hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1分子追跡による細胞膜分子ナノ集合体の動的情報交換システムの解明

生細胞の細胞膜上での1分子イメジングの時間分解能を0. 1ミリ秒まで、位置決め精度30nmを保ったまま改善した。この方法を用い、ラフト型受容体であるCD59のデジタル的シグナル変換が、以下の機構で起こることを見出した。すなわち、定常状態では、CD59はモノマーと寿命が100. 200ミリ秒程度のダイマーラフトやテトラマーラフトの間で激しく変換しているが、リガンド結合により、テトラマーより大きなラフトが安定化され、デジタルシグナルを発信する。我々は、最近、生細胞の細胞膜上で2種の分子が結合したり解離したりする様子を1分子蛍光追跡することに、世界で初めて成功した。また、Gタンパク質などの分子の活性化までをも1分子FRETによって1分子毎に見ることに成功した。すなわち、生細胞中で、分子の動き・相互作用・活性化が、1分子毎に手に取るようにわかるようになった。これに基づき、本年度は以下の研究をおこなった。【1】1分子レベルでの会合と活性化検出法の改善のため、3種分子を同時1分子追跡する装置の組み立てをおこなった。【2】個々の分子のパルス状活性化、ディジタル式(FM式)細胞内シグナルシステムの作業仮説の検証のため、まず、ナノラフト経由のシグナルについて調べた。すなわち、(1)様々なラフト型受容体(GPIアンカー型とFcepsilon受容体などの膜貫通型の両方を調べて比較)と細胞内シグナル分子(特に脂質アンカー型シグナル分子:LynなどのSrc-family kinaseを中心に)、の両者を、同時に、高速1分子追跡し、細胞内シグナル分子の安定化ラフトへのリクルートと、活性化の1分子観察をおこなうことに成功した。具体的な結果については、現在、データ収集を急いでいる。(2)刺激後のバルクでの活性化の時間変化と、1分子観察で見られる活性化パルス数の時間変化との相関を調べはじめた。Ras/Raf系、受容体会合体ラフト/Lynの系、について検討中である。【3】パルス状のシグナル発生をになう、短寿命のシグナル伝達ナノドメイン/ナノ集合体の形成機構とシグナル機構の解明のための研究について、さまざまな系について実験的に検討し、CD59クラスターラフトに膜貫通型タンパク質がリクルートされる系をパラダイムとして研究することに決めた。本年は、主に、以下の2点の研究をおこなった。【1】(1)タンパク質間相互作用に基づくナノ集合体と、(2)ラフト脂質間相互作用に基づくナノドメイン、の協同によって形成され働くメゾ複合体の形成機構を調べた。細胞外からの刺激が来る前の定常状態の細胞では、GPIアンカー型受容体は、特異的タンパク質間相互作用に基づくホモダイマーを形成し、それがラフト脂質間相互作用によって安定化されること(寿命が200ミリ秒程度)がわかった。【2】シグナル変換において、外部シグナルに対する応答の特異性には、タンパク質間相互作用は必須であるが、一方で、コレステロールや糖脂質の協同的ラフト脂質間相互作用は、どのような効果を持つかを調べた。その結果、細胞外からの刺激によって、GPIアンカー型受容体が大きな受容体クラスターラフトを形成することがわかった。これが、シグナル変換のプラットフォームになると考えられる。大きな受容体クラスターラフトは次の3ステップによって形成されることがわかった。【ステップ1】ラフト型受容体にリガンドが結合すると(おそらくは、それによって受容体の構造変化がおこり)、受容体のタンパク質部分での親和性が上がり、安定な2量体が形成される。【ステップ2】ラフト型受容体の安定な2量体が、脂質部分の相互作用によって協同的にコレステロールや糖脂質などのラフト脂質を濃縮する。【ステップ3】そうすると、ラフト脂質相互作用によって、別のラフト型受容体の安定2量体が結合し、大きな受容体クラスターラフトが形成される。我々は、生細胞中での、分子の動き・相互作用・活性化を、1分子毎に手に取るように見える方法の開発に成功した。そこで本研究では、これらの方法を用いて、ラフト関与のGlycosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI)アンカー型受容体(GPIAR)のシグナル変換機構を明らかにすることを目的としている。昨年度までの研究で、我々が開発してきた1分子イメジングのための超高速カメラを用い、プローブを工夫することによって、1分子レベルでの分子会合検出法の改善が大幅に進んだ。そこで、これらの新しい方法に基づき、研究を進めた。(1)まず、外部刺激が来る前の定常状態の細胞で、GPIARの動態を調べた。その結果、調べた3種のGPIARは、タンパク質相互作用によるホモダイマーを形成し、さらに、ラフト脂質相互作用によって安定化され、GPIARホモダイマーラフトを形成すること、ホモダイマーラフトの寿命は200ミリ秒で、常に形成と分解をくり返していることが分かった

(2)違う種類のGPIARのホモダイマーラフトは、ラフト脂質相互作用によって、ヘテロテトラマーラフトを形成することが分かった(もちろんホモテトラマーラフトも形成される)。寿命は、さらに短く、100ミリ秒であった。すなわち、ホモダイマーラフトはラフト脂質相互作用によって、大きなラフト(これらも短寿命)を形成する重要なユニットであることが分かった。(3)外部からのリガンド結合によって、ホモダイマーラフトが会合して、安定なシグナルラフトが形成されること、すなわち、ホモダイマーラフトは、シグナル変換の基本ユニットであることも示された。さらに、数理モデルを用いて、アクチン膜骨格によって仕切られた細胞膜で、全体としてのシグナルは変化しないのに、シグナルが局所的にバーストしながら、反応が進むことを示した。
マウス四肢切断部でのBMPによる骨形成誘導

