hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫タンパク質生産系の効率化に向けた転写産物調節性RNA結合タンパク質の機能開発

カイコを含むチョウ目昆虫のTIA-1様RNA結合蛋白質であるTRN-1は、培養細胞を用いた解析から、外来性遺伝子からの転写産物を排除することが明らかとなった。本物質についての生体内機能をさらに詳細に調べるため、BmTRN-1タンパク質および断片化変異体を過剰発現する培養細胞(BmN4)を作り、外来タンパク質発現への影響やウイルス増殖過程への影響を調べた。RNA認識配列(RRM)の3回繰り返し領域およびC末端領域からなる完全長の組換えBmTRN-1を過剰に発現させた場合に、外来リポーター遺伝子産物の生産量が著しく低下した。一方、RRM領域とC末端領域を個別に過剰発現させた細胞ではドミナントネガティヴ効果による外来レポーター産物の生産上昇が確認された。また細胞にバキュロウイルスを感染させた場合に、完全長のBmTRN-1が過剰に存在する細胞内ではウイルスの増殖の指標となるリポーター酵素活性の明確な低下が確認され、さらに細胞内ウイルスDNA量も減少した。GFPとの融合タンパク質を用いた初期的な蛍光顕微鏡解析から、RRM領域の断片化変異体とGFPとの融合タンパク質およびC末端領域とGFPの融合タンパク質は正常細胞において核に局在したが、完全長BmTRN-1は正常細胞では核と細胞質双方に存在した。一方弱毒ウイルスのAcNPVを感染させることにより、完全長BmTRN-1は核に移行することが明らかとなった。このことは完全長BmTRN-1にはウイルス感染によるストレス応答反応の働きで核内局在する構造的な要因があることを示している。以上の結果が示すように、ウイルスの感染に伴って局在性を変化させながらバキュロウイルス増殖過程を抑制する働きがあることから、BmTRN-1にはバキュロウイルスに対する自然免疫の役割も持つことが示された。カイコのTIA-1様RNA結合蛋白質であるBmTRN-1は、中腸において変態期にその発現亢進が見られる。また培養細胞を用いた解析から、このBmTRN-1には外来性遺伝子からの転写産物を排除することが明らかとなった。したがって、BmTRN-1は変態に伴う旧組織特異的な発現転写産物を効率的に機能不全化する働きもあると考えられる。RNA認識配列(RRM)の3回繰り返し領域およびC末端領域からなる完全長の組換えBmTRN-1とRRM領域のみからなる組換え断片化変異体を過剰に発現させた場合に、外来リポーター遺伝子産物の生産量が著しく低下した。したがって、RRM領域にはタンパク質発現を抑制する働きがあると確認された。また細胞にバキュロウイルスを感染させた場合に、完全長のBmTRN-1が過剰に存在する細胞内ではウイルスの増殖の指標となるリポーター酵素活性の明確な低下が確認された。さらにGFPとの融合タンパク質を用いた初期的な蛍光顕微鏡解析から、完全長BmTRN-1は正常細胞では細胞質に顆粒状に存在するが、ウイルスを感染させることにより核に移行することが明らかとなった。移行した核内では、顆粒状構造物としては検出されなかった。RRM領域の断片化変異体とGFPとの融合タンパク質は正常細胞において核に局在することも示された。したがってC末端領域は、BmTRN-1を細胞質に顆粒状に局在させると考えられる。

カイコのTIA-1様RNA結合蛋白質であるBmTRN-1は、中腸において変態期にその発現亢進が見られる。また培養細胞を用いた解析から、このBmTRN-1には外来性遺伝子からの転写産物を排除することが明らかとなった。したがって、BmTRN-1は変態に伴う旧組織特異的な発現転写産物を効率的に機能不全化する働きもあると考えられる。本物質についての生体内機能をさらに詳細に調べるため、BmTRN-1タンパク質および断片化変異体を過剰発現する培養細胞(BmN4)を作り、外来タンパク質発現への影響やウイルス増殖過程への影響を調べた。RNA認識配列(RRM)の3回繰り返し領域およびC末端領域からなる完全長の組換えBmTRN-1とRRM領域のみからなる組換え断片化変異体を過剰に発現させた場合に、外来リポーター遺伝子産物の生産量が著しく低下した。したがって、RRM領域にはタンパク質発現を抑制する働きがあると確認された。また細胞にバキュロウイルスを感染させた場合に、完全長のBmTRN-1が過剰に存在する細胞内ではウイルスの増殖の指標となるリポーター酵素活性の明確な低下が確認された。さらにGFPとの融合タンパク質を用いた初期的な蛍光顕微鏡解析から、完全長BmTRN-1は正常細胞では細胞質に顆粒状に存在するが、ウイルスを感染させることにより核に移行することが明らかとなった。移行した核内では、顆粒状構造物としては検出されなかった。RRM領域の断片化変異体とGFPとの融合タンパク質は正常細胞において核に局在することも示された。したがってC末端領域は、BmTRN-1を細胞質に顆粒状に局在させると考えられる。以上の結果が示すように、ウイルスの感染に伴って局在性を変化させながらバキュロウイルス増殖過程を抑制する働きがあることから、BmTRN-1にはバキュロウイルスに対する自然免疫の役割も持つことが示された。
小動物のチェレンコフ光分子イメージングにおけるハイブリッド光検出法の最適化

本研究の目的は、生体内の深部での放射性分子プローブの検出能力を向上させるために、チェレンコフ光の欠点を補完するハイブリッド光イメージングの最適化を図り、マウスなどの小動物実験へ応用する技術を開発することである。3年間で予定しているこの研究実施計画の初年度として、先ずベータ線を放出する放射性分子プローブの生体内チェレンコフ光発生特性機構と光減衰の解明を行うことであった。本研究代表者が所属する研究施設の放射線管理区域内に設定されている市販の蛍光・発光イメージングシステムであるPerkinElmer社製IVISSpectrumを用いて、ベータ線を放出する2つの放射性同位元素I-131とP-32を購入し、チェレンコフ光イメージングを行った。その結果、I-131に比べてベータ線エネルギーが約3倍高いP-32のチェレンコフ光強度がより大きく物体内での光減衰が少ないため、深部の検出に優れることがわかった。この2種類の放射性同位元素に対するチェレンコフ光の物理的な基礎的性質を測定できたことは、他の放射性同位元素(F-18やCs-137など)のベータ線エネルギーから生み出されるチェレンコフ光の物体内減衰の程度や光検出能力の限界の推定に役立つことに意義があった。今後計画を予定している、チェレンコフ光の深部検出を補助するガンマ線放射性同位元素の光検出技術開発の重要な基礎的成果になるものと考えている。また研究分担者には、この光検出技術を将来に応用することを目指している疾患モデル小動物の作成準備のためにラットのよる予備実験を行ってもらった。当該年度は、3年間で予定しているこの研究実施計画の初年度であった。当初の計画では、チェレンコフ光の発光に関する物理特性を調べるために紫外線・可視光線の分光光度計を実験に使用することを予定していたが購入できなかったため、放射線実験施設に設定されている蛍光・発光イメージングシステムを代用することができたが十分ではなかった。また、実験にはベータ線を放出する2つの放射性同位元素I-131とP-32を購入したが、予定していた放射性同位元素Cs-137の希望する放射能量と長い納入期間により入手が困難であったことも重なり、研究の進捗にやや遅れを生じている。本研究の基礎実験に関わる主要実験装置の代用と特定の放射性同位元素の入手ができなかったことにより初年度の進捗状況にやや遅れを生じたため、本研究の実施2年度目の計画の中に実行できなかった実験を追加していきたい。また、2年度目の研究代表者の研究実施については、当初の予定計画通りに進めていきたい。なお、研究分担者の研究については、初年度と同様に小動物の疾患モデル作成の準備を行ってもらうことを予定している。

