hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィトクロムの構造と機能解明のための有機合成化学的アプローチ

そこで本研究では,再構成フィトクロム中における発色団の構造と機能の関係を解明することを目的とし,まず,テトラピロール骨格の構成成分である四つのピロール誘導体(AD環)の新規一般合成法の確立と,それらのピロール誘導体のカップリング法を開発し,側鎖カルボン酸が遊離でアポ蛋白質と再構成が可能なPΦBや,従来,代替発色団として用いられてきたフィコシアノビリン(PCB),さらに20種以上のPCB誘導体の全合成を世界に先駆けて達成した。次に得られた合成発色団とアポ蛋白質とのin vitroにおける再構成実験により,フィトクロムの発色団結合サイト周辺の化学的環境解明と光可逆的機能の発現に成功し,これらの結果を総合して,発色団とアポ蛋白質との間の結合形成の概念図を描くことができるようになった。さらに発色団欠損重複変異株を用いたin vivoにおける再構成にも成功し,フィトクロムAとBでは発色団の機能が全く異なることを世界で初めて発見するとともに,D環18位におけるビニル基の重要性を指摘した。また,Agrobacterium tumefaciensから得られるバクテリオフィトクロムAgp1は,植物フィトクロムとは異なるN末端付近のシステイン残基でBVと共有結合していることが見出されていたが,その結合部位は不明であった。そこで種々のBV誘導体を合成し,in vitroでの再構成実験を行うことにより,BVはA環3位のビニル基で共有結合していることを明らかにした。植物は太陽光をエネルギーとして利用するための光合成系だけでなく,光環境の変化に適応するための多様な光受容系を構築した。これらの光受容系は,光に反応するために欠かせない「発色団」を構成成分としてもつ色素蛋白質である。フィトクロムは生理学的に不活性で赤色光吸収型のPr型と,生理的に活性で遠赤色光吸収型のPfr型との間で可逆的に相互変換する。この「赤・遠赤色光可逆的反応」は,植物の発生や成長・分化などの様々な過程に広く関係して,環境の光情報を植物に伝える重要な役割を果たしており,植物が生きて行くために欠くことのできない調節作用の一つである。テトラピロール発色団であるフィトクロモビリンは,天然から極めて少量しか得られず,不安定な上に精製も極めて困難である。そこで本研究では,発色団の構造変化と再構成フィトクロムの機能との相関や,アポ蛋白質と発色団との相対的配置ならびに相互作用などの解明,さらにシグナル伝達機構および光合成系遺伝子発現・調節機構の解明など,この分野を飛躍的に発展させるために,これまで合成が困難とされてきたフィトクロモビリン及びその誘導体の新合成法の確立など,フィトクロム発色団の構造と機能に関する有機合成化学的アプローチを試み,次のような成果を得た。1.アポ蛋白質と結合可能な遊離の側鎖カルボン酸を有し,Pf型およびPfr型で立体化学を固定した発色団の簡便合成法を開発した。2.立体化学を固定した発色団とアポ蛋白質の再構成に成功した。3.再構成フィトクロム蛋白質の結晶化を試み,X線構造解析実現へ向けて有用な知見を得た。4.光標識化部位を導入した構造・機能探索分子としての発色団の合成に向け,基本的な合成反応を検討し,好結果を得た。5.光学活性な発色団の合成を目指し,酒石酸エステルを不斉源として活用する高効率・高選択的なエナンチオ選択的反応を開発した。植物内に存在する光受容色素蛋白質フィトクロムは,生理学的に不活性で赤色光吸収型のPrと,生理学的に活性で遠赤色光吸収型のPfrとの間で可逆的に相互変換することにより,植物の発生や成長・分化などの様々な光形態形成を制御する上で重要な役割を果たしている。
多孔スリットを用いた陽電子顕微鏡の製作とその応用

電子顕微鏡は広く利用されているが、電子の代わりに陽電子を用いると思わぬ効果が期待される。電子は原子の存在する場所が見えるが、陽電子顕微鏡は原子のない部分を浮き彫りに出来る可能性がある。陽電子源としては^<58>Co、^<22>Naを使用した。交付申請書では^<64>Cuとしたが、実験の結果^<64>Cuは陽電子と同時に電子も放出するので、電子,陽電子の効果を分離するため、^<58>Co、^<22>Naを使用した。銅箔、ニッケル箔。^<22>NaClを京都大学原子炉実験所の原子炉で気送管中性子照射し、陽電子線源とした。0.5mm直径、長さ5cmの銅パイプを1,000本束ねて、その上に陽電子線源を置き、それを通して、フィルムまたはイメジングプレートに像を作らせた。種々の形の像が得られ、大成功裡に実験をすることが出来た、とくにイメジングプレートに陽電子が感じることが明らかになり、今後陽電子の積分レコ-デイングとして使えることがわかった。これを、さらに発展させて陽電子線量dとイメジングプレートの感度αすなわち、特性曲線を得ることができた。驚くべきことには特性曲線はa=Kdという関係が4桁にわたって成立することがわかった。陽電子のイメジングプレートへの応用は世界で最初の実験である。イメジングプレートは位置分解能も決してフィルムに劣らないことも証明された。今後イメジングプレートの陽電子への応用をテーマに研究を発展させたい。銅箔、ニッケル箔。
化学物質による水棲哺乳類細胞内受容体シグナル撹乱と感受性を規定する分子機構の解明

本研究の全体構想は、水圏生態系の頂点に位置し、進化学的に独自の分類群に属する水棲哺乳類の細胞内受容体のシグナル伝達系を対象に、環境汚染物質による系の撹乱を先端技術によって解析し、種特異的な感受性を評価することである。さらにその知見を基に、種差の原因となる感受性規定因子の分子的な理解を目指す。水圏生態系の頂点に位置する水棲哺乳類の細胞内受容体のシグナル伝達系を対象に、環境汚染物質による系の撹乱を解析し、種特異的な感受性を評価、更に種差の原因となる感受性規定因子の分子的な理解を目指す。鰭脚類・鯨類を対象種とし、多様な環境汚染物質の曝露が引き起こすシグナル伝達撹乱の全体像を明らかにし、細胞内受容体シグナル伝達撹乱の種特異的感受性とそれを規定する遺伝要因を分子レベルで解明する。アザラシ、イルカ、クジラを代表例として、化学物質による細胞内受容体機能の撹乱を現代的な解析方法で測定しようとするものであり、膨大なデータをどのように解析するか、方策を明確に示している。具体的な標的受容体も定めつつ、全ゲノム機能もカバーする研究であり、生体濃縮、生体反応物の網羅解析で新規の生化学ルートが見つかることも期待される。
繊維芽細胞増殖因子受容体3の膜貫通部位の機能構造解析

