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16世紀スペインにおける初期石切術書の研究

今年度は16世紀のスペインで成立した石切術書にみられる切石の作図法の記述方法の解明を課題とし,ヒネス・マルティネス・デ・アランダによる『構築物と石切術の作図法』を主な対象として,その記述構成の分析と整理を行った。作業に先立ち,16世紀スペインの石切術手稿本および関連する1617世紀成立の石切術書についての原資料目録を作成し,未入手のものに関しては復刻版を購入あるいは複写を入手した。また昨年度に引き続き,石切術に関する手稿本,刊本の内容(文章,図版)を電子情報化し,読解や分析の際に利便を図った。分析の結果,『構築物と石切術の作図法』本文からは,「前書き」,「規定」,「作図項目」からなる3つの記述の構成要素が抽出された。そして,これらの記述の構成要素の内容と,要素間相互の関係を検討することにより,同書における切石の作図法の記述方法に関して,次の2点の特質を指摘することができた。1.「前書き」において作図上の原型が設定される。それらの原型をもとにして,「作図項目」において構築物の変種を生成する。2.「規定」において基本的な作図操作が設定される。それらの作図操作をもとにして,「作図項目」において作図法を説明する。また,同書におけるこれらの記述方法の特質は,読者への序文において作者マルティネス・デ・アランダ自身が述べているように,「少ないものに多くを内包させる」という考え方を彼が評価し,その考え方を拠り所の一つとして切石の作図法の記述に応用していった結果であると推定される。今年度は「16世紀スペイン石切術書の内容分析と比較」を課題とし、石切術書出現期のスペインで、ほぼ時を同じくして成立した2点の手稿本(ヒネス・マルティネス・デ・アランダの切石による架構の作図書およびアロンソ・デ・パンデルビラの切石の作図書)に焦点を絞り、その内容分析を行った。分析に先立ち、16世紀スペインの切石作図書、および関連する1617世紀成立の石切術書についての原資料目録を作成し、未入手のものに関しては、復刻版を購入あるいは複写を入手した。また、本研究分野の中心的研究者であるマドリード工科大学建築学校(スペイン)のエンリケ・ラバサ・ディアス教授およびルーヴァン・カトリック大学(ベルギー)のホセ・カルロス・パラシオス教授を訪問し、研究課題に対するレビューを受けた。石切術手稿本の本文および図をデジタル情報化し、読解や分析の際の利便を図った上で、2点の手稿本の作図項目および作図法の比較を行った結果、次のような特質が抽出された。まず、同一建築部位あたりの作図項目数はマルティネスの方がはるかに多いが、それは各作図項目を定義する分類条件の多様さから生じていた。ただし、分類条件の構成要素の数は条件によって偏りが見られ、壁面形態や開口部の中心軸の種類を多くすることで作図項目数を飛躍的に増加させていることが判明した。一方、作図法に関しては、マルティネスが特定の作図法をあらゆる項目に援用しながらその有効性を示そうとしているのに対して、バンデルビラの場合は、建築部位の幾何学的特徴によって作図法を様々に変化させていた。マルティネスに比べると少なめのバンデルビラの項目数は、多様な作図法を無駄なく選んだ結果と捉えることができよう。
テレビ利用状態モニタによる片麻痺患者退院移行期の在宅定着状態把握

本研究は、片麻痺となった高齢者の退院後の在宅生活状態の変化をテレビ利用状態(TVOS)で把握することを目的とした。まずTVOS記録システムを開発し、被験者(男性、71歳、右片麻痺)宅でモニタリングした。これと同時に、毎月、認知や身体能力の評価を行った。テレビ利用時間と認知や身体能力の点数は、退院後の約3ヶ月までは増加傾向であった。TVOSは在宅での定着状態だけでなく認知症や身体能力の変化も反映する可能性が示された。増加している脳卒中で片麻痺となった患者が退院・在宅生活を開始すれば、入院中の手厚い看護・介護体制から自立し、在宅での生活に定着しなければならない。在宅患者がどのような日常生活状態を過ごし在宅定着により変化するかは未解明であるが、早期の退院が促されるようになり、在宅での定着状態の把握は重要になってきた。本研究では生活状態を反映するテレビ利用状態をモニタリングし、現在は未確立である退院時から在宅へと生活が変化する退院移行期における在宅定着状態の評価手法の確立を3年間で目指す。初年度は高齢片麻痺患者の退院移行期における1週間を通した活動状態や季節による活動状態の変化を年単位で長期間把握することを目的として、モニタリングシステムの構築を行った。試作システムの性能評価を行ったところ、当初の予測に反してインターネット通信に関するデータが十分に得られなかったため、仕様を再検討し、センサ内の通信モジュール部分を改良した。当初計画では、システムの試作・運用と共に退院患者のデータを収集する予定となっていた。ところがモニタリング開始に遅れが生じたため、試作システムの運用開始時期と退院時期に被験者となることを承諾していた患者の時期が一致せず、新たに被験者となっていただける患者を待つ必要があった。しかし、この時間を利用して、システム運用においては安定した通信環境と継続したモニタリングを実施するための十分な機器の整備を行うことができた。2年目として、本研究に参加していただける被験者宅にテレビ利用状態をモニタリングするシステムを設置した。さらに、被験者の通所リハビリテーション時に認知や身体能力などの評価を行い、テレビ利用状態と共に、これらの変化を記録した。要介護2の男性被験者の場合、退院直後にはテレビを利用する時間が不規則であったが、時間の経過と共に規則的なテレビ利用の習慣が確認されるようになってきた。また、通所リハビリテーション時に評価している各種項目では、退院前に比べて在宅へ移行後には(1)生活空間の広がり、(2)認知症テストや(3)機能的自立度は向上もしくは維持した。しかし、(4)身体能力に関しては低下する傾向が現れた。このように当初の目的通り、テレ利用状態からは在宅での定着状態が推定できる可能性が示されてきたが、身体能力に関しては退院前に比べて低下することが示された。これらについては、今後詳細にデータを解析・検討する必要がある。脳卒中で片麻痺となった患者が退院・在宅生活を開始すれば、入院中の手厚い看護・介護体制から自立し、在宅での生活に定着しなければならない。在宅患者がどのような日常生活状態を過ごし在宅定着するかは未解明であるが、早期の退院が促されるようになり、在宅での定着状態の把握は重要になってきた。本研究では生活状態を反映するテレビ利用状態をモニタリングし、現在は未確立である退院時から在宅へと生活が変化する退院移行期における在宅定着状態の評価手法の確立を3年間で目指した。まずテレビの利用状態(ON/OFF)を自動記録するモニタリングシステムを開発した。そして本研究に参加した被験者(男性、71歳、高血圧性脳内出血により右片麻痺、要介護2)宅に、テレビ利用状態モニタリングシステムを設置した。退院時からテレビ利用状態のモニタリングを開始し、約1年間継続させた。この被験者では退院直後にはテレビを利用する時間が不規則であったが、時間の経過と共に規則的なテレビ利用の習慣が確認された。テレビ利用の総時間数は約3ヶ月間までは徐々に増加した。通所リハビリテーション時に評価した各種項目では、退院前に比べて退院後の在宅へ移行後の約3ヶ月間までは、生活空間の広がり、認知症テストや身体能力は向上傾向であった。

