hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
走査型トンネル顕微鏡におけるスピン偏極トンネル現象に関する研究

1992年大気中STMで、GaAs薄膜試料-Ni探針でスピン偏極トンネル電流の検出に成功した。(1)本年度は超高真空の系に実験を移行し、定量的評価が可能となった。結果としてS/Nの良いスピン偏極電流が測定され、探針磁化およびGaAsスピン偏極度に依存することが明確となった。超高真空用STMユニットを用いて、10^<-6> Paで測定可能となた。この系に偏極光学系および制御系を作製設置した(2)STS測定において、大部分は光電子分光の測定結果で説明がつくが、表面準位を介したと思われるトンネル現象が観測され、メカニズムについては今後の問題である。(3)このGaAs薄膜の実験においては表面処理上の問題で原子分解能が得られていないが、GaAs単結晶のへき開面よりのスピン偏極トンネル電子を原子分解能で検出する実験がスタートしている。STM真空チャンバー中でへき開する治具を作製し、(110)単結晶面を出し、Ni探針でGaおよびAs原子像が得られている。Ga、Asでは状態密度が異なるため偏極度のちがいが検出されることが期待される。Ni探針でのGaAs原子像の観察は初めてのデータであるが、スピン偏極電流は現在検出されていない。
拡散過程とファジィ集合値確率解析の研究

本研究では、まず一次元拡散過程について強マルコフ性の条件は満たさないが、マルコフ性を満たす多くの新しい確率過程を解明し、それらのクラスを決定した。つぎにファジィ集合値確率変数について大数の法則の拡張を行い、大偏差原理を導出した。さらに、ファジィ集合や集合を係数にもつ確率微分方程式の確率1でファジィ集合や集合の値をとる解の一意的な存在を証明した。Chern-Simons解析における指数3次の項を被積分関数とする漸近剰余の評価を行った。2パラメータPoisson-Dirichlet分布について新たな特徴づけを与えた。1.強マルコフ性を満たさない連続な一次元マルコフ過程のクラスを双一般化拡散過程の理論の立場から決定した。2.集合値確率過程の確率積分は多くの場合2乗可積分の空間では有界にあるが、確率1で非有界であることをつきとめた。3.確率積分の項の係数を集合とする確率微分方程式の解は、多くの場合確率1で非有界であることを示した。4.確率積分の係数が通常の関数でずれの項の係数が集合である確率微分方程式の解はある緩い条件のもとで、確率1で有界集合の値をとる解をもつことを、比較定理を用いて証明した。5.上の結果をファイナンスのブラックショールズの市場モデルに応用した。7.Chern-Simons汎関数積分の1ループ近似をウィナー空間の枠組みで数学的に定義し、レベルパラメータに対する漸近展開定理得た。これを3次元球面の場合に量子不変量を展開係数から求めた。8.PitmanとYorが導入した2パラメータPoisson-Dirichlet分布について点過程の観点から解析を行った結果、相関関数の表示を基にして様々な特性量についての簡潔な表示が得た。1.ファジィ集合値をずれの係数にもち確率積分の係数が通常の関数確率微分方程式の解はある緩い条件のもとで、確率1で有界集合の値をとる解をもつことを証明した。2.上半連続関数の空間にいくつかの位相を入れて、それらの可分性についての検証を行った。またこの結果を用いて、上半連続関数の空間に値をとる独立確率変数のチェザロ和について大偏差原理が成り立つことを証明した。4.Chern-Simons積分の割引を入れた正規化について、Wiener空間の設定で数学的に定式化し、藤原の漸近展開の方法を適用した。5.集合値確率過程を実ブラウン運動の微分で揺動した確率積分を分割閉包の方法で定義した。クラトフスキーの選出定理を用いた議論がジェネラル・ナンセンスになることを防いだ。6.PitmanとYorが導入した2パラメータPoisson-Dirichlet分布について点過程の観点から解析を行った結果,相関関数の表示を基にして様々な特性量についての簡潔な表示が得られた.1.多次元ユークリッド空間上の上半連続関数の空間は、ファジィ集合の空間と考えられるが、この空間にいくつかの重要な位相を導入して、それらの間の関係を調べた。2. 1で導入した位相の中で可分性をもつものに関して、レベル集合が凸であるという条件の下でファジィ集合値確率変数についての大偏差原理と中偏差原理が成り立つことを証明した。3. 2におけるレベル集合が凸であるという条件がなくても、ある自然な仮定を付け加えれば、大偏差原理が成り立つことを証明した。4.ずれの係数が集合値で、係数がリップシッツ条件をみたすジャンプの項をもつ確率微分方程式が、確率1で有界集合の値をとる解を一意的にもつことを証明した。5. Chern-Simons摂動展開理論をウィナー空間の枠組みで定式化し、大胆な定義のもとで漸近展開主要項と漸近剰余評価を得た。6. PitmanとYorが導入した2パラメータPoisson-Dirichlet分布について点過程の観点から解析した結果,確率母関数の表示から様々な密度公式や極限定理が得た.
形が制御するYapを介した細胞増殖制御の分子機構の解明

