hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様な複雑チオペプチド抗生物質の高効率合成

本研究では、中分子化合物である複雑チオペプチド抗生物質の多様性合成を目指し、新規カップリング反応/環変換反応によるトリアリールピリジンの迅速合成と、2つの化学ライゲーション法を駆使したペプチド結合形成法を確立する。また、核となるマルチアリールヘテロ環の合成法を確立することを目的とした。本年度は、多種類のアリール基で置換されたナフタレン、アントラセンおよび、機能性分子の重要骨格であるベンゾヘテロール化合物の合成に着手した。1.多種類のアリール基で置換されたナフタレン、アントラセンの自在合成:テトラアリールチオフェンオキシドとアラインとの[4+2]付加環化反応を用いることでオクタアリールナフタレン、オクタアリールアントラセン、デカアリールアントラセンを合成した。本手法に従えば、チオフェンに導入するアリール基の種類を変えることで、ナフタレン、アントラセンの望みの位置にアリール基が導入可能となる。2.ヘプタアリールインドールの新規合成法の開発:多数の置換基を導入する多置換インドール合成に関しては未だ効率的な手法は限られ、特に3つ以上の異なる官能基を効率的に導入する手法は限られている。他のベンゾヘテロールの合成法に関しても同様の合成上の問題を抱えている。これらが多置換ベンゾヘテロール化学の化学的・物理学的性質・応用への進展を妨げているといっても過言ではない。今回、4つの簡便な部品(ジアリールインドール・アリールボロン酸・アリールブロモアセチレン・アリールアジリジン)を繋げイナミド中間体とした後に、逆電子要請型分子内[4+2]付加環化反応、続く酸化反応によるペンタアリールインドール(PAI)の合成、続く2度のアリール化反応によってヘプタアリールインドール(HAI: heptaarylindole)を合成することに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。核となるトリアリールピリジン合成法は準備研究により見出しており、本研究課題で改良化を行うことで、多種類のトリアリールピリジンを合成可能である。本年度は中心骨格であるトリアリールピリジン合成法の応用として、5つの異なるアリール基を有するペンタアリールピリジンの合成を行った。すでに脱カルボニル型カップリングにより多様に合成可能なジアリールオキサゾールをクロロ化した、化合物に対して、ケイ皮酸誘導体を作用させることで、ノシヘプチドなど多くのチオペプチド抗生物質にみられる、5-ヒドロキシ-2,3-6-トリアリールピリジン構造を合成した。導入したヒドロキシ基を足がかりとして、テトラアリールピリジンおよびペンタアリールピリジンの多様合成法を確立した。また、チオペプチド抗生物質のペプチド部位と、トリアリールピリジン部位の結合形成を容易に行う、2つの化学ライゲーション法を検討した。その結果、ネイティブケミカルライゲーション(NCL)法によるビスチオエステルとシステインから誘導したモデル化合物からの環状ペプチドの合成に成功した。さらに、カップリング/環変換反応という多アリール化芳香族化合物の合成法を拡張し、様々な多アリール化アセン類の合成と経てロールの合成にも成功した。すでに合成ターゲットとしているチオペプチド抗生物質の主骨格およびペプチド部位の合成は完了した。また、その合成から派生したカップリング/環変換反応を用いて、ペンタアリールピリジンに加えて、様々な多アリール化アセン類の合成と経てロールの合成にも成功している。このように、目的の計画に加えて、そこから派生した研究に関しても多くの結果を上げており、当初の計画以上に研究は進展していると言える。今回、4つの簡便な部品(ジアリールインドール・アリールボロン酸・アリールブロモアセチレン・アリールアジリジン)を繋げイナミド中間体とした後に、逆電子要請型分子内[4+2]

付加環化反応、続く酸化反応によるペンタアリールインドール(PAI)の合成、続く2度のアリール化反応によってヘプタアリールインドール(HAI: heptaarylindole)を合成することに成功した。主骨格である5-ヒドロキシトリアリールピリジンの収率および選択性の向上を狙う。また、ケミカルライゲーション法をさらにモデル化合物で検討し、目的のチオペプチド合成物質の合成に着手する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
選択的IRパルスを用いたシネダイナミックMRCPによる非侵襲的な膵外分泌機能評価

空間選択的IRパルス併用シネダイナミックMRCPを用いた膵液の排出動態は、膵外分泌機能診断として応用できる可能性が示唆された。形態的な重症度分類での軽ー中等度慢性膵炎では、空間選択的IRパルス併用シネダイナミックMRCPを用いた膵液排出スコアの程度と必ずしも一致するとは限らない結果となった。慢性膵炎における病期判定には、形態イメージと機能イメージを併せた評価が重要であると考えられた。選択的IRパルス併用cine dynamic MRCPによる膵液の動態イメージング法では、従来の画像診断では描出困難であった膵液の生理的な流れを非侵襲的、生理的、経時的に可視化することか可能であり、更に生理的な膵外分泌能を評価できる可能性が高い。本法を用いた膵液の流れと膵外分泌機能検査;BT-PABA試験(PFD試験)との関連性を検討することで、非侵襲的で比較的簡便に、生理的な膵外分泌機能評価法としての可能性が期待される。この結果を基に、膵管の形態変化の程度と膵液の流れ(膵外分泌機能)との関連性も検討することで、形態変化の乏しい病態での機能低下の有無も評価可能であれば、早期診断の一助となることが期待され慢性膵炎の早期診断や早期治療、治療効果判定、急性膵炎における急性期の膵外分泌機能障害や術後膵の診断と回復期における膵外分泌機能改善度の評価など、さまざまな臨床面への貢献が期待される。平成25年度施行されたBT-PABA試験(PFD試験)と選択的IRパルス併用cinedynamic MRCPのデーター解析を行い、平成26年度のデーター収集と解析を継続しつつ、それまでに得られた基礎データに基づき日常診療において慢性膵炎患者疑いでの選択的IRパルス併用cine dynamic MRCPによる膵液の動態イメージングのデーター収集と解析も行った。現在までのデータ解析では、本法による膵液の流れは膵外分泌機能検査結果と正の相関を示す傾向にあり、今後さらにデータ収集と解析、検討が必要と考える。選択的IRパルスを用いたシネダイナミックMRCPによる膵液の流れが、BT-PABA試験による尿中PABA排泄率と有意な相関を認めており、非侵襲的で簡便な本法による膵液の流れの評価が膵外分泌機能を評価できる可能性がある。近年、早期慢性膵炎は可逆的であるため、早期診断早期治療が重要であると言われている。また、慢性膵炎の重症度を評価するにあたって、形態変化のみではなく膵外分泌機能評価も重要であり、形態診断や膵外分泌機能評価は早期慢性膵炎が疑われるときに互いを補完するために使用されるべきであることが報告されている。しかし、現在非侵襲的、簡便に膵外分泌機能を評価できる検査はほとんどなく、今日の慢性膵炎診断基準では様々な画像(形態診断)を用いたものとなっている。よって、形態変化がmildな慢性膵炎や早期慢性膵炎での、簡便で非侵襲的な本法を用いた膵外分泌機能評価を行うことで、スクリーニング検査としての可能性を評価検討する必要性がある。今までの研究結果を元に、慢性膵炎の形態的変化による重症度と本法による膵外分泌機能障害の程度との関連性について現在検討を行っている。計画に沿って、データ収集と解析が比較的順調に進行している。MRCPは、低侵襲で行える膵・胆道疾患の画像検査として広く臨床応用されている形態イメージである。我々のこれまでの検討で、通常のMRCPに空間選択的IRパルスを併用することで局所的な膵液の流れを可視化する事が可能となり、連続撮像することで膵液の生理的な排出動態(動態イメージ)を評価することが可能となった。また、本法を用いた膵液の排出動態が、膵外分泌機能(機能イメージ)として評価できる可能性があることも示唆された。次に形態変化による様々な病期の慢性膵炎において、本法を用いた膵液排出スコアの変化についても検討した。形態的に重症の慢性膵炎では、形態変化の程度と一致し膵液排出スコアも著明に低下していた。中等度の慢性膵炎では膵液排出スコアの低下がないものや、軽度の慢性膵炎でも膵液排出スコアが低下しているものもみられた。形態的に軽ー中等度の慢性膵炎では、膵液排出スコアと必ずしも一致するとは限らない結果となった。慢性膵炎における病期判定には、形態イメージと機能イメージを併せた評価が重要であると考えられる。空間選択的IRパルス併用シネダイナミックMRCPによる膵液排出動態の評価は、簡便で非侵襲的に行える膵外分泌機能スクリーニング検査としての臨床応用の可能性があると考えられる。画像データ評価のためのDICOMビューワや画像編集ソフトなどを備えた専用PCを使用するにあたり、大量の画像データを迅速に編集、評価、解析する事が可能となった。現在までのデータ収集や解析結果では、選択的IRパルス併用cine dynamic MRCPによる膵液の流れと膵外分泌機能検査結果は正の相関を示す傾向にある。

