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近世身分制の解体と村・地域社会―熊本藩領の金納郷士を事例に―

本研究の最終年度にあたる平成26年度は、当初に計画していた細川家資料における藩政史料(主に「口書」)の調査・分析作業、ならびに研究成果の公表に向けた作業を重点的に行った。その結果、近世後期の金納郷士と村社会との関係を示した記述を、当該期の「口書」から数多く発見し、村社会や一般百姓層の動向に規定される金納郷士の実態に迫ることができた。また、細川家資料の藩政史料に質量ともに匹敵する、伊豆韮山江川文庫の代官所史料の調査・分析作業も継続して行い、藩領国地域と幕領地域との比較研究の観点から、熊本藩という「領国地域社会」の特質を浮き彫りにすることができた。以上で得た知見に関しては、1「近世後期藩領国の行財政システムと地域社会ー熊本藩を中心にー」(岩波講座『日本経済の歴史』研究会、平成26年5月)、2「近世後期の広域年貢請制と経済成長ー熊本藩領の手永を中心にー」(七隈史学会第16回大会、平成26年9月)で、それぞれ研究報告を行った。また、学術書として『日本近世の領国地域社会ー熊本藩政の成立・改革・展開ー』(稲葉継陽と共編、吉川弘文館、平成27年2月)を刊行することができ、個別の学術論文でも、1「近世後期藩領国における地方役人の『出世』と『派閥』」(稲葉継陽・花岡興史・三澤純編『中近世の領主支配と民間社会』、熊本出版文化会館、平成26年10月)、2「農民一揆後の『付ケ火』と近代移行期の地域秩序ー熊本県阿蘇郡を事例にー」(『史林』97巻6号、平成27年3月)などを発表することができた。日本近世史・近代史本年度、当初の研究実施計画で予定していたのは、以下の6点である。1細川家資料における藩政史料(主に「口書」)の調査・撮影・分析、2熊本県内の個人所有史料、熊本県政資料(県庁文書、熊本県立図書館所蔵)の調査・撮影・分析、3高知県での高知藩郷士関係の文献・史料の調査、4永青文庫研究センター主催シンポジウムでの研究発表、5国内の研究会・学会等での研究発表、6学術論文の公表上記のうち、3を除くすべてを、ほぼ達成することができた。1や2に関しては、「口書」や県政資料の量が予想以上に膨大であったため、すべて終了はできず、次年度に継続する部分もあるが、調査自体はおおむね順調に進展している。3に関しては未達成であるが、代わりに伊豆韮山江川文庫の調査を進めることができ、近世後期の幕領代官所行政に関する多くの知見を得ることができた。総じて、当初における研究目的と研究実施計画は、おおむね順調に進展していると評価できる。その理由は、当初の研究実施計画で予定していた、1永青文庫細川家資料における藩政史料(「口書」を中心)の調査・撮影・分析、2熊本県内の旧金納郷士家所有史料の調査・撮影・分析、3和歌山県での和歌山藩郷士関係の文献・史料の調査、4熊本大学文学部附属永青文庫研究センター主催「藩研究シンポジウム」(仮称)での研究発表のうち、3を除く三点については、ほぼ達成できたからである。1では、「口書」の量が予想以上に膨大であり全点の調査までは至らなかったが、それ以外の関連史料(「覚帳」「町在」など)に関する調査は、ほぼ終了することができた。2については、当初の計画どおりに実施することができ、4は「藩研究シンポジウム」の開催が平成25年度となったため、そこでの発表自体はできなかったが、代わりに日本史研究会12月例会などで、研究成果の中間報告を行うことができた。また、今年度に達成できなかった3についても、代わりに平成25年度予定していた高知藩郷士関係の文献・史料の調査を、部分的に実施することができた。平成26年度に予定していた、当初の研究実施計画は以下の4点である。1細川家
高解像度遅延造影ＭＲＩによる左房線維化評価：心房細動、心不全における臨床的意義

本邦では、高齢化が世界で類を見ないスピードで進行しており、心不全の有病率は急上昇している。心不全患者において左室拡張機能は主要な病態の一つであり、正確な評価が重要である。現在、左室拡張機能の指標として心臓超音波検査が用いられているが、再現性が必ずしも高くないため、信頼性の高い左室拡張機能の評価法の開発が求められている。本研究の目的は、心不全患者と心房細動患者を対象に高解像度3次元遅延造影MRIを用いて、左房心筋線維化の評価を行い、拡張機能障害の指標としての有用性や疾患重症度との関連性を検討し、新しい左室拡張機能のイメージングマーカーを開発することである。
エピジェネティック情報に基づく化学物質による自閉症発症のリスク評価

自閉症スペクトラム障害(自閉症)は近年ますます増加する神経疾患であり、その多くが幼少期から発症し、様々な行動異常を伴うなど大きな社会問題となっている。これまでに自閉症の原因候補遺伝子が多数報告されているが、遺伝子変異のみでは疾患の発症機序を説明できないのが現状である。胎児は母体を介した栄養供給とともに、有害な化学物質にも晒される危険性がある。これまでの培養細胞を用いた解析で、妊娠期の母体環境中から検出される一部の化学物質が、遺伝子の発現調節機構であるエピジェネティクスを乱し、細胞分化にも影響することを明らかにしている。本研究では、化学物質による神経細胞分化への影響についてエピジェネティクスに着目し、自閉症の発症メカニズムの解明を行う。これまでの研究で明らかとなった、ヒトiPS細胞のエピジェネティック状況を乱す5種類の化学物質(DEP,コチニン, S-421, Hg, Se)をヒトiPS細胞から分化誘導させたニューロスフィアに暴露し、神経幹細胞のマーカー遺伝子であるPAX6の発現解析、およびニューロスフィアのスフィア径をもとに、化学物質による神経分化への影響を評価した。その結果、5種類の化学物質の複合暴露はPAX6発現量を有意に増加させ、さらにスフィア径の有意な減少が認められた。これらのことは、母体環境中から検出され、エピジェネティック変異原として同定された5種類の化学物質が、初期の神経分化に悪影響をおよぼすことを示唆するものである。平成30年度は、妊娠期の母体環境中から検出される化学物質について、生体暴露状況に近い濃度で細胞に暴露し、神経細胞分化に影響する化学物質の同定を行った。これまでのヘテロクロマチンを指標とする研究で、ヒトiPS細胞のエピジェネティック状況を乱す5種類の化学物質(DEP,コチニン, S-421, Hg, Se)を同定している。ヒトiPS細胞からニューロスフィアへの神経幹細胞分化系を用いて、これら5種類の化学物質を暴露し、神経幹細胞のマーカー遺伝子であるPAX6の発現解析、および得られたニューロスフィアのスフィア径を指標に、化学物質の神経細胞分化への影響を評価した。生体暴露量を基準に14日間、化学物質暴露を行った結果、5種類の化学物質の複合暴露によってPAX6の発現量が有意に増加した。さらに、化学物質の暴露群では、対照群と比較してニューロスフィアのスフィア径が有意に減少していた。以上より、初期の神経細胞分化に悪影響をもたらす環境化学物質を同定できた。引き続き化学物質による神経細胞分化への影響を検証し、平成30年度に認められたPAX6の遺伝子発現異常へのエピジェネティクスの関与を検証する。また、5種類の化学物質それぞれをニューロスフィアに暴露し、単独暴露による神経細胞分化への影響を検証し、より影響度の強い化学物質の同定を行う。さらに、化学物質を暴露したニューロスフィアを神経細胞、グリア細胞に分化させ、化学物質による神経幹細胞での分化異常がその後の細胞分化にどのように影響するのかを検証していく。さらに、化学物質による遺伝子発現制御への影響を網羅的に検証するために、ゲノムワイドなDNAメチル化アレイ解析を行い、化学物質によってエピジェネティック変異が生じる遺伝子領域の絞り込みを行う。これらの結果より、自閉症の神経細胞分化異常において、従来の遺伝学による遺伝子変異解析とともに、エピジェネティック変異といった新たな指標による疾患の原因究明が可能になるものと考えられる。

