hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東日本古墳時代親族構造の研究

東日本の古墳に葬られた人物の社会的性格に対するこれまでの学説を検討し,整理を行った.そして,これまでの研究が古墳出土の人骨の性別や構成に重点を置き,生前の世代構成を検討しておらず,また仮説の域を出ないことを確認した.しかし,人骨の出土状態や副葬品との関係から生前の世代構成を復元し,人骨の遺伝的形質から親族構造の分析を行うという,筆者の方法では人骨を含めて保存状態の良好な古墳にしか適用できないため,造墓契機となった人物の性別を検討することで,これまで筆者が得てきた古墳時代親族構造の通時的展望との対比を試みた.具体的な方法としては,東日本の人骨出土古墳のうち単体埋葬の事例で性別が判定されている古墳,複数埋葬で最初に葬られた人物が明かとなっておりかつ性別が判定されている古墳を集成し,その地域差と時期的変化を検討した.なお,単体埋葬には,同一墳丘に1基の主体部で単体埋葬の場合と,複数の主体部でそれぞれ単体埋葬である事例があり,複数埋葬においても同様であることから,これらを分類して集成を行った.集成は,5世紀中葉までの古墳時代前半期までは,単体埋葬も複数埋葬での初葬者も男性が約60%,女性が約40%というものであった.それに対して,5世紀後半以降では男性が80%をこえ,男性優位になることが示され,西日本と同様,筆者が示してきた親族構造の変化と対応することが明らかになった.しかし,後半期においては西日本に比べて女性がやや多い傾向も得られた.また,7世紀前後においては,それ以前と異なり,埋葬される親族の範囲が拡大している可能性が強く示唆され,同時に,埋葬終了後に人骨を二次的に移動する行為が広範に行われており,この行為が当時の死の認定に関わるものであり,黄泉の国神話との関連があることが示唆された.東日本の古墳に葬られた人物の社会的性格に対するこれまでの学説を検討し,整理を行った.そして,これまでの研究が古墳出土の人骨の性別や構成に重点を置き,生前の世代構成を検討しておらず,また仮説の域を出ないことを確認した.しかし,人骨の出土状態や副葬品との関係から生前の世代構成を復元し,人骨の遺伝的形質から親族構造の分析を行うという,筆者の方法では人骨を含めて保存状態の良好な古墳にしか適用できないため,造墓契機となった人物の性別を検討することで,これまで筆者が得てきた古墳時代親族構造の通時的展望との対比を試みた.具体的な方法としては,東日本の人骨出土古墳のうち単体埋葬の事例で性別が判定されている古墳,複数埋葬で最初に葬られた人物が明かとなっておりかつ性別が判定されている古墳を集成し,その地域差と時期的変化を検討した.なお,単体埋葬には,同一墳丘に1基の主体部で単体埋葬の場合と,複数の主体部でそれぞれ単体埋葬である事例があり,複数埋葬においても同様であることから,これらを分類して集成を行った.集成は,5世紀中葉までの古墳時代前半期までは,単体埋葬も複数埋葬での初葬者も男性が約60%,女性が約40%というものであった.それに対して,5世紀後半以降では男性が80%をこえ,男性優位になることが示され,西日本と同様,筆者が示してきた親族構造の変化と対応することが明らかになった.しかし,後半期においては西日本に比べて女性がやや多い傾向も得られた.また,7世紀前後においては,それ以前と異なり,埋葬される親族の範囲が拡大している可能性が強く示唆され,同時に,埋葬終了後に人骨を二次的に移動する行為が広範に行われており,この行為が当時の死の認定に関わるものであり,黄泉の国神話との関連があることが示唆された.
尿中化学物質の網羅的分析による農薬類曝露マーカーの探索と分析法の開発

平成27年度までに測定法を確立した。平成28年度までに職業的農薬類曝露群の尿サンプルを合計90検体、そのコントロール群を74サンプル収集した。また、殺虫剤散布職域従事者の尿サンプルを合計281サンプル収集した。また、健康診断受診者の尿サンプルをコントロールサンプルとして収集を新たに開始している。これらのサンプルを利用して、メタボローム分析とターゲット分析を施した。その結果、メタボローム分析によって5つの農薬類に関連する新規バイオマーカー候補を検出した。また、ネオニコチノイド系およびピレスロイド系殺虫剤の尿中曝露マーカーの検出を可能とした。1年目にあたる平成26年度は計画通りに以下の3つの取り組みを実施した。1)殺虫剤散布職域従事者を対象に健康診断を8月および3月に実施し、それぞれ59および49名の検診参加者から生体試料を採取・保存した。また、8月には九州地方の花卉栽培業者を対象とした健康診断に参加し、研究参加への同意が得られた90名から尿サンプルを採取・保存した。2)8月に実施された殺虫剤散布職域従事者の健康診断で得られた尿59検体から網羅的化学物質分析を試みた。分析法は暫定的に尿中ピレスロイド系殺虫剤代謝物類の検出法、すなわちtert-ブチルメチルエーテルにて液-液抽出した後にHFIP(ヘキサフルオロイソプロパノール)で誘導体化したものをGC-MSにて分離分析を実施した。その後、アジレント社製のクロマトグラフデコンボリューションソフトウェアにて各クロマトピークを抽出し、NISTライブラリーにてピークの同定作業を行った。2名から他の57名にはほとんど存在しない特異的なクロマトピークが検出された。1名はハト忌避剤、他の1名は殺鼠剤を尿採取に近い日時に散布する作業を行っていたことがアンケート調査から判明した。現在は2名から検出された尿中代謝物の同定作業を進めている。3)新たに尿中ネオニコチノイド系殺虫剤分析法を確立し、初めて農業従事者(花卉栽培業者)に応用した。その結果、前述の殺虫剤散布職域従事者に比べて花卉栽培業者の尿中ネオニコチノイド系殺虫剤量は高値を示す対象者が散見された。これは、比較的作業者への曝露量が少ないと言われているネオニコチノイド系殺虫剤曝露の職業的曝露を証明した結果である。2年目にあたる平成27年度は計画通りに以下の取り組みを実施した。1)前年度と同様に殺虫剤散布職域従事者を対象に健康診断を8月及び3月に実施し、49名分及び38名分の生体試料を採取・保存した。これは前年度と同様の調査となるが、バイオマーカー等の信頼性の確認のために必要な検体であり、再現実験を試みる予定である。さらに、8月には九州地方の花卉栽培業者を対象とした健康診断で得られた尿82名とアンケート調査を行った。これまでに、一般生活環境中での化学物質曝露状況を差し引くために必要であったコントロール群となる対象者を用意できなかったが、今回初めて同地域の高齢者74名の生体試料を収集することができた。アジレント社製のGC-MSを用いて分離分析を行い、NISTライブラリー及びFihenライブラリーにて代謝物類を分析中である。サンプル前処理法はBouatraらの方法(PlosOne, 2013, 8, 9)を用いて水溶性代謝物及び有機酸代謝物分析を別々の前処理法で行う系統的分析法に切り替えた。これにより、一分析あたり、350種類の物質が検出され、そのうち150程度の物質がライブラリーで同定される手技を本研究室で確立できた。現在はこの方法は収集したサンプルに応用中である。前年度に予備的に57名から解析を試みた結果、2名から特異的な物質が検出された。そのうちの一つはクマリン系殺鼠剤の代謝物である可能性があることが対象者の薬剤使用履歴から判明した。動物実験にてクマリン系殺鼠剤の曝露と尿中代謝物のモニタリングを行ったが、この関係は明らかにならなかった。高分解能MSでの解析を試みるかどうか検討中である。3)前年度に開発した尿中ネオニコチノイド系殺虫剤の高感度分析法を利用して、アセタミプリドの生物学的利用能や曝露量と尿中排泄量の関係を明らかにした。さらに、ネオニコチノイド系殺虫剤の曝露量は1996年から現在にかけて上昇傾向にあることを明らかにした。サンプル採取は順調に進んでいるものの、新規バイオマーカーの探索という意味では現在も検討中にある。しかし、クロマト上では一般健常人では検出されないような巨大なピーク(化合物の痕跡)が見えることは確認しているため、検出装置のさらなる高分解化が必要かどうかを検討する必要がある。アジレントテクノロジー社が有するGC-QTOFにてその可能性を探索し、現状を打開する予定である。3年目にあたる平成28年度は以下の取組みを実施した。1)平成27年度と同様に殺虫剤散布職域従事者を対象に健康診断を8月および2月に実施し、45名および41名分の生体試料ならびに殺虫剤使用実績の調査を行った。2)アジレント社製のGC-MSおよびGC-MS/MSを用いて、尿中代謝物の網羅的分析と高感度ターゲット分析を実施した。

