hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酢酸の骨格筋におよぼす作用を介した抗肥満・抗老化の効果に関する研究

酢酸と運動負荷によるラット骨格筋における影響を検討した。SD雄ラットを、蒸留水を投与するrest-water群、酢酸を投与するrest-ace群、運動前に蒸留水を投与するwater-ex群、運動前に酢酸を投与するace-ex群の4群に分け、4週間飼育を行った。rest-ace群は体重増加の抑制、運動継続時間の増加、また運動中の燃料としてグルコースの利用の低下および脂肪の利用が促進した。ace-ex群では、シトクロムc遺伝子が有意に増加していた。その他、PGC1aおよびMHC1遺伝子が増加する傾向が見られた。これより酢酸摂取と運動トレーニングによって、骨格筋における遅筋線維の増加が示唆された。醸造酢の主成分である酢酸を継続的に摂取すると骨格筋などの組織に速やかに吸収されてAMPKを活性化し脂質代謝を促進することを示唆してきた。また昨年度の研究では、酢酸を4週間摂取させた場合また酢酸に加えて運動を負荷した動物における骨格筋性状について比較した。本年度の研究では、約3ヵ月間の長期酢酸摂取が骨格筋性状に及ぼす影響について検討した。5週齢のSD系雄性ラットを3週間の予備飼育後、水投与群(water群)および酢酸投与群(ace群)の2群に無作為に分けた。water群には蒸留水(5ml/kg BW)を、ace群には酢酸(1 vol%, 5ml/kg BW)を1週間に5日間胃ゾンデ法により約3ヶ月間投与した。飼育期間中に体重および摂餌量の測定、ならびに小動物代謝計測システムによる代謝測定を行った。投与期間終了後に運動耐久性試験(15m/minから2m/minずつ3分ごとに速度を増加させるプログラム)を行い、運動継続時間および運動中の燃料利用率について解析した。その後解剖して骨格筋を採取し、ミオシンATPaceの活性染色(pH4.6)により筋線維タイプの解析、ならびに定量的リアルタイムPCR法により筋線維関連遺伝子の発現解析を行った。ラットに酢酸を摂取させたace群では、water群と比較して飼育期間中に体重増加抑制傾向が見られた。運動耐久性試験における運動継続時間は、ace群で長い傾向があり、最大酸素摂取量は有意に高かった。運動耐久性試験中の燃料利用率について解析すると、ace群ではwater群と比較して脂肪を利用する率が高い傾向が見られた。骨格筋の切片染色による筋線維タイプの解析の結果、ace群の腓腹筋でタイプI線維が有意に増加し、ヒラメ筋では増加傾向であった。遺伝子発現を解析すると、腓腹筋においてace群でMHCIおよびチトクロムCの発現量が高い傾向であった。以上のことから、酢酸摂取により骨格筋における遅筋線維の割合が増加し、脂質代謝が促進されると示唆された。これまでの研究で、肥満の病態動物に酢酸を摂取させると、体脂肪蓄積・肥満を抑制することを示してきた。本年度の研究では酢酸の骨格筋における作用に焦点を絞り、ラットに酢酸を継続的に摂取させた場合の骨格筋における脂肪燃焼ならびにミトコンドリア生合成関連因子の解析、および酢酸摂取に運動トレーニングを加えた場合の効果を検討した。6週齢のSD系雄ラットを安静期に水を投与するrest-water群、酢酸を投与するrest-ace群、運動前に水を投与するwater-ex群、運動前に酢酸を投与するace-ex群に無作為に分け、2週間の予備飼育後、蒸留水または酢酸を週5日間4週間にわたり投与し、さらに運動負荷(18 m/分、30分間)を行った。4週間後に運動耐久性試験を行った後に解剖し、腹腔内脂肪量の測定、ならびに骨格筋を採取し、骨格筋におけるAMPK、ミオグロビン、GLUT4、PGC-1α、troponinI等のmRNAおよびタンパク質の発現量を解析した。酢酸を摂取すると水摂取に比較して腹腔内脂肪量の減少と体重増加の抑制がみられた。また耐久性運動下での脂肪の利用促進、グルコースの利用低下が見られた。酢酸摂取に運動トレーニングを加えると、運動トレーニングのみに比較して運動継続時間が増加し、運動中の燃料としてグルコースの利用の低下および脂肪の利用が促進した。酢酸摂取に運動トレーニングを加えた場合、酢酸摂取のみ、運動トレーニングのみに比較して腓腹筋では、troponinI、ミオグロビン、cytochrome cおよびGLUT4等の遅筋線維マーカー遺伝子が増加し、ヒラメ筋ではtroponinI、cytochrome cの増加、腹筋ではPGC-1α、troponinI、ミオグロビンおよびGLUT4の発現が増加していた。これより酢酸摂取と運動トレーニングによって、骨格筋における遅筋化が示唆された。

昨年度の研究では、約3ヵ月間の長期酢酸摂取が骨格筋性状に及ぼす影響について検討し、酢酸を摂取したace群では、対照群に比較して体重増加抑制傾向が見られ、運動耐久性試験における運動継続時間の延長、最大酸素摂取量の増加が見られた。また運動耐久性試験中における脂肪燃焼率が高い傾向が見られたことから、筋線維タイプを解析すると、ace群の腓腹筋でタイプI線維が有意に増加していた。そこで本年度の研究ではace群の骨格筋の生化学的性状を詳細に解析した。その結果、ace群ではTypeI線維のマーカー遺伝子であるMHCIの発現量が有意に高く、Tnni1(トロポニンI)の発現量は増加傾向であった。一方、TypeII線維のマーカー遺伝子であるMHCIIbは対照群に比較して有意に減少していた。さらにTypeI線維に多く発現するMEF2aも有意に増加に増加し、PGC-1aは増加傾向が見られた。以上のことから、酢酸摂取により骨格筋における遅筋線維の割合が増加すると示唆された。次に遅筋線維に多く存在するミトコンドリアの含有量について比較した。その結果、ace群では腓腹筋においてミトコンドリDNA量が有意に増加していた。さらにミトコンドリア内膜に存在するコハク酸脱水素酵素活性を比較すると、ace群で有意に増加した。これより、酢酸を摂取すると遅筋線維増加と共にミトコンドリアが増加すると示唆された。酢酸を投与したace群の腓腹筋において、AMPKタンパク質発現量の増加、ならびにリン酸化AMPK発現量の増加が見られた。以上より、酢酸を継続的に摂取すると、AMPKの活性化を介して遅筋線維の増加ならびにミトコンドリアの増加を誘導し、骨格筋における脂質代謝を促進させると示唆される。食品栄養学本研究課題は、酢酸の骨格筋における作用に焦点を絞り、以下の(1)(4)を目的としている。即ち、(1)ラットに酢酸を継続的に摂取させた場合の骨格筋における脂肪燃焼ならびにミトコンドリア生合成関連因子の解析、(2)酢酸摂取と運動による効果の比較検討、(3)高週齢動物の骨格筋における酢酸の影響、特に酢酸の抗老化作用の解析、(4)骨格筋における酢酸の作用機序の解明、を目的としている。現在までに、(1)および(2)について検討を行っており、また(3)について予備的な検討を行っているところである。平成25年度の研究において、ラットに酢酸を長期に摂取させた場合の腓腹筋、ヒラメ筋および腹筋における速筋線維および遅筋繊維のレベルを組織染色法による調べると特に腓腹筋において遅筋繊維が増加していたことから、酢酸によるその作用が高齢動物において同様に見られるかを今後明らかにする予定である。本研究課題では、酢酸の骨格筋における作用に焦点を絞り、以下の(1)(4)を目的としている。現在までに、(1)および(2)について検討を行っている。
ウイルソン病におけるCD1d拘定性TチュラルキラーT細胞の肝炎重症化誘導機序