さらに、化学物質の暴露群では、対照群と比較してニューロスフィアのスフィア径が有意に減少していた。以上より、初期の神経細胞分化に悪影響をもたらす環境化学物質を同定できた。引き続き化学物質による神経細胞分化への影響を検証し、平成30年度に認められたPAX6の遺伝子発現異常へのエピジェネティクスの関与を検証する。また、5種類の化学物質それぞれをニューロスフィアに暴露し、単独暴露による神経細胞分化への影響を検証し、より影響度の強い化学物質の同定を行う。さらに、化学物質を暴露したニューロスフィアを神経細胞、グリア細胞に分化させ、化学物質による神経幹細胞での分化異常がその後の細胞分化にどのように影響するのかを検証していく。さらに、化学物質による遺伝子発現制御への影響を網羅的に検証するために、ゲノムワイドなDNAメチル化アレイ解析を行い、化学物質によってエピジェネティック変異が生じる遺伝子領域の絞り込みを行う。これらの結果より、自閉症の神経細胞分化異常において、従来の遺伝学による遺伝子変異解析とともに、エピジェネティック変異といった新たな指標による疾患の原因究明が可能になるものと考えられる。当該年度は概ね研究が順調に進んだため、予定通りの予算執行ができた。故に、一部の予算については次年度に繰越し、細胞培養用の培地に当てることとした。
公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」に関する研究

本研究では、全国的なアンケート調査やインタビュー調査により、公民館が学校と地域をつなぐ有効な「連携推進母体」になり得ることを明らかにし、学校と地域の連携・協働における公民館の役割の重要性をあらためて確認することができた。また、公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」のための方策を導出した。本研究は、学校と公民館の連携のあり方を検討し、公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」方策について考察することを目的とする。「地域が学校を元気にし、元気な学校が地域を活性化する好循環づくり」のためには、学校にかかわる大人たち(保護者や地域住民、教職員等)による協議・熟議の場としての「連携推進母体」が重要になってくる。本研究は、この学校と地域の間の触媒の役割を果たす、「連携推進母体」としての公民館に焦点をあて、その有効性を事例分析等から探るとともに、「学校と地域の総合的な活性化」方策を導き出す。平成27年度は、「連携推進母体」として機能を果たしている公民館について注目し、その実態を全国的なアンケート調査によって探っていく。平成28年度には、初年度研究で明らかにした実態や資料等をもとに、公民館が「連携推進母体」となって学校・家庭・地域の連携をすすめる先駆的な事例を抽出する。その先駆的な事例については、研究分担者とともに現地に赴きインタビュー調査等を実施し、事例分析から学校と公民館の連携のあり方を考察する。平成29年度には、「連携推進母体」としての公民館の有効性を探るとともに、連携をすすめるうえでの障壁や課題についても検討していく。そして最後に、公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」をはかる具体方策についても提言をおこなう。本年度は、学校と地域の間の触媒となって取り組みを企画立案するための協議の場として公民館が機能を果たしている事例を全国的なアンケート調査によって探ることを計画した。具体的には、「学校支援地域本部」(文部科学省の補助事業の枠組みを活用して実施されている地域住民のボランティアによる組織的な学校支援活動)と「公民館」(名称が異なっていても社会教育法にある公民館に相当する役割を担っている施設)との関わりに関する実態について尋ねる調査を企画した。アンケートの内容は、基本情報として自治体内の「公民館」および「学校支援地域本部」の数、学校支援地域本部の活動や運営に公民館が何らかの連携を取っている事例の数、「学校支援地域本部」の運営事務局に当たる組織を「公民館」においている事例の数について尋ねる。次いで、自治体内で特長的な事例についての取り組みを記述してもらい、当該事例に関わる公民館の館長と職員の役割を確認する。さらに、市町村全域を対象にした学校支援地域本部の促進に資する協議を行っているネットワークの有無とそこでの公民館の役割といった点に関する定量的な把握を試みている。アンケートは、文部科学省が把握している全国で学校支援地域本部を実施している642の自治体に2016年2月に発送し、3月末に回収の締め切りとした。回収数は407で、回収率は63.3%である。2016年5月現在、アンケート結果の分析を進めている。平成28年度の研究は、昨年度に実施した公民館と学校支援地域本部の関わりに関する全国アンケート調査の分析を中心に行った。以下、分析の結果から、確認できたことをまとめておく。まず、「学校を核とした地域づくり」の視野をもった地域と学校の協働活動の今後の展開には、その活性化にむけて、個人であれ団体であれ、地域の多様な主体が参画することが想定されている。その意味においても、さらに分析の結果をふまえても、地域と学校をつなぐ「連携推進母体」の拠点が学校内ではなく地域の側に置かれるほうがより機能する場合があることがうかがわれた。そのため、本研究で注目した公民館が果たす役割の重要性をあらためて確認できた。さらに、本調査における自由記述においても、人材供給の調整役として、熟議の場として、そして、学校教育とはまた異なる原理の社会教育のアプローチを活動にうまく溶け込ませていく学習支援者として、公民館が有する可能性が認められた。ここに、これまで正面から取り上げられてこなかった、「連携・協働」の検討枠組みに「公民館」を組み込んでいく研究をすすめていく意義を見出すことができた。理由としては、本年度の研究をふまえて、3編の研究論文等をまとめることができた点にある。とりわけ、今後の研究の基礎となる公民館と学校支援地域本部の関わりに関する全国アンケートの結果について報告・考察した研究論文に関しては、量的な把握が行われていない中で、全国的な状況について実態の把握を試みたものであり、研究の成果としても注目される。

