hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Hymenolepis属条虫の片節形成における細胞群動態の研究

Hymenolepis属条虫における片節形成の機構を細胞群の動態という側面から解明するために以下の研究を実施した。感染(発育開始)後の種々の齢の虫体について、デジタイザーを用いて各種の計測を行ない、片節形成速度の変遷と、個々の片節の成長速度を計算した。その結果、片節形成速度や形成直後の片節幅径は、虫体の齢によって大きく変化するが、形成直後の片節縦径は常に一定であることが判明した。この観察は、分裂可能な唯一の細胞型であり、すべての細胞の幹細胞であるgerminaーtive cellの分裂頻度に関する従来の知見等から考えて、条虫の片節形成が、細胞分裂頻度やその他のパラメータの影響を受けない、単純な細胞行動の結果として理解し得ることを示唆している。そこで、片節形成に伴って起こる細胞の分布状態その他の形態学的変化を調べた。片節形成以前の虫体頚部のnedullary parenchyna内には、germinative cellを含む多数の細胞が存在する。これらの細胞の多くが、虫体長軸に垂直な、各一層の細胞から成るシート状に配列するようになる。虫体の矢状断および水平断切片では、これらの細胞シートが、はじめは網目状に連絡し合っているが、やがてシート間の連絡が切れて、各シートが独立する。これとほぼ同時に、虫体を縦走する一対の腹側排出主管を横方向に結ぶ排出細管が形成される。シートを構成する細胞のすべてがgerminative cellであるかは不明である。しかし後者には少なくとも二型があり、また一部は排出管の管壁細胞に分化するようである。横断排出細管の形成は、片節が形成されつつあることを示す最初の徴候であり、これより少し遅れて虫体表面の横皺が、明瞭な規則性を示すようになる(外分節)。細胞シートの形成がgerminative cell自体の性質によるのか、それとも他の細胞との相互作用が関与しているのかを調べるために、細胞のin vitro培養を試みているが、十分に成功していない。
アテロコラーゲン包埋法の応用

有効かつ安全ながんの遺伝子・核酸医薬による治療法の実現に向けて、アテロコラーゲン・デリバリーシステムによる生体内遺伝子発現制御法を開発した。この方法はバイオマテリアルの一種であるアテロコラーゲンをキャリアとして特に核酸医薬を生体内にデリバリーし、ヌクレアーゼによる生体内分解から核酸を保護することで、遺伝子ベクターの欠点であった生体内での非制御性を改善し、ベクターの能力を最大限に発揮させうる画期的な方法である。本年度はこのデリバリー技術を用いて,アテロコラーゲンとmicroRNAの複合体は、siRNAの場合と同様に、細胞に取り込まれやすいナノサイズの粒子径であり、生体内でのmicroRNAの安定性に大きく寄与し、ヒト前立腺がんで顕著に低下している事が判明したmicroRNA16の補充療法に有効である事を示した。さらに、このデリバリーの担がんマウスにおける腫瘍内での導入と消失を検討した結果、全身性の投与後、2日後に腫瘍内にmicroRNAが確認され、その濃度は3、4日と徐々に上昇し、最大値に達した後、2から3日間はその値を持続した後、ゆっくり消失し、10日後には確認不可能となった。他の正常臓器では、これとは対照的な動態となり、例えば肝臓では投与直後に正常値の2-3倍となったが、その6時間後には元の値にまで戻っていた。この知見は、今後、microRNAの補充療法におけるmiroRNAの体内動態を考える上で重要な参考になると考えられた。以上の解析から、アテロコラーゲン包埋方法の応用は、microRNAにまでその効果が及ぶ事が示唆され、今後のnon-coding RNAによる制がん研究に本法は有用であると考えられた。有効かつ安全な核酸医薬によるがん治療法の実現に向けて開発したアテロコラーゲンとsiRNAやmicroRNAの複合体は、細胞に取り込まれやすいナノサイズの粒子径であり、生体内での核酸医薬の安定性に大きく寄与していること、さらにはヒト前立腺がんで顕著に発現増加している2つの標的遺伝子に対する抑制(siRNA)療法や、転移に伴って低下している事が判明したmicroRNA16の補充療法に有効である事を示した。有効かつ安全ながんの遺伝子治療法の実現に向けて、アテロコラーゲン・デリバリーシステムによる生体内遺伝子発現制御法を開発した。この方法はバイオマテリアルの一種であるアテロコラーゲンをキャリアとして種々の治療用外来遺伝子ベクターや核酸医薬を生体内で徐放し、ヌクレアーゼによる生体内分解から核酸を保護することで、遺伝子ベクターの欠点であった生体内での非制御性を改善し、ベクターの能力を最大限に発揮させうる画期的な方法である。本研究では、アテロコラーゲン包埋法の応用として、遺伝子機能を特異的且つ高い効率で抑制可能なsiRNAのがん治療への応用の道を開く前立腺がんや乳がんにおける全身性の骨転移に対するsiRNAによる治療法の開発を試みた。我々が用いた方策はルシフェラーゼを発現するヒト前立腺がん細胞正PC-3Mを用いた骨転移モデルを用意し、リシフェラーゼを特異的に抑制するsiRNAをアテロコラーゲン複合体として尾静脈から全身投与し,そのマウスをバイオフォトニクスによるin vivoイメージングで解析することにより,骨転移巣でのルシフェラーゼの発光量を定量し、デリバリー効率と抑制効果を同時に判定するものである。その結果,siRNA単独投与では全身の骨転移巣でのルシフェラーゼ量はせいぜい20%程度の抑制であったのに対し,siRNA/アテロコラーゲン複合体投与マウスでは90%以上の絶大な抑制効果が認められた。またこれらの複合体を投与されたマウスでは毒性は認められなかった。しかし、複合体投与の際の動物の生体反応やより詳細な遺伝子発現の変化等をさらに慎重に検討する必要がある。我々の予備的な知見では,アテロコラーゲンによるsiRNAのデリバリーシステムは、動物の脳内や骨髄内までsiRNAをデリバリーしうることを確認しており,今後,前立腺がんや乳がんの標的遺伝子に対するsiRNAの効果を我々の系で評価することにより,siRNAの核酸医薬品としての利用価値が確立すれば、がん治療をはじめとした様々な疾病治療への応用が期待できる。この方法はバイオマテリアルの一種であるアテロコラーゲンをキャリアとして種々の治療用が依頼遺伝子ベクターや核酸医薬を生体内で徐放し、ヌクレアーゼによる生体内分解から核酸を保護することで、遺伝子ベクターの欠点であった生体内での非制御性を改善し,ベクターの能力を最大限に発揮させうる画期的な方法である。本研究では,アテロコラーゲン包埋法の応用として、遺伝子機能を特異的且つ高い効率で制御可能なsiRNAのがん治療への応用の道を開くことに力点を置く。アテロコラーゲンによる核酸医薬のデリバリー技術は、全身性に適応可能であることから、前立腺がんや乳がんにおける全身性の骨転移に対するsiRNAの治療法の開発を試みてきた。本年度はヒト乳がんのリンパ節転移に関与する遺伝子を同定し,その発現をsiRNAによって抑制し、転移を抑制する実験系の開発を試みた。まず、ひと乳がん細胞株MDA-MB-231細胞に関して,これまでの報告からリンパ節転移に係ることがin vitroの系で示唆されている17の候補に注目し,それぞれのsiRNAを用いて、マトリゲルによる細胞浸潤のアッセイ系を用いて、浸潤を効果的に抑制するsiRNAを検討した。

