hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低線量・低線量率放射線による細胞応答の発現機構

(細胞周期チェックポイント遺伝子の機能:広大・鈴木)・ニワトリDT40細胞の変異細胞系を用いて、分割照射回復現象が相同組換え系のDSB修復系によることを明らかにした。さらに低線量率では、相同組換えではなく非相同組換えが主要な経路であることを示唆する結果を得た。(DNA2重鎖切断修復の役割:京大・内海)・高線量率あるいは低線量率で照射し、照射マウス脾細胞のTCR遺伝子突然変異発現頻度の線量率依存性及びp53遺伝子機能との関係を解析した。低線量放射線のTCR突然変異誘発リスクは、線量率とp53依存性アポトーシス活性に依存することを明らかにした。(アポトーシス:産業医大・法村)・各臓器別の突然変異測定系のMutaマウスを用い、睾丸における低線量多数回照射による突然変異特性を明らかにした。(突然変異誘発機構:東北大・小野)・低線量・低線量率放射線照射した雄より生よれたELマウスで母親由来ミニサテライト配列の突然変異の誘発を観察した。(遺伝的不安定性の誘導:京大・丹羽)(1)センサー(受容;何が放射線を受容しているのか)・低線量及び低線量率放射線照射においては、誘導型NO合成酵素の蓄積誘導は変異型p53細胞にしか認められなかったが、野生型p53細胞においても低線量率放射線照射後の急照射により誘導型NO合成酵素の蓄積が誘導されることを明らかにした。(NOラジカルの関与:福井医大・松本)・NBS1蛋白は放射線により発生したDNA二重鎖切断を相同組換えにより修復するだけでなく、DNA損傷の認識によるシグナル伝達で細胞周期制御にも関与していることを明らかにした。(NBS1による低線量放射線損傷細胞の認識機能:広大・小松)(2)情報伝達(応答)・あらかじめの低線量・低線量率放射線により、後の放射線によるアポトーシスの誘導が抑えられる現象がDNA-PK欠損マウスではみられないことを明らかにした。(情報伝達誘導機構:奈良医大・大西)・低線量照射でリン酸化されたERK1/2はp90RSKのリン酸化、ヒストンH3のアセチル化を引き起こしクロマチンの構造変化が誘導され遺伝子転写活性を増強するが、10cGy以上の線量ではp53のリン酸化が優先して起きるためにこれらの反応が抑制されることを明らかにした。(遺伝子転写活性促進効果:長崎大・渡辺)(3)適応を含む機能発現・遅延型の放射線誘発アポトーシスには、細胞周期制御因子とcaspase非依存型の細胞死実行因子が関与していることを明らかにした。(細胞周期チェックポイント遺伝子の機能:広大・鈴木)・低線量率照射は分割照射回復の極限状態ではないことと非相同組換末端結合修復が重要であることを明らかにした。(DNA2重鎖切断修復の役割:京大・内海)・低線量放射線照射したマウスTCR遺伝子突然変異の経時変化がp53遺伝子依存性であることを明らかにした。(アポトーシス:産業医大・法村)・突然変異検出のためlacZ遺伝子を導入されたMutaマウスを用い、低線量多数回照射による肝臓と脾臓での突然変異特性を明らかにした。(突然変異誘発機構:東北大・小野)・受精卵でp53依存性S期チェックポイントを見つけた。照射精子次世代マウスでpink-eyed
高純度歯髄MSC・誘導神経堤細胞・誘導歯原性間葉細胞による歯周組織再生療法の実践

現時点での研究環境と状況によって、iPS細胞を使用した研究が困難な状況になってきていることから、一時的にLNGFRLow+THY-1High+ hDPSCs、iPS細胞から神経堤細胞に誘導したhiPS-LT-NCLCsを用いた研究は継続しつつも、もう一つの目標である光硬化型ゼラチンやそれに変わる新規歯周組織再生療法を可能にするスキャフォールドの開発を重点的に行う。これによって改めてヒト歯髄組織由来LNGFRLow+THY-1High+hDPSCsなどの細胞の使用が再開されれば、歯周組織幹細胞再生療法への足がかりになると考えている。予定していた幹細胞研究が進まなかったことにより、当初予定していた使用金額を下回った。これを踏まえて、当初から研究目的に上げていた新規歯周組織再生療法材料の開発に重点を置く方向で研究計画を立て、進めている。そのため、昨年度の未使用金額は今年度以降の歯周組織再生スキャフォールド開発に予算を充てていく予定である。
膜電位の光学的測定の高精度化を目的とした高輝度かつ超高安定輝度を有する光源の開発

