hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
黄砂は病原性ウィルスの「長距離の運び屋」として機能しうるか？

大陸から飛来する黄砂に付着した病原性細菌・ウィルスが感染性、病原性等の生物活性を保ったまま海を渡ることが出来るかどうかを検証するために、フラスコ内に黄砂を入れて撹拌することによって浮遊させ、温度、気圧、湿度などを調節することによって黄砂が大陸から日本へ飛来する状況を実験室内で再現する装置を作製することを試みた。本研究期間内ではこの装置の試作、条件検討並びに黄砂が飛来する間に曝される環境の分析を行ったが、今後は実際にモデルとなる病原性を持たない微生物、ウィルスを黄砂に付着させ、この装置再現した環境内で生物活性を保てるかどうかを調べる予定である。実験室内での黄砂飛来時の黄砂粒子周辺の微環境の再現系の確立においては、昨年度より引き続き、黄砂と類似の粒径および密度を持つ2種類のモデル微粒砂を用いて、フラスコ中に投入した微粒砂を撹拌子で浮遊させ、温度、気圧の調節および飛来途中における大都市圏通過に伴う環境汚染物質の混入をフラスコ中に当該物質溶液を注入することにより再現する系の開発・改良を行った。一方、蛍光プローブを用いた砂粒子周辺のイオン強度、pHを中心とした微環境測定の条件検討を行い測定系の確立については、微粒砂サンプルの周囲に蛍光プローブと共にいくつかの種類の油脂を滴下することによって、粒子周辺の溶液が拡散しないように固定した条件下で、蛍光による測定法の検討を行った。現在、検出感度、特異性の面で依然として問題があるため、解決を試みている。まず、先行研究、公開されている気象データを基に、黄砂の飛来・通過経路データ、通過地点上空の大気汚染に由来して黄砂粒子が通過時に曝露されると考えられる微環境データの収集・解析を行った。次に、丸型フラスコに黄砂と粒径、物性が類似したモデル微粒砂を入れ、これを攪拌子で撹拌することによりフラスコ内を浮遊させ、真空ポンプ、冷凍庫で気圧、温度を調節し、都市上空、海上など黄砂の移動経路上で黄砂粒子が曝露される塩水分、大気汚染物質を適時に注入することで黄砂飛来時の微環境を実験室内で再現する系の確立を試み、投入する砂サンプルの量、撹拌子の形状・大きさ、撹拌速度に関する条件検討を行った。黄砂粒子周辺の微環境、特に弱酸、弱塩基による緩衝作用の評価法の確立については、蛍光pHインディケーターを用いた粒子単位での測定、砂サンプルをごく少量の水で洗い流した水溶液を用いた測定法等の条件検討を行ったが、検出感度の面で本研究遂行上の要件を満たす結果が得られていない。今後、別種のpH,イオン強度蛍光インディケーターを用いた測定精度の向上を進める予定である。本研究期間において、最終的な段階であるモデル微生物、ウィルスの上記装置への投入・黄砂飛来時の状況の微環境下における生存(感染性、生物活性の保持)の検証を行うことが出来なかったが、今後継続して上記条件検討を進め、コントロールとしてのモデル微生物・ウィルスの生存の検証および黄砂が発生する大陸で採取した土壌サンプルのフラスコ内の「飛来」実験後の生物活性の検証を行う予定である。研究実施者が所属するグループ並びに他グループによる先行研究、公開されている気象データを基に、黄砂の飛来・通過経路データ、通過地点上空の大気汚染に由来して黄砂粒子が通過時に曝露されると考えられる微環境データの収集・解析を行った。現在実験室での微環境再現のために、得られた経路、微環境データの類型化を進めており、実験室における黄砂粒子周辺の微環境の再現にあたってなるべく少ないパラメータで実現出来るよう最小限必要な微環境パラメータが何であるかの検討を行っている。実験室内での黄砂飛来時の黄砂粒子周辺の微環境の再現系の確立においては、フラスコ、攪拌機を用いた装置の試作を行い、投入する砂サンプルの量、撹拌子の形状・大きさ、撹拌速度に関する予備的な条件検討を行った。黄砂粒子周辺の微環境、特に弱酸、弱塩基による緩衝作用の評価法の確立については、蛍光プローブ等を用いた粒子単位での条件検討には至っていないが、予備的に投入した砂サンプルをごく少量の水で洗い流した水溶液を用いた測定法の検討を行ったが、検出感度の面で本研究遂行上の要件を満たす結果が得られていない。蛍光プローブを用いた砂粒子周辺のイオン強度、pHを中心とした微環境測定の条件検討を行い測定系の確立を目指したが、条件検討の予備実験において、一部の塩濃度などの環境パラメータの測定法が感度、特異性の面において大きな改良の必要性があることが判明し、当該年度における当初の研究計画の完了が難しくなった。研究の基幹となる蛍光顕微鏡の導入が予定通りに行うことが出来なかった。そのため蛍光プローブを用いた砂粒子レベルでの微環境測定系の確立に関する実験が大幅に遅れ、基本データの収集・解析と予備的実験にとどまってしまった。

また、本研究以外での用務過多による本研究の実施のためのエフォートの確保が特に23年12月頃まで極めて困難であったことから研究全体の進捗が計画より遅れた。口蹄疫ウィルスほか黄砂で伝播する病原体の生存・活性の維持には特にpHが大きな影響を及ぼすため、蛍光プローブによる砂粒子周辺の微環境測定についてはpHの測定に重点を絞り、蛍光プローブ種、その組み合わせのおよび検出法の更なる検討を行い、実際の試料の解析な可能となる条件の確立を行いたい。一方フラスコ内での黄砂飛散の再現系を用いて、モデルとなる微生物、ウィルスの飛散実験を行い、生物的活性を保持するかを検証する系の確立も併せて行う。「現在までの達成度」の項で述べた理由で進捗が遅れている黄砂粒子表面の緩衝作用を評価する方法論の確立を中心に計画を進めるが、研究の上位目標である黄砂の飛来環境下で病原体が活性を保持できるかを検証することを第一義にするため、測定法については必要最小限の分子、イオンに関する評価法の確立を優先させる。実験室内での黄砂飛来時の黄砂粒子周辺の微環境の再現系の確立においては前年度の予備的研究の結果を踏まえ、再現すべき必要最小限の環境パラメーターに焦点を絞り、可能な限り単純な装置の開発に努める。25年度は、砂粒子周辺の微環境測定系の確立のために、蛍光プローブおよび関連試薬類を中心とした必要な消耗品購入のために、フラスコ内での黄砂飛散実験においては、モデル微粒砂、モデル微生物・ウィルスの培養用試薬・消耗品の購入に経費を充当する予定である。遅くとも24年度の前半までに蛍光顕微鏡ほか黄砂粒子周辺の微環境測定のための基幹備品・物品を導入する。黄砂飛来時の黄砂粒子周辺の微環境の再現系の確立のための装置に関する物品は23年度に基本的なものは導入済みであるため、条件検討において追加で必要となった部品の購入、黄砂粒子表面の微環境の測定のための試薬類の購入に使用する。
坐骨神経痛発現メカニズムにおける脊髄グリア細胞活性化の寄与

