hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌における染色体維持因子FANCJ発現の意義と新規分子標的癌治療戦略への展開

染色体は正確に複製されかつ分配されるメカニズムのおかげで、普段はその安定性を守っている。がんにおいては、そのメカニズムに異常を来し、染色体が不安定となる。申請者は、染色体安定性を守るために機能する因子の1つFANCJが通常より多く発現している大腸癌において、5-FUを含むがん化学療法の治療効果が少ないことを見出していた(Nakanishi et al. Ann Surg Oncol 2012)。本研究では、FANCJの発現と5-FU感受性との関係とそのメカニズムを実験的に追求し、FANCJとそのパートナーとの相互作用が重要であることを見出した。染色体不安定性は発癌や癌の進展の要因であるが、DNA損傷応答や修復機構の異常が原因であることが多い。染色体不安定性症候群ファンコニ貧血の原因遺伝子の1つFANCJは、その欠損により特徴的な染色体不安定性が引き起こされることやBRCA1,MLH1,BLMなどの重要な癌抑制遺伝子と直接会合し機能することが報告されている。このことから、染色体不安定性に伴う発癌や癌の進展において、FANCJの機能異常が深く関与する可能性がある。申請者は大腸癌症例において、FANCJ発現亢進を認める症例があること、またその症例では5-FUを含む術後化学療法の治療成績が不良であることを報告してきた。申請者はこれまでに、ニワトリDT40細胞株を用いた遺伝学的手法により、染色体不安定性症候群ファンコニ貧血原因遺伝子FANCJの破壊株を樹立し、抗癌剤シスプラチンや5-FU代謝物に対する細胞応答や感受性について解析を進めてきた。FANCJ破壊株は、シスプラチンに対して非常に高い感受性を示すが、5-FU代謝物FdUrdに対してもわずかに感受性を示した。このFdUrd感受性は野生型FANCJの発現により回復したことから、FdUrd感受性はFANCJ欠損によるものであると結論づけた。さらにこの感受性の相補には、FANCJのDNAヘリカーゼ活性、ミスマッチ修復因子MLH1との結合、DNA複製関連因子TopBP1との結合が必要であることを示唆する結果を得た。FANCJはMLH1,TopBP1と協調し、DNAヘリカーゼとして機能し、FdUrdに対する細胞応答に関わっていることが予想される。染色体不安定性症候群ファンコニ貧血の原因遺伝子の1つFANCJは、その欠損により特徴的な染色体不安定性が引き起こされることやBRCA1, MLH1, BLMなどの重要な癌抑制遺伝子と直接会合し機能することが報告されている。申請者は大腸癌症例において、FANCJ発現亢進を認める症例があること、またその症例では5-FUを含む術後化学療法の治療成績が不良であることを報告してきた(Nakanishi et al. (2013) Ann Surg Oncol 19:3627-35)。申請者はこれまでに、ニワトリDT40細胞株を用いた遺伝学的手法により、染色体不安定性症候群ファンコニ貧血原因遺伝子FANCJの破壊株を樹立し、抗癌剤シスプラチンや5-FU代謝物に対する細胞応答や感受性について解析を進め、昨年成果報告書においてこのFANCJ破壊株は、5-FU代謝物FdUrdに対してもわずかに感受性を示すこと、その感受性の相補にはFANCJのDNAヘリカーゼ活性、ミスマッチ修復因子MLH1との結合、DNA複製関連因子TopBP1との結合が必要であることを報告した。昨年度は、このことがヒトがん細胞株においても同様の表現型が見られるかについて検証を行った。さらに、2014年に大鵬薬品工業より国内での販売が開始された新規ヌクレオシド型抗腫瘍薬ロンサーフの薬効成分トリフルリジンの作用機序に関する研究を行い、トリフルリジンとFdUrdの作用機序に共通した部分と異なる部分があることを明らかにし、原著論文として発表した(Matsuoka et al. 2015)。

染色体は正確に複製されかつ分配されるメカニズムのおかげで、普段はその安定性を守っている。がんにおいては、そのメカニズムに異常を来し、染色体が不安定となる。申請者は、染色体安定性を守るために機能する因子の1つFANCJが通常より多く発現している大腸癌において、5-FUを含むがん化学療法の治療効果が少ないことを見出していた(Nakanishi et al. Ann Surg Oncol 2012)。本研究では、FANCJの発現と5-FU感受性との関係とそのメカニズムを実験的に追求し、FANCJとそのパートナーとの相互作用が重要であることを見出した。昨年の段階で、ニワトリDT40細胞を用いたFANCJ遺伝子破壊株および野生型や変異型FANCJ相補細胞株の樹立、これらの細胞を用いた表現型の比較解析が進められたことにより、目標が明確になったことが順調に研究を進められた要因と考えられる。また、FANCJの細胞内における分子機能についての報告が相次ぎ、知見が蓄積していること、5-FUやその代謝物、さらに昨年国内で上市された新規ヌクレオシド型抗腫瘍薬ロンサーフの薬効成分トリフルリジン(FTD)の作用機序に関する研究が進展し(Matsuoka et al. (2015) Mol Cancer Ther.14:1004-13)、これらの薬剤が細胞に及ぼす影響について申請者のグループでの実験結果や他のグループによる報告から細胞分子生物学的理解が可能となってきたことも、研究が順調に進められている要因と考えられる。分子細胞生物学今後は、細胞株を用いた表現型解析の結果の要因について検討する。FANCJは複製進行阻害剤投与時の複製とクロマチン構造の維持との共役において重要な役割を果たす(Schwab et al. (2013) J Cell Biol 201, 33-48)。この機能のため、FANCJは複製進行阻害からの復帰を促進すると考えられる。5-FUやその代謝物、FTDの働きにより、細胞内のヌクレオチドプールのバランスが崩れ、複製進行阻害が引き起こされると想定されている。十分な量のFANCJタンパクが細胞内に存在しないと、その複製進行阻害からの復帰がうまくいかず、癌の5-FUやFTDによる増殖抑制効果が高まると予想される。申請者は、実際に臨床検体を用いた研究から、癌部においてFANCJが過剰に発現する大腸癌症例では5-FUを含む術後化学療法の治療効果が少ないことを報告している(Nakanishi et al. (2013) Ann Surg Oncol 19:3627-35)。FANCJの機能と薬剤耐性との関係、FANCJ結合因子の関与の可能性について検討していく。ニワトリDT40細胞を用い、そのFANCJ遺伝子破壊株および野生型や変異型FANCJ相補細胞株の樹立を完了したことによりその表現型の比較解析が進められたこと、さらに5-FU代謝物の1つであるFdUrdの適正濃度が様々な細胞生物学的解析の結果、明確になったことが順調に研究を進められた要因と考えられる。
システム知能化のための不完全情報の処理と深層知識の自己組織化に関する研究

