hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルツハイマー病の病態における細胞内小胞体貯留Aβ42の果たす役割

アルツハイマー病の主病変を構成するAβ/APPとtauの相互作用がアルツハイマー病の病態において重要な役割を果たすことが示唆されている。我々は、APPのcytosol domainとcytosol proteinであるtauが相互作用を示し、それによってtauのリン酸化およびAPPのcytosol domainのThr668のリン酸化が調節されるとの仮説を実証するための研究を行ってきた。本研究では、APPのcytosol domainを有するC99とtauを対象にし、tauのリン酸化に及ぼすC99の影響を調べた。C99とtauをCOS7細胞で共発現させると、tauを単独発現させた場合に比べて、Thr181とThr231部位のリン酸化が抑制された。脱リン酸化酵素阻害実験から、この脱リン酸化には、PPIが関与することが分かった。TauとC99が直接結合するかどうかを免疫沈降法にて調べたが、結合が見られなかったので、両者の結合に際しては、第3の因子の存在が想定された。そこで、tauのリン酸化Thr231に結合し、tauの脱リン酸化に関与するとされるPin1に注目した。まず、Pin1はAPPのリン酸化Thr668に結合した。次いで、Pin1 1^<-/->MEF細胞を用いて、C99とtauを共発現した。Tauを単独発現させると、Pin1の有無に関わらず、tauのリン酸化は一定であった。TauとC99を共発現した場合、Pin1の存在によって、tauの脱リン酸化が亢進し、Pin1が存在しない時には、tauの脱リン酸化はみられなかっただけでなく、リン酸化の亢進がみられた。つまり、Pin1はC99と共同して、tauの脱リン酸化に関与し、Pin1が欠乏すると、tauのリン酸化が亢進するのである。このことから、アルツハイマー病脳において、tauの異常リン酸化過程に、C99/Pin1の関与が推測された。Aβ42について3種類のコンストラクトすなわち細胞質に発現するためにすべてのsignalを除き、N末端にMetを付加したMetAβ42、小胞体膜に貫通した状態で発現するためにAPP由来signal peptide (SP)を付加したSP-Aβ42、そして小胞体腔内に貯留させるためのsignal KDELを付加したMetAβ42-KDELをCOS7細胞に発現させ、小胞体障害の有無を解析した。Unfoldedprotein response活性化の指標となるGRP78,GRP94,PDIの発現亢進とcaspase12経路の活性化の有無を調べたところ、これらの変化は認めなかった。すなわち、今回用いた実験系において、Aβ42の発現が小胞体の障害を来たすことはないという結論を得た。Aβ42は小胞体で産生され、ERADによりて細胞質へ逆輸送されることが示されている。そこでAβ42とtauの相互作用を調べるために、SP-Aβ42あるいはMetAβ42とtauをCOS7細胞に共発現し、Aβ42がtauのリン酸化に与える影響を調べた。Tauの単独発現では、Thr181とThr231の部位でリン酸化を受け、GSK3βとの共発現によってリン酸化レベルを上昇させると、さらにSer202,Ser396,Ser404部位のリン酸化を受けた。ところが、tauあるいはtau+GSK3βの発現にさらにAβ42が加わると、これらの部位におけるtauの脱リン酸化が観察された。脱リン酸化酵素阻害剤による脱リン酸化反応の抑制効果を調べることによって、Aβ42による脱リン酸化反応にはPP1が関与していることが判明した。

これは、正常の細胞質においては、Aβはtauのリン酸化を亢進するのではなく、逆に脱リン酸化を惹起するものであることが明らかとなった。平成16年度には、このtauの脱リン酸化の分子的機序を解明する予定である。アルツハイマー病の病変を構成するAβ/APPとtauの相互作用がアルツハイマー病の病態において重要な役割を果たすことが示唆されている。我々は、APPのcytosol domainとcytosol proteinであるtauが相互作用を示し、それによってtauのリン酸化が調節されるとの仮説を実証するために実験を行ってきた。本研究では、APPのcytosol domainを有するC99とtauを対象にし、tauのリン酸化に及ぼすC99の影響を調べた。C99とtauをCOS7細胞で共発現させると、tauを単独発現させた場合に比べて、Thr181とThr231部位のリン酸化が抑制された。脱リン酸化酵素阻害実験から、この脱リン酸化には、PP1が関与することが分かった。TauとC99が直接結合するかどうかを免疫沈降法にて調べたが、結合が見られなかったので、両者の結合に際しては、第3の因子の存在が想定された。そこで、tauのリン酸化Thr231に結合し、tauの脱リン酸化に関与するとされるPin1に注目した。まず、Pin1はAPPのリン酸化Thr668に結合した。次いで、Pin1 1^<-/->MEF細胞を用いて、C99とtauを共発現した。Tauを単独発現させると、Pin1の有無に関わらず、tauのリン酸化は一定であった。TauとC99を共発現した場合、Pin1の存在によって、tauの脱リン酸化が亢進し、Pin1が存在しない時には、tauの脱リン酸化はみられなかっただけでなく、リン酸化の亢進がみられた。つまり、Pin1はC99と共同して、tauの脱リン酸化に関与し、Pin1が欠乏すると、tauのリン酸化が亢進するのである。このことから、アルツハイマー病脳において、tauの異常リン酸化過程に、C99/Pin1の関与が推測された。
中国における日本型自動車流通システムの多様性に関する研究

