hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物疫病菌の宿主選択的病原性因子の構造と作用機構

<2+>を結合させた原形質膜小胞を用い、疏水環境下でCa^<2+>との結合し蛍光化するクロロテトラサイクリン(CTC)の蛍光変化を指標に、菌体エリシターとP-GS処理による膜表面のCa^<2+>の動向を調査した。その結果、宿主原形質膜表面には一定量のCa^<2+>結合部位があり、エリシターはその結合を解除するが親和性菌由来のP-SGはその解除を阻害することが推察された。しかし、無細胞系の膜画分にはグルカナーゼやフォスファターゼ活性が存在し、P-SGを分解するため、その膜分子との結合実験にはさらに工夫のいることが判明した。構造解析については、分子量的に同じ分画のP-グルカンがpHによりクロマトグラフ的性質を変化させ、さらに分離し純化をさらにすすめた。個々の分離グルカンの活性検定を前年度開発したエリシター刺激の活性酸素生成反応の抑止作用で試みたが、宿主ならびにその品種に対して異なったサプレサ-活性を示すことが示唆され、構造の異なる多様なグルカンが菌より分泌されていることが判明した。そのため、構造解析には特定の分画に絞って量的に確保し検討することの必要性が生まれ、今後の検討課題とした。
小学校における英語コミュニケーション能力の評価方法のデザイン

本研究は日本の低年齢の学習者(小学生)の英語コミュニケーション能力の測定法の開発に寄与する。本研究は、コミュニケーション能力の測定においては、テストの信頼性や実用性などいくつか克服すべき課題があるものの、テストの妥当性が改善されたこと、肯定的な波及効果が顕著であったことなどの利点も明らかにした。また、研究協力者である小学校の英語教員志望の院生が評価基準の設定から、実際のテストでの測定や評価まで行う機会を得られたことも有意義であった。H20年度は鳴門教育大学附属小学校の5年生を対象にコミュニケーション能力面接テストを実施した。当初、当該小学校の教員に評価者としての参加を依頼する予定だったが、面接テストでの使用英語の適正さを客観的に判断してもらうために、英語母語話者3名(小学校英語・児童英語指導経験のある大学非常勤講師2名/ESL指導経験のある大学院生1名)に評価者として、評価者訓練、面接テスト、リコールセッションに参加してもらった。評価者訓練では、申請者が面接テストの評価項目、評価尺度、実施手順を詳しく口頭説明し、評価者が十分理解したことを確認してから面接テストに臨んでもらった。参加者は5年生110名、評価者は申請者と前述の英語母語話者3名の4名。それぞれの評価者の面接テストはビデオ撮影され、他3名の評価者は、後日その録画ビデオを見て評価した。その結果、評価者間信頼性は決して高いものではなかった(今後信頼性係数を求める)。原因としては、次の3つ挙げられる。まず一つは、面接テストは評価者が児童にタスクを課して、発話を促す方法で行われたが、評価者が発話を促すのに費やす時間や手段に差異が生じ、それが児童の発話量、さらには評価者の評価にも影響したようである。二つ目は、参加者が小学5年生だったため、評価項目の発音や正確さ、コミュニケーション方略能力を測れる程の発話が見られなかったことにあるようだ。最後に、評価者訓練の実施方法に問題があったようだ。口頭説明だけではなく、評価者にモデル面接テストで実際に評価してもらい、それぞれの評価者にテストの実施手順に対する誤解や、設定された評価尺度から逸脱した評価をするなどの傾向があれば、訓練中に訂正の必要がある。特に最後に挙げた評価者訓練におけるモデル面接テストの実施は、今後、コミュニケーション能力テストの実施経験の浅い小学校教員が評価者となる場合、不可欠だと言える。1. H20年度の研究結果の分析H20年度は、鳴門教育大学附属小学校の5年生を対象に、申請者を含め4名の英語母語話者を評価者として実施した面接テストの詳細にわたる分析を行った。特に、評価者間信頼性を高めるためには何を改善すれば良いのか、参加者の面接テストにおけるスコアと相関関係がある要因とは何か(例:英語に対する姿勢、テストに対する姿勢、他教科における学習態度や能力など)調査研究を行った。2. H20年度実施のコミュニケーション能力面接テストの改善と日本人を評価者としたテストの実施H20年度実施した面接テストの結果から、参加者の発話を促し、評価者が正確に評価できるくらいの発話量を誘発できるよう、評価者を訓練すること、評価者訓練でモデル面接テストを実施し、評価者のテストに対する理解を深め、評価者間の評価(スコア)の差異を縮小させることが、課題として挙げられた。この反省を踏まえ、面接テストの実施方法を改良し、英語コミュニケーション能力面接テストの経験のない、または少ないと思われる小学校教員が対象となるため、評価項目、評価尺度、実施手順を日本語で表記し、わかりやすい評価者訓練を計画、実施した。加えて鳴門教育大学の院生(小学校教員含む)に評価者となるよう依頼し、評価者訓練を受けない統制群と、訓練を受ける実験群に分け、その面接テストにおけるスコアと評価者間信頼性を比較。また、昨年度実施した英語母語話者が評価者となった面接テストの結果とも比較、考察した。次年度もこの比較研究を行い、学会等で発表を行う予定である。
制癌剤封入リポソ-ムによる膵癌targeting chemotherapyの検討

