hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食品のハラル制度の食品周辺分野への拡大の実態とその要因

研究目的は、ハラル制度・ハラル製品が、食品周辺分野(包装容器、医薬品、化粧品、輸送・保管、小売、レストラン)に拡大していること、その背景には、宗教・社会的な要因だけでなく、経済的な要因もあることを示すことである。非イスラム諸国を含む5カ国(マレーシア、インドネシア、シンガポール、アラブ首長国連邦(UAE)、オーストラリア)について、市場、新製品、研究開発、経済および法令・規格の動向等を調査した。なお、最終年度は、自由貿易都市:シンガポール、特異なハラル制度を有するオーストラリア、経済成長を遂げた中東のイスラム諸国:UAEで調査を行い、ハラル制度・製品動向について、アジアのイスラム諸国との差異を把握した。国内ではハラル原料の実態を調査した。その結果、国際的に、経済成長、産業の高度化、経済のグローバル化が進めば、ハラル制度・製品は食品周辺分野に拡大していく傾向があることを見出した。ただし、中東における拡大は、東南アジアに比べれば、遅々としている。また、東南アジアでは、ハラル制度に基づくハラル認証製品が拡大しているが、中東では、企業の責任でハラルを確保した製品が拡大している。その相違の背景は、第1に、中東は東南アジアよりも、宗教上の基本原則(ハラルの非成文性等)に忠実であり、制度化に否定的な考えがあるからである。第2に、東南アジアではハラル製品に注記(認証マークの貼付)するが、中東ではハラルでない製品に注記する、という慣行の相違があるからである。ハラル制度・製品の拡大動向は、宗教・社会構造と経済・産業動向の双方の影響を受ける、そして、地域的な差異があるという結果は、ハラルの概念は固定性が強いという従来からの考え方に、一石を投じることになる。この結果は、日本・欧米企業のイスラム市場開拓への有益な情報となる。研究成果を書籍(単著)として出版し、その後も研究を継続する。平成28年度は、研究の1年目として、東南アジアの3か国(マレーシア、インドネシア、シンガポール)を調査し、以下のとおり資料・情報を収集し、所期の知見を得た。第1に、これら3か国の現地調査で、食品周辺分野(食品容器、サプリメント、機能性食品、化粧品、医薬品)のハラル製品の流通動向に関する資料・情報を収集した。具体的には、小売店舗、サービス店舗などにおいて、ハラル認証マークの貼付された製品等を(報告者の自費で)購入して、表示内容等から、商品の種類、製造企業、生産地、含有成分、ハラル認証機関などの情報を取得した。その結果、いずれの国においても、多数のハラル認証製品が流通していることが明らかになった。また、原材料生産国・製品生産国・認証取得国・流通する国が異なる製品も散見され、食品周辺分野ハラル製品の動向と経済・社会の関係を単純化して見ることの難しさも明らかになった。第2に、これら3か国における食品周辺分野のハラル制度の内容・運用に関する資料・情報を収集した。マレーシアについては、マレーシアプトラ大学等のハラル研究員等との意見交換を繰り返し行い、制度の運用、今後の制度化の見通し等についての情報を得た。その過程で、食品周辺分野として、肥料や飼料等のハラルの重要性についても知見を得た。また、インドネシアのハラル認証製品法(2014年制定)が定める、2019年までに食品、化粧品、医薬品、化学品等のハラル認証の表示の義務化についての情報収集を行い、その実現速度が遅れている実態を把握した。第3に、3か国だけでなく、東南アジア諸国全体の経済・産業動向、食品などの物価動向についての資料・情報を収集した。これらは、食品周辺分野のハラル製品の動向と経済・社会の関係を分析するための必須の情報である。平成28年度は、研究の1年目として、当初の予定通り、東南アジアの3か国(マレーシア、インドネシア、シンガポール)について、現地調査、文献調査、インタビュー調査を行った。これらの調査を通して、(1)食品周辺分野のハラル製品の流通動向、(2)食品周辺分野のハラル制度の内容・運用実態、今後の制度化・制度改正の方向、(3)各国の経済・産業動向・食品などの物価動向、に関する有益な資料・情報を収集できた。シンガポールについては、当初は(3)の経済・産業動向の調査だけの予定であったが、(1)のハラル製品動向の調査にも着手できた。経済・産業動向については、予定していた3か国だけでなく、東南アジア全体の資料・情報を収集した。以上の調査から、食品周辺分野のハラル製品が普及しつつある実態を把握でき、分析に必要なデータを取得できる目途が立った。ただし、一部のハラル製品が、製造・流通過程において、国境を越えて移動する実態が明らかになり、食品周辺分野ハラル製品の動向と経済・社会の関係を単純化して見ることの難しさも明らかになった。このため、早い段階で、対象とする5カ国以外の国についても、ハラル製品の動向に関する資料・情報、経済・産業動向に関する資料・情報を、幅広く収集し、世界の大きな傾向を把握する必要性を感じている。そうすることにより、食品周辺野のハラル製品の動向と経済・社会の関係を分析するための、より良い方法を見出すことができると考える。また、食品周辺分野の製品として、肥料や飼料に関する調査の必要性も認識できた。研究初年度であるが、収集した資料・情報に基づき、ハラルに関する解説・総説を投稿(学会誌に1本、専門誌に2本)し、それらが掲載された。平成29年度は、研究の2年目として、海外ではマレーシアとシンガポールにおいて、国内では国立国会図書館等において、資料・情報を収集した。また、食品企業、化学品企業、ハラル認証団体等からも情報を収集した。