網羅的分析法は前年度同様にBouatra法(PlosOne, 2013)をサンプル前処理法として用い、データ解析にはNISTライブラリーおよびFihenライブラリーを用いた半定量法を採用した。これまでに収集した尿サンプルについて、網羅的分析を施したところ、前日にバードリペルというハト飛来忌避剤を散布した作業者から特異的な代謝物が検出された。3)作業者の聞き取り調査から、ピレスロイド系殺虫剤曝露の網羅的モニタリングの必要性が顕在化したため、尿中に排泄されるピレスロイド系殺虫剤代謝物の網羅的測定法をGC-MS/MSを用いて実施することに成功した。ピレスロイド系殺虫剤は蚊の駆除にも多用されており、特に蚊媒介性の疾患への対策を目的とした夏場の薬剤散布が多くなることが懸念される。そこで、まずは殺虫剤散布履歴のない一般健常人の尿中ピレスロイド系殺虫剤代謝物を検出した結果、冬に比べて夏に高い値を示すことが明らかとなった。メトフルトリンおよびプロフルトリンの共通代謝物である2,3,5,6-Tetrafluoro-1,4-benzenedimethanolの濃度は10検体の結果、5ug/L以下であった。現在は殺虫剤散布作業者について分析中である。平成27年度までに測定法を確立した。平成28年度までに職業的農薬類曝露群の尿サンプルを合計90検体、そのコントロール群を74サンプル収集した。また、殺虫剤散布職域従事者の尿サンプルを合計281サンプル収集した。また、健康診断受診者の尿サンプルをコントロールサンプルとして収集を新たに開始している。これらのサンプルを利用して、メタボローム分析とターゲット分析を施した。その結果、メタボローム分析によって5つの農薬類に関連する新規バイオマーカー候補を検出した。また、ネオニコチノイド系およびピレスロイド系殺虫剤の尿中曝露マーカーの検出を可能とした。各健康調査を利用した生体試料収集作業は、現場とのコミュニケーションを密にとりあり、信頼関係を構築する必要がある。そうでなければ、研究者による各種調査の円滑な実施は困難となるが、本研究では詳細な計画と現場との十分な準備期間をもうけたため順調に進展していると思われる。また、メタボローム分析法実施のための情報や技術の習得も順調に進んでいる。引き続き、入手サンプルの分析を新しい前処理方法で解析を進める。平成27年度にコントロール群となり得るサンプルを入手できたので、これと比較することで曝露群のマーカー探索を推進する予定である。高分解MSによる同定には、アジレントテクノロジー社と協力して、迅速な解析を実施する予定である。いずれにしても、コントロールサンプルを入手できたことが本研究の推進力となることはまちがいなく、このいわゆるコントロールクロマトグラフと比較した曝露マーカーの探索へと進むことができるため、研究の目標の達成が期待できる。環境分析化学研究実績の概要で示した通り、2名の尿から忌避剤や殺鼠剤の新規曝露バイオマーカーと思われる物質が検出されているが、同定作業に関する正確性を向上させるべく、分析機器の変更を検討している。すなわち、MS分解能が飛躍的に向上するGC-QTOFを用いた検討を実施予定である。尿中ネオニコチノイド系殺虫剤分析は、一般生活者集団で調査を行った場合、検出率が50%を切る物質が多く存在する。そのために、詳細な統計学的解析を実施することが困難であり、今後は尿中ネオニコチノイド系殺虫剤分析法の高感度化(分析装置の変更等を検討)を他の計画の進行と同時に進める予定である。
消化管疾患の診断と治療のための病変部計測システムの確立とその臨床応用

内視鏡医療において病変の大きさの把握は極めて重要であり、各種消化管疾患の治療対象の明確化、治療に伴う病変の大きさの変化を評価するには、内視鏡観察時に併行してその大きさを正確に把握する必要がある。しかしながら、現状ではそれを満足し得る測定方法は開発されていない。本計測システムは、距離が変化すると受光量が変化する特性を利用し、イメージプロセッサにより病変までの距離が自動的に算出され、その距離に応じて計測用グリッドの座標を演算する。本システムが臨床応用可能となれば、病変を観察しながらその大きさを瞬時に正確に把握することができ、治療対象の明確化や治療効果を客観的に正確に把握することができる様になる。
リガンド依存性受容体型チロシンキナーゼ阻害剤耐性機構の解明と克服

