hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クルクミンの子宮体癌細胞に及ぼす抗腫瘍活性とその分子作用機序の解明

天然癌抑制物質の一種とされているカレー成分内のターメリック含有のクルクミン(Curcumin)に着目し、子宮体癌を対象に細胞株の1種類であるIshikawa細胞株を用い、研究を行なった。子宮体癌患者は年々増加傾向で、当院においてもこの10年間に約2倍の増加傾向を示している。子宮体癌は食生活に密接に関係し、肥満患者の頻度が高いことは良く知られている。しかしながら子宮体癌の予防医学においては皆無であり、そこで申請者は前立腺癌でもアンドロゲンレセプターに作用、形質転換能、抗腫瘍効果抑制を得ることが可能なクルクミンを用い、ホルモンレセプターの核内リガンド結合を介する子宮体癌をin vivoの実験も加え、研究を行なった。しかしながら子宮体癌ではクルクミン投与にも関わらず、エストロゲンレセプターを介さず、転写因子のEstrogen Response Element(ERE)のみ抑制を認めた。一方、分子作用因子として作用に影響されるとされるActivator Protein-1(AP-1)は、クルクミンに投与により蛋白量、転写因子ともに抑制され、共役転写抑制因子であるcAMP response element-binding protein(CREB)-binding protein(CBP)においても強く関与を示していた。そのことにより、クルクミン投与による子宮体癌はAP-1、CBP、EREを介し、in vitroでの形質転換能は約90%、クルクミン摂取でのin vivoの腫瘍抑制能においても約75%抑制効果を認められた。本研究でクルクミンは子宮体癌においても有効な天然癌抑制物質であり、経口により容易に抗腫瘍効果を得ることから、今後治療に貢献できることだけでなく、予防的なサップリメントとしても効果があることを示唆した。現在投稿中である。申請者は天然癌抑制物質の一種とされているカレー成分内のターメリック含有のクルクミン(Curcumin)に着目し、子宮体癌細胞株の1種類であるIshikawa細胞株を用い、研究を行っている。子宮体癌患者は年々増加傾向を示し、当院においてもこの10年間に約2倍の増加傾向があった。子宮体癌は疫学的に食生活が密接に関係しており、肥満患者の頻度が非常に高いことは良く知られている。しかしながら子宮体癌の予防医学においては皆無のため、そこで申請者は以前、前立腺癌で検討を行なったクルクミンを用い、メカニズム、増殖能、形質転換能のみならず、in vivoの実験も加え、研究を行なった。子宮体癌においては、Estrogen Response Element(ERE)の抑制を認めたほか、分子転写作用因子でのActivator Protein-1(AP-1)の抑制も認めた。また上記の2つの転写機構とのcross linkが存在する共役転写抑制因子cAMPresponseelement-binding protein(CREB)-binding protein(CBP)も抑制されていることから、この3種類の因子がbingingされ、in vitroでの形質転換能は約90%、クルクミン摂取でのin vivo腫瘍抑制能では約75%抑制効果を起こったことが推測された。本研究でクルクミンは子宮体癌においても有効な天然癌抑制物質であり、ERE、AP-1、CBPを介し、in vitroの形質転換能だけでなく、in vivoにおいての腫瘍抑制能も可能であった。また容易に経口摂取での抗腫瘍効果を得ることから、治療等に貢献するだけでなく、予防的なサップリメントとしても効果が期待できる。現在、申請者は投稿に向け、主筆中である。現在投稿中である。
我が国の「新薬市場独占期間」の妥当性に関する多面的検討

本研究は、我が国の医薬品産業において、新薬開発のインセンティブを失わずに、ジェネリック・バイオシミラー市場を拡大していくための、新たな制度設計に資するためのものである。本年度は、当初の計画通り、新薬市場独占期間に関するデータベースの構築を行う傍ら、ジェネリック・バイオシミラー製品の市場参入時期を複雑化・細分化させる制度の変遷を整理した上で、2001年以降に行われたジェネリック・バイオシミラー製品に関する特許権侵害訴訟(新薬25品目)について、動向調査・分析を行った。調査分析の結果、2001年以降、訴訟件数自体は低水準(年3件以下)で推移しているが、この10年の市場環境の変化や関連制度の変更により、ジェネリック・バイオシミラー企業にとって、市場参入時期の判断はより難しくなっていることが示唆された。そして、それらに起因して、特許権侵害訴訟における新たな争点や判断が、確実に増加していることが明らかとなった。特に、損害賠償額の算定方法が示されたオキサロール軟膏(マキサカルシトール)、延長された特許権の効力範囲について新たな考え方が示されたエルプラット(オキサリプラチン)、バイオ後続品に対するレジュメン特許の特許権侵害が問題となったハーセプチン(トラスツズマブ)の事例は、今後への影響が大きいと考えられ、ジェネリック・バイオシミラー市場へ与えるインパクトについて、諸外国の動向を踏まえ、注視していく必要があると考えられる。本年度は、当初の計画通り、新薬市場独占期間に関するデータベースの構築を行う傍ら、ジェネリック・バイオシミラー製品の市場参入時期に着目し、その時期を複雑化・細分化させる制度の変遷を整理した上で、2001年以降に行われたジェネリック・バイオシミラー製品に関する特許権侵害訴訟(新薬25品目)について、動向調査・分析を行い、その結果について、学会講演および講演録(和文)、論文(査読付き英文)として発表したため。引き続き、新薬市場独占期間に関するデータ収集を行うとともに、2018年度に調査分析した特許権侵害訴訟の動向に関して、低分子医薬品とバイオ医薬品を区別して、諸外国との比較を行うなど、研究を推進していく予定である。次年度使用額のうち大半は物品費によるものであり、これは、医薬品関連データに関し、販売データの購入が、予算30万円に対し、実際は9万円程度にとどまったためである。次年度以降には、さらにデータ収集を行うために、販売データの購入を検討する予定である。
小児B細胞性腫瘍におけるラフトを介するアポトーシス誘導シグナル回路の解析