整形外科領域の坐骨神経痛モデルである2種類のラット神経根損傷モデルを作成し、疼痛関連動作を経時的に観察し、安定的に痛覚過敏を確認し、さらに前根損傷モデルの方が安定して痛覚過敏が顕著に検出できることを見いだした。両モデルにおいて、Iba-1、GFAPの上昇を確認することができ、特に前根損傷単独においてもグリア細胞の活性化が生じるという新しい発見があった。前根損傷モデルのL5レベルの脊髄後角にて、リン酸化ERKの有意な増加を確認した。アメリカとの共同研究において、下降性の疼痛促進経路においてニューロンとグリアのコミュニケーションが極めて重要である所見を発見し、J. Neurosciに発表した。本研究は、坐骨神経痛モデルを用いて、脊髄後角におけるシグナル伝達分子の活性化とグリア細胞自身の形態変化、あるいはグリア細胞における疼痛関連分子遺伝子の発現変化(炎症性サイトカインを中心に)、さらには神経因性疼痛との関連を解明することを目的とする。2...脊髄後角におけるグリア細胞の活性化の確認:マイクログリアのマーカーであるIba-1、アストロサイトのGFAPの免疫組織化学法を施行した。安定して、Iba-1、GFAPの上昇を確認することができた3...リン酸化MAPK、炎症性サイトカインの増減の定量化:術後1、3、7、14、21日目にL5レベルの脊髄後角を摘出し、ERK1/2活性化の指標であるリン酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、IL-18に対するpolyclonal抗体を用いた免疫組織化学を施行中である。今年度は、二種類の神経根損傷モデルを作成し(前根単独損傷モデル及び後根損傷モデル)その疼痛行動の計測、脊髄グリア細胞の変化について検討した。3...リン酸化MAPKの増減の定量化:前根損傷モデルにおける術後1、3、7、14、21日目にL5レベルの脊髄後角を摘出し、ERK1/2活性化の指標であるリン酸化ERKI/2(p-ERK1/2)を検出して現在その定量化を行っている。二種類の神経根損傷モデルを作成し(前根単独損傷モデル及び後根損傷モデル)その疼痛行動の計測、脊髄グリア細胞の変化について検討してきた。1...疹痛関連動作の確認:SD雄性ラットを用いて整形外科領域の坐骨神経痛モデルである2種類の神経根損傷モデルを作成し、疼痛関連動作(thermal hyperalgesia、mechanical allodynia)を経時的に観察し、安定的に痛覚過敏を確認できるようになった。前根損傷モデルの方が安定して痛覚過敏が顕著に検出できることを見いだした。3...リン酸化MAPKの増減の定量化:前根損傷モデルにおける術後1、3、7、14、21日目にL5レベルの脊髄後角を摘出し、ERK1/2活性化の指標であるリン酸化ERK1/2(p-ERK1/2)の有意な増加を確認した。4...アメリカとの共同研究において、下降性の疼痛促進経路においてニューロンとグリアのコミュニケーションが極めて重要である所見を発見し、J.Neurosciに発表した。
分子構造類似性の定量的評価に関する研究

本研究では、トポロジカルな構造情報のみに注目した構造類似性の定量的評価のためのアルゴリズムを考案するとともに対応するシステムの開発を目的とした。本研究では、先に筆者らが提案した部分構造列挙とその対応する部分グラフのグラフ特性量に基づく特徴づけによって生成されるフラグメントスペクトル表現をもとに化学構造のトポロジカルなプロフィールを記述した。各部分構造の特徴づけには構成原子の質量数の和を用いた。従って、ここでのフラグメントスペクトル表現は質量スペクトル様の表現として記述される。類似性の評価に際してはこれらのスペクトルを多次元パターンベクトルで表し、各パターン間のユークリッド距離に基づく類似度を定義した。また、これらの処理に対応するプログラムを開発するとともに一連のプロセスのシステム化を図った。作成したシステムをもとに、42種の向精神薬を用いてこれらの構造類似性解析を試みたところ、研究者の視覚的直感ときわめて良好な対応を有する類似性評価の結果を得ることができた。また、本法を化合物データベースの構造類似性検索の問題に応用し、合わせてその有用性を確認した。
新たな酸化ストレス依存性経路の同定

我々は昨年までに酸化ストレス依存性にERK/Fra-1経路を介してIL-11の発現が誘導されることを明らかにした(Nishina et al, Sci Signal 2012)。今回我々は環境汚染物質中に含まれる親電子物質の1種である1,2-Naphthoquinone (NQ)とよばれる物質がIL-11の発現を効率良く誘導するという現象を見出した。その後の解析から活性酸素刺激と同じように持続的なMEK/ERK経路の活性化とその後のFra-1の蓄積が、1,2-NQによるIL-11の発現に必須であることが判明した。1,2-NQはNRF2経路を活性化することが既に報告されていることから、今回の研究により1,2-NQはNRF2経路と共にIL-11経路を活性化することで、酸化ストレス応答を誘導していることが明らかとなった。またIL-11はヒトの胃がんや大腸がんで、またマウスのそれらのがんモデルにおいても高発現していることが知られている。そこでIn vivoにおいてIL-11産生細胞を可視化するために、BACクローンを用いてIL-11-GFPレポーターマウスを樹立した。現在一種のレポーターマウスのラインは、内在性のIL-11の発現とGFPの発現が非常によく相関していることを見出している。さらにIL-11の高発現している精巣で抗GFP抗体による免疫染色により、IL-11陽性細胞の同定に成功している。今後は、IL-11-GFPレポーターマウスに様々な炎症を誘導し、また胃がんや大腸がんモデルマウスと交配することで、IL-11産生細胞の同定を目指す予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。酸化ストレスは様々な生体応答を誘導する事が明らかにされているものの、その全貌の解明には至っていない。また代償性性増殖と呼ばれ、アポトーシスに陥った細胞が様々な因子を分泌して周辺細胞の増殖を促進し、生体の恒常性を維持する現象の存在が注目されてきている。しかしながら、アポトーシスと酸化ストレスは密接に結びついている事が示されているものの、酸化ストレスと代償性増殖の関係は明らかとなっていない。我々は酸化ストレスにより発現誘導される新規遺伝子を網羅的にスクリーニングする過程で、IL-6ファミリーに属するIL-11が、酸化ストレス依存性に発現が誘導されることを見出した。IL-11の転写制御機構を解析した結果、ERK2依存性にFra-1のリン酸化が誘導され、その結果Fra-1のタンパクレベルが安定化し、蓄積したFra-1がIL-11遺伝子のプロモーターに会合し転写を活性化していることが明らかとなった。またIL-11をin vivoに投与することにより肝臓においてSTAT3の活性化とc-Mycの発現誘導が認められた。さらにアセトアミノフェン(APAP)誘導性肝障害マウスモデルを用いた解析から、IL-11は酸化ストレス依存性に肝細胞から産生・分泌されること、人工的に作製したIL-11受容体アゴニストを投与することにより、APAPによる肝障害が改善し、肝細胞の代償性増殖も亢進することが明らかとなった。逆に、IL-11Ra1欠損マウスでは、APAPによる肝障害が増悪し、代償性増殖の低下が認められた。以上より、酸化ストレス依存性に産生されるIL-11が代償性増殖に関与することが初めて明らかとなった。IL-11は胃がんや大腸がんなどで高発現していることが示されていることから、1L-11は酸化ストレスとがん化を仲介する一つの因子である可能性が示された。

