hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フラビウイルスの共生と進化に関与する宿主及びウイルス因子の解析

現在、フラビウイルス科ウイルスの進化機構として、(1)フラビウイルス科ウイルスの粒子産生に関わる宿主由来のアポリポ蛋白質とウイルス由来のErnsまたはNS1蛋白質の共通性に関する研究を行なっている。また、新たな持続感染機構の解明として(2)ペギウイルス感染機構の解明に関する研究を行なっている。1)C型肝炎ウイルス(HCV)及びペスチウイルスの粒子形成において宿主由来のアポリポ蛋白質とウイルス由来のNS1及びErnsが共通した機能を持つことを明らかにし、報告した(PLoS Pathogens 2017)。さらに、分泌蛋白質の機能解析を進めるツールとして様々なフラビウイルス科ウイルスにスプリットnLucレポーターを搭載したウイルス(HCV、ペスチウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス)を作出し、報告した(J Viriol 2018)。さらに、最近NS1の機能を欠損したフラビウイルスの作出に成功し、現在ウイルス複製またはウイルス粒子形成に関与するNS1の変異体としてI273Eを同定した。このNS1変異体はウイルスゲノムの複製は起きるものの、ウイルス粒子産生は認められないことから、NS1が粒子形成にも重要な役割を持つことが明らかになった。2)九州大学との共同研究によってペギウイルス陽性の臨床検体の収集を開始した。これまでに、肝臓移植後の患者ではペギウイルス陽性率が健常人と比べて明らかに高いことが明らかになった。また、ペギウイルス陽性末梢血単核球では非感染と比較してISGの発現が誘導されていることがRNA-seq解析から明らかになった。このことから、持続感染しているペギウイルスも症状は認めないものの、免疫応答に少なくとも影響を与えている可能性が示唆された。フラビウイルス科ウイルスの進化に関する研究に関しては、2017年と2018年に論文報告できており、現在も投稿準備中であることからも分かる通り、予定通りにおおむね順調に進展していると考えられる。ペギウイルス研究も新規知見が得られ、論文投稿準備中であり、順調に経過していると考えられる。フラビウイルスの進化における分泌蛋白質の役割の保存性を検討する。特に、フラビウイルスの粒子形成におけるNS1の役割を宿主由来のアポリポ蛋白質や他のウイルス由来のErnsが代替できるかを検討する。また、ペギウイルスは持続感染していることが明らかになっているが、その免疫回避機構を明らかにする予定である。本年度は、膜結合性の分泌蛋白質であるペスチウイルスのErnsとフラビウイルスのNS1がフラビウイルス科のウイルスに共通して粒子産生に関与するかを調べた。まず、ペスチウイルスの完全長cDNAクローンからErns遺伝子を欠失させたクローンを作出した。ウイルス由来のErnsあるいはNS1蛋白質、および宿主由来のアポリポ蛋白質を培養細胞に強制発現させ、Erns遺伝子を欠失したウイルスRNAを導入した。その結果、NS1蛋白質、あるいは、アポリポ蛋白質を発現させた細胞でペスチウイルスの粒子産生を認めた。次に、ヘパシウイルスの粒子形成に必須なアポ蛋白質を欠失させた培養細胞に、ペスチウイルスのErns蛋白、あるいはフラビウイルスのNS1蛋白質を強制発現させてヘパシウイルスを感染させた。その結果、Erns、あるいはNS1蛋白質を強制発現させた細胞で粒子産生が回復した。以上の成績から、フラビウイルスの粒子産生には膜結合性の分泌蛋白質が重要な役割を演じることが示唆された。特に、ヘパシウイルスは種および組織特異性を獲得する間に、自身の遺伝子から膜結合性の分泌蛋白質を欠失させ、宿主の蛋白質を利用するように進化したと考えられる。一方、ペギウイルスはコア蛋白質を欠損しているが、その分子機構を解明するため、ペギウイルスの定量系を確立し、肝臓移植患者で健常人よりもペギウイルスの陽性率が有意に高いことが明らかになった。フラビウイルスの粒子形成における、宿主由来およびウイルス由来の膜結合性蛋白質の関与を解明し、論文を投稿し、マイナーリバイスとなっている。また、ペギウイルスに関しても、ウイルス価が高い患者を同定できており、研究は順調に進展していると判断できる。1)C型肝炎ウイルス(HCV)及びペスチウイルスの粒子形成において宿主由来のアポリポ蛋白質とウイルス由来のNS1及びErnsが共通した機能を持つことを明らかにした。アポリポ蛋白質を欠損したHuh7細胞及びErnsを欠損したペスチウイルスのリバースジェネティクス系を用いてそれらの分泌蛋白質の共通した役割を解明し、その内容を報告した(PLoS Pathogens 2017)。このことから、フラビウイルス科ウイルスが進化の過程でウイルス粒子産生に必要な因子をウイルス由来と宿主由来で使い分けながら進化したことが予想される。さらに、最近NS1の機能を欠損したフラビウイルスの作出に成功し、現在ウイルス複製またはウイルス粒子形成に関与するNS1の変異体を探索している。

当初予想していた通り、フラビウイルス科ウイルスの進化の中における宿主またはウイルス由来の分泌蛋白質の使い分けが明らかになってきた。さらに、その中で最も重要な分泌蛋白質であるErnsとNS1の役割を解析するツールとして、様々なフラビウイルス科ウイルスでレポーターウイルスの作出に成功した。このことから分泌蛋白質から見たフラビウイルス科ウイルスの進化に関する研究は概ね順調に進んでいると思われる。一方、ペギウイルスの研究に関しては、in vitroでの増殖系の確立が難航しているが、個体での役割が少しずつ明らかになってきており、この側面からペギウイルスの共生機構を解明しこうと考えている。このことからもペギウイルス研究も少し方向性が変わりつつあるものの、概ね順調に進展していると考えられる。現在、フラビウイルス科ウイルスの進化機構として、(1)フラビウイルス科ウイルスの粒子産生に関わる宿主由来のアポリポ蛋白質とウイルス由来のErnsまたはNS1蛋白質の共通性に関する研究を行なっている。また、新たな持続感染機構の解明として(2)ペギウイルス感染機構の解明に関する研究を行なっている。1)C型肝炎ウイルス(HCV)及びペスチウイルスの粒子形成において宿主由来のアポリポ蛋白質とウイルス由来のNS1及びErnsが共通した機能を持つことを明らかにし、報告した(PLoS Pathogens 2017)。さらに、分泌蛋白質の機能解析を進めるツールとして様々なフラビウイルス科ウイルスにスプリットnLucレポーターを搭載したウイルス(HCV、ペスチウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス)を作出し、報告した(J Viriol 2018)。さらに、最近NS1の機能を欠損したフラビウイルスの作出に成功し、現在ウイルス複製またはウイルス粒子形成に関与するNS1の変異体としてI273Eを同定した。このNS1変異体はウイルスゲノムの複製は起きるものの、ウイルス粒子産生は認められないことから、NS1が粒子形成にも重要な役割を持つことが明らかになった。2)九州大学との共同研究によってペギウイルス陽性の臨床検体の収集を開始した。これまでに、肝臓移植後の患者ではペギウイルス陽性率が健常人と比べて明らかに高いことが明らかになった。また、ペギウイルス陽性末梢血単核球では非感染と比較してISGの発現が誘導されていることがRNA-seq解析から明らかになった。このことから、持続感染しているペギウイルスも症状は認めないものの、免疫応答に少なくとも影響を与えている可能性が示唆された。フラビウイルス科ウイルスの進化に関する研究に関しては、2017年と2018年に論文報告できており、現在も投稿準備中であることからも分かる通り、予定通りにおおむね順調に進展していると考えられる。ペギウイルス研究も新規知見が得られ、論文投稿準備中であり、順調に経過していると考えられる。
プラセボ効果の個体間変動要因の解析と効果的カウンセリングへの応用