有尾両生類では切断された四肢の完全な再生が起こるのに対し、マウスなど哺乳類では四肢の再生はほとんど起こらない。指先の切断部で再生が見られるのと、より基部側の切断部で、軟骨の肥大が起こり、それが骨化するだけであった。本研究の結果、新生仔マウス四肢の切断後に新しく軟骨形成や骨化を起こすにはBMP-7またはBMP-2が必要で、これらBMPの濃度に依存して、骨パターンに類似の構造が形成されることが明らかになった。軟骨形成は切断部で広く起こり、急速に細胞塊を作り、骨化してゆくと考えられる。一方、BMPは主に切り株とは独立の構造を誘導し、これは軟骨形成を経て作られた。BMPの適当な濃度、キャリアー(徐放剤)を選択することによって、さらに他の成長因子を加えることによって、四肢の骨パターンに近いものが形成された。有尾両生類の四肢は成体においても完全な再生が可能だが、ヒトを含めた哺乳類では、指先の再生しか起こらない。この失われた再生能を取り戻すために、マウスの四肢で再生能に関係した性質がどの程度残っているかを明らかにするために、新生仔マウスの前腕部を切断、または掌部で切断し前腕部の骨の先端1/2を除去して、その空間にBMP7(骨形成タンパク質-7)等の細胞成長因子、四肢解離細胞の再構成塊等を加えて、形成される骨パターンを検討した。さらに骨形成に関係したタンパク質の生成を酵素抗体法で調べた。1)BMPによって形成される骨パターンは基質となるゼラチンの種類によって変わるが、前腕部に相当する骨が基部側にでき、先端部には小さな骨が形成された。この際、骨形成の前に軟骨形成があることが、II型コラーゲンの検出で確認された。なお、基部先端部以外には、前後軸、背腹軸に関係するパターン形成は見られなかった。2)四肢真皮を解離し、フィブリンゲルで再凝集させて上記の前腕部空間に移植すると、アリザリンレッド陽性の形態ができる。この構造はCalceinを取り込み、骨と類似の構造をとると考えられ、真皮内に骨細胞と類似の細胞に分化しうる能力を持った幹細胞的な細胞が存在することを示唆している。ただし、前段階としての軟骨形成は見られなかった。これらの結果は、哺乳類の四肢にも再生能に関係する性質が残っていることを示唆しており、今後、ヒトの四肢を再生する際の手がかりとして大きな意義を持つものと思われる。(1)有尾両生類の四肢が完全に再生するのに対し、ヒトを含めて哺乳類では指先の再生しか起こらない。これら哺乳類で、再生に関係する能力がどの程度保持されているかを知るために、BMP(骨形成タンパク)等のシグナル分子をマウス四肢切断部に加え、骨が形成されるかどうか、さらに形成された骨は四肢の骨と同じようなパターンを維持しているかを調べた。(2)マウスは生後2日目を用い、主に前腕部で切断した。シグナル分子はゼラチンゲルにしみこませて投与した。シグナル分子の分泌速度を調整するために、ゼラチンは種々の架橋度のものを作成使用した。(3) BMPのうち、BMP7, BMP2に骨形成能が見られた。BMP処理後、4日-5日で広い範囲で、軟骨形成(アルシアンブルー陽性)が起こり、さらに軟骨細胞が凝集し、7日目以降に骨化(アリザリンレッド陽性)がはじまった。(4)前腕部で切断した場合は、とう骨、尺骨に似た形態の骨が形成され、掌部で切断した場合は、腕骨、掌骨に相当すると考えられる骨が形成されるというように、骨パターンとの関連がみられた。(5) BMP自体には四肢を先端方向に伸ばす作用はない。繊維芽細胞成長因子FGF8処理により、切断された四肢は先端方向に伸びた。しかし、そのあとのBMP処理では、軟骨/骨形成は先端部でしか見られなかった。
神経極性形成を引き起こす新規分子Shootin1の分子作用機構と脳内機能の解析

本研究では、Shootin1が軸索にいかにして濃縮するのかを解析しShootin1が軸索のWave内のアクチンフィラメントと相互作用することによって軸索先端に輸送されることが解った。また、Shootin1が「クラッチ分子」としてアクチンフィラメントと細胞接着分子L1とを連結することにより軸索伸長のための牽引力を生み出すことがわかった。さらに、Shootin1ノックアウトマウスを作成して解析を行なったところ、大脳皮質、海馬、嗅球、中隔野、脳梁、海馬交連といった脳内の複数の領域で形成不全が認められた。このことから、Shootin1が脳神経系の発達に重要な役割を果たすことが示唆された。神経細胞は1本の軸索と複数の樹状突起を形成し極性を獲得する。神経極性は、神経細胞の基本的な機能であるシグナルの入出力や統合に重要な役割を果たす。最近の数多くの報告から、細胞内におけるシグナルの非対称性が培養海馬神経細胞の極性を形成することが明らかとなりつつある。しかし、このようなシグナルの細胞内における非対称性がどのような分子メカニズムで生じるかという問題は大きな謎である。最近、我々は新規神経極性形成タンパク質Shootinlを見出した。Shootinlは極性形成とともに神経細胞内で非対称に軸索に濃縮する。また、Shootinlが軸索形成作用を持ち、PI3-klnase(既知の極性形成タンパク質群のうちで最上流に位置する)の細胞内分布を制御したことから、Shootinlが神経細胞内における最初の非対称性のシグナルの形成に関与する重要な分子である可能性が示唆された。本研究では、このShootinlに焦点をしぼって重点的な機能解析を行い、Shootinlによる軸索形成作用の分子メカニズムおよび極性形成過程における非対称シグナル形成のメカニズムの解明を行った。その結果、Shootinlが「クラッチ分子」としてアクチンフィラメントと細胞接着分子L1とを連結することにより軸索伸長を引き起こすことがわかった。また、細胞内1分子解析によって、Shootinlがアクチンフィラメントと相互作用をすることにより神経突起先端に輸送されることも明らかとなった。さらに、Shootinlの脳内機能の解析のためにノックアウトマウスを作成し、現在その表現型を解析中であるが、海馬をはじめとする複数の脳領域に発生不全が見られたことから、Shootinlが脳神経系の発生に重要な役割を果たすことが示唆された。最近、我々は新規神経極性形成タンパク質Shootin1を見出した。Shootin1は神経細胞内における最初の非対称性のシグナルの形成に関与する重要な分子である可能性が示唆された。本研究では、このShootin1による軸索形成作用の分子メカニズムおよび極性形成過程における非対称シグナル形成のメカニズムの解明を行う。昨年度までの研究により、Shootin1が「クラッチ分子」としてアクチンフィラメントと細胞接着分子L1とを連結することにより軸索伸長のための牽引力を生み出すことがわかった。本年度は、Shootin1とアクチンフィラメントとの相互作用を介在する第2の「クラッチ分子」の探索を行った。免疫沈降法を用いて、種々のアクチンフィラメント結合タンパク質をスクリーニングしCortactinを同定した。CortactinはShootin1と直接結合し、また内在性のCortactinとShootin1も結合することがわかった。CortactinとShootin1は軸索先端でアクチンフィラメントと共局在し、細胞内1分子計測による解析の結果、両分子ともアクチンフィラメントと相互作用することが解った。さらに、In vitro actin sedimentationassayを行った結果、Shootin1とアクチンフィラメントは直接結合しないがCortactin存在下で両分子が結合することがわかった。以上の結果から、CortactinがShootin1とアクチンフィラメントとの相互作用を介在する第2の「クラッチ分子」として機能する可能性が示唆された。

Shootin1は神経細胞内における最初の非対称性のシグナルの形成に関与する重要な分子である可能性が示唆された。本研究では、このShootin1による軸索形成作用の分子メカニズムおよび極性形成過程における非対称シグナル形成のメカニズムの解明を行う。昨年度までの研究により、Shootin1が「クラッチ分子」としてアクチンフィラメントと細胞接着分子L1とを連結することにより軸索伸長のための牽引力を生み出すことがわかった。本年度は、軸索伸長速度の調節機構に関して、軸索誘引分子Netrin-1に着目して解析を行なった。その結果、Shootin1が誘引性軸索ガイダンス分子Netrin-1の下流でリン酸化酵素PAK1によりリン酸化を受けることが解った。また、PAK1によりリン酸化を受けたShootin1は、突起伸長作用が増強することも解った。このことから、Shootin1が細胞外Netrin-1の影響を受けて軸索を形成する方向性を決める興味深い可能性が示唆された。さらに、昨年度までに作成されたShootin1ノックアウトマウスの解析を行なったところ、大脳皮質、海馬、嗅球、中隔野、脳梁、海馬交連といった脳内の複数の領域で形成不全が認められた。このことから、Shootin1が脳神経系の発達に重要な役割を果たすことが示唆された。
分子標的薬の治療提案を目指した進行大腸癌に対する病理評価の試み

