hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高歪環状フェロセンの開環反応を利用した多核錯体の合成とその反応性

本研究では、有機遷移金属錯体の共存配位子として広く用いられるリン配位子に多核化の機能を持たせておけば、多様な有機遷移金属錯体を多核化することができると考えた。そこで、リン-炭素結合が開裂しやすいリン架橋[1]フェロセノファン配位子(1)を持つ有機金属錯体を合成し、これらの錯体のポリマー化法、および、リン-炭素結合への金属の挿入反応を利用した異核複核錯体の合成法を確立することを目的とする。1をTHF中で光照射するとポリマー化が起こりポリフェロセン誘導体が得られること見出した。さらに、生成物中には大環状骨格をもつdimerおよびtrimerがそれぞれ6%づつ含まれていることを見いだした。この低収率を改善することを目的として、まず環化反応の機構を明らかにすることに取り組んだ。その結果、この開環反応の機構は、鉄にη^5配位している2つのCp環のうちの1つがη^1へとring slippageを起こした錯体(2)を経て進行することを見出した。この結果より、1のオリゴマー化は、1)光反応によるring slippage型の2の生成、2)2のη^1-Cpに対してもう1分子の2の鉄中心が攻撃、3)フェロセンユニットの再生、4)2番目の鉄上からのη^1-Cpの脱離の4ステップが繰り返されることで進行すると結論した。一方、1を配位子としてもつW(CO)_5または、CpMn(CO)_2に0価白金錯体を反応させると1のCp-P結合に白金の酸化付加的挿入が起こり多核錯体が生成した。この際、白金上の配位子をバルキーなPPh_3にすると多核化の際に配位子が脱離し、白金上に空いた配位座をもつ錯体が生成することを見いだした。この配位座は、求電子性が強く、タングステン上に捕捉されたPPh_3のP-Ph結合が、この白金上の反応サイトで切断されることを見出した。そこで、リン-炭素結合が開裂しやすいリン架橋[1]フェロセノファン配位子を持つ有機金属錯体を合成し、これらの錯体のポリマー化法、および、リン-炭素結合への金属の挿入反応を利用した異核複核錯体の合成法を確立することを目的とする。本年度は、未だその合成例すら少ない大環状多座骨格をもつホスフィン配位子を効率的に合成することを目指した。その結果、リン架橋[1]フェロセノファンをTHF-中で光照射により重合させると大環状骨格をもつdimerおよびtrimerがそれぞれ6%づつ含まれていることを見いだした。この環化反応は配位性の溶媒中でのみ進行することから、より配位性の強いものを共存させれば反応中間体を細くすることが出来るのではないかとかんがえた。そこで、P(OMe)_3を共存させて光反応を行った結果、鉄にη5配位している2つのCp環のうちの1つがη1へとring slippageを起こすことを見出した。従って、当初予想していた架橋リン-炭素結合が開裂するのではなく、Cp環の1つが鉄から外れることで開環反応が進行することが強く示唆された。

本研究で得られた複数のフェロセンを骨格にもつ大環状リン配位子は、期待どおりキレートとして金属に配位出来ることを確認した。リン架橋[1]フェロセノファン配位子[Fe{Cp_2P(S)Ph}](1)は、フェロセンの上下のCp環がリン原子で結ばれているため、分子内に大きな歪みを有している。このため、リン架橋[1]フェロセノファン骨格は、容易に開環する。リン架橋[1]フェロセノファン配位子の光開環反応機構の解明昨年度行った研究により、1は、光照射より開環反応を起こしオリゴマー化することを明らかにした。さらに、この開環反応の機構は、鉄にη^5配位している2つのCp環のうちの1つがη^1へとring slippageを起こし進行することを見出した。本年度は、このring slippageした[Fe{(η^5-Cp)(η^1-Cp)P(S)Ph}](2)がフェロセン骨格を再生するステップの解明に取り組んだ。その結果、η^1へとring slippageを起こしたCp環に金属フラグメントが配位すると、η^5配位が形成されるともに、最初の鉄との結合が切断されることを明らかにした。また、このη^1-Cpが鉄から外れる反応は、2にPMe_3のような配位力の強い配位子を複数結合させることでも、達成された。これらの結果より、1のオリゴマー化は、1)光反応によるring slippage型の2の生成、2)2のη^1-Cpに対してもう1分子の2の鉄中心が攻撃、3)フェロセンユニットの再生、4)2番目の鉄上からのη^1-Cpの脱離の4ステップが繰り返されることで進行すると結論した。1を配位子としてもつW(CO)_5または、CpMn(CO)_2に0価白金錯体を反応させると1のCp-P結合に白金の酸化付加的挿入が起こり多核錯体が生成した。この際、白金上の配位子をバルキーなPPh_3にすると多核化の際に配位子が脱離し、白金上に空いた配位座をもつ錯体が生成することを見いだした。この配位座は、求電子性が強く、タングステン上に捕捉されたPPh_3のP-Ph結合が、この白金上の反応サイトで切断されることを見出した。
腎不全進行抑制を目的とした尿毒症物質の代償性排泄経路の解明とその誘導

