hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腕神経叢損傷に対する新開発上肢ロボットを用いた画期的リハビリテーション

本3症例は後観察期である介入後フォローアップ評価を終了し、研究完了している。現在は、肋間神経移行術を施行した2症例に対して、上肢ロボットを用いた訓練を継続中である。現在までに重篤な有害事象は発生していない。本研究の目的は、腕神経叢損傷における肘関節屈曲再建術に対して、ロボットを用いた新たなリハビリテーション技術を確立することである。本目的を達成するべく、腕神経叢損傷を受傷し肘屈曲再建術(肋間神経移行術)が施行された症例に対して、術後肘屈曲筋である上腕二頭筋が筋力[1]に達した時点から、上肢ロボットを用いたバイオフィードバック訓練を実施している。肘に装着した上肢ロボットは、検知した上腕二頭筋の筋活動情報を利用して、肘関節屈曲動作を患者本人の肘を曲げようとする運動意思のタイミングと同時に肘屈曲動作をサポートすることができた。これまでの通常のバイオフィードバック装置では、上腕二頭筋の筋活動を検知しその筋活動波形を患者本人が直視し、その波形出現タイミングを習熟訓練するといったものであるが、上肢ロボット訓練では、患者自身での肘屈曲動作ができない筋力[1]の段階から実際に患者の肘関節を屈曲し得るため、術後神経回復の一助として機能している印象がある。また、肋間神経は本来呼吸支配神経であり本神経を肘関節屈曲に使用するには、中枢神経系の変換が要求されるため、実際に肘関節が屈曲することは、中枢神経系の機能転換に対してもその機能回復の一助になっているものと推察する。実際の上肢ロボットを用いた訓練回数は、2週1回程度の頻度で、筋力[3]に到達するまで、合計1034回、外来通院にて実施した。訓練1回の所要時間は、評価を含み90分程度だった。1回の訓練では、適宜、休憩を挟みながら、肘関節屈曲動作1020回を510セット実施した。現在までに5症例が上肢ロボットを用いたバイオフィードバック訓練を終了した。各々の症例では、肘屈曲筋である上腕二頭筋が筋力[4], [4], [3], [4], [3]まで順調に回復した。腕神経叢損傷肘屈曲再建術(肋間神経移行術)後の5症例に対して、上肢ロボットを用いた肘屈曲バイオフィードバック訓練を実施し、全例で重篤な有害事象なく安全に上肢ロボットを用いた訓練を実施可能だった。5症例中3症例は後観察期である介入後フォローアップ評価を終了し、研究完了している。現在は、肋間神経移行術を施行した2症例に対して、介入後フォローアップ評価を継続中である。今後は新たに3-5症例を新規対象として、今年度と同様に上肢HALを用いたバイオフィードバック訓練、評価を実施する予定である。訓練頻度は、今年度と同様に週1回2週1回の頻度とし、訓練1回につき肘関節屈曲・伸展動作を1020回、510セット実施予定とするが、疲労度を考慮し、回数、セット数を適宜、調整していく。肋間神経移行術は年間およそ35件程度であり、症例数が乏しいことが危惧され、研究が当初の計画通りに進まないことが予想されるが、引き続き当大学整形外科関連病院に通知し、術後のリハビリテーションを当院リハビリテーション科で実施できるよう症例の受け入れ体制を、整備・強化し、対応する予定である。また、今年度に実施した対象者の訓練期間中の評価結果、フォローアップ評価結果をまとめ、学会報告、論文化を行う予定である。
初期近代イギリス演劇言語の劇場空間論的観点からの分析研究

本研究は、シェイクスピア劇をはじめとする初期近代イギリス劇のせりふを劇場空間において意味を成す演劇言語と位置づけ、劇場空間論的観点から分析することにより、高度に演劇的なせりふの用例を分類して提示することにより、せりふを演劇言語として扱うための枠組みを構築した。本研究は、シェイクスピア劇をはじめとする初期近代イギリス劇のせりふを劇場空間において意味を成す演劇言語と位置づけ、劇場空間論的観点から分析することにより、高度に演劇的なせりふの用例を分類して提示するとともに、せりふを演劇言語として扱うための枠組みを構築することを目的とするものである。本年度は次のような調査および研究を行った。(1)劇テクストの分析によるデータ収集。ファクシミリで間に合うものは国内で分析し、直接オリジナル・テクストを調査する必要のあるものはBritish LibraryとFolger ShakespeareLibraryで閲覧し、調査した。(2)関連する諸研究の調査および研究。劇場、舞台、演技に関する諸研究をはじめ、演劇全般を対象とする空間論だとか、記号論や表象論なども視野に入れた調査および研究を行い、理論を構築するための基礎を築いた。(3)具体的な問題を扱った論考の作成。研究の一端をなす問題に関して論文を書き、オリジナル・ステイジングや関連諸分野の研究者たちのリヴューを求めた。また劇場空間の使い方に関する論文である"Pindarus Above"をthe 5^<th> Blackfriars Conference(Staunton, Vriginia)で発表したり、その他の学会や研究集会でも関連論文を発表を行うことにより、有益なリヴューやコメントを得て、本研究を関連分野全体の中で見直すこともできた。1.劇テクストの分析によるデータ収集。ファクシミリで間に合うものは国内で分析し、直接オリジナル・テクストを調査する必要のあるものはBritishLibraryで閲覧し調査した。現代の劇場の上演では意味を成さなくなるせりふなども収集し分析した。2.関連する諸研究の調査および研究。3.具体的な問題を扱った論考の作成。とりわけ、シェイクスピア時代の劇場空間におけるオリジナル・ステイジングの復元の観点からせりふとト書きの問題を扱う論考"Stage Directions and the Stage Spae"(The Cambridge World Shakespeare Encyclopedia,vol.1所収[CUP,2011出版予定])を書くことにより、劇場空間における物理的現実と虚構世界の事実との関係に関する様々な具体的事実を考察することができた。ファクシミリで間に合うものは国内で分析し、直接オリジナル・テクストを調査する必要のあるものはFolger Shakespeare Libraryで閲覧し調査した。現代の劇場の上演では、舞台構造が違うため、意味を成さなくなるせりふなども収集し分析した。とりわけ、シェイクスピア時代の劇場空間におけるオリジナル・ステイジングの復元の観点からせりふの問題を扱う論考「シェイクスピア劇のせりふ-劇場の現実と虚構の事実-」(「シェイクスピア-劇場・俳優・テクスト」(研究社出版、2013出版予定)を書くことにより、劇場空間における物理的現実と虚構世界の事実との関係に関する様々な具体的事実を考察することができた。
Orienting movementにおける頸運動制御の中枢機序の解析

