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１７世紀歌舞伎の演技・演出―文献資料・絵画資料・民俗資料による総合研究―

民俗資料については、当初福島県双葉郡浪江町の獅子舞を主たる調査対象としていたが、残念ながら東日本大震災後の復旧が見込めず、当該年度は東京都佃島盆踊りの調査のみに終わらざるを得なかった。以上および平成25年度、26年度の研究を総合し、その成果を八木書店より刊行することを検討し、同書店から了承の回答を得た。書物の題名は『歌舞伎とはいかなる演劇か』とする予定である。構成は第一部総論、第二部各論、第三部資料の紹介と研究からなり、約350頁である。現在の原稿完成状況は、第一部90パーセント、第二部70パーセント、第三部50パーセントであり、平成29年度内の刊行を予定している。上述した玉川千之丞と今村久米之助の研究は、この本の核をなす研究となる。17世紀歌舞伎の演技・演出について、絵画資料の新しい発見があったため、研究は計画以上の進展をみた。平成26年度はフランス国立図書館デューレー・コレクション蔵の『としの花』(仮題)という絵画資料の発掘があったが、当年度(27年度)は今村久米之助の画像の発見という衝撃的とも言える成果があった。この画像は時代を寛文元年(1661)二年(1662)にほぼ特定することができ、描かれている役者も紋その他の徴証から、初代の今村久米之助と特定することができた。これは役者の名が分かる役者絵として現存最古のものとなる。この資料等を検討した結果、今村久米之助は色白の容貌に特色があり、ために高位の女性に扮することが似合う女方であったことが判明した。また、その顔を引き立てるため、被り物をしての登場という演出上の工夫を行った。文献資料についても『男色大鑑』『舞曲扇林』などを詳細に読み込むことによって、初代玉川千之丞の演技を明らかにすることができた。千之丞は『伊勢物語』を典拠とする「河内通」という演目をヒットさせた。とくに美声を聞かせてから御簾を上げて美しい顔を見せるという、画期的な舞台への登場を見せ、初期歌舞伎に演技重視の端緒を切り拓いた。さらに「すさまじい」嫉妬の演技を展開し、嫉妬事の開山と呼ばれた。稽古の段階で鏡を使って登場人物の表情を工夫するなど、従来の女方が美貌にのみ頼ったのに対し、「演技」というものを歌舞伎にもたらした。民俗資料による研究は一歩後退せざるを得なかったが、絵画資料・文献資料を用いての研究成果は大きく、その後退を補うことが出来た。従来の歌舞伎研究は演技・演出の解明において、成果が乏しく、研究の実績は僅少であった。今村久米之助と玉川千之丞の演技と演出を、かなりの程度まで明らかにできたことは、歌舞伎研究の新しい成果である。本研究は、文献資料、絵画資料、民俗資料の三種の資料によって、17世紀歌舞伎の演技・演出の解明を目指すものである。以下、当該年度の研究実績である。文献資料については『役者絵づくし』掲載の詞章の翻刻と解読に注力した。翻刻は基礎稿を完成することができた。『役者絵づくし』の詞章は翻刻されたことがなく、ほとんど資料が無かった元禄期以前の戯曲の一端を学界に提供する用意が調った。また翻刻をしていくなかで、これらの詞章は17世紀歌舞伎の舞台で歌われた歌や台詞であることが判明。とくに「鳴神」の詞章は、現在も上演される歌舞伎十八番「鳴神」の古態を示す、歌舞伎戯曲史にとって重要な資料であることを発見した。絵画資料については、主として『役者絵づくし』掲載の舞台図約50点の分析研究を実施した。これは17世紀とくに貞享期(1684ー1687)の歌舞伎の演技・演出の実態を描く貴重な資料であるが、絵には象眼(彫り直し)の跡があることを発見した。
軸器官のねじれにおける表皮細胞の役割

本研究では植物軸器官の方向性をもつねじれ現象の解説する2つのモデル(表皮細胞主導型伸長モデルと細胞層間偏差伸長調整モデル)を検証するために、シロイヌナズナ根の細胞層特異的に微小管制御因子や細胞伸長制御因子を発現させ、根伸長表現型を解析した。各種チューブリン優勢変異体を根表皮細胞特異的に発現させた植物体では、根の表皮細胞は通常に伸長し、根の生育や形態にはほとんど異常が見られなかった。また、カタニンやSAUR9を用いて皮層と表皮の間に伸長差を生み出す操作をすると、若干の伸長阻害と伸長方向の傾きが見られた。これらの結果は2つのモデルのどちらか一方を単純に支持するものではなかった。軸器官ねじれ現象を説明する2つのモデル(表皮細胞主導型伸長モデルと細胞層間偏差調整モデル)を検証するために、アラビドプシス植物体軸器官(根、胚軸)の細胞層特異的に微小管制御因子や微小管と無関係な細胞伸長制御因子を発現させ、軸器官の表現形を解析する。1)細胞伸長を抑制することが報告されている遺伝子をC1プロモーターを用いて根の内層細胞特異的に発現させたところ、植物体の生育阻害が見られ、次世代が得られなかったか(ACT2fiz1, IAA17aux3-1)、生育に影響を与えなかった(ACT1)。2)同様にPP2C-DとSAUR9を発現させたところ、根の伸長方向に若干の変化が見られた。3)カタニン矮性変異株にGFP-KTN1を表皮細胞特異的に発現させたところ、根の伸長が部分的に相補された。4)4種類の優性変異βチューブリンをGFP融合タンパク質としてWRKY72プロモーターを用いて根の表皮細胞特異的に発現させたところ、TUB6(S95F)とTUB6(T178I)で目的とする細胞層特異的発現系統が得られた。TUB6(S95F)-GFP発現個体では根の表皮細胞が強く右巻きにねじれ、表層微小管は弱い左巻きヘリックス構造を取っていた。一方、TUB6(T178I)-GFP発現個体では根の表皮細胞が弱く左巻きにねじれ、表層微小管はわずかに右巻きヘリックス構造を取っていた。この予備的な実験結果は、表皮細胞主導型伸長モデルを支持していると考えられるが、細胞層間偏差調整モデルを否定する結果ではない。幾つか試した遺伝子のうち、βチューブリン変異の2系統において目的とする結果が得られつつある。1)βチューブリン優勢変異とGFP融合たんぱく質、TUB6(S95F)-GFP、をWRKY72プロモーターを用いて根表皮細胞特異的に発現させた植物体で、根の表皮細胞が強く右巻きにねじれ、表層微小管が弱い左巻きヘリックス構造を取ることを前年度に報告した。この植物体系統をさらに解析したところ、GFP蛍光とねじれ表現型が連鎖しないことが判明した。さらなる解析の結果、右ねじれを示すtub4(P287L)変異株とこの変異株にGFP-TUB6(野生型)を形質転換した植物系統が混在しており、他の実験で作製していた植物集団を取り違えていた。2)再度、シロイヌナズナ野生株に表皮細胞特異的にTUB6(S95F)-GFPを発現させたT1およびT2植物を作製したところ、GFP蛍光を示し根がねじれて伸長する植物体は観察されなかった。従って、現時点では表皮細胞主導型伸長モデルを支持する実験結果は得られていない。3)根各細胞層の細胞の形、大きさ、配置を詳細に観察するために、GFP融合細胞膜たんぱく質マーカーを用いたライブイメージングと改変PI染色法による観察を行った。ライブイメージングでは細胞層により蛍光強度のばらつきがあり、一部の細胞タイプで3次元立体構築が困難であった。改変PI染色法では野生株と各種ねじれ変異株において良好な細胞形態データが取得でき、細胞伸長開始とともに細胞軸のねじれが始まり、内外の細胞軸間のずれはみられなかった。また、根毛分化細胞と非分化細胞でねじれに伴う細胞肥大に違いが見られた。ねじれ形質を示す個体の根については、各細胞層の細胞形態や微小管配置に関する、より詳細な情報を得る。効果のあった変異チューブリンを内皮細胞層特異的に発現させる系統も作成し、表皮細胞特異的発現系統を比較するのは非常に有効である。また、他のチューブリン変異についても、さらなる検討を加えてゆく。

