hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低栄養による繁殖機能低下を仲介するエネルギーセンサーの解明

乳牛などでは低栄養により繁殖機能が低下し、分娩後の受胎率の低下を招いている。このメカニズムを解明するため、脳に存在するエネルギーセンサーの候補である後脳の上衣細胞において、どのようにブドウ糖がセンシングされているのか、またこのセンサーからどのような神経経路を辿って、性腺刺激ホルモンの分泌が抑制されるのかをラットを用いて明らかにしようとした。その結果、上衣細胞において、細胞内得年ルギーセンサーであるとされるAMPキナーゼを介したグルコースセンシングが行われていることを明らかにした。また、上衣細胞が視床下部の室傍核を通って情報を伝達している可能性が示された。本研究は、高泌乳牛において飢餓状態と繁殖率の低下を引き起こす栄養シグナルがケトン体(負のエネルギーシグナル)であることを明らかするため、遺伝子改変マウスモデルを用いて、生殖機能を制御するケトン体センシング機構が、上衣細胞に存在すること、またセンシングの細胞内メカニズムを明らかにすることを目的とする。ケトン体輸送担体の上衣細胞特異的なコンディショナルノックアウトマウスを用いてケトン体センサーが後脳の上衣細胞であることを証明するとともに、上衣細胞特異的に蛍光タンパクを発現するトランスジェニックマウスを作製し、in vitroでケトン体センシングの細胞内メカニズムを明らかにする。これにより、重篤なケトーシスによる繁殖障害が頻発する高泌乳牛における性腺機能抑制予防や治療への基礎的知見を提供する。ケトン体の脳内センシングメカニズムにおいて、ケトン体の輸送担体MCT1が重要であることを糖尿病ケトーシスモデルで明らかにしている。よって本研究では、hFOXJ1-CreERT2マウスおよびMCT1-floxedマウスを作製し、これらの交配によりコンディショナルなMCT1ノックアウトマウスを得るため、トランスジェニック動物作製及びノックイン動物作製のためのDNAコンストラクトの作製を行う。後脳上衣細胞から視床下部への情報伝達経路を明らかにするため、第4脳室にwheat-germ agglutininを投与し、延髄カテコールアミン神経細胞と視床下部室傍核神経細胞にその存在が確認する。このことから、後脳上衣細胞は延髄から視床下部へ何らかの投射をしていることを証明する。上衣細胞によるエネルギー基質感知機構の解明:上衣細胞に特異的に蛍光タンパクを発現するマウスを作製した。このマウスは上衣細胞のみにビーナスタンパクを発現しており、in vitroで上衣細胞をリアルタイムに同定できる。このマウスの後脳上衣細胞付近の組織を採取し、細胞を拡散して顕微鏡下でビーナスを発現する細胞のみを集めたところ、ビーナス遺伝子を発現していた。この細胞を培養し、グルコース感知機構の一部とされているAMPキナーゼの活性化剤をin vitroにおいて投与したところ、ビーナス陽性細胞において細胞内カルシウムが上昇した。このことは、上衣細胞が低エネルギー状態を感知していることを示しており、われわれが以前示した実験結果とよく一致するものである。現在この結果を投稿すべく準備中である。上衣細胞から視床下部への神経経路の同定:第4脳室に神経トレーサーである小麦胚芽レクチンであるWGAを投与したところ、延髄孤束核および視床下部室傍核にWGAが輸送されることが確認された。このことは、われわれがすでに提唱しているエネルギー感知経路とよく一致する。この事実をより確実にするため、上衣細胞特異的に神経トレーサーである小麦胚芽レクチンであるWGAを発現するラットを作製した。この遺伝子改変ラットにおいても、同様の部位にWGAが確認された。現在WGAの遺伝子が上衣細胞にのみ発現していることを確認する作業を行っている。確認が済み次第、論文として発表する予定である。上衣細胞特異的なKOラットの作製:現在各種エネルギーセンサー関連タンパクを上衣細胞特異的にノックアウトするため、MCT1-floxedラットをはじめとする遺伝子改変動物を作製している。コンストラクトの作製に時間を要しているが、今年度中には成功させ、遺伝子導入を開始する予定である。本研究は、生殖を制御する新規エネルギーセンサー細胞の同定を行うため、その候補細胞のひとつである後脳の上衣細胞に焦点を当て、実験を行っている。本年度は、前年度に作出した上衣細胞にレポーター遺伝子の蛍光タンパク質を発現するマウス(Vim-Venusマウス)を用いて上衣細胞のエネルギーセンシングにおける役割を検討した。Venus蛍光を指標として上衣細胞を回収し、上衣細胞に発現する遺伝子解析を行った結果、上衣細胞のマーカーであるヴィメンチン遺伝子(Vim)のmRNA発現に加えて、AMPK(AMP-activated protein kinase:AMP活性化プロテインキナーゼ)遺伝子の発現が検出された。免疫組織化学により、上衣細胞はすべてAMPKタンパクを発現していた。AMPKは人から酵母まで真核細胞に高度に保存されているセリン/スレオニンキナーゼ(セリン/スレオニンリン酸化酵素)の一種で、細胞内のエネルギーのセンサーとして重要な役割を担っていると考えられている。したがって、上衣細胞が低栄養シグナルを感知する細胞内シグナリング経路として、AMPKを用いている可能性が示唆された。さらに、Venus陽性の上衣細胞をin vitroでAMPK活性化剤であるAICAR (5-amino-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide)に暴露したところ、細胞内カルシウムの顕著な上昇が認められた。またAICARをラットの第4脳室に投与したところ、血糖値にはまったく影響をあたえることなしに、血中LH濃度を抑制することが明らかとなった。