中国において日本型自動車流通システムは高く評価されている。本研究は、その背景と実態を中国の自動車産業政策及び自動車流通政策に焦点をあて、日系企業の戦略行動との関係から検討した。それによれば、中国の政策は、第1に日本型自動車流通システムの普及、第2に意図しない差異という重要な変化をもたらした。そして、この意図しない差異には、ふたつの自動車流通システムへの参画及び卸売り機能の外部化が含まれている。本研究は、これまで世界的に評価されてきた日本型自動車流通システムが、何故、中国自動車市場で多様化しそしまうのかを日系自動車メーカーにとっての「意図しない差異」という視点から明らかにするものである。・さて、本年度(22年度)の研究課題は「中国の自動車産業・流通政策の経緯・動向分析」であり、主に文献・資料研究の方法によって研究がなされた。・その結果、「生産重視から消費者・流通重視へ」の自動車産業・流通政策の転換の後に出された政府意見「流通を活発化させ,消費を拡大に関する意見」(国務院、2008年12月)、「流通を活発させ,消費を拡大」のテレビ電話会議(商務部、2009年3月)、「自動車消費を促進するための意見」(商務部、2009年3月)によれば、中国政府は、中古車市場を含めた中国自動車流通システムにおける多様性を奨励していることが明らかとなった。・すなわち、これまで中国自動車流通は「自動車ブランド販売管理実施弁法」によって垂直的・閉鎖的なシステムが志向されていると考えられてきたが、今後は、必ずしもそうではなく、したがって、垂直的・閉鎖的システムを内容とする日系自動車メーカーによる日本型自動車流通システムの推進にどのような影響を与えるかを考えていくことが重要となった。・最後に、以上のことを踏まえ、次年度に実施するインタビュー調査の項目について検討した。・なお、本年度における研究の成果は、中間報告として学会で報告した。メーカー主導の一律的な日本型自動車流通システムが中国自動車市場で何故多様化するかについて明らかにすることが本研究の的である。・本年度(23年度)の研究課題は、副課題1「中周の自動車産業・流通政策の経緯・動向分析」及び副課題2「日系自動車メーカーの合弁先企業の経営戦略分析」である。副課題1は、前年度からの引き継ぎであるが、中国における自動車産業政策及び自動車流通政策の最近の動向をみると、ますます流通及び消費への注視傾向が強くなってきていることが明らかとなった。これについては直近の政策動向を踏まえ、ディスカッションペーパーにおいて明らかにした。また、中国における自動車流通網が内陸にまで及びつつあることから、中小都市における自動車消費の動向についてもディスカッションペーパーに纏めた。・次に副課題2であるが、中国の自動車産業政策では合弁先は2社までと定められて部り、広州汽車はトヨタとホンダ、東風汽車はホンダと日産と組んだ。また、第一汽車とトヨタは包括提携関係を結んだ。これを日本企業側からみれば、トヨタとホンダはそれぞれ2社の中国企業と合弁し日産は1社のみである。その結果、日系企業においては2チャンネル体制と1チャンネル体制の2つのグループに分かれたが、そのことがブランド・イメージの統一性に関わる戦略上の差異を生じさせた。つまり、日系自動車メーカーの流通システムにおける多様性は中国自動車流通政策と深く関連している。また、流通網の整備にあたっても沿海部を重視してきたトヨタとホンダ、そして、内陸部を重視してきた日産との差異も明らかとなった。一方、自動車交易市場は中国自動車流通において地方政府によって政策誘導された固有な存在であるが、そこへの出店も日系自動車流通システムの多様性ももたらす結果となっていることが明らかとなった。これらの研究成果については、その一部を学会誌に掲載した。本研究は、中国自動車市場において日本型自動車流通システムが多様化する理由を明らかにするものである。最終年度である本年度(平成24年度)の研究課題は「中国の自動車産業・流通政策の経緯・動向分析」及び「日系自動車メーカーのチャネル戦略分析」であり、これまでの研究で明らかとなったように、両者は密接に関連している。研究方法としては、前者については、主に文献・資料研究によって、また、後者については、現地インタビュー調査によって研究が進められた。自動車流通システムを段階別にみると、日本型自動車流通システムでは、基本的に卸売り機能が内部化されているが、中国のトヨタについては、合弁2社のうち1社において卸売り機能が外部化されており、日系自動車メーカーにあっては、中国自動車市場において、卸売り段階における多様性の存在が明らかとなった。ただし、垂直統合という点でみるなら、両者は同じ狙いを持つものと考えて良い。続いて、小売り機能についてみると、何れの日系自動車メーカーにあっても、日本型のディーラーマネジメント、即ち、垂直統合が実施され、かつ、そのもとで店舗運営が行われていることがインタビュー調査から明らかとなった。そして、そうした日本型ディーラーシステムの中国自動車市場における浸透が、中国の自動車流通政策に基づいたものであることはいうまでもない。

このように、中国における日系自動車メーカーは、合弁先との関係から、必ずしも、日本と同じ自動車流通システムを全体として構築しているわけではないが、小売り機能に限ってみるなら、ディーラーに対するマネジメント、また、店舗の運営について、日本的な仕組みが導入され、幅広く実践されている。言い換えれば、日本型ディーラーシステムは中国自動車市場で評価されており、日系自動車メーカーの競争力発揮のための基盤となっている。設定した副課題については、順次、解を見出しており、おおむね順調に推移している。また、自動車交易市場の存在については、研究計画を推進していく中であらためてその重要性を認識し、調査等を通じた解釈を加えるなど、より発展的な研究をおこなっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。中国自動車流通市場には世界的に希な自動車交易市場があり、その存在は日系自動車流通システムが多様化する一つの要因となっている。そこで、今後の研究においても、この自動車交易市場を調査対象として取り上げ、研究の質的向上を図っていく。
産業の競争構造と投資:理論的及び実証的研究

