hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
看護基礎教育における家族看護学教育プログラムの開発と評価

そして他領域での学習と統合されて、臨地実習での家族看護の実践に発展していたことが明らかとなった。本年度は家族看護学教育プログラム開発に着手する計画としていたが、ヒアリング対象者との日程調整に時間を要したことや、現状分析がまだ不十分であったことから、教育プログラム開発にまで至っていない状況であり、進捗状況はやや遅れている。平成29年度は、家族看護学教育プログラムを開発し、評価をしていく予定であったが、前年度に実施した家族看護学の教育者からのヒアリングについて、対象者のバリエーションを増やし、より広くデータを収集する必要があり、3名追加し計13名のインタビューデータを得て分析した。教育者は試行錯誤しながら、家族看護の教育内容、教育手法を考え、卒業時の到達目標に向けた教育に取り組んでいたが、家族看護を専門とする教育者と、大学の事情により担当している教育者では、課題や困り事は異なっており、教育者のモデルも必要としていた。本研究の結果については、一部を第13回国際家族看護学会で発表した。平成30年度の日本家族看護学会学術集会においても発表予定である。また、全国の看護系大学の家族看護学に特化した科目のシラバスについて調査し、シラバスからみた看護学士課程の家族看護学教育の現状について、日本家族看護学会学術集会において発表した。現在6割以上の大学で教育はされているが、学内の教育者の不足やオムニバス形式による教育の一貫性の課題などが明らかになり、まずは1単位、8回程度の授業に含めるべき教授内容を明確にする必要性が明らかとなった。なお、本研究については論文化に向けて取り組んでいる。平成27年度に実施した家族看護学の講義を受けた学生へのフォーカスグループインタビューについて、時間経過と学習の積み重ねの視点から再分析を行い、家族看護学の学習に必要な内容として、学生が当事者として考えられる教育の機会の重要性が明らかになった。本研究も論文化に向けて取り組んでいる。平成29年度は、家族看護学教育プログラムの実施と評価を予定していたが、家族看護学教育の現状についてより明確にする必要があったため、インタビュー対象者の増員、シラバス調査と研究を拡大する必要があり、研究計画段階の予定よりもやや遅れている状況にある。そのため、研究期間は1年間延長した。平成30年度は、前年度までに実施した研究、家族看護学を受講した学生の学びについてのグループインタビュー、看護系大学の家族看護学の教育者からのヒアリング、家族看護学に特化した科目のシラバス調査および文献検討の研究結果に基づき、家族看護学の教育プログラムを考案し、8名の看護学教育者から専門的な評価を得た。考案したプログラムの概要は、看護師が家族に問題が生じていると考えている事例から、その家族の歴史のストーリーを作成するグループワークである。グループワークを通して、家族の関係性や役割等について過去から現在にかけて理解を深め、同時に自己の家族観にも目を向けることをねらいとする。さらに、その事例の家族の強みを考え、複数の家族員に対して考えた問いかけを模擬的に実践する要素も含めた。
胎児新生児期の栄養環境がもたらす活性酸素・NOストレスと生活習慣病発症との関連性

出生前のアディポサイトカインレベルと生後の体格との関連性、その後の肥満小児における酸化ストレス等について詳細に検討した。さらにラットの生後発達と摂食調節物質の遺伝子発現について研究した。また、脂肪細胞を培養し、TNFα等でNOやMCP-1産生等とこれらに対する薬剤の効果を検討し、さらにモデルでの研究を進めている。研究の過程で直面した小児の肥満判定法の問題点についても明らかにし、広く発表した。まず、生体内の酸化ストレスの基本データとして、肥満小児における血中イソプロスタン濃度を測定し、非肥満対照とそのレベルを比較した。血中イソプロスタン値に男女差ならびに年齢との相関はなく、肥満児は対照の3倍以上高値であり、腹囲および体脂肪率、脂質値やインスリン抵抗性指標と有意に相関した。また、内臓脂肪面積と良好な正相関を示し、肥満合併症および肥満症スコアが高値になるに従い高値となる結果を得た。すなわち、小児でも肥満によって脂肪組織での酸化ストレスが高まり、メタボリックシンドローム(MS)の一因になる可能性が示唆された。この結果は論文として発表できた。また、血中Brain-derived neurotrophic factorレベルについて検討した。この値が男女ともに特に高度肥満やMSを呈する場合に低値となることが明らかとなった。また、血中ビスファチン濃度および出生体重との関連性が高いことも判明した。また、ラット視床下部でのNesfatin-1(脂肪組織と視床下部の両方に発現する脳脂肪細胞系の新規摂食抑制蛋白)遺伝子発現について検討した。出生した仔ラットの脳を1,8,15,22,40および60日目に摘出して凍結切片を作成し、視床下部室傍核・視索上核・弓状核でのNesfatin-1遺伝子発現をIn situハイブリダイゼーション法で解析した。その結果、Nesfatin-1遺伝子発現は生後発達過程においてそれぞれ特異的な発現動態のパターンを呈し、それぞれの部位における生理作用に密接に関連している可能性が示唆された。これらの成績をもとに、胎児・新生児期の栄養とDoHaDに関わる研究を動物実験や脂肪細胞レベルからみる研究を開始している。また、臨床に直結する小児のBMIパーセンタイル値による肥満判定法についても研究している。肥満のみで酸化ストレスが高まる可能性が報告され、我々は肥満小児で検討し、21年度に小児でも酸化ストレスが高まるデータを論文として発表した。22年度は研究目的と研究計画にも示したとおり、基礎的研究として、3T3-L1培養脂肪細胞を用いた実験を行い、エンドトキシンやTNF-αなどサイトカインの添加で誘導型NO合成酵素が誘導されNOが産生されることとそれに伴って酸化ストレスが高まること、さらにMCP-1産生などに変動が生じる基礎的結果を得た。また、培養環境(低アミノ酸の栄養状態)で成育に差が生じる結果も得ている。これらを組み合わせ、されに確実な成績を出すように実験を続けている。また、新しい摂食調節物質である脳由来神経栄養因子(Brain-derived neurotrophic factor)レベルについて検討を継続し、高度肥満で低下するこの物質が出生体重と有意な正相関することが見出された。この結果について論文を作成中である。また、動物実験を行いNesfatin-1の出生後からの発現変動などについても特に初期の栄養環境の問題として引き続き検討している。さらに、臨床研究の観点から小児生活習慣病に直結する問題として、小児の体格判定法としてのBMIパーセンタイル値を用いた方法に問題が生じることが判明し、それを明らかにし、広く発表していくことを22年度の研究目的の1つとしてあげた。BMIパーセンタイル法と標準体重を基にする肥満度法とを直接対比させ、一般にも判りやすいかたちで成績を学会などを通して情報発信した。これは極めて重要な問題であるので新たに論文としてまとめ現在投稿している。海外で広く使用されている性別年齢別BMIパーセンタイル法は、日本でもその使用が検討されつつあったが、学童で使えないことを提言できたことは日本の医学を正しい道に進める手助けになったと自負している。前年度に引き続いて、3T3-L1細胞で、TNFαによるMCP-1産生などを検討した。分化させない、前駆脂肪細胞と分化させた後の成熟脂肪細胞どちらにおいても、TNFαの濃度依存的にMCP-1産生は増加した。この産生増加に対して、抗高脂血症剤(PPARα活性化剤)であるゲンフィブロジル、抗酸化作用も有するプロブコール、抗糖尿病薬でありAMPK活性化作用のあるメトホルミンなどの効果を検討した。成熟脂肪細胞においては、アディポネクチンやPAI-1、レプチンなどのアディポサイトカイン産生量の変動についても調べた。これらの薬剤がTNFαシグナルを部分的に阻害し、すなわち酸化ストレスを低減させる結果を得たので、現在、発表に向けて計画している。また、IUGRのモデルラットや出生後の栄養障害モデルなどを作成して、仔ラットの脂肪組織の代謝変化についての検討も開始した。今後さらに研究を継続することにしている。

