hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
巨大な非線形光学効果を有する擬一次元金属錯体の創製

20世紀の「エレクトロニクスの時代」から今21世紀は「光(フォトニクス)の時代」と言われている。その中枢を担うのが非線形光学効果である。大容量高速光通信や光コンピュータや光スイッチにとって、大きな非線形光学効果を、持つ化合物の開発は必須である。これまでの研究からナノワイヤー(量子細線)が量子閉じこめ効果のために大きな非線形光学効果を持つと言われていた。ナノワイヤーのうちで「バンド絶縁体」や「パイエルス絶縁体」に関する研究は非常に多かったが、強相関電子系の「モット絶縁体」に関する研究は皆無であった。我々は強相関電子計のモット絶縁体の一種である[Ni(chxn)_2Br]Br_2の三次非線形光学効果について電場変調法により求め、世界最高の値を持つことを示した(10^<-4> esu)。本研究においては電荷移動吸収帯を通信波長帯領域に持っていくことを目的に物質開発を行った。そのためにNiとPdの混晶系の作成を行った。[Ni(chxn)_2Br_2]と[Pd(chxn)_2]Br_2をいろいろな比率で混ぜたメタノール溶液を電解法で酸化したところ一連のNi-Pd混晶Ni_<1-x>Pd_x(chxn)_2X_3を単結晶で得ることに成功した。これを用いて電場変調法により三次非線形光学効果について測定する予定である。これまで非線形光学効果に関して「量子細線」として研究されてきた化合物群には、パイエルス絶縁体やバンド絶縁体がある。パイエルス絶縁体の代表的なものとしてはポリジアセチレンやポリアセチレンやハロゲン架橋白金混合原子価錯体などがあり、χ^<(3)>は10^<-8>10^<-10>e.s.u.である。バンド絶縁体の代表的なものとしてはポリシランがあり、χ^<(3)>は10^<-10>e.s.u.である。一方、もう一つの量子細線であるモット絶縁体に対する非線形光学効果に対する研究は皆無であった。我々が永年研究をしている擬一次元鎖ハロゲン架橋金属錯体は金属イオンがPtやPdの場合、電子格子相互作用が強いためにパイエルス転移を起こし、通常のパイエルス絶縁体になるが、Niの場合は電子相関が強いためにモット絶縁体になっている。この化合物の組成式は[Ni(chxn)_2Br]Br_2で表され、各Ni^<III>上に不対電子が反強磁性的に並んでおりJ値は-3600kに達する。この化合物は1.3eV付近に一次元方向に架橋BrからNiのupper-Hubbard bandへの大きな振動子強度を持つ電荷移動吸収帯がある。そのため大きなχ^<(3)>が期待される。実際に電場変調法によりχ^<(3)>を求めてみると10^<-4>e.s.u.にも達した。これは従来の1万倍以上の大きさである。このように大きなχ^<(3)>を持ったのはこの化合物が「量子細線」であり、強相関電子系でありかつ1光子禁制遷移双極子モーメントが非常に大きいためである。パイエルス絶縁体の代表的なものとしてはポリジアセチレンやポリアセチレンやハロゲン架橋白金混合原子価錯体などがあり、χ^<(3)>は10^810^<-10>e.s.u.である。この化合物の組成式は[Ni(chxn)2Br]Br2で表され、各Ni^<III>上に不対電子が反強磁性的に並んでおりJ値は-3600kに達する。

これまでの研究からナノワイヤー(量子細線)が量子閉じこめ効果のために大きな非線形光学効果を持つと言われていた。ナノワイヤーのうちで「バンド絶縁体」や「パイエルス絶縁体」に関する研究は非常に多かったが、強相関電子系の「モット絶縁体」に関する研究は皆無であった。我々は強相関電子計のモット絶縁体の一種である[Ni(chxn)_2Br]Br_2の三次非線形光学効果について電場変調法により求め、世界最高の値を持つことを示した(10^<-4> esu)。本研究においては電荷移動吸収帯を通信波長帯領域に持っていくことを目的に物質開発を行った。そのためにNiとPdの混晶系の作成を行った。[Ni(chxn)_2Br_2]と[Pd(chxn)_2]Br_2をいろいろな比率で混ぜたメタノール溶液を電解法で酸化したところ一連のNi-Pd混晶Ni_<1-x>Pd_x(chxn)_2X_3を単結晶で得ることに成功した。これを用いて電場変調法により三次非線形光学効果について測定する予定である。
敗血症下における免疫異常と成体幹細胞動態解析:骨髄移植による再生治療の試み