これらの結果から、低血糖は、上衣細胞にあるAMPKを活性化することで感知され、性腺刺激ホルモン放出ホルモン分泌を抑制し、性腺機能を抑制していることが明らかとなった。乳牛などでは低栄養により繁殖機能が低下し、分娩後の受胎率の低下を招いている。このメカニズムを解明するため、脳に存在するエネルギーセンサーの候補である後脳の上衣細胞において、どのようにブドウ糖がセンシングされているのか、またこのセンサーからどのような神経経路を辿って、性腺刺激ホルモンの分泌が抑制されるのかをラットを用いて明らかにしようとした。その結果、上衣細胞において、細胞内得年ルギーセンサーであるとされるAMPキナーゼを介したグルコースセンシングが行われていることを明らかにした。また、上衣細胞が視床下部の室傍核を通って情報を伝達している可能性が示された。予定していたVim-Venusラットを作製することができ、それを用いて上衣細胞が低血糖を感知していることを明らかにできた。生殖内分泌学もう一つの課題であった上衣細胞特異的なセンシングタンパクKO動物の作製については、受精卵に導入する遺伝子コンストラクトの作製が遅れている。今後、同動物の作成に集中する予定である。上衣細胞にGFPを発現する遺伝子改変マウスは現在ライン化しているが、一部の上衣細胞にしかGFPを発現せず、よりよいプロモーターを見つける必要がある。MCT-1のfloxedマウスを作製するためのコンストラクトはほぼ完成したが、ES細胞への導入が遅れている。トレーサーを用いた上衣細胞からの伝達経路の特定に関してはほぼ予定通り進行している。上衣細胞特異的に蛍光タンパクを発現するマウス、および特異的に神経トレーサーであるWGAタンパクを発現するラットがともに作製できたことで、研究は今後飛躍的に進展するものと考えている。しかしながら、上衣細胞特異的に各種センサー関連タンパクをノックアウトするための準備については、少し計画より遅れており、今年度の進展にかかっていると考えている。上衣細胞にGFPを発現するためのプロモーターは、foxj1などのより特異的なプロモーターを用いて実施する。ES細胞へのコンストラクト導入については次年度も引き続き行い、早期にキメラ動物を得るよう最善を尽くす。トレーサー実験は必要な動物数を得て、論文作成を開始する。現在最も遅延している実験計画がコンディショナルノックアウトラットの作製である。この作製にはラットのES細胞を用いることを予定していた。しかしTALENやCRYSPRなど新たな方法が開発されており、それらの方法を現在模索している。ES細胞を用いたノックアウトラットについてはすでに成功しているので、この方法については、引き続き実験を進める予定である。次年度は、GFP導入マウス及びfloxedマウスの両者のライン化が本格的に開始されるので、動物の飼養管理に相当の財源が必要となる。
強磁性多層膜の電子・磁気物性研究

従来の研究(研究課題番号:06650376;研究代表者:権藤靖夫)に端を発し、強磁性層間の直接交換相互作用による交換結合2層膜に関する研究の過程で、まさに幸運にも、最強磁化を有するFeCoV薄膜のソフト磁性化に関するシーズに遭遇した。この現象に着目し、実用化及びソフト磁性化のメカニズムに関して多くの探索をおこなってきた。現在までの結果を、以下に簡略に記述する。また、3d/4f遷移金属多層膜の極低温電子・磁気物性研究も開始している。(1)微量FeNiMoと二層膜化されたFeCoV及びFe50Ni50膜の保磁力が単層膜の保磁力の約1/10以下になること、また残留磁化も大きく減少する。さらに、適当な熱処理によって、保磁力が約1/30以下になる。最適熱処理条件の探索によって、熱安定性に優れた高飽和磁化(25kG)・低保磁力(1.0e以下)・異方性磁界(約500e)・低残留磁化強磁性膜の開発が期待できる。高周波励磁(1Mega Hz以上)においても高透磁率が得られることが確認された。(2)微量ソフト磁性層とFeCoV及びFe50Ni50との二層膜では、下地層磁化の異方性がセミハード膜の保磁力減少効果に強く関わっていることが判った。(3)さらに、下地層の磁化の異方性と第2層の磁化の異方性の有り無しが保磁力減少効果に関与することも示唆された。この現象の内容に関しては、検証が不十分であり、さらなる検討を必要とする。(4)保磁力減少効果と極薄FeNiMo層の磁化特性の異方性と第2層の磁化特性の異方性との相互作用との関係に関する実験的検討を進めると共に、微量FeNiMo層のFeCoV膜等の構造変化への影響があるのかどうかの確認を行う。(5)下地ソフト磁性層の磁化の異方性とセミハード第2磁性層の磁化の異方性との磁気的相互作用の可能性に関して理論的考察を展開中である。(6)さらに、極低温で強磁性を発揮する4f遷移金属のソフト磁性化に関する探索研究をスタートさせた。3d遷移金属で得られた上記の結果が活用できるかどうかの可能性を探索研究の初めとする計画である。この研究のために、液体He温度で磁化測定できる装置を試作した。磁化測定感度0.0025emuで極低温測定が可能である。さらに、この温度での磁気抵抗効果測定装置を試作する予定である。平成10年度研究項目薄いソフト磁性層によってFeCoV薄膜に誘導される磁気異方性の探索最強

磁化を有するFe-CO系磁性薄膜のソフト磁性化を実験的に検討した。現在までの結果の要約を以下に示す。(1)微量ソフト磁性層(体積率で約2%)との三層膜化によって、飽和磁化を殆ど減少させることなく、FeCoV薄膜の保磁力が約1/10以下に減少する。(2)ソフト磁性層は微量であるにもかかわらず、約100倍の体積を有するFeCoV膜の磁化特性を支配する可能性がある。(3)保磁力の減少効果は、基板に蒸着されたソフト磁性層の磁化特性の異方性に関連するように思われる。(4)磁化過程では、ソフト層とFeCoV層の両層が独立に振る舞うことなく、あたかも単層膜であるかのようなシンプルな磁化反転を示す。(5)微量ソフト層とFeCoV層との界面に形成された膜面に平行な磁壁が、FeCoV層に容易にかつ連続的に伝搬することが予想される。(6)磁壁形成に必要なソフト層の厚みが約50-100Åであろうと推定される。(7)一方、Fe膜の場合は、微量ソフト層による保磁力減少効果は全く生じない。(8)微量ソフト層のFeCoV膜の磁化過程に及ぼす本質的要因、例えば、FeCoV膜の優先的結晶成長に及ぼす下地ソフト層の影響等の検討が必要であろう。上述した顕著な保磁力減少効果の機構をさらに探索する。特に、保磁力減少効果の磁性層結晶構造との関係及び周囲温度依存性に関して探索する予定である。平成11年度研究項目薄いFeNiMo膜で挟まれたFeCoV及びFeNi膜の磁化特性FeCo系磁性薄膜の軟磁性化の可能性の探索過程で、微量(体積率で1-2%)のFeNiMo層で狭持されたFeCoV膜の磁化過程が変化し、保磁力が大きく減少することを見出した。微量軟磁性薄膜によるFeCoV薄膜の保磁力減少効果の原因等に関する実験的探索を展開した。薄膜試料は真空蒸着装置内で通常の抵抗加熱法を適用し、コーニングマイクロシートガラス0211上に、約1000eの磁場中で、室温で成膜された。磁化特性をVSMで測定し、磁区模様を磁気カー効果で観察した。FeCoV単層膜は保磁力が約1000eの半硬質磁性膜であるが、極薄のFeNiMo膜上に蒸着された2層膜では、保磁力がやく6%に減少する。この現象は2つの異なる磁化特性を有する磁性膜の通常の複合効果、からは説明できない。さらに、この現象は、FeCoV膜の高飽和磁化をほとんど損なうことがなく、実用的価値も高い。同様な現象が、FeNi膜でも観察された。FeCoV膜を狭持する軟磁性膜を変えた実験及び下地FeNiMoの成膜時に磁場を印可しない実験等によって、微量下地軟磁性膜の磁化特性の異方性がFeCoV膜及びFeNi膜の保磁力減少効果に強く関与することが推定された。1.極薄FeNiMoによってFeCoV膜及びFeNi膜に誘導された磁気異方性高飽和磁化を有するFeCoV薄膜のソフト磁性化を実験的に検討した。微量FeNiMo(体積率で約1-2%)と二層膜化されたFeCoV膜の保磁力が単層膜の保磁力の約1/10以下になり、適当な熱処理によって、保磁力が約1/30以下になる。同様な現象がFe50Ni50膜でも確認された。微量ソフト磁性層とFeCoV及びFe50Ni50との二層膜では、下地層の磁化の異方性がセミハード膜の保磁力減少効果に強く関わっていることが判った。さらに、下地層の磁化の異方性と第2層の磁化の異方性の有り無しが保磁力減少効果に関与することも示唆された。また、FeNiMoの上にFeCoV及びFe50Ni50を成膜した場合にのみ保磁力減少効果が顕著にみられる原因として、FeCoV及びFe50Ni50自身の構造変化に伴う磁気特性の変化が起こっているのかどうかの確認を必要とする。Gd・Tb・Dy等の4f遷移金属とFeCoV等の高飽和磁化薄膜との多層膜の磁化特性の探索実験を計画している。
ポリ乳酸生体吸収骨固定材の基礎的研究

