hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造血器腫瘍におけるr選択とK選択に関する研究

1.ヒトリンパ増殖性疾患モデルにおけるr選択とK選択の作用:Epstein-Barrウイルス(EBV)感染リンパ芽球様細胞株(LCL)にEBV-oriPを有するEBV-based vectorpMEEBを用いて各種リンパ腫関連遺伝子を電気穿孔法で導入した。hTERT発現plasmidは長期間の継代培養で失われず、優位性を獲得した。一方、c-mycとp53変異体などその他のリンパ関連遺伝子は優位性を獲得することができず、control vector同様に培養中から消失した。また、IgH CDRIIIのclonality解析や染色体分析から、EBV-LCL培養系ではclonal evolutionが早期に生じており、この実験系のクローン選択モデルとしての有用性が示唆された。2.造血器腫瘍における14-3-3σ遺伝子発現解析:129例の造血器腫瘍患者の臨床検体ならびに血液細胞株47株を用いてreal-time RT-PCR法で14-3-3σ遺伝子の発現を解析したところ、成熟リンパ系腫瘍において高発現例が多数存在することを見出した。ウエスタン解析ではmRNAレベルと同等の蛋白発現が確認されたが、14-3-3σ遺伝子のCpGアイランドのメチル化状態との関連性は認められなかった。発現機序は不明だが、成熟リンパ系腫瘍の一部の腫瘍化に14-3-3σ遺伝子発現が関与していることが示唆された。血液細胞株に14-3-3σ遺伝子発現を導入し、その作用を検討したところ、細胞周期停止が誘導されることはなく高発現が許容されることが判明した。高発現の作用・臨床的意義について、今後のさらなる検討が必要である。1.ヒトリンパ増殖性疾患モデルにおけるr選択とK選択の作用:Epstein-Barrウイルス(EBV)感染細胞に発現するEBNA1によってepisomeに維持されるEBV-oriPを有するベクタープラスミドpMEEBを用いて、c-myc、Bcl-2、cyclin Dfamily(cyclin D1, cyclin D2, cyclin D3)、p53変異体、hTERTの発現プラスミドを作製した。これらを、EBV感染リンパ芽球様細胞株(LCL)に電気穿孔法で導入し、IRES-GFPによって発現するGFPの発現をflow cytometryで検出することで、発現導入細胞を確認した。episomeに維持された導入プラスミドは、細胞の継代とともに通常徐々に失われていく。上記発現プラスミドのほとんどで、GFP陽性細胞は継代とともに徐々に消失していったが、hTERT発現導入細胞だけは、GFP陽性細胞が培養細胞中に長期間維持された。現在再現性を確認中である。また、複数の遺伝子導入による細胞増殖への影響を現在検討中である。2.造血器腫瘍における14-3-3σ遺伝子発現解析:129例の造血器腫瘍患者の臨床検体ならびに造血器細胞株47株を対象として、TaqManプローブを使用したreal-time RT-PCR法で14-3-3σ遺伝子の発現を解析したところ、一部の症例、特に成熟リンパ系腫瘍において高発現例が存在することを見出した。また、ウエスタン解析でもmRNAレベルと概ね同等の蛋白発現が確認された。14-3-3σ遺伝子のCpGアイランドのメチル化状態については、MSP法やbisulfite sequence法を用いたが、発現との関連性を見出すことはできなかった。発現機序については不明だが、成熟リンパ系腫瘍の一部の腫瘍化に14-3-3σ遺伝子発現が関与している可能性が示された。1.ヒトリンパ増殖性疾患モデルにおけるr選択とK選択の作用:hTERT発現プラスミドはEpstein-Barrウイルス感染リンパ芽球様細胞株(EBV-LCL)中に、長期間(3ヶ月以上)の培養でも失われず維持された。単独では速やかに消失するc-myc

その他のリンパ腫関連遺伝子の発現plasmidを複数個共導入することを試みたが、hTERTのみが長期間の培養で残存した。hTERTがEBV-LCLに増殖優位性を与えることができる唯一の遺伝子であった。EBV-LCLの培養ではIgH-CDRIIIPCRによるclonalityの解析や染色体分析から、容易にmonoclonalityが獲得されclonal evolutionが短期間に生じることが判明し、疾患モデルとしての有用性が示唆された。2.造血器腫瘍における14-3-3σ遺伝子発現解析:昨年度の成果をBMC Cancerに発表した。さらに、EBV-LCLもしくはEBV感染細胞株に14-3-3σ遺伝子発現プラスミドを電気穿孔法で導入し、14-3-3σ高発現の意義を検討した。Western解析で14-3-3σ蛋白の高発現を確認したが、細胞増殖の抑制はなく、flow cytometryによる細胞周期解析では、14-3-3σ導入によってわずかにS期とG2/M期の増加が認められた。しかし、継代培養ではcontrol vectorと同様に消失し、細胞増殖促進効果は認められなかった。よって、EBV感染細胞株では14-3-3σの高発現が許容され、細胞周期阻害因子として機能しないことが示唆された。14-3-3σ高発現の意義について今後さらなる解析が必要である。
オミックス解析を基盤とする遺伝子治療用ヘルペスウイルスベクターの合理的設計

本研究は、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターを用いて治療遺伝子を標的細胞に安全に送達する技術の確立を目指している。HSVベクターの医療実装にあたっては、細胞毒性の低減と治療遺伝子の持続的発現の二つを両立可能なHSVゲノム改変法を明らかにする必要がある。そのため、本年度は以下のとおり研究を進めた。1)HSVゲノムの遺伝子改変:従来、われわれはHSVゲノムから5つの毒性遺伝子の発現を欠損させることでベクターを無毒化していた。しかし、これらの遺伝子の近傍にはインスレーター領域など、遺伝子発現制御に重要な配列が複数存在する。これらのうち、どれを残し、どれを欠失させるのが最適かは明らかではない。そこで、こうした遺伝子発現制御配列のどれを欠失させるかについて複数のパターンの遺伝子改変を施し、その違いを調べる準備を行った。2)本研究では、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトームの網羅的解析により、HSVゲノム上で転写活性が保たれるゲノム領域を明らかにすることを目指している。その準備として、本年度は次世代シーケンサーを用いた実験系を確立するとともに、解析環境を整備した。また、in vitroでの検討に用いるラットの脊髄後根神経節の培養系を確立した。3)様々なHSV株のゲノム解析:HSVにはKOS株やHF株など複数の亜株が存在し、細胞毒性や増殖能に違いがある。こうした違いはゲノム配列の違いに起因すると考えられるが、それを具体的に明らかにすることはベクター開発上も有用である。そこで本年度はKOS株、HF株、vHG株という3つの亜株からウイルスDNAをとり、シーケンスライブラリを調製した。今後はこれらのサンプルのシーケンス解析を行い、塩基配列上の違いを明らかにする予定である。本研究は、平成30年度より研究種目・若手研究のご支援を賜り、継続させていただくこととなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。
法的状態構築義務としての遵法義務の基礎理論研究