本研究では、細胞の形の変化がHippoシグナル経路の起点となって細胞増殖を制御するという仮説を提案し、これを検討した。マイクロドメイン培養システムを含む一連の実験により、細胞の形がストレスファイバー量を規定していること、およびストレスファイバーがHippoシグナル経路を負に制御することを見出した。これらの結果を基に、細胞増殖の接触阻止に関して、細胞密度に依存して変化する細胞の形がストレスファイバーを介してHippoシグナル経路を制御することで接触阻止が成立する、という細胞間接触に依存しない新しいモデルを提唱した。本研究は、細胞接触非依存的な「細胞の形」の変化による細胞増殖制御の分子機構をYapの細胞内局在制御との関連に着目して明らかにすることを目指している。前年度までに、マイクロドメインによる形の制御を含んだ一連の実験により、ストレスファイバーはHpo経路を抑制的にする働きがあり、細胞の形がストレスファイバーを介してHpo経路に入力することでYapの局在を制御していることを明らかにした。今年度は、細胞の形およびストレスファイバーのHpo経路への関与をより詳細に調べる試みを行った。Hpo経路の上流のコンポーネントであるMerのdominant negative formを発現させると、丸い状態の細胞においてもYapが核局在を維持していることが観察された。この結果は、細胞の形によるYapの局在制御がHpo経路を介したものであるという先の解釈を支持する。また、JasplakinolideによってF-actinを安定化したところ、予想に反してYapの核局在が消失した。この阻害剤はF-actinに強く結合することでその構造を安定化させることを考えると、ストレスファイバーの機能に干渉している可能性が高い。そのため、ストレスファイバーの何らかの機能的な状態がHpo経路の抑制に重要であることが予想された。今後、ストレスファイバーがHpo経路を抑制する機構に着目することによって、より詳細な「細胞の形」の変化による細胞増殖制御の分子機構を明らかにしていくことが期待される。細胞間接触の影響を排除して細胞の形とYap局在変化の関連を検討するために、微小な細胞接着領域(マイクロドメイン)を用いたNIH3T3細胞の単一細胞培養を行った。30 x 30 μm以下のマイクロドメイン上では、細胞は丸い形を呈しYapは核から排出された。一方、40 x 40 μm以上のサイズでは、細胞は伸展しYapが核に局在した。また、伸展した細胞でのみ明瞭なストレスファイバーが認められたため、ストレスファイバーがYap局在制御に関与する可能性が示唆された。各種阻害剤を用いてストレスファイバーを薬理的に破壊したところ、いずれの場合もYapの核局在が消失した。また、50 x 50 μmサイズのマイクロドメインに播種した状態でサイトカラシンDに暴露してストレスファイバーを破壊したところ、伸展状態にありながらYapの核局在が消失した。これらの結果からストレスファーバーがYap局在制御に関与していることが示唆された。さらに、ストレスファイバーによるYap局在制御がHpo経路を介して行われるのかを調べるために、Lats2のdominant negative formの高発現によるHpo経路の阻害実験を行った。Hpo経路を阻害した状態でサイトカラシンDに暴露したところ、ストレスファイバーが破壊された状態でもYapの核局在が維持された。このことはストレスファイバー(F-actin)がHpo経路を抑制する働きを持つことを示唆する。これら一連の実験結果から、細胞の形がストレスファイバーを介してHpo経路を制御すことでYapの局在を制御していることが明らかとなった。この研究成果は本研究課題で新しく提唱した"細胞増殖の接触阻止が細胞の形の変化に起因して生じる"という仮説を支持し今後さらに詳細な分子機構の解明に発展していくことが期待される。本研究課題では達成目標を二つ設定した。一つは、細胞の形の変化によるYap局在制御はHpo経路を介すのか、あるいは別の経路が存在するのか?という問題に対して明確な回答を得ること、もう一つは、Yapの局在制御の具体的な分子機構を明らかにすることであった。マイクロドメインを用いた細胞の形の制御、ストレスファイバーの破壊、Hpo経路の阻害という一連の実験を通して、細胞の形によって増減するストレスファーバーがHpo経路を負に制御する因子として機能することを明らかにすることができた。この研究成果から、細胞の形の変化によるYapの局在制御はHpo経路を介するものである、という結論に達した。さらに後者の達成目標に関しても、ストレスファイバーがHpo経路を負に制御するという新規知見を得たことにより、細胞の形の変化によるYap局在制御の具体的な分子機構を明らかにする上で着目する分子をF-actinを中心とした関連分子に絞りこむことができた。これらの理由から、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価している。

23年度の研究実績より、形によるYap局在制御はHpo経路依存的な分子メカニズムが存在することが明らかとなり、さらに、そこにはストレスファイバー/F-actinが関与していることを世界に先駆けて見出すことができた。今後は、F-actinが具体的にどのような分子間相互作用を介してHpo経路を負に制御していくのかを検討することで、さらに詳細に"形が制御するYap局在制御の分子機構"を明らかにしていく。ところで、F-actinは細胞接着分子とも密接な機能的な関連が知られている。このことは、従来より提唱されてきた細胞接着に依存的な細胞増殖の接触阻止のメカニズムと、本研究課題で提唱した形に依存するメカニズムがF-actinによって統合されているかもしれないことを示唆する。そこで、上記の研究計画に乗っ取ったアプローチに加えて、F-actinに着目して細胞接触と形の変化がどのように関連しあってHpo経路に入力するのかを検討することも視野に入れ、研究を推進していく予定である。基本的な解析装置は現有であるため、分子生物学/生化学的解析に必要な試薬類全般が主たる研究費の使用用途として計画している。しかし、【今後の研究の推進方策等】で記載した通り、細胞接着と形の関連性の検討も想定している。この場合は、新規の微小構造を有した細胞培養システムを設計、構築する必要があり、微細加工に必要な経費も次年度の研究費の使用計画に含める。以上を考慮し、次年度研究費\1,100,000のうち、\600,000を消耗品、試薬代として、\100,000を学会参加費、\300,000を微細加工経費、\100,000をその他論文投稿費等に使用する計画である。
骨髄由来抑制細胞の炎症における役割の解明と新規免疫抑制療法の開発

a.SKGマウスでは関節炎以外にもリウマチ肺様の肺病変を呈す。これを確認した。肺病変におけるMDSCは、肺病変の進展に伴って増加することを明らかにした。肺MDSCをソーティングで単離し、CD4T細胞と共培養した結果、MDSCは確かにT細胞抑制活性を有すことを明らかにした。このことから、肺に遊走してきたMDSCは炎症を抑えることが明らかになった。b.研究の過程で、SKGマウス肺病変にはMDSCとは別のGr1+CD11bdimの樹状細胞様集団が現れることが明らかになった。この細胞はCD11cを表出し、単離してT細胞と共培養すると抑制活性を持つことから、制御性樹状細胞様細胞と名付けた。全肺細胞をGM-CSF存在下で培養するとこの細胞が誘導できることが明らかになった。少なくとも一部はMDSCから分化してくること、肺細胞が出すTGFbが関与していることが明らかになった。c.制御性樹状細胞様細胞を単離してSKGマウスに養子移入すると、肺病変の進展が抑制された。以上の結果は、MDSCは炎症局所において抑制的に働いていることを示している。さらには、制御性樹状細胞に分化して免疫抑制に働くことも明らかとなった。今後の検討課題は、これらの細胞がヒト関節炎や肺炎においてどのような役割を果たしているかを解明することである。(1)SKGマウスの関節炎や肺病変においても集積している細胞の多くがMDSCである。このMDSCを単離して機能解析すると、T細胞の増殖を抑制することが明らかとなった。(2)さらに私たちは、SKGマウスの肺病変が進行するにつれて、CD11b+Gr-1intの細胞集団が集積することを見出した。これらの細胞はCD11cを表出しており、樹状細胞であることが分かった。これらの細胞を取り出して機能解析したところ、MDSCと同様にT細胞増殖抑制能をもち、制御性樹状細胞であることが明らかとなった。この細胞をCD11b+Gr-1int tol-like DCと名付けた。この細胞の表現型は今までに報告されているものと一致しないため、新規tolDCではないかと考えている。(3)CD11b+Gr-1int tol-like DCは肺の細胞を培養することでMDSCの一部から誘導されることを明らかにした。肺細胞から誘導される樹状細胞は炎症制御性であったが、骨髄細胞を同様の条件で培養するとT細胞の増殖を刺激した。これらのことは、炎症の場でもMDSCは抑制的に働き、さらに制御性樹状細胞に分化してさらなる炎症制御に働くことを示している。今後は、なぜ肺では制御性樹状細胞が誘導されるかについて解析予定である。おおむね順調である。ただし、予想外の発見もあり、解析に時間がかかている。1)申請者らは、肺病変を来したSKGマウスの肺においてMDSCが増加すること、肺病変の重症化に伴いMDSCからCD11b+Gr1dim免疫寛容性樹状細胞(CD11b+Gr1dimtolerogenic dendritic cell (CD11b+Gr1dimtolDC))というこれまでに報告のないユニークな細胞が誘導されること、CD11b+Gr1dimtolDCを養子移入することで肺病変の進行が抑制されることなどを明らかにした。そのメカニズムとしては肺の線維芽細胞から産生されるTGFbが役割を果たしていると考えられた。さらなる解析のために、骨髄MDSCと肺MDSCの遺伝子発現を解析する予定である。2)mTOR阻害剤とGlutamnine代謝阻害剤存在下ではMDSCは樹状細胞への分化が抑制された。GM-CSFで培養後の細胞はT細胞を刺激したが、mTOR阻害剤とGlutamnine代謝阻害剤存在下で培養した細胞はT細胞刺激能が落ちていた。この理由としてPDL-1の上昇、TGFの増加などが考えられた。特筆すべきは両者を併用すると、相乗効果が認められ、よりMDSCが増えることが見出された。さらに、生体内での効果を検討するために、mTOR阻害剤とGlutamnine代謝阻害剤を関節炎モデルマウスに投与したところ、単剤でも関節炎抑制効果が認められたが、併用療法で相乗効果がみられ完全に関節炎を抑制した。同時にmTOR阻害やグルタミン代謝阻害はT細胞に対しても増殖、分化抑制能を持つことから、今後は多角的な検討が必要である。肺ではMDSCから分化する新規細胞を見出した。各組織におけるMDSCの違いについて検討開始した。これを確認した。