Forel野(FFH)ニュ-ロンと頸筋運動ニュ-ロンの結合様式、FFHの頸運動における役割を調べ以下の結果を得た。FFHニュ-ロンの大部分は橋・延髄網様体に投射した。このうち約半数が上部頸髄(C1-C3)に投射し、このうち更に約20%は下部頸髄(C7)に投射した。FFHニュ-ロンは頸筋運動ニュ-ロンに直接及び橋・延髄の網様体脊髄路細胞を介して2シナプス性に興奮結合し、この結合は頭挙上筋に特異的であった。以下の頸指向運動を行うように訓練した猫のFFHにカイニン酸を微量注入しこの部の細胞のみを選択的に破壊して、運動障害を調べた。猫はperimeterの前に立つように訓練した。perimeterには水平に7個、垂直方向に12個の赤外線発光ダイオ-ド(LED)が取り付けてあり、中央のLEDが点灯すると猫はこれを注視する。中央のLEDが消え即座に他の周辺のLEDが点灯すると猫はこれに向かって頭を動かし注視する。この時の眼球運動(EOG)、頸筋筋電図、Sel spotsystemにより頭の動きを同時に記録し解析した。垂直性筋運動は頸と体幹の接合部での回転運動(neck rotaion)、atolanto-occipital joint付近での回転運動(head rotation)、おもに前肢による頭の平行運動(parallel shift)の3種類に大別された。頭の最大角速度と回転角は正の相関を示しそのslopeは10deg/sec/degであった。両側のFFHにカイニン酸を微量注入すると、両側の頭挙上筋、体幹筋の著名な活動の増大(興奮性作用)が1020時間持続した。その後、体幹筋のト-ヌスは低下し、頭は下がったままとなった。約3日後には筋ト-ヌスも正常に戻り、頭を挙上し正常な位置に保てるようになった。垂直方向への頸指向運動、saccadeは完全に消失したが水平方向の頸運動は全く正常であった。その後垂直性指向運動は主にparallel shiftで補償されたが回転運動成分は障害されたままであった。以上よりFFHが垂直頸指向運動のpremoter centerであることがわかった。Forel野(FFH)ニューロンと頚筋運動ニューロンとの結合を調べ以下の結果を得た。1.HRPを1側のC2脊髄節に注入すると同側のFFHの中・大型の細胞が選択的に標識された。2.逆行性スパイクを指標としてFFHニューロンの脊髄投射レベルを調べると、大部分(88%)はC1-C3脊髄節に終止し、C7脊髄節まで下行するものは17%であった。3.微小電流刺激により誘発される逆行性スパイクを指標としてFFHニューロンの軸索投射を調べた結果、主軸索は前索内側を下行し、軸索側枝を前角の頚運動核及びその周辺のVII-VIII層に派生していることが分った。4.頚筋運動ニューロンより細胞内記録を行いFFHの刺激効果を調べた。

小さな(約200μV)単シナプスEPSPがほぼ選択的に頭の挙上筋(BCC)に誘発され、頭の側方屈筋(SPL)にはほとんど誘発されなかった。刺激有効部位はFFHに限局していた。5.FFHに23発の反復刺激を与えると、単シナプスEPSPの外に2シナプス性EPSPが誘発された。この効果は単シナプス性EPSPと同様にBCC運動ニューロンに特異的であり、以下の6、7の理由で橋・延髄網様体脊髄路細胞(RSN)を介することが分った。6.HRPを橋・延髄網様体(PMRF)に注入するとFFHの大部分のニューロンが標識された。7.微小電流刺激法によりFFHニューロンが橋・延髄網様体(PMRF)に豊富に分枝することがわかった。FFHを刺激するとPMRFのRSNに高頻度に単シナプスEPSPが記録された。この結合は、spike triggered averaging法で確認された。PMRFのRSNが頚筋運動ニューロンと直接結合することをすでに明らかにしているので、上記の2シナプスEPSPはRSNを介すると考えられる。前年度Forel野(FFH)ニュ-ロンが頚筋運動ニュ-ロンに直接及び橋・延髄の網様体脊髄路細胞を介して2シナプス性に結合することを明らかにした。この結合は頭挙上筋に特異的であった。本年度はFFHニュ-ロンの機能を調べるため頚指向運動を行うように訓練した猫のFFHにカイニン酸を微量注入しこの部の細胞のみを選択的に破壊して、運動障害を調べた。猫はperimeterの前に立つように訓練した。perimeterには水平に7個、垂直方向に12個の赤外線発光ダイオ-ド(LED)が取り付けてあり、中央のLEDが点灯すると猫はこれを注視した。中央のLEDが消え即座に他の周辺のLEDが点灯すると猫はこれに向かって頭を動かし注視する。この時の眼球運動(EOG)、頚筋筋電図、Sel spotsystemにより頭の動きを同時に記録し解析した。垂直性頚運動は頚と体幹の接合部での回転運動(neck rotation)、atolanto-occpital joint付近での回転運動(head rotation)、おもに前肢による頭の平行運動(parallel shift)の3種類に大別された。頚指向運動では頭挙上筋のburst発火、垂直方向のsaccadeは頭の動きにそれぞれ約100ms、10-20ms先行した。頭の最大角速度と回転角は正の相関を示しそのslopeは10deg/sec/degであった。両側のFFHにカイニン酸を微量注入すると、注入後10分内に両側の頭挙上筋、体幹筋の活動が増大し始め、頭、体幹は直線状になった。注入後約1日で頚、体幹筋のト-ヌスは低下し、頭は下がったままとなった。注入後3回以内に筋ト-ヌスも正常に戻り、頭を挙上し正常な位置に保てるようになった。垂直方向への頚指向運動、saccadeは完全に消失したが、水平方向の指向運動は全く正常であった。その後垂直性頚指向運動は主にparallel shiftで補償されたが、vertical saccade,head rotation,neck rotationは消失したままであった。以上よりFFHが垂直頚指向運動、特に回転運動成分のpremoter centerであることがわかった。
低酸素培養下におけるヒト歯髄幹細胞の有用性の検討

