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教職員人事行政の地方分権改革に関する調査研究

本研究は、公立小中学校における教職員雇用について分権改革に先行する事例に独自の分析枠組みを設定し再検証することを目的とするものである。県費負担教職員制度に並立して2006年度に全国展開されたのが市町村費負担教職員制度である。本研究では関東地方A町、関西地方B市における市町村費の教員雇用事例について関係者へのインタビュー調査、資料収集を行った。このうち、A町では1999年度より町立中学校において数学と英語のティーム・ティーチング(TT)のため、町費により非常勤講師を配置した。一方、B市では2005年度より専ら生徒指導に従事する教員を配置してきた。また、本研究では全国の市町村を対象としたアンケート調査を実施した。本研究は市町村費負担教職員制度の前史に相当する事例について、実証研究の観点から、その実態を明らかにすることを企図した研究である。県費負担教職員制度はその確立以降、全国の教育水準の確保に重要な役割を果たしてきた。同制度に付随して2006年度に全国展開されたのが市町村費負担教職員制度である。本研究はこの市町村教員の任用を題材に、この分野における分権改革が国から地方への権限委譲という一方向的なものではなく、市町村の先行事例を国の政策が取り込んでいった過程であったことを明らかにする。これまでの研究成果から、市町村教員雇用の先行事例は遅くとも1970年代には見られることが明らかになっており、分権改革によって初めて可能となったとする従来の評価は妥当ではない。本研究はこれらの事例に「前史的」事例という独自の分析枠組みを与えて分析し、従来とは異なった視点から分権改革の動態を跡づける。本年度は、長野県長野市、茨城県古河市などでのヒアリング調査、および資料収集など主に質的調査をメインとして取り組んだ。その他、県費負担教職員の人事異動を県教育委員会の出先機関として担う、地方教育事務所も、新しく研究対象に含め、地方分権改革、行財政改革、市町村合併との関係を検討した。教育事務所へのヒアリング調査も実施し、行財政改革によって地方教育事務所の役割が質的に変化しつつあることが明らかになりつつある。本年度はこれらの調査に基づいて、日本教育学会大会において研究成果を発表した。本研究は公立小中学校における教職員雇用について分権改革に先行する事例に独自の分析枠組み(前史的事例)を設定し再検証することを目的とするものである。県費負担教職員制度は全国の教育水準の確保に重要な役割を果たしてきた。同制度に並立して2006年度に全国展開されたのが市町村費負担教職員制度である。この制度は2006年に全国展開されたものの、必ずしも全国的に広がっているとは言えない。なお、前史的事例の研究枠組みは県費負担教職員との並立状況を検討課題としていることから、非常勤ではなくフルタイムの教員雇用を表す枠組みである。これらの自治体は非常勤講師の雇用によって自治体内の教育課題に対処していた。前述した通り非常勤講師雇用は前史的事例の研究枠組みには該当しないが、これら2市町がフルタイムではなくなぜ非常勤の雇用を選択したのか、その背景を探る対照事例として取り上げた。このうち、A町では1999年度より町立中学校において数学と英語のティーム・ティーチング(TT)実施のため、町費により非常勤講師を配置した。この政策形成には町長の問題提起から、教育委員会事務局における政策形成、議会における政治的対立など様々な経緯があった。本研究ではこれらも調査・分析対象とした。B市では2005年度より専ら生徒指導に従事する教員(生徒指導専任教員)を配置してきた。この生徒指導専任教員の受け持つ授業負担を軽減するために、市費により非常勤講師を雇用したのである。B市についても、政策形成の経緯を中心に調査・分析の対象としている。また、本研究では全国の市町村を対象としたアンケート調査も実施した。その集計・分析はまだ途上であるが、上記の事例調査との関連を踏まえつつ、引き続き研究成果を公表してゆく。必ずしも当初の予定通り進んでいない部分があることは否めない。平成23年度は長野県、茨城県古河市などでのヒアリング調査、資料収集など質的調査がメインとなった。これは、文部科学省の会議において、従来存在しないとされてきたデータが提示されたことによる。これによって当初の研究計画を若干修正する必要が生じた。平成24年度は23年度の積み残した課題を年度当初の段階で修正する。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は平成23年度にやや研究の遅れが出てしまっていることから、この修正に努めるとともに、学会発表などで成果を報告してゆく予定である。研究計画、研究内容の大枠には変更がない。
希土類材料の形態制御と機能の発現機構に関する研究

本研究では、希土類材料の形態(組成、原子価、構造)を制御することにより、出現する物性すなわち機能がどの様に変化するかを系統的に検討し、その機能の発現機構を明かにすると共に、より高度な材料を創製する上での設計指針を得ることを目的としている。本年度に得られた主な成果は以下の通りである。1.高性能ボンド磁石の創製Sm_2Fe_<17>N_Xの最も可能性のある磁石としての応用はボンド磁石であり、この場合優れた磁気特性と耐久性とを備えた磁性粉末を得ることが最も重要である。本研究では、Sm_2Fe_<17>N_X粉末に界面活性剤を用いた効率的湿式粉砕法を適用することで高い性能を有する磁性粉末(BH_<max>=41MGOe)とすることに成功した。さらに、Zn (C_2H_5)_2の紫外光分解で生成する金属亜鉛でSm_2Fe_<17>N_X微粒子表面を破覆安定化することで、高性能Zn/Sm_2Fe_<17>N_Xボンド磁石(BH_<max>=21.1MGOe)が得られることを見い出した。2.希土類錯体付活無機-有機複合蛍光体の作製とその応用シリカと有機のオリゴマーユニットからなるORMOSIL複合マトリックス内に錯体を導入したところ、さらに錯体を均一かつ高濃度で同マトリックス内に導入できることが明らかとなった。その結果、[Eu (phen)_2] Cl_3および[Tb (bpy)_2] Cl_3錯体を10mol%ドープし150°Cで加熱処理したORMOSIL複合体は強い緑色および赤色発光を示し、その相対発光強度は市販の蛍光体に対してそれぞれ、80および100%にも達した。一方、単結晶およびアモルファスシリコン太陽電池上に上記希土類錯体ORMOSIL複合体を被覆し、その光電流を被覆前のそれと併せて測定したところ、被覆後のa-Siおよびc-Si太陽電池の出力に顕著な増加が見られ、希土類錯体ORMOSIL複合体の被覆が太陽電池の出力増大に有効であることが明らかとなった。(1)プラズマ法により得られた永久磁石材料Sm_2Fc_<172>C_xN_yを、ボールミルを用いて単磁区粒子サイズまで粉砕した。これに伴い保磁力[iHc]の値は向上し、特に50時間粉砕した試料では11.4kOeにも達することが明らかとなった。また、粉砕の際溶媒として使用するヘキサン中に界面活性剤(スルホこはく酸ジ-2-エチルヘキシルナトリウム)を添加することで、試料を均一に粉砕できることも明らかとなった。一方、亜鉛アセチルアセトナートの分解により亜鉛金属を試料表面に均一にコートすると、保磁力が向上することがわかった(7.20→7.84kOc)。この理由は、試料粒子表面に存在する保持力低下の原因である凹凸およびクラックが亜鉛コートすることで埋まり、粒子表面がなめらかになったためであると考えられる。(2)センサの材料としてp型半導体である酸化ニッケルに酸化銅を混合した系を選び、Nox検出持性を調べた。3価としてAl,Co,Scの添加を実施した結果、スカンジウムが最も効果的であることがわかった。

