hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
児童養護施設における措置変更に関する実証的研究

また,職員支援の視点からは,措置変更について,チームで検討し,チームで責任を持つことが職員の負担軽減につながることや,気軽に話ができ,愚痴を言い合える関係を持っていることが職員の支援となっていることが示唆された。児童養護施設の職員に面接調査を行い,措置変更に至るプロセスを明らかにするとともに,措置変更に影響を与える要因や状況を明らかにした。措置変更プロセスは,子どもに関連する要因,職員に関連する要因,環境に関連する要因の3カテゴリーから構成される問題発生段階と,職員が検討の基礎となる観点をもちながら,子どもの行動レベルでのアセスメントを行い,措置変更の最終的な判断を行うまでの検討段階の2段階となっていた。措置変更を促進する方向に働く要因としては,担当者の負担,生活の安全を守りきれない状況,施設内での意見の相違が,措置変更を抑制する方向に働く要因としては,対応の工夫,適切な環境の模索があげられた。平成26年度は職員への面接調査を実施し,分析を行うことができた。その結果をもとに,平成27年度は全国の児童養護施設を対象とした質問紙調査を実施すべく,現在質問紙調査票を作成しているところであり,概ね順調に進展していると考える。平成27年度までに作成した仮説モデルが質問紙調査のデータと矛盾しないかどうかを検討するために,統計解析ソフトSPSSを用いて検証的因子分析を実施する。仮説モデルの適合度を検討することにより,児童の措置変更プロセスとそれに関与する要因についての仮説モデルを構築していく。臨床心理学平成26年度に作成した仮説モデルが質問紙調査のデータと矛盾しないかどうか検討するために,統計解析ソフトSPSSを用いて検証的因子分析を実施する。仮説モデルの適合度を検討することにより,措置変更に関与する要因に関する仮説モデルを構築していく。平成27年度において予定していた全国規模の質問紙調査が未実施となってしまったため,その費用が差額の主たる理由であると考える。音声記録の逐語記録化を研究者自身で行うなどしたため,予定していた人件費と実際の使用額に差が生じたことが主たる理由であると考える。平成28年度では全国規模の質問紙調査を計画している。質問紙の印刷費,郵送費,謝礼等に費用がかかることが見込まれるため,これに充当する予定である。平成27年度では全国規模の質問紙調査を計画しているため,質問紙の印刷費,郵送費,謝礼等に費用がかかることが見込まれるため,平成26年度の差額分はこれに充当する予定である。
Rainbowシステムを用いた原始銀河の分子ガス探査と銀河形成過程の解明

形成中の銀河(原始銀河)の分子ガス観測を通して、銀河形成の過程の解明や形成期の銀河の性質を明らかにするために、国立天文台の野辺山ミリ波干渉計とRainbowシステムを用いて、原始銀河候補天体と考えられる天体の観測を行った。赤方偏移3.1にあるSMM J2217+0013は非常に強いサブミリ連続波が検出されており、また、可視赤外波長域の分光撮像観測の結果が爆発的な星形成が現在も行われていることを示唆していることから、形成途上あるいは形成後間もない時期にある銀河であると考えられる。この銀河に対するCO(3-2)輝線観測を行ったが、有意に検出することはできなかった。進化段階が非常に若いと考えられるにもかかわらず、比較的少ない分子ガス量しか有していないことから、銀河の形成過程において、分子ガスの消費は非常に短いタイムスケールで進むか、あるいは多数の超新星爆発に伴う「銀河風」によって分子ガスは原始銀河外に放出されてしまう可能性があることが明らかになった。また、原始銀河の性質をより詳細に知るためのテンプレートとして、近傍宇宙の原始銀河類似天体であるNGC 6240の分子ガス多輝線観測も実行した。観測の結果、この天体の分子ガスの大部分は高密度かつ高温状態にあり、銀河中心付近に強く集中していることを明らかにした。また、高温高密度分子ガスの成因は重力不安定性によるものではなく、星形成領域からの強いアウトフローと分子ガスの相互作用によるものであることを示唆する結果が得られ、これは原始銀河においても同様であると推測される。
ビタミンD依存性くる病II型におけるビタミンD受容体蛋白の分子遺伝学的研究

ビタミンD依存性くる病II型は1,25(OH)_2ビタミンDに対する標的器官の受容体(VDR)に障害があり,乳幼児期に重篤なくる病,痙攣,成長障害,禿頭などを呈する。我々は本症が常染色体劣性遺伝性疾患であることを明らかにしたので,患者のVDR蛋白や遺伝子変異に関する分子遺伝学的解析を行った。日本人6症例のVDR蛋白およびmRNAのサイズおよび発現量は正常と差はみられなかった。また制限酵素で切断したゲノムDNAの分析でも患者のVDR遺伝子には大きな欠失や挿入はなかった。そこでVDR遺伝子の塩基配列を決定したところ,5症例ではVDRのDNA結合領域をコ-ドする第3エクソン内の140番目のGがAに変異していた。その結果,VDRが標的遺伝子と結合する部位を構成する47番目のアルギニンがグルタミンに置換していた。この変異部位はステロイドホルモン受容体ス-パ-ファミリ-の全てに共通する保存されたアミノ酸である。したがって,このアミノ酸はVDRとDNAとの結合に重要な役割を持っており,この遺伝子変異は本症の原因と考えられた。一方,同一遺伝子変異を呈する患者でも臨床症状および治療に対する反応性にかなりの差異が認められた。さらに治療中止後くる病は再発していない。以上の結果よりビタミンDのホルモン作用発現にはVDRに加えて核蛋白や環境因子が強く関与していることが示唆された。次に患者のVDR遺伝子の一塩基置換を簡易にスクリ-ニングする目的で,単鎖DNA高次構造変化検出法の有用性を検討した。正常対照と患者のパタ-ンは異なり明瞭に区別することができた。さらに患者の両親のパタ-ンは正常と患者の混合したパタ-ンを示し,保因者であることが示された。本法を用いて大規模のスクリ-ニングを行うことも可能であろう。さらに遺伝子変異が明らかにされていない症例における遺伝子変異部位の目安をたてるのに本法は有用と思われる。培養皮膚線維芽細胞および培養リンパ球を用いてビタミンD依存性くる病II型患者のビタミンD受容体蛋白および遺伝子変異について検討した。受容体に対するモノクロナ-ル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行ったところ6名の患者すべてにおいて、正常対照と同様52KDaの単一バンドが認められ蛋白量もほぼ同じであった。ノ-ザンブロット分析では患者のmRNAは正常対照と同様の発現量であり、そのサイズも4.6Kbを示した。制限酵素を用いたサザンブロット分析でも正常対照と同様のパタ-ンを示し、制限酵素断片長多型(RFLP)も認められなかった。したがって本症患者における受容体遺伝子には大きな欠失や挿入はなく、点変異などの小さな変異であると思われた。自験例では1,25(OH)_2D_3受容体複合体の核への取り込み量が低下していることから複合体が標的遺伝子DNAと結合する部位に異常があると考えられた。そこでこの部位をコ-ドする第2エクソンおよび第3エクソンの塩基配列を決定した。その結果第2エクソンと第3エクソン内にそれぞれ1カ所に一塩基置換が認められた。第2エクソン内+2のTからCへの変異は+1から+3に存在するATGをACGに変化させて開始コドンの消失をもたらすことになるが、患者でも正常と同じ分子量の蛋白が合成されていること、および正常対照でもこの変異が認められることから、この変異は非翻訳領域内の多型性のひとつで受容体遺伝子の調節などにも影響をおよぼさないものであると考えられた。