本研究では、FLT3阻害剤のリガンド(FL)依存性耐性機構のメカニズムを、変異FLT3(FLT3-ITD)あるいは細胞外領域欠失変異FLT3(cyFLT3-ITD)単独ならびに、それらと正常FLT3(Wt-FLT3)を共発現する細胞株で検討し、FL刺激によって共発現している正常FLT3とMAPKの活性化が関与していることを明らかにした。このリガンド依存性のFLT3阻害剤の抗腫瘍効果減弱作用は正常FLT3分子の発現量に影響を受けることが、ヒト白血病細胞のマウスへの異種移植系においても証明され、FLT3阻害剤の有効性を予測するバイオマーカーになることを明らかにした。昨年度までに、正常FLT3発現(Wt-FLT3)、変異FLT3発現(ITD-FLT3)、正常/変異FLT3共発現(Wt/ITD-FLT3)、細胞外領域欠失変異FLT3発現(cyITD-FLT3)、正常/細胞外領域欠失変異FLT3共発現(Wt/cyITD-FLT3)32D細胞を樹立し、cyITD-FLT3-32D細胞以外の変異FLT3発現細胞においては、FLT3に対する選択性の高さに応じて、FL刺激はFLT3阻害剤の増殖抑制効果の減弱を来すこと、これら各種FLT3発現32D細胞を同系のC3Hマウスに静注すると、変異FLT3発現細胞接種マウスは全例30日以内に白血病を発症・死亡したのに対し、正常FLT3共発現細胞は白血病を発症しないことを明らかにした。これら細胞株をNOD/SCIDマウス皮下に接種すると、その腫瘤形成速度は変異FLT3分子発現細胞よりも正常FLT3共発現細胞において有意に遅いことが明らかとなった。これら細胞株においてFL刺激は正常FLT3共発現細胞に対し細胞周期のG2停止とアポトーシス誘導をもたらすが、正常FLT3分子のリン酸化とMAPK、STAT3の活性化を誘導することが明らかとなった。一方、STAT5の活性化は変異FLT3分子特異的に認められ、FL刺激に基づく正常FLT3分子の活性化によっては誘導されなかった。これらの結果より、FLによる正常FLT3分子の活性化に起因するMAPKとSTAT3の活性化が細胞周期の停止、増殖速度の低下、更にはFLT3阻害剤の効果減弱に関与している可能性が示唆された。更に、リン酸化タンパクアレイによる解析の結果、正常FLT3共発現細胞にFL刺激を与えた際に特異的に活性化される候補分子を同定した。この活性化分子を介したシグナル伝達経路がFLによるFLT3阻害剤の効果減弱に関与している可能性が示唆され、現在解析を行っている。正常FLT3発現(Wt-FLT3)、変異FLT3発現(ITD-FLT3)、正常/変異FLT3共発現(Wt/ITD-FLT3)、細胞外領域欠失変異FLT3発現(cyITD-FLT3)、正常/細胞外領域欠失変異FLT3共発現(Wt/cyITD-FLT3)32D細胞に対する複数のFLT3阻害剤の増殖抑制効果をFL存在下、非存在下で比較検討した。cyITD-FLT3-32D細胞以外の変異FLT3発現細胞においては、FLT3に対する選択性の高さに応じて、FL存在下では阻害活性の減弱が認められた。この減弱効果は正常FLT3分子の共発現細胞において、より顕著に認められたが、cyITD-FLT3-32D細胞ではFLによる増殖抑制効果は認めなかった。これら発現32D細胞を同系のC3Hマウスに静注すると、変異FLT3発現細胞接種マウスは全例30日以内に白血病を発症し、死亡したのに対し、正常FLT3共発現細胞は白血病を発症しなかった。また、死亡までの期間はcyITD-FLT3-32D細胞が最も短期間であった。これら細胞株におけるFL刺激による細胞増殖、細胞周期に及ぼす影響を検討したところ、正常FLT3共発現細胞においては、細胞周期のG2停止とアポトーシス誘導が認められた。これらの結果より、FLによる細胞周期の停止が阻害剤の効果減弱に関与している可能性が示唆された。平成24年度から平成25年度の研究において、正常FLT3発現(Wt-FLT3)、変異FLT3発現(ITD-FLT3)、正常/変異FLT3共発現(Wt/ITD-FLT3)、細胞外領域欠失変異FLT3発現(cyITD-FLT3)、正常/細胞外領域欠失変異FLT3共発現(Wt/cyITD-FLT3)32D細胞を樹立し、cyITD-FLT3-32D細胞以外の変異FLT3発現細胞においては、FLT3に対する選択性の高さに応じて、FL刺激はFLT3阻害剤の増殖抑制効果の減弱を来すことを明らかにした。これら細胞株においてFL刺激は正常FLT3共発現細胞に対し、正常FLT3分子のリン酸化とMAPK、の活性化を誘導することを明らかにした。平成26年度は、正常および変異FLT3発現アレル比の異なる複数のヒト急性骨髄性白血病(AML)細胞を用いてFLT3阻害剤による増殖抑制効果に対するFL刺激の影響を評価した。

半固形培地を用いたヒトAML細胞の増殖評価系において、正常FLT3分子が変異FLT3分子と同等に発現しているAML細胞ではFL存在下でのFLT3阻害剤による増殖抑制効果は70%程度も減弱されることが確認された。更に、これらヒトAML細胞をNOGマウスに異種移植することにより樹立したヒトAMLマウスモデルにおいても、同様の結果を得た。しかし、FLT3阻害剤に加えてMEK阻害剤によりMAPK活性を抑制することにより、FLによる増殖抑制効果の減弱はキャンセルできることを明らかにした。これらの結果により、生体内で分泌されるFLによっても正常FLT3分子共発現AML細胞に対するFLT3阻害剤の治療効果は減弱させられることが明らかとなり、これまでの臨床試験の結果を再現する評価系を構築することができた。この評価系を用いることにより、より有効なFLT3阻害剤の開発を促進できることが期待される。血液内科学リガンド存在下における受容体チロシンキナーゼ阻害剤の効果減弱について、複数のFLT3阻害剤において検証を行い、選択性の高い阻害剤ほどリガンドによる阻害活性効果の減弱が強く認めることを確認した。更に、予想に反して、リガンド刺激は変異FLT3発現細胞の細胞周期を停止させ、アポトーシスを誘導することがin vitro, in vivoで確認した。このことは、正常受容体型チロシンキナーゼのリガンド刺激に基づく活性化が細胞周期の低下をもたらし、阻害剤の効果を減弱している新たな可能性を示唆しているが、正常FLT3共発現細胞にFL刺激を与えた際に特異的に活性化される候補分子を同定したことより、更なる研究の発展が期待できる。リガンド存在下における受容体チロシンキナーゼ阻害剤の効果減弱について、複数のFLT3阻害剤において検証を行った。当初計画よりも複数の阻害剤が入手可能となったため、6種類の選択性の異なる阻害剤で評価を行い、予想されたとおり、選択性の高い阻害剤ほどリガンドによる阻害活性効果の減弱が強く認めることを確認した。更に、予想に反して、リガンド刺激は変異FLT3発現細胞の細胞周期を停止させ、アポトーシスを誘導することがin vitroで確認されるとともに、同系マウスへの移植実験においても、正常FLT3分子発現細胞の生着・白血病発症が認められないことを確認した。このことは、正常受容体型チロシンキナーゼのリガンド刺激に基づく活性化が細胞周期の低下をもたらし、阻害剤の効果を減弱している新たな可能性が示唆された。今年度までの研究により、正常FLT3のリガンド刺激に基づく活性化が細胞周期の低下をもたらし、阻害剤の効果を減弱している新たな可能性が示唆された。リガンド刺激に基づく正常FLT3の活性化がMAPK、STAT3などの特異的分子の活性化をきたしていること、正常FLT3共発現細胞にFL刺激を与えた際に特異的に活性化される候補分子を同定したことより、この活性化分子を介したシグナル伝達経路がFLによるFLT3阻害剤の効果減弱に関与している可能性が示唆され、次年度以降、詳細な解析を実施していく。また、臨床検体を用いたin vitroならびにNOGマウスへの異種移植系においての評価を進める。
pMMO三核銅構造の機構解明を目的とする構造・機能モデルの合成

