hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性期の皮膚炎におけるTSLPの役割の解明

Thymic StromalLymphoPoietin(以下TSLP)はアレルギー性皮膚疾患の発症に重要であると多数報告があるが、慢性期の皮膚炎症におけるTSLPの役割は明らかではない。我々は、慢性期のTSLPの役割を解析できる皮膚炎モデルを構築し、TSLPが慢性期にも炎症の増悪化に重要であることを明らかにした。またTSLP標的細胞候補として樹状細胞、T細胞を同定した。TSLPレポーターマウスの解析からは免疫細胞からのTSLP産生も確認された。これらの結果は、慢性期の皮膚炎症局所における免疫細胞間相互作用による増悪化メカニズムの更なる解明に繋がることが期待される。Thymic Stromal LymphoPoietin(以下TSLP)は、アレルギー性皮膚疾患の発症開始に重要であると多数報告があるが、慢性炎症における役割は十分に解明されていない。そこで皮膚慢性炎症におけるTSLPの役割を明らかにするために、慢性期になるとTSLPを発現し、TSLPに依存的して慢性皮膚炎が増悪するマウスモデルを探索した。その結果、ある皮膚炎症誘導刺激物質を、マウス耳介に繰り返し塗布することによって、皮膚の肥厚の上昇とともに、TSLP発現が上昇することを見いだした。全身的なTSLPレセプター欠損(以下TSLPRKO)マウスでは、野生型マウスと比較して、初回刺激による皮膚の肥厚に違いは観察されなかったが、繰り返し刺激物質を耳介に塗布してくことによって生じる皮膚肥厚の増加は野生型マウスと比較して有意に減少し、さらに耳介におけるTh2サイトカイン発現も減少傾向がみられた。これらの結果は、皮膚炎症を慢性化させると、TSLPが皮膚の肥厚や炎症性サイトカイン産生細胞の誘導に重要な役割をもつことを示唆している。アレルギー性皮膚疾患患者では、TSLP産生細胞としてケラチノサイトが有名である。しかし、ほかの細胞もTSLP産能があることが報告されているものの、慢性皮膚炎症モデルでは、TSLPが産生されているかどうか、明らかにはなっていない。TSLPと同時に蛍光タンパク質GFPを発現するTSLP-GFPレポーターマウスを用いた解析から、皮膚慢性炎症モデルにおいて、TSLP産生を産生する白血球マーカーCD45陽性の免疫細胞を見いだした。しかし、その割合は、CD45陰性細胞よりも低く、ケラチノサイトがより重要なTSLP産生細胞であると考えられた。前年度の研究活動では、慢性期にTSLPに依存する皮膚炎を発症させるモデルを見いだした。またTSLP産生細胞を同定するために行ったTSLP-GFPレポーターマウスを用いた解析から、皮膚慢性炎症モデルにおいて、CD45陰性細胞だけでなく、CD45陽性の免疫細胞でもTSLPを発現していることを見いだした。TSLPの標的細胞を検出するために海外研究室より分与して頂いた条件的TSLPレセプター欠損マウスの繁殖が安定し、細胞特異的なTSLPレセプター欠損マウスの使用準備が進んでいる。アレルギー性皮膚炎(以下アトピー性皮膚炎)患者は、日本を含めた先進国の子供約15-30%、大人約2-10%を占め、近年さらに増加傾向にある。Thymic Stromal LymphoPoietin(以下TSLP)は、アレルギー性皮膚疾患の発症開始に重要であると多数報告があるが、慢性期の炎症におけるTSLPの役割は十分に解明されていない。そこで皮膚炎の慢性期におけるTSLPの役割を明らかにするために、慢性期になるとTSLPに依存して炎症が増悪化する皮膚炎モデルと、最初の抗原刺激による炎症応答からTSLPに依存する皮膚炎モデルを構築して解析をおこなった。どちらのモデルにおいても、慢性期の炎症時にTSLPレセプター(TSLPR)を欠損するマウスでは、マウス耳介に誘導した慢性期の炎症応答の減少が確認された。この結果は、慢性期においてTSLPが炎症増悪化に重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに樹状細胞やCD4細胞のみでTSLPRを欠損させたマウスでも炎症反応の減弱が観察された。この新規マウスを使用して得られた結果は、TSLPの標的細胞としてこれまで考えられてきた樹状細胞のほかに、新たにCD4細胞の存在を提唱している。さらにCD4細胞がTSLPの標的細胞であることを確認するためには、細胞移入実験等による炎症の増悪化反応などの確認が必要である。またTSLPレポーターマウスの解析から樹状細胞や単球系細胞からのTSLP産生も確認された。まとめると、慢性期の皮膚炎症の局所では、樹状細胞などから産生されるTSLPをCD4細胞が受け取り、起こっている炎症をさらに増悪化できる病原性CD4細胞へ変化させている可能性が示唆された。今回の得られた結果は、慢性期の炎症局所における免疫細胞間相互作用を介した炎症増悪化メカニズムの解明に繋がることが期待される。Thymic Stromal LymphoPoietin(以下TSLP)はアレルギー性皮膚疾患の発症に重要であると多数報告があるが、慢性期の皮膚炎症におけるTSLPの役割は明らかではない。

前年度に発見したTSLP依存的な皮膚慢性炎症を用いて、特に以下3項目について研究を推進する。(1)前年度では、TSLP-GFPレポーターマウスを使用することによってTSLP産生細胞の同定を行ったが、TSLP産生細胞数は、その後の分離・解析等を進めるために十分ではなかった。正確な成果の獲得を目指すために、効率的な細胞分離法の確立とともにマウスの繁殖を含めた詳細な実験計画を作成・実施する。(2)TSLP誘導因子の同定のために、関連すると考えられる遺伝子発現を確認する。(3)TSLP標的細胞の同定・解析を行うために準備している条件的TSLPレセプター欠損マウスに、皮膚慢性炎症を誘導し、TSLPの下流に存在する細胞の検出・機能解析を行う。免疫学
神経疾患における細胞内輸送の障害:細胞質ダイニンの制御と破綻

