hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PM2.5中イオウ同位体比および微量元素の定量的リアルタイム分析による発生源解明

後方流跡線と,ガス交換器とICP-MS/MSを接続して,10分間隔で得られた大気中金属濃度のデータを組合わせて行った濃度重み付け流跡線解析を行うと興味深い情報を抽出できた。2016年3月19日の測定ではあ、この日の島根県松江市のPM2.5中Mn, Fe濃度は明らかに中国北部からモンゴルの影響を強く受けていた。一方で、SbやPbは日本上空とくに関西圏からの影響を強く受けていた。越境汚染問題を解決するには、それぞれの排出源の寄与率を定量化することは非常に重要であり、本研究で用いた方法は起源を分けることに有用であること、元素によっては国内からの影響の方が強いことが明らかとなった。二つの四重極と反応セル(CRC)を持つトリプル四重極型ICP-MS/MSではイオウ( S )のスペクトル干渉を除くことができるため,S同位体比(34S/32S)を測定することが可能であると期待される.一般的に,ICP-MSで同位体比測定を行う場合は,空間電荷効果の補正が必要とされる.さらにICP-MS/MSでSをSOとして測定する場合には,SとO2の反応による質量差別効果および酸素との衝突による質量差別効果を補正する必要があると考えられる. SとO2の反応性を調べたところ,O2との反応による質量差別効果は無視できると考えられた.内部標準物質としてはガリウム(Ga)が最適であり,Gaを用いて空間電荷効果と酸素との衝突による質量差別効果を補正することでS同位体比を測定できた.さらに,高感度試料導入システム(apex-Q, Elemental Scientific Inc.),ガス交換器,ICP-MS/MS等を組合せてPM2.5に含まれる金属をリアルタイムに分析可能なシステムを構築した.この分析システムの性能を評価するため,排出源が特定できかつ短時間での濃度変化が期待される喫煙所から排出される副流煙に含まれている金属の評価に用いた.その結果,喫煙者数の増加や銘柄間による金属排出量の相違が観察できた.10月からはマルチノズルカスケードインパクターサンプラー(MCI-20-1025,東京Dylec)を用いて粒子状物質を分級捕集した.混酸による高温分解した試料をICP-MS/MSを用いて66元素の定量を行った.2014年より開始した大気降下物の解析結果も合わせてクラスター解析を行ったところ,自然起源と人為起源に元素を分けることができた.S同位体比測定における新たな補正方法を検討するためにSとO2の反応性を調べたところ,O2の流量0.34 ml/minの条件下では、CRC内においてSは不確かさの範囲内で100 %酸化物になっていた.この結果から、CRCでのSとO2との結合に由来するSの同位体分別は考えなくてよいと考察した.一方,Gaの酸化物生成比は0であり,O2との反応による同位体分別はないと考えられるため、内標準物質として適していると考えられた.最適な分析条件は、S濃度が100 ppb、積分時間が5 s、WTOが6 msであり、この条件下において相対標準不確かさを3.00 %から0.144%に小さくすることができた。最適条件下で認証値物質(0.04414±0.000026)を測定した結果,測定値が0.04940±0.000094であり,空間電荷効果,酸素との衝突による質量差別効果及び認証物質を用いた外部補正をした結果,0.04414±0.00018であり,相対不確かさ0.4%での測定が可能となった.MCIサンプラーを用いて捕集したAPM中に含まれる元素は,自然起源のグループとしては海塩粒子(Na, K, Mg, Sr, B, S)と土壌粒子(Ti, Sc,希土類元素)に分かれ,人為起源のグループは鉄鋼工業(Ca, Mn, Fe, Ni, Zn),化石燃料や廃棄物の燃焼・焼却(V, As, Se, Cd, Sb, Pb),自動車部材と排気ガス(Cu, Ba, Rh, Pt)に分類された.また,土壌粒子は春季に,燃焼系を起源とする元素は冬季にフラックスが高くなり,流跡線解析の結果より中国大陸からの黄砂飛来と長距離越境汚染の影響があると示唆された.風向風速ベクトル図との比較から、無風状態時にNa, Mg, Cd濃度が増加しているパターンが認められたため、近隣地域が元素排出に寄与していることが考えられた.さらに,HYSPLITモデル(NOAA)を用いた後方流跡線解析に,リアルタイム分析結果から得られた1時間ごとの元素濃度の平均濃度を用いた重み付けを行った濃度重み付流跡線解析(CWT)を行い,島根大学に到達した海抜500, 1000, 1500 mの空気塊を96時間追跡して元素の排出源の推定を行った.その結果,CdやPbは国内からの影響が大きかったが,Asは中国・モンゴルからの寄与が大きかった.Sは上海近辺の沿岸部や西安近辺の内陸部で高い寄与が疑われた.イオウ同位体比については,PM2.5濃度が30 μg/m3以上が必要であると昨年度試算していたが,2025 μg/m3程度でも場合により,不確かさは大きいものの同位体比分析が可能であった.

しかしながら,こういったPM2.5濃度が高い時間に合わせて測定を行うこと自体,予報の誤差などにより困難であり,想定していたように常にイオウ同位体比を得ることは困難であった.本研究で確立したリアルタイム分析システムを応用し,ストロンチウム90に最適化させたPM2.5中放射性ストロンチウムの迅速分析法も確立した.この結果については,日本分析化学会第65年会にて発表し,トピック講演に選ばれた.また,本手法は特許への申請(特願2016-155217)を行い,Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopyへ投稿中である.測定に際しての,検量線を測定するタイミングや測定開始前に導入系の洗浄を必ず行うといったプロセスの最適化により,金属元素のリアルタイム分析および濃度重み付流跡線による解析は,順調に進んでいる.得られたデータの解析も順調に進んでおり,測定データをGIS上で表現する段階まで問題なく実現できている.一方で,硫黄の同位体比分析については,常に不確かさを担保するのに十分な感度で測定できたわけでななかったが,32Sと34Sの地理分布には相違が認められ,アジア大陸内陸部を通過した際に34S/32S比が高くなった.また,観測地点である松江市から大阪周辺の日本上空においても34S/32S比が高くなった.現在,バックグラウンドの測定を合わせて行うことで妥当な測定値となることが試験的な分析から確認されている.毎月行っているAPMの分析結果では、北西からの流跡線の頻度とPM2.5中元素濃度は66元素61中元素で正の相関を示していた。他の方角では流跡線の頻度と濃度との正の相関は弱いあるいは負の相間であった。排出源が自動車とされるRh, Pd, Ptの地殻に対する濃縮係数は非常に大きく、北西からの流跡線の割合が増加するにしたがってPM2.5中のRhとPdの濃縮係数が増加する傾向にあった。このように、3週間の捕集期間の全体的な傾向として捉えてしまうと、越境汚染による影響が強い結果になってしまう。一方で、米国海洋大気庁のHYSPLITモデルを用いて,島根大学に到達した海抜500, 1000, 1500 mの空気塊を96時間追跡して得られた後方流跡線と,ガス交換器とICP-MS/MSを接続して,10分間隔で得られた大気中金属濃度のデータを組合わせて行った濃度重み付け流跡線(CWT)解析を行うと単純な3週間の連続捕集からは得られない情報を抽出できた。2016年3月19日の測定結果からCWT解析した結果、この日の島根県松江市のPM2.5中Mn, Fe濃度は明らかに中国北部からモンゴルの影響を強く受けていた。一方で、SbやPbは日本上空とくに関西圏からの影響を強く受けていた。これまでの報告から、Sbはゴミ焼却施設からの寄与だと考えられる。越境汚染問題を解決するには、それぞれの排出源の寄与率を定量化することは非常に重要である。本研究で用いたリアルタイム分析は、起源を分けることに有用であること、元素によっては国内からの影響の方が強いことを示すことが出来た。後方流跡線と,ガス交換器とICP-MS/MSを接続して,10分間隔で得られた大気中金属濃度のデータを組合わせて行った濃度重み付け流跡線解析を行うと興味深い情報を抽出できた。2016年3月19日の測定ではあ、この日の島根県松江市のPM2.5中Mn, Fe濃度は明らかに中国北部からモンゴルの影響を強く受けていた。越境汚染問題を解決するには、それぞれの排出源の寄与率を定量化することは非常に重要であり、本研究で用いた方法は起源を分けることに有用であること、元素によっては国内からの影響の方が強いことが明らかとなった。S同位体比の測定には100 ng/mL程度の信号強度が必要である.
神経系特異的RNA結合蛋白質による神経発生と高次機能の制御

