hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
改造ダイズタンパク質遺伝子の導入によるジャガイモの改質

遺伝子工学的に改変したダイズ貯蔵タンパク質グリシニンが、ジャガイモにおいて安定して蓄積できるかどうかを解析した。ジャガイモの主要貯蔵タンパク質であるパタチンのクラスIプロモータと、ダイズグリシニンA1aB1bサブユニットの改造遺伝子あるいは非改造遺伝子を植物用バイナリーデクターpBl101に連結した。そして各遺伝子コントラクトを、アグロバクテリウム法によりジャガイモに導入した。形質転換体の葉よりDNAを抽出してサザンブロッティングを行ったところ、いずれのものもジャガイモのゲノム当たり1ないし数コピーのグリシニン遺伝子が組み込まれていた。また、形質転換体の葉および塊茎よりRNAを抽出したノーザンブロッティングを行ったところ、塊茎のみにおいてグリシニン遺伝子の転写産物が検出された。このことは、パタチンクラスIプロモータの塊茎特異的活性が維持されたことを示している。次に、塊茎よりタンパク質を抽出してグリシニンの発現量を調べた。発現レベルは固体間で差異がみられたが、改造型あるいは非改造型による差異は少なく、全可溶性タンパク質当たり細孔10.2%検出された。抽出したタンパク質をショ糖密度勾配遠心にかけたところ、いずれの発現タンパク質とも78Sに相当する画分に沈降し、3量体を形成していると考えられた。電子顕微鏡を利用した免疫組織化学的観察の結果、発現タンパク質は柔細胞の細胞全体に分布しており、液胞にソーティングされたものと考えられた。しかしながら、還元剤の存在下でのSDS-PAGEパターンは、還元剤非存在下でのそれと変わらず、成熟型へのプロセッシングは受けていないと考えられた。以上により、改造型および非改造型ダイズグリシニンがジャガイモ塊茎において蓄積できること、しかもダイズ種子での生合成過程におけるのと同様に分子集合できることが判明した。
A型インフルエンザウイルスに潜状感染した脳脊髄で合の子ウイルスが誕生するか?

1.強毒トリインフルエンザウイルスはマウスの脳に持続感染する強毒トリインフルエンザウイルスの経鼻接種により多くのマウスは脳炎によって死亡するが、生き残ったマウスの脳を調べたところ、接種後48日まで脳病変、ウイルス抗原およびウイルスRNAが残存していた(Vet.Microbiol.,2003)。インフルエンザウイルスは8本のRNA分節から成っているが、PB2を除く7本の分節がこれらマウスの脳組織中に証明され、インフルエンザウイルスが脳組織中に持続感染する可能性が示された。2.ウイルスゲノムはマウスの脳に感染後60日まで残存するHsN3亜型の強毒トリインフルエンザウイルスを経鼻接種されて生き残った43匹のBALB/cマウスの脳を接種後180日まで経時的に病理検索し、接種後60日までウイルスゲノムが脳組織中に残存することが分かった。3.新しいインフルエンザウイルスが持続感染した脳で誕生する可能性少ない前項と同じHsN3亜型の強毒トリインフルエンザウイルスをBALB/cマウスに経鼻接種し、接種後20日後に別の亜型のインフルエンザウイルス(A/WSN/33(H1N1))を脳内接種(重感染)した。重感染より6日後に脳組織を採材し、ウイルス分離、ウイルスゲノム検索および病理検査を行った。しかしながら、重感染させた脳組織からウイルス粒子は分離されず、両亜型ウイルスゲノムの再集合も見られなかった。これは重感染ウイルスが宿主免疫によって脳から排除されたことを示している。従って、脳内に残存しているインフルエンザ、ウイルスゲノムが重感染した別のインフルエンザウイルスにレスキューされ、新しい合の子ウイルスが脳内で誕生する可能性は低いことが実験的に確認された。1.インフルエンザウイルスがマウスの脳に潜伏感染することの証明神経病原性トリインフルエンザAウイルス24a5b株(H5N3)を137匹のBALB/cマウスに経鼻接種したところ、98匹が感染を耐過した。感染後24日から48日まで4日おきにマウスを屠殺剖検し、脳および肺における組織病変、ウイルス抗原およびウイルスゲノムの消長を検索した。その結果、1)肺においては組織病変、抗原、ゲノムが感染耐過後速やかに消失するが、脳ではそれらのすべてが遺残すること、2)インフルエンザウイルスの8本のゲノム文節のうち、7本が感染後48日になっても脳に存続していること、3)上記事象は免疫抑制によって影響を受けないこと、を証明した。この結果を論文に纏め、Veterinary Microbiologyへ投稿した。2.潜伏感染したウイルスゲノムをもとに合の子ウイルスが誕生することの証明神経病原性トリインフルエンザAウイルス24a5b株(H5N3)をBALB/cマウスに経鼻接種し、感染20日後に免疫抑制処置し、別の神経向性強毒インフルエンザウイルスA/Hong Kong/483/97(H5N1)を経鼻接種したが、H5N1株で脳炎を発生させることはできなかった。これは、免疫抑制処置が不十分なため、H亜型が同じウイルスを再感染させることができなかったものとおもわれる。この実験では、ウイルス接種プラス免疫抑制マウスに限って肺胞上皮細胞の腺腫様増殖を伴う間質性肺炎が発生したので、その原因を検査中である。次に、H亜型の異なる神経向性強毒株A/WSN/33(H1N1)とH5N3株の重感染実験を行う。H1N1株には病原性の異なる株が含まれているので、プラークアッセイによって多数の株を拾い、それらの中から神経向性の強い株を選抜する実験を進めている。
急性白血病におけるゲノム薬理学を応用したテーラーメイド治療の確立

