hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
培養ヒト鼻粘膜支持細胞における細胞内一酸化窒素動態と細胞内Ca2+動態の検討

培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞以外に、手術時採取したヒト鼻粘膜血管内皮細胞の培養系の樹立と、上皮線毛運動への一酸化窒素の影響も検討したが、支持細胞の確立が困難で培養細胞での線毛運動の測定には成功していない。現在、ストロボスコピーと新たに購入した画像解析装置を組み合わせ測定系を検討している。昨年度検討中であった血管内皮細胞を用いたfura-2による細胞内カルシュウム濃度とDAF-2による細胞内NO産生量の同時測定の実験系では、ヒスタミンとロイコトルエン負荷に関する実験を行った。我々の実験系におけるヒスタミン負荷時の培養血管内皮細胞の細胞内カルシュウム濃度の上昇は負荷直後から認められるのに対し、NO産生は負荷後10分以上経過してからみられた。NO産生に関しては濃度依存性は明かでなかった。ロイコトルエンに関してもほぼ同様の傾向がみられた。培養液中にあらかじめ、リポポリサッカライド(LPS)を加えた場合のNO産生は亢進しており、iNOSの発現が示唆された。これまでの一連の検討から、鼻粘膜の微小循環は鼻粘膜血管内皮細胞のNO産生能が関与し、アレルギー性鼻炎などにみとめられる鼻閉は血管内皮細胞障害によるNO産生能の低下が一因であると思われた。これまでの報告からは線毛上皮の機能はNOにより制御され、NOはずり応力により血管内皮細胞が、LPS刺激などにより上皮細胞が産生することが示唆される。呼気に排泄される鼻粘膜由来のNOもこの両者が産生すると考えられ、これらの相互関係と病態との関連も今回の研究で明らかにした。上気道炎症時の鼻粘膜には炎症細胞が浸潤し、鼻粘膜支持細胞と炎症細胞の間ではケミカルメディエーターやサイトカインなどのネットワークが不雑に絡み合ってこの病態を形成している。この病態を解明するに当たり鼻粘膜細胞に対するケミカルメディエーター、一酸化窒素の影響を検討している。現在蛍光色素のfura-2をloadした培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞に、ヒスタミン、PAF、ロイコトリエン、を還流負荷しその細胞内カルシウム濃度をARUGUS100を使って検討している。培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞に対しては各種ケミカルメディエーター負荷は濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起し負荷終了後細胞内カルシウム濃度の低下を認めた。これらの反応は再現性がありヒスタミン、ロイコトリエンはそれぞれ受容体拮抗剤で反応がブロックされることを確認した。PAFに関してはブロッカーの問題も考えられるが拮抗剤による抑制は認められなかった。その他の支持細胞の上皮細胞、繊維芽細胞については現在培養を施行しているが測定実験系に有効な成育を認めておらず各種薬剤負荷の検討は遅れている。ヒスタミン負荷時の培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞での一酸化窒素動態については、その培養細胞上清中の濃度をFES-450にて検討したところヒスタミン濃度依存性に一酸化窒素の発現を認める傾向にあった。現在培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞をDAF-2にて染色すべく検討を行っている。平成13年度は、培養ヒト鼻粘膜血管内皮細胞以外に、手術時採取したヒト鼻粘膜上皮細胞の培養系の樹立と、上皮線毛運動への一酸化窒素の影響も検討したが、培養細胞での線毛運動の測定には成功していない。

ロイコトルエンに関してもほほ同様の傾向がみられた。培養液中にあらかじめ、リポポリサッカライド(LPS)を加えた場合のNO産生は亢進しており、iNOSの発現が示唆された。これまでの一連の検討から、鼻粘膜の微小循環は鼻粘膜血管内皮細胞のNO産生能が関与し、アレルギー性鼻炎などにみとめられる鼻閉は血管内皮細胞障害によるNO産生能の低下が一因であると思われた。これまでの報告からは線毛上皮の機能はNOにより制御され、NOはずり応力により血管内皮細胞が、LPS刺激などにより上皮細胞が産生することが示唆される。呼気に排泄される鼻粘膜由来のNOもこの両者が産生すると考えられ、これらの相互関係と病態との門違も今回の研究で明らかにした。
地域統合組織の加盟国国内政治に及ぼす影響に関する研究