1.制癌剤封入リポソ-ムの抗腫瘍効果の検討(1)抗膵癌モノクロ-ナル抗体である抗CA19ー9抗体を結合した、アドリアマイシン封入リポソ-ムは、ヒト膵癌より樹立した培養細胞株であるPKー1に対し、inーvivo,in vitroにおいて、アドリアマイシン単独投与よりも強い抗腫瘍効果を認めた。(2)in vivoでの腫瘍内濃度の検討では、抗CA19ー9抗体結合・アドリアマイシン封入リポソ-ムは、アドリアマイシン単独投与よりも強い腫瘍集積性と高い停留性を示した。(昨年度までのまとめ)2.制癌剤封入リポソ-ムの体内動態の検討(1)ヌ-ドマウスによるin vivoの腫瘍臓器内濃度の検討で、リポソ-ム靜注群は肝・脾の網内系臓器に有意に高濃度に分布し、心筋内ではアドリアマイシン靜注群よりも若干低濃度に分布していた。(2)雑種成犬を用いた体内動態の検討でも、ヌ-ドマウスの場合と同様に肝・脾の網内系臓器に有意に高濃度に分布し、網内系によるリポソ-ムのtrapping現象が示唆された。3.制癌剤封入リポソ-ムの肝機能に及ぼす影響についての検討雑種成犬を用いて、靜注後の肝機能の変動を検討したところ、リポソ-ム靜注群ではアドリアマイシン靜注群よりも、GOT・GPTが若干高値を示したが、有意の差は示さず、一週間以内に正常範囲に復した。以上のことより、制癌剤封入リポソ-ムによるtargeting chemotherapyは制癌剤単独投与に比べ高い抗腫瘍効果が得られ、しかも比較的安全に行い得ることが確認され、膵癌切除例の不顕性肝転移防止対策の一つとして有効であるものと考えられた。膵癌は治癒切除例においても術後高率に肝転移再発を来たし、その原因として術中からの不顕性肝転移の存在が考えられており、治療成績向上の為には不顕性肝転移の発生に対し何らかの対策を講じなくてはならない。そこで抗癌剤を封入したリポソームに抗膵癌モノクローナル抗体を結合した複合体によるtargetin g chemotherapyの膵癌への応用を試み研究を行ってきた。抗CA19 -9抗体結合・ADM封入liposame (lipo【c!】ADM=Ab)のヒト膵癌培養細胞株PK-1に対する抗腫瘍効果を検討した結果として、1.in vitroでの各接触条件下でlipo【c!】ADM=Abは、l ipo【c!】ADMおよびfreeADMより強い細胞障害性を示し、特に生体内条件に近い低濃度・短時間接触でも有意の細胞障害性を示した。in vivoでの腫瘍増殖抑制効果の検討でもlipo【c!】ADM=Ab静注群はfree ADM静注群より有意に殺細胞的に働き、組織学的にも強い癌組織破壊像を呈した。2.静注後5日目までの腫瘍内ADM濃度を経時的に測定することにより、in vivoでの腫瘍集積性を検討した。lipo【c!】ADM=Ab静注群はli po【c!】ADMおよびfreeADM静注群よりも常に高濃度を示し、濃度減少勾配も緩やかで最終的には後2者の2倍以上の腫瘍内濃度を示した。3.静注後5日目の主要臓器内ADM濃度を測定して体内動態を検討した結果、liposame静注群はfreeADM静注群より心筋内で若干低値、肝臓内では逆に3倍近い集積を示した。これは網内系でのtrappingによるものと思われたが、不顕性肝転移予防の観点からは、肝転移巣近傍に高濃度に抗癌剤を分布させることができ、逆に同濃度のADMを肝内に分布させるにはfreeADM投与量の1/3程度で済むことになり副作用も軽減しうる。以上のようにリポソームを用いたtargeting chemotherap yは膵癌切除術中からの補助化学療法として、従来の抗癌剤単独投与に比べさまざまな長所を有していることが判明した。3.制癌剤封入リポソ-ムの肝機能に及ぼす影響についての検討

雑種成犬を用いて、靜注後の肝機能の変動を検討したところ、リポソ-ム靜注群ではアドリアマイシン靜注群よりも、GOT・GPTが若干高値を示したが、有意の差は示さず、一週間以内に正常範囲に復した。以上のことより、制癌剤封入リポソ-ムによるtargeting chemotherapyは制癌剤単独投与に比べ高い抗腫瘍効果が得られ、しかも比較的安全に行い得ることが確認され、膵癌切除例の不顕性肝転移防止対策の一つとして有効であるものと考えられた。1.制癌剤封入リポソ-ムの抗腫瘍効果の検討(1)抗体癌モノクロ-ナル抗体である抗CA19-9抗体を結合した、アドリアマイシン封入リポソ-ムは、ヒト膵癌より樹立した培養細胞株であるPK-1に対し、in-vitro,in vivoにおいて、アドリアマイシン単独投与よりも強い抗腫瘍効果を示した。(2)in vivoでの腫瘍内濃度の検討では,抗CA19-9抗体結合・アドリアマイシン封入リポソ-ムは、アドリアマイシン単独投与よりも高い腫瘍集積性と停留性を示した。2.制癌剤封入リポソ-ムの体内動態の検討(1)ヌ-ドマウスによるin vivoの主要臓器内濃度の検討で、リポソ-ム静注群は肝・脾の網内系臓器に有意に高濃度に、心筋内でアドリアマイシン静注群より若干低濃度に分布していた。(2)雑種成犬を用いた体内動態の検討でも、ヌ-ドマウスの場合と同様に肝・脾の網内系臓器に有意に高濃度で、網内系によるリポソ-ムに対するtrapping現象が想定された。3.制癌剤封入リポソ-ムの肝機能に及ぼす影響についての検討雑種成犬を用いて静注後の肝機能の変動を検討したところ、リポソ-ム静注群ではアドリアマイシン静注群よりも、GOT・GPTが若干高値を示したが、有意の差は示さず、一週間以内に正常範囲に復した。以上のことより、制癌剤封入リポソ-ムによるtargeting chemotherapyは制癌剤単独投与に比べ高い抗腫瘍効果が得られ、しかも比較的安全に行い得ることが確認され、膵癌切除例の不顕性肝転移防止対策の一つとして有効てあるものと判断された。
摘出脳イメージングによる連合学習の分子生理学的研究

