hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼球形態形成過程におけるアポトーシス制御因子の意義の解明

アポトーシス、プログラムされた細胞死は、多彩な組織の正常発生過程において生理学的に起きている重要なメカニズムである。眼発生学的構造におけるアポトーシスの役割についてはまだ十分な説明がされていない。眼発生学的構造の異常発生は重症の眼先天異常を発生する。これら眼奇形の発生を予防するための有効な治療法を得るためには、まず眼発生学的構造の正常発生のメカニズムを知ることが重要である。以上のような理由で、今回我々は本研究において,眼発生学的構造の中で水晶体初期発生に着目した。水晶体発生メカニズムを明確にするために、マウスの水晶体初期発生におけるアポトーシスによる細胞死を観察した。実験動物として、C57BL/6NJCLマウスを使用し、アポトーシスの検出にはterminaldeoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxy uridine triphosphate (dUTP)-biotin nick end labeling (TUNEL)法を用い、各切片を光学顕微鏡で観察した。水晶体板が水晶体窩、水晶体胞へと陥入していく辺縁の表面外胚葉、退縮期の水晶体茎、水晶体胞腔内の胎仔表皮細胞にTUNEL陽性細胞が観察された。アポトーシスによる細胞死は、水晶体板の陥入、水晶体茎の退縮、水晶体胞腔内胎仔表皮細胞の消失に関与していると考えられた。研究期間の前半ではマウス正常眼球発生過程におけるアポトーシス細胞とそれを缶御する各種アポトーシス制御因子の局在を観察した。妊娠915日のC57BL/6NJCLマウスを屠殺して胎仔を取り出し光学顕微鏡で観察した。アポトーシスの検出にはTUNEL(deoxy uridine triphosphate-biotin nick end labeling)法を用いた。水晶体板から水晶体窩、さらに水晶体胞へと嵌入する際に表面外胚葉の嵌入部遠位端にアポトーシスが認められ、表面外胚葉が水晶体板という二次元的構造物から水晶体窩、水晶体胞と言う三次元的構造へと短時間に劇的に形態学的変化を遂げるためにその嵌入する辺縁部の表面外胚葉では活発な細胞増殖とともにアポトーシスによる生理的な細胞死も必要であると考えた。研究期間の後半では、妊娠マウスに強力な催奇形因子であるレチノイン酸を投与して、ヒト眼先天異常の実験モデルをその胎仔マウスに成立させた。実験動物にはC57BL/6NJCLマウスを用いた。とうもろこし油に溶解した全トランス型レチノイン酸10.0mg/kg(RA群)、あるいは同油に溶解したβ-thujaplicin280mg/kg(TH群)あるいは同油のみ(対照群)を、妊娠7日の母獣の腹腔内に注射し妊娠18日に母獣を屠殺して胎仔を取り出し光学顕微鏡で観察した。マウスの胎仔死亡率は、RA群9.3%、TH群9.8%、対照群2.2%で各群に有意差はなかった。臨床的にPeters奇形に相当する水晶体胞分離不全は、RA群26.9%、TH群10.9%、対照群2.2%で、対照群に比較してRA群、TH群で有意に高率に発症していた(p<0.05)。今回の研究では妊娠7日のマウスに催奇形性因子レチノイン酸を投与すれば、低い胎仔死亡率でPeters奇形に相当する水晶体胞分離不全を高率に成立させることができた。従来から我々は、眼正常発生過程の観察を行うとともに、眼先天異常の成立機序解明を試み、妊娠マウスに催奇形性因子を投与することにより各種ヒト眼先天異常の実験モデルマウスの作成を行ってきた。そして研究過程において、眼球の正常発生過程および先天異常成立過程には、アポトーシスが強く関与していることに着目してきた。水晶体胞の表面外胚葉からの分離、胎生裂の閉鎖、眼杯前縁部および胎生裂を通じて硝子体腔に侵入する第1次硝子体成分の退縮にアポトーシスが必須であると考えられ、今回研究の前半ではマウス正常眼球発生過程におけるアポトーシス細胞とそれを制御する各種アポトーシス制御因子の意義の解明を試みた。

妊娠915日のC57BL/6NJCLマウスを屠殺し胎仔を取りだし、光学顕微鏡で観察した。アポトーシスの検出にはApotosis in situ detection kitを用い,terminaldeoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated deoxy uridine triphosphate(dUTP)-biotin nick end labeling(TUNEL)法を行い、その後、ヘマトキシリンあるいはメチルグリーン液で、核染色を行った。水晶体から水晶体窩、さらに水晶体胞へと嵌入する際に表面外胚葉の嵌入部遠位端にアポトーシスが観察された。また眼先天異常は、実験モデル作成が困難で、現在まで基礎的研究は少なかった。今回研究の後半では、ヒト眼先天異常の実験モデルをその仔胎マウスに成立させた。実験動物にはC57BL/6NJCLマウスを用い、催奇形因子としてトランス型レチノイン酸、エタノール、ochratoxin Aを投与した。妊娠7日の母獣の腹腔内に、催奇形因子を注射し妊娠18日に母獣を屠殺して胎仔を取りだし光学的顕微鏡で観察した。マウスの死亡率は催奇形因子投与群、対象群で有意差は認められなかった。今回の研究では、低い死亡率で臨床的眼先天異常に相当するマウス実験モデルを作成することができた。
昆虫翅の起源と多様化メカニズムの解明とその応用

