hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味覚を題材とした教育用味覚センサキットの開発

従って,平成25年度の研究実施計画を予定通りに実施できたといえる.さらに,課題1において,難航することが予想されていたが,目標としていた塩味と酸味に応答する脂質膜が予定より早く探索できたため,次年度実施予定であった課題4を前倒しで開始することができた.課題4では,教育用味覚センサを導入した理科教室を実施し,理科教材としての教育用味覚センサの有用性が示唆された.平成25年度に前倒しをして遂行した課題4について,引き続き測定機構の高機能化を中心に進め,必要に応じて課題1,2,3の見直しを行い,フィードバックさせる.現在のところ教育用味覚センサの塩味と酸味に対する応答が示されたおり,来年度は,その他の味質に対して応答を示す脂質膜の作製に取り組む.また,使用している電圧計は,有するチャネル数と性能面において改善の余地があると考えている.従って,測定する味質を塩味と酸味以外にも拡大し,理科教材としての教育用味覚センサの利便性および教育効果の向上を目指す.本課題では最終年度(平成26年度)に理科教室の実施を行う予定であったが,本年度に実施した1センサの受容膜の作製,2センサ電極作製方法の確立,3測定系の確立が当初の予定より順調に進んだため,予定を繰り上げて理科教室の実施を行った.そのため,受容膜の材料,電極の選定に必要な物品費が当初の予定より少なくなった.平成26年度の予定を繰り上げて理科教室を実施した結果,学生(中高生)がセンサの作製を行った際に失敗してしまうケースが見られた.従って,作製方法のさらなる簡便化を目指して,電極材料の検討及び作製手順の見直しを行う.また,現在のところ,塩味,酸味に応答するセンサ受容膜の開発に成功したが,他の味質,選択性の向上を目指し,センサ受容膜の検討を行う予定である.理科教室は引き続き実施を行い,得られた問題点をフィードバックして,教育用味覚センサキットの開発を行う.
微分方程式の総合的研究

平成7年6月東京及び平成8年6月札幌において分担者会議を開催し,各年の研究集会のスケジュールを決定した.各年12月に開催した研究集会「微分方程式の総合的研究」には全国から約200名の研究者の参加があった.また.各分担者が主催する小規模研究集会が15回開かれた.たとへば,第20,21回偏微分方程式札幌シンポジューム(北海道大学),解析的偏微方程式と関連する常微方程式の課題(名古屋大学),非線型偏微方程式研究集会(東京都立大学)等.これらの研究集会を通して,微分方程式の次の分野において著しい研究成果を得た.(詳しくは,研究成果報告書を参照)(1)常微分方程式の定性的理論,(2)偏微分方程式の局所理論,(3)積分作用素と楕円型方程式(4)放物型方程式の幾何学的理論(5)発展方程式の大域的理論(6)数理物理学における非線型方程式論.平成7年6月東京及び平成8年6月札幌において分担者会議を開催し,各年の研究集会のスケジュールを決定した.各年12月に開催した研究集会「微分方程式の総合的研究」には全国から約200名の研究者の参加があった.また.各分担者が主催する小規模研究集会が15回開かれた.たとへば,第20,21回偏微分方程式札幌シンポジューム(北海道大学),解析的偏微方程式と関連する常微方程式の課題(名古屋大学),非線型偏微方程式研究集会(東京都立大学)等.これらの研究集会を通して,微分方程式の次の分野において著しい研究成果を得た.(詳しくは,研究成果報告書を参照)(1)常微分方程式の定性的理論,(2)偏微分方程式の局所理論,(3)積分作用素と楕円型方程式(4)放物型方程式の幾何学的理論(5)発展方程式の大域的理論(6)数理物理学における非線型方程式論.平成7年6月中旬、東京で分担者会議を持ち、平成7年度の研究集会等の開催日程等を決定した。参加者50名程度の比較的小規模の研究集会については、以下の6ヶ所で開催し、それぞれの分野での新しい研究成果の発表があった。1).第20回偏微分方程式論札幌シンポジューム(北海道大学)、2).偏微分方程式仙台研究集会(東北大学)、3).非線型偏微分方程式研究集会(中央大学)、4).変分解析と偏微分方程式(静岡大学)、5).解析的偏微分方程式と関連する常微分方程式の課題(名古屋大学)、6)先端技術における非線型問題及び関連話題(北海道東海大学)。全国的規模の研究集会は、平成7年12月21、22の両日東京電機大学で開催され、約300名の微分方程式の研究者の参加があった。この集会では、いままで未解決であった課題について新しい研究成果の発表にとどまらず、常微分方程式と偏微分方程式の境界領域の分野での講義も行い、参加者の交流に大きな寄与があった。以上の新しい研究成果は現段階でプレプリントで公表され、現在国際的な専門雑誌に投稿中であり、平成8年度には正式に報告されるであろう。もう1つの活動は、平成7年7月札幌で開催された第四回日本数学会国際研究集会「非線型波動(Nonlinear Waves)」に関わるものである。この集会の趣旨の1つに若手研究者の育成があり、その目的のために参加した若手研究者(大学院生等)に経済的援助を行った。平成8年6月札幌において分担者会議を開催し,8年度の研究集会のスケジュールを決定した。平成8年12月に日本大学の協力を得て全国規模の研究集会「微分方程式の総合的研究」を開催し,200名を超す参加者があった.また,主として分担者が主催する小規模集会が全国10ヵ所で開かれた.例をあげると第21回偏微分方程式札幌シンポジューム(北海道大学),非線型偏微分方程式研究会(東京都立大学),反応拡散方程式学の研究集会(東北大学),夏の偏微分方程式シンポジューム(赤穂いこいの家),第14回九州における偏微分方程式研究会(九州大学)等,これらの研究集会及び前年度の研究集会を通して,微分方程式の次の分野において多くの著しい研究成果を得た.(詳しくは研究成果報告書(冊子)を参照していただきたい).(1)常微分方程式の定性的理論(2)偏微分方程式の局所理論(3)積分作用素と楕円型方程式(4)放物型方程式の幾何学的理論(5)発展方程式の大域的理論(6)数理物理学における非線型方程式論.
ESR-CT用スピントレーサーの開発および臓器の機能測定への応用

