hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
26Sプロテアソーム複合体構造解析による超分子作動機構に関する研究

26Sプロテアソームは分子量250万、66個のサブユニットから形成される巨大なタンパク質分解酵素複合体であり、触媒部位を有する20Sプロテアソームと19S制御因子複合体から構成される。本複合体はユビキチンの付加された標的タンパク質を特異的に分解することにより、細胞周期の制御、抗原生成、タンパク質の品質管理などさまざまな役割を担っている。本研究では26Sプロテアソーム複合体の立体構造の決定を目指し、耐熱性酵母(Kluyveromyces marxianus)より精製した酵素標品を用い精製、結晶化を行った。しかし、現段階では構造解析に十分な26Sプロテアソーム複合体結晶は得られていない。そのため、完全な26Sプロテアソームの構造解析を目指すと共に、これまでに立体構造が解析されていない19S制御因子複合体の結晶化条件検討を行った。19S制御因子複合体の解析では、タンパク質を安定化するため、これまでに報告された相互作用分子との複合体を作製し、結晶化に向け安定化に寄与する結合タンパク質の解析を行った。また、プロテアソーム複合体の構造解析と共に本反応経路に関わるタンパク質の構造解析を行った。プロテアソームの複合体形成は専用のシャペロンタンパク質を必要とする。19S制御因子複合体の形成に関わる専用シャペロンタンパク質Rpn14に変異を導入することにより高分解能構造を決定した。また、ユビキチン-プロテアソームタンパク質分解経路を形成する、ユビキチン結合タンパク質を特異的に阻害することにより感染を拡大する赤痢菌エフェクタータンパク質OspI変異体の構造解析を行い、触媒活性部位の構造変化を示すと共に、それによる機能調節機構を推定した。本研究では26Sプロテアソーム複合体の立体構造の決定を目指し、遺伝子組み換えにより精製用のタグを導入した酵母を利用し、精製、結晶化を行った。しかし、得られた結晶は20Sプロテアソーム単独状態のものであったことから、26Sプロテアソームの安定化条件の検討を行い、ATP類似化合物や阻害剤により安定性が向上することを見出した。また近年、耐熱性酵母(Kluyveromyces marxianus)が見出され研究が行われていることから、耐熱性酵母よりプロテアソームの精製を行い、その安定性を解析した。その結果、耐熱性酵母より精製したプロテアソームはこれまで実験に用いていた出芽酵母のものより安定であることが明らかになった。プロテアソームの複合体形成には専用のシャペロンタンパク質の関与が必要である。19S制御因子複合体の形成に関わる専用シャペロンタンパク質Hsm3とプロテアソームサブユニットRpt1のC末ドメインの複合体構造をX線結晶構造解析により決定した。また、プロテアソームとは異なるが生体内においてユビキチン-プロテアソームタンパク質分解経路を形成する、ユビキチン結合酵素を特異的に阻害することにより感染を拡大する赤痢菌エフェクタータンパク質Osp1を見出し、その立体構造を決定した。酵母26Sプロテアソームの安定化に寄与する化合物の検索を行い、安定化したタンパク質を用いて結晶化を行っている。また、耐熱性酵母26Sプロテアソームの精製を行い、安定性を確認した。プロテアソーム複合体形成シャペロンHsm3とRpt1Cの複合体、Osp1の結晶構造解析に成功した。

平成23年度の研究より決定した、酵母26Sプロテアソーム安定化化合物との複合体を作製し結晶化条件の検討を行う。さらに、遺伝子組み換えにより耐熱性酵母26Sプロテアソームの大量精製系の構築を行い、結晶化条件を検討する。また、プロテアソーム複合体形成シャペロンを利用することにより、26Sプロテアソーム形成過程に中間体として生成するサブ複合体を安定に精製し結晶化、X線結晶構造解析を行う。サブ複合体構造はプロテアソームの全体構造および機能の理解に有用であると共に、プロテアソームの分子集合機構の解明において重要な知見となる。複合体構造解析研究に加え、プロテアソーム関連タンパク質の構造解析研究として、相互作用タンパク質の精製系構築、結晶化を行う。
規範的秩序構想としての憲法パトリオティズム――その論理的構造と政治的可能性――