我々は、神経系における転写後レベルでの発現調節機構に関与する遺伝子産物の候補を以下のような方法により見出すことに成功した。1.ショウジョウバエ神経系特異的蛋白質musashi遺伝子産物ショウジョウバエ神経系に異常を有する変異体のスクリーニングにより、感覚器を含む神経系における細胞の分化・運命決定を制御している神経系特異的RNA結合性蛋白質をコードするmusashi遺伝子の同定を行った。musashi遺伝子は、外感覚器を構成する母細胞の非対称性分裂を制御し、母細胞から生ずる細胞の分化・決定に必要とされることが示された。2.ショウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1の単離と遺伝子産物の解析(クローニングおよびin vitroにおける機能解析)musashi遺伝子ファミリーの哺乳類神経系における役割を明らかにするために、low stringenthybridization法により、ショウジョウバエmusashiに相同なmouse-musashi-1(m-msi-1)遺伝子のクローニングを行った。in vitroにおけるRNA結合能を明らかとした。(発現パターンの解析と予想される機能)m-Msi-1蛋白質の、成獣における発現パターンを検討したところ、神経系にほぼ限局しており、小腸における幹細胞や卵巣を除く神経系以外の組織においては、発現がみられなかった。次に、m-Msi-1蛋白質発現細胞の細胞型特異性を、組織切片および低密度の初代培養細胞の免疫組織化学的手法により検討したところ、中枢神経系では幹細胞(神経上皮細胞)のマーカーであるネスチンと同様に、中枢神経系の未分化幹細胞において特異的に発現しており、未分化幹細胞の非対称的分裂過程において、自己再生する幹細胞において強く発現していた。
誘導加熱を利用した省エネルギー型無着霜熱交換器の開発

誘導コイルの渦状コイルの圧力損失解析、インピーダンス測定実験、熱交換器加熱実験及び低温環境下における熱交換器除霜実験から以下のような結論が得られた。1)渦状コイルの圧力損失解析およびインピーダンス測定実験から圧力損失が大きい方が加熱効率も大きいという相関関係がある事が分かった。(2)熱交換器空気加熱実験において熱交換器全体へ均一な加熱が確認された。(3)0°Cの低温環境下におけるコイルへの30kHz高周波通電による熱交換器除霜実験にて除霜が検証された。熱交換器への加熱入力約31.5 Wにて30分で170gデフロストが可能であることが分かった。本研究は除霜に誘導加熱方式を適用し、逆サイクル運転せず、外部から直接加熱し、霜を融解するシステムを開発することを目的とする。本方式の開発により暖房時のノンストップ暖房、省エネルギー運転および熱交換器の能力向上や小型化が期待され、連続的な瞬時加熱、霜融解による“無着霜熱交換器"実現の可能性も有している。平成26年度は原理実証試験装置(下記低温環境試験室)の立ち上げと着霜検証を行った。特に無着霜熱交換器の原理実証評価のためには一定低温でかつ高湿度に制御しうる以下に示す低温環境試験室の構築と動作確認が必須であり本年度はこれに注力した。本装置は、外寸1200mm×2000mm×2530mmの断熱箱、その断熱箱内部を一定低温・一定湿度環境下に制御可能な冷凍装置、超音波加湿器(加湿量1.0 l/hr、ユーキャン製)、さらには着霜試験用冷却器(銅管直径9.25mm、アルミフィンピッチ4mm、伝熱面積2.35m2、着霜厚さ1mmを想定)およびその冷却器にー30°Cの不凍液(エチレングリコール72wt%)を供給可能な断熱箱外部に設置された低温恒温水槽(不凍液温度ー30°C時冷却能力約590W)から構成される。断熱箱内部の湿度を約80%にした状態で空気温度をー30°Cまで低下させた後、低温恒温水槽から循環ポンプにて温度ー30°Cの不凍液を着霜試験用冷却器に供給し、運転開始後、2時間以内で冷却器のフィン全面に着霜することを確認した。また、数10kHzの高周波を供給しうる電磁誘導コイルや駆動・制御回路を作製し、電気的な基本動作を確認した。さらに誘導加熱実験における電気絶縁、電気配線方法や試験方法について検討した。平成27年度は前年度に引き続き、原理実証試験装置の改良と原理実証実験を行った。改良は従来の逆サイクルを模擬して、温熱ブラインの循環系を追加整備した。また、電気系のインピーダンス測定による電力分配率を把握するための実験、誘導加熱による冷凍空調用熱交換器の加熱実験さらには、低温環境試験室で熱交換器に約250gの着霜をさせた後の除霜(デフロスト)実験を行った。以下にその概要について述べる。(1)インピーダンス測定による電力分配把握のための実験に関しては24巻コイルをコイルと熱交換器フィン間の距離Sを0.25cmにて設置した場合、縦置き(熱交換器のフィンの向きとコイルの長手方向が平行)が83.3%,横置きが77.3%、また、20巻コイルの場合も縦置きが71.3%,横置きが56.1%と縦置きの場合の加熱効率が大きいことが分かった。また、コイルの巻き数が大きいほど、熱交換器との距離Sが小さいほど加熱効率が大きい。24巻コイル、S=0.25cmで縦置きの場合、最大加熱効率を示すことが分かった。(2)誘導加熱による熱交換器加熱実験に関してはインピーダンス測定実験と同様なパラメータで実験を行い、24巻き、S=0.25cm、縦置きの場合の熱交換器の表面温度上昇が最も大きいことが分かった。また、鎖交する磁束が大きい熱交換器上部の温度上昇が顕著であった。(3)誘導加熱による除霜実験に関しては低温環境試験室の室温ー3°C下で熱交換器表面に約250g着霜する。この着霜量にて電気入力100W入力(熱交換器にて約50W加熱)の条件下での除霜実験を行った。結果、加熱後17分で熱交換器の前面側(コイル装着側)の霜を、30分で背面側の霜を全て除霜できることを確認し、誘導加熱による熱交換器の除霜が可能であることを立証した。これら事実から誘導加熱システムへの電気入力1000Wにて3分程度で除霜可能と言え、実用に給しうる可能性を得た。実験装置の立ち上げ、改良に時間を要していることもあり、熱・流体系における誘導加熱を考慮した熱・物質移動モデルの構築が遅れているためである。誘導コイルの渦状コイルの圧力損失解析,インピーダンス測定実験,熱交換器加熱実験及び低温環境下における熱交換器除霜実験から以下のような結論が得られた。(1)渦状コイルの圧力損失解析およびインピーダンス測定実験から圧力損失が大きい方が加熱効率も大きいという相関関係がある事が分かった。(2)熱交換器空気加熱実験において熱交換器全体へ均一な加熱が確認された.(3)熱交換器除霜実験において高周波通電による熱交換器誘導加熱による除霜が確認された.熱交換器への加熱入力約31.5 Wにて30分で170 gデフロストが可能であることが分かった。