【目的】ポリL乳酸(以下PLLAと略す)生体吸収材の生体内経時変化、PLLA骨固定システムの骨癒合過程について動物実験を継続した。【材料および方法】PLLA骨固定システム(プレート:3×20×1mm、4穴、曲げ強度170g、650g、分子量16万・スクリュー:8×2mm径、分子量16万)を試作した。(1)生体内検索として家兎背部皮下へプレートを埋入、経時変化を検討した。(2)骨癒合検索として家兎頬骨骨切りモデルに対し骨固定を施行、金属プレート固定群と経時比較検討した。【結果】(1)生体内検索:埋入したPLLAプレート(曲げ強度650g)は、経時的に白濁、膨化が進行し、移植後24週で分子量約12万、曲げ強度約500gに、52週では分子量約6万4千、曲げ強度約180gまで減少した。組織学的には、いずれの時期においても炎症反応や問題となる病的異物反応は認めなかった。(2)骨癒合検索:金属プレート固定群と差異なく良好な骨癒合を認めた。PLLAプレート固定群では、移植後36週、骨切り部に新生骨による骨癒合が完了し骨切り部は不明瞭となっていた。52週ではスクリュー部分にも溝に沿った骨形成を認めた。いずれの時期においても細片化したPLLAを貪食する組織球が観察されるものの、周囲組織に炎症反応や問題となる病的異物反応を示す所見は認められなかった。目的:ポリ-L-乳酸(以下PLLAと略す)に対し、その生体内変化について動物実験を行った。材料および方法:移植材として分子量10万14万PLLA(2mm径x3mmベレット・5x5x2mmプレート)を用いた。日本白色家兎を用い、硬組織内変化の検索として鼻骨・前頭骨骨欠損部ならびに同骨膜下に、軟組織内変化の検索として背部皮下・筋肉内に移植材を移植、その経時変化について観察した。結果:(1)肉眼的変化:ベレット・プレートとも、移植後2週より加水分解による色調の変化を生じた。本変化は4週以降顕著となり、12週では白色膨化・表面の亀裂を認めた。20週摘出時においても移植材の崩壊、吸収は認められないものの高度に脆弱となった。(2)走査電顕的変化:移植材表面は移植前に平滑であったのに対し、24週摘出時、無数の亀裂や膨化・落屑様の変化を認めた。36週摘出時には表面の亀裂はさらに深く凹凸も顕著となった。(3)組織学的変化:移植後4週では、いずれの部位においても手術侵襲によると思われる炎症細胞浸潤、線維芽細胞の増生を軽微ながら認めるものの異物反応は認めなかった。8週では移植材周囲に線維芽細胞の増生、線維化を認めたが、炎症細胞浸潤や毛細血管の増生などの所見はなかった。24週では移植材に亀裂が生じ、その間隙に周囲組織が侵入し、一部には移植材を取り込む組織球を認めた。32週では、プレートは移植部で触知されず、顕微鏡下にその細片化した存在が確認され、周囲には組織球による貪食像が観察された。40週では移植材はさらに細片化し、これらを貪食する組織球の増加も顕著となった。しかし炎症所見はなく、また周囲の瘢痕組織も金属材料移植時に比し極めて軽微であった。また骨膜からの骨新生像も観察された。【目的】ポリL乳酸(以下PLLAと略す)の生体内変化について動物実験を継続した。【材料および方法】移植材として、2mm径×3mmPLLAペレット(分子量14万)、5x5x2mm PLLAプレート(分子量10万)を用いた。日本白色家兎を用い、軟組織内変化の検索として背部皮下・筋肉内に、硬組織内変化の検索として鼻骨・前頭骨骨欠損部ならびに同骨膜下に移植材を移植、その経時変化を検討した。【結果】(1)肉眼的変化プレートは36週以降、分解吸収により消失し確認されなかった。分子量の高いペレットは経時的に白色膨化、脆弱化が進行し、72週でも確認された。(2)組織学的変化いずれの部位、時期においても炎症細胞浸潤や巨細胞の出現など病的な異物反応所見は確認されなかった。1、軟組織内変化:プレートは48週で確認されず線維組織の残存となった。ペレットは72週で細片化し、周囲には組織球による貧食像が確認された。2、硬組織内変化:骨膜下移植プレートは52週で消失し骨新生像が確認された。骨欠損部移植ペレットは72週で細片化し、組織球により貧食され周囲には骨新生の進行が確認された。(3)分子量変化移植後早期に急激に減少し、以降緩やかなカーブを描き減少した。分子量10万のプレートは36週で4600に、分子量14万のペレットは72週で4000に変化した。【材料および方法】

PLLA骨固定システム(プレート:3×20×1mm、4穴、曲げ強度170g、650g、分子量16万・スクリュー:8×2mm径、分子量16万)を試作した。(1)生体内検索として家兎背部皮下へプレートを埋入、経時変化を検討した。(2)骨癒合検索として家兎頬骨骨切りモデルに対し骨固定を施行、金属プレート固定群と経時比較検討した。【結果】(1)生体内検索:埋入したPLLAプレート(曲げ強度650g)は、経時的に白濁、膨化が進行し、移植後24週で分子量約12万、曲げ強度約500gに、52週では分子量約6万4千、曲げ強度約180gまで減少した。組織学的には、いずれの時期においても炎症反応や問題となる病的異物反応は認めなかった。(2)骨癒合検索:金属プレート固定群と差異なく良好な骨癒合を認めた。PLLAプレート固定群では、移植後36週、骨切り部に新生骨による骨癒合が完了し骨切り部は不明瞭となっていた。52週ではスクリュー部分にも溝に沿った骨形成を認めた。いずれの時期においても細片化したPLLAを貪食する組織球が観察されるものの、周囲組織に炎症反応や問題となる病的異物反応を示す所見は認められなかった。
活性イオウによる心筋ミトコンドリアの品質管理と環境ストレス適応機構