従来のNoxセンサがNOに対し感度が高いことに較べ、このセンサではNO_2選択性を示ことがわかった。さらに高感度なNO_2センサを得るために、薄膜化を行った。その結果、NO_2に対して低濃度域での感度、および応答速度(約10分から7分へ)が向上したが、NOに対してもNO_2と逆方向へ応答し選択性が失われた。そこで、熱処理条件の雰囲気を酸素に変えたところ、バルク体試料同様にNO_2選択性をもち、かつ高感度なセンサが得られた。(3)高い吸蔵水素濃度を有する水素吸蔵合金LaNi_<5.0>結晶膜の作製を試みた。製膜時の基板温度を変えることにより、種々の結晶化度を有する膜が得られた。573Kで得られる膜は、結晶バルクと同等の構造を持つことがわかった。この膜の吸蔵水素濃度は、303K,1.1MPaでH/LaNi_<5.0>=3.1以上であり、これまでに得られている膜試料のなかで最大の水素濃度を示した。また、表面が不連続な基板(焼結金属)を用いると、水素吸蔵時、膜面に水平な方向への膨張が容易となり、平滑な基板を用いた場合と比較して高濃度に水素を吸蔵できることがわかった。本研究では、希土類材料の形態(組成、原子価、構造)を制御することにより、出現する物性すなわち機能がどの様に変化するかを系統的に検討し、その機能の発現機構を明かにすると共に、より高度な材料を創製する上での設計指針を得ることを目的としている。本年度に得られた成果は以下の通りである。1.酸化セリウム超微粒子の作製と物性酸化セリウムは自動車用排ガス浄化触媒の助触媒として重要であると共に、レンズの研磨剤ならびに紫外線の吸収剤として多用されており、これらへの使用に当っては試料の粒径は極めて重要となる。ここでは、真空蒸着法とマトリックス単離法とを組み合せた手法(RAD法)により、数nmの平均粒径を有する酸化セリウム超微粒子の作製に成功した。2.希土類錯体付活無機-有機複合マトリックス蛍光材料の作製と発光特性希土類錯体は優れた発光特性を有する反面、その乏しい機械的強度と耐久性のためにこれまで実用に供されることはなかった。これに対し、シリカあるいは無機と有機成分の複合体であるORMOSILをマトリックスとし、これらに希土類錯体を導入することで、従来の無機蛍光体に匹敵する蛍光輝度を有する蛍光体を開発することに成功した。3.希土類複合酸化物を用いたNO_Xセンサ希土類と銅からなる複合酸化物をセンサ素子として用いることにより、NO_Xの構成成分であるNOとNO_2とをそれぞれ選択的に検出することに成功した。4.水素吸蔵性希土類金属間化合物薄膜の作製と水素吸蔵特性LaNi_5の結晶質薄膜を多孔質基板にスパッタ蒸着することにより、従来のアモルファス薄膜と比べてより多量の水素を吸蔵できることを見い出した。本年度に得られた主な成果は以下の通りである。1.高性能ボンド磁石の創製Sm_2Fe_<17>N_xの最も可能性のある磁石としての応用はボンド磁石であり、この場合優れた磁気特性と耐久性とを備えた磁性粉末を得ることが最も重要である。本研究では、Sm_2Fe_<17>N_x粉末に界面活性剤を用いた効率的湿式粉砕法を適用することで高い性能を有する磁性粉末(BH_<max>=41MGOe)とすることに成功した。
歪超格子によるII-VI族化合物半導体の物性制御

本研究では,歪超格子の採用によりII-VI族化合物半導体の物性を制御することを目的に, MBE(分子線エピタキシー)法,及びMOMBE(有機金属分子線エピタキシー)法により膜形成を行い,下記の成果を得た.1.MBE法によるZnSe-ZnTe歪超格子(SLS)の製作と評価:まずX線回折,透過電顕による格子像観察,ラマン散乱法などにより構造評価を行った.その結果,各層厚50〓以下では弾性歪により格子不整が緩和され,精度良く超格子構造が形成されていることが確認された.また超格子構造により形成される量子準位を,フォトルミネッセンス(PL)法により評価し,各層の膜厚制御により量子順位を可視光領域で制御可能であることを見い出した.また変調ドーピング法(n-SLS:ZnSe層にGaをドーピング, p-SLS:ZnTe層にSbをドーピング)によりp, n両伝導形の作成に初めて成功した.更に超格子構造の熱的安定性については,膜成長温度より180°C高い熱処理において相互拡散が認められた成長温度では無視できる程度であることが明らかとなった.2.MOMBE法によるZnS-ZnSe歪超格子の製作と評価:またGaAs基板上に超格子を形成し, PL法により量子準位の光学的評価を行った.その結果, 400nm台の青色領域でZnSe井戸層の膜厚制御により量子準位の制御が可能であることを見い出した.またGaP基板上にZnSバッファー層を設け超格子を形成したところPL発光の半値幅の改善が認められた.3.今後の計画:ZnSe-ZnTe歪超格子はタイプII超格子の為,発光材料に供するためには各層10〓以下で精度良く堆積する必要があり,単原子層成長技術の導入で本課題の達成を目指す.またMOMBE法では,現在までに得た技術をもとにポリタイプ超格子を作製し, ZnS-ZnSe歪超格子と合わせ,より広いエネルギー範囲における量子準位制御を目指す.本研究では,歪超格子の採用によりII-VI族化合物半導体の物性を制御することを目的に, MBE(分子線エピタキシー)法,及びMOMBE(有機金属分子線エピタキシー)法により膜形成を行い,下記の成果を得た.1.MBE法によるZnSe-ZnTe歪超格子(SLS)の製作と評価:まずX線回折,透過電顕による格子像観察,ラマン散乱法などにより構造評価を行った.その結果,各層厚50〓以下では弾性歪により格子不整が緩和され,精度良く超格子構造が形成されていることが確認された.また超格子構造により形成される量子準位を,フォトルミネッセンス(PL)法により評価し,各層の膜厚制御により量子順位を可視光領域で制御可能であることを見い出した.また変調ドーピング法(n-SLS:ZnSe層にGaをドーピング, p-SLS:ZnTe層にSbをドーピング)によりp, n両伝導形の作成に初めて成功した.更に超格子構造の熱的安定性については,膜成長温度より180°C高い熱処理において相互拡散が認められた成長温度では無視できる程度であることが明らかとなった.2.MOMBE法によるZnS-ZnSe歪超格子の製作と評価:またGaAs基板上に超格子を形成し, PL法により量子準位の光学的評価を行った.その結果, 400nm台の青色領域でZnSe井戸層の膜厚制御により量子準位の制御が可能であることを見い出した.またGaP基板上にZnSバッファー層を設け超格子を形成したところPL発光の半値幅の改善が認められた.3.今後の計画:ZnSe-ZnTe歪超格子はタイプII超格子の為,発光材料に供するためには各層10〓以下で精度良く堆積する必要があり,単原子層成長技術の導入で本課題の達成を目指す.またMOMBE法では,現在までに得た技術をもとにポリタイプ超格子を作製し, ZnS-ZnSe歪超格子と合わせ,より広いエネルギー範囲における量子準位制御を目指す.
アスピリンによるマスト細胞活性化の修飾に関する機序解明とアスピリン不耐症との関連