初期培養の成功率が当研究室では低く、コンタミネーションが問題となった。これらは患者から採取する際の口腔内に暴露されるといった問題点が浮き彫りになり、骨髄や体内から採取する方法より細心の注意を払うことが求められることが判明した。しかし、分離、培養に成功した場合では、多分化能は証明でき、歯髄組織から分離したこれらの多分化能を有した細胞は、これからの歯科領域での再生療法の臨床応用に対して一定の有用性があることが示唆された。現在、ヒト歯髄幹細胞の分離を行い、培養条件の最適化を行っている。現在時点では、8例からの成功率が2例となっており、この分離の成功率を挙げる条件を試験している段階である。分離した細胞を用いて低酸素下での培養と通常酸素濃度下での培養の比較を行っている段階である。増殖自体は低酸素条件の方が効率がいい傾向が示唆されている。歯髄幹細胞の分離の成功率がやや低い為、条件の最適化を精査する段階に遅れが生じている。また、分離に適した実際の患者数も少なくそれも遅れる原因になっている状態である。歯髄幹細胞を用いた、基礎的データの採取を行う。現状、抜歯した下顎第3大臼歯より分離、国立長寿医療センターより提供されている膜分取キットにて分離、培養を行っている。細菌のコンタミネーションを防ぐ手法が現在当研究室では確立途上であり、広く用いられている消毒法に改良を加えて基礎研究を行っていた。当研究室ではヒト歯髄幹細胞の分離、培養はサンプルも少ない段階であり、そのデータを増やしていくことが課題となっている。ヒト歯髄幹細胞を用いた再生療法に活用するためにもコンタミネーションをいかに防いでいくかが課題となる、採取部位が骨髄といった体内から採取可能な部位と異なり、外界と直結している口腔内では暴露しやすい為、初期培養での成功率が低くその改善を行っている。また、初期培養から3継代目の細胞を用いて、幹細胞である確認を分化、FACSにて確認を行った後、実験を行っていた。この2年間では初期培養の成功率向上にその期間のほとんどを使うことになっていた。今後、歯髄幹細胞の分離を進め、初期培養下での増殖効率の向上を目指す。分離した細胞の性質の変化(表面抗原の発現)を検討する。歯内療法学培養キット自体は研究室内に充分量在庫があった為、去年度は消耗品費用に余裕があった。今年度は、抗体等高額な消耗品を購入予定であり、費用は消化できると考えている。
災害・異常気象の頻度・不確実性の増大に対応する順応的管理・対策の経済分析

アジア諸国に焦点を当て、どの様な人々が気候変動に対して正しい認識・理解を持ち、またそうした正しい認識・理解のある人々は気候変動に対してより協力的であるのか明らかにした。欧米諸国の研究とは異なり、特に熱帯地域、バングラディッシュやフィリピンの人々は気候変動に対して正しい認識・理解を示し、且つそうした正しい認識・理解を持つ人々は気候変動対策に対してもより協力的である事が明らかになった。この結果は欧米諸国の人々を対象に行なった研究とは定性的に異なっており、気候変動対策における人々の正しい認識・理解を持つように促す事の重要性とそこから期待出来る自発的協力行動の高さを示唆している。今年度は本研究課題の二年目を迎え、気候変動・災害・異常気象等のデータを更に収集し分析した。主にアジアを中心とした国々で調査実験を行った。特に度重なるサイクロンが問題となっているバングラディッシュ沿岸地域、気候変動や温暖化が様々な形で影響を与えていると言われているインドネシア・バングラディッシュ内陸部、ネパール山間地域、フィリピンと日本で資源管理とそれに付随する農業生産に着目しデータを収集した。バングラディッシュで行ったサイクロンに対応する順応的資源農業管理に関する調査では、人々の心理的側面に着目した。特に、人々が毎回サイクロンに襲われる際に、どこまで災害対策に対し協力的であるのか、且つ順応的に行動しているかを調査した。インドネシア、バングラディッシュ内陸部とネパール山間地域では、現地の人々が気候変動に対してどのように認識し、またどのように農業生産や資源管理で対応しているのか追跡調査を行った。更に世界的な規模での気候変動の影響を分析するため、フィリピンと日本と貿易している各国の気候データ、資源、農業生産、そして貿易に関するデータを収集し、これらを用い世界の気候が温暖化した場合に、フィリピンの経済成長や貿易、そして日本の経済成長や貿易にどのような影響を与えるのか、現在分析している。一年目の研究を元にして更に二年目はより深く、気候変動と資源管理・農業生産の関連性や因果関係を分析出来ている。上記した現地研究調査とそこから得られたデータ分析により、少なくとも数篇の論文を纏める予定である。近年、気候変動により災害と異常気象の頻度上昇が増大したと言われている。本研究は、そうした変化に対し、農業や資源等に焦点を当てつつ、どのような対策を順応的にとっていくべきか、を分析し明らかにしていく。その第一段階として平成24年度では実際にそうした事が実際に起こっているのか、そして起こっているのならば人々がどのような認識を持ち、なんらかの対応をとっているのかを分析する事に注力した。特に、そうした気候変動による影響がより顕著である地域を選定し、日毎の気候データ、特に気温と降雨量を収集した。また同時にその選定地域に居住する人々に対して家計調査を行い、各家計の教育レベル、収入、家族構成、職業等を含む社会経済的なデータ、そして彼らの気候変動に対する認知について様々な側面から質問をして定性的なデータも収集した。その認知に関する定性的なデータというのは例えば「この地域において降雨量がここ25年間に上昇・減少しているか、もしくは変化していないか」という様な質問をし、それに対する答えを統計的に処理しているデータである。こうしたデータを収集する事で、統計学的に人々がどれだけ気候の変化に対して正しい認識を持っているのかを明らかに出来る。こうした気候データの収集と家計調査は、今までの所、ネパールとバングラディッシュで既に実施されている。特にバングラディッシュのデータに関しては統計的な分析も終了しており、既に論文として国際学術誌に投稿済みである。また、今年度もこうした気候データと家計調査を行っていく予定である。気候変動に関するデータを集積し、災害や異常気象の頻度と不確実性が増大しているのか、最終年度において多くのアジアを対象として分析を行った。その中で日本以外のアジアの国々の人々は気候変動、引いては災害や異常気象に対して鋭敏であり、且つ正しい認識を持っている事を明らかにした([1])。また、expertとnon-expertに分けて聞き取り調査を行う事で、その両者の認識にあまり違いが無い事等も明らかにした。つまり、本研究課題での一つの成果は、東南アジア、南アジア諸国、特に論文として纏められたバングラディシュ、ネパール、フィリピン、インドネシア等の発展途上国の人々は気候変動に対してある程度の正しい認識を持ち、且つその危機意識も高い、と云う事を明らかにした事である。これは、欧米諸国の人々の持つ気候変動に対する懐疑的認識とは一線を画している。更に、本研究課題は気候変動、災害、そして異常気象等に対して正しい認識を持つ人々は災害対策・資源管理に対して協力的であるか否か、分析を行った。この分析も上記したアジア各国を対象にして実施した。その結果、気候変動に対して正しい認識を持っている人の方が、災害対策や資源管理に対して協力的である事を明らかにした。この分析結果も数篇の論文として纏められており、現在査読付き学術誌に投稿中である。

