hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素固定化マイクロリアクターを用いる高分子の精密合成技術

本研究では、酵素とポリリジンの複合体を分子間架橋することで、ラッカーゼ酵素固定化マイクロリアクターを開発した。この固定化ラッカーゼは酵素活性を保ったまま、繰り返し再利用が可能であった。また、得られたラッカーゼ固定化マイクロリアクターは酵素反応を利用した高分子合成の技術開発に応用した。本研究では、酵素とカチオン性ポリマーであるポリリジンの複合体を分子間架橋することによりマイクロチャネル表面に酵素を固定化する独自の技術を応用し、長時間・繰り返し再利用が可能なラッカーゼ固定化マイクロリアクターを開発行うとともに、高分子合成に応用した。最終年度は研究計画に基づき、初年度に作製したラッカーゼ固定化マイクロリアクターを用いた高分子合成を行った。合成高分子の数平均分子量および分子量分布は、反応温度に依存すると考えられたため、先ず、マイクロリアクターの熱安定性を評価した。しかしながら、溶液状態の酵素よりも熱安定性が低下した。これは、酵素固定化時に用いた還元反応がラッカーゼの活性中心に存在する銅イオンへ影響したためと考えられた。そこで、還元反応を行わない条件で再度ラッカーゼ固定化マイクロリアクターを作製した。その結果、ラッカーゼ固定化マイクロリアクターは架橋反応による失活は見られず、酵素活性を保持していた。また、溶液状態の酵素よりも優れた熱安定性を示した。このマイクロリアクターをポリアクリルアミドの合成へ利用した。ラジカル分子は2, 4-pentandioneを基質として調製し、モノマー分子にはアクリルアミドを用いた。その結果、目的物であるポリアクリルアミドの生成を確認した。また、モノマー分子の流入速度、反応温度、重合反応部のチューブの長さと内径を調節することにより、合成高分子の数平均分子量および分子量分布が制御可能であることを見出した。初年度は研究計画に基づき、ラッカーゼ酵素の固定化条件を確立した。酵素の等電点(pI)は一般的にpI = 46であり、効率のよい酵素の固定化にはポリリジンを必要とする。固定化条件を最適化するため、異なるサイズのポリリジン2種を用い、固定化率および触媒活性を比較した。加えて、架橋剤の濃度が高い場合は固定化率が高いが活性低下が起こりやすい、一方、低い架橋剤濃度では活性は保持されるが固定化率は低くなることが考えられるため、固定化反応の架橋剤濃度の最適化も合わせて行った。これらの実験はサンプルチューブ内で行い、迅速に比較・検討した。また固定化されたラッカーゼの触媒活性評価には合成基質を用い、その吸光度変化を96穴タイタープレートリーダーにより評価した。その結果、ラッカーゼ固定化マイクロリアクター作製に最適な固定化条件を決定した。この結果をふまえて、マイクロリアクターの作製を行った。操作にはこれまで開発・利用している二重管構造のデバイスを用いた。ラッカーゼ固定化マイクロリアクターの触媒活性は合成基質を用いて評価し、サンプルチューブ内での固定化酵素と同様に触媒活性を保持していることを確認した。また、研究結果は論文発表と学会発表を行い、国内外に発信した。初年度の研究計画はラッカーゼ酵素の固定化法の最適条件の検討であった。現在までに、その固定化法の確立とマイクロリアクター作製への適用を行った。また、初年度に得られた研究結果は論文発表と学会発表を行っている。その為、研究はおおむめ順調に進展していると考える。本年度は作製したラッカーゼ固定化マイクロリアクターを用いた高分子の合成を行う。モデルとしてポリアクリルアミドの合成を検討する。ラジカル分子は2, 4-pentandioneを基質として調製し、モノマー分子にはアクリルアミドを用いる。ラッカーゼによる2,4-pentandioneの処理量、即ちラジカル分子の生成量はその後のモノマー分子の重合反応に重要と考えられる。そのため、マイクロリアクターの長さと内径を適宜変更して、最も効率のよいマイクロリアクターの形状を見いだす。合成高分子の数平均分子量および分子量分布は、モノマー分子の流入速度、反応温度、重合反応部のチューブの長さと内径を調節することにより制御可能と考えられる。また、必要であれば、カオスミキサーを用いることで効率的な重合反応を行う。加えて、重合反応では溶存酸素がその反応効率を低下させる可能性がある。その為、モノマー分子溶液を脱気することで、酸素濃度を低く抑え、反応効率を改善する。合成された高分子の分子量および分子量分布度の評価は既存のHPLCを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより行う。研究成果は論文発表するとともに可能であれば、特許出願を行い、積極的に国内外に発信を行う。初年度は計画していた研究課題が順調に進展した。その為、予想していた試薬や消耗品を購入する必要がなく、研究費に繰越金が生じた。そこでこの繰越金で、少量のサンプル量で結果の検討が可能な超微量パーソナル分光光度計を購入し、迅速な分析に利用する。また、最終年度も引き続き各試薬、マイクロリアクター作製材料と消耗品を購入する。加えて、論文投稿時の英文校閲および、学会発表などの成果発表に研究費を使用する。
根毛と膜輸送システムから解く植物の無機イオン吸収と蓄積の機構