敗血症性ショックの患者の血液から取り出した免疫担当細胞であるリンパ球及び単球の機能は、敗血症性ショックと診断された1日目から異常を認めた。この異常は3日目も続いていたが、病態が改善してきた7日目には回復を認めた。治療の甲斐なく死亡した症例では7日目でも回復していなかった。この結果は敗血症性ショックでは早期から免疫担当細胞の量的・質的低下が起こっており、免疫不全状態の回復の有無が重症化の鍵となっていることを示している。骨髄移植による免疫不全状態からの「再生」は敗血症に対する有効な治療法になりうる可能性が示唆された。敗血症患者検体からTCR多様性、PD-1/HLA-DRの発現状態の検討では重症度が高いほど免疫不全状態にあり、CD34+,VEGFR-2+/CD133+リンパ球動員率は高値で骨髄由来造血幹細胞の誘導率が高い傾向にある。しかし、病態・重症度、感染源(細菌・ウィルス)などによりこれらにも多様性がある。さらに症例数を重ねて検討を進める必要がある。敗血症は、過剰なサイトカインによる免疫の異常活性と免疫不全状態が複雑に混在した病態である。敗血症の初期段階は過剰なサイトカインによる免疫異常活性状態であり、この時期は多臓器障害を認めていても病態は可逆的であり、適切な感染源ドレナージと輸液・昇圧剤使用などの治療で改善する。重症敗血症状態が長期化する(感染源のドレナージ・炎症コントロールが不十分な状態が続く)と多臓器不全を認めるようになり既存の治療での改善は難しい不可逆な状態に陥る。この時期こそが免疫不全状態imnoparalysisであると考える。敗血症性ショック(重症化した敗血症)では診断直後より、既存の治療に加え、過剰なサイトカインを非選択的に除去する血液浄化法と活性化した好中球を吸着するPMX-DHPの施行によりimmunoparalysisへの悪化を抑制し病態を改善させることが可能であり、実臨床において良好な治療成績を収めており、その成果と有効性のメカニズムについて国内外の学会にて報告した。またこれら治療法を導入しても改善できなかった症例についても検討を加え、各内外の学会で報告した。敗血症の病態(hyperimmunolysisかimmunoparalysisか)については、引き続き敗血症性ショック患者の血液を採取しHLADR発現・CD34+,CD133+リンパ球動員率の測定などから検討している。マウス敗血症モデルへの骨髄造血幹細胞の自家移植の効果については研究・検討には至っていない。実臨床においては良好な成績を治め順調に学会等で報告しているものの、研究面においては平成27年9月より大学を移動した(藤田保健衛生大学から名古屋市立大学へ移動)経緯もあり、実験を行う状況を整えられなかった。また現在は救急患者の初期診療を主に担当しており、集中治療室での重症患者管理から離れた環境にあり、敗血症性ショック患者の血液採取などが行えていない。大学を移動後は敗血症患者に対して集中治療管理を行う機会が減少し検体採取が滞っており、研究室の準備も整っておらず研究が円滑に行えていない状態である研究成果の一環として、これまで関わってきた敗血症の治療方針と治療成績についてまとめ学会で報告した。治療成績は先進施設から報告されている救命率やSOFAscoreやAPACHEIIからの予測死亡率と比較しこれらを凌ぐ治療成績であった積極的な血液浄化(CHDFと比較し90倍のGDと2倍のQFを発揮するHDFと活性化好中球・血小板を効果的に除去するPMXを併用する)によりサイトカイン・ROS・cannabinoidsなどを除去でき、高い救命率を維持しているとの考察を加えたH27年度移動があり研究室の準備が整わず滞っている。現在はICUよりERでの初期診療を主な臨床業務としており、敗血症患者の集中治療を自科で行なっておらず、検体採取も停滞している敗血症生ショック患者のT細胞に及ぼす影響を調べため、敗血症患者のICU入室1、3、7日目の血液を採取し、T細胞レパトア形成に必須であるT細胞受容体(TCR)多様性の遺伝子解析、抗原提示の抑制分子であるprogrammed death(PD)-1のT細胞における発現(PD-1+CD4+)、HLA-DR+CD14+、CD3+リンパ球数のFACS解析を行った。TCR多様性は、敗血症性ショック患者の第1病日において多様性が最も少なく、以後経時的に多様性が回復したCD4+PD-1+リンパ球は、健常人に比して第1病日にすでに増加を示し以後病態の回復とともに減少した単球におけるHLA-DR発現は1病日にすでに著明に低下していたリンパ球数は健常人に比し敗血症性ショック患者において1病日にすでに減少を認め、以後全身状態の改善とともに回復傾向を示した。死亡例においては低値にて推移した。今回の結果より単球の抗原提示に必須であるHLA-DRの低下、TCRの多様性障害、さらにはPD-1の発現亢進が相まって抗原情報のT細胞への伝達障害が敗血症性ショック患者で認められることが推察された。リンパ球は数の減少のみならず質的障害も生じていることが明らかになった。Immunoparalysisは敗血症発症早期から認められ、重症化の原因である可能性が示唆された。骨髄幹細胞移植による免疫賦活療法が有効となる可能性が示された結果であった。

敗血症性ショックの患者の血液から取り出した免疫担当細胞であるリンパ球及び単球の機能は、敗血症性ショックと診断された1日目から異常を認めた。この異常は3日目も続いていたが、病態が改善してきた7日目には回復を認めた。治療の甲斐なく死亡した症例では7日目でも回復していなかった。この結果は敗血症性ショックでは早期から免疫担当細胞の量的・質的低下が起こっており、免疫不全状態の回復の有無が重症化の鍵となっていることを示している。骨髄移植による免疫不全状態からの「再生」は敗血症に対する有効な治療法になりうる可能性が示唆された。本研究計画を立案した当初の予想とかけ離れた結果ではないものの、やはり病態により免疫状態は複雑であり、多様性がある。さらなる症例数を重ねて検討を進める必要がある。敗血症は、過剰なサイトカインによる免疫の異常活性と免疫不全状態が複雑に混在した病態と言える。敗血症初期は過剰なサイトカインによる免疫異常活性状態であり、この時期は多臓器の障害を認めるものので病態は可逆的であり、適切な感染源ドレナージと輸液・昇圧剤使用などの治療で改善する。感染源が除去・炎症のコントロールが不十分が状態が続くと多臓器不全を認めるようになり既存の治療での改善は難しい不可逆な状態に陥る。この時期は免疫不全状態imnoparalysisであると考える。つまり、敗血症性ショック患者でも初期の段階(免疫賦活化状態)では、免疫を賦活化する必要はなくむしろ有害である可能性すらあり、免疫不全状態に陥って初めて、提唱する骨髄幹細胞移植による免疫再賦活化が必要となると考えている。今後は、まずは敗血症の免疫異常活性期と免疫不全期を見極める必要があり、免疫不全状態において本治療の有効性を探求していく。研究室の物品など準備を整え結果を学会発表・論文作成へと繋げる検体採取については集中治療部など他科と連携し円滑に行えるよう体制を整える救急医療、集中治療引き続き敗血症患者から検体採取を行い分析を進めていく。検体採取は、敗血症、重症敗血症・敗血症性ショックの各病態患者から行い、各病態ごとに検討を進めていく。マウス敗血症モデルより幹細胞移植の是非について検討していく大学の移動など重なり研究が進められなかった。臨床データは蓄積しているが保険診療内の治療であり、研究費を使用する必要がなかったため移動に伴い研究の整備、検体採取など準備が整わず研究が遅れているためこれまでの研究において当研究室に備蓄してあった実験器具・研究薬品などを使用したため、購入の必要がなかった血液採取、研究室の構築、パソコン購入、学会参加などに使用予定人件費での使用は考えていない研究のための物品購入、学会発表、データ整理のためのPC購入、ソフト購入などに使用する予定検体数に応じた物品・薬品・実験器具など購入する
ピルビン酸キナーゼにおけるアロステリック効果の発現機構の解明

本研究では、ピルビン酸キナーゼ(PK)のアロステリック効果に重要なアミノ酸残基を同定するために、同一遺伝子からalternative splicingによって生成する性質の異なるふたつのPKアイソザイム、M2(アロステリック型)およびM1(非アロステリック型)の一次構造を比較し、サブユニット接触面にあるどのアミノ酸残基が重要な役割をもつのかを部位特異的変異法により検討した。変異を導入した組換え酵素の発現にはバキュロウイルス昆虫細胞発現系を用いた。これによりラットピルビン酸キナーゼM1およびM2アイソザイムの組換え体酵素の大量発現系を確立できた。M1アイソザイムのサブユニット接触面にあるアミノ酸残基をM2のものに置換した酵素を発現、精製し、酵素学的な性質を調べたところ、Ala-398をM2型のArgに置換すると、基質であるphosphoenolpyruvateに対するHill定数が1(非アロステリック)から2.7へ大きく増加し、同時にKmが約8倍に増加することがわかった。さらに、この変異酵素はM2やLのようなnativeなアロステリック型アイソザイムと同様に、fructose-1,6-bisphosphateによって活性化され、サブユニット接触面の単一アミノ酸置換がhomotropicおよびheterotropicなアロステリック効果を引き起こすことがわかった。このようにサブユニット間の相互作用による各サブユニットの活性型および不活性型conformationの相互変換にサブユニット接触面のアミノ酸残基が重要な役割をもつことが示唆された。
放線菌シヤトルコスミドの構築とそれを用いる抗生物質生合成遺伝子のクローニング

