hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プラズマと生体ユニットとの原子・分子動的相互作用の解明

大気圧低温プラズマは、細胞や生体組織に直接照射することが可能であり、抗腫瘍効果などの画期的な実験結果が相次いで報告されており、メカニズム解明が急務である。プラズマ照射の生体への作用メカニズムの理解のためには、生物学的階層性の概念が重要であると考え、本研究では生体分子・細胞・組織・個体の各階層に対してプラズマ照射が及ぼす影響を解析・体系化した。プラズマが気相および水溶液中の化学反応を誘起して活性種を生成し、細胞壁・細胞膜に損傷を与え、活性種が内部に侵入して生体高分子に影響を及ぼし、その結果として細胞死などの細胞応答を示すというフレームワークが、多様なモデルにおいて共通していることを示している。本研究課題は大気圧や液中での低温プラズマ照射が及ぼす影響を系統的に解析し、従来の細胞生存率や治癒経過のみを指標とした解析からさらに踏み込み、分子・細胞・組織などへの影響を定量的に把握することを試みている。25年度はゲノムDNAとコートタンパク質のみで構成されるバクテリオファージを利用して、大腸菌などのモデル微生物よりもシンプルな実験系を構築し、DNA・タンパク質それぞれの損傷がプラズマによるウイルス不活化にどのように寄与するか、すなわち不活化の主因が、DNAへの損傷によるものか、それともコートタンパク質への損傷によるものかを調べた。試料としてバクテリオファージφX174を用い、様々な条件でプラズマ処理を行ったファージからDNAを抽出し、コートタンパク質を人為的に更新したファージを得てその活性を評価した。プラズマ処理ファージにはDNAとタンパク質いずれにも損傷がある可能性があるが、コートタンパク更新ファージにはDNAの損傷のみが受け継がれる。両者の相対的な感染率を比較した結果、ファージ不活化にはタンパク質損傷よりもDNA損傷の寄与が大きかった。本年度は電子スピン共鳴(ESR)装置を導入し、プラズマ処理されたサンプル水溶液中に存在するラジカルの分析に着手した。プラズマジェット照射によりOHラジカルが水中に生成していることを確認し、そのシグナル強度と前年度までに行ったDNA切断解析との比較を行ったところ、DNA切断回数とESRシグナル強度の間に相関関係が認められ、DNA切断にプラズマ照射により生成されるOHラジカルが寄与していることが示唆された。さらに、より実用的で重要なターゲットであるヒト由来培養細胞株(癌細胞など)を用いた実験系を構築し、上記で用いたプラズマ装置を用いてアポトーシス誘導可能な照射条件を見出した。本研究課題では、プラズマ医療科学の創成に向けて、巨視的・微視的両観点からプラズマと生体との相互作用を解明すべく、分子・細胞・組織・個体等の各生物学的階層についてプラズマ照射の影響を定量的に把握する方法論の確立と系統的解析を目的としている。分子レベルの解析では、プラズマ照射により溶液中に生成する活性種の計測を前年度に引き続き行った。電子スピン共鳴とスピントラップ剤を用いた短寿命活性種の計測のほか、過酸化水素・硝酸・亜硝酸といった長寿命生成物の検出・定量を行った。また、これまでに行ってきたDNA切断の計測系を応用して、アスコルビン酸やグルコースがラジカル消去剤として作用することを定量的に示した。さらに、前年度に引き続きゲノム核酸とコートタンパク質のみで構成されるシンプルな生体高分子複合体であるウイルス(バクテリオファージ)を用い、ゲノム核酸・コートタンパク質それぞれの損傷がプラズマによるウイルス不活化にどのように寄与するかを解析したところ、ゲノム核酸の損傷が重要であることが示された。これらのことから、DNAやタンパク質などの生体高分子は、プラズマ照射により溶液中に生成した活性種により酸化的損傷を受けることが考えられる。細胞レベルの解析では、出芽酵母細胞内のDNA損傷を、DNA修復酵素遺伝子のプロモーターを用いたレポーターシステムで解析した。さらに、この系を高感度化するためにレポーターシステムの改良も行った。また、より実用的で重要なターゲットであるヒト由来培養細胞株(がん細胞など)を用いて、プラズマ照射培養液投与による細胞死を解析した。上記の活性種計測の結果と併せて解析すると、肺がん由来の細胞株において過酸化水素濃度依存的に細胞死が起こっていることが示唆された。本研究課題では、プラズマ医療科学の創成に向けてプラズマと生体との相互作用を解明すべく、生体の階層性に着目して、分子・細胞・組織・個体といった各生物学的階層についてプラズマ照射の影響を定量的に把握する方法論の確立と系統的解析を目的としている。分子レベルの解析では、前年度に引き続きプラズマ照射によって水溶液中に生成する化学種の計測を行った。短寿命活性種は電子スピン共鳴、過酸化水素・硝酸イオン・亜硝酸イオンといった長寿命生成物は市販の試薬を用いて計測し、今年度はさまざまなプラズマ照射パラメータ(印加電圧・対象物までの距離・キャリアガスの種類・印加パルス極性など)を変化させたときの影響を系統的に解析した。その結果、短寿命活性種の生成にはプラズマと液面の接触が極めて重要であることが示され、活性窒素種生成には周辺空気の巻き込みが大きく影響することが明らかになった。また、DNA損傷を迅速に計測する新たな実験系の構築を行い、蛍光プローブによるROS検出の迅速・簡便さとDNA損傷特異性を兼ね備えた方法を考案した。プラズマジェットを所定の印加電圧・照射時間でDNA溶液に照射し、照射後の溶液の蛍光強度を測定したところ、蛍光強度は照射時間依存的に有意に増大し、その時間変化率は放電電力に比例した。また、抗酸化剤を添加すると蛍光増大は有意に減少した。溶液中RONSがDNA損傷に寄与することを示した。さらに、タンパク質を内包させた人工細胞モデルの構築を行い、膜損傷による細胞モデルの破壊と内包させたタンパク質の失活を観察した。