私は、植物の無機イオンや水の吸収と蓄積の詳細なメカニズムを明らかにするために、膜輸送システムと根毛に注目し、実験の過程で見出した新規タンパク質に焦点をあて、研究を進めている。下記、2項目に分け本年度の実施状況を記述する。(1) 1年度目に中心的に進めていた新規な無根毛株を用いた実験の過程で、プロテオミクス解析により、リン酸欠乏時の根毛にのみ検出されたタンパク質を見出し、SRPP (Seed and Root-hair Protective Protein)と名付けた。まず、機能欠失株を入手し、野生株と表現型を比較することにより、SRPPは乾燥などのストレスから根毛や胚、花粉を保護する役割をしているのではないかと推定した。さらに、GFPを融合させたSRPPタンパク質の局在を観察行い、細胞壁に局在していることが分かった。遺伝子欠失株srppの電子顕微鏡での観察により、SRPPは正常な細胞壁の構築に関与していると考えられた。これらの成果を論文として今年度発表した。現在、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞系でSRPPタンパク質を合成・精製し、生化学的特性の解析を進めている。(2)当研究室で見出した新規カルシウム結合タンパク質PCaP1は、既知のカルシウム結合ドメインを持たない天然変性領域の多いタンパク質である。PCaP1は植物の全組織に恒常的に発現しているが、機能欠失株pcap1において顕著な表現型は見つかっていなかった。地上部においてはPCaP1が気孔の閉鎖に関与していることを見出し、昨年度に論文発表を行ったが、根における機能は未解明であった。そこで、根の機能に焦点を当てて解析したところ、pcap1では水分屈性に異常を示すことを見出した。pcap1の重力屈性は正常であることから、PCaP1は根の屈曲ではなく、水分屈性に特異的に関与していることが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物の無機イオンと水の吸収・蓄積の詳細なメカニズムを明らかにするために、膜輸送システム、根毛、および実験の過程で見出した新規タンパク質に注目し研究を進め、2014年度は主として下記の成果を得た。1液胞膜亜鉛輸送体MTP1からみた細胞内・器官間亜鉛能動調節機構:シロイヌナズナの液胞膜亜鉛輸送体AtMTP1は細胞質の過剰な亜鉛を液胞内に輸送し隔離することで亜鉛過剰耐性に寄与している。AtMTP1がもつ細胞質側のヒスチジンに富んだループ(His-loop)に注目した。機能欠損株mtp1に、His-loop前半部分を欠落させた変異MTP1(His-half MTP1)を導入したところ、亜鉛欠乏条件下においてシュートが顕著に小さくなり、根の亜鉛含量が高く、シュートでの亜鉛含量が著しく少なくなっていた。つまり、His-loopは亜鉛欠乏時に亜鉛を液胞内に輸送・蓄積してしまわないためのブレーキ役として働いており、His-loopがないと欠乏時でも根の液胞内に亜鉛を輸送してしまい、シュートに十分な亜鉛が供給されないためにシュートの生育が悪くなることを明らかにした。この研究成果について論文発表した。2新規な根毛特異的タンパク質RHPPの分子特性と生理機能の解明:新規な無根毛株を用いたプロテオミクス解析により、リン酸欠乏時の根毛にのみ検出されたタンパク質RHPPに注目した。今年度は、まず機能欠失株の観察により、とくに根毛と種子に顕著な異常がみられることを見出した。3新規カルシウム結合タンパク質PCaP1の水分屈性に関する機能の解明:PCaP1は共有結合したミリストイル基によって細胞膜に局在化し、カルモジュリン等の情報伝達分子と結合する。当研究では、根での機能に焦点を当てて解析したところ、遺伝子欠失株pcap1では水分屈性に異常を示すことを見出した。根毛を形成しない新規な変異株を用い、野生株とのプロテオミクスによる比較解析により、リン酸欠乏時の野生株の根毛にのみ検出されるタンパク質SRPPを見出し、根毛特異性の高い分子として注目した。リン酸欠乏時には根毛が著しく増加し、リン酸の吸収に関わる根の表皮細胞のリン酸トランスポーターの発現上昇、難溶性のリンを吸収可能な形にするための酸性ホスファターゼや有機酸の分泌増大に寄与している。このようにリン酸欠乏時の根毛は重要な役割を果たしており、SRPPは根毛でどのような働きをしているのかを解明することとした。まず、機能欠失株srppを入手し、野生株と表現型を比較することによりSRPPの機能を推定した。srpp株は通常条件下では根毛に目立った表現型を示さないが、根毛が増加するリン酸欠乏あるいはエチレン処理の条件下では、根毛が短くなり、壊死している根毛の頻度が高かった。また、srpp株では萎縮した種子が多いという特徴もみられた。萎縮した種子では胚発達が途中で止まり、多数の細胞が死んでいた。プロモーターGUS解析により、SRPPは根毛や種皮、胚、鞘、珠柄、未熟な葯に強く発現していることを確認した。また、機能欠損株に自己プロモーター制御下でSRPPを発現させ相補すると、表現型が回復することも確認し、表現型の原因がSRPP遺伝子の欠損であることを証明した。これらの結果から、SRPPは乾燥などのストレスから根毛や胚、花粉を保護する役割をしているのではないかと推測している。

さらに、GFPを融合させたSRPPタンパク質の局在を観察したところ、細胞壁に局在していることが分かった。srpp株の胚を電子顕微鏡で観察すると、細胞壁が湾曲し、厚さが一定ではなく不均一になっている様子も見られ、SRPPは正常な細胞壁の構築に関与していると推定した。これまでに、液胞膜亜鉛輸送体に関する生化学的解析についての論文、亜鉛輸送体の亜鉛濃度センサー部位の植物体での分子生理学的特性に関する論文、そして根毛の分子生理学的機能に関する論文発表した。今年度は、新規な機能タンパク質SRPP分子を見出し、その分子生物学的特性を解析し、根毛と種子をストレスから護る役割を推定した。SRPPは、根毛を形成しない変異株と野生株のプロテオミクス解析により、リン酸欠乏時の野生株の根に特徴的に検出された分子である。一般に、リン酸欠乏条件下で根毛は増え、長くなる。したがって、SRPPは根毛特徴的な分子と位置づけられる。165アミノ酸で構成されるSRPPは、根毛と種子(果実)に特徴的な分子であり、細胞壁に検出された。SRPPについて、精緻な解析結果を示す論文は発表されておらず、類似の既知分子もない新しいタイプのタンパク質分子であり、今回、SRPPの特性と役割を解き明かしたことは、当初の予定、期待を大きく超えた研究成果であった。加えて、機能解明に関する研究の行き詰まっていた情報変換分子PCaP1について、再び焦点を当てた。網羅的な表現型解析の結果、予想もしなかった根の水分屈性に関わる機能を示唆する知見を得て、これを検証した。さらに、PCaP1が気孔の閉鎖に関与していることも明らかにし、他の知見と合わせて論文発表を行った。私は、植物の無機イオンや水の吸収と蓄積の詳細なメカニズムを明らかにするために、膜輸送システムと根毛に注目し、実験の過程で見出した新規タンパク質に焦点をあて、研究を進めている。下記、2項目に分け本年度の実施状況を記述する。(1) 1年度目に中心的に進めていた新規な無根毛株を用いた実験の過程で、プロテオミクス解析により、リン酸欠乏時の根毛にのみ検出されたタンパク質を見出し、SRPP (Seed and Root-hair Protective Protein)と名付けた。まず、機能欠失株を入手し、野生株と表現型を比較することにより、SRPPは乾燥などのストレスから根毛や胚、花粉を保護する役割をしているのではないかと推定した。さらに、GFPを融合させたSRPPタンパク質の局在を観察行い、細胞壁に局在していることが分かった。遺伝子欠失株srppの電子顕微鏡での観察により、SRPPは正常な細胞壁の構築に関与していると考えられた。これらの成果を論文として今年度発表した。現在、コムギ胚芽抽出物を用いた無細胞系でSRPPタンパク質を合成・精製し、生化学的特性の解析を進めている。(2)当研究室で見出した新規カルシウム結合タンパク質PCaP1は、既知のカルシウム結合ドメインを持たない天然変性領域の多いタンパク質である。PCaP1は植物の全組織に恒常的に発現しているが、機能欠失株pcap1において顕著な表現型は見つかっていなかった。地上部においてはPCaP1が気孔の閉鎖に関与していることを見出し、昨年度に論文発表を行ったが、根における機能は未解明であった。
酸化物薄膜における酸素欠損と電気的特性の関連性評価と膜質改善

