hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
共生微生物感染に必須なカルシウムスパイキング起動と受容に関わる宿主因子の機能解析

(1)Caスパイキングの受容因子であるCCaMKの機能獲得型CCaMK-CAの共生変異体への形質転換実験から、根粒菌・菌根菌の感染受容を司る共通シグナル伝達経路に属する宿主遺伝子群のうち、Caスパイキングの上流に位置づけられているSYMRK、CASTOR、POLLUX及びNup85遺伝子が、根粒菌及び菌根菌の感染過程に直接的に関与していないことを明らかにした。一方、根粒共生特異的経路に位置するNFR1は、根粒菌の感染過程に直接的に関与することが示され、NSP2は、CCaMKの下流に位置し、根粒器官形成過程を直接的に制御する事が示された。(2)イネTos17挿入変異体OsCCaMKは、花粉そのものが全く形成されない優性不稔表現型を示すことを明らかにした。この雄性不稔および菌根共生不全表現型は、OsCCaMKゲノム配列形質転換により相補されたことから、OsCCaMK遺伝子は、花粉形成および菌根菌共生の2つの過程に必須の遺伝子であることが示された。(3)菌根共生から根粒共生への進化の過程で、CASTOR/POLLUXおよびCCaMK遺伝子が機能的に進化しているかを検証するため、イネオルソログによるミヤコグサ変異体の相補実験を行った。OsCASTOR,OsCCaMKはミヤコグサ当該変異体の根粒共生表現型を完全に相補したが、OsPOLLUXでは、相補は不完全であった。これらの遺伝子では、イネ・ミヤコグサ間でのドメイン構造の大きな変化などはないことから、CASTOR/POLLUX及びCCaMKは、Caシグナル誘導に必要な因子として保存・維持され、根粒共生系においても、共生菌の「感染受容」過程を支える因子として機能していることが強く示唆された。CCaMK(カルシウム・カルモデュリン依存型プロテインキナーゼ)は、Nod factorにより起動されるCaスパイキング依存的に自己リン酸化し、下流因子をリン酸化することで根粒菌感染受容過程を制御していると考えられる。そこで、CCaMK自己リン酸化スレオニン残基をアスパラギン酸に置換したconstitutive active変異遺伝子(CCaMK-CA)を作出しAgrobacterium rhizogenes毛状根系によりミヤコグサへ形質転換した。その結果、根粒菌非感染条件における根粒様構造の形成が確認され、CCaMKが根粒構造形成誘導を含めた初期感染受容過程を制御していることが強く示唆された。現在、A.tumefaciensによるCCaMK-CA形質転換ミヤコグサを作出中である。イネのオルソログ解析として、Tos17タグラインの3D-poolスクリーニングより、POLLUXオルソログAK072312、及び、CCaMKオルソログAK070335について、エクソン挿入の変異体ラインを選抜した。一方、CASTORオルソログAK068216については、現時点でタグラインを得ることはできていない。ミヤコグサのCASTOR及びPOLLUXは、共にプラスチド局在型イオンチャネル様タンパクをコードし、それぞれの単独変異で共生能が完全に失われることから、両者の共生成立過程おける機能分担にも興味がもたれる。イネオルソログAK068216とAK072312が機能分担しているかは、両遺伝子の機能及び進化を理解するうえでも重要なポイントであるため、AK068216、AK072312のシングル及びダブルノックダウンを目的としたイネRNAi形質転換個体を作出した。また、ミヤコグサでのCCaMK-CA導入実験を受け、AK070335についても、CCaMK-CAを導入したイネ形質導入個体を作出した。(1)Caスパイキング起動に関与する遺伝子として、ミヤコグサでは、CASTOR・POLLUXの2遺伝子が同定されたのに対し、タルウマゴヤシでは、POLLUXオルソログと目されるDMI1遺伝子のみが同定されている。それぞれの遺伝子の機能進化及び機能比較を目的として、CASTOR・POLLUX及びDMI1遺伝子のスワップ相補実験による、ミヤコグサeastor及びpollux変異体の変異表現型の復帰の有無を解析した。Agrobacterium rhizogenesによる毛状根形質転換系によりDMI1遺伝子を導入した結果、DMI遺伝子は、eastor、pollux変異体、及び、eastor/pollux二重変異体の根粒菌感染表現型を相補することが明らかとなった。故に、DMI1遺伝子は準化の過程においてCASTOR・POLLUX遺伝子双方の機能を集約的に獲得した可能性が強く示唆された。(2)Caスパイキングの受容因子であるCCaMKの機能獲得型CCaMK-CAを形質転換したミヤコグサを作出した。同ミヤコグサのT1世代において、根粒菌非感染条件下で安定的に自発的根粒を着生する系統を複数得た。(3)イネTos17挿入変異体として、OsPolluxで2系統、OsCCaMKで1系統の変異体候補を選抜した。これら変異体の表現型解析から、OsPollux変異候補2系統では菌根菌感染不全表現型が、OsCCaMK変異候補系統では、菌根菌感染不全表現型、及び、Tos17挿入ホモラインにおいて不稔表現型が確認された。このことから、OsPollux遺伝子およびOsCCaMK遺伝子は、イネ根における菌根菌感染受容過程に関与することが強く示唆された。また、OsCCaMKは、イネの稔性への関与が強く示唆された。

また、海外のイネ変異体リソースから、新規にOsCastorの変異候補ライン3系統を入手した。(1)Caスパイキングの受容因子であるCCaMKの機能獲得型CCaMK-CAの共生変異体への形質転換実験から、根粒菌・菌根菌の感染受容を司る共通シグナル伝達経路に属する宿主遺伝子群のうち、Caスパイキングの上流に位置づけられているSYMRK、CASTOR、POLLUX及びNup85遺伝子が、根粒菌及び菌根菌の感染過程に直接的に関与していないことを明らかにした。一方、根粒共生特異的経路に位置するNFR1は、根粒菌の感染過程に直接的に関与することが示され、NSP2は、CCaMKの下流に位置し、根粒器官形成過程を直接的に制御する事が示された。(2)イネTos17挿入変異体OsCCaMKは、花粉そのものが全く形成されない優性不稔表現型を示すことを明らかにした。この雄性不稔および菌根共生不全表現型は、OsCCaMKゲノム配列形質転換により相補されたことから、OsCCaMK遺伝子は、花粉形成および菌根菌共生の2つの過程に必須の遺伝子であることが示された。(3)菌根共生から根粒共生への進化の過程で、CASTOR/POLLUXおよびCCaMK遺伝子が機能的に進化しているかを検証するため、イネオルソログによるミヤコグサ変異体の相補実験を行った。OsCASTOR,OsCCaMKはミヤコグサ当該変異体の根粒共生表現型を完全に相補したが、OsPOLLUXでは、相補は不完全であった。これらの遺伝子では、イネ・ミヤコグサ間でのドメイン構造の大きな変化などはないことから、CASTOR/POLLUX及びCCaMKは、Caシグナル誘導に必要な因子として保存・維持され、根粒共生系においても、共生菌の「感染受容」過程を支える因子として機能していることが強く示唆された。
卵巣癌におけるPaclitaxel耐性獲得に関わる分子機構の解明