酸化ストレス依存性に誘導される因子として同定したインターロイキン11が、死細胞から放出される事、およびIL-11受容体アゴニスト投与により、アセトアミノフェン投与による肝炎が改善し、逆にIL-11受容体欠損マウスでは肝炎が増悪することを示した。この研究は酸化ストレスと代償性増殖とを連結する因子を初めて同定した研究であり、サイエンスシグナル誌の表紙に取り上げられ、さらに日本経済新聞および共同通信社の新聞記事に掲載され、広く我々の成果を国民にアピールすることが出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はIL-11産生細胞をin vivoで可視化するためのIL-11 reporterGFPマウスの作製(既に一匹のトランスジェニックマウスを得ている)と、様々なモデルを用いることで、死細胞から酸化ストレス依存性に産生されるIL-11の生体に置ける役割を明らかにする予定である。
進行性腎障害に対する脱分化脂肪細胞(DFAT)を用いた細胞移植治療の開発

慢性腎障害の根治療法開発が切望される現在、本学で開発された、間葉系幹細胞と同等の多分化能を有する脱分化脂肪細胞(DFAT)を慢性腎障害モデルに細胞移植した。自己免疫疾患のANCA関連腎炎モデルマウスでは腎障害の改善が診られたが抗癌剤腎障害モデルラットでは改善が診られなかった。移植により抗炎症作用を持つTSG6が腎臓や肺に強発現しており、またTSG6発現をノックダウンしたDFATを移植した場合、改善効果がキャンセルされた。DFATの細胞移植は免疫調整作用により腎症を改善していると考えられた。自己免疫疾患による腎障害の疾患に臨床応用出来る可能性が示唆された。我々はDFATが免疫抑制作用を介して、免疫性腎炎モデル動物の病態を改善することを見出した(Maruyama T, et al. Systematicimplantation of dedifferentiated fatcellsamelioratedmonoclonal antibody 1-22-3-induced glomerulonephritis by immunosuppression withincreases in TNF-stimulated gene6. Stem Cell Res Ther 2015;6:80.#1)。その際に使用した腎炎モデルがラット特有の疾患であったためヒトの疾患に近いモデル動物に変更して、移植の効果・安全性を確認することが本研究の目的である。当初は予後不良の免疫性腎炎でヒト疾患にも存在するANCAについて、その疾患モデルであるSCG/Kjマウスに対してDFATの細胞移植を行う予定であった。しかし当研究費採択の決定後速やかに分譲依頼を2015年6月に行ったが、分譲されたのが2016年4月に遅延してしまった。理由は次項目の通りだが、その間以下の代替実験を行った。先に述べた我々の報告#1は他家移植、つまり別の個体で作製したDFATを移植細胞源として使用している。細胞移植は他家移植こそ効果があるという説もあり、それが真実ならば将来臨床応用を目指す際に他家移植による拒絶反応や感染症など安全性の面に不安が残るため、自家移植でも同様に効果が得られるのかを検証する必要性があった。そこで我々の報告#1と同様の対象動物、方法で自家移植による検証を行った。結果は他家移植と同等の効果が観られ血液や組織でのTSG-6の上昇や発現も確認された。DFATの腎疾患への細胞移植はより安全性の高い自家移植でも同様の機序で効果が期待出来ると考えられた。前項にも述べたが、目的疾患モデル動物の分譲の遅延が挙げられる。遅延の理由として当疾患モデルマウスは依頼されてから交配を始める点、繁殖が難しい点、繁殖後も死亡する個体も多く維持も困難である点、そのような中、他の研究施設からも依頼が多々重なっている点などが挙げられ、結果として目的動物モデルを入手するまでに依頼してから1年近く歳月を費やすことになってしまった。ただし平成28年4月4日にモデル動物を入手出来たので実験はそれ以降無事に開始しており、今後進捗状況は改善すると思われる。前年度は予定していたモデル動物を発注してから入手するまでに時間を要したため研究が遅延したが、モデル動物を入手後は移植を予定通り行うことが出来て、研究実績の概要に記した通りほぼ予想していた結果も得ることが出来て研究を進めることが出来た。但し移植されたDFAT細胞の局在や、移植後の腎組織の改善が予想したものとは違う結果となりさらなる研究が必要と考えられ、今後追加実験していく予定である。脱分化脂肪細胞(DFAT)は日大大学で開発され間葉系幹細胞と同等の多分化能を持つことが証明されている。我々はDFATが免疫抑制作用を介して、進行性免疫性腎障害モデルを改善する事を報告した(Maruyama, Fukuda et al. Stem Cell Res Ther 2015)。臨床応用を見据えてヒトにも存在する免疫性腎障害で、予後不良疾患であるANCA関連腎炎モデルSCG/ThpNkcマウスにDFAT細胞移植を施行した。結果、移植により生存率の上昇、尿蛋白量と血清ANCA値の減少、血液中の免疫性制御因子TSG-6濃度の有意な上昇を認めた。今年度の結果として移植によりCD44が抑制されている結果が得られた。またTregやIDOの変化を予想したが有意な変化は見られなかった。結論としてDFAT細胞移植はモデルマウスにおいてANCA関連腎炎を改善させ、その機序の一つにTSG-6の発現亢進による免疫調整作用が考えられた。ヒトにも存在するモデルでその効果や機序の一端を証明したことは、臨床化に近づけたと考える。今後はCD44の結果からDFAT細胞移植による糖尿病性腎症改善も期待されるが今後数年においては自己免疫疾患に絞って研究を進めることにする。ループス腎炎モデルを標的に加えて移植の治療効果と作用機序をTSG-6以外で再度検討する。免疫抑制作用として制御分子TSG-6、IDO、Th1サイトカイン、M1マクロファージサイトカイン、M2マクロファージサイトカインの血液、腎臓での発現や脾臓内の調節性T細胞の割合を評価する。siRNAにて免疫抑制分子をKOしたDFATを移植し、腎機能、尿蛋白、腎組織障害を評価し、免疫抑制作用の分子機序を検討する。さらに今回得られた免疫性腎炎マウスでのDFAT移植の投与細胞数、投与期間などのデータを蓄積しDFAT移植療法の臨床応用に繋げていく。

