hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウェルネス社会を築く地域医療情報ネットワークの効率性及び経済効果の実証研究

本研究の目的は、医療・介護・健康・福祉面での地域課題をICT(情報通信技術)を活用し、健康で活力のあるウェルネス地域社会を構築することにある。本研究では、医療・健康に関するビッグデータを構築し、それを医療機関や住民と共有・活用し、生活習慣病の予防と重症化の防止、二重投薬・検査の防止、医療サービスの効率化を目指すものである。今年度の研究では、2018年4月に解禁となったオンライン診療を中心に、これまで実績と今後の課題を分析した。オンライン診療とは、在宅の患者とクリニックを電気通信機器で結び、リアルタイムの患者情報を共有するものである。その内容は、1オンライン問診、2(狭義の)オンライン診療3遠隔服薬指導からなる。1オンライン問診とは、患者が診察前に自宅で、タブレットやスマートフォンを用いて、自分の病状や健康状態を入力し、また問診に回答する。これにより医師側では事前の情報収集と準備ができ、患者の主訴を把握できる。また、患者も自分の症状の変化に気付き易くなる。2オンライン診察は、遠隔の患者とスマホによるビデオチャットにより会話を行うもので、表情や声色などの患者の状態を適切に把握しながら診察できる。医師側のメリットは、訪問診療に要する移動時間を節約でき、診療の生産性を向上できる。また、簡便な診察であるので、受診・内服が困難な患者の治療からの脱落が防止できる。さらに、テキスト形式のメモにより、他職種の医療関係者との情報共有が可能となる。3遠隔服薬指導とは、オンライン診療を行っている患者で、地理的条件により対面での服薬指導が困難な場合に、テレビ電話等を活用して服薬指導を行うものである。服薬指導のオンライン化により、事前の問診、診察から薬の受け取りまで、一気通貫でデータのやりとりが完結し、在宅医療の充実を可能にする。ヒアリングを行った医師や患者からは、すでに述べたような効果が確認された。本研究では、医療・健康に関するビッグデータを構築し、このデータを医療機関や住民と共有し、活用することで医療の効率化、患者厚生の向上を図ることを目的としている。研究の初年度では、医療ビッグデータ蓄積の現状について、業界団体や企業での現状を調査した。その際、医療ビッグデータを蓄積するに当たっての課題、特に技術的、制度的な側面を重視した。これらのデータは、主に医療機関が作成する診察、レセプト、投薬情報に関するものであり、医学的には最も重要な情報である。他方、2018年度の研究では、医療データとして在宅の患者あるいは高齢者側から発信され医師が受診する情報に焦点を当てた。この情報の特徴は、リアルタイムで測定が可能である点にある。これに対して、昨年度に検討したデータは、診察の都度収集・蓄積される断続的なものである。IT機器の発達より、血圧、脈拍、歩数といったバイタルデータをリアルタイムで収集できるウェアラブルな端末が数多く開発され、実用化されている。しかし問題は、患者側から発信された情報は、医師や医療機関にとって信頼できるのか、また診療に使えるのかである。この問題を、オンライン診療・問診・服薬指導を実施している自治体で実地調査した。その結果、患者や高齢者自身が測定し、医師側に伝送したデータであっても、対面診療と適切に組み合わせることにより、医師の診断に対して有用な情報を与えることが分かった。またこれ以外にも、訪問診療に要する移動時間の節約、診察の効率化に貢献することが分かった。また、患者に側にも、通院時間の節約、治療からの脱落、薬の飲み忘れといった問題の改善に役立つことが分かった。これまで2年間の研究からは、1年目の医師側が作成ないし保有するレセプト、診察、投薬情報、2年目の患者住民が測定し発信するバイタルデータや服薬情報、これらについて知見を得た。本研究の最終年度においては、この両者を統合し、それを医療の現場でどのように役立てるか、この課題に挑戦したい。ICT機器は、1情報へのアクセス、2情報の収集・蓄積、3情報の分析、4分析結果の治療への応用といった面で貢献する。この過程に関して、これまで2年間の研究は、1と2の段階である。3年目の研究では、3と4について行いたい。その方法については、医師側が持つ診療情報と患者によるバイタルあるいはオンラインデータをどう組み合わせて、医師の診断の意思決定に役立てるかである。つまり、情報が増加すればするほど、それらのすべてを考慮して診断を下すには時間が掛かり、患者を前にして効率的でない。これには、AI(人工知能)を導入して意思決定を迅速化する必要がある。このような精巧なAIの開発には時間が掛かり、当面の研究では、小規模のクリニックを前提として、医師の診断を支援するシステムを検討していきたい。今ひとつの方向は、オンライン診療を普及させる制度的枠組の構築である。具体的には、オンライン診療の医療保険での診療報酬化である。その前提となるのが、オンライン診療の有効性や経済性の証明である。この点、医療技術の経済評価の困難さから研究実績は皆無といってよい。最終年度では、適当な地域を選定して、アンケート調査を基礎にオンライン診療の経済効果を推定したい。本研究の目的は、医療・介護・健康・福祉面での地域課題を、ICTを活用して解決し、健康で活力にあふれるウェルネス地域社会を構築するための政策的基盤を確立することにある。そのために、医療・健康に関するビッグデータを構築し、このデータを医療機関や住民と共有・活用し、(ア)生活習慣病の予防、(イ)疾病の重症化の防止、(ウ)