ミトコンドリアが細胞内レドックスバランスを認識する機構としてミトコンドリア分裂促進因子Drp1と融合促進因子Mfn1, Mfn2, Opa1の発現および活性を評価したところ、環境親電子物質メチル水銀によるミトコンドリア異常分裂はDrp1の活性化に起因することが明らかとなった。そこでメチル水銀がDrp1の活性を変化させる機構としてDrp1のポリイオウ化修飾に着目した。Drp1は通常ポリイオウ化により活性が抑制されているが、メチル水銀により脱イオウ化することが分かった。一方、硫化水素を添加し細胞内の活性イオウ量を増加させるとポリイオウ化修飾が回復した。Drp1の活性を制御するポリイオウ化部位を変異体解析により評価したところ、Cys624のポリイオウ化で活性が調節されていることが明らかとなった。次に、ポリイオウ化修飾で活性が調節されるメカニズムについて解析を行った。我々は低酸素刺激依存的なDrp1新規相互作用因子としてアクチン結合蛋白質Filamin Aを同定し、Filamin AはDrp1のGDP/GTP交換因子(GEF)として働くことでDrp1を活性化することを明らかにしてきた。そこでDrp1ポリイオウ化がFilamin Aとの相互作用に与える影響について評価した結果、Drp1 Cys624の脱イオウ化によってFilamin Aとの相互作用が強くなることで活性が調節されていることが明らかとなった。メチル水銀によりミトコンドリアの過剰分裂が起こった心筋細胞は物理的な伸展刺激に対して脆弱なることが明らかとなった。Drp1 Cys624のポリイオウ化ミミック変異体の導入や硫化水素により細胞内活性イオウ量を増加させることで親電子物質による心筋細胞の物理刺激脆弱性は改善した。このことから、Drp1 Cys624のレドック修飾が心臓のストレス適応に関わることが明らかとなった。環境化学物質は微量ではあるものの、化学反応性(親電子性)が高く、生涯にわたってこれら環境因子に曝露されることが疾患リスクを規定する一因になると考えられている。メチル水銀はその神経毒性が良く知られているが、神経毒性を示さない低濃度曝露によって心疾患リスクが上昇するとの疫学的研究結果が報告されている。我々はそのメカニズムを明らかにするために、低濃度メチル水銀を飲水投与したマウス心臓の圧負荷リスクを検討した。その結果、メチル水銀投与マウスでは圧負荷刺激後の心機能低下が顕著であった。メチル水銀飲水投与マウスはコントロールに比べて心筋ミトコンドリアが過剰分裂しており、これと一致するようにミトコンドリア分裂因子Dynamin-related protein 1 (Drp1)の活性が亢進していた。メチル水銀によるDrp1の活性化にはDrp1のシステイン624番が関与することが分かった。ラット胎児由来心筋細胞に低濃度メチル水銀を添加すると、機械伸展ストレスに対して脆弱になるが、これはミトコンドリア分裂を抑制することで回避された。即ち、メチル水銀による心筋ミトコンドリアの過剰分裂が、心疾患リスクの要因であると考えられた。Drp1は細胞内のシステインパースルフィドといった活性イオウ分子種によってシステイン624番がポリイオウ化修飾されており、このポリイオウ化修飾がDrp1の活性を負に制御していることが明らかとなった。親電子的性質を有するメチル水銀は、Drp1のポリイオウ化システインと反応することでDrp1の脱イオウ化を促進させ、Drp1の活性を上昇させることを明らかにした。以上の結果から、Drp1はレドックス応答性の高いシステイン624番のポリイオウ化修飾を介して自身の活性を調節することで、心筋ミトコンドリア品質並びに心疾患リスクに関与することが示唆された。環境化学物質の曝露と心疾患リスクの関連性を調べるために、外因性親電子物質であるメチル水銀をモデルに、低用量メチル水銀曝露がマウスの心疾患リスクに与える影響を検討した。そして、メチル水銀曝露による心筋ミトコンドリアの過剰分裂が圧負荷脆弱性の引き金になっていることをIn vivoマウスモデルから明らかにした。また、メチル水銀はミトコンドリア分裂制御因子であるDrp1を活性化することでミトコンドリア分裂を誘導することも見出した。次に、メチル水銀がDrp1を活性化するメカニズムについて検討を行った。メチル水銀は親電子性を有し、標的タンパク質のシステインチオール基をS-水銀化修飾することが知られている。細胞死を誘導する高濃度のメチル水銀処置では確かにDrp1のs-水銀化修飾が確認されたが、ミトコンドリア分裂を誘導する低濃度のメチル水銀処置ではDrp1のs-水銀化修飾は見られなかった。一方、Drp1はシステイン624番がポリイオウ化修飾されることで活性が負に制御されており、メチル水銀はDrp1ポリイオウ化システインから硫黄を引き抜くことでDrp1活性化を誘導することを見出した。これまでの結果を基に、Drp1はシステイン624番を介してレドックスセンサー分子として機能すること、環境化学物質による活性イオウの枯渇が疾患リスクの引き金となるモデルを立て、検証を進めている。

Drp1は通常ポリイオウ化により活性が抑制されているが、メチル水銀により脱イオウ化することが分かった。一方、硫化水素を添加し細胞内の活性イオウ量を増加させるとポリイオウ化修飾が回復した。Drp1の活性を制御するポリイオウ化部位を変異体解析により評価したところ、Cys624のポリイオウ化で活性が調節されていることが明らかとなった。次に、ポリイオウ化修飾で活性が調節されるメカニズムについて解析を行った。我々は低酸素刺激依存的なDrp1新規相互作用因子としてアクチン結合蛋白質Filamin Aを同定し、Filamin AはDrp1のGDP/GTP交換因子(GEF)として働くことでDrp1を活性化することを明らかにしてきた。そこでDrp1ポリイオウ化がFilamin Aとの相互作用に与える影響について評価した結果、Drp1 Cys624の脱イオウ化によってFilamin Aとの相互作用が強くなることで活性が調節されていることが明らかとなった。メチル水銀によりミトコンドリアの過剰分裂が起こった心筋細胞は物理的な伸展刺激に対して脆弱なることが明らかとなった。Drp1 Cys624のポリイオウ化ミミック変異体の導入や硫化水素により細胞内活性イオウ量を増加させることで親電子物質による心筋細胞の物理刺激脆弱性は改善した。このことから、Drp1 Cys624のレドック修飾が心臓のストレス適応に関わることが明らかとなった。まずはDrp1がレドックスセンサーとして環境化学物質をセンスするメカニズムを検証していく。これまでに単離心筋細胞を用いた系において、メチル水銀はDrp1の脱イオウ化を誘導することで活性を制御することを明らかにしてきた。そこで、メチル水銀以外の環境化学物質についても同様にDrp1のポリイオウ化レベルの減少を引き起こすのかについて調べる。Drp1以外のミトコンドリア制御分子(Mfn1, Mfn2, Opa1)についてもレドックスセンサーとして機能しているのかを検証する。さらに、環境化学物質を投与したマウス心臓においてDrp1の活性およびポリイオウ化レベルが変動しているかを検証する。加えて、環境化学物質を投与したマウスや様々な疾患モデルマウスにおける活性イオウ量の変動を調べることで、環境化学物質と活性イオウのバランスが破綻することが心疾患リスクを規定する要因となっているのかを検証する予定である。(理由)活性イオウ産生酵素CARS2欠損マウスの繁殖に時間がかかっているために、このマウスを用いたIn vivo実験にかかる費用は次年度に繰り越した。(使用計画)平成29年度はCARS2欠損マウスを用いた病態モデルマウスの作製、飼育と個体レベルでの機能解析を行うための物品費が主要な使用目的となる。さらには2018年9月京都で行われる日本生化学会大会への出張費、さらには海外学会への出張費、論文の投稿費用を計画している
試験管内における肝組織の再構成とその人工肝臓応用への基礎的研究

