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ＣＯＰＤ患者における肺気腫の進行抑制のための分子基盤の研究

HDAC7ノックダウン細胞では、低酸素下でのHIF-1αの核内移行が低下し、VEGF産生増加が抑制されていた。低酸素暴露によるサイトカインや蛋白分解酵素の産生増加は、HIF-1α非依存性、NF-kB p65依存性で、HDAC7ノックダウン細胞でも保たれていた。COPD患者で見られている低酸素応答の異常は、肺気腫の進行の要因のひとつとなっている可能性が示唆された。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、世界的に増加しつつある疾患であり、本疾患による社会的負荷が増大傾向にある。本疾患の進行には肺気腫の進行が重要な役割を占めている。本研究の最終目的は、肺気腫の進行を止める手段の開発である。我々は以前に、COPD患者では低酸素下でのHIF-1αとHDAC7の核内移行が対照群と比較して低下している事を発表した。HIF-1αはVEGFの転写因子であり、HIF-1αの核内移行の低下は、肺の血管床の低下、つまり肺気腫の進行に関与している可能性が考えられる。一方で低酸素は、炎症性サイトカインや蛋白分解酵素の誘導を行う事が知られている。以上より、HIF-1αの核内移行の低下しているCOPD患者においては、低酸素への適応および肺微小血管系の増殖を図る経路(hypoxia→HIF-1α経路)は抑制されているが、低酸素による炎症および蛋白分解促進の経路(hypoxia→炎症性サイトカイン産生)は保たれており、このバランスの崩れが、肺気腫の進行に関与しているという仮説を立てた。以上の研究成果の一部は、ERS Annual Congress 2013で発表した。今後、以上の結果をもとに臨床検体での確認を行う予定である。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、全世界で増加しつつある疾患であり、本疾患による社会的負荷が増大傾向にある。この研究の最終目的は、肺気腫の進行を止める手段の開発である。我々は以前に、COPD患者では低酸素に対するHIF-1αとHDAC7の核内移行が低下していることを発表した。一方で低酸素は、NF-kBの活性化を通して炎症性サイトカインや蛋白分解酵素の誘導を行うことが知られている。以上より、HIF-1αの核内移行が低下しているCOPD患者においては、低酸素への適応および肺微小血管系の増殖を図る経路(hypoxia→HIF-1α経路)は抑制されているが、低酸素による炎症および蛋白分解促進の経路(hypoxia→サイトカイン産生)は保たれており、このバランス崩壊が肺気腫の進行に関与しているとの仮説を立てた。1)低酸素によるHDAC7依存性のHIF-1αの応答ならびにVEGF産生の変化と、2)低酸素によるHDAC7非依存性のIL-8、MMP-9の産生増加を肺胞上皮様細胞株(A549細胞)を用いて検討した。A549細胞を酸素1%,二酸化炭素5%下で24時間培養し、核蛋白抽出液、胞体内蛋白抽出液、mRNAを得て各種測定を行った。その結果、低酸素暴露によりIL-8、MMP-9の産生の増加がみられ、これはHDAC7のノックダウンの影響を受けなかった。低酸素暴露によるHIF-1αの核内移行とHIF-1αのVEGFのプロモーター部位への結合は、HDAC7のノックダウンにより抑制傾向がみられた。以上のように、上記仮説の証明が進行中である。今後、A549での更なる検討と臨床検体での確認を行う予定である。我々は以前に、COPD患者では低酸素暴露下で、HIF-1αとHDAC7の核内移行が対照群と比較して低下していることを発表した。この所見と肺気腫の進行との関連を解明した。肺胞上皮様細胞株(A549細胞)を酸素1%,二酸化炭素5%下で培養した。低酸素暴露により、HIF-1αとHDAC7の両蛋白とも核内へ移行することを確認した(mRNA量は変化なし)。また、低酸素暴露により、NF-kB p65 DNA結合活性の増加とIL-8、MMP-9の産生増加とがみられた。これらはいずれもHDAC7のノックダウン(KD)の影響を受けなかったが、IKK2阻害薬で抑制がみられた。これにより、hypoxia→炎症性サイトカイン産生の経路は、NF-kBを介しており、HDAC7非依存性であると考えられた。

低酸素暴露によるHIF-1αの核内移行とVEGF産生増加は、HDAC7 KDにより抑制がみられた。以上のことから、HDAC7の核内移行が低下している患者においては、低酸素への適応および肺微小血管系の増殖を図る経路(hypoxia→HIF-1α経路)は抑制されているが、低酸素による炎症および蛋白分解促進の経路(hypoxia→炎症性サイトカイン産生)は保たれており、このバランスのくずれが、肺気腫の進行につながっている可能性を考えた。この成果は、第54回日本呼吸器学会学術講演会で発表した。さらには、実験の経過中に、HDAC7に加えて、あるAging関連蛋白がHIF-1αの核内移行に大きな役割を果たしている可能性があること発見した。現在、上記の両所見を臨床検体で確認中である。医歯薬学研究協力者の勤務する病院の診療体制の変化で、臨床検体の収集開始が遅れた。しかしその間に、健常者の血液を用い、臨床検体の解析に関するoptimisationを行った。また、患者のリクルートに関しても、システムの再構築が完了し、来月から患者のリクルートができる体制が整った。集中的に臨床検体を収集できる環境が整ったので、この遅延は今後回復できると思われる。初年度は細胞株を用いた検討を行う予定で、この結果に基づいて、次年度に臨床検体を用いた検討を予定していた。細胞株を用いた検討の90%が終了しており、現在、最終段階にある。予定通り、2013年の6月頃より、臨床検体の収集を始められるものと思われる。今後は、細胞株で証明した仮説(HDAC7の低下により生ずる、低酸素への適応および肺微小血管系の増殖を図る経路と、低酸素による炎症および蛋白分解促進の経路のバランスのくずれ)を、COPD患者から得た臨床検体を用いて明らかにしていく。現在は血液の採取と分子生物学的解析についてのoptimisationが終了したところである。来月より、患者のリクルートを開始する予定である。COPD患者および正常対象者をリクルートし、臨床データ(スパイロメトリー、6分間歩行(歩行距離と前後のSpO2)、残気量と肺拡散能の測定、胸部CT)を収集する。さらに血液を20ml採取し、血漿を得るとともにperipheral blood mononuclearcell (PBMC)を分離する。PBMCは、酸素1%,二酸化炭素5%下で24時間培養し、培養上清と細胞を回収する。培養後のPBMCからは、核蛋白抽出液、胞体内蛋白抽出液、cDNA(mRNAを逆転写したもの)を得て、-80度で一旦保存する。COPDの病態は多様である可能性があるので、100例のリクルートを行う。患者および対象群のリクルートの終了後、凍結保存してあった検体の各種の解析を行う。さらには、臨床データ(画像および呼吸機能データ)と分子生物学的解析との関連もあわせて検討していく。初年度に細胞株で証明しつつある仮説を、今後はCOPD患者から得た臨床検体を用いて証明していく。
細胞内ミトコンドリア輸送システムを利用した核酸送達キャリアの開発