第1に、両国において、医薬品に焦点を当てて、一般マーケットにおいてハラル製品の情報を収集した。その結果、医薬品分野では、ハラル製品がそれほど普及していないことが明らかになった。第2に、マレーシア国際ハラル見本市(MIHAS 2017)で、食品周辺分野(食品容器、サプリメント、機能性食品、化粧品、医薬品)のハラル対応製品やサービスの最新情報を、幅広く収集した。具体的には、ハラル認証マークの貼付された製品等を(報告者の自費で)購入して、表示内容等から、商品の種類、製造企業、生産地、含有成分、ハラル認証機関などの情報を取得した。その結果、食品周辺分野でも、世界各国で、多種多様なハラル製品・サービスが上市されている、あるいは上市の計画があることが明らかになった。第3に、マレーシアプトラ大学(UMP)を訪問し、担当教授らと意見交換をし、制度の運用、改正見通し等についての情報を得た。同大学ハラル製品研究所(IPPH)では、研究所内部の視察、研究員への聞き取り調査から、食品関連分野(おもに医薬品)についての研究開発動向を把握した。第4に、国立国会図書館等において、ハラルに製品やハラル分析に関する論文等を入手し、自然科学分野でのハラル研究の動向を把握した。企業や団体からも有益な情報を多数得た。また、昨年度に引き続き、東南アジア諸国全体の経済・産業動向、食品などの物価動向についての資料・情報を収集した。これらは、食品周辺分野のハラル製品の普及と経済・社会の関係を分析するための必須の情報である。2年間で、東南アジアの3か国(マレーシア、インドネシア、シンガポール)を現地調査し、経済・産業の動向、食品周辺分野(食品容器、サプリメント、機能性食品、化粧品、医薬品)のハラル製品の普及動向・制度およびその背景にある経済動向について、多数の有益な資料・情報を得た。その結果、この3か国については、本研究の目的である「食品周辺分野のハラル製品の普及動向とその背景にある経済動向の関係」について、その概略を把握できた。ただし、平成29年度は、当初計画で予定していたオーストラリアの現地調査に替えて、マレーシアの調査を2回実施した。マレーシア国際ハラル見本市(MIHAS 2017)、マレーシアプトラ大学(UMP)における情報収集である。MIHASにおける情報収集は、当初計画では、4年目(平成31年度)に予定していた。しかし、ハラル製品の製造・流通過程における国際移動が多いことがわかり、対象5カ国以外の国についても幅広く情報を収集し、研究の早い段階で、世界の大きな傾向を把握する必要性を認識したため、前倒しした。また、UMPおよび同大学ハラル製品研究所(IPPH)における、ハラル担当教授およびハラル医薬品の研究員との意見交換をする機会を得たので、これも、平成29年度に実施した。なお、食品企業、化学企業、認証団体との意見交換により、ハラルの現場情報を多数収集できた。さらに、UMPや国立国会図書館等における文献調査でも、多くの知見を得た。この2年間で、収集した資料・情報を整理分析して、解説・総説を計7本(学会誌:1本、経済専門誌:6本)寄稿し、それらが掲載された。
脊髄後角第I層細胞における後根誘起シナプス応答の解明

L4またはL5後根に単一および頻回刺激を加えると、グルタミン酸誘起のfast EPSPが誘起された。頻回刺激を加えると約20%の細胞ではfast EPSPに続いて緩徐シナプス応答が観察された。この応答をしめす細胞にサブスタンスPを灌流投与すると興奮性の脱分極が惹起された。Slow EPSPとサブスタンスP誘起の応答はNK1受容体拮抗薬で抑制された。記録された細胞の形態と軸索の方向から投射ニューロンと考えられた。末梢から痛覚情報を伝える無髄のC線維は数種類のペプチドを含有し、特にサブスタンスPやCGRPは痛覚伝達に重要な役割を果たしていると考えられている。C線維が多く終末する膠様質細胞からの記録では、サブスタンスPによって何ら変化が起こらず、これは免疫組織学的な結果とも一致した。そこで、サブスタンスP受容体を発現している第一層のニューロンから記録を行い、後根の頻回刺激によって緩徐なシナプス応答が誘起されるか、また、サブスタンスP投与によって同様の応答が記録されるかを調べ、両者の発生に関与するイオン機序を検討した。さらに、NK1受容体拮抗薬を用い、両者の応答が抑制されるかを調べた。第一層には投射ニューロンと介在ニューロンが存在することから、両者または投射ニューロンで応答が惹起されるかを明らかにするため、中心管の腹側部に単極刺激電極を設置し、逆行性の活動電位の有無によって投射ニューロンであることを同定した後、サブスタンスPの作用を検討した。サブスタンスPと同様、CGRPについても検討を加えた。サブスタンスPによって約20%の細胞に脱分極が観察され、その多くは投射ニューロンであった。得られた応答は膜抵抗の増大によるもので、その逆転電位からカリウムチャネルのclosingによるものと推測された。膠様質細胞では抑制性のペプチド、例えばソマトスタチン、エンケファリン、NPY等は過分極応答を誘起するが、サブスタンプPやCGRPを含め興奮性のペプチドは何ら作用を示さなかった。そこで、第一層の細胞に対しても抑制性のペプチドが何らかの作用を示すかを観察した。今の所、記録細胞数が少ないため結論を出すには至っていない。今後、NK1受容体を発現している深層ニューロンからも記録を行い、投射ニューロンであることを同定した後、サブスタンスPの作用を検討する。末梢から感覚情報を伝える感覚神経のうち無髄のC線維は、多くの種類のペプチドを含み、刺激によって脊髄後角に放出されることが示されている。しかし、その機能的な意義については未だ明らかではない。そこで、ラット脊髄スライスに後根を付した標本を作製し、後根誘起のシナプス応答の解析を行い、緩徐シナプス応答におけるペプチドの関与を明らかにする。緩徐シナプス応答は痛みの伝達にたいして修飾作用を示すと考えられており、ペプチドが痛み情報の伝達に作用を及ぼすかを明らかにすることは、今後の慢性疼痛の治療薬の開発に大きく貢献出来る。脊髄後角第II層の膠様質細胞には多くのC線維入力を受けているが、いずれの細胞もサブスタンスPやCGRPに対しては何ら作用を示さなかった。そこで、C線維が直接入力する脊髄後角第I層細胞から記録を行った。第I層ニューロンはは投射ニューロンと介在ニューロンが混在し、投射ニューロンの多くがC線維からの直接入力を受けている。第I層の細胞からパッチクランプ記録を行い、後根のC線維を頻回刺激した。刺激によって経過の速いfast EPSCが見られ、それに続いてslow EPSCが観察された。また、サブスタンスPを直接記録細胞に投与すると緩徐な内向き電流が惹起された。これらの緩徐応答はサブスタンスP受容体の拮抗薬によって抑制された。以上の結果から、脊髄後角第I層細胞はサブスタンスP含有のC線維の入力を受けていること、緩徐なシナプス応答が誘起されることが明らかとなった。今後、CGRPの作用についても明らかにしたい。また、鎮痛薬としての役割についても検討を加えたい。末梢から痛みの情報を伝えるC線維は様々なペプチドを含有し、脊髄後角におけるシナプス応答の増強に関与していると推測されるが、その詳細なメカニズムや作用部位については未だ明らかではない。このC線維は後角第1層とII層に入力しているが、II層の細胞からの記録ではペプチドを介する緩徐な応答は記録されていない。そこで、第1層の細胞から記録を行い、後根C線維の頻回刺激によって誘起される緩徐なシナプス応答を解析し、痛覚情報入力に対して如何なる作用を示すか明らかにすることを目的とした。脊髄後角第1層には痛み特異的投射ニューロンが存在していることから、その同定を行いシナプス応答の解析をおこなった。同定には中心管の腹側部に刺激電極を置き、逆行性の活動電位が惹起されることたよって行った。

