hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高磁場磁気共鳴装置での炭素-13グルコース高速脳内代謝マップによる脳機能画像

最終年度となる2年目は、前年度整備した検出用RFコイル、撮像のためのパルス系列、画像処理プログラムなどを活用しファントムとラットを用いてMRデータを収集した。超高速撮像法のEPIを応用したNMRスペクトロスコピー、エコープラナースペクトロスコピックイメージング(EPSI)法は、7Tの高磁場では従来の2Tに比べ、スペクトルの広がりが3.5倍になるので、同じ範囲のケミカルシフトを有する化合物を観察するためには、スペクトル幅を3.5倍に広げる必要があった。そのため、エコー信号を観測ための傾斜磁場強度は以前の3.5倍に増加し、サンプリングタイムは3.5分の1に短縮されるので、より急速な傾斜磁場の切り替えが要求され、ハードウェアの負担が増大し、期待していたような良好な結果は得られなかった。^1H検出^<13>C-NMR法については、phase cycleを工夫するなどして、^<13>C核の情報を隣接する^1H核の信号として高感度に検出することができた。しかし、化合物の分布画像を作成するためのケミカルシフトイメージング(CSI)に組み込んでみたところ、高濃度の^<13>C化合物ファントムの画像化は可能であったが、生体レベルの^<13>C化合物の画像化には成功しなかった。現在、正確な理由は明らかでないが、不要な信号を抑制し、多量子遷移を選択する傾斜磁場と位相エンコードの傾斜磁場の強度の差が大きすぎるため画像化が困難なのではないかと推測している。一方、^1-Hデカップリング^<13>C-CSIは、7Tという高い磁場の利点を活用し、ラットに1-^<13>Cグルコースを静脈投与し、30分の時間分解能で脳内の1-^<13>C-glucose、4-^<13>C-Glu/Gln、3-^<13>C-Glu/Gln、2-^<13>C-Glu/Glnのそれぞれを分離した画像の構築に成功した。カイニン酸誘発ラットてんかんモデルにこの方法を適用したが、麻酔の影響によるためか、残念ながら脳内のグルコース代謝に関して対照群とてんかんモデルの間に明らかな差異は認められなかった。今年度は、4月より稼動を開始した7Tの実験用の高磁場NMR装置を用いて、炭素-13グルコース高速脳内代謝マップを観測するためのパルスプログラム、データ処理プログラムの製作、信号検出RFコイル、信号フィルターの製作といったソフト・ハード面でのインフラの整備に取り組んできた。7TというNMR装置の高磁場化に伴う、観測周波数の上昇のため、RFコイルの製作は非常に困難であったが、試行錯誤を繰り返し、ようやくラット頭部に適用できる^<13>C,^1H-二重同調容積コイルを完成させた。ソフト面では、^<13>Cグルコースおよびその代謝産物の^<13>C化合物の脳内マッピングを行なうために、^1Hデカップルを組み合わせた^<13>C化合物の検出プログラム、高感度検出のための^1H-検出^<13>C-NMR法、高速代謝画像構築のためのエコープラナースペクトロスコピー法など独自のパルスプログラムを順次整備して、先に準備したRFコイル、フィルターと組み合わせ、^<13>C化合物の標準試料を用いて、NMRデータの収集とデータ解析を開始した。ここでも、高磁場化に伴い、NMR信号の測定感度は向上するものの、観測周波数帯域の拡大、緩和時間の変化、磁場の均一性の調整の難しさなど種々の問題に直面し、2Tの実験用のNMR装置で経験していた測定法、測定条件をそのまま応用することはできず、7Tの特徴を活かした、有効な測定条件の検討とソフト・ハードの更なる改良に取り組んでいるところである。一方、ラットによる動物実験について、実験プロトコールを設定し、学内動物実験委員会による承認を取り付け、NMR環境が整い次第、直ちに動物実験を行なえるよう準備を整えた。一方、^1-Hデカップリング^<13>C-CSIは、7Tという高い磁場の利点を活用し、ラットに1-^<13>

Cグルコースを静脈投与し、30分の時間分解能で脳内の1-^<13>C-glucose、4-^<13>C-Glu/Gln、3-^<13>C-Glu/Gln、2-^<13>C-Glu/Glnのそれぞれを分離した画像の構築に成功した。カイニン酸誘発ラットてんかんモデルにこの方法を適用したが、麻酔の影響によるためか、残念ながら脳内のグルコース代謝に関して対照群とてんかんモデルの間に明らかな差異は認められなかった。
脳の発達、維持、病態におけるスフィンゴ糖脂質の機能解析

スフィンゴリピドーシスは、スフィンゴ糖脂質のライソゾームにおける分解異常を病因とする疾患群で、その多くは重篤な神経病変をきたす。我々は、その疾患モデルマウスを作成し、脳の発達、維持、病態におけるスフィンゴ糖脂質の機能解析を行っている。スフィンゴ脂質活性化たんぱく質(サポシンA, B, C, D)は共通の前駆体であるプロサポシンから誘導される相同性の糖たんぱく質で,多くの疎水性スフィンゴ糖脂質のライソゾームにおける分解に必須である。最近我々は、サポシンDノックアウトマウス(Sap・DKO)を作成し、その小脳と腎臓にはHFA-セラミドが蓄積し、小脳プルキンエ細胞死による運動失調と腎尿細管変性による多尿を呈することを明らかにした。本研究ではSap-DKOにおける小脳プルキンエ細胞死の分子メカニズムの解析を行った。小脳プルキンエ細胞死は日齢120頃より左右対称のゼブラ状に領域特異的に進行し、そのパターンはセラミドの分解産物であるスフィンゴシンをスフィンゴシン-1-リン酸(SIP)に代謝する酵素であるスフィンゴシン・キナーゼ(SPHKI)の発現パターンと相関していることが抗SPHK1抗体を用いた免疫組織化学的検討で明らかになった。すなわち、Sap-DKOにおいてはSPHKIを発現していないプルキンエ細胞群がより早期に細胞死に至り、SPHK1を発現しているプルキンエ細胞群は病末期まで生存していた。同様の所見はNiemann・Pick病C型マウスモデルマウスの小脳においても見出された。一方、初代培養プルキンエ細胞を用いた検討でSPHK1はプルキンエ細胞樹状突起の棘突起部分に局在していることが明らかになった。これらの研究成果から、セラミド、スフィンゴシン、SIPは細胞死やCa代謝などに加え、小脳プルキンエ細胞における神経伝達においても重要な役割を果たしていることが示唆された。我々は,スフィンゴ糖脂質の神経系における機能に興味を持ち、その遺伝性代謝障害であるスフィンゴリピドーシスの疾患モデルマウスを用いて研究を進めている。本研究課題では、スフィンゴ脂質活性化たんぱく質のひとつであるサポシンDの特異的ノックアウトマウスの神経病変の解析に取り組んでいる。本年度はスフィンゴ脂質活性化たんぱく質(サポシンA、B、C、D)の前駆体たんぱく質であるプロサポシンを特異的に認識する抗体の作成に成功した。サポシンA、B、C、Dはそれぞれが特異的なスフィンゴ脂質のライソゾームにおける加水分解に必須である。一方、プロサポシンは、前駆体たんぱく質である以外にもそれ自体に神経栄養因子としての機能が推定されているが、直接的な証明はまだない。プロサポシン特異抗体を用いたウエスタンブロット解析では、マウスの全脳においてプロサポシンの分子量に一致する65kDa付近のバンドのみが同定され、サポシンの分子量である15kDa付近にはバンドを認めず、このバンドは吸収抗体において消失し、プロサポシンノックアウトマウスでは同定されなかった。以上の結果から、プロサポシン特異抗体が得られたと結論した。さらに、各種スフィンゴリピドーシスモデルマウス(サポシンDノックアウトマウス、サポシンAノックアウトマウス、Twitcherマウス)の全脳におけるプロサポシンの発現を検討したところサポシンDノックアウトマウス脳において野生型の約5倍と有意な増加が認められた。この発現増加は胎児期から認められ、サポシンD欠損による一次的な変化と考えられた。この抗体を用いた脳の免疫組織化学的検討では、大脳皮質、脳海馬体等の神経細胞において強い免疫染色性が得られ、特に脳海馬体のCA3領域において著明であった。