本研究は、人間が問題の視点に応じて情報を選択的に抽出し、それらを問題の解決に向けて適応的に組織化して利用する機能のモデル化と、その過程のコンピュ-タアルゴリズム化を目指したものである。すなわち、対象世界でのエピソ-ドとしての事象間の表層的な因果関係から、具体的事実に内包される普遍的な知識表現の構造単位を抽出し、それらを問題の注視点に応じて、問題の深層構造へ自己組織化する高次推論法を提唱した。現実世界から不完全、場合によっては矛盾する情報が与えられたとき、対象世界に成り立つ順序構造(例えば、あるアパ-トで「猫を飼うことが禁止されている」ならば、「犬を飼うことは禁止されている」は、暗黙の了解事である)に注目することにより、完全かつ整合性の保障された知識に統合する過程の定式化を行った。問題領域固有の制約を表す記号化知識としての区間制約ファジィ集合の概念を導入することにより、デ-タや信号(signal)・兆候や情景(sign)など、環境からの生情報を、記号化知識(symbolized knowledge)に抽象化・一般化する手法を提唱した。また、ニュ-ラルネット、遺伝アルゴリズム(genetic algorithm GA)などのデ-タ学習手法と、演繹学習EBLに基づく概念学習手法を融合することにより、同上の問題解決の定式化を行った。部分的情報を入手する複数のセンシング・処理主体の分散・協調により、整合性の保障された全体解釈の生成を行う手法を提唱した。さらに現在、下位機能の発現が上位機能によって制約・制御される生物の世界における自律分散的秩序維持のモデルーシナジェテックスーの考えに基づく同上の問題の定式化を行いつつある。現実世界での具体的・表層的事実に関する情報から、その背後に潜在する問題の深層構造を抽出する手法について研究し、以下のような成果を得た。すなわち、1.事実経過の記述である表層的事例の知識表現方式として、問題の当事者(主体)と主体の価値観に相当するノ-ドを導入した新しい因果連鎖ネット表現形式を導いた。この表現形式は、コンピュ-タによる効率のよい普遍的な因果推移への一般化を可能にするための必要最小限の文脈要素を与えるものである。2.上記文脈要素の連鎖からなる一般的知識表現の構造単位としての事象スキ-マを設定し、人間のプラン生成過程やオペレ-タの操作履歴などの事例に含まれる普遍的・典型的な行動パタ-ンを、上記構造単位の一定の順序・まとまりとして抽出、事象展開の本質をとらえた因果系列・マクロな操作手順を同定する手法を開発した。3.現実世界から得られる不完全、かつ場合によっては矛盾する部分的情報、すなわち、いくつかの上記の知識の構造単位が与えられたとき、対象世界で成り立つ順序構造に着目することにより、完全性、整合性のとれた知識に統合する手法を様相論理の立場から導出した。4.上記2の課題での成果に基づき、様々の集約・一般化レベル間およびレベル内での注視点の移動を可能にする対話システムを構築した。本システムにより利用者は、複雑な対象世界での実事例の内包する問題の本質を様々の抽象化レベルでとらえることができる。複雑なシステムにおいて生起する具体的事象から、問題の深層構造を抽出する認知プロセスのモデル化に関する研究を行い、以下の成果を得た。1.具体細目において異なるいくつかの具体事象やデ-タ事例から、共通属性の統合、差異属性の顕在化を通して、その後の事象展開・波及のあり方の典型(プロトタイプ、一般化仮説)を導出する「事例からの学習(Explanationーbased Learning,EBL)」による演繹プロセスの定式化を行った。また、同一の地殻変動条件のもとで得られる様々の地質構造パタ-ンを事例とみなし、ニュ-ラルネット型連想処理プロセスにより、仮説として設定した典型的地殻変動パタ-ンに類別する学習システムを構築した。

2.上記の一般化仮説のもとで新事実生起の予測など、仮説駆動のトップダウン推論・判断・決定のプロセスを、問題領域における常識としての順序構造に注目、区間制約条件としてファジィ概念をとらえることにより定式化する手法を確立した。3.部分的・断片的な情報が与えられたもとで、それらを補完総合して全体として整合する解釈、状況把握を導出する協調分散処理システムを構築した。その情報処理プロセスの定式化は、複数仮説のボトムアップ同時並行的活性化、解釈の整合性を保証する仮説のトップダウン選択の双方向推論機能と、推論モ-ドを切り替える情報伝達機能により実現される。システム知能化において、人間や環境とコンピュ-タの間の円滑な情報の交流は最も重要で、かつ解決の難しい課題である。本年度の研究においては、記号処理を主体とするコンピュ-タ内での情報表現形式に、人間の主観的判断のもつあいまい性や、環境からのデ-タや信号(signal)・兆候や情景(sign)など、記号化(概念化)される以前の生情報を抽象化・一般化する問題、および環境から得られるいくつかの部分的な不完全情報を統合し、全体として整合性のとれた解釈を導出する問題に焦点を当て、以下のような成果を得た。(1)デ-タや信号(signal)・兆候や情景(sign)など、生情報の記号化(概念化)においては、区間制約ファジィの概念を導入し、コンピュ-タのもつ記号化知識として表現された問題領域固有の制約を仮説とするトップダウンの制御により、現実の状況に整合するよう生情報を「概念化」する手法の定式化を行った。また、ニュ-ラルネット、遺伝アルゴリズム(genetic algorithm GA)などのデ-タ学習手法と、演繹学習EBLに基づく概念学習手法を融合することにより、同上問題の定式化を行った。(2)部分情報の統合による整合性の保障された全体解釈の生成においては、情報を入手する複数センシング・処理主体による分散・協調型問題解決の定式化を行い、さらに現在、下位機能の発現が上位機能によって制約・制御される生物の世界における自律分散的秩序維持のモデルーシナジェテックスーの考えに基づく同上の問題の定式化を行いつつある。
急性呼吸不全における低分子G蛋白Rap1の役割と治療応用の可能性

