hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
立体構造既知のタンパク質に対する薬物の結合サイト及び結合様式の計算化学的解析

ヒト血清アルブミン(HSA)は、主としてサイトI、サイトIIという二つの薬物結合サイトを持つ。これらの結合サイトは、通常の酵素などの結合サイトとは異なり、R-体、S-体の両方の薬物が結合することが知られている。このため、薬物がラセミ体として投与された場合、薬効の無い(弱い)対掌体の存在が、薬効のある(強い)対掌体の体内動態に影響を及ぼすことになる。従って、キラルな化合物について、詳細な蛋白結合の実験を行う前にコンピュータによるin silicoスクリーニングを行うことは、医薬品開発の上で有用である。我々は、分子動力学法による立体配座集団のサンプリングと3次元データベース検索法を組み合わせたタンパク質に対する薬物の結合様式決定法を考案し、HSA-薬物複合体を用いて、手法の検証を進めてきた。昨年、(R)-、(S)-ワルファリンそれぞれのHSAに対する結合について手法の検証を行った結果、R-体、S-体それぞれの正しい結合様式を再現できた。また、S-体の方が強くHSAに結合することも再現できた。今回、HSAに対する結合様式が未知である(R)-、(S)-イブプロフェンについて、解析を行い、結合様式の決定を試みた。その結果、イブプロフェンのR-体、S-体それぞれのHSAのサイトIIに対する結合様式は、ミリスチン酸と同一であることが計算により明らかになった。また、R-体の方が強くHSAに結合することも再現できた。基質特異性の低いHSAでさえ、結合様式を決定できたことから、この手法は、他のタンパク質にも適用可能であると考えられる。この手法を用いた新規薬物のHSAに対するin silicoスクリーニングは可能であり、また、HSAの薬物に対するキラル選択性も判別可能である。我々は、分子動力学法による立体配座集団のサンプリングと3次元データベース検索法を組み合わせたタンパク質に対する薬物の結合様式決定法を考案し、ヒト血清アルブミン(HSA)-薬物複合体を用いて、手法の検証を進めてきた。HSAは、主としてサイト1、サイト2という二つの薬物結合サイトを持つ。このため、薬物がラセミ体として投与された場合、薬効の無い対掌体の存在が、薬効のある対掌体の体内動態に影響を及ぼすことになる。この様な薬物としては、HSAのサイト1に結合するワルファリンが知られている。ワルファリンは、代表的な抗凝血薬であり、S-体の方が、R-体に比べて数倍薬理活性が高い。また、HSAに対する結合は、両方とも非常に強いが、S-体の方がわずかに強いことが分かっている。最近、ワルファリン1分子およびミリスチン酸6分子と複合体を形成したHSAのX線結晶構造が、R-体、S-体それぞれについて、決定された。今回、この複合体結晶構造を基に、高温分子動力学法によってサンプリングされたワルファリンの立体配座集団に対して3D検索を行ない、ワルファリンのR-体、S-体それぞれのHSAに対する結合について手法の検証を行った。その結果、我々の手法を用いて、R, S-ワルファリンそれぞれの正しい結合様式を再現できた。また、ワルファリンはS-体の方が強く結合することを再現できた。基質特異性の低いHSAでさえ、結合様式を.決定できたことから、この手法は、他のタンパク質にも適用できると考えらる。この手法を用いた新規薬物のHSAに対するin silicoスクリーニングは可能であり、また、HSAの薬物に対するキラル選択性も判別可能であると思われる。
屈折率ナノ制御による有機太陽電池の高効率光閉じ込め技術の創製

平成30年度の研究では、ナノテクスチャ(モスアイ構造)を導入した有機太陽電池の発電性能をさらに向上させるために、テクスチャ表面に機能性コーティングを行う手法について、主に検討を行った。コーティングの材料として酸化チタンを用いることで、酸化チタンの光触媒機能による自己浄化特性を利用して、光学性能を長期安定化することが期待される。一方、酸化チタンはナノテクスチャを構成する樹脂材料に比べて屈折率が高いため、材料間の屈折率のずれによる反射を引き起こす可能性がある。そこで、酸化チタンのみを使用した場合に加えて、酸化チタンと他の材料を合わせて使用した場合について、特性マトリクス法に基づく光学シミュレーションにより幅広く解析した。また、モスアイを構成する円錐間に隙間が存在する場合に、機能性コーティングによって性能低下を抑制する手法についても検討を行った。これらの解析の結果として、ナノテクスチャによる有効屈折率の調節と、テクスチャ表面での干渉の制御を同時に行うことで、デバイス全体の反射防止性能を改善するための光学技術を明らかにした。さらに、モスアイを構成する円錐の底面に多層干渉膜を接続したハイブリッド反射防止構造と、高屈折率ガラスを組み合わせた統合デバイスに関する検討も行った。この研究では、モスアイの周期の変化がデバイス内の光伝搬に及ぼす影響について、有限差分時間領域法(FDTD法)を応用して解析した。その結果、有機半導体のバンドギャップに対応する波長に近い、比較的長い周期のテクスチャパターンを用いることで、光の回折による発電層の電界の強化を通じて、発電電流が顕著に増加することが明らかとなった。当初の計画の通り、屈折率ナノ制御を応用して有機太陽電池の発電性能を改善するための光学技術の開発を行った。光制御に関する新しい知見が数多く得られており、研究は順調に進展していると判断できる。今後の研究では、光が斜めに入射した場合等の幅広い条件における光閉じ込め技術に関して、引き続き検討を実施する予定である。有機太陽電池の発電性能向上を目的として、屈折率ナノ制御を応用した反射防止構造による光閉じ込め技術に関する検討を行った。デバイス内の屈折率分布を適切に制御することを目指して、ナノテクスチャ(モスアイ構造)及び2層干渉膜から成るハイブリッド反射防止構造を、高屈折率ガラスと組み合わせた統合型デバイスの光学特性を解析した。特性マトリクス法に基づく光学シミュレーションでは、ハイブリッド反射防止構造によるガラス基板前面での反射抑制と、高屈折率ガラスの使用によるガラス基板後面での反射抑制の相乗的な効果により、発電層における光吸収が大幅に促進されることが明らかとなった。また、モスアイを構成する円錐間の隙間や残膜の存在に伴う反射を、ハイブリッド反射防止構造を用いた干渉制御を通じて抑制できることも判明した。この結果は、提案するデバイスの光学性能が、表面テクスチャの形状変化に対して高いロバスト性を有することを示唆している。また、有機太陽電池が室内用発電デバイスとしても注目されていることから、太陽光に加えてLED及び蛍光灯の光源スペクトルにおける反射防止性能の検討を行った。その結果、統合型デバイスでは、室外及び室内光源に対応した波長域での吸収を促進することで、光源によらずに優れた性能が得られることが示された。光学シミュレーションの結果に関する検証を行うため、高屈折率ガラスを用いて有機太陽電池デバイスを試作して発電性能を調査した。その結果、提案するデバイス構成により、幅広い波長の光に対して優れた光閉じ込め効果が得られることが明らかとなった。当初の目的の通り、有機太陽電池の屈折率ナノ制御に関する検討を行い、統合型デバイスを用いた光閉じ込め技術を提案した。シミュレーションと実験の双方から幅広い検討を行っており、研究全体として顕著な成果が得られている。今後の研究では、ナノテクスチャ表面における干渉層の導入等を検討することで、提案構造の性能をさらに向上させることが主な課題である。