3年間に渡る本研究の実施計画の初年度である前年度に、ベータ線放射性同位元素より発生するチェレンコフ光の発光機構に関する基礎的な物理特性を調べるために紫外線・可視光線の分光光度計を整備する予定であったが、予算内で措置できる適当な機器がなかったため購入を見送った。また、チェレンコフ光の観測実験のためにベータ線を放出する2つの放射性同位元素I-131とP-32を購入したが、予定していた放射性同位元素Cs-137の希望する放射能量と高価格および長い納入期間により入手が困難であったことも重なり購入を見送ったために前年度に未使用額が生じた。この前年度未使用額と今年度額を合わせた助成金により、前年度入手できなかった機器や放射性同位元素の購入を計画し、当該研究2年目の当初計画と合わせて円滑な執行に努める。
デング出血熱発病機構に関係するウイスル遺伝子の塩基配列解析

デング出血熱の発病機構に係るウイルス毒力説の直接的証拠を得る目的で、1993年タイ国東北部ナコンパノムにおいて臨床的に重篤度の異なる患者から分離された2型デングウイルス遺伝子の塩基配列と、それから推測されるアミノ酸配列を比較解析した。(1)ウイルス蛋白質のアミノ酸配列から、分離株は3つの亜型に分類され、亜型1は最も重症のDSS患者からの分離株、亜型2はDHF患者分離株2株とDF患者分離株2株、亜型3はDF患者分離株3株であった。(2)3'非コード領域(3'NCR)に推測される2次構造からも分離株は3つの亜型に分類され、亜型1はDSS患者分離株、亜型2はDHF患者分離株2株とDF患者分離株3株、亜型3は2株のDF患者分離株であった。これらの結果から、亜型1のアミノ酸配列と亜型1の3'NCRを有するウイスル株に感染した場合、臨床症状は重篤化する可能性があるのに対して、亜型3のアミノ酸配列と亜型3の3'NCRを有する株の感染は軽症で済む可能性が推測される。LLC-MK2細胞に形成されるプラークサイズは、ウイスル遺伝子の構造よりもむしろ、各株が分離された患者の血清反応と関係している。更に1993年、タイ国バンコックの流行から分離された4株の4型デングウイスル遺伝子を比較解析した。その結果、軽症のDF患者分離株に特異的なアミノ酸置換、及び比較的重症のDHF grade II分離株にそれぞれ特異的なアミノ酸置換が存在した。これらのアミノ酸置換は蛋白質の性状に重大な影響を与えると考えられるので、上記2型デングウイスルの結果と総合してデング出血熱の発病機構にウイスル遺伝子の塩基配列が関与していることを推測させる。これらのアミノ酸置換或いは3'NCR構造を有するウイルス株の生物学的性状の解析と、デング出血熱発病機構との係わりは今後の研究課題である。1)解析に使用するデングウイルス株の選定(1)1993年度文部省科学研究費補助金により実施したタイ国東北部ナコン・パノムにおける国際学術研究で分離された2型デングウイルス(D2)4株と、(2)日本学術振興会論博事業によってタイ国バンコックで分離された4型デングウイルス(D4)2株を解析した。D2株のうち、ThNH7/93は最も重症のデングショック症候群(DSS)から、ThNH28/93はデング出血熱(DHF重篤度IIから、ThNH52/93はDHF重篤度Iから、ThNHp11/93は軽症のデング熱(DF)から分離された。D4株のうち、CT-129はDHF重篤度Iら、CT-77は軽症のDFから分離された。2)塩基配列の解析各ウイルス株をヒトスジシマカ培養細胞C6/36で増殖後、感染培養液からウイルスRNAを抽出し、PCR増幅し、大腸菌ベクターにクローニング後あるいはPCR産物を直接使用して、ダイデオキシ法により塩基配列を解析した。塩基配列から推測されるアミノ酸配列、及び標準株の配列との比較はコンピュータープログラムによって求めた。3)結果D2に関して、まず遺伝子のE/NS1接合部位240塩基解析したところ、4株はすべて遺伝子型IIに分類された。

