hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糸球体血行動態調節機構の加齢性変化：腎臓の老化における病態生理的意義

糸球体単離灌流実験では、糸球体血行動態調節機構に及ぼす加齢の影響を検討したが、有意な成果は得られなかった。また、糸球体血行動態調節機構の分子生物学的機序を明らかにする目的で、輸出入細動脈の血管平滑筋細胞と血管内皮細胞の培養系確立を目指したが、確立するに至らなかった。腎内小胞体ストレスに関する検討では、悪性腎硬化症の腎臓では酸化ストレスを含む種々のストレスが増強しているにも関わらずオートファジーが減弱しており、腎障害に寄与している可能性を示唆する成果が得られた。また、降圧薬治療による腎障害の抑制にはマクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーの活性化が関与する可能性が示唆された。糸球体単離灌流実験と血管分子生物学的実験については未だ成果は得られていないが、腎内小胞体ストレス・酸化ストレスに関する検討では、悪性腎硬化症の動物モデルであるmalignant stroke-prone spontaneously hypertensive rats (M-SHRSP)を用いて、高血圧性腎障害とオートファジー、特にストレスとの関与が強いとされるマクロオートファジーとシャペロン介在性オートファジーの関連を検討し、以下の結果を得た。悪性高血圧レベルまで血圧が上昇した13週齢のM-SHRSPの腎臓では、マクロオートファジー関連蛋白LC3B-Iとシャペロン介在性オートファジー関連蛋白であるLAMP2aおよびHSC70の発現量が減少していた。ヒドララジン(Hyd)あるいはアゼルニジピン(Aze)で降圧することにより、腎機能障害と組織傷害は軽減した。LC3の免疫組織染色ではポドサイト、遠位尿細管、ヘンレ係蹄の太い上行脚および集合管に染色を認めたが、降圧治療により髄質におけるLC3B-II蛋白発現量が増加した。LAMP2aは近位尿細管と集合管に染色を認め、降圧薬治療により髄質における蛋白発現量が増加した。HSC70はポドサイド、遠位尿細管およびヘンレ係蹄の太い上行脚に染色を認め、Hyd投与により皮質における蛋白発現量が軽度に減少した。シャペロン介在性オートファジーではHSC70を含むシャペロン複合体とLAMP2aが結合することで基質がリソソーム内へ取り込まれるが、Aze投与群の集合管においてHSC70とLAMP2aの共発現増加が蛍光二重染色で確認された。以上の結果より、悪性腎硬化症の腎臓では酸化ストレスを含む種々のストレスが増強しているにも関わらずオートファジーが減弱しており、腎障害の進行に寄与している可能性が示唆された。また、降圧薬治療により腎障害の進行が抑制されるが、その機序にマクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーの活性化が関与する可能性も考えられた。糸球体単離灌流実験と血管分子生物学的実験については未だ成果は得られていないが、腎内小胞体ストレス・酸化ストレスに関する検討では昨年度の研究成果を進展させている。昨年度、我々は悪性高血圧の腎臓では酸化ストレスを含む種々のストレスが増強しているにも関わらず、オートファジーが減弱しており、腎障害の進行に寄与している可能性を述べたが、マクロオートファジー・シャペロン介在性オートファジーの関連性を含めた機序の詳細について検討を進めている。また、昨年度は13週齢の悪性高血圧モデル(MSHRSP)のみで検討を行ったが、幼若期(5,8週)や高齢期(20週)での変化を検討することで病態との関与を検討している。酸化ストレス・オートファジーとも高血圧確立前から増加しつつあり、血圧上昇の結果ではなく、悪性腎硬化症の病態に関与する可能性が強く示唆された。また、我々は降圧治療による腎障害進展抑制にマクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーが関与する可能性を昨年度に報告したが、その程度は降圧薬の種類により異なっていた(ARB>Ca拮抗薬>ヒドララジン)。薬剤間での効果の違いとして、レニン・アンジオテンシン系の関与および交感神経系の関与が考えられたため、詳細に検討している。また、レニン・アンジオテンシン系によって刺激されるアルドステロンの関与が強いことが明らかとなり、その詳細と機序を現在検討しているところである。また、昨年度は実験の難点としてMSHRSPではCa拮抗薬やヒドララジンで十分な降圧が得られずARBと血圧差が生じていたが、用量調整にて同レベルの降圧を行いながら各薬剤を比較検討することが可能になった。糸球体単離灌流実験と血管分子生物学的実験において成果が得られていないため。糸球体単離灌流実験では昨年度まで成果が得られていなかったため、今年度はウサギではなく高齢高血圧ラットを用いて加齢と高血圧が糸球体血行動態調節機構に及ぼす影響を検討したが、有意な成果は得られなかった。血管分子生物学的実験においても、腎細動脈の内皮細胞と血管平滑筋細胞の培養系を確立することができず、有意な成果を得ることはできなかった。腎内小胞体ストレス・酸化ストレスに関する検討においては、昨年度まで悪性高血圧モデルで得た研究成果を発展させている。今年度の成果として、悪性高血圧の病態では腎における小胞体ストレスが亢進しているもののアグリファジー機能が低下していることを明らかにした。さらに、降圧薬治療(特にRAS阻害薬)を行うことで小胞体ストレスが軽減でき、マクロオートファジーやシャペロン介在型オートファジーなどのアグリファジーが誘導された。

これらのことより小胞体ストレスやアグリファジーは高血圧性腎障害の病態に関与し、RAS阻害薬で活性化できる可能性が示唆された。現在、同じ腎硬化症においても、加齢によって生じる腎硬化症と高血圧によって生じる腎硬化症でどのような差異があるか検討を進めている。また、我々は加齢とともに傍髄質の血流が低下すること、さらにその機序にトロンボキサンA2(TXA2)が関与することを明らかにした。TXA2には直接的な血管収縮作用とスーパーオキサイドの産生亢進を介した血流低下作用があるため、現在、詳細について検討を進めている。糸球体単離灌流実験では、糸球体血行動態調節機構に及ぼす加齢の影響を検討したが、有意な成果は得られなかった。また、糸球体血行動態調節機構の分子生物学的機序を明らかにする目的で、輸出入細動脈の血管平滑筋細胞と血管内皮細胞の培養系確立を目指したが、確立するに至らなかった。腎内小胞体ストレスに関する検討では、悪性腎硬化症の腎臓では酸化ストレスを含む種々のストレスが増強しているにも関わらずオートファジーが減弱しており、腎障害に寄与している可能性を示唆する成果が得られた。また、降圧薬治療による腎障害の抑制にはマクロオートファジーやシャペロン介在性オートファジーの活性化が関与する可能性が示唆された。糸球体単離灌流実験と血管分子生物学的実験において、成果が得られていないため。糸球体単離灌流実験に関しては設備は完備されているが、実験が成功していない状態である。原因を追究して精度を上げ、予定していた内容で研究を進めていきたい。血管分子生物学的実験については腎輸入・輸出細動脈の内皮細胞と血管平滑筋細胞の培養系が確立できず進んでいない。現在、従来から用いていた培養細胞を用いて実験を代用できるか検討中であるが、可能ならば腎細動脈の培養系を確立させて当初の計画を進めたい。腎内小胞体ストレス・酸化ストレスに関する検討では病態メカニズムの解析のための検討を続けていく。医歯薬学腎臓内科学糸球体単離灌流実験に関しては設備は完備されているが、実験が成功していない状態である。血管分子生物学的実験においては、腎細動脈の内皮細胞と血管平滑筋細胞の培養系が確立できず、進んでいない状況である。早急に培養細胞を確立して、当初の計画を進めていきたい。腎内小胞体ストレス・酸化ストレスに関する検討では、降圧治療薬による効果の違いを詳細に検討し、病態メカニズムの解析を進めていく予定である。
野生種を活用したイネの新規種子脱粒性遺伝子座の同定と収量性改善への展開