しかし機能的自立度は退院直後に一時的に低下したが、半年程度で退院前までに回復した。テレビ利用の総時間および認知や身体能力は、これ以降大きな変動が認められず、回復維持期に移行したことが伺えた。このようにテレビ利用状態からは、在宅での定着状態を推定できるだけでなく、認知症や身体能力の状態も反映する可能性が示された。今後、症例を増やし上記の可能性を統計的に示す必要がある。被験者のデータ収集も開始され、当初予測に一致するデータも収集されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。被験者数を増加させ、退院時から在宅患者がどのような日常生活状態を過ごし在宅定着により変化するかを定量的に評価する。これを実現するため、研究協力者である医療従事者との連携を深め、被験者数の増加を図る。
超小形・超薄形移動通信用アンテナの設計法に関する研究

マイクロストリップアンテナ(以後,MSA)を移動通信用の超小形・超薄形アンテナとして応用する際重要となる設計上の問題点について,理論・実験両面より総合的に検討を加え,併せてこの種の平面アンテナの諸特性(放射パタ-ン,入力インピ-ダンス特性,無負荷Q,放射効率η,交差偏波成分など)を電波暗室内で精測するとともに当補助金による購入備品(アンテナデ-タ処理専用ワ-クステ-ション及び端末機)を積極的に利活用し、その設計基礎資料を明確化した。すなわち,(1)円偏波MSA素子を含めこの種の超小形・超薄型平面アンテナの放射効率,広角軸比,放射パタ-ン,帯域幅及び利得等の基本特性につき解析を行い,その解析結果の妥当性を実験的に検証した。(2)次いで,本円偏波平面アンテナ素子を試作し,その素子形状と放射特性の関係等を解明し,この種のアンテナ系の設計法を確立した。(3)さらに、直線偏波素子を含め,この種の超小形,超薄形アンテナに関する総合的設計基礎資料を取得した。(4)また,この種のアンテナ系を用いるビ-ム成形法,すなわち,目的に応じて所望のビ-ム形状を実現する手法の可能性についても検討を加えた。(5)上記手順により得られた設計資料を駆使し超小形・超薄型平面アンテナを設計・試作し,且つ,その放射諸特性につき考察を加え、この種のアンテナ系が移動通信用アンテナとして有用な一形式となり得ることを明らかにした。これからの研究成果を国内外の学会誌,及び複数の国際会議などにおいて精力的に発表を行っている。マイクロストリップアンテナ(以後,MSA)を移動通信用の超小形・超薄形アンテナとして応用する際重要となる設計上の問題点について、理論・実験両面より総合的に検討を加え、併せてこの種の平面アンテナの諸特性(放射パタ-ン、入力インピ-ダンス特性、無負荷Q、放射効率η、交差偏波成分など)を電波暗室内で精測するとともに当補助金による購入備品(アンテナデ-タ処理専用ワ-クステ-ション)を積極的に利活用し、その設計基礎資料を明確化した。すなわち、MSAを小形化する際重要となる放射効率η、帯域幅BW、無負荷Q値(Q_o)及び放射パタ-ンなどにつき検討を加え、その設計基礎資料を得るため、(1)テフロンファイバ-等の代表的高周波基板上にフォトエッチング技術により小形MSAを構成し、その素子形状比と放射効率η及び帯域幅BW等の関係を理論的に求め、その妥当性を実験等により総合的に検証した。(2)小形で且つ十分な放射効率を有するMSA素子につきその指向特性を理論的に求め、電波暗室内でそのパタ-ンを精密に測定し、上記設計理論の妥当性を検証した。(3)これらの結果より平面アンテナの小形化には、短絡面幅を制御する短絡面制御形MSAが有効であることを明確化し、その小形平面アンテナの特性を、購入備品であるワ-クステ-ションにより解析し、それらの成果の一部を国内外の学会において精力的に発表を行っている。(4)更に、短絡面制御形MSAの広帯域化のためスタック化MSAを提案し、これらの小形平面アンテナ系についての鋭意研究を行っている。本研究では,超小形・超薄形円偏波マイクロストリップアンテナ(MSA)素子を移動通信用アンテナとして応用する際重要となる放射諸特性を,当補助金による購入備品であるワ-クステ-ション用端末機(PC9801RX)を十分に利活用し,理論・実験両面より解明しその設計法を確立した。

(2)次いで,本円偏波平面アンテナ素子を試作し,その素子形状と放射特性の関係等を解明し,この種のアンテナ系の設計法を確立した。(3)さらに,直線偏波素子を含め,この種の超小形,超薄形アンテナに関する総合的設計基礎資料を取得した。(4)また,この種のアンテナ系を用いるビ-ム成形法,すなわち,目的に応じて所望のビ-ム形状を実現する手法の可能性についても検討を加えた。(5)上記手順により得られた設計資料を駆使し超小形・超薄型平面アンテナを設計・試作し,且つ,その放射諸特性につき考察を加え,この種のアンテナ系が移動通信用アンテナとして有用な一形式となり得ることを明らかにした。これらの研究成果を国内外の学会誌,及び複数の国際会議などにおいて精力的に発表を行っいる。
タンパク質機能改変技術による自己免疫疾患の分子病態解明と画期的治療法の開発