植物細胞生物学実験のスタートが若干遅れたこと、および抗体、制限酵素など比較的高価な物品の購入が予想よりも低く抑えられたことにより、次年度使用額が生じた。また、本年度は旅費を使用しなかった。複数のコンストラクトを作製し、多くの形質転換植物個体を解析するための分子生物学実験に必要な消耗品に使用する。また、国内学会の旅費を使用する。
多剤耐性大腸菌ST131クローン特異的タンパク質の同定とその機能解析

多剤耐性腸内細菌科細菌は,近年Escherichia coliの菌種を中心に病院内のみならず市中においても急増傾向にあり,2013年にはCDCが人類の脅威であるとの警告を発した。また,薬剤耐性菌感染症関連死亡率は,2050年には現在最も死亡率の高い悪性腫瘍のそれを上回るとの試算も報告されている。多剤耐性E. coli急増の原因は、Sequence Type 131に分類されるクローン(ST131)の世界的パンデミックであり、その原因は明らかとなっていない。われわれはこれまでに質量分析器を用いて、ST131に特異的な複数のタンパク質を発見してきた。その中には機能不明なタンパク質も含まれており、今後これらST131特異的タンパク質のタンパク質間相互作用など様々な機能解析を実施することで、ST131を代表とする薬剤耐性パンデミッククローンが世界的蔓延を遂げる原因が解明される可能性を秘めている。平成30年度は各種ST131特異的タンパク質の単離精製および同定し、その塩基配列解析を実施した。これにより5つのST131に特異的なタンパク質アミノ酸変異(YahO E34A [7655 m/z]、YjbJ V59D D60S T63K [8351 m/z]、YnfD S106T [8448 m/z]、HdeA Q92K N94S [9714 m/z]および7パターンのアミノ酸変異を伴う可溶性cytochrome b562 [11783 m/z]を発見した。HdeAは酸ストレス応答、可溶性cytochrome b562は電子伝達系に関与するタンパク質である。一方、YahO、YjbJおよびYnfDは現在のところその機能は明らかとなっていない。平成31年度以降はこれらのタンパク質の相互作用および機能解析を実施していく予定である。平成30年度は各種ST131特異的タンパク質を単離精製し、同定した。また、その遺伝子塩基配列解析も完了し、当初の計画通り研究は遂行されている。各種ST131特異的タンパク質同定後,機能不明なタンパク質はそのコーディング遺伝子を高発現pETベクター(Novagene)に遺伝子導入し,ST131およびnon-ST131特異的配列の2種類の遺伝子組み換え体を作製し,機能を比較する。pETベクターはpET-41aを使用し,それぞれGSTタグ付きおよびタグ無し2種類計4株の高発現株を作製し,以下の研究を実施する。a) GSTタグ付き抗原を用いたプルダウンアッセイによるタンパク質間相互作用解析,b) GSTタグ無し抗原を用いたウェスタンブロッティングのためのポリクローナル抗体作製,c)磁性ビーズによるポリクローナル抗体の精製および各種ブロッティングによる性能評価,d)各種抗体を用いたST131特異的タンパク質の細胞内局在性の確認。なお,a)について,GST系で解析不可能であった場合はHisタグを用いた系も検討する。

a) GSTタグ付き抗原を用いたプルダウンアッセイによるタンパク質間相互作用解析,b) GSTタグ無し抗原を用いたウェスタンブロッティングのためのポリクローナル抗体作製,c)磁性ビーズによるポリクローナル抗体の精製および各種ブロッティングによる性能評価,d)各種抗体を用いたST131特異的タンパク質の細胞内局在性の確認。なお,a)について,GST系で解析不可能であった場合はHisタグを用いた系も検討する。平成30年度の実験は予想以上にスムーズに遂行できたため、当初の予定より消耗品や外注費用の支出が抑えられた。次年度からは平成30年度に発見した各種ST131特異的タンパク質の機能解析を実施するが、これには様々な新しく調達する必要のある試薬が多数必要であると推測するため、平成31年度にその余剰金を繰り越した。
白血球遊走と血管型カドヘリンの関係

Paracellularpathwayに位置するV-cadherinの白血球透過性に対する役割を検討した。今度は、同様に2層式の培養プレートの上層に上記3種の細胞をそれぞれコンフルエントに培養し,上層にV-cadherin抗体を追加することによる白血球の遊走能に対する影響を検討した。その結果、CHO細胞では影響はなく、CHO/V-cad細胞、CHO/V-cad△cp細胞ともに特異抗体を加えない時よりも、透過性が亢進しCHO細胞の透過性と近似していた。従って、V-cadherinは内皮細胞のParacellularpathwayを通る白血球透過性に深く関与しているものと考えられた。血管型カドヘリンは血管内皮細胞特異的な接着分子で内皮細胞相互の接着を司るとともに、in vitroで血管透過性に関係があることがわがっている。炎症の際には白血球の血管外遊走という現象は炎症の場に到達するために必須のことであるが、白血球はカドヘリンの存在する内皮細胞相互の間隙を常に通過している。しかし、血管型カドヘリンと白血球遊走の関連は充分な証拠が集積していない。白血球遊走と血管型カドヘリン発現の関係を分子メカニズムの観点で研究したものは認められない。現在までのところ、V-cadherin specificな抗体が作成され、そのchracterizationが進行中である。また、V-cadherin全長のcDNAを導入した培養細胞(CHO/V-cad)とV-cadherinの細胞内ドメインを切断したcDNAを導入した培養細胞(CHO/V-ccdΔcp)のstableなCell lineが確立され、今後、2層式の培養プレートの上層にCHO/V-cadとCHO/V-cadΔcpをそれぞれコンフルエントに培養し、炎症性サイトカインを追加することによってV-cadherinの発現の変化を蛍光抗体法(IF)、Westren blotting、Northern blottingで検討する予定である。本研究は血管型カドヘリンが白血球遊走に関与することを分子メカニズムの観点で解明することを目的とする。また、V-cadherin全長のcDNAを導入した培養細胞(CHO/V-cad)とV-cadherinの細胞内ドメインを切断したcDNAを導入した培養細胞(CHO/V-cad△cp)のstableなCelllineが確立された。今度は、同様に2層式の培養プレート上層に3種類の細胞をそれぞれコンフルエントに培養し,上層に特異抗体を追加することによる白血球の遊走能に対する影響を検討した。従って、V-cadherinは内皮細胞のParacellular pathwayを通る白血球透過性に深く関与しているものと考えられた。
細胞分化による心不全の遺伝子治療

