hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経分化因子を用いた神経再生制御による神経障害性疼痛治療方法の開発

Notch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出るが、CNTFやEGFやBDNFで生存率の向上は現時点では認められなかった。低酸素暴露による生存率の向上を目指し、18%、15%での低酸素環境下での細胞生存率についてさらなる検討を行ったが上記低酸素環境における細胞生存率の向上は認められなかった。マウス小脳神経前駆細胞にはNotch ligandの一種であるNotch 1が発現している事がわかっている。この細胞のについてNotchシグナルの神経系細胞共培養下での働きを調べる目的で、Notchシグナルを作用させることで、マウス小脳神経前駆細胞自体やグリア細胞マーカー(Tuj1、NeuN、MAP2やGFAP、S100b)の分布や出現頻度が変化するのかどうかを免疫蛍光染色により解析した。Notchシグナルの作用方法は、Notch細胞内ドメイン(Notch intraceller domain : NICD)遺伝子を導入したAdeno virusを神経系細胞に感染させ、NICDを過剰発現させて直接作用させる方法と、Jagged1やDelta like ligand4を発現したマウスfibroblastと神経系細胞を共培養させて細胞接触作用させる方法で行なう。マーカーのうち、GFAPについてはNotchシグナルを過剰発現させる方法でも、共培養により細胞接触させる方法でもGFAPの発現量が増加する事が示唆された。他のマーカーについては発現量が変化しないか細胞自体の生存率が悪い事が影響し、発現量の検討までに至らなかった。マウス小脳神経前駆細胞にNotch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出る事がわかっており、BrdUの取り込みを観察し各細胞種の分裂能に変化が起こるのかどうかを検討したが、BrdUの発現量に大きな変化は認められず、CNTFはこの時期の生存率を向上させることは出来なかったと考えられた。これまでの研究でマウス小脳神経前駆細胞にはNotch ligandの一種であるNotch 1とNotch receptorの一種であるJagged 1が発現しており、その標的遺伝子はHES 5が主でHES 1はほとんど標的になっていない事がわかっている。HES 1は神経細胞においては標的遺伝子として一般的であるが、マウス小脳神経前駆細胞では異なっていた。このため、マウス小脳神経前駆細胞ではNotch signalを介した伝達機構とその効果が他と違う物である可能性が示唆されている。Notchシグナルの神経系細胞共培養下での働きを調べる目的で、Notchシグナルを作用させることで、神経細胞やグリア細胞マーカー(Tuj1、NeuN、MAP2やGFAP、S100b)の分布や出現頻度が変化するのかどうかを免疫蛍光染色により解析した。Notchシグナルの作用方法は、Notch細胞内ドメイン(Notch intraceller domain : NICD)遺伝子を導入したAdeno virusを神経系細胞に感染させ、NICDを過剰発現させて直接作用させる方法と、Jagged1やDelta like ligand4を発現したマウスfibroblastと神経系細胞を共培養させて細胞接触作用させる方法で行なった。前回も報告したが、GFAP発現量はNICD過剰発現の細胞でも、共培養での細胞でも発現が確認された。さらに今回、その発現量が増加する事が確認できた。さらにNotch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出る事がわかっている。細胞マーカの変化を観察するにあたっては、この時期の生存率を向上させる必要があり、まずは生存率向上のための神経成長因子の同定が必要であると考え、BrdUの取り込みを観察し各細胞種の分裂能に変化が起こるのかどうかを引き続きCNTFにて実験を繰り返したが、生存率の向上は認められなかった。また、EGFやBDNFにても同様の実験を行なったが生存率の向上は現時点では認められず、その他の方法にて生存率を向上させることが必要であると思われる。Notch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出る事がわかっている。また、低酸素暴露による生存率の向上を目指し、低酸素環境下での細胞生存率を検討したところ低酸素環境における細胞生存率の向上も認められない状況である。本研究にはNotch ligandを発現したマウス小脳神経前駆細胞の生存率向上が不可欠であるが、その方法が確立できていない。

各種成長因子を用いて実験を繰り返しているが、未だ生存率向上が認められていない。本年度は低酸素環境下での生存率向上を検討したが、そちらも生存率の向上は認められていない。他の方法を検討中であり、やや遅れていると判断した。これまでの研究でマウス小脳神経前駆細胞にはNotch ligandの一種であるNotch 1とNotch receptorの一種であるJagged 1が発現しており、その標的遺伝子はHES 5が主でHES 1はほとんど標的になっていない事がわかっている。Notchシグナルの神経系細胞共培養下での働きを調べる目的で、Notchシグナルを作用させることで、神経細胞やグリア細胞マーカー(Tuj1、NeuN、MAP2やGFAP、S100b)の分布や出現頻度を免疫蛍光染色により解析した。Notch細胞内ドメイン(Notch intraceller domain : NICD)遺伝子を導入したAdeno virusを神経系細胞に感染させ、NICDを過剰発現させて直接作用させる方法と、Jagged1やDelta like ligand4を発現したマウスfibroblastと神経系細胞を共培養させて細胞接触作用させる方法で行なった。GFAP発現量はNICD過剰発現の細胞でも、共培養での細胞でも発現し、その発現量が増加する事が確認できた。Notch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出るため、生存率向上のための神経成長因子の同定が必要であると考え、EGFやBDNFにても同様の実験を行なったが生存率の向上は認められなかった。本年は低酸素暴露による生存率の向上を目指し、18%、15%での低酸素環境下での細胞生存率についてさらなる検討を行ったが上記低酸素環境における細胞生存率の向上は以前、認められなかった。また、幼若脳神経細胞に対する麻酔薬の影響を再検討し、総説として論文投稿するとともに、神経障害性疼痛治療の一方法である硬膜外カテーテルのトラブルへの対処方法について検討し、執筆した。Notch signalを過剰発現する事で細胞の中期(3-4日間)の生存率に影響が出るが、CNTFやEGFやBDNFで生存率の向上は現時点では認められなかった。低酸素暴露による生存率の向上を目指し、18%、15%での低酸素環境下での細胞生存率についてさらなる検討を行ったが上記低酸素環境における細胞生存率の向上は認められなかった。本研究にはNotch ligandを発現したマウス小脳神経前駆細胞の生存率向上が不可欠であるが、その方法が確立できていない。各種成長因子を用いて実験を繰り返しているが、いまだに生存率の向上が認められない。各種マーカーの発現については確認できている状況であるため、引き続き進めていく。
慢性肉芽種に対する選択的増幅遺伝子を用いた遺伝子治療臨床応用に向けた技術開発