慢性膵炎の形態的変化による重症度と膵外分泌機能障害の程度との関連性について、追加のデータ収集と解析、検討を行い、本法による非侵襲的な膵外分泌機能評価と形態評価が、早期慢性膵炎のスクリーニング検査としての有用性について検討を進める予定で様々な臨床面への貢献が期待される。放射線科学膵形態変化の程度と膵液の流れ(膵外分泌機能)とのデータ収集と解析しつつ検討結果をもとに、施行頻度の高いMRCP(選択的IRパルス併用cine dynamic MRCP)のみでの様々な程度の慢性膵炎症例の形態と機能をデータをさらに蓄積、解析することが必要と考える。様々な程度の症例データ蓄積、解析することで、形態変化の乏しい病態での機能低下の有無評価の可能性がり、非侵襲的で簡便なスクリーニング法としてさまざまな臨床面への貢献が期待される。本年度、目標症例数に到達できずデータ収集が不足し、追加購入する予定であったパソコンを最終年度に延期したため。本年度購入予定であった液晶モニターを来年度に延期したため。パソコンや周辺機器、データ解析ソフト、学会旅費として使用予定。液晶モニター購入と学会旅費として使用予定。
膝蓋大腿関節症モデルラットの確立と力学的負荷がもたらす病理組織学的変化

対象として9週齢のWistar系雄性ラット40匹を使用した。MIAの投与量によって30匹ずつ2群に分け、それぞれ両膝関節内へMIA0.2mg、もしくは1.0mgを投与した。各群はさらに通常飼育群と非荷重群群の2群に分け、実験期間を2および4週、各群5匹とした。後肢懸垂方法としてキルシュナー鋼線を用いた尾部懸垂を採用した。飼育期間後、両膝関節より組織標本を作製し、薄切後、ヘマトキシリン・エオジン染色およびサフラニンO染色を実施した。その後、光学顕微鏡を用いて膝蓋大腿関節および内側脛骨大腿関節を観察し、関節軟骨に生じる組織学的変化をOARSI Histological scoreおよびmodified Mankin scoreに準じて評価し、統計学的処理を行った。その結果、0.2mgおよび1.0mg投与の両群において脛骨大腿関節および膝蓋大腿関節の関節軟骨には典型的なOA変化を認めた。そのOA変化は量及び時間依存的に高度となり、その程度は通常飼育群が非荷重群と比較してより高度であった。Scoringsystemでは非荷重群が荷重群と比較してて有意に低値を示した。以上より、非荷重状態はOA進行に対して抑制的に働くことが明らかになった。この結果より、非荷重状態が関節軟骨の変性を抑制し、そしてOAを含む基礎および臨床研究の多くの分野において有益であることを示す新しい組織学的証拠を明らかにした。当初の研究計画通り、非荷重状態がOA進行に及ぼす病理組織学的影響に関する解析が終了した。その途中成果を年度内に国内学会にて発表し、解析が完了した結果を英論文として投稿した(3月にAcceptされ、2019年度に公開される予定)。初年度において確立したPFOAモデルラットを用いて、力学的負荷環境がOA進行および滑膜や膝蓋下脂肪体に与える影響に関する研究は、学術的・臨床的に有益な知見が得られる可能性が高い。したがって、当初の研究計画通り、初年度の研究基盤の上に、今年度の研究をさらに推進させる。本研究の目的は、薬物の関節内投与による変形性膝関節症(Osteoarthritis;以下OA)モデルラットを用いて、膝蓋大腿関節における関節軟骨、滑膜、膝蓋下脂肪体に生じる変化を病理組織学的に明らかにし、力学的負荷環境を変化させることで、膝蓋大腿関節におけるOAが発症および進行する機序を病理組織学的に明らかにすることである。本年度は、ラット膝関節にモノヨード酢酸ナトリウム(Monosodium iodoacetate;以下MIA)を関節内投与することで膝蓋大腿関節における関節構成体の組織学的変化を調査することを目的として実験を行った。方法は、9週齢のWistar系雄性ラット(n = 60)に対して、両膝関節内にMIA0.2mgもしくは1.0mgを投与し、ラットOAモデルを作成した。実験期間を3日、1週、2週、4週、8週、12週とし、各飼育期間後、両後肢を採取し、脛骨大腿関節および膝蓋大腿関節における関節軟骨、滑膜、膝蓋下脂肪体の組織学的変化を観察した。その結果、0.2mgおよび1.0mg投与の両群において膝蓋大腿関節の関節軟骨にOAと同様の組織学的変化を認め、その程度は1.0mg投与群にて高度に進行していた。半定量的評価であるOARSI scoreにおいても同様の結果を得た。滑膜では0.2mgおよび1.0mg投与の両群において滑膜炎を認め、その程度は1.0mg投与群において高度であったが、両群とも時間経過によって改善した。膝蓋下脂肪体では0.2mg投与群では軽度の線維化を認めたが、時間経過によって改善した。1.0mg投与群では重度の線維化を認め、時間経過による改善は認めなかった。以上より、MIAの関節内投与によって膝蓋大腿関節、滑膜、脂肪体に組織学的変化を引き起こし、膝蓋大腿関節における変形性膝関節症(Osteoarthritis in the patellofemoral joint;PFOA)モデルとしてみなせる可能性を示唆した。初年度の研究計画通り、MIAの関節内投与が膝蓋大腿関節における関節構成体に引き起こす組織学的変化の解析が終了した。その途中成果を年度内に国内学会にて発表した。