正常B前駆細胞のラフトを介するアポトーシス誘導シグナル回路解析に応用する目的で、骨髄間質細胞株との共培養によって骨髄CD34陽性細胞からより効率的にpro-B細胞を分化・増殖する誘導系について検討した結果、この培養系でのpro-B細胞の分化・増殖に対してIL-7やInsulin-like growthfactor-1が必須であること、IGF-binding protein-3が抑制的に、同-6が促進的に作用することが明らかとなった。また、誘導されたpro-B細胞に対してCD24に対する特異抗体を添加してラストを架橋刺激することによってアポトーシスが誘導されることを確認した。一方、pre-B細胞株HPB-NULL細胞を用いてCD24の架橋刺激、あるいはpre-BCRの架橋刺激後の遺伝子発現変化を網羅的に解析することによって、それぞれの刺激によって同細胞に活性化される細胞内シグナル伝達回路の解析を試みたところ、CD24の架橋によって特異的に発現上昇する遺伝子としてCD24架橋後に発現上昇し、アポトーシスに直接関与する分子として、Caspase-10、CADが明らかとなった。さらに興味深いことに、Caspase-3のmRNAの転写を活性化することが明らかにされているHypoxia inducible factor 3や、神経細胞でアポトーシス誘導を起こすHuntingtin interacting protein 1などの分子も遺伝子発現が上昇することが明らかとなった。これらの因子は、CD24誘導性アポトーシスの中心的な役割を担うと考えられる。またこの他にも、様々な転写因子や、刺激伝達分子、酵素等がスクリーニングされてさらに詳細なパスウェイ解析により、小児B細胞性腫瘍におけるラフトを介するアポトーシス誘導シグナル回路解明に結びつくことが期待される。正常B前駆細胞からラフト成分を抽出して解析するための、sourceとして活用する目的で、種々の骨髄間質細胞株上で骨髄CD34陽性細胞からpro-B細胞を分化誘導、増殖する培養系を構築した。誘導されたpro-B細胞に、同細胞に発現するGPI結合蛋白であるCD24に対する特異抗体を添加し、ラフトを架橋刺激することによってアポトーシスが誘導されることを確認した。また、より効率的に正常B前駆細胞を誘導する条件について検討を行った。この結果、Insulin-like growthfactor(IGF)およびInsulin-like growthfactor-binding Protein(IGFBP)がpro-B細胞の誘導に重要な役割を担っていることを明らかになった。IGF-1はpro-B細胞の分化・増殖に必須であり、IGFBP-3とIGFBP-6は、pro-B細胞の分化・増殖をそれぞれ抑制、あるいは促進することが明らかとなった。一方、B前駆細胞株から抽出したラフト成分を免疫原とした単クローン抗体作成を開始し、細胞表面および細胞質内の蛋白を認識する抗体を複数樹立し、その正常解析を行った。また、B前駆細胞株のラフトを刺激し、その前後の遺伝子発現をMicro Arrayを用いて網羅的に解析した。さらに、バイオフラボノイドが多数のB前駆細胞性白血病細胞株に対してアポトーシスを誘導することを明らかにし、その分子機構について解析した結果、このアポトーシス誘導の過程でミトコンドリアの膜の障害に起因したカスパーゼの活性化が関与していることを明らかにした。正常B前駆細胞のラフトを介するアポトーシス誘導シグナル回路解析に応用する目的で、骨髄間質細胞株との共培養によって骨髄CD34陽性細胞からより効率的にpro-B細胞を分化、増殖する誘導系について検討した。抗IL-7抗体、抗IL-7受容体抗体、JAK-3キナーゼ抑制剤、等を添加してIL-7の機能を中和するとpro-B細胞の誘導効率が著しく低下したことから、この培養系においてpro-B細胞の分化、増殖に、IL-7が関わっていることが明らかとなった。しかし、IL-7を添加した場合にはCD19の抗原発現を即す作用を認めたものの、pro-B細胞の誘導効率に影響はなかった。

一方、pre-B細胞株HPB-NULL細胞を用いてCD24の架橋刺激、あるいはpre-BCRの架橋刺激後の遺伝子発現変化を網羅的に解析することによって、それぞれの刺激によって同細胞に活性化される細胞内シグナル伝達回路の解析を試みたところ、CD24の架橋によって特異的に発現上昇する遺伝子としてCD24架橋後に発現上昇し、アポトーシスに直接関与する分子として、Caspase-10、CADが明らかとなった。さらに興味深いことに、Caspase-3のmRNAの転写を活性化することが明らかにされているHypoxia inducible factor 3や、神経細胞でアポトーシス誘導を起こすHuntingtin interacting proteinlなどの分子も遺伝子発現が上昇することが明らかとなった。これらの因子は、CD24誘導性アポトーシスの中心的な役割を担うと考えられる。またこの他にも、様々な転写因子や、刺激伝達分子、酵素等がスクリーニングされてさらに詳細なパスウェイ解析により、小児B細胞性腫瘍におけるラフトを介するアポトーシス誘導シグナル回路解明に結びつくことが期待される。
神仏共存世界における人間の「現存」に関する倫理学的研究―『愚管抄』を中心に―

