hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファージディスプレイ法で同定した医薬小分子の新規相互作用の検証

本研究では、ファージディスプレイ(PD)法による予備試験において同定された医薬小分子の新規相互作用について検証し、それらの結合を確認した。1)抗生物質ロキシスロマイシン(RXM)とRXMのがん血管新生阻害作用の原因タンパク質の候補であるアンジオモチン(Amot)。2)抗腫瘍活性物質カンプトテシン(CPT)の結合候補タンパク質であるヒトプロスタグランジンE2受容体(hEP1)およびスプライシングファクターhnRNP A3。2)抗腫瘍活性物質カンプトテシン(CPT)の結合候補タンパク質であるヒトプロスタグランジンE2受容体(hEP1)およびスプライシングファクターhnRNPA3。ファージディスプレイ法により同定したカンプトテシンの新規結合候補タンパク質hnRNP A3およびロキシスロマイシンの新規結合候補タンパク質アンジオモチン(Amot)に関して、大腸菌を用いた遺伝子組み換えによる作製に成功し、各々の相互作用試験を遂行するための準備を終了した。いずれの化合物においても、上記のタンパク質と相互作用する可能性は過去に報告されておらず、スクリーニングで同定したペプチド配列をもとに候補タンパク質の推測を可能とするファージディスプレイ法の特筆すべき性質がミもたらした新規知見である。次年度では、相互作用の有無を検討する。また、本研究と同時にファージディスプレイ法自体の改良および最適化研究を並行して進め、水晶発振子マイクロバランス装置を用いた新規プラットフォームの開発および最適化に成功した(Takakusagi Y. et al. (2007)Bioorg. Med. Chem., 15, 7590-7598)。この方法を利用したカンプトテシンおよび臨床使用されている類縁体のイリノテカンのスクリーニングでは、既知結合タンパク質ならびにhnRNPA3を含む新規結合タンパク質の同定に成功し、ゲノムデータベースの中から新たな結合候補タンパク質のリストアップを達成している。本研究は臨床使用されている医薬小分子の作用機構や副作用の解明のみならず、優れた新規医薬小分子を分子設計するための基盤情報を構築するために非常に重要である。「医薬品となりうる優れた化合物はさまざまな標的と相互作用し、それに伴って生じる生物活性変化の調和を保って結果的に有効と判断される薬効を示している」という我々の仮説を証明するための最も適切な手法がファージディスプレイ法であり、本研究の成果によりこれらを実証し、従来のプロテオミクス的手法では困難な相互作用が次々と同定されると期待される。T7ファージディスプレイ(PD)法により、抗生物質ロキシスロマイシン(RXMの血管新生阻害作用の原因候補タンパク質としてアンジオモチン(Amot)を、抗腫瘍活性物質カンプトテシン(CPT)の新規結合タンパク質の候補としてhuman Eprostanoid receptor1(hEP1)およびhnRNP A3を同定した。それぞれの医薬小分子とタンパク質の相互作用を下記の検証実験により証明した。RXH :ビオチン化RXMをアビジンアガロースビーズに固定し、大腸菌遺伝子組み換えによって発現させたAmotのBIG3ドメイン(458E-596T)との相互作用をプルダウンアッセイにより試験した。その結果、Amotは、RXMの濃度依存的に結合することを確認した。RXMの血管新生阻害作用の原因タンパク質およびAmotを標的とする医薬小分子の例はこれまでに報告されていないことから、抗癌剤研究開発の基礎研究における非常に重要な知見である。CPT :膜7回貫通型受容体であるhEP1は、Gαqタンパク質と共役しており、セカンドメッセンジャーとしてCa^<2+>をリンクしている。各種バイオセンサーやプルダウン試験の結果、CPTは細胞内第3ループに強く結合し(K_D : 0.092画)、第3ループとGαqタンパク質の脱共役を引き起こすことを明らかにした。また、その結果としてCa^<2+>の細胞内流入を阻害することを、蛍光プローブFluo-4を用いた細胞シグナル実験により証明した。一方、CPTとスプライシングファクターhnRNPA3との相互作用をQCM装置により試験したところ、KD値として91.5μMの相互作用を確認した。またキイロショウジョウバエを用いた感受性評価では、hnRNP A3のノックアウトによりCPTの感受性が上昇することを確認した。いずれもCPTの新規分子標的の可能性が高く、創薬研究の重要知見である。
細胞周期依存的な発生・分化の機構:粘菌細胞を用いた解析

精度の高い同調培養系と、安定な細胞マーカーとしてβ-ガラクトシダーゼ発現ベクター形質転換された粘菌細胞(Dictyostelium discoideum Ax-2)とを用いて、飢餓処理の時点における個々の細胞の細胞周期上の位相がそれに続く形態形成(分化)期での細胞選別・パターン形成とどのように関連するかを詳細に解析した。その結果、細胞周期のなかにあって増殖/分化の分岐点と考えられるPS点の直前で飢餓処理された細胞(T7細胞)は集合中心として機能し最も早く集合するが、細胞塊(マウンド)においてはいったん細胞集団内で均一に分布し、その後、移動体においては後部に選別されること、一方、PS点の直後で飢餓処理された細胞(T1細胞)は遅れて集合に参加し、マウンドにおいては均一に分布するが、乳頭突起および移動体の形成に際して前部に選別されることが明確に示された。次に、増殖/分化の切り換え機構を探るため、PS点近傍で特異的に変動する遺伝子発現に注目し、細胞周期からの離脱の引きがねとなるような遺伝子の単離とその構造解析を試みた。その結果、PS点の直前で飢餓処理したときにのみ特に顕著に発現する遺伝子として3つ(Quitl,Quit2,Quit3)が見出された。これらの遺伝子の塩基配列を決定したところ、Quit1 mRNAはcAMPレセプター1(CAR1)をコードし、Quit2 mRNAは新規のCa^<2+>結合性タンパク質(分子量、19,500)をコードしており、また、Quit3にはORF(open reading frame)がないが、その相補鎖にはアネクシンVII(Annexin VII)がコードされており、アンチセンスRNAの形成によるAnnexin VII発現制御がありうること、などが明らかにされた。細胞性粘菌における多細胞体制の確立過程や細胞集団内での細胞分化・パターン形成の過程に、飢餓処理(発生開始のための処理)の時点での個々の細胞の細胞周期(cell cycle)の内位置が密接に関与している。また粘菌細胞は周囲に栄養源がなくなると、細胞周期G_2期内の1つの持異点(putative shift point:PS点)で増殖サイクルから離脱し分化状態に移行する。そこで、PS点近傍でのタンパク質のリン酸化状態に注目して、細胞がPS点から分化形質発現の方向に移行するための条件について解析した。その結果、増殖/分化の切り換えに関与する可能性の高いリン酸化タンパク質が3つ見い出され、分化へ移行するためには分子量101kDaおよび91kDaのタンパク質のリン酸化レベルが低いことに加えて、32kDaのタンパク質の脱リン酸化が必要とされる可能性が示された。また、プロテイン・キナーゼ阻害剤の一つであるK252aによって増殖期細胞を処理すると、飢餓処理後の発生が著しく促進され、このK252aによる発生促進効果はPS点近傍において特に顕著であることが明らかにされた。これらの事実は、増殖/分化の切り換えにPS点近傍でのタンパク質のリン酸化状態がきわめて重大な意義をもつことを示唆している。細胞周期と細胞分化・パターン形成の関連については、βガラクトシダーゼを有するベクターで形質転換された細胞と温度シフトによる同調培養系を用いて検討した。その結果、PS点直前にある細胞は、飢餓処理されると集合中心として機能するが、多細胞体(移動体)では後部に選別されること、一方、PS点直後の細胞は遅れて集合してくるが、移動体形成に伴って前部に選別されることが明確に示された。このことは、細胞分化・パターン形成におれる細胞周期の重要性を強く示唆するものとして注目される。

