hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
嚥下障害治療法としての反復経頭蓋磁気刺激と集中的リハビリテーション併用療法の確立

両側脳卒中後嚥下障害でも対応可能な両側経頭蓋磁気刺激療法を開発、この安全性と実効可能性を検討した。大きな有害事象なく、喉頭挙上遅延時間の短縮がみられることを示した。また嚥下障害に対する機能的磁気刺激の短期効果を検討、咽頭部に対する磁気刺激が嚥下関連大脳領域の活動性を上昇させること、短期的に嚥下反応速度が改善することを明らかにした。そして、喉頭挙上筋群への反復末梢磁気刺激法と嚥下リハビリテーションの併用療法の実行可能性と効果について検討し、この併用療法が安全に実施できること、嚥下機能障害に関するいくつかのパラメーターが改善することを明らかにした。前年度、反復経頭蓋磁気刺激:rTMSを脳卒中後嚥下障害患者に適応してきた。しかし禁忌(てんかん、頭蓋内金属など)が多いため安全に介入できる症例が限られており、未だ嚥下障害の治療法として確立するのは難しかった。また、慢性期の脳卒中後嚥下障害者にはなかなかrTMSの効果が現れにくかった。そこで我々は、機能的磁気刺激:Functional Magnetic Stimulation(FMS)を脳卒中後嚥下障害者に適応した。機能的磁気刺激は磁気コイルに電流を流すことでその垂直方向に磁場を発生させ、その磁気によって生体内に渦電流を起こし神経や筋肉を選択的に刺激する手法である。その刺激原理は電気刺激とほぼ同様に考えてよいが、痛みが少ないために電気刺激より深く、広範囲な刺激が可能であり、有害事象もほとんどないのが特徴である。これまでに呼吸筋に対するFMSが呼吸機能を改善させたとの報告や腸管へのFMSが腸管蠕動運動を改善させたという報告、胃へのFMSが胃排出能を改善させたとの報告等がなされている。嚥下障害に対しても頚部周囲にFMSを行うことで嚥下関連筋群の支配神経に対するニューロモジュレーションを介した嚥下反応速度の向上や咽頭筋群の収縮性改善が期待されるが、嚥下障害に対する機能的磁気刺激の研究報告は見当たらない。まずは脳卒中後軽度嚥下障害者を対象に20Hzと30Hzの機能的刺激前後での短期的な嚥下機能改善度合を比較した。結果、20Hzと30Hz間に大きな違いはなく、刺激前後で咽頭部の神経活動が賦活されたことがわかった。近年、経頭蓋磁気刺激:transcranial magneticstimulation(TMS)が脳の可塑性を引き起こし様々な機能障害を回復させることが明らかとなり、麻痺や認知機能に対するTMS介入について報告がなされるようになった。しかし嚥下障害に対するTMSの報告は少数の予備的研究に留まっており、適応となるべき疾患や病態、リハや薬物療法との併用療法の効果などについてはまったく知られていない。嚥下障害に対するTMS療法がどのような嚥下障害に有効であるのかを検討することは学問的に意義深いことであり、臨床現場で応用可能な治療法としてこの手法を確立することは社会にも大きな貢献になると考え、本研究を行うこととした。当該年度は入院での集中的嚥下リハとTMSの併用療法に関するプロトコルを施行し、その安全性について検討した。対象は嚥下障害にて食形態調整が必要となってから6ヶ月以上経過している脳卒中患者4人で本研究の説明を受け同意した者とした。意識レベルが一桁で無い者、呼吸状態の安定していない者、脳波検査で異常所見が確認された者は除外した。入院は慈恵第三病院にて6日間とした。入院に先立って嚥下造影検査を行い、詳細な嚥下評価を行い、入院後にカテーテル電極を用い喉咽頭部の運動誘発電位が最大になる部位を決定、嚥下体操などの個別嚥下リハとTMSを連日で行なった。そして退院日に入院前と同様に嚥下機能を評価し、嚥下機能改善の程度とその安全性について検討した。結果、6日間の併用療法はけいれんなどの副作用や神経症状の悪化、肺炎などをみることなく完遂された。TMS施行中に、咽頭部を内視鏡で観察したところ嚥下様運動の出現が観察された。嚥下機能の変化としては嚥下反射速度に改善傾向がみられ、増悪のみられたものはいなかった。実際の食事場面でも経口摂取能力の改善も認められ、むせこみの減少などが認められた。脳卒中後嚥下障害に対する機能的磁気刺激と集中的嚥下訓練併用プロトコルの安全性と実行可能性を検討することを目標に研究を行った。

対象は慢性期脳卒中後嚥下障害患者8人である.磁気刺激にはMagVenture社のMagProR30とパラボリックコイルを使用,刺激部位は舌骨上筋群とし,痛みを感じる閾値の90%程度の強さで刺激をした.刺激プロトコルとしては午前午後に分けての1日2回, 6日連続刺激とし, 1回の刺激は20Hzで3秒の刺激を30秒ごとに20回連続で行う10分間刺激とした.刺激直後に言語聴覚士による嚥下訓練を20分実施した.訓練としては口腔や舌の筋力増強訓練やストレッチ,頭部挙上訓練などを実施した.嚥下機能評価としては介入前後に嚥下造影検査を実施, Penetration Aspiration Scale (PAS), Laryngeal elevation delay time (LEDT), Functional Oral Intake Scale (FOIS), Mann Assessment of Swallowing Ability (MASA), Swallowing Quality of Life (SWAL-QOL)を評価した.統計解析にはWilcoxon signed-rank testを実施し前後比較した.対象患者の平均年齢は65歳,発症からの平均期間は34ヶ月であった. 6日間の連続刺激プロトコルは,全例大きな有害事象なく完遂された. MASA, PAS, LEDT, SWALQOLの4項目で有意な点数の向上がみられ,主観的にも客観的にも何らかの改善を認めた.脳卒中後嚥下障害に対する機能的磁気刺激療法と集中的嚥下訓練併用プロトコルの安全性と実行可能性を確認した.リハビリテーション医学本研究実施にあたり機器や病棟の体制、リハスタッフの体制は整っており特に問題なかった。また今回、研究対象者を外来リハ患者より比較的容易に集めることができたため、研究を順調に進めることができた。今後もこのペースで研究を続けていきたい。本研究を行うための機器や病棟やリハスタッフの体制は整っており問題ない。しかし本研究は慢性期の嚥下障害者を主な対象としており、慢性期の場合在宅生活者が多くリハビリのためだけに入院してくれるという患者をなかなか集めることが困難であった。そのためケースシリーズ止まりであり、今後さらに症例を集めて比較試験を行う必要であると考えられる。症例を集めることができれば、より効果のある脳卒中の病型や重症度、発症から時期の検討も今後可能であると考えられる。さらに効果のある嚥下障害の病態を明らかにすることでより適切なリハプログラムを検討することも可能であると考えられる。今後、rTMSと嚥下リハの併用療法を臨床応用することで嚥下リハの質を向上させることができればと考えている。従来のリハに比べ、本手法は直接食物を使う必要がないため安全に経口摂取困難な患者にも介入可能である。また今回十分検討できなかったが咽頭収縮力の改善効果や夜間の唾液誤嚥の減少による誤嚥性肺炎予防効果、刺激部位によっては舌圧の向上や咀嚼の協調性、胃食道逆流改善効果などにも有効な可能性がある。次回は機能的磁気刺激の長期効果について検討する予定である。1回の機能的磁気刺激の効果は一時的であるため、永続的なものとして汎化させるには連続刺激する必要があると考えられる。そこで連続刺激を使用した2週間プログラムを実施、前後での嚥下機能変化を嚥下造影検査や咽頭内圧検査にて検討し、刺激終了後も1ヶ月後まで経過を追うこととする。そして本プログラムの安全性と実施可能性を確認する。1機能的磁気刺激の長期効果の検証は、東京慈恵医科大学附属第三病院のリハ科病棟で行う。脳卒中、パーキンソン病、誤嚥性肺炎後嚥下障害患者を1520人(年齢:20歳以上80歳未満)集める。磁気刺激の禁忌(頚部金属、てんかんの既往)のあるものは除外する。14日間入院にて集中的嚥下訓練と磁気刺激の併用療法を行う。
熱水性卑金属鉱床生成の場における金属の挙動