本研究では生体分子レベルから個体レベルまで網羅する幅広い実施内容となっているが、液中に生成する活性種から核酸・タンパク質・脂質までのレベルでは概ね実験系の確立がなされたと考えられる。特に今年度開発したDNA切断の迅速計測は、従来法と比較して圧倒的に短時間で計測可能であるため、幅広く活用されることが期待される。細胞レベルでは酵母のレポーターシステムが構築されつつあり、さらがん細胞を用いた実験では、さまざまなプラズマ照射パラメータで生成した培養液に対する細胞応答を網羅的に解析する実験系が構築されており、さらなる進展が期待できる。本研究課題では、医療への応用に向けてプラズマと生体との相互作用を解明すべく、生体の階層性に着目して、分子・細胞・組織・個体といった各生物学的階層についてプラズマ照射の影響を定量的に把握する方法論の確立と系統的解析を行った。前年度に引き続きプラズマ照射によって細胞培養液中に生成する活性種計測を行った。その結果、本研究で用いたプラズマ源においては、比較的短寿命であるOHラジカル、スーパーオキシドと、過酸化水素・硝酸イオン・亜硝酸イオンといった長寿命生成物を培養液中に生成しており、その生成特性には導入ガスの湿度が大きく影響することが示された。同時に、抗腫瘍効果において重要な因子である過酸化水素は、液中で生成したOHラジカルの再結合によるものよりも、気相中で生成したものの寄与が大きいことが示された。また、前年度に開発したDNA損傷を迅速に計測する新たな実験系を用いて、細胞内部へのDNA切断因子の浸透性を考察した。この実験では、蛍光ラベルしたDNA分子を人工細胞モデルに内包させ、これに対してプラズマを照射した。その結果、プラズマ照射は人工細胞モデルを破壊しないが、その内部にDNA損傷を引き起こすが示された。さらに、多層構造を有する枯草菌芽胞において、プラズマが生成する活性種が時間と共に徐々に均一に枯草菌芽胞内部に浸透していき、内膜に到達することで枯草菌芽胞が不活化することが示唆された。以上の結果は、プラズマと生体との相互作用において、プラズマが水溶液中の化学反応を誘起して活性種を生成し、細胞壁・細胞膜を介してこれらが細胞内部に侵入して生体高分子に影響を与え、細胞死などの細胞応答を示すというフレームワークが多様なモデルにおいて共通していることを示している。本研究課題は、生体分子・細胞・組織・個体など各階層に対して、大気圧や液中での低温プラズマ照射が及ぼす影響を系統的に解析し、機能相互作用のモデル化とそれを踏まえたプラズマ医療の創成を目的としている。従来の細胞生存率や治癒経過のみを指標とした解析からさらに踏み込み、分子・細胞・組織などへの影響を定量的に把握することを試みている。分子レベルの解析では、生物に普遍的に存在するDNAの切断への影響を定量化している。
IgM-M蛋白と結合する末梢神経由来ウロン酸を有する糖脂質の機能に関する研究

形質細胞系異常増殖症はM蛋白血症として知られている。多発性ミエローマ、原発性マクログロブリレ血症、H鎖病などが知られている。この病気で約1割弱は末梢神経障害を呈する。患者血清による診断では末梢神経由来のmyelin-associated glycoprotein(MAG)と強く反応する抗体が存在することが知られている。我々は末梢神経の脂質画分にもこの抗体を強く反応する糖脂質が2つあることを見い出し、それらの構造解析をした結果、今まで神経系を含め他の臓器でも殆んど報告されていない次の様にグルクロン酸の3位に硫酸基をもつ新しい構造の酸性糖脂質であることを明らかにした。即ち主成分はGlcUA(3-sulfate)β1-3Gal β1-4GlcNAc β1-3Gal β1-4Glc1-1 ́ceramide,微量成分はGal-GlcNAc unitの繰り返し構造をもつセラミドペプタサツカライドであった。これら酸性糖脂質の機能は全てわかっていないがMAGと共通抗原となることから糖鎖構造が重要な役割をもっていると推定される。この酸性糖脂質はヒトのNK細胞のマーカーであるマウスIgM単クローン抗体、HNK-1(Leu-7)とcross-reactした。抗MAGあるいは酸性糖脂質抗体がNK活性を抑制して免疫調節機能になんらかの影響すなわちM蛋白異常排池に関与していると推定される。(以上の結果をJ.Biol.Chem.に発表した。)この糖脂質はショ糖密度匂配による細胞分画法ではミニリン分画のみならず、Schwann細胞およびAxolema分画にも検出された。更に硬膜にも局在することが証明された。多発性ニユーロパチーではミニリンだけでなく軸索も障害されることからこれら糖脂質は抗体のTargetとして重要であろうと推定された。また硬膜様な中枢葉由来の組織に存在することは、同じ中枢葉由来でBlood Brain Barrierを構築する血管内皮細胞にもこの糖脂質が局在する可能性を示唆している。(以上の結果をJ.Neurochem、に投稿し、受理された。)形質細胞系異常増殖症はM蛋白血症として知られている。)
赤外線パルス・フェイズ・サーモグラフィ法による大型構造物の高効率検査手法の開発

