hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウスiPS細胞由来胚様体を用いた気管上皮再生

本研究の目的は、気管欠損部における気管再建後の上皮組織再生促進を意図し、多能性幹細胞(iPS細胞)から気管上皮細胞への分化誘導技術を開発することにある。特に気管上皮細胞への分化に適した胚様体形成の条件について組織学的に評価し明らかにした。世界に先駆けてiPS細胞による気管上皮再生の第一歩となる技術が得られた。1iPS細胞の培養:マウス胎児線維芽細胞にpuromycin耐性遺伝子を導入し充分量のストックを確保した。iPS細胞の確保:マウス線維芽細胞由来iPS細胞をフィーダー細胞上に播種し培養した。継代培養を行い充分量のiPS細胞を確保した。iPS細胞の純化:トリプシン処理により細胞を剥離し、さらに剥離した細胞を別の培養皿で37°C、25分間培養することでiPS細胞を純化した。2足場材料の開発:アテロコラーゲンに凍結乾燥を施し、コラーゲンスポンジを作製した。3気管上皮様細胞の誘導:胚様体の作製:上皮様細胞へ分化させるためiPS細胞から胚様体を形成させた。まずiPS細胞とフィーダー細胞を分離し、得られたiPS細胞を低接着性の96wellプレート(PrimeSurface96UorV)に播種した。この際、播種する細胞数を変え、分化指向性を検証した。播種する細胞数を250、500、1000、2000/wellとし、浮遊培養した。また、浮遊培養する日数を変え、分化指向性を検証した。浮遊培養する日数を1日、2日、3日、4日とし胚様体を形成させた。培地にはKSRを添加したノックアウトDーMEM(無血清培地)を用いた。胚様体からの分化誘導:ゼラチンコーティングされた12well plateに胚様体を播種し、接着培養を行った。胚様体の接着培養を継続すると気管上皮様細胞が誘導された。また、アクチビンやb-FGFなどの増殖因子を使用しiPS細胞の上皮分化を促した。その際、増殖因子の濃度や増殖因子による誘導日数を変え、分化指向性を検証した。さらに接着培養に使用するゼラチンの種類や、培養環境も変化させ(Air-Liquid Interface)、検証した。増殖因子は4条件で行った。1)無血清培地のみ、2)activin Aのみ添加した無血清培地、および3)bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)のみを添加した無血清培地4)activin A及びbFGFを添加した無血清培地のそれぞれにおいて線毛上皮への分化誘導に影響するかを検証した。1気管上皮様細胞の誘導◇胚様体の作製:上皮様細胞へ分化させるためiPS細胞から胚様体を形成させる。まずiPS細胞とフィーダー細胞を分離し、得られたiPS細胞を低接着性の96wellプレートに播種する。播種する細胞数は1000/wellとし、浮遊培養する。浮遊培養する日数は5日間とし胚様体を形成させる。培地にはKSRを添加したノックアウトDーMEM(無血清培地)を用いる。◇胚様体からの分化誘導:ゼラチンコーティングされた12well plateに胚様体を播種し、接着培養を行う。胚様体の接着培養を継続すると気管上皮様細胞が誘導される。接着培養開始後5日間はactivinA100ng/mlとb-FGF100ng/mlの増殖因子を添加した分化誘導培地で培養を行う。その後、気管上皮組織への分化を促進させる目的でAir-Liquid Interfaceで維持培養する。2気管上皮形成についての検討通常の光学顕微鏡のほか、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて各細胞モデルについて気管の再生部位の経時的組織学的変化を観察・評価する。観察項目としては、上皮形成の有無、形態(線毛構造など)、上皮細胞の形質(線毛特異的タンパク:β-tubulinIV、Foxj1、上皮特異的タンパク:サイトケラチンAE1/3)などとする。医師薬学1iPS細胞の維持培養が確立できた:フィーダー細胞を確保しleukaemicinhibititory factorを発現したマウス胎児線維芽細胞(SNL 76/7)にpuromycin耐性遺伝子を導入し充分量のストックを確保した。2足場材料を開発した:アテロコラーゲンに凍結乾燥を施し、コラーゲンスポンジを作製した。3気管上皮様細胞の誘導:上皮様細胞へ分化させるためiPS細胞から胚様体を形成させた。

浮遊培養する日数を1日、2日、3日、4日とし胚様体を形成させた。4胚様体からの分化誘導:ゼラチンコーティングされた12well plateに胚様体を播種し、接着培養を行った。胚様体の接着培養を継続すると気管上皮様細胞が誘導された。また、アクチビンやb-FGFなどの増殖因子を使用しiPS細胞の上皮分化を促した。その際、増殖因子の濃度や増殖因子による誘導日数を変え、分化指向性を検証した。さらに接着培養に使用するゼラチンの種類や、培養環境も変化させ(Air-Liquid Interface)、検証した。増殖因子は4条件で行った。1)無血清培地のみ、2)activin Aのみ添加した無血清培地、および3)bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子)のみを添加した無血清培地4)activin A及びbFGFを添加した無血清培地のそれぞれにおいて線毛上皮への分化誘導に影響するかを検証した。(2)気管上皮組織含有スキャフォールドの開発:誘導した気管上皮様組織をコラーゲンゲルに付加しコラーゲンスポンジ上に被覆する。気管上皮組織の付加の仕方として、以下の3つの方法を検討している。(1)胚様体を気管上皮細胞に純化し付加する。(2)気管上皮組織を胚様体か一部切り取って付加する。(3)胚様体のまま付加する。(3)移植技術の開発:全身麻酔下に免疫不全ラットの気管を露出させ、気管上皮部分欠損モデルを作製する。スキャフォールドの細胞含面を気管内腔面となるように開窓部を覆う。(4)評価:観察期間(移植後数日)ののちに安楽死を施し、気管を摘出後行う。気管上皮の再建部位の組織像、蛋白質や遺伝子の発現に関して評価を行う。凍結切片及びパラフィン切片の双方を作製し、必要に応じ各種染色(免疫染色を含む)を行う。また走査電顕用の標本も作製する。通常の光学顕微鏡のほか、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いて各細胞モデルについて気管の再生部位の経時的組織学的変化を観察・評価する。観察項目としては、上皮形成の有無、形態(線毛構造など)、周囲組織との適合性の確認(H-E染色)、上皮細胞の形質(線毛特異的タンパク:β-tubulinIV、TTF-I、Foxj1、上皮特異的タンパク:サイトケラチンAE1/3、ラミニン...蛍光免疫染色による)などとする。本年度は計画通り研究を進め、成果発表を行ったが、実験器具・薬品類・調査研究のための旅費・成果発表費用において、本年度交付額に達しない範囲で研究を完遂できたため。実験動物・薬品類・実験器具など:336,868円成果発表・調査研究のための旅費:300,000円成果発表のための投稿料,英文校閲料:300,000円
老化特異的遺伝子の機能阻害による個体老化治療の研究

