hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
卵巣腫瘍の遺伝子治療に関する基礎的検討

正常胎盤組織からtotal RNAを抽出し、oligo (dt) cellulose span columnを用いてpoly (A) +RNAを精製し、Molony murine Leukemia Virus Reverse Transcriptaseにより、cDNAを合成した。それを鋳型としてp53,p16^<INK4>,p15^<INK4B>遺伝子の全コーディング領域が各々含まれるようなPCR primerを用いて遺伝子導入するDNAを作成した。各々のフラグメントは塩基配列が目的のものであることをシークエンスにより確認した。この正しい塩基配列を持ったp53,p16^<INK4>,p15^<INK4B>遺伝子のcDNAフラグメントを制限酵素(XhoI,BamHI)にて切断後、同一の酵素で切断した発現ベクターpMSGへ、T4DNA ligaseにより組み込み、さらに大腸菌へ感染させ大量のDNAを得た。次に癌抑制遺伝子p53およびCDK4inhibitorであるp16^<INK4>,p15^<INK4B>遺伝子の発現が見られない卵巣癌細胞株SKOV-3に上述のcDNAフラグメントをリポフェクチン法により細胞株へ導入し、導入された細胞株のクローンをHAT selectionにて選別中である。現在までに癌抑制遺伝子p53を導入した細胞の100個以上のクローンより導入した遺伝子が正しく発現しているクローンを12株得られた。それらのクローンを用いてp53遺伝子の発現を誘導してやると卵巣癌細胞株の増殖が抑制されることが証明された。この事実から癌抑制遺伝子p53に異常のある卵巣癌ではその機能を正常に戻すことが遺伝子治療に応用できる可能性が証明された。今後これらのクローンを用いて卵巣癌における癌抑制遺伝子p53の機能を詳細に検討すると共にCDK4inhibitorであるp16^<INK4>,p15^<INK4B>遺伝子でもその卵巣癌細胞株における機能解明のためにクローンの選別中である。
近世彫刻史における黄檗彫刻と中国明末清初彫刻の研究

隠元が寛文元年(1661)に京都・宇治の萬福寺に晋住後、中国人僧の日本各地での活動によって、黄檗寺院は発展と展開をみせた。その後、中国人僧の渡来数が減っていく中で、次世代としてその意志を受け継ぐ法系の日本人僧が活躍を見せはじめる。梅嶺道雪もその一人で、近江国(滋賀県)には梅嶺禅師の開創になる寺院が多く遺っている。本研究ではそこに遺される美術工芸品等に注目しデータを蓄積することで、近世における異文化受容の展開の一様相を明らかとした。本研究は、黄檗彫刻の再評価、すなわち黄檗彫刻を明末清初の中国造像史の中で評価し、加えて黄檗彫刻が、日本の彫刻に与えた影響と、その展開について検討することを目的とする。当該年度では、国内における黄檗寺院を中心に実査を行い、研究計画でその方法のひとつとした「黄檗彫刻の影響と展開」について検討した。1滋賀県近江八幡市に所在する福寿寺、正宗寺の梅嶺道雪にかかわる寺院の悉皆調査を数回にわたって行った。彫刻に限らず、絵画、古文書等も調査対象とした。なお、正宗寺については調査継続中である。2静岡県浜松市に所在する、大雄寺、宝林寺の独湛性瑩にかかわる寺院の調査を行った。大雄寺では絵画、彫刻について、宝林寺では二十四菩薩像について精査を行い、像表面にあらわされた文様や彩色の確認を行った。3大阪府豊中市に所在する瑞輪寺の彫刻作例について調査を行った。なお、当該寺院の調査は引き続き行う予定である。以上の調査で得られたデータを収集、整理することを年間を通じて行った。それによって、黄檗彫刻に指摘される和様化に向かう傾向を確認することができたのと同時に、その傾向は一様ではないことが理解できた。また、これらの寺院調査を行うなかで、請来された中国仏像彫刻を数躯見出すことができた。さらには今回、黄檗宗寺院以外にも、数躯の中国製と考えられる仏像を見出しており、今後さらに、対象となる中国仏像彫刻を各地で見出す可能性が高いと推測される。本年の研究活動期間は、5月後半より産前産後および育児休業の取得のため、実質2か月足らずであった。その中で、京都・泉涌寺所蔵の釈迦如来坐像の調査を行った。本像は明末清初制作の、中国製の仏像と考えられる。黄檗山萬福寺の開山である隠元隆琦が、後水尾天皇に献じた仏像で、その後泉涌寺に施入されたとの来歴をもつ。小像ではあるが、隠元に関わる貴重な1躯である。本像の写真撮影を行った上で、精査を行った。それにより、本像の背面の埋め木は、当初の仕様と考えられることが理解できた。これは、本像が何らかの霊木によって制作された可能性を示している。このことは、本像の泉涌寺に伝わる由来を記した文書の記述を裏付けるものとなった。本調査によって、新たな知見を得、また改めて黄檗における位置づけと、黄檗様の仏像の展開について考察した。その成果は、浜松市博物館における「初山宝林寺開創350年記念浜松にもたらされた黄檗文化」特別展図録において、本像の作品解説とコラムにより発表した。産前産後の休暇又は育児休業による中断のため、当該年度の研究実績はありません。産前産後の休暇及び育児休業を取得し、研究が一時中断したため、本研究課題の進捗状況はやや遅れている。隠元が寛文元年(1661)に萬福寺に晋住後、中国人僧の日本各地での活動によって、黄檗寺院は発展と展開をみせた。例えば静岡県浜松市には、独湛性瑩禅師が開創した宝林寺があり、また、福岡県北九州市の福聚寺は、即非如一禅師を開山とする。渡来した中国人僧は計80人ほどと言われており、彼らの多くは日本国内で黄檗派の発展に寄与した。梅嶺道雪禅師もその一人で、大眉性善禅師の法脈を継ぐ東林派下の人物である。近江や伊勢などには梅嶺禅師の開創になる寺院が遺っているが、そこに遺される美術工芸品等に注目した。滋賀県の近江八幡市には、梅嶺道雪禅師の開創になる正宗寺がある。正宗寺は萬福寺にならった伽藍配置で、安置される仏像も日本人仏師の手によるものではあるが、黄檗様の仏像である。また、梅嶺禅師に関わる遺品や墨跡や自筆と思われる絵画など、多くの遺物が残されている点でも貴重である。本年度は、これらの正宗寺の作例の調査を中心に行うことで、黄檗寺院の発展と展開の第2段階ともいうべき日本人僧の活躍の中から、黄檗様とは何かを明らかにするため、梅嶺禅師関連の作例に注目した。具体的には、梅嶺禅師の払子や帽子などの法具類、100点を超える直条や絵画の確認と調査を行った。また、三重県多気町の梅嶺禅師開創の法泉寺にも調査に赴き、正宗寺関連の直条や梅嶺禅師像等を確認した。