本研究はショウジョウバエ脳における神経可塑性の解明を目的として、摘出脳を用いたカルシウムイメージング実験を行っている。前年度までの研究により、嗅覚系の一次中枢である触覚葉に対する連続した電気刺激が触覚葉-キノコ体間シナプスにおける長期抑圧(Long-term depression; LTD)様のシナプス可塑性現象を引き起こすことを見出した。本年度はLTD様シナプス可塑性の形成機構について特にcAMPシグナル経路に注目して実験を行った。アデニル酸シクラーゼをコードするrutの突然変異体はLTD様シナプス可塑性を示さなかった。プレシナプス(触覚葉)とポストシナプス(キノコ体)のどちらのrut発現がLTD様シナプス可塑性に必要かを調べるため、突然変異体における組織特異的なrutの遺伝子回復実験を行った。その結果、キノコ体において特異的にrutを強制発現させたハエではLTD様シナプス可塑性が観察されたが、触覚葉特異的に強制発現させたハエでは観察されなかった。よって、キノコ体におけるRut依存的なcAMPシグナル経路がLTD様シナプス可塑性に必要であることが明らかとなった。RutはクラスIアデニル酸シクラーゼのため、連続刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇がcAMP生産を誘導し、結果LTD様シナプス可塑性が引き起こされると考えた。このことを検証するため連続刺激時のみにアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンを添加して測定を行ったところ、コントロールに比べ顕著なLTD様シナプス可塑性が引き起こされた。よって触覚葉への連続刺激はキノコ体細胞内のcAMP濃度を上昇させることで下流の経路を活性化し、その結果LTD様シナプス可塑性を誘導することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。行動実験によるこれまでの研究から、脳のインスリン分泌細胞とキノコ体の両方で発現するPainless(Pain)TRPチャネルがキイロショウジョウバエ長期記憶に必要であることを明らかにした。本研究は脳で発現するPain TRPチャネルの生理機能を解析し、神経可塑性におけるPain TRPチャネルの役割を解明することを目的とする。本年度は摘出脳イメージング実験を行い、以下の成果を得た。1.薬物刺激に対するキノコ体およびインスリン分泌細胞におけるカルシウム応答の測定蛍光カルシウムプローブGCaMP3をキノコ体に発現させた摘出脳へ脱分極刺激としてKCl刺激を行い、キノコ体におけるカルシウム応答を測定した。その結果、高濃度(30mM以上)のKCI暴露によってキノコ体における強い応答が観察された。また、インスリン分泌細胞にGCaMP3を発現させた摘出脳においても、KCl刺激によるカルシウム応答の測定に成功した。2000個以上の細胞から構成されるキノコ体だけでなく、10個程度の細胞群であるインスリン分泌細胞においても測定が可能になったことは、今後の解析にむけての大きな成果である。2.摘出脳に対する電気刺激実験系の確立摘出脳イメージング実験において、脳の特定領域へ電気刺激を行う技術を東京都医学総合研究所・上野耕平研究員の指導のもと習得した。そして、当研究室においても装置のセットアップを行い電気刺激の実験系を確立した。具体的には、脳の触覚葉に電気刺激を行うことで、投射先であるキノコ体におけるカルシウム応答を観察できた。摘出脳における電気刺激実験系は次年度以降に実施予定である神経連絡の検証や、神経可塑性の評価を行う上で必須の手法であり、本実験系を確立できたことは今後の研究を行う上で非常に重要な成果である。本研究は脳で発現するPainless (Pain) TRPチャネルの神経可塑性における生理的な役割の解明を目的として、ショウジョウバエ摘出脳を用いたカルシウムイメージング実験を行っている。本年度は前年度に確立した電気刺激実験系を用いて以下の成果を得た。1.蛍光カルシウムプローブGCaMP3をキノコ体に発現させた摘出脳の触覚葉へガラス電極を用いた電気刺激を行うと、投射先であるキノコ体におけるカルシウム応答が測定できる。この電気刺激を1秒おきに数十回繰り返し行うと、その後の電気刺激に対する(触覚葉/キノコ体シナプスを介した)カルシウム応答が低下する現象を見出した。2.ショウジョウバエの学習と記憶において、キノコ体におけるcAMPシグナル経路が重要な役割をしていることはよく知られている。アデニル酸シクラーゼ(rutabaga ; rut)突然変異体とホスホジエステラーゼ(dunce ; dnc)突然変異体の摘出脳に対して連続刺激を行った結果、rut突然変異体においてはカルシウム応答の低下は観察されず、dnc突然変異体においては野生型よりも顕著な応答の低下が観察された。よって連続刺激により誘導されるキノコ体の応答性低下は、哺乳類における長期抑圧のようなシナプス可塑性を反映していると考えられる。3. Pain TRPチャネルがキノコ体における神経活動に直接関与しているか調べるため、摘出脳に電気刺激や(Pain TRPチャネルを活性化させることが知られている)熱刺激を行ったがPain TRPチャネル依存的な応答は観察できなかった。また、pain突然変異体の摘出脳に対して連続刺激行ったところ、カルシウム応答の減少は観察されたがその持続時間が低下していた。よってPain TRPチャネルはシナプス可塑性の形成ではなく、維持に関与していることが示唆された。

前年度までの研究により、嗅覚系の一次中枢である触覚葉に対する連続した電気刺激が触覚葉-キノコ体間シナプスにおける長期抑圧(Long-term depression; LTD)様のシナプス可塑性現象を引き起こすことを見出した。本年度はLTD様シナプス可塑性の形成機構について特にcAMPシグナル経路に注目して実験を行った。アデニル酸シクラーゼをコードするrutの突然変異体はLTD様シナプス可塑性を示さなかった。プレシナプス(触覚葉)とポストシナプス(キノコ体)のどちらのrut発現がLTD様シナプス可塑性に必要かを調べるため、突然変異体における組織特異的なrutの遺伝子回復実験を行った。その結果、キノコ体において特異的にrutを強制発現させたハエではLTD様シナプス可塑性が観察されたが、触覚葉特異的に強制発現させたハエでは観察されなかった。よって、キノコ体におけるRut依存的なcAMPシグナル経路がLTD様シナプス可塑性に必要であることが明らかとなった。RutはクラスIアデニル酸シクラーゼのため、連続刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇がcAMP生産を誘導し、結果LTD様シナプス可塑性が引き起こされると考えた。このことを検証するため連続刺激時のみにアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンを添加して測定を行ったところ、コントロールに比べ顕著なLTD様シナプス可塑性が引き起こされた。よって触覚葉への連続刺激はキノコ体細胞内のcAMP濃度を上昇させることで下流の経路を活性化し、その結果LTD様シナプス可塑性を誘導することが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。今後の解析を行う上で必要となる、「1.キノコ体やインスリン分泌細胞における、薬物刺激に対するカルシウム応答の測定」と「2.摘出脳に対する電気刺激実験系」を今年度内に確立できたため、おおむね順調と言える。キノコ体の神経活動におけるPain TRPチャネルの寄与を直接観察することはできなかったが、(今後の実験系となりえる)成虫脳の神経可塑性を評価する新たな現象を見出せたため、おおむね順調に進んでいるといえる。本年度は実験系の確立を主な目的として研究を進めたため、次年度以降は、脳で発現するPain TRPチャネルの生理機能の解析と神経可塑性における役割の検証を行っていく。具体的には以下を計画している。Pain TRPチャネルの生理機能を解析するために、1.Pain TRPチャネルの突然変異体や、阻害剤を投与した時の摘出脳における、刺激に対するカルシウム応答の測定、2.シナプス開口放出に反応する蛍光プローブを用いた、神経分泌におけるPain TRPチャネルの関与の検証、3.電気刺激を用いたキノコ体とインスリン分泌細胞間の神経連絡の検証を行う。さらに、神経可塑性におけるPain TRPチャネルの役割を解析するために、4.学習によって刺激に対する摘出脳の応答が上昇するかを、突然変異体や阻害剤と組み合わせて検証する。本年度の解析ではPain TRPチャネルを介したカルシウム応答は観察できなかった。
アルカリ/中性塩によるセルロースの膨潤・溶解機構の解明と新規溶剤系の開発