進行大腸癌を対象として、EGFR、HER3の免疫染色を臨床病理学的に比較検討したところ、腫瘍先進部簇出におけるHER3の発現パターンがEGFRと逆になる傾向がみられた。免疫染色の病理評価においては、腫瘍内不均一性に十分な配慮をする必要があり、単なる陽性陰性といった評価のみでは、腫瘍の持つ生物学的特徴ひいては薬剤有効性を正確に反映しない可能性があることが示唆された。本研究では、進行大腸癌に対する分子標的薬の治療適応を厳密に判別するため、さらには分子標的薬の「個別化治療提案」の可能性を模索するために、進行大腸癌における1BRAF遺伝子変異、2EGFR遺伝子増幅、3HER2過剰発現を取り上げ、それらの病理評価法確立を目的とする。具体的な年次計画として初年度は染色法・解析法の立ち上げに重きを置き、1BRAFの免疫染色法とその評価法、2EGFRの免疫染色及びFISH法及びその評価法について検討する。また、3HER2の免疫染色&FISH法とその評価法の確立については、乳癌などでの経験を転用する。実施状況としては、BRAFの免疫染色は大腸症例のみならず、甲状腺腫瘍においても検討し、染色法としては概ね確立できた。その評価法については現在検討中であり、実際の遺伝子変異の状態を把握したうえで、その染色強度、部位、面積などを含めた染色指標を比較検討する予定である。また、HER2に関しても、乳癌における染色プロトコールを用いて、いくつかの大腸癌症例において染色を行い、良好な染色結果を得た。その評価法は既報も参考として、染色強度、部位、面積などを含めた染色指標を検討する予定である。これらについて対象症例を増やし、またEGFRの検討を行う予定であったが、研究代表者の研究施設異動による環境の立ち上げ等のため、当初の予定からは遅れている状況である。本研究では、進行大腸癌に対する分子標的薬適応における病理学的評価の可能性を追求するため、さらには分子標的薬の「個別化治療提案」の可能性を模索するために、1)BRAF遺伝子変異の評価法を確立する、2)HER2過剰発現、EGFR遺伝子増幅等の因子も評価する、ことを目的としている。本年度における具体的計画としては、1BRAF遺伝子変異の同定法を確立し症例蓄積する、2EGFR、HER2などについて免疫染色を施行し、評価法確立ののち症例蓄積する、とした。まずBRAF遺伝子変異に関しての実施状況としては、免染による病理学的アプローチを確立するに先立ち、パラフィン切片からのDNA抽出により直接シークエンス法の実験系を立ち上げた。それらは概ね確立でき、現在T2,T3の進行大腸癌症例100例ほどのデータを蓄積する段階にある。同様に重要な遺伝子であるk-rasについても、BRAF同様に検索を行っており、既報にあるように個々の腫瘍においてそれらの遺伝子変異は概ねmutually exclusiveな獲得であることを確認している。また、免疫染色の実施状況としてはEGFR、HER2等について進行大腸癌症例100例ほどで施行済であり、その評価法(染色強度・面積を加味した三段階法)を既報を参考にしながら確立し、現在は比較評価を行っている段階にある。総じて当初の予定からは遅れている状況ではあるが、概ね症例蓄積ができる段階まで挽回しつつある。本年度における具体的計画としては、1BRAFの同定法確立→症例蓄積、2EGFR、HER2などの免疫染色・評価法確立→症例蓄積する、とした。まずBRAF遺伝子変異に関しての実施状況としては、パラフィン切片からのDNA抽出により直接シークエンス法を行った結果、4.6%にBRAFの変異を確認した。それらの変異症例5例について、BRAF(V600E)抗体を用いた免疫染色による検討を行った結果、現在のところその5例いずれもが一部弱陽性の染色結果(強陽性例なし)に留まっている。今後も染色条件を含めた検討を続けていく予定としている。また、EGFR、HER2に関しては、100例弱の症例について免疫染色を施行した。EGFR染色の結果、弱陽性以上の所見が74%の症例に確認された。その染色態度を検討すると、癌巣内部の一部全体に染まるもの、癌の先進部のみに染まるもの、の2つのパターンに分けられた。現在、それらのパターンと予後等との関連につき精査を進めている状況である。HER2の染色結果については、HER3などの他因子との比較も加味しつつ、現在解析中の段階である。研究期間中に所属組織を異動した関係で、研究環境の立ち上げ(施設・設備の補充、研究助手の教育等)に時間を要し、スタート段階から立ち遅れが目立った。現在は研究環境立ち上げは完了したが、知見集積→成果発表がまだ間に合っていない状況にある。本研究では、進行大腸癌に対する分子標的薬適応における病理学的評価の可能性を追求することを目的としている。本年度は、手術的に切除された進行大腸癌(pT3-4)109例を対象として、癌治療の分子標的として昨今脚光を浴びているEGFR、HER2、HER3の免疫染色を行い、その染色態度を臨床病理学的に比較検討した。まずEGFRの免疫染色を検討したところ、109例中14例の腫瘍において陽性(14%)であった。

