hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小腸再生伸長術の前臨床研究

小腸再生伸長術は、短腸症候群患者の根治的治療法で、再生素材である“小腸粘膜下組織(SIS)"を用い、小腸長と同時に小腸吸収面積を倍加させる手法である。ヒトと同様の腸間膜形態をしている大動物に対して小腸再生伸長術を行い、再生小腸の形態・機能を明確にした。その結果、大動物でも小腸再生伸長術は施行可能であり、SISにより再生させた腸管は、ある程度の機能再生を伴った形態再生をしていることがわかった。ヒトで「小腸再生伸長術」が実現可能なのか、ヒト腸間膜に形態が類似したマイクロミニピッグを用い、再生小腸壁の形態・機能を明らかにすることを目的に、以下の実験を行った。●小腸間膜対側の小腸壁を5cm長軸方向に切開し、次いで切開部の間膜側小腸壁を、そこに流入する一葉の血管をそれぞれ温存しながら5cm切開し、さらに間膜とともに二葉に分けた。二葉に分けた小腸の口側および肛門側の一端を半周切離し、操作部小腸を長軸方向に二分した。そこで間膜ごと小腸の一葉を長軸方向にずらし、切離した半周の小腸の一端を1.5cm重ねるように縫合すると、長さ3.5cm×幅2cmの見かけ上の小腸壁全層欠損部が二ヶ所でき、そこに等面積のSIS(再生素材)を縫着し、小腸壁再生を誘導した。●6ヵ月後に標本を摘出し、組織学的検討ならびにin vitroで電気刺激、ムスカリン作動薬およびNO前駆体に対しての筋収縮、弛緩反応の評価を行った。また、再生部より抽出したALPの活性を正常部と比較し検討した。【結果】腹膜炎、腸閉塞などの合併症は認めず9例生存した。再生腸管は平均6cmで、摘出標本では肉眼所見、組織所見で正常部と連続する粘膜の再生を認めた。固有筋層レベルでは全長にわたり平滑筋の再生を認めた。PAS染色で円柱吸収上皮を認め、微絨毛、杯細胞の存在も確認できた。S100染色にて神経線維が確認できた。消化吸収に関与する細胞の存在を認め、再生部でも同様の機能を有する可能性が考えられた。in vitroの実験ではムスカリン作動薬、NO前駆体に対してそれぞれ濃度依存性の収縮、弛緩反応を認め、電気刺激で周波数依存性に収縮した。筋弛緩・筋収縮を認め、神経組織も存在していることから、神経伝達を伴う筋収縮運動が起きていると考えられた。再生部のALP活性は正常部と比較し同等であり、生化学的にも正常小腸と同様の機能を有する可能性が考えられた。ヒトで我々が考案した小腸再生伸長術が可能か否か、ヒト腸間膜に類似したマイクロミニピッグを用い、再生腸管の形態および機能を明確にすることを目的に以下の実験を前年度に引き続き行った。●小腸腸間膜対側の小腸壁を5.0cm、腸管の長軸方向に切開し、次いで切開部から間膜側小腸壁を、そこに流入する一葉の血管をそれぞれ温存しながら、5.0cm切開し、さらに間膜とともに二葉に分けた。二葉に分けた小腸の口側および肛門側の一端をそれぞれ半周切離した。そこで間膜ごと小腸の一葉を長軸方向にそれぞれずらし、切離した半周の小腸の一端を1.5cm重ねるようにして縫合すると、見かけ上、長さ3.5cm×幅2.0cmの小腸全層欠損部が二か所できる。そこに当面積の再生素材(SIS)を縫着し小腸再生を誘導した。●6か月後に標本を摘出し、薬物電気生理学的、生化学的および組織学的な検討を、健常小腸および再生小腸に対して行った。In vitroではムスカリン作動薬、NO前駆体および電気刺激に対しての筋収縮・弛緩反応を観察した。健常部および再生部をホモジナイズし、Western blot法にてALPの活性を観察した。抗α-smooth muscle actin抗体および抗desmin抗体にて染色を行い、平滑筋再生の有無と程度を観察した。抗S-100蛋白抗体を用い染色を行い、神経再生の有無と程度を観察した。PAS染色を行い、粘膜の形態を観察した。その結果、再生部では、ムスカリン作動薬および電気刺激に対し、それぞれ濃度依存性および周波数依存性の収縮波を認めた。またNO前駆体に対しては、濃度依存性の弛緩反応を示した。Western blot法では再生部には、ALPの活性を健常部と同様に認めた。免疫組織化学的観察によると、粘膜面では微絨毛を有した絨毛を認め、またGoblet細胞の再生も認めた。固有筋層には神経再生を伴った平滑筋再生を認めた。ヒト腸間膜に形態が類似したマイクロミニピッグに対し、ブタ小腸粘膜下組織を用いて「小腸再生伸長術」を行い、小腸再生における再生小腸壁の形態・機能を引き続き観察できた。ヒト腸間膜に類似したマイクロミニピッグを用い、再生腸管の形態および機能を明確にすることを目的に以下の実験を行った。1小腸壁および腸間膜を二葉に分け、間膜ごと小腸の一葉を長軸方向にそれぞれずらし、見かけ上の欠損部に当面積の再生素材(SIS)を縫着し小腸再生を誘導した。26か月後に標本を摘出し、薬物電気生理学的、生化学的および組織学的な検討を、健常小腸および再生小腸に対して行った。

In vitroではムスカリン作動薬、NO前駆体および電気刺激に対しての筋収縮・弛緩反応を観察した。健常部および再生部をホモジナイズし、Western blot法にてALPの活性を観察した。抗α-smooth muscle actin抗体および抗desmin抗体にて染色を行い、平滑筋再生の有無と程度を観察した。抗S-100蛋白抗体を用い染色を行い、神経再生の有無と程度を観察した。PAS染色を行い、粘膜の形態を観察した。その結果、再生部では、ムスカリン作動薬および電気刺激に対し、それぞれ濃度依存性および周波数依存性の収縮波を認めた。またNO前駆体に対しては、濃度依存性の弛緩反応を示した。Western blot法では再生部には、ALPの活性を健常部と同様に認めた。免疫組織化学的観察によると、粘膜面では微絨毛を有した絨毛を認め、またGoblet細胞の再生も認めた。固有筋層には神経再生を伴った平滑筋再生を認めた。小腸再生伸長術は、短腸症候群患者の根治的治療法で、再生素材である“小腸粘膜下組織(SIS)"を用い、小腸長と同時に小腸吸収面積を倍加させる手法である。ヒトと同様の腸間膜形態をしている大動物に対して小腸再生伸長術を行い、再生小腸の形態・機能を明確にした。その結果、大動物でも小腸再生伸長術は施行可能であり、SISにより再生させた腸管は、ある程度の機能再生を伴った形態再生をしていることがわかった。ヒト腸間膜に形態が類似したマイクロミニピッグを用い、「小腸再生伸長術」を行い、小腸再生伸長術における再生小腸壁の形態・機能を明らかにした。当初の計画通り、概ね順調に推移している。これまでの結果である、再生部での薬物電気刺激に対する濃度依存性および周波数依存性の収縮波および弛緩波を正常群と比較し、統計学的検討を行う。またWestern blot法でのALPの活性と、免疫組織化学的観察について、再生部および正常部を比較検討し、交付申請書の計画通り、学会にて報告し、論文化する予定である。消化器外科交付申請書の研究通り、今後は、マイクロミニピッグからSISを分離し、成長因子の保持状態を確認しながら、脱細胞化・フリーズドライ化の至適条件を検討し、強度を有したSIS移植片の作製技術を確立する予定である。当初予定旅費より安くなったため、若干の差額(13080円)が生じた。来年度の旅費として使用したい。
マウス培養胚盤胞による着床機構の解明と環境ホルモンの影響に関する研究

