hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢による退行性骨代謝変化と神経系相関

今回、科学研究費により局所発汗量が連続的に記録可能となり局所の自律神経機能の時系列的解析が可能となった.また,血液や尿において骨形成マーカーや骨吸収マーカーを測定し,臨床像、骨密度や自律神経機能との関連性を検討した.その結果はきたる第95回日本内科学会総会(4月:福岡)において発表する予定である.特に本大学のホロジック社製QDR-4500A型では骨密度のみならず一肢ごとの筋肉量、脂肪量の検討が同時に可能であり、我々はすでに患者においても検討を開始しているが、今後、さらに症例数を増やして研究を発展させていく予定である.骨租鬆症の成因を明らかにするために,神経系と退行性骨代謝変化との関連を検討した.代表的な中枢神経・末梢神経系の疾患である悩血管障害、パーキンソン病、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症の患者において十分なインフォームドコンセントの後に,D-Energy X-ray Absorptiometry(DEX-A)法、CXD法を用いて身体各部位の骨密度測定を行い,骨粗鬆症を的確に評価した上で,骨密度と中枢、末梢の運動神経障害、発汗、皮膚温などの自律神経機能検査、臨床神経学的検査との関連性を検討した.また、各症例については疾患の経過との関連についても比較検討した.今回、科学研究費により局所発汗量が連続的に記録可能となり局所の自律神経機能をより正確に把握することが可能となった.また,血液や尿において骨代謝マーカーである骨形成マーカーや骨吸収マーカーを測定し,臨床像、骨密度や自律神経機能との関連性を比較検討することかできた.今年度は骨検診に参加した地域住民の協力を得られたため健常成人における骨吸収マーカーの加齢変化との比較検討が可能となった.その結果の一部は第95回日本内科学会総会(4月:福岡),第39回日本神経学会総会(5月:京都),第51回日本自律神経学会(11月:東京)において発表した.神経疾患の骨減少の成因には運動障害による筋力低下も影響するが,それだけでなく骨の栄養や代謝に関係する自律神経系が関連することか示唆された.また,筋萎縮性側索硬化症においては骨減少が明らかになる以前から骨吸収マーカーの異常を認めたが,これらの成果は本研究を横断的,縦断的に行ったために得ることかできた.また本大学のホロジック社製QDR-4500A型では骨密度のみならず一肢ごとの筋肉量、脂肪量の測定が可能であるために、現在,骨代謝に及ぼすリハビリの長期的効果についても研究も継続しており,今後さらに症例数を増やして研究成果を報告していく予定である.
二重還流モデル腎集合管細胞を用いたイオンチャネル発現の分子制御機構

腎集合管より尿へのカリウム排泄は、ROMKと名付けられたKチャネルにより行われている。しかし、チャネルの膜発現機序には不明な点も多く、その解明は分子生理学的に重要である。本研究ではクローニングしたROMK遺伝子を培養マウスM1細胞に導入し、培養条件の違いに対するチャネル発現の影響をチャネル活性の観察と、細胞内のチャネル発現の形態を観察し検討した。その結果、二重還流法によるM1細胞管腔膜には発現に必要とされるPDZドメイン結合部を欠損させたROMKでも高率に発現することを見出した。このことは、ROMKの管腔膜のみへの発現は膜選択的であでるが、これは膜蛋白特異性を有しない結果であると考えられた。前年度までに培養マウス集合管細胞(M-1細胞)をメンブレンインサート上に単層培養し、二重還流状態にて管腔膜のイオンチャネルをパッチクランプ法で観察する手技を確立した。しかし、用いた培養細胞には本来のマウス集合管細胞に発現している目的としたROMK1 Kチャネルが存在しないことがPCR解析にて判明した。このため、ROMK1遺伝子をクローニングし、それを細胞内へ導入してその発現をパッチクランプ法で観察する方法を用いることとした。ROMK遺伝子にはEGFPをタグさせ、蛍光顕微鏡にてその導入を確認するため、二重還流装置を蛍光顕微鏡に装着させて実験を行った。その結果、二重還流下にて単層培養細胞内に充分な確率でEGFPの蛍光を認めることができたた。また、比較のために通常のガラスディッシュで培養した単一M-1細胞にも遺伝子導入をおこなったところ、同様の蛍光を認めることができた。ここで、チャネル活性の発現を単層培養細胞と単一細胞とで比較したところ、両者ともに蛍光を認めたにも関わらず、単層培養細胞では高頻度に多くのROMKチャネル活性が見られたが、単一細胞ではその頻度は低く、さらに認められるチャネル数も極めて少なかった。そこで、蛍光を発するROMKにタグさせたEGFP(ROMK-EGFP)が実際に細胞膜に存在するか否かを観察するため、実験中に細胞膜を蛍光染色させて観察したところ、単一細胞にもインサート上の細胞にも膜内に蛍光を認めた。このことはROMKチャネルの活性は管腔側に発現しやすく、極性がない膜ではたとえROMK1が存在しても活性は発現しにくいことを意味するものと考えられた。すなわち、細胞膜に局在するチャネルでも、膜の特性により機能発現が異なることを見出したことになる。このことは、細胞膜の蛋白機能はその局在のみでは細胞機能と関連しないこともあるという意義ある所見であると考える。培養マウス集合細胞であるM-1細胞では、ROMK1遺伝子導入によるKチャネル活性の発現は、極性のない単一細胞よりも極性を有する二重還流細胞の管腔膜に多いことを見い出した。しかし、この発現はC末端に標識のためのEGFPを連結させたROMK1の発現であり、C末端に存在する膜結合部位を阻害していた可能性がある。細胞膜への蛋白発現にはPDZドメインが重要であると考えられており、PDZへの結合部位はC末端に存在することが知られている。即ち、C末端にEGFPを連結させるとPDZ結合部位を阻害し、ROMK1の発現を抑制していた可能性がある。そこで、EGFPをROMK1のN末端に連結させて発現実験を行った。その結果、N末EGFPのROMK1では単一細胞、および二重還流細胞管腔膜ともに高頻度にROMK1 Kチャネル活性の発現を認めるようになった。このことは、PDZ結合部位が正常であれば、ROMK1 Kチャネルはいずれの細胞膜にも発現し得ることを示していることになる。しかし実際には、ROMK1 Kチャネルはin vivoでは集合管主細胞の管腔膜に発現する特性がある。この結果は、PDZが存在すれば、その発現に細胞膜選択制がないことを示唆しており、in vivoでの報告と矛盾する。そこで次に、PDZ結合部位をC末端より除いたROMKΔPDZbを作成し、発現実験を行った。その結果、ROMKΔPDZbは単一細胞での発言は弱いが、極性のある管腔膜には高頻度で発現することを見い出した。即ち、ROMK遺伝子の単一細胞への発現にはPDZが重要であるが、管腔膜への発現にはPDZを必要としないことが示唆された。これらの結果は、もしROMK1に対するPDZドメインがM-1細胞の膜には存在していないと考えると、in vivoのように、管腔膜に限局して発現することを説明することができる。今後、さらに検討したい。腎尿細管に存在するイオンチャネルは、生体が種々の環境に適応して生存し得る体液の水・電解質の調節に欠かせない。