三年間にわたる「規範的秩序構想としての憲法パトリオティズム」の研究をとおして、以下のことが明らかになった。第一に、憲法パトリオリズムの構想が決して現実を無視した抽象的な理論に終始しているわけではなく、むしろ政治理念の現実化をとおしての「憲法文化」の形成というプラグマティックな問題領域にかかわるものであるということ、そして第二に、憲法パトリオティズムがナショナリズム的な言説に親近性を示しつつも批判的な見地に立ち、「憲法文化」形成のための間主観的な「場」を確保するために熟議民主主義のモティーフに依拠しつつものそれに方向性を与えるモメントになっているということである。平成26年度は本研究の初年度にあたり、研究実施計画にもあるように、憲法パトリオティズムの理論的な全体像を再構成する作業をおこなうべく、主として研究上必要となる資料の収集および分析をおこなった。さしあたり、国内の大学をはじめとする研究機関に赴いて資料調査を行い、次いでドイツに赴いて、ベルリン州立図書館およびフンボルト大学付属グリム兄弟センターなどで欧文論文などの資料を収集した。そのうえで、憲法パトリオティズムの論理的構造およびその性質を明確にするべく、具体的には以下の二つの作業をおこなった。ひとつは、憲法パトリオティズムが登場してきた背後関係を政治理論史的な観点から考察することによって、現代政治のコンテクストにおいてこの論理が有用とされる理由を確認することである。そのために、近代化によって「脱魔術化」(合理化)を図ってきたはずの政治的領域が「再魔術化」(非合理化)されつつある状況が出現していることを明らかにし、合理と非合理の双方に目配りした政治的パースペクティヴの必要性を、神話と神話的思考をキーワードとして検討した。それによって、憲法パトリオティズムのような形式合理的なロジックの必要性を弁証したが、その成果となる論文は平成27年度に刊行されることになっている。もうひとつは、上記のような状況に対応しうるであろう憲法パトリオティズムのあり方を検討するために、合理と非合理の双方に開かれた人間像や社会像のあり方について考察し、そこから抽出される政治的秩序としての憲法観の輪郭を明確にすることである。そのため、主としてドイツの思想家であるカッシーラーやハーバーマスの議論を援用して、憲法パトリオティズムが前提としている人間や社会についての概念を整理した。その成果は平成27年度に行われる招待講演で発表することになっている。平成27年度は主として憲法パトリオティズムの理論的な全体像を再構成するという平成26年度の研究の中間報告及び関連する課題についての論文作成を行った。まず、本研究の中間報告として招待講演「憲法パトリオティズムの視座」(中国人民大学)および招待講演「憲法改正問題と憲法パトリオティズム」(北京理工大学大学院)を行った。ここでは、現実の政治的コンテクストにおける憲法パトリオティズムの存在意義について分析した。そのうえ、中国人民大学では、現地の研究者および大学院生を対象とする連続特別講義(第一回「憲法パトリオティズムの登場」、「憲法パトリオティズムの論理」、「憲法パトリオティズムの行方」)を開催し、国際的な視点から意見交換及び議論を行った。ここでは、憲法パトリオティズムの成立過程、論理構成、哲学的背景、今後の検討課題についての分析を明示した。また、上記の成果を踏まえ、論文「神話」(『政治概念の歴史的展開』第八巻所収)および「環境ー新たなる政治の変数」(『原理から考える政治学』所収)を発表し、憲法パトリオティズムの論理を検討するうえで考慮するべき思想的状況を整理した。具体的には、前者では、政治の領域の「脱魔術化」(合理化)と「再魔術化」(非合理化)の双方の圧力の存在を指摘し、その双方に目配せした憲法パトリオティズムのような形式合理的なロジックの必要性を弁証した。後者では、環境問題への取り組みに必要な思想的枠組みという観点のもと、憲法パトリオティズムにつながる熟議デモクラシーの必要性を説明し、現実の問題状況から憲法パトリオティズム的な言説の存在意義を論じた。以上の作業は憲法パトリオティズムに内在する論理的課題と現実的な有用性を検討するうえで欠かせない重要な取り組みであり、他の政治理論との関連性を分析する今後の研究課題に取り組む上での基礎となるものである。平成26年度科学研究費事業交付申請書に作成した平成27年度の研究実施計画については、予算の関係で公開の討論会について断念したほかは、ほぼ当初の予定通りに実施している。なお、こうした経緯から、当初の予想よりも多くの解決するべき課題を発見するに至ったため、それらをフォローするべく、日本国内の研究機関および図書館をはじめ、ベルリン州立図書館やフンボルト大学附属図書館などでの追加の資料収集を、当初の予定以上に行った。そのため、資料の分析および整理に当初見込んでいた以上の時間を要する事態になっているが、研究の進捗を著しく阻害する状況にまでは至っていない。また、予算の関係上開催できなくなった討論会のフォローのため、ハーバーマスの政治理論の研究者などとの議論・検討の場を設けるとともに、学会出席を機会に他の研究者とも意識的に意見交換を行った。以上から、平成27年度までの研究については、おおむね順調に進展していると判断している。平成28年度は前年度までの成果を踏まえ、憲法パトリオティズムの特徴を、他の政治理論、とりわけ熟議デモクラシーおよびリベラル・ナショナリズムとの比較考量によってさらに別の角度から解明する作業を行った。

具体的には、憲法パトリオティズムの考え方が熟議デモクラシーの論理とどのようなかたちで相互補完の関係にあるといえるのか、また、憲法パトリオティズムとリベラル・ナショナリズムとのパースペクティヴの両者の相似点と相違点は何なのかを整理するための資料解読及び分析を行った。上記研究のための論点整理として、北京理工大学学術交流会の招待講演で「政治と神話ーあるいは政治の両義性について」と題する報告を行った。ここでは主として、憲法パトリオティズムとリベラル・ナショナリズムの性質上の相似と構造上の相違について考察し、今後の政治的アイデンティティのあり方について意見交換を行った。この報告をとおして、憲法パトリオティズムの形式合理的な思考様式の背後にある人間観の現代政治理論における妥当性を明示し、憲法パトリオティズムが現代デモクラシー論において必要とされる根拠を明らかにしたが、同時にリベラル・ナショナリズム的な論理への有力な反論をより積極的に提起することの必要性を認識した。そのため、憲法パトリオティズムの秩序構想を現代政治理論のコンテクストに関連させつつ定位するという最終的な研究目的を取りまとめるにあたって、今一度この点について考察し改めて報告を行う機会が必要と判断し、その準備作業を行った。この報告は平成29年6月に天津師範大学学術交流会の招待講演において行う予定となっている。また、これと並走するかたちで、本研究の取りまとめとして学術論文の作成を行ったが、これについては予定されている報告を踏まえたうえで加筆修正して公表する予定である。三年間にわたる「規範的秩序構想としての憲法パトリオティズム」の研究をとおして、以下のことが明らかになった。第一に、憲法パトリオリズムの構想が決して現実を無視した抽象的な理論に終始しているわけではなく、むしろ政治理念の現実化をとおしての「憲法文化」の形成というプラグマティックな問題領域にかかわるものであるということ、そして第二に、憲法パトリオティズムがナショナリズム的な言説に親近性を示しつつも批判的な見地に立ち、「憲法文化」形成のための間主観的な「場」を確保するために熟議民主主義のモティーフに依拠しつつものそれに方向性を与えるモメントになっているということである。平成26年度科学研究費助成事業交付申請書に記載した平成26年度の研究実施計画については、予算の関係でホームページの作成を断念したほかは、ほぼ当初の予定通り実施している。また、予備的な考察ではあるにせよ、本研究の基礎となる情報を盛り込んだ論文を執筆するとともに、本研究に関する報告もすでにスケジューリングされているなど、業績も一部すでに形になりつつある。なお、外国語文献の関連資料が当初の想定よりもかなり多かったこともあって、その分析に予想よりも多くの時間がかかっているが、これも研究のスケジュールを大幅に遅延させるほどの影響を及ぼすには至っていない。以上から、平成26年度までの研究についてはおおむね順調に進展していると判断している。平成28年度は本研究の最終年度にあたり、これまでの成果を踏まえたうえで、憲法パトリオティズムの理論的特徴とその問題点をリベラル・ナショナリズムなど他の政治理論との関係性の中から明示するための論文を作成する作業に入る必要がある。
新規サイトカインIL-17Fの気道リモデリングへの関与