「地域が学校を元気にし、元気な学校が地域を活性化する好循環づくり」のためには、学校にかかわる大人たち(保護者や地域住民、教職員等)による協議・熟議の場としての「連携推進母体」が重要になってくる。本研究は、この学校と地域の間の触媒の役割を果たす、「連携推進母体」としての公民館に焦点をあて、その有効性を事例分析等から探るとともに、「学校と地域の総合的な活性化」方策を導き出す。平成27年度は、「連携推進母体」として機能を果たしている公民館について注目し、その実態を全国的なアンケート調査によって探った。平成28年度には、初年度研究で明らかにした実態や資料等をもとに、公民館が「連携推進母体」となって学校・家庭・地域の連携をすすめる先駆的な事例を抽出した。その先駆的な事例については、研究分担者とともに現地に赴きインタビュー調査等を実施し、事例分析から学校と公民館の連携のあり方を考察した。最終年度である平成29年度には、「連携推進母体」としての公民館の有効性を探るとともに、連携をすすめるうえでの障壁や課題についても検討した。そして研究成果の最終報告会を開催(3/3)し、公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」をはかる具体方策についても提言をおこなった。本研究では、全国的なアンケート調査やインタビュー調査により、公民館が学校と地域をつなぐ有効な「連携推進母体」になり得ることを明らかにし、学校と地域の連携・協働における公民館の役割の重要性をあらためて確認することができた。また、公民館を「連携推進母体」にした「学校と地域の総合的な活性化」のための方策を導出した。642の自治体に2016年2月に発送した『公民館等における「学校支援地域本部」の取組に関する実態調査』(3月末に締切)は、現在407通を回収することができている。このアンケート調査の集計と分析を4月5月末にかけておこない、全国的な公民館における学校支援活動への取り組み状況を定量的に把握する。また、こうした全国的な傾向をふまえたうえで、校支援に先進的に取り組む公民館について検討し、事例を選抜することを通じ、およそ6月7月を目途に、問調査先のリストを作成する計画である。8月10月にかけて、リストアップした公民館に対し、運営の実態や特長についてヒアリング調査をおこなう。基本的には2人1組となって訪問し、聞き取った質的データを分析についても、ともに協議しながらおこなう。こうしたヒアリング調査の結果を定性的に分析する視点としては、現在、公民館における学校支援活動の運営タイプや、支援の具体的な手法などを想定しているが、それ以外にも分析可能な視点がないか、10月11月をかけて慎重に検討をおこなう。なお、12月に実施される日本生涯教育学会では、主に定量的な分析結果を中心としながらも、ヒアリング結果の一部をなるべく多く追加して発表をおこなう予定である。1月3月にかけては、秋に検討を行った定性的な分析視点をふまえつつ、ヒアリング調査の結果を多角的に分析しながら、公民館における学校支援活動の実態を明らかにしていく。今後の研究の推進としては、公民館が「連携推進母体」となって積極的な協働活動を展開している事例のさらなる質的な分析があげられる。
多様な類似性解釈機構を備えた楽曲検索手法の開発～音響的類似性と言語的類似性の融合

本研究では,所与のクエリー楽曲に対して,ユーザが多様な視点から類似楽曲を検索できる枠組みを開発する.特に,従来の研究では個別に扱われていた楽曲の音響的なコンテンツ情報と言語的なラベル情報を統一的に扱うことで,様々な複合的な視点から楽曲の類似性を捉えることを目指す.具体的には,クエリー楽曲と類似した楽曲のグループとその類似性の根拠を形式概念分析により同定し,こうした楽曲グループをユーザに複数提示することで,クエリー楽曲の多角的な解釈に基づいた柔軟な類似楽曲検索が実現される.本研究では,所与のクエリー楽曲に対して,ユーザが多様な視点から類似楽曲を検索できる枠組みを開発する.特に,従来の研究では個別に扱われていた楽曲の音響的なコンテンツ情報と言語的なラベル情報を統一的に扱うことで,様々な複合的な視点から楽曲の類似性を捉えることを目指す.具体的には,クエリー楽曲と類似した楽曲のグループとその類似性の根拠を形式概念分析により同定し,こうした楽曲グループをユーザに複数提示することで,クエリー楽曲の多角的な解釈に基づいた柔軟な類似楽曲検索が実現される.
水素化脱硫・脱窒素反応を主体とする分子反応工学

水素化脱窒素反応(HDN)は水素化精製の重要なプロセスであり、一般的に担持モリブデン系触媒が用いらている。本研究では、このアルミナ担持モリブデン窒化物を様々な窒化条件(圧力、温度、流量)で調製し、カルバゾールのHDNに対する活性と触媒粒子内外の拡散の影響を検討した。また、各触媒の活性を形成されたモリブデン窒化物種の窒化条件による変化を検討した。カルバゾールのHDN活性(TOF)は活性金属Moが生成する900°C窒化触媒が最大で、700°C窒化触媒(γ-Mo_2Nが主表面種),500°C窒化・還元触媒(MoO_2)の順で低下した。触媒粒子内外の拡散の影響を評価するために、二つの異なる粒子径(da1=1.27mm、da2=0.605mm)を用いてカルバゾールのHDN反応を行った。本反応では、粒子径の比d_<a2>/d_<a1>(=r_<a1>/r_<a2>)は0.48となる。r_1/r_2は反応温度300°Cで0.98、340°Cで1.00、360°Cで1.01であった。触媒粒子間物質移動律速であると仮定した場合(HDN反応速度は触媒の粒子径に反比例)比は0.48となることから、本実験条件ではHDN速度の比は粒子径とは無関係であることが示され、従って、粒子外物質移動は無視し得る。次に細孔内拡散の影響をMadonとBoudartの手法に従って評価した。カルバゾールのHDN速度と表面活性モリブデン種の濃度の関係から、4種類の500°C処理触媒(NH_3流量4l/h,15l/h,NH_3圧5atm,H_215l/h還元)の活性モリブデン濃度とHDN速度は傾き1の直線関係を示し(物質移動,無視)、細孔内拡散の影響は認められない。また、700°Cおよび900°C窒化触媒はこの直線上には載らなかった。これはXPS,XRD,昇温脱離実験の結果から、700°C,900°Cで窒化処理した触媒上には500°C(MoO_2)とは異なるモリブデン種(MoO_2NとMo金属)が存在しているためであり、触媒粒子内の拡散による影響ではないと考えている。
高機能性ヒト用ハイブリッド型人工肝臓の開発と前臨床段階の性能評価