本研究は、培養尿細管細胞を用いて、生体内の組織に近い条件下における様々な因子によるイオンチャネルの機能や発現調節の分子機構について調べることを目的としている。平成23年度には尿細管細胞を細孔(0.2μM))を有する細胞培養用メッシュを装備したディッシュ(インサート)上でシート状に単層培養し、それを管腔側と基底側を二重還流する方法を確立するを第一の目的とした。インサートを用いた培養細胞の実験は少なくないが、電気生理学的実験等でイオンチャネルを二重還流下に観察した報告は未だなく、実験装置の設定や実験手技に困難な点が予想された。実際、恒温二重還流装置は完成したものの、還流時の微小な振動がパッチクランプ実験を困難なものにした。そこで、管腔側の還流は従来のペリスタポンプで還流し、閉鎖腔となる基底側の還流にはペリスタポンプを用いず、約10cmの高低差の落差により生じる流速を用いて還流を行うこととした。さらに試作した二重還流装置も度重なる不具合のため、二重還流装置そのものの開発に時間を要した。さらに、23年度末になりやっと還流装置上の細胞膜へのパッチクランプに成功したものの、その成功確率は未だ不十分な状況にある。新たな装置の開発の難しさを感じさせられながらも、何とか二重還流装置の一応の感性に至ることができ、今後さらにパッチクランプ実験の精度を高めたい。ROMK1遺伝子をM1細胞に導入して、その導入したチャネル遺伝子が実際に膜に発現しているか否か、またそれがチャネル活性を持っているか否かを観察することができるようになり、実験を進行している。これまでの実験にてすでにチャネルの膜局在やチャネル活性の違いを、細胞の管腔膜と極性のない細胞膜とでは異なることを観察しており、とくに極性がない細胞膜ではチャネル局在は認めても、チャネル活性がないなど、視覚的存在と機能的存在はかなずしも一致しないことを見出している。この結果は、膜発現に関わる因子の探索や機能発現のメカニズム解明に大きく寄与するものと考えられ、本研究の目的を達成するため過程としては、ほぼ計画に沿っていると考えられる。平成23年度は、哺乳類尿細管培養細胞を管腔膜側と基底膜側とを独立して還流させる恒温二重還流装置の構築することを目的とした。年度末になり、どうにかパッチクランプ実験を行える二重還流装置が完成し、その意味では初年度の達成度は80%程度と考えられる。しかし、チャネルの同定等は未だ不十分であり、研究の遅れを感じている。その理由の第一は、二重還流装置の試作品に、なかなか満足のいくものがなく、その開発のみに約半年がかかってしまったことが挙げられる。その後も還流中の振動でパッチパイペットが外れることが多く、最近になり、やっと還流方法の工夫によりその振動の除去にも成功し、今後の展望が開けるようになった。ROMK遺伝子の機能的膜発現が極性をもたせたM1細胞に多く発現することを確認した。一方、極性を持たない細胞膜ではチャネルの局在は認められるものの、実際のチャネル活性発現は低く、機能性蛋白がそれ自体の機能を発現するには、単に存在する以外に何らかの膜特性を有する因子が必要であると考えられる。本研究最終年度である25年度は、チャネルの活性発現と細胞膜極性に関する因子との関連を明らかにし、チャネル発現メカニズムの本質に迫りたいと考えている。完成した培養細胞の恒温二重還流装置を用いて、マウス腎集合管細胞であるM1細胞の管腔膜に生理的に発現しているイオンチャネルの検索を行う。
高選択的金属濃縮を司る鍵化学物質の探索

海産の無脊椎動物であるホヤは、血球の種シグネットリング細胞(バナドサイト)の液胞内にバナジウムを高濃度に濃縮している。バナジウム濃度は最高で約350mMで、濃縮係数が1,000万倍に達するという特異な生理現象である。海水中のバナジウムは鰓あるいは腸を経由して血液中に入った後にバナドサイトに取り込まれると考えられる。その各過程にはバナジウムと親和性を持つ物質あるいは還元物質が関与すると思われる。本研究ではホヤの血漿中および血球中に存在する、バナジウム結合能を持つ新規タンパク質の同定を行なった。バナジウムキレートカラムを用いて、バナジウム濃縮細胞の細胞膜画分から4.5kDaのタンパク質を同定した。このタンパク質に対応するcDNAが我々の持つESTデータベースから見つかり、全長42アミノ酸の未知のタンパク質であると推定された。このタンパク質に対するポリクローナル抗体を作製した。同様の手法で、血漿から20kDaのタンパク質を同定した。N末端配列を決定した後、RACE法により全長をコードするcDNAを単離した。予想されるアミノ酸配列は既知のVanabinファミリーと非常に相同性の高い配列であった。血球の可溶性画分をゲル濾過によって分画することにより、Vanabinよりも小さい分子量の位置にバナジウムのピークを3つ(A,B,C)同定した。ピークCは血球由来の黄色色素成分も含んでいた。これらの画分に含まれるバナジウムに由来するESRシグナルを解析したところ、ピークAはVanabinに結合した4価バナジウムとよく似たシグナルを与えた。ピークBもまた、Vanabinに結合した4価バナジウムとよく似たシグナルであったが若干ブロードであった。一方、ピークCは異なるシグナルを示した。海産の無脊椎動物であるホヤは、血球の一種シグネットリング細胞(バナドサイト)の液胞内にバナジウムを高濃度に濃縮している。本研究ではホヤの血漿中および血球中に存在する、バナジウム結合能を持つ新規タンパク質の同定を試みた。1.血球は、段階的遠心分離によって細胞質画分、細胞膜画分および細胞内小器官画分に分離した。膜画分および細胞内小器官画分は、尿素によって可溶化した。4価バナジウムを固定化したアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって、バナジウムと親和性を持つタンパク質をアフィニティー精製し、部分アミノ酸配列を決定した。細胞質可溶性画分からは、15kDa前後の複数のタンパク質、および28kDaと40kDaのタンパク質を単離した。15kDa前後の分子量を持つタンパク質は、いずれも既知のVanabin2と非常によく似た配列であった。40kDaのタンパク質はフルクトースニリン酸アルドラーゼと相同性が高かった。細胞膜画分からは、4.5kDaのタンパク質を同定した。2.血漿は限外濾過法でタンパク質を濃縮した後、バナジウムと親和性を持つタンパク質を精製した。その一つ、20kDaのタンパク質のN末端部分アミノ酸配列を決定したところ、リジンに富む配列であった。
抗癌剤持続動脈内注入による家兎血管壁に与える影響、及び肝組織の変化