着床機構の解明を目的として、着床浸潤モデルとしてマウス培養胚盤胞における細胞生物学的に解析する系を用いて硫酸化脂質、ビスフェノールAに着目しtrophoblast前細胞動態について着床初期にもたらす影響を検討している。これらについては、(1)硫酸化脂質は至的濃度において抑制的に働くこと、(2)ビスフェノールA(BPA)は、estrogen receptorを介した作用によりspreadingを制御している可能性があることを報告してきた。検討は、以下の項目について計画した。1)3次元内膜モデルにおける硫酸化脂質濃度の影響2)子宮内膜と胚盤胞の共培養下での硫酸化脂質の影響プロテアーゼ活性に対する硫酸化脂質の作用1)、2)については、従来のtrophoblast spreadingの培養皿に変え、スライド上に培養可能ゲルを作成し、ゲル内へのtrophoblast spreadingの状態をスライド上3次元で観察した。また、ゲル内の硫酸化脂質の濃度を変化させ、濃度によりその進展を解析した。2次元trophoblast spreading assayと同様に濃度依存性の抑制があることが示唆された。また、trophoblastから産生されるプロテアーゼ群の活性に対する硫酸化脂質の作用は抑制的に働くことが示唆された。以上より、硫酸化脂質は、trophoblastの浸潤を抑制的に制御することによって胚の着床に関与していると考えられた。3)ビスフェノールAは、高濃度においては抑制的に働く。しかもその抑制効果はestrogen antagonistより解除されることから、BAの作用する機序としてestrogen receptor介することがこの系においても示唆された。2001年THE 17^<TH> WORLD CONGRESS ON FERTILITY AND STERILITYに報告した。また、各細胞コンパートメント(特に内部細胞塊)においては、濃度により増殖促進、抑制の効果は認められなかった。したがって、高濃度でない条件ではtrophoblast spreadingと各細胞コンパートメントにおいてはなんらかの関係を認められなかった。着床機構の解明を目的として、着床浸潤モデルとしてマウス培養胚盤胞における細胞生物学的に解析する系を用いて硫酸化脂質、ビスフェノールAに着目しtrophoblast細胞動態について着床初期にもたらす影響を検討している。1)3次元内膜モデルにおける硫酸化脂質濃度の影響2)子宮内膜と胚盤胞の共培養下での硫酸化脂質の影響1)については、従来のtrophoblast spreadingの培養皿に変え、スライド上に培養可能ゲルを作成し、ゲル内へのtrophoblast apreadingの状態をスライド上3次元で観察することを試みている。また、ゲル内の硫酸化脂質の濃度を変化させ、濃度によりその進展が3次元下ではどのように制御されるかについて検討しつつある。スライド上で培養せしめるこの実験系での胚盤胞の培養自体が困難で改良を要すると思われる。2)は現在検討中である。また、各細胞コンパートメント(特に内部細胞塊)においては、ある濃度で増殖促進に働くと思われるが、その効果とtrophoblast spreadingの間にどのような関係があるかを検討中である。
ペプチドアレイを用いた微小管モーターの活性制御についての構造解析

KIF1CのFHAドメイン及びその近傍を含んだ領域の組換蛋白質の大量発現系構築を完了した。それぞれのフラグメントの多量体化をゲル濾過法と限定分解法にて解析した。またペプチドアレイを作成し、相互作用解析の条件検討を行っている。Kinesin-3ファミリータンパク質は微小管モーターのひとつである。微小管モータータンパク質は微小管が関わる細胞極性や分子の輸送に重要な役割を担う。中でもKIFICはマクロファージにおいて微小管の伸長端に集積し、細胞接着班様の構造体を制御することで細胞移動を制御すると考えられている。KIFICは分子内にFHAドメインを含む。このドメインの分子内相互作用によって微小管結合能を制御するといわれていが、その立体構造基盤は明らかにされていない。本研究ではペプチドアレイを用いてKIFICのFHAドメイン結合領域を決定するとともに、結晶構造解析によって立体構造基盤を、さらに表面プラズモン共鳴(BIACORE)・蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などを利用して分子活性化の制御機構を明らかにすることを目指す。平成20年度は、まずFHAドメイン近傍のペプチドアレイを作成しFHAドメインとの相互作用解析を行った。現在、ペプチドアレイを用いたウエスタンブロッティングの条件検討を行っている。またFHAドメインの大量発現系は構築済みで結晶化を行っているが、その単体の立体構造はアメリカの構造ゲノムプロジェクトによって解かれたため、それを用いてモデルを構築中である。FHAドメインの近傍領域を含む組換蛋白質も作成し、それらの結晶化を行うとともに、多量体化(自己阻害型の単量体か活性型の2量体)の解析をゲル濾過法にて行った。中でもKIF1Cはマクロファージにおいて微小管の伸長端に集積し、細胞接着班様の構造体を制御することで細胞移動を制御すると考えられている。KIF1Cは分子内にFHAドメインを含む。本研究ではペプチドアレイを用いてKIF1CのFHAドメイン結合領域を決定するとともに、結晶構造解析によって立体構造基盤を、さらに表面プラズモン共鳴(BIACORE)・蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などを利用して分子活性化の制御機構を明らかにすることを目指す。平成21年度は昨年に引き続きペプチドアレイを用いたウエスタンブロッティングの条件検討を行っている。それと並行して、FHAドメイン近傍の広い領域を含む領域の大量発現系を構築した。その分子について限定分解法にて分解産物をSDS-PAGEとゲル濾過法にて確認し分子内相互作用が存在するか確認した。現在結晶化に向けた詳細なコンストラクト作成と精製の条件検討を行っている。単量体形成領域と2量体形成領域はゲル濾過法によりほぼ決定し、濃度や緩衝液条件による多量体化の依存性を解析している。
分子進化学的手法によるHepatitis C virus感染経路の研究