本研究プロジェクトでは,企業の投資に関する経済分析をテーマとして,研究を進めた.研究をスタートさせるにあたっての研究代表者および2名の研究分担者の共通の認識は,戦後の日本企業と欧米企業の投資ビヘイビアにはかなり本質的な差異が存在するというものであった.その差が何であり,またそれが彼我の経済システムのいかなる相違に起因するのかを解明してみたいという関心が, 3名をこの共同プロジェクトに結び付けた因縁であった.われわれは,相互のディスカッションの過程で,第1の疑問に対する答えを次の4点に集約してみることにした.それらは, [1]日本企業は欧米企業に比べて投資ホライゾンが長い, [2]市場占有度の拡大ないしは高成長への志向が強い, [3]利益率,株価志向が弱い, [4]リスク許容度が低い,ということである.伊藤は,政府の産業政策のおり方および企業間の取引慣行から[1], [2]を説明した.小林は,終身雇用,年功賃金という日本企業の雇用慣行から[2], [3]を,また,市場の「コンテスタビリティ」という観点から[4]を説明した.また,西村は,金融システムのあり方と[3], [4]の関連について,理論的モデルを構成して分析を試みた.また,伊藤,小林は,日本の自動車産業を対象として,ヒアリングやデータ分析によって,いくつかの仮説の検証を試みた. (この研究は,他の研究プロジェクトの成果として出版される予定である. )幸い,本研究参加者は3名とも同じ学部に所属しており,日常のディスカッションやいくつかの学部セミナーでの報告が,研究を深化させる上で大きな役割を果たした.このような研究機会を与えていただいたことに感謝致します.本研究プロジェクトでは,企業の投資に関する経済分析をテーマとして,研究を進めた.研究をスタートさせるにあたっての研究代表者および2名の研究分担者の共通の認識は,戦後の日本企業と欧米企業の投資ビヘイビアにはかなり本質的な差異が存在するというものであった.その差が何であり,またそれが彼我の経済システムのいかなる相違に起因するのかを解明してみたいという関心が, 3名をこの共同プロジェクトに結び付けた因縁であった.われわれは,相互のディスカッションの過程で,第1の疑問に対する答えを次の4点に集約してみることにした.それらは, [1]日本企業は欧米企業に比べて投資ホライゾンが長い, [2]市場占有度の拡大ないしは高成長への志向が強い, [3]利益率,株価志向が弱い, [4]リスク許容度が低い,ということである.伊藤は,政府の産業政策のおり方および企業間の取引慣行から[1], [2]を説明した.小林は,終身雇用,年功賃金という日本企業の雇用慣行から[2], [3]を,また,市場の「コンテスタビリティ」という観点から[4]を説明した.また,西村は,金融システムのあり方と[3], [4]の関連について,理論的モデルを構成して分析を試みた.また,伊藤,小林は,日本の自動車産業を対象として,ヒアリングやデータ分析によって,いくつかの仮説の検証を試みた. (この研究は,他の研究プロジェクトの成果として出版される予定である. )幸い,本研究参加者は3名とも同じ学部に所属しており,日常のディスカッションやいくつかの学部セミナーでの報告が,研究を深化させる上で大きな役割を果たした.このような研究機会を与えていただいたことに感謝致します.昨年度の我々の研究は、主に理論的な分析を中心になされたが、投資活動が競争構造と密接な関係にあることを、様々な側面において明らかにすることができた。伊藤は、戦後の日本の企業成長の原動力のひとつが、一時的な保護政策のもとでの投資競争にあることを明らかにした。このような投資競争が生じるのは、市場が寡占的であり、投資が企業の長期的ポジションに影響を及ぼすからである。伊藤はこの研究を発展させ、政府の政策決定と民間の対応との間にある依存関係についても分析した。政府による補助金政策や貿易制限政策がどのように実施されるかということが経済のパーフォーマンスによって影響を受けるとしたら、民間企業の投資行動も、そのようなパーフォーマンスに影響を及ぼすような側面を持つであろう。西村は、完全競争的ではない経済で、さらに情報が不完全であるときに、各経済主体がどのように情報を利用し、それがマクロ的にはどのような結果をもたらすかを主として分析した。これは、企業の投資が常に不確実性のもとでなされることを考えると、投資行動の解明に重要な結果を与えている。小林は、投資行動が企業の財務的側面とどのようなかかわりを持つか、理論的モデルをつくって分析している。古典的なモジリアーニ・ミラーの世界では、両者間に関係はないが、情報やリスクといった側面を明示的に考えることで、様々な興味ある結果を導出することができる。小林は、今後この結果を、自動車産業など・ケースで検記する予定である。
Osmolyteを利用したタンパク質の折りたたみ機構の解析

まず、タンパク質SSIの構造形成機構を速度論的に探るため、pHジャンプ法をCDあるいはNMR測定を組み合わせて行った。実験条件としては4°C、pH5付近でSSIがnative構造が保持している状態から、pH1.5付近で低温変性後の特殊な3次構造(D′)をとる状態までのジャンプとした。これより、1、CDによると。3次構造が一度かなり壊れてから序々にD′構造が形成されることがわかった。これは、native構造とD′構造のCDスペクトル上の交点で測定を行うことで精密に測定できた。2、NMR法では、まずジャンプ直後、装置のdead timeに大きな構造転移があり、100秒かけてαヘリックスC端側にあるHis106やタンパク質内部にあるTrp86のシグナルが別の転移を示し、さらに320秒で最終的なD′構造となることがわかった。また、SSI主鎖ププチド結合のNH水素の重水素交換反応を2次元NMR法により全シグナルを分離して観測することにより、βシート中でも部位によて異なるゆらぎを持っていることを明らかにした。この際、大腸菌による発現システムによって同位体標識を行ったSSIも用いた。Osmolyteの効果は、まず安定性を熱測定によって調べた。この結果、最も効果の高かったsarcosineでは変性温度が10°C以上上昇し飛躍的に安定化に寄与することが明らかになった。ところが、変性の可逆性は逆減衰してしまい、平衡系として扱えないことがわかった。また、低温変性は、Osmolyteの添加によって0°C以上では明確に観測できないことがわかった。これらの結果は、Osmolyteが熱容量変化を減少させること、変性状態のタンパク質とも強く相互作用することを示唆するものである。
活断層モニタリングの手法開発とその実践による断層パラメータの推定

山崎断層のセグメントの一つである安富断層を横切る地下坑道に複数の地震計を設置し、その上を断層の走向に沿って通る中国自動車道からのトラフィックノイズを高サンプリングで連続的に観測した。この記録を地震波干渉法を用いて解析することで、断層帯において観測点間を伝わる表面波と実体波と考えられる波の抽出に成功した。この結果は、トラフィックノイズの連続観測によって、断層帯の地下構造が推定可能であることを示した。地震は活断層において繰り返し発生する。活断層近傍における構造の調査から、断層運動前の短中期的な物理現象を理解し、地震発生サイクルにおける時間的位置づけを明らかにすることを目指した研究を行う。本研究では近い将来中規模地震の発生が考えられる山崎断層帯(兵庫県)を研究の対象とし、特に自動車道からの人工ノイズ(トラフィックノイズ)を用い、地震波干渉法を利用して断層の構造を探査することを目的とする。山崎断層系の一つであり左横ずれ成分を伴う安富断層の一部直上を、中国自動車道が通っている。その地下数mで断層を水平に貫く安富観測抗内を中心に、観測を行った。設置した機材は、固有周期2秒の三成分速度型地震計であり、1 kHzサンプリングでトラフィックノイズを記録した。昨年度は、観測抗から数100 m内にある2つのトンネルも利用して、自動車道と安富断層の走向に沿う方向の測線でトラフィックノイズの観測を行い、表面波の伝播の抽出を行った。本年度は鉛直方向に伝播する波を抽出する目的で、観測抗内のみに6台の地震計を5 m間隔で直線状に設置し、トラフィックノイズの観測を行った。尚この際、観測を通じて見つかった、観測機器固有の記録時の問題を解決した。2か月間の連続観測記録を、地震波干渉法を用いて解析を行った結果、任意の地震計を疑似震動源とし、他の地震計をそれに対する観測点として伝わる波の抽出に成功した。以上の様な波の伝播の抽出に成功したことは、断層地下浅部構造の推定が可能であることを意味している。活断層において地震は繰り返し発生する。活断層近傍における断層運動前の短中期的な物理現象を理解し、地震発生サイクルにおける時間的位置づけを明らかにするための研究を行う。本研究では近い将来中規模地震の発生が指摘されている山崎断層帯(兵庫県)に着目する。本年度は、山崎断層系の一つであり左横ずれ成分を伴う安富断層を地下で水平に貫く安富観測抗内に、固有周期2秒の三成分速度型地震計6台を設置した。地震計と観測された記録を収集するロガーとは一台ずつ対になっており、1セットに付き24GBのCFカード(4GB*6枚)を用い、1khzサンプリングで記録の収集を行った。なお新規に購入した地震計とロガーはこのうちの4セットである。また、観測抗内に設置されたロガーの時計をGPSで正確に合わせるために、観測抗内にGPSのリモートアンテナを設置し、地表に設置されたGPSのアンテナで受信したのシグナルを再放射できるようにした。観測はオフラインで行ったため、観測開始後二度データ交換の作業を行った。この観測抗の約6m直上には断層に沿うように中国自動車道が走っており、本研究では主として車が通過する際に発せられるノイズの記録を連続収集した。おおむね良好に地震計の記録が得られていたが、一観測点で明瞭な記録が得られていなかった。これら記録されたノイズの解析を、地震波干渉法により試験的に開始した。別に設置されていた地震計の記録と併せて行った解析では、各観測点間を伝わる表面波(特にRayleigh波)の伝播を抽出することができた。所記の予定通り、安富断層を貫く観測抗に地震計とGPSアンテナを設置し、実際に記録が取れることも確認した。しかし一観測点で期待された様な記録が得られておらず、今後の解析に影響が及ぶ可能性もある。また予算の都合により観測点数を減らしたため、同様に解析結果の信頼性に影響が現れると思われる。平成23年度に得られた記録を中心に、解析作業に移る。地震波干渉法を改良して利用することで、顕著な表面波ではなく、構造探査に有効であるにも関わらずこれまで検出が困難であった実体波の検出を目指す。また観測記録が明瞭でない部分の影響を定量的に評価する。これにより、地下の1次元以上の構造が抽出できることを確認する。また、記録収集期間における解析結果の時間変化についても、季節変動を考慮しつつ解析を進める。継続して記録を収集するために、メディアの交換作業を定期的に行う。このためのメディア代、高速道路利用料、ガソリン代を計上している。また解析作業により得られた成果の一部を国内外の学術会議で発表する予定である。
移動端末対応疑似サーバシステム

