hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工環礁の水質浄化機能に関する研究-生態系モデルによるシミュレーション-

本研究では,(1)人工環礁の実地調査,(2)生態系モデルのレビュー,(3)人工環礁域生態系モデルの構築,を行った.以下にその概要を示す.(1)人工環礁の実地調査大阪府泉佐野市のりんくう公園内にある人工環礁において,水質,海藻の植生分布を中心とする毎月の調査,および底質,沈降物,浮遊生物,付着生物,遊泳生物を中心とする四季の総合調査を行った.その結果より,海藻の光合成作用を基礎とする生態系の物質循環が海水の溶存酵素や栄養塩濃度に大きく影響を与えていることなど,水質浄化機能に及ぼす生態系の役割をある程度明らかにした.(2)生態系モデルのレビュー従来行われてきた国内での生態系モデルに関する研究のレビューを行い,生態系モデルが,物理・化学的物質循環を基礎とする富栄養化モデル,プランクトンによる物質循環まで含めた浮遊生態系モデル,底泥の化学的物質循環とベントスによる物質循環を含めた底生生態系モデル,ある個体群の生物量と分布の変化を表す個体群動態モデル,などに分類できることを学ぶとともに,浮遊生態系モデルおよび底生生態系モデルの基本的な構築方法を学んだ.(3)人工環礁域生態系モデルの構築既存の生態系モデルの構築方法を基礎として,浮遊生態系モデルと底生生態系モデルとを組み合わせた人工環礁域生態系モデルの構築を行った.また,実地調査から得られたデータを用いていくつかの生物パラメタを導出し,これらを組み込むことによって対象海域に適応した生態系モデルを開発した.さらに,この生態系モデルを用いた数値実験を行い,人工環礁内の物質循環の定量的な評価を行うとともに,底泥食性動物を対象としたバイオマニピュレーションによる水質浄化効率の向上が可能であることを示した.平成9年度は,(1)人工環礁の実地調査,(2)生態系モデルのレビュー,(3)人工環礁域生態系モデルの基本スキームの構築,を行った.以下にその概要を示す.(1)人工環礁の実地調査大阪府泉佐野市のりんくう公園内にある人工環礁において,水質,海藻の植生分布を中心とする毎月の調査、および底質、沈降物,浮遊生物,付着生物,遊泳生物を中心とする四季の総合調査を行った.その結果,人工環礁域内の水質はほぼ一様であること,底質の栄養塩濃度や酸化還元電位が水深や基質の違いに大きく影響を受けること,海藻の光合成作用を基礎とする生態系の物質循環が海水の溶存酸素や栄養塩濃度に大きく影響を与えていることなど,人工環礁域における水質および底質の特徴を明らかにするとともに,水質浄化機能に及ぼす生態系の役割をある程度明らかにした.(2)生態系モデルのレビューこれまで(平成9年度以前)に行われてきた国内での生態系モデルに関する研究のレビューを行い,生態系モデルが,物理・化学的物質循環を基礎とする富栄養化モデル,プランクトンによる物質循環まで含めた浮遊生態系モデル,底泥の化学的物質環境とベントスによる物質循環を含めた底生生態系モデル,ある個体群の生物量と分布の変化を表す個体群動態モデル,などに分類できることを学ぶとともに,浮遊生態系モデルおよび底生生態系モデルの基本的な構築方法を学んだ.(3)人工環礁域生態系モデルの基本スキームの構築既存の生態系モデルの構築方法を基礎として,浮遊生態系モデルと底生生態系モデルとを組み合わせた人工環礁域生態系モデルの基礎スキームの構築を行った.さらに,実地調査から得られたデータを用いていくつかの生物パラメータを導出し,これらを生態系モデルに組み込むことによってモデルの精度を向上させた.本研究では,(1)人工環礁の実地調査,(2)生態系モデルのレビュー,(3)人工環礁域生態系モデルの構築,を行った.以下にその概要を示す.(1)人工環礁の実地調査大阪府泉佐野市のりんくう公園内にある人工環礁において,水質,海藻の植生分布を中心とする毎月の調査,および底質,沈降物,浮遊生物,付着生物,遊泳生物を中心とする四季の総合調査を行った.その結果より,海藻の光合成作用を基礎とする生態系の物質循環が海水の溶存酵素や栄養塩濃度に大きく影響を与えていることなど,水質浄化機能に及ぼす生態系の役割をある程度明らかにした.(2)生態系モデルのレビュー従来行われてきた国内での生態系モデルに関する研究のレビューを行い,生態系モデルが,物理・化学的物質循環を基礎とする富栄養化モデル,プランクトンによる物質循環まで含めた浮遊生態系モデル,底泥の化学的物質循環とベントスによる物質循環を含めた底生生態系モデル,ある個体群の生物量と分布の変化を表す個体群動態モデル,などに分類できることを学ぶとともに,浮遊生態系モデルおよび底生生態系モデルの基本的な構築方法を学んだ.(3)人工環礁域生態系モデルの構築既存の生態系モデルの構築方法を基礎として,浮遊生態系モデルと底生生態系モデルとを組み合わせた人工環礁域生態系モデルの構築を行った.また,実地調査から得られたデータを用いていくつかの生物パラメタを導出し,これらを組み込むことによって対象海域に適応した生態系モデルを開発した.さらに,この生態系モデルを用いた数値実験を行い,人工環礁内の物質循環の定量的な評価を行うとともに,底泥食性動物を対象としたバイオマニピュレーションによる水質浄化効率の向上が可能であることを示した.
細胞増殖・癌化の細胞内情報伝達とイノシト-ルリン脂質代謝

チロシンキナ-ゼとイノシト-ルリン脂質情報伝達系のクロスト-クは、ホスホリパ-ゼCγ(PLC)、PI3キナ-ゼなどSH_2/SH_3領域を介して行なわれている。このSH_2はチロシンリン酸化部位を認識すると考えられているが、どの様なアミノ酸配列が認識に重要であるかわかっていない。我々は、SH_2含有蛋白によく保存されているアミノ酸配列の各種合成ペプチドを作り、EGFーRとPLCーSC_2との結合への影響を調べた。8つのアミノ酸よりなるGSFLVRESが最も阻害活性が高くこの部位が結合に重要な役割を果たしていることがわかった。更にこのアミノ酸配列を認識する抗体を作り、SH_2を持つ新規蛋白を捜したところ、28KDaの蛋白が見つかった。本蛋白はチロシンリン酸化したEGFーRと結合でき、どこの組織にも豊富に存在した。一方、pp60^<vーsrc>の標的蛋白として、カドヘリン・カテニン複合体を見つけた。リン酸化を受けると細胞間凝集能の低下が生じること、チロシンキナ-ゼの阻害剤であるハ-ビ-マイシンでリン酸化が抑制され、凝集能が戻ることから、癌の転移・浸潤に関係しているかも知れないと考えられた。哺乳動物の各種PLCのうち相同性の高い部位をプライマ-として、酵母よりPLCをコ-ドする遺伝子のクロ-ニングを行った。すると、PLCδと最も似かよったPLCー1、という遺伝子がとれてきた。本遺伝子を欠失させると酵母の増殖が極めて遅くなった。
分子結合技術を用いた造影剤による革新的がんCT画像化技術の開発