同定した約20%の細胞では後根のC線維頻回刺激によって緩徐な脱分極性シナプス応答が観察され、その持続時間は30秒以上に渡って持続した。同じ細胞にサブスタンスPを灌流投与するとシナプス応答と類似の脱分極が誘起された。また、サブスタンスPの受容体であるNK1の拮抗薬を予め投与すると刺激と灌流投与による緩徐シナプス応答が抑制された。これらの細胞においては後根の単一刺激によって速い経過のEPSPが観察され、この応答は後根のA-deltaおよびC線維刺激で誘起された。そこで、緩徐脱分極電位発生中の細胞の興奮性について検討き行った。先ず、後根のC線維を頻回刺激して緩徐脱分極を誘起し、次に単一刺激誘起のEPSPを重畳させると、EPSPの多くは活動電位を発生させた。CGRPについてはその作用が弱く微小な脱分極が誘起されたのみで、詳細な解析はできなかった。これらの結果から、サブスタンスPを含有するC線維は1層に入力し投射ニューロンに緩徐脱分極を惹起して細胞の興奮性を増大させている可能性が示唆された。
発生運命に関わるRNAのWnt依存的な非対称分配機構の解析

動物の胚発生の過程で中胚葉と内胚葉は中内胚葉細胞から作られる。前年度までの研究で、脊索動物のホヤでは、中内胚葉細胞が極性化されており、将来中胚葉細胞になる側にNot mRNAが局在し、それが中胚葉細胞に受け継がれることで中胚葉と内胚葉の運命が分離されることを明らかにした。中内胚葉細胞に極性が生じる機構Not mRNAの局在が維持される機構の二つに着目した。中内胚葉細胞を極性化する機構については、極性を作るのに重要な因子を同定した。PI3Kの機能を阻害した胚では、Not mRNAが細胞の中央に局在し、中胚葉と内胚葉の両方の細胞に均等に分配され、運命が分離しなかった。PI3Kの抗体を作成し、免疫抗体染色を行ったところ、PI36とその産物である、PtdIns(3,4,5)P3の両方が将来の中胚葉側に局在していた。PI3K活性の偏りを乱すために、PtdIns(3,4,5)P3を分解するPTENの機能を阻害したところ、Not mRNAの局在が乱れ、運命分離が起こらなかった。PI3Kを過剰に発現させた胚でもNot mRNAの局在が阻害された。PtdIns(3,4,5)P3を中内胚葉細胞に注入したところ、Not mRNAは中胚葉側ではなく、細胞の中央に局在した。これらの結果は、PI3Kおよびその活性の局在が極性を作るのに重要であることを支持している。Not mRNAの局在に必要なmRNA結合因子を同定するために、Yeast three hybrid法により、20の候補因子を得た。2つについては機能阻害した胚でNot mRNAの分配が異常になった。1つの因子について抗体を作成して中内胚葉細胞における局在を観察したところ、細胞核と中胚葉側の細胞表層付近にシグナルが観察された。現在、これらの因子の機能と局在を検証する作業を継続している。動物の胚細胞は、外、中、内胚葉細胞の3つに大別される。これらのうち、中胚葉と内胚葉は中内胚葉細胞から作られる。この過程で中胚葉と内胚葉の運命を分ける分子機構について、細胞一個一個のレベルで詳細な理解が得られている例は非常に少ない。(当該年度の開始時点)脊索動物のホヤの胚では中内胚葉細胞が分裂する際に、中胚葉になる娘細胞にのみ、Not遺伝子のmRNAをWnt依存的に分配することで運命を分離していることを明らかにしていた。(今年度の成果)Not mRNAを中内胚葉細胞の将来中胚葉細胞を生じる領域に局在させる機構を調べた。その結果、(1)分裂前の細胞の核がNotRNAをザイゴティックに転写しつつ将来の中胚葉側に移動し、(2)細胞周期のM期にmRNAが核から細胞質に放出され、(3)染色体と分裂装置がmRNAを残して細胞の中央に戻ることを見出した。この過程で核の移動がmRNAの局在に必要であることを示した。これらの結果は、核の移動が運命の分離に重要な役割を果たすことを示している。多くの生物の細胞で観察されている核の移動について、新規の機能を示したおり、重要であるといえる。mRNAの局在を維持するために、分裂前のある時期の細胞間結合が重要であることを見出した。現在、これらの結果をまとめた論文を投稿中であるとともに、核の移動の極性を決定する機構について候補分子を使ったアプローチで探索している。動物の体を作る各種の細胞は、原腸陥入の前後に作られる外、中、内胚葉の間の相互作用によって作られる。近年、中胚葉と内胚葉は中内胚葉細胞から作られることがわかってきた。しかし、中内胚葉の細胞のうち、どれが中胚葉になり、どれが内胚葉になるのか決めている機構、すなわち中胚葉と内胚葉の運命を分けている機構については非常に少ない情報しか得られていない。前年度はNot mRNAを中内胚葉細胞の将来中胚葉細胞を生じる領域に局在させる機構を調べ、分裂前の細胞の核の移動とWnt依存的なNot mRNAの繋留が重要であることを明らかにした。この内容を今年度のDevelopmental Cell誌に掲載することができた。ホヤの論文としては初めての快挙である。今年度はさらに、Not以下の転写因子ネットワークを解析し、NotがFox遺伝子の非対称な発現を介して中胚葉と内胚葉を分離していることを明らかにした。Notが中胚葉形成に必要なコンピテンスファクターの発現を制御していることが分かった。Notが無いことによっておこる、内胚葉形成についても、複数のFox遺伝子とLim遺伝子によって形作られる転写因子カスケードを明らかにした。興味深いことに、Not遺伝子を含めたフィードバックループが中胚葉を形成する範囲を限定するのに重要である可能性が見えてきた。核について方向を決定する機構を解析し、複数の細胞内シグナル伝達経路のキナーゼが重要であることを見出した。現在、これらのキナーゼの局在や活性化の空間的パターンを解析中である。

中内胚葉細胞に極性が生じる機構Not mRNAの局在が維持される機構の二つに着目した。中内胚葉細胞を極性化する機構については、極性を作るのに重要な因子を同定した。PI3Kの機能を阻害した胚では、Not mRNAが細胞の中央に局在し、中胚葉と内胚葉の両方の細胞に均等に分配され、運命が分離しなかった。PI3Kの抗体を作成し、免疫抗体染色を行ったところ、PI36とその産物である、PtdIns(3,4,5)P3の両方が将来の中胚葉側に局在していた。PI3K活性の偏りを乱すために、PtdIns(3,4,5)P3を分解するPTENの機能を阻害したところ、Not mRNAの局在が乱れ、運命分離が起こらなかった。PI3Kを過剰に発現させた胚でもNot mRNAの局在が阻害された。PtdIns(3,4,5)P3を中内胚葉細胞に注入したところ、Not mRNAは中胚葉側ではなく、細胞の中央に局在した。これらの結果は、PI3Kおよびその活性の局在が極性を作るのに重要であることを支持している。Not mRNAの局在に必要なmRNA結合因子を同定するために、Yeast three hybrid法により、20の候補因子を得た。2つについては機能阻害した胚でNot mRNAの分配が異常になった。1つの因子について抗体を作成して中内胚葉細胞における局在を観察したところ、細胞核と中胚葉側の細胞表層付近にシグナルが観察された。現在、これらの因子の機能と局在を検証する作業を継続している。
抗原蛋白を表層ディスプレイする遺伝子組換えビフィズス菌を用いた経口ワクチン