卵巣癌おけるPaclitaxel感受性に関するtype IIIβ-tubulin(TUBB3)の過剰発現の影響と,その転写制御機構を解析した.転写制御に関しては,転写因子RESTの関与とそれに纏わるエピジェネティックな制御機構,遺伝子の構造異常について解析した.また,卵巣癌原発巣におけるTUBB3の発現と臨床病理学的事項との相関も検討した.さらに,卵巣癌以外の悪性腫瘍に関しても解析を行った.卵巣癌においてTUBB3の過剰発現は,進行度や転移などの予後不良マーカーと有意に相関した. TUBB3の過剰発現は, REST結合領域のRE-1配列近傍のメチル化状態とヒストン蛋白のアセチル化状態に依存していた. TUBB3過剰発現卵巣癌培養細胞株ではPaclitaxelに対する感受性が低下していた.REST遺伝子はいずれの細胞株でも安定的に発現しており,構造異常も認められず, TUBB3の発現に関して直接的関与は認めなかった.RESTinducible cloneによるdominant negative cloneでは, RESTはMeCP2ならびにSim3等の巨大なepigenetic regulator bodyを形成し, TUBB3の発現を細胞周期依存性に制御している可能性が示唆された.卵巣癌におけるTUBB3の異常発現は,その発現制御因子である転写因子RESTの結合領域に生じるエピジェネティックな機構の破綻による可能性が示唆された.悪性黒色腫では, TUBB3過剰発現株では卵巣癌と同様にPaclitaxelに対して抵抗性を持つものの,予後は逆に良好であった.このことはTUBB3の過剰発現は腫瘍によって異なる生物学的特性を付与すると考えられた.卵巣癌のPaclitaxelを用いた治療において, TUBB3の免疫組織学的解析は重要な情報である.さらに, Paclitaxelを主体とした化学療法施行に際して,エピジェネティックな腫瘍環境を考慮する必要があると考えられた.卵巣癌おけるPaclitaxel感受性に関するtype IIIβ-tubulin(TUBB3)の過剰発現の影響と,その転写制御機構を解析した.転写制御に関しては,転写因子RESTの関与とそれに纏わるエピジェネティックな制御機構,遺伝子の構造異常について解析した.また,卵巣癌原発巣におけるTUBB3の発現と臨床病理学的事項との相関も検討した.さらに,卵巣癌以外の悪性腫瘍に関しても解析を行った.卵巣癌においてTUBB3の過剰発現は,進行度や転移などの予後不良マーカーと有意に相関した. TUBB3の過剰発現は, REST結合領域のRE-1配列近傍のメチル化状態とヒストン蛋白のアセチル化状態に依存していた. TUBB3過剰発現卵巣癌培養細胞株ではPaclitaxelに対する感受性が低下していた.REST遺伝子はいずれの細胞株でも安定的に発現しており,構造異常も認められず, TUBB3の発現に関して直接的関与は認めなかった.RESTinducible cloneによるdominant negative cloneでは, RESTはMeCP2ならびにSim3等の巨大なepigenetic regulator bodyを形成し, TUBB3の発現を細胞周期依存性に制御している可能性が示唆された.卵巣癌におけるTUBB3の異常発現は,その発現制御因子である転写因子RESTの結合領域に生じるエピジェネティックな機構の破綻による可能性が示唆された.悪性黒色腫では, TUBB3過剰発現株では卵巣癌と同様にPaclitaxelに対して抵抗性を持つものの,予後は逆に良好であった.このことはTUBB3の過剰発現は腫瘍によって異なる生物学的特性を付与すると考えられた.卵巣癌のPaclitaxelを用いた治療において, TUBB3の免疫組織学的解析は重要な情報である.さらに, Paclitaxelを主体とした化学療法施行に際して,エピジェネティックな腫瘍環境を考慮する必要があると考えられた.【目的】Paclitaxelとシスプラチンの併用療法(TJ療法)は卵巣癌の標準療法として広く認知されてきた.しかし、類内膜癌・漿液性癌では70%程度の初回奏功率を示すものの、粘液性癌・明細胞癌では50%程度であり、組織型による、薬剤感受性の違いが存在することが想定されている.近年、卵巣癌を含めた各種ヒト悪性腫瘍で、type III β-tubulinの過剰発現が生じており、Paclitaxelの薬剤耐性機構の獲得に重要な役割を担っていることが明らかとなってきた.本研究では、「エピジェネティックマスター遺伝子RESTの不活化は、type III β-tubulinの発現誘導を引き起こし、薬剤耐性機構の形成に関与している」との仮説を立てるに至った.卵巣癌においてがん抑制遺伝子REST(RE-1 silencing factor)の異常を解析し、「RESTの不活化がtype III β-tubulinの発現誘導を介して、Paclitaxel耐性の獲得に重要な役割を果す」ことを明らかにする.【結果】(1)卵巣癌培養細胞株を用いた解析では、REST binding siteへのDNAメチル化はtype III β-tubulinの発現を強く抑制した.(2)脱アセチル化阻害剤によるアセチル化の抑制はtype IIIβ-tubulinの発現を誘導した.(3)卵巣癌切除組織の免疫染色結果では、過剰発現は有意に予後不良であった.【意義・重要性】type III β-tubulinの過剰発現は、DNAメチル化、ヒストンアセチル化によって制御されており、その発現過剰発現は高頻度に認められることが明らかとなった.【目的】Paclitaxelとシスプラチンの併用療法(TJ療法)は,卵巣癌の標準療法として広く認知されてきた.

しかし,類内膜癌・漿液性癌では70%程度の初回奏功率を示すものの,粘液性癌・明細胞癌では50%程度であり,組織型による,薬剤感受性の違いが存在することが想定されている。近年,卵巣癌を含めた各種ヒト悪性腫瘍で,type III β-tubulin (TUBB3)の過剰発現が生じており, Paclitaxelの薬剤耐性機構の獲得に重要な役割を担っていることが明らかとなってきた.本研究では,「エピジェネティックマスター遺伝子RESTの不活化は, TUBB3の発現誘導を引き起こし,薬剤耐性機構の形成に関与している」との仮説を立てるに至った.卵巣癌においてがん抑制遺伝子REST (RE-lsilencing factor)の異常を解析し,「RESTの不活化がTUBB3の発現誘導を介して, Paclitaxel耐性の獲得に重要な役割を果す」ことを明らかにする.【結果】(1)卵巣癌培養細胞株を用いた解析では, REST binding siteへのDNAメチル化はTUBB3の発現を強く抑制した.(2)脱アセチル化阻害剤によるアセチル化の抑制はTUBB3の発現を誘導した.(3)卵巣癌切除組織の免疫染色結果では,過剰発現は有意に予後不良であった.(4)RESTの発現は細胞周期依存性に発現のダイナミクスが観察され,細胞分裂に必須の要因であった.(5)Paclitaxelに対する感受性には細胞質内ヒストン脱アセチル化酵素RDAC6によるα-tubulinの脱アセチル化も強く関連していた.【意義・重要性】TUBB3の過剰発現は, DNAメチル化,ヒストンアセチル化によって制御されており,そのHDACを標的とした分子標的治療薬の開発は卵巣癌の治療に有用と考えられた.
マングローブ植物による嫌気性土壌への酸素供給と硝酸態窒素利用の可能性