本研究では、移動などによりノート型パソコンなどの移動端末の電源を落してもネットワーク上で実行途中のアプリケーションを継続して実行するためのシステムについて研究した。その結果、X11R6に対応した移動端末対応疑似サーバおよびその管理システムを開発し、携帯電話を含む電話回線を介してSUNワークステーションとMacintoshの間で動作を確認した。また一般のユーザが本システムを簡単に利用するためのユーザインターフェースについても検討を行ない、Macintoshに似たインターフェースを作成した。一方で時間の関係から具体的な通信性能と通信費を測定することはできなかった。但しエディタやワープロ、表計算などの文字主体のアプリケーションならば電話回線でも違和感なく利用できるという感触を得た。最後に本研究より、現行のX11R6で本システムを実現するためにはカラーマップの割り付けとウィンドウマネージャの介在が極めて問題であることが判明した。したがって今後は既存のアプリケーションに影響を与えないようにX11R6を改良する必要があるだろう。
超好熱始原菌T.kodakaraensisKOD1の全遺伝子機能解析

1.超好熱菌遺伝子破壊系の改良ΔpyrF株を宿主とし、pyrFマーカー遺伝子の上流および下流に相同領域を導入することにより、一段階目の相同組換えの後にpyrFマーカー遺伝子がゲノム上から脱落する系を開発した。この系では原理的には如何なる数の遺伝子でも破壊・導入が可能となる。2.中央代謝経路の解明炭素中央代謝に着目し、ゲノム情報からその存在が不明であった多数の遺伝子を特定した。(1)我々は超好熱菌ゲノム上でそれまで特定されていなかった糖新生経路の鍵酵素はfructose 1,6-bisphosphatase(FBPase)遺伝子を同定し、遺伝学的にその機能も証明した。(3)今まで知られていた経路と異なる構造的に新規な3種の酵素から構成される新しいキチン分解経路を発見した。Reverse gyraseは唯一の超好熱菌固有の酵素である。Reverse gyraseの特徴的な構造と本酵素が超好熱菌の生育に必須であると考「えられてきたことから、生命が超好熱菌として誕生したという説は否定されていた。我々はreverse gyrase遺伝子の破壊株を取得することに成功し、破壊株が90°Cで生育することを見いだした。したがって、reverse gyraseが存在しない条件であっても生命が高温環境(90°C)で誕生し得たことを実験的に証明した。本年度の研究成果は主に以下の通りである。1)新型酵素の発見:酵素活性が検出されているものの、超好熱菌ゲノム上に従来酵素と相同性・を示す遺伝子が存在しないタンパク質は多数存在する。糖代謝に関与するfructose 1,6-bisphosphate aldolase、fructose 1,6-bisphosphataseなどはその代表例であるが、我々はこれらをコードする遺伝子を同定し、構造的に新規な酵素であることを明らかにした。3)超好熱菌遺伝子破壊系の改良:我々はpyrF遺伝子をマーカーとしてKOD1株の遺伝子破壊を進めてきたが、本年度にtrpE遺伝子、hisD遺伝子などもマーカーとして使用可能であることを見出した。これらの遺伝子が全て破壊された変異株を構築中であり、これが単離されれば、KOD1株の複数の遺伝子を破壊した二重、三重破壊株を作製することが可能となり、より詳細な遺伝子機能解析が可能となる。今年度は(1)網羅的遺伝子破壊研究のための宿主細胞の構築、(2)DNA chipを利用したtranscriptome解析、(3)多数の遺伝子および発現産物の生化学的解析、(4)遺伝子破壊による遺伝子の生理学的機能の解析、を進めた。以下に本年度成果の例をいくつか挙げる。・KOD1株の全ゲノム解析に基づいたDNA chipの作製とtranscriptome解析KOD1のゲノム上に存在する2,306個の遺伝子の内、2,226個の遺伝子に対応するDNA chipを作製し、温度変化や炭素源の違いに着目した解析を行った。標識には異なる蛍光波長をもつ色素Cy3(570nm)およびCy5(670nm)を用い、Cy3-dUTPまたはCy5-dUTP存在下での逆転写反応により色素を導入した。異なる条件下で培養したtranscriptomeを比較した結果、培養条件により転写が制御されている遺伝子を多数同定することができた。・遺伝子破壊による機能解明我々はKOD1株内に新型FBPase(Tk-Fbp)の存在を発見し、本酵素がFBPに対して特異性の高い酵素であること、糖新生条件下でその発現量が増加すること、ゲノム解析が行われた全ての超好熱始原菌内にTk-Fbpの相同遺伝子が存在することなどを報告してきた。一方で、他の超好熱始原菌では異なる遺伝子の産物であるinositol monophosphatase(IMPase)がin vitroで高いFBPase活性を示したことから超好熱始原菌においてはIMPaseがFBPaseの役割を果たしていることが提案された。そこで、我々が開発した遺伝子破壊系を利用して、それぞれの遺伝子の欠損株を作製した(ΔTk-fbp,ΔTk-imp)。