1我々は、初代培養肝細胞を用いた実験により肝幹細胞様細胞(small hepatocytes)の分離、同定を行い、また肝細胞の分化、増殖に関わる諸因子の影響を検討してきた。small hepatocytesはコロニーを作るように増殖をし、1個の細胞が数百個の細胞に増殖した。この細胞は増殖因子を培養液中に加えなくても増殖するが、TGF-αを加えるとその増殖が良く促進された。small hepatocytesのコロニーは非実質細胞、特に肝上皮様細胞や星細胞に囲まれるとその増殖が抑制され、それらの細胞がコロニーの下に潜り込むとsmall hepatocytesは徐々にその形を変え、立方形や直方形になった。つまり、small hepatocytesはその体積を増し、背丈が高くなった。超微構造を観るとミトコンドリアやペルオキシゾームなどの細胞内小器官やtight junction,gap junction,desmosomeなどの結合装置が発達し、グリコーゲン顆粒が豊富で明らかに成熟した肝細胞であった(論文投稿中)。2我々は又、培養肝細胞が分化能を維持する条件の検討も行った。分離した細胞を一旦増殖させ、そのうえで分化誘導をかけると生体内に近いレベルまで分化機能を誘導できることがわかった。この実験系において培養肝細胞は、高分化した肝細胞でのみ誘導されると考えられるTryptophan oxygenase、Serine dehydrataseやP-450などの酵素を持ち、ギャップ結合蛋白質のconnexin32,26を発現していた。3増殖期の肝細胞がその増殖を止め、分化するときに遺伝子の転写調節が急激に変化するが、そのときに重要な働きをする因子を検索した。肝臓に多く発現している転写因子にはHNF-1,-3,-4,C/EBP-α,β,δなどがあるがそのうち、HNF-3γ,HNF-4,C/EBP-α,-βの発現が十分になされていることが肝細胞特異的な高分化機能を発現するようになるためには重要であることが解った。成熟ラット肝臓から小型肝細胞(幹細胞)を効率よく分離する方法を検討した。肝細胞はcollagenaseによる分散後、ほとんどの成熟肝細胞は50xg1分間の遠心により沈殿するが小型肝細胞もこの画分に多く含まれる。しかし、個々バラバラになった小型肝細胞は上清中にも含まれる。そこで上清を用いてその中に存在する小型肝細胞の単離を試みた。percoll gradientを高速遠心にて作製し、比重の差を利用して小型肝細胞を分離しようとしたがstellatecells(伊東細胞)と線維芽細胞との完全分離はできず、又、コロニーの出現効率も悪かった。上清画分からのコロニー形成を指標に各種増殖因子の影響を調べた。EGF,TGF-α,HGF,acidic FGFのコロニー形成能はほぼ等しく、コロニーを構成する細胞数ではTGF-αを培養液に加えた時が最も良かった。ヒト肝臓から小型肝細胞の分離を試みた。高年齢者の肝細胞であり、コロニーの出現率は良くなかったが、コロニー形成は認められ、ヒトの肝臓にも幹細胞に相当する細胞が存在することが解った。増殖期の肝細胞が増殖を止め、分化するときに遺伝子の転写調節が急激に変化すると考えられるが、そのときに重要な働きをするであろう因子を検索した。肝臓に多く発現している転写因子にはHNF-1,-3,-4,C/EBP-α,β,δなどがあるがそのうち、HNF-3γ,HNF-4,C/EBP-α,-βの発現が十分になされていることが肝細胞

特異的な高分化機能を発現するようになるためには必須であることが解った(論文投稿中)。成熟ラット肝臓から小型肝細胞(small hepatocytes)を効率よく分離する方法を検討した。肝細胞はcollagenaseによる分散後、50xg1分間の遠心により得られた上清をさらに50xg5分間遠心した。150xg5分間の遠心を繰り返すことにより多くの大型の肝細胞が死ぬため、small hepatocytesを多く含む細胞浮遊液が得られる。small hepatocytesはコロニーを作るように増殖をし続けた。この細胞は増殖因子を培養液中に加えなくても増殖するが、TGF-αを加えるとその増殖が良く促進された。small hepatocytesのコロニーは非実質細胞、特に肝上皮様細胞や星細胞に囲まれるとその増殖が抑制され、それらの細胞がコロニーの下に潜り込むとsmall hepatocytesは徐々にその形を変え、立方形や直方形になる。つまり、small hepatocytesはその体積を増し、背丈が高くなる。超微構造を観るとミトコンドリアやペルオキシゾームなどの細胞内小器官が発達し、グリコーゲン顆粒が豊富で明らかに成熟した肝細胞であった。肝細胞と非実質細胞の間にはtypeIV collagenやlamininに富んだ基底膜様構造ができていた。成熟化した肝細胞間にはtight junction,gap junction,desmosomeなどの結合装置が良く発達し、毛細胆管が形成されていた。Fluorescein diacetateを投与して肝細胞のpolarityを調べるとfluorescenceがその毛細胆管内に分泌され、tight junctionによりシールされている毛細胆管が網の目のようにつながっている像を観ることができた(論文投稿中)。in vitroで肝組織に類似した構造を作ることに成功した。この結果をさらに発展させて人工肝臓を作ろうと考えている。
ウイルスベクターを使用しない安全な血友病遺伝子・細胞治療法の確立