マングローブ林は熱帯・亜熱帯の沿岸域に成立し、その土壌はほぼ常時あるいは潮汐に伴って定期的に冠水するため、地下部は嫌気状態になることが多い。その結果、土壌中で酸素が必要な硝化(アンモニウム態窒素の酸化)が起こらず、マングローブ植物の窒素利用については、窒素源としてアンモニウム態窒素を利用すると考えられ、植物種によって大きく異なる硝酸態窒素を利用する能力は着目されてこなかった。しかし、予備調査の結果、マングローブの1種オヒルギは硝酸態窒素を利用している可能性が示された。マングローブ植物の多くが気根から大気中の酸素を獲得しており、その一部が根から土壌に漏出して硝化に利用された可能性があるが、根の分布と硝酸態窒素の生成の関係はまだ検証されていない。本研究では、マングローブ植物は気根からの酸素供給によって自らの根圏における硝化を促進しているのか、マングローブ植物は根圏で生成される硝酸態窒素を窒素源として利用できるのかという2点に関する検証を試みている。これまでに、予備調査で対象としたオヒルギ(やや陸側の塩分濃度が低い場所に分布)に加え、ヤエヤマヒルギ(耐塩性が高く、やや海側に分布)の実生苗を対象として硝酸態窒素利用能力を検証するための水耕栽培実験を行った。その結果、オヒルギはヤエヤマヒルギに比較して硝酸態窒素を利用する能力が高く、供給された硝酸態窒素に反応する能力も高いことが示された。マングローブ植物による根圏における硝化の促進に関しては、沖縄県西表島において現地調査を行う。オヒルギとヤエヤマヒルギの根圏を含む土壌を採取し、土壌中に分布する根量と土壌の硝化に関わる項目の比較を試みている。昨年度実施した予備実験に基づいて測定条件を設定し、同位体希釈法による硝化速度の測定を行っている。さらに今後は土壌微生物に関して分子生物学的手法を用いた調査を進める予定である。2018年度の実施内容は、2017年度に行った水耕実験における要確認事項のための補足的実験と、野外調査による土壌サンプルの採取と分析である。水耕実験において、細根の分類基準を変更することが植物の酵素活性の評価に影響し得ることが前年度の実験の結果から懸念されたため、細根をサイズによって分類して追試を行った。その結果、前年度に実施した実験の結果に影響はないことが確認された。また、野外調査においては、沖縄県の西表島においてオヒルギとヤエヤマヒルギの根圏土壌の採取と総硝化速度の測定を行った。対象2種の根が分布する範囲から採土円筒を用いて土壌を採取し、単位容積あたりの土壌中の細根分布量を測定した。現在、前年度に行った予備実験に基づいて設定された条件を用い、それぞれの土壌サンプルについて同位体希釈法により総窒素無機化・硝化速度の測定を進めている。研究計画にある分子生物学的手法を用いた土壌微生物の分析にはまだ至っていないが、サンプルは準備できており、他の項目についての分析も進んでいるので、総合的には問題なく進捗していると考える。今後は、主に野外調査で採取された土壌サンプルの分析、特に土壌微生物に関する分析を重点的に行う。また、これまでに得られた成果の公表を行う。前年度の野外調査において、沖縄県西表島に分布するオヒルギ(やや陸側の塩分濃度が低い場所に分布)とヤエヤマヒルギ(耐塩性が高く、やや海側に分布)の根圏土壌を採取した。当初、土壌サンプルを根の有無によって2分類とすることを予定していたが、樹木個体からの距離や方向の異なる複数のサンプルを採取し、それぞれについて土壌容積あたりの根量を調査する方法への変更を行った。これにより、マングローブ植物の根が土壌に及ぼす影響についてより詳細に把握することを試みる。また、硝化菌の分布について、土壌からDNAを抽出し、硝化を担う微生物機能群のアンモニア酸化酵素遺伝子を対象とした遺伝子の塩基配列解読および定量を行う。根量が土壌全体に占める根圏土壌の比率に反映されると考え、対象種のそれぞれについてこれらの項目と根量との比較を行う。その結果、土壌中で酸素が必要な硝化が起こらず、マングローブ植物は窒素源としてアンモニア態窒素を利用すると考えられてきた。しかし、先行研究と予備調査の結果、マングローブの1種オヒルギは硝酸態窒素を利用している可能性が示された。マングローブ植物の多くが気根から大気中の酸素を獲得しており、その一部が根から土壌に漏出して硝化に利用された可能性があるが、この酸素の移動と硝酸態窒素の生成の関係はまだ検証されていない。本研究では、マングローブ植物は気根からの酸素供給によって自らの根圏における硝化を促進しているのか、マングローブ植物は根圏で生成された硝酸態窒素を窒素源として利用しているのかという2点に関する検証を試みている。