スウェーデンにおいて、EU加盟を視野に入れ始めた1980年代後半から、左右の政党ブロック間の対立が明白化し、保守政党が右派ブロックの中心となり中道政党が霞むという傾向が現れ、従来の政治システムからの変容が見られることを明らかにした。また、EUに関する問題では、既存の政党、党支持者、経済社会組織の内部での統一性が崩壊するとともに、既存政党への不満が増大し、反EU、EU懐疑を主張する政党が、国内選挙や欧州議会選挙で躍進している状況を分析した。本研究では、スウェーデンがEC加盟を政策の選択肢として議論した1960年代からEUに加盟する1995年までのスウェーデン政治へのヨーロッパ統合の影響の分析を行ったうえで、1995年にEU加盟国となった以降のEUからスウェーデン国内政治への影響について考察を行うことにより、地域統合組織に加盟した国家で起こった国内政治の変容を明らかにすることを目指す。平成19年度は、スウェーデンがEEC加盟を政策の選択肢として議論した1960年代から、1995年にEU加盟を果たして12年が経過した現在までの、スウェーデンとヨーロッパ統合の関係を整理した上で、特に1970年代初頭にECへの完全加盟は行わないことを決定した国内政治を分析した。1990年代半ばまでは、スウェーデンはECとの良好な経済的関係を模索し、1960年代から70年代初頭にかけてのEC加盟の是非に関する国内での議論の結果、加盟申請は見送られた。1995年のEU加盟後は、いかに加盟国としてEUに影響を及ぼすか、また自国に不利にならないEUレベルでの政策を実現するかが、課題となっている。スウェーデン政府はEUに対して、平和維持活動、環境保護、途上国援助、社会政策、男女平等、情報公開などの分野で積極的な働きかけを行っている。EUレベルでの政策に対して国内世論の支持が低い分野では、スウェーデン政府はEUにおいて積極的に行動を起こせない場合もあるが、さまざまな機会を利用しながら、EUの中での存在感とスウェーデンの目指す政策の実現を模索している。1970年代初頭におけるスウェーデンのEC非加盟という決定で重要な点は、政府が中立政策と加盟は両立しないという政治的判断を下したことであった。この時期は、まだ国際化は一部の経済分野に限られており、将来的には国家主権の一部を放棄する可能性を伴うECへの加盟という政策が選択されることはなかった。国内政治の分析によって、EC加盟申請を強行することでスウェーデンの中立政策に関して各党間で激しい議論を戦わせることや、従来の中立政策のあり方を大きく変更することは、1970年代初頭の時点では国内のどの政治的アクターにとっても選択肢ではなかったことが明らかになった。平成20年度は、1980年代末から90年代初頭にかけての、スウェーデンを取り巻く国際環境、スウェーデン国内政治を考察し、スウェーデン政府がEC加盟申請決定に至った要因を分析した。1980年代末に国際環境は大きく変容し、スウェーデン政府が70年代初頭にEC加盟とは両立しないとした「中立政策」の意義は変容し、EC諸国とスウェーデンを含むEFTA諸国との関係も緊密化を目指す方向に変化し、EEA(欧州経済地域)創設のための交渉が開始された。スウェーデンを取り囲む国際環境の変化と同時に、スウェーデン国内でもさまざまな分野での国際化や分権化によって、国内政治の主要アクター間の関係が変化し、既存の政策決定システムが変容した。その結果として、スウェーデン政府は1970年代初頭以降、対外政策の選択肢から除外してきたEC加盟申請決定を短期間のうちに実現し、90年代初頭に加盟申請に至った。スウェーデンの対外政策の大きな転換を国内政治構造の変容から分析することには意義があったと考えられる。もう一つの研究成果として、1960年代から2000年代までのスウェーデンとヨーロッパ統合の関係を整理した。スウェーデンにとっては、1990年代半ばまではECと経済的に良好な関係を維持することが重要であり、1960年代から70年代初頭にEC加盟に関する議論はあったものの、加盟申請は見送られた。1995年のEU加盟後は、加盟国としてEUにどのように影響を及ぼすか、また自国に不利にならないようなEUレベルでの政策をいかに実現するかが、課題となっているといえる。スウェーデンのEU加盟前後の政策を通史的に整理することには、政策の変化を捉える意味で意義があったと考えられる。本年度は、欧州議会選挙を中心に、地域統合組織が加盟国国内政治に及ぼす影響の分析を行った。現地調査の前に、欧州議会選挙に関する資料、文献を収集し、欧州議会選挙期間中の5月下旬から6月上旬にかけてスウェーデンを中心にヨーロッパ諸国に赴き、各政党の実際の選挙活動と国民の反応を考察するとともに、各種資料を現地で収集した。10月に発表した学術論文では、スウェーデンで2009年以前に行われた欧州議会選挙の結果を踏まえつつ、2009年の欧州議会選挙を分析し、既存政党への不満や候補者個人の人気が反映される特徴があることを明らかにした。

また、国政選挙で議席を獲得していない新政党が多くの票を得ることがあるものの、欧州議会であっても新政党は議席を継続して獲得することが難しいことを提示するとともに、2009年の選挙ではインターネットに対する規制に反対する「海賊党」が議席を獲得した背景を分析した。同時に、7月から12月にかけてスウェーデンが2009年後半のEU議長国となったため、9月にスウェーデンに赴き、会議開催の状況やスウェーデン国民の反応について、現地での考察を行った。その際には、現地の図書館、書店等で各種資料や関連文献を収集した。EU議長国であった期間は、スウェーデン国内のマスメディアにおいてEU関係の報道が数多くなされていたが、前回議長国担当時にデモ隊と警察の衝突があったため、会議開催場所近辺の道路の封鎖や立ち入り禁止など厳しい警備が行われたこともあり、概して国民が高い関心を持てるような状況とは言えなかった。これらの調査結果については、平成22年度中に学術論文として発表予定である。平成22年度は、平成21年に現地で調査を行ったスウェーデンのEU議長国担当についての研究を進めた。現地において収集した各種資料や関連文献に加え、その後入手した資料や文献を用いて、日本では研究されることの少ない、スウェーデンにおけるEU議長国担当に向けた事前準備状況、議長国担当時の会議開催状況、会議の結果、他国からの評価、スウェーデン国民の反応等を考察し、執筆した学術論文を公刊した。また、平成22年9月にスウェーデンにおいて4年ぶりの総選挙が行われたため、選挙期間中に現地に赴き、複数都市を回って各党の選挙活動や選挙報道を調査し、EUに関わる問題がどのように扱われていたかを考察した。特に、各党のマニフェスト、マスメディアにおける議論、与野党間での対立軸と国民が関心を持つ争点について分析を行った。現地において収集した各種資料や関連文献を用いて、選挙運動および選挙結果を分析し、与党であった右派・中道4党が勝利し、移民排斥を唱える政党が躍進した背景を明らかにする学術論文を執筆し公刊した。今回の選挙では争点が国内政策に集中していたこともあり、EUに関する議論はあまりなされなかったが、議論の少なさについてマスメディアで問題として提起されていた。学術論文を発表する予定であった、1980年代におけるスウェーデンとECの関係およびスウェーデンの対EC政策に関する研究については、平成22年度の研究結果を踏まえて、平成23年度中に論文を執筆し、公刊する予定である。
象牙質接着部の亀裂伝播メカニズム