近年、腫瘍壊死因子(TNF-α)が種々自己免疫疾患における創薬ターゲットとして注目を集めている。しかしTNFのレセプターにはTNFR1とTNFR2の二つのサブタイプが存在し、それらの機能の違い、特にTNFR2の機能は十分明らかにされていない。そこで本研究では、我々が創製したTNFR2指向性TNF変異体を活用することで、TNFR2の機能を解明し、創薬標的としての可能性を探ることを目的とする。本研究では、TNFR2の細胞内アダプター分子としてAPP3を同定し、その機能の一端を明らかとした。本研究成果は、今後のTNFR2の機能の解明や創薬標的の可能性を探るうえで有用な知見になると考えられる。近年の分子標的治療薬の台頭に伴い、腫瘍壊死因子(TNF-α)が種々自己免疫疾患における創薬ターゲットとして注目を集めている。しかしTNFが結合するレセプターにはTNFR1とTNFR2の二つのサブタイプが存在し、各レセプターが可溶型/膜結合型TNFと相互に作用しつつ、非常に複雑かつ巧妙にその生体内反応が正負に制御されており、それらの機能の違いは十分明らかにされていない。そこで本研究では、TNFシグナルの多様性に着目し、我々が独自に創製したTNFR1及びTNFR2指向性TNF変異体(アゴニスト・アンタゴニスト)を活用することで、これまで困難であった各レセプターと病態との連関解析を通じて、自己免疫疾患に対する画期的な分子標的治療薬の開発に資することを目的とする。平成24年度は、in vivoでのTNFR2の機能解析を念頭に、マウスTNFR2(mTNFR2)指向性のTNF変異体(アゴニスト)の創出を試みた。マウスTNF-α(mTNF)中のレセプター結合領域に位置する6箇所のアミノ酸残基(Q31,R32,A33,A144,E145,S146)をランダムに置換した構造変異mTNFを網羅的に発現するファージライブラリを構築した。続いて作製したライブラリの中から結合力に基づくセレクションを行い、mTNFR1には結合せず、mTNFR2のみに親和性を有し、さらに、各レセプターを介した生物活性を指標にスクリーニングを行った。スクリーニングの結果、有望なmTNFR2指向性のmTNF変異体候補を得ることができた。各TNFレセプターを介したシグナル伝達の詳細な制御メカニズムは不明な点が多く残されている。従って、TNFとそのレセプターの全貌を解明するには、単に一方のレセプターをノックアウト・ノックダウンさせるだけでなく、両レセプターが共存した状態で機能解析する必要性がある。本研究では、レセプター選択的な結合能を有する構造変異TNFを用いて、TNFと2種類のTNFレセプターを介した組合せによって生ずる多種多様なシグナル伝達の差異を個々に解析することでTNF/TNFRの役割解明を図り、リガンド-レセプター結合の観点から自己免疫疾患の惹起・悪化と宿主の生体防御応答にかかわるシグナル経路を明確化する。さらに得られた知見をもとに、宿主生体防御能を低下させることなく、病態増悪のみを選択的に阻害できる画期的治療薬の開発を目指す。平成25年度は、in vitroにおける各TNFレセプターのシグナル伝達機構の解明を目的に、TNFR2指向性変異体を細胞に作用させ、免疫沈降により各レセプター複合体を回収した後、質量分析装置を用いて細胞内ドメインに結合する新規アダプター分子の同定を試みた。その結果、TNFR2のアダプター分子候補としてAminopeptidase P3(APP3)を同定した。一方近年、TNFR2がFoxp3陽性T-regに高発現しており、T-regの活性化に関わる可能性が報告されている。そこでTNFR2を介した免疫制御機構として、T-regの活性化との関連を検討した。マウスよりT-regを単離し、mTNFR2指向性アゴニスト刺激による活性化能を評価した結果、TNFR2刺激によりTregの増殖促進が確認できた。以上の結果から、TNFR2の機能の一端を明らかにすることができた。近年の分子標的治療薬の台頭に伴い、腫瘍壊死因子(TNF)が種々自己免疫疾患における創薬ターゲットとして注目を集めている。

そこで本研究では、TNFシグナルの多様性に着目し、我々が独自に創製したTNFR1及びTNFR2指向性TNF変異体(アゴニスト・アンタゴニスト)を活用することで、これまで困難であった各レセプターと病態との連関解析を通じて、自己免疫疾患に対する画期的な分子標的治療薬の開発に資することを目的とする。平成25年度までに、TNFR2のシグナルに関与するアダプター分子(APP3)を同定している。そこで平成26年度では、このAPP3に着目し、細胞内挙動の解析、細胞内シグナル伝達経路の解析を行い、TNFR2を介するシグナル伝達における役割の解明を試みた。その結果、APP3はTNFR2からのシグナルにより、ミトコンドリアから細胞質に局在が変化すること、また、シグナル伝達分子JNKのリン酸化に関与することが明らかとなり。TNFR2のシグナル伝達に重要な役割を担っていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。タンパク質工学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、マウス型TNFR2指向性のTNF変異体(アゴニスト)を取得することができており、当初の計画通り、概ね順調に進展している。本年度は、TNFR2の細胞内シグナルの解明に関してアダプター分子を同定できたこと、また、TNFR2がTreg細胞の機能に与える影響として細胞増殖促進作用が見られてことなどから、概ね当初計画通りに順調に進展していると判断した。現在のところ、概ね計画通りに研究は遂行できる見込みである。次年度は、取得したTNF変異体などを利用し、TNFR2を介した細胞内シグナルについての解析を試みる予定である。今後は、TNFR2の機能や創薬標的としのて可能性等を探るため、これまでに同定したTNFR2の細胞内アダプター分子候補の詳細な機能を明らかにしていく。特に、細胞内挙動やシグナル伝達経路の解析などを中心に進める予定である。当初計画よりも経費を節約できたことから、予算を一部次年度に繰り越すこととした。繰り越した予算は、次年度以降に、当初計画よりも詳細な実験を行うことなどに使用予定である。H25年度で予定していた研究に必要な経費が、実験方法の効率化により節約できた。そのためH26年度に、より実験の確度を高めるべく、詳細な実験を実施する費用として使用する予定である。TNFR2の細胞内アダプター分子の細胞内挙動を超解像顕微鏡なども用いて詳細に解析を試みる。また、疾患モデル動物を用いて、TNFR2のシグナル関連分子の機能解析を試みる。そのための試薬・器具・実験動物を購入する。
鳥類と哺乳の大脳相同性:グルタミン酸作動神経細胞による証明