2001年に我々が報告したIL-17Fは喘息との関与が示唆されているがその詳細な役割は不詳である。一方、吸入ステロイド薬は最も強力な喘息の長期管理薬であるが、重症喘息では抗喘息薬の効果は決して高くなく、今後の喘息治療の大きな課題である。重症喘息の原因の一つとして気道リモデリングが挙げられる。気道リモデリングの形成にはIL-11とIGF-Iを含むサイトカインネットワークが深く関与している。重症喘息の病態、特に気道リモデリングの形成メカニズムを解明するためにIL-17Fによる気道上皮細胞からのIL-11とIGF-Iの発現について検討した。その結果、IL-17FはIL-11とIGF-Iを有意に産生し、その発現メカニズムはRaf1-MEK1/2-ERK1/2を上流としたp90RSK-CREBおよびMSK1-CREBの2つの下流シグナル伝達経路が重要であることが明らかになった。以上からIL-17Fやそのシグナル伝達経路が喘息、特に重症喘息の新たな治療標的になる可能性が示唆された。一方、吸入ステロイド薬で喘息の長期管理は容易となってきたが、重症喘息は抗喘息薬の効果は決して高くなく、今後の喘息治療の大きな課題である。その原因の一つとして気道リモデリングが挙げられる。IL-11とIGF-Iは気道リモデリングの形成に深く関与する。IL-17Fやそのシグナル伝達経路が喘息、特に重症喘息の新たな治療標的になる可能性が示唆された。喘息の長期管理は吸入ステロイド薬により容易となってきたが難治症例は未だに存在する。その原因の一つとして気道リモデリングが重要である。気道リモデリングの形成には様々なサイトカインが関係している。その一つにIL-11があるがその誘導因子と発現機構は不明である。2001年に私はIL-17F(ML-1)を発見し報告した(Kawaguchi et.al. J. Immunol. 2001)。IL-17Fの産生細胞は最近注目を浴びているTh17細胞、好塩基球、肥満細胞である。これらの細胞はアレルギー性気道炎症において重要な役割を担っている。喘息患者の気道ではIL-17F遺伝子の発現が亢進し(Kawaguchi et. al. J. Immunol. 2001)、IL-17Fのアミノ酸変異を伴う一塩基多型が喘息と有意な相関を認め、喘息の重症化に関与する(Kawaguchi, et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2006、Kawaguchi, et al. Clin. Exp. Allergy. 2006)。これらのことからIL-17Fが喘息の病態形成に深く関与していると考えられる。そこでIL-17Fによる気道上細胞からのIL-11の発現について検討したところIL-17Fは気道上皮細胞からRaf1-MEK1/2-ERK1/2-MSK1-CREB経路を介し、IL-11の発現を誘導することを認めた。また、喘息と関連が深いTh2サイトカイヒであるIL-4およびIL-13はこの発現を増強させることも認めた。以上から本研究により喘息の難治化の原因の一つである気道リモデリングにIL-17FによるIL-11の発現の関与が示唆された。これらの結果はAm J Physiol Lung Cell Mol Physiolに掲載予定である。気道リモデリングの形成にはIL-11やIGF-Iなどの様々なサイトカインや成長因子が関係しているがこれらの誘導因子と発現機構は不明である。

2001年に我々はIL-17F(ML-1)を発見した(Kawaguchi et.al.J.Immunol.2001)。IL-17Fの産生細胞は最近注目を浴びているTh17細胞以外に好塩基球や肥満細胞が知られている。これらの細胞はアレルギー性気道炎症において重要な役割を担っている。喘息患者の気道ではIL-17F遺伝子の発現が亢進している(Kawaguchi et.al.J.Immunol.2001)。さらにIL-17Fの機能的多型は喘息の重症化に関与する(Kawaguchi et al.J.Allergy Clin.Immunol.2006、Hizawa et al.Clin.Exp.Allergy.2006)。これらのことからIL-17Fが喘息の病態形成に深く関与していることが考えられる。そこでIL-17Fによる気道上細胞からIL-11の発現をまず検討した。IL-17Fは気道上皮細胞からRaf1-MEK1/2-ERK1/2-MSK1-CREB経路を介し、IL-11の発現を有意に誘導した。また、Th2サイトカインであるIL-4およびIL-13はこの発現を増強させた。さらにIL-17FはIGF-Iの産生も有意に誘導した。以上よりIL-17Fは難治性喘息の治療標的になる可能性が示唆された。2001年に我々が報告したIL-17Fは喘息との関与が示唆されているがその詳細な役割は不詳である。一方、吸入ステロイド薬によって喘息の長期管理は容易となってきたが、重症喘息では抗喘息薬の効果は決して高くなく、今後の喘息治療における大きな課題である。その原因の一つとして気道リモデリングが挙げられる。IL-11とIGF-Iは気道リモデリングの形成に深く関与する。そこでIL-17Fが気道上皮細胞からIL-11とIGF-Iの発現を誘導するという仮説を立て検討した。まずヒト正常気道上皮細胞及びヒト気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞をIL-17Fで248時間刺激した。IL-11とIGF-IのmRNAの発現をリアルタイムPCRで、上清中のIL-11及びIGF-Iの蛋白濃度をELISAにて検討した。次にIL-4、IL-13単独もしくはIL-17Fと共刺激し、24時間後に上清を回収し、IL-11及びIGF-Iの蛋白濃度をELISAで測定した。次に各種阻害剤の抑制効果を検討した。MEK阻害剤(PD98059,U0126)、Raf1 kinase阻害剤(Raf1 kinase inhibitor I)、p38 MAPK阻害剤(SB202190)、JNK阻害剤(SP600125)、MSK1阻害剤(H89、Ro-31-8220)、DMSOで前処理後にIL-17Fで刺激し、24時間後の上清中のIL-11及びIGF-Iの蛋白濃度をELISAにて測定した。次にIL-17FによるMSK1のリン酸化の検討をWestern blottingを行った。さらにPD98059によるMSK1のリン酸化に与える影響を同様に検討した。次にMSK1、CREB、controlのsiRNAをBEAS-2B細胞に移入し、IL-17FによるIL-11及びIGF-Iの産生に対する抑制効果をELISAで検討した。最後にMSK1のsiRNAを移入したBEAS-2B細胞をIL-17Fで刺激し、CREBへの影響をWestern blottingにて検討した。統計学的有意
睡眠は運動パフォーマンス発揮のキーとなる視覚運動協調性を向上させるのか

睡眠は身体機能を回復させ、スポーツ競技に対するコンディションを整える上で重要であるが、運動パフォーマンスの獲得・発揮に関わる運動記憶を固定する機能も担っている。一方、スポーツ場面において、視覚から得られた情報を実際の身体パフォーマンスに反映する視覚運動協調性は、競技パフォーマンスに大きく関連していることが報告されている。視覚運動協調性は運動記憶の固定に関与し、運動パフォーマンスに影響を与えると考えられるが、睡眠が視覚運動協調性に及ぼす影響については不明である。本研究では、睡眠が視覚運動協調性に及ぼす影響を明らかにすることを目的とする。
光一光二重共鳴法による反応ポテンシャルの解明

