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日本統治時期における台湾の日本人住宅地の形成過程とその特徴に関する研究

両玄関とも土間の踏込があり、1段の式台があった。表玄関には、洋室の「書斎兼応接室」と「茶の間」が、その裏手には「座敷」、「居間」、「小児室」が配置された。座敷には床の間、付書院、違い棚を備えたため、書院造の要素を取り入れた住宅と言える。書斎兼応接室には作り付けの本棚が設置された。内玄関には、「女中室」、「台所」、「浴室」、「洗面室」が配置された。また、トイレは二箇所にあった。2「高等官官舎第四種」は、表側に式台を持つ土間のある「玄関」が設けられ、その玄関には、第三種と同じく洋室の「書斎兼応接室」と「茶の間」が、その裏手には床の間があり「座敷」と「居間」が配置された。また、「女中室」、「台所」、「浴室」も配置され、トイレも二箇所に設けられた。3「判任官官舎丙種」は、「玄関」、「居間」と「茶の間」が表側に設けられ、その裏手には床の間があり「客間」が配置された。茶の間の裏側には「炊事場」、「浴室」、「トイレ」の順で配置された。4「単身官舎」は、「玄関」、「広間」、共同用の「娯楽室」、「談話室」、「閲覧室」、「食堂」、さらに裏手には「炊事室」、「売店」、「炊夫室」、「浴室」、「トイレ」が配置された。南北棟は、踏込、玄関、部屋と共同用の洗面所、トイレが配置され、部屋は8畳「座敷」が八つあり、床の間や本棚もあった。南棟にも八戸の教員が入居でき、一戸につき8畳「座敷」と6畳「居間」が1室ずつ割り当てられた。その座敷には床の間が、居間には本棚があった。台湾の日本統治時期に関する史料・資料は、現在、主に国立中央図書館台湾分館と国史館台湾文献館に所蔵されている。当時の植民政府である台湾総督府に関する書物、新聞や公文類纂などの史料・資料が残されているため、本研究では、台湾においても、史料・資料文献調査を行っている。また、当時の供給型住宅の実態を把握するために、平成26年度から、日本統治時期に建設した官舎の遺構が残っている旧台北帝国大学(現台湾大学)を訪ね、許可を得た上で、旧昭和町の大学官舎の建築形式や居住状況などの実態について現地調査やインタビュー調査を行った。しかし、国史館台湾文献館では、史料・資料を閲覧するための電子化のシステムを現在導入中であるため、日本統治時期の供給型住宅(官舎、社宅、移民住宅、営団住宅)に関する史料・資料や配置図、平面図などの図面、仕様書については、一部しか手に入れない状況になっている。そのため、手に入れた史料・資料を中心に、供給型住宅の建築的特徴の分析を行った。当時の資料の入手が困難であり、研究遂行に想定以上に時間を要したものであった。また、供給型住宅の現居住者、居住していた日本人元居住者のインタビュー調査を行う予定があったが、インタビュー調査に協力いただくインタビュー対象者(研究協力者)の都合により、予定していた調査が延期となり、調査の実施に遅延が生じた。本研究は、日本統治下の台湾で日本人により建設された日式住宅の供給型住宅の特徴とその住宅地の形成過程を明らかにすることを目的としている。平成25年度は、研究課題を「文献史料・資料による台湾日式住宅の供給型住宅の建設経緯、形成背景の把握」とし、当時の図面、写真などに関する史料調査を行い、台湾日式住宅建設に至る歴史的背景や供給型住宅、住宅地の建設経緯を把握した。平成26年度、27年度は、研究課題を「現存する供給型住宅の実測調査、インタビュー調査による実態の把握」とし、現存する旧台北帝国大学の大学官舎遺構を中心に建築外観、形式、平面的な特徴などの実態を調査し、現居住者、元日本人居住者のインタビュー調査・分析を行った。平成28年度は、研究課題を「台湾日式住宅の建築的特徴の解明」とし、追加調査・分析を行い、収集した史料、写真や遺構の実測調査、インタビュー調査の結果を総合することにより、供給型住宅である大学官舎の平面構成などの建築的特徴を解明した。
ヒトT細胞白血病ウイルス2型(HTLV-2)によるT細胞不死化メカニズムの解明

成人T細胞白血病(ATL)はヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)が原因となる悪性の白血病であるが、HTLV-1とよく似たウイルスHTLV-2とATLとの関連は示されていない。しかし両ウイルスともin vitroでヒトT細胞を不死化することができることから、両者のトランスフォーミング蛋白Tax1、Tax2に何らかの機能の違いがあると考えられている。我々は、Tax2はNFATを恒常的に活性化しIL-2分泌を促進することにより感染細胞の増殖を導いていること、Tax1にはそのような活性は認められないことを見い出した。本研究ではTax2によるNFAT活性化の分子レベルでの解析によりHTLV-2によるT細胞不死化のメカニズムを解明することを目的とした。(1)NFAT活性化に関与するTax2会合分子の探索Tax2との会合分子をGST-Tax2融合蛋白を用いたヒトT細胞株からのpull down法さらに質量分析により同定を試みた。具体的にはヒトT細胞株の抽出液と、GST-Tax2およびネガティブコントロールとしてGST-Tax1融合蛋白を反応させ、それぞれの融合蛋白と結合する蛋白複合体を精製後、SDS-PAGE、CBB染色を行いGST-Tax2特異的に結合する蛋白質の有無を検討した。CBB染色のパターンを比較したところ、Tax2特異的に現れるバンドは検出できなかった。この結果から考えられ得ることは、Tax2にGSTを融合させることによりTax2のコンフォメーションに変化が生じ、目的とする蛋白質との会合がうまく進行しなかったという可能性である。より短いエピトープタグを付加したTax2を用いた精製が必要と考えられた。Tax1はNF-κB2/p100と結合し、p100からp52へのプロセッシングいわゆるNF-KBnoncanonicalpathwayを活性化する。Tax2においてその活性を検討したところ、Tax1とは異なりTax2にはp100プロセッシング活性が全くないことが明らかとなった。さらにTax2とp100との会合を免疫沈降法により検討したところ、Tax1とp100は細胞内で効率よく結合するが、Tax2とp100との結合は全くみられなかった。p100プロセッシングは癌ウイルスであるEBV、KSHV、HPVなどのトランスフォーミング蛋白によっても活性化されることが知られており、HTLV-1のみがATLを発症させる原因のひとつであると考えられた。成人T細胞白血病(ATL)はヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)の感染が原因となる極めて悪性の白血病である。HTLV-1と非常によく似たウイルスとしてHTLV-2が存在するが、この2つのウイルスの大きな違いは、HTLV-1がATLの原因となるのに対し、HTLV-2と白血病あるいはリンパ腫との関連は示されていないというところにある。我々はHTLV-2のトランスフォーミング蛋白であるTax2はT細胞活性化の主要な因子であるNFATを恒常的に活性化しIL-2分泌を促進するが、Tax1にはその活性はないこと、HTLV-2感染細胞はこのIL-2のオートクラインにより増殖することを見出した。本研究では、Tax2によるNFAT活性化およびT細胞不死化のメカニズムを分子レベルで明らかにすることを目的としている。1,Tax2におけるNEAT活性化部位の同定Tax2はNFATを強力に活性化するが、Tax1にはその活性はない。この性質を利用し、N末端側がTax2、C末端側がTax1となるようなキメラ蛋白を6種類作製し、NFAT活性化能をレポーターアッセイにより検討した。この結果Tax2が191番目のアミノ酸までのキメラはNFAT活性化能を保持しているが、Tax2が154番目のアミノ酸までのキメラではその活性が顕著に減少した。このことからTax2の154から191番目のアミノ酸の領域にNF酊活性化に重要な領域が存在することが明らかとなった。2,NFAT活性化に関与するTax2会合分子の同定Tax2との会合分子をGST-Tax2を用いたpull downおよびLC-MS/MSを用いた質量分析法により同定する予定である。この際対照として、Tax1およびNFAT活性化能のないTax2のGST融合蛋白を用いることでNFAT活性化に繋がる分子の同定が可能になると考えている。