繊維芽細胞増殖因子受容体3は細胞の増殖や分化に関与している1回膜貫通型の受容体である。膜貫通-膜近傍部位の構造機能解析から、受容体の活性化における膜貫通-膜近傍部位の役割を明らかにすべく研究を行っている。野生型と膜貫通部位に常時活性型変異が見出されているG380R変異型とA391E変異型の膜貫通-膜近傍部位の構造比較解析を行い、活性化における膜貫通-膜近傍部位の機能を考察する。24年度は蛍光実験により野生型の細胞質内膜近傍部位は脂質二重膜と結合し、G380R変異型とA391E変異型の膜近傍部位は脂質二重膜から解離していることがわかった。本年度はこの膜近傍部位の挙動の要因となる膜貫通部位の構造を偏光FT-IRを用いて解析した。その結果、G380R変異型とA391E変異型の膜貫通ヘリックスは野生型と比較して脂質二重膜に対してより垂直に近い角度で配向していることがわかった。次に異なる厚さの脂質二重膜に野生型の膜貫通-膜近傍部位を挿入し膜貫通ヘリックスの配向を変化させたときの膜近傍部位の挙動を蛍光実験にて観察した。その結果、野生型の膜貫通ヘリックスをより垂直に近い角度で配向させたとき細胞質内膜近傍部位が膜から解離した。これらのことから膜貫通部位の脂質二重膜に対する配向と膜近傍部位の膜からの解離には相関があると考えられる。この結果に関する論文は現在投稿中である。さらにリガンド結合に伴った膜貫通-膜近傍部位の構造変化を捉えることを目標とした半合成受容体の調製方法の確立を行った。24年度は合成ブロックの調製方法を確立し、収率は低いものの半合成受容体の調製は成功した。本年度は縮合方法の最適化と解析に必要な量の調製を試みたが、スケールアップに伴い確立した調製方法が使用できなかったため、現在再検討を行っている。昨年度、半合成受容体の調製においての細胞外領域と膜貫通-膜近傍部位の合成ブロックの調製に関しては確立したが、構造解析に必要な量の試料の調製を行うため、スケールアップを行ったところ昨年度確立した方法を用いることができず、再度検討が必要となったため。スケールアップした調製方法を確立するとともに、縮合条件の検討を行う。また、大量な試料が測定に必要なため大腸菌の発現系を用いて合成ブロックを得ていたが、目的蛋白質はヒト由来の蛋白質であるため、哺乳細胞の発現系を用いた合成ブロックの調製方法の確立とその哺乳細胞で得られた合成ブロックと膜貫通一膜近傍部位の合成ブロックの縮合反応の検討を行う予定である。受容体型チロシンキナーゼの一つである繊維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)の野生型と膜貫通部位に活性型変異をもつG380R変異型の膜貫通一膜近傍部位配列ペプチドの脂質二重膜中における構造比較を行い、活性化機構における膜貫通一膜近傍部位の役割を考察した。C末端に蛍光物質を導入した膜貫通一膜近傍部位配列ペプチドを用いた蛍光実験により、野生型は脂質二重膜と結合しており、G380R変異型は脂質二重膜から解離していることが考えられる結果が得られた。異なるファミリーに属しているErbB2/Neuにおいても同様の結果が得られており、膜近傍部位の脂質二重膜からの解離が受容体の活性化において重要な因子となるモデルを提唱している。FGFR3に関しても同様のモデルが成り立つと考えている。しかし、受容体の活性化機構における膜貫通一膜近傍部位の役割を理解するにはリガンド結合に伴う膜貫通一膜近傍部位の構造変化を捉えることが必要である。そこで固体NMRや蛍光実験を中心とした各種分光学的手法を用いてリガンド結合に伴う膜貫通一膜近傍部位の構造変化を捉えるべく、膜貫通一膜近傍部位のみが部位特異的標識された試料の調製を行うこととした。合成化学的に調製した膜貫通一膜近傍部位と大腸菌による発現で得られた細胞外領域を縮合することにより試料を調製する。合成ブロックである膜貫通一膜近傍部位と細胞外領域の単離精製、各種溶媒に難溶な膜貫通一膜近傍部位の中性水溶液中での溶解を可能とする界面活性剤の選択は完了している。また、抵効率ではあるものの縮合条件の探索も完了している。今後、さらに反応効率を上げる条件を探索し、測定に必要な量の試料を得、脂質二重膜に包埋し、測定を行う予定である。

次に異なる厚さの脂質二重膜に野生型の膜貫通-膜近傍部位を挿入し膜貫通ヘリックスの配向を変化させたときの膜近傍部位の挙動を蛍光実験にて観察した。その結果、野生型の膜貫通ヘリックスをより垂直に近い角度で配向させたとき細胞質内膜近傍部位が膜から解離した。これらのことから膜貫通部位の脂質二重膜に対する配向と膜近傍部位の膜からの解離には相関があると考えられる。この結果に関する論文は現在投稿中である。さらにリガンド結合に伴った膜貫通-膜近傍部位の構造変化を捉えることを目標とした半合成受容体の調製方法の確立を行った。24年度は合成ブロックの調製方法を確立し、収率は低いものの半合成受容体の調製は成功した。本年度は縮合方法の最適化と解析に必要な量の調製を試みたが、スケールアップに伴い確立した調製方法が使用できなかったため、現在再検討を行っている。半合成受容体を調製するために必要な合成ブロックである細胞外領域と膜貫通。膜近傍部位は単離精製することに成功しており、また、各種難溶な膜貫通-膜近傍部位の中性水溶液中での溶解条件の検討も完了している.低効率ではあるが、ライゲーション反応も成功しており、1年目の研究成果として判断するとおおむね順調に進展しているといえる。昨年度、半合成受容体の調製においての細胞外領域と膜貫通-膜近傍部位の合成ブロックの調製に関しては確立したが、構造解析に必要な量の試料の調製を行うため、スケールアップを行ったところ昨年度確立した方法を用いることができず、再度検討が必要となったため。今後、「11.現在までの達成度」で述べたライゲーション反応の再現性をとるとともに、単離精製し、測定に必要な量の半合成受容体を得る予定である。測定に必要な量の半合成受容体の調製方法を確立したのち、リガンド結合に伴う膜近傍部位の挙動変化を蛍光実験で観察するため、C末端に蛍光物質を導入した膜貫通一膜近傍部位と細胞外領域を確立したライゲーション反応を用いて縮合し、脂質二重膜に包埋し、蛍光実験の試料を調製する。その試料を用いて、リガンド結合に伴った膜近傍部位の挙動を蛍光実験で観察する。スケールアップした調製方法を確立するとともに、縮合条件の検討を行う。また、大量な試料が測定に必要なため大腸菌の発現系を用いて合成ブロックを得ていたが、目的蛋白質はヒト由来の蛋白質であるため、哺乳細胞の発現系を用いた合成ブロックの調製方法の確立とその哺乳細胞で得られた合成ブロックと膜貫通一膜近傍部位の合成ブロックの縮合反応の検討を行う予定である。
心筋障害ストレスに対する心筋保護機構：ＳＯＣＳによる細胞内シグナル調節の視点から