『愚管抄』の読解に関しては、写本を蒐集した上で、4種類の活字本での本文校合、及び現行の現代語訳の問題点の指摘とその箇所の試訳を分担して行い、思想内容も含めて議論した。その成果の一部は、リポジトリにて公開した。そして、上記の『愚管抄』の読解及び「道理」の分類などによって、『愚管抄』に描かれた神仏共存世界の構造と人間の「現存」との関係の一端を明らかにした。また史料読解と実地調査によって、慈円の生き方と知の様態を考察した。個別研究では、中世のみならず、近世や古代も含めた様々な神仏関係思想と人間の「現存」の関係の解明に取り組み、研究会で報告して議論を行い、いくつかの成果を公表した。共同研究:『愚管抄』文献読解に関しては、いくつかの写本を入手し、島原本との校合を始めた。また、岩波古典文学大系の本文、頭注、および大隅和雄の訳(講談社学術文庫版)について、研究分担者柏木・吉田・栗原、研究代表者上原で分担し、細かいチェックを始めた(ルビ、段落、句読点、訳・頭注の問題点など)。統一した形式に則ってレジュメを作成している。現地調査に関しては、8月末に、慈円の修行地である滋賀県大津市の葛川明王院、および京都府東山区の青蓮院を調査した。研究会は2回開催した。8月の現地調査の際に、京都宿泊施設において、調査地についての文献資料を読解した。3月末の神奈川大学での研究会においては、研究分担者柏木の報告(『今昔物語集』天竺部)を検討し、また、連携研究者佐藤正英『日本の思想とは何か』(筑摩書房)の「第1部現存の根本構造」について、特に〈もの〉・〈たま〉概念を中心として綿密な検討を行った。個別分担研究:研究代表者・上原は、神仏共存世界の空間的構造の解明のために、神信仰の景観から神仏習合的な景観への変遷について、特に山岳の意味に着目して考察した。研究分担者・柏木は、仏観念にかかわる研究を進め、とくに、生身の釈迦仏とは何か、仏の知が人間の現存の意味を解き明かすとはどういうことか、という問いが展開されたテクストとして『今昔物語集』天竺部を読解し、研究会で報告した。研究分担者・吉田は、物語化する死者という観点から、武士道書『葉隠』の読解作業を進め、また柳田國男『先祖の話』についての考察をまとめた。さらに、近代儒教の捉え方についても概観することにより、『愚管抄』の物語性について考察するための方法論的な足場を固めた。研究分担者・栗原は、近代以降の『愚管抄』研究を整理すべく文献を収集すると同時に、慈円の時間観・歴史観と中国由来の儒教教説との関係をめぐる分析作業に着手した。『愚管抄』文献読解に関しては、岩波古典文学大系の本文、頭注、および大隅和雄の訳(講談社学術文庫版)について、上原と柏木が部分的に細かいチェックを行い、ルビ、段落、句読点、訳、頭注などの問題点を洗い出した。それを踏まえて、全員で分担し、正確な訳を作成中である。現地調査は、8月末に、慈円の活動拠点であり墓もある善峰寺(京都市西京区)を調査した。また慈円の修行地である江文寺跡(京都市左京区)も調査した。また、慈円が晩年に住み、一時期、大懺法院を移転した東山の安養寺(吉水坊跡、京都市東山区)を調査した。研究会は2回行った。8月は、京都宿泊施設において、『愚管抄』(岩波古典文学大系)本文、及び頭注と大隅訳の問題点について議論し、訳出作業の手順を決めた。3月の神奈川大学での研究会においては、連携研究者佐藤正英の『日本の思想とは何か』(筑摩書房)、及び執筆中の『倫理学概論』をもとに、神・仏それぞれの原理と人間の「現存」について議論を行った。個別研究は、以下の通りである。研究代表者・上原は、『愚管抄』の本文、頭注、訳の検討を行うとともに、訳出作業を進めた。また天台教学における神仏関係の歴史を再検討した。研究分担者・柏木は、上原とともに『愚管抄』本文、頭注、訳の検討を行う一方、仏観念に関する研究を継続し、日本における仏観念の特質解明の準備として、先行仏伝テクストの載録挿話を整理した。研究分担者・吉田は、中近世の説話・物語文献と『愚管抄』とにおける「現存」構造の比較の土台を構築するため、謡曲・説経節・武士道書における「現存」の検討を行い、成果の一部を公刊した。研究分担者・栗原は、『愚管抄』の分担箇所に対する読解と並行して、近世以降の日本思想における人間の「現存」、とくに武士の自意識と、それを根拠づけた儒教的「天」観念をめぐる考察を行った。連携研究者・佐藤は、『倫理学概論』を執筆中である。年2回の研究会と現地調査はほぼ計画通りに実施することが出来た。しかし、『愚管抄』の写本蒐集および読解・現代語訳作業は、やや遅れている。理由の1つは、連絡研究者佐藤正英の著作についての議論に時間が取られていることが挙げられる。しかし、佐藤が執筆中の『倫理学概論』をもとにして、神と仏法それぞれの原理とその共存について、および人間の「現存」の構造についての議論を重ねており、その議論は当初の研究目的にかなった内容である。

それぞれの分担者の個別研究は、各時代の人間の「現存」解明の一翼を担っており、今後の『愚管抄』研究に集約できる内容となっている。現在、『愚管抄』訳出の分担作業を進めている。『愚管抄』巻第三までの読解作業として、岩波古典文学大系など4種類の活字本での本文校合、及び現行の注釈や現代語訳の問題点・試訳を各自が持ち寄り、問題点について議論した。この成果の一部は、3年間の中間報告としてリポジトリにて公開予定である。申請時の目的であった、神・仏・天とそれらの関係思想を人間の現存との関係において倫理学的に考察することに関しては、3年間を通じて研究会で報告と議論を行い、研究を進めることができた。最終年度の個別研究は以下である。研究代表者・上原は、自然観の変遷を軸にした神仏共存世界と人間の現存の構造について考察を進め、その一部を論文として公刊した。また独特の神仏共存思想をもつ一遍の研究も進めた。研究分担者・吉田は、神仏共存思想の深層的要因の一つである霊魂観の考察を行い、論文を一本、単著の改訂版を一冊公刊した。ともに近世以降に仏教を排除しようとして矛盾を抱えた思想家を論じたものである。他に『源氏物語』に見られる神仏共存思想について考察した。研究分担者・柏木は、『今昔物語集』天竺部に即して、「仏」観念について検討した。人々の現存の意味を解き明かす知を具えつつ、自身、現存する生身の人でもある釈迦仏の描写に基づき、院政期における仏、及び人の現存の捉え方について考察した。成果は現在まとめつつある。研究分担者・栗原は、神仏共存世界と人間の現存をめぐる近世以降の思想史的展開に目配りすべく、近松門左衛門の人形浄瑠璃についての論考二本、および儒学・武士道を主題とした自著の文庫版を公刊した。『愚管抄』の神仏共存世界と「現存」の構造、および慈円の生き方・知の様態の解明においては、本文と周辺文献の読解を前提とした議論、及び実地調査の成果もあって研究を進めることができた。特に慈円の修行・儀礼の地などの調査で、神仏共存世界の具体的な景観を目にすることができたのは大きな成果と言える。『愚管抄』の読解に関しては、写本を蒐集した上で、4種類の活字本での本文校合、及び現行の現代語訳の問題点の指摘とその箇所の試訳を分担して行い、思想内容も含めて議論した。その成果の一部は、リポジトリにて公開した。そして、上記の『愚管抄』の読解及び「道理」の分類などによって、『愚管抄』に描かれた神仏共存世界の構造と人間の「現存」との関係の一端を明らかにした。また史料読解と実地調査によって、慈円の生き方と知の様態を考察した。個別研究では、中世のみならず、近世や古代も含めた様々な神仏関係思想と人間の「現存」の関係の解明に取り組み、研究会で報告して議論を行い、いくつかの成果を公表した。年2回の研究会と現地調査はほぼ計画通りに実施することが出来た。しかし、『愚管抄』の写本蒐集および読解については、遅れがちである。理由の一つは、写本の数が多すぎてその選定に時間が取られたことが挙げられる。現在、読解の分担作業(レジュメ作成)を進めている。予定より遅れ気味である『愚管抄』の写本蒐集・校合および読解・現代語訳作業を優先的に進める。研究会は、当初年1回の計画であったが、年2回開催することとし、研究成果の集約のための議論、および公開に向けての作業を進める予定である。倫理学・日本倫理思想史『愚管抄』読解および写本の蒐集の後れを取り戻すべく努力中である。読解に関しては、それぞれの分担箇所についてのレジュメをWEB上で共有出来るシステムを利用し、作業の促進を図る。今年度8月の調査旅行(京都・比叡山)、3月の神奈川大学での研究会は予定通り実施する。
奥行き方向における距離判断に関する行動学的推定