プラセボ効果は全ての医薬品に存在し、薬効の大きさを決定づける因子の一つである。プラセボレスポンダーとノンレスポンダーを区別するためにカフェインとプラセボ(乳糖)の比較試験を行った。脳内化学伝達物質・セトロニントランスポーター(5-HT)遺伝子のlong allele home-genotypeを持つ被験者においてプラセボ活性が高いことを見出した。さらにCatechol-O-methyl transferase(COMT)はプラセボ効果との関連性が高いとの報告もあり研究に着手した。薬剤師の専門分野である服薬説明で薬効が増大するのは、脳への働きかけであり、その個人差を調べるために臨床試験を行った。薬物治療の臨床効果は、薬物要因だけではなくその他非薬物要因の影響を受け、一つには脳前頭前野を介するメカニズムが存在するという考えに基づき、臨床研究を進めた。本年度は、カフェインと乳糖(プラセボ)を用いてプラセボ効果について検討した。脳前頭前野の活性はnear-infrared spectroscopy (NIRS)を用いて脳血流量を測定した。セロトニントランスポーター遺伝子多型(5-HTTLPR)のLL型、SS型、SL型を分け、眠気を主観的指標に基づき、その関係性を検討した。海外の報告では、L-アレイを持つものがプラセボ効果を受けやすいとある。しかし、欧米人はLL型は32%を占めるのに対し、日本人は3.2%と人種差がある。日本人で5-HTTLPRとプラセボ効果との関連性の検討は本邦初の試みである。被験者42例につき、A群21名(1日目カフェイン-3日目プラセボ:カフェイン条件付け群)、B群21名(1日目プラセボ-3日目プラセボ:プラセボ群)、二重盲検にて臨床試験を行った。遺伝子多型については、SS型52.4 % (n=22)、SL型40.5% (n=17)、LL型7.10 % (n=3)であった。LL型はプラセボ群のみ存在した。眠気度調査では、カフェイン服用群がプラセボ服用群(1日目)において眠気が改善傾向を示した(有意差はない)。NIRSでは、カフェイン服用群の血流量減少傾向を示し、カフェイン脳細動脈収縮作用の薬理効果が観察された。遺伝子多型との関係では、眠気度調査ではLL型が有意に高い改善傾向を示した。NIRSではLL型が前頭前野の46野において有意に血流量が上昇した。LL型はプラセボ服用群であり、顕著に46野(ワーキングメモリー活性度に関連のある場所)が上昇し、プラセボ効果を客観的指標でも捉えることができた。LL型がプラセボ反応を受けやすいことが確認された。5-HTTLPRとプラセボ効果の関連性の検討は海外において若干であるが報告がある。しかし欧米人と日本人においては人種差があることから、プラセボ反応の解明のためには、日本人における検討が必要である。LL型が日本人で極端に少ないことから、検出力検討の結果40名以上の被験者を必要とした。LL型は3名存在したが、検討被験者数を増やして再現性を確認する必要があると考察した。しかし、すでに報告されている研究と同様の結果が得られ、研究の目標は概ね達することができた。さらにプラセボ効果は主観的指標(眠気など)の方が、客観的指標(NIRSなど)に比べ、有意に大きく出やすいという先行研究から次のように考察できる。遺伝子群に分けない検討では主観的指標の方にのみプラセボ効果がみられたが、遺伝群に分けた場合、LL群について主観的・客観的両者にプラセボ効果がみられた。研究成果は良好な結果といえる。薬物の治療効果は、薬本来の持つ薬理効果、自然治癒の非薬物要因の他に心理効果の影響を受ける。心理的要因の代表はプラセボ効果である。薬の効果に対する期待と過去に薬が効いたという条件付けが働くことに基づく効果であり、脳の認知機能、ワーキングメモリーを司る部位に関連がある。この部位は脳の前頭前野に位置し、近赤外線分光法(NIRS)を使用することでその活性度が非侵襲的に測定できる。またセロトニントランスポーター(5-HTT)遺伝子多型のLL型、SL型、SS型のうち、LL型を持つヒトでプラセボ効果を受けやすいという報告がある。そこで我々は、5-HTT遺伝子型とプラセボ効果の関連性を検討するために、カフェインとプラセボの2重盲検試験を行った。プラセボ群のLL型が最も眠気度の改善効果を示し、NIRSにおいても有意な活性度を示した。欧米人がLL型32%を占めるのに対し、日本人は3.2%と人種差がある。本研究は初めて日本人において得られた結果であり、人種差を考慮すると有意義な研究である。本年度は、臨床上において薬剤師の専門分野の一つでもある服薬説明(薬の効果に対し期待感が持てるカウンセリング)に着目した。カウンセリングで薬効が増大するのは脳の認知機能を担う部位への働きかけであり、プラセボ効果と同様に個人差があると考えた。被験者43名につき、1日目に生薬配合ドリンク剤を服用、1週間の休薬期間をおき、8日目にカウンセリングを加え1日目と同様の検査を行った。遺伝子多型は先行研究と同様な配分に分かれた。