具体的にはヒトT細胞株の抽出液と、GST-Tax2およびネガティブコントロールとしてGST-Tax1融合蛋白を反応させ、それぞれの融合蛋白と結合する蛋白複合体を精製後、SDS-PAGE、CBB染色を行いGST-Tax2特異的に結合する蛋白質の有無を検討した。CBB染色のパターンを比較したところ、Tax2特異的に現れるバンドは検出できなかった。この結果から考えられ得ることは、Tax2にGSTを融合させることによりTax2のコンフォメーションに変化が生じ、目的とする蛋白質との会合がうまく進行しなかったという可能性である。より短いエピトープタグを付加したTax2を用いた精製が必要と考えられた。Tax1はNF-κB2/p100と結合し、p100からp52へのプロセッシングいわゆるNF-KBnoncanonicalpathwayを活性化する。Tax2においてその活性を検討したところ、Tax1とは異なりTax2にはp100プロセッシング活性が全くないことが明らかとなった。さらにTax2とp100との会合を免疫沈降法により検討したところ、Tax1とp100は細胞内で効率よく結合するが、Tax2とp100との結合は全くみられなかった。p100プロセッシングは癌ウイルスであるEBV、KSHV、HPVなどのトランスフォーミング蛋白によっても活性化されることが知られており、HTLV-1のみがATLを発症させる原因のひとつであると考えられた。
琉球列島・東南アジアにおけるマングローブ林の伝統的管理利用に関する調査研究

マングローブの方言名プシキはマングローブの方言の総称である。オヒルギは方言でビギプシ(古見)、マツァプシキ(祖納)、マダプシキ(星立)、ヤエヤマヒルギはミープシ(古見)、マヤプシキ(星立)、ビープシキ(星立)、ハマザクロはトゥ〓ダプシ(古見)、ヒルギモドキはカニャーキー(星立)などと呼ばれている。マングローブの利用一番多くは、オヒルギやヤエヤマヒルギの皮を煮詰めて帆船の木綿帆、魚網、ミンサー織物などの染料として利用していたことである。皮を剥いだマングローブは薪に、またメープシやビギプシを切ってきて自家用木炭を作った。ビギプシは家のタルキや桁や洗濯物の竿掛用などに使われる。マングローブ林と食生活ガサミ(カニの一種)はゆでて身を取り、油で炒めたり、そのまま水炊きにする。また身を取ってメリケン粉と混ぜ、ダンゴ状にして油にあげカマボコを作る。ギジャグ(シレナシジミ)は身をオオタニワタリの新芽と混ぜ、油で炒める。アンサンガヤー(カニ)はおつゆに、サクラエビはゆがいて乾燥させ、野菜と炒めて食べる。そのほかに魚やウナギなどを取って料理して食べた。マングローブ林の管理利用伐採方法は小規模の皆伐や適度の抜き切りが基本だったようである。必要な利用可能なものだけを切って使う。老木や枯れ木を優先的に切り、適当に母樹を残して間引きをする。これといった利用上の取り決めがあったわけではなく、各人が長年の伝統的な生活の知恵にもとづいて、資源の再生する範囲内でうまく管理し利用していた。
正則化法によるスパース推定と超高次元データへの応用