鳥類と哺乳類の大脳の相同性を比較するために、鳥類の中枢神経系に存在するグルタミン酸作動性神経細胞の局在と神経回路を形態的に解析した。その結果、鳥の海馬体は中隔にグルタミン酸投射をしていることから哺乳理のもの(アンモン角と歯状回)と相同であると判明した。また巣外套は同様に哺乳類の大脳新皮質4層に相当する可能性がある。しかし他の多くの外套部位は未解決のまま残っている。鳥類大脳の相同性について比較神経解剖学の立場から証明を試みた。今年度はグルタミン酸神経細胞の存在と投射部位を2型小胞性グルタミン酸トランスポーター(vGLUT-2)のin situ hybridization法と免疫組織化学法および線維連絡法で解析した。2.免疫組織化学鳩の小胞性グルタミン酸トランスポーター(vGLUT-2)に対するポリクローナル抗体を作製した。vGLUT-2の中枢神経系内の分布を光顕免疫組織学で解析した。VGLUT-2の陽性反応は神経細胞体には観察されず、ニューロピル、数珠状あるいは神経細胞体周囲に点状に見られた。陽性反応は大脳から脊髄まで広く観察され、部位別では強い陽性反応は嗅球、大脳外套の大部分、線条体、背側視床、視床下部、小脳皮質で見られた。視蓋は中等度の陽性反応を示し、特に表層は数珠状の陽性産物が確認できた。脊髄は背角が中等度の陽性を示した。神経細胞体を取り巻く点状の陽性反応は延髄聴覚系の大細胞核と層状核で見られた。[発表:第115回日本解剖学会解剖誌85(Suppl.):191,2010]3.線維連絡鳩の後巣外套中間部(NCC)が脳内のどの部位と線維連絡しているかを、標識色素を微量注入することにより解析した。その結果、NCCは内在性回路が豊富に形成され、またNCC以外の大脳では中間中外套背側部、中間巣外套内側部、弓外套と強い線維連絡があった。大脳外へは視床の円形下核、卵形核、後視床核背外側部と連絡している。これらの所見からNCCは中間中外套背側部から大量の入力を受け入れ、弓外套へ出力することが明らかになった。[発表:J.Comp.Neurol.517 : 350-370,2009]【目的】鳥類の大脳外套の投射神経細胞の基本は哺乳類大脳皮質と同様グルタミン酸作動性である。これは2型小胞性グルタミン酸トランスポーター(VGLUT-2)のmRMを利用したin situ hybridization法により明らかにされたものである。この方法ではVGLUT-2発現神経細胞の局在は判定できるが、投射先は分からない。今回はVGLUT-2に対する抗体を用いた免疫組織化学により、鳩中枢神経系に存在するグルタミン酸作動性神経細胞の投射先を解明した。【材料と方法】鳩はペントバルビタールで麻酔後、0.1%グルタールアルデヒド-4%パラホルムアルデヒド混合液で灌流固定を行い、厚さ50μmの凍結切片を作製した。使用したVGLUT-2ポリクローナル抗体は、鳩VGLUT-2アミノ酸配列のC末端側に相当する部位の合成ペプチドを兎に免疫し得たものである。観察は光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて行った。【結果】陽性反応は神経細胞体には観察されず、ニューロピル、数珠状あるいは神経細胞体周囲に点状に見られた。視蓋は中等度の陽性反応を示し、特に表層は数珠状の陽性反応産物が確認できた。延髄では神経細胞体を取り巻く点状の陽性反応が延髄聴覚系の大細胞核、角核、層状核で見られた。電子顕微鏡による観察では、陽性反応は非対称性の前シナプスに局在していた。【結論】以上の観察から、鳩の脳脊髄ではグルタミン酸作動性神経細胞が広範にわたり、多数の部位に投射していることが明らかになった。【目的】鳥類の大脳外套の投射神経細胞の基本は哺乳類大脳皮質と同様グルタミン酸作動性である。これは2型小胞性グルタミン酸トランスポーター(VGLUT-2)のmRNAを利用したin situ hybridization法により明らかにされたものである。今回はシナプスに局在するVGLUT-2に対する抗体を用いた免疫組織化学と標識色素注入による線維連絡を組み合わせることにより、鳩中枢神経系に存在するグルタミン酸作動性神経細胞の主要な投射先を解明する。【結果】VGLUT-

2陽性反応は神経細胞体には観察されず、ニューロピル、数珠状あるいは神経細胞体周囲に点状に見られた。電子顕微鏡による観察では、陽性反応は非対称性の前シナプスに局在していた。VGLUT-2陽性反応は大脳から脊髄まで広く観察され、部位別では強い陽性反応は嗅球、大脳外套の大部分、線条体、背側視床、視床下部、小脳皮質で見られた。とりわけ大脳外套では中外套(mesopallium)が最強陽性を示した。視蓋は中等度の陽性反応を示し、延髄では聴覚系の大細胞核、角核、層状核で神経細胞体を取り巻く点状の陽性反応が明瞭に見られた。脊髄は背角が中等度の陽性を示した。線維連絡では、中外套は直下の内外套(nidopallium)と非常に強い相互連絡をしているほかに、視床からの入力が認められた。【結論】以上の観察とこれまでの研究成果から、鳩の脳脊髄ではグルタミン酸作動性神経細胞が広範にわたり、多数の部位に投射していることが明らかになった。そのうち中外套-内外套、海馬-中隔、嗅球-梨状葉、外套-線条体、聴覚系、視覚系、橋-小脳が主要な投射経路であると考えられる。
血清脂質バイオマーカーによる非B非C型肝発癌リスク予測法の開発