以上より、コイル間隙間p = 10 mmコイル、距離S = 5 mmの渦状コイルによる除霜は可能であるが低圧損を優先した場合は、デフロスト性能が低下することが分かった。また、除霜速度の把握から電気入力を500 Wと大容量化すると約6分程度でデフロスト可能であることが推測される。誘導コイルの渦状コイルの圧力損失解析、インピーダンス測定実験、熱交換器加熱実験及び低温環境下における熱交換器除霜実験から以下のような結論が得られた。1)渦状コイルの圧力損失解析およびインピーダンス測定実験から圧力損失が大きい方が加熱効率も大きいという相関関係がある事が分かった。(2)熱交換器空気加熱実験において熱交換器全体へ均一な加熱が確認された。(3)0°Cの低温環境下におけるコイルへの30kHz高周波通電による熱交換器除霜実験にて除霜が検証された。熱交換器への加熱入力約31.5 Wにて30分で170gデフロストが可能であることが分かった。無着霜熱交換器の原理実証評価のためには低温環境試験室の構築と動作確認が必須であり設計段階での試験方法や装置構成の検討や試運転等に時間を要した。このため、誘導加熱による除霜効果の再確認、影響パラメータの絞込みまで至らなかった。低温環境試験室の改良を含めてほぼ試験装置が構築された。誘導加熱除霜時における熱物質移動モデル構築のために、除霜実験検証を行いモデルの作成、確立を早急に行う予定である。パワーエレクトロニクス,熱工学低温環境試験室の構築がほぼ完了したので、設備の仕様や操作手順を整理する。また、これを利用した着霜・除霜試験方法の立案と誘導加熱の効率に及ぼすパラメータの絞込みを行う。さらに、熱・流体系における外部誘導加熱を考慮した熱物質移動モデルを提案し、実験との比較検証を行いたい。ほぼ予定通り予算を執行した。数千円程度の物品費が余ったが研究遂行に支障をきたすことはなかった。誘導加熱に必要な電磁誘導コイルや駆動・制御回路は一時的に代用可能なものがあり購入を見合わせたためである。繰越の物品費を平成28年度における実証試験のための部品購入に計上したい。次年度では上記の代用のものに替えて加熱容量の大きい新規の駆動制御回路を製作する予定である。
イチゴ植物工場を核とする群落生育診断技術の開発

イチゴの循環式移動栽培における効率的な栽培管理を目指し、非破壊非接触で群落の3次元情報、果実情報(数、大きさ)を推定し、栽培ベッド毎に個別管理可能な計測システムを開発した。各情報は、カラー画像と距離画像を組み合わせた画像処理アルゴリズムによって抽出を行った。イチゴ群落の3D再構築により任意の断面で草高や幅を推定でき、2.5ヶ月間経時的に計測した結果、推定値から経時変化の観察が可能であった。果実の情報に関しては、赤色果実同士の重なりを距離情報によって分離することで着果密度によらず約95%の精度で計数できた。さらに、果実の大きさを推定した結果、推定精度はRMSEP12%であった。移動栽培ベッドの横移送において、一定速度で移動させながらイチゴ群落および果実情報を取得し、栽培ベッドごとの情報を自動管理できるように計測システムを改良するとともに、イチゴ群落の草高と幅および果実数を推測する画像処理手法を開発し、精度を評価した。まず、改良した計測システムは、上方から3次元センサ(Kinectセンサ)でイチゴ群落、下方からRGBカメラおよびTOFセンサで果実計数を行うための画像を取得する。画像は、横移送速度16mm/sで栽培ベッドを移動させながらラインスキャンカメラのように合成され、1台の栽培ベッドの全体画像として取得される。また、栽培ベッドごとのIDを書き込んだRFIDタグを栽培ベッド側面に取り付け、取得した生育情報を該当する栽培ベッド番号と関連付けるシステムを付加した。次に、イチゴ「あまおとめ」を812株定植した長さ1mの栽培ベッド10台(草高の最大値は2739cm、幅の最大値は6183cm)を供試し、イチゴ群落の3D再構築を行い、草高および幅を推定し、実測値と比較した。その結果、任意の断面におけるイチゴ株の草高と幅が推測でき、距離情報に基づき葉領域のカラー情報が得られた。推定誤差は草高で平均1.6cm(最大3.4cm)であり、幅で平均3.7cm(最大6.6cm)であった。さらに、赤熟果および未熟果を検出し、計数するための画像処理手法を検討した。色画像のみを用いるRGB処理手法、色画像と距離画像を用いたRGB処理およびTOF+RGB処理の2つの画像処理方法を考案し、「あまおとめ」を定植した栽培ベッドの画像20枚に対して処理を行い、計数精度を比較した。その結果、検出成功率は、距離情報による果実の重なり判別アルゴリズムなどを付加したTOF+RGB処理の方がRGB処理よりも高く、赤熟果で94.3%、未熟果で78.7%であった。本年度は、栽培ベッドの横移送装置を用いて、イチゴのポット苗および群落(栽培ベッド)を3次元センサで撮影し、生育情報を推測する画像処理手法を開発した。まず、イチゴのポット苗を25株(「あまおとめ」15株、「さがほのか」10株、平均葉数6.5枚)供試し、3次元センサ(Microsoft、Kinectセンサ)をポット上面から0.8mの高さに設置して草高および苗の最大幅を推測し、実測値と比較した。その結果、草高の推測に関しては、実測値との相関(決定係数0.96)が高く、近似直線の傾きも0.90であった。一方、苗の最大幅の推測では、決定係数が0.83、近似直線の傾きが0.81で、草高の推測と比較してばらつきが見られた。次に、3次元センサから得られた葉の表面の測定点から三角形のポリゴンの面積を積算することにより葉面積を推測した。3枚の小葉からなるイチゴの葉(「さがほのか」92枚)を供試し、スキャナで計測した実測値と比較した。またポット苗(「さがほのか」51株、平均葉数6.1枚)を供試し、1株当たりの葉面積の推測値と実測値とを比較した。その結果、葉面積の推測では、実測値と相関はあるものの、近似直線の傾きが葉1枚で0.62、ポット苗で0.47となり、実測値と比較して小さかった。誤差要因として、葉の重なりやカールした形状、カメラの校正精度などが考えられた。さらに、栽培ベッドの横移送装置に3次元センサと照明を設置するとともに、駆動モータをステッピングモータに変更することにより、高精度な位置決めが可能なイチゴ群落計測システムを試作した。長さ1 mの栽培ベッドを80 mmずつ動かしてイチゴ群落(10株)の画像13枚を撮影し、ステッピングモータの位置情報に基づき各画像の3次元情報をつなぎ合わせることにより、ほぼ連続したイチゴ群落の3次元情報を構築し、群落の状態を可視化できた。大規模植物工場における効率的な栽培管理や経営管理を目指し、非破壊非接触でイチゴ群落の3次元情報、果実の数および大きさを推定して自動取得する技術を開発した。