次年度使用額は、材料等の購入費用が当初予定額に比べて少なかったために生じたものであり、有機太陽電池の実験での材料費として使用する予定である。次年度使用額は、材料等の購入費用が当初予定額に比べて少なかったために生じたものであり、有機太陽電池の実験での材料費等として使用する予定である。
アリストテレスの説明の理論における還元の問題

アリストテレスの哲学的思索の宝庫である生物学をめぐる近年の争点は目的因の存在論的身分である。或る人々は有機体の存在は質料因と始動因だけでは十分に説明できないと考え、他の人々はその本質の定義は目的因なしには不可能であるが、この両因による有機体の存在の十分な説明は可能であるとする。因果性(実在)と説明(言語)の関係をめぐるこの因難な問題接近の一基地を見定めたい。自然は複雑な構造を有し規則的で美しく無駄のない秩序を示す。人が人を生む複製機構の絶妙さこそ「最も自然なこと」であり、この自律的に形態発生する生物の秩序性の帰一的第一根拠が「実現さるべきもの」なる目的因である。目的は反省概念ではなく、理(設計図)の次元で資料に比と限界を与へ条件的に必然な質料を規定し(「理にも必然性はある」200b4)、時空特定可能な物理的次元で質料の自然的運動を引き起こす自然的原因である。熱冷等物理的必然運動なる自然学者の「自然的にある」は、理により形相づけられた質料の必然運動として、行為モデルに比され、解し直される。それ故質料の端的必然性は条件的必然性に「還元され」も「包摂され」(J.Cooper等)もせず、理上指定された質料が時空次元で一質料として独立した「自然的にある」必然運動を為すので、両者は同一事物の二次元の必然性である。(Phii8,9,PAil,De Anii4,GAiil,v8)生物の複製機構を範例とする「何故かくも自然は秩序正しいのか」という何故疑問に対する解が四原因論である。原因は実体の力の能動的・受動的発現と解される。始動因は場所上連続的な力の変動を生む物理的原因である。他方理にある善なる目的因は生成の完成状態なる形相因でもあり、受動的質料とそれに合着した始動因に秩序と方向性を賦与するその第一能動因、本質である。かくして目的因は質料・始動因と存在論的次元を異にしにそれらに還元されない。かく自然の帰一構造は原因論のそれとなる。(Phii3,7,Metv4)アリストテレスの哲学的思索の宝庫である生物学をめぐる近年の争点は目的因の存在論的身分である。(Phii3,7,Metv4)
モデル生物を用いた生理活性リゾリン脂質機能の包括的研究

近年リゾリン脂質に特異的に応答するGPCRが存在することがわかってきた。これらのGPCRは脂質メディエータリゾホスファチジン酸(LPA)やスフィンゴシン1リン酸(S1P)に対する受容体として機能する。また、これらリゾリン脂質を産生する特異的酵素も明らかとなった。興味深いことに、これらのGPCR、産生酵素は脊椎動物で高く保存されている。そこで、本研究では、マウスとゼブラフィッシュをモデル生物とし、脊椎動物で普遍的に保存されているリゾリン脂質の機能を明らかにすることを目的とした。その一つの成果として、LPA分解酵素の血管形成制御機構を明らかにした。本研究では、リゾホスファチジン酸(LPA)とリゾホスファチジルセリン(LPS)の生体内機能を解明することを目的とし、モデル生物としてマウスとゼブラフィッシュを用いた解析を行う。また、マススペクトロメトリーを用いたLPA,LPSの分析法を確立するとともに、モデル生物やヒト臨床サンプルにおけるこれらリゾリン脂質を分析することで、生理活性リゾリン脂質の産生/分解酵素、トランスポーターの機能を解明することを目的とする。本年度は、LPA受容体ノックアウトマウスおよび、LPA受容体変異体ゼブラフィッシュを用いた解析を行い、この遺伝子が発生段階のある特定の臓器の発生に非常に重要であることを見出した。特に、ゼブラフィッシュを用いた解析では、トランスジェニック系統を用いることで臓器の形態形成過程をリアルタイムで非侵襲的に観察できることから、これまでマウスでは解析が難しかった解析が今後可能になることが期待される。一方、マススペクトロメトリーを用いたLPAおよびLPSの分析法を確立した。特に、各LPAおよびLPSについて、結合している脂肪酸種だけでなく、その脂肪酸がグリセロール骨格の1位に結合しているか、あるいは2位に結合しているかを区別して解析できる簡便な系を確立した。このことにより、どのような分子種のLPAあるいはLPSが産生される機構、および、これまで殆どその意義が明らかでなかった2-アシル型リゾリン脂質の意義の解明が進むことが期待される。生理活性脂質の一群であるリゾリン脂質メディエーターは、様々な生理機能や病態機能に関与することが知られている。本研究では、リゾリン脂質の産生酵素や受容体以外に、これまで解析が困難であったトランスポーター、分解酵素、前駆体合成酵素等の関連分子の解析、さらにリゾリン脂質の高感度検出系を用いた解析を進めている。本年度は、液体高速クロマトグラフィーとマススペクトロメトリー(LC-MS/MS)を用いた高感度リゾリン脂質測定系を構築した。さらに、同様の技術を用いてリゾリン脂質の前駆体であるジアシルリン脂質測定系も構築した。このリゾリン脂質測定系を用いることで、毛髪形成時におけるリゾホスファチジン酸(LPA)の産生機構とその機能、血中におけるLPAの産生機構、新規リゾリン脂質メディエーターであるリゾホスファチジルスレオニンの検出、スフィンゴシン1リン酸(S1P)トランスポーターのリンパ球動態の制御について新たな知見を得ることができた。特に、毛髪形成におけるLPAの機能については、既存の育毛薬とは異なる細胞群(毛包の上皮細胞)を標的としており、新たな育毛薬の開発の基礎研究として意義深い。さらにヒトにおいてもLPAの産生機能欠損による先天性貧毛(脱毛)症を見出しており、これら患者の脱毛メカニズムを理解し創薬へと進める上で重要な研究である。ゼブラフィッシュを用いたリゾリン脂質の研究については、LPA産生酵素オートタキシンが血管形成に必須な役割を担っていること、この現象には主に2つのLPA受容体(LPA1とLPA4)が関与していることを見出した。オートタキシンはがん組織で高発現していることが知られており、がん細胞の増殖にオートタキシンが血管形成を介して促進的に作用することが示唆される。LPAのがん発生・進展における寄与については今後の研究課題であるが、本研究により血管形成における機能は着目すべき候補であることがわかった。【目的】生理活性脂質リゾホスファチジン酸(LPA)機能をモデル生物であるゼブラフィッシュを用い解析する。【方法・結果】ATX mRNAを投与したゼブラフィッシュ胚では心臓が左右2カ所に現れる二股心臓の表現型と尾部の水腫が観察された。発生過程において心筋前駆細胞は左右の二カ所に形成され、体軸中央に向かって遊走および融合することで1つの心臓が形成される。心臓は拍動していることから、二股心臓は心筋の分化の異常ではなく、細胞遊走の異常に起因するものとかんがえられる。二股心臓と尾部水腫の表現型は、酵素活性を有さない変異体ATX(T205A)mRNA投与時には観察されなかった。

