hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視覚障害児童・生徒の歩行指導における教員の連携に関する研究

研究代表者の指示のもと、研究協力者が精力的に本研究に取り組んでいること、検討会が3回開催されたこと、本研究の目的にそった具体的な連携の骨格が初年度の目標どおりに見えてきていること、などがその理由である。当初の計画どおり、研修の内容・方法・連携のあり方の確立、シンポジウムの開催、関連冊子の作成と配付を行う。当初の予定どおり以下のように進める。平成24年度は、昨年度と同様、(1)検討会の実施、(2)非専門教員への研修会の実施、(3)連携のあり方の検討会の実施、(4)状況視察を行い、さらに、(5)連携のあり方の実践を加えることで研修の内容・方法の確立へすすめていく。平成25年度は、当初の計画どおり、研修の内容・方法・連携のあり方の確立、シンポジウムの開催、関連冊子の作成と配付を行う。主な支出は旅費で、検討会の開催、研究協力者の盲学校へ他の研究協力者とともに訪問して実施されている研修会などの視察と検討、研究代表者が研究協力者の在籍する盲学校以外の盲学校の歩行指導や連携の状況の視察などに使用する。その他シンポジウムの開催及び資料作成に関する費用の支出がある。ビデオカメラやデジタルカメラを購入し、研修会の様子をビジュアルな状態で記録することで、検討会、さらに平成25年度に実施するシンポジウムなどの資料とする。旅費は、昨年度同様、検討会の開催、研究協力者の盲学校等へ他の研究協力者とともに訪問して実施されている研修会などの視察と検討、研究代表者が研究協力者の在籍する盲学校以外の盲学校の歩行指導や連携の状況の視察などに使用する。以上が主な研究費の使用計画である。
腎尿路奇形疾患のゲノム情報を基盤とした新しいヒトネフロン分化誘導系の構築

2年間において、下記の成果を得た。1)本邦CAKUT症例の収集・疫学調査を実施し、187家系206症例を収集した(syndromic CAKUT:105家系115症例、non-syndromic CAKUT:82家系91症例)。2)臨床表現型分類をもとに、44家系62症例について、網羅的遺伝子解析(シークエンス・次世代シークエンシング(NGS)・マイクロアレイ解析)を行い、責任遺伝子・領域を同定した。3)カスタム疾患パネルを用いたNGS解析により、臨床表現型から候補遺伝子の同定が困難であった症例についても、既報遺伝子やマウスのCAKUTで報告されている遺伝子など、候補遺伝子を絞り込んだ。高橋らのiPS細胞の発見により、難治性疾患の再生治療に期待が集まっている。これまで困難とされてきた腎ネフロン再生についても例外ではない。ヒト腎臓の器官再生を実現するためには、その発生過程のより詳細な理解が必要である。これまでの腎発生に関する知見の多くがマウス等動物データを基盤としたものであり、ヒト-齧歯類間の臓器形態、大きさ、発達速度の種差についての情報は未だ不足している。したがって、今後ヒトとマウスの発生制御の情報を相互に補完し、ヒト腎再生に向けた応用的展開が大切である。本研究は、先天性腎尿路奇形(CAKUT)の疾患機序に関わる、ヒト腎特異的な発生制御因子群とその相互作用の情報を活用し、新たな腎系譜in vitro分化誘導法を構築することを目的とする。平成25年度は、CAKUT症例の遺伝学解析により、発生を制御する新規分子群を同定する手がかりを得ることを目標とし、1)ヒト先天性腎尿路奇形症例の収集とその臨床表現型分類、2)次世代シークエンサーやマイクロアレイを用いたゲノムワイド解析、を協力研究者とともに実施した。研究計画開始時に既に収集済みであった症例も含め、これまでに合計206症例を収集した(平成26年3月現在)。その内訳は、腎尿路奇形以外の神経症状などを伴うsyndromic CAKUTが91症例、腎尿路奇形のみのnon-syndromic CAKUTが115症例であった。そのうち約60症例は、ゲノム領域の広汎欠失やCNVを含め、既知遺伝子の変異として同定できた。次世代シークエンサーによる網羅的解析により、複合的変異による可能性を示唆する症例も検出され、今後in vitro実験を含めた責任遺伝子の同定実験を進め、次年度計画へとつなげる予定である。iPS細胞を用いた再生医療に期待が高まる中、in vitro腎ネフロン構築については、その発生の複雑さと構成細胞の多種性により、他臓器よりも立ち後れている。本研究は、腎尿路発生異常を伴う先天性腎尿路奇形症候群(CAKUT)の原因遺伝子探査により、ヒトの腎発生必須遺伝子とその機構を明らかにし、その情報のin vitroネフロン分化誘導系への還元を目的とする。平成26年度は、下記の3項目について実施した。1)本邦CAKUT症例の収集・疫学調査:平成26年度までに、187家系206症例を収集した。腎外症状を伴うsyndromic CAKUTは105家系115症例、腎症状のみのnon-syndromic CAKUTは82家系91症例であった。2)収集症例の臨床表現型分類、および次世代シークエンサー(NGS)/マイクロアレイを用いたゲノムワイド解析:-1.症例中44家系62症例について、シークエンス解析により原因遺伝子(PAX2, EYA1, HNF1B, UMOD, OFD1, SALL1, CHD7)を、マイクロアレイ解析により責任遺伝子領域(染色体微細欠失:22q11.2、16q、1q21.1)を同定した。-2.疾患パネルを用いたNGS解析により、臨床表現型から候補遺伝子の同定が困難であった症例についても、PAX2、UPK3A、FRAS1、EP300など、既報遺伝子やマウスのCAKUTで報告されている遺伝子などが候補となる症例も見つかった。3)機能解析(in vitroアッセイ系の構築):疾患関連候補遺伝子のうち、機能解析の報告が乏しいものにつき、患者由来細胞などを用いたin vitroアッセイ系を立ち上げ中であり、今後その結果を報告予定である。これらの成果は、ヒトの腎発生に必須となる遺伝子および発生機構を理解する上で意義があり、重要な研究基盤を構築すると期待できる。腎臓発生・再生平成25年度の年次計画とした掲げた2項目につき、それぞれ次のように遂行できている。1)ヒト先天性腎尿路奇形症例の収集とその臨床表現型分類:症例収集については、研究協力者らの学会や厚生労働省難病班Webサイト等における研究ネットワークを駆使した尽力的なアナウンスにより、効率的に実施できている。

