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医療機器の開発に関する知的財産評価指標の有用性評価と妥当性検証

従来の汎用的な知的財産の評価では,特許やビジネスへの実現可能性は主要な指標として位置付けられてきた.しかしながら,アカデミアでの研究から創出された知的財産を産学連携による技術移転を伴って医療機器などの製品化につながるためには,臨床的状況をも踏まえてその価値が定量的に評価されることが望ましい.医療機器に関する知的財産の評価のレビューおよび意思決定プロセスを支援するために,本研究では3つの主要な項目(1特許,2事業実現可能性,および3社会的側面)から構成されていたスコア化評価ツールを開発した.これらについては有用性が得られる一方で,項目の一部には評価結果に偏る傾向が認められた.従来の汎用的な知的財産の評価では,特許やビジネスへの実現可能性は主要な指標として位置付けられてきた.しかしながら,アカデミアでの研究から創出された知的財産を産学連携による技術移転を伴って医療機器などの製品化につながるためには,臨床的状況をも踏まえてその価値が定量的に評価されることが望ましい.医療機器に関する知的財産の評価のレビューおよび意思決定プロセスを支援するために,本研究では3つの主要な項目(1特許,2事業実現可能性,および3社会的側面)から構成されていたスコア化評価ツールを開発した.これらについては有用性が得られる一方で,項目の一部には評価結果に偏る傾向が認められた.日本では医療における基礎研究・臨床については国際的にも高く評価されているにもかかわらず,研究成果の具現化である医療機器の製品化について国際的な競争力は米国に大きく後れをとっている.これは医療機器開発において,"医工連携"などによって基礎研究は進むものの研究成果を製品化へとつなぐしくみが良好に機能し難いことを示唆している.特に,研究成果から生じる知的財産については,現実には技術移転が困難なことが多く十分に活用されない状況も散見される,その原因として,既存の特許などの評価指標の定量化が困難で客観性を得難いこと,汎用的な評価指標であるため治験・薬事申請などを必要とする医療機器には適していないことが挙げられる,そこで本研究では,医療機器に特化した知的財産の定量的な評価指標を確立したうえで,その有用性を評価し,かつ妥当性を検証することを目的とした.平成24年度には,"医産連携"を促進させるための手法として,産学連携・知的財産に関する大学・研究機関・産業界の研究者・専門家らとの議論を参考に,研究成果として創出される知的財産を定量的かつ合目的に評価するための項目と手法を選定した.評価指標の主たる項目は,特許取得に関わる権利化への技術的可能性を考慮した特許性,製品化への可能性を考慮した事業性,オーファンデバイスとしての価値や治療概念の新規創出にもつながるインパクトなどを考慮した社会性の3つで構成した.これらの主たる項目より下位には各々詳細な指標を設定し,特に社会性については,医療従事者からの観点,患者・介護者からの観点および社会全般的な観点を反映できるように配慮した,なお,実際に本指標がどの程度有効であるかについては,今後さらにその妥当性などを検証する,研究成果から生じる知的財産については,現実には技術移転の難しさなども伴って十分に活用されているとは言い難いのが現状である.その原因として,既存の特許などの評価指標が定量化されておらず客観性に欠けること,汎用的な評価指標であるため治験・薬事申請などを必要とする医療機器には適していないことなどが考えられる.本研究は,医療機器に特化した知的財産の定量的な評価指標を確立したうえで,その有用性を評価し,かつ妥当性を検証することを目的とした.この目的を達成するため,これまでに医療機器の開発に際して生じる特許など知的財産に関する定量的な評価指標を開発した.この評価指標は特許など権利化の可能性,特許が実施されて活用されるための事業性,および医療機器本来の役割である救命など社会的な価値を示す社会性を主たる項目とした.医療機器開発に携わる医療機関,大学,企業など様々な属性の組織が本指標を取り扱うことが想定されるが,事業性や社会性など各々の組織によって重視する観点は異なると考えられるため,評価指標の開発においては組織ごとに“おもみづけ"できるようにも考慮した.平成25年度には,前年度に整理した医療機器についての評価指標に基づいて,研究代表者らの所属する機関内において創出された発明の評価に着手した.これには,同機関での発明の着想から権利化への過程において,権利化の可能性,事業性,社会性を評価する運用プロセスにも本指標が導入された.これらのことによって,指標として謳われるだけでなく,実地に意思決定を支援するシステムとしての機能も作動させることとなった.研究成果から生じる知的財産については,現実には技術移転の難しさなども伴って十分に活用することが難しい状況にある.その原因として,特許などの既存の評価指標は定量化が困難で主観に依存する傾向があること,医療に限定されない汎用的な評価指標であるため治験・薬事申請などを必要とする医療機器には適していないことなどが考えられる.本研究では,医療機器に特化した知的財産の定量的な評価指標を確立したうえで,その有用性を評価し,かつ妥当性を検証することを目的とした.この目的を達成するため,これまでに医療機器の開発に際して生じる特許など知的財産に関する定量的な評価指標を開発した.この評価指標は,特許など権利化の可能性,特許が実施されて活用されるための事業性,および医療機器としての社会的な価値を示す社会性の3つを主たる項目として全18項目を定めた.

平成26年度には,国内の大学・国立高度専門医療研究センターなどに所属する者が発明者となりアカデミアが出願人(企業を含まない)となっている公開特許情報を対象として,医療機器に関する出願をランダムに26件抽出し,当該指標に基づいて評価・解析した.権利化の可能性における新規性,事業性における製品化に至るまでのプロセス上の現在段階,社会性における機器の有用性などの項目は出願案件ごとのバラツキが大きく特徴が現れ易い一方で,事業性における市場性,社会性におけるオーファン性や環境への配慮などの項目は出願案件ごとの差異が認められ難い傾向が示唆された.26年度が最終年度であるため、記入しない。医療社会学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度について,当初の計画どおりに指標について選定できたため,その達成度はおおむね順調に進展しているものと考えられる.平成25年度について,当初の計画どおりに当研究センターにおけるこれまでの知的財産などからモデルケースとなる適切な事例を抽出し,本研究による評価指標の有用性と妥当性の検討を開始できたため,その達成度はおおむね順調に進展しているものと考えられる.26年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,当研究センターにおけるこれまでの知的財産などからモデルケースとなる適切な事例を抽出し,本研究による評価指標の有用性と妥当性の検討を開始する.なお,モデルケースとなる事例に係る秘密の保持については,充分に留意しつつ遂行する。今後は,当研究センター以外にも,外部機関との連携の可能性を探りつつ本研究による評価指標の有用性と妥当性の検討を行い,その成果をまとめる.26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は外部のリソースへの支出を抑えるなど当初の予定よりも効率的に研究を進捗させることができだ平成25年度は評価指標の有用性や妥当性を検討するにあたって旅費など弾力的に支出する計画である.当該年度は所属機関の発明から権利化へのプロセスにどう評価指標を実装する取り組みも実施しており,同研究内容においては想定していたより物品等に予算を供しなかったことに因る.知的財産に関する広く公開された情報を活用して本指標の妥当性と有効性を検証する計画であり,そのための役務などにも経費を供する可能性がある.
アルカンから第一級アルコールを高選択的に生成する酵素触媒の創生