本研究は赤外線サーモグラフィを用いた大型の構造物の効率的な非破壊検査手法の開発を目標として検討を行った。実験の結果、アクティブサーモグラフィ検査時の加熱方法としてレーザー走査加熱を利用することで、10 m遠方に位置する対象物であっても内部の欠陥検出が可能であることが確認された。また、温度データへのフーリエ変換により得られる位相画像を利用することで、欠陥検出が容易となること、および高周波数の位相画像に注目して検査を行うことで検査時間の短縮が可能であることも確認された。これらの技術を組み合わせることで、高効率かつ高精度な検査の実現が期待される。本研究では赤外線サーモグラフィを利用した大型構造物の効率的な非破壊検査技術の開発を目指し、検査精度の高精度化、検査の短時間化、および遠距離に位置する対象への検査の実現のそれぞれについて検討を行っている。検査の高精度化に向け、本年度は特に本研究での検査対象の一つとして考えている炭素繊維強化複合材料(Carbon fiber reinforced plastic: CFRP)への検査時における繊維の熱伝導率や積層構成による影響について有限要素解析と実験による定量的な評価を行った。さらに、実験より得られた温度画像にメディアンフィルタ等の画像処理を行うことで温度画像中のノイズ低減を試み、これと温度画像のフーリエ変換により得られる位相画像を併用することで従来の温度画像と比較して欠陥検出精度が向上することを確認した。検査時間の短時間化への試みとしては、位相画像の画像周波数を従来利用が検討されている周波数よりも高い周波数域へシフトさせる方法を考えている。位相画像の周波数は検査時間の逆数に依存するため、高周波領域の利用は実際の検査時間の短縮につながる。今年度は高周波数領域での欠陥部ー健全部間位相差がどの程度生じるかについて、解析的な検討を行った。検討の結果、高周波数領域での位相差は低周波数領域と比較して非常にわずかであったことから、これを効率的に検出するために上記のノイズ低減等の高精度化が重要であることが示唆された。観測点から遠距離に位置する対象への検査の実現の為には遠距離対象物を効果的に加熱することが可能な遠隔加熱システムの実現が求められる。検討の結果、本研究では距離減衰の小さなレーザー加熱装置が有望な候補と考え、本年度はその実現に向け装置の選定や装置メーカーとの打ち合わせを行った。加熱装置は平成27年度に導入し、実験室レベルでの検査の実証を行う予定である。本研究では高所や遠方に位置する大型の構造物に対する高効率な検査の実現の為、対象物に対して遠隔からの加熱を行い、その後の表面温度変化から内部異常部の検出を行う手法を提案している。本年度はこの遠隔加熱装置としてエネルギーの距離減衰の小さいレーザー加熱装置を導入し、その効果について基礎検討を行った。上記検討の第一段階として人工欠陥を有する小型のCFRPサンプルに対し、約1 m離れた距離からCO2レーザーによる走査加熱を行い、加熱後に得られる温度画像における内部欠陥検出能力の評価を行った。その結果、一般的にアクティブサーモグラフィ検査で使用される近距離からのフラッシュランプ加熱と同等の欠陥検出能力が1 m遠方からのレーザー加熱試験においても得られることが確認された。このことは、レーザー加熱を用いることで従来方法よりも遠方に位置する対象物に対して従来方法と同等の検査が可能であることを示す。加えて、一般的にパルス・フェイズ・サーモグラフィ法として知られる手法を基に、レーザー加熱後に得られた温度データにフーリエ変換を行うことで位相画像へ変換し、その効果を検証した。過去の報告では位相画像を利用することで加熱時に生じる加熱ムラなどの影響を低減し得ることが示されているが、本実験においては走査加熱の結果生じる加熱時間差に伴う温度勾配が位相画像に変換することで低減されることが確認された。このことは走査加熱に伴うデメリットの低減を意味する。また、検査時間の短縮による検査の高効率化を目指し、位相変換後の高周波数領域の位相値を検査に使用する方法についても検討を継続している。具体的には一次元熱解析により高周波数領域に生じる欠陥部位相差の大きさと、その周波数から逆算される検査時間を推測し、本手法の有効性について解析的な評価を行った。ここで得られた解析結果については次年度に実験的な検証を行う予定である。本年度は遠距離加熱減として計画していたCO2レーザーの導入を行い、これによる基礎実験から当初想定していた効果(従来方法よりも遠方に位置する対象物に対する検査の実現)が得られることを確認した。また、レーザー加熱後の温度画像の位相画像変換による効果も確認されたことから、提案していた検査システムの実証に向け、一定の成果が得られたと考える。また、本研究での課題の一つに挙げていた検査時間の短縮方法の検討についても、本年度は提案手法(位相画像変換後の高周波数領域位相差の利用によるフーリエ変換前温度データ取得時間の短縮)について解析的な評価を行い、検査時間の大幅な短縮が可能となることが予測された。実証実験は未着手であるが、次年度に期間内でその実施は十分可能である。さらに、提案手法を用いた検査の対象物の一つとしてコンクリート構造物も挙げていたことから、本年度は人工欠陥を有するコンクリートサンプルの作製を行い、これに対するレーザー加熱による試験も実施した。試験の結果、作製サンプル内の欠陥の検出が可能であることを確認した。本結果から、提案手法のコンクリートへの適用に関する検討についても、おおよそ順調に進捗していると言える。やや遅れている点として、検査精度のさらなる向上を目指したノイズ低減に関する点が挙げられる。

温度データへの移動平均、温度画像に対するフィルタリングなどを検討したが、実験的にはまだ顕著な効果が得られていない。一方で、解析的にはフーリエ変換前の温度画像に対する移動平均フィルタなどの画像処理を行うことで、フーリエ変換後の位相画像においても広帯域でのノイズ低減が得られることが示されており、今後はこの詳細な検討を行う必要がある。昨年度までの成果を踏まえ、本年度はレーザー加熱を利用した遠隔からの非破壊検査の有効性について実験的な検証を行った。実験は人工欠陥を有した大型の炭素繊維強化プラスチック(Carbon fiber reinforced plastic: CFRP)試験片およびコンクリート試験片をCO2レーザー源から10m離れた位置に設置した条件で行い、レーザー走査による遠隔からのアクティブ加熱、および赤外線カメラによる加熱後の表面温度の観察により、内部欠陥の検出可否について確認した。実験の結果、CFRPおよびコンクリートのいずれの試験片についても10m遠方からの加熱、および内部欠陥の検出が可能であることが確認された。これらの結果は、レーザー加熱と赤外線サーモグラフィを利用した構造物の遠隔非破壊検査が有効であることを示す。また、レーザーを走査しながら加熱することにより生じる検査位置間での加熱時間差を補正するため、観察された赤外線画像中の各点における温度データから最大温度点(レーザー照射時間)を抽出し、抽出された時間以降の温度変化データを画像化することで、観察領域全体を同時に加熱した条件と同様な温度変化画像を出力する処理を行った。レーザー走査が対象物上のある点を通過する時間は非常に短いことから、本処理を行うことで本手法はあたかも遠方に位置する対象へのパルス加熱検査を行ったかのような結果を示す。さらに、パルス加熱と同様の結果を示すことから、本手法により得られた温度データをフーリエ変換し位相画像を得ることにより、一般にパルス・フェイズ・サーモグラフィ(PPT)と呼ばれる検査法と同様の効果を遠方に位置する対象へ適用することが可能となる。PPTを用いることでS/N比の向上等の効果が得られることが知られているが、本手法による実験結果においても位相変換を利用することで検査精度の向上が確認された。本研究は赤外線サーモグラフィを用いた大型の構造物の効率的な非破壊検査手法の開発を目標として検討を行った。実験の結果、アクティブサーモグラフィ検査時の加熱方法としてレーザー走査加熱を利用することで、10 m遠方に位置する対象物であっても内部の欠陥検出が可能であることが確認された。また、温度データへのフーリエ変換により得られる位相画像を利用することで、欠陥検出が容易となること、および高周波数の位相画像に注目して検査を行うことで検査時間の短縮が可能であることも確認された。これらの技術を組み合わせることで、高効率かつ高精度な検査の実現が期待される。
代謝拮抗型免疫抑制薬のリンパ球増殖活性を用いた迅速薬効モニタリング法の開発

免疫抑制薬の薬物投与設計においてはファーマコキネティクスに加え、ファーマコダイナミクスを考慮することが重要と考えられている。しかし、代謝拮抗型免疫抑制薬のミコフェノール酸については、臓器移植後の免疫抑制療法において、固定投与量または体重あたりの投与量で画一的に投与されることや薬物動態を考慮して投与されることが多い。現在のところ臨床において利用可能なミコフェノール酸の簡便で迅速な薬効評価法は確立されていない。本研究は急性白血病細胞由来のCCRF-CEM細胞を用いて、患者血液を用いた代謝拮抗型免疫抑制薬のMTT法を応用したex vivo迅速薬効モニタリング法を確立することを目的とした。CCRF-CEM細胞を96ウェルプレートに3×10^3/ウェル播種し、10%ウシ胎児血清を含むRPMI Medium 1640、健常人より採取した血清、血漿を用い0.01、0.1、1、10μg/mLのミコフェノール酸溶液を調製し添加した。5%CO_2、37°Cの条件下で48時間インキュベート後、MTT法を行った。本評価法の妥当性について検討した結果、ミコフェノール酸は0.01-10μg/mLにおいて、濃度依存的にCCRF-CEM細胞の増殖抑制作用を示した。一方で血清または血漿を添加した場合には30-60%の細胞増殖抑制作用がみられ、その細胞増殖抑制作用がミコフェノール酸の濃度非依存的であった。以上の結果から、ミコフェノール酸の薬効評価法として、ヒト血液を用いる本ex vivo評価法は適さない-との結論に至った。
下痢症ウィルスの診断、分子疫学および免疫学的研究

