hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
北太平洋東西亜寒帯循環の繋がりと深層水湧昇域の空間分布解析

本年度は研究期間の3年目の最終年にあたり、一昨年度導入した観測機器を利用した夏期の観測準備を行った。また、限られた観測時間の有効利用を図るため、1950m深まで観測可能なXCTD2プローブを購入し、CTD観測の充実を図った。夏期(6月下旬8月下旬)に行われた、北海道大学水産学部附属練習船おしょろ丸の北洋航海には、研究代表者が乗船し、海洋観測に携わった。海洋観測は、時間的制約の中で、アラスカンストリーム海域・亜寒帯海流海域を横断する観測断面を3断面に渡って行うことが出来た。観測結果から、3断面のうちアラスカンストリームの上流域にあたる西経165度と170.5度では流域幅は広いものの流量は少なく、経度180度では流域幅は狭いものの構造が深く、多くの西向き流量が求められた。この結果から、アラスカンストリームが流下方向に増大する傾向は過去の観測結果と一致し、深層水湧昇域の密度傾斜の形状が大きく空間的に変化する事が流速構造や流量の変化に繋がっていることが確かめられた。この結果を踏まえて、今後は東西循環を繋ぐ流量、外部との流入・流出量に着目し、ADCPデータや水塊分析データを基に解析結果をまとめる予定である。さらにArgoフロートデータ、衛星データや気象データとの対応も図り、本研究で得られた成果がよりグローバルな海洋環境の変化と密接に係わっている事を確かめ、長期にわたるアラスカンストリームのモニター観測を一層重要な物と位置づけて行きたいと考える。本年度の成果の一部は、2005年日本海洋学会春季大会シンポジウムで発表・報告した。これからも更なる成果を公表し、広く意見を求めて研究のまとめにつなげたい。本年度は研究期間の初年度にあたり、観測機器の充実を図るため、XBT・XCTD・XCTD2観測で併用可能なデジタルコンバーター・ランチャーを購入し、夏期の観測準備を行った。夏期(6月下旬8月下旬)に行われた、北海道大学水産学部附属練習船おしょろ丸の北洋航海には、研究代表者および、大学院生1名、学部学生1名が乗船し、観測及びその補助に携わった。海洋観測は、ほぼ当初の計画通り、アラスカンストリーム海域・亜寒帯海流海域を横断する観測断面を4断面に渡って行うことが出来た。観測結果から、4断面のうちアラスカンストリームの最も上流域にあたる西経165度では9.4Sv(1Sv=10^6m^3s^<-1>)、西経172度では7.OSv、西経176度では11.6Sv、経度180度では22.1Svの西向き流量がそれぞれ求められた。この結果から、東西亜寒帯循環の分岐点は西経165度から172度の間にあると予想され、アラスカンストリームの南側で東向する亜寒帯海流との海水交換も盛んであることが分かった。この結果を踏まえて、今後は東西循環を繋ぐ流量、外部との流入・流出量に着目し、ADCPデータや水塊分析データを基に解析を進める。さらに衛星データや気象データとの対応も図り、東西循環の繋がりと、循環流のコアとなる湧昇域の空間分に着目して解析を進める予定である。また来年度、再来年度にも同様の観測を行い、経年変動の実態を明らかにしたい。本年度の成果の一部は、2003年日本海洋学会秋季大会、ハワイ大学おしょろ丸シンポジウム、海洋研究所大槌シンポジウム等で発表・報告した。これからも更なる成果を公表し、広く意見を求めて今後の研究につなげたい。本年度は研究期間の2年目あたり、昨年度導入した観測機器を利用した夏期の観測準備を行った。海洋観測は、ほぼ当初の計画通り、アラスカンストリーム海域・亜寒帯海流海域を横断する観測断面を3断面に渡って行うことが出来た。観測結果から、3断面のうちアラスカンストリームの上流域にあたる西経165度と170.5度では10Sv前後(1Sv=10^6m^3s^<-1>)、経度180度では20Sv前後の西向き流量がそれぞれ求められた。この結果から、アラスカンストリームが流下方向に増大する傾向は過去の観測結果と一致した。また過去の観測結果とあわせて、アラスカンストリーム1Svが運ぶ熱・塩分輸送量は、流下方向に低温・高塩化することも確かめられた。さらに高温低塩分水の流出は、流速構造の変化に繋がり、表層沿岸よりに在った最大流速値が、湧昇域の急峻化によって、流域中央部の亜表層に遷移する事も確かめられた。さらにArgoフロートデータ、衛星データや気象データとの対応も図り、東西循環の繋がりと、循環流のコアとなる湧昇域の空間分布に着目して解析を進める予定である。また来年度にも同様の観測を行い、経年変動の実態を明らかにしたい。本年度の成果の一部は、2004年日本海洋学会秋季大会、海洋研究所大槌シンポジウム等で発表・報告した。

これからも更なる成果を公表し、広く意見を求めて今後の研究につなげたい。本年度は研究期間の3年目の最終年にあたり、一昨年度導入した観測機器を利用した夏期の観測準備を行った。また、限られた観測時間の有効利用を図るため、1950m深まで観測可能なXCTD2プローブを購入し、CTD観測の充実を図った。夏期(6月下旬8月下旬)に行われた、北海道大学水産学部附属練習船おしょろ丸の北洋航海には、研究代表者が乗船し、海洋観測に携わった。海洋観測は、時間的制約の中で、アラスカンストリーム海域・亜寒帯海流海域を横断する観測断面を3断面に渡って行うことが出来た。観測結果から、3断面のうちアラスカンストリームの上流域にあたる西経165度と170.5度では流域幅は広いものの流量は少なく、経度180度では流域幅は狭いものの構造が深く、多くの西向き流量が求められた。この結果から、アラスカンストリームが流下方向に増大する傾向は過去の観測結果と一致し、深層水湧昇域の密度傾斜の形状が大きく空間的に変化する事が流速構造や流量の変化に繋がっていることが確かめられた。この結果を踏まえて、今後は東西循環を繋ぐ流量、外部との流入・流出量に着目し、ADCPデータや水塊分析データを基に解析結果をまとめる予定である。さらにArgoフロートデータ、衛星データや気象データとの対応も図り、本研究で得られた成果がよりグローバルな海洋環境の変化と密接に係わっている事を確かめ、長期にわたるアラスカンストリームのモニター観測を一層重要な物と位置づけて行きたいと考える。本年度の成果の一部は、2005年日本海洋学会春季大会シンポジウムで発表・報告した。これからも更なる成果を公表し、広く意見を求めて研究のまとめにつなげたい。
正規del Pezzo曲面上の直線の配置