二重投薬・検査の防止、(エ)医療機関での医療サービス供給の効率化、これらの実現を目指すものである。医療・健康ビッグデータ蓄積の例として、例えば、米国、New York市にあるHealthixは、市内の約500の医療機関と連携して、診断、検査、投薬等の医療データを、リアルタイムで共有する情報システムを構築し、現在1800万人のデータを蓄積、患者の医療情報の時系列上の推移を用いて、継続的な治療・観察に貢献するものの一つがビッグデータによるリスク管理、Population Risk Management、登録される患者数が増加すると、蓄積される各種の医療データも分析することで、上記の目的が実現される。一方、日本の現行制度では医療・健康ビッグデータを蓄積することは極めて困難である。その理由の一つは、医療情報システム統合のための費用負担が大きいことにある。住民のすべて医療・健康データにアクセスできるようするには、新しいシステムの構築、それに伴う制度改正、予算処置等多くの課題がある。この実現には、Data Health計画のような既存のネットワークの統合(あるいはカップリング)も必要である。また、具体的な工程表の作成も必要とされる。米国NYのHealthixでは、オバマケアの一環として、連符政府、州政府の補助金が用いられていて、医療機関の負担はない。これがシステムをうまく機能させている要因の一つである。本研究の目的はこれらの課題を解決する制度的枠組みを構築することである。これまで医療ビッグデータ蓄積の現状について、業界団体や企業での現状を調査した。その際、医療ビッグデータを蓄積するに当たっての課題、特に技術的、制度的な側面を重視した。これまで、1社会保険診療報酬支払基金(以下、支払基金と略記)、2生命保険業界、3創薬業界のヒアリングを行った。まず、支払基金は、医療保険の支払請求を審査し、保険から医療費を支払っているが、支払基金が扱う年間のデータ量は、20億件のレセプトデータ、0.3億件の健診データ、1.5億件の介護レセプト、さらにこれまで蓄積されたデータは医療レセプトで約110億件、特定健診等データ約1.7億件である。支払基金が担当する保険医療機関等の数は約23万か所、保険者の数は約1万8千か所、毎月取り扱うレセプトの数は約7,800万件といわれ、今後の医療ビッグデータ構築のプラットフォームになることが分かった。生命保険業界では、歩行数といった健康データを利用して、毎年一定数の歩行を行った場合、保険料が還付される生命、医療保険サービスがすでに販売されている。高齢社会での健康意識の高まりや、健康データを取るためのIT機器、特にスマートフォンの普及が挙げられる。創薬業界では、医療ビッグデータよりも遺伝子情報を創薬の開発に利用しようとしているが、医療ビッグデータは開発する新薬の絞り込みや治験での活用が考えられている。これらのヒアリングからの知見を基礎に、2年次以降の研究の方向性を決めていきたい。本研究の目的は、医療・介護・健康・福祉面での地域課題をICT(情報通信技術)を活用し、健康で活力のあるウェルネス地域社会を構築することにある。
薬剤関連顎骨壊死(MRONJ)における骨吸収抑制剤の蓄積に関する基礎的研究

ビスフォスフォネート系製剤(BP)やヒト型モノクロナール抗体製剤(デノスマブ)を代表とする骨吸収抑制剤によって起こる薬剤関連顎骨壊死medicationrelated osteonecrosis of the jaw (MRONJ)は現在深刻な問題となっており、侵襲的歯科治療を困難にする要因となっている。歯性感染症により歯周囲の海綿骨に骨硬化が認めることが知られている。また骨吸収抑制剤の投与によっても顎骨の海綿骨は硬化する。それより化膿性骨髄炎による海綿骨の変化と骨吸収抑制剤による変化をCT値を用いて定量的に評価した。MRONJと診断された50症例、化膿性下顎骨骨髄炎(OM)と診断された20症例、骨吸収抑制剤の投与歴がなく顎骨内に病変を認めない対照群50症例について下顎骨における海綿骨CT値を計測し一元配置分散分析法を用いて統計学的比較検討した。MRONJ群はOM群よりも有意に高値(P<0.01)であった。またOM群は対照群よりも有意に高値(P<0.05)であった。しかしながらOM発症は非発症部位と比較しCT値に有意差は認めなかった。このことよりMRONJによる海綿骨の骨硬化はOMによるものよりも高度であることが示唆された。ビスフォスフォネート系製剤(BP)やヒト型抗RANKLモノクローナル抗体製剤(デノスマブ)を代表とする骨吸収抑制剤によって起こる薬剤顎骨壊死medication-related osteonecrosisof the jaw (MRONJ)は、現在深刻な問題となっており、侵襲的歯科治療時の休薬の設定に関する科学的根拠は皆無である。本研究の目的は、顎骨内に蓄積された骨吸収抑制剤をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計を用いて定量的に計測することにより、骨代謝による蓄積量の変化から治療前の休薬を検討し、MRONJの発症予防となる治療戦略を構築するための基礎的研究である。本研究は、ラットを用いてBP(ゾレドロネート)と免疫グロブリン結晶化フラグメント結合オステオプロテゲリン(OPG-Fc:デノスマブの代替)を投与し、顎骨および全身骨(頭蓋骨、大腿骨、脊椎骨)を採取する。それらにおける蓄積量をMALDI-TOFMSを用いて検討する。また従来から行われている骨質評価(BMD・骨微細構造)および全身の骨代謝(骨代謝マーカー)との比較検討を行う。1.投与期間による骨の1蓄積量の変化2骨質の評価(BMD・骨微細構造)および骨代謝マーカー発現の比較検討をin vivoで検証2.休薬後の骨における製剤代謝能のin vivoの検証3.顎骨と全身骨の相違をex vivoで検証→1.2.より骨における骨吸収抑制剤の蓄積量および代謝能in vivoで解明する。また3.よりex vivoで器官特異的な薬剤の取り込みを解明し、科学的根拠のある休薬を検討する。昨年6月より東京医科大学茨城医療センターに転勤となったため、東京医科大学動物実験センターの使用が厳しい状態となったため当初の計画より遅れてしまっている。ビスフォスフォネート系製剤(BP)やヒト型モノクロナール抗体製剤(デノスマブ)を代表とする骨吸収抑制剤によって起こる薬剤関連顎骨壊死medication-related osteonecrosisof the jaw (MRONJ)は現在深刻な問題となっており、侵襲的歯科治療時の旧約の設定に関する科学的根拠は皆無である。本研究の目的は顎骨内に蓄積された骨吸収抑制剤をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析計を用いて定量的に計測することにより、骨代謝による蓄積量の変化から治療前の休薬を検討し、MRONJの発症予防となる治療戦略を構築するための基礎的研究である。東京医科大学茨城医療センターにおける動物実験センターの使用が厳しい状況のため当初の計画より遅れている。

また従来から行われている骨質評価(BMD・骨微細構造)および全身の骨代謝(骨代謝マーカー)との比較検討を行う。1.投与期間による骨の1蓄積量の変化2骨質の評価(BMD・骨微細構造)および骨代謝マーカー発現の比較検討をin vivoで検証2.休薬後の骨における製剤代謝能のin vivoの検証3.顎骨と全身骨の相違をex vivoで検証→1.2.より骨における骨吸収抑制剤の蓄積量および代謝能in vivoで解明する。また3.よりex vivoで器官特異的な薬剤の取り込みを解明し、科学的根拠のある休薬を検討する。勤務異動に伴い研究が滞っている状態である。ビスフォスフォネート系製剤(BP)やヒト型モノクロナール抗体製剤(デノスマブ)を代表とする骨吸収抑制剤によって起こる薬剤関連顎骨壊死medicationrelated osteonecrosis of the jaw (MRONJ)は現在深刻な問題となっており、侵襲的歯科治療を困難にする要因となっている。歯性感染症により歯周囲の海綿骨に骨硬化が認めることが知られている。また骨吸収抑制剤の投与によっても顎骨の海綿骨は硬化する。それより化膿性骨髄炎による海綿骨の変化と骨吸収抑制剤による変化をCT値を用いて定量的に評価した。MRONJと診断された50症例、化膿性下顎骨骨髄炎(OM)と診断された20症例、骨吸収抑制剤の投与歴がなく顎骨内に病変を認めない対照群50症例について下顎骨における海綿骨CT値を計測し一元配置分散分析法を用いて統計学的比較検討した。MRONJ群はOM群よりも有意に高値(P<0.01)であった。またOM群は対照群よりも有意に高値(P<0.05)であった。しかしながらOM発症は非発症部位と比較しCT値に有意差は認めなかった。このことよりMRONJによる海綿骨の骨硬化はOMによるものよりも高度であることが示唆された。現在の茨城医療センターでの診療の合間に研究を行えるように、診療の調整を図ること。また動物実験ではなく、同様の内容で臨床研究が可能か検討している。動物実験だけではなく、同様の内容を臨床研究に応用可能か検討している。動物実験の早期開始とともに同様の内容の臨床研究も行えるよう計画している。動物実験用の経費を使用することができなかったため計画の遅れに伴い消耗品等の購入が少なかったため。動物実験による研究が滞ってしまったため次年度から動物実験が可能であれば早急に開始したいと考えている。また厳しい時には、同じ内容の臨床研究に切り替え実験を開始する。次年度の将門品等の購入に使用する予定である。
内分泌腺の腫瘍の発生ならびに進展に関与する遺伝子変異の研究