1.ヒト肝不全血漿中におけるブタ肝細胞スフェロイドの機能発現ブタ肝細胞スフェロイドを充填したテスト用灌流培養システム(モジュール体積:18.8cm^3,細胞量:2g,総血漿量:140ml)を使用し,ヒト肝不全血漿中で評価を行った。その結果,肝性昏睡レベルにあるアンモニア濃度を1時間以内に昏睡レベル以下まで減少させ,この機能は少なくとも培養3日間以上維持された。2.温虚血イヌ肝不全モデルによるハイブリッド型人工肝臓の性能評価肝不全イヌによる治療効果の実証のために,生体肝臓の約10%のイヌ肝細胞スフェロイド(30g)を充填したハイブリッド型人工肝臓モジュール(多細管型ポリウレタン発泡体(PUE)充填層,体積:380cm^3)を作製した。本人工肝臓モジュールを含んだ体外循環システムを温虚血イヌ肝不全モデル(体重約15kg)に適用したところ,血中アンモニア濃度の上昇抑制,血糖値の維持などに効果が見られた。また,この結果は現在米国で臨床試験を進めているDemetriouらの人工肝臓と同等かそれ以上であった。3.温虚血ブタ肝不全モデルによるハイブリッド型人工肝臓の性能評価ヒトへの前臨床段階として,ブタ肝細胞スフェロイドを64g充填した人工肝臓モジュール(体積380cm^3×2本)を作製し,体重約25kgの温虚血ブタ肝不全モデルに適用した。その結果,対照群(細胞無)に比べて,延命時間の延長や血中アンモニア濃度の上昇抑制が見られ,本システムの有効性が示された。本研究によって,本システムが肝不全イヌ及びブタの症状改善に有効であることが示された。さらに,ヒト肝不全血漿中においても良好な機能発現ができたことから,本システムはヒト臨床において良好な治療効果を与えることが示された。1.イヌ肝細胞の三次元培養法を利用したハイブリッド型人工肝臓の装置化と最適培養条件の検討ポリウレタンフォーム(PUF)を培養担体として用いることでイヌ肝細胞の三次元培養に成功し、肝特異的機能の維持がはかれるようになった。また多細管型PUF充填層の開発でコンパクトな装置化がはかられ、最適細胞固定化密度に対する知見が得られた。これらの成果をもとにイヌ生体肝臓の10%の細胞量を固定化する人工肝臓として、直径52mm,高さ180mm,体積300cm^3の多細管型PUF人工肝臓モジュールが開発された。またこのモジュールの培養装置として、肝細胞の機能維持に重要なモジュールへの均一な酸素供給に優れた双方向フロー型培養装置(鈴木商館社製、共同研究者)を用い、モジュールのスケールに合わせて一部改造を行った。2.イヌ肝不全モデルの作成と対外循環システムの構築本人工肝臓の適用対象と考えられている急性肝不全(劇症肝炎を含む)のモデルとして、門脈下大静脈吻合温虚血イヌ肝不全モデルの作製に成功した。また既存のヒト用体外循環システムを改造し、本人工肝臓モジュールと組み合わせた体外循環システムを構築した。3.ハイブリッド型人工肝臓のイヌ肝不全モデルへの適用と性能評価本人工肝臓を含んだ体外循環システムをイヌ肝不全モデルへ適用したところ、肝性昏睡の原因物質の一つである血中アンモニアの解毒、血糖値の維持、コリンエンステラーゼなどの血中タンパク質の維持、血圧の維持、腎機能の維持などに本人工肝臓の有効性が示された。またこの結果は現在米国で臨床試験を実施している他研究者の人工肝臓の性能と同等かそれを上回るものであった。1.ブタ肝細胞球状組織体(スフェロイド)の最適培養条件の検討親水性

ポリウレタン発泡体(PUF)と血清添加培養培地(WilliamsE+10%FBS)を用いることによって,ブタ肝細胞スフェロイドの迅速形成(培養1日目)とアルブミン合成やアンモニア代謝などの高機能発現が少なくとも1週間以上良好に維持された。また,テスト用灌流培養システム(モジュール体積18.8cm^3,細胞量2g)を用いて,モジュールの最適装置条件(固定化細胞密度1.0×10^7cells/cm^3-PUF,モジュール内培地線速度6080cm/min)を見出した。2.ブタ用ハイブリッド型人工肝臓補助システムの構築とその性能評価上記の結果をもとに,これまでイヌ用として開発してきた体積380cm^3の多細管PUF充填層モジュールを2本使用し,細胞量約65g(生体肝臓の約10%)のブタ肝細胞を充填したブタ用人工肝臓モジュールを作製した。さらに,既存のヒト用体外循環システムを改造し,本モジュールを組み合わせた人工肝臓補助システムを構築した。本システムを温虚血肝不全ブタに適用したところ,延命時間の延長や血中アンモニア濃度上昇の抑制が達成された。ただし,血中アンモニア濃度を肝性昏睡レベル以下に維持できなかったことから,モジュールスケールアップ基準の見直しなど残された問題はあるが,これらの結果から本システムの治療効果への有効性が示された。3.ブタ肝細胞スフェロイドのヒト肝不全血漿中での機能評価ブタ肝細胞を充填したテスト用灌流培養システムを使用し,ヒト肝不全中で機能評価を行ったところ,肝性昏睡レベルにあるアンモニア濃度を1時間の内に昏睡レベル以下まで減少させた。これによって,本システムがヒト臨床において良好な治療効果を与えることが示された。
一般集団での殺虫剤曝露が健康へ及ぼす影響に関する実験的・疫学的評価