その結果、ヤエヤマヒルギはオヒルギに比較して硝酸態窒素を利用する能力が低く、供給された硝酸態窒素に反応する能力も低いことが示された。また、オヒルギとヤエヤマヒルギが分布する沖縄県西表島で採取した土壌について、硝化を担う微生物の活性の有無を確認する予備調査を実施した。方法として、窒素安定同位体トレーサーを土壌に添加し、その濃度の変化を測定することで硝酸の関わる反応経路や反応速度を解析する同位体希釈法を用い、この予備調査ではトレーサー添加量や培養時間について適切な条件を探った。結果として、土壌中に硝化を司る微生物が存在し、硝酸を生成していることが示され、同位体希釈法をマングローブ林土壌に適用する際の測定条件に関する情報を得られた。研究計画では、初年度は「野外調査におけるデータ収集」「水耕実験に向けた準備」を行う予定であった。このうち、野外調査におけるデータ収集に関しては、一部は計画通り実施されたが、一部は初年度中には測定が完了しなかったもの、予備実験段階にとどまり再度本実験が必要なものが残された。具体的には、マングローブ林の土壌中に硝化菌が存在することは確認されたが、定量的な活性測定には至らなかった。また、土壌DNAに関する項目と植物を介した酸素の土壌への供給に関しては平成30年度に実施することとした。水耕実験にむけた準備に関しては、研究分担者らが以前から栽培を行ってきた苗木を実験に使用することができたため、予定よりも実験が進捗した。一部に、確認のための再実験が必要な点が残されたが、再実験の計画・方法については既に確定しており、実施のための調整を進めている段階である。総合的には、野外調査については未実施部分が残されたものの、水耕栽培実験は予定よりも大きな進捗があったことから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断している。マングローブ林は熱帯・亜熱帯の沿岸域に成立し、その土壌はほぼ常時あるいは潮汐に伴って定期的に冠水するため、地下部は嫌気状態になることが多い。その結果、土壌中で酸素が必要な硝化(アンモニウム態窒素の酸化)が起こらず、マングローブ植物の窒素利用については、窒素源としてアンモニウム態窒素を利用すると考えられ、植物種によって大きく異なる硝酸態窒素を利用する能力は着目されてこなかった。しかし、予備調査の結果、マングローブの1種オヒルギは硝酸態窒素を利用している可能性が示された。マングローブ植物の多くが気根から大気中の酸素を獲得しており、その一部が根から土壌に漏出して硝化に利用された可能性があるが、根の分布と硝酸態窒素の生成の関係はまだ検証されていない。本研究では、マングローブ植物は気根からの酸素供給によって自らの根圏における硝化を促進しているのか、マングローブ植物は根圏で生成される硝酸態窒素を窒素源として利用できるのかという2点に関する検証を試みている。これまでに、予備調査で対象としたオヒルギ(やや陸側の塩分濃度が低い場所に分布)に加え、ヤエヤマヒルギ(耐塩性が高く、やや海側に分布)の実生苗を対象として硝酸態窒素利用能力を検証するための水耕栽培実験を行った。その結果、オヒルギはヤエヤマヒルギに比較して硝酸態窒素を利用する能力が高く、供給された硝酸態窒素に反応する能力も高いことが示された。マングローブ植物による根圏における硝化の促進に関しては、沖縄県西表島において現地調査を行う。オヒルギとヤエヤマヒルギの根圏を含む土壌を採取し、土壌中に分布する根量と土壌の硝化に関わる項目の比較を試みている。
ショッピングモ-ルの防排煙システムに関する基礎的研究

通常、アトリウムとそのに面する居室との間には、ガラススクリ-ンによって区間がなされている。しかしながら、アトリウム内に店舗、レストランなどを積極的に採り入れたショッピングモ-ルに対するニ-ズが今後増大することが予想される。そこで問題となるのは、店舗火災により煙が建物全体に伝播する危険がある。特に初期火災時における開口から流出する噴流の動きを把握することが防災対策上重要である。縮尺1/10のショッピングモ-ルの模型を製作し、アトリウムに面する店舗で火災が発生し、開口から煙が噴流する場合、火源の大きさ、開口の形状・バルコニ-の奥行長さ、手すりの有無などが空間内の煙流動に及ぼす影響を調べるために実験を行なう。その結果、開口から噴出する煙は、バルコニ-がない場合、水平方向に噴出した後、ただちに浮力により上方へ回転する。その後、壁側に沿って上昇する。バルコニ-がある場合、バルコニ-の奥行長さが長くなると上昇したプル-ムは壁面の影響が小さくなる。またバルコニ-の手すりによる影響であるが、手すりによる壁を通過した地点で上昇気流は横への広がり、上階の手すりの内側に熱流がたまる傾向を示す。モ-ガンらが示すようにバルコニ-先端で回転する際の局部的巻込みは明確に判らない。炭酸ガスの希釈の度合による煙の拡散度を調べることは発煙筒による煙の濃度より炭酸ガス濃度の拡散が大きいという傾向を示した。今回の実験の範囲内のみから判断すると、ショッピングモ-ルに対する防排煙システムは希釈によって煙濃度を減ずることは難しく、加圧システムの採用などを考慮する必要があるものと思う。
砒素中毒の病態形成の分子機構-法医分子中毒学的解明を目指して-

砒素による腎障害の病態形成における炎症性サイトカイン・IL-6および女性ホルモン・estrogenの役割についてマウスモデルを用いて解析した。砒素による腎障害では、autophagyを伴う尿細管上皮の細胞死が病態形成に強く関与することを見出した。IL-6は砒素により誘導されるERKのリン酸化を抑制することでautophagyを減少させ腎障害に対して保護的に機能することを明らかにした。さらに、砒素による腎障害に対する感受性に性差が存在することを見出し、その性差はEstrogenよるIL-6/Stat3 signalの抑制によることを明らかにした。砒素中毒の病態形成におけるIL-6の役割をIL-6KOマウスおよび野生型マウスを用いて検討した。本研究の開始時においてIL-6KOマウスは野生型マウスに比べて砒素に対する感受性がより高いことを明らかにしていたが、19年度はその分子機構を明らかにすべく研究を行った。砒素投与により誘導されるサイトカイン、ケモカインは両系統のマウスに明らかな差を認めなかった。さらに、砒素排泄に関わるトランスポーターの発現にも有意差はなく、それに伴って腎からの砒素の排泄にも差を認めなかった。しかし、IL-6KOマウスにおいて腎尿細管上皮細胞のautophagic cell deathの頻度が野生型マウスに比較して著明に高いことを見出した。このことがIL-6KOマウスが砒素に対して高い感受性を示す直接的な原因と考えられる。そこで、autophagic cell deathの制御に関与すると考えられるERKのリン酸化を検討すると、砒素により誘導される腎でのERKのリン酸化がIL-6KOマウスにおいて野生型に比べて有意に亢進していた。さらに、IL-6とERKリン酸化の関係を明らかにするために、マウス尿細管上皮細胞株(mProx24)を用いて抗IL-6抗体、JAKインヒビター(AG490)およびERKインヒビター(PD98059)の砒素によるautophagic cell deathに対する影響を検討したところ、IL-6/JAK/STAT3のシグナルがERKの活性化を抑制することが明らかとなった。このことから、砒素による腎障害においてIL-6はSTAT3の活性化を介してERKのリン酸化を阻害することで尿細管上皮細胞のautophagic cell deathを抑制して、保護的に機能することを明らかになった。また、砒素にに対する感受性の性差についても、より感受性の高い雌マウスの腎でERKのリン酸化の亢進を認めたことから、感受性の性差の本質はERKの活性化の差と思われる。20年度にはエストロジェンとJAK/STAT3のクロストークとERKの活性化の関係を明らかにしていく予定である。19年度の研究では砒素による腎障害の病態形成におけるIL-6の保護因子としての機能を明らかにしたが、平成20年度はさらにその分子機構について詳細に検討した。シスプラチンによる腎障害では、autophagyは保護的に機能してapoptosisを抑制することで尿細管上皮細胞を保護することが報告されているが、一方、砒素による腎障害ではautophagyは尿細管上皮細胞に対して細胞死を引き起こす主要な機構であることを明らかにした。IL-6はERKのリン酸化を抑制することでautophagyを抑えて、結果として尿細管上皮細胞を砒素による障害から保護することを明らかにした。さらに、砒素投与後にIL-6あるいはERKの阻害剤を投与することで腎障害が軽減できることを示した。このことは、砒素中毒の治療や、砒素を用いた癌治療における副作用の軽減に繋がる重要な知見と考えられる。IL-6に関する研究成果については現在論文を投稿中である。砒素に対する感受性の性差については、より感受性の高い雌マウスの腎でautophagyが雄マウスに比較して有意に亢進していることを見出し、さらに、ERKも雌マウスの腎で雄マウスに比べて有意にリン酸化が亢進していることを明らかにした。この性差にandrogenは関与せず、estrogenのみが関与することを示す結果を得たので、IL-6に関して得られた結果と総合して考察すると、estrogen受容体の活性化によるERKの活性化がautophagyを亢進することで尿細管上皮細胞の障害を増大しているものと考えられる。本研究の最終年度である21年度においては、マウス尿細管上皮細胞株を用いて砒素中毒におけるIL-6とestrogenのautophagy制御の分子機構についてさらに検討を進め、砒素中毒病態形成におけるIL-6とestrogenの機能を分子生物学的に解明する。21年度は20年度に投稿した砒素による腎障害におけるIL-6の保護作用に関する論文の再投稿に必要な多くの追加実験を行い、砒素による腎障害の病態形成機構へのautophagyの関わりとIL-6がautophagyを抑制する分子機構の詳細を明らかにすることが出来た。