これらの結果はプロサポシンの神経細胞における機能とサポシンD領域のその発現調節機能を推定させ興味深い。スフィンゴリピドーシスは、スフィンゴ糖脂質のライソゾームにおける分解異常を病因とする疾患群で、その多くは重篤な神経病変をきたす。我々は、その疾患モデルマウスを作成し、脳の発達、維持、病態におけるスフィンゴ糖脂質の機能解析を行っている。スフィンゴ脂質活性化たんぱく質(サポシンA, B, C, D)は共通の前駆体であるプロサポシンから誘導される相同性の糖たんぱく質で,多くの疎水性スフィンゴ糖脂質のライソゾームにおける分解に必須である。最近我々は、サポシンDノックアウトマウス(Sap-D KO)を作成し、その小脳と腎臓にはHFA-セラミドが蓄積し、小脳プルキンエ細胞死による運動失調と腎尿細管変性による多尿を呈することを明らかにした。本研究ではSap-D KOにおける小脳プルキンエ細胞死の分子メカニズムの解析を行った。小脳プルキンエ細胞死は日齢120頃より左右対称のゼブラ状に領域特異的に進行し、そのパターンはセラミドの分解産物であるスフィンゴシンをスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)に代謝する酵素であるスフィンゴシン・キナーゼ(SPHK1)の発現パターンと相関していることが抗SPHK1抗体を用いた免疫組織化学的検討で明らかになった。すなわち、Sap-D KOにおいてはSPHK1を発現していないプルキンエ細胞群がより早期に細胞死に至り、SPHK1を発現しているプルキンエ細胞群は病末期まで生存していた。同様の所見はNiemann-Pick病C型マウスモデルマウスの小脳においても見出された。一方、初代培養プルキンエ細胞を用いた検討でSPHK1はプルキンエ細胞樹状突起の棘突起部分に局在していることが明らかになった。これらの研究成果から、セラミド、スフィンゴシン、S1Pは細胞死やCa代謝などに加え、小脳プルキンエ細胞における神経伝達においても重要な役割を果たしていることが示唆された。
ストレス応答性転写因子による代謝リプログラミングを標的とした肝癌への革新的治療

難治性疾患の一つである肝細胞癌の分子機序解明を目的とし、ストレス応答転写因子Nrf2の臨床病理学的意義(平成28年度)および肝細胞癌細胞株を用いた機能解析(平成29年度)を行い、悪性度獲得への関与を明らかにしてきた。Nrf2シグナルの下流に存在するNqo1の発現を、肝細胞癌臨床検体127例を用いて検討を行った。Nrf2高発現症例においてNqo1遺伝子発現は有意に高かった。Nqo1高発現症例は悪性度(腫瘍マーカー、腫瘍径、肝内転移)に関与し、生存率において予後不良であった。がんの代謝と腫瘍免疫との関連を明らかにするため、肝細胞癌におけるPD-L1発現と末梢血中の白血球分画との関連について検討を行った。白血球分画として好中球、リンパ球、単球を用い、好中球/リンパ球比、血小板/リンパ球比、リンパ球/単球比を算出し、肝細胞癌に対して肝切除を行った281症例の臨床病理学的因子および予後との検討を行った。予後に関しては多変量解析にてリンパ球/単球比が独立した予後不良因子であった。リンパ球/単球比が低い症例で腫瘍マーカーが高値、腫瘍径が大きく、低分化肝細胞癌が有意に多かった。PD-L1発現は切除標本を用いて抗PD-L1抗体を用いた免疫組織化学染色にて評価した。PD-L1発現症例において有意にリンパ球/単球比が低かった。リンパ球/単球比が高く、PD-L1発現陰性の症例は予後が最も良好であった。肝細胞癌治療における問題点の一つは局所療法や塞栓療法後の局所再発であり、しばしば治療抵抗性へと進展する。近年、ストレス応答性転移因子の一つであるNrf2-Keap1制御系が抗酸化タンパク獲得、代謝リプログラミングにより癌の悪性化に寄与していることが明らかになってきている。Nrf2-Keap1制御系の解析は癌の悪性化獲得のメカニズムの解明に非常に重要であるだけでなく、新しい治療法開発に向けて、その研究の進展が期待されている。本研究の目的は、肝細胞癌におけるNrf2-Keap1制御系の分子生物学的解析と革新的治療法への応用を検討することである。具体的には、(1)肝細胞癌におけるNrf2-Keap1制御系発現異常、(2)肝細胞癌の悪性化獲得におけるNrf2-Keap1制御系の役割、メタボローム解析、(3) Nrf2-Keap1制御系による肝細胞癌の革新的治療の開発について詳細な検討を行う。平成28年度においては、肝細胞癌における活性化Nrf2タンパク発現を免疫染色にて検討を行った。臨床病理学的因子との比較を行い、浸潤・転移に関与し、独立した予後因子であることが明らかとなった。当初の目標通りに進んでいる。肝癌治療における問題点の一つは局所療法や塞栓療法後の局所再発であり、しばしば治療抵抗性へと進展する。近年、ストレス応答性転移因子の一つであるKeap1-Nrf2制御系が抗酸化タンパク獲得、代謝リプログラミングにより癌の悪性化に寄与していることが明らかになってきている。Keap1-Nrf2制御系の解析は癌の悪性化獲得のメカニズムの解明に非常に重要であるだけでなく、新しい治療法開発に向けて、その研究の進展が期待されている。本研究の目的は、肝癌におけるKeap1-Nrf2制御系の分子生物学的解析と革新的治療法への応用を検討することである。具体的には、(1)肝癌におけるKeap1-Nrf2制御系発現異常、(2)肝癌の悪性化獲得におけるKeap1-Nrf2制御系の役割、メタボローム解析、(3) Keap1-Nrf2制御系による肝癌の革新的治療の開発について詳細な検討を行う。平成28年度:Nrf2タンパク発現と臨床病理学的因子との検討を行い、肝細胞癌の浸潤・転移に関与し、独立した予後因子であることが明らかになった。平成29年度:肝癌細胞株を用いたNrf2の役割について検討を行った。非接着培養の肝癌細胞株においてNrf2タンパクおよびその標的遺伝子HO-1、Nqo1タンパク発現更新を認めた。Nrf2阻害によりHO-1およびNqo1タンパク発現は抑制された。非接着培養によって解糖系酵素およびNADPH産生酵素の発現亢進を認めた。Nrf2阻害剤を用いることによる肝癌細胞株の増殖および遊走が阻害された。概ね当初の目標通りに進んでいる。