精度の高い同調培養系と、安定な細胞マーカーとしてβ-ガラクトシダーゼ発現ベクター形質転換された粘菌細胞(Dictyostelium discoideum Ax-2)とを用いて、飢餓処理の時点における個々の細胞の細胞周期上の位相がそれに続く形態形成(分化)期での細胞選別・パターン形成とどのように関連するかを詳細に解析した。その結果、細胞周期のなかにあって増殖/分化の分岐点と考えられるPS点の直前で飢餓処理された細胞(T7細胞)は集合中心として機能し最も早く集合するが、細胞塊(マウンド)においてはいったん細胞集団内で均一に分布し、その後、移動体においては後部に選別されること、一方、PS点の直後で飢餓処理された細胞(T1細胞)は遅れて集合に参加し、マウンドにおいては均一に分布するが、乳頭突起および移動体の形成に際して前部に選別されることが明確に示された。次に、増殖/分化の切り換え機構を探るため、PS点近傍で特異的に変動する遺伝子発現に注目し、細胞周期からの離脱の引きがねとなるような遺伝子の単離とその構造解析を試みた。その結果、PS点の直前で飢餓処理したときにのみ特に顕著に発現する遺伝子として3つ(Quit1,Quit2,Quit3)が見出された。これらの遺伝子の塩基配列を決定したところ、Quit1 mRNAはcAMPレセプター1(CAR1)をコードし、Quit2 mRNAは新規のCa^<2+>結合性タンパク質(分子量、19,500)をコードしており、また、Quit3にはORF(open reading frame)がないが、その相補鎖にはアネクシンVII(Annexin VII)がコードされており、アンチセンスRNAの形成によるAnnexin VII発現制御がありうること、などが明らかにされた。
船主責任制限法体系の構築と保険制度の役割

大惨事となったタンカーからの油流出事故であるエリカ号による海洋汚染に関するフランス破毀院2012年9月25日判決は、海洋環境に損害を与えた当事者の責任のあり方について課題を投げかけた。本研究では、船舶の安全運航に支障のある船舶を排除する船級協会について、責任制限・免責を制限し、船級協会の第三者に対する責任を認め、海事関係者との協力のもとに船舶安全運航のための厳格な安全検査基準の構築と実施を求めた。次に傭船者について、ドイツとわが国の海商法改正動向における傭船契約自体の法的性質論と当該運送契約全体の構造を踏まえて、定期・航海傭船者の第三者に対する法的責任のあり方を検討した。船主責任制限法体系の理論的構築のために、責任制限権者としてこれまで認められていない船級協会について研究を進めている。船級協会は、劣悪な船舶を排除するため、「船級」という船主との私的契約上の委任に基づく格付けを実施する。ところが、この船級協会が付与した船舶が海難事故を発生させたときには、契約の相手方である船主に対する責任のみならず、当該船舶を譲受けた者や漁民・地域住民などの第三者に対しても責任が及ぶのかは、ドイツ法では船級契約の第三者保護効果として従来議論されてきた。しかし、船級協会に対するIMOの法規範およびEU法上の法規範を踏まえたうえでの議論の整理が必要になってきた。すなわち、IMOのルールよりもさらに厳格なエリカ号IIIパッケージ(民間船級協会の認定と委託制度について)の影響により、船級協会の二重機能(私契約上の委任に基づく格付けおよび旗国の行政による委任に基づく契約上委ねられた高権的(hoheitlich)行為)に対する法的評価が必要である。その調査により、船級協会が船主責任法体系にどのように位置づけられるのかを探る。欧州で発生したエリカ号事件とプレステージ号事件という大規模な海洋汚染事故を経て、船舶の安全航行がより一層重要になっている。本研究は、それを担保する仕組みの一つである船級についての役割と責任の在り方を探ることであり、船舶の安全航行に資する意義を有する。船主責任制限法体系の理論的構築のために、海法の重要な法源の一つであり、現在ドイツで改正の議論がなされている「ドイツ海商法」について、その動向を追跡調査している。海商法改正に関する専門家委員会の草案、法務省の草案および政府草案の流れを整理するとともに、それらに影響を与えた船主の団体などの意見書などをフォローしている。改正のポイントは多岐にわたるが、とりわけ、海上物品運送契約における運送人の責任体制を定めるハーグ・ルールとロッテルダム・ルールとのせめぎあい、および、それに関連して、責任法に対する私的自治の射程について詳細に検討している。海上運送法制度について、ロッテルダム・ルールの導入を試みた専門家委員会草案および法務省草案を否定し、ヘーグ・ルールの維持と修正で対応する政府草案の検討は、運送人の責任の在り方を探るうえで、意義のある研究である。大規模な海洋汚染事故を引き起こしたオイルタンカーであるエリカ号は、海洋環境法制に一石を投じた。このエリカ号事件判決(フランス破毀院2012年9月25日判決)を端緒として、定期傭船者の第三者責任(不法行為責任)法制の方向性を検討した。エリカ号事件判決により、船舶所有者、船舶管理会社、航海傭船者(事実上の傭船者)、船級協会などといった責任対象者の広がりとともに、環境に対する責任が、環境損害を被った地域・国やEUなどのレベルにおいて重くなる傾向が示されているように思われる。とりわけ、傭船者については、「事実上の傭船者」という、法形式上の傭船者ではなく、実質的経済的な傭船者を対象としている点で、注目に値する。その観点から、一般的には第三者に対する責任を負わないとされている「定期傭船者」の責任のあり方についても、定期傭船契約という内部関係、さらには当該オイル運送についてのスキーム全体を踏まえて検討する必要があるように思われる。その一方で、運送関係者の環境に対する責任加重は、資金等の拠出者の理解を得られなくなり、条約や基金の体制を揺るがすことになりうることから受け入れられないとして、批判的にとらえる立場もある。定期傭船者の法的責任に関する議論を整理していく中で、ドイツ海商法の動向、環境損害の回復、船主責任制限制度および船舶油賠法の責任制限制度の意義や範囲に関して、そのあり方の再検討が求められる。その上で、現在わが国の運送法制審議会では、定期傭船者の第三者に対する責任について消極的な規律が支持されているようであるが、その妥当性について判断するための資料提供につなげたい。海商法船級協会と船級協会を取り巻く国内外、とくにドイツの資料を収集および整理している。相当量の資料が蓄積されている。本研究の成果論文は、損害保険研究76巻3号(2014年11月)に掲載予定である。