1.副腎皮質腫瘍および膵ラ島腫瘍におけるrasオンコジンの点突然変異による活性化:アルドステロン産生腫瘍6例ならびに異所性レニン産生性肝癌1例につき、Hー,Nー,およびKーrasのコドン12および61の点突然変異を合成オリゴヌクレオタイド計40種類のプロ-ブを使用して検討したが、点突然変異は見いだされなかった。またインスリノ-マのパラフィンブロックから、PCR法を用して増幅したrasオンコジンのコドン12および61の点突然変異を検討したが点突然変異は見られなかった。2、甲状腺髄様癌、副腎褐色細胞腫、ならびに正常甲状腺・正常副腎におけるretプロトオンコジンの発現:甲状腺髄様癌と副腎褐色細胞腫ではretプロトオンコジンの発現が見られたが髄様癌以外の甲状腺癌ではretの発現は見られなかった。ノザンブロット法での検討では正常甲状腺には本オンコジンの発現は見られなかったが、正常副腎では極めて弱い発現が見られた。in situ hybridization法による検討では、本オンコジンの発現は甲状腺髄様癌細胞の細胞質に見られ、甲状腺瀘胞上皮細胞には見られなかった。3、褐色細胞腫における22番染色体長腕上の共通欠失領域:18例の褐色細胞腫につき、8種のプロ-ブを用いて検討し、共通欠失領域をD22S10からD22S1までの間に限定できた。この領域に本腫瘍の発生に関係する癌抑制遺伝子が存在するものと考えられる。4、甲状腺未分化癌におけるp53の突然変異:甲状腺未分化癌における癌抑制遺伝子p53の突然変異を検討中である。点突然変異の見られた症例が確認されているが、その頻度についてはさらに多くの症例を調べる必要がある。
植物の乾燥ストレス応答における新規フィードバック制御機構の解明

シロイヌナズナの乾燥ストレス応答において鍵因子として働いているAREB/ABF型転写因子やタンパク質リン酸化酵素SnRK2を制御するグループA脱リン酸化酵素2C(PP2C)に注目して研究を行った。グループA PP2CのうちABI1などのサブグループAaに属するPP2Cは、植物の生存に関わる基本的な機能を担っている一方で、HAIなどのサブグループAbに属するPP2Cは、ストレス時に特異的に機能し、重要な役割を果たしていることを明らかにした。申請者らは平成24年度までに、乾燥ストレス時のHAI遺伝子の発現誘導が、AREBまたはSnRK2をノックアウトした3重変異体において顕著に抑制されること、および、植物の生細胞中でSnRK2とHAIタンパク質が結合することを示した。昨年度(平成25年度)は、HAIのGFP融合タンパク質の局在性解析および遺伝子発現の詳細なプロファイリングを行った。また、大腸菌発現タンパク質を用いて、in vitroでのHAIタンパク質のリン酸化能におけるABA濃度特異性を明らかにした。これらの解析を通して、HAIによるフィードバック制御の基本的な特性を明らかにすることに成功した。一方で、HAIの3重変異体シロイヌナズナを用いて、各種表現型解析およびストレス応答試験を行った。本年度は、さらにHAI1、HAI2およびHAI3が属するサブグループAbのすべてのPP2Cをノックアウトした4重変異体(hai1 hai2 hai3 ahg3)を作製した。また、サブグループAaとAbにおけるPP2Cの役割と機能を明らかにするため、サブグループAaのPP2Cをノックアウトした3重変異体(abi1 abi1 hab1)と4重変異体(abi1 abi2 hab1 hab2)を作製した。しかしながら、サブグループAaの4重変異体種子は、ほとんど発芽せず、まれに発芽したものも野生型シロイヌナズナに比べて著しい生育阻害が観察された。これらの結果から、グループAa PP2Cは基本的な生育に関与していることが示唆された。一方で、グループAbの2種類の多重変異体は、通常生育条件下において野生型シロイヌナズナに比べて顕著な表現型の差を示さなかった。しかしながら、予備的な各種ストレス試験の結果から、水分ストレス時には、野生型に比べて顕著な表現型を示した。これらの結果から、グループAbのPP2Cは、ストレス特異的な役割を持っている可能性が示唆された。申請者らはこれまで、乾燥ストレス時のHAI遺伝子の発現誘導が、AREBまたはSnRK2をノックアウトしたそれぞれの3重変異体において顕著に抑制されること、および植物の生細胞中でSnRK2とHAIタンパク質が結合することを示してきた。本年度はさらに、HAIのGFP融合タンパク質の局在性解析および遺伝子発現の詳細なプロファイリングを行った。また、大腸菌発現タンパク質を用いて、in vitroでの脱リン酸化能におけるABA濃度の特異性を明らかにした。これらの解析を通して、HAIによるフィードバック制御の基本的な特性を明らかにした。次に、HAIの3重変異体を用いてHAIの乾燥ストレス応答についての解析を行った。HAI1、HAI2およびHAI3の各遺伝子のシングルおよびダブルノックアウト変異体においては、顕著な表現型はみられなかった。一方で、最近申請者らが作製したHAIの3重変異体においては、ストレスのない通常生育条件下では野生型と比べて目立った表現型はみられなかったが、1uM以上の比較的高濃度のABAに対する感受性の向上が顕著にみられた。HAIを解析する上でのこのような機能的重複性による問題点を克服するために、本年度は、さらに3重変異体に焦点をあて詳細な表現型の解析を行った。乾燥ストレスは、おもに浸透圧ストレスとして細胞に感受されていると考えられているので、具体的には、さまざまな濃度のABA、マン二トールおよびNaCl含有寒天培地を用いて浸透圧ストレスなどに対する感受性を調べた。また、土植え植物体を用いて、野生型との表現型の比較解析、乾燥ストレス耐性試験などを行った。申請者らは、平成24年度に、HAIのGFP融合タンパク質の局在性解析および遺伝子発現の詳細なプロファイリングに加え、大腸菌発現タンパク質を用いたHAIタンパク質の脱リン酸化アッセイを行った。また、25年度以降に、一過的発現再構成試験を行い、脱リン酸化能と下流遺伝子の発現への影響におけるPP2Cの機能を明らかにした。これらの解析を通して、HAIの脱リン酸化能におけるABA濃度特異性など、HAIによるフィードバック制御の基本的な生化学的な特性を明らかにした。一方で、ノックアウト変異体を用いた遺伝学的なアプローチによる研究も行った。まず、HAIのシングルおよびダブルのノックアウト変異体を作製したが、顕著な表現型の差がみられなかったため、HAIなどのサブグループAb PP2Cの3重および4重変異体に加え、ABI1などのサブグループAa PP2Cの3重および4重変異体を作製した。これらの多重変異体を用いて、各種ストレス処理実験や表現型解析に加えて、リアルタイムPCR法による遺伝子発現解析などを行った。