また、現在、これまでの研究成果を総合的に国際比較する研究も新たに開始しており、更なる発展が期待出来る。環境経済学アジアを中心とする様々な国で研究費を有効に活用しデータ収集が順調に進んでいる。また今までの所、その結果も興味深いものが多く、最終的には日本との比較検討等が可能となり更なる発展が見込まれる為。初年度の研究計画に基づき、ほぼ予定していた研究工程を順を追って完了出来ている。最終年度ではこれまで収集したデータを元にシナリオ分析をする予定である。つまり、どのような対策を講じる事でどの程度経済的に良い影響がもたらされるのか、数理モデル、統計・計量経済分析を応用し明らかにしていく予定である。気候、災害、それらに付随する不確実性も考慮し、人々の行動がどの様なものに影響を受け、どの様な要因がどの様に認識や行動に影響を与えるのかも更に分析を進める予定である。また、纏めとして気候変動やその不確実性に関する日本とアジアの人々の認識・行動と経済的影響の違い等に関しても比較検討を進めて行く予定である。研究計画に基づき、気候変動とそれに対する人々の認知だけでなく、更に気候変動に付随する災害や異常気象に関する考察を更に進める予定である。特に、認知を正しく保持している人とそうでない人とでは、気候変動とそれに付随している災害と異常気象に対する対応策に差が存在するのか、またそうした対応策を講じる上でどこまで協力的であるのか、等の課題を明らかにしていく予定である。そうする事で、経済学的な視点から更に一歩進んだ形で、異常気象と災害に関する対応策について分析を深めていく。現地調査を行う時期が現地の政治不安等によりずれ込んだ事。そして、自身の息子の大病等、様々な事情により当初の計画が履行出来なくなったため。最終年度は現地調査の仕上げの追跡調査、及び研究の纏め、その為の研究打ち合わせと旅費、また論文校正等に、主に研究の仕上げに必要な諸経費が研究費の主な使用目的になる。天災・異常気象に対して専門知識と幅広い経験を持つexpertとそうした知識と経験は持たないものの対象となる天災・異常気象を被害者として経験したnon-expertを被験者とし、Expertとnon-expertの各々に対しサーベイを行う(小谷・馬奈木、研究助手の雇用とその謝金)。このサーベイの目的は二つある。一つは、expertとnon-expertの両被験者に対し、実際にある特定事例の天災・異常気象がどの程度の頻度で起こっていると認知しているのか、そしてそれらが現実のデータとどこまで整合性があるか解析を行うことである。こうすることでexpertとnon-expertが正しい認知に基づいて天災や異常気象に対し対策や被害をどう考えていのか、が明らかとなり、最適な対策を考える際の重要な情報として利用できる。もう一つめの目的は、貨幣価値や経済価値に変換する事が難しいとされる資源環境・心理的損害をこのサーベイを通して突き止めることである。
人道的目的レーダのコロンビア現地展開のためのアンテナ工学的アプローチ

地中レーダと金属探知機を複合した地雷検知用「デュアルセンサ」ALISを利用し、コロンビア国立大学と協同し、レーダデータの効率的な取得法とCS法に代表される新しいレーダ画像再構成アルゴリズムを利用した近距離合成開口レーダの信号処理理論を発展させる。また媒質との相互作用を考慮したレーダ計測のため、土壌の性状評価手法と空間分布の統計的モデリングを提案し、その知見に基づき地雷検知センサ評価用のテストサイトを現地に設置する。地雷原とテストサイトで取得したデータを利用し検知対象に適合的なレーダ信号処理法を開発し、コロンビアで人道的地雷除去を実践によりODAによる本格的な導入を学術的に支援する。
糖転移酵素を用いた糖鎖の構造特異的分解反応の検討と応用

本研究では、糖転移酵素群の高い基質特異性・反応特異性に着目し、その逆反応に基づいた糖鎖の特異的分解反応を解析、至適化し色々な用途に応用するための基礎的な検討を行うことが目的である。主として、α1,6フコース転移酵素をモデルとして、どのように反応の平衡をシフトさせ効率よく逆反応を進行させればよいかを検討した。糖鎖は糖転移酵素群の高い基質特異性によって生合成される。本研究は、糖転移酵素による糖転移反応の逆反応に基づいた構造特異的分解を検討すること、またこのような逆反応を糖鎖構造の決定に利用することが目的である。すなわち、試験管内で糖鎖生合成を逆行させるという逐次分解法を検討し、新たな構造解析のベースとなりうるような糖鎖の高特異性逐次分解反応を確立する。平成24年度は前年度から引き続きGDP-フコースの分解系の至適条件の検討を行うとともに、逆反応の化学量論を再検討すること、本来の基質であるN型糖鎖以外のオリゴ糖を基質にしたフコシル化糖鎖の作製とそれを用いたより扱いやすい逆反応系の検討も併せて行っているところである。本研究は、糖転移酵素による特異性の高い糖転移反応の逆反応に基づいた構造特異的分解を検討すること、またこのような逆反応を糖鎖構造の決定に利用することが目的である。糖タンパク質のアスパラギン結合型(N型糖鎖)のコア構造の形成に関与するα1,6フコース転移酵素(FUT8)によって触媒される反応をモデルとして研究を行なってきた。逆反応によるフコース残基除去はすでに確認出来ており、この可逆的反応の平衡をどのようにコントロールし効率よく単糖除去を行うかを検討してきた。平衡をシフトさせるため生成物を系から取り除くため、前年度までは大腸菌の加水分解酵素によるGDP-フコースの分解とさらにフコースの還元を組み合わせた反応を共役させた反応系を検討してきた。これらの反応系を加えることで確かに糖転移酵素反応の逆反応が促進されることは観察されたが、平衡の大きなシフトあるいはそれによる反応効率の増加までには至らなかった。これについてはなお条件の検討が必要であるが、その一方で別の分解系を用いた検討も並行して開始した。大腸菌yffH、GDP-mannoseをGMPとマンノース1リン酸に分解する酵素であるが、これを発現させGDP-fucose分解する反応系を共役させた場合の効果を検討しているところである。この酵素は先に検討した系に比べて分子活性が約200倍であり、より効率よく平衡をシフトさせる、あるいは逆反応と共役することによってフコース除去の効率を上げることが期待される。平成23年度は、糖タンパク質のアスパラギン結合型(N型糖鎖)のコア構造の形成に関与するα1,6フコース転移酵素(FUT8)について、逆反応を有利に進めるため逆反応生成物であるGDP-フコースを分解する系についての検討を行った。GDP-フコースの加水分解活性をもつと報告されている大腸菌GDP-mannose mannosyl hydrolase (GDPMH)をpET28ベクターを用いてT7プロモーター制御化で大腸菌BL21(DE3)に株を用いて発現させた。誘導後細胞を回収し電気泳動によって組換えタンパク質を確認したところ、全タンパク質の20-30%の高レベルで発現させられることがわかった。pLys株でも同様の検討を行ったが発現量にほとんど差はなかった。ニッケルキレートクロマトグラフィーにより組換えタンパク質を精製してみると、300 mLの培養スケールからほぼ均一なタンパク質を50 mg得ることが出来た。これを用いてFUT8によるフコシル化糖鎖からのフコース除去反応に及ぼす効果を検討した。その結果、フコースの除去率は確かに上がっていることが確認された。しかし、現在のところ、合成-分解の平衡が顕著に分解側へシフトしたという結果は確認出来ていないのでこの点をさらに定量的に評価するとともに、平衡に影響を与える要因についてさらなる検討を行う必要があると考えている。昨年度までの結果をさらに進展させるために、組換え酵素が大量に調整しさらに検討を進めている。今のところ、満足出来るレベルで十分に糖の除去反応を進行させることが出来ていない。そのため、他の基質を用いた反応系も視野にいれ、とくに我々がこれまでに明らかにしてきたキトオリゴ糖を基質として用いた反応系についても同様の検討を始めている。こちらの系を用いることにより、糖転移酵素逆反応を用いたいわゆる糖の除去を定量的に進行させる条件の設定を検討しやすくなる可能性がある。当初予定していた検討はほぼ順調に行うことが出来た。