本研究の目的は、法に従う義務である遵法義務を、法的状態を実現する義務として理解した上で、法的状態の根本的な契機を理論的に解明し、法的状態を実現する義務の正当化根拠を探求することにある。従来提示された諸理論を批判的に検討した上で、本研究は、法的状態を実現する義務の正当化根拠が、個人の独立としての自由を尊重する義務であることを示した。その法的状態を実現する手段として、国家には消極的意義と積極的意義があるものの、法的状態を実現するためには不十分であることを示し、結論として、地球共和国が要請されることを示した。本研究の目的は、法に従う義務である遵法義務を、自然状態と対比される法的状態を構築する義務として位置づけた上で、法的状態の根本的な契機を理論的に解明し、法的状態を構築する義務の正当化根拠を探求することにある。この目的を達成するため、平成26年度には、1政治的責務正当化論における利益論を遵法義務正当化論の自由論へと転換するための共和主義の自由の検討と、2政治的責務正当化論の存在論的転回、3法的状態構築義務としての自然義務の具体的含意の考察を行った。1カントの法的状態論の基礎である自由は、消極的自由でも積極的自由でもない第三の自由として理解できるが、この第三の自由たる共和主義の自由を分析した。その結果、共和主義の自由が、奴隷をこそ不正義の典型例として捉える自由論であり、他者に対して正当化する義務を根底に置く議論であることを示した。2政治的責務を正当化するために自然状態と国家状態を対比する議論を、ゲーム理論を用いて分析した。その結果、自然状態が戦争状態となり国家が要請されるのは、人間の可死性にあること、可死性を克服するためには宗教を初めとする多様な方策がありうるが、いずれの方策も不完全であるため、決定を強制する国家が要請されることを示した。3法的状態を構築する義務を肯定することが、現実的な課題に対していかなる含意を持ちうるかについて、エボラ出血熱とそれに対する国際社会の援助や知的財産権制度のあり方を例にとって考察を加えた。この目的を達成するため、平成27年度には、第一に、平成26年度に行った政治的責務に関する研究を洗練させ、国際学会において報告するとともに英語論文化し、第二に、法的状態を実現する義務の根拠と含意を検討し、第三に、法的状態を実現する義務と刑罰の関係について考察した。1平成27年7月にワシントンDC(米国)で開催された法哲学・社会哲学国際学会連合の世界大会において、政治的責務と政治的正統性に関するスペシャル・ワークショップを企画・開催し、「政治的責務と人間の可死性」と題する報告を行った。この報告原稿を拡張した英語論文が刊行予定である。2政治的責務の正当化根拠として、法的状態を実現する義務について検討を重ね、その義務の根拠がどこにあるか、その義務が成立するための前提は何か、その義務がいかなる構造をしているか、その義務を果たすためにはどうすればよいか、その義務が結果的に何を要求するかについて洞察を得た。3法的状態を実現する義務は、犯罪に対してどのような対処を要求するか、特に刑罰はどのように正当化されうるかを検討した。平成27年11月に開催された日本法哲学会・学術大会において、統一テーマ「応報の行方」に関する大会委員長を務め、総括的な研究報告を行った。特に、応報という観念が今後いかなる意義を持ちうるのかについて考察を加えた。研究計画において、2つの研究作業を行い、成果報告を行うことを予定していた。研究作業予定の第一は、平成26年度に行った政治的責務に関する研究を洗練させ、英語論文化して国際学会において報告することである。これについては、平成27年7月にワシントンDC(米国)で開催された法哲学・社会哲学国際学会連合の世界大会において、政治的責務と政治的正統性に関するスペシャル・ワークショップを企画・開催して報告を行うと共に、そこでの批判的討議を通じて完成した論文が刊行予定である。研究作業予定の第二は、法的状態における匡正的正義の位置づけを検討することである。これについては、平成27年11月に沖縄で開催された日本法哲学会学術大会において、統一テーマの責任者として法的状態を達成するための刑罰の役割に関する報告を行うと共に、そこでの批判的討議を通じて完成した論文が刊行予定である。以上のように、研究計画における予定を順調に達成することができた。この目的を達成するため、平成28年度は、過去2年間の研究を踏まえつつ、二つの作業を行った。第一に、遵法義務の二つの契機を相互に関連づけながら深化させた。自然状態と対比される法的状態を、そこで獲得される利益ではなくそこで保障される自由に着目して構想するのは、他人の意思からの独立として自由を捉え、その自由が保障される状態として法的状態を構想したカントの理論を精緻化するものである。

これに対して、人間が死すべき存在であるという事実こそが法的状態を要請すると理解するのは、暴力死の恐怖と高慢という人間の本質的規定が国家を要請すると理解するホッブズの理論を発展的に再構成するものである。こうした、いわばカント的契機とホッブズ的契機がいかにして矛盾なく両立するかという点を、関連文献を精査しながら検討した。結果的に、法的状態を構築する義務の根底には、他者支配からの自由を尊重する義務が存在することを確認することで、カント的契機の意義を解明するとともに、法的状態と国家の複雑な関係をできる限り明晰に位置づける作業を行った。また、法的状態を構築する義務と刑罰の正当化論の関係についても、様々な角度から検討を進めた。第二に、平成26年度・平成27年度の研究成果と、同意論・関係的責務論・フェアプレイ論・利益論など、応募者が従来行ってきた政治的責務に関する理論研究とを融合させることで、政治的責務に関する包括的な研究として単著にまとめあげる作業を進捗させた。本研究の目的は、法に従う義務である遵法義務を、法的状態を実現する義務として理解した上で、法的状態の根本的な契機を理論的に解明し、法的状態を実現する義務の正当化根拠を探求することにある。従来提示された諸理論を批判的に検討した上で、本研究は、法的状態を実現する義務の正当化根拠が、個人の独立としての自由を尊重する義務であることを示した。その法的状態を実現する手段として、国家には消極的意義と積極的意義があるものの、法的状態を実現するためには不十分であることを示し、結論として、地球共和国が要請されることを示した。研究計画において、2つの研究作業を行い、成果報告を行うことを予定していた。研究作業予定の第一に、政治的責務正当化論における利益論を遵法義務正当化論の自由論へと転換することである。これについては、<法的状態は自然状態に比べて望ましい状態であり、その理由は法的状態が共和主義の自由を保障することにある>という理論仮説を検討すべく、共和主義の自由について研究を進め、論文を執筆した。研究作業予定の第二は、政治的責務の存在論的転回を遂行することである。これについては、自然状態がゲーム理論でいう囚人のディレンマ・チキン・シカ狩り・調整ゲーム・男女の争いのいずれであろうと、国家なしで協力関係が解決されうるのであるが、<人間が死すべき存在である>という事実こそが、自然状態を戦争状態にする根源的な要因であることを示すべく、論文を執筆した。以上のように、研究計画における予定を順調に達成することができた。平成26年度、平成27年度は研究計画に従って、順調に研究を推進することが可能であった。そのため、平成28年度についても、研究計画に従って研究を推進していくことにする。主として、これまでの研究で得た知見をもとに、政治的責務と遵法義務の相関関係について更なる理論的深化を図りながら、本研究の成果全体をまとめ公表することに尽力する。法哲学平成26年度は研究計画に従って、順調に研究を推進することが可能であった。そのため、今後についても、研究計画に従って研究を推進していくことにする。具体的には以下の通りである。第一に、平成26年度に行った政治的責務に関する研究を洗練させ、英語論文化して国際学会において報告する。
フォ-ストプル-ムにおける組織的構造の動力学と連行機構に関する研究