したがって-10から+12に存在するATGが本来の開始コドンと考えられた。一方、第3エクソン内+140のGからAへの点変異はアミノ酸配列上、47番目のアルギニンからグルタミンへの置換をもたらす。したがって1,25(OH)_2D受容体蛋白のDNA結合領域の構造および機能に重大な影響をおよぼし本症の病因となっていると考えられた。ビタミンD依存性くる病II型は1,25ジヒドロキシビタミンDに対する3標的器官の受容体(VDR)に障害があり,乳幼児期に重篤なくる病,痙〓,成長障害,禿頭などを呈する。我々は本症が常染色体劣性遺伝性疾患であることを明らかにしたので,患者のVDR蛋白や遺伝子変異に関する分子遺伝学的解析を行った。日本人6症例のVDR蛋白およびmRNAのサイズおよび発現量は正常と差はみられなかった。その中の5症例ではVDRのDNA結合領域をコ-ドする第3エクソン内の140番目のGがAに変異していた。その結果,VDRが標的遺伝子と結合する部位を構成する47番目のアルギニンがグルタミンに置換していた。この変異部位はステロイドホルモン受容体ス-パ-ファミリ-の全てに共通する保存されたアミノ酸である。したがって,このアミノ酸はVDRとDNAとの結合に重要な役割を持っており,この遺伝子変異は本症の原因と考えられた。一方,同一遺伝子変異を呈する患者でも臨床症状および治療に対する反応性にかなりの差異が認められた。さらに,治療中止後くる病の再発は認められない。以上の結果よりビタミンDのホルモン作用発現にはVDRに加えて核蛋白矢環境因子が強く関与していることが示唆された。次に患者のVDR遺伝子の一塩基置換を簡易にスクリ-ニングする目的で,単鎖DNA高次構造変化検出法の有用性を検討した。正常対照と患者のパタ-ンは異なり明瞭に区別することができた。さらに患者の両親のパタ-ンは正常と患者の混合したパタ-ンを示し,保因者であることが示された。本法を用いて大規模のスクリ-ニングを行うことも可能であろう。さらに遺伝子方異が明らかにされていない症例における遺伝子方異整位の目安をたてるのに本法は有用と思われる。
前立腺癌におけるカルシトニンレセプターの役割と解析

【目的】calcitonin(CT)はペプチドホルモンとしてcalcitonin receptor(CTR)を介して作用する。前立腺癌においてCTのparacrine/autocrine調節による前立腺癌の細胞増殖への関与が推測されている。一方,Mitogenactivated protein kinase(MAPK)は真核生物に普遍的に存在するセリン/スレオニンキナーゼであり,細胞増殖,分化に関して中心的な役割を担うことが明らかにされている。今回我々はCTRの発現の知られているヒト前立腺癌細胞株DU-145を用い,CTの作用とMAPKの関係について解析した。【材料と方法】MAPK活性をWestern blotting法によりを検出し,Northern blotting法により核内転写因子c-fos,c-jun mRNAの検出を行った。また細胞数計測を行い、CT添加による細胞増殖に対する効果を検討した。【結果】DU-145においてMAPKの自律活性がみられ,この活性はRas-MEK-MAPK経路を介していた。PKA阻害剤単独投与でMAPK活性の増強がみられ,またCT添加により一時的に活性が抑制された。CT添加によりc-fosの発現を一過性に惹起し,c-junの発現を抑制した。CT添加により若干の細胞増殖抑制効果がみられたが、統計学的有意差は認められなかった。【結語】PKA系はDU-145においてMAPK活性に抑制的に作用しており,CTによるMAPK活性抑制はPKA系を介することが推察された。またCTがCTRを介してMAPKのシグナル伝達に作用し,最終的に何らかの核内遺伝子を調節している可能性が示唆された。このDU145を用いた実験モデルはホルモン抵抗性前立腺癌に対する神経内分泌ペプチドの効果を検討する上で有用であると考えられる。【目的】前立腺癌においてcalcitonin(CT)のparacrine/autocrine調節による前立腺癌の細胞増殖への関与が推測されている。一方,mitogen activated protein kinase(MAPK)は真核生物に普遍的に存在するセリン/スレオニンキナーゼであり,細胞増殖,分化に関して中心的な役割を担うことが明らかにされている.今回我々はCTRの発現の知られているヒト前立腺癌細胞株DU145を用い,CTの作用とMAPKの関係について解析した。【方法】MAPK活性をWestern blotting法によりを検出し,Northern blotting法により核内転写因子c-fos,c-jun mRNAの検出を行った.【結果】MAPK(Erk1/2)の自律活性がみられ,この活性はRas-MEK-MAPK経路を介していた.PKA阻害剤単独投与でMAPK活性の増強がみられ,またCT添aチにより一時的に活性が抑制された.CT添加によりc-fosの発現が一過性に惹起され,c-junの発現が抑制された.【結語】DU145株においてMAPKの自律活性がみられ,この活性はPKA系を介することが推察された.以上のことより前立腺癌においてCTがCTRを介してMAPKのシグナル伝達に作用し,核内でのc-fos、c-jun等の転写調節により、細胞増殖や分化等に関与していることが示唆された.【目的】calcitonin(CT)はペプチドホルモンとしてcalcitonin receptor(CTR)を介して作用する。
体表面リング電極を用いた自律神経電気活動の非侵襲計測