Wntは心臓の発生早期において重要な役割をはたしていると考えられているが、心筋分化の際にWntシグナルがどのように関与しているのかは十分明らかにされていない。そこで、本研究ではP19CL6細胞を用いて心筋分化におけるWntの役割を調べた。P19CL6細胞をDMSOで心筋細胞へ分化誘導させるとcanonical WntのメンバーであるWnt-3aとWnt-8が一過性に発現することが確認された。P19CL6細胞にWnt-3aだけを一過性に強制発現させても心筋特異的転写因子の発現が誘導され、拍動する心筋細胞への分化が認められた。しかしcanonical Wntのシグナルを持続的に刺激すると、心筋特異的転写因子の発現の増加は抑制され拍動する心筋細胞への分化はみられなくなった。これらの結果からWntシグナルは心筋分化に対し、発現の時期や持続時間によりpositiveにもnegativeにも作用している可能性が示唆された。今後は心筋分化においてWntシグナルに関連する分子を解明し、遺伝子導入により非心筋細胞を心筋細胞に分化誘導させるための方法を探索する。最近、成人幹細胞の可塑性の機序として分化転換(transdifferentiation)や細胞融合(cell fusion)の存在が報告されている。我々は心筋細胞が他のさまざまな体細胞と融合するのか、またその後の形質はどうなるのか検討した。心筋細胞を血管内皮細胞、心筋線維芽細胞、骨髄細胞、内皮前駆細胞と共培養した結果、それぞれ自発的に細胞融合し心筋細胞の形質を獲得した。内皮細胞や線維芽細胞で発現する蛋白質の発現量は減少することから、心筋細胞の形質が優位になることが示唆された。また融合した細胞は細胞周期に入ることが示された。これらの現象はin vivoのモデルでも確認された。これらの概念は心不全の細胞治療にも役立つと思われる。心筋細胞は出生後分裂増殖能を喪失するため、心筋梗塞等で心筋細胞が失われた場合、心不全の原因となる。失われた心筋細胞を補う方法として非心筋細胞を心筋細胞に転換させる遺伝子治療法と細胞移植法があり、この方法を確立するためには、心筋細胞分化の分子機序を明らかにしていく必要がある。そこで心筋細胞に高率に分化することが知られている細胞株であるP19CL6細胞を用いて、DNA chipによりCSX遺伝子の上流分子について解析した。P19CL6細胞はDMSO添加後6日目より、CSX、GATA4、MEF2Cが発現し心筋細胞に分化するため、それ以前に発現する分子を同定しようと試みた。具体的には、分化前とDMSO添加後4日目、6日目の細胞よりRNAを抽出し、それぞれの時期に発現する遺伝子をDNA chipを用いて解析した。多くの転写因子、細胞増殖因子、細胞骨格分子などの発現に変化が認められた。今後個々の分子の心筋細胞分化における役割について解析を進める予定である。2.心筋細胞におけるWntの役割についての研究我々は以前、P19CL6細胞の心筋細胞分化にBMPが必須であることを示したが、この際にもDMSOによる処理が必要であることから、BMP以外の因子も関与していると考えられる。ショウジョウバエの心臓の発生にwinglessが必要であることや、羽の発生においてBMPのホモログであるdppとwinglessが協調して働くことが報告されている。そこでwinglessのほ乳類ホモログであるWntのP19CL6における役割を解析した。具体的には、Wntの機能を阻害する分子としてドミナントネガティブWntとFrzbをそれぞれ過剰発現したP19CL6細胞株を単離した。二種類の細胞株はともにP19CL6よりも高率に心筋に分化した。多能性胚細胞腫P19細胞の亜株であるP19CL6細胞は、1%のDMSOにより高率に心筋細胞に分化し、分化誘導後10日目で自律拍動する。これまで我々はP19CL6細胞の心筋細胞分化にMAPKKKファミリーのTAK1を介したBMP(bone morphogenetic protein)の作用が重要であることを報告した。BMPはTGF-βファミリーの一員であり、TGF-βによるシグナルには転写因子のSmadが関与し、このSmadやTAK1の共通のターゲット分子としてATF/CREBファミリー転写因子のATF-2がある。そこで今回は、P19CL6細胞の心筋分化におけるSmadとATF-2の役割について調べた。P19CL6細胞は培養液中に1%のDMSOを加えることにより心筋細胞に分化させることができるが、BMPのantagonistであるnogginを持続的に過剰発現する細胞株(P19CL6noggin)では分化が認められなかった。しかしP19CL6nogginにSmad1やSmad4を過剰発現させたところ、心筋細胞への分化がみられた。一方、抑制型のSmadであるSmad6を過剰発現した場合は分化はみられなかった。またSmad1、Smad4、TAK1による分化誘導はATF-2によりさらに増加し、逆に優性抑制型のATF-2により減少した。これらの結果から、P19CL6細胞の心筋分化にはTAK1やSmadおよび両者の共通のターゲットであるATF-2が協調的に作用することが明らかになった。P19CL6細胞の心筋分化には、DMSOによる処理が必要であることから、BMP以外の因子も関与していると思われる。