1.鉛直上向きに放流した二次元フォ-ストプル-ムの乱流拡散機構を解明するために、ジェット流動とプル-ム流動において乱流諸量の計測を行い、平均流動場や乱流構造に及ぼす浮力の影響を実験的に検討した。とくに、乱流強度、乱流流束や乱流エネルギ-収支に及ぼす浮力の効果を検討した。さらに、渦動粘性係数や乱流プラントル数の横方向分布を調べ、乱流粘性モデルの妥当性についても検討した。2.鉛直上向きに放流した二次元フォ-ストプル-ムに内在する組織的構造の特性を、(1)可視化法、(2)温度変動の多点同時計測と、(3)二方向流速・温度変動の二点乱流計測ならびにVITA法による条件付抽出・平均より明らかにし、連行機構や運動量と熱の乱流輸送機構との関連について考察した。ガルマン渦列状に左右非対称に配置された組織的構造が連行過程や放流水束の揺らぎ現象を支配する主要な要因であることが定量的に明らかになった。3.二次元フォ-ストプル-ムに内在する組織的構造に着目して、左右非対称に配置された組織的構造の流下方向への発達をランキン渦の渦列に相似パタ-ンで模擬する渦列モデルを展開した。計算結果は平均流速、乱流強度やレイノルズ応力の横方向分布、ならびに二次元ジェットとプル-ムの流動および乱流特性の違いを良好に予測することを示した。また、横方向流速やレイノルズ応力の生成機構は組織的構造の非対称な配置に原因していることがわかった。フォ-ストプル-ムは運動量流束と浮力流束を合わせ持つ自由乱流である。両流束の卓越度の違いにより、流動特性は大きく異なる。放流口近傍では運動量流束の卓越するジェット的挙動を呈し、流下距離の増加とともに浮力流束の卓越するプル-ム的挙動へと遷移する。連行係数がジェットからプル-ムへの遷移にともなって2倍強に増大する。この連行能の違いを究明すべく水理実験を実施した結果、放流水が左右に揺らぐフラッピング現象がプル-ムで特徴的に現われ、連行現象や乱流移送に直接的に関与していることが可視観測から分かった。その成因は中心軸に対して左右非対線に配置された大規模な組織的構造であり、その規模はプル-ムの半幅に相当する。さらに、2方向流連と温度変動の2点乱流計測、ならびにVITA法による条件付抽出により、組織的構造が流速変動のベワトル表現から定量的に抽出できた。それは明瞭な渦構造を形成しており、中心軸に対して非対称に配置されている。また、渦構造は流下方向に増大しながら5線形に拡がっている。条件付き平均したレイノルズ応力および乱流熱流束の分布から、組織的構造は運動量や熱の乱流輸送に貢献していることが分った。水理実験で得られた組織的構造をカルマン渦列のような非対線に配置した渦列で近似するモデルを展開し、各々の渦が誘起する流速場の線形重ね合わせにより時々刻々変動する乱流を計算するのが次年度の課題である。1.鉛直上向きに放流した二次元フォ-マトプル-ムの乱流拡数機構を解明するために,ジェット流動とプル-ム流動において乱流誘量の計測を行い、平均流動場や乱流構造に及ぼす浮力の影響を実験的に検討した。とくに、乱流強度、乱流流車や乱流エネルギ-収支に及ぼす浮力の効果を検討した。さらに,過動粘性係数や乱流プラントル数の横方向分布を調べ、乱流粘性モデルの妥当性についても検討した。2.鉛直上向きに放流した二次元フォ-ストプル-ムに内在する組織的構造の特性を、(1)可視化法、(2)温度変動の多点同時計測と,

(3)二方向流速・温度変動の二点乱流計測ならびにVITA法による条件付抽出・平均より明らかにし、連行機構や運動量と熱の乱流輸送機構との関連について考察した。カルマン過列状に左右非対線に配置された組織的構造が連行過程や放流水車の揺らぎ現象を支配する主要な要因であることが定量的に明らかになった。3.二次元フォ-ストプル-ムに内在する組織的構造に着目して,左右非対線に配置された組織的構造の流下方向への発達をランキン過の過列の相似パタ-ンで模擬する渦列モデルを展開した。計算結果は平均流連,乱流強度やレイノルズ応力の横方向分布,ならびに二次元ジェットとプル-ムの流動および乱流特性の違いを良好に予測することを示した。また,横方向流速やレイノルズ応力の生成機構は組織的構造の非対線な配置に原因していることがわかった。
皮膚血流量変動の周波数分析により局所の交感神経活動を非侵襲的に評価する方法の確立