下痢症ウイルスのなかで、ロタウイルスおよびアデノウイルスに関して、診断法の開発および方法の比較、ゲノムRNAおよびDNAの電気泳動法による比較、血清型の比較、下痢症における免疫学的側面の研究がなされた。次の新らしい成績を得た。(1)ラテックス凝集法、酸素抗体法を中心とした診断法の開発および評価がなされた。種々の臨床材料に用いた。(2)ロタウイルスの分子疫学的研究が、日本各地で長期間において行われ、流行疫学がつかめる様になった。従来のA群とは別にC群のロタウイルスが見い出された。アデノウイルスも制限酵素を用いることにより型別と分子疫学的研究が可能なことがわかった。血清型と泳動型の比較がなされた。(3)両ウイルスで、罹患児、健常児の血中、糞便中の抗ウイルス抗体について検討がなされた。ロタウイルス脳炎の存在の可能性が考えられた。川崎病態児にられたロタウイルスとアデノウイルス院内感染についての報告を行った。免疫不全状態での感染様式、ウィルスの特徴についても検討された。下痢症ウイルスの診断、流行疫学の臨床研究の基盤が築かれるとともにウイルス罹患時の免疫状態の研究の基盤も作られた。今後、ワクチン開発にむけての研究とともに、ウイルスの遺伝子、ペプチド次元での研究を行う予定である。ヒト下痢症ウイルスには、ロタウイルス,カリシウイルス,ノーウォーク因子,アデノウイルス,コロナウイルスなどがあり、これらの臨床診断、流行疫学については不明な点が多い。今年度は以下の成績を得られたので報告する。(1)下痢症ウイルスの診断について:糞便からのロタウイルスの検出について市販のラテックス凝集法(LA)2種と、われわれが開発したLAを比較した。いずれのLAも有用であった。またフィルターバイアルをもちいた検体の処理法,Avidin-biotin法,近赤外比濁法の各法について検討した。また血清型の異なるロタウイルス(Wa,【S_2】,マウス株,Odelia-4型)抗血清を用いたLAについても比較した。臨床材料で反応に差があることがわかった。RNAハイブリダイゼンション法でロタウイルスの検出および血清型の判定を試みた。これらはすべて新しい成績を含んでいる。(2)下痢症アデノウイルスについて、分子疫学的,血清学的,臨床的成績を述べた。アデノウイルスによる下痢症も多いこと、40,41型が主流であることがわかった。院内流行を証明できた。同じ血清型でも泳動型で区別された。(3)ロタウイルスの臨床面について、川崎病との関係、脳炎の可能性について言及した。(4)ウイルス抗体の測面からロタウイルスとアデノウイルスについて検討した。糞便抗体から、ウイルス罹患を推測できることがわかった。下痢症アデノウイルスの年齢別抗体保有分布を測定できた。今後も同様の研究を続ける予定である。昨年度に引きつづき,東京,大阪,京都その他の地区のロタウィルスの分子疫学を行った.ロタウィルスの流行泳動型(LおよびS型,亜型)の変動が続いて観察できた.また泳動型の細分類を行い, 32型に分類でき,各細分類型の頻度を調べた.ロタウィルスの血清型の変動をみると,この12年,東京地区では4型, 1型が多いが,大阪地区では3型がむしろ多く認められた.アデノウィルスの分子疫学的研究も制限酵素を種々用いて行った.40,41型が多いことが再確認出来た.過去約3000のロタウィルスの泳動型の検討のなかで,初めてC群のロタウィルス感染の母子例を見い出した.免疫学側面として抗ロタウィルス抗体について今回は,ウエスタン・ブロッティング法および,ベルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて,ウイルス各成分に対する反応を調べた.VP2,VP6の内層カプシド抗体反応が強くみられたがVP_3,VP_7に対する反応も一部の検体では認められた.来年度も分子疫学的研究を続け,ワクチンの開発,使用にむけて進む予定である.動物実験も続行して行っている.

昨年度に引き続き、東京、大阪、京都地域のロタウイルスの分子疫学的研究を行なった。ロタウイルスのRNA泳動型の細分類を行うとともに血清型についても検討した。東京地域を病院別に分けて検討した。泳動型に関しては、全く同一と考えられる株が、異なる病院、異なる期間において存在することがわかった。ロタウイルス(ヒト)は従来A群が多いが、63年2月4月にかけて、C群のロタウイルスの流行がみられた。血清型は、やはり東京地域では、1および4型が主流を占めていた。アデノウイルス下痢症に関しては、電気泳動法、ラテックス凝集法等で流行疫学を調べた。下痢便の約510%に認められた。ロタウイルス、アデノウイルスに関して、特異抗体の存在を健常者、患者において、ウェスタンブロット法で調べた。ウイルス各ペプチドに対する反応は個人差があることがわかった。これらのウイルス疫学調査は、今後も続けて行く必要性があり、諸外国の材料も検討に加えたい。またワクチン開発、抗ウイルス薬の開発の基礎成績となろう。
広温度域メカニカル・スペクトロスコピー測定システムの開発と応用