世界に先駆けて同定した鍵となる遺伝子をツールに、解析に適した非モデル昆虫を用い、RNAi法や形質転換体を用いた遺伝子機能解析法を駆使して、昆虫翅の多様性獲得に寄与した分子メカニズムの理解を目指した。その結果、鞘翅形成に重要な役割を果たす新規遺伝子の同定に成功した。この遺伝子のRNAiにより、鞘翅特異的にクチクラの硬化が阻害されるという大変興味深い表現型が得られた。このような鞘翅特異的な表現型はこれまで知られておらず、鞘翅の進化を考える上で鍵となる重要な発見である。本研究は、申請者が非モデル昆虫において発見した翅形成マスター遺伝子の予想外の多面的な機能に基づき、翅形成マスター遺伝子の機能を探ることで昆虫翅の起源と多様性獲得に寄与した進化プロセスの理解とその応用を目的とする。マダラシミ(Thermobia domestica)には、無翅昆虫であるにもかかわらず、翅形成マスター遺伝子vestigial(vg)が存在するが、その機能は全く不明である。そこで、マダラシミのvgの機能を探る一助として、マダラシミの胸部構造(翅の起源構造として古くから提唱されている側背板と呼ばれる背板突出構造が存在)に着目し、胸部を側背板、肢、胸部残渣に分け、定量リアルタイムPCR法によりvgおよびsdの発現解析を行った。その結果、予想に反する興味深い結果が得られた。この結果を検証するため、まず、マダラシミにおいてこれまでに確立したembryonic RNAi法およびnymphal RNAi法について条件を詳細に検討して、より解析の精度を高める工夫を行った。現在、新たに条件を確立したRNAi法に基づき、vgとsdの機能解析を行っている。翅アイデンティティーの決定機構を解析するため、まず翅と翅連続相同構造間で異なる役割を担う遺伝子を同定することが必要不可欠となる。そこで、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)を用いた研究によって明らかにされた翅形成の上位で働く候補遺伝子群をチャイロコメノゴミムシダマシ(Tenebrio molitor)からクローニングし、RNAi法による機能解析を行った。さらに、候補遺伝子アプローチでは不可能な未知の遺伝子を同定するため、網羅的な方法を試みた。チャイロコメノゴミムシダマシと同じ鞘翅目に属し、既にゲノム解読が完了したコクヌストモドキ(Tribolium castaneum)を用いたマイクロアレイ解析により、前胸および中胸の翅連続相同構造の形態的な差異をもたらす遺伝子を探索した。具体的には、コクヌストモドキの幼虫-前蛹期の前胸と中胸を比較したマイクロアレイの解析データをもとに、前胸および中胸間で発現差がみられる遺伝子を8個選抜した。これらの候補遺伝子のうち、6個の候補遺伝子においてRNA干渉(RNAi)法による機能解析を行い、得られた成虫の表現型を解析した。コクヌストモドキ(Tribolium castaneum)の翅構造はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の翅構造と異なり、前翅は硬化したクチクラ層を有する鞘翅であり、後翅は飛翔に用いる膜状の翅構造である。コクヌストモドキ蛹の蛹化後0、3、5日目の鞘翅および後翅の翅原基を比較したマイクロアレイの解析データを用いて、種々の条件で鞘翅および後翅の発現量を比較し、鞘翅と後翅の差異をもたらす遺伝子の候補として51個の遺伝子に絞り込んだ。次に、発現差の認められた51個の候補遺伝子についてlarval RNAi法による機能解析を行うため、コクヌストモドキの終齢幼虫にdsRNAをインジェクションした。成虫での表現型を観察した結果、29個の遺伝子のRNAiにより、翅において表現型が観察された。興味深いことに、RNAiにより鞘翅特異的な着色不全が観察される遺伝子が存在した。この遺伝子はRNAiによる機能解析の結果から、鞘翅特異的にクチクラの着色および硬化に関与することが示唆された。研究計画の変更あるいは研究を遂行する上で問題点などはなく、当初の計画通りおおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。分子昆虫学特に研究遂行上の問題点は現時点ではないため、予定通り研究計画を進める予定である。予想した結果と異なる結果が得られたため、これまでの条件と比較して、より精度の高い検証を行うための条件検討に時間を割かれてしまった。昆虫の飼育法の改良により、より多くの昆虫を実験に用いることが可能となった。

このため、異なる実験を同時進行させることにより倹約することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。若干の遅れがある研究項目については、重点的に取り組み当初の予定通り推進させる。その他については、研究計画通り遂行する。次年度は、当初の使用計画に加え、予想外の興味深い実験結果の検証に使用することにより、当初の予定を超える研究成果が期待される。予想外の結果が得られ、その結果の検証に時間が割かれたため、研究計画に若干の遅れが生じてしまった。次年度は、当初の使用計画に加え、今年度若干の遅れが生じた研究計画について使用する。
クラウドを利用したｅ－ラーニングによる学習支援とその波及効果の評価・分析

商用のクラウドサービスには様々なプラットホームが存在する。初年度は「Amazon Web Services」を用いてプロトタイプを作成した。2年目は別の商用サービスである「Google App Engine」上に高専四年生のある教科の学習コンテンツをリリースし,それを教材として学習支援を実践した。さらにユーザーをひきつけるための教材として数学検定対策演習のeラーニングシステムを企画し,クラウド上の学習コンテンツとして一般公開した。これらの教材を用いることによる学習支援の質の変化や学習コミュニティへの影響についての調査および研究は始まったばかりであり,これらかも継続していく必要がある。当初の計画では平成24年度は本システムの新機能である「解答に対する評価機能」と「Webページのカスタマイズ機能」を順次組み込む予定であったが,平成25年度に実施予定であったシステムのクラウド化を優先させた。変更の理由としては,本システムの特徴のひとつがクラウド対応だからであり,時間を掛けてから高機能なシステムをリリースするよりは,単純な機能だけであっても早期にリリースする方がユーザーにとってメリットが大きいからである。次に平成25年度の開発作業実績を述べる。商用のクラウドサービスには様々なプラットホームが存在し,初年度は「Amazon Web Services」を用いてプロトタイプを作成した。2年次は別の商用サービスである「Google App Engine」上に高専四年生のある教科の学習コンテンツをリリースし,それを教材として学習支援を実践した。上記のシステム構築および学習支援を研究報告としてまとめ,教育システム情報学会の特集論文研究会(ICTを活用した教育の質保障)にて発表し,有益なコメントを頂いた。平成25年度の計画は本システムの特徴のひとつとして挙げられるクラウド対応を行うことであり,この機能に関しては遅れることなく対応できている。しかし,平成24年度の作業である「Webページのカスタマイズ機能」は実装できていない。理由としては,本システムの大きな特徴がクラウド対応であり,優先順位が高いからである。時間を掛けてから高機能なシステムをリリースするよりは,単純な機能だけであっても早期にリリースする方がユーザーにとってメリットが大きいからである。今年度は主に次の二つの作業を行った。一つ目は,数学検定対策演習のeラーニング教材を企画し,商用のクラウドサービスである「Google App Engine」上の学習コンテンツとして開発した。二つ目は,本高専で実施された数学の定期試験の各設問の特性に関するデータを作問時の出題意図を基にしたモデルを用いて解析した。その結果として得られた傾向や特徴を現在開発中であるeラーニング教材にフィードバックする際の指針とし,本教材の作問検討時に活用していく予定である。その解析結果を研究報告としてまとめ,教育システム情報学会の研究会(教育・学習支援におけるユーザモデリングとデータマイニング)にて発表し,有益なコメントを頂いた。平成23年度の目的はシステムの「主要機能」を検討し、「システム構成」を確定させるためのプロトタイプを作成することであった。実作業としては、本研究の中核をなす数学オンラインテストシステムの実装方法の検討と稼働するサーバーの基盤構築を行った。システムの実装方法であるが、サーバーに「数式処理エンジン(Mathematica Player、SymPy等)」を組み込む方法と外部の「ナレッジシステム(Wolfram|Alpha)」を利用する方法を検討し、実際に小規模なシステムの構築およびそのテストを行う過程を経てから後者を採用することにした。本システムの特徴のひとつとしてクラウド対応があるが、商用サービスには様々なプラットホームが存在する。そのため、各サービスのメリット・デメリットを調査してから、本システムで採用する商用サービス(Amazon Web Services)を選択した。上記の主要機能の検討、プロトタイプ作成の方法を論文としてまとめ、日本数学教育学会の第44回数学教育論文発表会にて発表し、有益なコメントを頂いた。最終年度であるH26年度にはクラウドと学内のシステムの連携を図り、統合されたeラーニングシステムとしての本格運用を目論んでいた。後述する通りクラウドについては充実してきたが、学内のシステムについては予定していた進捗をクリアできていない状況である。開発というマンパワーが必要な部分は昨年度から雇っているプログラマーにより開発スピードを向上させることはできた。しかし、システムの仕様を決定する重要な局面では我々研究者の判断が必要な場面も多々あり、予定通り進まない状況もあったためである。クラウド上のシステムについては昨年度に引き続き数学検定対策演習のeラーニング教材を企画し,商用のクラウドサービスである「Google App Engine」上の学習コンテンツとして公開するところまでこぎつけた。昨年度には少量の教材しか作成できていなかったが、今年度は昨年度の倍以上の教材を開発するまでに至った。今年度はクラウド上の学習コンテンツを増やし公開することはできた。しかし、これらの教材を用いることによる学習支援における質の変化や学習コミュニティへの影響についての調査および研究は進んでいない。これらの研究を行うためには学習支援の実践を行い、ユーザーである学生の意見を数多く集める必要がある。そのためには、ある程度の長い期間を取って研究を継続していく必要がある。