本研究では、常温常圧での直鎖アルカン酸化反応において炭素鎖末端へ位置選択的にヒドロキシル基を導入することで、選択的に第一級アルコールを合成する酵素触媒の創製をめざす。平成30年度は、平成29年度において直鎖オクタンから1-オクタノールを選択的に得られる酵素について、異なるアミノ酸側鎖置換の酵素を調製し、直鎖オクタンからオクタノール位置異性体への生成速度に及ぼすアミノ酸側鎖置換の影響を調べた。その結果、標的とした2箇所のアミノ酸側鎖(アラニン328、アラニン82)は、アルコール位置異性体への選択性に強く影響を及ぼすことがわかった。また、直鎖オクタン酸化反応において目的とする第一級アルコールである1-オクタノールが選択率21%で得られるためには、アラニン328とアラニン82の両側鎖をトリプトファンに置換する必要があることが明らかになった。一方、選択率21%で直鎖オクタンから1-オクタノールを生成する酵素について、アラニン82とアラニン328に導入したトリプトファン側鎖が酵素基質結合部位への直鎖オクタンの結合状態に及ぼす影響を明らかにするため、Autodockによるドッキングシミュレーションを行った。その結果、導入したトリプトファンのインドール環およびフェニルアラニン87の芳香環が直鎖オクタンと相互作用することで、直鎖オクタン末端炭素がヘム鉄へ近接する結合状態を安定化していることがわかった。この安定化が1-オクタノールへの高い選択性発現の一因であることを示唆している。同時に、1-オクタノールを選択的に得られる酵素において、アラニン82とアラニン328に導入したトリプトファン側鎖が酵素基質結合部位への直鎖オクタンの結合状態に及ぼす影響を明らかにするため、Autodockによるドッキングシミュレーションを行った。シミュレーション時間とデータ解析に時間を要したため、当初予定していたシミュレーション結果に基づいた新たな酵素調製には至らなかった。平成30年度におけるドッキングシミュレーションによって、目的とする第一級アルコールである1-オクタノールを直鎖オクタンから選択的に生成するために寄与する酵素反応場因子の知見が得られた。この知見、および平成30年度に確立したシミュレーション手法を駆使して、本年度は酵素の触媒活性点近傍の構造を計算科学的にシミュレートし、より高い選択性と生成速度で1-オクタノールが生成する酵素の創生を推進する。平成29年度は、炭素数58の直鎖アルカン(ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン)から第一級アルコールを合成することを目的とした。そのため、複数の芳香族アミノ酸側鎖を触媒部位近傍に導入したシトクロムP450BM-3を調製し、炭素数58の直鎖アルカン酸化反応を行い、アルコール生成速度およびアルコール位置異性体への選択性を調べた。触媒近傍二箇所のアミノ酸側鎖アラニン(アラニン328、アラニン82)をトリプトファンやフェニルアラニンに置換した酵素を合成し、活性を保持した状態で精製することに成功した。シトクロムP450BM-3およびアミノ酸側鎖置換した酵素を用いて炭素数58のアルカン酸化反応を行った結果、炭素数58の直鎖アルカン酸化反応において、シトクロムP450BM-3のアルコール位置異性体への選択性と比べて、アミノ酸側鎖置換した酵素ではその選択性が多様に変化した。すなわち、標的とした2箇所のアミノ酸側鎖(アラニン328、アラニン82)は、アルコール位置異性体への選択性に強く影響を及ぼすことがわかった。また、アラニン328とアラニン82の両側鎖をトリプトファンに置換した酵素では、直鎖オクタン酸化反応において目的とする第一級アルコールである1-オクタノールが選択率21%で得られることが明らかになった。酵素の合成系の構築と酵素精製の最適条件の検討に時間を要したため、目標とした数の酵素反応を実施できなかったものの、直鎖オクタン酸化反応において第一級アルコールを生成する酵素が得られており、概ね順調に研究が進んでいる。

その結果、導入したトリプトファンのインドール環およびフェニルアラニン87の芳香環が直鎖オクタンと相互作用することで、直鎖オクタン末端炭素がヘム鉄へ近接する結合状態を安定化していることがわかった。この安定化が1-オクタノールへの高い選択性発現の一因であることを示唆している。平成30年度は、平成29年度において直鎖オクタンから1-オクタノールを選択的に得られる酵素について、異なるアミノ酸側鎖置換の酵素を調製し、直鎖オクタンからオクタノール位置異性体への生成速度に及ぼすアミノ酸側鎖置換の影響を調べた。同時に、1-オクタノールを選択的に得られる酵素において、アラニン82とアラニン328に導入したトリプトファン側鎖が酵素基質結合部位への直鎖オクタンの結合状態に及ぼす影響を明らかにするため、Autodockによるドッキングシミュレーションを行った。シミュレーション時間とデータ解析に時間を要したため、当初予定していたシミュレーション結果に基づいた新たな酵素調製には至らなかった。平成29年度において目的とする第一級アルコールである1-オクタノールを直鎖オクタンから生成する酵素が得られている。本年度は、この酵素の触媒活性点近傍の構造を計算科学的にシミュレートし、1-オクタノールが生成する機構について推測することで、直鎖オクタン以外のアルカン酸化反応において第一級アルコールが生成する酵素に必要となるアミノ酸側鎖置換部位を明らかにすることで、研究を推進する。平成30年度におけるドッキングシミュレーションによって、目的とする第一級アルコールである1-オクタノールを直鎖オクタンから選択的に生成するために寄与する酵素反応場因子の知見が得られた。この知見、および平成30年度に確立したシミュレーション手法を駆使して、本年度は酵素の触媒活性点近傍の構造を計算科学的にシミュレートし、より高い選択性と生成速度で1-オクタノールが生成する酵素の創生を推進する。酵素調製、特に酵素精製の最適条件の検討に時間を要したため、目標とした数の酵素反応を実施できなかった。平成29年度において最適条件を見出すことができたため、今年度以降は酵素調製を推進することができる。この酵素調製に必要となる試薬・器具の購入に未使用額を充てることとする。平成30年度は主にドッキングシミュレーションに注力したため、酵素調製には至らず、試薬等消耗品使用が予定より少なかったため、次年度使用額が生じた。この未使用額は、今年度に必要となる酵素調製に必要な試薬・器具の購入に充てる。
老人訪問看護の質評価指標の開発:ベストプラクティスに基づく評価項目策定及び標準化