150Wのキセノンランプ光源の光を、ダイクロイックミラーとコールドフィルターを用いて波長750nm以上を熱線成分として95%以上除去した後、干渉フィルターを通して膜電位感受性色素に最適な所定の波長の準単色光にしてプラスチック製の光ファイバーに取り込み、ランダムに混ぜた後、ファイバーの一部を分岐させて全体の10%程の光をフォトダイオードで測定した。そして、ちょうどキセノンランプ光源の光量の揺らぎを相殺するだけの光量を超高輝度発光ダイオード(LED)から発光させ、光源全体として光量を安定させる方式に取り組んだ。その結果、吸光を用いた膜電位の光学的測定に使用可能な精度を持った光量の安定度を有する光源の開発にほぼ成功した。成功のポイントは、LEDの発光量の制御にパルス巾変調(PWM)方式を導入したことである。すなわち、20kHzで高速にLEDを点滅させ、点灯と消灯のduty比を変えることにより発光光量を制御するこの方式によって、発光光量を制御電圧にリニアに制御出来るようになり、高精度な光量補正が実現した。生体標本の組織や動物種の違いにより、測定に用いる膜電位感受性色素が異なり、色素に合わせて異なる波長の準単色光を用いる為、緑色、橙、赤色のLEDを使い分ける必要があり、波長とLEDの種類により制御電圧とLEDにかける電圧の間の比例定数(回路としてはgain)が変化する。したがって、汎用性を持たせるにはリニアに制御出来ることが極めて重要である。われわれの用いている光学的膜電位測定装置のサンプリング周波数は毎秒1024回であり、20kHzで高速に点滅するLEDの点滅の影響は全くみられなかった。螢光の励起光光源として用いるには150Wではまだ光量が足りず、更に高出力の製品が必要であることがわかり、熱によるLEDの減光対策等が今後の課題として残された。高輝度超高安定輝度を有する光源の開発を目指し、まず基礎データとして、現在膜電位感受性色素を用いた膜電位の落射螢光法による光学測定に用いられている光源の問題点を洗い出す作業を行った。通常用いられている、落射顕微鏡を光学系とし、光源にハロゲン・タングステンランプを用いたシステムでは、実像面の拡大率として25倍から50倍程度を確保出来る場合は、十数回の加算処理と組み合わせることで、解析可能なSN比が得られることが確認出来た。この時の背景光強度は我々が受光器として用いているフォトダイオードの1ピクセル(1.35mm四方)当たりの光電流値に換算して2030nAであり、光源の輝度のゆらぎは、問題にならない範囲であった。しかし、測定対象にラットの大脳皮質等を用いる場合、電気活動を多数の部位から同時に記録する光学的膜電位測定法のメリットを生かす観点からすると、25倍の拡大率では測定領域が狭すぎ、より低倍で広い範囲から測定する必要がある。しかし、拡大率を小さくするとこのシステムでは背景光強度が数nAとなってしまい、解析可能なデータは得られなかった。そこで我々は、超高輝度発光ダイオードを励起光光源とし、タンデムレンズを光学系とするシステムを作製した。このシステムでは拡大率6倍で背景光強度は10nA前後であり、光源の輝度のゆらぎは、検出限界以下であった。このシステムの最大の問題点は、発光ダイオードの輝度が素子の発熱により暗くなってゆくことであり、当初の目的としている光源の改良に発光ダイオードを用いる場合でも、その対策が強く求められることが判明した。現在、ハロゲン・タングステンランプの光をレンズ外から光ファイバーにより標本に照射して励起光源とする装置を試作中であり、間もなく、どの程度の背景光強度が得られるかのデータが得られる見通しである。アーク発光系の光源のランプとして、広く収集した情報をもとに検討を加えた結果、研究開始当初に想定していたキセノンランプ光源より、メタルハライドランプ光源の方が、発光効率、色温度、価格のすべての点で研究の目的により合致すると考えられた為、交付申請時には17年7月発売予定のメタルハライドランプ光源を購入する予定とした。しかしデモ機を借りて確かめた結果、デモ機完成時まで予測困難との理由で性能表に掲載されていなかった、出力光に含まれる熱線の量が非常に大きいことが判明した。その結果、赤外線を遮断する目的で設置する予定であったコールドフィルター自体が耐熱温度を超えてしまい設置出来ないことがわかった。そこで、申請時に予定していたキセノンランプ光源を購入することに再度変更した。しかし、この光源の出力光に含まれる熱線の量も、メタルハライドランプ光源ほどではないもののかなり大きく何らかの改造が必要なことは、昨年度中に明らかになっていた。改造方法をいろいろ検討し、最終的には特注でダイクロイックミラーを作製し、さらにコールドフィルターを通すことで、熱線対策をすることに決定した。少量の特注品に対応してくれる業者を探し出し、波長700nm以上の光は95%以上透過し、600nm以下の可視光領域は95%以上反射するダイクロイックミラーを入手した。今年度はこれを組み込んだアダプターを作製することで熱線対策を施したキセノン光源とするところまで進捗した。一方、発光ダイオードはLumiledsのLuxeonシリーズが発光強度の点で最も目的に合致する素子と結論し、これを購入していろいろ調べた。最終的に、発光ダイオードの輝度が素子の発熱により暗くなってゆくことの対策だけがまだ見つからず、試行錯誤している状態にある。来年度は最後の難関であるこの点をどう解決するかに重点的に取り組む予定となった。

150Wのキセノンランプ光源の光を、ダイクロイックミラーとコールドフィルターを用いて波長750nm以上を熱線成分として95%以上除去した後、干渉フィルターを通して膜電位感受性色素に最適な所定の波長の準単色光にしてプラスチック製の光ファイバーに取り込み、ランダムに混ぜた後、ファイバーの一部を分岐させて全体の10%程の光をフォトダイオードで測定した。そして、ちょうどキセノンランプ光源の光量の揺らぎを相殺するだけの光量を超高輝度発光ダイオード(LED)から発光させ、光源全体として光量を安定させる方式に取り組んだ。その結果、吸光を用いた膜電位の光学的測定に使用可能な精度を持った光量の安定度を有する光源の開発にほぼ成功した。成功のポイントは、LEDの発光量の制御にパルス巾変調(PWM)方式を導入したことである。すなわち、20kHzで高速にLEDを点滅させ、点灯と消灯のduty比を変えることにより発光光量を制御するこの方式によって、発光光量を制御電圧にリニアに制御出来るようになり、高精度な光量補正が実現した。生体標本の組織や動物種の違いにより、測定に用いる膜電位感受性色素が異なり、色素に合わせて異なる波長の準単色光を用いる為、緑色、橙、赤色のLEDを使い分ける必要があり、波長とLEDの種類により制御電圧とLEDにかける電圧の間の比例定数(回路としてはgain)が変化する。したがって、汎用性を持たせるにはリニアに制御出来ることが極めて重要である。われわれの用いている光学的膜電位測定装置のサンプリング周波数は毎秒1024回であり、20kHzで高速に点滅するLEDの点滅の影響は全くみられなかった。螢光の励起光光源として用いるには150Wではまだ光量が足りず、更に高出力の製品が必要であることがわかり、熱によるLEDの減光対策等が今後の課題として残された。
分子系統学における有用遺伝子の探索:シヨウジヨウバエを用いたアプローチ

遺伝子のDNAの塩基配列、あるいは蛋白質のアミノ酸配列の進化のパターンは、遺伝子の機能、ゲノム上の位置などの要因によって異なる。そのため、系統解析においても結果が遺伝しによって異なる場合が生じる。そこで、配列データのどのような性質が系統解析の信頼性に影響するのかを明らかにし、系統解析に適した遺伝子を同定する試みを行った。系統関係がよく分かっているショウジョウバエ4種について7つの遺伝子の配列データを用いて系統関係を推定し、配列データの特性と系統樹推定の信頼性との関係を調べた。その結果、(1)推定される系統樹の信頼性(ブートストラップ値)は、配列データのサイト数、配列間の進化距離が同程度であっても遺伝子によって大きく異なること、(2)正しい樹形を支持する情報を持つサイトの数と誤った樹形を支持する情報を持つサイトの数の比が、推定される系統樹の信頼性をよく反映すること、(3)コドンの3番目の塩基座における塩基置換速度が1・2番目の塩基座に比べて極端に速い場合はアミノ酸の配列に翻訳して用いた方がよい結果が得られることがわかった。さらに、コンピュータ・シミュレーションの結果、塩基座間の置換率の変異とトランジション/トランスバージョン比の両方が大きくなると、相乗作用によって系統解析の信頼性が非常に悪くなることが明らかになった。これらの結果は、系統解析に広く用いられているミトコンドリアDNAが、実際は系統関係には適さないことを強く示唆した。一方、Xdh遺伝子とwhite遺伝子はショウジョウバエの系統解析に非常に適していることがわかり、今後、この分野の研究に有用であることが予想された。分子系統学では、DNA塩基配列やタンパク質のアミノ酸配列データを用いて生物分類群間の系統関係を分析するが、用いた配列データによって異なった結果が導かれる問題が生じる。原因は、多くの場合、配列データに含まれる系統情報の質と量が遺伝子の進化特性によって左右されるためと考えられる。そこで、配列データのどのような性質が系統解析の信頼性に影響するのか、その様な性質は遺伝子のどのような分子進化によってもたらされるのかを明らかにし、系統解析に適した遺伝子を同定することを試みた。方法は、実際の配列データの解析とコンピュータ・シミュレーションを用いた。配列データの解析は、系統関係が明らかなショウジョウバエの代表的な4種の7つの遺伝子について行い、系統樹推定の信頼性に影響する配列データの性質を検討した。その結果、(1)系統樹推定の信頼性は用いる配列データによって大きな差があること、(2)その差は配列データにおける進化速度のサイト間変異の程度に大きく影響されることなどがわかった。これらの結果をもとに、ショウジョウバエの系統解析にはwhite遺伝子が有効であることが予想された。コンピュータ・シミュレーションでは、特定のモデル系統樹に基づいて塩基置換を起こすことにより、祖先配列を4本の配列に分化させ、生じた4本の配列データから系統樹を再構築し、モデル系統樹の樹形が再現される確率を求めた。塩基置換の特性をいろいろ変え、どのような特性が系統樹再構築の精度に関わるかを調べた。その結果、トランジション/トランスバージョン比が高く、塩基置換率の塩基座間変異の程度が大きい場合、正しい系統樹が得られる確率が非常に低くなることがわかった。すなわち、分子系統学において広く用いられているミトコンドリアDNAの分子進化的特性は、系統解析には必ずしも適していないことが示唆された。
ストレス性自律生理反応の神経科学的基盤