法泉寺は現在廃寺となっており、遺された遺物も少ないが、地元の郷土資料館の協力を得ることができた。また、近江八幡市正宗寺においては、市教育委員会とご住職、また本山文華殿の協力を得て調査を行うことができた。国内寺院数か所の調査を予定していたが、2ヶ寺となってしまい、十分に時間が取れなかった。また、調査寺院に遺されていた黄檗関係の資料が主に書跡であったため、書跡の整理作業に時間をとられ、黄檗彫刻の調査数が限られてしまった。さらには、本年度から就労状況が変わったため、全体に本研究課題に取り組む時間が不足した。本年度は、昨年度に引き続き国内で黄檗彫刻の調査を中心に、江戸時代における黄檗彫刻についてのデータ収集を行い、それらに基づいて検討を加えた。調査は2ヶ寺計8回に及び、調査対象は彫刻のみならず絵画、書跡等にも及び、様々なデータを収集した。滋賀県では、黄檗派が積極的に活動を行い、黄檗寺院が多く存在したことが知られており、本年度の調査対象とした正宗寺、正瑞寺は梅嶺道雪禅師が大眉禅師を勧請開山として開いた寺院である。特に正宗寺は梅嶺の活動拠点となった寺院で、伽藍も本山である萬福寺に倣って整備された。そのため各堂に安置するための諸像も本山に倣って制作されたと考えられ、またその制作者はいわゆる本山仏師に近い人物が想定されていた。調査では想定される作者や制作時期の確認を行い、また、本調査の中で黄檗寺院内に安置される中国製の彫刻作例についても抽出した。研究期間全体を通じ、黄檗彫刻の日本国内における展開について、国内に現存する明末清初の中国製の作例との比較考察を行いながら、データの収集、整理を行った。黄檗彫刻は、本山に安置される仏師・范道生作の諸像や、本山仏師と呼ばれる日本人仏師によって制作された諸像に倣って制作されるものであることが確認されたほか、中国製の彫刻作例を強く意識した作風ながらも、造像経緯や来歴、当初の安置場所などが不明な作例があることも明らかとなった。確認のみ行った寺院の像も含めると、小像ながらも中国製と考えられる像が数多く現存していることが明らかとなった。梅嶺禅師の語録などにみえる活動記録を踏まえた上で各寺院に現存する諸資料を調査し、照合を行うことができた。隠元が寛文元年(1661)に京都・宇治の萬福寺に晋住後、中国人僧の日本各地での活動によって、黄檗寺院は発展と展開をみせた。その後、中国人僧の渡来数が減っていく中で、次世代としてその意志を受け継ぐ法系の日本人僧が活躍を見せはじめる。梅嶺道雪もその一人で、近江国(滋賀県)には梅嶺禅師の開創になる寺院が多く遺っている。本研究ではそこに遺される美術工芸品等に注目しデータを蓄積することで、近世における異文化受容の展開の一様相を明らかとした。本年度は5月後半より産前産後および育児休業の取得のため、実質2か月足らずの研究期間であった。そのため、調査も1カ寺のみとなり、予定していた萬福寺の調査も依頼がかなわなかった。しかしながら、隠元に直接かかわる像を実査できたことは非常に貴重であり、また本像の、黄檗における位置付けが極めて重要であることが理解できた。今後も引き続き中国製の仏像について調査を行っていきたい。今後は、国内での調査を中心に、黄檗寺院での調査を重点的に行う。特に黄檗派の中心寺院となる本山・萬福寺をはじめ、滋賀県や三重県等で活動を行った、梅嶺禅師に関連する寺院の調査を行い、国内における黄檗彫刻の受容と展開について明らかにする。なお中国における明代、清代の仏像彫刻の様式観を明らかにする点については、日本に舶載された中国製の仏像彫刻を調査し、黄檗彫刻との比較を行う中で検討し、考察をすすめたい。引き続き近江八幡市・正宗寺の調査を行い、全体の把握、目録の作成を行う。また、滋賀県内の別の梅嶺禅師関係の寺院を調査する。仏像調査の進捗状況がやや遅れているため、今後は彫刻作例の調査を優先的に行っていく。
世界の船舶墓場-バングラデシュ・チッタゴン沿岸における水質汚染調査と総合的把握

最終年度となる2018年度は、全体ワークショップを8月にチッタゴン、3月に日本で開催し、現地観測や研究成果を取りまとめ、汚染問題の解決に向けた総合的な環境対策シナリオを立案した。フィールド観測においては、ベンガル湾沿岸の船舶解体場周辺地域における重金属の濃度分布に関して12月まで一ヶ月毎に定期的なフィールド調査を実施し、汚染状況の季節変化を明らかにした。また大型海藻アカモクの幼胚や微生物を用いた沿岸海水のバイオアッセイ(毒性評価試験)では、沿岸海域に適用されるリサイクル資材等を対象に海水のpH変化によるアカモクの生長への影響を中心に検討し、アカモク幼胚は低pH域(6.5ー8)では影響をほとんど受けないが、高pH域(8.59以上)では生長阻害が生じることを明らかにした。船舶解体産業におけるマテリアルフロー解析では、昨年の大型船舶の有害物質インベントリ調査で鉛蓄電池が重要であることが明らかになったことから、本年度は鉛蓄電池のリサイクルに伴う鉛の環境への排出挙動について検討した。日本国内で鉛蓄電池リサイクルを行っている数カ所の事業所に着目し、PRTR制度で公表されたデータを整理することで、鉛蓄電池をリサイクルする際の鉛化合物の大気および水系への排出割合を推定した。国際・地域経済の動態分析に関するサブテーマでは、アジア諸国間における経済的な相互依存関係を分析した。貿易や投資の拡大によって、各国間の相互依存関係が年々強まりバングラデシュの船舶解体産業も組み込まれる一方で、船舶解体を巡る国際競争も発生している。この相互依存と競争は、船舶解体企業の存続をも左右し得るほどの強い影響を与えている。こうした船舶解体における汚染発生の背景にある経済構造を明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。バングラデシュにおける観測に先立ち、現地で実施可能な重金属分析および生態影響試験を検討した。鉛、ヒ素、カドミウム等の有害元素を中心に、超分子型固相吸着カートリッジに通して測定対象元素と妨害元素を分離後、液体電極プラズマ発光分析装置を用いて定量する方法を確立した。生態影響試験としては、大型海藻のホンダワラ類の幼胚を用いたバイオアッセイ法を確立した。観測水域の海水で幼胚を培養し、成長量や幼胚の形状等の変化から海水中重金属の海藻群落の形成への影響を評価した。ホンダワラ類の幼胚は、冷蔵庫で200日以上保管が可能であり、操作性の面から沿岸域の環境影響評価を行う海藻種として適当であった。チッタゴン沿岸域における観測については日本に現地の海外協力者を招いた全体会議を8月に開催し、船舶解体場周辺における総合調査の準備を進めた。現地観測は11月から開始し、チッタゴン大学の研究協力者との共同研究体制の下、水質及び底質のフィールド調査を実施した。今後、3年間に亘って定期的な調査を実施する。本年度は船舶解体地域周辺における重金属類の濃度分布から、チッタゴン沿岸域における水質汚染の現状を初めて明らかにした。船舶解体産業を巡る国際・地域経済の動態分析については、資料収集と聞き取り調査を通じて、実態把握を主に行った。マテリアルフロー解析ではバングラデシュの公表文献をレビューして現状を把握した。例えば船舶解体産業に由来する鉄鋼製品の物質投入量は、年間128万トン242万トンと推定され、バングラデシュ全体の鉄鋼製品投入量の約4055%を占める。書籍及び論文を通じて当該産業の置かれた現状を解明するほか、環境破壊を防ぐための国際的な取り組みについても調査した。同時に、聞き取り調査により、環境破壊がどの程度進んでいるのか、またそれが現地の生産活動に与える影響について、経済学的視点から情報収集を進めた。今回の調査に向けた金属の現場分析方法およびバイオアッセイ法を確立するとともにバングラデシュで現地調査を実施した。また国際・地域経済の動態分析について情報収集を行い、論文や学会における成果報告も積極的に進めている。本年度は、チッタゴン大学の研究協力者との共同研究体制の下、チッタゴン・ベンガル湾の船舶解体地域周辺における水質及び底質のフィールド調査を7月から3月まで2ヶ月毎に実施した。全体ワークショップを7月にチッタゴン、3月に日本で開催し、現地観測や研究成果の取りまとめを行った。重金属を対象としたin situ環境分析法については超分子型固相抽出と可搬型液体プラズマ発光分析装置を組み合わせた手法を鉛、ヒ素等について開発した。これらの手法を用いて、観測フィールドの重金属分布を現地調査で明らかにした。また大型海藻のアカモクの幼胚を用いた沿岸海水のバイオアッセイ手法については、アカモク幼胚を用いた毒性評価試験を行った結果、実際のバングラデシュ沿岸海域で採取した試料で生長阻害が明確に認められた。船舶解体産業を巡る国際・地域経済の動態分析については、前年度実施した実態把握調査からバングラデシュ及びその周辺国が置かれている経済状況を分析し、これを基にアジア諸国の相互依存関係を明らかにした。各国とも他国の経済状況や世界経済の動向から影響を受けやすいことが示された。マテリアルフロー解析では、世界の船舶の解撤状況やシップリサイクル条約への対応状況、船舶に関する有害物質インベントリ作成ガイドラインに関する文献、大型船の有害物質インベントリを調査し、バングラデシュでの船舶解体に伴う環境汚染について検討した。有害物質としては、アスベスト、フロン類、鉛等が挙げられる。特に鉛は現地調査において汚染度が高かったが、鉛蓄電池に由来しており、鉛蓄電池の処理・リサイクルについて対応すべき課題であることが分かった。