腫瘍内における染色性を比較検討したところ、腫瘍中央に比べて腫瘍先進部で染色強度が増加する傾向にあった。特に、腫瘍先進部の簇出においての染色性増大が目立った。次にHER2について検討したところ、109例中4例で陽性(4%)であった。HER2の腫瘍内における染色性については、腫瘍中央と腫瘍先進部での染色性の強度差は目立たなかった。最後にHER3についても同様に検討したところ、109例中44例において陽性(60%)と評価した。HER3の腫瘍内における染色性であるが、腫瘍中央に比べて腫瘍辺縁での染色性が低下する傾向があった。また、HER3陽性率と腫瘍分化度に有意差があり、HER3陽性腫瘍には高分化が多い傾向がみられた。以上を総合すると、in vivoでEGFRやHER3が二量体を形成することから、腫瘍先進部簇出におけるHER3の発現パターンがEGFRと逆になる傾向は、機能的メカニズムを考えるうえで興味深い結果と考えられた。また、低分化成分あるいは腫瘍先進部でHER3の発現低下がみられ、HER3をターゲットにした治療の可能性も議論になる中、今後の分子標的治療戦略における基礎的知見を提供するものと考えられた。進行大腸癌を対象として、EGFR、HER3の免疫染色を臨床病理学的に比較検討したところ、腫瘍先進部簇出におけるHER3の発現パターンがEGFRと逆になる傾向がみられた。免疫染色の病理評価においては、腫瘍内不均一性に十分な配慮をする必要があり、単なる陽性陰性といった評価のみでは、腫瘍の持つ生物学的特徴ひいては薬剤有効性を正確に反映しない可能性があることが示唆された。昨年度に研究組織を異動し、雇用開始した研究助手等の経験もいまだ不足している。加えて、本実験で予定していたBRAFの遺伝子変異を免疫組織化学で評価する実験成果が、他施設から次々と(皮膚癌、大腸癌、甲状腺癌などで)発表されるという状況に変化した。したがって、パフォーマンスを発揮できる研究環境を作りつつ、変化する状況に応じて計画や方略を微調整しながら(特にBRAFについては)実験を進めた結果、計画よりやや遅れる状況となっている。次年度は期間延長のうえ、状況に応じて計画や方略を微調整しながら、成果発表につなげていく予定である。まず、EGFR、HER2等の免疫染色結果については、他因子との関連にも注目しながら、引き続きデータの比較解析を行っていく。また、本実験で予定していたBRAFの遺伝子変異を免疫組織化学で評価する実験成果が、他施設から次々と(皮膚癌、大腸癌、甲状腺癌などで)発表されている。したがって、BRAFについては免疫組織化学的評価とPCRによる塩基配列同定の両者を同時進行していく方向性とする。病理学立ち上がった免疫組織化学的実験系であるEGFR、HER2等については、症例蓄積の後、それぞれのデータの比較評価を行っていく。またBRAF等については、他施設からの既報が増えつつあるため、免疫組織化学的評価とPCRによる塩基配列同定の両者を同時進行していく。平成25年8月に研究組織を異動したため、異動先での研究環境の立ち上げ、研究協力者の確保等に時間を費やさざるを得ない状況であった。そのため平成25年度における本実験に注ぐエフォートは、計画よりは必然的に少なくなった。
唾液腺組織構築のシグナル伝達機構と唾液腺腫瘍の遺伝子治療

唾液腺の腺房細胞分化を誘導する因子の同定を研究した.本研究以前,マトリゲルが唾液腺HSG細胞を腺房細胞に分化誘導させることがわかっていた.本研究では,ラミニン1とインテグリンα4β1,α6β1が結合することにより,下流のSrc family tyrosine kinaseを介してシグナルが伝達され分化が誘導されることが明らかになった。このシグナルは2次元の培養条件では分化誘導されず,3次元の培養が必要不可欠であった.3次元培養においても他の細胞外マトリックス(フィブロネクチンやコラゲン)では腺房細胞分化は誘導されなかった.2次元と3次元の異なりは細胞のコロニー形態で,8-10個の細胞間が強固に接着したコロニーの形成の有無にあった.tight junctionを調べると,desmoplakin1/2,ZO-1,E-cadherinは変化なく,他の分子の関与が示唆された.唾液腺腫瘍の1つである粘表皮癌の細胞株(TAK細胞)樹立に成功した.TAK細胞はcytokeratinの発現はないものの,vimentin,α-SMAの細胞骨格を有し,PAS陽性であった.唾液腺線癌細胞だけでなく,腺様嚢胞癌ACC細胞さらにTAK細胞も2次元培養ではラミニン1で増殖するが,3次元培養ではほとんど増殖が見られず,腺癌HSG細胞は腺房細胞に分化し,ACC細胞はアポトーシスが見られ,TAK細胞は管腔側導管細胞への分化誘導が見られた.これらの結果は,ラミニンゲルによる唾液腺腫瘍の分化誘導療法への可能性を示唆した.唾液腺の腺房細胞分化を誘導する因子の同定を研究した.本研究以前,マトリゲルが唾液腺HSG細胞を腺房細胞に分化誘導させることがわかっていた.本研究では,ラミニン1とインテグリンα4β1,α6β1が結合することにより,下流のSrc family tyrosine kinaseを介してシグナルが伝達され分化が誘導されることが明らかになった。このシグナルは2次元の培養条件では分化誘導されず,3次元の培養が必要不可欠であった.3次元培養においても他の細胞外マトリックス(フィブロネクチンやコラゲン)では腺房細胞分化は誘導されなかった.2次元と3次元の異なりは細胞のコロニー形態で,8-10個の細胞間が強固に接着したコロニーの形成の有無にあった.tight junctionを調べると,desmoplakin1/2,ZO-1,E-cadherinは変化なく,他の分子の関与が示唆された.唾液腺腫瘍の1つである粘表皮癌の細胞株(TAK細胞)樹立に成功した.TAK細胞はcytokeratinの発現はないものの,vimentin,α-SMAの細胞骨格を有し,PAS陽性であった.唾液腺線癌細胞だけでなく,腺様嚢胞癌ACC細胞さらにTAK細胞も2次元培養ではラミニン1で増殖するが,3次元培養ではほとんど増殖が見られず,腺癌HSG細胞は腺房細胞に分化し,ACC細胞はアポトーシスが見られ,TAK細胞は管腔側導管細胞への分化誘導が見られた.これらの結果は,ラミニンゲルによる唾液腺腫瘍の分化誘導療法への可能性を示唆した.HSG細胞にpcDNA3を発現ベクターとするwild-typeのc-Srcとdominant negativeのSrcK297Mを挿入し、HSG細胞にBglIIで一本化したプラスミドを挿入した。蛋白の発現はウエスタンブロットで確認し、Sre蛋白の発現が2-3倍のクローンを作成した。C-SrcあるいはSroK297Mを強発現する細胞の増殖や軟寒天中のコロニー形成能にはwild-typeと差はなかったが、SrcK297Mクローンは細胞接着能が低下し、さらにマトリゲルによる腺房細胞分化能を欠失していた。また、接着班ターゲットしたCskGFP-FAT、CskGFP-Pax、あるいはCskGFP-LIMを一過性に細胞に導入したところ、GFPを発現している細胞はマトリゲルによる腺房細胞分化を誘導されなかった。この腺房細胞分化に細胞間の結合が関わっているかどうかを検討するために、desmoplakin, ZO-1の発現について間接蛍光染色法を用いて検討した結果、分化した細胞においても両蛋白の細胞間発現は、非常にわずかであった。正常のマウス顎下腺細胞の樹立を数回試みたが、細胞の初期培養は可能であったが、継代培養可能な細胞は得られかなった。細胞は比較的早期に分化するためであり、恐らく培地の組成を改良しなくてはいけない。当教室で樹立したACC細胞以外に新たに今回mucoepidermoid carcinoma(high-grade malignancy)の細胞の樹立にも成功した。細胞生物学的検討により、細胞の由来を上記癌であることを確認した。驚いたことに、ACC細胞も、muco細胞もマトリゲルにより腺房細胞を誘導することが可態であった。唾液腺腫瘍の分化誘導療法の可態性が前進した。唾液腺細胞HSGを細胞外マトリックスの一つであるラミニンゲルで培養すると腺房細胞に分化した.