佐賀県は、厚生省の統計において肝癌による住民の死亡率が最も高い地域であり、また肝癌の原因の90%以上がHepatitis C virus(HCV)の感染によるものである事が判明している。県内において特定の地域の50才以上の住民にHCV感染者が多く認められ過去におけるHCVの流行感染が推定された。このようなHCV高感染地域における流行時期を同定すべく、50才以上の住民の780%に認められるHCV genotype1b型についてHCV遺伝子配列の変異速度をもとにした検討をおこなった。その結果、早くとも1948年すなわち戦後にこの地域にHCVが蔓延したものという結果が得られた。その後の検討として同じ地域の各年齢層におけるHCVgenotypeの比較を行った。60才以上のHCV感染者は、HCVgenotype1b型が80%を占め30才代から50才代のHCV感染者は、HCVgenotype1b型が約70%であった。20才代から70才代までのHCV感染者から得られたHCVgenotype1b型についてHCVenvelope領域の遺伝子配列のをもとに分子系統樹を作成し比較したところ殆どが同系統のHCVgenotype1b型であった。以上の結果より県内のHCV高感染地域においては、戦後まもなくの時期に同系統のHCVgenotype1b型の流行がみられ現在60才以上のHCV感染者に肝癌の多発をみている。また、30才代から50才代のHCV感染者も約70%が60才以上のHCV感染者と同系統のHCVgenotype1b型の感染がみられ今後の注意深い経過観察が必要であると考えられた。佐賀県は、厚生省の統計において肝癌による住民の死亡率が最も高い地域である。肝癌の原因の90%以上がHepatitis C virus(HCV)の感染による。佐賀県内において特定の地域に50才以上の住民のHCV感染率が高いHCV高感染地域が存在し、過去における流行感染が推定される。この地域におけるHCV流行時期を同定すべく、HCV遺伝子配列の変異速度を基にした分子進化学的手法による検討をおこなった。対象としては、県内におけるHCV高感染地域より当科を受診した15例のHCV感染者について血中HCVRNAを抽出しHCV envelope領域の376base pairをPCR法にて増幅し遺伝子配列を決定した。3例は、約78年間隔をおいた血清をpairにして遺伝子配列を決定し塩基置換速度の指標にした。決定した遺伝子配列を基にODENを用い6-parameter法にてmatrixを計算し塩基置換速度を求めた。系統解析により対象例はすべてHCV genotype1bであり、塩基置換速度は、平均3.77×10^<-3>/site/yearであった。系統樹上の分岐点までの距離についてHCV塩基置換速度を基に計算したところ対象例のHCVが、HCV高感染地域に分岐したのは、約40年前となり早くとも1948年すなわち戦後この地域にHCVが蔓延したものと考えられた。今後は個々の症例、ないしは夫婦のHCV感染例、母子間のHCV感染例についても検討する予定である。
致死性アデノウイルス感染症の病態解析に関する研究―骨髄移植後の再活性化を中心に

最近の造血幹細胞移植では、より強化された免疫抑制剤を用いてHLA不一致の移植を行うことも可能となってきた。その場合、移植の成功を規定する因子として免疫抑制状態下での感染症、特にウイルスの再活性化による致死的感染症が問題となる。以前は、サイトメガロウイルス(以下CMV)か、再活性化を代表する病原体であったが、抗ウイルス剤とγ-グロブリン製剤の効果的使用により発症頻度は減少した。本研究では、今後より強い免疫抑制状態下で発症頻度が増加すると予想される、アデノウイルス(ADV)、BKウイルス(BKV)、水痘帯状庖疹ウイルス(VZV)、CMV、Ebstein-Barrウイルス(EBV)の5種類のウイルス再活性化状態をリアルタイムPCRを用いて定量的にウイルス再活性化状態を評価した。造血幹細胞移植を施行された15名の患児を対象とした。患児の状態に変化がないときは、2週間毎に血清を採取した。発熱、血尿、GVHDの悪化した場合は、その都度検体を採取した。総検体数256の検討から、以下の結論が導かれた。(小児造血幹細胞移植において)1.CMVウイルス再活性化は、4/256で臨床上問題とならなかった。(いわゆる感染症)CMVに関しては、現在の予防法で十分と考えられた。2.ADV、ADVの再活性化は、対象患者15名中それぞれ1例のみであった。致死性にはいたらなかったが両ウイルス共に長期に渡り検出された。臨床的には出血性膀胱炎の様相を呈していたが、ウイルス学的にはウイルス血症であり常に、重篤化する可能性が考えられた。3.5/15名で帯状疱疹が発症した。通常帯状疱疹は、神経節に潜伏していたVZVの再活性化によるもので、支配神経領域に一致した局所疾患と考えられているが、PCR法によりウイルス血症であることが証明された。確かに免疫抑制状態下での全身VZV感染症は致死的となるので、今後この方法を用いてのウイルス量の詳細な検討により全身感染症へのリスクの層別化が可能と考えられる。初年度の実験計画予定では、造血幹細胞移植後のウイルスの再活性化を評価するシステムを確立することが主目標であった。実際には、アデノウィルス(以下ADVと略)、サイトメガロウイルス(以下CMVと略)、BKウイルス(以下BKVと略)を特異的にPCRで増幅する部分を確認した。更には、リアルタイムPCRという比較的新しいPCRを行い、造血幹細胞移植後の免疫抑制状態に伴うウイルス再活性化に伴う極微量のウイルスDNAコピー数の増減を評価できるようになった。造血幹細胞移植後の臨床検体を用いて各々のウイルスゲノム量を1週間毎の経過をおって測定中である。途中経過ではあるが、使用する免疫抑制剤の種類(サイクロスポリン、抗胸腺細胞グロブリン、メソトレキセート、FK506など)、GVHDの程度、HLAの一致度などにはよらず、ある一定の頻度でADV, BKVのウイルスゲノム量が増多し、自然に消失する傾向にあった。しかしながら明らかにウイルスが再活性化しウイルス血症まで起きているのは事実であり、この現象が造血幹細胞移植という特別な免疫抑制の下で観察されるのかを今後明らかにしていく必要がある。また疫学的には、小児の造血幹細胞移植患者の方が成人症例に比べアデノウイルス感染症が多いとされるが、.小児といえとも乳児から思春期症例まで含まれるため、次年度は成人症例にも幅を拡げ大規模な解析へと繋げていく予定である。

確かに免疫抑制状態下での全身VZV感染症は致死的となるので、今後この方法を用いてのウイルス量の詳細な検討により全身感染症へのリスクの層別化が可能と考えられる。
脳同期発振現象の解析に基づく認知・言語機能の統合とその失調評価・診断法の開発

