hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超臨界法によるナノ粒子ポリマー創成

このことから、表面修飾剤のカルボキシ基が酸化セリウム酸化セリウムナノ粒子の表面と結合し、アミノ基を表面に表出することで、ナノ粒子ポリマーの合成を実現する粒子が生成したと結論づける。超臨界水熱反応により合成した酸化セリウムナノ粒子をシリコン基板上に堆積させる際に、基板にナノ粒子との親和性を有する官能基を付与することで、ナノ粒子の単層膜を形成することに成功した。また、多層積層した構造も、溶媒中アニールなど高分子薄膜を作成する際の手法を用いることで、より規則配列した構造が形成されることが明らかとなった。研究計画に挙げた項目を全て実施するとともに、さらに数学研究者と連携することで、複合化構造の解析手法に新しい道筋をつけることに成功したため。今後は、本年度の成果をもとに、様々な官能基を表に出したナノ粒子を合成するとともに、その重合化に挑戦する。27年度が最終年度であるため、記入しない。化学工学昨年度までの研究をさらに進める。マイクロリアクターシステムと流動場シミュレーションを総合的に解析することで、反応場での反応、中間体生成、ミセル形成について反応機構を解明する。またその結果を速度論的に記述することで最適な反応条件の設計する反応工学基盤を構築する。ナノ粒子表面の有機分子の結合状態、結合分子密度、とナノ粒子形状(露出面)についても、実験と計算科学とを比較検討し、最終的には分子様ナノ粒子の設計基盤を確立する。
高解像度地形情報を用いた全球気候モデル出力データの高精度化

本研究では、超高解像度全球気候モデル(AGCM20)の地形データ及び現在気候再現出力を用いて,地形データの解像度が気候モデル出力に及ぼす影響を降雨量・河川流出量の視点を通して定量的に評価した.地形解像度による地形特性の反映度合を用いて,温暖化による洪水・渇水のリスク評価へのAGCM20出力の適用性を複雑な地形特性を持つ小さなスケールの流域に対しても広げる手法を模索した.本研究では、超高解像度全球気候モデル(AGCM20)の地形データ及び現在気候再現出力を用いて,地形データの解像度が気候モデル出力に及ぼす影響を降雨量・河川流出量の視点を通して定量的に評価した.地形解像度による地形特性の反映度合を用いて,温暖化による洪水・渇水のリスク評価へのAGCM20出力の適用性を複雑な地形特性を持つ小さなスケールの流域に対しても広げる手法を模索した.地球温暖化による河川流況変動に関する研究の最大の問題点は,気候モデルの詩空間スケールが河川流況変動の影響評価に用いる水文流出モデルのスケールに及ばない点である.今までは,この問題を解消するために様々な統計的及び物理的ダウンスケーリング手法が研究・利用されたが,気候モデルの将来気候出力に対するダウンスケーリング結果はそのいずれも安定的な結果を提供する事ができなかった.本研究は,文部科学省21世紀気候変動予測革新プログラムで開発されている超高解像度全球大気モデル(AGCM20)の20kmグリッドの出力に対して,より高解像度の地形特性をさらに反映することにより,安定的な地球温暖化による河川流況変動予測及び洪水・渇水のリスク評価が可能になる基本土台を提供することである.H21年度は,AGCM20の降水データの特性およびそのデータの河川流況変動予測への適用可能性について検討した.現在気候実験出力を用いて河川流況の再現性を評価したところ,数千km2以上の流域スケールに関してはAGCM20のデータそのままで適用可能であることが確認できたが,より小さな流域には安定的な解析が困難であることが明かになった.さらに,AGCM20の降水データはAMeDAS観測雨量データと比べて,降雨の地形依存性が低いことが確認できた.現在は,AGCM20の降水データが持っているこれらの特性を考慮して,空間スケールが気候モデル出力に及ぼす影響を定量化することを進めている.地形解像度による豪雨発生頻度・降水の空間分布特性・標高による温度変化等の現象がどの程度異なるかを定量化して,AGCM20出力値の地形特性反映度合を向上する手法を開発する予定である.本研究では、文部科学省21世紀気候変動予測革新プログラムで開発されている超高解像度全球大気モデル(AGCM20)の現在気候再現出力を用いて,地形データの解像度が気候モデル出力に及ぼす影響を降雨量・河川流出量の視点を通して定量的に評価した.その上で,AGCM20出力を用いた温暖化による洪水・渇水のリスク評価への適用性を複雑な地形特性を持つ日本の流域に対して高い精度で行った.H22年度は,今まで確認できたAGCM20の降水データの地形依存性の特性を念頭に置いて将来の降水パターンの変化及び河川流況変動予測を実施した.まず,降水量データを用い日本全国における降水パターンの変化を調べたところ,将来日本の降水量の増減は地域によって異なる特性を持っていることが明らかになった.しかし,降水量が増加する地域でも蒸発量の増加により利用可能な水資源が減少することが分かった.より詳細な水資源の変化を把握するために,分布型水文モデルを用いて東京の重要な水源である利根川流域の将来の流況変化およびそれに対するダム群の操作による水資源への影響評価を行った.分布型水文モデルでは,斜面流出モデルと河道モデルを中心として,対象流域の水資源利用状態及びそれに対する七つのダム群の操作による影響も考慮されている.AGCM20からの現在(19792003),近未来(20152039),将来(20752099),各25年間の降水と蒸発散データを入力し,利根川流域を対象に流出計算を行った.利根川流域におけるダム群の操作を考慮した河川流況変動予測の結果からは,現在のダム操作ルールを続けた場合,将来の水資源(特に初夏の利根大堰における河川流量)が現在の河川流量と比べて減少する可能性が高くなることが分かった.それを防ぐためには,現在のダム操作ルールを将来の河川流況変動に合わせて改良する必要があると思われる.今後の課題としては,河川流況変動予測における不確実性の定量化及び低減のために,様々なGCM出力を用いたアンサンブル解析が必要となる.
ソフトウェア分散開発における協調作業モデルとその支援環境

平成7年度の研究により以下のような成果を得た。1,プロトコル解析(予備実験)空間(対面/遠隔),メディア(音/テキスト),時間(同期/非同期)をパラメータとして,ソフトウェア仕様書の共同作成の実験をネットワークを介して実施した。この結果,コミュニケーションの複雑さ(例えば,一度に相手に投げかける話題の量)が,作業の効率,品質に悪影響を与えることが判明した(発表文献1,2)。2,プロトコル解析(本実験)コミュニケーションの複雑さを,「会話の長さ」,「一つのメールに含まれる話題数」,「発話に混在する話題数」の諸量で特徴づけ,また,作業の品質を,「完全な会話数」,「不完全な会話数」で特徴づけて,ソフトウェア仕様書のレビュー実験をネットワークを介して実施した。この結果,非同期の作業環境では,一回の発話か大きく,一度に様々な話題が投げかけられる傾向にあり,それが作業の完逐度に悪影響を与えることをF検定を用いて定量的に評価した(投稿準備中)。3,作用阻害要因検出モデルと分散作業モデルの提案分析結果(1)(2)に基づき,ネットワークを介した協調作業におけるモデルを,情報共有モデル(分散ワークスペースと自律メディエータ),コミュニケーション支援モデル(グループウェアベース)の2点にわたって提案した(発表文献3,4)。4,プロトタイプ開発とその評価実験上記モデルにもとづく,非同期のコミュニケーションの円滑化ツールと共有情報の変更管理ツールを開発した。以上の研究成果により,当初の研究目的,計画をほぼ完全に達成する成果を得た。
看護師の「働きがい」尺度の開発