ドリンク剤の効果である疲労感の改善についてはLL型がカウンセリング効果が高く改善した。NIRSではLL型が脳前頭前野において有意に活性度が高かった。カウンセリング効果を客観的にとらえることができた。5-HTT遺伝子多型とプラセボ効果及びカウンセリング効果の関連性の検討は海外において報告はある。また2000年頃から遺伝子多型との関連性をテーマとしたプラセボーム解析の報告が急激に増加した。しかし欧米人と日本人において遺伝子多型には人種差があることから、日本人における検討が必要である。LL型が日本人には極端に少ないことから、被験者数は相当数を必要とする。今年度はドリンク剤を使用してカウンセリング効果を実施したが、LL型は3例と母集団に偏りが生じた。しかし海外の論文並びにプラセボ薬を使った先行研究と同様の結果が得られ、研究の目標は概ね達することができた。ドリンク剤はその効果が心理効果を大きく反映すると想定したが、主観的評価よりNIRSを使った客観的評価で大きな成果を得た。カウンセリングは脳の前頭前野を大きく活性させていると考察した。そしてその活性度はLL型が最も大きかった。検討被験者は今後も増やす必要性があると考えた。プラセボ効果は全ての医薬品に存在し、薬効の大きさを決定づける因子の一つである。発現機構は、過去の経験や様々な情報により薬の効果が条件付けられると、薬への期待が高まりプラセボ効果が引き起こされることに基づく(Finniss et al, Lancet, 2010)。これまで脳活動とプラセボ効果の研究が進んでいたが、最近10年で、脳内化学伝達物質の遺伝子多型でプラセボレスポンダーとノンレスポンダーを区別するプラセボーム研究が台頭している。さらにプラセボームには人種差がみられる。欧米では研究が進んでいるが、日本での報告は無く、大きな遅れを取っていた。我々はカフェインとプラセボ(乳糖)の二重盲検比較試験を行い、5-HTT(Serotonin transporter)のlong allele homo-genotypeを持つ被験者においてプラセボ効果が高く、脳前頭前野の特定部位の活性が高いことを見出し、論文発表した(Isawa et al., Pharmazie, 2017)。一方、脳内化学伝達物質の中でも、特にCOMT (Catechol-O-Methyltransferase)遺伝子多型がカウンセリングやプラセボ効果との関連性が高いという報告がある(Hall TK et al., PloS ONE, 2012)従って、5-HTTだけではなくCOMTも加え、さらに規模の大きい臨床試験を目指すこととした。プラセボ効果をより明確にするために、全ての被験者は、カフェインの眠気防止作用の説明を受けるが、乳糖(プラセボ)を服用するという工夫をし、慶應義塾大学医学部倫理委員会ならびに薬学部倫理委員会の承認を得た。パイロット的な臨床試験として9例で行った。プラセボ効果の変更要因について、2000年以降に承認された睡眠薬の文献調査を行い、学会発表を行った(日本薬学会、2018年3月)。プラセボレスポンダーとノンレスポンダーを区別するためにカフェインとプラセボ(乳糖)の比較試験を行った。脳内化学伝達物質・セトロニントランスポーター(5-HT)
磁気共鳴画像を用いた器官形成期ヒト胚子の解析

ヒト器官形成期(胚子期)に発生する先天異常の解明のために、京都大学大学院医学研究科附属先天異常標本解析センターが保持しているヒト胚子のMR画像約1200例を出発材料として、コンピュータを用いた立体再構成、外表、内部諸器官の形態観察を行い、主要器官発生の定量可視化、胚子の個体差の検討を行った。得られた知見は、胎児成長の基準作成、先天異常例の抽出に寄与し、胎児診断の確立に有用である。ヒト器官形成期に発生する先天異常の解明のために、京都大学大学院医学研究科附属先天異常標本解析センターが保持している器官形成期のヒト胚子を用いて撮像したMR断層画像1200例を用いて、以下の手順でデータの加工、解析を進めた。MR画像データは1個体あたり256x256x512(voxel)の直方体の情報があるが、ソフトウエアImage Jを用いてMR画像データを適切に切断し抽出した。ソフトウエアOsiriXを用いて2種類のレンダリング手法(VR,MIP)を用いて三次元胚子像をコンピューター上に作製した。この胚子像はQuick Time-virtual reality(QT-VR)法を用いて作製、保存され、コンピューター上で胚子を1600方向から立体的に観察できるようになっている。VR像は、おもに体表観察に、MIP像は内蔵諸器官の把握に有用である。カーネギーステージで評価項目として使用されている外観、上下肢、感覚器の形態をVR像を用いて観察し、身体部位ごとに発生の進み具合を評価し、その差異をとらえ、各胚子の個体差を表現した。こうして得られたコンピューター画面上の胚子は、詳細な観察に耐えうる画質であることが分かった。対象症例について、外表写真の撮影を開始した。これはプロジェクト終了時にデータベースを公開することを目的としている。主要器官として、肝臓、脳神経管、脳室を選択しての発生段階の定量、可視化を行った。肝臓の発生及び周辺器官との関係を詳細に表すことができた。脳室では、幾何学的図形への近似を行い、形態学的な変化を抽象化した。これらのデータは、妊娠初期の胎児診断における重要な基礎的データとなると考えられる。また、解剖学的位置が立体座標で示せるというMRdataの特性を生かし、発生時の主要器官の形態形成と造形運動の数値化を試みた。内耳、外耳の動き、顔面形成、胃、消化管の下降、回転についてその動きを解析した。ヒト器官形成期に発生する先天異常の解明のために、京都大学大学院医学研究科附属先天異常標本解析センターが保持している器官形成期のヒト胚子を用いて撮像したMR断層画像1200例を用いて、データの加工、解析を進めた。対象症例について、外表写真の撮影(4方向)を終了した。主要器官として、肝臓、脳神経管、脳室、胃を選択しての発生段階の定量、可視化を行った。第3,第4脳室周囲において、脳実質の立体化を行った。より詳細な情報が必要な個体については、位相差CTを用いた撮像を開始した。また、3次元プリンターを用いて立体モデルを作成した。ヒト器官形成期に発生する先天異常の解明のために、京都大学大学院医学研究科附属先天異常標本解析センターが保持している器官形成期のヒト胚子を用いて撮像したMR断層画像1200例を材料とし、ソフトウエアOsiriX, AMIRA, FSLview等を利用して、データの加工、解析を進めた。三次元胚子像のコンピューター上での作製、対象症例についての外表写真の撮影(4方向)を行った。外表、内部観察を行い形態の計測を施行し個体差を定量化した。異常な計測値をもとに肝臓の形成異常の個体を抽出し解析を進めた。肝臓の正常発生及び周辺器官との関係を詳細に表すことができた。脳実質の立体化を行い神経核の発生を定量化した。より詳細な情報が必要な個体、特に内部臓器に異常がある可能性のある個体については、位相CTを用いた撮像、得られた画像の解析を開始した。

また、解剖学的位置が立体座標で示せるというMRdataの特性を生かし、発生時の主要器官の形態形成と造形運動の数値化を試みた。内耳、外耳の動き、胃、中腸の伸長、回転についてその動きを解析した。これらのデータは、ヒトの発生に新たな知見を加え、その理解につながるとともに、妊娠初期の胎児診断における重要な基礎的データに結びつくと考えられる。すでに肝臓、脳神経管、耳の移動に関してデータを英語論文としてまとめ、発表できた。また、肝臓については、異常個体の選別ができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。選別個体を中心に、より高解像度の胚子撮像をこころみる。また疫学データや胚子の外表観察や個体識別に役立つ外表写真や観察内容を含めた総合的データベースを構築したいと考えている。さらに、3次元データを分かりやすく表現し説明する方法としてコンピュータグラフィックスだけでなく3次元プリンターを使用したいと考えている。
超音波照射による筋肥大効果の仕組みを解明し、廃用性筋萎縮予防の可能性を探る。