c.制御性樹状細胞様細胞を単離してSKGマウスに養子移入すると、肺病変の進展が抑制された。以上の結果は、MDSCは炎症局所において抑制的に働いていることを示している。さらには、制御性樹状細胞に分化して免疫抑制に働くことも明らかとなった。今後の検討課題は、これらの細胞がヒト関節炎や肺炎においてどのような役割を果たしているかを解明することである。MDSCと制御性細胞について新しい知見が得られたため、この知見についても加えて解析する。現在までの知見をもとに、新規治療法の可能性を考える。
マカカ属サルの種分化に関する研究

マカカ属のサルはアジア大陸とそれに沿った島々および東南アジアの島嶼に広大な地域に分布しており,サル類のなかでも最も適応力にとみ,アフリカ大陸のヒヒ類とともにヒト以外の霊長類で最も主要なサルである.サル類の系統関係を明らかにしその進化について理解することにより,われわれヒトの起源と進化を考察するという霊長類学の重要な課題の目的のためには,サル類のなかでも最も主要な属である,マカカ属の種分化,系統関係を明らかにすることは意義あることと考えられる.本研究においては, 1)マカカ属のなかでも特異的な分布をしめすスラウェシ(セレベス)島の7種のマカクについて餌付け一時捕獲し,形態学,遺伝学,生化学の各専門分野からの総合的な研究, 2)スラウェシマカクと近縁関係にあるとされるブタオザルの社会生態学的調査研究と,ニホンザルをはじめとする他のマカクのそれらとの比較, 3)自然分布のない島で,極く小数の母群から出発したと思われるカニクイザルの種分化,近交係数の獲得についての実験動物学,遺伝学的研究を目的とした.1.スラウェシマカクスラウシ島北部のタンココバツアングスという保護林において,スラウェシマカクを代表するクロザル(ニグラ)の餌付け捕獲による調査を行い, X線撮影,身体計測,カラーアナライザによる毛色の分析,手足の手掌紋等皮膚隆線系および血液試料を採取した.これに加え,同島北部半島の広域調査を行い多数のニグラ,ニグレッセンス,ヘッキのペットモンキーで同様の調査を行った.これらの結果から,その3種の分布関係,形態的特徴を明らかにした.持ち帰った血液試料は1984年度の調査において採取したものと合わせ,本年度は各種の代表的な7種類のヘモグロビンα鎖の全一次構造を決定した. N末端より8,15,57,74,78番目のアミノ酸が置換した4種類のα鎖が同定された. A型を(T/S,D,G,D,H),B型を(T/S,G,D,D,H), C型を(S,D,G,D,H),D型を(T/SD,D,N,Q)とすると,マウラはA,トンケアナはA, B, D,ヘッキはC,ニグラ,オクレアータ,ブルネッセンスはそれぞれA, Bを持っていた.これらの分子型は相互に少なくとも2塩基以上の置換を必要とすることから複数回の遺伝的変化が生じていることを示唆する結果を得た.2.ブタオザル1985年以来継続している野生ブタオザルの社会生態学的研究を,インドネシア,西スマトラ州に於て行った.約5km^2の調査地に単位集団の存在を確認した.その内3集団について餌付け観察を行った.この3集団のサイズの平均は68頭であり,平均の遊動域は140haである.この集団どうしは遊動域をかなり重複させているが,この内の2集団は敵対的であった.餌場では9頭のオスのハナレザルも観察した.餌場における個体間の社会交渉の観察から解ったことは,ブタオザルの単位集団は複雄複雌の構成で,かつメスにかなり偏った社会性比(1:6.3)をもつ母系的な集団であり,ニホンザルなどの他のマカクの群れ型社会と共通する社会組織を持っていることである.しかし,その交尾システムは,いつも少数のメスが発情しているというメスの発情パターンに関係して, 2頭たらずの上位のオスの独占性の強い乱婚的なものである.3.パラオ共和国アンガウル島に生息するカニクイザル今回の調査で70頭を捕獲し,以下のような成績を得た.1).形態:永久歯列を備えていたものの形態をインドネシア産と比較すると,オスメス共に体重・前腕長・大腿長・下腿長・手長・頭長などが有意に小さく,小型化が生じていた.また程度の異なる毛色変異(灰白色化)が3頭に見られた.2).血液性状・寄生虫相:血液性状は他産地のものと差がなかったが,糞便内寄生虫卵は胃虫が1頭に認められたのみで,蠕虫相の単純さは特異的である. 3).遺伝的変異性は,他地域に比べて低いとはいえず,平均ヘテロ接合体率は10.2%とタイ国に次ぐ高さであった.またトランスフェリンの対立遺伝子は6種類で,タイ・マレイシア・インドネシア産との共通性を示す変異体を認められ,フィリピン産の雌雄一対に由来するという島の所伝を否定する結果となった.マカカ属のサルはアジア大陸とそれに沿った島々および東南アジアの島嶼に広大な地域に分布しており,サル類のなかでも最も適応力にとみ,アフリカ大陸のヒヒ類とともにヒト以外の霊長類で最も主要なサルである.サル類の系統関係を明らかにしその進化について理解することにより,われわれヒトの起源と進化を考察するという霊長類学の重要な課題の目的のためには,サル類のなかでも最も主要な属である,