電極背部に高入力インピーダンスBufferを実装した、体表面リング電極を製作した。別途製作した高CMRRの神経電位検出回路と組み合わせて、ヒト後膝部の坐骨神経を対象に自律神経電気活動(筋交感神経活動: MSNA)の非侵襲計測を試みた。記録結果のMSNA波形は不明瞭であったが、Wavelet変換に基づくディノイジング法を改良し、MSNAと推察される間歇的な群発火の検出に成功した。検出した群発火は、対側の坐骨神経より微小針電極にて同時記録したMSNAと、賦活化区間が概ね合致していた。また、同時検出した群発火を全波整流積分して得られるピーク値は、高い相関を示した。記録結果のMSNA波形は不明瞭であったが、Wavelet変換に基づくディノイジング法を改良することで、MSNAと推察される間歇的な群発火の検出に成功した。また、MNGと提案法にて同時検出した群発火を全波整流積分して得られるピーク値は、高い相関を有した。研究計画に沿って、外径9mm、電極間隔0.6mmの小型リング型ラプラシアン電極を製作した。体表面との接触により生じるバイアス電圧を抑えるため、電極表面には銀/塩化銀を塗布した。裏面にはインピーダンス変換を行うバッファ回路を実装し、能動電極とした。高入力インピーダンスのバッファ回路を実現するため、バッファ回路用のICには入力抵抗10TΩ、入力容量2pFの低ノイズOPアンプを使用した。製作した電極は、前年度に製作した低雑音生体用アンプに接続した。計測系の雑音特性を調べるためにロックインアンプを購入した。計測系の雑音評価を行った結果、参照信号を計測するための心電計や筋電計からのループ電流が雑音源となっている可能性が高いことが判明した。ループ電流の混入を防ぐため、主信号の計測系にアイソレーションアンプを導入した。導入の結果、雑音レベルが減少することを確認した。また、雑音レベルの経時変化から、電極と生体との接触面の間隙からも雑音が混入している可能性が示唆された。電極接着時に皮膚への前処理として生理食塩水を塗布することで、初期雑音が減少することを確認した。被験者への課題をハンドグリップからバルサルバに変更し、予備実験を行った。また、参照信号として連続血圧を追加した。実験の結果、数百μVの振幅と2ms程度の時間幅を持つ二極性あるいはメキシカンハット型のスパイクが、100200ms間隔で連続発生するスパイクトレインとして、複数被験者にて確認された。各スパイクの形状は、過去にマイクロニューログラフィーで計測された自律神経活動のスパイク波形と類似していた。何らかの神経活動を非侵襲的に計測できている可能性が高いと考えられる。ただし、バルサルバ試験と関係ないタイミングで発生したスパイクトレインも観測されており、マイクロニューログラフィーとの同時計測が必要であるとの結論に至った。平成24年度に計画していた、1小型電極の製作、2雑音の低減、3予備実験の実施の全てが完了した。また、期待していたスパイクトレインの検出にも成功し、各スパイクの波形が過去に報告されているマイクニューログラフィーの検出波形に類似していたことから、順調に進展していると言える。H24年度に発表した学会でのディスカッションで、関連研究者から「マイクロニューログラフィーとの同時計測の必要性」を強く指摘された。そこで、別の学会にてマイクロニューログラフィーのエキスパートを訪ね、共同実験を依頼し、承諾を得ることができた。当該大学での倫理審査も承認が得られたことから、平成25年度は、当初の計画(バルサルバ実験と解析)に加えてマイクロニューログラフィーとの同時計測実験も行う計画である。ポジティブな結果が得られ次第、学術論文あるいは国際会議での発表を準備する。該当なし
担子菌の生産する生理活性物質の単離,構造決定,合成

1.ドクササコー興奮性アミノ酸とその代孝的展開。ドクササコの毒成分はすでに報告したクリチジン、クリチオネイン,アクロメリン酸A,B,4ーアミノリン酸の他にまだあり,単離を続けた。その結果マウス致死毒性のある分画より新アミノ酸を得,スペクトルを考えうる生合成径路から構造を4ー(2ーカルボキシピロリル)ー3ーアラニンと推定し,合成によって確めた。合成品はキラルプレ-トで分割した。CD,キラルプレ-ト上のRf値とも天然品はlー体であることを示した。他にも神経興奮作用を示す分画を得たが構造は未定である。アクロメリン酸が強い神経興奮作用を示し薬理学研究での試薬となることがわかったため,これを使いたいとの要望が高まった。このため,より簡便な合成法並びにさらに合成し昜く同格の生理活性をもつ代合物の開発を行った。光DielsーAldesを用いる立体選択的ピロリジン環の形成によるロ-メトキシフエニルカイノイドの合成,プロリンC_4位のTsO基を立体保持で種々の置換基で置きかえる法による種々のフエンルカイノイドの合成を確立した。2.オオワライタケー神経興奮性成分とギムノピリンの立体構造。ラット春髓の脱分極活性を示す成が芳味成分として単離されていたギムノピリンのA_<10>とA_<11>に相当すると思われるに至った。このような鎖状多価アルコ-ルが神経興奮性を示す例はない。現位体構造決定のために種々の立体異性体を立体配置が明らかであるような方法によって合成し,スペクトルデ-タを比較して同定の可能性を探っている。3.ハナイグチー過酸化脂質生成阻害物質。表題の作用をもつ物質をハナイブチより単離し,1ーアセトキシ-2ーゲラニル-4,6ージヒドロキシベンゼンと構造を決定した。1.食用キノコであるハナイグチから過酸化脂質生成阻害活性物質を単離した。新鮮な菌体をアセトンで抽出し、抽出物を溶媒分画すると活性はエーテルおよび酢酸エチル可溶部に認められた。エーテル可溶部をシリカゲルクロマトグラフィー、LH-20カラムクロマトグラフィーおよびHPLCで分離し、活性を示す物質(oil、IC_<50>1.0μg/ml)を単離した。活性物質はHRMSよりC_<28>H_<40>O_4とわかり、^1Hおよび^<13>C-NMRとH-HおよびH-CCOSYスペクトルより1-アセトキシ-2、4-ジハイドロオキシ-6-ゲラニルゲラニルベンゼンとわかった。2.ドクササコより得られた強力な神経興奮作用物質アクロメリン酸の別途合成の開発を目指し、まずピリドン環部分がフェノールに置きかえられたものの合成法を開発した。L-メチオニンと2-ヒドリンドンより出発して1-ヒドロキシメチルアリル2-(O-ホルミルフェニル)エチルアミンを合成し、光照射によってエノル化させた状態での分子内ジールズアルダー反応を行い、プロリン環上に3個の置換基が立体選択的に組立てられる条件を検討した。その結果アミノ基とヒドロキシメチル基をカルボニル基で結んだオキサゾリドンの形でジールズアルダー反応を行うと望ましい立体配置のものが収率よく得られることを見出した。現在得られた物質をアミノ酸に誘導し、生理活性をテスト中である。