代表的抗白血病薬シタラビン(Ara-C)につき、ゲノム薬理学を応用したテーラーメイド治療の確立に向け、検討した。(1)Ara-Cの最終活性型である白血病細胞DNA内転入薬剤濃度の微量定量法を確立した。本法によりAra-C処理された培養白血病細胞DNA内濃度は、^3HAra-Cによる対照値に近似し、本法の妥当性が確認された。本法によりAra-C中等量投与中の2名の患者において経時的に白血病細胞DNA内濃度を、血中濃度、細胞質内濃度とともに測定した。1名ではいずれの濃度も投与後6時間で測定限界値以下に減衰したが、もう1名では血中、細胞内濃度とも遷延し、DNA内濃度は経時的に増加した。血中濃度、細胞内濃度の維持が薬剤のDNA内転入に重要であると考えられた。またDNA合成を停止させる為に必要なAra-C濃度は患者毎の白血病細胞で異り、DNA内薬物動態に基くテーラーメイド化の可能性が示唆された。(2)DNAマイクロアレイを用いた感受性予測の為、Ara-C耐性化関連因子を抽出する為、5つの造血細胞種(骨髄系1種、造血幹細胞系1種、単球系2種、リンパ球系1種)に対しそれぞれ臨床的耐性レベルに近い10倍前後のAra-C耐性細胞を樹立した。これらの細胞からcDNAマイクロアレイによる遺伝子プロファイルを比較解析し耐性に関与する遺伝子同定を行った。細胞間で認めた有意な共通の発現変化はHSPA8,C19orf2,PSAP, POU4F3,MBC2,LGALS1,CACNA2D3,AKT1の8遺伝子であった。しかし、いずれも発現レベルに2倍以上の明らかな変化は示さず、既知の耐性遺伝子であるhENT1, DCK, 5NTの発現は各細胞で異なっていた。以上より同様な条件でAra-C耐性化を誘導しても耐性機序は細胞株毎に異なることが示された。今後個々の症例でAra-Cの耐性機序につき本法により網羅的にスクリーニングし、Ara-Cに対する感受性を予測することでのテーラーメイド化が期待された。代表的抗白血病剤ヌクレオシドアナログ、シトシンアラビノシド(1-beta-D-arabinofuranosylcytosine,ara-C)の最終活性型代謝物であるDNA内転入ara-Cの微量定量法を確立した。本法は白血病細胞からの酸不溶性分画の抽出、酸不溶性分画からDNAの分離、DNAからヌクレオシドへの分解、ヌクレオシドからara-Cの分取からなり、最終的に得られたara-Cをラジオイムノアッセイにより測定した。測定法の各段階の回収率はいずれも90%を超えた。培養白血病細胞をara-Cで処理し、本法によりDNA内転入ara-C量を測定したところ、転入量はara-Cの濃度依存性、時間依存性に増加した。測定値の変動幅は約30%で、測定結果は放射性同位元素標識ara-Cを用いた比較実験の測定値と極めて近似し、本法の妥当性が確認された。本法を用いて、ara-C投与後の患者白血病細胞DNA内ara-C転入量を測定した。

急性骨髄性白血病患者(72歳、女性)において2度ara-C(lg/m^2)が1時間点滴静注で投与され、点滴終了5時間後にDNA内ara-C転入量はそれぞれ15、35(pmol/1x10^7cells)であった。以上より本法は臨床応用可能であると考えられた。またara-C耐性細胞に共通のゲノムレベルの変化の有無を確認するため、造血細胞の各lineageのcell lineにつき、各々の耐性細胞を作成中である。耐性細胞株樹立後は、microarray等による解析を計画している。代表的抗白血病剤ヌクレオシドアナログ、シトシンアラビノシド(1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, ara-C)の最終活性型代謝物であるDNA内転入ara-Cの微量定量法を確立した。本法によりDNA内転入ara-C量を測定したところ、転入量はara-Cの濃度依存性、時間依存性に増加した。測定値の変動幅は約30%で、測定結果は放射性同位元素標識ara-Cを用いた比較実験の測定値と極めて近似し、本法の妥当性が確認された。またara-C耐性細胞に共通のゲノムレベルの変化の有無を確認するため、造血細胞の各lineageのcell lineにつき、各々の耐性細胞を作製した。樹立した耐性細胞株はmyeloid系のHL60,K562,単球系のTHP1,Tリンパ球系のCEM,組織球系のU937の計5細胞でそれぞれAra-Cに10倍前後耐性を示している。同時に他の抗癌剤に対する交差耐性の有無も検討中であり、MIT(mitoxantron)に対しては交差耐性を示していなかった。VP16(etoposide)にはCEMのみが交差耐性を示し、AraCと同じヌクレオシドアナログであるdFdC(gemcitabine)に対してはK562以外が交差耐性を示し、F-ara-A(fludarabine)は逆にK562以外交差耐性を示さなかった。さらに他の数種類の抗癌剤で交差耐性の有無を確認する予定である。今後5つのcell lineageのmicroarrayによる解析を行い、耐性に関与する遺伝子同定を予定している。ゲノムレベルでの治療薬物モニタリング(GenomicTDM)及びマイクロアレイによる耐性診断を用いてのテーラーメイド医療の可能性を代表的抗白血病薬Ara-Cにつき検討した。代表的抗白血病剤シタラビンの最終活性型代謝物である白血病細胞DNA内転入薬剤濃度の微量定量法を確立し,臨床的に腫瘍細胞DNA内の治療薬物モニタリングを施行した。シタラビン中等量投与後の2名の白血病患者においてインフォームドコンセントを取得の上,経時的に採血し本定量法によりDNA内濃度を測定した。また血中濃度,腫瘍細胞質内濃度を同時に測定した。患者1では血中シタラビン濃度,細胞内シタラビン濃度,DNA内シタラビン濃度とも緩やかに減衰し,投与終了6時間後に測定限界値を下回った。患者2では血中シタラビン濃度,細胞内シタラビン濃度とも患者1に比べ遷延した。DNA内シタラビン濃度はむしろ経時的に増加した。血中濃度,細胞内質濃度の維持が薬剤のDNA内転入に重要であると考えられた。またDNA合成を停止させる為に必要なシタラビン濃度は患者個々人の白血病細胞で異なる事が示唆され,シタラビン治療の個別化の必要性が示唆された。5つの造血細胞種(骨髄系種,単球系2種,リンパ球系1種)から樹立したAra-C耐性細胞からcDNAマイクロアレイによる遺伝子プロファイルを比較解析し耐性に関与する遺伝子同定を行った。結果,細胞間で認めた有意な共通の発現変化はHSPA8,C19orf2,PSAP, POU4F3,MBC2,LGALS
細胞間コミュニケーションと空間的ゆらぎの輻輳による形態形成の解明