マカカ属の種分化,系統関係を明らかにすることは意義あることと考えられる.本研究においては, 1)マカカ属のなかでも特異的な分布をしめすスラウェシ(セレベス)島の7種のマカクについて餌付け一時捕獲し,形態学,遺伝学,生化学の各専門分野からの総合的な研究, 2)スラウェシマカクと近縁関係にあるとされるブタオザルの社会生態学的調査研究と,ニホンザルをはじめとする他のマカクのそれらとの比較, 3)自然分布のない島で,極く小数の母群から出発したと思われるカニクイザルの種分化,近交係数の獲得についての実験動物学,遺伝学的研究を目的とした.1.スラウェシマカクスラウシ島北部のタンココバツアングスという保護林において,スラウェシマカクを代表するクロザル(ニグラ)の餌付け捕獲による調査を行い, X線撮影,身体計測,カラーアナライザによる毛色の分析,手足の手掌紋等皮膚隆線系および血液試料を採取した.これに加え,同島北部半島の広域調査を行い多数のニグラ,ニグレッセンス,ヘッキのペットモンキーで同様の調査を行った.これらの結果から,その3種の分布関係,形態的特徴を明らかにした.持ち帰った血液試料は1984年度の調査において採取したものと合わせ,本年度は各種の代表的な7種類のヘモグロビンα鎖の全一次構造を決定した. N末端より8,15,57,74,78番目のアミノ酸が置換した4種類のα鎖が同定された. A型を(T/S,D,G,D,H),B型を(T/S,G,D,D,H), C型を(S,D,G,D,H),D型を(T/SD,D,N,Q)とすると,マウラはA,トンケアナはA, B, D,ヘッキはC,ニグラ,オクレアータ,ブルネッセンスはそれぞれA, Bを持っていた.これらの分子型は相互に少なくとも2塩基以上の置換を必要とすることから複数回の遺伝的変化が生じていることを示唆する結果を得た.2.ブタオザル1985年以来継続している野生ブタオザルの社会生態学的研究を,インドネシア,西スマトラ州に於て行った.約5km^2の調査地に単位集団の存在を確認した.その内3集団について餌付け観察を行った.この3集団のサイズの平均は68頭であり,平均の遊動域は140haである.この集団どうしは遊動域をかなり重複させているが,この内の2集団は敵対的であった.餌場では9頭のオスのハナレザルも観察した.餌場における個体間の社会交渉の観察から解ったことは,ブタオザルの単位集団は複雄複雌の構成で,かつメスにかなり偏った社会性比(1:6.3)をもつ母系的な集団であり,ニホンザルなどの他のマカクの群れ型社会と共通する社会組織を持っていることである.しかし,その交尾システムは,いつも少数のメスが発情しているというメスの発情パターンに関係して, 2頭たらずの上位のオスの独占性の強い乱婚的なものである.3.パラオ共和国アンガウル島に生息するカニクイザル今回の調査で70頭を捕獲し,以下のような成績を得た.1).形態:永久歯列を備えていたものの形態をインドネシア産と比較すると,オスメス共に体重・前腕長・大腿長・下腿長・手長・頭長などが有意に小さく,小型化が生じていた.また程度の異なる毛色変異(灰白色化)が3頭に見られた.2).血液性状・寄生虫相:血液性状は他産地のものと差がなかったが,糞便内寄生虫卵は胃虫が1頭に認められたのみで,蠕虫相の単純さは特異的である. 3).遺伝的変異性は,他地域に比べて低いとはいえず,平均ヘテロ接合体率は10.2%とタイ国に次ぐ高さであった.またトランスフェリンの対立遺伝子は6種類で,タイ・マレイシア・インドネシア産との共通性を示す変異体を認められ,フィリピン産の雌雄一対に由来するという島の所伝を否定する結果となった.
ＡｎＭＢＲとＡｎａｍｍｏｘ・ＨＡＰを組み合わせたプロセスによる生ごみのメタン発酵

当該年度に研究実績の概要:(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵。本研究では、生ごみの嫌気性発酵に及ぼす有機物負荷(OLR)の影響を評価した。OLRは2.43 g-COD/L/dから4.86, 7.29, 9.72, 14.58へと段階的に増加した。9.72 g-COD/L/dの条件では、有機物の除去率が高く、VFA濃度が低く維持され、メタンへの転換率も高かった。有機物分解とバイオガス生成について評価した結果、9.72 g-COD/L/dは最適な有機負荷であることを明らかにした。(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作の最適化。中空糸型嫌気性膜バイオリアクターの操作を最適化した。異なる濾過:休止比(F / R)が適用された。TS 25、20、15および10 g / Lについての最適F / R比は、それぞれ3分の濾過:6分の休止、3分の濾過:1分の休止、3分の濾過:1分の休止、3分の濾過:1分の休止であることを示した。対応する持続可能なフラックスは、3.6±0.5、9.3±0.2、10.1±0.4および13.2±0.3LMHであり、これらは連続濾過モードで達成されたものよりはるかに高かった。これらのパラメーターはAnMBRの設計や運転において必要不可欠なものである。(3)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵。生ごみと下水汚泥のTS比を100:0、75:25、50:50および25:75に変化させて連続実験を行い、メタンの生成状況と最適な膜操作モードについて検討した。いずれの原料条件でも安定した運転が得られたが、下水汚泥比率の増加に伴い、分解率やメタン生成率が減少したものの、消化液のろ過性が向上し、持続可能ファックスが増加した傾向が見られた。平成30年度において、「AnMBRとAnammox・HAPを組み合わせたプロセスによる生ごみのメタン発酵」を目指て(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵、(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作の最適化、(3)中温条件におけるをAnMBR用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵などの項目に分けて研究を進め、それぞれ具体的な成果を上げることができた。(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵について研究は、生ごみの嫌気性発酵に及ぼす有機物負荷(OLR)の影響を評価した。(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作最適化の研究は、TS 25、20、15および10 g / Lについての持続可能なフラックスは、3.6±0.5、9.3±0.2、10.1±0.4および13.2±0.3LMHであり、これらは連続濾過モードで達成されたものよりはるかに高かった。(3)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵について研究は、いずれの原料条件でも安定した運転が得られたが、下水汚泥比率の増加に伴い、分解率やメタン生成率が減少したものの、消化液のろ過性が向上し、持続可能ファックスが増加した傾向が見られた。その成果、第一著者査読付き論文2本と海外学会発表2件など多くの成果を挙げられる。また、関連の研究テーマに積極的に関わり、様々の貢献をした。全体として「当初の計画以上に進展している」と思います。省エネルギー化を実現するには、メタン生成能力を持つ嫌気性古細菌を活用することが有効であるが、従来技術では処理水のアンモニア性窒素量が高い等の問題があった。また、Anammox (Anaerobic Ammonium Oxidation)脱窒技術は従来の生物学的脱窒方法比べて、電子供与体が要らない、酸素要求量が少ない、処理費用が低いと報告されている。そこで、生ごみを活用し、低コストで安定運転なメタン産出と良好な水質確保技術は現状問題の解決に向ける重要な課題となる。既往研究によりAnammoxプロセスによって、高濃度窒素が除去されたと同時に排水中のリンも回収できたと報告された。そこで、申請者はHAP法を組み合わせたAnammoxを利用し、脱窒とリン回収を実現するAnMBR流出水の更なる改善を提案した。この二種類のプロセスを組み合わせれば高有機物負荷運転、窒素除去、リン回収、良好な排出水質ができるようになり、これまでなかった革新的な生ごみ処理システムを開発する。このように、生ごみや下水汚泥を再生エネルギーとしてメタンに変わり、高品質で安全安心な流出水及び環境への負荷の低減といった課題にも貢献できる。目的を達成するために、AnMBRとAnammox・HAPを組み合わせたリアクターのデザインを決定し、回分実験により基質の発酵特性と微生物の最適成長条件を検討し、更に連続実験により運転安定効果及び長期性を察する。その間に定期的に微生物をサンプリングし、分子生物学的な手法を用いて微生物群集構造解析及び数理モデルと物質収支を調査する。

