hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床遺伝看護分野の継続教育プログラム開発

本研究は、ARCSモデルとインストラクショナルデザインに基づく遺伝看護教育プログラム作成を開始した。まず教育プログラムの設計を開始した。ADDIEモデルの分析(1.コース情報収集、2.学習者情報収集、3.学習者分析、4.既存教材分析)を開始した。1周産期看護2難病看護3小児看護4がん看護の順に、共通した質問紙とFocus Group Interview調査を実施した。次にプログラムの設計(5.目標と評価項目一覧作成・6.利用可能方策一覧作成・7.方策の選択と設計・8.教授法との統合)と開発(9.教材の選択と開発)にとりかかった。周産期看護領域でプログラムを実施し評価を行った。プログラムを作成するに当たっての手順として、1、現時点での周産期・がん・難病・小児領域の看護職の教育目標(出口)の明確化、2、当該領域の現状(入り口)の明確化、3、そのギャップを埋めるための構造化を図った教育プログラムを作成する。その次に4、教育法略を作成(どのような情報を提示し、どのようなアクティビティを求め、評価を行うかを検討する)、さらに5、学習環境を工夫する。次年度は、周産期(新生児)看護領域とがん看護領域のプログラムを実施するのでそのための事前調査(入り口調査)を開始した。本研究は学習意欲に関連する概念である<注意(Attention)>、<関連性(Relevance)>、<自信(Confidence)>、<満足感(Satisfaction)>の学習の動機づけの4要因ARCSモデルに基づき、上級実践看護職者に対する遺伝看護実践力の向上を目指した教育プログラムを作成することを目的とした。平成27年度は周産期・新生児看護領域から取り掛かった。研究1として周産期・新生児医療の遺伝医療における看護職のケア参加度の実態と、遺伝看護実践能力向上に対する動機と関心度の程度に関する実態を調査した。研究2として周産期・新生児医療における遺伝実践能力(パフォーマンス)を向上させるために取り組むべき課題を調査した。本研究の対象者は日本看護協会ホームページ上に、所属施設を登録しているCNS(2015年10月25日現在49名)、CN(2015年10月25日現在366名)、計415名を対象とした。研究1の測定項目は属性、ID理論とARCSモデル(鈴木,1995)に加え、遺伝カウンセリング、遺伝看護活動を行っている研究者が協議のうえ作成した。項目は現在のCNSおよびCNの遺伝臨床において期待される役割と参加度の実態、遺伝看護実践能力向上に対する動機と関心度の程度に関する内容とした。研究2のインタビュー項目は、1臨床の周産期・新生児期の遺伝学的看護実践活動の中で、CNS・CNがうまく看護実践能力を発揮できていないと感じる状況、2うまく発揮できない原因は何か、3主体的・積極的な看護実践活動をすすめるには何が必要か、の3つの半構成的問いに対して自由に語ってもらった。現在、質問紙回収とFGIのデータ収集は終了した。FGI参加者は15名、質問紙は母性看護CNS25名(51.0%)新生児集中ケアCNは93名(22.4%)を回収した。遺伝看護実践の共通の教育デザインが決定し、それに基づき臨床家の学習意欲とパフォーマンスを挙げる方略と枠組みをつくることができ、各領域の調査を開始する基盤ができた。今後は、周産期看護に続いて難病看護、小児看護、がん看護の調査を同時に進める。現在がん医療における遺伝医療の注目度はアップしており、関連学会が教育体制整備の調査を開始したため、本研究と重複する部分があった。したがって周産期看護に続いて難病看護領域、小児看護領域の調査の準備を先行させることにした。平成28年度は、周産期看護領域、難病看護領域、小児看護領域の質問紙調査とフォーカスグループインタビューを実施し、これらの分析結果に基づくインストラクショナルデザインによる上級実践看護師への遺伝看護教育プログラムの作成を開始した。周産期看護領域の結果:高度実践看護師の現状は、遺伝看護ケアへの関心と重要性に対する認識は高く、やりがいを感じて実施している。しかし、知識や経験不足から自身の実践の評価を行うことができないことへの問題意識を持っていた。次に高度実践看護師に必要と考えるパフォーマンス(実践力)であるが、母性看護専門看護師は1遺伝学的検査、2遺伝性疾患、3遺伝カウンセリング、4妊娠初期の妊婦ケアの意義、5胎児異常の診断を受けた両親へのケア、6先天異常を持つ子供の養育家庭支援、7胎児と死別した両親のグリーフケア、8次子の妊娠へ不安を持つ両親への支援、9看護職者への遺伝看護ケアのサポートであった。また、新生児集中ケア認定看護師が必要と考えるパフォーマンス(実践力)に必要な課題は、1両親・家族をケアするための遺伝リテラシー、2両親が遺伝性疾患を持つ子供を育て始める過程の支援、3遺伝性疾患を持つ子どもの新生児期以降の養育支援、4家族中心のケアのためのシステム構築、5数か月のいのちと予想される子供と親のQOLの質を高めるケアに関する教育であった。周産期看護領域においては、現在、この結果を受けて教育プログラムを作成している。難病看護領域、小児看護領域については、質問紙調査とフォーカスグループインタビューを終えており、現在、現状とパフォーマンス向上のための課題を分析している。平成29年度の日本小児看護学会、日本遺伝看護学会に報告予定である。本研究は、インストラクショナルデザインによる教育プログラム作成を行っている。