この結果より、非荷重状態が関節軟骨の変性を抑制し、そしてOAを含む基礎および臨床研究の多くの分野において有益であることを示す新しい組織学的証拠を明らかにした。当初の研究計画通り、非荷重状態がOA進行に及ぼす病理組織学的影響に関する解析が終了した。その途中成果を年度内に国内学会にて発表し、解析が完了した結果を英論文として投稿した(3月にAcceptされ、2019年度に公開される予定)。初年度において確立したPFOAモデルラットを用いて、力学的負荷環境がOA進行および滑膜や膝蓋下脂肪体に与える影響に関する研究は、学術的・臨床的に有益な知見が得られる可能性が高い。したがって、当初の研究計画通り、初年度の研究基盤の上に、今年度の研究をさらに推進させる。当初の予定より実験動物および実験に使用する消耗品に対する支出が少なくなったため。余剰金額については来年度の国際学会の発表における参加費や旅費、論文投稿およびオープンアクセス費用などに充てる予定である。当初の予定より、論文投稿に関する費用の支出が遅れたため。余剰金額については来年度のオープンアクセス費用などに充てる予定である。
生体の栄養センサー・レプチンによる炎症免疫調節の分子機構

メタボリックシンドロームの基盤病態として全身の軽度の慢性炎症が指摘されている一方,飢餓や栄養不良の状態では,体脂肪量の減少とともに全身の免疫機能が低下し,易感染性を呈することが知られている。本研究では,肥満や痩せで大きく血中濃度が変化する脂肪細胞由来ホルモンのレプチンに着目し,レプチンが免疫応答や炎症反応を制御する可能性を検討した。絶食などによる低レプチン状態では,骨髄においてB細胞の分化異常をきたすが,単球系細胞の分化には異常をもたらさないこと,肥満による高レプチン状態では,骨髄細胞においてCCR2発現が亢進し,炎症性変化が生じている可能性があることが明らかとなった。レプチンによる炎症免疫調節の分子機構の解明を目的として,本年度,以下の検討を行った。1.栄養飢餓が及ぼす影響:従来より,栄養飢餓が胸腺の萎縮やT細胞の分化障害をもたらすことが知られている。我々は既に,絶食による血中レプチン濃度の低下やレプチン欠損マウスにおいて骨髄B細胞分化が障害されること,それらのマウスに対するレプチンの中枢投与が分化障害を抑制することを報告している。そこで,本研究では,摂食におけるレプチンシグナルに重要なメラノコルチン4型受容体(MC4R)と骨髄B細胞分化の関与を検討した。通常状態のMC4R欠損マウスは,骨髄B細胞分化に異常は認められなかった。また,48時間絶食させたMC4R欠損マウスでは,野生型マウスと同様に骨髄B細胞分化障害が惹起され,レプチンの投与で分化異常が抑制された。以上より,絶食による骨髄B細胞分化障害に対するMC4Rの関与は少ないことが示唆された。2.過栄養が及ぼす影響:肥満に伴い,脂肪組織における免疫担当細胞の種類や比率が大きく変化することが知られている。MC4R欠損マウスでは,脂肪組織への顕著なマクロファージ浸潤が認められるが,B細胞の変化は不明である。そこで,本研究では,脂肪組織におけるB細胞の変化とMC4Rの関与を検討した。MC4R欠損マウスと野生型マウスに高脂肪食(60%脂肪含有;8週間投与)を負荷し,脂肪組織におけるCD19,CD20の遺伝子の発現を検討した。高脂肪食負荷により,野生型マウスではCD19,CD20の遺伝子発現が低下傾向にあった。一方,MC4R欠損マウスにおいては,通常食下においてCD19,CD20の発現は通常食下の野生型マウスと同レベルであり,高脂肪食負荷によりそれらの発現は高脂肪食下の野生型マウスと同様に低下傾向が認められた。以上より、MC4Rは,肥満脂肪組織のB細胞変化には影響を及ぼさない可能性が示唆された。レプチンによる炎症免疫調節の分子機構の解明を目的として、本年度、以下の検討を行った。1.栄養飢餓が及ぼす影響:従来より、栄養飢餓が胸腺の萎縮やT細胞の分化障害をもたらすことが知られている。我々は既に、絶食による血中レプチン濃度の低下が骨髄B細胞の分化障害をもたらすことを報告している。そこで、本研究では、絶食に伴う骨髄単球系の変化を検討した。野生型マウスを48時間絶食させたところ、体重や脂肪組織の減少とともに、血中レプチン濃度は著しく低下した(対照3.4 ng/ml vs.絶食0.2 ng/ml)。この時、FACSを用いて骨髄細胞分画を検討したところ、CD11b陽性Gr1陰性細胞の比率は変化しなかった。以上より、絶食は、骨髄B細胞の分化障害をもたらすが、骨髄単球系には影響を与えないことが示唆された。2.過栄養が及ぼす影響:肥満に伴う脂肪組織へのマクロファージ浸潤は、メタボリックシンドロームの基盤病態として重要である。脂肪組織に浸潤する炎症促進性マクロファージは、MCP-1/CCR2系により骨髄より遊走することが報告されているが、末梢血単球の段階で既に炎症性変化を示すことが知られている。そこで本研究では、野生型マウスに高脂肪食(60%脂肪含有)を負荷し、骨髄細胞におけるCCR2遺伝子の発現を検討した。高脂肪食負荷2週の早期より、骨髄細胞におけるCCR2発現が有意に上昇した。一方、遺伝性肥満ob/obマウスでは、野生型マウスに比較して、骨髄細胞におけるCCR2の遺伝子発現が低下した。以上より、肥満に伴う高レプチン血症が骨髄細胞のCCR2発現に影響を及ぼすと考えられた。栄養飢餓、過栄養の二局面から、骨髄における免疫担当細胞の質的・量的変化に関する検討を順調に行っている。急性炎症モデルである腎虚血再灌流障害モデル、慢性炎症モデルである一側尿管結紮腎線維化モデルの立ち上げも実施している。栄養センサーとしてのレプチンの炎症免疫調節作用の意義と分子機構について、引き続き検討する。

