hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Hippoシグナル経路の抑制によるウシ卵巣の活性化と繁殖性向上技術の開発

理由1卵巣の断片化培養によりHippoシグナルが切断されることを確認するため、転写コアクチベーターであるYapの局在を調べたところ、顆粒層細胞の細胞質から核内への移行が認められ、Hippoシグナルが切断されていることを明らかにできた。2卵巣断片化培養により、細胞増殖因子のCCN2やBirc5遺伝子の発現は増加傾向を示したが、卵巣採材から断片化培養までの時間によっても遺伝子発現量が変化したことから、断片化培養による細胞増殖遺伝子の発現量に有意差は見られなかった。次年度は、採材から断片化培養までの時間を短縮して、遺伝子の発現を調べる予定である。3アクチン重合材の添加では、S1Pは細胞増殖遺伝子の発現が亢進したのに対し、LPAは発現量に差は見られなかった。アクチン重合剤の種類によって、Hippoシグナル切断の程度に差がある可能性が示唆された。ウシの卵巣では1回の排卵に約1000個の卵胞がリクルートされるが、その多くは卵胞発育の過程で退行し最終的に排卵に至るのは1個である。もし、発育途中の二次卵胞を活性化することで卵胞の退行を抑制することができれば、発育途中の卵胞数が増加し、卵巣予備能や受胎率の向上が期待される。また、過排卵処理やOPU-IVFなど既存の技術と組み合わせることで胚生産の効率化にもつながる。そこで、初期卵胞の発育を制御しているHippoシグナル経路を卵巣組織の断片化やアクチン重合剤により抑制し、初期卵胞の活性化を試みた。実験I:ウシ卵巣の断片化培養を行い、転写コアクチベーターであるYapの局在について免疫染色法を用いて調べた。培養開始時は、顆粒層細胞の細胞質にYapの局在が認められ、6時間後および48時間後には核内へのYapの移行が観察された。次に、組織断片化培養後の細胞増殖因子の関連遺伝子(CCN2, Birc5, CCN3, FGF1,SOX-2)の発現を調べた。Hippoシグナルの下流にある細胞増殖因子のCCN2およびBirc5遺伝子は、卵巣の断片化培養により増加傾向を示すものの、ばらつきが大きく有意差は認められなかった。実験II:アクチン重合剤添加による組織断片化培養における細胞増殖因子の関連遺伝子の発現を調べた。スフィンゴシン1リン酸(S1P)添加によりCCN2およびFGF1遺伝子の発現が増加する傾向を示した。一方、同じくアクチン重合材であるオレオイル-L-α-リゾホスファチジン酸(LPA)では、細胞増殖因子の遺伝子発現に増加は見られなかった。さらに、細胞透過性の優れるJasplakinolide(Jasp)を用いて、遺伝子発現を調べたところCCN2およびFGF1遺伝子の亢進がみられた。アクチン重合剤の種類によって、細胞増殖因子関連遺伝子の発現促進効果に差異があることが明らかとなった。卵巣の断片化培養によりHippoシグナル経路が抑制されることを確認するため、転写コアクチベーターであるYapの局在を調べたところ、顆粒層細胞の細胞質から核内へのYapの移行が認められ、Hippoシグナル経路の抑制が示唆された。卵巣の断片化培養により細胞増殖因子の遺伝子の発現を調べたところ、卵巣採材から断片化培養までにかかる時間が、卵巣内の遺伝子発現量に影響することが示されたことから、卵巣培養は全て食肉処理場内で行った。卵巣断片化培養により、細胞増殖因子のCCN2やBirc5遺伝子の発現は増加を示した。アクチン重合材の添加では、S1PとJaspでは細胞増殖遺伝子の発現が亢進したのに対し、LPAは無添加と比較して発現量に差は見られなかった。アクチン重合剤の種類によって、ウシ卵巣のHippoシグナル経路の抑制程度に差がある可能性が示唆された。
円形平面翼をもつ飛行体の空力・性能特性に関する研究

(1)円形平面翼の空力特性翼の空力特性の研究では、フリスビ-型翼は下面が凹型であるため、その下面を塞いだ翼や平板翼と異なる空力特性を示した。すなわち、●揚力、抵抗ともに他の翼型より大きく、失速迎角が高く、迎角に対しほぼ一定の揚抗比を示す。●ピッチングモーメント係数については、他の翼型は中心点周りに正の頭上げモーメントであるのに比し、フリスビ-型は負の頭下げモーメントを示し、その値も小さい。●翼の回転が周りの流体に及ぼす影響については、左右の非対称性はごく僅かであり、空力的には無視できる。これらのことから、フリスビ-が安定した姿勢で飛行する理由の一つはその翼型にあり、迎角や速度変動に対し不変の空力特性を有し、更に頭下げのモーメント特性のため回転数が低くても安定した飛行が可能であることが判る。(2)回転する円形平面翼の運動特性と飛行経路ジャイロ剛性を含めた円形翼の運動特性の解明では、右回転している翼では左にロールしながら左に旋回する水平面軌跡を描く。これは翼に働く正の小さい空気的ピッチングモーメントによる角運動量変化のため、位相が90度遅れた位置でロール角変化を生じるためであることを明らかにした。さらに2次元運動解析装置(ビデオトラッカー)を使いフライングデイスクの飛行経路の測定実験を行い、理論解析と比較し、良好な一致を得た。フリスビ-型翼のピッチングモーメント係数は、迎角20度付近で小さい負の値から、正の値に変化する。また、平板翼に比し大きな抵抗係数のため、飛行速度が減速するにつれ大きな迎角を取り、それにつれバンクしながら所定方向に旋回していくことを確認した。(3)飛行制御の基礎理論の開拓飛行制御の理論的研究では、H無限大制御、非線形制御、むだ時間系制御、適応制御などの種々の制御理論やその飛行制御への応用研究を行い、研究発表の項目に示す成果を得た。(1)回転する円形平面翼の空力特性の風洞実験風洞実験の供試模型は平板、凸型で前縁に丸みのある翼(フリスビ-型)、及び前縁が角ばった翼の3種類を使用し、風速、迎角、スピン回転数をパラメータとした6分力測定を行った。また平板翼については大型計算機を使った数値解析を行い、流線や圧力分布を求め、翼の回転が周りの流体に及ぼす影響を調査した。これらの実験データと解析結果と比較から、翼の空力特性を検討した。フリスビ-型は下面が凹型であるため、その下面を塞いだ翼や平板翼と異なる空力特性を示した。すなわち、・揚力、抵抗ともに他の翼型より大きく、失速迎角が高く、迎角に対しほぼ一定の揚抗比を示す。・ピッチングモーメント係数については、他の翼型は中心点周りに正の頭上げモーメントであるのに比し、フリスビ-型は負の頭下げモーメントを示し、その値も小さい。・翼の回転が周りの流体に及ぼす影響については、左右の非対称性はごく僅かであり、空力的には無視できる。(2)円形平面翼の運動特性と安定性の検討