自律神経活動を評価する方法として、心拍変動周波数分析が普及している。同様な考え方により、耳垂部皮膚血流量変動を周波数分析し、その低周波成分(0.03-0.15Hz)の大きさが脳幹部の自律神経機能を反映するかどうか調べるため、脳死患者と遷延性意識障害患者の間で比較することにより検討した。対象:脳幹機能が消失した脳死状態の患者群5名、脳幹機能は保たれている遷延性意識障害の患者群5名。方法:手指、耳垂部皮膚血流量信号および観血的動脈血圧、心電図第2誘導の波形をインピーダンス呼吸曲線とともにデータレコーダに記録した後、パソコンに取り込み、自己回帰スペクトル法により各信号の低周波成分(0.03-0.15Hz)の振幅を求め、2群間で比較することにより血流量変動に対する脳幹部機能の影響を検討した。結果:脳死群では変動がほぼ消失していたが、遷延性意識障害群では変動が正常者と同じように存在し、両者の間に明らかな差を認めた。考察:脳死群における耳垂部皮膚血流変動の消失の程度は、血管運動性交感神経活動の指標とされる血圧変動の低周波成分や心臓に対する交感神経活動の大きさを反映するとされる心拍変動の低周波成分/高周波成分の低下と比較して、はっきりと低下していた。血流量変動は、脳幹機能障害による自律神経機能の廃絶を血圧変動や心拍変動よりも鋭敏に反映する可能性があると考えられた。ただし、前年度の研究で明らかにしたように耳垂部皮膚血流量変動には交感神経活動以外に血管平滑筋原性のvasomotionが大きく影響する。このvasomotionが脳死時の他の内分泌性因子などにより影響を受けていた可能性もあり、今後内分泌ホルモンの分泌の程度と同時に検討する必要があると考えられた。耳垂部皮膚血流量変動より局所の交感神経活動の指標を得る事ができるか否か検討するため、以下の研究を行った。<研究1:交感神経活動を低下させた場合の検討>全脊椎麻酔、胸部硬膜外麻酔、胸部交感神経節切除術、右星状神経節ブロックが耳垂部皮膚血流量変動に及ぼす影響を検討した。方法:上記神経ブロック施行前後でレーザードップラ血流計による左右耳垂部皮膚血流量信号を記録した後、低周波成分(0.04-0.20Hz)振幅を求め、ブロック前後での変化を調べた。結果:低周波成分振幅は前2群では減少したが、後2群では一定の傾向を示さなかった。考察:遮断が広範囲に及ぶ前2群では遮断後、低周波成分振幅は減少したが、遮断が狭い範囲に限局した後2群においては一定の方向への変化を示さなかった。このことは交感神経遮断が耳垂部皮膚血流量の低周波成分振幅の大きさを変化させることを示す。ただし遮断の過程と低周波成分の振幅の大きさとの関係は線形の関係ではないことが示された。<研究2:交感神経活動を亢進させた場合の検討>:70度ヘッドアップティルト試験による人為的な交感神経賦活が耳垂部皮膚血流変動に及ぼす影響を検討した。方法:ヘッドアップティルトが耳垂部皮膚血流変動に及ぼす影響を、血圧変動と同時に解析することにより検討した。結果:耳垂部皮膚血流量の低周波成分振幅の大きさは立位により一定の方向への変化を示さず、また血流変動の低周波成分のピーク部に対する血圧のコヒーレンスは立位により増加した。考察:耳垂部皮膚血流量の低周波成分振幅と交感神経活動の間に線形の相関関係がないことが示唆された。ただし立位時には血圧とのコヒーレンスが強くなった。以上の2つの研究より耳垂部皮膚血流量の低周波成分には交感神経活動以外の因子(血管平滑筋原性のvasomotionなど)が影響し、交感神経活動の直接の指標にはならないことが示された。

このvasomotionが脳死時の他の内分泌性因子などにより影響を受けていた可能性もあり、今後内分泌ホルモンの分泌の程度と同時に検討する必要があると考えられた。
有限射影平面と一般アダマール行列

1≦l≦uλのリストがすべての異なるi,jに対して丁度λ回(一定個数)Uの各元を含むならば,(u,k,λ)-差行列と呼ばれる。D. Jungnickelはk≦uλであることを示した。しかしながら,任意のパラメータを持つ差行列を構成することに対して,一般的な方法は知られていない。上記論文では, u=p(>2)がquasi Sophie Germain素数,ここでλ=q(=2p+1)は素数ベキである,の場合を考えられ, F_qからF_q/{0}への関数を使ってZ_p上の(p,(p-1)q/2,q)-差行列が存在することを示される。点集合上正則に作用するが,ブロック集合上そうでない,自己同型群を持つ横断デザインのdualを構成することによって示される。この考え方がこの構成の独創的な点である。実は,この論文ではこの構成はより一般的な形の構成の具体例として述べられ,もう一つの構成の例についても述べられる。(1) uが素数でない素数pのベキqであるとき,コセット型一般アダマール行列GH(q,λ)の構造についての研究はここ一年始まったばかりである。筆者は安東正和氏とコセット型GH(4,6)を分類した。それらは,同値を無視して9個ある。(現在これが正しいかどうか再チェックしている)作用する全自己同型群のタイプは3種類あるように思える。最近その中の一つのタイプについて,群作用が明確にわかるようにGHの形を決めることが出来た。このGH Hに対応する対称横断デザインのパラメータはSTD_6[24;4]Dである。(Dの点の総数は24×4,各ブロックサイズは24, 2点を通るブロックは丁度6個かまたは0個,この双対構造も同様な性質を持つ)Dの全自己同型群Gの位数は12×4である。興味深いのはGがDの点上半正則に作用するが,ブロック上半正則に作用しないという事実である。(この事実は他の例共々(2)で一般論に進化した)ともかく,このHは一般的な記述がされる。そのパラメータはGH(4,2r)(rは素数)である。今後rが5,7,11,13で具体例があるかどうか,そして無限系列があるかどうか調べたい。(2)群論に詳しい研究者達は点とブロック上に正則に作用するデザインを様々なデザインについて研究している。筆者は昨年度の初めから,点上正則であるがブロック上正則でない自己同型群を持つクラス正則正則(あるいは半正則)対称横断デザインの研究を開始した。最初の具体例はクラス正則STD_4[12;3]である。(対応するGHはGH(3,4)である)これまでの一般アダマール行列の研究者達は幾何的な視点が不足していたためこの事実に気づかなかったように思われる。昨年の暮れ,筆者は点正則自己同型群を持つ(ブロック上正則でない)GH(p,p+1)をすべてのメルセンヌ素数pに対して構成した。(1)コセット型GH(4,6)の分類について,コンピュータによる計算に誤りがないかどうか現在チェックしている。計算量が多いので,計算を速めるアルゴリズムが必要であるが,出来ていない。非同値なGH(4,6)は当初10個であることを確認したが, 10個目の計算に誤りあることがわかった。従って,非同値なGH(4,6)は9個であることが予測される。全自己同型群の正確な記述をすることを試みている。全自己同型群の位数は, 24,48,80の3通りである。全自己同型群の型も3つであるように思える。2番目の型が有限体を使って一般化出来るかも知れないと思い,全自己同型群の正確な記述をした。これにより対応するGH(4,6)の形を群作用がわかるように書けた。この形はある一般化を予測させる。一般化を視野において出来るだけ沢山のGH(4,2r)(rは素数)を計算するつもりでいる。(2) GH(3,4)に対応するクラス正則対称横断デザインSTD_4[12;3]の自己同型群を調べる中で,非常に興味ある事実に気づいた。すなわち,この対称横断デザインは点正則であるが,ブロック上正則でない自己同型群Gをもつ。