本申請研究では、変異ミトコンドリアを標的とした治療戦略を確立するため、これまでに構築したミトコンドリア標的型キャリアを用いて、機能性核酸をミトコンドリアに送達し、ミトコンドリアへの核酸送達検証、機能評価を行うことを目的とした。平成28年度は、下記について研究を遂行した。ミトコンドリアDNAの変異・欠損は、ミトコンドリアの機能低下を引き起こし、ミトコンドリア病を誘発する。mtDNAのtRNA(Phe)にG625A変異を有するミトコンドリア病患者由来細胞を用いて、正常なtRNA(Phe)をミトコンドリアに補充する遺伝子治療戦略の検証を行った。はじめに、ミトコンドリアにおけるtRNA(Phe)の変異率をARMS-qPCR法を用いて算出する実験系を確立した。使用したミトコンドリア病患者由来細胞は、正常型mtDNAと変異型mtDNAが混在するヘテロプラスミー変異であり、変異率が80%程度であることを確認した。正常pre-tRNA(Phe)を搭載したミトコンドリア標的型キャリアをミトコンドリア病患者由来線維芽細胞に添加した結果、コントロール配列では変化がなかったのに対し、ミトコンドリアにおけるtRNA(Phe)の変異率が40%程度まで低下したことが示唆された。また、ミトコンドリア輸送能をもつRNA配列をpre-tRNA(Phe)に付加することにより、添加後8日目まで変異率が20%程度まで大きく低下することが示された。一方で、pre-tRNA(Phe)を導入したプラスミドDNAをリポフェクタミンを用いて核で発現させた場合には、変異率の低下がみられなかった。さらに、正常pre-tRNA(Phe)搭載ミトコンドリア標的型キャリアを添加したミトコンドリア病患者由来線維芽細胞では、コントロールと比較してミトコンドリア呼吸能が上昇することが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究では、細胞内動態を制御したミトコンドリア(Mt)標的型核酸送達システムの構築を目的とする。平成26年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。1.細胞内骨格を介してMtへ移行するキャリアの構築Mt標的型キャリア、MITO-Porterは、静電的相互作用を利用して薬物をMtに送達するが、Mt膜電位の低下した疾患細胞を標的とした際にはMt移行能が低下することが懸念された。電荷によらない送達戦略を用いたキャリアを構築するため、微小管輸送に関連するモータータンパク質、キネシンに結合するタンパク質のペプチド配列を選択し、MITO-Porterに修飾したキャリアを構築した。しかし、細胞への取り込みが非常に低かったため、細胞膜親和性を有する脂質エンベロープ膜に内封し、多重型にパッケージングすることにより、取り込み量を飛躍的に増加させることに成功した。さらに、キャリアに搭載した核酸の細胞内Mt送達量をqRT-PCRを用いて定量的に算出する評価系を構築したため、今後新しく構築したキャリアを用いた評価を遂行する。2.Mtへの核酸送達量を検証する評価系の確立Mt内への核酸送達による機能を評価するため、mtDNAにコードされた呼吸鎖複合体IVのサブユニットCOX2を標的としたアンチセンスRNAを使用した。従来のMITO-Porterを毒性の観点より改良し、ポチカチオンを用いた核酸ナノ粒子をキャリアに内封することにより、脂質投与量を10分の1に減少させることに成功した。さらに、Mt内部におけるアンチセンス効果を検証した結果、コントロール配列と比較し標的mRNA発現量の抑制、Mt膜電位の低下、ATP産生量の低下を確認した。これらの結果よりMITO-Porterを用いて核酸をMtに送達することにより、Mt内におけるアンチセンス効果が引き起こされたことが示唆された。本申請研究では、変異ミトコンドリアを標的とした治療戦略を確立するため、細胞内動態を制御したミトコンドリア標的型核酸送達システムの構築、および機能性核酸の送達によるミトコンドリア機能変化を検証することを目指す。平成27年度は、下記の項目について研究を遂行した。細胞内動態を制御した新規ミトコンドリア標的型キャリアの構築を行うため、ミトコンドリア選択的な輸送タンパク質を利用することを試みた。しかし、タンパク質精製やキャリア修飾が困難であることが問題となり、新たにミトコンドリア送達能を向上したキャリアの設計を検討している。ミトコンドリア標的型キャリアによるミトコンドリアへの核酸送達能を評価するためには、核酸による機能を評価することが必要となる。これまでに、ミトコンドリアDNAの遺伝子を標的としたアンチセンスRNAをキャリアに内封して送達することにより、アンチセンス効果が得られることが示唆されている。今年度はキャリア構築、評価系の最適化を行ったことにより、詳細なアンチセンス効果の検証を行うことを可能とした。評価の結果、標的タンパク質発現量の抑制、呼吸鎖複合体活性の低下を定量的に示すことができた。さらに、ヒト由来のマトリクス輸送配列を付加したアンチセンスRNAにおいても同様にアンチセンス効果が得られることを確認した。ミトコンドリア病患者由来細胞を用いた遺伝子治療戦略の検証を行うため、ミトコンドリアDNA変異率や詳細なミトコンドリア機能を評価するための実験系の構築を行った。

疾患細胞の遺伝子変異に基づき、機能性核酸の設計を進めており、キャリアを用いたミトコンドリア送達による機能発現を検証することを目指している。ミトコンドリア内の遺伝子を標的としたアンチセンスRNAの送達、評価には様々な障壁が存在することから、世界でも報告が数例ほどしかない。既存の知見が少ないことからも、今回得られた結果についてさらに詳細な検証が必要であると考え、MITO-Porterを用いたアンチセンスRNAの送達による機能評価を進めた。キャリア構築と評価系の最適化を行ったことにより、標的遺伝子のタンパク質、mRNA発現量抑制、呼吸鎖複合体活性等のミトコンドリア機能抑制を定量的に示すことに成功した。一方、新規ミトコンドリア標的型キャリアの構築に関しては、ミトコンドリア選択的な輸送タンパク質を利用することを試みたが、調製方法において改良が必要であることが分かった。そのため、現在新たにミトコンドリア移行性素子やポリエチレングリコールを用いてキャリアを最適化するための改善策を検討している。ミトコンドリア病患者由来細胞を用いて疾患治療の検証を行うことを目指し、変異ミトコンドリアを検証するための評価系の構築を行った。正常ミトコンドリアDNAと変異ミトコンドリアDNAが混在するヘテロプラスミー変異では、変異率が変動することによってミトコンドリア機能障害の程度が変化する。ミトコンドリアDNAの変異率を算出するため、PCR-RFLP法を用いた評価系を構築した。さらに、ミトコンドリア機能を詳細に検証するため、ミトコンドリアタンパク質発現効率や呼吸鎖複合体形成を評価するための実験系を最適化した。現在、疾患細胞の遺伝子変異に基づき、機能性核酸(RNA、DNA)の設計を進めているため、構築した評価系を用いてキャリアを用いたミトコンドリア送達による遺伝子発現、ミトコンドリア機能評価を遂行していく。本申請研究では、変異ミトコンドリアを標的とした治療戦略を確立するため、これまでに構築したミトコンドリア標的型キャリアを用いて、機能性核酸をミトコンドリアに送達し、ミトコンドリアへの核酸送達検証、機能評価を行うことを目的とした。平成28年度は、下記について研究を遂行した。ミトコンドリアDNAの変異・欠損は、ミトコンドリアの機能低下を引き起こし、ミトコンドリア病を誘発する。mtDNAのtRNA(Phe)にG625A変異を有するミトコンドリア病患者由来細胞を用いて、正常なtRNA(Phe)をミトコンドリアに補充する遺伝子治療戦略の検証を行った。はじめに、ミトコンドリアにおけるtRNA(Phe)の変異率をARMS-qPCR法を用いて算出する実験系を確立した。使用したミトコンドリア病患者由来細胞は、正常型mtDNAと変異型mtDNAが混在するヘテロプラスミー変異であり、変異率が80%程度であることを確認した。正常pre-tRNA(Phe)を搭載したミトコンドリア標的型キャリアをミトコンドリア病患者由来線維芽細胞に添加した結果、コントロール配列では変化がなかったのに対し、ミトコンドリアにおけるtRNA(Phe)の変異率が40%程度まで低下したことが示唆された。
ラマンスペクトル計測による細胞分化ダイナミクスの検出