神経細胞が正常に機能するためには細胞骨格、モータータンパク質によるタンパク質、小胞の輸送、神経突起内の軸索輸送が重要な役割を果たしている。逆に細胞内物質輸送の破綻は中枢神経系の形成不全や神経変性疾患の原因となっている。我々はこれまで滑脳症の原因遺伝子・LIS1の機能解析に取り組み、LIS1が代表的なモータータンパク質である細胞質ダイニンの重要な制御因子であることを明らかにしてきた。本研究課題では(1)細胞質ダイニンの制御にかかる因子の同定、(2)細胞質ダイニン制御因子の神経細胞におけるイメージングによる機能解析、(3)遺伝学的解析によるヒト神経疾患との関連の探索とノックアウトマウスによる疾患モデルの作成(4)モデルマウスを用いた新たな治療戦略の検証に取り組んだ。その結果、(1)細胞質ダイニンとカーゴの結合に際し低分子量G蛋白質のRab6が重要な役割を果たしていることを証明した。(2)後根神経節細胞を用いた実験から、細胞質ダイニンとRab6が結合し、微小管上を走っていることを一分子イメージング法を用いて可視化することができた。(3)滑脳症モデルとして作成したLIS1のヘテロ変異マウスを用いた実験から血液脳関門を通過できるカルパイン阻害剤によって生後の投与でも神経細胞のネットワーク形成が回復し、PETを用いた実験、マウス行動解析の実験から機能的回復が可能であることが証明された。(4)細胞質ダイニンの制御因子として同定したNUDCやPP4のノックアウトマウスの作成に取り組み、遺伝子改変を行ったES細胞の樹立に成功した。
電子線励起の蛍光観察を水中にて実現し、がん細胞や微生物の微細解析を目指す研究

大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡を駆使して相関観察することで、細胞の蛋白質の局在を自然な水環境中で可視化し、細胞や微生物の微細構造解析に向けた基盤構築を目指す。特に、電子線励起の蛍光顕微鏡による相関観察と、抗体ラベル系の開発に注力した。酸化亜鉛・タンパク質蛍光3種・qDot4種類に電子線照射し、CCD撮影した。EGFPとGFP等の蛍光タンパクでは蛍光観察できなかったが、ZnO粒子では数micro meter径の粒子が観察できた。qDotは4種共に凝集を形成し易く、電子線励起蛍光が弱かった。抗体ラベル系は、神経初代培養系とバイオフィルムなどを用いて開発した。本研究では、大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により電子線励起蛍光Cathodeluminescenceの観察を実現し、水中で細胞や微生物の微細構造解析に着手することを目指す。我々が新規に開発した大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)は、専用に開発した3.5cmディッシュ中央にある100nm厚の薄膜上のサンプルを水中または大気中で反射電子検出により観察できる。電子線走査位置ごとの反射電子として薄膜下に戻ってくる量を画像化するため、輝度値の違いによる白黒画像となる。しかし、電子線により高効率で励起でき、高輝度の蛍光を放出できる蛍光物質が未だに見つかっていないために、それをラベル物質として用いた多色観察は未だに実現していない。適した蛍光物質をスクリーニングし、高効率に観察することで、電子線に励起された複数種蛍光の観察実現を目指す。本年度は、電子線照射に対してタフな酸化亜鉛ZnOの粒子に着目し、様々なサイズの粒子を電子線の加速電圧や照射量を変えながら観察した。次にqDotを2種類とタンパク質蛍光2種類の観察を集中的に行った。また、観察装置的にはASEM上部の光学系に通常型CCDとEM-CCDを検出カメラとして設置して観察を行った。結果はEGFPとGFPでは、残念ながら全く蛍光は観察できなかったが、ZnO粒子ではEM-CCDと通常CCDの両方で明解な蛍光が検出でき、EM-CCDでは数micro meterサイズの極めて小さなZnO粒子が観察できた。qDotの結果は、検出限界に近く微妙である。最適な、電子線励起蛍光物質を見つけ、最終的にはこれらの粒子を用いて細胞や微生物の観察を行う。これまでの電子顕微鏡による水中観察では、電子線で高効率で励起できる適した蛍光物質が見つかっていないために、多色観察は実現していない。ここでは適した蛍光物質をスクリーニングすることで、電子線に励起された蛍光の観察実現を目指した。酸化亜鉛ZnOの粒子を観察し、次にqDotを2種類と、タンパク質蛍光2種類の観察を集中的に行った。結果としてqDotの結果は未だ微妙である。しかし、ZnO粒子ではEM-CCDと通常CCDの両方で明解な蛍光が検出でき、EM-CCDでは数micro meterサイズの極めて小さなZnO粒子が観察できたため。細胞中では、タンパク質は相互に作用し、複合体を形成し局在することで機能を果たす。ここでは、大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により励起蛍光の観察を実現し、水中で細胞や微生物の微細構造解析に着手することを目指す。我々が新規に開発した大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)は、3.5cmディッシュ上の水中サンプルを反射電子検出により輝度値の違いによる白黒観察が可能である。しかし、多色観察は実現していない。それは、電子線で高効率で励起できる蛍光物質が見つかっていないためである。適した蛍光物質をスクリーニングすることで、電子線に励起された蛍光の観察実現を目指す。本年度は、酸化亜鉛ZnOの粒子の他に、qDot4種類と、タンパク質蛍光3種類の観察を集中的に行った。また、装置的にはASEM上部の光学系に通常型CCDとEM-CCDを検出カメラとして設置して観察を行った。結果はEGFPとGFP等の蛍光タンパクでは、残念ながら全く蛍光は観察できなかった。しかし、ZnO粒子ではEM-CCDと通常CCDの両方で明解な蛍光が検出でき、EM-CCDでは数micro meterサイズの極めて小さなZnO粒子が観察できた。ラベルに用いた溶液中では、qDotは4種共にアグリゲーションを形成する傾向にあった。このアグリゲーションの可溶化が今後の課題として残った。今後は、このようなスクリーニングから最適な電子線励起蛍光物質を見つける。これらの粒子を用いてラベルすることで細胞や微生物の観察を行う。また、観察対象サンプルの免疫電顕のための抗体ラベル法開発としては、院内感染菌MRSAと神経初代培養細胞で条件を決定して、それぞれをScientific report誌に2報発表した。これまでの電子顕微鏡による水中観察では、電子線で高効率で励起できる蛍光物質が見つかっていないが、ここでは適した蛍光物質をスクリーニングすることで、電子線に励起された蛍光の観察実現に向け進めている。小さな酸化亜鉛ZnO粒子の観察に成功し、次にqDotを4種類と、タンパク質蛍光3種類の観察を集中的に行っている。結果として、qDotの結果は未だ微妙であるが、ZnO粒子ではEM-CCDと通常CCDの両方で明解な蛍光が検出できた。特に、EM-CCDでは数micro meterサイズの極めて小さなZnO粒子が観察できたため。また、抗体ラベル法開発としては、院内感染菌MRSAと神経初代培養細胞で条件を決定して、それぞれをScientific report誌に2報発表したため。