風洞実験で得られた空力データに基づき、飛行体の力学モデルを作製し飛行経路、安定性、突風応答などの運動特性を研究している。ジャイロ剛性を含めた安定性について解析を行い、特性を明らかにした。1)回転する円形平面翼の運動特性ジャイロ剛性を含めた円形翼の運動特性の解明では、右回転している翼では左にロールしながら左に旋回する水平面軌跡を描く。これは翼に働く正の小さい空気的ピッチングモーメントにる角運動量変化のため、位相が90度遅れた位置でロール角変化を生じるためであることを明かにした。さらに2次元運動解析装置(ビデオトラッカー)を使いフライングデイスクの飛行経路の測定実験を行い、理論解析と比較し、良好な一致を得た。2)安定操縦性改善のための制御系の設計本年度提案した飛行制御システムは、飛行条件の変化やモデルの不確かさに対するロバスト性に優れており、その有効性をシミュレーションにより検討した。しかし地面付近を高速で飛行する運動体では、円形翼に限らず、地面とのクリアランスの関係上、機体長を長くできないうえに、姿勢変化を小さく抑えることが必要となる。そのため固有の縦安定性を得ることが困難で、飛行制御系による安定操縦性の改善が極めて重要であり、幾つかの制御系を提案した。1)飛行制御の基礎理論の開拓前年度に引き続き飛行制御の理論的研究を行った。H無限大制御、非線形制御、むだ時間系制御、適応制御などの種々の制御理論やその飛行制御への応用研究を行い、研究発表の項目に示す成果を得た。2)回転する円形平面翼の運動特性の解明平成6および7年度の2年間の成果に基づき、回転する円形平面翼の運動特性を理論および実験両面から検証した。フリスビ-型翼は平成6年度の風洞実験では小さい負の頭下げモーメントを示した。一方、平成7年度の飛行経路の測定実験では小さい正の頭上げモーメントが作用している場合に理論解析と実験は一致する。この相異を更に詳しく調査するため、再度風洞実験を行ったところ、ピッチングモーメント係数は、迎角20度以下では小さい負から、20度以上では正に変化する。フリスビ-型翼は平板翼に比し大きな抵抗係数のため、飛行速度が減速するにつれ大きな迎角を取り、それにつれバンクしながら所定方向に旋回していくことを確認した。飛行安定性の観点から見れば、翼を回転させることにより得られるジャイロ剛性による安定増加効果は有力なものであるが、操縦性とのバランスを図る必要がある。操縦方式をいかにするかは今後の課題である。
安定かつ動的な紡錘体構造を実現する分裂期モータータンパク質の設計原理の探究

本研究は,細胞分裂時に現れる紡錘体の形成・維持の仕組みをモデルとして,個々の分子の数のゆらぎと,全体の構造の高い安定性・再現性との間のギャップを埋め,生物特有の安定かつ動的な構造・ネットワークを自己組織的に形成するための素子の設計原理を知ることを目的とした研究である.途中,研究計画の変更を行い,分子数に応じて運動方向性が逆転することが知られているkinesin-5に焦点を絞り,これが微小管を集団で架橋しながら運動する現象を研究対象とした.その結果,DNAナノ構造体を用いてkinesin-5を集積した複数多分子複合体の作製に成功し,運動方向の逆転と分子数の間の関係を研究することが可能になった.研究実施計画のうち,マクロな階層の実験計画に関して,本年度は,ガラス面上で紡錘体構造を再構成するためのコンポーネントの準備を行った.まず,ガラス面の処理として,テフロンコーティングとPEG系のポリマーによる処理をを施すことにより,ガラス面へのタンパク質の非特異的な吸着を防ぐことに成功した.この表面上で,モータータンパク質と微小管を混合し,再現よく微小管によるアスター状の構造体が出来ることが分かった.一方,ミクロな階層での実験については,精製して使用しているモータータンパク質のうち,kinesin-5の活性測定が本研究計画では鍵となっているが,先行研究を含めて,この測定がkinesin-5特有の構造がネックとなって進んでいない状況が続いている.kinesin-5は2量体をお互いに反対向きに向けた4量体であり,一方の2量体の頭部(ATPを加水分解して微小管と結合するモータードメインを含む球状の部位)がもう一方の2量体の尾部側に位置し,その両方が微小管と相互作用する,という複雑なものであり,単純に尾部に固定用のタグを入れただけでは,合計4つのタグが頭部側にも尾部側にも付加され,プローブに固定する際に,固定のされ方にバリエーションが生まれてしまう問題が起きていた.そこで,今年度は,4量体としてのkinesin-5の活性を観るために,適切な位置に固定用タグを入れる方法を確立した.これにより,単一の方法でプローブに固定されたkinesin-5の力発生を精密に測定できるようになることが期待される.マクロなスケールの実験は予定通り進行していることと,困難が予想されたkinesin-5の固定問題に関しても想定されたよりも大きな前進が得られたため,全体としては研究計画は順調に進展していると評価出来る.前年度の「今後の研究の推進方策」に述べたように,研究実施計画のうち,マクロな階層に関して,他の複数の研究グループが同様の趣旨の実験を行っているとの情報を得たため,さらにその先を行くため研究計画を一部変更し,分子数に応じて方向性を逆転させる両方向性のkinesin-5の一種にフォーカスを絞り,当初の計画の通り,DNA scaffoldによる多分子化と,光ピンセットによる力学測定を進めることとした.本年度は,両方向性のkinesin-5の発現系の確立と,DNA scaffoldを用いて分子数を規定した上で複数分子を配置する技術の確立に取り組んだ.両方向性のkinesin-5は,大腸菌,哺乳類培養細胞,昆虫細胞発現系のどれを使っても発現が悪く,DNA scaffoldによる分子の配置を行うにはタンパク質の量が足りなかった.そこで,可溶化タグとしてGFPをC末端に挿入したところ大幅な改善が観られ,DNA scaffoldに対して大過剰量のkinesin-5を反応させることに依って,4分子までの複数分子の連結が可能になった.その結果,1分子の運動方向と比較して,4分子では運動方向が逆転するものが現れた.先行研究では運動方向の逆転は多数の分子が相互作用することによって引き起こされると考えられており,数分子のレンジで運動方向が逆転することは全く想定されていなかったため,新しいモデルに繋がる知見が得られたと考えている.実験計画の一部変更があったものの,想定されていた発現系の問題が解決できたこと,DNA scaffoldを用いた実験で予想外の興味深い現象が観察できたことを考えると,全体としては順調に推移していると評価できる.昨年度までに,酵母の両方向性kinesin-5の発現・精製と,DNA scaffoldを用いた多分子複合体の作製に成功した.複数分子複合体のテンプレートとして,SSTと呼ばれるDNAナノチューブを用いた場合と,DNA origami法で作製した長さ約400ナノメートルのナノチューブを使用した場合の実験を行った.運動の観察はDNAテンプレートの一部に導入した蛍光色素を用い,全反射蛍光顕微鏡下で行った.kinesin-5は2本の微小管を架橋しながら運動する性質があるため,微小管2本と,kinesin-5自身,DNAテンプレートの4種類の蛍光プローブを同時に観察する必要がある.そのため,蛍光波長の異なる4種類の蛍光プローブを同じ1台のカメラで記録するための光学系を構築した.運動観察の結果,どちらのテンプレートを用いた場合でも,kinesin-5の分子数に依っては運動方向が逆転するケースがあることを確認したが,再現性が低く,この点は現状では不明瞭である.引き続きこれらの運動観察と解析を続行し,分子数と運動方向の関係を明らかにしたい.並行して,運動方向性決定と方向性逆転のメカニズムを理解するために,kinesin-5に外部負荷を掛けた時の応答を光ピンセット装置を用いて計測する実験系の構築を行った.予備実験の結果,kinesin-