本研究では、金属酸化物薄膜の代表として、最先端集積回路で適用が検討されているHfO_2系high-kゲート絶縁膜の絶縁特性を、測定・評価した。形成プロセスにおいては、界面安定化のためにhigh-k膜とシリコン基板との界面に挿入される極薄シリコン酸化膜は、表面への金属原子の吸着時に酸素引抜により、劣化する可能性があることを実証し、金属酸化物薄膜形成プロセスの原子的視点に立った制御の重要性を指摘した。電気的特性評価では、このような金属酸化物薄膜ではシリコン酸化膜とは異なり、界面律速ではなく、バルク律速であることを明らかにした。また、キャリアセパレーション法により、電子のみならず正孔も伝導に大きく関与し、酸素欠損や格子間酸素による膜中の欠陥準位を介した伝導が主要であり、これらを排除もしくは制御することが絶縁特性安定化に重要であることが明らかにした。リーク電流の経時変化から、電子を捕獲する酸素欠損がゲート電極近傍に、正孔を捕獲する格間酸素が基板近傍に、不均一に分布することが明らかとなった。伝導機構解明や電荷捕獲中心の原因追及において、陽電子消滅法による膜中の酸素欠損と特性との関連性を明らかにし、窒素添加がリーク電流を抑制し、同時にそのバラツキも抑制できることを明らかにした。このような窒素添加の効果は、第一原理計算によって支持された。金属酸化物薄膜のよって集積回路の高機能化を実現していくためには、さらに精度の高いプロセス技術と評価技術の構築を進めることが必須であり、また、実験物理と計算物理の融合が重要な役割を果たすことを示した。本研究では、超高密度半導体集積回路向けのシリコン酸化膜の代替として検討されている高誘電率ゲート絶縁膜のもっとも広く研究されているHfO2関連膜の伝導機構および信頼性を調査した。研究の結果、MOSキャパシタを用いたゲート絶縁膜のリーク電流評価は、素子形成が簡単で成膜後の工程が少ないことから、成膜以外の工程の影響が少なく、より本質的な物性を評価できるとされ、当初は、その評価に専念し、いくつかの結果を得た。しかし、MOSキャパシタより成膜後の工程が多くなるMOSFETを用いて、電子と正孔の伝導を個別に評価したところ、当初界面エネルギー障壁高さから主伝導機構が電子であるとの予想は覆され、界面シリコン酸化膜厚高誘電率絶縁膜厚の構成に大きく依存して、電子も正孔も伝導に寄与することが明らかとなった。また、同時に見かけ上主伝導が電子もしくは正孔の一方と見られても、実際には、両者のリーク電流が流れ、引き続き、膜中に捕獲され、リーク電流、容量やフラットバンド電圧(しきい値電圧)の時間変化をもたらし、信頼性評価においては、両者の効果を考慮することが必須であることが明らかとなった。また、高誘電率絶縁膜の形成の主要技術とされるALD(原子層吸着)の素過程である金属原子の吸着が、下地シリコン酸化膜の絶縁性を著しく低下することを示した。その原因として、金属原子被着によるシリコン酸化膜からの酸素原子の引抜が大きく関与していることを明らかにした。さらには、そのような劣化は、シリコン酸化膜を窒化したオキシナイトライド膜では緩和されることも、実証した。今後、上記知見を基に、さらに、高い電流ストレスでの上記スタックトゲート絶縁膜の劣化特性を、電気的特性およびプロセスの組み合わせにより評価する方法を構築し、劣化機構の解明につなげていく。今年度の研究では、MOSFETでのcarrier separation法により、信頼性と関連が深い深いとされる高誘電率ゲート絶縁膜(HfAlOxあるいはHfSiON膜)での電子および正孔捕獲について調査した。3nm程度の極薄絶縁膜にもかかわらず、主たる伝導機構の担体が、主たる捕獲電荷であり、トータルのゲート電流は減少する。しかし、支配伝導が両電荷でバランスされている場合には、両電流ともに減少し、膜厚方向に捕獲電荷が偏って分布することが明らかとなった。

つまり、電子捕獲中心がゲート電極近傍に、正孔捕獲中心が基板近傍に偏って分布することを意味する。膜中に酸素欠損ゲート近傍に、格子間酸素が基板近傍に偏って分布するとすることで説明することができる。また、HfSiO膜をゲート絶縁膜とするMOSキャパシタのリーク電流は、同じ面積でも大きく変化し、膜中の欠陥分布が不均一であり、また、経時破壊寿命の分布が広い時間範囲に分布することが明らかとなった。これは、均質性が重要な超高集積回路では、その適用に対する大きな課題である。成膜時に窒素Nを添加することで抑制でき、実験範囲内では添加量が増大にするにつれて、安定性が増すことが明らかとなった。これは、窒素添加により、欠陥である酸素欠損のエネルギー準位が絶縁膜の禁制帯内から伝導帯側に押し出され、伝導に寄与できなくなるという第一原理計算の結果を反映するものである。また、初期のリーク電流の分布と経時絶縁破壊寿命の分布が対応し、伝導欠陥と絶縁破壊寿命とが密接に関連していることが明らかとなった。
線形行列不等式(LMI)条件に基づくロバストサーボ系設計法

(1)LMI条件に基づく設計法に対する統一的枠組の構築:従来のスモ-ルゲイン定理や受動定理に基づくロバスト安定性条件を包括する統一的な解析条件を,フィードバック系のWP(Well-posedness)の概念を基盤として導出した.この条件は,ロバスト安定性に対して必要十分であり,現在主流となっているスケーリングやマルティプライヤなどによる十分条件に基づく安定性解析法を拡張した形となっている.この結果を応用することにより,種々のロバスト制御系設計問題を統一的に数値計算問題に帰着させ,数値計算法の視点から分類を行った.特に,WP条件で記述される一般的なクラスのロバスト制御問題を,効率よく大域解を計算可能なLMI(線形行列不等式)問題と,大域保証の無い局所解を計算可能なBMI(双線形行列不等式)問題,さらにこれら以外の数値計算困難な問題とにクラス分けを行い,様々な制御問題の本質的な難易度を数値計算法の立場から明らかにした.(2)制御問題の構造を考慮した内点法アルゴリズムの検討:まず、LMI拘束条件の最適化問題を対称行列に対する線形相補性問題として捉え、それに対する主双対内点法アルゴリズムを提案し、その収束性等について線形計画法の内点法の場合と比較した。さらに、この結果を制御系設計問題で生ずる構造を有した半正定値計画問題の数値解法にどのように適用するかについて検討し、ブロック構造を持つ問題に対する計算効率の高いアルゴリズムを得た。(3)CADシステムの開発:提案した内点法アルゴリズムに基づく半正定値問題の計算パッケージをC++言語で作成した。現在、これらの成果に基づいて、CおよびC++によるCADシステムの開発を行っており、プロトタイプができた段階である。
レチノイン酸受容体リガンドを介した網膜下瘢痕形成抑制機構の解明