NASHに特徴的な血清胆汁酸濃度の増加や分画の変化がみられ、これらの疾患における腸内細菌叢の変化を反映しているものと推測されたが、発がんの高リスク群の絞り込みをおこなうためのマーカーにはなりえなかった。NASH発がんモデルであるSTAMマウスの血清ならびに組織中の胆汁酸や酸化ステロール(OS)を経時的に追跡すると、発症のごく早期に酸化ストレスにより産生されるOSの増加がみられ、一方27-hydroxycholesterolに代表される酵素的に産生されるOSは減少していた。本研究により、コレステロール異化産物としてのみならず、病態の進展に関連してOSが質的に変動していることが示唆された。(1)収集された検体のうち、血清の胆汁酸分画についてLC-MS/MSを用いた検討を行っている。酸化ステロールは胆汁酸合成の際の代謝産物ともいえる側面をもっており、胆汁酸合成についてこれら疾患について確認する事は重要であろうこと(以前までの検討では、合成、吸収のマーカーまでは測定していたが、実際の合成産物の分画を検討した)、さらに、近年の報告では、肥満モデルラットでの肝発癌に腸内細菌が関与しており、腸内細菌が変調を与えるファクターとして2次胆汁酸濃度の増加、さらにこれによる肝星細胞を介したSenecence Associated Secretory Phenotype (SASP)の発現が示唆されており、ヒトにおいても同様の変化がみられるかを検討した。あくまで血清胆汁酸でのデータであるが、NASH患者においては健常対照群に比較して、1血清総胆汁酸濃度の上昇、2グリシン抱合体割合の増加、3ケノデオキシコール酸割合の増加がみられ、健常人と異なる腸内細菌叢の存在が示唆されたが、予測された2次胆汁酸(特にデオキシコール酸)の増加はみられなかった。これは種差によるものか、あるいは肥満そのものが与える影響なのか現段階では不明。(2) SVR後発癌において、酸化ステロールの増加がリスクマーカーになりうるかどうかという本研究の主目的に対する情報を得るため、HCV感染患者の血清酸化ステロールレベルがIFN治療によりどう変化するかを検討した。3ヶ月のIFN投与により(治療中)特定の酸化ステロールの有意な低下が認められた。主にAutoxidationにより増加する酸化ステロールがこの主体と考えられ、IFN治療による酸化ストレスの減少が示唆された。治療終了後長期にわたりこの状態が持続する事が肝発癌リスク低下に結びつく可能性がある。(1)昨年度に引き続き、血液中胆汁酸分画がNASHおよびNASH肝癌で異なるプロファイルを示すかどうかについて、患者サンプルを用いて検討した。健常人とNASH,NASH肝癌では明らかに異なる胆汁酸プロファイルを認めたが、NASHとNASH肝癌患者の間では明確な差が認められなかった。胆汁酸分画はNASH患者の中での高リスク群の絞り込みには有用性が乏しいものと推測された。(2)脂肪性肝疾患から発症する肝癌モデルとして、STAMマウスの検体を用い、まず肝組織中のコレステロールを測定した。STAMマウスはストレプトゾシン投与により膵内分泌能を破壊し、インスリン抵抗性をもたらした状態に高脂肪食を加えるモデル動物である。対照群に比べるとSTAMマウスでは有意に肝組織中コレステロールが増加していたが、高脂肪食投与のみの状況と比較すると、投与開始初期のコレステロールこそ増加するものの、週齢が進むにつれて差はみられなくなった。ベースとなるコレステロール量には差がみられないことから、今後酸化ステロールの違いを検討すると、酸化ステロールが増加するメカニズムがSTAMマウスではみられるものと考え解析を進めている。昨年度に引き続き、脂肪性肝疾患から肝癌を発症させるモデルとして、低容量のストレプトゾトシンを出生直後に投与したのち高脂肪食を与えて作成するSTAMマウスの検体を用い、血清並びに肝組織中の酸化ステロールについて解析した。酸化ステロール(OS)はコレステロール(CHOL)の酸化物であり、CYPファミリーにより酵素的に合成されるものとautoxidationにより非酵素的に合成されるものに分類される。OSのうち、LXRのリガンドとして作用するものはSREBP1cの活性化を介し肝細胞内の中性脂肪を増加させるが、一方でCHOL蓄積を抑制することで結果としてミトコンドリア障害や小胞体ストレスを減少させる。一方、OSの中にはLXRαに対してアンタゴニスト作用を有するものもありこれらによりむしろ炎症や線維化が促進される可能性がある。STAMマウスサンプルの解析は順調であり、現在脂質代謝関連遺伝子の発現について解析の途中である。消化器内科学STAMマウスの解析から得られたデータを元に、裏付けとなる培養細胞系を用いた実験系で仮説を実証する。NBNC肝癌、HCV治療後肝癌について症例の蓄積を開始し、血清サンプル、ならびに肝癌、背景肝組織についてプールを行っている。また、他施設(国立病院機構九州医療センター)にも依頼をして、同様のサンプルを集積している。酸化ステロールについては測定中のものも含め現在データを集積中である。

また、マウスNASH発癌モデル(STAMマウス)の血清、組織サンプルについて、RNAの抽出、メタボローム用サンプルの調整を開始している。発表した学会がいずれも近隣で行われており、交通費、宿泊費などの必要がなかったこと。国外の学会については、都合により出席を見合わせたこと。LCーMS/MS解析に使用したカラムの交換が不要であったこと。NBNC肝癌、SVR肝癌患者での血清酸化ステロールの増加が明らかになった場合、これをリスクマーカーとして考えるためには、非発癌例で実際に低下しているのかどうかが確認される必要があり、これらのサンプルについても追加を行い検討する。今年度中にSTAMマウスサンプルの解析結果を総括する。PCRに用いる消耗品などの費用が増加すること。細胞培養系を用いた実験を計画しており、これらの購入費用にあてる。発表した学会がいずれも近隣(都内)で行われており、交通費、宿泊費などの必要がなかったこと。上述したように、非発癌例やHCV治療後例でのサンプル測定追加が必要となり、これらの収集費用、解析に用いられる費用に当てる。
地震波干渉法による火山体地下構造の時間変化

我々は地震波干渉法と呼ばれる手法を用いて、豊富な地震観測が行われている浅間山の地震波速度構造およびその時間変化を求めた。それにより山体西部の深さ5-10kmにおいて顕著な低速度領域を発見した。この低速度領域は直径5kmもしくはそれ以下という小さなものであり、走時トモグラフィなどの従来の方法では検出が不可能と考えられる。主に海洋を起源とする脈動や,地震波の散乱によって生み出されるコーダ波などのランダムな波動場は,観測点間の相互相関をとることにより,地下構造はその時間変化を観測することができる.この手法を用いて地震や火山噴火にともなう地下の地震波伝搬速度の時間変化を求める研究が行われつつある.本研究は,地震波速度以外の情報,すなわち減衰構造や散乱構造の変化を地震波干渉法によってもとめることが目標である.本年度は,2007年に発生したPiton de laFournaise火山の噴火(フランス領レユニオン島)にともなう地下構造の変化を,微動を用いた地震波干渉法により求めた.まず,地震波干渉法による地下構造の時間変化を求める時間分解能を検討し,この場合には約1日の分解能があることを明らかにした.さらに,この噴火にともない発生したマグマの水平移動域付近においては,マグマ貫入前後で,地下構造の変化を反映した顕著な波動場の変化がみられることを発見した.この変化は地震波伝搬速度の変化だけで説明することは不可能であり,原因を他のものに求めなくてはならない.我々は減衰構造の時間変化にその原因を求め,それを検出する手法を提案し,マグマ貫入による減衰の増加により観測された波動場が説明出来ることを示した.主に海洋を起源とする脈動や,地震波の散乱によって生み出されるコーダ波などのランダムな波動場は,観測点間の相互相関をとることにより,地下構造やその時間変化を観測することができる.本年度は,この手法を用いて浅間山の地下構造およびその時間変化を求めることに成功した.まず最初に,2005年から2007年にかけて観測された脈動を用いて浅間山およびその周辺を伝わるレイリー波を抽出し,その伝搬速度から,浅間山周辺のS波速度構造を求め,浅間山西側深さ5-10kmに顕著な低速度領域を発見した.この低速度領域は,2004,2008-2009年の火山活動で貫入した岩脈(ダイク)および,過去に繰り返し貫入して冷え固まって作られたと思われるダイク,および2009年2月の噴火に同期して収縮したダイクの領域の下部に位置するため,マグマだまりを示すと思われる.マグマだまりの水平差し渡しは10km弱であり,地震学的にこのような小さなマグマだまりが見つかったのは初めてである.また,同手法により浅間山周辺の地震波速度構造の時間変化も見積った.浅間山周辺で発生した300個あまりの地震のコーダ波の相互相関をとることにより,観測点間の波動伝搬を抽出して速度変化を見積もった.その結果,2008年噴火に先立ち,約1.5%の速度減少があり,その速度減少が回復した後に噴火が発生したことが分かった.この速度減少および回復の期間は,地殻変動および地震観測により推定されるダイク貫入の時期よりも明らかに早く,この速度変化のメカニズムは今後検討が必要である.海洋波浪起源のノイズや地震記録のコーダ部分などはランダム信号と呼ばれているが、2つの観測点で記録されたランダム信号の相互相関をとると、あたかも片方の観測点を震源、もう片方の観測点を観測点とするような地震波伝搬記録が得られる。この特性を利用して、活火山における地震波速度構造およびその時間変化を求める研究を行った。我々は豊富な地震観測が行われている浅間山のデータを用いて、地震波速度構造およびその時間変化を求めた。まず、各観測点の上下成分の地震記録の相互相関をとることにより、観測点間の地震波伝搬を抽出した。抽出された地震波はレイリー波であるので、そこからS波速度構造を求めることができる。このようにして、我々は山体西部の深さ5-10kmにおいて顕著な低速度領域を発見した。地殻変動観測や人工地震を用いた浅部地震波速度構造などと組み合わせることにより、本研究により抽出された低速度領域はマグマだまりであると推定した。また、我々は地震記録のコーダ部分を用いて、浅間山の火山体全体を平均したレイリー波位相速度の時間変化を推定した。レイリー波位相速度は、2008-9年噴火に1年ほど先立って1%ほどの顕著な低下を見せている。これは、地殻変動データによって推定されるマグマ貫入よりも先行するものであり、求められた速度変化のメカニズムは明確にはなっていない。
単結晶酸化物半導体の表面を利用した光触媒作用機構の解明