1. DAOについては、前年度までに得ていた知見である、活性酸素種の産生により細胞老化を促進するという点についてさらに詳細な解析を行った。前年度までは抗がん剤処理によるDNA損傷誘導時にDAOが老化促進に関わることを明らかにしていたが、がん遺伝子の高発現による老化誘導の際にもDAOの活性が必要であるという知見が得られ、DAOが普遍的に老化誘導に働くことが明らかとなった。また、DAOによる細胞老化促進により、増殖能の低下や老化マーカーとなるβガラクトシダーゼの活性上昇だけでなく、炎症性タンパク質の分泌に対しても促進的に働くことが観察され、DAOが老化の際に起こる表現型の変化に対して広範な影響を持つことがわかった。以上の成果はLife Science Alliance誌にて発表した。2. LY6Dについても細胞老化との関連について解析を行った結果、老化細胞で観察される細胞質での空胞形成がLY6D依存的に起こることが明らかとなった。また、この空胞形成はエンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスにより形成され、低栄養で培養した際の老化細胞の生存促進に働いている可能性を明らかにした。さらに、LY6Dが空胞形成を誘導するシグナル伝達経路について解析した結果、LY6Dが細胞膜表面のラフト部位に集積することで細胞内のSrcやRasといった因子を活性化することが空胞形成に必要であることを明らかにした。以上の成果については第41回日本分子生物学会年会にて発表を行い、現在投稿論文の執筆を行っている。当初の研究計画ではマウス個体を用いた老化の解析を行う予定であったが、現在マウスの飼育環境の整備を行なっている段階であり、マウス個体を用いた実験を開始できていないことから、進捗は遅れていると言える。しかし、「研究実績の概要」にも記した通り、標的としている遺伝子であるDAOの細胞老化における機能については解析を進めて論文発表を行なったことから、より詳細に細胞老化誘導の分子メカニズムを明らかにしてきていると言える。また、研究計画の段階から対象にしてきたPRODHとDAOに加え、LY6Dの細胞老化における解析も行い、LY6Dが老化細胞の生存促進に働いている可能性を見出してきている。以上の知見は、マウス個体で細胞老化の人為的調節を行う実験系を確立する上でも非常に有用であり、本成果を活かしてマウスでの実験を迅速に進められるように準備を行っている状況であるため、現在までの進捗状況を(3)やや遅れていると評価している。今年度は引き続きマウス実験の整備を進めて行く。課題申請時からの対象遺伝子であるPRODHおよびDAOに加え、平成29年度の解析から新たに細胞老化との関連が明らかになったLY6Dを含めて、これら遺伝子の個体における機能調節がマウスの個体老化に与える影響についての解析を行っていく。それと同時にこれら遺伝子が細胞老化においてどのように働いているかについて、培養細胞を使った実験系でも解析を進めていき、細胞老化誘導の分子メカニズムをより詳細に明らかにして行く。具体的には、LY6Dに関して、細胞膜表面上のラフト部位に集積することでマクロピノサイトーシスが誘導されることを見出しているが、その集積にLY6Dのどの部位が必要であるかを、LY6D変異体を用いた解析により明らかにしていく。また、LY6Dを低分子化合物によりオリゴマー化させることができる変異体を細胞に発現させ、空胞形成を人為的に制御した際に老化細胞の生存に影響を与えられるかを明らかにしていく予定である。本年度は、本研究課題の標的遺伝子であるプロリン脱水素酵素(PRODH)とDアミノ酸酸化酵素(DAO)の細胞老化における機能解析を行い、以下の成果を得た。1. PRODHについては、前年度までに得ていた、活性酸素種を発生させることで細胞老化を誘導するという点についてさらに詳細な解析を行い、成果をJournal of cell science誌にて発表した。2. DAOについても細胞老化との関連について解析を行った結果、老化誘導時におけるDAOの酵素活性が、補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチドの細胞内濃度によって制御されていることを見出した。また、DAOの基質であるDアミノ酸を培養液に添加することによってDAOの細胞老化促進作用が上昇することが明らかとなった。以上の結果についてまとめた論文を国際誌に投稿し、現在Revision作業を行っている段階である。また、上記2つの遺伝子に加えて、新たにLymphocyte Antigen 6 family member D (LY6D)と細胞老化との関連いついても解析を行った。LY6Dは研究代表者の以前の研究から老化細胞で発現が上昇することが明らかとなっていた遺伝子である。本年度に行った解析から、LY6Dが老化細胞においてマクロピノサイトーシスという細胞外液の取り込み現象の誘導を介して細胞の生存促進に働いている可能性が明らかになった。本結果は細胞老化と個体老化との関連を明らかにする本研究課題の目的に対しても有用であると考えられるため、今後はLY6Dに関しても解析を続けていく予定である。当初の研究計画ではマウス個体を用いた老化の解析を行う予定であったが、現在マウスへの薬剤投与法や解剖法の技術習得を行っている段階であり、まだ実験に向けた飼育を実施できていないことから、進捗は遅れていると言える。ただし、「研究実績の概要」にも記した通り、標的としている遺伝子の機能解析については培養細胞を用いた実験系からの進展が見られており、より詳細に細胞老化誘導の分子メカニズムを明らかにしてきていると言える。また、当初から対象にしてきた2つの遺伝子に加え、Lymphocyte Antigen 6

family member D (LY6D)の細胞老化における解析も行い、LY6Dが老化細胞の生存促進に働いている可能性を見出してきている。以上のことより、本年度の解析から得られた結果を個体での細胞老化の調節に活かして、マウスでの実験を迅速に進められるように準備を行っている状況であるため、(3)やや遅れていると評価している。1. DAOについては、前年度までに得ていた知見である、活性酸素種の産生により細胞老化を促進するという点についてさらに詳細な解析を行った。前年度までは抗がん剤処理によるDNA損傷誘導時にDAOが老化促進に関わることを明らかにしていたが、がん遺伝子の高発現による老化誘導の際にもDAOの活性が必要であるという知見が得られ、DAOが普遍的に老化誘導に働くことが明らかとなった。また、DAOによる細胞老化促進により、増殖能の低下や老化マーカーとなるβガラクトシダーゼの活性上昇だけでなく、炎症性タンパク質の分泌に対しても促進的に働くことが観察され、DAOが老化の際に起こる表現型の変化に対して広範な影響を持つことがわかった。以上の成果はLife Science Alliance誌にて発表した。2. LY6Dについても細胞老化との関連について解析を行った結果、老化細胞で観察される細胞質での空胞形成がLY6D依存的に起こることが明らかとなった。また、この空胞形成はエンドサイトーシスの一種であるマクロピノサイトーシスにより形成され、低栄養で培養した際の老化細胞の生存促進に働いている可能性を明らかにした。さらに、LY6Dが空胞形成を誘導するシグナル伝達経路について解析した結果、LY6Dが細胞膜表面のラフト部位に集積することで細胞内のSrcやRasといった因子を活性化することが空胞形成に必要であることを明らかにした。以上の成果については第41回日本分子生物学会年会にて発表を行い、現在投稿論文の執筆を行っている。当初の研究計画ではマウス個体を用いた老化の解析を行う予定であったが、現在マウスの飼育環境の整備を行なっている段階であり、マウス個体を用いた実験を開始できていないことから、進捗は遅れていると言える。しかし、「研究実績の概要」にも記した通り、標的としている遺伝子であるDAOの細胞老化における機能については解析を進めて論文発表を行なったことから、より詳細に細胞老化誘導の分子メカニズムを明らかにしてきていると言える。また、研究計画の段階から対象にしてきたPRODHとDAOに加え、LY6Dの細胞老化における解析も行い、LY6Dが老化細胞の生存促進に働いている可能性を見出してきている。以上の知見は、マウス個体で細胞老化の人為的調節を行う実験系を確立する上でも非常に有用であり、本成果を活かしてマウスでの実験を迅速に進められるように準備を行っている状況であるため、現在までの進捗状況を(3)やや遅れていると評価している。平成30年度はマウス実験の整備を進めて行く。
水素吸蔵合金における水素侵入機構-水素吸蔵過程における格子欠陥の生成に注目して-