臨床的な観点からは、将来の生活習慣病発症、DOHaDとの関係から新生児期のアディポネクチンレベルについて検討し、一部成績を論文発表した。また、小児生活習慣病に直結する問題として、小児の体格(肥満)判定法を研究してきた。BMIと内臓脂肪の関連性、BMIパーセンタイル値を用いた肥満判定方法の問題点は論文として発表できた。また、新たに成人で轡囲を身長の1.5乗で割る新体格指標Body Adiposity Indexが発表されたので、これについて小児期においても有用かどうかを外来の肥満児のデータから検討し、日本肥満学会などで発表した。これについては、引き続き海外にも発信する(論文化する)ことを予定している。
機能に関わる溶液中核酸の準安定構造の研究

分子レベルで生命現象を理解するためには核酸ー核酸あるいは核酸ータンパク質の特異的相互作用を知る必要がある。換言すれば水溶液中における核酸の構造の多様性や安定性の総体、即ち準安定構造を含む知見がその現象の理解に重要と考えられる。3年間の本研究では十分に研究されていないこの領域に挑み、以下に述べるような新しい方法論の開発とそれを用いて新しい現象の発見がなされた。1.精密変性勾配ゲル電気泳動法の開発・洗練とそれによる溶液中核酸構造に関する知見の獲得および応用技術の開発:従来の変性勾配法を客観性・再現性が高く多情報な系である精密変性勾配ゲル電気泳動法に改良した。それにより、変性効果に依存した溶液中核酸の構造多様性およびダイナミクスを具体的に捉えることができた。ここでは確立された分子固有の「規格化移動度曲線」の概念は分離・同定に実用的であるのみならず、構造ー移動度相関の解析の基礎デ-タを与えるものであることが示された。実際、2本鎖DNAに関する精密TGGE解析のデ-タについては部分的に構造ー移動度相関が求められた。また、協同的融解や鎖解離に対応する実験デ-タを集めることが可能となった。この応用技術としてランダムPCRを組み合わせた「DNAプロフィ-リング法」を開発し、巨大ゲノム解析などに有効であることを示した。2.その他の溶液中核酸構造解析技術の開発と現象の発見:一本鎖核酸の溶液中構造を探る方法として「プライマ-活性測定法」を開発・洗練し、さらにマイクロISFET測定法にも発展させた。それにより分子内・分子間の準安定な二次構造を定量することが可能になり、一方でコンピュ-タプログラムによる理論的予測も予備的ながら成功した。この技術の周辺に「プライマ-・ストッパ-法」、「オリゴヌクレオチドと制限酵素の協同作用による異常切断現象」をはじめとしていくつかの技術的、現象的発見がなされた。1.精密勾配ゲル電気泳動法の開発洗練について:既にできあがっていた基本的枠組みの上に精密系としての洗練の作業と自動化を検討した。合成したオリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸、二本酸核酸に関する解析から精密系としての実験条件が明からになった。具体的に再現精度は従来の3%の誤差から今回2%以下の誤差にまで上がった。また協同的融解現象の温度を0.3度の誤差で測定できることが示された。これらのことをもとにしてPoland-Fixman-Friereや和田・伏見らの理論的融解温度との対比がある程度現実的になった。一方、核酸分子同定法として「DNAプロフィ-リング法」(ランダムPCR法と精密勾配ゲル電気泳動法との組合せ技術)が着想され、有効であることが示された。自動化に関する研究は画像入力を中心に種々方法的検討を行っている。2.酵素学的アプロ-チ:(1)プライマ-活性検定法;溶液中の核酸構造ダイナミクスを調べる上で独自に開発した本方法は新たにいくつかの方法的改善が付け加えられる(PS法、アンル-ト解析など)と同時に溶液中での核酸構造の具体的なデ-タが集められた。またそれらをもとに理論的に解析するためのコンピュ-タプログラムを開発した。(2)制御酵素法;溶液中の一本鎖核酸の構造ダイナミクスを反応速度論の実験から定量的にとらえた。同時に我々の一本鎖切断モデルを決定的に支持する結果を得た。3.熱振動装置について:装置本体およびその制御系をほぼ完成させた。同時に運転条件を概ね確立した。