虚血再潅流心筋障害モデルやドキソルビシン心筋障害モデルにおいて、心筋特異的SOCS3欠損マウス(SOCS3-CKO)の心筋障害が抑制されることを見いだした。その機序として、細胞死であるアポトーシス関連遺伝子群とミトコンドリア機能やエネルギー代謝に関わる遺伝子群が重要であることも明らかになった。本研究によって、虚血や薬剤などの障害ストレスによる心筋保護機構に、JAK-STAT3経路の負の制御因子であるSOCS3が重要であることが示された。今後、心筋のSOCS3が急性心筋梗塞や梗塞後心不全の新しい治療標的となることが期待される。虚血再潅流心筋障害モデル、ドキソルビシン心筋障害モデルやリポポリサッカライド(LPS)心筋障害モデルなどにおいて、心筋特異的SOCS3欠損マウス(SOCS3-CKO)の心筋障害が抑制されることを見いだした。野生型マウスでは、再潅流3時間後にSOCS3の発現を認め24時間後まで持続していた。SOCS3の発現と逆相関するようにSTAT3の活性化は抑制されていた。SOCS3-CKOマウスの心臓では再潅流後のSTAT3の活性化が遷延増強していた。SOCS3-CKOマウスの心臓では、TUNEL染色により評価した心筋アポトーシスが野生型マウスに比べ優位に抑制されていた。アポトーシス関連分子のなかで、Bcl2ファミリーのアポトーシス抑制遺伝子Mcl-1の発現亢進をSOCS3-CKOマウスにおいて認めた。SOCS3-CKOマウスにおいて虚血再潅流後の心筋障害が抑制される機序をさらに明らかにするためにマイクロアレイ解析を行った。その結果、細胞周期に関連する遺伝子群、炎症反応に関連する遺伝子群、さらには細胞外刺激に反応し創傷治癒に関連する遺伝子群が、野生型マウスと比較しSOCS3-CKOマウスにおいて異なって発現調節を受けていることが明らかとなった。細胞周期に関連する遺伝子群にはCcna2, Ccnb2, Cdc7, Cdc23, Cdca5, Cdkn3, Top2aなどが含まれ、炎症反応に関連する遺伝子群にはNfkb2, Relb, Il1b, Il6, Nfkbiaなどが含まれていた。細胞周期に関連する遺伝子の役割は不明であるが、SOCS3-CKOマウスにおいて虚血再潅流後の心筋障害が抑制される機序に炎症経路の活性化の変化が深く関わっている可能性が示唆された。最終年度に得られた研究成果は、ドキソルビシン心筋障害の病態におけるサイトカイン機能調節因子SOCS3 (suppressor of cytokine signaling-3)の機能解明と、SOCS3が虚血再潅流心筋障害の新たな治療標的となる可能性を明らかにした点である。心筋特異的SOCS3欠損マウス(SOCS3-CKO)において、ドキソルビシンによる心筋障害が優位に抑制されることは、既に明らかにしていたが、今年度、マイクロアレイ解析を行ったことにより、野生型マウスではドキソルビシンによる心筋障害によって発現が低下する遺伝子の中で、ミトコンドリア機能やエネルギー代謝に関わる遺伝子群がSOCS3-CKOの心臓において発現が優位に保たれていることが明らかとなった。今回のマイクロアレイ解析の結果より、心筋のSOCS3が欠失することにより、SOCS3によって負に制御されるJAK-STAT3経路の活性化が増強遷延化し、ミトコンドリア機能やエネルギー代謝に関わる遺伝子群の発現が保持され、結果としてドキソルビシンによる心筋障害が抑制されることが明らかとなった。一方、虚血再潅流心筋障害マウスに心筋保護効果を有するエリスロポイエチンを投与したところ、野生型マウスに比べ、SOCS3-CKOマウスでは、心筋梗塞が優位に抑制されていた。この結果は、心筋のSOCS3が欠失することにより、心筋保護を有するサイトカインの効果を増強できることを示していると考えられる。研究期間全体を通じて得られた結論は、虚血や薬剤などの障害ストレスによる心筋保護機構にSOCS3が重要であり、心筋のSOCS3がこれらの病態の治療標的となる可能性があるということである。虚血、圧負荷、感染や薬剤などのストレスによって心筋は障害を受け、心筋障害は心不全の要因となる。JAK経路を活性化するサイトカインがこれらの心筋障害を抑制することが知られている。我々はSOCS (suppressor of cytokine signaling)によるJAK経路の抑制機構を報告し、心筋特異的にSOCSの発現を抑制することによりストレス環境下における心筋障害が抑制できることを明らかにしている。本研究では、心筋のSOCS抑制による心筋保護機構を明らかにし、心筋保護に関わる新たな遺伝子の同定を行。

平成23年度は、心筋梗塞後心不全モデル、虚血再灌流心筋障害モデル、エンドトキシン急性心不全モデルにおける、JAK-STAT-SOCS経路の活性化について検証した。また、心筋特異的SOCS3ノックアウトマウス(SOCS3-CKO)にこれらのモデルを作成し、循環生理学的解析、生化学的解析、組織学的解析等を行い、これらの病態におけるJAK-STAT経路とSOCS3の役割について検討した。いずれのモデルにおいても、STAT3を活性化するサイトカイン(IL-6, LIF, G-CSFなど)の発現が心臓で高度に発現していた。STAT3のリン酸化とSOCS3の発現もこれらのモデルで観察され、SOCS3-CKOではコントロールマウスと比較し、心筋梗塞後リモデリング、虚血再灌流心筋障害、エンドトキシンによる急性心不全が優位に抑制された。SOCS3-CKOにerythropoietinを投与によって、SOCS3-CKOにおける心筋障害はさらに抑制された。このように、心不全の要因となるストレスによる心筋障害にJAK-STAT-SOCS経路が深く関わることが明らかとなった。本研究の目的は、心筋のSOCS3抑制による心筋保護のメカニズムを明らかにし、本機序に関わる遺伝子を同定することである。現在までに、虚血再潅流心筋障害、ドキソルビシン心筋障害やLPSによる心筋障害などのいずれのストレス下においてもSOCS3-CKOマウスの心筋障害が抑制されることを明らかにしている。これまでに、虚血再潅流心筋障害モデル、ドキソルビシン心筋障害モデルにおけるマイクロアレイ解析を行い網羅的に発現遺伝子を解析できいる。心筋細胞のSOCS3抑制による心筋保護機構について、特に、アポトーシス、ミトコンドリア関連遺伝子や炎症経路が重要であることを見いだすことができている。心筋梗塞後心不全モデル、虚血再灌流心筋障害モデル、エンドトキシン急性心不全モデルなどの心不全モデルを確立できている。特に、虚血再灌流による心筋障害の評価を行うためのエバンスブルー・TTC染色の手技は、循環器領域の実験手技において最も難易度が高いといわれているが、再現性をもってきれいな染色ができるようになっている。Real-time PCRによるJAK-STAT3を活性化するサイトカインがこれらのモデルで高度に上昇していることを見いだし、STAT3の活性化とSOCS3の発現が逆相関することから、これらの病態において、我々が焦点をあてている細胞内情報伝達経路とその制御系が深くかかわっていることを明らかにすることができた。さらに、SOCS3-CKOでは、心筋梗塞後リモデリング、虚血再灌流心筋障害、エンドトキシンによる急性心不全が抑制されることを見いだすことができており、これらの病態における治療標的にSOCS3がなり得ることが示すことができた。さらに、SOCS3が心筋特異的に欠失している状態では、erythropoietinなどのサイトカインの心筋保護効果が高まることがわかり、急性心筋梗塞のサイトカイン療法におけるSOCS3の重要性も明らかにできている。このように、当該年度の達成度としては概ね順調であると考えられる。心筋細胞のSOCS抑制による心筋保護機構について、特に、アポトーシス、ミトコンドリア障害、酸化ストレス、DNA障害などの関与について解析を進める。
NBS1依存性相同組換えの放射線生物影響における意義

