hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロパターニングと力学刺激負荷による血管平滑筋細胞の形質転換メカニズムの解明

本研究では,血管平滑筋細胞の形状や配列状態を操作する技術を確立するとともに,細胞に対して力学刺激を加えることにより,細胞の形状や配列状態,細胞に加わる力が血管平滑筋細胞の形質転換にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的として,2年間の研究を進めてきた.1.マイクロパターニングによる平滑筋細胞の形状・配列制御ならびに焦点接着斑の位置制御厚さ0.1mm程度のシリコーン弾性膜表面に対し,透過型電子顕微鏡試料用のグリッドシートをマスクとして酸素イオンを照射した.この手法により,特定の基板表面領域に官能基を形成して細胞親和性を向上させ,細胞の接着領域を制御し培養する技術を確立した.250pm×40pmの長方形状や,80μm×80μmの正方形状に細胞接着領域をパターニングしたところ,血管平滑筋細胞の形態をこれらのパターニング領域に沿って長方形状,正方形状に制御することができた.さらに,焦点接着斑の位置を細胞輪郭部位に集中させて,細胞収縮機構を構成するアクチンフィラメント(AF)を一定方向に配列させながら培養する技術を確立した.2.力学刺激負荷試験と細胞の形態内部構造観察および形質の評価ブタ胸大動脈血管より単離・培養した平滑筋細胞を試料として,1.によって長方形状に形態および配列状態を制御しつつシリコーン弾性膜上に培養した.そして,動脈の拍動を考慮した周波数1Hz,伸展率10%程の繰返伸展刺激を細胞の長手方向や幅方向に対して負荷した.繰返伸展刺激を常に細胞の長手方向に負荷した場合,AFが常に伸展負荷方向と同一方向に配列した形態を保ちながら,その発現量が増加した.しかし平滑筋ミオシン重鎖(SMMHC)等の発現量には著しい変化が見られなかった.また,平滑筋細胞をコラーゲンゲル内に3次元的に培養する系を構築し,同様の繰返伸展刺激を加えたところ,細胞が繰返引張方向に配向するとともに,AFやSMMHCの発現量が血管壁内から単離直後の収縮型細胞レベルまで向上することが明らかとなった.本研究は,血管平滑筋細胞の形状や配列状態を操作しつつ,細胞に対して力学刺激を加えながら内部構造変化を追跡することにより,細胞の形状や配列状態,細胞に加わる力が血管平滑筋細胞の形質転換にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的として,2年間の研究を進めている.本年度は,まず1)マイクロパターニングによる平滑筋細胞の形状および配列を制しつつ弾性膜上に培養する技術の確立を目指した.厚さ0.1mm程度のシリコーンシート表面に対して,ECRイオン照射装置を用いて酸素イオンを照射することにより,疎水性のシート表面の細胞親和性向上させ,十分な細胞接着性を得るための条件を確立した.さらに,一辺が数10□m数100□m程度の長方形や正方形の孔を有するシートメッシュをマスクとして利用し,細胞接着領域のアスペクト比,面積細胞間距離などを制御して,シリコーンシート上に細胞を培養する技術を確立するに至った.次に,2)リアルタイム観察型力学刺激負荷試験システムの開発として,シリコーンシート上に培養した細胞に対し,繰返し引張刺激を加えながら細胞を培養しつつ,その形態や内部構造を顕微鏡下で観察する系を構築するため,市販の細胞用繰返し伸展装置に対して,温度制御部およびAir-CO2混合ガス供給部を作製して,細胞に引張負荷を加えながら顕微鏡下で長時間培養できるように改良した.この装置を用いて,1)にて得た200□m×50□m程度の長方形状にパターニングを施した培養平滑筋細胞に対し,その長軸方向に繰返し引張刺激を負荷したところ,細胞内のアクチンフィラメントが常に大きなひずみを受けているにもかかわらず,その配向を維持し,さらにその形成量も無負荷時に比べ増加することが分かった.今後,さらに細胞内の接着タンパク質の分布様態や平滑筋マーカタンパク質の発現状態の変化に注目して研究を進める予定である.本研究では,血管平滑筋細胞の形状や配列状態を操作する技術を確立するとともに,細胞に対して力学刺激を加えることにより,細胞の形状や配列状態,細胞に加わる力が血管平滑筋細胞の形質転換にどのような影響を与えるか明らかにすることを目的として,2年間の研究を進めてきた.1.マイクロパターニングによる平滑筋細胞の形状・配列制御ならびに焦点接着斑の位置制御厚さ0.1mm程度のシリコーン弾性膜表面に対し,透過型電子顕微鏡試料用のグリッドシートをマスクとして酸素イオンを照射した.この手法により,特定の基板表面領域に官能基を形成して細胞親和性を向上させ,細胞の接着領域を制御し培養する技術を確立した.250pm×40pmの長方形状や,80μm×80μmの正方形状に細胞接着領域をパターニングしたところ,血管平滑筋細胞の形態をこれらのパターニング領域に沿って長方形状,正方形状に制御することができた.さらに,焦点接着斑の位置を細胞輪郭部位に集中させて,細胞収縮機構を構成するアクチンフィラメント(AF)を一定方向に配列させながら培養する技術を確立した.2.力学刺激負荷試験と細胞の形態内部構造観察および形質の評価ブタ胸大動脈血管より単離・培養した平滑筋細胞を試料として,1.によって長方形状に形態および配列状態を制御しつつシリコーン弾性膜上に培養した.そして,動脈の拍動を考慮した周波数1Hz,伸展率10%程の繰返伸展刺激を細胞の長手方向や幅方向に対して負荷した.繰返伸展刺激を常に細胞の長手方向に負荷した場合,AFが常に伸展負荷方向と同一方向に配列した形態を保ちながら,その発現量が増加した.

しかし平滑筋ミオシン重鎖(SMMHC)等の発現量には著しい変化が見られなかった.また,平滑筋細胞をコラーゲンゲル内に3次元的に培養する系を構築し,同様の繰返伸展刺激を加えたところ,細胞が繰返引張方向に配向するとともに,AFやSMMHCの発現量が血管壁内から単離直後の収縮型細胞レベルまで向上することが明らかとなった.
大腸菌RecA蛋白質によるヌクレオフィラメント形成機構の解析