それらによって約10秒の周期での核酸溶液の熱振動が可能となった。装置の有効性を調べるためのPCR実験では従来型に較べて高速に目的を達成する能力をもっていることを示した。1.精密変性勾配ゲル電気泳動について:(1)昨年までの研究で再現性の高い実験結果を得ることができるようになった。今年度は理論的に求められるDNA構造安定性に関する推定をこの実験結果と合理的に結び付けるための検討を行った。具体的にはこれまでに得られた二本鎖DNAの温度勾配ゲル電気泳動の結果とその理論的融解曲線との対比から構造ー移動度相関を求め、それに基づき、規格化移動度曲線をDNA塩基配列から理論的に推定できるようにし、さらにそのパタ-ンを描くことを可能にした。これにより実験結果を視覚的に予測できると同時に、理論的計算に必須の熱力学的パラメ-タの改善を(理論と実験の)パタ-ンの一致度をもとにして定量的に評価することが可能になった。(2)DNAプロフィ-リング;昨年開発したこの方法の有効性を調べるために近縁種の細菌あるいは同一種内の株間の差を調べる等の研究に応用を広げ、構造ダイナミクスのデ-タをえると同時に温度勾配法の試料チャ-ジ法(トンネルチャ-ジ)の開発などをおこなった。特に「ランダムPCR」についてはその方法的一般性が確認された。2.酵素学的アプロ-チ:(1)溶液中の核酸構造ダイナミクスの検出法としてのプライマ-活性測定法/プライマ-・ストッパ-法/PCR法;実験的デ-タの蓄積を行った。それと同時にこれらの方法論に共通する現象を解析するプログラムの開発を試み、実験結果をよく予測しうるものを得た。これは我々が従来から採用してきた論理の正当性を基本的に裏付ける意味を持つ。(2)制限酵素の異常切断現象の解析;正当な認識配列以外での特異的切断現象の解明につながるいくつかの新事実の発見があった。とりわけ、より化学的に詳細な解析を可能とするという意味で重要な「合成オリゴマ-を用いた切断の実証」がなされた。3.熱振動法:昨年開発した装置の改良(試料濃度のモニタ-可能化など)と試行実験を行い、熱振動に特異的な現象を捉えた。1.準安定2次構造の予測:Ffファ-ジ-本鎖DNAを鋳型とし,種々のプライマ-を用いて伸長反応を行わせた後,制限酵素の切断パタ-ンを解析すれば,鋳型鎖の準安定2次構造やプライマ-結合特異性のデ-タが得られる。後者に注目し,2次構成形成の熱力学的パラメ-タを用いた理論計算結果と比較した。実験結果を概ね説明できるが,理論モデルとパラメ-タを改良してさらに精密化する必要がある。この応用として,プライマ-の特異性を低くしてPCRを行い,その結果を温度勾配ゲル電気泳動で分析することにより,鋳型DNAの分類を行うDNAプロフィ-リング法を開発したが,そのプロフィ-ルを理論的に求めるプログラムを開発した。2.核酸構造とゲル電気泳動易動度との関係:ゲル電気泳動を行うと同時にゲルの温度を,DNAの変性温度付近で変化させれば,DNAの2次構造の熱安定性を電気泳動易動度の差として検出できる。この温度掃引ゲル電気泳動法を開発した。この方法の理論を確立し,従来の温度勾配ゲル電気泳動法と比較したところ,多くの場合わずかに良い分解能が得られることがわかった。GCクランプ法と併用し,260塩基の内の1塩基置換を実験的に検出した。
新規糖尿病モデルSDTラットの分子遺伝学的解析

非肥満性糖尿病の新たな動物モデルであるSpontaneously Diabetic Torii(SDT)ラットにおける糖尿病の原因遺伝子の同定を目標として、糖尿病に関与する遺伝子が存在する染色体領域を組み込んだラット系統を作製し、当該遺伝子が糖尿病の発症、インスリン分泌や糖の処理能力などに関与することを明らかにした。また、SDTラットにおける膵臓の炎症・線維化を引き起こす主要な遺伝子が存在する染色体領域を同定した。これまで研究代表者らは非肥満性糖尿病の新たな動物モデルであるSpontaneously Diabetic Torii(SDT)ラットと正常系統であるBNラットの交配から作出した戻し交雑仔を用いて糖負荷試験時の耐糖能を指標に遺伝学的解析を行い、ラット第1、2およびX染色体に耐糖能関達遺伝子座(Gisdt1-3)をマップした。本研究では、SDTラットにおける糖尿病の原因遺伝子を同定することを目標としている。今年度は下記の項目について研究を実施した。(1)耐糖能関連遺伝子座についてのコンジェニック系統の作出ラット第1および第2染色体上に存在する耐糖能関連遺伝子座(Gisdt1,2)の領域を絞り込み、それらの病態生理的役割を解明するため、戻し交配によりSDTラットの遺伝的背景にBNラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニックラットの作製を開始した。また、その逆にBNラットの遺伝的背景にSDTラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニックラットの作製を開始した。現在、それぞれN4からN5世代に達している。(2)マイクロアレイ解析と位置的候補遺伝子アプローチを組み合わせた侯補遺伝子解析生後4週齢のSDT、BNおよび(BN X SDT)F1ラットの購臓からRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイ解析において発現量に相違が認められ、かっラット第1および第2染色体上の耐糖能関連遺伝子座に位置する複数の遺伝子を抽出した。現在、これらの遺伝子についてリアルタイムPCR法による発現量の定量的解析およびシーケンス解析による遺伝子変異の検索を行っている。(1)耐糖能関連遺伝子座についてのコンジェニック系統の作出ラット第1および第2染色体上に存在する耐糖能関連遺伝子座(Gisdtl,2)の領域を絞り込み、それらの病態生理的役割を解明するため、前年度から継続して戻し交配によりSDTラットの遺伝的背景にBNラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニック系統の作出を行った。また、その逆にBNラットの遺伝的背景にSDTラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニック系統の作出を行った。それぞれN7からN10世代に達し、兄妹交配を開始した。(2)膵臓の炎症・線維化を引き起こす主要遺伝子座の同定とコンジェニック系統による確認F344ラットとSDTラットの交配から作出したF2仔を用いて糖尿病発症および耐糖能について遺伝解析を行い、ラット第3染色体に優性で作用する主要な遺伝子座を同定した。この遺伝子座についてF344ラットを遺伝的背景とするコンジェニック系統を作出したところ、膵臓に炎症・線維化が認められた。本遺伝子座はSDTラットの主病変である膵臓の炎症・線維化を引き起こす主要遺伝子座であると考えられる。本研究は非肥満性糖尿病の新たな動物モデルであるSpontaneously Diabetic Torii(SDT)ラットにおける糖尿病の原因遺伝子を同定することを目標としている。1.耐糖能関連遺伝子座についてのコンジェニック系統の表現型解析ラット第1および第2染色体上に存在する耐糖能関連遺伝子座(Gisdt1, 2)の病態生理的役割を解明するため、SDTラットの遺伝的背景にBNラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニック系統、およびBNラットの遺伝的背景にSDTラット由来の各耐糖能関連遺伝子座を組み込んだコンジェニック系統を作出し、糖尿病の発症や耐糖能について表現型解析を行った。その結果、親系統のSDTやBNラットと比較してコンジェニック系統は糖尿病の発症、インスリン分泌や耐糖能などに相違が認められたことから、各耐糖能関連遺伝子座の病態生理的役割の一端が明らかになった。2.膵臓の炎症・線維化を引き起こす主要遺伝子座の同定とコンジェニック系統による確認F344ラットとSDTラットの交配から作出したF2仔を用いて糖尿病発症および耐糖能について遺伝解析を行い、ラット第3染色体に優性で作用する主要な遺伝子座を同定した。この遺伝子座についてF344ラットを遺伝的背景とするコンジェニックおよびコンソミック系統を作出したところ、膵臓に炎症・線維化が認められた。このことから、本遺伝子座はSDTラットの主病変である膵臓の炎症・線維化を引き起こす主要遺伝子座であると考えられた。
PD-1遺伝子多型解析に基づく多発性骨髄腫治療効果予測バイオマーカーの検討