熱帯アジアを中心に世界で生産されるコメの約8割を占めるインディカ型栽培イネは、稔実種子が脱粒しやすいことから収穫時や運搬時に収量ロスが生じている。このため、脱粒に要する強度を人為的に調節することができれば増収が期待できる。しかし、栽培イネの非脱粒性は複数の遺伝子座の変異によって制御される量的形質であることがこれまでに明らかとなっており、既知の変異では生産地の収穫方法に対応した脱粒強度に調節することが難しい。本研究では、完全脱粒性を持つ野生イネ(Oryza rufipogon W630)と栽培イネ2品種(O. sativa日本晴・ジャポニカとIR36・インディカ)との交雑分離集団を活用することで、各栽培イネが有する脱粒性を低下させる特異的な自然変異を同定し、既知の遺伝子座との相互作用を解明するための実験系の構築を進めた。日本晴(ジャポニカ栽培イネ)の非脱粒性に関与した遺伝子座については、昨年度に作出した組換え個体について自殖種子を発芽させ、候補領域付近に座乗するDNAマーカーを用いて染色体断片を栽培・野生イネ由来と選抜して後代検定を実施した。また、候補領域内において新たな多型マーカーを増やして遺伝子型の判別実験を実施し関与する染色体領域について詳細な解析を行った。その結果、候補領域を限定化することができ、結果を論文としてまとめ投稿した。またIR36(インディカ栽培イネ)の非脱粒性に関与した遺伝子座については、これまでに同定した2か所の遺伝子座についてそれらの効果の検証を個別に実施し、両遺伝子座ともに効果を持つ実験結果を得た。また、既知遺伝子座との相互作用について今後明らかにするための実験系統の作出に着手した。日本晴(ジャポニカ栽培イネ)の非脱粒性を支配する遺伝子座として新たに同定したqCSS3については、昨年度の候補領域である2Mbほどの領域について、組換え個体を用いた高密度連鎖解析を行い、後代検定によって候補領域をおよそ500kbに限定した。一方、IR36(インディカ栽培イネ)の非脱粒性を支配する遺伝子座として同定されたqCSS2とqCSS7については、候補領域に座乗するDNAマーカーを用いて染色体断片を選別し、遺伝子座効果の検証を行うことができた。日本晴、IR36の実験系統において、引き続き組換え個体を用いた遺伝子マッピングを進め原因変異の同定を行う。また遺伝座間の相互作用を解明し、収量性を評価するための実験材料の構築はIR36を中心に用いて進める。平成30年度に発注したPCR機(バイオメトラ社製)について、海外取寄となったため納品が年度を跨ぐことになった。このため、平成30年度の予算を次年度に繰り越して執行することとした。次年度使用額は計画に基づいて消耗品の購入を中心に執行を行う。
消化管虚血再還流障害による癌転移促進のメカニズムの解明と転移抑制治療への応用

消化器癌の手術後に,急激な転移巣の顕在化と増大を経験することがあり、手術侵襲が何らかの影響を与えている可能性が考えられる.消化器癌の手術では,臓器を切除するために血管遮断を必要とし,温存される臓器にもしばしば虚血が起こる.血流の遮断と再還流による虚血再還流障害(IRI)は,その臓器障害により,様々なサイトカイン等のメディエーターの産生や自然免疫反応を惹起することが知られていることから,我々は,手術時の臓器の虚血再還流障害の転移巣増大への影響に着目し,マウスの腸管IRIモデルを作成することにより消化管のIRIによる転移巣増大のメカニズムを解明する.消化器癌の手術後に,急激な転移巣の顕在化と増大を経験することがあり、手術侵襲が何らかの影響を与えている可能性が考えられる.消化器癌の手術では,臓器を切除するために血管遮断を必要とし,温存される臓器にもしばしば虚血が起こる.血流の遮断と再還流による虚血再還流障害(IRI)は,その臓器障害により,様々なサイトカイン等のメディエーターの産生や自然免疫反応を惹起することが知られていることから,我々は,手術時の臓器の虚血再還流障害の転移巣増大への影響に着目し,マウスの腸管IRIモデルを作成することにより消化管のIRIによる転移巣増大のメカニズムを解明する.
海洋温暖化が東シナ海に進入する南方性水産有用魚類の回遊行動に及ぼす影響評価