本研究課題は,バルクゲルと同じ化学組成を持つナノ架橋体(マイクロゲル又はナノゲル)を合成し、バルクゲルの体積相転移(膨潤・収縮)を,(1)ナノ架橋体の粒径変化および(2)直鎖状高分子電解質のコンホメーション変化と比較しながら,架橋高分子(ゲル)の体積相転移の分子論的本質を見極めることを目的とした。具体的には、N-isopropylacrylamide(NIPA)系高分子網目に酸、塩基および酸・塩基両者からなるイオン基を導入した電解質ナノ架橋体を供試料として,動的光散乱・静的光散乱・電気泳動光散乱実験を行い、pH、温度,イオン強度を変化させた場合の粒径(流体力学半径と慣性半径)を詳細に調べ、架橋体の荷電状態(電気泳動移動度)と比較した。さらに,その結果をナノ架橋体の構成員である鎖状高分子電解質の結果と比較した。一方で,ナノ架橋体と反対符号の電荷を持つポリイオンとの複合体形成(架橋分子・鎖状分子間相互作用),異符号電荷を持つナノ架橋体間の複合体形成(粒子間相互作用)に関する研究を行った。また,中性高分子網目中に球状荷電を閉じ込めた新たな高分子電解質ナノ架橋体の合成法を確立するための基礎研究として,中性高分子/タンパク質(球状荷電)系の複合体形成に付いても予備的な実験を開始している。以上の結果は,我々が提案した分子論的な仮説『ゲルの体積相転移は,架橋高分子鎖間の斥力(同符号電荷間のCoulomb力)と引力のバランスが崩れた場合に起こり、引力としては疎水性相互作用、水素結合、van der Waals力、異符号電荷間のCoulomb力に分類できる:(a)Ilmain,F.;Tanaka, T.;Kokufuta, E.Nature1991,349,400;(b)Kokufuta, E.In : Physical Chemistry of Polyelectrolytes ; Radeva, T., Ed.;Marcel Dekker, Inc., New York, Basel,2000;Chapter 17』を用いて明確に説明できることが分かった。なお、これらの結果を応用して、高分子電解質系グラフト共重合と等価な物性を有するイオン性ナノ架橋体の合成法を考案し、本研究分野の新たな展開を試みつつある。花崗岩貫入岩体の固結に伴い,マグマから分離したマグマ水は高濃度の塩化物水溶液で,炭酸ガスなどの気体成分や重金属濃度も高濃度であり,このような溶液が鉱床の生成に密接に関与していると考えられている。今年度はマグマから分離した熱水が関与して生成した鉱床について以下の研究を行った。マグマ水や鉱床の生成に関与した熱水の化学組成とりわけ重金属濃度を知ることは,本研究では重要である。鉱床母岩や脈石鉱物中の流体包有物は,これらの熱水をトラップしていると考えられるので,放射光蛍光X線法で単一流体包有物の分析を試みた。チリ北部の斑岩型銅鉱床産流体包有物からはCu, Fe, Zn, Mn, As等が検出され,マッピングによりこれらの元素の包有物中での分布を明らかにすることができた。しかしながら定量分析を行うには母結晶によるX線の吸収の効果を経験的に求める必要がある。

このために石英母結晶中にCuおよびZn濃度既知の流体包有物を合成し,母結晶表面からの深度,CuおよびZn濃度,蛍光X線強度の関係を求める検量線を作成する実験を行った。X線の吸収の補正係数は試料表面からの深度の指数関数として表されることから,X線強度と深度を対数プロットすることにより補正曲線が得られ,検量線をほぼ確立する事ができた。北部北上帯に位置する変成層状マンガン鉱床に伴われるマンガン珪酸塩鉱物の酸素同位体比から,マンガン鉱床の熱変成機構の特徴を解明した。本鉱床は花崗岩体直上のルーフペンダントに位置し,花崗岩貫入時に高度の熱変成を受けており,マグマから分離した熱水の影響の痕跡があると期待される。鉱床内のごく近い位置に存在するマンガン鉱物間で酸素同位体の分配は平衡に達していない事が明らかとなった。熱変成はマグマ水のような流体が殆ど存在しない環境で起こったことを示峻する。本研究では,熱水の沸騰に伴う重金属の気相及び液相への分配を実験により定量的に求めることを目的のひとつとしている。高温高圧状態で共存する気相および液相中の金属濃度を決定する事が必要で,このための実験手法として人工流体包有物法を新たに開発した。昨年度導入した高温熱水反応装置を用いて,石英母結晶中にCuおよびZn濃度既知の流体包有物を合成し,流体包有物中の重金属濃度を高エネルギー加速器研究機構において放射光蛍光X線法により測定した。蛍光X線法では母結晶によるX線の吸収効果が大きく,流体包有物中の金属濃度を定量分析するためには分析手法の確立が必要である。母結晶表面からの深度,CuおよびZn濃度,蛍光X線強度の関係を求める検量線を作成する実験を進め,その結果を論文としてまとめ既に投稿した。同時に沸騰状態下で気相包有物および液相包有物を同時に合成し,それぞれに含まれるCuおよびZn濃度を測定した。低温での水-岩石反応に伴う重金属の挙動を解明するために,フィリピン西部のパラワン島にある含ニッケル・ラテライト鉱床において,地表から一定間隔ごとに系統的に採取した風化土壌を用いて各種元素の挙動を検討した。試料約50個について,主成分および微量金属の化学分析を行った。地表からの深度を指標に各種元素濃度のプロファイルを求め,風化の進行に伴う元素の挙動を解明しつつある。銅の安定同位体比測定方法を確立するために,米国標準局による標準試料(金属銅)を用いてTIMSによる同位体分析実験を行った。本研究では,熱水の沸騰に伴う重金属の気相及び液相への分配を実験により定量的に求めることを重要な目的としている。石英母結晶中にCuおよびZn濃度既知の流体包有物を合成し,流体包有物中の重金属濃度を高エネルギー加速器研究機構において放射光蛍光X線法により測定した。母結晶表面からの深度,CuおよびZn濃度,蛍光X線強度の関係を求める検量線を作成する実験を進め,その結果を論文としてまとめた。三者の関係は母結晶の密度,母結晶によるX線吸収係数などを用いて理論的に予測することが可能で,理論値と検量線は良く一致した。
羊膜幹細胞の同定法の確立および分化過程における組織構築の形態的解析