本年の研究により以下のことが示唆された.1.セルフエッチングプライマーを用いる2ステップデンティンボンディングシステムは,従来の3ステップシステムに比較し,その剪断接着強さほど繰り返し応力に対する疲労耐久性は高くないことが明らかになった.2.接着部のSEM観察の結果,セルフエッチングプライマーを用いる2ステップシステムの樹脂含浸層の厚さは,エッチング剤を用いる従来の3ステップシステムに比較し明らかに薄く,このことが疲労耐久性に影響しているのではないかと推測された.3.通常の樹脂含浸層の厚さよりさらに薄くするため,エッチング後,ADゲル(10%次亜塩素酸ナトリウム)を用い前処理を施すし,スーパーボンドD-ライナープラスを用いてレジンを接着させると,ほとんど接着強さを発揮しなくなった.このことから,スーパーボンドD-ライナープラスではコラーゲン繊維や10-3処理によりエッチングされた接着面の状態が接着に重要な役割を果たしていると推測された.4.同様にエッチング後ADゲルを用いた前処理を施し,ライナーボンド2Σシステムを用いてコンポジットレジンを接着した場合,その剪断接着強さはメーカー指示で接着した方法と同程度の値であったが,その疲労耐久性は若干低下する傾向が認められた.このことから,樹脂含浸層は繰り返し応力を緩衝する能力があることが示唆された.5.ウェットボンディングテクニックを用いる2ステップデンティンボンディングシステムは,術者によるボンディング剤塗布のテクニックの差により大きく剪断接着強さが変化することが示された.1.同一のシステムでありながら光重合型ボンディング剤に化学重合触媒を加えることで光・化学重合型となる、2方法の重合形式のボンディング剤を有する市販象牙質ボンディングシステムを使用して、ウシ象牙質にコンポジットレジンを接着した試験片に繰り返し応力を与え、以下の結果を得た。(1)光重合型ボンディング剤に化学重合触媒を添加ことにより、接着部の物性が何らかの影響を受け、剪断接着強さおよび疲労耐久性ともに向上した。(2)この破壊面を、EPMAにて分析したところカルシウムがわずかに存在する部位を主に、一部に豊富に存在する部位とほとんど存在しない部位を含んだ破壊であったことから、一部に象牙質やボンディング剤を含む樹脂含浸層を主体とした破壊であると推測された。2.1で得られた疲労寿命を基にし、その繰り返し数よりもわずかに前つまり疲労破壊直前に負荷をやめ、疲労亀裂の進展領域をSEMにて観察した結果、その亀裂は樹脂含浸層を一様に進展するわけではなく、弾塑性変形域内の弱い部分に生じた複数の亀裂を最終的に連続しながら、樹脂含浸層内外を徐々に進展していく像が観察された。現在、より詳細に亀裂を観察するために研究中である。本年の研究により以下のことが示唆された.1.セルフエッチングプライマーを用いる2ステップデンティンボンディングシステムは,従来の3ステップシステムに比較し,その剪断接着強さほど繰り返し応力に対する疲労耐久性は高くないことが明らかになった.2.接着部のSEM観察の結果,セルフエッチングプライマーを用いる2ステップシステムの樹脂含浸層の厚さは,エッチング剤を用いる従来の3ステップシステムに比較し明らかに薄く,このことが疲労耐久性に影響しているのではないかと推測された.3.通常の樹脂含浸層の厚さよりさらに薄くするため,エッチング後,ADゲル(10%次亜塩素酸ナトリウム)を用い前処理を施すし,スーパーボンドD-ライナープラスを用いてレジンを接着させると,ほとんど接着強さを発揮しなくなった.このことから,スーパーボンドD-ライナープラスではコラーゲン繊維や10-3処理によりエッチングされた接着面の状態が接着に重要な役割を果たしていると推測された.4.同様にエッチング後ADゲルを用いた前処理を施し,ライナーボンド2Σシステムを用いてコンポジットレジンを接着した場合,その剪断接着強さはメーカー指示で接着した方法と同程度の値であったが,その疲労耐久性は若干低下する傾向が認められた.このことから,樹脂含浸層は繰り返し応力を緩衝する能力があることが示唆された.5.ウェットボンディングテクニックを用いる2ステップデンティンボンディングシステムは,術者によるボンディング剤塗布のテクニックの差により大きく剪断接着強さが変化することが示された.
妊娠中の運動によるストレス緩和効果の検証：ランダム化比較対照試験

[目的]妊娠中の継続的な運動実施による長期的な妊婦の生理的・心理的ストレス反応の緩和効果を明らかにすることを目的に研究を行った。[方法]2014年11月2016年8月に東京都内の大学病院一施設で、妊娠中のヨガのランダム化比較対照試験を行った。正常な妊娠経過にあり、運動を制限する合併症のない妊娠20週前後の初産婦をリクルートし、ヨガ群56名と対照群57名に無作為に割り付けた。ヨガ群の参加者は、分娩まで週3回以上を目標に、60分間のヨガクラスの参加(月35回)と自宅でDVDを用いて3060分間のヨガの練習を行った。妊娠28週前後、妊娠36週前後で生理的ストレス反応指標の唾液中コルチゾールを測定するため、起床時、起床30分後、午後、就寝前の1日4回2日間、参加者は唾液採取を行った。心理面への効果については、心理尺度で精神的ストレス、抑うつ、不安、疲労を評価した。[結果]妊娠28週調査では、唾液検体の得られたヨガ群38名、対照群37名を解析対象とした。妊娠36週調査では、ヨガ群42名、対照群37名を解析対象とした。妊娠28週調査では、午後の唾液中コルチゾール値ではヨガ介入群で有意に低く、ストレス緩和効果が示された。一方、妊娠28週調査の他の採取時点、妊娠36週の唾液中コルチゾール値は両群間で有意な差はなかった。また、抑うつ、不安、精神的ストレス、疲労について、妊娠28週調査、妊娠36週調査で両群間に有意な差はなかった。ヨガの練習頻度の中央値は、妊娠28週で1.1回/週、妊娠36週で0.9回/週であり、目標としていた週3回よりも低い頻度であった。また、ヨガクラスへ参加できなかった参加者が、半数程度いたため、多くの妊婦が活用しやすいプログラムに改善することが課題である。28年度が最終年度であるため、記入しない。【研究の概要】東京都内1病院にて健常な経過にある妊婦を対象に、妊娠中のマタニティヨガのストレス緩和効果を検証するランダム化比較対照試験を実施している。2016年3月まで産婦人科外来にて妊娠1823週の妊婦に対し、研究への参加を依頼した。研究内容について同意が得られ、医師より運動の許可の得られた者を参加者として登録した。2016年3月までに通常の妊婦健診に加え研究者の提供するヨガプログラムに参加する「ヨガ群」56名と通常の妊婦健診のみを受診する「対照群」58名にランダムに割り付けを行った。ヨガプログラムは、自宅での練習に活用できるDVDと調査病院内で研究者が開催する月35回のヨガクラスで構成され、1回60分間の妊婦の生理的な特徴に合わせたプログラムである。【データ収集状況】参加者の妊娠経過に合わせて、妊娠20週前後のペースライン調査、妊娠28週・妊娠36週のアウトカム評価のための質問紙(属性、心理尺度)と唾液採取の調査を行っており、2016年7月までデータ収集を行う予定である。採取した唾液については、唾液中のストレスバイオマーカーである唾液中コルチゾールをEnzyme Immunoassay kitを用いて随時分析を行い、データ解析の準備を進めている。データ収集終了後の2016年8月以降にデータ解析を行い、研究成果を報告していく予定である。【解析計画】ヨガ群・対照群間での妊娠中の生理的・心理的ストレスを唾液中コルチゾールと心理尺度の得点を用いて比較し検証する予定である。また、ヨガの実施状況、ヨガプログラムへの参加者による評価についても合わせて検討していく。当初の予定よりも参加者の募集に時間を要し、2016年3月まで募集を続けた。そのため、現時点ではデータの解析に至っていないが、目標参加者数の50名を超えるヨガ群56名、対照群58名から研究参加の承諾を得られた。