新しい観測手法として開発したin situ環境分析法およびバイオアッセイ法を駆使してバングラデシュの現地調査を実施し、船舶解体場において初めて重金属の詳細な汚染状況を明らかにした。またマテリアルフロー解析や国際・地域経済の動態分析についても論文発表や学会において多数の成果報告を行った。2017年度は、全体ワークショップを12月にチッタゴン、3月に日本で開催し、現地観測や研究成果を取りまとめて中間報告を行った。フィールド観測においては、今年度は2016年度までの観測で得られた重金属の濃度分布に基づいて様々な環境指標を用いて汚染度を評価した。また新たにベンガル湾沿岸域の船舶解体場における汚染状況の季節変動を明らかにすることを目標として、2017年度から定期的な調査の実施を開始した。本調査は2018年10月まで継続して、最終年度に結果を報告する予定である。観測手法については昨年度の成果を引き継いで発展させており、重金属を対象としたin situ環境分析法について、鉛、ヒ素に加えてセレンの酸化状態別分析法を新たに開発した。また大型海藻アカモクの幼胚を用いた沿岸海水のバイオアッセイ手法(毒性評価試験)について、生長阻害物質のフェノールを基準に用いて比較・評価し、感受性が大型海藻と同程度(フェノールに対するNOEC(無影響濃度)は20mg/L)であることを確認した。船舶解体産業を巡る国際・地域経済の動態分析に関するサブテーマでは、バングラデシュ及びその周辺国における企業のビジネスのあり方を分析し、為替レートの変動など経済環境の影響をどのように受けているのかを明らかにした。そうした環境変化は、現地の労働者の雇用を不安定にする一つの要因となっている。マテリアルフロー解析では、前年度に引き続き、船舶の有害物質インベントリ作成ガイドラインに基づいて作成された有害物質インベントリを調査し、廃棄される鉛蓄電池が大きな汚染限となることを確認した。さらに鉛蓄電池のリサイクル状況を把握するために、鉛精錬企業へのヒアリングを含めた鉛蓄電池のフローについて調査した。一方でバングラデシュにおける鉛のマテリアルフローについては今後の課題とした。本プロジェクトで開発した新しい観測手法について計画以上に多数の論文が国際学術誌に受理され、また国際会議における成果報告も想定を超えて活発に進めることができた。最終年度となる2018年度は、全体ワークショップを8月にチッタゴン、3月に日本で開催し、現地観測や研究成果を取りまとめ、汚染問題の解決に向けた総合的な環境対策シナリオを立案した。フィールド観測においては、ベンガル湾沿岸の船舶解体場周辺地域における重金属の濃度分布に関して12月まで一ヶ月毎に定期的なフィールド調査を実施し、汚染状況の季節変化を明らかにした。また大型海藻アカモクの幼胚や微生物を用いた沿岸海水のバイオアッセイ(毒性評価試験)では、沿岸海域に適用されるリサイクル資材等を対象に海水のpH変化によるアカモクの生長への影響を中心に検討し、アカモク幼胚は低pH域(6.5ー8)では影響をほとんど受けないが、高pH域(8.59以上)では生長阻害が生じることを明らかにした。
位置運命決定因子におけるヒト成体器官機能制御の解明

左右非対称などの臓器位置決定は発生段階で位置運命決定因子により制御されているが、臓器位置が決定し成体となった後でも位置運命決定因子は発現し続けている。しかしながら成体後の位置運命決定因子による制御機能はほとんど解析されておらず、特にヒトにおける作用は全く不明である。申請者が専門としている炎症性腸疾患(IBD)では好発部位が知られており、潰瘍性大腸炎では直腸、クローン病では回腸末端が初発となることが多いが、なぜその部位に発症するか詳細な分子機構は不明である。本研究では、腸管の異なる部位由来のオルガノイドでの位置運命決定因子発現を動揺させることにより細胞機能が置換されることを確認し、位置運命決定因子と疾患感受性の関連を明らかとすることで病変好発部位形成の病態を解明することを目的とする。1)位置特異的大腸オルガノイド機能解析においては、左側の直腸及び右側の上行結腸より大腸オルガノイドを樹立した。増殖、幹細胞分画、炎症刺激応答、炎症刺激耐性を評価し、上皮細胞機能の部位別差異を解析した。2)位置運命決定遺伝子の抽出においては、両部位オルガノイドのマイクロアレイにより発現差異を認めた遺伝子を抽出した。3)位置運命決定遺伝子の確認においては、手術検体組織を用いて、生体組織内でも位置運命決定遺伝子の発現差異が維持されているかを手術検体を用いて、定量PCR及び免疫染色にて確認を行った。4)位置運命決定遺伝子発現の動揺においては、上行結腸由来オルガノイドにCrisper/CAS9システムを用いて特異的遺伝子を欠失させた。さらに、レンチウイルスを用いて直腸由来オルガノイドに特異的遺伝子を発現させた。当初の計画通りに、ヒト検体から腸管部位特異的なオルガノイドの樹立に成功している。さらに、マイクロアレイ解析により部位特異的発現遺伝子を同定し、その機能解析まで着手していることから、おおむね順調に進展していると判断した。部位特異的遺伝子の機能解析を行う予定である。部位特異的遺伝子の発現動揺の後、上行結腸由来オルガノイドが直腸由来オルガノイドの細胞機能に置換するか評価する。直腸由来オルガノイドも同様に置換を評価する。特に炎症刺激耐性などIBD病態と関与する機能が置換された場合には病変好発部位との相関を明らかとする。また、マウスへの移植モデルを構築し、in vivoにおける機能置換作用を評価する。最終的には位置運命決定因子を標的とした阻害薬もしくは作動薬を用いて上皮機能作用を確認し新規治療薬候補としての評価を行う予定である。理由:試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。使用計画:検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
海底鉱物サンプルを取得・分析する歩行式掘削プラットフォームの基礎的研究