1.放線菌-大腸菌シヤトルコスミドの構築λファージDNAのcohesive領域を切り出し,大腸菌プラスミドpUR222(ampicillin耐性及びβ-galatctosidase遺伝子の一部を含む)に連結しコスミドpUR222::cos約3Kbを構築した.これをもとに下記の2種の放線菌-大腸菌シヤトルコスミドを構築した.シヤトルコスミド1は放線菌内で多コピーのプラスミドpIJ101由来のpIJ703と上記コスミドとを連結して作成した.シヤトルコスミド2は放線菌内で単コピーのプラスミドSCP2^*の複製領域及びチオストレプトン耐性遺伝子と上記コスミドを連結して作成した.2.シヤトルコスミドと外来DNAとの連結反応及び形質導入条件の検討シヤトルコスミド1と2を制限酵素で1ヶ所切断した後, Sau3Aで部分消化した放線菌DNAを種々の混合比で連結し形質導入の効率を検討した結果,ベクターと外来DNA比が3:1の時が最も良いことが明らかとなった.またそこで得た形質導入体から得たプラスミドを放線菌S.lividansに導入したところシヤトルコスミド1より得た組換えプラスミドのほとんどは欠失を生じていた.3.ポリケタイド抗生物質生合成遺伝子のクローニング上記で作成したシヤトルコスミド2を用いてポリケタイド抗生物質kalafungin,nanaomycin methylester及びavermectin生産菌の遺伝子ライブラリーを作成しそれぞれ14×10^4個の形質導入体を得た.これらの遺伝子ライブラリーについて既に単離されているポリケタイド抗生物質actinorhodin生合成系の縮合段階の遺伝子をプローブとしてcolony hybridization法でクローンを選択した.これらのクローンから得た組換えプラスミドをS.lividansに導入し形質転換体を得たところkalafungin,nanaomycin methylester生産菌の遺伝子ライブラリーから得た組換えプラスミドの導入株は抗菌物質を生産した.1.放線菌-大腸菌シヤトルコスミドの構築λファージDNAのcohesive領域を切り出し,大腸菌プラスミドpUR222(ampicillin耐性及びβ-galatctosidase遺伝子の一部を含む)に連結しコスミドpUR222::cos約3Kbを構築した.これをもとに下記の2種の放線菌-大腸菌シヤトルコスミドを構築した.シヤトルコスミド1は放線菌内で多コピーのプラスミドpIJ101由来のpIJ703と上記コスミドとを連結して作成した.シヤトルコスミド2は放線菌内で単コピーのプラスミドSCP2^*の複製領域及びチオストレプトン耐性遺伝子と上記コスミドを連結して作成した.2.シヤトルコスミドと外来DNAとの連結反応及び形質導入条件の検討シヤトルコスミド1と2を制限酵素で1ヶ所切断した後, Sau3Aで部分消化した放線菌DNAを種々の混合比で連結し形質導入の効率を検討した結果,ベクターと外来DNA比が3:1の時が最も良いことが明らかとなった.またそこで得た形質導入体から得たプラスミドを放線菌S.lividansに導入したところシヤトルコスミド1より得た組換えプラスミドのほとんどは欠失を生じていた.3.ポリケタイド抗生物質生合成遺伝子のクローニング上記で作成したシヤトルコスミド2を用いてポリケタイド抗生物質kalafungin,nanaomycin methylester及びavermectin生産菌の遺伝子ライブラリーを作成しそれぞれ14×10^4個の形質導入体を得た.これらの遺伝子ライブラリーについて既に単離されているポリケタイド抗生物質actinorhodin生合成系の縮合段階の遺伝子をプローブとしてcolony hybridization法でクローンを選択した.これらのクローンから得た組換えプラスミドをS.lividansに導入し形質転換体を得たところkalafungin,nanaomycin methylester生産菌の遺伝子ライブラリーから得た組換えプラスミドの導入株は抗菌物質を生産した.1.放線菌-大腸菌シャトルコスミドの構築1)入ファージDNAのcohesive領域(ca.0.35Kb)をPst【I】で切り出し、Pst【I】で切断した大腸菌プラスミドpUR222(アンピシリン耐性遺伝子を含む)に連結させてコスミドを作成した(pUR222:cos)。2)上記のコスミドをPst【I】で部分消化した後、Pst【I】で切断した多コピープラスミドpIJ703(チオストレプトン耐性、メラニン形成)と連合させシャトルコスミド1(8.83Kb)とした。同様に上記コスミドをSal【I】で切断した後、放線菌単コピープラスミド【SCP2^*】の複製領域を含むXhoI-Sal【I】断片と連結し、さらにBamH【I】で切断した後、放線菌より得たチオストレプトン耐性遺伝子のBgl【II】-BamH【I】断片を連結させ、シャトルコスミド2(9.98Kb)とした。2.得られたシャトルコスミドの外来DNAとの連結反応及び形質導入条件の検討

シャトルコスミド1と2をそれぞれBgl【II】あるいはBamH【I】で切断後、Sau3Aで部分消化した放線菌染色体DNA(2040Kb)と3:11:1の混合比で連結させin vitueパッケージングを行い大腸菌を形質導入した。なおパッケージング系は自家調製のものを用いて行い、市販のものと同程度の結果を得た。その結果、およそ【10^4】形質導入体1μg染色体DNAの効率で形質導入体を得ることができた。得られた組み換えプラスミドは、大腸菌内ではコピー数が幾分減少したが脱落は観察されなかった。この形質導入体より分離した組み換えプラスミドはS.lividonsにおよそ【10^5】【10^6】形質転換体1μgプラスミドの効率で導入することができた。今後、上記シャトルコスミドを用いて、マクロライド抗生物質及びイソクロマンキノン抗生物質生産菌の遺伝子ライブラリーを作成する予定である。
新規小腸透過ペプチドの透過分子機構の解明