ドイツ海商法に関して、大きな論点となっている議論を整理している。現在までの研究の成果を5月に保険学セミナーという場において保険法・保険論の専門家の前で報告する。さらに、6月締め切りの損害保険研究への投稿も決定している。船主責任制限法という極めて特異な法制度のあり方と船舶の安全航行を担保するためにはどのような方策が必要であるのかということを意識しながら、各責任制限権者のありようを探るながら、それらの論点を調査分析および整理して船主責任制限法体系の理論を組み立てていく。ドイツ海商法の改正について、海上運送契約における責任法に対する私的自治の射程という論点のほかにも、実行運送人の責任、荷役作業員等の関係者の責任、定期傭船契約の性質、船舶アレストの規定など様々な論点がある。それらの論点を調査分析及び整理をして船主あるいは運送人等の責任制度の体系的な理論を組み立てていく。該当なし
微視付着力の直接計測とダイヤモンド薄膜付着の新しい強度評価基準の創成

本研究は、薄膜を構成する結晶核単独の付着力に着目し、これに基づいて化学気相合成法(CVD)により合成されたダイヤモンド薄膜の付着強度評価を行うことを目的とするものである。本年度は、昨年度の研究成果を踏まえ、以下の項目に関する研究を行った。コンピュータシミュレーションによる評価パラメータの抽出基板上のCVDダイヤモンドの結晶粒子について、基板との界面におけるき裂進展のシミュレーションを行った。進展中のき裂前縁におけるエネルギー解放率が進展量によらずに一定であると考えた場合、き裂の進展に要する負荷荷重すなわちき裂進展抵抗は、き裂進展量の小さい領域では進展とともに増大し、あるき裂進展量で極大値を取った後、き裂進展量の大きい領域では進展とともに減少することが明らかとなった。き裂進展に必要な荷重の極大値は、昨年度において実験的に計測された粒子を脱落させるために必要な負荷荷重、すなわち粒子の破壊抵抗値に対応しており、シミュレーション結果から得られる負荷荷重の極大値と実験的に得られた破壊抵抗値を一致させることにより、界面き裂進展の限界エネルギー解放率すなわち界面破壊じん性を評価することに成功した。CVDダイヤモンドと基板との付着強度を界面破壊じん性として明確に定量評価した例は、世界的にもほとんどない。また、同手法により求められた界面破壊じん性はダイヤモンド粒子の大きさによらずに一定であることから、核は巨視的に特別な強度を持たず、ダイヤモンド薄膜の付着強度と核発生密度との間に直接の比例関係が期待できないことが新たに示唆された。さらに、本研究により確立された界面破壊じん性評価法を駆使して合成条件の異なるCVDダイヤモンドの界面破壊じん性を計測し、非晶質グラファイトの微量混入により界面破壊じん性が著しく大きくなることが見出された。本研究は、博膜を構成する結晶核単独の付着力に着目し、これに基づいてダイヤモンド薄膜の寸着強度評価を行うことを目的とするものである。本年度は以下の項目に関する研究を行った。1.走査電子顕微鏡を用いた核形成の観察とその付着力の計測マイクロ波プラズマCVD装置により基板上に合成されたダイヤモンドを電子顕微鏡により観察し、離散的に発生した核が成長し、互いに合体して膜を形成する過程を把握した。連続した膜を形成する以前の独立したダイヤモンド粒子に対し、環境制御型走査電子顕微鏡内で触針により外力を負荷し、結晶核単独の破壊試験行った。さらにこの結果に基づき、ダイヤモンド粒子と基板との界面におけるき裂進展挙動を解析し、CVDにより合成されたダイヤモンドと基板との結合エネルギーを定量評価することに成功した。CVDダイヤモンドと基板との結合エネルギーの定量評価は、世界的にも前側がない。2.ダイヤモンド薄膜のリアルタイム破壊挙動観察上記1の観察結果から核発生密度を既知としたダイヤモンド薄膜に対し、ビッカース庄子を押込むことによるはく離破壊試験を行った。破壊挙動の詳細な観察に基づいて、押込み時の荷重変位曲線より得られる散逸エネルギーから基板の塑性変形に要したエネルギーを除去し、薄膜のはく離進展に伴つて解放されるエネルギーを実験的に算出した。この結果と上記の単独核の破壊試験の結果とを比較し、複数の核により基板に付着する薄膜の付着エネルギーすなわち薄膜の界面破壊じん性を、圧子の押込みの際の破壊挙動により定量的に評価する手順の検討を行った。
静脈付皮膚移植の実験的研究