一方、妊娠28週調査の他の採取時点、妊娠36週の唾液中コルチゾール値は両群間で有意な差はなかった。また、抑うつ、不安、精神的ストレス、疲労について、妊娠28週調査、妊娠36週調査で両群間に有意な差はなかった。ヨガの練習頻度の中央値は、妊娠28週で1.1回/週、妊娠36週で0.9回/週であり、目標としていた週3回よりも低い頻度であった。また、ヨガクラスへ参加できなかった参加者が、半数程度いたため、多くの妊婦が活用しやすいプログラムに改善することが課題である。2016年7月まで、研究参加者の質問紙と唾液採取の調査及びヨガプログラムの提供を行い、その後データ解析へ移行する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
100年使えるロバストな河川計画策定の新手法開発

本研究課題では,ロバストな河川計画を立案する手法を開発することを目標としており,想定した手法は,以下の3つであった.(1)過去数十年の客観解析データとメソスケール気象モデルで,PMPを求め,そもそも,気候変動によっても変動しない確率降水量・確率洪水を求める手法.(2)確率統計的に,今後100年間の「豪雨の記録の伸び」を予測するモデルを作り,100年先を先取りした計画を策定する手法.(3)現在使える降水量データから,豪雨の「真の母集団」を求める数学的な手法.結果として,(2)に分類される以下の手法が,ロバストな河川計画を立案する手法として有力であると考える.まず,過去の降水量データの時系列から,マルチフラクタル的な特徴をつかみ(現時点では3つのパラメータを同定することを意味する),確率統計的な時系列を生成する.ただし,ここで,気象学的に現実的ではない,「極端な降水量」は除外する.この「極端な降水量」は,PMPを上回る降水量という意味であるが,PMPを求める研究課題(上記1)については,3年間で十分な研究成果が出たとは言い難い.しかし,紀伊半島の豪雨の地形的な要因(山地の存在)を明らかにし,また,紀伊半島の南西部では梅雨期の降雨が支配的であり,南東部では9,10月の降雨が支配的であることなどを明らかにした.また,降水量データとして,NCEPの再解析データを用いることで生ずる問題点等も明らかにした.まず,18年度の研究計画は以下のようであった.開発1.過去数十年の客観解析データとメソスケール気象モデルで,PMP(可能最大降水量=物理的に考えられる降水量の極値)を求め,そもそも,気候変動によっても変動しない確率降水量・確率洪水を求める手法.18年度は「台風ボーガス導入手法の高度化」と「観測データの同化手法の開発.高度化」を行なう.開発2.確率統計的に,今後100年間の「豪雨の記録の伸び」を予測するモデルを作り,100年先を先取りした計画を策定する手法.18年度は「100年後の気候の予測値」を用いた解析を行なうと同時に,SSTと降水量の関係の解明を行なう.開発3.現在使える降水量データから,豪雨の「真の母集団」を求める数学的な手法.18年度は「ロバストな予測をするための数学的手法」の調査を行う.得られた成果は,以下のようである.○開発1に関し,気象モデルMM5を用い,九州地方,三重県域を対象として,「豪雨における山地の影響」を証明した.台風等で,山地を仮想的に取り払うと,豪雨の強度が弱まることを見出した.○開発2に関し,SSTと降水量だけでなく,気候変動において,太陽活動の影響が非常に大きいことを見出した.SST,太陽活動,地磁気,降水量,地球表面温度等の関係について,検討した.○開発3に関し,降水量データの統計モデルへの適合度を評価する手法について検討した.総括すれば,目標の70%程度の成果が得られたと考える,次年度に,遅れを取り戻す.まず,計画は以下のとおりであった。◎開発1に関しては,メソスケールモデルでPMP(可能最大降水量)を算定するための基本技術を得る。◎開発2に関しては,「100年後の気候の予測値」を用いた解析を行なうと同時に,前年度の,太陽活動についての検討を,さらに深める。◎開発3に関しては,「ロバストな予測をするための数学的手法」の調査を引続き行い,具体手な手法を提案できるようにする。また,確率分布あてはめの適合度評価をする指標を再検討する。得られた結果は以下のとおりであった。【開発1】◎PMPを求めるために,マルチフラクタルモデルを使用することを考え,モデルの構築を行なった。このモデルによる降水量再現結果は,土木学会年次講演会で発表する予定である。◎上記のマルチフラクタルモデルにより,時間的な降水量の分解と,空間的な分解(スケールダウン)がともに良好な結果で行なえることを確認した。【開発2】◎太陽活動に関する資料を多く集めたが,新たな知見は得ていない。【開発3】◎まずは,長い間用いられてきた,確率的極値水文量の算定式(IDF式)の精度を算定するSLSCという基準の統計的な意味を明らかにした。本研究は,ここから始まる。本研究課題では,ロバストな河川計画を立案する手法を開発することを目標としており,想定した手法は,以下の3つであった.(1)過去数十年の客観解析データとメソスケール気象モデルで,PMPを求め,そもそも,気候変動によっても変動しない確率降水量・確率洪水を求める手法.(2)確率統計的に,今後100年間の「豪雨の記録の伸び」を予測するモデルを作り,100年先を先取りした計画を策定する手法.(3)現在使える降水量データから,豪雨の「真の母集団」を求める数学的な手法.結果として,(2)に分類される以下の手法が,ロバストな河川計画を立案する手法として有力であると考える.まず,過去の降水量データの時系列から,マルチフラクタル的な特徴をつかみ(現時点では3つのパラメータを同定することを意味する),確率統計的な時系列を生成する.ただし,ここで,気象学的に現実的ではない,「極端な降水量」は除外する.この「極端な降水量」は,PMPを上回る降水量という意味であるが,PMPを求める研究課題(上記1)については,3年間で十分な研究成果が出たとは言い難い.