低分子G蛋白の一種であるRap1の急性呼吸不全における役割およびRap1の阻害による治療応用の可能性につき検討した。Rap1はCD11bやCD44などの発現調節を介して細胞接着を制御している。培養細胞では炎症刺激後にRap1発現が亢進し、マウスの実験的肺損傷でも発現亢進が一部にみられた。急性呼吸不全患者の気道上皮被覆液中でもRap1の高発現が見られた。次にRNA干渉によりRap1発現の阻害を試みた。培養細胞では発現を阻害できたが、マウスへの気道内投与では阻害効率が一定せず、治療応用にはさらなる検討を要すると考えられた。平成22年度は主に培養細胞を用いた検討と動物実験を行った。ヒト血管内皮細胞(HUVEC)および気道上皮細胞(Bes2b)の培養系を用いて、エンドトキシン(LPS)や腫瘍壊死因子(TNF-α)などの炎症性刺激を加えた際のRap1および関連する分子であるRhoA、Rasなどの発現を検討した。方法としてはリアルタイムPCR法による遺伝子解析とウェスタンブロット法による蛋白レベルでの解析を行った。HUVECでは、LPS投与6時間後にRap1の遺伝子発現が亢進し、RhoA、Rasについても同様に発現の亢進が見られた。TNF-αによる刺激でも同様の傾向であった。これらの遺伝子発現は炎症性刺激12時間後をピークにし、24時間後にはほぼベースラインに復していた。また蛋白レベルでも同様にRap1および関連するRhoA、Rasの発現亢進が見られた。Bes2bでもLPS投与6時間後にRap1の遺伝子発現が亢進し、RhoA、Rasについても同様に発現の亢進が見られ、TNF-α刺激でも同様の傾向であった。次にマウスの気管内にLPSを投与し、肺内の遺伝子発現がどのように修飾されるかを検討した。炎症性刺激後のRap1、RhoA、Rasの発現は、LPS刺激により亢進する傾向にあったが、個体間でのばらつきが大きかった。遺伝子発現を経時的に評価したところ、多くのマウスでLPS投与の4時間後から発現が亢進する傾向にあった。平成23年度は主に、培養細胞にsiRNAを導入してRap1の発現をノックダウンすることにより細胞の機能にどのような影響が出るかを検討した。Rap1遺伝子に相補的なヌクレオチド長の短い干渉RNA(siRNA)を作成し、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)および気道上皮細胞(Bes2b)に導入した。導入後の細胞を低酸素環境に置き、Rap1および関連する分子であるRhoA、Rasなどの遺伝子発現が減弱することを確認した。またこれらの発現は蛋白レベルでも低下していた。Rap1に対するsiRNAを導入した細胞では、様々な濃度のエンドトキシン(LPS)で刺激をしてもRap1、RhoA、Rasの発現亢進は見られなかった。アデノ随伴ウィルスベクターにRap1に対するsiRNAを発現させ、マウスの気道内に投与した。摘出した肺でRap1遺伝子発現を評価したところ、発現は確認できなかった。また気道内投与後に低酸素曝露を行ったが、Rap1の肺内での発現は確認できず、ノックダウンが成立しているものと考えられた。臨床研究として、呼吸不全患者において、気管支鏡的マイクロサンプリング法で気道上皮被覆液を採取し、Rap1、RhoA、Rasをウェスタンブロット法で評価した。一部の患者でこれらの分子の高発現が見られたものの、呼吸器系の基礎疾患の有無や呼吸不全の程度、酸素投与量による一定の傾向は認めなかった。また肺炎や全身性炎症反応症候群(SIRS)の有無により一定の傾向を示すこともなかった。平成24年度は前年度から継続して、siRNAによりRap1の発現をノックダウンした細胞の機能の解析を行った。siRNAをヒト肺線維芽細胞および樹状細胞に導入し、エンドトキシン(LPS)や腫瘍壊死因子(TNF-&#61537;)などの炎症性刺激を加えた。siRNAを導入した細胞では、Rap1および関連する分子であるRhoA、Rasなどの遺伝子発現が減弱しており、LPS刺激後の転写因子NF-&#61547;Bの活性化や炎症性サイトカイン(TNF-&#61537;、IL-8など)の発現を検討したところ、両細胞系ともに、siRNAを導入することでNF-&#61547;B活性化やサイトカイン発現が抑制された。Rap1に対するsiRNAを導入した細胞では、TNF-&#61537;による刺激を加えても、NF-&#61547;Bの活性化やIL-6の発現亢進が見られなかった。アデノ随伴ウィルスベクターにRap1に対するsiRNAを発現させ、マウスの気道内に投与する実験も前年度に引き続き行った。

摘出した肺でRap1遺伝子発現が確認できなかったことから、ノックダウンが成立しているものと考えられた。LPS腹腔内投与による敗血症モデルでは、siRNAを含まないウィルスベクターを投与した対照群で肺内のNF-&#61547;B活性化や炎症性サイトカインの発現亢進を認めた。Rap1に対するsiRNAを含むウィルスベクターを投与したマウスでは、LPS腹腔内投与後のNF-&#61547;B活性化やサイトカイン産生がやや抑制されたが、肺内への炎症細胞浸潤や肺血管外水分量などの肺損傷の指標についてはデータのばらつきが大きく、一定の傾向は見られなかった。平成22年度に培養細胞のノックダウンの実験系を確立するのに時間を要したことが最大の要因と考えられる。平成23年度についてはほぼ計画通りの進行であり、当初予定された達成度に近づきつつあると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。臨床検体については、一定の傾向が見られないため、平成24年度には症例の追加を行わないこととする。その分、ウィルスベクターを用いた抑制実験に注力し、ベクターの量反応関係や炎症性刺激の存在下における抑制効果について、研究期間内に一定の知見を集約することを目指す。
圧負荷肥大心筋における細胞周期関連遺伝子の解析

胎生期-新生児期の心臓形成に心筋特異的ホメオボックスや種々の増殖因子、低分子量G-proteinの関与することがあきらかとなりつつある。そこで、分化が終了したと考えられる成熟した心臓-心筋細胞で圧負荷刺激によって、胎生期に認められるような細胞の分裂・増殖のシグナルを生じるかどうか検討を行った。2.免疫組織学的検討より心筋細胞でPCNA発現を確認した。血管周囲の平滑筋細胞や結合組織などの非心筋細胞では発現はほとんど認められなかった。3.圧負荷心筋よりRT-PCR法を用いて心肥大ラットの心筋c-DNAライブラリーを作成。細胞分裂、特にG1-S期への移行に関するcyclin A遺伝子の発現の検討を行った。術後1w前後に著明な遺伝子発現の上昇を認めた。4.さらに心肥大が完成し心筋細胞の脱落、心筋線維化が生じる術後7-8wの心臓中で細胞の分裂・増殖と密接な関係を持つ細胞死であるアポトーシスが生じていた。以上のように圧負荷開始後、心肥大の形成以前の心筋細胞で分裂・増殖に関与するシグナルの上昇を認めた。これらの結果より心肥大の形成時に胎生期にみられる心臓の形成時と同様の制御機構が生じている事が示唆された。
RC高架橋の地震時挙動の実測・解析とRC構造物の耐震設計の合理化