次に、ATX機能亢進時に観察される表現型の作用機序を明らかにするために、同様の表現型を示す既存の変異体に注目した。生理活性脂質スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の受容体(S1P2)、およびS1Pのトランスポーター(Spns2)の変異体は、ATX過剰発現時に観察された表現型(二股心臓および尾部の水腫)を示す。そこでATXとS1Pシグナリングの機能的関連性を明らかにするために、S1P2あるいはSpns2 MOとATX mRNAを同時に投与したところ、二股心臓の表現型が相乗的に増強された。【考察】ATXの機能を抑制あるいは亢進時に、それぞれ血管形成異常あるいは二股心臓の表現型を見いだした。今後はこの表現型を指標にATXの詳細な生体内の作用機序に迫りたい。また私はATX-LPAシグナルとS1Pシグナルの心臓における機能的関連性をゼブラフィッシュおよびマウスで初めて見出した。血中のATX活性、および組織中のATX発現量が増大する様々な病態がこれまでに明らかになっていることから、今回見出したATX-LPAシグナルとS1Pシグナルの機能的関連性がこれらの病態に関与しているかを今後検証したい。本研究では、生理活性リゾリン脂質リゾホスファチジン酸(LPA)に関して、マウス、ゼブラフィッシュを用いた生理・病態機能の解明することを目的とする。これまで、LPA酵素オートタキシン(ATX)は胎児血管形成に関与する子Tが、マウス、ゼブラフィッシュモデルを用いて示されている。本年度は、TALENシステムを用い、ATXのノックアウトフィッシュを作製した。また、LPA受容体LPA4とLPA6のノックアウトゼブラフィッシュの作製を行い、LPA4/LPA6ダブルノックアウトフィッシュの作製を目指した。まず、ATX、LPA4のノックアウトフィッシュを作製できたことをPCRで確認した。LPA6は公的ライブラリーに変異体が存在することが判明したため、そこから入手した。MOのインジェクションの結果と反して、het/hetの掛け合わせで生まれたATX null fishは正常に発生し、アダルトまで成長した。受精卵にはATXタンパク質とmRNAが大量に発現しているため(maternalなATX)であると考えられた。現在、LPA4とLPA6のノックアウトゼブラフィッシュの掛け合わせを実施している。また、LPA4とLPA6のそれぞれのノックアウトマウスを交配し、LPA4/LPA6ダブルノックアウトマウスの作製を目指した。しかし、あらゆる掛け合わせを行っても、LPA4/LPA6ダブルノックアウトマウスは生まれてこなかった。LPA4ノックアウトでLPA6がヘテロのマウス、LPA4ヘテロでLPA6がノックアウトのマウスは生まれてきたが、その数は極めて少なかった。胎児の血管に着目すると、LPA4/LPA6ダブルノックアウトマウスはがATXノックアウトマウスとほぼ同様表現型を示すことがわかった。リゾホスファチジルセリン(LysoPS)はマスト細胞の脱顆粒促進、T細胞の増殖抑制などの作用を有する生理活性リゾリン脂質である。しかし、生体内のLysoPSの存在を示す知見は少ない。そこで私はマススペクトロメトリーを用いたLysoPSの検出系を確立し、さまざまな生体試料におけるLysoPSの検出を試みた。
新規バイオポリエステルのデザインのための関連酵素の構造-機能研究

バイオポリエステルの代表的な一つであるポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は生分解性を有し、かつ微生物によって作られる重要なポリエステルである。本研究課題では新規な構造を持つPHAのデザイン・合成システム構築に向けて、PHA分解に関与する酵素の構造と機能について検討するため、マルチドメイン構造を持つPHA分解酵素を結晶化し、タイプ1触媒ドメインの結晶構造を初めて明らかにした。また、芳香族バイオマスを利用するPHA合成システム構築に向けて、フェニル酢酸分解系酵素の結晶構造解析を行った。生分解性を有するバイオポリエステルは、微生物によって最終的に水と二酸化炭素に分解されバイオマスとなり、またバイオマスから微生物あるいは植物によって合成される資源循環型材料であり、持続的社会においては必要不可欠なプラスチックである。ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は生分解性を有する代表的なバイオポリエステルで、モノマーユニットの構造により多様な物性を示すので、幅広い分野での利用が期待され、実用化が望まれている。PHAの生合成の際にどのようなモノマーユニットが取り込まれるかは生合成系酵素の基質特異性に依存するため、天然の酵素では基質特異性のために合成できるPHAの種類は限られてくる。思い通りのモノマーユニットを持つPHAを得るためには、思い通りの基質特異性を持つ生合成系酵素(PHA合成酵素、モノマー供給酵素)を設計することが必要となってくる。モノマー供給系酵素としてフェニル酢酸分解系酵素に着目した。その中で酸素非依存的開環の代謝段階に関与する酵素PaaGの結晶構造を明らかにし、その反応機構を提唱した。PaaGは3量体酵素で、各サブユニットがリング状に会合する。サブユニットの構造はクロトナーゼ・スーパーファミリーに見られるスパイラル構造であった。活性部位と推定される部位には保存された極性残基Asp136が存在していた。基質が結合すると推定される領域は環状化合物が結合することができる十分広い空間を持っていた。結晶の非対称単位中に含まれる6本のポリペプチド鎖の構造を比較したところ、基質結合領域と隣接するkinkしたヘリックスのコンフォメーションに違いがあることが判り、酵素反応過程で構造変化が起こることが示唆された。触媒残基の位置について、機能が異なるクロトナーゼ・スーパーファミリー酵素との比較から、Asp136の開環反応における役割を推定し、触媒反応機構を提唱した。一方、任意にデザインされたPHAを分解するためにはPHA分解酵素の基質特異性に対するデザインも必要である。PHA分解酵素の立体構造を明らかにするため、バクテリア由来酵素の結晶化と構造解析を行い、触媒ドメインの分解能2.3Aにおける構造決定に成功した。結晶化にはポリエチレングリコールを沈殿剤として蒸気拡散法により得た。構造解析には金の誘導体結晶を利用し、Au-SAD法により位相決定した。触媒ドメインの構造モデルは構築できたが、リンカードメインおよびPHA吸着ドメインについてはモデル構築が可能な電子密度を得ることができなかった。触媒ドメインの構造は、シングルドメインであるカビ由来酵素の構造と比較して機能に関すると思われるいくつかの異なる特徴を有していた。ポリヒドロキシブタン酸は微生物によって作られまた分解される、R体3-ヒドロキシブタン酸をモノマーユニットとする水不溶性の生分解性脂肪族ポリエステルである。ポリヒドロキシブタン酸分解酵素はポリヒドロキシブタン酸をモノマーユニット単量体または二量体にまで加水分解する。多くのボリヒドロキシブタン酸分解酵素は触媒ドメイン、リンカードメイン、ポリマー結合ドメインの3つのドメインから成る。Ralstonia pickettii T1由来酵素(Rp酵素)の結晶化、X線構造解析を行った。触媒ドメインのみの電子密度が得られ、319残基から成る触媒ドメインの結晶構造を分解能1.7Aにおいて明らかにした。触媒ドメインはα/βhydroase foldと呼ばれる構造的特徴を持ち、Ser-166,Asp-241,His-300が触媒部位を構成していた。基質結合に関与する残基、すなわち疎水性ポケット残基や基質のカルボニル酸素と相互作用する残基を推定した。これらは、すでに立体構造を明らかにしているPenicilium funicullosum由来酵素(Pf酵素)と比べると、同一ではないが性質が似た残基によって構成されていた。