H26年度で本研究の研究年度は最終年を迎えてしまったが、積み残した課題については更なる研究を行い、学会において発表していく所存である。(1)はクラウドサービス上に構築している数学検定対策演習のeラーニングシステムである。教育工学本研究は四ヵ年の計画年度のうち前半の二ヵ年が終了した段階であるので,申請時の研究計画に記載した「平成24年度の計画」に照らし合わせて達成度を評価する。「研究実績の概要」で述べた通り,2年次に実装すべき機能を中止して3年次で行うべきクラウド化を優先させたため,総合的に進捗状況を判断すると「遅れている」という達成状況である。理由として,純粋な「研究」の部分については時間を見つけて行うことはできるが,「開発」というマンパワーが必要な部分については多少追い付けない状況にあるためである。この点については,開発体制の見直しを行い,開発スピードが上向くよう改善に努めていく所存である。本研究は四ヵ年の計画年度のうち三カ年が終了した段階であり,申請時の研究計画に記載した「平成25年度の計画」に照らし合わせて達成度を評価する。「研究実績の概要」で述べた通り,2年次に実装すべき機能を中止して3年次で行うべきクラウド化を優先させたため,総合的に進捗状況を判断すると「達成すべき機能の実装について遅れている部分が多い。また,コンテンツの数がまだまだ足りない。」という状況である。理由として,「開発」というマンパワーが必要な部分については人手が足りない状況が存在したためである。この点については,開発体制の見直しを行い,外部プログラマーに作業を依頼することにした。その結果としてコストは上昇したが,開発スピードは格段に向上した。本研究は四ヵ年の計画年度のうち初年度が終了した段階であるので、申請時の研究計画に記載した「平成23年度の計画」に照らし合わせて達成度を評価する。「研究実績の概要」で述べた通り、初年度の主要な目的は達成しているが、コンテンツの作成をふまえると「やや遅れている」という達成状況である。理由として、メンバーは教育活動が主な仕事であり、純粋な「研究」の部分については時間を見つけて行うことはできるが、「開発」というマンパワーが必要な部分については多少追い付けない状況にあるためである。この点については、開発効率の見直しを行い、改善に努めていく所存である。本研究は「現在までの達成度」で述べた通り,2年次に実装すべき新しい機能の開発を後回しにし,クラウド化を優先させたためコンテンツの作成が遅れている,という状況である。
多電子配位磁性イオンによる近藤効果の研究

本課題では次の問題を研究した。(1)磁性イオンの基本的模型であるアンダーソンモデルでは,弱相関の極限でフェルミ流体である。基本のアンダーソンモデルに基づくとき、非フェルミ流体状態は可能であるのか。可能であれば弱相関のフェルミ流体状態との間にどのような転移が生じるのか。(2)希薄ウラン系で2チャンネル近藤模型(TCKM)型異常物性を示している可能性の高い物質として、U_xTh_<1-x>Ru_2Si_2がある。この系の電気抵抗は降温につれ減少する。TCKMでは、通常逆に増加が期待されるが、アンダーソンモデルの立場からこれは理解可能か。(3) TCKMでは絶対零度で残留エントロピー1/2ln2が残る。結晶対称性の低下により、このエントロピーは低温で放出される。これに伴う低温比熱と帯磁率の相互の関連はいかになるか。本課題により次の結論を得た。(1)パラメータが弱相関から強相関に変化するにつれ、結晶場の状況に応じて、フェルミ流体や非フェルミ状態を含む様々なタイプの基底状態の間の転移が生じ得る。(2) f^2配位とf^3配位の揺らぎが主の場合、抵抗の温度依存性は降温につれ減少することが予想される。(3)残留エントロピーの放出はエネルギー分裂の約10分の1の温度に比熱のピークを作る。比熱ピークの生じる温度で、帯磁率の増大は飽和する。非フェルミ流体基底からフェルミ流体基底への転移の生じるパラメータ近辺でも、非フェルミ流体であれば残留エントロピーは1/2ln2である。最近U_xTh_<1-x>Ru_2Si_2の磁場中比熱が測定され、残留エントロピーは存在しないことが示された。計算結果に基づくと、通常のTCKM型としてこの系の低温異常の解釈をするのは困難である。格子歪みとの動的Jahn-Teller結合の役割を解き明かすべく研究を続行中である。f^2-配位のイオンにおいて結晶場基底状態が非クラマ-ス2重項である場合に、電子状態が2チャンネル近藤模型(TCKM)に対応づけられて、非フェルミ流体状態が発生、帯磁率が比熱係数に温度の対数に依存する異常の生じる可能性が指摘されて以来、活発な研究が行なわれてきたが、次の問題点があった。(1)磁性イオンの基本的模型であるアンダーソンモデルでは、弱相関の極限でフェルミ流体であり、この状態が強相関の近藤-重項につながるとの仮定から従来の近藤効果の研究は進められてきた。f^2-型イオンのTCKMへの対応づけは強相関極限として導かれているが、基本のモデルに基づくとき、このような状態は可能であるのか。(2)希薄ウラン系でTCKM型の異常物性を示している可能性が高いとしてU_xTh_<1-x>Ru_2Si_2が注目されるが、この系は電気抵抗が降温につれ減少するという性質をもつ。TCKMでは通常逆に増加が期待されるが、これが理解可能か。本課題では次のような結論を得た。(1)について、従来の仮定は必ずしも正しくなく、パラメーターが弱相関から強相関に変化するにつれ、アンダーソンモデルは、結晶場の状況に応じてフェルミ流体や非フェルミ状態を含む様々なタイプの基底状態を取り得る。また、これらの状態間で様々なタイプの転移を示す。