正規del Pezzo曲面上X(即ち,反標準因子-K_XがampleであるようなC上の正規ゴレンスタイン射影曲面)は次数d:=K^2_X【.1toreq.】6であればX上の直線L(即ち,(K_X・L)=-1となる有理曲線)は有限個でありその個体は固定したdに対して一意的に定まらず,その時のXの特異点(実は,有理二重点しか持たない)のタイプによって変わる.Xの非特異モデルをMとすると,MはP^2からalmost general positionにあるs(3【.1toreq.】s【.1toreq.】8)個の点をブロ-・アップする事によって得られる射影代数曲面である.この時,X上の直線LのM上の第一種例外曲線との間には一対一の対応があるので特異点を解消したM上で考える.今,Xd,Mdをそれぞれ代数d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】の正規del Pezzo曲面及びその非得意モデルとし,l_dにてM_d上の第一種例外曲線の個数とする.本研究では特別な場合として,各d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)に対してl_d=1の場合を考察した.得られた結果は次の通りである.(1)d=1の時,X_1はE_8型の有理二重点を唯一もつ。(2)d=2の時,X_2はE_7型の有理二重点を唯一もつ。(3)d=3の時,X_3はE_6型の有理二重点を唯一もつ。(4)d=4の時,X_4はD_5型の有理二重点を唯一もつ。(5)d=5の時,X_5はA_4型の有理二重点を唯一もつ。(6)d=6の時,X_6はA_1型及びA_2型の有理二重点を丁度二個もつ.(B).上述のX_d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)は全て第二ベッチ数b_2=1をもつC^2のコンパクト化であり,逆に,第二ベッチ数b_2=1をもつ正規del Pezzo曲面上でC^2のコンパクト化であるものは上述のX_d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)に限る.これらの結果は現在論文として準備中である.正規del Pezzo曲面上X(即ち,反標準因子-K_XがampleであるようなC上の正規ゴレンスタイン射影曲面)は次数d:=K^2_X【.1toreq.】6であればX上の直線L(即ち,(K_X・L)=-1となる有理曲線)は有限個でありその個体は固定したdに対して一意的に定まらず,その時のXの特異点(実は,有理二重点しか持たない)のタイプによって変わる.Xの非特異モデルをMとすると,MはP^2からalmost general positionにあるs(3【.1toreq.】s【.1toreq.】8)個の点をブロ-・アップする事によって得られる射影代数曲面である.この時,X上の直線LのM上の第一種例外曲線との間には一対一の対応があるので特異点を解消したM上で考える.今,Xd,Mdをそれぞれ代数d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】の正規del Pezzo曲面及びその非得意モデルとし,l_dにてM_d上の第一種例外曲線の個数とする.本研究では特別な場合として,各d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)に対してl_d=1の場合を考察した.得られた結果は次の通りである.(1)d=1の時,X_1はE_8型の有理二重点を唯一もつ。(6)d=6の時,X_6はA_1型及びA_2型の有理二重点を丁度二個もつ.(B).上述のX_d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)は全て第二ベッチ数b_2=1をもつC^2のコンパクト化であり,逆に,第二ベッチ数b_2=1をもつ正規del Pezzo曲面上でC^2のコンパクト化であるものは上述のX_d(1【.1toreq.】d【.1toreq.】6)に限る.これらの結果は現在論文として準備中である.
情報制御による競合学習の実現とその言語習得過程への応用

本研究では、人間の知能を模倣する新しい計算モデルを提案し、実際に言語習得過程のシミュレーションに応用しながらモデルの妥当性を探求した。最終的には、新しい知能、思考、認知の新しいパラダイムを創造することを目指して、研究を行なった。平成15年度は、新たにコストの概念を導入し、教師なし学習から教師有り学習へと拡張する試みをおこなった。また、教師指導学習法と情報量最大化と最小化の融合をより容易にする方法を提案した。まず、新たに情報量のコストという概念を導入した。コストは、コネクションと入力パターンの間の差として定義し、このコストを小さくしながら、情報量を最大化していく方法を考案した。このコストの導入によって、より入力パターンを忠実に反映することが可能となった。次に、教師有り学習への拡張である。情報量最大化法は、基本的には、教師なし学習法であり、教師情報を考慮することができない。そこで、多層型ネットワークを用い、誤差を最小化する層を追加することによって教師情報を扱うことができるような工夫を行なった。この方法は、radial-basis functionネットワークとかなり類似しており、radial-basis functionネットワークの拡張と考えることができる。第3に、教師指導学習法(Teacher-directed learning)の改善である。この方法は、誤差伝播を用いない新しい教師付き学習である。この方法では、訓練パターンと教師パターンについての情報量が最大化される。これまで、シグモイド関数を活性化関数として用いてきた。しかし、問題によっては、情報量最大化が不可能な場合が存在した。この問題を、ガウス関数を用いることによって、解決した。本研究では、人間の知能を模倣する新しい計算モデルを提案し、実際に言語習得過程のシミュレーションに応用しながらモデルの妥当性を探求していく。最終的には、新しい知能、思考、認知の新しいパラダイムを創造することを目指している。研究は、大きく計算モデルの設計と言語習得への応用研究とに分かれる。計算モデルの研究では、情報論的競合学習法の提案をおこなった。新しい情報論的競合学習は次の三つの特徴があることが確かめられた。まず第1に、ニューロンの競合は、ニューロンを直接制御することによって実現できる。従来の方法のように入力パターンを近似する必要はない。したがって、入力パターンの細かな差異に左右されることのない特徴抽出ができた。第2に、競合は情報量最大化法によって実現される。この、情報量最大化は、これまでの情報論的学習法と比べて、単純でかつ強力であることがわかった。また、これまでのニューラルネットワークに簡単に組み込むことができることを確かめた。第3に、この方法は、自己組織化のプロセスでの競合と協調を柔軟に制御できることがわかった。Kohonenの自己組織化マップと同様な形で、学習結果を空間上に配置する方法も簡単に情報論的競合学習を用いると実現できた。言語習得への応用では、日本語の授受動詞の習得をシミュレートした。新しい情報モデルが基本的な授受動詞の適切な区別をおこなうことができることを確かめた。ニューラルネットワークの学習を情報理論の立場から記述する研究をおこなった。研究では、学習は情報量最大化原理によって記述できると考えている。特に競合学習の過程を情報量最大化を用いて記述する研究を行なった。次の5つの新しい方法を提案した。外部の情報を最大化しながら成長しつづけるネットワークのモデルを提案し、言語習得、アンケート調査等に応用した。情報量を最大化する方法と協調する方法を組み合わせ自己組織化マップを生成する方法を提案した。情報量最大化を多層ネットワークへ応用した。このネットワークでは、どの層においても情報最大化が行なわれると仮定した。誤差伝播を用いない新しい教師付き学習を提案した。情報量を最大化するのと同様に最小化も行なえる方法を提案した。

