hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｂリンパ球に発現するシグレックとその糖鎖リガンドについての研究

Siglecファミリーの分子は種々の免疫細胞に発現し、シアル酸を認識して主に細胞の活性化を抑制する。本研究では、Siglecの1つCD22が糖鎖依存的に結合する同じ細胞上の分子(シスリガンド)を、近傍の分子を標識する手法を用いて同定した。ついで、CD22のシスリガンドCD45の機能解析により、シスリガンドによるSiglec制御の本態を明らかにした。さらに、シアル酸含有糖脂質ガングリオシドへの自己抗体を伴うギラン・バレー症候群に関連するSiglec-10多型の解析により、Siglec-10の機能低下がガングリオシドへの免疫応答を誘導し、本症候群の発症に関わることが示唆された。Siglecファミリーの分子はシアル酸を認識し、種々の免疫細胞に発現して主に抑制性の機能を持つ。Siglecは同じ細胞に発現するリガンド(シスリガンド)と構成的に会合することが示されているが、シスリガンドの役割に不明な点が多い。そこで、野生型B細胞およびCD22の特異リガンドであるα2,6シアル酸の産生に必須のシアリルトランスフェラーゼST6GalI欠損B細胞に我々が開発したCD22(Siglec-2としても知られる)結合シアル酸誘導体を作用させたところ、野生型B細胞ではBCR架橋によるシグナル伝達が抑制されたが、ST6GalI欠損B細胞では抑制されず、BCR架橋の際にシスリガンド発現分子がCD22を制御することが明らかとなった。シアル酸誘導体によりTLRリガンドによる野生型B細胞の活性化が増強するが、ST6GalI欠損B細胞ではTLRリガンドへの応答性が増強しており、この応答がシアル酸誘導体によりさらに増強することが明らかとなった。この結果は、TLRリガンドへの応答の際には、シスリガンド発現分子がCD22を制御するとともに、リガンドがCD22に結合することによりCD22の機能が抑制されることを示し、リガンドによるCD22の制御にはシスリガンド発現分子による制御とリガンドがCD22に結合することによる直接作用の2つのメカニズムがあることが明らかとなった。さらに、CD45欠損B細胞にシアル酸誘導体を作用させた際には、野生型B細胞で観察されたBCR架橋時のシグナル伝達抑制が解除されることが明らかとなり、CD45がCD22を制御する主要なシスリガンド発現分子であることが示唆された。我々が開発したCD22(Siglec-2としても知られる)結合シアル酸誘導体を作用させることで抑制性受容体CD22へのシスリガンドの作用を阻害するとBCR架橋によるシグナル伝達が抑制されたことから、シスリガンドがCD22の作用を抑制することでBCRシグナル伝達を増強することが明らかとなった。CD45は多量の糖鎖修飾を受けているために、CD22のシスリガンドの候補であった。実際に、我々はCD22とCD45が細胞表面上で会合していることをPLA法より明らかにしたCD45欠損B細胞ではCD22の抑制性機能に必須のCD22のリン酸化やチロシンフォスファターゼSHP-1との会合が低下しており、CD45がCD22の機能に必須であることが明らかとなった。しかし、シアル酸誘導体存在下では、CD22のリン酸化およびSHP-1との会合は、CD45欠損B細胞でも野生型B細胞と同様に認められたことから、CD22の機能を抑制するシスリガンドはCD45ではないことが明らかとなった。一方、BCR架橋なしにシアル酸誘導体のみでB細胞を処理すると細胞内Ca2+濃度が上昇することから、シスリガンドが静止状態のB細胞でのシグナルレベル(トニックシグナル)を制御することが明らかとなり、さらに、CD45欠損B細胞では化合物によるトニックシグナルの上昇が亢進していたが、CD22の糖鎖リガンドを欠損するST6GalI欠損B細胞ではトニックシグナルの変化が起こらなかったことから、CD45がシスリガンドとしてCD22を制御することでB細胞のトニックシグナルを制御することが明らかとなった。本研究では当初CD45がBCR架橋時にシスリガンドとしてCD22を制御することを示唆する知見が得られていたが、これは、この知見はCD45がCD22の抑制性機能に必須であるためで、CD45がシスリガンドとして機能しているためではないことが明らかとなった。CD45がCD22の抑制性機能に必要であるという知見は、これまでの報告とは異なり、新知見である。一方、CD45がトニックシグナル制御の際にCD22のシスリガンドとして機能することを明らかにし、当初の想定とは異なる形ではあるが、CD45がCD22のシスリガンドとして働くことを明らかにしたことで、目的を達成することができた。糖鎖とレクチンの反応は一般に弱いため、通常の方法でリガンド結合を同定するのはしばしば困難である。

そこで、チラミドを用いたProximity label法により解析を行い、IgM, CD22およびCD45がCD22に糖鎖依存的に会合していることを明らかにし、これらがシスリガンドであることを証明した。CD45によるCD22の機能制御にについての解析を行なったところ、CD45がCD22の機能に必須であることが明らかとなったが、CD22の機能を抑制する主なシスリガンドではないことが明らかとなった。一方、BCR架橋なしにシアル酸誘導体のみでB細胞を処理すると細胞内Ca2+濃度が上昇するが、CD45欠損B細胞では化合物による細胞内Ca2+濃度の上昇が亢進していた。このことから、CD45がシスリガンドとしてCD22を制御することでB細胞のトニックシグナルを制御することが示唆された。また、また、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシドへの自己抗体産生がおこるギラン・バレー症候群においてSiglec-10遺伝子に変異が集積していることを明らかにしている。組み換えSiglec-10タンパク質の産生を試み、数種の異なるコンストラクトを試すことで、ようやく組み換えSiglec-10タンパク質の産生に成功した。本研究では当初CD45がBCR架橋時にシスリガンドとしてCD22を制御することを示唆する知見が得られていたが、これは、この知見はCD45がCD22の抑制性機能に必須であるためで、CD45がシスリガンドとして機能しているためではないことが明らかとなった。CD45がCD22の抑制性機能に必要であるという知見は、これまでの報告とは異なり、新知見である。一方、CD45がトニックシグナル制御の際にCD22のシスリガンドとして機能することを明らかにし、当初の想定とは異なる形ではあるが、CD45がCD22のシスリガンドとして働くことを明らかにしたことで、目的を達成することができた。また、ギラン・バレー症候群で集積するSiglec-10の変異についての解析を行うために組み換えSiglec-10タンパク質の産生を試みてきたが、種々のコンストラクトを試すことでようやく組み換えSiglec-10タンパク質の産生に成功した。Siglecファミリーの分子はシアル酸を認識し、種々の免疫細胞に発現して主に抑制性の機能を持つ。Siglecは同じ細胞に発現するリガンド(シスリガンド)と構成的に会合することが示されているが、シスリガンドの役割に不明な点が多い。CD22は主にB細胞に発現し、特異的に糖鎖リガンドα2,6シアル酸を認識する。α2,6シアル酸を欠損するST6GalI欠損マウスおよびCD22の高親和性リガンドを欠損するCmah欠損マウスB細胞のシグナル異常についての解析を行い、α2,6シアル酸を欠損すると、辺縁帯B細胞への分化が減弱しIgM発現量の少ない濾胞B細胞への分化が増強するなどトニックシグナルの増強が認められた。さらに、CD22に高親和性に結合するシアル酸誘導体によりB細胞のCaイオン濃度が変化した。これらの結果から、CD22シスリガンドがB細胞トニックシグナルを制御することが明らかとなった。さらに、この制御がBCR架橋時の制御と正反対の制御であったことから、シスリガンドによるCD22の制御がBCRシグナル伝達によって制御されることが明らかとなり、新たなモデルを提唱した。
筋内脂肪のエネルギー代謝機序の解析－筋線維タイプによる脂肪合成・取込能の差異－