その結果,CXCR4,MMP-1,MMP-2,SLUGの4種の遺伝子に対するsiRNAがヒト乳がん細胞の浸潤能を顕著に抑制した。これらのリンパ節転移抑制候補siRNAsの効果を実証研究する方策として、動物モデルの構築を開始した。用いたMDA-MB-231細胞にルシフェラーゼ遺伝子を組込み、バイオフォトイメージングにより動物でのリンパ節転移をリアルタイムにイメージングすることに成功した。この細胞はfat padに移植され、50-60日後に腋下リンパ節への転移が確認された。移植部位での遺伝子発現を抑制することが可能かどうかは、がん細胞が発現するルシフェラーゼに対するsiRNAをアテロコラーゲン法により局所投与し,ルシフェラーゼの発現の抑制をフォトン数でカウントすることにより検証した。その結果,24時間後にルシフェラーゼの発現は90%以上抑制された。今後,in vitroで乳がんの浸潤を抑制することのわかった標的遺伝子に対するsiRNAの効果を動物の系で評価することで、リンパ節転移に関係する標的遺伝子の特定を行う。有効かつ安全ながんの遺伝子・核酸医薬による治療法の実現に向けて,アテロコラーゲン、デリバリーシステムによる生体内遺伝子発現制御法を開発した。この方法はバイオマテリアルの一種であるアテロコラーゲンをキャリアとして種々の治療用外来遺伝子ベクターや核酸医薬を生体内で徐放し,ヌクレアーゼによる生体内分解から核酸を保護することで,遺伝子ベクターの欠点であった生体内での非制御性を改善し,ベクターの能力を最大限に発揮させうる画期的な方法である。本年度は,このデリバリー技術を用いて,RNA干渉を利用したがん治療の戦略の実現に向けて,ヒト乳がん細胞や前立腺がん細胞の転移モデルを用いて,siRNAやmicroRNAの転移がん病巣への集積を検討した。まず,ルシフェラーゼを発表するヒト乳がんのリンパ節転移モデルを用いて,アテロコラーゲンとアンチ・ルシフェラーゼsiRNAの複合体を全身性に投与することで,乳房組織に移植したがん組織に効率よく導入され,なおかつルシフェラーゼの発現を80%以上も抑制した。また,前立腺がん細胞に,microRNA16の標的特異的配列であるBcl2遺伝子の3'UTR配列を結合させたルシフェラーゼのコンストラクトを組み込み,その細胞を用いて昨年度までに樹立した骨転移モデルを作成した。この動物に,アテロコラーゲンと複合体を形成させたmicroRNA16を尾静脈から導入した結果,大腿骨などのがん転移部位のルシフェラーゼの発現が60%以上も抑制された。以上の研究成果は,アテロコラーゲンのデリバリー技術は,siRNAのみならず,microRNAをも,全身の腫瘍部位に導入するために有効な方法であることを強く示唆するものである。今後は,これらのモデル系を用いて,ヒト乳がん細胞や前立腺がん細胞の転移抑制に有効なsiRNA,microRNAを用して,治療応用の基礎検討を行う予定である。有効かつ安全ながんの遺伝子・核酸医薬による治療法の実現に向けて、アテロコラーゲン・デリバリーシステムによる生体内遺伝子発現制御法を開発した。
成長軟骨板に依存する長管骨発生プロセスの理解 : 組織系譜解析によるアプローチ

ヘッジホッグ(Hh)シグナルは、軟骨細胞が産生する分泌性シグナルの一つとして骨格形成に必須であることが報告されているが、それが標的とする細胞及びそれが連なる組織系列は未だ不明である。本研究において成長板由来のHhシグナル応答細胞の骨伸長過程における動態を調べた結果、Hhシグナルを受容をした細胞は、成長板内の肥大軟骨細胞層及び成長板から一次海綿骨への移行部から骨格の長軸方向に沿って移動し、最終的に海綿骨や皮質骨の骨芽細胞及び骨細胞へと分化することがわかった。本研究により、成長板からのHhシグナル応答が、将来の骨格形成に寄与する前駆細胞プールの維持や増幅に関与しうることが明らかとなった。骨格系の主となる長管骨の伸長は骨端部の成長軟骨板に依存するが、如何なる機序のもとに成長板が骨形成に結び付いているのか、その詳細は未だ不明な点が多い。申請者は、成長軟骨板が産生するヘッジホッグ(Hh)蛋白が、成長板辺縁の細胞集団に作用し、それらが骨組織の構築に直接寄与する可能性を見出している。そこで、本研究では、Genetic Lineage Tracing法によって成長板由来のHhシグナル受容細胞に連なる細胞系列を可視化し、骨芽細胞/破骨細胞を中心とする骨代謝経路との関連性を細胞・分子レベルで検証することで、成長軟骨板を基軸とする長管骨の骨化プロセスの解明に迫る。本年度は、主にGenetic Lineage Tracing法を主体とした解析を行い、成長板軟骨細胞のインディアンヘッジホッグに応答した細胞集団が、長管骨を構築する骨芽細胞や骨細胞に直接分化することを明らかにした。またその過程で、成長板周辺においてヘッジホッグシグナルのアンタゴニストとして機能することが報告されているHhip遺伝子が、局所的に発現していることを明らかにした。研究は、当初の計画同士進展しているが、Genetic Lineage Tracing法で使用するタモキシフェンが、想定していたよりも強力な骨形成活性を持っていることが、研究途中で明らかになった。そこで、現在予定していたタモキシフェン投与条件を変更・修正し、解析を行っているが、研究計画を変更するほどの大きな支障とはなっていない。成長軟骨板の増殖・分化および骨置換によって、骨格系の大部分を占める長管骨は発達する。従来の研究は、初期胚子の未分化間葉細胞の凝集から軟骨細胞の分化・成熟に至る成長軟骨板そのものの発生過程に主眼が置かれ、その後の発育期での骨化プロセスについては未だ不明な点が多い。骨短縮・骨変形を特徴とする成長板早期閉鎖症や発育期成長板障害による骨形成不全など、長管骨の発達は成長軟骨板に強く依存するとされ、成長板と骨形成プロセスとを結びつける分子実体の解明が望まれてきた。申請者は、個体発生に必須のシグナル系であるヘッジホッグ(Hh)シグナルが活性化された細胞を、Genetic Lineage Tracing (GLT)法によってレポーター標識し、マウス生体内で長期的に観察できるシステムを構築した。成長軟骨板周辺では、Hhリガンドの発現による同シグナル経路の活性化が予想されるが、GLT法によりHhシグナルを受容した細胞をレポーター分子で可視化した申請者の研究で、成長板軟骨基質辺縁の細胞のみがHhシグナルに応答することを明らかにした。また、それらの細胞を長期的に追跡することで、成長板由来のHhシグナル受容細胞が骨基質の支持細胞へ最終的に分化することも、現在明らかにしつつある。Hhシグナルの直接標的Gli1のプロモーター依存的にCreを発現するマウスを用いたGLTを実施した。レポーター標識されたHhシグナル受容細胞の組織分布解析及び分化マーカー抗体を用いた細胞特性解析をおこない、成長板由来のHhシグナルと骨伸長プロセスとの関連性を検討した。Hhシグナルの受容を示すレポーター陽性細胞の多くは、成長板軟骨の辺縁部に局在していた。各種分化マーカーによる多重染色の結果、それらは骨芽細胞系列の細胞特性(Osterix及びRunx2陽性)を有することがわかった。さらに成長板周囲のレポーター陽性細胞は、標識後も、その数を増加させながら長管骨内部に長期的に存在・拡散していき、骨芽細胞及び骨細胞などの骨形成細胞へと分化することが判明した。またその一方で、骨髄中の血管周囲には、骨形成細胞とは異なる、特有の長い細胞突起を有したレポーター陽性細胞も点在しており、それらの多くが骨髄造血幹細胞ニッチとされるCAR細胞の特異的マーカー(Foxc1)を発現していることも分かった。本研究では、Genetic Lineage Tracing法によって成長板由来のHhシグナル受容細胞に連なる細胞系列を可視化し、骨芽細胞/破骨細胞を中心とする骨代謝経路との関連性について検証した。具体的には、成長軟骨板からのHhシグナルを受容した細胞集団が、長管骨の骨化プロセスに如何に組み込まれるかを、Gli1creERマウスによるGLT法で作製した細胞系譜地図にて精査した。その結果申請者らは、成長板軟骨が産生するヘッジホッグ蛋白が作用した特定の細胞(成長板の影響下にある細胞)が、骨を構成する主要な細胞成分へと分化することを明らかにした。さらにそれらは骨組織だけでなく髄腔を満たす骨髄間質の造血システムの要となる造血幹細胞ニッチにも直接コミットしうる可能性も見出した。