これらの結果を組み込んだ改訂稿はAmerical Journal of Pathologyに受理された。また、砒素による腎障害の性差についてもより深い分子機構の解明を目指して検討を行った。雌マウスは雄に比べて有意に高い砒素に対する感受性を示すが、その分子機構はEstrogen/Estrogen receptorのsignalがIL-6/Jak/Stat3のsignalとのcross-talkによりStat3の活性化を抑制するためであることを明らかにした。すなわち、雌マウスの腎では砒素投与後Estrogen/Estrogen receptorによりSocs3 (Jak/Stat3 signalの内在性inhibitor)の発現が著しく増加し、その結果として腎でのStat3のリン酸化が雄に比較して著明に抑制されていた。さらに、IL-6遺伝子欠損マウスでは砒素に対する感受性の性差が認められず、autophagyおよびERKの活性化に有意な性差を認めないことを明らかにした。これらのことは、砒素に対する感受性の性差はEstrogen/Estrogen receptorとIL-6/Jak/Stat3とのcross-talkが関与することを強く支持するものである。現在、培養細胞を用いた詰めの実験と論文の作成を並行して行っており、22年度中に論文として投稿する予定である。
近世数学史,特に関孝和の功績と西欧数学との比較研究,及び,その数学教育への活用

研究目的1.江戸時代の和算書の精読を通し,近世日本における数学の歩みを解明する.2.原典の精読を通し得られる数学史的視点を活かした授業の実践.研究,報告活動原書精読と授業研究に加え,以下などの研究活動を行った.・九州大学における日本科学史学会に参加,更に同大学桑木文庫にて資料を調査・日数教京都大会に続き日本数学史学会主催和算史跡研究会に参加・全国和算研究長崎大会にて講演,長崎の算額など資料を調査・RIMS研究集会「数学史の研究」にて講演・「数学教育の会」(学習院大学,お茶の水女子大学)にて講演・日本数学史学会50周年記念集会,京都大学所蔵和算書見学会,明治大学「社会に数理科学を発信する次世代型人材創発」等研究会に参加・清泉女子大学市民講座「和算に親しむ」を担当研究成果数学史の専門的な研究と高校授業研究は直接的な関連が薄いとも考えられるが,数学嫌いを生んでいる現状を鑑み,数学の本質的な意義,良さを伝えるため,数学が拠って生まれ来るその歴史を踏まえた授業研究が必要と考えている.しかし2次,3次文献を基に授業を行うことは弊害が予想され,たとえ一時代であれ先人達が築き上げた数学的な実りとそれに至る数学的営みをよく理解した上で教壇に立つことが肝要と考え,原典の解読に努める一方,歴史的視点を踏まえた授業を開講し6年,学生達から確かな反応を得ている.その教育活動における研究成果は「数学教育の会」で報告,一方,原典研究に関しては全国和算研究大会及びRIMS研究集会において報告の機会を得た.また朝倉書店『和算の事典』の執筆に続き,英文による関孝和の数論紹介が近日Springer社から刊行の予定である.和算を軸とした数学史の研究を深め,一方その理解を活かした授業実践のため研鑓を積み,歴史的視点を活かした文化としての新しい数学教育に向け一層の貢献を果たしたいと考えている.研究目的1.江戸時代の和算書の精読を通し,近世日本における数学の歩みを解明する.2.原典の精読を通し得られる数学史的視点を活かした授業の実践.研究,報告活動原書精読と授業研究に加え,以下などの研究活動を行った.・九州大学における日本科学史学会に参加,更に同大学桑木文庫にて資料を調査・日数教京都大会に続き日本数学史学会主催和算史跡研究会に参加・全国和算研究長崎大会にて講演,長崎の算額など資料を調査・RIMS研究集会「数学史の研究」にて講演・「数学教育の会」(学習院大学,お茶の水女子大学)にて講演・日本数学史学会50周年記念集会,京都大学所蔵和算書見学会,明治大学「社会に数理科学を発信する次世代型人材創発」等研究会に参加・清泉女子大学市民講座「和算に親しむ」を担当研究成果数学史の専門的な研究と高校授業研究は直接的な関連が薄いとも考えられるが,数学嫌いを生んでいる現状を鑑み,数学の本質的な意義,良さを伝えるため,数学が拠って生まれ来るその歴史を踏まえた授業研究が必要と考えている.しかし2次,3次文献を基に授業を行うことは弊害が予想され,たとえ一時代であれ先人達が築き上げた数学的な実りとそれに至る数学的営みをよく理解した上で教壇に立つことが肝要と考え,原典の解読に努める一方,歴史的視点を踏まえた授業を開講し6年,学生達から確かな反応を得ている.その教育活動における研究成果は「数学教育の会」で報告,一方,原典研究に関しては全国和算研究大会及びRIMS研究集会において報告の機会を得た.また朝倉書店『和算の事典』の執筆に続き,英文による関孝和の数論紹介が近日Springer社から刊行の予定である.和算を軸とした数学史の研究を深め,一方その理解を活かした授業実践のため研鑓を積み,歴史的視点を活かした文化としての新しい数学教育に向け一層の貢献を果たしたいと考えている.
コレステロール過酸化物を指標とした生体膜障害の分子機構とその法医学的応用