白血球分画として好中球、リンパ球、単球を用い、好中球/リンパ球比、血小板/リンパ球比、リンパ球/単球比を算出し、肝細胞癌に対して肝切除を行った281症例の臨床病理学的因子および予後との検討を行った。予後に関しては多変量解析にてリンパ球/単球比が独立した予後不良因子であった。リンパ球/単球比が低い症例で腫瘍マーカーが高値、腫瘍径が大きく、低分化肝細胞癌が有意に多かった。PD-L1発現は切除標本を用いて抗PD-L1抗体を用いた免疫組織化学染色にて評価した。PD-L1発現症例において有意にリンパ球/単球比が低かった。リンパ球/単球比が高く、PD-L1発現陰性の症例は予後が最も良好であった。肝細胞癌細胞株を用いたNrf2-Keap1制御系の機能解析を行い、悪性度への関与を行う。また、メタボローム解析によるNrf2-Kea1制御系による代謝リプログラミングを明らかにする。Nrf2の標的遺伝子Nqo1の変化をさらに検討する必要がある。臨床的意義に関しては切除標本を用いてNqo1発現の変化を検討する。当初、Nqo1の臨床的発現の意義に関する研究・実験を行う予定だったが、来年度行うこととなった。当初予定していたNqo1発現の実験を次年度行うために必要な抗体(Nqo1)等を次年度繰越金5万円で購入する
パーキンソン病の危険要因に関する分析疫学的研究

[目的]パーキンソン病になりやすいライフスタイルを若齢にさかのぼって明らかにする。[方法]北大神経内科の本症患者95名と年齢、性、地域を合わせた正常者を1:2に適合させ、218質問から成る調査票を用いて、症例対照研究を行ない、本症の危険要因を評価する。まず要因ごとの単相関を検出し、ついで主な要因が複合した場合の多重的効果を多重ロジステティック法で分析する。[結果及び考察]今回までにすべての調査を終了し、全部の項目と本症との単相関を検定し、つぎのような知見を得た。1)幼少期から蛋白質、ビタミン類、繊維質などの摂取が乏しく、とくに第二次成長期に、糖質、蛋白質、脂質の三代栄養素の摂取不足があり、39歳まで同じ傾向がみられる。40歳以降の食生活との関連は薄い。2)嫌酒傾向・嫌煙傾向3)若い頃に「運動神経」が悪く、体が硬く、瞬発力がない、体育・運動嫌い。肌の色が白い、一日の体調変化がない。4)本・新聞を読まない、筆不精、電話をかけない、友達が訪ねてこない・訪ねない、責任感が強くない。団体に積極的に参加しない、リーダーには絶対になりたくない、あまり外出しない。5)非社交的、無口、世話好きでない、ゆっくり喋る、余りいらいらしない、責任感が強くない。行動範囲が広くなく、内向的、外部との接触を嫌う傾向。6)子供(第一子)は成長、お座りが遅い。微細運動が遅い。あまり動き回らない。多くの研究を総合すると、本症は多数の遺伝子の関与する「素因」に、生涯にわたって環境要因が加重して、罹病への傾向が増すとされている。近年、分子遺伝学の分野の知見が増しているので、本研究では主として生活面から本症に関与する因子を把握した。本症の感受性遺伝子の解析が進んでいるが、今後は、ライフスタイルと遺伝的変異の交互作用をも含めた総合的な危険要因の評価が必要である。微細運動が遅い。あまり動き回らない。
ビッグデータから放射線抵抗性遺伝子プロファイルを同定する

我々は現在国際的に進行中の癌ゲノム配列情報やマイクロアレイによる遺伝子発現量を統計学的に解析して癌の放射線抵抗性にかかわりそうな遺伝子変異や遺伝子発現パターンを同定し、実際に細胞株を用いてその遺伝子変異や遺伝子発現を導入することで、放射線感受性が変化するかについて確認したいと考えている。平成28年度平成29年度の2年で、TCGAに公開されているデータから遺伝子発現パターンと予後相関について、初年度の平成28年度はまず研究遂行に適切なパーソナルコンピュータなどの環境を整えることから始め、公共データベースから遺伝子情報を抽出する作業を確立し、特にマイクロRNA-seqからの遺伝子発現量を解析することができるようになった。まず、マイクロRNAについて予後との相関を調べた結果、miR-654-3pの低発現である子宮頸癌では予後が不良であるという結果を得た。ここで、癌幹細胞は癌細胞集団の少数を占める抗がん剤や放射線治療に抵抗性で造腫瘍能の高い細胞として知られているが、子宮頸癌細胞株のHeLaの癌幹細胞のmiR-654-3pは低発現であることがわかった。miR-654-3pというマイクロRNAが低発現であれば、癌が癌幹細胞様細胞の集団となり、治療抵抗性となることが示唆された。本研究により、癌の臨床と、癌幹細胞の基礎研究を関連づけることができると考えられ、今後も新たな候補遺伝子の探索を続ける予定である。平成28年度平成29年度の2年計画で、TCGA(http://cancergenome.nih.gov)やICGC(https://icgc.org)に公開されているデータの中から必要な情報(患者背景、治療、予後情報、遺伝子変異情報等)を抽出し、遺伝子発現パターンと予後相関について、頭頸部癌や子宮頸癌、脳腫瘍など比較的放射線治療のウエイトが高い癌種で解析し、局所制御率や全生存期間との相関を解析する予定である。初年度の平成28年度はまず研究遂行に適切なパーソナルコンピュータなどの環境を整えることから始め、公共データベースから遺伝子情報を抽出する作業を確立した。特にRNA-seq、miRNA-seqからの遺伝子発現量を解析することができるようになった。その結果、これまで我々が行なってきた癌細胞株から放射線耐性株を作成する実験でのマイクロアレイの結果を比較検討した結果、いくつかの遺伝子の発現パターンが放射線耐性株と、臨床データベースから導き出された予後不良となる遺伝子発現パターンと予後との相関結果と一致することが明らかとなった。今後、さらなる解析を進めていく予定である。当初の予定通り、データベースからのデータ抽出と予後との相関を解析できるようになってきた。平成28年度平成29年度の2年計画で、TCGA(http://cancergenome.nih.gov )やICGC(https://icgc.org)に公開されているデータの中から必要な情報(患者背景、治療、予後情報、遺伝子変異情報等)を抽出し、遺伝子発現パターンと予後相関について、頭頸部癌や子宮頸癌、脳腫瘍など比較的放射線治療のウエイトが高い癌種で解析し、局所制御率や全生存期間との相関を解析する予定である。今後は、注目遺伝子のノックダウンや過剰発現が放射線抵抗性に寄与するかを細胞実験で検証をする。データベースからのデータ抽出と予後との相関を解析できるようになったが、注目遺伝子の選別に苦慮している。