開発システムは、定点観測が可能な循環移動式栽培の横移送において、栽培ベッドを16mm/sで移動させながら時系列で画像を合成することで、栽培ベッドの長さによらず全体画像を取得でき、RFIDシステムにより該当の栽培ベッド番号と関連付けができる。「あまおとめ」を812株定植した長さ1mの栽培ベッド10台(草高の最大値は2739cm、幅の最大値は6183cm)を供試し、群落上方より撮影した画像から3D再構築を行い、高さと幅を用いて推定精度を評価した結果、推定誤差は草高で平均1.6cm、幅で平均3.7cmであった。この手法を用いて3ヶ月間経時的に情報を取得したところ、実測値に対して推測値の経時変化が追随することが確認できた。2品種(「紅ほっぺ」8台、25.8果/台、「あまおとめ」14台、6.6果/台)を供試して、果実周辺を下方から撮影し、果実計数処理(RGB+TOF処理)を施した。その結果、赤色果実の計数成功率は「あまおとめ」で96.8%、「紅ほっぺ」で94.7%と精度よく計数できた。これは色情報と距離情報を組み合わせることで同色果実の重なりを分離できたためと推察された。また、RGB画像のみを用いた処理と比べて2割の精度向上が見られた。さらに、「紅ほっぺ」の栽培ベッド12台に対して、RGB+TOF処理により検出できた果実(180果)の最大径を推定した結果、RMSEは3.7 mmとなり、良好な推定精度を得た。植物環境工学イチゴ群落の3次元空間における幾何学的特徴量の計測に関して、3次元センサを用いて株の草高、幅を計測するアルゴリズムを考案し、推定精度を評価することができた。また、緑色の照明を用いて新葉を検出する手法を考案した。これらの手法を用いることにより苗の健全性を評価する見込みが得られた。イチゴ果実に関する情報として、計測システムで取得した栽培ベッドごとの画像において、果実を計数する画像処理アルゴリズムを考案し、計数精度試験を行ったところ、赤熟果では高精度に計数が可能であった。しかし、未熟果では計数精度の向上が必要であると考えられた。また、計数精度試験を行った時期が5月であったこともあり、株当たりの果実数が少なかったため、果実数の多い1月から3月にも計数精度試験を行う必要がある。さらに、計数のために検出したイチゴ果実の大きさ(直径)を推定する画像処理アルゴリズムを考案し、ピンポン玉や模型果実を用いて推定を行ったところ高い精度が得られた。今後、栽培ベッドに植えられた実際の果実を使って精度試験を行う予定である。また、RFIDを利用して栽培ベッドを個別認識し、生育情報を自動管理するシステムを構築し、精度試験時等に読み取り試験を行っている。9月の定植時に栽培ベッドにRFIDタグを取付け、6か月経過した3月においても問題なく読み取り可能であった。イチゴ群落の3次元空間における幾何学的特徴量の計測に関して、3次元センサを用いて苗の草高、幅および葉面積を計測するアルゴリズムを考案するとともに、ステッピングモータを用いてイチゴの栽培ベッドの高精度な位置決めを行い、栽培ベッド1台分の画像を合成するイチゴ群落計測システムを試作した。これと平行して3次元センサを用いて葉の傾きを推測するアルゴリズム、葉の重なりを分離して葉数を推定するアルゴリズムの開発を試みたが、実測値との相関が低く十分な精度が得られず、問題点の整理に時間を要した。今後アルゴリズムの再構築、または高精度3次元カメラの利用(TOFカメラなど)の再検討の必要性が認められた。
ヒト歯肉線維芽細胞におけるheterogeneityの検討:細胞表層分子を指標としてクローニングした各サブセットにおける機能の比較