慢性腎障害の根治療法開発が切望される現在、本学で開発された、間葉系幹細胞と同等の多分化能を有する脱分化脂肪細胞(DFAT)を慢性腎障害モデルに細胞移植した。自己免疫疾患のANCA関連腎炎モデルマウスでは腎障害の改善が診られたが抗癌剤腎障害モデルラットでは改善が診られなかった。移植により抗炎症作用を持つTSG6が腎臓や肺に強発現しており、またTSG6発現をノックダウンしたDFATを移植した場合、改善効果がキャンセルされた。DFATの細胞移植は免疫調整作用により腎症を改善していると考えられた。自己免疫疾患による腎障害の疾患に臨床応用出来る可能性が示唆された。今年度中にANCA関連血管炎モデルマウスSCG/KjへのDFAT細胞移植の効果および効果がある場合にはその機序を考察する。このマウスに対して移植の効果があるということになればヒトの腎疾患に対してもDFATの細胞移植が治療法になり得るということを示唆する。臨床応用して腎不全の新しい治療法を確立することが最大の目的であるため、その場合は効果と安全性を以下の内容で検証していく。DFATの腎炎に対する抑制効果についてMEDINETと細胞治療の共同研究を行い、再度その効果と機序について検証する。MEDINETと免疫性腎炎に対するDFAT細胞移植の臨床試験についてJST A-STEP FSに申請する。MEDINETと免疫性腎炎に対するDFAT細胞移植についてヒト幹細胞移植ガイドラインへの申請書を作成。厚労省PMDAに申請する。更にはDFATと近似した性質を持つとされる脂肪由来の間葉系幹細胞(ASC)が分泌するTSG-6が直接的、間接的にT細胞上に存在して、接着因子であるCD44を抑制してT細胞活性化や細胞浸潤を抑制することで免疫調整作用を発揮するという報告がある。CD44は改善すると糖尿病の治療につながるとも言われている。今回のDFATの慢性腎障害治療が慢性腎炎のみの適応だけでなく透析療法が必要な末期腎不全の原疾患で第一位の糖尿病性腎症にも当細胞治療の効果を期待でき、糖尿病性腎症モデルのOLETFラットを使用して糖尿病性腎症にも効果があるか検討していく。前年度行った実験ではDFAT移植により血液データや腎炎の組織像の改善が明らかでなかったことや移植後DFATの体内分布の詳細が判明しなかった点が予想とは違っていた。疾患モデルは予後不良のため、実験途中に自然死する個体が多く、それらのデータを今回加味しなかったため有意差が出なかった可能性が有る。途中死亡する疾患モデル群の個体も結果に入れて再実験する予定とした。また移植後のDFATの体内分布について、前年度実験では注射直後には肺に存在していることを確認出来たがそれ以降は局在を確認出来なかった。一説には間葉系幹細胞の細胞移植では障害臓器に集積するとも言われており病態改善の機序を考えるために重要である。前年度の実験ではGFP陽性のDFATを使用したが、細胞の大きさが通常と比べて210倍前後大きく、通常のDFATを移植した場合を再現しきれていない可能性があり次回の追加実験ではSIGMA社製の生細胞染色キットを使用して通常のDFAT細胞移植により近い形を再現して再実験する。
真菌類を利用した新規生活習慣病予防食品素材の開発

紅麹菌は動脈硬化のリスク低減を目的とした機能性食品素材の開発に有効な二次代謝産物を産生する食用微生物である。しかし一方で肝腎障害に関わるシトリニンを同時に産生する場合があり、食品素材への紅麹菌の応用に際しては適切な菌株選択と厳密な培養制御が必要である。そこで申請者は広汎な条件設定にも対応可能な上に調製が容易で、得られる培養産物をready to eatで利用可能な固体培養基剤を用いて菌株や培養条件を精査し、得られる紅麹菌培養物を実験動物に給餌して機能性を評価する研究プログラムを立案した。当年度の主目的は優良な紅麹菌株のスクリーニングと培養条件の検討である。従来紅麹菌の培養に用いられてきた米やイモのような植物性の基質はデンプンが主成分であるのに対し、本研究で用いる培地のそれは熱変性したホエータンパク質であるため、従来と組成の点で大きく異なることになる。そこで紅麹菌が本培地中へシトリニンを分泌した場合を想定し、それを定量するために、熱変性ホエータンパク質に直接既知量のシトリニンを加え、溶液の種類や処理条件を変えながら、最適な抽出条件の検討を行った。次にM. purpureus、M. ruber、M. pilosusの3菌種を当該固形培地上で培養し、培養物から抽出した代謝産物をHPLCまたは質量分析に供した。これによりシトリニンのみならずロバスタチン、アンカフラビン、モナスシン等の機能性成分の有無と共に定量を試みた。さらに抽出物のヒドロキシメチル-グルタリルコエンザイムA(HMG-CoA)還元酵素阻害活性を測定し、生物活性の点からも抽出物の評価を行った。その結果、別項に記載した点に関する改善の余地を残しつつも、シトリニン非産生かつHMG-CoA阻害活性を有する代謝産物が得られる条件としてM. ruberを25°CpH 4.04.5で培養した場合が挙げられた。今年度の主目的は1)紅麹菌が産生する代表的な毒素であるシトリニンの抽出、定量系の確立、2)昨年度よりも優良な紅麹菌株のスクリーニングと培養条件の検討、そして3)高脂肪・高ショ糖食飼育ラットにおける脂質代謝に及ぼす影響に関する動物実験であった。その結果を以下に示す。1)昨年度は酢酸エチルを用いてシトリニンを、75%エタノールを用いて代表的な二次代謝産物であるモナコリンを抽出していたが、実験毎に回収率が大きく異なり一定しなかった。そこで回収時に酸性化した酢酸エチルを用いて60°C30分間の抽出処理を行うことでシトリニンの抽出効率が約85%で安定した結果が得られるようになった。またこの方法でモナコリンも同時に約70%回収可能であることが明らかとなった。2)昨年度よりも供試菌株数を増やして検討した。シトリニン非産生性で鮮紅色を示し、かつモナコリンやプロテアーゼ産生の高かった点からM. rubber NBRC9203およびNBRC32318株を選出した。さらに培養温度や培養期間、胞子播種の密度等から検討し、NBRC32318株をpH 4.0で25°C10日間培養が最も好ましいものと判断した。3)本実験の飼料を調製するために上記の培養条件によって得られた培養産物を無脂肪チーズに混合し、現在熟成段階である。紅麹菌は、動脈硬化のリスク低減を目的とした機能性食品素材の開発に有効な二次代謝産物を産生する食用微生物である。しかし一方で肝腎障害に関わるシトリニンを産生する場合があり、食品への紅麹菌の応用に際しては適切な菌株選択と厳密な培養制御が必要である。そこで申請者は広汎な条件設定にも対応可能な上に調製が容易、かつ得られる培養産物をready to eatで利用可能な固体培地基剤を用いて、菌種、菌株や培養条件を精査し、得られる紅麹菌培養物を実験動物に給餌して機能性を評価するプログラムを立案した。今年度の目的は1)昨年度選抜した紅麹菌を用いた試料調製、2)当該飼料を高脂肪・高ショ糖食飼育ラットに給餌した場合における影響の調査であった。その結果、1)ゴーダタイプチーズの製法に倣い、脱脂乳を原料として低脂肪チーズを調製した。