本研究は,生態学的な視点から,奥行き方向の距離の知覚と身体の移動による距離の行動学的推定との関連性を明らかにしようとするものである。距離がどのように知覚されるかという問題は,大変古い問題であるが,主として自己を絶対的な基準としたegocentricな距離の知覚として取り扱われてきた。これに対して,シーンに存在する対象間の距離(allocentric distance)を我々がどのように知覚しているかに関する研究は少ない。2つの標的によって規定される標的間間隔が同じであれば,観察者から見て観察者から見て奥行き方向に提示された標的(奥行き提示条件)は,前額面に提示された場合よりも過小評価される。本研究でも,同様の結果が得られたが,2標的の仰角に対して前額面の距離(視角に換算)をプロットすると,提示条件にかかわらず線形性が見られた。このことは,知覚系はfull-cue条件ではallocentricな準拠枠で表現された距離を基本的にしつつも,egocentricな情報にもアクセスできることを示している。また,このように配置された標的をpreviewし,次いで目隠しでその標的の位置まで歩行を行う場合,大きな知覚的な歪みが観察されたにもかかわらず,歩行は概ね正確であった。しかしながら,刺激を前額面に提示するか奥行き方向に提示するかにより,歩行距離に違いが見られた。このことはegocentricな情報が十分に得られる場合,それをallocentricな距離として表現できるが,egocentricな情報が不十分な場合には,系統的な変位誤差が生じることを示唆している。これらのことから,full-cue条件下においては,知覚系と運動系は解離しておらず,両系とも2つの準拠枠にアクセス可能なこと,ただし,アクセスのしやすさに関するプライオリティが存在するものと考えられる。一般に,空間内にある刺激を表現するための座標系は,観察者から見て奥行き方面を正中面(sagittal plane),これと直交する面を前額面(frontal plane)として記述される。通常の明所条件下では,物理的に等価な距離であっても,正中面に提示された標的間の距離は前額面に提示された標的の距離よりも過小評価されることが知られている(空間の異方性)。では,標的への視覚誘導性行為(blind walking)はこの歪んだ知覚表現に依存しているのか。これを検討することが本研究の目的である。実験では,正中面(4-12m)に第1標的,これと直交する前額面あるいは正中面に沿って第2標的(1.0,1.5,2.0m)を置き,前額面に提示された2つの標的間の距離と正中面の距離とを知覚的にマッチングさせる実験および第1・2標的へblind walkさせる実験を行った。この際,第2標的が前額面にある場合は正中面方向に移動させ,正中面の標的には前額面方向に移動させるようにした。分析の結果,先行研究と同様,空間の異方性が確認されたが,第2標的への運動行動は先行研究とは異なり,奥行き方向の過小視の影響を受けた。この結果は,刺激提示と運動による再現の座標系が非対応であったことに起因すると思われる。つまり自己中心的位置は相対的距離とは独立しており,変換が困難であることを意味する。また,運動による定位行動は自己中心的手がかりのみに依存しているのではなく,相対的な知覚的手がかりの影響も受けることが明らかとなった。運動系はどちらの準拠枠にもアクセス可能であることが示唆された。通常の明所視条件下では,物理的に等距離であっても,奥行き方向に提示された標的間の距離は前額面に提示された距離よりも過小評価されるということが知られている(空間の異方性)。

しかしながら,これらの標的を観察した後に,その標的に目隠しで歩行を行うとこれを正確に実行できる(Loomis et al.,1992)。この結果は,知覚系と運動系とが異なるシステムに基づいているという仮説の行動学的例証であると考えられてきた(Milner & Goodale,1995)が,知覚系が2距離間の比較を行っているのに対して,運動系では位置情報を元に標的に向かって歩行していたと解釈することも可能である。そこで本実験では,Loomis et al.(1992)とほぼ同様の実験状況を設定し,提示された2標的間の提示方向にそった歩行を行ってもらう条件と,提示方向とは一致しない方向に距離を再生してもらう条件を設けた。後者の条件では,標的が存在しない仮想上の位置に歩行することを意味する。知覚的マッチングの結果,奥行き方向は前額面よりも一貫して過小視され,奥行き距離が増加するにつれてその傾向が強まるという結果が得られた。この結果は先行研究と一致するものであるが,2標的の仰角に対して前額面の距離(視角に換算)をプロットすると,奥行き提示条件でも前額面提示条件でも線形関係が見られた。また,目隠し歩行の結果は,第1標的までの歩行距離は先行研究同様4-12mの距離ではかなり正確であった。第1-第2標的間の歩行に関しては,刺激を奥行き方に提示すると奥行きにも前額面にも同様の距離を示したが,前額面提示条件の場合,奥行き方向への距離は前額面の距離を有意にオーバーシュートしていた。これらの結果は,egocentricな準拠枠の効率と知覚系・運動系の各準拠枠へのアクセスのしやすさにプライオリティがあるという点から考察された。
クローン化Kチャンネルの抗不整脈薬開発への応用の研究

1.電位依存性K^+チャンネル(1)ラット心筋のKチャンネルクローン(遅延整流型のKv1.2と一過性外向き型のKv1.4)に対する各種抗不整脈薬の影響を卵母細胞の発現系を用いて検討し、意外なことに比較的純粋な第3群抗不整脈薬(d-sotalol、E-4031、MS-551)は両K電流を抑制しないことを明らかにした。その他ネイティブのK^+電流を抑制することが知られている抗不整脈薬の影響を検討し、検討した薬剤のうちdisopyramide以外は濃度依存的に両K^+電流を抑制すること、そしてその抑制の時間依存性等において薬剤間で違いが認められることを明らかにした。しかし、両K^+電流を抑制するためにはネイティブの電流の場合と比較して大変高用量の薬剤が必要であったことは大きな問題である。(2)電気生理学的研究により多く用いられているウサギの心筋からShakerファミリーに属するK^+チャンネルをクローニングしその一次構造を決定した。それはKv1.5でありラットのKv1.5とアミノ酸レベルで85%の相同性を有していた。このK^+チャンネルに関する詳細な電気生理学的検討は現在行っている。2.内向き整流K^+チャンネルウサギの心筋より内向き整流特性を示すKチャンネル(RBHIK1)をクローニングし研究を行い、RBHIK1電流は外液Ba^<2+>やCs^+により時間依存的に抑制される事などを明らかにした。また、RBHIK1電流に対する各種不整脈薬の影響を検討したが、現在までに検討した薬剤の中にはRBHIK1の電流を抑制するものはなかった。しかしRBHIK1のmRNAは特に心室筋に非常に豊富に存在しており、生体内でも重要な役割を演じていることが示唆された。現在培養細胞へのトランスフェクションを行っておりパッチクランプ法を用いた単一電流の解析などの詳細な検討を進める予定である。1.心筋よりクローニングした2種類のKチャンネル(遅延整流型電流を流すKvl.2および一過性外向き電流を流すKvl.4)を卵母細胞に発現させ、それらの電流に対する抗不整脈薬の作用を検討し、代表的な第3群抗不整脈薬であるd-sotalol,MS-551,E-4031はそれらの電流に影響を与えないが、第1群に属するキニジンは両K電流を抑制することを明らかにした。K電流(遅延整流電流、一過性外向き電流、内向き整流電流)を抑制することがその作用メカニズムと考えられている第3群抗不整脈薬の代表的なものが心筋よりクローン化したKチャンネルの電流に影響を与えないということは予想に反する事実であったが、その原因については検討が必要である。さらに、その他の第1、第3、第4群に属する抗不整脈薬のうちネイティブのK電流を抑制することが知られている薬物のKv1.2電流、Kv1.4電流に対する作用を検討し、両K電流が抑制されるという結果を得ており、それに関しては現在まとめの段階である。2.機能的スクリーニング法により、腎臓およびマクロファージからクローニングされた2種類の内向き整流特性を示すKチャンネルのアミノ酸配列の情報をもとにウサギの心筋より内向き整流Kチャンネル(RBHIK1)をクローニングした。RBHIK1の特性を卵母細胞の発現系を用い検討したところ、RBHIK1を流れる電流は強い内向き整流特性を示し、その活性化の閾値電位はK^+の平衡電位とほぼ一致していた。また、その電流は外液Ba^<2+>やCs^+によって時間依存的に抑制された。