高性能な光触媒の開発には光触媒作用機構について基礎的な知見を増やすことが不可欠である。酸化チタンなどの半導体光触媒は二酸化炭素を光触媒的にメタンやメタノールなどに固定化還元できるなど、数多くの可能性を秘めている。しかし、通常の微粒子や担持光触媒系では多くの因子が触媒活性に影響を与えるため、解析が困難である。その解決のためには規定表面を使った触媒作用機構の解明が検討されるべきである。本研究では、酸化チタン単結晶を用い、その規定された表面構造を利用することで、光触媒作用機構の解明に関する新たな知見を得ることを目指した。特に、酸化チタン単結晶を利用して、水による二酸化炭素の固定化還元に対する光触媒反応の作用機構の解明を目指した。その清浄表面に二酸化炭素や水または反応中間体として予想される有機物を吸着させ、その吸着状態や光照射による反応生成物の分析を行った。質量分析計(Mass)、昇温脱離法(TPD)を組み合わすことにより、表面吸着種からの脱離種の同定および定量を行うことで吸着状態についての知見を得た。また、FT-IRや高分解電子エネルギー損失分光法(HREELS)により、吸着状態の直接観察を行い、発光測定とその時間分解測定により光励起活性種の反応ダイナッミクスを観測し、さらに、ESR測定を行い反応中間体の同定と反応機構の解明を行った。結晶面に依存して、反応生成物の活性および選択性が大きく変化することを明らかにした。
繊維/樹脂界面の動的環境強度特性評価と界面はく離疲労き裂進展のその場観察

複合材料は「組合せ」であるが故に数多くの特徴を有し,単一素材では実現できない特性の可能性に富んでいる一方,必然的に異種材料間に界面が存在し,その特性が複合材料の機械的特性に大きな影響を与える.しかしながら,繊維/樹脂界面の機械的特性や破壊機構,特に実使用下において重要となる動的環境強度特性に関する知識は,高強度・高弾性繊維強化複合材料の研究・開発の歴史が浅いこともあり,極めて乏しい状況にある.そこで,本研究においては,アラミド繊維とエポキシ樹脂を用いて,界面き裂を定量的に観察することができるモデルコンポジット試験片を考案し,乾燥空気中,実験室空気中,湿潤環境中において単繊維引き抜き試験を疲労荷重下で行い,界面はく離進展挙動に及ぼす水環境や繰り返し速度の影響を検討した.初期き裂の大きさは吸水時間に依存し,4週間吸水材は空中放置材に比べて大きな初期き裂が発生し,7週間吸水材の場合は埋め込み長さ全長にわたる初期き裂が生じた.初期き裂導入後のき裂進展については,界面き裂進展速度は界面き裂の進展にともなって低下し,最終的に停留した.界面き裂の停留は,最大荷重を界面き裂の表面積で除した値が,環境に固有な一定値に近づくことで条件付けられた.界面き裂は,乾燥空気中では実験室空気中に比べて高速に進展するのに対して,湿潤空気中ではほとんど進展しなかった.また,湿潤空気中でき裂進展試験を開始し,界面き裂が停留した後に乾燥空気を導入すると,き裂はふたたび進展を開始した.逆に,乾燥空気中で試験を開始し,界面き裂進展中に湿潤空気を導入すると,界面き裂は停留した.つまり,湿潤環境により,き裂進展速度が低下することがわかる.また,界面き裂進展速度は応力繰り返し速度に大きく影響を受け,繰り返し速度が低いときに速くなった.複合材料は「組合せ」であるが故に数多くの特徴を有し,単素材では実現できない特性の可能性に富んでいる一方,必然的に異種材料間に界面が存在し,その特性が複合材料の機械的特性に大きな影響を与える.しかしながら,繊維/樹脂界面の機械的特性や破壊機構,特に実使用下において重要となる環境強度特性に関する知識は,高強度・高弾性繊維強化複合材料の研究・開発の歴史が浅いこともあり,極めて乏しい状況にある.そこで,本研究においては,繊維/樹脂界面のその場観察が可能な単繊維強化エポキシ引き抜き試験片を作成し,水環境が破壊特性に及ぼす影響を定量的に評価した.単繊維引き抜き試験片を,80°Cのイオン交換水に7週間浸漬すると,繊維/樹脂界面強度が26%低下し,繊維破断強度が37%低下することが明らかとなった.引き抜き後の繊維表面を高分解能電界放射型電子顕微鏡により観察したところ,空中放置材には繊維表面に樹脂が付着しているのに対して,7週間吸水材には樹脂付着がほとんど見られず,吸水により繊維/樹脂界面強度が低下したことを明らかにした.また,種々の試験片形状を検討し,界面はく離疲労き裂進展のその場観察が可能な単繊維引き抜き試験片を新たに考案し,疲労荷重下でその場観察できることを示した.さらに,繊維/樹脂界面はく離のその場観察,AE波複数パラメータによるオンライン非破壊損傷評価から,引き抜き試験中に計測したAEが,埋め込み長さ全長にわたる繊維/樹脂界面はく離の不安定進展時に発生するもの,繊維破断時に発生するもの,stick-slip時に生じるもの,繊維/樹脂界面はく離の進展時のものの4種類に分類でき,埋め込み長さ全長にわたる繊維/樹脂界面はく離の不安定進展時や繊維破断時のAEは高振幅,長持続時間であることを示し,AE信号と破壊の関係を導き出した.複合材料は「組合せ」であるが故に数多くの特徴を有し,単一素材では実現できない特性の可能性に富んでいる一方,必然的に異種材料間に界面が存在し,その特性が複合材料の機械的特性に大きな影響を与える.しかしながら,繊維/樹脂界面の機械的特性や破壊機構,特に実使用下において重要となる動的環境強度特性に関する知識は,高強度・高弾性繊維強化複合材料の研究・開発の歴史が浅いこともあり,極めて乏しい状況にある.そこで,本研究においては,アラミド繊維とエポキシ樹脂を用いて,界面き裂を定量的に観察することができるモデルコンポジット試験片を考案し,乾燥空気中,実験室空気中,湿潤環境中において単繊維引き抜き試験を疲労荷重下で行い,界面はく離進展挙動に及ぼす水環境や繰り返し速度の影響を検討した.初期き裂の大きさは吸水時間に依存し,4週間吸水材は空中放置材に比べて大きな初期き裂が発生し,7週間吸水材の場合は埋め込み長さ全長にわたる初期き裂が生じた.初期き裂導入後のき裂進展については,界面き裂進展速度は界面き裂の進展にともなって低下し,最終的に停留した.界面き裂の停留は,最大荷重を界面き裂の表面積で除した値が,環境に固有な一定値に近づくことで条件付けられた.界面き裂は,乾燥空気中では実験室空気中に比べて高速に進展するのに対して,湿潤空気中ではほとんど進展しなかった.また,湿潤空気中でき裂進展試験を開始し,界面き裂が停留した後に乾燥空気を導入すると,き裂はふたたび進展を開始した.逆に,乾燥空気中で試験を開始し,界面き裂進展中に湿潤空気を導入すると,界面き裂は停留した.つまり,湿潤環境により,き裂進展速度が低下することがわかる.また,界面き裂進展速度は応力繰り返し速度に大きく影響を受け,繰り返し速度が低いときに速くなった.
fMRIによる文のオンライン処理に関わる脳活動の研究