中性塩の中でセルロースに対する膨潤・溶解作用の最も強いものの一つであるチオシアン酸カルシウムの作用を、この溶液中でセルロースが作るゲルの熱的挙動、および固体セルロースの溶解時の熱現象から調べた。その結果塩-セルロースゲルの融解。ゲル化挙動は水-アガロースゲルと類似した熱可逆性を示すことが分かった。ラミー繊維を用いたX線回析による検討から、チオシアン酸カルシウム-セルロース系では溶解に先立ち準結晶性の錯体が形成されることが分かり、その生成の最適条件(90°C、515分)を決定した。そして錯体の回析パターンから、その構造はアルカリセルロースに類似した疎水面の結合によるシート形成に基づくものであることが示唆された。アルカリセルロースの構造とその中でのセルロース分子鎖の状態を検討し、このときにはセルロースは比較的不動化された状態にあること、したがってセルロースI→セルロースIIの変態は水洗・再生の過程に起こることが強く示唆された。またこのとき逆平行鎖のセルロースIIが選択される理由がセルロース分子鎖の幾何学的構造にあると考えられた。チオシアン酸カルシウム溶液による溶解・再生処理の応用を検討し、TEMPO酸化によるセロウロン酸の調製の検討から、この処理がセルロースの化学修飾のための非晶化前処理として有効であることが分かった。これは他の誘導体調製にも応用できると思われる。次にチオシアン酸カルシウム溶液にセルロース以外の多糖も溶解することを利用してセルロース-アミロースの複合物を調製した。この混合溶液もゲル化するが、熱測定からその挙動にアミロースは分子レベルでは関与しないことがわかった。しかしこのゲルにはアミロースが固定化されており、ビーズ化してクロマトグラフィー用充填剤を作ることができることを見出した。各種のセルロースをチオシアン酸カルシウムの濃厚水溶液(以下ロダン溶液)に溶解したゲルについて、示差走査熱量計により溶解-ゲル化の挙動を調べた。その結果、融点は7090°C、ゲル化点は1030°Cの範囲にあり、セルロースの分子量と濃度によって変動することが分かった。固体セルロース-ロダン溶液の系を加熱すると初回昇温時にのみ60100°Cに顕著な吸熱または発熱、またはその両方のピークが現われ、これがセルロースの溶解過程に対応すると考えられた。その温度領域とピークの形状はセルロース試料によって大きく異なるが、その挙動とセルロース試料の特性(結晶形、結晶化度、分子量)の間の関係には系統性がなく、変動の理由は不明である。ラミ-繊維について、上記で求めた溶解温度領域である7090°Cにおいて結晶構造の変化過程を経時的に追跡した結果、セルロースI結晶の崩壊とともにセルロース-ロダン塩の錯体が形成され、これまで知られていなかった2.5nmという繊維周期を持つ錯体を発見した。各種のセルロースをチオシアン酸カルシウムの濃厚水溶液(ロダン溶液)に溶解したゲルについて示差走査熱量計により融解ーゲル化の挙動を調べた。固体セルロースーロダン溶液の系を加熱すると初回昇温時にのみ60100°Cに顕著な吸熱または発熱、またはその両方のピークが現われ、これがセルロースの溶解過程に対応すると考えられた。ラミー繊維について、上記で求めた溶解温度領域である7090°Cにおいて結晶構造の変化過程を経時的に追跡した結果、セルロースI結晶の崩壊とともにセルロースーロダン塩の錯体が形成され、これまで知られていなかった2.5nmという繊維周期を持つ錯体を発見した。

この錯体について,含まれる塩と水の量を評価し、グルコース残基1分子あたりCa(SCN)2が2.2分子、水が14分子という値を得た。これに基づきセルロース分子が疎水面で積重なり、その分子シートの間に塩と水の分子が入っているという錯体構造のモデルを提案した。
放射光を用いた動的繊維構造解析によるキトサンの錯体形成機構の解明

放射光を利用して収集したキトサン錯体の高分解能繊維回折データをもとに結晶解析を行った結果、キトサンHBr錯体について、従来よりも精度の高い解析結果を得ることに成功した。そこで、キトサンと酸分子間の相互作用の詳細について考察を行ったところ、錯体結晶中には2種類のBr^-が存在し、一方のBr^-はその周囲にある3本のキトサン分子鎖のアミノ基と水素結合をしており、他方のBr^-は1つのアミノ基と2つのキトサン分子の6位水酸基との間に水素結合を形成し結晶構造を安定化していることがわかった。さらに、これらの相互作用に加え、キトサン分子鎖間にC-H...Oの弱い水素結合が存在している可能性も示唆された。明らかになったキトサン錯体の結晶構造解析の結果をもとに、錯体の形成機構について検討を進めたところ、既に構造解析を終了していたと考えていたキトサン水和型(複合体形成前の結晶型)の構造について疑問な点が浮上した。すなわち、水和型の結晶中では結晶のa軸方向に沿って分子鎖が平行に、b軸方向に沿って分子鎖が逆平行に配列しているモデルが得られていたが、複合体の解析結果に基づいた構造転移に関する考察より、これとは逆に、a軸方向には逆平行な分子鎖が、b軸方向には平行な分子鎖が配列している可能性が予想された。そこで、キトサン結晶中における分子鎖の配向に関して明確な結論を得ることを目的として、キトサン水和型の繊維回折データの収集を行った。その結果、従来よりも高分解能の繊維回折データを収集することに成功した。現在、放射光繊維回折データに基づき、水和型の構造の再検討を進めている。以上のように、放射光データを用いた高分解能繊維結晶解析により、キトサン複合体の詳細な立体構造についてはじめて明らかにすることができた。これはキトサンの物性を活かした材料を開発する上で欠くことのできない基礎的な知見となる。平成18年度は、3シフト(24時間)の配分を受けたビームタイムを利用して(SPring-8のBL38B1ビームライン)、臭化水素酸錯体、硝酸錯体、乳酸錯体、塩化亜鉛錯体の繊維回折データの収集を行った。その結果、実験室のX線源を用いて測定したデータに比べ、回折強度の弱い反射についても精度の高い強度データを得ることに成功した。特に、臭化水素酸錯体は、実験室で通常利用することができるX線源であるCuKα線(波長1.5418Å)、MoKα線(波長0.7107Å)のいずれを使用した場合でも、臭素原子によるX線の吸収が大きいため鮮明な回折像を得ることができなかったが、波長0.98Åの放射光で測定を行った結果、高分解能でS/N比の高い繊維回折像が得られた。本年度放射光を利用して収集したX線回折データに基づき、キトサン臭化水素酸錯体構造解析を行ったところ、先に我々が決定したキトサンヨウ化水素酸錯体の結晶構造と同形であることが明らかになった。すなわち、錯体結晶中には結晶学的に2種類の臭素イオンが存在し、それら臭素イオンは互いに約5Åの間隔でキトサン分子の分子鎖軸方向と平行に配列し、臭素イオンによるカラムを形成していた。