その結果、サブグループAa PP2Cは植物の生存に関わる基本的な機能を担っている一方で、HAIなどのサブグループAb PP2Cは、ストレス時に特異的な機能をもっていることを明らかにした。また、主に変異体解析によって、サブグループA PP2Cによって制御されているAREB/ABF転写因子およびサブグループIII SnRK2プロテインキナーゼのストレス応答や細胞機能の恒常性に関わる新規の機能を明らかにした。これら一連の研究を通して、AREB/ABF型転写因子やSnRK2プロテインキナーゼを下流で制御するグループA PP2Cのストレス特異的なフィードバック制御においてHAIなどのサブグループAb PP2Cが重要な役割を果たしていることを示した。植物分子生物学本年度は、工程表通り、グループAaの3重変異体(abi1 abi1 hab1)と4重変異体(abi1 abi2 hab1 hab2)を作製した。また、グループAbの4重変異体(hai1 hai2 hai3 ahg3)を作製した。これまでは、グループAbに属するPP2CであるHAI1、HAI2およびHAI3に焦点をあてて解析を進めてきたが、今後、グループAaとAbのPP2Cを比較解析することにより、その役割分担や機能の違いが明確になり、植物の乾燥ストレス応答におけるグループA PP2Cを介したフィードバック制御機構が解明されることが期待される。本年度は、HAIの3重変異体を用いて、HAIによるフィードバック制御機構が、乾燥ストレス耐性、乾燥誘導性遺伝子の発現およびSnRK2によるリン酸化を介した活性化にどのような影響を与えているのかを調べた。また、HAIによるフィードバック制御機構がPP2Cの脱リン酸化能に与える影響を解明するため、脱リン酸化能に関わる解析を行った。総括できる結果は、まだ得られていないが、各項目の研究は、おおむね予定通り順調に進展している。コケやシダ植物ももっているグループAaのPP2Cとダイズやイネなどの被子植物のみがもっている新しいタイプのグループAbのPP2Cの役割や機能の違いを明らかにすることにより、なぜ被子植物では、新しいタイプのグループAb PP2Cが必要になったかを明らかにする。そのため、本年度までに作製した多重変異体のさまざまな観点からの比較解析に重点をおく予定である。高等植物に特異的なHAIの乾燥ストレス応答におけるフィードバック機構の役割を明らかにするために、HAIの3重変異体とサブグループAaおよびAbのPP2Cをノックアウトした多重変異体を用いて異なったストレス条件下における表現型などの比較解析を行う予定である。実験計画は順調に進捗しているが、本年度は思った以上に実験に時間をとられたため、予定していた海外学会と国内学会の参加を取りやめたことにより、次年度使用額が生じた。次世代シークエンサーを用いた網羅的な遺伝子解析などより費用のかかる先端的な解析に用いることを計画している。該当なし
関節リウマチに伴う骨粗鬆症治療戦略確立のための探索的研究

【目的・背景】関節リウマチ(RA)は、多関節滑膜炎を主病変とする全身性自己免疫疾患で、関節破壊、傍関節及び全身性骨粗鬆症を来たす。RAで滑膜が異常増殖し新生血管を伴って肉芽腫様となり、滑膜マクロファージが破骨細胞に分化し骨破壊をきたす。しかし、破骨細胞形成における血管内皮細胞の関与については不詳であり、内皮細胞機能も臓器により異なる。RA滑膜由来血管内皮細胞(RAEC)がM-CSFを高度に産生するという特徴を持ち、RAECがRA炎症部における破骨細胞の分化・誘導に関与することを明らかにした。【方法・結果】(1)Gene Chipにおける各種臓器由来血管内皮細胞での発現遺伝子解析から、RAECにおいてのみM-CSFの高発現が認められた。(2)RA患者滑膜より得たRAECにおけるM-CSFのmRNA高発現を認めた。(3)各種臓器由来血管内皮細胞およびRAECを培養するとRAEC培養上清中でのみM-CSFが増加していた。(4)RA患者由来滑膜線維芽細胞上のRANKLは強く発現していた。(5)RAECを敷いたtranswell上で末梢血単核球を共培養すると単球の著明な遊走が誘導された。(6)この経血管内皮遊走した単球にRANKLを添加するとTRAP陽性多核細胞形成'が誘導された。(7)Transwell chamber上層にRAECを下層に末梢血単核球およびRA線維芽細胞を添加した共培養系において破骨細胞形成が誘導され、M-CSF中和抗体添加により抑制された。【考察】今回の結果より、通常の慢性炎症部では形成されない破骨細胞が、RA滑膜炎症部でのみ形成される機序として、RAでは増殖したRAECからM-CSFが高産生され、破骨細胞前駆細胞である単球を呼び込み、RANKLを発現しているRA滑膜線維芽細胞の支持のもとで、破骨細胞の分化・成熟がもたらされるというRAに特徴的な悪循環機構の存在が明らかとなった。【目的】関節リウマチ(RA)では、滑膜の骨への進展による傍関節性骨粗鬆症化を認める。RA滑膜細胞は、周囲を常時細胞外マトリックスで囲まれるが、その主要なレセプターであるβ_1インテグリンを介してどのような細胞刺激シグナルが伝達されるかは不詳である。破骨細胞は、破骨細胞上のインテグリンβ_1とβ_3を介して骨基質構成糖蛋白質と接着して骨吸収機能を発揮し、β_2と骨芽細胞上のICAM-1との接着を介して骨芽細胞上のRANKLの刺激を受容し、成熟誘導される事を報告した。一方、骨芽細胞はβ_1インテグリンを介して骨基質蛋白質と接着するが、今回、β_1を介する接着が齎す細胞機能特性について検討した。【方法および結果】(1)Russelの方法で抽出したヒト骨芽細胞と骨芽細胞株MG63は、無刺激下でβ_1を高発現し、α_2、α_3、α_4、α_5、α_6も発現することをフローサイトメーターで確認した。