まず前年度行ったSOV,及びOSV文を理解する際の脳活動に関する実験結果の考察をさらに進めた。まず、統語処理に関与すると言われている左側下前頭回がSOV、OSVともに二番目の名詞句で強く活動したことから統語構造の一部が主語と目的語の二つが揃った段階で構築されると考えられる。次にやはり統語処理に関与すると言われている左側被殻と複数の構成素から一つの意味を理解する際に活動する左側下側頭回前部が文末で賦活化したことから、文全体の統語構造と文の命題は文末で作られると考えられる。次に今年度は一文の処理が完結したあとで再びその構造を修正し新しい構造を再構築する際の脳活動に関する実験を行った。本研究の目的は再分析の処理に関与する脳領域を特定すること、及び再分析を含む文と統語構造が複雑な文とが同一の脳領域で処理されるのか否かを特定することである。本研究では日本語を用い、同じ単語で構成される等位接続文(コントロール文)、目的語関係節文(統語構造が複雑な文)、再分析文の三種類の文を理解する際の脳活動を撮像した。各文は文節毎に呈示し、続けて名詞と動詞のペアから成るprobe questionを提示した。被験者には名詞と動詞のペアがすでに呈示された文の意味内容と照らし合わせて主語と述部の関係として成立するかどうかをボタン押しで答えてもらった。その結果、各条件とNull課題との比較では両側舌状回、右側小脳、両側下前頭回、左側中側頭回、補足運動野、右側角回を含む類似した領域が賦活化していた。しかし再分析を含む文と目的語関係節文との直接比較では左側上前頭回の内側面と右側頭頂間溝が賦活化していた。左側上前頭回の内側面の活動はオランダ語によるStowe et al.(2004)の結果と一致するものであった。以上の結果から統語構造が複雑な文とは別に再分析処理に固有の脳領域が存在する可能性が示唆された。本実験では日本語の基本語順文及びかき混ぜ文を主語、目的語、動詞の3部分に分け、一つずつ5.4秒に1回視覚刺激として呈示した。その結果、基本語順の文では主語で左側舌状回、目的語で左側下前頭回と左側補足運動野、他動詞で左側下側頭回が強く賦活化した。同様にかき混ぜ語順の文では目的語で左側舌状回と楔前部、主語で左側下前頭回、他動詞で左側被殻と右側中前頭回が賦活化した。両実験を比較すると、動詞が呈示されるまでは、賦活領域が類似しており、主語や目的語といった文法機能よりむしろ呈示される順番に依存して賦活領域が決定されていた。しかし動詞が呈示されたときに両文で全く異なる領域に賦活化が見られた。したがってHead-driven Parserの仮説を支持する結果となった。しかしかき混ぜ文の目的語の認知の際に、左側舌状回に加えて楔前部が賦活化しており、最初の名詞句に対する賦活化領域は両文で完全に同一ではなかった。また二番目の名詞句が呈示された際に統語処理に関わる左側下前頭回が賦活化しており、これはこの時点で文処理の一部がすでに始まっている可能性を示唆している。したがって、本実験の結果は脳内での文処理過程がincrementalとhead-drivenの両方の側面を持っている可能性を示唆している。理論言語学では両モデルの利点を備えた文処理モデルが提案されている(Mazuka,1998)。以上の実験手法は自然な言語理解と完全に同一ではないため、さらに基本語順とかき混ぜ語順の文を聴覚刺激で文頭から文末まで続けて聞いた際の脳活動の計測を行いその結果を前述した実験結果と比較した。その結果、基本語順文で、左側下前頭回、かき混ぜ語順文で左側下前頭回と右側中前頭回に有意な賦活化がみられた。これは視覚刺激による実験で賦活化した領域と同一であり、本研究が刺激の呈示方法に依存しない結果であることが示唆された。

被験者には名詞と動詞のペアがすでに呈示された文の意味内容と照らし合わせて主語と述部の関係として成立するかどうかをボタン押しで答えてもらった。その結果、各条件とNull課題との比較では両側舌状回、右側小脳、両側下前頭回、左側中側頭回、補足運動野、右側角回を含む類似した領域が賦活化していた。しかし再分析を含む文と目的語関係節文との直接比較では左側上前頭回の内側面と右側頭頂間溝が賦活化していた。左側上前頭回の内側面の活動はオランダ語によるStowe et al.(2004)の結果と一致するものであった。以上の結果から統語構造が複雑な文とは別に再分析処理に固有の脳領域が存在する可能性が示唆された。
イネのフラボノイド系ファイトアレキシン生合成酵素に関する研究