本年度は、当該研究の最終年であり振動台を合計5台東名阪高速道路の高架橋に設置し終えた。また、本研究の初期の段階で既に設置してあった名古屋高速道路大高線の地震計も東名阪高速道路高架橋に移設して重点的な観測態勢を整えた。現在その観測体制に入っている状況である。しかし今のところ観測にかかった地震は発生しておらず、地震待ちである。一方、大高線からは、1999年にいくつか地震波が観測されておりその部分については、高架橋の解析を行った。一方、本研究の構想が更に発展して現在名古屋全地域を考慮した数値振動台構想を抱くに至っているが、その為に100万自由度オーダのソルバーを開発しつつある。その第一歩は終了した。昨年の実績報告書でも見通しを延べたが、flexibility法に基づく、2軸曲げの非線形解析は完全に成功し、多数ほんの橋脚からなる高架橋システムの非線形地震応答の解析ツールは完成した。これらのツールの整備とともに本研究で目指したRC高架橋システムの実挙動の解明と耐震対策の一層の合理化が可能になるはずである。今後の地震観測と、一方の大自由度振動解析を組み合わせて成果を挙げてゆくつもりである。交付申請書でも述べたように,今期の研究計画は名古屋市及びその近郊におけるコンクリート製高架橋構造物を逐次調査するための戦略を立てることと,実際の数値振動台を構築するための理論を拡充することであった.まず理論の拡充については,高架橋構造物のような離散型のシステムに対する半無限境界の構築について,基本的なところに立ち返って検討を行い周波数領域での境界構築にほぼ成功した.大変おもしろい結果が得られており,線形システムである限りどのような複雑な離散形であっても,半無限境界の構築が可能となった.ついで,多数の橋脚を同時に取り扱って動的な応答を求める非線形解析については,flexibility法を用いて,2軸曲げ+変動軸力を受ける場合であっても簡単な1要素で表現が可能なような解析手法をほぼ完成させた.次に,地震計の設置による実測計画については,地震計設置場所をどのように敷設移動させるかが重要なのであるが,名古屋市南部地域の地盤条件の悪いところから,順次設置移動するのが良いと言うことになった.実際の高架橋については,コンクリート橋脚と同時に上部工もコンクリート製の所をまず第1候補と現在名古屋高速道路公社,道路公団と設置を打ち合わせている最中である.出来るだけ,効率かつ重要なデータが得られるように地震計の最適な配置,台数などを検討し,間もなく実施に移せると考えている.本年度は、当該研究の最終年であり振動台を合計5台東名阪高速道路の高架橋に設置し終えた。
遺伝子発現の光応答性人工トグルスイッチ回路の構築

前年度に引き続き、哺乳動物細胞内にトグルスイッチ回路を構築することを試みた。まず、幹細胞を含めた多様な細胞種で動作する転写抑制スイッチを開発した。具体的には、hEF1aプロモーター内にLacオペレータ、Tetオペレータを挿入した新規の転写抑制因子応答型EFプロモーターを作製した。その結果、Lacオペレータ及びTetオペレータを含んだ改変型EFプロモーターについて、それぞれ、転写抑制因子LacI及び転写抑制因子TetRによる応答活性を確認することが出来た。また、転写抑制因子LacI及びTetRと蛍光タンパク質(GFPとRFP)との融合タンパク質を作製し、それらが機能的であることを確認した。そこで、これらの抑制因子と改変型EFプロモーターを使って相互抑制型遺伝子回路を作製し、細胞内に遺伝子導入した。その際、Tol2トランスポゾンを使って染色体ゲノムに組み込むことで安定発現株を樹立し、DoxとIPTGの両方を添加した条件下で培養を行い、GFPとRFPの両方が陽性な細胞群を純化した。その後、DoxとIPTGの両方を除いた条件で培養を継続し、再びFACS解析を行ったところ、GFP+/RFP-細胞集団とGFP-/RFP+細胞集団の両方が現れたことから、トグルスイッチ機能が働いていることが示唆された。今後、このトグルスイッチ回路に光応答機能を付与することによって、本研究が目標とする光応答性トグルスイッチ回路の構築を目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、哺乳動物細胞において相互抑制型トグルスイッチを構成する人工遺伝子回路のプラスミドベクターの構築及び細胞株の樹立に取り組んだ。まず、薬剤誘導によって活性を制御可能な抑制型転写因子のペアを選定し、EF1aプロモーターにそれぞれの応答配列を組み込んだ人工プロモーターを作製した。転写因子による人工プロモーターの抑制効果が確認できたため、相互抑制型の回路を構築し、回路が染色体上に組み込まれた安定発現株を樹立した。現在、薬剤によるスイッチング機能をFACSによって解析しているところである。今年度は相互抑制型トグルスイッチ回路の構築と機能解析が目標であったが、機能解析が終了していないため。相互抑制型回路の機能解析が終了し次第、光受容タンパクを組み込んだ回路を使って安定発現株を樹立する。
胚性幹細胞を用いた高率心筋細胞誘導法の開発

胚性幹細胞(Embryonic Stem Cell(ES細胞))からの分化誘導は、生理的状況下における発生において重要な因子が同様に関与していると考えられている。そこで我々は、過去に心臓発生に重要とされる因子を検討したが、充分な効果は得られなかった。発生学的観点から見直したところBMP antagonistであるNogginが心臓発生領域で発現し、Nogginを胚性幹細胞に作用させると高率に心筋細胞を誘導できることを見いだした(Yuasa S, et. al. Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte diflferentiation of mouse embryonic stem cells. NatureBiotechnology. 2005 May; 23(5):607-611.)。さらなる分化誘導効率の上昇を目的として、発生学的に重要な他の因子も検討していたところ、現在までに数種類の遺伝子(分泌因子)が心臓発生予定領域に発現し、かっ胚性幹細胞の分化誘導効率を上昇させることが判明した。現在は、一つの因子に注目して解析中である。その因子のレセプターは、心臓発生の胎生中期に非常に強く発現している。その因子を胎仔に注射すると胎仔の心筋細胞が増殖することが確認され、新規心筋細胞増殖因子であることが判明した。また、その因子を分化途中のES細胞に添加することにより、心筋細胞を増殖することが判明した。
ヒト胎盤形成期の絨毛細胞虚血再潅流障害の病的意義に関する研究

本研究では、炎症や酸素濃度、母体好中球を介した炎症や虚血再潅流障害によって生成される活性酸素種・酸化ストレスを中心に、絨毛細胞とその外的環境としての好中球・血管内皮細胞との連関の観点から、妊娠高血圧症候群の病態形成過程を明らかにすること、さらにTNFがその過程の治療標的となる可能性について検討することを目的とした。本年度は胎盤のDNAの酸化による損傷の程度つまり酸化ストレスの指標となる8OHdG(8ヒドロキシデオキシグアノジン)を免疫染色法を用いて検出し、それぞれの疾患における活性酸素種の存否とその局在や出現時期を検討した。その結果、胎児体重の基準値からの偏差と8OHdG発現量の間には負の相関関係が存在する可能性が示唆された。すなわち、これまで一連の関連研究で発表してきた妊娠高血圧症候群のみならず、胎児発育不全においても、酸化ストレスがその病態形成に関与している可能性があることを示すものと考えられる。また、絨毛細胞を用いた培養実験において、TNF存在下では絨毛細胞にキサンチンオキシダーゼタンパクが誘導されることがわかった。これは、好中球などの炎症細胞が胎盤局所の活性酸素種の産生に関わることを示す知見と考えられる。今後は検討数を増やすとともに、また症例からえられた血清などを使用し、実験的に示唆された事象が実際の疾患のin vivoでも起こっているか否かを検証し、TNFが治療標的となりうるかを追求していくことが必要であると考えられた。
エクリン汗免疫異常の改善による掌蹠膿疱症の病態制御