2018年8月1日2018年10月5日に,東京都内の300床以上の機能評価認定病院に勤務する看護師1,987名に対し自記式質問紙調査を実施した。郵送法にて回収した。調査項目は看護師の働きがいに関する100項目と個人属性で,働きがいに関する100項目は,事前の看護師を対象としたインタビュー調査結果及び先行研究を参考に作成した。本研究は研究者の所属機関の倫理審査委員会の承認を得て実施した(承認番号KWU-IRBA #16106)。調査用紙を配布後郵送法にて747部回収し(回収率37.7%),無回答項目の多かった調査用紙を除き727部を分析対象とした(有効回答率97.5%)。対象者は男性8%,女性91%,無回答1%で,最年少20歳,最年長65歳,平均年齢:37.3歳であった。100項目のうち天井効果のあった6項目を削除し,最尤法で因子分析を実施した。共通性の因子抽出後が.16以下の15項目を削除し,プロマックス回転を行った。スクリープロットの結果より、因子数を4因子に固定し因子分析を行った。因子負荷量では0.40未満の項目を削除し,項目尺度得点相関(I-T相関)で相関係数.20以下を削除し,4因子28項目となった。28項目の信頼係数はCronbach's α:.92で,第1因子『仕事から得られる達成感(α:.90)』,第2因子『労働環境に対する満足感(α:.85)』,第3因子『対人関係の良さ(α:.87)』,第4因子『ストレス要因(α:.71)』であった。看護師の働きがい尺度に対し因子分析で抽出された4つの因子を下位尺度として採用した場合の信頼性を確認するために,クローンバックのa係数を求めた。その結果,第4因子を除いて,いず4も.80を上回り,第4因子についても.71であることから,尺度としての十分な信頼性が確認できた。本研究では,看護師の「働きがい」の構成要素を明らかにし,「働きがい」尺度を開発することを目的としている.平成28年度は,看護学,心理学,経済学,社会学等の領域の「働きがい」「職務満足」「motivation」に関する,理論的,研究的文献を検討し,看護師の「働きがい」の構成概念の枠組みについて検討しているところである.さらに,ハーズバーグの二要因理論の16項目を基にインタビューガイドを作成し,インタビュー調査の準備を行った.インタビュー調査及びアンケート調査に係る倫理申請に時間を要し,調査開始時期が当初計画よりも遅れてしまった.加えて,インタビュー調査の協力依頼に病院に説明に行ったこと,協力施設で倫理審査を行う必要が生じたことから,看護師へのインタビュー協力を得ることに時間を要した.さらに,インタビュー協力者が予定数得られず,協力者との時間調整等にも時間を要し,インタビュー調査の進捗に遅れが生じている状況である.卒後5年目から30年目までの看護師17名に「働きがい」に関するインタビュー調査を実施した。看護師の属性は、急性期病院のクリニカルケア病棟勤務、看護部教育担当師長、訪問看護師、外来看護師、救急外来勤務、認定看護師など様々であった。看護師の働きがいの要因として抽出されたのは、「患者からのポジティブな反応」「患者と接する楽しさ」「スタッフの人間関係」「インシデント発生後の対応」「教育システムの充実」「後輩育成」「給与の良さ」「休日が自由に取りやすい」「ワークライフバランスが取れている」「上司からのサポート」「キャリアを追求できる」「専門知識を生かせる」「任せてもらえる仕事が増えてきたこと」「魅力ある仕事だと実感できるから」などであった。これらの調査結果をもとに、質問紙を作成し、調査依頼を行っているところである。プールしたアイテムおよび、ハーズバーグの二要因理論による満足/不満足の要因である16項目から看護師の「働きがい」尺度の質問項目原案を作成し、看護管理学を専門とする大学教員に専門的見地から質問項目の内容や表現の適切さに関する意見をもらい修正を行った。看護師経験者8名に対し、質問項目原案票を用いて自記式質問紙留置き法によるプレテストを行い、質問項目の多さや適切さ回答時間等についての意見をもらい修正を行った。修正した調査用紙を用いて質問紙調査を実施すべく、300床以上の病院に調査依頼をしているところである。郵送法にて回収した。

100項目のうち天井効果のあった6項目を削除し,最尤法で因子分析を実施した。共通性の因子抽出後が.16以下の15項目を削除し,プロマックス回転を行った。スクリープロットの結果より、因子数を4因子に固定し因子分析を行った。因子負荷量では0.40未満の項目を削除し,項目尺度得点相関(I-T相関)で相関係数.20以下を削除し,4因子28項目となった。28項目の信頼係数はCronbach's α:.92で,第1因子『仕事から得られる達成感(α:.90)』,第2因子『労働環境に対する満足感(α:.85)』,第3因子『対人関係の良さ(α:.87)』,第4因子『ストレス要因(α:.71)』であった。看護師の働きがい尺度に対し因子分析で抽出された4つの因子を下位尺度として採用した場合の信頼性を確認するために,クローンバックのa係数を求めた。その結果,第4因子を除いて,いず4も.80を上回り,第4因子についても.71であることから,尺度としての十分な信頼性が確認できた。インタビュー調査から,看護師の「働きがい」に関する内容を多面的に抽出し,質問項目のアイテムをプールする.プールしたアイテムから看護師の「働きがい」尺度の質問項目原案を作成し,専門的見地から質問項目の内容や表現の適切さに関する意見をもらい修正を行う.看護師経験者に質問項目原案票を用いて自記式質問紙留置き法による調査を行い,質問項目の多さや適切さ,回答時間等についての意見をもらい,修正を行う.修正した看護師の「働きがい」尺度の原案を用いて,200床300床の病院で看護師300人を対象にプレテストを実施する.プレテストの結果から,質問項目の分布を確認し,項目内容の選定を行う.項目内容の選定後,下位尺度の作成をする.プレテストの結果から作成された,看護師の「働きがい」尺度を用いて,全国の特定機能病院および,300床以上の機能評価認定病院の看護師2,500名を対象に本調査を実施する.アンケート調査の結果から,看護師の「働きがい」尺度の信頼性・妥当性の検証および,共分散構造分析による因子間の相関の検証を行う.看護師の「働きがい」尺度を完成させる.修正した看護師の「働きがい」尺度の原案を用いて、東京都内の300床以上の病院で看護師300人を対象にプレテストを実施する。プレテストの結果から、質問項目の分布を確認し項目内容の選定を行う。項目内容の選定後因子分析を行い下位尺度の作成をする。下位尺度の信頼性係数(Cronbachのα係数)の算出を行う。妥当性係数(構成概念妥当性)の算出および妥当性係数の最大化を行う。看護師の「働きがい」尺度を完成させる。インタビュー調査が計画通りに進まず、インタビューにかかる経費が当初予定よりも少なかったため。インタビュー調査の協力者確保に時間を要し、計画通りに進捗しなかった。インタビュー調査後に質的分析を行い、質問項目を検討したため、質問紙の印刷が計画していた時期よりも遅れ、年度末に掛かり印刷業者への発注が次年度に繰り越すことになったため。今年度は早めに取り掛かり予算執行を行う。次年度に予定人数のインタビュー調査を実施し、計画通りに使用する
アレルギー発症に関わるサイトカイン受容体活性化機構の解明