廃用性筋萎縮の予防・病状軽減を目的に筋力トレーニングがよく用いられている。一方、超音波療法は骨折部位の治癒促進などに用いられているが、筋萎縮への効果は不明な点が多い。我々は、この超音波照射に筋細胞から分化誘導した筋管を肥大させる作用があることを見出しており、廃用性筋萎縮の予防に超音波療法も活用できる可能性があると考えている。そこで、培養骨格筋細胞に対する超音波の非温熱効果、特にメカニカルストレスに着目し、1培養骨格筋細胞より分化した筋管に対する超音波照射の肥大化作用の機序の解明と、2超音波照射の筋組織に対するin vivoにおける効果の検証を行うことを目的とした。本年度は、超音波照射による筋肥大効果の最適条件を検証するため、強度(0.11.0 W/cm2)、周波数(1、3 MHz)、運転サイクル(1050 %)を様々な照射条件で組み合わせ、超音波を照射した。筋肥大の解析は、超音波照射24時間後の筋管の横径を測定した。筋管の測定は、Trendelenburgらの方法を参考に、筋管の横径がおおよそ一様になっている箇所を筋管細胞の長軸に50μmの間隔をあけて3か所測定し、筋管横径の平均値を1本の横径とした。その結果、強度は、強度依存的に筋管の横径が大きくなる傾向があり、周波数は,1MHzよりも3MHzの方が筋管の横径が有意に大きくなった。運転サイクルも大きさ依存的に筋管の横径が大きくなる傾向であった。当初の研究予定として、平成30年度中に単離した筋衛星細胞、分化誘導した筋管、筋芽細胞(C2C12細胞)、間葉系幹細胞、筋組織由来線維芽細胞様細胞に対する超音波の作用を解析する予定であった。しかし、超音波照射による筋肥大効果の最適条件を決める研究に多くの時間が必要となり、予定通りに進まなかった。平成30年度中に行う予定であった超音波照射による筋肥大効果をウェスタンブロット法によるシグナル分子リン酸化やリアルタイムPCRによる分化マーカーの定量解析の他に、細胞内Ca2+濃度変化やROS産生などイメージング解析を令和元年度早々に実施する。また、令和元年度に実施する予定である研究は同時に進めていく。当初購入を予定していた、超音波治療器の購入費が少なく済んだ。また学会参加費、旅費も少なく済んだため。令和元年度は、ウェスタンブロット法によるシグナル分子リン酸化やリアルタイムPCRによる分化マーカーの定量解析を行う予定のため試薬購入費として使用する。
ヒトiPS細胞のミトコンドリア制御因子による新しい化学物質の神経毒性評価法の開発

化合物には、ヒト発達期への神経毒性が懸念されるものがあり、安全性の評価は重要である。現在、動物を用いた評価が行われているが、種差の問題もあり、発達期モデルであるヒトiPS細胞を用いたin vitro評価系が期待されている。しかしながら発達神経毒性の有用な評価マーカーはいまだ見出されていない。我々はiPS細胞を用いて神経毒性を有する農薬クロルピリホス(CPF)がミトコンドリア融合因子Mfn1を分解しミトコンドリア障害を引き起こすこと、さらにMfn1がミトコンドリアを介し神経分化を制御することを見出していた。本年度は神経毒性の懸念があるナノマテリアルを用いて発達神経毒性の検討を試みた。銀ナノ粒子(AgNPs)は抗菌作用を有し、化粧品などに用いられる。近年、AgNPsはゼブラフィッシュ脳の形成異常など中枢神経毒性が報告されているが、ヒトへの影響は不明である。そこで本研究では、ヒトiPS細胞を用いて神経系の形成におけるAgNPs曝露の影響を検討した。神経分化法にはTGF及びBMPシグナル阻害剤によるDual SMAD阻害法を用いた。まずAgNPs曝露後のiPS細胞で神経分化を行い、マーカー発現を検討した。その結果、AgNPs曝露により、神経誘導4、6、8日目までに各々外胚葉マーカーPAX6、FOXG1、神経前駆マーカーNestinの発現低下を見出した。次に、AgNPs曝露によりiPS細胞内ATP量が減少したことからCPFと同様ミトコンドリアの検討を行った。その結果、AgNPs曝露により、Mfn1蛋白が減少し、ミトコンドリア分裂が促進した。Mfn1ノックダウン細胞ではAgNPs曝露と同様、神経誘導に伴う分化マーカーの低下が認められたので、ヒトiPS細胞において、AgNPs曝露によりMfn1蛋白が減少してミトコンドリア機能が低下し、神経分化が抑制される可能性が示唆された。本年度はiPS細胞を用いて、ナノマテリアルであるAgNPsがミトコンドリア融合因子Mfn1蛋白を減少させ、ミトコンドリア機能(ATP産生)を負に制御することを明らかにした。さらに神経分化における検討を行い、AgNPsがMfn1蛋白の減少を介して神経分化を抑制することを見出した。Mfn1は船底防汚剤TBTや農薬CPFの曝露によっても減少するので発達神経毒性を有する化合物の重要な毒性ターゲット因子となる可能性がある。以上の結果から、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。これまでいくつかの化学物質に関してiPS細胞を用いた発達神経毒性の検討を行い、ミトコンドリア因子であるMfn1がターゲットとなることを示した。今後は発達神経毒性が懸念されている他の化学物質についてもあわせて検討したい。特にiPS細胞の自己複製やミトコンドリア機能(ATP産生能など)、神経分化などへの影響も検討する予定である。化学物質の中には、ヒト発達期の曝露により神経毒性が懸念されるものがあり、安全性の評価は重要である。現在、動物を用いた評価が行われているが、種差の問題もあり、発達期のモデルであるヒトiPS細胞を用いたin vitro評価系が期待されている。我々は神経毒性を有する農薬のクロルピリホスがミトコンドリア融合因子Mfn1を分解し、ミトコンドリア機能障害を引き起こすことを見出していた。本年度では、ヒトiPS細胞の自己複製や神経分化に対するMfn1の役割を明らかにするために、shRNAを用いてMfn1のノックダウンを行った。その結果、Mfn1ノックダウンした細胞では自己複製能の低下が認められた。さらにミトコンドリア分裂の亢進に伴い、ATP産生能の低下やミトコンドリア膜電位の脱分極も認められた。次にMfn1ノックダウンによる神経分化への影響を検討するために、dual SMAD阻害法を用いて神経分化を行った。その結果、Mfn1ノックダウンにより外胚葉マーカーであるOTX2、神経外胚葉マーカーであるPAX6、FOXG1、神経発達マーカーであるNCAM1、神経前駆マーカーであるNestinの発現低下が認められた。以上の結果から、Mfn1はミトコンドリア形態の融合を介して、iPS細胞の自己複製や神経前駆細胞への分化を制御することが示唆された。本年度はMfn1をノックダウンしたiPS細胞を用いて、Mfn1がミトコンドリアの融合を介して自己複製に関与することを見出した。さらにdual SMAD阻害法を用いて神経分化への影響を検討した。その結果、Mfn1が外胚葉の分化を制御し、神経前駆細胞の分化に関与することを見出した。