ヒト乳癌由来培養細胞MCF-7は培地へのheregulin添加によって、乳腺細胞様に分化する。分化に伴う細胞の内部状態変動をRaman分光法により追跡した。多次元の細胞内部状態を、単一細胞かつ非破壊で検出する方法としてRaman分光法は最も適当な方法である。我々は最長12日間に及ぶスペクトル変動を解析し、主要細胞内成分がサイクルを描きながら変化していくことなどを明らかにした。生細胞のラマンスペクトル計測に基づいて、細胞状態を定義し、状態遷移則を明らかにする方法を開発し、細胞分化・増殖のダイナミクスを明らかにすることが目的である。ヒト乳ガン由来の培養細胞MCF-7は、培地へのheregulin (HRG)添加によって、脂肪滴の蓄積、アルブミン分泌など、乳腺細胞様の性質を持つ細胞へ分化する。また、epidermal growthfactor (EGF)添加によって細胞増殖が促進される。HRG, EGFによる細胞分化、増殖応答の初期過程において、細胞内物質がどのようなダイナミクスを示すのか、単一細胞ラマンスペクトルの継時変化によって解析した。単一細胞の細胞質・核内の15点において計測したラマンスペクトルの平均で議論を行う。同一細胞の平均スペクトルを15分おきに2時間計測した。無刺激時の細胞においてもスペクトルは時間と共に数10%変動し、細胞毎にも違いがある。細胞間のスペクトル変動と単一細胞の15分間の変動は同程度であり、細胞内物質組成が短時間で大きく変動していることが示された。飽和量のHRGまたはEGF添加から2時間の間では、HRGで特に変動幅が増加した。この変動幅の増加は、単一細胞の時間変化、細胞集団の分布幅両者に共通している。全細胞・全時間平均スペクトルは刺激前から変化するが、変化幅は単一細胞あるいは細胞集団の変動幅に比べると小さい。さらに24時間後から2時間の間、同様の計測を行うと、HRG(細胞分化)では大きな変動幅を保ったまま、平均値が2時間後と同じ方向に更にドリフトするが、EGF(細胞増殖)では、刺激前あるいは2時間までと同様の変動幅を保ち、平均スペクトルのドリフト幅は小さく、方向性も認められない。以上のように細胞分化と増殖の過程において、細胞内物質組成変動に明確な違いがあることが認められた。生細胞のラマンスペクトル計測に基づいて、細胞状態を定義し、状態遷移則を明らかにする方法を開発しているラマン分光法は無染色・非侵襲な多次元計測法であることから、単一細胞の時間変化を追跡できるという、他の細胞状態計測法にない優れた特徴を有している。分化過程の時系列に沿って、細胞質、細胞核のラマン分光スペクトルを取得し、ダイナミクス解析を行った。HRGによる分化は10日2週間に及ぶ過程である。HRG添加前(0日)、添加後1,3,6,12日の多数の細胞からスペクトルを取得し主成分分析を行うと、第13主成分で張る3次元空間において、0日と12日の細胞群間はほぼ完全に分離していることがわかった。また、第7主成分までで95%程度のスペクトル情報を表現できた。そこで、0日目のデータ群をモデルとしたsoft independent modeling of class analogy (SIMCA)法で分化時系列の相図を描いた。SIMCA法では、多次元スペクトルデータをモデル群との成分量差を表す横軸と、新成分の量を表す縦軸の2次元に圧縮表示できる。相図上で分化過程は行きつ戻りつし、また、中間段階で大きなばらつきを示すなど、分化過程が単調な変化でないこと、細胞間の経路あるいは速度に違いがあることなどを示唆する結果が得られた。平成23年度の研究目標は、(1)ラマン分光顕微鏡の制作、(2)細胞計測条件の検討、(3)ラマンスペクトル計測と解析法の開発の3項目であった。(1)に関しては、倒立顕微鏡型の分光顕微鏡を自作し、生細胞内の1立方マイクロメートル程度の体積から1030秒で以下の解析に足るスペクトルを得ることができている。また、1軸の光学スキャナを導入し、x-&#61548;スペクトルを得る準備ができた。(2)に関しては、単一のMCF7細胞から細胞損傷を押さえて15分間隔で時系列データが取得できることを確かめた。分化ダイナミクスの計測には十分な時間分解能である。(3)に関しては、SIMCA法で分化ダイナミクスが描けることが明らかになった他、時間変化する波数領域を鋭敏に捉えるための一般化2次元相関分光法や、細胞ごとの分化ダイナミクスを調べ、状態分岐や統合をプロットする方法を開発した。以上のように研究はおおむね順調に進行している。ここまでに得られた状態遷移ダイナミクスは、細胞集団レベルの振る舞いである。平成24年度は、単一細胞のダイナミクスを計測・解析する。

計測条件、解析法はほとんど確立しているので、実際の実験データ取得と解析が課題である。細胞状態遷移の経路、細胞間のばらつき、細胞内オルガネラ(細胞核、細胞質、細胞膜等)毎の差異等に注目して、ダイナミクス解析を行う。各々の細胞分化反応に特徴的な、あるいは両者に共通するダイナミクスを抽出する。ラマンスペクトルに基づいて、各々の細胞が分化するか否か、どの細胞腫に分化するか、いつ分化するかを予測することを目指す。MCF7細胞の分化経路では、共同研究者によって細胞集団レベルでの遺伝子変動解析が行われている。ゲノムのダイナミクスと、ラマンスペクトルのダイナミクスを比較検討して、分化経路を規定する遺伝子群推定を行う。主として、細胞培養のための器具・試薬等の消耗品、研究成果発表や情報収集のための交通費に使用する。
原生動物における光感受性イオンチャンネルの同定