臨床表現型分類については、今後遺伝子解析の結果と併せて、より詳細に検討していく必要がある。2)次世代シークエンサーやマイクロアレイを用いたゲノムワイド解析:遺伝学的診断が確定していない症例を対象として網羅的遺伝子解析を行うことにより、多数の疾患責任候補領域・遺伝子が見つかってきている。新規の疾患責任候補領域や遺伝子の絞り込みは時間を要するが、解析進行に伴う情報集積により、今後より迅速化が期待できる。今後は、症例収集と遺伝子解析を引き続き実施すると共に、初年度の結果に基づいた1)詳細な表現型分類、および次年度計画である2)新規責任候補遺伝子の泌尿器発生における機能解析、を進めていく予定である。1)詳細な表現型分類:これまで収集・解析した症例につき、臨床表現型と遺伝子解析結果を照らし合わせ、より詳細な分類を行い、今後、CAKUTの診断・治療法の開発に役立つ情報基盤を構築する。2)新規責任候補遺伝子の泌尿器発生における機能解析:公開されているデータベースを参照し、発生学的機能が未解明であるものについて、発現時期・領域を詳細に解析し、ノックダウンやレポーターアッセイによる機能解析実験にて、泌尿器発生における役割を解明する。ヒトCAKUTは500人に1人と高頻度で発生する先天性疾患であり、神経症状などを併発するsyndromic CAKUTにおいては、既知遺伝子診断も進んでいる。ただし、既知遺伝子を対象としたスクリーニング法では解決できない症例や、軽度臨床症状を呈し遺伝子診断を実施しない症例も数多く存在していた。本研究を含め、我々は既知遺伝子以外も対象とした遺伝子スクリーニング法の確立に取り組んできているが、これまでの背景から本研究開始時においては、対象症例の研究班として収集を行っていることやその意義についてのアナウンスが浸透していなかったこともあり、症例収集に時間を要した。また既知遺伝子が原因遺伝子ある、従来のターゲットシークエンスで解決する症例もあり、網羅的遺伝子解析には至らない症例も少なくなかった。協力研究者らの学会および研究班webサイトなどでのアナウンスにより、既知遺伝子では解決できない症例も数多く集まってきているため、今後、網羅的遺伝子解析に使用予定である。また、多くの症例について網羅的遺伝子解析を進め、疾患関連と想定される遺伝子の新規候補領域・変異を探索・同定するためには、よりスムーズな情報処理システム構築やin vitro実験系が必要となる。
マトリックス重合によるケラチン複合体の生成

鶏羽を構成する主成分はケラチンというタンパク質で、タンパク質中のイオウとイオウとが架橋している。イオン液体に亜硫酸ナトリウムを添加した系を用いると鶏羽を全て溶解することができ、ケラチンに含まれるイオウを起点にアクリルを重合して複合体を調製することができる。本研究では3通りの重合法を実施・分析し、イオウ以外に酸素も起点として、ケラチンに連結しているアクリル鎖の密度を上げたところ、アクリル鎖の耐熱性を高めることができた。本研究では、動物性生物資源である羊毛や羽毛が有効利用されていない理由を、シスチンによる架橋構造のため成形性がないことによるものと考え、架橋構造の開裂とともにケラチンマトリックス存在下にラジカル重合を行い、加工性を有するプラスチックスに変換することを目指した。この変換を行う反応系を探索するために、まず、水に代表される活性水素を持つプロトン性極性溶媒、活性水素を持たない非プロトン性極性溶媒、カチオンとアニオンとに電離するイオン性溶媒の各溶媒系でスクリーニングを行った。選択した溶媒中でケラチンを加熱しケラチンマトリックスの反応性を高めたところでアクリルをラジカル重合し、その連鎖移動あるいは停止反応によってアクリル樹脂にケラチンを組み込んだアクリル-ケラチン複合体(グラフト共重合体)を得た。その結果、得られたアクリル樹脂成分のガラス転移温度が上昇することを新たに見出した。アクリルと比べて極性の低いスチレンを用いた場合、溶媒によってはスチレンの重合が進行せず、また重合が進行した場合であっても、スチロール樹脂成分のガラス転移温度はポリスチレンのガラス転移温度と変らず、スチレンはケラチンと相互作用をせず分離していることが考えられる。水に代表される活性水素を持つプロトン性極性溶媒、活性水素を持たない非プロトン性極性溶媒、カチオンとアニオンとに電離するイオン性溶媒より、ケラチンをホモリシスにより溶解、あるいは溶解しないまでも活性化した状態でラジカル重合を行い、ケラチン複合体を均一な系で得られる場合、不均一な系で得られる場合、そもそも複合体が得られない場合の場合分けとその分析は予定通り進行しているといえる。得られたケラチン複合体の性質を測定することにより複合構造の解析を行っているところ、アクリル樹脂をラジカル重合した複合体ではアクリル樹脂成分のガラス転移温度が上昇することが分った。いかなる条件でケラチンと相互作用し熱的性質を改善するのかパラメータをより精査するために事業期間を1年延長するに至ったことは、単年度での終結を目指したことを考慮すると、若干の遅れが生じているといわざるを得ない。ケラチン中に存在するシスチンが架橋点となっておりそのままでは成形性がない。昨年度は炭素ラジカルがシスチンのジスルフィド結合をアタックすることにより可溶化を伴いながらグラフト共重合体を得る方法でケラチン複合体の生成を試みた。今年度は、還元剤を積極的に添加してメルカプト基に変換したうえで、予めケラチンの側鎖に存在する官能基を修飾し、ラジカルリビング重合の開始剤に変換した後ビニル系単量体をグラフト重合し、ケラチン複合体の性質を明かにした。臭化2-ブロモイソブチリルを用い、ケラチン側鎖のアミノ基、水酸基、メルカプト基のすべてをアシル化し、導入した臭素原子と臭化銅(I)とを用いて原子移動ラジカル(ATRP)重合を行った。また、ケラチンのメルカプト基のみを開始点とするため、二硫化炭素と2-ブロモプロパン酸エチルとを用いメルカプト基をジチオチオカルボナートに変換し、可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合を行った。いずれの重合でもメタクリル酸メチルをはじめとするアクリル系単量体がケラチンをマトリックスとしてグラフト共重合体が得られた。得られたグラフト共重合体の熱的性質は、ATRPによるものとRAFTによるものとでは異なり、ATRPによるケラチンーアクリルグラフト共重合体のアクリル成分のガラス転移温度が大幅に上昇することを見出した。これはケラチン側鎖にアクリル系高分子が密集してグラフトした結果アクリル系高分子の分子運動が抑制されたためであろうと推察している。ケラチンをホモリシスにより溶解、あるいは溶解しないまでも活性化した状態でラジカル重合を行ったところ、アクリル樹脂をラジカル重合した複合体ではアクリル樹脂成分のガラス転移温度が上昇することが分った。しかしながら、アクリル樹脂成分のガラス転移温度より上の温度で熱圧成形が可能にはならなかった。本研究の目的である成形性を有する複合体を得るためには次に示す二つの方向があると考えられる。一つ目は、2015年度に用いたアクリルより極性が高く、ケラチンとより強く相互作用することを期待できる単量体を用い、単量体より生成する樹脂成分とケラチンとを相溶させ、相溶系のガラス転移温度より上の温度での成型を行う、ケラチンと複合させる樹脂側を改良するもの。二つ目は、ケラチンが持つ極性基を化学修飾あるいは除去し、ケラチン側の柔軟性、流動性を改良するもの。