2次電池の電極材料あるいは将来のエネルギー貯蔵材料として期待され近年盛んに研究開発がなされているプロチウム吸蔵のプロチウム吸放出圧は、一般的に当該合金の水素侵入サイトのエネルギーにより決定されると考えられている.本研究では、LaNi_5,FeTi, TiMn_2を供試材として取り上げ、合金化学的に決まる水素侵入サイトのエネルギー以外に、プロチウム吸放出圧を支配する因子が存在し、プロチウム吸放出圧の決定に寄与しているかを明らかにするとともに,水素化物形成過程をその場観察し,その機構を解明することを目的としている.2元系およびCo添加LaNi_5では,プロチウム放出庄は殆どサイクル数に依存しないものの,吸蔵圧は第1サイクルで特に高く,それ以降はサイクル数に依存しない.微粉化は第1サイクルで顕著に起こり,1サイクル終了後では、50100μm程度の大きな粒子も存在するが、微細なクラックが多数形成されており、実効的な粒径は5サイクル終了後と同じ20μm程度である.第1サイクルの吸蔵過程で10^<12>cm^<-2>オーダーの極めて高い密度の転位が導入される.この高密度の転位の導入は、プロチウム化合物内でのみ起こり、ミスフィット転位である.第1サイクルの吸蔵圧が特に高いのは、クラックの導入および転位の導入に要する過水素圧が必要なためである.TiMn_2のプロチウム吸放出圧のサイクル依存性、微細組織の変化はAl添加LaNi_5と類似している.FeTiでは2種のプロチウム化合物が形成されるため2段のプラトーが観察されるが、1段目の吸蔵プラトーはサイクル数増加とともに順次減少する.FeTiは、延性的なため微粉化はほとんど起こらず、転位の導入が各サイクル毎に起こる.従って、1段目の吸蔵プラトー圧の低下は、転位の導入に要する過水素圧がサイクル数増加とともに減少するためである.2次電池の電極材料あるいは将来のエネルギー貯蔵材料として期待され近年盛んに研究開発がなされているプロチウム吸蔵のプロチウム吸放出圧は、一般的に当該合金の水素侵入サイトのエネルギーにより決定されると考えられている.本研究では、LaNi_5,FeTi, TiMn_2を供試材として取り上げ、合金化学的に決まる水素侵入サイトのエネルギー以外に、プロチウム吸放出圧を支配する因子が存在し、プロチウム吸放出圧の決定に寄与しているかを明らかにするとともに,水素化物形成過程をその場観察し,その機構を解明することを目的としている.2元系およびCo添加LaNi_5では,プロチウム放出庄は殆どサイクル数に依存しないものの,吸蔵圧は第1サイクルで特に高く,それ以降はサイクル数に依存しない.微粉化は第1サイクルで顕著に起こり,1サイクル終了後では、50100μm程度の大きな粒子も存在するが、微細なクラックが多数形成されており、実効的な粒径は5サイクル終了後と同じ20μm程度である.第1サイクルの吸蔵過程で10^<12>cm^<-2>オーダーの極めて高い密度の転位が導入される.この高密度の転位の導入は、プロチウム化合物内でのみ起こり、ミスフィット転位である.第1サイクルの吸蔵圧が特に高いのは、クラックの導入および転位の導入に要する過水素圧が必要なためである.TiMn_2のプロチウム吸放出圧のサイクル依存性、微細組織の変化はAl添加LaNi_5と類似している.FeTiでは2種のプロチウム化合物が形成されるため2段のプラトーが観察されるが、1段目の吸蔵プラトーはサイクル数増加とともに順次減少する.FeTiは、延性的なため微粉化はほとんど起こらず、転位の導入が各サイクル毎に起こる.従って、1段目の吸蔵プラトー圧の低下は、転位の導入に要する過水素圧がサイクル数増加とともに減少するためである.2次電池の電極材料あるいはエネルギー貯蔵材料としての応用を目指して、より優れたプロチウム吸蔵特性を持つ新規合金の研究開発が近年盛んに行われている.一般的にプロチウム吸放出圧は、当該合金の水素侵入サイトのエネルギーにより決定されると考えられるが、本研究では、LaNi_5,FeTi,TiMn_2を供試材として取り上げ、化学的に決まる水素侵入サイトのエネルギー以外に、どのような因子が、どの程度、プロチウム吸放出圧の決定に寄与しているかを明らかにすることを目的としている.2元系およびCo添加LaNi_5では,プロチウム放出圧は殆どサイクル数に依存しないものの,吸蔵圧は第1サイクルで特に高く,それ以降はほとんどサイクル数に依存しない.微粉化は顕著に起こり,5サイクル終了時には全ての粉体の粒径は20□m以下になる.1サイクル終了後では、50100μm程度の大きな粒子も存在するが、微細なクラックが多数形成されており、実効的な粒径は20μm程度である.第1サイクルの吸蔵過程で10^<12>cm^<-2>オーダーの極めて高い密度の転位が導入される.第1サイクルの吸蔵圧が特に高いのは、クラックの導入および転位の導入に要する過水素圧が必要なためであり、クラック、転位いずれの導入も第1サイクルでほぼ完了するため、第2サイクル以降はほぼ一定の吸蔵圧を示すものと考えられる.TiMn_2のプロチウム吸放出圧のサイクル依存性、微細組織の変化はAl添加LaNi_5と類似している.