RecA蛋白質が行なうDNA鎖交換反応は、RecA蛋白質がATP存在下で単鎖DNAに結合してできるヌクレオフィラメントを介して行なわれ、このフィラメントの構造は、DNA鎖交換反応において重要な役割をする。このフィラメント上に存在する、siteI,siteIIと呼ばれる二つのDNA結合部位についてこれまで解析を行なってきた。平成5年度においては以下の実験を行なった。まず、クロスリンクの条件の検討を行なった。SiteIにのみDNAが結合しているヌクレオフィラメント(DNA-RecA-ATPγS複合体)に紫外線を照射した結果、Tyr103に加えて、アミノ酸残基178-183番目の領域内にもクロスリンクが架かった。この領域は、RecA蛋白質の立体構造に於てDNA binding wingと比較的近い位置にあるため、DNA binding wingに結合したDNAが、近接するこの領域にクロスリンクしたと考えられる。次に、Tyr103がDNAとの相互作用に関与しているかを調べた。Tyr103がトリプトファンに変化した変異型RecA蛋白質(RecA-Y103W)を部位特異的変異導入により作成した。トリプトファン残基の蛍光は回りの環境によって変化するため、DNAと相互作用していれば、その蛍光の変化が期待される。RecA-Y103W蛋白質のトリプトファンの蛍光を測定した結果、Tyr103に対応する残基(Trp103)の蛍光がDNAの結合により大きく変化し、RecA-Y103W蛋白質のTrp103はDNAと相互作用していることが明らかになった。その蛍光の変化の仕方から、DNAの塩基と塩基の間への挿入という非常に強い相互作用ではなく、比較的弱い相互作用であることが分かった。また、RecA-Y103W蛋白質の細胞内、試験管内に於ける活性を野生型RecA蛋白質と比較したところ、ほとんど変わらないことが示された。従って、野生型RecA蛋白質に於いて、Tyr103はDNAと相互作用している事が分かった。上記の研究成果はJournal of Biological Chemistryへの発表にむけて、2編の論文として、現在投稿準備中である。
ソフトマテリアルの熱移動過程の熱・分光イメージング

本研究の目的は動的過程の熱の拡散だけでなく、結晶化度や分子配向など、多くのパラメータの時間的変化をミクロスケールで、かつ同時にイメージングできる統合システム(マルチスペクトル赤外熱イメージングシステム)を構築することである。赤外線カメラを用いた温度イメージングは、非接触の温度測定であることから、試料内の温度場を乱さずに温度分布を可視化できるため、熱物性値の2次元イメージングなどへの応用が期待されている。しかし、赤外領域での輻射強度は、試料の温度だけでなく輻射率にも依存するため、混合系をはじめとした輻射率分布が強い系では、温度分布を正確に見積もることは難しい。マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムは、赤外分光イメージングと中赤外の熱イメージングを結合することでこの輻射率分布を逐次補正できるイメージングシステムである。今年度は、赤外スペクトルを用いた熱イメージングの輻射率分布補正のアルゴリズムの確立、熱イメージンの高感度化を中心に、動的に変化する温度場の赤外線カメラを用いたイメージング手法を開発した。今年度の研究で特に注目したのは、有機分子性結晶の相転移過程である。有機分子性結晶の相転移近傍では核からの逐次的な構造発現に伴って、測定面内に複数の相が共存する瞬間が存在する。このような状況では異なる輻射率をもった複数の相をまたがる温度分布を測定する必要があり、従来の方法では温度分布の絶対値を得ることは困難である。この問題を解決るために、本研究で開発してきたマルチスペクトル赤外熱イメージングシステムを用いた。マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムのデータ解析アルゴリズムを確立するためには、良好な熱シグナルと赤外スペクトルシグナルを得られるサンプルが必要である。特に、熱イメージング測定では、サンプルを保持する基板への熱拡散がイメージの温度空間分解能の低下をまねくことが知られており、今回はこの基板の検討から始めた。熱イメージングによる2次元の温度分布測定でのシグナル感度を上げるための基板として、SiNナノ薄膜を用いることを検討した。この基板は中心に穴の開いたSiの基板上に、101000nmのSiN薄膜が保持されているもので、中心部分はSiN薄膜が空中で保持されている状態になっている。この部分では基板の厚さが極端に薄いため基板への熱流が極端に抑えられており、この上に配置されたサンプルは、熱的には周りを断熱されて保持された状態に近い。ナノ薄膜上での熱イメージングは、シグナル感度を向上させ、マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムを有機分子性結晶の相転移などへ適用する上で効果的なプラットフォームとなる。今回、サンプルとして用いるのはn-tetracosaneである。C24は50.2 °Cに融点を持ち44.7°Cから融点のまでの間に固相-固相転移を持つ。今年度は、ナノ薄膜上での相転移の観察から、解析アルゴリズムの向上を図ると同時に、このナノ薄膜の熱物性値の測定も行なった。熱物性値は加熱に対するサンプルの温度応答から計測されるため、サブミクロンスケールの熱物性値計測を行うには、このスケールのセンサーやスポット加熱源を用いた温度計測を確立する必要がある。今回は、可視光よりも波長が短く50nmスケールのスポットに集光できる、電子線の吸収-発熱による加熱と、電子線リソグラフィーによって作製した起電力型ミクロセンサーを用いて、サブミクロンスケールの加熱に対するサンプルの温度応答の計測を行なった。本実験では、混合系の輻射率補正を、相転移過程に適用した。相転移に伴って輻射率が大幅に変わる過程でも、赤外分光イメージングによる輻射率分布補正が有効で、温度分布を見積もることが可能である。特に今年度の研究では、本システムで得られる膨大なイメージングデータの解析手法に大きな進歩があった。本システムで得られる1次データは面内256 x 256ピクセル各点の赤外スペクトルと熱輻射強度の時間変化であり、データ量は膨大である。今年度の研究では、これら二つのシグナルに対して、いくつかのモデルを構築し、より効率的なデータ解析を実現した。これにより、これまで指定した点で個々に計算していた温度変化が、測定面内全体で容易に計算できるようになった。また、AuとNiの異種金属界面を温接点とする起電力型センサーとして用いて、特定の周波数で変調させた電子線照射の、照射位置と測定位置での位相遅れを測定することでナノ薄膜上での熱拡散を測定することができた。本年度の研究で、マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムのための測定プラットフォームの構築、システムの各構成要素(ナノ薄膜等)の基本的な物性値の測定、解析手法の効率化などが完了し、これまでの溶液混合システムに加えて、融体からの結晶化など動的過程が容易にイメージングできるようになった。今後は、構造発現過程により焦点を当てて、偏光赤外スペクトルとの統合システムを構築する予定である。