この時、紅麹菌培養産物無添加群を対照とし、紅麹菌培養産物添加群(固形ホエー培地pH 4.0でMonascus ruber NBRC32318株を10日間培養して得られた培養産物をチーズ中に5%添加して熟成させたもの)を試験食として設定した。何れも11.5°Cで3ヶ月間熟成させたものを飼料用のチーズとして用いた。2)これまでに、一次胆汁酸の一つであるコール酸(CA)を飼料に微量添加することで肥満型脂肪肝を発症することを見出しており、新規脂肪肝発症モデルとして有用であるという知見を得ている。そこで、このCA誘導性脂肪肝に及ぼす試作チーズの生理作用について脂質代謝の面から検証した。その結果、タンパク源としてカゼインを摂取させた場合に比べ、チーズを投与した群において幾つかの代謝パラメーターに差異が見出された。しかしながら紅麹菌培養産物添加群と対照チーズの間に明確な差異は観察されなかった。平成27年度においては、既に選定した紅麹菌株(Monascus ruber NBRC32318)を用い、飼料を調製、動物投与実験と解析を行ってきたが、更なる候補菌株を得るべくスクリーニングを継続していたところ、Monascus pilosusNBRC4520株も調査対象となり得る菌株であることが明らかとなった。具体的には、NBRC32318株は培養温度を一定に保ち(25°C)、pH 4.0に調整した固形培地上で、10日間培養することで、シトリニン非産生、モナコリン高産生でかつ赤色を呈する培養産物を得ることが出来たが、NBRC4520株の場合は25°Cでは赤色色素を産生しないものの、培養を30°Cで行うことによって赤色を呈するようになる。その後、培養温度を25°Cに下げることで、赤色を維持しつつ、モナコリン産生性が向上することが明らかとなった。現在は培養日数を10日とし、30°Cと25°Cで培養する期間と順序を変えながら最も効果的な条件を検討している。また同時に培養pHも重要なファクターであるため、それも考慮しながらNBRC4520株に最も好適な培養条件を検討している。この結果を受けて、実験動物の脂質代謝に関わる生理作用についてNBRC32318株とNBRC4520を用いた場合で比較する予定である。糸状菌は発育が遅く、飼料(菌を使用した発酵乳製品)の調製にも長い時間を要するため、予定していた動物実験を延期せざるを得なくなり、本区分の判断に至った。紅麹菌は動脈硬化のリスク低減を目的とした機能性食品素材の開発に有効な二次代謝産物を産生する食用微生物である。しかし一方で肝腎障害に関わるシトリニンを産生する場合があり、食品への紅麹菌の応用に際しては適切な菌株選択と厳密な培養制御が必要である。そこで申請者は広汎な条件設定にも対応可能な上に調製が容易、かつ得られる培養産物をready to eatで利用可能な固体培地基剤を用いて菌種、菌株や培養条件を精査し、得られる紅麹菌培養物を実験動物に給餌して機能性を評価するプログラムを立案した。本研究分担者は、胆汁酸添加飼料を給与することによって非肥満型脂肪肝を再現するモデル型を確立してきた。本実験系ではコール酸給餌によって脂肪肝が誘発され、同時にアディポネクチン(アテローム性動脈硬化発症の抑制作用や、インスリン感受性の亢進作用、肝臓や筋肉での脂肪燃焼作用が知られている)の血中濃度低下を招くことが明らかとなっている。
光アンテナ-フラーレン誘導体二元系の光線力学治療薬としての応用

これまでに極性基を持つC60誘導体と光アンテナ部位となるカルボシアニン系の色素をリポソーム内に共存させることに成功した。今回は、C60誘導体の代わりにポルフィリンを用いた。光アンテナとしては、650nm付近に吸収をもち、C60誘導体の場合に用いたDiDを用いた。このとき、皮膚透過性が高く、深部のがんにも有効で、しかも光線力学治療でよく使用されている600nm以上の光を照射した。このポルフィリン-DiD二元系リポソームをがん細胞の一つであるHeLa細胞に取り込ませ、600 nm以上の波長の光を照射した。その結果、ポルフィリンのみの系と同じ毒性しか示さなかった。この原因は、DiDとポルフィリンのエネルギーレベルがあっていないため、この二元系間でエネルギー移動が起こらなかったことが原因として考えられた。そこで、光アンテナとして550nm付近に吸収極大をもつDiIを用いた。その結果、500nm以上の光を照射すると、ポルフィリン-DiD二元系リポソームはポルフィリン内包リポソームに比べ高いがん細胞に対する光線力学活性を示すことが明らかになった。この結果から、光アンテナDiIからポルフィリンにうまくエネルギー移動が起こり光線力学活性の向上が実現できたことになった。このように、今回調製したポルフィリンと光DiIを共存させた二元系リポソームは、500nm以上の光照射ではあるが非常に高い光線力学活性をもつことを示した。当初予定であった光アンテナーフラーレン誘導体二元系で高い光線力学活性が得られ、現在は光アンテナ、ならびに発生部位を変更しさらなる活性の向上を目指すことができている。今回、C60誘導体とDiD間では効率よくエネルギー移動が起こったのにポルフィリンとDiD間では全くエネルギー移動が起こらなかった。そこで、これら分子のエネルギーレベルを電気化学測定ならびに吸収スペクトル測定によって決定し、メカニズムの解析を行う。また、この知見を元に、新しい光アンテナ分子と活性分子の選択を行い、光線力学活性の向上と活性とエネルギーレベルの関係を明らかにする。本研究の目的は光捕集部位とフラーレン誘導体をリポソーム内に共存させることよって、新しいがん治療法として注目されている高い活性をもつ光線力学治療薬の開発である。緑色植物でも用いられている光捕集部位は、フラーレンがあまり吸収できない長波長での光を吸収して、フラ-レン誘導体にその光エネルギーを渡すことで、効率を上げるものである。しかし、リポソーム内に極性の高いフラーレン誘導体を導入することは困難であった。そこで、シクロデキストリン・フラーレン誘導体からリポソーム内にフラーレン誘導体を移す交換反応法を用いることにした。本年度はまず、交換反応法によってカチオン性置換基を持つフラーレン誘導体をリポソームに導入することを試みた。しかし、1H NMRスペクトルの測定結果から一部のフラーレン誘導体がリポソーム内に入らないことがわかった。そこで、フラーレン誘導体の導入量を脂質分子に対して10mol%から5mol%に減らすこと、シクロデキストリン・フラーレン錯体をリポソームに加えるとき、ゆっくりと撹拌をしながら加えることによってこの問題は解決できた。次に、作製したフラーレン誘導体含有リポソームを用いて、がん細胞であるHeLa細胞の光死滅実験を行った。その結果、非常に高い光線力学活性を持つことが明らかになった。この値は最もよく使用されているフォトフリンよりも高い値であった。この活性が高い原因は、長波長領域の吸収があること、フラーレン誘導体が膜表面近傍にあるため溶存酸素とのエネルギー移動効率が高くなり、その結果活性酸素の発生量が増加したためであることが確認できた。特に、フラーレン誘導体の膜内での存在位置による活性の向上は、今後光捕集部位との二元系においてもエネルギー移動効率の向上が期待できるため重要な知見となるものと考えられる。フラーレン誘導体がリポソーム内に全て入らないことは、本研究の大きな山であった。今回そのことが解決できたことによって、当初予定よりも早く、光捕集部位ーフラーレン誘導体の二元系での実験に進むことができるため。今回は、皮膚透過性が高く、深部のがんにも有効で、しかも光線力学治療でよく使用されている600nm以上の光を照射した。この二元系リポソームをがん細胞の一つであるHeLa細胞に取り込ませ、600 nm以上の波長の光を照射した。その結果、C60と色素やC70と色素を共存させた二元系リポソームに比べ、圧倒的に高いがん細胞に対する光線力学活性を示すことが明らかになった。この原因は、C60誘導体のみを含有したリポソームのこれまでの研究から、(1)C60誘導体がC60やC70に比べ長波長の可視光照射による一重項酸素の発生効率が高いこと、および(2)C60誘導体が膜表面近傍にあるため溶存酸素との接触確率が高いことが挙げられた。今回はこれらに加えて膜表面近傍に存在する光アンテナ分子を添加することによって、(3)光アンテナで吸収した光エネルギーを効率よくC60誘導体に受け渡すことができたことが高い光線力学活性を示した大きな要因となった。