プラスチックシャーレにラミニンをコートしても分化は誘導されず,3Dの培養条件が必要であった.他の細胞外マトリックスのフィブロネクチンやコラゲンではいくら3D培養しても分化は誘導されず,ラミニン1のみで腺房細胞分化が誘導された.ラミニンゲル上でHSG細胞は遊走し,8-10個の球形のコロニーを形成し,細胞間は強固に接着し,核が基底側に偏芯を引き起こす.ラミニンとインテグリンの結合が腺房細胞分化に必要であり,インテグリンはα4β1あるいはα6β1を介していた.その下流で分化にc-Srcの活性が必要であり,dominant negative発現細胞のHSG-K297M細胞ではルーズの細胞間接着を持つコロニーが形成されるものの分化誘導が起こらなかった.2D培養でもインテグリンからのシグナルは伝達されるため,Srcはインテグリン以外の細胞間tight junctionの形成にも関与すると考えられ,この形成が腺房細胞分化に必要なもう一つのシグナルと考えられた.細胞間tight junctionのdesmoplakin1/2,ZO-1,E-cadherinの発現は,変化がなく,他の分子が関与していると考えられた.唾液腺腫瘍の1つである粘表皮癌の細胞株(TAK細胞)を樹立に成功した.この細胞はcytokeratinは発現しないものの,vimentinとα-SMAの細胞骨格を有し,PAS陽性であった.唾液腺腺癌細胞だけでなく,粘表皮癌細胞(TAK),さらに腺様嚢胞癌ACC細胞などすべての唾液腺腫瘍細胞はラミニンで,2D培養では増殖するが,3D培養ではほとんど増殖が見られず,アポトーシスや導管管腔側細胞への分化誘導が認められた.これらの結果は,ラミニンゲルによる唾液腺腫瘍の分化誘導療法への可能性を示唆した.
種特異的な「神経幹細胞の増殖期」の時計制御のしくみ

本研究は、霊長類が大きな脳を獲得した機構の理解を念頭に、哺乳類間の「脳サイズの違い」を作り出す機構の解明を目的とする。1)脳脊髄液中の霊長類特有の因子の役割、2)力学的刺激の役割、この2つの観点から解析を進めた。昨年度に引き続き、マウス胚には発現しておらず、サル胚の脈絡叢(脳脊髄液を産生する器官)に発現する分泌因子を、大脳皮質拡大化因子の候補とし、その候補因子の作用を解析した。この候補因子は、ヒト神経幹細胞の増殖を促進し、マウス胚の脳を拡大化させる。ヒト脳オルガノイドの脈絡叢での発現も確認でき、霊長類の脳の拡大化に貢献している因子である可能性が強く示唆された。マウスでは、この候補因子は胚の時期は発現していないが、成体の脈絡叢では発現している。つまり、発現開始タイミングがマウスと霊長類では異なっている。このヘテロクロニーを制御するゲノム上の責任領域を現在解析中である。次に、力学的刺激が神経幹細胞の増殖に与える影響について解析を行った。ニワトリ胚で脳圧を下げると、脳が顕著に縮小した。さらに、リン酸化ミオシンの阻害剤をマウス胚の脳室に注入して張力を減弱させると脳サイズが小さくなった。このことは、張力が神経幹細胞の増殖に貢献していることを示唆する。現在、特殊デバイスを用いて張力の影響の詳細を解析中である。また、神経幹細胞が増殖して密度が上がってきた状態を細胞培養で模倣し、細胞の押し合いによる力学的刺激の作用を検討した。RNAseq解析より、押し合いの力は、細胞増殖に抑制的に働くことがわかった。このように、力学的刺激が神経幹細胞の増殖に作用することが明らかになった。種間によってその力にどのような違いがあるかは、今後の課題である。種間で力に違いがあり、脳の拡大化に関与する可能性は十分ある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。脳脊髄液がヒトの脳の拡大化に貢献しているのかどうか検証する。まずマウス胚では発現しておらず、サル胚の脈絡叢(脳脊髄液を産生する器官)に発現する分泌因子を単離し、その候補因子がヒトES細胞由来のヒト神経幹細胞(hNSC)の増殖を促すことを明らかにした。さらに、カニクイザル胚の脳脊髄液中に含まれる候補因子が神経幹細胞の増殖に貢献するかどうか検討した。サル胚の脳脊髄液は、hNSCに対して著しい増殖促進効果を示したが、この活性は候補因子に対する機能阻害抗体によって一部阻害されたことから、脳脊髄液中の候補因子が神経幹細胞に対する増殖促進を支える因子の1つであることが明らかになった。次に、種間の脳サイズの違いと候補因子の因果関係を検討するため、マウスの神経幹細胞に対する候補因子の影響を調べた。その結果、候補因子はマウス神経幹細胞の増殖を著しく促進した。さらにin vivoの検討を行い、マウス胚の脳に候補因子を作用させると、有意に大脳皮質が拡大するという結果が得られた。候補因子は、正常のマウス胚では見られないことから、脳発生期の候補因子の有無が脳サイズの違いに影響している可能性が示唆された。このように、脳脊髄液中の因子の違いが脳サイズの違いの原因であることを明らかにしつつある。さらに、神経幹細胞の増殖に脳圧が関与する可能性を検討する第一歩として、胚操作が容易なニワトリ胚を用い、脳圧を下げる実験を行った。その結果、脳圧低下によって、脳が顕著に縮小した。この結果は、脳圧が脳サイズの制御に関わる可能性を示唆する妊娠中の体調不良、産休と育児により研究に従事する時間が減ったため、若干の遅れがみられる。

また、神経幹細胞が増殖して密度が上がってきた状態を細胞培養で模倣し、細胞の押し合いによる力学的刺激の作用を検討した。RNAseq解析より、押し合いの力は、細胞増殖に抑制的に働くことがわかった。このように、力学的刺激が神経幹細胞の増殖に作用することが明らかになった。種間によってその力にどのような違いがあるかは、今後の課題である。種間で力に違いがあり、脳の拡大化に関与する可能性は十分ある。研究結果はポジティブなものが多く今後の展開が見込めるため、周囲のサポートを受けながら、遅れを取り戻すよう努めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
インドネシア農村の社会変動と都市化に関する比較社会学的研究