2種の欠損株をデンプンまたはピルビン酸を含む最少培地で培養したところ、デンプン存在下では双方の欠損株が宿主細胞と同等の生育を示したのに対して、ピルビン酸存在下ではΔTk_imp株は生育したが、ΔTk-fbp株は生育できないことが明らかとなった。この結果より、KOD1株内で糖新生に関与する遺伝子はTk_fbp遺伝子であり、Tk-impはFBPaseとして機能していないことが判明した。したがって、超好熱始原菌における真のFBPaseは我々の同定した遺伝子産物であることが強く示唆された。本年度の主な研究成果は以下の通りである。1)Thermococcus kodakaraensis全ゲノム塩基配列のannotation : KOD1株ゲノムは2,088,737bpからなり、タンパクをコードしているORFは2,306個と推定された。翻訳後アミノ酸配列をNCBI COGsデーターベースを対象とした相同性解析および機能推定を行ったところ、1165個のORFについてはなんらかの機能推定が可能であったが、残りは推定不可能であった。また261個についてはCOGsデータベース中に相同タンパクがなく、T.kodakaraensis固有のタンパク質であった。2)T.kodakaraensisの遺伝子破壊(交換)系の利用:我々が構築した超好熱菌特異的遺伝子破壊系を利して、超好熱菌における真のfructose 1,6-bisphosphataseを同定した。また、この系を利用し、超好熱菌固有の唯一の遺伝子であるreverse gyrase遺伝子を破壊した。その結果、これまで地質学的研究や進化系統的研究から示唆されてきたhot origin of lifeが、超好熱菌に必須であると考えられ、かつ2つの異なるタンパク質ファミリーが進化した後に出現した酵素であるreverse gyraseの存在により否定されていたが、少なくとも90°Cまでは生命が発生し得るというシナリオが成り立つことを示すものである。3)新規な代謝系の発見:我々は新規なchitin分解系を発見した。ChitinはTk-ChiAにより2糖にまで分解され、生じたGlcNAc_2はTk-Dacにより非還元末端のアセチル基が除かれ、その後、Tk-GlmAによりGlcNとGlcNAcに分解される。さらにGlcNAcもTk-DacによりGlcNとなる。生じたGlcNはhexokinaseホモログにより、GlcN6Pにリン酸化、最終的にGlcN6PがTk-GlmDによりFru6Pに変換されて解糖系へ入り利用される。我々はまた新規phosphopentomutaseおよび2-deoxyribose 5-phosphate aldolaseを同定することにより、解糖系とpentose代謝を結ぶ新しい代謝経路を発見した。さらにKOD1株由来hosphoenolpyruvate carboxykinase、malic enzymeを解析することにより細胞内C3およびC4化合物の代謝様式を明らかにし、さらに新型succinyl-CoA synthetaseを同定することにより、C4からC5化合物への変換経路を明らかにした。今年度も比較ゲノム、生化学的解析、遺伝子破壊技術を利用した遺伝子の機能解明を進めた。その結果、以下の遺伝子の機能が解明できた。
核蛋白質を核膜孔へターゲットする蛋白質複合体の同定及びその構成因子の機能解析

核蛋白質の核内への移行は、核局在化シグナルに依存した細胞質から核膜孔までの第一のステップと、エネルギーを利用して核膜孔を通過する第二のステップに大きく分けられる。本研究者は、in vivo培養細胞実験系とセミインタクト細胞を用いたin vitro実験系を駆使して、第一のステップに働く細胞質因子の解析を進めた。in vitro実験系を用いた解析より、核蛋白質は細胞質抽出液中で、安定な蛋白質複合体を形成し、この複合体自身が他の因子を必要とせずに核膜孔へ結合する活性をもつことを見い出した。この複合体を、その活性に基づいて「核膜孔ターゲティング複合体」と名付けた。この複合体を構成する因子を精製し、その中の58kDaと97kDaの因子が活性に必須であることを明らかにした。この2因子の部分アミノ酸配列を決定し、遺伝子クローニングに成功した。これらのrecombinant蛋白質を用いた解析から、58kDa因子は、核局在化シグナルを認識し、核蛋白質とともに核内に移行することが明らかとなった。一方、97kDa因子は、核局在化シグナルとは結合せず、58kDa因子に結合することによって3者の複合体を核膜孔にまでターゲットする活性を有することがわかった。更に、58kDa因子に対するアフィニティー精製抗体を、生きた培養細胞の細胞質に微小注入すると、同時に注入したSV40T抗原の核局在化シグナルをもつ核蛋白質の核内移行が阻害され、この因子が生きた細胞内で確かに核蛋白質輸送を担うことが証明された。本研究により、核蛋白質輸送の基本的pathwayの分子機構の全容を明らかにする上で重要な足がかりを築くことができ、当初の研究目的は十分に達成できたと考えられる。
有機硫黄化合物の特性を利用する新規な可視光多置換ヘテロアレーン合成法の開発