タンパク結合性が高い尿毒症物質であるインドキシル硫酸(IS)の蓄積は慢性腎臓病(CKD)の進行を早め、循環器疾患の危険因子となる。このためISの除去法の開発が望まれている。ISは腎機能正常時には腎排泄型であるが、CKD時には非腎性の排泄が推察された。そこで消化管分泌がCKDにおいてISの代償性排泄経路として関与する可能性について検討し、ISの消化管排泄経路の寄与は僅かであるが腎不全時に誘導され、Na+を駆動力とする2次性能動輸送が関与することを明らかにした。消化管分泌経路の寄与は小さく、この経路の誘導がIS除去法として有用かどうかは今後の課題である。本年度は、III群(高蛋白結合率)に属する尿毒症物質の排泄に、MRP2, BCRP, P-glycoprotein(P-gp)が関与する可能性について検討した。尿毒症物質からフェニル酢酸(PA)、インドキシル硫酸(IS)、インドール-3-酢酸(I3A)、馬尿酸(HA)、キヌレニン酸(KA)を選択し、MRP2, BCRP、P-gpを高発現するSf-9由来細胞膜ベシクルへの特異的蛍光プローブの取込阻害実験および尿毒症物質自体の取込を測定した。MRP2の特異的基質であるCDCF輸送の阻害は、HAを除くすべての尿毒症物質(3mM)で認められ、特にIS(40%)およびKA (84%)で顕著であった。またBCRPの特異的基質であるLucifer yellowの輸送を、ISおよびKAは、各々46%および58%阻害した。しかしKAおよびISはMRP2ならびにBCRP発現ベシクルにATP依存的に取込まれなかった。P-gpの特異的基質であるN-metheylquinidineの取込は、いずれにおいても阻害されなかった。以上より、ISおよびKAは、MRP2ならびにBCRPを阻害するが、それ自体は基質とはならないことが明らかとなった。輸送担体の候補であるABC transporterがISを輸送しなかったことから、消化管上皮細胞におけるISの輸送の方向性を検討した。Caco-2単層膜を用いた実験結果において、排出方向有意な輸送の存在が示唆されたが、各ABC transporterの阻害剤の影響は認められなかった。また、無処置ラットの回腸切片をDiffusion chamberに装着して行なったISの輸送実験においても、粘膜側から漿膜側への輸送が2,4-dinitrophenolで増大し、エネルギー介在性排出輸送が推察された。インドキシル硫酸(IS)の排出輸送へのABCトランスポーターの関与を評価する目的で、MRP2, BCRP、MDR1を高発現するSf-9由来細胞膜ベシクルへの特異的蛍光プローブの取込阻害実験およびIS自体の取込を測定した。ISは、MRP2およびBCRPの特異的基質の輸送を顕著に阻害したが、IS自体のATP依存的な取込は認められなかった。このことから、ISはMRP2ならびにBCRPを阻害するが、それ自体は基質とはならないと考えられた。次にCaco-2単層膜を用いてISの輸送の方向性を検討したところ、排出方向優位な輸送が確認された。緩衝液中のNaをN-メチルグルカミンに置換すると、吸収方向の輸送の増大と排出方向の輸送の低下が認められ、結局この時の両方向の透過係数は同レベルとなった。以上より、ISの排出輸送に関与する輸送体がCaco-2細胞に存在し、それがNa依存性の2次性能動輸送である可能性が示唆された。なお予備実験の結果ではあるが、SLC17系に特異的な阻害剤とされるDIDSおよびevansblueにより排出方向の輸送のみが完全に消失した。さらにラット摘出小腸における輸送特性をdiffusion chamberを用いて検討した結果、空腸、回腸、結腸におけるISの透過は吸収方向、排出方向で同等であり、結腸に比較して、空腸、回腸で高い透過性を示した。ISの輸送にはリン酸輸送体が関与する可能性があると考え、リン酸非含有緩衝液で透過性を検討したところ、空腸で吸収方向に比較して排出方向が5倍以上大きな透過係数を示した。以上より、消化管粘膜上皮にはISを分泌する輸送機構が存在し、それはNaを駆動力とする2次性能動輸送体であり、リン酸の排出輸送に関与するものである可能性があると考えられた。腎不全の予後悪化因子として知られるインドキシル硫酸(IS)は、タンパク結合性が高いため透析による除去が難しく体内に蓄積することが問題となっている。本研究では、5/6腎摘出ラットにおいて腎外クリアランスが存在することを示唆する論文報告に着目し、腎不全時の代償性腎外排泄経路として消化管分泌が機能する可能性について検討を行った。ラット小腸切片を装着したDiffusion chamber法による検討では、通常緩衝液中では経細胞輸送を示唆する透過係数を示すものの方向性は認められなかったが、リン酸不含緩衝液を使用すると排出方向優位な輸送が観察された。Caco-2細胞単層膜の透過においても排出方向優位な輸送が観察された。アデニン誘発腎不全モデルで消化管分泌の寄与率を検討したところ、軽度腎不全時には全身クリアランスの3%程度が消化管排泄される(正常時の3倍)ことが分かった。腎機能廃絶時には消化管の関与はさらに大きくなると推察された。

輸送系を推定することを目的にABCトランスポーターであるhMDR1, hMRP2, hBCRPを高発現させたSf-9膜ベシクルへの特異的基質の取り込みに対する阻害およびISの取り込みを検討した。ISはMRP2, BCRPを阻害するが、それ自体の取り込みは観察されなかった。そこで、2次性能動輸送の関与を想定し検討したところ、Caco-2細胞単層膜におけけるIS輸送はNa依存性を示した。そこで、消化管に発現する2次性有機アニオン排出輸送系であるSLC17A4の関与を想定し、SLC17A4基質によるISの排泄方向輸送の阻害、DIDS等の有機アニオン交換系阻害剤の影響、SLC17A4のRNAiによるノックダウンの影響をCaco-2細胞を用いて検討した結果、SLC17A4はISの輸送に関与しないことが推察された。以上より、ISは僅かながら消化管分泌され、SLC17A4とは異なるNa依存性の有機アニオン排出輸送系が関与すると考えられた。今後、輸送系の特定と機能の誘導が必要であると考えられた。タンパク結合性が高い尿毒症物質であるインドキシル硫酸(IS)の蓄積は慢性腎臓病(CKD)の進行を早め、循環器疾患の危険因子となる。このためISの除去法の開発が望まれている。ISは腎機能正常時には腎排泄型であるが、CKD時には非腎性の排泄が推察された。そこで消化管分泌がCKDにおいてISの代償性排泄経路として関与する可能性について検討し、ISの消化管排泄経路の寄与は僅かであるが腎不全時に誘導され、Na+を駆動力とする2次性能動輸送が関与することを明らかにした。消化管分泌経路の寄与は小さく、この経路の誘導がIS除去法として有用かどうかは今後の課題である。インドキシル硫酸の放射ラベル体を用いた物質収支実験(in vivo)および透過実験、細胞を用いた取り込み実験を行う予定としていたが、放射ラベル体の安定性の問題(一か月に5%分解)から、購入後速やかにに実験を行う必要があり、実験条件を非標識体で検討している段階で遅れている。また、Caco-2単層膜を用いた透過実験において排出優位な透過が確認されたが再現されない状況が続き、解決に時間を要したため、当初の予定から少なからず遅れている状況である。薬物動態学消化管においてインドキシル硫酸の排出輸送に関与するトランスポーターを推定する。その手段として、各種阻害剤の影響などからトランスポーターを絞り込み、RNAiによるノックダウンがISの取り込み活性に及ぼす影響などから推定する。RNAiはCaco-2を用いたin vitro実験に適用し、摘出小腸では阻害剤の影響のみを検討する。同時に、正常および腎不全モデルラットを用い、in situ single perfusion法で消化管排出クリアランスの全身クリアランスに対する寄与率を求める。放射ラベル体が入手できる準備が整えば、腎不全モデルおよび正常動物で消化管排泄を含めた物質収支実験を行う。さらに、推定したトランスポーターを誘導する方法があるか、各種核内受容体のagonistにCaco-2を暴露し、qPCRで標的トランスポーターの発現量への影響評価する。誘導の認められた物質に関しては、Caco-2単層膜に暴露後、排出輸送能の上昇の程度を評価する。最終的にはin vivoで効果を検証したい。
新生児期精嚢腺・尿道球部腺間質の前立腺上皮細胞に対する分化誘導能に関する研究