アスピリン(ASA)は抗炎症目的に様々な疾患で多用されているが、その一方でアスピリン不耐症などにおいて即時型アレルギーの増強因子として作用することが臨床上の問題点になっている。これらの反応ではロイコトリエン(LT)産生が亢進し、それに関与するLT合成酵素の殆どがマスト細胞に発現していると考えられているが、その機序は解明されていない。研究者はこれらの機序を解明する目的で平成19年度から本研究をい、平成20年度には以下の結果を得た。まず研究分担者の鈴木らはマスト細胞を抗原刺激するとカルシウム非依存性カルシム流入経路が活性化されることをみいだし、これをBiochem Pharmacol2008に報告している。このカルシウム流入には複数のチャンネルの関与が示唆がされるが、そのうちの1つは、薬理学的に興奮性細胞に存在しdihydropyridine(DHP)感受性を湿すL型カルシウムチャンネル(L-type Ca^<2+> channels LTCCs)に類似する。LTCCsは電位依存性カルシウムチャンネルのなかで開口時間の長いタイプで、CRAcチャンネルよりもはるかに大量のカルシウム流入を起こすことができる。またマスト細胞のLTCCs類似チャンネルはIgEを介して活性化され、サイトカイン産生を制御している。そこでマスト細胞を用いてASAによるDHP感受性チャンネルを介したLT産生経路の活性化を調べたところ、低濃度のASAはDHP感受性チャンネルを撰択的に活性化してIgEを介するマスト細胞のLT産生を増強していることがわかった。今回の研究を通して研究者らは、シクロオキシゲナーゼ活性阻害とは異なった新しいASAのマスト細胞に対する作用機序、則ちIgE非依存性ASAがカルシウム応答を調節することにより、IgEを介するマスト細胞を修飾することをみいだした。今後さらに研究を発展させ、ASAが即時型アレルギー反応を増悪化させる分子機序を解明する予定である。アスピリン(ASA)は抗炎症目的に様々な疾患で多用されているが、その一方で食物依存性運動誘発性アナフィラキシーなどにおいて即時型アレルギーの増強因子として作用することが臨床上の問題点になっている。これらの反応ではロイコトリエン(LT)産生が亢進し、それに関与するLT合成酵素のほとんどがマスト細胞に発現していると考えられているがその機序は解明されていない。これらの機序を解明する目的で今回の研究を行い、以下の結果を得た。ラットマスト細胞株RBL-2H3細胞において、ASAは抗原刺激によるLTC_4産生を低濃度で増強させるのに対し高濃度で抑制するという2相性を示した。LT産生には細胞外カルシウム(Ca)の流入が必要であることから、細胞内Caに対するASAの影響を検討した。その結果ASAは抗原刺激による細胞内Caの上昇を増強させた。次に細胞内Caの上昇がどのCa流入機構に関与しているか調べた。一般にマスト細胞のCa流入機構として小胞体Caストアの涸渇に依存して活性化するCapacitative Ca Entry(CCE)機構と、小胞体Caストアに依存しないnon-Capacitative Ca Entry(NCCE)機構の2つに大別される。ASAはCCEに対して濃度依存性に抑制し、NCCEに対してはCa流入を増強した。NCCE機構がLT産生にどのように影響しているか調べると、Ca流入と同様に抗原刺激はNCCEを介してLT産生を顕著に増加させ、さらにASAでは相乗的な増強効果がみられた。以上の結果からASAはNCCE機構を介してLT産生の増強効果を誘導していることが示された。
C4光合成に関与するPEPカルボキシラーゼ遺伝子の細胞タイプ特異的発現の分子機構

C4植物であるトウモロコシのPEPカルボキシラーゼ(PEPC)遺伝子は少なくとも三つ存在し、各メンバーは、根、緑葉、黄化葉などで互いに異なった組織特異的な発現をしていると考えられている。とくに、C4光合成に関与するPEPC遺伝子は葉肉細胞において強く発現され、維管束鞘細胞では発現されないので両細胞の分化による発現制御を解析する上で良いモデル系といえる。本研究は各々のPEPC遺伝子のプロモーター領域を同定することを目的とする。本年度の研究成果を以下に記す。1.すでに得ている4種類の染色体DNAクローンのうち三つ(λM324、λM21、λM91)は、C4光合成のPEPCcDNAの5'-非翻訳領域とほぼ完全に一致する塩基配列をもち、かつ転写開始始点を含むことがわかった。2.上記の三つのクローンについて転写開始点の上流約1.2kbの塩基配列を決定した。その結果、λM324は他の二つとは全く異なっていたが、λM21とλM91は互いによく似ていることがわかった。詳細なサザン・ハイブリダイゼーション解析によって、λM324がC4光合成のPEPC遺伝子のプロモーター領域を含むクローンであることが明らかとなった。3.黄化葉および根からもmRNAを調整し、各々についてcDNAライブラリーを作成した。4.根のcDNAライブラリーから根において最も強く発現しているPEPC遺伝子の部分長cDNA(約900bp)をクローン化し、塩基配列を決定した。翻訳領域の塩基配列およびそれから導かれるアミノ酸配列はC4光合成のPEPCと約80%の相同性を示したが、3'-非翻訳領域では、全く相同性はなかった。後者のDNA断片はたがいにハイブルダイズせず、それぞれの遺伝子の特異的プローブとなり得ることがわかった。これらのプローブによって両遺伝子がそれぞれ1コピー存在することがわかった。
アルツハイマ-型痴呆脳におけるアミロイド産生細胞の解明