一方の臭素イオンはその周囲にある3本のキトサン分子鎖のアミノ基と水素結合をしており、他方の臭素イオンは1つのアミノ基と2つのキトサン分子の6位水酸基との問に水素結合を形成し結晶構造を安定化していた。さらに、これらの相互作用に加え、キトサン分子鎖間にC-H...0の弱い水素結合が存在している可能性が示唆された。現在、平成18年度に強度データを収集した他の錯体について結晶構造解析を進めるとともに、錯体形成過程における回折像変化に関するこれまでの実験結果、および結晶構造解析結果をもとに、錯体形成過程の構造変化について検討を進めている。放射光を利用して収集したキトサン錯体の高分解能繊維回折データをもとに結晶解析を進めた結果、キトサンHBr錯体について、従来よりも精度の高い解析結果を得ることに成功した。そこで、キトサンと酸分子間の相互作用の詳細について考察を行ったところ、錯体結晶中には2種類の臭素イオンが存在し、一方の臭素イオンはその周囲にある3本のキトサン分子鎖のアミノ基と水素結合をしており、他方の臭素イオンは1つのアミノ基と2つのキトサン分子の6位水酸基との間に水素結合を形成し結晶構造を安定化していることがわかった。さらに、これらの相互作用に加え、キトサン分子鎖間にC-H...0の弱い水素結合が存在している可能性も示唆された。これまでに明らかになったキトサン錯体の結晶構造解析の結果をもとに、錯体の形成機構について検討を進めたところ、既に構造解析を終了していたと考えていたキトサン水和型(複合体形成前の結晶型)の構造について疑問な点が出てきた。すなわち、水和型の結晶中では結晶のa軸方向に沿って分子鎖が平行に、b軸方向に沿って分子鎖が逆平行に配列しているモデルが得られていたが、複合体の解析結果に基づいた構造転移に関する考察より、これとは逆に、a軸方向には逆平行な分子鎖が、b軸方向には平行な分子鎖が配列している可能性が予想された。そこで、平成19年度前期、後期ともに、それぞれ3シフト(24時間)ずつ配分された放射光のビームタイムを用いて、キトサン結晶中における分子鎖の配向に関して明確な結論を得ることを目的として、キトサン水和型の繊維回折データの収集を行った。その結果、従来よりも高分解能の繊維回折データを収集することに成功した。現在、放射光繊維回折データに基づき、水和型の構造の再検討を進めている。
アデノウイルス眼感染症発症メカニズムの分子生物学的解析と治療薬剤開発の研究

これまで,アデノウイルス感染の実験モデルとしては,ヒトアデノウイルスに適したHeLa細胞やA549細胞による単層培養系(2D)やマウス,家兎などの動物モデルがあったが,後者は再現性が低く,臨床観察にも適するとはいえなかった。これらに対して,縦方向の厚みを持たせて細胞を培養する手法を3次元培養(3D culture)が実用化され,皮膚モデルに次いで,角膜細胞モデルが確立されてきた。本研究では,この角膜3Dモデル(LabCyte CORNEA-MODEL,オリエンタル酵母)を用いて,病原性の異なる複数のアデノウイルス型(流行性角結膜炎,咽頭結膜熱,気管支炎及び新型)を感染させ,その細胞傷害効果と病態を経時的に観察する。さらに角膜上皮下混濁の発症が,上皮基底層でどのようにどの時点から始まっていくのか,型間の相違も含めて解析を予定している。この結果により,新型アデノウイルスによるウイルス性角結膜炎の病態が明らかになり,抗ウイルス薬あるいはステロイド薬の早期介入が有効かどうかが判明すれば,臨床的に非常に有用といえる。2018年度には角膜3次元培養モデルを用いて,アデノウイルスを実際に感染させた場合の,細胞生存率とその病理学的解析を複数の型を用いて行った。その結果,新型アデノウイルスの中でも,85型が最も細胞生存率が低く,56型は生存率が高いことがわかった。また,上皮細胞のタイトジャンクションの機能を示すマーカーであるZO-1の発現率の低下が特に翼細胞で見られる傾向があり,アデノウイルス感染性が上皮細胞に与える影響について,新しい知見が得られた。3D組織モデルを用いたアデノウイルス実験系における組織親和性のアデノウイルス型間の差異の検討と治療薬の有効性の検討を進めるにあたって,これまで使用されていなかった新しい実験モデルを用いた研究を進めているために,2017年度はその基礎的評価を行い,このモデルがアデノウイルス感染実験に使用できることを確認することができたので,次には抗アデノウイルス薬の増殖抑制作用についての評価を進めていくことができると計画している。以上から現時点では研究は順調に進捗しているといえる。新型のアデノウイルスによるウイルス性角結膜炎は,2015年頃から,国内での流行型の大半を占めるようになっており,角膜上皮障害の遷延による視力低下が大きな臨床上の課題になっている。ステロイド点眼薬で一時的に改善しても,中止後の再発をくり返し,有効な治療法がない。アデノウイルスの遺伝子は多岐にわたっているが,中和反応に関係するヘキソン,組織親和性に関与するファイバーなどがこれまで,既存の型を中心に研究されてきた。今回の研究ではこれまで知られてきた遺伝子に加えて,初期転写因子E1A, E2, E3などに含まれる部位に着目し,新型を含めた多くの型や結膜炎を生じない型も含めて,詳細に遺伝子系統解析を行い,角膜病変重症化の遺伝子レベルでの原因部分の解明を行う予定である。これによって,臨床的な変化が遺伝子レベルで明らかになり,治療薬への反応部位の特定が可能になり,臨床的にも有意義な研究と考えている。

ステロイド点眼薬で一時的に改善しても,中止後の再発をくり返し,有効な治療法がない。アデノウイルスの遺伝子は多岐にわたっているが,中和反応に関係するヘキソン,組織親和性に関与するファイバーなどがこれまで,既存の型を中心に研究されてきた。今回の研究ではこれまで知られてきた遺伝子に加えて,初期転写因子E1A, E2, E3などに含まれる部位に着目し,新型を含めた多くの型や結膜炎を生じない型も含めて,詳細に遺伝子系統解析を行い,角膜病変重症化の遺伝子レベルでの原因部分の解明を行う予定である。これによって,臨床的な変化が遺伝子レベルで明らかになり,治療薬への反応部位の特定が可能になり,臨床的にも有意義な研究と考えている。角膜3次元立体培養モデルの実験を遂行するにあたって,基礎自験の結果の評価をもとに必要な修正などを行うことを計画していたため,培養細胞系の必要経費が予算を下回ったために,次年度使用額が生じた。実験は順調に進捗しており,継続の計画を行うために,2019年度は予算通りの経費の支出が予想されている。
性病の比較文化史的研究-梅毒とエイズ