励起分子の反応では、いくつかの分子ポテンシャル間で二分子的な無輻射遷移を起こす。このような反応を理解するためには、反応物の始状態を明確に規定した上で、非断熱遷移の後に特定の最終成生物を与える励起分子の運動を、そのポテンシャル曲面をもとに議論する必要がある。本研究では、もり打ち反応の典型的な例と考えられる希ガスとハロゲン分子の高エネルギー状態の反応機構について検討した。本研究で用いた光一光二重共鳴励起法は、優れた状態選択性を持つので、この方法によればハロゲン分子のイオン対状態と呼ばれる一連の高エネルギー状態の単一振動・回転状態に光励起することができる。いくつかのイオン対状態の放射寿命から、レーザー発振遷移(^3П_ъ-^3П_u)の遷移モーメントは、約3Dと異常に大きいことが分かった。また他のイオン対状態でも、低位の共有結合状態への遷移モーメントは12D程度あることを明らかにした。さらに、これらイオン対状態と希ガス原子などとの反応断面積を測定したところ、反応断面積はXeで約150A^^・^2と異常に大きく反応物のイオン化ポテンシャルと良い相関を示すことから、この反応がXe^+-Cl_2^-を中間状態とするもり打ち機構で進むことを明かにした。この結果をもとにXe-Cl_2ファンデルワース分子を用いて、上記の反応で生成物を与えるXe^十-Cl_2^-イオン錯合体のポテンシャルを直接観測することを試みた。しかし、スペクトルには明確な振動構造が現れず、この反応ポテンシャルを規定することができなかった。
ヒト口腔癌の顎骨浸潤に関わる分子標的因子の解明

【目的】口腔扁平上皮癌は強い局所浸潤能を有しており、特に顎骨浸潤の有無は臨床上重要な問題点となる。骨浸潤には破骨細胞性骨吸収が重要な役割を演じていることがすでに報告されている。そこで我々は骨浸潤の詳細なメカニズムを明らかにするため、口腔癌組織における破骨細胞関連サイトカインの発現解析を行った。【対象と方法】対象は平成17年4月から平成19年1月に東京歯科大学千葉病院口腔外科を受診し、顎骨切除を施行した口腔扁平上皮癌患者で、本研究に同意を得た17例(男性8例、女性9例、平均64.5歳)である。これらの手術標本から病理学的検索を行い、顎骨非浸潤群6例、顎骨浸潤群11例に分類した。解析方法はパラフィン標本を用いて免疫組織化学的染色法を行い、腫瘍細胞における破骨細胞関連サイトカイン(IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-11,IL-18,PTHrP,TNF-α,TGF-β,RANKL,RANK,OPG)の腫瘍内発現を評価した。また手術標本より採取した組織サンプルからcDNAを作製し、定量RT-PCRを行い各サイトカインのmRNA発現量を定量的に観察した。【結果】免疫組織化学的染色において、IL-1α、IL-6、IL-11の発現が顎骨浸潤群で有意に高かった。またOPGの発現が顎骨非浸潤群で有意に高かった。また定量RT-PCRにおいて、IL-1α、IL-6、PTHrPのmRNA発現量が顎骨浸潤群で有意に高い結果となった。しかしその他のサイトカインでは明らかな有意差は認められなかった。【考察】口腔扁平上皮癌が顎骨へ浸潤するためには、IL-1α、IL-6、PTHrPの発現が重要な役割を演じているものと思われた。またOPGの発現が癌の進行を抑制していると考えられた。以上より破骨細胞関連サイトカインの発現解析がヒト口腔癌における顎骨浸潤能を評価し、診断、治療に応用できる可能性が示唆された。口腔扁平上皮癌は強い局所浸潤能を有し、顎骨への浸潤は臨床上大きな問題となっている。そこでヒト口腔癌における顎骨浸潤に関わるサイトカインの発現を分子病理学的に解析し、新たなマーカーとして臨床上有用であるか検討した。方法は当大学倫理規定にもとづき、同意の得られた手術標本の腫瘍細胞から、顎骨浸潤癌と非浸潤癌の間で骨吸収関連サイトカインの発現を免疫組織化学的に解析した。また同様の骨吸収関連サイトカインについてmRNAが発現しているか併せて検討をおこなった。結果として、今回検索したサイトカインはインターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-11、IL-18、副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、Transforming Growth Factor (TGF)-βの8種類であり、15症例についてプロスペクティブに解析した結果、顎骨浸潤癌で強い染色性を示したのはIL-6、PTHrPおよびTNF-αであり、歯肉癌の顎骨浸潤にこれらサイトカインの発現が関与している可能性が強く示唆された。そして本試料から採取したcDNAよりこれらのmRNAの発現を高頻度に確認した。さらに当教室で確立したマウス顎骨浸潤モデルで同様の結果を得ることが判明し、学会誌に投稿、掲載された。
加齢に伴うヒトゲノムの変化を利用した分子生物学的年齢推定法の確立