細胞中のタンパク質は相互に作用し、複合体を形成し局在することで機能を果たす。ここでは、大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により水中で蛋白質の局在を高分解能で観察し、細胞や微生物の微細構造解析に着手することを目指す。我々が開発した大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)は、下から電子検出により反射電子数を輝度値の違いで観察し、同時に蛍光ラベルを上から光学顕微鏡観察できる。さらに、電子線により高効率で励起できる蛍光物質を発見すれば、励起蛍光の観察も期待できる。酸化亜鉛・タンパク質蛍光3種・qDot4種類をCCDにより撮影した。EGFPとGFP等の蛍光タンパクでは蛍光観察できなかったが、ZnO粒子では数micro meterの粒子が観察できた。qDotは4種共にアグリゲーションを形成する傾向が出て、電子線励起蛍光が若干弱かった。次に、抗体ラベルする系を開発した。軸索区画化は脊髄等で観察され、脳の初期発生に重要と考えられている。神経初代培養細胞で糖鎖と微小管に対する免疫ラベリング条件を試行錯誤で決定して、軸索区画化を観察したところ、区画化には細胞骨格の特殊な構造と、異なる細胞骨格間での細胞輸送を媒介するタンパク質群の機能が重要であることを西原研究室との共同研究により見つけた。さらに、区画化が起こった時の抗原の蓄積は多角形状に起こることを発見し高分解能で観察した。また、炎症性疾患を引き起こすアクネ菌で、バイオフィルム内の細胞外基質における骨格構造を抗体ラベルし、蛍光顕微鏡と走査電子顕微鏡による相関観察を行った。さらに、その結果をFrontier in microbiology誌で報告した。今後、本検討で好成績だった蛍光粒子を基にさらなる探索を進め、タンパク質や様々の生体物質を高効率でラベルすることで組織・細胞・細菌の観察とそれらの生理機構の解明を進めて行きたい。大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)により、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡を駆使して相関観察することで、細胞の蛋白質の局在を自然な水環境中で可視化し、細胞や微生物の微細構造解析に向けた基盤構築を目指す。特に、電子線励起の蛍光顕微鏡による相関観察と、抗体ラベル系の開発に注力した。酸化亜鉛・タンパク質蛍光3種・qDot4種類に電子線照射し、CCD撮影した。EGFPとGFP等の蛍光タンパクでは蛍光観察できなかったが、ZnO粒子では数micro meter径の粒子が観察できた。qDotは4種共に凝集を形成し易く、電子線励起蛍光が弱かった。抗体ラベル系は、神経初代培養系とバイオフィルムなどを用いて開発した。ZnOでは明解な蛍光が検出できたが、EM-CCDでは数micro meterサイズの極めて小さなZnO粒子が観察できた。しかし、qDotを用いた予備検討では、EM-CCDを使っても結果は微妙であった。そのため、本年度は蛍光観察条件を検討しながら、qDotサンプルとして放出蛍光の波長が異なる数種類をさらに加え、また近年注目される半導体蛍光物質を幅広くスクリーニングする。全体として、スクリーニングの対象幅を拡げ観察条件を変えながら粘り強く研究を行う。
新規抗うつ薬結合蛋白質過剰発現マウスのストレス耐性とうつ病モデル動物の検討

プロテオミクス的手法を用い抗うつ薬結合蛋白質を同定することを目的とする。昨年までSSRIであるミルナシプラン結合蛋白質を同定することを目的に、アミド基に結合するアフィニティーカラムを作成し、ラット大脳のホモジェナイズしたサンプルを添加し、ミルナシプランに蛋白質を結合させた。アフィニティーカラムに結合させた結合蛋白質を高濃度のミルナシプランを添加し、分離抽出した結合蛋白質をCy3蛍光標識した。抗うつ薬を結合させていない対照のアフィニティーカラムからの抽出蛋白質をCy5で蛍光標識し、両サンプルを混合後、一枚の二次元電気泳動ゲルを施行した。蛋白質の解析には、2D解析システム・バリアブル・イメージアラナイザーを用い解析し、Cy3、Cy5の蛍光波長の差からレーザーの波長を変えて測定することで各蛋白質のスポットごとの定量差を比較し、さらに質量分析を行った。この方法で、現在抗うつ薬結合蛋白質を十数個同定した。このプロテオミクス手法を用いて同定した抗うつ薬結合蛋白質の一つが、dynamin-1であることを突きとめた。Dynamin Iは脳にのみ存在している。また、プレシナプスでの神経伝達物質分泌に関与している重要な蛋白質であることが、近年の研究で証明された。Dynamin Iは開口分泌時のカルシウムのセンサーの働きをしている。dynamin-1はGTPaseであるので、GTPase活性を測定することで、薬物がdynamin-1の機能に関与するかを検討し、Sertraline,fluvoxamineなどがdynamin-1のGTPase活性を著名に減少させたことを報告した。現在考えられている抗うつ薬の作用機序の仮説では、うつ病が抗うつ薬を服用しても臨床効果が2週間4週間経たないと軽快しない経時的解離は説明できない。抗うつ薬の作用を受容体だけで説明しようと試みる現在までの仮説では、抗うつ薬の作用機序の根本には迫れず新たな発想が必要となる。そこで受容体以外にも抗うつ薬が作用する可能性があるかを本応募研究ではプロテオミクス的手法を用い網羅的に検索し、分子生物学的方法を用いin vivoで抗うつ薬と結合するかを確認することを目的とする。アミド基を構1造中に持つ抗うつ薬であるSNRIであるミルナシプランをアフィニティーカラムに結合させる。さらに、ラット大脳のホモジェナイズしたサンプルを添加し、薬物に蛋白質を結合させる。高度濃度のアフィニティーカラムに結合させた薬物を添加し、分離抽出した蛋白質をCy3蛍光標識する。抗うつ薬を結合させていない対照のアフィニティーカラムからの抽出蛋白質をCy5で蛍光標識し、両サンプルを混合後、一枚の二次元電気泳動ゲルを施行する。蛋白質の解析には、2D解析システム・バリアブル・イメージアラナイザーを用いる。2D解析システム・バリアブル・イメージアラナイザーでは、Cy3、Cy5の蛍光波長の差からレーザーの波長を変えて測定することで各蛋白質のスポットごとの定量差を比較できる。従って、この方法で抗うつ薬結合蛋白質は、抗うつ薬結合アフィニティーカラムにて抽出した蛋白質が、対照とを比較し増加していることとなる。次に、二次元電気泳動にて抗うつ薬結合蛋白質と検出した蛋白質が何であるのかの同定をするために質量分析機Ion-trap型ESI-MSを使用し、質量分析を行い、蛋白質が何であるかを同定した。昨年までSSRIであるミルナシプラン結合蛋白質を同定した。アミド基を構造中にもつ他の抗うつ薬であるフルボキサミン、スルピリドをアミド基に結合するアフィニティーカラムに結合させる。高濃度のアフィニティーカラムに結合させた薬物を添加し、分離抽出した蛋白質をCy3蛍光標識する。2D解析システム・バリアブル・イメージアラナイザーでは、Cy3、Cy5の蛍光波長の差からレーザーの波長を変えて測定することで各蛋白質のスポットごとの定量差を比較した。次に、二次元電気泳動にて抗うつ薬結合蛋白質と検出した蛋白質が何であるのかの同定をするために質量分析機Ion-trap型ESI-MSを使用し、質量分析を行い、現在抗うつ薬結合蛋白質を十数個同定した。数個の蛋白質はクローニングを終え、現在蛋白質の機能と抗うつ薬との関係を検討している。