インドネシアでは、1970年代から工業化が進み、さらに80年代に入ると製造業、鉱業・採石、商業などの部門を中心にかつて見られなっかた高い経済成長を示すようになった。このような動きにあわせて、農村と都市との間の人、物、資本あるいは情報の流れが急激に進むようになり、都市にあっては居住人口が増大するとともに、農村部にあっては農業生産と生活条件が著しい変容を示すようになってきた。そこで、本研究では、このような80年代の社会・経済的条件の急激な変化にともなって、インドネシアの政治・経済の中心をなすジャワ島では、農村社会と都市社会のそれぞれにどのような社会構造的な変化が生じてきたかを、1984年、198990年および91年に現地調査で得た資料も活用して、明らかにしようとした。(1)農村社会の変動については、研究代表者の黒柳晴夫が担当した。ここでは、産業化や都市化にともなう農村社会の社会構造的な変動を、農村部への貨弊経済や経済合理的な生活様式の浸透という観点から考察を加えた。そして、従来広く見られた日本の無尽や頼母子にあたるアリサンに加えて、お互いにより合理的に金を融通しあう私的な庶民金融組織シンパン・ピンジャムが、相互扶助の一環として組織されるようになってきたことをあきらかにした。そして、その成果の一端が、90年10月末の日本社会学会で、口頭発表された。(2)都市社会については今野裕昭が分担した。ここでは、産業化にともなう都市化現象のひおとつにとして、家族が小家族化するという命題があるが、はたして発展途上国のひとつインドネシアではどうかを、ジャカルタ事例を取りあげて考察した。そして、ジャワではむしろ都市の家族に規模の大きな家族が多いことを明らかにし、途上国では都市化と小家族化は必ずしも相即しないことを明らかにした。
幾何学的変分問題の解の大域的性質に関する研究

1.3次元ユークリッド空間内にはめ込まれた曲面に対する非等方的表面エネルギーの臨界点(非等方的平均曲率一定曲面.以下,CAMC曲面と略記する)について研究した.特に,非等方的表面エネルギーが回転対称であって「凸性条件」を満たす場合については次の結果を得た.(1)埋め込まれた閉CAMC曲面は,(平行移動と相似を除き)ウルフ図形であることを証明した.(2)平行な二平面上に自由境界を持つ曲面であって,体積一定の条件のもとでの非等方的表面エネルギーと濡れエネルギーの和の臨界点となっているようなものについて研究し,次の成果を得た.(2-1)ウルフ図形の任意の部分は対応する変分問題のエネルギー最小解を与えることを証明した.(2-2)濡れエネルギー係数が非負である場合について,安定解の存在と一意性,幾何学的性質を決定した.(2-3)濡れエネルギー係数が負である場合については,CAMC曲面の安定性の判定及び安定解の存在と一意性についてのいくつかの判定条件を得た.さらに,いくつかの具体例についての数値計算により未解決な場合についての結果の予想をたてた.2.一般に,CAMC曲面の具体例の構成は,回転対称なものと平均曲率一定曲面を除き,困難である.本研究において,ある種の対称性を持つが回転対称ではないCAMC曲面の構成法を得た.これは,CAMC曲面についての理論を,結晶学,数理生物学を始めとする自然科学のさまざまな分野へ応用するという観点からも重要であると思われる.3.平面曲線の輪転曲線としての特徴付けについての新しい方法を得,平均曲率一定回転面に関する古典的なDelaunayの定理を一般化した.さらに,それを用いてCAMC回転面を特徴付けた.1.3次元ユークリッド空間内にはめ込まれた曲面に対する非等方的表面エネルギーの臨界点(非等方的平均曲率一定曲面.以下,CAMC曲面と略記する)について研究した.特に,非等方的表面エネルギーが回転対称であって「凸性条件」を満たす場合については次の結果を得た.(1)埋め込まれた閉CAMC曲面は,(平行移動と相似を除き)ウルフ図形であることを証明した.(2)平行な二平面上に自由境界を持つ曲面であって,体積一定の条件のもとでの非等方的表面エネルギーと濡れエネルギーの和の臨界点となっているようなものについて研究し,次の成果を得た.(2-1)ウルフ図形の任意の部分は対応する変分問題のエネルギー最小解を与えることを証明した.(2-2)濡れエネルギー係数が非負である場合について,安定解の存在と一意性,幾何学的性質を決定した.(2-3)濡れエネルギー係数が負である場合については,CAMC曲面の安定性の判定及び安定解の存在と一意性についてのいくつかの判定条件を得た.さらに,いくつかの具体例についての数値計算により未解決な場合についての結果の予想をたてた.2.一般に,CAMC曲面の具体例の構成は,回転対称なものと平均曲率一定曲面を除き,困難である.本研究において,ある種の対称性を持つが回転対称ではないCAMC曲面の構成法を得た.これは,CAMC曲面についての理論を,結晶学,数理生物学を始めとする自然科学のさまざまな分野へ応用するという観点からも重要であると思われる.3.平面曲線の輪転曲線としての特徴付けについての新しい方法を得,平均曲率一定回転面に関する古典的なDelaunayの定理を一般化した.さらに,それを用いてCAMC回転面を特徴付けた.1.3次元ユークリッド空間内の「凸性条件」を満たす非等方的表面エネルギーに対する変分問題の解(非等方的平均曲率一定曲面)について,次の結果を得た.(1)回転対称な非等方的表面エネルギーの臨界点であるような埋め込まれた閉曲面は,(平行移動と相似を除き)ウルフ図形であることを証明した.(2)非等方的平均曲率一定曲面に対する自由境界問題について,Euler-Lagrange方程式を求めた.(3)回転対称な非等方的表面エネルギーに対し,平行な二平面上に自由境界を持つ曲面であって,体積一定の条件のもとでの非等方的表面エネルギーの臨界点となっているようなものについて研究し,解の安定性に関する多くの結果を得た.一例として,次の結果を得た:ウルフ図形の母線の曲率に対するある仮定のもとで,平行な二平面で囲まれる閉領域に含まれる安定な臨界点であって埋め込みとなっているようなものは,ウルフ図形の上半分,下半分と短い円柱のみである.(4)平行な二平面上に自由境界を持つ曲面であって,体積一定の条件のもとでの非等方的表面エネルギーと濡れエネルギーの和の臨界点となっているようなものについて研究し,次の成果を得た.ウルフ図形の任意の部分は,対応する変分問題のエネルギー最小解を与えることを証明した.また,中央にbulgeを持つ非等方的平均曲率一定回転面の,回転軸方向に対称なすべての部分について安定であるか否かを決定した.2.複素2次元空間内のある種のLagurangian曲面を構成する式を具体的に構成した.また,そのような曲面の分類を行った.3.4次元空間形内のボンネ曲面についてチェン・ヤウの簡約定理の一般化を得た.また,相似幾何的観点からボンネ曲面と調和逆平均曲率曲面の統一的解釈を得た.さらに,空間形内のビアンキ曲面を新たに定義し基本的な性質を調べた.