miR-654-3pというマイクロRNAが低発現であれば、癌が癌幹細胞様細胞の集団となり、治療抵抗性となることが示唆された。本研究により、癌の臨床と、癌幹細胞の基礎研究を関連づけることができると考えられ、今後も新たな候補遺伝子の探索を続ける予定である。データベースから遺伝子発現量の解析はできるようになってきたが、今後は遺伝子変異の解析と放射線治療抵抗性について解析していきたい。今年度早期に注目遺伝子を決定し、その遺伝子の発現量と放射線抵抗性について解析を進めたい。10111円の次年度使用額が生じた。これは、今年度にデータベースからのデータ抽出と予後との相関を解析できるようになったが、注目遺伝子の選別に苦慮し、研究自体に若干の遅れが生じたため、消耗品を次年度に購入することが適切と判断した。
網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫の細胞レベルでの病態・構造・機能解析システムの確立

補償光学適用走査レーザー検眼鏡(AO-SLO)の眼底トラッキング機能を向上させるにより固視微動などの補正を高速で行うように改良した。黄斑浮腫が消失した陳急性網膜静脈閉塞症症例の視細胞の観察を行った。閉塞領域では健側に比べて、有意に視細胞密度が減少し、六角形細胞の出現率も低下していた。また、このような領域ではマイクロペリメトリーを用いて測定した網膜感度も低下していた。また、陳急性網膜静脈閉塞症では毛細血管の拡張が見られ、血管の障害が黄斑浮腫消失後も残存していた。中心窩に嚢胞様黄斑浮腫が残存した慢性期網膜静脈閉塞症でも視細胞密度が減少し、六角形細胞の出現率が低下していることが明らかになった。現在、補償光学を適用走査レーザー検眼鏡に適用することにより、生体下で二次元的に網膜を細胞レベルで観察することが可能である。そこで、本研究の全体構想は補償光学適用走査レーザー検眼鏡(AO-SLO)の撮影速度・感度・システムを改良し、生体下で三次元的に細胞レベルでの網膜の構造を画像化し、解析評価するシステムを開発する。これまで、網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫の病態・構造・機能の評価は光干渉断層計(OCT)を中心に進められてきた。しかし、現行のOCTでは解像度の限界から細胞レベルの評価は不可能であり、通常は網膜断面像で評価することが多い。そこで、AO-SLOを適応することにより、黄斑浮腫による網膜視細胞の障害を二次元的・定量的に評価し、機能障害との関係を明らかにする。さらに、改良AO-SLOを用いて、黄斑浮腫の細胞レベルでの三次元的な構造・病態・機能解析を行う。補償光学を適用走査レーザー検眼鏡の眼底トラッキング機能の向上により固視微動などの補正を高速で行うように改良した。更に、平面分解能約3ミクロンの高解像度画像を獲得するために、リアルタイムに眼球全体の収差を計測し、測定光束が眼底をスキャンする前後で波面補正素子を2度通過させることで完全に眼球収差を取り除くシステムを採用しているが、処理速度を高め、ことができるようにシステムに改良を行った。更に、フォーカルプレインを網膜色素上皮から硝子体腔側に自動的に移動させ、三次元的な撮影を行うことができるように装置の改良をおこなった。システムソフトウエアの改良を行い、撮影操作が簡便になり、撮影が効率よく行われるようになった。現有する補償光学を適用走査レーザー検眼鏡試作機を用いて、黄斑浮腫が消失した陳急例、黄斑浮腫を伴った急性例の視細胞を細胞レベルで撮影・画像化し、細胞障害の程度を定量的に解析した。その結果、網膜静脈閉塞症が生じた領域では視細胞密度が有意に減少し、マイクロペリメトリーを用いて測定した網膜感度は有意に低下していた。また、神経線維束を正常眼、緑内障眼で画像化し、緑内障眼では神経線維束が狭細化していることがわたった。これらより、網膜各層を補償光学を適用走査レーザー検眼鏡で画像化することが可能になり、今後、三次元構築を行うための準備が進んだ。平面分解能約3ミクロンの高解像度画像を獲得するために、リアルタイムに眼球全体の収差を計測し、測定光束が眼底をスキャンする前後で波面補正素子を2度通過させることで完全に眼球収差を取り除くシステムを採用しているが、処理速度を高め、ことができるようにシステムに改良を行った。補償光学を適用走査レーザー検眼鏡試作機を用いて、黄斑浮腫が消失した陳急例、黄斑浮腫を伴った急性例の視細胞を細胞レベルで撮影・画像化し、細胞障害の程度を定量的に解析した。その結果、網膜静脈分枝閉塞症が生じた領域では視細胞密度が有意に減少し、マイクロペリメトリーを用いて測定した網膜感度は有意に低下していた。また、網膜中心静脈閉塞症発症眼では僚眼の検眼に比べて有意に細胞密度が低下し、六角形細胞の出現率が低下していることがわかった。また、得られた動画から網膜の毛細血管を抽出し、画像化することが可能となった。