情動やストレス刺激は、自律神経系を含めた生体の恒常性維持機能に強い影響を与えるが、その脳内メカニズムはほとんど分かっていない。本研究では、情動を司る大脳辺縁系から恒常性維持機能を司る視床下部や脳幹への情動シグナル伝達に焦点を当て、その神経メカニズムの解明を目指す。そして、その目的のために、神経活動の光遺伝学的操作技術をin vivoの統合生理学に応用し、脳内の特定部位に投射するニューロン群の活動を特異的に操作する新規技術を開発する。平成21年度は、光によって活性化するカチオンチャネル(ChR2)およびクロライドポンプ(eNpHR)の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを作製し、そのウイルスをラットの体温調節に関わる視床下部や脳幹の領域に注入して、その領域のニューロン群が感染することを組織学的に同定することに成功した。次年度は、このウイルスを用いて、覚醒ラットの大脳辺縁系の様々な部位から恒常性維持機能に関わる脳部位への神経接続を特異的に活性化、あるいは抑制し、そのストレス性(情動性)自律神経反応への影響を調べることで、情動や心理ストレスが生体の恒常性維持機能に作用する神経科学的メカニズムを明らかにする。本研究によって得られる成果は、自律神経失調症などの様々なストレス疾患の病態解明に貢献するものであり、また、本研究で開発する神経接続の特異的操作技術は、多様な脳機能を司る神経回路及びその動作原理の解明に幅広く応用しうるものである。
時間栄養学を視点とした機能性食品成分の探索

機能性食品としてサイクロデキストリンを取り上げ実験を行った。時間栄養学的視点で研究を行うために、マウスを自由摂食下に、マウスにとっての朝食、昼食、夕食、夜食の4つの時間帯に、βコーンスターチを与えた(0.1g/mouse)。また、実験群はサイクロデキストリン(100 mg/Kg)を含むコーンスターチとした。経口投与後、15,30,60,120分後の血糖値を測定し、AUC(曲線下面積)で評価した。まず、コーンスターチ単独投与でも、投与時刻により、血糖値のAUCに差がみられた。すなわち、朝投与は低かった。つぎにサイクロデキストリン含有群では、全体的に血糖値の上昇が抑えられる傾向にあり、朝投与と昼投与群では、投与60分後の血糖値が有意に低かった。次に、血中インスリン量を測定すると、30分、60分後に、昼投与群で有意に低値を示すことがわかった。今度は、ラード摂取(0.1g/ mouse)による血液中の中性脂肪(TG)増大に対するサイクロデキストリン(100mg /kg)の効果について調べた。その結果、朝や昼に投与したラードは、血中のTGのAUCを大きく増大させた。また、サイクロデキストリンの同時投与は、特に昼間のTG増大を有意に抑制した。すなわち、朝食、昼食のデンプンによる血糖上昇やインスリン上昇、またラードによるTG上昇はサイクロデキストリンの同時投与で軽減されることから、肥満・糖尿病の予防効果を期待するサイクロデキストリンを含むトクホは、この時間に摂取することが勧められた。26年度が最終年度であるため、記入しない。
食生活リズムの乱れから発症する生活習慣病における小胞体ストレス応答経路の役割

体内時計の変調は、時差ぼけだけでなく生活習慣病の発症にも関連することが指摘されている。一方、食生活リズムの乱れは体内時計を乱す原因となるが、その分子メカニズムには未だ不明な点がある。本研究では、食餌摂取により小胞体ストレス応答経路の一つであるPERK経路の活性化により、肝臓での末梢の体内時計遺伝子の発現が調節できることが明らかにし、eIF2αリン酸化は肝臓での糖脂質代謝と体内時計を共役する働きがあることを見出した。本研究は、申請者が最近発見したeIF2αリン酸化シグナルによる時計遺伝子の変動を基に、末梢時計同調の新たなメカニズムとしての小胞体からのシグナル制御の可能性を研究し、食生活リズムの乱れから発症する生活習慣病における小胞体ストレス応答経路の役割を明らかにすることが目的である。そこで、平成23年度は、小胞体ストレス応答シグナルを介した摂食による体内時計遺伝子発現調節の解明を主な研究項目とし、小胞体ストレス応答シグナルを制御できるマウスを用いた個体解析と小胞体ストレス応答欠損細胞などを用いた分子生物学的解析の2つの解析を行った。平成24年度は、糖尿病など病態モデルにおけるeIF2αリン酸化シグナルの末梢時計遺伝子同調因子としての意義をFv2E-PERKマウスにおいて高脂肪食による肥満モデルとSTZ投与による糖尿病モデルを作製し、検証を行った。また、その作製したマウスにおいて、食事の時間を昼夜逆転するように制限して、AP20187刺激によるeIF2αリン酸化による体内時計と代謝関連遺伝子の変動を定量的RT-PCR法にて解析を行った。その結果、PERK経路により末梢の体内時計遺伝子の発現が制御されていることを見い出した。このことからeIF2αリン酸化は肝臓での糖脂質代謝と体内時計を共役する働きがあることを発見し、現在論文投稿準備中である。そこで、平成23年度は、小胞体ストレス応答シグナルを介した摂食による体内時計遺伝子発現調節の解明を主な研究項目とし、マウスを用いた個体解析と細胞等を用いた分子生物学的解析の2つの解析を行った。1.小胞体ストレス応答シグナルを制御できるマウスを用いた個体解析・Fv2E-PERKマウスにAP20187を投与して、投与24時間まで4時間毎に臓器を回収し、体内時計制御因子と代謝酵素の発現変動を解析・定量的RT-PCR法にて体内時計を制御する全20の転写因子の発現を解析・定量的RT-PCR法にて糖代謝と脂質代謝を制御する酵素の発現を解析2.小胞体ストレス応答欠損細胞などを用いた分子生物学的解析・小胞体ストレス応答欠損細胞(Ire1α欠損細胞、ATF6α欠損細胞、PERK欠損細胞)やFv2E-PERK発現細胞に、PER2やBmal1といった時計遺伝子プロモーター下にルシフェラーゼレポーターを組み込んだ体内時計リアルタイム測定系を構築・上記の測定系にて小胞体ストレス誘導剤投与で体内時計制御に関わる小胞体ストレス応答経路を同定(少なくともeIF2αリン酸化シグナルは重要であることは見出している)。・定量的RT-PCR法にて同定した小胞体ストレス応答経路欠損での体内時計を制御因子の発現を解析・ルシフェラーゼアッセイにて、上記解析で絞り込んだ遺伝子のプロモーター領域で応答に関わる領域の同定・ChIP解析にて予測した転写因子の関与を検証し、より詳細な分子機構の解明肝での末梢時計の新たな同調因子としてeIF2αのリン酸化シグナルが働くことを細胞レベルと個体レベルで見い出せたため。糖尿病など病態モデルにおけるeIF2αリン酸化シグナルの末梢時計遺伝子同調因子としての意義を検証1. Fv2E-PERKマウスにおいて高脂肪食による肥満モデルとSTZ投与による糖尿病モデルを作製する。2.作製したマウスにおいて、食事の時間を昼夜逆転するように制限して、AP20187刺激によるeIF2αリン酸化による体内時計と代謝関連遺伝子の変動を定量的RT-PCR法にて解析する。研究消耗品費(試薬・マウス等)
大阪万博における前衛芸術―考察と国際比較