1.3次元ユークリッド空間内にはめ込まれた曲面に対する非等方的表面エネルギーの臨界点(非等方的平均曲率一定曲面)について研究した.特に,非等方的表面エネルギーが回転対称であって「凸性条件」を満たす場合を扱い,平行な二平面上に自由境界を持つ埋め込まれた曲面であって,体積一定の条件のもとでの非等方的表面エネルギーと濡れエネルギーの和の臨界点となっているようなものについて研究し,次の成果を得た.(1)濡れエネルギーの係数が非負である場合について,安定解を決定した.(2)濡れエネルギーの係数が負である場合について,安定解の幾何学的性質を解析した.(3)平成16年度に得た結果(境界のない臨界点は(平行移動と相似を除き)ウルフ図形であること.中央にbulgeを持つ非等方的平均曲率一定回転面の,回転軸方向に対称なすべての部分についての安定性の判定.ウルフ図形の任意の部分のエネルギー最小性.その他)と上記(1)及び(2)の結果を論文にまとめ,国際的に評価の高い学術雑誌に投稿して受理された.(4)濡れエネルギーの係数が非負である場合について,安定解の存在と一意性,幾何学的性質を決定した.なお,上記研究成果の特別な場合として,平均曲率一定(CMC)曲面に対する結果が得られるが,それらの多くはCMC曲面についての結果としても新しいものである.2.曲面の2次元複素空間へのラグランジアンはめ込みの可能性とラグランジアン角度等の関係について研究した.3.離散化を伴う曲線の可積分な運動について研究し,特に曲率がBurgers方程式に従う複素双曲線内の曲線の運動が自然な離散化に由来することを示した.1.3次元ユークリッド空間内の非等方的平均曲率一定(CAMC)曲面についての研究を行った.(1)ウルフ図形が回転対称である場合について,前年度までに行った研究をさらに発展させた.すなわち,平行な二平面上に自由境界をもつCAMC曲面について研究し,自由境界での濡れエネルギー係数が負である場合について,CAMC曲面の安定性の判定及び安定解の存在と一意性についての研究を解析学的及び幾何学的に進め,いくつかの判定条件を得た.さらに,いくつかの具体例についての数値計算により未解決な場合についての結果の予想をたてた.(2)一般に,CAMC曲面の具体例の構成は,回転対称なものと平均曲率一定曲面を除き,困難である.本研究において,ある種の対称性を持つが回転対称ではないCAMC曲面の構成法を得た.これは,CAMC曲面についての理論を,結晶学,数理生物学を始めとする自然科学のさまざまな分野へ応用するという観点からも重要であると思われる.2.平面曲線の輪転曲線としての特徴付けについての新しい方法を得,平均曲率一定回転面に関する古典的なDelaunayの定理を一般化した.さらに,それを用いてCAMC回転面を特徴付けた.この研究成果及び上記1.(2)の成果を論文にまとめ,学術雑誌に投稿した.3.ボンネ曲面,調和逆平均曲率曲面,ビアンキ曲面,中心アファイン極小曲面,ウィルモア曲面といった可積分系と関わる曲面について研究した.また,離散化を伴うバーガーズ方程式の現れる曲線の可積分な運動についても研究した.
アミノ酸残基を含む新規キラルカリックスアレーン類縁体の合成とその性質

1.シスチンペプチドを環内に含むキラルカリックスアレーン類縁体の合成フェノール-ホルマリン系オリゴマー(1から5量体)とシスチンペプチド(Pro-Cys-S-S-Cys-Pro)より構成されたキラルカリックスアレーン類縁体を収率8-35%で合成した。2.環化物の構造NMRおよびCDスペクトルより、環内へ導入されたペプチド部分のキラリティーがシクロファン部分へ伝達し、キラルな窪みを提供していることが明らかとなった。特に、CDスペクトルにおいて、フェノール-ホルマリン系部分が3量体のものでは、その吸収強度が、著しく大きくなったことより、3量体においてキラリティーの伝達が大変有効に行われているものと考えられる。一方、CDスペクトルの溶媒効果を検討したところ、へキサン中に比ベエタノール中で著しくスペクトル強度が低下したことより、ペプチド部分からシクロファン部分へのキラリティーの伝達において水素結合が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。3.分子認識機能リン酸イオンとの分子認識機能について、DMSO中にて、UVスペクトルを用い検討したところ、フェノール-ホルマリン系部分が1および4量体のものでは、会合定数(Ka)は、10^3であったが、フェノール-ホルマリン系部分が2および3量体のものでは、会合定数(Ka)は、10^4と約10倍大きくなった。1.アミノ酸残基を含むキラルカリックスアレーン類縁体の合成フェノール-ホルマリン系二量体とアミノ酸メチルエステルより構成されたキラルテトラホモジアザカリックス[4]アレーン類を収率11-22%で合成した。2.環化物の構造NMRおよびCDスペクトルより、環内へ導入されたアミノ酸残基のキラリティーがシクロファン部分へ伝達し、キラルな窪みを提供していることが明らかとなった。特に、CDスペクトルにおいて、その吸収強度が、ヘキサン中に比べエタノール中で著しく低下したことより、アミノ酸残基からシクロファン部分へのキラリティーの伝達において水素結合が重要な役割を果たしていると考えられる。3.分子認識機能チロシン残基を有する環化物では、ラセミ体のアンモニウム塩に対してジアステレオマー錯体を形成し、^1H-NMR上でアンモニウム塩のエナンチオマーを識別できることを明らかにした。一方、他の残基、例えばロイシン、フェニルアラニンなどではそのような現象は観測されなかった。NMRおよびCDスペクトルからの知見と合わせて考えるとチロシン残基の水酸基がシクロファン中の分子内水素結合に影響を与え、シクロファン部分がより立った構造を取ること、そしてその結果、ラセミ体のアンモニウム塩を取り込むのに十分なキャビティーが形成できたものと考えられる。
頭頸部癌における低酸素誘導因子発現の転移への影響とその臨床応用に関する研究