近年、腸管での粘膜免疫の誘導が感染予防に対して大きな役割を果たすことが期待されており、生きた腸内細菌、プロバイオティクスを、抗原タンパク遺伝子のキャリアーとして応用した経口ワクチンの開発が研究されている。今回、我々は代表的なプロバイオティクスであるビフィズス菌を応用した経口ワクチンの研究開発を実施し、病原体の抗原を表層ディスプレイするビフィズス菌の開発に成功し、そのワクチン効果をネズミ・チフスモデルで確認した。腸管感染症の予防に関しては、その最初の感染部位である腸管での免疫を誘導することが効果的であると考えられる。近年、その免疫強化機能や腸管感染症の予防効果が報告されている腸内細菌、プロバイオティクスを、抗原遺伝子のキャリアーとして応用した経口ワクチンが研究されている。これまでに、抗原遺伝子が組み込まれた乳酸菌を用いた経口ワクチンの基礎研究が行われているが、ビフィズス菌を用いての経口ワクチン開発はほとんど行われていない。今回、我々は抗原蛋白を細胞膜外に発現、分泌するように設計した遺伝子組み換えビフィズス菌作製した。もともと免疫原性の弱いビフィズス菌における効率的な抗原提示のためには抗原蛋白の細胞膜表層での発現または分泌が必要である。また今回、サルモネラ菌感染症の抗原蛋白として選択したフラジェリンにはそれ自体にアジュバント作用があるという報告もある。現在までに、B.longum株よりABCトランスポーターファミリーである、galacto-N-biose/lacto-N-biose I-binding protein(GL-BP、基質結合蛋白質)の遺伝子をクローニングしフラジェリン抗原遺伝子を結合させ、ビフィズス菌に組み込むことによって抗原蛋白を表層にディスプレイする遺伝子組み換えビフィズス菌を作製した。フラジェリン-GL-BP結合蛋白の発現をウェスターンブロッティングにて確認すると同時に、抗フラジェリン抗体を用いた免疫染色で遺伝子組換えビフィズス菌ふぁフラジェリンタンパクを表層発現していることを確認した。またマウスを用いた動物実験で遺伝子組換えビフィズス菌を経口投与したマウスの糞便中に抗フラジェリン特異的IgA抗体が産出されることをELISA法で確認した。今後、ネズミチフス菌を用いて感染阻止効果を確認腸管感染症の予防に関しては、その最初の感染部位である腸管での免疫を誘導することが効果的であると考えられる。フラジェリン-GL-BP結合蛋白の発現をウェスターンブロッティングにて確認すると同時に、抗フラジェリン抗体を用いた免疫染色で遺伝子組換えビフィズス菌フラジェリンタンパクを表層発現していることを確認した。またマウスを用いた動物実験で本ワクチンを経口投与したマウスの糞便中に抗フラジェリン特異的IgA抗体が産出されることをELISA法で確認した。また、ネズミチフス菌を用たマウス腸チフスモデルで感染阻止効果を確認した。現在までに、B.longum株よりABCトランスポーターファミリーである、galacto-N-biose/lacto-N-biose I-binding protein (GL-BP、基質結合蛋白質)の遺伝子をクローニングしフラジェリン抗原遺伝子を結合させ、ビフィズス菌に組み込むことによって抗原蛋白を表層にディスプレイする遺伝子組み換えビフィズス菌を作製した。

フラジェリン-GL-BP結合蛋白の発現をウェスターンブロッティングにて確認すると同時に、抗フラジェリン抗体を用いた免疫染色で遺伝子組換えビフィズス菌フラジェリンタンパクを表層発現していることを確認した。またマウスを用いた動物実験で本ワクチンを経口投与したマウスの糞便中に抗フラジェリン特異的IgA抗体が産出されることをELISA法で確認した。また、ネズミチフス菌を用たマウス腸チフスモデルで感染阻止効果を確認した。
樹状細胞Fcγ受容体へのがん抗原ターゲティングによるがん免疫賦活方法の開発

樹状細胞(DC)に発現されているFcγレセプター(FcγR)に特定の癌抗原あるいは癌細胞をIgG免疫複合体として試験管内で結合させ,処理させることでDCの抗原提示能を飛躍的に亢進させる.これを担癌マウスに移入することで癌抗原特異的免疫応答を誘導する方法を開発することを目的とした.DCによる免疫賦活では,非特異的に抗原を取り込ませる方法,および糖鎖レセプターなどを介して取り込み効率を上昇させる方法が検討されている.レセプターを介する方法は少量の抗原で済むため効率良く行える利点があるが,糖鎖など特定のレセプターに認識される構造を持っていないものについては利用できない難点がある.今回の方法はどのような蛋白質であっても,それに対する特異的IgG抗体との複合体にすることでDC上のFcγRに結合させることができ,CD4+およびCD8+T細胞の活性化を誘導する抗原提示をおこなうことが可能となる.本法が発展することで癌の新規免疫療法の開発が行えるようになることが期待される.本年度はまずDCのFcγRへの抗原ターゲティングによりCD4+T細胞への抗原提示能力が約100倍亢進する結果が得られた.さらにCTLに対する活性化も得られることが分かり,特異的FcγRターゲティングにより癌免疫の賦活が可能であることが示された.樹状細胞(DC)に発現されているFcγレセプター(FcγR)に特定の癌抗原あるいは癌細胞をIgG免疫複合体として試験管内で結合させ,処理させることでDCの抗原提示能を飛躍的に亢進させる.これを担癌マウスに移入することで癌抗原特異的免疫応答を誘導する方法を開発することを目的とした.DCによる免疫賦活では,非特異的に抗原を取り込ませる方法,および糖鎖レセプターなどを介して取り込み効率を上昇させる方法が検討されている.レセプターを介する方法は少量の抗原で済むため効率良く行える利点があるが,糖鎖など特定のレセプターに認識される構造を持っていないものについては利用できない難点がある.今回の方法はどのような蛋白質であっても,それに対する特異的IgG抗体との複合体にすることでDC上のFcγRに結合させることができ,CD4+およびCD8+T細胞の活性化を誘導する抗原提示をおこなうことが可能となる.本法が発展することで癌の新規免疫療法の開発が行えるようになることが期待される.本年度はまずDCのFcγRへの抗原ターゲティングによりCD4+T細胞への抗原提示能力が約100倍亢進する結果が得られた.さらにCTLに対する活性化も得られることが分かり,特異的FcγRターゲティングにより癌免疫の賦活が可能であることが示された.
保育所における医療的ケアの必要な小児の受け入れの現状と課題