このことはSTD_4[12;3]が群Gで表現出来ることを意味する。そこで仮定を緩めて,次の問題が考えられる。点上半正則であるが,ブロック上半正則でない自己同型群を持つクラス正則対称横断デザインの研究をせよ。この研究は一般アダマール行列の研究にどれだけ寄与出来るか。昨年の暮れに対応するクラス正則対称横断デザインが正則自己同型群を持つ(ブロック上正則でない)GH(p,p+1)をすべてのメルセンヌ素数pに対して構成した。同じパラメータを持つGHはT. Fengによって2009年に構成されており,彼のGHとの関係を調べる必要がある。(1)コセット型GH(4,6)の形の決定については,全自己同型群の点クラスたちとブロッククラスたちの上での作用の仕方がわかっているので,時間をかければ解決可能である。従って, GHの一般化された形についても予測出来るであろう。有限体を使って特徴づける方法は色々と自由度があって,卓越した見方と辛抱強い多くの計算が必要である。なお,最近GH(4,5)が存在しないことを示した。これはde Launeyの予想の反例であり,何故このようなことが起こるのか考えるのも興味がある。EA(4)上のコセット型GHの研究とも関連がある。よりSTDとしての基本的な見方が必要なのかも知れない。ともかく計算機の助けが必要である。(2)点上正則自己同型群を持つクラス正則対称横断デザインの研究は,平峰豊氏の助力を得て点正則自己同型群を持つクラス正則双対横断デザインの研究に発展した。前者には一般アダマール行列が対応し,後者には差行列が対応する。最近平峰豊氏との共同研究で,奇素数pに対して, q=2p+1が素数ベキであるとき, (Z_p,(p-1)q/2,q)-差行列を構成した。この結果は従来知られた差行列と較べてみても行数が飛躍的に多く良い結果である。今後,平峰豊氏(熊本大学)と緊密な連絡を取り,この研究を進めて行きたい。また,海外での有限体の研究集会(2013年7月ドイツのマグデブルクで開催)にも出席し研究成果を発表し,外国の研究者とも情報交換をしてより良い研究に発展させたい。研究費の多くは(1)で述べた計算速度の速い計算機の購入と研究打ち合わせのために使いたい。また現行の研究成果の最新情報(過去の研究成果も含めて)を知るため,専門書の購入,論文の入手したい。該当なし。
イノベーション・ダイナミクスと地域貢献型中小企業の事業展開に関する経済史研究

本研究はグローバル競争の進展とともに地域経済の衰退、空洞化が問題視されるなかで、「地域にこだわり地域に貢献する企業」を地域貢献型企業として注目し、その革新的な事業展開について経済・経営史的に明らかにすることを目的とする。そのため平成30年度は、以下の3つの調査研究を進めた。1つは、長野県飯田市において次年度に聞き取り調査を予定している精密企業(M社)に関する資料調査を実施して関連情報の収集を行った。また飯田市を本拠として活躍する地域貢献型企業であるT社が中心となって取り組んでいる新規=航空宇宙関連産業の創出に関して、東京で開催された航空・宇宙機器開発展示会などで情報の収集を行った。2つめは、電球企業O社ならびに同社からスピン・アウトして設立されたS社の事業展開に着目し、地域貢献企業であったO社が進出先の秋田から鹿児島に事業移転をする際に、地域経済への影響を極力緩和する措置の一環としてS社を秋田に新設し、事業の一部継続をはかった点を明らかにした。また飯田市におけるLED照明器具に関する企業連携の取り組みに関する現地資料調査と、東京で開催されたライティング・フェア2019などへの参加によりLED電球企業の事業展開に関しても情報収集を行うことができた。3つめは本研究を進めるなかで、ニッチトップ型の中小企業(自社製品を積極的に開発・製造し、ニッチな販売市場において高い競争力とシェアを有する企業)の地域貢献型企業としての重要性に着眼するに至った。そこで茨城県で活躍するN社において聞き取り調査を実施し、その立地戦略と事業展開の特徴に関して一定の成果をあげることができた。平成30年度は本研究課題の1年目にあたり、当初の研究計画では海外(中国)と国内(青森県)でも聞き取り調査を実施する予定であった。しかしながら本年度になり勤務先の大学で役職(学類長)についたことから同公務との調整で長期学外出張の計画をたてることが容易ではない状況にあった。加えて海外調査に関しては、計画段階では現地に関する助言とともに通訳を兼ねる形で調査に参加してもらう予定でいた人が海外で事故にあうという予期しないことが起こった。そのため、飯田市や東京等の地理的に近く出張し易い場所での調査を優先し、上記2つの調査に関しては次年度以降に改めて実施することに計画を変更した。その一方で、研究実績の概要に記したように茨城における地域貢献型企業の調査と論文作成を新たに行うことができた。以上を総合した場合、現在までの進捗状況をやや遅れているものと自己点検評価した。今後の研究に関しては、当初の計画を以下の2点に関して変更する予定である。1つは、昨年度実施できなかった海外(中国)と国内(青森県)での調査を、令和元年度以降に実施することである。特に前者に関しては新たな協力者を得て、その助言を受けながら進めて行く予定である。2つめは、昨年度研究を進める過程で新たに事例研究対象に加えるに至った茨城におけるニッチトップ型中小企業に関する調査・研究を継続することである。以上によって、平成30年度の遅れを取り戻すとともに、令和元年度以降に予定している聞き取り調査、現地や学会等での情報収集を逐次実施して、本研究を推進して行きたいと考えている。

その一方で、研究実績の概要に記したように茨城における地域貢献型企業の調査と論文作成を新たに行うことができた。以上を総合した場合、現在までの進捗状況をやや遅れているものと自己点検評価した。今後の研究に関しては、当初の計画を以下の2点に関して変更する予定である。1つは、昨年度実施できなかった海外(中国)と国内(青森県)での調査を、令和元年度以降に実施することである。特に前者に関しては新たな協力者を得て、その助言を受けながら進めて行く予定である。2つめは、昨年度研究を進める過程で新たに事例研究対象に加えるに至った茨城におけるニッチトップ型中小企業に関する調査・研究を継続することである。以上によって、平成30年度の遅れを取り戻すとともに、令和元年度以降に予定している聞き取り調査、現地や学会等での情報収集を逐次実施して、本研究を推進して行きたいと考えている。次年度使用額が生じた主な理由は、当初の研究計画で平成30年度に実施予定であった海外(中国)と国内(青森県)での聞き取り調査を実施できなかったこと、それに関連して海外調査で利用する予定であった携帯用ノートパソコンの購入を見合わせたことによる。令和元年度以降、当初の研究調査に加えて、これらの調査を計画し直し実施することによって繰り越し額を含めた研究費を使用する予定である。
大腸癌の悪性度に関与する糖転移酵素の分子病理学的研究