原生動物の一種であるミドリゾウリムシについて、その光感受性イオンチャンネルの性質を調べた。ミドリゾウムシは、適度の光強度刺激に対しては、膜の過分極向きの電位変化をひきおこすが、強い光強度刺激では反対に膜の脱分極向きの電位変化をひきおこす。このような過分極、脱分極向きの電位変化は、それぞれ、セン毛膜と細胞体膜上にあるイオンチャンネルによって発生していることが、我々の研究によって明らかにされてきている。それぞれのイオンチャンネルの種類を知るために膜電流固定法を用いて調べると、セン毛の過分極応答はKチャンネル、細胞体の脱分極応答はCaチャンネルが開くことにより発生していることが分った。これらのチャンネルのさらに詳しい解析を行なうために膜電位固定法によって光刺激にともなう電流の解析を試みたが、S/N比がよくないために信頼性の高い結果がこれまでのところ得られていない。ひきつづきノイズレベルの小さな記録を取る試みを続ける予定である。このゾウリムシからセン毛部分のみを分離して集めることが可能である。そこで、高木(阪大、教養部)に協力していただき、セン毛のイオンチャンネルを人工膜にうめ込む方法によってイオンチャンネルの同定を試みた。そうすると単一分子レベルで、Kチャンネル開閉にともなう電流が記録された。このチャンネルが光感受性のものかどうかさらに詳しい解析を行なう予定である。これらの研究と並行して、ミドリゾウリムシの光感受性物質がロドプシンであるかどうか検討した。この細胞からレチナ-ルが抽出されたこと、またカエルロドプシン抗体と反応すること等の結果が得られたので、光感受性物質が、ゾウリムシでもロドプシンである可能性が示された。
層状半導体超薄膜の成長制御とその非線形光学応答

@試料作成はホットウォール炉を組み込んだ清浄真空槽を用い、Bil_3超薄膜結晶の育成を試みた。Cdl_2単結晶の臂開面を用いた基板と、ファンデアワールスエピタキシャル積層の結晶成長ができるとされているCaF_2単結晶の(111)劈開面の基板で、Bil_3起薄膜を成長させた。また、Cdl_2をマトリックスとしてBil_3板状結晶の種々の大きさのものを成長させた試料も準備し、得られた試料を光学測定、透過電子顕微鏡写真、および原子間力顕微鏡(AFM)により評価し、比較した。1) Cdl_2単結晶の劈開面の基板で、基板温度3550C、成長速度12A/secでは良好な単結晶と対応する吸収線幅の小さな励起子スペクトルを示し、膜厚が数十層と厚く、表面局在励子(2.lleV)、Cdl_2/Bil_3界面局在励起子(2.096eV)以外に複数の励起子ピークも現れた。Bil_3結晶1基本層厚(7A)を目指した超薄膜試料の光吸収スペクトルでは、Cdl_2をマトリックス中と同じBil_3微結晶の成長を示唆する結果が得られた。分子性励起子モデルでの解析結果から、基本層の整数倍単位で種々の膜厚のものがモザイク状に形成し、AFMによる積層状態の表面の直接観測からもミクロン単位の島状構造が確認された。電子顕微鏡による構造解析と光学測定の結果からから基板に層状結晶を用いても、Cdl_2/Bil_3の沃素の最稠密構造との整合性のため、Bil_3側に約1%の格子縮みが生じ、理想的なファンデアワールスエピタキシーではないことが解った。2)基板にCaF_2単結晶の(111)劈開面を用いると、2.02eVに新たに半値幅の小さな励起子吸収線が現れた。励起子発光は同位置に共鳴発光を示す。AFMによる観測結果はミクロン以下の島状結晶の成長が認められ、膜厚を基本層程度に薄くすると100nmの微結晶が表面に分布する。この試料の発光スペクトルの光強励起依存性を調べることを試みたが、十分な信号強度が得られなかった。一方、Cdl_2をマトリックスとした1基本層の板状結晶の非線形光学応答を調べると、励起強度に比例して成長する音響型格子と相互作用して緩和する発光帯いがいに、非線形に成長する発光帯が新たに観測された。この発光帯は微結晶中に励起された2励起子状態と考えられ、サイズが小さい微結晶では2励起子状態は安定に存在できないことが示唆された。

ホットウォール法を用いてCdI_2および、CaF_2基板上にBiI_3超薄膜を成長させた。作成試料の評価については、(1)透過型電子顕微鏡および、(2)原子間力顕微鏡による構造解析的手法と、(3)光吸収スペクトル、(4)光散乱スペクトルの光学的手法の両面から行った。また、光強励起下での半導体結晶の非線形光学応答に関する理論的研究を進めた。CdI_2基板上に成長させたBiI_3超薄膜で、厚さが一基本層の7Å以下では島状の微結晶状が成長する。また、2.5eVにはクラスター分子の存在を示唆する遷移が見られた。励起子遷移は量子サイズ効果のため、微結晶の粒径に応じて母体結晶より高エネルギーシフトを示すが、50Å程度の厚さでは2.062eVに励起子遷移が見られ、2.096eVにはCdI_2とBiI_3との界面に局在した界面励起子遷移が明瞭に現れた。(1)によるミクロな領域での構造解析からは,基板結晶のCdI_2の沃素の最密構造の間隔を反映したエピタキシャル成長のため、BiI_3のab面での格子間隔が圧縮されていることが分かった。このため励起子遷移のピークが10meVエネルギー側にシフトしていると理解された。(2)の直接観測による積層面内の均一なサイズの領域は数百Åであることが分かった。(3)から励起子遷移のピークは基板に強く依存し、CaF_2 (111)面の基板ではそれは30meV低エネルギー側に移動した。(4)の測定からこの試料では、層内の分子内振動モードと層間の分子間振動モード共ソフト化している事実から、エピタキシャル成長は沃素の最密間隔が圧縮された結果、積層方向に伸ばされており、その結果励起子遷移が低エネルギーシフトしたと考えられる。以上のようにホットウォール法による層状結晶の超薄膜の成膜の制御は可能であり、得られた試料の評価を構造と光学スペクトルの両面から検討した結果、目的の試料の作製のできることが分かった。@試料作成のためのホットウオール炉を組み込んだ清浄真空槽を一部改良し、ホットウオール法によりBiI_3超薄膜結晶の育成を行った。BiI_3結晶と同じ層状構造のCdI_2単結晶の劈開面を用いた基板以外に、ファンデアワールスエピタキシャル積層の結晶成長ができるとされているCaF_2単結晶の(111)劈開面を基板として、Bil_3超薄膜を成長させることを新たに試みた。得られた試料は光学測定、透過電子顕微鏡写真、および原子間力顕微鏡(AFM)により評価し、、以下の結果を得た。1)CdI_2単結晶の劈開面を用いた基板で、基板温度3550C、成長速度12A/secの試料が良好な単結晶と対応する吸収線幅の小さな励起子スペクトルを示すことが解った。2)成長速度から見積もってBiI_3結晶1基本層厚(7A)を目指した超薄膜試料の光吸収スペクトルでは、BiI_3微結晶成長を示唆する結果が得られた。一方、数基本層の膜厚を目指した試料では、BiI_3表面局在励起(2.11eV)、CdI_2/BiI_3界面局在励起子(2.096eV)以外に複数の励起子ピークが現れた。この結果の分子性励起子モデルでの解析結果から、基本層の整数倍単位で種々の膜厚のものがモザイク状に形成されていることが解った。実際、AFMによる積層状態の表面の直接観測からはミクロン単位の島状構造が確認された。3)電子顕微鏡による構造解析と光学測定の結果からから基板に層状結晶を用いても、CdI_2/BiI_3の沃素の最稠蜜構造との整合性のため、BiI_3側に約1%の格子縮みが生じ、理想的なファンデアワールスエピタキシ-ではないことが解った。4)基板にCaF_2単結晶の(111)劈開面を用いると、2.02eVに新たに半値幅の小さな励起子吸収線が現れた。励起子発光は同位置に共鳴発光を示す。AFMによる観測結果はミクロン以下の島状結晶の成長が認められ、膜厚を基本層程度に薄くすると100nmの微結晶が表面に分布する。
小児がん患者の遺伝子多形解析に基づくセロトニン受容体拮抗薬の適正使用に関する研究