高分子医薬品の開発には高分子の小腸透過を可能とするキャリアの実現が望まれている。独自に同定した小腸透過を促進する新規環状ペプチドを用い、本研究では、環状ペプチドの小腸透過の特性と機構の解明を目的とした。Caco-2細胞及びマウス小腸closed loop両方においてファージの透過は合成ペプチドによって阻害された。また、蛍光標識環状ペプチドがCaco-2細胞内に取り込まれ、その取り込みはエネルギー依存性の担体が介在し、マクロピノサイトーシスが関わることを示唆した。加えて、小腸透過促進には環状構造が必要なこと、また小腸透過環状ペプチドは密着結合を弱めず小腸上皮細胞への毒性が低いことを明らかにした。近年、ペプチド製剤やタンパク質製剤等の高分子医薬品の開発が盛んに行われており、現在40種類以上の高分子医薬品が発売されている。しかし、高分子医薬品は消化管内において酵素分解を受け、小腸において吸収されないため、バイオアベイラビリティが低いことが大きな課題である。従って、高分子医薬品の小腸吸収性を向上させる技術として、高分子の小腸透過を可能とするキャリアの開発が必須である。独自に同定したM13ファージの小腸透過を促進する新規環状ペプチドを用い、本研究では、環状ペプチドの小腸透過機構を解明し、小腸透過キャリアの分子基盤を構築することを目的とする。平成28年度は、環状ペプチドを提示するファージが環状ペプチドを介して小腸を透過しているか確認するために、透過に対する合成環状ペプチドの阻害効果を検討した。その結果、Caco2細胞及びマウス小腸closed loop両方においてファージの透過は合成ペプチドによって阻害された。また、蛍光標識環状ペプチドがCaco2細胞内に取り込まれ、その取り込みは非標識合成環状ペプチドによって阻害されることを確認した。また、取り込み機構を検討するために温度依存性とマクロピノサイトーシス阻害剤の影響を検討した。その結果、蛍光標識環状ペプチドのCaco2細胞内への取り込みは4度及びマクロピノサイトーシス阻害剤によって阻害された。また、環状ペプチドを提示したファージのCaco2細胞への取り込みも同様に阻害された。したがって、蛍光標識環状ペプチドの小腸上皮細胞への取り込み過程には、エネルギー依存性の担体が介在し、さらにマクロピノサイトーシスが関わっていることが示唆された。さらに、環状ペプチドのアミノ酸配列の相同性から検索を行ったところ、ある種の微生物のタンパク質が同定され、そのタンパク質を介した透過メカニズムが関与している可能性が提示された。当初計画の大部分は順調に進んでいる。新たなメカニズムが提示されたため当初計画のクロスリンクは延期し、阻害剤等の検討を優先させた。平成29年度は小腸透過様式を明らかにするために複数の化合物と透過ペプチドとの透過を検討した。蛍光化合物を結合した透過ペプチドは小腸上皮細胞を透過するとともにCaco2細胞への取り込みが観察された。インスリンは透過ペプチドとの共投与で血糖値を降下させることを前年度に示している。一方でデキストランと透過ペプチドのCaco2の共投与によってはデキストランの細胞への内在化は検出されなかった。また、M13 Phageと透過ペプチドの共投与は、透過ペプチドを発現するM13と比較して著しく小腸透過が低下した。さらにインスリンと透過ペプチドが相互作用するか検討した結果、両者は相互作用している可能性が高いことが示された。以上の結果から透過ペプチドはマクロピノサイトーシスで非特異的に化合物を輸送するのではなく、環状ペプチドと結合しているもしくは相互作用している化合物の小腸上皮細胞の透過を促進することが示された。当初計画を加速するとともに、新に提示されたメカニズムに対して細胞分子学的手法を用いて解析を行う予定である。生物薬剤学メカニズム提示による一部実験の変更によって購入予定消耗品が変更されたため。繰り越し分については平成29年度の早い時期に消耗品費として使用する計画である。
ヒト苦味レセプターＴＡＳ２Ｒの遺伝子多型と肝臓解毒酵素発現の個人差の関連性解析

アブラナ科植物に含まれるisothiocyanate類には発がん抑制作用がある。しかし、これには苦味があり、この苦味を強く感じ過ぎるために嫌いで摂取できない人で発がん率が高いことが示された。従って、発がん率の高い人では、この苦味成分を受け入れられないほど苦味感受性が高い遺伝子多型と、肝臓等でのこの植物由来物質の解毒化酵素の遺伝子多型の両方が関係しているかもしれない。TAS2R38の遺伝子多型とGSTM1とGSTT1の遺伝子頻度について比較したところ、PTC及びPROPの苦味を感じないAVI/AVIの被験者ではGSTM1+の割合が多いことが分かった。二つの遺伝子多型に関連性がある事が示唆された。研究の着想は、ブロッコリー等のアブラナ科植物の摂取量が少ない被験者集団で各種の発がん率が高いというヒト疫学データにある(Nutr. Cancer, 2007など)。アブラナ科植物に含まれるisothiocyanate類には苦味があり、この苦味を強く感じ過ぎて摂取しない人で発がん率が高いことが示唆される。すなわち、発がん率の高い人では、(1)植物体isothiocyante類の苦味成分を受け入れられないほど苦味感受性が高いことと(苦味レセプターTAS2Rの遺伝子多型)、(2)肝臓等でのこの植物由来物質の解毒化・無毒化の酵素の遺伝子多型の両方が関係しているのかもしれない。この(1)と(2)を明らかにすることが本研究の目的である。24年度は、苦味物質の官能検査と苦味レセプターの一塩基多型の関連性の研究手法を確立できた。具体的な苦味物質として3種類のジペプチドGly-Phe、Gly-Tyr、Ala-Trpと、代表的な苦味物質であるPROPやブロッコリー抽出液等を用い、gLMS法により苦味強度を評価した。TAS2R遺伝子の解析では、被験者の口腔内粘膜細胞からDNAを調製し、TAS2R1, 4, 19, 38, 44, 45等をPCRにより増幅した。研究手法は確立できたものの、残念ながらブロッコリー抽出液に応答するTAS2Rは同定できなかった。しかし、カフェイン等の他の苦味との応答性は認められた。すなわち、TAS2R44、45のハプロタイプを解析した結果、TAS2R44では3つのハプロタイプ(WMVI、RLAV、RMAV)、TAS2R45で2つのハプロタイプ(CMHLCTW、YVQFRR*)が観察された。これらの組み合わせにより、被験者48人は3種類の遺伝子型に分類することができた。肝臓解毒酵素のGSTsの多型については、ようやく解析を開始し始めている状況にある。しかし、カフェイン等の他の苦味との関連性は認められた。肝臓解毒酵素のGSTsの多型については、TAS2R38との関連性について検討してきて、ある程度の成果は得られた。すなわち、TAS2R38の遺伝子多型の違いの観点から分類を行ったところ、GSTM1とGSTT1の遺伝子頻度の2つともー(マイナス)であるnull typeはハプロタイプAVI/AVIには0人、PAV/AVIは8人、PAV/PAVでは7人という結果であった。この関連性については、さらに現在追及している。さらにGSTM1の有無だけで見るとPAV/PAVとPAV/AVIは等量あるにもかかわらずAVI/AVIはGSTM1+が多いことが明らかとなった。今後の研究で、被験者の尿中代謝物をモニタリングすることを介して、さらにisothiocyanate類の代謝系(解毒酵素の個人差)を特定することに応用していきたい。