従って、非フェルミ状態の発生は可能である。(2)に関連して、非フェルミ流体状態で、弱相関領域に近く、かつ、f^2配位とf^3配位の揺らぎが主な場合、低温で正の磁気抵抗が発生しうることを示した。正の磁気抵抗の現われるとき、抵抗の温度依存性は降温につれ減少する可能性が高い。このようなことが生じるのは、アンダーソンモデルに通常の近藤-重項を導く部分と非フェルミ流体状態を導く部分を同時に含み、その拮抗があることによる。多電子配位イオン系での近藤効果の発現は従来考えられていたよりはるかに多彩な内容を持つ。本年度は昨年度に引き続き次の課題を研究した。(1)希薄ウラン系で2チャンネル近藤模型(TCKM)型異常物性を示している可能性の高い物質としてU_xTh_<1-x>Ru_2Si_2がある。この系の電気抵抗は降温につれ減少する。TCKMでは、通常逆に増加が期待されるが、アンダーソンモデルの立場からこれは理解可能か。(2) TCKMでは絶対零度で残留エントロピー1/2ln2が残る。磁場印加や、結晶対称性の低下により、このエントロピーは低温で放出される。これに伴う低温比熱と帯磁率や抵抗異常との相互の関連はいかになっているか。本課題により次め結論を得た。(1)非フェルミ流体状態で、弱相関領域に近く、かつf^2配位とf^3配位の揺らぎが主の場合、抵抗の温度依存性は降温につれ減少することが予想される。(2)残留エントロピーの放出は磁場や対称性低下によるエネルギー分裂の約10分の1程度の温度に比熱のピークを作る。対称性低下の場合、比熱ピークの生じる温度で、降温につれての帯磁率の増大は飽和する。非フェルミ流体基底からフェルミ流体基底への転移の生じるパラメー夕近辺でも、非フェルミ流体状態であれば残留エントロピーはほぼ1/2ln2の大きさを持つ。フェルミ流体であれば残留エントロピーはほぼln2が一時に放出され、比熱のピーク位置の温度で帯磁率の増大は飽和する。最近U_xTh_<1-x>Ru_2Si_2の磁場中比熱が測定され、残留エントロピーは存在しないことが示された。計算結果に基づくと、通常のTCKM型としてこの系の低温異常の解釈をするのは困難である。格子歪みとの動的Jahn-Teller結合の役割を解き明かすべく研究を続行中である。
機能的イメージングと３次元再構築法による小脳皮質における情報処理機構の解析

アデノウイルス注入法により小脳プルキンエ細胞特異的にCa2+感受性蛍光タンパク質を発現させ、生きたマウスの小脳から二光子励起レーザー顕微鏡によってニューロン活動をリアルタイムで計測することで、特定の情報処理に関与するプルキンエ細胞群の網羅的同定というアプローチが可能となる。本研究では、小脳皮質上の機能単位の解明の為に、小脳皮質の唯一の出力細胞であるプルキンエ細胞に1波長励起2波長蛍光型Ca2+感受性蛍光タンパク質yellow cameleon2.60を発現させ、マウスの小脳から光学計測によりプルキンエ細胞の個々のスパイク発火を検出する実験手法およびデータ解析方法の確立を行った。アデノウイルス注入法によりプルキンエ細胞特異的に蛍光カルシウムセンサータンパク質を発現させたマウスを用いて二光子励起レーザー顕微鏡によるin vivoカルシウムイメージングを行うことで、登上線維入力によりプルキンエ細胞で生じる1回の複雑スパイクの発生をリアルタイムで計測可能であることを明らかにしてきた。独自に開発したこの実験系を用いて、オペラント条件付けに伴う運動学習獲得過程に関与する小脳回路の同定、および小脳における情報処理メカニズムの解明を目的に研究を行い、以下の成果を得た。1)マイコンボードを用いた自作電子回路により、ヘッドプレートにより頭部を固定したマウスの前肢によるレバー押し、および報酬である水が出る吸い口を舐める動作をリアルタイムで計測し記録可能な実験装置を構築した。この装置を用いて、音刺激中に前肢によりレバーを押すオペラント条件付けを頭部固定マウスに対して行い、60%以上のマウスが1週間以内に条件付け可能な実験条件を見出した。2)アデノウイルス注入法によりプルキンエ細胞特異的に蛍光カルシウムセンサータンパク質を発現させたマウスに対して、麻酔下で頭蓋骨を除去した後にカバーガラスで脳表面を覆いデンタルセメントにより周囲を固定した観察孔を作成した。術後回復したマウスを用いて二光子励起レーザー顕微鏡によりin vivoカルシウムイメージングを行ったところ、2ヶ月以上の長期間に渡って安定して小脳プルキンエ細胞の神経活動が計測可能であることを見出した。アデノウイルス注入法によりプルキンエ細胞特異的に蛍光カルシウムセンサータンパク質を発現させたマウスを用いて、二光子励起レーザー顕微鏡によるカルシウムイメージングおよび細胞外記録を同時に行い、登上線維入力によりプルキンエ細胞で生じる1回の複雑スパイクの発生を、測定されたカルシウムシグナルからデコンボルーション処理を施すことで精度良く検出できることを見出した。また、測定した個々のプルキンエ細胞のカルシウムシグナルの相互相関を計算することにより、小脳皮質上で相関した発火パターンを示すプルキンエ細胞群から成るマイクロゾーンの可視化を行った。マウスの頭部固定用装置を新たに作成し、麻酔下のみならず覚醒したマウスの小脳からプルキンエ細胞のカルシウムシグナルを検出可能な実験装置を構築した。さらに蛍光カルシウムセンサータンパク質を発現させたマウスから全脳を抽出し、パラフォルムアルデヒド固定の後にScale試薬により透明化を施し、二光子励起レーザー顕微鏡もしくはコンフォーカル顕微鏡を用いて蛍光観察することで、プルキンエ細胞の軸索を含む形態を測定可能であることを明らかにした。今後、体性感覚入力や歩行運動に伴い発火頻度が変化するプルキンエ細胞の活動を計測し、その後同一個体から単離した脳を透明化しプルキンエ細胞の形態を観察することで、本研究課題の当初の目的である体性感覚入力や歩行運動に関与する小脳皮質の機能的回路の全容の解明を目指す。本研究では、小脳皮質上の機能単位の解明の為に、小脳皮質の唯一の出力細胞であるプルキンエ細胞に1波長励起2波長蛍光型Ca2+感受性蛍光タンパク質yellow cameleon2.60 (YC2.60)を発現させ、マウスの小脳から二光子励起レーザー顕微鏡による光学計測によりプルキンエ細胞の個々のスパイク発火を検出する実験手法およびデータ解析方法の確立を行った。生きたマウスの脳から蛍光画像を取得する際には、麻酔条件下であっても心拍や呼吸等による脳自身の振動に由来するノイズにより、本来取得すべき神経細胞の活動電位発生に伴う蛍光シグナルが大きく歪められる。この問題点を解決するために、取得画像に含まれるノイズ成分を解析し、新たなレシオ画像作成方法を考案した。2つの異なる波長の蛍光画像の比を取ることで細胞内Ca2+濃度を測定出来るというYC2.60の利点を生かし、2つの蛍光画像に含まれるノイズ成分が比を取ったときにキャンセルされるようにスケーリング処理を施した。このような前処理を行った画像をもとに、単一発火に伴う細胞内Ca2+濃度変化ダイナミクスを推定し、逆畳み込み演算により光学的に取得したCa2+シグナルから複雑スパイク発火を90%以上の確率で検出可能な解析方法を確立した。

