hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯根膜由来幹細胞の血管形成誘導遺伝子および細胞内シグナル伝達様式の解明

我々は歯根膜組織中に存在する歯根膜幹細胞が血管を構築する能力を有することを初めて明らかとした。その際、同一組織由来の血管構築能力の高い細胞と低い細胞の2種類の細胞を樹立した。今回我々はこの2種類の細胞の網羅的遺伝子発現を解析・比較することで、血管新生を制御する可能性のある複数の遺伝子を選定することに成功した。さらに、血管構築能力の高い細胞による詳細な血管新生解析の結果、この細胞が血管を構築する際に同時に血液細胞も誘導している可能性を見出した。研究実施計画に示していたように、自身で樹立した単一の歯根膜細胞初代培養系から派生した2種類の細胞、1)血管形成能の高い細胞群と2)低い細胞群の血管形成能力の違いに着目し、この2種類の細胞間での遺伝子発現様式についてcDNAマイクロアレイを用いて網羅的に調査を行った。その結果、血管形成能力の高いもののみに優位に発現する遺伝子を"血管形成誘導能力の発現を制御すると思われる候補遺伝子"として選定を行うことに成功した。その後、マイクロアレイの結果より見出した複数の遺伝子を指標に、1)の細胞群において血管形成にかかわると思われるさまざまな刺激を行った際の各遺伝子の発現を調べた結果、特徴的な発現パターンを示す遺伝子群を見出した。興味深いことに、この遺伝子群の中には、その発現に正または負の相関関係を示すものがあり、現在ウェスタンブロットやリアルタイムPCR法などを用いて確認中である。さらに、上記においてピックアップしたモデル遺伝子の中から真の血管新生誘導遺伝子をin vitroにおいて絞り込むため、候補とした遺伝子に対するsi RNAを作成し、該当候補遺伝子のノックアウトを行うことにより血管形成が起こらなくなりうるかも現在調査中である。また、in vitro三次元血管形成誘導モデルにおいても、Tie-2遺伝子の強発現部位(血管形成性細胞)と弱発現部位(非血管形成性細胞)を見出しているが(Okubo.et.al J.Vasc.Res. 2010)、この歯根膜幹細胞による上記の2部位に対するレーザーマイクロダイセクションによる組織サンプルからのmRNAを抽出する作業を進め、さまざまな方法により、"歯根膜由来細胞の血管形成能力を制御する遺伝子"の同定を目指している。前年度(平成22年度)の研究実績報告において同一歯根膜細初代培養系由来の1)血管形成能の高い細胞群(以下A細胞群)と2)低い細胞群の2つの細胞を利用した各細胞間における遺伝子発現頻度差についてMicro-Arrayによる網羅的な発現解析を完了したことを報告したが、当該年度においてはさらにはエピジェネティクス解析としての網羅的DNAメチル化解析を完了した。その結果を前年度におけるMicro-Array解析と照合した結果、"血管形成誘導能力の発現を制御すると思われる候補遺伝子"として選定していた遺伝子のうちの複数がエピジェネティックなレベルでも同様の修飾を受けていることが判明した。その後、A細胞群に対してこの候補遺伝子の遺伝子発現レベルを指標にその発現を効率的に向上させるような環境下で血管新生を行うことによりin vitro三次元培養下にいて血管新生がより効率的に起こせることを見出した。興味深いことに、この遺伝子群の中には上記の刺激に呼応してその遺伝子発現に正または負の相関関係を示すものがあり、それらの遺伝子群が関わる血管新生誘導刺激に対するシグナル伝達機構についても現在調査を行なっている。さらに上記の如く効率的な血管新生を誘導した際の詳細な形態学的調査によって、大変興味深いことに旺盛に血管新生を誘導している領域において、エオジン好染の非接着性血球様細胞が多く出現することを見出した。一般的に造血幹細胞と血管前駆細胞はヘマンジオブラスト(hemangioblast)と呼ばれる共通前駆細胞から分化すると考えられている。よってこのデータはA細胞が血管構成性前駆細胞に比べより上位のヘマンジオブラスト様細胞である可能性を示唆しており、加えて現在候補としている遺伝子群がヘマンジオブラストの誘導をも制御している可能性を示唆している。現在これらの候補遺伝子をより効率的に発現させるためのアデノウィルスベクターを作成中でありこれにより更なる解析が進むものと期待される。