Alzheimer型痴呆脳に出現する老人斑アミロイドはβ/A4蛋白を主成分とすることが明らかにされたが,このβ/A4蛋白前駆体からアミロイド線維が形成される機序は未だ解明されていない.この脳アミロイドの由来に関しては血管由来説や神経細胞由来説が主流であるが,我々は星形グリア由来説を提唱し,本年度の研究では脳アミロイド沈着と星形グリアの関係を検討した.くも膜直下のβ/A4蛋白沈着の超微形態をみると少量のアミロイドが星形グリアの突起に取り囲まれていた.同部のβ/A4蛋白の局在を免疫電顕で観察するとβ/A4蛋白は太い星形グリアの突起の膜間に沈着していた(Neurosci Letter in press).一方,β蛋白陽性となった細胞外神経原線維変化の超微形態を検討すると,細胞外の神経原線維変化に星形グリアの突起が多数侵入している部分に,アミロイド線維が認め,星形グリアに取り込まれた細胞外神経原線維変化にアミロイドが二次的に沈着することを示した(Am J Pathol in submission).この様にβ/A4蛋白沈着と星形グリアの突起との密接な関係を明らかにしたので,さらに,β/A4蛋白前駆体の局在を検討した結果,アルツハイマ-型痴呆脳に多数出現する反応性星形グリアは,多量のβ蛋白前駆体を有していた.次の段階として,星形グリアにおけるβ蛋白前駆体産生を検討するため,in situ hybridization法を行った.β蛋白前駆体mRNAを認識するビオチン標識oligonucleotide probeを用いて酵素抗体法で検出を行い,星形グリアにおけるβ/A4蛋白前駆体合成を示した.この他にも細胞内神経原線維変化がβ蛋白前駆体の抗体で染色されることを見いだしたので,免疫電顕や脳から抽出した神経原線維変化の染色性を検討し,神経原線維変化にβ蛋白前駆体が少量含まれていることを明らかにした(Brain Res in press).Alzheimer型痴呆脳に出現する老人斑アミロイドはβ/A4蛋白を主成分とすることが明らかにされたが,このβ/A4蛋白前駆体からアミロイド線維が形成される機序は未だ解明されていない.この脳アミロイドの由来に関しては血管由来説や神経細胞由来説が主流であるが,我々は星形グリア由来説を提唱し,本年度の研究では脳アミロイド沈着と星形グリアの関係を検討した.くも膜直下のβ/A4蛋白沈着の超微形態をみると少量のアミロイドが星形グリアの突起に取り囲まれていた.同部のβ/A4蛋白の局在を免疫電顕で観察するとβ/A4蛋白は太い星形グリアの突起の膜間に沈着していた(Neurosci Letter in press).一方,β蛋白陽性となった細胞外神経原線維変化の超微形態を検討すると,細胞外の神経原線維変化に星形グリアの突起が多数侵入している部分に,アミロイド線維が認め,星形グリアに取り込まれた細胞外神経原線維変化にアミロイドが二次的に沈着することを示した(Am J Pathol in submission).この様にβ/A4蛋白沈着と星形グリアの突起との密接な関係を明らかにしたので,さらに,β/A4蛋白前駆体の局在を検討した結果,アルツハイマ-型痴呆脳に多数出現する反応性星形グリアは,多量のβ蛋白前駆体を有していた.次の段階として,星形グリアにおけるβ蛋白前駆体産生を検討するため,in situ hybridization法を行った.β蛋白前駆体mRNAを認識するビオチン標識oligonucleotide probeを用いて酵素抗体法で検出を行い,星形グリアにおけるβ/A4蛋白前駆体合成を示した.この他にも細胞内神経原線維変化がβ蛋白前駆体の抗体で染色されることを見いだしたので,免疫電顕や脳から抽出した神経原線維変化の染色性を検討し,神経原線維変化にβ蛋白前駆体が少量含まれていることを明らかにした(Brain Res in press).
アミン化合物に着目した，発酵による機能性向上機構の解明と新規米発酵食材の開発

アジアの発酵食品から分離されているさまざまな微生物を用いて米発酵物を製造し,その成分分析および生理活性を評価した。いずれの発酵物においても未発酵物と比較してポリフェノール,アミノ酸含量,還元糖量などの含有量が増加しており,微生物による活発な代謝活性が生じていることが示された。特に2種のRhizopusを用いた発酵物では高値を示した。生理活性評価では,抗酸化活性および脂肪分解活性が発酵によって有意に上昇することを明らかにし,特にMucor cillcinellodesを用いた発酵物において顕著であり,これらの生理活性を有する新規米発酵食材を開発するためのスターターとして有望であることが示された。昨今,余剰米や規格外米等の未利用米が急激に増加しているため,主食用以外の用途を開発し米の消費量を拡大することが急務となっている。米麹は,味噌や醤油,酒等,日本の伝統的な食品の製造に欠かせない食材であるが,日本の米麹はAspergillus属のカビを用いたもの(散麹)に限られている。一方で,アジア諸国に目を向けると,タイのLuck PangやインドネシアのRagi,ブータンのChang poo等,さまざまな米麹(餅麹)が存在する。そこで代表者は,新規米発酵食材の開発を目指すため,アジアの糖化微生物で純粋発酵させた米麹を製造し,それらに保健機能の解明に着手した。米は日本の最も重要な作物として全国的に栽培されてきた。しかし昨今,未利用米が急激に増加しているため,主食用以外の用途を開発し米の消費量を拡大することが急務となっている。本研究では,アジアに分布する糖化微生物を用いて米発酵物を製造し,保健機能を調査することで,機能性に優れ,かつ,バラエティーに富んだ米麹の開発を目指している。また本研究は,このような米発酵物を対象として,発酵による機能性付与のメカニズムを解明しようとするものである。米は我が国における最も重要な作物として全国的に栽培されてきた。そこで本研究では、未利用米の有効利用を目的として新規米発酵食材の開発を目指すとともに,米の発酵によりどのような機構で保健機能が備わるのかを明らかにすることを目指した。昨年度までに,発酵物と未発酵物の抗酸化活性や抗肥満作用を比較し,全発酵物(Aspergillus oryzae, Monascus pilosus NBRC 4520,Absidia corymbiferaNBRC 32279, Mucor circinelloides NBRC 4554, Mucor racemosusNBRC 4581, Rhizopus oligosporus NBRC8631, Rhizopus oryzae NBRC 4706, Saccharomycopsis fibuligera NBRC 1665)のうち, Mu. circinelloidesの発酵物において未発酵に比べて顕著な活性の上昇が見られていた。今年度は,その寄与成分の可能性が考えられるアミノ酸代謝物(tryptopholやtryptamine, Tyrosolなど)の生成が発酵条件により変化が見られるかを調査した。その結果、これらの生成は高温で長期間の発酵でより促進されることが分かった。また、米のタンパク質含量の増加に伴って,発酵物に含まれるアミン化合物の増加が見られるかを調べるためにアルブミンを添加した米の各発酵物を調整し,アミン化合物を測定したが,顕著な増加は見られなかった。今年度は実際に高タンパク質米を用いて発酵試験を実施することができなかったが,来年度以降の研究により,高タンパク質米の種類とアミノ酸代謝物の生成とその実用性について検討していく予定である。昨年度の報告において,平成26年度の目標として,製造した米発酵物を対象として脂肪分解活性とアミン化合物の生成との関係性を明らかにすることを上げた。今年度には,発酵物で抗酸化活性が上昇し,その活性物質も同定することができたが,目標に上げた課題を達成することができなかったたため,やや遅れていると判断した。食品化学平成27年度にはまず,米中の成分(アミン化合物)と脂肪分解活性との関係について明らかにする。また,発酵による抗酸化活性,脂肪分解活性の上昇とアミン化合物の生成との関係性を主成分分析を用いることにより解明する。また,機能性に富む米麹開発に向けた応用研究として,各種米発酵微生物を用いた米麹製造条件の検討を行う。平成25年度の目標は,製造した米発酵物の成分分析を行うことであったが,研究実績の概要に記したように,各発酵物に含まれる成分の特徴を明確に示すことができ,またそれのみでなく,各発酵物のうち3種の発酵物における脂質分解活性を明らかにすることができた。よって25年度の研究は,おおむね順調に進展していると判断した。