<NBS1のHRにおける機能ドメインの同定>NBS患者由来繊維芽細胞株を正常NBS1 cDNAにより相補したところ、放射線感受性とHR能が共に回復したことから、ヒト細胞においてもNBS1がHRに重要であることが判った。次に、種々の変異型NBS1 cDNAを作成し、一過的に発現させてHR頻度を測定することでHR修復に重要なNBS1の機能ドメインを検索したところ、N末端のFHA及びBRCTドメインとC末端のMIE11結合ドメインがHRに重要であることが明らかになった。また、ATMによりリン酸化される部位はHRには必須ではないことも判明した。これらの結果から、NBS1はMRE11/RAD50複合体をDSB周辺のクロマチンヘリクルートすることによりHRに機能すること、ATM非依存的に機能できることが示唆された。<他のHR因子との関連性の検討><NBS1のHRにおける機能ドメインの同定>NBS患者由来繊維芽細胞株を正常NBS1 cDNAにより相補したところ、放射線感受性とHR能が共に回復したことから、ヒト細胞においてもNBS1がHRに重要であることが判った。<他のHR因子との関連性の検討>
日本の貿易・直接投資が東アジアの環境汚染に与える影響についての研究

本研究では、途上国の側から汚染産業の移転が環境クズネッツ曲線に与えた影響を検討した。中でも、東アジア諸国に焦点をあて、日本及び米国と東アジア諸国との間における、汚染産業(鉄鋼・化学・窯業等)の貿易が、東アジア諸国の環境クズネッツ曲線に与えた影響を分析した。具体的には、1988年2000年における東アジア10カ国のCO_2排出量を、貿易依存度、製造業比率、環境汚染産業の対日米貿易を用いて推計した。分析の結果、東アジアから日本への環境汚染財の輸出増、及び製造業比率が、東アジアのCO_2排出量の増加につながることが分かった。一方、汚染産業の対米貿易は東アジアの環境クズネッツ曲線に対する影響は見られなかった。この研究の成果は、松浦克己・広島大学教授との共著として、2006年度には、口頭で大阪市立大学経済学会特別研究会で報告され、Journal of the Korean Economyという査読付雑誌に掲載された。なお、このほかに、貿易とは直接関係はないものの、環境問題に関連する研究として、環境に関連するニュースが、国内企業の株価にどのような影響を与えるのか、という研究も同時に平行して行った。その内容は、長山昌平・東京大学大学院工学系研究科修士課程在籍、及び、友澤孝則・東京大学大学院工学系研究科修士課程在籍との共著として、口頭では、Asia-Pacific Economic Association 2006年年次総会、日本経済学会2006年秋季大会で発表され、一部は査読付雑誌(レターズ)のEconomics Bulletinに掲載された。残りの分析については、別の英文査読誌に投稿中である。一方、2006年度初めに予定していた、東アジアの貿易に関する分析を拡張した研究-(1)CO_2以外の環境汚染指標(SO_2,NO_x, BODなど)についても成立するかどうか、あるいは(2)東アジア諸国の環境汚染問題が、欧州諸国との貿易関係によって影響されるのかどうか-については、上記の活動のため、進展が遅れており、2006年度中には成果が出ていないことをお詫びを含めて報告する。中でも、東アジア諸国に焦点をあて、日本及び米国との汚染産業貿易が環境クズネッツ曲線に与えた影響を分析した。また、比較のため、ラテンアメリカ諸国における環境汚染がアメリカとの貿易によってどのような影響を受けるのかについても研究を進めた。具体的には、1986年から1999年におけるラテンアメリカ14カ国のCO_2排出量を、貿易依存度、製造業比率、環境汚染産業の対米貿易を用いて推計した。分析の結果、ラテンアメリカから米国への環境汚染財の輸出増が、ラテンアメリカのCO_2排出量の増加につながる反面、輸入は排出量減少につながることが分かった。なお、本研究を実施するに当たって、東アジアの研究部分については、平成16年11月平成17年10月まで野村財団からも研究助成を受けたことを報告する。野村財団の研究助成については、平成17年度の科研費申請書類作成時点では、合否が判明していなかったので、事後報告になったことをお詫びする。
大久野島毒ガス傷害者にみられる気管支前癌病変の分子生物学的解析

毒ガス傷害者のうち、強曝露群(イペリット・ルイサイトの製造に直接従事した者)を中心に、約60例について、気管支分岐部生検を実施した。1例について、25点の分岐部より組織を採取し、194切片を得た。採取した組織は、ホルマリン固定後、パラフィン包埋した。病理組織学的診断として、異形成5例(2.6%)偏平上皮化生14例(7.2%)移行上皮化生24例(12.4%)基底細胞増生42例(21.6%)杯細胞増生43例(22.2%)を得た。これらのパラフィン包埋材料よりDNAを抽出し、Kーras遺伝子領域をPCR法により増幅した。codon12、13、61について、Dot hybridization法により点突然変異の有無を検索したが、現在まで、変異は検出されていない。検出感度の向上を図るため、S.Leviらによるdesigned primer(Cancer Research 51,3497ー3502,1991)を用い、designed RFLPs法を行い、検索を進めている。尚、p53遺伝子exon58の点突然変異の有無について、PCRーDGGE法による検索を開始した。毒ガス傷害者90例について、血清Anti BAST(Basal Aspect of Syncytiotrophoblast)抗体価を測定した。抗原として、ヒト胎盤凍結切片を用い、被検血清を一次抗体とし、RITC標識抗ヒトμ鎖抗体を二次抗体として用いた。X8以上の陽性例は、31例(34.4%)であり、広島における近距離原爆被爆者に匹敵するものであった。
水と磁場との相互作用:構造と物性