平成30年度はジャッキアップ式海底歩行型プラットフォームのプロトタイプを用いて、陸上での歩行実験を実施した。このプラットフォームは、ドリル装置等を搭載する予定のデッキと、4本脚で自重を支えるステージを2セット有し、X方向、Y方向に移動させることができる。1セットの4本脚で自重を支えながら、残りの1セットの4本脚を移動し、歩行する。各脚は1本ずつ単独で動かすことができ、傾斜面でもデッキを水平に保つことができる。まず、平坦な場所での歩行実験を通じて、デッキを水平に保ったまま歩行できることを確認した。脚が着地しているかどうかを認識するために脚先端にタッチセンサーを取り付けた。この実験を通じて、8本の脚を動かすシーケンス制御アルゴリズムを改良しながら構築した。次に、軟弱な場所がある場合の対応方法を検討するため、傾斜のない床にスポンジやもみ殻入り枕などを設置し、脚を降下させていった際、脚が潜り込んで止まらない状況を模擬して、実験を実施した。脚の降下ストロークの上限に達するか、脚の先端に取り付けたタッチセンサーでスイッチがONになれば、軟弱箇所を通過して固い地盤に到達したとみなす方式が機能することを確認した。さらに、傾斜をつけた面を用意し、傾斜面の昇降の歩行実験を行った。これまでに構築してきたシステムで、傾斜は45度まで昇降でき、本プラットフォームの特徴を実験で実際に確認することができた。平成31年度の水中歩行実験に向けて、モーター部の水密カバーの検討を開始した。当初計画通り、脚の先端にタッチセンサーを取り付け、陸上での歩行実験を通じて、8本脚による歩行アルゴリズムについて検討した。本プラットフォーム開発に必要な機能確認実験として、1)平坦な場所での歩行実験、2)軟弱な箇所がある場合の歩行実験、3)傾斜がある場合の歩行実験、を予定していたが、これらの実験を全て実施し、アルゴリズムを修正しながら構築し、実験データを蓄積した。おおむね順調に進展している。平成31年度は、プラットフォームのプロトタイプを水中仕様に改造し、水中での歩行実験を開始する。水中用のプラットフォームでは、センサー部、脚のアクチュエータ部を防水加工しなければならない。水中実験においても、平坦な場所での歩行実験、軟弱な場所がある場合の対応方法、傾斜の登下坂の歩行実験を行い、水中での歩行制御アルゴリズムの検討、最適な移動方法に関する考え方の整理を行う。経費使用の結果、端数が出た。
ウマにおける同種他個体・ヒトとの社会的絆形成を促す心理・生理要因に関する研究

本研究の目的は、同種個体間の社会的絆の意義が明らかになっており、ヒトとも長く共に暮らしてきた伴侶動物でもあるウマを対象に、同種他個体・ヒトとの社会的絆の質や強さを把握した上で、社会的絆形成を促す心理・生理要因を探ることである。本年度は、同種他個体・ヒトとの社会的絆の質や社会的絆形成を促す要因に関する研究を2つ実施した。第1の研究では、まず、ウマのストレスが既知の同種他個体によって緩和されるかを検討した。ウマを群れから孤立させ、新奇環境に曝すことでストレスを与えた。単独でストレスに曝される条件を単独条件、群れの仲間である同種他個体とともにストレスに曝される条件を社会的条件として設定した。ウマのストレス行動(落ち着きなく動き回る行動・いななき・排便)は、単独条件でよりも社会的条件で減少した。血漿中コルチゾール濃度は条件間では差が見られなかったが、単独条件でのみ事前よりも事後の濃度が上昇していた。次に、同様の手続きを用いて、ウマのストレスが既知のヒトによって緩和されるかを検討した。その結果、ウマのストレス行動は、単独条件でよりもヒトとともにストレスに曝される条件で減少した。平均心拍数は条件間では差はなかったが、単独条件でのみ事前よりも実験中の平均心拍数が上昇した。以上の結果から、ウマにおいては、既知の同種個体やヒトの存在がストレスを緩和する役割を果たすことがわかった。第2の研究では、集団飼育されているウマを対象に、類似性がウマ同士の社会的絆形成を支えているかを検討した。具体的には、社会的絆の指標として近接割合を用いた。オトナのメスウマでは、繁殖状態が一致していたり、年齢が近いほど、近接割合が高くなった。仔ウマでは、日齢が近いほど、近接割合が高くなった。以上の結果から、ウマの社会的絆は繁殖状態の一致や年齢・日齢の類似性によって促進されることが明らかになった。本年度は、北海道大学北方生物圏フィールド科学センター静内研究牧場の協力を得て、同種他個体・ヒトとの社会的絆の質や社会的絆形成を促す要因に関する研究を2つ実施することができた。またそれらの2つの研究については論文執筆を進めているところである。よって、本研究はおおむね順調に進展していると言える。ウマの社会的絆の質や社会的絆形成を促す要因に関する研究は、来年度以降も、引き続き、上記の牧場や酪農学園大学馬術部などの研究協力施設の協力を得て、計画通りに研究を進めることができる見込みである。よって、来年度以降も、スムーズな研究を展開していくことができると考えている。
大学附属病院における卒後臨床研修の在り方に関する調査研究