この教育設計のプロセスにおいては、まず学習意欲(看護師らが持つ課題への関心すなわち教育を受ける前の状態の把握)と、パフォーマンス(獲得したい実践能力すなわち教育を受けた後の成果)の調査が不可欠になる。この結果をうけて、プログラムを作成、プログラムの実施、評価と続く。周産期看護領域は、学習意欲と目指すパフォーマンスの分析が終了し、研究成果の公表を終え、プログラムを作成中である。難病看護領域ならびに小児看護領域は学習意欲と目指すパフォーマンスの調査を終了し分析を行っている。平成29年に研究成果の公表を行いプログラムを作成する予定である。がん看護領域においては、調査の準備を行っている。難病看護領域および小児看護領域のプロジェクトリーダーが熊本大学、宮崎大学であり、平成28年度の熊本地震による復興にかかわる庶務が加わり、研究を進めるのに困難を要した。このことについては、連携研究者を加え、リーダーの負担を軽減しつつ、進めている。がん看護領域においては、日本家族性腫瘍学会にて看護職に対する調査が先行した関係で、新たな調査の枠組みを行うか、検討する必要があった。現時点では我々の枠組みの調査を実施できる見通しが持てたので平成29年度に実施する予定である。国内の高度実践看護師である専門看護師と認定看護師等を対象とした、臨床専門領域別の遺伝看護教育プログラム開発を試みた。理論枠組みはインストラクショナルデザインのARCSモデルを援用した。学習者の学習意欲を高める方略として、看護師が困難と感じていること(A:注意を向けていること)、どのような成果が得られたら満足できるか(S:満足度)を調査し、それに基づき、R:関連性、C:自信、を高めるプログラムを作成した。周産期看護領域は母性看護専門看護師が、周産期遺伝看護に関する学習意欲を持ち、主体的に遺伝看護実践活動のパフォーマンスが向上するための教育プログラムを作成した。さらに実施し評価を開始している。評価は、遺伝看護教育プログラム前後のCNSの遺伝看護実践活動の過程や学習課題の達成度を分析することにより、教育の効果について評価する。また、学習意欲と動機づけの程度を分析し、作成した教育プログラムの構成について評価する。効果評価は「目標達成度調査(浅野)」と「パフォーマンス調査(Gibbs,1988)」、そして半構造化面接による。構成評価は、動機づけ調査(鈴木,2015)、基礎知識テスト(浅野)、教材評価(CIS)、研修評価(IMMS)である。難病看護領域、小児看護領域は、昨年行った質問紙調査ならびにフォーカスグループインタビュー分析を行い、AとSの部分を公表した。(日本遺伝看護学会誌,16巻2号に掲載)がん看護領域は、質問紙調査とフォーカスグループインタビューを行った。本研究は、ARCSモデルとインストラクショナルデザインに基づく遺伝看護教育プログラム作成を開始した。まず教育プログラムの設計を開始した。ADDIEモデルの分析(1.コース情報収集、2.学習者情報収集、3.学習者分析、4.既存教材分析)を開始した。1周産期看護2難病看護
ミトコンドリア病に対する新規遺伝子治療にむけた基礎的研究

遺伝子治療が困難で対症療法のみにとどまっている致死型ミトコンドリア遺伝子疾患であるMELAS(乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症)に対し、ウィルスベクターを利用しない化学化合物(DNA結合化合物PIポリアミド、発明者:矢野隆光(研究協力者))による新規遺伝子治療を確立することを目標としている。この効果は患者サイブリッド細胞では効果が確認されていた。このため、患者皮膚線維芽細胞を用いてPIポリアミドの効果を培養条件下に確かめることを計画した。平成27年度には茨城県立医療大学倫理委員会の規定に従って3名のMELAS患者および患者対照から皮膚片を採取し、3か月の継代培養を経て皮膚線維芽細胞培養系を樹立した。また、皮膚線維芽細胞を用いたポーラログラフィーによるミトコンドリア機能測定の予備実験を行い、測定系の条件を確立した。しかしながら研究協力者の健康上の理由により実験が中断され、PIポリアミドを添加した細胞培養に至らなかった。平成28年度には新たな研究教職者に依頼し、3種類の異なる濃度のPIポリアミドを添加した細胞培養を1か月間、2回行った。継代培養の際、1週間毎にトリプシン処理をした細胞の一部からDNA抽出キットを用いてDNAを抽出した。そしてPCRを行い、PIポリアミドの効果を検討した。その結果患者皮膚線維芽細胞ではPIポリアミドは遺伝子変異率に対して効果がないことが確認された。また細胞の代謝系に対しての効果を確認するためのマススペクト解析を行うため、細胞培養上清を凍結保存した。平成29年度にはマススペクト解析の予備実験を行い、測定系の条件を確立した。平成30年度には予備実験にて確立した測定条件を用い、実際の患者細胞培養上清のマススペクト解析を行った。今後学会等にて発表を行う予定である。遺伝子治療が困難で対症療法のみに留まっている致死型ミトコンドリア遺伝子疾患であるMELAS(乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症)に対し、ウィルスベクターを利用しない化学化合物(DNA結合化合物PIポリアミド、国際特許出願番号:PCT/JP2012/058957、発明者:矢野隆光(研究協力者))による新規遺伝子治療を確立することを目標としている。この効果は患者サイブリッド細胞で既に確認されている。また、サイブリッド細胞を用いら毒性実験では、細胞機能に影響を及ぼさないことがわかっている。本研究の目標は、患者皮膚線維芽細胞を用いてDNA結合化合物PIポリアミドの効果を培養条件下で確かめることである。この効果が確認された場合、まず患者皮膚線維芽細胞より分化誘導した人工多能性幹細胞(iPS細胞)、並びに筋管細胞を用いて効果を確認し、その後臨床治験をすることを予定している。平成27年度には、MELAS患者及び患者対照から皮膚片を採取し、皮膚線維芽細胞培養系を樹立する。皮膚片採取の際には茨城県立医療大学倫理委員会の規定に従い、患者の同意を得た上で患者の不利益にならないよう皮膚採取時の疼痛および感染対策、その後の情報漏洩対策を行う。皮膚線維芽細胞を3か月継代培養し、培養安定化を得る。その後、PIポリアミド添加培養液を用いた培養を3種類の濃度別に行う。培養の際は適宜トリプシン処理をした後に継代培養をし、細胞密度が70-80%程度を保つようにする。そして初期3か月は2週間毎に、その後6カ月間は1か月毎に、継代培養をする際のトリプシン処理をした細胞の一部を、DNA抽出キットを用いて処理しDNAを抽出する。このDNAは保存し、次年度にPCRを行う際の鋳型とする。同時に次年度のマススペクト解析に用いるため、細胞培養上清を凍結保存する。予定通り3名のMELAS患者から皮膚片を採取し、3か月の継代培養を経て、皮膚線維芽細胞培養系を樹立した。また、皮膚線維芽細胞を用いた、ポーラログラフィーによるミトコンドリア機能測定の予備実験を行い、測定系の条件を検討、確立した。しかしながら研究協力者の健康上の理由によりPIポリアミド添加した細胞培養に至らず、実験の進捗が予定より遅れている。遺伝子治療が困難で対症療法のみに留まっている致死型ミトコンドリア遺伝子疾患であるMELAS(乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症)に対し、ウィルスベクターを利用しない化学化合物(DNA結合化合物PIポリアミド、発明者:矢野隆光(研究協力者))による新規遺伝子治療を確立することを目標としている。このため患者皮膚線維芽細胞を用いてDNA結合化合物PIポリアミドの効果を培養条件下に確かめることを計画した。平成27年度には茨城県立医療大学MELAS倫理委員会の規定に従って3名のMELAS患者および患者対照から皮膚片を採取し、3か月の継代培養を経て皮膚線維芽細胞培養系を樹立した。平成28年度では新たな研究協力者に依頼し、3種類の異なる濃度のPIポリアミドを添加した細胞培養を1か月間、2回行った。その結果、患者皮膚線維芽