各運転段階で得られたデータに基づいて、数式化、モデル化による実証を行い、実用化に向けて安定したメタン生産、窒素除去、リン資源回収を提案する。研究成果により、AnMBRとAnammox・HAPを組み合わせたプロセスについてLCA評価を行う。当該年度に研究実績の概要:(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵。本研究では、生ごみの嫌気性発酵に及ぼす有機物負荷(OLR)の影響を評価した。OLRは2.43 g-COD/L/dから4.86, 7.29, 9.72, 14.58へと段階的に増加した。9.72 g-COD/L/dの条件では、有機物の除去率が高く、VFA濃度が低く維持され、メタンへの転換率も高かった。有機物分解とバイオガス生成について評価した結果、9.72 g-COD/L/dは最適な有機負荷であることを明らかにした。(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作の最適化。中空糸型嫌気性膜バイオリアクターの操作を最適化した。異なる濾過:休止比(F / R)が適用された。TS 25、20、15および10 g / Lについての最適F / R比は、それぞれ3分の濾過:6分の休止、3分の濾過:1分の休止、3分の濾過:1分の休止、3分の濾過:1分の休止であることを示した。対応する持続可能なフラックスは、3.6±0.5、9.3±0.2、10.1±0.4および13.2±0.3LMHであり、これらは連続濾過モードで達成されたものよりはるかに高かった。これらのパラメーターはAnMBRの設計や運転において必要不可欠なものである。(3)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵。生ごみと下水汚泥のTS比を100:0、75:25、50:50および25:75に変化させて連続実験を行い、メタンの生成状況と最適な膜操作モードについて検討した。いずれの原料条件でも安定した運転が得られたが、下水汚泥比率の増加に伴い、分解率やメタン生成率が減少したものの、消化液のろ過性が向上し、持続可能ファックスが増加した傾向が見られた。平成30年度において、「AnMBRとAnammox・HAPを組み合わせたプロセスによる生ごみのメタン発酵」を目指て(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵、(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作の最適化、(3)中温条件におけるをAnMBR用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵などの項目に分けて研究を進め、それぞれ具体的な成果を上げることができた。(1)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみのメタン発酵について研究は、生ごみの嫌気性発酵に及ぼす有機物負荷(OLR)の影響を評価した。(2)生ごみ処理における中空糸嫌気性膜バイオリアクター操作最適化の研究は、TS 25、20、15および10 g / Lについての持続可能なフラックスは、3.6±0.5、9.3±0.2、10.1±0.4および13.2±0.3LMHであり、これらは連続濾過モードで達成されたものよりはるかに高かった。(3)中温条件におけるAnMBRを用いた生ごみと下水汚泥の混合発酵について研究は、いずれの原料条件でも安定した運転が得られたが、下水汚泥比率の増加に伴い、分解率やメタン生成率が減少したものの、消化液のろ過性が向上し、持続可能ファックスが増加した傾向が見られた。
絶対量計測に基づく比較プロテオミクスによる生体内代謝経路の制御機構の解明