本研究では、一般的な訪問看護において全ての訪問看護師に期待する実践内容を「質指標(quality indicators)」とし、高齢者訪問看護質指標の開発に取り組んだ。まず、指標の対象となる領域を設定した。今回は、高齢者に対する訪問看護に頻発する問題や、訪問看護の利用によって療養状況の改善が見込まれる問題、今後訪問看護における重要性が増すと思われる問題を中心に、16の問題領域をとりあげることにした。個々の研究者がそれぞれ担当領域を決め、その領域に関する指標の作成に責任を持つことになった。指標の作成過程は、それぞれの研究者により若干異なる。しかし、作成にあたって利用すべき基本的な情報を、(1)文献と(2)その間題領域のエキスパートが持つ実践知、と定めた。この結果、16領域に関ずる483指標が作成された。次段階として、質指標の訪問看護現場への適用可能性を検討するために全国調査を実施した。1.で作成された指標に対して、全国の訪問看護ステーション5,322ヶ所に働く訪問看護師に回答を依頼した。この結果を基にして、指標を最終決定した。最後に、家族支援と褥瘡ケア質指標を選び、自記式の質問に対する訪問看護師の回答と実際の実践内容がどの程度対応するかを検討するために、C県において調査を実施した。始めに県内の全ステーションに家族支援質評価指標を送付し、回答の平均値の高かったステーション1件と低かったステーション1件を選んで、質指標への回答と看護記録から把握できる実践内容との対応を検討した。家族支援は看護記録と看護師の質評価への回答との対応があまりみられなかった一方で、褥瘡ケア質指標には対応が見られた。家族の介護負担感等及び褥瘡の発生率と看護師の質評価への回答には関連が確認できず、看護師による回答平均点により実践内容の質をそのまま推測することは困難と思われた。本研究では、高齢の在宅療養者に典型的に見られる問題に対する「最善の看護」(ベストプラクティス)を具体的に定義し、それを基に訪問看護サービスの質を評価する指標を開発・標準化することを目的とした。初年度はベストプラクティスを定義し、それに照らして実践の質を評価するための設問を策定した。今回は以下のような問題領域を対象とした:排尿・栄養・嚥下障害・褥創およびスキンケア・転倒防止・糖尿病・認知症・家族支援・清潔・睡眠障害。これらの領域における適切な看護ケアについて、国内外の看護・医学・福祉系文献(教科書・マニュアル・研究論文)を検索およびレビューし、訪問看護でのベストプラクティスとそれに基づく質評価のための設問を作った。日本の訪問看護の現状においては、適切なケア方法に関する十分な実証データが得られない領域も多いため、文献検討の際には、教科書に記述されるこれまでの典型的な介入方法、個別例の経験に基づく意見(総説)も採用した。文献検討にもとづく設問の策定に続き、作成されたたたき台を該当領域の看護研究者・訪問看護実務のエクスパートに供して内容を検討、適宜修正した。エクスパートによる検討は、まず問題の領域ごとに3-5名に依頼し、訪問看護で一般的に看護師が実践するという条件でのベストプラクティスについて討議した。問題領域により1回から数回のエクスパート会議を実施した。さらに、全ての領域を統合し、訪問看護のエクスパート7名によるパネルを形成して、ベストプラクティスとそれにもとづく評価項目案を最終的に決定した。

この検討の途中で、褥創およびスキンケアは褥創ケア及びスキンケアに分離し、清潔ケアは、清潔ケア・口腔ケア・感染防止の3領域に分離した。計13領域に対して、各30-40項目の質評価指標が策定された。次年度はこの指標を用いて全国実態調査を実施する予定である。本研究では、高齢の在宅療養者に典型的に見られる問題に対する「最善の看護」(ベストプラクティス)を具体的に定義し、それを基に訪問看護サービスの質を評価する指標を開発・標準化することを目的とした。2年目の本年度は、昨年度の検討で必要性が明らかになった領域の検討を追加し、質評価項目を用いて、全国の訪問看護ステーションを対象とした看護実践内容の調査を実施した。今年度追加された領域は以下のようなものである:排便ケア・慢性疼痛ケア・運動機能の維持/回復・終末期ケア。これらの領域における適切な看護ケアについて、国内外の文献をレビューし、訪問看護でのベストプラクティスとそれに基づく質評価のための設問を作った。文献検討の際には、教科書に記述されるこれまでの典型的な介入方法、個別例の経験に基づく意見(総説)も採用した。文献検討にもとづく設問の策定に続き、作成されたたたき台を該当領域の看護研究者・訪問看護実務のエクスパートに供して内容を検討、適宜修正した。エクスパートによる検討は、問題の領域ごとに3-5名に依頼し、訪問看護で一般的に看護師が実践するという条件でのベストプラクティスについて討議した。問題領域により1回から数回のエクスパート会議を実施した。以上により作成された16領域の質評価指標を全国5322件の訪問看護ステーションに4領域分ずつ配布し、日ごろの看護実践で実施されている内容がどの程度であるかを検討した。回収総数は1579施設(29.7%)であり、領域によりばらつくが、有効回答率は21.2%から29.8%であった。領域ごとの得点は、100点満点換算で71.5から90.3の範囲であり、設定された質評価項目の実施率(自記式の回答による)が7割から9割であることが示された。来年度は、作成された質評価指標の有効性評価する予定である。本年度は、質評価指標の妥当性を評価した。まず、家族支援質評価指標にっいて、C県内の全ての訪問看護ステーション194件に計970通の調査票を送付し、60件の255名から回答を得た。その結果を元に、家族支援質評価指標得点の高いステーションと低いステーション各1件を対象として、看護記録調査を実施した。また、介護者家族への質問紙調査も同時に実施した。なお、看護記録調査では褥瘡ケア・スキンケア指標の内容も検討した。看護記録への調査では、質評価指標の内容を示すと思われる記録の内容を定義し、そのような内容が一定の期間内に記録内に存在した場合には「1」、しない場合には「0」を与え、指標の内容を示す記録がどの程度存在するかを指標ごとの「記載率」として算出した。
数理物理学に現れる偏微分方程式の解の研究