FeTiでは2種のプロチウム化合物が形成されるため2段のプラトーが観察されるが、1段目の吸蔵プラトーはサイクル数増加とともに順次減少する.微粉化はほとんど起こらず、転位の導入が各サイクル毎に起こる.従って、FeTiの1段目の吸蔵プラトー圧の低下は、転位の導入に要する過水素圧がサイクル数増加とともに変化(減少)するためであると考えられる.2次電池の電極材料あるいは将来のエネルギー貯蔵材料として期待され近年盛んに研究開発がなされているプロチウム吸蔵のプロチウム吸放出圧は、一般的に当該合金の水素侵入サイトのエネルギーにより決定されると考えられている.本研究では、LaNi_5,FeTi, TiMn_2を供試材として取り上げ、合金化学的に決まる水素侵入サイトのエネルギー以外に、プロチウム吸放出圧を支配する因子が存在し、プロチウム吸放出圧の決定に寄与しているかを明らかにするとともに,水素化物形成過程をその場観察し,その機構を解明することを目的としている.2元系およびCo添加LaNi_5では,プロチウム放出圧は殆どサイクル数に依存しないものの,吸蔵圧は第1サイクルで特に高く,それ以降はサイクル数に依存しない.微粉化は第1サイクルで顕著に起こり,1サイクル終了後では、50100μm程度の大きな粒子も存在するが、微細なクラックが多数形成されており、実効的な粒径は5サイクル終了後と同じ20μm程度である.第1サイクルの吸蔵過程で10^<12>cm^<-2>オーダーの極めて高い密度の転位が導入される.この高密度の転位の導入は、プロチウム化合物内でのみ起こり、ミスフィット転位である.第1サイクルの吸蔵圧が特に高いのは、クラックの導入および転位の導入に要する過水素圧が必要なためである.TiMn_2のプロチウム吸放出圧のサイクル依存性、微細組織の変化はAl添加LaNi_5と類似している.FeTiでは2種のプロチウム化合物が形成されるため2段のプラトーが観察されるが、1段目の吸蔵プラトーはサイクル数増加とともに順次減少する.FeTiは、延性的なため微粉化はほとんど起こらず、転位の導入が各サイクル毎に起こる.従って、1段目の吸蔵プラトー圧の低下は、転位の導入に要する過水素圧がサイクル数増加とともに減少するためである.
腸内細菌代謝物を介した腸内細菌と宿主の共生～腸脳相関への展開と応用～

本研究課題は、腸内細菌から宿主に受け渡される物質(主に細菌代謝物を想定)から、宿主の脳の発達や維持に関わる共生因子を探索し、その作用機所を解明することを目的とした。それにより、腸内細菌を介した「腸脳相関」を理解するとともに、疾病治療や診断といった応用を目指すものである。《Aβ凝集調節因子の探索》アルツハイマー病の原因タンパク質であるAβタンパク質の凝集を制御する機能性物質を探索した。Aβ凝集はモノマー、オリゴマー、凝集体(シート構造)と段階を経るものであるため、複数の方法で多角的に評価すべきであるという結論に至った。そのため、本年度は、遠沈法、HPLC分析による評価を導入し、スクリーニングを続けた。遠沈法では、遠心分離により凝集Aβを沈殿画分、非凝集Aβを上清画分として分離し、重合したAβオリゴマーの〝重合分子サイズ′′を特に評価するものである。さらに、上清画分をHPLCにより分析することで〝Aβモノマー′′に絞った定量も行った。さらに、Thioflavinを用いたin vitroのスクリーニング系では、シート構造をとった凝集Aβを特異的に検出することができる。これら3つの方法を組み合わせることで、より厳密に候補サンプルの選定を行うとともに、候補サンプルが凝集過程のどの段階に効果があるか、という点についてまで予測を行うことが可能となった。一方、腸内には、ヒト自身が摂取した食物由来の成分に加え、それらを腸内細菌が代謝して産生される物質が多量に存在する。それらの中には、腸脳相関における機能が注目されていない物質が含まれると考えられ、また、物質自体が未発見(未同定)である可能性も高い。そのため、糞便中物質から、Aβ凝集調節機能をもつ物質を網羅的にターゲットとするアプローチ方法も必要である。そのため、本年度はマウスおよびヒトの糞便の抽出物についても、同様のスクリーニングを行った。《Aβ凝集調節因子の探索》アルツハイマー病の原因タンパク質であるAβタンパク質の凝集を制御する機能性物質を遠沈法、Thioflavinアッセイ、HPLC分析の3方法により、多角的にスクリーニングを実施した。標品が入手可能な物質におけるスクリーニングにより、複数の候補化合物が見出された。これらはいずれもヒトから腸管内に分泌され、腸内細菌による代謝・変換を受ける物質である。また、血中や脳にも存在することが示されていることから、実際の生体内においても機能を持つ可能性が高いと考えられる。一方、マウス糞便抽出物についても同様の方法で分析を行った。その結果、マウスの飼育条件(主に餌の組成)により、糞便抽出物のAβ凝集調節機能が変化することを見出した。これは、食生活とそれに伴う腸内環境の変化により、腸内で生産されるAβ凝集調節物質の量あるいは機能が変化することを示唆するものであり、たいへん興味深い。さらに、ヒト糞便抽出物についても評価を行った。こちらについても、個体によりAβ凝集調節機能に大きな差があることが見出された。《その他》腸内細菌叢の調節が、本研究で注目するアルツハイマー病を含む神経変性疾患と密接に関わるという報告が増えていることより、プロバイオティクスであるビフィズス菌による調節についても注目した。特に昨年度は、乳児腸管に形成されるビフィズスフローラが、ビフィズス菌のなかでも少数派の種であるBifidobacterium bifidumによるヒトミルクオリゴ糖分解物のクロスフィーディングに起因する可能性を明らかにした。この〝少数派細菌の腸内細菌叢あるいは宿主への起用の可能性′′については、神経変性疾患との関りを考える上でも、非常に重要なファクターとして、今後も検討していく。《共生因子の同定》マウスおよびヒト糞便からは、機能物質の単離精製を進め、構造を決定する。機器分析は、必要に応じて共同研究とする。血中および脳への取り込みと蓄積効率を検討する。《共生因子の生合成経路の解明》標品の候補化合物の一部については、腸内細菌による代謝経路がすでに明らかにされているため、in vitroにおける培養実験あるいは精製酵素を用いた実験から、その変換を確かめる。一方、代謝経路が明らかになっていないものについては、ゲノム配列上からの予測に加え、実際に変換活性を持つ腸内細菌の探索も行っていく予定である。マウスについては、現在行っている高脂肪食給餌条件に加え、他の飼育条件についても同様に検討する意義があると考えられる。ヒトについては、糞便回収の際に、個人の年齢、体系、食生活などについてのアンケートを行っているため、今後n数を増やしていくことで、それらとの相関を検討できるようになると考えられる。また、ヒト糞便については、同時に16S rDNAのメタゲノム解析も行っているため、Aβ凝集調節機能に関わる菌の選定へとつなげたい。特に、マウスとヒトともに、16SrDNAメタゲノム解析から腸内細菌叢の解析を行い、その結果と照らし合わせることにより、関りが深い菌種の探索を行っていく予定である。《Aβ凝集調節因子の探索》アルツハイマー病の原因タンパク質であるA