またフェニル基をピリジル基にした場合に同様の反応がおきるかテスト中である。3.ガンタケのアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質の単離を試みたが活性の鮮明な分画ができるに至らなかった。またドクササコからすでに単離した以外の毒物質を単離すべくバイオアッセイを検討し、ミルワームによる方法を見出した。これにより微量でのアッセイが可能となったので分画が進められよう。ニセクロハツを新潟県で少量採集し、毒性を検査したがマウスを死亡させるような毒性が見られず、分画は進めていない。1)ハナイグチより過酸化脂質生成阻害活性を示すボレグレビロ-ルを単離しその構造を1ーアセトキシー6ーゲラニルゲラニルー2、4ージハイドロオキシベンゼンと決定した。2)ドクササコにはアクロメリン酸よりも更に毒性が強いと思われる物質が含まれているが、これはより微量なのでミルワ-ムを使ったアッセイで分画を進めており、糖のようなNMRを与える強い毒分画を得ている。この分画中に4ーアミノピリジンー2、3ージカルボン酸を単離し、構造を決定した。3)アクロメリン酸(AA)と同様な強い神経興奮作用をもち、しかもより合成し易い化合物として、AAのピリドンカルボン酸部分をフェノ-ルに置き換えた物質を想定し、これを合成した。窒素の片側は2ー(2ーアミノエチル)ーベンツアルデヒドにし、もう一方はビニルグリシノ-ルになるような二級アミンを合成し、ベンツアルデヒドの光エノル化によって得たジエンとビニル基のジ-ルズアルダ-反応を行い、望ましい形に置換されたプロリンを合成した。この際ビニルグリシノ-ルのNとOHを環状カルバメ-トとして保護すると反応は完全に立体選択的に進行し、一挙に望ましい立体配置をもつものを得た。この後官能基を整えて得たカイノイドは、フェノ-ルの形でAAーAとAAーBの中間程度の強さの神経興奮性を示し、メトキシフェニルとしたものではAAーAの数倍の活性を示した。これは現在知られている物の中最強の活性物質である。また、4ートシロキシプロリンの3位にカルボキシメチル基を導入したものにジフェニル銅リチウムを作用させるとTsoーが立体保持でフェニル基と置換する。この反応を鍵反応としてフェニルカイノイドを合成した。この物質はカイニン酸程度の活性を示した。この方法はプロリン核の4位に種々の置換基をもつカイノイドの合成法として有用である。4)オオワライタケ毒成分を探索中に得られた4、6ーデカジインー1、3、8ートリオ-ルの絶対配置を、絶対配置既知のものから、分解産物を合成することにより(3S、8S)と決定した。1)ドクササコの毒成分:われわれはこれまでにクリチジン(1)、アクロメリン酸A(2)、B(3)、クリチオネイン(4)を単離しているが新たに5__,6__を単離し合成的に構造を決定した。5__,6__にはマウス致死毒性がないが、ピリジンー2,3ージカルボン酸がハンチントン病で見られるような神経軸索の障害を起すことが知られているので生理活性については期待している。6__の構造はbiogenesisで推定し上記の経路で合成して同定した。2)オオワライタケの毒成分:われわれはさきにマウス致死毒性のあるジムノピリンを単離し構造を決定したがオリゴイソプレノイドの三級アルコ-ル部分の立体化学が未決定であるため類似体の立体化学が種々変ったものを合成しMOM基で保護したものについてNMRを検討した。その結果重ベンゼン中でのNMRでMe基のシグナルが分離し、同定が可能であることがわかった。3)ハナイグチの過酸化脂質生成阻害活性を検討した。右の化合物を単離構造決定したが、これは酸素阻害として働くようである。
全方向・全方位に力覚提示機能を有する遠隔微細作業システムの開発

近年,マイクロ・ナノスケールサイズの精密な技術の発展に伴い様々な分野において微細な作業を可能とする装置の開発が行われている.この場合,対象物は数mm数μmと非常に微小であるため,人の手で直接操作することは困難である.そこで注目されているのが視覚情報に加え触覚情報を提供することができる力覚フィードバック装置である.本研究では上記の微細作業のニーズに対応する特殊な力センサを開発し,そのセンサを具備するマイクロマニピュレーションと力覚インターフェイスをネットワークで繋ぐことによりネットワーク環境があれば場所を選ばず遠隔操作が可能な力覚フィードバック型マイクロマニピュレーションシステムを開発した.さらにネットワークシミュレータを用いて通信の遅延に関する影響も検討を行った.近年,マイクロ・ナノスケールサイズの精密な技術の発展に伴い様々な分野において微細な作業を可能とする装置の開発が行われている.この場合,対象物は数mm数μmと非常に微小であるため,人の手で直接操作することは困難である.そこで注目されているのが視覚情報に加え触覚情報を提供することができる力覚フィードバック装置である.本研究では上記の微細作業のニーズに対応する特殊な力センサを開発し,そのセンサを具備するマイクロマニピュレーションと力覚インターフェイスをネットワークで繋ぐことによりネットワーク環境があれば場所を選ばず遠隔操作が可能な力覚フィードバック型マイクロマニピュレーションシステムを開発した.さらにネットワークシミュレータを用いて通信の遅延に関する影響も検討を行った.全方向・全方位について力覚情報を提示するシステムを開発するに当たり,力覚を検知するセンサの開発が不可欠となる.本年度はこれまで1軸の力情報しか検出できなかった微細作業システムを多軸で力検出を可能にする3軸小型力覚センサの開発を行った.本機は走査型電子顕微鏡の真空チャンバー内で使用するため,コンパクトかつ真空仕様でなくてはならない.センサは一体構造型で半導体歪ゲージを用いており,各軸の出力特性は,X軸は1.49×10^<-2>[N/100μst],Y軸は1.14×10^<-2>[N/100μst]Z軸は1.17×10^<-2>[N/100μst]となっている.各軸の干渉成分はいずれも10%以下と低く方向分離性能は高いため,干渉成分除去のための較正行列を使わなくても直接各軸よりフィードバック信号を取ることが可能である.このセンサを微細作業装置に搭載して検証実験を行った.半月状の凹みを設けたシリコン基板上で,凹み形状に倣ってプローブを操作しハプティックデバイス(SensAble社製PHANToM)にフィードバックして力覚が正しく提示されるかどうかを計測した.その結果押し込み力(Z軸)だけでなく摩擦力方向(X軸,Y軸)も検出できることを確認できた.この際の力覚提示の拡大率はZ軸で約200倍である.通信遅延を含む遠隔操作については,マレーシアのマレーシア工科大学・人工知能ロボット研究所のAdha Imam Cahyadi博士と共同で長時間の通信遅延が存在する状況下での遠隔制御システムの安定性に関する理論的研究を進めており,その成果の一部は既に雑誌に投稿済みである.平成23年度は,本課題に関連して主に2種類の研究課題を重点的に進めた.ひとつは,前年度に作成した多軸力覚センサを用いた微細作業システムによる実機実験である.もうひとつは,遠隔操作を前提としたネットワークエミュレータを用いた通信遅延システムに関する研究である.前者については,電子顕微鏡内で硬軟様々な試料を用いて押し込み力や摩擦力を計測すると共に,ハプティックデバイス(PHANToMOMNI)を介して操作者に提示される力を6軸力センサにより同時計測および比較を行うことで多軸力覚センサの実用性を評価した.後者については,「wlinee」というエミュレータソフトウェアを用いて通信遅延やフレームロスを人工的に発生させながら力覚フィードバック実験を試みた/本実験では1秒程度の遅延を与えながら単軸方向(Z軸)の計測実験を実施した.その結果,位置情報および力情報共にサーバ・クライアント間に指定通りの遅延環境を生成できることを確認した.なお遠隔操作系に関する海外との実機実験については,マレーシア工科大学・入工知能ロボット研究所のAdha Imam Cahyadi博士の協力を想定していたが,本人が母国インドネシアのガジャマダ大学に移動する等の事情から思うように進まなかった.本年度は主にシステムの有用性と海外との安定的な遠隔操作を実現させるため,マイクロマニピューションシステム(MMS)と,人工的に通信時間の遅延を生じさせるネットワークエミュレータであるWlineeを用いて複数の実験を行うとともに,それと並行して多次元的に微小力を検出できるセンサを用いたMMSの性能評価実験を実施した.まずWlineeを用いた実験において,その性能を評価するために様々なモードの時間遅延を創出し操作者側に与える影響を確認した.その結果,Wlineeは遠隔操作システムの評価を目的として汎用性の高いソフトウェアであることを確認した.次にMMSの性能評価実験では,走査型電子顕微鏡の中で,供試材であるシリコンゴムの動摩擦係数の計測を実施した.その結果,公称値に非常に近い計測値を得られることができたことから,力覚センサの性能が極めて高いことが立証された.これによって従来の計測方法では困難な微小領域の表面摩擦の計測を行えることが確認できた.また,追従精度実験においては非常に精度の高い追従性を2つの実験から確認することができた.