アレルギー疾患に関わるサイトカインであるヒトインターロイキン13(IL-13)とその受容体であるヒトIL-13受容体・鎖1(IL-13R・1)およびヒトIL-4受容体・鎖(IL-4R・)との活性状態における相互作用様式を明らかにするために、電気泳動、ゲル濾過および表面プラズモン共鳴測定法による相互作用解析を実施した。その結果、IL-13とIL-13R・1およびIL-4R・(いずれも細胞外領域)は1:1:1で結合していることを、その結合力と共に確認した。インターロイキン13(IL-13)は種々のアレルギー疾患、特に気道過敏性充進や粘液産生といった気管支喘息の病態形成に重要な役割を果たしているサイトカインであることから、1:L-13やその受容体は創薬の標的として注目されている。本申請研究は、リガンドであるヒトIL-13とその受容体であるヒトIL-13Rα1(細胞外領域)およびヒトIL-4Rα(細胞外領域)との活性状態における相互作用様式を決定すると共に、活性状態のリガンドー受容体複合体の立体構造を明らかにし、研究協力者の有する生化学的知見を統合して、ヒトI平成19年度前半はIL-13、IL-13Rα1及びIL-4Rαの大量調製を実施し、IL-13とIL-4Rαは約10mg、IL-13Rα1は約30mgの試料を取得した。平成19年度後半は各試料を用いてNative-PAGE、ゲルろ過および表面プラズモン共鳴測定法による相互作用解析により、IL-13とIL-13Rα1およびIL-4Rαがいかなる活性化複合体を形成しているかをその結合力と共に確認した。その結果、結合比はおそらく1:1:1で、IL-13Rαの存在下でIL-13のIL-13Rα1及への親和性が増大す平成19年度の研究成果は、研究発表欄に記載のとおり1件学会発表済みで、雑誌論文についても1件受理済みで現在印刷中である種々のアレルギー疾患、特に気道過敏性亢進や粘液産生といった気管支喘息の病態形成に重要な役割を果たしているサイトカインであるヒト・インターロイキン13(IL-13)とその受容体であるヒト・IL-13Rα1(細胞外領域)およびヒト・IL-4Rα(細胞外領域)との活性状態における相互作用様式を決定すると共に、活性状態のリガンドー受容体複合体の立体構造を明らかにし、連携研究者の有する生化学的知見を統合して、ヒトIL-13受容体の活性化機構を原子レベルで解明することが目的である。前年度は、IL-13、IL-13Rα1及びIL-4Rαの大量調製と相互作用解析を実施し、IL-13とIL-13Rα1およびIL-4Rαが1:1:1の結合比で活性化複合体を形成していることをその結合力と共に確認した(この結果は今年度に11に記載の雑誌論文として発表)。平成20年度前半は、IL-13/IL-13Rα1相互作用を高分解能立体構造から明らかにすることを目指して、ヒトIL-13/ヒトIL-13Rα1(1:1)複合体の調製・結晶化・構造解析を抗体との複合体化の手法を用いて試みた。連携研究者らが保有するIL-13Rα1に対するマウス抗体を消化酵素パパインを用いてFab断片化した後に、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製後のFabとIL-13およびIL-13Rα1との結合をゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した結果、IL-13Rα1との結合は確認できたが、IL-13/IL-13Rα1/Fab複合体の形成を確認するには至らなかった。平成20年度後半は、前年度に決定されたIL-13/IL-13Rα1/IL-4Rα(1:1:1)複合体構造に基づき、連携研究者のグループと共同でIL-13によるシグナル伝達におけるIL-13Rα1のD1ドメインの役割をより詳細に理解するために、変異体を用いて構造と機能の相関を確認した。種々のD1ドメイン変異体を作製し、リガンドに対する結合および生物活性を確認した結果、D1ドメイン中のVal35, Lue38, Val42に対するAla変異体は、変異導入箇所がIL-13への結合部位に存在していないにもかかわらず、結合および生物活性が顕著に減少していた。この結果は、これらの疎水性残基がIL-13Rα1の立体構造形成に必須であることと考えられた。一方、Lys76,Lys77, IIe78に対するAla変異体で確認された活性の減少は、IL-13とIL-13Rα1間の結合が直接的に失われたことに起因することが、立体構造から確認された。この結果は、連携研究者のグループおよびリガンド/受容体(1:1:1)複合体構造を決定したStanford大学のGarcia教授との共著論文として、現在投稿中である。
永続投与のいらない「夢の 21 世紀型免疫抑制剤」創製への挑戦