βタンパク質の凝集を制御する機能性物質を探索した。Aβ凝集はモノマー、オリゴマー、凝集体(シート構造)と段階を経るものであるため、複数の方法で多角的に評価すべきであるという結論に至った。そのため、本年度は、遠沈法、HPLC分析による評価を導入し、スクリーニングを続けた。遠沈法では、遠心分離により凝集Aβを沈殿画分、非凝集Aβを上清画分として分離し、重合したAβオリゴマーの〝重合分子サイズ′′を特に評価するものである。さらに、上清画分をHPLCにより分析することで〝Aβモノマー′′に絞った定量も行った。さらに、Thioflavinを用いたin vitroのスクリーニング系では、シート構造をとった凝集Aβを特異的に検出することができる。これら3つの方法を組み合わせることで、より厳密に候補サンプルの選定を行うとともに、候補サンプルが凝集過程のどの段階に効果があるか、という点についてまで予測を行うことが可能となった。一方、腸内には、ヒト自身が摂取した食物由来の成分に加え、それらを腸内細菌が代謝して産生される物質が多量に存在する。それらの中には、腸脳相関における機能が注目されていない物質が含まれると考えられ、また、物質自体が未発見(未同定)である可能性も高い。そのため、糞便中物質から、Aβ凝集調節機能をもつ物質を網羅的にターゲットとするアプローチ方法も必要である。そのため、本年度はマウスおよびヒトの糞便の抽出物についても、同様のスクリーニングを行った。《Aβ凝集調節因子の探索》アルツハイマー病の原因タンパク質であるAβタンパク質の凝集を制御する機能性物質を遠沈法、Thioflavinアッセイ、HPLC分析の3方法により、多角的にスクリーニングを実施した。標品が入手可能な物質におけるスクリーニングにより、複数の候補化合物が見出された。これらはいずれもヒトから腸管内に分泌され、腸内細菌による代謝・変換を受ける物質である。また、血中や脳にも存在することが示されていることから、実際の生体内においても機能を持つ可能性が高いと考えられる。一方、マウス糞便抽出物についても同様の方法で分析を行った。その結果、マウスの飼育条件(主に餌の組成)により、糞便抽出物のAβ凝集調節機能が変化することを見出した。これは、食生活とそれに伴う腸内環境の変化により、腸内で生産されるAβ凝集調節物質の量あるいは機能が変化することを示唆するものであり、たいへん興味深い。さらに、ヒト糞便抽出物についても評価を行った。こちらについても、個体によりAβ凝集調節機能に大きな差があることが見出された。《その他》腸内細菌叢の調節が、本研究で注目するアルツハイマー病を含む神経変性疾患と密接に関わるという報告が増えていることより、プロバイオティクスであるビフィズス菌による調節についても注目した。特に昨年度は、乳児腸管に形成されるビフィズスフローラが、ビフィズス菌のなかでも少数派の種であるBifidobacterium bifidumによるヒトミルクオリゴ糖分解物のクロスフィーディングに起因する可能性を明らかにした。
マルチスレッドLispの実時間GC機能の導入とヒューマノイド行動の実現

本研究では,新しいソフトウェアの応用領域として実世界において認識行動処理を行うヒューマノイドを対象とし,実世界知識表現の上位の記述から,認識行動の並列性記述,リアルタイム性の必要な反射系を,並列性,実時間性,対話性,三次元モデリング機能を特徴とするLisp言語を用いることで,実世界の動的な振る舞いや多様な状況に対応可能な大規模かつ複雑なヒューマノイドソフトウェアを効率よく開発するためのプログラミング環境を構築することを目指し,以下のことを行った.(1)行動制御プログラミング環境から利用可能な実時間三次元視覚システムの構築関節の制御プログラムだけではなく,高速の視覚処理機能を搭載した場合に対するLispシステムとの統合環境の構築を行った.三次元視覚処理としては,再帰的に局所相関演算処理を行うことで高速処理が可能となる両眼立体視覚処理を実現した.関節制御に比べれば処理時間が長く,検出対象の種類によって処理時間が異なるものが発生する視覚処理を上位の行動判断系から利用可能な統合システムを実現し,実時間GC機能をもつマルチスレッドLispにおいて,関節制御レベルの処理と視覚情報処理を並存させた行動実験が可能なシステムの実現を行った.(2)ヒューマノイド行動の総合実験これまでに開発してきたヒューマノイド行動用のプログラムを実時間性を考慮したプログラムとして再構成し,視覚を用いながら実時間性能の必要となる全身行動を行うヒューマノイド実験を行いシステムの評価と研究総括を行った.総合実験としては,物体が身体に近づいてくる際の身構え動作,二足歩行動作をとりあげ,実時間GC処理が転倒を起こさない歩行行動に有効であることを確認した.本年度は,ロボットのプログラミング開発環境となるマルチスレッドLispにおける実時間応答性を高めるために不必要になったメモリ領域を回収するごみ集め処理(GC)による中断時間をできるだけ短くするための実時間GC処理の導入を以下のような手順で行った.(1)マルチスレッドLisp : EusLispのソースツリーの整理現産総研の松井氏のもとでオリジナルソースが管理されているEuslispの処理系において,そのごみ集め処理部を実時間GC機能で置き換える形でのソースプログラムの整理を行った.(2)実時間GCの実現実時間GCとして京都大学湯浅教授らのもとで開発されたリターンバリア方式による実時間GC機能をEuslispへ統合することを行った.(3)実時間OS上への移植EusLispにリアルタイムOSのシステムコールを利用した実時間スレッド機構を実装すべく,リアルタイムOSであるART-Linux上にEuslispを実装した.(4)実時間Lisp環境からヒューマノイドロボットを動かすための制御ソフトウェアの構築周期実行処理,および,センサからのイベントに対応する処理を,EusLispのスレッドにより記述し,実時間GCの性能評価を行った.本研究では,新しいソフトウェアの応用領域として実世界において認識行動処理を行うヒューマノイドを対象とし,実世界知識表現の上位の記述から,認識行動の並列性記述,リアルタイム性の必要な反射系を,並列性,実時間性,対話性,三次元モデリング機能を特徴とするLisp言語を用いることで,実世界の動的な振る舞いや多様な状況に対応可能な大規模かつ複雑なヒューマノイドソフトウェアを効率よく開発するためのプログラミング環境を構築することを目指し,以下のことを行った.(1)行動制御プログラミング環境から利用可能な実時間三次元視覚システムの構築関節の制御プログラムだけではなく,高速の視覚処理機能を搭載した場合に対するLispシステムとの統合環境の構築を行った.三次元視覚処理としては,再帰的に局所相関演算処理を行うことで高速処理が可能となる両眼立体視覚処理を実現した.関節制御に比べれば処理時間が長く,検出対象の種類によって処理時間が異なるものが発生する視覚処理を上位の行動判断系から利用可能な統合システムを実現し,実時間GC機能をもつマルチスレッドLispにおいて,関節制御レベルの処理と視覚情報処理を並存させた行動実験が可能なシステムの実現を行った.(2)ヒューマノイド行動の総合実験これまでに開発してきたヒューマノイド行動用のプログラムを実時間性を考慮したプログラムとして再構成し,視覚を用いながら実時間性能の必要となる全身行動を行うヒューマノイド実験を行いシステムの評価と研究総括を行った.総合実験としては,物体が身体に近づいてくる際の身構え動作,二足歩行動作をとりあげ,実時間GC処理が転倒を起こさない歩行行動に有効であることを確認した.
ファブリック素材だけからなる柔軟機構の制御と設計のためのモデリング