ヒト羊膜上皮および羊膜間葉系細胞はsphere形成能が高く、単離細胞と比し、Oct3/4, Klf4,c-Myc,Sox2、NanogなどiPS細胞(誘導多能性幹細胞)作成に不可欠な転写因子の発現が高い。またマウス羊膜細胞では、SSEA-1(+)C-kit(-)でsphereを形成する細胞のみがinner cell massに導入され分化することが明確となった。Sphere形成と表面マーカーの発現を併せて評価することで、幹細胞の純化分画が可能となった。1)ヒト羊膜細胞の単離方法を樹立し、羊膜および羊膜細胞の細胞学的性質を明確にした。hAECは、ほとんどの細胞がcytokeratin(+),vimentin(+)であり、その中にstem cell markerであるOct3/4,SSEA-4,BCRP(+),Sox2(+)の細胞が混在していた。一方hAMCは骨髄などの間葉系幹細胞のマーカーとして報告されているCD73(+),CD105(+),CD90(+)の細胞群が存在することが明らかとなった。さらに、幹細胞の単離のために、spheroidの作成を試みた。採取したhAECおよびhAMCをultra low attachmentdissue上で培養しspheroidを作成、stem cell markerによる染色を行った。Spheroidは内因性のalkaline phosphataseに強い陽性を示した。hAECのspheroidはいずれも、Oct3/4(+), Nanog(+)、Sox2(+)遺伝子を発現していた。このことはiPS細胞で幹細胞としての特性を獲得するために導入された遺伝子が羊膜ではすでに発現しており、羊膜が再生医療の材料として十分に意義があることを示唆する結果である。2)マウス羊膜および羊膜細胞の細胞学的特性を検討し、羊膜細胞の多分化能検討のためにキメラ作成を試みた。hAMCには、継代が可能で、強い増殖能を示す細胞群が存在することが明確となった。この細胞群は継代を繰り返すに従い、90%以上の細胞がCD73 (+), CD105 (+), CD90 (+)で、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化が可能であった。これらのことより本細胞群は羊膜間葉系幹細胞であると考えられる。現在、この細胞の株化を検討している。hAECおよびhAMCいずれもspheroid形成能が高い。形成されたspheroidは内因性のalkaline phosphataseの活性が高く、Oct3/4(+), Nanog (+)、KLF-4 (+), c-myc (+)など、iPS細胞作成に不可欠な転写因子をすでに発現していることが明らかで、再生医療の材料として十分に意義があることが示唆された。2)羊膜細胞の多分化能を検討するため、マウス羊膜から幹細胞の純化を検討した。マウス羊膜細胞をlow attachment dishに播種するとsphereの形成が観察された。sphereはSSEA-1 (+)c-kit (-)alkalin phosphatase (+)あるいはSSEA-1 (-)c-kit (+)の2つの染色パターンを示した。さらに培地として上皮系細胞特有の培地あるいは間葉系特異の培地を使用することにより、これらのsphereが神経、神経膠細胞あるいは骨細胞および脂肪細胞に分化することが、免疫染色およびRT-PCRによって明確となった。本研究の目的である羊膜幹細胞を純化することが可能となった。
高エネルギー重イオン衝突反応におけるジェットとＱＧＰ流体のダイナミクスの統合

本研究では相対論的重イオン衝突実験において生成する、クォークやグルーオンがカラー閉じ込めから解放された状態であるクォーク・グルーオン・プラズマ(QGP)の性質を知ることを目的とする。相対論的重イオン衝突実験では流体力学に従い時空発展するバルクとしてのQGPと同時にジェットと呼ばれる高エネルギーのクォークやグルーオンがQGPの中を通過する。その際、ジェットとQGPの構成粒子の間の強い相互作用によってQGP流体中には音波が生じる。この音波は、ジェットがQGPの音速を超えて通過するために、マッハコーンと呼ばれる特徴的な構造を持つ衝撃波を形成する。本研究ではQGPの流体的性質を顕著に反映するこの衝撃波のフローパターンが終状態の運動量分布や粒子分布にどう現れるかを、QGPの時空発展を相対論的流体方程式を数値的に解くことによってシミュレーションを行って調べた。その結果、QGP流体はジェットから受け取った運動量によって励起され、マッハコーンが形成した。さらにそのマッハコーンによってジェットが失った運動量が輸送され、ジェットから非常に大きな角度分布にわたって運動量が分布することを示した。これはLHCにおけるCMSグループによる相対論的重イオン衝突実験の結果と定性的に一致する。さらに、このマッハコーンはQGP流体自体の膨張をその衝撃波面によって押し返す。その結果、この押し返しの方向に対応する方向の粒子が減少することが示された。この粒子が減少する方向はマッハコーンの波面の方向を示すものであり、QGPのジェットに対する流体的な応答の新たなシグナルとなりうる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではジェットからのエネルギー・運動量流入によるQGP流体中の流れを相対論的流体力学を(3+1)次元空間で数値的に解くことで記述する。その際、高エネルギー重イオン衝突実験により則した計算を行うため、座標系にはカーテシアン系ではなく、膨張する座標系(Milne座標系)を用いる。このMilne座標系における相対論的流体方程式を書き下し、Piecewise Parabolic Method (PPM)という流体の移流を2次の精度で扱う非常に精度の高い手法を用いた相対論的流体方程式の解を求めるコードの実装を行った。本研究で注目している、QGP中での流れを引き起こすジェットが受け渡すエネルギー・運動量は、QGP流体全体のもつエネルギーに比べると非常に小さい。そのため、流体中でのエネルギー・運動量保存則は数値計算の中で非常に高い精度で守られてなければならない。しかしながら、本研究を進める中で、従来膨張座標系における相対論的流体方程式の数値計算でよく用いられている手法では、その座標系が膨張している方向に関して、数値計算のための離散化が適切ではないことによる、エネルギー・運動量保存の精度の低下があることが明らかになった。本研究では、このエネルギー・運動量保存の精度の低下は致命的であるため、膨張座標系での数値計算おいてより適切な離散化を行い、さらに移流を求める手法とも整合性のとれた新たな手法を開発した。この新手法を用いて膨張座標系における相対論的流体方程式の数値計算コードを実際に実装を行い、エネルギー・運動量保存が非常に高い精度で守られていることを確認した。さらに、上述のコードを用い、実際の高エネルギー重イオン衝突実験で生成されるような膨張するQGP流体中をジェットが通過するような場合のシミュレーションを行った。その結果、QGP流体由来の粒子がジェットの周りの広い角度にわたって励起され、特に大角度においては非常に多くの低運動量がジェットが損失したエネルギー・運動量を担っていることを示した。この結果は、上述のLHCでのCMSグループの実験と定性的に一致した。数値計算コード実装の時の困難のために、当初の計画ほどの研究結果はでていない。しかしながらそのコード実装の困難に対する解決であるあらたな手法は、本研究課題のみならず、現在主流となりつつある他の多くの研究に対しても非常に有効なものである。