近年、AgNPsはゼブラフィッシュ脳の形成異常など中枢神経毒性が報告されているが、ヒトへの影響は不明である。そこで本研究では、ヒトiPS細胞を用いて神経系の形成におけるAgNPs曝露の影響を検討した。神経分化法にはTGF及びBMPシグナル阻害剤によるDual SMAD阻害法を用いた。まずAgNPs曝露後のiPS細胞で神経分化を行い、マーカー発現を検討した。その結果、AgNPs曝露により、神経誘導4、6、8日目までに各々外胚葉マーカーPAX6、FOXG1、神経前駆マーカーNestinの発現低下を見出した。次に、AgNPs曝露によりiPS細胞内ATP量が減少したことからCPFと同様ミトコンドリアの検討を行った。その結果、AgNPs曝露により、Mfn1蛋白が減少し、ミトコンドリア分裂が促進した。Mfn1ノックダウン細胞ではAgNPs曝露と同様、神経誘導に伴う分化マーカーの低下が認められたので、ヒトiPS細胞において、AgNPs曝露によりMfn1蛋白が減少してミトコンドリア機能が低下し、神経分化が抑制される可能性が示唆された。本年度はiPS細胞を用いて、ナノマテリアルであるAgNPsがミトコンドリア融合因子Mfn1蛋白を減少させ、ミトコンドリア機能(ATP産生)を負に制御することを明らかにした。さらに神経分化における検討を行い、AgNPsがMfn1蛋白の減少を介して神経分化を抑制することを見出した。Mfn1は船底防汚剤TBTや農薬CPFの曝露によっても減少するので発達神経毒性を有する化合物の重要な毒性ターゲット因子となる可能性がある。以上の結果から、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。神経毒性を有する化学物質のターゲットであるMfn1が神経分化に関与することを見出している。そこでMfn1の下流にあり、神経分化に関与する遺伝子の同定を目指す。Mfn1をノックダウンしたiPS細胞を用いて、DNAマイクロアレイによる遺伝子の網羅的解析を行って絞り込む予定である。候補となる遺伝子はRNAi法により自己複製や神経分化に対する影響を調べる予定である。これまでいくつかの化学物質に関してiPS細胞を用いた発達神経毒性の検討を行い、ミトコンドリア因子であるMfn1がターゲットとなることを示した。今後は発達神経毒性が懸念されている他の化学物質についてもあわせて検討したい。特にiPS細胞の自己複製やミトコンドリア機能(ATP産生能など)、神経分化などへの影響も検討する予定である。shRNAの納期やiPS細胞を用いた神経分化評価系の立ち上げに予想以上に時間がかかってしまい、研究費を繰り越しせざるを得なくなった。必要な研究機器はある程度揃っており、研究費は主に研究試薬やDNAマイクロアレイの受託経費に充てる予定である。また本研究で得られた知見を国内外の学会や誌上などでの外部発表資金にも使用する予定である。試薬の納期(分化剤やミトコンドリアアッセイ試薬など)に予想以上に時間がかかってしまい、研究費を繰り越しせざるを得なくなった。必要な研究機器はある程度揃っており、研究費は主に研究試薬に充てる予定である。また本研究で得られた知見を国内外の学会や論文にも使用する予定である。
光合成を駆動する特殊なクロロフィルに関する研究

光合成の初期過程で重要な役割を担っているのがクロロフィル(葉緑素)である。酸素発生型の光合成にはクロロフィルaが不可欠だとされてきたが、本研究では南洋のホヤに共生する原核藻類Acaryochloris marinaが、クロロフィルaではなくクロロフィルdで酸素発生型の光合成を実現していることを発見した。通常の酸素発生型光合成は、系1および系2という二つの光化学系から構成されている。我々はこれまで、系1の初発電荷分離体がクロロフィルaのエピマーであるクロロフィルa'であり、系2の一次電子受容体がクロロフィルaの中心金属Mgが外れたフェオフィチンaであることを明らかにしてきた。ところが、クロロフィルdを主要色素とするA.marinaでは、系1の初発電荷分離体がクロロフィルdのエピマーであるクロロフィルd'であるのに対し、系2の一次電子受容体は通常と同じくフェオフィチンaであることを明らかにした。さらに、系2の初発電荷分離体も通常と同じクロロフィルaであった。すなわち、A.marinaはこれまでに例がない色素レベルで非常にキメラな構成であることが判明した。A.marinaはホヤの体内に棲息しているが、他の藻類も多数共生している。興味深いことに、A.marinaの主要色素であるクロロフィルdはクロロフィルaよりも波長の長い光が利用できる。そのため、ホヤ内においてクロロフィルa型クロロフィルが吸収出来なかったより波長の長い光をA.marinaは活用できることになる。このことが、A.marinaがクロロフィルdをアンテナ色素として選んだ理由の一つだと推定される。酸素発生型の光合成生物はクロロフィルa(Chl a)を主要色素とし、光化学系(photosystem ; PS)1およびPS2の反応中心には、それぞれChl a'(Chl aのエピマー)とフェオフィチンa(Phe a : ChlaのMgが脱離して2個のHが入った色素)が鍵クロロフィルとして微量存在している。前者はPS1の電子供与体P700として、後者はPS2の一次電子受容体として機能している。近年、群体ホヤ体内から分離されたシアノバクテリアAcaryochloris marinaは、酸素発生型の光合成を行うにも関わらず主要色素はChl dであった。Chl dはChl aのリングIのビニル基がホルミル基に代わったもので、Chl aよりも少し長波長の赤色光を吸収する。A.marinaは他の藻類と同様に、二つの光化学系(PS1&,PS2)を持つ。我々は、A.marinaには微少量ではあるがChl aが存在することから、鍵クロロフィルとしてChl a'とPhe aが存在すると予想したが、高速液体クロマトグラフィーを用いた精密色素分析より「Chl a'は存在せずChl d'が代わりに機能していること」を明らかにしてきた。本研究では、A.marinaの光化学系に存在する鍵クロロフィルの役割に関する知見を得ることを目的として、光質を変化させてA.marinaを培養し、色素の精密分析を行った。その結果、白熱灯および蛍光灯のどちらで培養してもA.marinaにはChl d'とPhe aが常に検出され、Chla'とPhe dは検出されなかった。このことは、PS1の電子供与体P740がChl a'ではなくCnl d'からなり、PS2の一次電子受容体が通常の酸素発生型と同じくPhe aであることを強く示唆する。また、(1)微少量存在するChlaのChl d'およびPhe aに対する比率は桁違いに小さいこと、(2)PS2の反応中心を構成するD1/D2タンパクはA.marinaと他の酸素発生型生物間でホモロジーが高いが、アンテナおよびPS1タンパクでは低いことが明らかになった。以上のことより、PS2の反応中心は通常の酸素発生型とは似ているもののアンテナ系は大きく異なると推測される。A.marinaは他の藻類と同様に酸素発生型の光合成を行い、二つの光化学系(PS1&PS2)を持つ。これまでの酸素発生型の光合成生物では、Chl aが主要色素で、PS1およびPS2の反応中心には、それぞれChl a'(Chl aのエピマー)とフェオフィチンa(Phe a。Chl aのMgが脱離して2個のHが入った色素)が鍵色素として機能していることを我々は証明してきた。前者はPS1の電子供与体P700として、また後者はPS2の一次電子受容体として機能している。A.marinaには、微少量ではあるがChl aが存在することから、我々はA.marinaのPS1にChl a'が、PS2にPhe aが存在すると考えた。ところが、A.marinaの精密色素分析を行ったところ、Phe aは検出されたが、Chla'は検出されなかった。代わりにChld'が検出された。このことは、A.marinaのPS1電子供与体P740はChl a'ではなくChl d'であり、PS2の反応中心は他の酸素発生型と同じChl a型であることを強く示唆する。光強度を変えて白熱灯で培養したところ、Chl d'/Phe aのモル比は、光強度に依存せずほぼ一定であった。すなわち、A.marinaのPS1/PS2比は白熱灯の光強度に依存しない。これは、Chl aで光合成を行うシアノバクテリアが、光強度によってPS1/PS2を大きく変化させるのと大きく異なる。