1.常微分方程式に、周期外力が働くと、解は色々複雑な挙動を示す。外力のパラメーターに応じて、外力と同じ周期の解が複数個存在したり外力周期の整数倍の周期をもつ解が複数個存在したり、あるいは、カオス的な振舞いをしたりすることが、計算機シミュレーションでは見られていたが、その厳密な証明はなかった。本研究ではこの計算機による数値計算を精密に調べ、区間演算による正確な誤差評価を行うと共に、基本解の評価も計算機による数値計算と誤差解析を併用して、外力と同じあるいは整数倍の周期を持つ複数個の周期解の存在証明を初めて厳密に行った。外力パラメーターが非常に大きい時には、誤差評価等が、まだ不足しており今後の課題である。この計算機を用いた証明法は、これからの微分方程式の解の構造を調べ、解析的証明を与える新しい有効な一つの方向を示している。文献〔1〕。その際計算機による区間演算のソフトが必要であるが、IBMのACRITHソフト以外、日本のコンピューターで動く良質のものがなく、今後作成され利用されるべき重要なソフトの一つである。2.粘性気体に周期的ピストン運動が加わる時の気体の運動を研究した等温気体の場合には、ピストンと同じ周期を持つ運動が存在することが証明できた。1の常微分方程式系の場合と異なり、非線形偏微分方程式系の問題であり、その解の安定性や、複数個の周期解の存在等、今後解析さるべき多くの問題がある。更にポリトロピック気体の場合にはピストンと同じあるいは整数倍の周期を持った周期解が存在しないことが証明できた。これは、解が必然的にカオティックであるか爆発するかを示すものであり、その解析は今後の興味深い課題である。文献〔3〕3.斜面上を流れる自由表面を持った流体運動の基礎的解析を行った。文献〔4〕1.常微分方程式に、周期外力が働くと、解は色々複雑な挙動を示す。文献〔1〕。文献〔4〕
加工食品中の特定原材料の検出に適した遺伝子検査法の開発

加工食品中の特定原材料の遺伝子検査で問題となるDNAの劣化に対して、その劣化過程とPCR検出率との関係および劣化DNAの検出法と試料調製法を検討した。λDNAを用いた基礎検討で高温高圧負荷によるDNA劣化がポアソン過程に従うことが分かり、劣化DNAとPCR検出率の関係式が得られた。劣化DNAの検出率は人工核酸の導入によるPCR増幅サイズの縮小化で改善した。検出感度や実際の試料への応用などの課題もあるがDNA断片から元の配列を復元する方法で約20塩基を検出できた。シリカ膜スピンカラムのDNA抽出の改良法は、劣化DNAを簡便な操作で大量に回収でき、そのPCR検出率は他の抽出法と同等であった。本研究の目的は加工食品中の特定原材料の検出に適した遺伝子検査法の開発である。今年度は、1PCRによる食品中の原材料の検出が加工処理で低下する要因を解明するためのPCR増幅領域の長さと劣化DNAの検出率の関係の解析、2劣化DNAを検出するための新規遺伝子検出法の開発について検討した。今回は基礎的な検討に焦点を絞ったため、食品のゲノムDNAではなく、塩基配列が適度な長さで品質が安定しているλDNAを試料に用いた。1では、λDNAに対して人工塩基を含んだ8塩基のプローブと17塩基のプライマーを用いて増幅領域45506 bpの間で11種類のPCR条件を作成した。λDNA水溶液をオートクレーブで105°Cにて390分間処理して劣化DNA試料を調製し、定量PCRで解析した。その結果からDNA試料への処理時間及びPCR増幅サイズと検出率の対数との間にそれぞれ負の直線関係が成立し、処理時間とPCR増幅サイズの増加に伴いPCRによる検出率が低下することが確認された。またその傾きからPCR増幅サイズが大きいほど単位負荷時間当たりの検出率が低下することが明らかになった。2では、λDNAの中の420塩基の配列でdTの代わりにdUを組込んだDNAを合成した。その配列の中の17塩基のDNAを合成し劣化DNAと見立て、その合成DNAと混合した。その17塩基のDNAを起点にポリメラーゼで複製反応した後、ウラシルーNーグリコシラーゼを加えてdUを含んだ合成DNAを分解した。この反応液の一部を取って複製した配列を定量PCRで測定した。その結果、複製の起点となるDNAの添加量が多いほどCt値が低くなった。更に105°C90分で処理したλDNAが複製の起点となるかを検討したところ、水の対照群よりも約5サイクル低いCt値が得られた。従って、本方法で劣化DNAから復元した配列を定量PCRで検出できることが確認できた。本研究では加工食品中の特定原材料の検出に適した遺伝子検査法の開発を目的とし、食品の加工処理で劣化したDNAの検出に焦点をあて、(1)PCR増幅サイズと劣化DNAの検出率の関係、(2)劣化DNAの検出法、(3)劣化DNAの抽出法について検討した。検討(1)は食品のDNAではなく品質が安定したλDNAで基礎的な解析を行った。λDNAに対して増幅サイズ45506bpの間で11種類のPCR条件を作成し、105°Cで390分間及び105115°Cで15分間処理して調製した劣化λDNA試料を定量PCRで測定した。検出率は処理時間とPCR増幅サイズの増加に伴い低下し、処理時間及びPCR増幅サイズと検出率の対数との間に負の直線関係が成立した。その傾きからPCR増幅サイズの大きさが単位負荷時間当たりの検出率を低下させることが示唆された。また、負荷温度及びPCR増幅サイズと検出率の対数でも同様の関係が得られた。これらの直線関係から増幅サイズが異なる2つの定量PCRで得られた値により未劣化に相当するDNA量が算出できると考えられた。検討(2)では(1)で得られた式から増幅サイズの縮小化に伴う検出率改善効果が予測できると考えられた。また、人工塩基で増幅領域を縮小した45 bpのPCRは劣化DNAの検出率を高め、ピーナッツDNA検出でも劣化試料の検出率を改善できた。更に、λDNA中の90 bpの配列でdTの代わりにdUを組込んだ復元プローブを用いることで、20 bp程度のDNA断片が検出できた。この方法をピーナッツの遺伝子配列に適用した場合も検出が確認された。検討(3)はラット肝臓試料を用いた基礎検討であるが、アルカリSDS法とシリカ膜のスピンカラム法を組み合わせた簡便なDNA抽出法においてグアニジンを高濃度にすることで劣化DNAの回収量を増やすことができた。これらの劣化DNAに関する新しい知見は、加工食品の遺伝子検査での検出率低下を解決する上で有用と思われる。