動脈硬化巣局所のマクロファージ増殖におけるSkp2の役割の解明と治療への応用

【増殖刺激およびAMPK活性制御によるSkp2発現およびSkp2活性の定量】【動脈硬化モデルマウスを用いた動脈硬化病変局所におけるSkp2-p27kip経路および細胞周期の評価(in vivo)】動脈硬化モデルマウス(Apo E KOマウス)にhigh fat dietを行い動脈硬化症モデルマウスとして血管病変局所でのp27kipおよびSkp2の発現評価をするために、大動脈弁輪部の連続切片を用いてMφの表面抗原マーカー(CD11b)と細胞周期進行のマーカー(PCNA)およびp27kip抗体Skp2抗体で多重免疫染色を行った。動脈硬化弁輪部で増殖マクロファージに一致したSkp2の発現を認めた。培養細胞および動脈硬化モデルマウスを用いた実験を進め、上記の通り仮説を裏付ける結果が出ている。・アポE欠損マウスの動脈硬化巣におけるSkp2およびp27kipの発現を定量化することで、in vivoの実験系で動脈硬化症発症・進展におけるSkp2-p27kip経路の関与について解析する。・Wholebody Skp2欠損マウスの骨髄を9.5 Gy照射アポE欠損マウスに静注することでSkp2欠損骨髄移植アポE欠損マウスを作製する。このマウスは骨髄由来細胞のSkp2が欠損している為、動脈硬化症病変局所におけるMφのSkp2も欠損していると考えられる。・Skp2欠損骨髄移植アポE欠損マウスで、動脈硬化疾患モデルであるアポE欠損マウスにAICARを810週間の連日皮下投与後sacrifyし、腹腔Mφの増殖誘導刺激に対する反応やSkp2発現およびSkp2活性の変化を評価し、コントロールマウスと比較検討する。・動脈硬化病変のサイズを定量化し動脈硬化巣におけるp27kipおよびSkp2の評価し、コントロールマウスと比較検討することでSkp2の動脈硬化症の発症・進展に及ぼす影響を解明する。マクロファージにおいてSkp2によりp27kipのタンパク発現が調整されていることを証明するためにマウス腹腔マクロファージおよび骨髄由来マクロファージを用いて増殖誘導刺激(Ox-LDL、GM-CSF、M-CSF)によるSkp2発現およびp27kipのタンパクレベル(western blot法)・mRNAレベル(RT-PCR法)での発現とMφ増殖能との関連を解析した。・細胞増殖の評価を、[3H]チミジン取り込み法、細胞数算定法を用いて行い、増殖誘導刺激(Ox-LDL、GM-CSF、M-CSF)により有意に細胞増殖が誘導された。現在は、AMPK活性化剤AICARおよびアデノウイルスベクターを用いて恒常活性型constitutively active mutant(T172D) -AMPKα(CA-AMPK)、優位抑制型dominant negative mutant(T172A)-AMPKα(DN-AMPK)を過剰発現することでAMPK活性制御を行い、増殖抑制状態での上記評価を行っている。またSkp2のユビキチン化とマクロファージ増殖能との関連を解明するためp27kip抗体で免疫沈降を行い、ユビキチン抗体でユビキチン化を定量化することでSkp2のユビキチン化を評価している。培養細胞を用いた実験を中心に進め、上記の通り仮説を裏付ける結果が出ている。・各種培養細胞を用いてMφ増殖時(または増殖抑制時)のSkp2およびp27kip発現を定量化することで、Mφ細胞周期制御におけるSkp2-p27kip経路の役割についてin vitroの実験系で評価する。(1)AMPK活性化剤をアポE欠損マウスに投与してAMPK活性とSkp2発現との関連について生体内で検討する。(2)Mφ特異的テトラサイクリン誘導性Skp2トランスジェニックマウスとアポE欠損マウスを交配し、動脈硬化症の程度を評価する。(3)Skp2欠損マウスの骨髄をアポE欠損マウスに移植し、動脈硬化症の程度を評価する。以上の方法でMφ増殖におけるSkp2-p27kip経路の全容を明らかにし、動脈硬化症の治療標的となり得るかを検討する。