L1型正則化法にもとづくスパース推定は,近年取得される超高次元データを計算機を使って高効率に推定することの出来る手法で,ここ数年で急速に発展してきた.本研究で行った成果は主に2つある.1つ目は,回帰モデルにおけるL1正則化法において,モデルに含まれる調整パラメータを効率的に選択することのできるアルゴリズムを提案した.2つ目は,因子分析モデルにおけるL1正則化法を提案し,従来法である因子回転との関係性を明らかにした.どちらの研究においてもソフトウェアパッケージ(Rパッケージmsgps, fanc)として公開しており,だれでもフリーで使うことができる.昨年度は因子分析モデルに正則化法を適用し,その理論的な性質について考察した.今年度はこの内容をさらに発展させ,すべての解を効率的に計算するアルゴリズムを構築した.また,そのアルゴリズムを実装するソフトウェアパッケージを公開した.(1)昨年度提案した因子分析のスパース推定法の計算アルゴリズムを改良した.まず,初期値を適切に設定するよう工夫した.また,EMアルゴリズムの内部のCoordinate Descentアルゴリズムを並列演算した.(2)提案手法を手書き文字データに適用し,その有効性を検証した.すると,因子負荷量が十分にスパースな場合においても(すなわち,画像が十分に圧縮されていても)画像をきれいに復元できることが分かった.(3)因子分析の正則化最尤推定値を高速に計算することができるソフトウェアRのパッケージfancを公開した.このパッケージには,あらゆる調整パラメータに対する因子と変数の関係性を可視化することのできる,グラフィカルツールを含む.このツールを用いることにより,分析者が因子を解釈しやすいモデルを探し,対応する適合度を見ることによって適切なモデルを選択するという,これまでなかった新たな解析が可能となった.(4)因子分析モデルにスパース推定を適用すると,第1因子がすべての変数に影響を与えるという直感に合わない結果が頻繁に得られた.その原因を因子回転の観点から探ったところ,正則化項の性質である,パラメータを正確に0と推定することが原因であることが判明した.また,この問題を解決するには,因子間相関を入れたモデルを用いるか,他の因子回転基準を用いれば良いということも分かった.L1型正則化法にもとづくスパース推定は,近年取得される超高次元データを計算機を使って高効率に推定することの出来る手法で,ここ数年で急速に発展してきた.本研究で行った成果は主に2つある.1つ目は,回帰モデルにおけるL1正則化法において,モデルに含まれる調整パラメータを効率的に選択することのできるアルゴリズムを提案した.2つ目は,因子分析モデルにおけるL1正則化法を提案し,従来法である因子回転との関係性を明らかにした.どちらの研究においてもソフトウェアパッケージ(Rパッケージmsgps, fanc)として公開しており,だれでもフリーで使うことができる.平成24年度では,以下のL1型正則化法における高速な推定アルゴリズムと調整パラメータの選択に関する研究を行った.(1)超高次元データから有効な情報を高効率に抽出することのできるL1型正則化法に基づく線形回帰モデルの推定問題において,推定値を求める高速なアルゴリズムと適切な調整パラメータの選択が本質的となる.本研究では,この2つの問題に対処するために,数理的アプローチと計算アルゴリズムを融合させた新たなモデル評価基準のアルゴリズムを導出し,推定値と調整パラメータを効率的に計算する方法を提案した.提案手法は,従来の調整パラメータ選択法であるクロスバリデーションより数倍計算スピードが速く,かつ安定して予測精度の高い調整パラメータを選択できることを数値的に示した.さらに,ソフトウェアRのパッケージmsgpsを公開した.(2)正則化法に基づく因子分析モデルのスパース推定を行った.まず,因子分析モデルにおける正則化法は,古典的な因子回転問題の一般化であり,因子回転法よりスパースな解を求めることができることを理論的に示した.次に,EMアルゴリズムとCoordinate Descentアルゴリズムを組み合わせた新たなアルゴリズムを提案した.このアルゴリズムは,これまでなかった非凸ペナルティに基づく因子分析モデルの効率的なスパース推定を可能とした.数値実験を通して提案手法の有効性を検証したところ,非凸ペナルティに基づく正則化法は,因子回転やlassoよりスパースな解を持つため,推定された因子が解釈しやすく,さらに安定した推定量を求めることができることが分かった.今年度は,昨年度提案した因子分析モデルのスパース推定法を改良し,さらに因子分析モデルを回帰モデルに拡張した因子回帰モデルに関する研究に取り組んだ.(1)昨年度は,因子分析モデルのスパース推定を行うと直感に合わない解が得られることを数値的に示した.そこでまず,その現象の解明に取り組んだ.すると,因子負荷行列が完全単純構造を有するとき,本当は因子間相関があるにも関わらず因子間相関を仮定しないモデルで推定すると,全く違う因子の構造が抽出されるということを理論的に示すことができた.この結果より,Lassoタイプのスパース推定法によって因子分析を行うときは,因子間相関を入れる事が極めて重要であるということがわかった.さらに,実際に因子間相関を入れたモデルのスパース推定法及びそのアルゴリズムを提案した.実際のデータに適用すると,多くのベンチマークデータに対して,因子間相関を仮定しない場合にはうまく因子を抽出できないが,因子間相関を仮定すると適切な因子が抽出される傾向にあることがわかった.(2) Rパッケージfancのアップデートを行った.まず,因子間相関を仮定した場合のパラメータの推定をできるようにした.また,高次元データに対し,複数の調整パラメータに対する解を可視化するため,ヒートマップに基づくグラフィカルツールを追加した.

(3)因子分析モデルの拡張である因子回帰モデルのスパース推定を試みた.因子回帰モデルは,データの次元圧縮と回帰を同時に行う方法であるが,最尤推定を行うと,通常の回帰モデルの最尤推定と同様に,変数間の相関が大きい時に多重共線性の問題が発生する.そこで,どのような場合に多重共線性の問題が発生するのかを探ったところ,因子分析で独自分散が負と推定される不適解問題と対応することがわかった.さらに,多重共線性の問題に対処するための罰則項を加えた,罰則付き最尤法を考案した.統計科学正則化法に基づく因子分析では,新たな方法論を提案しただけでなく,従来の方法論との関係性を理論的に考察し,従来法よりスパースに推定できるという新たな知見を発見した.さらに,実際に高次元データに適用できるよう効率的なアルゴリズムを構築した.この方法論,理論,アルゴリズムを1つの論文としてまとめ,著名な国際ジャーナルに採択された.また,グラフィカルツールを含むソフトウェアfancをWeb上に公開した.できるだけ多くの研究者に使ってもらえるよう,国内外で学会発表し,ソフトウェアパッケージについて詳しく述べた.平成24年度研究計画には,回帰モデルに対するGeneralized Path Seekingアルゴリズムの拡張による新しい一般化自由度の推定アルゴリズムの導出が含まれていたが,そのアルゴリズムの導出のみならず,サンプルサイズが大きいときにより高速に推定できる方法も提案した.具体的には,提案したアルゴリズムは,サンプルサイズが1000を超えるとき,元々のアルゴリズムより数千倍計算が速くなることが分かった.また,平成25年度の研究計画に含まれていたクロスバリデーションとの数値的な比較検証やRのパッケージ開発はすでに完了した.この研究内容をJoint Statistical Meetingで講演した.また,国際誌Computational Statistics and Data Analysisに採択された.因子分析モデルにおけるスパース推定法では,当初の計画である因子分析へのlassoの適用のみならず,提案手法の理論的整合性を深く追求し,きわめて広範囲のペナルティに対する汎用性のあるアルゴリズムを開発することに成功した.具体的には,正則化法が,これまで数十年間スタンダードな方法として行われていた因子回転法の一般化であり,よりスパースな解を求めることができることを理論的に示した.さらに,EMアルゴリズムとCoordinate Descentアルゴリズムを組み合わせたアルゴリズムは.きわめて安定しており,当初計画していなかった非凸ペナルティへの適用も可能となった.その非凸ペナルティがより安定したスパースな解を求める鍵となることを数値的に示した.この研究内容をスペインでの国際会議であるCOMPUTING & STATISTICSで招待講演を行った.
環境因子の発がんリスク評価