これらの新しい方法を用いて、人間の思考、言語等を解明する研究を行なった。ニューラルネットワークの学習を情報理論の立場から記述する研究をおこなった。研究では、学習は情報量最大化原理によって記述できると考えている。特に競合学習の過程を情報量最大化を用いて記述する研究を行なった。次の5つの新しい方法を提案した。外部の情報を最大化しながら成長しつづけるネットワークのモデルを提案し、言語習得、アンケート調査等に応用した。情報量を最大化する方法と協調する方法を組み合わせ自己組織化マップを生成する方法を提案した。情報量最大化を多層ネットワークへ応用した。このネットワークでは、どの層においても情報最大化が行なわれると仮定した。誤差伝播を用いない新しい教師付き学習を提案した。この方法では、訓練パターンと教師パターンについての情報量が最大化される。情報量を最大化するのと同様に最小化も行なえる方法を提案した。
CAST/ELKSの機能制御から捉える網膜シナプスのスクラップアンドビルド

本年度も引き続き、リバイスのための追加実験を行った。具体的には、条件付きダブルノックアウトマウスで見出された視細胞死がアポトーシスによるものであることをTUNEL法によって形態学的に明らかにした。さらに、網膜特異的にGCaMPを発現させるためのAAVベクター構築を進め、光応答による双極細胞の活性化をモニターできる系の確立を行い、LED刺激によって網膜細胞の応答の検出に成功した。一方、この光刺激がどの程度生体内の現象を反映しているかについては、引き続き条件検討が必要と思われた。また、ドイツマックスプランク研究所のTobias Moser博士との共同研究で、パッチクランプ法を用いてプレシナプスのカルシウムチャネルに着目した解析を継続し、CAST/ELKSダブルノックアウトマウス網膜ではカルシウムチャネルの機能が大きく阻害されていることを見出した。この成果は、Calyx of heldシナプスにおけるデータと高い相関性があり、CAST/ELKSがカルシウムチャネルと相互作用して、神経伝達物質の放出を制御しているという一般原理の提唱につながった。また、将来的に網膜視細胞から双極細胞への神経伝達を直接モニターするために、双極細胞特異的に膜電位センサーを発現させるベクター開発を開始した。さらに、網膜における異所性のシナプス形成のスクラップアンドビルドの解明のために、特にリン酸化シグナル伝達に着目した。具体的には、AMPKファミリーのマスターリン酸化酵素・LKB1がこの異所性シナプス形成を制御していることを確かめるとともに、CAST/ELKSのそれぞれのリン酸化部位(セリン残基)をアラニン残基に置換した変異マウスの交配・繁殖を進めた。これら変異マウスとLKB1変異マウスを交配させLKB1シグナル系とCAST/ELKSのリン酸化についての関連について今後予備データを得る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アクティブゾーンタンパク質CASTおよびELKSは網膜のリボンシナプスにも発現・局在する。リボンシナプスは、網膜シナプスの特徴的なアクティブゾーンであり、網膜視細胞からの神経伝達物質の放出を時空間的に厳密に制御している。そこで、本研究では、網膜神経伝達におけるCAST/ELKSファミリーの役割、特にリボンシナプスの形成、維持、破綻(スクラップ&ビルド)における役割の解明を目的とする。前年度までの研究過程で、CAST/ELKSダブルノックアウトマウスの網膜解析のデータをまとめ論文投稿を行った。そこでは、通常のダブルノックアウトに加え、生後発達の段階でELKSが欠損してダブルノックアウトになる条件付きノックアウトマウスの網膜解析も進めていた。本年度は、投稿論文がリバイスとなったため、コメントに対応する追加実験を主に行った。具体的には、条件付きダブルノックアウトマウスで見出された視細胞死がどのようなメカニズムで引き起こされるのかを明らかにする目的で、TUNEL法を用いた形態学的解析を進めた。さらに、網膜特異的にGCaMPを発現させるためのAAVベクター構築を進め、光応答による双極細胞の活性化をモニターできる系の確立を試みた。具体的には、双極細胞に特異的に発現させるためのプロモーターの選定を進めるとともに、共焦点レーザー顕微鏡にLED刺激が可能となる簡便な装置開発を行った。さらに、網膜視細胞からの神経伝達物質の放出異常について、パッチクランプ法を用いてプレシナプスのカルシウムチャネルに着目した解析を進めた。TUNEL法による解析から、生後発達の過程でCAST/ELKSダブルノックアウトになるマウスの網膜では、野生型に比べて顕著にTUNELシグナルの増加が見られた。このことから、この視細胞の細胞死はアポトーシスによる細胞死であることが示唆された。次に、双極細胞特異的に発現させるためのプロモーターに関しては、先行研究において、グルタミン酸受容体であるmGluR6のプロモーター領域が適しているとの報告があったので、本プロモーター(エンハンサーIn4s-In3を加えて一部改変)とGCaMP6fをつなげたAAVベクター構築を行った(AAV-In4s-In3-mGluR6-GCaMP6f))。予備的な発現実験では、網膜双極細胞において十分な発現がみられた。さらに、パッチクランプ実験については、CASTノックアウトおよびCAST/ELKSダブルノックアウトの視細胞(杆体細胞)において、カルシウムチャネルによる電流密度が顕著に低下することを見出した。以上の成果から、本研究は概ね順調に進展していると判断した。

さらに、網膜における異所性のシナプス形成のスクラップアンドビルドの解明のために、特にリン酸化シグナル伝達に着目した。具体的には、AMPKファミリーのマスターリン酸化酵素・LKB1がこの異所性シナプス形成を制御していることを確かめるとともに、CAST/ELKSのそれぞれのリン酸化部位(セリン残基)をアラニン残基に置換した変異マウスの交配・繁殖を進めた。これら変異マウスとLKB1変異マウスを交配させLKB1シグナル系とCAST/ELKSのリン酸化についての関連について今後予備データを得る。CAST/ELKSダブルノックアウトマウスの網膜では、異所性のシナプス形成に加えて、グリア細胞の顕著な活性化が見られており(未発表データ)、グリア細胞の役割についても解析を進める予定である。GCaMP6のウイルスついては、十分なタイターが得られており、LED刺激強度の条件検討が済み次第、当該ウイルスを網膜双極細胞に発現させ、光刺激時におけるカルシウムシグナルの増減を測定し、定量化する。CAST/ELKSダブルノックアウトマウス網膜の表現型は、難病である網膜黄斑変性症の特徴とも類似しており、モデルマウスとしての確立を目指し、より詳細な細胞・組織レベルの解析をすすめる。具体例の一つとして、遺伝性の網膜黄斑変性症の原因遺伝子が幾つか知られており、これらの遺伝子産物とCAST/ELKSとの相互作用を生化学的に解析する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
Notch1遺伝子を介した胃上皮細胞老化機構逸脱による新たな胃癌発癌機序の解明