実験結果としてはポジティブではあったものの、効果的な反応を実現するためにはまだ検討の余地は残されている。引き続き、糖ヌクレオチドの分解系の活性に至適な条件を検討するとともに、上記のような他のオリゴ糖を用いた反応系についても検討を行い、どのような要因(オリゴ糖基質の性質、ヌクレオチド、糖ヌクレオチド、pH、基質濃度、酵素濃度等)が大きく影響するのかを系統的に検討し、条件を至適化していく。また、同時に他の糖転移酵素あるいはオリゴ糖に適用し、その汎用性についても明らかにしていきたい。検討・解決すべき点としては、糖転移酵素活性の至適条件と糖ヌクレオチド加水分解酵素の至適条件がかなり異なること、また後者に必須な2価金属イオンとヌクレオチドのキレート効果がどのように影響を及ぼしているか、などいくつかすでに上がっており、酵素のエンジニアリングも含めてさらに検討していく予定である。平成24年度は、結果的に学会発表が近場であったため旅費がほとんど必要なかったこと、研究自体が多少膠着した時期があったため研究費を次年度に持ち越すことになった。この研究費分については、使用時期が多少ずれてしまったが、最終年度である平成25年度の研究の進展のために充てることになる。使用目的としては、当初の計画どおり主として消耗品に使用するが、いくつか予定している論文発表(校正、出版)の費用にも適切な額を充てる。当初の計画通り主として消耗品に使用し、機器や高額物品への使用予定はない。また、研究の進展に応じて、学会発表旅費および論文校正等の費用にも一部使用する。
細胞マルチポラリティのパターン形成の数理モデリング解析

本年度は、細胞性粘菌の細胞極性の反応拡散方程式モデル、およびそれを簡単化した2変数モデルの数値的解析を行った。前者については、これまでの空間1次元・周期境界条件を、空間2次元(平面)に拡張し、スポットパターンと進行波パターンの数値的な再現を試みた。グリッドが粗い場合、数値誤差の蓄積により、理論モデルとのずれが生じるが、グリッドサイズを小さくして計算量を増やすことにより、一貫した結果を得ることが可能であった。後者については、興奮系にゆらぎの項を取り入れた2変数の偏微分方程式系を検討した。この系の解析によって、細胞極性のシグナルに興奮系をもつことの意義がより明らかになると考えられる。細胞極性に関しては、分子レベルのプロセスに基づいた分子生物学的研究のみならず、ソフトマター物理学の考え方に基づいて本質を大胆に捨象した、生物物理学的な研究の進展がめざましく、その成果を数理モデルに取り入れるため、文献の検討を同時に進めている。また、9月に札幌で偏微分方程式に関するシンポジウムに参加し、反応拡散方程式にとどまらず、様々なタイプの偏微分方程式に対する、主に関数解析の観点からの数学的解析手法について学ぶことができ、自身の研究対象に対するその適用の検討を開始した。細胞極性の反応拡散方程式モデルを質量保存反応拡散系の摂動とみなすというアイディアを現在数値実験で検証しつつあるが、関数解析の理論はその数学的な正当化に役立つと考えられる。数値計算および理論解析の両面から研究を進めている。現象の把握を進めるため、数値計算を先行させている。ほぼ質量保存反応拡散系のアイディアについて、理論解析にもつながる進展があった。空間2次元での数値解析については計算量の増大に伴う困難が生じているが、今後スピードアップを図る。今後、数値実験で確認されている複極性の現象の解明に迫る。次の2方面から行う。まず、より数学的に扱いやすい空間1次元系での、細胞の大きさなどの別のパラメータを分岐パラメータとした分岐解析を進める。さらに、空間2次元での分岐解析を、数値計算と並行して進めていく。最終的には細胞膜を模した閉曲面上での分岐解析が行えることが目標である。昨年度末にマシンを増強したので、計算処理速度の向上が期待される。また、成果の論文化に向けて、数理生物学、応用数学の関連学会での発表を行い、フィードバックを得る。共同研究者との連絡を密にする。次の2方面から行う。
超電導量子干渉装置を用いた嚥下中枢の研究