数値計算コードの根幹的な部分の実装はほぼ完了したので、まず現在可能な計算を進め、解析を行う。同時に、今後の新しい計算のための数値計算コードの実装も同時に進めていく予定である。
対象の相対的関係認知に関する実験的検討

2つの対象を区別する際、大きさの違いのような両者の相対的関係に基づいて選ぶ「移調」が示されるか、コモンマーモセットを用いて検討した。大きさの異なる正方形を用いて検討した結果、マーモセットは移調を示し、新奇な刺激対に対しても訓練された相対的関係に基づいて反応した。さらにこの反応が、訓練された刺激に限定されず一般的に応用されるような関係概念であるかどうか、新奇な形の刺激対でテストしたところ、マーモセットはここでも2刺激の相対的特徴に基づく移調を示した。形が異なり類似性に基づいた刺激般化が成立しないような場合、外周長を手掛かりにして反応することが初めて示された。本研究はコモンマーモセットを用い、物理的特徴に基づいて対象を区別するという比較的単純な弁別行動から、複数の刺激の特徴間の関係を抽出し様々な場面に応用させるという関係概念が成立するか、そして成立するならばどのような視覚的処理を行うことにより達成されるのか、について検討することを目的としている。本年度は、この目的達成のために必要な装置や刺激の開発と、行動評価に必要な反応を確立させることを目指した。マーモセットは他の多くの実験動物と異なり、食餌制限が難しく、個別で実験を行うことが情動反応を引き起こしやすい。そのため、多くの個体を用いて準備実験を行うことで、マーモセット一般に非常に嗜好性の高い強化子を用い、多くの試行に少量ずつ提示できるような装置を開発した。さらに、実験個体以外に別のマーモセットを実験室内に置き、お互いが自由に観察できる条件を設け、情動反応を少なくし、安定した反応が得られる実験環境を作った。その上で、被験体を実験装置に馴化させ、繰り返し装置から強化子を提示し、これにも馴化させた。反応形成としてタッチパネルに近づく行動をすべて強化することから始め、最終的にタッチパネルが検出可能な十分な強さの接触反応を形成した。タッチパネルへの反応が安定した後、白色円をモニタに提示し、この円の提示範囲内の反応のみ強化した。さらに、この円がモニタ上のあらゆる位置に提示してもそれを追いかけて反応できるように訓練を行った。このような反応が安定した後、モニタ上に大きさの異なる正方形を一対提示し、どちらか一方への反応を強化するという刺激弁別訓練を行ったところ、すべての個体で急速に正答率が上昇することが認められた。従って、本年度は今後弁別行動から刺激般化、概念形成へと解析を進めていく上で最も基礎的な行動訓練の枠組みを整えることができたといえる。昨年度、本実験系の遂行に必要な装置とタスクコントロールプログラムの開発を行い、効率良く一対の刺激間の弁別を形成できる環境を整えることができた。本年度は、弁別行動の随伴性を逆転させことによる、カテゴリー学習を訓練することを目指した。すなわち、個々の刺激の大きさのような絶対的特徴ではなく、「より大きい」「より小さい」のような相対的特徴を共有する刺激に随伴性(強化か非強化か)を共有させ、カテゴリー形成を訓練した。画面上に大きさの異なる正方形を一対提示し、初めはより大きな方にタッチすると餌を得られ、この課題を正確に行えるようになったら、今度はより小さな方に反応すると餌が得られることを訓練した。ヒト被験者では、随伴性の逆転を行うと初めのうちは直前の随伴性に基づいて誤反応を繰り返すが、逆転を何度も繰り返されると、逆転後速やかに新しい随伴性に従った行動を示すようになる。本実験の被験体も、逆転を繰り返す内に90%を超えるほどの正答率への回復が急速になっていくことが確かめられた。先行研究では逆転学習後の回復が、他の霊長類に比べて遅く、正確さも劣ることが指摘されていたが、本実験ではほぼ同等な成績が認められた。これは、本実験が用いた手続きの特徴である、提示刺激の位置のランダム化により、被験体の課題従事へのモチベーションがより維持されたことによるものと考えられる。これにより、最終的な目的であるところの相対的概念の転移(移調)テストに向け、ベースライン行動を標準的に訓練する方法が確立されたと言える。本研究はコモンマーモセットを用い、物理的特徴に基づいて対象を区別する弁別行動から、複数の刺激の特徴間の関係を抽出し、様々な場面に応用させるという関係概念が成立するか、そして成立するならばどのような視覚的処理を行うことにより達成されるのか、について検討することを目的とした。昨年度までに訓練プログラムを開発し、タッチパネル反応形成、大きさの異なる二つの刺激に対する弁別行動の訓練を行ってきた。今年度は大きさの異なる刺激対に対する反応が、刺激の絶対的あるいは相対的特徴のいずれに基づいているかテストを行った。例えば、大・中・小の3つの正方形を用意し、訓練として大と中を提示し、大を選べば正解とする弁別訓練を行うと、刺激の絶対的大きさ、あるいは二刺激の相対的な大きさのいずれかを手掛かりとして用いる可能性がある。そこで、テストにおいては、大・中の刺激を提示する訓練試行に、中・小の刺激を提示するテスト試行をランダムに混ぜ、それに対する反応を検討した。