神経生理学小脳プルキンエ細胞特異的にカルシウムセンサータンパク質を発現させることで、光学的に細胞の発火を計測できる実験系を構築した1年目に続き、光学測定に必須な頭部固定条件でオペラント条件付けを施す実験系の構築に成功した。また、条件付け学習の途中および学習後の小脳皮質の活動を同一個体で光学計測するために必須な観察孔の作成にも成功した。今回新たに行った透明化単離脳の蛍光イメージングにより、蛍光カルシウムセンサータンパク質を発現させたプルキンエ細胞の軸索を含む形態観察が可能であることがわかった。この結果をもとに、今後3次元画像取得条件の最適化、および測定された蛍光画像から任意のプルキンエ細胞の軸索を正確にトレースするためのデータ解析方法の確立を試みる。上記の研究成果を元に、カルシウムセンサータンパク質を発現させ、小脳上に観察孔を作成したマウスにレバー押しタスクを行わせ、前肢によるレバー押しに関与する小脳皮質上の領域を同定する。さらに行動実験後のマウスから小脳を単離しScale処理により透明化を施し、プルキンエ細胞の軸索に発現するカルシウムセンサータンパク質の蛍光をコンフォーカル顕微鏡により計測することで、レバー押しに関与するプルキンエ細胞群の投射先を同定する。以上の結果により、レバー押し動作に関与する小脳の神経回路を単一細胞レベルで明らかにする。自発発火に相関を示す同じマイクロゾーン内に存在するプルキンエ細胞、およびヒゲに対する応答や歩行運動に伴い発火が上昇するプルキンエ細胞群を二光子イメージングにより同定し、観測後同一個体から摘出した全脳をScale試薬により透明化し、それぞれのプルキンエ細胞の投射先をトレースすることにより、神経回路の機能的回路を明らかにする。主に消耗品代および旅費として使用する。
脳におけるアポリポ蛋白Eによる自然免疫制御機構について

アポリポ蛋白E(apoE)はLPS刺激によるマイクログリア細胞からの炎症性サイトカインの分泌を抑制した。これはTLR4シグナル経路の活性化を抑制することにより、炎症性サイトカインの転写を抑制していると考えられた。また、apoEはTLR2,3シグナル経路の活性化も抑制した。apoEによるTLRシグナル抑制経路にはLDL受容体やLRPは関与せず、スカベンジャー受容体Bが関与していた。【目的】脳におけるアポリポ蛋白E(アポE)による自然免疫制御機構を調べる。平成19年度はリポポリ多糖(LPS)によるToll様受容体4(TLR4)シグナル経路の活性化がアポEによりどのように制御されるかを調べた。【方法および結果】初代培養ミクログリアまたはマクロファージ細胞をLPSで刺激し、培養上清にアポEを加えたときの蛋白質のリン酸化、量の変化をRT-PCR、ウエスタンブロット法などで調べた。ミクログリア細胞およびマクロファージ細胞にLPS刺激を行うとp38MAPキナーゼ、IkappaB、ERK、JNK、AKTなどがリン酸化され、そのシグナル経路の下流であるiNOSが活性化したりIL-6やTNF-alphaなどの分泌が促進されたりした。あらかじめアポEを培養上清に加えておくとp38MAPキナーゼ、IkappaB、ERK、JNKのリン酸化は抑制された。さらにlkappaBの分解が抑制され、NFkappaBの核移行が抑制された。これらの変化によりiNOSに誘導される一酸化窒素、IL-6、TNF-alphaなど炎症性サイトカインの分泌も抑制された。しかしAKTのリン酸化は抑制されなかった。アポEによるTLR4経路制御機構に関わる蛋白をRNA干渉法あるいは阻害剤などを用いて検索した。その結果、スカベンジャー受容体BやCXCR4などの関与が示唆された。しかし、アポE受容体は関与しないことがわかった。【まとめ】アポEはLPSによるTLR4シグナル伝達経路の活性化を抑制することで炎症性サイトカインの分泌を負に調節することがわかった。この経路にはこれまで知られているアポE受容体ではなくスカベンジャー受容体BやCXCR4が関与している可能性が示唆された。平成20年度は平成19年度に引き続きアポEがToll様受容体4(TLR4)下流シグナル経路の活性化を抑制する機構の詳細を調べた。さらに、アポEによる炎症抑制効果が他の細胞種、他のTLRファミリーにおいて見られるかを確認した。【方法】RNAiを作用させたミクログリアまたはマクロファージ細胞でアポEによる炎症抑制効果があるか調べ、TLR4経路制御機構に関わる蛋白質を検索した。アポEがTLR4以外のTLRファミリーからのシグナル経路の活性化を抑制する能力を持つか調べた。【結果】LDL受容体、LRPのいずれかあるいは両方のRNAiを作用させた細胞やLDL受容体欠損マウス由来マクロファージ細胞において、アポEによる炎症抑制効果に変化はなかった。しかしスカベンジャー受容体BのRNAiを作用させた細胞において、アポEによる炎症抑制効果は減弱していた。アポEによる炎症抑制効果は既知アポE受容体であるLDL受容体、LRPではなくスカベンジャー受容体Bを介していると考えられた。さらにApoEはTLR3のアゴニストであるPolyI : CおよびTLR2のアゴニストであるペプチドグリカン刺激によるp38MAPキナーゼの活性化を抑制したが、TLR7のアゴニストであるImiquimod刺激によるp38MAPキナーゼの活性化を抑制しなかった。また、アポEによる炎症抑制効果はマウスマイクログリア細胞だけでなく、ヒト細胞やマクロファージ細胞でも見られた。この経路にはこれまで知られているアポE受容体ではなく、スカベンジャー受容体Bが関与していた。アポEはTLR3、TLR2の下流経路の活性化も抑制した。
新しい微小領域分析法の開発とその石造物分析への応用

研究分担者のDelalieux Filip博士は平成13年11月末に来日し、様々な事情により平成14年12月に帰国された。この1年間に多くの研究成果を挙げられた。具体的には、EPMAの斜出射測定の利点である局所分析という特徴を生かして、薄膜の面内でのキャラクタリゼーションに取り組んだ。薄膜の評価はこれまで主にX線反射率測定により行われてきたが、この方法では1次X線が試料全面を照射するため試料全体の評価になってしまう。斜出射EPMA法では局所領域での薄膜分析に応用できる点が特徴となる。Filip Delalieux博士は細かい装置の改善など独自のアイデアを提案するなど積極的に装置開発に取り組み、平成14年3月にはデーターが取れるようになった。さらにX線微細ビームを用いたX線元素マッピング装置の開発にも取り組んでいただいた。この手法に斜出射X線測定を併用することにより深さ方向の情報を得ることが可能となり、3次元元素分析を提案した。特別研究員奨励費では蛍光X練マッピング分析用ソフトウエアーを購入した。このソフトによりマイクロX線ビームを2次元的に走査しながらX線分析を自動測定でき、非破壊的3次元X線元素分析の基礎データーの取得に多いに活用できた。諸事情により滞在期間が1年間に短縮され、研究課題にある石造物への応用は時間的に困難であったが、上記のように多くの成果が得られた。研究成果は、学術英文雑誌5報(内投稿中2編)にまとめられ、国際会議で8件の口頭・ポスター発表できた。
胚性幹(ES)細胞で特異的に発現する遺伝子群ECATの機能解明