遅筋と速筋に発現する脂質代謝関連遺伝子を網羅的に解析し、その発現量の比較を行った。遅筋モデルとしてsoleus、速筋モデルとしてEDLを用い、各々の筋組織からRNAを抽出・処理した後、次世代シーケンサーを用いたRNA-Seq解析に供した。得られたデータセットの品質評価・マッピング・発現量の正規化を行い、遅筋(soleus)と速筋(EDL)に発現する遺伝子の差異について検討した。遅筋と速筋それぞれに発現する全ての遺伝子を比較した結果、558個の遺伝子について有意な発現量の差異が認められた。そのうち遅筋における発現が多い遺伝子は230個であり、遅筋タイプの筋線維マーカーであるMyHC1をはじめ、β酸化・TCA回路関連遺伝子を中心に有意に発現量が高かった。速筋における発現が多い遺伝子は228個であり、糖代謝に関わる遺伝子発現量が有意に高いことが分かった。遅筋に多く発現する脂質代謝遺伝子について詳細に解析した結果、脂質酸化系に関連する遺伝子だけでなく、脂肪酸取込に関わるCD36 (fatty acid translocase)および、トリグリセリド合成に関わる遺伝子についても有意に多く発現していた。これらの脂質合成系の遺伝子発現量の増加はreal time RT-PCRにおいても認められた。したがって、当初の推測通り、遅筋においては、酸化によるエネルギー燃焼を行いつつ合成系の働きも亢進しエネルギー枯渇を防いでいることが示唆された。当初の研究計画では、脂肪酸取込に関わるCD36、脂肪酸合成に関わるDGAT1(あるいはDGAT2)など数種のキーとなるタンパク質について遅筋と速筋における動態を調べる予定であった。しかしながら、初期の計画にはなかったRNA-Seq解析を用いたことで、上記のタンパク質を合成する遺伝子をはじめとして、遅筋に多く発現するその他の脂質合成関連遺伝子の存在が複数挙がってきたことは非常に大きな収穫であったと考えている。本年度遂行したRNA-Seqにより、遅筋および速筋における遺伝子発現の大まかな差異はつかめたので、今後はH24年度に確立した4種類のミオシン重鎖アイソフオームの分類手法を利用して、より詳細に脂質関連遺伝子の差異について検証していく予定である。骨格筋は生体最大のエネルギー消費器官であり、そのエネルギー代謝調節、特に脂肪代謝調節機構の解明が肥満解消に最も重要であると考えられる。脂肪酸の正味消費量は、酸化分解とトリグリセリド合成(脂肪合成),の収支で決まるため、合成経路の理解は不可欠であるが、「脂肪合成」の調節機構はほとんど分かっていない。代謝機序の全体像を理解するためには、酸化・合成の両面から作用機序を調べる必要がある。本研究では骨格筋の「脂肪合成・蓄積能力」に焦点を当て、筋線維タイプの差異に応じた脂肪酸取込・脂肪合成活性・蓄積能の差異、また、脂肪合成・蓄積においてキーとなるタンパク質を明らかにすることを目的とする。初年度では、筋線維タイプ(1,2A,2X,2B型)を分類・明視する実験系構築のため、各筋線維タイプのミオシン重鎖アイソフォームを識別するラットモノクローナル抗体をそれぞれ作製した。各々の抗体上清を用いて、マウス骨格筋横断切片(soleus、plantaris、gastrocnemiusを含む)の免疫組織染色を行ったところ、各ミオシン重鎖アイソフォーム特異的な染色像が得られた。この結果は、作製した抗体が筋線維タイプを正確に識別していることを示している。現在、筋線維タイプを明視するため、各精製抗体と標識キットを用いた条件検討を行っている。また、並行して、筋内脂肪量を評価するための予備実験を行った。単離直後の筋線維をNile redおよびBODIPY493/503にて染色し、脂肪滴の染色および存在を確認した。さらに、マウス骨格筋線維を生体外で培養するため、培養条件の最適化を試みた。その結果、細胞外マトリクス分解酵素は、単独で使用するよりも複数の酵素を組み合わせることでその効果が飛躍的に高まり、生存率の向上につながることを見出した.本年度(2年目)は、前年度に作出した4種のミオシン重鎖(MyHC)アイソフォーム特異的な抗体に酵素標識(あるいは蛍光標識)を施し、それぞれの抗体を視覚的に識別する分類手法を確立した。酵素抗体染色については、1次抗体に酵素を標識し基質と反応させ、4種の筋線維タイプを個別に発色させることに成功した。蛍光抗体染色については、1次抗体に蛍光物質(647,594,500,405nm)をそれぞれ標識し(α-MyHC1-647nm,α-MyHC2A-594nm,α-MyHC2X-500nm,α-MyHC2B-405nm)、これらを個別に用いて蛍光抗体染色が可能であることを確認した。さらに、4種の蛍光標識1次抗体を混合して免疫染色を行うことにより、1枚の切片上で4種それぞれのアイソフォームを視覚的に識別することを可能にした。現在、この分類手法を利用して単離直後の筋線維(生細胞)をタイプごとに分取することを試みている。分取された筋線維から得られたRNAをRNA-Seqに供し、筋内脂肪蓄積および合成に関わる因子を探索する予定である。RNA-Seqにより得られた膨大なデータセットの解析手法を習得するため、7月から9月まで2ヶ月間、イギリスの欧州分子生物学研究所-欧州バイオインフォマティクス研究所(EMBL-EBI)に留学し研修を行った。また、筋内脂肪量の差異を評価するため、単離直後の筋線維をBODIPY493/503にて染色し、脂肪滴の存在を確認した。