さらに、RBHIK1のmRNAの各種組識における発現をRNAブロッティングにより検討したところ、特に心筋においては心室筋に大量に発現しているのに対し心房筋にはほとんど発現していないことが明らかとなった。このRBHIK1を流れる電流に対する各種抗不整脈薬の影響は今後検討する課題である。1.内向き整流Kチャンネルウサギの心筋よりクローニングした内向き整流特性を示すKチャンネル(RBHIK1)に対する各種抗不整脈薬(第4群のverapamilや心筋のI_<K1>を特異的に抑制すると言われているRP62719等)の影響を卵母細胞の発現系を用いて検討したが、検討した薬剤の中にはRBHIK1の電流を抑制するものはなかった。しかし、RBHIK1のmRNAはウサギの心室筋に非常に豊富に存在しており生体内でも重要な役割を演じていると考えられるため、更に詳細な検討が必要である。その意味で、現在パッチクランプ法を用いた単一電流の解析やヒトの培養細胞へのトランスフェクション等を行っている。2.電位依存性Kチャンネル(1)昨年度より研究を続けているラット心筋のKチャンネルクローン(遅延整流型のKv1.2と一過性外向き型のKv1.4)に対する各種抗不整脈薬(第1群のdisopyramide、flecainide、第3群のclofilium、bertosamil、第4群のverapamil)の影響を検討し、disopyramideは両K電流を抑制しないが、その他の薬剤は濃度依存的に両K電流を抑制すること、そしてその抑制の時間依存性等において薬剤間で違いが認められることを明らかにした。しかし、両K電流を抑制するためにはネイテイブな電流の場合と比較して大変高用量の薬剤が必要であった。今後その原因に関する検討が必要である。(2)電気生理学的研究により多く用いられているウサギの心筋からShakerファミリーに属するKチャンネルをクローニングしその一次構造を決定した。それはKv1.5でありラットのKv1.5とアミノ酸レベルで85%の相同性を有していた。このKチャンネルに関する詳細な電気生理学的検討は現在行っている。
複雑骨格を創成する革新的生合成マシナリーの開拓と精密機能解析

平成30年度は、前年度までに同定した新奇天然化合物の生合成マシナリーの同定と精密機能解析を継続して行った。具体的には、メチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行った。メチルベンゼン骨格を含むポリエン化合物はII型様のポリケチド合成酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、これらの組換え大腸菌を利用して、まず4種のケトシンテース(KS)と4種の鎖長決定因子(CLF)の組み合わせを決定することに成功した。これにより、今後は、個々のKSとCLFとの組み合わせでin vitro反応を行い、その生産物を決めていくことで機能を明らかにすることができる。また、ベンゼン環を生成すると予想している酵素の遺伝子を生産放線菌内で破壊することができた。その結果、破壊株では確かにメチルベンゼン骨格を持つ化合物の生産が消失したことから、この遺伝子がメチルベンゼン化合物の生産に関与していることを示すことができた。また、ヌクレオシド系化合物、具体的には、A-94964の生合成の精密解析を中心に進めた。A-94964生産菌のドラフトゲノムシーケンスとバイオインフォマティクス解析から得られた生合成遺伝子の情報を利用し、個々の生合成反応を推定することでA-94964の生合成経路を提案し、論文として発表することができた。放線菌が生産するナフテルピンやフラキノシンなどのメロテルペノイド生合成の研究を進め、生合成に必須のメチル化反応を触媒する酵素を同定した。並行して、放線菌が生産するアルカロイドであるカルキノスタチンやラバンドキノシンの生合成マシナリーの精密機能解析を進め、ラバンドキノシンついては昨年度発表した鍵酵素に関する総説を発表した。また、カルキノスタチンについては、全生合成経路を提案し、鍵酵素のX線結晶構造解析に成功したので現在論文を執筆中である。平成30年度は、メチルベンゼン骨格を含むポリエン化合物はII型様のポリケチド合成酵素遺伝子を大腸菌で発現させ、これらの組換え大腸菌を利用して、まず4種のケトシンテース(KS)と4種の鎖長決定因子(CLF)の組み合わせを決定することに成功した。また、ベンゼン環を生成すると予想している酵素の遺伝子を生産放線菌内で破壊することができ、破壊株では確かにメチルベンゼン骨格を持つ化合物の生産が消失したことから、この遺伝子がメチルベンゼン化合物の生産に関与していることを示すことができた。ヌクレオシド系化合物の生合成マシナリーの精密機能解析については、A-94964生産菌のドラフトゲノムシーケンスとバイオインフォマティクス解析から得られた生合成遺伝子の情報を利用し、個々の生合成反応を推定することでA-94964の生合成経路を提案し、論文として発表することができた。イソインドリノン骨格という新しい骨格をもつポリケチドを単離し、その生合成マシナリーを同定することに成功し、論文として発表することができた。さらには、カルキノスタチンについては、全生合成経路を提案し、鍵酵素のX線結晶構造解析に成功したので現在論文を執筆中である。班員間の共同研究も積極的に進め、A01班公募班の工藤史貴博士とはホスホン酸化合物であるfosfomycinのメチル化機構に関して論文を発表することができた。またA02班計画班の脇本敏幸博士とはヒドラジンの生合成マシナリーの同定に関して論文を発表することができた。以上の成果から、順調に進展していると判断した。今後は引き続き、ヌクレオシド系生物活性物質とポリケチド化合物の生合成マシナリーの同定と精密機能解析を継続する。具体的には、ヌクレオシド系生物活性物質としてアミプリマイシン、ミハラマイシン、アングストマイシン、ポリケチド化合物としてメチルベンゼン骨格を有するポリエン化合物の生合成マシナリーの精密機能解析を行う。同定した生合成マシナリーを用いて、ヌクレオシド系化合物の新規誘導体を作出する研究にも着手する。また、一昨年度に明らかにしたトリコスタチンの生合成酵素の結晶化についても引き続き進める。これまでに、酵素の精製条件が完了し、in vitroでの酵素活性も検出できていることから、結晶が得られれば活性型酵素の構造解析が可能になる。本研究課題では、「抗生物質ホルミシス」を様々な微生物に適用して休眠遺伝子を覚醒させることで、これまで得ることができなかった新奇な生合成マシナリーを開拓する。また、構造多様なヌクレオシド系抗生物質やペプチド系抗生物質などの生合成マシナリーも同定する。さらには、それらの精密な反応機構を解明するとともに、改変などを通して生物合成系を再設計し天然にはない化合物の創成を目指している。methylbenzene含有天然化合物の発見と生合成マシナリーの同定:「抗生物質ホルミシス」により放線菌Streptomyces sp. SANK60404株において生産が活性化される新奇な2つのmethylbenzene含有天然化合物を開拓することに成功した。これらの化合物は、特徴的なmethylbenzene環とC5N(2-amino-3-hydroxycyclopent-2-en-1-one)ユニットを共通の部分構造としておりポリエン鎖の長さのみが異なっている。安定同位体標識した前駆体を用いたトレーサー実験から、両化合物はポリケタイド合成系(PKS)によって生合成されることを明らかにした。また、その生合成マシナリーとして既知のPKSとは異なる新奇な物質合成システムの候補を見出した。