最終年度はデータ解析と成果のとりまとめに専念した。(課題1)台湾沿岸域におけるカンパチの行動調査:過去2年に放流した25個体のうち16個体からのデータの回収に成功した。2017年11月に放流し翌2018年8月に再捕された個体からは258日間の深度・温度(水温・腹腔内温度)・位置情報を得ることに成功した。解析個体数は前年度から倍増の16個体に増えたので興味深い結果を得た(以下、課題3で詳述する)。(課題2)カンパチの漁獲統計の整理:台湾の研究協力者より得た台湾東部成功漁港で水揚げされた2000-2018年の漁獲データおよび鹿児島の定置網で収集された2003-2017年の漁獲データを解析した。台湾の漁獲量は年ごとに増加、鹿児島の逆に減少の傾向が認められ、当初の予測から逆の結果となった。台湾のNominal CPUEは経年変化が認められ、ラニーニャが発生していた年(2010-11年)にCPUEが最高値とになり気候変動と連動していることが示唆された。(課題3)行動データの解析:(水平移動)全個体の位置を解析し行動圏を推定したところ、コアエリアは台湾南東部沿岸域と台湾北東部に出現した。カンパチは海底地形が起伏に富んだ東部沿岸域もしくは黒潮が北から北東へ流向を変化させる北東部の大陸棚斜面域の沿岸もしくは陸棚斜面で湧昇が頻発する海域を摂餌場所として選好することが示唆された。(鉛直移動)標識個体は黒潮の流れる表層混合層を避けて季節躍層直下の経験水温が20.1±1.322.5±1.9(°C)となる68±28109±21(m)の深度帯に滞在し、そこから最深で521m、水温差は10°C程度に及ぶ鉛直移動を繰り返していた。また、滞在深度は季節変化が認められ、11月4月までがやや深く(100m前後)、5月以降は浅くなり、季節的な温度成層の強化に伴い滞在深度を変化させることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。課題1:台湾沿岸域におけるカンパチ・バショウカジキの行動調査カンパチ及びバショウカジキの東シナ海における周年の経験水温特性、回遊経路と分布域を明らかにするため行動調査を実施した。(カンパチ調査)平成28年11月にカンパチを台湾東部沿岸域で捕獲して、状態の良い2個体の成魚に深度・水温・位置情報を経時記録できる浮上式のアーカイバルタグ(以下、タグ)を装着し放流した。放流から9ヶ月後の平成29年8月に浮上させるよう設定したが、最初のタグは12月に不具合により浮上し、2個体目のタグは2月中旬に再捕獲された。幸いにも2台のタグともに物理的な回収に成功して、タグのメモリから秒単位の時間分解能の高いデータを得ることができた。2週間及び3ヶ月のデータを予備的に解析したところ、滞在深度の最頻値は80-90mの範囲にあり、日周的な鉛直移動の変化が認められた。さらに、生息水温を解析したところ最頻値は21-23°Cにあり、水温の上限・下限値の範囲は13-27°Cであった。回遊経路については現在解析中であるが、タグの浮上位置もしくは再捕位置から推察すると、放流地点から100km以内に生息していたことがうかがえた。(バショウカジキ)一方、バショウカジキについては平成28年7月に同じく台湾東部沿岸域で捕獲して、状態の良い2個体の成魚に深度・水温・加速度・速度・体温を同時に時記録できる浮上式のアーカイバルタグ(以下、加速度タグ)を装着し放流した。2台のタグともに物理的な回収に成功して、タグのメモリから秒単位の時間分解能の高いデータを得ることができた。データを予備的に解析したところ、滞在深度の最頻値は表層付近にあった、時折、水温躍層内に進入するような鉛直移動が認められた。さらに、生息水温を解析したところ、水温の上限・下限値の範囲は14-31°Cであった。本年度については、調査は予定通り実施できた。カンパチ、バショウカジキともに初年度から行動記録の取得に成功したが、いずれのタグも初期設定よりも早期に浮上してしまったり、標識魚が想定外に再捕されてしまい、長期間の周年データを取得するには至らなかったことから、本年度の研究進捗は「やや遅れている」と判定した。秋から冬にかけてのデータは既に取得済みであるが、春から夏、そして夏から秋ににかけての深度・温度記録の取得ができておらず、翌年度はこのデータの取得に積極的に取り組む必要がある。また、バショウカジキについては台湾の共同研究者が有する過去の水温・深度記録を解析に使用することの許可を得たが、カンパチについては新規でデータ取得の必要があることから、次年度のフィールド調査はカンパチに重心を置いて行うように研究計画の一部を変更する。(課題1)台湾沿岸域におけるカンパチの行動調査:本年度はカンパチを主対象に絞り標識放流を実施した。平成29年11月に台湾東部沿岸域で捕獲した状態の良い22個体に再捕獲が必要なアーカイバルタグもしくは浮上式アーカイバルタグを取り付けて放流した。

平成30年4月上旬までに最長で135日間のファインスケールの深度・温度(水温・腹腔内温度)・位置情報を得ることに成功した。これで前年度調査の再捕分を含めて合計8個体分のデータが解析可能となった。(課題2)カンパチの漁獲統計の整理:過去の漁獲統計を整理するために情報収集に努めた。(課題3)行動データの解析:平成30年4月に回収されたタグを除いた7個体分の解析結果を示す。(滞在深度・経験水温)滞在深度は平均で79±16106±29(m)、最も浅い深度が28m、最も深い深度が405mであった。一方、経験水温の範囲は12.727.4(°C)で15°C程度の範囲におよんだが、カーネル平滑分布の95%信頼区間から上限値と下限値を求めたところ17.4-23.320.9-26.9(°C)となり、個体内の水温範囲は6°C程度にとどまった。同海域に生息するシイラより広範囲の水温帯を経験していたが、熱交換係数から推定すると、本種は比較的高い断熱性をもつことにより海面には出現しないものの水温躍層の上部から躍層を越えて底層へ潜行できると考えられた。(水平移動)82日間の記録期間の個体の水平移動を見ると、放流後に黒潮を越えて東方へ約75 kmほど移動した後、2週間かけて石垣島の周辺まで北上した。それから1ヶ月かけて、東岸沿いを南下し台湾南端へ、さらに台湾海峡まで西進した。最終的に放流地点付近に戻り再捕された。移動範囲は緯度で北緯21.5824.87度、経度で東経118.5123.13度の範囲を移動していた。本年度はカンパチを研究対象種に絞ったことが功を奏して、初年度の遅れを取り戻せるのに十分なデータが取得できたことから、順調に進捗していると判断できる。昨年度の調査では渡航した時に現地に次々に台風が襲来して十分な調査時間を確保することができなかった。これをふまえて、今年度は現地での滞在期間を十分に確保したことに加えて、現地の漁業者とも円滑にコミュニケーションを図ったことが功を奏して、予定していた尾数を捕獲できたことにより前年度の遅れを取り戻すに十分な放流個体数を確保できた。一方、本年度の調査で採用したアーカイバルタグからデータを得るためには放流個体を再捕獲してタグを物理的に回収する必要があった。魚を再捕した漁業者が我々へ連絡してくれることが調査成功の鍵となると考えて、現地の研究協力者(台湾水産試験所・江偉全博士)と協同して現地の漁業団体や水産関係機関への周知、さらにはSNSを通じた情報の拡散に精力的に取り組んだ。現在までにのべ24個体の放流魚のうち、8個体の再捕に成功しており回収率は33%におよんだ。これは当初の予想を大きく上回る回収率であり、現地における本研究の調査体制は十分に確立したことを示している。現在、平成30年5月と7月にデータ取得予定の浮上式アーカイバルタグを取り付けた2個体、さらに残り12個体の放流魚の数個体のデータ回収が見込めることから、最終年度には夏季の高水温期を含んだ生息水温範囲が解析可能となる。現在でもすでに数ヶ月間の野外での行動記録に基づいて生息水温範囲の計算を終えており、最終年度に向けて研究目標は十分達成できる。最終年度はデータ解析と成果のとりまとめに専念した。(課題1)台湾沿岸域におけるカンパチの行動調査:過去2年に放流した25個体のうち16個体からのデータの回収に成功した。2017年11月に放流し翌2018年8月に再捕された個体からは258日間の深度・温度(水温・腹腔内温度)・位置情報を得ることに成功した。解析個体数は前年度から倍増の16個体に増えたので興味深い結果を得た(以下、課題3で詳述する)。(課題
Ring fingerモチーフを有する新規遺伝子SRG34の分子生物学的研究