臓器移植において免疫抑制剤は必須であるが現行薬には永続投与の必要性や副作用の問題がある。本研究にて研究代表者は寛容肝移植モデルにおいて誘導される免疫抑制抗体(anti-H1抗体)の作用機序解明とin vivo薬理作用の実証を試みた。その結果、本抗体が直接T細胞に作用して免疫抑制作用を示すこと、また、その作用が制御性T細胞依存性および非依存性の機序にて発揮されることを発見した。更に研究代表者は、本抗体がラット心移植モデルのグラフト生着を延長させることも示した。臓器移植において免疫抑制剤の投与は必須であるが、現行薬剤には永続投与の必要性と副作用の問題がある。研究代表者はラット肝移植モデルに見られる免疫抑制剤なしに臓器が自然生着する現象の分子基盤を解明し、術後の同ラット血中に新規の免疫抑制抗体が誘導されていることを発見した。本研究では、この生体に備わっている拒絶反応回避の仕組みに学び、これを次世代型免疫抑制剤の創製へとつなげるべく、同免疫抑制抗体の薬理作用機序解明ならびに創薬応用展開に資する知見を得ることを目的としている。昨年度は、免疫抑制抗体(anti-H1抗体)の薬理作用を規定する標的細胞の同定に成功し、本抗体がconventional T細胞(Tcon)に作用すること、また、本抗体がその作用濃度に応じて制御性T細胞(Treg)依存性ならびに非依存性の二相性のメカニズムを介して免疫抑制作用を発揮していることをつきとめた。本年度ではこのうちTreg依存性の免疫抑制シグナル伝達経路につき更に詳細な作用機序の解明を試みた。その結果、anti-H1抗体はTconを介してTregの免疫抑制機能を増強させていること、その際にTregの細胞数増加は認められないこと、また、当該Tregの機能亢進発揮には本抗体によるTconへの共刺激に加えてT細胞抗原受容体架橋シグナルも必要であることが判明した。更に、anti-H1抗体の臨床展開への一環として肝移植患者における本抗体価の動態追跡を行ったところ、ラットの自然生着肝移植モデルにおいて見られる本抗体の誘導様式と同様の表現型を示す症例が認められた。また、術後長期を経過した患者においては本抗体価が有意に上昇している症例、あるいは逆に術前より抗体価が低下している症例、の2つのパターンに大別できることが明らかとなった。研究代表者はラットの肝移植モデルに見られる免疫抑制剤なしに臓器が自然生着する現象の免疫学的メカニズムを解明し、術後の同ラット血中に新規の免疫抑制抗体が誘導されていることを発見した。本研究では、この生体に元来備わっている拒絶反応回避の仕組みを応用し、一度きりの投与で安全かつ効果的な臓器移植を実現させる「夢の21世紀型免疫抑制剤」の創製に挑戦すべく、本免疫抑制抗体の薬効試験と作用機序の解明を行うことを目的としている。本年度はまず、研究代表者が作製した拒絶反応抑制抗体(anti-H1抗体)の薬理作用を規定する標的細胞の検索を試みた。本抗体がT細胞に作用して免疫抑制作用を発揮しうるとの先行知見に鑑み、その活性化T細胞に対する効果を検証した。その結果、本抗体はアロ混合リンパ球反応ならびにT細胞抗原受容体(TCR)架橋刺激に伴うT細胞の活性化を著明に抑制することがわかった。興味深いことにanti-H1抗体によるT細胞活性化抑制機序にはその抗体濃度により二相性が観察され、sub-optimal doseにおける抑制作用の発揮には制御性T細胞(Treg)が必要であること、一方、high doseにおいては本抗体がconventional T細胞(Tcon)に直接作用してTCRシグナル伝達経路を負に調節していることが示唆された。また前者のTreg依存的な免疫抑制作用の発揮にもTconの存在が必要であることがわかり、本抗体の薬理作用を担う主要な標的細胞がTconであることが明らかとなった。更に、anti-H1抗体のin vivo薬理試験の一環としてラット心移植モデルへの投与試験を実施した結果、有意なグラフトの生着延長効果を認めた。本年度では、anti-H1抗体の免疫抑制作用機序解明への足がかりとして、そのT細胞に対する制御性活性の発現を担うプライマリーターゲットがTconにあることをつきとめ、本抗体の標的抗原を同定する上で必須な細胞ソースを絞り込むことができた。更に予想外にも、本抗体のT細胞活性化抑制機序にTreg依存性および非依存性からなる二相性のメカニズムがあることも判明し、本研究の着手時には想定し得なかった創薬シーズを新たに発見できる可能性も広がってきた。また、anti-H1抗体のin vivo免疫抑制活性の検証においても概ね想定した成果を上げることができた。以上、本年度においては当初目的通りの達成度を得ることができていると考えている。本年度にて明らかとなった免疫抑制抗体の標的T細胞サブセット(Tcon)から、その免疫抑制シグナルの起点となる標的抗原を同定する。

アプローチとしては初代Tconをソースとした細胞表面抗原のプロテオーム解析のほか、本抗体と高反応性を示すT細胞株を用いた同様の解析からも平行して抗原の同定作業を進める。目的の責任抗原であるか否かの検証には、Tconにおける同分子のノックダウンに伴うanti-H1抗体の免疫抑制活性の減退、あるいは過剰発現による当該活性の亢進を指標として用いる。更に標的抗原からTCRシグナルの阻害につながる新規の免疫抑制シグナル伝達経路があるのか、また、同抗原架橋シグナルがいかにしてTreg依存的な免疫抑制活性をも調節しうるのか、その分子機構の解明にチャレンジする。更にanti-H1抗体のin vivo薬理活性を引き続き検証すべく、これをラット同所性肝移植モデルに投与してドナー肝の生着延長が認められるか否かを確かめるとともに、その延長効果が免疫抑制剤を必要としない寛容肝移植モデルに見られるそれと匹敵しうるのか否かを比較解析する。次年度の研究費としては物品費(1,100,000円)および旅費(200,000円)を計上しており、前者は本研究実施に係る消耗品費として、後者は国内における情報収集旅費として使用する計画である。なお、本年度研究費には東日本大震災の影響による研究打ち合わせ出張の取りやめに伴う残額(99,705円)が生じており、同経費は次年度の研究打ち合わせ用国内旅費として使用する計画である。
ダイオキシンによる自己免疫疾患感受性規定因子の解析

自己免疫疾患は近年増加傾向にあり、環境化学物質への曝露の素因がある先進工業国で自己免疫疾患の有病率が高いことから、環境化学物質がその原因の一つとして指摘されている。自己免疫疾患には、Treg(自己免疫を抑制)やTh17(自己免疫を誘導)が中心的な役割を果たしており、各T細胞間の恒常性の破綻が自己免疫疾患の原因であると考えられている。最近、ダイオキシン受容体(AhR)がTregとTh17の分化のレギュレーターであることが示されたが、未だ自己免疫疾患発症の個人差を説明する因子の特定には至っておらず、疾患発症機構についてはほとんど分かっていない。そこで本研究では、ダイオキシン類による免疫系への機構的関与及び自己免疫疾患の感受性規定因子の解明を目的とし、世界で唯一の、多様な自己免疫疾患を発症し、環境化学物質に対する多様な感受性差が認められるモデルマウス(MRL/1pr・C3H/1pr・MXH/1pr系統)を対象に、TCDD曝露に対するTh17/Treg分化能の系統差を比較検証した。実験系の確立後、まずTCDD曝露後のTh17/Treg分化バランスを検証した所、TCDDの推定される現実的な曝露濃度範囲において、自己免疫現象-特に血管炎を発症するMRL/1pr,MXH6/1prおよびMXH53/1prマウスでは、Th17/Treg分化バランスが崩れ上昇傾向を示すのに対し、発症しないC3H/1prおよびMXH54/1prマウスでは分化バランスが保持されることが初めて判明した。このことは、自己免疫疾患を発症し易い遺伝的背景をもつ個体では、環境因子によりさらにその発症度や重症度が悪化することを示唆している。さらに、自己免疫疾患の感受性規定因子の解明を最終目標に、近交系マウスの系統数を増やし、ダイオキシン暴露後のTregの誘導が、自己免疫現象の発現もしくはダイオキシンに対する感受性のいずれに依存しているのかを追求した所、必ずしも前者に依存するのではなく、後者に依存することが初めて明らかとなった。
培養肝細胞を用いた広範肝切除後の残存肝細胞障害の研究