慢性肉芽腫症に対する選択的増幅遺伝子を用いた遺伝子治療臨床研究に向けた技術開発1.治療遺伝子(gp91^<phox>)導入細胞の移植実験1)移植前処置の最適化の検討これまでの検討で、前処置を何も行わない条件での、尾静脈移植(IV-BMT)および骨髄内移植(iBMT)の両群間で移植生着効率に有意差はなく、かつ生着効率も極めて低値であることが分かった。このため、非致死的放射線照射(2Gy)を前処置として用い、IV-BMTとiBMTの両群で比較した。この結果、両者で生着は確認でき、治療遺伝子の発現で活性酸素産生率(IV-BMT 10%,iBMT 30%)と高値を示した。2)選択的増幅遺伝子によるin vivo増幅選択的増幅遺伝子(SAG)システムを搭載したレトロウイルスベクターに治療遺伝子(GP91^<Phox>)を組み込んだベクターを作成し、これを遺伝子導入した細胞をマウスモデルに移植し、動作を確認した。この結果、非致死的照射による前処置後に、iBMTを行ったマウスで生着が確認でき、さらにSAGの分子スイッチであるエリスロポエチン(EPO)投与後、一過性に治療遺伝子を導入した細胞数の末梢血での増加が確認できた。これにより、活性酸素産生細胞の増加が達成できた。しかし、選択的増加は一過性で、EPO刺激依存性であった。2.安全性の検討LAM-PCR法を用いた、レトロウイルスの遺伝子組み込み部位(インテグレーションサイト)の解析をした。これまでの遺伝子導入したマウスの血液細胞を経時的に追跡した結果、特異的な組み込み部位の増加はみられず、ベクターウイルスのランダムな組み込みを確認した。今後も長期に観察する予定である。慢性肉芽腫症(CGD)に対する遺伝子治療臨床応用に向けた技術開発1.遺伝子導入用ベクターの構築ヒトgp91phox遺伝子を選択的増幅遺伝子(SAG)システム搭載のレトロウイルスベクターに組み込み、まずマウス造血幹細胞を標的に遺伝子導入実験を行った。導入効率は、ほぼ50%以上を安定して到達し、かつin vitroで活性酸素産生(導入遺伝子の発現)が確認され、ベクターシステムがワークすることが確認できた。2.遺伝子導入細胞の移植実験1)移植前処置のない条件の検討前処置なしの条件で、尾静脈注入移植(IV-BMT)で行う群と骨髄内移植(iBMT)で行う群で、生着効率を比較検討した。それぞれ、5匹のマウスで行ったが、両群とも生着が確認できなかった。前処置なしでの移植は、今回の実験系では困難であることがわかった。2)移植前処置として放射線照射を行う検討2Gyと4Gyの2群の非破壊的骨髄照射を行ったのちに、遺伝子導入細胞の移植を行った。このときもIV-BMTとiBMTの2群に分けて比較検討を行った。この結果、いずれの群でも生着は確認でき、2Gyの弱い照射の群でかつiBMTの群で生着効率、および活性酸素産生率(40-70%)で高い値を示した。現在、移植後のマウスに関して、安全性の検討を行っているところである。慢性肉芽腫症に対する選択的増幅遺伝子を用いた遺伝子治療臨床応用に向けた技術開発1.治療遺伝子(gp91^<phox>)導入細胞の移植実験1)移植前処置の最適化の検討昨年までの検討で、前処置を何も行わない条件での、尾静脈移植(IV-BMT)および骨髄内移植(iBMT)の両群間で移植生着効率に有意差はなく、かつ生着効率も極めて低値であることが分かった。

このため、本年度は非致死的放射線照射(2Gy)を前処置として用い、IV-BMTとiBMTの両群で比較した。この結果、両者で生着は確認でき、治療遺伝子の発現で活性酸素産生率(IV-BMT 10%,iBMT 30%)と高値を示した。2)選択的増幅遺伝子によるin vivo増幅選択的増幅遺伝子(SAG)システムを搭載したレトロウイルスベクターに治療遺伝子(GP91^<phox>)を組み込んだベクターを昨年度までに作成したため、これを遺伝子導入した細胞をマウスモデルに移植し、動作を確認した。この結果、非致死的照射による前処置後に、iBMTを行ったマウスで生着が確認でき、さらにSAGの分子スイッチであるエリスロポエチン(EPO)投与後、一過性に治療遺伝子を導入した細胞数の末梢血での増加が確認できた。これにより、活性酸素産生細胞の増加が達成できた。しかし、選択的増加は一過性で、EPO刺激依存性であった。3)安全性の検討LAM-PCR法を用いた、レトロウイルスの遺伝子組み込み部位(インテグレーションサイト)の解析をした。これまでの遺伝子導入したマウスの血液細胞を経時的に追跡した結果、特異的な組み込み部位の増加はみられず、ベクターウイルスのランダムな組み込みを確認した。今後も長期に観察する予定である。
被災地における中高年女性への起業支援手法の開発