医療的ケアの必要な小児の保育所への受け入れの実態および課題を明らかにすることを目的に、実際に受け入れた経験のある看護師5名を対象とした面接調査を質的帰納的に分析した結果、【受け入れへの前向きな姿勢】【看護師の葛藤や不安】【現行の制度上の課題】など11のカテゴリが形成された。さらに、全国の保育所看護職を対象とした質問紙調査を実施した結果、医療的ケアの必要な児の受け入れ経験があるのは回答者の21%であり、受け入れ困難な要因として、他の職員の理解を得にくい、人員不足、設備の問題等の回答率が高かった。医療的ケアの必要な小児の保育所への受け入れの実態および課題を明らかにし、今後の体制整備に向けた課題を検討することを目的とし、平成25年度には、医療的ケアの必要な小児を実際に受け入れた経験のある保育所看護職5名を対象とし、組織としての受け入れ体制・看護職の役割・児を受け入れる上での看護職の認識・実際の支援内容および課題等に関する半構成的面接を実施した。質的記述的分析の結果、医療的ケアを要する小児の保育所への受け入れの現状と課題として、【園としての体制整備】【受け入れに向けて看護師が行った準備】【受け入れを可能にしている条件】【受け入れへの前向きな姿勢】【医療的ケアを要する児の保育の状況】【看護師の実践】【児を受け入れたことでのプラスの影響】【看護師の葛藤や不安】【看護師へのサポートの必要性】【現行の制度上の課題】の10カテゴリが形成された。看護師は、対象児が健康な子ども達とともに生活する統合保育に様々な意義を見出しながらも、感染予防等、対象児の健康管理・安全管理と両立させるのは困難であることに葛藤をいだきながら保育を行っていることや、臨床を離れた場で医療処置を行うことに対する不安感じていることが明らかとなった。また、看護師一人での対応では限界があるが、必要な人員配置には補助金が不十分である、保育所配置の看護職が医療的ケアを実施するための手続きや書類等が整えられておらず、実施可能な範囲が不明確であるなど、現行の制度には様々な課題のあることが示された。次年度は、同調査を継続しつつ、これらの結果を元に調査票を作成し、医療的ケアの必要な小児の受け入れの経験の有無や現状での可否、必要な条件、研修ニーズ等に関して、全国の保育所に勤務する看護職を対象としたアンケート調査を実施していく。医療・保健の進歩により、高度な医療処置を必要とする慢性疾患児でも、退院し在宅で生活する小児が増加してきているが、保育所等の集団生活の場への、このような小児の受け入れ体制はほとんど整えられていない。これらのことから、保育所における医療的ケアの必要な小児の受け入れの現状と課題を明らかにすることを目的とし、平成24年度には、第1段階として、医療的ケアの必要な児を受け入れた経験のある保育所看護職を対象とした実態調査を開始した。所属機関の疫学研究倫理審査委員会に研究計画の申請を行い、研究実施の許可を受けた。まず、1例目として、吸引の必要な小児を受け入れた経験のある保育所看護師1名を対象に、面接ガイドを用いた半構成的面接を実施した。面接内容は録音して逐語録化し、質的帰納的に分析した。分析の手順として、逐語録は意味のある文節ごとにラベルをつけコードとした。コード化の際には、意味内容を変えないよう、対象者の語った言葉をそのまま用いた。これらのコードを相互に比較し、類似した内容をまとめてラベルをつけ、カテゴリとした。1例目の逐語録を分析した結果、保育所における医療的ケアの必要な小児の受け入れの現状と課題として、「日々の体調管理の必要性」「保育は保育士が中心」「職員全体の共通理解」「看護師と保育士との役割の分担と共有」「統合保育と安全管理との葛藤」「医療処置実施に対する看護師の不安」「子どもに対する責任感」の7つのカテゴリが導き出された。平成25年度も引き続き面接調査を実施し、例数を重ねて、比較検討を行いながら分析を行っていく予定である。本研究課題では、保育所における医療的ケアの必要な小児の受け入れの現状と課題を明らかにすることを目的とし、第1段階として、平成25年1月26年4月にかけて、医療的ケアの必要な小児を実際に受け入れた経験のある保育所看護職者を対象とした半構成的面接調査を実施した。質的記述的分析の結果、医療的ケアを要する小児の保育所への受け入れの現状と課題として、【園としての体制整備】【受け入れに向けて看護師が行った準備】【受け入れを可能にしている条件】【受け入れへの前向きな姿勢】

【医療的ケアを要する児の保育の状況】【看護師の実践】【児を受け入れたことでのプラスの影響】【看護師の葛藤や不安】【看護師へのサポートの必要性】【現行の制度上の課題】【社会的な認知】の11カテゴリが形成された。統合保育と対象児の健康管理・安全管理との両立の困難さによる葛藤、臨床を離れた場での医療処置に対する不安、さらには、人員配置の問題や、保育所配置の看護師が医療的ケアを実施するための手続きが未整備であるなど、現行の制度には様々な課題のあることなどが示された。平成26年度は第2段階として、これらの結果を元に調査票を作成し、医療的ケアの必要な小児の受け入れ経験の有無や現状での可否、必要な条件、研修ニーズ等に関して、全国の保育所に勤務する看護職を対象とした質問紙調査の準備を行った。全国保育園保健師看護師連絡会の協力を得て、質問紙調査票は、同会の会報の発送に合わせ平成27年4月に送付した。今後、調査結果の分析を行うとともに、研修ニーズの分析から新たな研究課題へと繋げていきたい。看護学面接調査の対象となり得る保育所が限られており、調査対象の選定に期間を要したため、第一段階の面接調査が当初計画よりも遅れ、第二段階調査に着手できていない。倫理審査の申請や面接調査の開始時期が、当初計画よりも遅れたため。研究補助を依頼し、データ入力・データ分析等の効率化を図る。定期的に会議を設定し、分析作業を進める。研究代表者、研究分担者で分担して面接調査を実施する。ICレコーダ反訳は業者委託として効率化する。第一段階の面接調査の実施が遅れ、当該年度内に第二段階アンケート調査の実施ができなかったため。次年度請求研究費と合わせ、25年度末に実施した面接調査のICレコーダ反訳委託料、およびアンケート調査送付のための通信費として使用する。24年度分を計画的に使用した結果、残額が生じたが、次年度請求研究費と合わせ、面接調査のための交通費・ICレコーダ反訳委託料として使用する。
顔特徴・顔印象の定量的解析手法の顔認知機能解明への応用