CTの造影剤はがんに対しては非特異的であるが、一方、糖誘導体「F-18FDG」を放射性トレーサーとして用いたPositron Emission Tomography(PET)検査はがん細胞の糖代謝異常亢進をみる検査であり、がんへの特異性が高い分子イメージングである。しかし、PET装置では放射性核種の半減期が短いことや大規模な設備が必要な点でCT装置と比べると汎用性が低い。最近、分子と分子を細胞内や細胞表面で接着させるクリック反応技術が注目されており、この技術を応用し、CT造影剤とトレーサー分子となるがんマーカーをクリック反応させて、CTによる新たな特異的がんイメージング技術の開発を目指す。
運動パターン形成と分岐理論およびその歩行ロボット実現への応用

動物は、如何なる足数を持つものでも一般的に歩行周期に対する接地時間比(デューティ比)によって最適な歩行パターンを形成・選択している。そのことは既にHoytらの馬の単位距離当たりの酸素消費量を調べた研究などで明らかになっている。そこで本研究では六足歩行ロボットの歩行時の消費エネルギーに注目し、動物において見られる特性がロボットにも成立するかどうかを実験的に検討を行った。まず、本研究における供試機としてISロボティクス社製のGenghisIIを用い、これに六足動物の代表である昆虫に多く見られるWave、Tripodという2種類の歩行パターンで歩行を行わせた。そして、これらの歩行パターンにおいて歩行速度を変化させるパラメータ(デューティ比及び歩幅)を変化させ、それぞれの歩行速度での歩行時における単位距離当たりの平均消費エネルギーを求めた。その結果、Waveでは、単位距離当たりの平均消費エネルギーが最小となるよな各歩幅に対するデューティ比、並びに各デューティ比に対する歩幅が存在し、歩幅が小さくなるに従ってデューティ比も小さくするほうがよいことが分かった。一方Tripodでは、デューティ比に拘らず歩幅が最大の時、つまり歩行速度が大きいほど単位距離当たりの平均消費エネルギーが最小となることが分かった。これらの結果を、上述の馬に関する研究で各歩行パターンにおける酸素消費量が少なくなるような最適な歩行速度が存在するという結果と比べると、Waveの場合は同様な特性が現れるが、Tripodの場合は歩行速度が大きいほど平均消費エネルギーが少なくなるのみであった。脚式歩行ロボットの特性として、サーボモータやその制御回路、各種センサの特性、プログラミング方法や、コンピュータ・インターフェイス、電源機構などを調べた。また、予備的な実験として、ウェーブ歩行からトライポット歩行まで、5種類の歩行パターンをプログラミングし、歩行実験を行った。また、これらの歩行パターンにおいて、単位移動距離あたり消費されるエネルギーを計測するため、電源部に電流計測回路を設計・制作・追加した。本実験により、実際に歩行速度、歩行パターン、消費エネルギーの関係を計測し、消費エネルギーをおさえるふさわしい歩行パターンが存在し、それは歩行速度に依存して変化することを確認した。脚式歩行ロボットの機械的・電気/電子的特性に関する解析・理解、および各種インターフェイスやプログラミング言語・プログラミング方法に関する解析・理解はほぼ完了した。この点は当初の計画通りである。また、歩行速度、歩行パターン、消費エネルギーの関係の計測・解析が行えたのは、当初の計画を越えるものである。しかし、現在の脚式歩行ロボットの駆動回路では、脚を動かすサーボモータの微妙な速度制御が困難なことが判明した。このため、上の計測は比較的せまい範囲でしか行えなかった。現在、サーボモータの速度制御用回路の設計・制作・追加を実験中である。生物のような柔軟な動きを実現するためにはサーボモータの微妙な速度制御が必要であり、現在、その実現へ向けて研究・開発を行っている。それが完了すれば、消費エネルギーが減少するように歩行パターンを分岐・変化させる柔軟な動きをする脚式歩行ロボットの実現へ向けた研究へと進めることができる。生物の歩行運動における各脚の周期パターンは、一般に安定平衡状態としてリミットサイクルを持つ常微分方程式系でモデル化される。これらを相互作用させたときの周期パターン形成およびその周期パターンの分岐に関して、生物における中枢パターン発生器(CPG)と呼ばれるモデルがある。実際にはCPGの指令により肢体(脚式歩行システム)を物理的に駆動しなければならない。また、その駆動時の情報からCPGにより発生される周期パターンをふさわしく修正、分岐、自己組織するよう、CPGを構成する必要がある。そこで本研究では、実際に脚式歩行ロボットを用いて実験することにより、運動パターン形成のための分岐理論と、その歩行ロボット実現への応用法の確立を目的とする。研究実績としては、エネルギー効率を考慮した脚式移動ロボットの歩行パターン生成についてシミュレーション手法を提案したが、計算時間をかなり削減する必要があるため、その結果はまだ得られていない。一方、自律分散システムを用いた多脚歩行ロボットに必要となる機能とそのアルゴリズムについては、シミュレーションによって、各歩容が実現されかつ移動速度の変化に伴い歩容も滑らかに変化することが確認された。しかし、脚の本数が増加するにつれ著しく歩行速度が遅くなる。これを解決するためには脚の本数に応じても歩容を変更する必要がある。また、遊脚を許可する目安になるポイントと脚の本数と関係について、理論的な裏付けのとれたルールを今後検討する必要がある。

これらの結果を、上述の馬に関する研究で各歩行パターンにおける酸素消費量が少なくなるような最適な歩行速度が存在するという結果と比べると、Waveの場合は同様な特性が現れるが、Tripodの場合は歩行速度が大きいほど平均消費エネルギーが少なくなるのみであった。
化学物質の肝毒性発現におけるＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の役割に関する研究