しかし、赤外領域での輻射強度は、試料の温度だけでなく輻射率にも依存するため、混合系をはじめとした輻射率分布が強い系では、温度分布を正確に見積もることは難しい。マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムは、赤外分光イメージングと中赤外の熱イメージングを結合することでこの輻射率分布を逐次補正できるイメージングシステムである。今年度は、赤外スペクトルを用いた熱イメージングの輻射率分布補正のアルゴリズムの確立、熱イメージンの高感度化を中心に、動的に変化する温度場の赤外線カメラを用いたイメージング手法を開発した。今年度の研究で特に注目したのは、有機分子性結晶の相転移過程である。有機分子性結晶の相転移近傍では核からの逐次的な構造発現に伴って、測定面内に複数の相が共存する瞬間が存在する。このような状況では異なる輻射率をもった複数の相をまたがる温度分布を測定する必要があり、従来の方法では温度分布の絶対値を得ることは困難である。この問題を解決るために、本研究で開発してきたマルチスペクトル赤外熱イメージングシステムを用いた。マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムのデータ解析アルゴリズムを確立するためには、良好な熱シグナルと赤外スペクトルシグナルを得られるサンプルが必要である。特に、熱イメージング測定では、サンプルを保持する基板への熱拡散がイメージの温度空間分解能の低下をまねくことが知られており、今回はこの基板の検討から始めた。熱イメージングによる2次元の温度分布測定でのシグナル感度を上げるための基板として、SiNナノ薄膜を用いることを検討した。この基板は中心に穴の開いたSiの基板上に、101000nmのSiN薄膜が保持されているもので、中心部分はSiN薄膜が空中で保持されている状態になっている。この部分では基板の厚さが極端に薄いため基板への熱流が極端に抑えられており、この上に配置されたサンプルは、熱的には周りを断熱されて保持された状態に近い。ナノ薄膜上での熱イメージングは、シグナル感度を向上させ、マルチスペクトル赤外熱イメージングシステムを有機分子性結晶の相転移などへ適用する上で効果的なプラットフォームとなる。今回、サンプルとして用いるのはn-tetracosaneである。C24は50.2 °Cに融点を持ち44.7°Cから融点のまでの間に固相-固相転移を持つ。今年度は、ナノ薄膜上での相転移の観察から、解析アルゴリズムの向上を図ると同時に、このナノ薄膜の熱物性値の測定も行なった。熱物性値は加熱に対するサンプルの温度応答から計測されるため、サブミクロンスケールの熱物性値計測を行うには、このスケールのセンサーやスポット加熱源を用いた温度計測を確立する必要がある。今回は、可視光よりも波長が短く50nmスケールのスポットに集光できる、電子線の吸収-発熱による加熱と、電子線リソグラフィーによって作製した起電力型ミクロセンサーを用いて、サブミクロンスケールの加熱に対するサンプルの温度応答の計測を行なった。本実験では、混合系の輻射率補正を、相転移過程に適用した。相転移に伴って輻射率が大幅に変わる過程でも、赤外分光イメージングによる輻射率分布補正が有効で、温度分布を見積もることが可能である。特に今年度の研究では、本システムで得られる膨大なイメージングデータの解析手法に大きな進歩があった。
個体発生における細胞骨格の動態を制御する遺伝子ネットワークの解明

I.Aurora Aキナーゼが関わる微小管形成経路の解明われわれは、線虫初期胚にγ-チューブリンとAuroraAキナーゼがそれぞれ独立に寄与する微小管合成経路が存在することを見いだしている。われわれは線虫AuroraAキナーゼの活性化型(リン酸化型)のみを特異的に認識する抗体を作成し、Aurora A蛋白質は中心体と微小管上に検出されるのに対して、活性化型Aurora Aキナーゼは中心体の中央部に特異的に局在することを見いだした。さらに、変異型(不活化型)Aurora Aを用いたin vivo解析により、Aurora Aのキナーゼ活性は中心体成熟には必須だが、微小管合成には必要ではないことを見いだした。以上の結果から、Aurora Aのキナーゼ活性依存的機能に加えて、キナーゼ活性非依存的機能が紡錘体形成に重要であることがはじめて明らかとなった。II.線虫γ-チューブリン結合タンパク質の解析多くの生物種でγ-チューブリン複合体が微小管のnucleationに重要であることが知られているが、線虫ではγ-チューブリン複合体構成因子の一部が見いだされておらず、その機能については不明な点が多い。本研究でγ-チューブリン(TBG-1)に結合するタンパク質を線虫抽出液から免疫沈降と質量分析で網羅的に同定した。そのなかから他の生物種のγ-チューブリン複合体構成因子と弱い相同性を示すタンパク質2つを見いだし、GTAP-1,GTAP-2と命名した。これらの因子のRNAiによって、TBG-1の中心体へのリクルートが減少することが見いだされたが生育には異常がなかった。このことはGTAP-1,2がγ-チューブリン複合体の構成因子であるが微小管形成能における役割は補助的であることを示唆している。本研究では線虫C.elegansの胚発生をモデル系として、RNAiによる遺伝子機能破壊と個体レベルのライブイメージングを統合的に用いることにより、個体発生における細胞骨格の動態を制御する遺伝子ネットワークを明らかにすることをめざす。(1)個体レベルの細胞骨格の動態解析に必要な技術開発(2)胚発生過程における細胞骨格の動態を解析するための多色4次元イメージング技術の確立(3)得られた4次元画像データの定量的解析法の確立(2)胚発生期の細胞骨格の動態に影響を及ぼす遺伝子群の同定と機能解析(1)定量的4次元イメージング解析を用いた、細胞骨格の動態に影響を及ぼす遺伝子群のRNAiスクリーニング(2)同定した遺伝子産物の生体内における局在および分子機能解析(3)胚発生期における細胞骨格の動態を制御する遺伝子ネットワークモデルの構築と検証(1)スクリーニングで同定した遺伝子群と既知の細胞骨格関連遺伝子群の相互作用解析による遺伝子ネットワークモデルの構築(2)分裂酵母や培養細胞を用いた、構築した遺伝子ネットワークの普遍性の検証本研究計画では、線虫C. elegansの胚発生過程における細胞骨格(特に、微小管とアクチン)の動態に着目し、RNAiによる遺伝子機能阻害と4次元イメージングを駆使して、個体発生において細胞骨格の動態を制御する遺伝子ネットワークを包括的に明らかにすることをめざす。19年度は、個体レベルの細胞骨格の動態解析に必要な技術開発と、初期胚における紡錘体微小管の動態に絞った解析を行なった。1)紡錘体微小管・中心体を可視化するための蛍光融合蛋白質マーカー発現株の作出まず、線虫初期胚で蛍光融合蛋白質を発現させるためのベクターを開発するとともに、線虫の形質転換法を最適化し、形質転換株の作成効率を向上させた。確立した系を用いて、初期胚における紡錘体微小管・中心体の動態を可視化するための蛍光融合蛋白質マーカーを発現する線虫株を作製した。2)初期胚における紡錘体微小管・中心体の動態の4次元イメージング解析法の確立C.elegans初期胚における紡錘体微小管および中心体の3次元空間における動態を追跡するための単色4次元イメージング技術を確立した。現在、このシステムを基盤として、2種類以上の蛋白質を同時に可視化する多色4次元イメージングを行うシステムを構築中である。3)中心体の動態の定量的解析法の確立上記の4次元イメージングシステムを用いて、野生型と細胞極性に異常を示す変異体群の初期細胞分裂期における中心体動態を高時空間分解能で解析した。今年度は以下の研究を行った。1)線虫初期胚における紡錘体微小管・中心体の動態の4次元イメージング解析法の確立C.elegans初期胚における中心体・微小管・核膜・細胞膜・染色体等の細胞内構造を同時に2種類あるいは3種類可視化して3次元ライブイメージング(=多色4次元イメージング)を行うシステムを構築した。2)線虫初期胚における中心体動態の定量的解析野生型および細胞極性関連因子RNAi胚において、受精直後から第二分裂までの中心体と細胞膜の4次元イメージデータを取得し、その動態を定量的に解析した。その結果、中心体と核の相対的位置についての新たな表現型を見いだした。3)γ-チューブリンとAurora Aキナーゼがそれぞれ独立に寄与する微小管合成経路の解析