細胞膜表面の糖鎖は発生や分化,癌化に伴って著しく変化し,しかもこれら糖鎖の多くは特異的な抗体によって認識されることから癌特異的あるいは癌胎児性抗原とみなすことができる.最近,sialyl Lewis Xを発現した大腸癌はSialyl Lewis Xを発現していない大腸癌にくらべて有意に肝転移の率が高く,また予後も不良であることが示された.糖鎖は一連の糖転移酵素の作用により生合成されることから,本研究では大腸癌の悪性度を規定する糖転移酵素の候補分子としてムチン型糖鎖の生合成を規定するコア2β1,6-N-アセチルグルコサミン転移酵素(C2GnT)とアスパラギン結合型糖鎖上に存在するN-アセチルラクトサミンの生合成を規定するβ1,4-ガラクトース転移酵素-l(β4GalT-l)にターゲットを絞り,大腸癌組織におけるこれら糖転移酵素の発現とその臨床病理学的意義を検討した.その結果,大腸腺腫から大腸癌に進展する過程でβ4GalT-lの発現レベルは有意に増強し,また大腸癌の中でもC2GnTを発現している症例は発現していない症例に比べて有意に脈管侵襲が強く,また進達度も深い傾向にあることが明らかになった.以上より,大腸癌の発生や進展にこれら糖転移酵素の発現が深く関与している可能性が示唆された.細胞膜表面の糖鎖は発生や分化,癌化に伴って著しく変化し,しかもこれら糖鎖の多くは特異的な抗体によって認識されることから癌特異的あるいは癌胎児性抗原とみなすことができる.最近,sialyl Lewis Xを発現した大腸癌はSialyl Lewis Xを発現していない大腸癌にくらべて有意に肝転移の率が高く,また予後も不良であることが示された.糖鎖は一連の糖転移酵素の作用により生合成されることから,本研究では大腸癌の悪性度を規定する糖転移酵素の候補分子としてムチン型糖鎖の生合成を規定するコア2β1,6-N-アセチルグルコサミン転移酵素(C2GnT)とアスパラギン結合型糖鎖上に存在するN-アセチルラクトサミンの生合成を規定するβ1,4-ガラクトース転移酵素-l(β4GalT-l)にターゲットを絞り,大腸癌組織におけるこれら糖転移酵素の発現とその臨床病理学的意義を検討した.その結果,大腸腺腫から大腸癌に進展する過程でβ4GalT-lの発現レベルは有意に増強し,また大腸癌の中でもC2GnTを発現している症例は発現していない症例に比べて有意に脈管侵襲が強く,また進達度も深い傾向にあることが明らかになった.以上より,大腸癌の発生や進展にこれら糖転移酵素の発現が深く関与している可能性が示唆された.平成9年度は大腸癌の悪性度を規定する糖転移酵素の候補分子としてムチン型糖鎖の生合成を規定するコア2β-1,6-N-アセチルグルコサミン転移酵素(C2GnT)にターゲットを絞り,大腸癌組織におけるC2GnT遺伝子の発現とその臨床病理的意義を検討した。46例の大腸癌患者を対象に癌部と非癌部からそれぞれ生検組織を採取し,シアリルルイスa(SLa)とシアリルルイスx(SLx)は免疫組織化学的に,C2GnT mRNAは生検組織から抽出したtotal RNAよりRT-PCR法で増幅して検出した。その結果,癌細胞におけるSLaの発現率は74%で,リンパ節への転移率と正の相関性を示した。しかしながら正常粘膜でも一部の症例ではSLaが陽性であった。さらに癌組織でSLaやSLxに加えてC2GnT遺伝子を発現している症例は,それぞれ50%,61%に認められた。このようなムチン型糖鎖を発現している症例は発現していない症例に比べて有意に脈管侵襲が高かった。さらにC2GnT遺伝子自体は癌組織のみで特異的に発現しており(63%),この遺伝子を発現している症例は発現していない症例に比べて脈管侵襲のみならず進達度も有意に深い傾向にあった。以上の結果から,ムチン型糖鎖として発現するSLa・SLxやC2GnT遺伝子は癌細胞の進展に深く関与している可能性が示唆された。平成10年以降では,大腸癌細胞におけるC2GnT遺伝子の発現をin situ hybridization法で解析する予定である。平成10年度は大腸癌の悪性度を規定する糖転移酵素の候補分子としてN-アセチルラクトサミンの生合成を規定するβ-1,4-ガラクトース転移酵素-I(β4GalT-I)にターゲットを絞って検討した.まず最初にヒトのβ4GalT-Iに対する特異抗体を得るため,この酵素のステム領域に相当する18個のアミノ酸(ASSQPRPGGDSSPVVDSG)からなるペプチドを合成して,家兎に免疫しポリクローナル抗体,A18Gを作製した.A18Gのβ4GalT-Iに対する特異性は,β4GalT-I cDNAを導入したCOS-1細胞のゴルジ装置や細胞膜とA18Gが特異的に結合したことで確認した.次にA18GとN-アセチルラクトサミンに対する特異抗体,H11を用いて,大腸腺腫ら大腸癌の進展に伴うβ4GalT-IならびにN-アセチルラクトサミンの発現パターンを免疫組織化学的に解析した.

その結果,β4GalT-Iの発現レベルは正常大腸粘膜ではきわめて弱いものの,大腸腺腫から大腸癌に進展するに従って明らかに増強し,またN-アセチルラクトサミンについてもほぼ同様の傾向が認められた.以上の結果から,β4GalT-Iの発現レベルと大腸腫瘍の進展とは正の相関があり,さらに腫瘍細胞で発現するN-アセチルラクトサミンは主としてβ4GalT-Iによって規定されている可能性が示唆された.平成11年度は平成10年度に作製したβ1,4-ガラクトース転移酵素-I(β4GalT-I)に対するポリクローナル抗体、A18Gの抗原特異性を解析した。最近、新たなβ1,4-ガラクトース転移酵素として5種類のアイソザイム(β4GalT-IIVI)が次々とクローニングされ、β1,4-ガラクトース転移酵素は遺伝子ファミリーを形成していることが明らかにされた。そこで、A18Gがβ4GalT-I以外のβ1,4-ガラクトース転移酵素アイソザイムとも反応するか否かを免疫細胞化学的に検討した。まず、ヒトβ4GalT-II,-III,-V,-VIのcDNAをヒト胎児脳のcDNAライブラリーからPCRを用いて単離し、動物細胞発現ベクター、pcDNAIに組み込んだ。なお、β4GalT-Iをコードするベクター、pCAG-GTとβ4GalT-IVをコードするベクター、pcDNA3-β4GalT-IVはそれぞれBrunham Institute,福田道子教授と福田穰教授より供与を受けた。次に、これらの発現ベクターをCOS-1細胞に遺伝子導入し、48時間後にA18Gで免疫染色を行った。その結果、A18Gはβ4GalT-Iが導入されたCOS-1細胞のゴルジ野あるいは細胞膜とのみ特異的に反応したが、他のβ1,4-ガラクトース転移酵素のアイソザイムが導入されたCOS-1細胞とは全く反応しなかった。以上の結果より、A18Gはβ4GalT-Iとのみ反応する特異抗体であることが明らかになった。
マイクロマシン技術を用いた超軽量・高角度分解能宇宙X線望遠鏡の開発