このマウスは骨髄由来細胞のSkp2が欠損している為、動脈硬化症病変局所におけるMφのSkp2も欠損していると考えられる。・Skp2欠損骨髄移植アポE欠損マウスで、動脈硬化疾患モデルであるアポE欠損マウスにAICARを810週間の連日皮下投与後sacrifyし、腹腔Mφの増殖誘導刺激に対する反応やSkp2発現およびSkp2活性の変化を評価し、コントロールマウスと比較検討する。・動脈硬化病変のサイズを定量化し動脈硬化巣におけるp27kipおよびSkp2の評価し、コントロールマウスと比較検討することでSkp2の動脈硬化症の発症・進展に及ぼす影響を解明する。残額わずかで次年度に使用する。
日本で就職している元中国人留学生のキャリア形成：職業的アイデンティティに着目して

近年、日本で就職する外国人留学生数は増加傾向にある。しかし、就職後の外国人留学生の離職率は高く、多くの企業は外国人社員の適応や定着率の向上等の対応に苦慮している。そこで、本研究では、日本で就職している元中国人留学生の職業的アイデンティティ・ステイタスを明らかにし、彼・彼女らの職業的アイデンティティと職務満足度や仕事の継続意思等のキャリア・アウトカムとの関連を検証する。この目的を達成するために、日本で働く元中国人留学生を対象としたアンケート調査を実施する。本研究の成果を通じて、日本で働く元中国人留学生のキャリア形成のプロセスをより深く理解し、日本企業への定着や適応を促進することが期待できる。
免疫抑制薬の副作用に着目した慢性移植腎症の分子機構解明と非侵襲マーカーの探索

腎臓移植後の慢性移植腎症(CAN)は、高度な線維化を伴う慢性腎臓病様の機能障害をもたらす。腎臓移植治療におけるCAN克服を目指し、移植腎組織の線維化進展につながる尿中バイオマーカーの探索を行った。腎移植患者73名より尿並びに血液検体の回収を終え、尿中バイオマーカー候補タンパク質並びに免疫抑制薬の血中濃度推移、臨床経過との関連性について解析を進め、尿中のNGAL、MCP-1、LC3と術後3ヶ月以後に見出される急性拒絶反応や尿細管炎を主とする組織障害との関連性が示された。従って、腎移植後のCNIによる腎障害発症を早期予測するための指標として尿中のNGALやMCP-1、LC3の有用性が示された。腎臓移植患者の過半数は慢性移植腎症(Chronic Allograft Nephropathy, CAN)と呼ばれる移植腎組織の高度線維化を伴う慢性腎臓病様の機能障害に陥るため、移植腎の生着は維持されるものの、機能低下による血液透析への再導入が問題とされている。CANの要因として、生化学データに反映されない軽微な拒絶反応(Subclinical Rejection)の遷延とカルシニューリン阻害薬(CNI)の副作用である腎毒性の蓄積が疑われるが、分子機構は未解明である。そこで、腎臓移植治療におけるCAN克服の手がかりとして動物実験を含めた系統的な解析を計画し、まず初めに臨床標本の収集を中心に開始した。その結果、腎移植後1年以上経過した患者のうち、拒絶反応などの合併症疑いにて来院し、移植腎の病理評価の対象となった症例が約30例、移植術当初より尿並びに術後3か月目の腎生検組織の提供に同意いただいた症例は約50を数えた。当初目的の3年以内に125例収集という計画について、概ね達成できると考えられる。過去、肝臓移植患者における尿中NGAL漏出量がCNI腎症の診断マーカーになり得ることを見出している事から、NGALを中心に検討を進める予定である。