基質結合領域周辺の分子表面はPf酵素と異なり負の電荷を帯びていた。このことは、マルチドメイン酵素とシングルドメイン酵素では疎水性基質ポリマーとの相互作用様式に違いがあることを示唆している。アミノ酸配列の違いからRp酵素はType I、Pf酵素はType IIに属するが、両者は互いにcircular permutationの関係にあることが判り、進化的に関係があることが示唆された。これらの結果は、ポリヒドロキシブタン酸分解酵素の立体構造に基づく機能改変にとって重要であり、バイオポリエステル・エンジニアリングの発展に大きく寄与する。
リュウキュウマツの遺伝的多様性と進化的位置の解明

これまでにリュウキュウマツの進化的位置の解明に取り組み、リュウキュウマツとクロマツ間には直接的な祖先ー子孫関係はなく、タイワンマツなど東アジアに分布するマツ属植物と強く関係することが明らかとなった。古地理学的知見に基づけば、奄美大島・沖縄本島と石垣島・西表島に分布するリュウキュウマツには相違がある可能性が考えられた。最近では、次世代シーケンサーの出現により、集団構造を解明する上で新たなDNAマーカーが多数報告されている。今後のリュウキュウマツ抵抗性育種を視野に入れれば、ゲノミックSSRマーカーが最初に開発されるマーカーの一つであると考え、そのライブラリー作成に取り組んだ。ゲノミックSSRのモチーフには(AG)nおよび(AC)nを選択し、ライブラリーの開発に取り組んだところ、濃縮率が30%以上となるライブラリーを開発することが出来た。現在、このライブラリーから得られたマーカーの候補について順次スクリーニングを進めているところである。これとは別にリュウキュウマツの抵抗性を検証するため、リュウキュウマツ苗を育成し、沖縄本島の被害地より新たな線虫系統作出を行った。その結果、新たに3つのアイソレイトが作出され、そのうち一系統は強病原性を示した。さらに、リュウキュウマツを対象として樹体内におけるマツノザイセンチュウの増殖過程および遺伝子発現についても初めて明らかにした。この結果は、クロマツとは異なり、むしろタイワンマツで報告されている症状に類似することから、マツ材線虫病の観点からもリュウキュウマツはクロマツとは異なる系統であることが示唆された。従って、当研究の目的であった進化的位置について、リュウキュウマツは東アジアに分布するマツ種群と同一系統に属し、本州に分布するアカマツやクロマツ尾てゃことなる系統であることが明らかとなった。リュウキュウマツの進化的位置を特定するため、既に公表されているクロマツ葉緑体ゲノムを利用して、葉緑体全体をPCR増幅出来るプライマーを設計した。これらPCR産物の塩基配列超は5kbp10kbpであり、リュウキュウマツでも全て良好に増幅した。これら増幅産物(アンプリコン)に基づいて断片化後、アダプターを設計し、次世代シーケンサーMiseqを利用して塩基配列の決定を行った。これにより決定された塩基配列はリュウキュウマツ葉緑体ゲノムの約8090%と推定される。1度のランにより決定できなかった理由として、ソフトウェア自体の能力に依存していると考えられた。得られた塩基配列を利用して、東アジアに分布するマツ属植物と比較した結果、予想されたように、1リュウキュウマツはアカマツよりもクロマツとより近縁な関係にあった2リュウキュウマツは中国や台湾に分布する他マツ属植物と近縁であったが、塩基配列にリュウキュウマツ特異な部分が認められ、固有種として認定できる可能性が高い。ことが明らかとなった。これらの結果に基づいて、古地理学的知見と併せてリュウキュウマツの拡大経路について推定した。一方で、本研究で用いたサンプルが沖縄本島で採取されたものであり、より大陸との古地理学的関係性が深い、宮古島や石垣島などに生育するリュウキュウマツは独自の系統学的系統を示す可能性があることから、これら島嶼に赴きサンプリングを行った。今後は、島嶼間の関係性を中心に解析を進める予定である。当初、クロマツ葉緑体ゲノムを利用したプライマー設計では、リュウキュウマツ葉緑体ゲノム全体のアンプリコンが得られる保証は不透明であったが、比較的容易にゲノム全体の情報が得られたことから、進化的位置について概ね理解することが出来たことによる平成28年度までにリュウキュウマツの葉緑体ゲノム塩基配列に関する情報を集積してきた。この結果、リュウキュウマツの進化的位置が明らかになる一方で、既往の研究では、リュウキュウマツ・タイワンマツ・広東マツが中国・台湾・沖縄諸島にかけて混在しており、葉緑体ゲノム配列レベルではその分類学的差異が存在しない可能性が示唆されていた。そこで既往の研究を追試した結果、既往の研究のデータは全く異なる分類群のデータが混在することが明らかとなった。この結果から、リュウキュウマツの進化的位置は中国・台湾に分布するマツとは異なることが決定的担ったと考えられる。また、平成2829年度にかけて、西表島・石垣島・宮古島・沖縄島・奄美大島からリュウキュウマツを各島それぞれ30個体以上採取し、これらサンプルを用いてDNA抽出を行った。これらサンプルを利用すれば、島嶼間における差異をより明確に出来ると考えられる。現在、個体間の関係性を評価できる葉緑体ゲノムマーカーの開発と新たなマーカーの開発に取り組んでいる。葉緑体全ゲノムの個体間の変異について一部から変異情報が得られた。より網羅的な情報収集を図る必要性がある。予定するサンプル収集はほぼ終了した。新たなマーカーの開発にも着手しており、過去文献の追試も行ったことから、概ね順調に予定を消化していると考えられる。