(2)骨芽細胞上のβ_1を特異抗体と二次抗体で架橋形成刺激すると、RANKLとICAM-1の発現が3時間をピークに著明に誘導された。さらに、同様の刺激により細胞内オステオカルシン、I型コラーゲンの発現も誘導された。(3)リガンド基質(ファイブロネクチン、コラーゲン)との接着を介するβ_1刺激でも、同様に骨芽細胞上のRANKLとICAM-1、細胞内オステオカルシン、I型コラーゲンの発現が誘導された。(4)骨芽細胞上のβ_1刺激により、骨芽細胞は有意な増殖活性を呈した。(5)β_1刺激による上記細胞表面機能分子と骨基質蛋白質の発現誘導は、チロシンリン酸化阻害薬の添加により濃度依存性に減弱した。【考案】骨芽細胞は骨形成および骨吸収の双方に関与するが、今回の検討により骨芽細胞に発現するβ_1インテグリンは、骨基質との接着で誘導されるチロシンリン酸化等の細胞内シグナルを介する骨形成細胞への分化と同時に、RANKLとICAM-1の発現を介した骨吸収刺激作用の獲得が誘導される事が明らかとなった。即ち、骨芽細胞上のβ_1刺激は、破骨細胞および骨芽細胞機能を誘導することにより、高回転型の骨代謝を齎す可能性が示唆された。【目的】関節リウマチ(RA)は続発性骨粗鬆症をきたす。prostaglandins(PGs)合成酵素であるcyclooxygenase(COX)-2は、破骨細胞と骨芽細胞の双方に作用し骨代謝調節に於いて中心的役割を担う。一方、fibroblast growth factor(FGF)-2は、強力な骨代謝調節因子として知られるが、PG誘導活性も有する。FGF-2は、RA関節滑膜線維芽細胞(RASF)より産生されRA病態の中心的分子である。FGF-2シグナル伝達において不可欠なco-receptorとして機能するヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、RASF上に強く発現しており、この過剰発現したHS糖鎖の撹乱による骨代謝への効果を検討した。【方法・結果】(1)FGF-2はRASFの増殖を増強し、RASF上のRANKLとICAM-1の発現を増強した。(2)FGFR-1発現はRAと変形性関節滑膜線維芽細胞(OASF)で同程度だが、HSPGはRASFで強く発現していた。(3)滑膜でのHSPG発現は、OAでは血管周囲だが、RAでは滑膜細胞自体にも強く分布していた。(4)RASF上のHSをヘパリナーゼ等で酵素処理すると、FGF-2依存性の細胞増殖およびRANKL発現誘導は阻害された。(5)末梢血単核球とRASFの共培養での破骨細胞形成は、FGF-2中和抗体、ICAM-1抗体、OPGの添加、およびRASF上のHS酵素処理により著明に抑制された。(6)グリコサミノグリカンの人工的伸張開始因子であるβ-D-xylosideを改変し増殖因子の結合性を低下させるXyl-NapOH(D)を用いて、HS糖鎖の進展を阻止しFGF-2とHS糖鎖の結合を阻害すると、細胞増殖と破骨細胞形成が阻害された。【考察】FGF-2は滑膜増殖のみならずRASF上のRANKLとICAM-1の発現誘導を介して破骨細胞形成促進、続発性骨粗鬆化を引き起こす。RASFに特異的に発現するHSPGは、FGF-2シグナル伝達を制御しているが、現在までFGF-2のco-receptorであるHS糖鎖に着眼したRA制御の報告は無い。ヘパリナーゼ等より毒性が少ないXyl-NapOH(D)によるHS糖鎖撹乱は、細胞増殖と破骨細胞形成を抑制しRA続発性骨粗鬆化抑制の有力な治療制御標的である。【目的・背景】
刺激応答性ポリマーを応用した新規MRIプローブの開発

分子イメージングは、生体分子の挙動・機能を直接可視化できるため、多くの生物学的知見をもたらしてきた。その中でも、核磁気共鳴イメージング(MRI)は、生体深部を高い時空間分解能で可視化できるため、生物個体レベルでの観察に最適な分子イメージング法として近年注目を集めている。これまでに、酵素反応、金属イオン濃度変化、pH変化などをターゲットとする機能性MRI造影剤が開発されてきた。しかしながら、小分子化合物をベースとする機能性造影剤は、可逆的検出が困難であり低感度である。また、造影剤の局所濃度や組織由来のバックグラウンドが影響し、定量的なイメージングができない。蛍光イメージングでは、異なる2波長における蛍光強度比を測定する"レシオイメージング"によって、定量的評価が可能であるが、MRI造影剤ではそのような定量的イメージング法は未だ開発されていない。そこで、pH応答性ナノ球体ポリマーとGd^<3+>錯体を融合した高機能性MRI造影剤を開発した。本造影剤によって、既存の造影剤を遥かに上回る高い感度でpH変化をMRI検出できた。さらに、ナノ球体ポリマー自身が、Gd^<3+>錯体を有さずともT_2強調画像のみに影響を与えるユニークな性質を持つことを見出した。この性質を利用し、ナノ球体ポリマー内部に常磁性シリカナノ粒子を内包したコア-シェル型造影剤を開発した。その結果、MRIによるレシオ測定が達成され、定量的pHイメージングに初めて成功した。レシオ型蛍光プローブが、細胞を用いた生命科学研究に大きな進展をもたらしたように、本造影剤はin vivoにおける分子メージングのブレイクスルーとなるであろう。ポストゲノムと呼ばれる現代、遺伝子の塩基配列は次々に解読されているが、生体内で起こる様々な生命現象の多くは、未だ未解明である。分子イメージングは、生きたままの生物個体内において、生体イベントをリアルタイムで可視化できるため、生命科学研究における強力な手法の1つである。その中でも、磁気共鳴イメージング(MRI)は、生体深部まで高い時空間分解能で可視化できる強力なイメージング手法として注目を集めている。これまでに、MRI造影剤に化学修飾を施し、様々な生体内イベントを可視化するMRIプローブが開発されてきた。しかし、MRIプローブは未だ発展途上段階であり、そのデザイン・合成手法は限られている。本研究では、MRI造影剤開発における新たな素材として刺激応答性ポリマーナノ粒子に着目・応用し、ナノ粒子型MRIプローブの開発に成功した。本MRIプローブは、pHに応じて粒子径の大きさが変化し、それに伴いMRI造影能が変化するスイッチ機能を有している。本プローブを用いたin vitroにおけるMRI測定では、高感度にpH変化を検出可能であった。腫瘍組織周辺のpHは正常組織と比較し弱酸性に傾いていることが知られており、腫瘍組織イメージングへの応用が期待される。また、スイッチ機能を有したナノ粒子型MRIプローブはほとんど報告例がなく、本研究はMRIプローブ開発における有用な指針を示したといえ、今後の分子イメージングの発展に大きく寄与すると期待できる。
3軸試験供試体のバィファケーションモードにおよぼすスケールパラメータの影響