カルボニル基のα位にスルフィドを導入したオキシインドール誘導体の可視光酸化還元触媒共存下での二量化反応について調査した。可視光酸化還元触媒を用い青色LED光照射下、大気中反応を試みることで、効率的に目的の二量体を与えることが明らかとなった。さらに、収率の向上を目指し、フェニルチオ基をベンゾチアゾール基で置換することを試みたが、生成物が極めて不安定であったため、これを断念した。一方、本二量化反応の基質汎用性について調査したところ、環状イミドや鎖状カルボニル化合物(エステル、アミド、およびケトンのカルボニル基)のα位にフェニルチオ基を導入した化合物では、いずれも目的の二量体を与えず、ほとんど基質原料が回収された。このことから、先の二量化反応は硫黄官能基だけでなく基質構造の寄与も大きいことが判明した。他方、硫黄官能基の脱硫置換反応を利用する新しい炭素ー炭素結合形成の検討においては、ベンジル位にフェニルスルフィドを導入した基質を用いた場合、可視光酸化還元触媒反応条件下では酸化反応が進行して生成したスルホン体や脱硫に伴って酸素または水が付加したアルデヒドが主として生成し、炭素求核剤との連結反応は進行しなかった。一方、同スルフィドを酸化して得たスルホンに対して可視光酸化還元触媒反応を試みたところ、オレフィン体と反応させることで、スルホンの脱離とともにアルケニル化が進行した生成物を得ることに成功した。カルボニル基のα位にスルフィドを導入したオキシインドール誘導体に対し、触媒としてRu(bpy)3Cl2やEosin Yを用い、460 nmの青色LED光照射下、大気中反応を試みると目的の反応が効率よく進行した。この結果をうけ、N-メチルスクシンイミドのカルボニル基のα位にフェニルチオ基を導入した化合物を調製し、先と同様の条件下にて反応を試みたものの、目的の二量化生成物は全く得られなかった。また、フェニル酢酸メチルやそのアミド誘導体、アセトフェノンに対しフェニルチオ基を導入した鎖状のスルフィド体も同様に調製し、反応を試みたが、いずれの場合もスルフィドの酸化によりスルホンやスルホキシドが生成するだけで、二量化反応は進行しなかった。さらに、酸化反応の影響を受けないスルホンを基質とした場合においても、反応は進行しなかったことから、先の二量化反応は硫黄官能基だけでなく基質構造の寄与も大きく、本反応の基質汎用性の獲得には、基質構造を更に改良する必要があることを明らかとした。また、前述の反応開発と並行して、脱硫を伴う置換反応も検討した。ベンジル位にフェニルスルフィドを導入した基質とマロン酸ジエチルやアセト酢酸エチルなどの求核試薬の当量混合物を可視光酸化還元触媒共存下、青色LEDを照射して攪拌したところ、スルフィドが酸化されて生じたスルホキシドや脱硫後に酸素または水が付加して精製したと考えられるアルデヒドが主生成物として得られた。一方、ジフェニルエチレンとの反応では脱硫とともにアルキニル化が進行した化合物が得られた。これらは、スルホンまたはスルフィドを利用することで脱硫を伴う新たな官能基導入が可能であることを示しており、今後の反応開発において極めて重要な成果である。このことから、当該研究は概ね順調に進展したものと判断される。現状において、オキシインドール誘導体の二量化の反応条件は確立したが、他の基質への適応が適っていない。次年度以降は二量化の汎用性の獲得を目指した基質検討を進めるため、異なる硫黄官能基の導入を検討する。また、新たに見出すことが出来た脱硫を伴う炭素ー炭素結合形成反応について詳細を調査するため、カップリング対象をスクリーニングする。併せて、反応メカニズムを明らかにする目的で、基質の電気化学特性の調査を進める。

この結果をうけ、N-メチルスクシンイミドのカルボニル基のα位にフェニルチオ基を導入した化合物を調製し、先と同様の条件下にて反応を試みたものの、目的の二量化生成物は全く得られなかった。また、フェニル酢酸メチルやそのアミド誘導体、アセトフェノンに対しフェニルチオ基を導入した鎖状のスルフィド体も同様に調製し、反応を試みたが、いずれの場合もスルフィドの酸化によりスルホンやスルホキシドが生成するだけで、二量化反応は進行しなかった。さらに、酸化反応の影響を受けないスルホンを基質とした場合においても、反応は進行しなかったことから、先の二量化反応は硫黄官能基だけでなく基質構造の寄与も大きく、本反応の基質汎用性の獲得には、基質構造を更に改良する必要があることを明らかとした。また、前述の反応開発と並行して、脱硫を伴う置換反応も検討した。ベンジル位にフェニルスルフィドを導入した基質とマロン酸ジエチルやアセト酢酸エチルなどの求核試薬の当量混合物を可視光酸化還元触媒共存下、青色LEDを照射して攪拌したところ、スルフィドが酸化されて生じたスルホキシドや脱硫後に酸素または水が付加して精製したと考えられるアルデヒドが主生成物として得られた。一方、ジフェニルエチレンとの反応では脱硫とともにアルキニル化が進行した化合物が得られた。これらは、スルホンまたはスルフィドを利用することで脱硫を伴う新たな官能基導入が可能であることを示しており、今後の反応開発において極めて重要な成果である。このことから、当該研究は概ね順調に進展したものと判断される。現状において、オキシインドール誘導体の二量化の反応条件は確立したが、他の基質への適応が適っていない。次年度以降は二量化の汎用性の獲得を目指した基質検討を進めるため、異なる硫黄官能基の導入を検討する。また、新たに見出すことが出来た脱硫を伴う炭素ー炭素結合形成反応について詳細を調査するため、カップリング対象をスクリーニングする。併せて、反応メカニズムを明らかにする目的で、基質の電気化学特性の調査を進める。
遺伝子改変動物を用いた活性型ビタミンDによる癌予防・治療評価系の構築

活性型ビタミンDの生合成経路の鍵酵素であるビタミンD1α位水酸化酵素(!αOHase)の欠損マウス(!αOHase-/-)を作出し,安定した表現型を示す系統を樹立した.表現型解析の結果,ビタミンD受容体遺伝子欠損マウス(VDR-/-)と同様に,成長不全,軟骨の肥大化・低Ca血症・高PTH血症・骨形成不全の所見が認められた.この表現型異常の大半は低Ca血症が主要因であるため,高Ca補給飼育を行なった結果,ほぼ完全に正常に回復した.そこで,高Ca含有飼料にてこれらのマウスを飼育しながら,交配によりダブルノックアウトマウスの作出を現在試みている.ダブルノックアウトマウスが作出できれば完全なビタミンD不応性固体となるため,外的に移入する癌細胞に対してビタミンD誘導体の抗腫瘍作用を解明することが可能となる.また,平成19年度には,細胞レベルでVDRノックダウン細胞を樹立し,骨形成におけるビタミンDの作用がVDR依存的なもの,あるいはリガンド依存的なものの両方があることを明らかにした.特に,VDRをノックダウンした骨芽細胞の方が細胞増殖や分化が亢進したことから,骨芽細胞の増殖・分化にはVDRがネガテイブレギュレーターとして機能していることが明らかとなった.このような作用は,骨芽細胞だけでなく癌細胞においても認められる可能性が高く,現在,癌細胞においてもVDRノックダウンによる効果を解析している.また,新規ビタミンD誘導体として,in vivoにおける副作用となるCa代謝調節作用を弱める構造モチーフを持つ2α-Fluoro-19-nor-22-oxa-1α,25-D_3(2αF-22-oxa-1,25-D_3)を開発した.in vivoにおける腫瘍形成抑制作用をGFP標識肺癌細胞であるLLC-GFP細胞を移入した野生型(WT)およびVDR^<-/->マウスを用いて評価した結果,2αF-22-oxa-1,25-D_3を投与することで投与量依存的に腫瘍形成が抑制され,血管新生も有意に抑制されることがわかった.また,この作用は宿主にVDRが欠損している場合にも認められたことから,2αF-22-oxa-1,25-D_3の抗腫瘍作用が宿主側のCa調節作用を介するものではなく,癌細胞に対する直接作用によるものであることが明らかとなった.以上より,本研究によってビタミンD誘導体の癌治療効果を解析できる動物評価系を構築し,癌細胞の増殖・転移抑制に優れたビタミンD誘導体の開発への道を拓くことに成功した。本年度は、(1)ビタミンD1α位水酸化酵素(1αOHase)遺伝子欠損マウス(1αOHase^-/^-)の作出と表現型の解析を行い、1αOHase^-/^-とビタミンD受容体遺伝子欠損マウス(VDR^-/^-)のダブルノックアウトマウス[(1αOHase^-/^-)・(VDR^-/^-)]の作出準備を行った。