ウイルソン病は常染色体性劣性の銅代謝異常で、銅輸送体ATP7Bの遣伝子異常による。高親和性銅輸送体Ctrlにより肝細胞に取り込まれた銅は、ATP7Bと結合し小胞体輸送経路で胆汁に分泌される。あるいはアポセルロプラスミンに組み込まれてセルロプラスミンとなり全身に分配される。ウイルソン病では胆汁への銅分泌障害がおこる。セルロプラスミン合成障害もおこることがある。結果として肝細胞に慢性に銅が蓄積して、つづいて脳への銅蓄積が起こる。銅は、はじめ肝細胞質にメタロチオネインと結合して蓄積し、多量になるにつれリソソームへ、あるいは核にも移行する。肝細胞傷害の主体は核とミトコンドリアの銅による酸化障害であり、肝硬変まで進行する。ところでウイルソン病の人症例とモデル動物のラットでは銅蓄積による慢性進行性肝傷害を背景にリンパ球の浸潤を伴う劇症型の肝炎を発症することがある。この免疫病態が解明されていなかったので、本研究を行っている。リンパ球浸潤を伴う肝炎発症時にウィルソン病患者の末梢血にはVα24陽性Vβ11陽性のナチュラルキラーT細胞が有意に出現した(この細胞のT細胞抗原レセプターはCDldに提示された抗原を認識するので以下CDld-NKT細胞と称する)。この時にCD3陽性CD161陽性の通常のNKT細胞に変化はなかった。ウイルソン病ラットにおいて黄疸発症時には単核球の浸潤と肝細胞壊死を広範囲にみとめる肝炎が存在した。この時点のラットにフローサイトメトリーにてTCRβの強い発現を認めるNKT細胞が出現した。このNKT細胞をソートして1)TCRαの塩基配列をシークエンスした結果はVα14-Jα2S1のCDld-NKT細胞だった。2)劇症肝炎未発症のウィルソン病ラットに移入しても劇症肝炎は誘発できなかった。さらに劇症肝炎発症時のラット肝細胞の膜脂質分画、あるいは銅負荷培養肝細胞の膜脂質分画にCDldを介して、すなわちCDldにロードされた抗原としてCDld-NKT細胞を活性化するものを発見することができなかった。ウィルソン病(WD)は常染色体劣性銅代謝障害で、原因遺伝子(銅輸送P-type ATPase : ATP7B)は1)肝細胞内トランスゴルジネットワークにおいてHAH1より銅を受け取り胆汁中に分泌し、2)銅をセルロプラスミンと結合させ血中に放出する。ATP7Bの遺伝子異常により肝臓、脳、角膜などに銅が蓄積し組織を傷害するとされ、免疫系の関与は示されてない。申請者は、協力者らと共にWD患児3人を対象とした。症例1と2は、14才と12才の兄弟で血清銅とセルロプラスミン低値、肝脾腫なし、Kayser-Fleischer輪と神経学的徴候なし、肝機能と脳MRI正常、肝細胞内銅含有量増加、肝生検で軽度の肝細胞変性、少数の単核球浸潤、軽度の脂肪変性を認め、ATP7B遺伝子に父由来のエクソン15(L1083F)と母由来のエクソン18(D1296N)複合変異を認めた。症例3は14才女児で軽度の黄疸と貧血で発症し、Kayser-Fleischer輪陽性、血清銅高値、

尿中銅排泄多量、脳MRIでレンズ核の軟化、グリオーシスと銅沈着を認め、ATP7B遺伝子に父由来のエクソン11(A874V)と母由来のエクソン8(R778L)の複合変異を認めた。5日後にクームス陰性の溶血性貧血を伴う劇症肝炎を発症、生体肝移植を施行され、摘出肝は銅含有多量、炎症細胞浸潤と巣状壊死を伴う大結節性肝硬変であった。全3症例で治療前末梢血中CD1d拘束性NKT細胞であるVα24陽性Vβ11陽性NKT細胞の絶対数が増加していたが、CD3陽性CD161陽性NKT細胞と総リンパ球の絶対数は正常であった。症例1と2のキレート剤治療後、症例3の生体肝移植後のVα24陽性Vβ11陽性NKT絶対数は有意に低下、症例3は正常化したが症例1,2は正常値まで回復せず。今年度の成果:1.ウィルソン病における肝傷害を病理組織標本で詳細に検討した。現在一般的に銅の組織分布は、銅染色標本を光学顕微鏡を用いて観察している。この方法によって、ウィルソン病の肝組織における各肝細胞の傷害のレベルと銅の蓄積についての明瞭な相関関係を提示することはできなかった。そこで、硬X線を用いて1ピコのレベルまで光の波長をあげて組織における銅の局在を検討した。その結果、各肝細胞の傷害レベルと銅の蓄積の間に明徴な相関関係が存在することを示すことができた。詳しくは肝細胞の傷害レベルに銅の荷電数が関与している可能性をしめすデータを得ることができた。これらは複数の人の症例、およびウィルソン病モデルラットの双方において同様に事実として確認された。2.ウィルソン病における肝障害がInvariant Vα14陽性ナチュラルキラーT細胞によることを証明する目的で、肝炎を発症したラットから、この細胞分画をフローサイトメトリーで分離し、トランスファーされて肝炎を発症するラットの条件を検討している。その途中で、平成17年当初より使用していたウィルソン病モデルラットは銅トランスポーターATP7Bの遺伝子異常に加えて、レセプター型チロシンキナーゼの遺伝子異常を有することが判明した。これでは銅負荷に対する免疫系の反応を正確に知ることができないため、後者の遺伝子異常をはずし『ATP7Bの遺伝子異常』のみをもつ系統を、新たにウィルソン病実験モデルラットとして、当初の実験から繰り返すこととした。今年度の成果:1.ウイルソン病のヒト肝組織における各肝細胞の傷害のレベルと銅の蓄積について、硬X線を用いた測定を行い、関係性を調べた。2.平成17年当初より使用していたウイルソン病モデルラット(LECラット)は銅トランスポーターATP7Bの遺伝子異常に加えて、レセプター型チロシンキナーゼの遺伝子異常を有していた。レセプター型チロシンキナーゼの遺伝子異常をはずし、ATP7Bの遺伝子異常のみを有するLECラットを得た。3.このラットがウイルソン病肝炎を発症した時に、Invariant Va14陽性ナチュラルキラーT細胞を分離し、ウイルソン病ラット由来培養肝細胞にin Vitroで添加し、細胞傷害活性を示す条件を提示することができた。成果の公表を見合わせる必要がある場合に該当し、その理由及び差し控え期間等を記入した調書(A4判縦長横書1枚)を添付した。
肥大軟骨細胞より骨芽細胞への分化転換におけるRunx2の役割