小タンパク質を介したアシル化反応の発見:カプラザマイシンは放線菌Streptomyces sp. MK730-62F2より単離されたジアゼパノン環を含むユニークな構造を持つヌクレオシド系抗生物質である。カプラザマイシンの生合成遺伝子クラスター中の各遺伝子の破壊株を作製し、その培養抽出液を解析することで生合成中間体と推測される化合物の同定を試みた。次に同定した生合成中間体候補化合物と、破壊した遺伝子産物の組換え酵素を用いてin vitro活性試験を行うことで各種酵素の機能同定と生合成経路の同定を試みた。その結果、生物活性に必須であるアシル側鎖の形成機構として、68個のアミノ酸からなる小タンパク質を介した新奇なアシル化機構を発見した。当初の予定通り、「抗生物質ホルミシス」により放線菌Streptomyces sp. SANK60404株において生産が活性化される2つの新奇天然化合物を開拓することに成功した。また、その特異な生合成マシナリーを同定しつつある。さらには、ジアゼパノン環を含むユニークな構造を持つヌクレオシド系抗生物質であるカプラザマイシンの生合成における、生物活性に必須なアシル側鎖の形成機構として、小タンパク質を介した新奇なアシル化機構を発見した。以上のように、新奇天然化合物の開拓と新奇な生合成マシナリーを発見することができたことから、おおむね順調に進行していると判断した。平成29年度は、テルペン環化酵素CotB2の結晶構造の解明、放線菌の生産するポリケチドtrichostatin (TSA)の生合成マシナリーの解明、放線菌のユニークなテルペン合成酵素cyclolavandulyl diphosphate synthase (CLDS)の結晶構造と反応機構の解明、放線菌の生産するホスホン酸化合物fosfomycinの生合成酵素Fom1の機能解明に関する研究成果をあげ、学術雑誌に掲載することができた。CotB2の研究では、基質類似体ゲラニルゲラニルチオジホスフェートを結合したCotB2のはじめての高分解能X線結晶構造の解明に成功し、CotB2触媒作用の間の環形成および立体化学の絶妙な制御のための構造的基礎を提供した。ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の阻害剤として生化学の分野で広く利用されているTSAのHDAC阻害活性には、ヒドロキサム酸基が重要な役割を果たすことが既に知られていたが、これまでヒドロキサム酸基がどのように作られるかは不明のままであった。今回、TSAを作るために必要な全ての遺伝子を同定し、それらの働きを解明することに成功した。さらに、遺伝子工学の手法を用いてTSAの高生産株を作製するとともに、組換えタンパク質を用いた試験管内反応によりTSAのヒドロキサム酸基を作るための新しい機構を提唱した。CLDSの研究では、ラベル基質を用いた試験管内反応によりCLDSの環化反応には分子内プロトン転位が関与することを示した。また結晶構造に基づく変異体解析において8番目のプロリンおよび173番目のフェニルアラニンが環化反応に重要な残基であることを示した。以上の結果から、CLDSの環化反応には基質の配置の制御が要因の一つとなっており、基質同士の接近が分子内プロトン転位反応を開始させ、続く環化反応を促進することを突き止めた。
多様な監査・保証形態が与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究