(1)装置の開発室温から約1000°Cまでの温度範囲において,10^<-5>Hzから10Hzの振動数領域で強制振動法により固体の弾性・擬弾性特性を測定できる装置を開発した.試料の寸法は太さ0.5-2mm,長さ20-50mm程度の棒状,あるいは同程度の剛性を持つ板状で,歪振幅10^<-5>ないし10^<-4>の捩り振動における応力と歪の関係(複素弾性率の実部と虚部)を測定し,弾性率と内部摩擦を求めるものである.測定はコンピュータにより自動化されており,温度を一定に保った状態で振動数を走査して測定を繰り返し,弾性率と内部摩擦を振動数の関数として求める.一定の速さの温度を変化させながら測定することも,また共振自由減衰法で内部摩擦を測定することも可能である.(2)応用Ll_2型金属間化合物および規則合金における原子拡散による擬弾性緩和を測定し,原子ジャンプの頻度と拡散係数を求めることに成功した.また,体心立方金属中の侵入型溶質原子の拡散による緩和現象の測定を系統的に進め,理論的に予想された緩和強度と緩和時間が十分な精度で測定できることを確認した.(1)装置の開発室温から約1000°Cまでの温度範囲において,10^<-5>Hzから10Hzの振動数領域で強制振動法により固体の弾性・擬弾性特性を測定できる装置を開発した.試料の寸法は太さ0.5-2mm,長さ20-50mm程度の棒状,あるいは同程度の剛性を持つ板状で,歪振幅10^<-5>ないし10^<-4>の捩り振動における応力と歪の関係(複素弾性率の実部と虚部)を測定し,弾性率と内部摩擦を求めるものである.測定はコンピュータにより自動化されており,温度を一定に保った状態で振動数を走査して測定を繰り返し,弾性率と内部摩擦を振動数の関数として求める.一定の速さの温度を変化させながら測定することも,また共振自由減衰法で内部摩擦を測定することも可能である.(2)応用Ll_2型金属間化合物および規則合金における原子拡散による擬弾性緩和を測定し,原子ジャンプの頻度と拡散係数を求めることに成功した.また,体心立方金属中の侵入型溶質原子の拡散による緩和現象の測定を系統的に進め,理論的に予想された緩和強度と緩和時間が十分な精度で測定できることを確認した.(1)測定装置装置のプロトタイプをひととおり完成させ、強制振動の振動数範囲は10Hzから10^<-4>Hz、温度範囲は室温から800°Cまでの測定が可能になった。しかし、弾性エネルギー損失のバツクグラウンドが10^<-3>と高い問題がある。これを低下させるために振動子およびその周辺の構造の改良を検討したが、まだ結論に至っていない。(2)波形解析方法強制振動法に加えて共振自由減衰法でも精度の高い測定が行えるようにするために、減衰波形から対数減衰率を求める際にウエーブレット変換を利用して波形解析することを検討した。波形信号の積分強度から計算する方法やフーリエ変換による方法と比較すると、減衰の大きさや信号のがS/N比によって、精度・所要時間に関して一長一短があることがわかり、必ずしも常に優れているとは限らないことがわかってきた。今後、実際の信号を解析し、その結果にもとづいて利用方法を検討する。(3)実験L1_2型規則構造をとるA_3B化合物におけるマイノリティー原子(B原子)の応力誘起再配向にもとづく擬弾性緩和効果を測定することを目的として、金属間化合物Ni_3Alおよび同じ構造をとる規則合金Pt_3Feの試料を作製した。この実験では試料の組成が重要なパラメタとなるので、現有の電子プローブ微小分析装置に新しい分光結晶を取り付けて測定精度を向上させ、組成を精密に分析した。次年度はこれらの試料を用いて高温で測定を行い、装置の性能評価を詳細に行う予定である。(1)装置の開発装置本体は前年度末までにほぼ完成したが、今年度は種々の部品を改良し、また周辺機器を設置するなどし、まず、小さな試料で測定するための試料クランプを試作した。試料の寸法は当初は直径1mm長さ40mm程度としていたが、長さ10mm程度の小さな単結晶でも測定が可能なように、試料クランプを新しく設計・制作した。まだ良好な結果は得られていないが、もう少々の手直しで標準的な大きさの試料と同様な精度の測定が可能になる見込みである。次に、電気炉を改良して均熱部をより長くし、温度範囲も昨年までの上限800°Cから1000°Cまでに広げた。また、温度測定用のディジタル電圧計を制御用コンピュータと接続して温度データも自動記録できるようにした。測定振動数は10Hzから10^<-5>Hzまで可能になったが、精度に関しては10^<-3>Hzより低い範囲でまだバックグラウンドが高いという問題があり、解決のために工夫が必要である。(2)データ解析手法の確立本装置では応力に対する歪みの位相のずれを測定するが、測定データとしては歪みの応方と同位相の成分と90°位相が遅れた成分が得られる。これら二つの量を擬弾性緩和の理論に基づいて解析し、緩和時間と緩和強度を求めるソフトウエアを開発した。(3)応用L1_2型規則構造をとる金属間化合物Ni_3A1における緩和現象を、いくつかの異なる組成の試料について行った。

予想通り、アンチサイトA1原子の応力誘起再配向による明瞭な緩和ピークが観測され、緩和の活性化パラメタと緩和強度が求められた。組成が26.5%A1の試料においては緩和強度が10^<-1>のオーダーという点欠陥の緩和現象としては例を見ない大きさで、その様な場合にも本装置では正確な測定が可能であることが実証された。(1)装置の開発装置本体は平成13年度末にほぼ完成し,平成14年度には形状や硬さ・脆さが異なる種々の試料の測定が可能になるような試料クランプなどの周辺部品の改良を行った.今年度は,熱的な試料のドリフト変形に対応できるように,これまで真空チェンバー内部に設置していた振動変位を検出する光学挺子をチェンバー外部に移設した.これにより,室温から約1000°Cまでの広い温度範囲で大きくドリフト変形する試料においても一回の測定で確実にデータを収集できるようになった.また,前年度より進めていた温度データの自動計測・収集システムも完成し,全体として汎用性のあるシステムになった.(2)データ解析手法の確立前年度に開発した,振動応力に対する歪の実数成分と虚数成分の両者を理論的に一貫した方法で解析する方法を,汎用性のあるソフトウエアとして完成させ,システムの一部として実装した.(3)応用前年度から継続して行ってきたL1_2型金属間化合物および規則合金における原子拡散による擬弾性緩和の測定に加えて,鉄における侵入型溶質原子の拡散による緩和現象の測定を系統的に進め,理論的に予想された緩和強度と緩和時間が十分な精度で測定できることを確認した.
青少年の危険ドラッグを含む薬物乱用の実態とライフスタイルに関するモニタリング研究