われわれは以前の研究から、線虫初期胚にγ-チューブリンとAurora Aキナーゼがそれぞれ独立に寄与する微小管合成経路が存在することを見いだしている。今年度の研究により、Aurora Aが関与する経路は、細胞分裂期に凝縮した染色体周辺で形成される微小管合成に必須であることを見いだした。この染色体依存的微小管形成にはγ-チューブリンは関与していない。この結果より、これらの二つの微小管合成経路が時空間的に協調することが紡錘体形成に重要であると推測される。本研究では線虫C.elegansの胚発生をモデル系として、RNAiによる遺伝子機能破壊と個体レベルのライブイメージングを統合的に用いることにより、個体発生における細胞骨格の動態を制御する遺伝子ネットワークを明らかにすることをめざす。今年度は以下の研究を行った。1)線虫初期胚における中心体動態の定量的解析昨年度に引き続き、野生型および細胞極性関連因子RNAi胚の受精直後から第二分裂までの中心体と細胞膜の4次元イメージデータを取得し、その動態を定量的に解析した。その結果、PAR蛋白質経路に依存して、星状体微小管と細胞膜との相互作用が前極側と後極側で異なることが見いだされた。2)γ-チューブリンとAurora Aキナーゼがそれぞれ独立に寄与する微小管合成経路の解析昨年度に引き続き、線虫初期胚ににおけるγ-チューブリンとAurora Aキナーゼがそれぞれ独立に寄与する二つの微小管合成経路の解析を行った。さらに、変異型Aurora Aを用いたin vivo解析により、Aurora Aのキナーゼ活性は微小管合成に必要ではない可能性が示唆された。また、免疫沈降と質量分析によるAurora Aおよびγ-チューブリン結合蛋白質の網羅的同定をすすめている。その結果、線虫におけるγ-チューブリン複合体をはじめて同定し、その構成成分を明らかにした。その他の結合蛋白質についても解析をすすめている。I.Aurora Aキナーゼが関わる微小管形成経路の解明われわれは、線虫初期胚にγ-チューブリンとAuroraAキナーゼがそれぞれ独立に寄与する微小管合成経路が存在することを見いだしている。われわれは線虫AuroraAキナーゼの活性化型(リン酸化型)のみを特異的に認識する抗体を作成し、Aurora A蛋白質は中心体と微小管上に検出されるのに対して、活性化型Aurora Aキナーゼは中心体の中央部に特異的に局在することを見いだした。さらに、変異型(不活化型)Aurora Aを用いたin vivo解析により、Aurora Aのキナーゼ活性は中心体成熟には必須だが、微小管合成には必要ではないことを見いだした。以上の結果から、Aurora Aのキナーゼ活性依存的機能に加えて、キナーゼ活性非依存的機能が紡錘体形成に重要であることがはじめて明らかとなった。II.線虫γ-チューブリン結合タンパク質の解析
がん関連遺伝子が及ぼす放射線効果への影響

西村等はTirapazamine(TPZ)、Ortho-chloracetyl carbamoyl fumagillol(TNP470)、40°C60分加温(MHT)、ガンマ線照射、シスプラチン、Brdu等の難解複雑な併用処理を行い、その後cytochalasine B等を指示薬として用い、照射やシスプラチンにかかわらずTPZとMHTの併用効果を認めた。三橋等は52例の子宮頚がん(当然の事ながら偏平上皮がん)患者にいづれも外部放射線と3回の膣腔内brachytherapyを行った。HPVの16,18及び33型についてPCR法で鑑別した。又、p53についてはPCR-SSCP法でそのstatusを検定した。HPVは76.9%の患者に出現し、p53 statusがmutantであった患者は26.9%であった。HPVの存在とp53 statusの間には有意相関があった。mutant p53の患者はその50%で再発し、wt-p53の患者はその80%で局所制御された。p53のmutationは局所再発と有意に相関した。またp53 statusは、再発なしの生存率曲線と局所制御率との間で有意差を示し、StageIIIB子宮頚がん患者の放射線治療における予測因子となり得るようである。Cancer 91:80-89,2001片山等は進行胃がんの腹膜転移の予防と治療のための持続的腹膜温湯潅流(CHPP)を32例の進行がんに根治的摘除術及びCHPPを行った。その内15例では腹腔転移の予防(腹膜浸潤が疑わしい症例)をはかり、17例(腹膜浸潤の疑いの低い症例)についてはCHPPをほどこして治療的効果を期待した。これらの患者を手術のみの対照群と術後腹膜再発について比較した。予防的CHPPによる腹膜再発と発生率は各々26%と35%で、手術のみの対象群が各々42%と17%であるのに比べて有意に高かった。therapeutic CHPP処理群の中心生存率は11ヶ月、これに対し摘除術後のみの群は6ヶ月で、対照群より長期に渡って生存した。予防的CHPPの研究ではCHPPは独立の予後因子ではあるが、治療的CHPPにおける独立の予後因子は、むしろ完全な摘除術であることが解った。CHPPはすでに発生した腹腔内転移には特段の根治的効果はないが、腹腔内転移を予防するための治療法としては有効である事が解った。更に術後のランドマイズドトライアルが必要であろう。Oncology 57:106-114,1999当班においては、温熱・シスプラチン同時併用による温熱感受性増感は、従来報告されている機構の他HSFの活性化阻止によるHsp72の誘導抑制が一つの原因である事を明らかにした^<1)>。温熱高感受性マウスL細胞のP53遺伝子が野生型である事を証明した^<2)>。熱帯産薬用植物由来天然化合物による温熱感受性増感を明らかにした^<3)>。マウスL細胞はブレオマイシン(臨床濃度相当)にCell phape responseしない事を明らかにし、併せてBLMによる亜致死的障害はBLM処理終了後、2-3時間で修復される事を明らかにした^<4)>。また、ヌードマウス移植ヒト腫瘍でP53野生型が証明された株は放射線高感受性であり、変異型の場合は多く放射線抵抗性である事を報告した^<5)>。増殖の早いFSa-II腫瘍では、20回分割照射を低酸素中で行うと1日2回20回照射(10日)ではTCD50が167.8Gyである。1日1回20回照射(20日)では226.8Gyに増加した。この増加分59Gyは10日間の照射期間延長に伴う再増殖によると考えられるが、同じ20回分割照射を空気中で行うと、1日2回20回照射(10日)はTCD50が108.5Gyまでしか増加しない。即ち再増殖による59Gy中の48.4Gy分を再酸素化が放射線増感して取り崩したと考えられる。。照射前温熱化学療法を行うと、TCD-50は有意に低下し、同僚法後10日までの間の再増殖を抑制した^<6)>。マウス線維芽細胞のP53遺伝子をknock outし、そこへvector neoと野生型P53遺伝子を導入するとapoptosis頻度が上がり温熱高感受性となったが、変異型p53導入ではこのような所見は認められなかったと報告した。^<7)>加納・林等はマウス肺繊維芽L細胞を用いp53 statusが細胞温熱致死感受性、アポトーシスの発現頻度、hsp72及びp53蛋白の蓄積に関連することを報告した。即ち、L細胞の温熱感受性は同種のマウスEhrlich腹水癌細胞に比べて著しく高感受性を示した。L細胞のp53遺伝子のstatusは野生型であることを解明した。44°C加温後のL細胞におけるアポトーシス発現頻度は加温後37°C間隔時間の延長とともに増加し6時間で全細胞の約25%に達した。