このC60誘導体と光アンテナ部位を共存させた二元系リポソームは、C60と光アンテナ部位およびC70と光アンテナ部位を共存させた二元系リポソームに比べ、それぞれ約10倍、また現在最も光線力学治療において使用されているフォトフリンに比べ約3.5倍高い光線力学活性を有することが明らかになった。このように、今回調製したC60誘導体と光アンテナ部位を共存させた二元系リポソームは、非常に高い光線力学活性をもつことを示した。当初の予定であった光アンテナーフラーレン誘導体二元系とすることで、光アンテナー未修飾フラーレンを大幅に超える光線力学活性を有することを明らかにできた。これまでに極性基を持つC60誘導体と光アンテナ部位となるカルボシアニン系の色素をリポソーム内に共存させることに成功した。今回は、C60誘導体の代わりにポルフィリンを用いた。光アンテナとしては、650nm付近に吸収をもち、C60誘導体の場合に用いたDiDを用いた。このとき、皮膚透過性が高く、深部のがんにも有効で、しかも光線力学治療でよく使用されている600nm以上の光を照射した。このポルフィリン-DiD二元系リポソームをがん細胞の一つであるHeLa細胞に取り込ませ、600 nm以上の波長の光を照射した。その結果、ポルフィリンのみの系と同じ毒性しか示さなかった。この原因は、DiDとポルフィリンのエネルギーレベルがあっていないため、この二元系間でエネルギー移動が起こらなかったことが原因として考えられた。そこで、光アンテナとして550nm付近に吸収極大をもつDiIを用いた。その結果、500nm以上の光を照射すると、ポルフィリン-DiD二元系リポソームはポルフィリン内包リポソームに比べ高いがん細胞に対する光線力学活性を示すことが明らかになった。この結果から、光アンテナDiIからポルフィリンにうまくエネルギー移動が起こり光線力学活性の向上が実現できたことになった。このように、今回調製したポルフィリンと光DiIを共存させた二元系リポソームは、500nm以上の光照射ではあるが非常に高い光線力学活性をもつことを示した。当初予定であった光アンテナーフラーレン誘導体二元系で高い光線力学活性が得られ、現在は光アンテナ、ならびに発生部位を変更しさらなる活性の向上を目指すことができている。フラーレン誘導体含有リポソームが作製できたため、今後この系に光捕集部位を導入する。色素としてはカルボシアニン系色素であるDiDを用いる。DiDは細胞膜などを染色する色素であり、その安全性は高く低毒性である。また、吸収最大波長を650nm付近に持ち、この波長は光線力学治療のレーザー光源として最もよく用いられている波長に合致する。このDiD-フラーレン誘導体二元系を用いて、HeLa細胞を用いた細胞実験、およびアントラセン誘導体を用いた一重項酸素発生能の評価を行う。一方、がん細胞の細胞内は正常細胞に比べpHが低いことが知られている。そのため、より低pHにおいて活性の高い光線力学治療薬を開発できれば、がん細胞選択性が出せる。そこで、光捕集部位として低pHにおいてのみ650nm付近の吸収が大きくなる色素を用いた実験も行う予定である。今後は、これらの知見をもとに、これまでとは異なる種々の光アンテナ分子を用いてC60誘導体との組み合わせを試すことによって、最適な光アンテナ分子を見出す。
古代朝鮮と中国・日本との文化交流

今年度は、昨年度につづく城郭と今年度からはじめた金石文の現地調査を主とした。城郭では667年創設の対馬の金田城と久留米市の高良山の神篭石との表面調査である。金田城は対馬の中心部浅茅湾を防衛する位置にあり、七世紀にはじまる百済・新羅の山城のうち、戦斗用山城であることが明らかになった。しかし、同城一の木戸付近などに残っている石塁の石は、百済王都周辺の石城山城・青馬山城などや新羅王都周辺の明活山城・南山城・西兄山城などの石と比べ、著じるしく大きく、単なる住民の避難所でないことが明らかになった。太宰府市の大野城は文献の上から、これを実証している。高良山の神篭石は、列石の配置が山腹から山頂におよび、百済の包谷式山城に類似している。また筑後平野に面した部分にはかなり高い石塁がみられ、七世紀後半にあらわれる新羅山城の行政的示威と類似している。しかし、通説の、百済木川土城の根石との関連性はそれ程顕著でない。金石文の研究では、宮城県の多賀城碑、埼玉県の稲荷山古墳出土銑剣銘、栃木県の那須国造碑、群馬県の上毛三碑などを実地見学し、種々の知見をえた。(1)これら五碑がいずれも渡来民関係の碑である。(2)それにも拘わらず、地方行政や個人礼讃などの新羅・百済の碑文に比較すると、系譜記事の多い日本的要素の強いことが知られる。古代の朝鮮と日本の城郭・金石文を比較すると、いずれも伝来当初から受容地の地域性が顕著で、伝播する文化程度の高低と必ずしも関係がない。むしろ、文化受容地域の要求に従って、受容文化の内容が変容している。それ故、古代東アジア史を中国文化を中心に一元的にとらえようとする従来の研究方法では、史実に即した歴史は成立しない。東アジア、ひいては世界を史実に即して多元的にとらえ、日本や朝鮮の地域文化を尊重する立場で、古代東アジア史を再建する必要があろう。古代朝鮮の城郭は,漢が朝鮮に四郡を置き,各地に県城を作ったことからはじまる.漢代城郭の特徴は,冲積平野など平坦な地に,版築による堅固な土塁でかこんだものであった.その形態は,住民の居住地を含めた集落全体を防衛する外郭と,宮殿や官衛など支配者の施設を特別に保護する内城とから成り立っている.朝鮮諸国は,中国の県城を奪って,これを使用するとともに,強力な侵略軍から住民を守るために,朝鮮独特の山城を作った.古代朝鮮の城郭の特徴は,内城が殆んど発達せず,外郭が非常に発達したところにある.日本の城郭は, 7世紀中葉に百済の亡命貴族の指導によるものからはじまるが,これら朝鮮式山城には住民保護の外郭がなく,官衛防衛の内城的性格が強い. 8世紀の東北地方の官衛は丘上にあって,土塁や木柵で防禦している.この形式は,古代朝鮮の平野部にある村落防衛の在城と類似しているが,その機能はいちじるしく異なっている.朝鮮も日本も,中世以降の城郭の基本的性格で古代のそれを継承していることが知られた.次に,北海道の近世・近代の城郭では,アイヌ族などの小数民族のチャシが,はじめ川を遡る鮭・鱒など魚群探知の生産施設であった.松前藩などの勢力がこの地方に進出すると,チャシは生産施設から城郭的な機能を持つ施設に変化した.このような変化がどの程度一般化できるか否かは,より詳細な調査にまちたい.次に,オランダのナルディン城などを模したものとされる函館の五陵閣・四陵閣は,その性格が大きく異なる.五陵閣は近世城郭と同じく,封建領主の城の機能しかなく,市民との関係が断絶している.四陵閣は戦闘用の小要塞の機能しかない.朝鮮でも日本でも,文化交流にあたり文化提供者に重点を置きすぎた従来の考え方に対し,受容者側の要求がより重視する必要のあることを知ることができた.今年度は、昨年度につづく城郭と今年度からはじめた金石文の現地調査を主とした。