細胞ではPIポリアミドは遺伝子変異率に対して効果がないことが確認された。また細胞培養の際、次年度にマススペクト解析を行うため、細胞培養上清を凍結保存した。マススペクト解析に関しては予備実験を行った。平成27年度に研究協力者の健康上の理由により実験が中断され、PIポリアミドを添加した細胞培養に至らなかった。このため全体的に遅れている。遺伝子治療が困難で対症療法のみにとどまっている致死型ミトコンドリア遺伝子疾患であるMELAS(乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症)に対し、ウィルスベクターを利用しない化学化合物(DNA結合化合物PIポリアミド、発明者:矢野隆光(研究協力者))による新規遺伝子治療を確立することを目標としている。この効果は患者サイブリッド細胞では効果が確認されていた。このため、患者皮膚線維芽細胞を用いてPIポリアミドの効果を培養条件下に確かめることを計画した。平成27年度には茨城県立医療大学倫理委員会の規定に従って3名のMELAS患者および患者対照から皮膚片を採取し、3か月の継代培養を経て皮膚線維芽細胞培養系を樹立した。また、皮膚線維芽細胞を用いたポーラログラフィーによるミトコンドリア機能測定の予備実験を行い、測定系の条件を確立した。しかしながら研究協力者の健康上の理由により実験が中断され、PIポリアミドを添加した細胞培養に至らなかった。平成28年度には新たな研究教職者に依頼し、3種類の異なる濃度のPIポリアミドを添加した細胞培養を1か月間、2回行った。継代培養の際、1週間毎にトリプシン処理をした細胞の一部からDNA抽出キットを用いてDNAを抽出した。そしてPCRを行い、PIポリアミドの効果を検討した。その結果患者皮膚線維芽細胞ではPIポリアミドは遺伝子変異率に対して効果がないことが確認された。また細胞の代謝系に対しての効果を確認するためのマススペクト解析を行うため、細胞培養上清を凍結保存した。平成29年度にはマススペクト解析の予備実験を行い、測定系の条件を確立した。平成28年度より新たな研究者に依頼し実験を再開したが、平成29年度中途で退職となり、再び実験の遅れにつながった。
DNA型および血液型を利用した、性犯罪事件の容疑者の特定に関する法医学的研究

1.従前の研究により、我々はヒトデオキシリボ核酸分解酵素(DNaseII)が精液中に存在する遺伝マーカーであることを発見した。今回、ヒトDNaseIIの完全長cDNAおよび遺伝子のクローニングに成功し、その構造を決定した。さらにその遺伝子は第19染色体短腕13.2-13.1領域に位置することを明らかにした。なお、本研究で明らかにされたヒトDNaseII cDNAおよび遺伝子は脊椎動物DNaseIIについて初めて報告された知見であった。2.DNaseIIは活性強度に関する遺伝的多型を示す数少ない酵素の一つであるが、今回その分子論的基盤を確立した。その多型はDNaseII遺伝子の近位プロモーター領域に位置するsingle nucleotide polymorphismに基づく転写活性の変動に起因することが明らかとなった。3.ヒトDNaseIIは成熟型としてheterotrimeric構造を示し、さらに成熟型への変換には固有のsignal peptide、N-glycosylationおよび特定部位におけるcleavageが必須であることを明らかにした。4.DNaseI多型について、新規な対立遺伝子DNASEI^*5および^*6を発見し、その表原型が21種類に分類可能となった。その結果、DNaseI多型の個人識別能がさらに向上した。特に6型酵素は不安定で寿命の短い分子種であった。5.DNaseI多型がコーカソイドおよびニグロイド集団にも認められ、その多型がworld-wideなものであることが明らかとなった。さらに日本人集団においてその対立遺伝子頻度に地理的勾配が見出された。6.STR多型としてHumTOPおよびHumLPLについて個人識別への適用に必須な集団遺伝学的基盤が確立できた。今回得られた研究成果から、DNaseIおよびIIは精液からの有用な個人識別マーカーになることが判明した。精液(斑)などの法医学的試料からの個人識別能を向上させるためには新しい精液からの個人識別マーカーの発見・導入が必須である。本研究では、我々が発見した精液中の遺伝マーカーであるデオキシリボ核酸分解酵素II(DNase II)に関してDNA試料からの型判定法確立のため、ヒトDNase IIcDNA構造の解明を目的とした。Rapid amplification of cDNA end法を用いヒト甲状腺RNAよりDNase IIをコードする完全長cDNAが得られた。全長1593bpのDNase IIcDNAには、16アミノ酸残基のsignal peptide部分、91アミノ酸残基のpropeptide部分および253アミノ酸残基のmature protein部分より構成される全長360アミノ酸残基のポリペプチドをコードする1080bpのopenreading frameが含まれていた。この構造に基づき大腸菌を利用した発現系も確立できた。本研究成果より、DNase IIはheterodimeric構造を有することが確認された。このcDNA構造はリソゾーム酵素であるcathepsin superfamilyのそれに類似していた。さらに、ヒト各臓器についてDNase II活性定量およびRT-PCR分析より、DNase II遺伝子の発現は特定臓器に遍在していることが明らかとなった。ヒトDNase II cDNA構造は、脊椎動物DNase IIについて初めて報告されたcDNA構造である。現在、ヒトDNase IIの遺伝子的多型性の分子論的基盤を解明すべく研究を継続している。有用な個人識別マーカーとして活用されているデオキシリボ核酸分解酵素I(DNase I)型に関して、新しい対立遺伝子や多型部位を発見した。この結果はDNase Iの個人識別能のより一層の向上をもたらした。精液(斑)からの個人識別能を向上させるためには、精液からの新しい個人識別マーカー(遺伝マーカー)の発見およびその個人識別への適応が必須である。本研究では、我々が発見した精液中の遺伝マーカーの一つであるデオキシリボ核酸分解酵素II(DNase II)に焦点を絞り、法医学的応用のための基礎的知見を得ることを目的とした。