MeIQxについて全員の協力のもとに行った前年度の発がん実験における肝細胞の5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)標識率を検索した。すなわち、肝細胞の増殖能が最も高い21日齢の雄性F344ラットを用い、0, 0.001, 0.01,0.1, 1,10ppmの低濃度域および100ppmのMeIQxを16週間連続投与した群におけるBrdU標識率はglutathione S-transferase placental form (GST-P)陽性細胞巣の出現とほぼ同様の曲線を示した。2)ラット肝発がんプロモーター,sodium phenobarbital (PB)は低濃度では肝GST-P陽性巣の発生を抑制し、PBの作用閾値の存在を再確認した。3) mutated allele specific amplification法はがん遺伝子の微少な変異を検出する方法としては不適当であることが判明した。4) IQとMeIQxの複合投与はその発がん性を増強した。5) PhIP-DNA付加体量には発がん標的臓器と非標的臓器の間に差はみられなかった。6)イニシエーション活性中期検索法におけるGST-P陽性細胞巣の発現程度は腫瘍発生と良く相関していた。7) p53ノックアウトマウスの膀胱発がん感受性はホモ欠失型>ヘテロ欠失型>野性型の順であった。8) lacI遺伝子導入マウスにおいて高濃度のMeIQxは発がん標的臓器にlacI変異頻度の上昇をもたらしたが、低濃度では上昇はみられなかった。9) quinolineとその誘導体の3-fluoroquinolineの発がん性はAmes試験の結果と良い相関性を示した。10) dimethylnitorsamineの低濃度域におけるラット肝発がんリスクの実験を班員全員の共同のもとに行っている。ラット肝発がんプロモーターであるsodium phenobarbitalはラット肝の前がん病変のマーカーである胎盤型glutathione S-transferase(GST-P)陽性細胞巣の発生を低濃度域では抑制させ、プロモーターであるにもかかわらず肝発がんを逆に抑制することを見出した。ヒトに発がん性が指摘されている砒素および砒素化合物の体内代謝産物であるdimethylarsenic acidは比較的低濃度域でもラット肝と膀胱発がんを促進させ、特に膀胱発がんでは環境中に存在すると同程度の低濃度からプロモーション作用を発揮した。ヘテロサイクリックアミンのTrp-P-1およびMeIQxの肝発がんイニシエーション活性は用量相関性であった。またヘテロサイクリックアミンの低濃度複合はラット肝発がんに対してisoadditiveに作用したが、組合せにより真の相乗効果も観察された。v-Ha-ras導入トランスジェニックマウスはethynylestradiolによる乳腺発がんに、TG-p53マウスはニトロソ化合物による膀胱発がんに高感受性であることが明らかにされた。発がん物質によるマウスHa-rasの微小変異をmutated allelic specific amplication法で検出することができた。ヒト末梢白血球DNAよりN^7-メチルグアニンを10^7のグアニン当り0.440の範囲で検出した。ヒト剖検ないし手術材料の腎,大腸よりMeIQx-DNA付加体を検出し、ヒトがMeIQxに曝露されていることが明らかにされた。さらに酸化的ストレスによるDNA障害のマーカーである8-hydroxyguanine(8-OHG)の測定法の改良を行い、少量組織で8-OHGの測定が可能となった。MeIQxについて全員の協力のもとに以下の発がん実験を行った。離乳後、肝細胞の増殖能が最も高い21日齢の雄性F344ラット2140匹を用い、0,0.001,0.01,0.1,1,10ppmの低濃度域および100ppmのMeIQxを4週間投与後、肝発がんプロモーターのsodium phenobarbital(PB)を追投与した群、およびそれぞれの濃度のMeIQxを16週間連続投与した群の2実験群を設け、検討した。現在までの検討結果:(1)肝における前癌変化の指標であるglutathione S-transferase placental form(GST-P)陽性細胞巣の発生は両実験群ともMeIQxの0.0011ppm群では対照群と全く差はないものの、10ppmでは増加(PB追投与群)、ないし増加傾向(MeIQ連続投与群)が認められ、高濃度の100ppmでは明らかに有意な発生増加を示した(平坦-立ち上がり直線)。(2)MeIQx投与の4週および16週目のいずれにおいても0.01100ppmの間で肝におけるMeIQx-DNA付加体(dG-C8-MeIQx)が検出され、しかもMeIQx投与量と付加体量との間に直線的な相関を認めた。(3)肝DNAの8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)形成は、MeIQx投与の4週目では1ppmから上昇し、10ppm以上で有意に増加した。第16週目においては、0.01ppm以上でMeIQxの用量に依存した上昇を示した(平坦-立ち上がり直線)。すなわちMeIQxは肝に8-OHdGを形成させ、さらにその形成はMeIQx投与期間の延長によって蓄積することが判明した。(4)MeIQxの代謝活性化に関与するCYP1A2の肝における蛋白発現量はMeIQxの投与群で増加し、しかもMeIQx投与量と蛋白発現量との間に直線的な相関を認めた。

以上、MeIQxの発がんリスクに関して、高濃度域の発がん実験結果の反応曲線から低濃度の反応を推測できないことを明らかにした。MeIQxについて全員の協力のもとに行った前年度の発がん実験における肝細胞の5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)標識率を検索した。すなわち、肝細胞の増殖能が最も高い21日齢の雄性F344ラットを用い、0, 0.001, 0.01,0.1, 1,10ppmの低濃度域および100ppmのMeIQxを16週間連続投与した群におけるBrdU標識率はglutathione S-transferase placental form (GST-P)陽性細胞巣の出現とほぼ同様の曲線を示した。2)ラット肝発がんプロモーター,sodium phenobarbital (PB)は低濃度では肝GST-P陽性巣の発生を抑制し、PBの作用閾値の存在を再確認した。3) mutated allele specific amplification法はがん遺伝子の微少な変異を検出する方法としては不適当であることが判明した。4) IQとMeIQxの複合投与はその発がん性を増強した。5) PhIP-DNA付加体量には発がん標的臓器と非標的臓器の間に差はみられなかった。6)イニシエーション活性中期検索法におけるGST-P陽性細胞巣の発現程度は腫瘍発生と良く相関していた。7) p53ノックアウトマウスの膀胱発がん感受性はホモ欠失型>ヘテロ欠失型>野性型の順であった。8) lacI遺伝子導入マウスにおいて高濃度のMeIQxは発がん標的臓器にlacI変異頻度の上昇をもたらしたが、低濃度では上昇はみられなかった。9) quinolineとその誘導体の3-fluoroquinolineの発がん性はAmes試験の結果と良い相関性を示した。10) dimethylnitorsamineの低濃度域におけるラット肝発がんリスクの実験を班員全員の共同のもとに行っている。
拒食症の感受性遺伝子の網羅的同定と機能解析による発症カスケードの解明