本研究は、キャリアの履歴を分析するツールである「マトリックス履歴書」を用いて、被災地の中高年女性の起業を支援する手法の開発を目指したものである。まず、歴史上や実在する女性起業家のマトリックス履歴を分析することで成功に必要な要素を洗い出した。次に中高年女性へのアンケート調査により地域に必要とされる起業や能力開発のニーズを明らかにした。さらに、中高年女性を対象としたセミナーを実施すると共に、参加者からの声を反映し、今後のセミナーや能力開発に活用できる「女性のための起業マニュアルー未来は自分で切り開く!ー」(161頁)を制作、地域の女性等に配布した。最後に、研究の成果を国内外の学会で発表を行った。一年目の本年度は、ほぼ、研究計画通りに研究を行うことができた。具体的には、1第1段階:起業支援に関する文献収集と分析:国内外の起業や起業支援に関する文献を広く収集することになっていたが、どちらかというと、国内の文献が中心であり、海外の文献収集は2年目以降の課題である。2第2段階:起業ニーズの把握と「起業支援手法(案)の提示」として、福島高専の女性卒業生を中心にヒアリング調査を行った。具体的には、/いわき市内でフェアトレードの会社を立ち上げたSSさん、/いわきで社労士として起業支援も行っているMSさん、/東京でイラストレータとして活躍するKさん、/その他、大企業の研究者を取りまとめる女性管理職のAさん、/IT研究者のNさん等である。さらに、いわきの起業家として、3名の若手経営者の方々と1名のベテラン経営者の方(男性)に対してもヒアリング調査を行った。具体的には、/福島高専卒業生で木材チップの会社と運送会社を経営するN氏、/N氏の紹介による木材加工会社の若手経営者A氏、/いわき市内で割り箸の加工業を経営するT氏、/いわき市内でタクシー会社とバス会社を経営するM氏等。とりわけ、女性起業家の方々には、「マトリックス履歴書」の作成をお願いした。ヒアリング調査の結果、起業家の育成モデルとして、エドガー・シャインのキャリア・アンカーの8つのカテゴリーでいうと、TF(専門能力)→CH(挑戦)→EC(起業)→GM(経営管理)→SV(社会貢献)の順にキャリアを形成していることがわかった。これらのヒアリング調査で得られた知見については、下記の学会で発表を行い、参加者からのフィードバックを得た。ヒアリング調査の結果をもとに、起業支援セミナーを実施すべく、高専生の母親を対象にアンケート調査を行い、中高年女性の起業や能力開発に対するニーズ調査を行った。本年度は、昨年度末に行ったアンケート調査(福島高専コミュニケーション情報学科の保護者)の結果を初め、研究の成果を国内外の学会で発表すると共に、女性向けの起業準備セミナーを2回行った。具体的には、以下の学会での発表を行った。さらに、昨年度末のアンケート調査を踏まえて、下記の2回、起業準備セミナーを行った。1親子で学ぶ実践ビジネス2女性のための就業・起業準備セミナー上記2回のセミナーは、女性の起業ニーズを探るためのセミナーであり、「起業に興味のある女性受講者」を確保するため、単なる「女性のための起業準備セミナー」とはせずに、親子共々学べることで、中高年女性の参加を容易にするものである。また、前者は、起業に興味を持つ中高年女性ということでは参加者が限られるとの懸念から、就業希望者も含める等、範囲を広げて行った。合計4日間のセミナーを通して、セミナーを充実させるために必要な講師等の特性等については、あきらかになったものの、受講者確保の方策については、依然として課題であることがわかった。昨年度の高専の保護者へのアンケート結果を踏まえ、女性のための起業セミナーを2回、4日間にわたって開催でき、受講生からのコメント等を収集できたのは順調な成果といえる。しかし、まだ、セミナー実施時に行ったアンケート結果の集計、分析が終わっておらず、実際に中高年女性の起業に対して、どれだけ効果があったのか示せない状況である。また、高専の保護者を対象に行った起業準備セミナーについてのニーズ調査を中心に論文にまとめ、日本産業教育学会に投稿したところ、下記の結果を得た。1実際にコースを実施する以前のアンケート段階のものであり、「実践研究」として発表するのは、無理がある。2「実践研究」であれば、カリキュラム編成での試行錯誤、参加者の反応、それを受けての改善点の定義などの具体的な論述に力点を置くべき。3アンケート(高専の保護者132名を対象に行ったもの)が、中高年女性全体を説明するものであるか説明が不十分。以上から、次回はセミナー実施後の結果も踏まえ、再投稿の予定である。本年は、研究結果の最終年として、報告書の作成や学会発表、そして、報告書の作成を中心に行った。本研究で行ったヒアリングや、中高年女性へのアンケート調査結果、そして女性のための起業支援セミナーの結果について、「中高年女性の起業化育成に向けた能力コースの検討」として、日本産業教育学会の産業教育研究第47巻第1号(2017年1月発行に)掲載することができた(pp.21-28)。具体的には、東日本大震災の被災地でもある福島県で行ったニーズ調査を基に検討、実施した女性を対象にした中高年女性の起業準備のための能力開発コースについて報告をおこなった。

「自己分析」、「地域理解」、「経営知識の習得」、「ネットワーキング」からなるフレームワークを開発後、実際に2つのセミナーを実施、評価すると共に、3つの課題として、新たな起業支援の仕組み作りの必要性、魅力的なカリキュラムの継続的な開発、そして、早期教育段階での起業についての啓発の必要性を提起した。また、マトリックス履歴書を用いた起業家の成功要因等の分析をIEVC2017(ベトナム、ダナン)で発表を行った。研究代表者らの勤務する高専の生んだゲームクリエーターに焦点を当て、マトリックス履歴書を用いて分析することで、高専が起業にどのように貢献したのかを示唆した。さらに、本研究の集大成とも言える「女性のための起業マニュアルー未来は自分で切り開く!」(全161ページ)を2017年4月1日に出版した。本研究に携わった4名の研究者全員が分担し、6章からなる自己分析や起業のフレームワークやビジネスプラン、事例等を示した包括的なマニュアルであり、起業を考える女性を中心に活用が期待できるものとなっている。昨年度は、研究代表者が副校長(学生担当)としての校務に追われ、学会発表等、当初予定したとおりに行えなかった。しかしながら、日本産業教育学会に実践研究として論文を報告できたこと、そして、当初の計画通りとはいえ、年度末直前に「女性のための起業マニュアルー未来は自分で切り開く!」を完成できたことは大きな収穫だった。とりわけ、後者は、今後起業を考える女性にとっては有益な資料となると考え、高専や女子大の授業での活用も計画している。本年度は、今までの研究成果を国内外に広く発表することを中心に行った。具体的には、2017年4月1日の「女性のための起業マニュアルー未来は自分で切り開く!ー」(西口美津子・渡部美紀子・芥川一則・大野邦夫(著)、全161頁)を地域や関連する団体等に配布した。また、英語による研究成果の発表を海外で行った。具体的には下記の2つの国際学会にアブストラクトを投稿し審査を受けた後、英文発表原稿(それぞれA4サイズ6ページ及び同18ページ)を投稿して発表を行った。内容)クラウドファンディングが女性の起業に与える影響について文献等から紹介すると共に、日本での女性の起業の現状を分析し、また、クラウドファンディングによる具体的な起業の事例(いわき市における子育て支援カフェの例)を紹介した。また、クラウドファンディングと女性の起業の親和性について示唆を行った。内容)科研費研究の成果物として完成させたマニュアルの制作に着手してから完成までを、日本における女性の就業と起業の現状に触れながら紹介した。本研究は、キャリアの履歴を分析するツールである「マトリックス履歴書」を用いて、被災地の中高年女性の起業を支援する手法の開発を目指したものである。まず、歴史上や実在する女性起業家のマトリックス履歴を分析することで成功に必要な要素を洗い出した。次に中高年女性へのアンケート調査により地域に必要とされる起業や能力開発のニーズを明らかにした。さらに、中高年女性を対象としたセミナーを実施すると共に、参加者からの声を反映し、今後のセミナーや能力開発に活用できる「女性のための起業マニュアルー未来は自分で切り開く!ー」(161頁)を制作、地域の女性等に配布した。最後に、研究の成果を国内外の学会で発表を行った。おおむね、研究計画どおりに研究が推移している。
生後早期における父子の関係性構築支援を目的とした介入効果の検証

本研究は、生後早期の親子関係構築支援ツールとして世界20か国以上で活用され、母親の感受性を高め、産後うつの発症リスクを低減させることが実証されているNeonatal Behavioral Observation (NBO) Systemを用いて、新生児の父親に対する早期育児支援介入を行う。そして、NBOによる育児支援介入が、父子相互作用、父親のメンタルヘルス、育児への関与などに及ぼす効果を量的及び質的に評価し、本法の父親への早期育児支援ツールとしての有効性を検証することを目的とする。
組換えウエストナイルウイルスE蛋白質によるCTL誘導性ワクチンの基礎的研究