本研究は、ライフスタイルと薬物乱用との関連性の観点から、18歳から22歳の青少年における健康なライフスタイルのあり方を評価することを目的とした。この目的を達成するために、平成27年度から平成30年度までの4年計画で、青少年の健康なライフスタイルに関するモニタリング調査研究に取り組んだ。平成30年度の研究成果として、平成29年3月から実査を行っていた無記名の自記式質問紙法による第2回調査の回収が4月に終了した。第2回調査は、関東地域(東京都、千葉県、神奈川県、埼玉県、群馬県、茨城県、栃木県)に住む18歳から22歳の男女個人を対象に、住民基本台帳に基づき、層別二段階無作為抽出法を適用した計画標本1,700人(地点数85)を抽出し、訪問配付法により1,170人に質問紙を配付した。そして、訪問及び郵送回収法により、計画標本の内937人から得られた回収票についてデータクリーニングを行い、最終的に有効回答標本933人(回収率54.9%)のデータを確定した。その確定した調査データに基づき、第2回調査の1次報告書を作成し、関係機関及び研究者に対して報告書を送付した。また、2016年の第1回調査から得た有効回答標本1,015人のデータに基づき、国際学会1件、国内学会3件の学会発表を行った。国際学会の発表では、飲酒経験とアルコール飲料選好との関連性における男女差を明らかにした。国内学会の発表では、飲酒経験とライフスタイルとの関連性における大学生と社会人との差異、喫煙行動とライフスタイルとの関連性における男女差、若年労働者における目標及び目標実現への行動とライフスタイルとの関連性をそれぞれ明らかにした。今後も、第1回及び第2回調査の研究成果について、継続して発表していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、ライフスタイルと薬物乱用との関連性の観点から、18歳から22歳の青少年における健康なライフスタイルのあり方を評価することを目的としている。この目的を達成するために、平成27年度から平成30年度までの4年計画で、青少年の健康なライフスタイルに関するモニタリング調査研究に取り組んでいる。調査対象は、18歳から22歳の関東地域に住む日本人男女とし、統計的無作為抽出法に基づいた個人抽出による標本調査を2回実施する。その調査データに基づき青少年の健康なライフスタイルのあり方を評価する計画である。平成27年度の研究実績として、文献を追加収集し、質問項目の検討を重ね、100問強の質問から構成される質問紙を完成させた。その質問紙を用いた第1回調査では、関東地域(東京都、千葉県、神奈川県、埼玉県、群馬県、茨城県、栃木県)の18歳から22歳を対象に、住民基本台帳に基づいて、層化2段無作為抽出法を適用した1,800人の計画標本を抽出した。その計画標本のうち、質問紙を訪問配付とポスティングの方法による配付を合わせて1,145人に配付した。計画標本のうち655人については、配付が不能であった。回収方法は、回収率を上げるため、計画段階で訪問回収及び郵送回収という2種類の方法を準備した。回収は完了していないが、現時点で回収率50%以上を確保している。研究テーマ及び対象年齢の問題から、回収率の低下が懸念されたが、結果的には回収率50%を確保できそうであり、計画通りかそれ以上の調査データを得られそうである。また、第1回調査と同時並行で、新しい質問紙を作成するために収集した文献と、過去の調査データに基づいて新しい視点から分析した内容について成果をまとめ、3件の学会発表を行った。それに加えて、投稿中であった論文1件が採択された。現在までの進捗状況は下記の通りである。1.青少年におけるライフスタイルと薬物乱用との関連性についての文献を追加収集し、質問紙を作成することになっていたが、計画通り質問紙を完成させた。2.平成27年度内に第1回調査の実査を完了する計画となっていたが、調査状況及び予算の都合から、平成28年4月までに第1回調査を完了する計画に変更となった。そのため、調査の実査を、前半の業務(質問紙・依頼文の印刷製本、調査対象者の抽出作業、質問紙の配付)と後半の業務(質問紙の回収及びデータ入力)の二つに分け、平成27年度は前半の業務について業者に委託した。研究班は、調査の進捗状況を逐次確認しており、必要に応じて委託業者に指示を出している。3.青少年のライフスタイルと薬物乱用との関連性について文献収集した成果をまとめ、学会で発表することについては、3件の学会発表を行った。それらは、平成27年度の質問紙作成において検討した内容について、研究班が過去に収集した調査データに基づいて分析し、その成果を整理した。それらに加えて査読中であった論文1件が採択され、平成27年度に学会発表した1件について学会論文雑誌への投稿を推薦され、現在投稿中である。

その調査データに基づき青少年の健康なライフスタイルのあり方を評価する計画である。平成28年度の研究実績として、平成27年度3月から実査を行っていた無記名の自記式質問紙を用いた第1回調査の回収が4月に終了した。第1回調査は、関東地域(東京都、千葉県、神奈川県、埼玉県、群馬県、茨城県、栃木県)の18歳から22歳を対象に、住民基本台帳に基づいて、層化2段無作為抽出法を適用した1,800人の計画標本を抽出し、訪問配付により質問紙を1,145人に配付した。そして、訪問及び郵送回収法によって、その計画標本のうち1,022人から得られた有効回収票についてデータクリーニングを行い、最終的に有効回答標本1,015人(回収率56.4%)のデータを確定した。その確定した調査データに基づき、1次報告書を作成し、関係機関及び研究者に対して報告書を配付した。また、第1回調査の実施に合わせて収集した文献の検討、過去の調査データに基づいて新しい視点から分析した研究成果、最新の調査データに基づいた若者に好まれるアルコール飲料に関する研究成果をまとめた計3件の学会発表を行った。それに加えて、平成28年度中に、投稿中であった論文2件が掲載された。現在までの進捗状況は下記の通りである。1.青少年におけるライフスタイルと薬物乱用との関連性について文献を追加収集し、計画通り第1回調査の質問紙を完成させた。2.第1回調査全体を、前半の業務(質問紙・依頼文の印刷製本、調査対象者の抽出作業、質問紙の配付)として平成27年度に、後半の業務(質問紙の回収及びデータ入力)として平成28年度に実施するように二つに分け、平成28年4月までに第1回調査を完了した。3.収集した回収標本についてデータクリーニングを行い、有効回答標本1,015人の調査データを確定した。その確定した調査データに基づいて、第1回調査の1次報告書を作成し、情報発信のために関係機関及び研究者に配付した。4.青少年のライフスタイルと薬物乱用との関連性について文献収集した成果、研究班が過去に収集した調査データに基づいた成果、そして第1回調査のデータに基づいた成果をまとめ、平成27年度から現在まで計6件の学会発表を行った。これらに加えて、平成28年度に査読有の論文2件が掲載された。本研究は、ライフスタイルと薬物乱用との関連性の観点から、18歳から22歳の青少年における健康なライフスタイルのあり方を評価することを目的としている。この目的を達成するために、平成27年度から平成30年度までの4年計画で、青少年の健康なライフスタイルに関するモニタリング調査研究に取り組んでいる。調査対象は、18歳から22歳の関東地域に住む日本人男女とし、統計的無作為抽出法に基づいた個人抽出による標本調査を2回実施する。平成29年度の研究実績として、まず第1回調査の研究成果に基づき、第2回調査の調査規模と調査費を再検討した。その結果、計画標本を減らすことを確認し、無記名の自記式質問紙を用いた第2回調査を準備し、平成30年3月から実査(調査対象者への質問紙の配付および回収)を行っている。第2回調査は、関東地域(東京都、千葉県、神奈川県、埼玉県、群馬県、茨城県、栃木県)の18歳から22歳を対象に、住民基本台帳に基づいて、層化2段無作為抽出法を適用した1,700人の計画標本を抽出した。
１分子解析によるプロトン駆動型輸送モーターの動態探査