平成7年10月、本調査研究に関して“大学附属病院等における卒後臨床研修について"そて中間まとめを行った。その内容の大筋を示す。1.卒後臨床研修について(1)卒後臨床研修の考え方:卒後教育及び医師国家試験を経て、期待される医師像を見直し、幅広い基本的診療能力を修得させるために行われるものであり、よき医師を養成する上で不可欠である。しかし、その実施に当たっては1)幅広い基本的診療能力の修復2)臨床研修施設の独創性3)研修医の進路を考えた多様性、選択制等が必要である。(2)大学病院における卒後臨床研修の課題1)病院全体としての研修プログラムを作成2)研修方式はロ-テイト方式を採用する。3)研修プログラムの公開と研修医の選択制4)研修実施体制と評価体制の確率2.全国レベルでの卒後臨床研修改善・充実に向けた組織の設置大学病院関係者及び臨床研修指定病院関係者等による独立した組織を設け、以下の事業を行う。(1)到達目標、研修プログラム、研修方式、研修実施、評価体制等の調査研究並びに相互評価(2)大学病院と臨床研修施設との連携促進3.大学病院における卒後臨床研修改善・充実の取組(1)研修目標:平成元年の医学関係者審議会議臨床研修部会作成の「卒後臨床研修目標」を参考にして、各病院独自の基本的、総合的研修目標を定める(2)研修プログラム:病院全体の研修プログラムを作成-自主性、多様性、選択制を確保する。(3)研修実施体制:病院長を研修の最高責任者として卒後研修委員会を設置し、実施体制及び責任体制を確率する。研修医の受け入れ数は指導体制、特に指導医の資格と人数に基づいて定める。(4)研修修了の評価:評価方法、体制の確率が必要である。などである。以上の中間まとめを行い、今後は卒後臨床研修の抜本的改善、充実の必要性が認められることは、各専門家間に於いても同一であり、それを施行する上での方策等の不一致を議論し、一日も早い具体案を作成する必要がある。そのため文部・厚生両省を含めて大学関係者、臨床研修指定病院、医師会の方々が同一の場で議論し、合意点に到達すべきと思われる。本年度の調査研究により、以下の点が明らかとなった。1)卒後臨床研修の抜本的改善・充実の必要性。2)この改善・充実のためには、到達目標を設定し、この目標達成のためのプログラムを、病院全体として、研修指定病院等との連携に於いて作成する。完遂するための評価並びに指導体制の確立が必要である。3)卒後臨床研修は、卒前教育、専門研修・生涯研修と継続性・一貫性がなければならない。その改善・充実にはこれらを通じて一貫した教育を行い、且つ、その継続性に於いて改善出来るのは大学附属病院であり、その中心的役割を有しなければならない。4)大学附属病院は、各自、自主性、独自性の中に、各々特色あるプログラムを作成し、その評価を行い、到達目標を達成するために努力をする必要がある。5)卒後臨床研修の義務化は、医師免許、保険医の問題に関連し、これら資格の制限は、基礎研究者への誘致を阻害し、又、臨床医にあっては、医師としての責任ある医療行為の制限にもつながるため、義務化に関連する規制は、今後日本の医学・医療の発展にマイナスの要因となる恐れがある。6)今後、到達目標の作成・改善、研修プログラムの評価、更には財源処置・配分などに関して全国レベルの大学附属病院・臨床研修指定病院関係者などによる独立組織の設置の必要性が考えられる。以上、教育・研究・診療を自からの手で行い、真に日本医学の発展と、絶えず国民に良質の医療を行わんとして努力している大学附属病院が中心となり、待遇改善を期し、卒業臨床研修を、時代の要請に則した幅広い期待される医師の養成のため、自主努力によって抜本的に改善せんとするものである。

(3)研修実施体制:病院長を研修の最高責任者として卒後研修委員会を設置し、実施体制及び責任体制を確率する。研修医の受け入れ数は指導体制、特に指導医の資格と人数に基づいて定める。(4)研修修了の評価:評価方法、体制の確率が必要である。などである。以上の中間まとめを行い、今後は卒後臨床研修の抜本的改善、充実の必要性が認められることは、各専門家間に於いても同一であり、それを施行する上での方策等の不一致を議論し、一日も早い具体案を作成する必要がある。そのため文部・厚生両省を含めて大学関係者、臨床研修指定病院、医師会の方々が同一の場で議論し、合意点に到達すべきと思われる。
超高感度音速測定装置の開発と超音波スペクトロスコピー

われわれのおこなっている超音波スペクトロスコピーとは、超音波の音速と吸収係数を測定し、物質中の電子やイオンのさまざまな励起状態を知る実験手段である。藤村研究室では、過去数年にわたり、位相比較法に基づいた超音波精密測定装置の開発研究をおこなってきた。超音波を物性研究に応用するには、温度および磁場依存性の測定が極めて重要である。本研究では、低温(1.4K),磁場(8テスラ)中での、計算機を利用した超音波完全自動測定装置を完成させた。その結果、音速の相対分解能は【10^(-7)】まで向上し、音速測定による音響的ドハース=ファンアルフェン効果の観測に成功するなど新しい飛躍をもたらした。さらに、【^3He】-【^4He】希釈冷機を利用した極低温領域(100mk)での超音波実験装置の建設への予備的な研究をおこない、次年度(61年度)に完成させる目途をつけることができた。超音波を物性研究に利用する場合、これまでは主として吸収係数の測定に重点がおかれ、音速すなわち弾性定数の精密測定から、物質中の微視的な情報を得ようとする研究は確立されていなかった。超音波と固体中の電子やイオンとの相互作用の本質は、電子やイオンの量子状態のもっている電気的四重極モーメントと超音波によって誘起された弾性歪との結合にある。このような四重極二歪相互作用を、具体的な物質に即した超音波実験により明らかにする研究も、重要な研究課題であり、次のような成果があった。1.高密度近藤物質(Ce【B_6】,Ce【Cu_6】),価数揺動物質(Sm【B_6】,【Sm_3】【Se_4】)の特異な4f電子状態が弾性的性質におよぼす影響について、実験的研究をおこなった。2.La【B_6】,Ce【Sn_3】などの弾性的量子振動の観測にも成功し、ランダウ準位と弾性歪との相互作用の微視的起源を明らかにした。
ヒト大腸腫瘍性病変の立体構造と粘膜固有層マクロファージに関する検討