しかし,紀伊半島の豪雨の地形的な要因(山地の存在)を明らかにし,また,紀伊半島の南西部では梅雨期の降雨が支配的であり,南東部では9,10月の降雨が支配的であることなどを明らかにした.また,降水量データとして,NCEPの再解析データを用いることで生ずる問題点等も明らかにした.
下顎の繰り返し運動を制御する運動調節プログラムの構築

1.下顎運動曲線,身体各部の動きとその強さを示す加速度を用いて,下顎運動を調節する運動プログラムの構造を明らかにすることを目的に下顎タッピング運動を観察し,以下の結果を得た.2.タッピング時,前額部は開・閉口の極めて初期に下顎の移動方向とは逆方向に動いている.このことは、当該の頭部の動きは運動開始前にプログラムされていたことを示している(p<0.001;前者で全試行中の94.0%,後者では96.5%).3.また,下顎タッピング時の開口量やタッピング強度が増すと,頭部の動揺はそれに伴って大きくなることを確認した.4.タッピング時に歯に加わる衝撃は,頭部に加えて四肢の遠位の骨や軟絹織にまで伝播し,これらの伝播振動刺激は身体全体に影響を与えていることが示唆された.また,伝播刺激の振幅は姿勢によって異なり,姿勢が顎機能の調節や維持に影響を及ぼすことが示唆された.5.タッピング力は開口距離,咬合接触相時間,閉口相時間および最大開口速度を変えて調節しているが,この調節に開口相時間と運動周期はほとんど関与していなかった.このことは、力の調節に関与する特定の運動相が存在することを示している.6.以上のことは,下顎運動を調節するプログラムは階層構造を有しているという仮説を補強したものと考えた.1.下顎運動曲線,身体各部の動きとその強さを示す加速度を用いて,下顎運動を調節する運動プログラムの構造を明らかにすることを目的に下顎タッピング運動を観察し,以下の結果を得た.2.タッピング時,前額部は開・閉口の極めて初期に下顎の移動方向とは逆方向に動いている.このことは、当該の頭部の動きは運動開始前にプログラムされていたことを示している(p<0.001;前者で全試行中の94.0%,後者では96.5%).3.また,下顎タッピング時の開口量やタッピング強度が増すと,頭部の動揺はそれに伴って大きくなることを確認した.4.タッピング時に歯に加わる衝撃は,頭部に加えて四肢の遠位の骨や軟絹織にまで伝播し,これらの伝播振動刺激は身体全体に影響を与えていることが示唆された.また,伝播刺激の振幅は姿勢によって異なり,姿勢が顎機能の調節や維持に影響を及ぼすことが示唆された.5.タッピング力は開口距離,咬合接触相時間,閉口相時間および最大開口速度を変えて調節しているが,この調節に開口相時間と運動周期はほとんど関与していなかった.このことは、力の調節に関与する特定の運動相が存在することを示している.6.以上のことは,下顎運動を調節するプログラムは階層構造を有しているという仮説を補強したものと考えた.1.定距離反復下顎運動の調節様式バイオフィーヂバックを用いて,指定した開口距離の再現を習得してから約30秒後に,指定距離の下顎タッピング運動を行うよう指示した.指定開口距離は約2,5,10,15,20,30mmおよび連続タッピングが可能な最大開口量である.被験者は平均年齢26.5歳の健常有歯顎者9名である.現在課題運動遂行時の下顎運動図を記録・分析しているが,それらの結果から以下の機構の存在が示唆されている.1)咬合時間および周期はできるだけ一定に保とうとしている.2)閉口相速度と開口相速度を調節して,リズミカルな定距離運動の維持を計ろうとしている.3)上記2)を円滑に行うためのバッファーとして,平坦相(定距離維持相)を利用している.4)上記2),3)で特定の周期を維持できない時には,条件に適した新しい周期を設定する.2.タッピング力の調節様式バイオフィーヂバックを用いて,指定した強さの力で下顎タッピング運動を行うよう指示した.指定した力の大きさは,最大タッピング力(T)の1/6,2/6,3/6,4/6,5/6の5種類である.課題遂行時のタッピング周期や閉口距離などは被験者の任意な調節に任せた.被験者は平均年齢23.2歳の健常有歯顎者9名である.現在までの結果をようやくすると以下の通りである.1)指示した力の大きさによって経試行的調節様相が異なる.すなわち,指示した力が小さいときには試行初期のタッピング力は目標よりも大きい.2)指示力の増加に伴い開口距離,咬合相時間,最大開口時間,最大開口速度が増加し,逆に閉口相時間は減少した.3)これら結果は,周期と開口相時間がタッピング力の直接的調節因子でないことを示している.下顎の繰り返し運動を制御する運動調節機構を解明する目的でタッピング力を分析した。被験者は顎口腔系に特記すべき異常がない健常成人9名(平均年齢23.2歳)である。被験者の最大タッピング力の1/6、3/6、4/6、5/6の力を目標値とし、視覚フィードバック下でできるだけ正確に目標値を再現するよう指示して反復性下顎タッピング運動を行わせた。タッピング力の再現脳は課題によって有意に異なり、目標値が大きいほど力の調節が容易であった(P<0.001)。また、試行初期には目標値が小さい課題におけるタッピング力は目標値より大きく、逆に目標値が大きい課題におけるタッピング力はその目標値よりも小さかった。

いずれの場合でも、試行の進行に伴ってタッピング力は目標値に近づいた。開口距離は課題間で差があり(P<0.001)、目標値が小さいほど開口距離が小さかった。最大開口速度と最大閉口速度は目標値が大きくなるにつれて増加した(P<0.001)。しかし、開口相時間と周期の課題間差は統計的に有意でなかった(P=0.481,P=0.662)。またこれらの変量と試行回数間の交互作用にも大きな効果は認められなかった(P>0.01)。以上のことから、タッピング力の調節にタッピング運動の開口相時間と周期はほとんど関与していないことが示された。
多言語併用環境における日本語の習得、教育、及び支援に関する研究