抗うつ薬を結合させていない対照のアフィニティーカラムからの抽出蛋白質をCy5で蛍光標識し、両サンプルを混合後、一枚の二次元電気泳動ゲルを施行した。蛋白質の解析には、2D解析システム・バリアブル・イメージアラナイザーを用い解析し、Cy3、Cy5の蛍光波長の差からレーザーの波長を変えて測定することで各蛋白質のスポットごとの定量差を比較し、さらに質量分析を行った。この方法で、現在抗うつ薬結合蛋白質を十数個同定した。このプロテオミクス手法を用いて同定した抗うつ薬結合蛋白質の一つが、dynamin-1であることを突きとめた。Dynamin Iは脳にのみ存在している。また、プレシナプスでの神経伝達物質分泌に関与している重要な蛋白質であることが、近年の研究で証明された。Dynamin Iは開口分泌時のカルシウムのセンサーの働きをしている。dynamin-1はGTPaseであるので、GTPase活性を測定することで、薬物がdynamin-1の機能に関与するかを検討し、Sertraline,fluvoxamineなどがdynamin-1のGTPase活性を著名に減少させたことを報告した。
ラオス南部の農村部における児童のクイ肝吸虫症の罹患要因の検討

ラオス南部の農村部では,タイ肝吸虫感染への高い感染率が公衆衛生上の問題となっている.しかしながら,これまでラオスでは,タイ肝吸虫感染に対する予防プログラムが十分に開発されてきていない.そこで,本研究では,これまでラオスやタイで実施されてきた,タイ肝吸虫感染に関する研究や予防プログラムの成果と課題について情報を収集し,対象地域の住民のタイ肝吸虫感染に関する予防知識,健康問題に関する意識やニーズなどの把握を行い,感染の危険性の高い魚種(リスクフィッシュ)を同定することを通して,効果的なタイ肝吸虫感染に対する予防プログラムを開発することを目的とし,以下の4つの調査および活動を実施した.・ラオスおよびタイの国際機関,教育省・保健省,大学,JICA事務所NGO等を訪問し,これまで両国が実施してきたタイ肝吸虫感染に関する予防プログラムの情報を収集した.また,両国で使用されている保健衛生教育の教科書を分析した.その結果,既にラオスでは,小学校用の教科書の中に,タイ肝吸虫感染に対する予防教育が導入されているが,内容や記述に誤りかおること,治療の方法等が述べられていないことが分かった.・学校教育,学校保健に関するニーズ,健康意識等を把握するための調査を実施し,簡易質問紙を開発した.・対象地域において,捕獲,摂取されている魚のリスク(感染を媒介するメタセルカリアが魚に寄生しているかどうか)を同定するために,タイのマヒドン大学において研修を受けた.また,当該分野の第一人者であるコンケーン大学のパイブーン教授から,これまでの東北タイ地域におけるタイ肝吸虫感染に関する調査と予防活動の現状に関する講義を受けた.また,さらに今後の研究協力関係を構築した.・対象地域の小学校教師および保健所の職員と意見交換を行い,タイ肝吸虫感染の予防教材を開発し,ラオスでの小学校用の保健衛生教育の教科書の改訂時に開発した教材を提供した.本研究は,ラオスの中南部の農村地域において,児童のタイ肝吸虫感染に関わる要因を明らかし,児童の感染率を低下させるための予防プログラムを開発、実践し、評価することを目的としている.タイ肝吸虫は,メタセルカリアが寄生したコイ科の魚(リスクフィッシュ)を人が生で摂取することにより感染する。これまでの研究では,ラオスにおいて感染源となっている魚の摂取方法,リスクフィッシュの摂取習慣の実態,児童の魚の摂取習慣の実態等は十分に明らかにされていない。そこで,本年度は,以下の4つの調査を実施した.1.対象地域の住民に対する質問紙調査や,フォーカスグループインタビューなどを行い,対象地域において生で摂取することでタイ肝吸虫に感染する危険性が高いリスクフィッシュを同定した.その結果,対象地域で捕獲・摂取されている約160種の魚うち,7種類の魚が感染の危険性が高いことが分かった.2.対象地域内の児童約250名に,朝,昼,夕食での魚の摂取の有無,魚の調理法,摂取した魚の種類について記録する自記式の記録帳を配布し,魚の摂取習慣の現状を把握した(データは,現在分析中).3.調理法の観察によって,リスクフィッシュの調理法の実態把握を行った。4.児童250名と児童の親118名を対象に,質問紙調査行い,タイ肝吸虫に関する知識の現状を把握した.その結果,タイ肝吸虫の感染の有無を問わず,タイ肝吸虫の感染原因,症状,予防法を知っている親が少ない(約20%)ことが分かり,基礎的な予防知識の普及が必要であることが示唆された(児童のデータに関しては分析中).上記の検討を踏まえて,今年度は,予防教育プログラム導入のための予備的調査を進めていきたい.ラオス南部の農村部では,タイ肝吸虫感染への高い感染率が公衆衛生上の問題となっている.しかしながら,これまでラオスでは,タイ肝吸虫感染に対する予防プログラムが十分に開発されてきていない.そこで,本研究では,これまでラオスやタイで実施されてきた,タイ肝吸虫感染に関する研究や予防プログラムの成果と課題について情報を収集し,対象地域の住民のタイ肝吸虫感染に関する予防知識,健康問題に関する意識やニーズなどの把握を行い,感染の危険性の高い魚種(リスクフィッシュ)を同定することを通して,効果的なタイ肝吸虫感染に対する予防プログラムを開発することを目的とし,以下の4つの調査および活動を実施した.・ラオスおよびタイの国際機関,教育省・保健省,大学,JICA事務所NGO等を訪問し,これまで両国が実施してきたタイ肝吸虫感染に関する予防プログラムの情報を収集した.また,両国で使用されている保健衛生教育の教科書を分析した.その結果,既にラオスでは,小学校用の教科書の中に,タイ肝吸虫感染に対する予防教育が導入されているが,内容や記述に誤りかおること,治療の方法等が述べられていないことが分かった.・学校教育,学校保健に関するニーズ,健康意識等を把握するための調査を実施し,簡易質問紙を開発した.・対象地域において,捕獲,摂取されている魚のリスク(感染を媒介するメタセルカリアが魚に寄生しているかどうか)を同定するために,タイのマヒドン大学において研修を受けた.また,当該分野の第一人者であるコンケーン大学のパイブーン教授から,これまでの東北タイ地域におけるタイ肝吸虫感染に関する調査と予防活動の現状に関する講義を受けた.また,さらに今後の研究協力関係を構築した.・対象地域の小学校教師および保健所の職員と意見交換を行い,タイ肝吸虫感染の予防教材を開発し,ラオスでの小学校用の保健衛生教育の教科書の改訂時に開発した教材を提供した.
CCD画像を用いた酸素摂取量測定装置の開発