大西等は、p53以外の遺伝子背景を均一にした細胞系を作製し、p53遺伝子型の違いのみを基準にして癌治療効果を培養細胞レベルで検討してきたが、p53欠損あるいは変異型p53を持つ癌細胞においても、正常型p53蛋白質が持つ機能を発揮させ、正常型p53蛋白質を持つ癌細胞と同程度の温熱・放射線あるいは抗癌剤による殺細胞効果が期待できる可能性が示唆された。さらにNaClのp53非依存的なX線増感作用が確認された。西村らは、食堂癌の放射線治療において細胞周期をG_2/Mでblockするdocetaxelとmild hyperthermia(MH)が細胞周期、特にG_0細胞分画に与える影響を検討し、これらの細胞周期を変化させるmodalityと放射線との最適な併用法を研究したその結果MH処置群のGo細胞分画の比率は処置後12時間で最大に増加し、処置後24時間でもコントロール群より有意に高かった。一方Docetaxel投与群はG_2/M期の比率が増大し、それに伴いG_0/G_1期の細胞は減少した。即ち、1時間という温熱が細胞周期に大きな影響を与えていることが明らかになり、放射線との併用を考える上で、重要な知見が得られた。新部等は、ヒト神経膠芽種における増殖、分化とアポトーシス誘発との関係を明らかにすることを目的に、腫瘍の増殖分画DNA合成に関与する酵素、グリアへの分化等と放射線や抗悪性腫瘍剤によるアポトーシス誘発について検討した。その結果上衣芽腫では放射線誘発或いは、Etoposide誘発のアポトーシスは上衣芽種の特定の分化を示さない細胞と上衣ロゼットを構成している細胞に高率で、血管周囲偽ロゼットを構成するGFAP陽性細胞では低率だった。また、アポトーシスの出現後、相対的にGFAP陽性率は上昇しKi-67、TopoII、TS陽性率は一過性に低下する傾向を示した。なお、膠芽種ではいずれの細胞でもアポトーシスその出現は乏しかった。西村等はTirapazamine(TPZ)、Ortho-chloracetyl carbamoyl fumagillol(TNP470)、40°C60分加温(MHT)、ガンマ線照射、シスプラチン、Brdu等の難解複雑な併用処理を行い、その後cytochalasine B等を指示薬として用い、照射やシスプラチンにかかわらずTPZとMHTの併用効果を認めた。三橋等は52例の子宮頚がん(当然の事ながら偏平上皮がん)患者にいづれも外部放射線と3回の膣腔内brachytherapyを行った。HPVの16,18及び33型についてPCR法で鑑別した。又、p53についてはPCR-SSCP法でそのstatusを検定した。HPVは76.9%の患者に出現し、p53 statusがmutantであった患者は26.9%であった。HPVの存在とp53 statusの間には有意相関があった。mutant p53の患者はその50%で再発し、wt-p53の患者はその80%で局所制御された。p53のmutationは局所再発と有意に相関した。またp53 statusは、再発なしの生存率曲線と局所制御率との間で有意差を示し、StageIIIB子宮頚がん患者の放射線治療における予測因子となり得るようである。Cancer 91:80-89,2001片山等は進行胃がんの腹膜転移の予防と治療のための持続的腹膜温湯潅流(CHPP)を32例の進行がんに根治的摘除術及びCHPPを行った。その内15例では腹腔転移の予防(腹膜浸潤が疑わしい症例)をはかり、17例(腹膜浸潤の疑いの低い症例)についてはCHPPをほどこして治療的効果を期待した。これらの患者を手術のみの対照群と術後腹膜再発について比較した。予防的CHPPによる腹膜再発と発生率は各々26%と35%で、手術のみの対象群が各々42%と17%であるのに比べて有意に高かった。
幼少期ストレスによる肥満発症のメカニズムの解明

遊び行動をしているラットと、同居個体の遊びを観察しているが一緒に遊ぶことを阻害されているラットで、視床下部室傍核のオキシトシンニューロンが活性化された。遊び行動長期阻害ラット群では、幼少期から成熟するまでの摂食量と体重に差がなかった。オキシトシンプロモーター制御下でヒトジフテリア毒素受容体を発現する遺伝子改変ラットとプロラクチン放出ペプチド(PrRP)プロモーター制御下でヒトインターロイキン2受容体αサブユニットを発現する遺伝子改変ラットを作製した。これらにジフテリア毒素或いはイムノトキシンを局所投与し、部位特異的にオキシトシンニューロン或いはPrRPニューロンを破壊することに成功した。幼少期に虐待やネグレクト、孤独といった社会的ストレスを経験すると、摂食の異常と肥満が起こりやすいという疫学的な報告がある。しかし、このメカニズムは明らかではない。一方、我々は延髄プロラクチン放出ペプチド(PrRP)産生ニューロンー視床下部オキシトシン産生ニューロン回路が摂食を終了させることを示してきた。また、我々は幼少期のオキシトシンが成熟後の社会行動を維持するのに重要であることを示してきており、幼少期に虐待やネグレクトを経験したヒトで、血中オキシトシン濃度が低下していることが知られている。本研究の目的は、幼少期に社会的ストレスを受けると、このPrRP-オキシトシン神経回路が可塑的に機能低下し、その結果成熟後に摂食量が増大して肥満するという仮説を検証することである。幼少期の遊び行動は、社会行動や認知機能の発達に重要と言われている。そこで、幼少期の社会的ストレスとして、社会的隔離によって遊ぶことができない群と、隣で他者が遊んでいるのを観察できるが一緒に遊ぶことができない群の検討を行うことにした。まず、遊び行動をしているラットでは、視床下部のオキシトシン産生ニューロンが活性化される様子が認められた。他者の遊び行動を観察しているが一緒に遊ぶことができない個体では、一匹で遊ぶ行動が惹起され、遊び行動をしているラットと同様にオキシトシン産生ニューロンが活性化される様子が認められた。現在、これらの動物の成熟後の行動、摂食量、体重変化の解析を始めている。また、これまでに我々は、オキシトシン産生ニューロンを部位特異的に破壊して、その機能を探る目的で、オキシトシン遺伝子のプロモーター下にヒトジフテリア毒素受容体遺伝子を組み込んだトランスジェニックラットを作製してきた。これに対してジフテリア毒素を投与し、特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊できるラインを確立した。幼少期に社会的ストレスを経験すると、成長後に高甘味食、高カロリー食の摂取が増加し、肥満が誘発される。本研究では、幼少期に社会的ストレスを受けると、延髄プロラクチン放出ペプチド(PrRP)産生ニューロンー視床下部オキシトシン産生ニューロン回路が可塑的に機能低下し、その結果成熟後に高嗜好性食物の摂取が増大して肥満するという仮説を検証する。幼少期の社会的ストレスとして、社会的隔離によって遊び行動を阻害した群と、隣で他者が遊ぶところを観察できるが一緒に遊ぶことを阻害した群の検討を行った。遊びを経験してきた正常群と比較したところ、社会的ストレス群では社会行動に異常が見られたが、幼少期から成熟するまでの間の摂食量、体重変化には差がなかった。また、これまでに我々は時期場所特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊し、その機能を探る目的で、オキシトシン遺伝子プロモーター制御下でヒトジフテリア毒素受容体を発現する遺伝子改変ラットを作製してきた。これに対してジフテリア毒素を局所投与し、部位特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊することに成功した。同様に、PrRP産生ニューロンを時期場所特異的に破壊する目的で、PrRP遺伝子プロモーター制御下でヒトインターロイキン2受容体αサブユニットを発現する遺伝子改変ラットを作製してきた。これに対してイムノトキシンを局所投与し、部位特異的にPrRP産生ニューロンを破壊する系を確立しつつある。遊び行動を阻害した群では、摂食量の変化、肥満は観察されないことが明らかになった。一方で、オキシトシン産生ニューロンとPrRP産生ニューロンを特異的に破壊できる系が確立しつつあり、ほぼ計画通りに進んでいる。本研究の目的は、幼少期に社会的ストレスを受けると、延髄プロラクチン放出ペプチド(PrRP)産生ニューロン-視床下部オキシトシン産生ニューロン回路が可塑的に機能低下し、その結果成熟後に摂食量が増大して肥満するという仮説を検証することである。遊び行動をしているラットでは、視床下部のオキシトシン産生ニューロンが活性化される様子が認められた。また、遊びを経験してきた正常群と比較したところ、社会的ストレス群では成熟後の社会行動に異常が見られたが、幼少期から成熟するまでの間の摂食量と体重変化には差がなかった。