磁束変化に伴う水の構造・物性変化を検証し,溶存酸素を含む場合にのみ純水の磁気処理効果を確認した。ラマンスペクトルや接触角,粘度,蒸気圧に変化がみられ,これらの間の相関は高かった。磁気処理効果の出現・消失には誘導時間が必要であり,数十分にわたる記憶効果を示した。これらはハイドレート形成時にも見られ,磁気処理による水のラマンバンド変化から示唆されるハイドレートあるいは過冷却水様構造形成と矛盾しない。「水の磁気処理効果」に対して,科学的観点から厳密に雰囲気と条件を制御して,磁束変化に伴う水の構造と物性の変化を検証した。新規購入した遠隔測定用ファイバーラマン装置によって水を磁気処理しながらラマンスペクトルをその場測定した。真空脱気された蒸留水のラマンスペクトルは磁気処理によって変化しなかったが,酸素を溶存した蒸留水は磁気処理によって水由来の進藤バンドが大きく変化した。接触角の変化した磁気処理水は粘度も低下し,よい相関を示した。この変化は,添加物の水構造への効果とよい相関を示した。また,磁気処理効果は1時間以上保持され,記憶効果を示した。これらの結果は,水の磁気処理変化は水の構造変化を伴うものであることを示唆している。これまでの赤外吸収スペクトル変化に矛盾しない結果となった。また,1msのパルス磁場の繰り返し照射によっても磁気処理効果が観測された。一方,静磁場下の純水や塩水溶液の熱分析をin-situ DSCで行ったところ,磁場下で凍結した共晶の融点がわずかにシフトすることが確認された。以上の結果から,水は磁場と相互作用して構造や物性を変化させ,その程度は静的磁場よりも動的磁場中の方が顕著であることがわかった。水の磁気処理効果に対して,科学的観点から厳密に雰囲気と条件を制御して,磁束変化に伴う水の構造と物性の変化を検証した。昨年度購入した遠隔測定用ファイバーラマン装置によって水を磁気処理しながらラマンスペクトルをその場測定して,4004000cm^<-1>の範囲の水由来のすべてのバンド(水素結合を含む)強度が増加するという前年度の結果をほぼ再現できた。磁気処理水の保存に関する基礎検討を行い,温度や時間などの条件を検討した。磁気記憶の時間を10倍以上にできる感触を得た。接触角の低下した磁気処理水は粘度の低下やラマンバンドの増加の他,めっき液に使用すると銅めっきの効率やめっき相の高品質化をもたらした。1msのパルス磁場の繰り返し照射は,磁気処理と同じ効果を与えうることがわかった。このことから,磁束と水との相対運動が磁気処理効果には必要であることが再確認できた。この効果はパルス照射回数に依存し,数回で飽和する傾向がみられた。水および電解質水溶液の凍結電位への静磁場効果を電位の他,X線回折や本年度購入のDSC装置を用いて検討した。凍結電位は磁気処理によっては変化しなかったが,磁場中凍結にともなう凍結電位は低下した。また,ラマンバンドの変化も観測されたが,相関性や再現性は今後さらに検討が必要である。昨年度までに,科学的観点から厳密に雰囲気と条件を制御して,磁束変化に伴う水の構造と物性の変化を検証し,水の磁気処理効果を確認した。磁場中測定用ファイバーラマン装置で確認された磁気処理中の水のスペクトル変化を,磁場外の高感度ラマン装置で記憶として再確認した。真空蒸留した水に酸素を溶存させた場合にのみ,ラマンスペクトルや接触角,粘度,蒸気圧に変化がみられ,これらの間の相関は高かった。磁気処理効果の出現には誘導時間が必要であり,また,この効果は磁気処理終了後数十分にわたる記憶効果を示した。記憶の消失にも誘導時間がみられた。このような現象は,最近10年ほどの間に報告されるようになった,種々のクラスレートハイドレート形成時の誘導時間やハイドレート溶解後の再結晶化の際の構造記憶と酷似する。クラスレートハイドレート中の水の伸縮ラマンバンドは磁気処理前後の水の差スペクトルの形状とよく似ていた。また,このバンド形状は過冷却水のスペクトルとも似ていることから,磁気処理水は準安定状態の構造が関わっており,誘導時間や記憶効果はその形成や崩壊に関連していると推察される。磁気処理効果は磁気処理水を水に80%以上混合したときに初めて出現し,磁気処理時間とともに純安定状態が形成され,また,磁気処理終了後の時間経過とともに消失すること,つまり誘導時間の存在と矛盾しない。磁気処理による水物性の変化や機能発現は構造由来であり,この純安定な構造は保存されることが分かった。
原始太陽系と惑星の起源

重点領域研究「原始太陽系と惑星の起源」に関し、i)太陽系星雲の起源と変遷、ii)臣大惑星の起源と進化、iii)隕石の起源と母天体、iv)地球型惑星の起源と構造、v)惑星の大気の起源と変遷、vi)太陽系の起源にかかわる惑星探査の基礎、の6班を構成し、昭和62年度より平成元年度までの3年間にわたり研究を推進した。本研究はこの重点領域研究の成果をとりまとめ、その資料に基づき欧文出版を行い、成果を広く世に残すことを目的としている。成果取りまとめ及び出版編集会議は4回開催され、全般にわたる研究成果の評価、検討を行った。その結果、本重点領域研究が太陽系形成の研究に果たした大きな貢献を欧文図書として刊行することが決定された。出版される欧文図書は、国際的に広いレベルで、太陽系星雲の誕生、その中での巨大惑星の誕生、地球型惑星の研生、そして隕石によるその足取りの解明、惑星の大気の生成と変遷を内容とし、広く一般にも理解されるものであると同時に、先導性を持ってわが国のこの方面における学術のレベルを上げ、次代の研究者の養成にも不可決な資料としての意義を持つものである。第1章太陽系星雲第2章巨大惑星の起源第3章小天体と地球型惑星の起源第4章隕石の起源第5章惑星大気の変遷第6章太陽系の探査を内容として、執筆・編集が進められた。本年度内に全ての作業が終了し、本研究の目的が達成された。
胎児性胆汁酸を指標とする先天性肝胆道疾患診断法の開発

先天性肝胆道疾患の早期診断・治療法の開発を究極の目標とし、高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)による胆汁酸の高感度系統分析法を確立し、尿試料へ適用して胎児性胆汁酸の由来並びに抱合型式を解明した。ついで、胎児ー新生児に固有の胎児性胆汁酸に対する特異抗体を作成しラジオイムノアッセイ(RIA)による先天性胆道閉鎖症(CBA)のマススクリ-ニング法としての基盤を確立した。【HPLCによる尿中胎児性胆汁酸の抱合様式の解析】固定化3αーhydroxysteroid dehydrogenaseカラムをHPLCのポストリアクタ-とし、生成するNADHの1ーメトキシフェナジンメトサルフェ-トによる化学発光検出によって抱合型胎児性胆汁酸のpmolオ-ダ-での一斉分析を可能とした。ついで本法を尿中胆汁酸組成の解析に適用し、新生児期にはタウリン抱合型1β及び6α水酸化胆汁酸が主要成分であり、成人とは異なる胆汁酸代謝様式の存在を実証した。【RIAによる先天性胆道閉鎖症マススクリ-ニング法の開発】抱合型1βー水酸化コ-ル酸に高い特異性を有するRIAを開発し、新生児、健常女子、妊娠尿中の本胆汁酸レベルを解析し、胎児ー新生児期には胆汁酸が1β水酸化によって尿中へ特徴的に排泄される1β水酸化代謝経路が存在することを確証した。ついでこれらの知見を基にして血液浸染乾燥ろ紙中本胆汁酸の微量定量法を開発し、生後5日のCBA患児に適用した。その結果、健常児(0.97mg/disc)に比しCBAでは2.35ng/discの有意に高いレベルであり、本法が迅速性とともに簡便性にも優れたマススクリ-ニング法として臨床応用しうることが明らかとなった。先天性胆汁酸代謝異常症のマススクリ-ニングによる早期診断治療を究極の目標にかかげ、今年度はイムノアッセイに必要不可欠な試薬として、胎児新生児に特有な胆汁酸の特異抗体を調製した。又、精密診断の基盤として、高速液体クロマトグラフィ-による高感度系統分析法を確立し、尿試料へ適用して胎児性胆汁酸の由来並びに抱合様式を解明した。1)グリシン抱合型1β,3α,7α,12α-tetrahydroxy-5β-cholan-24-oic acid(I)をハプテンとして側鎖カルボキシル基を介して結合したウシ血清アルブミン及びウシγグロブロン複合体をウサギ、モルモット、ラット、マウスに免疫して抗血清を作成した。^<125>I標識ヤギ抗ウサギIgGをB/F分離の第二抗体に用いる力価検定の結果、ウサギで産出した抗血清が1001000倍の希釈率で優位に結合親和性を示し、種による抗体産出能の違いが認められた。他方、Iの^<125>I標識ヒスタミン誘導体を抗原としたアッセイ系ではブリッジ現象に帰因した親和力の低下を招来し、ELISA法確立に向けての基礎的知見が得られた。2)固定化3α-hydroxysteroid dehydrogenaseカラムをHPLCのポストリアクタ-とし、生成するNADHの1-メトキシフェナジンメトサルフェ-ト及びミクロペルオキシダ-ゼ/イソルミノ-ルによる化学発光検出によって胎児性胆汁酸のpmolオ-ダ-での高感度一斉分析を可能ならしめた。又、本法の尿試料への応用に際し必須となるsolvolysis条件に改良を加え定量精度の向上が達成された。