(2)それにも拘わらず、地方行政や個人礼讃などの新羅・百済の碑文に比較すると、系譜記事の多い日本的要素の強いことが知られる。古代の朝鮮と日本の城郭・金石文を比較すると、いずれも伝来当初から受容地の地域性が顕著で、伝播する文化程度の高低と必ずしも関係がない。むしろ、文化受容地域の要求に従って、受容文化の内容が変容している。それ故、古代東アジア史を中国文化を中心に一元的にとらえようとする従来の研究方法では、史実に即した歴史は成立しない。東アジア、ひいては世界を史実に即して多元的にとらえ、日本や朝鮮の地域文化を尊重する立場で、古代東アジア史を再建する必要があろう。
長波長発光材料創出のための波長制御指標の確立

目標としていた700nmに達する新規化合物の合成に成功した.また市販している長波長材料アカルミネ;の炭素原子を窒素原子に置き換えだけで,発光酵素との反応で波長が長短する現象を見出した.アカルミネの芳香環部位2位の炭素を窒素原子で置換すると50nm程度短波長化するが,同様に5位を置換しても発光波長はほぼ変化しなかった.現在のところまで,ホタル生物発光の発光波長を制御するポイントとして,左環芳香環部分の炭素原子を窒素原子に置き換える事で発光波長を長短できる事を発見している.実際に,帆当たる生物発光の長波長発光基質アナログで実用化しているアカルミネの芳香環部,ジメチルアミノ基オルト位の炭素原子を窒素原子に置き換えると約30nm程度生物発光が短波長シフトするが,同基メタ位で同様の事を行っても波長にあまり影響がない事がわかった.これを元に,アカルミネの課題であった低水溶性を解決した.目標としていた700nmに達する新規化合物の合成に成功した.また市販している長波長材料アカルミネ;の炭素原子を窒素原子に置き換えだけで,発光酵素との反応で波長が長短する現象を見出した.アカルミネの芳香環部位2位の炭素を窒素原子で置換すると50nm程度短波長化するが,同様に5位を置換しても発光波長はほぼ変化しなかった.1.ホタル生物発光系における、化学構造デザインによる新規波長制御技術の創製を行う。ホタル生物発光(北米産ホタル発光酵素を用いた場合)の長波長化と化学構造のデザインについては,一定の指標を持っていたが,700nmに近づくとこれらの長波長化の効果が著しく阻害されることがわかっていた(WO2010/106896).また,これらとは異なったアリル化法で長波長化する方法も見出していた(PCT/JP2012/071207).そこで,これらの長波長化を複合した場合,どのような効果が得られるかを検討した.水酸基(-OH)をジメチルアミノ基(-NMe2)へ変換(+30nm程度)し,二重結合部位を環構造(+30nm程度)とした.さらに芳香環部位にアリル基を導入(+3050nm程度)した化合物を合成し,長波長化を試みた.このほか,発光基質の活性化体であるルシフェリルアデニレートのAMP部位を各種別の核酸に変更した化合物も合成したが,顕著な長波長化につながるデータは得られなかった.2.700nm以上の長波長発光材料の創製をもってこれを検証する。出発化合物として,アカルミネとして市販している本学で創製した世界最長波長の化合物(675nm)に対し,二重結合部位を環構造(+30nm程度)とした.さらに芳香環部位にアリル基を導入(+3050nm程度)した化合物を合成し,長波長化を試みた.これらの法則が適応できれば,計算上は750nm程度の発光が得られることになる.(但,北米産ホタル発光酵素を用いた場合)本化合物は,期待される750nmには及ばなかったものの,ついに発光極大で700nmを得るに至った.この成果は日本経済新聞(2013.3.26:科学技術欄)に掲載されている.目標としていた700nmに達する新規化合物の合成に成功した.また市販している長波長材料アカルミネの炭素原子を窒素原子に置き換えだけで,発光酵素との反応で波長が長短する現象を見出した.これは,本研究で新たに見いだされた人為的波長制御方法である.具体的には,アカルミネの芳香環部位5位の炭素を窒素に置き換えると約50nm短波長シフトするが2位を同様に置換しても,波長はほぼ変化しなかった.また2位と5位を置換した場合は,約50nm短波長シフトすることから,この方法での波長制御は,2位の置換に優位性があることも判明した.これまでは置換基を導入するなど,骨格を大きく変化させて波長変換を行っていたが,僅か原子1つを置換するだけで波長が変化すること,また,置換位置に優位性があること新たに見いだした.これは,今後の人工発光基質の化学構造デザインの目安として重要なインフォメーションとなろう.さらに,当初予定していた,天然の北米産ホタル発光酵素を用いて,発光極大が700nmに達する人工発光基質の創製にも至った.これは,天然型のルシフェリンールシフェラーゼ反応で生じる世界最長波長であり,世界最先端技術と考えられる.本研究で予定した成果は全て得られたと考えられる.(1)は文部科学省のプロジェクトが作成生物有機化学ホタル生物発光系における化学構造による発光波長変換に成功した例を見つけることができている.ホタル生物発光基質アナログの芳香環部位の炭素原子を1つ窒素原子に置き換える事で,その置換位置により,50nm程度の生物発光波長の人為的な長短に成功した.これは,既に確立している技術とは異なる変換手法での短波長化と長波長化であり,新しい方法と考えている.「ホタル生物発光系における、化学構造デザインによる新規波長制御技術の創製」には至っていないが,長波長化技術の組み合わせで「700nm以上の長波長発光材料の創製」は達成した.これは,ホタル生物発光系を直接利用した人工発光系としては,申請者らの世界最長波長材料を超え,世界最長波長となっている.