中枢神経系で重要な役割を果たすNMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)の2Cサブユニットの遺伝子(Grin2c)が、肝細胞肥大誘発作用、肝細胞傷害性あるいは肝細胞増殖性肝肥大誘発作用を示す化学物質の投与ラット肝臓で顕著に発現亢進することを見いだし、これら化学物質の作用にNMDARが何らかの役割を果たすものと推定された。しかし、肝細胞株でこのような化学物質によるGrin2c遺伝子の発現亢進を見いだすことができず、他の細胞種から産生される因子など間接的な要因で発現亢進が引き起こる可能性が考えられた。本研究では、NMDA受容体2Cサブユニット(NR2C)遺伝子の発現亢進とそれに伴うNMDA受容体の機能変化が、環境化学物質(医薬品、農薬、食品添加物を含む)の肝肥大誘発作用、肝細胞傷害性、肝発がん性といった肝毒性発現にどのように関わるかを明らかにすることを目的としている。1年目は、(1)肝がん細胞で機能しうるNMDA受容体が発現していること、(2)その発現が細胞増殖に関連していること、(3)肝細胞増殖を伴う肝肥大を惹起する硝酸鉛のラットへの投与により、肝肥大の度合いに応じて、NMDA受容体NR2Cサブユニット(Grin2c)遺伝子の発現亢進率が上昇することから、フェノバルビタール(PB)、クロフィブレート(CF)、ピペロニルブトキシド(PBO)といった肝細胞肥大誘発を伴う肝肥大のみならず、肝細胞増殖を伴う肝肥大でもNMDA受容体が何らかの機能を発揮する可能性があることなどを示した。2年目は以下のような研究を実施した。1.肝細胞肥大を伴う肝肥大を惹起するとされる肝発がんプロモーターであるβナフトフラボン(BNF)、インドール-3-カルビノール(I3C)、および肝細胞傷害作用有するアセトアミノフェン(AA)をラットに投与し、得られた肝臓RNAでのGrin2c遺伝子の発現を検討した。その結果、I3CとAA投与群では顕著なGrin2c遺伝子発現亢進が認められたが、BNF投与群では有意な発現亢進は認められなかった。このことから、肝細胞傷害過程で、NMDA受容体が何らかの機能を発揮する可能性、Grin2c遺伝子発現は特定のタイプの肝肥大形式で引き起こる可能性が考えられた。2.種々培養細胞株に、PB、CF、PBOを処理し、Grin2c遺伝子の発現誘導性を検討したが、現段階では、その誘導性を確認することが出来なかった。本研究では、NMDA受容体2Cサブユニット(Grin2c)遺伝子の発現亢進とそれに伴うNMDA受容体の機能変化が、環境化学物質(医薬品、農薬、食品添加物を含む)の肝肥大誘発作用、肝細胞傷害性、肝発がん性といった肝毒性発現にどのように関わるかを明らかにすることを目的とする。1年目は、肝がん細胞で機能しうるNMDA受容体が発現していること、その発現が細胞増殖に関連していること、肝細胞増殖を伴う肝肥大を惹起する硝酸鉛のラットへの投与により肝肥大の度合いに応じてGrin2c遺伝子の発現亢進率が上昇することから、肝細胞肥大誘発を伴う肝肥大のみならず、肝細胞増殖を伴う肝肥大でもNMDA受容体が何らかの機能を発揮する可能性があることなどを示した。2年目は、肝細胞肥大を伴う肝肥大を惹起するとされる肝発がんプロモーターであるβナフトフラボン(BNF)、インドール-3-カルビノール(I3C)、および肝細胞傷害作用有するアセトアミノフェン(AA)をラットに投与し、得られた肝臓RNAでのGrin2c遺伝子の発現を検討した。3年目である平成25年度は、種々培養細胞株に、肝肥大誘発化学物質を処理し、Grin2c遺伝子の発現誘導性を検討したが、現段階では、その誘導性を確認することが出来なかった。また、NMDA受容体が発現している肝がん細胞にNMDA受容体に対する阻害剤メマンチン処理を行い、そのRNAについて、DNAマイクロアレイにより実施し、現在、遺伝子発現の網羅的解析を実施中である。本研究代表者は、フェノバルビタール、クロフィブレート、ピペロニルブトキシドなどの肝細胞肥大誘発作用を有する非遺伝毒性物質をラットに投与後、その肝臓において、NMDA受容体2Cサブユニット(NR2C)遺伝子が異常に発現亢進することを見出している。

本研究は、この発現亢進とそれに伴うNMDA受容体の機能変化が、環境化学物質(医薬品、農薬、食品添加物を含む)の肝肥大誘発作用、肝細胞傷害性、肝発がん性といった肝毒性発現にどのように関わるかを明らかにすることを目的とした。本年度は以下のような研究を実施した。1.ヒト肝がん由来細胞株であるHepG2、Huh-7細胞での各種NMDA受容体サブユニット遺伝子の発現を解析し、これら細胞株で機能しうるNMDA受容体が発現している可能性を見いだした。2.上記2種細胞株に対し、NMDA受容体に対する阻害剤であるメマンチンを暴露し、細胞増殖抑制が引き起こることを見いだした。このことから、これら細胞株で発現するNMDA受容体は、細胞増殖に何らかの機能を有している可能性を見いだした。3.ラットへの硝酸鉛投与により、肝細胞増殖を伴う肝肥大が惹起される。本研究代表者は、その感受性がSDラット>Wistar-Kyoto(WKY)ラット>脳卒中易発性高血圧自然ラット(SHRSP)であることを既に報告している。これら系統へ硝酸鉛を単回投与し、肝臓でのNMDA受容体NR2Cサブユニット遺伝子の発現を検討したところ、SDラットでは投与6時間後から顕著な発現亢進が見られ、48時間後には約80倍に達した。一方、WKYラットでは投与12時間後に約20倍の一過的な発現亢進が見られたのみで、また、SHRSPでは発現の亢進が認められなかった。このことから、硝酸鉛が惹起する肝肥大においてもNMDA受容体NR2Cサブユニットの発現亢進が何らかの意義を持つものと思われた。本研究では、NMDA受容体2Cサブユニット(Grin2c)遺伝子の発現亢進とそれに伴うNMDA受容体の機能変化が、環境化学物質(医薬品、農薬、食品添加物を含む)の肝肥大誘発作用、肝発がん性といった肝毒性発現にどのように関わるかを明らかにすることを目的としている。当該年度は、前年度からの継続で、HepG2細胞株やHuh-7細胞株などのヒト肝がん細胞株に、これまでのラット投与実験で肝Grin2c遺伝子の発現を亢進させた肝肥大誘発化学物質を処理し、Grin2c遺伝子の発現誘導性を検討した。しかし、誘導性を確認することは全くできなかった。このことから、1つには、Grin2c遺伝子の発現亢進は、肝肥大誘発化学物質の直接的作用で引き起こるものではなく、肝実質細胞以外の肝臓内細胞種から肝肥大誘発化学物質刺激により産生された何らかの因子が肝実質細胞に作用することにより引き起こる可能性が想定された。また、がん細胞あるいは株化細胞におけるGrin2c遺伝子は、化学物質に対して転写応答能を失ってしまった可能性も考えられた。今後は、初代肝細胞や、種々肝臓内の細胞種を混合させた培養、肝細胞以外の非神経系由来細胞株などを用いて、Grin2c遺伝子の化学物質による応答性を検討する必要がある。分子毒性学PB、CF、PBO、硝酸鉛といった肝肥大誘発物質に加えて、2年目は、さらにBNF、I3Cといった肝肥大誘発物質とAAといった肝傷害性物質をラットに投与後、肝Grin2c発現を検討し、新たに、肝細胞傷害過程で、NMDA受容体が何らかの機能を発揮する可能性、Grin2c遺伝子発現は特定のタイプの肝肥大形式で引き起こる可能性を見いだしたことは大きな成果であると考える。しかしながら、本研究の大きな目的であるGrin2c遺伝子の発現亢進メカニズムとNMDA受容体の肝細胞における機能の解明については、PB、CF、PBOを処理した培養細胞株で、Grin2c遺伝子の発現亢進が現段階では認められておらず、難航を極めている。この点から、本研究の達成度は「やや遅れている」と判断せざるを得ない。
FALSにおけるプロテアソーム機能低下に伴うSOD過剰発現の機構解明と治療