筋線維によっては脂肪滴をほとんど有していないものも存在しており、系をさらに最適化し定量評価を実施することにより、筋線維タイプと筋内脂肪の蓄積状態において相関の有無が明らかになると期待される。遅筋と速筋に発現する脂質代謝関連遺伝子を網羅的に解析し、その発現量の比較を行った。遅筋モデルとしてsoleus、速筋モデルとしてEDLを用い、各々の筋組織からRNAを抽出・処理した後、次世代シーケンサーを用いたRNA-Seq解析に供した。得られたデータセットの品質評価・マッピング・発現量の正規化を行い、遅筋(soleus)と速筋(EDL)に発現する遺伝子の差異について検討した。遅筋と速筋それぞれに発現する全ての遺伝子を比較した結果、558個の遺伝子について有意な発現量の差異が認められた。そのうち遅筋における発現が多い遺伝子は230個であり、遅筋タイプの筋線維マーカーであるMyHC1をはじめ、β酸化・TCA回路関連遺伝子を中心に有意に発現量が高かった。速筋における発現が多い遺伝子は228個であり、糖代謝に関わる遺伝子発現量が有意に高いことが分かった。遅筋に多く発現する脂質代謝遺伝子について詳細に解析した結果、脂質酸化系に関連する遺伝子だけでなく、脂肪酸取込に関わるCD36 (fatty acid translocase)および、トリグリセリド合成に関わる遺伝子についても有意に多く発現していた。これらの脂質合成系の遺伝子発現量の増加はreal time RT-PCRにおいても認められた。したがって、当初の推測通り、遅筋においては、酸化によるエネルギー燃焼を行いつつ合成系の働きも亢進しエネルギー枯渇を防いでいることが示唆された。本研究遂行において、筋線維タイプの分類は必要不可欠なものである。当初の計画では、その分類に購入抗体を利用する予定であったが、検討の結果、明確な分類ができないと判断し、抗体作製を速やかに実施した。この成果により、永続的な特異的抗体の入手が可能になった。併せて、培養系の最適化や筋内脂肪量の評価系の検討など、研究遂行の核となる技術について初年度でほぼ整備できた。従って、計画に完全に沿ってはいないものの、おおむね順調に計画が進展していると評価できる。本研究計画において、筋線維タイプの分類が必要不可欠であるが、前年度に作出した1次抗体に蛍光物質を標識することにより、当初の計画通り、迅速かつ簡便な筋線維タイプ同定法が確立できた。この成果は次年度以降の検討を行う上で非常に有益な進捗であったと言える。また、RNA-Seq解析のためにEBML-EBIにてバイオインフォマティクスの基礎を学べたことも大きな成果であった。当初の研究計画では、脂肪酸取込に関わるCD36、脂肪酸合成に関わるDGAT1(あるいはDGAT2)など数種のキーとなるタンパク質について遅筋と速筋における動態を調べる予定であった。しかしながら、初期の計画にはなかったRNA-Seq解析を用いたことで、上記のタンパク質を合成する遺伝子をはじめとして、遅筋に多く発現するその他の脂質合成関連遺伝子の存在が複数挙がってきたことは非常に大きな収穫であったと考えている。今後の研究推進方策として、抗体標識方法を検討し、各筋線維タイプを同定する手法を確立させることが急務とされる。
複合絶縁系の接触界面を横切るキャリア輸送機構の研究

近年、電気、電子機器・部品の小型化に伴って複合絶縁材料に加わる電界が益々高くなりつつある。この複合絶縁系には、多くの界面が存在しており、これが複合絶縁系の界面での電子性電荷の交換率に非対称特性をもたらす。本研究ではこの非対称性を、複合系を構成する高分子の電子レベルに基づいて解明するため、それらを評価する手法の確立を目指した。そこで、複合絶縁系を構成する各種高分子の電子レベル(フェルミレベル、イオン化ポテンシャル、電子親和力あるいは電子やホールの実効的な伝導レベル)を各種の手法(ケルビン法、XPS(X線光電子分光法)、大気中UPS(紫外線光電子分光法)、光キャリア注入法等々で評価した。従来、絶縁性高分子の電子状態と帯電性に関する研究はなされてきたが、絶縁性高分子の電子性伝導と電子状態との関係、各種手法から得られる電子性準位相互の関連性については検討がなされてこなかった。本研究では、電子性準位相互の関連性、特に電子性キャリアの実効的な伝導レベルと価電子帯との関連について詳細に検討した。次に、熱やUV光によって変化させた絶縁性高分子表面の電子状態と高分子の化学構造やフェルミレベルとの関連について調べて考察した。さらに、複合積層モデルシステムを作製して複合系の接触界面を横切るキャリア輸送と複合系を構成する各材料の電子レベルとの関連について電導特性に基づいて検討した。また、ケルビン法が絶縁性高分子の熱劣化機構やUV劣化機構の解明に有効であることも指摘した。本研究は、複合絶縁系の電導の非対称性をはじめ、界面での電子性キャリアの電荷交換過程を解析して高電界用複合絶縁材料を開発するため必要な電子レベルの評価法の確立に貢献できたものと思われる。複合絶縁系では、界面での電荷交換がキャリアの移動方向、温度、印加電界、キャリア種によって複雑に変化するなど、構成する材料の電気的特性が界面の効果によって隣接する材料の影響を受けることがある。こうした電導の非対称性はPE-EVA、PS-PMMA、アルミナーEpoxy、シリカ-Epoxyなど広く複合絶縁系に見られる現象であるが、その原因については十分に明らかになっていない。これら複合絶縁系の界面電気物性を理解することは、高電界用複合絶縁材料の開発に不可欠であると考えられる。本研究では、こうした複合系の電導の非対称性の原因を複合系を構成するポリマーの電子レベルに基づいて明らかにするため、それらを評価する手法の確立を目指している。今回、XPS、大気中紫外線光電子分光法(大気中UPS)、光注入電流法、ケルビン法などを用い、ポリビニルピリジン(PVP)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン(PS)、ポリビニルカルバゾール(PVK)など各種ポリマーの電子レベルを推定した。その結果、ポリマー表面への水分や気体分子の吸着、不純物の付着、あるいは固体構造の変化などによりポリマー表面の電子状態は容易に変化することが明らかとなった。また、各種ポリマーのイオン化ポテンシャルIpをXPSの価電子帯スペクトルの第1ピークの立ち上がりから得られた結合エネルギーにケルビン法で評価した仕事関数を加えて推定した。PVKの場合、光注入電流法によって求まるホールの実効的な伝導レベルは価電子帯上端のレベルIpと一致するが、PSの場合、一致しない。さらに、大気中UPSによってPSやPMMAの帯電や接触電位差に寄与する電子レベルが評価できることがわかった。こうして求めた電子レベルの評価法を各種有機デバイスに適用した。この原因を解明するには複合系を構成する絶縁性高分子の電子レベルの評価法を確立する必要がある。