最後に遅れを発生させた環境下での遠隔操作では3軸の力に対してのフィードバックを確認することができた.本年度の主たる研究成果は,2012年11月にマレーシアで開催されたMJIIT-JUC Joint Symposiumにおいて口頭発表により報告されている.国外の研究協力者との共同実験はできなかったがそれ以外は概ね順調に進んでいる.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は本研究の最終年度にあたるため更なる検証実験の実施と成果の発表に重点をおく.24年度が最終年度であるため、記入しない。
病院における外来診療機能の再編成に関する建築計画的研究

近年の病院における外来診療は、医療技術や治療薬の進化により、短期滞在手術、内視鏡手術、がん化学療法など、様々な高度医療が提供されるようになってきた。しかし現状では、従前からの建築・設備環境の中で、これら高度医療を提供している病院も多く、軽微な処置行為と高度な医療行為とが混在して実施されている状況がある。このような実態は、効率的で安全な医療の提供や、患者のQOLという観点から、改善の必要性が高いといえる。しかし高度な外来診療の提供に対応した建築・設備的な必要諸条件は、建築関係者のみならず、医療従事者や病院管理者の間でも明らかになっていない。このような背景をふまえて本研究では、主にがん外来化学療法を実施する医療機関を対象とした調査研究を実施し、その結果として以下のような知見が得られた。(1)がん外来化学療法は実施時間が長いことから、読書やテレビなど患者サービスの充実が求められる。これは娯楽的な意味合いだけでなく、リラックスした状態を保つことが治療効果にもつながるため、重要な視点である。また治療内容等に関する書籍をおくなどして、治療に関する情報提供を積極的に行うことが望ましく、これに対応した建築計画が求められる。(2)看護師や患者へのヒアリング調査により、治療空間の環境工学的条件としては、無関係な騒音や過度の照明などは望ましくないことが分かった。抗がん剤の投与は副作用を伴うことから、病室に準ずる音環境・光環境が求められる。(3)治療中の容体急変に対応するため、医療配管やストレッチャーベッドなどの設備・備品が必須である。また緊急時の搬出動線確保が可能な平面計画が非常に重要であることが分かった。これらを総合すると、がん外来化学療法を提供する施設の建築設備においては、これまでの外来診療部門とは異なる患者像を想定した建築計画上の配慮が求められることが分かった。医療サービスの提供ニーズが多様化・高度化している昨今、病院は自らもてる機能の見直しが求められている。とくに外来診療については、麻酔技術や治療薬の進化により、短期滞在手術適応症例の拡大や、通院による内視鏡手術、がん患者の外来化学療法など、これまでにない高度医療の提供がみられるようになってきた。しかし現状では、従前からの建築・設備環境の中で、これら高度医療の提供を実施している病院も多く、軽微な処置行為と高度な医療行為とが混在して実施されている状況も少なくない。しかし高度な外来診療の提供に対応した建築・設備的な必要諸条件は、建築設計者の間でも、また医療従事者・病院管理者の間でも明らかになっていない。このような背景をふまえて平成16年度は、がん外来化学療法を実施する医療機関を対象とした研究を実施した。その結果として以下のような事項が明らかになった。娯楽的な要素ばかりでなく、治療内容等に関する書籍をおくなどして、治療に関する情報提供を積極的に行うことが望ましく、これに対応した建築計画が求められる。(2)患者へのヒアリング調査において、騒音や明るすぎる照明などは望ましくないという意見があった。(3)治療中の容体急変に対応するため、医療配管やストレッチャーベッドなどの設備・備品が必須であり、また緊急時の搬出動線確保が平面計画上、重要であることが分かった。
癌化・老化を左右する新規非コードRNAの機能解析

近年の大規模なトランスクリプトーム解析の結果、ゲノムの大部分の領域が転写されていること、その大半がタンパク質をコードしないノンコーディングRNA(ncRNA)であることが明らかとなった。ncRNAの中で最大の構成員をもつものはmRNAと同じような遺伝子構造をもつ長鎖ncRNAであるが、その機能はほとんど謎である。そこで本研究課題では、長鎖ncRNAの機能及び作用マシナリーの解明を目的とした。本年度の研究により、長鎖ncRNAであるANRIL(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus)が、細胞老化を抑制していることを明らかとした。さらにその作用マシナリーとして、ANRILはクロマチンサイレンシングに関与するポリコームタンパクと結合し、INK4遺伝子座へのポリコームタンパクリクルートメントを促進することを明らかとした。また、高解像度タイリングアレイ解析により、細胞周期制御遺伝子群(56個)の近隣に存在する216個の長鎖ncRNAを同定した。その中で、DNA損傷シグナルによって発現誘導される新規長鎖ncRNA、PANDA(p21 associated ncRNA DNA damage activated)がアポトーシスを抑制する機能を持つことを明らかとした。その作用マシナリーとして、PANDAは転写因子NF-YAと結合し、アポトーシス促進遺伝子群プロモーター上へのNF-YA結合を阻害することによって、アポトーシス促進遺伝子群の転写を抑制していることを明らかとした。本年度の研究により、我々はINK4遺伝子座近隣に存在する長鎖ncRNA、ANRILが細胞老化を抑制することを明らかとした。INK4遺伝子座にはCDKインヒビターp15、p16及びp53安定化因子ARFがコードされている。ANRILをノックダウンすると、p15及びp16のmRNA量が増加し、早期細胞老化が誘導された。またRIPアッセイの結果、ANRILはポリコームタンパクであるSUZ12と結合することが分かった。さらにANRILをノックダウンすると、INK4遺伝子座上のSUZ12結合量が顕著に減少した。これらの結果から、ANRILの機能として、ポリコームタンパクと結合し、INK4遺伝子座へのポリコームリクルートメントを促進することにより、この領域の転写を抑制するというモデルが考えられた。
階層粉体の基礎物理特性解明と衝突応答