また、我々は部位特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊し、その機能を探る目的で、オキシトシン遺伝子プロモーター制御下でヒトジフテリア毒素受容体を発現する遺伝子改変ラットを作製した。これに対してジフテリア毒素を局所投与し、部位特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊することに成功した。同様に、PrRP産生ニューロンを部位特異的に破壊する目的で、PrRP遺伝子プロモーター制御下でヒトインターロイキン2受容体αサブユニットを発現する遺伝子改変ラットを作製した。これに対してイムノトキシンを局所投与し、部位特異的にPrRP産生ニューロンを破壊することに成功した。遊び行動をしているラットと、同居個体の遊びを観察しているが一緒に遊ぶことを阻害されているラットで、視床下部室傍核のオキシトシンニューロンが活性化された。遊び行動長期阻害ラット群では、幼少期から成熟するまでの摂食量と体重に差がなかった。オキシトシンプロモーター制御下でヒトジフテリア毒素受容体を発現する遺伝子改変ラットとプロラクチン放出ペプチド(PrRP)プロモーター制御下でヒトインターロイキン2受容体αサブユニットを発現する遺伝子改変ラットを作製した。これらにジフテリア毒素或いはイムノトキシンを局所投与し、部位特異的にオキシトシンニューロン或いはPrRPニューロンを破壊することに成功した。幼少期に遊び行動をすると、視床下部オキシトシン産生ニューロンが活性化されることを明らかにした。また、他者の遊び行動を観察できるが自分は遊べない状況のラットでは、一人遊びが惹起されること、視床下部オキシトシン産生ニューロンが活性化されることを確認した。さらに、これまでに開発してきたオキシトシン遺伝子のプロモーター下にヒトジフテリア毒素受容体遺伝子を組み込んだトランスジェニックラットに対し、薬剤を投与して特異的にオキシトシン産生ニューロンを破壊できるラインを選定した。これらは当初の計画通り順調に進展している。高甘味・高カロリー食摂取を抑制するPrRP-オキシトシン神経回路の同定を行うため、オキシトシン産生ニューロンとPrRP産生ニューロンを特異的に破壊できる遺伝子改変ラットを用いる。また、特定の薬物(Clozapine-N-Oxide)でのみ活性化する人工受容体DREADD (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)をアデノ随伴ウイルスベクターによって導入し、局所のPrRP-オキシトシン回路の働きを選択的に抑制あるいは賦活化することで、高甘味・高カロリー食摂取におけるこの神経回路の機能を検証する。幼少期の遊び行動の阻害は摂食量と体重変化には影響しなかったが、さらに、これらの動物に対して、高嗜好性食物に対する反応性を検証する。また、成体におけるPrRP-オキシトシン神経回路の神経活動と遺伝子発現を検討し、可塑的な機能低下があるのかを検証する。これらについて、DREADDシステムを用いてPrRP-オキシトシン神経回路の賦活化実験を行い、高甘味・高カロリー食の過剰摂取を阻止できるかの検討を行う。分子神経科学、生理学遊び行動の時に、PrRP産生ニューロンが活性化されるのかを検討する。
高秩序高分子ナノ組織体における光機能プロセスの基礎解析

本研究では高分子Langmuir-Blodgett(LB)膜を分子素子への応用が可能な材料ととらえ、その基礎的性質に関して検討を行っている。高分子LB膜は分子レベルでの積層体の構築であるため様々な機能を有する薄膜を順次積層することにより新規な機能発現が期待できる。そこで今年度はヘテロ積層体を用いた光機能素子の作製を試みた。前年度までの研究結果より優れた高分子LB膜を示しかつ膜厚が1nmと非常に薄いために層間の相互作用が起こりやすいtert-ペンチルアクリルアミド(tPA)またはneo-ペンチルメタクリルアミド(nPMA)をベースとして用い、芳香族色素としてピレン、フェナンスレンおよびアントラセンを共重合により導入した高分子p(tPA/PyMA),p(tPA/Phen),p(nPMA/AMMA)を合成した。また電子ドナー性を有するジメチルアニリン(DMA)、アクセプター性を有するジニトロベンゼン(DNB)を有する高分子p(tPA/DMA)、p(tPA/DNB)合成した。これらすべての高分子は水面上で安定な単分子膜を形成しLB法により基板に転写することが可能であった。そこで芳香族LB膜と電子ドナー、アクセプターLB膜との光誘起電子移動を応用した、光スイッチング素子、光駆動型論理演算素子の作製を試みた。1.光スイッチング素子;p(tPA/PyMA),p(tPA/DMA),p(tPA/DNB)のヘテロ積層膜を銀基板上に作製し、ピレンの励起にともなうヘテロ積層膜の光学的変化を利用することにより、銀の表面プラズモンを励起している光の強度をコントロールすることができた。プラズモンの解析よりこれはヘテロ膜において形成されたラジカル種がプラズモン励起波長において吸収を示すためであることが示唆された。2.光駆動型論理演算素子;フェナンスレンとアントラセンの励起波長を入力信号、p(tPA/Phen)とp(tPA/DNB)層間およびp(nPMA/AMMA)とp(tPA/DMA)層間での光誘起電子移動にともなう光電流を出力信号とした新規な光駆動型AND論理回路、EXOR論理回路を提案し作製を試みた。AND論理ではHighとLowの出力が約3倍離れた素子を作製することに成功した。また電流値の絶対値を出力としたEXOR論理回路ではHighとLowの出力が100倍以上離れた素子を作製することができた。
歯髄疾患ならびに歯牙移植への応用を目指した細胞賦活化法の開発