SOD1遺伝子変異を原因とするFALSのモデルマウスおよび患者の皮膚線維芽細胞における変異SOD1蛋白の蓄積機序について検討した。主としてユビキチン-プロテアソーム系(UPS)により分解される変異SOD1蛋白は、UPS機能低下状態では分解機能低下により増加するが、その増加は単なる分解抑制のみによるのではなく、UPS機能低下状態での過剰発現が関与していることを明らかにし、その経路にはp38-MAPKが関連していることを明らかにした。UPS機能低下状態でのSOD1蛋白過剰発現は変異SOD1蛋白蓄積ひいてはFLAS病態における重要な要素である。プロテアソーム阻害に伴うSOD1蛋白過剰群現の機序の解明これまでに解明したプロテアソーム阻害によるSOD1蛋白過剰発現の機序を解明するため、そのシグナル伝達に係わっている可能性を考えていたMAPK-p38、MAPK-ErkI、MAPK-JNK、PI3Kについて解析した。培養線維芽細胞内で起こるMG-132誘導SOD1発現に対して、それぞれの阻害剤を加えて検討したところMAPK-p38阻害剤であるSB203580で著明に抑制され、MAPK-JNK阻害剤であるSP60012が部分的に抑制したこと。このことからmPK系がSOD1過剰発現に強くかかわっていることがわかった。さらにその裏付けとして、1)MG132によるp38-MAPK活性化の確認。2)mRNAレベルでのSOD1過剰発現の抑制効果の確認。を行った。その結果、いずれも裏付ける結果が得られた。今年度まででプロテアソーム阻害によるSOD1蛋白過剰発現にはMAPK(特にp38-MAPK)を関与することを明らかにした。次年度以降、この結果をもとにさらに研究を進める。プロテアソーム阻害に伴うSOD1蛋白過剰発現の機序の解明昨年度までにプロテアソーム阻害によって起こるSOD1蛋白過剰発現のシグナル伝達にMAPK-p38が強く係わっていることをマウス皮膚線維芽細胞で確認してきた。今年度、同様の現象が同様の遺伝子変異を持つFALS患者の皮膚線維芽細胞で認められるものか検討した。結果、患者組織ではこれまで確認が困難であった変異SOD1蛋白がMG132存在下では容易にウエスタンブロットで確認出来た。マウスで確認された同現象がヒト培養細胞でも確認された。さらに、ノザンブロットでも発現上昇が確認出来、SOD1蛋白の発現増加はRNA過剰発現に由来するということが証明できた。昨年までの研究でマウスで確認された現象がヒト培養細胞でも確認できた。プロテアーゼ酵素活性の検討今年度は遺伝性変性疾患であるハンチントン病(HD)の皮膚線維芽細胞の活性を検討した。HDでは正常対照に比してプロテアソーム活性の低下/上昇は認めず、カテプシン系(カテプシンK、S/L、K)の活性上昇が認められた。SOD1変異マウスでプロテアソーム活性が低下するとの報告があるが、遺伝性変性疾患であるHDでは異なった結果であった。これを疾患対照ともしながら、研究をさらに進めていく。FALSの原因遺伝子産物である変異SOD1蛋白はユビキチン化され、プロテアソームで分解されると考えられ、MG132を用いたプロテアソーム阻害下でユビキチン化した正常SOD1、変異SOD1蛋白をウエスタンブロットで検討したところ、変異SOD1蛋白はポリユビキチン化されたスメア状に検出された。このことから変異SOD1蛋白がユビキチン化され、プロテアソームで分解されることを明らかにした。プロテアソーム阻害下で変異SOD1が大幅に増加する現象について着目し、神経細胞内で蓄積する機序に分解抑制だけでなく過剰発現機序が関わっている可能性を考えた。プロテアソーム阻害下においてActinomycinDによる転写抑制をかけたところ、変異SOD1蛋白量は大幅に減少した。このことからプロテアソーム阻害下ではSOD1蛋白が過剰発現することを明らかにした。SOD1遺伝子に変異をもつことでFALSが発症する機序には、SOD1蛋白が運動ニューロンに発現しやすく、プロテアソーム機能低下状態で蓄積することだけでなく、プロテアソーム阻害下で過剰発現することが関わっていると考えた。この現象にはプロモーターが関与していると考えられ、トランスジェニック動物の発症にプロモーターを含めた導入が有用であることにも関係していると推測できる。プロテアソーム阻害下でのSOD1過剰発現の機序について、シグナル伝達に関わる蛋白を検索するため、阻害剤、リン酸化反応を用いて蛋白発現を検討したところMAPK-p38が強く係わっていることを確認した。この現象はヒト皮膚線維芽細胞でもほぼ同様の結果が確認できたことから、患者生体内での変異SOD1蛋白の細胞内蓄積の機序にプロテアソーム阻害に伴うSOD1蛋白過剰発現が関わっていることが明らかにできたと考えた。
細胞がん化過程の時空間制御機構の解析