特に、飢餓あるいは過栄養状態において種々の病態モデルを作製することにより、病態生理的意義の解明に繋げたい。消耗品を中心とする物品費に使用する。・分子生物学,生化学関連試薬(制限酵素等):200,000円・実験動物関連(飼料等):800,000円・細胞培養関連(血清等):300,000円
ヒト声帯粘膜の幹細胞システムの解明

ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞の可能性が高まってきている。また細胞が密に分布するヒト声帯黄斑は、組織幹細胞を維持している微小環境(幹細胞ニッチ)である可能性が高まってきている。ヒト声帯粘膜の幹細胞システムを検討した。ヒト声帯黄斑内の細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞あるいは骨髄の間質細胞であるであることが示唆された。成人と新生児の声帯黄斑内の細胞は、分化度が低く、3杯葉への分化が可能であり、多分化能を持ち、杯葉を越えて分化する可能性がある細胞であることが示唆された。声帯黄斑内の細胞が幹細胞性を維持するためには、幹細胞ニッチとしてのヒト声帯黄斑の微小環境が重要であることが示唆された。ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞としての機能を持ち、ヒト声帯黄斑は組織幹細胞を維持している微小環境(幹細胞ニッチ)であることが我々の研究から示唆されており、ヒト声帯粘膜の幹細胞システムを解明する研究を継続している。(1)声帯黄斑内の細胞の起源を解明している。ヒト成人と新生児の黄斑内の細胞にはCD34、CD45、collagen type Iが発現しており、造血細胞あるいは骨髄由来のcirculating fibrocytesに関連した細胞である可能性が示唆された。(2)ヒト声帯黄斑内の細胞の組織幹細胞性(幹細胞システム)を解明している。ヒト声帯黄斑内の細胞は、黄斑(幹細胞ニッチ)の微小環境により、対称性分裂を行ったり非対称性分裂を行った。また非対称性分裂を行う場合は、colony-forming unitを形成した。このことからヒト声帯黄斑内の細胞は、間葉系幹細胞あるいは骨髄の間質幹細胞の可能性が示唆された。(3)ヒト声帯黄斑における幹細胞性の維持(幹細胞システム)を解明している。黄斑(幹細胞ニッチ)の微小環境により、ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞の特徴を示したり、示さなかったりすることから、ヒト声帯黄斑内の細胞が組織幹細胞性を維持するためには、黄斑(幹細胞ニッチ)の微小環境が重要であることが示唆された。研究計画に沿って研究が進展してる。(1)ヒト声帯黄斑内の細胞の由来胚葉を解明する。ヒト声帯黄斑内の細胞には、Cytokeratin、GFAPを保持した中間系フィラメントを認めることから外胚葉由来の細胞であること。Desmin、Vimentinを保持した中間系フィラメントを認めることから中胚葉由来の細胞であること。内胚葉マーカーであるSox17が陽性であることから内胚葉由来の細胞であることがわかった。このことから声帯黄斑内の細胞は三胚葉由来の細胞であり、三胚葉への分化が可能であり、胚葉を越えた分化が可能な細胞である可能性が示唆された。(2)ラベル保持細胞法を用いて、ラット声帯の組織幹細胞の局在と分布を解明する。ラット声帯黄斑内の細胞はラベル保持細胞であり、Ki67が陰性であることから細胞増殖が休止期の細胞であった。このことからラット声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞である可能性が示唆された。(3)ラット声帯黄斑が幹細胞ニッチの一つであるヒアルロン酸リッチマトリックスであるかを解明する。ラット声帯黄斑の細胞間質にはヒアルロン酸が豊富に存在していた。ラット声帯黄斑のラベル保持細胞はヒアルロン酸受容体であるCD44を発現していた。これらのことからラット声帯黄斑はヒアルロン酸リッチマトリックスであり、幹細胞ニッチである可能性が示唆された。研究計画に沿って、研究が進展している。ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞、黄斑は幹細胞ニッチであることが我々の研究から示唆されている。1)ヒト成人と新生児の黄斑内の細胞にはCD34、CD45、collagen type Iが発現しており、骨髄由来のcirculating fibrocytesに関連した細胞である可能性が示唆された。2)ヒト声帯黄斑内の細胞は、黄斑の微小環境により対称性分裂または非対称性分裂を行った。また非対称性分裂を行う場合はcolony-forming unitを形成した。3)黄斑の微小環境により、ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞の特徴を示したり、示さなかったりすることから、ヒト声帯黄斑内の細胞が組織幹細胞性を維持するためには、黄斑の微小環境が重要であることが示唆された。4)ヒト声帯黄斑内の細胞には、Cytokeratin、GFAPを保持した中間系フィラメントを認めることから外胚葉由来の、Desmin、Vimentinを保持した中間系フィラメントを認めることから中胚葉由来の、内胚葉マーカーであるSox17が陽性であることから内胚葉由来の細胞であることがわかった。このことから声帯黄斑内の細胞は三胚葉への分化が可能であり、胚葉を越えた分化が可能な細胞である可能性が示唆された。5)ラット声帯黄斑内の細胞はラベル保持細胞であり、Ki67が陰性であることから細胞増殖が休止期の細胞であった。