健康な歯周組織を有するボランティアから歯肉線維芽細胞(HGF)をout-growth法により獲得した。さらに細胞ダメージを受けることなくセレクションが可能なimmunomagnetic cell separation法により、subpopulationを行い、その後FACSにより再度Thy-1発現の確認および細胞表層抗原発現の検討を行った。つまり、ヒト抗Thy-1モノクロナール抗体によりimmunomagnetic cell separation法を行ったところ、Thy-1(+)と判定された細胞群の内、およそ85%がFACS分析によりThy-1(+)であり、Thy-1(-)と判定された細胞群の内、0.8%がThy-1(+)であった。また今回調べたいくつかのprimaryなHGFの中でThy-1(+)の割合は1040%の範囲であった。線維芽細胞の基本的な細胞機能にはコラーゲンの合成能があり、今回Thy-1(+)細胞およびThy-1(-)細胞によるコラーゲン産生と非コラーゲンタンパクの産生について両群細胞間で比較を行ったところ、Thy-1(+)細胞のコラーゲン産生と非コラーゲンタンパクの両者においてThy-1(-)細胞より高い産生能を示した。つまり歯周組織の再生において、コラーゲンおよび非コラーゲンタンパクの合成能が高いThy-1(+)細胞が優勢な歯周組織においてはThy-1(+)細胞の割合が少ない歯周組織と比較して、歯周組織再生過程においてHGFがより重要な役割を果たしていることが考えられた。健康な歯周組織を有するボランティアの同意を得た上で採取した歯肉組織から歯肉繊維芽細胞(HGF)をout-growthにより獲得し、抗Thy-1モノクローナル抗体を用いたFACSにて各ドナー細胞のcell sortingおよび細胞表層抗原の識別を行なった。その結果、ドナーのおよそ3050%がThy抗原を発現していた。次に、各細胞群をアフィニティーカラムにてクローニングし、それぞれThy-1(+)、Thy-1(-)細胞として確立した。これら2群の細胞を未刺激あるいはIFN-γにて(100U)刺激し、細胞表層分子の発現の比較を行なった。その結果、IFN-γ添加により、Thy-1(+)細胞と比較してThy-1(-)細胞に有意にMHCクラスII抗原の発現が誘導された。また、IFN-γ刺激によりHGFのcollagen産生能はThy-1(+)、Thy-1(-)細胞ともに減少する傾向が認められた。しかし、局所免疫応答の制御においてIFN-γと拮抗していると考えられ、Th2細胞由来のサイトカインであるIL-4で刺激(10ng/ml)した場合、Thy-1(+)細胞においてのみ有意にcollagenI,III型の産生が促進した。また、それはmRNAレベルにおいても促進されていた。現在、HGFにおけるcollagen貪食能に関わる機能、特に抗体レセプターであるFcR(CD16,32,64)がHGFにおいて発現するのかどうか、およびその発現条件について検討中である。
刺激応答性高分子膜の合成とその応用

(1)N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)をポリビニルアルコール(PVA)にグラフトした共重合体から膜を製造し、その膜の感温性および物質透過性におよぼす温度の影響などについて検討した。ジメチルスルホキシド(DMSO)中のPVAにNIPAAmを加えて開始剤として過硫酸カリウムを用いて40°C、20時間重合することによりPVA-g-NIPAAmを収率よく合成できた。この共重合体のDMSO溶液からシャーレ中で溶媒を蒸発させることにより膜を得た。この膜を120°Cで8時間熱処理して水不溶性膜を得た。PVA-g-NIPAAmの転移温度を示差走差熱量計により測定した結果、p-NIPAAmと同じく約34°Cであった。PVA-g-NIPAAmの水中での膨潤度は転移温度以上で急激に低下することが認められた。これらの膜によるアルカリ金属イオンの透過速度を検討した結果、転移温度までは上昇したが、それ以上では急激に減少した。また分子量の異なるエチレングリコールの透過を温度を変えて検討した。温度を変えることにより分子量の異なるものの透過をコントロールすることができた。なお分子量20000のポリエチレングリコールはいずれの温度でも透過しなかった。(2)フォトクロミック分子としてスピロピラン(SP)誘導体を用いこれをテトラエチレングリコールジメタクリラート、ドデシルメタクリラート、およびヒドロキシエチルメタクリラートからなる三元共重合体(GDH)にドープあるいは共重合体させて得られた高分子膜の光感応性について検討した。SPは高分子膜中でも溶液中と同様の光異性化を行うことが認められた。これらの膜を二室型セルの中央に固定化し、UV照射側セルおよび未照射側セルの塩濃度の異なる場合は勿論、等濃度の系においてもUV照射により膜電位が発生することが認められた。この膜電位発生機構を種々の実験を行って検討した。
溶血レンサ球菌が産生するNAD分解酵素による毒性発現機構の研究

本研究の目的は、溶血レンサ球菌の病原性機構を分子レベルで解明し、効果的な治療法や新しい医薬品の開発に応用することである。溶血レンサ球菌はヒトへの感染に重要な毒素を細胞外へ分泌しており、これらの毒素が感染症の発症には重要であるが、特にNAD分解酵素(NADase)を中心に毒性発現機構を解析した。グラム陽性菌である溶血性レンサ球菌は硬くて厚い細胞壁を持つため、これが障害となってグラム陰性菌のような直接毒素を宿主細胞内に送り込むタイプIII分泌系を使うことができない。そこで分泌型毒素であるストレプトリジンO(SLO)が宿主細胞膜上に形成した孔から、NADaseのような毒素が細胞内に移行していると推測される。しかしながら、細胞膜上に孔を形成しただけでは、毒素分子を細胞内に効率よく導入することはできない。そこで、さらなる機構が存在しているのではないかと考え、NADaseとSLOの分子間相互作用について詳細に解析した。その結果、(1)NADaseとSLOは弱い複合体を形成、(2)SLOと同様にNADaseもコレステロールと弱く結合、(3)コレステロールはSLO活性を阻害するがNADase活性には影響しないことなどを明らかにした。以上の結果から、細胞外へ分泌されたSLOとNADaseは、ヒト細胞膜上の脂質ラフトと呼ばれるコレステロールに富む領域で濃縮され、SLOが細胞膜上で形成する孔よりNADaseが細胞内へ効率よく移行することが示唆された。SLOがコレステロールに結合するとコンフォメーション変化が起こることが報告されており、これによりNADase-SLO複合体が解離するのではないかと考えている。また、申請者らはNADaseの阻害剤に関する特許を取得した。本研究により得られた成果は、溶血レンサ球菌感染症を理解するために重要な知見であり、新しい治療法や薬剤開発への応用が期待される。病原性の溶血レンサ球菌は,咽頭炎,リウマチ熱,急性糸球体腎炎,猩紅熱などを引き起こし,特に本菌による劇症型の感染症は死亡率が高い。しかしながら,溶血レンサ球菌の病原機構については,現在でも不明な点が多く,活発に研究が続けられている。本研究の目的は,溶血レンサ球菌が産生する病原性因子の作用機序や病原性メカニズムを明らかにすることである。溶血レンサ球菌は多くの毒素を分泌することが知られているが,本感染症の確定診断には本菌が産生する溶血毒素であるストレプトリジン0(SLO)に対する中和抗体価の測定が臨床的に使われている。SLOは本感染症において古くから重要な毒素と考えられ詳細に研究されてきたが,その病原性への関与については現在でも不明な点が多い。これまでに申請者らは,SLOがエフェクター分子であるNAD分解酵素(NADase)を宿主細胞内に移行させることを明らかにしている。SLOはコレステロール結合性細胞溶解毒素ファミリーに属し,他の病原菌においても高度に保存されているが,特定の毒素を宿主細胞内に移行させる機能が確認されているSLOだけである。我々は,SLOの分子量がファミリーの中で最も大きく、そのN末端領域はSLOに特徴的なことから、この領域がNADaseを宿主細胞内に移行させるために必要な領域ではないかと考え,その機能を解析した。その結果,(1)SLOのN末端領域がNADaseの細胞内移行に関与していること,(2)SLOはNADaseと分子間相互作用していること,(3)SLOは細胞膜に孔を形成するだけでなく,溶血活性とは別の細胞毒性を有していることを明らかにした。現在,SLOによるNADaseの細胞内移行およびSLOの細胞毒性機構について,さらに詳細に解析している。
探索的脳研究に寄与する脳深部蛍光イメージング法の開発