ウエストナイルウイルス(WNV)は、時に致死性の脳炎・髄膜炎を発症させるヒト感染性ウイルスであるが、未だヒト用の実用ワクチンは存在しない。近縁のウイルスで得られた知見より、エンベロープ(E)蛋白が防御免疫を誘導するものと期待されている。本研究においては、組換えWNV E蛋白とcross-presentation誘導性アジュバントとの組み合わせによる、中和抗体のみならずCTLも誘導する組換え成分ワクチンの開発を目的として、数種類のWNV E蛋白質発現系を確立し、またCTLの標的細胞を樹立した。ウエストナイルウイルス(WNV)は、フラビウイルス属に属する蚊媒介性のヒト感染性ウイルスであり、その感染により高齢者層を中心に死亡率が4から14%におよぶ脳炎・髄膜炎を発症させる。自然界においては鳥と蚊によって感染環が成立し維持されているが、広い宿主域を持ち、米国東海岸での最初の患者の報告から僅か5年余りで北米大陸全域で発症例が報告されるようになったことからも、一旦ウイルスの侵入を許せば、その根絶はほぼ不可能であり、現在の国際間の交通事情や来るべき高齢化社会を考えれば、その対策は急務である。WNV感染に対して抗ウイルス薬は無く、ワクチン接種による感染予防が最も効果的と考えられており、現在種々のワクチンの開発が進められているが、未だヒト用の実用ワクチンは存在していない。近縁の日本脳炎ウイルスに対する現行ワクチン(不活化ワクチン)による知見より、ウイルス構造蛋白であるE蛋白が中和抗体を誘導することが知られているが、不活化ワクチンや成分ワクチンはその性質上、生ワクチンやDNAワクチンと異なってCTLは誘導されない。本研究では、昆虫細胞発現系により大量発現させた組換えWNV E蛋白を、大阪大学の明石満らにより開発されたcross-presentationを誘導する比較的安全なアジュバントであるγ-polygluthami acid(γ-PGA)でencapsulateしたものをワクチン候補としてマウスに免疫することにより、生ワクチン同様に中和抗体のみならずCTLも誘導するのか、また現行の家畜用不活化ワクチンよりもより効率的にWNV感染に対して防御するのか等について中心に検討を行い、安全かつ効果的なWNV組換え成分ワクチンの開発に向けた基礎的研究を行う。ウエストナイルウイルス(WNV)は、我が国に侵入を危惧されている蚊媒介性のヒト感染性フラビウイルスであり、高齢者層を中心に時に致死性の脳髄膜炎を発症させる。現時点では治療薬は無く、ワクチン接種による感染予防が最も効果的と考えられているが、未だ実用ワクチンは開発されていない。近縁の日本脳炎ウイルスに対する現行ワクチン(不活化ワクチン)による知見より、ウイルス構造蛋白であるE蛋白が感染予防に重要な中和抗体を誘導することが知られているが、生ワクチンとは異なり不活化ワクチンでは、ウイルス排除に重要な役割を果たす細胞傷害性T細胞(CTL)が誘導されない。そこで本研究課題ではWNVの組換えE蛋白を用いたcross-oresentationの系により、中和抗体のみならずCTLを誘導する、より安全な成分ワクチンの基礎的研究を行うこととし、研究初年度に当たる本年度においては主に、昆虫細胞による租換えWNVE蛋白の大量発現系を確立するために、以下の2点を行った。1.バキュロウイルス発現系による組換えWNVE蛋白の作成WNV(NY99-6922株)由来のPrMとE蛋白質のcDNAが入ったプラスミド(pcWNME)より、PrMの最終45塩基からEの1290塩基(E蛋白質N末端側80%相当部)を増幅するようにprimerを設計してPCR法により同部を増幅、N末端側にHis tagを持つInvitrogen社Bac-to-Bac SystemのドナープラスミドpFastBacHTAのEcoRIとXhoIサイトに導入してクローニングし、組換えドナープラスミド(pFastBacWNE)を作製した。これをbacmidが内在する大腸菌株DH10Bacにtransfectさせてtranspositionを起こさせることにより組換えbacmidを得た。今後は、この組換えbacmidを蛾由来の細胞株Sf9にtransfectすることにより組換えバキュロウイルスを得て、さらにこれをSf9もしくはHigh Five細胞に感染させることにより組換えWNVE蛋白を大量発現させ、Niキレートクロマトグラフイーを用いて精製する予定である。2.Drosophila発現系による組換えWNVE蛋白の作成E蛋白質cDNAの1番目から1218番目の塩基を増幅するようにprimerを設計し、PCR法により同部を増幅、C末端側にHis tagを持つInvitrogen社Drosoohila Expression Systemの発現ベクターpMT/Bip/V5-His AのBglIIとXhoIサイトに導入してクローニングし、組換え発現プラスミドpMTBip-WNE406)を得た。今後はこれをpCoHygroと共に、ショウジョウバエ由来S2細胞にco-transfectしてhygromycin-Bで選択し

stable transfectantを樹立、硫酸銅添加により誘導をかけて組換えWNVE蛋白を大量発現させ、Niキレートクロマトグラフイーを用いて精製する予定てせある。本年度においては昆虫細胞による組換えウエストナイルウイルス(WNV)E蛋白の大量発現系を確立するために、以下の2点を行った。1.バキュロウイルス発現系による組換えWNVE蛋白の作成昨年度においては、WNV(NY99-6922株)由来のPrMとE蛋白質のcDNAが入ったプラスミド(pcWNME)より、PrMの最終45塩基からEの1290塩基(E蛋白質N末端側80%相当部)を増幅するようにprimerを設計してPCR法により同部を増幅、N末端側にHis tagを持つInvitrogen社Bac-to-Bac SystemのドナープラスミドpFastBac HT Aに導入してクローニングし、組換えドナープラスミド(pFastBacWNE)を作製した。しかしながら、この系ではシグナル配列上流にHis tagが存在することになり、分泌蛋白質として発現され得ないことに気付いたので、本年度はドナープラスミドとしてpFastBaclを用い、C末端側相当primerにHis tag配列を組み入れて、ほぼ同様の手法にてBam HIおよびXho Iサイトに導入して組換えドナープラスミド(pFastBacl-WN80E)を再構築した。この組換えドナープラスミドpFastBacl-WN80Eを、bacmidを内在する大腸菌株DH10Bにtransfectさせることによりtranspositionを起こさせて組換えbacmid(Bac/WE80E)を得た。現在は、この組換えbacmidを蛾由来の細胞株Sf9にtransfectさせて組換えバキュロウイルスを作製中である。今後は、組換えバキュロウイルスを、同じく蛾由来の細胞株であるHigh Five細胞に感染させることにより組換えWNV E蛋白を大量発現させ、これをNiキレートクロマトグラフィーにより精製する予定である。2. Drosophila発現系による組換えWNV E蛋白の作成昨年度に構築した組換え発現プラスミドpMT/Bip-WNEを、ショウジョウバエ由来S2細胞にtransfectさせて硫酸銅添加により誘導をかけると、組換えWNV E蛋白を一過性に発現することを確認した。現在は、pMT/Bip-WNEとpCoHygroをS2細胞にco-transfectしてhygromycin-Bで選択することによりstable transfectantの樹立を試みている。今後は、このstable transfectantに組換えWNV E蛋白を大量発現させ、これをNiキレートクロマトグラフィーにより精製する予定である昨年度に引き続き本年度において、昆虫細胞による組換えウエストナイルウイルス(WNV)E蛋白の大量発現系を確立するために、以下の2点を行った。1.バキュロウイルス発現系による組換えWNVE蛋白の作成WNV(NY99-6922株)
ミャンマー・カレン村落の焼畑土地利用履歴と森林生態系の長期的変遷に関する研究