本研究では、個々の細胞が持つ「ゆらぎ」が生物組織の細胞運命の決定に与える影響を解析するための実験系として、ラン藻の一種である、Anabaena sp.PCC7120のヘテロシスト(異形細胞)形成の実験系を候補として選び、これらの材料について、一定の培養条件下でのヘテロシスト分化のパターンの違いを計測するためのシステムの構築を試みた。次に収集したパターンを分類し、細胞間のゆらぎが原因と見られるパターンを選別した。さらに、これらのサンプルに対し、培養条件を変動させることで外部環境がゆらぎパターンに及ぼす影響を探ることで、最終的にこれらのパターンの挙動から数理的モデルを構築することを目標とした。研究の結果、これまではヘテロシストの形成には必須と考えられてきた細胞分裂が起きない場合においてもヘテロシストが形成されていることが観察され、これまで考えられていたよりも早い時期に、既にヘテロシスト分化の運命が決定付けられていることが示唆された(Arch.Microbiol., Toyoshima, M., N.V., Sasaki, et al.2009)。申請者はこのような早い段階における運命決定の原因はハゲノムにあるのではないかと考え、昨年度の研究によって開発された、「位置プロファイル法」を海洋性シアノバクテリア14種のゲノムに適用した。その結果、これらのゲノムにおけるゲノムの構造的なゆらぎが明らかになった(Genome Biol.Evol., Sasaki, N.V., and N., Sato, 2010a)。また、得られた結果をデータベースに取り込み公開した(Database, Sasaki, N.V., and N., Sato, 2010b)。これらの結果から、ゲノムの構造と細胞活動との関連が示唆された。(769字)近縁生物間のゲノムを比較すると、「コアゲノム」と呼ばれる、ゲノム間で共通である遺伝子が存在しているが、研究代表者はこれらの位置関係を明らかにするために、新規手法である、「位置プロファイル法」を開発した。この手法を海洋性シアノバクテリア14種のゲノムに適用した結果、これらのゲノム間に7つの保存領域が存在することが明らかになり、またその可視化にも成功した。本研究における保存領域の可視化によって、これらのコアゲノムによってゲノム再編成の様子を観察することが可能になった。この手法は多くのゲノムを比較する際に有利であるが、他方、糸状性ラン藻の2つのゲノム間の比較においても同様の構造を検出することができた。この可視化によって、糸状性シアノバクテリアのゲノムには保存領域と非保存的な領域がモザイク状に存在していることが明らかになったが、この様なモザイク構造は、ある種の糸状性シアノバクテリアが窒素飢餓状態に置かれた際、ゲノム上での遺伝子発現の活性化部位のモザイクと類似している所がある。このとき形成される異形細胞の形成は細胞分化の単純なモデルとして考えることができるが、この決定機構には、初め均質であった細胞群に細胞増殖等の過程で「ゆらぎ」が発生し、それが増幅されることによって細胞運命が決定される様な仕組みが考えられる。現在、この「ゆらぎ」がゲノムの非保存領域の性質に関連しているのではないかと考え、更なる解析を進めている。これらのことと、ゲノム構造と遺伝子活性化部位のモザイク構造を考慮すると、本研究によって得られる知見が、これまでのゲノム研究ではアプローチが難しかった、ゲノム構造と細胞分化との関連に一つの光を与えることが期待される。(716字)本研究では、個々の細胞が持つ「ゆらぎ」が生物組織の細胞運命の決定に与える影響を解析するための実験系として、ラン藻の一種である、Anabaena sp.PCC7120のヘテロシスト(異形細胞)形成の実験系を候補として選び、これらの材料について、一定の培養条件下でのヘテロシスト分化のパターンの違いを計測するためのシステムの構築を試みた。(769字)
幼児期の脳内ストレス処理回路の発達と成熟に内臓知覚過敏が及ぼす影響

本研究では、幼児期における脳内ストレス処理回路に内臓知覚過敏の有無が及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。対象児200名に国際10-20法に則って、脳波電極を装着し、75dBの聴覚刺激時の聴覚誘発電位とGo/Nogo課題中の事象関連電位を測定した。機能性腹痛群は対照群に比べてN2電位の潜時が有意に短かった。発達早期からのストレス脆弱性予防法プログラムとして、機能性腹痛の改善を介した注意制御の改善という予防プログラムの有用性が示唆された。平成21年度は、情動ストレス制御が未発達である幼児期における脳内ストレス処理回路の機能に内臓知覚過敏の有無が及ぼす影響を明らかにするため、まず以下の仮説を検証した。《仮説》7歳時点で内臓知覚過敏(機能性腹痛)の既往歴を有する子どもは、これを有さない子どもに比べて、(1)情動コンフリクト(Go/Nogo)刺激を呈示されたときに誘発される抑制・エラー関連電位の反応性が高い。(2)聴覚刺激時に誘発される大脳誘発電位の反応性が高い。聴覚誘発電位では、潜時0-10msecの明瞭なABR(IV波)が得られた。機能性腹痛群は対照群に比べてV波の潜時が有意に短かった。CSI腹部症状関連項目合計得点と母親の養育態度のケア因子得点との間に有意な負の相関がみられた(r=-0.235 p<0.05)。事象関連電位では、潜時200-400msecのN2電位が得られた。機能性腹痛群は対照群に比べてNogo刺激時のN2電位の振幅が有意に大きかった。機能性腹痛症状を持つ児童では、聴覚刺激に対する脳幹反応が感作されているという仮説(2)および情動コンフリクト刺激に対する前頭葉機能が亢進しているという仮説(1)が部分的に支持された。次年度以降、対象者を拡大してこれらの仮説をより詳細に検証していく必要がある。情動ストレス制御が未発達である幼児期における脳内ストレス処理回路の機能に内臓知覚過敏の有無が及ぼす影響を明らかにするため、平成22年度は、以下の仮説を検証した。《仮説》7歳時点で内臓知覚過敏(機能性腹痛)の既往歴を有する子どもは、これを有さない子どもに比べて、(1)表情刺激を呈示されたときに誘発される事象関連電位の反応性が高い。(2)聴覚刺激時の脳波パワースペクトラ成分が速波化されている。聴覚刺激時の脳波パワースペクトラ成分では、両群とも周波数帯域の主効果が有意であり(F(2,42)=175.3,P<0.001)、θパワー(4.07.8Hz)優位であった。群と周波数帯域の交互作用は有意でなかった。表情関連電位では、潜時300-500msecのP3電位が得られた。機能性腹痛群は対照群に比べて怒り刺激時のP3電位の振幅が大きい傾向がみられた。P3電位の潜時には群間で有意な差はみられなかった。機能性腹痛症状を持つ児童では、表情刺激に対する大脳皮質反応が亢進しているという仮説(1)が一部指示された。聴覚刺激中の脳波パワースペクトラが速波化されているという仮説(2)は支持されなかった。次年度以降、対象者を拡大し、両親の養育態度、病気行動などの要因も組み入れ、仮説をより詳細に検証していく必要がある。平成23年度は、前年度までに検証してきた以下の仮説について、症例数を拡大して検証した。これにより、情動ストレス制御が未発達である幼児期における脳内ストレス処理回路の機能に内臓知覚過敏の有無が及ぼす影響について、性差などの複数の影響因子についても詳細に検討することが可能となった。《仮説》7歳時点で内臓知覚過敏(IBS様症状)の既往歴を有する子どもは、これを有さない子どもに比べて、(1)情動コンフリクト(Go/Nogo)刺激を呈示されたときに誘発される抑制・エラー関連電位の反応性が高い。平成22年度までに、(1)事象関連電位では、潜時200-400msecのN2電位が得られ、IBS群は対照群に比べてNogo刺激時のN2電位の振幅が有意に大きいことが示された。(2)聴覚誘発電位では、潜時0-10msecの明瞭なABR(IV波)が得られ、IBS群は対照群に比べてV波の潜時が有意に短かいことが示された。さらに今年度の検討において、これら脳内ストレス処理過程における内臓知覚過敏の有無が及ぼす効果に、性差および両親の養育態度の差があることが示唆された。これまでにわれわれのグループは、成人の過敏性腸症候群患者で内臓刺激に対する脳幹反応および前頭前野活性が増強している所見を得ている。