癌遺伝子情報伝達系の統合的理解を目指し、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理の基づくバイオセンサーの開発とシミュレーションモデルの構築とを行った。上皮細胞増殖因子受容体の制御機構を理解するために、多くのFRETバイオセンサーを開発した。これらのバイオセンサーや生化学的手法を使って、細胞内情報伝達因子の活性制御に関わるパラメータを計測し、実測データに基づくシミュレーションモデルを構築した。がん化の過程をコンピューター上で再現するシステムを構築できれば、ピンポイントの創薬や、理論に基づいたオーダーメイド治療法の選択などが極めて迅速にできるようになることが期待されている。われわれは細胞がん化にきわめて重要な役割を果たす細胞増殖情報伝達系(チロシンキナーゼ-Ras-Raf-MARK)の情報伝播過程の画像化を行い、その実測データに基づくシミュレーションの構築を行った。昨年度までにFRETプローブを使って活性変化の動態を解析したので、本年度は、まず、DronpaというOn/Offができる蛍光蛋白を使って分子間の解離定数を測定した。さらに、個々の分子の濃度、脱リン酸化酵素により不活化の速度などを定量的イムノブロッティング法を用いて測定した。これらのデータをもとに最小必須コンポーネントからなるシミュレーションモデルを構築した。このモデルにおいて、Rafの量がこの情報伝達系のシグナルの強度をもっとも規定していることが予想された。そこで、RNAiを用いてRafをノックダウンしその影響を解析したところ、確かに、細胞内のRafの量がこの細胞増殖情報伝達系の強度の設定に大きな影響を与えていることが明らかとなった。一方、このモデルではシグナルの強度は情報伝達の下流に行くほど低下していくが、実際にシグナル強度は逆に強くなっていくことが分かった。今後、この原因を突き詰めていくことで、Ras/Raf/MEK/ERK情報伝達系の活性制御機構についてより深い理解が得られるものと期待される。がん化の過程をコンピューター上で再現するシステムの構築へ向けて研究を続けている。本年度は、悪性黒色腫や甲状腺がん、大腸がんなどで高頻度に変異の認められるBRafにつきその情報伝達のメカニズムを解析した。BRafは全体としてはcRafと非常に高い相同性を有しているが、そのN末端側にBRafに特徴的な約100アミノ酸からなる領域(BRSR)を有している。BRafの構造変化をモニターするFRETプローブを用いて解析し、以下の知見を得た。(1)BRafもcRaf同様に、刺激前は不活性型閉構造、刺激後は活性化型開構造をとる。(2)活性化型開構造をとるにはRasに結合することが必要である。(3)BRSRはBRafどうしのホモダイマーおよびcRafとのヘテロダイマーの形成を司る。(4)BRSRによるダイマー形成にはPLC依存性の細胞内カルシウムの動員が必要である。(5)ダイマー形成により、Rasへの親和性が増強し、細胞膜上への移行が促進される。これらの結果を昨年度報告したシミュレーションモデルに導入し、Rasの活性化が見られなくとも、細胞内カルシウムの増加によりRaf、MEK、ERKの活性化が観察されうることをインシリコで確認した。この結果は、上皮細胞増殖因子受容体から伝播される細胞増殖シグナルが、Rasを介する経路とカルシウムを介する経路とに一旦別れた後、BRafのレベルで合流することを示している。このような情報の分枝化や再合流は、細胞増殖シグナルの不規則な発火を抑え、増殖シグナル伝播の信頼性を上げるものと考えられる。また、この結果は、BRafがcRafよりもがん化能が高い理由の少なくとも一部は、カルシウムシグナルにより活性が増強される性質を有していることから説明できることを示しており、抗がん剤とカルシウム拮抗薬との併用ががん治療に有用ではないかと示唆するものである。増殖因子刺激情報伝達系のシミュレーションモデル構築のために、FRETプローブの作成と、モデル構築とを並行して行った。まず、リン脂質PIP3,PI(3,4)P2に対するFRETプローブおよびセリンスレオニンキナーゼAktに対するFRETプローブを作成した。増殖因子刺激情報伝達系のモデルとしては、神経細胞増殖因子により刺激されたPC12細胞を使った。この系において、リン脂質代謝系と低分子量GTP結合蛋白とのクロストークについて解析を行った。その結果、Rac1およびCdc42と、PI3キナーゼとの間にはポジティブフィードバックループとネガティブフィードバックループの両者が同時に存在することがモデル構築により明らかとなった。そこで、そのネガティブフィードバックループの実体解明を試み、PIP3-5'フォスファターゼの一つSHIP2が、PC12細胞における神経突起の数を決めるのに重要な働きをしていることが明らかとなった。一方、上皮細胞増殖因子受容体によるPI3キナーゼ情報伝達系の下流因子として重要なAktの活性化機構については、以下に示す知見を得た。PI3キナーゼにより産生されたPIP3およびPI(3,4)P2により、Aktがまず細胞膜ヘリクルートする。このAktおよびPIP3を足場としてPDK1が細胞膜へ局在化する。

以上のように、本年度の研究により増殖刺激におけるG蛋白、リン酸化酵素、およびリン脂質代謝系の間のクロストークが明らかになった。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の原理を利用して、細胞増殖情報伝達系の因子の活性を測定するプローブ群の開発を行い、これら細胞がん化に重要な役割を果たす分子群の活性化状態の画像化を行い、さらに、そのデータをもとに細胞増殖情報の伝播過程を定量的に解析し、得られたパラメータをもとに、細胞増殖情報伝達系のインシリコでの再構築を行った。まず、上皮細胞増殖因子情報伝達系のシミュレーションモデルの改良するために、ERK、MEKの核内外移行速度の計測を新しい技術を開発して行った。さらに、脱リン酸化の速度を定量的に評価した。現在、これらのデータを組み込んだ反応をシミュレーションモデルを構築中である。次に、上皮細胞増殖因子から形態変化を誘導する情報伝達系の解析を行い、APCに結合するAsefが上皮細胞増殖因子依存性のRac1の活性化に重要であることを見出した。最後に、イノシトールリン脂質の濃度を測定する一群のFRETバイオセンサーを開発し、細胞運動時のイノシトールリン脂質の濃度勾配を測定した。この濃度勾配のデータをもとに、イノシトールリン脂質の代謝系の動態モデルを作成した。今後、このイノシトールリン脂質系を上記、細胞増殖シグナル系のモデルと統合し、細胞の形態と増殖シグナルとをモデル化していく予定である。21世紀生物学の大きな流れは、生命現象のコンピューター上での再現である。がん研究においては、がん化の過程をコンピューター上で再現するシステムを構築し、これを使うことによって、もっとも効率的にがん細胞の増殖を止めうる分子を狙い撃ちにしたピンポイントの創薬や、理論に基づいた個人に至適なオーダーメイドの治療法が可能となる。本研究は、この目的に向かって、下記の研究を遂行した。1.上皮細胞増殖因子情報伝達系のシミュレーションモデルの改良:新たな実測データをパラメータ化し、version2のシミュレーションモデルを完成させた。2.スキャッフォールドタンパク質を組み込んだシミュレーションモデル:スキャッフォールドタンパク質Shoc2/Sur8の機能を解析し、それを組み込んだモデルを完成させた。Shoc2/Sur8はカルシウム情報伝達系とRas/MAPK情報伝達系の接点として機能していることが明らかになったので、これにより、細胞増殖因子情報伝達系とカルシウム情報伝達系のクロストークを組み込んだことになる。3.グアニンヌクレオチド交換因子Sosの多段階リン酸化の導入:上記モデルに、SosのERKによるリン酸化、ならびにネガティブフィードバックモデルを追加し、モデルの制度を向上させた。以上の研究により、実測データに元ずくシミュレーションモデルに、細胞増殖情報伝達系とカルシウム情報伝達系の一部と実装することができた。今後、細胞形態の維持に関わる情報伝達系などを実装していくことでより精巧なモデルができるものと期待される。
肺腺癌の診断,悪性度診断の客観化を目指した遺伝子診断システムの確立