平成26年度には,まずダンシルクロライド誘導体化によるアミン化合物の分析法の確立を行う。そして,その手法を用いて,製造した米発酵物中のアミン化合物種の特定と含有量の調査を行う。また,現在これらの米発酵物に見いだされている脂肪分解活性とアミン化合物の関与について主成分分析(PCA)により詳細に調査する。さらに,米発酵物のin vivoにおける抗肥満活性をICRマウスを用いて検討する。また,効果を示した米発酵物中に含まれるアミン化合物を分析し,in vitroによる脂肪分解活性とin vivoにおける抗肥満作用,そして,それに寄与するアミン化合物種について総合的に考察する。平成26年度に当初の予定にない物品を購入する必要が生じたため。平成25年度の繰越金は,NMR用溶媒およびサンプルチューブの購入のために使用する。また,平成26年度の予算は,アミン化合物の標準サンプルおよび分析用試薬,脂肪分解活性測定用,ICRマウスを用いたin vivo抗肥満試験のための消耗品費に使用する予定である。
ナノダイヤモンドによる新規MRリンパ管造影法開発:  in vivo study

我々は,ウサギ(日本白色種)を用いて,古典的リンパ管造影を行うことに成功した.また,CTで撮像して,これを元に3次元画像を作成したところ,非常に鮮明なウサギのリンパ系画像を得ることに成功した.この手法は,多くの他施設においても,リンパ系の動物実験を行うことを可能にするもので,我々は,普遍的で有用なモデルの開発に成功したと考えている.動物を用いたMRI撮像実験を行うことによって,ナノダイヤモンド・Gd複合造影剤(Gd-DTPA-Nd)は,炭素-炭素共有結合程度の強固な結合により,数百nm数μm程度の凝集体を形成してしまうことが判明した.これを解消することが,今後の検討課題である.リンパ系の画像化技術は,血管系画像に比して大きな遅れをとっている.リンパ管造影は油性造影剤を用いる古典的方法が現在も一般的であるが,侵襲が大きく,難渋することも多い.近年,リンパ系の低侵襲検査法として,通常MRI造影剤を用いたリンパ管造影(MRリンパ管造影)が研究されているが,リンパ系との親和性が低く,描出能が不十分である.この問題点を解決するために,Gd-DTPA-Ndナノ複合粒子(Gd-DTPA-Nd)」に着目した.本剤はナノスケールでかつ生体適合性・化学安定性に優れており,MRリンパ管造影の造影剤に適していると考えられる.本研究の目的は,未だ不明であるin vivoにおけるGd-DTPA-Ndの体内動態と安全性評価並びにMRリンパ管造影でのGd-DTPA-Ndの造影効果の評価である.本年度は、古典的直接リンパ管造影の手技確立と実験動物のリンパ系画像解析を行った。日本白色種2匹を用いて、リンパ管造影を行った。造影剤は油性造影剤(リピオドール)を用いた。動物実験用X線透視装置で、体幹部リンパ系が全体に描出されたことを確認した。MDCTにて体幹部リンパ系の詳細な3D画像を得ることに成功した。ウサギでのMRI撮像実験前の予備実験として、SDラットを用いた.0.05M Gd-DTPA-Ndを足底皮下に各0.1ml注入し,MRIで撮像を行った.しかし、MRIでのリンパ管の描出は認められなかった.Gd-DTPA-Ndの溶液中での凝集が問題であると考え,ホモジナイザーを利用して分散液を作成することとした.純水中でのGd-DTPA-Ndを作成することに成功した.Gd-DTPA-Ndの溶液中での凝集のため、MRIでの造影効果の判定が不能であった。分散が可能となる手段が見つかりそうなため凝集の問題を解消できると考え、来年度はMRIでの造影効果を判定する予定である。今年度は,まず最初に昨年度に引き続き,ウサギにおいて古典的直接リンパ管造影の手技確立のための実験を行った.下腿リンパ管又は膝窩リンパ節を露出し,30 Gリンパ管造影用針を穿刺し,油性造影剤(リピオドール)を各1 mlシリンジで用手的に緩徐に注入した.注入終了後,動物実験用X線透視装置で撮影を行い全身のリンパ系の解析を行った.今年度,この手技が安定して行うことができ,ウサギにおいて古典的直接リンパ管造影の手技を確立することができた.次にホモジナイザーを利用して純水中で分散したナノダイヤモンド・ガドリニウム複合造影剤(Gd-DTPA-Nd)を用いて,皮内注射による間質MRリンパ管造影を行った(ウサギでのMRI撮像実験前の予備実験として、SDラットを用いた).SDラットの両側足底に0.1 Mに調整したGd-DTPA-Ndを皮内注射し,MRI装置で撮像した.MRI装置は1.5T MRI (Achieva, Philips)を用いた.SDラットを検査台に固定し,表在コイルを用いてenhanced 3D T1high-resolution volume excitation with fatsaturation (e-THRIVE)で撮像を行った.得られた画像を確認したところ,リンパ系の描出は不良であった.この原因について,純水中では分散しているものの,生体内でGd-DTPA-Ndが凝集するためではないかと考えられた(一次粒子径がナノスケールであるGd-DTPA-Ndは,炭素-炭素共有結合程度の強固な結合により,数百ナノメートル数マイクロメートル程度の凝集体を形成してしまう).本研究から,Gd-DTPA-Ndの課題である生体内での凝集を解消することがMRリンパ造影に特化した造影剤を開発することに重要であることが分かった.我々は,ウサギ(日本白色種)を用いて,古典的リンパ管造影を行うことに成功した.また,CTで撮像して,これを元に3次元画像を作成したところ,非常に鮮明なウサギのリンパ系画像を得ることに成功した.この手法は,多くの他施設においても,リンパ系の動物実験を行うことを可能にするもので,我々は,普遍的で有用なモデルの開発に成功したと考えている.動物を用いたMRI撮像実験を行うことによって,ナノダイヤモンド・Gd複合造影剤(Gd-DTPA-Nd)は,炭素-炭素共有結合程度の強固な結合により,数百nm数μm程度の凝集体を形成してしまうことが判明した.これを解消することが,今後の検討課題である.