昨年度までの研究で,イネのフラボノイド系ファイトアレキシンであるサクラネチンの生合成酵素ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ(NOMT)をコードする遺伝子の候補として,エリシター処理によって顕著に誘導されるO-メチルトランスフェラーゼ遺伝子AK069960を見いだした.しかし,大腸菌を用いたAK069960のGST融合タンパク質の発現を行ったが,可溶性タンパク質がほとんど得られなかった.今年度は,マルトース結合タンパク質融合タンパク質を大腸菌を用いて発現させ,可溶性タンパク質を得ることに成功した.しかし,この融合タンパク質は全くNOMT活性を示さなかった.AK069960が実はNOMTではない他のメチルトランスフェラーゼをコードしている可能性も考えられるが,各種エリシター処理によるmRNAの誘導性はNOMT活性の誘導性と非常に良く一致しており,現時点ではまだ本遺伝子がNOMT遺伝子の最有力候補である.今後は,他の発現系を用いたAK069960のタンパク質発現を試みる予定である.昨年度の研究でサクラネチン(4',5-dihydroxy-7-methoxyflavanone)の代謝産物として,ゲンクワニン(4',5-dihydroxy-7-methoxyflavone)を同定した.本年度は重水素標識サクラネチン([methyl-d_3]サクラネチン)を合成し,これを用いたトレーサー実験を行った.重水素標識サクラネチンをイネ葉片に与えてインキュベートすると,24時間後には与えた重水素標識サクラネチンの80%が消失し,2%が重水素標識ゲンクワニンに変換されていた.このことから,サクラネチンの一部はイネ体内でゲンクワニンに代謝されることが確認できた.しかし,その変換効率の低さから,他の代謝経路の存在の可能性も示唆される.イネのファイトアレキシンであるサクラネチンの生合成酵素ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ(NOMT)とほぼ同様の機能を持つオオムギのフラボノイド7-O-メチルトランスフェラーゼ(HVOMT)の配列を用いてイネゲノムデータベースをBLASTによって相同性検索を行った.NOMT活性はイネ葉を紫外線照射することによって顕著に増加することが知られているので,得られたHVOMTに相同性が高い遺伝子配列をもとにプライマーを設計し,紫外線照射イネ葉片から調製したcDNAをテンプレートとしてPCRによる遺伝子の増幅を試みた.コントロールとして,紫外線照射をしていないイネ葉片から調製したcDNAをテンプレートとしたPCRを同時に行った.その結果,紫外線照射によって発現が増加する遺伝子が2つ(アクセッション番号AK069308,AK069721)確認された.この2つの遺伝子の全長cDNAをクローニングし,さらに発現ベクターに導入して大腸菌によってタンパク質を生産させた.今後はこの発現タンパク質がNOMT酵素活性を示すかどうかを確認する予定である.また,紫外線照射したイネ葉には今までにはイネにおいての存在は報告されていないフラボノイド化合物であるゲンクワニン(4′,5-dihydroxy-7-methoxyflavone)が存在することも明らかにした.ゲンクワニンはサクラネチンとは違い,イネいもち病菌に対してほとんど抗菌活性を示さなかった.イネ葉から抽出した粗酵素液によってサクラネチンからゲンクワニンへの変換が触媒されることを確認した.したがって,ゲンクワニンはイネ葉におけるサクラネチンの代謝産物の一つであると推定できる.昨年度の研究でイネのフラボノイド系ファイトアレキシンであるサクラネチンの生合成酵素ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ(NOMT)をコードする遺伝子の候補として,オオムギふのフラボノイド7-O-メチルトランスフェラーゼ(HVOMT)と高い相同性を持つAK069308,AK069721の二つの遺伝子を選定した.今年度はこの二つと,同様にHVOMTと高い相同性を持つAK072740を加えた三つの遺伝子について,大腸菌による組換タンパク質の発現を行い,そのNOMT活性の確認を行った.しかし,発現タンパク質は全くNOMT活性を示さなかった.一方,HVOMTとの相同性はこれらの三つの遺伝子ほどは高くないが,紫外線・塩化銅・ジャスモン酸処理によって顕著に誘導されるO-メチルトランスフェラーゼ遺伝子AK069960を見いだした.現在のところ,AK069960が最もNOMT遺伝子である可能性が高いものであると考えている.大腸菌を用いたAK069960のGST融合タンパク質の発現を行ったが,可溶性タンパク質がほとんど得られず,現時点ではNOMT活性を検出することに成功していない.現在,効率的な可溶性タンパク質の発現系を検討しているところである.従来の研究でNOMTであると間違って報告されていたコーヒー酸3-O-メチルトランスフェラーゼについて大腸菌による発現タンパク質を用いた機能解析を行った結果を学術論文として発表した.昨年度の研究で初めて明らかにしたサクラネチンの代謝産物であるゲンクワニンについては,そのイネに対する生長阻害活性をサクラネチンと比較したところ,ゲンクワニンはサクラネチンと比較して非常に弱い阻害活性しか示さなかった.

このことから,サクラネチンからゲンクワニンへの代謝はイネ体内におけるサクラネチンの自己毒性の回避として起こっている可能性が示唆された.昨年度までの研究で,イネのフラボノイド系ファイトアレキシンであるサクラネチンの生合成酵素ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ(NOMT)をコードする遺伝子の候補として,エリシター処理によって顕著に誘導されるO-メチルトランスフェラーゼ遺伝子AK069960を見いだした.しかし,大腸菌を用いたAK069960のGST融合タンパク質の発現を行ったが,可溶性タンパク質がほとんど得られなかった.今年度は,マルトース結合タンパク質融合タンパク質を大腸菌を用いて発現させ,可溶性タンパク質を得ることに成功した.しかし,この融合タンパク質は全くNOMT活性を示さなかった.AK069960が実はNOMTではない他のメチルトランスフェラーゼをコードしている可能性も考えられるが,各種エリシター処理によるmRNAの誘導性はNOMT活性の誘導性と非常に良く一致しており,現時点ではまだ本遺伝子がNOMT遺伝子の最有力候補である.今後は,他の発現系を用いたAK069960のタンパク質発現を試みる予定である.昨年度の研究でサクラネチン(4',5-dihydroxy-7-methoxyflavanone)の代謝産物として,ゲンクワニン(4',5-dihydroxy-7-methoxyflavone)を同定した.本年度は重水素標識サクラネチン([methyl-d_3]サクラネチン)を合成し,これを用いたトレーサー実験を行った.重水素標識サクラネチンをイネ葉片に与えてインキュベートすると,24時間後には与えた重水素標識サクラネチンの80%が消失し,2%が重水素標識ゲンクワニンに変換されていた.このことから,サクラネチンの一部はイネ体内でゲンクワニンに代謝されることが確認できた.しかし,その変換効率の低さから,他の代謝経路の存在の可能性も示唆される.