前者では候補となる単量体が限られ、その単量体が必ずしもアクリルと同じ系で重合するとは限らないこと、および、そもそも高分子同士が相溶することは稀である事を考慮すると、残り一年の方策としては厳しい。したがって後者の、ケラチンに前処理を加える、それに合わせて異なる重合開始剤・重合系を設計し、ケラチン複合体の調製方法を確立する。グリーン・環境科学本研究において、ケラチンマトリックスを用いてアクリルを重合し、アクリル樹脂にケラチンを組み込んだ結果、アクリル樹脂のガラス転移温度が大きく上昇することを見出した。マトリックス重合によりビニル系高分子がケラチンと強い相互作用を示すのかパラメータを整理し、ケラチン複合体の調製方法を確立するための実験・検証を行うべく、事業期間を1年延長するため、直接経費の一部を次年度使用額に充てた。ケラチンが持つ極性基を化学修飾あるいは除去し、ケラチン側の柔軟性、流動性を改良する方策、すなわちケラチンに前処理を加え、それに合わせて異なる重合開始剤・重合系を設計し、ケラチン複合体の調製方法を確立する。この実験を行うために必要な試薬・溶媒類を昨年度の試薬・溶媒等購入額と同程度購入するために使用する計画である。
強相関電子系における超伝導ゆらぎの異方的磁場効果

本研究では、高温超伝導現象解明の鍵を握る、超伝導位相ゆらぎを調べるため、超伝導転移温度(Tc)及び電子相関の違う4種類の超伝導体(有機化合物、銅酸化物)に対して電気抵抗と磁気トルク測定を行った。その結果、すべての物質で超伝導位相ゆらぎが観測された。また詳しい解析、比較から、位相ゆらぎはTcの1.12倍程度高温から現れはじめ、電子構造の2次元性が強い程、強められる傾向があること、電子相関の強さに依らないことが明らかになった。これは超伝導ゆらぎの起源として電子構造の2次元性が関連していることを示唆するものである。本研究の目的は、2次元性の効果に着目し、強相関電子系超伝導における重要な未解決問題である、位相ゆらぎ超伝導の起源、転移の性質を明らかにすることである。特に申請者らがこれまでに発見した面内磁場による位相ゆらぎ超伝導の起源を明らかにするために、電子相関、次元性の異なる超伝導体を用い、面内磁場中での電気抵抗、磁気トルクの系統的な精密測定を行うことである。本研究を通して、有機化合物k-(BEDT-TTF)2Cu(NCS)2、k-(BEDT-TTF)2Cu(N(CN)2)Br、a-(BEDT-TTF)2NH4Hg(SCN)4、及び銅酸化物Bi2Sr2CaCu2O8+xの計4種類の強相関系超伝導体に対して測定を行い、すべての物質で位相ゆらぎ超伝導状態が存在することを明らかにすることができた。特に最終年度にはa-(BEDT-TTF)2NH4Hg(SCN)4、及びBi2Sr2CaCu2O8+xの解析を進めることにより、位相ゆらぎの起源には電子構造の2次元性が関連していることが示唆された。また有機物、銅酸化物超伝導体の両者において位相ゆらぎ超伝導が現れ始める温度は、ネルンスト効果が現れる温度より低いことがわかった。これはネルンスト効果が位相ゆらぎではなく、超伝導に関係ない秩序相などの要因で現れる可能性を示唆している。同時に、位相ゆらぎ超伝導状態が、銅酸化物超伝導体で盛んに議論されている“擬ギャップ“の形成に関連していない可能性にも言及することができた。特に申請者らがこれまでに発見した面内磁場による位相ゆらぎ超伝導の起源を明らかにするために、電子相関、次元性の異なる超伝導体を用い、面内磁場中での電気抵抗、磁気トルクの系統的な精密測定を行う。そしてTc近傍で精密なI-V測定を行うことで転移の性質を調べ、KT転移(位相無秩序化シナリオ)の直接的証拠を得ることである。初年度はこれまで得られた相図をさらに発展させるため、低温、強磁場領域の広いで磁気トルクと電気抵抗の角度依存性の精密測定を行った。特にk-(BEDT-TTF)2Cu(N(CN)2)Brに対して測定を行い詳しく解析を進めることが出来たため、超伝導ゆらぎの発現に有効電子相関は関連しないことを明らかにすることができた。この結果はネルンスト効果測定の結果と矛盾しており、ネルンスト効果の解釈に問題が残っていることを明らかにしたと考えている。初年度の目的である、k-(BEDT-TTF)2Cu(N(CN)2)Br、NbSe2に対して十分な測定及び、詳細な解析を行うことができた。またそれぞれ論文にまとめ出版することもでき、初年度の研究目的はほぼ達成したと考えている。さらに当初の計画にはなかったa-(BEDT-TTF)2NH4Hg(SCN)4(超伝導転移温度1K)、銅酸化物超伝導体Bi2Sr2CaCu2O8+x(超伝導転移温度100K)超伝導転移温度がそれぞれ1ケタ異なる超伝導体に対しても測定を行うことができた。次年度は初年度で得られた相図を詳細に比較し、面内磁場中での位相ゆらぎ超伝導に対する熱ゆらぎ、次元性の効果を明らかにする。そしてk-(BEDT-TTF)2Cu(N(CN)2)Br、k-(BEDT-TTF)2Cu(NCS)2に対し、面内磁場中で精密なI-V測定を行うことでこの転移の性質を調べ、KT転移(位相無秩序化シナリオ)の直接的証拠を得る。また初年度で新たに測定したa-(BEDT-TTF)2NH4Hg(SCN)4、銅酸化物超伝導体Bi2Sr2CaCu2O8+xの解析を引き続き進め、超伝導ゆらぎに対する熱ゆらぎ効果を新たな課題として詳細に調べる。

これまで手元にある機器でI-V測定を行ったところ、明確なKT転移の証拠を得ることは出来なかった。そこでさらに精密でSN比の高いI-V測定を行うための計測機器を購入する予定である。磁気トルク測定に必要なマイクロカンチレバー、抵抗測定に必要な金線、カーボンペースト等は常時必要な消耗品を購入する。また国内外の学会で研究成果の発表を行う予定であり、そのための旅費、外部の共同実験施設への実験のための旅費を計上する。
リスクプレミアムの推定におけるバイアス補正とモデル選択に関する理論と応用