ラットモデルにおいては、タクロリムスを用いて作成したCANモデルラット組織作成の再現性について、検討を進めた。一定数のサンプルの収集を待って、計画している項目の測定に進む予定である。平成27年度の、年度途中に担当医の退職等が重なり、当初の初年度におけるde novo腎移植症例については収集症例数を75例と設定していたが、50例分しか集めることができなかった。目標症例数については3年間の計画と考えると余裕を持って計画していることから達成可能と考えらる。なお、昨年10月より新しい医師の着任により、腎移植治療が再開されたため次年度以後の臨床検体の収集については概ね達成達成できる考えられる。臨床検体の収集については平成27ねん10月に着任した医師によって着実に集まっており、当初の遅れを取り戻すに至っている。一方、平成28年夏に使用していた動物実験施設が感染のため全ての飼育動物の処分と施設の洗浄、一定期間の使用不可となった。そのため、使用する動物実験施設を九州大学薬学部から医学部の施設に変更することを決定し、平成28年度末にようやく使用の許可をいただいた。したがって、動物実験については当初の予定を実施することができていない。腎臓移植患者の過半数は慢性移植腎症(Chronic Allograft Nephropathy, CAN)とよばれる移植腎組織の高度な線維化を伴う慢性腎臓病様の機能障害に陥るため、移植腎の生着は維持されるものの、機能低下による血液透析への再導入が問題とされている。そこで、腎臓移植治療におけるCAN克服の手がかりとして、移植腎組織中の免疫抑制薬の濃度がsubclinicalな拒絶反応並びに薬剤成人毒性の遷延と障害の蓄積、組織線維化の進展につながると仮説を立てて系統的な解析を実施した。腎移植患者73名より尿並びに血液検体の回収を終え、尿中バイオマーカー候補タンパク質並びに免疫抑制薬の血中濃度推移、臨床経過との関連性について解析を進めた結果、尿中のneutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)、Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1)とタクロリムスによる急性腎障害発現との関連性が示された。一方、Liver type-Fatty Acid Binding Protein (L-FABP)をはじめとする4種類の尿中バイオマーカー候補分子との関連性は認められなかった。従って、腎移植後のCNIによる腎障害発症を早期予測するための指標として尿中のNGALやMCP-1の有用性が示された。さらに、長期間のCNI暴露とsubclinicalな拒絶反応の継続に伴うCANの検出には尿中のKidney injury molecule 1漏出との関連性が示唆された。

腎移植症例数は順調に推移していることから、臨床検体の収集を着実に積み重ねることを第一に考え、随時尿中バイオマーカーの測定に着手することで、遅れを取り戻すことは十分に可能と考える。新しく使用許可の降りた動物実験施設において実験系を立ち上げ、遅れを取り戻すように努力したいと考える。29年度が最終年度であるため、記入しない。臨床薬理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
生物防除微生物由来のスーパーオキシド生成エリシターの探索とその作用機構