つまり、テスト試行で小を選べば、訓練で不正解刺激となった中を避ける反応と考えられ、中を選べば、2刺激の相対的大きさに基づきより大きな方を選んだと考えられる。テストの結果、コモンマーモセットは相対的な大きさに基づいた選択、「移調」を示した。さらに、この移調が様々な刺激に応用可能な関係概念であるかどうか、新奇な刺激対を提示してテストした。その結果、5種類の刺激対に対して、訓練刺激対と同じ相対的な大きさに基づく反応が示されたため、関係概念として利用されていると考えられた。5種類の刺激対に対する反応には違いがあり、訓練刺激と外周長が近い刺激に対して最も高い確率で相対的反応が示された。これにより、マーモセットが相対的大きさという抽象的関係概念を使いうること、刺激般化が使えない場合は、外周長の類似性を利用する傾向があることが、初めて示された。2つの対象を区別する際、大きさの違いのような両者の相対的関係に基づいて選ぶ「移調」が示されるか、コモンマーモセットを用いて検討した。大きさの異なる正方形を用いて検討した結果、マーモセットは移調を示し、新奇な刺激対に対しても訓練された相対的関係に基づいて反応した。さらにこの反応が、訓練された刺激に限定されず一般的に応用されるような関係概念であるかどうか、新奇な形の刺激対でテストしたところ、マーモセットはここでも2刺激の相対的特徴に基づく移調を示した。形が異なり類似性に基づいた刺激般化が成立しないような場合、外周長を手掛かりにして反応することが初めて示された。当初の予定通り、弁別行動の訓練から、逆転学習訓練方法の確立まで到達したため。実験心理学これまで通り、被験体の体調管理に留意し、実験を毎日同じ時間に規則的にできるようにしていく。当初予定していたように、本年度の目標である、実験装置や環境の開発と基盤となる行動形成訓練に成功したため。行動訓練と認知課題のテストには相当の月日を要するため、マーモセットの健康管理には特に留意する。飼育管理についての知識は他の実験動物に比べそれほど一般化されていないため、マーモセットを用いて研究中の他研究室の知見や意見を活用したい。未使用の発生は効率的な物品調達を行った結果であり、次年度の研究費と合わせて消耗品購入に充てる予定である。物品費は実験を長期にわたり効率よく行うための消耗品の購入が中心となる。情報収集と成果発表を行うために、旅費によって国内・国外学会に参加する。
歯冠・歯列形態のデータベースおよびＣＡＤ／ＣＡＭに応用する統計解剖モデルの構築

対象の患者データ(11症例)から一例を抽出し,第一大臼歯の欠損モデルを作成し,残りの症例の第一大臼歯のモデルから部分最小二乗回帰を用いることで,抽出した症例の欠損した第一大臼歯形状を推定した.推定形状と正解形状との誤差をAverage Symmetric Surface Distance (ASD)を用いて評価した.leave-one-out交差検証により,本手法の精度を評価したところASD誤差は0.60±0.17(mean±std)mmであった.症例数を増加することにより,臨床応用可能であることが示唆された.本研究は、CAD/CAMシステムにおいて,患者個々の審美・機能的形態に対応する補綴装置の製作を目標に,歯列模型より得られる歯冠・歯列形態を三次元情報としてデータベース化し,形態の統計解析から標準化モデル(計算解剖モデル)構築をめざしている.平成24年度にはソフトウエアの開発を手付け,個々のデータを保管するデータベースの構築を行った.当初,平成24年度に行う予定であった歯列のデータ化は一般的に研究用模型を三次元表面形状測定装置にて計測を行い,三次元再構築画像を製作することにより得られる.しかし,三次元再構築画像の製作までには計測ピッチ,計測方向,ポリゴン生成までの処理(Aling,Marge)などの条件設定の検討を行う必要がある.そこで,平成25年度これまでの研究により臨床的に応用可能な精度を持つオプトレース(松風)を改良した三次元表面形状測定装置を用いて,データ化における条件設定を試みた.三次元表面形状測定装置にて得られた8方向の点群データを三次元解析ソフト(VRmash)を用い最小二乗法にてレジストレーション後,ポリゴンの生成を行う.それぞれ計測ピッチやポリゴンの生成方法にて製作を行い歯列模型のデジタルデータを比較することから最適なデータを選択した.計測ピッチおよび各点群のレジストレーション方法,データの補完など十数個の条件の組み合わせを試し,比較することから,詳細かつスムースな形状を取得できた.今後はこれらのデータから解剖学的特徴点を取得できるソフトウェアの開発を行う.対象の患者データ(11症例)から一例を抽出し,第一大臼歯の欠損モデルを作成し,残りの症例の第一大臼歯のモデルから部分最小二乗回帰を用いることで,抽出した症例の欠損した第一大臼歯形状を推定した.推定形状と正解形状との誤差をAverage Symmetric Surface Distance (ASD)を用いて評価した.leave-one-out交差検証により,本手法の精度を評価したところASD誤差は0.60±0.17(mean±std)mmであった.症例数を増加することにより,臨床応用可能であることが示唆された.本研究は歯列模型より得られる歯冠・歯列形態を三次元情報としてデータベース化し,形態の統計解析から標準化モデル(計算解剖モデル)を構築する.個々にバリエーションのある歯冠・歯列形態をモデル化することから,CAD/CAMシステムにおいて,患者個々の審美・機能的形態に対応する補綴装置の製作が容易に行えることを目的とする.平成24年度における当初の計画はデータの収集および三次元再構築画像の製作および精度検証などであった.しかし,三次元再構築画像の製作には精度が求められ,様々な条件設定やデータの容量,計測ピッチ計測方法などが存在することから,本研究に適したデータの構築が必要となる.データ形式の決定のためには各歯種における解剖学的特徴点の抽出のための統計処理(主成分分析)を行うソフトウエアが必要であったが,ソフトウェアの完成には形態の特徴点を数学的に解析するアルゴリズムの選択および開発が必要となり,本年度は試行錯誤的に開発を行っていたため,データ形式の選択まで行うことが困難であった.そこで本年度は平成25年度以降に予定していたデータベースの構築(データ管理とバックアップシステム):三次元再構築画像は個人情報であるため専用PCにてデータ管理を行う.データベースにはバックアップシステムを設け,さまざまな原因で失われる可能性のあるデータを保護する.データベースには上顎歯列模型,下顎歯列模型,咬合状態の形態データ,および年齢,性別,疾患の有無,疾患の種類を記録し,それぞれにおける形態の比較を行える環境を設定した.歯科用CAD/CAMシステムでは,従来の補綴装置製作方法(ロストワックス法)とは異なる,補綴装置の歯冠形態を計算機上で設計する必要がある.しかし,患者個々の解剖学的形態や機能に調和させるのは容易ではない.そこで,人体の解剖構造を統計数理的に表現し,コンピュータによる診断・治療支援を行える計算解剖学的手法を用い,隣在歯の歯冠形態から当該歯(支台歯)の歯冠形態を統計的に推定することを目的とした.本研究で,歯冠形態のデータ抽出が容易なCT画像から構築した一歯のデータを対象とし,統計解剖モデルの構築を検討した.補綴科へ来院し,CT撮影を行った258名のうち,口腔内に金属修復物を認めず,矯正治療の既往のない11症例を抽出し、その第一大臼歯を対象とした.対象のCTデータから三次元解析ソフト(Amira4.1.2,Mercury Computer Systems)を用いて第二小臼歯,第一大臼歯,第二大臼歯を領域抽出した.Thresholdを用いて自動抽出した後、連続部(接触点部)を手動で修正した.対象の患者データから一例を抽出し,第一大臼歯の欠損モデルを作成し,残りの症例の第一大臼歯のモデルから部分最小二乗回帰(PLSR; Partial Least Squares Regression)1)を用いることで,抽出した症例の欠損した第一大臼歯形状を推定した.推定形状と正解形状との誤差をAverage Symmetric Surface Distance (ASD)を用いて評価した.以上のleave-one-