1)様々な三核銅錯体の合成・結晶構造・磁性:トリピリジン配位子tris(6-methylpyridyl)methane(L^1)、又は、bis(6-methylpyridyl)pyridylmethane(L^2)とCuX_2(X=Cl or Br)をMeOH中で、一晩反応させた後にNaOHおよびNaPF_6を加えて、三核銅錯体[Cu(L^1O)]_3(X)(PF_6)_2(X=Br,1,Cl,2)、又は、[Cu(L^2O)]_3(X)(PF_6)_2(X=Br,3,Cl,4)を得た。単結晶X線構造解析から、1-4の構造は、正三角形型の三核銅錯体である事がわかった。磁化率の温度変化の測定から、1-4についてのJ値をそれぞれ-19.24,-4.80,-3.70,-0.30cm^<-1>と決定した。これらの値は、1-4において、銅-銅間に弱い反強磁性的相互作用が働いていることを示している。従来の正三角形型三核銅錯体は、ほとんどの場合、銅-銅間に強い反強磁性的相互作用を示している。従って、1-4は、従来にない特異な磁気的相互作用を示す三核銅錯体として重要である。また、1-4のJ値はpMMO三核銅中心のJ値と類似していることから、1-4はpMMOの三核銅構造を研究するための構造モデルとして期待される。2)配位子水酸化機構の解明:三核銅錯体1-4の生成過程で配位子LはLOHへと水酸化されていた。これは銅が触媒するアルカンの水酸化反応であり、銅含有モノオキシゲナーゼの反応と関連するので、反応機構を解明することは重要である。そこで、(1)^<18>O_2を用いた同位体ラベル実験、(2)中間体の単離、(3)中間体の反応性の検討、(4)中間体の分光学的・電気化学的研究により、水酸化機構を明らかにした。この反応では、銅(II)イオンそのものが酸化剤として作用する事が明らかになった。即ち、配位子の炭素ラジカルから銅(II)イオンへの1電子移動によって銅(I)イオンと配位子カルボカチオンを生じる。このカルボカチオンにMeOHが求核攻撃して、配位子が一原子酸素化される。これは、銅(I)錯体及び中間体の結晶構造解析によって証明された。
生体ブラウニアンマシン集合系のデザインと協調メカニズムの解明

本研究では、筋肉の収縮単位であるミオシンフィラメントをDNAナノテクノロジーを駆使してデザインし、フィラメント内部のモーター分子群の動態や運動相関を1分子レベルで解析するのが目的である。前年度からの実験の最適化を行うことで、独自に構築した暗視野顕微鏡を用いて、フィラメント内のミオシン分子1個の動作を従来の報告にない精度で直接観察することに成功し、高速AFMを用いて、ミオシン分子の構造変化と分子間の運動相関を直接観察することに成功した。いずれも、50年近い筋研究の歴史の中で、直接観察が望まれながらも実現できなかった観察であり、筋研究の中での大きなマイルストーンとなる成果だと確信している。具体的な成果は以下である。筋収縮の分子メカニズムについて実験・理論の両面から多種多様な研究が展開され、ミオシンレバーアーム部位の構造変化を基盤としたレバーアーム仮説が定着した。しかし、筋収縮の機械特性や協同効果を説明するのに重要となる、力発生時の構造変化の動的な特性や、力発生の初期過程については不明な点も多かった。直接観察ができなかったことが原因であり、今回、DNAオリガミをベースにした人工ミオシンフィラメントを作製することで、その観察を可能にした。ミオシンモーター部位は、マイクロ秒の時間スケールでブラウン運動しながらアクチンと弱い結合解離を繰り返し、その結合解離特性がブラウニアンラチェットの特性を持つこと、また、前方にバイアス結合を行うことを発見した。バイアス結合後は、アクチンと強い結合状態を形成し、レバーアームの2段階かつ可逆的な構造変化を起こした。力発生時のこれらの動的特性は、筋収縮の力-収縮速度関係、熱産生さらには、外力下での効率的、適応的な筋収縮特性、協同効果といった機械特性を包括的に説明する分子基盤を提供する。本年度では、独自に作成した人工ミオシンフィラメントをアクチンフィラメント上に固定し、フィラメント内の筋肉ミオシン分子1個の動作を精密に測定することを行った。ミオシン分子1個の動態を1nm,数十マイクロ秒の時空間分解能で観察するために、金ナノ粒子をミオシン近傍にラベルし、マイクロミラータイプの全反射照明顕微鏡を構築した。この光学設計により、40マイクロ秒の時間分解能で0.5 nm (ガラス固定した金粒子位置の標準偏差)を得ることができた。ミオシン近傍にラベルした金ナノ粒子の動きを観察したところ、ATP存在下でノンプロセッシブな一方向運動が観察され、ATP濃度に依存してアクチンへの結合時間の変化が見られた。さらに、蛍光ATPとステップ運動との同時観察も行い、ミオシン由来の運動を観察している確認を取ることができた。従来の光ピンセット法を用いた1分子計測においては、ミオシンよりも20倍以上大きいプローブが必要であり、応答時間の遅さや回転弾性に起因するミオシン運動の検出限界が存在するが、本研究で開発した手法ではミオシン分子と同程度の40nm金粒子をbifunctionalに固定しているため、運動素過程を詳細に観察できると期待している。今後は、観察条件のさらなる最適化を行い、フィラメント内の分子動態素過程を詳細に解析する予定である。また、フィラメントのすべり運動中に、複数のミオシン分子動態観察を行い、ミオシン分子間の運動相関を解析する準備も進めていく。本研究では、従来の1分子計測手法ではハイスループットでの計測が難しい、モーター分子運動素過程を詳細に観察する新たな実験系開発が含まれている。DNAナノテクノロジーを組み合わせた新規性の高いストラテジーであり世界でも類を見ない。そのため、様々な困難が予想されたが、当該年度における目標であった、ミオシンフィラメント内部のミオシン1個の運動素過程観察をすでに実現することができたため、おおむね順調に進展していると考えている。実験条件のさらなる最適化を進めることで、従来の手法では観察できなかったイベントを捉えることができると期待している。また、本研究の手法の利点である、ミオシンフィラメント内部の複数の分子運動動態観察を可能にするためのストラテジーも確立しているため、おおむね研究計画通りに伸展している。