DZNの腹腔内投与によってコントロール群の耐糖能にはなんら影響を与えなかったが、II型糖尿病モデル動物の耐糖能は劇的に悪化した。現在のところ詳細なメカニズムは究明できていないが、DZNがインスリン分泌能を抑制しているわけではないことは明らかとしている。日本人が日常的に曝露しているピレスロイド系殺虫剤の量は、アメリカやドイツで報告されている尿中代謝物レベルと同等であったことから、同等であることが推察される。さらに血中の一酸化窒素代謝物レベルと尿中3PBAレベルに有意な正の相関が検出されたことから、微量の殺虫剤曝露においても酸化ストレスを誘導する可能性を示唆することができた。殺虫剤散布作業を専門とする職域集団を対象とした研究で、殺虫剤を散布していない従業員は他の職域従事者に比べて日常の殺虫剤曝露レベルが高いことが示唆された。殺虫剤の広範な使用によって、日常的にこれらに殺虫剤へ曝露することが考えられる。特に日本は他国よりも農耕地面積あたりの殺虫剤使用量が多いという報告がある(経済協力開発機構、Environmental Performance Reviews Japan)。本年度はヒトへのピレスロイド系殺虫剤の非職業的曝露レベルを把握するために、北海道Y町および愛知県S市で得られた一般生活集団の尿中ピレスロイド系殺虫剤代謝産物である3フェノキシ安息香酸(3-PBA)の測定をガスクロマトグラフ/質量分析計にて実施した。その結果、両群における尿中の3-PBAレベルに有意な差は見られなかった。また、諸外国での報告と比較しても、尿中の3PBAレベルは同等かそれ以下であった。これらの結果より、地方と都会での非職業的なピレスロイド系殺虫剤の曝露レベルに差がないこと、さらには諸外国の曝露レベルともほぼ同等であることが示唆された。2型糖尿病モデル動物を用いて、有機リン系殺虫剤であるダイアジノン(DZN)の毒性実験を行った。その結果、糖負荷試験にて耐糖能を評価した場合、DZNは2型糖尿病モデルラットであるGoto-Kakizakiラットの耐糖能を有意に悪化させた。この現象にはDZNの動態変化、膵臓の組織学的変化、インスリン分泌能の変化は関与しないことを明らかとしたが原因は不明であり、さらに詳細な検討が必要である。前年度はピレスロイド系殺虫剤の非職業的曝露レベルを把握するために、北海道Y町および愛知県S市で得られた一般生活集団の尿中ピレスロイド系殺虫剤代謝産物である3フェノキシ安息香酸(3-PBA)の測定をガスクロマトグラフ/質量分析計にて実施した。本年度はこの結果を国際雑誌であるEnvironmental Researchに投稿・掲載受理された。東海地区における殺虫剤の散布を専門とする職域集団(PCO)を用いて、殺虫剤の職業的曝露レベルを把握する目的で尿中殺虫剤代謝物の測定を用いたバイオモニタリングを行った。その結果、コントロール群に比べて3日以内に殺虫剤を散布した群では有意に尿中殺虫剤代謝物が高値を示した。興味深いことに、PCOの中で殺虫剤を散布していない従業員(事務や営業職など)における尿中殺虫剤代謝物濃度は殺虫剤散布作業者に比べて低い値を示したが、コントロール群よりも高い値を示した。これは散布作業者と共有する場所での間接的曝露、あるいは殺虫剤散布溶液の調整・運搬等に発生すうものであると聞き取り調査から推察された。これらの結果より、殺虫剤を散布する作業者以外の従業員も殺虫剤曝露による健康リスクを考慮する必要があることが分かった。
多能性幹細胞を用いた赤血球輸血製剤の大量安定供給システムの構築

多能性幹細胞を用いて、輸血用赤血球を工業的に大量産生し、安定供給を目指すことを目的とした研究である。以下の4項目に分けて実験を行なっている.[1.ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導].多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への新規の分化誘導方法を開発した.本方法を用いて得られた造血前駆細胞をさらに成人型赤血球へ分化成熟させるべく検討を行った.ヒト栄養欠乏性貧血で認められるサインにヒントを得て、現在の培地組成に不足している栄養素を補い赤血球産生量を増加させることで欠乏因子の重要性を証明した(論文準備中).次に、様々な多能性幹細胞の株間で造血前駆細胞の誘導効率が大きく異なる問題に対して、培養条件による外部環境因子の影響を新たに発見し、特許申請ならびに2018年米国血液学会での発表へと繋げた.[2.不死化赤血球株のプロファイリング].不死化赤血球株を用いて、成人赤血球に特徴的な“脱核"と“グロビンスイッチの完遂"を目的に検討を行った.不死化赤血球株の分化成熟相における明視野MG染色によって観察し、分化成熟の最適化に成功したが、依然、成人型赤血球の条件である脱核・グロビンスイッチは完遂していない.[3.臍帯血由来培養赤血球と多能性幹細胞由来分化培養赤血球の比較].臍帯血由来赤芽球と不死化赤血球株,多能性幹細胞からの分化赤芽球で近しい細胞表面抗原が現れることを確認した.これらを採取し,トランスクリプトーム解析で厳密に比較,臍帯血由来培養赤血球を模倣するためにどのような因子が必要かを解析する.[4.不死化赤血球株の新規バイオリアクターへの適用・応用].不死化赤血球株へバイオリアクターを適用することで脱核やグロビンの変化が起きるかを検討したが,血小板製造のための最適化条件では不死化赤血球はほぼ死滅し維持培養ができないことが明らかになった.今後さらなる条件設定の検討を行う.本実験全体の重要な基礎部分である「ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導法の確立」において新たな発見があり,その解明に予想よりも多くの時間を費やすことが必要だったため全体に遅れが出ているものと考える.具体的には多能性幹細胞の培養条件を整えることによって株間で不均一であった造血前駆細胞の分化誘導効率をコントロールできるという,派生的ではあるが従来の再生医療における一つの問題点を解決するかもしれない重要な発見であった.これについては結果をまとめ鋭意論文執筆中であり,今後は赤血球分化および解析の実験を再開していく.引き続き,多能性幹細胞を用いた赤血球輸血製剤の大量安定供給システムの構築を目的に計画を立て,実験を行う.[1.ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導].本実験開始前で新規に開発した造血前駆細胞の誘導法は従来の分化方法の約100倍の効率で分化生成が可能であった.これに現在はさらに改良を加え,従来法の170倍前後まで効率をあげることに成功している.この方法によって得られた造血前駆細胞を細胞表面抗原を用いて既報の分類方法で分類し赤血球前駆細胞を抽出し,プロファイリングと成人型赤血球への分化方法の検討を行う.[2.不死化赤血球株のプロファイリング].これまでの検証で,不死化赤血球株は赤血球分化過程の最終分化過程をよく模倣するものであると考えられる.このため,既報および自実験の結果を踏まえ,赤血球最終分化に重要とされる因子を加える実験を試みる.[3.臍帯血由来培養赤血球と多能性幹細胞由来分化培養赤血球の比較].トランスクリプトーム解析を行い,臍帯血由来培養赤血球を模倣するための因子を解析する.[4.不死化赤血球株の新規バイオリアクターへの適用・応用].バイオリアクター条件の最適化を進める.具体的には,不死化赤血球株が死滅した原因が環境からのメカノストレスによるものなのか,酸素環境などの化学的な変化によるものなのかなどを一つずつ検証していく.多能性幹細胞を用いて、輸血用赤血球を工業的に大量産生し、安定供給を目指すことを目的とした研究である。以下の4項目に分けて実験を行なっている.[1.ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導].多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への新規の分化誘導方法を開発した.本方法を用いて得られた造血前駆細胞をさらに成人型赤血球へ分化成熟させるべく検討を行った.ヒト栄養欠乏性貧血で認められるサインにヒントを得て、現在の培地組成に不足している栄養素を補い赤血球産生量を増加させることで欠乏因子の重要性を証明した(論文準備中).次に、様々な多能性幹細胞の株間で造血前駆細胞の誘導効率が大きく異なる問題に対して、培養条件による外部環境因子の影響を新たに発見し、特許申請ならびに2018年米国血液学会での発表へと繋げた.[2.不死化赤血球株のプロファイリング].不死化