out交差検証により,本手法の精度を評価した.両隣在歯(第二小臼歯、第二大臼歯)から当該歯(第一大臼歯)の形状が推定された.推定形状と正解形状との誤差は小さく,本法により隣在歯の形態から補綴装置の歯冠形態を推定するCAD/CAMシステムへの応用の可能性が示唆された.クラウンブリッジ補綴学本研究は、CAD/CAMシステムにおいて,患者個々の審美・機能的形態に対応する補綴装置の製作を目標に,歯列模型より得られる歯冠・歯列形態を三次元情報としてデータベース化し,形態の統計解析から標準化モデル(計算解剖モデル)構築をめざしている.研究の進行状況として平成24年度・平成25年度の予定であった,歯列模型のデジタル化における設定条件およびデータベースの構築が完了していることからおおむね順調に進展していると思われる.当初の平成24年度被験者のデータ採取(研究用模型の作製)アルジネートもしくはシリコーン印象にて採得された印象をもとに,研究用模型を製作する.次に,研究用模型を三次元表面形状測定装置にて三次元再構築像を作製する.被験データは,個々の歯,歯列,並びに上下の対合関係の再現が可能である.三次元再構築画像の製作および精度検証得られた研究用模型のデジタルデータは,三次元的な座標を有し,これにポリゴンを生成することで三次元再構築データとすることが一般的である.しかし,そのデータは個々のデータの容量により,そのデータベース総容量が決定する.したがって,使用目的に応じたデータ採得が重要となるため,計測ピッチ,計測方向と回数,AlingとMargeなどの条件設定の検討が必要となる.これらの条件を抽出後,個々のデータの容量を決定する.実際には平成25年度以降で予定していたデータベース(データ管理とバックアップシステム)の構築を行い,各歯種における解剖学的特徴点の抽出のための統計処理(主成分分析)に着手した.当初の計画であったデータの採得は行っていないが,平成25年度以降の計画を行ったためやや遅れている感はあるものの,おおむね順調に進展していると思われる.平成26年度は,現在開発中の解剖学的特徴点を自動で抽出し,これらの座標値を統計解析することで標準化モデルを作製できるソフトウェアを完成し,歯列モデルの標準化モデルの製作を行う.ただし,標準化モデルの製作には多くのデジタルデータが必要なため,サンプル数を増加させ,データを収集していく必要がある.今後は当初の計画であったデータの採得および三次元再構築画像の製作および精度検証を行うと共に本年度より着手している各歯種における解剖学的特徴点の抽出のための統計処理(主成分分析)についての研究を行う.主成分分析は,多変量(多次元ベクトル)の持つ情報を少数個の特性値に要約することのできる数学的手法である.あらゆる形状を含む三次元空間から歯冠形態が占める定義域を決定する.
国際赤道レ-ダ-を中心とした赤道大気観測推進に関する研究調査

本研究では赤道レ-ダ-建設候補地の現地調査を実施し、さらに赤道大気研究に関する国際シンポジウムをインドネシアにおいて開催した。1.過去数年間にわたって行われた、赤道大気観測所設立に関するフィジビリティスタディの成果をもとに、インドネシア共和国西スマトラ州ブキティンギ市近郊に建設候補地を選定した。観測所候補地において、中心的設備となる赤道レ-ダ-・システムに関する電波環境調査を実施し、電波雑音の強果、ならびに周囲の山岳からの反射エコ-(グランド・クラッタ-)の特性を調査した。インドネシア共和国の技術評価応用庁(BPPT)が行った建設候補地の地形調査の結果をも含めて赤道レ-ダ-の詳細設計を行った。2.京都大学超高層電波研究センタ-とBPPTが中心となって、赤道大気研究に関する国際シンポジウムが既に2回開催してきたが、国際協同観測計画等の世界的動向を調査するために平成3年5月に第3回国際シンポジウムを、ジャカルタにおいて開催した。会議には日本・インドネシア・米国・フランス・オ-ストラリアから百余名が出席し、地球環境変化を研究対象としているSTEP、IGBP、TOGA/COARE、TRMMといった国際協同観測計画と赤道レ-ダ-計画との関連を中心に活発な議論がなされた。主な結論は以下の通りである。(1)赤道大気は海洋と結合して、局在する運動・熱エネルギ-や化学物質をグロ-バルに輸送する、地球大気循環システムのエンジン部に相当し、なかでも活動度の変動が激しいインドネシア域は地球環境変化の鍵を握る重要な領域であることが認識された。(2)赤道大気が地球環境変化に重要な影響を与えていることは世界各国の研究者が共通して認識しているにも拘らず、赤道域での総合的な研究体制が十分に整備されていなかったために赤道大気の種々の物理化学現象の研究は未解明の部分が多いことが力説された。(3)インドネシアの西スマトラ域は、積雲対流が活発であるばかりでなく、アジア・モンス-ンの通過路として最も興味深い地域である。また、太平洋とインド洋の境界となり、海流が複雑に変化する重要な領域である。一方、東太平洋において赤道に沿って展開されている観測網と、シベリアー日本ーインドネシアーオ-ストラリアー南極と広がる子午線沿いの観測ネットワ-クの交点として、重要な地点である。(4)大気観測用の大型レ-ダ-(赤道レ-ダ-)を赤道直下の西スマトラ州に建設し、地表から高度約1,000kmにいたる大気を優れた時間・高度分解能で長期間にわたって連続的に測定し、赤道大気が地球環境変化に及ぼす影響を科学的に解明することが必要である。また、赤道大気研究や大気観測技術に関する最新の成果を考慮すると、多岐にわたる研究手法を有機的に結合し、赤道大気の振舞いを総合的に研究することが重要であることが示された。(5)京都大学超高層電波研究センタ-は1984年以来MUレ-ダ-(Middle and Upper Atmosphere Radar)を用いて高度2ー400kmの大気観測を行ってきていることから、この経験を活かし赤道レ-ダ-の建設に責任を持ち、地球環境変化の科学的解明により国際社会に貢献することが要請された。(6)赤道大気観測を有効に行うにはこれらのハ-ドウェアの建設だけでなく、運営面を重視する必要があり、日本とインドネシアが中心となって、赤道大気観測所を中心に赤道大気に関連して幅広い研究活動を、長期間にわたって定常的に支援する組織として国際赤道大気研究センタ-(ICEAR:International Center for Equatorial Atmosphere Research)提案された。(7)インドネシア国内に赤道大気研究グル-プの育成を図るために、日本人研究者がインドネシアの主要な大学・研究機関において集中セミナ-を行うとともに、京都大学のMUレ-ダ-を用いた実験にインドネシア人研究者の参加を要請し、国際共同研究を行う必要があることが示された。