摂食障害は90年代後半より若年層を中心に急増した精神疾患であり、治療法や予後予測法の確立が待ち望まれる。我々は、マイクロサテライトを用いたゲノムワイドな相関解析法により新たに見出した拒食症感受性遺伝子群について、その分子機能解明の鍵となる多数の相互作用を同定するとともに、83アミノ酸から成る領域等、創薬ターゲットとして有望な機能ドメインを特定した。摂食障害は、90年代後半より急増した、予後不良の例も存在する深刻な精神疾患である。従来は母子関係が主要因とされてきたが、近年の疫学的研究や、双生児を対象とした遺伝学的研究は、遺伝要因が摂食障害の形成に大きな役割を果たすことを示している。従って、摂食障害の遺伝要因の解明と、見出された遺伝要因を基盤とする病態の解明は、疾患の治療・予防方策を構築する上での重要な課題である。我々は、独自に開発した3万個のマイクロサテライトを用いたゲノムワイドな相関解析法によって同定した15個の拒食症感受性領域を基盤として、疾患感受性遺伝子を同定する。同定した拒食症感受性遺伝子については、それらの機能・ネットワーク解析、疾患モデル動物作成などを通じて疾患カスケードを追求し、発症の分子機構を解明する。さらに、低分子リガンドデザインなどケミカルゲノミクスによる機能評価を行い、拒食症の治療・予防方策の基盤を構築する。摂食障害は、拒食症、過食症及び特定不能の摂食障害に分類されるが、90年代後半より若年層を中心に急増している。拒食症と過食症は同一患者で合併することが多く同一の遺伝要因が関与すると考えられている。しかしながら、摂食障害に対する有効な治療法は未開発であり、予後不良の例(6%が死の転帰をとる)も存在することより、摂食障害の病態の解明は重要な課題である。そこで、摂食障害の遺伝要因・病態の解明を目的として、我々が開発した3万個のマイクロサテライトを多型マーカーとして用いたゲノムワイドな相関解析を行った。その結果、これまで11個の100kbに絞り込まれた遺伝子候補領域を見いだした。さらにこれらのなかで4個の領域についてSNPなどの多型マーカーによる相関解析を行い、それぞれ1個ずつ、計4個の感受性遺伝子を同定した。それらは、CNTN5(contactin5;神経軸索の結合に関連する接着蛋白)、SYT12(syanptogamin XII;神経伝達物質の放出に関与)、NET01(neuropilin and tolloid-like receptor;輸送に関わる神経膜蛋白)、PARK7(parkin7;神経細胞死調節)であり、いずれも神経細胞の機能調節に関わると推定され、摂食障害の病態を考えるうえで興味深い。これらのうち、CNTN5ノックアウトマウスについて解析を行ったが、軽微な聴覚障害が認められた。また、マウスをENU突然変異処理により、SYT12遺伝子についてはアミノ酸置換を伴う4種類のノックインマウス、及びNET01についてはアミノ酸置換を伴う1種類のノックインマウスが作成された。これらについての摂食障害と関連する表現型の同定と解析は今後の課題である。また、バイオインフォマティクスを用いたネットワーク解析やプロテオミクスにより、疾患発症カスケードを解明し、摂食障害の治療・予防方策の基盤を構築することも目指す。CNTN5、SYT12、NETO1、PARK7は、独自のゲノムワイドマイクロサテライト相関解析の結果同定した摂食障害感受性遺伝子であり、何れもが神経系で機能すると推測されている。SYT12、NETO1についてはENU点突然変異マウスを計5個同定し、スピードコンジェニック法を用いた純化を行っている。先に取得したCNTN5 KOマウスも含め、これらの変異体マウスは、通常の飼育条件下では明らかな摂食行動の異常を示さない。より詳細な行動解析・神経機能解析が必要であり、摂食に伴いストレス負荷をかける等、摂食障害の発症機序をより反映する条件での解析を準備している。また、これら遺伝子のネットワーク解析を目的とした酵母ツーハイブリッド解析を進行中である。従来法による解析の結果得られた相互作用因子情報は極めて限られていたため、従来法の10倍程度の検出力を持つ新たな酵母ツーハイブリッド法を独自に開発し、これを用いて相互作用因子解析を続行している。我々が独自のゲノムワイドマイクロサテライト相関解析の結果同定した摂食障害感受性遺伝子であるCNTN5、SYT12、NETO1、PARK7は何れもが神経系で機能すると推測されている。そこで本年度はそれらの遺伝子の分子機能を明らかにし、疾患に関わる生物学的ネットワークを同定する目的で、従来法の10倍程度の検出力を持つ新たな酵母ツーハイブリッド法を独自に開発し、これを用いて相互作用因子解析を行った。SYT12、及び、NETO1について、各々148個、及び、73個のYTH相互作用因子を同定することができた。さらに、驚くべきことに、これら2因子の相互作用因子のうち43因子が共通であった。従って、構造的には類似性が認められないこれらの因子は、インテラクトームの視点からは高い類似性を持ち、共通の生物学的機能に関与していると考えられる。

さらに、SYT12のYTH相互作用因子として、SH3GL3(摂食行動と関連が深い疾患である糖尿病の感受性遺伝子として我々が先に同定した遺伝子)が同定され、これらが直接相互作用することが示唆された。これらSYT12、NETO1、SH3GL3のYTH相互作用因子に特徴的な点は、シナプス小胞のリサイクリング・開口放出に関連するものが数多く含まれている点である。例えば、SNARE complex member 1、Syntaxin (STX)8/17/18、Sorting nexin 1/2/6/7、Synaptojanin 1、Carboxypeptidase E、Synaptobrevin、Dynamin1等が含まれる。この結果は、これらの遺伝子の機能に関する次のような既知の情報とも符号する。即ち、SYT12は、神経伝達物質やホルモンの放出に関与するシナプトタグミンファミリーの遺伝子であるが、特に、「自発的な神経伝達物質の放出」に関与する可能性が指摘されている。また、NETO1ノックアウトマウスでは長期増強LTPに変化が見られ、さらに、SH3GL3はシナプス終末に局在するエンドサイトーシス関連因子である。従って、この相互作用解析の結果、摂食障害の疾患カスケードの起点として、シナプス小胞のリサイクリング・開口放出のプロセスの重要性が明らかになった。さらにSYT12とSH3GL3との相互作用は、摂食障害と糖尿病の分子的なリンクの可能性として興味深い。ゲノムワイドなマイクロサテライト解析により、摂食障害の感受性遺伝子として同定したSYT12とNRO1の両者について、それぞれ我々が改良した酵母Two Hybrid法を行い、両者ともシナプス小胞開口放出・リサイクリングに関係しているSH3GL3とSyntaxin8と相互作用していることが、明らかとなった。これらの相互作用は、FRET、BRET、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、DHFR等を用いたPCAによって神経細胞においても確認された。これらの事実は、摂食障害がシナプスにおける神経伝達物質の代謝による異常によって発症することを示唆する。これらの結果からシナプス小胞開口放出に関係しているSyntaxin8に対し、構造的な立場から摂食障害の創薬の標的としての低分子リガンド探索を考えている。尚、SYT12が2型糖尿病の感受性遺伝子であるSH3GL3とも相互作用することが実証され、摂食行動と糖尿病との関連が推測され興味深い。一方、摂食障害感受性遺伝子のマウス変異体の解析として、SYT12、CNTN5、NETO1の各々のマウス変異個体、及び、これらの掛け合わせによって得られるダブル・トリプル変異個体を用いて、これらの遺伝子の変異が及ぼす効果を検討したが、通常の生理学的・生化学的データの収集や、行動解析に加えて、ストレス下における行動異常について検索してが、現在までのところ正常マウスとの相違は観察されなかった。CNTN5、SYT12、NETO1、PARK7は、我々独自のゲノムワイドマイクロサテライト相関解析を用いて、新規に同定した摂食障害感受性遺伝子であり、何れもが神経系で機能すると推測される。
パーキンソン病PARK7の原因遺伝子DJ-1の機能解析