その結果、男性サンプルのTYR-F1のS2プライマーを利用した領域の第2番目のCpG部位で、年齢とメチル化の強い負の相関が見られた。その他の部位では、ほとんどの遺伝子でメチル化の変化が観察されず、あったとしても年齢とは全く相関の見られない大きな変化であった。本研究では、最終的に加齢とメチル化との明らかな相関を示す遺伝子領域を見出すことができなかったが、正常な個体においても、メチル化の程度に差があることが観察されたので、加齢と相関する部位が存在するであろうことが示唆された。本年度は、各年齢層の男女8例の司法解剖例から採集された腹部皮膚組織片から抽出したDNA試料を利用して、コラーゲン生合成・分解関連の遺伝子について、メチル化の程度を住商バイオサイエンス社に委託してPyrosequencing法により解析した。8座位の遺伝子は、Prolyl 4-hydroxylase(PH)、Lysyl hydroxylase(LH)、Procollagen N-proteinase(PNP)、Procollagen C-proteinase(PCP)、Prolyl 4-Hydroxylase,alpha polypeptide,type2(P4HA2)、Lysyl oxidase(LOX)、Collagen、Type I、Alpha-1(COL1A1)、Matrix Metalloproteinase 1(Collagenase 1;MMP1)でこれらのプロモーター周辺領域及び第1エクソンのエンハンサーと推察される領域で、それぞれ13つのPCR増幅産物を設定し、それぞれのPCR増幅産物について、Pyrosequencing用プライマーを設計し、Pyrosequencing反応を行った。各Pyrosequencing反応で、10箇所程度のCpG配列のメチル化の程度を測定した。その結果、COL1A1遺伝子で、第1エクソンの約100bp上流内に含まれるTATAボックス及びGC配列周辺、並びに1.3kb上流のGC配列周辺において、メチル化の程度がやや異なるCpG配列が観察された。また、PNP遺伝子で、第1イントロン内の第1エクソンの約1.4kb下流のGC配列周辺において、メチル化の程度がやや異なるCpG配列が観察された。検体数が少なかったため、これらのメチル化の程度とと加齢との明らかな関係は認められなかったので、今後、これらの部位について、生体試料及び解剖試料の例数を増やして、検討したいと考えている。なお、本研究は、名古屋大学医学部倫理委員会に許諾の申請をして承認された。今年度は、弾性線維の主成分であるElastin(ELN)、セラミド合成関連のβ-Glucocerebrosidase(GBA)及びSphingomyelinase(SMPD1)、セラミド分解酵素のAcid ceramidase 1(ASAH1)、メラニン合成関連のTyrosinase(TYR),5,6-Dihydroxy-indole-2-carboxylic acid oxidase(TYRP1)及びDopachrome tautomerase(DCT)の7種類の遺伝子を選択し、前年度同様に、各年齢層の男女8例の司法解剖から採取された腹部皮膚組織片から抽出したDNA試料を利用して、これら遺伝子でのメチル化の程度を住商バイオサイエンス社に委託してPyrosequence法により解析した。これらの遺伝子のプロモーター周辺領域及び第1エクソンのエンハンサーと推察される領域において、それぞれ23つのPCR増幅産物を設定し、それぞれのPCR産物についてPyrosequencing用プライマーを設計して、Pyrosequencing反応を行った。その結果、GBAとTYR遺伝子のそれぞれ一つの増幅産物においてメチル化の変化が見られたので、より詳細に検討するために、年齢の異なる試料を男女各7例に増やし、それぞれの試料を真皮・表皮組織と皮下結合組織に分離してDNAを抽出した。これらのDNA試料について、メチル化の変化が見られたGBAとTYR遺伝子の各一領域(GBA-F1及びTYR-F1)を増幅して同様に解析したところ、男性試料の真皮・表皮組織と皮下結合組織共にTYR-F1のS2プライマーを利用した領域の2番目のCpG部位で、年齢とメチル化の強い負の相関が見られた。その他の部位では、メチル化の変化量が各年齢層で小さかったり、年齢とは全く相関の見られない大きな変化であった。
発現調節ベクターの開発

Saccharomyces cevevisiaeにおいて,クローン化遺伝子の発現調節を行うことを目的として,ホスファターゼ生産調節系とヒスチジン合成遺伝子HIS5の解析を行い,プロモーター検索ベクターの構築を試みた.ホスファターゼ系では,培地中の代謝因子(無機リン酸;Pi)の有無に関する信号が, 5個の遺伝子が関係する調節系により酵素構造遺伝子まで伝達されている.そのうちPHO4タンパクは構造遺伝子の発現に必要な正因子である.PHO2タンパクも多くの構造遺伝子の発現に必須であり,核に局在し構造遺伝子の5 ́上流部へ結合する.PHO80タンパクは負因子として正因子に干渉しその機能を阻害する.負因子の生産にはPHO85遺伝子が関係し,負因子活性はPHO81タンパクにより阻害される. PHO81遺伝子の発現には正因子を介してこの調節系が関係する.すなわち調節系全体は閉鎖環を形成し, Piは,おそらく, PHO81タンパクに働きかけることにより正因子活性を調節し,構造遺伝子とPHO81遺伝子の発現調節を行う.正負両因子は構成的に極く僅か生産され,両因子が量的に均衡していることが正常な調節機能に必須である.PHO2タンパクも極く僅か生産されており, Pi濃度と自律的な発現抑制を受けている.HIS5遺伝子については,塩基配列,転写様式などについての総合的知見を確立し,さらに5個ある正因子認識配列について,相互の間隔,方向性,欠失効果などについて研究し,タンパク質コード部に最も接近した1つが最重要であるとの知見を得た.これらを基に,プロモーター検索ベクターを構築し,プロモーター活性を有するDNA断片のクローニング,また上記各遺伝子のプロモーター部の塩基配列と活性の関係について研究し,数々の有用な知見とDNA断片を得た.例えば,酵母宿主によるタンパク質の生産では,目的のタンパク質構造遺伝子のコピー数を増やすよりも,正因子量を上げることが生産性増大に効果的である.Saccharomyces cevevisiaeにおいて,クローン化遺伝子の発現調節を行うことを目的として,ホスファターゼ生産調節系とヒスチジン合成遺伝子HIS5の解析を行い,プロモーター検索ベクターの構築を試みた.ホスファターゼ系では,培地中の代謝因子(無機リン酸;Pi)の有無に関する信号が, 5個の遺伝子が関係する調節系により酵素構造遺伝子まで伝達されている.そのうちPHO4タンパクは構造遺伝子の発現に必要な正因子である.PHO2タンパクも多くの構造遺伝子の発現に必須であり,核に局在し構造遺伝子の5 ́上流部へ結合する.PHO80タンパクは負因子として正因子に干渉しその機能を阻害する.負因子の生産にはPHO85遺伝子が関係し,負因子活性はPHO81タンパクにより阻害される. PHO81遺伝子の発現には正因子を介してこの調節系が関係する.すなわち調節系全体は閉鎖環を形成し, Piは,おそらく, PHO81タンパクに働きかけることにより正因子活性を調節し,構造遺伝子とPHO81遺伝子の発現調節を行う.正負両因子は構成的に極く僅か生産され,両因子が量的に均衡していることが正常な調節機能に必須である.PHO2タンパクも極く僅か生産されており, Pi濃度と自律的な発現抑制を受けている.HIS5遺伝子については,塩基配列,転写様式などについての総合的知見を確立し,さらに5個ある正因子認識配列について,相互の間隔,方向性,欠失効果などについて研究し,タンパク質コード部に最も接近した1つが最重要であるとの知見を得た.これらを基に,プロモーター検索ベクターを構築し,プロモーター活性を有するDNA断片のクローニング,また上記各遺伝子のプロモーター部の塩基配列と活性の関係について研究し,数々の有用な知見とDNA断片を得た.例えば,酵母宿主によるタンパク質の生産では,目的のタンパク質構造遺伝子のコピー数を増やすよりも,正因子量を上げることが生産性増大に効果的である.酵母のホスファターゼを対象とした遺伝子発現調節機構の研究および酵母を宿主とするプロモーター検出ベクターの改善を行った。1)遺伝子発現調節系の解析:酸性ホスファターゼと無機リン酸導入酵素の生産は培地中の無機リン酸により調節され、濃度の高い時には抑制される。そこには、PHO2,PHO4,PHO80,PHO81およびPHO85の5個の調節遺伝子産物が働いている。61年度は、PHO2,PHO4およびPHO81遺伝子の転写と翻訳を調べ、以下の結果を得た。構造遺伝子の発現に必須な正因子を生産するPHO4は、低レベル構成的に転写され、翻訳を含めて他の調節遺伝子の影響を受けない。PHO2の転写も低レベルであるが、低リン酸培地中では、転写量は2-3倍に上昇する。また、活性なPHO2タンパクによりPHO2自身の発現量が減少するが、他の調節遺伝子の影響は受けない。これに対し、PHO81遺伝子の転写はリン酸により抑制され、Pho2とPho4変異細胞では停止し、Pho80とPho85変異細胞では構成的となる。この結果、この遺伝子発現調節系は、量的に調和した各調節因子からなる閉鎖回路を形成し、自律調節機構を持つと結論される。2)プロモーター検索ベクターの改造:細胞内外の信号を受信し、発現を司どる領域が、各構造遺伝子のタンパクコード部の5′上流にある。この領域を含むDNA断片のクローニングを目的として、60年度はpVC717プラスミドを構築した。61年度は、これを用いて、プロモーター活性を持つDNA断片が容易に分離できることを認めた。