本研究においては、性病、とりわけ梅毒とエイズの文化史的研究を目的として、それらの全体史の外観から入った。問題の項目を明確にするために、まず梅毒に限定して、その歴史的・社会史的および文化史的観点の整理につとめ、その問題点の洗い出しに務めた。実はまだ未解決の問題が山積していることがその過程で明らかになったのであるが、たとえば梅毒の起源、その感染ルートさえ定説があるわけではない。一応、従来から定説とされてきたアメリカ大陸起源、コロンブスのアメリカ大陸到達時での旧大陸ヨーロッパへの伝播節を取りつつ、他の可能性についても完全には排除していない。それは、たとえば小アジア(トルコ)での風土病であるといった可能性である。文化史的問題として、性病の社会的意味付けがある。忌むべき病気として完全に社会から差別を受け、隔離され、忌避されたのかどうか。そこに現代では考えられない性病に対する肯定的意味付けがあった可能性を否定できない。さらに日本という地区を限定して語るとき、16世紀に輸入された梅毒が、そのまま19世紀まで特段の対策も取られないまま放置されたのはなぜか、という問題が残る。それが、外国の駐留軍の安全のために検毒が開始されたことも、当時の日本における性病の認識のあり方を示していよう。19世紀以降、西洋諸国で取られた性病対策は、まず売春婦の検査から始まったが、その検査がもたらした社会的影響の問題も未解決である。そこにあらたに始まった衛生運動と共に、政府官憲による道徳の管理という問題もあろう。しかし、生殖・性に関する問題は個人の秘密に属する部分であり、隠蔽される可能性が高い。それゆえに性病も潜在化することが多く、その罹患者数、死亡者数の実数を把握するのは困難であろう。こうした諸々の問題を通して、性病の実態とその対策に供する文化的資料を提供するのが最終的な目的であり意義である。性病の比較文化史的研究の第一段階として、梅毒の歴史的事実の分析・考察から着手した。その際、すでに研究成果のある結核の治療法としての温泉(鉱泉)療法の梅毒への応用を見、治療法としての入浴、また鉱泉飲用の社会史的、文化史的意義を検討した。従来、梅毒の西洋社会での流行は、コロンブスのアメリカ大陸行に始まるとされてきたが、西アジアあるいは小アジア(トルコ)ですでにそれ以前から梅毒と同様の病痕が見られることから、その流行の原因あるいは発生の地の特定はまだ結論を得ていない。アメリカ大陸での風土病として存在していたのか、あるいは既に他の地域で存在していたのかを特定する作業が残っている。一方、西欧社会での梅毒蔓延の理由の一つとして、大衆浴場における混浴の習慣があげられるが、その資料的跡付けを試みた。さらに、梅毒の流行により、患者の身体に生じた様々な症状の一つとしての皮膚病(皮膚の痒み等)が、結果的には入浴による治療法の導入をもたらし、それが中世で廃れた入浴の習慣を復活させた原因ともなったことを併せて検討した。今後の展開としては、西洋社会における梅毒の蔓延過程の基礎資料の収集と、この病が東洋に拡散していく過程の検討、さらには幕末・明治維新当時の梅毒の蔓延状況と、国交の開始されたばかりの西洋列強諸国との梅毒を巡る外交的交渉の資料博捜と、その分析・考察に進む予定である。また、これらの研究と並行して、淋病、下疳などの性感染症と現代のエイズに関する先行研究を渉猟し、梅毒との類似、差異を検討して、性病研究全体の輪郭を整える作業に従事することとする。

本年度は主に性病・梅毒文献渉猟とその研究史を調査する年度であった.すでに昨年度末から今年度当初にかけて、梅毒及びエイズを中心とする性感染症に関する文献に関し、10数年来交流のある英国ロンドンにあるウエルカム医学史研究所研究員及びオックスフォード大学ウエルカム医学史研究所研究員と意見交換を行った.また、そうした西洋文献の収集、解読に着手した.昨年度に引き続き、日本国内の江戸時代から明治時代にかけての梅毒文献を主に探ることとしたが、日本の文献は少なくまたその所在も限られていた.5月には名古屋大学医学部の書庫を中心に探索した.6月には、台湾の国立中央研究院から招待を受け、そこで疾病に関する講演の後、研究員と討議・意見交換を行った.また同研究院で中国における梅毒ならびに疾病一般の文献収集を行った.梅毒研究史に関して特に有意義な討議があった.7月以降は、日本学術振興会の共同研究員として来日したモンタナ大学ラビノビッチ教授と共同で、江戸時代の庶民の疾病に関する心理ならびに想像力に関して集中的に文献検索、ならびに討議した.特に名古屋の蓬左文庫において江戸時代およびそれ以前の医学書を調査、検討した.8月以降は、主に東京の国立公文書館、国立国会図書館での文献検索にあてた.政府の公式記録の中に、あらたな資料を発掘するためである.また9月以降は、従来すでに収集した文献の整理にあたり、併せて精読を開始した.12、1月は、これまでに入手した文献に依拠して論文執筆を開始し、紀要にその一部を発表することとした.本研究においては、性病、とりわけ梅毒とエイズの文化史的研究を目的として、それらの全体史の外観から入った。問題の項目を明確にするために、まず梅毒に限定して、その歴史的・社会史的および文化史的観点の整理につとめ、その問題点の洗い出しに務めた。実はまだ未解決の問題点が山積していることがその過程で明らかになったのであるが、たとえば梅毒の起源、その感染ルートさえ定説があるわけではない。一応、従来から定説とされてきたアメリカ大陸起源、コロンブスのアメリカ大陸到達時での旧大陸ヨ-ロッパへの伝播説を取りつつ、他の可能性についても完全には排除していない。それは、たとえば小アジア(トルコ)での風土病であるといった可能性である。文化史的問題として、性病の社会的意味付けがある。忌むべき病気として完全に社会から差別を受け、隔離され、忌避されたのかどうか。そこに現代では考えられない性病に対する肯定的意味付けがあった可能性を否定できない。さらに日本という地区を限定して語るとき、16世紀に輸入された梅毒が、そのまま19世紀まで特段の対策も取られないまま放置されたのはなぜか、という問題が残る。それが、外国の駐留軍の安全のために検梅が開始されたことも、当時の日本における性病の認識のあり方を示していよう。19世紀以降、西洋諸国で取られた性病対策は、まず売春婦の検査から始まったが、その検査がもたらした社会的影響の問題も未解決である。そこにあらたに始まった衛生運動と共に、政府官憲による道徳の管理という問題もあろう。しかし、生殖・性に関する問題は個人の秘密に属する部分であり、隠蔽される可能性が高い。それゆえに性病も潜在化することが多く、その罹患者数、死亡者数の実数を把握するのは困難であろう。こうした諸々の問題を通して、性病の実態とその対策に供する文化的資料を提供するのが最終的な目的であり意義である。
リモートセンシングと生物光学モデルを結び付けた高濁度水域の水質監視手法の開発