今年度は,階層粉体の衝突に関するデータの解析と論文発表,付着性粉体層内の空隙の安定性に関するデータ解析と論文執筆などを中心に研究活動を行い,同時に階層粉体の力学特性の特徴付けに必要となる新規実験系の検討や準備を行った.階層粉体の衝突実験は,ドイツブラウンシュバイク工科大学のブルム教授との国際共同研究課題として実施されたものであり,そのデータ解析を本年度の前半に集中的に行った.その結果,階層粉体および通常の粉体(ガラスビーズ)をターゲットとして用いた微小重力衝突実験(弾丸は固体弾)でのターゲットの膨張速度は弾丸の持つ衝突エネルギーのターゲットへの等方的分配に基づくスケーリングにより説明可能なことが明らかになった.このエネルギーの等方的分配はターゲットが階層粉体であるか否かにかかわらず成り立つ普遍的なスケーリング則であることが実験結果より明らかになり,これにより階層粉体と通常の粉体は微小重力下での衝突応答が類似しているということが示唆された.この類似性が微小重力衝突実験に特有の結果であるか,それともより普遍性の高い類似性であるかという問題は今後検討を進める必要のある重要な課題であると考えている.付着性粉体層内の空隙の安定性に関する研究については,濡れた粉体層中のトンネル構造の力学的安定性に関する実験についてこれまで得られた結果の解析とまとめを行った.付着性の粉体は容易に凝集構造等を形成することよりある種の階層構造を持つ粉体となっているが,その付着性粉体層内部にある空隙の安定性は,砂浜に見られるカニの巣穴の安定性から彗星表面に観測される地盤沈下的陥没地形構造に至るまで幅広い自然現象と関連することが詳しい検討から明らかとなった.得られた結果の学会,論文等での発表にも積極的に取り組んだ.その他,粉体斜面や固液分散系への衝突実験も行い,階層粉体に関する新たな実験系の検討・準備も進めた.いくつかの階層粉体に関連する実験結果について検討・解析等を進め,結果をまとめることに成功した.得られた結果は学会や論文等で発表され,研究計画の初年度から具体的研究成果の発表に至り順調な研究の滑り出しができたと言える.さらに,粉体の摩擦や流れ,衝突による崩壊などの様々な現象の研究についても取り組むことがてき,それぞれの研究で一定の成果を得て,結果の論文発表を行うことができた.また,新規実験系の検討についても十分に行うことが出来た.微粒子の扱いに必要となるハンドリング環境や設備の準備,真空環境などの検討・装置整備を着々と進め今後の実験をスムースに行う準備を整えることができた.当初計画では主に実験準備を進めることを初年度の目標としていたが,それに合わせてこれまでに得られたデータ等の解析なども進めることに成功し,論文等の発表も行うことができた.継続的研究活動の中で比較的早い段階から成果を得られた部分は予想以上の進捗と言えるが,実験系の検討や装置の準備は年度末ぎりぎりまでずれ込んでしまった部分もある.以上の状況より,本研究計画は多少のムラはあるもののおおむね順調に進展していると考えている.今後も引き続き様々な階層構造を有する階層粉体の基礎物理特性の研究を行う.昨年度までに得られた結果の解析とまとめを進める一方で新規実験にも取り組む.結果の解析・まとめとしては,昨年度に行った粉体斜面への衝突実験と固液分散系への衝突実験の結果の解析を進めて結果を発表することが目標となる.実験としては,昨年度までに準備した微粒子の凝集ハンドルリング系や真空系などの装置群を用いて,ミクロ粒子の凝集体により構成されるマクロ粒子群に振動や低速の一軸圧縮などを加えその応答を計測する系を想定している.とくにミクロ粒子の凝集により構成されたマクロ粒子がどのような外力により破砕等に至るかを短い時間スケール(振動)と長い時間スケール(低速一軸圧縮)の二種類の極限で計測し両者を系統的に比較する.また,ミクロ粒子の凝集により構成されるマクロ粒子の集合を粉体と見なした場合の流れ挙動についても比較的簡単な斜面流のような状況で計測することを計画しており,得られた結果をガラスビーズなどの通常の粉体の場合と比較しつつ階層粉体と通常粉体の流動特性の類似点・相違点を検討する.すなわち,階層粉体を構成する一個粒子の力学特性と,それらが集団となった粉体的状態での力学特性をそれぞれ個別の実験に基づいて評価することが本年度の研究の方向性となる.その他にも,天体物理的応用を視野に入れた衝突による地形緩和に関連する実験・データ解析等にも取り組む.天体上では空気抵抗等の効果がなく重力も様々となり,そのような状況で天体表面に分布する粉体(レゴリス)が付着性等の効果で特異な挙動を見せる場合がある.そのような挙動も本研究の対象としている粉体の階層構造等に由来する特殊なものと考えることができる.以上の様な実験および解析等を通して階層粉体の挙動を明らかにしていくことが今後の研究推進の主な方策となる.今年度は,階層粉体の衝突に関するデータの解析と論文発表,付着性粉体層内の空隙の安定性に関するデータ解析と論文執筆などを中心に研究活動を行い,同時に階層粉体の力学特性の特徴付けに必要となる新規実験系の検討や準備を行った.階層粉体の衝突実験は,ドイツブラウンシュバイク工科大学のブルム教授との国際共同研究課題として実施されたものであり,そのデータ解析を本年度の前半に集中的に行った.

その結果,階層粉体および通常の粉体(ガラスビーズ)をターゲットとして用いた微小重力衝突実験(弾丸は固体弾)でのターゲットの膨張速度は弾丸の持つ衝突エネルギーのターゲットへの等方的分配に基づくスケーリングにより説明可能なことが明らかになった.このエネルギーの等方的分配はターゲットが階層粉体であるか否かにかかわらず成り立つ普遍的なスケーリング則であることが実験結果より明らかになり,これにより階層粉体と通常の粉体は微小重力下での衝突応答が類似しているということが示唆された.この類似性が微小重力衝突実験に特有の結果であるか,それともより普遍性の高い類似性であるかという問題は今後検討を進める必要のある重要な課題であると考えている.付着性粉体層内の空隙の安定性に関する研究については,濡れた粉体層中のトンネル構造の力学的安定性に関する実験についてこれまで得られた結果の解析とまとめを行った.付着性の粉体は容易に凝集構造等を形成することよりある種の階層構造を持つ粉体となっているが,その付着性粉体層内部にある空隙の安定性は,砂浜に見られるカニの巣穴の安定性から彗星表面に観測される地盤沈下的陥没地形構造に至るまで幅広い自然現象と関連することが詳しい検討から明らかとなった.得られた結果の学会,論文等での発表にも積極的に取り組んだ.その他,粉体斜面や固液分散系への衝突実験も行い,階層粉体に関する新たな実験系の検討・準備も進めた.いくつかの階層粉体に関連する実験結果について検討・解析等を進め,結果をまとめることに成功した.得られた結果は学会や論文等で発表され,研究計画の初年度から具体的研究成果の発表に至り順調な研究の滑り出しができたと言える.さらに,粉体の摩擦や流れ,衝突による崩壊などの様々な現象の研究についても取り組むことがてき,それぞれの研究で一定の成果を得て,結果の論文発表を行うことができた.また,新規実験系の検討についても十分に行うことが出来た.微粒子の扱いに必要となるハンドリング環境や設備の準備,真空環境などの検討・装置整備を着々と進め今後の実験をスムースに行う準備を整えることができた.当初計画では主に実験準備を進めることを初年度の目標としていたが,それに合わせてこれまでに得られたデータ等の解析なども進めることに成功し,論文等の発表も行うことができた.継続的研究活動の中で比較的早い段階から成果を得られた部分は予想以上の進捗と言えるが,実験系の検討や装置の準備は年度末ぎりぎりまでずれ込んでしまった部分もある.以上の状況より,本研究計画は多少のムラはあるもののおおむね順調に進展していると考えている.
ヒト培養細胞株を用いた簡便な腎毒性の検出；IL-6/IL-8レポーターの応用