本研究は、柔らかく人に好まれる触感を持つファブリック材料だけからなる機構を対象とした。この機構は分布型の冗長機構ではあるが、外力が小さい場合には、糸長から姿勢が定まることを利用し、糸長と機構姿勢の対応表を用いた位置制御手法を提案した。外力計測手法を開発しコンプライアンス制御を実現した。コンプライアンスを変えることで、提案機構を用いたぬいぐるみロボットの印象が変化することを確かめた。また、回転3自由度を持つ新規機構を提案した。柔軟機構のシミュレーションについては実時間性を重視して、コンピュータグラフィクス分野でリアルタイムシミュレーションに用いられ、有限要素法より高速な、Shape Matchingという手法の適用を検討している。柔軟物のシミュレーションを高速に実現できることを確認したが、物理特性に応じたパラメータ設定手法が確立していないため、検討を続けている。シミュレーションモデルの評価までは到達できなかった。また、機構の挙動を説明するための簡便なモデルも見つかっておらず、新たな機構の設計の難しさは解消してない。機構制御については、昨年度できなかったインピーダンス制御を、2自由度の力センサを機構の根本に配置するように変更することで実現した。これにより、柔軟機構自体の柔らかさを活かしつつ、制御による柔軟な加重や運動を付加することができた。例えば、非常に弱い力を加えるだけで、人の手の動きに合わせて動くことができる。昨年度のSIGGRAPHの展示を初め、国内の展示会・学会等でも展示・発表を行ったところ、国内外の研究者・企業から研究等への利用の打診があった。しかしながら、現状では我々による手作りにより作成しているのため製作に手間が掛かり過ぎ、簡単に提供することができない。また、利用しているモータが高価であるため、多自由度の機構では費用がかさむ。このため、現状では、多くの研究者にロボットを提供することは難しい。また、柔軟部分は用途ごとに異なる形状や機構が求められる。そこで、駆動部を安価に頒布できるユニットとして設計し、安価に頒布できる設計と製作体勢を整えてたい。24年度は、SIGGRAPH Emerging Technologiesという世界最大のコンピュータグラフィクスとインタラクション技術の国際会議のデモ展示に採択されたため、デモ展示するための機構の試作と制御の優先順位を上げて研究を進めた。その結果、機構のデモ展示を中心に、機構の試作、力制御、研究を進めることとなった。デモ展示では、提案機構を用いたぬいぐるみロボットを制作し、3次元距離画像カメラを用いて周囲の人の姿勢を計測し、目の前の人を注視したり手を伸ばしたりすることで注意を引き、人々の接触を引き出すことに成功した。接触後も動作を続けることで、利用者に触感を提示することが実現できた。機構の試作では、可動域の大きな回転3自由度を持つ6本糸駆動の布と綿からなる機構を作成した。また糸長と機構の姿勢を計測し対応表を作成することで位置制御を実現した。糸張力を計測し、インピーダンス制御を行うことも試みたが、糸の摩擦の影響で力計測のヒステリシスが大きくコンプライアンスを大きく取ることは難しかった。コンプライアンスを高くするためには、ファブリック素材機構に加わる外力を機構の根本で計測するなど、新たな力計測手法が必要だと考えられる。シミュレーションについては、変形を扱う有限要素法のシミュレータを開発した。現時点では扱える変形は非線形が無視出来る微小変形にとどまるので、今後大変形に必要な剛性行列のリアルタイム更新部分の開発を進める。ファブリック機構の設計支援のためのシミュレーションでは、リアルタイムシミュレーションのためにShape Matchingを利用することを検討した。既存のShape Matchingでは物性から変形特性を定めることができないため、有限要素法と数式レベルでのシミュレーションアルゴリズムの比較を行った。アルゴリズムが大きく異なるため、数式を比較して対応を求めることは困難であることが分かった。そこで、まず、Shape Matchingを何らかの物理モデルのシミュレーションとみなすことができないか検討しており、有望なモデルを検討している。今後、Shape Matchingを説明できることを確認した上で、有限要素法などの既存手法と比較し、物性から変形パラメータを定める手法を研究したい。ファブリック機構とその制御技術については、位置制御に加えて力制御を実現することができ、力制御のゲインを調節することで、ぬいぐるみロボットの印象を変化させることができた。また、機構と制御については、利用したいという問い合わせを数多く受けている。これに対応するため、モータと減速機を含む駆動部と制御回路・ソフトウェアを安価に頒布できるユニットとして実現することを目指している。ユニットの実現に必要な静粛で安価な減速機の検討を行い、有望な減速機構の見当を付けることができた。今後、設計を進め、配布可能なユニットを完成させたいと考えている。ヒューマンインタフェース有限要素法とは定式化が全く異なるShape Matchingという手法が有望に見えるため、そちらを検討しはじめたため時間がかかっている。また、機構自体の有用性に注目が集まっているため、機構をロボット研究者に提供できるようにすることも重視している。このため当初の計画自体の実施はやや遅れている。デモ展示するための機構の試作と制御の優先順位を上げて研究を進めた。

このため、計算機モデルの作成とシミュレーションについては24年度内に完成させることができなかったが、機構の試作と制御については予定より早く実現することができた。ファブリックからなる柔軟機構のシミュレーション手法と、機構を説明するモデルはどちらも重要な課題だと考えているので、着実に進めていきたいと考えている。一方で、機構自体の可能性の検討は、我々が行うよりも、機構を頒布することで利用法が発見されることを期待するほうが良いと考えている。こちらは、時期も重要だと思うので、26年度中に頒布できるようにしたい。25年度には、24年度に完成させられなかった有限要素法による変形シミュレーションを完成させるため、剛性行列計算を高速化し、リアルタイムに更新する仕組みを開発する。また、布、綿の有限要素モデルを作成し、機構をシミュレータ上で表現できるようにする。また、有限要素法のパラメータを校正するため、柔軟機構上の多数の点の変位を計測する仕組みを作成する。翌年度行う予定の試作を一部今年度に行ったため、試作に必要なモータなどの材料費が増加した。そこで、翌年度分を一部前倒ししたが、実際には予想より若干試作が遅れ残額が発生した。予定通り試作を続ける。該当なし
分子生物学的手法によるナノ粒子状レアメタルの発癌リスク評価