3-5kgの白色家兎(48羽)の両耳を使用した。家兎耳中央部に4.5×3.0cmのarial pattern flapをデザインし、神経血管束を温存したままで軟骨面より剥離挙上したのちに元の位置に戻して固定した。その后中心動脈、神経を切離し植皮片内の中心静脈のみを温存した静脈付皮膚移植片の状態とした。植皮片内の通過静脈として温存した中心静脈に、静脈血ならびに動脈血を流入流出させることによって、移植床が血行不良の場合の生着の有無を検討した。その結果、静脈血が流入、流出する静脈付皮膚移植片は、表皮壊死をきたしながらも生着した。(昭和62年度報告)。動脈血が、静脈系を逆流して、流入、流出する静脈付皮膚移植片は、1本の静脈灌流路では壊死に陥り、2本の静脈灌流路を温存した場合には、一部表皮壊死を生じながらも生着した。静脈血、動脈血どちらの流入流出する場合でも表皮壊死の部位は、植皮片内の静脈網の粗な部分と一致していた。実験Iと同様に白色家兎(37羽)の両耳を使用した。家兎耳の軟骨面を移植床とし、植皮片内に中心動脈が含まれないように3.0×4.5cmの静脈付皮膚移植片を作製した。この植片片の中央には1本の通過静脈のみが走行し、この通過静脈に順行性に静脈血、動脈血を流入流出させることによってその生着の有無を検討した。その結果、家兎耳に作製したNominated artevyを含まない静脈付植皮片が移植床が血行不良な場合でも、その静脈系に静脈血あるいは動脈血を流入流出させることによって生着することが証明された。生着にとって、植皮片内の血管網の分布状態は重要な要素であると思われた。実験IIで作製したモデルは、実験Iに較べてより臨床応用に近く実際的であると考えられる。(昭和63年度)3-5kgの白色家兎(48羽)の両耳を使用した。(昭和63年度)以前,われわれは移植床の血行の良いラットの背側正巾部に4×6cmのaxal pattern tlapのpanncuus casnosusを含む植皮片を作製し,植皮片内の静脈還流路の有無による植皮片の生着率を比較検討した結果,静脈還流路のない植皮片は全例壊死になるにもかかわらず,静脈還流路のある植皮片は表皮壊死を起こすが全例生着することを報告した.しかしながら移植床が血行不十分な場合には動脈血または静脈血の流入のない静脈還流路のみの植皮片では生着し得ないことも判明した.この実験結果より,静脈血がone-wayに流入流出すれば,移植床が血行不十分な場合でも植皮片は生着するのではなかろうかと考え,この条件を満たすモデルとして家兎の耳を使用し,軟骨面を血行不十分な移植床と想定した実験モデルを作製した.1.実験方法グループ1:家兎の耳の中央に4.5×3.0cmの植皮片を作製,この部位で植皮片内に入るすべての動静脈神経を切離した群(10耳)グループ2:group 1と同じく3.0×4.5cmの植皮片を作製し,中心静脈のみ温存した群(36耳)検索方法は,経時的な肉眼的観察, microangiograpCuy,組織学的検索をおこなった.2.実験結果:Group 1は肉眼的組織学的にも10耳全部が完全壊死を呈した. Group 2は36耳中16耳は術后2週間以内にmicroangiograpCeyを施行したため残り20耳につき検討した.

20耳のうち18耳は生着し残り2耳は部分壊死を生じた.3.結語兎耳の軟骨面を血行不十分な移植床と想定して,軟骨膜を含む4.5×3.0cmの植皮片を軟骨上で作製し,その中央を走行する中心静脈のみ温存する場合でも植皮片は生着可能なことを証明した.3ー5kgの白色家兎(48羽)の両耳を使用した。家兎耳中央部に4.5×3.0cmのaxial pattern flapをデザインし、神経血管束を温存したままで軟骨面より剥離挙上したのちに元の位置に戻して固定した。その后中心動脈、神経を切離し植皮片内の中心静脈のみを温存した静脈付皮膚移植片の状態とした。植皮片内の通過静脈として温存した中心静脈に、静脈血ならびに動脈血を液入流出させることによって、移植床が血行不良な場合の生着の有無を検討した。その結果、静脈血が流入、流出する静脈付皮膚移植片は、表皮壊死をきたしながらも生着した。(昭和62年度報告)動脈血が、静脈系を逆流して、流入、流出する静脈付皮膚移植片は、1本の静脈灌流路では壊死に陥り、2本の静脈灌流路を温存した場合には、一部表皮壊死を生じながらも生着した。静脈血、動脈血どちらの流入流出する場合でも表皮壊死の部位は、植皮片内の静脈綱の粗な部分と一致していた。実験Iと同様に白色家兎(37羽)の両耳を使用した。家兎耳の軟骨面を移植床とし、植皮片内に中心動脈が含まれないように、3.0×4.5cmの静脈付皮膚移植片を作製した。この植片片の中央には1本の通過静脈のみが走行し、この通過静脈に順行性に静脈血、動脈血を流入流出させることによってその生着の有無を検討した。その結果、家兎耳に作製したNominated arteryを含まない梢脈付植皮片が移植床が血行不良な場合でも、その静脈系に静脈血あるいは動脈血を流入流出させることによって生着することが証明された。生着にとって、植皮片内の血管綱の分布状態は重要な要素であると思われた。実験IIで作製したモデルは、実験Iに較べてより臨床応用に近く実際的であると考えられる。(昭和63年度)
心房細動と睡眠時無呼吸：呼吸リズムからの心房細動発生機序の検証