滲出型加齢黄斑変性は、網脈絡膜に存在する新生血管とそれに伴う増殖性変化がその疾患の本態であると考えられる。新生血管の退縮については抗VEGF剤の硝子体投与により治療効果をある程度得られるようになってきた。一方、重症や再発例では抗VEGF剤投与でも十分な効果が得られないことも多い。特に、晩期に形成される網膜下の線維性瘢痕組織が視機能低下の一因をなす。現在、滲出型加齢黄斑変性の治療において、晩期合併症のひとつである網膜下の線維性瘢痕組織への特異的な治療法が存在しない。本研究では、網膜色素上皮細胞を基点とした網膜下線維性瘢痕の形成、網膜組織破壊の病態解明を行い、レチノイン酸受容体およびその特異的なリガンドによる線維性瘢痕の形成における役割を明らかにすることを目的とする。これまで、線維化の中心的な役割を果たすTGFーβ2による網膜色素上皮細胞の細胞収縮、上皮間葉系移行に対して、レチノイン酸受容体アゴニストの中でRAR-α、γアゴニストに抑制作用があることをこれまで明らかにしてきた。RAR-αアゴニストは、in vivoの脈絡膜新生血管形成モデルマウスにて新生血管の発生は抑制しないことが、一方でRAR-γアゴニストはその発生を抑制し、新生血管発生に対する各受容体が異なる作用を果たすことが明らかになった。さらに、網膜色素上皮細胞においてTGF-β2存在下でRAR-γアゴニスト処理の有無による発現分子の変動をmRNAシークエンスおよびRT-PCRをベースとしたSAGEにて解析した。種々の分子の発現量が変動していたが、中でも滲出型加齢黄斑変性の発症、進行に関与している補体分子の発現をRAR-γアゴニストが有意に抑制していることが明らかになった。滲出型加齢黄斑変性は、網脈絡膜に存在する新生血管が病態に大きな影響をきたす。近年抗VEGF薬の登場にて、新生血管への退縮効果を得られるようになってきた。一方で、晩期に二次的に形成された網膜下の線維性瘢痕組織が視力予後に多大な影響をもたらす。この網膜下に形成される線維性瘢痕組織への特異的な治療法が存在しない。本研究では、これまでの研究でレチノイン酸受容体アゴニストRAR-α、γアゴニストがin vitroで網膜色素上皮細胞を基点としたTGFーβ2による網膜色素上皮細胞の細胞収縮、上皮間葉系移行を抑制することを明らかにした。結果としては、RAR-α、γアゴニストに網膜色素上皮細胞の細胞収縮の抑制、細胞外基質の分解酵素のMMPsの発現抑制、細胞外基質との接着に寄与する接着斑構成分子のパキシリンのリン酸化を抑制することを明らかにした。また、両RAR-α、γアゴニストは、網膜下瘢痕形成モデルマウスで、瘢痕形成を抑制した。さらに、RAR-αアゴニストは、in vivoの脈絡膜新生血管形成モデルマウスにて新生血管の発生は抑制しない、一方でRAR-γアゴニストはその発生を抑制することを明らかにした。これらの結果から、RAR-α、γアゴニストは、作用の程度差はあるにしても、ともに網膜下瘢痕形成を抑制する一方で、脈絡膜新生血管抑制に関しては異なる作用を発揮することが明らかになった。続いて、培養網膜色素上皮細胞においてTGF-β2存在下でRAR-γアゴニスト処理の有無による発現分子の変動をmRNAシークエンスおよびRT-PCRをベースとしたSAGEにて解析した。両RAR-α、γアゴニストは、網膜下瘢痕形成モデルマウスで、瘢痕形成を抑制した。今後は、脈絡膜新生血管と網膜下瘢痕形成へのこらの受容体および下流のシグナル等について検討していく必要がある。同様に今後は、RAR-αアゴニスト更には、in vivoモデルからの採取した網膜組織についても同様の検討を行い、それぞれのアゴニストの作用機序や下流で働くシグナル伝達経路等についても検討していく。滲出型加齢黄斑変性は、網脈絡膜に存在する新生血管とそれに伴う増殖性変化を本体とする疾患である。近年抗VEGF剤の硝子体投与によりかなりの治療効果を得ることが出来るようになってきた。しかしながら、重症や再発例では抗VEGF剤にて治癒にいたらず、二次的に形成された網膜下の線維性瘢痕組織が視力予後に多大な影響をもたらす。

現在、滲出型加齢黄斑変性の治療において、未だ網膜下に形成される線維性瘢痕組織への特異的な治療法が存在しない。本研究では網膜色素上皮細胞を基点とした網膜下線維性瘢痕の形成、網膜組織破壊の病態解明を行い、レチノイン酸受容体およびその特異的なリガンドによる線維性瘢痕の形成における役割を明らかにすることを目的とする。最終的にはレチノイン酸受容体リガンドを介した網膜下瘢痕形成抑制の新規治療薬を開発することが最終目標である。本研究では線維化の中心的な役割を果たすTGFーβ2による網膜色素上皮細胞の細胞収縮、上皮間葉系移行に対して、レチノイン酸受容体アゴニストの中でRAR-α、γアゴニストに抑制作用があることが明らかになった。まずはRAR-αアゴニストの細胞収縮、上皮間葉系移行の分子機序について検討した。RAR-αアゴニストは、細胞収縮に寄与するMMPsの発現を濃度依存性に抑制した。さらに、網膜色素上皮細胞と細胞外基質との接着に関与する接着斑構成蛋白質パキシリンの発現、チロシンリン酸化について検討した。結果として、RAR-αアゴニストは、パキシリンの発現、チロシンリン酸化を優位に抑制した。これらの研究結果からRAR-αアゴニストが網膜色素上皮細胞の細胞収縮、上皮間葉系移行を抑制し、網膜下の線維性瘢痕組織形成を抑制する可能性が示唆された。RAR-γアゴニストについても同様の検討を今後行っていく予定である。滲出型加齢黄斑変性は、網脈絡膜に存在する新生血管とそれに伴う増殖性変化を本体とする疾患であるが、二次的に形成された網膜下の線維性瘢痕組織が視力予後に多大な影響をもたらす。この網膜下に形成される線維性瘢痕組織への特異的な治療法が存在しない。これまでの研究でレチノイン酸がin vitroで網膜色素上皮細胞を基点としたTGFーβ2による網膜色素上皮細胞の細胞収縮を抑制することを明らかにしていた。本研究でレチノイン酸受容体アゴニストの中でRAR-α、γアゴニストに網膜色素上皮細胞の細胞収縮の抑制作用があることが明らかになった。RAR-αアゴニストはRAR-γアゴニストほどの網膜色素上皮細胞の細胞収縮抑制作用はないが、細胞外基質の分解酵素のMMPsの発現抑制や網膜色素上皮細胞と細胞外基質との接着に寄与する接着斑構成分子のパキシリンのリン酸化を抑制することが明らかになった。RAR-γアゴニストについては、網膜色素上皮細胞の細胞収縮及び上皮間葉系移行の抑制が明らかとなった。RAR-αアゴニスト同様に、MMPsの発現、活性化を抑制し、パキシリンのリン酸化抑制も明らかにした。さらに上皮間葉系移行の分子マーカーであるα-SMアクチンやフィブロネクチンの発現についても抑制した。滲出型加齢黄斑変性は、網脈絡膜に存在する新生血管とそれに伴う増殖性変化がその疾患の本態であると考えられる。新生血管の退縮については抗VEGF剤の硝子体投与により治療効果をある程度得られるようになってきた。一方、重症や再発例では抗VEGF剤投与でも十分な効果が得られないことも多い。特に、晩期に形成される網膜下の線維性瘢痕組織が視機能低下の一因をなす。現在、滲出型加齢黄斑変性の治療において、晩期合併症のひとつである網膜下の線維性瘢痕組織への特異的な治療法が存在しない。本研究では、網膜色素上皮細胞を基点とした網膜下線維性瘢痕の形成、網膜組織破壊の病態解明を行い、レチノイン酸受容体およびその特異的なリガンドによる線維性瘢痕の形成における役割を明らかにすることを目的とする。
ダウン症児における閉塞性睡眠時無呼吸と睡眠習慣に関する実態調査