従来の大阪万博研究は、戦後復興や高度経済成長といった文脈から言及されることが大半であった。しかし本研究では、大阪万博が戦後の海外の万博から多大な影響を受けており、また前衛芸術家がその実験的な展示に深く関わっているのではないかとの仮説を立て、その立証を試みた。3年間を通じて、研究代表者と研究分担者は数回に渡り海外の万博会場跡地を訪れ、大阪万博が58年のブリュッセル万博及び67年のモントリオール万博と特に近い関係にあること、また複数のパビリオンにおいて画家、作曲家、映像作家、グラフィックデザイナーといった前衛芸術家たちが重要な役割を果たしていたことを解明した。研究の概要は次のようなものである。日本万国博覧会(1970年。以下大阪万博と記す)における前衛芸術運動について、美術家・建築家・デザイナー・音楽家が協同した企画に焦点を絞り、基礎的な資料を調査・収集する。次にこれらの動きを戦後の国際的な前衛の流れの中に位置づける。ブリュッセル万博やモントリオール万博など先行する戦後の万博、そして大阪万博後の動きにも着目し、それらにおける同種のプロジェクトを調査・研究することにより、万博という場が総合芸術の表現に対しどのような可能性を与え、それを実現したのか、さらにはそれが戦後の前衛芸術運動においてどのような位置を占めていたのかを検討する。23年度は研究年度の一年目として、まず今後の分析の切り口を定めるところからスタートした。巨大イヴェントゆえに膨大な資料が残されており、さらにテーマの細目を立てることで調査範囲を絞りこむことが目的であった。24年度は前年度の研究を受けて定めた切り口を掘り下げ、また資料の収集を進めることを大きな目的とした。またそれと並行して、研究論文を随時発表し、成果の蓄積を図ることとした。具体的には、暮沢・江藤の両名で秋にモントリオールまで出張し、67年のモントリオール万博会場跡地を訪れ、今の残る関連施設を調査したほか、現地の博物館等で当時の資料を鑑賞し、また文献資料を収集した。その後ニューヨークでも39年と64年の世界博の調査を行ったが、滞在中に災害にあったため十分な成果は得られなかった。またそれに先立って、初夏には現代の万博の展示を調査するために韓国の麗水まで出張したが、この調査に際しては暮沢と江藤のスケジュールが一致しなかったため、各自別々に行った。また暮沢は2月下旬に大阪の万博公園を訪れて現地調査を行ったほか、基幹施設の設計者である曽根幸一からの聞き取り調査を実施した。以上の概要を踏まえ、暮沢と江藤の両名は3年計画での調査に着手し、23年度、24年度ともに両名合同での海外出張を実施し、現地調査や文献収集を行ったほか、研究成果の蓄積を図るべく出版社のウェブサイト上での定期的な論文発表を開始した。そして最終年度に当たる25年度は、本研究に当たっては、引き続き現代の万博の調査が不可欠と考え、暮沢・江藤の両名で夏に2000年のハノーバーの万博会場跡地を訪れ、現地調査や文献収集を行った。また冬には、H24年にモントリオールでの調査後に訪れたニューヨークでの39年及び64年の世界博の調査がハリケーンの影響で不十分だったことを補うべく、ニューヨークでの再調査を計画したが、スケジュールの都合でこの調査は暮沢が単独で行うこととなった。またH24年度に引き続き、研究成果をまとめるべく相互の論文の執筆・発表や聞き取り調査を行った。これら3年間の研究成果の総体は、近々暮沢と江藤の共著書という体裁で発表される予定である。

巨大イヴェントゆえに膨大な資料が残されており、さらにテーマの細目を立てることで調査範囲を絞りこむことが目的であった。二名合同での海外調査を実施し、また複数回の打ち合わせによって意見交換を重ねたこともあり、現在の調査テーマは二名合わせて10程度にまで絞り込まれている。これから1年程度かけて、これらのテーマを順次掘り下げていく計画である。なお、具体的な調査概要については、暮沢・江藤両名の共同連載という形で、青弓社のサイトで随時発表していく予定である(詳細は備考欄を参照のこと)。なおこの連載によって発表された研究成果を書籍化して、最終的な研究成果の報告とする計画である。国際比較については、前年度に引き続き、24年度は暮沢・江藤でモントリオール万博やニューヨーク世界博の会場跡地へと出向き、基礎資料を収集したほか、暮沢・江藤とも個別に麗水万博の調査を行った。また暮沢は大阪の万博公園に出向いて基礎資料を収集したほか、基幹施設の設計者である曾根幸一へのインタビューも行った。国際比較について23年度は二人でパリのBIEに出向き、基礎資料を収集した。また暮沢は事後調査の一環としてセビリア万博の会場でも現地調査を実施した。さらに青弓社の理解を得て、定期的に研究成果を発表できる場を確保した。H24年度に引き続き、個々のテーマの個別調査を継続する。またH24年度の調査の結果、パヴィリオンの展示や参加作家についての情報収集が必ずしも十分とは言えず、より詳細な調査を行う必要があることが明らかになったため、最終年度である本年度はより詳細な調査に取り組む予定である。研究成果の発表を引き続き行い、最終目標である研究成果の書籍化に向けてさらなる内容の充実を図っていく。また今年度は、研究内容を一層充実させるべく、博覧会協会のあるパリでの文献調査と、ドイツ、北欧等の周辺諸国での情報収集を主目的とした海外調査を行う予定である。なお今までの研究成果の一部は、青弓社の理解を得て、同社のホームページ上に「大阪万博のインパクト」というタイトルにて暮沢・江藤両名の連載形式で発表されている。前述のように、この連載をまとめて書籍化して本研究の最終的な成果の報告とする予定である。すでにテーマの絞り込みは終了しているので、今後は個々のテーマについての個別調査へと重点を移行する予定である。今後はウェブ連載を通じて順次研究成果を発表していく予定だが、最終目標である書籍化に際しては、初出時の原稿に加筆・改稿を行い、新たな研究成果を盛り込む予定である。また大阪万博に大きな影響を与えたモントリオール万博の資料収集を中心に、24年度も海外調査を引き続き行う予定である。24年度は暮沢・江藤合同で海外調査を行ったのをはじめ、各自で個別に国内外の調査も行い、文献の収集も行った。25年度も同様に国内外での調査を継続し、文献の収集を進める予定である。基本的に調査は暮沢・江藤合同で行う計画だが、勤務先の都合次第では、個別で行う可能性もある。研究費の使途に関しては、暮沢は旅費を主体に、江藤は旅費と物品費を半々の比率で使用する予定である。
ポンプリミタ-とコンディショニングによる逆転磁場ピンチプラズマ放電制御の研究