ミャンマー・バゴー山地のカレン村落周辺では,長期に及ぶ焼畑耕作により木本の優占する植生の一部はタケの優占する植生へと変化したが,様々な遷移段階の休閑林の存在は種の多様性を高め,休閑林からの有用植物の採取も認められている.また,本調査地で広く営まれているタケを伐開する焼畑は休閑期の早期の植生回復を促しており,非常に合理的である.現在,S村周辺の森林植生は伐採と回復がほぼ均衡した状態にある可能性が高く,新たな森林減少の要因となる可能性は低い.現状の人口密度が維持される限りは,植生回復の観点からは持続的な焼畑耕作が可能といえる.ミャンマー・バゴー山地のカレン村落周辺では,長期に及ぶ焼畑耕作により木本の優占する植生の一部はタケの優占する植生へと変化したが,様々な遷移段階の休閑林の存在は種の多様性を高め,休閑林からの有用植物の採取も認められている.また,本調査地で広く営まれているタケを伐開する焼畑は休閑期の早期の植生回復を促しており,非常に合理的である.現在,S村周辺の森林植生は伐採と回復がほぼ均衡した状態にある可能性が高く,新たな森林減少の要因となる可能性は低い.現状の人口密度が維持される限りは,植生回復の観点からは持続的な焼畑耕作が可能といえる.GPSを用いた現地踏査、聞き取り調査、植生調査と中解像度の衛星画像(Landsat,JERS)を用いたリモートセンシングによって、カレンによる伝統的な焼畑耕作が長期にわたり営まれてきたミャンマー・バゴー山地のS村周辺の土地被覆の長期的変化を解析した。S村では集落中心から約1km以内は村落共有林として保全され、集落中心から1-4kmのエリアで高頻度に焼畑が営まれていることがわかった。このエリアでは、休閑期間12年程度で焼畑が開かれており、タケが優占する休閑林が卓越している。現地観察や先行研究によれば、集落周辺の休閑林にはチークの生育がほとんど認められないことが確認されており、高頻度の火入れの繰り返しによって、休閑地の植生はチークに比べて耐火性の高いピンカド(Xylia xylocarpa)などの樹種に置き換わっていった可能性が示唆された。一方、集落中心から4km以上離れたエリアでは、焼畑の頻度が低いため、木本が優占する休閑期の比較的長い休閑林が形成されており、過去20年間で焼畑に使用されてこなかった森林の割合も高かった。長期に及ぶ焼畑耕作の結果、かつてのチーク天然林は姿を変え、木本の優占する植生の一部はタケの優占する植生へと変化したものと思われるが、様々な遷移段階の休閑林の存在は種の多様性を高める役割を果たしており、休閑林からの有用植物の採取も認められている。また、タケを伐開する焼畑は休閑期の早期の植生回復を促しており、植生回復の観点からも非常に合理的である。2001年以降は木本が優占する群落の減少は認められなかったことから、現在のS村周辺の森林植生は伐採と回復がほぼ均衡した状態にある可能性が高いといえる。過去約20年間のS村の焼畑土地利用履歴を時間的・空間的に再構成するため、1988-2006年度の衛星画像(JERS・LANDSAT)を用い、調査地周辺の土地被覆をClass1(木本が優占する群落)、Class2(タケが優占する群落やイネ科の高茎草本群落)、Class3(焼畑地・裸地)に分類した土地被覆区分図を作成した(教師付分類・最尤法)。これらの土地被覆区分図を全て重ね合わせ、土地被覆が常にClass1であった場所を残存林として抽出した。残存林は村落面積の約13%にあたる657.5haで、集落中心から1km以内が最も残存林の面積割合が高く、その外側では集落中心から離れるほど面積割合が高くなる傾向を示した。この結果、集落中心から1km以内は水源涵養や薪炭採取のための村落共有林が保全され、集落中心から概ね1-4km以内の森林がよく焼畑に開かれ、4km以上離れた森林では伐開頻度が低いことが確認できた。また、近年はClass2の植生を焼畑に伐開する世帯が増えていることが確認された。S村には残存林を新たに伐開する余地は十分にあるが、これらの多くは集落中心から離れているため、集落中心から比較的近く、伐採が容易でよく燃えるタケ群落が好んで開かれたものと思われる。植生調査の結果、タケが優占する群落を伐開した焼畑地では、休閑4年目にはタケの旺盛な再生が認められたが、木本が優占する群落を伐開した焼畑地ではタケの再生がほとんど認められず、休閑4年目ではイネ科の草本が優占していたことが確認された。熱帯のタケは地下茎で分布を拡大しないため、タケの優占している休閑林を伐開し、タケの早期の回復を利用して12年程度のサイクルで焼畑を繰り返すことは、植生回復の観点からも非常に合理的である。また、この結果、木本群落の伐採が抑制され、近年のClass1の緩やかな増加の一因となっている可能性が示唆された。ミャンマー・バゴー山地で焼畑を営むカレンのS村において、衛星画像から作成した植生図と過去の焼畑位置図を重ね、焼畑伐開前の植生を解析した結果、約9割の焼畑でタケの優占する林分が伐開されていたことがわかった。