本研究では、複数種の酵母について異なる培養条件でのタンパク質発現量を比較し、種間におけるプロテオームの多様性を解析した。S.cerevisiaeを含めSaccharomycetaceae科に属する8種の酵母のグルコース培地での増殖速度は11.5倍程度しか違いがなかったのに対し、グリセロール培地および酢酸培地では、S.cerevisiaeおよび同属の3種の酵母のほうが属の異なる4種の酵母より増殖速度が23倍遅かった。グリセロールを炭素源としとき、S.cerevisiaeならびに同属の酵母1種(S.mikatae)に対し、属の異なる酵母(K.waltii)において、主にミトコンドリアタンパク質や酸化ストレス応答因子などの発現量に違いがあった。これら一群のタンパク質が種間での増殖速度の差異に関わっていることが示唆され、現在それらの増殖速度への影響を解析している。今年度は、分析試料の多次元分画による絶対定量解析の感度と網羅性の向上に取り組んだ。具体的にはタンパク質レベルおよびペプチドレベルでの分画手法の導入による分析可能タンパク質数の向上を図った。出芽酵母から抽出した総タンパク質を電気泳動で分離後、24個のゲル断片に切り分けゲル内でペプチドに消化し、それぞれをLC-MS/MSにより分析した。また一方で、総タンパク質をペプチドに断片化後、液相の等電点電気泳動により24個の画分に分離し、LC-MS/MS分析に供した。多次元分画の導入により検出されたタンパク質数が約700種類から約3000種類へと増加し、約4倍の解析能力の向上が可能となった。また、解析に用いるタンパク質の量を検討したところ、250μgと750μgとで検出タンパク質数に大差なかったことから、1mg以下のタンパク質で十分であることが分かった。さらに、2種類以上のペプチドが検出されたタンパク質の割合が多次元分画の導入により50%から75%へと向上し、より信頼性の高い解析結果を得ることができた。本タンパク質数(3000種類)はプロテオームの約半数に相当する。また、解糖系、発酵、TCAサイクル、酸化的リン酸化などの代謝経路に関わる約90種類の酵素について、その約90%が検出可能となった。さらに、各タンパク質で検出されるペプチド数も平均して約4倍に増加し、より定量に適したペプチドの選別が可能となった。以上より、代謝関連酵素群の定量解析に必要な感度を有する分析システムを構築することができた。酵母計8種について、グルコース培地とグリセロール培地での増殖速度を計測した。S.cerevisiaeと同属の3種の酵母はグリセロール培地で増殖速度が23倍低下したのに対し、属の異なる4種の酵母では両培地での増殖速度の差異は11.5倍程度であった。そのうちS.cerevisiaeならびに同属の酵母1種(S.mikatae)と、属の異なる酵母1種(K.waltii)について、両培地でのタンパク質発現量の違いを質量分析により計測した。これら3種の酵母について、糖代謝、発酵、TCA回路、電子伝達系、酸化的リン酸化などの代謝に関わる酵素群計147種類のうち、92117個(6280%)のタンパク質について質量分析による検出に成功し、種間ならびに異なる培養条件下での発現量の違いを非標識法により比較解析した。グリセロール培地ではその取り込みに関わる酵素の発現量が多く、一方でグルコーストランスポーターの発現量が低いなど、各炭素源の利用に直接関わるタンパク質発現量の違いが確認された。S.cerevisiaeとS.mikataeでは両培地間で解糖系酵素の発現量に差はみられなかったが、K.waltiiではグリセロール培地で解糖系酵素の発現量が顕著に低下していた。また、グリセロール培地では、S.cerevisiaeとS.mikataeではTCA回路に関わる酵素がより多く発現していたのに対し、K.waltiiではむしろ減少傾向にあった。両培地での増殖速度の差異が小さい酵母(K.waltii)においては、特定の代謝酵素群の発現量を増加させるのではなく、むしろ必要最低限にタンパク質の発現量を抑えることで環境の違いにうまく適応していることが示唆された。一方で、タンパク質の代謝回転速度の計測時に用いる過剰量のアミノ酸について、酵母の生育ならびにタンパク質発現量への影響が少ない濃度範囲を定めることに成功した。以上より、種間で代謝酵素発現量の違いを系統的に比較解析することは、環境変化に適した代謝制御機構を明らかにする有効な方策であることを示すことができた。Saccharomycetaceae科に属する8種の酵母について、グルコース、グリセロール、酢酸、エタノールを炭素源としたときの増速速度を系統的に調べた。

グルコース培地では、調べた8種の酵母の増殖速度の差異は11.5倍程度であった。一方で、呼吸によるエネルギー産生に依存する炭素源であるグリセロール、酢酸、またはエタノール培地では、S. cerevisiaeおよび同属の3種の酵母のほうが属の異なる4種の酵母より増殖速度が23倍遅かった。近縁種どうしで増殖の呼吸依存性に系統的な違いが確認された。次に、S. cerevisiaeならびに同属の酵母1種(S. mikatae)と属の異なる酵母(K. waltii)について、グルコースまたはグリセロールを炭素源としたときのタンパク質発現量の差異を、LC-MS/MSにより比較解析した。グリセロールを炭素源としときにK. waltiiにおいて、TCA回路、酸化的リン酸化、グリオキシル酸回路、補酵素の合成、脂肪酸代謝などに関わる代謝酵素群の発現量が増加していた。また、酸化ストレス応答、ミトコンドリアタンパク質輸送に関わるタンパク質群においても発現量の増加がみられた。増殖の呼吸依存性が高い種において、呼吸代謝やミトコンドリア機能の亢進のみならず、その結果生じる酸化ストレスへの耐性も向上していることが示された。また種が分岐する過程で生じた約450ペアの重複遺伝子について、S. cerevisiaeとK. waltiiで発現量を比較した。発現量が高くなおかつ重複遺伝子間で進化速度の遅い遺伝子は、遺伝子重複が生じたS. cerevisiaeでのタンパク質発現量がK. waltiiの発現量の約半分であった。S. cerevisiaeは遺伝子重複の過程で発現量の負荷を各遺伝子に分散することで進化を遂げてきた可能性が示唆された。2種類の炭素源で培養した3種の酵母について、代謝酵素群の発現量を調べたことで、すでに種間での発現量比較解析から環境応答に適した代謝制御機構の一部が明らかになってきたことは、当初の計画より進展している研究成果である。一方で、より正確な定量計測に用いる標準のデザインと作製が達成できていない点は、やや遅れている。双方を合わせておおむね順調に進展していると判断する。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は解析する酵母の種を拡大するとともに、他の炭素源(エタノールまたは酢酸など)で培養した際の発現量比較解析も実施する。また、炭素源を置換した直後の発現量変化を時系列的に追跡し、環境応答の動態の違いについても解析する。同時に計測条件を確立しつつあるタンパク質代謝回転速度の差異も、複数の酵母間で計測するとともに、これらのデータを統合し、各々の種における特徴的な代謝経路の特定と酵母が有する環境変化への最適な応答機構の解明を目指す。また、より正確な定量計測のための標準について、その系統的なデザイン手法を開発するとともに、高感度・高精度な発現量の比較解析を行う。
発達期における社会的時差ボケが生体リズムの環境適応機構に及ぼす可塑性