顔特徴・顔印象の定量的解析手法を利用した顔認知機能の解明について、以下の研究を行った。1.2つの異なる顔に対する似ているか否かの判断に係る顔認知親子の顔の類似性に対する主成分分析による定量的比較に関して、年齢印象操作による方法と顔部品特徴による方法を検討した。年齢印象操作による方法では、子供の顔に対して大人への年齢印象操作を行った上で親(大人)の顔と比較することにより、親子の顔を直接比較する場合に比べ、類似性評価の精度を向上することができた。顔部品特徴による方法では、子供と大人(親)の2つのグループに分け、各々の固有空間で顔特徴解析を行うことにより、各グループの中で入力顔特徴を定量化した。定量化された顔特徴を言葉による顔特徴記述に置換え、顔部品ごとの類似比較を行い、その結果を統合することにより親子の顔の類似性を柔軟に評価できるようにした。また、車のフロントフェースについて、各部品形状、配置に関する固有空間を求め、人間の顔に対してと同様に、対話的に特徴解析、特徴操作を行うための基礎的システムを構築した。2.顔の3次元形状に対する認知の仕組みの解明ステレオ画像計測により顔部分の3次元形状を取得するシステムの整備を行った。また、正面顔とは異なる典型的な例として横顔を取上げ、主成分分析を用いて横顔特徴の定量的分析を行った。正面顔に対してと同様の横顔特徴解析ツールの構築を進めた。また、どの主成分にどの様な横顔特徴が表れているのかを調べた。3.顔特徴・顔印象の定量的解析及び顔画像生成ツールの機能の拡充Bag of Words手法を顔による個人認識及び表情認識に適用する方法を考案し、従来の認識手法に比べて撮影条件の違いに頑健でかつ認識性能が高いことを実験により確認した。また、GPGPUによる並列演算を利用して顔特徴点の検出処理の高速化を図り、顔特徴点の検出から似顔絵生成までを実時間で行えるようにした。(1) 2つの異なる顔に対する似ているか否かの判断に係る顔認知親(成人)と子供とでは、頭部の骨格形状が異なるため、成人同士での類似顔判定手法をそのまま適用することはできない。そこで、子供の顔から成人の顔への成長に伴う平均的な変化量を調べ、子供の顔から成人になった時の顔を推定する。この結果と親の顔との間で類似度評価を行うことにより、親子での顔の類似度合いを判定できるようにした。また、我々は相手の顔から受ける印象を物の形にたとえることが良くある。例えば、「下駄、卵、ボール、人参、おむすび」が代表的である。入力顔がこれら5通りの物の形の特徴をどの程度有しているかを判定できるようにした。(2)顔の3次元形状に対する認知の仕組みの解明これまでの正面顔に対する特徴解析に加えて、横顔輪郭形状の平均形状を求め、入力横顔輪郭と平均輪郭との差分形状に係る主成分を導出した。(3)顔特徴・顔印象の定量的解析及び顔画像生成ツールの機能の拡充顔特徴点位置のロバストな検出方法として、顔パーツの輪郭線形状の統計的モデルとSIFT特徴量を用いた方法を考案した。また、照明条件の違い等を初めとした多様な撮影条件に対して安定に精度良く特徴点を抽出するために、特徴点位置の統計的性質(平均、分散)を利用して誤抽出の有無を判定し、補正処理を自動的に施す方法を開発した。(4)顔特徴・顔印象の認知我々が顔認知を行う場合、顔の特徴や印象を画像パターンとして捉えるだけでなく、言葉に置き換えて捉えることも普通である。特に、各顔パーツの長さ、太さ、大きさ、角度に対しては直感的に言葉で表現することが多い(眉が長い/短い、など)。そこで、主成分による記述を言葉による記述に置き換え、更に、この結果に基づいて人間の主観印象をより良く反映した類似顔検索を行えるようにした。3.顔特徴・顔印象の定量的解析及び顔画像生成ツールの機能の拡充

Bag of Words手法を顔による個人認識及び表情認識に適用する方法を考案し、従来の認識手法に比べて撮影条件の違いに頑健でかつ認識性能が高いことを実験により確認した。また、GPGPUによる並列演算を利用して顔特徴点の検出処理の高速化を図り、顔特徴点の検出から似顔絵生成までを実時間で行えるようにした。
エンドセリン変換酵素の特性解析と構造決定

1.エンドセリンを産生するブタ肺を材料にして、その膜分画から、エンドセリン変換酵素を精製し、特性解析を行った。2種(M1,M2)のエンドセリン変換活性をもつ酵素を検出し、いずれも膜結合型中性金属プロテアーゼであった。M1はビッグエンドセリン-1のみを切断し、内皮由来の変換酵素とほぼ同一の特性をもち、一方、M2はニュートラルエンドペプチダーゼと非常によく似ていた。M1酵素の阻害剤として、ホスホラミドンが有効であり、ホスホラミドンおよびその誘導体は、降圧薬となり得る可能性が示唆された。2.ビッグエンドセリン-1のin vivo昇圧機構の解析in vivo投与したビッグエンドセリン-1がいかに昇圧活性を発現するかを解明するために、(1)臓器に蓄積した標識bigET-1分子型の解析、また(2)標識big ET-1を培養内皮細胞および平滑筋細胞と反応させたときの分子型を解析を行った。その結果、上記いずれの場合も標識big ET-1のET-1への変換が実際に起こっていた。big ET-1がin vivoで昇圧活性を持つのは、変換酵素により生成したET-1が引き起こすと結論した。3.ET-2を産生するとヒト腎線腫瘍ACHN細胞を用いて、ET-2の生合成経路とET-2変換酵素の特性について検討した。その結果、中間体(big ET-2)は38個のアミノ酸残基であることが判明した。また、ET-2変換酵素のpH依存性、基質特異性、プロテアーゼ阻害剤の効果、分子量、クロマトグラフィー特性を解析し、内皮細胞由来のET-1変換酵素と比較した。ET-2変換酵素はホスホラミドン感受性中性金属プロテアーゼであり、big ET-1に対して最も高い酵素活性を持ち、ET-1変換酵素と同一あるいは非常に似た酵素であることが分かった。[中性金属型エンドセリン変換酵素の精製と特性解析]エンドセリンを産生するブタ肺を材料にして,その膜分画から,39残基の非活性型ビッグエンドセリンー1から活性型21残基のエンドセリンー1への変換活性をもつ酵素を精製し,その特性解析を行った。精製は疎水クロマトグラファ-,DEAE陰イオン交換,ゲルろ過クロマトグラフィ-を行った。[結果]2種(M1,M2)のエンドセリン変換活性をもつ酵素を検出し,いずれも膜結合型中性金属プロテア-ゼであった。M1は糖タンパク質である,ビッグエンドセリンー1のみを切断し,他のビッグエンドセリンは切断せず、内皮由来の変換酵素とほとんど同一特性をもっていた。一方,M2は腎臓などに多く存在するプロテア-ゼ,ニュ-ロエンドペプチダ-ゼ24.11(NEP)と非常によく似ていた。M1酵素の阻害剤として,ホスホラミドンが有効であり,その有効濃度はμM濃度であり,NEPのnM濃度とは明かに異なっていた。[考察]以上のことから,エンドセリン産生組織,肺には,エンドセリン変換活性をもつ金属プロテア-ゼが存在することが明らかになった。またビッグエンドセリンー1からエンドセリンー1への変換はホスホラミドン感受性であり,NEPとは異なるプロテア-ゼにより細胞内で起こることが示唆された。ホスホラミドンおよびその誘導体は,(1)一種の降圧薬となり得る可能性を示しており,(2)M1酵素選択的な阻害剤を開発すべきこと,(3)エンドセリンー1特異的酵素の存在から,さらに他のエンドセリンー2およびー3特異的酵素の在存する可能性が示唆された。[目的]