今回は、これまでに検討してきた評価法の内、ケルビン法の有効性について検討するため、基準となるAuと絶縁性高分子との接触電位差に及ぼす高分子の膜厚の影響、また、高分子の劣化要因であるUV光や熱がその表面状態に及ぼす影響についてAuに対する高分子薄膜の表面電位を測定して調べた。PVP(ポリビニルピリジン)の場合、接触電位差は正で膜厚の増大に伴って大きくなり、55nm付近より一定(+0.44V)となった。一方,PVK(ポリビニルカルバゾール)の場合、接触電位差は負で膜厚の増大に伴い負方向に大きくなり、約160nmより一定(-0.37V)となった。このように、材料の種類によってフェルミ準位とAuと高分子膜との間の電子の授受領域が異なる。次に、接触電位差に対する熱の影響について調べた。PVP、PVKともに200°Cの熱処理によって仕事関数がそれぞれ0.28eV、0.07eV増大することがわかった。これはIRスペクトルの吸収ピークの増大と対応している。このように加熱により高分子の化学構造が変化して、そのフェルミ準位を変化させることがわかった。更に、接触電位差に対するUV光の影響について検討した。PVPの接触電位差はUV光の照射時間の増大につれて小さくなった。一方、PVKの接触電位差はAuに対し負方向に小さくなり、照射時間が10分を経過すると一定となった。UV光照射によりPVPの仕事関数は照射10分後に0.08eV大きくなり、PVKの仕事関数は逆に0.11eV小さくなることがわかった。これもIRスペクトルより分子構造の変化と対応していた。以上、ケルビン法は、高分子の電子レベルの評価法として、特に、高分子の紫外線劣化、熱劣化の解析手法として有効であることが明らかとなった。
器官形成におけるNotchシグナルの機能とその分子基盤の統合解析

Notchシグナルは進化上保存された細胞間シグナル伝達経路であり、多様な組織の発生に関わっていることが知られている。本研究では、ゼブラフィッシュを用い、リガンドおよびNotch受容体の生理機能、活性制御機構を解析した。その結果、Mib1-Jagged1-Notchシグナルによる脊索細胞の運命決定と脊索の機能制御やNLKによるNotch1タンパク質のリン酸化修飾を介したNotch転写活性複合体形成阻害制御メカニズムを明らかにした。Notchリガンドの器官形成における生理機能解析1)deltaリガンドの神経発生期における機能:ゼブラフィッシュdeltaA,deltaDの発生期における発現パターンをIn situ hybridization法によって、解析した。両遺伝子とも、神経系においては、神経管脳室帯近辺に発現し、受精後2日目をピークに3日目には、神経管内での発現は、減少し、一部限局するのみであった。タンパク質レベルでも、抗deltaA抗体を用いてdeltaA蛋白の発現を確認したところ、同様の1日目から2日目への発現増加が認められた。このことは、神経形成が2日目をピーク行われることを示唆する。一方、グリア細胞は2日目以降、増加し、神経細胞産生からグリア細胞産生へのスイッチとNotchシグナルとの関係が示唆された。deltaA変異体、deltaD変異体の神経細胞の分化異常を各変異体で比較したところ、deltaA,deltaDで、ともに神経過剰形成とそれに伴う、神経幹細胞の減少が認められた。さらに、deltaA,deltaD二重変異体を作成し、同様の解析を行ったところ、2重変異体では、それぞれ単独の変異体より重篤な表現型が認められた。このことより、神経幹細胞の維持に、deltaAとdeltaDが協調的に働くことが示唆された。2)Jaggedリガンドの脊索形成における機能:ゼブラフィッシュjaggea1a,jagged1bの機能阻害では、脊椎骨の形成以前に中軸構造を維持する脊索を構成する液胞細胞が増加する。さらに解析を進めたところ、脊索細胞の液胞細胞の周りに存在する基底膜が形成不全であること、その構成成分であるコラーゲンタンパク質が減少し、基底膜形成タンパク質に重要な小胞体を含む細胞数が減少することが明らかとなった。このことから、Jaggedが基底膜産生細胞の数を増加させる働きがあると考えられた。高等生物でのNotchシグナルの生理機能とその分子機構は、複数リガンド・受容体の存在やそれらの発現場所・時期・活性の複雑な調節機構の存在のため、不明な点が多く残されている。本研究では、Notchリガンド機能に焦点をあて、個体における生理機能を明らかにする。そのため、モデル動物として、脊椎動物であるゼブラフィッシュを用いることで、初期発生での複数のリガンドの機能解析を行った。脊索は脊椎動物共通の発生過程で一過性に生じる中軸構造である。本年度は、MibによるJaggedのユビキチン化を通じたJagged-Notchシグナル活性化が、液胞細胞と非液胞細胞の分化を調節し、その調節によって、脊索の周囲に存在する筋組織形成誘導に関与する事を解明した。2)Deltaによるfilopodia誘導機構とその生理機能の解明本年度は、Delta1の強制発現が、filopodiaの形成を促すメカニズム解析を行った。その結果、a)Delta1によるfilopodia形成誘導に、Notchシグナル活性化は関与しない事、b)Delta1の細胞膜直下のアミノ酸領域が重要である事、c)Deltaがゼブラフィッシュ神経細胞の移動に関与する事、などを明らかにした。3)Mibによるリガンドの活性化機構解析Mib1によるDelta1のユビキチン化修飾はNotchとの結合やバルクのDeltaのエンドサイトーシスのステップに関与せず、トランスエンドサイトーシスによって引き続き起こるNotch細胞外ドメインと結合したDelta1の細胞内輸送を制御していることが示唆された。多細胞生物の発生や恒常性維持には、細胞間シグナル伝達が重要である。中でもNotchシグナル伝達は膜タンパク質のリガンド・受容体による細胞間情報伝達を特徴とする。Notchリガンド活性の調節機構については、これまでにユビキチンリガーゼMind bomb1 (Mib1)がNotch受容体のリガンドであるDelta1の細胞内領域をユビキチン化し、Notchシグナルを正に制御することが知られている。しかし、Mib1がNotchシグナル活性化をもたらす機構については不明な点が残されている。本年度の解析により、Mib1がNotch細胞外ドメインと結合したDelta1の初期エンドソームへの輸送またはそれ以降の細胞内輸送がNotchシグナルの活性化に重要であるということを明らかにした。他方、Notchリガンド機能に焦点をあて、個体組織形成における未解明の生理機能を明らかにするため、脊椎動物神経管においてV2-IN progenitors (p2)から興奮性V2a-IN、抑制性V2b-INの二種類への神経分化過程を解析した。