四肢、脊椎、肋骨、頭蓋底等の骨格は、内軟骨性骨化によって形成される。内軟骨性骨化では、まず間葉系細胞が凝集し、軟骨原器が形成され、II型コラーゲンを産生する未熟軟骨細胞に分化する。未熟軟骨細胞は骨幹部では成熟しX型コラーゲンを産生する肥大軟骨細胞になる。肥大軟骨細胞はさらに終末期肥大軟骨細胞となる。終末期肥大軟骨細胞はアポトーシスで死滅していくと考えられてきたが、最近、一部の細胞は骨芽細胞に分化転換することが示された。Runx2は、骨芽細胞分化及び軟骨細胞後期分化に必須な転写因子である。しかし、Runx2 KOマウスの一部の骨格(脛骨、橈骨)の軟骨細胞は、Runx3との機能重複のため終末期肥大軟骨細胞まで成熟しており、骨幹部は石灰化しているが、軟骨への血管侵入は全く認めない。また、Runx2 KOマウスでは、軟骨細胞が最終分化した骨格でもVEGFの発現が低下しており、Runx2はVEGFを誘導し、軟骨への血管進入を制御すると考えられてきた。Runx2が軟骨への血管侵入に必要であるか検証するために、肥大軟骨細胞特異的にCreを発現するCol10a1 Creトランスジェニック(tg)マウスをRunx2 floxマウスと交配し、肥大軟骨細胞特異的にRunx2を欠失させたRunx2コンディショナルKO (cKO)マウスを作製した。しかし、組織標本で軟骨への血管侵入が野生型マウスと同程度に認められた。Col10a1 CreマウスとCAG-flox-LacZレポーターマウスを交配し、LacZ陽性肥大軟骨細胞が骨芽細胞に分化転換することをベータガラクトシダーゼ染色で確認できた。Runx2 cKOマウスの骨量を6週齢及び22週齢でマイクロCTで解析したが、海綿骨、皮質骨ともに骨量は野生型マウスと有意な差を認めなかった。四肢、脊椎、肋骨、頭蓋底等の骨格は、軟骨内骨化によって形成される。軟骨内骨化では、まず間葉系細胞が凝集し、軟骨原器が形成され、II型コラーゲンを産生する未熟軟骨細胞へと分化する。未熟軟骨細胞は増殖するとともに、骨幹部では成熟しX型コラーゲンを産生する肥大軟骨細胞になる。肥大軟骨細胞はさらに終末期肥大軟骨細胞となり、軟骨基質は石灰化し、軟骨周囲から血管が侵入する。血管とともに軟骨周囲の間葉系細胞が侵入し、骨芽細胞へと分化、軟骨は骨幹部より骨へと置換されていく。これまで、終末期肥大軟骨細胞はアポトーシスで死滅していくと考えられてきたが、最近、一部の細胞は骨芽細胞に分化転換することが示された。Runx2ノックアウト(KO)マウスは、骨芽細胞が存在せず、軟骨内骨化も阻害され、出生直後に死亡する。軟骨細胞の後期分化は阻害され、軟骨内骨化によって形成される骨格の多くは未熟軟骨細胞によって形成されている。すなわち、Runx2は、骨芽細胞分化及び軟骨細胞後期分化に必須な転写因子である。そこで、Runx2を肥大軟骨細胞特異的に欠失させ、軟骨内骨化のプロセスにおいて、Runx2が軟骨への血管侵入に必要であることを証明することにした。肥大軟骨細胞特異的にCreを発現するCol10a1 Creトランスジェニック(tg)マウスをRunx2 floxマウスと交配し、肥大軟骨細胞特異的にRunx2を欠失させたRunx2コンディショナルKO (cKO)マウスを作製した。Runx2 cKOマウスとコントロールマウスで、石灰化及び軟骨への血管侵入に差を認めなかった。軟骨細胞特異的にCreを発現するCol10a1 Creトランスジェニック(tg)マウスをRunx2 floxマウスと交配し、肥大軟骨細胞特異的にRunx2を欠失させたRunx2コンディショナルKO (cKO)マウスの作製に成功した。さらに組織解析において、最終分化した肥大軟骨細胞層への血管侵入を野生型マウスと比較検討した。しかし、胎生16.5日の四肢の組織切片のH-E染色では血管侵入の明確な差は認めなかった。したがって、血管内皮細胞を染色する抗CD34抗体を用いた免疫組織染色で血管侵入を詳細に検討するとともに、VEGF発現の違い、軟骨細胞の最終分化段階の違い、アポトーシスの違いを詳細に検討する必要性が生じた。これらは、今後の研究の推進方策の記載の方法で、検討していく。

しかし、Runx2 KOマウスの一部の骨格(脛骨、橈骨)の軟骨細胞は、Runx3との機能重複のため終末期肥大軟骨細胞まで成熟しており、骨幹部は石灰化しているが、軟骨への血管侵入は全く認めない。また、Runx2 KOマウスでは、軟骨細胞が最終分化した骨格でもVEGFの発現が低下しており、Runx2はVEGFを誘導し、軟骨への血管進入を制御すると考えられてきた。Runx2が軟骨への血管侵入に必要であるか検証するために、肥大軟骨細胞特異的にCreを発現するCol10a1 Creトランスジェニック(tg)マウスをRunx2 floxマウスと交配し、肥大軟骨細胞特異的にRunx2を欠失させたRunx2コンディショナルKO (cKO)マウスを作製した。しかし、組織標本で軟骨への血管侵入が野生型マウスと同程度に認められた。Col10a1 CreマウスとCAG-flox-LacZレポーターマウスを交配し、LacZ陽性肥大軟骨細胞が骨芽細胞に分化転換することをベータガラクトシダーゼ染色で確認できた。Runx2 cKOマウスの骨量を6週齢及び22週齢でマイクロCTで解析したが、海綿骨、皮質骨ともに骨量は野生型マウスと有意な差を認めなかった。胎生15.5日と16.5日のコントロールマウスとRunx2 cKOマウスの大腿骨パラフィン切片を用いて、抗CD34抗体を用いた免疫組織染色を行い、血管内皮細胞を検出、血管侵入のレベルに差があるか検討する。胎生15.5日と16.5日の大腿骨パラフィン切片を用いて、抗VEGF抗体を用いた免疫組織染色を行う。さらに、抗Runx2抗体(核に染色)と抗VEGF抗体(細胞質に染色)で、二重免疫組織染色を行う。これにより、Runx2発現とVEGF発現が相関するか調べる。また、大腿骨、脛骨よりRNA及び蛋白を抽出、real-time RT-PCR法でVEGF mRNA、Western blot法でVEGF蛋白を調べる。胎生15.5日、16.5日、新生児、6週齢、3ヶ月齢、6ヶ月齢、12ヶ月齢のマウスを調べる。胎生15.5日、16.5日、新生児は、骨格標本と組織解析を行う。6週齢以降のマウスは、マイクロCT、骨組織形態計測、組織解析にて調べる。胎生15.5日と16.5日のコントロールマウスとRunx2 cKOマウスの大腿骨パラフィン切片で、軟骨細胞・骨芽細胞マーカー遺伝子のプローベを用いたin situ hybridizationを行う。また、Runx2抗体を用いて、免疫組織染色を行う。さらに、大腿骨、脛骨よりRNAを抽出、real-time RT-PCR法でこれらの発現を調べる。胎生15.5日と16.5日のコントロールマウスとRunx2 cKOマウスの大腿骨パラフィン切片で、BrdUラベル・TUNEL染色を行うことにより、骨幹部領域の終末期肥大軟骨細胞、分化転換中の細胞、及び分化転換した骨芽細胞の増殖・アポトーシスを調べる。予想に反して、肥大軟骨細胞特異的にRunx2を欠失させたRunx2コンディショナルKO (cKO)マウスでは、野生型マウスに比較し肥大軟骨細胞層への血管侵入に明確な差を認めなかった。これが、間違いないか、多くのマウスで繰り返し確認したため、抗CD34抗体を用いた免疫組織染色や、抗VEGF抗体を用いた免疫組織染色、TUNEL染色の施行が遅れた。
慢性疾患患者末梢白血球の環状テロメアＤＮＡの定量によるゲノム老化の評価について