本研究の目的はProgrammed cell death 1 (PD-1)関連一塩基多型(SNPs)解析に基づき、多発性骨髄腫(MM)におけるPD-1と抗腫瘍免疫細胞の関連を明らかにすることで、予後や治療効果予測のバイオマーカーへの臨床応用である。健常者に比べMM患者ではIDO2 R248Wの高活性タイプのRR型が有意に多かった。IDO1では有意な差は認められなかった。IDO2 R248W RR型(高活性タイプ)では低活性タイプと比べ、予後改善効果が高い免疫調節薬・プロテアソーム阻害薬といった新規薬剤治療率が高いにもかかわらず、両群の全生存期間に差はなく、IDO2 SNPsがMM新規薬剤の予後改善効果に影響を与える可能性を考え、さらなる解析を行っている。PD-1は疲弊したT細胞(Tex細胞)だけでなく老化したT細胞(Tsen細胞)にも発現が認められる。MM患者ではTsen細胞が増加している報告もあり、今後Tsen細胞とPD-1の関係を明らかとするべく、in vitroでのT細胞老化の誘導を検討している。本研究の目的は、Programmed cell death 1(PD-1)関連一塩基多型(SNPs)解析に基づき、多発性骨髄腫におけるPD-1と抗腫瘍免疫細胞の関連を明らかにすることで、予後や治療効果予測のバイオマーカーへの臨床応用である。初年度は、健常者と多発性骨髄腫患者の3つのPD-1 SNPs(-606G/A・+7209C/T・A215V )を決定し、比較検討を行った。健常者と多発性骨髄腫患者における、各SNPの遺伝子型頻度およびアレル頻度に有意差は認められなかった。多発性骨髄腫患者において遺伝子型により臨床背景を比較したところ、PD-1 +7209低産生型は高産生型患者に比べ有意に形質細胞腫の割合が高く、PD-1 A215V AA型はAV&VV型患者に比べ骨病変の患者が多く、PD-1 SNPsが多発性骨髄腫の症状に影響することが示唆された。しかし、いずれのSNPにおいても全生存期間には有意な差は認められなかった。また、免疫系に影響を与えるとされる新規薬剤治療群(サリドマイド・ボルテゾミブ)でも同様の解析を行ったが、いずれの項目においても有意な差は認められなかった。PD-1 SNPsのうち-606G/Aと+7209C/TはPD-1 mRNA発現との関連が報告されているが、リンパ球表面PD-1発現との関係は未だ明らかにされていない。現在、並行してPD-1 SNPsとリンパ球表面PD-1発現とmRNAの関連をフローサイトメトリー法やリアルタイムPCR法で検討している。当初の計画通りPD-1 SNPsの遺伝子型決定と解析が完了した。フローサイトメトリー法によるPD-1測定は一度に多くの測定が行えないため、やや遅れている。SNPsの解析では、MM患者は健常者に比べPD-1 GCC/GCCハプロタイプの割合が有意に高かった。MM患者を各遺伝子型によって2群に分け臨床背景・予後を比較するとCTLA-4 -1722 AG & GG型で髄外病変合併の割合が有意に高かった。また、PD-L1 TT & TC型では血清アルブミン値が低かった。CTLA-4 -1577GG型では国際病期分類III期の割合が有意に高かった。しかし、いずれのSNPsにおいても予後および新規薬剤(サリドマイド・ボルテゾミブ)の反応性には有意差は認められなかった。また、健常者においてリンパ球表面PD-1発現量とmRNA発現量を比較したが、いずれもSNPsの遺伝子型においても有意な差は認められなかった。SNPsの解析はおおむね当初の計画通り進行している。リンパ球表面PD-1発現の測定は一度に多くの測定ができないため遅れている。また、健常者では現在有意な差は認められないため、異なる評価法を検討中である。今後は、PD-L1の2SNPsについて健常者と多発性骨髄腫患者の遺伝子型を決定し、解析を行う。また、SNPsとPD-1発現の関係性を明らかとするために、健常者におけるリンパ球表面PD-1の測定を引き続き行う予定である。今後はさらにPD-1以外の免疫チェックポイント分子のSNPsの解析を検討している。

また、PD-1は疲弊したリンパ球だけでなく老化したリンパ球にも強く発現することが知られており、MM患者では老化したリンパ球が増加しているといった報告もされているため、この2つを鑑別するマーカーを検索するとともに免疫反応の違いを検討して行く予定である。
矯正的歯の移動における結合組織成長因子の役割-アポトーシスによる歯槽骨の改造-

結合組織成長因子(CTGF)は、in vivoにおける機械的刺激において、骨細胞、骨芽細胞で遺伝子発現することが知られているが、その役割は明らかではない。一方、in vitroにおける機械的刺激によって、CTGFがヒト腎線維芽細胞で発現し、アポトーシスを誘導したとの報告がされている。本研究は、マウス実験的歯の移動モデルを作成し、in situハイブリダイゼーション法を用いて歯周組織におけるCTGF mRNAの発現を検討した。また、TUNEL染色及びISOL染色にてDNAの断片化を経時的に検索し、歯周組織に発現するCTGFが歯槽骨リモデリング時の細胞のアポトーシスに関与している可能性を検討した。機械的刺激による骨リモデリング時に、CTGF mRNAは骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞に発現しており、CTGFが骨のリモデリングに関与していることが強く示唆された。CTGF mRNAを発現する骨細胞は、歯の移動開始から12時間後まで増加し、その後1日から21日まで経時的に減少した。すなわち、CTGF mRNAは歯の移動の機械的刺激が加わった初期において、歯槽骨圧迫側の骨細胞で一過性に多く発現することが明らかになった。また、歯槽骨圧迫側におけるTUNEL陽性骨細胞は、歯の移動開始から12時間後まで増加し、その後1日から21日まで経時的に減少した。この変化は骨細胞におけるCTGF mRNAの発現様相とほぼ一致していた。さらに、歯の移動12時間後では、歯槽骨圧迫側にISOL染色陽性を示す骨細胞が多く認められることから、骨細胞の細胞死はアポトーシスによると考えられる。以上のことから、実験的歯の移動時の骨細胞において、CTGFが発現しアポトーシスを誘導することによって、骨リモデリングに関与している可能性が示唆された。これらの結果は国際誌に投稿中である。本年度、我々はマウスを用いて矯正的歯の移動モデルを作成し、in situ hybridizationを用いて結合組織成長因子(以下CTGF)の遺伝子発現とTUNEL及びISOL染色を経時的に検索し、歯周組織に発現するCTGFが歯槽骨リモデリング時の細胞のアポトーシスに関与している可能性を検討した。その結果、機械的に刺激された骨リモデリング時に、CTGFは骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞に発現しており、CTGFが骨のリモデリングに関与していることが示唆された。CTGFを発現する骨細胞は、歯の移動開始から12時間後まで増加し、その後1日から21日まで経時的に減少した。すなわち、CTGFは歯の移動のメカニカルストレスが加わった初期において一過性に、歯槽骨圧迫側の骨細胞で多く発現することが明らかになった。この変化は骨細胞におけるCTGFの発現様相とほぼ一致していた。さらに、歯の移動12時間後では、歯槽骨圧迫側にISOL染色陽性を示す骨細胞が多く認められた。加えて、歯の移動3日後では、歯槽骨圧迫側に無細胞性骨小腔が増加し、その後7日から21日まで経時的に減少した。以上の結果から、歯槽骨圧迫側の骨細胞では、歯の移動を開始して2時間後に有意にCTGFが増加し、6時間後にアポトーシスが有意に増加した。さらに、歯の移動1日後に無細胞性骨小腔が有意に増加し、3日後に破骨細胞が有意に増加した。その後、10日後より歯が急激に移動し始めた。これらのことから、我々は、骨細胞で発現していたCTGFとアポトーシスが機械的刺激の骨リモデリングの反応として誘導され、骨リモデリングの重要な役割を担っていることを報告した。さらに、本研究で作成したマウスの矯正的歯の移動モデルは、矯正臨床で行われている歯の移動と同様に機械的刺激に対する歯槽骨のリモデリング過程を細胞ならびに分子レベルで観察できる有用な系であることを報告した。