S村全域の土地被覆は木本が32%、タケが44%、草本が14%、裸地・その他が10%であり、休閑年数の長い木本の優占する林分を伐開する余地は十分にある。しかしながら、S村では伐採が容易で良好な火入れをもたらすという理由から、タケに少量の木本が混生する二次林が好んで焼畑に伐開されることが聞き取り調査で確認されており、このことがGIS/RSを活用した解析結果からも裏付けられた。また、タケの優占する二次林の伐採・火入れは、休閑初期の早期の植生回復を促す上でも有効なことが、これまでの研究で明らかにされている(鈴木他2007)。このように、S村ではタケの伐採・火入れを中心に焼畑が営まれているが、2009年3月よりS村周辺ではホウライチク属のタケであるBambusa tuldaの一斉開花が始まり、S村内では約140haの竹林が枯死したと推定された。立ち枯れ直後のタケは非常に堅く、伐採が困難であることから、2010年の焼畑はタケの枯死地帯を避けて伐開されたが、開花後のタケの実生が再び焼畑に伐採できる程度に生長するにはかなりの年月を要するため、2011年以降のS村の焼畑伐開地選択にも大きな影響を与えることが予想される。また、タケの開花後に大量発生したネズミの食害で、2009-2010年伐開の焼畑の陸稲は壊滅的な打撃を被った。ネズミの食害によるリスク分散のため、2011年はお互いの焼畑を離して伐開することが検討されている。このように、数十年に一度発生するタケの一斉開花は、最適な焼畑伐開地の減少と焼畑作物の収量激減という二重の災いをもたらし、焼畑伐開地選択にも大きな影響を与えることが確認された。
プロトテカワクチンの開発

Prototheca zopfiiによる難治性乳房炎は、有効な防除法は確立されていない。そこで抗プロトテカ抗体検出用ELISAプレートを作製し、プロトテカ性乳房炎感染牛およびプロトテカ不活化抗原投与牛における血清中抗体価を測定し、血清学的診断法の有用性について検討を行った。プロトテカ感染牛血清では、非感染牛および酵母感染牛血清と比較して有意な抗体価の上昇を確認した。抗体上昇のカットオフ値を43.4に設定したところ、高感度(94%)および高特異性(100%)を確認した。不活化抗原接種による2回投与では抗体価上昇は認め、カットオフ値を上回る抗体価上昇と、投与12週後までの抗体価の維持を認めた。葉緑素不含藻類であるプロトテカ属で、牛舎環境周辺に腐生性に存在するPrototheca zopfiiは、牛乳房炎の原因藻類であり、乳量の減少、白色の凝固物を含んだ希薄な乳汁の分泌を引き起こす。本藻類は、少なくとも2つの遺伝子型(P. zopfii genotype 1およびgenotype 2)に分類され、後者は牛の乳房炎から分離される。両遺伝子型は、18S rDNA末端および26S rDNA D1/D2領域の遺伝子解析により鑑別されてきたが、近年本藻類のβ-tubulin遺伝子配列が一部公開された(Mancera et al ., 2011)。しかし、同遺伝子の情報はgenotype 1でのみに留まり、genotype 2に関しての報告は未だ無い。今回、genotype 2のβ-tubulin遺伝子解析を行い、genotype間での同遺伝子配列の相違を調べた。P. zopfiiの遺伝子型同定における、β-tubulin遺伝子配列の有用性が示唆された。さらに、新たな防除法の確立を目的として、genotype 2から作成した粗抗原を用いた、ELISA法によるPrototheca性乳房炎発症牛血清の検討を行っている。また乳房炎発症牛血清と交差した抗原に関して、ブロッティング解析中である。現在、症例数を増やし、乳房炎発症牛および非分離牛血清中抗体価を決定すると共に、ワクチン開発に応用する予定である。試作プロトテカワクチン投与時の抗体価測定および安全性の検討適切な防除法の確立を目的に、ホルムアミド不活化プロトテカワクチンを試作し、仔牛および成牛に対する接種安全性を確認した。また抗牛プロトテカ抗体価測定用ELISA系を作製し、抗体価測定応用および診断応用への有用性を検討した。無作為に抽出した感染牛/非感染牛血清を用いて、genotype 2破砕物を固層化抗原(1 μg/well)としたELISAの分析精度を比較し、良好な希釈直線性、再現性を得た(アッセイ内変動係数:3.79.1 %、アッセイ間変動係数:9.919.8 %)。プロトテカ感染牛、非感染牛および酵母感染牛血清の各抗体価をそれぞれ測定し、プロトテカ感染牛血清に有意な高値を確認した(p < 0.01)。設定カットオフ値を基に、試作不活化ワクチン投与牛(1.0 x 107 cells/mLおよびアジュバント)の抗体価上昇を検出した結果仔牛では、投与4週後まで抗体価の上昇を認めず、移行抗体の影響が考えられた。一方、同ワクチン一回接種の成牛では、抗体価の軽度な上昇を認めたが、カットオフ値以上への抗体価上昇および維持を得られず、一回接種法は不適と考えられた。そこで、投与濃度を増加(1.0 x 108 cells/mL)させ、初回接種4週後に第二次接種を行って測定した結果、8週後まで維持されるカットオフ値を超えた抗体価を認めた。以上から、試作不活化ワクチンの免疫原性/安全性、接種牛の一般状態および血液検査所見の健常性を確認し、本不活化ワクチンの牛プロトテカ乳房炎防除への可能性が示唆された。以上、得られた実績は、牛難治性乳房炎原因藻類Prototheca zopfiiの分子疫学的調査(第157回日本獣医学科学術集会,北海道大学,2014年.9月9日12日)およびSurvey and Discussion for Medical Phycology(第58回日本医真菌学会総会. 2014年, 11月1日-2日,横浜)にて発表を行い、現在学術論文へ投稿準備中である。プロトテカは藻類であるので、一般的に使用されている人薬や動物薬で特異的に作用する薬剤は存在しない。そのため効果的な治療法が無く、乳汁中にプロトセカを排出している感染牛の隔離・淘汰しか対策が無いのが現状である。一度牛舎内で発生すると、酪農家にとって経済的損失が大きい疾患である。感染被害が拡大する前に、プロトテカ乳房炎の早期診断が必要であるが、従来の診断法は乳汁からの直接分離同定しかなく、同定するまでの時間がかかることや、特殊穴な分離技術が必要であることから、早期診断が難しいのが現状である。そこで新たな診断法の確立を目的として、特異的抗プロトテカ抗体価測定用ELISA法を作成し、プロトテカ乳房炎牛および非乳房