ラット胎生期泌尿生殖洞、新生児期精嚢腺および尿道球部腺間質と成獣前立腺上皮の組織組み替え実験を行い間質の誘導能について形態および機能発現に関して検討した。ラットの泌尿生殖洞、精嚢腺、尿道球部腺をトリプシン処理した後、実体顕微鏡下に間質を取り出した。成獣ラット前立腺後側葉上皮先端を、微小解剖法を用いて取り出し間質と組み合わせ、ラット腎被膜下に移植し、in vivoにて1カ月培養した。培養後の組織はH&E染色、および免疫組織化学的染色に使用し、分泌蛋白はSDS-PAGE法、およびWestern blots法にて検討した。抗体にはラット前立腺前葉抗体(抗C3抗体)、後葉抗体(抗DP-1抗体)、後側葉抗体(抗Probasin抗体)を用いた。結果では、DP-1およびProbasinはそれぞれ後葉、後側葉に特異的に認められ、組み替え組織においても発現が維持されているが、前葉に特異的であるC3は、精嚢腺を用いた場合では発現が認められないが、尿道球部腺および泌尿生殖洞間質を用いた場合、新たに発現を認めた。本来増殖能を持たない成獣前立腺上皮が胎生期および新生児期間質により増殖し、新しい前立腺腺官組織を形成することが示された。精嚢腺間質との組み替え組織では後側葉の分泌蛋白のみを認めることより前葉への誘導能を認めず後側葉への誘導能が示唆され、尿道球部腺および泌尿生殖洞間質との組み替え組織では全ての分葉の分泌蛋白を認めることより、後側葉だけでなく、前葉への誘導能も示唆された。また、発生起源から考えると前立腺および尿道球部腺は内胚葉由来の泌尿生殖洞より分化し、精嚢腺は中胚葉由来のWolffian管より分化する。このように由来の異なる副生殖腺を用いても成獣前立腺上皮は増殖し、それぞれに特異的な分泌機能を与え、間質の起源により異なった分葉への誘導能を持つことが示唆された。
乳癌術後患者のリンパ浮腫予防対策の検討-末梢皮膚血流量の指標的有効性-

本研究は、乳癌術後患者のリンパ浮腫発生予測の指標として血流量測定法の応用の可能性を探るため、患者の血流量値を測定し危険範囲を明確にすること、加えて保存療法の効果と周径・血流量との関連を明らかにすることを目的に行った。研究者は、最終的にはリンパ浮腫の発生予測指標を見出すことを目的に、研究の準備研究と本研究を位置づけ、専門家のアドバイスを受けつつ、血流量測定法の指標的有効性を乳癌患者・一般女性の協力を得て探求した。プレテストの結果と先行研究に基づき、左右上肢の周径差<(患側上肢周径)-(健側上肢周径)>が1cm以上の患者をリンパ浮腫患者と定義した。調査した結果を分析すると、(1)対象者全てにおいて、左血流量は右血流量よりも多く、(2)一般女性と非浮腫患者の血流量および血流量差には差を認めず、(3)血流量差は浮腫患者が非浮腫患者と一般女性に比べ有意に高値であった。これらから、リンパ浮腫を発症すると血流量差が増大すると思われた。さらに、(4)左右乳癌患者とも、浮腫の重症度別でみると重症度が増悪するに従い血流量差は増大し、(5)左右乳癌患者とも、%血流量差30.0以上でリンパ浮腫保有率が100%となり、非浮腫患者のMean+3SD値は29.61を示した。また、血流量差7ml/min/100g以上で、リンパ浮腫保有率が約9倍高くなった(相対危険比:9.27、95%信頼区間:2.323-36.994)。以上の結果から、%血流量差、血流量差がリンパ浮腫発症予測指標となり得、そのカットオフ値は、%血流量差29.61、血流量差7ml/min/100gであった。また、リンパ浮腫治療法の用手リンパドレナージ前後で測定したところ、用手リンパドレナージ施術直後は周径の減少が見られないが、血流量差減少の変化は確認できた。浮腫を発症すると血流量差が増大するという結果から、血流量差が減少したことは浮腫が軽快方向へ向かっていることを表していることが考えられた。今回得られた結果を今後研究発表や論文投稿し、並行して研究を継続し、リンパ浮腫の予防策を探求することを目指したい。本研究の目的は、(1)乳癌術後患者のリンパ浮腫発生予測の指標として、血流量測定法の応用の可能性を探るため、患者の血流量値を測定し、危険範囲を明確にする。(2)リンパ浮腫治療として行われている保存療法の効果と周径・血流量との関連を明らかにすることである。研究者は、最終的にはリンパ浮腫の発生予測指標を見出すことを目的に、リンパ浮腫の改善と悪化防止、発症防止に対するアプローチを検討する研究の準備研究と本研究を位置づけ、末梢皮膚血流量測定法の指標的有効性を検討する。平成16年度は、末梢皮膚血流量値の測定と専門知識の収集に重きをおいた。徳島県のリンパ浮腫専門病院にてリンパ浮腫患者、広島県及び山口県近郊の乳癌患者会に入会し乳癌術後社会生活を送っている片側乳癌患者、さらにコントロール群として乳癌に罹患していない者を対象に測定を行った。また、乳癌診療およびリンパ浮腫診療を専門領域とする研究者との合同ディスカッションに参加し専門知識の習得に努め、本研究関連領域の学術集会に参加し最新の知見も得た。平成17年度は、収集したデータの解析やまとめを行うよう計画している。

また、リンパ浮腫治療法の用手リンパドレナージ前後で測定したところ、用手リンパドレナージ施術直後は周径の減少が見られないが、血流量差減少の変化は確認できた。浮腫を発症すると血流量差が増大するという結果から、血流量差が減少したことは浮腫が軽快方向へ向かっていることを表していることが考えられた。今回得られた結果を今後研究発表や論文投稿し、並行して研究を継続し、リンパ浮腫の予防策を探求することを目指したい。
脂質二分子膜におけるイオン透過のダイナミクスに関する生物電気化学的研究