厚層標本の共焦点レーザー顕微鏡下観察により大腸腺腫・腺癌・過形成性ポリープの立体構築の画像化が可能であった。これまでの手法は酵素等で腺管を単離するため、全体の構造をとらえられない欠点があったが、我々の手技により組織としての観察が可能であった。過形成性ポリープは粘膜固有層の中・下部では比較的高い腺管密度を示した。しかし、立体構造上、数個の腺管が合流し1つの腺管開口部を共有するため、LPMの局在する粘膜固有層の上層では密度が著しく低下し、ここにLPMが存在する像が観察された。一方、腺腫・腺癌、特に腺癌では腺管の密度が非常に上昇し、粘膜固有層上層でも高い腺管密度が維持されており、ここにLPMはみられなかった。いわゆるserrated adenomaでは腺管密度の低い病変の内部にときにLPMが観察された。以上より、マクロファージが腫瘍内にみられない原因は腺管密度の増加に伴う粘膜固有層の狭小化と考えられた。腺腫・腺癌および過形成性ポリープでは上皮細胞の更新速度が増加していることが既に知られており、アポトーシスに陥る上皮細胞の増加が予想される。アポトーシスに陥った上皮細胞の貪食を行うLPMがこれに伴って増加すると考えられる。過形成性ポリープや一部のserrated adenomaのような腺管密度の低い病変ではLPMは病変内に止まれるが、腺腫・腺癌では腺管密度が高く粘膜固有層が狭小化するため、LPMが押し出される形となり、病変周辺にのみLPMが存在することが今回の観察結果より示唆された。目的と背景以前より、大腸腫瘍性病変の周囲にしばしば多数の粘膜固有層マクロファージ(LPM)が集簇することが知られていたが、病変の周囲にのみ集積する理由は不明であった。我々は、"腫瘍化による立体構造の変化により、腫瘍内外の粘膜固有層が立体的に連絡を持たなくなるためマクロファージが腫瘍内に遊走できず腫瘍周囲に集簇が起こる。"という仮説を立て、検証を行っている。本年度の実績大腸腺腫、腺癌、過形成性ポリープのそれぞれ20病変に対しヘマトキシリン・エオジン染色と免疫組織染色を行い、粘膜固有層マクロファージの分布につき検討した。非腫瘍性隆起病変である過形成性ポリープでは隆起病変内部にもLPMが局在するが、腺腫、腺癌等の腫瘍性疾患では腫瘍内部にLPMの増加はみられず、病変の周囲にのみ多数のLPMが存在していることが判明した。この現象は内視鏡画像の検討でも確認され、両病変の鑑別上有用な指標の一つと思われた。次年度の予定さらに症例を集積し、次年度は本検討の主目的である立体構造の解析を行う予定である。さらに、症例の集積を待って、sellated adenomaに対する検討も行いたい。
DNAプロ-ベによる胎児の風疹ウイルス感染診断法の確立

1.風疹ウイルスゲノムの増幅検出風疹ウイルスゲノムの増幅検出については、最終的に、(1)ウイルスRNAをグアニジン・フェノ-ル・クロロフォルムで抽出する。(2)RNAの逆転写後の相補的DNAのPCRによる増幅は2段階で行う(mested PCR)、(3)増幅DNAの検出は、アガロ-スゲル電気泳動後のDNA断片のエチジウムブロマイド染色による、事とした。2.妊娠中の風疹遺伝子診断妊娠中に発疹が出現し、風疹IgM抗体が検出された10症例について、抗体上昇以前の母血清6例、胎盤絨毛10例、治療中絶された胎児の組織5例について、ウイルス遺伝子の検出を試みた。陽性例は、血清2例、絨毛9例、胎児5例であった。胎児陽性例は全て絨毛陽性であったので、絨毛での陽性結果は、即、胎児陽性と診断して差しつかえないものと考えられた。3.風疹感染胎児におけるウイルス増殖部位臓器別に遺伝子検出を行なった胎児の症例について、ウイルス遺伝子陽性は、胎盤、腎、肝、脳、〓帯の各臓器であり、胎児感染は全身感染であると思われた。陰性の臓器は、脾、心、肺、眼、胸腺であった。この時、胎児血の風疹IgM抗体は陽性であったので、〓帯血IgM抗体陽性とウイルス遺伝子陽性、即ち、胎児でのウイルス増殖とが相関していることが確認された。4.先天性風疹症候群患児からのウイルス遺伝子の検出出生した患児の髄液、リンパ球、血清、咽頭ぬぐい液、尿、白内障手術の為摘出したレンズからも遺伝子が検出され、胎内持続感染であると思われた。1.風疹ウイルスゲノムRNAからの相補的DNA(cDNA)の作成(1)抽出ウイルスRNA。増幅cDNAで判定して、7ケの部位の内、6ケで作成可能であった。(2)ウイルス粒子RNA。ウイルス粒子をSDSで可溶化したRNAで作成可能になった。(3)ウイルス感染細胞RNA。感染細胞を加熱破壊し、可溶化したRNAで作成可能であった。2.cNDAのPCRによる増幅(1)プラスミドDNA。7ケの部位の内、6ケで増幅可能であった。(2)ウイルスRNAより作成したcDNA。プラスミドDNAに比べて、非特異的なDNAバンドの増幅が多かった。これは、ウイルス以外の細胞由来のDNAやcDNAによるものと思われた。3.マイクロプレ-トでの酵素反応による増幅されたcDNAの検出(1)ビオチン化DNAプロ-ベの作成。増幅したcDNAを検出するプロ-ベとして、ビチオン化DNAをPCRで作成した。試みた3ケの部位で、全て効率よく作成された。(2)検出条件の検討。マイクロプレ-トに増幅したcDNAを吸着させ、このcDNAにハイブリダイズしたDNAプロ-ベ上のビオチンに対して特異的に結合するストレプトアビジンで標識したペルオキシダ-ゼを作用させ、結合したペルオキシダ-ゼの酵素反応により、cDNAを検出した。DNAの希釈濃度を検討した。(3)検出の特異性。風疹ウイルスRNAのcDNAの特定部位以外は他のいかなる種類のDNA、cDNAともハイブリダイズせず、極めて特異性が高いものと思われた。1.風疹ウイルスゲノムの検出感度の検討風疹ウイルス粒子内、又は、風疹ウイルス感染細胞内のウイルス特異RNAから相補的DNA(cDNA)を作成し、その一部領域をPCR法により増幅し、増幅産物をマイクロプレ-トに吸着後、DNAプロ-ベにより検出する方法の確立は、昨年度の本研究の新しい到達点であった。今年度は、この検出法の検出感度を既存の検出法と比較した。

それぞれの検出法における検出可能な最少cDNA量(pg)は、アガロ-スゲル電気泳動法で520、^<32>Pプロ-ベによるサザ-ンブロッティング法で0.11.0、ペルオキシダ-ゼの発色によるマイクロプレ-ト法で200、βーガラクトシダ-ゼの蛍光によるマイクロプレ-ト法で1.5であった。蛍光によるマイクロプレ-ト法の検出感度は、^<32>Pプロ-ベによるサザ-ンブロッティング法に、ほぼ比肩しうる高感度のものであった。蛍光法は、放射性同位元素を用いなくてもすみ、かつ最大限96の試料を一度に検査できるという大きな利点を持つ。風疹ウイルス感染症の動物モデルの作成風疹ウイルスのウサギ皮下接種による感染モデル系の作成を試みた。リンパ球からのウイルスゲノムの検出に当っては、予めリンパ球から全RNAを抽出しておく事が、非特異的なバックランドを下げるために必要であると思われる結果を得た。1.風疹ウイルスゲノムの増幅検出風疹ウイルスゲノムの増幅検出については、最終的に、(1)ウイルスRNAをグアニジン・フェノ-ル・クロロフォルムで抽出する.(2)RNAの逆転写後の相補的DNAのPCRによる増幅は2段階で行う(nested PCR)、(3)増幅DNAの検出は、アガロ-スゲル電気泳動後のDNA断片のエチジウムブロマイド染色による、事とした。2.妊娠中の風疹遺伝子診断妊娠中に発疹が出現し、風疹IgM抗体が検出された10症例について、抗体上昇以前の母血清6例、胎盤絨毛10例、治療中絶された胎児の組織5例について、ウイルス遺伝子の検出を試みた。陽性例は、血清2例、絨毛9例、胎児5例であった。胎児陽性例は全て絨毛陽性であったので、絨毛での陽性結果は、即、胎児陽性と診断して差しつかえないものと考えられた。3.風疹感染胎児におけるウイルス増殖部位臓器別に遺伝子検出を行なった胎児の症例について、ウイルス遺伝子陽性は、胎盤、腎、肝、脳、〓帯の各臓器であり、胎児感染は全身感染であると思われた。陰性の臓器は、脾、心、肺、眼、胸腺であった。この時、胎児血の風疹IgM抗体は陽性であったので、〓帯血IgM抗体陽性とウイルス遺伝子陽性、即ち、胎児でのウイルス増殖とが相関している事が確認された。4、先天性風疹症候群患からのウイルス遺伝子の検出出生した患児の髄液、リンパ球、血清、咽頭ぬぐい液、尿、白内障手術の為摘出したレンズからも遺伝子が検出され、胎内持続感染であると思われた。
多重チューブアクチュエータの開発