小児の白血病の治療は長い治療期間を要すること、成人に比較して体力また予備能が低いことなどから十分な制吐管理が必須であるが、小児がんの治療に伴う悪心・嘔吐の治療ガイドラインはなく、医師の経験に基づく治療が行われているのが現状である。5-HT_3受容体拮抗薬(5-HT_3receptor antagonist, 5-HT_3RA)は、第4脳室最後野の化学物質受容体、および回腸の求心性迷走神経末端に発現するセロトニン受容体を遮断することにより制吐作用を発揮する薬剤である。5-HT3RAのひとつであるグラニセトロンは、本邦で最も使用頻度の高い薬剤であり、その効果はP-糖タンパク質(P-glycoprotein, P-gp)の遺伝子多型の影響を受けることが報告されているが、日本人における5-HT_3RAの効果に関するP-gpの遺伝子多型の検討はなされておらず、本邦において承認されている7剤の5-HT_3RAを選択する際の科学的根拠は得られていない。そこで本申請研究では、悪心・嘔吐の治療ガイドラインのない小児がん患者における制吐管理についての科学的根拠を得ることを目的とした。2012年4月1日2013年1月31日の期間に、鹿児島大学病院・小児科の入院患者のうち5-HT_3RAを処方された患者は45人であり、オンダンセトロン、またはグラニセトロンが処方されていた。小児科医が5-HT_3RAを選択する際の科学的根拠はなく、また、特定の5-HT_3RAが無効の場合に他の5-HT_3RAへ変更するなどの対応は行っていないのが現状であり、5-HT_3RAを選択する際の科学的根拠の確立が急務であることが明らかとなった。さらに、対象が小児であることを考慮すると、患者が経験している主観的な悪心や食欲不振等の症状を正確に評価・測定する方法を確立することが重要であることが明らかとなった。
シナプス可塑性における神経栄養因子の役割の欠損脳レスキュー実験による解明

神経栄養因子とその受容体がシナプスの可塑性に関与していることを示唆する報告がなされている。しかし、大脳皮質視覚野においては外因性の神経栄養因子による影響しか調べられておらず、内因性の神経栄養因子が実際にどのような役割を果たしているのかは未だ不明である。そこで、内因性の神経栄養因子の作用を検討するため次の実験を行った。1.脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子欠損マウス(生後610日齢)から大脳皮質視覚野スライス標本を作製し、II/III層の錐体細胞をホールセル・パッチクランプ法により-70mVに膜電位固定し、IV層刺激に対する興奮性後シナプス電位(EPSCs)を記録した。まず野生型とホモ欠損型において、シナプス前細胞の開口放出に差があるかを検討するためペアドパルス解析法を行った。その結果、ホモ欠損型では野生型に対して有意に開口放出確率が高かった。2.次に長期抑圧(LTD)を誘発する刺激を与えて、野生型とホモ欠損型との評価を行った。その結果、野生型ではLTDが生じなかったのに対し、ホモ欠損型では有意にLTDが生じた。1の結果を考慮すると、内因性のBDNFを欠損させた場合、開口放出確率が高いためにシナプス長期抑圧が生じやすくなったと考えられる。3.2の実験結果が、本当に内因性のBDNFを欠損させたことによる結果なのかを検討するため、今度はBDNFを補ってやるレスキュー実験を行った。記録外液にBDNFを加えて終濃度50ng/mlにしてやり、ホモ欠損型に対して同様の実験を行った。その結果、有意にLTDの誘発を阻止することができた。つまり、BDNFを欠損させたマウスで誘発されたシナプス長期抑圧は、BDNFを補ってやることで阻止することができた。以上の結果から、内因性のBDNFはシナプス長期抑圧を阻止していることが示唆された。
心筋細胞の圧受容体機構及び圧負荷心における細胞内情報伝達系の解析

我々はこれまでに,心筋細胞に機械的伸展負荷を加えると,蛋白リン酸化酵素の活性化,前癌遺伝子及び胎児型遺伝子の発現に続いて心肥大が形成され,伸展した心筋細胞から放出されるアンジオテンシンII(AngII)が肥大反応の一因であるものの,AngII以外の液性因子の関与も示唆されることを明らかにしている。今回,伸展負荷によって生じる心肥大におけるエンドセリン(ET)とAngIIの役割を解析した。ET受容体(ETaR,ETbR)の特異的阻害薬(BQ-123,BQ-788),AngII受容体(AT1-R,AT2-R)の特異的阻害薬(CV-11974,PD123319)で前処置したラット新生仔培養心筋細胞を伸展し,Raf-1kinase(Raf-1),MAPkinase(MAPK)活性,フェニルアラニン取り込みを測定した。さらに,伸展した心筋細胞でのET-1遺伝子を解析し,培養液中のET-1,AngII濃度を測定した。その結果,伸展負荷によってRaf-1→MADKの一過性の活性化に続いて,24時間後のアミノ酸の取り込みが亢進した。これらは,BQ123,CV-11974あるいは両者の併用による前処置でそれぞれ,3653%,4357%,7285%抑制されたが,BQ788及びPD123319による前処置は全く影響しなかった。また,10分間伸展した心筋細胞培養液中で,それぞれ10pM,160pMのET-1,AngIIを検出し,30分60分の伸展負荷でET-1mRNAの発現が一過性に亢進した。以上より,伸展負荷により心筋細胞から直接放出されるET-1,AngIIが,ETaRとAT1-Rを介し情報伝達系を活性化し,心筋細胞肥大を引き起こすことが判明した。さらに,伸展負荷でET-1産生も亢進することも明らかとなった。
新しい細胞死magentosisにおけるポリADPリボシル化の意議:授乳期乳腺(退縮期)をはじめとするホルモン反応性諸臓器を対象とした分子病理学的研究