我々はこれまで、抗うつ薬(イミプラミン、サートラリン)長期投与によりラット脳内で発現の変化する遺伝子およびEST(expressed sequence tags)を網羅的に探索する作業を続け、これまでに約200個の候補遺伝子を同定してきた。その中で、SRG#34フラグメントの部分塩基配列をもとに5'及び3'RACE(rapid amplification of cDNA ends)法により全塩基配列を決定し相同性検索を行ったところ、アルツハイマー病患者死後脳で発現が増加する遺伝子として発見されたkf-1と高相同性を示すことが明らかとなった。また、予測されるアミノ酸配列から、タンパクの折り畳みに関与していると考えられるZinc fingerファミリーであるRingfingerモチーフ(Ring-H2 fingerモチーフ)を有することが明らかとなった。RT-PCR法により発現の変化を再確認・定量したところ、コントロール群と比較し抗うつ薬長期投与群のラット海馬で約3倍、前頭葉皮質で約1.5倍の増加が確認された。しかし、単回投与、及び他の中枢神経系作動薬であるハロペリドールでは発現の増加が認められなかったことより、SRG#34の発現変化は、抗うつ薬の臨床効果に深く関与している可能性が示唆された。さらに、ラット各組織における発現をノザンブロッティング法により比較した結果、肝臓、腎臓に多く、脳、心臓にも発現しているが、脾臓、肺、骨格筋には非常に少ないか、あるいは発現が見られないことが明らかとなった。現在、作製した抗SRG#34抗体を用いて、タンパクレベルでの発現変化及び免疫組織化学的手法により分布等の検討を行っている。今後、本遺伝子がコードするタンパクの生体における生理機能を検討するために本遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを培養細胞に導入し、細胞の基本的機能である分化・増殖、細胞周期、生存について検討する計画である。さらに、遺伝子-タンパク相互作用を検討し、可能であればDNA-タンパク複合体の形成を検討するためのアッセイ系(ゲルシフト法、スーパーシフト法)を構築することを計画している。
協働効果を発揮する多様な触媒の構築が可能な系の開発

複素環の窒素原子をLewis塩基部位弱いLewis酸を酸性部位にもち,それらの協働効果による活性化効果の発現を検討するに当たり,用いる複素環の選択が必要となる。そこで,ピリジンと比べて検討例の少ないピリダジンに着目し,その特性を把握することにした。4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)は,求核触媒として汎用性が高く,特に酸無水物とアルコールからエステルを生成させる反応では,最も広く用いられている触媒であるが,対応する4ージメチルアミノピリダジンの触媒能が著しく低いことが報告されていた。そこで,5位にもアミノ基を導入し2つのアミノ基を環内に固定すれば不利を克服して触媒能が上がると考えその誘導体を検討することとした。合成に関しては,3種類の誘導体をそれぞれ4段階で合成できた。その際に,対称の4,5-ジアミノ体に加えて非対称の3,4-ジアミノ体も副生したので,その検討も行った。Et誘導体についてCD3CN中で塩基性を比較したところ,非対称体>DMAP>対称体となり,非対称体と対称体とでは,pKaの差が1のあることがわかった。また,フェナシルブロミドを求電子試薬に用いて求核性を比較したところ,CDCl3中では,非対称体:対称体:DMAP=19:6:1,C6D6中では,非対称体が溶けなかったためそれ以外について比較したところ対称体:DMAP=14:1となった。上記のエステル化反応における触媒能を検討したところ,CDCl3中では,DMAP:非対称Et体:対称Et体:非対称Bn体:対称Me体:対称Bn体の順となりおおよその速度比が9:3.5:3:3:1:1となった。ところが,C6D6中では,DMAP:対称Et体=1:2と逆転し,分子設計がある程度正しいことが示された。この結果の詳細について,論文として報告を行った(J. Org. Chem.2016, 81, 8710-8721.)。そこで,ピリジンと比べて検討例の少ないピリダジンを対象とし,性質を把握することにした。合成に関しては,3種類の誘導体をヒドラジン塩酸塩と3,4-ジクロロ無水マレイン酸からそれぞれ4段階で合成できた。ところが,C6D6中では,DMAP:対称Et体=1:2と逆転し分子設計がある程度正しいことが示された。複素環の窒素原子をLewis塩基部位弱いLewis酸を酸性部位にもち,それらの協働効果による活性化効果の発現を検討するに当たり,予備実験で,ピリジンが,塩基性が4-ジメチルアミノピジン(DMAP)と比べて低いにも関わらず十分に役割を果たすことができた。ピリダジンはピリジンと比べてさらに塩基性が低いことが知られていることから,ピリダジンも検討対象とすることにしたが,求核性が問題となることからピリダジン誘導体の性質を調べることとし,分子設計によって求核性を自在に変動させることができるかどうかを検討することにした。本来は,深追いをするつもりはなかったが,DMAPとの比較で塩基性や求核性や触媒能に関して興味深い結果が得られた。多様な研究例があるピリジン誘導体とは異なり,アミノ基置換ピリダジンについての検討の前例が1つしかなく,しかもそれがネガティブであった点からすると,本来の協働効果と直接関係がないが,有用な知見が得られたと言える。そして,この結果についてはまとめることができ,論文投稿(J. Org. Chem.)に至っている。このように,本来の協働効果についての検討に至っていない点では,「やや遅れている」と見なすことができる。

そこで,ピリジンと比べて検討例の少ないピリダジンに着目し,その特性を把握することにした。4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)は,求核触媒として汎用性が高く,特に酸無水物とアルコールからエステルを生成させる反応では,最も広く用いられている触媒であるが,対応する4ージメチルアミノピリダジンの触媒能が著しく低いことが報告されていた。そこで,5位にもアミノ基を導入し2つのアミノ基を環内に固定すれば不利を克服して触媒能が上がると考えその誘導体を検討することとした。合成に関しては,3種類の誘導体をそれぞれ4段階で合成できた。その際に,対称の4,5-ジアミノ体に加えて非対称の3,4-ジアミノ体も副生したので,その検討も行った。Et誘導体についてCD3CN中で塩基性を比較したところ,非対称体>DMAP>対称体となり,非対称体と対称体とでは,pKaの差が1のあることがわかった。また,フェナシルブロミドを求電子試薬に用いて求核性を比較したところ,CDCl3中では,非対称体:対称体:DMAP=19:6:1,C6D6中では,非対称体が溶けなかったためそれ以外について比較したところ対称体:DMAP=14:1となった。上記のエステル化反応における触媒能を検討したところ,CDCl3中では,DMAP:非対称Et体:対称Et体:非対称Bn体:対称Me体:対称Bn体の順となりおおよその速度比が9:3.5:3:3:1:1となった。ところが,C6D6中では,DMAP:対称Et体=1:2と逆転し,分子設計がある程度正しいことが示された。この結果の詳細について,論文として報告を行った(J. Org. Chem.2016, 81, 8710-8721.)。弱いLewis塩基性部位と弱いLewis酸性部位をもつ化合物として,予備的にテトラキス(o-ピリジル)スタナン(o-Py4Sn)を検討し,無水酢酸と第2級アルコールとのエステル化反応で,ピリジンのみの場合と比べて著しい活性化能があり,DMAPに迫るものであることが明らかとなった。ピリジンの数と触媒能の間に相関が存在する可能性があることからピリジン置換基を13個もつ誘導体を合成し,その触媒能を検討する。また,アルコールと(t-BOC)2Oの反応でDMAPを用いると反応させるアルコール2分子をもつ炭酸エステルが副生することが知られているが,o-Py4Snの立体効果によりそれが抑制でき,酸が発生しないために触媒が分解しないと考えられることから,DMAPに勝る触媒となりうるのでその検討を行う。さらに,塩基触媒によってアシル基が中央に転位しやすいことから困難とされているグリセリンの選択的アシル化への応用を試みる。そして,Michael付加を経たシクロプロパン化反応の触媒としての有用性も検討する。触媒についても,分解が抑えられると考えられる同族のケイ素を導入した化合物について検討する。ケイ素の場合には,Lewis酸性が不十分な場合,DMAPを導入した化合物や高配位典型元素化合物に対して抜群の安定化効果があるMartin配位子やピリジンをベースとしたMartin配位子類似の新規配位子を有する化合物を検討する。これらでは,アセチル基やCO2との反応によって5配位の三方両錐構造を安定化できる構造となっているため,5配位化が促進されると期待できる。特に,CO2捕捉体においては,CO2部位に形式電荷が乗らないため,CO2捕捉剤としての期待が大きい。
視覚誘導性眼球運動における運動の促進と抑制のメカニズムに関する研究