この原因を明らかにすべく、より短波長の光に富む蛍光灯で培養したA.marinaの色素分析を行う予定である。光合成の初期過程で重要な役割を担っているのがクロロフィル(葉緑素)である。酸素発生型の光合成にはクロロフィルaが不可欠だとされてきたが、本研究では南洋のホヤに共生する原核藻類Acaryochloris marinaが、クロロフィルaではなくクロロフィルdで酸素発生型の光合成を実現していることを発見した。通常の酸素発生型光合成は、系1および系2という二つの光化学系から構成されている。我々はこれまで、系1の初発電荷分離体がクロロフィルaのエピマーであるクロロフィルa'であり、系2の一次電子受容体がクロロフィルaの中心金属Mgが外れたフェオフィチンaであることを明らかにしてきた。ところが、クロロフィルdを主要色素とするA.marinaでは、系1の初発電荷分離体がクロロフィルdのエピマーであるクロロフィルd'であるのに対し、系2の一次電子受容体は通常と同じくフェオフィチンaであることを明らかにした。さらに、系2の初発電荷分離体も通常と同じクロロフィルaであった。すなわち、A.marinaはこれまでに例がない色素レベルで非常にキメラな構成であることが判明した。A.marinaはホヤの体内に棲息しているが、他の藻類も多数共生している。興味深いことに、A.marinaの主要色素であるクロロフィルdはクロロフィルaよりも波長の長い光が利用できる。そのため、ホヤ内においてクロロフィルa型クロロフィルが吸収出来なかったより波長の長い光をA.marinaは活用できることになる。このことが、A.marinaがクロロフィルdをアンテナ色素として選んだ理由の一つだと推定される。
フラクチャ-フリップ法とフラクチャ-フリップ細胞化学による細胞膜巨分子構築の解析

近年、フラクチャ-フリップ法と呼ばれる凍結割断技術が考察され、nmオ-ダ-での細胞膜表面巨分子構築の電子顕微鏡(以下電顕)解析が可能になった。本法は、凍結割断によって露出された細胞膜の疎水性部分を炭素蒸着することによって、細胞膜を物理的に固定し、細胞を融解、洗浄後、炭素固定された細胞膜を電顕用グリッドに回収し、再びその親水性表面に白金蒸着を行い、電顕下で観察する。本申請研究では、種々の細胞や細胞内小器官の膜構造をフラクチャ-フリップ法を用い、高分解能観察を行うとともに、主要膜蛋白の細胞化学的検索を試みた。以下、例として、赤血球膜および肝細胞核膜の結果を略述する。[ヒト赤血球]同一レプリカ膜で、多数の赤血球膜の外側および内側表面の観察が可能であった。内側表面にスペクトリンの免疫反応陽性の網目状構造が明瞭に観察された。炭素蒸着膜をTriton処理に引き続き、アルカリ溶液等で処理した試料では、網目状構造が消失し、細胞質側真表面が観察された。赤血球膜外側表面が比較的平滑であるのに比べて、細胞質側真表面には直径8ー10nmの膜粒子が多数存在し、一部の粒子にバンド3の免疫コロイド金の標識が認められた。[ラット肝細胞から単離した核膜]膜に付着したリボゾ-ムと明瞭なサブユニット構造をもつ核膜孔複合体が観察された。レクチンの一種であるWGAを標識したコロイド金でレプリカ膜を染色すると、核膜孔の中心部に特異的に結合した。この所見は核膜孔にNーacetylglucosamine residueが存在することを示す。以上の結果は凍結割断、炭素蒸着されたmembrane halvesは細胞膜の形態学的観察のみならず抗原性の残存に優れていることから、膜蛋白の細胞化学的観察に良好な試料であることを示唆している。細胞膜の巨分子構築ならびにそれらの動態の解明は、細胞生物学の中心課題の一つである。近年、フラクチャ-フリップ法と呼ばれる凍結割断技術が考案され、nmオ-ダ-での細胞膜表面巨分子構築の電子顕微鏡(以下電顕)解析が可能になった。本年度は、人工基質に接着ならびに伸展しているマクロファ-ジ(M_φ)を試料として用い、形質膜表面の受容体の同定ならびにその動態をフラクチャ-フリップ細胞化学法によって検討した。M_φは人工基質への接着ならびに伸展時に、その接着部形質膜に多数の被覆陥凹を形成することが知られており、すでに、我々は接着表面をフラクチャ-フリップ法で観察し、15ー25nm径の膜表面粒子が凝集し、細胞内へ取り込まれることを明らかにしている。[材料と方法]双面凍結割断用試料台に接着、伸展させたラット肺胞M_φの新鮮試料を急速凍結、凍結割断、炭素蒸着した。生理的食塩水で炭素蒸着膜を試料台から剥離、洗浄後、細胞化学標識(金コロイド標識ConA,WGA,免疫複合体)或はフィブロネクチン結合部位の免疫細胞化学的検出を行った。反応後、洗浄、フラクチャ-フリップ法に従い細胞膜表面を白金蒸着し、電顕観察を行った。[結果と考察]ConAならびにフィブロネクチン結合部位は膜表面粒子の凝集領域に一致して観察された。金コロイド標識WGAあるいは免疫複合体は細胞膜表面に一様に分散して結合した。