医歯薬学今年度は、代表的な加工処理の一つである高温高圧処理によるDNAの劣化とPCRの検出率との関係を検討し、DNAの処理時間及びPCR増幅サイズと検出率の対数との間に負の直線関係があること、処理時間とPCR増幅サイズの増加に伴いPCRでの検出率が低下することを明らかにした。この結果を用いることで、PCR検査に用いるプライマーの増幅領域の長さからDNA試料の劣化に伴う検出率低下の程度を予測するという目的を達成することができた。また、人工塩基を用いることで作成することができた増幅領域45塩基のPCR条件は、例えば105°C30分で処理したDNA試料に対して一般的なPCR検査で用いられる増幅領域100塩基程度のPCRに比べてその検出は約55倍高く、劣化したDNA試料の検査に有用であることも確認できた。更に、極度に劣化したDNA試料から元の配列を復元して検出する方法を開発し、その方法によって105°C90分処理したDNA試料の検出を高めることができた。従って、加工処理によるDNAの劣化の解析や劣化DNAの検出に関わる技術の開発については、当初の計画をある程度達成できた。一方、当初の計画では、食品、特に特定原材料である落花生のゲノムDNAを試料に用いて行う予定であった。しかし、全長が極めて長いゲノムDNAは試料として品質の安定を確保することが難しいため、今回は全長が適度な長さのλDNAを試料として用いて基礎的な検討を行った。従って、今回の研究では、食品の遺伝子検査に対して、有用な情報や技術を間接的にしか提供できなかった。また、劣化DNAから配列を復元して検出する方法は開発できたが、その特異性、検出感度、操作性などについては更なる検討が必要であった。今年度の研究ではλDNAを試料に用いて、DNAの劣化の解析や劣化DNAの検出法の開発について基礎的な検討を行うことができた。次年度はそれらの知見や技術を活かして、特定原材料である落花生のゲノムDNAを試料とし、その劣化の解析やDNA検出法の開発を効率良く進める。更に、それらの結果から加工処理によるDNAの劣化の程度を表す数式もしくは変換表を作成し、それを使うことで未加工処理DNA相当量が算出できるようにする。また、開発した劣化DNAの検出技術を活かすために、食品からの劣化DNAの抽出に適したDNA抽出法もしくはPCR阻害物質抑制試薬を用いたPCR試料調製法について検討する。近年、我々はシリカ膜を利用したスピンカラムによるDNA抽出において、カラムにDNAを吸着させる際の溶液のカオトロピック塩濃度の違いによって、劣化DNAの回収量に差が生じることを見出しており、この知見も応用する予定である。これらの検討を通して、加工食品中の特定原材料の検出に適した遺伝子検査法の開発を目指す。一方、今年度、λDNAで行ったDNAの劣化の解析や劣化DNAの検出に関する基礎的な検討についても継続する。今年度検討できなかった他の加熱加圧条件、pHの変化、酵素添加などによるDNAの劣化の解析、今年度開発した劣化DNAから配列を復元して検出する方法の特異性、検出感度、操作性の改善についての検討など、詳細かつ幅広く検討を進める予定である。それらから得られた結果も落花生のDNA試料を用いた検討に随時反映していく。
発がんイニシエーション過程におけるTGF-βの役割

申請者は、発がんのイニシエーションの起こりやすさを規定する生体内因子の解明を目的として本研究を始めた。これまでに得られた知見より、TGF・βがNrf2の活性を抑制することで、発がんのイニシーションが起こる頻度を上昇させているのではないかという仮説を立てた。TGF-βがNrf2の活性を抑制する分子メカニズムの解明を行う過程で、MafKがTGF-βの標的遺伝子であることを発見した。MafKは小Maf群転写因子に属し、Nrf2のパートナー分子である。マウス乳腺上皮細胞NMuMGを用いて樹立したMafK安定発現細胞では、予想外なことに浮遊培養におけるSphere形成の亢進、免疫不全マウスでの腫瘍形成、さらに上皮間葉転換EMTを誘導し腫瘍の浸潤・転移にも寄与していることが明らかになった。MafKがこれらの現象をどのように制御しているのかをさらに検討するため、MafKにより発現が変動する遺伝子の網羅的解析を行った。発現が亢進していた遺伝子のいくつかに対するsiRNAを用いて、発現を低下させた際のSphere形成について検討した。その結果、膜タンパク質であるGpnmbをノックダウンすることにより、Sphere形成が有意に抑制されることが明らかになった。NMuMG細胞にGpnmbを安定的に発現させた細胞株を樹立し、Sphere形成、腫瘍形成、EMT誘導について検討した。Gpnmb単独でもこれらを誘導することが明らかとなり、MafKによって発現が上昇するGpnmbが、がん幹細胞機能の獲得、EMT誘導に寄与しているという新たな知見を得ることができた。(抄録なし)申請者は、発がんのイニシエーションの起こりやすさを規定する生体内因子の解明を目的として本研究を行った。これまでにTGF-βがNrf2の活性を抑制することで、発がんのイニシエーションが起こる頻度を上昇させているのではないかという仮説を立てた。MafKは小Maf群転写因子に属し、ホモ2量体またはNrf2と複合体形成を形成して、化学発がん剤解毒酵素、抗酸化タンパクなどの標的遺伝子の転写活性を制御することが知られている。そこでマウス乳腺上皮NMuMG細胞を用いてMafK安定発現細胞を樹立した。予想外なことに、MafK発現細胞では浮遊培養におけるSphere形成が亢進し、免疫不全マウスでの腫瘍形成も促進していた。このことより、MafKが、がん幹細胞機能の獲得に寄与することが明らかになった。近年、上皮間葉転換(EMT)を起こした細胞が幹細胞・がん幹細胞様の性質を獲得しているという報告がある。そこでMafK発現細胞でのEMTマーカーの発現を検討したところ、上皮マーカーE-cadherin、Occludinの発現低下、および間葉系マーカーN-cadherin、Fibronectinの発現亢進が見られた。さらにMafKはE-cadherinプロモーターに結合し、その転写活性を抑制することを見出した。MafKが腫瘍形成能やEMTを促進するという報告は今までになく、MafKが、がん幹細胞機能の獲得とEMT誘導に寄与しているという全く新たな知見を得ることができた。これまでに得られた知見より、TGF-βがNrf2の活性を抑制することで、発がんのイニシーションが起こる頻度を上昇させているのではないかという仮説を立てた。TGF・βがNrf2の活性を抑制する分子メカニズムの解明を行う過程で、MafKがTGF-βの標的遺伝子であることを発見した。マウス乳腺上皮細胞NMuMGを用いて樹立したMafK安定発現細胞では、予想外なことに浮遊培養におけるSphere形成の亢進、免疫不全マウスでの腫瘍形成が促進していた。さらにマウスの皮下にできた腫瘍の組織学的解析を行ったところ、腫瘍細胞が皮下組織まで浸潤しており、悪性度の高い腫瘍を形成していることが判明した。このことより、MafKががん幹細胞機能の獲得に寄与することが明らかになった。そこでMafK発現細胞でのEMTマーカーの発現を検討したところ、上皮マーカーの発現低下、および間葉系マーカーの発現亢進が見られた。MafKが腫瘍形成能やEMTを促進するという報告は今までになく、MafKががん幹細胞機能の獲得、EMT誘導に寄与しているという全く新たな知見を得ることができた。MafKがこれらの現象をどのように制御しているのがさらに検討するためにMafKにより発現が変動する遺伝子の網羅的解析を行い、腫瘍形成能獲得に寄与していると考えられる遺伝子を同定することができた。