(2)赤道大気が地球環境変化に重要な影響を与えていることは世界各国の研究者が共通して認識しているにも拘らず、赤道域での総合的な研究体制が十分に整備されていなかったために赤道大気の種々の物理化学現象の研究は未解明の部分が多いことが力説された。(3)インドネシアの西スマトラ域は、積雲対流が活発であるばかりでなく、アジア・モンス-ンの通過路として最も興味深い地域である。また、太平洋とインド洋の境界となり、海流が複雑に変化する重要な領域である。一方、東太平洋において赤道に沿って展開されている観測網と、シベリアー日本ーインドネシアーオ-ストラリアー南極と広がる子午線沿いの観測ネットワ-クの交点として、重要な地点である。(4)大気観測用の大型レ-ダ-(赤道レ-ダ-)を赤道直下の西スマトラ州に建設し、地表から高度約1,000kmにいたる大気を優れた時間・高度分解能で長期間にわたって連続的に測定し、赤道大気が地球環境変化に及ぼす影響を科学的に解明することが必要である。また、赤道大気研究や大気観測技術に関する最新の成果を考慮すると、多岐にわたる研究手法を有機的に結合し、赤道大気の振舞いを総合的に研究することが重要であることが示された。(5)京都大学超高層電波研究センタ-は1984年以来MUレ-ダ-(Middle and Upper Atmosphere Radar)を用いて高度2ー400kmの大気観測を行ってきていることから、この経験を活かし赤道レ-ダ-の建設に責任を持ち、地球環境変化の科学的解明により国際社会に貢献することが要請された。(6)赤道大気観測を有効に行うにはこれらのハ-ドウェアの建設だけでなく、運営面を重視する必要があり、日本とインドネシアが中心となって、赤道大気観測所を中心に赤道大気に関連して幅広い研究活動を、長期間にわたって定常的に支援する組織として国際赤道大気研究センタ-(ICEAR:International Center for Equatorial Atmosphere Research)提案された。(7)インドネシア国内に赤道大気研究グル-プの育成を図るために、日本人研究者がインドネシアの主要な大学・研究機関において集中セミナ-を行うとともに、京都大学のMUレ-ダ-を用いた実験にインドネシア人研究者の参加を要請し、国際共同研究を行う必要があることが示された。
暑熱による脳障害の機構解明と改善に有効な薬物の開発

Wistar系雄性ラットの海馬スライス標本を用い、神経活動に対する高温の影響を細胞内記録法により検討した。(1)標本灌流液を36°Cに維持し、CA1ニューロンの静止膜電位(-68.7±1.5mV)が安定した後40°Cに12分間上昇させると、膜抵抗の減少を伴う過分極電位(3.6±0.5mV)が58分以内に発生した。同時に記録したSchaffer側枝の電気刺激に誘発される興奮性シナプス後電位(EPSP)は、温度上昇により速やかに抑制され5分後には安定した(抑制率40%)。(2)32°Cに維持した灌流液中にアデノシンを投与すると、CA1ニューロンに過分極電位が発生し、シナプス前性に興奮性アミノ酸の放出が抑制されてEPSPが減少した。これらの反応はアデノシンA_1受容体(A_1)を介していた。(3)A_1拮抗薬DPCPX(1μM)を溶解させた灌流液中では、36°Cから40°Cへ上昇させた時の速やかなEPSPの抑制は阻害された。また、アデノシン(10μM)存在下では36°Cから40°Cへ上昇させた時のEPSPの抑制は軽減した。(4)DPCPX、アデノシンいずれの存在下でも、灌流液温を36°Cから40°Cへ上昇させると、対照液中と同様に膜抵抗の減少を伴う過分極電位が発生した。(5)対照液中で40°Cを持続させると20分以降にEPSPの増大、50分以降に不可逆性の急峻な脱分極が起こった。以上より温度上昇時には、(1)内因性アデノシンが非常に早期から増加しA_1を介して興奮性アミノ酸の放出を抑制すること、(2)過分極電位の発生にはA_1以外の要因が関与することが示唆された。A_1の活性化は主に神経保護的な意義があると考えられている。高温が続くとアデノシンA_2受容体(A_2)の活性化や他の機構により細胞の興奮性促進、破綻をもたらす可能性もある。今後、A_2の関与やA_1アゴニストによるさらなる神経保護効果を検討したい。(1)Wistar系雄性ラットの海馬スライス標本(厚さ400μm)を用いて、CA1ニューロン活動に対する高温の影響を細胞内記録法により検討した。標本灌流液(人工脳脊髄液)を36°Cに維持し、静止膜電位(-67.4±1.2mV)が安定した後、58分間40°Cに上昇させると、膜抵抗の減少を伴う過分極電位(3.2±0.8mV)が発生した。この過分極電位は、36°Cに戻すと20分程度で回復した。また、同時に記録したSchaffer側枝の電気刺激に誘発される興奮性シナプス後電位(EPSP)は、温度上昇により可逆的に40%程度抑制された。しかし40°Cに維持したニューロンでは5090分後に、36°Cから42°Cに上昇させたニューロンでは10分以内に、OmV付近に至る急峻な脱分極電位が起こり、EPSPは完全に消失した。急峻な脱分極電位が発生した後には、灌流液温を36°Cに低下させても静止膜電位、EPSPともにほとんど回復しなかった。以上の結果から、(1)シナプス伝達を含めたCA1ニューロンの興奮性は、温度上昇により速やかに抑制されること、(2)40°Cを超える高温や40°Cの持続により、CA1ニューロンの膜機能に不可逆的な障害が起こることが示唆された。(2)アデノシンA_1受容体アゴニストであるADAC(adenosine amine congener)のCA1ニューロンに対する影響を、32°Cに維持した灌流液中で検討した。ADACは、A_1受容体を介して濃度依存性(0.011μM)にCA1ニューロンに過分極電位を起こし、EPSPをシナプス前性に(興奮性アミノ酸放出の抑制により)抑制することが示唆された。ADACの効果はアデノシンの100分の1に近い低濃度で観察された。これらのデータをふまえ、(1)で観察された高温による障害に対するADACの保護作用の有無を検討する予定である。