416歳の116名のダウン症(DS)児の養育者および健常対照群として345名の非DS児の養育者に質問票調査を行い、回答者のうち賛同を得たDS児43名および非DS児60名にパルスオキシメーターによる2晩の経皮的酸素飽和度測定を実施した。頻度睡眠呼吸障害の疑いがある症状の有無・頻度と、DS児に特徴的な睡眠体位とされている体位の頻度、および睡眠呼吸障害の重症度指標として用いられる3%ODIを算出し、それぞれDS児と非DS児でそれぞれ違いがみられた(詳細は本文参照)。検定を含めた詳細な解析については、今後可及的速やかに進める予定である。本研究では、わが国のダウン症児における閉塞性睡眠時無呼吸の頻度と重症度、および睡眠習慣に関して、養育者の主観的評価、およびパルスオキシメーターによる客観的評価の両面を同年代の健常児と比較し、ダウン症児における閉塞性睡眠時無呼吸に対する看護介入の意義について検討することを目的としている。平成26年度は、研究実施準備期間として、主に平成27年度初頭からの調査に向けた準備を重点的に行った。具体的には、まず山口県内のダウン症親の会に在籍する幼児期思春期のダウン症児と保護者、および山口県内の幼稚園・小学校・中学校に在籍する園児・児童とその保護者を対象とした研究説明会の開催を行い、研究への協力を依頼した。その結果、当初の予定通りの必要対象者数が確保できる見通しである。しかしながら、パルスオキシメーターの装着については、多くの保護者より「パルスオキシメーターが睡眠中に外れないか心配」「子どもが嫌がって外すかも知れない」といった声が聞かれた。そのため、センサーの固定ができるだけ違和感なく、十分に行える方法を検討していく。また、信頼性の高い質問票の作成、およびパルスオキシメーターによって得られたデータの解釈には閉塞性睡眠時無呼吸に関する専門的医学知識が不可欠であるため、睡眠呼吸障害や循環器内科を専門とする医師と検討を重ね、質問票の質問項目を検討しながら、閉塞性睡眠時無呼吸に関する専門的知識の充実、およびパルスオキシメーター解析に必要な知識の充足に努めた。本研究では、日本人ダウン症(DS)児における閉塞性睡眠時無呼吸(OSA)の頻度や発生要因の検討を目的とし、福岡県のダウン症者150名を対象に、OSA関連症状や睡眠習慣の現状に関する質問紙調査を行った。その結果、一部のOSA関連症状が一般人口より高率に見られた。さらに、肥満以外のOSA危険因子の存在が大きいことや、保護者が観察した座位での特徴的な睡眠姿勢が睡眠呼吸障害への防御姿勢として出現しており、OSAの早期発見につながるサインとなりうる可能性が示された。その後、日本ダウン症協会福岡県支部および山口県内のダウン症親の会々員のうち415歳のDS児と、山口県内の小中学校に通う同年代の非DS児を対象に、アンケート調査計152名、うち同意を得られた調査対象者に2連続2夜パルスオキシメーターによるスクリーニング検査を行っている。2016年3月末時点で計35名のスクリーニングを終了しているが、単純解析の結果ではDS児の90%以上、健常児の60%以上が3%酸素飽和度低下指数による評価で「異常の疑いあり」という結果であった。そのうち数名の対象者から受診予定である旨の報告を得ている。しかしながら、一般小児およびDSのSDB有病率と比較し明らかに高率であるため、さらに詳細な解析および統計学的検討、およびパルスオキシメーターデータ上のノイズやアーチファクトを取り除く作業が必要であると考えられ、現在実施中である。本研究では、山口県内のダウン症親の会を通じ、ダウン症を持つ研究対象児の募集を進めたが、当初、山口県内には大規模なダウン症親の会が少ないため情報が乏しく、アプローチまでに時間を要した。しかし、現在は順調に交渉が進んでおり、健常児が在籍する一般の幼稚園、小・中学校に対するアプローチも順調に進んでいるため、問題はない。27年度が最終年度であるため、記入しない。生涯発達看護学平成27年度は、7月頃より質問票調査を開始し、9月中には回収を終える予定である。その後、質問票のデータ解析を進めながら、8月よりパルスオキシメーターによる調査を開始する。成果発表に関しては、まず質問票の分析結果を12月頃に学会にて発表し、3月までにはパルスオキシメーターの分析結果も加え、学会および論文で発表することを目標とする。
ナノ粒子-RNA複合体ナノワイヤの電子輸送機構の理論的解明