肺腺癌に特異的な遺伝子変化,肺腺癌の生物学的挙動に関連した遺伝子変化を同定する目的で,肺腺癌の発現プロファイルの解析を進めた.1)浸潤関連遺伝子,判別マーカーの同定:レーザーマイクロダイセクション法とDNA chipを用い,肺腺癌辺縁部,中心部癌細胞,ならびに細気管支肺胞上皮癌細胞(BAC)と正常肺における発現プロファイルの比較を行った.正常部で発現が低く,辺縁部癌細胞で発現亢進していたプローブを71個,中心部癌細胞で亢進していたもの105個,辺縁部と中心部で共通して発現亢進が見られたもの81個を抽出した.中心部高発現105プローブから,BACで発現亢進していた25個のプローブを差し引き,重複したプローブ,ESTを差し引いた65個の遺伝子を肺腺癌浸潤関連遺伝子として,解析を進めている.このうち10個は肺非小細胞癌の予後,転移マーカーとして既に報告されていた.47個については,肺以外の臓器の癌で発現亢進,腫瘍形成に関係しているという報告があった.8個が癌での機能が未知の遺伝子であった.さらに肺腺癌とBACの判別マーカーとなる候補遺伝子についても解析を進めている.2)癌抑制遺伝子候補の臨床病理学的意義:p73ならびにTSLC1の肺腺癌外科切除例に対する発現解析を行った.p73は63例(66%)において癌細胞の核内に陽性所見がみられた.P73陰性所見は65歳以上の症例に多く,発現低下は単変量,多変量解析で有意な予後不良因子であった.一方,TSLC1は,93例中33例にのみ陽性で,TSLC1陰性所見は男性例,低分化癌に多くみられた.TSLC1発現低下は予後不良因子であったが,とりわけ男性例において顕著であった.P73は高齢者,TSLC1は男性腺癌における進展に関与する癌抑制遺伝子であり,不均一な肺腺癌における層別化に有効なバイオマーカーとなることが示唆された.肺腺癌に特異的な遺伝子変化とともに,肺腺癌の生物学的挙動に関連した遺伝子変化を同定する目的で,肺腺癌の発現プロファイルのDNA chipによる解析を進める.今年度は,これらの解析における基本的な問題である以下の3点について検討を行った.癌内部の発現不均一性:肺腺癌では,しばしば中心部に瘢痕形成が見られ,瘢痕形成部の腫瘍細胞は腫瘍周辺部の腫瘍細胞に比べより悪性度の高い組織像を示すことが多い.免疫組織化学的解析を行い,細胞周期関連蛋白の中でもcyclinD1以降の制御機構が癌中心部,辺縁部で異なっていること,さらに腫瘍中心部(特に浸潤先進部)においてlaminin-5とcox-2が共発現していること,アクチビンAの発現が辺縁部でむしろ亢進していることが見出された.今後,肺腺癌の癌中心部,辺縁部をマイクロダイセクションし遺伝子発現プロファイルを解析する際,結果の妥当性を検証する上で有用な情報となる.マイクロダイセクション試料へのDNA chip応用に関する技術的問題:マイクロダイセクション試料をDNA chip解析するためには,可及的に試料の回収を短時間に行うことが必要であるが,凍結切片を20秒という短時間で染色を行ってもRNA integrityの低下が避けがたいことが明らかとなった.凍結に代えて,何らかの固定を行った材料から出発する等,新たな技術開発を早急に行う必要性がある.肺癌の発現情報解析のためのバイオインフォマティックスの開発:マイクロアレイで測定された発現情報と染色体上の位置情報を統合することによって,遺伝子単位による詳細な異常領域の同定が期待されている.本手法を用いると,異常領域を数百Kベースの解像度による同定が可能であり,実用性は極めて高いが,発現量の絶対値が低いとSN比も低くなってしまう現状では,抑制異常領域よりも増幅異常領域の同定の方が精度が高いと考えられた.肺腺癌に特異的な遺伝子変化、あるいは肺腺癌の生物学的挙動に関連した遺伝子変化を同定する目的で、肺腺癌の発現プロファイルの解析を進める。本年度は、以下の3点について検討を行った。(1)肺腺癌の血清診断、治療標的の同定に向けたプログラムの開発とその応用:肺腺癌12症例と正常各臓器での遺伝子発現プロファイルのデータを比較解析し、非癌肺組織よりも肺腺癌で高発現している遺伝子の中から診断、治療標的の候補を12種類選出した。候補遺伝子を効率よく選出するため、従来のような手作業でなく、臓器の大きさや臓器特異的な血管構造などを考慮した臓器ごとに閾値を設定し結果を見ながら閾値設定を変化できるインタラクティブなシステムを構築した上で遺伝子の選出を行った。(2)トランスクリプトームの情報からゲノムの増幅、欠失を予測するプログラムの開発とその妥当性の検証:網羅的に解析可能なtranscriptomeの情報からからゲノムの欠失、増幅等の癌の原因となり得る構造異常を検出するExpression Imbalance Mapというアルゴリズムを開発した。この方法は従来のCGHよりも高い分解能でゲノムの構造異常を検出可能であった。また正常肺と肺扁平上皮癌のDNA chipによって得られた発現情報をこの手法により解析することにより、従来CGH等で報告されているゲノムの増幅、欠失とよく一致した結果が得られることを確認した。

(3)炎症・創傷治癒と浸潤・転移に共通して発現誘導される遺伝子の解析:癌の浸潤・転移に重要な遺伝子の中には、炎症・創傷治癒の過程で誘導される物質が多い。その代表的物質であるlaminin-5のγ2鎖に注目し、その転写開始地点の上流1.5kbの領域の解析を行った。また培養細胞を用いた「引っ掻きアッセイ」が、癌の浸潤先進部における遺伝子発現誘導のモデルになることを確認した。肺腺癌に特異的な遺伝子変化,あるいは肺腺癌の生物学的挙動に関連した遺伝子変化を同定する目的で,肺腺癌の発現プロファイルの解析を進めている.1)炎症・創傷治癒に関連した遺伝子としてS100蛋白ファミリーに注目した.肺の正常上皮細胞株と肺腺癌細胞株7株におけるS100family蛋白16種類の発現を比較した結果,最も顕著な違いを示すものはS100A2,S100A4,S100Pであった.小型肺腺癌手術症例における免疫組織化学的な検討では,S100A2陽性症例は予後良好の傾向がみられたが,S100A4陽性例では予後不良であった.さらに,S100A2,S100A4について,A549肺腺癌細胞株を用い,遺伝子導入による発現増強によって下流遺伝子の同定を行った.その結果,S100A2下流には増殖,アポトーシス関連遺伝子が含まれており,また,発現が変動する遺伝子の多くは,細胞表面の膜内蛋白であった.2)肺腺癌瘢痕部での癌細胞の挙動を探る手がかりとして,低酸素ストレスによって誘導される肝腺癌細胞の生物学的挙動の変化,遺伝子発現変化について検討した.A549肺腺癌細胞株は低酸素状態では,増殖抑制,細胞接着の低下,紡錘状形態変化を示す一方,運動能の亢進がみられた.低酸素下24時間,48時間後の遺伝子変化を網羅的に解析したところ,hexokinase2(glycolysisのrate limiting enzyme),VEGF, LOX, LOX like 2などの遺伝子において発現増強がみられた.一方,遺伝子機能database(Gene Ontology)を用いた解析により,発現が低下している遺伝子群には,DNA修復に関連するものが含まれていることが判明した.3)ExpressionImbalance Mapによる肺腺癌細胞株のトランスクリプトーム解析を行い,ゲノム上共通して発現の低下している領域より癌抑制遺伝子の候補遺伝子を100個同定した.さらにSNIPを利用した新たなアルゴリズム,マイクロダイセクションの微小検体のトランスクリプトーム解析を組み合わせ,高解像度で癌抑制遺伝子の候補遺伝子の絞込みを行っている.肺腺癌に特異的な遺伝子変化,肺腺癌の生物学的挙動に関連した遺伝子変化を同定する目的で,肺腺癌の発現プロファイルの解析を進めた.1)浸潤関連遺伝子,判別マーカーの同定:レーザーマイクロダイセクション法とDNA chipを用い,肺腺癌辺縁部,中心部癌細胞,ならびに細気管支肺胞上皮癌細胞(BAC)と正常肺における発現プロファイルの比較を行った.正常部で発現が低く,辺縁部癌細胞で発現亢進していたプローブを71個,中心部癌細胞で亢進していたもの105個,辺縁部と中心部で共通して発現亢進が見られたもの81個を抽出した.中心部高発現105プローブから,BACで発現亢進していた25個のプローブを差し引き,重複したプローブ,ESTを差し引いた65個の遺伝子を肺腺癌浸潤関連遺伝子として,解析を進めている.このうち10個は肺非小細胞癌の予後,転移マーカーとして既に報告されていた.47個については,肺以外の臓器の癌で発現亢進,腫瘍形成に関係しているという報告があった.
リポソームの糖修飾に関する研究