本研究は,土のもつ微視構造の影響を考慮した連続体の力学を開発することを最的な目的としている。つまり,土を連続体近似する過程において,粒状体であるとう特徴を導入することである。このうち,本年度は,材料の極性を考慮しうる連続理論,すなわちマイクロポーラ理論(コッセラ連続体理論)を実際の問題へ適用しその適用性について検討を行っている。まず,コッセラ連続体理論とは,通常の連続体理論の枠組みの上に微細要素の回の効果を導入しているため,通常の釣り合い方定式に偶応力と回転の効果が付加さる。このため,方程式が非常に複雑なものとなる。そこで,本研究では,この複雑を除去するため,一般的な3次元での記述は行わず,回転の方向が一方向に限定でる2次元(平面ひずみ状態)について定式化を行った。また,材料の構成則は,最基本的な構成関係であるドラッカー・プラガ-の基準に基づく弾塑性構成関係を用た。以上の定式化を行った後,有限要素法への適用を行った。また,材料のもつひみ軟化およびひずみ硬化特性を安定して解析するため,解析手法には,リターンマピング法および弧長増分法を用いた。本年度の研究では,特に,有限要素とコッラ連続体を適用した数値解析結果について検討を行った。まず,コッセラ連続体理に特有のパラメータであるスケールパラメータについてパラメトリックスタディー行った。そして,当該メッシュに対する影響を与える最小のスケールパラメータを定した。次に,異なるメッシュ分割で解析を行い,メッシュサイズとスケールパラメータについて検討を行った。
ヒト疾患の原因遺伝子の解析を通じて,ユビキチンの新たな役割を理解する

<パーキンソン病の原因遺伝子産物であるE3;Parkinの解析>遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子産物Parkinはユビキチンリガーゼ(E3)であることが報告されており,このことはユビキチンシステムの破綻がパーキンソン病を引き起すことを如実に示している.しかしながら従来はParkinを高いE3活性を保持したまま精製するのは難しく,また試験管内でE3活性を見るための適当な基質が存在しないことが,生化学的な解析を困難にしていた.代表者は以前にRma1という新奇タンパク質がE3活性を有することを明らかにしたが(J.Cell Science 2001),解析の過程でRma1に融合したMBP(マルトース結合タンパク質)がRma1によって効率よくユビキチン化されることを見出した.さらに詳しく調べた結果,Rma1に限らずに様々なE3において本来の基質がわからなくても,融合したMBPを偽基質として認識させることによって,E3活性を簡便に評価できることが解った.そこでこの系を上述のParkinに応用したところ,高いE3活性を保持したままParkinを精製し,そのE3活性を仔細に検討することが可能となった.生化学的な解析を進めた結果,従来の報告とは異なり(1)Parkinそれ自身はポリユビキチン化ではなくてモノユビキチン化を触媒すること,(2)全ての患者由来の変異でParkinのE3活性が失われている訳ではないこと,等を明らかにした(J.Biol.Chem. 2006).これらの結果はParkinの役割に関して新たな視点を与えるものとして,海外学会でも高い評価を得ている.<パーキンソン病の原因遺伝子産物であるE3;Parkinの解析>遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子産物Parkinはユビキチンリガーゼ(E3)であることが報告されており,このことはユビキチンシステムの破綻がパーキンソン病を引き起すことを如実に示している.しかしながら従来はParkinを高いE3活性を保持したまま精製するのは難しく,また試験管内でE3活性を見るための適当な基質が存在しないことが,生化学的な解析を困難にしていた.代表者は以前にRma1という新奇タンパク質がE3活性を有することを明らかにしたが(J.Cell Science 2001),解析の過程でRma1に融合したMBP(マルトース結合タンパク質)がRma1によって効率よくユビキチン化されることを見出した.さらに詳しく調べた結果,Rma1に限らずに様々なE3において本来の基質がわからなくても,融合したMBPを偽基質として認識させることによって,E3活性を簡便に評価できることが解った.そこでこの系を上述のParkinに応用したところ,高いE3活性を保持したままParkinを精製し,そのE3活性を仔細に検討することが可能となった.生化学的な解析を進めた結果,従来の報告とは異なり(1)Parkinそれ自身はポリユビキチン化ではなくてモノユビキチン化を触媒すること,(2)全ての患者由来の変異でParkinのE3活性が失われている訳ではないこと,等を明らかにした(J.Biol.Chem. 2006).これらの結果はParkinの役割に関して新たな視点を与えるものとして,海外学会でも高い評価を得ている.
胎仔期ダイオキシン曝露ラットの骨成長を指標とした毒性機構の解明とそのリスク評価

ダイオキシンの骨形成への影響と母体の性ホルモン濃度変化との関連性検討を目的に以下の実験を行った。1.造骨系培養細胞株を用いたin vitroでの骨形成に対する2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(dioxin)の影響。骨芽細胞株MC4の細胞外Ca沈着物(nodule)の形成と骨形成マーカーであるalkaline phosphatase活性は、細胞増殖に影響を及ぼさない濃度(<10nM)のdioxinで用量依存的に抑制(EC50≒1nM、培養肝細胞でのCYP誘導濃度に相当)。nodule形成抑制作用の発現には培養前半期(成熟期)でのdioxin添加が必須であり、培養後期(石灰化期)のみの添加では観察されず、同様なnodule形成抑制は軟骨芽細胞株ATDC5でも観察された。2.胎生期の軟骨形成に対するdioxinの影響。胎生16日齢のマウスより摘出した脛骨を用いた器官培養法で、dioxin(10nM)は脛骨の長軸方向への伸長に対し有意な抑制作用を確認。3.成熟ラットの骨塩量に対するdioxinの影響。Dioxin(25μg/kg.p.o.)投与10日後、雌ラット脛骨近位端部の骨塩量の有意な低下が認められた。Dioxinは造骨系細胞の成熟機構を阻害し骨形成に対して抑制作用を発現すること、また、胎生期でのdioxin暴露は骨成長に対し阻害効果を惹起する危険性を指摘。胎仔期ダイオキシン暴露実験の予備的検討を目的に以下の実験を行った。2)dioxinのラット骨塩量に対する影響。dioxin(25 μg/kg,p.o.)投与ラット(Wistar系雌,12週齢)で、投与10日後脛骨骨幹端近位部(骨代謝が最も活発な部位)で骨塩量の低下が観察され、dioxinは性成熟ラットにおいても骨形成を抑制する可能性が示唆された。3)血清性ホルモンとその代謝産物の一斉分別定量法の開発とdioxinの性ホルモン濃度に及ぼす影響。超高分解能GC-MSを用いて、従来のRIAやERISA法より遙かに高感度で高精度の性ホルモンと代謝産物(検出限界:β-estradiol=1 pg/ml,progesterone=5 pg/ml,testosterone=5 pg/ml)の同時測定法を開発した。雌ラット(Wistar系,12週齢)に体重および肝肥大等が認められない低用量のdioxin(0.25 μg/kg,p.o.)投与で、血清中のβ-estradiolとprogesterone値の有意な増加が認められ、一般毒性より低レベルのdioxin汚染で血清性ホルモンレベルが既に変化する可能性を見出した。また、高用量のdioxin(25 μg/kg,p.o.)投与で、testosterone値の顕著な上昇と性周期の乱れ(発情後期の延長)が観察された。ダイオキシンの骨石灰化に対する抑制機構の解明と胎仔期ダイオキシン暴露の骨成長への影響の検討を目的に以下の項目を検討した。1.平成11年度の研究成果である2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)の骨芽細胞の分化成熟に対する抑制機構の解明を目的に、骨芽細胞分化のマスター遺伝子Cbfa1発現に対するTCDDの影響を検討した。骨芽細胞株MC3T3-E1のsubclone4(MC4)において石灰化を抑制する濃度のTCDD(10nM)は、MC4細胞の核分画中のOSE-2とOCE-1(骨芽細胞におけるCbfa1結合配列)結合物質量に全く変化を及ぼさなかった。2.長幹骨成長の指標とされる内軟骨性骨化に対するTCDDの影響。1)軟骨芽細胞株ATDC5を用いたin vitroでの検討。TCDD(<10nM)はATDC5の石灰化軟骨(nodule)産生を用量依存的に抑制した。