リスクのある資産を保有する際の報酬であるリスクプレミアムの大きさが明らかになれば、投資家及び企業の意思決定に役立つ。本研究は、資産価格モデルに関する推定方法の改良を行うことで、リスクプレミアムのより良い推定値を得ることを目標とするものである。統計理論とシミュレーションによって提案した推定方法の性質を明らかにし、主に国内データを用いた実証分析に応用する。
高齢者の意思決定特性とQOLとの関係の研究

高齢者の意思決定の特徴の一つとしてフレーミング効果をとり上げ、さらに生活の質(QOL)との関連についても検討を加えた。青森市およびその近辺の高齢者164名と非高齢者312名のデータについて、先の項目について実証的な検討を行なった。その結果、非高齢者とは対照的に、高齢者にはフレーミング効果が顕著には見られないという結果が得られた。また、左脳機能が優位な者はQOLが高いという興味深い結果が得られた。本研究の初年度の研究目的は、高齢者の意思決定を情報処理モードの視点から検討することと、この両者とQOLとの関係を詳細に検討することであった。そこで、情報処理モードとして半球優位性に基づく意思決定方略を考え、ヒューリスティック意思決定方略とシステマティック意思決定方略とを仮定し、高齢者と非高齢者について調査を行なった。調査の最終有効標本数は476名であり、高齢者(平均年齢71.8歳)は164名、非高齢者(平均年齢47.3歳)は312名であった。調査の結果、半球優位性は従来言ねれていたような右半球得と左半球得点との差で考えるより、左・右半球のそれぞれの得点単独で考える方が論理的であること、QOLと有意な相関を示したのは左半球得点であり、右半球得点と有意な相関を示したQOL下位尺度は存在しないこととが明らかにされた。左・右半球の得点の差が何らかの意味を持つとする従来の視点は,左・右半球の機能が1次元のスケール上に存在することを仮定し、われわれの脳が右半球か左半球かの2者択一的な機能性を保持している、とする立場である。左・右半球の機能性の相違は既に大脳生理学的にも確立されているといえるが、問題はどの程度の優位性が各個人に存在するかである。典型的に右半球の機能とされている「考える時にイメージを用いる」と、左半球の機能と考えられている「考える時に言葉を使う」に関する項目は、右半球あるいは左半球に対する明確な因子負荷値が得られなかったため今回の分析からは除外された。因子に対する明確な負荷値が得られなかった原因は、多くの人がイメージと言葉の両方を用いて考えるとする解釈が最も論理的である。この点に関してはさらに詳細な分析が必要であるが、本調査で得られたデータの分析は、左・右半球機能が尺度として多次元の特性を備えている可能性と、さらに意思決定に及ぼす影響について多くのことを示唆している。大学生を対象にしたフレーミング効果の実験結果と異なり、われわれが以前行なった研究では、高齢者ではポジティブ、ネガティブ両フレームにおいてリスクを避ける反応が一貫して見られた。そこで本研究では、高齢者のフレーミング効果に影響を与えていると思われる要因として半球優位性を仮定して実験を行なった。また、半球優位性とQOLとの関係についても分析を行った。QOLと半球優位性との関係については、若年者群のデータ分析が終了している。左脳機能はほとんどのQOLサブスケールとの相関は有意であった(特にQOL総得点との相関は.391であった)にも関わらず、右脳機能はどのQOLサブスケールとも全く有意な相関を示さなかった。右脳・左脳機能と自己効力感との関係においては、「行動の積極性」と「能力の評価」に対しては右脳機能,左脳機能共に統計学的に有意な相関を示した。しかし、「失敗に対する不安」とは有意な相関は観察されなかった。本研究において得られたデータは、左脳機能はQOL、幸福感、自己効力などと関連性が高く、「より良い意志決定」であることを支持する結果をもたらした。右脳・左脳の機能は一般的に「人生の成功」や「学業成績の向上」と関連するといわれてきたが、本研究において高齢者の幸福感を学術的に研究していく上でも重要な構成概念であると結論された。
薬物の副作用低減のための非侵襲的薬物代謝酵素活性推定法の開発

ヒト・肝臓に発現している14種類の薬物代謝酵素であるCYPと8種類以上の副腎ステロイドを反応させた。その結果ほぼCYP3A4のみが、各種代謝物をHPLCチャート上に示した。その中で、17alpha水酸化プロゲステロンと11-デオキシコルチゾールからアンドロステンジオンの生成がGC-MSにより確認され、CYP3A4がLyase活性を有していることが明らかとなった。主要代謝物である6beta水酸化物の同定も行い、6beta水酸化活性とLyase活性におけるKm、Vmaxの比較検討を行った。今年度は、まず昨年度確定できなかったCYP3A4のLyase活性の確認を反応行った。具体的には、CYP3A4と17α-OH-Progesteroneとを反応させた後、酢酸エチルで抽出し、窒素ガスで乾固した。抽出された反応物をトリメチルシリル化等を行い、ガスクロマトグラフィー-質量分析により分析を行い、Lyase活性による生成物であるAndrostendioneの生成を市販品との比較により確認した。次に、13種類のヒト・肝臓・CYPについて、11-DeoxycroticosteroneとCorticosoteroneに対する17α水酸化活性について、高速液体クロマトグラフ上の市販品(11-DeoxycortisolとCortisol)との保持時間の比較により検討を行った。その結果、すべてのCYPで、17α位の水酸化活性は見られなかった。しかしながら、CYP3A4に関しては、6β位の水酸化物と思われるピークが見られた。しかしながら11-DeoxycroticosteroneとCorticosoteroneの6β水酸化物は市販されていなかったため、市販品の入手可能な6β水酸化cortisolを用い、Cortisolに対する6β水酸化の検討を行った。6β水酸化活性が見られたのはCYP3A4のみであった。この活性は従来から知られていた活性でああったが、その酵素反応速度論的パラメータは報告されていなかったため、今回二十逆数プロットを用い求めたところ、Vmax=3.50nmol/min/nmol P450、Km=17.1 μmpl/Lが得られた。また、CYP3A4については、11-Deoxycortisolについても6β水酸化物であろうと思われる比較的大きなピークがみられ、6β水酸化活性を示すことが示唆された。本申請者は、ヒト・肝臓におけるステロイド代謝を検討するために、主たるCYPであるCYP3A4含め11種類の肝臓CYPと、Cortisol, Corticosterone, 17aOH-Progesterone (17OH-Prog), Estradiol, Androstenedione (AD), 11-Deoxycortisol, 11-Deoxycorticosteroneなどを反応させ、HPLCにより生成物の分析を行った。結果、HPLCのクロマト上で多くの有意な生成物が得られたのは、今回はCYP3A4のみであった。例えば、Cortisolからは6bOH-Cortisolのピークが、17OH-prog, 11-Deoxycortisolからは、Cortisolと同様に6b水酸化物と考えられるピートと、さらにそれぞれADと同じ保持時間のピークが得られた。またGC-MSによってもADが生成されていることを確認した。これらの活性は、側鎖切断反応(Lyase activity)であり、CYPとしては、これまで副腎のCYP11AとCYP17のみが報告されている。このことは、肝臓においてステロイド合成経路の一部がなされる可能性が示され、副腎CYP17の欠損の際に考慮すべきことが明らかになった。そこでCYP3A4のAD生成に対するKm, Vmaxを求めた。さらに6b水酸化活性とリアーゼ活性の比較のため、6b-11-Deoxycortisolを合成し、11-Deoxycortisolに対するKm, Vmaxを求め、Lyase activityやCortisolに対する6b水酸化等との比較を行い、CYP3A4の基質認識の検討を行った。本研究の目的は、各種ヒト・肝臓・CYPの活性を、尿中のステロイド代謝物の定量値から推定する方法を開発し、ヒトにおける薬物代謝の個人差に由来する副作用発現の軽減に資するものである。今年度の結果より、各種ステロイドに対する6β水酸化活性が、CYP3A4特異的な活性であることが明らかにされた。現在、既にCortisolについては、尿中6β水酸化Cortisolの定量の有用性が報告されているが、その酵素反応速度論的検証はされておらず、今回検討を行った。今後の他のステロイドに対する6β水酸化活性に対する酵素反応速度論的パラメータを明らにすることでより正確な予測が可能となるもと思われる。従って、上記判断が妥当であると思われた。