ヒト苦味レセプターTAS2Rの苦味物質リガンド活性に関する研究が、世界的規模で進められている。ジペプチドなどは特有の苦味を有するため食品への利用が制約されているが、優れた機能性を持つため、苦味を低減させることで食品や医療食・調味料等に用い、ヒトの健康維持に役立てることができる。そこで本研究では、ペプチドを含む苦味物質を用いたヒト官能試験により苦味受容能の個人差を調べ、苦味レセプターの一塩基多型と苦味感受性の関連性を先ず明らかにし、最終的には同じ手法でアブラナ科植物の苦味物質の解毒酵素活性の個人差との関係を明らかにしようとしている。23年度は、苦味物質の官能検査と苦味レセプターの一塩基多型の関連性の研究手法を確立しようとした。苦味物質として、3種類のジペプチドGly-Phe、Gly-Tyr、Ala-Trpと、代表的な苦味物質である6-n-propylthiouracil(PROP)等を用い、gLMS法により苦味強度を評価した。TAS2R遺伝子の解析では、被験者の口腔内粘膜細胞からDNAを調製し、TAS2R1、4、38をPCRにより増幅した。得られたPCR産物を用い、塩基配列を決定した。その結果、TAS2R1は2箇所、TAS2R4も2箇所、TAS2R38は既報通り3箇所でSNPが検出された。TAS2R1では、935番目の位置のSNPにより、2つのtypeに分類された。TAS2R1の935番目の位置のSNPのtype別に苦味強度を調べたところ、CCホモの被験者はC/Tヘテロの被験者に比べ、用いたうちの2種類のジペプチドの苦味強度が有意に低かった。以上のことから、TAS2R4の389番目の位置のSNPは人種間で発生率が異なっているものと推測された。さらにTAS2R4が、あるジペプチドの苦味感受性に、TAS2R1が2種類のジぺプチドの苦味感受性に関与している可能性が示された。24年度の検討により、TAS2Rに関しては、ブロッコリーの苦味感受性を分類することはできなかった。しかし、グレープフルーツに対して感じる苦味の程度とGly-Tyrの苦味感受性の間に関係性が見られた。文献の欧米人においては、TAS2R19の299番目のアミノ酸がシステインホモである被験者は、グレープフルーツジュースに対する苦味感受性が高く嗜好性が低い(J.E.Hayes et al.,2010)という報告があることから、TAS2R19の299番目のアミノ酸によって被験者を群分けし、各苦味物質に対する苦味感受性を比較した。その結果、299番目のアミノ酸がシステインホモである群が、システインとアルギニンのヘテロである群と比べると、Gly-Tyrに対する苦味感受性が高い傾向が見られた。しかし、今回の結果では欧米人とは異なるデータが得られた。SNPの位置については、細胞内C末端近傍部位に存在しており、この位置のSNPはシグナル伝達に関与している可能性が考えられた。引き続き、isothiocyanate類について検討している最中である。また、GSTsの遺伝子多型の解析は開始した段階にあり、計画よりも遅い状況となっている。震災の影響を受けたドクターコースの学生の研究進行が悪く、最後には経済的理由のためにバイトが可能な医学研究科に転研究科せざるを得なかった。このため、当研究は進展が悪かった。幸い25年4月から新ドクターコースの学生が入り、既に予備試験を行っている。今後、アブラナ科植物由来のisothiocyanate類を用いた検討は25年度に実施することになっている。
微細脳構造変化と脳機能障害に基づく認知症の高精細臨床的サブタイプ評価法の確立

初年度に、自動画像解析に適合した撮影プロトコルの検証と基礎的データの蓄積として、ファントム実験系を製作し、様々な画像シーケンスを指向した。具体的には特殊拡散テンソル画像(NODDI)、3D-T1強調像(MPRAGE)、高精細T2強調冠状断像、FLAIR、SWI、非造影脳血流画像(ASL)、T2*強調像、のMRI撮影のパラメータ設定を行った。また撮影パラメータの調節と基礎的データの蓄積として、自動画像解析には高精度かつ3Dデータでの取得が必要である。各校精度コントラスト画像特有のパラメータ設定制限など様々な特質を考慮しながら行い、最終的に最適候補プロトコルを絞り込んだ。具体的には、3D-T1強調像(MPRAGE)を解剖学的画像とし、無名室測定として、2D-T2強聴画像診断、特殊拡散テンソル(NODDI)、非造影脳血流画像(ASL)を機軸プロトコルとし、バリエーションプロトコルとしてT2強調像、FLAIR、12軸拡散強調像(DWI)を組んだ。次年度に健常例での基盤的プロトコルの模索として、健常例での基盤的プロトコルの確定をすべく、機軸プロトコル最適候補プロトコルとバリエーションプロトコルを撮影した。同時に撮影パラメータを変化させて測定値にどういった変化が見られるのか画像データを蓄積した。最終年度には、最近の知見を取り入れるべく、人工知能(AI)放射線画像診断(AINNAR)研究を立ち上げた。まず、予備的な試用実験として、軽度の認知症患者(MCI)のMRIを用いて、DWI・T2WI・FLAIR等5種類のコントラスト画像の鑑別能についてAIの性能を調べたところ、わずか78症例で93%超の正診率を示した。この結果を英語論文で発表した。次に、健常者、MCI、アルツハイマー型認知症について、冠状断thin sliceT2強調像を用いたAI分別能を測定し今後brush upしていく予定である。まずはじめに、自動画像解析に適合した撮影プロトコルの検証と基礎的データの蓄積として、ファントム実験系を製作し、様々な画像シーケンスを試行した。具体的には特殊拡散テンソルNODDI・3DーT1強調像MPRAGE・T2強調像(ACーPCライン垂直冠状断)・FLAIR・SWI、非造影脳血流画像ASL、T2*強調像のMRI撮影パラメータのパラメータの設定を行った。各高精度コントラスト画像特有のパラメータ設定制限など様々な特質を考慮しながら行い、最終的に最適候補プロトコルを絞り込んだ。具体的には、3DーT1強調像MPRAGEを解剖学的画像とし、無名質測定として、2DーT2強調冠状断、特殊拡散テンソルNODDI、非造影脳血流画像ASLを機軸プロトコルとし、バリエーションプロトコルとしてT2強調像、FLAIR、12軸DWIを組んだ。次に健常例での基盤的プロトコルの模索として、健常例での基盤的プロトコルの確定をすべく、機軸プロトコル最適候補プロトコルとバリエーションプロトコルを撮影した。これを用いて、臨床応用でのVARIATIONに対する原因究明と解決法のヒントとなる基礎的データとすべく現在解析中である。本年度の研究目標として、(1)自動画像解析に適合した撮影プロトコルの検証と基礎的データの蓄積および(2)健常例での基盤的プロトコルの模索を挙げていたが、ファントム実験系の製作し、各種のMRI撮影パラメータの設定を行い、撮影パラメータの調節と基礎的データの蓄積を実行し、最終的に最適候補プロトコルの絞り込みとして、機軸プロトコルを、3d-T1強調像MPRAGE、2d-T2強調冠状断、特殊拡散テンソルNODDI、ASLと設定し、バリエーションプロトコルとしてT2強調像、FLAIR、12軸DWIを組んだ。また健常例において、同時に撮影パラメータを変化させた基礎的データを蓄積し、現在解析を行っている。また、最近の知見を取り入れるべく、人工知能(AI)放射線画像診断(AINNAR)研究を立ち上げた。AINNAR