本研究課題について以下に示す結果を得た.〔実験〕1.生体安全性の高いin vivo測定用ラジカルを開発するために,ヒドロキシエチルスターチ及びデキトランに安定ラジカルを化学結合させ,高分子糖スピントレーサーを合成した.2.高分子糖スピントレーサーをマウスに投与し,X-band ESRおよびL-band ESRを用いてマウス体内におけるラジカル寿命を測定した.3.生体組織または臓器におけるスピントレーサーの集積性を検討するためにESR-CTの測定を行い,マウス臓器における分布画像の経時変化を追跡した.4.肝臓障害,腎臓障害及び皮膚癌を発症させたモデルマウスを用い,臓器または癌組織のラジカル分布を測定,正常マウスと比較した.5. ESR-CT法を臓器機能の測定に応用するために,分子量の異なる高分子糖スピンプローブを合成.肝臓障害マウスおよび腎臓障害マウスに投与し,正常マウスと比較した.〔結果〕1.デキストランを予め投与し肝臓RES系を飽和させたマウスは,高分子糖ラジカルのクリアランスが顕著に増大した.2.肝臓障害発症マウスにおける高分子糖ラジカルの血中クリアランスは,正常マウスに比較し,著しく増大した.3.肝臓障害発症マウスにおける肝臓部位のESR-CT画像の時間変化は,肝臓内の部位によるラジカル消去能の差が明白に現れた.4.癌の進行度と血中クリアランスには相関性があり,癌の進行が進むにつれて体内のラジカル消去速度は遅くなった.5.肝臓障害マウスと腎臓障害マウスにおいて,分子量4万及び10万の2種類のデキストランスピンプローブの動態は,肝臓,腎臓の機能障害による分子量の差異が明白に現れることが分かった.以下の目的で研究を計画した.1.生体内のラジカルの発生,分布,消滅,を画像として追跡するESR-CT法を、臓器生理学およびDDSの研究分野に応用すること.2.高分子糖スピントレーサーの生体への適用限界を検討する為,デキストラン,ヒドロキシエチルスターチ,グリコーゲン,プルランをスピンラベル化し,マウス体内でのラジカルの寿命,臓器への分布を測定し,比較すること.3.化学修飾により高分子糖スピントレーサーの物性を制御し,生体組織または臓器での蓄積性を変化させ,臓器特異性を発現させること.本年度は以下の実験を行った.1.ヒドロキシエチルスターチ及びデキトランにラジカルを化学結合させ高分子糖スピントレーサーを合成した.2.高分子糖スピントレーサーをマウスに投与し,X-band ESRによりマウス体内でのラジカル寿命を測定した.4.実験的に障害を発症させたマウスを用い,臓器または組織(肝障害,腎障害,担癌)中のラジカル分布を測定,正常マウスと比較した.これらにより本年度は以下の結果を得た.1.肝障害発症マウスにおける高分子糖ラジカルの血中クリアランスは,正常マウスに比べ,著しく遅くなった.2.肝障害発症マウスにおける肝臓部位のESR-CT画像の時間変化は,肝臓内の位置によるラジカル消去能の差が明白に現れた.3.癌の進行度と血中クリアランスには相関性があり,癌の進行が進むにつれて体内のラジカル消去速度は遅くなった.本研究課題について以下に示す結果を得た.〔実験〕1.生体安全性の高いin vivo測定用ラジカルを開発するために,ヒドロキシエチルスターチ及びデキトランに安定ラジカルを化学結合させ,高分子糖スピントレーサーを合成した.2.高分子糖スピントレーサーをマウスに投与し,X-band ESRおよびL-band ESRを用いてマウス体内におけるラジカル寿命を測定した.3.生体組織または臓器におけるスピントレーサーの集積性を検討するためにESR-CTの測定を行い,マウス臓器における分布画像の経時変化を追跡した.4.肝臓障害,腎臓障害及び皮膚癌を発症させたモデルマウスを用い,臓器または癌組織のラジカル分布を測定,正常マウスと比較した.5. ESR-CT法を臓器機能の測定に応用するために,分子量の異なる高分子糖スピンプローブを合成.肝臓障害マウスおよび腎臓障害マウスに投与し,正常マウスと比較した.〔結果〕1.デキストランを予め投与し肝臓RES系を飽和させたマウスは,高分子糖ラジカルのクリアランスが顕著に増大した.2.肝臓障害発症マウスにおける高分子糖ラジカルの血中クリアランスは,正常マウスに比較し,著しく増大した.3.肝臓障害発症マウスにおける肝臓部位のESR-CT画像の時間変化は,肝臓内の部位によるラジカル消去能の差が明白に現れた.4.癌の進行度と血中クリアランスには相関性があり,癌の進行が進むにつれて体内のラジカル消去速度は遅くなった.5.肝臓障害マウスと腎臓障害マウスにおいて,分子量4万及び10万の2種類のデキストランスピンプローブの動態は,肝臓,腎臓の機能障害による分子量の差異が明白に現れることが分かった.
ウイルス抵抗性遺伝子のシグナル伝達経路の解明

Brassica campestrisおよびNicotiana tabacumの発現型ファージcDNAライブラリーを用いて,ToMV MPと相互作用するタンパク質(MIP:MP-interacting protein)のcDNAをウエストウエスタン法でスクリーニングした結果,B.campestris由来のクローンMIP102,MIP105,MIP106およびタバコ由来のMIP204が得られた。これらのうち最も結合力の強いMIP102はArabidopsis thalianaで転写コアクチベーターとして報告されたKELPのホモログであり,A.thalianaのKELP遺伝子産物を用いてもToMVMPとの相互作用が認められた。さらに,これら2種のKELPはいずれもCTMV-WやCMV-OのMPとも相互作用することが判明した。一方、MIP204についても、トマトのエチレン応答遺伝子とのホモロジーが見出され、転写コアクチベーターの1種に属することが判明した。KELPはPR遺伝子の1種PRHAを調節することが報告されており、KELPのような核内因子が細胞質において合成された直後にMPにトラップされて核内への輸送が阻害され、PR遺伝子の発現が何らかの影響を受けることが予想される。現在我々は,ToMVのMP以外に、CMVのCPおよびMPをプローブとして追加し、またTMVに対する抵抗性遺伝子NのTIR,NBS,LRRの各ドメインを含む領域を組換えタンパク質として発現・精製した。これらをプローブとしたウエストウエスタンスクリーニングにより,各種タンパク質と相互作用する細胞因子のcDNAクローンが得られたので,今後はこれらの機能解析を行う予定である。
金属錯体ナノ空間における高分子集合構造の自在制御と機能発現