ステロイド代謝CYP3A4については、今後、市販されていない、11-DeoxycroticosteroneとCorticosoterone、11ーDeoxycortisolの6β水酸化物の合成を試み、得られた合成品を用い、それぞれを基質とした場合の6β水酸化活性の酵素反応速度論パラメータを求め、CYP3A4活性の推定方法の検討を行いたい。また、明らになったCYP3A4のLyase活性は、17位への酵素の反応であり、今回の6β位とは全く異なった位置になり、この両活性の関係も速度論的マラーメータの比較と既に報告されているCYP3A4の立体構造を用い明らかにしたい。また、これまのでところ、他のCYPに関して位置特異的反応は、弱い活性が2,3のCYPについて見られているので、これらの活性についてより詳しい検討を行い、活性の推定への応用の検討を行いたい。一方、副腎CYPであるCYP17等がこれらの活性を有していないことの確認も行いたい。また、引き続き生体内に存在する他のステロイドに対する活性の検討も行う予定である。今年度は、ヒト・肝臓に主として発現している11種類のCYPについて、5種類のステロイドについて、網羅的に検討を行い、特にCYP3A4について、これまでに報告のない活性を見出すことが出来た。このことは、肝臓のCYPで発現量が最も多いCYP3A4の生理的な意義を考える上で重要な知見であると同時に、CYP3A4の活性検出にも重要な知見となった。今後、他の基質に対しても、同様に特異的な活性の検出が期待できることから、本研究の目的達成に関して、順調に進展していると判断した。次年度以降は、今年度の11種類に加え、胎児肝特異的CYPであるCYP3A7についても検討を行いたい。このCYP3A7は、胎児肝のみならず、新生児肝においても発現していることが知られており、小児薬理領域で重要なCYPとなっているからである。そこで、大腸菌の発現系を用い、CYP3A7の発現試みることにする。発現用ベクターpCWを用い、CYP3A7とP450還元酵素の共発現系を構築し、形質転換後得られたCYP3A7発現大腸菌より膜を調製し酵素試料として活性測定に利用の予定である。また、昨年度のCYP3A4と17OH-Prog, DOCとの反応における、未知生成物はそれぞれ6位の水酸化物であると思われるが、これらの生成物の同定を試み、速度論パラメーターの確定を行い発表を行う予定である。また、上記のCYP3A7を含めた計12種のCYPに対して、来年度はミネラルコルチコイド系の11-Deoxycorticosterone, Corticosterone, Ardosterone等について、検討を行う。またΔ5系の17-OH-Pregenenolone, Dehydroepiandrosteroneについても検討の予定である。これらの結果と、他の論文や我々の過去のデータと合わせることにより、ステロイド合成系における各生成物に対する主要ヒト・肝臓CYPの代謝特性が明らかとなる。また、一方で、尿中代謝物としては、5位が還元された生成物が多いことから、先に5位が還元された後、CYPにより酸化代謝されている可能性も高い。そこで各生成物の5位の還元体に対する反応も検討を行いたい。このことに関して、状況によっては、新たにステロイド還元酵素の発現系を構築し、反応系へ添加することも検討したい。
高度な環境予測技術を統合したコンクリート構造物の環境劣化予測システムの構築