本研究では、(1)ET-1,ET-2の生合成経路の解析とそのET変換酵素の特性および構造の解析すること、一方、(2)新しい心血管作動性物質を検索し、構造解析を行うとともに、その作用機序を解析することを目的とした.[結果](1)ETの生合成経路とET変換酵素の解析:これまでにET-1のcDNA構造解析により、ET-1前駆体から、まず中間体big ET-1が産生し、次にET-1変換酵素により21残基のET-1ができるという生合成経路を提唱した.実際に内皮細胞培養上清の解析より、その生合成経路が正しいことを示し、さらに、big ET-1はET-1の約100分の1の収縮活性しか持たず、酵素的変換は生理的に重要な意義を持つことを明らかにしてきた.本研究では、(i)ET-1産生する内皮細胞、副腎髄質、肺、脳を用いて、ET変換酵素の精製および特性解析を試み、ET変換活性を持つ酵素の系統的解析を行い、ET変換活性をもつ酸性プロテアーゼ(カテプシンD)の単離に成功したが生理的酵素ではなかった.一方、(ii)内皮細胞に膜結合型中性金属プロテアーゼの存在を検出し、in vivoおよびin vitroで金属プロテアーゼ阻害剤ホスホラミドンにより強力に阻害され、big ETによる血圧上昇を抑制することを明かにした.(iii)ET-2産生細胞(腎由来腫瘍)の生合成経路およびET-2変換酵素の特性の解析から、ET-2変換酵素と内皮細胞由来のET-1変換酵素は同一あるいは非常に似た酵素であることが分かった.
ぶどう膜炎に伴う併発白内障の成因と予防法に関する研究

Smad3^<ex8/ex8>マウスとSmad3^<+/+>マウスをエーテル麻酔し,足底にリポポリサッカライドを30μg注入して実験的エンドトキシン誘発ぶどう膜炎を惹起した。一定時間後(1,2,6,12時間,1,2,5,10日,1,3か月後)に屠殺,眼球摘出し,組織学的検討を行った。眼球の連続切片を作成した。Smad3^<+/+>マウスでは,HE染色でぶどう膜炎誘発後局所的に前嚢下白内障と思われる部分が1ケ月後に認められたものがあった。上皮間葉系移行のマーカーであるα平滑筋アクチン,コラーゲンの発現が1ケ月目以降に若干みられた。TGFβ,CTGFなどのgrowth factorは1ケ月後に軽度に認められた。上記切片でTGFβ系の活性化の指標となるリン酸化Smad2,Smad3の核内移行の有無,さらにそれらの発現時間経過,発現部位について,免疫組織化学で検討した。リン酸化Smad2,Smad3は10日目に核内に染色性がわずかに認められた。Smad3^<ex8/ex8>マウスでは白内障はみられなかった。またα平滑筋アクチン,コラーゲン,TGFβ,CTGFは認められなかった。TUNNEL法により水晶体上皮細胞のアポトーシスを検討した。Smad3^<+/+>マウスでは1日目にTUNEL陽性細胞がみられた。Wistarラットをエーテル麻酔し、足底にリポポリサッカライドを200μg注入して実験的エンドトキシン誘発ぶどう膜炎を惹起した。一定時間後(1、2、6、12時間、1、2、5、10日、1、3か月後)に屠殺、眼球摘出した。HE染色ではぶどう膜炎誘発後、局所的に前嚢下白内障と思われる部分が1ヶ月後に認められたものもあった。しかし全例ではなかった。上皮間葉系移行のマーカーであるα平滑筋アクチン、コラーゲンの発現が1ヶ月目以降に若干みられた。TGFβ、CTGFなどのgrowth factorは10日後から1ヶ月後に軽度に認められた。各種innterleukin、各種cytokine発現を免疫組織化学とin situハイブリダイゼイションで検討したが、優位な上昇がみられなかったため、再度ラット数を増やして実験予定である。PCNA(proliferative cell nuclear antigen)の発現を免疫組織化学的に調べ、水晶体上皮細胞の増殖能を検討したところ、10日目より核内に若干の染色性が疑われたが、明らかではなかったため再度ラット数を増やして染色し、検討予定である。TUNNEL法により水晶体上皮細胞のアポトーシスをそれぞれ検討したが、明らかに染色されなかった。再度ラット数を増やして染色し、検討予定である。上記切片でTGFβ系の活性化の指標となるリン酸化Smad2、Smad3の核内移行の有無、さらにそれらの発現時間経過、発現部位について、免疫組織化学で検討した。リン酸化Smad2、Smad3は10日目に核内に染色性がわずかに認められた。いずれもラット数を追加して、さらに検討予定である。一定時間後(1、2、6、12時間、1、2、5、10日後)に屠殺した。角膜輪部から眼房水を採取し、また水晶体を摘出して、各々で全TGFβ2量および活性型TGFβ2量、FGF2量を免疫アッセイで測定した。眼房水および水晶体とも12時間後から5日後で全TGFβ2量および活性型TGFβ2量、FGF2量は若干増加していた。Smad3^<ex8/ex8>マウスとSmad3^<+/+>マウスをエーテル麻酔し、足底にリポポリサッカライドを30μg注入して実験的エンドトキシン誘発ぶどう膜炎を惹起した。一定時間後(1、2、6、12時間、1、2、5、10日、1、3か月後)に屠殺、眼球摘出し、組織学的検討を行った。Smad3^<+/+>マウスでは、HE染色でぶどう膜炎誘発後局所的に前嚢下白内障と思われる部分が1ヶ月後に認められたものがあった。TGFβ、CTGFなどのgrowth factorは1ヶ月後に軽度に認められた。またα平滑筋アクチン、コラーゲン、TGFβ、CTGFは認められなかった。