研究の試用実験として単純X線写真の分類、頭部MRI画像分類、並びに臨床実験として脳転移検出分類(キャデラック脳転移研究)を実行し良好な結果を得たため、学会発表した。また臨床応用として、認知症のAI画像診断研究を計画し、倫理審査委員会の承認を得た。最終年度である本年度では、AINNAR研究を推し進め、AI画像診断の有用性と限界を見極めるべく精力的に画像解析を進めていく予定である。初年度に基礎実験として自動画像解析に適合した撮影プロトコルの検証と基礎的データの蓄積として、ファントム実験系を行い、撮影プロトコルを決定した。次年度には、健常例での基盤的プロトコルの模索として、撮影パラメータを変化させて測定値にどういった変化が見られるのか画像データを蓄積した。また、当初の計画を実行するだけでなく、最新の知見を取り入れるべく、最近の知見を取り入れるべく、人工知能(AI)放射線画像診断(AINNAR)研究を立ち上げた。未経験の研究領域ではあったものの、試用実験として単純X線写真の分類、画像実験として頭部MRI画像分類、並びに臨床応用実験として脳転移検出分類(キャデラック脳転移研究)を実行し良好な結果を得るとともに、認知症に対する高精細画像を用いた画像診断としてAINNARを応用するべくその技術的な基盤構築を果たすことができた。また、倫理的な側面として、認知症のAI画像診断研究を計画し、倫理審査委員会の承認を得た。すでに認知症を専門とする精神科臨床医の協力の下に、250例余のMRI画像および臨床診断を得ている。現在のところ画像解析を進めているところである。初年度に、自動画像解析に適合した撮影プロトコルの検証と基礎的データの蓄積として、ファントム実験系を製作し、様々な画像シーケンスを指向した。具体的には特殊拡散テンソル画像(NODDI)、3D-T1強調像(MPRAGE)、高精細T2強調冠状断像、FLAIR、SWI、非造影脳血流画像(ASL)、T2*強調像、のMRI撮影のパラメータ設定を行った。また撮影パラメータの調節と基礎的データの蓄積として、自動画像解析には高精度かつ3Dデータでの取得が必要である。各校精度コントラスト画像特有のパラメータ設定制限など様々な特質を考慮しながら行い、最終的に最適候補プロトコルを絞り込んだ。具体的には、3D-T1強調像(MPRAGE)を解剖学的画像とし、無名室測定として、2D-T2強聴画像診断、特殊拡散テンソル(NODDI)、非造影脳血流画像(ASL)を機軸プロトコルとし、バリエーションプロトコルとしてT2強調像、FLAIR、12軸拡散強調像(DWI)を組んだ。次年度に健常例での基盤的プロトコルの模索として、健常例での基盤的プロトコルの確定をすべく、機軸プロトコル最適候補プロトコルとバリエーションプロトコルを撮影した。同時に撮影パラメータを変化させて測定値にどういった変化が見られるのか画像データを蓄積した。最終年度には、最近の知見を取り入れるべく、人工知能(AI)放射線画像診断(AINNAR)研究を立ち上げた。
コバルト-ホスフィニン錯体をもちいるヘテロ小員環化合物のカルボニル化

本研究は,エポキシド・オキセタン・アジリジンなどのヘテロ小員環化合物と一酸化炭素との反応を取り上げ,最終的にはπアクセプター性のホスフィニンが配位したコバルト錯体をもちいて高効率・高選択的な触媒系を開発することを目的とする.1)本年度は,これまでに報告例のないオキセタンと一酸化炭素との共重合について集中的に検討をおこなった.リン配位子をもつアシルカルボニルコバルト錯体を種々合成し,それらを開始剤とすることで,初めて本共重合に成功した.得られる共重合体は,エステル部分とエーテル部分を含むのもであった.その比率は,もちいるリン配位子の種類・当量によって制御でき,最高63%のエステル部分をもつ共重合体を合成することに成功した.得られたポリマーは,これまでに現実的な条件下で合成された中で,主鎖中の4-ヒドロキシアルカン酸エステル部分(γ-ラクトンが開環した構造)の含有率が最も高いものである.γ-ラクトンの単独開環重合には,高温・超高圧という非現実的な重合条件が必要なため,本成果はポリ(γ-ラクトン)の有効な合成法となりえる可能性がある.なお,既報のビホスフィニンをもちいて,開始剤となるアシルカルボニルコバルト錯体の調製を試みたが,錯形成が確認できなかった.2)カルボニルコバルト錯体をもちいることで,ハロゲン化アルキル,一酸化炭素,エポキシドから一挙に水酸基がエステル保護さされたハロヒドリンが得られることがわかった.生成物は,種々の有用化合物の合成中間体として利用できる可能性がある.本研究は,エポキシド・オキセタン・アジリジンなどのヘテロ小員環化合物と一酸化炭素との反応を取り上げ,最終的にはπアクセプター性のホスフィニンが配位したコバルト錯体をもちいて高効率・高選択的な触媒系を開発することを目的とする.1)本年度は,これまでに報告例のないオキセタンと一酸化炭素との共重合について集中的に検討をおこなった.リン配位子をもつアシルカルボニルコバルト錯体を種々合成し,それらを開始剤とすることで,初めて本共重合に成功した.得られる共重合体は,エステル部分とエーテル部分を含むのもであった.その比率は,もちいるリン配位子の種類・当量によって制御でき,最高63%のエステル部分をもつ共重合体を合成することに成功した.得られたポリマーは,これまでに現実的な条件下で合成された中で,主鎖中の4-ヒドロキシアルカン酸エステル部分(γ-ラクトンが開環した構造)の含有率が最も高いものである.γ-ラクトンの単独開環重合には,高温・超高圧という非現実的な重合条件が必要なため,本成果はポリ(γ-ラクトン)の有効な合成法となりえる可能性がある.なお,既報のビホスフィニンをもちいて,開始剤となるアシルカルボニルコバルト錯体の調製を試みたが,錯形成が確認できなかった.2)カルボニルコバルト錯体をもちいることで,ハロゲン化アルキル,一酸化炭素,エポキシドから一挙に水酸基がエステル保護さされたハロヒドリンが得られることがわかった.生成物は,種々の有用化合物の合成中間体として利用できる可能性がある.
光学計測システムを用いた神経活動の16000点同時測定による記憶構造の解析