来年度は、Gd-DTPA-NDの直接MRIリンパ管造影、間質MRIリンパ管造影、体内動態評価と安全生を行う予定とする。放射線医学研究がやや遅れているため、次年度使用額が生じた。来年度予定しているGd-DTPA-Ndを用いた直接MRリンパ管造影とGd-DTPA-Ndを用いた間質MRリンパ管造影に加えて、Gd-DTPA-Nd静注後の体内動態評価と安全性評価も行う計画としている。
近赤外超短パルスレーザによる光音響生体イメージング技術の開発

ヒトの組織や臓器を生きたまま見る方法として、エックス線断層撮影法、磁気共鳴画像(MRI)法、超音波断層撮影法など様々な方法があり、実際に医療の現場で頻繁に使われ威力を発揮している。しかしながら、それらの方法の空間分解能はたかだか数ミリメートルであり、様々な創意工夫により年々その分解能は向上されているが、原理的測定限界がある。一方、光を使った生体計測が、近年注目されており、光コヒーレンス断層映像法(OCT)に代表される医療への応用が発展してきている。光を使うと非常に高い空間分解能で測定が可能であるが、反面、光は生体により散乱、吸収されやすいという性質を持つため、生体への浸透深度が短いという欠点があり、OCTの応用は血管内膜のように厚さが薄いもの、あるいは眼など比較的透明なものに限られてしまう。例えば、末梢血管のような10μmから100μmの大きさのものを生体深部で捉える方法がこれまでになかった。本研究では、光の高空間分解性と、超音波の生体内長距離伝播特性の両方を利用した、全く新しいイメージング技術である多光子励起光音響イメージング(multiphoton excitation-assisted photoacoustic tomography(MEAPAT))を提案した。この方法では、近赤外域の高ピークパワーを持つ光パルスを利用する。生体内に光パルスを集光して入射させると、焦点での高光密度により、焦点部でのみ非線形な吸収効果が誘発される。その非線形な吸収による光音響波を測定することにより、生体深部を高空間分解能で観測できる。様々な実験や考察(MEAPATと従来型光音響イメージングとの比較、MEAPATの深さ分解能の見積り、MEAPAT信号を増強する工夫)を行い、提案している方法によるイメージングシステムを構築し、その有効性を示した。結果は、MEAPATが生体深部を10μm以下の空間分解能で計測するのに極めて有効な方法であることを示している。本年度は、近赤外超短パルスレーザを用いた多光子励起光音響生体イメージング技術の開発のために以下の検討を行った。1.多光子吸収による光音響波のMHz周波数帯域トランスデューサによる検出近赤外ナノ秒光パルスをローダミンB/クロロホルム溶液に集光照射した際、発生する光音響波がパルスエネルギーに対して2乗の依存性を持つことがわかった。通常のMHz周波数帯域の音響トランスデューサにより2光子吸収による光音響波を検出可能であることを示した。2.多光子吸収による光音響イメージングと1光子吸収による光音響イメージングによる光軸方向の分解能の比較ナノ秒光パルス照射により発生する光音響波の光軸(深さ)方向位置依存性を測定した結果、1064nmの場合(2光子吸収)は532nmの場合(1光子吸収)に比べて信号発生領域が狭いことがわかった。多光子吸収を利用すると光音響イメージングの深さ方向の分解能が向上することを示した。3.フェムト秒光パルスにより発生する光音響波の検出再生増幅器により増幅した近赤外フェムト秒光パルスにより光音響波発生可能であることを示した。4.フェムト秒光パルスのパルス幅の制御(プリズム対、分散媒質伝播(バルク、液体、ファイバー))多光子励起光音響波発生のためにパルス波形(パルス幅)の最適化のための光学系を構築し、パルス波形の変化を評価した。5.多光子吸収光音響波測定に最適な音響トランスデューサの選定

近赤外ナノ秒光パルスを用いて多光子励起光音響波検出のための、音響トランスデューサの最適化を行った。6.ナノ少光パルス用いて発生した光音響波の血液含量依存性生組織依存性生位置依存性の検討ラットの肝臓を用い、血液量により光音響波強度が変化することを示した。光音響波により血液量のイメージングが可能であることを意味する。1.多光子励起による光音響波を周波数の低い音響トランスデューサで検出できることが明らかとなった。従来の光音響イメージングではどのくらいの深さ部分まで観察することが出来るかどうかは、音響トランスデューサの周波数によって制限されていたが、周波数による制限なく、より深い部分のイメージングが可能であることが示された。2.多光子励起光音響イメージングと通常の光音響イメージングとにより測定された血管ダミー(液体で満たされたガラスチューブ)の断面形状を比較し、多光子励起光音響イメージングの方がより正確に断面形状を捉えていることを示した。3.多光子励起光音響波発生の理論計算により実際の測定で得られる結果を正確に推測できることを示し、この理論計算を元に、多光子励起光音響イメージング(20倍の対物レンズ、10MHzの音響トランスデューサを使用)により得られる深さ分解能を計算したところ、10μm以下であることがわかった。この結果は、同じ周波数の音響トランスデューサを用いた通常の光音響イメージングに比べて、多光子励起光音響イメージングのほうが深さ分解能の向上が図れることを意味している。4.多光子吸収断面積と熱膨張率/比熱の値が大きいほど、多光子励起光音響信号が大きくなることが明らかとなった。そのような物質を血管造影剤として使用すれば、生体深部の毛細血管のイメージングが可能となると考えている。
「技術変化に伴う社会的価値意識と生活行動・時間の変容の研究」