「多様な監査・保証業務の形態が利害関係者に与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究」をテーマとし、多様な財務情報に対して、異なる監査・保証業務を職業会計士がどのように提供し得るのか、また提供しているのか、について、監査及び証明業務で先行するアメリカを中心に検討し、特に特別目的の財務情報の監査・証明業務の提供実態について明らかにした。同時にドイツにおける任意監査・証明業務の実態についても、連携研究員の協力を得てその詳細を検討した。最終的にわが国での任意の監査・証明業務に関する実務がそれほど導入・定着していないことが確認されたため、実務指針の一層の充実を含めた対応の必要性を提言した。本研究課題は、平成26年改訂監査基準が導入した「特別目的の財務情報に対する監査」を中心に、「多様な監査・保証携帯が与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究」をテーマとして、国際監査基準(ISA)800「特別目的の財務報告の枠組みに準拠して作成された財務諸表に対する監査」とISA 805「個別の財務諸表または財務諸表項目等に対する監査」のわが国における実施可能性とそのあり方を明らかにすることを目的としている。平成27年度においては、特別目的の財務情報の監査・保証業務を既に導入している国について、職業会計士がどのように当該業務を整備・運用しているのか、を検討した。今年度は、先行事例としてISAs 800と805が規定される前から、既に過去財務情報の監査以外の証明業務を実施している国であるアメリカの事例を扱った。特にアメリカ公認会計士協会(AICPA)では、専門職業基準として監査基準(SAS)、証明業務基準(SSAE)、会計・レビュー業務基準(SSARS)を設定し、証明業務への対応を図っている。さらに、アメリカの公開企業会計監視委員会(PCAOB)が、AICPAによる当該基準をPCAOB監査基準として取り込み、より実効性の高い基準化が指向されていた。これらの基準において規定された、特別目的の財務情報の証明業務における具体的特徴、すなわち対象となる財務情報、証明業務契約受託における検討事項、作成のための会計基準、証明業務手続実施における考慮事項、種々の監査報告の態様、を確認し、当該基準の適用を検証した先行研究を渉猟した上で研究成果に纏めることができた。平成27年度の研究成果として、「証明対象の多様化に伴う証明業務の展開」『同志社商学』第67巻第4号(平成27年3月)4156頁を公表した。当初の実施計画では、(1) ISAs 800・805を導入している国でどのような制度化がなされたのか、(2)導入国における当該業務の特徴、(3)先行研究の渉猟による一般目的・特別目的財務情報の監査の特徴、(4)一般目的・特別目的財務情報の監査におけるあり得る構成要素の組み合わせを明らかにすることを目的としていた。本稿では、過去財務諸表以外に対する証明・保証業務を先進的に導入してきたアメリカにおける一連の保証業務の基準を、特別目的の財務情報の観点から一体的に整理し分析している。当初想定したドイツにおける特別目的財務情報に対する監査の基準については成果を得ることができなかったものの、諸外国よりも最も進んだ保証業務を展開するアメリカの特別目的の財務情報に対する証明業務について、制度的・実務的に検証することができ、所期の目的はおおむね達成していると考えている。本研究課題は、企業会計審議会が平成26年改訂監査基準において導入した「特別目的の財務情報に対する監査」を中心に、「多様な監査・保証形態が(利害関係者)に与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究」をテーマとして、国際監査基準(ISA)800「特別目的の財務報告の枠組みに準拠して作成された財務諸表に対する監査」とISA 805「個別の財務表または財務諸表項目等に対する監査」のわが国における実施可能性とそのあり方を明らかにすることを目的にしている。平成28年度においては、前年度に引き続き、職業会計士が多様な財務情報の監査・保証業務をどのように提供し得るのか、また提供しているのか、について、監査及び証明業務で先行するアメリカを中心に検討した。特に特別目的の財務情報の監査を規定する公開企業会計監視委員会(PCAOB)とアメリカ公認会計士協会(AICPA)による基準のみならず、任意監査・証明業務を規制するAICPAによる実務指針が、どのように実務に適用されているのか、を明らかにするように努めた。一方、わが国でも当該監査基準に基づき、実際に特別目的の財務情報の監査がどの程度実施されているのか、について実態調査を試みることで、その定着度を測った。この結果、アメリカのように任意監査ないし証明業務のような、20世紀初頭から当事者間で情報の信頼性を保証する専門業務、に対するニーズが存在した国に比して、わが国での任意の監査・証明業務に関する実務が、これら基準化によってもそれほど進展していないことが確認され、今後、実務指針の一層の充実を含めた今後の対応について提言を行なった。(理由)当初の実施計画では、特別目的の財務情報に対する監査・証明業務における4つの構成要素(利用目的、監査・保証対象となる情報、業務手続、必要な確信の程度)が、「適正性」と「準拠性」意見との関連でどのように組み合わされるのかを実態調査を通じて明らかにした上で、各構成要素の組み合わせとその結果としての保証効果について概念的な整理とモデル化を目的としていた。現在までの進捗状況では、上記論文及び学会発表において構成要素間の概念整理について纏めることができている。

また当初予定したドイツの特別目的の財務情報に対する監査・証明業務の内容を完全には終えていないものの、わが国における実態調査の結果は得られており、その分析結果とモデル化については取り纏めつつあるところである。本研究課題は、わが国企業会計審議会が平成26年に改訂監査基準に導入した「特別目的の財務情報に対する監査」を中心に、「多様な監査・保証業務の形態が利害関係者に与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究」をテーマとし、国際監査基準(ISA)800「特別目的の財務報告の枠組みに準拠して作成された財務諸表に対する監査」とISA 805「個別の財務表又は財務諸表項目等に対する監査」のわが国における実施可能性とそのあり方、ならびに導入実態を明らかにすることを目的とした。平成27・28年度においては、職業会計士が多様な財務情報の監査・保証業務をどのように提供し得るのか、また提供しているのか、について、監査及び証明業務で先行するアメリカを中心に検討した。特に特別目的の財務情報の監査・証明業務を規定する公開企業会計監視委員会(PCAOB)とアメリカ公認会計士協会(AICPA)による基準のみならず、任意監査・証明業務を規制するAICPAによる実務指針がどのように実務に適用されているのか、を明らかにした。平成29年度においては、わが国で当該改訂監査基準に基づいた特別目的の財務情報の監査が、どの程度導入されているのかについて、日本公認会計士協会の協力を得て実態調査を行ない、日本会計研究学会スタディ・グループ報告の一部に反映させた。さらに当該特別目的の財務情報の監査をわが国同様に導入しているドイツにおける実態について、連携研究員の協力を得て明らかとした。最終的に、先行する諸外国に比して、わが国での任意の監査・証明業務に関する実務が、これらの基準化によってもそれほど導入・定着していないことが確認されたため、今後の実務指針の一層の充実を含めた対応の必要性を提言した。「多様な監査・保証業務の形態が利害関係者に与える保証効果への影響に関する国際的・実証的研究」をテーマとし、多様な財務情報に対して、異なる監査・保証業務を職業会計士がどのように提供し得るのか、また提供しているのか、について、監査及び証明業務で先行するアメリカを中心に検討し、特に特別目的の財務情報の監査・証明業務の提供実態について明らかにした。同時にドイツにおける任意監査・証明業務の実態についても、連携研究員の協力を得てその詳細を検討した。最終的にわが国での任意の監査・証明業務に関する実務がそれほど導入・定着していないことが確認されたため、実務指針の一層の充実を含めた対応の必要性を提言した。平成27年度に明らかにした国際監査基準(ISA)800と805、ならびにアメリカにおけるPCAOB監査基準(AS)、AICPAのSAS・SSAE・SSARSが想定する特別目的財務情報に対する監査・保証業務の制度的・実務的特徴に基づき、利用目的、監査・保証対象となる情報、業務手続、必要な確信の程度、という4つの構成要素の組み合わせの違いから、保証の効果について測定するための方策を検討する。またこれらの構成要素の種々の組み合わせに基づく監査・保証業務において、期待される監査人の業務内容と確信度、想定利用者による利用目的・方法を整理する。この際、理論的に整理した各意見表明形態による保証の効果を検討する。
タイプA行動の変容に及ぼす不安とセルフ・エフィカシ-の効果