ミオシンモーター部位は、マイクロ秒の時間スケールでブラウン運動しながらアクチンと弱い結合解離を繰り返し、その結合解離特性がブラウニアンラチェットの特性を持つこと、また、前方にバイアス結合を行うことを発見した。バイアス結合後は、アクチンと強い結合状態を形成し、レバーアームの2段階かつ可逆的な構造変化を起こした。力発生時のこれらの動的特性は、筋収縮の力-収縮速度関係、熱産生さらには、外力下での効率的、適応的な筋収縮特性、協同効果といった機械特性を包括的に説明する分子基盤を提供する。フィラメント内部のミオシン1個の運動素過程観察においては、前年度に引き続きデータの取得と解析作業を進める。本研究の時間分解能では、従来の手法では検出できなかった、ミオシンアクチン間の弱い相互作用とみられる結合も観察している可能性があるので、ミオシンのブラウン運動と弱い相互作用、力発生の素過程を客観的・定量的に解析するための統計的手法(隠れマルコフモデルなど)を用いて進めていく。フィラメント内部のミオシン分子間の運動相関については、量子ドットの多色観察によって解析が可能になるため、ラベル方法の最適化などを進めていく。(理由)年度末近くになって購入予定だった試薬(人工ミオシンフィラメント作成用の合成オリゴ)の納入遅延が判明し納入に年度をまたぐ可能性がでて、発注をキャンセルしたため。(使用計画)次年度始めに試薬を購入し人工ミオシンフィラメント作成を行い、実験を遂行する。
卵管自動能を制御するペースメーカーとその機能発現機構の解明

1)カルシウムオシレーションパターンによる培養卵管平滑筋およびペースメーカー細胞の特徴解析培養細胞ごとのカルシウム変動パターンを数学的手法を用いて解析を行い、その特徴からウシ卵管収縮を引き起こすペースメーカー細胞の同定を試みた。検討の結果、オシレーションパルスの短いもの、長いもの、全く変動を示さないなど、個別の細胞において様々なパターンが存在することが明らかとなった。しかしながらこれらのパターンは細胞濃度などの培養条件が大きく影響することが明らかとなったため、この中からペースメーカー細胞を特定するにまでは至っていない。2)培養細胞を用いた関連イオンチャネルの同定前年度に検討した収縮に関与するイオンチャネルを特定するため、エレクトロポレーション法を用いたイオンチャネルの遺伝子ノックアウトまたはノックダウンを試みているが、導入効率が低く条件を検討中である。そこで各種イオンチャネルの阻害剤を用いて培養細胞のカルシウムパターンに影響が起こるか調査した。これまでに電位依存性カルシウムチャネル、小胞体カルシウムイオンチャネルを検討したが、変動パターンに影響は認められなかった。培養細胞の状態が、生体組織と異なっていることが考えられる。3)ペースメーカー・平滑筋細胞間の刺激伝達経路の検討培養細胞にギャップジャンクション阻害剤を作用させ、カルシウム変動パターンを観察したが、有意な影響は認められなかった。カルシウムパターンが細胞間で同期せず異なっていることから、現行の培養方法ではギャップジャンクションは形成されていない可能性が考えられた。以上より、培養条件のさらなる検討が今後の重要課題であると考えられる。当初予定していたカルシウムオシレーションパターンによるペースメーカー細胞の特定が、現在の培養系では困難であることが判明したため。現在、細胞間でカルシウム変動を同期化させるための培養方法を検討している。培養条件においてオシレーションパターンに変化が認められたことから、さらに変更を加えて生体組織のように細胞間で同調させ、それを用いて検討を実施していく予定である。卵管収縮を制御するペースメーカー細胞の同定を目的に、細胞膜電位の制御に関与するイオンチャネル、並びに脱分極の伝達様式を検討した。さらに、平滑筋培養細胞を用いたペースメーカー細胞の探索手法の確立を試みた。1)ウシ卵管峡部組織を用いて収縮試験を行い、収縮に関与すると考えられる電位依存性Ca2+チャネル(VDCC),小胞体からのCa2+放出レセプター,カリウムチャネルについて各阻害剤が自発収縮に与える影響を検討した。2)収縮試験によってギャップジャンクション阻害剤が卵管自発収縮の収縮回数および振幅に与える影響を調べ、刺激伝達様式について検討した。3)ウシ卵管峡部の平滑筋細胞培養法およびライブセルイメージングによるCa2+オシレーションの観察条件を検討した。1) VDCC阻害剤および小胞体カルシウム放出レセプター阻害剤の添加により、卵管組織の収縮は完全に停止した。これらの結果から、細胞外からCa2+を供給するVDCCおよび小胞体からCa2+を放出するレセプターが卵管自発収縮に必須であることが示唆された。カリウムチャネル阻害剤の添加により、収縮回数および振幅が影響を受けことから、カリウムチャネルがペースメーカーおよび平滑筋細胞の再分極および過分極に関与することが示唆された。2)ギャップジャンクション阻害剤により収縮回数および振幅が減少したことから、ギャップジャンクションが組織内で刺激を伝達することが示唆された。3)培養平滑筋細胞の密度がコンフルエントのときのみCa2+オシレーションが観察されたことから、Ca2+オシレーションの発生には、ある程度の細胞間接着が必要であると考えられた。Image Jおよび交互交換関数を用いて各平滑筋細胞の輝度の変化や同期性を評価することが可能となった。培養平滑筋・ペースメーカー細胞のカルシウムオシレーションが非常に活発で細胞ごとに様々なパターンが観察されたため、カルシウムオシレーションの有無だけではペースメーカー細胞の同定が困難であることが明らかとなった。現在別の観点からペースメーカーの道程を試みているため、次年度は本実験をさらに加速化する。