この部位では4株間にアミノ酸配列の相違は存在しなかったが、塩基配列の相違はDSS株とDF株間で6塩基、DSSとDHF株間では1塩基であったことから、変異の蓄積によってそのウイルス株に感染した患者の臨床症状が軽減されると推測された。次いで解析領域をC,PrM/M,E,NS1遺伝子に拡大した結果、PrM,NS1領域に株特異的なアミノ酸変異の存在が発見された。このことはDHFの発病機構に関係するウイルス毒力遺伝子の存在を示唆するものである。現在遺伝子残された領域について解析を進めている。D4に関してはE領域を解析したが株特異的なアミノ酸変異存在しなかったので、D2株間の相違が認められた部位を解析する予定である。1,解析したデングウイルス株:2型デングウイルス(D2)4株中、ThNH7/93は最も重症のデングショック症候群(DSS)から、ThNH28/93はデング出血熱(DHF)重篤度IIから、ThNH52/93はDHF重篤度Iから、ThNHp11/93は軽症のデング熱(DF)患者から分離された。4型デングウイルス(D4)4株中、CT-74はDHF重篤度IIから、CT-129とCT-158はDHF重篤度Iから、CT-77はDF患者から分離された。2,塩基配列の解析:各株をC6/36細胞で増殖後、感染培養液からウイスルRNAを抽出し、RT-PCRで増幅し、クローニング、又は直接、蛍光色素標識ダイデオキシ法で塩基配列を解析し、解析した。3,結果1)D2株の解析:構造蛋白質および非構造蛋白質の1つ(NS1)において、株特異的で蛋白質の性質に重大な影響を与えるアミノ酸変異としては、NS1領域の1053番目のAsp→Gly置換はDSS株特異的であり、PrM領域130番目のIIe→Arg置換はDF株特異的であった。非コード領域において、5′非コード領域は全株で完全に保存されたいたが、3′非コード領域の末端から297-299番目の塩基置換(TCG→CAA)の結果、DF株に予想される2次構造がDSS,DHF株と大きく異なっていた。2)D4株解析:構造蛋白質およびNS1において、株特異的で蛋白質の性質に重大に影響を与えるアミノ酸変異としては、PrM領域145番目のAsn→His置換、E領域470番目のLeu→Trp置換、E領域520番目のLys→Thr置換、E領域598番目のThr→Ala置換がDHF重篤度II株特異的であり、PrM領域136番目のLeu→Phe置換、NS1領域914番目のSer→Phe置換、NS1領域1042番目のHis→Gln置換はDF株特異的であった。4,考察:本研究によって発見された株特異的で蛋白質の性質又は3′非コード領域の2次構造に重大な変化を与えると予想される変異を、他の分離株でも確認すること、及び、今回の結果とウイスル株の生物学的性状ないしは発病機構との関係解析が今後の課題である。デング出血熱の発病機構に係るウイルス毒力説の直接的証拠を得る目的で、1993年タイ国東北部ナコンパノムにおいて臨床的に重篤度の異なる患者から分離された2型デングウイルス遺伝子の塩基配列と、それから推測されるアミノ酸配列を比較解析した。(1)ウイルス蛋白質のアミノ酸配列から、分離株は3つの亜型に分類され、亜型1は最も重症のDSS患者からの分離株、亜型2はDHF患者分離株2株とDF患者分離株2株、亜型3はDF患者分離株3株であった。(2)3′非コード領域(3′NCR)に推測される2次構造からも分離株は3つの亜型に分離され、亜型1はDSS患者分離株、亜型2はDHF患者分離株2株とDF患者分離株3株、亜型3は2株のDF患者分離株であった。これらの結果から、亜型1のアミノ酸配列と亜型1の3′NCRを有するウイルス株に感染した場合、臨床症状は重篤化する可能性があるのに対して、亜型3のアミノ酸配列と亜型3の3′NCRを有する株の感染は軽症で済む可能性が推測される。
高速時間分解システムによる量子ドットのテラヘルツ光吸収測定

単一および二重へテロ構造上に作成したドット配列のテラヘルツ光吸収を調べた。単一へテロ構造上のドット配列のテラヘルツ光吸収の励起強度依存性より,光励起下での高磁場側へのピークシフトが生ることを見いだした。またシフト量が励起強度に比例し,一定以上の強度ではバルクのGaAsの有効質量0.067m_0のサイクロトロン共鳴位置に収束していることを明瞭に観測出来た。これは光励起による垂直方向の閉じ込めポテンシャルの減少で説明できることを示した。さらにバンドパスフィルターを用いた光励起下でGaAs層のみを励起した場合でも、やはりピークシフトが生じることが分かった。したがって選択的に波長による光励起でドットの縦方向の厚みと横方向のドット径を独立にコントロールすることが可能となることが分かった。さらに二重へテロ構造上に作成した縦型二重ドット構造では,吸収信号には二重ドットのそれぞれからの共鳴信号として2つの共鳴ピークが観測できた。ところが光変調信号では低磁場側ピークの変調信号は単一ドット構造で見られたものと同じピークシフトの特徴をはっきり示す一方、高磁場側のピークには光励起に伴うピークシフトは生じていないことが見いだせた。このことより縦型二重ドット構造では光励起により表面に近いドットのみの閉じ込めポテンシャル変調が生じていること,選択光励起により表面側のドットの縦方向および横方向のサイズ変化を引き起こすことが可能であることが示唆された。これを利用すれば2つのドット間の相対距離および一方のドットサイズ変更にともなう二重ドット間の結合状態の変化が光励起によりコントロールできるものと思われ、他方のドット信号をモニターすれば、結合ドッ卜系の研究に光励起が有効な手段を与えることが分かった。
一酸化炭素ナノバブルを活用するフロー系超高効率連続的カルボニル化反応の開発

有機合成上極めて重要なカルボニル化合物を得られる、一酸化炭素を用いたカルボニル化反応は大変有用であるが、通常、加圧・加熱条件を要し、一酸化炭素が高い毒性を持つため、スケールアップには危険も伴う。そこで、一酸化炭素の微小泡(ナノ・マイクロバブル)を含む水を本反応の気体源として利用することにより、気液界面積が飛躍的に増大し、反応が加速するのではないかと考えた。また、マイクロフローリアクターを用いることにより、スケールアップも安全に行えるものと期待して研究に着手した。すなわち、カルボニル化アミド化反応を題材としてとりあげ、通常撹拌条件とホモジナイザーを用いて微小な泡を発生させる旋断混合条件について結果を比較した。その結果、1)気体の拡散が遅い高粘性溶媒中で行う、2)気体分子の濃度が律速段階に影響を与える反応において、旋断混合条件の方が、反応が速く進行することを初めて明らかにした。また、微小泡の寿命が当初の予測より短く、マイクロリアクター中に一酸化炭素ガスを多量に導入するのは困難であることが判明した。この結果をうけ、一酸化炭素同様、毒性のClカルボニル源であるホスゲンガスをマイクロリアクター外から導入するのではなく、系中で発生させて、そのまま消費するプロセスの開発に取り組んだ。すなわち、安全で取り扱い容易なトリホスゲンとジイソプロピルエチルアミンをマイクロリアクター内で混合し、ホスゲンを系中で発生させた。これをカルボン酸と反応させて酸塩化物を調製し、さらに次のマイクロリアクターにおいてアミンと反応させてアミドを合成する連続反応プロセスの開発に初めて成功した。有機合成上極めて重要なエステル、アミド、カルボン酸、ケトンといったカルボニル化合物を得られる、一酸化炭素を用いたカルボニル化反応は大変有用であるが、通常、加圧・加熱条件を要し、スケールアップには危険も伴う。本年度の研究実施計画に従い、まず、市販ナノバブル生成装置を利用して、一酸化炭素微小泡水を調製した。次に、調製した微小泡水中の一酸化炭素濃度を測定した。その結果、予測と比べて一酸化炭素濃度が低いことが示唆された。そこで、旋断混合機を用い、一酸化炭素微小泡水を調製することとした。本方法と通常のマグネチックスターラーによる撹拌法でカルボニル化反応を試行した結果、旋断混合機による撹拌条件において、顕著な反応加速効果が観察された。さらに、同手法をマイクロフロー反応へ展開したところ、さらなる反応加速効果が観察され、水中、室温、常圧下においても極めて速やかにカルボニル化反応が進行することが分かった。本手法は今後カルボニル化反応以外の気液二相系反応にも広く応用できる可能性を秘めており、得られた結果の意義は大変大きいと考えている。
子どものコンピテンスの低下傾向の要因分析-児童期から思春期にかけての横断的・縦断的検討を通して-