教室では、in vivoの実験にて肝広範切除後には末梢血及び門脈血中のTxB_2、6-KF濃度が上昇し、肝不全発生例ではさらに上昇して高値を示すことを報告してきた。さらに肝広範切除後の残存肝より分離したKupffer細胞、肝実質細胞及びこれらの細胞のco-cultureを用いた実験にて、TxA_2アナログの肝細胞細胞障害作用、PGI_2アナログの直接及び間接の肝実質細胞保護作用、並びにTxA_2合成阻害剤のKupffer細胞よりのTxA_2産制の抑制を介した間接的肝実質細胞保護作用を報告してきた。本年度の実験は、肝広範切除後の門脈血中のTxB_2濃度の上昇に着目し、肝広範切除後の肝細胞障害発生における脾臓、特に脾マクロファージの関与について検討した。【方法】(実験I)70%及び80%肝切除を行い、これに脾摘を併施した実験群を作成し、門脈血中、脾静脈中及び腸間膜静脈中のTxB_2及び6-KF濃度を測定。肝切除後24時間後に肝実質細胞を分離し、viability、bleb形成率を測定(実験II)肝切除後24時間目に脾摘(-)の各実験群より脾臓を摘出し、脾マクロファージを分離培養し、培養液中TxB_2及び6-KF濃度を測定。【結果】(実験I)80%肝切除では80%肝切除では70%肝切除に比し、門脈血中TxB_2及び6-KF濃度が有意に上昇し、特に脾静脈血中の濃度上昇が著名であった。脾摘を併施した群ではTxB_2濃度の上昇が有意に抑制された。80%肝切除では肝実質細胞のviabilityの低下やbleb形成率の上昇が著名であったが、脾摘群ではこの変化が有意に抑制された。(実験II)80%肝切除後の脾マクロファージのTxA_2産生には有意に亢進しており、これに対してTxA_2合成阻害剤やPGI_2アナログの添加はTxA_2産生を有意に抑制した。以上の結果より、肝広範切除後にはKupffer細胞のみならず、脾マクロファージのTxA_2産生も亢進しており、肝実質細胞障害の発生に脾臓が関与していることが示唆され、また、TxA_2阻害剤やPGI_2には脾マクロファージに対してもTxA_2産生を抑制作用のあることが認められた。現在、同様の方法を用いて肝広範切除後の残存肝障害の発生に於ける腸管の関与や、閉塞性黄疸下の肝細胞障害につきて研究を進めている。

広範肝切除切除後には血中TxB2や6-KFが高値を示し、肝不全発生例では術後24時間目より再上昇をきたすこと、また、PGI2アナグロやTxA2合成阻害剤の投与は、術後の肝不全の発生を抑制することを報告してきた。今回、培養細胞を用いchemical mediatorと肝切除後の肝障害との関係につき検討した。【実験I】犬を用いOP-2507(OP:PGI2アナログ),OKY-046(OKY:TxA2合成阻害剤)を前投与した後、84%肝切除を行い24時間後に肝実質細胞を分離し、細胞生存率、培養液中LDH、bleb形成率、ミトコンドリア機能、細胞内Ca^<++>及びcAMP、培養液中過酸化脂質、組織学的所見を検索。〈結果-1〉非投与では肝細胞膜やミトコンドリア機能は正常肝に比し有意に障害されたが、OP並びOKY前投与ではこれらが良好に維持され、特にOPでその効果が著明であった。【実験II】84%肝切除施行後6時間目に肝実質細胞を分離し、OP,OKY及びSTA2(ST:TxA2アナログ)を添加し各薬剤の肝細胞に対する直接効果を検討。〈結果-2〉ST添加群では肝細胞膜やミトコンドリア機能の障害が著明、OP添加群では良好に維持され、肝細胞に対する直接保護作用が示唆された。一方、OKY添加群ではこのような作用はなく、肝実質細胞と肝非実質細胞との相互作用が示唆された。【実験III】84%肝切除後6時間目に肝細胞とKupffer細胞を分離し、さらにこれらの細胞のCo-Cultureを行い、OP及びOKYを添加して各薬剤の効果を検討。〈結果-3〉非添加ではKupffer細胞は著明に活性化されており、TxA2産生も亢進していたが、OP添加群ではKupffer細胞の活性化やTxA2産生が有意に抑制され、OKY添加群でもTxA2産生はOP同様に有意に抑制された。Co-Cultureでは非添加で肝細胞の障害は高度で、肝実質細胞単独培養に対すST添加群と同様の障害を示したが、OP及びOKY添加群では肝細胞障害は有意に抑制され、特にOPで著明であった。以上よりOPには肝細胞に対する直接保護作用のみならずKupffer細胞の活性化抑制とTxA2産生抑制作用を介する間接的な保護作用があることが示され、また、OKYにはKupffers細胞のTxA2産生抑制を介する間接的な肝細胞保護作用があることが示された。最近、種々の肝障害の発生において肝非実質細胞や脾臓マクロファージ、門脈内皮細胞などの関与が注目されており、現在、分離細胞の立場よりこれらの細胞と広範肝切除後の肝障害との関係につき検討を進めている。教室では、これまで肝広範切除後には、TxB_2や6-KFなどのprostanodidが上昇し、合併症発生例ではさらに上昇して高値を示すことを、臨床や動物実験にて報告し、また、TxA_2合成阻害剤やPGI_2アナログの投与が、広範肝切除の残存肝障害の発生を著明に抑制し、生存率を有意に改善することをも報告してきた。さらに、肝広範切除後の残存肝より分離した肝実質細胞を用いた動物実験では、肝広範切除後の肝細菌は細胞膜やミトコンドリアが高度に障害されており、これに対して、TxA_2アナログの添加は著明な細胞障害作用を示し、一方、PGI_2アナログの添加は細胞膜やミトコンドリアを保護し、直接の細胞保護作用があることが認められた。しかし、in vivoの動物実験で効果の示されたTxA_2合成阻害剤の添加では直接の細胞保護作用は認められず、他の細胞保護作用機序が示唆されたため、肝非実質細胞の1つであるKupffer細胞に着目して実験を行うこととした。肝広範切除後6時間目に肝実質細胞とKupffer細胞を分離培養し、培養液中に各薬剤を添加し、Kupffer細胞のTxB_2や6-KFの産生能を測定するとともに、これらの細胞をco-cultureし、培養後の肝実質細胞の障害の程度を検索した。
降伏点現象および不均一塑性変形を記述する多軸繰返し塑性構成モデルとその応用