研究成果の一部は、Histochem Cell Biol誌(Haraguchi et al., Histochem Cell Biol. 2018Apr;149(4):365-373.)において、筆頭著者及び責任著者として発表した。ヘッジホッグ(Hh)シグナルは、軟骨細胞が産生する分泌性シグナルの一つとして骨格形成に必須であることが報告されているが、それが標的とする細胞及びそれが連なる組織系列は未だ不明である。本研究において成長板由来のHhシグナル応答細胞の骨伸長過程における動態を調べた結果、Hhシグナルを受容をした細胞は、成長板内の肥大軟骨細胞層及び成長板から一次海綿骨への移行部から骨格の長軸方向に沿って移動し、最終的に海綿骨や皮質骨の骨芽細胞及び骨細胞へと分化することがわかった。本研究により、成長板からのHhシグナル応答が、将来の骨格形成に寄与する前駆細胞プールの維持や増幅に関与しうることが明らかとなった。27年度の研究によって、成長板由来のHhシグナル受容細胞で機能する新規標的分子Hhip遺伝子を同定することに成功した。よって、研究申請当初に予定していた実験計画に加えて、このHhip遺伝子の機能解析を、マウスgene targeting法を用いて、行う予定である。遺伝子改変動物作成には、作出スピードを上げるために、cas9-crisperシステムを採用する予定である。組織系譜解析により、軟骨細胞由来のHhシグナルが直接的に作用するのは、強いStemness特性を有し、かつ、骨組織を構築する骨形成細胞あるいは骨髄中の造血機能を支えるCAR細胞などへとコミットする能力を持った骨端軟骨直下に存在する細胞集団であることが示された。これまで成長板の軟骨細胞は、主に将来骨へと置換される軟骨成長板の発生源として考えられてきたが、それ以外にも、長管骨における骨形成や造血への関与が推察される骨端軟骨直下の細胞集団に影響しうる制御シグナルのprimary sourceとして機能している可能性を明らかにしていく予定である。骨形成及び骨代謝今年度末に予定していた実験を延期になったため、77,604の繰越し金が発生した。H28年度に実施予定であったRNAシークエンス解析を、次年度での実施に計画を変更したため。免疫組織染色の抗体購入のために、使用する予定である。長管骨内のHhシグナル受容細胞において、発現を見せる分子をDNAアレイ解析により同定する。
多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和

今年度は,去年度公開した多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和を実行するプログラム"SparsePOP"の改良を行った.変数の数や制約式が多い問題においては,入力した問題から半正定値計画問題を構築する部分で,莫大な時間を費やしていたので,主にその部分の改善を行った.これにより,多項式最適化問題の応用例である"センサー配置問題"に対して,センサーの数が1000個の問題に対して,少なくても得られた半正定値計画問題を解くよりも数倍速く,半正定値計画問題を構築することができた."センサー配置問題"とは,温度,音量や光などを精度よく観測する為にワイヤレスセンサーを配置する最適化問題である.なお,この研究は,東工大の小島政和先生と韓国のKim先生との共同研究である.SparsePOPのC++への移植も行っている.半正定値計画問題を解くソルバーとして"SDPA"を利用している.現段階では,まだ完成していないが,ある種の多項式最適化問題に対してはSDPAよりもSeDuMiの方が精度の良い結果を返すことが数値実験でわかった.等式制約を持つ多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和では,得られる半正定値計画問題は自由変数と呼ばれる変数を持つ性質がある.自由変数を持つ半正定値計画問題に対しては,しばしば精度の良い結果が得られないことが経験的に知られている.今年度の研究ではできるだけ半正定値計画問題の疎性を壊さずに,自由変数を消去する手法を構築し,数値実験を行った.なお,この研究は,東工大の小島政和先生との共同研究である.今年度は,既に公開しているSparsePOPという多項式最適化問題の最小値の下界値を求めるソフトウェアの改良に従事した.まず,得られる半正定値計画問題の構造を利用して,冗長な制約を減らすことで,半正定値計画問題の求解時間を短縮することを目指した.しかしながら,実際様々なテスト問題に対して実験してみたが,冗長な制約を減らしても,有為な時間差や精度は得られなかった.次に,半正定値計画問題を得るためにかかる時間を短縮することを目指した.SparsePOPは,MATLABを利用しているがこれを,C++で組むことで高速化を達成することができた.この作業は,修士課程の杉元君の協力してもらった.これにより,MATLABよりも数倍から十数倍の高速化が得られた.今後,大規模な多項式最適化問題に対して並列計算を行うことを予定しており,現在C++で組まれているSDPARAと呼ばれる並列計算を利用して半正定値計画問題を解くソフトウェアと組み合わせるためには,必要不可欠な作業である.現在,C++の公開を目指して,マニュアルやソフトウェアの整備を急いでいる.また,理論的な側面として,多項式最適化問題から得られる半正定値計画問題と,その多項式最適化問題の変数に対してaffine変換を施すことで得られる多項式最適化問題から得られる半正定値計画問題があるaffine変換で対応がつくことを示し,現在学術誌に投稿している.今年度は,去年度公開した多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和を実行するプログラム"SparsePOP"の改良を行った.変数の数や制約式が多い問題においては,入力した問題から半正定値計画問題を構築する部分で,莫大な時間を費やしていたので,主にその部分の改善を行った.これにより,多項式最適化問題の応用例である"センサー配置問題"に対して,センサーの数が1000個の問題に対して,少なくても得られた半正定値計画問題を解くよりも数倍速く,半正定値計画問題を構築することができた."センサー配置問題"とは,温度,音量や光などを精度よく観測する為にワイヤレスセンサーを配置する最適化問題である.なお,この研究は,東工大の小島政和先生と韓国のKim先生との共同研究である.SparsePOPのC++への移植も行っている.半正定値計画問題を解くソルバーとして"SDPA"を利用している.現段階では,まだ完成していないが,ある種の多項式最適化問題に対してはSDPAよりもSeDuMiの方が精度の良い結果を返すことが数値実験でわかった.等式制約を持つ多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和では,得られる半正定値計画問題は自由変数と呼ばれる変数を持つ性質がある.自由変数を持つ半正定値計画問題に対しては,しばしば精度の良い結果が得られないことが経験的に知られている.今年度の研究ではできるだけ半正定値計画問題の疎性を壊さずに,自由変数を消去する手法を構築し,数値実験を行った.なお,この研究は,東工大の小島政和先生との共同研究である.
成長因子を用いた気管粘膜再生過程