Harterの理論に準拠して、児童期から思春期の子どものコンピテンスを測定する尺度を作成し、その発達的変化、及び変化の要因について、主に幼稚園の年中時から中学校2年時までの追跡児67名、及びその両親と担任教師、さらに小学校4・6年、中学校2年時では該当学年の在籍児全員269名を対象とした資料に基づいて検討した。その結果は、以下の5点にまとめられる。1)日本の子どもでもHarterの枠組みに即してコンピテンスの様態を測定することは概ね妥当である。すなわち、幼児用は学習、運動、仲間からの受容、母親からの受容、児童用は学習、運動、容姿、社交性、行い、自己価値、思春期用は学習、運動、仲間からの受容、容姿、行い、親友関係、自己価値からなる。2)コンピテンスの発達的変化として、(1)一貫して低下する領域(学習・学校、容姿)、(2)変化しない領域(行い)、(3)思春期に上昇する領域(社交性)の3つのパターンが見られる。3)思春期においてコンピテンスの重要性認知が相対的に高いのは仲間からの受容、行いであり、運動の重要性は低下する。4)コンピテンスの現実認知は他者評価としての両親・教師評価とを比較すると、総じて教師評価との相関が高く、その傾向は思春期において顕著である。5)コンピテンスの低下傾向の要因として、(1)子どもの現実認知と重要性認知との差が増大すること、(2)小学校4年以降ではコンピテンスの他者評価が子どもの現実認知に影響と及ぼしていること、(3)思春期における現実認知の様態には子どもの家族に対する捉えや自分自身の行動特徴の捉えを反映していること、つまりコンピテンスの現実認知の高い子どもは家族や自分自身の行動特徴を肯定的に捉えていること、などがあげられる。1)思春期におけるコンピテンス測定尺度の作成思春期におけるコンピテンス認知を測定する尺度を作成するため、Harterによる思春期用コンピテンス尺度を翻訳し、中学13年生約300名を対象に尺度化を試みた。さらにこのうちの約70名を対象に、尺度の信頼性の検討するために再テストを実施した。その結果、日本の思春期の生徒のコンピテンス認知を測定に適応し得る尺度であることが判明した。2)思春期のコンピテンスの発達的変化の検討上記の資料に基づいて、思春期におけるコンピテンス認知の発達的変化を横断的に検討しつつあるが、現在までのところ、中学生についてもコンピテンスの自己評価は発達的に低下する傾向が見られこと、重要性評価が自己評価を上回ることなどが明らかにされた。今後は自己評価と他者評価(両親、及び教師)の関連動について詳細な分析を行なう予定である。3)児童期から思春期にかけてのコンピテンスの発達的変化の検討幼稚園年長時からの追跡児について、小学校1年、4年、6年、中学校2年でのコンピテンスの自己評価、他者評価、及び日常行動に関する自己評価、さらに同様な他者評価について縦断的な変化を検討しつつあるが、現在までのところコンピテンスに関して自己・他者評価ともに発達的に低下すること、追跡児の思春期でのコンピテンスの自己評価はその他の生徒に比べて低いこと、教師評価も相対的に低いことなどが明になってきている。4)コンピテンスの低下傾向の要因の検討授業場面での行動観察の手続きについて予備的検討を行ない、観察の枠組みをほぼ決定した。

さらに、観察資料の限界が予測されるため、学業成績、及び自分や家族についての作文もコンピテンスの低下傾向の要因分析の対象に加えることにし、現在、作文に表現されている自分や家族の捉えと質問紙によるコンピテンスの自己評価との関連について分析を進めている。Harterの理論に準拠して、児童期から思春期の子どものコンピテンスを測定する尺度を作成し、その発達的変化、及び変化の要因について、主に幼稚園の年中時から中学校2年時までの追跡児67名、及びその両親と担任教師、さらに小学校4・6年、中学校2年時では該当学年の在籍児全員269名を対象とした資料に基づいて検討した。その結果は、以下の5点にまとめられる。1)日本の子どもでもHarterの枠組みに即してコンピテンスの様態を測定することは概ね妥当である。すなわち、幼児用は学習、運動、仲間からの受容、母親からの受容、児童用は学習、運動、容姿、社交性、行い、自己価値、思春期用は学習、運動、仲間からの受容、容姿、行い、親友関係、自己価値からなる。2)コンピテンスの発達的変化として、(1)一貫して低下する領域(学習・学校、容姿)、(2)変化しない領域(行い)、(3)思春期に上昇する領域(社交性)の3つのパターンが見られる。3)思春期においてコンピテンスの重要性認知が相対的に高い領域は仲間からの受容、行いであり、逆に運動の重要性認知は低下する。4)コンピテンスの現実認知と他者評価の両親評価・教師評価とを比較すると、総じて教師評価との相関が高く、その傾向は思春期において顕著である。5)コンピテンスの低下傾向の要因として、(1)子どもの現実認知と重要性認知との差が増大すること、(2)小学校4年以降ではコンピテンスの他者評価が子どもの現実認知に影響を及ぼしていること、(3)思春期における現実認知の様態には子どもの家族に対する捉えや自分自身の行動特徴の捉えを反映していること、つまりコンピテンスの現実認知の高い子どもは家族や自分自身の行動特徴を肯定的に捉えていること、などがあげられる。
最大パワー密度1.5倍を実現する電力変換器のスタートアップ手法の開発

本研究は,パワーデバイスを極限状態において動作させ,電気自動車の車載充電器の小型化・低コスト化を実現するための技術開発およびその評価を行う。これは、低コスト化・小型化へのボトルネックであった充電器のスタートアップ回路を、主回路を制御することにより,不要とするものである。1年目は、スタートアップ動作の理論解析と短絡動作の評価手法を開発する。2年目には、スタートアップ動作の耐久性評価を行う。以上の結果から,スタートアップ回路がない場合でも,従来と同等の性能が得られることを明らかにする。
近代日本の地域自治‐村と大字の法史学的研究‐