循環器疾病の心房細動(AF)と呼吸器疾病の睡眠時無呼吸(SAS)には、その背後に自律神経系のバランスの崩れという共通点やAFの発生頻度がSASの重症度に依存するという報告から、何らかの病因学的な存在が推測されてきた。しかし、これまでに両者の因果関係は明確に示されていない。本研究は循環動態を一定に保ち、中枢側(延髄の呼吸ニューロンの活動)と効果器側(心臓、血管、呼吸活動)の同時記録が可能なin situ標本を用いて、副交感神経系を刺激したときの延髄の呼吸ニューロンの活動変化と、その結果生じる呼吸リズムや心拍動リズムの変化を比較・検討し、心房細動の発生と呼吸活動の変化との関連を電気生理学的に検証することを目的としていた。本研究期間は前年度から継続して延髄の呼吸ニューロンの活動そのものが変化した場合の効果器、すなわち心拍リズムや呼吸リズムがどのような影響を受けるか、また心房細動発生の有無の検討を行った。呼吸ニューロンの活動変化を惹き起こす方法として心拍出量の変化、具体的には対外循環によって全身灌流させている灌流液の流量を変化させ、呼吸ニューロンの活動変化、そして同時に灌流圧、心拍数、呼吸数の変化を記録した。灌流量の増加に伴い灌流圧、心拍数、呼吸数は増加し、時には呼吸性不整脈も観察された。一方、灌流量を減少させると、灌流量の減少直後は心拍数には殆ど影響はみられなかったが、呼吸数と灌流圧は減少、そしてその後は呼吸や心拍が突然停止してしまうという現象が観察された。呼吸ニューロンの活動については、灌流量の増加では呼吸ニューロンの活動は、その活動間隔が短くなる傾向がみられた。また灌流量を減少させた場合は、その活動間隔が長くなるだけではなく、発火パターンの規則性にも変化がみられる傾向があった。灌流量を減少させた場合の呼吸ニューロンの発火パターンについて、呼吸や心拍が停止する際を含めて検討を続けたいと考えている。心疾患である心房細動(AF)や呼吸器疾患である睡眠時無呼吸(SAS)は異なる臓器の疾病である。しかしAFやSASの背後には交感神経系/副交感神経系のバランスの崩れといった共通点や、AFの発生頻度がSASの重症度に依存するという報告から、両者には何らかの病因学的な関連があると推測されてきた。しかし両者の因果関係は明確に示されていない。本研究は循環動態を一定に保ちながら、中枢側(延髄の呼吸ニューロンの活動)と効果器側(心臓、血管、呼吸活動)の同時記録が可能なin situ標本を用いて、副交感神経系を刺激したときの延髄の呼吸ニューロンの活動変化と、その結果生じる呼吸リズムや心拍動リズムの変化を比較・検討し、心房細動の発生と呼吸活動の変化との関連を電気生理学的に検証することを目的とした。本研究期間は(1)延髄の呼吸ニューロンの活動が変化した場合の効果器側への影響、すなわち心拍や呼吸リズムがどのように変化するか、と心房細動発生の有無の検討(2)副交感神経刺激が及ぼす心拍や呼吸リズムへの影響に関する実験が中心となった。(1)は延髄の呼吸ニューロンの活動変化を惹き起こす方法として心拍出量の変化、具体的には対外循環によって全身灌流させている灌流液の流量を変化させることで、呼吸ニューロンの活動の変化を検討した。また効果器側の灌流圧、心拍数、呼吸数の変化も、同時に記録した。灌流量を増加させた場合、呼吸ニューロンの活動は、その活動間隔は短くなる傾向がみられ、心拍数や呼吸数、灌流圧は増加し、時には呼吸性不整脈と思われる不整脈が観察された。次年度は灌流量を減少させた場合について、検討する予定でいる。(2)は副交感神経刺激で心拍や呼吸リズムは不規則となり、また灌流圧の上昇傾向が観察された。しかし心房細動の発生は観察されなかった。次年度は(1)の続きを中心に研究を進める予定でいる。

一方、灌流量を減少させると、灌流量の減少直後は心拍数には殆ど影響はみられなかったが、呼吸数と灌流圧は減少、そしてその後は呼吸や心拍が突然停止してしまうという現象が観察された。呼吸ニューロンの活動については、灌流量の増加では呼吸ニューロンの活動は、その活動間隔が短くなる傾向がみられた。また灌流量を減少させた場合は、その活動間隔が長くなるだけではなく、発火パターンの規則性にも変化がみられる傾向があった。灌流量を減少させた場合の呼吸ニューロンの発火パターンについて、呼吸や心拍が停止する際を含めて検討を続けたいと考えている。
キャピラリーガス比例計数管によるcDNAマイクロアレイ解析装置の試作研究

現在、cDNAマイクロアレイの解析装置として2種類の蛍光物質でDNAを標識する方法が主流である。この装置では、遺伝子の発現量測定を蛍光レーザ-顕微鏡とCCDカメラで構成されるイメージスキャナーによって行っている。このスキャナーに期待される性能として、サイズが数10μmで間隔100μm程度に配列されているスポットを、定量的に識別できることが強く求められている。本研究の目的は、従来のスキャナーと比較して、100倍の感度と定量測定が期待されるキャピラリープレートガス比例計数管の開発研究である。本研究は、cDNAマイクロアレイ解析装置に我々が独自に開発した放射線検出器であるキャピラリーガス比例計数管(CGPC)をスキャナー(光検出器)として応用するための試作研究であり、検出器としての感度とダイナミックレンジの特性を調べることを目的とし研究計画とした。そこでCGPC専用チェンバー、ガス導入システムを整え、山形大学に設置されてある真空紫外線CCDカメラプラズマ発光観察装置とその光学系を用いてキャピラリープレートからの発光および電荷信号を観測し検出器としての感度とダイナミックレンジの特性試験を行った。専用チェンバー内にアルゴン混合ガスを封入し、5.9keVのX線及び約5MeVのα線を入射させて、ガスチェンバー内で生じる電子数比を約1000倍に変化させてガス検出器としての特性を調べた。約1000倍のエネルギー比を持つX線およびα線に対して本検出器は安定に動作した。また。各々のイベントに対するCCDの光量分布を比較したところ、その光量比も約1000倍の値を示し、高光量部での線形性が保たれており、ダイナミックレンジが1000でも安定に動作することを示した。一方、感度の問題に関して、CGPCはガス増幅度約7000まで動作する事がわかった。また。
がん細胞結合ペプチドの高効率自動探索とその多様な条件への適用