膜を介した電荷移動は呼吸・代謝や神経伝達など様々な生体機能の発現に重要な役割を演じており、個々の反応だけではなく、複数反応の共役現象についても研究されてきた。特に近年は医薬品・農薬の開発やバイオセンサーの開発などが盛んに行われており、安全性・耐久性・効率がより高い薬剤・デバイスの開発が期待されている。そのためには、より詳細な膜透過におけるダイナミクスについての解析が必要とされている。そこで、植物の気孔開閉を制御するイオンチャネルKAT1を用いて、その動的挙動の解析を行うと共にその特性評価を行うことを目的とした。'本年度は共存イオンの働きにも注目して、膜内の拡散係数と膜内へのイオンの分配係数を見積もり、透過電流に及ぼすイオン種毎の寄与を評価することを試みた。具体的には膜を介した二水相の電解質溶液を置換できるセルを新たに設計・作製し、印加電位毎の単一チャネル電流値を測定することでその評価を行った。その結果、KAT1においてもこれまで用いたチャネル形成ペプチドと同様に共存イオンのイオン半径とチャネル孔径の関係が重要であることが分かった。また、イオン半径の方が小さい場合は分配項が、大きい場合は拡散項が主に関わることで、透過目的イオンの透過促進及び透過阻害が起こっていることも分かった。平成22年度から対イオン(共存イオン)の重要性に注目して研究を進めてきたが、単一チャネル測定からもその重要性が確認できた。これまでの知見に基づき、膜を介したイオン透過のダイナミクスにおいて、疎水性イオンやキャリア化合物、チャネル・ポンプの存在が重要だが、透過目的イオンだけではなく対イオンが透過特性に大きく関わっていることを明らかにした。従来は、イオンチャネルはチャネル孔と透過イオンの大きさのみが、その透過特性を決めていると考えられてきたが、特性評価を行う際は対イオンの挙動も重要であることが判った。膜透過現象は、生命活動に深く関与するため古くから注目されてきたが、現在では医薬品のみならず、安全と効率を兼ね備えた生物の機能を応用したデバイスへの展開も期待されている。そこには膜透過におけるダイナミクスの詳細な情報が必要で、現在まで我々は膜透過現象に関わる3つのタイプ(疎水性イオン、キャリア化合物、チャネル・ポンプ)のいくつかについて基礎研究を行ってきた。本研究では、学問的にも応用面でも注目のある膜チャネルも研究対象として、農芸化学的手法に電気化学・物理化学的手法を組み合わせた特性評価を行ってきた。本年度は、膜チャネルKAT1(カリウムチャネルの一種)をリボソームを介して脂質二分子膜へ再構成する方法を、リボソームと脂質二分子膜の脂質組成の変更および測定セルの改良を行って検討した。具体的には、前者は生体中でKATlに結合して存在していることが分かったホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成を用いれば活性を保ったままであることが多くなり、後者はセル容積の極小化と脂質二分子膜の向きの変更でリボソームが再構成しやすくなった。しかし、安定して膜チャネルの機能解析が行えるまでにその効率性を十分に向上させることは出来なかった。また、この過程で、KAT1を介した二水相間のイオン組成を変化させることでチャネルの開閉挙動と共存イオンによる阻害挙動の検討を行った。その結果、共存イオンがアニオンかカチオンかに関係なく疎水性のイオンが存在すれば開閉頻度が下がるという傾向が観測された。このことは、カリウムチャネルの研究ではカリウムイオンの動きのみを注目されがちだが、共存アニオン挙動の重要性を示唆している。膜透過現象は呼吸・代謝や神経伝達など様々な生体機能の発現に重要な役割を演ずるため、その反応機構についての研究が行われてきた。近年では、得られた知見に基づき、膜透過に関与する医薬品・農薬の開発やバイオセンサーの開発も行われている。安全性・耐久性が高く、より効率の良い薬剤やバイオデバイスの開発を行うには、より詳細な膜透過のダイナミクスについての解析が必要となる。そこで、イオン透過によって発現する機能に興味が持たれているイオンチャネルについて、動的挙動の詳細な解析と共にその特性評価を行った。イオンチャネルの働きによる脂質二分子膜を介したイオン透過についての研究を行う前に、まずチャネル蛋白質をより効率良く脂質二分子膜へ再構成する必要がある。本年度は、再構成時に必要な脂質の種類や周囲のイオン組成などについても検討し、セル形状の改良も行った。さらに、効率良くイオンチャネルの機能解析を行うため、測定中に溶液組成を換えることができるセルを開発して、共存イオンの影響を評価した。その結果、従来選択的に透過すると考えられてきたイオンだけでなく、膜電位印加に伴い、イオン半径が同等のイオンも透過し、同時に対イオンも逆方向に透過していることが判明した。イオン透過は、チャネル内部及び周辺部へのイオン(アニオン及びカチオン)の分配過程とチャネルを介したイオンの移動過程に分けられることが判った。また、イオンチャネルの孔径に比べて大きなイオンは通りにくいが、チャネル孔径に比べて小さなイオンではイオン半径が大きいほど透過電流が大きくなった。

そこで、植物の気孔開閉を制御するイオンチャネルKAT1を用いて、その動的挙動の解析を行うと共にその特性評価を行うことを目的とした。'本年度は共存イオンの働きにも注目して、膜内の拡散係数と膜内へのイオンの分配係数を見積もり、透過電流に及ぼすイオン種毎の寄与を評価することを試みた。具体的には膜を介した二水相の電解質溶液を置換できるセルを新たに設計・作製し、印加電位毎の単一チャネル電流値を測定することでその評価を行った。その結果、KAT1においてもこれまで用いたチャネル形成ペプチドと同様に共存イオンのイオン半径とチャネル孔径の関係が重要であることが分かった。また、イオン半径の方が小さい場合は分配項が、大きい場合は拡散項が主に関わることで、透過目的イオンの透過促進及び透過阻害が起こっていることも分かった。平成22年度から対イオン(共存イオン)の重要性に注目して研究を進めてきたが、単一チャネル測定からもその重要性が確認できた。これまでの知見に基づき、膜を介したイオン透過のダイナミクスにおいて、疎水性イオンやキャリア化合物、チャネル・ポンプの存在が重要だが、透過目的イオンだけではなく対イオンが透過特性に大きく関わっていることを明らかにした。従来は、イオンチャネルはチャネル孔と透過イオンの大きさのみが、その透過特性を決めていると考えられてきたが、特性評価を行う際は対イオンの挙動も重要であることが判った。イオンチャネルの活性が低かったため、測定データが限られており、イオン透過ダイナミクスに関する考察は膜タンパク質以外のイオンチャネルについて行った。但し、選択的に透過するとされたイオンについての情報だけでなく、対イオンの影響など従来とは異なる評価も行えた。KAT1のようなチャネルタンパク質について、より安定な機能解析法の検討を行う。同時にイオンの膜透過ダイナミクス解明のため、チャネル形成ペプチドなどのイオンチャネルを用いて、イオン透過の促進及び阻害についての解析を行っていく予定である。特にチャネル近傍の界面電位の変動などについて解析を行う予定である。また、チャネルの開寿命・開閉頻度についての考察は、二分子膜に埋め込むイオンチャネル数を制御する技術がない限りは解析ができないことが判明したため、行わないことにした(統計学的解析は可能だがあまり意義を見いだせないため)。
傍腫瘍性神経症候群に伴う抗神経細胞抗体の高感度検出法の検討