モノアミン神経系は、ニューロモデュレーターとしてネットワークを構成する個々の神経細胞の膜特性、チャンネル特性をダイナミックに変化させ、実質的に神経ネットワーク内のシナプス結合をリアルタイムでコントロールすることから、学習、記憶に重要である。モノアミン神経系は広い投射領域持つことから、その学習、記憶との関わりを明らかにするには、神経活動の多点同時測定が不可欠である。本研究では匂いの学習能力が高いヤマナメクジの神経系を用い、モノアミン神経系と記憶との関係を光学計測による多点同時測定により明らかにすることをめざした。まず、マメクジの脳神経系の匂いの情報処理中枢であるプロセレブラム(PC)におけるLFPの基本的性質を電気生理学的に調べた。単離神経系においてPCのLFPは通常無活動(quiescent)であり、まれに周波数1Hz前後、振幅数10mVで振動することが明らかとなった。また組織学的にPCに投射していることを確認したドーパミン、セロトニンに関して潅流投与を行った場合、LFPはquiescentから大振幅で周期2秒程度の振動に制御していることを意味し、PCにおける匂いの情報処理に重要な役割を担うと思われる。また、PCに出力する触覚神経節ではほとんどのプレパレーションで0.5Hz程度のLFP振動がみられたことから、匂い情報処理においてはPC及び触覚神経節における神経集団での振動的活動が重要であることが示唆された。これら神経集団での活動を多点同時計測するため、光学計測システムを立ち上げた。膜電位感受性色素は数系列知られており、現在PCにおける光学測定に適した色素のスクリーニング中である。
液膜輸送系と関連させた遠心液々分配クロマトグラフィーの新分離機構

本研究者らが開発した分離助剤添加型遠心液々分配クロマトグラテァー(CPC)と液膜輸送系との相関性につき研究を行い、新しい分離・精製・濃縮の技術としての発展に繋がる原理を解明することを目的とした。設備は三鬼エンヂニヤリング製CPC-L.L.(Model-NMF)を購入して用いた。CPCと液膜輸送系との共通点と相違点とを考慮して、相関表を構成した。ニトロフェノール類(ピクリン酸とp-nitrophenol)の水溶液を試料(基質)とし、CHCl_3溶媒中のn-BuOHを分離助剤として、同じ化学構成でCPCと液膜輸送系との挙動を直接比較したところ、両系ともにp-nitrophenolの方がピクリン酸よりもn-BuOHと強い相互作用を示した。その結果、CPCによって等量混合物をNMR的に純粋な両フラクションに容易に分離できた。また、n-BuOHという単純で安価な試剤を用いて分子種の選択的液膜輸送ができることが分った。このことはCPCが新しいタイプの多段液膜輸送系として扱えることを示す。次に、研究を希土類金属イオン(RE^<3+>)のCPC分離と選択的液膜輸送とに拡張した。この場合もDi(2-ethylhexyl)-リン酸(D2EHPA)を分離助剤とし、移動相に塩酸水溶液を用いた系により、各軽希土類金属のCPC分離に成功し、これらの選択的液膜輸送もかなりの程度に可能であることが分った。CPCでも液膜輸送系でも、RE^<3+>とD2EHPAとの相互作用は、抽出系でよく知られている酸・塩基平衡と一致していて、この平衡式に含まれる因子の調節によって、CPC分離の度合も液膜輸送速度も調節できることが明らかになった。即ち、分離助剤添加型CPCの方法は有機及び無機化合物にも広く適用できる。また、CPCからの情報を液膜という新技術系に適用できることの意義は大きい。さらに、光学分割への応用に必要な基礎条件を整理し、母体となる種々の方法を適用する際の問題点並びに考慮すべき点の一覧表を作成し、今後の研究のための指針とした。(目的)分離助剤添加型遠心液々分配クロマトグラフィーと液膜輸送系との相関性につき研究を行い、新しい分離・精製・濃縮の技術としての発展に繋がる原理を解明することを目的としている。(研究経過と成果)1.設備として三鬼エンヂニヤリング製CPC-L.L.(Model-NMF)を購入し、この装置の性能を種々の条件下で検討して本研究課題に適した性能をもつことをまず確認した。2.水素結合および疎水性相互作用の組み合わさった効果を知る目的でn-BuOHを分離助剤としたクロマトグラフィーにおけるニトロフェノール類の分離挙動と、これと全く同じ構成の液膜を用いたときの液膜輸送における挙動とは極めて良く対応していることがわかった。3.一方、強い酸,塩基相互作用の効果を知る目的でブルシンを分離助剤としたときの芳香族有機酸のクロマト挙動は、強いピークブロードニングを引き起こすことがわかった。このことは、比較的弱い相互作用を中心にして研究を進めてゆくことが効率の良い方向であることを示している。

4.また、これらの結果を説明し、かつ、このクロマトと液膜輸送との相関移動における共通性と相違点とを明確にする合理的な基本モデルを導き出した。6.Di-(2-ethyl-hexyl)-リン酸/n-ヘプタン系固定液相を用いて、希土類金属イオンの抽出分離効果を検討した結果、この固定液相が遠心液々分配クロマトグラフィーによってLaとSmイオンとを分離できる可能性を見出し、現在この系を用いて遠心液々分配クロマトグラフィー上で両者を分取規模で分離するための諸条件を検討している。(目的)分離助剤添加型遠心液々分配クチマトグラフィー(CPC)と液膜輸送系との相関性につき研究を行い,新しい分離・精製・濃縮の技術としての発展に繋がる原理を解明することを目的としている.(研究経過)設備は昨年度に購入した三鬼エンヂニヤリング製CPCーL.L.(ModelーNMF)を用いている.62年度当初研究計画での種々の基礎条件の検討が早く進行できたので,予定を早めて62年度は希土類金属イオンの分離精製に重点を置いた研究を行い,以下の研究成果を上げることができた.(研究成果)1.Diー(2ーethylーhexyl)ーリン酸(2DEHPA)/nーヘプチン系固定液相を用い,移動相に塩酸水溶液を用いて, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Euの軽希土類金属イオンのCPCにおける挙動を検討した.2.この系は, 2DEHPAのPーO^-H^++ュSY.dblharw.+ャPーO^-M^+酸塩基交換反応を基礎としていることから,希土類金属イオンのCPCにおける保持値が移動相中の塩酸濃度に強く影響されることを見出した.3.この知見をもとにして,従来困難とされていた周期率表中で隣接するイオンの組(La/Ce, Ce/Pr, Pr/Nd, Nd/Sm, Sm/Eu)を効果的に分離することに成功した.このうち, Pr/Ndの組の分離は完全ではないが純品回収率を約50%に抑え,不完全分離部分のリサイクルによって純品を効率よく得られることが分った.他の組は何れも一度だれのCPC操作で50:50混合物から容易に各純粋イオンを得ることができた.4.希土類金属イオンの原子番号が大きくなるにつれて,ピークの拡がり著しくなることが分ったが,例えばSm/Euの系では,固定相の有機溶剤としてトルエンを用いることにより,ピークの拡がりを解決できた.5.CPCと同一の二相構成の液膜輸送の研究を行い,希土類金属イオン選択的液膜輸送ができることが分った.即ち, CPCと液膜輸送系とは我々の系でよく対応している.また,両系ともに液々抽出系とよく対応している.(目的)分離助剤添加型遠心液々分配クロマトグラフィー(CPC)と液膜輸送系との相関性につき研究を行い、新しい分離・精製・濃縮の技術としての発展に繋がる原理を解明することを目的としている。(研究経過)設備は一昨年度に購入した三鬼エンヂニアリング製CPC-L.L.(Model-NMF)を用いている。62年度から開始した希土類金属イオンの分離精製並びに選択的液膜輸送によるセンシングに重点を置いた研究を行い、以下の研究成果を上げることができた。(研究成果)1.Di-(2-ethyl-hexyl)-リン酸(D2EHPA)を分離助剤とし、移動相に塩酸水溶液を用いた系を用いて、重希土類全属イオンのCPCにおける挙動を検討した。重希土類の場合、原子番号が大になるにつれて、ピークの拡がりがさらに著しくなったが、固定相溶媒の極性の高いものを選らべば、ピークの拡がりを解決できることが分った。
大腸菌においてメナジオン毒性を抑制するキノン還元酵素の誘導とその役割