炎牛の抗体価の測定を行った。さらにプロトテカから作成した粗抗原を作成し、それを非感染牛へ投与し、抗体価の推移も調べた。その結果、本ELISA法は、プロトテカ乳房炎牛で特異的に抗体価が高く、また非感染牛へ抗原を投与すると、抗体価の上昇が認められることから、プロトテカ乳房炎の診断に有効であることが確認された。ELISA法は、家畜保健所やコマーシャルラボなどでも行える手法であり、分離同定よりも簡易に行えることから、本疾患の防除に役立つものと考える。Prototheca zopfiiによる難治性乳房炎は、有効な防除法は確立されていない。そこで抗プロトテカ抗体検出用ELISAプレートを作製し、プロトテカ性乳房炎感染牛およびプロトテカ不活化抗原投与牛における血清中抗体価を測定し、血清学的診断法の有用性について検討を行った。プロトテカ感染牛血清では、非感染牛および酵母感染牛血清と比較して有意な抗体価の上昇を確認した。抗体上昇のカットオフ値を43.4に設定したところ、高感度(94%)および高特異性(100%)を確認した。不活化抗原接種による2回投与では抗体価上昇は認め、カットオフ値を上回る抗体価上昇と、投与12週後までの抗体価の維持を認めた。平成26度は、酪農学園において既にワクチン接種を行って、副作用の発現の有無の確認および有意な抗体価の上昇を確認できる投与摂取量の検討を行うことができた。その結果、本不活化ワクチンの牛プロトテカ乳房炎防除への可能性が示唆された。平成27年度は、26年度の再現性と抗体価の上昇継続を確認が主な目的であるため、研究計画で障害が起きるような可能性は低いと考えている。獣医臨床病理学平成27年度は、ワクチンの有効期間(抗体価の上昇期間)および副作用の判定を行うため、以下の研究計画を企画した。ワクチンの作成およびELISAを用いた血清抗体価を測定は、日本大学で行い、被検牛の飼育およびワクチン接種は、酪農学園大学で行う。1.第1回目投与実施日:平成27年5月第1週または2週目。1)成牛を510頭用意する。2)プロトテカをホルマリンで不活化後、生理食塩水で洗浄・回収し、1 X 108 /mlの藻数に調整する。これに等量の不完全フロイントアジュバンドと混合後、各群の牛へ2mlずつ頚部皮下投与する。3)投与直前および後4週間後毎に5mlずつ各実験牛の頸静脈から採血し、一般血液検査(CBCおよび生化学検査)を行うとともに血清を回収する。4)血清については、プロトテカを固相化したELISAを用いて抗体価を測定する。5)投与後の牛の一般状態を観察するとともに、ワクチン投与部位の皮膚の硬結、腫脹、疼痛の有無を確認する。2.第2回目投与(ブースター)実施日:平成27年6月第1週または2週目(第1回目投与から4週後)。1)前回と同様に調整したワクチンを投与する。1 X 108 /mlのプロトテカ+アジュバント1ml右側頚部に投与する。2)投与直前および後1週間後毎に5mlずつ各実験牛の頸静脈から採血し、一般血液検査(CBCおよび生化学検査)を行うとともに血清を回収する。3)投与後の牛の一般状態を観察するとともに、ワクチン投与部位の皮膚の硬結、腫脹、疼痛の有無を確認する。3.継続採血実施日:平成27年12月まで。1)2回目投与4週間後から4週間ごとに採血し、血清を分離し、抗体価をELISA法にて測定する。今年度は、酪農学園大学と共同研究のもと、子牛へ作成した粗抗原ワクチンの投与実験を行った。
流路健全性の保全・回復を目的とするデータ駆動型の河道能動制御法

大規模な河川災害により人命と社会資産の損失が繰り返されている.発災時の避難経路の確保と発災後の早期復興のためにも交通網など重要インフラの被害を最小化したい.一方,現在の河道の多くは,土砂堆積により水流が偏心しやすく,樹木の繁茂と相まって不要な破堤や氾濫を誘因しかねない.そこで本研究では,流路健全性の保全と回復のための河道能動制御法を提案する.情報科学,河川工学,地盤工学,物理学の異分野融合研究体制で,河川災害予防のためのサイバー・フィジカル・システムを創出する.センサー群による情報収集,計算機によるシミュレーション,アクチュエータ群による能動的水制のプロトタイプ・システムを構築する.大規模な河川災害により人命と社会資産の損失が繰り返されている.発災時の避難経路の確保と発災後の早期復興のためにも交通網など重要インフラの被害を最小化したい.一方,現在の河道の多くは,土砂堆積により水流が偏心しやすく,樹木の繁茂と相まって不要な破堤や氾濫を誘因しかねない.そこで本研究では,流路健全性の保全と回復のための河道能動制御法を提案する.情報科学,河川工学,地盤工学,物理学の異分野融合研究体制で,河川災害予防のためのサイバー・フィジカル・システムを創出する.センサー群による情報収集,計算機によるシミュレーション,アクチュエータ群による能動的水制のプロトタイプ・システムを構築する.
励起スペクトル－蛍光スペクトル同時取得可能な走査型光学顕微鏡の開発

顕微鏡により、試料の蛍光スペクトルを測定する顕微蛍光分光法はこれまでよく行われてきたが、励起スペクトルの測定を効率的に行える顕微鏡システムはなかった。励起スペクトルの測定には、試料を励起する波長を走査する必要があるため、蛍光スペクトルを測定するより時間がかかるのが一般的である。フォトニック結晶ファイバを用いてフェムト秒パルスレーザーの光を白色光に変換しそれをプリズムで分光して、励起光とした。試料の異なる場所に異なる励起波長を照射する光学設計とすることで、励起スペクトルを効率的に取得できる顕微鏡を初めて開発した。励起スペクトル測定に用いる白色光発生のため、フォトニック結晶ファイバを購入し、既設のフェムト秒チタンサファイアレーザーを導入して白色光発生のための光学系を構築した。非常に高い位置決め精度の光学調整が必要なため、あらたに高精度ファイバーアライメントシステムを購入し、システムに組み込んだ。構築した白色光発生系により、必要なスペクトル幅、強度を有する白色光が発生されることを確認した。また、SF11のプリズム、スリットなどを組み合わせた分光用の光路を構築し、発生した白色光を波長ごとに分離して顕微鏡対物レンズへ導入する光学系を構築した。励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラーを購入して対物レンズへ励起光を導入する光路を構築し、実際にサンプル上で励起光が波長ごとに分離して線上に集光されることを確認した。励起スペクトル測定を実現するために導入したフォトニック結晶ファイバおよびSF11ガラス製のプリズム、スリットを組み合わせた光学系を構築し、サンプル上で線上に集光する光学システムの最適化を行った。種々の検討の結果、励起スペクトル測定に必要となる、幅が広くフラットなスペクトルを持つ出力光を得るためには、フォトニック結晶ファイバへのフェムト秒レーザー光の入射および出射部分には対物レンズを用いる方式が最良であることが分かった。本助成金により対物レンズを購入し、システムに組み込んだ。さらに、超音波アクチュエータZ軸ステージを購入し、サンプルと対物レンズの焦点を自動調節するためのシステムを構築した。LabViewによりプログラムを構築し、コンピュータから制御可能となるようにした。同時に、板バネを用いた構造を持つXYステージを設計し、金属工作センターと協力して製作した。その結果、X、Y方向へのサンプル位置の粗動調節を高い精度で行うことが可能となった。ナイルブルー溶液を用いた試験的な実験により、構築しているシステムを用いて励起スペクトル測定が可能であることを実証した。建物の改修工事が、当初予定していたよりも長引いたため、2014年度8月まで退避スペースであるプレハブ棟での実験を余儀なくされた。改修後の建物への移設作業などもあり、年度の前半は予定よりも研究の進展は遅れ気味であった。移設前に、新たに購入する物品の選定を済ませていたため、移設後には順調に研究は進展している。光生物物理化学これまでに達成した白色光発生の光学系、分光システム、顕微鏡システム、を統合して、今年度前半までに室温での動作実証を行う。それとともに、装置の完成のために新たに別の資金で購入予定のCCDカメラによる検出器を組み込み、顕微鏡システムとして稼働させる。簡単な蛍光ビーズをガラス表面にスピンコートした試料を用いて、励起スペクトルの測定と顕微画像の取得を同時に行うことを目指す。こうした実験により、波長分解能、空間分解能、の評価を行い理論的に予想される値を実現するよう光学系を最適化する。年度の半ば頃、使用している対物レンズが損傷している疑いのある実験結果が得られ、新たな対物レンズの購入を計画した。その場合、2014年度配分額だけでは不足する可能性があったため、急き年度の半ばで次年度配分額を前倒し支払請求した。幸い、対物レンズは実際には損傷していないことが分かったため、前倒しで支給された額は残ったため、おおきな次年度使用額が生じることとなった。当初の予定のとおり、今年度にピエゾステージなどを購入して、配分額を使用する。
生理学的外力作用下での細胞内応力分布のダイナミクス