5では,従来型キネシン(kinesin-1)の計測で使われるようなpNレベルの力ではなく,もっと小さな力のやり取りによって運動方向の逆転が起きている可能性が考えられた.本研究は,細胞分裂時に現れる紡錘体の形成・維持の仕組みをモデルとして,個々の分子の数のゆらぎと,全体の構造の高い安定性・再現性との間のギャップを埋め,生物特有の安定かつ動的な構造・ネットワークを自己組織的に形成するための素子の設計原理を知ることを目的とした研究である.途中,研究計画の変更を行い,分子数に応じて運動方向性が逆転することが知られているkinesin-5に焦点を絞り,これが微小管を集団で架橋しながら運動する現象を研究対象とした.その結果,DNAナノ構造体を用いてkinesin-5を集積した複数多分子複合体の作製に成功し,運動方向の逆転と分子数の間の関係を研究することが可能になった.研究実施計画のうち,マクロな階層の実験計画に関しては,他の複数の研究グループが同様の趣旨の実験を行っている可能性が出てきたため,研究計画の変更を視野に入れて検討中である.一方,ミクロ-中間の階層の実験計画は,現在得られたタグ付きのkinesin-5を用いて,当初の計画通り,DNA origamiによる複数分子の配置,光ピンセットによる力学測定などを進めていく予定である.研究材料として両方向性のkinesin-5に絞ったことで,多少の実験の詳細の変更はあるものの,全体としては,当初の研究実施計画の趣旨である「一分子と多分子の間のルールを知る」,というポイントは変更せずに研究を進める予定である.特に,光ピンセットを用いてミクロとマクロの中間の階層についての知見を得る,という目標は,最終年度に向けて大きな課題として取り組んでいきたいと考えている.すでにDNA scaffoldを用いた運動観察で結果が出ており,このDNA scaffoldに光ピンセット用のプローブを結合させれば力学測定は可能であることから,この計画の実現性は高いと考えている.生物物理学研究計画の若干の変更に伴い,次年度の消耗品が多く掛かることが予想されたため.細胞培養のための培養液あるいは,タンパク質精製用試薬に充てる予定である.
ニーズベースの医師需給再推定と地域医療資源配置の医療経済分析

本年度は、前年度の基礎的情報収集および先行研究サーベイの成果を踏まえて、1)医師需給推定の基礎となる医師供給に関する決定要因分析、特に地域のプライマリケア医の動向に関する予備的推定作業2)ニーズ推定の基礎となる地域における医療ニーズ動向や医療施設選択、また医療に対する満足度や世帯構造と医療ニーズとの関連に関する、厚生労働省の基幹統計個票データによる分析作業3)英国、オランダにおける医師確保と他職種連携に関する実態調査を実施した。まず1)については、公表データ(二次データ)を用いて、診療所医師のうちプライマリケアに従事していると想定される医師群の過去15年間のデータから、二次医療圏単位でのストック(就業者数)とフロー(対前年変化)とをプロットし、その動向からOLSシミュレーションによって今後のプライマリケアの就業予測を行った。その結果1ストックについてはすべての医療圏で経年的変化が全く見られないのに対して、フローは大きな格差があること、2フローの動向を踏まえたシミュレーションからは、すべての医療圏で今後プライマリケア従事者の減少が予測されること、が明らかになった。この結果は国際地域医療看護研究学会2017で報告するとともに、論文化した。また2)では、「国民生活基礎調査」「医療施設調査」「受療行動調査」の個票データから、医療ニーズと医療供給体制との関係を検討した。その結果1世帯成員の健康意識(主訴)の大きさと診療所医師数および訪問看護実施数との間には、それぞれ正の関係と負の関係が見られ、地域ケアの充実が世帯成員の健康度の維持に貢献する可能性があること、2患者の診療満足度には医師の十分なコミットメントが強く働いている可能性があること、が示された。この結果は現在論文化の途上である。3)については、特にオランダの地域看護と医師との代替による地域医療資源確保の実態を確認した。全体としては研究計画に沿って研究が進められているものの、研究代表者が2018年1月3月まで健康上の理由で入退院を繰り返したため、実質的に研究が行えたなかったこと、また厚労省の開示データのデータベース化に予想外の時間を要したことなどから、当初の予定に比べるとやや研究の遅れがあると考えられる。ただし現時点でいずれの障害もほぼ解決されており、最終年度に向けて遅れを取り戻すべく研究速度を上げる態勢がとれるものと考える。今後(次年度)は、厚労省開示データに基づく分析を終了し、わが国の(地域単位の)医療ニーズの決定要因を明らかにするとともに、医師自身のワークライフバランスなど就業環境の変化も視野にいれた、医師供給動向の再検討も行って、ニーズベースによる医師需給推定の新たな可能性と課題を明らかにすること、また、近年急速に進展しているAI導入やゲノム医療、遠隔医療などの医療提供体制全般の変革が、医師需給にどう影響するかについて、国際的視点からをふまえた議論をおこない、それと本研究で得られる知見との整合性について検討する予定である。また、医師需給のあり方はその補完的資源である看護師の動向や、急性期慢性期およびプライマリケアといった専門性の分化のあり方とその就労意識に密接にかかわることから、これらの今後の動向を新たに病院、診療所を対象にした質問紙調査によって情報収集し、単に数的な需給予測だけではなく、いくつか予想される医療従事者の就労シナリオを提示することで、今後の医師需給のリアリティとは何かについて問題提起できるように考えている。いっぽうで、本研究テーマの先駆的地域である米国、カナダ、英国および大陸ヨーロッパにおける医師需給モデルの構築実態と医療人材配置の現状について精査し、本研究の分析モデルに応用するため、同地域の医療労働・医療政策研究者を招聘して研究パネルを立ち上げ、研究視点や方向性、分析手法の妥当性などについて検討した。これらの検討をもとにして、ニーズベースの医師需給予測モデルの考慮すべき特性や必要な変数などを検討した。以上の研究成果により、次年度では「国民生活基礎調査」や「就労実態基礎調査」の個票ベースでの定量分析を行うとともに、看護師の今後の就労動向、およびIT普及による医師労働の変化などの定性的検討もふまえた、将来の地域医療ニーズのモデル化作業にとりかかることとした。初年度計画における基礎的文献の調査、および国際比較研究のためのパネルづくり、また医師、看護師などの地域医療専門職の就労動向と地域住民の受診動向についてのミクロデータ収集(アンケート調査)などがおおむね予定どおり実施され、またその成果の一部を論稿として公開可能にした。さらに、派生的な研究対象として、アジア(ラオス)の医師需給推定に向けた調査方法の共有や、地域看護の特性とその必要性に関する聞き取り調査などが行えたことで、本研究テーマを進めるための分析対象の拡張が図れたことは重要な進展である。