1.平成21年度では、金のナノ粒子の熱フォノン、特にブリージングモードとオブロングモードフォノンが単電子トンネリングに及ぼす効果を、ナノ粒子1個からなる単電子トランジスタにおいて、理論的に明らかにした。ナノ粒子からなるナノワイヤの電子輸送現象において、ワイヤーを構成するナノ粒子の熱フォノンによる動的な変化はナノワイヤの電気伝導特性に著しい効果を及ぼすことが懸念された。そこで、ナノ粒子のフォノンの代表的なモードとして、ブリージングモードとオブロングモードフォノンの電気伝導度への寄与を理論的に明らかにし、これまで知られていた分子トランジスタとの比較を行った。その結果、閾電圧近傍でTHzフォノンの放出と吸収による新たなチャンネルが電気伝導に寄与するが、その全電流への寄与が小さく、無視し得ることが明らかとなった。一方、フォノン吸収を伴った単電子トンネル伝導によるナノ粒子内の冷却効果は認められなかったが、フォノン放出によるナノ粒子内の温度の増加は著しいものがあった。2.ナノワイヤの電子輸送現象を、モンテカルロ法による数値シミュレーションに基づいて行った。モンテカルロシミュレーションを実施するに当たり、熱浴を一昨年確立したNose-Hoover力学を用いて構成し、シミュレーションを実施した。その結果、熱浴にNose-Hooverの方法を用いることで生じる記億効果が大きく、例え定常状態でも電流値が安定しない問題が生じた。様々なパラメータ値でシミュレーションを行い、この問題を回避することを試みたが成功するに至っていない。本研究の最終年度に当たり、非平衡状態にNose-Hoover力学を適用することの問題点を見いだし、本モデルの正当性を再考する必要性に至った。金のナノ粒子2個からなるナノワイヤーの電流電圧特性とワイヤーを囲む熱浴の温度との関係を、数値シミュレーションにより明らかにしている。平成19年度(初年度)では、単電子トンネリングによる電子輸送現象を、ナノ粒子上の電子数を表す確率とそれが従うマスター方程式により表し、一方ナノ粒子の運動を古典動力学により表した。熱浴をNose-Hoover力学を用いて表した。その結果、以下の事柄が明らかとなった。1.電子のトンネリングにより、荷電したナノ粒子はバイアス電場中でクーロン力を受け、振動する。2.振動は2つのモードを示し、電流値はそれぞれのモードに対応した値を示す。3.バイアスの増加とともに振動のエネルギーが大きくなり、熱浴の温度を上回るようになる。このとき、熱浴に運動エネルギーが奪われ、振動状態の遷移と電流の著しい低下を示す。これは英国の共同研究者の実験と一致している。4.振動の遷移が生じる温度が実験より2倍程度大きい。このように、実験事実を定性的に説明する機構を発見したが、定量的にまだ一致を見ていない。トンネル伝導を記述するために用いたマスター方程式による方法を用いたが、この場合電子の不連続性が失われ、上述したような振動の遷移が生じにくいことが予想される。次年度は、電子の不連続性を考慮し、モンテカルロ法を用いたシミュレーションによりワイヤーの電気伝導特性を調べる。1.平成20年度では、金のナノ粒子の熱フォノンが単電子トンネリングに及ぼす効果を、ナノ粒子1個からなる単電子トランジスタにおいて、理論的に明らかにした。そこで、ナノワイヤの電気伝導特性を調べる前に、1個のナノ粒子からなる単電子トランジスタにおける熱フォノンの電子のトンネルへの影響を調べた。その結果、閾電圧近傍でTHzフォノンの放出と吸収による新たなチャンネルが電気伝導に寄与するが、その全電流への寄与が小さいことが分かった。2.ナノワイヤの電子輸送現象を、モンテカルロ法による数値シミュレーションに基づいて行っている。モデルを構築する上で、DNAの力学的性質を水分子が無い状態で検討した結果、エントロピー力に基づく復元力は適当ではなく、新たに力学的な復元力を仮定しなければならないことが判明した。モンテカルロシミュレーションを実施するに当たり、昨年確立したNose-Hoover力学を用いて、モデルを構築している。これにより、最終年度で本研究の目的を達成できると考える1.平成21年度では、金のナノ粒子の熱フォノン、特にブリージングモードとオブロングモードフォノンが単電子トンネリングに及ぼす効果を、ナノ粒子1個からなる単電子トランジスタにおいて、理論的に明らかにした。

モンテカルロシミュレーションを実施するに当たり、熱浴を一昨年確立したNose-Hoover力学を用いて構成し、シミュレーションを実施した。その結果、熱浴にNose-Hooverの方法を用いることで生じる記億効果が大きく、例え定常状態でも電流値が安定しない問題が生じた。様々なパラメータ値でシミュレーションを行い、この問題を回避することを試みたが成功するに至っていない。本研究の最終年度に当たり、非平衡状態にNose-Hoover力学を適用することの問題点を見いだし、本モデルの正当性を再考する必要性に至った。
交通データによる地域文化施設の整備効果計測方法に関する研究

文化活動を経済的に評価する方法の欠如が、使いにくく没個性的な施設整備の一因となってきた。本研究では、住民がある活動施設における文化活動に高い価値を見出しているがゆえに、長い移動時間をかけてその施設にくると考え、交通移動時間の長さをもとに文化活動の魅力度と経済評価額を求めることを考える。上述の目的を達成するため、次のような内容の研究を実施した。1.サービスの取引価格と需要が直接観測できない場合に、交通費用などの別の市場の価格を用いて需要曲線を推定する「代替市場法」が開発され、欧米における適用が進められている。それらの事例をレビューした結果、交通費用法の応用性は広いが、政策誘導バイアスが起こりやすいことがわかった。2.バイアスの除去方法に関する研究を実施した。既存の代表的な方法では交通費用として直接の金銭的費用と間接の時間的費用を取り入れることが多い。この場合、利用率の違いをすべて交通費用によるものと仮定すると、勤務時間などの制約の影響が支配的な場合には過小評価になる危険性がある。そのため、アンケート中で当該の行動以外の活動に関する時間の利用についても尋ねることにより政策誘導バイアスを発生させにくくするとともに、時間制約の影響を分離し、バイアスを除去する方法を考察した。3.ある活動に初めて参加する者と、継続的に参加する者とでは施設の評価額は大きく異なると考えられる。実際のアンケート結果からこの違いを確認するとともに、それらを考慮した施設整備効果の計測方法を提案した。以上のことより、移動時間と費用をもとに信頼性の高い評価額を算出する方法の開発に寄与した。
死別後の不適応遺族を予測するリスク評価法の開発