糖尿病網膜症等の細小血管障害をおこす疾患では毛細血管を通過する血球の速度にばらつきがあることが分かった。網膜各層を補償光学を適用走査レーザー検眼鏡で画像化することが可能になり、今後、三次元構築を行うための準備が進んだ。実際の慢性の黄斑浮腫を有する中心窩の周囲の視細胞の観察も行い、細胞配列に大きな乱れが生じ、cystoid spaceを伴っているのが観察された。眼科AO-SLOの眼底トラッキング機能の向上により固視微動などの補正を高速で行うように改良した。また、眼球全体の収差を計測・処理速度を高めることができるようにシステムに改良を行った。改良したAO-SLO試作機を用いて、黄斑浮腫が消失した陳急例、黄斑浮腫を伴った急性例の視細胞を細胞レベルで撮影・画像化し、細胞障害の程度を定量的な解析を行った。また、得られた視細胞の画像と光干渉断層計での網膜視細胞層の健常さ、厚さとの関連を解析した。嚢胞様黄斑浮腫を認めた症例のcystoid space下の視細胞をAO-SLOで撮影し、黄斑浮腫症例でも撮影が可能であることを確かめた。また、本システムを用いて、正常人の網膜循環動態を測定し、得られたデータから網膜毛細血管レベルの血流量・血流速度・血管径・血球の流速度の正常値を計測した。補償光学を適用走査レーザー検眼鏡の眼底トラッキング機能の向上により固視微動などの補正を高速で行うように改良した。更に、平面分解能約3ミクロンの高解像度画像を獲得するために、リアルタイムに眼球全体の収差を計測し、測定光束が眼底をスキャンする前後で波面補正素子を2度通過させることで完全に眼球収差を取り除くシステムを採用しているが、処理速度を高め、ことができるようにシステムに改良を行った。更に、フォーカルプレインを網膜色素上皮から硝子体腔側に自動的に移動させ、三次元的な撮影を行うことができるように装置の改良をおこなった。システムソフトウエアの改良を行い、撮影操作が簡便になり、撮影が効率よく行われるようになった。現有するSLO試作機を用いて、黄斑浮腫が消失した陳急例、黄斑浮腫を伴った急性例の視細胞を細胞レベルで撮影・画像化し、細胞障害の程度を定量的に解析した。その結果、網膜静脈閉塞症が生じた領域では視細胞密度が有意に減少し、マイクロペリメトリーを用いて測定した網膜感度は有意に低下していた。また、遷延性黄斑浮腫を伴った症例での視細胞は撮影できる症例とできない症例があることがわかった。また、神経線維束を正常眼、緑内障眼で画像化し、緑内障眼では神経線維束が狭細化していることがわたった。また、網膜毛細血管を流れる、白血球を画像化し、速度の測定も行った。改良したAO-SLOを用いて、網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫症例の撮影を行い、生体下で三次元的な細胞レベルでの黄斑浮腫の画像化を行い、病態・構造・機能の解析を行う。また、網膜毛細血管レベルでの個々の血球の循環動態を観察し、網膜循環静脈閉塞症に伴う循環動態の変化・黄斑浮腫への影響を評価する。改良したAO-SLOを用いて、黄斑浮腫が消失した陳急例、黄斑浮腫を伴った急性例の視細胞を細胞レベルでの撮影を行う。得られたデータを基に黄斑浮腫の構造を三次元的に画像化する。撮影解析したデータとマイクロペリメトリーを用いて測定した網膜感度を比較検討することにより、網膜視細胞の障害の程度と網膜機能との関連を検討する。改良したAO-SLOにマイクロペリメトリーを搭載し、細胞レベルで刺激を行い、網膜の感度と、細胞障害の程度との関連を検討する。
細菌群集の機能遺伝子組成の環境に依存した収斂現象の解明

環境が類似した細菌群集間で、系統組成が大きく異なっているが遺伝子機能組成が類似する「細菌群集の収斂現象」について、公共のメタゲノム配列データを収集・解析することで、その存在を明らかにするとともに、収斂現象が観察されやすい環境の特徴を明らかにすることができた。また、収斂現象を引き起こす要因として、当初は遺伝子の水平伝播を仮定していたが、その影響は限定的であり、自然選択等の他の要因が主として考えられることを示唆することができた。収斂現象が観察される細菌群集の特徴を明らかにするために、公共の塩基配列データベース中に存在するメタ16S・メタゲノムサンプルの配列データと付随するメタデータを、キーワード検索を基にして網羅的に取得した。しかしながら、それらのデータはメタデータからのメタ16Sデータとメタゲノムデータの判別が困難であったため、サンプルごとにメタ16Sデータなのかメタゲノムデータなのかを配列の多様性を基に自動で判別するプログラムを開発した。上記の自動判別プログラムの他に配列のクオリティフィルタリングプログラムや、メタ16Sとメタゲノムの区別無くGPUを用いてサンプルの系統組成を16S rRNA遺伝子配列から高速に計算するプログラム、遺伝子予測後に既知の機能遺伝子配列データベースに対して配列類似性検索を行うことで遺伝子機能組成を推定するプログラム等を開発した。それらのプログラムを用いて、スーパーコンピュータを用いて全サンプルに対して計算を実行し、全サンプルの系統組成と、多くのサンプルの遺伝子機能組成データを得ることが出来た。一部のサンプルの遺伝子機能組成データを得るための計算は未だ実行中ではあるが、2016年度の初旬には完了する予定である。これらのデータは、本研究の目的を達成する上で必須となる基盤データである。当初はメタゲノムサンプルごとの系統組成および遺伝子機能組成の推定用の計算は1年目で終わらせる予定であったが、メタ16Sとメタゲノムあわせて約15万件と、予想よりもデータの数がかなり多くなっていたため、遺伝子機能組成推定のための計算が1年目では終わらなかったため、やや遅れているとした。しかしながら、2年目の初旬でこの計算は完了する見込みである。平成27年度に開発した、メタ16Sとメタゲノム配列データの解析パイプラインを用いて、遺伝研スーパコンピュータ上で公共のメタ16S・メタゲノムデータについて解析を行い、メタ16S・メタゲノムサンプル由来の約6万サンプルの系統組成と、メタゲノムサンプル由来の約4千サンプルの遺伝子機能組成を得ることができた。それらのサンプルの生息環境のアノテーション付けについては、別プロジェクトで開発している微生物の生息環境オントロジーMEOを用いて、研究協力者と共にアノテーション付けをサンプルごとに行った。得られた各サンプルの系統組成データと遺伝子機能組成データを比較解析して、収斂現象が観察されるサンプルを抽出するために、ほとんどのサンプルで存在量が普遍的に多い必須遺伝子を平均存在量やサンプル間の変動係数等の統計量を基に特定して除外し、また一部のメタトランスクリプトームデータのように遺伝子機能組成が極端に偏っているサンプルを除外した。その後、遺伝子機能組成及び系統組成それぞれで相関解析等の解析を行い、両結果を統合した上で、解析結果の統計量から収斂現象が起こっていそうなサンプルペアを抽出した。抽出したそれらのサンプルペアごとに、メタゲノム解析の精度を高めるためにサンプルごとに配列を再アセンブルした後再度遺伝子機能組成を推定し、可能であればメタゲノムからのドラフトゲノム構築やメタゲノムからのほぼ完全長の16S rRNA遺伝子配列の再構築等の、収斂現象が起こっていると言えるサンプルペアを確定するための詳細な比較メタゲノム解析を現在行っている。平成28年度の中旬に研究代表者が東京工業大学から国立遺伝学研究所に異動したため、計算機環境の変更等によって、一ヶ月弱解析を行えない時期があったため、研究計画にやや遅れが生じている。昨年度までに行った、メタ16Sとメタゲノム配列データの解析パイプラインの開発と公共のメタ16S・メタゲノムデータの解析により、系統組成が全く異なる細菌群集間で遺伝子の機能組成が生息環境に依存して類似する、細菌群集の収斂現象が起こっていそうなサンプルペアを抽出することができた。それらのサンプルペアは、大まかな傾向としては、土壌等の非常に多様な群集に比べると、宿主に共生する細菌群集や極地等の極限環境等、中程度以下の系統的な多様性の群集に多い傾向が見られた。なお、遺伝子の機能組成をどのレベルで整理するかによって収斂現象が起こっていそうなサンプルペア数は大きく変化し、かつ、遺伝子機能組成として類似していると推定されたサンプルペア間でも、各遺伝子機能にアサインされた遺伝子の機能ドメイン構成やオペロン構造等のレベルまで詳細に解析すると、サンプルペア間でそれらは大きく異なっている場合が多く、水平伝播等で様々な環境間で同一の遺伝子クラスターやオペロンが移動していることが、収斂現象の原因である可能性は低いことが明らかになった。研究を進める過程で、どこまで遺伝子機能を細かく分類するか、特に、実験的な機能解析が詳細に行われているモデル微生物から遠いが環境中では優占している系統群に対して、配列データのみからどの程度詳しい遺伝子機能を推定できるかという問題点に直面した。今後、本研究で得られた収斂現象が起こっていそうなサンプルペアの情報と、高度なバイオインフォマティクスの解析技術や高精度なリファレンスデータベースが組み合わされることによって、なぜある環境で特定の遺伝子機能組成を持った群集が形成されるのか、等の研究へと発展できると期待される。