Helicobacter pylori (H.pylori)感染によって、加齢とともに胃粘膜萎縮が進展し分化型胃癌が生じる。幹細胞の分化維持を担う細胞膜受容体Notch1レセプターは胃癌発癌にも関与していることが報告されている。本研究の胃癌培養細胞株を用いた検討によって、Notch1レセプターは胃癌細胞においてエピジェネティックな変化で抑制を受けており、その発現が回復すると癌抑制遺伝子p53の発現を介して細胞老化が誘導され、造腫瘍能が抑制を受けることが示唆された。Helicobacter pylori(H.pylori)感染あるいは老化によって固有胃腺が減少し胃粘膜萎縮が進展し分化型胃癌が発症すると考えられているが、その分子生物学的発癌機構を解明することを目的としている。細胞分化および老化の両面で作用しているNotch1遺伝子に着目して本年度より研究を進めている。Notch1レセプター(NFL)を強制発現する安定細胞株は、マウス胃上皮培養細胞株を用いて作製中である。また、H.pylori長期感染マウス胃粘膜萎縮モデルを作製したが、壁細胞に対する免疫組織化学検討で壁細胞数の有意な減少や、proton pumpの発現の有意な低下を認めて、胃粘膜萎縮が生じていることが確認できた。このモデルにおいてNotch1遺伝子の発現も有意な低下を認めているため、UCSC Genome BrowserでNotch1遺伝子のCpGアイランドを検索したところ、exon1を中心に2491bpのCpGアイランドが存在することを確認できた。このため、次にマウス胃上皮培養細胞株を用いて脱メチル化剤5-AZA存在下で、Notch1遺伝子の発現を定量PCRで検討したところ、5-AZA添加でH.pyloriによるNotch1発現抑制は軽減された。つまり、H.pylori感染胃粘膜上皮においては、DNAのエピジェネティックな変化がNotch1レセプターの発現に関与していることが示唆された。H.pylori長期感染マウス胃粘膜萎縮モデルを作製し胃粘膜萎縮が生じ、Notch1遺伝子の発現抑制が関与していることが示唆された。H.pylori感染によるNotch1遺伝子の発現抑制には、脱DNAメチル化剤を用いた検討からDNAのエピジェネティックな変化が関与していることが類推できた。胃粘膜においてはHelicobacter pylori(H.pylori)感染によって固有胃腺が減少し、胃癌の発生母地となる胃粘膜萎縮と腸上皮化生が進展することが知られているが、その分子生物学的機序は近年、本研究者の研究も含め明らかとなってきている。また、膜貫通型受容体であるNotch1遺伝子は、細胞分化および老化を制御し、さらに癌幹細胞の観点から胃発癌に関与していることを明らかにしている。このため、本研究ではNotch1遺伝子による老化制御機構逸脱による発癌機構の解明を目的としている。本年度までに、作成したH.pylori長期感染マウス胃粘膜萎縮モデルでは、壁細胞数の有意な減少と、mRNAレベルでのプロトンポンプの発現の有意な低下を認め、胃粘膜萎縮(老化)が生じていることを明らかにしている。そして同様にNotch1遺伝子の発現が低下していることが判明したため、DNAメチル化に着目した。Notch1遺伝子にはpromoterからexon1までの領域2491bpのCpGアイランドが存在することを確認した後、マウス胃上皮培養細胞株GSM06を用いて脱メチル化剤5-Aza存在下で、Notch1遺伝子の発現を定量PCRで検討したところ、H.pyloriによるNotch1発現が回復し、さらにBisulfate Sequencingで検討したところ、CpGアイランドの一部がDNAメチル化を受けていることが判明した。このため、DNAのエピジェネティックな変化がNotch1レセプターの発現に関与していることが示唆された。H.pylroi長期感染マウス胃粘膜組織や胃上皮培養細胞を用いた検討より、DNAメチル化によってNotch1遺伝子発現が抑制を受け、その結果、胃粘膜萎縮といった老化に関与していることが示唆された。固有胃腺においてはHelicobacter pylori (H.pylori)感染によって加齢とともに進む壁細胞や主細胞数の減少が加速され、胃癌の発生母地となる胃粘膜萎縮と腸上皮化生が進展すると考えられている。また、膜貫通型受容体であるNotch1遺伝子は胃の分化維持や発癌にも関与していることが知られており、本研究者も癌幹細胞の観点から胃発癌に関与していることを明らかにしている。このため、本研究ではNotch1遺伝子による老化制御機構逸脱による発癌機構の解明を目的とした。H.pylori長期感染マウス胃粘膜萎縮モデルではNotch1発現が抑制を受けていることを明らかにしているため、その機序としてepigeneticな発現調整機構であるDNAメチル化に着目した。Notch1promoterからexon1までの2491bpの領域にCpGアイランドが存在することを同定した後、胃癌培養細胞株AGSに対して脱メチル化剤5-Aza-dcを添加し定量PCRで検討したところ、Notch1発現は2.4倍程度まで回復した。さらに本年度は、既にADAM17阻害剤Marimastat添加によりNotch1レセプターが発現維持されることをFACSと蛍光免疫染色で確認しているAGS細胞を用いて検討した。50μMMarimastat存在下では、マトリゲル内でのコロニー形成数の低下を認めた。また、Marimastat存在下ではAGS細胞において濃度依存性にp53の発現誘導を確認した。