近年、一般社会において生活を営む上で、社会的時刻と体内時計に依存した生物学的時刻との間に乖離が生じた、いわゆる「社会的時差ボケ」の健康リスクが提言されている。本研究では、「社会的時差ボケ」の成因機序として“週末の夜更し・朝寝坊"に着目し、平日と週末のスケジュール変移に伴って生じる光環境シフトをシミュレートしてマウス輪回し行動リズムを測定した。規則的な性周期をしめす中年期雌マウスを、1週間毎に環境明暗サイクルをシフトする“社会的時差ボケ"環境下におくことで、規則的だった性周期は消失した。“社会的時差ボケ"サイクルは、若年性成熟期雌マウスの性周期を乱すことはなかった。「社会的時差ボケ」は体内時計の生理的時間と、社会スケジュールの時間が乖離することで生じる。マウス輪回し行動リズム測定を用いた実験により、1週間サイクルのうち、2日間昼夜を模した光に暴露される時間帯を3時間シフトさせる光環境プロトコール下に暴露することにより、消灯時刻(スケジュール上の活動開始時刻)と実際の活動開始時刻(生理的時刻)に乖離が生じることを見出した。この実験環境プロトコールの結果は休日(Free day)明け初日(月曜日)の時差ボケが最大となる「ブルーマンデー」の兆候を示した。さらに慢性的時差ボケプロファイルに作用する主要因子(夜更し・朝寝坊・その変位時間・日数の割り振り)を分析し、体内時計中枢・視床下部視交叉上核の概日リズム変位動態を明らかにした。視交叉上核の動態は、行動測定記録のリズム変位から予測がつくことであり、実際、今年度作成した15分間光パルスに対する輪回し行動リズムの位相反応曲線は、視交叉上核に生じた位相変位を鋭敏に再現したものであった。平日(月・火・水・木・金)と週末(土・日)をシミュレートした1週間光環境サイクル、いわゆる「社会的時差ボケ」スケジュールは、middle-aged期における雌マウスに、性周期不整を引き起こすことを発見した(Takasu et al. Cell Rep. 2015)。雌性生殖機能は加齢と共に減退し、閉経を迎えるまでの移行期には性周期の不整や消失を伴う。概日リズム機能もまた加齢の影響から逃れることはできず、middle-aged期にはすでに自由継続周期の変化、リズム位相の不整、視交叉上核神経出力の減弱がみとめられる。時計遺伝子Cry KOマウスは、自由継続周期に変調をきたしCry1 KOは概日周期の短縮を、Cry2 KOは概日周期の延長を呈するが、24時間周期の明暗サイクルに同調し、野生型と同等の繁殖が可能である。社会的時差ボケ環境下で性周期不整を示す野生型雌性マウスに対し、Cry KO雌性マウスは、本来、妊娠・出産可能な812ヶ月齢期に早期性周期不整を伴う不妊を呈することをみいだした。Middle-aged Cry1, 2 KOマウスに生じる性周期不整と早期不妊は、環境明暗サイクルをマウス遺伝型固有の周期に調整することで劇的に改善された。さらに、社会的時差ボケ時における視床下部・視交叉上核の発光レポーターリズムex vivo記録系により、概日リズム中枢の1週間位相変位動態を記録し、生理機能不全が視交叉上核リズム出力の位相変位に起因するものであるとの結論を得た。以上の結果は、サーカディアンペースメーカーの環境リズムと生理機能タイミングとの調和をはかる重要性、すなわち「生物時計活用戦略」を明示する。また、生殖機能の早期減退が概日リズム機能の加齢変調によって生じるリスクと共に、環境の最適化により早期不妊症を回避できる「サーカディアン戦略」を示唆している。「社会的時差ボケ」と加齢による生殖機能減弱の因果関係は、当初H27年度研究計画にはなかったが、慢性的時差ボケに作用する主要因子の検討が済んでいたため、厳密な結論を得ることができた。「ブルーマンデー」は就学期おいて深刻な問題であり、社会的不適応の一因となり得る。生理機能や行動の概日リズムを制御する体内時計中枢は、視床下部・視交叉上核に存在する。視交叉上核は自律的に約24時間(概日)のリズムを刻み、環境光の変化を入力することで、概日リズムを24時間周期に調整している。本研究では、「ブルーマンデー」の成因・機序を解明するため、光環境を操作し“社会的時差ボケ"モデルマウスを作製した。12時間毎に点灯/消灯する24時間周期の明暗環境条件下でマウス輪回し行動を記録すると、毎日消灯時刻に輪回しを開始する正確な日内行動リズムを示す。

その後、5日間を8時/20時の明暗サイクルに設定し、2日間を11時/23時の明暗サイクルにシフトさせる“週間"サイクル条件に移行した。同条件下での視交叉上核リズム出力動態を明らかにするため視交叉上核にワイヤー電極を挿入し、自由行動下における神経活動記録を行った。視交叉上核の神経活動は明期に高発火頻度/暗期に低発火頻度を示す明瞭な日内リズムを示した。定常の昼:高/夜:低の神経活動は、消灯時刻の3時間遅延時に高発火頻度を維持し、リズム位相の後退を示した。輪回し行動の開始は消灯時刻を20時に戻した34日後に再び消灯時刻と一致し、行動リズムの動態と視交叉上核リズムは一致していた。また、明期の3時間延長と、暗期の延長とを比較すると、明期の延長は視交叉上核リズムの位相後退を引き起こすのに対して、暗期の延長は位相変位を示さなかった。以上より、本実験でシミュレートした週間明暗環境シフトサイクルでは、暗期前半に光曝露されることにより容易に視交叉上核リズム位相の後退が生じ、光環境サイクルの前方シフトに再同調するまでには数サイクルの移行期間が必要となることから、慢性的に“社会的"時差ボケ状態が成立することが明らかになった。当初の研究計画通り、マウス個体行動レベルの測定記録を終え、実験条件の最適化を済ませた。今後2年度に及ぶ研究計画遂行の基盤として十分な成果といえる。最終年度は、「社会的時差ボケ」環境光スケジュールを用い、育成環境の撹乱が生理機能リズム制御神経回路に引き起こす神経可塑性について検討する。環境生理学初年度に確立した「社会的時差ボケ」環境条件プロトコールを用い、育成環境の撹乱が体内時計回路に引き起こす神経可塑性について検討する。神経可塑性は発生発達期の環境因子に依存する。「三つ子の魂百までも」が体内時計にも該当するかを検証する。対照群は光環境12時間明期/12時間暗期の規則正しい飼育環境で交配→妊娠→出産→離乳を経過した雄マウスを用い、実験群は妊娠の成立直後から3週間の胎仔期を社会的時差ボケ条件下で経過し、さらに出生後3週間までの哺育期を同じく社会的時差ボケ条件下で経過した雄マウスを用いる。体内時計機能の可塑性は離乳後より輪回し行動測定系に移し個体行動リズムの機能スクリーニングを行い評価する。また、機能的可塑性が確認された場合、胎仔期(発生期)のみに環境リズム撹乱を付与した条件と、出生後哺育期(発達期)のみ同条件下に置いた場合について個体行動リズム機能を評価する。さらに加齢における光環境の影響を検討する。論文公表後の成果報告のため、旅費の比重が増した。前年度未使用分にて、ほぼ計画使用額と同等になった。研究計画の早期遂行を優先させたため、旅費を計上していた学会の参加を見合わせた。その分、研究補助員の技術指導を行うことができ、次年度以降の研究進展が期待できる。未使用分は研究補助員の謝金に充て、研究の更なる進展をはかる。研究補助員の雇用時間(謝金)が増加することが予想されるため、繰り越し分は謝金に充てる。
口腔癌における低酸素非依存的代謝活性亢進機構の解明