ナノ粒子状レアメタルの発癌リスクをin vitro発癌試験により検討した。先端産業界で有用なインジウム、ジスプロシウム、タングステン、モリブデンについてAmes試験を行い、ナノ粒子状酸化ジスプロシウム、酸化インジウム、酸化タングステンに変異原性を見出した。Bhas42細胞を用いた形質転換試験では、酸化インジウムと酸化ジスプロシウムに形質転換能を認めたが、粒径による活性の差異は認められなかった。本研究の目的は、ナノ粒子状レアメタル(希少金属)の健康影響、特に発癌に対するリスクを遺伝子レベルで評価することである。先端産業に不可欠な金属素材であるレアメタルの中でも特に化学反応性の高いナノ粒子に着目し、ナノ粒子が生体に与える健康影響、レアメタル曝露の危険性を明確にする。これまでに国際がん研究機関(IARC)で発癌リスクが分類されていない金属で、先端産業界で有用なレアメタル元素について研究を行う。具体的には、液晶導電膜で使用されているインジウム(In)、高性能磁石や光磁気メモリで使用されているジスプロチウム(Dy)、半導体で使用されているタングステン(W)やモリブデン(Mo)を被験物質として選定し、使用した。各金属のナノ粒子溶液を用意し、動的光散乱解析装置を用いて各々のナノーマイクロ範囲の粒子径分布を測定し、被験物質のナノ粒子含有割合を明らかにした。また、サルモネラ菌TA98株とTA100株を用いたエームス試験により各被験物質の変異原性を検討した結果、すべての金属の通常径粒子およびナノ粒子で変異原性は認められなかった。今後、培養細胞株を用いた細胞毒性試験および形質転換試験、短期発癌モデルマウスを用いたin vivo発癌性試験、レアメタル投与担癌マウスの網羅的遺伝子発現解析を行い、発癌関連遺伝子の発現変化を指標としたナノ粒子状レアメタルのin vivo評価系を確立する。具体的には、液晶導電膜で使用されているインジウム(In)、高性能磁石や光磁気メモリで使用されているジスプロチウム(Dy)、半導体で使用されているタングステン(W)やモリブデン(Mo)を被験物質として選定し、各金属について通常径粒子とナノ径粒子を使用した。今年度はサルモネラ菌TA98株、TA100株、TA1535株、TA1537株及び大腸菌WP-2uvrA株を用いたエームス試験により各被験物質の変異原性を検討した。ナノ径Dy粒子では直接法と代謝活性化法共にすべての菌株で変異コロニー数が濃度依存的に増加したのに対し、通常径粒子ではコロニー数の増加がほぼ認められなかった。Inでもナノ径粒子のみでTA1537株でコロニー数が増加し、Wもナノ径粒子のみでTA98株でコロニー数が増加した。今後、Bhas42及びBALB/3T3培養細胞株を用いた形質転換試験及び細胞毒性試験、短期発癌モデルマウスを用いたin vivo発癌性試験、レアメタル投与担癌マウスの網羅的遺伝子発現解析を行い、発癌関連遺伝子の発現変化を指標としたナノ粒子状レアメタルのin vivo評価系を確立する。酸化インジウム(In_2O_3)、酸化ジスプロチウム(Dy_2O_3)、酸化タングステン(WO_3)、モリブデン(Mo)のナノ粒子溶液を用意し、ゼータ電位測定装置を用いて各ナノ粒子溶液の分散能を明らかにした。また、サルモネラ菌4株と大腸菌1株を用いたエームス試験により各被験物質の変異原性を検討した結果、マイクロサイズと比べてナノサイズのDy_2O_3で強い変異原性がみられ、ナノサイズのIn_2O_3及びWO_3でも弱い変異原性がみられた。Bhas42細胞を用いた形質転換試験では、In_2O_3とDy_2O_3で変異コロニー数の増加がみられたが、ナノサイズとマイクロサイズでは変異コロニー数に差はみられなかった。以上の結果から、ナノサイズのIn_2O_3とDy_2O_3では変異原性と形質転換能が共に認められ、発癌イニシエーション活性とプロモーション活性を有することが示唆された。今後、短期発癌モデルマウスを用いたin vivo発癌性試験やアメタル投与担癌マウスの網羅的遺伝子発現解析によるナノ粒子状レアメタルの発癌性の検討及び発癌機序の解明が望まれる。
Heart-on-chipによる心筋梗塞時不整脈のメカニズム解明

研究代表者は2018年7月末より米国に渡航し、ハーバード大学Wyss Instituteにて研究を開始した。本研究の中間目標である臓器チップによる心臓虚血再灌流障害モデルの作成に先立ち、腎臓虚血再灌流障害モデルの作成に着手した。心臓虚血再灌流障害は心筋梗塞の、腎臓虚血再灌流障害は腎移植時の臓器障害の病態に関与しており、医学的意義は大きい。シリコン樹脂(polydimethylsiloxane)製の2チャンネル臓器チップ上にヒト腎臓血管内皮細胞およびヒト腎臓近位尿細管上皮細胞を共培養し(腎臓チップ)、この培養系に過酸化水素投与を行うことにより虚血再灌流障害の模擬状態モデルを作成した。このモデルにおいて核染色および傷害細胞を検出するpropidium iodide染色を行い、蛍光顕微鏡像を撮像し細胞傷害をイメージングにより定量的に測定する実験系を確立した。また、虚血再灌流障害のモデルとして過酸化水素投与に加え、低酸素/再酸素化処理および塩化コバルト投与法の評価を行なった。低酸素刺激が有効に与えられているかを確認する方法として、低酸素誘導因子1α(HIF1α)のELISA検出を行なった。さらに虚血再灌流障害のメカニズムとして補体活性化のレクチン経路に着目した。補体活性化のレクチン経路では、傷害細胞にマンノース結合レクチン(MBL)とC4d補体が沈着することが知られている。これを確認するため、腎臓チップに過酸化水素を投与し、MBLとC4dの免疫染色を行なった。なお補体活性化には血漿成分が不可欠であるため、腎臓チップ上でヒト血漿および全血の灌流を行なった。その結果、過酸化水素の濃度増加に伴いMBLとC4dの沈着が増加する傾向が腎臓近位尿細管上皮細胞において見られた。1.臓器チップ実験を行うためのPDMS表面の活性化処理、足場タンパク質による表面処理、細胞培養法、培地・血液灌流法、低酸素負荷法、顕微鏡イメージング法を習得した。これらの方法は心臓細胞を用いることで容易に心臓虚血再灌流障害チップモデルに応用することができる。2.本研究の目的は、ヒト心筋細胞おけるTRPM4チャネルの不整脈寄与の解明である。日本では研究協力者らがラット心筋細胞株H9c2を用いた研究を継続しており、一過性受容器電位チャネルサブタイプM4(TRPM4チャネル)をCRISPRノックアウトした系での実験方法を確立した。ヒトiPS心筋細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトを行うための準備は整っており、目的に対し順調に研究を進めている。1.血液脳関門(BBB)チップヒトiPS細胞を分化誘導した臓器チップの取り扱い方法を習得するため、BBBチップの実験方法を習得する。BBBチップは神経細胞、星状細胞、脳血管内皮細胞および周皮細胞の共培養系である。この実験系を虚血再灌流障害の模擬状態に曝露する。これは脳梗塞のモデルとなり医学的意義が大きい。これまで研究代表者は心筋細胞のみを用いた実験系で研究を行ってきたが、虚血再灌流障害では血管内皮細胞の影響が大きいと考えられており、また心筋細胞は心臓線維芽細胞と機能的連携があることが知られている。したがってBBBチップにおける共培養系の習得は、心筋細胞、心臓線維芽細胞および血管内皮細胞の共培養により心臓チップをより生体の心臓に近づける点で大いに有効である。2.ヒトiPS細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウト研究代表者らはラット心筋細胞株H9c2細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトに成功しており、かつヒトiPS細胞の心筋細胞への分化誘導をルーチンで行なっている。今年度はヒトiPS細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトを行い、ヒトの心臓虚血再灌流障害におけるTRPM4チャネルの関与を調べる。内定年度:2017研究代表者は2018年7月末より米国に渡航し、ハーバード大学Wyss Instituteにて研究を開始した。