本研究ではテロメアの長さから病気による老化促進の測定を目指している。テロメアとは染色体の末端部のことで、細胞分裂の時にテロメアが短くなるため、白血球のテロメアの長さから老化の程度が判る。しかし、実験的なストレスや疾病の種類ごとに、平均長や切れ落ちたテロメアからわかるテロメア短縮量よりも、テロメアの長さの分布のほうが鋭敏に異なっていた。過酸化水素、生活習慣病、慢性炎症では、短いテロメアが増え、放射線暴露や慢性神経疾患では、短いテロメアが減る、つまり老化細胞が死滅することがわかり、病的老化に2種類のパターンがあることが判明した。テロメアの長さの分布の推移によって質的に異なる細胞の老化を追跡できる。これまで、種々の慢性疾患患者を対象に、(1)末梢白血球テロメアDNAの平均長、(2)その長さの分布、(3)サブテロメア領域エピジェネテイックな変化としてのメチル化の程度を追跡し、また、(4)テロメア領域由来の環状DNAの定量解析を行い、疾病状態のゲノムの老化速度への影響を評価することを目指してきた。このうち、テロメア環状DNA定量が、最もゲノム老化速度の逐次変化を鋭敏に反映するものと期待し解析をすすめてきたが、環状DNA量が多くの因子の影響を受けるため、一定の見解を得るに至っていない。一方で、サブテロメアのメチル化やテロメア長の分布変化がヒトの疾病状況に依って比較的一定の傾向を示すことがわかってきている。慢性疾患状態では、テロメア平均長よりもサブテロメアの変化や長さの分布の方がより鋭敏に疾病特異的な変化を検出できることを示すことができた。また、ヒト血管内皮細胞培養系を用いて、病的ストレス増大条件下(酸化ストレス、放射線照射、低酸素下条件)におけるテロメアの変化を追跡して、この仮説を検証しつつある。我々は疾患における体細胞テロメア長関連因子を追跡し、そのゲノム老化性変化で捉えようとしてきた。このため平均テロメア長、テロメア長の分布、サブテロメア領域のメチル化の程度、テロメア短縮に伴う環状テロメアDNA量の4因子を測定して、細胞の老化速度の測定を試みてきた。培養ヒト血管内皮細胞で、老化促進因子として低線量X線照射で処理した場合と過酸化水素添加の処理を行った場合で、テロメア変化が異なり、前者では短いテロメアが減少し、後者では短いテロメアが増加した。すなわち、X線照射は短いテロメアを含む老細胞減らす効果が強い一方、過酸化水素は、細胞死滅よりも細胞全体にテロメア短縮効果が強いことが示された。前者では、平均テロメア長は変わらないかむしろ長くなる場合があり、これまでの老化パターンと異なることが判ってきた。見方をかえると、2種類の老化パターンがあるといえる。そして、臨床例でも、パーキンソン病やアルツハイマー病がX線パターンに属し、糖尿病、虚血性心疾患、サルコイドーシス、日常の強いストレス、喫煙などは、過酸化水素パターンにあたる。これらのことは、前者では平均テロメア長の短縮では、老化の程度を把握できない場合があることと、テロメア環状DNAの増加といった定量的側面の追跡は、その測定が困難さ以前に、それだけでは、この二つの老化を区別することが不可能であることも判った。最終的に、老化の程度は長い領域のテロメア量の減少に反映され、二つのパターンの区別は、短い領域の増加、減少の別により区別できると考えられた。そして、長短それぞれの領域のサブテロメアのメチル化は、その補助データとして使えることが判った。今回の研究は、最終的に体細胞レベルのテロメア長分布、すなわち若年細胞集団と老年細胞集団の相対的推移を追跡することが、疾病における老化促進をゲノムレベルで捉えることにつながることを示したと言える。申請者は、様々な疾患の患者における白血球やストレス環境下の培養血管内皮細胞で老化関連のゲノム変化であるテロメアの短縮について解析を進めてきている。さらにテロメア短縮に平行して生じるテロメア環状DNAを検出して、細胞の老化の過程をほぼリアルタイムで追跡することを試みている。ヒト末梢血ならびに培養ヒト血管内皮細胞についてRolling Circle Amplification (RCA)法により、テロメア由来の環状DNAの増幅を行い、サザン法により半定量的に捉える方法を取った。これまでで浮かび上がってきた問題点として、以下の二つが上げられる。(1)テロメア環状DNA量は、バラツキが大きく一定の結果が得難い。つまり同じ条件で培養された細胞群でも、また特定の個人の同一サンプル解析でも、異なる量のテロメア環状DNAが検出され、ほかの老化関連パラメータとの相関を検証できるに至っていない。また、(2)環状DNAサンプルには、テロメア環状DNA以外の染色体ゲノム由来の環状DNA多く含まれ、その多くは反復配列を含んでいた。