環境が類似した細菌群集間で、系統組成が大きく異なっているが遺伝子機能組成が類似する「細菌群集の収斂現象」について、公共のメタゲノム配列データを収集・解析することで、その存在を明らかにするとともに、収斂現象が観察されやすい環境の特徴を明らかにすることができた。また、収斂現象を引き起こす要因として、当初は遺伝子の水平伝播を仮定していたが、その影響は限定的であり、自然選択等の他の要因が主として考えられることを示唆することができた。得られたメタゲノムサンプルごとの系統組成および遺伝子機能組成データと、それらのサンプルのメタデータを半自動的に整理して生息環境の抽出およびアノテーション付けを行い、本研究で解析に用いる基盤データの完成を急ぐ。データが大量になっているので、系統組成および遺伝子機能組成データをサンプル間で比較解析する際には、全サンプルを一度に比較解析に用いるのではなく、サンプルごとに統計量を計算して詳細に比較解析すべきサンプル群を絞り込むことで、解析の効率化を行う。抽出した収斂現象が起こっていそうなサンプルペアの高精度な比較メタゲノム解析を急ぎ行い、どのような環境で、どのような機能遺伝子について、収斂現象が起こっているのかを詳細に明らかにする。微生物生態学・ゲノムインフォマティクスメタゲノムの遺伝子機能組成の計算が完了しなかったため、予定していた国際学会での発表2件への応募をとりやめたことによって、次年度使用額が生じた。研究代表者が年度の中旬に東京工業大学から国立遺伝学研究所へと異動した関係で、使用できる計算機環境および実験室環境の変更等があったため、研究の進捗が遅れ、予定していた国際学会での発表申し込みに間に合わず、国際学会への出張を1回分取りやめた。また、研究環境が大きく変わったため、購入を予定していた物品についても、異動前後で使える機器が違う等の問題により年度内の購入を取りやめたため、次年度使用額が生じた。今年度にはメタゲノムの遺伝子機能組成の計算は完了するので、今年度末近くに開催される国際学会2件での発表を計画しており、その旅費として使用したい。異動先の国立遺伝学研究所での研究環境が整ったため、物品の購入を進め、研究成果の国際学会での発表と論文発表を急ぐ。
メラノソーム輸送におけるRab27A活性化の時間的・空間的解析

シナプトタグミン様タンパク質(Slp)はアミノ末端にRab27A結合ドメインSHD(Slp homology domain)を有しており、このドメインを利用して活性型Rab27Aを選択的に認識するツールを作ることが本研究課題の目的である。Slpファミリーのうち、Slp2-aは活性型Rab27Aのみを検出するのに対して、Slp4-a(別名granuphilin-a)は活性型・不活性型Rab27Aの両方を認識する。この予備的実験の質を高めていけばRab27A活性化センサーを開発出来る可能性が高い。即ちGFP-Slp2-a-SHDと単量体赤色蛍光タンパク質(monomeric red fluorescent protein, mRFP)を融合したSlp4-a-SHDを精製し、両者を同時にメラノサイトにマイクロインジェクションして可視化すれば、生細胞内で活性型・不活性型Rab27Aを同時に観察することが可能と考えられる。現在、これらの精製タンパク質の準備を行うと共に、今後の解析に必要となる可視化技術の最適化を行っている。本研究課題では、内在性Rab27Aの機能を阻害せずにRab27Aの活性化を高感度に検出するRab27A活性化センサーの作製を目指している。シナプトタグミン様タンパク質(Slp)およびSlac2ファミリーの8つのタンパク質はアミノ末端に活性型Rab27A特異的結合ドメインSHD (Slp homology domain)を有しており、このドメインを利用すれば活性型Rab27Aを選択的に認識するツールを作ることが可能と考えられる。しかし、野生型のSHDを用いては内在性タンパク質と競合する可能性が高い。そのため、Rab27AとSHDの結合親和性の最適化が重要な問題となる。そこで今年度はSHDの点変異体やキメラなど様々な変異体を作製して、Rab27Aとの結合親和性の最適化を図った。その結果Rab27Aとの結合が強いものから弱いものまで、様々な結合親和性を持つSHD変異体が得られた。今後は得られた変異型SHDタンパク質の精製とメロシアニン蛍光色素の導入を行い、Rab27A活性化センサーとして実際に利用可能なものを選択していく計画である。また作製した活性化センサーを用いて生きたメラノサイトにおける内在性Rab27Aの活性化を時間的・空間的に解析することが本研究課題の最終的な目標である。その為にはRab27Aとそのエフェクター(Slp/Slac2)の機能に関する更なる知見の積重ねが必要である。そこで今年度は機能があまり解明されていなかったRab27A結合タンパク質Slac2-cに関して、メラノソーム輸送における機能解析を行った。その結果、Slac2-cは以前に明らかにしたRab27A-Slac2-a-ミオシンVa複合体とは対照的に、Rab27A-Slac2-c-ミオシンVIIa複合体として、網膜色素上皮細胞のメラノソーム輸送で機能する事を示唆する結果が得られた。
次世代イメージング法によるヒト神経筋セグメントの可塑性評価と運動療法の基盤構築