まだペースメーカー細胞の同定に至っていないため、まずはカルシウムオシレーションのパターンを手掛かりにして遺伝子発現の違いを細胞ごとに検討し、遺伝子発現を明らかにすることでペースメーカー細胞の特性を明らかにする。同時に培養細胞への遺伝子導入条件を早急に確定し、ぺースメーカーが活動するために必要なイオンチャネルを遺伝子ノックアウトもしくはノックダウンを用いて決定する。現在、細胞間でカルシウム変動を同期化させるための培養方法を検討している。培養条件においてオシレーションパターンに変化が認められたことから、さらに変更を加えて生体組織のように細胞間で同調させ、それを用いて検討を実施していく予定である。
静脈麻酔薬のラット大脳皮質NMDA受容体に及ぼす影響の研究

Wister系雄性ラットを無麻酔下に断頭し全脳を摘出、ホモジナイズと遠心分離によりP2分画を採取し、不純物除去のためにTriton X-100で処理し、NMDA受容体を含んだ膜標本を得た。RIリガンドに[3H]glutamateを用いて2°C、incubation時間15分の条件下でNMDA受容体の存在を確認した。propofolのreceptorに及ぼす影響についての検討を行った結果、ばらつきが大きくreceptorに対するリガンドの結合の傾向がつかめない状態であるため、現在サンプル数を増やしての検討を行っている。更にこれらの手技に改良を加えながらmidazolamのNMDA受容体への影響を検討中である。上記の結果は学会・論文等で発表予定である。
リスク管理のプラットフォーム

震災、津波、洪水、地崩れ、火山爆発、感染症、テロ、経済危機など多様なリスクについて、それぞれの分野のリスク管理について文献渉猟および専門家へのインタビューを通じてリテラシーを身につけた上で、その成果を執筆中の『公共政策』(有斐閣)のリスク管理の総論の部分および各論の各章に反映させる。延長していただいた29年度にはとくに火山について研究を深めた。様々なリスクに関する研究書、映像資料、展示物を利用して疾病(感染症と食中毒)、地震と津波、テロリズムに関する知見を広めつつ、フィーマットに落とし込む努力を続けている。いくつかの重要な点をあげておく。歴史的な記録から学ぶべことは、地震に限らず、きわめて重要であることが判明した。世界史や日本史をリスクという観点から整理し、学校教育においても児童・学生に教える必要があることが判明した。リスク発生時のコミュニケーションの重要性も改めて認識された。政府に対する信頼を高める情報発信の方法は言うにおよばす、国民の間での正しい知識に基づく情報交換そして外国語(とくに英語)表記による注意喚起や教育などは、当の外国人にとってだけでなく、彼らと接する日本人にとっても重要であることが判明した。後二者もまた学校教育において体系的に教える必要があるものである考えるにいたった。リスクに対する行政官の発想がショートスパンであることは人事政策における重要な課題であることが明らかになった。ある官僚の正直な言によれば、官僚の時間感覚は「1,2,たくさん」であるということである。すなわち、政策形成に責任を有する官僚は2年で異動するために、この期間での業績を上げることに主たる関心があり、それ以上は3年であれ、10年であれ、100年であれ同じ程度の関心、すなわちほとんど関心をもたないということである。「忘れた頃にやってくる」災害に対しては非常に脆弱であるといわざるをえない。官僚に過度に依存することなくリスクに備える方策を考える必要があることが判明した。総じて、リスク対応を継続的に行えるようにするには、学校教育がきわめて重要であり、さらに研究計画を拡大・進化させる必要があると判断するにいたった。多くの自治体がリスク発生時の記者会見の仕方について実習を含む学習をしている。リスク対応研究の現状については、1,それぞれ分野が高度に専門分化しているために、相互交流はなきに等しいこと、2,それぞれの専門分野はほぼ孤立していること、3、ほとんどが自然科学者によって行われていることが特徴として指摘できる。そして、リスク対応の実際の担い手と政治家、行政官、企業を検討した結果、それぞれ以下の理由から大きな期待を寄せるべきでないことを明らかにした。(1)陣笠議員は再選に血道を上げており、大物政治家といえども、いつ起こるともしれない出来事に備えるべきだと訴えたところで、配下の陣笠議員の「票」には結びつかないことから、政治家には期待できない。(2)行政官は在任中の2年間に一定の成果を上げることを目指す。その成果が人事考課に反映され、次にどのポストに就くかが決められるからである。したがって、3年先のことは、10年、30年、100年先のことと同様に、自分には関係のない遠い未来の世界に属するという感覚であることから、大きな期待はできない。(3)東日本大震災を経た日本においてリスク対応は巨大なビジネス・チャンスとなっている。「震災対策技術展」というイベントが年に数回、開催されている。震災という言葉が冠されてはいるが、地震と津浪に限らず、地震、土砂、落雷などに多様なリスクに事前事後に対応する商品が展示されている。しかし、防災商品の大口購入者は地方自治体である。財政難に苦しむ地方自治体がいつまで防災関連に予算を投入し続けることができるかは、一般国民の関心次第である。予算が削減されれば、利潤を追求する企業は防災関連商品の製造販売を断念せざるをえない。それゆえ、企業にも大きな期待をかけることはできない。以上の理由から、リスク管理のプラットフォームは、学校教育における正規科目として提供する必要がある。本研究ではそのためのカリキュラムの原型を作成した。上記のカリキュラムのイメージを示せば以下のようである。たとえば、高校においてある曜日の1時間目が総合学習の時間であるとする。1週目は英語の教師が「海外旅行中に災害に遭遇したときに知っておくべき英単語と表現を教える」、2週目は日本史の教師が「日本の災害の歴史を古文書や歴史小説を題材に教える」、3週目は数学の教師が「現在の暗号がどのように作られているかを素因数分解の知識を前提に教える」、4週目は「理科の教師が地震発生のメカニズムを教える」。5週目は「美術の教師がヴェスビオス火山の噴火によって一瞬に消えたポンペイの町に残された壁画について教える」・・・・等などである。リスク対応に特化した「新しい総合学習」のメリットは以下の通りである。1,学校の正規科目に採り入れることによって、生徒・児童は継続的にリスクについて学習する機会を与えられ、ひいてはこれが記憶の継承に貢献する。