また、培養基の糖源をガラクトースにすると発現を開始するDNA断片も得られた。しかし、翻訳段階で期待通りに働かない場合があり、その原因がATGコドンに近い上流にさらにATG配列が散在し、翻訳開始が乱されるためと考え、これを切除したプラスミドpVC727を構築した。このプラスミドに既知のヒスチジン遺伝子の5′上流を結合して、期待どうりに機能することを認めた。
ヒト赤血球膜蛋白質Band3膜貫通ドメインの電子線結晶構造解析

Band3のアニオン透過機能は、膜貫通ドメイン(MD)がアニオンを認識して内向き型/外向き型の状態を往復するというダイナミックな構造変化によって実現されると考えられている。しかし、これまでBand3 MDの立体構造解析は20Åの分解能までしかなされておらず、原子レベルの構造解明には至っていない。本研究は外向き型/内向き型Band3MDの構造を二次元結晶化及び電子線結晶学に基づいて解き、これらを比較することによってアニオン透過機構の全容解明を目的とした。外向き型(H_2-DIDS結合型)Band3MDの二次元結晶化において、これまで行っていたカチオン性界面活性剤DTACによる結晶融合や、L-Lysineによる結晶成長促進ではシート状結晶が得られたが、それはモザイク状(小単位の結晶が一面に存在)であるため分解能が低く、また形成頻度が非常に低かった。それに対し、今回見出した、リン脂質にDOPC (LPR=0.28)を、界面活性剤に0.1%C_<12>E_8を用い、組成が10mM Tris (pH9.0)、20mM NaCl、0.1mM SrCl_2、10mM Na_4P_2O_7、0.02%NaN_3の外液に対して20°Cで透析を行うという二次元結晶化条件では、これまでのシート状結晶より高い分解能(30Å)を示すチューブ状結晶が観察された。さらに形成頻度も極低温電子顕微鏡による観察が可能な程度にまで改善した。現在のチューブ状結晶は直径が大きいため、電子顕微鏡用試料作成の際に結晶がくずれていると考えられる。したがって、直径が小さくなるか、破れてシート状結晶になることで大幅に分解能が向上すると推測される。
準結晶の触媒活性の表面科学的研究

本研究は、準結晶の触媒活性の機構を探るために、清浄準結晶表面上に作られたミクロな金属クラスターからなるモデル触媒系を構築し、ガス分子の解離吸着など触媒反応にかかわる基礎課程に関して研究することを目的としている。そこで、(1)清浄準結晶表面の創出とキャラクリゼーション、(2)モデル触媒系の構築とキャラクリゼーション、(3)モデル触媒系とガス分子の反応、の研究を計画した。その結果、(1)については、i相準結晶(i-)Al-Pd-Mnとi-Al-Cu-Ruにおいて、清浄5回対称表面の作成に成功し、STMでその表面構造を観測した。特にi-Al-Cu-Ruの清浄表面作成に、世界で初めて成功した。これらの表面のSTM像を詳細に解析し、以前に解析したi-Al-Cu-Feの表面と比較分析したところ、これら3つの準結晶の5回対称表面の構造は、すべて我々が提案した"interlayer spacing rule"で説明できることを見出した。これはi相準結晶の安定表面生成が、構成元素が異なるにもかかわらず共通の規則に従うことを示したという点で、準結晶研究上の重要な成果である。同時に、本研究の計画においても、モデル触媒の基板として比較対象可能な3つの異なる表面を手に入れた点で高く評価できる。(3)については、今後の研究で取り組む予定である。
B細胞初期分化におけるBach転写ネットワークの解明