bipotential scaffoldに異なる濃度のb-FGFを加え、最終的に1枚の人工材料当たりb-fGF濃度(A)0ng,(B)10ng,(C)100ngとなるよう作製した。b-FGFの徐放は3日以内に行われることが確認された。3種類の濃度の人工材料をラットの気管欠損部に移植し、移植後7日、14日、28日の気管再建部の評価を行った。気管粘膜上皮層および上皮下層においてb-FGF濃度が高いほど再建に有利な環境であることが分かった。また、(C)の移植モデルにおいて気管再建部の評価を行った。本研究ではvitrigel薄膜をコラーゲンスポンジに付加するbipotential scaffoldを作製し、さらに工程の中で成長因子basicfibroblast growthfactor(b-FGF)を加えた新たな人工材料を作成とした。将来的に気管再建における上皮化促進、機能面の改善を確認することを目的としている。平成26年は農業生物資源研究所と協力し、人工材料におけるb-FGF濃度の調整を行い人工材料の作製を行った。また、作製した人工材料内のb-FGFが移植後にどのような徐放形態をたどるのか調査をっ進めた。結果的に2日以内の比較的早期に徐放が行われることが確認された。2015年の研究は人工材料に含有させるb-FGF濃度を3種類((A)0ng,(B)10ng,(C)100ng)設定し、それぞれの人工材料が気管粘膜再生に及ぼす影響を光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡で観察すること、を目的としている。SDラットに気管欠損を作り、人工材料を移植後7日、14日、28日の状態を評価した。含有しているb-FGF濃度が高いほど、気管粘膜再建の程度は気管上皮においても上皮下層においても有利であった。また、人工材料(C)において気管再建部を走査型電子顕微鏡で観察し、線毛の再生を観察することができた。移植後7日の時点から線毛は観察可能であった。研究計画書に記載されている工程はほぼ達成されており、次年度の評価に進むことができると判断する。医歯薬学新たに作成した3種類の人工材料を動物に移植し、これまでの人工材料との比較を行う。気管再建部の内視鏡評価、組織学的評価を行う予定である。物品費、人件費の予定額を使用せず研究を予定どおり進めることが可能であったため。次年度分の物品費、人件費に追加し使用する予定である。
骨芽細胞におけるビオプテリンの抗アポトーシス作用機序の解明

NOは生体内でNO synthase(NOS)により生成されるが、その活性発現には補酵素としてテトラヒドロビオプテリン(BH4)を要求する。近年、このBH4に培養細胞に対する細胞増殖作用、anti-oxidant作用、NOSの補酵素としての働きなど新たな生理作用が着目されつつある。平成10-11年度基盤研究(c)(2)<骨芽細胞におけるビオプテリンの抗アポトーシス作用機序の解明>において1)炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IFN-γ)にてMC3T3-E1 cellを処理することは、強い細胞増殖抑制および細胞死を誘導し、同時にNOを産生すること、さらにこの細胞死がアポトーシスを介することを確認した。2)サイトカイン処理によりBH4が細胞内で産生された。3)BH4がMC3T3-E1に対し濃度依存的な細胞増殖性を示し、BH4によりアポトーシスが濃度依存的に阻止できることを確認した。以上のことから、サイトカインによりアポトーシスを誘導するNOと抑制するBH4が共誘導され、細胞死は両者のバランスによって決定づけられる可能性が示唆された。さらに4)Actinobacillus actinomycetemcomitans由来莢膜多糖抗原が骨芽細胞にたいしアポトーシスを介した細胞増殖抑制を示すことを明らかにしアポトーシスが病態(特に若年性歯周病)の進行に関わる可能性を明示した。このことは、本研究課題である骨芽細胞におけるアポトーシスの制御の探求が臨床分野においても応用可能な知見を与えることを示唆する。結果の一部はJADR大会、歯科基礎医学会学術大会、日本薬理学会年会にて発表を行った。(1)研究の背景骨の形成と吸収を制御する因子として、サイトカインの役割は、広く認識されているが、最近このサイトカインの情報を伝達する物質として一酸化窒素(NO)の細胞内での挙動が着目されつつある。NOはNO synthase(NOS)により生成されるが、その活性発現には補酵素としてテトラヒドロビオプテリン(BH4)を要求する。近年,このBH4に培養細胞に対する細胞増殖作用、anti-oxidant作用、アポトーシスを惹起するNOの生合成酵素NOSの補酵素としての働きなど新たな生理作用が着目されつつある。(2)研究目的1)サイトカインによるマウス骨芽細胞MC3T3-E1 cellsの増殖抑制がアポトーシスによるものか2)その際遺伝子レベルで誘導された誘導型NOSおよびGTPCH-Iの最終酵素産物NOとBH4がおのおの細胞内で産生されるか3)BH4の果たす役割、特に抗アポトーシス作用があるか4)骨芽細胞のアポトーシスが病態に関わる可能性について検討を行った。(3)結果1)炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IFN-γ)で処理することは、強い細胞増殖抑制および細胞死を示し、同時にNOを産生することを確認した。LDH assay,細胞周期解析、ELISAにて、この細胞死がアポトーシスを介したものと確認した。2)サイトカイン処理により最終酵素産物BH4が細胞内で産生された。3)BH4がMC3T3-E1に対し濃度依存的な細胞増殖性を示した。4)骨芽細胞のサイトカインによるアポトーシスがBH4により濃度依存的に阻止できることを確認した。4)Actinobacillus actinomycetemcomitans由来莢膜多糖抗原がアポトーシスを介した細胞増殖抑制を示すことを明らかにし、骨芽細胞のアポトーシスが病態(特に歯同病)に関わる可能性を明示した(Journal of Dental Research,1999,in press)。現在、実験結果を踏まえての総括的な考察及び付加的実験を行っている。結果の一部はJADR大会にて発表を行い、また現在論文投稿中である。