プラズマ閉じ込めに非常に重要である、プラズマ壁-相互作用を能動的に制御する為に、ポンプリミタ-系を組み上げ、逆転磁場ピンチト-ラス装置REPUTE-1に設置した。このポンプリミタ-系は、Zr/Al非蒸発ゲッタ-ポンプ、リミタ-ヘッド、継手、リミタ-導入部、バルブ、広帯域電離真空計、四重極質量分析器等よりなる。ゲッタ-ポンプは所期の排気速度を満足した。熱負荷を考慮したシミュレ-ションにより設計したリミタ-ヘッドを3種類用意し、それぞれの得失を比較している。何れもポンプリミタ-を作動せずに、ヘッドをプラズマ中に挿入しても、プラズマ放電に悪影響を与えていない。又、プラズマ端に挿入したヘッドに負のバイアス電圧を付加すると、ワンタ-ン電圧の減少等のプラズマ・パラメ-タの向上が見られている。真空壁のコンディショニングとして、フォトトロン・ベ-キング、グロ-放電、カ-ボニゼ-ションを行い、それを不純物汚染度、水素吸収、放出速度の観点から調べている。残留ガス種と分圧は、四重極質量分析器(全圧は広帯域電離真空計を使用)によって評価する。フォトトロンでは、予期通り時間と共に水の分圧が減少した。グロ-放電、カ-ボニゼションにより、第一壁中の水素含有量を調べ、その制御によって、プラズマ・パラメ-タの向上、ポンプアウト現象の軽減をする事ができた。以上の事を踏まえ、プラズマ-壁相互作用を総合的観点から調べ、REPプラズマ放電の最適化の理解を進めている。
悪性脳腫瘍関連遺伝子h-neuの機能解析とそれを応用した分子標的治療の開発

我々は、10番染色体10q25.1に位置するh-neuの機能解析を行い、この造伝子が悪性神経膠腫においてどのように機能しているかを見出すべく実験をおこなってきた。まず、h-neuの抗体を作製し、この抗体がh-neu蛋白を検出できることを免疫組織学的に観察できたので、この抗体を使って悪性神経膠腫のサンプルを用いてgradeごとの染色を行った。しかし、gradeごとの染色性の違いが認められなかったために、h-neuの発現はそれ程高くないと判断し、Real-Time PCRを行ったところ、悪性神経膠腫ほど発現が低下している傾向が認められた。このh-neuの発現の低下が悪性神経膠腫の生物学的特性にどのような影響を与えるかを解析するために、われわれはh-neuのsi-RNAを作製し、悪性神経膠腫の培養細胞でh-neuの発現を強制的に低下させ、コントロール群とで増殖速度の比較を行ったが、差を認めなかった。逆にh-neuを強制的に高発現させて、悪性神経膠腫の培養細胞の増殖速度を解析したところ、培養細胞の株の種類によって結果のばらつきが認められた。この結果のばらつきが、もともと細胞株のh-neuの発現の違いによるものである可能性をNorthern blotにて定量したが、h-neuの発現量と増殖速度抑制との相関は培養細胞での実験では認められなかった。そこで、h-neu自体がどのような機能を持っているのかをまず解析することにしてh-neuの強制発現系を用いてプロテオミクスによる解析の準備を行っている。現時点ではまだ新しい知見は得られていない状況であるが、今後もh-neuの機能解析を続行していく予定である。データが集積され、結果がまとまったら速やかに発表したいと考えている。本研究では我々が同定した新規遺伝子h-neuが悪性グリオーマの発生もしくは悪性化に何らか関わっているという仮設のもとに、この遺伝子の機能解析をおこなっている。この遺伝子は悪性グリオーマで高頻度に欠失している染色体10番の長腕に存在し、グリオーマの細胞株にて変異が認められた。特異的にh-neu分子を認識する抗体の作製に成功し、この抗体を使った実験を現在行っている。まず、免疫組織学的解析とウエスタンブロット法により、抗体がh-neu分子を認識できることが確認できており、グリオーマ腫瘍サンプルにおいてのgradeによる発現の違いも認められた。しかしながら、同時に行ったReal-Time PCRでは発現の違いがgradeによる差がみとめられず、mRNAと蛋白の発現の矛盾の解釈が出来ない状態である。機能解析としては、構造上転写因子としての機能が最も考えられるために、h-neuが転写する分子を同定するために、細胞株にh-neuを強発現させた状態で、コントロールベクターを発現させたものと比較して発現が高かった分子の同定をDNAマイクロアレイ、及びプロテオミックスによる手法で解析中である。h-neu分子を逆に発現低下させることにて腫瘍細胞の生物学的変化を観察すべく、si-RNAを用いる方法にて細胞内のh-neuの発現をノックダウンすることを計画しているが、グリオーマの細胞ではもともとの発現が低いために、比較的発現の高い細胞株を現在選定中である。h-neuに関する論文は今のところ、投稿できていないが、悪性グリオーマに関する実験系が確立されてきており、今後将来的にグリオーマ治療の臨床応用に結びつくデータが得られることが期待できると考えられる。

我々は、10番染色体10q25.1に位置するh-neuの機能解析を行い、この遺伝子が悪性神経膠腫においてどのように機能しているかを見出すべく実験をおこなってきた。まず、h-neuの抗体を作製し、この抗体がh-neu蛋白を検出できることを免疫組織学的に観察できたので、この抗体を使って悪性神経膠腫のサンプルを用いてgradeごとの染色を行った。しかし、gradeごとの染色性の違いが認められなかったために、h-neuの発現はそれ程高くないと判断し、Real-Time PCRを行ったところ、悪性神経膠腫ほど発現が低下している傾向が認められた。このh-neuの発現の低下が悪性神経膠腫の生物学的特性にどのような影響を与えるかを解析するために、われわれはh-neuのsi-RNAを作製し、悪性神経膠腫の培養細胞でh-neuの発現を強制的に低下させ、コントロール群とで増殖速度の比較を行ったが、差を認めなかった。逆にh-neuを強制的に高発現させて、悪性神経膠腫の培養細胞の増殖速度を解析したところ、培養細胞の株の種類によって結果のばらつきが認められた。この結果のばらつきが、もともと細胞株のh-neuの発現の違いによるものである可能性をNorthern blotにて定量したが、h-neuの発現量と増殖速度抑制との相関は培養細胞での実験では認められなかった。そこで、h-neu自体がどのような機能を持っているのかをまず解析することにしてh-neuの強制発現系を用いてプロテオミクスによる解析の準備を行っている。現時点ではまだ新しい知見は得られていない状況であるが、今後もh-neuの機能解析を続行していく予定である。
生態系の物質リサイクル系における生物多様性の役割と創出・維持機構