タンパク質の膜透過反応はすべての生物に保存された基本的なメカニズムの一つである。その反応を達成させるためのプロトン駆動型のモーターSecDFがある。SecDFは膜タンパク質であり,膜貫通領域と可溶性領域を持つ。可溶性領域は非常に可動性に富んでいることが示されていたが,その詳細は明らかではなかった。本研究では,これまでの報告とは異なるかたちのSecDFの結晶構造解析を明らかとした。続く機能解析もあわせ,SecDFの機能モデルを提唱した。細菌の生育に重要な役割をになうタンパク質としてプロトン駆動型モータータンパク質SecDFがある。このSecDFは、タンパク質膜透過チャネルであるトランスロコンと相互作用して複合体を形成する膜タンパク質である。トランスロコンを経由する生命必須の現象であるタンパク質の膜を超えた輸送に関わる。SecDFはプロトンの濃度勾配を利用して、大きな構造変化を伴いながらタンパク質の輸送に関わるとされている。本研究では、そのSecDFの可動性領域がどのように機能するかを明らかとすべく、高速原子間力顕微鏡を用いて1分子のSecDFをリアルタイムで解析した。その結果,SecDFの構造変化の平衡状態はバッファーのpHなどに依存する可能性があるとの予備的な結果を得た。また、SecDFのプロトン透過活性を詳細に調べるため,高いpH感受性のGFPと、SecDFを大腸菌内に発現させ、SecDFが過剰発現させた大腸菌がどの程度プロトンを通すのかについて検討を行った。プロトンの透過と、可動性領域が密接に関連していることを明らかとした。これらの動態観察と、SecDFの結晶構造解析の結果を統合し、SecDFの新規のモデルを提唱した。SecDFは、少なくとも2つの状態(I型、F型)構造をとり、膜透過の中間体の状態はI型構造であるとした。I型構造では基質と強く相互作用し、プロトンの力を使いながら、基質タンパク質を細胞外へ引っ張ると考えられた。SecDFはI型、F型の構造変化を繰り返し段階的にタンパク質の膜透過に関与していることが考えられる。計画にそって順調に進めている。本年度はSecDFの動態に関する知見をえて、構造解析の結果と統合してSecDFの分子メカニズムを提唱した。細胞質で合成されたタンパク質が細胞膜を越えて輸送される過程は,すべての生物に保存されている。真正細菌ではモータータンパク質SecA ATPaseがタンパク質膜透過チャネルSecYEG複合体と相互作用し,SecAがATPの加水分解に伴うダイナミックな構造変化を繰り返すことで,タンパク質の膜透過を駆動する。これまでX線結晶構造解析などによりSecタンパク質の構造解析が達成され,構造情報に基づいた機能解析も進められてきた。しかしながら,Secタンパク質によるタンパク質膜透過の動的な解析の報告はなく,タンパク質膜透過反応については不明な点が多く残っている.動的解析を進めるにあたり,タンパク質膜透過反応の煩雑な系を単純化するため,SecYとSecAをリンカーで繋いだ融合タンパク質を用いて,SecY-A/E/G複合体(SecYAEG)を調製し,その機能の解析を進めた.SecYAEGはタンパク質膜透過活性を持ち,Nanodiscと呼ばれる1ユニット再構成系を用いて,基質タンパク質であるproOmpAと相互作用することを明らかにした.動的構造解析は優れた時空間分解能を持つ高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を用いて測定を行った.まずNanodiscに再構成されたSecYEGとSecYAEGをSecAが検出できる細胞質側が上向きで固定化することに成功し,SecAがSecY上に位置し構造変化することを確認した.本研究によりSecタンパク質によるタンパク質膜透過の動的解析が進展し,高速AFMによるNanodiscを用いた膜タンパク質の動的解析の手法が確立できた.タンパク質の膜透過反応はすべての生物に保存された基本的なメカニズムの一つである。SecDFの動的メカニズムに迫るため、今後はSecDFのリアルタイム動態観察を主軸とした実験と、プロトンの濃度勾配から運動へのエネルギー変換についての知見をえるためSecDFの変異体の機能解析等を進める。SecDFのリアルタイム動態観察には、高速原子間力顕微鏡ならびに蛍光1分子観察を進める。高速原子間力顕微鏡では外部の構造変化を、蛍光一分子では分子内部の構造変化を見出す。SecDFについては、反復運動を行なっているのか回転運動をおこなっているのか、未だ不明である。まずは、この変化を見出し、次に詳細なドメインの構造変化を追跡していく。エネルギー変換については、どれだけのプロトンがSecDFの構造変化に必要であるのかについては情報がない。これを明らかとするためには定量的な生物物理学的な手法でのアプローチする。1分子のタンパク質によるプロトンの流入を測定できるマクロ装置が開発されており、その装置を用いてSecDFによるプロトン透過の測定を行う。SecDFは膜へと再構成し、そのマイクロ装置に展開させる。SecDF1分子による蛍光変化については、蛍光をもちいて定量的に観察する。系を組むことができれば、プロトン透過活性を失った変異体や、可動性を失った変異体を用いるなど、一連の変異体解析によって、SecDFのプロトン透過についての詳細な情報を得る。これら実験を通して、SecDFの作業機序を明らかとする。

構造生物学本実験計画では、タンパク質の精製と測定が主な実験手法である。特にタンパク質の精製過程に使用する界面活性剤などの金額が高価である。本年度は、予定よりも測定の予備実験である条件検討に多くの時間を費やしたため、タンパク質の精製の回数が予定より減少したため、次年度使用額を生じた。今年度は、測定に適したサンプル調整のため、予定より多くの変異体のタンパク質を精製し測定に用いる。繰越分の予算はタンパク質精製のための消耗品に利用する。
腸管粘液分泌を担うゴブレット細胞におけるAQP9の特異的発現および機能の解析