肥大化軟骨細胞(成熟軟骨細胞)のマーカーであるtypeX collagenの発現もnodule形成の抑制と平行して低下した。2)胎生期の長幹骨の器官培養法による検討。胎生16日齢のマウスより摘出した脛骨を1週間培養すると、脛骨は長軸方向へ平均45%伸長した。TCDD(10nM)添加により骨の伸びは25%有意に抑制された。TCDDは骨芽細胞および軟骨芽細胞などの造骨系細胞の成熟分化を抑制し、骨の石灰化を阻害する可能性を示す知見が得られた。成熟分化抑制機構におけるCbfa1の発現調節の関与は否定的であった。胎生期のTCDD暴露で長幹骨の伸長が障害される可能性が示唆された。
曲面LVLの連続成形装置の開発

原材料であるスギ単板の熱板乾燥について新しい方法を提案し,從来の熱気乾燥に比べて非常に効率が良いことを示した。単板の縱継ぎ方法としてフィンガージョイントの可能性を検討し,装置を試作した結果,高周波加熱よりも単純な熱板乾燥の方が効率が良いことを明らかにした。また,この方式により接着された部分は,その前後の単板強度の平均値とほぼ等しい強度をもつことが証明された。キャタピラ-型の連続プレス(圧締部分の幅300mm,長さ700mm)の中に蒲鉾型LVL(外径390mm,肉厚30mmの円筒の1/6)の成型用治具(長さ1m)を挿入し,上下キャタピラ-から高周波電圧をかけ,その中でスギの厚さ2.5mmの単板にメラミン・ユリア樹脂接着剤を塗布したもの13層を成形した結果,プレス通過時間は陽極電圧に依存するが,アークを生じない範囲で710分程度であることがわかった。この結果から連続プレスの圧締部分の長さを710mに改造すれば,毎分1mの成形LVLが連続的に生産できることが予測される。この場合,治具を夛数用意して材料と共に挿入する必要がある。連続プレス方式に先立って熱板プレスに金型を取りつけて行なった断続型のプレス実験では,長さ1m,外径300mm,内厚3.5mmのフェノール樹脂含浸円筒LVLの1/6部分を圧締成形し,前後,左右にフィンガージョイントし,長さ5.4mの円筒を製造した。この円筒の内部に比重0.38のウレタン発泡体を充填した結果,横圧縮強度は約40倍に改善された。この場合の応力分布を有限要素法による数値解析で求めた結果,応力集中が非常に少いことがわかった。曲げ応力の分布も正常であった。最後に繊維方向が幅方向の帯状の単板をクラフト紙で裏打ち補強し,スパイラルに巻き付け接着成形する新型の円筒LVL成形方式を試行した結果,高能率の成形が可能であることが推察された。本年度行った研究成果を要約すると以下の通りである:1.単板にミニフィンガーを切るには専用の刃物の開発が必要であるが、単板数十枚を束にして、通常のフィンガーカッターで切削することもまた、無欠点単板については有効である。自動送り付き縦継ぎ装置を試作し、単板のフィンガージョイント実験を行った結果、高周波加熱式よりも熱板加熱式の方が実用性が高いと考えられた。2.イソシアネート系接着剤の高周波特性には問題がなかった。3.高圧水蒸気を側面から噴射するタイプの新型蒸気噴射式連続プレスを用い、平板LVLを製造した。その際、一層毎に波型の単板を挿入すると、極めて均一な加熱が行われ、厚さに無関係に高速生産が可能であった。この方法を曲面LVLに適用する方法を検討中である。4.長さ1mの治具を用いて加熱成形した6分の1円筒シェルを用いて、フィンガージョイントにより長さ5.4m、外径30cm、肉厚3.5cmのLVL円筒を作り、曲げ性能が調べたところ、同寸法の硬質塩ビのパイプに比べて、重さが約2.5分の1、曲げ剛性は約2倍であった。このことから、円筒LVLの柱としての挫屈強高は非常に優れていることが明らかとなった。

5.高周波プレス内に連続的に木製治具を通過させ、連続的にLVLを製造する原理を開発する目的で、縞状の特殊な電極を考案し、これを用いて、6分の1円筒型の成形LVLを製造した結果、極めて効率良く、成形できる見通しが立った。1.原材料であるスギ単板(2.5mm厚)の熱板乾燥について,上下両熱板と単板の間にフォードリニアスクリーンを挿入する方法と,単板2枚の間に排気金網を挿入し,これらを同時に熱板間にスクリーンを介さずに挿入し熱圧する方法の効率を比較したところ,熱圧時間は後者の方が幾分短かい傾向が見られ,単板の厚さを増加させればその効果は更に顕著になるものと考えられる。2.単板の縦継ぎについて,昨年に引き続き,フィンガージョイントの実験を継続した結果,熱圧接着したフィンガージョイントはその前後のジョイントの無い部分に比べて強度的に低下が認められないことが明らかとなった。3.上記のフィンガージョイント単板を用いて高周波加熱型キャタピラー式連続プレスを用いて曲率半径(外径)150mmの曲面LVL(蒲鉾型シェル)を成型した。治具にはアピトン合板構成の積層材を用い,長さ1mのものを3個用意し,それらを次々と材料の上下に続けて挿入することにより,連続したLVL成形品を製造できることを明らかにした。4.上記の成型LVLを組合わせて円筒状の試験体を製造し,ウレタンを内部に発泡充填した。この場合の発泡体充填効果については,円筒の横縮試験と,数値解析の両面から検討したが,破壊はLVLと充填発泡体の間で生ずることが明かとなった。5.幅のせまい単板のテープ(真交方向)をヘリカルワインドする新しい円筒LVLの製造方法の検討を進め,それが将来のLVL工業に効果的な技術であることがわかった。
非可解代数群の作用を受ける3次元代数多様体の研究