一定時間後(1,2,6,12時間,1,2,5,10日,1,3か月後)に屠殺,眼球摘出し,組織学的検討を行った。眼球の連続切片を作成した。Smad3^<+/+>マウスでは,HE染色でぶどう膜炎誘発後局所的に前嚢下白内障と思われる部分が1ケ月後に認められたものがあった。上皮間葉系移行のマーカーであるα平滑筋アクチン,コラーゲンの発現が1ケ月目以降に若干みられた。TGFβ,CTGFなどのgrowth factorは1ケ月後に軽度に認められた。上記切片でTGFβ系の活性化の指標となるリン酸化Smad2,Smad3の核内移行の有無,さらにそれらの発現時間経過,発現部位について,免疫組織化学で検討した。リン酸化Smad2,Smad3は10日目に核内に染色性がわずかに認められた。Smad3^<ex8/ex8>マウスでは白内障はみられなかった。またα平滑筋アクチン,コラーゲン,TGFβ,CTGFは認められなかった。TUNNEL法により水晶体上皮細胞のアポトーシスを検討した。Smad3^<+/+>マウスでは1日目にTUNEL陽性細胞がみられた。
急性腎不全発症予防薬開発とその臨床応用

本研究は急性腎不全でのエンドセリン(ET)の役割の解明を行い、その成果を受けてエンドセリン受容体に対する抗体を作成し、急性腎不全を予防することを狙ったものである。急性腎不全におけるエンドセリン(ET)の役割について種々の検討を行った。腎臓でのETの発現動態に関してはET1,そしてET3が大切であることを示し、さらに高浸透圧で発現増加することを示した(発表1-3)。馬杉腎炎モデルではメザンギウム細胞にET1とET3の発現が増加しており、この増加はトロンボキサンA2受容体拮抗剤で抑制されることが分かった(Tohoku J Exp Med in press)。腎機能悪化にETが関与していることを示すデータである。さらに急性腎不全モデルとしてウサギにおいて疎血腎、水銀剤投与腎を作成し腎でのETの発現を検討した。どちらのモデルにおいても集合管に著明なET1の蛋白発現の増加を認めた(Exp Nephrol in press)。以上の結果は急性腎不全においてET系を抑制すれば、腎不全の進展は抑えられるとする、本研究の仮説を証明したものでその意義は高いと考えられる。そこでETAならびにETB受容体に対する抗体を作成しETの働きをブロックする試みを行った。一般に膜受容体は疎水性が高く、高力価の抗体を得ることが難しい。本研究においても様々な工夫を行ったが、受容体は認識する抗体は得られたが、機能を抑えるいわゆる中和抗体を得ることは出来なかった。今後さらに検討が必要であり、抗体以外のアプローチの可能性も考えるべきと思われた。急性腎不全では、今まで一番強力な血管収縮性物質として知られていたアンギオテンシンIIよりもさらに強力なエンドセリンというペプチドが血液中に放出されている事が知られている。エンドセリンは糸球体濾過量や腎血流量を低下させるため、急性腎不全でエンドセリン値が高値であることは腎機能を低下させている可能性が考えられる。しかし、エンドセリンは腎糸球体や血管系だけでなく髄質集合尿細管においても合成および分泌されている。またエンドセリン受容体にはA型受容体とB型受容体とがあり、A型受容体は腎糸球体と血管系にみられ、B型受容体は腎糸球体と髄質集合尿細管にみられる。研究の目的は実際の実験モデルにおいてエンドセリンがどのように作用しているかについてエンドセリン受容体抗体の投与による腎機能の推移を検討する事にある。今年度は急性腎不全で受容体がどのように変化するかについての検討を行った。急性腎不全ではA型受容体が低下し、B型受容体が増加した。A型受容体が低下したという事はエンドセリンによる血管収縮作用に対する保護作用である。B型受容体はバゾプレッシンの作用を抑制する受容体で水、Na利尿をきたす。B型受容体が増加したという事は、急性腎不全により水、Naが貯留した状態に対する生体の防御作用の現れであると考えられる。このように急性腎不全においてエンドセリン受容体が重要な反応をしている事が示された。急性腎不全におけるエンドセリン(ET)の役割の詳細については未だ不明な点が多く、精力的に基礎的検討を行った。ラットの阻血急性腎不全モデルにおいて、血漿ET-1値は虚血後3時間で上昇を認め12時間でピークに達した。ET-1mRNAの腎での発現はこの血漿ET-1の値と同様の時間経過を示すことにより、腎での産生が血漿ET-1の上昇に寄与していることが明らかになった。一方ETの受容体に関しては阻血によりET-A受容体のmRNAは低下、ET-B受容体mRNAの上昇が認められた。これらの変化も3-12時間で認められているので、急性腎不全の予防のためには腎障害発生の早期に予防薬を投与する必要のあることが明らかとなった。

また急性のmesangiolysisを起こしてGFRを低下させる馬杉腎炎モデルにおいて、ET1とET3のmRNAの発現亢進を認め、その程度が腎障害と相関し、さらにトロンボキサンの受容体阻害剤で抑制されることも示した。以上の基礎検討と平行して、ETA,ETB受容体に対する抗体作成とその評価を行った。一般に膜受容体は疎水性が高く、高力価の抗体作製は困難なことが多い。我々もETA,ETB受容体に対する抗体を各々のいくつかのエピトープで試みているが、未だ抗体価が高く、特異性の高いものは得られていない。Western blot法による解析も行っているが、シングルバンドの認識する抗体は得られていない。今後さらに、エピトープの変更、抗体作製方法の変更などを行う予定である。急性腎不全におけるエンドセリン(ET)の役割について更に検討を行った。馬杉腎炎モデルではメザンギウム細胞にET1とET3の発現が増加しており、この増加はトロンボキサンA2受容体拮抗剤で抑制されることが分かった(Tohoku J Exp Med in press)。腎機能悪化にETが関与していることを示すデータである。さらに急性腎不全モデルとしてウサギにおいて疎血腎、水銀剤投与腎を作成し腎でのETの発現を検討した。どちらのモデルにおいても集合管に著名なET1の蛋白発現の増加を認めた(Exp Nephrol in press)。以上の結果は急性腎不全においてET系を抑制すれば、腎不全の進展は抑えられえるとする、本研究の仮説を証明したものである。そこでETAならびにETB受容体に対する抗体を作成しETの働きをブロックする試みを行った。一般に膜受容体は疎水性が高く、高力価の抗体を得ることが難しい。本研究においても様々な工夫を行ったが、受容体は認識する抗体は得られたが、機能を抑えるいわゆる中和抗体を得ることは出来なかった。今後さらに検討が必要であり、抗体以外のアプローチの可能性も考えるべきと思われた。