従来から低出力レーザー照射により骨芽細胞あるいは歯根膜細胞の増殖や石灰化が促進することが知られている。本研究はこのような低出力レーザーのヒト細胞への作用効率を最大限に高めて歯髄細胞や歯周組織構成細胞を賦活化して、保存あるいは再生療法に応用しようというものである。まず出力3mWの赤外光(830nm)ならびに可視光(670nm)レーザーをヒト口腔上皮由来KB細胞に照射し炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。その結果、いずれの波長のレーザーも1.8Jの照射でKB細胞からのspontaneousなIL-8産生を有意に抑制することが明らかとなった。これは低出力レーザー照射が歯肉上皮細胞からのケモカイン産生の抑制を介して抗炎症的に働くことを示唆するものと考えられた。しかし、3mWの出力では旋光抽出条件や照射時間を変えても、歯肉線維芽細胞(HFG)や歯根膜細胞(PDL)機能に影響を与えることはできなかった。そこで我々の予備研究から、可視赤色光領域に比べて生体組織による吸収・散乱が大きい短波長領域のレーザーを用いることとした。すなわち、波長532nm、出力150mWのレーザーを用いて、12.6Jの照射をHGFに行ったところ、陽性対照としたIL-1刺激の場合に比べて5分の照射時間で有意に高いGM-CSF産生を生じることが明らかとなった。さらに、この照射条件では未照射群に比べて細胞のviabilityに低下は認められなかった。今回の結果より、歯肉上皮細胞に対しては低出力レーザーがケモカインの産生抑制を介して抗炎症的に働くこと、HGFなどの深部歯周組織を構成する細胞については、従来の報告よりも低出力の短波長域レーザーの照射により効率的に細胞機能を制御できることが明らかとなった。
肺癌に対する抗ＥＧＦＲ抗体の感受性因子の探索と新しい併用療法の開発

本研究は、分子標的治療薬である抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブの肺癌領域におけるバイオマーカーの検出及び耐性克服についての基礎的研究である。本研究でセツキシマブ耐性肺癌細胞株において、KREMEN1遺伝子が発現低下していることと、Wntシグナル経路が活性化していることを見出した。従ってWnt経路の活性化抑制が耐性化克服に有効であり、感受性を示さない細胞においても適応範囲を拡大できる可能性がある。本研究の目的は、肺癌化学療法の個別化医療を目的とする基礎的研究でありEGFR分子標的治療薬である抗EGFRモノクローナル抗体セツキシマブの効果予測因子(バイオマーカー)をみつけることにより、肺癌領域での有効性価値を高めるため、ヒト肺癌細胞株を用いてセツキシマブに感受性を示した細胞株の特徴を調べるとともに、薬剤耐性細胞株を樹立させ、耐性化後の分子機構を探り、セツキシマブ耐性の克服法を検討することにある。初年度では、多種の肺癌細胞でスクリーニングを行い、遺伝学的背景の検討または何らかのシグナル伝達経路の活性化抑制メカニズムなどを解析と同時にセツキシマブ耐性細胞株を樹立、さらにクローン化しその耐性化について、網羅的に解析した。セツキシマブに対しさまざまな機序で耐性化する中、ひとつの有力なパターンとして、Wntシグナルの活性化及びmTORシグナルの活性化が挙げられた。さらに、次年度ではその解析結果をもとに薬剤選択の参考となりうるバイオマーカーを目指し応用的な検討を行った。マイクロアレイにおける網羅解析での結果をさらに絞り込む中、リアルタイムPCR解析を行った中、Wntシグナルの中のKREMEN1という遺伝子が、セツキシマブに感受性を示していた野生型に比べ、耐性化クローンにおいて減少しており、これはWnt経路の活性化がみられた。よって、耐性克服としてWntシグナルの活性抑制も今後の検討課題であることが示唆された。EGFR抗体治療薬セツキシマブ耐性細胞株のクローンの樹立化により、個々の耐性機序の解明への足がかりとなり、解析方法としては、マイクロアレイの網羅解析により、おおむねターゲットを絞ることができた。また、その耐性機序に大きく二つのパスウェイを導きだすことができ、今後の研究に有効な結果を得ることに成功した。網羅解析について、H24年の7月にマイクロアレイ解析法についての権威者である、マウントサイナイ大学のCharles powell教授に直接ご指導頂くことができ、当初の予定よりも、スムーズに次のステップへと進むことができた。マイクロアレイ解析によって得られた、セツキシマブ耐性に関する2つのパスウェイについて、さらに立証するために、遺伝子の転写発現をルシフェラーゼアッセイ等を用い、立証していきたいと考えている。さらに、この立証がうまくいった場合、動物実験によりさらに検討をすすめていく。前年度分の479,727円分について、マイクロアレイ解析を行うのに予定していた金額ですが、専門の先生にご教授いただくことができ、その分、解析費用を軽減することができました。また、そこで新たにターゲットとなるパスウェイを明らかにすることができましたので、当初は計画していませんでしたが、ルシフェラーゼアッセイ他、転写の発現解析をその分の費用において、行いたいと思います。しかしながら、これらの解析はおよそ100万円ほどかかります。さらに蛍光顕微鏡、リアルタイムPCRまで行うことになるとさらに30-40万円を要することになると予想されます。また、最終的な動物実験において今年度の予算とうまく組み合わせて使用する計画をたてています。
高速遠心成形法を利用した表面傾斜金属化接合用アルミナの創製

金属とセラミックスの接合における残留応力の緩和,および界面反応性の向上を目的に,高速遠心成形法に用いて,単一プロセスで表面に金属粉末を傾斜化させたアルミナの創製を試みると共に,その接合性について検討した.結果を以下にまとめる.1)接合金属としてNbとステンレス鋼(SUS304)を選び,これらの金属と傾斜化アルミナの接合界面に生じる応力状態をFEM解析した結果,Nb/Nb傾斜アルミナの界面近傍応力はアルミナ中のNb傾斜幅を大きくすることによって改善できることが明らかになった.一方,SUS304/SUS304傾斜アルミナの接合では,傾斜部厚みや傾斜分布形状の変更によっても,目立った応力緩和効果は認められなかった.2)アルミナ表面の金属傾斜分布形状を制御するために,粉砕時間を変えた金属粉末をアルミナに加えて高速遠心成形を行った結果,粉砕時間の異なる粉末を混合し,更に粉末量を制御することで,傾斜域厚さ5mmで金属の濃度分布が緩やかに変化するNb傾斜化アルミナ成形体を得ることが出来た.3)Nb傾斜およびSUS304傾斜化アルミナを放電焼結法で焼結した結果,それぞれ1673K×600s,1523K×3.6ksで焼結可能なことが分かった。Nb傾斜化アルミナでは割れが発生しなかったのに対して,SUS304傾斜アルミナは金属粉末量が増加するに従って傾斜部とアルミナ界面において割れが生じた.4)Ag-27.5mass%Cu-2.0mass%Tiろうを用いて,Nb傾斜アルミナとSUS304との接合を試みた結果,傾斜部が厚く金属量が緩やかに変化するようなNb傾斜アルミナを用いることで,割れのない金属/セラミックス接合体継手が得られ,この方法によって割れ発生を防止できるだけの応力緩和効果が期待できることが明らかとなった。
プラステイン反応を利用した血圧低下ペプチドの連続合成