有機分子のコンフォメーションやパッキングを外部刺激で変化させることで発光特性を動的に変化させる方法が注目を集めている。しかし、その報告の多くは熱や機械的圧力といった外部刺激に限られており、溶媒の圧力をセンシングして発光を変化させたという例は無い。溶媒の蒸気の圧力を発光により検出できれば、揮発性有機物の検出センサーとしての応用が期待できる。本研究では、発光性分子であるdistyrylbenzene (DSB)を柔軟な多孔性金属錯体の細孔中に導入し、溶媒分子の吸着や熱といった外部刺激を与ることで発光をスイッチングすることを試みた。粉末状のホスト錯体[Zn2(terephthalate)2(triethylenediamine)]n(1)にDSBを導入した。ホスト骨格が元の構造(1)から変形した構造(1')に変化した複合体(1'⊃DSB)であることを確認した。1'⊃DSBにアセトニトリルを吸着させると、ホスト骨格が元の構造(1)へと変化した複合体(1⊃[DSB+CH3CN])が得られた。さらに、その複合体(1⊃[DSB+CH3CN])から真空引きによりアセトニトリルを除去してもホスト骨格の構造が保たれた複合体(1⊃DSB)であることがわかった。蛍光量子収率測定を行った所、1'⊃DSBでは0.02である一方、1⊃[DSB+CH3CN]や1⊃DSBでは0.61、0.54となり、発光強度に大きな差異が見られた。また、1⊃DSBを150°Cで加熱すると、1'⊃DSBの状態に戻り、熱や吸着といった外部刺激によってホスト骨格と共に発光挙動を変化させることができた。得られた複合体において発光挙動が異なる原因を検討するために、IR測定を行ったところ、1'の骨格中ではDSBはねじれていることが示唆された。すなわち、分子のコンフォメーション変化が発光挙動の変化に大きく寄与していることがわかった。アセトニトリル吸着過程においてホスト骨格の変化とゲストのコンフォメーション変化が同期して起こり、ゲストのもつ発光機能が変化するという興味深い結果であり、分圧と発光強度の関係から蒸気圧センサーとしての応用が期待できる。近年2nm以下の均一な細孔を有する多孔性金属錯体が注目を集めている。多孔性金属錯体の細孔のサイズや表面環境は様々に変化させることができるため、その細孔中に高分子を導入することで、細孔中における高分子鎖の本数や環境を自在にかつ厳密にコントロールすることが可能となる。そのような細孔に取り込まれた高分子鎖数本め集合体がどのような物性を示すかということは、高分子ナノ材料の物性評価という観点から非常に重要である。本研究では、細孔中に結晶性の高分子であるポリエチレングリコール(PEG)を導入し、その相転移挙動を検討した。多孔性金属錯体[Cu2(L)2(triethylenediamine)]nのジカルボキシレート配位子Lを系統的に変化させ、一連の錯体を合成した。PEG(Mw=600)のアセトニトリル溶液にそれぞれの錯体を浸漬した後、真空下で90°Cに加熱してPEGを細孔内へと導入した。DSCにより、細孔サイズが異なる細孔中でのPEGの融点を測定したところ、バルク状態のPEGの融点より低くなり、更に細孔サイズに強く依存して変化することが分かった。すなわち、高分子鎖数本程度の集合体の融点を初めて観測し、更に高分子の本数に依存した融点の変化を明らかにした。一方、細孔サイズはほぼ同じで、配位子Lの置換基の異なる錯体を用い、細孔中でのPEGの融点の比較を行った。錯体の細孔表面とPEGとの相互作用が強いほど融点が上昇することが分かった。以上より、細孔サイズおよび細孔の表面環境を変えることで、細孔中のPEGの相転移挙動を自在にコントロールすることができた。高密度記憶素子の構築に向け、強誘電性高分子のナノ構造体が形成され、その物性評価が盛んに行われている。しかし、基板上の高分子ナノ構造体やナノ細孔中の高分子を用いたこれまでの研究では、数nm以下の領域での物性は未だ明らかになっていない。そこで、強誘電性を示すフッ化ビニリデンオリゴマー(o-VDF)を多孔性金属錯体の細孔中に導入することで、細孔中における誘電挙動について検討を行った。o-VDFをアセトンに溶解させ、そこに細孔径が1×1nm2である多孔性金属錯体[Tb(benzene tribenzoate)]n.(1)を浸漬した後、窒素雰囲気下で140°Cに加熱することで、融解したo-VDFを細孔内へと導入した。粉末X線回折、窒素吸着測定などにより、多孔性骨格を保持したまま細孔内にo-VDFを導入できたことを確認した。得られた複合体の誘電分散測定を行ったところ、-120°Cおよび0°C付近に誘電緩和を観測した。バルクのo-VDFや錯体1ではこのような緩和挙動は観測されず的細孔中に閉じ込められたo-VDF由来の誘電緩和であると考えられる。複合体において観測された二つの緩和は、共にアレニウス型の周波数依存性を示し、それぞれo-VDFの局所的な運動(-120°C)、再配向に伴うセグメント運動(0°C)に由来することが示唆された。1の細孔中におけるo-

VDFの強誘電性についても予備的な検討を行ったところ、誘電緩和の観測された0°C付近においてヒステリシス幅の増大が見られた。すなわち、細孔サイズが1nmの細孔中においても、o-VDFが強誘電性を示しうることが示唆された。今後は細孔のサイズ、環境の異なる種々の多孔性金属錯体にo-VDFを導入し、その誘電挙動について検討を行う予定である。有機分子のコンフォメーションやパッキングを外部刺激で変化させることで発光特性を動的に変化させる方法が注目を集めている。しかし、その報告の多くは熱や機械的圧力といった外部刺激に限られており、溶媒の圧力をセンシングして発光を変化させたという例は無い。溶媒の蒸気の圧力を発光により検出できれば、揮発性有機物の検出センサーとしての応用が期待できる。本研究では、発光性分子であるdistyrylbenzene (DSB)を柔軟な多孔性金属錯体の細孔中に導入し、溶媒分子の吸着や熱といった外部刺激を与ることで発光をスイッチングすることを試みた。粉末状のホスト錯体[Zn2(terephthalate)2(triethylenediamine)]n(1)にDSBを導入した。ホスト骨格が元の構造(1)から変形した構造(1')に変化した複合体(1'⊃DSB)であることを確認した。1'⊃DSBにアセトニトリルを吸着させると、ホスト骨格が元の構造(1)へと変化した複合体(1⊃[DSB+CH3CN])が得られた。さらに、その複合体(1⊃[DSB+CH3CN])から真空引きによりアセトニトリルを除去してもホスト骨格の構造が保たれた複合体(1⊃DSB)であることがわかった。蛍光量子収率測定を行った所、1'⊃DSBでは0.02である一方、1⊃[DSB+CH3CN]や1⊃DSBでは0.61、0.54となり、発光強度に大きな差異が見られた。また、1⊃DSBを150°Cで加熱すると、1'⊃DSBの状態に戻り、熱や吸着といった外部刺激によってホスト骨格と共に発光挙動を変化させることができた。得られた複合体において発光挙動が異なる原因を検討するために、IR測定を行ったところ、1'の骨格中ではDSBはねじれていることが示唆された。すなわち、分子のコンフォメーション変化が発光挙動の変化に大きく寄与していることがわかった。アセトニトリル吸着過程においてホスト骨格の変化とゲストのコンフォメーション変化が同期して起こり、ゲストのもつ発光機能が変化するという興味深い結果であり、分圧と発光強度の関係から蒸気圧センサーとしての応用が期待できる。
分子分光学的手法による惑星系始源物質の蒸発素過程に関する研究