このことからラット声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞である可能性が示唆された。6)ラット声帯黄斑の細胞間質にはヒアルロン酸が豊富に存在し、ラット声帯黄斑のラベル保持細胞はヒアルロン酸受容体であるCD44を発現していた。ラット声帯黄斑はヒアルロン酸リッチマトリックスであり、幹細胞ニッチである可能性が示唆された。7)ヒト声帯黄斑内の細胞を、脂肪、軟骨、骨組織に分化誘導できた。ヒト声帯黄斑内の細胞は組織幹細胞の可能性が高まってきている。また細胞が密に分布するヒト声帯黄斑は、組織幹細胞を維持している微小環境(幹細胞ニッチ)である可能性が高まってきている。ヒト声帯粘膜の幹細胞システムを検討した。ヒト声帯黄斑内の細胞は骨髄由来の間葉系幹細胞あるいは骨髄の間質細胞であるであることが示唆された。成人と新生児の声帯黄斑内の細胞は、分化度が低く、3杯葉への分化が可能であり、多分化能を持ち、杯葉を越えて分化する可能性がある細胞であることが示唆された。声帯黄斑内の細胞が幹細胞性を維持するためには、幹細胞ニッチとしてのヒト声帯黄斑の微小環境が重要であることが示唆された。ヒト声帯粘膜の幹細胞システムの解明をさらに行う。1.ヒト声帯黄斑内の細胞の幹細胞性と幹細胞システムの解明を行う。2.ヒト声帯の組織幹細胞と細胞周辺環境(幹細胞ニッチ)の幹細胞システムの解明をさらに行う。医学引き続き研究を行うため、当該年度で余った予算を、次年度で使用する予定であるため。年度代わりの支払いの関係試薬、実験材料など次年度で相殺する
生物生産におけるマシンビジョンに関する研究-植物形態情報認識アルゴリズムの開発-

この研究は,機械の目による認識のアルゴリズムを開発し,それを機械の知能化における支援システムとしての情報計測システムとして構築することを目指したものである.ここでは,特にワークセルロボットに用いられることを前提とし,ロボットの目としての認識する形状情報における特徴を空間周波数領域でとらえ,その情報を認識への利用情報とすることを試み,その可能性と問題点について検討を行った.具体的には機械が植物体の形状を認識する方法として,植物体の形状を画像計測による2次元情報のパターンとして,認識できるように特別な座標系(極座標系)への変換処理と2次元FFT処理を中心に,形状情報を単純化し,クラスター分けを行うアルゴリズムを組み立てた.ハードウェアの構成は,マシンビジョンシステムにおける目の動きを機能するための画像入力システムとして,ロボットモデル(三菱電気(株):ム-ブマスターEX RV-M1),CCDモノクロカメラ(ピアス(株):PX-380)を基本に,認識用の計算機および画像入力ボードを加えて構成した.また,ソフトウェアの構成は,次のことを基本として,物体の認識アルゴリズムの開発を行った.物体の形状をパターンとして認識するためには,その大きさ,位置,方向が異なる場合でも,同じ図形ならば同じ形状として認識しなければならない.そこで形状に関する大きさ,位置,方向の情報を標準化あるいは正規化することにより形状認識を試みた.大きさについてはその画素数からズ-ミング処理を,,置については2次元FFT処理あるいはモーメントからの重心演算処理を,方向情報については角度方向と半径方向を2次元とする極座標変換後に2次元FFT処理を適応させた.その結果,単純な図形については,これらの処理が有効であることが確認できた.しかし,複雑な図形については画素数の問題もあるが,クラスタ分けができる程の十分な精度が得られなかった.この研究は,機械の目による認識のアルゴリズムを開発し,それを機械の知能化における支援システムとしての情報計測システムとして構築することを目指したものである.ここでは,特にワークセルロボットに用いられることを前提とし,ロボットの目としての認識する形状情報における特徴を空間周波数領域でとらえ,その情報を認識への利用情報とすることを試み,その可能性と問題点について検討を行った.具体的には機械が植物体の形状を認識する方法として,植物体の形状を画像計測による2次元情報のパターンとして,認識できるように特別な座標系(極座標系)への変換処理と2次元FFT処理を中心に,形状情報を単純化し,クラスター分けを行うアルゴリズムを組み立てた.ハードウェアの構成は,マシンビジョンシステムにおける目の動きを機能するための画像入力システムとして,ロボットモデル(三菱電気(株):ム-ブマスターEX RV-M1),CCDモノクロカメラ(ピアス(株):PX-380)を基本に,認識用の計算機および画像入力ボードを加えて構成した.また,ソフトウェアの構成は,次のことを基本として,物体の認識アルゴリズムの開発を行った.物体の形状をパターンとして認識するためには,その大きさ,位置,方向が異なる場合でも,同じ図形ならば同じ形状として認識しなければならない.そこで形状に関する大きさ,位置,方向の情報を標準化あるいは正規化することにより形状認識を試みた.大きさについてはその画素数からズ-ミング処理を,,置については2次元FFT処理あるいはモーメントからの重心演算処理を,方向情報については角度方向と半径方向を2次元とする極座標変換後に2次元FFT処理を適応させた.その結果,単純な図形については,これらの処理が有効であることが確認できた.しかし,複雑な図形については画素数の問題もあるが,クラスタ分けができる程の十分な精度が得られなかった.
β3インテグリン機能発現におけるキンドリンの役割解明と新たな因子の探索・同定