3次元培養の一種であるがん細胞スフェロイドに対して,がん細胞特異的結合ペプチドを探索するデバイスの開発を行ってきた.内部に旋回流を生じる液滴流(スラグ流)を利用して,浮遊状態にあるスフェロイドに対して,ペプチドを効率よく接触させ,つぎに付着しなかったペプチドを洗浄するためのマイクロ流体デバイスをこれまでに開発した.このデバイスで付着洗浄工程を実現するためには,液滴の位置を適切に制御する必要がある.2018年度はカメラ画像により液滴の位置を取得し,マイクロブロアとシリンジポンプにより制御するシステムを開発した.これにより,付着洗浄工程を自動化する見通しを得た.接着系細胞に対しても,がん細胞特異的結合ペプチドを探索するデバイスを開発してきた.非特異的結合するペプチドを除去する機能を持つデバイスを開発し,その機能が実現できていることを確認した.このほか,低酸素・低グルコース状態のがん細胞に対する特異的結合ペプチドを探索する準備として,そのような状態のがん細胞を生成するデバイスの開発を行った.また,ファージを検出するために,プラークアッセイが広く用いられているが,非常に手間のかかる作業である.そこで,これを自動化するデバイスの開発に着手した.一方,ファージを可視化できれば実験の効率を大幅に改善できると期待できる.そこで,蛍光ビーズを用いたファージ検出システムの構築を検討した.種々の条件検討を行い、T7ファージとプロテインGコーティング蛍光ビーズを,T7ファージ結合抗体を介して結合させることに成功した.さらに、ペプチドスクリーニングのモデルとして、インテグリンに結合する既知ペプチドGRGDSPを提示したT7ファージを作成し,インテグリンを高発現するがん細胞株U87MGへの結合を確認した.3次元培養も含めて,デバイスの要素技術,システム開発はほぼ完了している.ファージを用いた実験に関しては,生物系特有のノウハウがあるのでその準備をしてきた.ネックとなっていたファージが可視できないことに関しては,可視化の見通しを得た.デバイスやシステムの開発は今後も行うが,ファージを用いた実験に比重を移す.生物系特有のノウハウについては,生物系の研究者にアドバイスを仰ぎながら研究を進める.接着系細胞に対して,正常細胞に結合するペプチドを除き,がん細胞に特異的に結合するペプチドをペプチドライブラリから探索するためのマイクロ流路デバイスを開発した.このデバイスでは流路の切替が必要であるため,バルブが必要である.そこで,流路高さの高い流路でも確実に開閉できるバルブを開発し,このデバイスに実装した.また,従来のペプチド探索では,ペプチドライブラリの大半が細胞上部を細胞に接触せずに通過していた.そこで,天井-細胞距離を近づけることを考え,その効果を流体シミュレーションで確認した.一方,洗浄はペプチド探索の効率と精度を大きく左右する.しかし,現状では洗浄流速を経験的に調整している.そこで,がん細胞に結合するペプチドを提示したファージの結合力を計測するために、蛍光色素標識によるファージ検出システムの構築を検討した。モデルとして、乳がんマーカータンパク質HER2に結合することが知られているペプチドKCCYSLを提示したT7ファージを作成し、緑色蛍光色素AF488を結合させた。作成したファージの蛍光はプレートリーダーで容易に検出可能であることを確認した.3次元培養の一種であるスフェロイドは生体内の細胞に近いと言われている.そこでがん細胞スフェロイドに対しても,がん細胞特異的結合ペプチドを探索する方法の開発に着手した.内部に旋回流を生じる液滴流(スラグ流)を利用して,浮遊状態にあるスフェロイドに対して,ペプチドを効率よく接触させることを考え,そのためのデバイスを開発した.このデバイスを用いて,スフェロイドとペプチドとの接触を促進できる条件を探索した.また,スラグ流は用いずに,多数のスフェロイド群を接着させて,がん細胞特異的結合ペプチドを探索する方法も考案した.接着系細胞に対してペプチド探索するデバイスの開発を進めている.また,3次元培養の一種であるがん細胞スフェロイドに対するペプチド探索にも着手しており,おおむね順調に進捗している.3次元培養の一種であるスフェロイドは生体内の細胞に近いと言われている.そこで,がん細胞スフェロイドに対して,がん細胞特異的結合ペプチドを探索するデバイスの開発を行った.内部に旋回流を生じる液滴流(スラグ流)を利用して,浮遊状態にあるスフェロイドに対して,ペプチドを効率よく接触させ,つぎに付着しなかったペプチドを洗浄するためのマイクロ流路デバイスを考案した.このマイクロ流路デバイスでは,毛細管現象を利用して,スフェロイドは通さずに不要なペプチドを含む液をだけを排出し,つぎに純粋な培養液を加えて希釈することにより洗浄する.実験によりその動作を確認した.また,スラグの操作方法を検討し,受動バルブを用いたスラグの操作方法を開発した.多数のスフェロイドにより群構造を構成し,それに対してがん細胞特異的結合ペプチドを探索することも考えた.多数のスフェロイドを凝集させて培養できるデバイスを考案し,実験によりその動作を確認した.接着系細胞に対しても,がん細胞特異的結合ペプチドを探索することを考えた.従来のペプチド探索では,ペプチドライブラリの大半が細胞上部を細胞に接触せずに通過していた.しかし,天井を下げるという方法では効果的に流路を狭めることができない.そこで,天井下げないで流路を狭める方式を考案した.デバイスの付着・洗浄・回収性能をファージを用いて評価するために,がん細胞に付着するファージが必要であるので,それを作成することにした.そこで,抗体をがん細胞膜に発現させて,抗原ペプチド発現ファージと強力に結合するシステムの構築を検討した.

任意のタンパク質をがん細胞膜上にディスプレイする技術を開発し,抗体の標的結合ドメインをがん細胞膜にディスプレイすることに成功した.3次元培養も含めてデバイスの開発は順調に進捗している.ファージを用いた実験に関しては,生物系特有のノウハウがあり準備している.3次元培養の一種であるがん細胞スフェロイドに対して,がん細胞特異的結合ペプチドを探索するデバイスの開発を行ってきた.内部に旋回流を生じる液滴流(スラグ流)を利用して,浮遊状態にあるスフェロイドに対して,ペプチドを効率よく接触させ,つぎに付着しなかったペプチドを洗浄するためのマイクロ流体デバイスをこれまでに開発した.このデバイスで付着洗浄工程を実現するためには,液滴の位置を適切に制御する必要がある.2018年度はカメラ画像により液滴の位置を取得し,マイクロブロアとシリンジポンプにより制御するシステムを開発した.これにより,付着洗浄工程を自動化する見通しを得た.接着系細胞に対しても,がん細胞特異的結合ペプチドを探索するデバイスを開発してきた.非特異的結合するペプチドを除去する機能を持つデバイスを開発し,その機能が実現できていることを確認した.このほか,低酸素・低グルコース状態のがん細胞に対する特異的結合ペプチドを探索する準備として,そのような状態のがん細胞を生成するデバイスの開発を行った.また,ファージを検出するために,プラークアッセイが広く用いられているが,非常に手間のかかる作業である.そこで,これを自動化するデバイスの開発に着手した.一方,ファージを可視化できれば実験の効率を大幅に改善できると期待できる.そこで,蛍光ビーズを用いたファージ検出システムの構築を検討した.種々の条件検討を行い、T7ファージとプロテインGコーティング蛍光ビーズを,T7ファージ結合抗体を介して結合させることに成功した.さらに、ペプチドスクリーニングのモデルとして、インテグリンに結合する既知ペプチドGRGDSPを提示したT7ファージを作成し,インテグリンを高発現するがん細胞株U87MGへの結合を確認した.3次元培養も含めて,デバイスの要素技術,システム開発はほぼ完了している.ファージを用いた実験に関しては,生物系特有のノウハウがあるのでその準備をしてきた.ネックとなっていたファージが可視できないことに関しては,可視化の見通しを得た.がん細胞の3次元培養に対するペプチド探索の見通しが立ってきたので,これについては予定よりも早く進める.手作業ではスフェロイドは扱いにくので,それを培養しペプチドスクリーングデバイスに手作業を介さずに移すためのデバイスなど,周辺要素の整備も検討する.ペプチド探索では,工程を繰り返す必要があるため,今後は繰り返し工程が可能なデバイスを開発する.生物系特有のノウハウについては,生物系の研究者にアドバイスを仰ぎながら研究を進める.デバイスやシステムの開発は今後も行うが,ファージを用いた実験に比重を移す.
樹状突起のパターン形成:分岐の複雑度や受容野のサイズを調節・維持する分子機構