以上のことから、実験的歯の移動時の骨細胞において、CTGFが発現しアポトーシスを誘導することによって、骨リモデリングに関与している可能性が示唆された。これらの結果は国際誌に投稿中である。
UCP4発現誘導による脳虚血耐性獲得メカニズムの解明と新たな脳梗塞治療法への挑戦

UCP4(uncoupling protein 4)はミトコンドリア内膜にある脱共役蛋白で、脳特異的に発現しており、神経細胞を酸化ストレスから守る可能性が示唆されているものの、その役割や機能は解明されていない。これまでの研究で、ラット中大脳動脈閉塞後に小脳室頂核(FN)電気刺激を行うと脳梗塞が縮小することが報告されており、さらに当研究室では、FN電気刺激によって大脳に広範囲な虚血耐性を獲得することを発見し、UCP4がFN電気刺激による虚血耐性獲得に重要な役割を持つ可能性を導き出した。我々はFN電気刺激によるUCP4の発現がコリナジックな経路を介して行われるという仮説を立て、今年度は、カルバコール刺激によってUCP4の発現が誘導されるかどうか検証した。UCP4の発現を評価する方法については、UCP4-tdTomato(UCP4 promote赤色蛍光タンパク質tdTomatoレポーターベクター)を構築し、UCP4が発現するとtdTomatoの赤色蛍光が観察できることから、蛍光顕微鏡での観察を行った。まず、初代培養大脳皮質神経細胞(生後1日齢のラットから取り出した)を用いて、UCP4-tdTomatoをトランスフェクション後、カルバコール刺激を行ったところ、UCP4の発現がコントロールに比べて1.4倍増加し、さらにアトロピンによってその発現が抑制されることを確かめた。SHRラット(12週齢オス)を用いた実験においては、脳室カニュラを設置し、UCP4-tdTomatoをリポフェクション法にて脳室内に投与後、インフュージョンポンプを用いて脳室内にカルバコール投与を行ったところ、大脳皮質広範にUCP4が発現し、その発現量はコントロール群に比べて優位に増加していた。以上の結果より、コリナジックな経路で(アセチルコリン受容体を介して)UCP4の発現が誘導されることを明らかにした。初代培養大脳皮質神経細胞にUCP4-tdTomatoのトランスフェクションを行い、発現の様子を長時間観察する方法を確立した。さらにラット脳へのトランスフェクション法およびカルバコールの脳室内投与方法を確立した。これらの手法を用いることで、当初の目的であった、アセチルコリン受容体を介してUCP4の発現が誘導されることを明らかにできたことから、おおむね順調に進展していると判断した。次年度は、UCP4の発現が誘導されることで虚血耐性を獲得するかどうかを明らかにするための実験を行う。神経細胞に低酸素・低グルコース負荷をかけることで疑似的な虚血モデルを再現することを検討している。まず酸素濃度を制御できるCO2インキュベーターシステムを構築し、酸素濃度0.1-21%における細胞死亡率を求め低酸素・低グルコース負荷条件の最適化を行う。次に低酸素・低グルコース負荷を行い、カルバコール刺激あり・なしでのUCP4発現量と細胞の死亡率等を評価する。

次に低酸素・低グルコース負荷を行い、カルバコール刺激あり・なしでのUCP4発現量と細胞の死亡率等を評価する。当初の計画では、試薬・器具類を購入する費用として計上していたが、研究室の在庫品を使用できたことから、相当額を執行しなかった。次年度は成果発表または論文発表を行う予定であり、そのための費用として計上したい。
小児白血病および神経芽種の遺伝子発現プロファイリングと予後予測

当院もしくは他院で治療を行った、あるいは治療継続中の小児白血病もしくは神経芽腫患児の臨床的特徴さらには予後因子の解析を行ってきた。小児白血病では予後良好とされてきたTEL-AML1症例での再発例やMLL遺伝子の再構成を来たした症例を中心に検討を行い、神経芽腫では予後不良と従来されてきたN-myc増幅症例であるにもかかわらず長期生存している症例を中心に検討を行った。これらの解析結果に基づいて遺伝子発現解析を行う症例の絞込みを行った。さらに当大学の倫理委員会で遺伝子解析研究の承認を得たうえで、これに基づく説明書と同意書を作成し患児の親権者から残存検体での研究の同意を得て遺伝子発現解析を行っている。現在はマイクロアレイで得られた膨大なデータの解析を行っている段階である。予後予測に有用である可能性のある遺伝子候補は多数抽出されている。さらには既知のプロファイリングデータとの比較検討、クラスタリング解析から小児白血病の新たな分類の可能性を模索している段階である。すなわち小児急性白血病の中で未だ予後不良なMLL遺伝子再構成を伴う急性リンパ性白血病の予後予測を行うことが可能となる新たな分類方法が最近報告されているが、この分類の正当性を裏付ける新たなデータをまとめている。症例数を増やし、かつ他の白血病との比較検討からこの分類の有用性が極めて高いことを証明する研究としてデータ解析の最終段階に入っている。近日中に論文としてまとめて報告できる見込みである。さらに当大学の倫理委員会で遺伝子解析研究の承認を得たうえで、これに基づく説明書と同意書を作成し患児の親権者から残存検体での研究の同意を得て遺伝子発現解析を一部開始している。予後予測に有用である可能性のある遺伝子候補は多数抽出されてはいるが、実験の性質上ノイズと考えられる遺伝子がその大半を占めていることが予想される。従って得られた結果を慎重に解釈し、ノイズではない有意な遺伝子群の選別を現在行っている。すなわち以前から得られていたデータとの比較検討、相関係数を用いたクラスタリング解析、さらには主成分解析といった手法を用いて症例の特殊性の確認と抽出される遺伝子群の意義付けに関する解析を進めている。今後はこれらの結果に基づいて、追加でマイクロアレイを行う症例の検討を行っていくのとあわせて、PCRやノーザンブロッティングなどの解析手法を用いた結果の検証を行い有意な遺伝子の選別をさらに進めていく予定である。
バイオマスキチン・キトサンから生体特異性新材料の開発