これまでにp2の維持とV2a-IN /V2b-IN細胞の運命決定の二箇所にNotch signalingが関与する事が知られていたが、どのNotch ligandを活性化し、どのNotch receptorにシグナルを送る事によって、progenitorの維持と細胞の運命決定という2つの事を制御しているのかは分かっていなかった。本年度は、p2の維持には、Mibを介したDeltaA/DeltaDの活性化が重要である一方、V2a-IN /V2b-IN細胞の運命決定には、DeltaA/DeltaDは重要な役割は持っていないことを明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。
赤血球膜タンパク質band3の構造解析

Band 3タンパク質は真核生物においてのみ保存されているアニオントランスポーターであり、主な機能として赤血球膜上では外の塩素イオンと内の炭酸イオンの交換を行っている。このアニオントランスポーターの機能はこのband3蛋白質の膜貫通ドメインがイオン分子を認識することによるダイナミックな構造変化が関わっており、band3分子の構造がその機能に深くかかわっていることを示している。本研究の目的はBand3の研究を基盤としたポリトピック型アニオントランスポーターの構造またそれに伴った機能の解明である。そのため我々は具体的に以下のような目的をもって研究を行った。1)Band3タンパク質の立体構造解析、2)膜貫通領域peptideの存在状態、3)赤血球膜の老化に伴うタンパク質の構造変化、以上である。1)に関しては、高濃度に精製できる条件、結晶化条件を検討し、現在、低分解能ながら3次元結晶化条件を決定した。今後もさらに分解能を上げるべく条件検討を行っていく。また2)、3)に関しては、赤血球膜タンパク質バンド3のほとんどすべての膜貫通領域(gly361val911)のトリプシン消化ペプチドを高感度なMALDI-TOF/MSとLC/MSを利用し、簡便に検出できる系を確立した。その際に、赤血球膜の老化に関わる一つの因子であるメチオニンの酸化をLC/MSを用いて定量的に検出できる方法も確立した。さらに化学修飾とBand3タンパク質のペプチドの検出方法を利用し、アニオントランスポート活性に必須なアミノ酸を同定した。さらにこのペプチドの検出方法はバンド3タンパク質だけでなく、その他の赤血球膜タンパク質の膜貫通ペプチドの検出にも応用できることもわかった。これらの結果は現在論文として投稿し、その一部は国際雑誌Biochemistryに受理された。最近のゲノムプロジェクトの結果は、真核生物においてはその進化の度合いが進むにつれて細胞膜を経由するトランスポートに関連するタンパク質が増加していることを示した。これは高度な生命を維持するためにはトランスポーターが必要であることを示している。band3タンパク質は真核生物においてのみ保存されているアニオントランスポーターであり、主な機能として赤血球膜上では外の塩素イオンと内の炭酸イオンの交換を行っており、生物の酸素の運搬に関連している。また、幅広い特異性を持って陰イオンの交換を行い、生物のあらゆる器官にそのホモログが存在している。これらのアニオントランスポーターの機能はこのband3蛋白質の膜貫通ドメインがイオン分子を認識することによるダイナミックな構造変化が関わっており、band3分子の構造がその機能に深くかかわっていることを示している。このような目的をふまえて、今期間内で我々は、質量分析計とHPLCとの併用により、高感度にかつ定量的に赤血球膜タンパク質の膜内ドメインのトリプシン分解ペプチドを検出できる方法を開発した(投稿中)。また、有機溶媒による抽出法により、赤血球膜タンパク質の存在状態を簡便かつ迅速に検出する方法を開発した(投稿中)。さらにこれらの方法といくつかの化学修飾を組み合わせ、膜蛋白質band3の活性発現に重要な部位の検出を行った(投稿準備中)。また我々は原子レベルでの構造解析を目指し、Band3蛋白質の精製・結晶化を行い、現在約20Åの解像度を持つ結晶を得ている。今後さらに高解像度の構造解析を進めていく予定である。
ビスフェノール分解菌を利用したOA用紙再生プロセスの確立に関する研究