脳の情報処理や病態を研究する場合、個体レベル(in situ)での実験が必要であるが、脳深部のin situイメージングは未だ困難である。本研究では、個体レベルでリアルタイムな信号伝達の評価が可能になる生体内蛍光イメージング法を開発するために、観察法および蛍光ラベル法の研究を行い、脳室カニュラによるin situ lipofection法により、蛍光蛋白をアダルトラット脳で発現させ、ファイーバー共焦点顕微鏡により脳深部の任意の場所の蛍光像を観察することが可能になった。これにより、培養細胞レベルの知見を個体の脳で生きたままリアルタイムに検証でき、探索的研究を発展させることができる。【平成25年度の研究内容と結果】1)観察法の開発:軟性ファイバーの先端にレンズを配置した新たなファイバー共焦点顕微鏡を開発するために、先端に装着する焦点距離60μm以内のレンズの選定を検討したが適切なレンズを選定することができなかった。理論的には、ガラスの屈折率を1.5とすると、焦点距離= 1.5rとなる。仮にファイバーの先端に直径0.2ミリのボールレンズを置くと過程すると、f = 1.5 ×0.1 = 0.15 mmとなり、ボールの中心から焦点までの距離は、0.15-0.1=0.05となり、この場合に初めて先端から対象物までの距離が、生体内を共焦点顕微鏡で観察可能な距離と考えられる60μmより小さくなる。それよりも焦点距離が大きいと、生体内での散乱により適切な焦点を結ばせることができず、適切なレンズが無いため、まず先端レンズなしの硬性ファイバー共焦点顕微鏡でラット海馬CA1領域の虚血再灌流時のヒドロキシラジカル発生の検出を試みた。その結果再灌流時に急激なヒドロキシラジカルが産生されることが、ヒドロキシラジカルの蛍光指示薬であるHPF(ヒドロキシフェニルフルオレセイン)により可視化できた。2)蛍光ラベル法の開発:自己血から赤血球を分離し、PKH26GL(赤色蛍光:励起波長551nm、蛍光波長567nm)により染色し、in vivoでの観察を行い、脳血流の可視化を可能にした。プラスミドの脳室内投与によるin situ lipofection法による蛍光蛋白発現を可能にし、electroporation法によるplasmid導入法では、細胞がfunctionalかどうかの断定に向けて実験を継続中である。【研究全体の目的】現状では生体脳深部のin situイメージングは未だ困難である。本申請では:1)脳の任意の部位の共焦点蛍光像を観察する方法を開発し動物での実用性を確認する;2)脳の任意の部位に蛍光蛋白を発現させる方法を開発し動物での実用性を確認することを目的とし、本研究期間終了時には、脳表と脳深部を問わず任意の場所に蛍光色素や蛍光蛋白により細胞や細胞内器官に蛍光ラベルし、共焦点蛍光像を観察することを可能にするための研究を行う。【平成24年度の研究内容と結果】1)観察法の開発:軟性ファイバーの先端にレンズを配置した新たなファイバー共焦点顕微鏡を開発するために、電興社(浜松市)と連携し、1自家蛍光の少ないイメージングファイバーの選定、2先端に装着する焦点距離60μm以内のレンズの選定を行った。【結果】電興社(浜松市)と連携し、自家蛍光の少ないイメージングファイバーが選定でき、平成25年度に共焦点ユニットとレンズを介してカップルし、ファイバー共焦点顕微鏡として稼働できる見込みである。先端に装着する焦点距離60μm以内のレンズの選定はまだ達成できておらず、25年度の課題として残している。1)観察法の開発:先端レンズ無しの硬性ファイバーをマルチピンホール式共焦点スキャナユニットとカップルさせた「共焦点ファイバー顕微鏡」により、ラット脳深部の蛍光観察を行った。虚血再灌流モデル(4血管閉塞による一過性前脳虚血)において、ヒドロキシラジカル消去剤(エダラボン)は容量依存的に海馬CA1領域の遅発性神経細胞死を抑制したので、そのメカニズムをさらに検証するためにイメージングを行った。ラット海馬CA1領域で、ヒドロキシラジカル蛍光指示薬のHPF(ヒドロキシフェニルフルオレセイン)とスーパーオキシド蛍光指示薬のMitoSoxを、それぞれ窒素ガスで加圧して脳内にインジェクションすること(Pressurized bolus injection法)により投与(染色)し、ヒドロキシラジカル消去剤(エダラボン)投与時の海馬CA1領域のラジカルの産生の評価を行った。その結果、ヒドロキシラジカル消去剤(エダラボン)は容量依存的に海馬CA1領域のヒドロキシラジカルの産生を抑制し、遅発性神経細胞死とパラレルであった。一方、最も遅発性神経細胞死を抑制する濃度のエダラボン投与でもスーパーオキシド産生は抑制されておらず、細胞死を引き起こす重要なメディエータはヒドロキシラジカルであることを実証した。2)蛍光ラベル法の開発:プラスミドの脳室内投与によるin situ lipofection法による脳内蛍光蛋白発現法に関して改良を加え導入効率を高めた。

ラット(BW 300g)に脳室カニュラを設置し1週間後に、脳室内にDNA量16.7μg/kg (BW)、DNA 2.5 μgあたりLipofectamine3000 reagent 5μLを混ぜ、室温で5分インキュベート後に1 μL/minで脳室内投与を行うことにより効率良く蛍光蛋白が発現することが分かった。脳神経外科学申請書に記載した「研究期間内に達成しようとする研究の目標」は:1)脳の任意の部位の共焦点蛍光像を観察する方法を開発し動物での実用性を確認する;2)脳の任意の部位に蛍光蛋白を発現させる方法を開発し動物での実用性を確認することである。そのうち1)に関しては、硬性ファイバー共焦点顕微鏡でラット脳深部の蛍光観察・可視化ができたこと、2)に関しては、プラスミドの脳室内投与によるin situ lipofection法による蛍光蛋白発現を可能にしたことより「おおむね順調に進展している」と自己評価した。申請書に記載した「研究期間内に達成しようとする研究の目標」は:1)脳の任意の部位の共焦点蛍光像を観察する方法を開発し動物での実用性を確認する;2)脳の任意の部位に蛍光蛋白を発現させる方法を開発し動物での実用性を確認することであるが、そのうち1)に関しては、ファイバーの選定が終わり新たなシステムが構築できる見込みであること、2)に関しては、electroporation法により脳の任意の部位に蛍光蛋白を発現させることができた(ただし、今後これらの精査が必要であるが)から。引き続き、脳の任意の部位の共焦点蛍光像を観察する方法と、脳の任意の部位に蛍光蛋白を発現させる方法に関する研究開発を行い、観察法および染色法(蛍光蛋白発現法)のfeasibilityを検討する予定である。平成24年度に確立できなかった手技については継続して研究開発を行い、軟性のファイバー共焦点顕微鏡による観察と、脳内へのelectroporation法によるplasmid DNAのtransfectionを可能にする。1)ファイバー共焦点顕微鏡のfeasibilityの検証:カルシウム指示性蛍光色素をpressurized bolus injection法により投与しラット海馬のCA1領域を染色する。開発したファイバー共焦点顕微鏡により、海馬CA1領域の虚血・再灌流による細胞内カルシウムイオン濃度の検討を行い、平成24年度に開発したファイバー共焦点顕微鏡のfeasibilityを検証する。2)electroporation法のfeasibilityの検証:cameleon(Fluorescence Energy Transferの原理によりカルシウムイオン濃度が上昇すると蛍光がシアンから黄緑色に変化するcalcium-indicating GFP variant)をラット海馬のCA1領域にelectroporation法により発現させ、ファイバー共焦点顕微鏡により海馬CA1領域の虚血・再灌流による細胞内カルシウムイオン濃度の検討を行い、蛍光色素による結果と比較検討する。
自己学習型Neural Networkによる高精度脊髄損傷機能予後予測法の開発