DNase II遺伝子は全長6kbに及び、6個のエキソンから構成された。また、3'非翻訳領域には4カ所のpolyadenylation signalが存在しており、それらが作用した少なくとも3種類の鎖長の異なるDNase II mRNA分子種が転写されることを明らかとした。3.ヒト肝臓から精製したDNase IIに関する蛋白質化学的解析から、DNase IIは活性な状態で`non-identical heterotrimeric'な構造をとることをつきとめた。この知見によって初めて哺乳類DNase IIのサブユニット構造が確定した。さらに、deletion mutagenesisによって構築した変異体の動物細胞における発現実験から、活性型DNase IIの形成にはproteolytic processingが必要であることを明らかとした。4.新しい蛍光試薬であるSYBRGreenを用いた感度の高いDNase II活性測定法ならびにアイソザイム解析法を開発した。これによって微量な法医学的試料からのDNase II解析が可能となった。本年度は、我々が発見した精液中の新規な個人識別マーカーであるデオシシリボ核酸分解酵素(DNase)IおよびIIに関して、以下の研究を実施した。1.従前の研究からヒトDNaseIIは活性強度に関する遺伝的多型を示す数少ない酵素であることを見出したが、今回その分子論的基盤を解明した。前年度明らかにしたヒトDNaseII遺伝子構造に基づき、各対立遺伝子におけるプロモーター領域についてtransient transfection luciferase assayによって転写活性を精査した。その結果、近位プロモーター領域に位置するsingle nucleotide polymorphismがプロモーター活性の変動に関与することが判明した。従って、DNaseII多型における活性の強弱は対立遺伝子間の転写活性の変動に基づくDNaseII酵素産生量の相違に起因することが明らかとなった。3. DNaseI多型において新規な対立遺伝子DNASE1^★6を見出した。この対立遺伝子にはエキソン7にC1826T置換が認められ、それに伴いN末端より185番アミノ酸残基のArgがCysに置換されていた。このアミノ酸置換によって構造の安定化に関与する正常なdisulfide結合の形成が妨げられ、不安定な分子種となることが明らかとなった。
量子ドットナノプローブを活用したアミロイド凝集阻害物質の探索とその作用機序の解明

アルツハイマー病をはじめとするアミロイド病は、アミロイドタンパク質の凝集が引き金となり発症するため、その凝集阻害物質は病気の予防や治療に有用である。本研究では最近我々が開発したアミロイドβ(Aβ)凝集阻害物質の微量ハイスループットスクリーニング法(MSHTS法)を活用し、Aβ凝集阻害物質の探索、および作用機序の解明に取り組んだ。また、MSHTS法をAβ以外のアミロイドに拡張するための検討を行った。さらに、神経細胞毒性の高いアミロイドオリゴマーの形成阻害物質の新規スクリーニング法の開発にも取り組んだ。最終年度となる2018年度は、まず、前年度までに予備検討を進めてきたMSHTS法の自動化に取り組んだ。具体的には、自動分注機を用いたサンプル調製法の最適化や、天然物のような様々な色素を含むサンプルでもより定量的に評価することが可能なイメージ取得条件の検討、さらにはこれらを高速で進めるためのシステム全体の最適化を行った。これにより、従来は1名の研究者が一日に10サンプル程度凝集阻害活性評価が可能であったものを、一日250サンプル程度、より正確に評価できるようになった。実際にこの自動化システムを用い、北海道産植物抽出エキス500種類の評価を行い、これらの植物の分類と活性の相関について明らかにした。また、本手法を用い、化合物ライブラリーからの凝集阻害物質の探索、さらにはタウ凝集阻害物質の探索も行った。これらの結果については、国際学術誌に論文として発表すると共に、自動化システムについては特許出願した。加えて、神経細胞毒性が高いアミロイドオリゴマーの大きさを量子ドットナノプローブ集合体の蛍光画像から単粒子解析することで推測する手法を開発し、実際にこの手法を用いて、Aβ凝集阻害活性が知られているポリフェノール類のAβオリゴマー形成阻害活性を評価しポリフェノール間の活性の違いについて比較した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。最近我々は、量子ドットによるアミロイドβ(Aβ)凝集のリアルタイムイメージング法を応用したAβ凝集阻害物質の微量ハイスループットスクリーニング法(MSHTS法)を開発した。本研究ではMSHTS法を活用し、Aβ凝集阻害物質の探索、および作用機序を解明に取り組んだ。我々は、以前シソ科ハーブ系香辛料の一種であるサマーサボリーの活性本体がロスマリン酸であることを報告した。そこで、ロスマリン酸のAβ凝集阻害機構を解明するために、様々なロスマリン酸誘導体を合成し、MSHTS法およびThT法を指標として構造活性相関の解析を行った。これらの成果については学会で発表し、現在国際専門誌に論文を投稿中である。また、これまで高いAβ凝集阻害活性が明らかになっている青ジソの活性本体の探索にも取り組んだ。その結果、複数の活性本体が凝集阻害活性に寄与している可能性が示唆された。今後も活性本体の探索に取り組み、青ジソによるAβ凝集阻害機構を明らかにする予定である。新たなAβ凝集阻害物質の発見を目指し、北海道産植物抽出物ライブラリー(504種類の抽出物)の活性をMSHTS法により評価した。その結果、植物の分類と活性に相関が見られることが明らかになった。この成果については、現在論文発表の準備を進めているところである。Aβ以外のアミロイド凝集についても量子ドットを用いた可視化が可能になりつつある。これまで幾つかのペプチド凝集の可視化に成功しており、タウについては凝集過程の3Dタイムラプス観察や、ロスマリン酸による凝集阻害の様子の直接観察にも成功するなど、先行して研究が進みつつある。初年度に計画していたロスマリン酸のAβ凝集阻害機構の解明については、予定通り誘導体を用いた構造活性相関解析が終了し、現在論文投稿中である。また、この研究を進める際に、低濃度のロスマリン酸がAβ凝集体の形態に影響を与えることが新たに明らかになり、現在その解析を進めているところである。青ジソの活性本体の単離までは終了できなかったが、複数の活性物質が協同的に作用している可能性が明らかになるなど、当初の予定とは異なる状況となったため、それをふまえて次年度以降も研究を続ける予定である。新たな活性本体の発見を目指し、約500種類の植物抽出物を含むライブラリー、約100種の低分子有機化合物を含むライブラリーの解析を終え、学会発表や論文発表の準備を進めている。また、2016年度文科省共通政策課題(基盤的設備等整備分)が年度途中に採択され、自動分注システム、共焦点レーザーシステム、GC-MSを新たに導入することができた。そこで、これまで手動で行ってきた分注作業を自動化することで、MSHTS法の高速化、高精度化に向けた手法の改良を新たに開始した。また、共焦点システムにより凝集体の三次元画像の観察が可能になったため、凝集阻害物質による阻害だけでなく、阻害物質が凝集体の形状に与える影響も解析出来るようになり、新たな情報が得られつつある。このように、MSHTS法については、当初の予定よりシステムの高度化が進んでおり、今後の研究の加速が期待される。