p53は細胞老化を誘導することが知られており、Notch1レセプターが維持されるとp53が発現し細胞老化が誘導されることが示唆された。つまり、H.pylori感染によってepigeneticな変化を受けNotch1レセプターの発現が維持できなくなると、p53の発現が低下し細胞老化から逸脱し発癌に結びつくことが類推された。Helicobacter pylori (H.pylori)感染によって、加齢とともに胃粘膜萎縮が進展し分化型胃癌が生じる。幹細胞の分化維持を担う細胞膜受容体Notch1レセプターは胃癌発癌にも関与していることが報告されている。本研究の胃癌培養細胞株を用いた検討によって、Notch1レセプターは胃癌細胞においてエピジェネティックな変化で抑制を受けており、その発現が回復すると癌抑制遺伝子p53の発現を介して細胞老化が誘導され、造腫瘍能が抑制を受けることが示唆された。Notch1が胃粘膜萎縮に関与していることが示唆されているため、Notch1レセプター発現マウス胃上皮細胞株の樹立を進め、細胞老化マーカーp53、p21、p16、CDK2、CDK4/6等の変動をwestern blotを用いて検討する。一方、作製したH.pylori長期感染マウス胃粘膜萎縮モデルにおいては、Notch1のDNAメチル化が生じているかBisulfate Sequencing等を用いて検討を進める。Notch1発現抑制が胃粘膜萎縮という老化減少に関与していることが示唆されたため、Notch1レセプター強制発現マウス胃上皮細胞株を用いて、細胞老化マーカーとなりうるp53、p21、p16、CDK2の制御状態をwestern blotやsiRNAを用いて把握する。消化器内科学Notch1レセプター発現を制御したマウス胃上皮培養細胞株を用いたin vitroでの細胞老化現象の検討を、次年度を行うことにしたため。現在までの研究成果を考慮・確認するためにH.pylroi長期感染マウス胃粘膜組織やマウス胃上皮細胞株における老化程度とDNAメチル化状態を次年度に行うことになった。細胞老化を、形態学的な細胞膨化状態やFACSを用いた細胞周期状態を検討・確認するための一部として使用予定である
癌進展及び創傷治癒における脾臓由来マクロファージを用いた革新的治療法の開発

創傷治癒における脾臓マクロファージの役割を明らかにする目的で、マウス皮膚欠損モデルを作成し、FACScanにて創傷治癒に関連があるとされたマクロファージであるLy6Cの単球を採取、分離することが可能となった。皮膚欠損モデルに脾臓摘出を併設したが、創の縮小には脾摘群とコントロール群では明らかな差はなかった。肝癌に対する肝切除成績は、肝切除と脾臓摘出を同時に行った症例では脾腫のない症例と同等の生存率、無再発生存率で、脾摘により改善していた。免疫抑制性の環境を作り出している脾臓を摘出することで肝癌に対する免疫応答が改善した可能性がある。現在、C57BL/6マウスを用いて皮膚切開モデル(1.5cm長)、皮膚欠損創傷治癒モデル(1.5cmの皮膚欠損)を作成し、創傷治癒モデルを確立した。創傷治癒の評価項目として創耐張力、欠損面積、治癒日数、病理を損傷1、3、5、7日、14日、28日と経時的に観察することで、客観的な評価モデルが確立した。このモデルに脾臓摘出(同時、異時性)、及び破砕脾臓の腹腔内移植モデル、および標的となるマクロファージを再注入した群を作成し、創傷治癒力を比較検討する予定である。脾臓摘出マウスは安定的に作成することができるようになった。脾臓の破砕腹腔内散布は評価が困難であったため、現在、後腹膜への脾臓の移植を検討し、施行している。一方、FACScanを用いて標的のマクロファージであるLy6C陽性/陰性の単球を採取、分離することに成功した。創部の治癒過程の病理組織標本を作成し、FKN、TGFβの免疫組織化学染色を行う。末梢血、骨髄、創傷局所へのLy6C陽性単球の浸潤も合わせて比較検討する。最終的には脾臓Ly6C陽性細胞を増殖させて、治癒力の促進を図ることを最終目標としている。a創傷治癒に関する研究はマウス皮膚欠損モデルを作成した。一方、FACScanを用いて創傷治癒に関連があると報告されたマクロファージであるLy6C陽性の単球を採取、分離することが可能になった。皮膚欠損モデルに脾摘を同時に行ったが、創部の縮小には脾摘群とコントロール群に明らかな差はなかった。そこで今後、単離したLy6C陽性細胞を培養し、腹腔内注入することで創傷治癒への影響を検討する。一方、肝細胞癌の肝切除例の検討で、CTにおける脾臓容積の300ml以上の脾腫合併症例では300ml未満の症例に比べて有意に予後不良であった。肝細胞癌の無再発生存率も300ml以上症例では有意に不良であった。多変量解析でも脾臓容積は独立した予後因子であった。,肝切除と同時に脾摘を行った症例では生存率、無再発生存率ともに脾臓容積300ml未満症例と同等に改善していた(論文投稿準備中)。脾臓を摘出することで、なぜ無再発生存を含めた長期予後が改善するのであろうか。われわれは脾摘の肝機能改善効果を報告してきた。生存率をみると術後早期からの再発、生存に差がみられる。もし肝機能の改善効果を介した作用であれば術後早期ではなく術後晩期の生存や再発に差がみられることが多い。したがって、脾摘によって抗腫瘍免疫が活性化されていると推察する。われわれはC型肝硬変の症例において脾摘後に末梢血におけるPD-1陽性のCD4 T細胞が減少し、免疫賦活になっている可能性を報告した。したがって、肝硬変における脾腫は免疫抑制に作用している可能性があり、脾摘はこの免疫抑制を改善している可能性がある。これらを肝癌切除群における脾摘の有無による免疫系の評価を行い、その機序を解明し肝癌切除における新たな治療戦略を構築したい。創傷治癒に関する研究ではマウス皮膚欠損モデルを作成し、FACScanにて創傷治癒に関連があるとされたマクロファージであるLy6Cの単球を採取、分離することが可能となった。皮膚欠損モデルに脾臓摘出を併施したが、創の縮小には脾摘群とコントロール群では明らかな差はなかった。単離したLy6C陽性細胞の腹腔内注入でも明らかな差は認められなかった。一方、肝細胞癌に対する肝切除成績の検討で、CTにおける脾臓容積300ml以上を脾腫と定義した。脾容積300ml未満の症例に比べて、術後の生存率、無再発生存率ともに脾腫合併症例では有意に不良であった。多変量解析でも脾臓容積300ml以上は有意な予後不良因子であった。肝切除と脾臓摘出を同時に行った症例では脾臓容積300ml未満の症例と同等の生存率、肝細胞癌の無再発生存率であり、癌の再発を含めて長期予後は脾摘により改善していた(論文投稿中)。以前、C型肝硬変症例で摘出された脾臓の組織では免疫抑制性のCD4陽性のregulatoryTcellやPD-L1, L2陽性細胞が増加していることを報告した。さらに脾臓を摘出後は末梢血中のPD-1陽性の細胞が減少していることを見出した。