本研究は、現代の高度技術社会における専門的・技術的職業者、特に研究者の生活時間を実態調査によって明らかにするものである。まず、「国勢調査」および「社会生活基本調査」の既存デ-タを分析する作業から始め、この10年間で研究者や技術者を含む専門的・技術的職業者が急激に増大していることが明らかにされた。また、これらの人々の生活行動および時間使用が他の職業従事者と際立って異なることを検証した。さらに、専門的・技術的職業者、特に研究者の生活時間の実態を明らかにするために、全国の大学教員を中心に有為抽出した約400名余りを対象に生活時間調査を行った。これは、より本格的な調査を行うためのパイロット調査である。回答者は教授51名、助教授・講師41名、助手18名、その他11名であった。分野別では、人文17名、社会38名、工学41名、その他25名である。研究者の1日の生活時間は、仕事490分、睡眠428分、通勤90分、テレビ・新聞71分、身の回り55分などで、仕事時間は8時間10分と一般有業者よりも長いが、趣味・娯楽は短くなっている。1日の生活のリズムを見ると、通勤時刻は講義日では8時30分、研究日では9時である。帰宅時刻では、午後6時30分と9時過ぎの二つのピ-クがある。属性別にみると助手は仕事時間が長く、年齢が高くなると仕事の時間が減少する傾向にある。研究者の仕事時間の配分を教育時間、研究時間、その他の時間の3種類に区分すると、仕事時間の構成は教育時間38%、研究時間38%、その他24%であった。教育時間は助手、助教授、そして教授の順に短くなる。世代別にみると50歳後半は会議・打ち合わせが長くなる。文系と理系では、理系が教室単位の教育・研究の分業体制ができているのに対して文系では教育・研究は個人中心に進められていることが明らかになった。
組換えCDVの作出によるCDV‐M蛋白の機能解析と新型ウイルスワクチンの開発

ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を発現する組換えイヌジステンパーウイルス(CDV)を用いて、組換えCDVベクターにおける外来遺伝子発現の制御機構について解析を行った。組み換えCDVベクターでは主に、転写制御配列ではなく、ウイルスゲノム上流に近い位置にある遺伝子ほど遺伝子発現が大きくなるというpolar attenuationより外来遺伝子の発現がコントロールされていることを明らかにした。また、これを利用して組換えCDVベクターにおいて外来遺伝子の発現量をコントロールすることが可能であり、組換えCDVが遺伝子ベクターとして将来利用できることを示した。新型CDVワクチン候補として、M遺伝子欠損組換えCDVの作出を行った。M蛋白はウイルス粒子形成・出芽に重要とされ、M遺伝子に欠損や変異を持つウイルスは感染細胞からの正常なウイルス粒子の放出がないことが他のウイルスで知られている。人為的にM遺伝子を欠損したウイルスは感染細胞からウイルスが排出されないために高い安全性が期待され、新しいワクチン候補として有用であると考えられ、CDV国内分離株を基に、M遺伝子を欠損させ、かわりに蛍光蛋白EGFP遺伝子を挿入したM遺伝子欠損組換えCDVを作出した。観察により組換えCDVは細胞間を直接伝播していると考えられ、ウイルス放出のない新たな組換え生ワクチン候補として有用と考えられた。また、EGFPにより可視化されたウイルスは、細胞、動物への感染後の追跡が可能であり、今後の基礎研究に有用なツールになると期待できる。イヌジステンパーウイルス(CDV)の膜タンパクの一つであるMタンパクの機能解析を行うことを目的として以下の実験を行った。1)CDVのMタンパクをほ乳類細胞に一過性、あるいは持続的に発現させたときのMタンパクの局在や、宿主細胞タンパクとの相互作用、宿主遺伝子発現への影響を検索するために、Mタンパクを発現ベクターに組み込み、ほ乳類細胞での発現を試みた。具体的には一過性大量発現のためにpCAGGSベクターを用いた。また、Cre/locPシステムにより発現をコントロールできるよう、neo耐性遺伝子をもつpCALNLベクターにM遺伝子を組み込み、293細胞へ導入し、薬剤耐性細胞を選出した。さらに、恒常的にM遺伝子を発現する細胞を得るために、同様にneo耐性遺伝子をもつpcDNAベクターにM遺伝子を組み込み、293細胞へ導入し、薬剤耐性細胞の選出を試みたが、Mタンパクを恒常的に発現する細胞を得ることはできなかった。今後はMタンパクの一過性発現によりMタンパクの機能解析を行っていく。2)Mタンパク単独ではなく、ウイルスの増殖環におけるMタンパクの機能解析のためにMタンパクを欠失した組換えCDVの作出のために、M遺伝子を欠失したCDV全ゲノムを作製し、リバースジェネティクスによりMタンパク欠損CDVの作出を試みた。具体的にはMタンパクを欠損したウイルスは通常とくらべて増殖やCPE形成能が劣ることが予想されるため、リバースジェネティクスによりウイルスのレスキューが成功していることを示すマーカーとして、M遺伝子ORFをEGFP遺伝子ORFと入れ替えたCDVゲノムを構築した。さらに、レスキューの際にMタンパクを供給する目的で1)のMタンパク発現ベクターやMタンパク発現細胞を用いて実験を行っている。この組換えウイルスと親ウイルスを比較し、Mタンパクの機能解析を行っていく。イヌジステンパーウイルス(CDV)の膜タンパクの一つであるMタンパクの機能解析を行うことを、目的として以下の実験を行った。具体的には一過性大量発現のためにpCAGGSベクターを用い、Mタンパクのみを発現させることで、宿主細胞(293細胞)でのRNA合成が阻害されるかどうかを検索した結果、MタンパクのみをpCAGGSベクターを用いて導入するだけでは、細胞での発現効率の低さもあり、十分な検討ができなかった。そのため、Cre/loxPシステムにより発現をコントロールできるよう、neo耐性遺伝子をもつpCALNLベクターにM遺伝子を組み込み、293細胞へ導入し、薬剤耐性細胞を選出したが、効率的なスイッチング発現を行う細胞群をえることができなかった。これを解決するために、invitirogenのgeneswitchシステムを用いてMタンパクをスイッチング発現する細胞株を作製した。さらにこれを用いてMタンパクと相互作用する宿主側因子の探索などを行っていく。2)1)で作製したMタンパクスイッチング発現293細胞を用いて、リバースジェネティクスによりMタンパク欠損CDVの作出を試みている。具体的にはMタンパクを欠損した組換えCDVは増殖やCPE形成能が劣ることが予想されるため、リバースジェネティクスによりウイルスのレスキューが成功していることを示すマーカーとして、EGFPを用いている。EGFPの観察により、ウイルスの増殖様式(培養上清に放出されるのか、細胞間を直接伝播するのか)などの観察が肉眼的に行え、親ウイルスとの比較によりMタンパクの機能解析を行うと同時に、ウイルスワクチンやベクターとしての可能性を探って行く。