心筋細胞分化による遺伝子治療をおこなう上で、分化に関与するシグナルを解明していくことは極めて重要であるため、今後もさらに研究を進めていく予定である。マウスの胎生期癌細胞であるP19細胞より単離されたP19CL6細胞は、ジメチルスルフォキシド(DMSO)存在下での培養でほとんどの細胞が自発的に拍動する心筋に分化し、心筋特異的遺伝子の発現を認めることから、心筋分化の研究に関してin vitroにおける有用なモデルである。これまでbone morphogeneticprotein (BMP)が心筋の分化に重要であることは示されてきたが、その分子レベルでのメカニズムは未だ解明されていなかった。そこで心筋分化におけるBMPの役割を明らかにするため、BMPに結合してその機能を阻害する背側化因子nogginを過剰発現したP19CL6細胞(P19CL6noggin)を単離し、これを解析した。その結果、BMPはBMPのシグナル伝達系の一因子であるTAK1および転写因子のSmadの両者を介して心筋特異的転写因子であるCsx/Nkx2.5、GATA-4の発現に寄与していることが明らかにされた。この機序はP19CL6細胞における心筋の分化に必須であると考えられた。SmadファミリーもTAK1と同様にTGF-βシグナル伝達因子の一つであり、また最近ATF/CREBファミリーに属する転写因子ATF-2がSmadとTAK1の共通の核内ターゲットであることが報告された。そこで次に、SmadおよびATF-2が心筋細胞分化に関与しているかどうかをP19CL6細胞を用いて調べた。P19CL6におけるトランスフェクションの結果から、転写因子ATF-2はSmadおよびTAK1と協調してβMHCのプロモーター活性を上昇させることが示された。また、不活性型のATF-2の過剰発現によってβMHCを含むいくつかの心筋特異的遺伝子のプロモーター活性は抑制され、さらには心筋特異的遺伝子のmRNAの発現および心筋細胞への分化も抑制された。これらの結果から、ATF-2はSmadおよびTAK1と協調して心筋細胞の分化に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、酵母のtwo hybrid systemを用いてCsx/Nkx2.5と会合する分子を複数単離した。マウスの多能性胚細胞腫であるP19細胞より単離されたP19CL6細胞は、DMSO存在下での培養でほとんどの細胞が自発的に拍動する心筋細胞に分化し、心筋特異的遺伝子の発現を認める。心筋分化の早期に発現する新規の遺伝子を同定するために、DMSO処理前と分化6日目とでDifferential displayを行い、分化6日目のみで発現の見られる遺伝子を選択した。その結果、新規の遺伝子を単離しMidoriと名付けた。マウス胎仔で発現を調べると、MLC2vと同様、胎生7.5日からcardiac crescentに一致して発現が見られ、その後も胎生10.5日までは心臓原基に限局して発現し、骨格筋原基(体節)には発現していなかった。MidoriはP19CL6細胞の心筋への分化過程において、CSX、GATA4、MEF2Cなどの転写因子よりも早期に核内に限局して発現し、Midori自身の転写活性を高めることから転写制御因子として働いているものと考えられた。
高分解能原子核乾板と超解像顕微鏡法を用いた暗黒物質検出システムの開発

原子核乾板を用いた暗黒物質探索の国際プロジェクトNEWS(Nuclear Emulsion for WIMPs Search)の一環として、超微粒子写真乳剤の原子核乾板上に記録される、暗黒物質に起因する微細飛跡の検出システムの確立を目指した。光学顕微鏡を用いて解像度以下の微細飛跡を検出するための超解像顕微鏡法として、蛍光標識化法、表面局在プラズモン共鳴発光法を検討し、光学顕微鏡で解像しない像を詳細観察することができた。さらに超微粒子乳剤の増感、ノイズ除去などの原子核乾板応用技術を開発した。微細飛跡の超解像顕微鏡法のキーテクノロジーとなる蛍光標識化法において,新規購入した蛍光標識化色素では飛跡が発光しないという問題が生じた.この問題の解決の中で,構造の類似した色素を1/1000のレベルで混入すると,両者の相互作用により飛跡を形成するヨウ化銀上で特異的に強く発光することを見いだした.旧色素では含まれていた不純物により発光可能となったことを解明し,混合色素系を用いた発光プロセスを確立した.これにより飛跡の不発光問題は解決された.この知見を元に各種色素の組み合わせを試み,識別の容易な発光を示す色素の組み合わせがいくつか見いだされた.超微粒子写真感光材料の開発に関しては,ハロゲン化銀結晶サイズ40nmの製造処方を確立した.さらに,現像処理工程における低温現像法の開発によって,疑似的な暗黒物質シグナルと見なしている炭素イオンに対する現像確率を100%近く維持した状態で,ノイズ発生をこれまでの1/20まで抑えることに成功した.ハロゲン化銀結晶も含めたデバイス構造としての感光材料に対する新たなシミュレーションの構築によって,超微粒子乳剤における検出限界を定量的に推定することに成功した.また,このシミュレーション結果は,現在の光学解析システムによる検出性能とよく一致し,検出器の理解が劇的に進んだ.超微粒子化による感度低下を補う低温赤色光後露光補力処理の温度依存性を調べた.低温ではSN比が向上するが,分散した放射線による感光効果を集中化させる処理も温度依存性を持つため,補力効率が低下する.最適温度を見出し,簡便な装置で補力処理が可能となった.新たに現像銀等の金属微粒子が持つプラズモン共鳴を利用した超解像顕微鏡法に着想し,そのための解析法を提案して,原理実証を行った.その結果,光学顕微鏡で10nmの分解能が達成可能であることを実証した.ダークマター検出の国際プロジェクト(NEWS; Nuclear Emulsion for WIMPs Search)が本格的に動き出した.その検出手段としての原子核乾板の特性向上と飛跡検出技術の多方面・総合的な開発が求められ,技術開発の方向の最適化と実用化に向けた検証が進められた.ダークマター検出に適した感度の原子核乾板が必要とされるが,乳剤調製の段階での感度調節は,異なる乳剤を多数調製する必要がある.ストック乳剤から簡便な処理で感度を変える方法を求めた.増感剤や減感剤を塗布前に添加する方法と,塗布後の乾板をそれらの溶液に浸漬する方法による感度調整法を試みた.同時にS/N向上のためにノイズとなるカブリも簡便に低減する方法を探求した.ダークマター検出に不可欠な低速粒子の飛跡の選択的検出法のため,低速粒子特有の核阻止能による結晶欠陥生成を検出する現像法として,内部現像の手法に着目し,電子阻止能による感光を除去する減感剤と併用することで,選択的検出に適した乳剤設計と処理法を開発した.また,赤色光後露光補力の温度依存性をさらに詳細に調べ,補力の最適条件を求めた.ダークマターによるμm以下の微細な飛跡を光学顕微鏡で検出するための超解像的な顕微鏡技術の開発を進めた.蛍光標識化法において,昨年度見いだした特異的な発光メカニズムに基づく解析をさらに進めた.蛍光標識化法に適した色素の探索を行い,励起状態を順に伝達する3色素の組み合わせにより吸収波長と発光波長を大きく分離することで,S/Nの向上を目指した.また蛍光発光への基板の影響などを調べた.これらを飛跡検出に適用する条件を探索した.感光材料の開発は進捗がみられた.乳剤塗布前に添加するだけで感度調節とカブリ除去の両方が得られる添加剤として,テトラゾリウム化合物を見いだした.これは添加量の調節で段階的に感度を下げ,またカブリを大幅に低減した.逆に増感剤としてはトリエタノールアミンが有効であることを見いだした.塗布済み乾板を増感剤溶液に浸漬するという,さらに簡便な方法で感度上昇が得られた.これは超微粒子乳剤に特に有効であった.また,赤色光後露光補力の温度依存性が明らかになったことで,露光後の補力処理による感度上昇の条件が得られた.これらの方法によれば感度の異なる乳剤を毎回調製する必要がなく,1種類のストック乳剤から必要な感度の感光材料が得られることになる.これは原子核乾板の調製場所ではなく,使用場所で感度調節が可能となることであり,輸送中のバックグラウンド放射線の露出の影響を避け,予備実験の結果に即応した最適実験計画をたてることができる.種々の銀塩写真技術を適用した新しい検出技術が開発された.内部現像法により,低速粒子の核阻止能の作用のみを選択的に検出する技術の可能性が示され,これはダークマターを選択的に検出することを可能にする.蛍光標識化法用の色素が発光しない問題の解決を受けて,色素間の相互作用による発光というメカニズムの知見を元に,蛍光標識化法の色素を探索した.