私たちが「良く見る」ことができるのは、眼の動き(眼球運動)が巧みに調節されているからである。本研究では、視覚刺激の動きで誘発される眼球運動反射を対象とし、その眼球運動反射の制御に関係する運動調節機構について調べた。見ている対象物が、静止しているか動いているかに応じて眼球運動の大きさが異なること等、時々刻々の状況に応じて運動を適切に調節するメカニズムについて、その理解を促進する数多くの所見を得た。本研究では、静止注視点の存在が眼球運動発現へ及ぼす影響を詳しく調べることで、注視行動を実現する時働く脳の運動抑制機構(以下、注視システムと呼ぶ)を詳細に理解することを目的としている。ヒトを被験者とした行動実験、統計学的手法を用いた解析およびモデル構築・シミュレーション技術を利用した解析を行い、注視システムの神経機構の理解を進めていく計画である。平成20年度において、種々の眼球運動反応における注視システムの影響を調べるための実験設備の準備および所期の目的を達成するための行動実験課題を確立し、その実験課題を用いてヒト被験者の眼球運動を記録した。視運動性反応における運動抑制機構について詳細に調べる実験を実施し、視運動性反応の視覚-運度変換のゲインがヒト被験者の行動に応じて変化し、静止した視標を注視している時には非常に低くなることを明らかにした。この結果の一部は平成20年度3月の学会で発表し、また残りの一部は平成21年度7月の国際生理学会大会で発表する予定である。また、視運動性反応抑制課題遂行中のヒト被験者の眼球運動を詳細に調べ、静止注視点を固視している時の視覚-運動変換のゲインは、同時に呈示される視覚刺激の動きに依存し、同方向の場合には非常に低くなることを明らかにした。この結果の一部はExp Brain Resに投稿し既に受理されている。さらに、静止注視点の存在がサッケード運動の発現に及ぼす影響、円滑追跡眼球運動の発現に及ぼす影響、視運動性反応の発現に及ぼす影響について詳細に調べた。その結果、これらの眼球運動の発現における静止注視点の存在の影響は互いによく似ていることがわかってきており、共通の神経機構の存在を示唆する点で重要な所見と考えている。本研究は、静止注視点の存在が視覚誘導性眼球運動の発現に及ぼす影響を詳しく調べることで、注視行動を実現する時に働く脳の運動抑制機構(注視システム)を理解することを目的としている。以下に当該年度の主要な成果を示す。(1)広い視野を覆う視覚刺激を動かすことによって反射的に誘発される眼球運動反応(追従眼球運動)を詳細に調べ、その反応の大きさが、静止した対象を注視している時と動く対象を追跡している時とでは異なり、静止した対象を注視している時には非常に小さくなることが明らかとなった。さらに、この行動に基づく反応の変化が、この眼球運動を司る神経経路の出力に近い部分で起ることを強く示唆する所見を得た。この結果はJ Neurophysiolに掲載された。(2)静止した対象を注視している場合でも、同時に呈示される動く対象に注意を向けている時(心の眼で追跡する時)には、注視行動に基づく運動抑制の効果が低くなることがわかった。実際に行っている行動だけでなく、被験者の注意の移動等の内的な要因の関与も示唆される。この結果は国際生理学会大会で発表した。(3)静止注視点の消失と運動開始のタイミングを様々に変えて、静止注視点の消失が種々の眼球運動(追従眼球運動反応、サッケード運動、円滑追跡眼球運動)の発現に及ぼす効果を調べ、その効果が全ての眼球運動反応で非常に似ていることがわかった。本研究の結果から、脳の運動抑制機構には視覚要因、行動要因および被験者の注意等の内的要因(心的要因)が関与することがわかり、また同じ機構が全ての眼球運動に作用している可能性を示した。本研究で研究対象としている、時々刻々変化する状況の中で運動を合目的的に調節する機能は、脳の柔軟な運動制御の基盤となっていると考えられる。これは、我々がまだ理解できていない重要な脳機能の一つであるが、本研究の結果はその脳機能の理解をさらに進展させるものである。
脂肪滴特異的脂質代謝酵素に着目した脂肪滴形成機構の解析