更に本法を適用して尿中胆汁酸組成を精査したところ、新生児期にはタウリン抱合型1β及び6α水酸化胆汁酸が主要成分として排泄されることが判明し、成人とは異なる代謝様式の存在が実証された。更に、病態との関連から生体肝移植患児の尿中胆汁酸成分を検索した結果、健康成人に近似した組成の排泄様式を示し、消化管機能の回復状況が本法によって明白になった。Tauroー1 βーhydroxycholic acid (TauroーCAー1 βーol:1)の“ブリッジヘテロロ-ガス"酵素イムノアッセイ(EIA)を確立すべく、17位アルキル側鎖の炭素鎖長の異なる2種のハプテンを用いて抗血清を作成し、〔^3H〕ーRIAにおける特異性を検討するとともに尿試料への適用を試みた。【抗TauroーCAー1βーo1抗血清の調製】1の17位アルキル側鎖は各種胆汁酸に共通の部分構造であるうえ、ハプテン分子の特徴的な母核構造から遠く離れた位置にあり、特異抗体の作成上有利と思われる。そこで、EIAへの展開をも考慮し24位グリシンおよびβーアラニン誘導体をハプテンとしてウシ血清アルブミン結合体を調製し、ウサギの背部皮下に反復投与して抗血清を得た。【抗血清の特異性】特異性に優れるEIAの確立には、トリチウム標識抗原を用いるRIAで特異性が保証されることが必要とされる。そこで、標識抗原として【2ー^3H】tauroーCAー1βーo1を合成し、近緑胆汁酸との交差反応性試験により特異性を検討した。その結果、各抗血清はいずれも満足しうる至適希釈曲線を与え、用量作用曲線の感度(約50ー20000 pg)も良好であり、親和定数も高い値(1.251.46×10^9M^<-1>)を示した。コ-ル酸、ケノデオキコ-ル酸の体液中レベルは胎児ー新生児期にはCAー1βーo1とほぼぼ同量に達し、アッセイの妨害物質となるが、いずれの抗血清も0.050.94%と無視しうる低い交差反応性であった。これに対しglycoーCAー1βーo1とは100%近い反応性を示し、ハプテンのキャリア蛋白とブリッジ部位が17位アルキル側鎖に起因した結果が得られた。これらの結果、グリコ体をも含めた抱合型CAー1βーo1の測定には十分満足しうるものと思われる。そこで良好な結果を示した抗血清を用い、未熟児、健常女子、妊婦尿中レベルの測定を試みたところ、胎児一新生児期における胆汁酸の特徴的な1β水酸化代謝経路の存在を支持する結果が得られた。前年度までに開発したtaurol βーhydroxycholic acid(Tauro CAー1 βーol)のラジオイムノアッセイ(RIA)を先天性胆道閉鎖症(CBA)のマススクリ-ニング法として活用すべく、血液浸染乾燥ろ紙(DBS)中本胆汁酸の微量定量法を開発し患児に適用するとともに、ガスクロマトグラフィ-ー質量分析計(GCーMS)によるプロファイルアナリシスによって裏付けとなる胆汁酸組成の解析を試みた。【RIAによる先天性胆道閉鎖症のマススクリ-ニング法の開発】生後5日の新生児足踵より得られるDBS1disc(1/8inch:全血4μl)を緩衝液(0.1ml)中1時間超音波処理後、直後RIAに付し胆汁酸濃度を求めた。本法の添加回収率は86109%であり、変動係数は3.48.8%と信頼度の高いアッセイ法であった。健常新生児のDBS193検体を測定したところ、0.97±0.68ng/discであり、GCーMSで測定した結果とよく符合するものであった。これに対してCBA5検体では2.35±0.5ng/discと優位に高い値を示し、診断法としての可能性が示唆された。【GCーMSによるプロファイルアナリシス】胆汁酸を電子親和性の高い含
出芽酵母ゴルジ体の精製法の開発及びそれらを用いた逆行小胞輸送の解析