チューブを円筒状に編み,内部に通した軸を駆動する1軸2自由度のアクチュエータの駆動方法の改良を行った.これまでに開発していた5mmの軸を駆動させる装置では,3本の右巻きチューブと3本の左巻きチューブの計6本のチューブから構成されていたため,3本の同方向の巻きチューブを順に駆動する際に,それぞれがオーバーラップして駆動していなかった.新たに開発した内視鏡の保持を目標とした10mmの軸を駆動させる装置ではそれぞれ6本の右巻きチューブと左巻きチューブの組み合わせからなり,それぞれのチューブを個別に駆動させると,装置の太さに対して駆動力が小さくなるため,片側の巻き組みの中で常に2本が加圧するようにオーバーラップした駆動方法をとる事にした.またチューブの伸縮による編みチューブの全体の変形を予測する手法を確立し,最大速度で動作するための内径を求め,内径14mmの装置で最大3mm/sの速度で動作させることができた.また6本編みチューブ式管内推進装置については,これまでは右巻きチューブの駆動からなる右螺旋捻転動作と左巻きチューブからなる左螺旋捻転動作の組み合わせによって,片方だけの駆動による螺旋捻転動作,同時に進行方向に駆動することによる平面状の屈曲動作,同時に逆方向に駆動することによるその場回転を実現していた.これに加えて右左の螺旋を複合した新しい駆動パターンを考案し,先頭部を壁面の片側方向に押し付けながら駆動する方法を開発し,分岐管において任意の方向に進路を選択することに成功した.転出により研究体制が変わり,前に所属していた組織に残してきた博士学生を遠隔から指導しながら装置開発を行ったため,新しい装置の開発があまりできなかった.その分変形の理論解析等に力を入れたため.今年度で雇用が終わり,来年度はまた転出となる.今年度まで指導していた博士も卒業するため来年以降は新たに装置を作るよりも,データ取得のための装置を作り,これまでの結果をまとめる方向で研究を進める予定である.特に編みチューブ式アクチュエータに関しては,力学的な特性を評価したいと考えている.本年はまず6本の中空編みチューブ内に軸を入れて駆動する2自由度アクチュエータの改良を行った.加圧による膨張で軸方向に伸びる効果を利用して中空編みチューブを屈曲させ,駆動されていない側の内壁のチューブを駆動軸に押し付ける方法では,チューブが0.1気圧程度で容易に破裂してしまい,駆動圧力を上げることが出来ず,編み角や内径を変化させても,速度,力共に大きな向上が見込めなかった.そこで加圧によって軸方向に縮むマッキベン型細径人工筋を用いる方式を採用した.マッキベン型人工筋はメッシュ状のチューブによって覆われており横方向の膨張が拘束されるため,より大きな圧力を加えても破裂しにくい.また中空編みチューブ全体もチューブが縮むことによって変形するため,駆動しているチューブが直接駆動軸に押し付けられることなりより大きな力が出せる.また内壁の発生させる波の理論式より中空編みチューブに最適な内径を求めた.さらにチューブの膨張は時間遅れが生じることから最適な駆動周波数があることも確認された.これにより内径8mmで中空円筒状に編んだ6本編みチューブに直径5mmの軸を通した試作機により,従来の試作品の速度0.55mm/sから速度1.7mm/sに推進速度を向上させた.さらに,チューブを12本に増やし,直径10mmの軸を駆動する試作機も製作した.またチューブを平面上に編むことで水平高校に2自由度に推進力を出す平面2自由度アクチュエータの試作も行った.当初の予定ではチューブ3本で周期的に上面下面に現れるように編む予定であったが,縦チューブと横チューブで非対称な編み方となることから,4本で周期的に編むこととした.またチューブで編むだけでは面そのものが軸方向にのびる影響でのびてしまい,面の反りが小さくなると考え,縦横に張った糸の間を通してチューブを通す方式を提案し,動作確認を行った.本年度より,自分が他大学に転出することになり,研究を旧組織に残してきた学生を指導しながら続けたが,昨年度より指導していた学生であったため,滞りなく研究を続けることが出来た.ただし雇用期間の決まっている転出であり,新たに学生が配属されていないことから,来年度以降は人手不足の恐れがある.チューブを円筒状に編み,内部に通した軸を駆動する1軸2自由度のアクチュエータの駆動方法の改良を行った.これまでに開発していた5mmの軸を駆動させる装置では,3本の右巻きチューブと3本の左巻きチューブの計6本のチューブから構成されていたため,3本の同方向の巻きチューブを順に駆動する際に,それぞれがオーバーラップして駆動していなかった.新たに開発した内視鏡の保持を目標とした10mmの軸を駆動させる装置ではそれぞれ6本の右巻きチューブと左巻きチューブの組み合わせからなり,それぞれのチューブを個別に駆動させると,装置の太さに対して駆動力が小さくなるため,片側の巻き組みの中で常に2本が加圧するようにオーバーラップした駆動方法をとる事にした.またチューブの伸縮による編みチューブの全体の変形を予測する手法を確立し,最大速度で動作するための内径を求め,内径14mmの装置で最大3mm/sの速度で動作させることができた.