本研究においては,脳の分散同期処理による「結び付け問題」に基づいて,高次認知・言語行動における個人能力・創造性および脳半球間・半球内同期性に着目し,言語・音楽能力の高低得点の正常者群と言語・認知障害および統合失調症の患者群を対象とする言語・音楽能力の向上,さらに社会生活技能訓練プログラムの実行前後の各種データと,訓練中の記録ビデオ・音声,さらにMRIによる脳の形態情報,言語,ジェスチャーおよび音楽認知課題時における脳波・脳磁図などの機能情報をも統合して認知・言語機能失調性評価・診断システムの開発を目差した。具体的には,以下の5項目を推進した。1.皮質・皮質下系の考察をもとに,個人能力,障害性・統合失調性の特定化に最適な事象関連電位・発振の抽出と,それらの間の相関スペクトル解析法を開発した。2.脳形態・容積定量計測法,認知・言語能力の個人性評価値と事象関連電位・高周波律動発振パラメタとの相関性解析法を改良し,正常者,患者に適用した。3.ミスマッチ・ネガティビティ検出課題に基づき,検査に用いる視聴覚課題ファイルを,自然音および合成音を用いて作成した。4.データベース化アルゴリズムを実用化に向けて改良・発展を進め,正常者および認知・言語障害者の統合解析データベースの構成を試みた。5.認知・言語機能とその失調性,訓練効果の評価,ならびに個人訓練プログラム作成のための基準を,正常者と統合失調者に適用して正当性を検討した。以上の成果を総合し,海外共同研究者から特に認知言語機能失調性検査・評価の定量化の知見を導入して,認知・言語能力と統合性・失調性評価・診断システムの臨床応用可能性を確認した。言語コミュニケーション行動は,バイオメトリクスや利用者に即した学習・思考支援システム,精神障害者の治療・社会復帰訓練の評価,反社会性犯罪,狂信的宗教や民間療法,ストレスによる性格変容解明など種々の場面において,個人の置かれた状況下での思考過程・性格やそれら障害性が反映しているとして,個人性やその障害の特定を,従来の構造化された問診や感情,パーソナリティ,精神症状など心理状態の自己採点による評価,音声や身体表現等の行動パタンや談話・対話構造の分析的特徴,専門家による行動からの心理状態の認知の3種のデータに加えて,脳の各要素機能モジュール間の同期性機能統合に関する情報を採用して客観化・定量化を目指した。1.個人性,障害性の脳機能計測・解析法の開発を,高密度言語関連脳電位・磁場および高周波律動波の多部位間相関動態映像のMRI脳3次元画像へのマッピングを中心に進め,行動指標との対応を検討した。2.正常者および社会復帰を目指して生活技能訓練プログラムを受診中の精神疾患患者を対象に,ロールプレイによる構造化性格変容訓練中の言語行動評価,ジェスチャー,表情,韻律などの非言語表現を含めたビデオ音声データ,脳機能統合データの統合に向けて正常・病的対話記述コーパスの体系化を検討した。3.上記コーパスを用いた生活技能訓練による性格変容の治療効果に対する客観的・定量評価法の可能性を検討した。4.関連脳・行動データの分散コンピューティング・共有ディスク化ネットワークデータベースシステムの設計を行った。5.地域・文化の異なる現場における個人性・障害性抽出ネットワークシステムの臨床応用を目差して,男女差,文化環境による異同の検討を開始した。

本研究においては,脳の分散同期処理による「結び付け問題」に基づいて,高次認知・言語行動における個人能力・創造性および脳半球間・半球内同期性に着目し,言語・音楽能力の高低得点の正常者群と言語・認知障害および統合失調症の患者群を対象とする言語・音楽能力の向上,さらに社会生活技能訓練プログラムの実行前後の各種データと,訓練中の記録ビデオ・音声,さらにMRIによる脳の形態情報,言語,ジェスチャーおよび音楽認知課題時における脳波・脳磁図などの機能情報をも統合して認知・言語機能失調性評価・診断システムの開発を日差した。具体的には,以下の5項目を推進した。1.前年度の皮質・皮質下系の考察をもとに,個人能力,障害性・統合失調性の特定化に最適な事象関連電位・発振の抽出と,それらの間の相関スペクトル解析法を開発した。2.前年度の脳形態・容積定量計測法,認知・言語能力の個人性評価値と事象関連電位・高周波律動発振パラメタとの相関性解析法を改良し,正常者,患者に適用した。3.前年度のミスマッチ・ネガティビティ検出課題に基づき,検査に用いる視聴覚課題ファイルを,自然音および合成音を用いて作成した。4.前年度のデータベース化アルゴリズムを実用化に向けて改良・発展を進め,正常者および認知・言語障害者の統合解析データベースの構成を試みた。5.前年度の認知・言語機能とその失調性,訓練効果の評価,ならびに個人訓練プログラム作成のための基準を,正常者と統合失調者に適用して正当性を検討した。以上の成果を総合し,海外共同研究者から特に認知言語機能失調性検査・評価の定量化の知見を導入して,認知・言語能力と統合性・失調性評価・診断システムの臨床応用可能性を確認した。
血管形成・動静脈分化に関与する新規遺伝子群のTALEN法による機能解析