湖沼は、飲料水や工業・農業用水の供給や、また身近な漁場として、人類の生活にとって重要な役割を担っている。しかしながら、近年、富栄養化に伴う藻類の異常発生など様々な環境問題が生じている。本研究では、衛星データから高濁度湖沼の水質パラメータ、すなわちクロロフィルa濃度、トリプトン濃度、波長440nmにおける溶存有機物の吸収係数、を推定するための3つの新しい手法を開発した。これらの手法の有効性について、2つの高濁度のアジア湖沼において検証した結果、良い推定結果が得られた。SDA法に基づいた水質濃度の推定モデルは、対象とした水質濃度の情報のみを含むC値をモデルの独立変数として利用しているため、室内実験用、及び衛星画像用の各エンドメンバーのSRSをそれぞれ適切に選定できれば、実験室で作成した推定モデルがそのまま衛星画像に適用できると考えられる。現地調査日(2006年2月18日)の霞ヶ浦には珪藻が優占していたことから、珪藻の培養株と霞ヶ浦の底質を用いて、Chl-a,NPSSの推定モデルを事前に作成じた。室内実験用のエンドメンバーのSRS(以下laboratory-SRSと呼称)には、容器の影響を取り除くために、同様の小型容器中の植物プランクトン溶液、及びNPSS溶液の反射スペクトルを用いた。一方、衛星データ解析用のSRS(以下satellite-SRSと呼ぶ)は、現実には測定困難であることから、今回は生物光学モデルを用いて算出した。パラメーターは文献値から引用し、霞ヶ浦の特長を加味するため、生物光学モデルによってシミュレーションした霞ヶ浦の反射スペクトルと現地で観測した反射スペクトルを比較することによってsatellite-SRSを補正した。推定したsatellite-SRSを用い、SDA法によって衛星データからCp、Cn値を算出し、室内実験によって作成したモデルを用いてChl-a、NPSS濃度を推定した結果、Chl-a、NPSS濃度の推定精度は相対平均2乗誤差で表すと、それぞれ±10.5%、±15.9%となった。更に、同様の推定モデル、及びsatellite-SRSを用い、同じく珪藻が優占していた過去の衛星画像(1994年4月22日)からChl-a濃度を推定した結果、Rel.MSEは±7.3%となった。以上の結果より、SDA法は高濁度湖沼に適用可能であることが分かり、更に、過去の衛星画像に対しても同様の推定モデルを利用することができるので、推定モデルは頑健であると言える。一般的に、湖沼は時期によって優占している植物プランクトン種が異なるため、様々な植物プランクトンが優占する時期に対するSDA法の適用性を検証する必要がある。本研究では、異なる時期のLANDSAT/TMデータが入手できなかったため、霞ヶ浦から採集した湖水サンプルの室内測定結果を用い、前年度で用いたChl-a濃度推定モデルの適用性を検証した。湖水サンプルの採集は、2009年6月から2010年3月の期間に月に一度、5地点で行った。また、湖水サンプル用のエンドメンバー(以後lake-SRSと呼称)については、それぞれの時期と同種の植物プランクトンの培養株の反射スペクトルを測定し、さらに、実湖水サンプルの反射スペクトルによって補正した値を利用した。霞ヶ浦湖水サンプルを優占種毎にグループ化(珪藻優占、藍藻優占、珪藻+藍藻)し、補正済みのlake-SRS用いて各々のグループのChl-a濃度を推定した結果、珪藻優占、及び珪藻+藍藻の時期においては、前年度で開発した推定モデルから良い精度でChl-a濃度を得ることができたが、藍藻が優占していた時期では推定精度が悪かった。この原因を考えるために、霞ヶ浦に優占する3種類の藍藻株(Microcystis aeruginosa, Anbaena flos-aquae, Planktothrix agardhii)を用いて室内コントロール実験を行った。その結果、得られたChl-a推定モデルは、植物プランクトン種間で違いがあることが明らかとなった。しかしながら、推定モデルの作成に使用するバンドの組み合わせを変えることによって、どの植物プランクトン種でも同程度の精度のChl-a推定モデルが作成できることが明らかとなった。本研究では、衛星データから高濁度湖沼の水質パラメータ、すなわちクロロフィルa濃度(Ch1-a)、トリプトン濃度、波長440nmにおけるCDOMの吸収係数、を推定するための3つの新しい手法を開発した。まず、高濁度水域の反射スペクトルからCh1-aを高精度で推定するために、新たな3波長指数を提案した。新3波長指数の有効性について、アジアの2つの高濁度湖沼(すなわち、日本の霞ヶ浦と中国の〓池)から収集したデータを用いて検証した。その結果、2つの湖沼において、新3波長指数とCh1-aの間に強い相関がみられ(R^2>0.83)、Ch1-aを高精度で推定することができた。次に、高濁度水域における水中基本成分の濃度を同時推定する手法SAMO-LUTを開発した。

SAMO-LUTはCh1-a、トリプトン濃度、CDOMを推定するための3つの半理論・半経験的な指数に基づいている。LUT法と繰り返し捜索戦略ほ法も衛星データから計算した指数に最適な推定モデルを選択するために導入した。SAMO-LUTの有効性について、3種類のデータセットを用いて検証した。その結果、ノイズが含まれないシミュレーションデータを用いた場合、SAMO-LUTではほぼエラーなしの推定結果が得られ、この手法は優れたメカニズムを有するものと考えられた。現地調査データと衛星データを用いた場合も、良い推定結果が得られ、相対誤差はそれぞれ10%と39%以下であった。最後に、対象水域での特定固有光学特性(SIOP)を入手できない場合でも、高濁度水域における水中基本成分の濃度を同時推定できる手法RMIMを開発した。RMIM手法に必要な入力パラメータはわずか数地点での水域からの分光反射率、水サンプルからのCh1-a、トリプトン、CDOM各濃度である。これらのデータは定期的な衛星観測とフィールド水採取、その分析から取得できる。RMIMの有効性について、2種類のデータセット(Hydrolightシミュレーションデータデータ、MERIS衛星データ)を用いて検証した。その結果、相対誤差は6.8%22.7%であった。
麻薬性鎮痛薬の薬効を制御する血液脳関門輸送機構の解明