掌蹠膿疱症の病態にエクリン汗腺が関与しているという事実を基に、病変部の水疱内容中に病態に関与すると思われる物資の同定を試みた。この結果、病変部水疱内に含有されるhCAP18/LL37がその後に引き続き生じる手掌足底部の炎症性病変の形成に寄与することがqRT-PCRを用いた炎症性サイトカインの発現様式の検討により明らかとなった。このことから本疾患が単なる水疱膿疱形成性病変ではなく、自然免疫系抗菌ペプチドの発現異常が関与する病態であることが明らかとなった。本研究は病変部の表皮内汗管および周囲の角化細胞に対し、掌蹠膿疱症の病態形成に大きく寄与すると見なされている、1喫煙(ニコチン)、2皮膚常在菌叢、3エクリン汗含有成分(hCAP-18/LL37)の変化の3点について検討を行い、これらの物質で掌蹠膿疱症の病態に関与するIL17関連サイトカインなどを誘導しうるか検討を行った後、これら物質により生じる皮膚免疫系の異常を治療候補物質にて抑制あるいは改善しうるかという点を検証することを目的している。初年度の目標として正常手掌部・非手掌部から角化細胞を用いた3次元培養表皮(LSE)及びエクリン汗培養細胞(NCL-SG3)を用いて、掌蹠膿疱症患者病変部水疱内容を反応させ、健常人汗による反応性との比較を行い水疱内容物に本疾患の病態に寄与する物質が存在するかという点を検証した。本研究は病変部の表皮内汗管および周囲の角化細胞に対し、掌蹠膿疱症の病態形成に大きく寄与すると見なされている、1喫煙(ニコチン)、2皮膚常在菌叢、3エクリン汗含有成分(hCAP-18/LL37)の変化の3点について検討を行い、これらの物質で掌蹠膿疱症の病態に関与するIL17関連サイトカインなどを誘導しうるか検討を行う。これら物質により生じる皮膚免疫系の異常が確認された場合、治療候補物質による改善の試みを行う。水疱後に引き続いて生じる掌蹠膿疱症の炎症誘因として、水疱内LL37濃度の上昇が強く示唆された。そのため、水疱内容に含有されるhCAP18/LL37の蛋白量をdot blotting /densitometryにより検討し、おおむね3μMと確認をした。この濃度を用いてLL37が表皮ケラチノサイトに実際に炎症性変化を引き起こすことが可能かどうかを検討した。二次元単層培養系ケラチノサイトにLL37合成ペプチドを添加し、経時的にIL-17, IL-8, IL-1α, IL-1βmRNA及びタンパクレベルをqRT-PCR及びELISAにて検討し、upregulationが生じることを確認した。LSEに対して、ニコチン抽出液及びS.aureus及びS. epidermidis(heat inactivated bacteria component)を添加し、同様に炎症性サイトカインの動態を観察した。qRT-PCRにて明らかなupregulationが確認できなかったことから、表皮角化細胞に対するこれら物質の直接的病態への関与の可能性が低いことが示唆された。しかしながら、既報論文では二次元単層培養系において炎症性サイトカインが誘導されているという報告があり、二次元単層培養系とLSEの最大の相違点であるところの角層バリアの影響が考慮される。従って、この角層バリアが障害を受けている場合に関与がある可能性について、さらに追加実験を行い、検証をする必要が生じた。正常手掌部・非手掌部から角化細胞を用いた3次元培養表皮(LSE)及びエクリン汗培養細胞(NCL-SG3)を用いて、掌蹠膿疱症患者病変部水疱内容を反応させ、健常人汗による反応性との比較を行い水疱内容物に本疾患の病態に寄与する物質が存在するかという点を検証し、有力な原因物質(の一つ)を同定した。皮膚科学掌蹠膿疱症の増悪物質と見なされる他の候補物質として、1喫煙(ニコチン)による作用を同様に継続検討する。水疱内LL37とその濃度が確認されたことから、LL37による二次的な炎症誘導を抑制する物質を検討する。当座の目標であった正常手掌部・非手掌部からの角化細胞を用いた3次元培養表皮(LSE)の構築には成功したものの、細胞分化増殖および角化マーカーについて発現の差異を認めることができなかった。しかしながら基本的には手部からの正常細胞の採取を行いprimary cultureを行いLSEを作成、掌蹠膿疱症患者病変部水疱内容および健常人汗による刺激を行い、角化細胞の反応性においてその差異を認めるにいたった。

掌蹠膿疱症の増悪物質と見なされる2S.aureus及びS.epidermidis、および3膿疱内好中球に見られたhCAP-18/LL37異常フラグメントの一部の作用に関する検討は終了しているが、を作用させ、患者水疱内容および血清を作用させたときのプロファイルと比較・検討を行うが、1喫煙(ニコチン)および3異常フラグメントの検討が完了していない。本年度は、掌蹠膿疱症の増悪物質と見なされる1喫煙(ニコチン)、2S.aureus及びS.epidermidis、3水疱内に確認されたhCAP-18/LL-37などを作用させ、患者水疱内容物をLSEに作用させた際のプロファイルとの比較・検討を行う。明らかな原因物質の同定を並行して行い、候補物質が見つかった時点で、正常角化培養細胞およびエクリン汗管細胞を用いてその作用を機序を検討する。継続検討に対する予算として計上し、引き続き検討を継続する。当座の目標であった正常手掌部・非手掌部からの角化細胞を用いた3次元培養表皮(LSE)の構築には成功したものの、細胞分化増殖および角化マーカーについて発現の差異を認めることができなかったため用意するLSEの種類が予想より少なくなったことに大きく起因する。掌蹠膿疱症の増悪物質と見なされる1喫煙(ニコチン)、2S.aureus及びS.epidermidis、3膿疱内好中球に見られたhCAP-18/LL37異常フラグメントを作用させ、患者水疱内容および血清を作用させたときのプロファイルと比較・検討を行うが、3のフラグメントが複数となったため、この合成ペプチド作成費用などにあてるものとする。
校内の植物を用いた植物性油脂の教材化とその試行