一方、テロメア長解析においては、培養ヒト血管内皮細胞を用いた実験で、DNA障害性の細胞刺激因子として低線量X線照射で処理した場合と過酸化水素添加の処理を行った場合で、細胞が障害される程度は、X線照射では、短いテロメアが減少する傾向、すなわち老細胞の減少傾向がみられたが、過酸化水素添加では、生理的な老化性変化に近く、長さによらず細胞集団全体に一定のテロメア短縮傾向を示した(いずれも投稿中)。このように、細胞に対するストレスの違いによって、影響を受けるテロメア長のウインドウが変化することが判明した。このことは、単に平均テロメア長の短縮やテロメア環状DNAの増加といった定量的側面の追跡だけでは、細胞の老化性変化の内容を追跡するには不十分ではないかと考えるにいたっている。テロメア環状DNAは、そのサイズ分布に揺らぎが大きいこと、ミトコンドリアDNAなど他の大量の環状DNAを内部標準にした場合にも回収率が一定でない、または未知の要因に依って回収量が大きく異なることなどが障壁となり、一定の見解を得ていない。しかし、他のテロメア関連パラメータの解析により、ヒトの疾病による身体ストレスを老化促進度に置き換えて評価することが可能になりつつある。老化の病的促進は、単に生理的な老化変化が早まるパターンと生理的な老化とは異なるパターンでテロメア変化を来すものとに分かれることがわかってきたが、いずれの場合でも、長いテロメアの減少速度が最も鋭敏なパラメータとなりうる可能性を示しつつある。以上から、当初の「環状DNAを中心に解析を進める予定」から、方向修正を余儀なくされているものの、ゲノム病的老化のテロメア解析による、より鋭敏な老化性速度変化の検出とその定量的評価が具体化してきており、全体の印象としては、7080%の達成度と自己評価している。これまで、生活習慣病患者の臨床検査値やパーキンソン病やアルツハイマー病といった慢性疾患患者におけるテロメア変化の性差を論じた論文を報告してきた。同疾患でも性別によってテロメア長分布が全く異なる事象を報告したが、性別によるテロメア長変化の差を特定の疾患で認めたことは、新知見である。こういった、長いテロメア変化と短いテロメア変化に対応するテロメア環状DNAの量と長さの検出を試みた。環状テロメア量は、バラツキが大きく一定の傾向を認めなかった。また、環状テロメアの長さは、RCAでは求められないため、環状DNA分画をサザン法で検出して比較することを試みたが、環状テロメアが微量なため検出できなかった。同様に、投稿中の培養ヒト血管内皮細胞のテロメア長分布変化すなわち、短いテロメアが減少する低線量X線照射と長いテロメアが減り短いテロメアが増える過酸化水素添加において、RCA法にて、それぞれ環状テロメアDNA量の定量比較を試みた。患者白血球サンプルの場合よりも、単位ゲノムDNA量に比べ、シグナルが強く、培養細胞では環状テロメア量が増加している傾向が見られたが、X線量や過酸化水素濃度との相関は捉えられなかった。これまでの実験の環状テロメア量のバラツキには、環状DNA分離の際の染色体直鎖DNAの夾雑と染色体内部の存在するテロメア類似配列由来の環状テロメアDNAによる可能性を推定している。
血管内皮ミトコンドリアSirt3を標的としたARDS後肺線維症治療法の探索

我々はNox由来のROSが誘導する内皮間葉転換(EndMT)が肺線維化に関与している事を報告してきた。血管内皮細胞膜脂質中に局在する高度不飽和脂肪酸が、ROSにより過酸化脂質となり、アセチルCoAの調整を介してEndMTを制御する事も報告されている。今回、脂肪酸のβ酸化を触媒する長鎖アシルCoA脱水素酵素の制御遺伝子Sirt3が、EndMTの調節に関与していると仮説を立て、それをターゲットにした新規線維症治療法確立を目的として研究を立案した。遺伝子改変動物を用いた検証で仮説が証明されれば、ヒト肺検体から作成した3D-pulmosphereを用いてpreclinical studyを予定する。
氷・岩石から構成される火星氷床及び氷衛星物質のレオロジーに関する実験的研究

火星や氷衛星に見られる流動地形の形成過程やテクトニクス,そして熱進化過程における氷衛星の形状変化や密度進化を考えるためには,氷・シリカ混合物のレオロジーを知ることが非常に重要となる.本年度は,昨年度に引き続き,流動則(ε=A_0exp(-Q/RT)・σ^n:εは歪速度、σは応力、Qは活性化エネルギー,Rは気体定数,Tは絶対温度,A_0とnは定数)を調べるための変形実験を行った.昨年度調べた氷・シリカ混合物の流動則に対する残存空隙率依存性を,実験条件であるシリカ含有率と温度範囲をさらに広げて調べた.その結果,上記の流動則にシリカ含有率および空隙率依存性を組み込んだ新たな流動則,ε=Bexp(-Q/RT)・[σ/(1-φ)^k]^n(φは空隙率,Bとkは定数でQとnと共にシリカ含有率のみに依存し,シリカ含有率の増加とともに大きくなる)を導くことに成功した.そしていびつな形状から球形へと氷衛星の形状が変化する条件を推定するために1次元熱進化数値モデルを構築した.これは熱伝導による熱輸送過程を組み込んだモデルで,実験で得られた流動則と氷・シリカ混合物の音速測定実験により得られた弾性率を組み込み,岩石含有率や残存空隙率が氷衛星の形状変化条件にどのように影響を及ぼすかについて考察した.その結果,岩石含有率が大きいほど,さらに残存空隙率が大きいほど,氷衛星の形状が起こる氷衛星半径が小さくなることがわかった.また,昨年度行った圧子圧入実験を冷凍庫内で数日間かけて行い,昨年度よりもさらに低歪速度である10^<-7>s^<-1>台まで得ることに成功した.また,与える荷重を3種類変化させても,同じシリカ含有率の試料を用いれば結果はほぼ一致した.そして,変形実験で得られた流動則と圧子圧入実験で得られた流動則を比較したところ,整合的であることを確認した.火星や氷衛星に見られる流動地形の形成過程やテクトニクス・熱進化過程を知るためには、氷・シリカ混合物のレオロジーを知ることが非常に重要となる。そこで本年度は、レオロジーの中でも特に流動則(ε=A・σ^n:εは歪速度、sは応力、Aとnは定数)に着目し、それを求めるための変形実験を行った。先行研究から、シリカ含有率が同じ試料でも結果のばらつきが大きく流動則の決定精度が悪いという問題があった。この原因を圧密試料の残存空隙率のばらつきであると予測し圧密実験により、圧密条件と残存空隙率の関係を調べた。この実験から圧力を10MPaから30MPaと変化させると、空隙率が約5%減少することが分かった。そこで残存空隙率に着目し、氷・シリカ混合物の流動則に対する残存空隙率依存性を変形実験から求めた。その結果、各空隙率で結果を整理することができ、さらに同じシリカ含有率でも空隙率の増加と共に強度が減少することが分かった。さらに本年度は実際の氷衛星表面の環境を再現して、低温度・低歪速度下での実験を試みた。今までは-25°C以上で実験を行っていたがさらに低温度にするために、試料部分とピストン部分のみをドライアイスで冷やして実験を試みた。そして温度が-50°Cから-70°Cの範囲内での実験に成功した。また、1回の実験で連続的な応力と歪速度の関係を得ることが出来る流動則を効率的に求めるための新しい方法として圧子圧入試験法の開発を行った。この方法を用いて実験を行った結果、約1日の実験で歪速度が約10^<-3>s^<-1>から10^<-6>s^<-1>までの範囲を得ることに成功した。この結果から、さらに数日実験を行えばさらに低歪速度の実現が可能であることが予測された。火星や氷衛星に見られる流動地形の形成過程やテクトニクス,そして熱進化過程における氷衛星の形状変化や密度進化を考えるためには,氷・シリカ混合物のレオロジーを知ることが非常に重要となる.本年度は,昨年度に引き続き,流動則(ε=A_0exp(-Q/RT)・σ^n:εは歪速度、σは応力、Qは活性化エネルギー,Rは気体定数,Tは絶対温度,A_0とnは定数)を調べるための変形実験を行った.昨年度調べた氷・シリカ混合物の流動則に対する残存空隙率依存性を,実験条件であるシリカ含有率と温度範囲をさらに広げて調べた.その結果,上記の流動則にシリカ含有率および空隙率依存性を組み込んだ新たな流動則,ε=Bexp(-Q/RT)・[σ/(1-φ)^k]^n(φは空隙率,Bとkは定数でQとnと共にシリカ含有率のみに依存し,シリカ含有率の増加とともに大きくなる)を導くことに成功した.そしていびつな形状から球形へと氷衛星の形状が変化する条件を推定するために1次元熱進化数値モデルを構築した.これは熱伝導による熱輸送過程を組み込んだモデルで,実験で得られた流動則と氷・シリカ混合物の音速測定実験により得られた弾性率を組み込み,岩石含有率や残存空隙率が氷衛星の形状変化条件にどのように影響を及ぼすかについて考察した.