β3インテグリンはαIIbβ3およびαVβ3から構成されるインテグリンファミリーの一員である。αIIbβ3は血小板上の主要なインテグリンであり、血小板凝集に必須である。αVβ3は血管構成細胞および腫瘍細胞などに発現し、血管病や腫瘍の増殖転移に関わっている。キンドリンはILKなどの細胞内タンパク質と相互作用するインテグリン活性化因子として機能している。我々はILKがインテグリンの活性化に関わることを報告してきた。本課題においてαIIbβ3活性化におけるキンドリン-3のドメイン機能を研究した。キンドリン-3の何れのサブドメインもαIIbβ3の活性化に重要な役割を担う可能性が示唆された。β3インテグリンは血液細胞(血小板など)、血管構成細胞、腫瘍細胞などに発現する接着受容体であり、血栓症や血管病の発症・進展および腫瘍の浸潤・転移において重要な役割を果たしている。しかしながら、インテグリン機能発現における分子機構の詳細は明らかではない。申請者らは発現クローニング法によりintegrin-linked kinase(ILK)がインテグリン活性化に関わる因子の1つとして同定し報告した。本研究では、ILK結合タンパク質の1つである細胞内タンパク質キンドリンに着目し、インテグリン機能発現に関わるメカニズムを明らかにする。また、キンドリンが関連する細胞内タンパク質および新たなインテグリン機能発現因子の探索・同定とその機能解析などの基礎的研究を行い、創薬シーズとして展開することを目的にしている。今回はキンドリン-3欠損細胞株の作製に取り組んだ。キンドリン-3を発現するヒト慢性骨髄性白血病細胞(K562細胞)にCRISPR/Cas9ゲノム編集法を用いて欠損株を樹立した。K562細胞はβ1インテグリンを発現する細胞である。本細胞においてアゴニスト刺激によりβ1インテグリンの活性化が誘導された。一方、樹立したキンドリン-3欠損細胞ではβ1インテグリンの活性化に障害がみられた。次に、ヒト巨核球系白血病細胞を用いてキンドリン-3欠損細胞の樹立に取り組んでいる。本細胞はβ3およびβ1インテグリンを発現している。これまで、アゴニストの刺激によりいずれのインテグリンも活性化されることを観察できた。細胞株の遺伝子導入効率が悪いことや細胞の多様性などにより目的細胞株樹立に時間を要している。β3インテグリンは血小板、血管構成細胞、腫瘍細胞などに発現する接着受容体であり、血栓症や血管病の発症・進展および腫瘍の浸潤・転移において重要な役割を果たしている。しかし、インテグリン機能発現に関わる分子機構の全容は明らかはでない。申請者らは発現クローニングの手法を用いてintegrin-linked kinase(ILK)がβ3インテグリンの機能発現に関わる因子の1つとして単離報告した。本研究では、ILK結合タンパク質の1つであり、インテグリン活性化に必須の細胞内アダプタータンパク質キンドリンに着目し、インテグリン機能発現のメカニズムを明らかにする。また、キンドリンが関連する細胞内タンパク質や新たなインテグリン機能発現因子の探索実験など基礎的研究を通じて、創薬シーズとしての展開を目指している。今回は前年度に引き続いてキンドリン欠損株の樹立に取り組んだ。今回新たにヒト赤芽球白血病細胞(HEL, human erythroleukemia)を用いた。本細胞はアゴニスト刺激に反応して活性化するβ3インテグリン、αIIbβ3を発現することを確認している。クリスパー・キャス9ゲノム編集法を用いてキンドリン-3欠損クローン細胞を樹立できた。欠損細胞のインテグリンαIIbβ3はアゴニスト刺激に対して不応性であった。つぎに、欠損クローン細胞にキンドリン-3を一過性にトランスフェクションしてレスキュー実験を行ったところ、アゴニスト刺激反応性にαIIbβ3の活性化が観察できた。遺伝子導入効率が低い細胞を用いていることや細胞株の不均一性などにより、目的とするクローン細胞株の樹立に時間を要した。しかし、インテグリン機能発現における分子機構の全容は明らかではない。申請者らは発現クローニング法によりintegrin-linked kinase(ILK)がβ3インテグリンの機能発現に関わる因子の1つとして単離報告した。本研究では、ILK結合タンパク質の1つである細胞内タンパク質キンドリンに着目し、インテグリン機能発現のメカニズムを明らかにする。今回は前年度においてクリスパー・キャス9ゲノム編集法を用いて樹立できたキンドリン-3欠損ヒト赤芽球白血病(HEL, human erythroleukemia)細胞を用いてキンドリンのドメイン機能を検討した。方法としてミュータントのキンドリン-3を欠損細胞に導入してインテグリン機能発現への影響を観察した。キンドリンの各サブドメインを除去したミュータントを作製し導入実験を行ったところ、キンドリン-3欠損細胞のαIIbβ3はアゴニスト刺激に対して応答能を欠如し、野生型キンドリン-3の導入によりαIIbβ3の活性化機能を回復できた。一方、各サブドメインを個別に欠損させたミュータントはいずれも活性化誘導能に障害を認めた。

αIIbβ3は血小板上の主要なインテグリンであり、血小板凝集に必須である。αVβ3は血管構成細胞および腫瘍細胞などに発現し、血管病や腫瘍の増殖転移に関わっている。キンドリンはILKなどの細胞内タンパク質と相互作用するインテグリン活性化因子として機能している。我々はILKがインテグリンの活性化に関わることを報告してきた。本課題においてαIIbβ3活性化におけるキンドリン-3のドメイン機能を研究した。キンドリン-3の何れのサブドメインもαIIbβ3の活性化に重要な役割を担う可能性が示唆された。これまでの実験を継続して行う。種々変異型キンドリンの作製と機能解析、キンドリン-3相互作用タンパク質に関する解析実験などを進める。これまでの実験を継続して実施する。種々変異型キンドリン-3の作製および機能解析、キンドリン-3相互作用タンパク質に関わる解析実験などを進める。血栓止血学予定していた消耗品をより安価なもので購入し、節約して使用した。消耗品をより安価な物で購入し、節約して使用した。比較的高額な消耗品の購入(ゲノム編集キット、RNAi試薬、エレクトロポレーション試薬、抗体など)、学会参加に関連した使用を計画している。消耗品の購入、学会参加に関連した使用を予定している。
フォトニック結晶のための異種レジスト多層膜を用いた一括リソグラフィ技術の開発