本研究では、トマト病害に対する生物防除微生物である2株のPaenibacillus属細菌からエリシター(植物体の抵抗性を誘導する物質)の単離を試みた。細菌株の培養ろ液および菌体画分をトマトリーフディスクに処理し、活性酸素生成活性を指標にエリシター活性を検出した。いずれの画分からも活性が検出されたが、これらの活性は不安定であった。一方、供試菌株から精製されたキシラナーゼを用いたところ活性酸素生成活性が検出された。また、同酵素をトマト根部に処理することで感染時特異的タンパク質遺伝子の発現上昇がみられたことから、同酵素がエリシターとして機能することが示唆された。生物防除微生物であるPaenibacillus属細菌2菌株が有するトマト植物体の抵抗性誘導機構の作用機作を解明する目的で、本年度は同細菌株由来のタンパク質または低分子化合物を標的として、スーパーオキシド(O2-)生成エリシターの単離・精製を試みた。滅菌したトマト根を添加した培地で細菌株を培養し、培養ろ液画分と菌体画分を回収した。さらに菌体画分については、菌体破砕後に遠心分離により、細胞質画分と細胞膜壁画分に分画した。これらの画分をトマトリーフディスクに添加し、O2-生成を化学発光試薬を用いて測定したところ、いずれの画分からもリーフディスクのO2-生成誘導活性が認められた。いずれの画分もプロテイナーゼKの処理によりO2-生成誘導活性が低下したことから、O2-生成エリシターはタンパク質性の物質であることが示唆された。このうち、植物体に直接接触作用すると考えられる培養ろ液画分からのエリシタータンパク質の同定を試みた。同画分を透析膜に入れ、ポリエチレングリコールにより脱水濃縮後、脱イオン水で透析したところ、O2-生成誘導活性が上昇したことから、エリシタータンパク質は分子量10kDa以上であることが示唆された。次にエリシターの精製を行うため、陽イオン交換、陰イオン交換および疎水クロマトグラフィーカラムを用いて溶出液を分画したが、いずれのカラムクロマトグラフィーを用いた場合にも、活性画分が検出されなかった。このことから、培養ろ液画分のエリシタータンパク質は、不安定であるか、複数のタンパク質によってO2-生成誘導活性を発現する可能性が示された。供試菌株の培養ろ液画分、細胞質画分、細胞膜・壁画分のいずれからも、トマトリーフディスクを用いてO2-生成活性を検出することに成功し、さらにエリシターがタンパク質性物質であることを明らかにした。当該年度は、培養ろ液画分からのエリシターの精製を試みたが、カラムクロマトグラフィーでの溶出の過程で活性が失われ、目標であったエリシターの精製には至らなかった。本年度は、トマト根腐萎凋病に対する生物防除微生物であるPaenibacillus sp. 42NP7株が産生するキシラナーゼに着目してエリシター活性を検証した。Paenibacillus sp. 42NP7株は4種類以上のキシラナーゼアイソザイムを産生するが、このうち、トマト根部を含む培地で培養した際に培養液中に高度に分泌される精製キシラナーゼを用いた。本精製酵素の部分アミノ酸配列を解析し、得られた配列をもとに縮重プライマーを設計し、PCR法によりキシラナーゼ遺伝子全長を取得した。本酵素の推定アミノ酸配列はP. rhizosphere由来のglycoside hydrolasefamily 11キシラナーゼと高い相同性を示した。精製酵素を用いて、トマトリーフディスクでのスーパーオキシド(O2-)生成誘導活性を調査したところ、対照区(緩衝液処理区)よりも高い誘導活性が検出された。また、精製酵素をトマト苗の根部に処理することで複数の感染特異的タンパク質(PRタンパク質)をコードする遺伝子の発現量が対照区にくらべ増加した。以上から同キシラナーゼはO2-生成エリシターであることが示唆された。これまでエリシター活性を持つキシラナーゼとしては、Trichoderma属糸状菌由来の特異なアミノ酸配列を有するキシラナーゼで知られているが、そのアミノ酸配列を持たないPaenibacillus属細菌由来のキシラナーゼも同様にエリシター活性をもつことが示された。エリシタータンパク質が不安定である可能性を考え、各種タンパク質安定化剤(還元剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等)を、使用する緩衝液に添加して、精製を試みる。また、培養ろ液画分以外の細胞質画分や細胞膜・壁画分からもエリシターの精製にも新たに取り組む。植物病理学当該年度の予算に計上していた吸光プレートリーダーは、別予算で入手した機器を利用できることとなったため、購入しなかった。