赤血球株を用いて、成人赤血球に特徴的な“脱核"と“グロビンスイッチの完遂"を目的に検討を行った.不死化赤血球株の分化成熟相における明視野MG染色によって観察し、分化成熟の最適化に成功したが、依然、成人型赤血球の条件である脱核・グロビンスイッチは完遂していない.[3.臍帯血由来培養赤血球と多能性幹細胞由来分化培養赤血球の比較].臍帯血由来赤芽球と不死化赤血球株,多能性幹細胞からの分化赤芽球で近しい細胞表面抗原が現れることを確認した.これらを採取し,トランスクリプトーム解析で厳密に比較,臍帯血由来培養赤血球を模倣するためにどのような因子が必要かを解析する.[4.不死化赤血球株の新規バイオリアクターへの適用・応用].不死化赤血球株へバイオリアクターを適用することで脱核やグロビンの変化が起きるかを検討したが,血小板製造のための最適化条件では不死化赤血球はほぼ死滅し維持培養ができないことが明らかになった.今後さらなる条件設定の検討を行う.本実験全体の重要な基礎部分である「ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導法の確立」において新たな発見があり,その解明に予想よりも多くの時間を費やすことが必要だったため全体に遅れが出ているものと考える.具体的には多能性幹細胞の培養条件を整えることによって株間で不均一であった造血前駆細胞の分化誘導効率をコントロールできるという,派生的ではあるが従来の再生医療における一つの問題点を解決するかもしれない重要な発見であった.これについては結果をまとめ鋭意論文執筆中であり,今後は赤血球分化および解析の実験を再開していく.引き続き,多能性幹細胞を用いた赤血球輸血製剤の大量安定供給システムの構築を目的に計画を立て,実験を行う.[1.ヒト多能性幹細胞からヒト造血前駆細胞への分化誘導].本実験開始前で新規に開発した造血前駆細胞の誘導法は従来の分化方法の約100倍の効率で分化生成が可能であった.これに現在はさらに改良を加え,従来法の170倍前後まで効率をあげることに成功している.この方法によって得られた造血前駆細胞を細胞表面抗原を用いて既報の分類方法で分類し赤血球前駆細胞を抽出し,プロファイリングと成人型赤血球への分化方法の検討を行う.[2.不死化赤血球株のプロファイリング].これまでの検証で,不死化赤血球株は赤血球分化過程の最終分化過程をよく模倣するものであると考えられる.このため,既報および自実験の結果を踏まえ,赤血球最終分化に重要とされる因子を加える実験を試みる.[3.臍帯血由来培養赤血球と多能性幹細胞由来分化培養赤血球の比較].トランスクリプトーム解析を行い,臍帯血由来培養赤血球を模倣するための因子を解析する.[4.不死化赤血球株の新規バイオリアクターへの適用・応用].バイオリアクター条件の最適化を進める.具体的には,不死化赤血球株が死滅した原因が環境からのメカノストレスによるものなのか,酸素環境などの化学的な変化によるものなのかなどを一つずつ検証していく.
歯周病患者末梢血白血球の歯周病原性細菌内毒素に対する応答とTLR2の発現について

歯周炎患者の歯周ポケットからは、多くの歯周病原性細菌が分離され、その細胞壁構成成分は宿主免疫系を活性化する。自然免疫系によるこれら菌体成分の認識機構には不明な点が多かったが、近年、Toll-like receptor (TLR) 4およびMD-2がLPSの認識に、またTLR2はペプチドグリカンやリポプロテイン等の菌体成分の認識に重要な役割を果たしていることが明らかとなった(J. Exp. Med,2001,194,79-88)。我々は、自然免疫系による歯周病原性細菌の認識機構を明らかにするために、TLR2およびTLR4発現レポーター細胞を用い、数種の歯周病原性細菌の炎症性転写因子NF-kB活性化誘導能を比較した。その結果、Actinobacillus actinomycetem-comitans等の凍結乾燥菌体はTLR2発現レポーター細胞とTLR4発現レポーター細胞の両方を活性化するのに対し、Porphyromonas gingivalis等の凍結乾燥菌体はTLR2発現レポーター細胞のみを活性化した(日歯周誌2001、43(秋季特別号)、118)。更に、これらの歯周病原性細菌からLPSを抽出して活性を解析すると、P. gingivalisのLPSは他のLPSによるTLR4依存性の刺激伝達を抑制する効果を有することも明らかとなった(Infet. Immun.,2002,70,218-225)。P. gingivalisのLPSは歯周病患者白血球に対してもTLR4に特異的な抑制作用を示すことから、今後、歯周病患者および健常者末梢血白血球におけるTLR2、TLR4の発現量と上述の歯周病原性細菌LPSで刺激した際の炎症性サイトカイン産生量の関係、さらにこれらが歯周病患者の病型・重症度におよぼす影響について解析を継続していく予定である。歯周炎患者の歯周ポケットからは、多くの歯周病原性細菌が分離され、その細胞壁構成成分は宿主免疫系を強力に活性化する。自然免疫系による細胞壁構成成分の認識機構には不明な点が多かったが、近年、Toll-like receptor(TLR)4がLPSの認識に、またTLR2はペプチドグリカンやリポプロテイン等の菌体成分の認識に重要な役割を果たしていることが明らかとなった(J.EndotoxinRes.6(5),2000,in press)。我々は、自然免疫系による歯周病原性細菌菌体成分の認識機構を明らかにするために、TLR2およびTLR4発現レポーター細胞を用い、数種の歯周病原性細菌の炎症性転写因子NF-κB活性化誘導能を比較した。その結果、Actinobacillus actinomycetemcomitans等の凍結乾燥菌体はTLR2発現レポーター細胞とTLR4発現レポーター細胞の両方を活性化するのに対し、Porphyromonas gingivalis等の凍結乾燥菌体はTLR2発現レポーター細胞のみを活性化した(日歯周誌、42(春季特別号)、76、2000)。更に、これらの歯周病原性細菌からLPSを抽出して活性を解析すると、P.gingivalisのLPSは他のLPSによるTLR4経路の刺激伝達を抑制する効果を有することも明らかとなった(日本免疫学会総会・学術集会記録、30、281、2000)。現在、歯周病患者および健常者末梢血から白血球を分離し、TLR2、TLR4発現量を解析中であり、今後、末梢血白血球におけるTLRの発現量と上述の歯周病原性細菌LPSで刺激した際の炎症性サイトカイン産生能の関係についても検討し、TLR発現量と歯周病患者の病型・重症度との関係を考察する予定である。