超伝導量子干渉装置(SQUID : super-conductive quantum interferece device)により、中枢神経活動に伴って発生する微弱な磁気を非侵襲的に記録し、神経活動の部位をミリ単位で同定することができる。嚥下障害は生活の質(quality of life)を大きく低下させるだけでなく、患者の早期の社会復帰や自立を妨げる大きな要因となっている。しかし過去の研究の多くは動物での脳幹嚥下中枢より末梢に関してであり、嚥下障害の原因の大多数を占める脳梗塞や脳出血で侵される大脳皮質の嚥下に対する機能はほとんど知られておらず、有効な臨床診断と治療が未発達である。最近では脳波やfMRI、PETなどの検査法も開発されているが、いずれの方法も嚥下の研究には空間的、時間的分解能が十分でない。今回の研究では、これまで進めてきた独創的な手法を用いて、臨床検査を視野におきつつ、SQUIDの持つ高い感度と空間的時間的分解能により嚥下に果たす大脳の役割を解析した。今回、正常被験者6名の甲状舌骨筋より咽頭期嚥下の指標として筋電図を記録し、随意的な繰り返し嚥下運動中に中枢で誘発される磁気を加算記録することができた。この結果、甲状舌骨筋の活動に数十ミリ秒先行して大脳皮質弁蓋部および島皮質に神経活動を同定することに成功した。この部位は味覚に関与している部位の前方にあたる。このことから嚥下の口腔期に大脳弁蓋部および島皮質に発生する中枢神経活動が咽頭期嚥下を惹起するメカニズムに関与すると考えられる。研究の概要脳磁気とは超電導量子干渉装置(SQUID、Super-conductive Quantum Interference Device)を用いて中枢神経活動に伴って発生する微弱な時期を記録し、神経活動の部位や様式を解析する手法である。その時間分解能は約3ミリであり、時間分解能は1ミリ秒以下と高い制度を持っている。研究代表者はこれまでSQUIDを用いて聴覚、体性感覚そして味覚刺激に対する大脳皮質の機能マッピングを開発してきた。医療の高度化と高齢化が進む現在、脳血管障害のため救命しても嚥下障害が残存し、QOL(生活の質)が低下することによって社会復帰や自立の妨げとなる場合が多い。また脳血管障害で救命できる症例の多くがこのような大脳病変による仮性球麻痺による嚥下障害を示している。しかし、今まで脳幹に存在する嚥下中枢をコントロールする上位脳の制御機構については殆ど知見が無い。今回の研究では嚥下運動遂行時の大脳皮質活動を記録し、大脳皮質が嚥下中枢に対しどのような制御を行っているか、そのメカニズムの解明することを目的とする。このために、嚥下に対する味覚溶液供給装置、嚥下のトリガーとしての舌骨上筋群活動を記録する装置、それにより脳磁気を加算し、解析、表示するソフトウェアおよびハードウェアを開発する。さらに、この手法によって嚥下障害の診断法の確立と臨床応用をめざす。研究の実績正常被験者5名の頸部舌骨上筋群より筋電図を記録し、自律的なジュースによる嚥下運動中に中枢で誘発される磁気を加算記録した。この結果、舌骨上筋群の活動に数十ミリ秒先行して、大脳弁蓋部および島部に活動を同定することに成功した。この部位は味覚に関係しているとされる部位の前方にあたる。このことから、嚥下口腔期に大脳弁蓋部および島部に発生する中枢活動が嚥下運動を惹起するメカニズムに関与していると考えられる。研究の概要脳磁気は超電導量子干渉装置(SQUID、Super-conductive Quantum Interference Device)を用いて中枢神経活動の部位や様式を解析する手法である。

医療の高度化と高齢化が進む現在、脳血管障害のため救命しても嚥下障害が残存し、QOL(生活の質)が低下することによって社会復帰や自立の妨げとなる場合が多い。しかし、今まで脳幹に存在する嚥下中枢をコントロールする上位脳の制御機構については殆ど知見が無い。今回の研究では、嚥下運動遂行時の大脳皮質活動を記録し、大脳皮質が嚥下中枢に対しどのような制御を行っているか、そのメカニズムの解明することを目的とした。研究の実績正常被験者5名の頸部舌骨上筋群より筋電図を記録し、自律的なジュースによる嚥下運動中に中枢で誘発される磁気を加算記録した。この結果、舌骨上筋群の活動に数十ミリ秒先行して、大脳弁蓋部および島部に活動を同定することに成功した。また、正常成人6名について、自発的少量水嚥下字の脳磁気活動を計測し、その電流源を同様に大脳弁蓋部に同定した。また、この活動は咽頭粘膜を麻酔することで消失した。大脳弁蓋部は味覚に関係しているとされる部位の前方にあることから、嚥下口腔期に大脳弁蓋部および島部に発生する中枢活動が嚥下運動を惹起するメカニズムに関与していると考えられる。過年度までの研究に加え、正常被検者6名より咽頭期嚥下の活動開始に約100msec先行して始まり約50msec前にピークを示すcurrent dipoleを皮質運動野最下部付近,弁蓋部および近傍の島皮質に同定することができた。また、この皮質活動の咽喉頭粘膜表面麻酔によるdipoleの変化から皮質嚥下領野の活動は咽頭期嚥下の惹起性に多大な影響を及ぼすものと考えられた。この部位は味覚に関与する皮質領野の前方に位置する。このことから、嚥下口腔期に大脳弁外部および島皮質に発生する中枢活動が咽頭期の嚥下運動を惹起するメカニズムに関与すると考えられる。これらの結果を踏まえ、本年度は嚥下困難症例2例についても同様の検査を行った。症例を対象に随意的に開始した少量水嚥下時の脳磁気活動を37チャンネルSQUIDを用いて記録し、32回の嚥下時の脳磁信号を加算平均する。加算平均のためのトリガー信号は、甲状舌骨筋の筋電図活動を全波整流した後、時定数0.1secで積分し、スライサーを用いて咽頭期嚥下の活動開始を検出した。甲状舌骨筋の活動開始時を時刻0として加算平均した各チャンネルの脳磁気信号を解析し、咽頭期嚥下に先行して脳内に発生する電流双極子(current dipole)を時間-空間的に同定した。解剖学的部位の同定には別に記録したMRI画像に3次元的に双極子記録をsuperimposeすることにより各被検者の嚥下の皮質領野を空間的に同定した。これまでに記録した正常者の嚥下に関与する双極子の時間的・空間的関係を嚥下障害者患者、特に脳血管障害による嚥下障害症例と比較した結果、皮質弁蓋部および島皮質でのdipole出現より咽頭期嚥下の開始までの時間が延長し、咽頭期嚥下の惹起が遅延することが明らかとなった。
認知心理学成果を組み込んだストループ検査の現代化