運動療法の効果検証や新規的なプログラム開発に向けて,ヒト生体における骨格筋内の局在的な組織弾性の可視化・定量化を基に,性状特性に及ぼす運動の影響から筋組織の可塑的変化を明らかにすることを目的とした.ストレッチの運動効果を検討した結果,関節柔軟性の増加は筋の形状変化に関係なく,安静時の筋弾性低下に起因することが明らかになった.また,運動中の下腿筋弾性の筋間差は筋長増大に伴い開くことから,筋にかかる力学的ストレスは筋間で不均一である可能性が示唆された.本年度の研究では,最新工学技術である超音波剪断波エラストグラフィを応用し,ヒト生体における骨格筋の組織弾性,即ち硬さを非侵襲的に画像化し,客観的な指標で定量評価する方法を検討した.更に,関節可動性と筋組織の弾性特性の関係を探索した.硬さの定量評価は,その評価方法の確立に向けて,超音波ビームによる微細振動からの剪断波伝播速度に基づいて取得される剪断弾性係数の計測における信頼性と妥当性を検討した.腓腹筋を対象とした安静時弾性係数の測定値の再現性は,0.9以上の級内相関係数,4%未満の変動係数および0.2キロパスカルの測定標準誤差が得られたことから非常に良好であることが明らかとなった.また,取得される筋の弾性係数は,腱・腱膜に対して斜めに走行する筋線維の傾斜角度,即ち羽状角の影響を受けることが懸念される為,特製のファントムや生体に近似した御遺体を使用して測定値の妥当性を確認した.その結果,剪断弾性係数は羽状角の程度に影響される可能性を示す現象が実証された.従って,超音波剪断波法を用いた骨格筋の硬度評価では,個々の筋が有する形状特性を十分に考慮することが必要であることが示唆された.関節可動性と筋硬度の関係は,足関節の他動的な背屈角度と腓腹筋の安静時弾性係数との相関分析により検討した.その結果,背屈角度と腓腹筋の弾性係数との間には負の相関関係(-0.74 -0.67)にあることが明らかとなった.このことから,安静時の筋硬度が低いほど関節柔軟性は高い可能性のあることが示された.今回の検討は,リハビリテーション領域における筋スティフネスの定量評価法の構築や関節可動域制限の改善に対する運動療法の開発・効果判定に向けた基盤資料となり得る.本年度の研究では,次世代イメージングの超高速超音波法による定量的な筋スティフネスの臨床評価法の確立に向けて,ヒト生体および御遺体の羽状筋組織を対象に弾性計測の妥当性検証を進めるとともに,筋スティフネスに対する運動療法の効果検証や新規的な運動プログラム開発に向けた基盤研究を推進した.羽状筋の特徴である腱に対して斜めに配列する筋線維の傾斜角度の影響を検討した結果,筋線維が腱とほぼ平行に走行する紡錘状の筋弾性と比較して羽状の筋弾性は高値を示したことから,羽状筋のスティフネス定量は真の値よりも過大評価している可能性が示唆された.運動療法で頻繁に施行される下腿筋群のストレッチングの介入効果を検討した結果,関節柔軟性の増加は筋の形状変化に関係なく,安静時筋スティフネスの低下に起因することが明らかになった.更に,腓腹筋を構成する外側頭と内側頭の筋弾性は有意に筋間で異なるものの,ストレッチによる経時的な変化は筋間で一様であることが示された.また,ストレッチング時に観察される筋弾性の動態を検討した結果,下腿三頭筋スティフネスの筋間差は筋長増大に伴って著明に開大したことから,筋に負荷される力学的ストレスは筋間で不均一である可能性が示唆された.これまでの一連の検討は,リハビリテーション領域における筋組織性状の定量評価法の構築や運動器障害に深く関与する筋スティフネスへの運動療法の開発・効果判定に向けた基盤資料となりうる.また,得られた研究の成果は,リハビリテーション科学やスポーツ医科学分野の国内外で開催された学術集会ならびに国際誌に公表した.運動療法の効果検証や新規的なプログラム開発に向けて,ヒト生体における骨格筋内の局在的な組織弾性の可視化・定量化を基に,性状特性に及ぼす運動の影響から筋組織の可塑的変化を明らかにすることを目的とした.ストレッチの運動効果を検討した結果,関節柔軟性の増加は筋の形状変化に関係なく,安静時の筋弾性低下に起因することが明らかになった.また,運動中の下腿筋弾性の筋間差は筋長増大に伴い開くことから,筋にかかる力学的ストレスは筋間で不均一である可能性が示唆された.本年度の研究では、最新工学技術の超高速リアルタイム超音波エコーイメージング法を応用し、ヒト生体における単一筋内の組織弾性を非侵襲的に可視化し客観的に評価する可能性を探るとともに、筋組織の力学特性に及ぼす運動の影響を分析した。下腿三頭筋を対象とし、キロパスカル単位の絶対量で算出した弾性計測において、非常に高い測定値の再現性が確認でき、更に関心領域内で明瞭な弾性の空間分布のマッピングが可能であった。一方、筋の深層部や腱組織の弾性画像は十分な描出を得ることが難しい例もみられ、定量可能な対象領域は限定される可能性が予想された。また、本手法で捉える筋振動からの剪断波伝播速度に基づいて取得される組織弾性は筋線維の走行方向に影響される傾向があり、筋束が斜めに位置する羽状筋では筋の縦断面での撮像が妥当であることが明らかとなった。

運動療法が筋組織の力学的特性に及ぼす可塑的な変化を明らかにするため、腓腹筋外側頭・内側頭およびヒラメ筋を対象に、足関節の他動的背屈の影響や静的なストレッチングの効果を検討した。その結果、足背屈に伴う下腿三頭筋の弾性変化パターンから、荷重位での他動的な足関節背屈運動中における筋束領域の力学ストレスは3筋間で著しく異なる可能性のあることが示唆された。また、短時間の静的ストレッチング運動が腓腹筋内の局所弾性に及ぼす急性の影響を検討した結果、腓腹筋束部の弾性は施行後に低下するが、その効果は時間経過に伴って小さくなり、運動前の状態には15ー20分以内に戻ることが明らかとなった。また、ストレッチングによる腓腹筋の力学的特性変化におけるタイムコースは腓腹筋外側頭・内側頭の2筋頭間で類似することが示された。今回の検討は、リハビリテーション領域における運動療法プログラムの新規開発や筋の硬さ(スティフネス)の定量評価法の構築に向けた基盤資料となり得る。リハビリテーションを展開する上で骨格筋の可塑性解明とその多面的な定量評価法の確立に向けて,研究目的の達成に影響がない範囲で現在までに研究内容の遂行順序が多少前後するものの,当初の研究目的で掲げた次世代イメージング法を用いた筋組織の粘弾性の定量評価方法の構築ならびに力学的因子に基づく運動療法の開発に向けた検討について予定通り進捗している.リハビリテーションを展開する上で骨格筋の可塑性解明とその多面的な定量評価法の確立に向けて、研究目的の達成に影響がない範囲で現在までに研究内容の遂行順序が多少前後するものの、当初の研究目的で掲げた次世代イメージング法を用いた筋組織の粘弾性の可視化・定量化ならびに力学的因子に及ぼす運動の影響の検討について予定通り進捗している。今後は,これまで取得した基礎資料を基づき,次世代イメージングの超高速超音波法による定量的な筋スティフネスの臨床評価法の確立に向けて,改良型弾性ファントムや御遺体の筋組織を使用した妥当性の検証を更に進めるとともに,弾性係数に及ぼす体液変化の影響を明らかにしてゆく.また,超音波ドプラ法による筋内微小循環動態の定量評価法を検討し,力学的・代謝的因子に及ぼす運動の影響を包括的に分析し,運動療法効果の機序解明や新規の運動プログラム開発に向けた基盤研究を推進する.最終年度にあたる本年度は,リハビリテーション科学やスポーツ医科学分野の国際学会ならびに国際誌に本研究で得られた新知見を積極的に公表する予定である.今後は、これまで取得した基礎資料を基に次世代イメージングの超高速超音波法による神経筋組織のスティフネスの定量評価法の確立に向けて、弾性ファントムを作製し妥当性の検証を更に進めるとともに、超音波ドプラ法による筋内の微小循環動態の定量評価方法を検討し、力学的・代謝的因子に及ぼす疾病、障害および運動の影響を包括的に分析してゆく。また、無侵襲イメージングの拡散テンソル画像法や機能的磁気共鳴画像法を用い、ヒト神経筋セグメントの3次元組織構造と機能的役割の解明に向けた予備実験を開始する。当該年度に若干の未使用の研究費が生じた理由は,実験材料に要する費用が見込みよりも少額となったこと,更にデータ解析処理の協力に要する時間が当初の見込み予定時間よりも短縮でき,謝金の実支出が少額となった為である.また,繰り越される研究費は翌年度に割り当てた研究費と合わせて,弾性ファントム作製や足関節張力計に要する物品費に計上する予定である.他の旅費,謝金,その他の直接経費は交付申請書に記載した内容で当初の計画通り執行する予定である.当該年度に若干の未使用の研究費が生じた理由は、実験補助およびデータ解析処理の協力に要する時間が当初の見込み予定時間よりも短縮でき、謝金の実支出が少額となった為である。
均一化cDNAライブラリーを用いた病原菌の形態分化に関与する遺伝子群の分離、解析