高感度の宇宙X線観測にとって、天体からの微弱なX線を集光結像するX線望遠鏡は今や欠かせない。本研究では次世代の衛星を目指して、マイクロマシン技術を用いたオリジナルの方式の開発を行った。そして世界で初めて、本方式での鏡の試作とX線反射の実証、望遠鏡1段分の試作とX線結像の実証などに成功した。本計画では、これまで世界最軽量であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を、重量で2桁軽量化しつつ、角度分解能は1桁向上した、「1000cm^2の有効面積と10秒角の分解能を備えたkgクラスの究極の軽量源望遠鏡」を目指す。鍵となるのが日本が得意とする様々なマイクロマシン技術である。我々は本計画以前に、シリコン結晶異方性エッチングを用いて製作した鏡面で軽量化の基本概念を実証してきた。本計画では、(1)シリコンドライエッチングによる軽量X線反射用の微細構造の製作、(2)X線LIGAを用いた軽量X線反射用の金属微細構造の製作、(3)磁気流体を用いたエッチング面の研磨、(4)シリコン水素アニールを用いたシリコンエッチング面の平滑化、(5)塑性変形もしくは弾性変形による高精度な変形の開発を行う。この方法で開発する望遠鏡は我々のオリジナルである。今年度、我々は本方式を実証するため2つの技術目標を掲げた。1つ目がX線反射の実証であり、光学系ではなく、マイクロ鏡アレイが並んだ鏡チップと呼ばれる1cm角程度の大きさのチップを用いた。2つ目が結像の実証であり、シリコンドライエッチングで4インチ基板に穴を光学系形状に開け、まずは側壁を平滑化せず塑性変形して、可視光で結像を評価した。我々はシリコンおよびニッケル鏡チップの両方でX線反射の実証に成功し、(3)または(4)の平滑化によって側壁が3-5nm rms程度となることを確認した。また可視光結像にも成功し、回折で決まる分解能とほぼ同レベルの焦点を得た。これらは開発の大きなステップとなるものである。年度前半は特許申請(2件)の関係上、発表は差し控えたが、年度後半では、2つの国内学会での発表、1つの国際学会での招待講演を行った。また来年度、3つの国際学会での発表、1つの集録、3本の投稿論文を予定している。本計画では、これまで世界最軽量であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を、重量で2桁軽量化しつつ、角度分解能は1桁向上した、「1000cm^2の有効面積と10秒角の分解能を備えたkgクラスの究極の軽量X線望還鏡」を目指す。本計画では、(1)シリコンドライエッチングによる軽量X線反射用の微細構造の製作、(2)X線LIGAを用いた軽量X線反射用の金属微細構造の製作、(3)磁気流体を用いたエッチング面の研磨、(4)アニールを用いたシリコンエッチング面の平滑化、(5)塑性変形もしくは弾性変形による高精度な変形の開発を行う。昨年度、我々はドライエッチングとアニール、塑性変形を使った大開口効率(40%)の4インチシリコンX線光学系を試作し、可視光での結像実証に成功した。またニッケル)麻光学系の新たな製作プロセスを公安し、テストを開始した。成果は国内学会で4件の発表を行い、国際学会で5件の一般発表と1件の招待講演を行った。また5本の投稿論文を書き上げて、4本が受理された。また日米で2本の修士論文をまとめた。本計画では、これまで世界最軽量であった日本のすざく衛星のX線望遠鏡を、重量で2桁軽量化しつつ、角度分解能は1桁向上した、「1000cm^2の有効面積と10秒角の分解能を備えたkgクラスの究極の軽量X線望遠鏡」を目指す。我々はドライエッチングとアニール、塑性変形を使った大開口効率(40%)の4インチシリコンX線光学系を試作し、本方式で世界で初めてのX線結像実証に成功した。またニッケルX線光学系の試作プロセスに目処を付けた。そして本格的な2段望遠鏡を目指して、2枚の基板の高精度アラインメント装置をデザインし、製作した。

成果は国内学会で4件(うち招待講演1件)、国際学会で4件(うち招待講演1件)の発表を行った。さらに関連成果として6本の査読付き論文が出版され、1本の修士論文ぶ書かれた。
IFN-γで誘導されるトリプトファン代謝酵素の転写制御因子cDNAクローニング

前年度までに、ヒトトリプトファン代謝酵素(IDO)遺伝子を単離し、転写開始点から約0.5kb上流にIFN-stimulated response element(ISRE)とX-box様配列が存在し、その配列にIFN-γに応答するプロモーター活性のあることを明らかにしてきた。また、mRNAの合成誘導が蛋白質合成阻害剤で阻害されることから、本酵素誘導にはde novoの蛋白合成が必要であること、そしてその蛋白合成は、IFN-γ添加から3時間以内に起こっていることを見いだしてきた。さらにチロシンキナーゼ阻害剤であるherbimycin AやgenisteinでIDOmRNA発現が完全に阻害されることからある種のチロシンキナーゼが関与していることも明らかにしてきた。ヒトトリブトファン代謝酵素遺伝子の転写制御因子のcDNAの単離に必要な以下の知見を得た。(1)本酵素のmRNAの転写開始点から約0.5kb上流には、IFN-stimulated response element(ISRE)とX-box様配列が存在し、その配列にIFN-γにresponsiveなプロモーター活性が存在することを明らかにしてきが、CATアッセイで検討したそのプロモーター活性は、ゼロから爆発的なIFN-γによる本酵素mRNA誘導と比較すると、余りにも微弱であった。従って、このエレメントと協同して働く別のレスポンスエレメントがさらに5^′上流に存在する可能性が示唆されたので、本酵素遺伝子を含むより長いgenomicクローンをhuman YAC library(理化学研究所ジーンバンク、浴先生より供与)から、PCR法で2種類単離した。現在、これらのgenomicクローンの構造を解析中である。(2) IFN-γによる本酵素誘導をヒト培養細胞について免疫組織学的に検討したところ、全ての細胞で均一に酵素誘導が生じているのではなく、5個の内1個の割合で強く誘導されていることが判明した。転写因子を抽出する際には、高い誘導能の見られる細胞を用いることが必要であると考えられるので、その細胞のクローン化を試みている。(3)本酵素のmRNA誘導は、蛋白合成阻害剤の添加で阻害されることから、その生合成にある種の蛋白誘導が必要であること、そしてその蛋白誘導は、IFN-γ添加から3時間以内に生じるので、IFN-γ添加後、経時的に細胞抽出液を調製し、ISREとX-box様配列に結合する因子を検索をしたが、未だ特異的な因子を同定するまでには至っていない。
ナノＤＤＳ製剤／タンパク質製剤の動態を制御し開発を支援する画期的新技術の構築