3次元微細周期構造からなる3次元フォトニック結晶は次世代光学素子として広く応用研究されている.ただし, 3次元フォトニック結晶の製造は困難であり,その大量生産技術は確立されていない.本研究の目的は, 3次元微細周期構造の大量生産のための製法として"異種レジスト一括リソグラフィ"を提案し,実現することである.異種レジスト一括リソグラフィとは,感光性の異なるレジストを含むレジスト多層膜の各層に一括で2次元パターンを作製するリソグラフィ技術である.異種レジスト一括リソグラフィの実現には「感光性を維持した周期レジスト多層膜の作製」が必須であり,昨年の研究では,レジスト多層膜作製時のレジストの混合(ミキシング)の問題を解決するために中間膜のラミネート成膜が有効であることを示した.そこで,本年度は中間膜のラミネート成膜を用いた周期レジスト多層膜作製技術の確立を目指した.中間膜には, 1現像液が"浸透"する2中間膜上へのレジスト膜の成膜が可能である,という二つの機能が要求される.この二つの機能を同時に満たす中間膜の成膜方法として, (A)材料による方法(B)中間膜の構造による方法,の二通りの方法を検討した.(A)では「現像液には可溶,レジスト溶液には不溶である材料」によって12を満たそうとした.しかし,適切な材料を発見することはできなかった.(B)では「現像液・レジスト溶液の双方に不溶だが,現像液は通過可能,レジスト溶液は通過不可能な"隙間"のある構造」によって12を満たそうとした.多孔質ガラスを用いることで"隙間"のある中間膜を作製したが,現像液を通過させることはできなかった.(抄録なし)本研究の目的は,3次元微細周期構造の大量生産のための製法として"異種レジスト一括リソグラフィ"を提案し,実現することである.異種レジスト一括リソグラフィとは,感光性の異なるレジストを含むレジスト多層膜の各層に一括で2次元パターンを作製するリソグラフィ技術である.一年目の研究実施計画として,(1)現像液浸透構造の作製手法の確立(2)構造の設計(3)レジストの選定があった.(1)現像液浸透構造の作製手法の確立,および(2)構造の設計については,ωロールナノインプリントを用いた貫通穴加工による流路を導入したモザイク構造,(B)2種類の光源を用いた選択層のみへの露光によるウッドパイル構造,の二通りの方式を設計し研究した.(A)ロールナノインプリントを用いて75%程度の転写率を実現した.転写率75%というのは流路導入のための貫通穴加工としては課題が残っているもののロール型を用いたナノインプリントとしては十分に高いレベルにある.(B)2種類の光源を用いた選択層のみへの露光によるウッドパイル構造については以下のように設計した.ウッドパイル構造では(A)のような流路を作製せずとも最上層から最下層まで現像液が到達できる.ただし,一括露光する際に奇数層・偶数層にそれぞれ独立したパターン作製が必要であるため,2種類の光源・4種類のレジストを用いてそれぞれのパターンの干渉を防ぐ.よって4種類のレジストからなる周期多層膜の作製が必要となるが,感光性を維持した多層膜の作製が中間膜のシート供給により実現できることを示した.一括リソグラフィの実現にとって最も重要な要素技術である現像液浸透構造の作製手法に関して,(A)(B)の両方式で成果が得られたことの意義は大きい.3次元微細周期構造からなる3次元フォトニック結晶は次世代光学素子として広く応用研究されている.ただし, 3次元フォトニック結晶の製造は困難であり,その大量生産技術は確立されていない.本研究の目的は, 3次元微細周期構造の大量生産のための製法として"異種レジスト一括リソグラフィ"を提案し,実現することである.異種レジスト一括リソグラフィとは,感光性の異なるレジストを含むレジスト多層膜の各層に一括で2次元パターンを作製するリソグラフィ技術である.異種レジスト一括リソグラフィの実現には「感光性を維持した周期レジスト多層膜の作製」が必須であり,昨年の研究では,レジスト多層膜作製時のレジストの混合(ミキシング)の問題を解決するために中間膜のラミネート成膜が有効であることを示した.そこで,本年度は中間膜のラミネート成膜を用いた周期レジスト多層膜作製技術の確立を目指した.中間膜には, 1現像液が"浸透"する2中間膜上へのレジスト膜の成膜が可能である,という二つの機能が要求される.この二つの機能を同時に満たす中間膜の成膜方法として, (A)材料による方法(B)中間膜の構造による方法,の二通りの方法を検討した.(A)では「現像液には可溶,レジスト溶液には不溶である材料」によって12を満たそうとした.しかし,適切な材料を発見することはできなかった.(B)では「現像液・レジスト溶液の双方に不溶だが,現像液は通過可能,レジスト溶液は通過不可能な"隙間"のある構造」によって12を満たそうとした.多孔質ガラスを用いることで"隙間"のある中間膜を作製したが,現像液を通過させることはできなかった.現像液浸透構造の作製手法について,実験を進めるにつれ当初の計画より制約が多いことが分かり,進展はあったものの作製手法の確立・論文発表には至らなかった.また,当初の計画では2年目に行う予定たっだレジスト多層膜の作製手法に着手できている.現像液浸透構造の作製手法について今年度に引き続き研究し,来年度中に確立させる.

感光性を維持した多層膜の作製に課題が見つかったが,中間膜のシート供給により解決し,論文にまとめる.最終年度に光学特性の評価まで行えるよう,一括露光・一括現像のためのリソグラフィ手法を確立する.(抄録なし)
末梢神経再生におけるSchwann cell由来サイトカインの発現と役割について-特にninjurin-1,-2,HGFのin vivoにおける神経線維再生促進効果について-

ninjurin-2の機能解析を進めるためにRNAレベル、蛋白レベルの発現をラットを用いて検索した。ninjurin-2は主としてリンパ組織、造血組織に強い発現が見られた。中枢神経系ではRNA発現は弱くembryoではadultより強い発現が見られた。免疫組織化学的検索によりこれはninjurin-2蛋白のradial glia細胞における発現によるものであることが明らかとなった。末梢神経系では主として末梢神経節(三叉神経節、後根神経節)神経細胞において弱い発現が見られたが、ミエリンを形成するシュワン細胞には発現はほとんど見られなかった。末梢神経傷害後には、神経細胞においてもシュワン細胞においても発現の上昇が認められた。神経細胞での発現上昇はシュワン細胞よりも早く起こり、1-3日に発現のピークが認められた。ninjurin-2発現vectorをトランスフェクションしたJurkatを用いたadhesion assayと合成ペプチドを用いた阻害実験を行った。その結果、ninjurin-2も細胞接着因子であることが確認され、その機能ドメインはN末端側の細胞外領域に存在することが明らかになった。ninjurin-2を過剰発現するchinese hamster ovary(CHO)cellとそうでないCHO cellの上で、後根神経細胞の初代培養を行った所、神経突起の進展はninjurin-2を発現するCHO cell上で促進されることがわかった。ninjurin-2は、正常な状態で既に末梢神経細胞に発現されているという点でninjurin-1とは対照的で、正常な状態でも何らかの機能を持つ可能性が考えられるが、神経傷害後にはninjurin-1と同様に発現が上昇し、homophilicな細胞接着を介して神経突起の進展を促進し、神経再生を促している可能性が示唆された。ninjurin-1を過剰発現する初代培養シュワン細胞をレトロウィルスベクターを用いて作成したところ、形態、分裂速度などについては正常シュワン細胞と比較して変化が見られなかった。今後これを用いたin vivo実験により、ninjurin-1のシュワン細胞の機能に与える影響を解析していく。ninjurin-2のmRNA発現を全身の各臓器で検討したところ、ninjurin-1に比較して非常に低い事が判明した。preliminaryなRT-PCRによる解析では、脳、後根神経節などの神経系に強い発現が認められた。現在ninjurin-2に対するウサギポリクローナル抗体を作成中であり、これを用いた免疫組織化学法により、今後さらに詳細な発現部位の解析を行う。ninjurin-2はninjurin-1とのアミノ酸配列の類似から細胞接着因子であることが予想された。ninjurin-1機能解析を行った時と同様に、ninjurin-2発現vectorをトランスフェクションしたJurkatを用いたadhesion assayと合成ペプチドを用いた阻害実験を行った。ninjurin-2はninjurin-1と同様にhomophilicな細胞接着に関与するものと考えられる。今後さらに詳細な機能ドメインの解析を進める予定である。免疫組織化学的検索によりこれはninjurin-2蛋白のradialglia細胞における発現によるものであることが明らかとなった。