ゲノミックSSRのモチーフには(AG)nおよび(AC)nを選択し、ライブラリーの開発に取り組んだところ、濃縮率が30%以上となるライブラリーを開発することが出来た。現在、このライブラリーから得られたマーカーの候補について順次スクリーニングを進めているところである。これとは別にリュウキュウマツの抵抗性を検証するため、リュウキュウマツ苗を育成し、沖縄本島の被害地より新たな線虫系統作出を行った。その結果、新たに3つのアイソレイトが作出され、そのうち一系統は強病原性を示した。さらに、リュウキュウマツを対象として樹体内におけるマツノザイセンチュウの増殖過程および遺伝子発現についても初めて明らかにした。この結果は、クロマツとは異なり、むしろタイワンマツで報告されている症状に類似することから、マツ材線虫病の観点からもリュウキュウマツはクロマツとは異なる系統であることが示唆された。従って、当研究の目的であった進化的位置について、リュウキュウマツは東アジアに分布するマツ種群と同一系統に属し、本州に分布するアカマツやクロマツ尾てゃことなる系統であることが明らかとなった。昨年度、島嶼群からサンプリングを行い、これらのサンプルを利用して更に詳細な解析を進める予定である。古地理学的知見についても加味しながら、沖縄島嶼群全体に分布するリュウキュウマツの固有性など明らかにする。現在、葉緑体ゲノムに加えて新たなDNAマーカーを開発中である。このマーカーを利用することで、島嶼間の差異がより明確に出来ると考えられる。ほぼ当初計画通り予算については執行できている一方で、計画を進める中で来年度もこの計画を中心に沖縄で発生するマツ材線虫病に向けたアプローチや保全策の立案などに経費がかかることから、無理な執行を控えたことによる。上記理由と共に、当初目的を達成すると共に、この研究を中心としてより保全も含めた寄り視野の広い研究へと発展させる意向である。
リアノジン受容体遺伝子異常による遺伝性心臓疾患の病態解明

遺伝性心臓疾患は、遺伝性不整脈症候群(IPAS)と心筋症とに大きく二分され、若年期から重篤な臨床像を呈する疾患である。我々のグループは2000年代よりカテコラミン誘発性多型性心室頻拍(CPVT)に対するリアノジン受容体遺伝子(RYR2)変異の検索をおこなってきたが、近年次世代シーケンサーを用いた解析を開始して以来、その他のIPASや心筋症においてもRYR2遺伝子変異が多数同定されるようになった。我々は本研究を通し、RYR2遺伝子変異と遺伝性心臓疾患の関連を明らかにし、心筋症と不整脈両方の治療に貢献することを目的とする。
シナプス可塑性解明への分子細胞生物学的アプローチ

シナプス可塑性を表わす現象として、長期増強(LTP)、刺激後増強(PTP)、長期抑圧(LTD)などが知られている。長期増強は中枢の海馬で初めて見い出された現象で、記億や学習の素過程をなすものであろうと考えられている。長期増強現象は中枢以外の交感神経節などでも見い出されており、こちらの方が刺激投与や固定の容易さの点で、実験材料として優れている。本研究ではネコまたはラットの上頸神経節(SCG)を用いて、長期増強現象を機能形態学的に解明することを目的とした。本年度の研究から次のようなことが明かとなった。1)長期増強発現の頻度:最適の条件づけ刺激(10Hz,50sec)を与えた場合、ネコSCGの約60%において刺激後増強に引き続いて長期増強が発現し、その増強度はコントロール値の約120%であった。30%のSCGでは長期増強の発現に5-10分の遅延が認められた。残り10%のSCGでは長期増強の発現は見い出されなかった。この長期増強発現の有無はどのような生理的条件の相違によるものであるかについて、さらに検索を続けている。2)シナプス再構築に関わるシナプス形態の変化:SCGを刺激終了直から1時間に渡る観察期間の任意の時点で、舌動脈経由の局所灌流法を用いて固定し、シナプスの機能的形態変化を電子顕微鏡を用いて検索した。長期増強を発現したSCGでは、解離型シナプスがまず最初に増加し、その出現頻度は5%から約30%へと著明に増加した。続いてシナプス小棘が形成され、その出現頻度もコントロールの0%から9%へと大きく増加した。以上の所見から、まず解離型シナプス、続いてシナプス小棘が形成されることにより、シナプス分割が進行するというシナプス再構築メカニズムが考えられた。このようなメカニズムによるシナプス増加が、長期増強時のシナプス伝達効率増加の機構の一部を形成しているのであろう、と考えられる。シナプス可塑性を表す現象として長期増強(LTP)、刺激後増強(PTP)長期抑圧(LTD)などが知られている。本研究では長期増強現象の解明に重点をおいて検索を進めた。材料として、ネコ又はラットの上頸神経節を用いた。LTPは海馬で初めて検出された現象で、記憶・学習の素過程をなすものであろうと考えられている。長期増強現象は上頸神経節でも検出されている。加えて、こちらの方が刺激投与や材料固定の容易さの上で優れている。これが上頸神経節を材料として用いた理由である。本年度の実験から次の2点について明らかな成績を得た。1)シナプス増強発現のための最適条件刺激の確定(高速パワーラブシステム使用)長期増強発現のための最も安定した条件刺激は10Hz50秒(500パルス)であった。刺激終了直後に刺激後増強(PTP)が出現し、約1分後に消失した。この時点で約20%のシナプス増強を示す長期増強が存在した。このLTPは条件刺激終了後3時間、殆ど減少を示すことなく継続してみられた。これに対し、10Hz5秒10秒(50100パルス)の条件刺激では明瞭なPTP出現を示すが、LTPは全く出現しなかった。