再生不能とされてきた脊髄損傷に対し、近年様々な治療アプローチが考案され、その効果への期待が高まっている。しかし脊髄損傷患者においては受傷直後から症状固定期まで運動機能自体はある程度自然回復し、さらにこの自然回復は個人間で大きく異なるため、「真の治療効果」の判定は困難である。そこで今回、膨大かつ複雑なデータを人工知能に学習させ結果を予測するArtificial Neural Networkを用い、脊髄損傷後の機能予後予測法の開発を行う。まず、脊髄損傷患者の入院時のASIA motor score, AIS,神経学的受傷高位、手術の有無、年齢、性別、血糖値、血圧などこれまでに脊髄損傷の予後との相関が報告されたパラメータをANNの構築に用いた。しかしこの手法では評価項目を選ぶ時点でバイアスが存在している。教師データとの照らし合わせとback propagationによって各階層間のパラメータの重み付けを自動的行うANNの利点を生かし、我々は今回入院時の動脈血pH,末梢血Hb値、白血球数・分画、身長、体重、各種生化学検査データ、糖尿病や高血圧等既往症の有無、受傷起点、受傷から来院までの時間(hr)、体温等々様々な項目を先入観なく入力し、新規にANNを構築した。また、MRIによる損傷部位のaxial像、sagittal像から算出された面積、体積及び損傷局在情報を作成し、新たにANNのパラメータとして取り込みを行なった。さらにこれらのデータをもとにブラウザベースで予測プロファイルの作成を行なった。これにより、32項目からなるデータを入力する事により新規発症患者の最終的な運動機能の予後を予測する事が可能になった。今後ANNを用いた予後予測dataと実際の機能予後を比較する事により現時点でのANNの有用性を評価するとともに、さらに症例数及び項目を増やして予測精度の向上を目指す。
芳香族ビスケテン化合物を用いる芳香族ポリエステル・ポリアミドの新規合成法

1)アントラセンとナフタレン骨格の芳香族ビスケテン(9、10-ジカルボニル-9、10-ジヒドロアントラセン(1)と1、4-ジカルボニル-1、4-ジヒドロナフタレン(2))はバーチ還元、続く二酸化炭素との反応、ジカルボン酸の酸塩化物への変換、脱気ベンゼン中での脱塩化水素反応によりベンゼン溶液として得ることが出来た。1、2-ジカルボニル-1、2-ジヒドロベンゼン(3)はベンゾシクロブテンの光反応により得ることが出来る。2) 1と4種類のベンゾキノン類との反応を室温で行い、いずれの場合もポリマーを収率よく得た。得られたポリマーのキャラクタリゼーションより芳香族ポリエステルであることが明らかになった。1とベンゾキノン類との間で無触媒交互共重合が起き芳香族ポリエステルを生成することが明らかとなった。3) 2は高反応性のため高濃度の溶液としては得られなかった。2の前駆体である酸塩化物とベンゾキノン類あるいはベンゾキノンジイミン類とを混合した後、その溶液に塩基を加えることで系中に2を発生させ反応させた。得られたポリマーのキャラクタリゼーションより、ベンゾキノン類との反応生成物は芳香族ポリエステル、またベンゾキノンジイミン類との反応生成物は芳香族ポリアミドであることが明らかになった。1とベンゾキノン類おるいはベンゾキノンジイミン類との間で無触媒交互共重合が起き芳香族ポリエステル、芳香族ポリアミドを生成することが明らかとなった。4)ベンゾシクロブテンに光照射することにより系中に3を発生させベンゾキノン類あるいはベンゾキノンジイミン類と反応させた。3とベンゾキノン類との反応系のESR測定より重合はラジカル機構で進行していること、またポリマーの分子量が時間とともに増加することによりジラジカルが生成し、その再結合反応でポリマーを生成することが明らかになった。しかし、光照射により生成ポリマーの分解反応が起きるため高分子量のポリマーを生成しないことも明らかになった。1.アントラセン骨格及びナフタレン骨格の芳香族ビスケテン化合物(9,10-ジカルボニル-9,10-ジヒドロアントラセン(1)及び1,4-ジカルボニル-1,4-ジヒドロナフタレン(2)の合成に成功した。2.化合物1と2は置換ベンゾキノン化合物と脱気ベンゼン中で反応して、ポリマーを生成することを見いだした。得られたポリマーはモデル化合物との比較から芳香族ポリエステルであることが明らかになった。とくに長鎖の置換基を有するベンゾキノンとの反応では、ポリマーの溶解性が向上し、分子量数万のポリエステルであることがわかった。3.ベンゾシクロブテンジオン(3)と置換