NOは生体内でNO synthase(NOS)により生成されるが、その活性発現には補酵素としてテトラヒドロビオプテリン(BH4)を要求する。近年、このBH4に培養細胞に対する細胞増殖作用、anti-oxiclant作用、NOSの補酵素としての働きなど新たな生理作用が着目されつつある。平成10-11年度基盤研究(c)(2)<骨芽細胞におけるビオプテリンの抗アポトーシス作用機序の解明>において1)炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α,IFN-γ)にてMC3T3-E1 cellを処理することは、強い細胞増殖抑制および細胞死を誘導し、同時にNOを産生すること、さらにこの細胞死がアポトーシスを介することを確認した。2)サイトカイン処理によりBH4が細胞内で産生された。3)BH4がMC3T3-E1に対し濃度依存的な細胞増殖性を示し、BH4によりアポトーシスが濃度依存的に阻止できることを確認した。以上のことから、サイトカインによりアポトーシスを誘導するNOと抑制するBH4が共誘導され、細胞死は両者のバランスによって決定づけられる可能性が示唆された。さらに4)Actinobacillus actinomycetemcomitans由来莢膜多糖抗原が骨芽細胞にたいしアポトーシスを介した細胞増殖抑制を示すことを明らかにしアポトーシスが病態(特に若年性歯周病)の進行に関わる可能性を明示した。このことは、本研究課題である骨芽細胞におけるアポトーシスの制御の探求が臨床分野においても応用可能な知見を与えることを示唆する。結果の一部はJADR大会、歯科基礎医学会学術大会、日本薬理学会年会にて発表を行った。
コイ科魚類の生殖腺刺激ホルモン遺伝子の発現調節機構の解明

申請者はこれまでにコイ科魚のキンギョを材料として、魚類の性成熟過程における下垂体生殖腺刺激ホルモン(GTH)II型の生理作用、分泌調節についての研究をすすめてきた。また申請者は、これまでにキンギョの2種類のGTH(I型およびII型)遺伝子(cDNA)のクローニングをコイ科魚類では初めて行い、その構造を明らかにした。しかしサケ科以外の魚類では、これら2種類のGTH、特にGTH-I型の成熟への関与についてはほとんど明らかではない。そこで本研究では、得られたcDNAをプローブとして、キンギョの成熟過程におけるGTH-IおよびII遺伝子の発現動態、調節機構、すなわちGTHの合成調節を調べ、コイ科魚類の成熟の内分泌調節機構を解明することを目的としている。本年度は、以下の3点について研究を行った。1)キンギョのGTH遺伝子の発現の季節変化GTH-IIについては、雌雄とも成熟度と相関した変化がみられ、産卵期に高い発現がみられたが、GTH-Iは、その発現動態が雌雄で異なった。雌ではGTH-IIと同様な変化を示し、雄では顕著な変化がみられなかった。2)キンギョのGTH遺伝子の構造解析既に得られているcDNAをもとに、キンギョGTH遺伝子のクローニングを行った。その結果、GTH-IおよびGTH-IIの遺伝子の構造が、それぞれ高等動物のFSHおよびLHの遺伝子の構造にに類似していることが明らかとなった。3)キンギョ以外のコイ科魚類のGTH-IのcDNAクローニングコイ科のコイおよびソウギョにおいてGTH-IのcDNAをクローニングし、コイ科魚類におけるGTHの二元性を確認した。しかしサけ科以外の魚類では、これら2種類のGTH、特にGTH-I型の成熟への関与についてほとんど明らかではない。本年度は、性ホルモンによるGTH遺伝子の発現調節を明らかにするために、性ホルモンが下垂体GTHのmRNAレベルに及ぼす影響をノザンブロット法により調べた。成熟前の稚魚、成熟初期あるいは成熟状態の魚に性ホルモン(エストラジオール、テストステロンおよび11-ケトテストステロン)を投与した結果、GTH-Iの発現は、性ホルモンにより抑制され、一方GTH-IIの発現は若干の促進がみられた。また生殖腺摘出による性ホルモンの除去、さらに生殖腺摘出魚に対する性ホルモンの投与の実験からも、同様の結果が得られた。これらの結果から、2種類のGTHの発現は性ホルモンにより、異なる調節を受けていることが明らかとなった。コイ科魚類においても、サケ科で報告されているようにGTH-Iが成熟初期、GTH-IIが成熟後期に生殖腺の発達に重要な役割をしているのだとしたら、性ホルモンが盛んにつくられる成熟後期にGTH-I型の発現が性ホルモンにより抑制されるのは、生殖腺の発達に重要な機構と考えられる。

そこで本研究では、得られたcDNAをプローブとして、キンギョの成熟過程におけるGTH-IおよびII遺伝子の発現動態、調節機構、すなわちGTHの合成調節を調べ、コイ科魚類の成熟の内分泌調節機構を解明することを目的としている。本年度は、以下の3点について研究を行った。1)キンギョのGTH遺伝子の発現の季節変化GTH-IIについては、雌雄とも成熟度と相関した変化がみられ、産卵期に高い発現がみられたが、GTH-Iは、その発現動態が雌雄で異なった。雌ではGTH-IIと同様な変化を示し、雄では顕著な変化がみられなかった。2)キンギョのGTH遺伝子の構造解析既に得られているcDNAをもとに、キンギョGTH遺伝子のクローニングを行った。その結果、GTH-IおよびGTH-IIの遺伝子の構造が、それぞれ高等動物のFSHおよびLHの遺伝子の構造にに類似していることが明らかとなった。3)キンギョ以外のコイ科魚類のGTH-1のcDNAクローニングコイ科のコイおよびソウギョにおいてGTH-IのcDNAをクローニングし、コイ科魚類におけるGTHの二元性を確認した。
人魚共通寄生虫アニサキスの姉妹種間のアレルゲン、宿主内移動、地理的分布の比較