MafKは小Maf群転写因子に属し、Nrf2のパートナー分子である。マウス乳腺上皮細胞NMuMGを用いて樹立したMafK安定発現細胞では、予想外なことに浮遊培養におけるSphere形成の亢進、免疫不全マウスでの腫瘍形成、さらに上皮間葉転換EMTを誘導し腫瘍の浸潤・転移にも寄与していることが明らかになった。MafKがこれらの現象をどのように制御しているのかをさらに検討するため、MafKにより発現が変動する遺伝子の網羅的解析を行った。発現が亢進していた遺伝子のいくつかに対するsiRNAを用いて、発現を低下させた際のSphere形成について検討した。その結果、膜タンパク質であるGpnmbをノックダウンすることにより、Sphere形成が有意に抑制されることが明らかになった。NMuMG細胞にGpnmbを安定的に発現させた細胞株を樹立し、Sphere形成、腫瘍形成、EMT誘導について検討した。Gpnmb単独でもこれらを誘導することが明らかとなり、MafKによって発現が上昇するGpnmbが、がん幹細胞機能の獲得、EMT誘導に寄与しているという新たな知見を得ることができた。TGF-βの標的遺伝子であるMafKが腫瘍形成を促進するという新たな知見を得ることができた。今後その詳細な分子メカニズムを解明することで、発がんやがんの進展を防ぐ研究の糸口になると期待できる。さらにMafKの標的遺伝子のうち腫瘍形成能獲得に寄与している遺伝子を同定することができ、今後詳細な分子メカニズムの解明につながるものと思われる。これによって発がんやがんの進展を防ぐ糸口になるものと期待する。今後は、MafKが浮遊培養におけるSphere形成や、腫瘍形成を促進する分子メカニズムについて詳細に検討する。マイクロアレイを用いてMafKによって発現が変動する遺伝子の網羅的解析は行ったので、その結果をもとにMafKによる腫瘍形成促進、EMT誘導に関わる遺伝子について検討する。またMafKの発現が亢進しているがん細胞でMafKをノックダウンした際の腫瘍形成能についても検討する。また他の小Maf群転写因子(MafF,MafG)のTGF-β応答性、腫瘍形成への影響についても検討する。MafKにより発現が変動する遺伝子の中から、腫瘍形成能獲得に寄与している遺伝子を同定できたので、今後は、その遺伝子がMafKによる腫瘍形成、EMT誘導にどれほど寄与しているのかについて詳しく調べる。またその遺伝子単独でのSphere形成、腫瘍形成、EMT誘導、TGF-β応答性についても検討する。(抄録なし)
エキゾチック反応を使ったテンソル偏極度計と新しいスピン励起状態の研究

スピンおよび荷電スピンに関して選択的な反応による原子核の応答を調べることは、核内における相互作用の複雑な振舞いを理解するために重要である。荷電スカラー型スピン励起については、選択的にそのような状態を励起する手段(プローブ)がなくほとんど知られていない。これに対し、(d,d')反応のテンソル偏極分析能およびテンソル偏極移行係数を測定すれば荷電スカラー型スピン励起状態を選択することが可能なことが指摘されている。しかしながら、これらの偏極量測定は実験的に難しく、殆ど測定されたことがない。これは偏極度の分析に使用することができる様な、大きなテンソル偏極分析能を持つ適当な反応が知られていなかったことに起因している。本研究の目的は、大きなテンソル偏極分析能を持つ、エキゾチックな1H(d,2He)n反応を利用して、高効率テンソル偏極度計のプロトタイプを設計製作し、荷電スカラー型スピン集団運動状態を調べることである。2Heは非束縛粒子であり、極短時間で二陽子に崩壊する。その二陽子は、約0.7Mevをピークとする相対エネルギー分布を持っており、実験室系では小さな相対角度(数度程度)を持って放出される。このような二陽子を測定するために、6.5x6.5x220cm^3のプラスチックシンチレータを密着して組み上げ、高計数率に耐え、且つ高エネルギー(d,d')反応においても使用可能な高効率テンソル偏極度計を設計製作した。現在オフラインテストを行っている。同時に実効偏極分解能のモンテカルロシムレーションを行い配置の最適化を行っている。3月に理化学研究所のサイクロトロンのビームを使い実験を開始し、荷電スカラー型スピン励起状態を調べる予定である。
世界遺産候補「百舌鳥・古市古墳群」の天皇陵古墳の意味をめぐる葛藤

大阪府の百舌鳥・古市古墳群は、早ければ2019年にもユネスコにより世界文化遺産に登録される見込みである。ただし同古墳群には、仁徳天皇陵や応神天皇陵など6基の天皇陵古墳が含まれている。これらは現在、皇室の祖先の墓として宮内庁が管理し、祭祀が行われている。本研究は、これら6基の天皇陵古墳を対象として、これらに付与された意味を、それに関わる人々の言説や行動の分析を通して明らかにする。
新しいオピオイドペプチドの細胞固体レベルでの機能解析に基づく分子設計