頭頸部癌症例のHIF1-α発現について検討を行った。早期舌癌25症例の免疫染色ではHIF1-αの核内発現と遅発性頸部転移との関係が示された。また経口的腫瘍切除の適応となった早期下咽頭癌症例においてリンパ節転移の有無とHIF1-α発現との間に相関を認めた。さらにHIF1-α阻害薬を用いて下流シグナルの変化をReal Time PCRで測定した。頭頸部癌細胞株にHIF1-α阻害薬を投与することにより、EMT関連遺伝子のなかではTWISTが、また癌幹細胞に関係するNANOGおよびOCT3/4遺伝子の発現が低下し、これらの遺伝子発現がHIF1-αにより制御され転移病巣形成に関与していることが示された。頭頸部癌の転移は予後不良因子であり、そのメカニズムを解明し治療方法を開発することが予後を改善していくために必要である。癌細胞は様々な遺伝子発現を調整し転移病巣を形成している。複雑な癌転移のメカニズムを解明するには、頭頸部癌の同所移植モデルを作成し、その転移プロセスについて解析する必要があるこれまでに我々は頭頸部癌細胞株のFaDu細胞をマウスの舌粘膜に移植し、頸部転移を生じる同所移植モデルを確立した。このモデルの舌腫瘍および転移リンパ節におけるmRNA発現について、RNA-seqによる遺伝子発現解析をこれまで行ってきたが、本データをさらに詳細に分析した。その結果、低酸素応答因子(HIF)に関連するシグナルの他に、NFkBやケモカインレセプターに関連する遺伝子の発現の増加が転移リンパ節内で認められた。これらの因子についても頭頸部癌転移に関わっている可能性が推察される。次に、慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科において過去に手術治療を行い、5年以上経過した早期舌癌症24例のホルマリン固定標本を用いて、HIF1-alphaの免疫染色を行った。後発リンパ節転移(DNM)を生じた症例においてHIF1-alphaの発現の増加を認め、その発現は核内を中心としたものであった。HIF1-alphaは低酸素下で細胞内に蓄積し、核内に移行することで低酸素下での細胞生存に関わる様々な転写因子の発現を行う。その際に血管新生因子を発現することで癌細胞の転移にも関わっていると考えられている。今後は、血管新生因子以外にEMTやケモカインレセプター、NFkBなどについての発現とHIF1-alphaとの発現の関係について検討していく予定である。頭頸部癌の転移は予後不良因子の一つであり、そのメカニズムを解明し治療方法を開発することが必要不可欠である。癌の転移は複数のステップからなり、癌細胞は様々な遺伝子発現を調整し転移病巣を形成している。低酸素応答因子(HIF1-α)は低酸素下で細胞内に蓄積し、核内に移行することで低酸素下での細胞生存に関わる様々な転写因子の発現を行うだけでなく、血管新生因子を発現することで癌細胞の転移にも関わっている。頭頸部癌のリンパ節転移の形成にHIF1-αが関わるメカニズムを究明することで、HIF1-α抑制を介した転移抑制治療の可能性を追求するのが本研究の目的である。これまで我々は頭頸部癌細胞株のFaDu細胞をマウスの舌粘膜に移植し、頸部転移を生じる同所移植モデルを確立した。このモデルの舌腫瘍および転移リンパ節におけるmRNA発現について、RNA-seq法で遺伝子発現解析を行った結果、転移リンパ節において、HIF1-αに関連する遺伝子発現増加を認めた。そこで、慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科において過去に手術を行い、5年以上経過した早期舌癌24症例のホルマリン固定標本を用いてHIF1-αの発現を検討したところ、後発性リンパ節転移を生じた症例ではHIF1-α発現の核内での増加を認め、HIF1-αが臨床検体においても転移に関わっていることが示された。また、頭頸部癌細胞株にHIF1-α阻害薬であるKC7F2を投与したところ、濃度依存性に増殖率が抑制された。またKC7F2投与後の細胞からmRNAを抽出し、Real time PCR法で遺伝子発現を評価したところ、上皮間葉転換に関わるTWISTの発現の低下、およびE-CADHERINの発現増加をみとめた。また幹細胞形質に関わるNanogやOct3/4の発現低下が生じることがわかった。これらの遺伝子発現は頭頸部癌転移形成に関わっていることが推察される。臨床検体の解析、in vivoモデルの解析の大部分が終了している。またin vitroの解析も順調に進んでいる。研究代表者は2011年より2年間Johns Hopkins Universityにて頭頸部癌の転移に関する研究を行った。その中で頭頸部癌細胞を口腔咽頭腔に移植し、所属リンパ節に転移を生じさせる同所移植モデル(orthotopic model)を確立した。この同所移植モデルの原発巣とリンパ節転移を採取し、それぞれ組織での遺伝子発現をRNA-seq法で解析し、転移リンパ節で発現の亢進している遺伝子および活性化しているシグナルを統計的に抽出した。その結果、転移リンパ節においてHIF1およびHIF2シグナルの亢進を認め、頭頸部癌の転移巣形成にHIF1が関わっていることを示した(頭頸部癌学会2015神戸市)頭頸部癌においても、他癌と同様に低酸素応答因子のHIF1-αが腫瘍増悪に関与していることが明らかになってきた。

我々はHIF1-α発現と頭頸部癌転移について注目し、これまでにHIF1-αが頭頸部癌転移に強く関係していること、HIF1-α阻害により腫瘍の進行を抑制できる可能性を示してきた。2014年より慶應義塾大学医学部耳鼻咽喉科学教室で治療を行った頭頸部癌症例のHIF1-α発現について検討を行った。早期舌癌25症例の免疫染色ではHIF1-αの核内発現と遅発性頸部転移との関係が示された。また経口的腫瘍切除の適応となった早期下咽頭癌症例においてリンパ節転移の有無とHIF1-α発現との間に相関を認めた。頭頸部癌症例のHIF1-α発現について検討を行った。さらにHIF1-α阻害薬を用いて下流シグナルの変化をReal Time PCRで測定した。頭頸部癌細胞株にHIF1-α阻害薬を投与することにより、EMT関連遺伝子のなかではTWISTが、また癌幹細胞に関係するNANOGおよびOCT3/4遺伝子の発現が低下し、これらの遺伝子発現がHIF1-αにより制御され転移病巣形成に関与していることが示された。現在はHIF1-αノックダウン細胞を作成中で、この細胞によるin vitroでの機能解析および、動物モデルでの評価を行うことで、HIF1-αと頭頸部癌転移との関連性に着いて十分な検討が行える。頭頸部外科舌癌以外にも下咽頭癌についてもHIF1-alphaの免疫染色を行う。頭頸部癌細胞株においてHIF1-alphaのノックダウンを行い、転移に関連する遺伝子の発現について評価する。HIF1-alpha阻害薬を用いて、頭頸部癌細胞への影響について評価する。実験の順序を変えたことが次年度繰越が生じた理由である。当初はHIF1-αノックダウン細胞株の作成および解析をH27年度から開始する予定で、そのための費用を確保していたが、これらの実験をH28年度に行うこととした。替わりにHIF1-α阻害薬を用いた解析をH27年度に行った。ノックダウン細胞株の解析にかかる費用が高額のため、結果として一部分の予算をH28年に繰り越しすることとなった。複数の頭頸部癌細胞株をもちいてHIF1-αノックダウンを行う。作成された細胞の期の解析および動物モデルを用いた転移形成の検討を行う。
細胞接着の情報伝達機構と腎炎糸球体局所におけるその活性化に関する研究

本研究では、細胞外基質蛋白がその細胞表面受容体であるインテグリンとの結合を介して細胞の増殖や分化を制御する生理活性物質であるとの観点より、1)糸球体上皮細胞やメサンジウム細胞を用いたin vitroの培養系で、細胞外基質蛋白との結合により活性化される情報伝達経路を明らかにし、これを基盤として、2)腎炎糸球体においてこれらの経路がいかなる動態にあるかを、ループス腎炎のモデルであるlprマウスを用いたin vivoの系で解析することを目的とした。我々の得た知見は以下の通りである。1)インテグリンを介した細胞接着の刺激によりMAPキナーゼの活性化が誘導される(森野ら、J.Biol.Chem.270:269-273,1995)。2)同様の刺激により新規情報伝達分子であるp130Casのチロシンリン酸化が亢進する(野島ら、J.Biol.Chem.270:15398-15402、1995)。接着刺激によりリン酸化されたp130Casはアダプター分子であるc-Crkと結合してMAPキナーゼの上流として機能する可能性がある。(浜崎、野島ら、論文投稿中)以上の事実より、細胞外基質とインテグリンの結合により細胞内の情報伝達系が活性化されること、また活動性腎炎の糸球体局所ではこれらの情報伝達経路の活性化が生じており、腎炎の進展に寄与していることが推定された。