Anisakis pegreffi三期幼虫をニジマス体腔内に外科的に挿入するという攻撃試験を行い、昨年度Anisakis simplex s.s.で行った同様の攻撃試験の結果と比較した。その結果、A. pegreffiiはA. simplex s.s.に比較して、明らかに筋肉に侵入しにくいことが示された。また、両種ともに、水温が高いほど筋肉に移行する期間が短くなったが、水温は筋肉への移行率に大きな影響を与えなかった。体腔内の虫体をみると、A. simplex s.sでは宿主組織による鞘の形成がみられたのはいくつかの虫体に限られていたが、A.pegreffiiではほとんどの虫体に対して宿主反応が見られた。また、体腔内と筋肉内の虫体の合計はどちらも経過時間とともに減少した。体腔内での宿主反応により虫体が死滅する、あるいは虫体の筋肉への移行が阻害されるという現象が生じているものと思われた。北部日本海のマアジならびにサクラマスから得られた虫体の種を分子生物学的に判別したところ、全てA. simplex s.s.であった。この結果をQuiazon et al. (2011)が示した結果と併せ考えると、A. simplexは日本沿岸の太平洋側と北部日本海に分布し、A. pegreffiiは東シナ海と西部日本海に分布することが確かめられた。このことから、A. pegreffiiは東シナ海から西部日本海に主として生息する鯨類・海獣類を終宿主とし、A. simplex s.s.は太平洋ならびに北部日本海に生息する鯨類・海獣類を終宿主としている可能性が示された。(抄録なし)(1)AnisakissimplexとAnisakispegreffiiのニジマス体内での動態に水温ならびに塩分が及ぼす影響を調べるための感染実験の準備を行った。大学構内の飼育施設にニジマス飼育のための循環式実験水槽をセッティングし、実験用ニジマスを山梨県水産技術センターから60尾入手し、大学構内に運搬し、10,15,20°Cの淡水および15°Cの海水中に馴致した。現在、寄生虫入手のための魚を手配し入荷を待っている。(2)Anisakis simplexとA.pegreffiiのカンパチへの感染実験を鹿児島県水産技術センターで行うため、当該センター飼育施設の下見を行うとともに、研究実施のための飼育場所、施設、時期、供試魚の入手法などについて研究打ち合わせを行った。実施時期は実験可能なサイズのカンパチが入手可能になる6月以降に実施することとした。また、小型のカンパチを使用して予備的な攻撃試験を行い、その結果かに基づき、当初予定していた麻酔したカンパチ胃内への強制投与に変えて、カンパチを一尾づつ小型水槽に入れてアニサキス虫体を入れた餌(ペレット)を自発的に経口投与することとした。(3)日本近海の魚類に寄生するアニサキスのPCR-RFLPならびにITS領域の塩基配列解析による種同定を目的として、サバ類を中心に様々な魚種から虫体の採集を行った。現在、これらの虫体からDNAを抽出し、ITS領域のPCR-RFLP解析ならびに塩基配列の決定を行っているところである。本研究は、人魚共通寄生虫であるAnisakis simplexの中の姉妹種A.simplex s.s.とA.pegreffiiについて、アレルゲン、宿主内移動、地理的分布について比較することを目的としている。本年度は、アレルゲンならびに宿主内移動に関する研究を実施した。(1)姉妹種2種から主要な3アレルゲン(Ani s 1,2,12)とマイナーな1アレルゲン(Ani s 9)のcDNAを得、演繹アミノ酸配列を決定したところ、アミノ酸配列にほとんど違いが認められす、また、IgE結合エピトープならびにヒト白血球抗原結合モチーフは保存されていた。これらの結果から、この姉妹種は同じアレルゲンを持っており、同様のアレルギー反応を示し、また、アレルギー反応が交差することが示唆された。これはA.pegreffiiのアレルゲンを明らかにした初めての研究である。(2)ニジマスをA.simplex s.s.で攻撃した。その際、以前行った経口攻撃試験では、消化管から体腔に移動せずに消化管から直接糞と一緒に排泄された虫体の存在が示唆されたので、今回は、ニジマスに手術を施し、ニジマスの体腔内に直接虫体を挿入して攻撃した。また、同様に以前の実験は低水温でのみの実験であったため、今回は3つの温度区を設定して攻撃した。その結果、以前の実験と同様に、A.simplexs.s.は、高温では移動に要する時間が短くなるものの、前回の実験と同様、筋肉への移動が確認された。25年度にA.pegreffiiで同様の実験を行い、その結果と併せて2種の宿主内移動の様式を比較する予定である。Anisakispegreffi三期幼虫をニジマス体腔内に外科的に挿入するという攻撃試験を行い、昨年度Anisakis simplex s.s.で行った同様の攻撃試験の結果と比較した。

体腔内の虫体をみると、A. simplex s.sでは宿主組織による鞘の形成がみられたのはいくつかの虫体に限られていたが、A.pegreffiiではほとんどの虫体に対して宿主反応が見られた。また、体腔内と筋肉内の虫体の合計はどちらも経過時間とともに減少した。体腔内での宿主反応により虫体が死滅する、あるいは虫体の筋肉への移行が阻害されるという現象が生じているものと思われた。北部日本海のマアジならびにサクラマスから得られた虫体の種を分子生物学的に判別したところ、全てA. simplex s.s.であった。この結果をQuiazon et al. (2011)が示した結果と併せ考えると、A. simplexは日本沿岸の太平洋側と北部日本海に分布し、A. pegreffiiは東シナ海と西部日本海に分布することが確かめられた。このことから、A. pegreffiiは東シナ海から西部日本海に主として生息する鯨類・海獣類を終宿主とし、A. simplex s.s.は太平洋ならびに北部日本海に生息する鯨類・海獣類を終宿主としている可能性が示された。研究を実施を担当する外国人研究員の来日が11月末であったため、すぐに年末年始を迎え実験開始が遅れた。また、飼育試験に使用する予定であった飼育施設が不調となりその修理のために時間を要した。アレルゲンの比較については、予想以上に進展しており、主要4アレルゲンのうち3つを比較することができた。宿主内移動については、本年度中にA.pegreffiiをもちいた攻撃試験を計画し2回準備を行ったが、活力のある虫体を得ることが困難で、実験を開始することができなかった。地理的分布については、虫体の採集にとどまり、姉妹種の同定までには至っていない。計画通り、感染実験、アレルゲンの検索、アニサキスの地理的分布状況の検査を行う。アレルゲンの比較については、主要アレルゲン1つを残し、ほぼ終了し、残ったアレルゲンについても完了する見通しが立っている。そこで、平成25年度はA.pegreffiiによる攻撃試験を地理的分布の比較について集中して研究を実施する。特に、平成24年度に虫体が入手できず実施できなかったA.pegreffiiによる攻撃試験については以下のように対処する。24年度は、分布域である九州の市場から輸送されたサバ類からA.pegreffii虫体得ていたが、これらの魚体はしばしば半冷凍状態にまで冷却されており、虫体が活力を失っていた。そこで、25年度は九州で直接買い付けて輸送することも試みる。(抄録なし)
正規化・データベース化した病理DICOMの探索による術中患部移動変形計算について