2,しばしば「学校で学んだことは世の中に出て役に立たない」とする俗説を是正することができる。自らの命を守る学習が役に立たないわけがない。3,「丸暗記は良くない」という俗説をある程度払拭できる。すべてのことが丸暗記で済むことはないが、丸暗記しなければならないことはある。小学校低学年で学ぶ九九などはその典型である。漢字もそうである。リスク対応教育を通じて、丸暗記こそが自らの命を守ることがあることを知らしめることができる。4総合学習の目標が明確になる。現在の総合学習は「自ら課題を見付け、自ら学び、自ら考え、主体的に判断し、よりよく問題を解決する資質や能力を育てる」とされているが、肝心の目標が明確ではない。有意義な人生を送るため、社会で活躍するためと言っても、やはり茫漠としている。「新しい総合学習」の目標は「いざというときに自分の命を守ること」である。これほど明確な学習の目標はありえない。われわれは常に様々なリスクに囲まれ、ときにそれが現実化したとき危機に遭遇する。リスクが現実化した直後、各種の対応策を検討し、それらを講じる。しかし、時がたてば事件・事故は静かに忘れさられ、対応策もおざなりにされる。そのようなことをわれわれは繰り返してきた。リスクはあくまでも確率として把握されるために現実感に乏しく、危機は滅多に起きないために緊迫感が薄いためであろう。本研究の目的は、様々な分野におけるリスク(地震・津波、新型インフルエンザ、金融危機、テロ)を横断する対応策を一定の様式に従って整理することによって、相互学習を可能にする「リスク管理のプラットフォーム」を作成し、リスク管理全般への関心を継続させる方策を提示することであった。その研究成果は、執筆中の『公共政策』(有斐閣)におけるリスク管理に関する各論「11章新型感染症」「12章地震と津波」等を総括する総論部分「10章リスク管理論の概要外商害よ」としてまとめられることになる。震災、津波、洪水、地崩れ、火山爆発、感染症、テロ、経済危機など多様なリスクについて、それぞれの分野のリスク管理について文献渉猟および専門家へのインタビューを通じてリテラシーを身につけた上で、その成果を執筆中の『公共政策』(有斐閣)のリスク管理の総論の部分および各論の各章に反映させる。延長していただいた29年度にはとくに火山について研究を深めた。初年度と同様の方針で調査研究を進める。研究書を咀嚼して、要点を整理する。映像資料を通じて、リスクに対するリアリティある理解を進める。やがて薄れていく記憶をいかに継承するかについて検討する。今後の研究計画は一にも二にも充実したカリキュラムとテキストの作成である。行政学公共政策予定していた現地調査が先方の事情によっていったん中止になったために、その旅費が残ったため。2017年の日本行政学会におけるリスク関連パネルで討論者を依頼されたために、調査研究を引き続き実施して、有意義な討論を展開して、学会に貢献するとともに、研究を一層充実させるため。今年度に現地調査を実施する計画である。
遺伝子複製速度を制御するDNA高次構造と化学環境の効果

本研究ではDNA複製反応の経時的な観察を行い、鋳型核酸の安定性および周囲の分子環境によって複製速度が制御されるメカニズムを定量的に解明することである。鋳型DNAの熱力学的安定性と複製反応の相関性を定量的に解析することを中心に研究を推進した結果、DNA複製反応速度は鋳型核酸のもつ熱力学的安定性だけでなく、鋳型DNAが形成する二次構造のトポロジーに大きく依存したことを見出した。さらに分子クラウディング環境に応じてトポロジーが変化する事でも複製速度が変化した。以上の成果は、生体反応が核酸構造によって制御される新たなメカニズムを示唆するものである。平成26年度は様々な高次構造を持つ鋳型核酸が複製反応に及ぼす影響を検討した。Klenow Fragment DNAポリメラーゼを用いたゲル電気泳動による予備的な実験により、鋳型核酸中にグアニン四重鎖が形成されるとその安定性に応じて複製反応速度が低下した。特に4枚のグアニン-カルテットからなるグアニン四重鎖の場合は、Klenow Fragmentが四重鎖構造の手前で複製反応を停止させた。同様の手法で、これらの相補的な鋳型核酸についても同様に複製反応の影響を検討したところ、弱酸性(pH 6.0)環境において複製反応速度が低下した。この場合、シトシンリッチな配列がi-motif構造を形成し、その高次構造によっても複製反応が阻害された事が示唆された。特に、ヒトのがん細胞の活性に関わるHif1α遺伝子配列を用いた場合、i-motif構造形成に伴う複製反応の停止が観察され、i-motif構造も複製反応の障害になり得ることが示された。周囲の分子環境の影響についても検討を進めている。溶媒環境の効果においては、分子クラウディング効果をもたらすポリエチレングリコール(平均分子量200)共存下においてグアニン四重鎖による複製速度の低下が顕著に観察された。一方で、i-motifを形成するDNAの複製速度に関してはあまり影響が無かった。さらに圧力の効果も検討を始め、グアニン四重鎖を持つ鋳型DNAの構造が圧力によって不安定化することを見出した(高圧力の科学と技術(2015)in press)。平成27年度は鋳型DNAの熱力学的安定性と複製反応の相関性を定量的に解析することを中心に研究を推進した。その結果、Klenow FragmentによるDNA複製反応速度は鋳型核酸のもつ熱力学的安定性(-ΔG)が大きくなるにつれ低下する事が観察された。興味深いことに、複製速度の熱安定性依存性は鋳型DNAが形成する二次構造のトポロジーに大きく依存した。特に、シトシンリッチな配列が形成するi-motif構造は、グアニン(G)リッチな配列からなるG四重鎖構造と比較して複製速度を大きく低下させた。また、G四重鎖構造でもパラレル型の方がアンチパラレル型の方が複製速度を低下させる影響は大きかった。高次構造を持つ鋳型核酸の複製反応における分子環境の影響についても検討し、ポリエチレングリコール存在下で変化するG四重鎖のトポロジー変化によって複製速度が大きく変化することも見出した。さらに圧力の影響を検討し、圧力によってG四重鎖が不安定化する一方、i-motif構造が安定化することを明らかにし、論文発表した。この知見を基に、現在複製反応に対する圧力効果の定量的解析を進めている。複製反応における鋳型DNAの高次構造の影響は定性的には知られていたが、定量的な解析はこれまでほとんどなかった。本研究において複製速度と高次構造の熱力学的安定性が定量的に相関付けられただけでなく、そのトポロジー依存的な速度差があることが見出されたことは、これまで未知であった核酸高次構造のトポロジーの生化学的意義に迫るに極めて重要な知見である。以上から研究課題に対する進捗は現在までのところ順調に進展している。平成28年度はまず鋳型核酸の安定性と複製速度の相関性の定量解析を行った。核酸構造のトポロジー毎に安定性(-ΔG)の異なる配列を用意し、複製反応速度定数(k)を解析したところ、-ΔGとlnkが直線関係にあることが見出された。この直線の傾きはトポロジーの違いを反映していた。最も傾きが負に大きいものがi-motif構造を形成する鋳型核酸の複製であり、i-motif構造が他の核酸構造より複製を抑制する効果が大きいことが定量的に解析できた。続いて、分子環境の影響を解析するために20 wt%ポリエチレングリコール1000(平均分子量1000)存在下で測定を行ったところ、構造の安定性が向上し複製速度はさらに低下した。興味深いことに、ヒトテロメアG四重鎖の鋳型核酸がポリエチレングリコールの影響でMixed型からParallel型へと構造変化し、それによりトポロジー依存的な複製速度が変化し、構造安定性と複製速度の相関がi-motifに近い値を取るようになった。本研究で得られた結果は、細胞内環境に応じて生じるトポロジー依存的な遺伝子発現の可能性を示唆する。