量子ドットを用いたAβ以外のペプチドの凝集過程の可視化についても進みつつ有り、Tauについては新たなシステムを用いて、計画以上の研究の進展が進んでいる。一方で、Aβオリゴマー形成阻害物質の新規スクリーニング法の開発については、計画より若干遅れている。全体としては計画以上に進んでいる部分が多いが、一部遅れているところもあるため、(2)と自己評価した。アルツハイマー病をはじめとするアミロイド病は、アミロイドタンパク質の凝集が引き金となり発症するため、その凝集阻害物質は病気の予防や治療に有用である。本研究では最近我々が開発したアミロイドβ(Aβ)凝集阻害物質の微量ハイスループットスクリーニング法(MSHTS法)を活用し、Aβ凝集阻害物質の探索、および作用機序の解明に取り組んだ。また、MSHTS法をAβ以外のアミロイドに拡張するための検討を行った。初年度に引き続き、ロスマリン酸のAβ凝集阻害機構を解明するため、MSHTS法を用いて様々な酸誘導体を用いた構造活性相関の解析を行い、国際学術誌に論文発表した。我々はこれまでに紫蘇の高いAβ凝集阻害活性を明らかにしてきた。そこで、本研究では様々な品種の紫蘇を栽培し、その凝集阻害活性を比較したところ、品種によって活性に違いがあることが明らかになった。北海道白糠町に生息する植物約200種のライブラリーを自ら作成し、そのAβ凝集阻害活性を評価した。その結果、植物の分類と活性に相関があることを明らかにした。Aβ以外のアミロイド凝集のうち、タウとαシヌクレインの凝集体を量子ドットナノプローブを用いて可視化することに成功した。タウに関しては、ロスマリン酸や分子シャペロンによる凝集阻害の様子を3D観察することにも成功した。また、画像解析により、凝集阻害活性を50%効果濃度として数値化することも可能になった。MSHTS法の自動化に向けた条件検討を行った。自動分注機による混合条件の検討により、Aβ凝集阻害活性の評価の際、Aβと阻害物質の混合条件が阻害活性に大きく影響することが明らかになった。また、自動撮影システムを用い、蛍光顕微鏡による最適画像取得条件の検討を行った。以上の成果を融合し、MSHTS法の自動化システムを構築した。ロスマリン酸誘導体を用いたロスマリン酸によるAβ凝集阻害機構については、詳細な検討を終え、論文をpublishすることができた。Aβ以外のアミロイドの凝集の可視化として、これまでにタウとαシヌクレインの可視化に成功しており、分子シャペロン等による凝集阻害の様子の観察や、阻害活性の数値化も可能となった。様々な品種の紫蘇や、自ら作成した北海道白糠町産植物ライブラリの評価、MSHTS法の自動化については、計画に含まれていない研究であり、計画以上に研究が進展しているといえる。以上、当初の計画についてはほぼ順調に進捗していること、また、計画以上の進展も見られたことから、現在時点では、(1)当初の計画以上に進展していると判断した。
粉雪雪崩の二次元数値シミュレ-ション手法の開発

本研究の目的は三次元的な地形の影響を考慮した粉雪雪崩の平面二次元数値シミュレ-ション手法を開発することにある。まず、空気中の粉雪雪崩を淡水中の塩水による密度フロントで置き換えた模擬実験を行った。実験では、幅広の水槽を用いて、密度フロントの三次元的な広がり特性を把握した。この実験結果を研究代表者が開発した雪崩の一次元モデルに反映させ、雪崩の走路を含めて解析できる二次元数値シミュレ-ションモデルを開発した。粉雪雪崩の三次元的な流動特性を知るため、雪崩を淡水中の塩水による密度フロントで置き換えた模擬実験を行なった。まず基本となる斜面勾配が一定な場合の密度フロント(あるいはサ-マル)の横方向の広がり特性、形状の変化特性、周囲水の連行特性を調べた。雪崩による底面からの巻き上げ、沈降特性を明らかにするため、既往の文献調査を行い、底面からの巻き上げと雪粒子の粒子径、密度などの粒子特性および底面でのせん断応力との関数関係を明らかにした。密度フロントに関する以上の実験成果を基に、研究代表者が提案している粉雪雪崩の一次元解析モデルを拡張・発展させ、二次元解析モデルを構築した。このモデルは流体力学的モデルであり、空気と雪の収支式、雪崩の流下方向の運動量方程式、乱れエネルギ-方程式で構成される。これに加えて、二次元モデルでは、斜面に対して直角2方向の運動量方程式を考慮した。このことにより、従来の一次元モデでは考慮されなかった地形の影響を考慮し、雪崩の走路をも解析できる手法が開発した。上述のモデルを実験室での模擬雪崩の実験結果と比較し、二次元モデルの妥当性を検討し、さらにモデルの改良を行った。粉雪雪崩の二次元解析モデルを実際に起こった表層雪崩に適用し、地形条件を入力として与え数値解設析をおこなって雪崩の走路、到達距離などの比較からモデルの妥当性を検討した。
卵巣癌の微細環境決定因子としてのTGF-β1結合蛋白と悪性度の評価