本科研グループが設立した「マルチリンガリズム研究会」などを通して、研究を進め、その成果を雑誌や国際学会で発表するとともに、その成果に基づいた「多言語同時学習支援」の国際シンポジウムや試行プログラムも実施し、「多言語併用環境における日本語の習得、教育、及び支援」に関する全体の研究実績を報告書にまとめた。主な研究実績の概要は以下の通り。1.幼児から成人までを対象に、(1)1人1言語・3.実際に試行的な「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援プログラム」を実施し、多言語併用環境での日本語の教育や支援、そのための日本語教員養成に関する基礎的なデータを得た。環境1言語仮説(2)思考言語と優越言語(3)言語環境の変化(4)品詞(5)言語選択(6)アイデンティティ(7)場所格(8)テンス・アスペクト等の観点から、タガログ語・英語・韓国語・ポルトガル語・スペイン語・中国語等の多言語併用環境における日本語習得の実態が解明された。(これらの主な成果は、スイスでの国際学会「The fourth International Conference on Third Language Acquisition and Multilingualism」のProceedings(CD-ROM版)として出版。)2.国際シンポジウム「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援」をマルチリンガリズム研究会と日本語教員養成機関(大学院>とで共催し、3力国(+台湾)での多言語学習・習得の実態の報告を受け、多言語同時学習支援プログラムと多言語併用環境での日本語の教育や支援のできる日本語教員養成プログラムの研究・開発に着手できた。3.実際に試行的な「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援プログラム」を実施し、多言語併用環境での日本語の教育や支援、そのための日本語教員養成に関する基礎的なデータを得た。(1)十数名の研究協力者と共に本科研独自の研究会を定期的に行うと共に、本科研を核にして2004年2月に創設した「マルチリンガリズム研究会」(http://jsl-server.li.ocha.ac.jp/multilingualism/index.html)を活用して、公開の研究発表を行った。それぞれの研究会は主として宮崎と東京で行ったが、テレビ会議方式を活用し、外国の大学とも連携した研究会も試行的に行った。(2)長友が主にタガログ語・英語・日本語併用環境の幼児、史が主に中国語・英語・フランス語・日本語併用環境の小学生、森山が主に韓国語・英語・日本語併用環境の高校生を対象に、データを収集し、分析すると共に、定例研究会で分析結果に関する討議を進めた。藤井は派遣先の台湾という多言語社会の中での日本語教育の実態と言語政策に関する研究に従事した。研究協力者も各自研究テーマを設定し、データ収集とその分析を行った(3)研究成果については、2005年9月にスイスで行われる国際学会「The Fourth International Conference on Third Language Acquisition and Multilingualism」で発表することにした。本科研に関しては、9つの研究発表が受諾されたが、そのうちの6つについては、「Multilingualism in Japan」というシンポジウムを設定して、発表を行うことにしている。「マルチリンガリズム研究会」(本科研のメンバーで設立)の例会やスイス・フリブールで開催の「The Fourth International Conference on Third Language Acquisition and Multilingualism」の「Multilingualism in Japan」というコロッキア等で公表した主な研究実績は以下のようなものである。(1)家庭内の「1人1言語」仮説(One Person-One Language Hypothesis)と、家庭・学校・地域社会の「1環境1言語仮説」(One Environment-One Language Hypothesis)組み合わせた仮説は、日本社会でも支持される事例が見られる。しかし、3言語(日本語・タガログ語・英語)

併用幼児を対象とした約3年間の事例研究においては、家庭内だけの3言語保持努力には限界があり、多言語保持を支援する学校と地域社会の言語環境の整備が必要であることも分かった。(2)2歳の時からの約10年間におよぶ3言語(英語・中国語・日本語)併用話者対象の研究では、帰属グループ・社会・文化・個性・言語・家族関係・国籍等が要因となり、変化しながら発達する複数のアイデンティティがあることが明らかにされた。(3)2言語(韓国語・日本語)併用環境から英語を含む3言語併用環境になった高校生における「言語転移」を「誤用分析」に基づいて分析した結果、韓国語がT(=thought)-Language、日本語と英語がS(=speaking)-Languageとして「言語転移」に関わるという認知言語学的仮説を提示できた。(4)日本語・スペイン語・英語を均等に発達させているメキシコ在住日本人を対象に、来日後の会社や私生活での3言語併用の実態を調べた結果、3言語のcode-switchingやアイデンティティの揺れに関わるさまざまな内的・外的要因を示すことができた。これまでの研究の深化を図るとともに、「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援」の国際シンポジウムや試行プログラムを実施し、それらの成果を報告書にまとめた。本年度の主な成果の概要は以下の通り。2.3言語併用能力を身につけた研究協力者の体験談をまとめてもらい、多言語習得の内省的根拠を得た。3.国際シンポジウム「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援」を日本語教員養成機関(大学院)と共催し、3力国(+台湾)での多言語学習・習得の実態の報告を受け、多言語同時学習プログラム協同開発の可能性と多言語同時学習支援のできる日本語教員養成シラバスに関する検討を行った。4.同じく、日本語教員養成機関とともに「多言語(日本語、韓国語、中国語)同時学習支援プログラム」を試行的に実施し、多言語習得とそのための日本語教員養成に関する基礎的なデータを得た。
合理的デザインによる高感度バイオ分子間相互作用検出用クッションタンパク質の創製