P. gingivalisのLPSは歯周病患者白血球に対してもTLR4に特異的な抑制作用を示すことから、今後、歯周病患者および健常者末梢血白血球におけるTLR2、TLR4の発現量と上述の歯周病原性細菌LPSで刺激した際の炎症性サイトカイン産生量の関係、さらにこれらが歯周病患者の病型・重症度におよぼす影響について解析を継続していく予定である。
アデノウィルスベクターを用いた色素性乾皮症の相補群診断法の確立

色素性乾皮症(XP)の診断には、光線過敏症の診断、相補群の決定、責任遺伝子の変異同定の3過程が必要であるが、このうち、予後を予測する上で最も重要な検査は相補群の決定である。XP相補群の診断には各相補群由来細胞のセットと細胞融合技術が必要であり、限られた施設でのみ行われている。迅速で正確な相補群の決定と変異部位の同定は、両親、家族への生活指導と神経症状の重症度を含めた予後予測に必須である。このため、多施設で簡便に検査、診断が行えるシステムの確立が求められている。われわれは、各群のXP遺伝子を発現する組み換えアデノウイルスのセットを作製し、患者由来細胞にウイルスを感染させ紫外線照を行うだけで短時間に容易に相補群を決定できるシステムの確立を行った。8相補群のうち、A・B・C・D・E・Fの6相補群のcDNAをクローニングし全長をシークエンスしてコード領域に変異がないことを確認した。これらのうち、XP-A、XP-B、XP-Dをそれぞれ発現する組み換えアデノウイルスAd-XP-A、Ad-XP-B、Ad-XP-Dを作製した。XP-A遺伝子に異なる変異を有する3株のXP-A患者由来線維芽細胞に、Ad-XP。A、Ad-XP-C、Ad-XP-Dを感染させ、UVB照射実験を行ったところAd-XP-A感染細胞のみUVB照射後の細胞死が抑制された。以上より、アデノウイルスベクターを用いた色素性乾燥皮症の簡便な相補群診断法が確立され、少なくともXP-Aの迅速な遺伝子診断が可能となった。色素性乾皮症(XP)の診断には、光線過敏症の診断、相補群の決定、責任遺伝子の同定の3過程が必要であるが、このうち、予後を予測する上で最も重要な検査は相補群の決定である。日本のXP患者の約50%はXP-Aであるが、約50%は非A群であり、相補群の診断が必要である。迅速で正確な相補群の決定と変異部位の同定は、両親、家族への生活指導と神経症状の重症度を含めた予後の説明に必須である。本研究は、各群のXP遺伝子を発現する組み換えアデノウイルスのセットを作製し、患者由来細胞にウイルスを感染させ紫外線照を行うだけで短時間に容易に相補群を決定できるシステムを確立するものである。8相補群のうち、A、B、C、D、E、Fの6相補群のcDNAをクローニングし全長をシークエンスしてコード領域に変異がないことを確認した。これらのうち、XP-A、XP-C、XP-Dをそれぞれ発現する組み換えアデノウイルスAd-XP-A、Ad-XP-C、Ad-XP-Dを作製した。XP-A遺伝子に異なる変異を有する3株のXP-A患者由来線維芽

細胞に、Ad-XP-A、Ad-XP-C、Ad-XP-Dを感染させ、UVB照射実験を行ったところAd-XP-A感染細胞のみUVB照射後の細胞死が抑制された。以上より、アデノウイルスベクターを用いた色素性乾燥皮症の迅速な遺伝子診断が可能であり、少なくともXP-Aの迅速な遺伝子診断が可能となった。
薬物の肺挙動・肺毒性研究のための肺胞上皮Ⅰ型細胞モデルの開発

ヒト肺胞上皮II型細胞モデルとして汎用されているA549細胞から、限界希釈法によって複数のクローン細胞を得た。得られたクローンの中から、I型細胞に特異的に発現している異物排出ポンプP-glycoprotein (P-gp)の発現・機能の高いA549/P-gp細胞を得ることができた。A549/P-gp細胞では親細胞に比べてP-gpのみならずI型マーカー遺伝子の発現も上昇しており、I型細胞の形質を有するものと考えられた。A549/P-gp細胞を用いて、P-gp機能に及ぼすタバコ煙抽出物(CSE)の影響を解析し、CSEは肺胞上皮細胞のP-gp機能を阻害することを明らかにした。肺胞上皮はI型細胞とII型細胞からなるが、吸入製剤の主たる薬物吸収部位である肺胞表面の90%以上を覆っているのは肺胞上皮I型細胞である。従って、肺からの薬物吸収や薬物の肺毒性を研究する上で、I型細胞は重要なターゲットとなる。しかし現在、広く利用可能な肺胞上皮I型細胞の特性を有するヒト由来株化細胞は知られていない。本研究の目的は、薬物の肺挙動・肺毒性研究の推進のため、新たな肺胞上皮I型細胞モデルを開発することである。初年度の成果は、以下の通りである。1)まずヒト由来肺胞上皮細胞のセルクローニングから検討を開始した。ヒト肺胞上皮モデルとして汎用されているA549細胞を限界希釈法によって播種し、コロニー形成後、クローニングシリンダーを用いてセルクローニングを行った。これまでに、20クローンを得た。2)それらクローンについて、II型細胞に比べI型細胞で発現が高いcaveolin-1などのmRNA発現を親株のA549細胞と比較し、その発現の高いクローンを選別した。3)それらの中で、クローン20(A549/CL20)において、I型細胞に特異的に発現しているとされるMDR1 (P-glycoprotein (P-gp))の高発現が観察された。A549/CL20細胞についてローダミン123の取り込みを指標にP-gpの機能活性を評価したところ、親株では見られなかったP-gp活性が認められた。従って、A549/CL20細胞は、少なくとも肺胞上皮I型細胞のP-gp機能を解析する上で、有用なI型細胞モデルと考えられた。肺胞上皮はI型細胞とII型細胞からなるが、吸入製剤の主たる薬物吸収部位である肺胞表面の90%以上を覆っているのはI型細胞である。平成27年度の成果は、以下の通りである。1)初年度にI型細胞特異的に発現・機能している排出トランスポーターP-glycoprotein(P-gp)の発現・機能が高いA549のクローン細胞(A549/P-gp細胞)を得ることに成功した。A549/P-gp細胞について、肺胞上皮I型細胞のマーカーmRNAおよびII型細胞マーカーmRNAの発現を親細胞のA549と比較検討したところ、I型マーカーは上昇しており、II型マーカーは変化が認められなかった。従って、A549/P-gp細胞ではI型細胞としての形質が親細胞に比べて高いものと考えられた。2)肺胞上皮I型細胞は、II型細胞に比べて扁平の上皮であり、1個の細胞の表面積は広く厚さは薄い細胞であることが、大きな形態的特徴である。しかし、A549/P-gp細胞の形態は、親細胞と同様であった。我々の研究室では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるphenylbutyrate (PBA)を別の研究目的で用いていたが、偶然、細胞が扁平化することを他の細胞で認めた。そこで、A549/P-gp細胞をPBAで処置したところ、I型細胞と類似した扁平状の形態に変化した。I型細胞特異的に発現・機能しているP-gpの発現・機能が高いA549/P-gp細胞は、肺胞上皮におけるP-gp研究に適した細胞であるとともに、他の遺伝子発現においてもI型形質が高まっていることが明らかになった。さらにこの細胞をphenylbutyrateで処置することで、細胞形態の面でもI型細胞に近づけることができた。これらの結果は、I型のモデル細胞の樹立に向けて有望な結果と考える。最終年度の成果は、以下の通りである。1)排出トランスポーターP-glycoprotein(P-gp)は、肺胞上皮ではI型細胞に存在する。