化学合成されたペプチドの降圧食品素材への適用が不可能な現状で、当該保健食品の開発・研究はすべて天然蛋白質からの酵素分解を主体としている。そこで本研究では、従来の研究アプローチとは全く逆の過程、すなわち加水分解酵素の逆合成反応を利用した天然アミノ酸からの活性ペプチドの連続生産を目指した。本年度においては、最適加水分解酵素のプラステイン反応性(脱水縮合によるペプチド合成反応)に関わる合成条件(酵素剤の選択、反応条件、添加剤)を明らかにした。1)themolysinによるVY合成:pHの影響は顕著であり、pH44-6の範囲においてのみ合成が認められた。pH5.0,反応時間24h、5mM CaCl2存在下において、0.1%シュガーエステルの添加によって約3倍の合成量の増大が認められた(1352nM)。2)50°Cの条件で反応は促進され、合成速度は40pmol/ml/hと見積もられた。3)Carboxypeptidase Aの場合においては、0.5%グリセロール添加によって反応は促進され、24時間の反応によって2936nmol/lの合成が認められた。以上の結果、両酵素を併用することによって、より高い合成収率を得ることが可能であると推察され、溶媒-水(海面活性剤添加)混合系が反応促進に有用であることが判明した。本年度においては、まず加水分解酵素のプラステイン反応性(脱水縮合によるペプチド合成反応)を明らかにし、アミノ酸からのペプチド合成が可能かどうかの大命題的検証と、酵素剤の選択、反応条件の最適化を試みた。1)プラステイン反応条件の検討:酵素、アミノ酸加水分解酵素の基質特異性を考慮して、アミノ酸としてはGly,Val,Leu,Phe,Tyr,Argを選択した。対応する酵素としてキモトリプシン、トリプシン、パパイン、アルカリプロテアーゼ、ペプシンを選択した。また、反応条件は以下のように固定し、まず反応pHの影響を検討した:3mM AA:enzyme(10:1)/0.1 M phos.buffer(pH5-8),37°C,24h,反応停止0.1% TFA。反応生成物の検出は逆相HPLC(5%-35% CH3CN/0.1%TFA)法により行った。その結果、いずれの酵素においてもpH7,8ではBlankと比較して新たなピーク(220mn検出)は認められなかったが、一部酵素においては低pH環境下の条件で新たなピークが出現し、確実にペプチド合成反応が達成されていることが判明した。2)プラステイン反応条件の検討:溶媒環境低極性溶媒を用いて同様の検討を行ったところ、両酵素とも溶媒極性の低下とともにペプチド合成が促進された。本条件での反応収率は現在のところ0.1%であると見積もられ、さらなる収率の向上と合成ペプチド類の同定を遂行中である。
多重極限環境下電子物性測定による高温有機強磁性と非フェルミ液体伝導機能の追究

磁性金属原子を含まない純有機化合物に強磁性機能を持たせる理論的指針は、すでに1960年代に提唱され、多くの化学者がその実現を試みてきた。しかし、現実に強磁性体が初めて合成されたのは1990年になってからのことである。この分野の研究は従来化学的アプローチが先行していたが、本研究では物理的視点から純有機磁性の一般的研究を行った。我々は、反強磁性体のネール温度は例外なく圧力と共にはじめから上昇することを系統的に明らかにしてきた。この特徴を積極的に利用して、磁気転移温度を向上させる指針を研究した。具体的目標には、本来スピンがキャントしたモーメントを持つ反強磁性体を加圧することにより強磁性成分を持たせたまま磁気転移温度を上昇させる機構の解明を目指した。この手法により常圧で35Kの転移温度をもつ有機物を1.6GPaの加圧下で66Kまで上昇させることに成功し、強磁性モーメントをもつ純有機磁性体の転移温度を液体窒素温度まで上昇させて、世界記録を更新する寸前に迫っている。近年高温超伝導体や重い電子系の量子臨界点(磁気不安定点)で非フェルミ液体的、あるいは超伝導的伝導現象が実現しているのは周知の通りである。本研究では、特に結晶場基底状態が非磁性をしめす希土類電子系で電気四重極子モーメントの秩序相あるいはガラス状態の発生を詳しくしらべ、さらに四重極子モーメントと共存する伝導電子系が新しい非フェルミ液体的挙動を示すことを見出し新たな研究を展開している。SQUID磁束計に高圧下帯磁率用クランブセル及びダイアモンドアンビルセルを組み込んだ測定システムの立ち上げ;備品で要求していた7テスラAC測定付高感度磁化率測定装置が11月に入荷し、これに予め開発していた上述の圧力セルを組み込んで、立ち上げ実験を繰り返し続行している。この作業と連動して、純有機強磁性体の高圧下の実験を行い以下のような成果を得た。代表的純有機強磁性体b-p-NPNN(Tc=0.61K)及びp-Cl-C_6H_4=N-TEMPO(Tc=0.28K)の加圧下物性測定(比熱、磁化率、磁化、構造解析等)とそれらの生滅機構を追究した。従来の結果を要約すると、加圧により前者のTcは先ず下降し、約6kbarの圧力で反強磁性に転移したのち、磁気転移温度は上昇に転じる。後者のTcは圧力とともに先ず下降し、その後約2kbar毎に上下を繰り返した後、約9kbar以上では反強磁性となって上昇する。共通している点はいずれも高圧で反強磁性に転移する点である。電荷移動、b-水素メカニズム等の相互作用機構が理論的にも指摘されているが、10kbarで格子定数が約5%縮む効果では上述の変化は説明できず、基や分子団の回転が重要な役割を演じることが解ってきた。一方加圧と共にTcが最初から上昇する例も見出した。中辻等の発見したTc=0.42Kの強磁性結晶2,5DFPNNの磁化率の圧力依存性を詳細に調べた。19.5kbarの加圧下でもしっかりした強磁性の特徴を示していることが解った。磁気比熱で見ても、対応する転移温度あたりで鋭いピークを示していることが解った。このことは分子間相互作用が3次元的にも強磁性のまま保たれており、前の2例の面間相互作用が反強磁性へ移行する場合とは対称的な結果になっている。次の4つの研究課題について、成果を上げてきた;1。純