キノン類(ベンゾキノン、ドデシルチオベンゾキノン)を種々の溶媒(ベンゼン、アセトニトリル、クロロホルム)に溶解し、高圧水銀ランプで光照射すると、3はオルト型芳香族ビスケテン化合物(1,2-ジカルボニル-1,2-ジヒドロベンゼン(4))を生成、置換キノン類と反応して、分子量20003000程度の芳香族ポリエステルを生成することがわかった。ポリマーの溶解性が高いので、今後ESR測定を通して、この反応を解明する予定である。高圧水銀畑ランプの照射下、ベゾシクロブテンジオン(1)とキノン類(ベンゾキノン(2a)、ドデシルチオベンゾキノン(2b))との反応を三種類の溶媒(ベンゼン、クロロホルム、アセトニトリル)中で検討した。光照射下で、化合物1はキノン類と反応してポリマー(収率68-85%)と少量のDiels-Alder付加体(収率4-9%)を生成した。生成ポリマーの分子量は2000-3000であった。1と2bとからのポリマーは通常の有機溶媒に可溶で、そのスペクトル解析より芳香族ポリエステルであることがわっかった。1と2bとの反応系について、反応時間にたいするポリマー分子量の変化を検討した。ポリマーの分子量が時間とともに増加することを見いだした。更に1と2aの反応系のESR測定から重合はラジカル機構で進行していることがわっかった。これらの事実より1とキノン類の光反応による芳香族ポリエステル生成の機構は、1の光反応により生成した1、2-ジカルボニル-1、2一ジヒドロベンゼンがキノン類と反応してビラジカルを生成し、そのビラジカルが再結合をへてポリマーを与える機構であることが明らかとなった。同様に、高圧水銀ランプの照射下、ベゾシクロブテンジオン(1)とキノンジイミン類(N,N-ジエトキシカルボニルベンゾキノンジイミン(2a)、N,N-ジベンゾイルベンゾキノンジイミン(2b)、N,N-ジベンゼンスルフォニルキノンジイミン(2c)、N,N-ジフェニルベンゾキノンジイミン(2d))との反応をベンゼン中、0°Cで検討した。1と2a、1と2bの反応では1時間で分子量1500-2500の淡黄色粉末固体が70一95%の収率で得られた。得られたポリマーは仕込み組成に関係なく1:1組成で、モデル化合物とのIR,NMRスペクトルの比較より芳香族ポリアミドであることがわっかつた。しかし、このポリマーは光照射により分解をされるため高分子量のポリマーが生成しないことが新たな知見として得られた。
タイトジャンクション(TJ)は、隣り合う細胞間隙の物質透過を制限すると共に細胞膜を頂端側と側基底側に分離することによって、生体の構築・維持に必須の役割を果たしている。このTJの形成・分解には、TJを構成する膜蛋白質であるクローディンやオクルーディンの細胞膜への小胞輸送の調節が重要だと考えられる。研究代表者は、60以上のメンバーが同定されている細胞内小胞輸送の代表的な制御系であるRabファミリー低分子量G蛋白質(Rab)に注目し、TJに局在するRab13が、クローディンのゴルジ体から細胞膜へのエクソサイトーシスおよびオクルーディンのエンドソームから細胞膜へのリサイクリングを特異的に制御することを明らかにしてきた。そこで、本研究では、細胞極性・接着の制御におけるRab13の役割を明らかにする目的で、Rab13結合蛋白質を同定し、以下の結果を得た。1)酵母Two-hybrid法を用いて、GTP結合型Rab13に特異的に結合する分子としてJRABを同定した。2)JRABはマウス乳腺上皮(MTD-1A)細胞のTJに局在した。3)JRABのRab13結合領域欠失変異体は、Rab13のGTP結合型変異体と同様にオクルーディンのリサイクリングおよび機能的TJの形成を抑制した。4)JRABは、Rab13のGDP結合型変異体を発現しても細胞膜に局在したが、アクチン重合阻害剤サイトカラシンD処理すると細胞膜から解離した。5)JRABは、マウス線維芽(NIH3T3)細胞のストレスファイバーおよびカルシウムをキレートしたMTD-1A細胞の放射状のアクチンフィラメントと共局在した。これらの結果から、Rab13-JRAB系は、オクルーディンのリサイクリングおよびアクチン細胞骨格を介して、細胞極性・接着を制御していることが示唆された。このように、本研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。細胞極性・接着は、物理的に隣り合う細胞間隙の物質透過を制限し、細胞膜を頂端側と側基底側に分離すると共に、細胞膜上の膜ドメインとしてシグナル伝達分子を集積しているタイトジャンクション(TJ)によって支えられている。TJの形成には、構成する膜蛋白質であるクローディンやオクルーディンが、細胞膜まで小胞輸送されることが必要であり、正常な発生・分化や癌細胞の浸潤・転移といった病理過程において、TJはダイナミックに形成・分解されている。細胞内小胞輸送の代表的な制御系であるRabファミリー低分子量G蛋白質(Rab)には60以上のメンバーが同定されており、個々のメンバーが特定の細胞内膜系に局在して小胞輸送および膜ドメイン形成を制御している。これまでに、TJに局在するRab13が、クローディンのゴルジ体から細胞膜への輸送およびオクルーディンのエンドソームから細胞膜へのリサイクリングを特異的に制御することを明らかにしてきた。そこで、本年度の研究では、細胞極性・接着の制御におけるRab13の役割を明らかにする目的で、Rab13の標的蛋白質の同定を試み、以下の結果を得た。2)JRABは脳、肝臓、腎臓、肺に発現し、マウス乳腺上皮(MTD-1A)細胞のTJに局在した。3)JRABのRab13結合領域欠失変異体(JRAB-N)は、オクルーディンの細胞膜へのリサイクリングを特異的に抑制した。
4)JRAB-Nは、カルシウムスイッチしたMTD-1A細胞における機能的TJの形成を抑制した。これらの結果から、Rab13は、標的タンパク質JRABを用いて、細胞極性・接着を制御していることが示唆された。このように、本年度の研究は予想以上に進展し、当初の目的はほぼ達成できた。生体を構築・維持していくためには、タイトジャンクション(TJ)が隣り合う細胞間隙の物質透過を制限すると共に細胞膜を頂端側と側基底側に分離することが必要不可欠である。このTJの形成・分解には、TJを構成する膜蛋白質であるクローディンやオクルーディンの細胞膜への小胞輸送の調節が重要だと考えられる。研究代表者は、60以上のメンバーが同定されている細胞内小胞輸送の代表的な制御系であるRabファミリー低分子量G蛋白質(Rab)に注目し、TJに局在するRab13がクローディンのゴルジ体から細胞膜へのエクソサイトーシスおよびオクルーディンのエンドソームから細胞膜へのリサイクリングを特異的に制御することを明らかにし、さらにRab13結合蛋白質JRABを同定してきた。そこで、本年度の研究では、細胞極性・接着の制御におけるRab13の役割を明らかにする目的で、JRABの機能解析を行い、以下の結果を得た。1)JRABは、GTP結合型Rab13と特異的に結合し、マウス乳腺上皮(MTD-1A)細胞のTJに局在した。2)JRABのRab13結合領域欠失変異体は、Rab13のGTP結合型変異体と同様にオクルーディンのリサイクリングおよび機能的TJの形成を抑制した。3)JRABは、Rab13のGDP結合型変異体を発現しても細胞膜に局在したが、アクチン重合阻害剤サイトカラシンD処理すると細胞膜から解離した。4)JRABは、マウス線維芽(NIH3T3)細胞のストレスファイバーおよびカルシウムをキレートしたMTD-1A細胞の放射状のアクチンフィラメントと共局在した。これらの結果から、JRABはRab13とアクチン細胞骨格をリンクすることによって、細胞極性・接着を制御することが示唆された。