その結果1ストックについてはすべての医療圏で経年的変化が全く見られないのに対して、フローは大きな格差があること、2フローの動向を踏まえたシミュレーションからは、すべての医療圏で今後プライマリケア従事者の減少が予測されること、が明らかになった。この結果は国際地域医療看護研究学会2017で報告するとともに、論文化した。また2)では、「国民生活基礎調査」「医療施設調査」「受療行動調査」の個票データから、医療ニーズと医療供給体制との関係を検討した。その結果1世帯成員の健康意識(主訴)の大きさと診療所医師数および訪問看護実施数との間には、それぞれ正の関係と負の関係が見られ、地域ケアの充実が世帯成員の健康度の維持に貢献する可能性があること、2患者の診療満足度には医師の十分なコミットメントが強く働いている可能性があること、が示された。この結果は現在論文化の途上である。3)については、特にオランダの地域看護と医師との代替による地域医療資源確保の実態を確認した。全体としては研究計画に沿って研究が進められているものの、研究代表者が2018年1月3月まで健康上の理由で入退院を繰り返したため、実質的に研究が行えたなかったこと、また厚労省の開示データのデータベース化に予想外の時間を要したことなどから、当初の予定に比べるとやや研究の遅れがあると考えられる。ただし現時点でいずれの障害もほぼ解決されており、最終年度に向けて遅れを取り戻すべく研究速度を上げる態勢がとれるものと考える。今後は、1)わが国の公式統計の個票データ分析(データ公開申請による)を行うこと、2)医療労働(医師、看護師等)の現在および将来の就業の予測や就労時間、ワークロードのの変化予測(IT、AI進展との関連で)を、実際の就労者への聞き取り等から行うこと、およびカナダ、米国、ヨーロッパの医療人材需給予測研究とわが国の研究との関連についての、分析モデルレベルでの比較検討を行うこと、を中心として、さらに今年度実施した横浜地域の地域医療人材の配置予測についてさらに精緻なデータ収集と分析を行い、その結果を行政や医療機関の専門家と共有し意見交換を行いながら研究を進めていく予定である。今後(次年度)は、厚労省開示データに基づく分析を終了し、わが国の(地域単位の)医療ニーズの決定要因を明らかにするとともに、医師自身のワークライフバランスなど就業環境の変化も視野にいれた、医師供給動向の再検討も行って、ニーズベースによる医師需給推定の新たな可能性と課題を明らかにすること、また、近年急速に進展しているAI導入やゲノム医療、遠隔医療などの医療提供体制全般の変革が、医師需給にどう影響するかについて、国際的視点からをふまえた議論をおこない、それと本研究で得られる知見との整合性について検討する予定である。また、医師需給のあり方はその補完的資源である看護師の動向や、急性期慢性期およびプライマリケアといった専門性の分化のあり方とその就労意識に密接にかかわることから、これらの今後の動向を新たに病院、診療所を対象にした質問紙調査によって情報収集し、単に数的な需給予測だけではなく、いくつか予想される医療従事者の就労シナリオを提示することで、今後の医師需給のリアリティとは何かについて問題提起できるように考えている。
鶏の受精時における卵・精子間の結合分子と膜融合に関する研究

鶏精子をPBSで洗浄し所定の濃度(1×10^9cells/ml)になるように150mM NaCl,5mM MgSO_4,15mMKC1,10mM benzamidine,20mM HEPESで懸濁し,1時間4°Cに静置の後,高圧窒素ガスによる方法(N_2 cavitation)により精子細胞膜を分離し,パーコール密度勾配遠心法を用いて細胞膜分画を得た。この細胞膜小胞と,蛍光ラベルをしたリン脂質小胞を混合し,細胞膜小胞とリン脂質小胞の融合を,蛍光の消光を用いて測定し,精子細胞膜小胞の融合条件の解析を試みた。すなわち,細胞膜小胞をダンジルクロリドにより蛍光ラベルし,ロ-ダミンによりラベルしたリン脂質小胞と混合し,励起波長350nmでの500nmの蛍光強度の減少を測定し両小胞間の膜融合の頻度測定を試みたが,自然の消光との間で有意な融合は検出出来なかった。これは蛍光試薬による細胞膜小胞の標識が十分でないためと考えられたが,この標識の効率を上げることは出来なかったため,fluorescence energy transfer法は,今回の系に用いるには不適当と考え,この方法による膜小胞の融合検出を断念した。ついで,細胞膜小胞に蛍光試薬(carboxyfluorescein)を含有させ,その消光剤DPX(p-xylene-bis-pyridinium bromide)を含有するリン脂質小胞と混合し,蛍光強度の減少から,両小胞の融合を測定する方法を検討中である。また,鶏精子の細胞膜の部城特異性を知る目的で,超音波処理した精子の頭部と尾部の,蔗糖およびパーコール密度勾配法による分画を試みている。現在,それぞれ90%程の純度の分画をを得ることができるが,完全な分画には成功していない。
1930年代の満州国における日韓交流史の研究－〈移民〉と〈民族協和〉－