目的:野兎を用いて5-FUの動脈内持続投与による末梢血管の内腔および血管壁の形態変化,肝組織の変化を検討する.対象と方法:2.5kgの家兎を対象とした.まず全麻下にて開腹し脾動脈にカテーテルを挿入,透視下にて腹腔動脈系の造影を行い血管解剖を把握し浸透圧微量注入器を腹腔内に留置する.注入器にはコントロール群である生理食塩水と5FUをそれぞれ群別に注入,いずれも総投与量は2mlとした.また閉腹後の血管造影のため,三つ又状にもう一つのカテーテルも留置し,閉腹後の造影が可能となるように工夫した.全例このシステムで統一した.結果:前年度ではコントロール群を除き死亡例が多発したため今年度は5FU濃度を4mg/kgの膿度に変更し,全量2mlを一定として,輸液流量を10μl/hr,5μl/hr,2.5μl/hrの3つのモデルを設定し,それぞれ7日,14日,28日後の変化を観察した.28日モデルは1例のみであったが,いずれの群も血管造影および組織学的検討にて予想されていた血管内膜変化は観察されなかった.併せて施行した肝組織変化に関しても同様であった.考察:原因としては5FU濃度の関与が示唆された.おそらく低濃度のため血管壁変化を来すには及ばなかったと考えられた.同濃度であれば観察期間を延長させる必要があったが,市販されている浸透圧微量注入器が最大で28日であるため,これ以上の観察期間の延長は不可能であった.以上より,臨床的には薬剤濃度の低下が血管壁変化の頻度を減少させると推察された.また臨床例は数か月から数年間の動注例が多く,薬剤濃度だけではない治療期間の関与も大きいと示唆された.しかしながら抗腫瘍剤を低濃度化(総投与量の低下)することは,血管障害を減少させる可能性はあるが,抗腫瘍効果の低下が懸念されると考えられ,前述の理由も考慮し本研究の結果から明確な判断を得ることは困難と考えられた.本研究の目的は野兎を用いて5-FUの動脈内持続投与を注入量および注入速度,薬剤濃度を変化させ,数週間にわたる末梢血管の内腔および血管壁の形態変化を観察し,動注による影響を検討し,肝組織の変化も検討することである.我々は2.5kgの家兎20匹を対象とした.方法はまず全麻下にて固定したのち,脾動脈を剥離,露出させ直接穿刺によりテーパードカテーテルを挿入し同血管を結紮固定,透視下にて腹腔動脈系の造影を行い血管解剖を把握する.実際の血管造影はDSAの撮影も行い正確な血管解剖の把握,及びカテーテル位置の問題のないことが確認可能であった.同時にカテーテルと結合して浸透圧微量注入器を腹腔内に留置.この注入器内にはコントロール群である生理食塩水と5FUをそれぞれ群別に注入した.いずれも投与量は2mlとした.また同時に閉腹後も血管造影を可能とするために三つ又状にもう一つのカテーテルも留置し,腹壁部から造影剤を注入できるようにポート状のものを埋め込む工夫もおこなった.全例このシステムを採用し統一した.現段階では術後観察中に死亡例が多発したためコントロール群である生理食塩水注入分のみの結果にとどまっている.この群に関しては病理解剖も行い血管内膜を主体とした血管壁の観察や動脈径の測定などが可能であった.同群においては明らかなカテーテルによる機械的刺激による血管壁への影響は認められず,また末梢側も含め生理食塩水による内膜などの変化も認められなかった.しかしながら抗癌剤使用群では感染によるものと考えられる死亡例が多発したため現在薬剤濃度を再検討中である.おそらく濃度が高すぎたことが原因と考えられているが,カテーテル留置時における侵襲性の高い手術操作も加味されていると考えられる.なお抗癌剤投与群も初期段階による血管造影や病理学的検討は進んでいる.今後も引き続き実験計画に基づき検討していく所存である.目的:野兎を用いて5-FUの動脈内持続投与による末梢血管の内腔および血管壁の形態変化,肝組織の変化を検討する.対象と方法:2.5kgの家兎を対象とした.まず全麻下にて開腹し脾動脈にカテーテルを挿入,透視下にて腹腔動脈系の造影を行い血管解剖を把握し浸透圧微量注入器を腹腔内に留置する.注入器にはコントロール群である生理食塩水と5FUをそれぞれ群別に注入,いずれも総投与量は2mlとした.また閉腹後の血管造影のため,三つ又状にもう一つのカテーテルも留置し,閉腹後の造影が可能となるように工夫した.全例このシステムで統一した.結果:前年度ではコントロール群を除き死亡例が多発したため今年度は5FU濃度を4mg/kgの膿度に変更し,全量2mlを一定として,輸液流量を10μl/hr,5μl/hr,2.5μl/hrの3つのモデルを設定し,それぞれ7日,14日,28日後の変化を観察した.28日モデルは1例のみであったが,いずれの群も血管造影および組織学的検討にて予想されていた血管内膜変化は観察されなかった.併せて施行した肝組織変化に関しても同様であった.考察:原因としては5FU濃度の関与が示唆された.

おそらく低濃度のため血管壁変化を来すには及ばなかったと考えられた.同濃度であれば観察期間を延長させる必要があったが,市販されている浸透圧微量注入器が最大で28日であるため,これ以上の観察期間の延長は不可能であった.以上より,臨床的には薬剤濃度の低下が血管壁変化の頻度を減少させると推察された.また臨床例は数か月から数年間の動注例が多く,薬剤濃度だけではない治療期間の関与も大きいと示唆された.しかしながら抗腫瘍剤を低濃度化(総投与量の低下)することは,血管障害を減少させる可能性はあるが,抗腫瘍効果の低下が懸念されると考えられ,前述の理由も考慮し本研究の結果から明確な判断を得ることは困難と考えられた.
天体衝突により発生する衝突蒸気雲内における触媒反応