本研究では、マイクロアレイ法と遺伝子発現パターンを併用して選定した脳血管形成への関与が想定された11遺伝子を対象にCRISPR/Cas9法を用いて遺伝子破壊体を作成し、脳血管系の形態形成メカニズムを明らかにすることを目的とした。その結果、対象とした全11遺伝子に対してゲノム編集能を有するsgRNAの作製に成功した。また10遺伝子に対しては、フレームシフトを生じる変異体の作成にも成功し、現在これらの系統を用いて脳血管形成に関わる表現型の解析を進めている。一方並行して眼を支配する血管形成過程を解析し、ゼブラフィッシュとマウス胚子においてその初期過程を明らかにすることに成功した。平成26年度には、対象とした11遺伝子をそれぞれ破壊した系統の樹立を目指した。研究計画を策定した当初はTALEN法が、標的部位への特異性ですぐれていたため、これを用いて遺伝子破壊体を作成をめざし、eng2a遺伝子のゲノム編集活性を持つTALENの作製に成功した。現在F2世代のホモ接合体を作成し、表現型の解析を進めている。一方で急速な遺伝子編集技術の進歩をふまえて、残りの10遺伝子に関しては、CRISPR/Cas9による遺伝子編集を持ちいたノックアウト体の作製を目指した。この点では、申請内容に対して、使用する手法に関して変更を加えているが、最終的に目標遺伝子の破壊体の作製を目指している点では、なんら変更はない。CRISPR/Cas9は、off-target効果への懸念が強く持たれていたが、最近の研究報告で、設計段階である程度その影響を押さえられることが判明している。作成の簡便さをふまえ、本研究でも残り10遺伝子に関しては、CRISPR/Cas9法を用いることとした。CRISPR/directにより、off-targetの少ない標的部位を選定し、sgRNA(single guide RNA)を10遺伝子を対象にそれぞれ合成し、Cas9 mRNAとともに、1細胞期の受精卵にインジェクションした。その結果5遺伝子に関しては、HMA法解析により遺伝子編集活性を有するsgRNAを得ることに成功した。残り5遺伝子に関しては、活性の見られなかった原因を現在検討している。標的配列部位のシークエンス解析から1遺伝子に関しては、標的ゲノム配列内に変異が見つかり、これがsgRNAが機能しなかった原因であることが判明した。残り4遺伝子に関しては、原因がまだ不明なため、sgRNAの合成に問題がなかったかを、再合成により検証している。我々は、小型魚類のゼブラフィッシュを用いて、初期の脳血管系がいかにして構築され、そののちどのようにして脊髄の血管系と統合されるか、その全過程を明らかにすることに成功した。そしてetsrp/etv2遺伝子の発現を抑制し、血管形成を阻害した胚において発現が上昇する遺伝子群を、脳血管系が形成されるタイミングでマイクロアレイ法により解析した。1.5倍以上の上昇を示した遺伝子群の発現パターンを、我々が詳細に解明した血管形成過程やその動静脈分化領域と比較し、関連領域で特異的に発現している11遺伝子を抽出した。これらの遺伝子群には、頭部の血管形成領域の神経組織や間質に特異的に発現している遺伝子や、脳動脈の形成領域で発現を示す遺伝子、脳静脈の形成領域に近接した神経組織で発現を示す遺伝子、伸展する血管が接触する脳幹-脊髄の腹側領域で特異的な発現を示す遺伝子などが含まれている。本研究課題では、これらの遺伝子群を破壊(ノックアウト)したゼブラフィッシュ系統をそれぞれ作成し、それらを用いて血管形成や動静脈分化への影響を評価し、血管形成の鍵となる新たな遺伝子の同定を目指す。遺伝子破壊系統の作成の際には、血管系で特異的に蛍光を発するTg(fli1a:EGFP)y1の系統を用いることで、遺伝子破壊の血管系への影響をイメージングにより可視化し簡便に評価を行う。同時に動静脈分化マーカー遺伝子の発現変化、あるいは電子顕微鏡観察などを併用して多角的に血管形成や動静脈分化への影響を評価する。表現型の得られた遺伝子に関しては、mRNAによる表現型の回復を確認し対応する遺伝子の関与を検証し、脳血管形態の形成メカニズムの解明を目指す。平成26、27年度で、対象とした11遺伝子をそれぞれ破壊した系統の樹立を目指した。27年度末までに、ゲノム変種活性を有するsgRNAを10遺伝子に対して作成に成功し、血管系で特異的に蛍光を発する組み換えゼブラフィッシュとの交配によるF1世代の飼育を進めている。残る1遺伝子に関しても複数の標的領域に対するsgRNAを新たに設計・合成し、そのゲノム編集活性の評価を準備している。すでにF1世代の飼育を進めている10遺伝子に関しては、28年度中にゲノム変異の同定とホモ個体の作成、血管形成への影響の評価を行うための準備は整っており、概ね計画通りに順調に進行していると考えられる。我々は、ゼブラフィッシュを用いて、初期の脳血管系形成過程の全容を明らかにすることに成功した。そしてマイクロアレイ法により、etsrp/etv2遺伝子の発現を抑制した際に発現が上昇する遺伝子群を、脳血管系が形成されるタイミングで解析した。1.5倍以上の上昇を示した遺伝子群の発現パターンをデータベース上から取得し、脳血管形成領域や動静脈分化領域と比較することで、その関連領域で特異的に発現している11遺伝子を抽出した。これらの遺伝子群には、頭部の血管形成領域の神経組織や間質で特異的に発現している遺伝子や、脳動脈の形成領域で発現を示す遺伝子、脳静脈の形成領域に近接した神経組織で発現を示す遺伝子、伸展する脳血管が接触する脳幹-脊髄の腹側領域で特異的な発現を示す遺伝子などが含まれていた。

本研究課題では、これらの遺伝子群を破壊したゼブラフィッシュ系統をそれぞれ作成し、それらを用いて血管形成や動静脈分化への影響を評価し、血管形成の鍵となる新たな遺伝子の同定を目指す。破壊体の系統作成には、血管系で特異的に蛍光を発するTg(fli1a:EGFP)y1を用いることで、イメージングにより血管形成への影響を可視化する。表現型が認められた系統に対しては、さらに動静脈分化のマーカー遺伝子の発現変化なども併せて解析することで、脳血管形成メカニズムの解明を目指す。2016年度には、継続して遺伝子破壊体の作成を行い、5遺伝子でフレームシフトを生じるホモ接合遺伝子破壊体を取得した。しかしこれらの破壊体においては血管形成に目立った異常は認められなかった。残りの5遺伝子に関しては、フレームシフトを生じる雌雄体が揃わなかったため現在次世代を飼育しており今後継続して解析していく。1遺伝子に関しては、フレームシフトを生じる個体が得られなかったため、F0世代から作成し今後解析していく。本研究では、マイクロアレイ法と遺伝子発現パターンを併用して選定した脳血管形成への関与が想定された11遺伝子を対象にCRISPR/Cas9法を用いて遺伝子破壊体を作成し、脳血管系の形態形成メカニズムを明らかにすることを目的とした。その結果、対象とした全11遺伝子に対してゲノム編集能を有するsgRNAの作製に成功した。また10遺伝子に対しては、フレームシフトを生じる変異体の作成にも成功し、現在これらの系統を用いて脳血管形成に関わる表現型の解析を進めている。一方並行して眼を支配する血管形成過程を解析し、ゼブラフィッシュとマウス胚子においてその初期過程を明らかにすることに成功した。平成26年度には、対象とした11遺伝子をそれぞれ破壊した系統の樹立を目指した。eng2aに関しては、F2世代でのホモ接合体の樹立に成功した。また残りの5遺伝子に関しては、ゲノム編集活性を有するsgRNAを作成し、現在F0世代を飼育している。一方で残りの5遺伝子では、5遺伝子のゲノム編集が確認できたF0世代が作成できていない。この点でやや予定から遅れているが、現在その遅れを取り戻すべく鋭意解析を進めており、十分挽回可能であると考えている。継続して、11遺伝子の遺伝子破壊体の作成を進める。ゲノム編集活性を認めた10遺伝子に関しては、すでに血管系で蛍光を発する遺伝子組み換え体と交配し得られたF1世代を飼育している。育ったF1世代に対しては、各個体ごとにfin clip法によるゲノム抽出とHMA法による変異の同定を行い、各変異パターンごとにシークエンス解析を行い、フレームシフトを生じる変異を有する個体を同定する。同一変異体の雌雄を交配してホモ接合体のノックアウトゼブラフィッシュの系統の樹立を目指す。系統樹立後は、その表現型解析を進めていく。ゲノム編集活性を有するsgRNAが得られなかった1遺伝子では、標的部位を変えて新たに設計・合成を行い。活性を有するsgRNAが得られるように実験を進めていく。
新規水溶性フラーレン誘導体の合成とフォトダイナミックアクション