その結果,岩石含有率が大きいほど,さらに残存空隙率が大きいほど,氷衛星の形状が起こる氷衛星半径が小さくなることがわかった.また,昨年度行った圧子圧入実験を冷凍庫内で数日間かけて行い,昨年度よりもさらに低歪速度である10^<-7>s^<-1>台まで得ることに成功した.また,与える荷重を3種類変化させても,同じシリカ含有率の試料を用いれば結果はほぼ一致した.そして,変形実験で得られた流動則と圧子圧入実験で得られた流動則を比較したところ,整合的であることを確認した.
原発性胆汁性肝硬変症の動物実験モデルの作成および発症機序の解明

原発性胆汁性肝硬変(PBC)の病態を解明する目的で,胸腺摘出マウスを用いて動物実験モデルを作成しその発症機序を解明することを試みた。生後3日目に胸腺を摘出したマウスに種々の胆管抗原を免疫したところ、胆管上皮細胞を免疫した群においてのみ高率に胆管病変を作成することができた。胆管病変はリンパ球,マクロファージ、形質細胞を中心とした細胞浸潤と胆管上皮細胞の変性からなっていた。浸潤リンパ球はCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞からなり、CD4陽性細胞が多い傾向にあった。胆管上皮細胞にはHLA classI,II抗原が表出されていた。また胆管周囲に巨細胞も出現していた。これらの所見はヒトのPBCと類似する所見であった。さらにこれらのマウスの血清を調べたところ、PBCに特有である抗ミトコンドリア抗体(AMA)が出現しており、また免疫した胆管抗原の88,76,37,30,21KDの蛋白に対し抗体が出現していた。AMAはヒトPBCに出現するAMAと同様にPyruvate dehydrogenaseに対する抗体であった。以上の実験結果から本モデルはPBCの動物実験モデルとして使用できるものと考えられ、さらに検討を継続中である。今後標的となる胆管抗原の同定、進行性の病変の作成、種々の病変を抑制するための薬剤効果などの検討が必要である。動物実験モデルの作成とその形態的・免疫組織学的検討1)動物実験モデルの作成:生後2ー4日のAJ系マウスの胸腺を摘出し、胸腺摘出マウスを作成した。このマウスではリンパ球のサプレッサ-機能が低下しているため自己免疫反応を起こしやすいことが知られている。2)胆管細胞分画の抽出及び動物への免疫:同系マウスの胆管上皮細胞または胆嚢上皮細胞の細胞膜成分を分離することを試みたが、抗原量が少なく困難であった。そこで1)ラットから分離した胆管上皮細胞、2)ブタの胆嚢上皮細胞、および3)ブタの胆管上皮細胞を胆管抗原として用いた。またこれらの細胞のホモジェネ-トも刺激抗原として用いた。3)PBC類似胆管病変の形成:上記の胆管抗原を生後8ー12週の胸腺摘出マウスに週1回、Freundのcomplete adjuvant,incomplete adjuvantとともに腹腔内に投与した。注射後、経時的に肝を採取し組織学的に胆管病変を検索した。ブタの胆管上皮細胞を投与したマウス5匹中3匹に門脈域、特に胆管周囲にリンパ球、形質細胞を主体とした単核球の浸潤を認めた。ブタの胆嚢上皮細胞、ラットの胆管上皮を刺激抗原とした場合には、胆管病変は認められなかった。またホモジェネ-トを刺激抗原とした場合は、胆管病変は認められなかった。4)胆管周囲浸潤リンパ球の免疫組織学的同定:胆管周囲に浸潤したリンパ球の表面形質を免疫組織学的に検討するとCD4、CD8Tリンパ球およびB細胞リンパ球が浸潤していた。特にCD4T細胞がCD8T細胞より多く浸潤する傾向にあった。1.PBC動物実験モデルの胆管病変の電子顕微鏡的観察ブタの肝内胆管細胞を免疫した群において22匹中14匹(64%)に胆管周囲に細胞浸潤を伴う胆管病変を認めた。電子顕微鏡による観察では浸潤細胞は主にリンパ球、形質細胞、マクロファ-ジから成り、一部のリンパ球は胆管上皮細胞間に進入していた。また胆管上皮細胞の空胞化変性を一部に認めた。形質細胞の粗面小胞体は良く発達し,著明な蛋白合成を示唆していた。マクロファ-ジは電子密度の高い物質をライソゾ-ム内に含有し、貪食が盛んであることを示唆していた。この様な所見はヒトにおける慢性非化膿性破壊性胆管炎に類似する所見であった。2.胆管病変の免疫組織学的検討胆管周囲浸潤リンパ球の免疫組織学的同定を行った。CD

4陽性Tリンパ球、CD8陽性Tリンパ球、B細胞の浸潤を認め、CD4リンパ球がCD8リンパ球より多い傾向があった。胆管上皮細胞にはHLA class 1,class 2抗原の表出を認めた。これらの抗原はヒトの胆管上皮細胞でも表出が認められていることとあわせ興味深い。3.血清中各種抗体の検討細菌・ウイルス感染を否定する目的で各種抗体価を測定したが、肝障害を来す細菌・ウイルスの抗体は陰性であった。PBCではミトコンドリアに対する抗体が特徴的であり、このモデルでも抗ミトコンドリア抗体を検索したところ、高率に陽性であった。インムノブロット法による検討ではピルビン酸脱水素酵素の72kD蛋白に一致する抗体を認め、ヒトのPBCに出現するM2抗体と同じものと考えられた。我々は原発性胆汁性肝硬変(PBC)の動物モデルを作成し、その発症機序につき過去2年間検討してきた。本年度は以下の点につき検討し、一部のものは現在続行中である。1)モデルマウスにおける対応抗原の同定胸腺摘出マウスにブタの胆管上皮細胞を免疫することで、PBC類似病変を作成した。免疫した胆管上皮細胞のどの抗原に対して個体が反応しているかを検討した。すなわち、胆管上皮細胞をホモジェナイズした超遠沈上清をSDS-PAGEで電気泳動し、western blot法で病変を認めたマウスの血清中の抗体を調べた。その結果、88,76,37,30,21kDの蛋白に対する抗体が証明され、病変マウスは免疫された胆管上皮細胞の蛋白に対して免疫反応を惹起していると考えられた。これらのうちどれが病変の惹起と関係しているかについて現在検討中である。2)長期抗原刺激の影響胸腺摘出マウスに8週間胆管細胞を免疫するとPBC類似胆管病変が出現するが、さらに長期に免疫した場合病変が進展するか否かを検討した。5匹のマウスに胆管抗原を6カ月免疫したところ胆管病変は継続して観察された。しかし胆管消失や胆汁うっ滞を来すまでにはいたらなかった。3)抗ミトコンドリア抗体(AMA)の解折胆管抗原を免疫した群においてAMAが出現するが、これがpyruvate de hydrogenase(PDH)に対する抗体であるか否かをPDHに対するELISA法およびSDS-PAGE,western blottingにて確認した。その結果、PDHの68,52,47kDの蛋白に対する抗体であることが確認され、ヒトのPBCで認められるM2抗体と一致していた。
プロテオーム時代の計算情報生物学