バイオ分子間相互作用検出の基盤技術であるバイオ分子の固体表面上への固定化に関し,表面親和性ペプチドタグと超好熱菌由来のCutA1タンパク質をクッション性足場タンパク質として利用した高度機能的固定化法の検証を行った.水晶振動子マイクロバランス法による評価を通じ,合理的デザインによって金表面上における精密固定化配向制御が可能で相互作用検出感度の向上が可能なリガンド分子を創製できた.また,金ナノ粒子親和性ペプチドを独自に開発し,比色法による相互作用の高感度検出への応用が可能であることを示した.さらにCutA1へのVHH抗体の挿入が可能な部位を見出し,高い分子デザイン許容性を明らかにした.バイオ分子間相互作用を高感度で簡便,迅速に検出可能な革新的システムの確立を目指し,固体表面親和性ペプチドおよびクッションタンパク質をスペーサーとして利用する新しいアイデアに基づいたリガンド分子固定化法の検討を進めた.まず8残基のアミノ酸から構成されるStrepTagII(STII)をリガンドとし,多様な分子デザインを行い,その固定化形態が相互作用検出に及ぼす影響について比較評価した.リガンド分子の固定化には親水性ポリスチレンに親和性を示すPS-tagを用い,スペーサー(クッションタンパク質)として超好熱菌由来の単量体TkHIIならびに3量体のCutA1を利用した.STIIを束縛する3次元構造体であるコイルドコイル構造は人工配列のEK coilとした.様々なリガンド分子を発現するためのベクターを構築し,発現・精製後,アナライト分子であるHRP標識Streptavidin (SA)あるいはStrepTactin (ST)との相互作用を検出した.その結果,ペプチドの束縛ならびに空間的に有利となる配置となるようデザインすることで相互作用検出感度が顕著に向上することを見出した.また,金表面上でも相互作用検出に関する検討を行った.金親和性ペプチドを連結したCutA1中にリガンドペプチドSTIIを挿入し,QCMセンサーチップ上に固定化後,SAとの相互作用を検出したところスペーサーの長さに応じた検出量が得られた.超好熱菌由来のモデルクッションタンパク質であるCutA1に分子デザインを施し,その調製を試み,高度な構造安定性に基づいた予測通り,リガンドペプチドおよびスペーサーとしてのCoiled coil配列を挿入しても安定性が維持されることが確認できた.さらにこれらの各種CutA1を表面親和性ペプチドを介して固定化し,アナライトとの相互作用を検出しリガンドの固定化形態が感度におよぼす影響を評価するという当初予定していた研究について,特に遅れはなく,順調に進展している.固体基材上においてバイオ分子間相互作用の高感度検出を可能とする簡便・迅速な測定システムの確立を目指し,研究を進めた.固体表面親和性ペプチドに加え,足場としてのクッションタンパク質CutA1を利用した,新しいアイデアに基づいたリガンド分子固定化法の検討を行った.平成28年度はリガンド分子をタンパク質,その中でもVHH抗体とした.VHH抗体のクッションタンパク質CutA1への挿入・連結が発現タンパク質の構造安定性に及ぼす影響ならびに,発現デザイナータンパク質固定化後の相互作用検出感度について調査した.その結果,CutA1とほぼ同程度の分子量のVHH抗体であってもCutA1中に束縛しつつ挿入することが可能であることがわかった.また,束縛することによりVHH抗体の耐熱性が向上することを明らかにできた.さらに,CutA1,固体表面親和性ペプチドおよび分子認識素子としてのタンパク質を用いた分子デザインを通じ,リガンド分子の固定化密度や配向性,空間配置などを制御することにより,Enzyme-Linked Assayや水晶振動子マイクロバランス法による相互作用検出において,最適な相互作用検出感度を示しうる分子の合理的な設計が可能であることがわかった.一方で,新規に金ナノ粒子親和性ペプチドを見出し,金ナノ粒子へのリガンド分子のワンンステップ修飾および高感度相互作用検出系に適用できることを示した.超好熱菌由来のモデルクッションタンパク質であり,高度な構造安定性を有するCutA1を足場として多様な分子デザインを施し,発現させた各種デザイナーキメラタンパク質の構造安定性ならびに相互作用検出を評価した.その結果,足場タンパク質への挿入あるいは連結によっても安定性が維持されうること,リガンド分子の連結様式により,固定化後の相互作用検出感度が影響されることがわかった.また,金ナノ粒子親和性ペプチドを新たに見出し,これを用いた金ナノ粒子へのリガンド分子のワンンステップ修飾が可能であること,感度のよい相互作用検出に利用できることを明らかにできた.これら当初予定していた研究について,特に遅れはなく,順調に進展している.クッション性足場タンパク質であるCutA1の合理的な分子デザインを通じ,固体基材上においてバイオ分子間相互作用を感度よく検出するための技術基盤の確立を進めた.本年度は親水性ポリスチレン表面,金表面に加え,金ナノ粒子を用いた分子間相互作用の比色検出系への適用について検討を加えた.独自に見出した金ナノ粒子親和性ペプチド,AuNP-tagをクッションタンパク質に連結し,さらに挿入したリガンドペプチドStrepTagII (STII)の固定化が可能であるか調査した.その結果,CutA1とAuNP-tagの利用により,分散安定性がより高い状態で,リガンドのワンステップ修飾が可能であることがわかった.これにアナライト分子Streptavidin (SA)を添加した結果,アナライト濃度に依存し,高感度なSA-STII間特異的な相互作用に起因する金ナノ粒子の凝集が確認された.

さらに,反応系の塩濃度の増加に応じて,リガンド修飾金ナノ粒子のゼータ電位が変化し,拡散電気二重層の圧縮によって,粒子同士の静電反発が緩和され,相互作用検出の感度が向上することがわかった.CutA1を利用したリガンド分子固定化は,ペプチドSTII-AuNP-tagを修飾した金ナノ粒子を用いた相互作用検出系と比べ,高塩濃度でも粒子が安定に分散を維持でき,多様なサンプルの比色検出への応用に期待できたことから,CutA1を用いるメリットが十分に示された.また分子デザインの検討により,スペーサーあるいは束縛性の高い残基の挿入を通じ,VHH挿入CutA1の調製がより安定で簡便となる条件を見出した.バイオ分子間相互作用検出の基盤技術であるバイオ分子の固体表面上への固定化に関し,表面親和性ペプチドタグと超好熱菌由来のCutA1タンパク質をクッション性足場タンパク質として利用した高度機能的固定化法の検証を行った.水晶振動子マイクロバランス法による評価を通じ,合理的デザインによって金表面上における精密固定化配向制御が可能で相互作用検出感度の向上が可能なリガンド分子を創製できた.また,金ナノ粒子親和性ペプチドを独自に開発し,比色法による相互作用の高感度検出への応用が可能であることを示した.さらにCutA1へのVHH抗体の挿入が可能な部位を見出し,高い分子デザイン許容性を明らかにした.バイオ分子間相互作用検出の詳細な比較と汎用性の担保が可能となるシステムを確立すべく,CutA1をクッションタンパク質として用い,表面親和性ペプチドを連結した形の分子の固定化特性および固定化後の構造維持に関する詳細な解析を行う.リガンドペプチドの挿入による構造変化が特に見られなかったことおよびCoiled-coil構造などのユニット導入でも構造安定性に特に問題が生じなかったことをふまえ,ペプチドに加えて,より大きなタンパク質の挿入可能性について検討を進め,多様なバイオ分子間相互作用の検出への本技術の適用を目指す.また,親水性ポリスチレンならびに金に加え,金ナノ粒子を固定化基材として用い,バイオ分子固定化による機能化も検討する.これらの検討を通じて超高感度バイオ分子間相互作用検出システムの開発を進めるとともに,クッションタンパク質の実用化可能性について総合的に評価する.バイオ分子間相互作用検出の詳細な比較と汎用性の担保が可能となるシステムを確立すべく,CutA1をクッションタンパク質・足場として用い,表面親和性ペプチドを連結した形の分子の固定化特性および固定化後の構造維持に関する詳細な解析を行う.リガンドペプチドやタンパク質の挿入,連結によっても構造変化が特に見られなかったこと,ならびにCoiled-coil構造などのドメイン導入でも構造安定性に特に問題が生じなかったことをふまえ,より大きなバイオ分子の挿入可能性について検討を進め,多様なバイオ分子間相互作用の検出への本技術の適用を目指す.また,金ナノ粒子を固定化基材として用い,親和性ペプチドを介したバイオ分子固定化による機能化が可能であることがわかったことから,相互作用検出高感度化にむけたクッションタンパク質の適用,検出に及ぼす物理化学的要素についても詳細に検討する.
可変領域の安定性を利用した抗原濃度測定法の実用化