本研究は,高等学校化学の内容に対応した実験教材として,生徒に馴染みが深いと考えられる学校内に植栽されている植物から油脂を抽出し,抽出した油脂のケン化価やヨウ素価を調べることでおおよその構造を推定する教材の開発を目指したものである。搾油のために利用したのは,ナンキンハゼの実の皮(烏臼油)と,オリーブの実(オリーブオイル)である。どちらも粉砕した試料から,ヘキサンを用いた溶剤抽出法により油脂を抽出し,収率を求めた。また,得られた油脂については,水酸化カリウムを用いたケン化価測定と,シクロヘキサン-ウィイス法を用いたヨウ素価測定を行い,分子量や分子構造の推定を行い,文献値と比較した。その結果,高等学校化学で扱える範囲の実験でも,妥当性の高い実験結果が得られることが明らかになった。開発した教材の有効性については,科学系のクラブに所属する生徒を対象に試行を行った。生徒実験に時間がかかること,生徒の学年によって内容に対する理解度と実験技能に大きな差が出ること,などの課題は残ったが,実験結果は予備実験と同様に良好であり,教材の実施により生徒の興味・関心や科学の利用に対する理解の向上が確認された。教材の難易度については,中学生にはやや難しく,化学基礎を履修した高校生であれば概ね問題ないレベルであった。なお,この研究の成果の一部は,平成28年度日本理科教育学会近畿支部大会(於:大阪教育大学)で発表したほか,広島大学附属福山中・高等学校中等教育研究紀要に掲載された。
有機硫黄化学の基礎および応用的研究

本研究は,1996年に日本において開催の予定されている第17回有機硫黄化学国際シンポジウムを最大限実りのあるものとするため,国内の当該分野における多方面の研究者を組織し,研究内容の面からの企画を行うことを目的として行われた。有機硫黄化学国際シンポジウムは,1964年にその第1回が開催され,有機硫黄化学の分野の唯一の国際会議として,その分野の発表に大きな貢献をしてきた。第15回シンポジウムはフランスのカーンで1992年に開かれ,第16回シンポジウムは1994年7月ドイツのメルゼブルクで開かれた。本総合研究は,第16回シンポジウム終了後直ちに日本での開催に向けて,以下のような企画調査を行った。有機硫黄化学の研究範囲は近年とみに急速な拡大を見せ基礎的側面から,材料への応用,工業的応用,医薬・農薬への応用などに到るまで広範囲に及ぶ。そこで,まず基礎,応用それぞれの分野での研究者が研究連絡会を行い,それぞれに現状を整理し,将来への発展の糸口を探った。その後基礎,応用分野における研究連絡会での討論を基に,両分野の研究者が集合し,全体研究連絡会議を行い,国際会議開催のかめのテーマ選択を行った。また,有機硫黄・リン化合物討論会が発展して作られたヘテロ原子化学討論会で,研究班員が発表を行い,情報を交換した。さらに3回の幹事会も行った。
量子アニーリングの基礎理論

シミュレーテッドアニーリングは、組み合わせ最適化問題における近似解法として広く普及している。シミュレーテッドアニーリングにおいては温度を適切に制御することにより状態を徐々に最適な方向に持っていく。本研究においては、状態間の繊維のメカニズムとして、温度の変わりに量子揺らぎを用いてより高速な最適解の探索の方法を確立し、巡回セールスマン問題に応用した。さらに、その成果を使って量子揺らぎによる画像処理技法の最適化にも新しい視点を導入した。横磁場のあるイジング模型の基底状態における系の様々な性質は、横磁場のない有限温度の性質に類似した側面を持っている。そこで、平衡系の性質のみならずシミュレーテッドアニーリングのような動的な課題に対しても、横磁場が温度と同等以上の役割を果たすと期待することができる。実際、横磁場を時間の関数として変化させたイジング模型の基底状態を時間依存シュレディンガー方程式の数値解や量子モンテカルロ法で計算したところ、相互作用の形態に依存せずに常に横磁場による量子揺らぎを利用した量子アニーリングの方が温度揺らぎを利用した従来の方法より正しい基底状態に確実に到達することが明らかになった。この成果を、典型的な最適化問題である巡回セールスマン問題と、確率的なプロセスを用いた画像修復に適用し、良好な結果を得た。特に後者では、温度制御と量子効果の導入を適切に組み合わせることによりハイパーパラメータの推定誤差に対して安定な修復が可能となることが示された。量子効果を利用して、スピングラスやニューラルネットワークのような多数のエネルギー極小を持つシステムの最低エネルギーを求める方法の開発をした。エネルギーの値の違う極小の間の遷移のメカニズムとして従来のような古典的な熱励起に代えて量子力学的な状態遷移を採用し、これによって最低エネルギー状態に到達する速度が高速化される可能性について検討した。シュレディンガー方程式の数値解によって、このアイディアの現実的な有効性を確認した。エネルギー空間が極めて複雑な構造を持つシステムの低エネルギー状態の探索(アニーリング)に量子効果による遷移過程を用いる研究を開始した。すなわち、従来のアニーリングで用いられた熱励起による状態遷移を記述するマスター方程式に代えて、状態間の遷移の行列要素を含むシュレディンガー方程式を採用した。この、シュレディンガー方程式の遷移項を時間変化させることが、マスター方程式による熱励起でのアニーリングの温度制御に対応するものとみなし、遷移項の変化による基底状態の探索を、温度制御による通常のシミュレーテッドアニーリングと比較した。数値的な計算の結果、遷移項、(すなわち量子効果)によるほうが、あらゆる条件下でより確実に基底状態に到達することが明らかにされた。組み合わせ最適化問題に対する近似解法として、シミュレーテッドアニーリングが知られている。適切な温度制御により徐々に最適な状態を絞り込んで探索する手法であり、実用的な局面において大きな成果を上げている。本研究では、状態間の探索のメカニズムとして、温度の代わりに量子ゆらぎを用いてより高速な最適解の探索の可能性を確立し、巡回セールスマン問題に応用した。横磁場のはいったイジング模型の基底状態における系の様々な性質は、横磁場のない有限温度の性質に類似する側面を持っている。そこで、平衡系の性質のみならずシミュレーテッドアニーリングのような動的な問題に対しても、横磁場が温度と同等以上の役割を果たすと期待することは自然である。実際、横磁場を時間の関数として変化させたイジング模型の基底状態を時間依存シュレディンガー方程式の直接的な数値解や量子モンテカルロ法で計算したところ、相互作用の形態によらずどの場合でも横磁場を利用した量子アニーリングの方が正しい基底状態により確実に到達することが明らかになった。この成果を、組み合わせ最適化問題の典型例である巡回セールスマン問題に適用した。様々な都市の配置につき数値計算を行ったところ、いずれの場合にも量子アニーリングの方がより確実に最短経路の探索に成功することが分かった。