今年度は、死別後の不適応遺族のリスク評価法の妥当性を検討するため、一昨年から昨年にかけて作成したリスク評価尺度25項目を用いて、死別後初期段階における看護師評価と、遺族の自己評価の比較検討、および遺族のうつ状態との関連性の検討を行った。対象は、ホスピスで亡くなった患者の遺族、および担当の病棟看護師である。看護師に対しては、看取り後7日目に質問紙調査を実施した。一方、遺族については、患者の死後、23ヵ月の時点で、郵送による自記式質問紙調査を行った。調査対象となった31名の遺族のうち、21名から回答が得られ、20名の有効回答を分析対象とした。遺族の性別は男性7名、女性13名であり、年齢は3474歳で平均56.9歳(SD=11.2)であった。故人との続柄は、故人から見て、配偶者が10名、子が5名、兄弟姉妹が3名、姪と友人が各1名であった。ホスピス剤院日数は1043日で、平均21.7日(SD=9.9)であった。故人享年は4491歳で、平均65.9歳(SD=12.3)であった。結果として、遺族自己評価と看護師評価を比較検討すると、設定した25項目のうち10項目で、不一致率が30%を上回っていた。特に「感情状態」「性格傾向・信念」のカテゴリーで不一致数が多かった。各症例における不一致数と、患者の在院日数の関連を検討すると、負の相関関係が示され、在院日数が長い症例ほど、不一致数が少なくなる傾向が明らかとなった。そして、看護師によるリスク評価と、遺族のうつ状態の程度との有意な関連性は示されなかった。今回の結果は、不適応遺族を死別後に第三者が評価することの困難さを示唆するものである。特に、在院日数が短い患者の家族の場合には、正確なリスク評価が難しいと考えられる。また入院中における家族へのケアとして、臨床に向けては、看護師による家族の感情面への積極的な介入による理解と、他職種によるチームアプローチによる多面的な家族ケアの重要性が示唆される。今年度は、死別後の不適応を予測する有効な因子を探索することを目的に、遺族本人によるリスク評価と、遺族の精神健康との関連性を検討した。本研究の調査対象は、ホスピスにて亡くなられた患者312名の家族である。148家族180名から回答が得られ、回収率は52.9%であった。本研究では、178名からの有効回答を分析対象とした。調査内容として、先行研究に基づき、遺族のリスク評価のための評価因子として26項目を作成した。また、遺族の精神健康の状態を測定するため、(1)GHQ日本版の28項目版と、(2)CES-Dの短縮版を用いた。結果として、出現頻度が最も高かったリスク関連事象項目は「患者と良好な関係であった」(93%)であり、最も低かった項目は「患者の臨終に間に合わなかった」(6%)であった。リスク評価の各項目得点について、GHQ-28による評定での健康不良群と健常群の間で、t検定を用いて比較したところ、26項目のうち5項目で有意差が認められた。Pearsonの積率相関分析の結果では、26項目のうち10項目がGHQ-28とCES-Dの両方と有意な正の相関関係にあった。今回、自らの健康不良、未解決の過去の喪失体験、家族や周囲のサポートの欠如、患者の死に対する心の準備状態、強い不安が、遺族の精神健康の状態に関係していることが明らかとなり、これらの事象がリスク評価において重要な評価因子である可能性が示唆される。また、相関分析の結果に注目すると、自責傾向、家族関係、怒りやいらだち、患者への依存、精神疾患歴といった項目も評価因子の候補として挙げられる。これら10項目のうち、強い不安や自らの健康不良は、末期患者の家族に比較的多く見られる事象であると考えられる。それに対し、精神疾患歴、家族や周囲のサポートの欠如、未解決の過去の喪失体験は出現頻度が低く、高リスク遺族に特徴的な事象と言えるかもしれない。今年度は、死別後の不適応を予測する有効な因子を探索することを目的に、看護師によるリスク評価を実施し、昨年度調査した遺族の精神健康状態との関連性を検討した。昨年度の遺族調査で有効回答が得られた遺族のうち、配偶者を亡くした87名に関して、患者のプライマリーナースであった看護師に回答を求めた。調査の結果、18名の看護師から、78名の配偶者喪失者についての回答が得られ、回収率は88.6%であった。回答した18名の看護師の看護師経験は615年で、平均8.9年であった。本人及び看護師からの回答が得られた配偶者喪失者78名の性別は男性24名、女性54名であり、年齢は3785歳で平均64.3歳であった。死別からの経過期間は7-21カ月で、平均13.8カ月であった。調査内容は、遺族のリスク評価尺度26項目と、主観的なリスク総合的評価(11件法、010点)である。調査の結果、GHQ-28もしくはCES-Dと有意な相関関係を示すリスク評価項目は認められなかった。また、総合的なリスク評価と、GHQ-28及びCES-Dとの相関関係も見られなかった。

今回の結果は、家族と看護師との認識の不一致の可能性を示すものであり、本研究でリスク関連事象と想定した家族(遺族)の心理社会的状態を第三者が評価することの難しさを示唆するものであると考えられる。また、本研究では看護師の総合的なリスク評価と遺族の精神健康の状態との関係も示されず、看護師による総合評価が最も予測力が高いとしたParkesらの研究報告を支持することはできなかった。ただし今回の調査では、調査時から721か月前時点の家族の状態を尋ねており、看護師の記憶の低下による回答の歪みが推察されるため、結果の解釈にあたってはこの点に留意する必要がある。今年度は、死別後の不適応遺族のリスク評価法の妥当性を検討するため、一昨年から昨年にかけて作成したリスク評価尺度25項目を用いて、死別後初期段階における看護師評価と、遺族の自己評価の比較検討、および遺族のうつ状態との関連性の検討を行った。対象は、ホスピスで亡くなった患者の遺族、および担当の病棟看護師である。看護師に対しては、看取り後7日目に質問紙調査を実施した。一方、遺族については、患者の死後、23ヵ月の時点で、郵送による自記式質問紙調査を行った。調査対象となった31名の遺族のうち、21名から回答が得られ、20名の有効回答を分析対象とした。遺族の性別は男性7名、女性13名であり、年齢は3474歳で平均56.9歳(SD=11.2)であった。故人との続柄は、故人から見て、配偶者が10名、子が5名、兄弟姉妹が3名、姪と友人が各1名であった。ホスピス剤院日数は1043日で、平均21.7日(SD=9.9)であった。故人享年は4491歳で、平均65.9歳(SD=12.3)であった。結果として、遺族自己評価と看護師評価を比較検討すると、設定した25項目のうち10項目で、不一致率が30%を上回っていた。特に「感情状態」「性格傾向・信念」のカテゴリーで不一致数が多かった。各症例における不一致数と、患者の在院日数の関連を検討すると、負の相関関係が示され、在院日数が長い症例ほど、不一致数が少なくなる傾向が明らかとなった。そして、看護師によるリスク評価と、遺族のうつ状態の程度との有意な関連性は示されなかった。今回の結果は、不適応遺族を死別後に第三者が評価することの困難さを示唆するものである。特に、在院日数が短い患者の家族の場合には、正確なリスク評価が難しいと考えられる。また入院中における家族へのケアとして、臨床に向けては、看護師による家族の感情面への積極的な介入による理解と、他職種によるチームアプローチによる多面的な家族ケアの重要性が示唆される。
頭頸部癌への重粒子線治療によるimmunogenic cell deathの検討