1.パラコート中毒パラコート中毒による膜脂質過酸化を調べるため、パラコート10mg/kgをラットの腹腔内に一回投与し、腎、肝、肺におけるコレステロール過酸化物(Ch-OOH)濃度の経時変化を調べた。投与2時間後において、腎では2倍、肝では1.5倍にCh-OOHが増加した。1日後、及び5日後においても腎では対照値の2倍に増加したままであった。パラコート中毒では間質性肺炎の他に尿細管壊死等の腎障害も併発し、死に至る。今日の投与量はごく少量であるにもかかわらず、腎のCh-OOHが2倍に増加していたことは腎障害発現のトリガーとなることを示唆している。2.アルコール性筋障害アルコール長期摂取により筋障害が60%の高率で起こる。組織学的に分析すると、骨格筋Type II fiberの選択的萎縮が認められる。アルコール投与ラットにおいて骨格筋の脂質過酸化を指標として筋障害を調べた。ラットに75mmol/kgのアルコールを1同腹腔内投与し、2.5時間及び24時間後にヒラメ筋(soleus, Type I fiber優位)と足底筋(plantaris, Type II fiber優位)を採取し、膜脂質のCh-OOHを定量した。アルコール投与24時間後に、ヒラメ筋足底筋において、7α-OOH、7β-OOHはともに30-40%の上昇が見られ、アルコール1回投与によっても骨格筋の脂質過酸化の亢進が見られた。一方、投与後の早い時期(2.5h)においては、足底筋では7α-OOH,7β-OOHともに上昇は見られたが、ヒラメ筋では変化が見られなかった。これはType II fiberが障害を受けやすいことを示唆するものである。3.一酸化炭素中毒CO中毒における遅発性脳損傷をコレステロール酸化物(oxysterol)を指標として脂質過酸化の視点から調べた。ラットにCO1005ppmを1.5時間吸入させ、一方hypoxia(低酸素障害)とCO中毒の間に脂質過酸化に差があり、CO中毒による脳障害がhypoxiaでは説明できなかった。7α-OOH、7β-OOHはパラコート投与前のラットの各組織から検出できた。パラコート投与2時間後において、腎では2倍、肝では1.5倍にCh-OOHが増加した。肝では1日後に対照値に戻っていた。肺ではいずれの時間においても変化が見られなかった。今回は、アルコール投与ラットにおいて骨格筋の脂質過酸化を指標として筋障害を調べた。

ラットに75mmol/kgのアルコールを1回腹腔内投与し、24時間後にヒラメ筋(soleus,Type I fiber優位)と足底筋(plantaris,Type II fiber優位)を採取し、膜脂質のCh-OOHを定量した。コントロールラットにおいて、足底筋中の7α-OOH、7β-OOHはともにヒラメ筋中の7α-OOH、7β-OOHよりも有意に高かった。それは、ヒラメ筋(Type I fiber優位の骨格筋)では、catalse,glutathione peroxidase,SDO等の消去系酵素の活性値が足底筋(Type II fiber優位)よりも高いためである。アルコール投与24時間後に、ヒラメ筋、足底筋において、7α-OOH、7β-OOHはともに30-40%の上昇が見られ、アルコール1回投与によっても骨格筋の脂質過酸化の亢進が見られた。1.アルコール性筋障害アルコール性長期摂取により骨格筋の障害が60%という高率で起こる。骨格筋Type II fiberの選択的萎縮が認められる。昨年アルコール1回投与24時間後に、骨格筋の脂質過酸化を調べたところ、コレステロール過酸化物(7α-OOH、7β-OOH)はともに上昇が見られた。今回、投与2.5時間後に調べたところ、足底筋(Type II fiber)では、7α-OOH、7β-OOHともに上昇が見られたが、ヒラメ筋(Type I fiber)では、変化が見られなかった。これはType II fiberが障害を受けやすいことを示唆するものである。2.一酸化炭素中毒CO中毒における遅発性脳損傷をコレステロール酸化物(oxysterol)を指標として脂質過酸化の視点から調べた。ラットにCO1005ppmを1.5時間吸入させ、一方hypoxia(低酸素障害)とCO中毒の間に脂質過酸化に差があり、CO中毒による脳障害がhypoxiaでは説明できなかった。3.セルロプラスミン欠損症患者の脳セルロプラスミン遺伝子のexon7の5-bpのinserionの異常が同定された患者の死後、脳の脂質を抽出し定量した。対照脳に比しoxysterolの蓄積を見出し、過剰鉄蓄積と脂質過酸化の亢進を見出し、過剰鉄蓄積と脂質過酸化の亢進を呈した。
植物プランクトンの細胞周期と毒性の発現に関する研究

本研究では、毒化機構の総合的な理解を目指すための基礎的研究として、(1)広島湾で分離された渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseについて、細胞周期のどの時期に毒が生産されているのか?(2)実際の海洋環境(広島湾)においても同様の現象が起こっており、群集全体の毒量の変化に影響しているのか?を明らかにすることを目的とした。まず、A.tamarense培養の同調化について検討した結果、A.fundyenseで成功している明暗法では同調化しないことがわかった。そこで、非同調培養系のまま培養条件を変えて、細胞周期と毒生産量の変化を調べた。その結果、光制限による増殖速度の低下と共にG1期の細胞の割合が増加し、細胞当たりの平均毒性値も高くなることがわかった。このことからA.fundyenseと同じくA.tamarenseにおいても、群集全体の増殖速度の低下は、G1もしくはG0期の時間が長くなることによって引き起こされ、その間に毒の生産が行われていることが示唆される。また、このことから増殖速度と細胞当たりの毒性値が逆相関の関係にあるというこれまでの観察結果を説明することができる。広島湾における野外観測の結果からA.tamarenseの細胞当たりの毒性値は、0.28224pg・cell^<-1>と大きく変動することがわかった。いくつかの環境要因を分析した結果、アンモニア態窒素濃度と有意な正の相関があることがわかった。アンモニアが、高い窒素含有率の貝毒成分を生合成するための供給源となると同時に、高濃度で藻類の増殖を抑制しG1期時間を延ばすことによって毒の生産を促進していると考えられる。これらの研究成果の一部は、平成11年度春季水産学会で発表し、2編の学術論文としてJournal of Plankton Researchに投稿中である。本年度の研究では、(1)有毒渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseの細胞周期の判別、(2)培養の同調化、(3)A.tamarenseの毒性の測定、について方法論の検討を行い、これらの手法を用いた培養実験を計画していた。(1)については、クロロフィル色素を抽出した後、RNaseAを含むPropidiumiodideで染色することによって判別に必要な染色像が得られることがわかった。染色後フローサイトメーターで分析したところ、G_1とG_2+M期およびその間のS期に由来すると思われる明瞭なサイトグラムが得られた。(2)については明暗法による同調化を試みたが、培養実験系の不備から未だ同調化を確認できていない。(3)については、粗抽出液を簡易カラムで部分精製することによって夾雑物の影響をあるていど回避し、有効な測定値を得られることがわかった。培養実験では、A.tamarenseをGPM培地を用い、水温15°C明暗周期12L/12Dで培養した。細胞濃度が約2000cells/mlに達したところで48時間暗条件にして、細胞周期の同調操作を行った。再び培養を開始し、2時間置きに48時間サブサンプルを採取した。フローサイトメーターによる解析の結果、ほとんどがG_1期の細胞で占められ(G_1:8590%、G_2+M:510%、S:27%)、明瞭な周期的変化は見られなかった。藻類細胞は、定常期に入るとG_1期の時間が長くなるかあるいはG_0期に入ることが報告されており、今回の実験でも開始時に細胞が定常期に入っていたと思われる。最終目標である細胞周期と毒産生の関係を見るためには、対数増殖期を維持しながらサブサンプルを採取できる実験系を構築することが必要と思われる。来年度、培養規模を大きくして実験開始時の細胞濃度を低くした実験系を使って解析を行う計画である。
自然界におけるロタウイルスの感染環の解明とその流行予測