(1)抗酸化ストレス能従来の結果に加えて、ビスフェノールAが活性酸素を誘発し、ミトコンドリア阻害を起こし、DJ-1がその防御に当たる事を示した。更に、C106が酸化されたDJ-1のみを認識する抗体を作成した。(2)ミトコンドリアの機能調節DJ-1はミトコンドリアComplex1に直接結合し、DJ-1ノックダウン細胞ではComplex1の酵素活性が低下していることから、DJ-1はComplex1の正の制御因子であることが明らかとなった。(3)転写調節因子DJ-1は転写coactivatorあるいはcorepressorとして作用する。ターゲット遺伝子として、アンドロゲン受容体、p53に加えて、tau遺伝子の転写抑制を行うことでストレス防御にあたる。(4)プロテアーゼDJ-1はParkinの基質であるPael受容体、家族性アミロイドポリニューロパシーの原因タンパク質トランスサイレチンを分解することを明らかにした。2)パーキンソン病治療薬候補としてのDJ-1と、酸化ストレス誘導細胞死抑制能を有するDJ-1結合化合物の同定6-ヒロドキシドーパミンを中脳黒質に注射したパーキンソン病モデルラットに同時にDJ-1タンパク質を注射すると、黒質、線条体のドーパミン神経細胞死とそれに伴う行動異常を劇的に(90%)抑制した。次に、DJ-1の活性中心であるシステイン106領域に結合する化合物をバーチャルスクリーニングした。得られた複数の化合物は過酸化水素誘導によるSH-SY5Y細胞死を顕著に抑制し、細胞内の活性酸素を除去した。3)DJ-1とパーキンソン病以外の神経変性疾患(1)脳梗塞脳虚血による脳梗塞モデルラットにDJ-1タンパク質を注入すると、神経細胞死と行動機能低下が60%以上軽減された。脳梗塞後、DJ-1は脳精髄液に分泌される。(2)家族性アミロイドニューロパシー(FAP)DJ-1はFAP原因タンパク質transthyretin(TTR)とともに細胞外に分泌されTTRを分解した。FAP患者ではDJ-1が血清中に分泌されるが、健常人、FAP発症前carrierでは分泌されない。
機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤としての有用性解析

本研究は、Porphyromonas gingivalisのII型線毛クローンの歯周病および抗てんかん薬誘発性歯肉肥大との関連を明らかにし、さらに同クローン線毛タンパクをターゲットとした機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤モデルを構築し、その有用性を解析することを目的とした。その結果、抗てんかん薬誘発性歯肉肥大患者75名、450部位の歯肉縁下プラーク細菌叢のPCR解析を行った結果、歯肉肥大の発症と同クローンの存在との間に顕著な相関関係が認められた。更に、歯肉肥大部位に歯周治療を施し、real-time PCR法により同クローンの量的変化を測定した結果、臨床的な改善が認められた箇所においては同クローンの有意な減少が認められたが、臨床症状の改善が認められなかった部位においての量的変化は見られなかった。同様の知見が成人性歯周炎患者においても得られ、P.gingivalisのII型線毛遺伝子クローンは歯周病および抗てんかん薬誘発性歯肉肥大の原因因子であることが強く示唆された。P.gingivalisのII型線毛がヒトフィブロネクチンと特異的に結合することが示されたため、フィブロネクチンの線毛との結合領域の同定を行った。フィブロネクチン全タンパクをカバーする10分割フラグメントをリコンビナントタンパクとして作製した。ドットブロットアッセイおよびBIACOREを用い、精製リコンビナントタンパクとII型線毛リコンビナントタンパクとの結合親和性を評価したところ、フィブロネクチンタンパクのII型線毛との結合モチーフである特定領域を同定した。これらの結果をもとに、P.gingivalisのII型線毛タンパクと特異的に結合するフィビロネクチン領域とIgG/Fc領域とを融合させたキメラIgGタンパク質の大量発現系の構築をおこなった。cDNAライブラリを用いて、IgG1/Fcフラグメントをコードする遺伝子断片と、II型線毛結合領域をコードするフィブロネクチン遺伝子断片を連結させたベクターを作製し、CHO細胞に導入することによりフィブロネクチン-Fc融合タンパクを得た。現在、同融合タンパクの機能評価を行っているが、顕著な有用性の確認には至っていない。本研究は、歯周病菌Porphyromonas gingivalisのII型線毛をターゲットとした除菌療法を歯周治療に応用するために機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤モデルを構築し、その有用性を解析することを目的としている。そこで、先ず、II型線毛タンパクに強い付着特性を有するヒトフィブロネクチンとの線毛との結合領域の同定から研究を開始した。フィブロネクチンの線毛との結合領域を同定するために、フィブロネクチン全タンパクをカバーする10の分割フラグメントを作製し、精製した。2.各フィビロネクチンフラグメントとP.gingivalis線毛との結合親和性の評価ドットブロットアッセイおよびBIACOREを用いた評価により、フィブロネクチンタンパクの特定領域がP.gingivalis線毛に強い結合親和性を有することが示された。3.Fc融合タンパク質の大量発現系の構築マウス脾細胞cDNAライブラリを用いて、IgG1/Fcフラグメントをコードする遺伝子断片とP.gingivalis線毛特異的親和性を有する領域をコードする遺伝子断片をPCR法によりクローニングした。得られた遺伝子断片の塩基配列を確認後,まず、フィブロネクチン遺伝子断片のpSecTag2/hygベクターへのクローニングを行った。このベクターを用いることにより、分泌タンパクとして精製する事が可能となる。