(2)がん治療薬となる可能性の高いビタミンD誘導体の開発を目的として、2α位に官能基を導入したビタミンD誘導体について活性を評価した。(3)ビタミンD誘導体をがん治療薬として適用する際に問題となる高カルシウム(Ca)血症を惹起しない誘導体として、2α-Fluoro-19-nor-22-oxa-1α,25-dihydroxyvitamin D_3(2α-F-19-nor-22-oxa-1,25-D_3)を開発しがん治療効果を評価した。研究成果は以下のとおりである。(1)1αOHase^-/^-の作出と表現型の解析:F1ヘテロマウスを作出し、ヘテロマウス雌雄の交配により1αOHase^-/^-の作出に成功した。表現型の解析では、リアルタイムPCRにより1αOHase^-/^-では1αOHaseは発現していないこと、副甲状腺ホルモン(PTH)発現が亢進していること、Ca代謝調節関連タンパク質の発現が低下していることがわかった。また、骨形成・成長不全が認められ、特に背骨の湾曲や軟骨の過形成に伴う歩行不全の表現型を呈する個体も見出された。(1αOHase^-/^-)・(VDR^-/^-)マウスの作出に関しては、現在VDR^-/^-と1αOHase^-/^-の交配を開始している。(2)がん治療薬となる可能性の高いビタミンD誘導体の開発として、2α位に様々な鎖長の官能基を導入し、ビタミンD応答遺伝子に対する転写活性を評価した。その結果、2α位へhydroxypropyl基を導入することによりVDR結合性が高くなり高い活性を示すことがわかった。また、導入官能基の末端に水酸基を持つ場合の方が、血中ビタミンD輸送タンパク質(DBP)に対する結合性が高くなることがわかった。(3)ビタミンD誘導体をがん治療薬として適用する際に問題となる高Ca血症の発症を防ぐ新規誘導体として、2α-F-19-nor-22-oxa-1,25-D_3を開発し、標的遺伝子に対する転写活性、Ca代謝調節作用、GFP発現転移性マウス肺癌細胞(LLC-GFP)を移入した野生型およびVDR^-/^-マウスにおける腫瘍形成抑制作用の評価を行った。その結果、高用量投与によっても高Ca血症を惹起することなく、LLC-GFPによる腫瘍形成を著明に抑制する作用を有することを明らかにした。平成18年度から平成19年度にかけて、活性型ビタミンDの生成の鍵酵素であるビタミンD1位水酸化酵素(1α-OHase)の欠損マウス(1α-OHase-/-)を作出し、安定した表現型を示す系統を樹立した。表現型解析を行った結果、ビタミンD受容体遺伝子欠損マウス(VDR-/-)と同様に、成長不全・軟骨の肥大化・低Ca血症・高PTH血症・骨形成不全であることが明らかとなった。この表現型異常の大半は低Ca血症が主要因であるため、Ca補給飼育を行った結果、ほぼ完全に表現型が回復した。そこで、高Ca含有飼料にてこれらのマウスを飼育し、交配によりダブルノックアウトマウスの作出を現在試みている。ダブルノックアウトマウスが作出できれば完全なビタミンD不応性個やため、外的に移入する癌細胞に対する投与したビタミンD誘導体の抗腫瘍作用を解明することが可能となる。また、平成19年度には、細胞レベルでVDRノックダウン細胞を樹立し、骨形成におけるビタミンDの作用がVDR依存的なものあるいはリガンド依存的なものの両方があることが明らかとなった。
超低速ミュオニウムの高効率・高密度生成

ミュオニウムは正ミュオンと電子から構成されるレプトン2体束縛状態である。熱エネルギーのミュオニウム(超低速ミュオニウム)の電子を剥ぎ取りさいかそくすることで超低エミッタンスミュオンビームが実現できる。これは新しいミュオン異常磁気能率(g-2)・電気双極子能率(EDM)の精密測定を可能とするが、ボトルネックは低い正成功率である。申請者らは超低速ミュオニウムを従来より約10倍高い効率で生成する方法を開発した。本課題では新しい穴加工方法を導入することでさらに高効率かつ高密度で超低速ミュオニウムを生成する方法を開発する。今年度は、熱エネルギーのミュオニウムを効率良く生成する方法の開発を行った。2017年7月から約1ヶ月の間、カナダ・ブリティッシュコロンビア大学及び附設原子核物理研究所(TRIUMF)に滞在した。ブリティッシュコロンビア大学先端分光イメージング研究室(LASIR)において、ミュオニウム生成物質として用いるシリカエアロゲルにレーザーアブレーション法で穴加工・溝加工を施し、加工条件を系統的に変化させたサンプルの生成に成功した。これをブリティッシュコロンビア大学キャンパス内にある加速器実験施設であるTRIUMFに持ち込み、そこで利用できるミュオンビームに照射し、真空中での熱ミュオニウムの生成収量を測定した。25サンプルについてミュオニウムの生成データを取得することができた。今回製作した新しいサンプルについてもこれまでと同程度の収量が得られることがわかり、懸念されていたサンプル作成の再現性が確かめられた。計画通りに、穴加工のパラメータ(穴系・ピッチ・深さ)を系統的に変化させたサンプルの作成に成功、ミュオニウム生成収量の測定が実施できた。収量のパラメーター依存性はほぼ予想通りの傾向を示すことがわかった。加えて、弱い磁場中での測定を行い、真空中でのミュオニウムのスピン歳差運動を測定することができた。これによって、真空中に放出されたミュオニウムがスピン偏極していることを確かめた。また、およそ50時間にわたって同一サンプルのデータを収集し、ミュオニウム生成収量が時間とともに変化しないことを確かめることができた。H29年度に取得したデータに基づき、ミュオニウム生成に関する現象論的モデルを構築する。また、過去にJ-PARCで得たデータとの比較を行い、矛盾がないかどうか確かめる。データからスピン偏極度の導出を試みる。これらをまとめて、学術論文として出版する。本研究のアプローチと比較するため、スイス・PSIで開発されているミュオン冷却方法について調査・検討を行う。
造血幹細胞の転写因子GATA-2の転写調節機構と発癌