悪性腫瘍に伴い各種神経障害を来す傍腫瘍性神経症候群を的確に診断し,早期の治療を開始するために,その病態に関連する抗神経細胞抗体の検出系を確立することが重要である.本研究では,蛋白細胞生化学と免疫組織化学を組み合わせることで検出力を高めることが分かった.一方初代神経細胞を対象とした免疫細胞化学では,抗神経細胞抗体が病態を引き起こすメカニズムの解明に有用な手段である可能性が示唆された.悪性腫瘍に伴い各種神経障害を来す傍腫瘍性神経症候群を的確に診断し,早期の治療を開始するために,その病態に関連する抗神経細胞抗体の検出系を確立することが重要である.本研究では,蛋白細胞生化学と免疫組織化学を組み合わせることで検出力を高めることが分かった.一方初代神経細胞を対象とした免疫細胞化学では,抗神経細胞抗体が病態を引き起こすメカニズムの解明に有用な手段である可能性が示唆された.傍腫瘍性神経症候群(PNS)の診断と病態解明の必須である抗神経細胞抗体の高感度検出法を確立するために,商用のドットブロットキットの他,凍結マウス脳を用いた免疫組織化学(IHC),マウス脳ホモジネートを用いたウェスタンブロット法(WB)およびマウス海馬初代培養細胞に対する免疫細胞化学(ICC)の4法に加えて,既知の各種チャネルに対する抗体を検出する系を確立することを目標とした.具体的には,昆虫由来のSF9細胞膜上にバキュロウイルスを用いた発現系により,各種チャネル蛋白を発現させ細胞免疫染色により,その発現を確認することとした.VGKC,VGCC,NMDA受容体各サブユニットのコンストラクトをcDNAライブラリあるいは購入可能なベクターより入手し,バキュロウイルスベクター上へのクローニングに成功した.SF9細胞へのinfectionを行い,免疫染色ならびにウェスタンブロット法により発現確認を試みたが,いずれのコンストラクトも発現は確認できなかった.原因として多回膜貫通型タンパクのため3次構造をうまくとれず,タグも含めた抗体が反応しなかった可能性や発現量が低かった可能性を考慮した.今後,GFP蛋白を融合させたチャネル蛋白を発現させ,容易に発現レベルを確認すること,患者血清中の各種抗チャネル抗体の検出は,別の蛍光染色により可視化して,共焦点レーザー顕微鏡で確認するといった系への改良を行ってゆきたい.傍腫瘍性神経症候群(PNS)の診断と病態解明の必須である抗神経細胞抗体の高感度検出法を確立するために,商用のドットプロットキットの他,凍結マウス脳を用いた免疫組織化学(IHC),マウス脳ホモジネートを用いたウェスタンブロット法(WB)およびマウス海馬初代培養細胞に対する免疫細胞化学(ICC)の4法を比較検討した.本研究の2年間でPNSを疑われた対象患者数は30例,疾患対象群は9例であった.本研究の結果,23例でなんらかの陽性所見を認め,そのうち18例では複数の方法で陽性が確認された.ドットプロット法陽性例(=既知抗体陽性例)は13例出会ったが,3例では相当うるバンドがWBで検出されず偽陽性の可能性がある.IHCは本研究で19例と最も高く陽性を示した.WBは14例で陽性を示した.IHC,WBとも陽性例でかつドットプロット法陰性の症例は4例あり新規抗体の存在が示唆された,最も感度が高いことが期待されたICCは14例で何らかの染色パターンを示したが,多くがカルチャーに混在したグリア細胞への反応であり特異的とは言い難かった.Hu抗体陽性例の血清では,3例中2例で,細胞固定前に血清を培養液に加えた後固定し,GFP結合抗ヒトIgG抗体で可視化すると細胞体内で陽性所見がみられ,患者血清中の特異抗体は細胞内へなんらかの機序で取り込まれる可能性が示唆された.以上から,PNSスクリーニング法については,IHC,ついでWBがすぐれており,ICCについてはスクリーニングには適さず,むしろ抗体によるPNS発症機序の解明に寄与すると考えた.今後,本研究で示唆された新規PNS関連抗神経抗体の抗原同定を進めてゆく予定である.
DNAチップを用いた遺伝性ニューロパチーの包括的遺伝子解析

遺伝性ニューロパチー(Charcot-Marie-Tooth病)の遺伝子チップによる診断システムを確立する目的で研究が設定された。CMT1,CMT2,DSS(Delerille-Sottas syndrome),CHN(congenital hypomyelinating neuropathy),Giant axonal neuropathyおよび小脳失調症合併例(SCAN1,AOAI,AOA2)などの臨床型を示す疾患に対応するべく、既知の27遺伝子をチップに搭載した。さらに、末梢神経関連遺伝子および既知の遺伝子の関連遺伝子の中から、遺伝性ニューロパチーの原因となりうる10の候補遺伝子も搭載した。このマイクロアレイチップで110.938塩基の配列を決定できる。我々は、PCRのステップの最適化、multiplex化を行い、最終的には、最適化を行うことで586のPCR反応を25本のチューブで増幅することが可能となり、増幅過程が飛躍的に簡素化された。2日間の行程で8例の検査が可能となった。実際には、患者およびコントロール症例約110例について解析を行い、多数の遺伝子異常が見つかっている。症例によっては、エクソン単位で一部配列がはっきりしない例も認められたが、全般的にはシークエンス解析より、遙かに精度が高いものであった。本チップによる遺伝子解析では、遺伝子異常を調べるコストと時間が飛躍的に縮小し、実際、患者1例あたりのスクリーニングの費用は140万円から7万円に節約できた。Charcot-Marie-Tooth病の診断DNAChipチップは完成し、十分実用的である。遺伝性ニューロパチー(特にCharcot-Marie-Tooth病)は約2,500人に1人が発症し、比較的頻度の高い遺伝性神経疾患である。遺伝性ニューロパチーは、臨床的、遺伝的に多様であり、現在までに27以上の遺伝子が同定されている。今年度は現在遺伝性ニューロパチーの原因遺伝子として報告されている27遺伝子と、遺伝性ニューロパチーの原因となりうる10の新規候補遺伝子を選択し,プライマーを設定し、1枚のDNA Chip (resequencing chip)上に110.938塩基の配列を搭載したGene Chipを作成した。本DNAチップは、resequencing array (Affymetrix社製)と呼ばれるもので、グラスチップ上に25merのDNAプローブの中央の1塩基をACGT4種類にしたものを、順に一つずつずらして並べることにより、シークエンス配列を決定するものである。このDNA Chipを用いて多数のプライマーを効率よくPCR反応させるために、Multiplex PCR法を用いて検討した。Multiplex PCRは、1つのチューブに複数のプライマーを入れて反応させる方法で、これによりPCRの本数を10分の1以下に減らすことができる。そのPCR産物をプールし、断片化後ラベルしてDNA Chipと反応させた後、高性能スキャナーでデータを取り込み、配列を決定する。現在のところ、このシステムは順調に働いており、実際の検体で確認したところ、99.9%以上の確率でその配列を読むことに成功した。このGene Chipを用いることで、すべての遺伝子を検索する場合の費用対効果は18倍、時間対効果は数十倍になり、迅速で正確な包括的遺伝子診断システムが完成した。すでに数例の実際の患者DNAでこの方法を用いて遺伝子検査を行い、2例でこれまで診断されていなかった既知の遺伝子変異が明らかとなり、この方法が極めて有用であることが明らかになった。CMT1, CMT2, DSS(Dejerine-Sottas syndrome), CHN(congenital hypomyelinating neuropathy), Giant axonal neuropathyおよび小脳失調症合併例(SCAN1, AOA1, AOA2)などの臨床型を示す疾患に対応するべく、既知の27遺伝子をチップに搭載した。