OA用紙(感熱紙、ノンカーボン紙)に含まれる顕色剤ビスフェノールA(BPA)を分解菌を用いて除去し、古紙再生工程でのロイコ染料との可逆反応によるパルプ発色障害を防止するプロセスを提案するため、種々の実験的検討を行った。活性汚泥から分離されたBPA分解菌Pseudomonaspaucimobilis FJ-4株は、BPAをプロパン部の炭素骨格の組み換えと酸化により開裂し、生成したp-ヒドロキシベンズアルデヒドとp-ヒドロキシアセトフェノンを完全分解するものと推定されたが、この分解酵素の生産はBPAによって高度に誘導された。FJ-4は通常の栄養培地を始めとし各種培地で増殖させることができ、BPA分解の最適pHは7.0-7.2、最適温度は約30°Cであった。従って,古紙再生への適用では、この範囲の(反応)条件で使用することが望ましい。OA用紙再生への活用の実用的検討として、ロイコ染料とBPAを含む市販感熱紙をパルプ化し、熱を加えてて発色させたものに、FJ-4株の培養液を添加し、現在の再生工程で添加される各種薬品(炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、硫酸アルミニウム)の存在下での脱色を試みたところ、比較的長期間を要するものの、パルプはほぼ完全に脱色された。またここで、脱色がBPAの反応系からの分解除去によることを高速液体クロマトグラフ分析により確認した。以上の実験結果から、BPA分解菌を活用して発色障害のないOA用紙再生工程を構築できる可能性が示された。最後に、分解菌を用いたいくつかの感熱紙の再生工程を提案した。OA用紙に含まれるロイコ染料の代表的な顕色剤ビスフェノールA(BPA)を生物分解することにより、古紙再生工程でのパルプの発色を防止するための基礎的検討を行った。BPAを効率よく分解することの出来る細菌株FJ-4株を活性汚泥から分離し、生理特性を調べることにより、Pseudomonas paucimobilisと同定した。ガスクロマトグラフ質量分析計による代謝物分析の結果、FJ-4株は、BPAをそのプロパン部で開裂し、プロトカテキン酸とp-ヒドロキシアセトフェノンとした後、プロトカテキン酸のオルト経路を経由して完全分解していることが示されたが、おそらく酵素の親和性が低いためにプロトカテキン酸を若干培地中に蓄積する傾向を示した。この分解反応のキーとなる最初の開裂に開与している酵素およびその遺伝子については、現在トランスポズンTn5を用いた変異株の解析により検索中である。FJ-4株のBPA分解酵素は構成的に生産されるため、その大量採取には菌体の効率的培養が重要であることが明らかになり、最適温度は30度、pHは7であることがわかった。また、古紙再生への活用の予備検討として、市販の感熱紙をパルプ化して発色させ、これにFJ-4株を添加することで脱色がおこるかを調べたところ、再生工程で添加される各種薬品の共存下でも、長期間試験を継続すればパルプが白色に脱色された。従って、効率のよいFJ-4株(およびその分解酵素)の利用形態を採用すれば、本菌株を用いた古紙再生工程構築が可能であることが示唆された。OA用紙に含まれる顕色剤ビスフェノール(BPA)を分解菌Pseudomonas paucimobilisFJ-4を用いて分解し、古紙再生工程でのロイコ染料によるパルプの発色障害を防止するプロセスを提案するための検討を行った。まず、BPA分解のメカニズムの理解のため、FJ-4株によるBPAの代謝物と関与酵素についての詳細な検討を行い、不完全ながら分解経路の推定にいたった。BPAはプロパン部の炭素骨格の組み換え後に酸化されて開裂し、生成したp-ヒドロキシベンズアルデヒドとp-ヒドロキシアセトフェノンを完全分解しており、プロパン部の炭素骨格組み換えと酸化を行う酵素がプロセス構築に不可欠であると考えられた。

この酵素の生産は構成的にも行われていると考えられるが、BPA誘導によってさらに効率よく生産されるようになることから、安価かつ有効な誘導物質の検索が望まれる。トランスポズンTn5を用いたFJ-4株のBPA代謝変異株の作成により本酵素の生産制御の解析を試みたが、有効な変異株は得られなかった。古紙再生への活用の実用的検討として、各種ロイコ染料とBPAの混合物や、市販感熱紙をパルプ化して発色させたものに、FJ-4株の培養を添加し各種薬品の存在下での脱色を調べたところ、市販パルプは白色に脱色された。ここで、脱色はBPAの分解除去によることを高速液体クロマトグラフにより確認した。しかし、ロイコ染料とBPAの混合物では、おそらく発色が固相でのみ安定におこるため実験が適正に行えず、必ずしも有為な脱色効果は確認できなかった。また効率のよい脱色のために分解条件の最適化の実験的検討を行い、いくつかの感熱紙の再生工程プロセスを提案した。
照射効果モニターのための新しい単クローン抗体の作製

X線照射後新たに出現するタンパク質について、照射効果の指標としての可能性を探るために詳細な検討を行い、このタンパク質に対する単クローン抗体の目指した。X線照射したMOLT-4において、2次元電気泳動と銀染色により、分子量41kDa、等電点pI=4.0のタンパク質(p41)の新たな出現が認められた。p41の出現は4時間目以降明らかとなり、その量は1Gyから10Gyの間で線量依存的であった。部分アミノ酸配列より、p41は白血病のがん関連遺伝子set産物であることが示唆された。部分アミノ酸配列に基づいて15残基のペプチドを合成し、これをウサギに投与して抗p41ポリクローナル抗体を得た。抗p41抗体は、p41に加え分子量42kDaのタンパク質(p42)とも反応した。非照射細胞ではp42のみが認められた。p41の出現がタンパク質合成阻害剤では抑えられなかったことと、照射後^<35>S-アミノ酸を添加した場合にはp41が標識されず、照射前に^<35>Sを取り込ませた場合には照射後標識がp41とp42に認められたことより、p41はp42を前駆体とする翻訳後修飾産物であると考えられた。p41の出現はホスファターゼ阻害剤バナジン酸塩によって阻害され、この翻訳後修飾にはタンパク質のリン酸化/脱リン酸化が関与している可能性が示唆された。抗p41ポリクローナル抗体は、当初の計画通りに作製され上記のようにp41/p42の解析に有効であることが明らかとなった。単クローン抗体については作製を継続中である。平成7年度は特に以下の2点につき報告する。1)MOLT4白血病細胞を主に用いてp41タンパク質を精製、アミノ酸配列の決定等を行なった。精製は主としてO′Farrellの二次元電気泳動を用い、ク-マシ-ブルーまたは銀染色により照射後のスポットp41について、ゲルより切りだしたスポットを集め、エンドペプチダーゼ消化後、アミノ酸配列を決定した。その後ホモロジー検索の結果、白血病細胞の癌関連遺伝子SETと高い相同性をもつことが明らかになった。2)ポリクローナル抗体の作製。決定された配列をもとに、合成ペプチドを作製し、この合成ペプチドを抗原とし家兎にてポリクローナル抗体を作製中である。得られたポリクローナル抗体を用いてWestern blotting解析を行ない、p41のスポットを特異的に染色するか、また他の染色スポットの有無について解析する予定である。またポリクローナル抗体作製後(次年度以降)、1)抗体を用いてp41の照射後の発現の時間的推移、照射線量との関連性、細胞内局在、各種細胞・組織分布について解析する予定である。2)また抗p41単クローン抗体の作製および、p41の生化学的機能解析を行なうために、nativeなp41蛋白の精製を各種クロマトグラフィーを用いて行ないつつある。3)単クローン抗体作製後、免疫沈降法、病理組織染色等によりp41の生物学的特性、細胞内局在、および各種細胞、組織分布や機能の解析をすすめ、またp41の意義づけおよび有用性の解析をヌードマウス腫瘍を含めて行なう予定である。放射線高感受性を示すヒトTーリンパ腫MOLT-4細胞にX線(10Gy)を照射後(10時間)、2次元電気泳動によって、分子量41kDaのタンパク質p41(等電点4.0)の誘導が検出された。次にp41の部分アミノ酸配列を決定し、ホモロジー検索の結果、p41は非常に長い酸性ドメインをC末端に有するset遺伝子産物であることが示唆された。