また6本編みチューブ式管内推進装置については,これまでは右巻きチューブの駆動からなる右螺旋捻転動作と左巻きチューブからなる左螺旋捻転動作の組み合わせによって,片方だけの駆動による螺旋捻転動作,同時に進行方向に駆動することによる平面状の屈曲動作,同時に逆方向に駆動することによるその場回転を実現していた.これに加えて右左の螺旋を複合した新しい駆動パターンを考案し,先頭部を壁面の片側方向に押し付けながら駆動する方法を開発し,分岐管において任意の方向に進路を選択することに成功した.転出により研究体制が変わり,前に所属していた組織に残してきた博士学生を遠隔から指導しながら装置開発を行ったため,新しい装置の開発があまりできなかった.その分変形の理論解析等に力を入れたため.6本編み中空チューブや6本編み管内推進装置は,これまではただ周期的に右螺旋と左螺旋のチューブに同じ動作をさせるだけで,両者の組み合わせによってチューブ全体に波状のうねりを発生させて推進力を発生させていた.このため装置の先端は常に左右に振りながら動く状態となっていた.その動きを考察すると,チューブの駆動順序を変えることで,先端の屈曲方向を軸に対して一方向に固定したまま,胴体全体で波を発生させることが出来ることがわかった.これを利用することで管内推進装置としては分岐管で任意の方向に移動することが可能となる.そこでこれを実証する.また平面編みチューブでは糸の編み方とチューブの編み方を同一にすると,糸とチューブが干渉することもわかったため,これを回避する編み方を考案した.チューブ本数も縦4本と横4本の8本で周期動作を発生させることから,これらも駆動方法の組み合わせを変えることで,従来の駆動方法とは異なる制御方法がある可能性があるのでこれを試す.来年度から人手が減ることを考え,新たな装置開発よりも,主に制御による性能向上を目指す予定である.今年度で雇用が終わり,来年度はまた転出となる.今年度まで指導していた博士も卒業するため来年以降は新たに装置を作るよりも,データ取得のための装置を作り,これまでの結果をまとめる方向で研究を進める予定である.特に編みチューブ式アクチュエータに関しては,力学的な特性を評価したいと考えている.一円単位で端数を正確に使い切るために必要となるかもわからない不要な物を買うのは好ましくない考えたため.来年度に新たに研究室を立ち上げる必要が有り,人手も無いことから,装置の力学特性を測るための計測用の器具の開発を自動化したいと考えており,従来の予定では購入する予定の無かった3次元の自動加工機の導入を考えている.
mTOR を標的としたオートファジー誘導型の新しい B 細胞リンパ腫治療法の開発

悪性リンパ腫は未だ予後不良な血液悪性疾患のひとつであるが、予後を不良にする最大の原因は抗がん剤に対する抵抗性にある。抗がん剤はリンパ腫細胞にアポトーシスやネクローシスなどの細胞死を誘導する目的で使用されるが、このような従来型の薬剤とは一線を画する治療法が希求されている。そこで本研究では、アポトーシスやネクローシスなどの細胞死シグナルとクロストークしない自己融解型の細胞死、オートファジーを誘導する治療法を試みた。オートファジーの誘導にはmTORに対するsiRNAを用い、siRNAのデリバリーとB細胞リンパ腫のターゲティングには、CD19抗体で標識したsiRNA-PEG/KALA PECMシステムを開発した。「研究の目的」悪性リンパ腫は未だ予後不良な血液悪性疾患のひとつであるが、予後を不良にする最大の原因は抗がん剤に対する抵抗性にある。そこで本研究では、アポトーシスやネクローシスなどの細胞死シグナルとクロストークしない自己融解型の細胞死、オートファジーを誘導する治療法を試みる。オートファジーの誘導にはmTORに対するsiRNAを用い、siRNAのデリバリーとB細胞リンパ腫のターゲティングには、CD19抗体で標識したsiRNA-PEG/KALA PECMシステムを開発する。オートファジー誘導の判定は、ウエスタンブロット法によるLC3-IIの検出などにより行った。「平成23年度の業績」悪性リンパ腫疑いの患者を対象として病理学的検索を目的に通常の医療行為の範疇でリンパ節生検が施行される際、事前に本研究の目的と意義を文書により説明し、文書により同意を受ける方法により被験者からインフォームド・コンセントが得て、生検されたリンパ節の一部を細切し、浮遊したリンパ腫細胞を回収した。通常の病理学的検索によりCD19陽性B細胞リンパ腫と診断された場合は、そのリンパ腫細胞を対象としてCD19-mTORのオートファジー誘導効果を検討した。陰性コントロールにはIgG-mTOR、IgG-scrambleおよびCD19-scrambleを用いた。細胞数の定量化はMTT法で、細胞死の性状はHoechst 33342による核染色を用いた蛍光顕微鏡観察で、LC3-IIの出現はウエスタンブロット法で検討した。その結果、すべてのリンパ腫細胞でCD19-mTORの抗腫瘍活性を確認した。特に、通常の化学療法に不応な症例や寛解後の再発症例などから得られたリンパ腫細胞は、通常のアポトーシスやネクローシスなどの細胞死に抵抗性であるが、このような細胞にもCD19-mTORは効果的にオートファジー細胞死を誘導した。「平成24年度の業績」これまでのin vitro実験で用いたNamalwa細胞はSevere Combined Immunodeficiency (SCID)マウスに移植可能であり、これをin vivo実験に用いた。同細胞をSCIDマウスの背部皮下へ移植し、腫瘤が形成され直径6 mmに達した時点で、尾静脈より各種濃度のCD19-mTORを投与した。陰性コントロールには、IgG-mTOR、IgG-scrambleおよびCD19-scrambleを用いた。投与後、腫瘍径を経時的に測定したところ、CD19-mTORの腫瘍増殖に対する濃度依存的な抑制効果を確認した。更に、B細胞リンパ腫患者のリンパ節から採取したリンパ腫細胞を用いて検討を進めた。悪性リンパ腫疑いの患者を対象として病理学的検索を目的に通常の医療行為の範疇でリンパ節生検が施行される際、事前に本研究の目的と意義を文書により説明し、文書により同意を受ける方法により被験者からインフォームド・コンセントが得て、生検されたリンパ節の一部を細切し、浮遊したリンパ腫細胞を回収した。通常の病理学的検索によりCD19陽性B細胞リンパ腫と診断された場合は、これらのリンパ腫細胞を、あらかじめ抗アシアロGM1抗体を腹腔内投与したSCIDマウスの背部皮下へ移植した。

腫瘤が形成され直径6 mmに達した時点で、尾静脈よりCD19-mTORを投与した。CD19-mTORの投与量は、in vitroの検討結果を参考にして決定した。陰性コントロールには、IgG-mTOR、IgG-scrambleおよびCD19-scrambleを用いた。投与後、腫瘍径を経時的に測定したところ、CD19-mTORの腫瘍増殖に対する抑制効果を確認した。現時点で平成23年度中に行うと計画した実験は完遂し、期待していたデータを得ている。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、当初の計画通りin vivo実験を行う。Namalwa細胞をSCIDマウスの背部皮下へ移植し、腫瘤が形成され直径6mmに達した時点で、尾静脈より各種濃度のCD19-mTORを投与する。陰性コントロールには、IgG-mTOR、IgG-ScrambleおよびCD19-Scrambleを用いる。投与後、腫瘍径を経時的に測定し、CD19-mTORの腫瘍増殖に対する抑制効果を検討する。更に、B細胞リンパ腫患者のリンパ節から採取したリンパ腫細胞を、あらかじめ抗アシアロGM1抗体を腹腔内投与したSCIDマウスの背部皮下へ移植する。腫瘤が形成され直径6mmに達した時点で、尾静脈よりCD19-mTORを投与する。CD19-mTORの投与量は、上記の検討結果を参考にして決定する。陰性コントロールには、IgG-mTOR、IgG-scrambleおよびCD19-scrambleを用いる。投与後、腫瘍径を経時的に測定し、本治療法の有用性を結論づける。