトキシンC5aにより惹起されるこれら重篤な炎症性病態の全容を解明するために、C5aに対する阻害ぺプチドを、相補性ぺプチド創出技術を用いて創出した。C5a相補性ペプチドAcPepAの効果をラット脳虚血再灌流モデルで検討したところ、AcPepAを投与した群はクリニカルスコアを有意に抑制した。ヒトのC5a阻害ペプチドAcPepAを相補性ペプチド創出技術を用いて創出しており、C5a活性阻害示すことを確認して来た。そこで、このヒトC5a阻害ペプチドがラット実験系において、抗炎症作用を発揮できるかを検証し、さらにラットC5aの活性を阻害できる相補性ペプチドを新たに設計して、抗炎症作用の基礎的な作用機序の解明ことを試みた。まず、C5a相補性ペプチドのラットC5aへの結合性を調べるために、大腸菌発現系を用いて遺伝子組み換えラットC5aを作製することを試み、発現ベクターを構築した。また、ラットC5aの機能阻害活性を解析するために、ラット好塩基球細胞株RBL-2H3及び顆粒球細胞株ShayにおけるC5aレセプターの発現を調べたところ、共にC5aレセプターが発現していることが分かった。次にザイモザンで処理したラット血清を用いてRBL-2H3細胞に刺激を加えてみたが、未処理の細胞を大きな変化はなかった。RBL-2H3細胞上のC5aレセプターの発現があまり強くないのが原因と考えられたので、細菌感染時にC5aレセプターの発現が増強するのではないかと考え、LPSでRBL-2H3細胞を刺激したところ、C5aレセプターの発現が増強されることが明らかとなった。一方、ヒトPL37部分を標的としてANTISにて検索したのと同様に、ラット相補性ペプチドを新たに設計することを試み、9種のラットC5a相補性ペプチドを設計した。これらのラット相補性ペプチドの受託合成を行った。ヒトのC5a阻害ペプチドAcPepAを相補性ペプチド創出技術で創出しており、C5a活性阻害示すことを確認して来た。今回は12種の新規C5a相補性ペプチドを設計し、これらの相補性ペプチドの活性測定を行った。プラズモン磁気共鳴検出装置BIAcoreを用いて、C5aに特異的に結合反応を示すかを検討したところ、amidePep11及びその関連ペプチドであるT3713-6、T3713-8が今までの相補性ペプチドと比較しても顕著にC5aと結合し、その結合定数は約10^<-5>とペプチドとしてはかなりの高値であった。次に、新規相補性ペプチドがC5aの機能を阻害するかどうかを、ヒト好中球を用いたカルシウムシグナルの阻害効果で検討したところ、amidePep11はC5a刺激によるCa2+流入を著しく阻害することができた。現在in vivoモデルにおける阻害効果を検討中である。一方、C5aの機能阻害活性を解析するために、ヒト末梢血におけるC5aレセプターの発現を調べたところ、単球においてC5aR,C5L2の2種類のC5aレセプターが発現しているが、T細胞及びB細胞には発現していないことが分かった。また、ラット好塩基球細胞株RBL-2H3におけるC5aレセプターの発現は昨年報告したとおり、C5aR及びC5L2を発現していた。細菌感染時にC5aレセプターの発現が増強するのではないかと考え、LPSでRBL-2H3細胞を刺激したところ、C5aR及びC5L2の両C5aレセプターの発現が増強されることが明らかとなった。また、ウイルス感染モデルとしてpoly-ICで刺激を行ったところ、LPSと同様にC5aR及びC5L2の両C5aレセプターの発現が増強されることが明らかとなった。C5a阻害ペプチドがラット実験系において、抗炎症作用を発揮できるかを検証するため、まず、ラット組織における2つのC5a受容体の発現をRT-PCRで行った。C5aRは、SpleenとThyroidで主に発現している一方、C5L2は、Spleen,Kidney,Testis,Thyroid,Large intestine,Blood,Lungで発現していることが確認できた。合成したC5a相補性ペプチドの阻害活性が脳疾患における代表的なモデルであるラット脳虚血再灌流モデルで有効であるかどうかを検討した。C5a相補性ペプチドAcPepAを投与した群はクリニカルスコアを有意に抑制した。また、延命効果も見られた。しかしながら、TNF、MIF、IL-1、IL-6等のサイトカインを蛍光ビーズ法により測定したところ、差は見られず、ELISA法で測定したHMGB1も同様であった。

さらに脳の組織学的評価をH.E染色およびKluver-Barrera染色で行ったが、正常ラット脳と比較すると脳虚血再灌流ラットにおいて虚血性変化は起こっているもののC5a相補性ペプチド投与群においてその変化が減弱していることは確認できなかった。新規合成したC5a相補性ペプチドのラットC5aに特異的に結合するかどうかを調べるため、まずラットC5aは遺伝子組み換えラットC5aの作製を試みた。ラット肝臓からmRNAを採取し、PCRで増幅後クローニングを行い、ラットC5a配列を決定した。その後大腸菌発現ベクターに組み込み、ラットC5a発現ベクターを作製した。同様にラットC5aの不活化型であるC5adesArg発現ベクターも作製した。新規C5a相補性ペプチドを設計したところ、プラズモン磁気共鳴検出装置BIAcoreにおける解析で今まで創生したAcPepAよりもC5aに特異的に結合反応を示すペプチドを少なくとも3種類見いだせた。また、C5aの第2受容体であるC5L2の機能解析も進んでおり、概ね順調であると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。C5a阻害ペプチドが、ラット実験系において抗炎症作用を発揮できるかを検証し、さらに炎症性サイトカインの活性を阻害できる相補性ペプチドを新たに設計して、抗炎症作用の基礎的な作用機序を解明する。今年度は特に、脳疾患における代表的なモデルであるラット脳虚血再灌流モデルについてもC5a相補性ペプチドが有効であるかを、動物の延命効果の他、病態のクリニカルスコア、TNF、MIF、IL-1、IL-6及びHMGB1等炎症性のサイトカイン濃度で比較検討する。