明治維新は、日本社会に大きな混乱をもたらした。中央政府のレベルでは、旧大名、公卿、藩閥有力者等のさまざまな実力者が激しい対立を繰り返した。この結果、政府を離れて武装蜂起する者も珍しくなく、明治10年代までは、国家権力はきわめて不安定で、国家組織も頻繁に変更が加えられ、なかなか一定しなかった。こうした状況下で明治政府は、さまざまな国家事業を構想し、その実現を地方に迫った。ここで求められたのは、中央国家の要請を迅速に遂行する地方役場体制と充実した財政基盤であった。この目的のもとで、地方では、数ヵ村を合併させ、地方の人的・物的資源を国家事業に集中させる計画が企図された。地方行政は、有給官吏ではなく、無給の名誉職者たちに委ねられ、この体制の下で富裕な豪農・地主層だけでなく自作層まで動員されることとなった。彼らは従来経験したことがないような多大の負担を否応なく負わされたため、辞退者が続出し、地方での事業推進は必ずしも順調に進まなかった。富県村役場資料の特徴は、他地域でみられない、明治10年代の資料が多く残っていることにある。他地域では、町村制が施行される明治22年以降の資料、それも明治30年代以降の資料しか残されていないことが一般的だが、富県村では、明治10年代より戸長役場の動きを示す資料が多く残されているのである。この明治10年代の資料を具体的に挙げると、「請願届綴」「経費日計簿」「代人保証綴」などがあり、これらの資料から、明治10年代における町村合併がいかなる事態をもたらしたかを解明する手がかりを得られた。そこには、役場体制の再編成が、新規になされた私的所有公認の諸政策と絡み合いながら進行する状況が確認できる。今年度の調査は、夏季と冬季に予定通り行われた。この調査は、富県公民館に所蔵されている旧役場資料の仮目録を作成した上、資料をデジタルカメラで撮影するという内容であった。この調査は、研究代表者、分担者が日程を調整して臨んだが、近年の大学業務の多忙化・多様化によって直前に調査に来られなくなった者もいた。しかし、研究協力者(研究者およびアルバイト)を動員することによって人数を補った。この結果いずれの調査でも、購入したデジタルカメラ5台に、参加者個人が利用できるカメラも加え、常に6から7台のカメラで資料を撮影することに成功した。撮影については、明治期資料の撮影が順調に進み、その中で明治10年代の資料については、簡単な内容整理にも着手することができた。昨年度同様、年2回の現地調査を行って資料を撮影する。研究者の参加については大学業務の多忙化に伴う一定の困難の発生が予想できるが、その分を研究協力者とアルバイトの確保によって補っていく方針である。これまでのぺースを崩すことなく、明治期資料を撮影し終え、大正期資料の撮影に入りたい。資料分析については、明治10年代資料の内容整理をさらに進め、明治20年代資料とのつながりを見いだすことを目標とする。

撮影については、明治期資料の撮影が順調に進み、その中で明治10年代の資料については、簡単な内容整理にも着手することができた。昨年度同様、年2回の現地調査を行って資料を撮影する。研究者の参加については大学業務の多忙化に伴う一定の困難の発生が予想できるが、その分を研究協力者とアルバイトの確保によって補っていく方針である。これまでのぺースを崩すことなく、明治期資料を撮影し終え、大正期資料の撮影に入りたい。資料分析については、明治10年代資料の内容整理をさらに進め、明治20年代資料とのつながりを見いだすことを目標とする。
沿磁力線電流の解析に基く地球磁気圏極冠の物理に関する研究

人工衛星で計測された地球磁場データの解析から次の4種類の新知見を得た。(1)北向き惑星空間磁場に伴う大規模NBZ沿磁力線電流系の特性より、この電流系はCUSP領域より尾部側でIMFと地球磁場が反平衡再結分を起し、磁気圏高緯度境界層領域VLA5MA MANTLE内に真夜中から真昼に向うプラズマ応力が発生し生起されること。(2)大規模region1 region2沿磁力線電流と電離層電気伝導度との関係より,region1電流系は主として磁気圏内定電圧源に起因し、region2電流系は定電流源と定電圧源双方の性質を有すること。(3)磁気圏赤道面領域では、L=4088の全領域にわたり地球の周りを西向きに流れる水平電流が存在する。その強度は夜間で強く(0.85MA/Re)昼間で弱く(0.52MA/Re)強度比は23:1である。夜間で強化された西向き電流は22-02時、L=15.688の領域において局所的に弱まった部分が発生し、サブストーム固有の磁場変動の集積効果と思われる。L=4.088の全領域で、夕方側で地球に向い、朝方側で地球から外向きに流れる半径方向水平電流も存在し、強度はどのL殻上でも93MA/Reである。これら水平電流系は夕方側に正の発散、朝方側に負の発散を生じている。発散の位置、推定される沿磁力線電流の方向と強度は、region2沿磁力線電流系とほゞ一致する。L【approximately equal】4.0-8.8領域には地球に向うプラズマ圧力勾配が存在し、この領域がregion2電流系の発生源と〓〓〓(4)磁気圏赤道領域では夜側のL【approximately equal】4.09.0にわたって沿磁力線電流が発達するが、これはサブストーム時に変形した磁気圏磁場が双極子磁場に戻るダイポーラリゼイション開始時に数分-数十分先行して発生する。サブストーム時の沿磁力線電流の生起には従来のモデルとは別に半径方向に流れる水平電流(午前側で外向き、午后側で地球向き)の発達が本質で最真夜中で最大となるプラズマ〓〓〓人工衛星で計測された地球磁場データの解析から次の4種類の新知見を得た。サブストーム時の沿磁力線電流の生起には従来のモデルとは別に半径方向に流れる水平電流(午前側で外向き、午后側で地球向き)の発達が本質で最真夜中で最大となるプラズマ〓〓〓人工衛星MAGSATで計測された地球磁場資料を解析し惑星間空間磁場IMFが北向き時の沿磁力線電流FAC系の大規模構造に関する次の諸点を明かにした。(1)大規模沿磁力線電流系は異った2個の部分(昼間部分と夜間部分)より成る。(2)IMFBz>0時の昼間部FAC系はNBZ電流系とRegion1電流系が主体である。IMFθ角(YZ平面内のベクトルがZ軸となす角)が0゚(Bz>By>0)から90゚(By>Bz>0)へと回転するにつれ、NBZとRegion1電流系は午前・午后間で非対称となる。NBZとRegion1電流系の強度は真昼から朝夕方に向けて減衰していく。IMFθ角が90゚をこえても(Bz<0)、NBZ電流系は極めて午前午后非対称にはなるがRegion1電流系の高緯度側すなわち昼間極冠域に存続している。(3)IMFBz>