ゲノム生物学の時代を迎え、ゲノム・プロテオームの計算生物学は生物科学全体に位置づけられる重要な分野となりつつある。第一線の研究者による重点的研究の組織化が待たれている現状を踏まえ、特定領域研究(A)の申請を目的として、研究方法、研究組織、研究経費などの企画調査を行った。国内のタンパク質の立体構造計算の分野は、大型コンピュータの最初の導入以来の研究の歴史をもち、世界に誇れるレベルの研究が行われているにも関わらず、これまでゲノム情報の特定領域研究にほとんど組み込まれてこなかった。米国と欧州のゲノム研究とは大きな違いを生じている。8月に第1回の班会議を開催して、構造ゲノミックスと機能ゲノミックスを中心とした公開国際シンポジウムを開催すること、特定領域研究(A)を申請することを決定した。予定通り、特定領域研究(A)「プロテオーム時代の情報構造生物学」(領域代表:郷通子)を申請した。2000年1月17、18日には海外から4名の若手の第1線の研究者を招いて、公開国際シンポジウム「プロテオーム時代の計算情報生物学」を東京で開催した。200名の参加者があり、活気に溢れた会場には、この分野に対する大学や企業の研究者からの期待感がよみとれた。一方、ミレニアム構想のもとに国家的プロジェクトとして特定領域研究(C)が、平成12年度から発足することが決定された。申請中の特定領域研究(A)「プロテオーム時代の情報構造生物学」は、「ゲノム情報科学の新展開」(領域代表:高木利久)の1項目「タンパク質高次構造に基づくゲノム情報科学」(班長:郷通子)として合流することになった。従って、本基盤研究(C)は、予定よりも少なくても1年早く、その目的を達成することができた。班員のほとんどが、この特定領域(C)のメンバーとして、5年間の「ゲノム情報科学」プロジェクトの重要な課題に取り組む。
フリーラジカル産生からみた重金属による白血球活性化の分子機構

金属熱の発症機序を解明する目的で亜鉛を中心とした重金属、さらに金属キレート剤による肺胞マクロファージ及び好中球の活性化機序をスーパーオキシド産生を指標として細胞-内情報伝達機構の面から解析した。これらの貧食細胞からのスーパーオキシド産生刺激能は硫酸亜鉛(ZnSO4)<酸化亜鉛(ZnO)<水酸化亜鉛(Zn(OH2))の順に増強した。これら亜鉛及び亜鉛酸化物を認識する貧食細胞の細胞内情報伝達機構の違いとして次のことがわかった。亜鉛イオンに対しては、カルシュウム非依存性でプロテインキナーゼCの関与が少なく、スーパーオキシド由来ではない過酸化水素の発生が認められ、未知の細胞内情報伝達経路の関与が考えられた。酸化亜鉛に対しては、細胞外カルシウム非依存性で還元型グルタチオン(GSH)にプライミング減少による刺激作用の増強がみられ、チロシンキナーゼ型の受容体を介している可能性が示唆された。水酸化亜鉛に対しては、細胞外カルシウム依存性で細胞内への流入がみられプロテインキナーゼCの活性化が関与しており、粒子の貧食が主な機構であると思われた。これらのことより、亜鉛化合物の微妙な分子構造の違いを貧食細胞が認識できることがわかった。水酸化亜鉛による好中球の活性化とNO(一酸化窒素)の関係では、産生されるNOを著名に減少させる作用を有しているが、これはスーパーオキシドとの反応によるものか又は直接吸着されことが考えられた。さらに白血球接着因子であるLAF-1は水酸化亜鉛による活性化には何ら関与を示さなかった。その他、カドミウムと金属キレート剤エチルジチオカ-バメートに好中球活性化作用が認められ、ガドリニウムに活性化貧食細胞の抑制作用等も認められた。20%カゼインのラット腹腔内投与によって得られた好中球を用いて、水酸化亜鉛や亜鉛などによりスーパーオキシドの産生がどのような影響を受けるかを検討した。水酸化亜鉛は、用量依存性に好中球のスーパーオキシド産生を増強させることが判明した。その機序を分析したところ、特異的膜受容体の存在が示唆され、さらに、GTP結合蛋白、プロティンキナーゼC、ミオミン軽鎖キナーゼなどが受容体からNADPHオキシダーゼまでの情報伝達に関与していることが判明した。カルシウムイオンの動態に関しては、数種類のチャンネルブロッカーを用いた検討より、スーパーオキシド産生に抑制的に作用するものに特異性が認められた。さらに、細胞外のカルシウムイオンの細胞内への流入が、刺激と同時に蛍光法によって確認された。酸素電極を用いることによって、スーパーオキシドの産生に伴う酸素の消費が著明に亢進することも認められた。電子顕微鏡による検討では、水酸化亜鉛粒子の貧食がみられ、X線分析装置で亜鉛粒子であることの確認をも行った。水酸化亜鉛は好中球からのNO(一酸化窒素)の産生を抑制することが判明したが、それがスーパーオキシド産生増加によるものか、直接的に作用によるものかは不明である。亜鉛イオンは、低濃度で好中球のルミノール依存性化学発光の発現形態に影響を与えることがわかった。すなわち、亜鉛により一峰性の発光が二峰性に変化し、特にFMLP刺激でその作用が顕著となる。この現象には膜受容体からプロティンキナーゼCを介した伝達機構とは別の経路の存在が示唆された。カゼインのラット腹腔内投与によって得られた好中球や、肺胞洗浄によって得られたマクロファージを用いて、亜鉛、水酸化亜鉛、酸化亜鉛などがスーパーオキシドの産生にどのように影響するかを検討した。