末梢神経傷害後には、ninjurin-1の場合と同様に神経細胞においてもシュワン細胞においても発現の上昇が認められた。神経細胞での発現上昇はシュワン細胞よりも早く起こり、1-3日に発現のピークが認められた。後根神経細胞の初代培養をおこない、細胞をninjurin-2を過剰発現するchincsehamsterovary(CHO)cellとそうでないCHOcellの上で培養したところ、神経突起の進展はninjurin-2を発現するCHOcell上で促進されることがわかった。ninjurin-2は、正常な状態で既に末梢神経細胞に発現されているという点でninjurin-1とは対照的で、正常な状態でも何らかの機能を持つ可能性が考えられるが、神経傷害後にはninjurin-1と同様に発現が上昇し、homophilicな細胞接着を介して神経突起の進展を促進し、神経再生を促している可能性が示唆された。
組織的メタ遺伝子解析の多重検定理論とその実用化

ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム、そして、フェノームなど、今後10年のライフサイエンスの基幹を担うであろう網羅的多面多階層計測から生成されるトランスオミックスデータを統合的に解析するための基礎理論と統計的方法論を開発した。本研究では、とりわけ、トランスクリプトームとデータベースを介して入手される網羅的生体内分子間相互作用情報を組み合わせ、細胞の分子機能に関与する転写因子モジュールを同定することを目的に研究開発を推進した。メタ遺伝子の知見とマイクロアレイデータの発現情報を統合して、ケース・コントロール間の遺伝子発現差に関わる生化学機能に関わる遺伝子集合を同定するための統計的検定理論の開発を実施した。当該年度で対象とした統計的問題は以下の二点である.(1)個別の仮説が与えられたもとで,仮説集合全体の有意性を評価するための方法論を構築,(2)仮説集合間に論理的包含関係がある場合の多重比較検定法を考案した。具体的には、有向グラフ構造で結び付いた仮説集合の多重検定を性能評価する上でFalse Discovery Rate(以下、FDR)基準を導入し,統計的に最適な検定・決定方式を導いた.また、試験的にMetaGP(http://metagp.ism.ac.jp)というウェブアプリケーションの開発を行った。ユーザー側見れば、(1)計測したマイクロアレイデータをサーバーにアップロード,(2)データベースのメタ遺伝子データに基づき仮説集合を定義,(3)有意性スコアを算出,(4)FDRの計算,(5)統計的有意性に基づくバイオマーカーメタ遺伝子の予測結果を出力,というサービス形態になる.本研究のもう一つの課題は,メタ遺伝子のデータベース拡充である.既存ツールの多くがGOのメタ遺伝子解析に焦点を当てているが,GOは遺伝子の機能分類に過ぎない.当該年度では,これに転写モジュールとタンパク質相互作用の情報を追加することで,発現制御のシステム的理解に結び付けるべく、転写因子のプロモータ結合部位やタンパク質相互作用データベースの整理を行い、次年度以降の機能拡張へ向けた準備を実施した。トランスオミックス計測を真に有効活用するには、各種ライフサイエンスデータベースと連携した知識発見デバイスが必要不可欠となる。本研究では、トランスクリプトームとデータベースを介して入手される網羅的生体内分子間相互作用情報を組み合わせ、細胞の分子機能に関与する転写因子モジュールを同定することを目的に研究開発を推進した。統計的観点から問題を眺めると、個別遺伝子の検定から得られた統計的エビデンスを統合して、分子機能ユニット全体のエビデンスを算出する問題として定式化される。これはメタアナリシスやマルチタスク学習と密接に関連すること、さらには、非巡回有向グラフで関連付けられた論理的包含関係を持つ多重検定の問題であることが判明した。計画研究の最終年度に相当する当該年度では、方法論のプロトタイプを完成させ、開発されたデータ解析手法を研究代表者が関わっている肺がん細胞の薬剤耐性機構の研究に応用し、そこで得られた研究成果をライフサイエンス系の論文誌に投稿した。また、MetaGP (http://metagp.ism.ac.jp)というウェブアプリケーションの開発を行った。
高血圧成因解明に向けての血小板由来増殖因子(PDGF)のシグナリングに関する研究

高血圧自然発症性ラット(SHR)由来の動脈平滑筋細胞(VSMC)をPDGF-AA及び-BBで処理すると,PDGF-BBでは細胞増殖が起こったのに対しPDGF-AAでは細胞の肥大化が見られた.正常ラット(WKY)由来の細胞ではPDGF-BBは強い増殖作用を起こすがPDGF-AAはなんら作用を示さない.したがってPDGF-AAの作用はSHRに特有のものであり,本態性高血圧患者における動脈平滑筋細胞が肥大化を起こしていることが知られているので,高血圧発症との関連性が考えられる.そこでPDGF-AAによる細胞肥大化のメカニズムについて検討した.SHRの細胞にはPDGF-AAを結合するPDGF-αリセプターがPDGF-BBに特異的なβリセプターとともに発現していた.WKYの細胞にはαリセプターの発現が見られなかったことより,αリセプターの発現がSHRの細胞におけるPDGFに対する異常な応答を起こす原因であり,さらに高血圧発症との関連性が示された.次にSHRの細胞でのPDGF-AAと-BBのシグナリングの相違を検討した.チロシンリン酸化を調べたところ,phospholipase C-_<γ1>,phosphatidylinositol 3-kinaseのリン酸化はともに見られたが,Ras-GTPase activating protein(GAP)のリン酸化はPDGF-BBでのみ見られた.フォスフォリパーゼ類の活性化について比較したところ,PDGF-BBではフォスフォリパーゼC,Dともに活性化されダイアシルグリセロール及びフォスファチジン酸のレベルの上昇が見られたのに対し,PDGF-AAではフォスフォリパーゼDの活性化が起こらず結果的にフォスファチジン酸のレベル上昇は起こらなかった.したがってGAPのチロシンリン酸化の有無,フォスフォリパーゼDの活性化の相違が本細胞におけるPDGF-AAと-BBの作用の違いを引き起こしていると考えられる.血圧調節に係わる細胞である動脈平滑筋細胞には血小板由来増殖因子(PDGF)β型リセプター(PDGFR-β)が発現しており,PDGF-ABおよび-BBが主要な増殖因子として機能する.しかしながらα型リセプター(PDGF-α)は存在しないためPDGF-AAは作用を示さない.ところが,昨年度までの研究で高血圧自然発症性ラット(SHR)の動脈平滑筋細胞には正常ラット(Wistar-Kyoto rats,WKY)の細胞と異なりPDGFR-αが発現しておりPDGF-AAが作用を示すことを明らかにした.さらにSHR由来の細胞に発現しているPDGFR-αは細胞増殖ではなく細胞の異常な肥大化のシグナル伝達を行うことを示し,本態性高血圧症患者一般に見られる肥厚との関連性が考えられることから,PDGFR-αの動脈平滑筋細胞における発現が高血圧症発症に重要である可能性を示唆した.