延辺朝鮮族自治州の延吉を訪れ、高齢日本語話者へのインタビュー、日本語書籍について調査などを行った。高齢日本語話者へのインタビュー内容の一部については、『愛知教育大学大学院国語研究』(第27号、2019年3月)において報告した。以下に論文の概要について記す。高齢日本語話者へのインタビューは日本語で行われたが、日本語能力の多くは満州国崩壊後に培われたと考えられること、さらに日本語・日本文化の記憶が鮮明であることなどを指摘した。その上で、高齢日本語話者の幼少時の記憶には、継続的な日本語・日本文化との接触が何らかのかかわりを持っているのではないかと推測した。また、インタビュアー(インタビューを行う側)の問題点に言及した。インタビューを進める過程で気づいたのは、「日本人」がインタビューを行うことの問題である。インタビューの目的は、旧満州国における日本語・日本文化との接触に関することに主眼があり、歴史的な問題は視野に収められていなかった。しかしインタビューの過程で、インタビュアーは「日本人」であることを自覚し、インタビューの質問内容は当初の予定から大きく逸脱することになった。この点について、論文では、ライフストーリー研究における「対話的構築主義アプローチ」という観点から考察した。論文ではインタビューの一部を掲載したが、着目したのは高齢日本語話者が、童謡や軍歌を鮮明に記憶し、実際に歌っていたことである。この事は、帝国主義と身体に刻み込まれた韻律の関係性が重要な課題であることを示唆している。延吉において、高齢日本語話者にインタビューを行い、内容の一部については論文で報告した。また旧満州国にかかわる日本語書籍について、調査を行うことができた。他方、高齢日本語話者のインタビュー内容については、考察すべき点が多くあることが明らかになった。現在、問題点についての整理を行いつつ、インタビュー内容について再検討している段階である。収集した資料の整理とさらなる考察が課題となっている。今後は、高齢日本語話者へのインタビュー内容について、同時代資料からの検討、植民地朝鮮という観点からの考察、などを行っていきたい。高齢日本語話者へのインタビューについては、旧満州国に限ることなく、韓国、台湾においても行っていきたい。旧満州国にかかわる日本語書籍の調査は、存在を確認した段階である。さらに調査を進めて、資料的な価値について検討を加えていきたい。2017年8月18日から8月20日にかけて、中国の延辺大学で行われた第五回中日韓朝言語文化比較研究国際シンポジウムにおいて、「越境する朝鮮人知識人と京城図書館ー日本・朝鮮・間島ー」と題して発表した。発表では、まず植民地朝鮮における図書館の位置づけについて言及した。植民地朝鮮において、朝鮮人の私財によって、私設図書館が設立される。記録によれば、多くの朝鮮人知識人が閲覧に訪れ、盛況であったことがわかる。しかし、財政難から私設図書館は京城府に移管されることになる。その一方で、植民地朝鮮から、多くの朝鮮人知識人が間島に移住する。図書館人もその中に含まれていた。発表では、間島での朝鮮人図書館人の動向について調査し、朝鮮人知識人が図書館にかかわることの意味について考察した。また、延辺大学の所在地である延吉市在住の高齢日本語話者(朝鮮民族)にインタビューを行った。インタビューでは、主として旧満州国における日本文化との接触、日本語の習得状況などについて尋ねた。2017年12月には、台湾の台北において高齢日本語話者にインタビューを行った。インタビューでは、主として植民統治時代の台湾における日本文化の受容、日本語の習得状況、日本人の教員との関係などについて尋ねた。2017年3月には、中国の北京において、旧満州国で幼少期を過ごした高齢日本語話者(漢民族)にインタビューを行った。インタビューでは、主として旧満州国における中国人と日本人との接触、日本語の習得状況、日本文化の受容について尋ねた。本研究の課題第は、旧満州国における日韓交流史について考察することである。第五回中日韓朝言語文化比較研究国際シンポジウムにおいて、「越境する朝鮮人知識人と京城図書館ー日本・朝鮮・間島ー」と題して発表することができた。また、旧満州で幼少期を過ごした、朝鮮民族、漢民族の高齢日本語話者にインタビューすることができた。朝鮮民族と漢民族の双方から、旧満州国における日本文化の受容について話を聞けたことにより、研究上、有益な情報が得られた。他方、台湾において高齢日本語話者から日本文化の受容にかかわる話が聞けたことにより、植民統治の違いが、日本文化との接触に影響を与えていたことが確認できた。しかしながら、延吉市において日本語書籍などの資料調査ができなかったこと、さらにはインタビュー資料の整理が遅れていることが課題として残った。

インタビューの目的は、旧満州国における日本語・日本文化との接触に関することに主眼があり、歴史的な問題は視野に収められていなかった。しかしインタビューの過程で、インタビュアーは「日本人」であることを自覚し、インタビューの質問内容は当初の予定から大きく逸脱することになった。この点について、論文では、ライフストーリー研究における「対話的構築主義アプローチ」という観点から考察した。論文ではインタビューの一部を掲載したが、着目したのは高齢日本語話者が、童謡や軍歌を鮮明に記憶し、実際に歌っていたことである。この事は、帝国主義と身体に刻み込まれた韻律の関係性が重要な課題であることを示唆している。延吉において、高齢日本語話者にインタビューを行い、内容の一部については論文で報告した。また旧満州国にかかわる日本語書籍について、調査を行うことができた。他方、高齢日本語話者のインタビュー内容については、考察すべき点が多くあることが明らかになった。現在、問題点についての整理を行いつつ、インタビュー内容について再検討している段階である。収集した資料の整理とさらなる考察が課題となっている。今後は、旧満州国や植民統治時代の台湾で幼少期を過ごした高齢日本人にインタビューを行い、植民統治時代の日本人の経験と、朝鮮民族、漢民族、台湾人の経験との差異を明らかにしたい。他民族の経験との比較は、旧満州国における日韓交流の状況についての考察に有効であると考える。これまで行ってきたインタビューについてまとめ、日本文化との接触、日本語の習得がいったいどのような意味を持っていたのかという点について、同時代資料や先行研究を参照しつつ、考察を深めていきたい。今後は、高齢日本語話者へのインタビュー内容について、同時代資料からの検討、植民地朝鮮という観点からの考察、などを行っていきたい。高齢日本語話者へのインタビューについては、旧満州国に限ることなく、韓国、台湾においても行っていきたい。旧満州国にかかわる日本語書籍の調査は、存在を確認した段階である。さらに調査を進めて、資料的な価値について検討を加えていきたい。延辺朝鮮族自治州、旧満州に属する地域において、引き続き聞き取り調査を行うことを予定していたができなかった。また延吉市において資料調査を行うことを予定していたが、依頼先との日程調整ができず、調査ができなかった。次年度は、延辺朝鮮族自治州において聞き取り調査を行い、延吉市では資料調査を行いたい。さらに、旧満州に限らず、植民統治された地域において広く資料調査を行い、日本文化との接触について研究を行っていきたい。研究室の改修にともない、機器、関連する文献の購入が困難な状況であった。そのため、収集した資料の整理、考察が十分に行えなかった。また延辺朝鮮族自治州の延吉において日本語書籍について調査を行ったものの、資料の確認しかできなかった。今年度は、機器、文献などを購入して、収集した資料の整理・考察を行いたい。
光学活性アミノ酸金属塩のルイス酸的触媒機能