本研究では,粘塑性変形は降伏(弾性限界)応力を超過した応力の作用により生じると考える超過応力(overstress)構成式を用い,境界曲面の中を降伏曲面が移動する二曲面モデルにより硬化特性を記述する繰返し粘塑性構成式を提案した.その構成式を用いて,軟鋼板の単軸引張りにおけるリューダース帯の伝播,種々の繰返し塑性変形(速度の異なる引張り試験,定ひずみ繰返し試験,ひずみおよび応力制御ラチェット試験)における応力-ひずみ応答などのFEM数値シミュレーションを行い,軟鋼板を用いた実験結果と比較検討を行った.得られた主な結果は以下のとおりである.(1)軟鋼板の単軸引張りにおけるリューダース帯の伝播挙動について●可動転位密度の急激な増殖と転位速度の応力依存性を考えることにより上降伏点からの降伏降下およびその後の降伏段を表現できた.また,降伏段のひずみ速度依存性もよく表現できた.●実験では,リューダース帯が試験片の片側のみから伝播するものや,片側からリューダース帯が発生し,その伝播途中でもう一端からも発生伝播するケースが観察された.これについては,試験片の形状誤差や,試験片を治具に取り付ける時の誤差により,応力集中の仕方が異なったためであると考えられる.●解析では,上降伏点からの急激な降伏降下を考慮することにより,塑性ひずみの局所化による不均一変形(リューダース帯の伝播)をよく表現できた.また,塑性変形が発生する弱要素の与え方(不整の程度)の違いにより上記の現象をうまく表現することができた.(2)繰返し塑性変形挙動について●非硬化領域を考慮することで実験結果が示すような繰返し硬化のひずみ幅依存性を表現することができた.●応力制御ラチェットの解析結果は,実験結果が示すラチェットひずみの進行におよぼす応力速度の影響,ひずみ進行の停止(シェイクダウン)などの挙動をよく表現できた.とりわけ応力-ひずみヒステリシスがほぼ閉じるような移動硬化則を用いることでより精度の高い解析が可能になった.本研究では,粘塑性変形は降伏(弾性限界)応力を超過した応力の作用により生じると考える超過応力(overstress)構成式を用い,境界曲面の中を降伏曲面が移動する二曲面モデルにより硬化特性を記述する繰返し粘塑性構成式を提案した.その構成式を用いて,軟鋼板の単軸引張りにおけるリューダース帯の伝播,種々の繰返し塑性変形(速度の異なる引張り試験,定ひずみ繰返し試験,ひずみおよび応力制御ラチェット試験)における応力-ひずみ応答などのFEM数値シミュレーションを行い,軟鋼板を用いた実験結果と比較検討を行った.得られた主な結果は以下のとおりである.(1)軟鋼板の単軸引張りにおけるリューダース帯の伝播挙動について●可動転位密度の急激な増殖と転位速度の応力依存性を考えることにより上降伏点からの降伏降下およびその後の降伏段を表現できた.また,降伏段のひずみ速度依存性もよく表現できた.●実験では,リューダース帯が試験片の片側のみから伝播するものや,片側からリューダース帯が発生し,その伝播途中でもう一端からも発生伝播するケースが観察された.これについては,試験片の形状誤差や,試験片を治具に取り付ける時の誤差により,応力集中の仕方が異なったためであると考えられる.●解析では,上降伏点からの急激な降伏降下を考慮することにより,塑性ひずみの局所化による不均一変形(リューダース帯の伝播)をよく表現できた.また,塑性変形が発生する弱要素の与え方(不整の程度)の違いにより上記の現象をうまく表現することができた.(2)繰返し塑性変形挙動について●非硬化領域を考慮することで実験結果が示すような繰返し硬化のひずみ幅依存性を表現することができた.●応力制御ラチェットの解析結果は,実験結果が示すラチェットひずみの進行におよぼす応力速度の影響,ひずみ進行の停止(シェイクダウン)などの挙動をよく表現できた.とりわけ応力-ひずみヒステリシスがほぼ閉じるような移動硬化則を用いることでより精度の高い解析が可能になった.(1)降伏点現象の実験観察種々の結晶粒径(10,27,71μm)を持つ低炭素鋼を用いで,油圧サーボ材料試験機により次の4種類の材料試験を行った.a)種々のひずみ速度の引張り,b)定ひずみ幅(引張り-圧縮)繰返し試験,c)応力制御ラチェット試験,d)ひずみ制御ラチェット試験.これより,横領のひずみ速度依存性は粒径が小さいほど顕著であること,降伏段近傍のラチェットひずみ累積の主な原因は粘塑性変形であることなどが明らかとなった.(2)繰返し塑性構成モデルの導出降伏点現象は転位の急激な増殖と転位速度の強い応力依存性によるものと考えられるので,これを表現するモデル(塑性ひずみ速度ε^p^^・と偏差応力sの関係)を,可動転位密度ρ_m,等方硬化(降伏曲面半径Yと抗応力D),移動硬化(背応力α)概念を用いて,次式の枠組みで導出した.ε^p^^・=3(s-α)ε^^<-^^・>/2σ^^-,ε^^<-^^・>=bρ_mφ(〈(σ^^--Y)/D〉/M(b:バーガースベクトル,M:Taylor因子)関数ψの具体形,ρ_m,Y,D,αの発展式について種々の検討を行った.その結果,実験で観察された応力-ひずみ応答を良くシミュレートできる構成式の具体形を定めることができた.

(3)モデルの有限要素解析コードへの組込み上記モデルを大変形有限要素解析コードへの組込んだ.これを用いて肩Rを持つ板試験片の引張り-圧縮などの数値シミュレーションを行ったところ巨視的な荷重-変位曲線などは実験結果をよく再現していた.またひずみ局所化についても概ね実験結果の傾向とよく一致していた.本研究では,粘塑性変形は降伏(弾性限界)応力を超過した応力の作用により生じると考える超過応力(overstress)構成式を用い,境界曲面の中を降伏曲面が移動する二曲面モデルにより硬化特性を記述する繰返し粘塑性構成式を提案した.その構成式を用いて,軟鋼板の単軸引張りにおけるリューダース帯の伝播,種々の繰返し塑性変形(速度の異なる引張り試験,定ひずみ繰返し試験,ひずみおよび応力制御ラチェット試験)における応力-ひずみ応答などのFEM数値シミュレーションを行い,軟鋼板を用いた実験結果と比較検討を行った.得られた主な結果は以下のとおりである.●可動転位密度の急激な増殖と転位速度の応力依存性を考えることにより上降伏点からの降伏降下およびその後の降伏段を表現できた.また,降伏段のひずみ速度依存性もよく表現できた.●実験では,リューダース帯が試験片の片側のみから伝播するものや,片側からリューダース帯が発生し,その伝播途中でもう一端からも発生伝播するケースが観察された.これについては,試験片の形状誤差や,試験片を治具に取り付ける時の誤差により,応力集中の仕方が異なったためであると考えられる.●解析では,上降伏点からの急激な降伏降下を考慮することにより,塑性ひずみの局所化による不均一変形(リューダース帯の伝播)をよく表現できた.●非硬化領域を考慮することで実験結果が示すような繰返し硬化のひずみ幅依存性を表現することができた.●応力制御ラチェットの解析結果は,実験結果が示すラチェットひずみの進行におよぼす応力速度の影響,ひずみ進行の停止(シェイクダウン)などの挙動をよく表現できた.とりわけ応力-ひずみヒステリシスがほぼ閉じるような移動硬化則を用いることでより精度の高い解析が可能になった.
外科的顎矯正術における周術期の気道管理法の確立に関する研究