生体内外から生体に作用した力は疾患を誘発する.本研究はそれらの発症メカニズムの解明を目的とし,発症に関与すると指摘される細胞内で応力が分布する様子(細胞内応力分布)を生体内環境と同様の力学環境下での細胞について測定した.これを実現するために新規実験系を開発し,測定された細胞内応力分布ダイナミクスを支配する物理メカニズムとして細胞の物理構造を担う細胞骨格に着目した.その結果,細胞内応力分布が力学環境下で変化する様子はノイズの除去が急務であることが分かった.また,1つの細胞に着目した細胞内応力が力学環境下で変化する様子は十分に観察でき,細胞骨格の切断とともに複数の挙動が観察された.本研究では,力が誘発する疾患の発症メカニズムを解明することを目的として,発症に関与すると指摘される細胞内応力分布を,生体内の力学環境を模擬した応力作用下で測定する.その中でも,平成25年度は測定に必要な新規実験系の開発を続行した.当初の予定では細胞を播種するゲルとしてゼラチンゲルを予定していたが,開発を進める中で下記のような問題点が判明した.つまり,細胞を剥離させるのに当たって細胞が完全に剥離しない問題や,仮に完全に剥離できたとしても実験効率が極端に低い問題である.そこで,ゼラチンゲルの代わりにポリアクリルドゲルを用いることとした.このことにより,薬剤を用いて細胞を剥離させることが可能になり,ゼラチンゲルを用いることによって発生していた問題が解消されると期待した.そこでポリアクリルアミドゲルを再現性良くPDMSに化学結合させる技術の確立を目指した.具体的には,シランカップリング剤を用いたPDMS表面を化学修飾する手法を採ることとした.しかしながら,現状としてポリアクリルアミドゲルを再現性良くPDMSに化学結合させることには成功しておらず,引き続き問題点を抽出して技術の確立を目指しているところである.本研究では,力が誘発する疾患の発症メカニズムを解明することを目的として,発症に関与すると指摘される細胞内応力分布を,生体内の力学環境を模擬した応力作用下で測定する.その中でも,平成25年度はポリアクリルアミドゲルを再現性良くPDMSに化学結合させることを引き続き目指した.特に,PDMS表面の化学修飾の条件最適化,ならびにポリアクリルアミドゲルのゲル化における酸素除去に注力した.それらの対策にも関わらずポリアクリルアミドゲルを再現性良くPDMSに化学結合するには至らなかった.計画全体を達成するため,ポリアクリルアミドゲルに代わり,低弾性率PDMSをPDMSに結合させる方法についても検討を行った.その結果,PDMSの配合率によってポリアクリルアミドゲルに近い低い弾性率が実現できること,低弾性率PDMSをPDMSに特定の厚さだけ重層させるようにして結合ができること,この重層によって底面のPDMSが形状を崩さないこと,低弾性率PDMS表面のみに蛍光ビーズを局在させることが可能なことなど,ポリアクリルアミドゲルに代わって低弾性率PDMSを採用することが可能なことが分かった.一方で,ポリアクリルアミドゲルや低弾性率PDMSを検討する以前に採用していたゼラチンゲルによる実験結果の解析を進めた.その結果,培養細胞を複数回にわたり引張刺激した場合,1度目の引張刺激における応力上昇と2度目のそれによる応力上昇とでは,1度目の応力上昇は2度目のそれよりも総じて低いことが分かった.生体内外から生体に作用した力は疾患を誘発する.本研究はそれらの発症メカニズムの解明を目的とし,発症に関与すると指摘される細胞内で応力が分布する様子(細胞内応力分布)を生体内環境と同様の力学環境下での細胞について測定した.これを実現するために新規実験系を開発し,測定された細胞内応力分布ダイナミクスを支配する物理メカニズムとして細胞の物理構造を担う細胞骨格に着目した.その結果,細胞内応力分布が力学環境下で変化する様子はノイズの除去が急務であることが分かった.また,1つの細胞に着目した細胞内応力が力学環境下で変化する様子は十分に観察でき,細胞骨格の切断とともに複数の挙動が観察された.本研究では,力が誘発する疾患の発症メカニズムを解明することを目的として,発症に関与すると指摘される細胞内応力分布を,生体内の力学環境を模擬した応力作用下で測定する.その中でも,平成24年度は測定に必要な新規実験系の開発を進めた.当初の予定では細胞を播種するゲルとしてゼラチンゲルを,細胞に応力作用を与える環境温度として室温を予定していたが,開発を進める中で下記に示す問題点が判明した.具体的には,細胞をゼラチンゲルに播種した場合,細胞を剥離させる操作に大きな困難を伴うことが分かった.この困難さは,研究を予定通り遂行させることに対しても支障となることが予想された.また,細胞に応力作用を与える環境温度として室温を用いた場合,その後に得た知識に依れば,細胞の力学構造を担う細胞骨格が物理的な性質そのものを変化させてしまうことが分かった.室温は昼夜,季節による変動が大きく,再現性が高い実験結果を得ることに対して支障となることが予想された.これらの問題点を解消させて新規実験系の開発を完成させるため,以下のような計画変更を行うこととした.具体的には,ゼラチンゲルの代わりにポリアクリルドゲルを用いることとした.このことにより,細胞を剥離させる操作に薬剤剥離が可能になり,操作の困難さが解消される.この代替法については,現在も方法の確立を進めているところである.また,環境温度として室温の代わりに生理的温度である37°Cを用いることとした.そのために,新たに小型細胞培養機の選定を進め,早期に購入することを現在予定している.