このような脳賦活パターンの変化は7歳で既に生じており、その変化には性差があると考えられる。また、過敏性腸症候群の病態生理に両親の養育パターンの影響が認められたことから、発達早期からの過敏性腸症候群予防の方策が示唆された。平成24年度は、前年度までに検証してきた以下の仮説について、症例数を拡大して再現性を検証し、さらに性差について追加検証を行った。≪仮説≫7歳時点で内臓知覚過敏(機能性腹痛)の既往歴を有する子どもは、これを有さない子どもに比べて、(1)情動コンフリクト(Go/Nogo)刺激を呈示されたときに誘発される注意制御関連電位の反応性が高い。(2)聴覚刺激時に誘発される大脳誘発電位の反応性が高い。対象は、東北コホート調査に登録された生後84か月の児童ー母親ペアのうち神経生理学検査に参加した284組であった。対象児200名に国際10-20法を用いて脳波電極を装着し、75dBの聴覚刺激時の聴覚誘発電位とGo/Nogo課題中の事象関連電位を測定した。同時に母親からChildren Somatization Inventory(CSI)を聴取した。CSIは子供の身体症状を定量化するものである。CSI腹部症状関連項目合計得点の高い群を機能性腹痛群、低い群を対照群とし、群間比較を行うとともに、性差との交互作用効果を検定した。聴覚誘発電位では、潜時0-10msecの明瞭なABR(IV波)が得られた。機能性腹痛群は対照群に比べてIII波の潜時が有意に短かった。この群間差は女児で強く認められた。事象関連電位では、潜時200-400msecのN2電位が得られた。機能性腹痛群は対照群に比べてNogo刺激時のN2電位の潜時が有意に短かった。この群間差に性差は認められなかった。これまでにわれわれのグループは、成人の過敏性腸症候群患者で内臓刺激に対する脳幹および背外側前頭前野の脳血流反応が増強している所見を得ている。このような脳活動の変化は7歳で既に生じており、その変化には一部性差があると考えられる。発達早期からの過敏性腸症候群予防法として注意制御をターゲットとした認知的介入の有用性が示唆される。当初の計画である幼児を対象とした脳波データと腹痛症状データの収集は平成23年度までに予定通りの症例数についてすべて完了した。一方、成人を対象とした脳構造画像データの収集は、当初の計画時の申請額からの減額により、進んでいない。幼児を対象とした脳波データを用いて、研究の目的をおおむね達成することは可能である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでにわれわれのグループは、成人の過敏性腸症候群患者で内臓刺激に対する脳幹反応および前頭前野活性が増強している所見を得ている。今回の研究課題において、このような脳賦活パターンの変化が、7歳で既に生じており、その変化には性差があることが明らかにされつつある。次年度以降、幼児期の脳内ストレス処理回路と内臓知覚の相関関係について、発達早期のストレス脆弱性予防の臨床に応用可能な分析結果を得るよう研究を進展させる必要がある。
Regnase-1の作用機構から探る自然免疫応答における転写後調節の解明

本研究では,インターロイキン6などのサイトカインmRNAの分解を行うことで過剰な免疫応答を抑制するRNase Regnase-1の作用機構の解明を試みた。Regnase-1はサイトカインなどの分泌蛋白質の翻訳が生じている小胞体に多く存在し,蛋白質合成装置であるリボソームと共局在する事が明らかとなった。そして,Regnase-1はリボソームおよびRNAヘリカーゼUPF1と相互作用し,UPF1依存的に蛋白質翻訳が生じているmRNAを分解すること分かった。この蛋白質翻訳と共役したRegnase-1によるmRNA分解機構は免疫応答において早急な蛋白質翻訳の停止を可能にすると考えられる。本年度は,RNase Regnase-1によるmRNA分解機構を解明するために,まずRegnase-1の細胞内局在に関し検討を加えた。免疫染色法や免疫電子顕微鏡法あるいは細胞分画法により,Regnase-1は細胞質やendoplasmic reticulum (ER)に局在し,蛋白質合成装置であるリボソーム(ribosome)と共局在する事が分かった。更に,Regnase-1はmRNAのタンパク質翻訳活性化状態であるポリソーム(polysome)に局在することが分かった。次に,Regnase-1と相互作用するタンパク質をプロテオミクス法の1つであるiTRAQ法により網羅的に解析した結果,多くのribosomal proteinsが相互作用タンパク質として検出された。そこで,Rengase-1がribosomeと直接結合するかどうかをribosome-binding assayにより解析した結果,Regnase-1はribosomeと直接結合するRNaseであることが分かった。以上の結果は,Regnase-1がribosomeと結合し,translationally active mRNAを標的にして分解していることを示唆している。そこで,Regnase-1がtranslationally active mRNAを分解しているかどうかを,タンパク質合成阻害剤やタンパク質翻訳不活性型mRNAを用いて検討した結果,Regnase-1はタンパク質翻訳が不活性化状態ではmRNAを分解しないことが分かった。つまり,Regnase-1はtranslationally active mRNAを分解していることが分かった。昨年度の研究により,RNase Regnase-1はサイトカインなどの分泌蛋白質の翻訳が生じているendoplasmic reticulum (ER)および蛋白質合成装置であるリボソームと共局在し,translationally active mRNAを分解する事が明らかとなった。そこで,本年度はRegnase-1がどのようにtranslationally active mRNAを分解しているのか検討した。Regnase-1は蛋白質翻訳の終結反応(translation termination)と共役してRNA分解を生じていた。そして,Regnase-1はリボソームと直接結合するRNaseであり,更にRegnase-1はRNA helicase UPF1と相互作用し,UPF1依存的にmRNAを分解していることが分かった。このRegnase-1とUPF1の相互作用は蛋白質合成を阻害すると減少することから,Regnase-1とUPF1の相互作用は蛋白質翻訳依存的に生じていることが分かった。また,Regnase-1はUPF1のhelicase activity依存的にmRNAを分解しており,これはUPF1のhelicase activityによるmRNA-蛋白質(mRNP)複合体のリモデリングがRegnase-1によるmRNA分解に関与していることを示唆している。本研究により,Regnase-1は蛋白質合成装置であるリボソームおよびRNA helicase UPF1と結合することによってtranslationally active mRNAsを分解するこれまでに報告されていない全く新しいタイプのRNaseであることが明らかとなった。分子生物学,免疫学
移植片対宿主病の組織障害責任分子の同定とその病理学的機構に関する基礎的研究