平成30年度には、沿岸域に設置された構造物周辺の自然環境条件を再現できる風洞施設を用いて、構造物表面の劣化促進物質量に関する模型実験を昨年度に引き続いて実施した。実験では、橋桁形状に応じた表面の到達塩分量と到達する飛来塩分粒子の粒径分布について検討を行った。その結果、橋桁模型の各部位表面で、到達塩分量と到達粒子粒径が異なることが確認された。橋桁模型の海側壁面では、到達している飛来塩分粒子の粒径が大きく、下部の梁部分では比較小さい粒径が到達している傾向があることが明らかになった。橋桁の各部位表面への飛来塩分粒子の到達過程を詳細に把握するために、模型実験の条件を再現した風と飛来塩分粒子の輸送・到達過程の数値シミュレーションを実施した。その結果、計算結果は、実験結果を概ね再現でき、橋桁形状や周辺地形が変化した場合でも汎用的に予測できることが示された。また、風洞実験の研究成果を実橋梁に適用できるようにするために、沿岸域に設置されている実構造物を対象とした飛来塩分粒子の現地観測とそれを再現した数値解析を並行で実施した。その結果、実構造物に到達する飛来塩分粒子の到達量と粒径分布を現地観測結果から明らかにでき、観測結果が実験結果と同様の傾向であることが示された。さらに、構造物外部の環境作用(降雨・飛来塩分量)に応じたコンクリート表面物質量の定量評価モデルの構築・改良を昨年度に引き続いて実施した。その結果、外部の時系列的な環境作用に応じてコンクリート表面の劣化促進物質量の収支を予測できる数値モデルの構築を行い、既往研究の長期的な現地観測結果を概ね再現できることがわかった。これらの研究成果を査読付論文(コンクリート構造物の補修・補強アップグレード論文集2018、コンクリート工学年次論文集2019(掲載決定)等)として整理・発表を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成2931年度の研究期間内に、コンクリート工学および気象学・海岸工学の知見と方法論を総合的に利用することで、自然環境作用に応じた構造物表面の劣化促進物質量を予測する手法を構築する予定である。さらに、過去・現在・将来の時系列的な自然環境作用から構造物内部の劣化予測が可能な環境劣化予測システムの開発を行う予定である。平成29年度には、構造物の将来の劣化予測の入力条件となるデータを作成するために、過去のデータを統計的に整理した。気象学・海岸工学分野の数値解析技術(気象モデル・波浪推算モデル)を用いて、実橋梁に作用する環境条件の推定を行うともに、その結果から飛来塩分の推定を行った。さらに、推定結果の妥当性を確認するために、気象作用と飛来塩分の現地観測を実施し、その結果と数値解析による予測結果を比較することで、予測結果が実際の現象を十分に再現できることが確認できた。その成果を査読付論文(コンクリート工学年次論文集、土木学会論文集B2(海岸工学))として整理・発表を行った。風洞実験により構造物から表面の劣化促進物質(水分・塩分)の移動過程を解明し、それを参考に理論的な物理過程にもとづいた数値モデルの構築を行うために、自然環境を再現できる風洞施設の構築を行うとともに、コンクリート表面の塩分濃度の時間変化を把握するために予備実験を実施した。予備実験の結果から、コンクリート表面の塩分量が時間の経過とともに、定常状態に近づいていくことが確認された。さらに、コンクリート表面の水分と塩分量に質量保存則を適用した予測モデルを構築し、予備実験の再現計算を実施した。その結果、構築した予測モデルで、コンクリート表面の塩分量の時系列変化を十分に再現できることが確認できた。(1)自然環境作用データ(システムの入力条件)の作成とそれを用いた予測解析平成29年度には、環境劣化予測システムの入力条件となる自然環境作用のデータを作成するために、過去の気象・波浪データを気象庁および国交省港湾局から取得し、その整理を行った。その後、構造物の将来の劣化予測の入力条件となるデータを作成するために、過去のデータを統計的に整理するとともに、気象学・海岸工学分野で確立されている数値解析技術(気象モデル・波浪推算モデル)を用いて、実際の環境作用の推定を行った。本年度の検討では、日本海沿岸に位置する実橋梁に作用する気象・波浪作用の推定を行い、十分に実現象を再現できることが確認できた。さらに、数値解析技術の予測精度を確認するために、実構造物周辺の地形を含めた詳細な計算を実施するとともに、現地調査を実施し、両者が概ね一致することを示すことができた。(2)構造物への自然環境作用とそれに応じた表面物質の移動・再配分の定量化コンクリート構造物の形状に応じた降雨・結露の洗い流しによる表面物質の移動・再配分の過程を定量化するために、自然環境作用を再現できる風洞施設を構築した。構築した風洞施設は、構造物周辺および表面の自然環境作用をコントロールできるものであり、対象とする主な環境作用は風、降雨、塩分(飛来塩分・凍結防止剤による塩分)である。風洞内で発生させる飛来塩分は、新潟県上越地方で実施した現地観測を参考に粒経100μm程度となるように、飛来塩分発生機の調整を行った。現在、基礎的な予備実験を実施している状況である。

実験では、橋桁形状に応じた表面の到達塩分量と到達する飛来塩分粒子の粒径分布について検討を行った。その結果、橋桁模型の各部位表面で、到達塩分量と到達粒子粒径が異なることが確認された。橋桁模型の海側壁面では、到達している飛来塩分粒子の粒径が大きく、下部の梁部分では比較小さい粒径が到達している傾向があることが明らかになった。橋桁の各部位表面への飛来塩分粒子の到達過程を詳細に把握するために、模型実験の条件を再現した風と飛来塩分粒子の輸送・到達過程の数値シミュレーションを実施した。その結果、計算結果は、実験結果を概ね再現でき、橋桁形状や周辺地形が変化した場合でも汎用的に予測できることが示された。また、風洞実験の研究成果を実橋梁に適用できるようにするために、沿岸域に設置されている実構造物を対象とした飛来塩分粒子の現地観測とそれを再現した数値解析を並行で実施した。その結果、実構造物に到達する飛来塩分粒子の到達量と粒径分布を現地観測結果から明らかにでき、観測結果が実験結果と同様の傾向であることが示された。さらに、構造物外部の環境作用(降雨・飛来塩分量)に応じたコンクリート表面物質量の定量評価モデルの構築・改良を昨年度に引き続いて実施した。その結果、外部の時系列的な環境作用に応じてコンクリート表面の劣化促進物質量の収支を予測できる数値モデルの構築を行い、既往研究の長期的な現地観測結果を概ね再現できることがわかった。これらの研究成果を査読付論文(コンクリート構造物の補修・補強アップグレード論文集2018、コンクリート工学年次論文集2019(掲載決定)等)として整理・発表を行った。(1)構造物への自然環境作用とそれに応じた表面の物質移動・再配分の定量化のための実験コンクリート構造物の形状に応じた降雨・結露による洗い流しで生じる表面の物質移動・再配分の過程を定量化するために、平成29年度に構築した自然環境作用を再現できる風洞施設を用いて、室内実験によりその物理過程の解明を行う。構築した風洞施設は、構造物周辺への自然環境作用をコントロールできるものであり、対象とする主な環境作用は風、降雨、塩分(飛来塩分・凍結防止剤による塩分)である。(2)環境作用と表面の物質移動過程(表面境界条件)の予測モデルの開発風洞実験を実施した結果から構造物の表面物質量を予測するための数値モデルの開発に取り組む予定である。構造物表面での物質の移動・再配分は、実験結果を参考に流体力学分野で用いられる方法論をベースにモデルを構築する。モデルの構成は、構造物の表面形状に応じた水分の流れと塩分の移流拡散現象を3次元空間で再現できるモデルである。数値モデルは実験結果にもとづきパラメータを調整することで予測できるように構築する。その他の過程は実験結果と既往の現地調査結果を参考に数値モデルの開発を行う。開発したモデルを研究代表者が開発済みの環境作用モデルに統合し、数値モデルの拡張を行う。(3)コンクリート構造物の環境劣化予測システムの構築これまでの研究で開発してきた環境作用と表面の物質移動過程の予測モデルとコンクリート内部の劣化予測モデルを統合し、環境劣化予測システムの構築を行う。劣化予測モデルは、浸透塩分量・水分量、鉄筋の腐食量、構造物の各部材の耐力を計算できるモデルとする予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Bergman空間と∂^^-コホモロジーの複素解析