さらに、末梢神経関連遺伝子および既知の遺伝子の関連遺伝子の中から、遺伝性ニューロパチーの原因となりうる10の候補遺伝子も搭載した。このマイクロアレイチップで110.938塩基の配列を決定できる。我々は、PCRのステップの最適化、multiplex化を行い、最終的には、最適化を行うことで600のPCR反応を約20本のチューブで増幅することが可能となり、増幅過程が飛躍的に簡素化された。2日間の行程で8例の検査が可能となった。実際には、患者およびコントロール症例約110例について解析を行い、多数の遺伝子異常が見つかっている。症例によっては、エクソン単位で一部配列がはっきりしない例も認められたが、全般的にはシークエンス解析より、遙かに精度が高いものであった。本チップによる遺伝子解析では、遺伝子異常を調べるコストと時間が飛躍的に縮小し、実際、患者1例あたりのスクリーニングの費用は137万円から7万5千円に節約できた。Charcot-Marie-Tooth病の診断DNA Chipチップは完成し、十分実用的である。
ミネラロコルチコイド受容体コリプレッサーを標的にした糖尿病性腎症治療薬の創薬

糖尿病性腎症患者が著増しており、糖尿病性腎症の病期進行抑制のための治療法の確立が急務である。糖尿病性腎症進行にアルドステロンやMineralocorticoid受容体(MR)が関与すると示唆されているが、最近MRに結合しその作用を抑制する蛋白(Corepressor)、GEMIN4が同定された。本研究の目的は、メサンギウム培養細胞にGEMIN4のpromoter配列を発現したGEMIN4-Luc安定発現株を樹立し、同細胞を用いてGEMIN4の作用を活性化する化合物のスクリーニングを網羅的に探索・特定した後、1型糖尿病性腎症モデル(iNOS/RAGEダブルTGマウス)に投与を行い、糖尿病性腎症の発症・進展抑制効果と、既存のMR拮抗薬との併用の有用性を検証することを目指した。。MRに結合する蛋白を標的にした新規創薬は全く行なわれておらず、本研究は非常に新規性が高いと考えた。研究をすすめる中で野生型(コントロール)マウス、iNOS/RAGEダブルTGマウスEPL投与iNOS/RAGEダブルTGマウスから糸球体のみを単離し、糸球体よりRNAを抽出し、DNAの合成・cDNAマイクロアレイ解析を施行したが、糸球体の単離の手技の安定性の問題から十分な解析を行うことが出来なかった。そこでIn Vitro実験を集中的に進めたが、GEMIN4-Luc安定発現株の作成に予想より時間がかかり研究期間に実現が困難であったため、並行して作成して先に発現株が得られたChoRE-Luc安定発現株を用いて、東北大学化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)を行い、2個のヒット化合物が得られた。現在、同化合物をiNOSトランスジェニック(TG)マウスに投与して、尿中アルブミン排泄量の検討を行い、更にその薬理効果や他薬剤との比較・検討するところまで至っている。本研究の目的は、メサンギウム培養細胞にGEMIN4のpromoter配列を発現したGEMIN4-Luc安定発現株を樹立し、同細胞を用いてGEMIN4の作用を活性化する化合物のスクリーニングを網羅的に探索・特定した後、1型糖尿病性腎症モデル(iNOS/RAGEダブルTGマウス)に投与を行い、糖尿病性腎症の発症・進展抑制効果と、既存のMR拮抗薬との併用の有用性を検証することである。以上より、糖尿病性腎症の進行予防のための創薬・新規治療法の確立を目指している。糖尿病性腎症の治療薬は、これまでもレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)阻害薬が使用されてきたが、アルドステロン・ブロックの腎保護作用の機序に関しては未だ十分には解明されていない。GEMIN4などのMRのCorepressorはごく最近明らかになったこともあり、MRに結合する蛋白を標的にした新規創薬は全く行なわれておらず、本研究は非常に新規性が高い。また既存のMR拮抗薬との併用によって相乗効果が期待できる可能性がある。更に、in vivoでの検証実験に用いるiNOS/ RAGEダブルTGマウスは1型糖尿病性腎症モデルとして非常に優れており、現時点では本邦の東北大学と金沢大学でしか継代していない事から、新規リード化合物の尿中アルブミン減少効果や腎組織病変改善効果を世界に先駆けて明らかにする事が可能となると考えられる。iNOS/RAGEダブルTGマウスの腎病理組織などの解析から初年度始める予定であったが、同モデル動物の交配や糖尿病腎症発症の重症度の把握などに難渋しているため、in vitroの研究を先行し、細胞株樹立などを優先することとしている。更に、in vivoでの検証実験に用いるiNOS/ RAGEダブル

TGマウスは1型糖尿病性腎症モデルとして非常に優れており、現時点では本邦の東北大学と金沢大学でしか継代していない事から、新規リード化合物の尿中アルブミン減少効果や腎組織病変改善効果を世界に先駆けて明らかにする事が可能となると考えられる。野生型(コントロール)マウス、iNOS/RAGEダブルTGマウスEPL投与iNOS/RAGEダブルTGマウスから糸球体のみを単離し、糸球体よりRNAを抽出し、DNAの合成・cDNAマイクロアレイ解析を施行したが、糸球体の単離の手技の安定性の問題から十分な解析を行うことが出来なかった。現在はIn Vitro実験を集中的に進めているが、GEMIN4-Luc安定発現株の作成に予想より時間がかかっているため、並行して作成して先に発現株が得られたChoRE-Luc安定発現株を用いて、東北大学化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)を行い、2個のヒット化合物が得られた。現在、同化合物を、iNOSトランスジェニック(TG)マウスに投与して、尿中アルブミン排泄量の検討を行っている。糖尿病性腎症患者が著増しており、糖尿病性腎症の病期進行抑制のための治療法の確立が急務である。糖尿病性腎症進行にアルドステロンやMineralocorticoid受容体(MR)が関与すると示唆されているが、最近MRに結合しその作用を抑制する蛋白(Corepressor)、GEMIN4が同定された。本研究の目的は、メサンギウム培養細胞にGEMIN4のpromoter配列を発現したGEMIN4-Luc安定発現株を樹立し、同細胞を用いてGEMIN4の作用を活性化する化合物のスクリーニングを網羅的に探索・特定した後、1型糖尿病性腎症モデル(iNOS/RAGEダブルTGマウス)に投与を行い、糖尿病性腎症の発症・進展抑制効果と、既存のMR拮抗薬との併用の有用性を検証することを目指した。。MRに結合する蛋白を標的にした新規創薬は全く行なわれておらず、本研究は非常に新規性が高いと考えた。研究をすすめる中で野生型(コントロール)マウス、iNOS/RAGEダブルTGマウスEPL投与iNOS/RAGEダブルTGマウスから糸球体のみを単離し、糸球体よりRNAを抽出し、DNAの合成・cDNAマイクロアレイ解析を施行したが、糸球体の単離の手技の安定性の問題から十分な解析を行うことが出来なかった。そこでIn Vitro実験を集中的に進めたが、GEMIN4-Luc安定発現株の作成に予想より時間がかかり研究期間に実現が困難であったため、並行して作成して先に発現株が得られたChoRE-Luc安定発現株を用いて、東北大学化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)を行い、2個のヒット化合物が得られた。現在、同化合物をiNOSトランスジェニック(TG)マウスに投与して、尿中アルブミン排泄量の検討を行い、更にその薬理効果や他薬剤との比較・検討するところまで至っている。同細胞を用いた、ハイスループットスクリーニングを精力的に行い、薬剤スクリーニングまで着手することを推し進める。GEMIN4-Luc安定発現株が得られた後に、東北大学化合物ライブラリーのハイスループHTSを行い、得られたヒット化合物をiNOS/RAGEダブルTGマウスに投与し、尿中アルブミン排泄量の検討を行う。
炎症性神経疾患におけるヘルペス属ウイルスDNAの検討