当初の目的であった、Bach因子のB細胞初期分化における役割として、CLPsでB細胞特異的遺伝子の発現開始を制御していることを明らかにした。さらに、Bach2を多能性前駆細胞(MPPs)へ発現させるとpre-proB様の細胞に誘導できることがわかった。これらの結果から、Bach因子は多能性前駆細胞からのB細胞の系列決定に重要である可能性を示した。これらの発見は、血液細胞分化の転写ネットワーク全体を理解する上で、重要なものであると考えられる。Bach因子がCLPsでEbf1遺伝子の転写を促進するメカニズムは不明である。今後は、Bach因子の直接標的因子を探索するため、pre-proBで分化が停止しているEbf1欠損細胞を用いてBach因子もしくは、Bach因子とヘテロダイマーを形成する小Maf因子の抗体を用いて、chip sequenceを行う。その結果と、DNAマイクロアレイのデータを照合し、Bach因子の標的遺伝子を探索する。B細胞とT細胞は、Hematopoietic Stem cell(HSC)より、Multipotent progenitor(MPP)、Limphoid primed multipotent progenitor(LMPP)、Common lymphoid progenitor(CLP)の前駆細胞を経て分化する。転写抑制因子Bach1とBach2の二重欠損マウス(DDマウス)では骨髄のB細胞数が最も未熟な分化段階であるpro-B細胞から減少していた。したがって、Bach因子はリンパ球分化を制御している可能性がある。この可能性を検証するため、本年度はDDマウスの骨髄B細胞数減少の原因を以下の4つの項目について検討した。第一に、細胞増殖能が低下している可能性を検証した。DDマウスにBrdUを腹腔投与し、B細胞への取り込みをフローサイトメーターで解析したが、野生型のB細胞と同等であった。第二に、抗体遺伝子の組み換えの異常が原因である可能性を検証した。VDJ組み換えの頻度をPCR法で測定したが、DDと野生型マウスのB細胞で差を認めなかった。第3に、B細胞に必須の遺伝子発現の異常が原因である可能性を検証した。骨髄のDDB細胞と、野生型B細胞で、DNAマイクロアレイおよび、定量PCRを実施した結果、E2A、EBF、Pax5などのB細胞の初期分化に重要な遺伝子の発現は同等であった。これらのことから、DDマウスのpro-B細胞からの分化は正常に行われている可能性が高いと考えられた。第四に、リンパ球系前駆細胞が減少していることが原因である可能性を検証した。DDマウスの骨髄のLMPP数を測定したところ、野生型の半数以下に減少している事を発見した。また、CLPの数も同様に半数以下に減少していた。これらの異常は単独欠損マウスでは見られなかった。さらに、DDマウスのLMPPの減少がT細胞へ与える影響ついて検討を行い、予備的な実験で、胸腺中に存在するEarly T cell progenitorの数が野生型の半数以下に減少していることも確認した。よってDDマウスで見られるpro-Bからの細胞数減少は前駆細胞であるLMPPの減少が原因である可能性が高い。Bach因子が互いに機昨日を補う形で、LMPPの分化を促進している可能性が考えられ、リンパ球分化に重要な因子である可能性が示唆された。B細胞、T細胞は、Hematopoietic Stem cell (HSC)より、Multipotent progenitor (MPP)、Lymphoid primed multipotent progenitor (LMPP)、Common lymphoid progenitor (CLP)の前駆細胞を経て分化する。昨年度までの研究により、転写抑制因子Bach1とBach2の二重欠損マウス(DDマウス)では骨髄のLMPP、CLPが減少している事が分かった。そのため、骨髄中のpro-Bから全ての段階のB細胞と、胸腺のEarly Thymic Progenitor (ETP)が減少していると考えられた。したがって、Bach因子はHSCからのリンパ球分化を制御している可能性がある。本年度は、第一に、DDマウスの血球分化の障害が、血球側の問題か、分化を支持する環境側の問題かを明らかにするため、骨髄移植実験を行った。致死量の放射線を照射したCD45.1 congenicマウスに、テスト細胞である野生型とDDのHSC100個と、競合細胞であるCD45.1、CD45.2ヘテロマウスの2×10^5個の骨髄有核細胞を尾静脈注射により移植した。移植16週後、末梢血中のB220陽性B細胞とCD4, CD8陽性T細胞の競合細胞に対する割合は、野生型のテスト細胞が51%、34%だったのに対し、DDマウスのテスト細胞では12%、1%と、著しく低かった。一方、CD11bとGr-1陽性のミエロイド細胞へ分化したテスト細胞の割合は、野生型とDDで同等だった。このことから、DDマウスでみられるリンパ球の分化障害は、血球側の問題であると考えられた。第二に、Bach因子による血球分化制御機構を調べるため、野生型と、DDマウスのHSC、MPP、LMPP、CLPを分取し、定量PCRによる遺伝子発現解析を行った。その結果、DDマウスのHSCではミエロイド分化に重要な転写因子であるPU.1とC/EBPαが、それぞれ野生型の1.2倍と2.8倍に上昇し、ミエロイド分化が亢進している可能性が示唆された。

また、DDマウスのCLPではB細胞分化に必須の転写因子であるEBFとPax5の発現が野生型の半分以下に低下しており、異常な集団である可能性が示された。これらの結果から、Bach因子はHSCからのリンパ球分化を制御しており、正常なCLPの分化に重要であると考えられた。当初の目的であった、Bach因子のB細胞初期分化における役割として、CLPsでB細胞特異的遺伝子の発現開始を制御していることを明らかにした。さらに、Bach2を多能性前駆細胞(MPPs)へ発現させるとpre-proB様の細胞に誘導できることがわかった。これらの結果から、Bach因子は多能性前駆細胞からのB細胞の系列決定に重要である可能性を示した。これらの発見は、血液細胞分化の転写ネットワーク全体を理解する上で、重要なものであると考えられる。Bach因子がCLPsでEbf1遺伝子の転写を促進するメカニズムは不明である。今後は、Bach因子の直接標的因子を探索するため、pre-proBで分化が停止しているEbf1欠損細胞を用いてBach因子もしくは、Bach因子とヘテロダイマーを形成する小Maf因子の抗体を用いて、chip sequenceを行う。その結果と、DNAマイクロアレイのデータを照合し、Bach因子の標的遺伝子を探索する。
トカラ列島における森林性鳥類の生物地理:渡瀬線を挟んだ島々での繁殖分布と集団構造