以上の所見は、基質への接着ならびに伸展に細胞膜表面のマンノ-ス糖鎖、フィブロネクチン受容体が関与していることを示唆する。フラクチャ-フリップ法は、凍結割断によって露出された細胞膜の疎水性部分を炭素蒸着することによって、細胞膜を物理的に固定し、細胞を融解、洗浄後、炭素固定された細胞膜を電顕用グリッドに回収し、再びその親水性表面に白金蒸着を行い、電顕下で観察するものである。本方法は簡便かつ高分解能観察を可能にしたが、原則的に細胞膜外側表面の観察に限られる。本年度、我々は、本法に界面活性剤TritonーXを併用したFractureーflip/Triton法でヒト赤血球膜細胞質側表面の観察と内在性膜蛋白Band3の免疫細胞化学的検索を行った。材料と方法:ヒト新鮮赤血球を急速凍結、-120°Cで凍結割断し、炭素蒸着を行った。蒸着試料をHepes緩衝2%TritonX-100で室温、30分処理した。処理後、同緩衝液で洗浄、グルタルアルデヒド固定を行い、蒸留水で洗浄した。試料を電顕用グリッドに回収、急速凍結、凍結乾燥した後、細胞膜表面に一方向ないしは低角度回転白金蒸着を行った。コロイド金標識法によるスペクトリンとバンド3の免疫染色はTriton処理後に行った。結果:同一レプリカ膜で、多数の赤血球膜の外側および内側表面の観察が可能であった。内側表面にスペクトリンの免疫反応陽性の網目状構造が明瞭に観察された。炭素蒸着膜をTriton処理に引き続き、アルカリ溶液等で処理した試料では、網目状構造が消失し、細胞質側真表面が観察された。赤血球膜外側表面が比較的平滑であるのに比べて、細胞質側真表面には直径8ー10nmの膜粒子が多数存在し、一部の粒子にバンド3の免疫コロイド金の標識が認められた。以上の結果は凍結割断、炭素蒸着されたmembrane halvesは細胞膜の形態学的観察のみならず抗原性の残存に優れていることから、膜蛋白の細胞化学的観察に良好な試料であることが示唆された。
昆虫病原性微胞子虫の宿主細胞適合性〜昆虫およびヒト培養細胞での比較検討

カイコ微粒子病病原Nosenma bombycis NIS OO1株胞子を,広範囲(25°C37°C)の温度条件下で培養可能な鱗翅目ヤガ科昆虫由来Spacibptera frugipeda NIAS-Sf-D1細胞系およびヒト子宮頸部癌由来HeLa S-3細胞系へ接種し,27°Cまたは37°Cで培養した。胞子接種7日後の感染培養からタンパク質を抽出し,各組み合わせと各培養温度下でのタンパク質発現の変化を,1次元及び2次元電気泳動により解析した。Sf-D1細胞系は微胞子虫非感染下でも培養温度によって異なるタンパク質発現パターンを示し,37°Cでは2030KDa程度のタンパク質が減少する一方で,約63KDaタンパク質の発現の増強が認められた。微胞子虫感染特異的に発現するタンパク質について,27°C培養区では,HeLa S-3細胞系では微胞子虫が感染増殖するにもかかわらずタンパク質動態の変化は全く認められなかったが,Sf-D1細胞系においては約27 Kdaのタンパク質が新たに誘導された。また37°C培養区では,Heda S-3細胞系においてのみ約40 Ma及び70 Kdaのタンパク質の発現が認められ,本微胞子虫の感染は成立しないものの,胞子発芽からスポロプラズムの宿主細胞侵入が,これらストレスタンパク質誘導の一因となっている可能性が示唆された。また,本微胞子虫胞子表面抗原に特異的なIgG抗体を供試し,免疫染色により胞子表面抗原の動態を光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて解析した。胞子表面抗原は生活環を通して普遍的に存在するものではなく,その発現はenvironmental sporeが形成される時期と重なっていた。一方, primary sporeには抗原抗体反応は認められず,これら二型胞子がその役割だけでなく抗原的にも全く異なることが明らかとなった。微胞子虫の感染成立には特異的レセプターや接着因子などは関与しないとされているが,これまでに我々は,細胞レベルでの宿主-微胞子虫適合性の存在を確認してきた。本研究では,微胞子虫の宿主細胞適合性を明らかにするため,微胞子虫を接種した適合性細胞および非適合性細胞における各細胞小器官の変化と微胞子虫との関わりを,形態学的および分子的に検証することを目的としている。本年度は,微胞子虫としてカイコ病原性微胞子虫のNosema bombycis NIS 001,Nosema sp.NISM11,未記載種TB-2M-H1およびTB-2L-H1株を,昆虫培養細胞系としてヤママユガ科昆虫由来Antheraea eucalypti,ヤガ科昆虫由来Spodoptera frugiperda SF21AEII,カイコガ由来Bombyx mori BmN4およびBmC-140細胞系を供試して,各組み合わせにおける双方の形態学的変化を万能顕微鏡および透過型電子顕微鏡下で詳細に観察した。供試した微胞子虫-昆虫培養細胞系の各組み合わせにおいて,宿主細胞適合性に関与するような形態学的差異を明確にすることはできなかった。TB-2L-H1株はB.mori BmN4細胞系においてのみ宿主細胞を融合,多核化する能力を有しており,巨大なシンシチアを形成した。また,N.bombycis NIS 001株とヒト子宮頸部癌由来HeLa S3細胞系の組み合わせにおいて,28°Cおよび37°Cの培養温度条件下で同様の形態学的検証を行った。28°C培養区ではスポロプラズムからの正常な成長,増殖が観察され,胞子接種48時間後から早生型胞子の孵化殻および二次感染体が確認された。一方,37°C培養区では,胞子から射出されたスポロプラズムがHeLa S3細胞細胞質中に侵入しているのが観察されたが,原虫細胞核は徐々に崩壊していき,その後の成長は全く認められなかった。本年度はまず,微胞子虫としてカイコ微粒子病病原Nosema bombycis NIS001株を,昆虫培養細胞系としてヤガ科昆虫由来で広範囲の温度条件(2537°C)下で培養可能なSpodoptera frugiperda NIAS-Sf-D1細胞系,およびヒト子宮頸部癌由来HeLa S-3細胞系を供試した。N.bombycis胞子をアルカリ処理後,各培養細胞系へ接種し,27°Cまたは37°Cで維持した。経時的に微胞子虫胞子接種細胞培養のサンプリングを行い,細胞感染率および微胞子虫の増殖を調査した。N.bombycis胞子をHeLa S-3細胞系に接種した区では,27°Cで培養した場合においてのみ微胞子虫の感染・増殖が観察された。また,NIAS-Sf-D1細胞系に接種した場合も,微胞子虫感染および増殖が確認されたのは27°C培養区のみであり,やはり温度が微胞子虫の宿主範囲決定の重要な因子となっていることが明らかとなった。次に,供試した微胞子虫-培養細胞系の各組み合わせおよび培養温度において,胞子接種7日後の感染培養からタンパク質を抽出し,SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果,各微胞子虫感染細胞系に,宿主細胞または培養温度特異的に発現する数種類のタンパク質の存在が確認された。また,カイコ病原性微胞子虫Nosema sp.NIS M11株胞子をアルカリ処理後,S.frugiperda SF21 AEII細胞系へ接種し,微胞子虫持続感染細胞系を樹立した。その感染培養上清によって処理した未感染SF21 AEII