抗体の作製:得られた配列に基づいた合成ペプチドに対し、まずはじめにポリクローナル抗体を作製し、この抗体を用いたX線照射後のMOLT-4細胞に対するWestern Blottingの結果、p41に加え、分子量42kDaのタンパク質p42が共に反応した。p41、p42の解析:p41はタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド処理でも誘導が阻害されなかったことなどから、X線照射により誘導されるp41はp42の翻訳後修飾を受けた修飾体であることが示唆された。また、誘導の阻害剤としてはホスファターゼ阻害剤であるvanadateが阻害効果を有することが確認された。現在、p41、p42の精製、さらにモノクローナル抗体の作製を継続中である。今後、モノクローナル抗体を用いてWestern blotting、及び免疫沈降法、病理組織染色等によりp41(p42)の発現機構、生物学的特性、細胞内局在を調べ、さらに各種細胞、組織分布や機能の解析をすすめ、p41の意義づけおよび有用性の解析をヌードマウス腫瘍を含めておこなう計画である。
異材継手境界における中間層の成長と強度のシミュレーション解析

異種金属の接合は,省資源,部品の高性能化やコスト低減等のために,工業的に非常に重要な課題となっている.本研究では,「継手特性に及ぼす中間層の影響」を解明しやすい純Al/純Niの摩擦圧接に関し,後熱処理条件と層成長,さらに層成長と継手の破断位置の特定,応力・ひずみの観点を含めた継手の破断に関する重要な検討を行い,以下に要約する知見を得ている.(1)継手引張強さは熱処理温度の増加とともに急激に低下し,673K以上ではほぼ0MPaになった.また,境界部の中間層(金属間化合物層)が約(0.52)μmを超えると急激に低下した.(2)後熱処理によって境界部に4つの中間層,Al_3Ni, Al_3Ni2,AlNiおよびAlNi_3相が生成した.これらの層の中で,Al_3Ni_2の生長速度が最も速く,計算によって求めた生成の自由エネルギーも最も小さかった.ナノインデンテーション法によって求めたAl_3Ni_2相(層)の硬さは[HV625HV720]であり,Al母材の硬さ[HV48HV69]およびNi母材のそれ[HV319-HV348]よりも高かった.(3)598KではAl母材とAl_3Ni層との間,もしくはAl_3Ni層とNi母材との間で継手の破断が生じた.破断面は典型的な延性破面を呈した.673Kの熱処理では,Al母材と[Al_3NiあるいはAl_3Ni_2]層で,772KではAl母材とAl_3Ni_2層の間で破断は生じた.これらの破面ぜい性的な破面を呈した.(4)継手の方向にかかわらず,熱処理後の継手の計算により求めた外周部のAl母材の残留応力は93MPから127MPaの引張であった.この高い残留応力は,中間層と母材との界面で生じる破断の一つの原因となっているものと考えられた.本研究の結果,異材継手境界部において中間層が成長すると,破断が中間層と母材と界面で生じる.この結果は注目すべき事象であり,母材と中間層との接合力が低下することが一員と推定されるが,今後の重要な課題と考えられる.異種金属の接合は,省資源,部品の高性能化やコスト低減等のために,工業的に非常に重要な課題となっている.本研究では,「継手特性に及ぼす中間層の影響」を解明しやすい純Al/純Niの摩擦圧接に関し,後熱処理条件と層成長,さらに層成長と継手の破断位置の特定,応力・ひずみの観点を含めた継手の破断に関する重要な検討を行い,以下に要約する知見を得ている.(1)継手引張強さは熱処理温度の増加とともに急激に低下し,673K以上ではほぼ0MPaになった.また,境界部の中間層(金属間化合物層)が約(0.52)μmを超えると急激に低下した.(2)後熱処理によって境界部に4つの中間層,Al_3Ni, Al_3Ni2,AlNiおよびAlNi_3相が生成した.これらの層の中で,Al_3Ni_2の生長速度が最も速く,計算によって求めた生成の自由エネルギーも最も小さかった.ナノインデンテーション法によって求めたAl_3Ni_2相(層)の硬さは[HV625HV720]であり,Al母材の硬さ[HV48HV69]およびNi母材のそれ[HV319-HV348]よりも高かった.(3)598KではAl母材とAl_3Ni層との間,もしくはAl_3Ni層とNi母材との間で継手の破断が生じた.破断面は典型的な延性破面を呈した.673Kの熱処理では,Al母材と[Al_3NiあるいはAl_3Ni_2]層で,772KではAl母材とAl_3Ni_2層の間で破断は生じた.これらの破面ぜい性的な破面を呈した.(4)継手の方向にかかわらず,熱処理後の継手の計算により求めた外周部のAl母材の残留応力は93MPから127MPaの引張であった.この高い残留応力は,中間層と母材との界面で生じる破断の一つの原因となっているものと考えられた.本研究の結果,異材継手境界部において中間層が成長すると,破断が中間層と母材と界面で生じる.この結果は注目すべき事象であり,母材と中間層との接合力が低下することが一員と推定されるが,今後の重要な課題と考えられる.異種金属の接合は,省資源やコスト低減等のために工業的に非常に重要な課題となっている.本年度の研究では,過去にほとんど研究がなされておらず,本研究の重要目的の一つである「継手特性に及ぼす中間層の影響」を解明しやすい(1)純Ti(チタン)/純Ni(ニッケル),並びに(2)純Al(アルミ)/純Niの摩擦圧接に関し,基礎的検討として,接合条件と後熱処理条件が継手特性に及ぼす影響を明らかにし,以下に要約する知見を得ている.(1)純Ti/純Ni継手:摩擦圧力および摩擦時間ともに,引張強さに及ぼす影響は小さかった.継手はTi母材で破断するとともに,一部はTiと中間層Ti_2Niの界面で生じた.後熱処理を施すと,温度の上昇とともに継手引張強さは低下した.とくに,ラルソン-