本研究においては、ケイ酸塩鉱物の蒸発・凝縮過程を実験室で再現するために、摂氏5000度以上の温度が実現可能なマイクロ波熔融装置に、耐熱石英ガラスによる真空高温光学セルを製作し組み合わせた実験装置を製作した。この装置を用いて、石英ガラス及びPeri clase(MgO)粉末を蒸発し、得られた凝縮物のキャラクタリゼーションを電子顕微鏡観察、特性X線元素マッピング、フーリエ変換赤外分光などの手法によりおこなった。この凝縮物の組成はMg:Si原子数比で1:5であり、赤外拡散反射スペクトルからはアモルファスSiO2およびForsteriteの混合物で、特にForsterite微粒子の粒径は0.1μm程度と非常に小さいことが明らかになった。実際に、ガスからの液相を経ることなく鉱物の微結晶を得た例は報告されておらず、近年の赤外線天文衛星のスペクトル観測結果の解釈において重要である。また、実際の星間塵微粒子の生成場であるO-rich AGB星の環境をシミュレートするため、蒸発下のArバッファーガスに微量の酸素を混合した条件下でのMgO+SiO2系の蒸発実験を行った。その結果、組成はエンスタタイトに近く、表面はアモルファスな、コンドリュールに類似した球状の微粒子を得た。この微粒子計138個の粒径分布は非平衡凝縮過程を強く示唆するガウス分布であった。実験系において珪酸塩の非平衡凝縮を実現した例は報告がなく、星間ダストの生成のメカニズムの詳細な検討において重要な結果が得られた。本研究においては、太陽系の始源物質である炭素を含む分子に対する赤外領域での高分解能分光をおこなうために、パルスノズル法とFT-IRを組み合わせた装置の設計と製作を行った。ノズルからの超音速ジェット中に太陽系の始源物質の候補となりうる炭素クラスターやラジカルを効率よく生成するために、本科学研究費によりパルスNdYAGレーザー、および2逓倍波発生装置を購入した。また、分光装置である現有のフーリエ変換型赤外分光器において、パルスノズルおよびパルスレーザーとの同期をとるためのステップスキャン動作を実現するソフトウエアを購入した。またパルスノズルの開閉の制御及びFT-IRとの精密な同期を維持するために、タイミング・コントローラーとパルス・ジェネレータを設計・自作した。この装置を用いて、FT-IR分光器を用いた気相のCOの時間分解・高分解能振動回転スペクトルの測定に成功した。また並行して、ケイ酸塩鉱物の蒸発素過程を実験室で再現するために、摂氏5000度以上の温度が実現可能なマイクロ波熔融装置に、耐熱石英ガラスによる真空高温光学セルを製作し組み合わせた実験装置を製作し、FT-IRに組み合わせた実験を行い、フォルステライトの蒸発に成功した。今後、これらの実験装置を用いた不安定分子種の生成実験を行い、原始惑星系星雲における星間塵などの固体物質の非平衡蒸発過程を実験室で再現し、赤外・可視分光法を応用することにより高温の鉱物表面の物理化学過程の研究を行うことが可能になった。
セル生産の実態調査、作業実験および分業論とセル生産の整合的理論化

本年度は,オリンパス(株)伊那工場,味の素冷凍食品(株)中部工場,中部セキスイ工業(株)本社工場,花王(株)和歌山工場,(株)安西製作所,台湾松下電器股分有限公司の工場視察を行った。各工場は,それぞれ異なる作業を主体としており,異なる生産形態をとっている。また,雇用政策においても,熟練作業者を主体とすることを方針にしている工場と,パートタイマーのような非熟練作業者を主体とすることを方針としている工場とがあった。課業内容が雇用政策に及ぼす影響,雇用政策の違いが生産形態に及ぼす影響などについても研究上のヒントを得ることができた。このような視点から,工場セル化することが合理的と思われる工程と,ライン化することが合理的と思われる工程を識別しながら視察した。各工場の取り組みに関する説明を受けながら,原価改善の業績評価法に関する着想を得た。これを今後の研究課題としたいと考えている。さらに,(社)日本能率協会中部地域本部主催の生産技術研究部会・中間報告会に出席し,前ソニーEMCS美濃加茂テック・プレジデント加藤典孝氏の講演を聴講した。これによって,同社がセル生産を導入するに至ったプロセスの一端を知ることができた。加藤氏からは講演会後も話を伺い,様々な研究上のヒントを得ることができた。セル生産を導入している工場を調査することにより、セル生産の導入プロセスにおける改善活動の役割について明らかになった。改善活動の視点から分業された生産ラインを観察した場合、分業に起因するムダが発見される。つまり、分業はこれまで利点ばかりが強調されてきたが、不利点もある。改善活動によってこの不利点を排除することで、結果的にセル生産と呼ばれる生産形態が生じる。また、ベルトコンベアの廃止がセル生産の特徴としてあげられるが、これは生産性の向上には直接関係しないことも明らかになった。改善活動の結果としてベルトコンベアは不要になるために廃止されるのであり、廃止したから生産性が増大するのではない。さらに、セル生産の生産性増大の根拠を動機に求める説もあるが、セル生産において必要とされる動機は、外発的動機ではなく内発的動機であることがわかった。今後、議論を進めるためには、動機の種類を区別して議論する必要がある。本年度は、(株)花王川崎工場、コマツ大阪工場、長浜キヤノン(株)、ダイキン草津工場、三菱電機名古屋製作所を訪問し、各社の生産性向上の取り組みについて調査した。その他に、日本能率協会の主催する研究発表会、セル生産導入のコンサルタントであるPEC産業教育センターの山田日登志氏の講演会などにも出席した。昨年度、生産シミュレーションソフトウェアARENAを購入し、操作方法を習得しようと努めたが、未だ完全に利用できる段階にまで至っていない。その理由として、セル生産で主に分析の対象にしなくてはならない運搬や取り置きという動作は、通常の物流では無視されることもあるほど微少な活動であり、これをシミュレーションモデルに組み込むには非常に複雑な作業が求められるからである。
腎不全に合併する高ホモシステイン血症が心血管疾患発症・進展に関わる機序の解明