我々は、移植片体宿主病(GVHD)モデルマウスの血清プロテオミクスにより、ヒト臨床サンプルおよびマウスGVHDにおける血清での高発現が生命予後と強く相関するケモカインCCL8を見出した(Blood. 2008,111:4403-4412、Exp Hematol. 2011, 39(11): 1101-11112)。CCL8欠損マウスを作製し、アロ移植を実施したところ、GVHDの予後が劇的に改善された(米国血液学会56th ASH,2004)。本研究では、GVHD組織障害におけるCCL8の役割を分子レベルで解析し種々の重要な知見を得た。1CCL8の免疫系での役割の検討:本基礎的検討で、CCL8欠損はリンパ球系の発生、成熟および活性化には変化をもたらさないことが確認された。CCL8が欠損しても免疫機能に影響がないことが証明され、感染症などのGVHD以外の重篤な合併症への懸念が解消した。しかしなT細胞免疫および抗原提示機能および体液性免疫機能については今後も検討を要する。2標的臓器障害における役割の検討:本基礎的検討によって、GVHD標的臓器である皮膚、肝臓、腸管における組織障害が、CCL8欠損により著明に抑制されていることが明らかとなり、さらにGVHDによる組織障害はすべての臓器に見られるものの、障害レベル軽減されることが判明した。このことは、CCL8が特定の造血または免疫系の機能に関わっているのではなくGVHDの基盤的組織障害機構に重要な役割を果たしていることを示唆する。そこで、障害臓器におけるCCL8の機能を検討することを目指し、CCL8の発現様式、発現細胞を同定し組織障害との関連を明らかにした。中和抗体などの治療実験はさらに検討継続が必要である。造血幹細胞移植は血液悪性腫瘍などに対する根治的な治療法であり、その適応は先天性免疫不全や代謝疾患など多岐にわたっている。しかし、重篤な合併症としてのGVHDが造血幹細胞移植の成否を左右する。そのためGVHDの克服は非常に重要な課題である。我々はプロテオミクス技術を用いてGVHDマウスモデルにおいてGVHDのバイオマーカーとしてケモカインCCL8を同定し、ヒト臨床サンプルおよびマウスにおける血清での高発現が生命予後と強く相関することを示した。血清中に含まれる単一分子としてGVHDのバイオマーカーとして同定された唯一の分子であり、内外で高い評価を受けている。(The Hematologist. 2008,5(3):10)CCL8のGVHDにおける役割を解析することを目的としてCCL8欠損マウスをzincfinger nucleaseを用いて近交系C57BL6のバックグラウンドで確立し、Balb/cアロ造血幹細胞移植をCCL8欠損マウスに実施したところ、劇的な予後の改善が認められた。すなわち、CCL8が欠損している環境ではGVHD死亡は起こらず、CCL8が移植片から産生され再びホスト中に検出されるようになると同時にGVHD死亡が再発する。この事実から、CCL8の存在が、マウスの予後に直結していることが明らかとなり、CCL8はGVHD死にきわめて重要な役割を有していることが示唆される。そこで、本研究では造血幹細胞移植での重篤な合併症GVHDにおけるCCL8の役割を分子レベルで解析し、CCL8の診断治療での分子標的としての可能性を基礎的に検討することを目指す。28年度は1)C57BL6バックグラウンドのCCL8KOマウスを用いた解析,2)Balb/cバックグラウンドのCCL8KOマウスの作出,3)CCL8アンタゴニスト開発を目指した分泌タンパク質産生を実施することを計画した。1)C57BL6バックグラウンドのCCL8KOマウスを用いた解析については初期的な血液細胞を中心とした解析および移植後の動態の解析をほぼ終了した。2)Balb/cバックグラウンドのCCL8KOマウスの作出については予定どおり完成し、実験に供与するために生産段階に入った。また一部は初期的検討実験を開始した。3)CCL8アンタゴニスト開発を目指した分泌タンパク質産生については、組み換え系の準備がほぼ整った。大量産生、タンパク質精製の段階に進む予定である。造血幹細胞移植は血液悪性腫瘍などに対する根治的な治療法であり、その適応は先天性免疫不全や代謝疾患からがんなどの悪性固形腫瘍にまで多岐にわたっている。しかし重篤な合併症としての移植片対宿主病が造血幹細胞移植の成否に重大な影響をあたえ、移植片対宿主病のコントロールが造血幹細胞移植治療の成否を左右する。そのため移植片対宿主病の克服は造血幹細胞移植医療を安全かつ効果的に推進するために必須である。我々は血清プロテオミクスと機械学習を組み合わせたアルゴリズムを応用して移植片対宿主病のバイオマーカーとしてケモカインCCL8を同定した。ヒト臨床サンプルとマウスサンプルの双方の検討で本分子の発現が生命予後と強く相関し、さらに後ろ向き臨床研究により移植後30日以内での高発現は早期移植関連死に強く相関することを明らかにした。そこでCCL8の移植片対宿主病における機能を分析する目的で遺伝子欠損マウスを遺伝子編集法にて作成し、アロ骨髄を移植したところ早期移植関連死が強く抑制されることを見出し、その機構の基礎的検討を続けている。