アミノ糖脂質および中性糖脂質を合成し、糖修飾リポソームを調製、そのリポソームの毒性、体内動態、および肝臓取り込みのメカニズムを肝灌流法等によって検討し以下の知見を得た。1、アミノ糖修飾リポソームは、従来リポソームに正電荷を付与するために用いられてきた塩基性脂質ステアリルアミンを組み込んだリポソームより、かなり低い溶血活性および毒性を示した。2、ラットにおいてアミノ糖修飾リポソームを投与したものは肝臓の取り込みが抑制されており、高い血中滞留性を示したが、中性糖修飾リポソームは未修飾リポソームと変わらなかった。このことから正電荷が肝臓の取り込みを抑制に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。3、肝臓灌流実験より、アミノ糖修飾リポソームは灌流液中では未修飾リポソームや中性糖修飾リポソームに比べ高い取り込みを示したが、灌流液中に血液を添加した場合、アミノ糖修飾リポソームの肝臓による取り込みが抑制されることがわかった。未修飾リポソームや中性糖修飾リポソームは血液を添加することにより、肝臓の取り込みが促進されていた。次に血液を血清と赤血球とに分離し、それぞれ灌流液に添加したところ、血清成分がアミノ糖修飾リポソームの取り込みを若干ではあるが抑制していた。しかし、赤血球を添加した場合の取り込み抑制が最も大きく、アミノ糖修飾リポソームは赤血球との相互作用、おそらく静電的引力により血球に結合し、肝臓の取り込みを回避していることが明らかとなった。
絶対寄生性線虫の全ゲノム増幅による次世代シーケンシング解析

寄生性線虫における難培養性はゲノム解析時の大きな障害となる。本研究では寄生性線虫における効率の良いゲノム解析を行うための全ゲノム増幅(WGA)ー次世代シーケンシング法を開発することを目指した。既存の全ゲノム増幅シーケンシングデータを用いて問題点を抽出し、この問題を解消する3種のWGA方法を考案した。それぞれの方法をモデル線虫C. elegansを使用し、増幅均一性、一塩基多型、キメラ構造DNAの生成について検証した。その結果、いずれのゲノム増幅法も一塩基多型への影響はあまり大きくないこと、大きなサイズのライブラリーには増幅時に作成されるキメラDNAが品質に大きな影響を与えることを明らかにした。寄生性線虫における難培養性はゲノム解析時の大きな障害となっており、一個体の線虫(single worm)からの全ゲノム増幅(WGA)-次世代シーケンサー(NGS)による解析は、寄生性線虫におけるゲノム研究に大きな進展をもたらすと期待される。本研究では寄生性線虫における全ゲノム増幅ー次世代シーケンシング法を開発し、線虫個体間の比較ゲノム解析に用いることで寄生線虫の病原性関連遺伝子の解明を目指す。今年度は3種の全ゲノム増幅法をC. elegansゲノムDNAに適用し、各増幅産物をIllumina社Hiseq2000を用いてシーケンス解析を行った。シーケンスライブラリーサイズには350bと3kを用い、ライブラリーサイズによる品質への影響も検討した。同時に非増幅DNAを用いて同様のライブラリー作製およびシーケンスを行い比較標準とした。C.elegansのゲノムDNA10ugを数マイクログラムに増幅し、各ライブラリーを作成し、次世代シーケンスリードを獲得した。得られたNGSリードをリファレンスゲノムにマッピングし、増幅均一性(カバレージ)、一塩基多型(SNPs)、キメラ構造DNAの生成について検討した。その結果、全ゲノム増幅による一塩基多型への影響はあまり大きくないこと、リピートが多く含まれるゲノム領域での増幅が一定にならないこと、ライブラリーサイズが大きい場合には増幅時に作成されるキメラDNAがライブラリー品質に大きな影響を与えることを明らかにした。多くの寄生性線虫における難培養性はゲノム解析時の大きな障害となっている。1個体からの全ゲノム増幅-次世代シーケンサーの組み合わせによる解析は、寄生性線虫におけるゲノム研究に大きな進歩をもたらすと期待される。本研究では寄生性線虫における効率の良いゲノム解析を行うための全ゲノム増幅ー次世代シーケンシング法を開発し、線虫個体間の比較ゲノム解析に用いることで寄生線虫の病原性関連遺伝子の解明を目指す。今年度は、1)既存のWGAシーケンシングデータを詳細に検討し、WGA反応によって発生するゲノムの一部重複、欠損、塩基の取り込みエラー、不均衡増幅、およびそれに基づくゲノム再構築(アセンブリー)の際の問題について詳細に明らかにし、2)明らかにした問題点に基づいて、新たなWGA法を考案し、C. elegansゲノムを使った増幅を行う計画のもと研究を遂行した。既存の全ゲノム増幅シーケンシングデータ(2種の線虫:ヒツジ捻転胃虫Haemonchus contortus、ジャガイモシストセンチュウGlobodera pallida)をドラフトゲノムへのマッピングにより、増幅均一性(カバレージ)、一塩基多型(SNPs)、キメラ構造DNAの生成について検討し、ゲノムアセンブリにはキメラ構造の生成が大きな問題になることを確認した。WGAには3種の方法を考案し、それぞれの方法でモデル線虫C. elegansを使用し線虫ゲノムを増幅する手法を確立した。本研究では寄生性線虫における効率の良いゲノム解析を行うための全ゲノム増幅(WGA)ー次世代シーケンシング法を開発し、線虫個体間の比較ゲノム解析に用いることで寄生線虫の病原性関連遺伝子の解明を目指す。今年度は、昨年度までにモデル線虫で確立した1個体からのWGAシーケンシング法を他線虫に適応し、集団における個体の多様性を全ゲノムレベルで検出することを試みた。動物寄生線虫であるStrongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis線虫に感染したラットの糞を2%寒天培地上でインキュベートし這い出した感染幼虫をワームピッカーを用いてWorm Lysis Solutionを含むチューブに各1個体ずつ移動した。線虫溶解液の一部をWGA反応に供し、得られた増幅DNAを用いてシーケンスライブラリ(Nextera)を作成した。次世代シーケンサー(Miseq、Ilumina)で獲得したリードをリファレンスゲノムにマッピングし、SNP、Indel、CNVの検出を行うことができた。27年度は、昨年度に引き続き1個体からのWGAシーケンシング法を動物寄生線虫であるStrongyloides ratti, Strongyloides venezuelensis線虫他線虫に適応し、集団における個体の多様性を全ゲノムレベルで検出することを試みた。増幅DNAをNexteraキットを用いてシーケンスライブラリを作成した。