Jenkins Activity Survey(JAS)によって抽出されたタイプA行動者とノン・タイプA行動者(各6名)を対象として、(1)解決困難な課題場面でのタイプA行動者特有の解決方略が存在するかどうか,(2)嫌悪刺激を伴う課題場面において、タイプA行動と不安、セルフ・エフィカシ-との関係はどのようになっているか、(3)タイプA行動者が不安に対処するときに、セルフ・エフィカシ-を向上させる手続きはどうような効果を持っているか、という点を検討するために実験を行った。用いられた課題は、数列穴埋め課題10題で、制限時間内に課題を解くことができない場合には、嫌悪刺激として電撃が与えられた。また、各試行に先立って、課題をどのくらい確実に解くことができるかについてのセルフ・エフィカシ-評価が行われ、各試行後には、セルフ・エフィカシ-を向上させるための操作として、心拍数と末梢皮膚温のフィ-ドバック、および言語的教示が与えられた。実験の結果,(1)タイプA行動者は、ノン・タイプA行動者に比べて反応時間が短く、行動的反応傾向にある。(2)タイプA行動者は、課題成功にともなってセルフ・エフィカシ-を高く見積もる傾向にある。(3)タイプA行動者は、自らの生理的反応に関するフィ-ヒドバック情報を有効に活用することのできる傾向にある。等の諸点があきらかにされた。
X線自由電子レーザーのナノ集光システムの開発

X線自由電子レーザー(XFEL:X-ray Free Electron Laser)は,従来の放射光光源を凌駕する優れた可干渉性,極短パルス性,極限的ピーク強度を持ち,蛋白質分子の無損傷状態分析や,X線領域での非線形光学の発展が期待されている.これらのためにはXFELの集光が不可欠であり,私の研究室では,独自の精密加工・計測法を用いてX線ミラーを開発し,集光サイズ10nm以下を目指している.X線自由電子レーザー(XFEL:X-ray Free Electron Laser)は,従来の放射光光源を凌駕する優れた可干渉性,極短パルス性,極限的ピーク強度を持ち,蛋白質分子の無損傷状態分析や,X線領域での非線形光学の発展が期待されている.これらのためにはXFELの集光が不可欠であり,私の研究室では,独自の精密加工・計測法を用いてX線ミラーを開発し,集光サイズ10nm以下を目指している.
新規MAPキナーゼ制御因子Sprouty/Spredの発生と癌における機能解析

Ras-Raf-ERK経路の正および負の制御因子は多数知られているが、我々が発見したSprouty/Spredファミリーもそのひとつである。Sprouty/Spredファミリー分子は、増殖因子やサイトカインによるERK経路活性化を抑制する調節因子である。哺乳類ではSproutyは4種類、Spredは3種類報告されている。我々はSprouty/Spredファミリーの生理的な役割を明らかにするためにSprouty/Spredファミリーのノックアウト(KO)マウスを作製し、解析を行ってきた。胎仔期においてSpred1, Spred2は似通った発現パターンを示し、抑制機能に差を認めない事から相補的に働くことが予想されたため、Spred1,Spred2のダブルノックアウト(DKO)マウスを作製した。Spred1/Spred2 DKO胎仔は胎生12.5日から15.5日にかけて100%致死であり、著明な出血、浮腫を認めた。in vitro、in vivoの解析から、Spred1/Spred2 DKO胎仔ではリンパ管発生に必須のVEGF-C/VEGFR-3シグナルが過剰に入ることにより、血管はほぼ正常であるがリンパ管の発生異常が起こり死亡することが明らかとなった。一方、Sprouty2/Sprouty4 DKO胎仔も胎生12.5日までに血管の異常を認め100%致死であり、Sprouty4KOマウスにおいては血管新生に重要なVEGF-A/VEGFR-2シグナルが過剰に入り、血管密度の増加、血管新生の亢進を認めるが、リンパ管はほぼ正常であった。以上より、Sproutyは血管新生、VEGF-A/VEGFR-2シグナルの調節因子として、Spredはリンパ管発生・新生、VEGF-C/VEGFR-3ジグナルの調節因子として使い分けられている事が示唆された。その機構の解析の過程で、VEGF-A/VEGFR-2シグナルはRas非依存性(PLC-PKC依存性)にRaf-ERK活性化を引き起こし、VEGF-C/VEGFR-3シグナルはRas依存性にRaf-ERK活性化を引き起こすことが明らかとなり、Ras非依存性のERK活性化をSproutyが、Ras依存性のERK活性化をSpredが抑制しているというモデルを提唱している。さらに最近我々はベルギー、フランス、アメリカとの国際共同研究において、カフェオレ斑を持つが、NF1遺伝子に変異を認めない家族性優性遺伝の神経線維腫症1型様患者での解析において、ヒトSPRED1に多数の変異を発見し報告した。SPRED1は'neuro-cardio-facial-cutaneous'(NCFC)症候群の原因遺伝子の一つであり、新しい癌抑制遺伝子の候補であることが示唆された。Sprouty遺伝子はチロシンキナーゼ型受容体シグナルを抑制する細胞膜関連タンパク質である。ショウジョウバエSproutyの4つのオルソログ(Sproutyl-4)が哺乳類では同定されている。哺乳類Sprouty(mSprouty)の生体内での機能を解明するためにノックアウト(KO)モデルが作られている。Sprouty1欠損マウスはウォルフ管がグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)/RETシグナルに対する感受性が上がっているために腎臓の発生において複数の尿管と腎臓が形成される。Sprouty2欠損マウスは我々の解析の結果、腸や食道の神経過形成により食道アカラシア、拡張した食道、腸の偽閉塞、消化運動系の生理的異常を示すことが明らかにされた。これらの表現型はGDNFに依存しており、Sprouty2もGDNF/RETシグナルを負に制御していることを示している。このようにSprouty1とSprouty2の生理的な機能はジーンターゲッティング法を用いて調べられているが、今日までSprouty4欠損マウスの詳細な解析はまだ報告されていない。今回の研究ではSprouty4欠損マウスを作製し、特徴付けを行った。Sprouty4欠損マウスの大部分は生直後に下顎欠損のため死亡するが、残りは生存可能で生殖能力があった。大部分のSprouty4欠損マウスは発育遅延を呈し、ほぼ全てに合指症・多指症がみられた。Sprouty4欠損胎仔線維芽細胞(MEFs)において、FGFに対するERK活性化は遷延したが、EGFに対するERK活性化の遷延はみられなかった。Sprouty2とSprouty4の2重欠損マウスは胎生致死であり、頭蓋顔面、肢、肺の形態形成に重篤な異常を認めた。これらの知見は胚発生とFGFシグナルにおける、Sprouty2とSprouty4の機能が重複的であるとともに非重複的でもあることを示唆している。