Magentosis(核がPAS染色でmagentaに染色される)はヒト授乳期乳腺の退縮早期に認められる細胞死の特異な一形態で、一本鎖DNAの蓄積を伴っている。本研究の目的は、われわれの見出したこのmagentosisの生態学的意議の解明にある(1)Magentosisが授乳期乳腺退縮早期にのみみられる減少なのか否かを確認するため、ヒトのホルモン反応性臓器におけるmagentosisの出現を観察した。その結果、1例の甲状腺乳頭癌を除いて、magentosisの出現は確認されなかった。甲状腺癌におけるmagentosisは発表準備中である。(2)マウスを用いた実験系では授乳期乳腺におけるmagentosisの出現動態を検討した。残念ながら、マウス乳腺においてはapoptosisが主体であり、ヒトのmagentosisに相当する変化はさまざまな実験条件下においても見出すことができなかった。(3)magentosisを示す核におけるPAS陽性反応と一本鎖DNA出現の関係を明らかにする目的で、ポリADPリボシル化に注目した生化学的・組織化学的検討を行った。poly(ADP-ribose)の核内蛋白への付加による活性阻害は、一般に、DNA損傷に伴う緊急停止反応として理解されている。免疫組織化学的にpoly(ADP-ribose)の存在が確認され、ribose分子内のvicinal diol基の存在がPAS陽性反応として認識される可能性が高いと思われた。本実験期間中にmagentosisの実験モデルが確立されなかったために、不本意ながら詳細な組織化学的・分子病理学的検討が不可能であった(ヒトの新鮮な授乳期乳腺組織を入手することは事実上むずかしい)。今後とも、実験モデルの作製を中心に検討してゆきたい。われわれは、ヒト授乳期乳腺の退縮早期にapoptosisと異なる特徴ある細胞死を見いだし、magentosisと名づけた。Magentosisの核はHE′染色上均一無構造を呈し、PAS染色陽性(magenta色に染まる)であり、一本鎖DNAの蓄積を伴う。本年度は以下の3点について研究を行った。(1)ヒト内分泌臓器におけるmagentosis:諸種正常内分泌臓器をスクリーニングしたが、magentosisの所見は認めなかった。しかし、1例の甲状腺乳頭癌細胞の核にmagentosisが見いだされたので現在投稿準備中である。(2) magentosisの動物モデル作製:妊娠・授乳・離乳の各期のウィスター系雌ラットの乳腺を採取し、組織化学的、電顕的に解析した。CaseinないしlysozymeよりなるPAS陽性球状物質が観察されたものの、magentosisの所見は認められなかった。apoptosisは離乳後4日に多く観察され、10日頃には細胞数の減少が目立った。一方、離乳18日の乳腺組織において変性上皮細胞が頻繁に観察されたが、電顕的には小胞体・ミトコンドリアの膨化がみられ、壊死に至る過程と考えられた。授乳5,11日に強制離乳を行った場合、授乳中に卵巣切除を行った場合も合わせ検討したが、離乳後にみられる細胞変性像が主体であり、magentosisの所見は観察できなかった。(3) magentosisにおけるポリADPリボシル化の関与の検討:pADP5μgをニトロセルロース膜にスポットしPAS染色を行った結果、粘液やグリコーゲンに比して弱いものの、明らかな陽性所見が得られた。また、magentosis陽性のヒト授乳期乳腺およびラット授乳期乳腺のバラフィン切片に対して、Trevigen社製抗poly(ADP-ribose)抗体(ポリクローナルおよびモノクローナル)を用いた免疫染色を行った。しかし残念ながら、陽性所見は得られなかった。現在さらに検討中である。

Magentosis(核がPAS染色でmagentaに染色される)はヒト授乳期乳腺の退縮早期にみられる細胞死の一形態で、一本鎖DNA蓄積を伴う。本研究の目的は、このmagentosisの生物学的意義の解明にある。(1)magentosisが授乳期乳腺退縮早期にのみにみられる現象なのか否かを確認するため、昨年度に引き続き、ヒトのホルモン反応性臓器におけるmagentosisの出現を観察したが、1例の甲状腺乳頭癌を除いて、magentosisの出現は確認されなかった。甲状腺癌におけるmagentosisに関しては、現在発表準備中。(2)昨年に引き続き、マウスを用いた実験系で授乳期乳腺におけるmagentosisの出現動態を検討した。マウス乳腺においてはapoptosisが主体であり、ヒトのmagentosisに相当する変化はさまざまな実験条件下においても見出すことができなかった。(3)magentosisを示す核におけるPAS陽性反応と一本鎖DNA出現の関係を明らかにする目的で、ポリADPリボシル化に注目した組織化学的検討を行った。poly(ADP-ribose)の核内蛋白への付加による活性阻害は、DNA損傷に伴う緊急停止反応として理解されている。免疫組織化学的にpoly(ADP-ribose)の存在が確認され、ribose分子内のvicinal diol基の存在がPAS陽性反応として認識される可能性が高いと思われた。実験モデル作製が不成功だったために、小回りの利いた解析を行うことができなかった(ヒト授乳期乳腺を新鮮材料として入手することは困難であった)。
日本の環境技術・省エネ技術を中国に移転するための経済モデルの創出