次世代シーケンサー(Miseq)で獲得したリードをリファレンスゲノムにマッピングし、SNP、Indelの検出を行った。また核およびミトコンドリアのde novoアセンブリーも行い、ミトコンドリアについては完全ゲノムを再構築することができた。寄生性線虫における難培養性はゲノム解析時の大きな障害となる。本研究では寄生性線虫における効率の良いゲノム解析を行うための全ゲノム増幅(WGA)ー次世代シーケンシング法を開発することを目指した。既存の全ゲノム増幅シーケンシングデータを用いて問題点を抽出し、この問題を解消する3種のWGA方法を考案した。それぞれの方法をモデル線虫C. elegansを使用し、増幅均一性、一塩基多型、キメラ構造DNAの生成について検証した。その結果、いずれのゲノム増幅法も一塩基多型への影響はあまり大きくないこと、大きなサイズのライブラリーには増幅時に作成されるキメラDNAが品質に大きな影響を与えることを明らかにした。モデル線虫で確立した手法を他の線虫種にも適用することで個体レベルの多様性解析を行うことができた。当初の達成目標はおおむねクリアできている。寄生虫ゲノミクス次世代シーケンサーの解析が混雑しているためデータの獲得までに時間を要し、研究期間延長を行った。今年度は解析用サンプルを前倒しで準備することで、早めのデータ獲得を行う。本プロジェクトはほぼ当初の計画通り、順調に進展している。次世代シーケンサーの解析が混雑しているためデータの獲得までに時間を要したため、次年度使用額と研究期間延長を行った。今年度の解析で最も成績の良かったゲノム増幅法を用いて、寄生性線虫の個体を増幅し次世代シーケンスリードを獲得し、個体間の比較解析を行う。モデル線虫C.elegansゲノムを3種の全ゲノム増幅法で増幅し、次世代シーケンサーを用いて大量のシーケンスリードを獲得する。獲得したリードをリファレンスゲノムにマッピングし、増幅均一性(カバレージ)、一塩基多型(SNPs)、キメラ構造DNAの生成について検討する。今年度は機械の稼働状況から実施できなかった次世代シーケンシング解析を次年度に繰り越したため。26年度の次世代シーケンシング解析に使用する。全ゲノム増幅のための試薬、次世代シーケンシング費用、および研究打合せ旅費に使用する。
レーザー光音響法による溶液中の超微粒子の生成・成長過程のその場観察

本研究では、レーザー光音響法の超微粒子生成・成長過程観察への適用をめざし、溶液中のコロイド粒子から得られる光音響シグナル強度の特性について一般的な記述をすることに成功した。その特徴を以下にまとめる。(1)コロイド粒子から発せられる音響強度は、1粒子あたりの光吸収断面積に比例し、溶液中の数密度を乗ずることによってその濃度に対する情報が得られる。これを一般式として定量的に表すことができた。(2)光音響法は、ナノメートル程度からミクロンに至る幅広い粒径範囲に対して適用可能である。すなわちそのダイナミックレンジが広い。(3)光音響シグナル強度の測定によって、未知の微粒子物質の光吸収断面積を求めることができ、微粒子が溶液中に懸濁した状態においても適用できる。(4)コロイド粒子による光散乱に基づく音響シグナルを、光吸収に基づく音響シグナルと区別しながら同時に計測することに成功した。両シグナル強度の定量化により、光散乱および光吸収断面積の計算を裏付けることができ、物質の光学定数を決定するにあたってより信頼性が増した。本研究のもう一つの特微である放射性元素テクネチウムを用いた実験では、はじめてそのコロイドの存在を明らかにし、さらに溶液中における粒子成長の様子を光音響法によって示すことができた。また、この時のコロイド粒子の成長機構に関して、新たに微粒子の衝突・凝集モデルを確立し、テクネチウムコロイドの成長を定量的に説明することに成功した。本研究では、溶液中のコロイド粒子や超微粒子をその場観察する手法としてレーザー光音響法を新たに導入し、粒子の種類(物質)、サイズ、濃度による情報を詳しく検討することにより、その場観察による超微粒子の生成・成長過程を解明することを目的とする。今年度は、音響シグナル検出部の改良を行うとともに、単分散ポリスチレン微粒子および金コロイドを対象として基礎的な検討を行った。コロイド粒子から発する光音響シグナルを解析した結果、その強度は溶液中に存在する粒子の数密度と1粒子あたりの光吸収断面積の積に比例していることがわかった。この関係は、ポリスチレン微粒子(粒径はミクロン前後)および金コロイド(粒径はナノメートルオーダー)のいずれの場合においても共通して保たれ、光吸収により発生する音響シグナル強度の定式化への第一歩を踏み出した。また、金コロイド分散溶液は塩化金酸をクエン酸により還元して調製したが、その際、ナノメートルオーダーの微粒子が数十分の間に次第に成長して来る様子が観察された。それに伴って変化する光音響シグナル強度を、粒子サイズの関数である光吸収断面積と粒子数密度を用いて定量的に表わすことができた。これは、溶液中のコロイド粒子の成長に関して、光音響法による初めての動的観察例である。ここで得られた関係をもとに、放射性元素テクネチウムのコロイドの成長過程観察に光音響法を適用した。その結果、粒子が時間とともに徐々に大きくなる様子が観測された。また、この成長は小さな粒子どうしの衝突過程によって進行していることが明らかとなり、これを理論的に解析した。

本研究のもう一つの特徴である放射性元素テクネチウムを用いた実験では、はじめてそのコロイドの存在を明らかにし、さらに溶液中における粒子成長の様子を光音響法によって示すことができた。また、この時のコロイド粒子の成長機構に関して、新たに微粒子の衝突・凝集モデルを確立し、テクネチウムコロイドの成長を定量的に説明することに成功した。