腎不全は、それ自身が心血管疾患の危険因子であるが、心血管疾患の危険因子である高ホモシステイン血症を合併する。腎不全に伴う高ホモシステイン血症の成因機構を明らかにすること、腎不全に合併する心血管疾患に高ホモシステイン血症がどのように関与するかを明らかにすることを目的に、5/6腎摘除ラットを腎不全モデルとして用い、代謝フラックス解析及び薬理学的解析を行った。その結果、腎不全ではホモシステインからメチオニンへの再メチル化能が低下していることが高ホモシステイン血症の成因の一つであることが明らかになった。また、腎不全に高ホモシステイン血症が合併すると、血管平滑筋に及ぶ障害が惹起されることが示唆された。メチオニンの代謝物であるホモシステインの血漿濃度が高い状態は、心血管疾患の危険因子の一つである。末期腎不全患者は、心血管疾患合併頻度の高い病態であり、その原因の一つとしてホモシステインの蓄積が挙げられている。本研究では、高ホモシステイン血症をホモシステインの生成と代謝の平衡が崩れている状態と捉え、末期腎不全ではどのような機序で高ホモシステイン血症を呈するか、腎機能低下に伴う高ホモシステイン血症がどのように血管系に影響するかを明らかにしようとするものである。平成26年度では、慢性腎不全のモデルとした5/6腎摘除ラットを対象に、ホモシステインの生成(脱メチル化)能、代謝(再メチル化及びイオウ転移)能を定量評価した。5/6腎摘除ラット及び偽手術ラットに、安定同位体標識メチオニン([2H7]メチオニン)及びホモシステイン([2H4]ホモシステイン)をそれぞれ個別に持続静脈内投与し、経時採血して得た血漿中の[2H7]メチオニン、[2H4]メチオニン、内因性メチオニン、[2H4]ホモシステイン及び内因性ホモシステイン濃度を測定した。それらをもとに、それぞれの標識体のenrichmentを算出し、enrichmentが一定になった(定常状態に達した)ときの値を得た。[2H7]メチオニン投与の結果から再メチル化クリアランス(CL(RM))を算出したところ、5/6腎摘除ラットのCL(RM)は偽手術ラットに比べて低値を示し、手術による腎実質の減少により再メチル化経路が障害されることが明らかになった。一方、[2H4]ホモシステイン投与の結果から得られる脱メチル化クリアランス(CL(DM))は、5/6腎摘除ラットと偽手術ラットに差異が認められなかった。当初、5/6腎摘除ラットではCL(DM)は低下するものと考えていただけに、予想外の結果であった。5/6腎摘除ラット作出後の飼育期間を長くすることによって、より腎機能が低下した状態における血漿中Hcy濃度上昇の機構を明らかにすることを目的とし、偽手術ラット、術後2週および5週飼育した5/6腎摘除ラットに対して[2H7]Metおよび[2H4]Hcyの持続静脈内投与法による代謝フラックス解析を施行した。その結果、5/6腎摘除後の飼育期間を長くすることによって、血漿クレアチニンが上昇した一方で、術後5週飼育した5/6腎摘除ラットの血漿ホモシステイン濃度は術後2週の5/6腎摘除ラットに比べてむしろ低値を示した。また、術後5週飼育した5/6腎摘除ラットでは、術後2週飼育したラットに比べてホモシステインの再メチル化代謝回転速度が低下したのに対して、メチオニンの脱メチル化代謝回転速度およびホモシステインのイオウ転移代謝回転速度は大きくなった。これらの結果より、5/6腎摘除後の飼育期間が長くなることによって、メチオニン-ホモシステイン-シスタチオニン代謝系に関与する酵素の発現に変化がおきていると考えた。そこで、偽手術ラットおよび術後5週飼育した5/6腎摘除ラットの肝臓および腎臓を用い、real-time PCR法を用い、メチオニン-ホモシステイン-シスタチオニン代謝系に関与する酵素遺伝子の発現解析を行った。その結果、メチオニンの脱メチル化反応に関わる酵素系の肝臓における発現が、いずれも偽手術ラットに比べて5/6腎摘除ラットで亢進していた。また、イオウ転移反応に関わるcystathionine γ-lyaseの肝臓での発現も5/6腎摘除ラットで亢進していた。これらの結果から、5/6腎摘除によって減少したホモシステイン代謝酵素の減少を肝臓が代償し、メチオニン-ホモシステイン-シスタチオニン代謝系を維持しているものと考えられた。血液透析患者では中等度の高ホモシステイン血症を呈していることが多い。そこで、5/6腎摘除後の飼育期間を長くすることで、中等度の高ホモシステイン血症の病態モデルを作出しようと考えた。しかし、術後5週飼育しても、目的とした病態モデルが作出できなかった。代謝フラックス解析の結果をふまえ、術後の飼育期間が長くなることで、腎実質が減少した分を肝臓が補っているものと仮説をたて、肝臓および腎臓におけるメチオニンーホモシステインーシスタチオニン代謝酵素遺伝子の発現解析実験を行った。当初設計したプライマーでは解析できないことがあり、再設計等を行ったため、実験の遂行がやや遅れぎみではあったが、仮説を裏付ける結果を得つつある。5/6腎摘除(摘除量:約70%)後2週あるいは5週飼育したラットを慢性腎不全モデルとして用い、[2H7]Met及び[2H4]Hcyの持続静脈内投与による代謝フラックス解析を施行した。

その結果、HcyのMetへの再メチル化代謝回転速度は5/6腎摘除によって偽手術ラットに比べて低下したものの術後飼育期間による差違はないこと、Metの脱メチル化代謝回転速度及びHcyのイオウ転移代謝回転速度は偽手術ラットと差違がないことが明らかになった。術後5週飼育した5/6腎摘除ラットの肝臓及び腎臓を用い、real-time PCR法により、Met-Hcy代謝系に関与する酵素遺伝子の発現解析を行った。その結果、脱メチル化反応に関わる酵素系の肝臓における発現は、偽手術ラットに比べて5/6腎摘除ラットで亢進していた。また、イオウ転移反応に関わるcystathionine γ-lyaseの肝臓での発現も5/6腎摘除ラットで亢進していた。これらの結果から、5/6腎摘除によって減少したHcy代謝酵素の減少を肝臓が代償し、Met-Hcy代謝系を維持しているものと考えられた。H28年度では、術後5週飼育した5/6腎摘除ラットの胸部大動脈を用い、マグヌス法により血管収縮弛緩性を評価した。その結果、5/6腎摘除によって内皮依存的な血管弛緩性が減弱すること、高Met食で中等度の高Hcy血症を誘導すると血管平滑筋に及ぶ血管障害が惹起されることを示唆する知見が得られた。本研究で用いた腎部分摘除量だけでは、中等度の高Hcy血症を呈した腎不全モデルを作出することができなかったため、高Hcy血症の成因機構解明には至らなかったが、腎機能高度低下と高Hcy血症が合併すると、相乗的に血管弛緩性を障害することを示すことができた。今後、腎摘除量を5%増やしたり、高Met食や高Hcy食で中等度の高Hcy血症としつつMet-Hcy代謝系酵素を誘導したのちに、代謝フラックス解析を行う予定である。腎不全は、それ自身が心血管疾患の危険因子であるが、心血管疾患の危険因子である高ホモシステイン血症を合併する。腎不全に伴う高ホモシステイン血症の成因機構を明らかにすること、腎不全に合併する心血管疾患に高ホモシステイン血症がどのように関与するかを明らかにすることを目的に、5/6腎摘除ラットを腎不全モデルとして用い、代謝フラックス解析及び薬理学的解析を行った。その結果、腎不全ではホモシステインからメチオニンへの再メチル化能が低下していることが高ホモシステイン血症の成因の一つであることが明らかになった。また、腎不全に高ホモシステイン血症が合併すると、血管平滑筋に及ぶ障害が惹起されることが示唆された。5/6腎摘除ラット作出後、血漿クレアチニン及びホモシステインが偽手術ラットに比べて有意に高値となるような飼育期間が予想以上に長期間必要であったことにより、投与実験が遅れている。また、術後の飼育期間中に、腎実質の減少により起きたメチオニンーホモシステイン代謝系の代謝フラックスを補うように、肝臓などの他臓器に存在するメチオニンーホモシステイン関連酵素の発現が誘導された可能性を評価することを目的とした、RT-PCRを用いた発現解析を行う予定であったが、プライマーの構築ができたところにとどまっている。腎機能低下に伴う高ホモシステイン血症が血管系に及ぼす影響を検討する。5/6腎摘除ラットより摘出した動脈(胸部大動脈を用いる予定)を用い、血管収縮弛緩反応を測定する。中等度の高ホモシステイン血症とするため、高メチオニン食での飼育を行う。また、これまでの結果から、5/6腎摘除ラットでは、S-アデノシルメチオニンを基質とするメチル基転移反応が亢進していることが予想された。
優生外来種移植による嫌気性ミクロフローラの改良と動態解析方法の開発