腎臓は血液から老廃物を濾過後、水分や栄養分を再吸収する機能をもつため、毒性物質の暴露を受けて傷害されやすい。医薬品などの開発における腎毒性試験には、主にラットなどの実験動物が用いられてきた。しかし、実験動物で多くの化合物の腎毒性を明らかすることは費用や時間がかかるうえ、腎毒性試験を通過した医薬品候補化合物の多くが臨床試験での腎傷害により開発断念されているなどの問題がある。そのため医薬品の開発初期段階でも利用しうる、簡便な培養細胞による腎毒性試験法の併用が期待されている。現状では、ある程度腎臓細胞としての形質を保持するヒト細胞株の選定や、生理的な腎傷害様反応に基づく腎毒性物質の検出系の構築などが培養細胞を用いる際の課題点として挙げられる。最近、腎臓由来初代培養細胞では腎毒性物質に反応してIL-6/8 mRNAの発現量が上昇することが報告された。本研究では、ヒトにおける腎毒性を簡便にかつ定量的に検出するため、IL-6/IL-8遺伝子レポーターを導入したヒト腎臓培養細胞株を用いたスクリーニング系を確立する。このため、(1) IL-6 + IL-8遺伝子レポーターの作製、(2a)ヒト腎臓由来培養細胞の選定及びアッセイ条件の確認、(2b)ヒト腎臓由来細胞株にレポーター遺伝子を導入(レポーターを含む安定細胞株の樹立)、(3)レポーター遺伝子が実際に様々な腎毒性物質に応答するかを確認する。平成28年度はRT-qPCRによって本研究に適した細胞株に目処をつけた。平成29年度では主にレポーター遺伝子の構築を行った。今年度は、用いるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子の組み合わせ)の再検討を行った。その後、当該細胞株に一過性にトランスフェクションし、腎毒性物質として知られるピューロマイシンなどいくつかのテスト化合物を用い、レポーター遺伝子は概ね期待通りの応答をすることを確認した。本研究では、ヒトの腎毒性を簡便にかつ定量的に検出するため、IL-6/IL-8遺伝子レポーターを導入したヒト腎臓培養細胞を用いたスクリーニング系を確立する。このため、(1) IL-6 + IL-8遺伝子レポーターの作成、(2a)ヒト腎臓由来培養細胞の選定及びアッセイ条件の確認、(2b)ヒト腎臓由来細胞株にレポーターを導入(レポーターを含む安定細胞株の樹立)、(3)レポーター遺伝子が実際に様々な腎毒性物質に応答するかを確認する。本研究課題は、平成28年度の10月に追加採択となった。その後、用いる培養細胞を選定するために、腎毒性物質を投与によって腎障害様の初期反応(IL-6とIL-8遺伝子の活性化)がみられるかをまず確認した(上記2a)。申請書に記載した細胞をいくつか試しており、その中の一つの細胞株で腎毒性物質(ピューロマイシンなど)に反応して、顕著なIL-6/IL-8 mRNAの発現量の上昇をRT-PCRで確認した。今後は、腎毒性物質の種類を増やして、この細胞の有用性を確認したい。IL-6とIL-8遺伝子のレポーター構築に関しては(上記1)、IL-6遺伝子のレポーターを新たに構築した(研究分担者らの情報から、IL-6遺伝子のレポーターにはより長い転写調節領域が必要であると考えられ、新たなコンストラクトを作成する必要に迫られたため)。今後、このレポーターを一過性に発現させ、レポーターとしての機能を確認したい。IL-8遺伝子レポーターに関しては、研究分担者がすでに所有しているコンストラクトがあり、免疫系の培養細胞では適切に機能することを確認している。今後さらに多種類の腎毒性物質に対する反応性を確認する必要があるものの、利用可能なヒト腎臓由来細胞株に目処をつけられたことは大きな進展である。研究分担者らの情報により、IL-6遺伝子のレポーターにはより長いゲノム領域(プロモーター領域)が必要であると考えられ、新たなコンストラクトを作成する必要に迫られた。しかし、現段階で新たなレポーターの作成自体は終了しており、腎臓細胞株での機能確認が期待される。平成28年10月に追加採択となった事情を考慮すると、おおむね順調に進展していると思われる。これに対する現在の課題は、ある程度腎臓細胞としての形質を保持するヒト細胞株の選定や、生理的な腎傷害様反応に基づく腎毒性物質の検出などが挙げられる。これまでに、腎臓由来初代培養細胞では腎毒性物質に反応してIL-6/8(炎症性サイトカイン・ケモカイン)mRNAの発現量が上昇することが報告されている。