琉球列島北部に位置するトカラ列島の鳥類記録を集約し、種および島ごとに記録頻度の季節的変化を明らかにした。繁殖が確認された種は31種で、保全の必要性が高い種が含まれた。屋久島および奄美大島の繁殖種と比較すると、3地域の中ではトカラ列島でのみ繁殖する種が少なからず存在する。トカラ列島の繁殖鳥類群集が単に面積や標高、供給源となる島からの距離などにより制約されているだけではなく、地史的背景の影響を受けて形成された可能性があると考えられた。トカラ列島における鳥類の観祭記録の整理、情報不足地域の現地調査、聞き取り調査による新たな記録の収集、既存の文献の収集と整理を行い、現時点での網羅的なトカラ列島の鳥類目録を作成し、種ごとに季節的な記録頻度の変化を明らかにすることにより、繁殖種・繁殖の可能性の高い種、および繁殖の可能性のある種を抽出すると共に、今後の補完調査が必要な地域と季節の特定を行った。その結果から明らかになった、トカラ列島における全記録種数は317種で、島ごとの記録種数は最も多い中之島の257種から、平島の231種、悪石島の172種、宝島の162種、口之島の127種、諏訪之瀬島の122種、小宝島の89種、臥蛇島の42種、横当島の37種、上ノ根島の9種まで大きく異なっていた。種数最大の中之島の面積がトカラ列島中最大で、最大標高も高く、最も面積の小さい上ノ根島で最も記録種数が少ないという事例は認められたが、面積や標高は必ずしも記録種数と相関はしていなかった。現地調査では、鳥類の調査がほとんど行われていなかった無人島の一つ、臥蛇島に上陸して現地調査を実施し、これまで記録のなかったキビタキ、ヤマガラ、サンコウチョウなどの生息や、アカヒゲ、メジロなどの繁殖を確認した。また、臥蛇島以外の無人島(横当島および上ノ根島)について現地調査実施のための情報収集を行った。トカラ列島における繁殖種について遺伝子サンプル収集と形態計測を行った。トカラ列島の百人島における繁殖期・越冬期の生息密度調査を継続し、諏訪瀬島・平島・中之島などの鳥類相について直接観察・捕獲調査・赤外線センサー式自動撮影装置による記録・タイマー式デジタル録音装置による記針を行うとともに、トカラ列島全島についての過去の記録資料を収集した。また、鳥類の調査がほとんど行われていなかった無人島、臥蛇島・横当島・上ノ根島の3島での調査を夏期に実施し、直接観察による鳥類調査を実施するとともに、赤外線センサー式自動撮影装置およびタイマー式デジタル録音装置の設置を行った。無人島における直接観察では、これまで記録のなかった島でアカショウビンなどの繁殖を示唆する記録を得ることができた。設置した機器は1年間以上の稼働が可能な設計となっており、次年度のほぼ同時期に回収して分析することで、遠隔で鳥類相の季節変化を明らかにできる予定である。また、トカラ列島10島の鳥類相について、これまでのデータをとりまとめ、森林総合研究所研究報告に公表した。公表したデータによって鳥類の種ごとに各島の月ごとの記録頻度を知ることができ、記録状況からそれぞれの種が繁殖している可能性があるのか、通過しているだけなのか、あるいは越冬しているのかを推定することができる。例えば、トカラ列島に生息する希少鳥類では、カラスバトが10島すべてで季節を通して記録がある一方で、アカヒゲは8島、アカコッコは7島、イイジマムシクイは3島に繁殖期の記録が限定され、トカラ列島内でも鳥類相には島問の相違が明確なことを明らかにした。このような分布の不均一性についての情報は希少鳥類の保全を図る上で重要な基礎情報となる。トカラ列島における鳥類記録を整理し、種および島ごとに季節的な記録頻度の変化を明らかにした。トカラ列島における全記録種数は317種で、島ごとの記録種数は最も多い中之島の257種から、平島の231種、悪石島の172種、宝島の162種、口之島の127種、諏訪之瀬島の122種、小宝島の89種、臥蛇島の52種、横当島の51種、上ノ根島の32種まで大きく異なっていた。面積最大の中之島で記録種数が最大で、面積最小の上ノ根島で最も記録種数が少ないという事例は認められたが、面積や標高は必ずしも記録種数と相関はしていなかった。また、営巣記録と繁殖期の記録頻度から繁殖種・繁殖の可能性が高い種を抽出すると、トカラ列島全体で31種であった。島ごとの鳥類記録を収集する過程においては、これまでは鳥類調査がほとんど行われていなかった無人島(臥蛇島・横当島・上ノ根島)で短期の上陸調査を実施するとともに、二種の自動記録装置(赤外線センサー式自動撮影カメラとタイマー式デジタル録音機)を設置することにより長期記録を試みた。

2011年夏に設置した装置を2012年夏に回収して解析した結果、繁殖期の連続的なさえずりの記録から繁殖の可能性が高い種を抽出することが可能となり、いずれの島でもアカヒゲとアカコッコの繁殖の可能性が示唆された。上ノ根島・横当島は陸生生物における生物地理区の境界の一つである渡瀬線の南に位置し、地理的には渡瀬線の北に位置するトカラ列島中部の大きな島よりもむしろ奄美大島に近いが、地史的にはトカラ列島の一部を成す比較的新しい火山島である。アカヒゲとアカコッコが夏鳥として繁殖している可能性が高いと推測されたことなどにより、上ノ根島・横当島の鳥類群集はトカラ列島の影響を強く受けて形成されていると考えられた。この研究の成果は生物地理研究と希少鳥類の保全のための利用が期待される。計画通りに、これまでの観察記録・文献資料・有人島における補足調査成果をとりまとめて公表することができ、無人島の現地調査と遠隔記録装置の設置も実施することができており、おおむね順調と評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。概ね計画通りに進行しており、最終年度には遠隔記録装置の回収とそのデータの解析、先に公表したトカラ列島の鳥類相についてのデータの不十分な地域・季節を補完する成果論文の公表を進める予定である。
フッ化セシウム触媒による含酸素環状化合物の開環反応

我々は過去2年にわたり1,4-ベンゾジオキサンおよびオキサゾリジノン骨格の簡略化プロセスを開発した。1,4-ベンゾジオキサン骨格はアドレナリン受容体括抗作用を有するため種々の医薬品に利用されている。我々はCsF触媒によるグリシドール開環とトシル化反応、および水添反応を連結することにより有用なビルディングブロック2-トシルオキシー1,4-ベンゾジオキサンを得た。さらにカルバマートを求核剤とするカルボナートの開環反応による抗菌性を有するオキサゾリジノンの合成に成功した。しかし、いずれのプロセスにおいても99%以上の光学純度のオキシランを用いても生成物の光学純度に若干の低下が認められた。これは開環反応の際のグリシドールのラセミ化、あるいはカルバマートの求核反応の際のカルボナートのラセミ化に起因するものである。本年度はこれらの問題の解決に二つの方法で対処した。まず最初に反応条件の改良を試みた。たとえば、溶媒、反応温度等を精査したが収率に若干の向上が認められたが光学純度については満足すべき結果は得られなかった。次に無溶媒反応を検討した。反応は室温で進行し、光学純度の向上は認められたが良好な収率が得られなかった。もう少し反応条件を改善する必要性がある。とくに少量の溶媒を添加して反応混合物の粘性を増すことにより収率が向上するものと考えられる。二番目に、生成物の再結晶に与る精製を行った。その結果、オキサゾリジノンについては98%eeまで光学純度を向上させることに成功した。本年度は抗菌剤(S)-N-[[3-(3-Fluoro-4-morpholinylphenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl]methyl]acetamide,U-100766のIntegrated Chemical Processについて重点的に検討した。当初、抗菌剤U-100766を合成するにあたってカルバマートによるカルボネナートの開環反応を利用することを計画していた。ところが、カルバマートは常法に従って比較的容易に調整できるものの、光学活性カルボナートの合成は極めて困難であった。とりわけ最終的に必要とされるアセトアミド基の導入は煩雑な実験操作を必要とすることから、カルボナートに代わる新たな出発原料の開発に取り組んだ。様々な基質を検討したところ、エポキシドがカルボナートと同じ光学活性C3単位として利用できることがわかった。そこで、入手が容易な光学活性グリシジルノシラートを出発原料として調整した3-(N,N-ジベンジルアミノ)プロピレンオキシドを用いることにした。フッ化セシウム触媒存在下、エポキジドとカルボナートとを反応させたところ、反応は速やかに進行し目的とするオキサゾリジノン化合物を構築する事が出来た。続いて常法に従って官能基変換を行い目的化合物U-100766を合成することができた。同様の手法を利用して種々の誘導体の合成にも成功した。しかし、生成物2の光学純度を測定したところ僅かながらその低下が観測された。今後は、さらに反応条件を検討して光学純度の低下を防ぐ予定である。