前年度に引き続き、炭酸塩(CaCO_3)からの二酸化炭素(CO_2)の衝突脱ガスの解明を目指し、研究を遂行した。従来考えられてきた衝突脱ガス機構は、衝撃波通過直後の段階では、まだCaCO_3は分解しておらず、希薄波の伝播による圧力の解放後に分解が起こり、脱ガスするというものであった。しかし、衝撃圧が十分に高ければ、衝撃波通過直後の段階で、すでに分解が起こると考えられる(Hugoniot上での分解)。そのような場合、従来考えられてきたよりも大規模な脱ガスが起こるはずである。CaCO_3のHugoniot上での分解が起こる衝撃圧を知るには、高温・高圧におけるCaCO_3の分解境界を知る必要がある。しかし、従来の研究ではCaCO_3の分解境界は1700K、数十barまでしか求められていなかった。そこで本研究では本年度、レーザー加熱式ダイヤモンドアンビル装置(LHDAC)を用いて、高温・高圧におけるCaCO_3の分解境界を求めた。第一段階として、LHDACにおける高温測定法の改良を行い、高温領域の温度測定を可能にした。第二段階として、ラマン分光法およびエネルギー分散型X線分光法を用いたCaCO_3分解の判別手法を確立した。第三段階として、広い温度・圧力領域におけるCaCO_3の分解境界を求めた(最大5000K、10GPa)。その結果、CaCO_3は高温・高圧領域において非常に安定で、分解しにくいことが判明した。この結果は、衝撃圧が高くなったとしても、CaCO_3からの大規模な衝突脱ガスは起こりにくいことを示唆している。6500万年前のK-P境界における生物大量絶滅機構の一つの仮説として、炭酸塩から脱ガスしたCO_2による温室効果が提唱されているが、本研究の結果は、CO_2による温室効果は非常に小さく、生物大量絶滅機構とはなり得ないことを示している。本研究は、天体衝突に伴う惑星表層からの脱ガス現象の解明を目標としている。「衝突脱ガス」は、惑星の表層環境に影響を与える重要な現象である(e.g.,生命の起源、生物大量絶滅)。従来の衝突脱ガスの研究では、脱ガス量は天体衝突時に発生する衝撃波が通過した後に達成される衝撃圧により、一意に決まるとされてきた。しかし近年、衝突クレーター堆積物の分析から、衝撃圧からの圧力解放過程において起こる現象が脱ガス効率に寄与している可能性の報告がされている。そこで本研究では衝撃圧状態からの解放過程に注目して、衝突脱ガスの見直しを行っている。現在は、地球上に多量に存在する炭酸塩(CaCO_3)からのCO_2の衝突脱ガス現象に注目している。まず、炭酸塩(CaCO_3)からのCO_2の衝突脱ガスの描像を、熱力学的手法を用いて見直した。衝撃圧からの解放が断熱等エントロピー過程であることに着目し、衝撃波の通過により増加するエントロピーと、CaCO_3の状態変化に必要なエントロピーを計算し、両者を比較した。その結果、衝撃圧の大きさにより、解放過程は(a)圧力解放後に固体のCaCO_3からCO_2が脱ガス、(b)圧力解放後にメルトのCaCO_3からCO_2が脱ガス、(c)衝撃波通過直後にCaCO_3が分解の3タイプに分類できることがわかった。(必要な衝撃圧は(a)(b)(c)の順に高くなる。)それぞれの圧力解放過程ごとに脱ガス機構が異なるため、従来考えられていた衝突脱ガスの描像では、脱ガス量は正しく求めることができないことが明らかになった。この結果を受け、それぞれの圧力解放過程からの脱ガス効率を求めるため、CaCO_3の「熱分解実験」および「逆反応実験」を行うための化学反応実験装置の構築を行い、現在データを取得中である。

6500万年前のK-P境界における生物大量絶滅機構の一つの仮説として、炭酸塩から脱ガスしたCO_2による温室効果が提唱されているが、本研究の結果は、CO_2による温室効果は非常に小さく、生物大量絶滅機構とはなり得ないことを示している。
顎顔面骨格の再生医療に向けた軟骨分化決定因子に関する研究

本研究は、顎顔面骨格の形成に重要な役割を果たしている軟骨細胞の分化に関与する遺伝子について検討することを目的としている。1.ラットの様々な軟骨におけるCTGFの発現6週齢ラットの下顎頭軟骨、下顎骨骨折治癒過程に出現する軟骨、大腿骨成長板軟骨、大腿骨関節軟骨を用い、CTGF, collagen type I, II, X mRNAの発現をin situ hybridizationにより解析した。その結果、type I collagenは大腿骨成長板軟骨では認められなかったが、下顎頭軟骨、大腿骨関節軟骨では表層近くの増殖軟骨細胞に認め、下顎骨骨折治癒過程では凝集した間葉系細胞に発現した。CTGFは肥大軟骨細胞だけでなく、type I collagenと共発現した。以上より、CTGFが軟骨の初期分化に対して何らかの役割を果たしていることが示唆された。Runx1,Runx2,Sox9 mRNAの発現の解析にはin situ hybridizationを行った。Runx1、Sox9は軟骨とRunx2を発現する骨形成部に隣接して発現した。Runx1,Sox9の発現は骨化と共に著しく減少し、骨化した顎顔面骨には認められなかった。また、Runx2の発現はRunx1の遺伝子破壊の影響は受けなかったが、Runx1の発現部位はwildtypeに比べ、Runx2 knockoutマウスで広がった。以上の結果より、Runx1は初期の膜性骨化に役割を果たしている可能性が示唆された。3.内軟骨性骨化におけるZac1の機能軟骨細胞培養系を用いて、軟骨の分化に伴うZac1遺伝子の発現をRT-PCRにより検討した。胎生17日齢ニワトリ胚胸骨より軟骨細胞を分離して3週間培養したところ、経時的にZac1遺伝子の発現は減少した。また、Zac1の軟骨基質代謝への影響を調べるために、Zac1遺伝子をニワトリレトロウイルス系を用いてニワトリ軟骨細胞に導入し発現させ、green fluorescent proteinのみを組み込んだ対照群の細胞と比較検討した。その結果、これらの細胞に軟骨基質の産生減少と分解を促進することが知られているレチノイン酸を作用させると、対照群ではIX型コラーゲンの発現の減少とMMP-13,ADAM-TS5の発現の増加が認められたが、Zac1遺伝子導入群では、これらの変化が顕著に抑制された。以上の結果より、Zac1は軟骨基質代謝を調節することにより軟骨発生制御に関与すること、Zac1の発現が軟骨組織の恒常維持に重要であることが示唆された。4.レーザーマイクロダイセクション法を用いた分化初期の軟骨細胞が発現する遺伝子のプロファイリング新生仔マウス下顎頭軟骨から単離したcollagen type Iを発現する軟骨細胞群とcollagen type Iを発現しない軟骨細胞群の2群を用い、それぞれの細胞群が発現する遺伝子のプロファイリングをマイクロアレイ法で行った。これらの方法は下顎頭軟骨の層毎における軟骨細胞の解析に有用なことが示唆された。4.レーザーマイクロダイセクション法を用いた分化初期の軟骨細胞が発現する遺伝子のプロファイリング