1.繊維状ファージを用いた新規な蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムの確立ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを構築した.これを各種の抗体可変領域VH/VL間の相互作用測定に応用したところ,モデル系で抗原添加に伴う相互作用変化を測定できた(オープンサンドイッチ法,OS法).さらにこのシステムでは二つのドメインVH, VL両者を同時に提示して抗原でパニングすることも可能であり,実際にフレームワーク領域のライブラリを作製し,これまで不明であった抗原結合能とVH/VL相互作用の強弱との関係,およびVH/VL間の相互作用を決定づける残基を明らかにした。2.低分子の非競合的免疫測定法としてのOS法の確立上記のSpFvシステムを用いて,各種低分子(ビスフェノールA,11-デオキシコルチゾール,ホスホチロシン,ジベレリンA24,オステオカルシンペプチド等)に対する抗体遺伝子クローニングと,OS法による非競争的免疫測定に成功した。いずれの抗原検出においても従来の競合法に比べ,高い検出感度と広い測定濃度域を得ることができた。また得られた遺伝子を用いてVHとアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質,およびMBP-VL融合蛋白質等の精製蛋白質を作製し,これらを用いて実用的な測定系を組むことができた。3.真核細胞を用いた抗原特異的抗体発現細胞選択系の開発抗原を認識して活性化し,増殖信号を伝達できる細胞表面キメラ受容体を発現させたIL-3依存性細胞株を用いて,抗原特異的な抗体断片を選択し,かつ細胞にCre recombinaseを発現させることで培養上清に糖鎖修飾scFvを分泌できるシステム(ASAPシステム)を構築した。1.繊維状ファージを用いた新規な蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムの確立ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを構築した.これを抗体の可変領域を構成する二つのドメイン(H鎖可変領域VHおよびL鎖可変領域VL)間の相互作用測定に応用したところ,確かに抗原添加に伴う相互作用変化を測定できた(オープンサンドイッチ法).またファージ産生ホストとしてアンバーサプレッサー変異株を用いることで,二つのドメインVH, VL両者を同時に提示し,可変領域としての抗原結合能を評価することも出来た.しかしながらこれをライブラリからの抗原結合クローンの濃縮に用いた場合,しばしば発現産物の細胞毒性によるとみられる遺伝子の欠落が起こったため,ベクター上にコードされる遺伝子の上流および下流に2個のグルタミンパーメアーゼ由来ターミネーターを挿入したところ,遺伝子の安定性が顕著に改善され抗原によるライブラリ選択が可能になった.2.SpFvシステムによる,環境ホルモンビスフェノールAの非競争的免疫測定オープンサンドイッチ法は小分子の非競争的測定が出来るという他にない特徴がある.上記spFvシステムにより,既存の抗ビスフェノールA抗体3種のオープンサンドイッチ法への適性を判定したところ,抗原への親和性の高いクローンほど適性が高いという結果を得た.最適と思われるクローンについて,VHとアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質,およびVLとビオチン化タグとの融合蛋白質を作製してビスフェノールA濃度を測定したところ,競合法より高い感度で非競争的に濃度測定を行うことができた.

1.新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを用いた抗体VH/VL相互作用の強弱を決定する残基の同定抗体の可変領域を構成する二つのドメイン(H鎖可変領域VHおよびL鎖可変領域VL)間の相互作用が抗原添加の有無により変化することを利用すれば,小分子抗原濃度を非競合的に高感度に測定できる(オープンサンドイッチ法,OS法)。昨年度構築した,線維状ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを用いてコンビナトリアルライブラリを作製し,これまで不明であった抗原結合能とVH/VL相互作用の強弱との関係を明らかにすることができた。またVH/VL間の相互作用を決定づけるフレームワーク残基の同定に成功した。2.オープンサンドイッチ法による溶液中でのチロシンリン酸化の検出上記の情報をもとに,必ずしもオープンサンドイッチ法に適していない抗リン酸化チロシン抗体PY20の可変領域をこれに適した性質に改変し,溶液中のホスホチロシン濃度およびリン酸化チロシン含有ペプチドを蛍光共鳴エネルギー移動量の変化として検出することに成功した。チロシンキナーゼの高効率スクリーニング法としての応用が期待できる。3.SpFvシステムによる,小分子の非競合的免疫測定上記spFvシステムを利用し,既存の抗小分子抗体3種のOS法への適性を判定した。この結果,11-デオキシコルチゾール(11DC),植物ホルモン(ジベレリンA24)およびカビ毒の一種について,OS法での濃度測定が可能であった。11DCおよびカビ毒の検出感度と測定濃度範囲を競合法のそれと比較したところ,数倍の検出感度と100倍近い測定濃度範囲が得られることが判明し,競合法に比べたOS法の優位性が確かめられた。1.新規蛋白質間相互作用測定系split Fv(spFv)システムを用いたペプチドの非競合的免疫測定骨代謝の診断マーカーとして重要なオステオカルシン(Bone Gla Protein, BGP)に対する抗体をモデルに,これまで報告例のない低分子ペプチドの非競合的免疫測定を試みた。この際,VH, VL間相互作用の測定が可能なファージ提示系であるspFvシステムを用い,BGP N/C末端を認識する6種類の抗体のオープンサンドイッチ法への適性を調べたところ,うち一種類につき顕著な抗原濃度依存的VH/VL相互作用変化が観察された。そこでVL断片をマルトース結合タンパク質MBPとの融合タンパク質として大腸菌で発現精製しマイクロプレートに固定化し,VH断片をアルカリフォスファターゼとの融合タンパク質として発現精製し,サンプルと共に当該プレートで反応させた。洗浄後の酵素活性を測定したところ,競合法より優れた感度と測定濃度域を,特別な条件検討なしに得ることができた。2.オープンサンドイッチ法に適した抗体選択のための無細胞選択系の開発ファージ提示系より原理的に大規模なライブラリを作製でき,高性能の抗体断片が選択できると期待される無細胞タンパク質合成・選択系の構築を試み,精製された必須因子のみからなる無細胞タンパク質合成系Pure Systemを用いて,抗ウシ血清アルブミン一本鎖抗体scFvの発現に成功した。