3色素からなる青色光吸収,赤色光発光の色素系を構築した.吸収波長と発光波長を大きく分離することで,発光の観察が容易となる.新規な蛍光発光メカニズムという観点から,吸着媒体の影響などの基礎的な知見も多数得られた.ただ飛跡を検出するための発光条件の最適化がまだ確立されておらず,この条件の確立が急務である.原子核乾板を用いてダークマターを検出する国際プロジェクト(NEWS: Nuclera Emulsion for WIMPs Search)が進行中である.ダークマターの反跳粒子のような短寿命素粒子が作る飛跡は,光学顕微鏡で解像しないほど微細であり,このような微細飛跡の検出が必要である.本研究ではそのプロジェクトの一環として,微細飛跡の検出技術の開発を進めた.光学顕微鏡は安価で簡便な測定機であるが,解像度不足を補う超解像顕微鏡法の適用が必須となる.ここでは,1蛍光標識化法と,2局在表面プラズモン共鳴発光法の2つの手法を検証した.飛跡を作る現像銀粒子を媒染剤に変換し,蛍光発光色素を吸着させる蛍光標識化法では色素の選択が重要であるが,色素間の相互作用により飛跡上で特異的発光を示す混合色素系を見いだした.これより微小現像銀粒子の解像限界を調べた.光学顕微鏡では解像しない微小粒子も,蛍光標識化法では粒子ごとの発光点として観察され,超解像顕微鏡法として利用可能であることが確認された.しかしながら,高解像度の超微粒子乳剤からなる原子核乾板では,重粒子イオンの飛跡が記録されなかった.これは原子核乾板の感度不足で飛跡が写っていないためと結論され,超微粒子乳剤に適した増感法の探求を行った.超微粒子乳剤では各種の還元剤の添加により,大きな感度上昇が得られることが見いだされた.もう一つの手法として,金属微粒子の示す局在プラズモン共鳴発光の利用を検証した.光学顕微鏡の光学系の工夫により,解像しない微小粒子が発光で認識され,超解像顕微鏡法となりうることが示された.この局在プラズモン共鳴発光は偏光依存性を持ち,微細現像銀はフィラメント状で異方性があることから,偏光を回転させることで接近した粒子も順に発光して,区別して検出することができた.原子核乾板を用いた暗黒物質探索の国際プロジェクトNEWS(Nuclear Emulsion for WIMPs Search)の一環として、超微粒子写真乳剤の原子核乾板上に記録される、暗黒物質に起因する微細飛跡の検出システムの確立を目指した。光学顕微鏡を用いて解像度以下の微細飛跡を検出するための超解像顕微鏡法として、蛍光標識化法、表面局在プラズモン共鳴発光法を検討し、光学顕微鏡で解像しない像を詳細観察することができた。さらに超微粒子乳剤の増感、ノイズ除去などの原子核乾板応用技術を開発した。蛍光標識化法の開発の進捗がはかばかしくなかった.これは実績でも述べたように,新規購入した蛍光標識化法用の色素で飛跡が発光しないという問題の解決に時間をとられたためである.旧色素にたまたま不純物が混入していたため,偶然の結果として飛跡を発光させる蛍光標識化法を組み立てることができたのであるが,新規購入色素は純度が高すぎたために発光しなかった,という想定外の結果であった.しかしその原因が明らかになったことで,今年度以降の進捗が期待できる.超微粒子写真感光材料の調製は進捗した.
分泌性シグナル分子の不均等分散を生み出す分子基盤