触媒的不斉反応の分野で、不斉マイケル付加反応の開発はいまだ未解決である。特に、多くの種類の不斉炭素を簡便に構築できるプロキラルなマイケルアクセプターの反応にはほとんど成功例がない。本年度の研究では,アミノ酸金属塩を用いるカルボニルの新しい触媒的活性化法を用いて,プロキラルアクセプターへの活性メチレン化合物の不斉マイケル付加を検討した。単純なマロン酸エステルの初めての不斉触媒的マイケル付加反応を開発した。合成容易で安価なアミノ酸Rb塩(5mol%)存在下で,マロン酸ジイソプロピルはエノン,エナールへ比較的高い不斉収率で共役付加する。鎖状の(E)-エノン、エナールは(S)-配置の付加物を与え、環状(Z)-エノンは(R)-付加物を与える。このことは、不斉誘起がプロキラルなアクセプターのエナンチオ面を区別して進行していると考えると、良く説明できる。活性中間体として、エノンとアミノ酸触媒から生成するイミニウム塩を考えた。すなわち,触媒は塩基として作用するのみでなく,アクセプターを活性化し,エナンチオ面を区別していることになる。アミノ酸金属塩にルイス酸と類似した触媒機能があるとみなすことができる。本触媒はニトロ化合物の不斉共役付加にも利用できる。5-10mol%の触媒存在下、ニトロ化合物とエノンから、光学活性付加物が収率よく得られた。とくに、嵩高い三級ニトロ化合物を用いた場合に高い不斉誘起が見られた。たとえば、ニトロシクロヘキサンとシクロヘプタノンとの反応では、最高84%eeを達成した。生成物の絶対配置はマロン酸エステルの場合と同じで、どちらも同様な反応機構で進行していることを示している。
神経活動をゲノムに記録するシステムの開発

脳の情報処理機構を解明するためには、脳を構成する全ての神経細胞の活動を経時的に長期間記録し、機能との対応を解析することが必要不可欠である。しかし、現在使われている神経活動の記録法には欠点があり、脳を構成する全ての神経細胞の活動を長期に亘り記録することができない。本研究では、Cas9の発現に神経活動依存性を持たせることにより、神経活動の履歴をstgRNA (self-targeted guide RNA)発現カセット上のindelとして記録し、今まで困難であった脳を構成する全ての神経細胞の活動履歴を記録できる系を開発する。C6グリオーマは、ATPを投与することによりc-fosの発現が上昇する細胞株である。本年度は、C6グリオーマのc-fos遺伝子座の3'末端非翻訳領域に2Aペプチドを介し、Cas9をノックインした細胞株を樹立した。樹立した細胞株に、CMVプロモーター(CMVp)の下流にTetR(tetリプレッサータンパク質)をつないだベクターを導入し、c-fos依存性にCas9を発現し、なおかつ、tetRを恒常的に発現している細胞株を樹立した。樹立した細胞株に、tetオペレーターDNA配列を含むRNA polymerase IIIのH1プロモーター(H1p-1xTetO)の下流にstgRNAをつないだベクターを導入した細胞株を樹立した。現在、ATPとドキシサイクリン(Dox)を添加することによりstgRNA上にindelが起きるかどうか、T7 E1アッセイにより確認中である。実験計画通りの遺伝子を導入した細胞株を樹立した。しかし、その細胞株がc-fosの発現上昇の程度の違い依存し、stgRNA上にindelを起こすかどうかのdeep sequenceによる確認をしている最中である。細胞株が、神経活動をDNA上のindelとして記録することを確かめる。以下の3系統のマウスを作成し、交配することにより神経活動をゲノム上に記録できるマウスを作成する。a.c-fos遺伝子座にCas9をノックインしたマウス作成したマウスにドキシサイクリン入り餌を投与し、PTZでてんかん発作を誘発し、脳の各部位からDNAを抽出し、stgRNAノックイン部位をPCRで増幅し、deep sequenceによりindelが起きている割合を解析し、神経活動がゲノム上に記録されているかを明らかにする。
生体関節および人工関節における多モード適応潤滑機構