造血幹細胞の自己複製維持に必要と考えられる転写因子GATA-2の発現制御機構を解析した.GATA-2遺伝子の発現をGFPレポーター蛋白質で解析可能なトランスジェニックマウスを作成し,9.5日胚,13.5日胚において,それぞれpara-aortic splanchnopleura,胎児肝でのGFP遺伝子の発現を解析した.その結果,GATA-2遺伝子の転写制御に必須なシスエレメントを複数同定することに成功した.9.5日胚についてはGATA因子が大きく貢献するエレメントを同定し,報告した.他の2つについては,胎児肝を用いたIn vivo footprinting法によっても何らかの結合因子が生体内で機能している可能性が示された.現在,クロマチン免疫沈降法によって,その領域に結合する因子の同定を進めている.また,トランス因子の絞り込みが難しいエレメントについてはOne-hybrid法を行っている.現在までに機能している可能性のある候補因子として同定したもののうち,2つについては造血幹細胞レベルで機能していることが既報により報告されているが,他の一つの因子については,未だ造血幹細胞での機能は報告されておらず,新規に造血幹細胞の活性を左右しうる因子を同定した可能性がある.これらの発現過剰状態や抑制状態をレトロウイルスベクターを用いて作製し,細胞株において検討することは生体での造血細胞形成の試験管内制御モデルの実現にむけての.今後の課題である.1.GATA-2遺伝子破壊マウスの造血系再建法による必要領域の検証(1)GATA-2遺伝子破壊マウスは,胎生11.5日までに胎内で致死となるが,GATA-2遺伝子を必要とする組織に遺伝子発現をもたらす発現制御領域のもとに,これを発現させるトランスジーンをもつトランスジェニックマウスと交配することにより,胎生致死を回避することが出来る.共同研究者であるミシガン大学エンゲル教授の指導のもとに,GATA-2遺伝子を含む,250kbpの長さの領域をカバーするYACを用いて作られたトランスジェニックマウスは,GATA-2遺伝子破壊マウスの胎生致死を回避することができる.我々はすでにGATA-2遺伝子遠位第1(IS)エクソンの上流3.1kbpの遺伝子発現制御領域が,胎生9.5日胚の造血組織にGATA-2を発現させる機能を担っていることを明らかにした.この遺伝子発現制御領域が9.5日胚において胎生致死をレスキューできるか否かを検証するために,この制御領域にGATA-2 cDNAを融合させた構築のトランスジェニックを作成し,このトランスジェニックマウスとGATA-2遺伝子破壊マウスとの交配を行い,その胎生致死の時期を現在検討している.(2)また,これと同様の手法によって,より詳細な遺伝子制御領域の解析が可能である.すなわち,3.1kbpの中で特に9.5日胚において重要であった26bpの領域を,YAC構築から削ったものを用いてトランスジェニックマウスを作成し,GATA-2遺伝子破壊マウスの胎生致死を回避しないことが明らかになれば,この26bpがYACのような長い領域において機能を持つことが証明できる.2.GATA-2遺伝子発現を規定する上位の転写因子の同定(1)26bpは9.5日胚で重要であったが,13.5日胚の胎児肝においては必須ではないことをトランスジェニックマウス法により明らかにした.新たに13.5日胚の胎児肝造血細胞においてGATA-2を発現させるのに必須の領域を,明らかにしつつある.(1)造血幹細胞の自己複製能維持に必要と考えられる転写因子GATA-2の発現制御機構を解析した.GATA-2遺伝子の発現をGFPレポータータンパク質で解析できるトランスジェニックマウスを作製し,9.5日胚のpara-aortic splanchnopleura,同13.5日胚の胎児肝でのGATA-2遺伝子の発現を解析した.その結果,GATA-2遺伝子の転写制御に必須なシスエレメントを含む領域を同定することに成功した.現在,さらに結合領域を絞り込むために,同トランスジェニック法とin vivo footprint法による解析を行っている.今後は,その結合配列に対するトランス因子を同定するために,One-Hybrid法を行うことを予定しており,フローサイトメトリーにて分取したGFP陽性細胞からcDNAライブラリーを作成中である.(2>造血幹細胞の性質を有した細胞株を作成することは,GATA-2を中心とした転写因子相互作用を解明する点から,今後の解析にたいへん有用である.そこで温度感受性T抗原を,胎児造血幹細胞に発現しているトランスジェニックマウスの作製に取り組み,成功した.今後,同トランスジェニックマウスから得られる血液幹細胞を用いて,血液細胞系の分化に重要な転写因子群の発現プロファイルを網羅的に解析し,分化の方向に働く転写因子群とその拮抗因子群を同定する予定である.同定後,分化に拮抗する因子群を,レトロウィルス系を用いて,分化抑制状態にある各種培養細胞や,分化抗原を発現する骨髄細胞に導入し,分化/脱分化の制御を試みる.造血幹細胞の自己複製維持に必要と考えられる転写因子GATA-2の発現制御機構を解析した.GATA-2遺伝子の発現をGFPレポーター蛋白質で解析可能なトランスジェニックマウスを作成し,9.5日胚,13.5日胚において,それぞれpara-aortic splanchnopleura,胎児肝でのGFP遺伝子の発現を解析した.

その結果,GATA-2遺伝子の転写制御に必須なシスエレメントを複数同定することに成功した.9.5日胚についてはGATA因子が大きく貢献するエレメントを同定し,報告した.他の2つについては,胎児肝を用いたIn vivo footprinting法によっても何らかの結合因子が生体内で機能している可能性が示された.現在,クロマチン免疫沈降法によって,その領域に結合する因子の同定を進めている.また,トランス因子の絞り込みが難しいエレメントについてはOne-hybrid法を行っている.現在までに機能している可能性のある候補因子として同定したもののうち,2つについては造血幹細胞レベルで機能していることが既報により報告されているが,他の一つの因子については,未だ造血幹細胞での機能は報告されておらず,新規に造血幹細胞の活性を左右しうる因子を同定した可能性がある.これらの発現過剰状態や抑制状態をレトロウイルスベクターを用いて作製し,細胞株において検討することは生体での造血細胞形成の試験管内制御モデルの実現にむけての.今後の課題である.