胚性幹細胞(ES細胞)は初期胚に由来する幹細胞で、成体を構成するすべての細胞へと分化する多能性を維持したまま、半永久的に増殖する。私たちは、ES細胞で特異的に発現する遺伝子群(ECAT : ES cell associated transcript)を同定した。本研究の目的は、ECAT遺伝子産物の機能を解析することであった。ESG1のゲノム構造を解析し、多数の偽遺伝子と一つの遺伝子を同定した。遺伝子ターゲティングにて機能解析を行った。ESG1はES細胞においてもマウスにおいてもノックアウトしても顕著な表現型は観察されなかった。NanogはES細胞から原始内胚葉への分化を抑制することが明らかとなった。ERasの膜局在機構について解析した。ERasは形質膜に局在することが機能上必須であり、ファルネシル化、メチル化、パルミチル化の修飾をC末端が受けることにより形質膜に局在することが明らかとなった。遺伝子ターゲティングによるSox15の機能解析を行った。ES細胞においてSox15はSox2とは異なる遺伝子群の発現調節に関与していることが明らかとなった。しかしSox15はES細胞においてもマウスにおいてもノックアウトしても顕著な表現型は観察されなかった。胚性幹細胞(ES細胞)は哺乳動物の初期胚(ブラストシスト)に由来する幹細胞で、成体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま、半永久的に増殖する。この特性からES細胞は糖尿病や神経変成疾患などに対する幹細胞療法の資源として期待されている。一方、ES細胞は不死であることや未分化であることなど腫瘍細胞との共通点も多い。さらにES細胞を生体に移植すると三胚葉系の様々な組織を含む奇形腫を形成することから、ES細胞は腫瘍細胞に類似するだけではなく、ある意味では腫瘍細胞そのものであると考えられる。これまで、ES細胞がこれらの特性を維持する分子機構の解明を目指して、ES細胞で特異的に発現する遺伝子群(ECAT : ES cell associated transcript)の同定と機能解明を進めてきた。本研究の目的は、ECAT遺伝子群がES細胞の特性維持、生殖細胞形成、および癌の発生と進展において果たす役割を解明することである。本年度に見いだした成果としては、分化多能性維持に必須であることを示したホメオボックス転写因子ECAT4(Nanog)の標的遺伝子候補を同定したこと、ECAT5は恒常的にPI3キナーゼを活性化しているが、PI3キナーゼはES細胞の増殖に加えて、未分化状態維持においても重要であること、ECAT5は3種類の脂質修飾により細胞膜に局在すること、ECAT4やECAT5のエンハンサー領域を同定したこと、ECAT8ノックマウスを作製し、精子細胞における減数分裂に必須であることなどがある。胚性幹細胞(ES細胞)は哺乳動物の初期胚に由来する幹細胞で、成体を構成するすべての細胞へと分化できる多能性を維持したまま、半永久的に増殖する。私たちははこれまで、ES細胞がこれらの特性を維持する分子機構の解明を目指して、ES細胞で特異的に発現する遺伝子群(ECAT : ES cell associated transcript)の同定と機能解明を進めてきた。本研究の目的は、ECAT遺伝子群、特にECAT4 (Nanog)がES細胞の特性維持、生殖細胞形成、および癌の発生と進展において果たす役割を解明することである。昨年度に同定した候補遺伝子についてクロマチン免疫沈降によって真の標的遺伝子であるかを検討した。2.Nanogの複合体解析3.Nanogの生体における発現様式の解析Nanog遺伝子座にEGFPをノックインしたマウスやES細胞を用いて、発現様式を詳細に解析した。4.Nanog遺伝子の調整領域の解明昨年度に同定した調節領域のエピジェネティックな修飾を詳細に解析した。5.Nanog遺伝子のコンディショナルノックアウトマウス解析Nanogの第2エキソンがloxPで囲まれたマウスの樹立を試みた。6.他のECAT遺伝子の機能解析新たに同定したヒトES細胞と共通しているECAT遺伝子に関して、遺伝子ノックアウトと過剰発現などによる機能解析を行っている。
遅延型過敏症の非特異的抑制因子NSFのcDNAのクロ-ニング

NδFはハプテン(低分子感作性物質)の投与によって脾臓に誘導された抑制性マクロファ-ジから産生される分子量56kDaのサイトカインである。NSFは遅延型過敏症の発現を非特異的かつほぼ完全に抑制する。本年度はこの抑制性マクロファ-ジからNsFのmRNAを抽出しそのcDNAのクロ-ニングを目ざし次の実験を行った。(1)、mRNAの抽出;ファ-ストトラック(インビトロ-ゲンのmRNA抽出用キット)を用いて、精製したプラスチック付着性の抑制性マクロファ-ジからmRNAを抽出した。数回の作業を繰り返すことによってcDNAのクロ-ニングに十分な量(14.5μg)のmRNAを抽出することができた。(2)、cDNAのライブラリ-からポジティブクロ-ンを拾うためのスクリ-ニング系の確立;目的とするcDNAのクロ-ンを拾うには、NSFのN末端のアミノ酸配列を知り,それに対応するDNAのプロ-ブを合成するのが確実である。NSFの精製方法を一応確立していたため,NSFを含む培養上清から、DEAEーセファセル,セファデックスGー100,逆相高速液クロでNSFを精製し、SDS電気泳動にかけ目的とするバンドを含むゲルから蛋白を溶出させプロテインシ-ケンサ-にかけたが,ノイズが多くN末端のアミノ酸配列を読み取ることができなかった。そのため再度精製方法の改良を試みた。その結果、グリ-ンA(アフィニティの一種)で極めて選択性の高い精製を行なえることが判明した。現在はこの精製方法を加え、NSFの高度の精製品を準備し、プロテインシ-ケンサ-にかけるべくサンプルを集めている。
絹本著色絵画の技法史的展開に関する研究

本研究は日本と中国における絹本著色絵画の材料・技法史的展開に着目し、絹地の加工と描画実験を通して画絹に関する諸問題の解明を目指すものである。画絹のみから得られる情報には限りがあるが、通史的にみて画絹と著色技法には多くの相関関係がみとめられる。特に(1)古代における滲み止めや精巧に描画するための素地加工と(2)大画面制作のための絹継については研究の蓄積が乏しい部分であり、これらの諸条件が描画の過程でどのように作用するのかを中心に、後の時代の展開も含めて考察する。作品の調査、画論、技法書等の分析に加え、在来製糸・製織技術で織られた絹を用いてサンプル制作し、多角的な検証を行っていきたい。
局所皮質異形成ラットのてんかん原性獲得には皮質ネットワークが関与する