下水処理プロセスから大量発生する余剰活性汚泥や都市型生ゴミなどを嫌気性微生物により分解してメタンガスとして回収するプロセスが利用されているが,この嫌気的ミグロフローラによる反応速度は非常に低く,中でもメタン生成アーケアの反応がプロセスの律速過程となっている。本研究では,海底熱床付近などの特殊環境から単離された増殖とメタン生成特性に優れたメタン生成アーケアを移植して高効率な嫌気的メタン生成プロセスを構築すること,さらに遺伝子解析を応用した定量方法を開発して移植時の優生種および既存種の動的挙動を解析することを目的としている。アーケアに限らず,既存種に対する異種外来微生物の移植に関する研究はほとんどない。そこで,淡水型メタン生成アーケアMethanothermus fervidusと海水型メタン生成アーケアMethanothermocuccus okinawensisをアーケアのモデルとし,それぞれの嫌気的環境下における増殖特性を調べ,培養操作方法について検討した。さらに,2種のアーケア共存下において一方のアーケアのみを分析できるDNAプライマーを新たに設計し,そのPCR分析条件を明らかにした。そして,このプライマーを用いたリアルタイムPCRによる分析を行い,2種混合培養において一方のアーケアが優先的に増殖する条件(温度,塩濃度)を明らかにした。次に,M.fervidusの培養液に少量のM.okinawensisを移植して種々制御条件を変化させて培養を行った。その結果,温度および塩濃度を制御することにより少量のM.okinawensisが多量のM.fervidusを凌駕して優先的に増殖できることを明らかにした。下水処理プロセスから大量発生する余剰活性汚泥や都市型生ゴミなどを嫌気性微生物により分解してメタンガスとして回収するプロセスが利用されているが,この嫌気的ミクロフローラによる反応速度は非常に低く,中でもメタン生成アーケアの反応がプロセスの律速過程となっている。本年度,まず始めにメタン生成アーケアの優生種として淡水型のMethanothermusfervidusと海水型のMethanothermocuccus okinawensisを理研バイオリソースセンターより入手し,純粋培養i系によってそれぞれの増殖特性を調べた。その結果,これまでの報告とは異なり,海水型であるM.okinawensisの増殖に最適な塩濃度は培養温度の低下によって低濃度側にシフトすることを見出した。これは,M.okinawensisを嫌気性汚泥消化タンクに移植するには極めて好都合である。さらに,混合培養系でメタン生成アーケアの分布と密度を測定するためにリアルタイムPCRとターミナルRFLPの利用を想定し,そのための幾つかのDNAプライマーを既往の文献から設計してそれらの種特異性について検討した。下水処理プロセスかち大量発生する余剰活性汚泥や都市型生ゴミなどを嫌気性微生物により分解してメタンガスとして回収するプロセスが利用されているが,この嫌気的ミクロフローラによる反応速度は非常に低く,中でもメタン生成アーケアの反応がプロセスの律速過程となっている。そこで,淡水型メタン生成アーケアMethanothermus fervidusと海水型メタン生成アーケアMethanothermocuccusokinawensisの2種混合培養を行ってそれぞれの増殖挙動を分析するために,一方のアーケアのみを分析できるDNAプライマーを新たに設計し,そのPCR分析条件を明らかにした。そして,このプライマーを用いたリアルタイムPCRによる分析を行い,2種混合培養において一方のアーケアが優先的に増殖する条件(温度,塩濃度〉を明らかにした。

次に,M.fervidusの培養液に少量のM.okinawensisを移植して種々制御条件を変化させて培養を行った。その結果,温度および塩濃度を制御することにより少量のM.okinawensisが多量のM.fervidusを凌駕して優先的に増殖できることを明らかにした。
口腔内環境と毛髪における重金属の蓄積濃度との関連性について

既製乳歯冠の成分は鉄6574%、クロム1719%、ニッケル913%である。既製乳歯冠は、永久歯の鋳造冠に比べ口腔内で咬磨耗や化学的刺激による成分の溶出がしやすいと考えられている。口腔内に既製乳歯冠を継続して有している小児は、既製乳歯冠の除去あるいは脱落後半年以上経った小児より毛髪中の鉄の蓄積濃度が統計学的に有意に高かった。歯科用金属材料に含まれる車金属か体内蓄積を生じているのかは不明である。我々は,毛髪ミネラル検査により毛髪中微量元素濃度を測定し体内に蓄積した重金属の種類と蓄積度を推定し,歯科材料との関連性と子どもたちの成長・発達状態との関連性について研究を行っている。乳臼歯の歯科治療で歯冠崩壊の著しい歯や歯髄処置歯は,修復材料として,歯科用金属を用いることがある。特に小児歯科臨床において診療時間,通院回数に配慮して既製乳歯冠を用いることが一般的であり,永久歯の鋳造冠に比べ小児の咬合め成長発育を阻害しないために既製乳歯冠は,鉄・クロム・ニッケルなどの重金属を含み,イオン化が高く口腔内への溶出も懸念されるが小児の成長発育に配慮すると,用いざる得ない。申請者らの今までの発表では,既製乳歯冠装着既往の有無により,毛髪中微量元素濃度(鉄・クロム・ニッケル)の有意差を示すことができなかった。本研究では,サンプル数を増やし,既製乳歯冠既往なし,既製乳歯冠装着中,過去に既製乳歯冠既往ありめ3群で比較検討するために,サンプルの蓄積を行っている。特に,過去に既製乳歯冠既往者は,脱落してから半年以上を対象とした。毛髪中微量元素濃度は.採取部分が頭髪の根元から35cmであり,約4か月で5cm伸びる(1日0.4mm伸びる)。そして,鉄・クロム・ニッケルの半減期は不明であるが水銀の体内からの半減期は70日である。以上のことより,過去に既製乳歯冠既往者は,既製冠脱落半年以上で採取する頭髪の半減期と判断した。本研究では,現在までに,健常児で既製乳歯冠既往なし16人,既製乳歯冠装着中16人,過去に既製乳歯冠既往あり8人,広汎性発達障害児で既製乳歯冠既往なし25人,既製乳歯冠装着中11人,過去に既製乳歯冠既往あり11人で採取してきた。現在,装着時期の違いによる体内に蓄積した重金属に有意差の有無について検討するために,サンプルを蓄積中である。歯科治療で用いる金属材料に含まれる重金属は,口腔内で溶出するか,体内蓄積をどの程度生じているのかは不明である。そこで,申請者は,被験者へ負担の少ない毛髪ミネラル検査により毛髪中微量元素濃度を測定し体内に蓄積した重金属の種類と蓄積濃度を推定し,歯科材料との関連性と子どもたちの成長・発達状態との関連性について研究を行っている。小児歯科臨床において診療時間,通院回数に配慮して既製乳歯冠を用いることが一般的であり,永久歯の鋳造冠に比べ小児の咬合の成長発育を阻害しないために既製乳歯冠は,鉄・クロム・ニッケルなどの重金属を含み,イオン化が高く口腔内への溶出も懸念されるが小児の咬合の成長発育に配慮すると,用いざる得ない。本年度は,既製乳歯冠既往なし群,既製乳歯冠装着中群,過去に既製乳歯冠既往ある群(現在口腔内に装着していない)の3群で比較検討するために,サンプルの採取を行った。特に,過去に既製乳歯冠既往ある群は,脱落してから半年以上を対象とした。毛髪中微量元素濃度の採取部分が頭髪の根元から35cmであり,約4か月で5cm伸びる(1日0.4mm伸びる)ことと,鉄・クロム・ニッケルの半減期は不明であるが水銀の体内からの半減期は70日であることより,過去に既製乳歯冠既往ある群では,既製冠脱落半年以上で採取する頭髪の半減期と判断した。現在までに,健常児で既製乳歯冠既往がない群22人,既製乳歯冠装着中の群16人,過去に既製乳歯冠既往ある群9人,広汎性発達障害児でそれぞれ26人,13人,13人の採取を行った。そして,得られた結果より統計解析を行った。
骨髄由来内皮前駆細胞におけるプロスタノイドの包括的役割解明