生体関節と人工関節における多モード適応潤滑機構を解明するために,関節モデルおよび生体関節軟骨の摩擦試験や人工関節の歩行シミュレータ試験,人工軟骨材料PVA(ポリビニルアルコール)ゲルの評価試験を行うとともに,歩行時の膝関節部の動的挙動との関連を検討した.1.生体関節における多モード適応潤滑の解明ゲル膜潤滑と滲出潤滑に着目した.ゼラチンゲル摩擦面をゼラチンの低濃度溶液で潤滑した摩擦試験では,ゲル膜が沈着しやすい条件下で最小摩擦状態を実現できることが判明した.また,豚肩関節軟骨の摩擦試験により,ゲル膜潤滑の挙動の変化を観測できた.滲出潤滑作用に対しては,軟骨表面のレーザ顕微鏡による表面画像と形状の時間変化の観測により,部位による自由水の移動の差異を識別できた.PVAゲルにおける滲出挙動の可視化観察により,滲出水による低摩擦の実現を確認できた.2.人工関節における多モード適応潤滑人工膝関節のシミュレータ試験により,従来材料製の円筒型と,解剖学的デザインの大腿部とシリコーンゴム製の脛骨部から構成される人工膝関節では,0.1Pa・s程度の中粘度の潤滑液使用下で,かなりの弾性流体潤滑膜が形成されることを実証した.潤滑液の粘度が低い場合には,多モード適応潤滑機能が必要となるため,滲出効果を検討した.ステンレス鋼製大腿部とPVA製脛骨部から構成される円筒型人工膝関節は,低粘度潤滑液のもとでも極めて低い摩擦状態を実現できた.また,形成的な観点から多モード潤滑を実現する案として,二円弧型膝関節の評価を試みた.3.生体関節と人工関節の臨床評価と潤滑モード表面損傷をきたし潤滑機能も低下した変形性膝関節症患者では,歩行時には接地直後に過大な側方加速度が発生し,足底板により改善できることが実測で判明し,関節機能の臨床的評価の手段としても有用であることがわかった.生体関節と人工関節における多モード適応潤滑機構を解明するために,関節モデルおよび生体関節軟骨の摩擦試験や人工関節の歩行シミュレータ試験,人工軟骨材料PVA(ポリビニルアルコール)ゲルの評価試験を行うとともに,歩行時の膝関節部の動的挙動との関連を検討した.1.生体関節における多モード適応潤滑の解明ゲル膜潤滑と滲出潤滑に着目した.ゼラチンゲル摩擦面をゼラチンの低濃度溶液で潤滑した摩擦試験では,ゲル膜が沈着しやすい条件下で最小摩擦状態を実現できることが判明した.また,豚肩関節軟骨の摩擦試験により,ゲル膜潤滑の挙動の変化を観測できた.滲出潤滑作用に対しては,軟骨表面のレーザ顕微鏡による表面画像と形状の時間変化の観測により,部位による自由水の移動の差異を識別できた.PVAゲルにおける滲出挙動の可視化観察により,滲出水による低摩擦の実現を確認できた.2.人工関節における多モード適応潤滑人工膝関節のシミュレータ試験により,従来材料製の円筒型と,解剖学的デザインの大腿部とシリコーンゴム製の脛骨部から構成される人工膝関節では,0.1Pa・s程度の中粘度の潤滑液使用下で,かなりの弾性流体潤滑膜が形成されることを実証した.潤滑液の粘度が低い場合には,多モード適応潤滑機能が必要となるため,滲出効果を検討した.ステンレス鋼製大腿部とPVA製脛骨部から構成される円筒型人工膝関節は,低粘度潤滑液のもとでも極めて低い摩擦状態を実現できた.また,形成的な観点から多モード潤滑を実現する案として,二円弧型膝関節の評価を試みた.3.生体関節と人工関節の臨床評価と潤滑モード表面損傷をきたし潤滑機能も低下した変形性膝関節症患者では,歩行時には接地直後に過大な側方加速度が発生し,足底板により改善できることが実測で判明し,関節機能の臨床的評価の手段としても有用であることがわかった.生体関節と人工関節における多モ-ド適応潤滑機構を解明するために,生体関節モデルの摩擦試験や人工関節の歩行シミュレ-タ試験,人工軟骨材料PVA(ポリビニルアルコ-ル)ゲルの潤滑機能の評価試験を行うとともに,歩行時の膝関節部の動的挙動との関連を検討した.まず,軟質材摩擦面を有する人工関節モデルによるシミュレ-タ試験により,生体関節の潤滑状態の評価を試みた.解剖学的デザインの大腿部と,生体軟骨に近い弾性率を有するシリコ-ンゴム製の脛骨部から構成される人工膝関節に対する歩行模擬実験を行った.その結果,0.1Pa・s程度の中粘度の潤滑液が供給されるならば,弾性流体潤滑効果により摩擦面間の直接接触が防止されることを実証した.しかるに,潤滑液の粘度が低下した場合には,かなりの直接接触が発生することもわかった.そのような過酷な条件下では,多モ-ド適応潤滑機能が必要となる.本年度は,ゲル膜潤滑と滲出潤滑に着目し,関節軟骨モデルを用いた研究を進めた.ゲル膜潤滑における関節液の固体的挙動・ゲル膜形成を調べるために,生体材料であるゼラチンゲルで摩擦面モデルを作成し,ゼラチンの低濃度溶液を潤滑剤として使用し,往復動摩擦試験を行った.その結果,ゲル膜が沈着しやすい条件下で最小摩擦状態を実現できることが判明した.滲出潤滑作用に対しては,PVAゲルにおける滲出挙動をレ-ザ顕微鏡で観察するとともに,各種摩擦材の組合せに対して滑り試験を行い,低粘度条件下でも低摩擦を実現できることがわかった.ステンレス鋼製大腿部とPVA製脛骨部から構成される円筒型人工膝関節では,歩行条件下でも極めて低い摩擦状態を実現できた.

また,表面損傷をきたし潤滑機能も低下した変形性膝関節症患者では,歩行時には接地直後に過大な側方加速度が発生することが実測で判明し,関節機能の臨床的評価の手段としても有用であることがわかった.生体関節と人工関節における多モード適応潤滑機構を解明するために,関節モデルおよび生体関節軟骨の摩擦試験や人工関節の歩行シミュレータ試験,人工軟骨材料PVA(ポリビニルアルコール)ゲルの評価試験を行うとともに,歩行時の膝関節部の動的挙動との関連を検討した。1.生体関節における多モード適応潤滑の解明ゲル膜潤滑と滲出潤滑に着目した.ゼラチンゲル摩擦面をゼラチンの低濃度溶液で潤滑した摩擦試験では,ゲル膜が沈着しやすい条件下で最小摩擦状態を実現できることが判明した.また,豚肩関節軟骨の摩擦試験により,ゲル膜潤滑の挙動の変化を観測できた.滲出潤滑作用に対しては,軟骨表面のレーザ顕微鏡による表面画像と形状の時間変化の観測により,部位による自由水の移動の差異を識別できた.PVAゲルにおける滲出挙動の可視化観察により,滲出水による低摩擦の実現を確認できた.2.人工関節における多モード適応潤滑人工膝関節のシュミレータ試験により,従来材料製の円筒型と,解剖学的デザインの大腿部とシリコーンゴム製の脛骨部から構成される人工膝関節では,0.1Pa・s程度の中粘度の潤滑液使用下で,かなりの弾性流体潤滑膜が形成されることを実証した.潤滑液の粘度が低い場合には,多モード適応潤滑機能が必要となるため,滲出効果を検討した.ステンレス鋼製大腿部とPVA製脛骨部から構成される円筒型人工膝関節は,低粘度潤滑液のもとでも極めて低い摩擦状態を実現できた.また,形状的な観点から多モード潤滑を実現する案として,二円弧型膝関節の評価を試みた.3.生体関節と人工関節の臨床評価と潤滑モード表面損傷をきたし潤滑機能も低下した変形性膝関節症患者では,歩行時には接地直後に過大な側方加速度が発生し,足底板により改善できることが実測で判明し,関節機能の臨床的評価の手段としても有用であることがわかった.
抗腫瘍活性物質のハイスループットスクリーニング法の開発と応用