本研究によって、哺乳類細胞の脂肪滴上で中性脂質合成が行われている可能性が提示され、その際脂肪滴上のアシルCoA合成酵素が重要な役割を果たすことが示唆された。ヒト肝由来培養細胞をモデルとした場合、細胞の周縁部に存在する脂肪滴で中性脂質合成が盛んであるとの状況証拠が得られた。また、脂肪滴特異的脂質代謝酵素に緑色蛍光蛋白を融合させた蛋白は、生細胞中で発現させると脂肪滴表面に蛍光が観察されることから、脂肪滴の動態観察に有効と考えられた。脂肪滴は細胞内における中性脂質貯蔵装置であり、脂肪滴形成は肥満、脂肪肝、動脈硬化などの生活習慣病の発症と関与している。本研究課題は、脂肪滴に存在する脂質代謝酵素に着目することで、脂肪滴の形成および消失のメカニズムを明らかにすることを目的としている。今年度の研究では、主に次の2っのことを明らかにした。1.脂肪滴消失系についての解析細胞内のアシルCoA合成酵素活性を阻害した場合に脂肪滴が退縮するが、今回の研究では、脂肪滴退縮過程にリパーゼなどの脂質代謝酵素が関与するか否かを調べた。オレイン酸存在下で1日培養することによって細胞内に脂肪滴を形成させた後、アシルCoA合成酵素の阻害剤であるtriacsin Cを添加してさらに培養を続けると、脂肪滴の消失がみられた。この際、triacsin Cの添加と同時に脂質加水分解酵素の阻害剤であるtetrahydrolipstatinも添加したところ、脂肪滴の消失は強く抑制された。したがって、脂肪滴の消失過程には脂質加水分解酵素が関与することが考えられた。2.脂肪滴形成系についての解析脂肪滴にアシルCoA合成酵素が存在することから、脂肪滴でアシルCoAが産生されるものと考えられたが、このアシルCoAが脂肪滴上で利用されうるか否かを調べた。単離した脂肪滴を^<14>C標識オレオイルCoAと反応させ、反応産物を薄層クロマトグラフィーで解析したところ、放射標識されたtriacylglycerolとcholesteryl esterの産生が検出され、脂肪滴が中性脂質合成能を有していることが明らかとなった。この結果から、脂肪滴上のアシルCoA合成酵素は脂肪酸を材料としてアシルCoAを供給し、それによって中性脂質合成が促されて脂肪滴形成が進行するものと考えられた。これらのメカニズムは脂肪滴形成の初期過程や脂肪滴の発達過程に寄与しているものと考えられる。昨年度までの研究では、細胞内で脂肪酸を基質として中性脂質が生合成される際に、脂肪滴に存在するアシルCoA合成酵素が重要なことを示す結果を得ている。この成果をふまえ、今年度の研究では、細胞内における脂肪滴の形成部位を明らかにすることをめざした。ヒト肝由来培養細胞HuH7をNile redで染色したところ、細胞の周縁部に穎粒状の蛍光が観察された。Nile redは疎水性色素であり、生体内では中性脂質との親和性が高いことを考慮すると、脂肪滴が細胞の周縁領域に分布しているものと考えられた。これを検証する目的で、蛍光標識脂肪酸を細胞に投与し、中性脂質の合成部位の検出をこころみた。その結果、やはり細胞周縁部に顆粒状の蛍光が検出され、細胞周縁部の脂肪滴で中性脂質合成が盛んなことが示唆された。一方、脂肪滴は細胞の中央部分には少量しか検出されないことから、細胞中央付近の脂肪滴の分布について、他のオルガネラの分布との比較を行った。その結果、脂肪滴は核の存在する領域には検出されず、また、ゴルジ特異的蛍光染色との比較から、ゴルジ体の分布する領域にも脂肪滴は殆ど存在しないことがわかった。これらの結果から、中性脂質合成とそれに引さ続く脂肪滴の形成は細胞の周縁部分からはじまり、脂肪滴形成の進展にともなって細胞の中心方向へと進行していくことが考えられた。これまでの研究から、脂肪滴に特異的に存在する脂質代謝酵素として、17β-hydoxysteroid dehydrogenase11(17βHSD11)を見いだしている。今年度の研究では、生細胞中での脂肪滴の生理的な動態の観察が可能な系を確立する目的で、17βHSD11のC末端側にGFPを融合させた蛋白の細胞内発現を試みた。17βHSD11-GFP発現ベクターを作成し、ヒト肝

由来培養細胞株HuH7にトランスフェクトして細胞内分布を観察した結果、脂肪滴と考えられる球状の細胞内顆粒の表面に緑色蛍光が観察された。細胞に脂肪酸の1種であるオレイン酸を投与して脂肪滴の発達を促進させたところ、蛍光を発する顆粒の大きさも増大していた。また、同様の手法によって、ペプチドトランスポーターの一種であるTAPL(ABCB9)のC末端にGFPを融合させたコンストラクトにっいても細胞内分布を調べた。この場合にも、蛍光は球状の細胞内顆粒の表面に観察されたが、この蛍光は蛍光標識デキストランを貪食させた場合のシグナルやリソソームマーカと局在が一致することから、TAPL-GFPはリソソームに局在しており、脂肪滴とは分布が異なっていた。これらの結果から、17βHSD11-GFPは脂肪滴に特異的に分布しているものと考えられた。さらに、17βHSD11-GFP安定発現株の樹立を試みた。緑色蛍光を発するコロニーが1つ観察され、コロニーの細胞数を1000ヶ程度にまで増殖させることに成功した。しかし、その後の限界希釈によるサブクローニングでは細胞は漸次死滅した。
「議会運営における時間」に関する比較研究

(1)本共同研究の目的・課題:本共同研究は、密接な関わりを有する「議会と時間」をめぐる諸問題を国際的な視野で検討することにより、日本の国会が直面している議会審議と運営に関わる問題点を明らかにするとともに、それを解消するための方策を探究しようとするものである。平成30年度は、主に、外国(特にフランス)の研究者と日本の実務家との意見交換を通じて問題点とそれを解決するための処方箋の明確化に努めた。また、フランスでのワークショップの合同開催により、国際的な学術交流も試みた。(2)研究会の開催:平成30年7月に、フランス・サンテチエンヌ大学のDisant教授を本科研費で招聘し、北海道大学、慶應大学、同志社大学で「議会・時間・憲法院」の三者関係に関わる問題点についての報告をしてもらった。また12月には東京で、国会図書館と議院法制局の職員を招いて研究会を開催し、「議会運営における時間」をめぐる諸問題についての意見交換を行った。会期不継続の原則を廃止した場合の問題点など、研究者がなかなか気がつかない論点を知ることができ有益であった。(3)国際ワークショップの合同開催:平成31年3月に研究代表者と分担者が渡仏し、リール大学(テーマ:「議会と時間」ーフランスと日本の視点の交錯)とINALCO(テーマ:日本における民主主義、憲法及び議会)で研究成果の一部を公表するためのワークショップを合同で開催し、フランスの研究者や学生と意見交換を行った。フランスに限定されるが、日本の憲法や議会に関する国際的な情報発信を行うことができたように思う。(1)実務家を招いての研究会の開催により、研究者だけの共同研究では視野に入ってこない問題点を知ることができるとともに、「議会と時間」の関係について日本の国会が直面している諸問題を克服するために検討しなければならない論点がより明確になった。(2)主にフランスの研究者との意見交換を通じてであるが、「議会と時間」をめぐる問題が特殊日本的なものではなく、「普遍的な問題」であることが理解できた。したがって、問題解消のための基本視角を国際的視野で探究することの重要性が分かった。(3)フランスでのワークショップの合同開催により、情報や知見の国際的な一方通行ではなく、双方向的な学術交流に微力ではあるが貢献できたように思う。(1)共同研究の成果をまとめた論文集を刊行する(出版助成を得て来年初めまでに刊行予定)。(2)本年9月にジュネーブにある列国議会同盟の職員と本共同研究の成果について意見交換を行う。(3)来年3月に東京で、外国の研究者と日本の実務家を招聘して国際シンポジウムを開催し、「議会運営をめぐる時間」に関する問題点を総括することを試みたい。(1)本共同研究の目的・課題:本共同研究は、「議会運営における時間」の問題を国際的な視野で研究することにより、問題の所在を明らかにするとともにそれを解消・克服するための方策を探究しようとするものである。具体的には、「会期制」、「議事日程」、「議事協議機関」を取り上げ検討することを課題として設定しているが、平成29年度は、主に、研究組織全体における問題意識の共有と課題の明確化を図るべく、外国(イタリアとフランス)での調査に加えて、研究会の開催と国際的なワークショップで中間報告を行った。(2)研究会の開催(札幌):平成29年8月に、国会運営や国会審議のあり方について鋭い問題提起を行ってきている大山礼子氏(駒澤大学)を招聘し、「日本の立法過程ー国際比較から見た国会審議の特色と問題点ー」というタイトルで報告をしてもらい、共同研究に参加している研究者との間で意見交換を行った。(3)外国(イタリア・フランス)での調査:平成29年9月に、イタリアとフランスの憲法裁判所・憲法院と下院を訪問し、裁判官や議会職員にヒアリングを実施した。このヒアリングにより、それぞれの国における国会審議のあり方やそれに対する憲法裁判所の関与の仕方等について意見交換を行った。フランスでの調査に当たっては、事前に質問票を送付しそれに回答を得る形でヒアリングを実施した。ヒアリングの内容については、コメントを付して近々公表する予定である。なお、憲法院と国民議会での調査終了後、リール大学で開催された国際シンポジウム「法律の制定」に参加し、欧州主要国の議会制度研究者と意見交換を行った。(3)国際ワークショップでの報告(広島):平成30年3月に、広島大学で開催された「日仏公法セミナー」において、研究代表者と研究分担者2名が、研究成果の一部をフランス語で報告し、フランス人研究者と意見交換を行った。(1)大山礼子氏を招聘した研究会の成果として、国際比較から見た日本の国会審議の特色と問題点について、研究組織全体における問題意識の共有と課題の明確化を実現することができた。たとえば、自民党における法案の事前審査の国会審議に及ぼしている影響や会期不継続の原則の見直しの必要性などである。(2)外国での調査は、対象国がいずれも二院制を採用していることもあって、国会運営において直面している問題の共通性が理解できたが、他方において、政党状況や国会議員の個性、更には違憲審査制の違いが立法や国会運営のあり方に与えている影響について検討する必要性を強く感じた。(3)国際ワークショップでの報告によって、研究成果の一部をフランス人研究者に発信することができた。本共同研究の柱の一つである学術的な国際交流の一端は実現できたように思われる。