更に、(e,q)がこの五つの場合、(P^2,eB_q+mC)の極大ガロア被覆が存在するための必要十分条件も得た。例えば、(e,q)=(3,5)のとき、(P^2,3B_5+mC)の極大ガロア被覆Xの存在するための必要十分条件は、m=2,3,4,6,12である。このとき、Xは、正規射影有理的代数曲面になる。
輸送分子モーターを連結したシステムの一分子観察

本研究は細胞内輸送に関わる分子モータータンパク質が、複数集まって輸送を行う際の分子モーター間の協調性の仕組みを明らかにすることを目的とする。そのために本年度は、昨年度作成したキネシンの単頭を双頭キネシンに直接連結させた変異体キネシンを用い、単頭を運動能のない変異体キネシンに置きかえて微小管上に固定することにより、双頭キネシンに負荷をかけてそのときの内部構造状態を一分子FRET法によって観察した。キネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離することのできない変異体キネシン頭部を融合したキネシンを作成し、その運動を蛍光一分子イメージング法を用いて観察したところ、一部のキネシンは野生型と同じ速度で運動したものの、大部分のキネシンは見かけ上停止して微小管上に固定された。次にこのコンストラクトの野生型頭部に二つの頭部間の位置関係を区別することのできるFRETプローブを導入し、一分子FRET法を用いて負荷存在下でのキネシンの構造変化の検出を行った。飽和ATP濃度条件下で運動中の個々のキネシン分子のFRET効率変化を観察したところ、短い間両足結合状態を取るが、主に片足結合状態を取ることが示された。この結果は無負荷状態で運動中のキネシンの場合(主に両足結合状態を取る)と大きく異なるものであり、ATP結合に伴う片足結合状態から両足結合状態への遷移が運動サイクル中に強い負荷依存性を持つことを示すものである。これらの結果は、複数のキネシンが協調して運動する際の分子間に働く負荷の役割を説明するものである。分子モータータンパク質キネシンが多分子で輸送を行うときの分子間協調性の仕組みを調べるために、2分子のキネシンを連結させた複合体を人工的に作製し、これを用いて2分子間の協調性をしらべた。まず、免疫抑制剤であるラバマイシンによって誘導される架橋反応を利用することによって、2つのキネシン分子を特異的にクロスリンクした「2分子キネシン」を作成した。それぞれの分子をあらかじめ異なる色素で蛍光標識して、全反射蛍光顕微鏡による1分子観察法を用いて同時観察したところ、およそ10%程度の分子がクロスリンクされていることを確認した。これら2分子キネシンは1分子キネシンとほぼ同じ運動速度を示したが、微小管に結合してから離れるまでの移動距離は1.5倍程度上昇した。次に、遺伝子組み換えを用いてキネシンの単頭を双頭キネシンに直接連結させた変異体を作製し、その運動を1分子レベルで観察した。双頭キネシンに1つの単頭をつなげたキネシンは、双頭キネシンに比べて微小管上に停止する分子の割合が上昇し、また運動を示す分子の運動速度は低下した。それに対して、双頭に単頭を2つつなげたキネシンは、1つの場合よりも運動している分子の割合が低下したものの、運動している分子が連続的に移動した距離は双頭キネシンの2倍に上昇した。これらの結果は、架橋された2分子の間では微小管からの解離を抑える効果が生まれて、複合体として長距離輸送を行うことが可能になると言うことを示唆するものである。
応答機能を有するビアリール型酸化還元対の集合化とその機能開発

研究代表者は、電子移動に伴い分子構造が著しく変化する動的酸化還元系の多機能化に取り組み、多重入力・多重出力が可能な分子応答系へと発展させることに成功した。具体的には、電位およびpHの両方の変化によって発光能がON・OFFスイッチングされる応答性分子を構築した。電位とpHという二つの外部刺激のうち一方のみではこの変化は生じないため、この分子はAND型のロジックゲートとみなすことができる。さらに、その応答挙動は、発光の他にUV-Vis・CD・FDCDスペクトルにも劇的な変化を伴い、複数の手段で感度よく検出することが可能である。研究代表者はまた、動的酸化還元系を単分子膜として電極表面に自己組織化させることに成功した。動的酸化還元系は、通常の酸化還元系とは異なり、酸化体と還元体の間の電子交換が起こらないため、電極表面上で不均一に酸化種と還元種を発生させることが可能であると考えられる。そのような電極の作成成功例はこれまでになかったが、研究代表者が構築した動的酸化還元系分子は、金(111)表面と安定に化学結合を形成した。また、実際にその電極表面を酸化還元して、動的酸化還元挙動が起こっていることをIRスペクトルで明確に帰属することに成功した。これは、溶液中だけでなく、電極表面でも動的酸化還元という現象が起こることの初めての確認であり、酸化還元分子を用いた分子メモリなどの応用に指針を与える重要な知見である。今年度、報告者はまず金電極修飾能を有する酸化還元系の設計と合成を行った。分子設計としては、金と安定な結合を形成するもの、酸化体であるカチオン状態が安定であるもの、中性の水の電位窓領域において酸化還元が行えるものを目指して行い、新規な酸化還元系の構築に成功した。このものは、2電子酸化を受けると新たなC-C結合が生成したジカチオンとなり、2電子還元を受けると結合が切断されて元の中性体へと戻る、動的酸化還元系である。次に、この中性体の希薄溶液に金電極を浸漬することにより、金-S結合が形成され、中性体で修飾された金電極を構築することが可能であることを明らかとした。修飾金電極のサイクリックボルタモグラムは、酸化ピークと還元ピークが大きく分裂した電位に観察され、バルク溶液中と同様、電位移動に際してC-C結合の生成・切断が起こっているのではないかと考えられた。そこで、修飾金電極に電位を与えながら全反射IRスペクトルを測定し、単離された中性体とジカチオン塩のバルクIRスペクトルとの比較を行った。その結果、酸化ピークでは中性体からジカチオンへの、還元ピークではジカチオンから中性体への変化が起こっていることを確かめることができ、金電極上でも動的酸化還元挙動が見られることが明らかとなった。また、ピークの間の領域においては中性体・ジカチオンどちらのスペクトルもそのままのピーク形状を維持した。これは、その間の広い電位領域において還元体と酸化体のいずれの状態も取りうるということを意味し、報告者が構築した修飾金は、高い電気化学的双安定性を有する自己組織化膜の初めての例であることが明らかとなった。