分泌性シグナルタンパク質は様々な生命現象に重要な役割をはたすが、それらが空間的にどのように分布し、その分布がどのように制御されるか、という問題は実験方法の制約もありほとんど理解が進んでいない。それに対して本研究では、組織免疫染色方法を改良して生理的条件でのWnt-3aタンパク質の空間分布をマウス胚脊髄神経管をモデルに解析するとともに、アフリカツメガエル初期胚においてWntタンパク質の空間分布を制御する因子を同定し、発生過程における作用を明らかにした。さらに、生化学的解析によりWntタンパク質に性状の異なるさまざまなフォームが存在し、細胞極性や細胞種によりそれらの分泌が異なることを明らかにした。Wntをはじめとする分泌性シグナル因子が様々な発生現象に重要なことは、動物個体を用いた分子遺伝学的解析などにより精力的に示されてきた。ではそこから一歩進んで、器官の発生において、いかにして固有のかたちが形成され、特徴的な領域化のパターンが確立するのかということを理解するためには、それらのプロセスに関わる分泌シグナルの空間分布の制御機構を解明することが重要となる。本研究ではWntタンパク質の空間分布に着目し、(1)感度の高い抗体を用いた内在性Wntタンパク質の生理的条件下での空間分布の観察、(2)ライブイメージング技術によるWntの動的挙動の解析、(3)アフリカツメガエル胞胚上皮系を用いたWntの空間局在を制御する因子の探索、の3点の研究を進めている。平成23年度の研究では以下のような結果が得られた。(1)我々が独自に作製した抗Wnt3a抗体を用いて、マウス胚の脊髄神経管におけるWntタンパク質の局在を再現性よく検出できる条件を確立した。(2)マウス胚を用いたWnt-3aのライブイメージングを行うため、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスを作製するためのターゲティングコンストラクトを作製した。(3)アフリカツメガエル胞胚上皮系にEGFP-Wntを注入してライブイメージングを行い、Wntの空間動態の観察が可能であることを確認し、長時間安定して観察できる条件を検討した。平成24年度以降は、以上の結果のうち、特にマウス胚組織内におけるWntタンパク質の動態に着目して研究を進める予定である。Wntタンパク質の空間分布の実態とその制御機構を理解するため、本年度は以下に述べる成果を得た。Wnt-3aタンパク質の不均一分布に関わる因子の解析:昨年度までの研究から、後脳から脊髄にかけての神経管の背側領域において、Wntタンパク質は不均一な空間分布を示し、しかもその分布には3通りの様式があることがわかった。そこで、この不均一分布に関わる因子を検討するため、神経管の背側領域でヘパラン硫酸鎖合成に必須な遺伝子のコンディショナルノックアウト胚を作製したところ、上記3通りの分布様式のうちの1つに異常が認められた。このことから、ヘパラン硫酸鎖はWntの空間分布を制御する要因の一つではあるものの、それ以外の要因により制御される空間分布様式が存在することが新たに明らかになった。脊椎動物胚内におけるWntタンパク質のライブイメージング: Wntタンパク質の局在化プロセスを時空間的に解析するため、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスを樹立し脊髄神経管において解析を行ったところ、EGFPの発現量が予想に反して低く、検出方法等の改良が必要であることがわかった。そこで、胚体内でWntのライブイメージングを行う新たな方法として、蛍光標識した抗体を用いてWntを可視化する方法を試み、アフリカツメガエル胚において観察に成功した。上皮細胞におけるWnt不均一局在:アフリカツメガエル胞胚上皮細胞で異所的に発現させたWntは細胞の周辺でクラスターを形成することを見いだしていたが、本年度は内在性Wntも同様にクラスター形成することを新たに作成した抗Wnt抗体により確認するとともに、このクラスターと細胞骨格系との共局在を強く示唆する結果を得た。器官の発生において、いかにして固有のかたちが形成され、特徴的な領域化のパターンが確立するのかということを理解するためには、それらのプロセスに関わる分泌シグナルの空間分布の制御機構を解明することが重要となる。(1)においては、マウス脊髄神経管においてWnt3aタンパク質の空間局在を詳細に解析し、神経管の管腔側に局所的に集積することを発見した。さらに、このような集積に関わる因子を同定するためさまざまな変異体マウス胚を用いて空間局在の検討を開始した。

(2)においては、マウス胚を用いたWnt-3aのライブイメージングを計画しているが、本年度はEGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスの作製が完了したことから、次年度以降に生理的条件下においてWntタンパク質の動的挙動をライブイメージングにより追跡することが可能になった。(3)においては、アフリカツメガエル胚を用いてWntの不均一局在を制御する因子の探索も進めており、その候補因子とWnt8タンパク質の共局在を確認することができたことから、次年度においては候補因子が実際にWntの不均一局在を制御するかどうかを検討できるものと考えられた。平成23年度の当初に予定した計画の諸項目の進展状況は以下の通りである。Wnt-3aタンパク質の不均一分布の形成過程の観察については、様々な発生段階にある脊髄神経管において、抗Wnt-3a抗体による免疫組織染色を行い、Wntの空間分布を解析することに成功した。マウス胚内におけるWnt-3aタンパク質のライブイメージング系の確立については、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスを作成するためのターゲティングコンストラクとに予期せぬ問題が発覚したため、平成24年度に繰り越したが、無事にノックイン可能なコンストラクトの作成に成功した。アフリカツメガエル胞胚上皮系を用いたWnt不均一局在のライブイメージングについては、胞胚上皮系にEGFP-Wntを注入してライブイメージングを行い、Wntの空間動態の観察が可能であることを確認し、長時間安定して観察できる条件を検討した。以上の成果を総合的に判断し、本研究はおおむね順調に進展していると判断する。25年度が最終年度であるため、記入しない。発生過程におけるWntの機能についてはすでに膨大な報告があるにもかかわらず、Wntタンパク質そのものの空間分布の詳細な解析は脊椎動物ではほぼ皆無であった。マウスの発生過程におけるWntタンパク質の空間分布を解析したこれまでの結果から、このタンパク質の空間分布がこれまでの通説とは異なり、組織内の局所に局在化するということが示された。この結果は当初の予想をはるかに超える新奇性を含んでおり、今後のさらなる展開が期待できるものとなっている。これまでの研究成果をふまえ、以下の実験を実施することを計画している。1 Wnt-3aタンパク質の不均一分布の形成過程の観察:前年度の研究から、後脳から脊髄にかけての背側領域において、Wntタンパク質の不均一な局在が確認された。そこで、様々な発生段階にある野生型マウス胚、およびWntの変異体を含む複数の変異体を用いて、抗Wnt抗体による免疫組織染色を行い、Wntの空間分布の時空間的変化を詳細に解析するとともに、空間分布の規定に関わる要因を検討する。2マウス胚内におけるWnt-3aタンパク質のライブイメージング系の確立: Wntタンパク質の局在化プロセスを時空間的に解析するために、マウス胚そのものを用いたWnt-3aのライブイメージングを行う。そのために、EGFP-Wnt3aをWnt-3a遺伝子座に組み換えたノックインマウスの作製を行い、脊髄神経管におけるWntタンパク質の動的挙動を解析する。
GADD45による細胞増殖抑制メカニズムの解析

Gadd(growth arrest and DNA damage inducible)45遺伝子は、DNA損傷により強く発現が誘導される遺伝子群の一つとしてCHO細胞から単離されたものである。GADD45の発現はp53依存的であり、その機能としてG1チェックポイント機構、あるいは除去修復機構への関与が示唆されているが、その詳細は明確ではない。我々は、Gadd45遺伝子の発現制御が可能なベクターを構築し、高発癌性遺伝病であり、放射線高感受性、及びp53応答経路をはじめとする細胞周期チェックポイント異常を特徴とするataxia telangiectasia(AT)細胞に導入する実験系を確立した。この系を用いて本研究では、AT細胞の表現形質とGadd45遺伝子との関係、及びGadd45遺伝子の機能について調べ、以下のことを明らかにした。(1)正常細胞では、細胞密度依存的にGADD45の発現が上昇するが、AT細胞ではこの現象は全く見られない。(2)AT細胞では、GADD45の構成的発現レベルが低く、放射線による発現誘導も約20時間遅延する。しかし、放射線による発現誘導は見られる。(3)我々が確立したGadd45導入AT細胞では、誘導剤添加後2時間という早期に放射線照射時と同等レベルのGADD45発現が見られる。また、誘導されたGADD45は、誘導剤除去後も48時間は細胞内で安定に存在する。(4)GADD45の高発現により、細胞増殖の遅延、および約40%のコロニー形成率低下が見られる。(5)GADD45の高発現は、AT細胞の放射線高感受性には全く影響を与えない。また、顕著なG1、およびG2停止、あるいはDNA合成率の低下を引き起こさない。以上の結果は、GADD45が細胞増殖抑制機能を担っていること、しかし、その抑制は細胞周期チェックポイント機構による細胞周期の停止を介するものではないことを示唆している。
気相エピタキシャル成長法による硫化亜鉛成長層の伝導性および発光色の制御