2)長期増強に応じたシナプスの機能的形態変化我々の開発した舌動脈を経由する局所潅流法を用いて、上頸神経節を条件刺激終了の直後からそれに続く長期増強発現の各時点で固定し、シナプスの機能的形態変化を電子顕微鏡を用いて検索した。LTPを発現した神経節ではパーフォレイテッド・シナプス(perforated synapse;PF)とシナプス小棘(synaptic spinule;SP)の著明な形成・増加が認められた。PFはコントロール材料では全シナプスの約5%の頻度で検出されるが、実験例では20-30%の高頻度で出現した。またPFに付随して見出されるSPはシナプスの分割に関与する構造ではないかと推察された。両者ともその形成は非常に迅速で、条件刺激投与中に秒単位の速度で出現することが明らかとなった。シナプス可塑性を表わす現象として、長期増強(LTP)、刺激後増強(PTP)、長期抑圧(LTD)などが知られている。長期増強は中枢の海馬で初めて見い出された現象で、記憶や学習の素過程をなすものであろうと考えられている。長期増強現象は中枢以外の交感神経節などでも見い出されており、こちらの方が刺激投与や固定の容易さの点で、実験材料として優れている。本研究ではネコまたはラットの上頸神経節(SCG)を用いて、長期増強現象を機能形態学的に解明することを目的とした。本年度の研究から次のことが明かとなった。1)長期増強発現の頻度:最適の条件づけ刺激(10Hz,50sec)を与えた場合、ネコSCGの約60%において刺激後増強に引き続いて長期増強が発現し、その増強度はコントロール値の約120%であった。30%のSCGでは長期増強の発現に5-10分の遅延が認められた。残り10%のSCGでは長期増強の発現は見い出されなかった。この長期増強発現の有無はどのような生理的条件の相違によるものであるかについて、さらに検索を続けている。2)長期増強に伴うシナプス形態の変化:長期増強を発現したSCGでは解離型シナプスがまず最初に増加し、その出現頻度は5%から30%へと著明に増加した。続いてシナプス小棘が形成され、その出現頻度も0%から9%へと大きく増加した。以上の所見から、まヅ解離型シナプス、続いてシナプス小棘が形成されるというシナプス再構築メカニズムが考えられた。このようなメカニズムによるシナプス増加が、長期増強時のシナプス伝達効率増加の機構の一部を形成しているのであろう、と考えられる。
転位と粒界の相互作用とマクロ特性に関する原子・転位論的研究

低Σ値の粒界に対する第一原理計算により,内殻が閉殻な金属に比べて方向性の強い結合を持つものの方が安定な粒界を形成することを示した.転位とΣ3粒界の相互作用の状態遷移解析により,エネルギー障壁を定量的に示しDSC転位と粒界に垂直なステップ転位に分解して低エネルギー障壁で粒界すべりを引き起こすことがわかった.また,離散転位法と境界要素法のマルチスケールモデルを構築しメゾスケールの変形特性の評価を行った.低Σ値の粒界に対する第一原理計算により,内殻が閉殻な金属に比べて方向性の強い結合を持つものの方が安定な粒界を形成することを示した.転位とΣ3粒界の相互作用の状態遷移解析により,エネルギー障壁を定量的に示しDSC転位と粒界に垂直なステップ転位に分解して低エネルギー障壁で粒界すべりを引き起こすことがわかった.また,離散転位法と境界要素法のマルチスケールモデルを構築しメゾスケールの変形特性の評価を行った.構造材料は,一般に多数の結晶粒からなる多結晶体として構成され,その機械的特性は材料内部の組織によって大きく異なる.とりわけ転位と結晶粒界は,各々が材料の変形に大きく寄与するとともに,互いの相互作用は材料全体の性質を決定する最も重要な因子である.しかしながら,これらの粒界構造と多結晶材料の機械的特性の関係に関しては,実験による経験則が基本となっており,メカニズム解明に関する定量的な評価はなされていない.本研究では,対応粒界や小傾角粒界,ランダム粒界を含めた様々な粒界構造における特性について,原子論的解析手法を用いて粒界構造や変形メカニズム,転位との相互作用などの定量的な評価を行った.まず,FCCアルミニウムとBCC鉄に対して,原子モデルにより〈100〉軸および〈110〉軸回転のΣ3Σ99までの多数の対応粒界(CSL)を構築し,粒界エネルギーなどの基本特性を評価した.その結果,経験的な原子間ポテンシャルを用いた場合も,多様な粒界構造とエネルギーはよく再現され,〈110〉粒界では粒界エネルギーと粒界の存在によって増加する過剰自由体積に非常に強い相関関係が存在することがわかった.また,アルミニウムと鉄に対してΣ3粒界と完全な刃状転位の反応過程をNEB状態遷移解析によって評価した結果,反応には非常に高いエネルギー障壁を超える必要があることがわかった.さらに,転位は粒界と反応する際に,粒界面に平行な転位と垂直な方向のバーガースベクトルに分解することで粒界面の移動と粒界すべりを引き起こすことがわかった.構造材料は多数の結晶粒からなる多結晶体として構成され,その機械的特性は材料内部の組織によって大きく異なる.転位と結晶粒界は,各々が材料の変形に大きく寄与するとともに,互いの相互作用は材料全体の性質を決定する最も重要な因子である.本研究では,対応粒界や小傾角粒界,ランダム粒界を含めた様々な粒界構造における特性について,原子・転位論的解析手法を用いて粒界構造や変形メカニズム,転位との相互作用などの定量的な評価を行った.まず,Al,CuのΣ3Σ11の低Σ値の対応粒界に対して,第一原理計算を用いた粒界エネルギーの評価を行った.その結果,d軌道が閉殻なCuに対して方向性の強いp軌道の特性によりAlの方が安定な粒界を形成することがわかった.この傾向はMishinによるEAMポテンシャルでよく再現されることから,古典分子動力学法によりΣ99までの対応粒界・ランダム粒界を構築し,構造因子の検討を行った.対応粒界についてはHRTEMによる観察結果によく一致することを示すとともに,観察例の少ないランダム粒界に対してはボロノイ多面体解析により,粒界部で不均質なアモルファスライクな構造をとることを示唆した.また,刃状転位が安定なΣ3粒界と相互作用する際には,Peierlsポンシャルに対して非常に大きなエネルギー障壁を越える必要があることを定量的に示し,転位は粒界面に沿ったDSC格子転位と粒界に垂直なステップ転位に分解して低いエネルギー障壁で粒界すべりを引き起こすことがわかった.小傾角粒界との相互作用に関して,離散転位力学法と境界要素法のメゾスケールモデルを構築し,粒界からの転位の射出にについて結晶粒の回転角の影響や自由表面からの距離に対する影響を定量的に示した.このように転位と多様な粒界構造を含む系に対して,原子・転位論的手法を用いて構造特件およびマクロな力学特性を体系的に理解することができた.
将来債権譲渡論の再検討――ドイツ包括債権譲渡論を手がかりとして