胎児脳に冷却損傷を与え両側皮質に異形成を作成したラットでは海馬から生じる自発てんかん発作を生じた.免疫染色定量評価では,皮質異形成部のグルタミン受容体興奮性の増大に続いて海馬のグルタミン受容体興奮性の増大を認め, Phaselocking解析では異形成部と海馬の同期性が発作前に増加した.これらは,皮質-海馬のネットワークを介して海馬の興奮性が経時的に増大していくことを示唆していると考えられた.胎児脳に冷却損傷を与え両側皮質に異形成を作成したラットでは海馬から生じる自発てんかん発作を生じた.免疫染色定量評価では,皮質異形成部のグルタミン受容体興奮性の増大に続いて海馬のグルタミン受容体興奮性の増大を認め, Phaselocking解析では異形成部と海馬の同期性が発作前に増加した.これらは,皮質-海馬のネットワークを介して海馬の興奮性が経時的に増大していくことを示唆していると考えられた.[目的]我々が開発した胎児期作成皮質異形成ラットではキンドリング刺激において海馬がてんかん原性を獲得するのに要する時間が対照に比べて優位に短く,グルタミン受容体の発現が異形成皮質において増加していた.これは皮質異形成の存在により皮質-海馬のネットワーク構築が変化し,てんかん活動をより起こしやすい状態になっているためと推測した.これを証明するために,1.異形成を増加させたラットを作成し,てんかん閾値の上昇の有無を確認する.2.皮質異形成と海馬間のネットワークの形成を確認する.[方法]1.胎生18日目,母ラットから子宮を有茎のまま取り出し,子宮壁外から胎児頭蓋に冷却プローベで障害を加えて再び母ラット後腹膜腔にもどし局所皮質異形性モデルを作製.この時以前に報告した左前頭葉部位への皮質異形性より広範囲の異形成を作成するために,両側前頭部に冷却プローベを接触させて両半球に皮質異形成を作成.出生4週間目に記録用電極を両前頭部皮質・海馬に埋め込んだ.電極埋め込み2週間後より脳波の測定を開始した.脳波測定終了後にラット脳を摘出して病理的評価を行った.対象9匹.2.発作間欠期(発作終了1分後発作開始1分前),発作前(発作開始1分前発作開始),発作中,発作後(発作終了発作終了1分後)の4時期にわけて,それぞれの時期からアーチファクトの無い10秒間の記録を36個切り出してPhaselocking解析.電極間の同期を記録毎,周波数(245Hz)毎に評価した.[結果]1.9匹中2匹において自発性のてんかん性放電がみられた.摘出脳にHE染色を行い両側前頭葉の異形成を確認した.2.自発発作中,特に同側皮質-海馬間で同期の上昇を認めた.[結論]両側に皮質異形成を作製したラットモデルにおいて,キンドリング刺激を与えなくとも自発性にてんかん原性が獲得された.ネットワーク解析においては,皮質異形成と同側海馬の同期が上昇していることが証明された.[目的]我々が開発した胎児期作成皮質異形成ラットでは,異形成が片側の場合は自発てんかんを生じなかったが,グルタミン酸受容体の発現が異形成皮質において増加していた.両側に異形成を作成した場合は自発性てんかん放電を認め,Phaselocking valueを用いて解析すると同側皮質-海馬間でてんかん活動の同期が高まることがわかった.今回は更に免疫組織学的解析を加え,てんかん原性のネットワーク構築を探索する.[方法]1)胎生18日目,母ラット子宮壁外から胎児頭蓋に冷却プローベで障害を加えて再び母ラット後腹膜腔にもどし局所皮質異形性モデルを作製.この時A.片側2か所で両側計4か所冷却プローベを接触,B.片側1か所で両側計2か所に冷却プローベを接触,C.両側計4か所の常温プローベを接触,の3グループに分けた.出生4週間目に記録用電極を両前頭部皮質・海馬に設置し生後35日77日の間,脳波計測とビデオによる症状観察を行った.2)生後35日と77日に脳を取り出し病理的評価および免疫染色によるグルタミン酸受容体発現の定量を行った.[結果]1)生後50日以降にAグループの7匹中5匹に自発性のてんかん性放電を認め,発作時には無動,口部自動症を認めた.B,Cグループではてんかん性放電を認めなかった.2)異形成は前頭葉に存在したが,海馬には形態学的な異常は認めなかった.Aグループで生後28日の海馬でNMDA受容体2A,2Bの増加,生後77日でNMDA受容体R1,2A,2B,GLAST,GLT1の増加を認めた.[結論]両側前頭葉皮質に異形成を有するラットで海馬から始まる自発性てんかん放電を認め,発作症状は人間の内側側頭葉てんかんと類似していた.海馬の形態に異常はなかったがグルタミン酸受容体NMDAR1,R2A,R2Bに増加がみられた結果は,側頭葉外の皮質異形成の存在により海馬のグルタミン酸受容体を介するネットワークの構築が変化することを示唆した[背景・目的]我々が開発した胎児期作成皮質異形成ラットで両側半球に異形成を作製した場合に,異形成の存在する皮質では無く海馬からはじまる自発てんかんを生じた.

この時,海馬の形態に異常はなかったがグルタミン酸受容体NMDAR1,R2A,R2Bに増加がみられたことから,皮質-海馬のグルタミン酸を介するネットワークが海馬てんかん原性獲得に関与していると推定された.この推定を補強するために,硬膜下電極記録よりも感度が高く,容積伝導の影響を受けにくい皮質内電極記録を異形成部に対して行い,また同部におけるグルタミン受容体の変化も検討した.[方法]胎生18日目,胎児頭蓋両側半球に冷却損傷を加えて再び母ラット後腹膜腔にもどし両側半球に局所皮質異形性モデルを作製.出生4週間目に記録用深部電極を両前皮質異形成部・海馬に設置し生後35日77日の間,脳波計測とビデオによる症状観察を行った(9匹).また生後35日と77日に脳を取り出し病理的評価および免疫染色によるグルタミン酸受容体発現の定量を行い対照ラットと比較した(異形成ラット各9匹,対照ラット各5匹).[結果]皮質異形成ラット9匹中6匹で海馬から出現する自発てんかん放電を認めた.この6匹中3匹で皮質異形成内記録に発作間欠期てんかん性放電を認めた.海馬の自発発作はなかったが皮質異形成から自発発作を生じたラットが1匹存在し,このラットでは発作間欠期にもてんかん性放電を認めた.皮質異形成部では生後28日目・78日目ともNR1,2A,2Bの染色強度が有意に上昇していた.海馬では生後28日目よりも78日目で,よりNR1,NR2Bの染色強度が上昇していた.[結論]大脳皮質異形成を有するラットで海馬から始まる自発性てんかん放電に加え,異形成部に発作間欠期てんかん性放電および自発てんかん発作性放電を認めた.また皮質異形成部でもグルタミン受容体の変化が見られた.これらは側頭葉外の皮質異形成の存在がグルタミン酸受容体を介するネットワークの構築変化により海馬に自発てんかんを誘発したことを示唆した.
プラスミドR64の接合伝達領域の解析