本研究で我々が樹立したP-gpの発現・機能が高いA549/P-gp細胞を用いて、P-gp機能に及ぼすタバコ煙抽出物(CSE)の影響を解析した。その結果、CSEは初代培養I型細胞およびA549/P-gp細胞のP-gp機能を阻害することが明らかとなった。これらの研究を通じて、I型細胞特異的に発現・機能しているP-gpの発現・機能が高いA549/P-gp細胞を樹立し、それを具体的な研究に活用することでI型細胞モデルとしての有用性を示すことができた。ヒト肺胞上皮II型細胞モデルとして汎用されているA549細胞から、限界希釈法によって複数のクローン細胞を得た。得られたクローンの中から、I型細胞に特異的に発現している異物排出ポンプP-glycoprotein (P-gp)の発現・機能の高いA549/P-gp細胞を得ることができた。A549/P-gp細胞では親細胞に比べてP-gpのみならずI型マーカー遺伝子の発現も上昇しており、I型細胞の形質を有するものと考えられた。A549/P-gp細胞を用いて、P-gp機能に及ぼすタバコ煙抽出物(CSE)の影響を解析し、CSEは肺胞上皮細胞のP-gp機能を阻害することを明らかにした。これまで株化培養肺胞上皮細胞でP-gpの発現や機能を明確に示した例は少なく、A549細胞においてもコンセンサスは得られていなかった。今回得たA549/CL20細胞は明確なP-gp機能を示したことから、肺胞上皮I型細胞の機能解析に有用なモデルと期待される。一方、I型化を推し進める因子の探索も平行して行っているが、今のところ明確にI型細胞化を誘導する因子は見つかっていない。phenylbutyrate処置によってA549/P-gp細胞が扁平化したが、その形質については未だ不明であるため、親細胞や未処置のA549/P-gp細胞と比較しながら解析を進める。またこれら細胞を用いて、薬物の輸送や外因性物質の毒性を解析し、I型細胞モデルとしての有用性を検証する。生物薬剤学今後は、I型化を促進する可能性のある因子(TGF-β1、insulin-like growth factor-I、c-Jun N-terminal kinase阻害剤など)について、さらに検討を進める。また、初年度に得られたA549/CL20細胞を用い、P-gpの発現・機能調節の解析に活用できるか検証するとともに、本細胞の構造的特徴やP-gp以外の機能的特性についても解析を進める。また、I型細胞に特異的に発現している遺伝子を導入することで培養肺胞上皮細胞の形質制御(I型化)を試みる予定だが、まず導入に適した遺伝子候補について最新の情報を収集・整理し選択する。初年度に得たI型細胞特異的に発現・機能している排出トランスポーターP-glycoprotein(P-gp)の発現・機能が高いA549のクローン細胞(A549/P-gp細胞)を中心にその特性を解析し一定の成果を得たが、その有用性の検証に当初の想定よりも時間がかかった。また、I型化を進める可能性のある化合物として細胞形態への作用から偶然phenylbutyrateを見出したが、さらに広く検討するには至らなかったため、化合物購入用予算に一部繰越が生じた。新たな肺胞上皮I型細胞モデルを開発するにあたり、まずヒト由来肺胞上皮細胞A549のセルクローニングから検討を開始した。これまでに、20クローンを得て、またその中にI型細胞に特異的に発現しているとされるMDR1 (P-glycoprotein)を高発現しているクローン(A549/CL20細胞)を見出した。
Anaphase−promoting Complex（APC）の活性制御機構

蛋白分解は細胞周期進行に重要な意味を持つことがわかってきた。特に、分裂期における時期特異的、基質特異的蛋白分解機序に関してはここ数年Cell、Nature、Scienceと言った一流誌を賑わしている。Anaphase-promoting complex(APC)はCut2/Pds1や分裂期Cyclinをユビキチン化し、分裂期進行を調整する分子量1500kDa以上のユビキチンリガーゼ複合体である。我々は、Plkの特異的リン酸化によってAPCは活性化し、逆にPKAにより不活化することを報告した(Molecular Cell,1,371-380,1998)。最近、酵母の遺伝学的解析からCdc20、Hct1/Cdh1といったWD-repeat蛋白がAPCの基質特異性を規定していることが示唆された。しかし、これら蛋白群とリン酸化による制御の関係についてははっきりしていない。そこで今年度はこれらWD-repeat蛋白と時期特異的リン酸化が、どの様にAPCの活性化に関与しているかを明らかにすることを目的とした。まず、ヒトHct1/Cdh1のホモログ(Fzr)を単離し、Cdc20ホモログであるp55CDC/Fzyと共に、Cyclin BやCut2をAPCによる特異的ユビキチン化基質として、リン酸化による制御を含めてAPCの活性制御機序を検討した。In vitroでFzy、FzrはCdc2/Cyclin B(MPF)によりリン酸化される。MPFによりリン酸化したFzyを、精製したS期APCに加えるとCyclin B、Cut2の両者を十分にユビキチン化させる活性を持つが、非リン酸化型は活性はなかった。ところが、Fzrは非リン酸化型が活性化型であり、リン酸化によってAPCと結合できなくなることもわかった。Fzr依存によるAPCの活性化ではCut2はユビキチン化されなかった。また、Mad2はFzyを抑制するが、Fzrには効果がなかった。さらに、活性化型のFzy、FzrをPlkによってリン酸化したAPCに加えた場合、相乗効果を示すが、PKAでリン酸化したAPCに加えると活性がなくなった。以上よりAPCはリン酸化による制御とFzy、FzrといったWD-repeat蛋白群による基質及び時期特異的制御を受けており、その効果は両者間で相乗的であることがわかった。