運動時の筋肉における代謝活動を評価するためには、節肉で消費された酸素摂取量を測定する必要があるが、そのためには、静脈血採取や高価な血流計を用いる必要がある。近赤外線による血管のCCD画像を分析することによって静脈血管経などの形態情報とともに、静脈血に限定した酸素飽和を評価できる可能性がある。したがって、この近赤外線CCD画像解析によって、静脈に限定した酸素動態から局所筋での酸素摂取量を評価できるものと考えられる。本研究では、CCD画像分析による静脈酸素動態評価法の妥当性を検討することを目的とした。まず、シスッメックス株式会社との井同で、肘正中静脈に近赤外線をあててその反射像をCCDカメラで撮影する装置を開発した。この装置では、まず、手首に装置を固定して血管画像が測定できるかどうか、また、手首の形状の異なる人においてもその測定が可能であるかどうかを検討した。固定する機構について試行錯誤を繰り返し、男性の被験者においてはほぼ固定して血管画像を得られるようになった。得られた静脈画像と、超音波画像診断装置(日立メディコ:HDI-3500)のリニヤープローブ(12MHz)で得られるその画像を比較した結果、その妥当性が検証された。次に、手首固定では筋肉での酸素消費を評価しにくいため、肘屈曲部位にある正中静脈の撮影が可能となるように装置を改良した。一部の被験者においては、正中静脈画像が得られ、そのときの超音波画像診断装置とのデータとはぼ一致した。しかしながら、正中静脈部位に装置を固定することが困難であること、また、正中静脈の部位、皮膚表面からの深さの個人差が大きいことから、多くの人を対象とした場合の装置固定機構の開発に関しては今後の課題となった。画像が得られた場合には、静脈に限定された血液の酸素化動態は画像より分析できるため、今後、1)固定装置の開発、2)画像取得時間の短縮による血流評価法の開発、を行うことにより、新しい酸素摂取量装置の実用化が可能となるものと考えられる。シスメックス株式会社(神戸)において、肘正中静脈に近赤外線をあてその反射像をCCDカメラで撮影する装置のプロトタイプを開発中であるが、肘部分の装置より先に、手首固定型装置をまず製作している。ほぼ完成しているが、手首での固定法に関して、手首のサイズ、形状、静脈の位置の個人差が大きいため、現在試行錯誤中である。完成次第、その装置を使って、筑波大学体育科学系において、安静時の静脈画像を撮影し分析し、静脈経変化の妥当性をエコードップラー装置を使って検討する予定である。平行して、筑波大学体育科学系においては、エコードップラー装置での、静脈経測定と血流量測定に関して、オリジナルのコンピューター解析システムを開発している。血管経とそこに流れる血流速度を同時にモニターしながら、ノートパソコン上での解析をめざしている。自動・連続測定を可能とするために、疑似血液をビニールチューブに一定量流して、その流速を正確に測定できるかどうかを確かめながらプログラムを改良している。また、音声合成シンセサイザーを用いて様々な超音波を発生させ、その信号を的確に分析できるかということに関しても、現在検討中である。血管経の測定に関しては、画像解析ソフトの開発とともに、高速高解像度動画収集のハードウエアの選定中である。現在、血流速度のみの測定に関しては、長時間リアルタイムでの測定がほぼ可能となった。現時点で、このような長時間・自動・連続測定のできるシステムを生理学実験に用いた報告は、世界的にも見られないことから、これを用いての運動生理学実験を開始し、データを収集中であり、興味ある知見も見いだされつつある。画像が得られた場合には、静脈に限定された血液の酸素化

動態は画像より分析できるため、今後、1)固定装置の開発、2)画像取得時間の短縮による血流評価法の開発、を行うことにより、新しい酸素摂取量装置の実用化が可能となるものと考えられる。
要介護高齢者に対する歯科診療の効果の検証と合理的な治療方針への基盤構築

要介護高齢者の心身の状態や社会環境は多様で,身体的または社会経済的な理由で十分な歯科治療を行うことが困難な場合が多い.特に訪問診療の場合,環境や機材による制約も多く,患者の状態や生活状況に応じた個別化医療が必要である.本研究では,様々な状態の要介護高齢者に対し,どのような歯科介入が効果的であるかを明らかにする.対象は長野県某地域の後期高齢者とし,要介護高齢者に対する歯科治療,特に訪問診療が,口腔機能の向上や維持,栄養状態,サルコペニアやフレイル,認知機能や要介護度に及ぼす影響を5年間の後ろ向き縦断研究と3年間の前向き縦断研究で検証する.要介護高齢者の心身の状態や社会環境は多様で,身体的または社会経済的な理由で十分な歯科治療を行うことが困難な場合が多い.特に訪問診療の場合,環境や機材による制約も多く,患者の状態や生活状況に応じた個別化医療が必要である.本研究では,様々な状態の要介護高齢者に対し,どのような歯科介入が効果的であるかを明らかにする.対象は長野県某地域の後期高齢者とし,要介護高齢者に対する歯科治療,特に訪問診療が,口腔機能の向上や維持,栄養状態,サルコペニアやフレイル,認知機能や要介護度に及ぼす影響を5年間の後ろ向き縦断研究と3年間の前向き縦断研究で検証する.
ポリエーテルによる抽出の機構と溶液内構造の研究

本研究においては、アルカリおよびアルカリ土類金属イオンとポリエーテルとの有機相中における錯形成、およびピクリン酸イオンとのイオン対生成・分配平衡を調べた。また、最も単純な系の一つである第4級アンモニウムイオンの抽出挙動も調べた。抽出平衡の解析においては、イオン対解離や複核生成等有機相中での副反応をを考慮した厳密な平衡解析を行った。また、電気伝導度測定により有機相中のイオン対解離およびイオン種のイオンの大きさ、形状またイオン対の構造を推定した。これらの結果により、イオン対抽出に対する新しい機構を提案した。すなわち、イオン対抽出の機構の解析においてそのステップを、各イオンの水相から有機相への移行、そして有機相中での錯形成、会合の機構で説明した。ここで提案した機構による解析により、イオンの分配、錯形成、イオン対生成の各段階のエネルギーをかなり厳密に評価できた。これまで説明できなかった、非対称なイオンの抽出特性や、化学量論を示さなかった抽出系の特異的な挙動などが理論的に説明できた。また可視・紫外吸収スペクトル、NMRスペクトル等の分光学的測定により、ミクロな分子レベルでの構造も明らかにし、さらに、分子軌道計算による理論との比較検討を行った。これらの抽出機構の理論により、ポリエーテル誘導体による抽出・分離定量の系に適用し、より高感度、効率的な金属イオンの分析法の開発が可能となったと考えられる。これにより、希土類元素、アクチニド元素をも含めた金属イオンの分族・定量法の基礎が確立された。
深海冷湧水・熱水噴出域における化学合成微生物群集制御要因の解明に関する研究