卵巣癌などの早期発見が難しい癌は悪性化しやすく,予防や早期診断に有効な指標も確立していない。我々は近年増加している卵巣癌において,良性腫瘍と比べて悪性卵巣癌で発現量が増加または減少する遺伝子を検出し,卵巣癌特異的にTGF-B1(Transforming Growth Factor-β1)と,その結合蛋白LTBP-1L(Latent TGF-βBinding Protein-1L)が過剰に発現していることを見い出してきた。そこで本課題ではLTBP-1Lの過剰発現を引き起こすメカニズムの解析と,卵巣癌の悪性度との相関についての解析を行った。昨年度までに,癌で過剰発現するLTBP-1Lの活性化機構には転写レベルでの制御が最も重要であり,LTBP-1Lゲノムプロモーター領域に見い出した2ケ所の遺伝子多型(SNPs)が発現上昇に深く関与することを明らかにした。これは,この領域に結合する転写因子との結合力が高まるためであり,実際に活性が強い遺伝子型プロモーターには転写因子が多く結合していることをつきとめた。本年度は多くの卵巣癌臨床症例において遺伝子型を調べ,遺伝子型ごとのLTBP-1L蛋白発現量を比較すると共に臨床データとの関与を解析した。その結果,転写活性が高い遺伝子型症例では蛋白の発現量も高く,さらに興味深いことに他の遺伝子型症例に比べて生存率が有意に低いことが明らかになった(T Higashi et al. J Mol.Diagn. in press)。一方,癌症例と健常者で比較すると遺伝子頻度に有意な差がなかったため,この多型は卵巣癌のかかりやすさには影響せず,多型によるLTBP-1L蛋白の過剰発現が,癌の進行に関与していると考えられた。今後,悪性化のリスクファクターとしてのLTBP-1L蛋白の寄与を明らかにすることにより,LTBP-1Lを標的とした新たな診断や治療法の可能性について検討していく必要がある。[研究目的]女性のライフスタイル変化や,社会問題化している内分泌撹乱化学物質は卵巣癌のリスクファクターであり,卵巣癌は近年増加傾向にある。TGF-β1(transforming growth factor β1)は多くの癌細胞において発現増加し,予後の悪さと相関するが,なぜ発現増加に至るのか未だ不明である。我々は過剰発現するTGF-β31を細胞外へ分泌するキャリアー蛋白LTBP-1(latent TGF-βbinding protein1)に注目し,卵巣癌組織でLTBP-1の2種類のサブタイプLTBP-1S(short)とLTBP-1L(long)のうちLTBP-1LのみがTGF-β1と同時に顕著に発現増強していることを初めて見いだした。本研究課題ではLTBP-1L発現増強メカニズムやその生理学的意義の解明を目的として,プロモーター領域の解析を行った。[方法と結果]両サブタイプのプロモーターについて5'端から順に配列を欠失させた遺伝子断片をレポーター遺伝子発現ベクターに組み込んだプラスミドを構築し,プロモーター活性を調べたところ,LTBP-1Lプロモーターのみで活性が見られ,転写活性化に必要な領域を約300bpの範囲に特定した。さらにシークエンス解析により,この活性化領域内と領域より下流の5'非翻訳領域内に癌組織特有の一塩基変異が同時に検出されることを見いだした(未発表)。[考察]LTBP-1SとLTBP-1Lの発現調節は転写レベルで調節されていることが明らかになった。LTBP-1Lプロモーターの転写活性化領域内で癌組織特有に検出された2つの変異がLTBP-1L発現増強や疾患に関与している可能性が示唆された。これらの変異と転写調節因子の関与についてさらに調節機構を明らかにしていく。LTBP-1Lプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子上流に組み込んだレポーター遺伝子を用いて,変異の有無による転写活性変化を測定した。その結果,変異導入により転写活性が著しく上昇することが確認された。変異を含む遺伝子配列に特異的に結合する転写因子をゲルシフトアッセイにより同定し,この因子を強制共発現させると,さらに転写活性が上昇することが確認された。また,実際に卵巣癌臨床症例組織において,多くの症例で変異が起こり,蛋白発現とも相関することを検出した。これらのことから、癌で過剰発現するLTBP-1Lの活性化機構には転写レベルでの制御が最も重要であり,遺伝子変異が発現上昇に深く関与することを明らかにした。今後はさらに多くの症例において遺伝子型と臨床データとの相関を解析し,発癌および悪性化のリスクファクターとしてのLTBP-1蛋白の寄与を明らかにすると共に、診断マーカーとしての有用性を検討していく。

これは,この領域に結合する転写因子との結合力が高まるためであり,実際に活性が強い遺伝子型プロモーターには転写因子が多く結合していることをつきとめた。本年度は多くの卵巣癌臨床症例において遺伝子型を調べ,遺伝子型ごとのLTBP-1L蛋白発現量を比較すると共に臨床データとの関与を解析した。その結果,転写活性が高い遺伝子型症例では蛋白の発現量も高く,さらに興味深いことに他の遺伝子型症例に比べて生存率が有意に低いことが明らかになった(T Higashi et al. J Mol.Diagn. in press)。一方,癌症例と健常者で比較すると遺伝子頻度に有意な差がなかったため,この多型は卵巣癌のかかりやすさには影響せず,多型によるLTBP-1L蛋白の過剰発現が,癌の進行に関与していると考えられた。今後,悪性化のリスクファクターとしてのLTBP-1L蛋白の寄与を明らかにすることにより,LTBP-1Lを標的とした新たな診断や治療法の可能性について検討していく必要がある。
ゲノム編集技術を利用した神経分化関連転写因子MIBP1の機能解析