今回の研究によりCCL8欠損マウスではアロ骨髄に対するT細胞免疫は保たれていること、放射線感受性はマウスの遺伝背景に関係なく保たれていること、移植片対宿主病標的臓器において骨髄球系ミエロペロキシダーゼ陽性細胞群が大きく減少しており組織障害の抑制と深く関わっていることを明らかにできた。ケモカインCCL8の移植片対宿主病における発現更新の移植片対宿主病での役割を検討するために2種類の近交系マウスの遺伝背景を有する遺伝子欠損マウスすなわちC57BL6とBALBcの背景を有するマウスを作出することができた。さらにLY5.1と5.2のアイソジェニックなマウスペアも作出できた。これらのマウスを用いて移植片対宿主病による死亡に関連する各種因子を総合的に分析する基盤が構築された。すなわち移植片対宿主病は、移植前の宿主への抗がん剤治療や放射線照射などによる組織障害、移植ドナーT細胞による宿主アロ抗原の認識と免疫活性化、標的臓器での組織障害の3段階が必要とされている。遺伝子改変マウス群の確立によりそれぞれの段階を詳細に分析することが可能となった。我々は、移植片体宿主病(GVHD)モデルマウスの血清プロテオミクスにより、ヒト臨床サンプルおよびマウスGVHDにおける血清での高発現が生命予後と強く相関するケモカインCCL8を見出した(Blood. 2008,111:4403-4412、Exp Hematol. 2011, 39(11): 1101-11112)。CCL8欠損マウスを作製し、アロ移植を実施したところ、GVHDの予後が劇的に改善された(米国血液学会56th ASH,2004)。本研究では、GVHD組織障害におけるCCL8の役割を分子レベルで解析し種々の重要な知見を得た。1CCL8の免疫系での役割の検討:本基礎的検討で、CCL8欠損はリンパ球系の発生、成熟および活性化には変化をもたらさないことが確認された。CCL8が欠損しても免疫機能に影響がないことが証明され、感染症などのGVHD以外の重篤な合併症への懸念が解消した。しかしなT細胞免疫および抗原提示機能および体液性免疫機能については今後も検討を要する。2標的臓器障害における役割の検討:本基礎的検討によって、GVHD標的臓器である皮膚、肝臓、腸管における組織障害が、CCL8欠損により著明に抑制されていることが明らかとなり、さらにGVHDによる組織障害はすべての臓器に見られるものの、障害レベル軽減されることが判明した。このことは、CCL8が特定の造血または免疫系の機能に関わっているのではなくGVHDの基盤的組織障害機構に重要な役割を果たしていることを示唆する。そこで、障害臓器におけるCCL8の機能を検討することを目指し、CCL8の発現様式、発現細胞を同定し組織障害との関連を明らかにした。中和抗体などの治療実験はさらに検討継続が必要である。研究計画書に申請したとおり、1)B6KOとBalbKOを用いた双方向性アロ移植による検討,2)中和抗体を含む各種モノクローナル抗体の作成,3)Pichia pastorisを用いたアンタゴニストと作成系の確立の実施に進む要諦である。1)B6KOとBalbKOを用いた双方向性アロ移植による検討についてはBalbKOの産生準備が整い次第移植実験を開始する。2)中和抗体を含む各種モノクローナル抗体の作成については、1次免疫スクリーニング系の検討段階であり鋭意検討を進め抗体作成に取り掛かる。
弱毒変異株を用いたサイトメガロウイルスの病原性の実験的解析

ヘルペスウイルス科に属するヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、胎児に先天性巨細胞封入体病を引き起こし、また臓器移植患者やエイズ患者などの易感染性宿主に重篤なサイトメガロウイルス(CMV)感染症を起こす。HCMVの感染様式や病原性に関する研究は、その強い種特異性のため、HCMVを動物に感染させる実験が不可能であることから、動物のCMVをその本来の宿主動物に感染させて行われてきた。我々は、HCMVのモデルとしてマウスCMV(MCMV)を用い、この問題に取り組んだ。変異株の致死的感染力低下のメカニズムを調べる目的で、変異株と野生株および変異株の間でin vivoにおけるウイルス学的・病理学的特性を比較した。wtとrec21wの遺伝学的な違いはattである。両株の増殖パターンは10種の臓器内においてほとんど同じであった。しかしながら、wt感染マウスの肝臓に見られる臓器傷害、および腹腔内出血はrec21w感染マウスでは軽度であった。すなわち、attはMCMVの増殖には全く影響しないにもかかわらず臓器傷害作用を減弱させる変異である。この結果からMCMVが致死感染を起こすには臓器傷害因子が必要であることがわかった。一方、rec21wとts21の遺伝学的な違いはtsにある。rec21wが感染臓器内でよく増殖したのに対し、ts21はほとんど増殖しなかった。また、ts21の感染による臓器傷害はrec21wによるものよりさらに軽度で、ほとんど認められなかった。これは、ts21が臓器内でほとんど増殖しないことに対応する。すなわち、tsはウイルス増殖に必須の因子に起こった温度感受性変異であり、ts21の弱毒性はマウス臓器内が非許容温度であることに起因することが明らかになった。サイトメガロウイルス(CMV)の感染機構や発症病理を明らかにするため、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)ーSmith株(wt)より弱毒変異株(rec21w)を分離した。2x10^4 PFU/mouseのwtは生後2日目の新生マウスに致死感染を起こすが、これに対し同力価のrec21wは致死感染を起こさない。wtとrec21wによって生じた病変を比較することによって、以下のようなことが明らかになった。1.wt感染マウスでは血性の腹水の貯留と著しい成長障害が見られた。一方、rec21w感染マウスでは腹水の貯留は認められたものの、出血はwtの1/6と軽度であり、成長障害も見られなかった。2.wt感染マウスの肝臓では、非感染マウスで見られる髄外造血巣が著しく減少しており、多数の感染巣や広範な壊死巣および出血が見られた。一方、rec21w感染マウスの肝臓では感染巣の数はwtの60%であり、壊死巣や出血は見られず、髄外造血巣も減少していなかった。その他の臓器でもrec21wの感染による障害はwtによるものに比較すると軽微であった。3.wt感染マウスとrec21w感染マウスの臓器内感染性ウイルス量は同等であった。この結果から、wtとrec21wの感染における臨床病理学的な差がウイルスの増殖能の違いによらないことが明らかとなった。4.MCMV初期抗原に対するモノクロ-ナル抗体によって肝臓の実質細胞とクッパ-細胞が感染していることがわかった。rec21wの弱毒性に関する細胞レベルでの検討は検在進行中である。rec21wは臓器内でwt並みに増殖するにもかかわらず臓器に障害を与える能力が低下していた。MCMVが致死感染を起こすためにはウイルスの増殖も必要であるが、さらにウイルスが産生する組織障害因子が必須であることが示唆された。ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は種特異性が強く、実験動物を用いた感染実験を行うことができない。