私は前年度「柔軟な食物網仮説」を提出した。本仮説は以下のように要約される。生物が環境に応じて餌を変化させる柔軟性がない場合には生態系の複雑性が増すに従って種構成は維持されにくくなるが、ある場合には複雑な系がされやすくなる「生物多様性の自己安定化作用」を意味する。本年度は、この「柔軟な食物網」仮説を発展・深化させることを主眼においた。今年度の主な研究実績は以下の通りである。1)Science誌上にて「柔軟な食物網」仮説に関する論争をおこなった。具体的には、「柔軟な食物網」仮説の成立する条件がどれほど現実的であるのかを議論した。数理モデルを用いた解析から「柔軟な食物網」仮説はきわめて多様な条件下で成立する事が示された。これは、この仮説が現実の生態系でもじゅうぶんに働きうる事を示している。この結果はScience誌上にて学術論文として発表した。なお、これらの研究の一部は形骸の研究機関において遂行された。機関名、期間は以下の通り:カーディフ大学(英国、ウェールズ)平成15年5月10月オランダ生態学研究所・陸水学研究所(オランダ)平成15年10月平成16年1月生態系は「生産者-分解者系」をエンジンとする系として理解できる。多くの生物はこれらの生物を補食したり寄生したりすることで存続している。同時に、これらの捕食/寄生者はこの「生態系のエンジン」を維持する際にも共存を促進する効果などを通じて重要な役割を果たしていると考えられてきた。この理論を背景に補食/寄生者が被食者の共存を促進する機構に関する理論研究を行なった。計算機を用いた数理モデルの解析から被食者の空間分布のパターンが捕食者による被食者共存にとって重要な働きをすることを示し、American Naturalist誌に単著論文として発表した。複雑な生態系が維持されるメカニズムに関する理論研究を行なった。自然生態系では驚くほど多様な生物種が多様な関係を結んでいる。この複雑な生態系がいかにして維持されるかは生態学における難問の一つであった。本研究では、数理モデルを用いた理論研究からこの問いに一定の回答を得、SCIENCE誌において単著論文として発表した。この研究では「生産者-分解者系」を含む複雑な食物網のモデルを構築し、計算機シミュレーションによりそれを解析した。そこから、生物の持つ臨機応変に行動する柔軟性が複雑な生態系の維持にとって重要であることがわかった。具体的には、生物の柔軟性を考慮しない場合には生態系の複雑性が増すに従って系は不安定になるが、柔軟性が高いときには複雑な系ほど安定になるのである。これは、食物網における「生物多様性の維持機構」と「生物多様性が生態系に果たす役割」は、たがいに表裏一体であることを意味する。生物多様性が生態系を安定化することにより生物多様性の維持を促進し、促進された多様性がさらなる多様性の維持に貢献するのである。この結果は一種の双利共生である「生産者-分解者系」のみならず、食物網全体が一種の「双利共生系」となりうることをしめしている。また、前年度の研究成果である「物質循環(生産者-分解者リサイクル系)を考慮に入れた植物群集の数理モデル」の結果を三木健との共著論文としてEcology Letter誌において学術論文として発表した。機関名、期間は以下の通り:カーディフ大学(英国、ウェールズ)平成15年5月10月オランダ生態学研究所・陸水学研究所(オランダ)平成15年10月平成16年1月
新規キノン型ビルトイン補酵素の構造と触媒機能及び生合成機構

本研究では、近年相次いで発見されているペプチド・ビルトイン型のキノン補酵素を含有する酵素の構造と機能、及びタンパク質翻訳後修飾によるキノン補酵素の生合成機構を解明することを目的とした。平成12年度には、銅アミン酸化酵素の触媒反応における銅イオンの役割を明らかにするため、Co^<2+>及びNi^<2+>置換型酵素を調製し、反応速度論的・分光学的解析を行った。Cu^<2+>型酵素では反応の律速段階は還元的半反応にあったが、CO^<2+>及びNi^<2+>型酵素では酸化的半反応にあった。金属置換型酵素のX線結晶構造解析の結果と併せて、銅イオンは本酵素の酸化的半反応において、還元された酸素分子をプロトン化して過酸化水素として遊離するのに重要な役割を担うことを明らかにした。一方、新規なキノヘムタンパク質アミン脱水素酵素(QHNDH)に含まれるTTQ様補酵素の構造や生成機構を明らかにすることを目的として、酵素遺伝子のクローニングを行った結果、Fe-Sクラスターを含有するタンパク質が本酵素サブユニット遺伝子の近傍にコードされていることが判明し、補酵素の生成に関与すると推定した。平成13年度は、QHNDHのX線結晶構造解析を行い、新規なペプチド・ビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン(CTQ)を発見するとともに、CTQを含む小サブユニットが4ヶ所の分子内チオエーテル結合を含む極めて特異な構造をもつことを明らかにした。平成14年度は、銅アミン酸化酵素に含まれるトパキノン(TPQ)補酵素が銅イオン依存的に自動的に生成する過程を時間分割X線結晶解析により追跡し、TPQ生成途上の2つの中間体の構造を決定することに成功した。また、触媒塩基であるアスパラギン酸残基に変異を導入し、変異型酵素の反応速度論的解析とX線結晶解析を行うことにより、本酵素の精密な触媒反応機構を解明した。種々のアミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する銅アミン酸化酵素は、新規なキノン型ビルトイン補酵素、トパキノン(TPQ)を含有している。このTPQ補酵素は、酵素タンパク質中の特定のチロシン残基が翻訳後修飾を受けて生成する。私どもはこれまでに、TPQの生成が2価銅イオンと分子状酸素の存在下で起こる自触的反応であることを明らかにした。さらに、細菌の銅アミン酸化酵素のX線結晶解析を行い、銅イオンとTPQをともに含まない前駆体型アポ酵素とTPQ含有活性型ホロ酵素の構造を決定した。その結果、アポ酵素とホロ酵素の構造には大きな違いはほとんどないが、いくつかの活性部位残基の位置や向きが大きく異なっていることが明らかになった。また、銅アミン酸化酵素の触媒反応は、基質アミンによるトパキノンの還元反応と分子状酸素による還元型トパキノンの再酸化反応の2つの半反応からなるping-pong機構で進行する。本年度は、本酵素の触媒反応における銅イオンの役割を明らかにするため、Co^<2+>及びNi^<2+>置換型酵素を調製し、反応速度論的・分光学的解析を行った。Cu^<2+>型酵素では、反応の律速段階は還元的半反応にあるが、Co^<2+>及びNi^<2+>型酵素ではトパキノンへの再酸化反応の速度が顕著に低下しており、律速段階は酸化的半反応にあった。また、Co^<2+>及びNi^<2+>型酵素における酸化的半反応過程を分光学的に解析したところ、イミノキノン中間体と考えられる吸収が観察された。