外科的顎矯正術おける周術期の安全かつ確実な気道管理法を確立することを目的に、術直後から数日間にわたる気道の形態学的変化と呼吸生理学的変化を検討した。手術時間、手技がほぼ一定しているObvegeser Dal Pont法による下顎後退が目的の外科的矯正術患者13名を対象に鼻腔通気度計を用い、マスク・アンテリオール法よる鼻腔抵抗の変化とファイバースコープによる鼻腔内の形態的変化を調査し、さらに手術による上咽頭部の気道形態の変化を検討する目的で、同上手術患者10名の術前、術後の側面頭部x線規格写真を比較検討、また健康成人10名に塩酸トラマゾリンの点鼻効果についても検討した。1.気管内挿管側の鼻腔抵抗はチューブによる機械的圧迫による拡大のため抜管後低下したが、2日目以降には術前と同じ状態になった。2.非挿管側の鼻腔抵抗は逆に抜管後増加し、2日目以降回復した。3.全鼻腔抵抗はほとんど変化なく経過した。4.塩酸トラマゾンの点鼻は気道管理に極めて有用であった。5.ファイバースコープによる鼻腔内検査で異常所見は認められなった。6.気道の前後径は減少傾向にあったが、舌の上後方への移動で干渉された。7.気道面積は減少傾向にあったが、有意ではなかく、これ自体問題となる可能性はない。以上のことから、下顎骨後退術では手術自体により気道狭窄を起こす可能性はないが、気道に直接侵襲を加える手術の特殊性から術中より術後にかけて慎重な気道管理が必要であると考えられた。手術前後で鼻腔通気度を測定し、経鼻挿管の気道としての鼻腔におよぼす影響を調べた。(研究対象および方法)対象は新潟大学歯学部附属病院中央手術室で外科的顎矯正術のため経鼻挿管が予定された、ASAIIIで鼻疾患の既往のない患者12名とした。測定は鼻腔通気度計(MPR-2100、日本光電社製)を用い、マスク・アンテリオール法にて行なった。測定項目は、挿管側と非挿管側の最大流速値における鼻腔抵抗値(R_A)と、これらの値から算出された総合鼻腔通気抵抗値とした。そして手術前、抜管直後、術後1日目、2日目、3日目、4日目のそれぞれの値を比較し検討を行った。(結果)吸気時のR_Aの呼気時のR_Aとの間には、大きな違いはみられなかった。しかし、挿管側ではR_Aは抜管直後ではわずかに減少する傾向があり、これらは吸気時には有意な減少を示していた。さらに手術翌日では上昇する傾向があったが、手術前の値とは有意差は認められなかった。手術2日目にはR_Aは手術前とほぼ同じ程度に落ち着き、その後変化はほとんどみられなかった。非挿管側では、R_Aは抜管直後に増加した。これは呼気時に有意な変化であった。手術翌日にはR_Aは手術前とほぼ同じ程度に低下し、その後は明かな変化はみられなかった。両側の総合通気抵抗値では、手術前から術後3日目まで、ほとんど変化が認められなかった。(考察)以上の結果から、経鼻挿管を行った患者では、術後2日間は鼻閉には特に注意して気道管理を行わなければならないことが示唆されると思われた。現在、ファイバースコープにて鼻腔内の形態的変化を、術前から術後3日目まで経時的に観察を行っている。

手術時間、手技がほぼ一定しているObvegeser Dal Pont法による下顎後退が目的の外科的矯正術患者13名を対象に鼻腔通気度計を用い、マスク・アンテリオール法よる鼻腔抵抗の変化とファイバースコープによる鼻腔内の形態的変化を調査し、さらに手術による上咽頭部の気道形態の変化を検討する目的で、同上手術患者10名の術前、術後の側面頭部x線規格写真を比較検討、また健康成人10名に塩酸トラマゾリンの点鼻効果についても検討した。1.気管内挿管側の鼻腔抵抗はチューブによる機械的圧迫による拡大のため抜管後低下したが、2日目以降には術前と同じ状態になった。2.非挿管側の鼻腔抵抗は逆に抜管後増加し、2日目以降回復した。3.全鼻腔抵抗はほとんど変化なく経過した。4.塩酸トラマゾンの点鼻は気道管理に極めて有用であった。5.ファイバースコープによる鼻腔内検査で異常所見は認められなかった。6.気道の前後径は減少傾向にあったが、舌の上後方への移動で干渉された。7.気道面積は減少傾向にあったが、有為ではなかく、これ自体問題となる可能性はない。以上のことから、下顎骨後退術では手術自体により気道狭窄を起こす可能性はないが、気道に直接侵襲を加える手術の特殊性から術中より術後にかけて慎重な気道管理が必要であると考えられた。
淡水魚類腸内細菌の分子分類学的検討とその応用に関する研究

2.ティラピアおよびソウギョの腸内細菌についても同様の検討を行った結果、両魚種とも好気性細菌はAeromonas veronii, Citrobacter freundii, Plesiomonas shigelloidesなどを含むクラスターに分類された。また嫌気性細菌は主にFusobacteriaおよびCFB groupに分類された。3.FISH法を用いてキンギョの糞便内細菌叢を検討した結果、既知の細菌群のほかにα-およびβ-Proteobacteriaも優占することが判明した。AER66およびBAC303はAeromonasおよびBacteroides A型菌を計数するのに有効であった。4.ヒラメおよびマダイについても同様に16S rDNA塩基配列に基づいて腸内細菌を検索した結果、Vibrio fischeri, V.scophthalmiおよびV.carchiariaeに近縁のクラスターに分類された。2.各細菌群のrRNAに特有の塩基配列を標識とした蛍光プローブを用いるFISH法が魚類腸内細菌相の測定に有効であるか否かを検討した。その結果、検出できる菌数は培養法よりも多く、かつプローブ間の計数値にも高い相関関係が得られるなどの事実から、FISH法が魚類腸内細菌相の測定に極めて有効であることが判明した。3.FISH法を用いてキンギョの糞便内細菌相を経時的に測定し、キンギョの腸内では古細菌、AeromonasおよびAcinetobacterが優占するが、各細菌種の密度に顕著な個体差や日別変動があることを見出した。4.キンギョ、コイおよぶティラピアの消化管各部位における細菌相の比較を行った。その結果、多くの菌種では消化管前部から後部に移行するに伴い、細菌数が増加した。しかしその程度は魚種によって異なり、全長に対する腸管長の影響を受けていることが示唆された。5.これ以外に抗菌活性物質やneuraminidaseを生産する腸内細菌の分子系統学的解析を行った結果、いずれもVibrio属細菌であることが判明した。1.魚類腸内細菌叢の構成および定着に関して研究を行い、以下の結果を得た。3.ヒラメ(Paralichthys olivaceus)およびマダイ(Pagrus major)についても同様に16S rDNA塩基配列に基づいて腸内細菌を検索した結果、Vibrio fischeri,Vibrio scophthalmiおよびVibrio carchiariaeに近縁のクラスターに分類された。また何れの魚種・個体からも嫌気性細菌は分離できなかった。4.腸内細菌の粘液付着性を測定するためのアッセィ系の確立を検討し、テトラゾリウム塩を用いることによって容易に腸内細菌の粘液付着性を定量化することができることを見いだした。5.コイ(Cyprinus carpio)腸内細菌の粘液に対する付着性を検討した結果、優占菌であるAeromonas属細菌は他の細菌種に比較して高い付着性を示した。この結果は魚類腸管内において細菌が定着するためには粘液付着性が重要な因子になる可能性が高いことを強く示唆するものである。
小児白血病治療を目指したGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体T細胞の最適化