本研究の目的は、術前や術後(術中MRIが導入されれば術中)のDICOMを正規化し、それらのDICOM脳の濃淡値から粘性・弾性・剛性・塑性などのパラメータを探索し、症例・年齢・性別などを軸としたブレインシフトデータベースを作成することである。昨年度および今年度は、脳外科手術の患者数が少なく、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)の取得が遅れていた。そこで、その状況下で得られた数少ないペアを利用して、術前・術後のDICOM脳のセグメンテーションおよびそれらの位置姿勢合わせ、頭蓋骨・悪性腫瘍・血管のセグメンテーション、術前術後の脳内特徴点の抽出とそのマッピングを実施した。さらに、多数の特徴点マッピングデータから、ブレインシフトの発生部位を検出したり、その用途における多数の特徴点検出・マッピングアルゴリズム(KAZE, AKAZE, ORB, SIFTなど)を比較したりした。この一方で、脳DICOMの粘性・弾性・剛性・塑性などの物理パラメータを推定し、変形をシミュレーションするソフトウエアをUnityで作成し、小規模のデータでそのソフトウェアの動作検証を行った。そこで次年度は、患者のデータセット(術前・術後DICOMペア)の取得が進むと思われるので、患者の症例・年齢・性別からブレインシフトが事前に計算できるようなデータベースが設計できるものと考えている。そこでは、多数の患者の脳DICOMを比較・評価し、それらの特徴量を患者の個人差に依らないようにする。昨年度、予期したより脳神経外科手術の件数が少なく、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)の取得が著しく遅れてしまった。この遅れが、現在の遅れにまだ繋がっている。今年度、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)が15件程度になった。そこで、それらにおいて、脳や頭蓋骨・悪性腫瘍・血管のセグメンテーション、術前術後の脳内特徴点の抽出とそのマッピングを実施している。また、それらにおいて、多数のマッピングデータからブレインシフトの発生部位の検出を行っている。現在の処理では、1患者当たりの処理時間は、現在1か月程度を要している。そこで、多数の患者のデータ処理の効率化も新たな課題になり実施している。脳DICOMのセグメンテーション領域の粘性・弾性・剛性・塑性などのパラメータを基に、変形をシミュレーションするソフトウエアは一応完了しているものの、粘性・弾性・剛性・塑性などのパラメータ推定に必要な大規模データを待つ状況となっている。また計画では、GPGPUを用いた並列処理バージョン、および手術中の医師に強調して示したい器官をその進行に応じて強調色にしたり、手術に無関係な器官の透明度を高めたりする3次元可視化ソフトウエアの開発は未だ着手していない。最後に、データベースの仕様策定は完了しているが、データ不足のため検討したいくつかの正規化手法を試すには至っていない。次年度は、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画)の取得が進むので、患者の症例・年齢・性別などに依存したブレインシフトを事前計算するデータベースが設計できるものと考えている。そこでは、多数の患者の脳DICOMを比較・評価し、それらの特徴量を患者の個人差に依らないようにする予定である。変形過程を再現するシミュレータに特徴点マッピング(ブレインシフト)を重ね合わせることで、脳変形シミュレーションのリアル化・精度向上を図る。同時に、この重ね合わせにより、粘性・弾性・剛性・塑性などの物理パラメータを正解に推定する。また、手術中、医師に強調して示したい器官をその進行に応じて強調色にしたり、手術に無関係な器官の透明度を高めたりできる3次元可視化ソフトウエアを製作し、それらのリアルタイム性を高めるためGPGPUを用いて並列処理を行うようにする。これにより、通常のCPUで動作する(低速脳変形描画)ものをGPGPU版(高速脳変形描画)に変更する。そして、シミュレーションのリアルタイム性を評価し、切開手術がよりしやすくなるようにする。さらに、多くの患者の脳DICOMデータをデータベース化し、症例・性別・年齢、脳DICOM画像を元に、多くのブレインシフトを正規化するソフトウエアを開発する。現在、データベースは患者の症例・年齢・性別、脳DICOM画像、特徴点3次元画像からなるが、もっと多くの種類の有意なデータを取り扱えるように、データベースの拡張性も併せて検討する。本研究の目的は、患者の術前や術後(術中MRIが導入されれば術中)のDICOMを正規化し、それらからDICOM脳の濃淡値の粘性・弾性・剛性・塑性などのパラメータを探索し、症例・年齢・性別などを軸としたブレインシフトデータベースを作成することである。現在、患者の脳DICOMをCT/MRIで計測し、現在データを収集中を行っている。脳DICOMデータの使用を患者に承諾とりながらそのデータを使用し、器官(脳腫瘍・動脈瘤・血管・神経)をセグメンテーション化の作業を行っている。また脳DICOMのすべてのボクセルに粘性・弾性・剛性・塑性などの物理パラメータを推定し、変形をシミュレーションするソフトウエアを作成し小規模のデータでそのソフトウェアの検証を行っている。その変形の正確さ評価するにあたり脳の特徴点を追跡する必要があり、実3D脳画像での特徴点とシミュレーションに得られた3D脳画像の特徴点の一致度を求める必要がある。特徴点を脳の血管にとり3次元的にマッチングすることが良さそうでありそのアルゴリズムの設計している。しかし、現在までプログラムはまだ通常のCPUで動作するだけであり、GPGPU版まで手が回っていない。