新たな人為制御の目安がえられたので,もう少しこの目安について,考察をふかめてゆき,実用性を付与したい.長波長化技術の組み合わせでついに「700nm以上の長波長発光材料の創製」は達成できたが,やはり,新しい長波長化技術は手にしておきたいところである.また長波長材料は水溶性に乏しいことが問題とされている.水溶性を付与し,かつ長波長となるような化合物の構造探索を続けたい.該当なし
神経ステロイドの急速な合成を制御する機構の解明

本研究は、神経ステロイドの合成機構を解明することを目的とした。昨年度はモデル系として小脳顆粒細胞を用いたが、本年度は神経ステロイドの主要な標的であるラット海馬において検討を行った。海馬では女性ホルモン(エストラジオール)が神経機能に対し顕著な急性作用をもたらすので、海馬におけるエストラジオールの合成経路を確定することを目指しHPLC解析による代謝実験を行った。その結果、海馬ではDHEAからアンドロステンジオールを介してエストラジオールが合成されていることが明らかとなった。これは末梢生殖腺のステロイド合成経路(DHEA→ナンドロステンジオン→テストステロン→エストラジオール)とは異なっており、脳独自の合成調節を行っている段階である可能性があるものと思われる。また、内分泌かく乱物質(環境ホルモン)であるビスフェノールAの神経ステロイド合成に与える影響を検討したところ、ビスフェノールAは海馬のエストラジオールの合成を阻害するにも拘わらず、ステロイド合成急性調節蛋白質(StAR)の発現量に対しては有意な変動を与えなかった。StARのみならず、コレステロール運搬能を持つと考えられるMLN64蛋白質の発現に対して与える影響も検討したが、これについても抑制は検出されなかった。よって、ビスフェノールAはコレステロールの運搬の段階ではなく、合成経路の下流を司るチトクロムP450等の酵素に対し阻害効果を及ぼしているものと思われる。本研究では、これまで用いられてきたペプチド抗体のみならず、リコンビナントのStAR蛋白質に対して作成された新規の抗体を用いてウエスタンブロットを行い、やはりペプチド抗体と同じく37-kDaの位置にバンドが得られることを確認した。StARをコードするmRNAの存在も特異的プライマーを用いたRT-PCR法によって確認し、P450sccなどに比べ数十倍のmRNAが存在することが観察された。37-kDa StARが検出されないという報告が米国のグループによってなされたが、やはり37-kDa StARはラット海馬に存在することを確認することができた。本年度は、神経ステロイドの急速な合成制御機構を解明するために、まずラット小脳より調製した顆粒神経細胞の初代培養系において、全ての神経ステロイドの前駆体であるプレグネノロンの産生を検討した。その結果、確かに内在性コレステロールよりプレグネノロンが合成されることを確認した。更に、細胞外カルシウムの存在下においてNMDAで刺激することにより、顆粒神経細胞におけるプレグネノロンの産生が有意に高まることを観察した。次に、ステロイド合成の基質であるコレステロールのミトコンドリア内での輸送を担い、神経ステロイドの合成速度を調節すると考えられるステロイド合成急性調節蛋白質(StAR)の動態を検討した。ミトコンドリアにおける37-kDa及び30-kDaのStARの量の変化を、特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析によって追跡したところ、NMDAによる刺激に対して、ミトコンドリア外膜における37-kDa StARが減少し、ミトコンドリア内膜における30-kDa StARが増加することが観察された。この変化は、プレグネノロンの産生とよい一致を示したことから、StARがコレステロールを急速にミトコンドリア内で輸送してミトコンドリア内膜のチトクロムP450sccにコレステロールを供給する過程が、神経ステロイドの急速な合成の速度を制御していることを示すものと思われる。
心肥大関連チロジンキナーゼ遺伝子のクローニングとその病態解析

正常、及び肥大心筋に発現しているチロシンキナーゼ型受容体のプロフィールを明らかにし、肥大心に関連した遺伝子を特定するため、2腎-1クリップ高血圧ならびにDOCA-Salt高血圧ラット肥大心とコントロール正常心によりmRNAを抽出後、チロシンキナーゼ遺伝子のコンセンサス配列を利用したRT-PCR法による部分遺伝子クローニングを行った。その結果、サブトラクションPCR法により得られたクローンのうち81クローンについて塩基配列を決定し、10個の受容体型チロシンキナーゼ遺伝子、5個の非受容体型チロシンキナーゼ遺伝子、さらに未知の遺伝子由来のクローンが2個見いだされた。最も多く発現している受容体型チロシンキナーゼは、Tie2/Tekであり、以下Ryk,IGF-1受容体、PDGF-β受容体、PDGF-α受容体、FGF-3受容体、KDR/Flk-1、Axl/Ufo、Insulin受容体、CSF-1の順に発現が見られた。一方、非受容体型チロシンキナーゼ群には、Arg/c-Ab1、c-Ros1、JAK-1、JAK-2、JAK-3が同定された。また、semi-competetive RT-PCR法によりHGFとその受容体であるc-Met,VEGFとその受容体であるKDR/Flk-1、Tie-1、Tie2/Tekの発現が確認されたが、いずれも肥大心とントロール正常心の間でmRNAレベルに差を認めなかった。しかし、免疫化学染色法で、2腎1クリップ高血圧ならびにDOCA-salt高血圧性肥大心の心室でコントロールと比べ、c-MetおよびTie-2のimmunostaining増大が認められた。そこでWestern blot analysisを用いて蛋白レベルでの発現を検討したところ、2腎1クリップ高血圧においてDOCA-salt高血圧やコントロールラットと比較し、HGF、c-Met、Tie-2の増加が見出された。以上より、心筋におけるチロシンキナーゼ型受容体には、既知の心肥大増殖因子以外に血管内皮増殖因子ファミリーが関与している可能性が示唆された。正常、及び肥大心筋に発現しているチロシンキナーゼ型受容体のプロフィールを明らかにし、肥大心に関連した遺伝子を特定するため、DOCA-Salt高血圧ならびに2腎-1クリップ高血圧ラット肥大心とコントロール正常心よりmRNAを抽出後、チロシンキナーゼ遺伝子のコンセンサス配列を利用したRT-PCR法による部分遺伝子クローニングを行った。その結果、サブトラクションPCR法により得られたクローンのうち80クローンについて塩基配列を決定した。データベース検索により受容体型チロシンキナーゼ群には、PDGF受容体-α、PDGF受容体-β、FGF受容体-3、Insulin受容体、IGF-1受容体、Tie2/Tek、Flk-1、Axl/Ufo、RYK、CSF-1受容体が、非受容体型チロシンキナーゼ群には、c-Abl、c-ros、JAK-1、JAK-2、JAK-3が、さらに未知の遺伝子由来のクローンが2個見いだされた。受容体型チロシンキナーゼのうち心筋では、Tie2/Tek、RYK、CSF/1受容体が最も多く発現していた。既知の遺伝子のうち、免疫化学染色によりFlk-1 Flt-1及びそれらのリガンドVEGF、c-MetとそのリガンドHGF、またTie2/Tekの心臓での発現を確認した。