ミラーのパラメータが19×10^320×10^3以上,すなわち中間層厚さが数ミクロン以上になると,急激に引張強さが低下した.中間層は,773Kの「Ti_2Ni, TiNi」の2層から,1173Kの「Ti_2Ni, TiNi, Ti濃化層,TiNi_3」の4層まで増加した.継手の破断は,低温ではTiNi, TiNi_3の中間層中で,高温ではTiNi_3とNi母材の界面で生じた.(2)純Al/純Ni継手:摩擦圧力および摩擦時間ともに,引張強さに及ぼす影響は小さく,全てAl母材で破断する継手が得られた.後熱処理より,接合界面には,573KにおけるAl_3Niの一層から,773KにおけるAl_3Ni, Al_3Ni_2,AlNi及びAlNi_3の四層が生成した.継手引張強さは,層幅が23ミクロン以上で低下することを見いだし,現在破壊機構の検討を続けている.異種金属の接合は,省資源,部品の高性能化やコスト低減等のために,工業的に非常に重要な課題となっている.本研究では,「継手特性に及ぼす中間層の影響」を解明しやすい純Al/純Niの摩擦圧接に関し,後熱処理条件と層成長,さらに層成長と継手の破断位置の特定,応力・ひずみの観点を含めた継手の破断に関する重要な検討を行い,以下に要約する知見を得ている.(1)継手引張強さは熱処理温度の増加とともに急激に低下し,673K以上ではほぼOMPaになった.また,境界部の中間層(金属間化合物層)が約(0.5-2)μmを超えると急激に低下した.(2)後熱処理によって境界部に4つの中間層,Al_3Ni, Al_3Ni_2,AlNiおよびAlNi_3相が生成した.これらの層の中で,Al_3Ni_2の生長速度が最も速く,計算によって求めた生成の自由エネルギーも最も小さかった.ナノインデンテーション法によって求めたAl_3Ni_2相(層)の硬さは[HV625HV720]であり,Al母材の硬さ[HV48HV69]およびNi母材のそれ[HV319HV348]よりも高かった.(3)598KではAl母材とAl_3Ni層との間,もしくはAl_3Ni層とNi母材との間で継手の破断が生じた.破断面は典型的な延性破面を呈した.673Kの熱処理では,Al母材と[Al_3NiあるいはAl_3Ni_2]層で,772KではAl母材とAl_3Ni_2層の間で破断は生じた.これらの破面ぜい性的な破面を呈した.(4)継手の方向にかかわらず,熱処理後の継手の計算により求めた外周部のAl母材の残留応力は93MPから127MPaの引張であった.この高い残留応力は,中間層と母材との界面で生じる破断の一つの原因となっているものと考えられた.本研究の結果,異材継手境界部において中間層が成長すると,破断が中間層と母材と界面で生じる.この結果は注目すべき事象であり,母材と中間層との接合力が低下することが一員と推定されるが,今後の重要な課題と考えられる.
ゲノム編集治療の安全化に向けた修復用DNAのオフターゲット組込みの制御

遺伝性疾患に対する遺伝子治療を行う場合に外来の正常遺伝子をゲノムに挿入すると、遺伝子発現が挿入部位の影響を受けるとともに、がん遺伝子近傍に挿入された場合にはがんを発症する危険性があった。一方で正常遺伝子を染色体外で発現させる場合には、長期的にみると効果が減弱してしまう。副作用を少なくして治療効果を継続させるためには、変異遺伝子を正常遺伝子に置き換える遺伝子修復治療を実現させる必要がある。近年開発されたゲノム編集技術により、標的配列の正確な改変が現実的に可能となった。本研究では安全性の高い遺伝子修復技術を開発するために、霊長類モデル動物での遺伝子修復治療を行い臨床に応用することを目指す。同時に、遺伝子修復の安全性を改善するために、正常遺伝子配列が標的以外に組み込まれた細胞を除外するための新規技術を開発することを目標とする。遺伝子修復治療の実現のために、CRISPR-Cas9システムを利用してIL2RG欠損マーモセットの造血幹前駆細胞(CD34陽性細胞)にゲノム編集を行い、欠損部位の相同配列を含むドナーDNAを用いて遺伝子修復を行う。モデルマーモセットに応用するために、ヒト造血幹前駆細胞を用いてIL2RG領域の遺伝子修復技術の検証を行った。ドナーDNAによる相同組み換えが起きた細胞の割合を測定すると、治療に必要な組み換え効率を達成できた。遺伝子修復治療を行う場合に、ゲノム編集による切断部位にベクターDNAが非相同組換えで組み込まれることが起こる。安全性向上を行うために、細胞に自殺を促す活性を持つiCaspase9遺伝子をドナーDNAに組み込み、非相同組換えが起こった細胞を除去する技術の開発を行った。IL2RG領域の配列を含むドナーDNAにVenusレポーター遺伝子を組み込むことにより、遺伝子修復効率をVenus陽性細胞の割合で測定した。ヒト造血幹前駆細胞に電気穿孔法でSpCas9とガイドRNAをRNP(Ribonucleoprotein)の形で導入して、直後にアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いてVenusレポーター遺伝子を含むドナーDNAを感染させた。15日培養して相同組み換えが起きた細胞をVenus陽性細胞の割合で測定した。ヒト造血幹前駆細胞への遺伝子修復効率は、目標であった10%を超えた38%だった。造血幹細胞コロニーアッセイ(CFUアッセイ)を行うと、遺伝子修復を行った造血幹前駆細胞の未分化性は野生株と変わらなかった。ヒト造血幹前駆細胞への相同組み換えの効率は目標値を達成したため、今後はゲノム編集によるオフターゲット効果の検証を行う。ゲノムワイドにオフターゲット領域の検出を行うために、CIRCLE-seq法を用いて検証を行う。iCaspase9遺伝子が組み込みこまれたドナー配列をAAVベクターを用いて培養細胞に導入する。iCaspase9はCIDというダイマライザーを加えると活性を持つので、薬剤を加えた後に非相同組み換えが起きた細胞の割合を測定する。

iCaspase9遺伝子が組み込みこまれたドナー配列をAAVベクターを用いて培養細胞に導入する。iCaspase9はCIDというダイマライザーを加えると活性を持つので、薬剤を加えた後に非相同組み換えが起きた細胞の割合を測定する。当初予定していた次世代シーケンサーを用いた研究を、次年度に実行することになったため。