このような免疫抑制性の環境を作り出している脾臓を摘出することで肝癌に対する免疫応答が改善し、予後が改善した可能性を仮説として今後とも研究をすすめていく予定である。創傷治癒における脾臓マクロファージの役割を明らかにする目的で、マウス皮膚欠損モデルを作成し、FACScanにて創傷治癒に関連があるとされたマクロファージであるLy6Cの単球を採取、分離することが可能となった。皮膚欠損モデルに脾臓摘出を併設したが、創の縮小には脾摘群とコントロール群では明らかな差はなかった。肝癌に対する肝切除成績は、肝切除と脾臓摘出を同時に行った症例では脾腫のない症例と同等の生存率、無再発生存率で、脾摘により改善していた。免疫抑制性の環境を作り出している脾臓を摘出することで肝癌に対する免疫応答が改善した可能性がある。a創傷治癒に関しては脾臓摘出の影響が明らかでなかったためモデルの再検討を含め、新たな検討を行うために研究がやや遅れた。脾腫の肝癌切除後の検討に関しては全く明らかな現象であり、脾摘によってそれらが改善することを見出したことは臨床的にも意義が大きい。現時点のデータで論文化することと、今後の基礎的研究に発展させたい。肝臓外科学a創傷治癒に関しては脾臓摘出の影響が明らかでなかったためモデルの再検討を行う。現時点のデータで論文化することと、臨床におけるHCCに対するCTL活性などの評価を含め、今後の基礎的研究に発展させたい。創傷治癒モデルの作成に時間を要した。また、その他の項目の検討は進んでいる。脾臓の移植モデルを完成させる必要がある。モデルが完成すれば脾臓のマクロファージのマーカーによる同定、採取は可能となっており、実験は飛躍的に進行する。創傷治癒モデルの作成に時間を要したために当該年度にて使用できなった。当初予定していた分析の実験を次年度行う為に必要な試薬を次年度繰越額165,636円で購入する。
劣通信環境における攻撃耐性を備えた高信頼通信システムの構築

近年,劣通信環境における通信技術の研究が盛んに行われているが,既存技術の多くはすべてのノードが善意的・協力的であることを前提として研究開発されてきている.しかし,実際にはネットワークをこわす攻撃が仕掛けられる恐れがあり,劣通信環境下の通信技術は攻撃に極めて脆弱である.脆弱性を解消するためにインターネットにおけるセキュリティ技術を用いれば良いようにおもえるが,ノードの密度が疎な劣通信環境下では,つねに接続できるサーバや認証局がないため,その適用は困難である.よって,信頼度の高い情報収集を行うには,劣通信環境下に適したセキュリティ対策の確立が必要不可欠である.そこで,本研究では,劣通信環境で発生する特有の攻撃を複数想定し,それらの対策を提案することで,実用に耐え得る高信頼・高セキュアな通信システムの確立を目指し研究を進めている.平成30年度は,主に,二つの攻撃(フラッディング攻撃,フェイクメッセージ攻撃)に着目し,それらの攻撃の振る舞いの解析,および,その対策法について検討を進めた.フラッディング攻撃では,攻撃端末が無用なデータを過剰に生成し,ネットワーク資源の枯渇を引き起こす.一方,フェイクメッセージ攻撃では,攻撃端末がデータを受信するとそのメッセージを偽のメッセージに置き換えを行う攻撃である.これらの攻撃の振る舞いをマルコフ解析によって明らかにした.さらに,理論解析の結果に基づき,フラッディング攻撃とフェイクメッセージ攻撃の対策法をそれぞれ提案した.計算機シミュレーション実験によって,提案した対策法の性能評価を行い,その有効性を示した.さらに,前年度に検討を進めたアンチパケット攻撃の対策法の研究成果をまとめ,論文誌に投稿中である.研究計画通りにおおむね順調に進んでおり,研究成果を論文誌や国内研究会で発表できている.さらに,当初計画で想定していたフラディング攻撃の対策法に加え,フェイクメッセージ攻撃の対策法についても検討できており,順調に進んでいる.平成30年度はおおむね順調に研究を進められたため,引き続き研究計画に沿って進めていく.平成30年度に提案したフラッディング攻撃や,フェイクメッセージ攻撃の対策法を改良し,国際会議や研究会でその成果を発表する予定である.近年,大規模災害の発生時など通信インフラのない劣通信環境における通信技術の研究が盛んに行われている.既存技術はすべてのノードが協力的であることを前提として研究開発されてきたが,実際にはネットワークをこわす攻撃が仕掛けられる恐れがあり,劣通信環境下の通信技術は攻撃に極めて脆弱である.脆弱性を解消するためにインターネットにおけるセキュリティ技術を用いれば良いようにおもえるが,ノードの密度が疎な劣通信環境下では,つねに接続できるサーバや認証局がないため,その適用は困難である.よって,信頼度の高い情報収集を行うには,劣通信環境下に適したセキュリティ対策の確立が必要不可欠である.また,劣通信環境下の通信技術は期待されているものの,実用化がほとんど進んでおらず,脆弱性の解消なくして,その実用化は困難である.そこで,本研究では,劣通信環境で発生する特有の攻撃を複数想定し,それらの対策を提案することで,実用に耐え得る高信頼・高セキュアな通信システムの確立を目指している.平成29年度は劣通信環境特有の攻撃の一つであるアンチパケット偽造攻撃に着目し,その攻撃の振る舞いを理論解析によって明らかにした.理論解析の結果に基づき,アンチパケット偽造攻撃の対策法として,攻撃を仕掛けているノードを特定する方法を考案した.計算機シミュレーション実験によって,考案した対策法の性能評価を行い,その有効性を示した.さらに,当初計画では,平成30年度に予定していたフラッディング攻撃の理論解析についても着手し,フラッディング攻撃の振る舞いを明らかにした.研究計画通りにおおむね順調に進んでおり,研究成果を論文誌や国内研究会で発表できている.さらに,当初計画では,平成30年度に予定していたフラッディング攻撃の理論解析を前倒しして着手できている.近年,劣通信環境における通信技術の研究が盛んに行われているが,既存技術の多くはすべてのノードが善意的・協力的であることを前提として研究開発されてきている.しかし,実際にはネットワークをこわす攻撃が仕掛けられる恐れがあり,劣通信環境下の通信技術は攻撃に極めて脆弱である.脆弱性を解消するためにインターネットにおけるセキュリティ技術を用いれば良いようにおもえるが,ノードの密度が疎な劣通信環境下では,つねに接続できるサーバや認証局がないため,その適用は困難である.よって,信頼度の高い情報収集を行うには,劣通信環境下に適したセキュリティ対策の確立が必要不可欠である.そこで,本研究では,劣通信環境で発生する特有の攻撃を複数想定し,それらの対策を提案することで,実用に耐え得る高信頼・高セキュアな通信システムの確立を目指し研究を進めている.平成30年度は,主に,二つの攻撃(フラッディング攻撃,フェイクメッセージ攻撃)に着目し,それらの攻撃の振る舞いの解析,および,その対策法について検討を進めた.フラッディング攻撃では,攻撃端末が無用なデータを過剰に生成し,ネットワーク資源の枯渇を引き起こす.一方,フェイクメッセージ攻撃では,攻撃端末がデータを受信するとそのメッセージを偽のメッセージに置き換えを行う攻撃である.これらの攻撃の振る舞いをマルコフ解析によって明らかにした.さらに,理論解析の結果に基づき,フラッディング攻撃とフェイクメッセージ攻撃の対策法をそれぞれ提案した.計算機シミュレーション実験によって,提案した対策法の性能評価を行い,その有効性を示した.さらに,前年度に検討を進めたアンチパケット攻撃の対策法の研究成果をまとめ,論文誌に投稿中である.研究計画通りにおおむね順調に進んでおり,研究成果を論文誌や国内研究会で発表できている.さらに,当初計画で想定していたフラディング攻撃の対策法に加え,フェイクメッセージ攻撃の対策法についても検討できており,順調に進んでいる.