新生仔マウス下顎頭軟骨から単離したcollagen type Iを発現する軟骨細胞群とcollagen type Iを発現しない軟骨細胞群の2群を用い、それぞれの細胞群が発現する遺伝子のプロファイリングをマイクロアレイ法で行った。これらの方法は下顎頭軟骨の層毎における軟骨細胞の解析に有用なことが示唆された。本研究は、顎顔面骨格の成り立ちに重要な役割を果たしている軟骨細胞に分化を決定づける因子を、実験動物組織に特異的に出現する細胞群の分離同定により明らかにすることを目的としている。本年度は顎顔面の硬組織の発生、発達成長過程、あるいは骨折モデルにおける創傷治癒過程で出現する各種細胞の遺伝子発現の詳細を検討した。ラット下顎頭骨折モデルに対するCTGE, Cbfa1,Collagen type I, II, X mRNAの発現をin situ hybridization法により経時的に解析した。その結果、膜性骨化と内軟骨性骨化による修復部で特徴的な遺伝子発現パターンを観察した。同時に下顎頭軟骨、大腿骨関節軟骨、大腿骨骨端成長板軟骨における上記遺伝子の発現を検討し、各種軟骨細胞層における特異的遺伝子発現を解明した。また、発生過程のマウスの顎顔面におけるCbfa1,Runx1,Sox-9の遺伝子発現をin situ hybridization法により検討した。その結果、骨化予定領域にCbfa1のみならずRunx1,Sox-9の発現が一部オーバーラップしており、未分化間葉系細胞のうち前軟骨芽細胞と前骨芽細胞の両者の性質をもった細胞の存在が示唆された。またこれらの細胞の存在は、長管骨部より顎顔面部においてより顕著であった。一方、組織片から特定細胞を分取するレーザーマイクロダイセクション法とそれに引き続く特異細胞、組織の遺伝子発現の検討は、従来から軟組織に対して行われているのみであった。そこで、同手法を硬組織で適応する基礎的実験を行った。組織の固定、切片作製、遺伝子抽出にわたる一連の過程に改変を加えた。本研究は、顎顔面骨格の形成に重要な役割を担っている軟骨細胞の分化に関与する新規遺伝子の,同定およびその遺伝子の発現様式,機能解析を目的としている。本年度は、レーザーマイクロダイセクション法により、新生児マウス下顎頭軟骨を構成する線維層と軟骨細胞層の単離法の確立およびそれぞれの層からRNAの抽出を試みた。さらに抽出されたRNAを用いてCollagen type I,IIの遺伝子発現をRT-PCR法により検討した。クライオスタットにて未固定非脱灰切片を作成する手法を確立したのち、トルイジンブルー染色を行い線維層と軟骨細胞層の分別を行った。レーザーマイクロダイセクションにより得られた線維層および軟骨細胞層から全RNAの回収後、リバーストランスクリプション反応を行った。RNA抽出の成否を検討するために、ハウスキーピング遺伝子であるG3PDHの遺伝子発現を検索した結果、両者の細胞層からRNAが確実に抽出されていることが確認できた。
幼児期気質に関する２０年間の時代変化と規定要因についての学際的研究

3つのコホートの幼児期気質の時代変化、幼稚園児と保育所児の気質の違い、心理社会的要因及び環境化学物質と気質の関連を検討するため、質問紙調査、リアルタイムネットインタビュー、子どもの毛髪金属分析を行った。質問紙調査の結果では、現在の子どもの気質は1992年と違いはなく、2002年の幼児の気質のみが他の年代と比べてやや異なっていた。また、保育所児の方が外向性・高潮性が高かった。ネットインタビューと紙面調査により得られた家庭環境と気質データの関連を検討したところ、気質は兄弟姉妹の有無や家庭生活での身体的凝集性と関連していた。また、母親妊娠中、及び現在の子どもの食生活が気質と関連することが判明した。本研究目的は、子どもの気質の20年間のコホート変化、幼稚園児と保育所幼児との気質発達における違いの有無、気質発達への心理社会的要因及び環境化学物質の影響の有無、を明らかにすることである。よって本年度は以下のことを実施した。1.化学物質等の発達への影響についての文献レヴューを行い、メチル水銀、ダイオキシン類等が魚介類を介して摂取されるという結果を基に、魚介類汚染データの検討、並びに北海道、関西地区での販売魚介類を調べ、食事調査項目を作成した。また、化学物質悪影響と拮抗する家庭環境についての項目、社会疫学的観点からの項目を追加し、気質質問項目と合わせて大規模調査票を作成した。本調査票を幼稚園児に配布し約30名からの回答を得たが、回収率が低いため項目をさらに精選した。2.リアルタイムで子どもの生活状況を調べるための質問項目を作成し、承諾の得られた11名の母親に携帯メールを送り、web上での回答を求めた。概ね問題なく回答が得られることが確認された。3.縁故者に毛髪提供を依頼し、誘導結合プラズマ質量分析計による毛髪分析手法確立のための実験を行った。標準毛髪サンプル水銀量にほぼ一致する数値が得られることが確かめられた。しかし、応募者からの送付毛髪量は不十分であったため、毛髪採取方法等を変更した。4.文献レヴューより紙面調査のみでは化学物質影響要因を検出できない可能性が考えられたため、実験室で母子行動観察の予備実験を行った。5.大規模予備調査での子ども及び母親の気質に関連する諸要因について探索的に検討した。子どもの気質発達は食生活(野菜、脂の少ない魚、缶詰やコンビニ等の食品摂取)、育児行動、育児信念、妊娠中の喫煙状況、胎児への働きかけ等との間に有意な相関がみられた。一方、母親の気質は、授乳期間、幼児の食生活、育児信念、胎児・子どもへの働きかけ等との間に有意な関連性が認められた。調査Iのデータを使用し、以下の分析を行った。幼稚園児を対象とし、20年間の幼児期気質についての変化を検討したところ、効果量は小さいが(偏η2 = .01)、2002年の幼児期気質は10年前(1992年)及び10年後(2012年)と比べて、エフォーロフル・コントロール(EC)が高く、高潮性が低いという年代効果が見られた。否定的情動性(NA)についての年代効果は有意ではなかった。次に、気質発達への影響要因を探るため、性別、月齢、出生順位、通園施設(幼稚園・保育所)、出生時身長・体重、授乳状況・期間、父母の年齢・就学年数、母親喫煙歴、妊娠中母親の食品摂取、子どもの現在の食品摂取を独立変数とした階層的回帰分析を行った。結果、子どもの気質発達は、母親の妊娠中食品摂取及び乳児期栄養、幼児期の食品摂取と関連することが明らかとなった。特に、簡便調理食品(レトルト食品、缶詰、コンビニ弁当等)の摂取頻度が高いと子どものNAは高く、ECは低い傾向があった。また、妊娠中に母親が野菜をより頻繁に摂取すると、子どものECが高かった。さらに、ECは、後に生まれた子の方が、また、人工乳栄養よりも母乳栄養で育った子どもの方が高い傾向が見られた。調査IIでは、協力者から採取した毛髪の金属含有量を測定した。主な重金属の濃度中央値はクロム0.10、水銀0.88、鉛0.96、カドミウム0.002マイクロg/gであり、水銀濃度と食事調査による水銀摂取推定値との相関値は有意(r = .30)となり、食事調査の妥当性が得られた。厚生労働省の食品からのダイオキシン類一日摂取量調査等の報告に基づいて食事調査からダイオキシン類摂取量を推定したところ、中央値は12.13pgTEQ/kg体重/週となった。また、子どもの気質と遊びとの関連を検討したところ、特に音楽遊びが子どものEC発達と関連していることが示唆された。