血液凝固第VIII因子(FVIII)は主に肝臓の類洞内皮細胞で産生されていることが知られている。FVIIIは巨大なタンパク質で、切断や糖鎖修飾など、複雑な翻訳後修飾を経て、ER経路を経て分泌される。その為、未熟な多能性幹細胞よりも、ER経路がより発達した肝臓細胞や血管内皮系細胞の方が基本的にはFVIIIの分泌が高いことが期待される。そこで、さらに優れたFVIII産生細胞がないか検討するために、FVIIIを恒常的に発現しているiPS細胞を、EB(胚様体)形成を経てランダムに三胚葉由来の細胞群へ分化させ、FVIIIを高発現している細胞群を免疫染色後にソートし、ERマーカーや細胞表面マーカーから、どの様な細胞種においてFVIIIの発現が高いか探索を行った。最後に血友病Aマウスモデルで細胞移植実験を行う。温度応答性細胞回収培養皿(セルシード社UpCell)を使いFVIIIを発現する細胞シートを作製しマウスの皮下へ移植する。細胞シートは生体内移植後の機能的接着に有効であるとともに、外来性マトリックスを使用しないため移植に伴う炎症を少なく押さえることが可能である。細胞移植実験後の治療効果は、1抗第VIII因子抗体(インヒビター)産生量のELISA測定、生体内での免疫応答を確認するための2サイトカインアッセイ(IL-6 TNF-αなど)、3T細胞増殖試験、制御性T細胞誘導試験(FVIII特異的制御性T細胞発現誘導の検討)などを行い、免疫寛容成立のメカニズムを詳細に検討する。また同時に、実験によって起こり得る副反応等も慎重に観察する自己細胞を用いた血友病A細胞治療をさらに安全に臨床応用するには、ウイルスベクターを使用せずに患者自身の細胞へFVIIIを効率よく遺伝子導入し、持続して発現させることができるベヒクル細胞を大量に作製する方法を確立する必要がある。そこで構築したpiggyBacトランスポゾン由来のFVIII発現ベクターを血友病患者由来のヒトiPS細胞へ導入し、FVIII遺伝子発現を検討する必要がある。また、FVIIIを導入したiPS細胞を様々な細胞へ分化誘導することで、FVIIIがどの細胞で効率よく発現し分泌することが明らかになれば、細胞治療に必要なベヒクル細胞を患者iPS細胞から無限大に大量に作製することが可能となる。GFP発現プラスミドのサイズが4.1Kbであるのに対してヒト第VIII因子(FVIII:全長型、Bドメイン欠如型、ブタとヒトのハイブリッド型)発現プラスミドは、それぞれ10.6 kb、8.1 kb、8.0 kbとサイズが大きく、プラスミド導入の効率が低下することが予想される。これまでの検討では同時に遺伝子導入を行うpiggyBac転移酵素(transposase)発現プラスミドとの比率1:4が最も効率よく遺伝子導入が可能であった。前年度は、新規遺伝子導入法(Neon, Nucleofector, NEPA21等の電気穿孔法)や、ベクターの複数回投与等行い遺伝子導入効率の向上を検討した。その結果サイズが大きくなればなるほど遺伝子導入効率は低下するが、複数回投与することで、十分なFVIII遺伝子発現に成功した。各種細胞に新規piggyBacトランスポゾン由来のFVIII発現ベクターを用いて遺伝子導入を行い、十分なFVIII活性の分泌を確認している。血友病遺伝子細胞治療に対する新しい遺伝子導入ツールとして非ウイルス型のpiggyBacトランスポゾン由来のベクターを開発し、臨床応用へ向けた有効性を確認する。本ベクターは従来のウイルスベクターの様な封じ込めP2レベルでの取り扱いが不要で、ウイルス由来タンパク質に対する免疫応答のリスクも少ない。目的細胞に転移酵素と同時にプラスミド導入を行うという簡便な操作で、安価に高効率で目的遺伝子の挿入ができるプラスミドDNAベクターである。これまでのウイルスベクターでは不可能であった、大きなサイズのcDNA全長を導入できる革新的なシステムで次世代型血友病遺伝子細胞治療法の確立を目指してきた。その結果これまでに、1iPS細胞からFVIII生産細胞への分化誘導を検討した。FVIIIの分泌生産に適した細胞種マーカーを指標に、健常人iPS細胞および血友病患者由来iPS細胞を目的の細胞種へと分化誘導を行った。その結果改良型FVIIIを発現するDox応答型piggyBacベクターの構築に成功した。2半透膜デバイスによる高機能獲得型FVIII発現の検討水溶性分泌タンパク質であるFVIIIは透過するが、数十μmを超える細胞は透過しない1-2μmの孔径をもつ生体親和性のポリエチレンテレフタレート膜でデバイスを作成し、FVIII生産細胞を内部へ封入する。可溶性栄養分の流入やFVIII分泌を効率化するために、表面積を広くした円盤状の新規開発デバイスであり、培養皿上で長期にわたりFVIIIの分泌効率および、生産細胞の生存を観察した。現在分化細胞に導入して、従来型との分泌量比較実験を行っている。また血友病Aマウスの背面皮下にデバイスを移植し、市販のTheraCyteデバイスとの比較、およびデバイスの有無においてFVIIIの血中生産量、中和抗体の生成、および発現期間を検討している。一般にES細胞やiPS細胞等の未分化多能性幹細胞は、レンチウイルスベクター等による遺伝子導入効率が悪く、また導入した外来遺伝子の発現が維持できないサイレンシング現象がみられる。我々のiPS細胞におけるGFP遺伝子を導入した検討において、新規piggyBacベクターはレンチウイルスベクターよりも遺伝子導入効率がよく、また導入された遺伝子のサイレンシングもかなり回避出来ることを見出している。これらについては、分泌されるFVIII活性の長期持続性によって確認する。

また血友病患者より樹立したiPS細胞へもFVIII発現piggyBacベクターを導入し、FVIIIの発現分泌を測定する。FVIIIは主に肝臓の類洞内皮細胞で産生されていることが知られている。FVIIIは巨大なタンパク質で、切断や糖鎖修飾など、複雑な翻訳後修飾を経て、ER経路を経て分泌される。その為、未熟な多能性幹細胞よりも、ER経路がより発達した肝臓細胞や血管内皮系細胞の方が基本的にはFVIIIの分泌が高いことが期待される。そこで、さらに優れたFVIII産生細胞がないか検討するために、FVIIIを恒常的に発現しているiPS細胞を、EB(胚様体)形成を経てランダムに三胚葉由来の細胞群へ分化させ、FVIIIを高発現している細胞群を免疫染色後にソートし、ERマーカーや細胞表面マーカーから、どの様な細胞種においてFVIIIの発現が高いか探索を行っているが、データが安定せず移植実験へ進むことが遅れた血液凝固第VIII因子(FVIII)は主に肝臓の類洞内皮細胞で産生されていることが知られている。そこで、さらに優れたFVIII産生細胞がないか検討するために、FVIIIを恒常的に発現しているiPS細胞を、EB(胚様体)形成を経てランダムに三胚葉由来の細胞群へ分化させ、FVIIIを高発現している細胞群を免疫染色後にソートし、ERマーカーや細胞表面マーカーから、どの様な細胞種においてFVIIIの発現が高いか探索を行った。最後に血友病Aマウスモデルで細胞移植実験を行う。温度応答性細胞回収培養皿(セルシード社UpCell)を使いFVIIIを発現する細胞シートを作製しマウスの皮下へ移植する。細胞シートは生体内移植後の機能的接着に有効であるとともに、外来性マトリックスを使用しないため移植に伴う炎症を少なく押さえることが可能である。細胞移植実験後の治療効果は、1抗第VIII因子抗体(インヒビター)産生量のELISA測定、生体内での免疫応答を確認するための2サイトカインアッセイ(IL-6 TNF-αなど)、3T細胞増殖試験、制御性T細胞誘導試験(FVIII特異的制御性T細胞発現誘導の検討)などを行い、免疫寛容成立のメカニズムを詳細に検討する。また同時に、実験によって起こり得る副反応等も慎重に観察する一般にES細胞やiPS細胞等の未分化多能性幹細胞は、レンチウイルスベクター等による遺伝子導入効率が悪く、また導入した外来遺伝子の発現が維持できないサイレンシング現象がみられる。我々のiPS細胞におけるGFP遺伝子を導入した検討において、新規piggyBacベクターはレンチウイルスベクターよりも遺伝子導入効率がよく、また導入された遺伝子のサイレンシングもかなり回避出来ることを見出している。
シナプトタグミンファミリーの膜局在化シグナルの解析