癌細胞は非常に高い増殖活性を示し、低酸素環境下におけるHIF1活性化による糖代謝亢進が深く関与していると理解されてきた。しかし、口腔癌症例でのFDG-PETとFMISO-PETの対比から高度の糖代謝活性を低酸素状態単独では説明しえない症例が存在する。全項目で転移巣に特異的な高発現を確認。HIF1は腫瘍中の低酸素に非依存的な発現パターンを示し、部分的だが糖トランスポーター発現に関与、増殖活性との非常に強い関連が考えられた。本研究のメインテーマである口腔癌の代謝活性化につき重要かつ最終的な意義をもつ臨床情報としてPETデータの蓄積を継続中。研究代表者の帰任後、低酸素PETとしてのFMISO-PET利用も再開した。本研究計画において、最初の柱として規定した臨床腫瘍組織における低酸素非依存的HIF1α活性化に関しては、標本準備を終え、現在は当該標本の染色処理途中である。本作業終了後、データ整理の上、速やかに公表にむけての執筆作業に移行する。研究代表者の短期国内移籍により、上記プロジェクトに遅れが生じ、本年度予定としていた動物実験について、予備実験からの開始が必要だったが、予備実験に関しては本学動物実験委員会の承認を済ませており、必要機器、材料の調達を終えているため、直近での動物実験関連プロジェクト開始を予定している。研究成果の公表に関しては、データ整理を終えた範囲について国際学会および国内複数の全国学会において発表。今後の研究展開の方向性を検討するために有益な情報交換ができた。また情報収集目的に一連の学会参加の中で、多数の施設で腫瘍低酸素関連の研究が進む中、本来、腫瘍低酸素研究の根本事象としての腫瘍内酸素分布の評価は、現実問題として困難であり、詳細な現象論が確立していない現状と理解した。その点において本研究でも、組織中酸素分圧の生体計測の手法により、臨床組織における実測値をもとに評価を予定しているが、その成果に立脚することこそ、本研究の優位性につながるものと考えている。口腔癌臨床情報としてのPETデータ蓄積および解析のための環境整備を終了。しかし、研究代表者の国内短期移籍のため低酸素PET検出試薬として核種プロバイダー施設を必要とするFMISO-PETの利用ができず、当初予定の24年度分の臨床研究を終えることができなかった。25年度の帰任が決定しており、帰任次第、倫理委員会への新たな承認申請のうえ臨床研究開始とともにFMISO-PETの利用再開を予定している。情報収集面では学会レベルでの最近の知見において組織中低酸素染色に使用している低酸素検出プローブと、糖代謝を制御している標的分子HIF1活性化との間に組織中分布、ひいてはそれぞれ必要とする組織中酸素分圧のレンジに差異があることが示唆されるようになってきていることを再確認。臨床研究段階のFMISO-PETでの低酸素検出メカニズムが同一であること考慮すると、研究計画立案にあたり前提条件とした、臨床腫瘍組織中の糖代謝活性および低酸素の検出率の乖離を説明するうえで合理的な概念となりうることを認識した。研究協力者との調整においては事前調整済ではあったが、研究開始を報告のうえ、動物実験にあたっての材料供与につき、動物種、遺伝子改変動物の遺伝情報につき具体的な確認、調整ができた。当初より25年度予定としていた動物実験については材料調達後、予備実験からの新規プロジェクト開始の扱いとなるが、研究代表者帰任の件もあり予定通りの遂行が可能な準備が整った。癌細胞は非常に高い増殖活性を示し、その必要エネルギーは高度に亢進した代謝活性により維持されている。この機構には腫瘍特異的な低酸素環境下における転写因子HIF1活性化による糖代謝亢進が深く関与していると理解され、増殖活性が高い腫瘍ほど中心部に低酸素領域を生じるとされてきた。しかし、臨床において非常に高い代謝活性を示す腫瘍組織において糖質の取り込み活性を利用したFDG-PETでは高率に陽性所見が得られるのに対し低酸素領域を反映するFMISO-PETにおいては、陽性所見の検出率は低くとどまっている。この乖離から高度の代謝活性を低酸素状態単独では説明しえない症例が存在することになり、治療応用を念頭に本研究を開始した。研究期間中、研究代表者の国内移籍、帰任があり当初研究計画より研究着手に時間を要したが、計画した動物実験の予備データ蓄積とともに、研究全体を支える根本的な現象論を確立するため臨床研究を進めた。蓄積されていたFDG-PET、FMISO-PET撮影症例につき、保存されていた病理標本の再評価として2000個を超えるリンパ節標本を検証。75個の転移陽性リンパ節を網羅的に組織染色し転移病巣におけるHIF1発現、増殖活性を示すKi67発現を評価、糖質取り込み活性を推測する目的でGLUT1発現も検討した。結果、全検証項目で転移巣に特異的な高発現が高頻度に確認され、相互の相関が示唆された。

GLUT1に関しては発現パターンからHIF1の関与は部分的であると結論したが、HIF1発現パターンは腫瘍組織中に想定される酸素濃度勾配と関連性は低く、逆に増殖活性との非常に強い関連が考えられた。本検討結果はこれまで報告例の無い現象であり、その新規性から現在、公表にむけての準備中である。口腔癌研究代表者の短期国内移籍により研究計画初年度に予定していたFMISO-PETが使用できなかったが、本年度始めの帰任後に当該研究プロジェクトを再開した。現在は標本準備を終えて、染色等の標本処理の途中である。当初計画中で本年度の予定内容であった動物実験が並行したプロジェクトとなってしまい、予定内容を終了することができなかったが、必要機器、材料の調達を終え、予備実験内容に関して本施設動物実験委員会の承認を済ませているため、直近でのプロジェクト開始を予定している。研究代表者の短期間に限定した国内移籍により、当初研究計画中のFMISO-PETの利用ができなかった点が大きい。しかし、予定以上の情報交換、研究機器および材料調達の調整がすでに済んでおり、予定機器の選定が終了、購入を進めている。25年度には移籍先からの帰任が決定しており、FMISO-PETの利用再開とともに臨床研究を開始予定。さらに、当初予定していた動物実験も開始可能と考えている。臨床データ検討に関し、現在進行中の標本処理が終わり次第、データ整理の上、公表に向け執筆作業に移る。動物実験データに関しては予備実験終了後、本実験に移行するが、当初予定の化学発癌モデルによるデータ収集とともに、倫理委員会での承認後になるが、本学付属病院における臨床研究として強力なサポートデータとなることが期待される、臨床データの蓄積を開始したい。24年度予定であった臨床データの検討を再開。同時に当初から25年度予定としていた動物実験開始を予定している。既に選定を終えている、必要機器の購入を早期に済ませることを優先。動物実験開始にあたり各種消耗品の購入、環境整備にはいる。なお、当初計上していた予算にしたがい情報収集を継続する。