Bergman空間に関しては、C^nの有界領域の上Bergman核とBergman計量の評価が、完全円形領域の場合に進歩し、滑らかな境界をもつ場合の重対数評価を拡張して、Jarnicki-Pflugの定性的完備性を定量的なものにおきかえた。さらにTP^nの領域についても特異ファイバー計量を用いてL^2評価の方法を応用し、Bergman核関数の評価式をえた。この場合、C^nとは異なった現象として、局所的超擬性が必ずしも大域化できない例があることを発見した。∂^^-コホモロジーに関しては、境界正則性に重要な役割を演じる有界皆既関数がTP^nの領域の場合にも、C^2-擬の条件下で存在することを示した後、この証明に用いられる武内の定理の別証を、測地線の複素化の変分を計算することによって与えた。最近になって、L^2正則関数の拡張定理を複素多様体上にうまく一般化するとSkodaの割算定理が系として導けることを発見した(論文は掲載決定済).Bergman空間に関しては、C^nの有界領域の上Bergman核とBergman計量の評価が、完全円形領域の場合に進歩し、滑らかな境界をもつ場合の重対数評価を拡張して、Jarnicki-Pflugの定性的完備性を定量的なものにおきかえた。最近になって、L^2正則関数の拡張定理を複素多様体上にうまく一般化するとSkodaの割算定理が系として導けることを発見した(論文は掲載決定済).α方程式の理論は解析的には複素ユークリッド空間の領域で深い所まで理解が進んでいるが、複素多様体上ではまだ不明な点が多い.そこでP^nの擬凸領域の境界の大域的な性質を問題としてとり上げ、境界がC^2級の場合に領域上の有界な多重劣調和皆既関数(bounded plurisubharmonic exhaustion function)の存在を示し(Sibony氏との共同研究)、さらに一般には局所的な超擬凸性(hyvereonvexity)が必ずしも大域的な超擬凸性を意味しないことを示した(Diederich氏との共同研究)、さらに、Bergman空間の理論に一石を投じたと思われる大沢、竹腰のL^2正則関数の拡張定理をメインテーマとして、多変数複素解析の入門書を著した。Bergman空間に関しては、C^nの有界領域上のBergman核をBergman計量の評価が、完全円形領域の場合に進歩し、滑らかな境界をもつ場合の重対数評価を拡張して、Jarnicki-Pflugの定性的完備性を定量的なものにおきかえた。さらにIP^nの領域についても特異ファイバー計量を用いてL^2評価の方法を応用し、Bergman核関数の評価式をえた。この場合C^nとは異なった現象として、局所的超擬凸性が必ずしも大域化できない例があることを発見した。∂^^-コホモロジーに関しては、境界正則性に重要な役割を演じる有界皆既関数がIP^nの領域の場合にも、C^2-擬凸の条件下で存在することを示した後、この証明に用いられる武内の定理の別証を、測地線の複素化の変分を計算することによって与えた。最近になって、L^2正則関数の拡張定理を複素多様体上にうまく一般化するとSkodaの割算定理が系として導けることを発見した(論文は掲載決定済)。
数種落葉果樹成木の^<13>C光合成の側枝間一次転流に関する研究

オウトウ、セイヨウナシ、リンゴおよびカキ各1品種の成木を用い、果実肥大最盛期の2年生側枝間の^<13>C光合成産物の一次転流(施与後約4472時間)の実態を調査した。また、枝齢の異なる側枝の基部に環状剥皮処理を施し、果実および枝の肥大を無処理区(対照区)と比較するとともに、プラントキャノピーアナライザを用いてリンゴ'ふじ'の成木内の10本の3年生側伎に着生した果実の肥大および品質とこの3年生側枝、隣接3年生側枝および隣接4年生側枝の光環境との関係を調査し、間接的に側枝単位の炭素収支の季節的動向を調査した。1.同一の3卒生側枝上において、^<13>CO_2を十分施与した1本の2年生側枝から周辺全側枝への^<13>Cの合計分配率の範囲は、オウトウでは約2.5約27%、セイヨウナシでは約5約29%、リンゴで約0.5約16%およびカキでは0約31%であった。これは4ないし3年生側枝間の一次転流の場合より高かった。以上の結果、果実肥大最盛期の2年生側枝の炭素収支は総じて半閉鎖経済的様相を呈するものと考えられる。2.いずれの樹種においても一部を除き、果実および枝の最終径あるいは日肥大率には、環状剥皮処理区と対照区の間に大きな違いが見られず、また、枝齢間には一貫した影響は認められなかった。リンゴの側枝の光環境(プラントキャノピーアナライザによるDIFN_<360,0-74>、DIFN_<S45,0-74>およびGAPS_<S45,16-31>)と果実のBrixやL^*a^*b^*の各色度値との間の相関は、いずれも、調査果実の着生した3年生側枝の光環境>3側枝平均の光環境>隣接3年生側枝の光環境>隣接4年生側枝の光環境の順に高かった。有意な高い相関が認められたものの多くは調査果実の着生した3年生側枝の光環境のDIlFN_<360,0-74>と3側枝平均のDIFN_<360,0-74>であった。上記の実験結果から、3年生側枝の炭素収支は果実生育期間を通してほぼ閉鎖経済的であるものと考えられる。リンゴ,セイヨウナシ,オウトウおよびカキ各1品種の成木を用い,果実肥大最盛期における2年生側枝間の^<13>C光合成産物の一次転流(施与後約4472時間)の実態を調査した.1.同一の3年生側枝上において,^<13>CO_2を十分施与した1本の2年生側枝から周辺全側枝への^<13>Cの合計分配率の範囲は,リンゴでは約0.5約16%,セイヨウナシでは約5約29%,オウトウでは約2.527%,およびカキでは0約31%であり,全体としての平均は1割前後であった.これは前報(山本ら,1999.園芸学会雑誌印刷中)の4ないし3年生側枝の場合より高かった.

施与側枝の位置の違いおよび周辺側枝への遮光処理の影響は明らかではなかった.2.周辺の個々の側枝内の果実への^<13>C分配率の要因解析を行ったところ,重相関分析による寄与率はセイヨウナシで約83%,リンゴで約55%,オウトウで約41%であり,取り込み変数(変数増減法による)は樹種により異なった.また,周辺の個々の側枝への^<13>C分配率と果実への^<13>C分配率との間の相関はカキを除く3者で極めて高かった.カキの側枝間転流には果実よりも発育枝葉の影響が無視できないものと考えられた.3.以上の結果,果実肥大最盛期の2年生側枝の炭素収支は総じて半閉鎖経済的様相を呈し,平均1割程度の,多くて約2,3割の光合成産物が他の側枝に転流することが推察できた.次年度の計画:リンゴを中心に,数年生側枝単位の結果部の葉群の光環境の調査方法を検討するとともに,結果部の光環境の違いが果実肥大,品質および着色に及ぼす影響を調査し,光合成産物の側枝間一次転流の性格を考慮した合理的な整枝剪定および光環境改善の方法を明らかにしたい。^<13>Cを用いた前年度の研究成果をふまえ、4樹種の成木の枝齢の異なる側枝の基部に環状剥皮処理を施し、果実および枝の肥大を無処理区(対照区)と比較するとともに、プラントキャノピーアナライザを用いてリンゴ'ふじ'の成木内の10本の3年生側枝に着生した果実の肥大と品質とこの3年生側枝、隣接3年生側枝および隣接4年生側枝の光環境との関係を調査し、間接的に側枝単位の炭素収支の季節的動向を調査した。1.オウトウ、セイヨウナシ、リンゴおよびカキのいずれにおいても、一部の環状剥皮処理区で対照区に較べ果実の最終横径がわずかに大きくなり、逆に枝の最終径が小さくなったが、多くの処理区間あるいは枝齢間には一貫した影響は認められなかった。一部の環状剥皮処理区で果実成長期の極く限られた時期に、対照区に較べ果実の日肥大率が有意に高くなったが、果実成熟期には大きな違いが認められなかった。枝の日肥大率にはほとんどの時期において対照区と処理区の間に有意差が認められなかった。2.3種の側枝の光環境(プラントキャノピーアナライザによるDIFN_<360,0-74>、DIFN_<S45,0-74>およびGAPS_<S45,16-31>)ならびに3側枝のDIFN_<360,0-74>の平均とBrixやL^*a^*b^*の各色度値との間の相関は、いずれも、調査果実の着生した3年生側枝の光環境>3側枝平均の光環境>隣接3年生側枝の光環境>隣接4年生側枝の光環境の順に高かった。有意な高い相関が認められたものの多くは調査果実の着生した3年生側枝の光環境のDIFN_<360,0-74>と3側枝平均のDIFN_<360,0-74>であった。果径および果重については強風落果のため調査できなかった。3.上記の結果から、3年生側枝の炭素収支は生育期間を通してほぼ閉鎖経済的であるものと考えられる。
制御性T細胞特異的転写因子Foxp3の恒常的発現機構の解明による自己免疫疾患治療