気相成長法で化合物構成元素の蒸気圧制御により可能であることを示した硫化亜鉛(ZnS)エピタキシャル層の伝導性制御技術を確実なものとするために以下の項目を目的に本年度の研究と行った。1)Zn蒸気圧とNH_3添加量に対する電気的・光学的特性の対応関係の精密化を行い、P型伝導度の制御性の向上を図る。2)発光中心を添加したP型層で発光色と伝導性の制御が分離して行えるか調べる。3)p-n接合形成を念頭にn型層の低坑率制御技術を検討する。1)については、無添加成長層とN添加層の基板面に無直方向の成長層の格子パラメーターが成長層のストイキオメトリーの変化に対応していると解釈できる結果が得られた。これはP型層の出現には化学量論組成のずれを生ずるような過剰なZn蒸気圧下でのNH_3の添加が有効であることを裏付ける結果である。しかし、更に制御性を向上するためには、発表論文に記したようなP型層に固有とみられる浅いドナー準位の起源が、不純物か、N導入に伴なら欠陥か、化学量論組成のずれに伴なう欠陥かのいずれによるかを明らかにすることが今後必要である。2)のP型層での発光色制御については、AgやAg_2Sを原料とし原料温度6001000°CでAgが関与した青色発光が観測される。しかしAgとNH_3同時添加層の特性制御は未だ出来ておらず、今後変調ドーピング的な手法まで含めて検討する必要がある。3)のn型伝導度の制御についてはZnCl_2とZnI_2がドーバント原料として適していると考えられる結果が得られているが、更に条件の最適化が必要である。
大腸菌アンモニア同化制御の定量的ダイナミックモデル構築とシステム的理解

大腸菌にとって、グルタミン酸とグルタミンは、アミノ酸やヌクレオチドの前駆体として重要であるが、このグルタミン酸とグルタミンの合成にはアンモニアが必要である。アンモニア同化の複雑な制御機構を理解するには数学モデルの構築が不可欠である。本研究では、大腸菌アンモニア同化の定量的ダイナミックモデルを構築した。そして、それを用いて、これまでアンモニアチャネルだと考えられていたAmtBがアクティブトランスポーターであることを指摘した。また、モデル構築の過程で、新規の生化学パラメータ推定法を開発し、それを支援するためのC言語のライブラリを開発した。本研究の目的は、大腸菌アンモニア同化の定量的ダイナミックモデル構築とその制御構造の理解である。平成26年度では、大腸菌アンモニア同化システムのダイナミックモデルが概ね完成した。まず、制約付き最適化を用いた新しい動力学パラメータ推定法を開発した。これにより動力学パラメータの測定値からの変更を最小限に留めながら、実験データを定量的に再現できるダイナミックモデルを構築することができた。既存のダイナミックモデル(Bruggeman et al., FEBS J, 2005)にアンモニア輸送とその制御を追加した。当初の研究計画では、アンモニア輸送はモデルに含めない予定であったが、より予測能力の高いモデルを構築するためにアンモニア輸送もモデルに追加した。また、培養条件の違いを再現できるようにアンモニアの拡散もモデリングした。その結果、異なる3つのグループが報告した培養条件の異なる実験データを定量的に再現できるモデルを構築できた。今後は、構築したダイナミックモデルを使って、アンモニアトランスポーターのアクティブトランスポーター説とチャネル説を検証する。また、近年報告されている積分フィードバック制御に関しても詳細に解析する。現在のところ、遺伝子発現制御はモデルに含めておらず、酵素の濃度はモデルへの入力として与えている。今後は、遺伝子発現制御を微分方程式でモデリングすることを目指す。遺伝子発現制御を追加後、我々のグループが予測していた履歴現象が生じるかどうか検証する。本研究の目的は、大腸菌アンモニア同化の定量的ダイナミックモデルの構築とその制御構造の理解である。平成26年度には、アンモニアの輸送と拡散を考慮したモデルが完成していた。平成27年度は、それを使って主に解析と予測を行った。その成果の一部について、2015年11月にシンガポールで行われたシステムバイオロジー国際会議で口頭発表を行った。モデルを使ってアンモニアトランスポーターのアクティブトランスポーター説とパッシブトランスポーター説を検証した。パッシブトランスポーターを仮定すると実験データを再現できないことから、アクティブトランスポーター説がより有力であると結論づけた。さらに、アクティブトランスポーターに関して、輸送機構の異なるいくつかの速度式を構築し、どの輸送機構がもっともらしいか調べた。アンモニア無益回路によるエネルギーの無駄を最小化するために、アンモニアトランスポーターとグルタミン合成酵素の活性制御が合理的に行われていることを明らかにした。また、環境のpH変化に対する応答を予測した。タンパクGlnKはアンモニアトランスポーターに結合しアンモニア輸送活性を制御することが知られている。GlnKはアンモニア無益回路の最小化に寄与しているという説もあるが、未だにその生物学的役割がはっきりとしていない。今後は、この点に関して解析を進める予定である。具体的には、GlnK欠損株や、GlnKがウリジリル化されない場合などをシミュレーションする。今後は、パラメータ同定可能性などを調べることで構築したモデルの妥当性の検証も行う予定である。当初の予定では、タンパク質-遺伝子レベルのダイナミックモデルを構築する予定であった。しかし、遺伝子発現の実験データをモデルの入力とすることで、タンパク質-遺伝子レベルのモデルを構築せずとも十分に良いモデルが構築できた。これまでに、アンモニア輸送と拡散を考慮したモデルが完成していた。また、それを使って、アンモニアトランスポーターがアクティブトランスポーターであるという予測を得た。平成28年度は、主にパラメータ推定法の改良と新しい予測を行った。パラメータ推定法を改良し、代謝物濃度の測定データの信頼性を考慮したパラメータ推定手法を開発した。これまでの手法では、速度パラメータの測定値の不確実性だけを考慮していた。つまり、代謝物濃度の測定値は必ず正しいものと仮定していた。新しい手法では、代謝物濃度の測定データも場合によっては不正確であることを考慮する。これによって、速度パラメータと代謝物濃度の測定値の信頼度のバランスをとりながら、より現実的なモデルを構築することが可能になった。アンモニアトランスポーター欠損株がアンモニアのAcid trappingを行っている可能性を指摘した。我々の予測では、アンモニアトランスポーター欠損株は低アンモニア培養時に増殖速度が著しく低下する。しかし、実験データによると、現実のアンモニアトランスポーター欠損株は我々の予測よりも増殖速度が高い。この結果から、アンモニアトランスポーター欠損株がアンモニアトランスポーター以外の方法でアンモニアを輸送していることが予想された。1つの説明として、細胞内pHを下げることで、拡散によるアンモニアの取り込みを促進していること(Acid trapping)を予想した。