本研究目的は、子どもの気質の20年間のコホート変化、幼稚園児と保育所幼児との気質発達における違いの有無、気質発達への心理社会的要因及び環境化学物質の影響の有無、を明らかにすることである。昨年度実施した予備調査(紙面調査、ネット調査、毛髪採取)結果に基づいて調査質問項目の精選及び毛髪採取方法等の改変等を行った後、全国5か所の幼稚園、保育所(合計21園)の在園児の家庭に対して紙面調査を実施した(調査I)。さらに調査I協力者の中からより詳細な調査への承諾が得られた家庭に対して、紙面調査、ネット調査、子どもの毛髪採取を実施した(調査II)。これらデータに基づき、子どもの気質、家庭環境、養育者の心理特性等について分析を行った。気質発達については、調査Iデータから、幼稚園と保育所の子どもの気質に違いがあることが判明し、「外向性・高潮性」は保育所の子どもの方が、また「エフォートフル・コントロール」に関しては3歳児で保育所の子どもの方が高い傾向があった。またリアルタイムのネット調査の結果からは、兄弟姉妹の存在、入浴や食事等の生活を一緒にしている家族成員、日本的育児様式等が気質発達に関連することが見出された。子どもの家庭環境に関しては、子どもを幼稚園・保育所のいずれに通わせているかということよりも、年収による違いが見られ、基本的に年収が高い方が望ましい環境を整えているようであった(年収の高い方が、体罰が少なく、勉強に対する期待が大きく、子どもを多くのおけいこに通わせ、野菜をよく食べさせる等)。母親の育児信念は日常の家庭生活の様相(子どもが誰と一緒に食事をするか、子どもへの読み聞かせや合唱などの教育行動)に関連しており、また、母親としての不安の有無には、子どもへの制限や罰の使用回避、自身の怒りの制御、家庭の年収,子どもの否定的情動性などが関係していることが明らかとなった。23年度の計画通り、調査項目を作成して予備調査を実施し、結果を分析した。次年度本調査のための協力者募集は山口県、奈良県、山梨県、北海道(2地域)の幼稚園・保育所で行う了承が得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。前年度の予備調査では紙面調査票回収率が50%を下回った。よって、保護者の負担を軽減して回収率を向上させるため、調査項目を洗練した。その後、国内5か所(山口県、奈良県、山梨県、札幌市、滝川市)の幼稚園及び保育所(合計21園)を通じて、合計1475部のアンケートを配布した。予測通り、回収率は予備調査を上回った(園毎の回収率の平均は67.8%、回収総数942名)。また、保育所の子ども数が幼稚園児数に比べて少ない為、予定にはなかった滝川市内保育所2か所から追加の保育所データを収集した。調査IIのネット予備調査では、協力申請者の中に、メール受信不能により参加できない者が複数名いたため、自動返信機能を用いてメール受信可能な母親のみ参加できるように応募要領を変更し、携帯電話で確実にメール受信可能な母親みを調査IIの対象者とした。調査IIでは、当初の協力者目標数150名には達しなかったが、最終的に紙面調査、ネット調査、毛髪提供の全てに協力した人数は118名となった。また、当初の計画には含まれなかったが、子どもの気質への遺伝的影響検討のため、父親に対しての紙面調査を実施し、ほとんどの家庭の父親からの協力を得ることができた。また、予備調査分析で、半数以上の子どもの毛髪採取量が不十分であったため、毛髪採取方法を変更した。結果、ほぼ全員から十分な毛髪量を得ることができた。
実験胃潰瘍の底部結合組織の収縮活性について

実験胃潰瘍の底部結合組織の収縮活性について研究を行い、以下の実績を得た。1.実験胃潰瘍である酢酸潰瘍を作製し、その潰瘍底部から肉芽組織を含む全ての結合組織の単離に成功した。2.その単離した潰瘍底部結合組織が、セロトニン、ブラジキニン、プロスタグランジンFla、カルバコール等の薬物によって収縮することを証明した。またこの潰瘍底部結合組織が平滑筋層を全く含んでいなかったことにより、確認された収縮反応は肉芽組織そのもの、主に筋繊維芽細胞もしくは繊維芽細胞を介して認められるものであることが推察された。3.我々は、既にラットに作製した酢酸胃潰瘍が非ステロイド系抗炎症薬であるインドメタシンの連続投与によってその治癒が遅延されることを報告している。このインドメタシンを投与した動物の潰瘍底部より結合組織を単離しその収縮活性を検討したところ、対照群と比較してその活性が有意に減弱していることが判明した。4.組織学的な検討よりもインドメタシンが収縮反応を抑制していることが明らかとなった。また、インドメタシンを投与した群の潰瘍底部の肉芽組織は、異常かつ過剰なコラーゲン繊維の走行が観察され、肉芽組織の繊維化が高度に進行しているものと考えられた。5.インドメタシンの投与によって認められた肉芽組織の繊維化をステロイド系抗炎症薬の一つであるプレドニゾロンを処置することによって分解すると、胃潰瘍の有意な縮小が認められた。このことは、インドメタシンによる胃潰瘍の治癒遅延の機序に高度な繊維化を介した肉芽組織の収縮抑制が関与していることを示すものである。以上より、胃潰瘍の治癒は肉芽組織の収縮によって進行するものであることが明白となり、この点に関するより詳細な検討は、胃潰瘍の治癒を論じる上に於いて重要な知見を提供しうるものであると考えられた。
インターネットを用いた小児がん関連課題解決のための成功事例報告システムの開発

本研究では小児がん患者や小児がん経験者およびその保護者が、入院治療を経て地域で学校生活や日常生活を送るために必要な情報とはどのような内容なのか、有益な情報にアクセスするためにはどのような環境を整えればよいのかを検討する。その結果、「就学や就職を見据えた小児がん特有の課題に対する情報とはどのような内容か」「小児がん患者が抱える個別性の高い課題の解決に資する情報とはどのような内容か」「有益な情報に容易にアクセスするためにはどのような環境が必要か」の示唆を得ることができる。
ラット胎仔を用いた胎生期の薬物代謝系の特異性の解析

本研究は胎児肝における薬物代謝能の特性を明らかにすることにより、妊娠母体に投与される薬物や、母体を通して入ってくる化学物質の胎児への薬効評価や、副作用・毒性の予測を行う為の基礎データを得ることを目的として行われた。この為にラット胎仔肝におけるチトクロームP-450(P-450)柔薬物酸化酵素の特性を調べ、更に同じように増殖が激しく、薬物代謝能の低下している再生肝と比較することにより胎仔肝におけるその制御機構を解明することを試みた。ラット胎仔肝におけるP-450の系酵素活性は非常に少ないが、妊娠後期より出産直前の時期に急激に上昇していた。またその特性としては、【b_5】の存在量がP-450に比較して異常に高いこと、薬物酸化に際して【b_5】及びcyt・【b_5】reductareの関与度、NAbHのNADpHに対する相乗効果などが高まつていることがあげられる。胎仔肝におけるP-450分子種に関しては、誘導剤によって母体や成熟動物の肝に誘導される分子種と異なる性質のものが誘導されることが示唆されたので、現在その分子種の精製を試みている。一方ラット再生肝においては、肝部分切除後4日目までの細胞増殖期に、P-450及びその関連酵素系の活性が減少しており、【b_5】のP-450に対する相対的な存在量もわずかに増加していた。薬物酸化におけるNADHの寄与も増大傾向にあった。3日目の再生肝より、P-450分子種を分離精製したところ、3種の主要分子種とその他の分子種が得られたが、主要成分に関しては、再生肝に特有に増減する分子種は認められなかった。これは再生肝におけるP-450の低下は、全般的なP-450の減少に起因することを示唆している。以上より胎仔肝においては成熟動物肝や再生肝と異なる特性をもつ薬物代謝酵素系が存在することが示唆されたが、更にそのP-450分子種の精製と特性解析によって、ヒト胎児肝における薬物代謝能の特性を明らかにすることが今後望まれる。
１分子in vivoイメージング超解像ナノ解析によるクロマチン動作原理解明