0時の夜間部FAC系は、昼間部と異るNBZ電流系が通常のRegion1,2電流系の高緯度側に発達する事で特徴づけられる。夜間NBZ電流系は多重構造を有し、真夜中より朝夕方に向って発展している。NBZとRegion1電流系共に強度は真夜中より朝夕方に向って減衰している。NBZとRegion1電流系は午前・午后間で著しく非対称である。IMFθ角が90゚を越えると(Bz<0)夜間NBZ電流系は極冠域には存続せず通常のRegion1,2電流系が強化され夜側から朝夕方にかけて広領域に発展する。以上を総括して新発見事実は、大規模FAC系および随伴する大規模プラズマ対流系はIMFがBz>0からBz<0に移行しても存続し、それらの遷移は連続的である事と、大規模FAC系とプラズマ対流系は少くともIMFBz>0時には異った2個源で磁気圏に考えるべき事である。IMFと地球磁場の磁場再結合が原因と考えられるが、その物理過程はカスプ領域とその磁気圏尾部領域に独立に発生しているものと推定され、太陽風エネルギーと運動量の輸入に示唆を与えてきた。1.磁気圏尾部におけるサブストーム時の沿磁力線電流の研究.人工衛生AMPTE/CCEによる磁場計測データを解析した結果(<apprxeq3.9-9.4Re 1Z1<1.7Re)(a)東西向磁場〓乱(△By)はサブストーム・ダイポーラリゼイションに7<40分先行して発生する.△Byの振巾はダイポーラリゼイション開始時に最大に達する場合が最も多い.ダイポーラリゼイション開始前に発達し終り,その開始時に振巾変調を示す場合もある.(b)△Byはダイポーラリゼイションにより誘起されたものではなく, Region1+Region2 Birkeland電流系の発達として考えられる.(c)これらのBirkeland電流系は,秋冠域に発生する等価電流系の朝方向きの成分が急速に発達する時に,ほぼ同時に発達を開始する.極光帯の電気伝導度が周囲に比して特別に増加した時に対応すると考えられる.サブストーム発生には地球向きのプラズマ圧力勾配のみならず,朝側および夕側から真夜に向く圧力勾配が生起されることを示唆している.2.磁気圏赤道面における大規模電流系の研究.同じCCEで計測された磁場データを用いて,長時間にかけて乱れた状態(3<Kp<6)(〓70<Dat<〓20nT)での磁気圏(L=4.0-8.8Re)赤道面付近に発生している電流系を決定してきた.(a)方位角方向電流は西向きに流れ,真昼-真夜中間の強度の非対称性を示し,真夜で2-3倍強い.夜側の西向き電流がL=5.68.8Re MLT=2100-0300で局所的減少を示すのはサブストームダイポーラリゼイションの集積効果であると考えられる.(b)半径方向電流は夕方側で地球向き,朝側で地球から外向きに流れる.強度はLが大きい程大きい. (これらは新発見)(c)総括すると,磁気圏の夕方側には水平電流の【O!+】発散(源)が存在し,磁気圏の夕方側には水平電流の【O!-】発散(吸い込み)が存在していることが知れる.上記,朝は,〓軌道衛生で観測してきたregion2沿磁力線電流系に対応する.人工衛星AMPTE/CCEで計測されたベクトル地球磁場データを解析し、地球磁気圏赤道面付近における大規模電流系に関して、新知見を得た。(1)水平電流系、地球磁気嵐時には地球磁気圏L=4.0L=8.8の領域に流れる地磁気赤道面に平行な水平電流はコイロの成分より構成される。地球の周りを西向きに流れる電流系と地球中心から外向き又は地球中心に向かって流れる半径方向電流系である。
口腔粘膜に発現する免疫抑制分子調節による免疫応答の制御

口腔を含む粘膜組織においては,全身と異なった独特の免疫応答が誘導されることが知られている.一方,補助刺激分子は免疫応答を正または負に調節することが知られており,これらの分子の発現調節を行うことにより,免疫応答をコントロールすることが期待される.本研究においては,未だ完成されてない口腔粘膜ワクチンの開発の足がかりとなることを期待して,口腔粘膜組織を独特な免疫応答の誘導部位として捉え,角化上皮細胞を中心として口腔粘膜組織細胞の解析を行うことを目的とした.粘膜組織細胞に発現する補助刺激分子によるin vivo免疫応答の制御を検討するためには、遺伝子改変動物が有用である.そこで,角化上皮細胞に特異的に抑制性補助シグナル分子であるB7-H1(PD-L1)を発現するトランスジェニックマウスを作成するため、角化上皮細胞特異的に機能するケラチン-14(K-14)のプロモーターとB7-H1(PD-L1)を連結するコンストラクトを作成し,コンストラクトをもちいて,トランスジェニックマウスを樹立した.フローサイトメトリーによる解析の結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスの角化上皮細胞上のにB7-H1発現が認められた.そこで,そのマウス用い,マウスアレルギー性皮膚炎(接触性皮膚炎)モデルにおいて,DNFBをハプテン抗原とし,耳介腫脹反応を測定した.その結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスは,同腹のコントロールマウスと比較して,低量を投与した場合には腫脹反応が抑制され,高量を投与した場合には亢進していた.B7-H1は抑制性補助シグナル分子であり,このトランスジェニックマウスにおいては免疫応答が抑制することが期待されたが,高量投与では免疫応答が亢進した結果が得られ,粘膜組織では独特の免疫応答を有すことを,分子レベルで示唆する結果であると考えられる.口腔を含む粘膜組織においては,全身と異なった独特の免疫応答が誘導されることが知られている.一方,補助刺激分子は免疫応答を正または負に調節することが知られており,これらの分子の発現調節を行うことにより,免疫応答をコントロールすることが期待される.本研究においては,未だ完成されてない口腔粘膜ワクチンの開発の足がかりとなることを期待して,口腔粘膜組織を独特な免疫応答の誘導部位として捉え,角化上皮細胞を中心として口腔粘膜組織細胞の解析を行うことを目的とした.粘膜組織細胞に発現する補助刺激分子によるin vivo免疫応答の制御を検討するためには、遺伝子改変動物が有用である.そこで,角化上皮細胞に特異的に抑制性補助シグナル分子であるB7-H1(PD-L1)を発現するトランスジェニックマウスを作成するため、角化上皮細胞特異的に機能するケラチン-14(K-14)のプロモーターとB7-H1(PD-L1)を連結するコンストラクトを作成し,コンストラクトをもちいて,トランスジェニックマウスを樹立した.フローサイトメトリーによる解析の結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスの角化上皮細胞上のにB7-H1発現が認められた.そこで,そのマウス用い,マウスアレルギー性皮膚炎(接触性皮膚炎)モデルにおいて,DNFBをハプテン抗原とし,耳介腫脹反応を測定した.その結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスは,同腹のコントロールマウスと比較して,低量を投与した場合には腫脹反応が抑制され,高量を投与した場合には亢進していた.B7-H1は抑制性補助シグナル分子であり,このトランスジェニックマウスにおいては免疫応答が抑制することが期待されたが,高量投与では免疫応答が亢進した結果が得られ,粘膜組織では独特の免疫応答を有すことを,分子レベルで示唆する結果であると考えられる.口腔を含む粘膜組織において独特の免疫応答が誘導されることが知られており、本研究においては,未だ完成されてない口腔粘膜ワクチンの開発の足がかりとなることを期待して,口腔粘膜組織を独特な免疫応答の誘導部位として捉え,角化上皮細胞を中心として口腔粘膜組織細胞の解析を行うことも目的とした。まず、粘膜組織細胞に発現する補助刺激分子によるT細胞応答の制御の検討を行うため、角化上皮細胞の補助刺激分子の発現を観察した。その結果、B7-2(CD86)、B7h(B7-H2、ICOSL)、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)の発現が認められ、特に、B7-H1(PD-L1)の発現はIFN-g□□□□刺激により顕著に誘導された。一方で角化上皮細胞のT細胞の応答へ与える影響を検討するため、角化上皮細胞株にB7-H1(PD-L1)あるいはB7-DCを遺伝子導入し、遺伝子導入株を樹立した。今後、これらの細胞株を用いてT細胞の応答へ与える影響を解析する予定である。一方で、粘膜組織細胞に発現する補助刺激分子によるin vivo免疫応答の制御を検討するためには、遺伝子改変動物が有用である。角化上皮細胞に特異的にB7-H1(PD-L1)を発現するトランスジェニックマウスを作成するため、角化上皮細胞特異的に機能するkeratin-14のプロモーターとB7-H1(PD-L1)を連結するコンストラクトを作成し、これを卵細胞への移入を試みている。マウス樹立後in vivoにおける免疫応答を解析する予定である。