MIBP1(HIVEP2)遺伝子はDNA結合ドメインとしてZincフィンガーを持つ巨大転写因子をコードしている。本研究は、ゲノム編集により転写因子MIBP1(HIVEP2)にエピトープタグ配列を挿入し、タグ配列に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降-シーケンスを行う方法(CETCh-seq法)を確立し、MIBP1の転写因子としての機能、特に脳神経系での標的遺伝子を解明することを目指している。本年度は、ゲノム編集を行うために作製した2種類のプラスミド(CRISPRガイドRNAおよびCas9を発現するプラスミド、エピトープタグ挿入用ドナープラスミド)を導入した培養細胞(HT1080線維肉腫細胞およびHCT116大腸がん由来細胞)の解析を行った。薬剤耐性により選択したクローンをPCRおよびシーケンス解析することにより、MIBP1遺伝子の末端に相同組換えによりFLAG配列がノックインされたクローンを選別した。HT1080由来のクローン(HT1080-M5)、HCT116由来のクローン(HCT116-M15)においてそれぞれ片側のアレルにのみノックインが検出された。それらの細胞をウエスタンブロット解析することにより、全長約270 kDのMIBP1-FLAG融合タンパク質の発現を確認した。また、抗FLAG抗体を用いて融合タンパク質を免疫沈降できることを確認した。以上のようにクロマチン免疫沈降(ChIP)を行うための条件検討を進めている。また一方で、公共データベース等に登録されている高速シーケンサーを利用した遺伝子発現解析の結果をもとに、MIBP1の機能についての情報学的解析を行っている。昨年度行ったHT1080細胞を用いた実験でゲノム編集によるノックインの効率が予想より低かったため、本年度新たにHCT116細胞のゲノム編集を行った。しかし、薬剤耐性のクローンは多数得られたが、相同組換えにより目的通りのノックインを起こしているクローンの割合は低かった。CETCh-seq法の原著では、薬剤耐性に基づいて選択したプールの細胞を使用することを推奨しているが、今回の実験で得られたプールでは目的のノックイン細胞以外の割合が多くなる可能性があるため、方針を変更してプールではなく個々の細胞を解析することにした。また、HT1080-M5とHCT116-M15について、ウエスタンブロット解析によりMIBP1-FLAG融合タンパク質が安定に検出される条件を見出すのに時間がかかった。これはMIBP1タンパク質が分解されやすい性質を持つためではないかと考えている。転写因子MIBP1の末端に相同組換えによりFLAGエピトープタグがノックインされた細胞をを用いてMIBP1タンパク質結合部位の探索を行う。具体的には、FLago抗体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)を行い、次に超並列型シーケンサーを用いてChIPにより回収されたDNAの配列解析(ChIP-seq解析)を行う。これによりMIBP1が結合する遺伝子群を同定する。また、並行して、神経系の細胞分化とMIBP1の発現誘導の関係を検討し、脳神経系での標的遺伝子を解明するために適切な細胞系にCETCh-seq法を応用する。本年度は、CRISPRガイドRNAおよびCas9を発現するプラスミド(PX458にCas9のターゲット配列としてMIBP1遺伝子終止コドン近辺の配列を挿入し、ガイドRNAとして発現されるようにしたもの)、およびエピトープタグ挿入用ドナープラスミド(pFETCh_Donorにホモロジーアームを挿入したもの)を構築した。ホモロジーアームとはドナープラスミドのエピトープタグ挿入用カセットの両側に挿入される相同組換えを起こさせるために必要な配列で、本研究ではMIBP1遺伝子の終止コドン周辺の約2 kbの配列に相当する。この配列を、ゲノム編集の対象となるヒトHT1080細胞のDNAからPCRにより増幅し、シーケンス解析を行った。ヒトゲノム参照配列と1か所のSNP以外は完全に一致することが確認できたので、これらの配列をIn-FusionクローニングによってpFETCh_Donorプラスミドに挿入した。つぎに、作製したこれら2種類のプラスミドをリポフェクション法によりHT1080細胞に導入した。このプロトコールでは、相同組換えが起きた場合にG418に対し薬剤耐性を示すようになるはずであるが、実際に薬剤耐性を獲得したクローンが得られた。現在、それらの細胞を解析し目的通りにMIBP1タンパク質のC末端にFlagタグが挿入されているかどうかの検討を行っている。CETCh-seq法は2015年にMendenhallらにより開発された方法であるが、その後、新しい手法も次々に開発されている。より着実な成果が得られる方法はないかと考え、情報収集を行ったため、検討に時間がかかった。しかし、最終的にはプロトコールが確立している点などを考慮して当初の予定通りMendenhallらの方法を採用し、彼らのグループのプラスミドを入手して、MIBP1遺伝子ゲノム編集用のプラスミド構築を行った。

本研究は、ゲノム編集により転写因子MIBP1(HIVEP2)にエピトープタグ配列を挿入し、タグ配列に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降-シーケンスを行う方法(CETCh-seq法)を確立し、MIBP1の転写因子としての機能、特に脳神経系での標的遺伝子を解明することを目指している。本年度は、ゲノム編集を行うために作製した2種類のプラスミド(CRISPRガイドRNAおよびCas9を発現するプラスミド、エピトープタグ挿入用ドナープラスミド)を導入した培養細胞(HT1080線維肉腫細胞およびHCT116大腸がん由来細胞)の解析を行った。薬剤耐性により選択したクローンをPCRおよびシーケンス解析することにより、MIBP1遺伝子の末端に相同組換えによりFLAG配列がノックインされたクローンを選別した。HT1080由来のクローン(HT1080-M5)、HCT116由来のクローン(HCT116-M15)においてそれぞれ片側のアレルにのみノックインが検出された。それらの細胞をウエスタンブロット解析することにより、全長約270 kDのMIBP1-FLAG融合タンパク質の発現を確認した。また、抗FLAG抗体を用いて融合タンパク質を免疫沈降できることを確認した。以上のようにクロマチン免疫沈降(ChIP)を行うための条件検討を進めている。また一方で、公共データベース等に登録されている高速シーケンサーを利用した遺伝子発現解析の結果をもとに、MIBP1の機能についての情報学的解析を行っている。昨年度行ったHT1080細胞を用いた実験でゲノム編集によるノックインの効率が予想より低かったため、本年度新たにHCT116細胞のゲノム編集を行った。しかし、薬剤耐性のクローンは多数得られたが、相同組換えにより目的通りのノックインを起こしているクローンの割合は低かった。CETCh-seq法の原著では、薬剤耐性に基づいて選択したプールの細胞を使用することを推奨しているが、今回の実験で得られたプールでは目的のノックイン細胞以外の割合が多くなる可能性があるため、方針を変更してプールではなく個々の細胞を解析することにした。また、HT1080-M5とHCT116-M15について、ウエスタンブロット解析によりMIBP1-FLAG融合タンパク質が安定に検出される条件を見出すのに時間がかかった。これはMIBP1タンパク質が分解されやすい性質を持つためではないかと考えている。ゲノム編集用のベクターを培養細胞にトランスフェクトして薬剤耐性となったクローンから、転写因子MIBP1の末端に相同組換えによりFlagエピトープタグがノックインされた細胞を選び、これを用いてMIBP1タンパク質結合部位の探索を行う。具体的には、Flag抗体を用いたクロマチン免疫沈降(ChIP)を行い、次に超並列型シーケンサーを用いてChIPにより回収されたDNAの配列解析(ChIP-seq解析)を行う。これによりMIBP1が結合する遺伝子群を同定する。また、並行して、神経系の細胞分化とMIBP1の発現誘導の関係を検討し、脳神経系での標的遺伝子を解明するために適切な細胞系にCETCh-seq法を応用する。転写因子MIBP1の末端に相同組換えによりFLAG
Nd-Fe-B系磁石のナノ構造制御による保磁力機構解明と高保磁力磁石の研究開発