A群ロタウイルスのP遺伝子型に特異的な抗体を検出しうるラテックス凝集試験法の開発を行った。その結果、ヒト由来ロタウイルスWa株のVP8蛋白質を抗原としたラテックス凝集試験では、ヒトの主な流行遺伝子型P[4]とP[8]ロタウイルスに対する抗体を特異的に検出できることが明らかとなった。同様に、サル由来のSA-11株を用いたラテックス凝集試験では、動物の一部で流行している遺伝子型P[2]とP[3]ロタウイルスに対する抗体を、ハト由来のPO-13株を用いたラテックス凝集試験では、トリの流行遺伝子型P[17]ロタウイルスに対する抗体を特異的に検出可能であった。自然界におけるA群ロタウイルスの感染動態を解明することを目的に、今回開発したラテックス凝集試験を用いて、人、家畜、愛玩動物及び野生動物に対する血清疫学調査を実施した。鳥類においてのみ流行していると考えられてきたトリロタウイルスが人を含む哺乳類にも感染していることから、本ウイルスが人獣共通感染症の病原体である可能性が示唆された。一方、各種動物で様々なロタウイルスの感染が起きていることが推測され、特にウシとイノシシにおいて既知あるいは未知のロタウイルスの感染が高頻度に起きていることが示唆された。このように血清疫学調査から未知のA群ロタウイルスの流行を推測できたことは、本感染症の制御のための貴重な方法論を含む情報を提案していると考えられる。また、本研究のために収集された野生動物の血清を用いて、日本脳炎に関する血清疫学調査を実施したところ、イノシシが日本脳炎ウイルスの増幅動物である可能性が明らかとなった。日本に養豚が導入される以前の本ウイルスの流行に、イノシシが大きく関わっていた可能性と同時に、今後の潜在的宿主となるリスクを指摘することができた。ロタウイルスPO-13株(トリ由来)、SA-11株(動物由来)およびWa株(ヒト由来)VP8蛋白質をグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合の形で大量に大腸菌で発現させ、精製した。この発現精製蛋白質が培養胞上のレセプターに特異的に結合することを確認した。続いて、各ウイルスの精製GST-VP8蛋白質をラテックス凝集試験に応用した(各Wa-、SA-、PO-LA試験)。秋田県のヒト100例、岐阜県のニホンザル87例および岐阜県のハト80例の血清を用いて、それぞれWa株、SA-11株及びPO-13株に対する中和試験とLA試験を行い、その結果を比較した。Wa、SA-11及びPO-13各株に対する免疫血清を用いて、交差LA試験を行ったところ、ホモの系ではWa-、SA-及びPO-LA抗体価がそれぞれ1024、256及び2048倍であったのに対して、ヘテロの系ではいずれも8倍未満となった。ヒト血清においてWa-LA試験と中和試験との結果の一致率は91.0%であった。両試験の抗体価の間には高い相関関係が認められた(r=0.817)。同様に、サル血清においてSA-LA試験と中和試験の結果の一致率は75.9であり、両抗体価の間には相関関係が認められた(r=0.672)。ハト血清においてPO-LA試験と中和試験の結果の一致率は80.0%であり、両抗体価間には比較的高い相関関係が認められた(r=0.794)。3つの異なるタイプのロタウイルスに対する抗体を特異的に検出するLA試験の開発に成功した。現在、様々なロタウイルス株に対する免疫血清を作製し、VP8蛋白質間の相同性の程度と交差LA反応の関係について検討を進めている。

異なるPタイプのロタウイルス10株に対する免疫血清を用意し、平成16年度に開発した3つの異なるPタイプのヒトロタウイルスWa株、サルロタウイルスSA11株およびトリロタウイルスPO-13株のVP8蛋白質を利用したラテックス凝集試験(それぞれWa-、SA-、PO-LA試験)の特異性と交差性について検討を進めた。その結果、VP8蛋白質のホモロジーが80%以上の組み合わせの場合、交差反応性があることが確認された。このことから、Wa-、SA-およびPO-LA試験により、それぞれヒトの主な流行遺伝子型P[4]とP[8]、動物の一部で流行している遺伝子型P[2]とP[3]、およびトリの流行遺伝子型P[17]のロタウイルスに対する抗体を特異的に検出できることが確認された。この3つのラテックス凝集試験を用いて、1975年から1992年にかけて収集されたヒト血清3131例についてロタウイルスに対する抗体調査を行った。これらのヒトの間では、Wa-LA抗体陽性率が85.8%と主にヒトロタウイルスの流行が起きていた。一方、PO-LA試験でも1.4%で抗体陽性例が見つかり、ヒトにおいてトリロタウイルスの感染も確認された。特に1985年にトリロタウイルスに対する抗体陽性率が7.5%と高い傾向があり、トリロタウイルスの小規模な流行が起きていた可能性が示された。これはトリロタウイルスが人獣共通感染症の病原体である可能性を世界で初めて示す結果となった。同様に、全国のウシ346例の各ロタウイルスに対する抗体を調べた結果、SA-LA試験で60.9%とウシでは動物ロタウイルスが中心となり感染環が形成されていた。しかし、ヒトおよびトリロタウイルスに対する抗体陽性率もそれぞれ46.6%、52.2%と高く、ウシでは種々のロタウイルスが複雑に感染している状況が推測された。平成16年度で確立された3つの異なるPタイプ(ヒトの主な流行遺伝子型P[4]とP[8]、動物の一部で流行している遺伝子型P[2]とP[3]、及びトリの流行遺伝子型P[17])のロタウイルスに対する抗体を特異的に検出することが可能なラテックス凝集試験(LA試験)を用いて、各種動物でのロタウイルスの感染状況を調査した。調査した動物は、ドブネズミ112、ヌートリア43、タヌキ39、イノシシ43、ニホンジカ60、ニホンザル87、カワウ90、イヌ101及びネコ63例である。その結果、ドブネズミ、ヌートリア及びカワウでは、いずれのLA試験でも07.1%と低い抗体陽性率であった。特にヌートリアでは、02.3%とほとんど今回調査したロタウイルスの感染が起きていないことが示された。また、名古屋の下水道に生息していたドブネズミではヒトロタウイルスに対する抗体陽性個体は、112例中わずか2例(1.8%)であった。前年度の調査からヒトでは高率なヒトロタウイルスの感染が確認されており、本ウイルスの感染には動物による感受性も重要な因子であることが示唆された。タヌキでは、トリ及び動物ロタウイルスの感染が比較的低頻度で起きていることが示された。イノシシ、ニホンジカ、ニホンザル、イヌ及びネコでは、動物ロタウイルスの感染が中心となり、トリ及びヒトロタウイルスの感染が加わる複雑な感染環の形成が示された。特にイノシシでは4977%の高い抗体陽性率となり、イノシシはロタウイルスの病原巣として重要である可能性が考えられた。そこで、今回収集した血清を用いて、別の重要な人獣共通感染症病原体である日本脳炎
慢性石灰化膵炎(膵石症)に対する経口膵石溶解療法の病態生理学的および臨床的研究