金属置換型酵素のX線結晶構造解析の結果と併せて、銅イオンは本酵素の酸化的半反応においてイミノキノン中間体の加水分解過程に必須の役割を担うと推定した。一方、新規なキノヘムタンパク質アミン脱水素酵素に含まれるTTQ様補酵素の構造や生成機構を明らかにすることを目的として、酵素遺伝子のクローニングを行った。その結果、Fe-Sクラスターを含有するタンパク質が本酵素サブユニット遺伝子の近傍にコードされていることが判明し、補酵素の生成に関与すると推定された。本研究では、最近相次いで発見されているペプチド・ビルトイン型のキノン補酵素を含有する酵素の構造と機能を明らかにするとともに、タンパク質翻訳後修飾によるキノン型ビルトイン補酵素の生合成機構を解明することを目的としている。グラム陰性細菌のPseudomonas putida及びParacoccusdenitrificansは、培地中にn-ブチルアミンやベンジルアミンを加えると、これらをエネルギー源として資化するため、キノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素(QHAmDH)を細胞膜内のペリプラズム画分に誘導生成する。本酵素は、αβγのヘテロ三量体サブユニット構造をもち、約60kDaのα-サブユニットには2分子のヘムcが、約9kDaのγ-サブユニットには構造未知のビルトイン型キノン補酵素が含まれている。触媒反応においては、基質アミンに由来する2電子はキノン補酵素、ヘムcを経由して、アズリンやチトクロムc550などの電子受容体タンパク質に受け渡され、最終的には末端酸化酵素により分子状酸素の水への還元に使われる。平成13年度は、Ps.putida及びP.denitrificansのQHAmDHに含まれるキノン補酵素を同定するため、両細菌の酵素のX線結晶構造解析を行った。その結果、両細菌の酵素がともに新規なペプチド・ビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン(CTQ)を含有することを解明するとともに、CTQを含む小サブユニットが4ヶ所の分子内チオエーテル結合を含む極めて特異な構造を有することを明らかにした。ペプチド・ビルトイン型補酵素は、ビタミン由来の補酵素と異なり、タンパク質を構成するアミノ酸残基が特異的な翻訳後修飾を受けて生成する。ビルトイン型補酵素を形成するためにタンパク質はさまざまな戦略を用いている。本年度は、銅アミン酸化酵素に含まれるビルトイン型補酵素の一種、トパキノン(TPQ)が銅イオン依存的に自動的に生成する過程を時間分割X線結晶解析により追跡し、その過程における活性部位の構造変化を明らかにした。具体的には、まず厳密な嫌気条件下でアポ酵素の結晶を作製し、嫌気条件を保ったまま銅イオンを加えた。この結晶を液体窒素温度で凍結し、銅イオンを結合しただけのTPQ生成の第一段階の構造として解析を行った。次いで、結晶を好気的な(酸素を含む)緩衝液に移すことによりTPQ生成反応を開始させ、一定時間毎に結晶を凍結した。これらの結晶についてデータ取得と解析を行った結果、期待通りTPQ生成途上の2つの中間体の構造を決定することに成功した。これは、タンパク質の翻訳後修飾過程の構造変化を明らかにした初めての例である。
疾病を有するヒト血液を微量に添加した溶液から析出するCuCl_2結晶の晶相と疾病との相関

CuCl_2水溶液に健常者および脳血管型老人性痴呆症患者の血液を添加し、CuCl_2水和物の樹枝状結晶を成長させた。健常者の血液を添加して成長させた結晶は、無添加で成長させた結晶と比較して水和数が多い結晶の含まれることが我々の研究により既に明らかとなっていた。そこで、血液を無添加および添加した溶液中から成長させた結晶に関して、それぞれ単結晶X線構造解析を行った。前者の結晶系は、斜方晶系(Pmna)、格子定数はa=8.0868(7)A,b=3.7444(5)A,c=7.4122(7)Aであった。後者に関しては、水分子由来の酸素の熱振動が前者のそれより異方性が激しいものの、格子定数に有意差が認められず、過剰な結晶水はアモルファス的に配置していることも考えらた。詳細は解析中である。Arレーザー(488nm)を光源に健常者、脳血管型老人性痴呆症患者の血清のレーザー・ラマンスペクトルの測定を行ったことろ1500cm-1及び1150cm-1付近に極大が観測された。Larssonらによると、健常者のスペクトルと比較して、肝炎患者のそれは強い蛍光を発すると報告しているが、脳血管型老人性痴呆症患者の場合は、強い蛍光のバックグラウンドは観測されなかった。一方、血液を添加して成長させた結晶と無添加の結晶では異なったスペクトルが得られた。結晶の異方性があるため、慎重な解析を必要とするが、疾病と関連のある血液成分が結晶面に選択的に結合し血清の状態では検出されない差を増幅して検出している可能性もある。Cuの周りの対象性をみるために、電子スピン共鳴(ESR)の測定を試みた。樹枝状結晶の粉末で測定を行ったところ、異方性が大きく測定の再現性に乏しいため、磁場⊥c軸で単結晶での測定を行った。その結果、無添加の結晶と健常者の血液を添加した溶液から成長させた結晶では異なったスペクトルを与えた。前者のg値は2.193であり、後者は2.165であった。後者には2.105にショルダーピークが認められた。このショルダーピークは角度依存性を示したことから血液の成分はある結晶面と作用していることが示唆された。詳細は解析中である。
てんかん病態における脳内D-セリンの機能解明