骨髄由来内皮前駆細胞(EPC)における血管ホメオスターシスに関与するプロスタノイドPGであるPGI2およびTXA2の役割を解明した。EPCには、PGの特異的受容体を発現しており、PGそれぞれの特異的受容体欠損マウスおよび、同マウス由来EPCを用いて、血管リモデリングモデルおよび下肢虚血モデルを用いて、これらのPGによって、EPC機能が厳密に制御されていることを明らかにした。1.EPCにおけるPGI2、TXA2シグナルの役割PGI2およびTXA2の特異受容体IP、TP欠損マウス骨髄の単核球成分から、MACS法によりEPCを分離精製し、EPCのファイブロネクチン(FN)への接着能やFN上での増殖能のおよぼす、それぞれの特異的アゴニストの効果を評価した。また、その際の各種遺伝子発現(血管新生因子など)への影響も評価した。EPCの接着能は、血管新生促進作用においても重要な機能であり、その変化は、EPCの血管新生作用にも影響を与えることが示唆され、以下の実験系を展開している。単離胸部大動脈をマトリゲル内で培養することにより血管新生を観察できるEx vivo血管新生アッセー系を確立し、このゲル内に分離精製したIPおよびTX欠損EPCを混合培養することにより、EPCの血管新生への作用を明らかにした。この結果から、EPCは血管新生を促進すると共に血管内皮に分化して新生血管に取り込まれることはまれで、新生血管周囲に周細胞化して血管成熟化に寄与することを明らかにした。IP欠損EPCでは、この作用が著明に低下していることを明らかにした。今後、TP欠損EPCでの検討と、その機序解明にむけた実験を展開していく。また、これらin vitroで明らかになったIPおよびTX欠損EPC機能変化について、in vivoでの血管新生への役割についてhind limb ischemiaモデルを用いて確認していく。これらin vitroで明らかになったIPおよびTX欠損EPC機能変化について、in vivoでの血管新生への役割についてhind limb ischemiaモデルを用いて確認している。現在、投稿準備中である。骨髄由来内皮前駆細胞(EPC)は、障害血管の修復や虚血組織の血管新生に寄与する働きがあり、心血管疾患病態に防御的に働く細胞として知られている。本研究では、プロスタグランジンのEPCへの影響を総合的にみることを目的として、心血管系生理に密接に関与するPGIとその拮抗作用をもつTXとの相互作用をみている。我々は、PGそれぞれの特異的受容体欠損マウスを用いて、EPC機能に与えるPGの役割を、EPCの細胞および生体での病態動物モデルで明らかにした。PGIは、EPCの機能、とりわけ生体における障害血管リモデリング抑制作用や虚血組織改善作用を亢進することを明らかにした。TX系の役割についても、併せて行い、TPがEPC機能に対して、PGIと拮抗する働きがあることを見出しており、本申請期間終了後もひきつづき解析をしていく予定である。本研究は、循環器系国際学会や全国学会で発表し、一部は論文として発表している。本研究で重要なin vivo実験、特にHind limb ischemia(HLI)モデルは、すでに世界中で確立した方法である。Knockoutマウスを利用する都合上C57B16マウスを用いているが、HLIにおいて重篤な虚血を誘発できないという問題があり、当初期待したペースで実験がすすまなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記、11の問題点は、何点かの改良点を加えて、持続的な末梢虚血モデルとして確立することができた。現在、本法をもちいて、EPCのin vivo機能解析実験が進められている。
光スイッチ素子へ向けた一次元電子系の超高速非線形光学応答の研究