平成29年度はおおむね順調に研究を進められたため,引き続き研究計画に沿って進めていく.平成29年度に提案したアンチパケット偽造攻撃の対策法を改良し,国際会議や研究会でその成果を発表する予定である.平成30年度はおおむね順調に研究を進められたため,引き続き研究計画に沿って進めていく.平成30年度に提案したフラッディング攻撃や,フェイクメッセージ攻撃の対策法を改良し,国際会議や研究会でその成果を発表する予定である.計算機を購入しなかったため,次年度使用額が生じた.次年度の早い時期に計算機を購入する予定である.おおむね順調に研究を進められているため,計算機サーバの購入費用への支出を抑えた.次年度には,これまでに得られた成果をまとめ,論文誌,国際会議や研究会での成果発表を予定しているため,論文投稿費や旅費に使用する予定である.
地域医療システム構築における保健所保健師の連携機能に関する研究

地域医療連携体制の構築における保健所保健師の連携機能の特徴を明らかにすることを目的とした。その結果、面接調査では【連携づくり関係者の温度差の是正】等、5つのカテゴリと13の概念からなる特徴を明らかにした。質問紙調査は「関係機関が主催する多職種・専門職の研修や集まりに参加する(84.5%)」等の関与が多く見られた。これらの結果から、地域医療連携における保健所保健師の機能の現状が確認され、教育研修の充実が必要であると示唆された。【目的】地域医療システムづくりを推進する保健所保健師の"連携"機能を探求することを目的とし、研究の初年度にあたる平成22年度は、地域医療システム構築を推進する役割を担っている保健所保健師が、関係者とどのように連携づくりを行っていくのか、そのプロセスを明らかにすることを目標とした。【研究実施計画】文献検討をし課題の明確化を行った上で、個別インタビュー調査を実施し、上記のプロセスを検討した。【結果及び考察】1)内外の文献を検討した結果、行政保健師の連携機能は、(1)明確に整理されている状況ではないが、(2)多機関や多職種が同じ目標に向かって情報を共有し協働できるように支援することであり、その対象も個人だけではなく、組織や地域住民という集団としてる。また、(3)情報の交換や協働、それぞれの関係機関や人的物的資源の調整を担うことであると整理できるのではないかと考えられた。2)個別インタビュー調査は6名を対象に実施した。当初、一人1時間1時間半を設定していたが、2時間3時間と長時間に渡った。分析の結果、地域医療保健システムの構築に関わった保健所保健師は、関係者の中で最も立場の弱い職種(調査の事例では"福祉職")が、(1)関係職種の話合いの場の内容が理解できるように、内容の説明を行ったり、共通言語で話せるように調整したりしており、立場の弱い職種のエンパワメントを推進していた。この過程は、保健師自身の専門的知識を確認したり、情報発信技術を高めたり、チームの中での役割を確認したりする変化を伴っていた。分析は理論的飽和まで至っておらず、次年度に追加の調査を実施し、より明確が分析を行うことが課題である。【目的】地域保健医療システムづくりを推薦する保健所保健師の"連携"機能を明確にし、具体的な実践方法を探求することを目的とし、研究2年目にあたる平成23年度は、22年度に引き続き、地域医療連携システムづくりに関わっている保健所保健師が、関係者とどのように連携づくりをしていくのか、そのプロセスを明らかにし、その上で他職種との違いを明らかにする為の質問紙を開発することを目的とした。【研究実施方法】昨年度実施した保健師への個別インタビューでは、理論的飽和化までいたっていなかった為に、引き続き保健師に対してインタビューを実施した。そのカテゴリーをベイスにして、自記式質問紙の開発を試みた。【結果及び考察】1)保健師に対する個別インタビューは7名の者を対象として実施し、昨年度の対象者6名と併せて13名となった。これらの分析の結果、地域医療保健医療システムを構築する役割にある保健師は、関係者の中で立場の弱い職種(訪問看護師、ヘルパー、住民)などが、(1)他職種での話し合いで十分役割が果たせるように「情報を理解しやすい形に加工して発信」「わかりやすく情報発信できるよう支援」をする機能を発揮しいえいた。(2)保健師自身も事業の役割や位置づけを確認し、連携作りにおける役割を認識するだけでなく、保健師の機能を確認し自信をもって活動が展開できるように変化していた。これらは、システム作りに関わる複数の職種のそれぞれがエンパワメントしていく課程であると考えられた。2)保健師の連携づくりと他の職種のそれの違いを明らかにする為に質問紙の開発に取り組み、プレテストを実施したが本調査を実施するまでには至っておらず、次年度に本調査を実施し当初の目的を達成する予定である。【目的】地域医療システムづくりを推進する保健所保健師の“連携"機能を探求することを目的とし、昨年度はその機能を個別インタビュー調査を通して探求した。それを踏まえて本年度は、アンケート票を作成し数量的に保健師機能の特徴を明らかにすることを目的とした。【研究実施計画】インタビュー調査の結果を踏まえ自記式質問紙を作成し、全国の県型保健所(371箇所)で地域連携づくりに関わっている保健師を対象にアンケート調査を実施。【結果及び考察】1)回答数292(78,8%)、回答した中で1保健所が医療連携に関与している219件(75%)、関与していない73件(19.7%)、2関与している保健所の中で保健師が関わっていると回答したものは148件(67,6%)であった。2)保健師の平均年齢49.2歳、事業担当平均年数2.3年、職位では係長級49名(33,1%)であった。