海底熱水や冷湧水活動葉地球のマグマ活動に伴う普遍的な現象であり、海洋や大気に放出される化学成分は膨大である。これらを直接利用する、もしくは二次的に利用する微生物群集の地球表層に及ぽす生物的な影響は当然大きいと予想されるにもかかわらず、その分布さえも全くと言っていいほど明らかになっていない。本年度は、昨年度以前に取得した、地質学的およぴ地理的に異なる条件下にある深海熱水(水曜海山、沖縄トラフ、南部マリアナ背弧拡大軸)や冷湧水噴出域周辺(日本海)のプルーム試料の微生物群集構造について、昨年度導入したDGGE法、Rainbow-FISH法、CARD-FISH法による解明を試みた。水曜海山では、現場での倍加速度が約1日であることを明らかにし(査読中)、水曜海山熱水プルーム中の微生物活性は非常に高く、カルデラ内に供給される有機物量の95%以上は化学合成微生物が生産していることが示された。水曜海山熱水プルーム中の微生物はCARD-FISH法などの増感手法を用いずと,も容易に検出が可能であることからも、水曜海山熱水プルーム中の微生物が高活性であることを支持している。その他の海域におけるプルーム中微生物は沖縄トラフ鳩間海丘およぴ南マリアナ海域を除き微生物の有為な増殖は認められなかった。鳩間海丘およぴ南マリアナ海域では、CARD-FISH法による増感により特定微生勢の検出が可能であり、DGGE法を併用した解析から、水曜海山とほとんど同じ硫黄酸化に関わる微生物が検出され、プルーム中で増加した微生物細胞の約半数に相当するごとが明らかとなった(投稿中)。このことから、北西太平洋の熱水活動域における熱水プルーム中では、γプロテオバクテリアに属する硫黄酸化微生物が卓越することが明らかとなった。硫黄酸化微生物の割合と噴出熱水の化学成分組成、熱水プルームの水深の間に明確な関連性は認められないが、熱水活動の熱源となるマグマの酸化度により、硫黄酸化微生物の割合が制御されている可能性が示された。海底熱水や冷湧水活動は地球のマグマ活動に伴う普遍的な現象であり、海洋や大気に放出される化学成分は膨大である。これらを直接利用する、もしくは二次的に利用する微生物群集の地球表層に及ぼす生物的な影響は当然大きいと予想されるにもかかわらず、その分布さえも全くと言っていいほど明らかになっていない。本年度は、地質学的および地理的に異なる条件下にある深海熱水(水曜海山、沖縄トラフ、南部マリアナ背弧拡大軸)や冷湧水噴出域周辺(日本海)のプルーム探査およびプルーム水採取を行い、ドメインレベルでの微生物群集構造のため、Rainbow-FISH法(Sunamura and Maruyama 2006)を開発し、定量的なFISH-DC法(Maruyama and Sunamura 2000)、CARD-FISH法との併用により熱水プルーム中微生物群集構造を測定した。その結果、水曜海山、沖縄トラフ、南部マリアナ背弧拡大軸の熱水プルーム中では、周辺海水に比べ1.53倍程度の微生物細胞数の増加が認められ、主に、Bacteriaが増加していることが明らかとなった。また、水曜海山熱水プルーム中では、最大で一日1mLあたり30000細胞が生産されていることを明らかにした。一方、冷湧水プルームでは、微生物細胞の増加は認められず、メタン酸化細菌もほとんど検出されなかった。これらの微生物群集構造をより詳細に解明するために、DGGE装置を購入し、DGGE法を用いた比較群集解析を開始した。

硫黄酸化微生物の割合と噴出熱水の化学成分組成、熱水プルームの水深の間に明確な関連性は認められないが、熱水活動の熱源となるマグマの酸化度により、硫黄酸化微生物の割合が制御されている可能性が示された。
社会認識記憶とその障害としての自閉症の研究

CD38の遺伝子と自閉症の関連の探索について、我々はCD38遺伝子変異(特にR140W変異)に注目しました。金沢大学附属病院に診断された自閉症の患者さんとコントロールの健康人の血液を取って、DNAを抽出して、PCRでCD38遺伝子の8つエクソンのシーケンスをスクリーンしました。データベースに比較して、トータルの15SNPsを発見しました。中に12個のSNPsもうHapMapで報告されました、他の3つは新しいSNPs。特にR140W変異は我々のデータによって、自閉症患者さん持つの頻度は、コントロールに比べると、有意に高いです。このR140W変異によって、自閉症患者さんの血漿オキシトシンレベルはコントロールに比べると、有意に低いです。この研究は、CD38遺伝子のR140W変異と自閉症は相関関連を示唆しました。このCD38遺伝子のR140W変異は自閉症の一つ生物マークと思って、CD38遺伝子変異によってオキシトシン分泌不足は自閉症の発症原因の一つを考えています。加えて、オキシトシンの投与は血漿オキシトシン濃度低いの自閉症の患者さんにとって、有効な治療方法と考えています。オキシトシン誘導の雄の養育行動とマウス間のコミュニケーションの関連について、我々は父親マウスの養育行動のモデルを設定しました。自分の子供と分離することによって、母親マウスといろいろなコミュニケーション(特に超音波を出す)を採って、ホームケージに戻ると、上手に子供を世話しました。オキシトシンはこの行動の発生に促進することが分かってます。この研究は、マウス間のコミュニケーションは一つの手段にとって、雄の養育行動を誘発することが示唆しました。
外生菌根菌の種多様性と基質利用能力の違いが宿主植物の養分獲得に与える影響の解明