さらに,フィブロネクチン遺伝子断片の3'側にマウスIgG1 Fcフラグメントの遺伝子断片を連結させ、両融合タンパクをコードする遺伝子断片を作製した。次年度は、作製したフィブロネクチン-Fc融合タンパク遺伝子をCHO細胞に導入させ、培養上清をSDS-PAGE上に展開し,抗マウスFcフラグメント抗体を用いて発現の確認を行う。その後、目的とする機能評価を継続する予定である。本研究は、Porphyromonas gingivalisのII型線毛クローンの歯周病および抗てんかん薬誘発性歯肉肥大との関連を明らかにし、さらに同クローン線毛タンパクをターゲットとした機能性免疫グロブリン融合タンパクの歯周ポケット貼剤モデルを構築し、その有用性を解析することを目的とした。その結果、抗てんかん薬誘発性歯肉肥大患者75名、450部位の歯肉縁下プラーク細菌叢のPCR解析を行った結果、歯肉肥大の発症と同クローンの存在との間に顕著な相関関係が認められた。更に、歯肉肥大部位に歯周治療を施し、real-time PCR法により同クローンの量的変化を測定した結果、臨床的な改善が認められた箇所においては同クローンの有意な減少が認められたが、臨床症状の改善が認められなかった部位においての量的変化は見られなかった。同様の知見が成人性歯周炎患者においても得られ、P.gingivalisのII型線毛遺伝子クローンは歯周病および抗てんかん薬誘発性歯肉肥大の原因因子であることが強く示唆された。P.gingivalisのII型線毛がヒトフィブロネクチンと特異的に結合することが示されたため、フィブロネクチンの線毛との結合領域の同定を行った。フィブロネクチン全タンパクをカバーする10分割フラグメントをリコンビナントタンパクとして作製した。ドットブロットアッセイおよびBIACOREを用い、精製リコンビナントタンパクとII型線毛リコンビナントタンパクとの結合親和性を評価したところ、フィブロネクチンタンパクのII型線毛との結合モチーフである特定領域を同定した。これらの結果をもとに、P.gingivalisのII型線毛タンパクと特異的に結合するフィビロネクチン領域とIgG/Fc領域とを融合させたキメラIgGタンパク質の大量発現系の構築をおこなった。cDNAライブラリを用いて、IgG1/Fcフラグメントをコードする遺伝子断片と、II型線毛結合領域をコードするフィブロネクチン遺伝子断片を連結させたベクターを作製し、CHO細胞に導入することによりフィブロネクチン-Fc融合タンパクを得た。現在、同融合タンパクの機能評価を行っているが、顕著な有用性の確認には至っていない。
低エネルギー(0.5〜1000eV)領域における多価イオンの電荷移行反応の研究

初年(62年)度研究では、高分解能イオン分光法によりNe^2・-N_2衝突における1電子捕獲過程移行反応を調べるのと平行させて、高電離多価イオンの電荷移行反応の研究に必要な多価イオン源開発を行った。63年度には、開発した多価イオン源に改良を加え、イオン源の特性を調べた。そして、これまでほとんど測定のない低エネルギー(12000eV)領域でC^4・-He衝突を手始めに2・3の多価イオンの衝突系で電荷移行反応断面積測定に成功した。本研究の主な研究成果の概要を以下に示す。(1)高分解能イオン分光法によるNe^2・-N_2衝突における1電子捕獲過程移行反応の研究:Ne^+生成イオンの運動エネルギーの分析から、Ne^<2+>・-N_2衝突における1電子捕獲過程移行反応は極めて状態選択的であること、軌道電子が捕獲されてできるN_2^+(X,A;v)イオンが生成されその振動分布はフランク・コンドン的でないこと、内核2σ。結合電子の電子捕獲過程など数々の新しい知見が得られた。(2)小型EBIS多価イオン源の開発:液体窒素でソレノイドを冷却する新しい方式でEBISイオン源やその励磁電源を大幅に小型化し、C^<6+>、N^<7+>やO^<8+>の裸イオンやNe^9・Ar^<16+>の高電離多価イオンの引き出しに成功した。(3)低エネルギー多価イオン衝突における電荷移行反応断面積の測定:C^<4+>-HeやNe^<4+>-Heなどの衝突における1電子および2電子捕獲過程の今まで測定のない低エネルギー(12000eV)領域の反応断面積の絶対値が測定された。低エネルギーC^<4+>-He衝突では、2電子捕獲過程が主要反応でその断面積は測定エネルギー領域内に極大を示す、1電子・2電子捕獲の低エネルギー断面積には多価イオン衝突故期待されたオービティング現象は現れていないなどの新しい知見が得られた。初年度における研究は,低エネルギー多価イオンの電荷移行反応の研究に必要な小型の多価イオン源の開発に重点がおかれ,次の様な手順で,初期の目的をほぼ達成することができた.1.小型EBIS多価イオン源の設計・製作.イオン源動作に必要な磁場発生装置を,液体窒素で空芯ソレノイドコイルを直接冷却する新しい方式を採用し,小型化・低電力運転を可能にした.その結果,排気系,コントロール電源を含むイオン源全体を50×50cm^2の架台上に組み込み従来になく小型化に成功した.2.磁場強度分布特性の測定.カソードおよびコレクター部をμメタルと鉄にて磁気シールドすることで,EBISイオン源動作に必要な磁場の急激な立上がり・立下がりを実現されていることが確認された.3.小型EBIS多価イオン源の動作テスト.(1).液体窒素自動補給機能も良好に動作し,液体窒素消費量もほぼ計算通りで,1KG磁場発生で1.2l/h程度で充分実用になることが判った.(2).イオン路の真空度は,イオン源動作に必要な10^<-9>Tor台の超高真空も実現できる.しかし,液体窒素導入時に10^<-9>Tor台の微少リークが生じる改善すべき問題がある.