本研究は,バイオマスであるカニ殻から得られるキチン・キトサンを,化学修飾による分子設計で,生体特異性材料に変換するを目的とする.1)血中コレステロール値降下...高コレステロール(0.9%コレステロール含量)飼料,これに1%(0.4g/日/kg体重)と2%(0.8g/日/kg体重)キトサンを添加した飼料で兎を3969日間飼育(経口投与)し,血清と肝臓のコレステロール値とトリアシルグリセロール値の変化を追跡した.1%キトサン経口投与はこの両値に殆ど影響しなかった.2%キトサン経口投与(39日間)は血清コレステロール値をコントロール値の約2/5,血清トリアシルグリセロール値を約3/5と低下させた.また,肝臓において,この両値は大差を示さなかった.しかし,病理学解剖にて,キトサンを経口投与しない兎の肝臓は肥大と共に異常な赤褐色を示し, 2%キトサン経口投与した兎の肝臓は肥大もなく正常な暗褐色をしていた.2)生物組織内吸収性材料...キトサンと脂肪酸無水物の反応で調製した一連のN-アシルキトサン誘導体のリゾチームとキチナーゼ酵素分解性を調べた.N-アセチルキトサンゲルは天然キチンより813倍も酵素分解され易い.さらに,酵素分解性はN-アシル基の化学構造に依存しN-acetyl>N-propionyl>N-formyl>N-butyrylの順で酵素分解された.経口投与により兎はキチンを2835%およびキトサンを7983%消化した.この様に,リゾチームやキチナーゼ酵素反応速度は基質の立体配座と共にN-アシル基の化学構造により制御できることが解り,キチンやキトサンの経口投与による生体内薬物除放性基材や生体組織内吸収性材料になる手がかりが得られた.今後,キチン・キトサンの化学修飾で薬物除放性基材など生物組織および消化管内吸収性の医学やバイオテクノロジー用材料を開発する研究を展開する.本研究は,バイオマスであるカニ殻から得られるキチン・キトサンを,化学修飾による分子設計で,生体特異性材料に変換するを目的とする.1)血中コレステロール値降下...高コレステロール(0.9%コレステロール含量)飼料,これに1%(0.4g/日/kg体重)と2%(0.8g/日/kg体重)キトサンを添加した飼料で兎を3969日間飼育(経口投与)し,血清と肝臓のコレステロール値とトリアシルグリセロール値の変化を追跡した.1%キトサン経口投与はこの両値に殆ど影響しなかった.2%キトサン経口投与(39日間)は血清コレステロール値をコントロール値の約2/5,血清トリアシルグリセロール値を約3/5と低下させた.また,肝臓において,この両値は大差を示さなかった.しかし,病理学解剖にて,キトサンを経口投与しない兎の肝臓は肥大と共に異常な赤褐色を示し, 2%キトサン経口投与した兎の肝臓は肥大もなく正常な暗褐色をしていた.2)生物組織内吸収性材料...キトサンと脂肪酸無水物の反応で調製した一連のN-アシルキトサン誘導体のリゾチームとキチナーゼ酵素分解性を調べた.N-アセチルキトサンゲルは天然キチンより813倍も酵素分解され易い.さらに,酵素分解性はN-アシル基の化学構造に依存しN-acetyl>N-propionyl>N-formyl>N-butyrylの順で酵素分解された.経口投与により兎はキチンを2835%およびキトサンを7983%消化した.この様に,リゾチームやキチナーゼ酵素反応速度は基質の立体配座と共にN-アシル基の化学構造により制御できることが解り,キチンやキトサンの経口投与による生体内薬物除放性基材や生体組織内吸収性材料になる手がかりが得られた.今後,キチン・キトサンの化学修飾で薬物除放性基材など生物組織および消化管内吸収性の医学やバイオテクノロジー用材料を開発する研究を展開する.
消化管ホルモンを介する臓器相関

○エンドセリンが膵微小循環の調節に重要な役割を果すことを明らかにし得た。さらに、エンドセリンはラット膵炎モデルにおいてその浮腫を軽減させることを観察し得たが、エンドセリン拮抗剤を用いることによりこの現象に対する裏づけが得られた。○ラットにおける膵切除後の残存膵に、EGFレセプターの発現を観察し得たが、これは膵切除後の残存膵の再生機序に、EGFが深く関与し得ることを示唆するものである。○ラットにおける実験的膵炎モデルに対する免疫抑制剤の影響を検討したところ、Cyclosporinによる膵炎増悪作用の方が、FK506による膵炎増悪作用よりもより著明であった。これは臓器移殖後にしばしば見られる膵炎発症およびその悪化に対する免疫抑制剤の関与を考慮するうえで興味ある知見である。○大動物からの膵ラ氏島分離は従来より困難とされてきたが、イヌおよびブタ膵からのviabilityに富むラ氏島を大量に分離し得る方法を確立し得た。○チューブ型のハイブリッド型人工膵を用いて、in vitroにおける検討を施行したところ、アガロースゲルをラ氏島と一緒に封入することにより、長期培養後においても良好なインスリン分泌反応が得られることが判明した。In vivoにおける糖尿病ラットに対する同種移植後にも、免疫抑制剤を用いることなく長期にわたる生着が得られた。○新しく開発されたバッグタイプのハイブリッド型人工膵内に、イヌから分離したラ氏島を封入後、糖尿病作製ラットの腹腔内への異種移植を施行したところ、著明な血糖値の低下が観察された。このバッグタイプのハイブリッド型人工膵は、将来的に糖尿病に対する有力な治療法になり得る可能性も想定される。・エンドセリンは、血管内皮細胞由来の広範な生物活性を有するペプチドとして注目を浴びているが、ラットにおける急性膵炎モデルにおいて、その浮腫を軽減させる作用のあることが判明した。種々の病態にエンドセリンが関与していると考えられ、その血中濃度測定法の確立が急務であるが、抽出法を用いないで、血清そのものからエンドセリンの濃度を測定できる系が、ほぼ確立されつつある。アッセイの感度も秀れたものである。・シオニンは、ガストリンとCCKの両者に極めて類似した構造式を有するペプチドであるが、シオニンも、膵に対してCCRとほぼ同程度の生物活性が認められることがわかった。ガストリン作用である胃酸分泌に対する作用に関しても、シオニンはガストリンとほぼ同程度の生物活性を有していた。・膵ラ島分離に関しては、大動物であるブタおよびイヌから、常時1gあたり2000-5000個のう島を分離し得るシステムを開発し得た。分離ブタラ島を、イヌの門脈内へ移植するという異動移植を施行したところ、免疫抑制剤を用いないと急性拒絶反応が惹起されるが、免疫抑制剤の投与により、45日の生着がみられることがわかった。・異種移植を、免疫抑制剤から開放された状態で行いうると想定されるハイブリッド型人工膵の研究が急務である。分離ラ島をチューブ型人工膵(MRPT)として移植した場合には、ラ島がチューブ内で集合して一部壊死を起す傾向にあったが、一旦アガロースに浮遊させてチューブに入れると、ラ島が凝集しないでかつ良好にその機が維持されることが判明した。この新しい方式を用いて移植すると、明きらかにインスリンの反応も良く、長期にわたって人工膵が生着するものとおおいに期待される。現在新しいbagtypeの人工膵を開発中であるが、これは、prelimineryな実験で、チューブタイプよりもインスリンの反応性等が良好であることが観察されてきている。
食事誘導性の大腸癌発症メカニズムの解明