新しい動力学パラメータ推定法の開発とダイナミックモデル構築という目標を達成することができた。今後は、タンパクGlnKの生物学的役割について調べる。また、パラメータ同定可能性を調べることでモデルの妥当性を検証する。システム生物学今後は、まずロバストネス解析を行う。さらに、遺伝子発現制御をモデルに加える。本件とは別に予定外の予算が得られたため。海外共同研究者との打ち合わせを、その研究者の大学ではなく、学会会場で行ったために海外出張費が抑えられた。共同研究を加速させるため海外共同研究者の研究室に滞在することを考えている。平成27年度のスーパーコンピュータ使用料として使う。
ヤヌスミセル粒子構造の量子化

本研究では、親水性金属ナノ粒子に疎水性ポリマー粒子を付加したダイマー型両親媒性ヤヌス粒子が形成するヤヌスミセルにおいて、その会合数とそのパッキング構造に分布や乱れがない、量子化された構造の創成を目指す。ヤヌス粒子を創製する前段階として低分子系両親媒性化合物であるカリクサレン系脂質の会合挙動について研究を行った。この脂質は、ヤヌス粒子のモデル分子となる。まず、非イオン性の親水性部位を付加したカリクサレン系脂質において、水溶液のpHや温度を制御することにより、ミセル会合数を精密に制御可能であることを示した。このとき、形成されるミセル構造はプラトニック(正多面体)構造と類似の構造であることを明らかにした。この研究成果は、「Journal of colloid and interface science」に掲載された。また、これまでの研究では両親媒性分子の親水性官能基の影響に着目してきたが、疎水性基のアルキル鎖長について詳しく検討した例がなかった。そこで、カチオン性カリクサレン系ミセルにおけるアルキル鎖長依存性について、詳細に検討した。興味深いことに、アルキル鎖長を少しずつ長くした際、ミセル構造はあるアルキル鎖長に達すると棒状へと変化した。しかし、ミセルが球状粒子を形成するアルキル鎖長では、そのミセル会合数は非常に小さく、どれも単分散性を示した。このとき、ミセル会合数は不連続に増加し、その会合数はプラトニック構造の形成を示唆したものであった。本研究成果は、「Langmuir」および「Soft Matter」のカバーとして選出された。ヤヌス粒子を創製する前段階として低分子系両親媒性化合物である強イオン性官能基を有するスルホナトカリクサレン系脂質の会合挙動について研究を行った。疎水性部位の体積が非常に小さいとき、プラトニックミセルとしては最小の会合数4の単分散テトラマーミセルを形成することを見出した。またこのミセルが強イオン性官能基を有していることから溶液の塩濃度によって敏感に形態変化が起き、会合数6のヘキサマーミセルへ変化することも明らかにした。この結果は、「soft matter」のバックカバーとして選出された。また、このミセル系において疎水性部位の体積増加に伴い、非常に興味深い現象が観測された。通常のプラトニックミセルの会合数は正多面体の頂点数と一致するがこのミセル系では必ずしもその値と一致せず、疎水性部位の体積増加に伴い会合数17や24といったミセルを形成した。しかし、これら会合数もプラトニックミセル形成メカニズムで提案されている表面被覆率とミセル構造の熱力学的安定性との関係によって説明することができる。表面被覆率を考える際にクーロンポテンシャルを考慮した球面上の最密充填問題(トムソン問題)において、会合数17や24は被覆率が比較的高いことが示されている。つまり、スルホナトカリクサレン系ミセルのような強イオン性官能基をもつプラトニックミセルにおいてハードコアポテンシャルを考慮した球面最密充填問題(テーマス問題)ではなく、トムソン問題を考慮する必要があることが示唆された。この発見は、「Langmuir」へ報告した。これまでの研究結果から、剛直な構造体であるスルホナトカリクサレン系ミセルも単分散ミセルを形成することを明らかにしてきた。またこのミセルの会合数は正多面体の頂点数と一致しないものであったが、ミセルの被覆率と熱力学的安定性の観点から説明できることが分かった。この概念を巨大粒子へと応用することでヤヌス系ミセル系におけるプラトニックミセル集合体の構築が可能となる。

今後は、ヤヌス系ミセルの足掛かりとして低分子化合物よりさらに巨大な高分子系ミセルにおけるプラトニックミセルを創製する。プラトニックミセルを形成するためには親水・疎水の界面面積を精密に制御する必要があり、従来の高分子系両親媒性化合物においてその精密制御は非常に困難である。そこで、ボトルブラシ状高分子を親水基として有する高分子系両親媒性化合物を合成し、そのブラシ鎖長を制御することで界面面積をコントロールする。得られる高分子系両親媒性化合物はまさにヤヌス系両親媒性化合物と同類のものであり、モデル巨大分子としてのその分子会合挙動を明らかにする。
音声知覚と音素知覚の境界を探る:ミスマッチ陰性電位(MMN)を手掛かりに

脳が言語音をどのように認知するかという問いに関して、これまで数十年に渡り多くの研究がなされてきた。その中で、ヒトが言語音を認知する際、音響、音声、音韻といった知覚の段階が存在するといわれてきた。本研究では、行動実験と脳波計測実験の両面から、この音声と音韻の知覚段階の違いとその境界について調査する。また、これまでの研究で使われてきた実験方法の妥当性も検証する。
運動療法の鎮痛効果に対するキヌレン酸の役割～慢性痛に対する新たなアプローチ～

痛みが慢性化する機序の解明を目指し、キヌレン酸が慢性痛に対する新たな治療アプローチと成りうる可能性を探る。まずは、マウスを用いて神経障害性痛モデルを作製し、強制的に運動療法を行わせる。運動療法の強度の強弱で鎮痛効果の程度、血液、脳脊髄液中のキヌレン酸の濃度変化が見られるかを検討する。また、神経障害性痛モデルは、痛みの影響で健常マウスに比べ運動量が低下、筋肉内のキヌレニンアミノトランスフェラーゼ;KATが減少している可能性があり、リアルタイムPCRを用いてKAT遺伝子発現量を解析する。最後に、in vitro autoradiography法によりキヌレン酸の結合部位の検討を行う。