本研究では、セリンラセマーゼノックアウト(SRKO)マウスを用いて、PTZ誘発痙攣発作における脳内D-セリンの機能を検討した。SR-KOマウスは高濃度のPTZにより誘発されるclonic-tonic痙攣発作に対し抵抗性を示し、痙攣発作の持続時間が野生型(WT)マウスに比べ有意に短かった。この結果に一致して、SR-KOマウスでは高濃度PTZ投与後の大脳皮質、海馬CA1、CA3ならびに扁桃体におけるc-fos(神経活動の興奮レベルの指標)発現細胞がWTマウスに比べ有意に減少した。また、WTマウスではPTZ投与後に細胞外グルタミン酸濃度が上昇するのに対し、SR-KOマウスではPTZ投与後の細胞外グルタミン酸濃度の増加が認められなかった。以上の結果から、D-セリンの合成を抑制することにより全般性tonic-clonic痙攣など重症の痙攣に対する感受性を低下させることが示唆され、今後SRやD-セリンをターゲットとする新規治療薬の開発が重症の痙攣発作の治療に役立つと考えられる。NMDA型グルタミン酸受容体は中枢神経系において興奮性神経伝達を担っており、その過剰活性化はてんかんの病態に深く関わることが報告されている。D-セリンはNMDA受容体の機能を調節する内在性コ・アゴニストのひとつである。本研究では、D-セリンの合成酵素であるセリンラセマーゼ(SR)をノックアウト(KO)したマウスを用い、ペンチレンテトラゾール(PTZ)誘発痙攣におけるD-セリンの役割を検討した。野生型(WT)マウスとSR-KOマウスにPTZ(50mg/kg)を腹腔内投与しところ、検討したすべてのマウスにおいて全身性強直性間代性発作が誘発された。しかし、SR-KOマウスでは、痙攣発作の持続時間がWTマウスに比べ有意に短かった。さらに、SR-KOマウスは痙攣発作後すべての生存したのに対して、WTマウスは1匹死亡したことから、SR-KOマウスではPTZにより誘発される痙攣発作の程度が緩和されることが明らかとなった。この結果に一致して、SR-KOマウスでは、PTZ投与2時間後の大脳皮質におけるc-fos(神経活動の興奮レベルの指標)発現細胞がWTに比べ有意に減少し、さらにPTZ投与3日後の海馬歯状回における活性化アストロサイトの数もWTマウスに比べ有意に少なかった。また、海馬歯状回にカニューレを留置し、自由行動下のマウスでMicrodialysisを行ったところ、WTマウスではPTZ投与後に細胞外グルタミン酸濃度が上昇するのに対して、SR-KOマウスではPTZ投与後の細胞外グルタミン酸濃度の増加が認められなかった。以上の結果から、D-セリンの合成を抑制することによって、PTZ投与により誘発される痙攣を緩和できることが明らかになり、今後SRやD-セリンをターゲットとする新規治療薬の開発がてんかんの治療戦略に役立つと考えられる。本年度では、PTZ誘発痙攣発作前後の細胞外グルタミン酸およびD-セリンの濃度変化を明らかにするため、50mg/kgPTZ投与後の神経細胞の活性化レベルが一番高い領域である海馬歯状回にカニューレを留置し、Microdialysis行った。その結果、WTマウスではPTZ投与後に細胞外グルタミン酸濃度が上昇するのに対し、SR-KOマウスではPTZ投与後の細胞外グルタミン酸濃度の増加が認められなかった。細胞外D-セリンの濃度に関しては、WTおよびSR-KOマウス両方ともPTZ投与後に減少する傾向が認められたが、両群の間に有意差はなかった。SR-KOマウスのPTZ誘発痙攣に対する感受性をさらに詳しく検討するため、65mg/kgおよび35mg/kgPTZの投与実験を行った。その結果、65mg/kgPTZ投与群では46%のWTマウスで全般性tonic-clonic痙攣発作が観察されたが、SR-KOマウスでは全般性tonic-clonic痙攣発作が認められなかった。この結果に一致して、SR-KOマウスでは65mg/kgPTZ投与2時間後の大脳皮質、海馬CA1、CA3ならびに扁桃体におけるc-fos(神経活動の興奮レベルの指標)発現細胞がWTマウスに比べ有意に減少した。一方35mg/kgPTZ投与群では、PTZ投与後の痙攣発作の程度ならびにc-fos発現において、野生型(WT)とSR-KOマウスの間で統計学的有意差が認められなかった。これらの結果から、SR-KOマウスでは高濃度PTZ投与により誘発される全般性tonic-clonic痙攣など重症の痙攣に対する感受性が低下することが明らかになった。
隔年開花種コダチスズムシソウと毎年開花種オキナワスズムシソウの一方向交雑の解析

沖縄本島と周辺離島に分布し、毎年開花するオキナワスズムシソウS.tashiroi(オキナワ)と沖縄本島、八重山諸島、台湾島に分布し、6年に一度一斉開花するコダチスズムシソウS.flexicaulis(コダチ)の分布が重なる沖縄島本部半島に見られる推定雑種の詳細な形成プロセスを明らかにし、形成された雑種が独立種として確立する雑種種分化が生じているのかどうか明らかにするため、推定両親種の分布範囲において野外調査を行い、1)生活史、2)外部形態、3)訪花昆虫などを観察・比較した。また、4)葉緑体・核DNA系統解析、5)CAPS解析を行った。この結果、推定雑種は実際の交雑により生じたもので、形態的にも遺伝的にも一様ではなく、コダチからの花粉が交配することにより、雑種第1代およびその後代が形成されており、オキナワからの花粉はほとんど貢献していないことが明らかとなった。これについて、現地調査にもとづき、一斉開花の時にのみ十分なポリネーターが活動し、その際に圧倒的に大量な花粉がコダチから提供されることが主な理由であると推定した。また、雑種後代が存在することから、推定雑種が独立種として分化する方向に向かっているとは言えないと考えた。奄美大島を除く奄美群島と沖縄島北部に分布し、毎年開花する多年草であるStrobilanthes tashiroiオキナワスズムシソウ(以下オキナワ)と沖縄島中部・北部に分布し6年周期で開花して枯れる1回繁殖型多年草S.glanduliferaコダチススムジソウ(以下コダチ)を対象とし、形態比較と生育環境調査、DNA多型に基づく系統学的・集団遺伝学的解析に加え、集団内での送粉者による花粉流動の観察、形成される種子の発芽実験、交配実験などを行うことにより、オキナワ×コダチの交雑で生じたと考えられる推定雑種の形成プロセスを詳細に検討し、形成された雑種が独立種として確立する雑種種分化が生じているのかを明らかにすることを目的として研究を進めている。野外調査は2008年12月、2009年1月、2月に行なった。12月の野外調査では、沖縄本島におけるオキナワとコダチの分布域を詳細に調べた。1月の野外調査では、石垣島、西表島、久米島、伊平屋島、沖縄本島においてDNA多型解析および花粉観察用のサンプルを採取し、外部形態の測定を行なった。2月の野外調査では、沖永良部島、徳之島、沖縄本島においてDNA多型解析および花粉観察用のサンプルを採取し、外部形態の測定を行なった。沖縄本島ではポリネーター観察を行なった。遺伝的な解析については、葉緑体DNAおよび核DNAの系統解析に有効な領域のスクリーニングを行ない、いくつかの領域を用いて交雑の可能性を調べている。高精度実体顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて花粉観察を行ない、推定雑種を認識した。以上の結果、来年度に起こる予定のコダチの一斉開花で、どのように交雑が起こるかを追求する準備が調つてきた。奄美大島を除く奄美群島と沖縄島北部に分布し、毎年開花する多年草であるオキナワスズムシソウ(以下オキナワ)と、沖縄島中部・北部に分布し6年周期で開花して枯れる1回繁殖型多年草コダチススムジソウ(以下コダチ)を対象とし、オキナワ×コダチの交雑で生じたと考えられる推定雑種の形成プロセスを詳細に検討し、形成された雑種が独立種として確立する雑種種分化が生じているのかを明らかにすることを目的として研究を進めている。<野外調査>沖縄島のオキナワおよび推定雑種が予定通り結実したので、マーキング個体からの種子採取と、温室での播種を行い、発芽能力を検証した。1年前に開花したコダチは沖縄本島では全部枯死したのに対し、石垣島、西表島では生き残るものが少数あった。コダチの最近縁種であるS.flexicaulisについて台湾で野外調査を行い、比較のためのDNA多型解析および花粉観察用のサンプルを採取し、外部形態を測定した。また、同種あるいは最近縁種が分布することを期待して屋久島および中国浙江省などで調査を行なった。