平成11年度には,出芽酵母early Golgiに局在するt-SNAREであるSed5蛋白質にmycタグを連結して免疫沈降法によりearly Golgi画分を特異的に濃縮することに成功した.本年度はlate Golgiに局在するt-SNAREであるTlg2蛋白質にmycタグを連結して同様の方法によりlate Golgi膜画分(Tlg2 vesicle)の精製を試みた.取得されたTlg2 vesicleに存在する蛋白質をまずウエスタンブロッテイングによりSed5 vesicleの蛋白と比較した.ER-Golgi間の膜輸送に関わるv-SNAREであるSec22蛋白質とゴルジ体での蛋白質の糖鎖修飾に関わるMnn9蛋白はSed5 vesicleに多く存在し,Tlg2 vesicleにはほとんど見いだされなかった.それに対してlate Golgiで働くエンドプロテアーゼであるKex2蛋白質はTlg2 vesicleにのみ存在し,late Golgiから出芽した輸送小胞のv-SNAREであるVti1とSft1蛋白質はそのほとんどがTlg2 vesicleに存在した.これらの結果はTlg2 vesicle画分にはlate Golgi膜画分が濃縮されていることを示しており,本研究により出芽酵母のearlyとlate Golgi体画分を簡便に分離精製することが可能になった.さらにまたSed5 vesicleとTlg2 vesicleを大量に調製して存在する蛋白質を2次元電気泳動により分離して両者のプロファイルを比較した.Tlg2 vesicleにのみ存在する蛋白質5種類に注目して,N末プロテインシークエンスにより同定を試みた.うち一つはlate Golgiから液胞へ輸送される蛋白質のレセプターであるVps10/Pep1であった.他の蛋白質についてはTOF-MSによる同定を行っている.出芽酵母のearly Golgi膜画分を免疫学的に単離するためのタグとして、early Golgiで機能するt-SNAREであるSed5蛋白を選択した。myc6-Sed5の融合蛋白をコードする配列を染色体上のSED5遺伝子と置換してmyc6-Sed5を唯一のSed5蛋白として持つ株を作製した。この株から坑myc抗体を用いて免疫沈降することによりSed5蛋白質の局在する膜画分(Sed5 vesicles)を単離することを試みた。免疫沈降で回収された膜画分をTriton X-100で可溶化した後にSed5 vesiclesに含まれる蛋白をSDS-PAGEとウェスタンブロッティングにより解析した。今まで存在の知られているマーカー蛋白による抗体を用いてSed5 vesiclesに存在する蛋白を調べたところ、Golgi体で蛋白の糖鎖修飾に関係しているMntl,Van1,Mnn9蛋白とER-early Golgiの膜輸送で機能しているYpt1,Sec22蛋白が多く回収されているのに対してERに局在する蛋白であるSec71蛋白とlate-Golgiに存在するプロテアーゼであるKex2蛋白はほぼ完全に除かれていた。さらにSed5 vesiclesを大量に調製、2次元電気泳動により分離してその構成蛋白質をプロテインシークエンシングにより固定した。その結果、ERから出芽するCOPII小胞へのカーゴの蛋白の濃縮に機能しているEmp24,Erv25,Erp1などの膜蛋白が見いだされた他、機能未知の膜蛋白であるYm1067cmも見いだされた。以上の結果からSed5をタグとして用いた免疫沈降により出芽酵母のearly,medial Golgi膜画分が効率よく単離できることがわかった。またYML067c遺伝子の解析も進めており、遺伝子欠損株の作製、HAあるいはmycタグの連結して局在、共沈してくる蛋白を検索することによりそのERあるいはGolgi体での機能を調べている。平成11年度には,出芽酵母early Golgiに局在するt-SNAREであるSed5蛋白質にmycタグを連結して免疫沈降法によりearly Golgi画分を特異的に濃縮することに成功した.本年度はlate Golgiに局在するt-SNAREであるTlg2蛋白質にmycタグを連結して同様の方法によりlate Golgi膜画分(Tlg2 vesicle)の精製を試みた.取得されたTlg2 vesicleに存在する蛋白質をまずウエスタンブロッテイングによりSed5 vesicleの蛋白と比較した.ER-Golgi間の膜輸送に関わるv-SNAREであるSec22蛋白質とゴルジ体での蛋白質の糖鎖修飾に関わるMnn9蛋白はSed5 vesicleに多く存在し,Tlg2 vesicleにはほとんど見いだされなかった.それに対してlate Golgiで働くエンドプロテアーゼであるKex2蛋白質はTlg2 vesicleにのみ存在し,late Golgiから出芽した輸送小胞のv-SNAREであるVti1とSft1蛋白質はそのほとんどがTlg2 vesicleに存在した.これらの結果はTlg2 vesicle画分にはlate Golgi膜画分が濃縮されていることを示しており,本研究により出芽酵母のearlyとlate Golgi体画分を簡便に分離精製することが可能になった.さらにまたSed5 vesicleとTlg2 vesicleを大量に調製して存在する蛋白質を2次元電気泳動により分離して両者のプロファイルを比較した.Tlg2 vesicleにのみ存在する蛋白質5種類に注目して,N末プロテインシークエンスにより同定を試みた.うち一つはlate Golgiから液胞へ輸送される蛋白質のレセプターであるVps10/Pep1であった.他の蛋白質についてはTOF-MSによる同定を行っている.
非定型炎症を伴う精神疾患モデル動物を活用したマイクロ精神病態の同定と分子機序解明

各種精神疾患モデルマウスの系統のうちヒト遺伝学的解析や死後脳解析での知見を考慮の上、最も妥当性の高いと考えられるSchnurri-2 KOマウスに特に注目し引き続き以下の解析を進めた。(1)遺伝的・環境的要因が脳の軽度慢性炎症を引き起こすメカニズムの解明:ジーンチップデータに基づいたバイオインフォマティクス解析により、炎症・神経過活動・「未成熟歯状回」の遺伝子発現パターンが非常に似ていることがわかってきた。環境的要因が脳の軽度慢性炎症を引き起こすメカニズムを調べるためストレス負荷モデルおよび神経過活動モデルマウスにおいて脳内分子発現変化の予備的解析を行った。今後匹数を増やして詳細な検討を行う。(2)脳の軽度慢性炎症が原因となって生じるマイクロエンドフェノタイプの同定:Schnurri-2 KOマウスを用いた3D電顕(電子顕微鏡)によるコネクトーム解析により、スパインレベルでの変化がわかりつつある。また、統合失調症患者とそのモデルマウスでは、DNAメチル化などのエピゲノム異常が生じている可能性が示唆されている。慢性炎症を呈するモデルマウスの脳においてどのようなエピジェネティクス変化が生じているか調べるためメチローム解析を行い、現在データの解析中である。さらに海馬のジーンチップデータのバイオインフォマティクス解析により炎症を始めとした各種の分子レベルでの表現型を正常化する可能性が考えられる薬剤を複数選定し、実際にマウスに投与した。現段階では行動レベルでのスクリーニングで顕著な効果はまだ得られていないが、今後さらに別の薬剤や複数の薬剤の併用などの検討を行う。また、当初の計画以上の進展としてジーンチップデータのインフォマティクス解析により統合失調症患者の前頭皮質が擬似的未成熟状態にある可能性があることが分かった。新たなマイクロエンドフェノタイプ同定への一助になると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。我々が「網羅的行動テストバッテリー」でのスクリーニングにより絞り込んだ精神疾患様の行動異常を示すモデルマウスなどを用い以下の解析を進めた。(1)遺伝的・環境的要因が脳の軽度慢性炎症を引き起こすメカニズムの解明:精神疾患様行動異常を示す遺伝子改変マウスについて、脳サンプルを用いたジーンチップ解析を行った。さらに、複数系統のモデルマウス(遺伝子改変マウスおよび薬剤投与を行ったマウスや神経過活動を誘導したマウス)の脳サンプルのジーンチップデータを用いてバイオインフォマティクス解析を行った。これにより複数のモデルマウスで共通して生じている分子変化を同定し、軽度慢性炎症を引き起こすコモンパスウェイの絞り込みを行った。その結果、これらのマウスに共通して変動するパスウェイとして、炎症関連パスウェイを含むいくつかのパスウェイが示唆された。脳に軽度の慢性炎症が生じているマウス系統・遺伝子をさらに同定していくと同時に、これらのパスウェイへの介入により、軽度慢性炎症の抑制、あるいは炎症に伴って生じる各種のマイクロエンドフェノタイプのレスキューができるか検討する。(2)脳の軽度慢性炎症が原因となって生じるマイクロエンドフェノタイプの同定:軽度慢性炎症を示すモデルマウスの脳において、共通した形態レベルでのマイクロエンドフェノタイプが無いかどうか探索する。患者死後脳とモデルマウスの海馬では、活動の弱いシナプスの除去を行うC1qファミリー分子が上昇している。この点に着目し、シナプス・スパインの形態を調べるため、Schnurri-2 KOマウスを用いて3D電顕(電子顕微鏡)によるコネクトーム解析を開始した。全体として概ね順調に進展していると言える。詳細は以下の通り。(1)遺伝的・環境的要因が脳の軽度慢性