研究課題として取り組んだ経済モデルは(1)国民の環境改善、省エネに対するコンセンサス(2)長期的な規制(3)規制と調和するインセンティブ(4)地域間の競争を組み合わせたモデルであるという仮説を同研究の集大成として纏めた論文『低炭素経済実現のためのビジネスモデル』が、中国、ドイツ、アメリカ、韓国、日本における20に及ぶ学会報告でこの分野の有識者の賛同を得られたことでほぼ実証された。この論文の中で、2009年より日本において進行した地上デジタル放送への移行が規制として働き、偶然同時期に導入されたエコ・ポイントが組み合わされ、非常に大きな効用が得られたテレビが他のどの環境対応商品よりも抜きんでて販売を伸ばしたという事実が上記仮説を裏付けることとなり、学会での承認に繋がった。但し、当初予定した具体的な技術による中国における実証実験は、天津Smart Cityに目標が絞られたが、知財保全の保障の壁が破れず、北京大学、清華大学、ハルビン工業大学等の中国のこの分野の研究者の支援や、三菱地所、協和機設他日本企業の協力が得られたにも拘わらず、知財保全という壁が越えられず、実証実験には至らなかった。しかし、昨年度忠南大学(韓国太田)及び明治大学において開催された学会においては、天津大学、西南交通大学、南開大学、武漢大学の代表が上述の経済モデルに強い関心を示し、それぞれの地域で実施している廃棄物の回収や省エネの活動に同様の経済モデルの有効性が見られることや、理論化されたモデルを積極的に取り入れて行く意向を示したことは、本研究の成果として上げることが出来る。中国の環境改善を行う方法論を「Eco-Economy-The Possibility of China]に纏め、6月18日北京で国連(ESCAP)主催のAsia-Pacific Forum on Low CarbonEconomy-China2009にて発表。北京大学、北京工科大学、清華大学の斉教授、欒教授より中国におけるもっとも深刻な環境問題は水問題であるとの指摘を受ける。同内容の論文を6月24目大阪市立大学にて開催された中国経済学会にても発表。課題を水問題に絞り、革新的な水浄化技術であるナノバブルに関し8月8日熊本大学にて開催された日本混相流学会において矢部会長、協和機設社辻社長と面談。ナノバブル技術と油水分離技術(日立プラント)を組み合わせたシステムが有効との示唆を受ける。具体的に中国での実証実験の可能性を検討する為円借款で中国の環境改善の実績があるJICAを訪問し、実証実験の組み立て方について示唆を受ける。9月18日現地の調査の為北京・上海においてJICA北京事務所の他当地で環境事業で実績のある森松工業を訪問。この成果を持って10月日立プラント、協和機設を数回にわたり訪問し、実証実験の具体的な条件等に関し討議。環境ビジネスモデル設計に関し、11月21日名古屋大学にて開催された日本情報経営学会にて「ビジネス創出とビジネスモデル設計」を発表。次いで11月28日東京にて開催された日本経済政策学会に於いて環境ビジネスを可能にする経済モデルに関して「How to create a business Model for Environment Improvement and Energy Saving」を纏め発表。同会議にて中京大学並河教授、蔡大鵬博士より経済モデル創出に関し賛同を得る。2010年2月25日清華大学の紹介でハルビン工業大学の馬教授、趙教授ら7名のミッションが来訪。日本の水浄化技術を導入した実証実験を天津にて行うプロジェクト提案があった。以上の活動により、研究目的である経済モテルの創出に関しては、日本情報経営学会に於いて論文として纏める方向で、技術に関しては日立プラント、協和機設と共同開発する方向で、中国における実証実験に関してはハルビン大学等の協力を得て、天津にて2010年中に実施する方向で今後JICA等と連携して研究活動を発展させることとなった。中国の環境改善を行う方法論を論文

『低炭素経済実現のためのビジネスモデル』に纏め、1月4日中国海南大学、5月6日天津・南開大学、6月2日西安・西北大学にて、何れも日本学術振興会・アジア研究教育拠点事業プログラムの中で発表し、海南大学胡国柳教授、南開大学王晶教授、西北大学徐波教授、天津大学高挙紅教授など中国を代表する環境関連の研究者と意見交換を行った。その結果天津にて中国政府が推進中のSmart Cityの中に、分散型水浄化設備として日立の油水分離技術とナノバブル技術を組み合わせたシステムを紹介し実証実験を行うという示唆を得た。発表した論文は『中国低炭素経済発展報告2011年』として出版された。一方、環境経済学の先駆的な研究が行われているフライブルク大学の招聘に応じ、9月22日同大学でのセミナーに参加し、上記論文に日本のエコポイント政策の効用を加えた論文を発表し、同大学Oliver Landmann教授、Wolfgang Eggert教授等と意見交換を行った。エコポイントというインセンティブの効果が予想以上に大きい故、同論文中の環境改善の経済モデル設定に賛同を得た。これらの成果を踏まえ同論文を改訂しシンガポールのInstitute of Southeast Asianに提出し、同シンクタンクの紹介により米国Texas A&M大学より講演要請があり、2011年3月22日同大学にて発表した。同大学のKerry_Cooper教授、Julian Gasper教授とも経済モデルに関する意見交換を行い、米国におけるグリーン・ニューディール政策との比較検討を行った。天津のSmart Cityに参加する為、日本における実証結果を提出する必要があり、三菱地所が皇居のお堀の浄化計画にナノバブルを使用する意向が確認できたため、協和機設とともに同プロジェクトに参加する為のプレゼンを行い、同社の合意を得た。今後、論文を査読申請するとともに、同プロジェクト推進を行う。平成21年度に作成した中国の環境改善を行う具体的な方法論を含む論文『低炭素経済実現のためのビジネスモデル』を、同分野の研究者(中国、欧州、米国の各大学)との交流で得た知見をもとに全面改訂を行った。その要諦は、2009年に日本で実施されたエコポイント制度が予想を超えて有効に機能したこと。また、同制度が地上デジタル放送への移行という、規制と結び付いたケースが、より効果的に作用したことを勘案し、規制とインセンティブを組み合わせた経済モデルが、実際に機能した事実を踏まえ、更に、同様の効果が現れた1973年第一次オイルショックより約30年間にわたる日本の官民を挙げての継続的な省エネ運動に注視し、(1)一般消費者の環境マインドの高揚が省エネや環境改善に対するコンセンサスの形成に繋がった(2)中長期的な規制の必要性(3)具体的なインセンティブ以上を組み合わせた経済モデルに修正した。改訂後、実際に中国に於いて巨大な潜在需要があり、日本の技術を渇望する「水浄化」の分野に絞って、実証実験を行う前提となる、日本における実証実験の為に三菱地所を中核とする三菱グループの皇居のお堀の浄化計画や次世代ビルデイングプロジェクトと連携。
電極-細胞間シンクロナイゼーションに基づく細胞内遺伝情報発現制御とその応用