そこで、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)をHCMVのモデルとして、その野生株(wt)より弱毒変異株を分離し、両ウイルスを用いた比較感染実験によってサイトメガロウイルスの感染および発症にかかわる因子の解析を試みた。HCMV感染症は内存性潜状ウイルスの再活性化による場合が多いが、MCMVもマウス唾液腺に持続感染し、免疫機能の低下によって再活性化を起こし得る。この持続感染機構の解析を目的として、上記弱毒方異株のtsとattが持凍感染成立に及ぼす影響を検討した。新生マウスに致死量以下(5.3x10^3PFU/mouse)のwtあるいはrec21wを接種1カ月後、唾液腺と膵臓からは10^4から10^5PFU/organの、脾臓からは10^1から10^2PFU/organの感染性ウイルスが回収された。rev21接種マウスの唾液腺にはwt接種マウスと同等の感染性ウイルスが認められたが、膵臓でのウイルス量はwtやスec21wの1/25から1/50であり、脾臓では感染性ウイルスが認められなかった。ts21はこれらの臓器に全く認められなかった。いずれのウイルスも肝臓中には認められなかった。4週齢のマウスに1.0x10^4PFU/mouseのwtを接種すると、唾液腺からのみ10^4PFUの感染性ウイルスが回収された。rec21wを接種した場合も同じ結果が得られたが、ts21およびrev21を接種したマウスではどの臓器にも感染性ウイルスは認められなかった。以上の結果から、attは持続感染の成立を妨げないのに対して、tsは持続感染を阻害することが示唆された。
マネージメントシステムを導入した包括的健診・保健指導体制の確立

本研究では、健康診断業務の品質を重視した業務の再構築とともに、より効果的な保健指導プログラムの開発を目指した。健康診断業務の品質を管理するために、当施設の健康診断業務を既存のマネージメントシステムであるHACCPの導入プロセスに沿って再構築した。この取り組みによって、正確な健康情報の提供ができる仕組みを健康診断業務に取り入れた。結果として、PDCAサイクルの概念を業務に持ち込むことができた。効果的な保健指導プログラムの開発には、少ない機会で受診者の生活習慣の行動変容を促す必要がある。そのためには、わかりやすい保健指導であることが望まれる。そこで、当施設では、「体験型」をテーマとした保健指導体制を新たに確立した。肥満のある受診者を対象に保健指導を行ったところ、51.2%の受診者で肥満が改善した。われわれの課題の対象として当初予定していた特定健診・保健指導は平成20年度は全国でうまく運用されておらず、任意の人間ドック受診者に対して行う健康診断、保健指導の業務を研究対象とした。1.精度の高い健診・保健指導体制の構築これまで行ってきた健診・保健指導に、新しいツールの開発や指導手法の再検討を加えながら、われわれが行う標準的な健診・保健指導体制の確立に努めた。健診業務の精度を高めるためには業務の確実かつ円滑な実施が求められる。健診業務の作業工程一覧表の中から、運用上、精度を高めることの妨げになる事象を抽出し(危害分析)、改善を繰り返すことで健診版クリニカルパスを試作した。保健指導の方法の開発では、常にPDCAサイクルを意識し、これまでの保健指導で抽出した問題点を解決し有効な指導手法の確立に努めてきた。さらに、医師、保健師だけではなく、管理栄養士や健康運動指導士によって、ヘルスケアサポートチームを結成し“体験型"をテーマとした保健指導体制を目指している。2.一連の業務の質を確保するためのHACCP導入健診センターの医師・保健師が協力して、HACCP導入の7原則と5つの手順に沿いながら、HACCPをモデルとしたマネージメントシステムを、健診業務と保健指導業務に導入することを目指してきた。健診業務については、受診者の満足度、漏れのない検査の実施、的確な結果報告書の作成が重要なポイント(Critical Control Point;CCP)として挙げられた。保健指導業務に関しては、安全な運動指導がCCPと考えられた。HACCPの管理の特徴であるCCPの連続的記録を実施しながら業務を行っている。1.精度の高い健診・保健指導体制の構築精度の高い健康診断業務の運用体制の構築を目指して、一連の健診業務の作業工程表を作成し、作業内容を見直し、標準的な健診業務手順を決定した。平成21年度はそれを反映させて健診業務を再構築し運用を開始した。保健指導の方法の開発では、医師、保健師、管理栄養士、健康運動指導士の連携によって、"体験型"をテーマとした保健指導体制を実践してきた。人間ドックの受診時に実際にカロリーや塩分を定めた食事を摂ることで目標カロリーを実感していただく。また、カロリーカウンターを装着し運動することで運動による消費カロリーを実感していただく。さらには、安静時代謝量の測定を行うことで、運動によるエネルギー消費と食事による摂取エネルギーならびに安静時代謝量から、具体的なエネルギー出納を提示し生活指導に役立ててきた。2.一連の業務の質を確保するためのマネージメントシステム(HACCP)の導入精度の高い健診を行うためには、専門医との診断のダブルチェック体制により診断の精度を保つこと、作成した結果報告書に誤った記載がないことが必要となる。これらが確実になされることを連続的記録し、監視するために、標準的な健診業務の手順を示した健診版クリニカルパス上に、チェックポイントを設け、健診受診者のパスをすべて回収した。現在、これらを集計しており、健常人を対象とする単調な流れ作業である健康診断では、約2-10%程度のヒューマンエラーが隠れていることが判明した。また、エラーを回避するための改善策も試行中である。本研究課題では、精度の高い健康診断・保健指導を提供できる業務管理の体制を構築することを目指してきた。そのためには、健康診断業務の品質を管理することを重視した業務の再構築と、より効果的な保健指導プログラムの開発が必要と考えられ、検討を行ってきた。(1)健康診断業務の品質を管理することを重視した業務の再構築健康診断業務の品質を管理するために、既存のマネージメントシステムであるHACCPの導入プロセスに沿って、われわれの施設の健康診断業務を再構築した。この取り組みによって、当施設での健康診断では、ミスの少ない健康情報の提供ができる仕組みを取り入れただけでなく、健康診断業務のヒューマンエラーの実態を知ることもできた。