シナプトタグミンはマウスにおいて遺伝子レベルで少なくとも13種類のアイソフォームが存在することが知られているが、シナプトタグミン1以外のアイソフォームの機能、組織分布及び細胞内局在はほとんど明らかにされていない。そこで本年度は三つの異なるサブグループに属するシナプトタグミン4,5,7に対する特異的な抗体を作成し、その詳細な組織分布および細胞内局在を検討した。その結果、これら三種類のシナプトタグミンは異なる組織分布を示すだけでなく、同一の細胞においても(PC12細胞)全く異なる細胞内局在を示すことが明らかとなった。すなわちシナプトタグミン4はゴルジ体に、シナプトタグミン7はトランスゴルジネットワークに、そしてシナプトタグミン5は有芯顆粒上に存在していた(Biochem. J. (2002)365,173-180;J. Biol. Chem. (2002)277, 24499-24505;J. Biol. Chem.(2003)278,in press)。これらのシナプトタグミンはいずれも6つのドメイン(細胞外アミノ末端ドメイン、膜貫通領域、スペーサードメイン、C2Aドメイン、C2Bドメイン、カルボキシル末端ドメイン)から構成されているが、スペーサー領域ではアイソフォーム間の保存性が特に低くなっている。従って、シナプトタグミン4,5,7の細胞内分布の違いはスペーサー領域に起因するものと予想され、実際、欠失変異体を用いた解析からシナプトタグミン4分子においてはスペーサー領域がゴルジ体局在化には不可欠であることが明らかとなった。申請者はこれまでの研究からシナプトタグミン1に関しては神経終末(axon)のシナプス小胞に、シナプトタグミン4に関してはゴルジ体から主にポストシナプス(dendrite)方向へ輸送される小胞(膜)に局在することを明らかにしている。そこで本年度はまずこれら二つのアイソフォームが何故異なる小胞に局在するのかを分子レベルで明らかにするため、シナプトタグミン4分子のゴルジ体局在化シグナルの同定を試みた。シナプトタグミン、ファミリーはいずれも6つのドメイン(細胞外アミノ末端ドメイン、膜貫通領域、スペーサードメイン、C2Aドメイン、C2Bドメイン、カルボキシル末端ドメイン)から構成されているので、まず各ドメインあるいは幾つかのドメインを欠損した様々な変異体タンパク質(T7及びFLGAタグ付き)を作成した。次にこれらの欠失変異体をPC12細胞(シナプトタグミン4を内在的に発現する細胞株)に強制発現させ、免疫組織・細胞膜分画、電子顕微鏡による解析を行った結果、アイソフォーム間で保存性の最も低いスペーサー領域がシナプトタグミン4分子のゴルジ体局在化には不可欠であることが明かとなった(Fukuda, M., Ibata, K.and Mikoshiba, K.(2001)J.Neurochem.77,730-740)。
光メモリー機能を有するフォトクロミック錯体高分子の合成

フォトクロミック化合物のcis-1,2-dicyano-1,2-bis(2,4,5-trimethy1-3-thienyl)ethane(cis-dbe)、を有する4種の新規Ag(I)錯体([Ag_2(cis-dbe)(X)_2](X=CF_3COO(1),C_2F_5COO(2),C_3F_7COO(3),[Ag_2(cis-dbe)(CF_3SO_3)_2](4))の合成に成功し、いずれも単結晶X線構造解析にも成功した。1と2の両錯体は、cis-dbeのシアノ基およびチエニル基のSに4個のAgが配位することにより一次元鎖を形成している。1および4では、アニオンは一次元鎖内のAg同士を架橋しているが、2および3では、アニオンは隣り合う一次元鎖を架橋し、二次元シートを形成している。1の黄色錯体は405nmの光照射で、閉環構造の赤色に変化し、523nmにピ-クを有するスペクトルを与えた。これに523nmの光照射をすると再び黄色に戻り、523nmのピークが消滅した。2-4の錯体も同様にフォトクロミズムを示すことを明らかにした。軌道エネルギーの計算結果より、HOMOからLUMOへ一重項励起した後、thienyl基が回転しながら、光閉環反応が起こり、この際にHOMO、LUMO間で軌道の対称性が反転うることを示した。またCI法による励起状態の反応解析は、H-dbe、F-dbeのHOMOからLUMOへの励起波長が、いずれも閉環体が開環体に比べ長波長側にあり、定性的には実験値と合致する結果を得た。置換基効果に関しては、閉環体の励起エネルギーが、cis-dbe>F-dbe>H-dbeの順であつた。その原因として、まず計算結果より、LUMOの軌道エネルギーは電子吸引性の強さの順(F>H>CH_3)に応じて下がっていること、またHOMOの軌道エネルギーは基底状態のエネルギーの順(F-dbe>cis-dbe>H-dbe)に応じて下がっていることが示された。その結果、HOMO-LUMO間のエネルギー差はcis-dbe>F-dbe>H-dbeになることが明らかにされたフォトクロミック化合物のcis-1,2-dicyano-1,2-bis(2,4,5-trimethy1-3-thienyl)ethane(cis-dbe)、を有する4種の新規Ag(I)錯体([Ag_2(cis-dbe)(X)_2](X=CF_3COO(1),C_2F_5COO(2),C_3F_7COO(3),[Ag_2(cis-dbe)(CF_3SO_3)_2](4))の合成に成功し、いずれも単結晶X線構造解析にも成功した。その結果、HOMO-LUMO間のエネルギー差はcis-dbe>F-dbe>H-dbeになることが明らかにされたフォトクロミズムを有する化合物にcis-1,2-dicyano-1,2-bis(2,4,5-trimethyl-3-thienyl)ethene(cis-dbe)がある。これは、固体、溶液状態に関わらず、波長405nmの光照射で2つのチオフェン環が閉環することにより黄色から赤色に変化し、546nmの光照射で再び開環し黄色に戻る。我々はcis-dbeのCu(I)錯体ポリマーが固体状態でもフォトクロミズムを示すことを明らかにしてきた。本研究でcis-dbeを有する4種の新規Ag(I)錯体の合成に成功した。