ただし、それは対象と内容のいずれの面でもいまだ部分的・片面的なものにとどまっており、今後は共同研究の内容を深めるとともに、双方向的な学術交流が必要となろう。(1)本共同研究の目的・課題:本共同研究は、密接な関わりを有する「議会と時間」をめぐる諸問題を国際的な視野で検討することにより、日本の国会が直面している議会審議と運営に関わる問題点を明らかにするとともに、それを解消するための方策を探究しようとするものである。平成30年度は、主に、外国(特にフランス)の研究者と日本の実務家との意見交換を通じて問題点とそれを解決するための処方箋の明確化に努めた。また、フランスでのワークショップの合同開催により、国際的な学術交流も試みた。(2)研究会の開催:平成30年7月に、フランス・サンテチエンヌ大学のDisant教授を本科研費で招聘し、北海道大学、慶應大学、同志社大学で「議会・時間・憲法院」の三者関係に関わる問題点についての報告をしてもらった。また12月には東京で、国会図書館と議院法制局の職員を招いて研究会を開催し、「議会運営における時間」をめぐる諸問題についての意見交換を行った。会期不継続の原則を廃止した場合の問題点など、研究者がなかなか気がつかない論点を知ることができ有益であった。(3)国際ワークショップの合同開催:平成31年3月に研究代表者と分担者が渡仏し、リール大学(テーマ:「議会と時間」ーフランスと日本の視点の交錯)とINALCO(テーマ:日本における民主主義、憲法及び議会)で研究成果の一部を公表するためのワークショップを合同で開催し、フランスの研究者や学生と意見交換を行った。フランスに限定されるが、日本の憲法や議会に関する国際的な情報発信を行うことができたように思う。(1)実務家を招いての研究会の開催により、研究者だけの共同研究では視野に入ってこない問題点を知ることができるとともに、「議会と時間」の関係について日本の国会が直面している諸問題を克服するために検討しなければならない論点がより明確になった。(2)主にフランスの研究者との意見交換を通じてであるが、「議会と時間」をめぐる問題が特殊日本的なものではなく、「普遍的な問題」であることが理解できた。したがって、問題解消のための基本視角を国際的視野で探究することの重要性が分かった。(3)フランスでのワークショップの合同開催により、情報や知見の国際的な一方通行ではなく、双方向的な学術交流に微力ではあるが貢献できたように思う。本共同研究の課題である「議会運営における時間」に関わる諸問題の解消・克服のための方策を明らかにするために、国際的な観点からの比較研究を深めるとともに、研究会を通じて議会実務家との交流を推進することを考えている。後者の作業は、方策を提言という形で具体的化するために不可欠なプロセスと位置づけられよう。具体的には、以下のような活動を予定している。(1)国際的なワークショップの開催:フランスのリール大学で「議会と時間」という共同研究プロジェクトを遂行しているグループと共催でワークショップを開催することによって、「議会と時間」をめぐる諸問題を共通の問題意識の下に異なった角度から掘り下げた意見交換を行い、議会運営に関わるパラダイム的なものを明らかにし、それを世界に発信することを考えている。このワークショップを平成30年9月に、リールで開催するべく計画を進めている。
子宮内膜の脱落膜化不全病態に関わるプロテアーゼの同定及び非侵襲的臨床診断法の開発