また、アデノシン(10μM)存在下では36°Cから40°Cへ上昇させた時のEPSPの抑制は軽減した。(4)DPCPX、アデノシンいずれの存在下でも、灌流液温を36°Cから40°Cへ上昇させると、対照液中と同様に膜抵抗の減少を伴う過分極電位が発生した。(5)対照液中で40°Cを持続させると20分以降にEPSPの増大、50分以降に不可逆性の急峻な脱分極が起こった。以上より温度上昇時には、(1)内因性アデノシンが非常に早期から増加しA_1を介して興奮性アミノ酸の放出を抑制すること、(2)過分極電位の発生にはA_1以外の要因が関与することが示唆された。A_1の活性化は主に神経保護的な意義があると考えられている。高温が続くとアデノシンA_2受容体(A_2)の活性化や他の機構により細胞の興奮性促進、破綻をもたらす可能性もある。今後、A_2の関与やA_1アゴニストによるさらなる神経保護効果を検討したい。
凍結保存が困難な菌根性担子菌培養株の長期保存法の開発

真菌類の中でも菌株保存が特に困難である菌根性担子菌類の菌株の凍結保存法および凍結保存後の菌株の品質評価法を開発し、本菌群の長期保存法を確立することを目指す。研究方法は、以下のとおりである。1凍結保存前の前培養法の改良:これまでに効果が認められている多孔性鉱物を培養基材とした手法を改良する。2凍結保存後の菌株の品質評価法の確立:宿主植物との共培養によって菌根形成能の保存性を評価する手法を確立する。3汎用性の高い保存法の確立:多種多様な菌株を用い,1で改良した保存法の有効性を評価し、培地、凍結法、凍結保護剤、復元培養法などに改良を加え、菌株を長期間安定して保存できるプロトコルを開発する。
糸状菌によりセルロース生分解におけるセロビオース脱水素酵素の機能

白色腐朽菌Phanerochaetechrysosporiumはセルロースを基質にして培養することによって、2種のセロビオース脱水素酵素、すなわちセロビオース酸化酵素(CBO)およびセロビオースキノン脱水素酵素(CBQ)を生産するが、このうちCBQはCBOのプロテアーゼによる分解によって2次的に派生してきたものであることを明らかにした。したがって、セルロース生分解に直接的に関与するのはCBOであると考えられた。また、CBOは発見当初は酵素を電子受容体とする酸化酵素と考えられていたが、チトクロムcなどの3価鉄を含む化合物を電子受容体とする酸化還元酵素であることを示した。CBOは単独では綿セルロースを全く可溶化することができなかった。また、セルラーゼとともに作用させても、その明確な相乗効果は認められない。したがって、CBOは高分子セルロースの可溶化には重要な役割を果たしていないものと推察された。このことは、CBOが結晶性および非晶性を問わず高分子セルロースの還元末端の酸化能力が極めて低いことからも裏付けられた。さらに、CBOのセルロースへの吸着状態を免疫電子顕微鏡で観察したところ、CBOはセルロースの非晶性領域の一部にのみ結合されることが明かとなった。以上のことから、CBOは少なくとも結晶性セルロースの生分解の初期過程に直接的な関与はしていないものと思われた。したがって、CBOの機能はある程度までに低分子化された非晶性セルロースやセロオリゴ糖の代謝、特にCBOがチトクロムcなどの鉄を含有する化合物を電子受容体としていることを考慮すると、セロオリゴ糖の菌体内への取り込みや、その後のエネルギー代謝に共役した何らかの重要な役割を果たしているものと推察される。糸状菌Phanerochaetechrysosporiumによるセルロース生分解と2種のセロビオース脱水素酵素であるセロビオース酸化酵素(CBO)ならびにセロビオース:キノン酸化環元酵素(CBQ)の誘導について調ベた。セルロースを基質とする培地で本菌を培養すると、対数増殖期から培養後期にセロビオース脱水素酵素活性が増加する。CBOとCBQはチトクロムCの環元において、前者が効率的に環元するのに対して後者は出来ないことにより、明瞭に区別される。このことから、対数増殖期には主としてCBOが生産され、CBQは培養後期になって著しく培地中に蓄積されることが明らかとなった。したがって、本菌によるセルロース生分解時に一次的に生産されるセロビオース脱水素酵素はCBOであり、CBQは二次的な産物であることが示唆された。このような理由から、以後の実験にはCBOを用いることにした。セルロースを基質として本菌を培養した培養液からDEAEイオン交換クロマトグラフィーを用いて、CBO、エンド型セルラーゼならびにエキソ型セルラーゼを分離精製し、各々の酵素が綿セルロースの可溶化に与える影響を基質の重量減少から評価した。その結果は、エンド型セルラーゼならびにエキソ型セルラーゼの組み合わせのみが、綿セルロースの可溶化に大きな影響を与え、CBOは綿セルロースの可溶化に対しては大きな貢献をしていないことが示唆された。CBOに対して酸素よりも良好な電子受容体であるキノン化合物や鉄化合物を添加した反応系でも、このことは同様であった。CBOのセルロース生分解での役割は依然として不明であるが、培地中の蓄積されたCBO量(20mg/l程度)を考慮すると、CBOの重要性については疑いの余地はない。今後は、本菌によるセルロースのエネルギー代謝という点により着目し、セルロース生分解時におけるCBOの電子受容体とその役割について検討を加えて行く。Phanerochaete chrysosporiumの生産するセロビオース脱水素酵素のうち、セルロース生分解に関与していると思われるセロビオース酸化酵素(Cellobiose oxidase:CBO)の機能について解析をおこなった。

ホヤの外套膜から調製したセルロースのミクロフィブリルにCBOを吸着させ、抗体-金コロイド法を用いた透過型電子顕微鏡によりセルロースに対するCBOの吸着状態を観察した。その結果、CBOは高結晶性のミクロフィブリル表面には結合せず、ミクロフィブリルに付随した非晶性領域と思われる部分にのみ吸着されることを明らかにした。また、15量体の不溶性高結晶セロオリゴ糖にCBOを作用させても、セロオリゴ糖の還元末端の酸化はほとんど観察されず、濁度変化の観察などによってもCBOがセロオリゴ糖の結晶構造を分解している様子は認められなかった。さらに、セルラーゼによるセロオリゴ糖の可溶化に対するCBOの相乗効果は認められなかった。したがって、CBOはセルロース結晶構造の分解には直接的には関与していないことが強く示唆された。一方、7量体の可溶性セロオリゴ糖に対して、CBOはセロビオースに対するのと同程度の速度で還元末端を酸化することができた。しかしながら、CBOにはカルボキシメチルセルロース(CMC)の還元末端は酸化できず、またCMCを加水分解する能力(エンド型グルカナーゼ活性)は認められなかった。CBOによる可溶性セロオリゴ糖の還元末端の酸化は、セルラーゼによるセロオリゴ糖の再重合化を抑制し、セルロース分解生成物をセロビオノラクトンに限定すると考えられる。CBOの電子受容体についてはFe(III)錯体であることを明らかとしたが、菌体外液にはこのような錯体化合物を見いだすことはできなかった。したがって、CBOの電子受容体は菌体膜上に存在している可能性が高い。以上のことから、CBOはセルラーゼによるセルロース分解生成物の菌体内への取り込みと、その後のエネルギー代謝において重要な役割を果たしていると考えられた。