ナノ粒子を用いて薬を患部に運ぶ製剤等の開発では、血中から速やかに消失することがしばしば問題となる。本研究では、長期間血中を流れる性質を持つ低分子ペプチドを探し出すことにした。まず、いろいろな種類の5つのアミノ酸からなるペプチドを表面に発現したファージ(ウイルスのようなもの)をマウスに投与した。血液中を長く流れるファージには、この性質をもったペプチドがファージ表面に結合している。こうして、血液中を長く流れる性質をファージに与えるペプチドが得られた。これらのペプチドを表面につけることにより、ナノ粒子を長く血液中に留めることには成功しなかったが、これができれば、薬を患部だけに届けられる。ナノDDS製剤/組換えタンパク質製剤等の開発において、血中からの速いクリアランスがしばしば問題となる。現状ではポリエチレングリコール(PEG)修飾が多用されており、これに代わる良い手法がない。本研究は、長期血中滞留性をファージに付与できる低分子ペプチドをファージディスプレイペプチドライブラリーから選別し、これら高分子製剤の長期血中滞留性を簡便に付与する方法論の確立を目指した。これまでに、5残基のランダムなアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを提示するファージライブラリーをマウスに尾静脈内投与し、24時間循環させた後、残存ファージを回収することにより長期血中滞留性ファージを回収した。回収率は232倍であった。この濃縮ファージをクローン化し、得られた30個のファージクローンに発現しているアミノ酸配列をDNA解析により決定し、高頻度に発現が認められる6種類の候補ペプチドを得た。クローン化した各ファージの血中滞留性についてin vivoバイオパニングと同様の方法で評価した結果、最終的に長期血中滞留性を示す3種類のペプチドの同定に成功した。次に、長期血中滞留性ペプチドのリポソームDDSへの応用を図るため、3種類のペプチドについてそれぞれ脂質誘導体を合成した。各ペプチド修飾リポソームを調製し、マウスにおける体内動態を検討した結果、脾臓における捕獲の回避と血中滞留性の上昇傾向が観察されたが、リポソームの凝集が見られたことから、リポソーム化にはさらなる検討が必要である。しかしながらこれらのペプチドを発現するファージ自体は長期血中滞留性を示すことから、得られたペプチドをタンパク製剤などへ応用できる可能性は十分にあることが示唆された。本研究は、長期血中滞留性をファージに付与できる低分子ペプチドをファージディスプレイペプチドライブラリーから選別し、これら高分子製剤の長期血中滞留性を簡便に付与する方法論を確立するという挑戦的研究として位置付けている。まず、5残基のランダムなアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを提示するファージライブラリーをマウスに尾静脈内投与した。マウスの血液中を24時間循環させた後、残存ファージを含む血液を回収することによりバイオパニングを行った。バイオパニングを5ラウンド行ったところ、最終ラウンドのファージの回収率が第1ラウンドに比べ、232倍に上昇した。この結果から長期血中滞留性を有するファージの回収に成功したことが示唆された。この濃縮ファージをクローン化し、得られた30個のファージクローンに発現しているアミノ酸配列をDNA解析により決定した。その結果、高頻度に発現が認められる異なる6種類の候補ペプチドが得られた。そして、各ペプチド修飾リポソームを調製し、マウスにおける体内動態を検討した。その結果、有望なペプチド修飾リポソームでは、脾臓における捕獲の回避と血中滞留性の上昇傾向が観察された。以上の結果より、ファージライブラリーから選別した5残基のペプチドは、血中滞留性の向上に寄与する可能性が示唆された。本研究は、PEGに代わる新たな機能性分子として短鎖のペプチドに着目し、バイオ医薬品やDDS医薬品の開発に有用な長期血中滞留性ペプチドの探索を行った。方法としては、ファージディスプレイペプチドライブラリー法を用いたin vivoバイオパニングを用いた。5残基のランダムなアミノ酸配列からなる直鎖状ペプチドを提示するファージライブラリーをマウスに尾静脈内投与し、24時間後に血液中に残存ファージを回収するという方法論を用いた。これは以前、ファージディスプレイペプチドライブラリー法により新生血管に集積するペプチドを探索したところ、ペプチド修飾リポソームに、長期血中滞留性が見出されたことに端を発している。

バイオパニングを5ラウンド行ったところ、最終ラウンドのファージの回収率は232倍に上昇した。また濃縮ファージをクローン化し、DNA配列解析によりアミノ酸配列を決定した。さらにクローン化した各ファージの血中滞留性についてin vivoバイオパニングと同様の方法で評価した結果、最終的に長期血中滞留性を示す3種類のペプチドの同定に成功した。この種類のペプチドを発現しているファージクローンは、それぞれコントロールのランダムペプチド発現ファージに比べ、明らかな長期血中滞留性を示すことを確認した。次に、長期血中滞留性ペプチドのリポソームDDSへの応用を図るため、3種類のペプチドについてそれぞれ脂質誘導体を合成した。そして、各ペプチド修飾リポソームを調製し、マウスにおける体内動態を検討した。その結果、有望なペプチド修飾リポソームでは、脾臓における捕獲の回避と血中滞留性の上昇傾向が観察された。これらのことから、研究はほぼ順調に進んでいる。しかしながらコントロールとして用いたPEG修飾リポソームに比べ、血中滞留性は劣っていたため、更なる改良が必要である。ファージディスプレイペプチドライブラリーを用いたin vivo biopanningにより細網内皮系(RES)回避能を有する長期血中滞留性ペプチド発現ファージを選別した。これまでこの方法で、十分に血中滞留性のよいファージクローンを得ることに成功したため、当初予定していた、ヒト由来マクロファージを用いたin vitro biopanningによる絞り込みは行わずにクローニングに研究を進めた。クローニングしたファージの動態等の解析に基づき、候補となるペプチドでリポソームを修飾し、その体内動態をした結果、血中滞留性の向上は見られたものの、コントロールとして用いたPEG修飾リポソームには及ばなかった。本手法により十分に血中滞留性のよいファージクローンを得ることには成功していることから、コンセプトは正しいと考え、同様な方法でのバイオパニングとヒトマクロファージ由来細胞を用いたインビトロバイオパニングを組み合わせて、再度ペプチドの探索を行う。一方で、得られたファージクローンは長期血中滞留性を示すにもかかわらず、このペプチドをリポソームに修飾した場合には長期血中滞留性が低下する理由として、候補となったペプチドの溶解性が低く、脂質への修飾に難点があることがあげられる。長期血中滞留性ペプチドのコンセプト自体は稼働すると考えられたことから、今後はリポソームのペプチド修飾法などについても詳細に検討する。これらを通して、バイオ医薬品やDDS医薬品の開発に有用な長期血中滞留性ペプチドの探索を成功させる予定である。【長期血中滞留性ペプチド修飾リポソームの改良】本研究では、固定水相の形成により長期血中滞留性を付与するPEGに代わる、生体におけるタンパク質等の血中滞留性を決定する因子を模倣した。