その結果、過酸化水素の濃度増加に伴いMBLとC4dの沈着が増加する傾向が腎臓近位尿細管上皮細胞において見られた。1.臓器チップ実験を行うためのPDMS表面の活性化処理、足場タンパク質による表面処理、細胞培養法、培地・血液灌流法、低酸素負荷法、顕微鏡イメージング法を習得した。これらの方法は心臓細胞を用いることで容易に心臓虚血再灌流障害チップモデルに応用することができる。2.本研究の目的は、ヒト心筋細胞おけるTRPM4チャネルの不整脈寄与の解明である。日本では研究協力者らがラット心筋細胞株H9c2を用いた研究を継続しており、一過性受容器電位チャネルサブタイプM4(TRPM4チャネル)をCRISPRノックアウトした系での実験方法を確立した。ヒトiPS心筋細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトを行うための準備は整っており、目的に対し順調に研究を進めている。1.血液脳関門(BBB)チップヒトiPS細胞を分化誘導した臓器チップの取り扱い方法を習得するため、BBBチップの実験方法を習得する。BBBチップは神経細胞、星状細胞、脳血管内皮細胞および周皮細胞の共培養系である。この実験系を虚血再灌流障害の模擬状態に曝露する。これは脳梗塞のモデルとなり医学的意義が大きい。これまで研究代表者は心筋細胞のみを用いた実験系で研究を行ってきたが、虚血再灌流障害では血管内皮細胞の影響が大きいと考えられており、また心筋細胞は心臓線維芽細胞と機能的連携があることが知られている。したがってBBBチップにおける共培養系の習得は、心筋細胞、心臓線維芽細胞および血管内皮細胞の共培養により心臓チップをより生体の心臓に近づける点で大いに有効である。2.ヒトiPS細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウト研究代表者らはラット心筋細胞株H9c2細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトに成功しており、かつヒトiPS細胞の心筋細胞への分化誘導をルーチンで行なっている。今年度はヒトiPS細胞のTRPM4チャネルのCRISPRノックアウトを行い、ヒトの心臓虚血再灌流障害におけるTRPM4チャネルの関与を調べる。
サイトカインシグナル伝達に関わる転写因子NF-IL6とSTATファミリーの役割

われわれは、IL-6の核内ターゲットであるNF-IL6とSTAT3をクローニングした。その後、NF-IL6とSTATファリーメンバーのin vivoでの役割をノックアウトマウスを用いて研究している。(1)NF-IL6関連遺伝子ノックアウトマウスの作製:NF-IL6β,IgEBP欠損マウスを得ることができた。NF-IL6βノックアウトマウスでは炎症性サイトカインや急性期蛋白質の発現に異常は認められなかった。細菌感染に対しても抵抗性であった。IgEBP欠損マウスは生後すぐに死亡した。現在、その死因を検討中である。(2)NF-IL6標的遺伝子の探索:NF-IL6欠損マウスと野生型マウス由来の腹腔マクロファージをLPS+interferon γによって刺激したのち、正常マウスのマクロファージでは誘導されるがNF-IL6欠損マクロファージでは誘導されてこない、いくつかのcDNA断片をdifferentila display法によって得た。現在、完全長cDNAをクローニングしている。(3)STATファミリーメンバーノックアウトマウスの作製:STAT3ノックアウトマウスは、胎生期の極めて初期に死亡し、原腸形成に至らないことが判明した。STAT3の胎生期の発現パターンがvisceral endodermに限定されていることより、STAT3ノックアウトマウスの死因は、胎盤の機能不全によると考えられた。STAT6ノックアウトマウスにおいては、IL-4,IL-13のシングナル伝達が障害され、STAT6がIL-4とIL-13のシグナル伝達に必須の分子であることが判明した。
高温押し出し加工による超伝導セラミックスの高密度線材化技術の研究

計画研究の最終年度にあたる本年度は,以下の4点を中心として,過去3年間の研究成果をまとめる方向で研究を進めた。1.高温加工時のカン材質の選択についてこれまでの研究では,高温押し出し加工中に超伝導セラミックスが還元されてしまうと言う欠点があった。種々の金属とその組み合せを検討したが,決論としては銀を適用した場合にセラミックス相に与えるダメ-ジが最も少なかった。銀は高温で変形抵抗が極めて低くなり,カンの材料としては扱いにくいが,ダイスの形状や潤滑剤を工夫することによって,まずまずの形状に高温押し出しすることが可能になった。2.高温加工中の超伝導セラミックスの緻密化機構Bi系超伝導セラミックスについて,高温押し出し加工前後,および加工品を熱処理した後の焼結体組織を高分解能電子顕微鏡で観察し,高温加工に伴う短時間緻密化機構を調査した。その結果,本研究で行った高温加工プロセスにおいては,まず粒子同士の機械的な破壊を伴いながら緻密化が進行し,同時に過渡的な非晶貭相(液相)の存在がそれを促進させていることが明らかとなった。3.線材化技術の総合化研究室温スウェ-ジング加工,高温押し出し加工,高温圧延加工(ホットロ-リング),HIP(高温静水圧加圧)等の組み合せを行って,より実用目的に適した線材化加工技術に関する提言を行うことができた。4.長尺線材化加工について高温押し出し加工は長尺化には適さないと考えられがちであるが,実験室的に可能な範囲での長尺化試験を試み,500mmの均質な長尺化が可能であることを確認した。