フラーレンはサッカーボール分子(C60フラーレン)およびラグビ-ボール分子(C70フラーレン)を代表とする新しい炭素素材の総称である。それらの大量合成法が確立された1990年以降、その超伝導体としての特異な物性に基づき、高機能炭素材料への応用研究が広範に行われてきた。しかしながらフラーレンは水にまったく溶解しないことから、その生物活性に関する研究はこれまでにほとんどなかった。本研究は、新規水溶性フラーレン誘導体をC60およびC70よりそれぞれ調製し、それらの光細胞毒性を測定することにより、癌の光物理化学療法に用いることのできるポルフィリン以外の新しいタイプの光増感剤の開発を目的として行った。中村ら(東大理)により、トリメチレンメタン活性種を用いた環化付加反応をキ-ステップとして、C60およびC70よりそれぞれ合成された新規水溶性フラーレンカルボン酸(1および2)のヒトBリンパ球(Raji細胞)に対する光細胞毒性を調べた。その結果、ポジティブコントロールとして用いたpheophorbide aが0.5μMで顕著な光細胞毒性を示したのに対し、1および2はいずれも50μMでまったく光細胞毒性を示さなかった。本結果は、これらフラーレン誘導体の三重項寿命がポルフィリン誘導体と比べてきわめて短いこととよく一致している。最近、フラーレン誘導体は一重項酸素による有機反応に光増感剤として有効であることが報告されているが、癌の光物理化学療法においてはポルフィリン誘導体のような有効性は期待できないことが明らかになった。しかしながら、これらフラーレン誘導体は光細胞毒性、細胞毒性がともにきわめて低かったことより、ドラッグのキャリアーとして役立つかもしれない。
アデノシン受容体による代謝型グルタミン酸受容体の機能調節と運動学習の制御

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は,細胞膜表面ないしは細胞内で異種のGPCRと複合体を形成し,機能的な相互作用を行っている。神経細胞においてもGPCRの異種複合体の形成は確認されているが,生理的な役割は殆どわかっていない。本研究においては小脳プルキンエ細胞におけるアデノシンA1受容体と代謝型グルタミン酸受容体に注目し,これらの相互作用が運動学習に重要な小脳LTDの誘導を制御している事を明らかにした。記憶・学習は気分,覚醒,興味など様々な心理的要因によって変化する。記憶・学習の細胞レベルの基礎過程としてシナプス伝達効率の変化(シナプス可塑性)が盛んに研究され,分子メカニズムの解明が進んでいる。しかしながら,シナプス可塑性がどの様な心理的機序で制御されているかについては未解明の点が多い。本課題では、小脳依存的な運動学習の基礎過程であるシナプス可塑性:小脳長期抑圧が制御されるメカニズムに注目し検討を行った。GPCR同士が機能的に相互作用することから、我々は小脳長期抑圧の誘導に関わる代謝型のグルタミン酸受容体(mGluR1)と他のGタンパク質共役型受容体(GPCR)の相互作用に着目した。本課題を実施結果から、以下の点が明らかになった。(1)免疫沈降法および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法によって、mGluR1とアデノシンA1受容体(A1R)が相互作用する事を明らかにした。(2)A1Rの特定の部位の構造とアミノ酸配列がmGluR1との相互作用に重要である事を示した。(3)蛍光ラベル抗体を用いたFRETにより小脳においてもmGluR1とA1Rが相互作用している事を示した。(4) A1Rの活性化がmGluR1のシグナル伝達を抑制し、小脳長期抑圧の誘導を抑制する。以上より,mGluR1とA1Rは細胞膜近傍で複合体形成し,相互作用することで小脳の長期抑圧を制御していることが明らかになった。現在は、mGluR1とA1Rの相互作用を操作する方法を検討中であり、可能となった場合には小脳依存的運動学習制御メカニズムの解明や、小脳の障害による運動失調の治療方法の確立などにつながる。さらに他のGPCR同士の相互作用についても明らかにし、現在も研究を進めている。近年GPCRの立体構造の解明が進んでおり、GPCR相互作用の分子機構と生理的な意義について更なる発展が期待できるものである。シナプス伝達効率が持続的に変化するシナプス可塑性は記憶・学習の細胞レベルでの基礎過程であると考えられ,研究が盛んにすすめられている。小脳皮質の平行線維ープルキンエ細胞間のシナプス伝達が持続的に低下する長期抑圧(小脳LTD)は小脳依存的な運動学習に関わると考えられている。我々は小脳LTDの誘導に関わる代謝型グルタミン酸受容体(mGluR1)が異種のGタンパク質共役型受容体(GPCR)と相互作用し,シナプス可塑性が調節されている可能性に注目し研究を進めてきた。これまでにアデノシンA1受容体(A1R)の活性化がmGluR1のシグナル伝達を調節し,小脳LTDの誘導効率を変化させることが分かった。本研究では,ライブセル・イメージングと電気生理学的,生化学的解析によってA1RとmGluR1の相互作用の分子メカニズムと生理作用の解明を目指し以下の実験を行った。1免疫沈降法のよる相互作用部位の特定。2蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)イメージング法によるA1RとmGluR1相互作用の解析。3全反射蛍光(TIRF)顕微鏡イメージングによるA1RとmGluR1複合体の動態観察。以上の実験結果より,mGluR1とA1Rは細胞膜のごく近傍で複合体形成し,相互作用することが分かった。また、mGluR1とA1Rの相互作用について重要な役割を果たす部位が判明した。今後,mGluR1とA1Rの相互作用と小脳依存的運動学習の関係について解析をすすめることで,記憶・学習などの脳の高次機能について分子レベルで理解する事につながると期待される。Gタンパク質共役型受容体同士の相互作用についてのイメージングおよび生化学的解析は、実験計画当初の通りすすんでおり、学会等で研究成果を発表している。分子メカニズムについては更なる詳細な検討が必要であるので、今年度の研究を継続し実施する。また、共同研究によって平成24年度に実施を計画している小脳依存的運動学習を評価する系の確立もすすんでおり,GPCR相互作用と運動学習の解析は十分実施可能な状況である。以上の結果より、交付申請書に記載した研究の目的の達成は「おむね順調に進展している」と判断できる。当初の実験計画に従い、GPCRシグナル・クロストークの生理学的、行動学的な研究を実施する。また,GPCRへテロ複合体形成の分子メカニズムについては更なる詳細な検討を必要としているので,今後も継続して実施する。

生理学的、行動学的解析に必要な実験動物(ラットおよびマウス)、試薬類を購入する。電気生理学的に詳細な解析を行うため、解析装置を購入する。また、学術雑誌への投稿費および国内外の学会での研究成果発表を行うための出張費として使用する予定である。
古代マヤ文明南西周縁域の広域考古人骨研究