2)保健師の関与で多かった(かなり担っている、少し担っている)のは、1関係機関が主催する多職種・専門職の研修や集まりに参加する125人(84.5%)、2会議や作業部会のメンバーの意思決定を尊重する119人(79.1%)、3関係機関の長と連携会議開催前後に連絡を取ったりする109人(73.6%)、4調査のデータなどの情報を参加者の誰でもが理解しやすいようにする116人(78.4%)、5関係者への研修会の当日の運営をする108人(73.0)%などであった。3)保健師の関与で少なかった(あまり担っていない、ほとんど担っていない)のは、1住民への説明会で実際の説明をおこなう109人(73.6%)、2住民への説明会の会場の準備や案内を発送・発信する103人(69.6%)、2住民の説明会や説明用パンフレットの作成の企画をする89人(60.6%)などである。従来重要とされてきた地域診断や個別事例の分析などへの関わりが、予想より少ない結果であった。前年度の調査での個別インタビューだけでは、理論的飽和化まで至らなかった為に、追加の個別インタビューを実施し、その分析を行う必要が生じた為に、自記式質問紙の開発が遅れ、プレテストまでは実施したが本調査までには至ることができなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は研究の最終年に当たる為に、前年度実施しきれなかった数量的調査を速やかに実施し、これまでの研究を学会等で報告するとともに、研究の総まとめを行い報告書を作成する予定である。
アミロイド前駆体タンパク質細胞内輸送へのコレステロール代謝の関与

アルツハイマー病における老人斑の主要構成成分であるアミロイドβ(Aβ)は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)から産生される。本研究ではコレステロールの脳特異的酸化物である24S-hydroxycholesterolが、小胞体ストレス応答を介して小胞体シャペロンであるGRP78の発現を誘導し、APPとGRP78の複合体形成促進によるAPPの細胞内輸送の抑制によってAβ産生を抑制することを明らかにした。アミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein、APP)の細胞内輸送における24S-hydroxycholesterol(24S-OHC)の影響について、24S-OHC存在下でAPPへの結合が増加するタンパク質として昨年度同定された小胞体シャペロンであるGlucose-regulated protein 78 (GRP78)の解析を行った。24S-OHC処理した細胞では小胞体からのカルシウム放出と、それに伴う小胞体ストレス応答の誘導が起きていたことから、GRP78の発現誘導が小胞体ストレス応答によるものであることが明らかとなった。GRP78 siRNAにより24S-OHC誘導性のGRP78発現上昇を抑えたところ、24S-OHC処理細胞で認められていた未成熟型APPの蓄積やAβ産生抑制効果は減少した。これまでの結果から24S-OHCなどの酸化ステロールは、小胞体ストレス応答によるGRP78の発現誘導およびAPP/GRP78複合体の形成亢進を起こすことで、APPのCOP-II小胞を介した小胞体からゴルジ体への輸送を阻害した結果、Aβ産生酵素が存在するゴルジ体以降のオルガネラにAPPが到達せず、Aβ産生量が減少する可能性が示唆された。また目的IIについて、APPの予想ステロール結合部位と推定されるVGSNK配列のうち、ヒト野生型APPを鋳型としてpoint-mutagenesis法によりバリン、セリン、リジンをそれぞれアラニンに置換した変異体を用いて、内在性に発現するAPPと同程度の発現レベルになるような安定発現細胞株を作製した。イムノブロット法を用いたAPPタンパク質量の確認およびELISA法を用いたAβの定量によりVGSNK配列のうちセリンとリジンが24S-OHCによるAβ産生メカニズムにおいて重要な役割を果たす可能性が示された。アミロイド前駆体タンパク質(APP)の細胞内輸送における24S-hydroxycholesterol(24S-OHC)の影響について、免疫沈降法と質量分析法を組み合わせて24S-OHC存在下でAPPへの結合が増加するタンパク質の同定を試みた。その結果、LC-MALDI-TOF-MS法により複数のタンパク質が同定され、中でも小胞体シャペロンであるGlucose-regulated protein 78 (GRP78)に着目し以後の解析を行った。異なる種類のAPPに対する抗体を用いた免疫沈降法からGRP78はAPPに直接結合し、24S-OHC処理により結合が増加することが確認された。またGRP78の発現量が24S-OHC存在下の細胞において増加することがreal-time PCR法やウエスタンブロット法により明らかとなった。これらの現象はAPPが定常的に高発現するCHO細胞に加え、神経細胞株であるSH-SY5Y細胞においても確認された。以上の結果から24S-OHC処理は細胞内でGRP78の発現を誘導し、増加したGRP78が小胞体でAPPと結合する可能性が示唆された。また目的IIについて、APPの予想ステロール結合部位と推定されるVGSNK配列のうち、ヒト野生型APPを鋳型としてpoint-mutagenesis法によりバリン、セリン、リジンをそれぞれアラニンに置換した変異体を作製した。リポフェクション法により野生型CHO細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン耐性遺伝子を利用した選別法により、各変異体を安定的に発現する細胞株を樹立した。ウエスタンブロット法を用いたAPPタンパク質量の確認およびELISA法を用いたAβの定量によりVGSNK配列のうちセリン、リジンが24S-OHCによるAβ産生メカニズムにおいて重要な役割を果たす可能性が示された。目的Iについて、的確な抗体を決定し、共免疫沈降法により回収した共沈タンパク質を質量分析法により解析することが出来た。また酸化コレステロール誘導性APP代謝抑制に関わる候補タンパク質となるGRP78を同定することが出来た。目的IIについては、APPの変異体を作製し、安定的に発現する細胞株を受理することが出来た。またAPPの代謝に関与することが予想される複数のアミノ酸残基を同定することが出来た。また計画以上の発見として過剰な酸化コレステロールは神経細胞にNecroptosisという新規の細胞死形態を引き起こすことが明らかとなった。以上のことから、交付申請書に記した目的における平成23年度の計画は順調に進展している。APPとの結合が確認されたGRP78については、siRNA法によるノックダウン等により、酸化ステロールによるAPP代謝抑制への直接的な関与があるかについてさらに検討を行う。APPに対する予想

ステロール結合部位の変異体の解析については、各変異体の現細胞株よりも高発現系の細胞株の樹立を検討し、得られた安定株を用いて、in vitro transport assay等によりさらなる解析を行う。今年度に引き続き次年度においても培養細胞株を用いた実験を行うため、当初の計画通り細胞培養用試薬の購入を計画している。またsiRNA法や免役沈降法に必要な生化学、分子生物学実験試薬についても購入する。特に抗体の購入費の割合が大きくなることが計画される。加えて産生されたAβの定量に必要なELISA用試薬の購入も予定している。