ストループ効果はもともとStroop (1935)が行った研究に基づくが、最近、認知心理学、特に注意研究において重要な課題になっているが、臨床研究において、現代の認知心理学の動きを反映したものにすることが求められている。本研究では、以下の事柄を研究した。1,課題のコンピュータによる洗練化、タブレット装置等2.マニュアル反応による認知神経科学的研究、3.マニュアル反応における熟練技能、タイピングの自動化の研究、4.大学生と高齢者による認知コントロール機能の比較。総じて、マニュアル反応で反応傾向の一貫性が欠如しており、臨床場面への応用のためには、さらに詳しい実験研究が必要である。最近の認知心理学における認知コントロールの動向は著しく進歩している。これに対して、臨床心理学で検査法として使用されているストループ課題は、認知心理学の現代の水準の内容に比べるとかなり遅れていると言わなければならない。本研究では、現代の認知心理学実験で行われている水準に追いつくのが目的である。我々は3つの研究を行うことにした。今年度はそのうち、2つに研究を絞った。ひとつはストループ検査法に音声認識技術を適応することによって、音声反応による集団検査法を実現することである。もう一つは、タブレットを使った実験を行うことによって、認知心理学で行われている課題切り換えや、ストループ課題の変換説の検証を行うことである。今回の音声認識による識別は、当初はもっと高いと期待した。しかし、予想外に低く、87%から90%の認識率しか得られなかった。「あか」と「あお」という音声の識別が特に低かった。そこで、さらに高い認識率を目指して継続して検討中である。タブレットを使った実験で得られたのは、共同研究者が開発した集団式ストループ検査法で得られた逆ストループ効果が、検査法の中に課題切り換え場面が含まれている可能性であった。この内容は、2013年に札幌で開催された日本心理学会第77回大会で本研究の代表者と箱田教授が企画したシンポジウムの中で、当時大学院生だった芦高勇気学生が発表した「逆ストループ効果の発生メカニズム臨床検査法の認知心理学からの検討」のなかで触れたとおりである。臨床検査法に、最新の認知心理学の成果を組み込むことは現代とくに日本の状況で必須になっている。例えばコンフリクト課題としてのストループ課題に関して、最近認知心理学の実験場面で行われている「課題切り替え」「ネガティブプライミング」「比率一致性効果」「コンフリクト適応効果」の成果を臨床場面の検査法に組み込むために、ノートコンピュータを用いた簡便な検査法を開発する。コンフリクト課題としてのストループ課題は、実験室場面では精密な実験が行われており、各試行ごとの反応時間とエラーを捉えることがごく普通に行われている。しかし、臨床検査法としては未だにトータルの反応時間を使った紙ベースの検査が行われている。本研究では、検査法を開発するために、情報工学の専門家が加わるとともに、簡便な検査法を開発してきた研究者が分担者になり、その検査法の有効性をチェックする。今年度は、ストループ検査法の音声反応バージョンとして、集団検査が可能な音声認識技術を組み込んだストループ検査の集団バージョンの開発を行った。認識率は95%以上であり、有効性を確認した。この検査法とタブレット型の検査法との関連性についても検討を行った。さらに、最近継時的な試行間の効果として、コンフリクト適応効果が盛んに研究されており、そのときのワーキングメモリーの容量との関係として、ワーキングメモリー容量の低い高齢者を参加者として用いたときに、コンフリクト適応効果が得やすいという結果が得られるだろうという予想のもとに、高齢者に対して実験を行い、この仮説からの予想通りの成果を得た。ストループ検査は臨床場面で行動を指標とした検査法として広く使用されているが、臨床検査法として歴史が古く、現代の実験心理学特に認知心理学の進歩に必ずしも対応しているとは言えなかった。本研究では、現代の認知心理学の動きに対応した方向でこの検査を現代化することを目的に研究をおこなった。最初に音声認識技術を取り入れたストループ検査法の自動化について研究を行った。ストループ検査では一般に人間が行うエラーが少なく、約1%だといわれている。これに対して、コンピュータの音声の判定誤差はほぼ1%あり、完全に自動化するのが困難な状況であることが、研究の積み重ねによってわかった。コンピュータの場合、どこでエラーを発するかが特定できない。ストループ検査のもう一つの展開は、研究分担者の箱田が行ってきたクロスマッチング法によるマニュアル反応ストループである。こちらは、認知心理学で広く用いられている実験法としてのマニュアル(ボタン押し)反応であり、ボカール反応では得られない逆ストループ効果が得られる結果が広く得られている。多くの実験を使って、この場面に仮題切り替えが含まれていることを確かめた。高齢者の認知機能との比較においては、前後関係で得られるコンフリクト適応効果は、高齢者の方で得られ、学生では得られない。コンフリクト適応効果が、認知機能を指していると考えると、高齢者の方が認知機能が高いという結果を示しており、コンフリクト適応効果が、コンフリクト解決の効果であるのかどうかという問題が発生した。このことは、この効果が、通常マニュアル反応(ボタン押し反応)で得られやすく、ボーカル反応では得られていないという結果とともに、反応モダリティの問題を喚起することとなった。

本研究では、以下の事柄を研究した。1,課題のコンピュータによる洗練化、タブレット装置等2.マニュアル反応による認知神経科学的研究、3.マニュアル反応における熟練技能、タイピングの自動化の研究、4.大学生と高齢者による認知コントロール機能の比較。総じて、マニュアル反応で反応傾向の一貫性が欠如しており、臨床場面への応用のためには、さらに詳しい実験研究が必要である。音声認識技術を使用したストループ検査法の開発が終わり、評価を行った。ほぼ満足できる水準に達していた。特に、参加者によっては100%認識できる場合があった。タブレット型PCの検査法についても開発がおわり、その検査法に含まれる「課題切り替え」機能についての認知心理学的検討について、当初の目的を達成した。認知コントロールについて国際ジャーナルに研究を発表した。臨床アセスメントストループ検査の音声認識バージョンは完成した。現在認知コントロールで問題となっている課題切り替え機能とコンフリクトとの関係を調べるための実験を行う。高齢者データの追加分のデータをとり、高齢者でコンフリクト適応効果がむしろ高いという結果の原因を探り、ワーキングメモリーとコンフリクト適応効果との関係について検討を行う。コンフリクト適応効果(試行間の関係)が高齢者で高く、ストループ干渉量が高齢者で低いという結果は、コンフリクト適応効果がコントロール機能を表していると考えると、直感的に矛盾しているため、それを解決できるための実験を行う。二つの研究のうち、音声認識の技術が予想外に低かった。実際に予算的に基盤研究(C)のため、研究に予想以上に予算が必要だったことが関係している。従って、本年度も引き続き研究を行う。タブレットに関する研究は、当初に予定していた計画以上に進んでいる。従って、二つの研究の進行具合は、一つの研究が遅れ、もう一つの研究が進んでいるので、プラス・マイナスし、このように評価した。昨年度分担金を回すことができなかった。今年度は、分担研究者に研究費を回し、特に高齢者を対象にしたストループ課題の実施と、課題切り替えとストループ課題との関係について詳しく調べる。音声認識の実験については、認識がもっとも容易な色名単語を使って、100%認識ができる水準を目指して検討中である。おそらく今年度の早期に終了できる見込みである。またタブレットPCの実験については、さらに多くの実験を行い、国際ジャーナルに投稿できる水準を目指す予定である。分担金と謝金に使用する。音声認識実験の進行が思いの外、認識率が悪かった。今年度も継続して行う予定である。ただし、今年度の早い段階で終了する予定である。実験に必要な実験参加者の謝礼やデータ集計のための謝金に使用する予定である。
ハイパワー・インセンティブに基づく人間主体の生産システム