近年、植物病原菌の感染器官である付着器の形成機構について遺伝子レベルでの解析が行われている。これまでディファレンシャルスクリーニングによって、付着器形成時に特異的な発現を示す数種の遺伝子の分離が報告されているが、その分離効率は高くなく、また得られた遺伝子はほとんど高発現遺伝子である。従来のディファレンシャルスクリーニングにおけるこれらの問題がクローン間の存在比を一定にした均一化cDNAライブラリーを用いることで解決されると考え、本研究において、均一化cDNAライブラリーの構築を行い、このライブラリーに対するスクリーニングを行った結果、付着器形成時に特異的な発現を示す11種の遺伝子の分離に成功した。1.ウリ類炭そ病菌における均一化cDNAライブラリーの構築本菌における均一化cDNAライブラリーの構築を試みた。構築されたライブラリーについて均一化の評価を行った結果、通常のcDNAライブラリーにおいては遺伝子間の割合に約300倍の差が見られたのに対し、均一化処理を行ったライブラリーにおいては、その差は約10倍まで下がり、均一化が成功していることが判明した。これは糸状菌における均一化cDNAライブラリー構築の最初の報告例である。2.付着器形成時に優先的な発現を示す遺伝子の分離均一化cDNAライブラリー中のクローンについて、ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより、菌糸生育時に発現が見られず付着器分化時に発現が見られる遺伝子群の選抜を試みた。その結果、付着器分化時に優先的に発現する11種の遺伝子(CAD1からCAD11と命名)の分離に成功した。CAD遺伝子の発現量は高発現から低発現まで多様であった。3.分離されCAD遺伝子の解析CAD遺伝子の幾つかについて構造決定を行った結果、メタロチオネインまたはAspergillus属のマイコトキシン合成クラスター遺伝子などとの相同性が見い出された。近年、植物病原糸状菌の分生胞子から付着器(感染器官)への形態分化システムについて遺伝子レベルでの解析が行われている。解析法の一つとして付着器分化時に特異的な発現を示す遺伝子のディファレンシャルスクリーニングによる分離、解析が挙げられる。これまで数種の植物病原菌においてディファレンシャルハイブリダイゼーション、サブトラクション法を組み合わせた形で目的遺伝子の分離が試みられているが、分離効率は決して高くはなく、また得られた遺伝子はほとんど発現量の高い遺伝子に限られている。このようなディファレンシャルスクリーニングにおける問題の解決策としてcDNAクローンの存在比を一定にした均一化cDNAライブラリーを用いることが挙げられる。本研究においては植物病原菌ウリ類炭そ病菌(Colletotrichum lagenarium)において、より効率的なディファレンシャルスクリーニングを行うため、均一化cDNAライブラリーの構築を試みた。本菌の付着器分化過程における分生胞子のnlRNAより合成したcDNAに対し、2回の均一化処理を行い、均一化cDNAライブラリーとした。コロニーハイブリダイゼーションにより既知遺伝子の割合を調査した結果、通常のライブラリーにおいて遺伝子間の割合の差が900倍であったのに対し、均一化ライブラリーにおいてはその差は14倍にまで減少していた。したがって構築したライブラリーは高度に均一化されていると推定された。この均一化ライブラリーのクローンに対しディファレンシャルハイブリダイゼーション法を用いて菌糸生育過程では発現せず、付着器分化過程において発現する遺伝子の単離を試みた。計1900個のcDNAクローンに対しディファレンシャルハイブリダイゼーションを行い、陽性と思われるクローンについてさらにRNAブロット分析を行った。その結果、付着器分化過程特異的な発現を示す遺伝子が12種単離された。得られたクローンに対し部分的に塩基配列を決定した結果、重複が一つ見られたので、計11種の独立した遺伝子が分離されていることが判明した。これらの遺伝子の発現は高発現型に限られず、低発現を示す遺伝子も数種存在していた。
化合物半導体薄膜太陽電池の大面積化に関する研究

本研究では太陽電池用材料に必要な大面積薄膜を作製することを目的として、一度の堆積で化合物半導体が得られるone-step法に着目し堆積を行なった。太陽電池用材料として注目されているCuInSe_2,CuInS_2およびこれらの混晶CuIn(Se,S)_2について電着を試み以下の知見が得られた。1.one-step法によるCuInSe_2,CuInS_2薄膜の電気めっき堆積条件について検討した。その結果、CuInSe_2の方がCuInS_2に比べて電着しやすいことがわかった。CuInSe_2は電着溶液のpHが1.52.0までの溶液で、電着電位が-1.0-1.8Vまでの広い範囲で化学両論組成の堆積膜が得られた。一方、化学両論組成のCuInS_2が得られる条件はpHが2.02.5、電着電位が-1.3-1.7Vの比較的狭い範囲であった。また、CuIn(Se,S)_2混晶の作成を試み、SeとSの比を変えた堆積膜の作製に成功した。2.堆積基板として2×7cmのスライドガラス上にMo金属電極を堆積したものを用いて、電着膜の密着性および面内の均一性について検討した。堆積基板が大きくなるとめっき曹内の電極配置および溶液の攪拌速度が、均一性に大きく影響を与えることがわかった。3.上記の実験により得られた薄膜に電気炉を用いて真空中で熱処理を行った。X線回折測定による評価で、熱処理温度とともにカルコパイライト相の成長が見られたが、CuIn,CuSe等の異相も存在することがわかった。4.熱処理を行った結果、比較的異相の少ない試料について金属/半導体接続を形成して電気特性について検討した。Al/CuInSe_2およびAl/CuIn(Se,S)_2について整流性を確認した。