2年間の研究を通じて得られた研究成果は次の通りである。1.大腸菌を0.2ー0.3mMの2ーmethylnaphthoquinone(メナジオン)存在下に増殖させると、はじめ増殖は阻害されるが、3ー6時間後に増殖が回復する。この細胞をフレンチプレスで破壊し、細胞質分画の酵素を調べたところ、FMN依存のNADHーキノン還元酵素(NQR)が約20倍に誘導合成されている事を見いだした。2.メナジオン処理によって同時にsuperoxide dismutase(SOD)も誘導される。一方、パラコ-ト0.15mMで処理した場合、SODは誘導されるが、FMN依存のNQRは全く誘導されず、本酵素の誘導はメナジオンに特異的であった。3.メナジオンで誘導される酵素をDEAEーSephacel,DEAEー5PW,HACー5CPで精製し、比活性3205units/mgproteinの酵素標品を得た。4.本酵素はSDS電気泳動で分子量24KDaの単一蛋白質であり、活性型は同一サブユニットの2量体である。5.本酵素はNADH特異的であり、反応にはFMN(半飽和濃度0.54μM)を要求する。6.キノン化合物に対する基質特異性は動物細胞から分離・精製されているNAD(P)Hーquinone oxidoreductase(DTーdiaphorase)とほぼ一致する。7.反応機構はピンポン型で、NADHおよびメナジオンに対する真のKmは132μMおよび1.96μMである。8.ジクマロ-ルはNADHに対して強力な拮抗阻害を示し、Kiは0.22μMである。9.キノン還元様式は2電子還元反応によってキノ-ルを生成する。10.本酵素の基質となるキノン誘導体は必ずしも酵素誘導能を示さず、すでに調査した誘導体の中では、キノン構造の2位にアルキル基、3位に置換基の無い化合物のみが酵素誘導能を示した。11.動物細胞においてDTーdiaphodase誘導能があるとされる化合物は必ずしも大腸菌のFMN依存NQRの誘導基質として作用しない。メナジオンを0.20.3mM加えた栄養培地で大腸菌を増殖させると,はじめ増残はおさえらているが,36時間後に増殖が見られた。この細胞を対数増殖後期で集菌し,フレンチ・プレスで菌を破壊した後,細胞膜分画と細胞質分画に分離した。これらの分画のメナジオン還元酵素を分析した所,細胞質分画にFMN依存でHADHに特異的なキノン還元酵素がメナジオンを加えずに増殖させた細胞に比較して,20倍以上増加している事を発見した。メナジオンは細胞内で一電子還元されると大量の活性酸素を発生するが、同様に活性酸素を発生するパラコ-トによってこの酵素は誘導されず,メナジオンに特異的であった。そこで,メナジオン存在下に増殖させた大腸菌から本酵素の分離・精製を進めた。精製酵素はSDS-電気泳動で24KDaであった。反応はNADHに特異的で,補酵素としてFMNを要求した。キノン化合物に対する特異性は動物細胞で知られているNAD(P)H-キノン還元酵素(DT-diaphorase)とほぼ一致した。

本酵素はDT-diaphoraseの特異的阻害剤であるジクマロ-ルによって強く阻害され,阻害形式はNADHに対して競合的であった。また,キノンの還元様式は二電子還元型であった。大腸菌においてメナジオンで誘導されるNADH-キノン還元酵素はメナジオンを二電子還元する事から,一電子還元による活性酵素の生成を抑制するので,メナジオン毒性を軽減するための応答と考えられる。動物の場合にも,DT-diaphoraseは誘導酵素であり,きわめて類似した生理的応答と言える。興味深い事に、本酵素はNADHに特異的でFMN依存であるのが動物細胞のDT-diaphoraseと異なるにもかかわらず,分子量,キノン化合物に対する基質特異性,ジクマロ-ル感受性,キノン還元様式でDT-diaphoraseと一致していた。現在,大腸菌をモデルとして本酵素の誘導機構の解析を進めている。前年度の研究で、大腸菌を0.2ー0.3mMの2ーメチルナフトキノン(メナジオン)存在下に増殖させると、細胞質分画にNADHに特異的で反応にFMNを要求するキノン還元酵素が誘導される事を見いだした。本年度は本酵素を細胞質分画からDEAEーSephacel,高速液体クロマト用カラムDEAEー5PWおよびHACー5CPで精製を進め、140倍(比活性3205units/mg protein)に精製した。メナジオンで誘導しない細胞の細胞質の比活性と比較すると、約4000倍に精製された。精製酵素はSDSーゲル電気泳動で分子量約24KDaの単一蛋白質で、SephacrylSー200によるゲル瀘過では活性が50kDaの所に溶出されるので、活性型酵素は同一サブユニットの2量体と考えられる。フラビン要求性は半飽和濃度で比較すると、FMN0.54μM,FAD16.5μMで、FMNはFADより約30倍効果的であった。キノン化合物に対する基質特異性はナフトキノン、ベンゾキノン誘導体に高い活性を示し、動物細胞から分離・精製されているNAD(P)Hーquinone reductase(DTーdiaphorase)の基質特異性とほぼ一致した。本酵素の反応機構はピンポン型で、NADHおよびメナジオンに対する真のKm値は132μMおよび1.96μMであった。ジクマロ-ルはNADHに対して拮抗的に阻害し、Kiは0.22μMであった。キノンの還元様式は2電子還元によってキノ-ルを生成した。これらの酵素的性質は動物細胞のDTーdiaphoraseと極めて類似しており、大腸菌における本酵素の誘導は動物細胞におけるDTーdiaphoraseと生理的にも同様の意味を持つと考えられる。しかし、本酵素の誘導に必要な化合物の構造特異性を調べると、動物細胞で有効とされている多くの化合物は大腸菌の酵素誘導には2、3の例外を除いて無効であり、誘導シグナルについて相違が確認された。大腸菌での誘導基質として、キノン構造の2位にアルキル基が存在し、3位に置換基の無い構造が最も重要と考えられる。