放射線治療は癌細胞に作用して細胞死を誘導するが、それだけにとどまらず、一部の癌細胞では細胞死によって、免疫刺激分子の発現や免疫シグナル分子の放出をきたすことが明らかになってきた。今回、放射線照射(X線と重粒子線)による免疫学的作用について検討した。重粒子はX線と比較して高い殺細胞効果(アポトーシス誘導能)を認めた。更に放射線照射によってcalreticulinの発現増強とともにCD47の発現低下を認めた。放射線照射による抗腫瘍免疫応答の誘導のメカニズムの一つとして放射線照射された癌細胞はマクロファージによって貪食されやすくなり、癌抗原提示を促進している可能性が示唆された。放射線治療は頭頸部癌の治療において確立された効果的な治療法であり、その果たす役割は非常に大きい。放射線照射によって癌細胞は細胞死を生じるが、一部の癌細胞では放射線照射による癌の細胞死によって、細胞表面に免疫刺激分子の発現増強や、免疫シグナル分子の放出をきたし抗腫瘍免疫応答を刺激するimmunogenic celldeath (ICD)を起こすと言われている。今回、頭頸部扁平上皮癌に対してX線と新しい放射線治療である重粒子線によるICDの違いについての検討を行う。今年度は、まずX線照射によるICDについて検討した。頭頸部扁平上皮癌細胞株Gun-1(下咽頭癌由来)とHSC-3(舌癌由来)に対してX線を10Gy照射し、72時間後にアポトーシス誘導とCalreticulinの発現を検討した。また、免疫関連分子として、HLA class I, DR, B7family, CD47の分子の発現変化についてフローサイトメトリーにて解析した。予想通り、両細胞株ともアポトーシスを生じていた。Gun-1においてCalreticulinの発現の増強を認めた。またHLA class Iの発現低下、CD47分子の弱い発現低下を認めた。HSC-3においては、Calreticulinのわずかな増強とHLA class I、B7H1、CD47分子の発現低下を認めた。X線照射にてICDを生じている可能性が高いが、免疫学的変化は細胞株による違いがあると思われる。更にCD47分子の発現低下やB7H1分子の低下は、monocytesへの貪食促進やT細胞抑制の解除などの可能性が示唆された。照射のdoseやアッセイまでの時間設定など条件を変えての検討を進めているところである。放射線照射によって癌細胞は細胞死を生じるが、これまで放射線照射は、抗がん剤と同様に癌細胞とともに免疫系を構成する造血細胞にも細胞死を誘導することにより免疫抑制に働くと考えられてきたが、一部の癌細胞では放射線照射による癌の細胞死によって、細胞表面に免疫刺激分子の発現増強や、免疫シグナル分子の放出をきたすことがわかってきた。昨年までに頭頸部扁平上皮癌細胞株に放射線照射を行い、免疫関連分子の発現変化について検討したところ、Calreticulinの発現増強を認めるとともにCD47分子の発現低下がみられた。Calreticulinの発現増強はいわゆるimmunogenic cell deathを生じていることを示唆するが、今回は照射によって発現が低下したCD47についてその役割を調べた。CD47はdon't eat meシグナルであり、マクロファージなどによる貪食を阻害する作用がある。放射線照射によるCD47発現の低下は、マクロファージなどにより貪食されやすくなり、癌抗原提示が促進されると思われる。in vitroの系で頭頸部扁平上皮癌のCD47を抗体でブロックあるいはsiRNAで遺伝子発現を低下させるとマクロファージの貪食能が増強した。癌組織のCD47発現を免疫組織化学法にて検討、頭頸したところ、頭頸部扁平上皮癌でCD47発現が認められ、更に高発現症例の予後は不良であった。今後は放射線照射後の再発症例でのCD47の発現を解析することと、X線照射と重粒子線とでCD47の発現低下の比較検討を行っていく。昨年度は重粒子線が一時休止したため、利用できない期間があった。また、CD47の発現低下の実験は安定したデータを得るために、繰り返しの実験が必要であったこと、CD47の免疫組織化学法に適した抗体の探索に時間を要したことが挙げられる。放射線治療は頭頸部扁平上皮癌の治療として確立された治療法であり、手術とともにその果たす役割は非常に大きい。また、近年は粒子線治療も開発が進んでおり、頭頸部非扁平上皮癌に対して当院でも臨床試験が行われている。X線、粒子線ともに癌細胞に作用して細胞死を誘導するが、それだけにとどまらず、一部の癌細胞では細胞死によって、免疫刺激分子の発現や免疫シグナル分子の放出をきたすことが明らかになってきた。放射線照射による癌細胞死はがん微小環境にも様々な影響を及ぼし、間質細胞との相互関係によって環境を変化させると考えられる。これまでに頭頸部扁平上皮癌細胞株に対して、X線や重粒子線を照射し、アポトーシス誘導能やcalreticulin発現の増強などを評価してきた。更に放射線照射によって細胞株による相違はあるが、一部の細胞株ではHLA class I、B7H1、CD47などの発現の変化が認められた。今年度は更に、アデノシン代謝に関与するCD39とCD73について放射線照射による影響を検討した。今回検討した細胞株にはCD39の発現は認めなかった。一方、CD73は両細胞株とも高発現していたが、放射線照射によるCD73発現の変動は認めなかった。

癌細胞はCD39/CD73を介してアデノシン代謝に関与し免疫を抑制すると言われ、低酸素状態はCD73を誘導することなどが知られているが、放射線の直接作用による発現の制御はなかった。放射線治療は癌細胞に作用して細胞死を誘導するが、それだけにとどまらず、一部の癌細胞では細胞死によって、免疫刺激分子の発現や免疫シグナル分子の放出をきたすことが明らかになってきた。今回、放射線照射(X線と重粒子線)による免疫学的作用について検討した。重粒子はX線と比較して高い殺細胞効果(アポトーシス誘導能)を認めた。更に放射線照射によってcalreticulinの発現増強とともにCD47の発現低下を認めた。放射線照射による抗腫瘍免疫応答の誘導のメカニズムの一つとして放射線照射された癌細胞はマクロファージによって貪食されやすくなり、癌抗原提示を促進している可能性が示唆された。頭頸部扁平上皮癌細胞株に対するX線照射によりCalreticulinの発現上昇がみられたことは、Immunogenic cell deathが生じていることであり、加えて免疫関連分子の発現変化も認められた。しかしながら、これら分子の発現には細胞株間による差が認められた。今後は、どの細胞株を使い、どのような照射条件で研究を進めていくかといった条件設定に時間を要すると思われる。X線照射によるCD47発現の変化以外に、Calreticulinの局在変化、HMGB1の測定などは重粒子線照射と同時並行で施行していく。また最近はeat meシグナルなどについての研究も始めているので、これらについても本実験のターゲット分子として検討を加えていく。耳鼻咽喉科今年度中にX線照射による実験を繰り返し行いながら、線量設定や照射後の時間について条件設定を行なう一方、HMGB1の測定、免疫細胞染色、樹状細胞あるいは単球への貪食作用の変化を調べていく。X線照射で設定された条件を用いて重粒子線による実験へと移行していく。