平成29年度の調査によってその優れた保存状態と当初の想定を超える規模が判明したグアテマラ南海岸のシンカベサス遺跡考古人骨群を中心に研究を進めた。平成30年度を通し国内外の研究機関で進めてきた安定同位体の分析結果が整ったことは特筆に値する。分析結果は当初の研究案通り専用データベースに統合され、巨視骨学鑑定結果、出土考古コンテクストと突き合わせ、議論が進められた。平成31年3月末現在で得られたデータをとりまとめると、以下のような所見を報告することができる。1)シンカベサス考古人骨群は定住農耕を営む集団であったようである。これは骨学的に得られた性別と死亡時年齢の分布状況を、先行研究(古代マヤ文明の最盛期である「古典期」を代表する都市遺跡コパンの巨大考古人骨群)と比較し、得られた所見である。2)一方、シンカベサス考古人骨群は同都市集団と大きくライフスタイルを異にする集団であったようである。これは下肢骨の形態計測の比較から得られた所見である。3)シンカベサス考古人骨群は性別による明白な分業のない社会を生きていたようである。これは生存時最大身長の分布や歯牙う蝕罹患率、大臼歯損耗状況を古典期コパンの都市集団と比較し、タンパク源の配分状況や基礎糧食文化の性差を議論した結果、得られた所見である。4)シンカベサス考古人骨群が生きた先古典期終末期のグアテマラ南海岸には、活発な移民流動が存在していたようである。これは同考古人骨群の第一大臼歯から抽出したストロンチウム安定同位体比を、先行研究のリファレンスと比較し、得られた所見である。5)シンカベサス考古人骨群の食性は、トウモロコシに依存する多様性に乏しいものだったようである。これは同考古人骨群の長骨片から得られた炭素と窒素の安定同位体比を、先行研究のリファレンスと比較し、得られた所見である。平成29年6月から11月まで、グアテマラに滞在し、同国デルバジェ大学、同国立歴史学人類学研究所(IDAEH)の施設にて、南海岸地方由来の考古人骨群の巨視骨学鑑定、並びに同位体分析の為の試料採取を行った。シンカベサス考古人骨群:1980年代の先行研究によれば30体前後の個体数ということであったが、その実100体以上を含む非常に大きな考古人骨群であった。保存状態も当初考えられていたよりもずっと良好で、本研究における中心的な役割を果たす考古人骨群となった。平成30年4月現在、全個体の作業を終了している。まだ暫定的なものではあるが、以下のような非常に興味ぶかい所見が得られた。1)歯牙う蝕のパターンと損耗状況の分析から、先行研究とは明白に異なる食糧事情が認められ、紀元前の海岸地域(例:レイノサ遺跡)というよりは、より時代が新しい古典期(紀元後200年から900年頃)と呼ばれる時代の内陸部のものに近い食糧事情(例:コパン遺跡)が示唆された。2)多くの個体に戦闘行為に関わると思われる暴力の痕跡が認められた。3)現在までマヤ文明圏には存在しないとされていた「環状式(Annular Type)」と思われる特殊な頭蓋変形を伴う個体を複数体確認した。4)壊血病を罹患していると思われる個体を複数体確認した。バルベルタ考古人骨群:事前確認の通り約30体の個体を含む考古人骨群であった。シンカベサス考古人骨群に比べ保存状態に優れず、あまり画期的と呼べる所見を得ることはできなかった。しかし、歯牙による食糧事情の考察に関しては、シンカベサスとはまた異なり、よりレイノサに近い紀元前の海岸地域らしい様相が見て取れた。最後に、以上を踏まえて、平成30年4月現在の所見を総合すると、紀元前の南海岸地方にはライフスタイルを異にする複数の集団が割拠していたようである。本課題における調査のうち最も時間を要する作業である現地での巨視骨学鑑定の全行程を完了している為、課題の進捗は概ね順調な状況を示していると判断する。平成30年度の初頭(5月中)には採取した同位体分析の試料を関係各国に輸送する予定であり、年度の中頃までには前述した全個体情報のデータベース化と統計分析が完了、年度後半には課題の最終的な考察がまとめられるはずである。

これは下肢骨の形態計測の比較から得られた所見である。3)シンカベサス考古人骨群は性別による明白な分業のない社会を生きていたようである。これは生存時最大身長の分布や歯牙う蝕罹患率、大臼歯損耗状況を古典期コパンの都市集団と比較し、タンパク源の配分状況や基礎糧食文化の性差を議論した結果、得られた所見である。4)シンカベサス考古人骨群が生きた先古典期終末期のグアテマラ南海岸には、活発な移民流動が存在していたようである。これは同考古人骨群の第一大臼歯から抽出したストロンチウム安定同位体比を、先行研究のリファレンスと比較し、得られた所見である。5)シンカベサス考古人骨群の食性は、トウモロコシに依存する多様性に乏しいものだったようである。これは同考古人骨群の長骨片から得られた炭素と窒素の安定同位体比を、先行研究のリファレンスと比較し、得られた所見である。平成30年度は安定同位体分析と採取データのデータベース化、共時集団内、並びに通じ集団間での統計分析を行う予定である。特にシンカベサス考古人骨群で得られた所見に関し、他地域・他時系列の考古人骨群と詳細に比較検証を行う予定である。平成29年度から繰り越した1,300,000円は同位体分析の為の業務委託費用として30年度に使用する予定である。29年度中に同位体分析費用を行使しなかった理由は、グアテマラから試料を輸出する手続きに時間を要したからであり、30年度の初頭には執行する予定である。
非母語の音声習得における音韻カテゴリー境界の形成

第二言語の音韻習得の困難に関わる要因として、言語によっては一般の聴覚心理的特性からみると特異的な音韻境界を持った特殊な音韻カテゴリーが存在し、そのことが習得困難原因となる場合のあることが示唆されている。外国人日本語学習者にとって日本語の特殊拍の習得はしばしば困難を伴う。これについてはいわゆる時間長の判断が基礎となるが、その知覚について日本語話者と外国人学習者の特性を比較した。長・短母音の知覚については、日本語母語話者は長・短母音同定において音の高さ、強さの影響を受けないが、外国人学習者は影響を受ける傾向があることが確認された。一般の聴覚心理的現象では、音の長さの知覚に高さ、強さが影響する傾向があるが、日本語話者は高さ、強さに依存しない継続時間長の言語的カテゴリーを形成していると考えられ、直接的な音の長短とは別のタイミングに着目している可能性が示唆された。促音・非促音の知覚については、日本語話者では無音区間長だけでなく、先行母音長の増加が促音判断の増加にをもたらしたが外国人学習者ではその効果は小さい。日本語話者では促音の判断が、母音の立ち上がりのタイミング知覚に基ずく当該音節全体の長さによることを示唆された。以上両現象ともに、日本語話者では直接の時間長の知覚では無く音声のタイミング判断が基礎に有り、日本語のモーラリズムの特性が反映されているものと考えられた。第二言語の音韻習得の困難に関わる要因の一つとして言語によっては聴覚心理的にみると特異的な音韻境界を持った特殊な音韻カテゴリーが存在し、そのようなカテゴリーが習得困難をもたらす場合のあることが最近示唆されている。本研究は日本語の長・短母音等を対象とし、学習初級者が第二言語の音韻カテゴリー境界をどのように形成し、それが母語話者のものとどのように異なるかを検討することを目的としている。多くの外国語話者にとって日本語の長母音・短母音の習得は困難を生ずる。韓国語話者を対象とした申請者等の研究では、純音や母音音声の長さの弁別という非言語的課題では、韓国人、日本人ともに音の高さ、強さの影響を受けるが、長・短母音の同定という言語的課題では韓国人のみ影響を受け、日本人は影響を受けない。本研究ではまず、中国語話者を対象とし、日本語長・短母音の知覚特性が韓国語話者と同様に日本語話者と異なるかどうかを検討した。予備的結果では韓国人と同様の傾向が見られたが、さらにデータを補充して検討している。上述の日本語話者の知覚特性は、長・短母音の音素対立を有し、かつ高低ピッチアクセントを有する日本語の特性が関係していることが推察される。ただし他の可能性として日本人は音の長短を直接知覚しているのではなく、音声のタイミングを元に音韻判断を行っていることが考えられる。これに関連して促音の知覚実験を行ったところ、ata, attaの同定において無音区間の長さだけでなく第1母音の長短が知覚に影響していることがわかった。このことは、第1母音長と無音区間の長さを合わせた第2母音の立ち上がりのタイミングが促音の知覚に関係していることを示唆している。この点について外国人日本語学者との比較検討を今後行う予定である。第二言語の音韻習得の困難に関わる要因として、言語によっては聴覚心理的特性からみて特異的な音韻境界を持った特殊な音韻カテゴリーが存在し、習得困難原因となる場合のあることが示唆されている。本研究ではこの問題につき、第二言語学習の初級者がどのようなカテゴリー境界を形成し、又それが母語話者のものとどのように異なるかを検討することを目的とする。外国人日本語学習者にとって日本語の長母音・短母音の習得はしばしぱ困難を伴う。これにつき合成音による長・短母音の同定において、外国人学習者は一般に音の高さ、強さの影響を受けるが、日本語母語話者は影響を受けないことが確認された。聴覚心理的には、音の長さの知覚に高さ、強さが影響する傾向があると考えられるが、日本語話者は高さ、強さに依存しない継続時間長のカテゴリーを形成していると考えられる。