樹状突起はシナプス入力または感覚入力を受け取る神経突起である。本研究ではまず、特定のサブクラスニューロンにおいて、そのクラスに特徴的な突起パターンの形成を担う転写調節因子を発見した。また、初期エンドソームの積み降ろしの調節により突起の分岐が制御されることを明らかにした。さらに、新規のミトコンドリアタンパク質が、正常な樹状突起形成および突起の縮退・変性を抑制する役割を果たすことを示した。7回膜貫通型カドヘリンは、カドヘリンスーパーファミリー内で進化的に保存されたサブファミリーを形成している。ショウジョウバエの7回膜貫通型カドヘリンFlamingo(Fmi)は上皮細胞や神経細胞の形態形成に重要であることが知られている。上皮細胞でのFmiの機能は徐々に明らかにされてきているが、神経細胞の形態形成におけるFmiの分子機能はほとんど明らかにされていない。そこで我々はdendritic arborization (da)neuronsの樹状突起の伸長制御におけるFmiの役割を検討するために、Fmiの構造機能解析を行った。fmi変異胚においてda neuronの樹状突起は過度に背側に伸長してしまうが、この表現型はFmi::EYFPを神経細胞で発現させることでレスキューした。興味深いことに、カドヘリンリピートを欠いているが、タンパク質間相互作用を担うと予想されるモチーフが細胞外にあるdeltaN::EYFPでも、この表現型はレスキューした。このことは、Fmiにはカドヘリンリピート以外の細胞外領域でのヘテロフィリックなタンパク質間相互作用があり、樹状突起の伸長を制御する未同定の分子が存在する可能性を示唆している。そこで我々はこの仮説上のリガンド分子を探索している。胚期の樹状突起の伸長制御とは別に、幼虫後期では、隣り合う神経細胞の樹状突起間でFmiのホモフィリックな相互作用が存在することが示唆されている。このことは、両体側から背側正中線の方へ伸長してきた樹状突起の末端がお互いを避けあうのに対して、fmi変異体では、末端が過度に重なり合うという観察から推測されている。この系における我々の機能解析の結果をあわせて、Fmiの分子機能の観点から、この異なった胚期と幼虫期における表現型を議論した。森に生きる樹々の枝ぶりのように、ニューロンが発達させる樹状突起のパターンも多岐に渡る。そして、この形態上の多様性は、ニューロンのタイプ固有の情報処理を支えている。例えば、網膜の神経節細胞やショウジョウバエのclass IV dendritic arborization(da)neuronは受容野を一様に覆う樹状突起を発達させる。これらのニューロンのように、領域全面を覆い、かつ同種細胞間で重複の少ない受容野形成をタイリングと呼ぶ。以前我々は、タイリングするdaneuronが突起切断に際して、"space-filling"パターンを再生することを明らかにした。その他の結果と合わせて、実験データは自己組織化機構が"gspace-filling"型の樹状突起の発生を制御していることを示唆していた。今回我々は、細胞構造を含む、二変数(ActivatorとSuppressor)反応拡散モデルを構築した。細胞内のActivatorは樹状突起の成長を制御する。SupPressorはActivatorから合成され、細胞外空間を拡散して突起問の抑制性の相互作用を担う。シミュレーションの結果、我々のモデルは、樹状パターンを自律的に形成した。加えて、空間制御の二つの特徴である、タイリングと再生を再現した。さらに我々は、数値計算から伸長し分岐するパターン形成の条件を求めた。最後に、我々はシミュレーションで得られたパターンを、"突起の整列度"という統計量で分類できることを見いだした。予備的な解析の結果、この統計量は細胞内部のActivatorの分布を反映していた。従って、この統計量から現実のニューロンの形態を分類すること、さらに細胞の外形から、細胞内部のActivatorの分布を予測することが出来るかもしれない。樹状突起が描く幾何学的なパターン、ニューロンのクラス毎に著しく異なり、この多様性は各クラスに特有の生理機能を反映していると考えられている。我々は樹状突起の分岐の複雑度、伸長、そして安定性がどのように調節されるのかに注目している。ショウジョウバエの感覚細胞のサブグループであるdendritic arborization (da)neuronは、樹状突起のパターン形成を研究する上で優れた特徴を有している。腹部体節内に誕生する全てのda neuronが同定されており、樹状突起の分岐がより複雑な順番に、そして受容野のサイズがより大きな順番に、クラスIからクラスIVまでの4つのクラスに分類されている。da neuronでGFPを発現するトランスジェニック系統を用いると、生体内での樹状突起形成を単一細胞の高解像度で、経時的に観察することができる。我々はまず、特定のクラスのda neuronで選択的に発現する遺伝子を分離し、その中から、各クラスに特徴的な突起パターンの形成に関わる遺伝子を見つけた。このアプローチと並行して、突起の分岐や伸長異常を指標とする突然変異体のスクリーニングを行い、原因遺伝子を同定して各々の機能を調べた。