熱ショックタンパク質(Hsp90)をN-およびC-末端を介してアミノプロピルシリカに固定化したカラムを調製した。これらのカラムを組合わせ、天然物中より微量の抗腫瘍活性物質のハイスループットスクリーニングへの適用を試みたところ、cepharanthine,isotetrandrine,berbamine,cycleanine, quercetin,wogonin,chrysin,rutinがHsp90阻害剤である可能性が示唆され、glycyrrhizin,baicalin,baicalein,ginsenoside,curcuminはHsp90阻害剤ではないことが推測された。本研究の目的は、標的タンパク質(レセプター、酵素など)を固定化したアフィニティー基材を調製し、アフィニティー基材と高分離能カラムを組み合わせ、化合物ライブラリー、漢方薬などの植物由来の天然物、かびなどの生物由来の天然物中より微量の抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングし質量分析法を用いることにより、オンラインで微量の抗腫瘍活性物質の構造情報を得ることである。熱ショックタンパク質(Hsp90)をN-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化する方法として、アミノプロピルシリカゲルをグルタルアルデヒドで活性化し、Hsp90を含む溶液と振とうし、N-末端を介して固定化した。一方、Hsp90をC-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化する方法としてHsp90を0.1 Mリン酸塩緩衝液(pH 7.0)中で、1-ethyl-3-(3-methylaminopropyl)carbodiimideおよびN-hydroxysulfosuccinimideと反応後、アミノプロピルシリカゲルと室温で24時間反応させることにより、C-末端を介してアミノプロピルシリカゲルに固定化した。得られたそれぞれのHsp90固定化アミノプロピルシリカゲルを内径5 mm、長さ50 mmのガラスカラムに充填し、Hsp90 (+)カラムを作成した。また、ヒドロキシルアミンを用いて、Hsp90 (-)カラムも同様に調製した。しかし、今回は、マーカー物質としてノボビオシンあるいはゲルダナマイシンを用いたHsp90 (+)およびHsp90 (-)カラムによる天然物中の抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングする分析法の確立、活性の評価、結合能の評価および非特異的結合の評価には至っていない。本研究の目的は、標的タンパク質(レセプター、酵素など)を固定化したアフィニティー基材を調製し、アフィニティー基材と高分離能カラムを組み合わせることにより、化合物ライブラリー、漢方薬などの植物由来の天然物および生物由来の天然物中より微量の抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングし質量分析法を用いることにより、オンラインで微量の抗腫瘍活性物質の構造情報を得ることである。熱ショックタンパク質(Hsp90)をN-末端を介してアミノプロピルシリル化(APS)シリカゲルに固定化する方法として、APSシリカゲルをピリジン緩衝液(pH 6.0)中、グルタルアルデヒドで活性化し、Hsp90を含む溶液と振盪し、N-末端を介して固定化した。一方、Hsp90をC-末端を介してAPSシリカゲルに固定化する方法として、Hsp90を10 mMリン酸塩緩衝液(pH 5.5)中で、1-ethyl-3-(3-methylaminopropyl)carbodiimideおよびN-hydroxysulfosuccinimideと反応後、APSシリカゲルと4°Cで24時間反応させることにより、C-末端を介してAPSシリカゲルに固定化した。得られたそれぞれのHsp90固定化APSシリカゲルを内径2 mm、長さ50 mmのカラムに充填し、Hsp90 (+)カラムを作成した。また、ヒドロキシルアミンを用いて、Hsp90(-)カラムも同様に調製した。Hsp90カラムとコントロールカラムから溶出した成分を、さらに高性能分離を行い得られたクロマトグラムの差クロマトグラムから、抗腫瘍活性物質を探索する。グリチルリチン酸、シコニン、マグノロールなど標準生薬を用いて、Hsp90阻害剤のスクリーニングに適用した。今後、更にいくつかの標準生薬でシステム化を行い、実際に種々の微量の活性物質の探索研究に適用する。調製したHsp90-NT,Hsp90-CTおよびControl-NT充填剤をそれぞれガラス製カラム(50 ×2.0 mm I.D.)に充填し,移動相に10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)を用いてフロンタル・アフィニティー・クロマトグラフィーによりビスコクラウリン型アルカロイドの解離定数(Kd)を評価した.また,Hsp90-NTおよびControl-NTカラムにおけるビスコクラウリン型アルカロイドの保持時間(tR)および保持係数(k)も併せて測定した.Quercetin,chrysin,rutin,glycyrrhizin,curcumin,wogonin,baicalin,baicaleinおよびginsenosideの生薬成分のtRをHsp90-NTおよびControl-NTカラムを用いて測定した.横軸にControl-NTカラムでのtRを,縦軸にHsp90-NTカラムでのtRをプロットしたところ,直線が傾き1の直線であり,この直線よりも左上に位置する生薬成分が,Control-NTよりもHsp90-NTで保持が大きく,Hsp90阻害剤である可能性を示唆している.

その結果,ビスコクラウリン型アルカロイドであるcepharanthine,isotetrandrine,berbamine,cycleanineと生薬成分であるquercetin,wogonin,chrysin,rutinが,傾き1の直線よりも左上に位置しており,これらはHsp90阻害剤である可能性が示唆された.また,glycyrrhizin,baicalin,baicalein,ginsenoside,curcuminは,傾き1の直線上あるいは右下に位置しているため,Hsp90阻害剤ではないと推測された.熱ショックタンパク質(Hsp90)をN-およびC-末端を介してアミノプロピルシリカに固定化したカラムを調製した。これらのカラムを組合わせ、天然物中より微量の抗腫瘍活性物質のハイスループットスクリーニングへの適用を試みたところ、cepharanthine,isotetrandrine,berbamine,cycleanine, quercetin,wogonin,chrysin,rutinがHsp90阻害剤である可能性が示唆され、glycyrrhizin,baicalin,baicalein,ginsenoside,curcuminはHsp90阻害剤ではないことが推測された。Hsp90をN-末端あるいはC-末端を介してAPSシリカゲルに固定化したHsp90(+)およびHsp90(-)カラムを調製することが可能となった。得られたHsp90を固定化したアフィニティー基材を、フロンタルクロマトグラフィーシステムにより評価するが、実際にアフィニティー基材と高分離能カラムとしての逆相系粒子充填型カラムの組み合わせの検討ができていない。そこで今回、標的タンパク質を固定化したアフィニティー基材を用い、高分離能カラムとの組み合わせを検討していたため、遅れの原因になった。分析化学Hsp90を固定化したアフィニティー基材と高分離能カラムの組み合わせを用い、化合物ライブラリーならびに植物由来の天然物、生物由来の天然物の抽出液中の抗腫瘍活性物質のハイスループットスクリーニングを行う。Hsp90(+)およびHsp90(-)カラムおよび逆相系充填カラムを連結した系に、化合物ライブラリーあるいは生薬の抽出液を負荷する。Hsp90(+)カラムにアフィニティーを持つ成分はトラップされるため、Hsp90 (+)およびHsp90(-)カラムを用いて得られたクロマトグラムを比較することにより、抗腫瘍活性物質をハイスループットスクリーニングすることが可能になる。さらに検出法として質量分析法を用いることにより、未分離の微量の抗腫瘍活性物質の探索も可能となる。また、天然物中に大量に存在する化合物の妨害は、それらに対する分子インプリントポリマーを調製することにより、除去することも検討する。固定化に用いるHsp90は高価な化合物のため、固定化の方法をしっかり確立する必要があった。そこで、Hsp90のかわりにcellobiohydrolaseを用いてプレテストを行った関係でカラムの調製が遅れた。アミノプロピルシリカゲルと同様に、キャピラリー内壁にHsp90を固定化し、Hsp90 (+)キャピラリーカラムを作成する。Hsp90 (-)キャピラリーカラムも同様に作成する。得られたHsp90を固定化したアフィニティー基材を、フロンタルクロマトグラフィーシステムにより評価する。