炎症や組織損傷に伴う慢性痛は熱などの侵害性刺激に対する感受性が亢進する痛覚過敏反応と触覚刺激などの非侵害性刺激により誘発される痛覚(アロディニア)に分類され、脊髄後角が痛覚伝達に関わる重要な部位である。脳内オピオイド受容体は薬理学的にμ,κ,δの3種類に分類され、痛覚・記憶・内分泌・自律神経性運動調節をはじめとする多彩かつ重要な中枢作用を示す。最近、上記の3つの古典的オピオイド受容体に加えて、第4のオピオイド様受容体が存在することが明らかとなった。我々は、1)その内因性物質としてウシ脳より17個のアミノ酸から成るペプチドを単離・同定し、本ペプチドがラット、ブタ脳から精製されたノシセプチン(=オ-ファニンFQ)と同じアミノ酸配列を持つこと、2)髄腔内投与したノシセプチンが痛覚過敏反応とアロディニアを誘発させること、3)上位中枢だけでなく、脊髄後角の神経細胞に発現していること、4)ノシセプチンによる痛覚反応が抑制性アミノ酸グリシンやプロスタグランンジンD2で抑制されることから、オピオイド系とプロスタグランジン系が密接に関連すること、5)ノシセプチンの前駆体には、さらにノシセプチンの痛覚反応を抑制する別の17個のアミノ酸から成るペプチド・ノシスタチンがコードされていること、6)その作用はC末端側の6個のアミノ酸が必須であることを明らかにした。以上の結果は、新規オピオイドペプチド・ノシセプチンの作用機序を解明するだけでなく、ノシスタチンの単離・同定は、非ペプチド性鎮痛薬の創薬につながることが期待される。
モデル選択のための情報量規準の漸近的性質

MallowsのCpと漸近バイアス補正版の通常及びリッジ回帰における漸近キュミュラント1.状況の把握:Mallows (1973)のCpは通常の線形単変量重回帰分析におけるモデル選択の規準のひとつで平均自乗誤差の推定量であるとともに、未来のデータとの乖離の期待値の推定量にも対応する。回帰分析におけるモデル選択の主な問題は適切な説明変数を選ぶことである。候補の全ての説明変数の中に正しいモデルがあることを前提とし、候補のモデルが正しい説明変数群を含む場合(not underfitted)、Cpは赤池情報量規準(AIC)と同等であることが知られている。Cpのバイアスはモデル選択の規準におけるウェイトをナイーブに推定していることに起因するためこれを改善した。2.主な成果:一般性のために基準変数が複数ある場合の重回帰分析すなわち多変量重回帰分析を扱った。リッジ多変量重回帰分析でもバイアス補正をした統計量が得られている(Yanagihara & Satoh, 2010)。通常の回帰分析はリッジパラメータが0の場合であるので、その場合を含むリッジ多変量重回帰分析において、Cpを拡張した統計量の漸近キュミュラントを導出した。モデルがunderfittedの場合、非正規分布の下で漸近バイアスはO(1)の次数まで導出した。モデルがnot underfittedの場合は試行の結果から漸近バイアスはより高次に小さくなることが明らかになった。統計量の構成より、非正規分布の下でもこれらが成立することを示した。同様に後者の場合、Cpと正規下においてそれをバイアス修正した統計量に共通な漸近分散は分布に依存しないことを示した。このような非正規下での漸近的に頑健な結果は、非負のリッジパラメータにも依存しないことを明らかにした。関連する成果を4編の査読付き国際誌に発表した。また、同成果を1件の国際会議と5件の国内の学会大会で発表した。研究は順調に進展しているので、引き続き研究計画に則り研究を推進する。1.モデル選択のための情報量規準の漸近キュミュラントとその利用: AIC等の情報量規準については、最尤推定量やベイズ推定における事後モードを特別な場合として含む加重スコア法のパラメータの推定量を用いて、AIC等を評価することが有用であった。加重スコア推定量によるAIC等については、対数尤度(加重スコア)導関数を用いて1次の高次漸近キュミュラント等を導出した。AIC等のバイアス補正はパラメータの最尤推定量を用いる場合では、通常のAIC等を求めた後に事後的に一定の値を加えてバイアスを修正するものである。一方、加重スコア法の場合、高次の漸近バイアスがウェイトの関数であることから適当なウェイトを用いることにより、高次の漸近バイアスの出現を予防できた。とくに指数分布族の自然パラメータの場合は結果が簡単になった。2.因子分析(FA)・共分散構造分析における情報量規準と漸近バイアス:制約のないブロック対角行列のモデルを考えるとその漸近バイアスは正規性の下で既知の値で表される。それをFAモデルのパラメータ数と等値させることで漸近バイアスの近似値を得た。最小自乗規準に関しては未来のデータを用いた予測最小自乗(PLS)とPLSの現在と未来の2段階の期待値をとった期待予測最小自乗(EPLS)が定義した。加重最小自乗のEPLSの予測に関して、漸近バイアスを導出した。さらに任意の分布の下でも、TICにおけるバイアス補正と類似の方法でそれを導出した。FAにおいて広く受け入れられている適合指標であるRMSEA(root mean square error of approximation)及びAICよりも良い結果が得られる場合があった。関連する成果を3編の査読付き国際誌と4編の査読付き国内誌に発表できた。また、同成果を3件の国際会議と4件の国内の学会大会で発表した。

このような非正規下での漸近的に頑健な結果は、非負のリッジパラメータにも依存しないことを明らかにした。関連する成果を4編の査読付き国際誌に発表した。また、同成果を1件の国際会議と5件の国内の学会大会で発表した。研究は順調に進展しているので、引き続き研究計画に則り研究を推進する。前倒し請求を含め10万円単位で使用予定額を計画したため、10万円未満の残額が生じた。過年度の前倒し請求を含め10万円単位で使用予定額を計画したため、10万円未満の残額が生じた。
Wntシグナル抑制分子RNF43のがんへの関与