本研究においては、状態間の繊維のメカニズムとして、温度の変わりに量子揺らぎを用いてより高速な最適解の探索の方法を確立し、巡回セールスマン問題に応用した。さらに、その成果を使って量子揺らぎによる画像処理技法の最適化にも新しい視点を導入した。横磁場のあるイジング模型の基底状態における系の様々な性質は、横磁場のない有限温度の性質に類似した側面を持っている。そこで、平衡系の性質のみならずシミュレーテッドアニーリングのような動的な課題に対しても、横磁場が温度と同等以上の役割を果たすと期待することができる。実際、横磁場を時間の関数として変化させたイジング模型の基底状態を時間依存シュレディンガー方程式の数値解や量子モンテカルロ法で計算したところ、相互作用の形態に依存せずに常に横磁場による量子揺らぎを利用した量子アニーリングの方が温度揺らぎを利用した従来の方法より正しい基底状態に確実に到達することが明らかになった。この成果を、典型的な最適化問題である巡回セールスマン問題と、確率的なプロセスを用いた画像修復に適用し、良好な結果を得た。特に後者では、温度制御と量子効果の導入を適切に組み合わせることによりハイパーパラメータの推定誤差に対して安定な修復が可能となることが示された。
数値地理情報と衛星リモートセンシングデータを用いた日立市の森林環境の把握

本年度の研究成果は、以下の2項目に大別される。(1)現地調査における植生活力図の有意性の検証(2)多年度間にわたる植生変遷の把握前述の現地検証結果を基にして、複数年度間の植生指標値の変動を画像化した。研究では、経年動向表示画像と定義した。この結果、日立市西部の山林において経年的に植生活力が低下している地域が発見された。経年動向表示画像と現存植生図との照合の結果、ブナやコナラ等の原生林分布地域であることが判った。遠隔計測による本結果を裏付けるため、管内営林署に電話にてヒヤリング調査を行ったが、結果を断定できる情報を得ることは出来なかった。裏付けについては今後の課題とするが、原生林の活力低下は日本全国での報告例があり、興味深い知見と考える。具体的に6つの小目的を設定して研究を展開した。以下、目的毎に研究成果を列挙する。(1)情報項目の定義と情報の収集・整理:本目的に関しては、1990年1994年および最新データとして1997年の衛星データの整備、日立市周辺領域の数値地形モデルの加工・編集さらに参考文献を十数編入手した。このデータと情報を使用して、以下の解析作業を展開した。(2)衛星データを用いた土地被覆分類図および植生指標図の作成:一般的な衛星データの分類方法である教師付き最尤法を用いて、大火災の発生した1991年のデータより土地被覆分類図を作成した。さらに、正規化植生指標に加えて、文献調査で情報を入手したK値植生指標およびTasseled Cap変換のGreennessの2つの植生指標図を衛星データより作成した。K値植生指標を計算する際に定義する非植生ライン(ソイルラインと呼ぶ)の計算に際して必要となる湿潤乾燥した裸地の選定問題に関する検討および可視-近赤外散布図と土地被覆との対応問題について後述した発表論文で議論した。さらに、植生域評価という同一解析目的に対する指標間の評価結果の違いについて発表論文で議論を展開した。(3)数値地形モデルを用いた各種地形情報の作成:本項目については、標高区分、起伏、開析、傾斜、等高線、水系、谷密度および日陰各図の作成を進めた。(5)データセットの整備:以上の解析基礎データを、日立市を6等分したエリア毎にデータサイズを統一させ、データセット化した。HTMLを用いてホームページにて展開する準備も終了した。現状の研究では、セット化したデータを対象として、植生指標と地形情報の相関関係の分析を進め、市街化区域に高い反応を示す開析度図以外の地形情報は植生活力と相関が高いことを確認した。危険域の評価問題と森林の枯死原因の分類には現地調査の必要性が強く認識されたため、来年度の課題とし、必要とする計測機器の購入作業を進めた。
先天性ケトン体代謝,脂肪酸β酸化系異常症の酸素診断と分子病態解析

本年度先天性ケトン体代謝異常症のβ-ケトチオラーゼ欠損症(T2欠損症),サクシニル-CoA:3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ(SCOT)欠損症,細胞質チオラーゼ(CT)欠損症および脂肪酸β酸化系異常症の極長鎖アシル-CoA脱水素酵素欠損症について酵素診断,病態解析を行った.先天性ケトン体代謝異常症の患者スクリーニング:3疾患について,乳児期より重篤なケトーシス発作が繰り返す症例について,活性測定,蛋白解析を行ったが,オランダの症例がT2欠損症であると診断できたが,他の所を例では3疾患は否定された.SCOT欠損症の解析:SCOTcDNAのクローニング,染色体座位を決定し,また1例の遺伝子変異を同定してAm J Hum Genetに発表した.またcDNAを大腸菌で発現させ,精製して抗体を作成し,線維芽細胞やリンパ球を用いたイムノプロットを行い,診断に有用であることを明らかにし,Biochim Biophys Actaに発表した.現在SCOT遺伝子をクローニング中である.日本およびオランダの症例の遺伝子解析も現在進行中である.T2欠損症の解析:現在までに当教室で27例が本症と診断され,蛋白質遺伝子解析をおこなっている.本年度も解析が進み,25例で遺伝子変異を同定できた(うち5例は1方の変異のみ).これまでに解析してきた27例について追跡調査用紙を作成し,発送するところである.これをもとに遺伝子解析の結果と検討し遺伝子型/表現型の関係を明らかにする予定である.CT欠損症の解析:現在確立した方法は,免疫沈降を利用したものであるが,細胞分画法を採り入れ,さらに簡便な方法を確立した(投稿中).またT2,CT,SCOTがどの臓器,組織で発現しているかについてイムノプロット,ノーザンプロットを行い,ヒトにおける酵素の臓器分布を明らかにした(投稿中).VLCAD欠損症の解析:VLCAD欠損症と診断した3症例の遺伝子変異を同定した(論文作成中).本年度先天性ケトン体代謝異常症のβ-ケトチオラーゼ欠損症(T2欠損症),サクシニル-CoA:3-ケト酸CoAトランスフェラーゼ(SCOT)欠損症,細胞質チオラーゼ(CT)欠損症および脂肪酸β酸化系異常症の極長鎖アシル-CoA脱水素酵素欠損症について酵素診断,病態解析を行った.先天性ケトン体代謝異常症の患者スクリーニング:3疾患について,乳児期より重篤なケトーシス発作が繰り返す症例について,活性測定,蛋白解析を行ったが,オランダの症例がT2欠損症であると診断できたが,他の所を例では3疾患は否定された.SCOT欠損症の解析:SCOTcDNAのクローニング,染色体座位を決定し,また1例の遺伝子変異を同定してAm J Hum Genetに発表した.またcDNAを大腸菌で発現させ,精製して抗体を作成し,線維芽細胞やリンパ球を用いたイムノプロットを行い,診断に有用であることを明らかにし,Biochim Biophys Actaに発表した.現在SCOT遺伝子をクローニング中である.日本およびオランダの症例の遺伝子解析も現在進行中である.T2欠損症の解析:現在までに当教室で27例が本症と診断され,蛋白質遺伝子解析をおこなっている.本年度も解析が進み,25例で遺伝子変異を同定できた(うち5例は1方の変異のみ).これまでに解析してきた27例について追跡調査用紙を作成し,発送するところである.これをもとに遺伝子解析の結果と検討し遺伝子型/表現型の関係を明らかにする予定である.CT欠損症の解析:現在確立した方法は,免疫沈降を利用したものであるが,細胞分画法を採り入れ,さらに簡便な方法を確立した(投稿中).またT2,CT,SCOTがどの臓器,組織で発現しているかについてイムノプロット,ノーザンプロットを行い,ヒトにおける酵素の臓器分布を明らかにした(投稿中).VLCAD欠損症の解析:VLCAD欠損症と診断した3症例の遺伝子変異を同定した(論文作成中).
肝癌の生長を数式化するための基礎的検討 -細胞増殖とアポトーシスの面から-