口腔を含む粘膜組織においては,全身と異なった独特の免疫応答が誘導されることが知られている.一方,補助刺激分子は免疫応答を正または負に調節することが知られており,これらの分子の発現調節を行うことにより,免疫応答をコントロールすることが期待される.本研究においては,未だ完成されてない口腔粘膜ワクチンの開発の足がかりとなることを期待して,口腔粘膜組織を独特な免疫応答の誘導部位として捉え,角化上皮細胞を中心として口腔粘膜組織細胞の解析を行うことを目的とした。粘膜組織細胞に発現する補助刺激分子によるin vivo免疫応答の制御を検討するためには、遺伝子改変動物が有用である。前回,角化上皮細胞に特異的に抑制性補助シグナル分子であるB7-H1(PD-L1)を発現するトランスジェニックマウスを作成するため、角化上皮細胞特異的に機能するケラチン-14(K-14)のプロモーターとB7-H1(PD-L1)を連結するコンストラクトを作成したことを報告した.今回,そのコンストラクトをもちいて,トランスジェニックマウスを樹立した.フローサイトメトリーによる解析の結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスの角化上皮細胞上のにB7-H1発現が認められた.そこで,そのマウス用い,マウスアレルギー性皮膚炎(接触性皮膚炎)モデルにおいて,DNFBをハプテン抗原とし,耳介腫脹反応を測定した.その結果,K14-B7-H1トランスジェニックマウスは,同腹のコントロールマウスと比較して,腫脹反応が促進されていた.B7-H1は抑制性補助シグナル分子であり,このトランスジェニックマウスにおいては免疫応答が抑制することが期待されたが,この系においては免疫応答が亢進した結果が得られ,粘膜組織では独特の免疫応答を有すことを,分子レベルで示唆する結果であると考えられる.
血液細胞の造血幹細胞へのダイレクトリプログラミング

本研究においては、造血転写制御遺伝子を組み合わせて分化血液細胞に導入し、造血幹細胞へとリプログラム可能な系を確立することにより、造血幹細胞の形質を規定する転写因子群の最小限の組み合わせを明らかにすることにより、造血幹細胞制御の分子機構を理解するとともに、血液細胞の造血幹細胞へのダイレクトリプログラミングにより、iPS細胞を介さない新しい造血系再生医療の可能性を検証することを目的とした。E2A欠損pro-B細胞に、重要な造血転写制御遺伝子群を組み合わせて導入し、造血幹細胞・多能性前駆細胞へのダイレクトリプログラミングに挑戦したが、骨髄球系前駆細胞の表現型を有する細胞が増幅されたのみで、いまだリプログラミングには成功していない。目的の達成にはさらなる技術的改善が必要である。iPS細胞は、ES細胞に代表される多能性幹細胞の形質維持に必須な転写因子(Oct4, Sox2, Nanog)をリプログラム因子として用いるが、造血幹細胞の形質維持に重要な分子の中で、Oct4, Sox2, Nanogに相当する分子は明らかとなっていない。初年度に引き続き、E2A欠損pro-B細胞に、重要な造血転写制御遺伝子群を組み合わせて導入し、造血幹細胞・多能性前駆細胞へのダイレクトリプログラミングに挑戦したが骨髄球系前駆細胞の表現型を有する細胞が増幅されたのみで、いまだリプログラミングには成功していない。本研究においては、造血転写制御遺伝子を組み合わせて分化血液細胞に導入し、造血幹細胞へとリプログラム可能な系を確立することにより、造血幹細胞の形質を規定する転写因子群の最小限の組み合わせを明らかにすることにより、造血幹細胞制御の分子機構を理解するとともに、血液細胞の造血幹細胞へのダイレクトリプログラミングにより、iPS細胞を介さない新しい造血系再生医療の可能性を検証する。初年度は、E2A欠損pro-B細胞に、重要な造血転写制御遺伝子群を組み合わせて導入し、造血幹細胞・多能性前駆細胞へのダイレクトリプログラミングに挑戦したる。転写因子としては、Gata2, Runx1, SCL, HoxB4, ERG, Fli1, Gfi1, Gfi1B, Bmi1, Ezh2などを発現するレンチウイルスを作製し、様々な組み合わせでE2A欠損pro-B細胞に導入した。ウイルスを感染後、赤芽球・巨核球分化を誘導する条件下で培養を行い、赤芽球・巨核球分化能を有する多能性前駆細胞へのリプログラミングを誘導する遺伝子の同定を試みた。しかしながら、骨髄球系前駆細胞の表現型を有する細胞が増幅されたのみで、いまだリプログラミングには成功していない。当初の計画を順調に実施しているが、期待していた効果は得られておらず、血液細胞の造血幹細胞へのダイレクトリプログラミングには至っていない。上述のように、転写因子群による造血幹細胞・多能性前駆細胞へのダイレクトリプログラミングでは成果が得られていない。そこで、発現クローニングにより、E2A欠損pro-B細胞が多能性(赤芽球・巨核球分化能)あるいは造血幹細胞としての自己複製能を獲得し得る責任分子を同定する。具体的には、Pax5-/- pro-B細胞に造血幹細胞から作製したレトロウイルスcDNAライブラリーを感染後、赤芽球・巨核球分化を誘導する条件下で培養を行い、赤芽球・巨核球分化能を有する多能性前駆細胞へのリプログラミングを誘導する遺伝子を同定する。さらに、感染細胞を放射線照射マウスに移植し、pro-B細胞を長期骨髄再建能を有する細胞へとリプログラミングしうる遺伝子群を同定する。レトロウイルスcDNAライブラリーを用いたリプログラム因子のスクリーニングのための培養試薬や、in vivoスクリーニングのための実験用マウスの購入や飼育のために使用する予定である。
唾液腺癌由来α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの遺伝子クローニングと機能解析