クロマチン動作原理解明を目的として、新しい技術開発により「動的クロマチン構造と機能」研究を展開した。高解像度の多色同時観察が特長の生細胞多色蛍光1分子イメージング超解像顕微鏡を構築した。移動部分軌跡解析法など、超解像ナノ解析・分子動態と相互作用定量化法を開拓した。高精度分子動態解析のために、動態を保持したままガラス表面に分子を導入する試料作成方法を開発した。領域内共同研究により、ヌクレオソームとRNAポリメラーゼ、ヒストンバリアントによる違い、転写制御タンパク質、クロマチンリモデリングINO80複合体、核小体液相構造に関し、生細胞動態の分子動態・局在・相互作用を解析し、新しい描像を得た。顕微鏡分野の大きなトピックである超解像イメージング法において、高解像度化と従来法の難点である時間分解能のリアルタイム性の克服を中心とする、超解像ナノ解析法の新規開拓と細胞核動態観察最適化により、クロマチン構造の細胞レベルin vivo分子動態・要素間相互作用・核内配置の動態を解明することを目的とした。そのために、生細胞多色1分子イメージング超解像顕微鏡の開発と構築、多色超解像ナノ解析法の開発と定量化法の開発を行った。独自技術の1分子蛍光顕微鏡法である対物レンズ型全反射照明法(BBRC, 1997, Nature, 1999)と薄層斜光照明法(HILO法、Nat Methods, 2008)を基にした多色1分子イメージング蛍光顕微鏡をベースに超解像法を融合し、多色超解像顕微鏡システムを構築した。1分子FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)・1分子イメージングを同時使用可能とし、厚みのある細胞核観察に対応するため、4色同時観察・高解像度高画質結像系・数ミリ秒以上の高時間分解能・Z方向の高精度走査能を有する仕様とした。解析・定量化法においては、各色ごとに輝点重心位置を求めて解析を行うこととした。異なる色の画像間では、光学限界の制約を受けないので、多色顕微鏡システムのハードウェア性能と画像の高画質性が満たされれば、10 nm分解能が達成できるためである。多色同期イメージング画像を用いて、10 nm分解能で生細胞における分子間距離を定量する方法と、そのための解析ソフトウェアシステムを開発構築した。精度が実際に10 nmあるかの検証のため、精度の評価を平行しつつ、ハード系・ソフト系を開発・構築した。光学顕微鏡超解像イメージングの大きな国際的潮流が起こっているが、現在用いられている方法ではリアルタイム性・生細胞観察との両立に難があった。これを克服すべく顕微鏡技術・解析技術開拓を行い、新学術研究領域「動的クロマチン構造の解明」内の共同研究を展開して、クロマチン動態解明を行った。1.生細胞多色1分子イメージング超解像顕微鏡と、多色超解像ナノ解析・定量化法の開発。1分子イメージング技術を用い、リアルタイム多色同期イメージングの超解像解析技術を構築した。10nmオーダーの解像度達成に向けて、時間変動・多色間位置ずれの高難度問題を克服する方法を開拓した。2.ヌクレオソーム生細胞動態。1分子超解像軌跡追跡と、FRAP法(木村班と共同研究)と融合解析し、ヌクレオソーム動態に関する新しい描像を得た。3.ヒストンバリアント生細胞動態。ヒストンH2・H3バリアントをGFP標識した生細胞の1分子観察とFRAP法により、動態研究を推進した(胡桃坂班・木村班・大川班と共同研究)。4.クロマチンリモデリング複合体生細胞動態。同手法により、アクチン関連分子ArpやIno80のクロマチンリモデリングタンパク質とヌクレオソーム相互作用動態に関する新しい描像を得た(原田班・木村班と共同研究)。5.高精度超解像解析のための脂質二重膜構築法。流動性を確保して基板上に分子・細胞を保持する簡便な方法を開発した。従来法では、煩雑なガラス表面洗浄処理や専用装置が必要であるため、試料調整に困難が伴い利用が限られていた。本研究で開発した方法は、脂質二重膜をガラス基板上に、均一な膜を再現性高く、簡便に作製できる。生細胞イメージング・1分子解析・in vitro表面分子分析など、広汎な利用を可能にするもので、クロマチン構造変化の超解像解析においても高精度計測を可能にした。生細胞多色1分子イメージング光学顕微鏡の超解像ナノ解析法の開拓により、新学術研究領域テーマ「動的クロマチン構造と機能」の新たな展開を計り、クロマチン動作原理解明することを目的としている。領域内の共同研究を展開して、クロマチン動態解明を行った。1.生細胞多色1分子イメージング超解像顕微鏡と、多色超解像ナノ解析・定量化法の改良。1分子イメージング技術を用いリアルタイム多色同期イメージングを行う超解像解析技術を改良した。10nmオーダーの解像度達成に向けて、時間変動・多色間位置ずれの高難度問題を克服する方法を改良した。1分子超解像軌跡追跡と、FRAP法(木村班と共同研究)と融合解析し、ヌクレオソーム動態に関する新しい描像研究を進めた。ヒストンH2・H3バリアントをGFP標識した生細胞の1分子観察とFRAP法により、動態・超解像研究を推進した(胡桃坂班・木村班・大川班と共同研究)。