細胞系へM11株胞子を接種し,本微胞子虫の感染および増殖を調査した。その結果,M11の増殖は全く確認されず,既感染宿主細胞では,寄生者である微胞子虫の感染・増殖に対抗する何らかの防御(阻害)物質が産生されている可能性が強く示唆された。カイコ微粒子病病原Nosenma bombycis NIS OO1株胞子を,広範囲(25°C37°C)の温度条件下で培養可能な鱗翅目ヤガ科昆虫由来Spacibptera frugipeda NIAS-Sf-D1細胞系およびヒト子宮頸部癌由来HeLa S-3細胞系へ接種し,27°Cまたは37°Cで培養した。胞子接種7日後の感染培養からタンパク質を抽出し,各組み合わせと各培養温度下でのタンパク質発現の変化を,1次元及び2次元電気泳動により解析した。Sf-D1細胞系は微胞子虫非感染下でも培養温度によって異なるタンパク質発現パターンを示し,37°Cでは2030KDa程度のタンパク質が減少する一方で,約63KDaタンパク質の発現の増強が認められた。微胞子虫感染特異的に発現するタンパク質について,27°C培養区では,HeLa S-3細胞系では微胞子虫が感染増殖するにもかかわらずタンパク質動態の変化は全く認められなかったが,Sf-D1細胞系においては約27 Kdaのタンパク質が新たに誘導された。また37°C培養区では,Heda S-3細胞系においてのみ約40 Ma及び70 Kdaのタンパク質の発現が認められ,本微胞子虫の感染は成立しないものの,胞子発芽からスポロプラズムの宿主細胞侵入が,これらストレスタンパク質誘導の一因となっている可能性が示唆された。また,本微胞子虫胞子表面抗原に特異的なIgG抗体を供試し,免疫染色により胞子表面抗原の動態を光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて解析した。胞子表面抗原は生活環を通して普遍的に存在するものではなく,その発現はenvironmental sporeが形成される時期と重なっていた。一方, primary sporeには抗原抗体反応は認められず,これら二型胞子がその役割だけでなく抗原的にも全く異なることが明らかとなった。
バルトリハリ言語哲学における「意味の世界」の分析と<能力>抽象の研究

1.措定した意味に対応した言語項目の抽象にパーニニ文法家がとった方法は,<肯定的共在関係>(anvaya)と<否定的共在関係>(vyatireka)に基づく推理であった.この推理は,言語項目とその意味の理解の間に因果関係を発見するのに資する。バルトリハリの<能力>論こそは,この言語分析の方法論から導かれたものである。2.因果論的アスペクトから,カーラカ理論においては,単一のモノ・コトとしての<実体>が多様な<行為>の実現に参与し,多様な表現が成立するという事実が,モノ・コトとしての<実体>に<属性>たる<能力>を措定せしめた.そしてこのことは,次のようなテーゼを生む.「単一のものがその<能力>によって多様に現れる」実在としての文からの下位の言語単位の概念的設定も,実在としての意味の融合体からの構成的意味の概念的設定も,言葉の<自己指示>理論も,さらには形而上学もこれによって説明される.3.<能力>は,<扶助>を本質として,モノ・コトとしての<実体>に相関してはそれから区別され,形而上学のレベルで究極的<実体>に相関してはそれから区別されず,非実在である.同じ所与の言語運用が様々に見られ,様々に概念化され,様々に説明されるのと同様に,存在論的<実体>であるコトバ原理もまた様々に見られ,様々に概念化されるのである.あたかも同一対象を筒を通じて様々な角度から見,そして語るように.4.かくして,バルトリハリにおいて,言語運用の観察から帰納されたその言語哲学思想の核心は,究極的<実体>を多様な<能力>の担い手として捉え,それを多様な言語活動の源泉として把握するその<能力>論である.1.措定した意味に対応した言語項目の抽象にパーニニ文法家がとった方法は,<肯定的共在関係>(anvaya)と<否定的共在関係>(vyatireka)に基づく推理であった.この推理は,言語項目とその意味の理解の間に因果関係を発見するのに資する。2.因果論的アスペクトから,カーラカ理論においては,単一のモノ・コトとしての<実体>が多様な<行為>の実現に参与し,多様な表現が成立するという事実が,モノ・コトとしての<実体>に<属性>たる<能力>を措定せしめた.そしてこのことは,次のようなテーゼを生む.「単一のものがその<能力>によって多様に現れる」実在としての文からの下位の言語単位の概念的設定も,実在としての意味の融合体からの構成的意味の概念的設定も,言葉の<自己指示>理論も,さらには形而上学もこれによって説明される.3.<能力>は,<扶助>を本質として,モノ・コトとしての<実体>に相関してはそれから区別され,形而上学のレベルで究極的<実体>に相関してはそれから区別されず,非実在である.同じ所与の言語運用が様々に見られ,様々に概念化され,様々に説明されるのと同様に,存在論的<実体>であるコトバ原理もまた様々に見られ,様々に概念化されるのである.あたかも同一対象を筒を通じて様々な角度から見,そして語るように.4.かくして,バルトリハリにおいて,言語運用の観察から帰納されたその言語哲学思想の核心は,究極的<実体>を多様な<能力>の担い手として捉え,それを多様な言語活動の源泉として把握するその<能力>論である.本研究は,インド言語哲学の泰斗バルトリハリ(5世紀頃)の主著『ヴァーキャパディーヤ』「<行為実現能力>の章」(『サーダナ・サムッデーシャ』)に基づき,バルトリハリの<能力>による「意味の世界」の体系化をたどり,その<能力>に関わる諸問題を,パーニニ文法学の伝統という彼の思想体系化の原点から正当に解明することを目的とする.本年度は,『サーダナ・サムッデーシャ』の<行為実現者>一般論部(第1詩節第44詩節)及『ディシュ・サムッデーシャ』(第23詩節第28詩節)の翻訳研究を行った.以下の事項が明らかとなった.1.バルトリハリにおいて,<能成者>は文意から<能力>の抽象を通じて措定されるものであり,それは<能力>である.そして<能成者>が<能力>であるという見解は,彼の創見になるものではなく,パーニニ文法学の伝統において確立されているものなのである.バルトリハリは,<能力論>の導入によって,パタンジャリにおいて<属性>とみなされたものを<能力>に同定し,彼の<能成者論>を展開しているということができよう.2.<実体>は<自己同一性>を保つものである.<実体>が<能成者>である限り,同一の<実体>に関する多様な<能成者>の表現は正当化されえない.同一の<実体>に関する多様な<能成者>の表現は,<実体>に多様な<能力>が想定されることによって確保される.3.この<能成者