本研究では、見込生産と受注生産の両生産形態の下で、市場の多様化なニーズに迅速にかつ経済的に対処することを狙いとし、製品の形状、寸法、製造方法などの類似性に基づくグループ生産と労働者の希望労働時間を重視したフレキシブル労働時間制の下で、生産と販売の両部門の裁量労働制を導入し、労働の成果を評価し応分の報酬を与えることによって、企業の収益増大と労働者への高い報酬を実現する最適なインセンティブ設計問題について定式化し理論解析を行なった。企業の高収益性と労働者の満足度を同時達成させるインセンティブ機構の設計に当り、本研究ではプリンシパル・エイジェンシー理論を用いて、生産能力増大に励む生産部門での努力と潜在的な市場需要の開拓をに励む販売部門での需要量拡大努力の相乗効果が生みだす生産実績を労働者の努力水準に応じて成果配分ルールを最適に決める。詳細には、生産現場における完全情報を有する各セル内の労働者は、生産準備のための段取りやセル内の運搬時間の短縮、残業時間の設定、希望労働時間の延長などによる生産可能時間の増大に権限と裁量性を与え、生産量増大のために励む。また、販売部門の労働者は、独自の類似製品を専門的な製品知識や顧客情報に基づいて製品需要品の拡大に励む。その結果としてもたらされる成果は、生産量増大のために投入した努力水準と不確実的な環境要素によって事前に決められた最適な成果配分ルールに従って、企業と生産・販売部門の両労働者の三者に配分される。これによって、多様な価値観をもった優秀な人材は生産システムと融合化され、長期間安定した職場を与えることができると共に、企業は状況変化にフレキシブルかつ経済的に適応しつつ適正利益を確保できる競争優位を占める人間主体のフレキシブルな生産システムの枠組が解明された。
内分泌かく乱物質の次世代影響とゲノムインプリンティング

本研究では,内分泌かく乱物質であるBisA曝露を多世代にわたって行った線虫受精卵のヒストンH3のメチル化およびアセチル化修飾状況を定量的に解析することに成功した.線虫は,BisA曝露で経世代的に産卵数が減少することを報告しているが,本研究の結果から,その際に受精卵中の細胞において特異的なヒストンH3Lys4のジメチル化修飾体,Lys9のアセチル化修飾体が減少していることが分かった.このことは,内分泌かく乱物質の経世代的な影響はエピジェネティックな修飾として次世代の受精卵に受け継がれる可能性が高いことを示すものである.本研究では,内分泌かく乱物質であるBisA曝露を多世代にわたって行った線虫受精卵のヒストンH3のメチル化およびアセチル化修飾状況を定量的に解析することに成功した.線虫は,BisA曝露で経世代的に産卵数が減少することを報告しているが,本研究の結果から,その際に受精卵中の細胞において特異的なヒストンH3Lys4のジメチル化修飾体,Lys9のアセチル化修飾体が減少していることが分かった.このことは,内分泌かく乱物質の経世代的な影響はエピジェネティックな修飾として次世代の受精卵に受け継がれる可能性が高いことを示すものである.本研究課題では,内分泌かく乱物質暴露によるエピジェネティックなゲノムの修飾状態の変化を明らかにすることを目的にした.研究を開始するにあたって,DNAメチル化レベルの定量変化をターゲットとしたが,線虫はDNAメチラーゼ酵素が働いていないことから,ヒストン修飾を新たなターゲットにすることにした.実験系を変更するにあたり,今年度はヒストンの調製方法および検出方法についての検討に重点を置いた.ヒストン修飾はヒストン分子種中の特異的な位置にあるアミノ酸のモノ,ジ,トリメチル化,アセチル化の状況を調査する必要がある.そこで,それぞれの修飾に特異的な抗体を使用することとした.ヒストンH3のLys4および9の修飾状況に注目した.コントロールおよびビスフェノールAに暴露した成虫線虫をアルカリブリーチ処理することで卵を得た.約50万個の線虫の卵を液体窒素で冷凍し,粉砕した後,タンパク質を抽出し,ヒストンH3を精製キットを用いて部分精製した.部分精製画分をSDS-PAGEサンプル緩衝液で溶解・加熱処理し,12%ゲルを用いてタンパク質を分離した後,ウエスタンブロッティングを行った.その結果.部分精製ヒストン画分に染色レベルで相当するたんぱく質バンドが得られ,抗ヒトヒストンH3用合成ペプチド抗体で単一なバンドが検出された.また,メチル化ヒストン抗体ではその検出状況は異なっていた.以上のことから,抗ヒトヒストン抗体は線虫のヒストンH3にも使用可能であることが分かった.また,ビスフェノールA暴露群においてヒストンH3の修飾状況が変化する可能性が示唆された.今年度,実験条件が確立できたので,次年度はより定量的な実験を行う.今年度は,ビスフェノールA(BisA)暴露による線虫ヒストンH3の修飾状況変化を特異的抗体によるウエスタンブロッティングによる定量的な測定を行った.0, 0.01, 0.1, 1 mMBisAに線虫を暴露し,世代ごとの産卵状況を確認しながら,3世代目まで継代培養した.各世代において成虫体内の受精卵を収集した.それら受精卵中のコアヒストンタンパク質を精製,回収し,粗コアヒストン画分を得た.一定量の各粗コアヒストン画分をSDS-PAGEで分離した後,タンパク質を膜にウエスタンブロットした.ヒストンH3およびそのLys4-モノ,ジ,トリメチル,Lys9-モノ,ジ,トリメチル,アセチル修飾状況をそれぞれに特異的なモノクローナル抗体を用いて検出した.未修飾ヒストンH3は,大量に存在し,BisA暴露で大きな量の変動は見られなかった.Lys4のメチル化修飾状況において,モノメチルは変化がなかったのに対し,ジメチルはBisA暴露によって用量依存的,経世代的に低下する傾向が見られた.Lys9の修飾状況においてはメチル化修飾の大きな変化は観察されなかったが,アセチル化修飾が0.01 mMBisA暴露の1世代目から大きく減少した.いずれのLysにおいてもトリメチル修飾は極めて少なかった.線虫の産卵数は,1 mMBisA暴露では1世代目から激減した.また,0.1 mMBisAでは,2世代目から産卵数が大幅に減少した.これらのことから,線虫受精卵中のヒストンH3は,親世代のBisA暴露で修飾状態が変化することを明らかにすることができた.特にヒストンH3のLys4のジメチルおよびLys9のアセチル化修飾はBisA暴露により,大きく変化したことから,内分泌かく乱物質はエピジェネティックな発現調節にも関わる可能性が強く示唆された.環境生物化学当初,予定していた実験内容について検討したところ,検出の可能性が低いことが分かった.そのため,今年度は新たな実験系を用いて研究を進めることとした.特異抗体を用いる必要があり,線虫タンパク質に対する抗体作成あるいは他の生物タンパク質に対する市販抗体の活用について検討する必要があった.多種類の市販抗体の特異性についての検討が中心になったことから,やや遅れる結果となった.特異抗体の反応特異性について確認でき,市販抗体の使用が可能であることが分かったため,抗体による検出系が使用できる.分析に必要な線虫の卵の量を含め,分析条件を確定できたため,実際の定量的な比較解析を急ぐこととする.当初の研究計画を変更したため,予定した通り研究の結果が得られなかった.

そのため,主に成果発表等に予定していた学会に出席するための旅費等を使用せずに,次年度繰り越しとした.今年度は,修正した計画を着実に実行するため,繰り越した金額は計画変更に伴い必要になった電気泳動および抗体等の消耗品の購入および成果発表に使用することにする.