Epstein-Barrvirus(EBV)はヘルペス属ウイルスの一つであり,不顕性感染やリンパ系細胞への持続感染が知られている.近年,EBVが関与していると思われる,種々の神経合併症が報告されているが,その検討はいまだに不十分である.そこで本研究では,髄膜脳炎を対象としてEpstein-Barvirus(EBV)-DNAを検索し,病因における意義について検討した.19971998年にかけて当科を受診した髄膜脳炎症例で,PCR法で髄液EBV-DNAを検索し,陽性例ではPCRによる経時的なDNAの半定量を行い,臨床症状と対比した.(1)髄液EBV-DNAは,4例の髄膜脳炎において陽性であった.(2)2例は急性脳炎例(このうち1例は急性小脳炎)で,残り2例は意識障害や髄膜刺激症状のない,軽微な症状で長期の経過をたどった慢性髄膜脳炎例であった.(3)経時的EBV-DNAの検討では,急性脳炎2例では,抗ウイルス薬の治療で症状は改善し,それに伴い髄液EBV-DNAは消失した.しかし,慢性例のうち1例では,治療後も臨床症状は軽度の改善にとどまり,髄液EBV-DNAは1年後でも依然陽性であった.EBV-DNAの測定は,髄膜脳炎の診断に有用であり,EBV-DNA量は臨床症状を反映する可能性があり,その髄膜脳炎の診断,治療効果や予後の判定に有用であると考えられた.髄膜脳炎例のうち,慢性例が4例中2例で認められ,慢性に経過する神経症状を呈する症例においては,EBVは鑑別すべき疾患の一つであると考えられた.慢性,再発性の経過を辿った髄膜脳炎例の髄液に対してpolymerase chain reaction(PCR)法を行い,単純ヘルペスウイルス(HSV)-DNAの疾患との関与を検討.さらにウイルスの半定量を行い,慢性,再発性の経過を辿らない単純ヘルペス脳炎(HSE)と比較,検討した.1)患者髄液のバンドの濃さと,段階希釈した陽性コントロールを比較することにより,おおよそのウイルス量が測定できた.2)慢性,再発性髄膜脳炎4例全例で,HSV-DNAは陽性であった.ウイルスDNA量は2例では2×10^2pfu,他の2例では22×10^2pfuを示した.3)急性HSEでは,5例全例でHSV-DNAは陽性であり,経過を追えた3例では症状の軽快と共にウイルスDNA量は減少した.以上より慢性,再発性髄膜脳炎を来した症例では,HSV-DNAの関与が示唆され,起因ウイルスとなっている可能性が考えられた.急性のHSE症例に比較してもウイルス量は同等かそれ以上認められ,初発から長期間を経てもなおウイルス量は多く,また,持続したあるいは断続的なウイルス増殖があることを強く示唆した.本年度は炎症性神経疾患患者髄液からDNAを抽出し,PCR法を施行した.特に慢性,再発性髄膜脳炎患者におけるHSV-DNAの関与が示唆された.また,ウイルス量の半定量の確立を行い,慢性例においてウイルス量の変化を観察した.来年度においてはプライマーを複数の領域内に作製し,PCR法を施行する.また,それにより,Aciclovir耐性株について,検討を行う予定である.<中枢神経感染症におけるEpstein-Barrvirusの意義>Epstein-Barrvirus(EBV)はヘルペス属ウイルスの一つであり,不顕性感染やリンパ系細胞への持続感染が知られている.近年,EBVが関与していると思われる,種々の神経合併症が報告されているが,その検討はいまだに不十分である.そこで本研究では,髄膜脳炎を対象としてEpstein-Barvirus(EBV)-DNAを検索し,病因における意義について検討した.19971998年にかけて当科を受診した髄膜脳炎症例で,PCR法で髄液EBV-DNAを検索し,陽性例ではPCRによる経時的なDNAの半定量を行い,臨床症状と対比した.(1)髄液EBV-DNAは,4例の髄膜脳炎において陽性であった.(2)2例は急性脳炎例(このうち1例は急性小脳炎)で,残り2例は意識障害や髄膜刺激症状のない,軽微な症状で長期の経過をたどった慢性髄膜脳炎例であった.(3)経時的EBV-DNAの検討では,急性脳炎2例では,抗ウイルス薬の治療で症状は改善し,それに伴い髄液EBV-DNAは消失した.しかし,慢性例のうち1例では,治療後も臨床症状は軽度の改善にとどまり,髄液EBV-DNAは1年後でも依然陽性であった.EBV-DNAの測定は,髄膜脳炎の診断に有用であり,EBV-DNA量は臨床症状を反映する可能性があり,その髄膜脳炎の診断,治療効果や予後の判定に有用であると考えられた.髄膜脳炎例のうち,慢性例が4例中2例で認められ,慢性に経過する神経症状を呈する症例においては,EBVは鑑別すべき疾患の一つであると考えられた.
生体内超音波干渉を利用した深組織光イメージング

生体深部組織の視感度(visibility)向上のために、光と超音波の特徴を利用した新しいイメージング技術を提案した。この方法は、光の高コントラスト特性、高空間分解特性と、超音波の生体内長距離伝播特性、生体内屈折率平滑化とにより可能となる。光の生体ダミーとラット腸間膜血管を用いた実験結果から、従来法に比べて生体深部における深さ方向visibility向上が可能であることが明らかとなった。本研究は,様々な光イメージング,例えば,共焦点レーザ走査型顕微鏡,多光子顕微鏡,第2高調波(Second-harmonic generation:SHG)顕微鏡に代表されるような深さ分解能を持つイメージングシステムで,さらなる深部観察をするために,生体内に超音波干渉を起こさせて,それにより生体内の不均一さによる散乱の効果を平滑化し,深部イメージングの視感度(Visibility)を向上させることを目的としている。今年度は,そのための基本的な知見を得るための実験(生体内振動の光イメージングへの影響と光と音響波の相互作用の解明に関する実験)を行なった。生体散乱体のダミーとして,散乱板(オパール光拡散ガラス)を顕微鏡対物レンズとイメージングターゲットの間に置いて,散乱板を振動させることによって,得られるイメージの視感度が向上するかどうかを調べた。イメージングターゲットとしては,HE染色されたラット脳の切片を用いた。その結果として,散乱板を振動させた場合と振動させない場合とを比較すると,視感度が散乱板を振動させた場合の方が向上することが明らかとなった。これは散乱体として用いたオパール光拡散ガラスの不均一さが振動させることにより,均一化されるためであると考えられ,原理的に提案している方法が深部イメージングに有効であることを示した。今後としては,今年度得られた結果を活かし,超音波発生のためのパラメータの最適化,様々な光イメージング技術や様々なターゲットへの応用を考えていく予定である。本研究の目的は、様々なイメージングシステム、例えば、共焦点レーザ走査型顕微鏡、多光子顕微鏡、第2高調波(Second-harmonicgeneration : SHG)顕微鏡に代表されるような深さ分解能を持つシステムを改良し、さらに深い部分の観察を可能にすることにある。その目的のために、生体内に起こさせた超音波を利用し、生体深部の視感度(Visibility)の向上を提案している。今年度は、外部から超音波を生体内に起こし、それにより生体深部のVisibilityを向上することに加えて、観察のために使用するレーザを直接利用し、レーザ照射することによって発生する超音波(光音響波)により、より深い部分のVisibilityを向上させることを目的として研究を行った。特に、金ナノ粒子を利用することにより、深部イメージングのVisibilityが向上することを明らかにした。実験としては、1064nmのナノ秒光パルスを超音波発生の励起光として用い、ローダミンB水溶液で内空を満たしたガラスチューブから発生する光音響波とローダミンBと金ナノ粒子を混合した溶液で満たしたガラスチューブから発生する光音響波との信号強度を比較した。その結果として、金ナノ粒子を混合した場合に信号は増強されることが明らかとなった。また、金ナノ粒子をラット腸間膜の血管に入れ、光音響イメージングを行った場合に、血管の断面が正確に捉えられていることを示した。これらのことから、金ナノ粒子を利用することにより光音響信号が増強され、生体深部イメージングのVisibilityの向上を助けることが明らかとなった。
文化の資源化と活用の論理-地方競馬の衰退を背景とした「馬事文化」の創出-