肝癌の生長を数式化するため、ヌードマウスに移植したヒト培養肝癌細胞株(PLC/PRF/5)の生長について検討した。すなわち、移植腫瘍が対数増殖をとることを確認し腫瘍体積倍加時間(DT)を算出したうえで、マウスを経時的に屠殺し腫瘍を切除した。屠殺前に3時間の感覚をあけてbromodeoxyuridine (BrdU)とiododeoxyuridine (IdU)を腹腔内投与し、S期細胞を二重標識した。得られた組織よりパラフィン切片を作成しHE染色、Ki-67免疫染色、BrdU-IdU二重免疫染色を行った。こうしてHE染色上でのアポトーシスの頻度(A)、Ki-67陽性率(B)、BrdU単独標識率(C)、を算定した。またコンピュータ解析により、アポトーシスで生じる平均縮小率(f)も算出した。ここでBの頻度の増殖期細胞が細胞周期時間(Tc)だけかかって細胞周期をまわり、Cの頻度のS期細胞は3時間の間にG_2期に入るので、B/Tc=C/3(式1)と書ける。一方、細胞がアポトーシスに要する時間をTaとすると、組織レベルでは、単位時間あたりB/Tc-f・A/Taの率で腫瘍が生長していくと思われるのでDT=ln2/B/Tc-f・A/Ta(式2)とおける。これに式1を代入するとTaが求められる。20腫瘍を検討した結果、A=0.0110.023、B=0.4000.551、C=0.0250.047、f=0.6000.628、DT=4.47.6×24であった。そこで式1よりTc=50.467.2、これを式2に代入してTa=2.83.2時間と見積もれた。以上より、DT≒ln2/B/Tc-f・A/3と近似しうると結論された。現在、PLC/PRF/5以外の肝癌細胞株についても検討中である。このような数式化によって、より詳細に肝癌の生長過程を評価できるものと期待され、臨床症例にも応用していきたい。
腎細胞癌の実験モデル、特に転移モデルの確立と腎細胞癌における転移機序に関する研究

Streptozotocin化学発癌で得られた腎腺癌を静脈内あるいは脾内注射することでそれぞれ高肺転移株あるいは高肝転移株を選別できた。これらの株の特性を検討するとin vitro浸潤能は肺あるいは肺の高転移株程高く、in vitro浸潤能とin vivo転移能とが比例する結果となっていた。このように実験的に選別した高転移株の性状をさらに検索したところ、肺高転移株では皮下移植した際に形成される自然発生による肺転移結節数が原腫瘍よりも多く、通常の自然発生肺転移株と共通した性格を持っていることがわかった。さらに、高転移株の転移臓器親和性をみたところ肺転移株は原腫瘍あるいは肝転移株より肺転移の頻度が高く、肺転移株が臓器親和性を有する結果が得られた。マウス腎腺癌での結果を踏まえたヒト腎細胞のin vitro浸潤能を検討したが、同一症例の転移巣から得られた転移巣由来株は原発単由来株よりもin vitro浸潤能が高かった。したがって、マウス腎腺癌での結果はヒトでも当てはまる可能性が示唆された。このin vitro浸潤能の機序を検討してみると、in vitro浸潤能の程度が細胞外基質であるtypeIV collagenを分解する能力と良く相関した。したがって、in vitro浸潤能は癌細胞のtype IV collagen分解能、さらにはmetalloproteinaseの分泌と関連していると考えられた。ヒト腎細胞癌の培養株は全体としては、EGFによりその浸潤が促進され、逆にTGFーβ_1により抑制された。これらの結果はtypeIV collagen分解能の程度ときわめてよく合致した。このことから、EGFあるいはTGFーβ_1のin vitro浸潤能への影響はそれらの成長因子のtype IV collagen分解能に対する作用により発揮されると思われた。この結果は、これらの成長因子がin vivoにおいても同様な作用を示す可能性を意味している。サイトカインはあるいはLAK療法による肺転移抑制効果を検討したが、IFNーγ、ILー2およびLAK療法に転移抑制効果のあることがわかった。A)ヒト腎細胞癌にIn vivo(ヌ-ドマウス)可継代株を3株、およびin vitro可継代株を4株を樹立した。これらの株はいづれもヒト腎細胞癌と全く同様の病理組織学所見を有しており、in vitro可継代株のうち1株は肺転移を、他の1株は肺転移を示す傾向が認められた。B)マスル腎細胞癌:Streptozotocin(STZ)による化学発癌でマウス腎細胞癌が得られた。この腎細胞癌は、電顕および光顕上尿細管上皮由来の上皮性悪性腫瘍であり、ヒト腎細胞癌の顆粒細胞型腎細胞癌と類似の特徴を有することが判明した。さらにSTZによる腎細胞癌の発癌過程は、尿細管上皮の空胞様変性した組織内腔の過形成、腺腫様過形成、癌という一連の変化があり、ヒト腎細胞癌の発生過程を検索する上でも極めて有用な実験系であると思われた。この株は可継代株(STZ-RCC)として樹立でき安定した継代が可能であることも判明したこのSTZ-RCCをin vitroでも継代可能株とすることもできた。II.マウス腎細胞癌の転移モデル転移の最初のstepであるinvasionを定量的に評価する“invasionassay"を確立し、上述したヒト腎細胞癌株4株を用いてのinvasive potentialを検討した。