わが国の悪性新生物による死因は、全死因の28.5%を占め、大腸癌の死亡率は、男性で3位、女性で1位である。大腸癌の発症・進展には食事などの環境因子が与える影響が非常に大きいが、その詳細なメカニズムは未だ多くが明らかになっていない。これまでに食事誘導性の大腸癌発症メカニズムとして、腸炎および大腸癌を抑制する生理活性物質ISPP1の同定に成功した。本課題では、高タンパク食による生理活性物質ISPP1の発現・分泌抑制メカニズムの解明、ISPP1の腸内細菌叢に与える影響の検討、組織特異的ISPP1欠損マウスを用いた大腸癌発症メカニズムの解明を目指し、食事誘導性の大腸癌発症メカニズムを明らかにする。
脳血管攣縮の実験的研究ー特にクモ膜下出血後の脳血流動態についてー

臨床例においてクモ膜下出血(subarachnoid hemorrhage:SAH)直後からの脳血流動態を正確に評価する事は困難であるため、ラットの大槽内自家動脈血0.3ml注入によるSAHモデルを作製し、脳血流量(cerebral blood flow:CBF)、硬膜外圧(epidural pressure:EDP)、平均動脈血圧(mean arterial blood pressure:MABP)を連続測定し、出血直後から2時間後までの脳循環動態を検討した。同じ方法でSAHを作製してもSAH直後のCBFやEDPの変化は一様ではなく、3つのtypeに分類できた。また、脳底槽への血腫の拡大様式も脳血流動態で分類した3つのtype間で差異が認められた。これらの違いは、クモ膜下腔の形態学的個体差による注入血液分布の差異に依存しているものと推定された。以上よりSAH直後の脳血流動態は頭蓋内圧の変動に大きく左右されるため、特に重症SAH例では上昇した頭蓋内圧に対するすみやかな処置が重要であると思われる。次に、臨床的に遅発性脳虚血症状をきたす脳血管攣縮は内膜肥厚や内弾性板の皺縮などの組織学的変化を伴っている。またSAH後の脳血管攣縮の程度はクモ膜下腔の血腫量に依存するため、動物モデルにおいてもできる限り多くの血液を注入する工夫がなされている。そこで、大槽内自家動脈血2回注入法をラットに応用することにより脳血管攣縮の作製を試みた。しかし、今回の方法ではラットの脳血管に内膜肥厚や内弾性板の皺縮などのvas-culopathyを示唆する組織学的な変化は得られなかった。血液の注入回数や注入総量を増やすなどの再検討も必要と考えられるが、現時点でラットを用いたSAHモデルは晩期脳血管攣縮を検討する上では限界があると考えられた。ラットの大槽内自家動脈血注入モデルを用い、血腫注入直後の脳表脳血流量(CBF)、および硬膜外圧(EDP)の変化を連続測定した。超急性期のCBF、およびEDPの変化は医科の3つの型に分類された。YTPE1(軽度SAH群):血腫注入直後EDPはほぼ瞬時に拡張期血圧以上に上昇し、それに対応してCBFが著明に低下する。その後、EDPは5分以内に回復し、CBFもovershootを示したのち元のレベル、もしくはやや低い値に戻るもの。TYPE2(中等度SAH群):血腫注入直後瞬時に上昇したEDPは5分以上持続する。その後、徐々に回復傾向を示し、CBFも同様に回復傾向を示すもの。TYPE 3(重度SAH群):血腫注入直後瞬時にEDPが上昇し、回復傾向を示すものの高値を持続する。これに反し、下降したCBFの回復がほとんどみられないもの。生食注入群ではTYPE1と同様の変化を示したが、元のレベルへの回復はより速やかであった。さらに、TYPE1およびTYPE2において、血腫注入60分後および120分後のCBFには有意な低下はみられなかった。この結果はmicrosphereを用いた実験で、SAH後30、60分でCBFが徐々に低下したとする従来の報告例とは異なる。TYPE3では、不整脈の出現や肺水腫の合併が高率にみられた。また、これら3群の分類は脳底槽の血腫の多少と相関を示す傾向にあった。人の遅発性脳血管攣縮の病態を研究する上では、このモデルにおける晩期脳循環動態の検討が必要である。

また、大槽内1回血液注入モデルでは、72時間後の脳底動脈の電顕的観察でvasculopathyを示さなかったとする報告もあり、大槽内2回血液注入法を用いることにより、ラットにおいてもvasculopathyをきたすような晩期血管攣縮モデルの開発も今後検討していく予定である。ラットを用いたクモ膜下出血(SAH)モデルは、小動物であるがために注入量や注入法のわずかな差異によって超急性期の脳血流動態に違いが生じやすく、従来報告されているような一定のSAHモデルを得ることが困難である。これまでの研究結果から、われわれは超急性期の脳血流のパタ-ンを知ることにより、クモ膜下出血モデルを3群に分け、同一条件下の一様な実験モデルを作製した。これによりクモ膜下出血直後の超急性期の脳血流動態を把握することができたが、Solomonらも述べているように、このモデルでは病理組織学的にvasculopathyをきたさず、人の遅発性脳血管攣縮(晩期虚血病変)の病態を検討するには不適当である。さらに、ラットの脳血管では側副血行路が発達しており、臨床的にみられるような虚血症状を出現させることは困難である。これらの問題点を考慮した上で、われわれは、まず超急性期の脳血流のパタ-ンを知ることにより、一定条件下にあるモデルを振り分け、Varsosらが犬を用いた実験で大槽内2回血液注入法により血管撮影上の脳血管攣縮を高率に再現させたように、われわれもラットの大槽内2回血液注入法を用いたのち、病理組織学的な検討を行なうつもりである。また、前処置として両側総頸動脈を結紮するなどの虚血病変をきたしやすいモデルによるクモ膜下出血後の脳循環動態の検討も行なっていくつもりである。これまでに我々は、ラットのクモ膜下出血(SAH)モデルを用い、超急性期の脳循環動態を脳血流量、硬膜外圧を連続測定することにより評価してきた。今年度はSAH後の脳血管を組織学的に観察した。組織学的にも強い脳血管攣縮をきたすSAHモデルとして、犬では大槽内自家動脈血2回注入法(double injection method)が広く用いられている。そこで、ラットにも自家血2回注入法を用いることにより、強い脳血管攣縮を惹起させうるかどうかを検討した。方法:SpragueーDawley rat(male,200ー250g,n=30)を用い、自家動脈血を0.3ml/30sec.を大槽内に注入した。48時間後に再び自家血を0.3ml/30sec注入した。その後、2.5%glutaraldehydeで潅流固定し脳血管を光顕にて観察した。結果:自家血を2回注入したのち24時間後に潅流固定した例において、光学顕微鏡下では中大脳動脈の内弾性板の皺縮がみられ、内皮細胞の一部が剥離している所見がえられた。これに対し、生食を2回注入したものでは同様の組織学的変化は認められなかった。考察:ラットにおいても大槽内自家動脈血2回注入法を用いることにより、組織学的にも変化をきたす脳血管攣縮を作成できる可能性が示唆された。しかし、1回目の大槽内血腫注入後24時間以内に死亡する例が多く(n=18/27)みられ、また2回目の血腫注入直後に死亡するものも多かった(n=7/27)。一方、生食注入群(n=3)では、急性期に死亡する例はみられず、臨床経過においては血液注入群との間に明かな差があった。SAH後の晩期脳血管攣縮のモデルとするには未だ十分な生存する例数(n=2/27)が得られていない。今後さらに、1回注入後での組織学的な検索や2回注入の際の血腫量の再検討が必要と思われた。
ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解機構及びビリベルジン還元酵素との相互作用