癌細胞より産生される唾液腺癌由来免疫抑制物質を明らかにするために、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(α-NaGalase)の酵素活性の高い唾液腺癌細胞を用いて、癌細胞に由来するa-NaGalase遺伝子のクローニングを行なうことを目的として行った。具体的には1、顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalase精製とポリクローナル抗体の作製、2、cDNAライブラリーからクローニング、3、Gc protein、GcMAF、GM-CSFなどの生体高分子への作用とその標的細胞への影響について検討した。その結果、ホモロジー解析から本蛋白は脱糖鎖機能のみならず核酸の巻きもどし機能を有することが推測された。クローニングされたベクターを線維芽細胞に遺伝子導入したところ、細胞増殖の亢進とO-グルカナーゼ活性が認められた。α-NaGalaseのendoならびにexo活性をPNAレクチン結合試験で検討したところ、O-グルカンのシアル酸を遊離する活性がみられた。そこで、O-グリカンを有する生体高分子への影響をGcProteinとGcMAFを用いて検討した。単球/マクロファージの活性酸素産生能とラテックスビーズの貪食能は、本酵素によって低下した。すなわち、生理活性物質の脱糖鎖によって活性を低下することが示唆された。そこで、GcMAFによる単球・マクロファージの遺伝子の挙動に対する本酵素の作用をマイクロアレイで検討するため、RNAを抽出してcDNAライブラリーを作成した。その結果、α-NaGalaseは癌細胞の増殖に加え、免疫細胞の機能を抑制することが推測され、宿主免疫抑制機構の一つとして、癌細胞に由来るα-NaGalaseの作用が考えられた。顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalaseを精製し,ポリクローナル抗体を作製した.HSG細胞を無血清培養し,細胞抽出液および培養上清を回収した.ゲル濾過カラム,イオン交換クロマトグラフィーを用いて粗分画した蛋白をFPLCカラムで最終精製した.各分画におけるα-NaGalase活性をYamamotoらの方法で測定したところ,本蛋白はExo-α-NaGalase活性とEndoα-NaGalase活性が確認された.この蛋白分画をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動し分子量を同定したところ,約50kDaの蛋白バンドが得られた.精製蛋白は,フロイントアジュバントを用いてSPFウサギに免疫し,ヒトα-NaGalaseに対する抗血清を得た.さらに,抗血清からプロテインA吸着カラムを用いて,抗α-NaGalase IgGポリクローナル抗体を得た.抗体の有用性は,抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認された.HSG細胞におけるα-NaGalaseの発現を,一次抗体を抗α-NaGalaseウサギ抗体,二次抗体として抗ウサギIgGFITC標識ヤギ抗体を用いてstreptABC法で免疫染色して観察したところ,α-NaGalaseは,細胞質ならびに核内に顆粒状に存在した.以上の結果から,HSG由来α-NaGalaseは,Exo-α-NaGalase活性のみならずとEndoα-NaGalase活性を有する約50kDaの蛋白であると推測された.この蛋白は核内と細胞質内にも存在しており,核内移行蛋白であることが示唆された.今後は,cDNAの合成後,蛋白細胞発現ベクターを構築し,糖鎖修飾された蛋白を精製する予定である.顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalaseを精製し,ウサギに免疫して抗血清を得た。さらに,プロテインA吸着カラムを用いて抗α-NaGalase IgGポリクローナル抗体を得た。抗体の有用性は、抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認された.

HSG細胞におけるα-NaGalaseの発現を,一次抗体を抗α-NaGalaseウサギ抗体,二次抗体として抗ウサギIgGFITC標識ヤギ抗体を用いてstreptABC法で免疫染色して観察したところ,α-NaGalaseは,細胞質ならびに核内に顆粒状に存在した.唾液腺癌細胞のcDNAを作製する前に、ValidationのためにHeLa細胞を用いてZAP-cDNAライブラリーを作製した。Uni-ZAP XRライブラリーからmass-excisionを行いE.coli SOLRstrainでクローニングを試みた。IPTGと温度シフトによって蛋白を発現させ、抗体によってクローニングを行った。また、レクチンを用いて脱糖鎖活性を検討した。その結果、1.ホモロジーから脱糖鎖機能を有する蛋白であると推測される、2.クローニングされたベクターで発現蛋白の回収が可能である、3.α-NaGalase活性を示す蛋白は,Exo-α-NaGalase活性のみならずEndo α-NaGalase活性を有する約50kDaの蛋白であることが明らかとなった。なお、これら抗体を用いた実験手技の妥当性はATP bindingcassette transporterの抗体を用いたイムノブロットなどでvalidationを行った。今後は,唾液腺癌細胞からcDNAを作製してクローニングを行い、精製蛋白を得る予定である。癌細胞より産生される唾液腺癌由来免疫抑制物質を明らかにするために、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ(α-NaGalase)の酵素活性の高い唾液腺癌細胞を用いて、癌細胞に由来するα-NaGalase遺伝子のクローニングを行なうことを目的として行った。具体的には1、顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalase精製とポリクローナル抗体の作製、2、cDNAライブラリーからクローニング、3、Gc protein、GcMAF、GM-CSFなどの生体高分子への作用とその標的細胞への影響について検討した。その結果、ホモロジー解析から本蛋白は脱糖鎖機能のみならず核酸の巻きもどし機能を有することが推測された。クローニングされたベクターを線維芽細胞に遺伝子導入したところ、細胞増殖の亢進とO-グルカナーゼ活性が認められた。α-NaGalaseのendoならびにexo活性をPNAレクチン結合試験で検討したところ、O-グルカンのシアル酸を遊離する活性がみられた。そこで、O-グリカンを有する生体高分子への影響をGc ProteinとGcMAFを用いて検討した。単球/マクロファージの活性酸素産生能とラテックスビーズの貪食能は、本酵素によって低下した。すなわち、生理活性物質の脱糖鎖によって活性を低下することが示唆された。そこで、GcMAFによる単球・マクロファージの遺伝子の挙動に対する本酵素の作用をマイクロアレイで検討するため、RNAを抽出してcDNAライブラリーを作成した。その結果、α-NaGalaseは癌細胞の増殖に加え、免疫細胞の機能を抑制することが推測され、宿主免疫抑制機構の一つとして、癌細胞に由来するα-NaGalaseの作用が考えられた。