(3).このイオン源の動作テストで,バックグラウンドガスの炭素・窒素・酸素のH様多価イオンまでが観測された.微少リークが改消できれば,裸イオン生成も充分期待できる.リークのある現状においても,He様多価イオンまでの多価イオンならば電荷移行反応断面積測定に必要な強度が得られる.目下,微少リーク守消に努めつつ,OPIG実装の複式質量分析計にイオン源を接続,断面積測定準備中.本年度は、62年度にソレノイド・コイルを液体窒素で冷却する新方式を採用して開発した小型EBIS多価イオン源に若干の改善を加え、炭素、窒素、酸素の裸イオン(C^<6+>、N^<7+>、O^<8+>)そして、ネオンやアルゴンの高電離多価イオン(Ne^<9+>、Ar^<16+>)を引き出すことに成功した。また、小型EBISから引き出された多価イオンのエネルギー幅はを速法で測定したところ0.4×qeVと狭く、この小型EBIS多価イオン源は低エネルギー多価イオン衝突実験のイオン源として充分使用できることが実証できた。液体窒素でソレノイドを冷却する新方式は、EBISイオン源とその励磁電源の小型化だけでなくEBISイオン源の運転に必要な超高真空確保にも威力を発揮した。この新方式の小型多価イオン源の性能について、昭和63年11月米国(ブルックヘブン研究所)で開催された"EBISイオン源とその応用"に関する国際シンポジウムにおいて招待講演として発表する機会を得ることができた。そして更に、イオン源からイオンをパルス的に引き出す回路を製作し、イオン源から引き出されるイオンの価数分布の時間変化を観測し、コンピュータ・シュミレーションの結果との比較からEBISイオン源中における電子衝撃による逐次電離による多価イオン生成の様子を調べた。また、一方これと平行して、C^<4+>-HeやNe^<4+>-Heなどの衝突における1電子および2電子捕獲過程の今まで測定のない低エネルギー(12000eV)領域における電荷移行反応断面積測定にも成功し新しい知見が得られた。
臓器特異的ミオシンアイソザイムを指標とする臓器特定法の開発

本研究は、臓器特異的なミオシンアイソフォームを指標として、臓器の特定を行う方法の開発を目的とするものである。そこで、まずヒト脳、肝よりミオシンを抽出精製し、これらを抗原として抗ヒト脳(HBM1,4,6)及び抗ヒト肝ミオシンモノクローナル抗体(HLM,1,4)を作製した。これらの抗体の臓器特異性をELISAにより検討した結果、HBM11は脳に特異的なミオシンアイソフォームを認識し、HBM6は非筋肉組織に共通のミオシンアイソフォームを、HBM4は骨格筋、心筋以外の全てのミオシンアイソフォームの認識することが判明した。しかし、HLM1,4は何れも肝以外の臓器のミオシンとも反応し、肝ミオシン特異的ではないことが明らかとなった。これらの抗体を用いるイムノブロッティングにより、各臓器におけるミオシンアイソフォームの組成を調べたところ、脳には少なくとも4つ、肝、脾には2つ、腎には3つのミオシンアイソフォームが存在することを明らかにした。脳のミオシンアイソフォームのうち、分子量の大きい2つはほぼ脳に特異的であり、脳以外の臓器では腎及び大動脈に極くわずかに存在するのみであった。HBM1はこの脳特異アイソフォームを認識し、脳を他の臓器から識別するという本研究の目的にかなったものであった。一方、肝のミオシンアイソフォーム組成の大部分が非筋肉組織に共通するものから構成されており、もし肝特異的アイソフォームが存在しても極く微量であり、臓器特定への利用は不可能と思われる。脳損傷を有する患者及び剖検死体血清からの脳特異ミオシンアイソフォームの検出を、HBM1を用いるサンドイッチELISAで検討した結果、感度に問題を残すもののその検出は可能であった。以上、本研究の当初の目的はほぼ達成されたと考える。今後高感度化をはかり、脳損傷の血清学的診断法へと発展させたいと考えている。ヒト脳より精製したミオシンを抗原としてモノクロナ-ル抗体を作製し、平滑筋ミオシンと非筋肉組織のミオシンの両方を認識する抗体および非筋肉組織のミオシンのみを認識する抗体とともに、脳に特異的にミオシンアイソザイムを認識する抗体を得ることに成功した。また、ヒト肝より精製したミオシンを抗原としてモノクロ-ナル抗体の作製を行ったが、非筋肉組織に共通のミオシンアイソザイムを認識する特異的抗体は得られていない。これらのヒト脳および肝のミオシンに対するモノクロ-ナル抗体を用いて各臓器(脳、肝、賢、大動脈)のミオシンアイソザイムの多様性をイムノブロット法により解析し、次のことを明らかにした。1.脳には二種の脳特異的ミオシン重鎖アイソフォ-ムが存在し、それ以外に非筋肉組織に共通した二種のミオシン重鎖アイソフォ-ムが存在する。2.肝には少なくとも三種のミオシン重鎖アイソフォ-ムが存在しする。3.賢には少なくとも三種のミオシン重鎖アイソフォ-ムが存在し、そのうちの一つは、脳特異的ミオシン重鎖アイソフォ-ムと共通の特異エピト-プを有するが、その分子量は脳特異重鎖より小さい。4.大動脈には二種の平滑筋ミオシン重鎖に加え二種の非筋肉組織ミオシン重鎖アイソフォ-ムが存在し、そのうちの一つは脳特異重鎖アイソフォ-ムと共通した特異エピト-プを有するが、その分子量は脳特異重鎖より小さい。これらの結果は、ミオシンアイソザイムのパタ-ンによる臓器の識別が可能なことを示唆するものと考えている。以上の結果は、文年4月日本法医学会総会で発表する。

そこで、まずヒト脳、肝よりミオシンを抽出精製し、これらを抗原として抗ヒト脳(HBM1,2,3,4)及び抗ヒト肝ミオシンモノクローナル抗体(HLM1,2,3,4)を作製した。これらの抗体の臓器特異性をELISAにより検討した結果、HBM1は脳に特異的なミオシンアイソフォームを認識し、HBM3は非筋肉組織に共通のミオシンアイソフォームを、HBM4は骨格筋、心筋以外の全てのミオシンアイソフォームを認識することが判明した。しかし、HLM1,3,4は何れも肝以外の臓器のミオシンとも反応し、肝ミオシン特異的ではないことが明らかとなった。これらの抗体を用いるイムノブロッティングにより、各臓器におけるミオシンアイソフォームの組成を調べたところ、脳には少なくとも4つ、肝、脾には2つ、腎には3つのミオシンアイソフォームが存在することを明らかにした。脳のミオシンアイソフォームのうち、分子量の大きい2つはほぼ脳に特異的であり、脳以外の臓器では腎及び大動脈に極くわずかに存在するのみであった。HBM1はこの脳特異アイソフォームを認識し、脳を他の臓器から識別するという本研究の目的にかなったものであった。一方、肝のミオシンアイソフォーム組成の大部分が非筋肉組織に共通するものから構成されており、もし肝特異的アイソフォームが存在しても極く微量であり、臓器特定への利用は不可能と思われる。脳損傷を有する患者及び剖検死体血清からの脳特異ミオシンアイソフォームの検出を、HBM1を用いるサンドイッチELISAで検討した結果、感度に問題を残すもののその検出は可能であった。以上、本研究の当初の目的はほぼ達成されたと考える。今後高感度化をはかり、脳損傷の血清学的診断法へと発展させたいと考えている。