膜型ユビキチンリガーゼRNF43は、正常幹細胞や各種がん細胞で高発現することが報告されていた。しかしRNF43の機能とそのがん化に関与する分子メカニズムは不明であった。本研究において以下の解明を行い報告を行った[ Tsukiyama, MCB, 35:2007 (2015)]。1.RNF43はN末端側でFzdの発現調節を行い、Wnt/βcatenin, noncanonical Wntシグナルを抑制する。2.C末端側でDvlとの結合依存的にnoncanonical Wntシグナルを抑制する。3.がんにおけるRNF43のミスセンス変異がWnt/βcateninシグナルの過剰活性化を引き起こす。Wntは局所的なシグナル伝達に機能する細胞外分泌型糖タンパク質で、現在までに19種類のWntが古典的・非古典的Wntの2つのサブファミリーを形成している。これらのWntの多くは、初期発生、形態形成、出生後の個体恒常性の維持などに重要な役割を担っていることが知られている。特に古典的Wntシグナルの異常活性化と発がんの密接な関係は古くから知られており、その一例として家族性大腸がんにおけるβcateninの分解異常は、古くから研究されてきた。RNF43はさまざまなWnt受容体(ほとんどのFzと、共役受容体のLRPなど)の発現調節に関わることが報告されているが、RNF43がどのようにしてWnt受容体群を幅広く認識しているのかは、全く解明されていなかった。そこで我々は、まずWnt受容体であるFzdをRNF43がどのように認識しているのか、また古典的・非古典的Wntシグナルの両方の下流でエフェクターとして機能するDvlとの結合様式を免疫沈降法を用いて解明すると共に、これらの結合がWntシグナルを調節する上でどのような意味を持っているかを、培養細胞やカエル胚を用いた機能検討を行って来た。その結果、RNF43はその細胞外ドメイン(PAドメイン)でFzdのCRDと結合する事でFzdの分解を介したWntシグナルの調節を行っている事、またその細胞内ドメインにおいてDvlと結合して非古典的Wntシグナルの調節を行っているが、RNF43-Dvlの結合は古典的Wntシグナルの調節には関与していないこと、がんで同定されたRNF43の変異によりWntシグナルの恒常性維持機構が大きく崩れていることなどが明らかとなった。現在は、これらの得られた知見をまとめ、発表を行っているところである(論文投稿中)。RNF43は以前より大腸がんの患者において高発現している分子として報告されていたが、最近までそのがん化に関与する分子メカニズムは不明であった。しかし近年、RNF43とそのホモログであるZNRF3がR-spondinの非存在下においてWnt受容体であるfrizzled (Fzd)をユビキチン化することでエンドサイトーシスを引き起こし、細胞表面のFzd発現量を低下させることによりWnt/βcateninシグナルを抑制することが報告された。またRNF43がWntシグナル調節のコアファクターとして機能することに加え、大規模エクソーム解析により特に胆管がんや膵臓がん、大腸がん、胃がんにおいてRNF43の変異が高頻度に検出されたことから、遺伝子変異によるRNF43の機能異常ががん化において重要な役割を果たしていることが推測されていた。そこで平成26年度に申請者らは、がん患者の持つRNF43のミスセンス変異がWnt/βcateninシグナルのネガティブフィードバックループをポジティブフィードバックループへと変換し、Wnt/βcateninシグナルをR-spondin非依存的に増幅をすることが発がんの一端となっていることを国際学術誌に報告した[Tsukiyama, Mol Cell Biol, (2015), in press]。その報告の中で、申請者らはこれらのミスセンス変異がRNF43の細胞内局在に異常引き起こすことがWntシグナル調節異常の一因となっていること、RNF43はN末端側とC末端側で異なる機能を持つことをが明らかした。幹細胞特異的に発現するユビキチンリガーゼであるRNF43は、以前より大腸がんの患者において高発現している分子として報告されていた。しかし最近まで長らくそのがん化に関与する分子メカニズムは不明であった。そこで我々は本研究課題において、RNF43の細胞外ドメインがWnt受容体であるFzdを標的として認識し、分解を誘導することによりWnシグナルを抑制していること、RNF43の細胞内ドメインはFzdの分解とは独立して、Dvlとの結合を介してnoncanonical Wntシグナルだけを抑制する機能を持つことを明らかにした。また、がん患者のゲノム解析より同定されたRNF43の細胞外ドメインのミスセンス変異がRNF43の細胞内局在異常を引き起こすこと、その結果Wnt/βcateninシグナルだけがR-spondin非依存的に異常活性化することを報告した[Tsukiyama, Mol Cell Biol, 35:2007 (2015)]。そこで次に我々は、RNF43によるWntシグナル調節についてさらに詳細な解析を行った。その結果、RNF43は複数の翻訳後修飾を受けること、これらの修飾がRNF43のWntシグナルを調節機能に影響を与えることを見出した(全て未発表)。これらの結果を踏まえて、現在それぞれの翻訳後修飾を引き起こす細胞の状況を検討中であり、正常細胞やがん細胞が置かれた場所や状況によってどのようにRNF43がWntシグナル調節に関与しているのかを解明する材料を得ることができた。

本年度の研究で生み出された研究シーズは、平成28年度からの次期研究課題にて継続して研究し明らかにしていく計画である。膜型ユビキチンリガーゼRNF43は、正常幹細胞や各種がん細胞で高発現することが報告されていた。しかしRNF43の機能とそのがん化に関与する分子メカニズムは不明であった。本研究において以下の解明を行い報告を行った[ Tsukiyama, MCB, 35:2007 (2015)]。1.RNF43はN末端側でFzdの発現調節を行い、Wnt/βcatenin, noncanonical Wntシグナルを抑制する。2.C末端側でDvlとの結合依存的にnoncanonical Wntシグナルを抑制する。3.がんにおけるRNF43のミスセンス変異がWnt/βcateninシグナルの過剰活性化を引き起こす。平成26年度に計画していた、RNF43のミスセンス変異によるがん発症のメカニズムの解明については、平成25年度の研究により解明したRNF43の詳細な機能解析の結果と併せて、国際学術誌に発表を行った[Tsukiyama, Mol Cell Biol, (2015), in press]。さらに平成26年度以前の研究で計画されていた、RNF43の機能に必須な結合分子の解明についても、複数の結合分子を同定済みであり、現在その解析を行っているところである。また、遺伝子改変マウスの作製についても同様に、現在進行中であるため、研究計画は概ね順調に進行していると考えられる。腫瘍生物学そこで、平成27年度の研究では、RNF43の変異、切断、修飾がWntシグナル調節と細胞のがん化に及ぼす影響の検討を、培養細胞やカエルモデル系を用いて行う。加えて、以前申請者らが報告したRNF43によるp53の活性調節機構[Shinada, BBRC, (2011) 404:143]へRNF43の変異がどのように影響するかも明らかにし、RNF43の機能異常によるがん化過程をWntシグナル調節、p53の機能制御の両側面から解明する計画である。さらにRNF43のWntシグナルやp53依存的がん抑制機能に影響を及ぼす変異体を同定し、その変異を持つ遺伝子改変マウス(ノックアウト・ノックインマウス)の作製を行い、RNF43の変異によるがん化過程のより詳細な解明を進めて行く予定である。平成25年度の研究実施計画は1.RNF43とDvl2、Fzd5との結合様式の解明、2.RNF43の機能に必至な結合分子の同定、を予定していた。まず1.についての成果は、RNF43とFzdがそれぞれの細胞外ドメインを介して結合していることを明らかにした。この結合様式の解明は、Fzdと同じくCRDタンパク質の一つであるRspo1が、RNF43-Fzdの結合を解除しRNF43依存性のFzdの分解をキャンセルするメカニズムの理解を理解する上で大きく役立つものである。また、RNF43-Dvl2間の結合についても、RNF43の細胞内ドメインに結合していることは確認出来ていたが、詳細な結合部位までは同定できていなかった。そこで多数の欠失変異体を用いた免疫沈降実験を行い、その結合部位を10アミノ酸程度まで絞り込むことが出来た。また、RNF43-Dvlの結合と古典的Wnt