突然変異体のスクリーニングから、ダイニン軽中鎖をコードする遺伝子の突然変異を分離した。その表現型の解析から、ダイニンモーターが樹状突起を分岐させる活性を持つ分子複合体、あるいはオルガネラを輸送する仮説を立てた。積荷の候補を探索し、Rab5を含む初期エンドソームが分岐形成に必要な積荷であることを示した。我々の結果は、ダイニン複合体が初期エンドソームの積み降ろしを調節することで、細胞体から突起周辺部に向かう軸に沿った分岐パターンの多様性が生み出される可能性を示唆している。また樹状突起の形成とその維持に、ミトコンドリアの融合と分裂のダイナミクスが重要な役割を果たすことを示唆する結果も得た。神経細胞同士が正常な機能を有する神経回路を形成するためには、軸索の正しい標的への投射だけでなく樹状突起が空間的に適切なパターンに展開されることが必要である。一般的に、ひとつの神経細胞に由来する樹状突起は互いに交差することなく分岐・伸長して受容領域を埋める。また、あるグループに属する神経細胞は、それぞれの細胞が他の細胞の領域に侵入することなく樹状突起を展開し、受容野全体を完全に被覆する。このような均一で重複のない受容野の被覆は、神経ネットワークが入力情報を曖昧なく処理することを保障するものと考えられる。これまでに、樹状突起間に働く抑制的な相互作用によって突起同士が交差することなく受容野を覆うことが知られている。しかしながら、この樹状突起の交差忌避を制御する細胞内および分子的メカニズムについては多くが未解明のままである。ショウジョウバエのFlamingo(Fmi)は進化的に保存された7回膜貫通カドヘリンであり、上皮の平面内細胞極性の調節に必要である他、神経細胞では軸索の伸長や樹状突起の形態を制御している。fmi変異体では樹状突起の全体の形態に著しい異常は無いものの、同一の神経細胞由来の突起が野生型に比べ有意に高い頻度で交差する表現型が見られた。fmi変異体において神経細胞に特異的なレスキュー実験を試みたところ、突起の交差頻度は野生型と同程度まで回復した。このことからFmiは神経細胞で自律的に機能し、樹状突起の交差忌避を制御していることが示された。樹状突起の交差忌避におけるFmiの作用機序をさらに詳細に明らかにするため、私達はyeast two-hybrid法によって下流因子の探索を行い、その候補を同定した。この研究で私達は、Fmiとその下流因子を含む新規のシグナル伝達経路によって、樹状突起の交差忌避が調節されていることを明らかにした。ある種の神経細胞は方向性をもった樹状突起伸長を示し、特定の方向へ偏った樹状突起パターンはその神経細胞の生理的機能を特徴づけている。しかし、軸索ガイダンスの制御機構が精力的に研究されてきたのに対して、樹状突起の伸長方向を制御するメカニズムはまだ不明な点が多い。
アラーミンシグナルを介した角膜潰瘍形成の分子機序解明

角膜上皮細胞あるいは角膜線維芽細胞を凍結,融解させてネクローシスを誘導,細胞抽出液を採取すると主にIL-1α,HMGB-1などが検出された。これらアラーミン分子はNF-kB,MAPKを活性化した。同定したアラーミン分子を用いヒドロキシプロリンを測定するとコラーゲン分機能が有意に促進された。またMMP2,3,9で発現上昇がみられコラーゲン融解促進作用が示唆された。角膜上皮細胞のバリアー機能へのアラーミン分子の作用を検討したところ,TERの低下,ZO-1,occludin,E-cadherin,β-cateninの発現を抑制し,アラーミン分子はバリアー機能を落とす作用があることが示唆された。感染性角膜潰瘍は,種々の病原微生物が角膜に感染し傷害が角膜深部に広がり形成される.感染性角膜潰瘍は感染初期なら抗菌剤による治療が容易であるが,ある程度進行した角膜潰瘍ではすぐには治癒にいたらず,さらに進行する例をよく臨床の場でみかける.また,感染性角膜潰瘍は,たとえ治癒してもしばしば角膜実質に永続的な瘢痕,混濁をきたし,著しい視力障害をきたすことがある.このことは,病原微生物の死滅のみでは角膜潰瘍形成及び瘢痕化は十分に阻害できないことを示唆する.本研究の目的は,自然免疫に焦点をあて,感染性角膜潰瘍形成及び瘢痕化の病態解明を行い,より特異的な治療法を開発することである.近年,感染や外傷などで傷害を受け,壊死した細胞から細胞内分子が放出され,自然免疫系を活性化させることが明らかになってきた.壊死細胞より放出された細胞内分子の多くは,TLRsによって認識される.このように,侵襲や障害局所の壊死細胞から遊離してきて,周辺細胞の自然免疫を誘導する分子をアラーミンと呼ぶ.アラーミンは組織修復に関与する一方で,局所炎症をオートクライン,パラクライン的にさらに増悪させる.平成26年度の研究においては,角膜実質細胞を凍結・溶解させることで細胞壊死を起こさせ,そこから分泌されるアラーミン分子を数種類特定した.そのアラーミン分子を健常な角膜実質細胞に添加し,さらなる分泌促進の有無とシグナれ伝達経路の特定,また細胞死,および細胞増殖への影響を検討した.さらに検討を進めることで,壊死細胞による健常細胞への炎症波及効果を抑制するための新たな感染性角膜潰瘍治療薬の確立を目指す.平成26年度,角膜上皮細胞,あるいは角膜線維芽細胞を凍結,融解させることでネクローシスを誘導し,そこから細胞抽出液を採取し,アラーミン分子を同定した。さらにアラーミン分子を用いて,NF-kB, MAPKなどのシグナル伝達経路の解析や細胞死,細胞移動や接着に対する作用を検討した。平成27年度は,同定したアラーミン分子を用い,I型コラーゲンにて三次元培養した角膜線維芽細胞と共培養した。培養上清を採取し,限外濾過されたコラーゲン分子よりヒドロキシプロリンを測定し,コラーゲン分解能が有意に促進されていることがわかった。また,コラーゲン分解酵素の一つであるMMPsの発現を検討したところ,MMP2,3,9で発現上昇がみられた。このことから,アラーミン分子はコラーゲン融解を促進する作用があることが示唆された。次に角膜上皮細胞のバリアー機能へのアラーミン分子の作用を検討した。まずはTrans Epithelial Resistance:TERを測定したところ,アラーミン分子を添加したほうが有意に下がっていた。またタイトジャンクション機能を評価するためにZO-1, occludin,アドヘレンスジャンクションを評価するのにE-cadherin, β-cateninの発現を免疫組織学的に検討したところ,これらの発現は抑制されていた。これらのことから,アラーミン分子はバリアー機能を落とす作用があることが示唆された。ウサギ角膜炎モデルについての検討は現在進行中である。平成26年度の達成目標である, 1壊死に陥ったヒト角膜上皮細胞、角膜線維芽細胞より分泌されるアラーミン分子の同定, 2シグナル伝達経路の検討, 3細胞死,細胞増殖への検討, 4細胞移動,細胞接着に対する作用の検討までは達成できている。医歯薬学引き続,角膜線維芽細胞のI型コラーゲン三次元培養系におけるコラーゲン分解への作用の検討,角膜上皮細胞のバリアー機能への作用の検討,ウサギ角膜炎,潰瘍形成モデルにおけるアラーミンシグナル抑制による効果の検討を行っていく。特に課題の変更は予定していない。本年度における実験計画に大きな変更はなかったが、当初予定していた実験試薬の変更により706,752円の次年度使用額が生じた。