二拍有意味単語を用いた実験でも同様の結果が得られたが、語末においてその傾向が顕著であること、母語のリズム特性(シラブルリズム、ストレスリズム)による差は小さいことが見られた。一方、促音の知覚に関し、日本語話者では促音の判断が、第二音節母音の立ち上がりのタイミングに依存していることが示唆された。上記の長短母音の同定についても、このようなタイミング構造の判断が基本と成っている可能性が考えられ、検討の必要がある。第二言語の音韻習得の困難に関わる要因として、言語によっては一般の聴覚心理的特性からみると特異的な音韻境界を持った特殊な音韻カテゴリーが存在し、そのことが習得困難原因となる場合のあることが示唆されている。外国人日本語学習者にとって日本語の特殊拍の習得はしばしば困難を伴う。これについてはいわゆる時間長の判断が基礎となるが、その知覚について日本語話者は独特の判断基準を有していると考えられた。長・短母音の知覚については、日本語母語話者は長・短母音同定の言語的課題において音の高さ、強さの影響を受けないが、外国人学習者は影響を受ける傾向があることが確認された。一般の聴覚心理的現象では、音の長さの知覚に高さ、強さが影響する傾向があるが、日本語話者は高さ、強さに依存しない継続時間長の言語的カテゴリーを形成していると考えられ、実質的な音の長短では無く音の内容とは別のタイミングに着目している可能性が示唆された。一方、促音・非促音の知覚については、無音区間長だけでなく、日本語話者では先行母音長の増加が促音判断の増加に結びつくことが見出されたが外国人学習者ではその効果は小さい。すなわち、日本語話者では促音の判断が、母音の立ち上がりのタイミング知覚に基ずく当該音節全体の長さによることを示唆された。以上両現象ともに、日本語話者では直接の時間長の知覚では無く音声のタイミンク判断が基礎に有り、日本語のモーラリズムの特性が反映されているものと考えられた。
高分解能衛星情報を使用したタイプの異なる森林のCO2吸収量の緊急推定方法の確立

高分解能衛星IKONOS, QuikBirdを利用して、スギ人工林の炭素貯留畳の推定を行った。対象地は新潟県巻町管内角田山周辺,及び津川町管内である。この管内一帯に、角田山周辺に調査プロット21個、津川町一帯に45個を設定し、プロットの材積とプロット位置に該当するバンド3の平均輝度値との相関を調べたところ、いずれの地域にも指数関係が成立した。そこで、新潟県森林GISを利用して、スギ人工林を抽出し、衛星画像と森林基本図を重ね合わせし、小班内の各画素の平均輝度値を算出し、これを上記の指数式に当てはめて、小班単位の材積を推定した。森林が貯留する炭素量は、材積に容積密度と炭素率を乗じることで推定可能である。スギの容積密度は0.32、炭素率は0.5である。一般的には、炭素は幹だけでなく、枝、葉、根にも含まれる。幹量から、全体の炭素量を推定するには拡大係数1.7が使われる。しかし、今回は材積の推定を主体に考慮しているので、材積から貯留する炭素量のみを推定した。その結果、角田山周辺のスギ人工林の炭素貯留畳は39,988トン、津川町の炭素量は180,101トンと推定された。一方、わが国の民有林には材積が記載された森林簿がある。しかし、この森林簿はコンピューター内の成長式により、材積を計算するため、現状に合っていないとの指摘がなされている。そこで、森林簿材積と高分解能衛星から求めた材積を比較してみた。その結果、RMSE(残差平方の平均値)で比較したところ、角田山は高分解のRMSEは134m3/ha,森林簿は162m3/ha,津川町は高分解能のRMSEは220m3/ha,森林簿は239m3/haとなり、高分解能衛星を利用した材積推定の方が精度のよいことが分かる。高分解能イコノス画像はマルチバンドで4mx4m、パンクロマチック・パンドで1mx1mであり、単木の樹種区分が期待される。画像判読と現地検証の結果、以下のことが明らかになった。1)イコノスのパン画像が最も森林現況の把握に適しており、空中写真の判読精度に近づいた。2)単木判読では、1m分解能のパン画像とフォルスカラー画像は樹冠直径が3m以上の孤立木、人工林では6m以上、天然林では81m以上の単木判読が可能であった。一方、高分解能イコノス画像を使って、森林簿の精度を調べた。森林簿はコンピューター内に組み入れられた成長式を使って小班の材積を算出する。森林は成長式通りに成長するわけでなく、森林簿の精度が問題になる。森林が吸収するCO2量は材積量に比例する。そこで、高分解能イコノス、ランドサット衛星から推定した材積、森林簿の材積、現地プロットの材積を比較した。3)プロット内に含まれるイコノス衛星の各画素の平均輝度値とプロットの現地調査による材積との間には重回帰式が成立した。4)ランドサットの画素とプロットの現地調査による材積との間にも重回帰式が成立した。5)そこで、現地調査によるブロット材積と森林簿に記載されている材積、イコノス衛星から推定された材積、ランドサット衛星から推定された材積を比較した。6)現実プロット