不育症の病態解明と流産を早期に予知する非侵襲的診断法の確立を目的とし、不育症患者の妊娠初期子宮頸管粘液(CM)及び流産後脱落膜中のIL-33とその活性制御に関わるカテプシンG(CTSG)、ST2の発現量を測定し、妊娠予後及び胎児染色体異常の有無との関連を検討した。結果、CM中のCTSGは流産群、特に胎児染色体正常群で有意に高値であった。また生児獲得群でみられるIL-33とCTSG、St2との正、負の相関関係が流産群では認められなかった。IL-33、CTSG、St2バランスの異常が不育症病態に関与し、またそれらのアンバランスが妊娠初期のCMで検出可能であり流産の予測因子になる可能性が示唆された。【目的】近年妊娠出産の高年齢化が著しいが、流産等の妊娠合併症の発症率は母体年齢とともに上昇する。流産を繰り返す不育症の病態解明及び、流産を早期に予知し治療に結びつけるための非侵襲的診断法の確立を目的とする。妊娠極初期の妊娠維持機構(子宮内膜の脱落膜化や絨毛形成)はホルモンやサイトカインにより活性化された蛋白分解酵素(プロテアーゼ)やその内因性インヒビターによる調節機構が関与していると考えられ、今年度は着床に関与するとされるIL-33及びIL-33の活性化に関わるとされるcathepsin G(CTSG)に焦点をあて脱落膜及び子宮頸管粘液中での発現を検討した。【方法】倫理委員会の承認を得て、患者同意のもとに実験を行った。流産手術時に得られた脱落膜組織におけるIL-33とCTSGの発現を免疫組織染色法(IHC法)で確認し、胎児染色体異常群(n = 19)と正常群(n = 15)のIL-33及びCTSGの発現量をELISA法で測定し比較した。また反復流産患者(n = 59)の妊娠初期頸管粘液中のIL-33及びCTSGとその後の妊娠帰結を流産群(n = 25)と出産群(n = 33)とで前方視的に検討した。【結果】IHC法にて流産脱落膜組織中にIL-33とCTSGの発現が認められた。脱落膜中の発現量はともに胎児染色体異常の有無で有意差はみられなかった。妊娠初期頸管粘液中CTSGは両群間で差は認められなかったが、IL-33は流産群17.14±11.56(median±IQR、以下同様)pg/mL、出産群0.00±3.90pg/mLで有意に高値であった(p<0.05)。【結論】IL-33及びCTSGが反復流産病態に関与し、妊娠初期頸管粘液中IL-33の上昇が流産の予知因子となりうる可能性が示唆された。妊娠予後が判明する前の妊娠極初期に採取した子宮頸管粘液中のIL-33の発現量を前方視的に検討し、その後流産した群で有意に高値であるという結果が得られた。この結果は、子宮頸管粘液中のIL-33が妊娠予後を予測する因子としてのバイオマーカーとなりうる可能性を示唆するものであると共に、不育症の病態解明に結びつく可能性も示唆している。脱落膜組織中の発現の検討ではIHC法で抗IL-33抗体と抗CTSG抗体の染色性は形態学的に異なる細胞に認められたがその発現部位の詳細な検討は今後の課題である。脱落膜組織中のIL-33、CTSGの発現量はELISA法にて染色体異常群と正常群とで有意差は認められなかったが、研究対象となった症例数が今年度分ではまだ少ないため、症例数を増やすことで有意差が得られる可能性がある。〈目的〉流産を繰り返す不育症の病態解明及び、流産を早期に予知し治療に結び付けるための非侵襲的診断法の確立を目的とする。今年度は、昨年度検討した着床に関与するとされるIL-33と、その活性化に関わるcathepsin G (CTSG)について、脱落膜及び子宮頸管粘液中における発現量を症例数を増やして検討する。また両者の組織内の局在についても検討する。〈方法〉本研究は倫理委員会の承認を得て、患者同意のもと実験を行った。流産手術時に得られた脱落膜組織におけるIL-33とCTSGの発現と局在を免疫組織染色法(IHC法)で確認し、胎児染色体異常群(n = 59)と正常群(n = 34)のIL-33及びCTSGの発現量をELISA法で測定した。また不育症患者の妊娠初期頸管粘液中のIL-33及びCTSGとその後の妊娠帰結を流産群(n = 22)と出産群(n = 48)とで前方視的に検討した。〈結果〉IHC法にて流産脱落膜組織中にIL-33とCTSGの発現が認められたが、発現量はともに胎児染色体異常の有無で差はみられず、組織内局在の違いは明らかでなかった。妊娠初期頸管粘液中CTSGは流産群2.82±8.26 (median±IQR、以下同様)ng/mL、出産群0.50±1.70

ng/mLで有意に高値であり(p<0.05)、更に流産群において胎児染色体正常群の妊娠初期頸管粘液中CTSG発現量(14.95±10.68ng/mL、n = 4)が胎児染色体異常群(1.96±3.07ng/mL、n = 14)より有意に高値であった(p<0.05)。IL-33は両群間で有意差はないものの、CTSGと同様に流産群、特に胎児染色体正常群で高値である傾向が認められた。〈結論〉IL-33及びCTSGが反復流産病態に関与し、妊娠初期頸管粘液中CTSGの上昇が流産の予知因子となりうる可能性が示唆された。妊娠帰結が判明する前の妊娠ごく初期に子宮頸管粘液を採取しその予後を前方視的に検討したところ、流産に至った症例ではCTSGの発現量が有意に高値であるという結果が得られた。特に胎児染色体正常群、すなわち母体因子による流産と思われる症例でCTSGの発現量が有意に高値であったことから、子宮頸管粘液中のCTSGが妊娠予後を予測するためのバイオマーカーとなりうる可能性を示唆するだけでなく、治療に結び付く可能性も示唆している。なぜなら胎児染色体数は通常受精・着床時から不変であり胎児因子による流産の予防は難しいが、母体因子の場合は妊娠判明後の介入でも予後改善が期待できるからである。但し今回までの検討では流産群の内、胎児染色体正常群及び異常群の症例数に偏りがあり、結論付けるにはまだ症例数が不十分であると思われるため更に症例の蓄積が必要である。また不育症におけるCTSG、IL-33の役割についての詳細な病態解明も今後の課題である。脱落膜組織中の発現及び局在の検討では、IHC酵素法で抗IL-33抗体と抗CTSG抗体の染色性が各々形態学的に異なる細胞に認められたため、その発現部位を詳細に検討するため蛍光多重染色法を行ったが特徴的な差異は捉えることができていない。染色条件や選択抗体を変えて改めて解析することで更なる結果が得られる可能性がある。脱落膜組織中のIL-33及びCTSGの発現量は染色体異常群と正常群とで有意差は認められなかったが、解析に使用した材料が流産後の組織であるため、流産に至る経過での局所の炎症反応や免疫系の変化により修飾を受けた結果を反映している可能性がある。今回の検討で、妊娠経過中の状況を鋭敏に示していると考えられる子宮頸管粘液で有意な結果が得られたことは臨床的にもより有意義であると思われる。〈目的〉前年度までの結果で原因不明不育症患者の妊娠初期子宮頸管粘液中のカテプシンG(CTSG)の発現が流産群特に絨毛染色体正常流産群で有意に高値であり、妊娠初期CTSGの上昇が染色体正常流産の予知因子となる可能性が示唆された。一方、CTSGによって活性型となるIL-33に関しては妊娠初期子宮頸管粘液中で検出され、有意差は得られなかったものの、CTSG同様に絨毛染色体正常流産群で高値である傾向が認められた。そこで子宮頸管粘液中のIL-33がCTSG以外の因子により調節されている可能性を考え、今年度はIL-1受容体ファミリーに属しIL-33のデコイ受容体として機能するST2の発現量を検討した。IL-33/ST2伝達経路は不育症病態、特に着床時の受精卵の選別に重要な役割を果たしているとの報告があるが子宮頸管粘液での発現は未だ報告がない。〈方法〉IL-33の解析を行った同患者の妊娠初期子宮頸管粘液を用いST2の発現量をELISA法にて測定し、その後の妊娠帰結を流産群(n = 22)と出産群(n = 48)とで前方視的に検討した。更に流産群については絨毛の染色体検査の結果により胎児染色体異常群(n = 14)を対照とし、胎児染色体正常群(n = 4)を対象として検討した。IL-33とST2の発現量の相関関係についても検討を行った。〈結果〉妊娠初期頸管粘液中ST2は、流産群と出産群の間で発現量の有意差は認められなかった(P = 0.75)。一方IL-33とST2の相関関係については、出産群において有意に軽度の正の相関が認められた(r = 0.37, p = 0.03)のに対し、流産群においては有意な相関関係は認められなかった。〈結論〉