(1)外生菌根菌群集の時間変化、地理的分布パターン本邦亜熱帯シイ林において、2年間に渡り外生菌根菌群集の調査を行ったところ、種レベルでは3か月から6か月という時間スケールで群集の入れ替わりが起こること、この群集の時間変化には、時間による気候要因(気温・降水量)の変化よりも、環境の変化に依らない純粋な時間経過における群集変化の両者の影響が大きいことを明らかにした。次に、スダジイと共生している外生菌根菌相が、地理的にどのような分布パターンをもっているのかを明らかにするため、沖縄県石垣島から、新潟県佐渡島までの13か所のスダジイ林において外生菌根菌群集の調査を行った。その結果、種多様性は温度に伴い減少すること、群集組成は気候要因(気温・降水量)と空間的な距離の影響を受け変化することが明らかになった。群集組成は特に、空間的距離の影響が強く、地理的な分布パターンには、ある種にとって好適な環境があっても到達できないという分散制限が影響することが示唆された。(2)外生菌根菌の基質利用能力の違いが宿主植物の養分獲得に与える影響の解明無菌状態のスダジイ実生に、野外で採集した腐植層とミミズの糞塊をそれぞれ接種することで、基質中の菌根菌をスダジイの根に定着させた。外生菌根菌は、スダジイ実生から12種、感染源として用いたFH層・糞塊中から24種がそれぞれ検出された。このうち9種がスダジイ菌根及び基質中から共通に検出された。実生に形成された外生菌根菌のうち、感染源の違いによって検出頻度に差が見られた種がいたことから、林床基質の違いは外生菌根菌群集に影響を与えうる要因であることが示唆された。一方、外生菌根菌群集の違いと、宿主の生長量には有意な関係が見られなかったことから、外生菌根菌群集は宿主の生長という機能においては、種が異なっても類似の機能を果たすという機能的冗長性を持つことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の目的は、本邦亜熱帯スダジイ林を中心とした外生菌根菌群集(種多様性、群集組成)の解明と、群集による窒素養分獲得特性の違いの検討を通して、外生菌根菌群集の違いが宿主の養分獲得にどのような影響を及ぼすのかを検討することである。本年度の研究成果は以下の通りである。1、外生菌根菌群集の時間変化、地理的分布パターン本邦亜熱帯林の調査地において、2年間に渡り外生菌根菌群集の調査を行ったところ、123種の外生菌根菌が検出された。種レベルでは3か月から6か月という時間スケールで群集の入れ替わりが起こることが明らかとなった。この群集の時間変化には、時間による気候要因(気温・降水量)の変化及び、環境の変化に依らない純粋な時間経過における群集変化の両者の寄与が検出された。この研究結果は、複数年に渡り外生菌根菌の群集動態とその要因を検討した初の研究例として、国内外の学会において発表を行い現在、国際的な学術誌へ投稿準備中である。スダジイと共生している外生菌根菌相が、地理的にどのような分布パターンをもっているのかを明らかにするため、沖縄県から、新潟県までの14か所のスダジイ林において外生菌根菌群集の調査を行った。現在、次世代シーケンサーによるシーケンス解析を終了し、分布パターンの解析を行っている。2、外生菌根菌の基質利用能力の違いが宿主植物の養分獲得に与える影響の解明異なる林床基質中での外生菌根菌相の違いは、菌根菌の基質利用能力・選好性を反映しているのかを調査するため、操作実験を行っている。本年度は、調査地における外生菌根菌の宿主であるスダジイの種子を採集し、無菌状態で発芽を行った。その後、無菌のスダジイ実生に、調査地で採集したFH層とミミズの糞塊を摂取することで、基質中の菌根菌について菌根合成実験を行っている(釣菌法)。(2)外生菌根菌の基質利用能力の違いが宿主植物の養分獲得に与える影響の解明

無菌状態のスダジイ実生に、野外で採集した腐植層とミミズの糞塊をそれぞれ接種することで、基質中の菌根菌をスダジイの根に定着させた。外生菌根菌は、スダジイ実生から12種、感染源として用いたFH層・糞塊中から24種がそれぞれ検出された。このうち9種がスダジイ菌根及び基質中から共通に検出された。実生に形成された外生菌根菌のうち、感染源の違いによって検出頻度に差が見られた種がいたことから、林床基質の違いは外生菌根菌群集に影響を与えうる要因であることが示唆された。一方、外生菌根菌群集の違いと、宿主の生長量には有意な関係が見られなかったことから、外生菌根菌群集は宿主の生長という機能においては、種が異なっても類似の機能を果たすという機能的冗長性を持つことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。室内実験と野外調査・データ解析を並行して行っている。室内実験は、植物生長の遅さから、計画書の予定よりやや遅れているものの、その時間を利用して野外調査のデータ解析・学会発表を大きく進行させた。これにより、課題全体の目的に対しては、順調に進展を続けている。今後も、本年度と同様に室内実験と野外調査で取得したデータ解析を並行して進める。野外調査で取得したデータに関しては、本年度で解析が進んできたため、学術論文の執筆と国際・国内学会での発表を中心に行う。さらに、より発展的な解析を行うため、国内外の研究者と連絡をとり、新奇解析手法の習得を行う。室内実験では、植物生長を細かに記録することで、当初予定していた実験期間を再検討し、期間内に研究目的にかなうデータ取得をできるよう対応を行う。
発話障害者支援装置を目的とした発話タイミングとイントネーションに関する研究