昨年度までに最適化してきた改変型GMR CAR-Tの医師主導臨床試験の開始に向けた安全性評価の一環として、CAR-Tの細胞外領域のタンパク質可溶性画分を調製し、リガンド部位の組織交差性試験を実施する準備を推進した。具体的には、CARを構成するリガンド領域とスペーサー領域を直列に繋いだCARの細胞外領域をコードする遺伝子を哺乳類細胞で高発現・分泌させる目的でSUMOstarタグとHisタグの融合たんぱく質として発現させるたため、哺乳類細胞での分泌てうタンパク発現に最適化されたベクターを用いてExpiCHO又はExpi293細胞へ遺伝子導入を行った。培養上清よりNiカラムを用いて融合タンパク質を精製し、SUMOstarタグとHisタグをSUMOプロテアーゼにより切断し、CARの細胞外領域の可溶性タンパクを取得した。取得した可溶性タンパクの生物活性を測定するため、SPR法にて解析を行った。市販のFc融合GMRタンパク質をプロテインAによってセンサーチップに固定化し、任意の濃度で調整したGMR CAR細胞外領域のタンパクを流し、固定化したGMRへの結合活性を評価した結果、文献値と遜色ないKD値で結合することを確認した。現在、さらなるタンパク収量の上昇を目指して、ベクターの載せ替え、培養条件等の最適化を継続して実施している。最終的な目標は、外部委託試験として予定している組織交差性試験の開始と評価完了である。2)医師主導治験へ向けたPMDA相談も複数回実施している。3)開発品の安全性評価の一環とした本課題での実施試験が順調に推移している。調製およびGMRへの結合親和性が確認できたGMR CAR細胞外領域タンパク質につき、さらにタンパクの収量を上げるために、さらに最適化されたベクターへの載せ替えを行う。収量の上昇が確認できたら、組織交差性試験の委託試験に向けた十分量の調製タンパク質の取得を試みる。最終的には組織交差性試験の評価完了を目指す。1)骨髄性腫瘍を標的としたGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体T細胞(GMR CAR-T)の最適化を目的に,腫瘍細胞殺傷と同時に分泌されるサイトカインの放出を抑えるようなshRNAを搭載した遺伝子改変ベクターの構築を行った。本ベクターを健康成人末梢血単核細胞にエレクトロポレーションによって導入し,培養して作製される改変型GMR CAR-Tは,従来の野生型(shRNA搭載なし)と比較して,腫瘍細胞への殺傷効果に優れることを確認した。2) GMR CAR-TのGM-CSF受容体に対する選択性を評価する目的で,慢性骨髄性白血病細胞株K562にGMRαまたはGMRβを単独に発現する安定発現株の取得を試みた。GMRαまたはGMRβそれぞれのトランスポゾンベクターの構築を完了させ,K562に遺伝子導入し,磁気細胞分離法にてGMRα単独またはGMRβ単独の安定発現株を取得した。3) GMR CAR-Tのin vivoにおける効果を確認するため,急性骨髄性白血病細胞株THP-1とその陰性対照としてK562を選択し,in vivoイメージングにより抗腫瘍効果を判定するために,両腫瘍細胞のルシフェラーゼ発現株を準備した。eGFPとルシフェラーゼを安定的に発現するためのトランスポゾンベクターの構築を行い,構築が完了した。さらに,それぞれのベクターをエレクトロポレーションによって両細胞株に遺伝子導入し,磁気細胞分離法にてeGFP・ルシフェラーゼ発現K562細胞の取得に成功した。THP-1については遺伝子導入条件のさらなる最適化が必要であり,作製を継続中である。2)予定していていたGMR CAR-Tの受容体選択性評価のツールとしてのベクター構築,GMRα単独またはGMRβ単独のK562安定発現株を取得できた。3) In vivo試験に使用する,ルシフェラーゼ発現細胞株の取得が予定通り進捗した。上記理由に基づき,順調に進展していると考えられる。

1)今回創製できた改変型CAR-Tを足掛かりに,さらに多角的なアプローチでベクターの改変を継続的に推進し,従来型からのさらなる優位性と安全性を担保できる最終型のベクターを選定する検討を継続する。2)作製が完了したGMRα単独またはGMRβ単独の発現株に対するGMR CAR-Tの効果を検証し,受容体選択性についての考察を行う。3)ルシフェラーゼ発現THP-1細胞の取得に関する検討を引き続き継続し,作製ができた場合は,免疫不全マウスへ投与し,細胞のマウスへの生着,in vivoイメージングの予備試験へと移行し,最終的にはGMR CAR-Tのin vivoでの効果を確認したい。調製およびGMRへの結合親和性が確認できたGMR CAR細胞外領域タンパク質につき、さらにタンパクの収量を上げるために、さらに最適化されたベクターへの載せ替えを行う。収量の上昇が確認できたら、組織交差性試験の委託試験に向けた十分量の調製タンパク質の取得を試みる。最終的には組織交差性試験の評価完了を目指す。予定していたベクターの構築が順調に進み,必要最小限の試薬類の購入で賄うことができた。次期は,動物試験等も予定しており,予備検討を含めて動物購入費が増加すると予定される。さらに,必要となる試薬類も定期的に購入することとなる。ベクターの改変等、必要最小限の試薬類の購入で検討が進んだことが大きな理由である。今後は安全性評価等の外部委託が予定されているため、タンパクの量産等で必要となる培地類、精製に使用する物品の購入に全額を使用する予定である。
バクテリオロドプシンを用いたフォトニックスイッチ素子の試作

光による光の制御は高速化の可能性や多重並列処理の容易さから、光通信や光情報処理への適用が注目され、フォトニックスイッチ素子への要求が高まっている。本研究は生体膜バクテリオロドプシン(bR)のフォトクロミズム利用して回折型平板レンズのホログラムを書き込み、集光機能をもった光制御型スイッチ素子として提案、試作した。その結果以下の知見を得た。1.Arイオンレーザを用いた2光束干渉法で、一方に凸レンズを挿入すると平面波と球面波が干渉して、bR薄膜上に同心円状のゾーンプレートのホログラムが記録される。これは回折型平板レンズとして機能するので読みだし光(信号光)を集光する。He-Neレーザを用いて集光機能を確認し、スポット形状、スポットサイズ、回折効率から最適記録条件を見いだした。2.ゾーンプレートは実時間で書き込まれるので、on/offまたは、バクテリオロドプシンの偏光認識性を利用した偏光変化で書き込み光を制御できる。これによって信号光のスイッチング動作が確認できた。ゾーンプレートの回折機能によって、波長の異なる入力光は波長ごとに別の場所に集光する。30μm薄膜の薄い試料を用いて、読みだし光の入射角度がブラッグ角度から±3°の許容範囲をもつことを確認した。これを利用すれば、入力進号が波長分割でき、一素子で集光、波長分割機能をもつスイッチ素子実現の可能性が高いことが分かった光による光の制御は高速化の可能性や多重並列処理の容易さから、光通信や光情報処理への適用が注目され、フォトニックスイッチ素子への要求が高まっている。これを利用すれば、入力進号が波長分割でき、一素子で集光、波長分割機能をもつスイッチ素子実現の可能性が高いことが分かった