同手法により、アクチン関連分子ArpやIno80のクロマチンリモデリングタンパク質とヌクレオソーム相互作用動態に関する新しい描像研究を推進した(原田班・木村班と共同研究)。5.高精度超解像解析のための脂質二重膜構築法。流動性を確保して基板上に分子・細胞を保持する簡便な方法を改良した。従来法では、煩雑なガラス表面洗浄処理や専用装置が必要であるため、試料調整に困難が伴い利用が限られていた。本研究で開発した方法は、脂質二重膜をガラス基板上に、均一な膜を再現性高く、簡便に作製できる。生細胞イメージング・1分子解析・in vitro表面分子分析など、広汎な利用を可能にするもので、クロマチン構造変化の超解像解析においても高精度計測を実現した。超解像ナノ解析法の新規開拓と細胞核動態観察最適化による、クロマチン構造の細胞レベルin vivo分子動態・要素間相互作用・核内配置の動態解明という目的を達成すべく、本年度の研究計画5項目を推進した。「1.生細胞多色1分子イメージング超解像顕微鏡と多色超解像ナノ解析・定量化法の開発改良」に関しては、高画質化・高速化・多自由度化・多色同期化・高精度化を中心に、顕微鏡システムを改良した。多色超解像ナノ解析法・定量化法を改良し、10 nm精度の検証を進めた。「2.ヌクレオソーム生細胞動態」と「3.ヒストンバリアント生細胞動態」においては、1分子超解像法とFRAP法の融合解析により研究を進めた。「4.クロマチンリモデリング複合体生細胞動態」では、クロマチンリモデリングINO80複合体を構成する種々のタンパク質を用い、動態・超解像解析を推進した。「5.高精度超解像解析のための脂質二重膜構築法」では、簡便に脂質二重膜を構築する方法の開発により、蛍光標識再構成クロマチンを用いて高精度な構造変化計測研究を進めた。いずれも順調に進展している。生細胞多色1分子イメージング光学顕微鏡の超解像ナノ解析法の開拓により、新学術研究領域テーマ「動的クロマチン構造と機能」の新たな展開を計り、クロマチン動作原理解明することを目的としている。領域内の共同研究を展開して、クロマチン動態解明を行った。1.生細胞多色1分子イメージング超解像顕微鏡と、多色超解像ナノ解析・定量化法の改良。クロマチン動作原理解明のための超解像顕微鏡システムのための高解像度化と、多種顕微鏡法への対応を進めた。多色位置ずれ補正の高精度化、多色超解像ナノ解析方法の高速化を行うとともに、1分子軌跡追跡を用いた分子動態の新しい定量解析方法を開発し、従来求めることができなかった反応速度定数の定量を単色の1分子イメージング画像のみから行うことを可能にした。2.ヌクレオソーム生細胞動態。1分子超解像軌跡追跡と、FRAP法(木村班と共同研究)と融合解析し、ヌクレオソーム動態に関する新しい描像研究をさらに進めた。3.ヒストンバリアント生細胞動態。ヒストンH2・H3バリアントをGFP標識した生細胞の1分子観察と超解像法により、動態・超解像研究を転写状態との関係解明を主眼として推進した(胡桃坂班・木村班・大川班と共同研究)。4.クロマチンリモデリング複合体生細胞動態。
自己修正機能を有する自律分散システムの数理モデル作成とその数理解析

(1)忌避物質が含まれた領域を通過中の真正粘菌に対して時間周期的光刺激を与える実験を行い,10分周期の光刺激の場合に特徴的に,光刺激がない場合と比べて忌避物質の通過時間が短縮されることを発見した。本研究では,「抑制後リバウンド」という現象に注目することによって、実験で観察された現象の仕組みを解明した。(2)ネットワーク内の2点をつなぐ経路を探索するシステムを提案した。提案したシステムはネットワークの切断等の外部摂動が生じた際にも自動的に新たな経路を探索する機能を有する。このような機能を有するために,ノードダイナミクスを記述する方程式が満たすべき条件を示した。生物実験グループと共同研究を実施し、忌避物質が含まれた領域を通過中の真正粘菌に対して時間周期的光刺激を与える実験を行ったところ、10分周期の光刺激の場合に特徴的に、光刺激がない場合と比べて忌避物質の通過時間が短縮されるという興味深い実験結果を得た。従来、光刺激は真正粘菌にとっては忌避的な効果があると考えられていたため、この結果は直観に反する。そこで、従来、真正粘菌のモデルでは考慮されていなかった、「抑制後リバウンド」という弛緩振動子に特徴的にみられる現象に注目することによって、実験で観察された現象の数理機構の解明を試みた。現象を数理的に解明するためには、粘菌の伸展運動を再現する数理モデルを作成する必要がある。先端部の伸展運動に対してはカルシウムイオン濃度変化を記述する方程式、原形質流動に対してはDarcy則に基づく方程式を採用し、それらを相互作用させた偏微分方程式によるモデルを導出した。導出した数理モデルを用いて数値実験を行った。光強度と光照射周期をコントロールパラメータとし、光刺激に対する細胞の応答を調べた結果、伸展運動のダイナミクスが示す振動の周波数と光刺激の周波数が近いときに、抑制後リバウンド現象が顕著に観察され、忌避物質が含まれた領域の通過時間が短縮されることが明らかになった。この数値実験結果により、粘菌が光刺激に対して伸展運動を活性化させる仕組みとして細胞先端で起きる化学反応の非線形性が重要な役割を果たしていることが示された。真正粘菌にとって光は忌避的な刺激であり,一般的には移動速度が減少することが知られている.昨年度の研究により光刺激を時間周期的に与えた場合では,キネーネ帯の通過時間が光刺激を加えない場合の通過時間と比べて短くなるという結果を得た.今年度はその仕組みを詳細に解析した.生物実験家との共同研究により,光刺激により移動運動が活発化したグループと抑制されたグループに二分化される現象を発見した.数理モデルに対する数値実験によって、実験で観察された行動の二分化を再現するに成功した.自己修復機能を再現する自律分散システムを構築するためにネットワーク上での力学系を研究した。具体的な課題としてループネットワーク探索問題を扱った.ループネットワークを自動的に発見すること、およびループネットワークが切断した場合に自発的に新たなループネットワークを探索する性質を有するシステムを提案することに成功した。本研究では、複数の自己組織化パターン、および空間スケールが異なる自己組織パターンの相互作用を解析する手法を開発し、真正粘菌と脳活動で観察される遷移ダイナミクスの発生機構を解明することによって、実際の生命現象で観察される機能的振る舞いの仕組みを解明する。さらに、そこで得られた知見をもとに、自己修正機能を有する自律分散システムの設計法を提案する。そのために、数理モデルの作成を行う。また、これらの現象の理解には緩和振動子の集団運動に対する分岐構造解析が不可欠であるため、従来の解析手法を発展させる。1.自己修復機能を実現する自律分散システムを構築するために,ネットワーク上での力学系を研究した。昨年度に構築したループ探索モデルを発展させ,ネットワーク内の2点をつなぐ経路を探索するシステムを提案した。ネットワークのノードダイナミクスとして振動現象を示す方程式を採用した。このような機能を有するシステムを作成するために,ノードダイナミクスを記述する方程式が双安定系となるパラメータ領域を採用した。2.真正粘菌の移動運動を再現する数理モデルを作成した。これまで我々が作成した細胞先端部分の厚み変化を記述する数理モデルに管構造を再現する数理モデルをカップリングさせることにより,実験で観察される通路形状に依存した輸送管構造を再現することに成功した。自己修復機能を有するネットワークモデルの作成に関して,従来はノードダイナミクスを記述する方程式として双安定系の方程式を採用してきたが,今年度の研究において振動現象を示す方程式においても作成可能であることを示すことができた。本年度は,真正粘菌変形体の移動運動に関する数理モデルの作成と,自律分散型ネットワークモデルの工学的応用に関する研究を行った。真正粘菌変形体の移動運動には,先端部分における化学反応,細胞全体で発生する収縮弛緩運動,管構造の形成という3つの現象が関わっている。それらは,互いに相互作用することによって効率的な移動を実現すると考えられているが,その数理機構は解明されていない。本年度は,生物実験で観察される領域形状に応じて管が効率的な位置に配置される現象に着目し,その数理機構を考察した。上記3つの現象を組み込んだ数理モデルを作成し,数値実験を行った結果,先端形状に応じて管の位置が決定されることが明らかとなり,生物実験データ解析からもその数理機構の妥当性が検証された。平成27年度に作成したネットワークモデルをロボットアームの制御に現れる,ある境界値問題に適用した。