1および4では、アニオンは一次元鎖内のAg同士を架橋しているが、2および3では、アニオンは隣り合う一次元鎖を架橋し、二次元シートを形成している。1の黄色錯体は405nmの光照射で、閉環構造の赤色に変化し、523nmにピークを有するスペクトルを与えた。これに523nmの光照射をすると再び黄色に戻り、523nmのピークが消滅した。2-4の錯体も同様にフォトクロミズムを示したが、4は1-3と比較して閉環反応に要する時間が長かった。これは、(1)σ結合を形成するチエニル基のC(1)...C(1')間の距離が、1-3では3.453.51Åであるのに対し、4では3.61Åでより遠いこと、および(2)1-3はAg-S距離が2.792.92Åと長いのに対し、4では2.52Åと短く、チエニル基がより強く固定されていることから、4では閉環反応が起こりにくいと考えられる。軌道エネルギーの計算結果より、HOMOからLUMOへ一重項励起した後、thienyl基が回転しながら、光閉環反応が起こり、この際にHOMO、LUMO間で軌道の対称性が反転うることが示された。またCI法による励起状態の反応解析は、H-dbe、F-dbeのHOMOから、LUMOへの励起波長が、いずれも閉環体が開環体に比べ長波長側にあり、定性的には実験値と合致する結果を得た。置換基効果に関しては、閉環体の励起エネルギーが、cis-dbe>F-dbe>H-dbeの順であった。その原因として、まず計算結果より、LUMOの軌道エネルギーは電子吸引性の強さの順(F>H>CH3)に応じて下がっていること、またHOMOの軌道エネルギーは基底状態のエネルギーの順(F-dbe>cis-dbe>H-dbe)に応じて下がっていることが示された。その結果、HOMO-LUMO間のエネルギー差はcis-dbe>F-dbe>H-dbeになることが明らかにされた。
人工関節摺動面の潤滑特性向上に関する基礎的研究

現在、整形外科領域で臨床に用いられている人工関節摺動面の材質は、超高密度ポリエチレン製のソケットと、金属(SUS316L、Co-Cr合金)やセラミックス(アルミナ、ジルコニア)製のボールとの組み合せが一般的である。この摺動面が摩耗すると、人工関節の再置換をおこなわなければならなくなる。また摺動面で発生した摩耗粉は、ステムと骨との間に入り込み、ルーズニングの原因となる。研究代表者は、軸受の潤滑機構に関する研究を人工関節に応用し、人工関節摺動面の摩擦・摩耗を減少させ、その寿命を延長させることを目的として研究をおこなった。研究代表者は、軸受の潤滑面に微細な凹凸パターンを付加することによって、潤滑特性が向上することを確認している。人工関節摺動面においても、軸受と材質は異なるが同様の効果が期待できると考え、人工関節摺動面に用いられている材質(超高密度ポリエチレン、SUS316L)を用いて潤滑実験をおこなった。まず基礎的な摩擦・摩耗実験装置を設計・試作し、表面に凹凸とパターンを付加した試料での潤滑実験の結果と、凹凸パターンを付加しない試料での潤滑実験の結果を比較した。その結果、摩擦面に凹凸パターンを付加した試料は、摩擦係数や摺動面の摩耗状態、摩擦力の安定性などの面で優れた特性を示すことが確認できた。また、パターンの形状・分布などに関して、最適な条件を得ることができた。次に上記の基礎実験結果をふまえ、実際の人工関節を模擬した摩擦・摩耗実験装置を設計・試作し、歩行状態を模擬した変動荷重を与えて潤滑実験をおこなった。その結果、臨床使用を模擬した実験でも、摺動面への凹凸パターン付加の有効性が確認された。
軽量小物体の精密把握運動における把握力制御について

健常成人を対象に手指での6gから200gまでの軽量小物体の精密把握運動中の把握力・持ち上げ力関係について調べた。重量が22g以下では把握面の摩擦状況に関わらず軽量程把握力/持ち上げ力比、把握力に占める安全領域の割合、力の変動係数が増大した。重量弁別実験および指先の物理的変化実験からは皮膚感覚情報が軽量物体把握時に減少することが示唆された。軽量域での把握力の変動増大と安全領域の上昇は、被験者自身が随意的に把握力を必要以上に上昇させていることも示しており、把握力の対費用効果が軽重量域では重い重量とは異なり対生理学的効率よりも対心理的安定性を重視する戦略が取られていることが示唆された。本研究では、100g以下の軽量な小物体の精密把握持ち上げ運動における把握力と持ち上げ力(重量)の協調機能および把握力の余剰分である「安全領域:safety margin」の調節機能、それらと指先の皮膚の摩擦係数の非線形的変化、および皮下の組織の弾性(ステイフネス)変化との関係について明らかにすることを全体の目的とした。平成24年度では、昨年度に製作された超小型軽量を用いて20名の健常成人と20名の高齢者を対象として本実験を実施した。さらに昨年度製作されたポジションセンサーと力覚センサーを用いた指先の皮膚下組織のステイフネス計測装置を用いて予備実験のデータ収取も実施した。また、本研究用に開発したMATLABによるデータ分析ソフトを用いて、それらのデータ解析を行い、把握運動時の力と時間変数(把握力最大値、把握力および持ち上げ力の微分最大値、安定把握時の把握力および持ち上げ力、滑り発生時の把握力、滑り係数、把握力の安全領域値)を求めた。それらの統計的な検討は現在進行中である。ポジションセンサーと力センサーを用いた指先の弾性変化、および把握指の接触面積と力関係に関するデータ解析プログラムを完成させた。これまで得られた本研究の成果を、カナダ・バンクーバーでの国際学会(Progress in Rehabilitation Research,平成24年10月9日13日開催)、国内学会(日本体力医学会、岐阜大学:平成24年9月14日16日、および運動学習研究会、大阪大学:平成24年2012年6月17日18日)での発表も行った。本研究では、100g以下(6g200g)の軽量な物体操作時の指先が発揮する力の成分(垂直および水平成分)を経時的に計測可能な装置を開発し、それを用いて把握運動制御における力調節の機能を詳細に探ることを目的とした。25年度では、昨年実施された40名(青年群20名および高齢者群20名)のデータ解析を完了し、評価指標に基づく統計処理を実施した。その結果、25g以下の物体把握では、発揮される把握力と重量との比、およりその安全領域の安定把握力に対する比率も100g以上の重量での場合に比べて有意に大きくなることが判明した。この現象は、微量な重量の物体を把持する際には微細な把握力調節機能が減退することを示唆するものと考えられた。25年度では、昨年実施された把握面接触面積、指先皮下組織の粘弾性特性、把握面との吸着性に関する追加実験のデータの解析も行われた。また、2件法による微細な重量弁別テストも青年群で追加実験として実施した。把握力実験とこれらの追加実験での結果から、軽量物体操作時の過大な把握力安全領域には、(1)把握面接触面積の微小化により指先部の活動可能な蝕圧受容器数の減少、(2)微量な把握力と微小な指先皮膚変位による蝕圧受容器への刺激の低下、(3)皮膚面の吸着力の相対的影響の増大、(4)これらに関連する微細な重量弁別機能の低下、などが関連することが示唆された。これらの結果の一部は、米国で開催された北米神経生理学会WCPT-AWP(2013年9月5日9日:台中)、京都で開催されたNeuro2013 (2013年6月20日23日:京都)、第48回日本理学療法学術大会(2013年5月24日26日:名古屋)、健康スポーツ科学研究会(2014年1月11日:武庫川女子大学)において発表した。