カーボンナノチューブ(以下NT)は大きな光学非線形性や、チューブ間のエネルギー・電荷移動による超高速緩和といった特徴から光スイッチ材料への応用が期待されている。また、近年NTのチューブ内にフラーレン、有機分子や色素分子を導入しNTの電子状態を変調させる試みが盛んに行われている。本研究では、二層NTにおける励起子・キャリアダイナミクスを超高速分光で明らかにすることを試みた。二層NTにおけるチューブ間相互作用を明らかにすることで、単層NTで観測される、チューブ間のエネルギー・電荷移動過程に対する基礎的な理解につながる。単層NTでは見られない二層NT特有のバンド構造に由来する光励起状態の緩和過程を明らかにすることにより、二層NTのフォトニクス材料としての応用につながると考えられる。外側、内側チューブの平均直径が約1.7nm、約1.0nmの二層NTを用い、時間分解能約200fsのポンププローブ分光測定を行った。励起光エネルギーを選択することで、特定のチューブ径のNTを選択的に励起することができる。内側チューブの励起子吸収帯を励起し、それに伴う外側チューブの励起子吸収帯の吸収飽和ダイナミクスを観測した。まず、内側チューブを励起することで、外側チューブの励起子吸収帯に吸収飽和が観測されることが明らかとなり、チューブ間での励起子の移動が確認された。また、異なる直径の内側チューブを励起すると、外側チューブの吸収飽和のピークエネルギーが変化することも明らかとなった。これらの結果は、内側チューブの直径と外側チューブの直径に相関があることを示している。ダイナミクスの解析から、チューブ間のエネルギー・電荷移動は、0.1ps以内ときわめて高速に起こることも明らかとなった。これらの結果は、二層NT内でチューブ間の相互作用が働いていることを明らかにしたものであり、単層NTとは異なる光学特性につながるものと期待される。次世代の全光デバイスに向けた材料の一つに、三次の非線形光学材料がある。三次の非線形光学効果を利用すると全光型の高速信号処理デバイスが実現できる可能性がある。このような非線形光学材料として、近年半導体単層カーボンナノチューブ(SWNT)が注目を集めている。従来、半導体SWNTの非線形光学応答に関する研究は、励起子や光キャリアが実励起されることによる吸収飽和や、それらの緩和ダイナミクスに注目したものであった。最近になって半導体SWNTが光シュタルク効果を示すことが報告された。光シュタルク効果は、二準位系と輻射場の相互作用によって準位がシフトする現象であり、光パルス幅程度の時間での吸収変調が可能となるため超高速光スイッチの原理として注目されている。このことは、コヒーレントな非線形光学応答を理解することが、SWNTを非線形光学材料として用いるためには重要であることを示している。本研究では、これまで主にバンドル状SWNTが用いられてきたのに対して、孤立分散に優れたSWNT薄膜を用いて、励起子吸収に対して共鳴、非共鳴のエネルギーで励起した際の非線形光学応答を詳細に測定し、理想的な一次元電子系であるSWNTにおける光シュタルク効果の性質を明らかにすることを目的とした。実験は、130フェムト秒レーザーを用いたポンププローブ吸収分光測定を行った。SWNTのコヒーレント非線形光学応答では、光シュタルク効果によるブルーシフトに加えてブロードニングによる吸収変化が生じ、さらに、このブロードニングは励起子吸収に近共鳴の励起条件でのみで現れることが明らかとなった。この結果は、SWNTの一次元構造のために、励起子間相互作用による非線形光学応答が観測されたものと考えられる。
GLUT4膜移行を制御するマシーナリー分子群の網羅的同定

インスリン反応性GLUT4膜移行機構に関わる制御蛋白質の同定およびそれらの機能について、生化学的手法および生細胞のイメージング技術を組み合わせることにより解析した。GLUT4小胞のインスリン反応性獲得には、GLUT4に直接会合する3種類の蛋白(Sortilin-p75NTR-proNGF)による複合体形成とそれに伴うGLUT4の蛋白寿命制御が重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、このGLUT4を含む蛋白複合体形成は、細胞内シグナル伝達系を活性化して積極的に筋分化にも関与することを明らかにした。GLUT4小胞サイドからの一連の生化学的・細胞生物学的検討を推進することにより、「インスリン受容体シグナル」と「GLUT4小胞輸送システム」を連結する分子基盤を明らかにすることを最終目標としている。インスリンに反応するGLUT4小胞に会合するマシーナリー蛋白群を選択的に回収するため、以下の検討を行った。【計画】本年度は、遺伝子改変myc-GLUT4-enhanced cyan fluorescent protein (ECFP)を恒常発現する3T3L1脂肪細胞と磁性ナノビーズ標識myc抗体を用いることにより、インスリン反応性を呈するGLUT4含有小胞のみを選択的に回収する方法を確立することを試みた。また、生細胞内でGLUT4分子挙動を観察するための顕微鏡を構築し、GLUT4小胞に共局在することが既に知られている蛋白群を利用し、これらの小胞形成における関与に解析することを目的とした。【実績1】サイズの異なる磁性ビーズにより、インスリン反応性を示すGLUT4小胞およびGLUT4分子のみを、磁力を用いて選択的に回収することに成功している。現在、スケールアップした条件で多量の蛋白回収方法を検討中である。他方、GLUT4小胞関連蛋白として知られるsortilinとGLUT4蛋白の寿命を延ばす働きを有するUbc9の直接的な連関について新知見を得ており、GLUT4小胞形成に関わる蛋白複合体の一部として機能している可能性について現在さらに検討中である。【実績2】生細胞内におけるGLUT4分子の挙動解析のリアルタイムイメージング顕微鏡システムを構築した。ECFPの蛍光によるGLUT4分子挙動に加え、EYFPを融合させたsortilinを用いて、GLUT4小胞をとりまく状況についてリアルタイムイメージングにて解析を行った。そして、GLUT4小胞形成過程における両蛋白の時空間的な連関について重要な新知見を得た。GLUT4小胞の形成・運搬に関わる因子群を生化学的に同定するとともに、生細胞イメージング技術によりそれらの機能を解析する。そして、「インスリン受容体シグナル」から「GLUT4小胞の制御」へと連結させる分子基盤を明らかにすることを最終目標としている。【計画】これまでに確立したGLUT4選択的精製手法を用いることにより、GLUT4と直接的な会合能力のあるSortilinをもう一つのツールとして利用して、GLUT4/Sortilin複合体に含まれる他の構成蛋白群の同定と解析を試みた。また、昨年度までに独自に構築したconfocal顕微鏡を用いてGLUT4/sortilin小胞の制御についての解析をおこなうことを目的とした。【実績1】GLUT4とsortilinはデタージェント処理により小胞を可溶化した状態でも比較的強固な蛋白複合体を維持していることを生化学的に確認した。一方、生細胞のイメージング解析により、sortilinはlysosome-TGN(trans-Golgi-network)-細胞膜をゆっくりとリサイクルしているものの、GLUT4との会合はその巡回ルートの特定の時期(小胞)においてのみ一時的に複合体を形成することを見いだした。【実績2】また、sortilinとGLUT4複合体とともに、低親和性NGF受容体(p75NTR)が細胞膜とendosome上においてさらに会合することを見いだした。重要なことに、sortilin-p75NTRにはそのリガンドとなるproNGFやproBDNFが結合することによって、Rhoファミリー低分子量GTP蛋白の活性化を伴う細胞内シグナル系を活性化し細胞分化に直接関与することを明らかにした。【まとめ】インスリン反応性GLUT4貯蔵小胞の形成過程において、GLUT4と直接会合することによりその選別に関わっているsortilinが、他の機能受容体蛋白とも複合体を形成しながら細胞内シグナルを活性化できることをはじめて明らかにした。「GLUT4小胞」と「受容体シグナル」を連結する重要な機構の一つであると推察される。インスリン反応性を獲得しているGLUT4小胞の形成・運搬に関わる因子群を同定するとともに、生細胞イメージング技術によりそれらの機能を解析することを目的としている。インスリン反応性GLUT4膜移行システムは脂肪細胞および筋細胞の細胞分化とともに発達していくため、本年度は、分化した脂肪細胞に加え、分化型培養筋細胞におけるインスリン反応性GLUT4小胞の形成機構について、独自の特殊培養系で得られた高度発達型筋細胞を用いて、あわせて解析することを試みた。