1.in vitro実験:DMOーH_2O,DMOーNaHCO_3,クエン酸ーH_2O,クエン酸ーNaHCO_3溶液(DMO,クエン酸濃度;07.7mM,[HCO_3^-];12.575mM),DMOー膵液,クエン酸ー膵液中にCaCO_3 0.2gを添加し,溶解度を検索した。CaCO_3の溶解度はDMO,クエン酸濃度には正の,[HCO_3^-]には負の関係が認められ,[HCO_3^+]が50mEq/l以上では頭打ち現象が認められた。両有機弱酸の非離型由来のH^+がCaCO_3の溶解過程に密接に関与していると考えられ,最終的にDMO・Ca^<++>,クエン酸・Ca^<++>のコンプレックスが形成されると推測される。膵液を溶媒とした時のCaCO_3の溶解パタ-ンはH_2O,NaHCO_3溶液を溶媒とした時と全く異なり,今後の検討が必要である。2.in vivo実験:慢性胃・膵瘻犬を用い,セクレチン刺激下で実験を行った。DMOの前駆物質であるTMOを0160mg/kg1日連続経口投与した場合,膵液中へのDMO排泄はTMO投与量,血漿DMO濃度,膵液[HCO_3^-],膵液pHに依存した。DMOの50200mg/kgを静注した場合,DMOは速やかに膵液中に排泄され,用量依存性に膵液重炭酸塩分泌を抑制し,200mg/kg投与では膵液水,Na分泌も抑制した。膵液中へのDMO排泄率はDMO投与量に関係なく2.32.6%とほぼ一定であった。3.臨床試験:膵石症25例にTMOを0.615g/日経口投与し膵石の消長を検索した。50%以上の膵石の縮小ないし減数を5例(20%),部分的溶解を9例(36%)に認めた。膵外分泌機能を検索しえた7例中3例において,TMO療法中に外分泌機能障害は正常に復した。膵性糖尿病12例(48%)中,7例では経口剤のみでコントロ-ル可能であった。一旦生成された膵石による膵実質の進行性破壊に対し,膵石の溶解消失や膵石の増大,増加を防止することは,病態生理学的にも臨床上も意義あることと考えられる。将来ESWLとの併用療法やビ系胆石の溶解療法に発展する可能性がある。2.in vivo

実験:慢性胃・膵瘻犬を用い、DMOの前駆物質であるTMOを0160mg/kg/日14日間連続経口投与し、翌日セクレチン刺激下で膵液および血液を採取した。1)DMOは血中ではTMOに対して用量依存性に増加し、膵液中にはTMO投与量、血漿DMO濃度、膵液重炭酸塩濃度および膵液pHに依存して排泄された。2)血中TMO濃度はDMOに比しきわめて低値であり、TMOの膵液中への排泄はnegligibleであった。3.臨床試験:ヘルシンキ宣言に則り、14例の膵石症患者(すべて外来患者)にTMOを0.61.5/日経口投与し、34カ月毎に腹部単純X線撮影およびCTscanを行った。一部の患者には膵外分泌機能検査、ほぼ全例に膵内分泌機能検査を施行した。1)24カ月以上の治療期間中、明らかな膵石の溶解は5例(36%)、溶解の可能性のあるもの5例であった。2)TMO療法の効果は治療前の膵手術の有無や膵内外分泌機能の程度とは無関係のように思われた。3)空腹時血糖は1例を除き満足すべきレベルであった。4)膵外分泌機能を追跡している7例中3例に本療法中に膵外分泌機能の改善が認められた。5)TMO非投与の対照群10例では、ほぼ同じ長さの観察期間中に膵石の自然消失や膵外分泌機能の改善を認めなかった。1.in vitro実験:予め採取したイヌ膵液を用いて、DMOの01,000μg/ml溶液を作製。膵液〔HCO_3^-〕はHCI添加により変化させた。溶液中にCaCO_30.2gを加え、既報のごとく濾液中のCa濃度、pHを測定した。CaCO_3の溶解度はDMO/NaHCO_3溶液の場合と同様に、種々の〔HCO_3^-〕膵液においても〔HCO_3^-〕に依存して低下したが、濾液中pHの変化はわずかであった。すなわちDMOによるCaCO_3の溶解はpHの低下も関与しているが、DMOの脱カルシウム作用によるCa^<++>(DMO^-)_2コンプレックスの形成に起因することが示唆された。2.in vivo実験:慢性胃・膵瘻犬を用い、DMOの前駆物質であるTMOを0160mg/kg/日、14日間連続経口投与。翌日セクレチン刺激下で膵液および血漿を経時的に採取。本年度新たに得られた結果は(1)膵液〔HCO_3^-〕は膵液DMO濃度に密接に依存して低下するが、膵液pHは有意の変動を示さなかった,(2)膵液DMOクリアランスなる新しい概念を提唱した。3.臨床試験:ヘルシンキ・東京宣言に則り、17例の膵石症患者にTMOを0.61.5g/日経口投与。34カ月毎に腹部単純X線撮影およびCTscanを行い、膵石の消長を検索した。一部の患者では、膵内外分泌機能を追跡した。TMOの療法中、24カ月以上治療群において明らかな膵石の溶解を5例(29.4%)、部分的溶解を7例(41.2%)に認めた。膵外分泌機能障害の改善は7例中3例に認められた。膵性糖尿液は8例(47.1%)に認められたが、うち5例は経口糖尿病薬のみでコントロ-ル可能であった。TMO療法開始前に膵体尾部切除を受けていた1例にのみ、本療法中にインスリン投与が必要になった。本例では、残存膵頭部の膵石はほぼ完全に溶解消失し、膵外分泌機能障害は高度であるにもかかわらず、少量のインスリン投与で糖尿病はよくコントロ-ルされている。本例を含め、TMO療法中の患者のquality of lifeは良好である。1.in vitro実験:DMOーNaHCO_3水溶液(〔DMO〕:7.7×10^<ー2>7.7mM,[HCO_3^ー]:12.575mM)中でのCaCO_3の溶解度は、DMOーH_2O溶液に比して低く,[HCO_3^ー]が高くなるにしたがってpHに対する直線性は消失し,頭打ちとなった。クエン酸ーH_2O溶液中でのCaCO_3の溶解度はDMOーH_2O溶液と同様であったが,クエン酸ーNaHCO_