昨年度はRT-qPCRによって本研究に適した細胞株をに目処をつけた。そこで今年度は主にレポーター遺伝子の構築を行った。その後、当該細胞株に一過性にトランスフェクションし、腎毒性物質として知られるピューロマイシン処理などによって正常に動作しうるかを確認した。その結果、レポーター遺伝子は概ね、期待通りの応答をすることが確認された。本研究は平成28年度10月に追加採択となったのち、アッセイに適用しうる細胞株の選定をRT-PCRを指標によって行った。平成29年度では、主にIL-6及びIL-8遺伝子レポーターの構築を行なった。IL-6とIL-8の転写調節領域は、ヒトゲノム断片を含むBACよりPCRにて増幅し、SLG(緑色発光ルシフェラーゼ)を含むベクターにクローニングした。クローニングされた配列を確認後、CAG-SLR(赤色発光ルシフェラーゼ)コンストラクトと共に一過性にトランスフェクションし、ピューロマイシン処理を行った。その後、ルシフェラーゼアッセイを行い、SLGとSLRシグナルの比率を指標に、IL-6とIL-8レポーターが期待通りに動作することを確認した。ただし、ピューロマイシンは真核生物でのリボソーム阻害剤であり、タンパク質合成も阻害される。その結果、SLGとSLRの発光量自体は優位に減少していた。今後、タンパク質合成阻害作用を含まない他の腎毒性物質でもレポーターが期待通りに動作するかを確認する必要がある。また当初の計画では、基質は同じルシフェリンであるが発光波長が異なるSLG(緑色ルシフェラーゼ)とSLR(赤色ルシフェラーゼ)の組み合わせを用いる予定をしていたが、波長の区別のための特殊なルミノメーターが必要になる。そこで、より一般的な(汎用性の高い)デュアルルシフェラーゼアッセイを利用することにした。このため、まずは使用する基質が異なるNano Luc(プロメガ社)とELuc(Toyobo)の組み合わせを試したが、両ルシフェラーゼが干渉し、うまく測定できなかった。現在、Nano Lucとホタルルシフェラーゼ(プロメガ社)の組み合わせをDual Luciferase Reporter assay kitで試しており、確認後、この組み合わせに移行したい。腎臓は血液から老廃物を濾過後、水分や栄養分を再吸収する機能をもつため、毒性物質の暴露を受けて傷害されやすい。医薬品などの開発における腎毒性試験には、主にラットなどの実験動物が用いられてきた。しかし、実験動物で多くの化合物の腎毒性を明らかすることは費用や時間がかかるうえ、腎毒性試験を通過した医薬品候補化合物の多くが臨床試験での腎傷害により開発断念されているなどの問題がある。そのため医薬品の開発初期段階でも利用しうる、簡便な培養細胞による腎毒性試験法の併用が期待されている。現状では、ある程度腎臓細胞としての形質を保持するヒト細胞株の選定や、生理的な腎傷害様反応に基づく腎毒性物質の検出系の構築などが培養細胞を用いる際の課題点として挙げられる。
硫黄入り堆肥を用いて、農業に由来する窒素汚染をコントロールする

窒素化合物による環境汚染は深刻であり、環境中の窒素をコントロールし、地球環境と共存できる農業が求められている。我々は、堆肥中の硫黄酸化細菌に着目し、これまでの研究から、堆肥に硫黄を添加するとアンモニア揮散が抑制される可能性を見出した。硫黄添加堆肥における硫黄酸化ポテンシャルは堆肥化後期に高くなることから、本堆肥を種菌として利用して、堆肥を作成する(硫黄酸化細菌強化堆肥)と、さらなるアンモニア揮散抑制効果が得られるのではないかと考えられた。一方、硫黄酸化細菌は無酸素条件下で硝酸を脱窒することができるとの報告から、硫黄酸化細菌強化堆肥は、アンモニア揮散の抑制だけでなく、施肥土壌からの硝酸流出抑制にも貢献するのではないかと予想された。そこで、本研究では、硫黄酸化細菌を強化した堆肥が、堆肥や施肥土壌に由来する窒素汚染(アンモニア揮散や硝酸流出)抑制に有効かどうか調査することを目的とした。硫黄入り堆肥を種菌に用いて、硫黄酸化細菌強化堆肥を作成し、その物理化学的特性を明らかにした。元素硫黄を添加しない通常堆肥と比較すると、pHは、硫黄酸化細菌強化堆肥で有意に低下し、アンモニアガス濃度は堆肥化14, 28日目で有意に低下した。これらの結果から、硫黄酸化細菌強化堆肥は、堆肥からのアンモニア揮散を抑制している可能性が示された。硫黄添加堆肥における硫黄酸化ポテンシャルは、堆肥化後期に高くなることから、本堆肥を種菌として利用して、堆肥を作成する(硫黄酸化細菌強化堆肥)と、さらなるアンモニア揮散抑制効果が得られるのではないかと考えられた。本年度は、硫黄入り堆肥を種菌に用いて、硫黄酸化細菌強化堆肥を作成し、その物理化学的特性を明らかにした。元素硫黄を添加しない通常堆肥と比較すると、pHは、硫黄酸化細菌強化堆肥で有意に低下し、アンモニアガス濃度は、堆肥化14, 28日目で有意に低下した。これらの結果から、硫黄酸化細菌強化堆肥は、通常の堆肥と比較して、pHが低下することで、堆肥からのアンモニア揮散が抑制されている可能性が示された。硫黄酸化細菌強化堆肥および通常堆肥における硫黄酸化細菌、脱窒細菌、硝化細菌の群集組成を分子生物学的手法を用いて明らかにする予定であったが、未だ着手できていない。また、各サンプルのアンモニウムイオン、硝酸イオン、硫酸イオン濃度も測定できていないことから、進捗状況はやや遅れているとした。本研究を遂行するために、各微生物の群集組成解析については、業者に委託する予定である。今後は、硫黄酸化細菌強化堆肥による硝酸流出抑制効果を検討するために、実験室スケールで、本堆肥を土壌に施肥し、既知の濃度の硝酸水を滴下し、流出する硫酸濃度をイオンクロマトグラフィーで測定する。また、その際の土壌中の窒素代謝関連遺伝子の解析を行い、施肥土壌中の窒素代謝について明らかにする予定である。次年度使用額が生じた理由は、妊娠および出産により、予定通り実験を遂行することが出来なくなったためである。当初の計画では申請者が本実験を行なう予定であったが、次年度に業者に委託して行う予定である。また、業者に委託する費用を確保するため、施肥土壌における脱窒活性測定を削り、硫黄酸化活性と硝酸流出抑制活性のみを測定する予定である。
藍色細菌のDNAチップの開発と生物時計研究への応用

多くの生物では、様々な生理現象の活性が約24時間の周期で変動することが知られている。これは生物時計と呼ばれ、地球の自転に伴い24時間周期で繰り返される光や温度の変化に適応するための機構と考えられる。我々は近藤氏(名大・院・理)との共同研究で、藍色細菌で24時間振動を生み出す分子機構の中核遺伝子kaiABCを同定している。本研究はリズム発振遺伝子kaiABCの生み出す振動情報がどのような遺伝子ネットワークを経て下流の遺伝子群へ伝達されていくのかをDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解明することを目的とする。DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現の概日リズムをモニターするためには、莫大な数のマイクロアレイが必要とされる。しかし、現在市販されているマイクロアレイは非常に高価であり、これらを用いて概日リズムの研究を行うのは経済的に限界がある。そこでまずオリゴDNAを用いた安価なマイクロアレイの開発を行った。その結果、1)オリゴアレイにより発現量が非常に低い時計遺伝子kaiABCの発現を検出できる、2)HPLC精製を省略したオリゴDNAを用いてもシグナル強度の低下はほとんどない、3)オリゴ鎖長が45塩基でも十分な強度のシグナルを得られることを明らかにした。2)、3)の改良により、アレイの作製コストを約4分の1に削減できた。今後はかずさDNA研究所により全ゲノム塩基配列が決定された好熱性藍色細菌Thermosynechococcuselongatusのオリゴアレイを作製し、生物時計研究に応用する。好熱性であるためタンパク質の熱安定性が高く、別途計画しているプロテオミクス解析やタンパク質のX線結晶構造解析に非常に有利であるため、これらをアレイの結果と合わせることにより生物時計の全体像が明らかにできると考えている。