これまで遺伝資源としてまた文化資源として保護されてきた農用馬や在来馬を、保護に止まらず積極的に活用することを求める日本馬事協会の方針転換により、生産・飼養者が「生きた文化財」としての馬の価値を捉え直し、文化財に経済的な価値を付与する様相を分析した。特に天然記念物としての在来馬を文化財保護制度の枠組みの中で活用する際に生じる様々な問題を分析し、文化を資源化し活用する際の主体の戦略を考察した。3年計画の初年度である本年度は、主に農用馬や在来馬の生産者・保存会を対象とした現地調査を実施し、当事者が主張する「民俗文化」「伝統文化」保存の必要性の論理を分析した。農用馬や在来馬の生産振興の補助金は地方競馬の減収に伴い減額され、大規模な繁殖農家・肥育農家でなければ生産・飼育で採算を得ることは難しい。特に農用馬や在来馬は、農耕や物資の運搬といった従来の用途・役割を失ったことで頭数が減少し、生産者は新たな活用策を見出し、馬と関わり続けるための理由付けを必要としている。本年度は(1)農用馬に関して、熊本市の藤崎宮側大祭、盛岡市・滝沢村のチャグチャグ馬コを対象とし、飼育の委託や貸借のシステム、調教方法など、祭りやイベントへの活用の状況を調査した。また、肥育農家や馬肉業者等を対象に、馬肉の消費拡大に取り組む過程で、生産者と馬との関係が再構築されていることを分析した。(2)在来馬については、沖縄県八重山郡与那国町を中心として、与那国馬の乗用化推進事業に関する調査を実施した。在来馬は遺伝資源であり、生産者は品種を保存する役割を課せられている。しかしながら家畜の価格は需給関係の中で決められ、浩用の道がなければ需要も生まれない。そのため、単に保存するだけでは生産者の生産意欲を維持できず、需要を高め取引価儀格を安定させる必要がある。こうした中、全国乗馬倶楽部振興協会による在来馬乗用化推進事業を通じて、与那国馬を調教し全国の乗馬クラブへ販売するシステムの確立が図られている。生きた文化財としての在来馬を保存するだけではなく活用し経済的な利益を生み出しながら、新たな価値を付与しようとする生産者の取組みを中心に分析した。本年度は、主に(1)国の天然記念物である宮崎県串間市の御崎馬と(2)愛媛県今治市の文化財である野間馬を事例に、遺伝資源であり生きた文化資源でもある在来馬を、保存に止まらず積極的に活用することを求める方針転換をきっかけに、生産現場に生じた矛盾と葛藤を調査した。これまで生産者は在来馬を、補助を得て保存することに努めてきたが、地方競馬の減収に伴い補助が減額され、今後は補助に頼ることなく生産・飼育することが求められている。しかしながら、在来馬の活用に当たっては、血統管理や品種保護の側面から、様々な制限が生じてくる。また、生産者の間にも在来馬は「文化」であり、補助を得て保存するものという認識があり、文化を保存する役割を担わされながら、経済的な負担を強いられ始めたことで、生産意欲にも影響が出始めている。そもそも、御崎馬は野生馬であることに価値があるとされ、野生馬の社会をそのままの形で保存することが重要とされてきた。廃馬を調教し乗用に活用することが模索されているが、このことで御崎馬の特徴や価値が揺らぐことへの懸念も窺える。その一方、野生馬ならではの特徴を生かした新たな調教法を生み出すなど、関係者は積極的な活用策を模索している。また野間馬は今治市の所有であり、自治体が委託する指定管理者により保護されているが、血統管理・品種保護のため信頼性の高い施設への譲与しか認められず、文化財という枠組みの中で活用することは様々な困難を伴う。本年度は、文化財である在来馬を、再び活用し経済的な価値を生み出すことを模索する生産・飼育の現場が抱える矛盾や葛藤を分析し、文化と経済の関係を問う布石とした。本年度は、日本在来馬のうち御崎馬、野間馬、与那国馬に焦点を当て、日本馬事協会による「保護から「活用」への方針転換の中で、飼養者それぞれが新たな在来馬との関係を模索し、文化財としての在来馬の「価値」を捉え直す様相を分析した。これまで在来馬の飼養者は「日本在来馬」「天然記念物」として国や自治体から貴重な文化財、自然資源を保護する役割を付与されてきた。日本馬事協会では、中央競馬会からの助成を得て、在来馬の保存会に繁殖や品種管理を目的とした支援を実施してきたが、競馬産業の衰退により助成が減額され、2007年(平成19)以降、保護を目的とした支援から活用を目的とした保存会活動に助成金を支出することへ方針が転換された。

つまり、在来馬はこれまで貴重な「遺伝資源」「文化財」として捉えられ、補助を得て飼養するものと捉えられてきたが、今後は飼養者が自ら在来馬の付加価値を生み出し、補助に頼らず飼育することを求められていると言える。こうした中、在来馬を調教し全国の乗馬クラブへ販売することで、在来馬に新たな価値を付与しようとする積極的な取り組みも見られる。しかしながら活用に当たっては様々な混乱も生じている。在来馬は、その土地特有の環境で生み出されてきた文化財であり、生育環境も含めて価値づけられ、その環境の中で保護することが求められてきた。そのため飼養者は、土地から切り離し、他者に飼養を託す中で在来馬の価値を保つことができるのか、何をもって在来馬の価値が決定し、何を守り何を変えてよいのか、在来馬の価値を模索しており、その詳細を明らかにした。