平成14年度は、電極-細胞間シンクロナイゼーションに基づく培養細胞の遺伝情報発現制御を、細胞機能変換の手段として応用した、培養細胞による細胞デバイス作製や細胞分化誘導への展開を行った。hsp70プロモーターの下流に、酵素、サイトカイン、ペプチドホルモン類のような生体有用物質の遺伝子を連結したプラスミドを作成し、形質導入した細胞は電位印加による有用物質産生制御が可能な細胞デバイスとなりうる。本年度はその例として、低周波・微小電位印加による分泌タンパク質産生細胞デバイスの作成を試みた。レポータータンパク質として分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)を採用した。hsp70プロモーターの下流にSEAP遺伝子を組みこんだプラスミドを作成し、これを用いて筋芽細胞であるC2C12細胞に形質導入して安定発現株を得た。この細胞に熱刺激、または電気刺激を印加すると、培地中に活性型SEAPが安定的に分泌されることが明らかとなった。またhsp70プロモーターの下流に、神経細胞特異的分化誘導転写因子であるNeuroD2遺伝子、IRES領域、そしてEGFP遺伝子を連結したプラスミドを作成した。これを用いて神経芽細胞腫由来N1E-115細胞に形質導入した。この細胞は熱刺激および電位印加により神経突起を伸長し、神経細胞様へと分化することを、細胞形態変化および細胞内に発現したEGFPの蛍光観察により確認した。このことから電極-細胞間シンクロナイゼーションに基づく細胞分化誘導系を構築可能であることが示された。レポータープラスミドとして、活性化された転写因子AP-1、SRF、NF-κB、CREBPが認識して結合するエンハンサーの繰り返し配列の下流に、TATA boxとホタルルシフェラーゼ遺伝子を配した、動物細胞導入用のシスエンハンサープラスミドを用いて、マウスアストログリア細胞に形質導入した。その結果、各転写因子の活性化を、ホタルルシフェラーゼの生物発光活性の上昇に変換して測定することが可能なマウスグリア細胞を構築することができた。導入したそれぞれの細胞を、対極及び参照電極とともに、ポテンシオスタットならびにファンクションジェネレーターへと接続したガラス透明電極(ITO蒸着電極)上で培養した。そして、10Hz、0300mVの交流電圧を1時間印加し、電気刺激を中断後さらに培養を継続することにより、電極とのシンクロナイゼーションによる転写因子の活性化を誘導した。比較実験として、培地にPKC活性化剤であるPMAを添加し、各転写因子の活性化誘導を行った。電位印加及びPMA添加後24時間後に細胞を回収し、細胞内に発現したホタルルシフェラーゼの発光活性を、ルミノメーターで測定した。その結果、PMAによる細胞活性化では、AP-1、NF-κB、SRF転写因子活性化が引き起こされルシフェラーゼ活性が上昇すること、また電位印加によりSRF、NF-κB転写因子が活性化し、ホタルルシフェラーゼの機能発現が誘導されることが明らかとなった。これらのなかで最も顕著な活性化は、電気刺激によるNF-κB転写因子の活性化であることが明らかとなった。この結果より、電気刺激印加による細胞機能応答は、酸化ストレスといった他の物理的外部刺激による細胞内シグナル伝達経路の活性化と関連性があることが示唆された。
ヒト15番染色体移入による自閉症モデルマウスの作製

<ヒト15番染色体短腕領域を保持したトランスクロモソミックマウスの解析自閉症モデルの作製>ヒト15番染色体断片を保持したTCマウスは,ホームケージ活動量の増加,新奇物体に対する異常な興味を示したので,平成23年度はこの行動異常が何に起因するのかを明らかにするため,マイクロアレイによるマウス遺伝子の発現解析をおこなった。しかしながら,マウス遺伝子自身に顕著な発現変化を認めた遺伝子は無く,TCマウスの行動異常は移入ヒト染色体上の遺伝子の影響であることが示唆された。今回移入したヒト染色体断片上には脳機能に関わる遺伝子がいくつか存在するが,15q11-q13に位置し,父性発現を呈するHBII-52 snoRNAは,選択的スプライシングに関与し,この異常により脳神経に異常をきたす可能性が示唆されている。そこでHBII-52が関与している数種の遺伝子の選択的スプライシングのパターンを解析したところ,少なくともCRHR1遺伝子の選択的スプライシングのパターンがTCマウスで異なっていることが明らかとなった。今後は他の遺伝子の選択的スプライシングの有無を検索すると共に,CRHR1の選択的スプライシングの変化がTCマウスで見られる行動異常に関係があるのかをCRH刺激試験などを行い明らかにしていく。<ヒト15番染色体重複のin vitroモデルの解析遺伝子発現制御における染色体ペアリングの役割>染色体の数的異常のin vitroモデルとして,母方ヒト15番染色体をヒトの神経系の細胞に移入した結果,遺伝子の数は増加したにもかかわらず,発現量が減少している遺伝子が存在した。そして,正常でみられるGABRB3 3'領域の相同遺伝子間のペアリングが,母方15番染色体重複モデル細胞では顕著な減少を認めた。この結果をHuman Molecular Geneticsに投稿し,アクセプトされた。本申請課題の目的は、自閉症において最も頻回に認められる染色体異常である『母方15番染色体長腕領域の重複』をin vivoおよびin vitroモデルで再現し、過剰染色体が遺伝子発現にいかに影響を与えるかを解析することにある。1)ヒト15番染色体を保持したトランスクロモソミックマス(TCマウス)の作製まず,ヒト15番染色1本を微小核融合法を用いマウスES細胞への移入を試みた。しかし,インタクトの15番染色体はマウスES細胞に移入することが出来なかった。そこで,UBE3A遺伝子の3'領域とテロメア配列をつないだテロメアトランケーションベクターを作製し,テロメアトランケーション法によりヒト15番染色体長腕をおよそ25Mbまで短くした。続いて,この短くしたヒト15番染色体を,マウスES細胞に移入したところ,ヒト15番染色体を独立に保持するクローンを得ることが出来た。集合キメラ法によりキメラマウスを作出し,キメラマウスをC57/BL6マウスと交配,ヒト15番染色体を保持したF1マウスを得た。2)ヒト神経系細胞株へのヒト15番染色体移入微小核細胞融合法を用い,母方のヒト15番染色体1本をヒト神経系細胞株SH-SH5Yに移入した。定量PCR法により15q11-q13領域の遺伝子発現を解析した結果,ヒト15番染色体1本を過剰に保持しているにもかかわらず,SNRPN,GABRB3,CHRNA7の発現低下を認めた。GABRB3領域においては,相同染色体のペアリングが高頻度に認められ,それが遺伝子発現制御に重要であるとの報告があるため,母方のヒト15番染色体1本を移入したSH-SH5Y細胞を用い,GABRB3領域の相同染色体のペアリングをFISH法により解析した。その結果,樹立した細胞ではGABRB3領域の相同染色体のペアリングの頻度が著しく低下していることが分かった。1.ヒト15番染色体を保持したトランスクロモソミックマウス(TCマウス)の作製H21年度に作出したヒト15番染色体断片を保持したTCマウスで行動テストバッテリー解析を行い,行動異常が認められるかを探索した。その結果,ヒト15番染色体断片を保持したTCマウスは,運動,聴覚,記憶,学習,驚愕反応,不安様行動,社会的行動などのテストでは,コントロール群と比較し大きな違いはなかったのに対し,ホームケージ活動量に顕著な増加を認め,さらに,新奇物体に対しての興味が高かった。今後,マウスを組織学的,分子生物学的に解析し,ヒト15q11-q13領域の重複によりどのような異常が生じるのかを明らかにする。2.ヒト神経系細胞株へのヒト15番染色体移入15q11-q13領域の遺伝子発現制御には,染色体ペアリングが重要な役割を果たしていることが明らかになったため,その分子機構の解明を目指し,まずペアリング領域を詳細に決定した。その結果,GABRB3遺伝子の3'領域が特異的にペアリングしていることを明らかにした。一方,他の染色体上のGABAレセプター遺伝子群領域では染色体ペアリングが認められず,15番染色体特異的であることが明らかとなった。さらに,高次クロマチン構造の形成に関わるMECP2,CTCFが15番染色体GABRB3領域のペアリングに関与していることをノックダウン実験により明らかにした。以上の実験より,染色体ペアリングが遺伝子の発現制御に関与していることを直接的に示すことが出来た(論文投稿中)。<ヒト15番染色体短腕領域を保持したトランスクロモソミックマウスの解析自閉症モデルの作製