診断レベルの維持を目的に行っている専門医との診断のダブルチェックについても、約2-10%程度のチェック漏れがあることが判明した。すなわち、健常人を対象とする単調な流れ作業である健康診断は、一見安全に思える。約2-10%程度のヒューマンエラーが隠れていることが判明した。また、そうしたエラーを分析し、その改善策を提言した。結果として、PDCAサイクルの概念を業務に持ち込むことができたものと考えられた。(2)より効果的な保健指導プログラムの開発効果的な保健指導体制を開発するためには、少ない機会で受診者の日常生活での行動変容を促すためには、わかりやすい保健指導であることが必要であると考えた。そこで、当施設では、「体験型」をテーマとした保健指導体制を新たに確立した。肥満のある健診受診者を対象に保健指導を行ったところ、51.2%の受診者で肥満が改善した。
食育プログラムに重点をおいた保幼小接続期のスタートカリキュラムの開発と実践

近年、食育の対象は全世代に小児から高齢者までわたるが、特に子供については、発達・発育における基盤づくりの対象として重視されている。平成32年度から実施される小学校の学習指導要領の生活科において、入学当初にスタートカリキュラムの編成・実施が明記されたことから、本研究では(1)保幼小接続期の子供を対象とした、縦断的な食育プログラムに重点をおいたスタートカリキュラムを開発する。(2)口づくりのための口腔周囲筋トレーニングの有用性及び、口腔機能の評価の分析することで、(3)子供の健康と日常生活における子どもの集中力等について、K-CPT2とKIDS(発達検査)の評価を行い効果を検証する。
グリースのビンガム粘弾性特性が潤滑膜内のコアの生成消滅に及ぼす影響

グリースのレオロジー特性を把握することが本研究を進める上でその基本となることから、市販されている種々のグリースを用い、回転振動式レオメータを改良試作し、加振振動と応答振動の振幅比および位相差を測定して、グリースの物理的特性値を実験的に解明した。その結果、グリースの代表的な化学的特性値である調度が減少すると、降伏応力、粘性係数および弾性係数はともに増大することが明らかにし、また、これらの市販のグリースのレオロジー特性は、1個のスライダと各2個の非線形のばね要素と減衰要素を結合したビンガム非線形4要素粘弾性モデルによって、表現できることも明らかにした。このレオロジー方程式を3次元流れの流体潤滑理論に適用するために、降伏応力テンソルを導入した一般的なビンガム非線形粘弾性レオロジ方程式を構築し、このテンソル表示のレオロジー方程式を直角座標系と円柱座標系の潤滑問題に対して、互いに比較しながら、コアの有無によって異なるこのレオロジ方程式を、ビンガム粘弾性特性によるコアの生成消滅の時刻歴と考慮し、かつコアが潤滑面間を浮いて流れる場合やコアが壁面に一部付着する場合などに分類して適用し、コアの種々の状態に対する一連の潤滑方程式を解明した。一方、回転しながら振動する有限幅ステップスラスト軸受の試験機を設計製作した。ステップを有する下方円板を電磁加振機によって振動させ、回転する上方円板との間にグリースを満たし、透明なアクリル樹脂で製作した両円板間の潤滑膜内のコアの形状を設定した時刻でストロボを発光させるメカトロ回路によって刻々と撮影する機構によって、スク-ズ作用下でコアの状態を測定することに始めて成功し、グリースのビンガム粘弾性特性が潤滑膜内のコアの生成消滅に及ぼす影響を明らかにした。グリースのレオロジー特性を把握することが本研究の基本であることから、市販されている種々のグリースを用い、回転振動式レオメータを改良試作し、加振振動と応答振動の振幅比および位相差を測定して、グリースの降伏応力、粘性係数、弾性係数などの物理的特性値を実験的に解明した。その結果、グリースの代表的な化学的特性値である調度が減少すると、降伏応力、粘性係数および弾性係数はともに増大することが明らかになった。このレオロジー特性実験に基づいて、グリースに対する降伏応力テンソルを導入した一般的なビンガム非線形粘弾性レオロジ方程式を構築し、コアの有無によって異なるこのレオロジ方程式を、ビンガム粘弾性特性によるコアの生成消滅の時刻歴を考慮し、かつコアが潤滑面間を浮いて流れる場合やコアが壁面に一部付着する場合やコアが潤滑面間を前面的に満たす場合などに分類して適用し、コアの種々の状態に対する一連の潤滑方程式を誘導した。この試験機では、ステップを有する下方円板を電磁加振機によって振動させ、回転する上方円板との間にグリースを満たし、透明なアクリル樹脂で製作した両円板間の潤滑膜内のコアの形状を設定した時刻でストロボを発光させるメカトロ回路によって刻々と撮影する機構を採用した。次年度に行うグリースの潤滑性能実験の基礎研究として、本年度は試作した試験機が設計通りの精度と性能を有することや潤滑膜内の油膜状況が撮影できることなど実験装置の検定を行った。前年度に行ったレオロジー特性実験を詳細に検討して、市販の種々のグリースに対して、1個のスライダと2個の非線形ばね要素と2個の非線形減衰要素を結合したビンガム非線形4要素粘弾性モデルによって、グリースのレオロジー特性が表現できることを明らかにした。このレオロジー方程式を3次元流れの流体潤滑理論に適用するために、降伏応力テンソルを導入した一般的なビンガム非線形粘弾性レオロジ方程式を構築した。

このテンソル表示のレオロジー方程式を直角座標系と円柱座標系の潤滑問題に対して、互いに比較しながら、コアの有無によって異なるこのレオロジ方程式を、ビンガム粘弾性特性によるコアの生成消滅の時刻歴を考慮し、かつコアが潤滑面間を浮いて流れる場合やコアが壁面に一部付着する場合やコアが潤滑面間を前面的に満たす場合などに分類して適用し、コアの種々の状態に対する一連の潤滑方程式を誘導した。一方、前年度試作した回転しながら振動する有限幅ステップスラスト軸受試験機を改良製作した。グリースガンによる給油機構やグリースに含まれる気泡の除去機構ならびに電磁加振機によって振動するステップを有する下方円板と回転する上方円板との平行度をパソコンによって計測し調整する機構を付加した。この結果、両円板間にグリースを満たし、透明なアクリル樹脂で製作した両円板間の潤滑膜内のコアの形状を設定した時刻でストロボを発光させるメカトロ回路によって刻々と撮影することによって、スク-ズ作用下でコアの状態を測定することに始めて成功し、グリースのビンガム粘弾性特性が潤滑膜内のコアの生成消滅に及ぼす影響を明らかにした。