すなわち、亜鉛により一峰性の発光が二峰性に変化し、特にFMLP刺激でその作用が顕著となる。この二峰目の発光は、H_2O_2の産生に由来するが、NADPHオキシダーゼによるスーパーオキシドからではない別の機構によるものであることがわかった。水酸化亜鉛は、好中球、マクロファージのスーパーオキシド産生を増強させ、その機序として、膜受容体、GTP結合蛋白、プロティンキナーゼC、ミオシン軽鎖キナーゼ、細胞内カルシウム上昇など細胞内情報伝達機構が貪食と伴に関与していることがわかった。酸化亜鉛には、軽度肺胞マクロファージのスーパーオキシド産生増強作用が認められるが、細胞外カルシウムを無添加にするとこの作用はさらに増強され、PMAのように直接プロティンキナーゼCを活性化する作用が考えられた。さらにGSH(グルタチオン)を添加すると、スーパーオキシド産生は著明に増強されることも判明した。それらの機序について検討中である。水酸化亜鉛を気管内投与し、病理組織学的検討を行った結果、肺胞マクロファージのNBT陽性細胞が著名に観察され、さらにPCNA抗原が肺胞マクロファージ及び末端気管支上皮細胞にみられた。塩化亜鉛投与群では、それらの作用はみられず、水酸化亜鉛が肺胞マクロファージを活性化しスパーオキシドを産生し、さらに増殖刺激作用を有していることがin vivoで証明された。硫酸亜鉛による亜鉛イオンとしての好中球に対する作用としては、スーパーオキシド産生刺激と過酸化水素産生刺激の2種類あって、それぞれ別の情報伝達経路を介していることが判明した。特に、スパーオキシド産生に関しては、受容体を介しているが、カルシウムイオンの関与が少ない伝達経路を介していることが示唆された。酸化亜鉛も好中球のスパーオキシド産生刺激作用を有するが、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入や貯蔵型カルシウムイオンの遊離などがなくても十分なスパーオキシド産生刺激作用があることや、還元型グルタチオン(GSH)の存在下でその作用が著名に増強されることなどや、さらに、チロシンキナーゼ阻害剤が低いIC50を示すことなどから、酸化亜鉛による好中球活性化の機序には、カルシウムイオンに依存しないチロシンキナーゼ型の受容体を介した情報伝達経路が関与している可能性が示唆された。
気道粘膜組織に存在するメモリ-B細胞の機能解析

肺メモリーB細胞は二次リンパ器官のものと比較し、より成熟段階の進んだメモリーB細胞であることを見いだした。さらに、再感染したウイルスに応答して多量のIgA抗体産生細胞を産生し、気道中のウイルス量を有意に低下させることが明らかとなった。肺メモリーB細胞は、二次リンパ器官のメモリーB細胞と多くの遺伝子発現パターンを共有する一方で、肺メモリーB細胞で特異的に発現増加・低下する遺伝子が存在し、その中の1つの遺伝子を欠損したマウスを作製した。最近我々は、インフルエンザウイルスの主要な表面抗原であるヘマグルチニンの組換えタンパクをプローブとして、ヘマグルチニンに特異的なメモリーB細胞を同定することに成功した。この手法を用い、メモリーB細胞の局在部位を検証したところ、インフルエンザウイルスを気道感染させたマウスでは、IgA陽性メモリーB細胞が肺組織に存在することを見いだした。さらに、細胞移入実験により感染防御効果をレシピエントマウスに賦与できることを明らかにした。この肺に存在するIgA陽性メモリーB細胞が、感染防御を担う新しいメモリーB細胞サブセットであるという仮説を検証するため、DNAマイクロアレイを用いて脾臓メモリーB細胞と発現遺伝子を比較した。その結果、肺メモリーB細胞は、脾臓メモリーB細胞で強く発現することが知られているCD80、sarcospan等の分子を高発現する一方で、脾臓メモリーB細胞と若干異なる遺伝子発現プロファイルを示すことが明らかとなった。また、肺のIgA陽性メモリーB細胞が発現する重鎖抗体遺伝子を解析したところ、脾臓メモリーB細胞と同程度の体細胞突然変異の蓄積が観察された。さらに、ウイルス再感染4日後の肺組織において、ヘマグルチニン特異的なIgA陽性抗体産生細胞が高頻度(>0.1%)で検出されたことから、このメモリーB細胞は迅速な抗体産生分化能を有することが明らかとなった。以上のように、肺に存在するメモリーB細胞はその分化過程で抗体遺伝子の親和性成熟を伴い、迅速な抗体産生分化能を獲得するメモリーB細胞サブセットである可能性が推察された。1)肺メモリーB細胞が高発現する液性因子の機能解析全身系メモリーB細胞と比較し、肺メモリーB細胞で高発現する液性因子に関し、タンパクレベルでの発現増加を確認した。組換えタンパクを作製し抗インフルエンザウイルス活性をin vitroで調べた結果、有意な抗インフルエンザウイルス活性を認めず、さらに、マウス気道に投与した場合でも顕著な感染防御効果を観察することはできなかった。生体内での機能的役割を明確にするため、B細胞選択的な遺伝子欠損マウスの作製に着手し、ターゲティングベクターを構築した。2)肺メモリーB細胞の産生・分化機構の解析肺メモリーB細胞の産生・分化機構のモニターを容易にするため、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパクに特異的な抗体heavy/light chain遺伝子を導入したマウスを作製した。このマウスでは、末梢B細胞の約90%がインフルエンザウイルスに特異的なB細胞抗原受容体を発現することを確認し、さらにインフルエンザウイルス粒子とともに培養すると、細胞分裂後に抗体産生細胞へと分化することが判明した。また、このB細胞を野生型C57BL/6マウスに移入した後ウイルスを経鼻感染させると、移入したB細胞が応答し抗体産生細胞へと分化することが明らかとなった。以上の結果から、本システムは、インフルエンザウイルス感染に対する肺メモリーB細胞の産生・分化機構の解析に有用であると考えられる.1)肺メモリーB細胞が高発現する液性因子の機能解析二次リンパ器官のメモリーB細胞に比べ肺メモリーB細胞で高発現する液性因子に関し、B細胞選択的な遺伝子欠損キメラマウスを作製した。2)肺メモリーB細胞の産生・分化機構の解析肺メモリーB細胞の産生kineticsと表現型を二次リンパ器官のメモリーB細胞と比較した結果、二次リンパ器官のメモリーB細胞は感染後20日までに存在頻度がピークに達するのに対し、肺メモリーB細胞の存在頻度はその後もゆるやかに増加しつづけることが明らかとなった。さらに、産生された肺メモリーB細胞は、成熟型メモリーB細胞のマーカー分子として提唱されているCD73,CD80、CD273を高頻度で発現することやIgA陽性細胞の頻度が高いことから、二次リンパ器官のメモリーB細胞と比較し、より成熟段階の進んだメモリーB細胞であると考えられた。再感染ウイルスに対する肺メモリーB細胞の応答性と機能を細胞移入実験により検証したところ、二次リンパ器官のメモリーB細胞に比べ肺メモリーB細胞は再感染ウイルスに速やかに応答してより多量のIgA抗体産生細胞へと分化し、ウイルス量を有意に低下させることが明らかとなった。さらに、IgA抗体産生細胞の出現経路を詳細に調べた結果、IgA陽性メモリーB細胞に加え、IgA陰性メモリーB細胞からもほぼ同程度のIgA抗体産生細胞の供給が認められた。

以上の結果から、肺メモリーB細胞の一部は、IgA陽性メモリーB細胞からIgA抗体が供給される従来の経路に加え、再活性化後IgAスイッチを引き起こしてIgA抗体再生細胞を供給する可能性が示唆された。