鋳型DNAの熱力学的安定性と複製反応の相関性を定量的に解析することを中心に研究を推進した結果、DNA複製反応速度は鋳型核酸のもつ熱力学的安定性だけでなく、鋳型DNAが形成する二次構造のトポロジーに大きく依存したことを見出した。さらに分子クラウディング環境に応じてトポロジーが変化する事でも複製速度が変化した。以上の成果は、生体反応が核酸構造によって制御される新たなメカニズムを示唆するものである。様々な高次構造を持つ鋳型核酸の複製反応に対する影響を検討し、その安定性に応じて反応速度が低下、さらには停止することが確認できた。特にi-motifによる影響はこれまで報告例が無く、新たな知見である。また分子環境に伴う影響も既に検討し始めており、ポリエチレングリコールによる分子クラウディング効果が複製反応に及ぼす影響や、高圧力による鋳型DNA安定性の効果など、複製反応の分子環境特性の解析が出来つつある。以上から研究課題に対する進捗は現在までのところ順調に進展している。DNA複製反応のリアルタイム解析法の開発を行い、スループット性をあげた解析手法の開発に取り組む。また、核酸の高次構造形成速度に関しても知見を得るために、ストップトフロー解析などを行い、得られた速度定数を複製速度と関連性があるか評価する。さらにG四重鎖やi-motif構造に対して結合する低分子化合物やタンパク質が存在する際の影響を定量的に解析する。生体関連化学鋳型DNAの種々の高次構造が与える複製反応への影響を調べるために、UVメルティング法を用いて鋳型DNAの安定性の熱力学的パラメータを定量的に算出する。また開発中の複製反応のリアルタイム観察法の条件検討を行い、複製速度を定量化する。得られたDNAの熱力学パラメータと複製反応の速度パラメータを相関付ける。鋳型DNAの効構造形成に関する速度パラメータに関してもストップトフローなどを用いて解析し、複製速度と関連性があるか検討する。分子クラウディング環境や圧力による影響に関しても、定量的に結果を解析する。論文発表用の英文校正の納品が遅れたため。測定手法の変更に伴い、使用予定であったビオチン化DNAの購入を見送ったため。英文校正の支払を次年度に行う。測定手法が確立され次第、新たに設計したDNAの購入費用として順次使用する。
オルタナティブオートファジーの分子機構および生理的意義の解明

本研究では、Atg5/Atg7非依存性のオルタナティブオートファジーの全容を解明することを目的として研究を開始した。具体的には、オルタナティブオートファジー制御機構の解明、特に既知の細胞生存や代謝の制御に関与する分子との相互作用、コンベンショナルオートファジーとのクロストーク、生理的・病理的意義、さらにオルタナティブオートファジーの特異的マーカーの同定などを目的とした。前年度までに、アポトーシスの抑制因子であるBcl-2がコンベンショナルオートファジーの制御に関与していること、また一方で、我々が同定したオルタナティブオートファジーにおいても、Bcl-2がその制御に関係しているということを細胞の系およびマウスの系で明らかにした。オートファジーが飢餓応答として重要であることから、代謝制御に関与する分子との相互作用について検討を行った。ミトコンドリアタンパクのアセチル化の制御に重要なサーチュイン分子であるSIRT3がオートファジー、特にミトコンドリア特異的オートファジーであるマイトファジーの制御に関係している可能性を考え、実験を行った。遺伝子ノックダウン、またはノックアウト細胞を用いた検討により、SIRT3の欠損がオートファジーの抑制をもたらす可能性が示唆された。また、マイトファジーに対するSIRT3の影響は明らかではなかった。今後はSIRT3と相互作用するオートファジー制御因子の同定を目標とし、プロテオーム、インターラクトローム解析を行って行く予定である。ミトコンドリア内代謝制御に重要と考えられるアセチル化制御とオートファジーとの関連を示した。Bcl-2によるオルタナティブオートファジー制御のメカニズムの解析を続行し、さらにアセチル化制御との関連も検討する予定である。アポトーシスの抑制因子であるBcl-2がコンベンショナルオートファジーの制御に関与していると報告されている。一方で、我々が同定したオルタナティブオートファジーにおいても、Bcl-2がその制御に関係しているという仮説を提示し、細胞の系およびマウスの系を用いて検討を行った。まず、Bcl-2ノックアウトの新生児マウスを飢餓状態とし、ウェスタンブロットによりオートファジーの評価を行った。その結果、腎臓においてBcl-2ノックアウトでコンベンショナルオートファジーは軽度の抑制が見られた。一方で、心臓、肝臓などその他の臓器においては顕著な差異は認められなかった。また、Bcl-2ノックアウトMEFについてはいずれの刺激でもオートファジーの誘導に軽度の抑制が見られた。そこでBcl-2をノックアウトMEFに再度発現させたところ、コンベンショナルオートファジーは部分的に回復した。以上より、Bcl-2はコンベンショナルオートファジーの誘導に関しては、全体としては限定的な役割にとどまるものの、促進的に制御しているものと考えられた。オルタナティブオートファジーに関しては、Atg5およびBcl-2のダブルノックアウト(DKO)マウスを作成した。マウスは正常に出生したが、Atg5単独ノックアウトマウスと同様に、新生児期に全て死亡した。肉眼的観察においては著明な形態的異常は認められなかった、組織学的な検討では、DKOの腎臓において明らかな糸球体数の減少が認められた。一方で、Atg5/Bcl-2 DKO MEFにおいては、エトポシド刺激下において、Atg5単独欠損MEFよりも顕著なオルタナティブオートファジーの誘導が見られた。さらに、オルタナティブオートファジーの生体内での役割を検討するため、Atg5/Bcl-2 DKOマウス新生児の腎臓においてLamp-2抗体による免疫染色を行った。その結果、Atg5/Bcl-2 DKOでは野生型に比べて顕著なLamp-2陽性ドットの形成が認められ、細胞での検討と同様に、オルタナティブオートファジーが亢進していることが示唆された。新しく発見したオートファジー機構に関して、Bcl-2が候補分子である事を見出し、さらに生体におけるBcl-2のオートファジー調節機能を明らかにし得た。

Atg5/Bcl-2両欠損マウスの更なる個体数の解析と、Bcl-2によるオルタナティブオートファジー制御のメカニズムの解析を行っていく予定である。Bcl-2によるオルタナティブオートファジー制御のメカニズムの解析を続行し、さらにアセチル化制御との関連も検討する予定である。