幾つかの生物種のヘムオキシゲナーゼ(HO)を用いてヘム分解機構を検討した。以下にその成果を記す。1.ヘムがヒドロキシヘムへ酸化される過程での活性化酸素の実態が酸化型ヘム鉄に結合したヒドロペルオキソ分子種である事を実証した。2.ヘム分解過程の三つの段階での基質特異性について検討した。第2段階では特異性を欠くが、第1と第3段階ではα特異性がある事を証明した。3.初めて藍草のHO-1の大腸菌での発現系を確立した。精製した藍草のHO-1とヘムとの複合体での、ヘム分解反応は哺乳類に比べて緩やかであった。これはヘムポケットの構造に起因する、酸素活性化機構の違いに因るものと思われた。4.ジフテリア菌のHOの結晶化とその解析、更には酸素化型の結晶化とその解析に成功した。ヘムに結合した酸素分子はヘムのα-メテン炭素に向かって屈曲しており、私どもの以前の共鳴ラマン法で推測された結果を立証できた。5.一般のHOではα型のビリベルジンしか生成しない。しかし、緑膿菌のHOではβとδ型が生成される。未だ結晶解析の報告はないが、これは恐らく、αメテン部位がアミノ酸残基によってマスクされていることによって起ると考えられる。そこで、ヘムを回転させる事に因ってα体の生成が見られると考え、幾つかの変異酵素を作成し成功した。6.今まで昆虫のHOの酵素化学的な報告は全くなかった。今回、私どもはショウジョウバエのHOの大腸菌での発現と精製に始めて成功した。反応機構の大筋は他の酵素に比べてほぼ同じではあったが、過酸化水素で反応が進行せず、また、ベルドヘムの捕捉が出来ないなどかなりの違いが観察された。驚くべき事に、ヘムの酵素との結合に第5と第6配位子は無関係であった。これがショウジョウバエのHOの独自性の源と思われた。申請時では原核植物である藍草のSynHO-1の発現系を確率したばかりであった。その後精製法を確立した。藍草HO-1によるヘム分解反応は動物や病原性細菌による分解機構とほぼ同じであったが、細部では異なっていた。これはヘムポケットの構造が違っており、そのため、酸素活性化に関与するアミノ酸残基、電子伝達経路が微妙に違っていることに起因するらしい。各段階での酸素活性化機構を解明する一助として第二、第三段階での基質、生成物特異性をラットHO-1を用いて検討した。第二段階での反応ではヒドロキシヘムの四つの異性体の全てが対応するベルドヘムに転換できたのに対し、第三段階の反応ではαベルドヘムのみがαビリベルジンに酸化され、他の三つのベルドヘムは対応するビリベルジンには転換できず、おそらく非酵素的反応で壊されてしまうという結果を得た。これは第三段階ではベルドヘムの鉄に結合した活性化酸素がヘムポケットの構造によって制限を受け、α位しか酸化できないためであり、第二段階では酸素活性化にはヒドロキシヘムの鉄が関与しないためと推測された。昆虫では酸素運搬にはヘモグロビンは利用しないが、呼吸鎖やシトクロムP-450を構成するプロトヘムは必須である。従って、ヘムオキシゲナーゼも存在する筈であるが、これまで報告はなかった。ショウジョウバエの遺伝子に動物酵素とホモロジーの高い配列が存在したので、これを基に発現系と精製法を確立した。次年度には昆虫のヘム分解機構も併せて解明する。

幾つかの生物種のヘムオキシゲナーゼ(HO)を用いてヘム分解機構を検討した。以下にその成果を記す。1.大腸菌で発現、精製した藍草のHo-1とヘムとの複合体での、ヘム分解反応は哺乳類に比べて緩やかであった。これはヘムポケットの構造に起因する、酸素活性化機構の違いに因るものと思われた。(論文1)2.藍草のHO-2の発現系と精製法を確立した。今まで、HO-2は発現させても封入体となると報告されており、私どもはこの点を克服した。3.ジフテリア菌のHOの結晶化とその解析、更には酸素化型の結晶化とその解析に成功した。ヘムに結合した酸素分子はヘムのα-メテン炭素に向かって屈曲しており、私どもの以前の共鳴ラマン法で推測された結果を立証できた。(論文2、3)4.一般のHOではα型のビリベルジンしか生成しない。しかし、緑膿菌のHOではβとδ型が生成される。未だ結晶解析の報告はないが、これは恐らく、αメテン部位がアミノ酸残基によってマスクされていることによって起ると考えれる。そこで、ヘムを回転させる事に因ってα体の生成が見られると考え、幾つかの変異酵素を作成し成功した。(論文4)5.今まで昆虫のHOの酵素化学的な報告は全くなかった。今回、私どもはショウジョウバエのHOの大腸菌での発現と精製に始めて成功した。反応機構の大筋は他の酵素に比べてほぼ同じではあったが、過酸化水素で反応が進行せず、また、ベルドヘムの捕捉が出来ないなどかなりの違いが観察された。驚くべき事に、ヘムの酵素との結合に第5と第6配位子は無関係であった。これがショウジョウバエのHOの独自性の源と思われた。(論文5)6.ヘム分解過程の三つの段階での基質特異性について検討した。第2段階では特異性を欠くが、第1と第3段階ではα特異性がある事を証明した。(論文6)