新型CDVワクチン候補として、M遺伝子欠損組換えCDVの作出を行った。M蛋白はウイルス粒子形成・出芽に重要とされ、M遺伝子に欠損や変異を持つウイルスは感染細胞からの正常なウイルス粒子の放出がないことが他のウイルスで知られている。人為的にM遺伝子を欠損したウイルスは感染細胞からウイルスが排出されないために高い安全性が期待され、新しいワクチン候補として有用であると考えられ、CDV国内分離株を基に、M遺伝子を欠損させ、かわりに蛍光蛋白EGFP遺伝子を挿入したM遺伝子欠損組換えCDVを作出した。観察により組換えCDVは細胞間を直接伝播していると考えられ、ウイルス放出のない新たな組換え生ワクチン候補として有用と考えられた。また、EGFPにより可視化されたウイルスは、細胞、動物への感染後の追跡が可能であり、今後の基礎研究に有用なツールになると期待できる。
光合成膜脂質合成経路を標的としたシアノバクテリア特異的阻害剤の開発

シアノバクテリア特有の光合成膜脂質合成経路を阻害する化合物の開発を目的として,化合物ライブラリを用いたハイスループットスクリーニングに適したタンパク質の選抜,活性測定系の開発を計画した。すでに活性が確認されていたシアノバクテリアSynechocystissp. PCC 6803由来の糖脂質合成酵素(MgdA)を用いたところ,SN比が低かったため,より高活性のMgdAを探索し,好熱性シアノバクテリア由来のMgdAが,およそ2倍の活性を示すことがわかった。今後,このタンパク質にtagを付けたものを精製することで,比活性の高い酵素画分を得て,蛍光試薬を用いた検出系を確立したい。本研究では,シアノバクテリア特有の光合成膜脂質合成経路を阻害する化合物の開発を目的として,化合物ライブラリを用いたハイスループットスクリーニングの実施と結晶構造解析を基盤とした薬剤デザインを行い,リード化合物を選定することを計画した。申請当初は既にin vitroでの活性が確認されているシアノバクテリアSynechocystissp. PCC 6803由来の糖脂質合成酵素(MgdA)を大腸菌で発現させ,ハイスループットスクリーニングに利用することを計画していたが,測定の結果SN比が低く,ハイスループットスクリーニングに利用するための低容量で安定して活性を検出することが難しいことがわかった。そこで,より高活性のMgdAを得るため,シアノバクテリア5種から合計6つのmgdA遺伝子を単離し,それぞれ大腸菌用の発現ベクターに組み込み,大腸菌膜での糖脂質合成活性(糖脂質の蓄積)を調べた。その結果,好熱性シアノバクテリアであるThermosynechococcus vulcanus由来のMgdAが,これまでのSynechocystis sp. PCC 6803由来のMgdAと比べ,およそ2倍の活性を示すことがわかった。現在,Thermosynechococcus vulcanus由来のMgdAを発現した大腸菌から膜画分を抽出し,それを用いた蛍光試薬での検出系の確立を行っている。これができ次第,早急にハイスループットスクリーニングを行い,シアノバクテリア特有の光合成膜脂質合成経路を特異的に阻害するシード化合物の選定を進める。研究の当初は,すでに活性が確認できていたSynechocystis sp. PCC 6803由来のMgdAを用いたハイスループットスクリーニングを進めることを計画していたが,繰り返し測定を行った結果,安定して十分なSN比を示す活性を得ることが出来なかった。誘導剤の濃度や培養温度など,発現誘導の方法の検討を行ったが,顕著な改善が見られなかったことから,他のシアノバクテリアからオルソログを単離して,より活性が高いものを探索することとした。申請当初にin vitroでの活性が確認されていたシアノバクテリアSynechocystissp. PCC 6803由来の糖脂質合成酵素(MgdA)を用いる計画だったが,SN比が低いことがわかったため,より高活性のMgdAを探索した。その結果,好熱性シアノバクテリアであるThermosynechococcus vulcanus由来のMgdA(TvMgdA)が,およそ2倍の活性を示すことがわかった。そこで,TvMgdAを発現させた大腸菌から膜画分を抽出し,蛍光試薬を用いた検出系で活性を測定したところ,やはりSN比が十分ではないことがわかった。TvMgdAは好熱性シアノバクテリア由来のため,この酵素を含むタンパク質溶液を熱処理し,他のタンパク質を不活化することを試みたが,大きな効果は見られなかった。次に,MgdAを粗精製することを考え,MgdAのN末端にHis-tagを付加した融合タンパク質を作製したが,活性が検出されなくなってしまった。現在,C末端にHis-tagを融合したMgdAを作製しており,この融合タンパク質で活性が検出されれば,粗精製を行うことでSN比を上げたい。これと並行して,MgdAの膜貫通部位を除いたコンストラクトを作成し,可溶化を試みたところ,貧栄養培地で低温誘導することで可用性画分にタンパク質が得られることが分かった。この画分を用いて活性測定をしたが,残念ながら活性は検出されなかった。今回の結果より,好熱性シアノバクテリアであるThermosynechococcus vulcanus由来のMgdAが,これまでのSynechocystis sp. PCC 6803由来のMgdAと比べ,およそ2倍の活性を示すことがわかった。今後,この組換えタンパク質を用いてハイスループットスクリーニングを進める。

また,今回高活性をもつことがわかったMgdAは好熱性バクテリア由来である。これまで,この株や近縁株から,多くのタンパク質の結晶構造が明らかとなってきた。研究計画でも記した通り,糖転移活性部位の結晶構造解析も計画していることから,この糖転移酵素の膜貫通部位を除いたコンストラクトを作成し,結晶構造解析にも利用したい。植物脂質生理学当該年度は,ハイスループットスクリーニングを開始する予定であったが,研究実績の概要に記載した通り,より活性の高い目的酵素の単離に注力したため実施できなかった。その分の予算を繰り越している。当該年度の予定していたハイスループットスクリーニングに関係する試薬の購入,費用,旅費等に使用する。