炎症を引き起こすメカニズムの解明:ジーンチップ解析およびそのデータに基づいたバイオインフォマティクス解析は計画通り順調に進展している。(2)脳の軽度慢性炎症が原因となって生じるマイクロエンドフェノタイプの同定:エピゲノム解析については実験条件の検討に時間を要し、次年度に進展が期待できる。3D電顕によるコネクトーム解析を予定通り開始した。初年度において検討した条件や得られた知見に基づき、(1)遺伝的・環境的要因が脳の軽度慢性炎症を引き起こすメカニズムの解明、および(2)脳の軽度慢性炎症が原因となって生じるマイクロエンドフェノタイプの同定について、それぞれ本格的な解析を実施する。新たに、以下の項目についても実施する。(1)については、モデルマウスにおけるエピゲノムの異常について、メチローム解析などによる検討も行う。(2)では、ストレス負荷や神経過活動の誘導などの環境要因により、脳内での慢性炎症が生じるのか、また炎症に伴いどのようなマイクロエンドフェノタイプが生じるのか検討する。26年度が最終年度であるため、記入しない。
3価コバルトを酸化剤とする有機金属化合物等の連続分解/無毒化フローシステムの開発

本研究では、有機金属化合物として有機水銀(塩化メチル水銀、塩化エチル水銀、塩化フェニル水銀)を用いた。3価コバルトイオンでこれらを酸化分解し、その結果生成した水銀イオンを冷蒸気発生/原子蛍光法によって定量することで分解率を求める、フロー分析システムを開発した。3価コバルトイオンは極めて強い酸化剤ではあるが、非常に不安定で保存が難しいことから、同イオンを2価コバルトイオンの電解酸化により閉鎖系内で連続的に発生・供給することが可能なフロー式の電解装置を製作し、システムに組み入れた。3価コバルト発生のための電解電流やフローシステムにおける各試薬の流速等の諸条件を最適化したのち、有機水銀を完全に分解するために十分な条件について検討した。対照として、水銀量として同濃度(10ppb)の塩化第二水銀溶液を用い、これから得られる原子蛍光強度を100%として、各有機水銀の分解率を測定したところ、95°C以上の加温条件下で3価コバルト処理を行うことにより、反応コイル長を3mと短くしても、ほぼ100%の分解率が得られることがわかった。他の有機物が共存する場合、それが3価コバルトイオンを消費して、有機水銀の分解が妨害されることも予想されたが、グルコース、グリセロールおよびシステインの300ppmまでの共存は、特に影響を与えなかった。水銀の還元気化を妨害することが知られている各種無機イオンについては、共存許容濃度は次のとおりであった:Cl^-,3000;Br^-,1000;S_2O_3^<2->,300;S^<2->,30;I^-,3ppm。本法を、大学排水および河川水への有機水銀の添加回収試験に適用したところ、いずれの試料においても、ほぼ100%の良好な回収率が得られ、本法は実試料の分析に十分に応用可能であると結論した。
肝臓の炎症性発がん初期段階を構築するoncomiR分子の同定と治療応用

慢性肝炎から肝がんに至るがん化のイニシエーション過程に作用するマイクロRNA分子[oncogenic micro RNA ; oncomiR(s)]を同定することを目的とした。これまで確立したB型肝炎ウイルス(HBV)トランスジェニックマウスを用いた炎症性発がんモデルにおいて、経時的な遺伝子発現および酸化ストレスと相関する8個のoncomiR分子を明らかにした。これらの分子は、肝臓における前がん状態で悪性転化を制御する標的となる可能性が示唆された。慢性肝炎から肝がんに至るがん化のイニシエーション過程に作用するマイクロRNA(miRNA)分子を同定することを目的とした。これまで確立したB型肝炎ウイルス(HBV)トランスジェニックマウスを用いた炎症性発がんモデルにおいて、前がん状態を誘導する(イニシエーション)過程における遺伝子発現および酸化ストレスの原因分子としてoncomiRの関与を明らかにするために以下の実験計画を実施した。(2)発現遺伝子プロファイル解析:炎症性発がん過程の初期段階に相当する時期(肝炎69ヵ月目)の発現プロファイルを明らにした。この時期には106個の遺伝子が慢性肝炎から発がんに至る過程(非がん組織)で特異的に変動していることが観察された。また、組織学的に前がん結節(preneoplastic foci)と呼ばれるがん化に向かう細胞集団が出現する時期(前がん状態)に先行していることが分かった。(3)miRNA分子の分離、検出:マイクロアレイ法を用いて、がん組織において特異的に変動している遺伝子について網羅的にスクリーニングしたところ、発現の亢進を示す4個のmiRNA遺伝子が明らかとなった。これより(2)(3)の結果を対比することによって、前がん状態での発現プロファイルを制御しているmiRNA候補分子の選択を進めている。(1)発現遺伝子プロファイル解析:炎症性発がんモデル(Nakamoto et al.: J. Exp. Med. 188:341, 1998)の発がん過程の初期段階に相当する時期(肝炎69ヵ月目)の発現プロファイルを明らかにした。この時期に特異的に変動する106個の遺伝子が構築するパスウェイ解析から、c-Mycの変動とそれに関連する細胞内シグナル経路(ERK/JNK/P38MAPK、PI3K/Akt、NFkB系)の活性化が起こっている可能性が示唆された。(2)miRNA分子の分離、検出:マイクロアレイ法を用いて、がん組織に特異的な9個のmiRNA遺伝子が明らかとなった。(3)miRNAによる分子病態の制御:(2)で検出されたmiRNAについて、既報に基づいて標的となる遺伝子候補を検索したところ、(1)での変動遺伝子のうち、各miRNA分子について37個の標的遺伝子が候補として該当することが明らかとなった。これより、(3)でのmiRNAとその標的遺伝子が制御する細胞内シグナルや機能解析を進めている。(1)発現遺伝解析、miRNA分子の検出:炎症性発がんモデル(Nakamoto et al.:J.Exp.Med.188:341,1998)のがん化初期段階に相当する時期(肝炎69ヵ月目)の発現プロファイルを明らかにした。この時期に特異的に変動する157個の遺伝子(シグナル伝達26個、細胞増殖23個、代謝23個、転写・分化15個、その他)を明らかにした。これらは肝炎の急性期や肝がん組織にみられる遺伝子群とはほとんど重複を認めない特徴的なものであった。さらに、同時期に発現が変化する8個のmiRNAを同定した。(2) miRNA分子の機能解析: 8個のmiRNA分子のうちで6つは既報の患者肝組織での検討結果と一致しており発がん病態への関与が強く示唆された。また、2つのmiRNAについて肝がん細胞株での細胞増殖作用とコロニー形成能をともに亢進させることを見出した。これより、肝臓における前がん状態で悪性転化を制御するmiRNA分子(oncomiR)が同定された。