データベースは、患者の症例・年齢・性別、脳DICOM画像、手術映像等の最小限のデータからなるように設計するともに、3D Slicerを利用して多数の患者の脳DICOMを比較・評価し、それらの特徴量を患者の個人差に依らないようにするためのDICOMデータ正規化方法を検討した。当初予期したより手術の件数が少なく脳のDICOMデータの収集が進まず、全体的に進捗が遅れている。現在、逐次データが得られ次第、、器官のセグメンテーション化を行っているところである。脳DICOMのすべてのボクセルに粘性・弾性・剛性・塑性などの物理パラメータを推定し、変形をシミュレーションするソフトウエアは一応完了しているものの推定に必要な大規模データを待つ状況となっている。また計画では、GPGPUを用いた並列バージョンや、手術中の医師に強調して示したい器官をその進行に応じて強調色にしたり、手術に無関係な器官の透明度を高めたりできる3次元可視化ソフトウエアはまだ開発に至っていない。データベースの仕様策定は完了しているが、データ不足のため検討したいくつかの正規化手法を試すには至っていない。本研究の目的は、術前や術後(術中MRIが導入されれば術中)のDICOMを正規化し、それらのDICOM脳の濃淡値から粘性・弾性・剛性・塑性などのパラメータを探索し、症例・年齢・性別などを軸としたブレインシフトデータベースを作成することである。昨年度および今年度は、脳外科手術の患者数が少なく、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)の取得が遅れていた。そこで、その状況下で得られた数少ないペアを利用して、術前・術後のDICOM脳のセグメンテーションおよびそれらの位置姿勢合わせ、頭蓋骨・悪性腫瘍・血管のセグメンテーション、術前術後の脳内特徴点の抽出とそのマッピングを実施した。さらに、多数の特徴点マッピングデータから、ブレインシフトの発生部位を検出したり、その用途における多数の特徴点検出・マッピングアルゴリズム(KAZE, AKAZE, ORB, SIFTなど)を比較したりした。この一方で、脳DICOMの粘性・弾性・剛性・塑性などの物理パラメータを推定し、変形をシミュレーションするソフトウエアをUnityで作成し、小規模のデータでそのソフトウェアの動作検証を行った。そこで次年度は、患者のデータセット(術前・術後DICOMペア)の取得が進むと思われるので、患者の症例・年齢・性別からブレインシフトが事前に計算できるようなデータベースが設計できるものと考えている。そこでは、多数の患者の脳DICOMを比較・評価し、それらの特徴量を患者の個人差に依らないようにする。昨年度、予期したより脳神経外科手術の件数が少なく、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)の取得が著しく遅れてしまった。この遅れが、現在の遅れにまだ繋がっている。今年度、患者のデータセット(術前・術後DICOMペアやその術中動画像)が15件程度になった。そこで、それらにおいて、脳や頭蓋骨・悪性腫瘍・血管のセグメンテーション、術前術後の脳内特徴点の抽出とそのマッピングを実施している。
細胞分化におけるエピジェネティックパターン成立機構の解明

マウス胚性幹細胞(ES細胞)の試験管内分化誘導システムを用いて,赤血球の最終分化に必須な転写因子GATA-1による赤血球系列特異的なエピジェネティックパターン成立機構の解析をおこなった.その結果, GATA-1は,多能性造血前駆細胞から赤血球系列への運命決定において,赤血球系列固有のエピジェネティックパターン成立に寄与していることが示唆された.マウス胚性幹細胞(ES細胞)の試験管内分化誘導システムを用いて,赤血球の最終分化に必須な転写因子GATA-1による赤血球系列特異的なエピジェネティックパターン成立機構の解析をおこなった.その結果, GATA-1は,多能性造血前駆細胞から赤血球系列への運命決定において,赤血球系列固有のエピジェネティックパターン成立に寄与していることが示唆された.マウス胚性幹細胞(ES細胞)を試験管内で血液細胞へ分化させる手法を用いて,赤血球系前駆細胞における,組織・細胞系列固有のエピジェネティクスパターン成立のメカニズムについての研究を行った.いくつかの遺伝子に関して,(1)mRNA発現,(2)ヒストンアセチル化,(3)ヒストンメチル化,(4)DNAメチル化の解析をおこなっている.マクロファージや好中球の分化に関与している遺伝子に関して,野生型の赤血球系前駆細胞では,mRNA発現の抑制・ヒストンH4の脱アセチル化が認められ,ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により,mRNA発現抑制の解除が認められている.また,赤血球分化に必須な転写因子GATA-1を欠損した赤血球系前駆細胞では,いくつかのマクロファージや好中球の分化に関与している遺伝子に関して,mRNA発現持続・ヒストンH4の脱アセチル化解除が認められ,今後,それらの遺伝子の転写調節領域におけるGATA-1の結合を,クロマチン免疫沈降などにより調べる予定である.赤血球系前駆細胞において,GATA-1と結合しているタンパクを同定するために,細胞内でビオチンリガーゼにより,ビオチン化されるアミノ酸配列を付加したGATA-1(bioGATA-1)を作成した.さらに,抗生物質テトラサイクリンにより,外来性遺伝子の発現量を制御できるTET-OFFシステムを用いて,GATA-1欠損Es細胞へbioGATA-1を遺伝子導入し,細胞株を樹立した.今後,このEs細胞株を用いて,ES細胞から赤血球系前駆細胞までの各分化段階でbioGATA-1タンパクを発現させ,ストレプトアビジンを利用したプルダウンにより,bioGATA-1に結合するタンパクを精製する予定である.マウス胚性幹細胞(ES細胞)を試験管内で血液細胞へ分化させる手法を用いて,赤血球系前駆細胞における,組織・細胞系列固有のエピジェネティクスパターン成立のメカニズムについての研究を行っている。赤血球最終分化に必須な転写因子GATA-1を欠損したES細胞から得られた未分化赤血球系前駆細胞では,本来,赤血球系細胞では発現しないGM-CSF受容体(GM-CSFRα)の発現が認められた。GM-CSFRαは,好中球・マクロファージ系列の細胞の増殖・分化を支持するサイトカインGM-CSFの受容体である。一方,ES細胞を赤血球系前駆細胞まで分化誘導後,Cre/LoxPシステムを利用して,GATA-1遺伝子の欠損を誘導してもGM-CSF受容体の発現が誘導されることはなかった。このことから,GATA-1は,ES細胞から赤血球前駆細胞までのいずれかの分化段階において,GM-CSFRα遺伝子の発現抑制をおこなうこと,およびこの発現抑制は,不可逆的であり,いったん発現抑制されると,GATA-1を欠損させてもその発現抑制は解除されないことが判明した。そこで,さらにGM-CSFRα遺伝子の転写調節機構を調べた結果,ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンA処理により,野生型赤血球系前駆細胞において,GM-CSFRα遺伝子の発現が認められることが判明した。今後,さらにこの遺伝子の発現調節機構に的を絞って,研究を進めていく予定である。我々は,赤血球終末分化に必須な転写因子GATA-1を欠損させたマウス胚性幹細胞(ES細胞)を樹立し,赤血球分化におけるGATA-1の役割を解析してきた.GATA-1欠損ES細胞を赤血球系へ分化誘導すると,成熟赤血球への分化が阻害され,未分化赤血球系細胞がエリスロポエチン(EPO)とOP9ストロマ細胞依存的に自己複製することを,我々は見出していた.さらにこのGATA-1欠損赤血球系細胞が分化多能性を示し,好中球・マクロファージなどへ分化できることを見出している.この,GATA-1欠損赤血球系細胞の分化多能性獲得機構を探るため,Cre/LoxPシステムにより,コンディショナルにGATA-1を欠損できるES細胞を樹立し,解析をおこなった.ES細胞において,GATA-1を欠損させた場合,そのES細胞由来の赤血球系細胞は分化多能性・自己複製能を示すのに対し,未分化赤血球系細胞まで分化誘導後にGATA-1の欠損を誘導すると,自己複製能は示すが分化多能性は持たないことが判明した.そこで,両者を比較した結果,好中球・マクロファージ分化を支持する好中球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の受容体(GM-CSFRα)の発現が異なることを見出した.すなわち,ES細胞においてGATA-1を欠損させた場合,赤血球系細胞はGM-CSFRαを発現しているのに対し,野生型赤血球系細胞ではGM-CSFRα発現は不活性化されていること,またGM-CSFRα