【目的】本研究では、薄膜技術を用いNd_2Fe_<14>B/Nd-richモデル界面を作製し、Nd-rich相の酸化状態と界面組織ならびに保磁力との関連を調べている。本年度はNd-rich相の酸化状態を変化させ、界面に出現する各種Nd-rich相の存在割合を定量的に調べ、Nd-rich相の相変化ならびに組織変化が保磁力に及ぼす影響を調べた。【実験方法】UHVマグネトロンスパッタリングにてNd-Fe-B層を成膜した。Nd-Fe-B層を低真空雰囲気下(O_2濃度0.02Vol.ppm)またはArガス雰囲気下(O_2濃度2Vol.ppm)で保持することで酸化処理し、250-650°Cで60分間熱処理した。最後にTaキャップ層を成膜した。【結果】1.Arガス雰囲気下で酸化処理後、350°Cで熱処理すると保磁力は未酸化(as-depo.)試料の約20%まで低下したが、このときNd_2Fe_<14>B/Nd-rich界面にはhcp Nd_2O_3相の存在割合が高かった。一方、650°Cで熱処理すると保磁力はas-depo.試料と同等の値まで回復した。このとき非平衡相であるアモルファス相などが界面に支配的であることを定量的に明らかにした。2.酸素濃度の異なる雰囲気下でNd-Fe-B薄膜を酸化処理した場合の熱処理に伴う保磁力と組織の変化の違いを調べた。酸素濃度の低い低真空雰囲気下で酸化した試料では、350°Cでの熱処理に伴う保磁力の低下が抑制された。このとき、Nd_2Fe_<14>B/hcp Nd_2O_3界面の形成が抑えられている事が明らかとなった。一方、酸化条件によらず、650°Cで熱処理すると保磁力は回復し、界面には非平衡なNd-rich相が支配的に存在することを定量的に示した。さらに、この非平衡なNd-rich相中にはNdだけでなくFeも含まれていることを明らかにした。3.以上より、高保磁力型Nd-Fe-B焼結磁石の実現には界面にhcp Nd_2O_3相の形成を抑えるように酸素含有量を低減することが重要であると言える。また、650°C近傍で熱処理するとNd-Feからなる液相が出現し、その液相がNd_2Fe_<14>B/hcp Nd_2O_3界面に侵入することでNd_2Fe_<14>B相表面の格子の乱れを修復して保磁力が回復したと考えられる。さらに冷却後に界面に出現する非平衡相(アモルファス相)が、Nd_2Fe_<14>B相とhcp Nd_2O_3相を分断することも保磁力回復の一因と考えられる。【目的】近年、Nd-Fe-B系焼結磁石の保磁力向上が求められている。そのためには本系磁石の保磁力機構の解明が求められている。そこで本研究では、薄膜技術を用いNd_2Fe_<14>B/Nd-richモデル界面を作製し、Nd-rich相の酸化状態と界面組織ならびに保磁力との関連を調べている。【実験方法】超高真空マグネトロンスパッタリング装置を用いてMgO基板上に成膜したTaバッファ層上にNd-Fe-B層を成膜した。Nd-Fe-B層をArガス雰囲気下(O_2濃度2Vol.ppm)で保持することで酸化処理し、250-650°Cで60分間熱処理した。2.酸化後に350°Cで熱処理を施すことで、保磁力はas-depo.試料の20%程度まで低下することが分かった。この試料において、界面にはhcpNd_2O_3相がNd-rich相として出現しており、さらにNd_2Fe_<14>B相表面に格子の不連続部分が観察された。Nd-Fe-B系磁石の保磁力機構は逆磁区の核生成型であると言われていることから、上述したNd_2Fe_<14>B相における格子の不連続部分の形成が保磁力低下の要因であることが示唆された。3.酸化後に650°Cで熱処理を施した試料では、保磁力はas-depo.試料のそれとほぼ同等の値まで回復した。この試料において、界面にはアモルファス相ならびにC-Nd_2O_3相がNd-rich相として出現していることが明らかとなった。アモルファス相ならびにC-Nd_2O_3相はNd-O二元系平衡状態図上には存在しないことから、非平衡相であると考えられ、Nd_2Fe_<14>B/非平衡相界面ではNd_2Fe_<14>B相表面は平坦であった。これら非平衡なNd-rich相の出現は650°Cでの熱処理中に液相が出現したことを示唆しており、その液相が冷却された結果、アモルファス相などが形成されたものと予想される。

本年度はNd-rich相の酸化状態を変化させ、界面に出現する各種Nd-rich相の存在割合を定量的に調べ、Nd-rich相の相変化ならびに組織変化が保磁力に及ぼす影響を調べた。【実験方法】UHVマグネトロンスパッタリングにてNd-Fe-B層を成膜した。Nd-Fe-B層を低真空雰囲気下(O_2濃度0.02Vol.ppm)またはArガス雰囲気下(O_2濃度2Vol.ppm)で保持することで酸化処理し、250-650°Cで60分間熱処理した。最後にTaキャップ層を成膜した。【結果】1.Arガス雰囲気下で酸化処理後、350°Cで熱処理すると保磁力は未酸化(as-depo.)試料の約20%まで低下したが、このときNd_2Fe_<14>B/Nd-rich界面にはhcp Nd_2O_3相の存在割合が高かった。一方、650°Cで熱処理すると保磁力はas-depo.試料と同等の値まで回復した。このとき非平衡相であるアモルファス相などが界面に支配的であることを定量的に明らかにした。2.酸素濃度の異なる雰囲気下でNd-Fe-B薄膜を酸化処理した場合の熱処理に伴う保磁力と組織の変化の違いを調べた。酸素濃度の低い低真空雰囲気下で酸化した試料では、350°Cでの熱処理に伴う保磁力の低下が抑制された。このとき、Nd_2Fe_<14>B/hcp Nd_2O_3界面の形成が抑えられている事が明らかとなった。一方、酸化条件によらず、650°Cで熱処理すると保磁力は回復し、界面には非平衡なNd-rich相が支配的に存在することを定量的に示した。さらに、この非平衡なNd-rich相中にはNdだけでなくFeも含まれていることを明らかにした。3.以上より、高保磁力型Nd-Fe-B焼結磁石の実現には界面にhcp Nd_2O_3相の形成を抑えるように酸素含有量を低減することが重要であると言える。また、650°C近傍で熱処理するとNd-Feからなる液相が出現し、その液相がNd_2Fe_<14>B/hcp Nd_2O_3界面に侵入することでNd_2Fe_<14>B相表面の格子の乱れを修復して保磁力が回復したと考えられる。さらに冷却後に界面に出現する非平衡相(アモルファス相)が、Nd_2Fe_<14>B相とhcp Nd_2O_3相を分断することも保磁力回復の一因と考えられる。