マウス小腸に発現するAQP分子種を解析したところ、AQP1,3,4,5,7,8,9が発現しており、AQP0,2,6は発現していなかった。AQP9についてはRT-PCRおよび以下のin situハイブリダイゼーション(ISH)で小腸におけるその発現が初めて明らかとなった。小腸の細胞機能におけるAQPの役割を考察するために、各細胞種に発現するAQP分子種を調べた。小腸粘膜上皮において、パネート細胞にはAQP1,3,4が、吸収上皮細胞にはAQP1,3が発現していると推測された。杯細胞および内分泌細胞に発現するAQPの詳細は単一分子種の発現分布からは同定できなかった。そこで、マーカー分子を用いて解析を行った結果、内分泌細胞に関しては発現分子種の同定には到っていないが、小腸上皮においてはいずれの細胞種も複数種のAQPが発現していることが明らかとなった。また、杯細胞にはAQP9を発現している細胞と発現していない(もしくは発現量が非常に少ない)細胞が存在することが明らかとなった。AQP9を発現している杯細胞に注目し、消化管におけるAQPの機能を解析した。大腸の杯細胞では強いAQP9の発現が観察されたが、胃の粘液分泌細胞である表層粘液細胞ではAQP9の発現は観察されなかったことから、AQP9は小腸および大腸の粘液分泌細胞種である杯細胞に特異的な機能を担っていると推定された。ISHおよび免疫染色の結果、AQP9は杯細胞の一部に発現していると考えられたため、杯細胞での発現が知られている10種のマーカー分子の発現様式を解析し、AQP9がどのような杯細胞に発現しているのかを解析した。その結果、AQP9の発現は分化段階には依存しないことが示された。このことと、AQP9が水以外にも様々な小分子を透過させる性質を持つことを合わせて考えると、AQP9は粘液組成を多様化させることに関与していると推察された。消化管、とくに小腸は食物の消化のために水(消化液)の分泌を行うとともに、外界から摂取された水の大部分の吸収を担っており、水のホメホスタシスにとって重要な器官である。しかし、その機構には未だ不明な点が多い。筆者のグループは、形質膜を通して水が輸送されるプロセスに関与する水チャネルaquaporin(AQP)について、小腸でのその発現の様式と機能の実態を解明する目的で研究を行っている。現在、AQPは哺乳類において10のサブタイプが同定されている。ヒト小腸mRNAをテンプレートにしてRT-PCRを行ったところ、AQP1、3、4、5、7、8、9、10の8つのサブタイプについて発現が確認された。一方、小腸吸収上皮細胞のモデルであるヒト結腸癌由来の培養細胞Caco-2について同様のRT-PCRを行ったところ、AQP3、4、7、8、10の5つのサブタイプの発現が確認された。次いで、RT-PCRにおいて発現が確認されたサブタイプについてマウス小腸でin situハイブリダイゼーションを行い、その局在を解析したところ、AQP1、4、5、7、9は十二指腸から回腸にかけて陰窩の底部に、AQP1は十二指腸、空腸の微柔毛の中間から底部にかけて、AQP4は十二指腸の微柔毛の先端、AQP5は十二指腸、空腸の微柔毛全体、AQP7、9は十二指腸の微柔毛全体にシグナルが見られた。AQP3は十二指腸から回腸にかけて微柔毛および陰窩全体にシグナルが観察された。AQP4にっいてマウス小腸および小腸吸収上皮細胞様に分化したCaco-2で抗体染色を行ったところ、マウス小腸においては十二指腸の微柔毛の先端部および陰窩にシグナルが観察され、Caco-2では側底部側の細胞膜にシグナルが観察された。以上のように、小腸の多様な部位に水チャネルが発現し、水のホメオスタシスに関与する実態が解明されつつある。小腸におけるAQPの発現様式の解析を以下の通り行う。現在までに、RT-PCRにようて小腸では少なくとも7つ、また、小腸上皮細胞様の分化を示すヒト結腸癌由来の培養細胞Caco-2では少なくとも4つのAQPサブタイプの発現を確認した。ヒト小腸に発現するAQP分子種についてマウス小腸を用いて、in situハイブリダイゼーション法によって、発現する細胞種の特定を行い、1)AQPO...発現が確認されなかった。2)AQP1...シグナルは絨毛の中心部と絨毛の上皮および陰窩に観察された。3)AQP3...最も強いシグナルが得られた。シグナルは絨毛および陰窩の上皮細胞ほぼ全てに観察された。4)AQP4...陰窩にシグナルが観察された。5)AQP5...十二指腸腺に強く発現していた。6)AQP7...十二指腸腺に強く発現していた。AQP8...発現が確認されなかった。7)AQP9...絨毛および陰窩の上皮の一部にシグナルが観察された。このように小腸にはAQP分子種が多種発現しており、機能的な役割分担を行っている可能性が示唆された。また、十二指腸腺にはAQP1、3、5、7が発現していた。これらで機能分担を行っている可能性が示唆された。

さらにAQP9については抗体を用いた詳細な研究を行ったところ、AQP9はゴブレット細胞の側底部の膜上に局在することが判明した。また、AQP9は小腸以外にも、大腸のゴブレット細胞に発現していた。この結果から、ゴブレット細胞が腸管内に粘液を分泌する細胞であることから、ゴブレット細胞特異的に発現するAQP9が小腸および大腸における粘液の恒常性維持に関与していることが示唆された。小腸の消化・吸収に関与するAQPを探索した。マウスを用い、RT-PCR法によって小腸に発現するAQP分子種の同定を行ったところ、これまでに報告のなかったAQP9の発現を見出した。しかもこの分子は小腸において、杯細胞(goblet cell)特異的に発現していた。そこで杯細胞におけるAQP9の機能を明らかにすることを目的に2つの研究を行った。杯細胞様の培養細胞株を利用した機能解析系を確立するためにAQP9を内因的に発現していないLS174TおよびHT-29 MTXにAQP9を定常的に発現する細胞株の作製に成功した。この細胞を用いることにより、粘液の生成・分泌へのAQP9の関与を解析することが可能となった。杯細胞のプロファイリングを行うためにAQP9と杯細胞のマーカー分子であるClca3、Cftr、MUC2、mucinファミリーとの比較・検討を行っていたところ、これらとは一致せず、杯細胞の性質には依存しない発現パターンを示した。さらに、小腸におけるAQPの発現ならびに機能について、小腸細胞の分化段階との関連で解析を試みた。まず、小腸吸収上皮細胞様に分化し、消化・吸収研究のモデルとして広く用いられている培養細胞株CaCO-2の未分化期から分化完了期までの異なる段階でのAQP発現をRT-PCR法によって解析した。その結果、小腸吸収上皮細胞にin vivoで発現していると報告のあるAQP3は未分化期には発現が見られず、分化に従って発現が増大したのに対して、in vivoでの発現の報告のないAQP4は分化段階によらず定常的に発現していた。マウス小腸に発現するAQP分子種を解析したところ、AQP1,3,4,5,7,8,9が発現しており、AQP0,2,6は発現していなかった。AQP9についてはRT-PCRおよび以下のin situハイブリダイゼーション(ISH)で小腸におけるその発現が初めて明らかとなった。小腸の細胞機能におけるAQPの役割を考察するために、各細胞種に発現するAQP分子種を調べた。小腸粘膜上皮において、パネート細胞にはAQP1,3,4が、吸収上皮細胞にはAQP1,3が発現していると推測された。杯細胞および内分泌細胞に発現するAQPの詳細は単一分子種の発現分布からは同定できなかった。そこで、マーカー分子を用いて解析を行った結果、内分泌細胞に関しては発現分子種の同定には到っていないが、小腸上皮においてはいずれの細胞種も複数種のAQPが発現していることが明らかとなった。また、杯細胞にはAQP9を発現している細胞と発現していない(もしくは発現量が非常に少ない)細胞が存在することが明らかとなった。AQP9を発現している杯細胞に注目し、消化管におけるAQPの機能を解析した。大腸の杯細胞では強いAQP9の発現が観察されたが、胃の粘液分泌細胞である表層粘液細胞ではAQP9の発現は観察されなかったことから、AQP9は小腸および大腸の粘液分泌細胞種である杯細胞に特異的な機能を担っていると推定された。ISHおよび免疫染色の結果、AQP9は杯細胞の一部に発現していると考えられたため、杯細胞での発現が知られている10種のマーカー分子の発現様式を解析し、AQP9がどのような杯細胞に発現しているのかを解析した。