今年度の研究では、集合債権譲渡担保に関して、近時相次いで出された判例の分析を行った。特に、集合債権譲渡担保が公序良俗違反とされる諸相及びその内実との関連で、各判例がどのように位置付けられるのか、という分析視角が、独自的である。まず、最判平成11年1月29日や、最判平成12年4月21日によると、集合債権譲渡担保は、譲渡人の経済活動の自由の侵害という局面で、その有効性、すなわち反公序良俗性が問題となる。そこで、債権が包括的に譲渡担保に供されてもなお、担保設定者に処分可能な財産が残されており、担保設定者がその自由意思で他の債権者に弁済できる、ということが必要となる。従来、集合債権譲渡担保においては、担保設定者に取立権を付与することが都合がよいとされてきたのは、この意味で非常に示唆的である。そして、平成13年11月22日、最判平成13年11月27日、最判平成14年10月10日を手がかりにして、集合債権譲渡担保の法的構成、担保設定者に取立権を認める法的構成、対抗要件具備方法について考えることができる。これを踏まえて、本契約型、予約型等、集合債権譲渡担保の類型ごとの特徴及び問題点を比較検討した(以上については、一部を判例批評として投稿準備中である)。もっとも、集合債権譲渡担保による担保設定者の利益侵害の問題は、担保設定者への取立権付与だけで処理できるものではない。これは、他の債権者の利益侵害の問題とあわせて、今後の検討課題である。また、非典型担保及び契約の性質決定に関する議論の各論として、集合債権譲渡担保の本質(的要素)とは何かを探ることも、今後の検討課題である。今年度の研究では、ドイツにおける包括債権譲渡担保に関する議論を比較法研究の対象とし、その分析を行った。とりわけ、包括的な債権譲渡担保の反良俗性の内実をドイツではどのように捉えているか、の研究が、最大の課題である。そして、ドイツにおいて包括的な債権譲渡担保が良俗違反とされる諸相及び反良俗性の内実を、次のように分析した。1包括的な債権譲渡担保それ自体の広範性を問題とした反良俗性は、譲渡人の経済活動の自由の侵害(桎梏)という局面で問題となる場合がある。譲渡人の桎梏は、さらに異なった観点で問題となる。譲渡人がその自由意思で他の債権者の弁済をなしうるかという観点と、過剰担保という観点である。2対抗要件制度が存在しないドイツでは、包括的な債権譲渡担保が設定されても、外部からは容易に認識できない。そこで第三者は、担保設定者の与信可能性について誤解し損害を被る危険がある。この危険を捉えて、第三者の利益侵害(与信可能性に関する誤解)という局面で、包括的な債権譲渡担保の反良俗性が問題となる。3さらに、延長された所有権留保と包括債権譲渡の競合の場面で、契約侵害という観点で包括債権譲渡の反良俗性が問題とされる。注目するべきは、ドイツでは、反良俗性の各内実に対応して、それを基礎づけている客観的事情を除去するための予防的法技術が、いくつか考案された。そして、判例によってその妥当性が承認されている。以上のようなドイツ法分析から得られた示唆は次のようなものである。またそれは、次年度の主要な検討課題の一つである。すなわち、包括的な債権譲渡(担保)につき、譲渡人や他の債権者の利益侵害の程度は、民法九〇条の反公序良俗性と、他の債権者の利益侵害についてはさらに、民法四二四条の詐害性によって評価し、日本固有の議論を展開していくことである。但し、ドイツでは、主に動産または債権の包括的譲渡担保の反良俗性が問題とされている。例えば、包括的な債権譲渡(真正譲渡や債権売買)における反(公序)良俗性が、ドイツの議論からは必ずしも明らかにならないことには、十分留意しなければならない。なお、これらの研究成果を、民商法雑誌(11.研究発表を参照)にて公表することができた。

もっとも、集合債権譲渡担保による担保設定者の利益侵害の問題は、担保設定者への取立権付与だけで処理できるものではない。これは、他の債権者の利益侵害の問題とあわせて、今後の検討課題である。また、非典型担保及び契約の性質決定に関する議論の各論として、集合債権譲渡担保の本質(的要素)とは何かを探ることも、今後の検討課題である。
間欠的低酸素環境下での代謝系を介した転写制御機構の解明

生体への低酸素負荷の影響を検討するために、赤血球増殖因子EPOの遺伝子改変マウスを樹立した。その結果、成獣で重度の貧血を発症し、各臓器への酸素供給が慢性的に低下するマウスの樹立に成功した。このマウスを全身性の慢性低酸素応答モデルとして、代謝産物と遺伝子発現の解析に利用している。また、論文発表を行った。低酸素-再酸素化の影響を解析するために、マウス腎臓の尿管結紮再解放や虚血再潅流を施した。その結果、低酸素や炎症環境が腎臓のEPO産生細胞を筋線維芽細胞へと形質転換させ、組織線維化を進行させることを明らかにした。このとき、EPO産生細胞ではDNAメチル化酵素の発現が亢進し、遺伝子発現様式が大幅に変化していることを見いだし、論文発表した。さらに、酸化ストレス防御に機能する転写因子Nrf2を活性化することにより、虚血再潅流による腎障害が軽減されることを発見した。そこで、Nrf2の条件付き欠損マウスを用いて、低酸素-再酸素化に対するNrf2の腎保護効果について解析を進めている。低酸素環境での生体応答機構を解明するために、転写因子複合体解析に加え、代謝(メタボローム)と転写(マイクロアレイ)の網羅的解析を取り入れることができた。その結果、代謝産物が転写因子を介して遺伝子発現を制御する機構を見いだした。また、低酸素誘導性転写因子HIFの抑制因子PHDの欠損は、低酸素応答と同様に代謝経路と遺伝子発現を変化させることを見いだした。この結果は、低酸素応答のほとんどがHIFに依存していることを示している。25年度が最終年度であるため、記入しない。間欠的低酸素の生体への影響を検討するために、マウス臓器の虚血再潅流解析を行った。腎臓では組織の線維化が進行したが、このとき、尿細管間質に存在する造血因子エリスロポエチン(Epo)の産生細胞が形質転換することを明らかにした。形質転換した細胞はEpo産生能を失い、組織線維化に直接的に寄与していた。Epoは低酸素誘導性の転写因子HIFによって発現誘導されることから、HIFによるEpo産生細胞の機能維持効果や組織保護効果の検討を開始した。また、Epo産生細胞の解析を行う過程で、胎仔神経堤にEpo産生細胞が局在することを見いだし、神経堤Epo産生が正常な胎仔型造血に必須であることを明らかにした。さらに、遺伝子改変マウスを用いて転写因子Nrf2による組織保護効果についても解析を進めている。一方、骨格筋ではEpoが損傷した筋細胞の修復を促すことを見いだし、報告した。低酸素下での転写制御系の分子機構を解明する目的で、貧血モデルマウスとHIF過剰発現マウスを樹立し、マイクロアレイ解析とメタボローム解析を行った。また、HIF恒常活性化細胞を複数種類樹立し、低酸素応答性のクロマチン制御系について解析した。さらに、転写因子Nrf2およびHIF-2aの核内タンパク質複合体を単離し、その構成因子を解析したところ、クロマチン構造変換に関わる因子が同定された。また、細胞内でのalpha-ケトグルタル酸合成系が低酸素感知に重要な役割を果たすことを見いだした。低酸素ー再酸素化による個体レベルの影響を明らかにすることができた。当初計画では、腫瘍組織での低酸素ー再酸素化領域を同定し、間欠的低酸素環境下での転写制御系について解析する予定であったが、実験条件の検討中である。また、低酸素下での代謝制御系と転写制御系の関連を解析するためのモデルマウスと細胞株を作出することができた。さらに、転写因子HIFおよびNrf2の核内タンパク質複合体単離に成功した。