人工喉頭への自然なイントネーションの付加や発声障害者のための訓練方法に役立てることを目的に、音声の自然性や発話にイントネーションや発話タイミングが与える役割を調べている。本年度は、指圧による人工喉頭のイントネーション制御を用いて、発話タイミングを含めた音声の自然性の検討を行った。昨年度は、できるだけ単純な手法でイントネーションを制御することを目的に指圧-周波数変換装置を作成し検討を行ったが、一種類の制御手段で自然性を向上させることは難しかった。そこで、イントネーション生成モデルのひとつであるアクセント・フレーズ指令モデルを考慮し、実験を行った。まず、垂直方向と水平方向の指圧を測定できる力センサを利用し、イントネーション制御装置を作成した。垂直方向の力に対しては、力がある閾値を越えると自動的に一定の割合で周波数が減少する、擬似フレーズ成分を生成するようにした。水平方向に加えた力に対しては、力に比例する形で周波数が変化する、擬似アクセント成分を生成するようにした。そして、2つの成分を加算することによって人工喉頭の振動周波数を作り出した。このような制御システムで、まず擬似アクセント成分のみで、各被験者に適したパラメータを見つけ出した。次に、各被験者に対して、擬似フレーズ成分を加えない場合と擬似フレーズ成分の周波数減少割合をパラメータとした場合で制御を行わせ、その時の人工喉頭音声の自然性や発話タイミングを調べた。その結果、個人差があったが、擬似フレーズ成分の周波数減少を補う形で水平方向成分の力を制御していることが振動周波数の変化の傾向から示唆された。また擬似フレーズ成分の付加により、発せられた音声が自然に聞こえた。このことから、擬似フレーズ成分の付加は、制御の仕方に影響を与え、またその音声も自然にする傾向が示された。本研究では、発話タイミングやイントネーションが音声の自然性や発話に与える役割を調べ、その結果を人工喉頭への自然なイントネーションの半自動付加や失語治療への訓練方法に役立てることを目的としている。本年度は以下の実験のうち特に(2)について検討を行なった。(1)イントネーション、発話タイミング加工音声の聴取実験(2)指や呼気圧などを用いたイントネーション制御による発声実験具体的には、人工喉頭のイントネーションをその使用者の指による圧力変化やポテンショメータの角度変化により制御しその音声を比較検討する実験を行った。つまり、イントネーションを制御し発声を行った時にどのような要素に注目しているかを、音声のイントネーションの変化パターンの解析結果や発声した音声の聴取実験から検討した。その結果、周波数変化速度やその変化の継続時間を検討するための指針を得た。上記に基づき、生体情報フィードバック用システム用の実時間収録ボードやコンピュータを購入し、研究結果に基づく構築を行った。このシステムでは制御パラメータを変化させながら実時間でフィードバックをかけることを考えており、現在製作中である。また、本研究の関連事項として音声を用いた運動機能障害者のための装置入力デバイスの研究も行い、発話タイミングの調整などにより、音声の基本情報を装置入力手段に使用できることを確認した。また、本年度の結果から呼気圧等のセンサや増幅装置などの電子部品、手指や頚部などに装置を固定するための装具用機械部品をそろえた。本年度は障害を持った方に心理物理学実験の協力を得る段階までいたらなかったため、謝金を使用していない。また、イントネーションに関する最新の研究や資料等の調査研究のため学会参加や研究室の訪問を行い、実験内容をより充実させるための資料を得た。本研究では、人工喉頭への自然なイントネーションの半自動付加や失語治療への訓練方法に役立てることを目的に、音声の自然性や発話にイントネーションや発話のタイミングが与える役割を調べている。本年度は指圧でのイントネーション制御に着目し、前年度の結果を受けて、特に発せられた音声の自然性を向上させるための基本的な要素は何かということについて検討した。まず、実験システムを見直し、指圧力から音声基本周波数への変換関数等をコンピュータで簡単に変更でき、実時間処理で圧力から音声基本周波数への変換ができる装置を構築した。また、指圧のセンサも作り直した。この装置を用いて、変換関数のおおよその値を見つけ出した。また、音声基本周波数の変動のしやすさが音声の自然性に影響を与えていることが示唆されたため、変動を抑えるための一次ローパスフィルタを導入し、遮断周波数を変えた時の音声の自然性への影響について検討した。その結果、変動を抑えた遮断周波数0.5Hz程度の値で比較的自然性が高かった。しかしながら、被験者から"大きな差は感じられなかった"との内観報告も得た。一種類の制御入力手段で自然性を向上させるのは問題があり、音声基本周波数生成モデルのひとつであるアクセント指令・フレーズ指令モデルを考慮した制御方法との比較検討が必要であると感じている。現在、このモデルを参考にした制御装置の製作を始めている。また、上記研究のための聴力検査用の機材や装置製作用の工作機、力覚センサやシステム構築用のA/D変換デバイスなどをそろえた。また、学会参加や研究室の訪問を行い、イントネーションや発話タイミングに関連する資料の収集や意見交換を行った。

本年度は、指圧による人工喉頭のイントネーション制御を用いて、発話タイミングを含めた音声の自然性の検討を行った。昨年度は、できるだけ単純な手法でイントネーションを制御することを目的に指圧-周波数変換装置を作成し検討を行ったが、一種類の制御手段で自然性を向上させることは難しかった。そこで、イントネーション生成モデルのひとつであるアクセント・フレーズ指令モデルを考慮し、実験を行った。まず、垂直方向と水平方向の指圧を測定できる力センサを利用し、イントネーション制御装置を作成した。垂直方向の力に対しては、力がある閾値を越えると自動的に一定の割合で周波数が減少する、擬似フレーズ成分を生成するようにした。水平方向に加えた力に対しては、力に比例する形で周波数が変化する、擬似アクセント成分を生成するようにした。そして、2つの成分を加算することによって人工喉頭の振動周波数を作り出した。このような制御システムで、まず擬似アクセント成分のみで、各被験者に適したパラメータを見つけ出した。次に、各被験者に対して、擬似フレーズ成分を加えない場合と擬似フレーズ成分の周波数減少割合をパラメータとした場合で制御を行わせ、その時の人工喉頭音声の自然性や発話タイミングを調べた。その結果、個人差があったが、擬似フレーズ成分の周波数減少を補う形で水平方向成分の力を制御していることが振動周波数の変化の傾向から示唆された。また擬似フレーズ成分の付加により、発せられた音声が自然に聞こえた。このことから、擬似フレーズ成分の付加は、制御の仕方に影響を与え、またその音声も自然にする傾向が示された。
カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIの活性発現の調節

カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIは脳神経組織に高い活性を有し脳の多くの蛋白質をリン酸化し、神経伝達物質の生合成と分泌、微小管の重合脱立合の調節等神経機能のダイナミックな調節に関与する極めて重要な酵素である。そこで本酵素の活性調節を明らかにすることによりキナーゼIIの関与するシナプス機能はじめ神経機能の制御機能を分子レベルで解明することを目的に研究を進めている。本年度は、本酵のαとβサブユニットのcDNAを調整し、cDNAをExpression Vectorに導入し、動物培養細胞において発現されることにより以下の結果を得た。すなわち、αとβサブユニットの両者を同時にCHO細胞に導入し酵素活性の発現を調べたところ非常に高い活性が認められた。また、α、βサブユニット単独でも酵素活性が発現するが、αβ両者同時に発現させた場合に最も高い活性が得られた。またNortherr BlottingとImmunobloltingより、それぞれα、βのmRNAと酵素蛋白が生成していることも確認できた。発現した蛋白の性質を調べたところαβ両者同時に導入したものではαβ複合体を形成し脳のキナーゼIIと同様の性質を示した。一方、αサブユニット単独でも重合し分子量は脳のキナーゼIIと同じ値を示し酵素学的性質も比較的良く似ていた。しかし、βサブユニット単独では重合せず低分子として存在したが酵素学的性質は脳の酵素とよく類似していたが、カルモデュリンに対する親和性はβサブユニット単独の場合が最も大きく、αが最も小さかった。また、発現した酵素は自己リン酸化され一時的にCa^<2+>非依存性活性が出現することがα、βサブユニット単独でもαβ複合体でも明らかとなった。このように、αβcDNAを動物細胞で発現させることにより酵素のα、βサブユニットの基本的な性質が明らかとなり、今後はこのcDNAを神経細胞に導入することにより、神経組織におけるキナーゼIIの役割を明らかにしたい。