オキシコドンの効率的な血液脳関門輸送を担う有機カチオン/プロトンアンチポーターが、ヒト血液脳関門細胞で機能することを示した。オキシコドンに加え、弱オピオイドのトラマドールが有機カチオン/プロトンアンチポーターの基質となり、高い脳移行性を制御することを示した。またアポモルヒネの構造異性体を用いたインビトロおよびインビボの解析から、血液脳関門輸送系は構造異性体を区別することはないことが示唆されるとともに、血液脳関門の有機カチオン/プロトンアンチポーターがアポモルヒネのレスキュー治療薬としての速やかな薬効発現を制御することを示した。ヒト血液脳関門モデル細胞としてヒト脳毛細血管内皮細胞株(hCMEC/D3細胞)を用い、モルヒネの構造類似体であるトラマドールおよびアポモルヒネの輸送特性を解析した。その結果、トラマドールおよびアポモルヒネはオキシコドンと同様にプロトン/有機カチオン交換輸送体によって効率的に輸送されることが示され、高い輸送クリアランスを持つことが示された。アポモルヒネは構造異性体が存在し、R体はS体に比べラットの脳/血液遊離型濃度比が高いことが報告されているが、R体とS体でhCMEC/D3細胞の取り込み輸送に差はなかった。アポモルヒネのエナンチオマー間で血液から脳への輸送は差がないことが示唆され、脳からの排出輸送の違いがS体と比べR体の脳内濃度が高くなる可能性が考えられた。hCMEC/D3細胞を用いたsiRNA実験の有用性について、OCTN2/SLC22A5のカルニチントランスポーターとしての機能を解析した。リポフェクション法によりhCMEC/D3細胞への高いsiRNA導入効率が得られ、OCTN2 siRNA処理により、カルニチン輸送の顕著な低下が観察された。hCMEC/D3細胞におけるカルニチン輸送特性と遺伝子発現解析の結果と合わせ、OCTN2/SLC22A5がヒト血液脳関門におけるカルニチン輸送の主要分子であることが示された。またhCMEC/D3細胞におけるRNA干渉法は、ヒト血液脳関門におけるカチオントランスポーターの機能解析に有用な方法であることが示された。In vitro BBBモデル細胞としてヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞を用いて、オキシコドン、モルヒネおよびフェンタニルの細胞内取り込みを測定したところ、モルヒネの細胞内取り込みに比べ、フェンタニルとオキシコドンの取り込みが高値を示した。さらにジフェンヒドラミンおよびピリラミンのhCMEC/D3細胞への取り込みは、プロトン濃度勾配を駆動力とすることが示され、ヒト血機能関門においてもオキシコドントランスポーターが機能することが示唆された。麻薬性鎮痛薬の中でも類似化学構造を持つモルヒネとオキシコドンはヒトにおいても対照的な脳移行特性を持つことが示唆された。即ち、モルヒネがP-糖タンパク質によって脳への移行が制限されるのに対し、オキシコドンは積極的に脳内に取り込まれると考えられる。このことは、麻薬性鎮痛薬による疼痛緩和において有用な知見となるばかりでなく、オキシコドントランスポーターを利用した新規中枢作用薬の開発にもつながると考えられる。さらにオキシコドントランスポーターの分子同定のため、hCMEC/D3細胞におけるトランスポーター遺伝子発現を解析した。378種のSLCトランスポーターのうち、約50種の候補分子の遺伝子発現をqPCRにより測定したところ、hCMEC/D3細胞においてMDR1に匹敵する極めて高いmRNA発現を示す6種のトランスポーターを同定した。加えて、脳関門で機能することを我々が報告したPMATと同程度の発現を示す8種のカチオントランスポーターを見出した。これらの知見は強制発現細胞およびRNA干渉を用いてオキシコドントランスポーターの同定を進める上で、重要な知見となる。加えて、hCMEC/D3細胞を用いたsiRNA法による遺伝子発現抑制条件の最適化を行い、効率的に標的遺伝子の発現を抑制することに成功した。麻薬性鎮痛薬の脳移行を担うプロトン/有機カチオン輸送体の光学異性体認識性に関して、アポモルヒネエナンチオマーを用いて解析した。実験としてin vitro血液脳関門モデル細胞およびin vivo脳関門輸送測定法を用いた。これらの結果から、脳関門細胞への取り込み輸送、ラット血液脳関門を介した血液-脳取り込み輸送および脳-血液排出輸送のいずれにも異性体間での差はなく、立体選択的な血液脳関門輸送はみられなかった。またアポモルヒネの脳への取り込み輸送は脳からの排出輸送より大きく、速やかな薬効発現にプロトン/有機カチオン輸送体が寄与することが示唆された。さらにオピオイド作動薬で癌性疼痛に用いられるトラマドールが、オキシコドンなどの麻薬性鎮痛薬と同様にプロトン/有機カチオン輸送体により脳内に取り込まれ、血液に比べ脳内で高い濃度勾配を形成することを見出した。

薬物動態学ヒトの血液脳関門モデル細胞を用いて、麻薬性鎮痛薬オキシコドンの脳移行を担うプロトン/有機カチオン交換輸送体の機能を解析することにより、モルヒネの構造類似体であるトラマドールやアポモルヒネがその基質となることが明らかとなり、アポモルヒネのエナンチオマー解析から、この輸送系は構造異性体を区別しない可能性が示唆された。さらにプロトン/有機カチオン交換輸送体の分子同定に関して、ヒト血液脳関門細胞におけるカチオントランスポーターの機能をRNA干渉法で評価する系を構築することができ、RNA干渉法により候補分子をスクリーニング出来ることが示された。以上の点から、現時点において本研究課題はおおむね順調に進展していると評価する。ラットのみならずヒトの血液脳関門においてもオキシコドンを輸送するプロトン交換輸送系が機能することを、ワールドワイドに評価されている唯一のヒト血液脳関門モデル細胞であるhCMEC/D3細胞を用いて明らかにできた。このことは本研究の根幹をなす部分であり、本研究全体からみても大きな成果であるといえる。加えて、hCMEC/D3細胞を用いることにより、ヒトにおける脳移行機構の解明、さらにはヒト脳移行性の予測法確立にもつながることが示唆された。従って、麻薬性鎮痛薬のみならず中枢作用型塩基性薬物の開発ならびに適正使用のために有用な情報を与え得るものと考えられ、この点に関して本研究課題が順調に進展していると考えられる。また、血液脳関門におけるプロトン交換輸送系の分子実体の解明に関しては、候補分子を絞り込むことができ、hCMEC/D3細胞を用いたsiRNA法による標的遺伝子の発現抑制の実験条件確立に成功した。このプロトン交換輸送系の分子同定は日本国内外、大学および企業の多くの研究者がチャレンジしているテーマであるが、未だその分子実体は解明されていない。これまでにsiRNAを用いた輸送体探索までには至らなかったが、siRNAによる輸送体探索の準備を整えることができた。従って、これまでに誰も成功していない血液脳関門におけるプロトン交換輸送体の分子実体の解明に向けて、大きな足掛かりをつかんだと考えている。以上の点から、現時点において本研究課題はおおむね順調に進展していると評価している。アポモルヒネのエナンチオマー間での脳/血液遊離型濃度比の違いについて明らかにするため、アポモルヒネのR体とS体で血液から脳への取り込み輸送および脳から血液への排出輸送をインビボで比較する。アポモルヒネの放射標識体は入手困難なので、non-RIでのインビボ血液脳関門輸送実験系を構築する。血液脳関門非透過性の蛍光標識体を標準物質として用いてin situ脳灌流法およびbrain efflux index法を行うことにより、アポモルヒネの血液から脳への取り込みクリアランスおよび脳から血液への排出クリアランスを評価し、エナンチオマー間で比較する。本研究で最適化したsiRNAによる遺伝子発現抑制実験条件を用い、外因性カチオン輸送体、内因性カチオン輸送体、プロトン交換輸送輸送体である約40種のSLCトランスポーターがプロトン/有機カチオン交換輸送体の分子実体となり得るかをスクリーニングする。