CD4陽性ヘルパーT細胞のサブセットの一つであるCD4(+)CD25(+)制御性T細胞(以下Treg)は、免疫応答を負に制御し、免疫系のホメオスタシス維持の上で重要な役割を担っていると考えられている。マウスにおいて、その減少で関節炎、腸炎、胃炎、甲状腺炎などの自己免疫疾患が誘導され、逆にこの細胞群の移入によりこれらの病態が治療可能であることが示されており、このTregを新たに誘導し、その細胞数、機能を制御することができれば、生体内のホメオスタシス回復という新しい形の治療が可能になると考えられる。Treg特異的な転写因子としてFoxp3が同定されているが、そのTreg機能や分化に関する機構は明かではない。我々は、このFoxp3分子の作用及び調節機構を解析するため、その会合分子をyeast two hybridを用いて探索し、SOCS1及びSOCS3をそのパートナーとして同定した。この研究では、この会合と実際のTregにおけるFOXP3との関係を検討した。実際のTregにおいても、Foxp3とSOCS3の会合が確認できた。そこで、SOCS1或いはSOCS3をshRNAでtargetingし、Foxp3導入による誘導型Tregにおける抑制活性の変化を検討したが、targetingによって機能には大きな影響が認められなかった。FOXP3発現を安定化させるのではないかという仮説で出発したが、SOCS3とFOXP3の会合がT細胞レセプター刺激で減少することも見いだしており(preliminary data)、SOCS1欠損マウスではTregの出現が抑制されていると報告や、またSOCSファミリーには蛋白分解活性もあるという事実を考え合わせると、SOCS分子はTreg分化過程において、会合と解離をしながら、FOXP3の蛋白量を調節している可能性を現在考えている。CD4(+)CD25(+)制御性T細胞(以下Treg)は、免疫系のホメオスタシス維持の上で重要な役割を担っている。自己免疫疾患や関節リウマチ患者では、Tregは既に減少(或いは機能低下)した状態と考えられ、このTregを新たに誘導し、その細胞数、機能を制御することができれば、生体内のホメオスタシス回復という新しい形の治療が可能になると考えられる。Treg特異的な転写因子Foxp3は、ヒトではTregでない通常のT細胞でも誘導されることが判明しているので、Foxp3のTregでの恒常的発現へと繋がる機序の解明がTregの分化誘導とその制御機構の解明に重要だと考えられる。そこで、本研究では、このFoxp3の発現調節機構を明らかにし、自己免疫疾患患者末梢血由来T細胞をTregへと再分化誘導する治療法の開発をめざす。平成17年度は、まずFoxp3発現安定化に関与すると考えられる分子の単離を行った。TregよりpolyA選択にてmRNAを調整し、二本鎖cDNA合成後、pGADT7-Recに組み込み、酵母Y187株に導入した酵母ライブラリーと、ベイトとして、FOXP3 cDNA全長或いは断片をpGBKT7に組み込み、それを酵母株AH109株に導入して、この両者を接合させ、栄養要求性を指標に、候補遺伝子を持つと考えられる酵母クローンを約40個選択した。そしてpCMV-Mycに組み込んだ候補cDNAと、pCMV-FLAGに組み込んだFOXP3全長或いは断片とを、293細胞及びJurkat細胞にco-transfection後、cell lysateから抗FLAG抗体を用いて免疫沈降し、抗Myc抗体にて可視化することで、associationが確認された15個のcDNAクローンを単離した。さらに、レトロウィルスベクターを用いてマウス脾臓CD4陽性T細胞にFoxp3を強制発現Foxp3させ作成した制御性T細胞にて確認した。

現在この中のSOCS3に注目し、RNAiを用いてその機能解析を進めている。CD4陽性ヘルパーT細胞のサブセットの一つであるCD4(+)CD25(+)制御性T細胞(以下Treg)は、免疫応答を負に制御し、免疫系のホメオスタシス維持の上で重要な役割を担っていると考えられている。マウスにおいて、その減少で関節炎、腸炎、胃炎、甲状腺炎などの自己免疫疾患が誘導され、逆にこの細胞群の移入によりこれらの病態が治療可能であることが示されており、このTregを新だに誘導し、その細胞数、機能を制御することができれば、生体内のホメオスタシス回復という新しい形の治療が可能になると考えられる。Treg特異的な転写因子としてFoxp3が同定されているが、そのTreg機能や分化に関する機構は明かではない。我々は、このFoxp3分子の作用及び調節機構を解析するため、その会合分子をyeast twp hybridを用いて探索し、SOCS1及びSOCS3をそのパートナーとして同定した。この研究では、この会合と実際のTregにおけるFOXP3との関係を検討した。実際のTregにおいても、Foxp3とSOCS3の会合が確認できた。そこで、SOCS1或いはSOCS3をshRNAでtargetingし、Foxp3導入による誘導型Tregにおける抑制活性の変化を検討したが、targetingによって機能には大きな影響が認められなかった。FOXP3発現を安定化させるのではないかという仮説で出発したが、SOCS3とFOXP3の会合がT細胞レセプター刺激で減少することも見いだしており(preliminary data)、SOCS1欠損マウスではTregの出現が抑制されていると報告や、またSOCSファミリーには蛋白分解活性もあるという事実を考え合わせると、SOCS分子はTreg分化過程において、会合と解離をしながら、FOXP3の蛋白量を調節している可能性を現在考えている。