alpha-ケトグルタル酸合成系酵素がNrf2と相互作用しており、酵素阻害によって低酸素応答系が一様に活性化することを見いだした。初年度に確立した遺伝子改変マウスや細胞株を用いて、転写因子HIFによる転写制御の分子機構解析を進める。とくに、代謝産物による転写活性制御やクロマチン構造の変換機構に注目した解析を行う。既に網羅的解析のデータを得ており、HIFおよびNrf2の共役因子も同定しているので、これらの因子の役割について、過剰発現実験やノックダウン実験によって明らかにする。以上の成果を論文発表する。また、組織酸素分圧モニターを導入し、腫瘍組織での間欠的低酸素領域の検出系を確立する。培養細胞に間欠的低酸素曝露を行い、慢性的低酸素に対する応答機構との比較を行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周病病態における細胞内亜鉛イオンの役割の解明

本研究は、歯周病病態における歯周組織構成細胞内の亜鉛イオン濃度の変動およびその影響について検討した。これまで、マウス歯根膜細胞株、ヒト歯根膜細胞株およびヒト歯肉上皮細胞株において、酸化ストレス(過酸化水素: 101000μM)は細胞内非タンパクチオールからの亜鉛イオン遊離を促進することで、細胞内亜鉛イオン濃度を上昇させることを明らかにしている。今年度は、酸化ストレスによる細胞内亜鉛イオン濃度上昇のメカニズムを更に検討した。過酸化水素300μMおよび塩化亜鉛30μMの共刺激を行い、蛍光顕微鏡にて観察したところ、過酸化水素単独刺激よりもFluoZin-3 AM蛍光強度が増強した。この結果から、酸化ストレスは細胞膜の亜鉛イオン透過性を亢進し、細胞内亜鉛イオン濃度上昇に寄与することが示唆された。以上から、酸化ストレスは細胞内亜鉛イオン貯蔵部位からの亜鉛イオンの遊離および細胞膜の亜鉛イオン透過性を亢進することによる細胞外からの亜鉛イオンの流入を促進することにより、細胞内亜鉛イオン濃度を上昇させることが示唆された。次に酸化ストレスによって誘導される細胞内亜鉛イオンの作用について、ウエスタンブロッティング法およびreal-time PCR法を用いて評価した。歯根膜細胞株および歯肉上皮細胞株において、過酸化水素(300μM)はMAPKカスケードおよびAktシグナルの亢進を認め、細胞内亜鉛イオンキレート剤TPEN (510μM)はこれらを抑制した。また、歯肉上皮細胞において、過酸化水素はIL-1Bなどの炎症性サイトカインの産生を促進するが、TPENはこれらを抑制した。以上から、酸化ストレスによって誘導される炎症性シグナルの活性化に、酸化ストレス誘導性細胞内亜鉛イオンが関与している可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。歯周病病態における歯周組織構成細胞内の亜鉛イオンの変動を検討するために、フローサイトメーターおよび蛍光顕微鏡を用いて実験を行った。まずヒト歯根膜細胞株、マウス歯根膜細胞株およびヒト歯肉上皮細胞株において、歯周病原因細菌の感染により、細胞内の酸化的ストレスが亢進するか、各細胞にP.gーLPS刺激を加え、細胞内のスーパーオキシドアニオンならびに過酸化水素の生成を蛍光プローブBES-So-AMおよびBES-H2O2-Acを用いて評価した。この結果、LPS刺激によりBES-So-AMならびにBES-H2O2-Acの蛍光増強を認めた。このことから、LPS誘導性に酸化的ストレスが亢進することが示唆された。更に、酸化的ストレス(過酸化水素:101000μM)により細胞質内亜鉛イオンが変動するか検討するために、細胞内亜鉛イオンを検出する蛍光プローブFluoZin3AMを用いて検討した。この結果、酸化的ストレスによりFluoZin3AMの蛍光増強を認めた。また、酸化的ストレス誘導性FluoZin3AM蛍光増強は、細胞内亜鉛イオンキレート剤TPENにより減弱するが、細胞外亜鉛イオンキレート剤DTPAでは減弱しなかったことから、酸化的ストレスにより、細胞内亜鉛イオン貯蔵部位からの亜鉛イオン遊離が示唆された。次に、細胞内亜鉛イオン貯蔵部位を検討するために、細胞内非タンパクチオールをモニターする蛍光プローブCellTracker GreenCMFDAを用いて検討した。この結果、酸化的ストレス誘導性に細胞内亜鉛イオン濃度が上昇する条件下では、CellTracker Green CMFDAの蛍光強度は減弱した。以上から、歯周病原因細菌感染により酸化的ストレスが増大し、酸化的ストレスにより細胞内の亜鉛イオン貯蔵部位の1つである細胞内非タンパクチオールからの亜鉛イオン遊離を促進することが示唆された。歯周組織構成細胞において、酸化的ストレスにより細胞内亜鉛イオン動態が変化することが明らかとなった。しかし、P.gーLPS刺激により細胞内亜鉛イオン濃度の顕著な変化は検出できなかったため、歯周病原因細菌の感染により、細胞内の酸化的ストレスが亢進し、この酸化的ストレスによって細胞内亜鉛イオン動態が変化するという結果となった。また、細胞内亜鉛イオン動態変化による影響については、現在解析中である。

歯根膜細胞株および歯肉上皮細胞株において、過酸化水素(300μM)はMAPKカスケードおよびAktシグナルの亢進を認め、細胞内亜鉛イオンキレート剤TPEN (510μM)はこれらを抑制した。また、歯肉上皮細胞において、過酸化水素はIL-1Bなどの炎症性サイトカインの産生を促進するが、TPENはこれらを抑制した。以上から、酸化ストレスによって誘導される炎症性シグナルの活性化に、酸化ストレス誘導性細胞内亜鉛イオンが関与している可能性が示唆された。細胞内亜鉛イオンの変化により、歯根膜マーカーの発現について検討しているが、顕著な変化が認められない場合は、MAPKカスケードなどの細胞内シグナル伝達経路について網羅的に解析する予定である。また、細胞質内において発現する亜鉛イオントランスポーターファミリーについても解析を予定してる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。