接合伝達は、細菌細胞種内、種間の遺伝物質の伝達に関与しており、細菌における遺伝情報の交換ひいては進化の問題を考察する上で重要な過程である。本研究は不和合性群IIに属するプラスミドR64の接合伝達領域(54kb)の全体像を明らかにする目的で、この領域の全塩基配列を決定するとともに、各遺伝子の産物を同定、さらにその突然変異体を作成し、各遺伝子の接合伝達における役割を明らかにすることを目的とした。従来の我々の研究により、54kbからなるR64の接合伝達領域のうち、oriTオペロン約4kbおよび線毛形成領域約19kbの領域のDNA塩基配列はすでに決定されていた。今回の研究により、一部片鎖だけであるが、54,089bpの全塩基配列を決定することができた。この間、2.2kbのギャップを除いてほぼ全域に遺伝子領域が存在すると考えられる。一部片鎖だけであるので正確にはいえないが、現在まで少なくとも39個のORFが認められた。さらに数個のORFの存在が推定される。2遺伝子を除いて他の遺伝子は同方向に並んでいる。2個の調節遺伝子traBC、14個の細線毛形成遺伝子群pilI-V、pilVのC末端部を7種に変換させるシャフロンDNA再編成の部位特異的組換え酵素をコードしているrci、EDTA耐性ヌクレアーゼをコードするnuc、大腸菌dnaG変異を抑制するsog、表面排斥に関係するexc、oriT特異的ニッケースをコードするnikAB等の遺伝子群が現在まで同定されている。各遺伝子の遺伝子領域を決定し、遺伝子産物を検出するとともに、挿入、欠失変異を作成し、機能の解析を行った。さらにR64接合伝達遺伝子群の発現制御に関する研究をおこない、traBC遺伝子がnuc、sogを含むオペロンの正の調節をしていることを明らかにした。本研究は不和合性群IIに属するプラスミドR64の接合伝達領域(54kb)の全体像を明らかにする目的で、この領域の全塩基配列を決定するとともに、各遺伝子の産物の同定、さらにその突然変異体を作成し、各遺伝子の接合伝達における役割を明らかにすることを目的とする。前年度までの我々の研究により、54kbからなるR64の接合伝達領域のうち、線毛形成領跫約19kbおよびoriTオペロン約4kbの領域のDNA塩基配列はすでに決定されていた。本年度は、sog遺伝子周辺約6kbおよびexc遺伝子からoriTオペロンまでの約7kbの領域の塩基配列を決定した。その結果、あらたにsog、exc、traXYZの5遺伝子を同定することができた。また、oriTに関する研究では、oriTニックの導入位置を決定した。ニック周辺の塩貴配列の比較およびmob遺伝子群のアミノ酸配列の比較とから、R64接合伝達領域の発現制御に関する研究では、traBC遺伝子が正の調節をしており、このオペロンの転写開始点から267ヌクレオチドの非翻訳領域があり、ここで転写減衰が起こっている可能性が指摘された。一方、シャフロンのDNA再編成によりそのC末端部を変換しているpilV遺伝子に関する研究では、lacZーpilVタンパク融合遺伝子を作成し、その産物を精製、これに対する抗体を作成した。この抗体はpilV産物と反応すると推定された。現在その他のR64接合、達領域の塩基配列を解析中である。接合伝達は、細菌細胞腫内、種間の遺伝物質の伝達に関与しており、細菌における遺伝情報の交換

ひいては進化の問題を考察する上で重要な過程である。本研究は不和合性群I1に属するプラスミドR64の接合伝達領域(54kb)の全体像を明らかにする目的で、この領域の全塩基配列を決定するとともに、各遺伝子の産物を同定、さらにその突然変異体を作成し、各遺伝子の接合伝達における役割を明らかにすることを目的とした。前年度までの我々の研究により、54kbからなるR64の接合伝達領域のうち、線毛形成領域約19kb、sog遺伝子周辺約6kb、およびexc遺伝子からoriTオペロンまでの約11kbの領域のDNA塩基配列はすでに決定されていた。本年度は、残りの領域約18kbの塩基配列を決定した。まだ完全には両鎖ともは決定されていないが、あらたにtraE-Pとnucの13遺伝子を同定することができた。oriTに関する研究では、部位特異的突然変異法で多数の変異株を分離し、DNA配列とoriT活性の関係を明らかにした。またNikAタンパクを精製し、このタンパクがoriT配列に特異的に結合することを明らかにした。R64接合伝達領域の発現制御に関する研究では、traBC遺伝子がsog遺伝子を含むオペロンの発現に正の調節作用を示しており、その制御機構は坑転写終結であることが推定された。sog遺伝子に関しては多数の欠失プラスミドを作成しその遺伝子領域を決定するとともに、その遺伝子産物を検出した。また、sog遺伝子の挿入変異株が作成することにより、sog遺伝子が接合伝達に必須であることを明らかにした。シャフロンの部位特異的組換え酵素遺伝子であるrci遺伝子に関しては多数の変異株を分離しつつある。
血管平滑筋細胞におけるアクチン遺伝子発現調節機構

動脈硬化巣には増殖型に形質転換した血管平滑筋細胞が遊走分裂していることが知られている。この細胞の形質転換の変化過程においては発現遺伝子の変換、なかでもアクチンを含む主要な収縮蛋白質のアイソフォーム変換がおきている。この遺伝子発現変化を解析するため、まず正常な血管平滑筋組織における血管平滑筋特異的アクチン遺伝子の発現調節系を明らかにしなければならない。ヒトの血管平滑筋特異的アクチン遺伝子のどの部分が組織特異的な発現に必要であるかを見出すため、転写制御領域に各種の変異を導入したものにリポーター遺伝子を結合してトランスジェニックマウスを作成し、成体及び胎仔における各臓器での発現状態を調べた。血管平滑筋アクチン遺伝子の5'上流から、第1エクソン、第1イントロン及び第2エクソンの一部までを持つトランスジェニックマウスにおいては、平滑筋特異的遺伝子発現が見られた。しかし、第1イントロンの異種間で保存された約150塩基を欠失すると発現できなくなった。この150塩基には10bpのCArG配列とTAATをモチーフにするA/TBF転写調節系などが同定され、前者にはSRFが後者にはHox系の転写因子が結合することがin vitroで示された。これら2種類のモチーフのそれぞれに点変異を導入した遺伝子は大動脈での発現が見られなくなった。血管平滑筋アクチン遺伝子のin vivo発現には第一イントロン内の種間で保存されたCArG配列とA/TBF転写調節系が血管平滑筋特異的発現に必須であることが明らかになった。この領域は組織特異的in vivo遺伝子発現ベクターとして利用する事が可能である。