その代わりに、エリシター活性の検出に必要な化学発光試薬や精製に必要な消耗品が当初よりも多く必要になったため、これらの購入に充てた。精製エリシターの病害抵抗性誘導活性の指標となるファイトアレキシンの蓄積量を調査するための高速液体クロマトグラフィー装置の構成ユニットを購入する。
中世前期における諏訪信仰の総合的研究

中世前期の諏訪信仰は、種々多様な文化伝承を媒体として流布・展開した。本研究では、その実相を解明するため、当時における諏訪信仰の主流を担った信州・諏訪上社の大祝諏訪氏に関わる伝承について考察した。まずは、『諏訪上社物忌令』や『大祝諏訪信重解状』などといった、鎌倉時代に成立した大祝家ゆかりの文献類を再検討した。さらには、大祝家文書に含まれる新出のテキストについても調査を進め、大祝家独自の諏訪伝承の諸相や当家と関わる信仰文化の実情を明らかにした。本年度は、研究代表者(二本松康宏)と共同研究者(永松敦、中澤克昭、二本松泰子)を中心として「中世前期諏訪信仰研究会」を立ち上げ、参会の便宜上、中澤克昭の勤務先である上智大学(東京都)を会場として研究課題に取り組んできた。平成26年度は7月19日(土)、10月25日(土)、1月24日(土)、3月27日(金)にゲストスピーカーやゲスト参加者を含めたブレスト・ミーティングを設けている。研究会としての長野県諏訪地域における現地調査を予定していたが、研究費の執行開始が7月からとなってしまったため、当該年度のうちに現地調査を実施することはできなかった。平成27年度には諏訪地域における現地調査を実施する。なお、二本松康宏と二本松泰子は平成26年12月にアラブ首長国連邦にて開催された世界鷹狩りの祭典への参加を予定していたが本務校での業務が重なり出張ができなかった。個人での研究活動としては以下のような取り組みをしている。二本松康宏...「諏訪縁起」をテーマとして民間伝承(伝説)のフィールドワーク、「陬波御記文」と「陬波私注」による御射山信仰の始原に関する研究。永松敦...「諏訪上社物忌令」をめぐって宗教民俗学の視点から諏訪地域におけるフィールドワーク。中澤克昭...「広疑瑞決集」をめぐって中世の諏訪氏の殺生観の成立。二本松泰子...「大祝信重解状」をめぐって中世前期の諏訪信仰とその伝承、鷹術における思想との関連。二本松康宏、永松敦、二本松泰子の研究成果(論文)は『諏訪信仰の中世』(福田晃・徳田和夫・二本松康宏編、三弥井書店、2015年6月刊行予定)にそれぞれ掲載される予定である。平成28年度に本課題をテーマとした学術集会もしくはシンポジウムの開催を目指し、その企画をすすめる。また、本課題における成果物として論文集を刊行する企画を立ち上げる。【1】研究代表者(二本松康宏)と共同研究者(永松敦、中澤克昭、二本松泰子)を中心とする「中世前期諏訪信仰研究会」の定例会を開催した。その概要は以下のとおりである。第5回例会/2015年6月27日(土)/茅野市神長官守矢史料館/研究発表「諏訪上社関連遺跡について」柳川英司、実地見学「諏訪大社御射山祭祀関連遺跡」。第6回例会/2016年3月6日(日)/上智大学四谷キャンパス/研究発表「『広疑瑞決集』について」中澤克昭、研究発表「中世における『諏訪大明神絵詞』をめぐって」石井裕一朗。【2】課題研究の成果の一部として『諏訪信仰の中世ー神話・伝承・歴史ー』(福田晃・徳田和夫・二本松康宏編、三弥井書店、2015年9月)を刊行した。11名の共著者のうち本課題研究者による所収論文は以下のとおりである。二本松康宏「諏訪縁起の変容ー陬波大王から甲賀三郎へー」、二本松泰子「鷹書からみた中世の諏訪ー廣田宗綱書写『才覚之巻』記載の諏訪の言説を端緒として」、永松敦「中世諏訪の狩猟神事ー稲と鹿・葦と薄ー」。「中世前期諏訪信仰研究会」としての研究発表ミーティングを中心に研究はおおむね順調に進展している。とくに本年度は茅野市神長官守矢史料館を会場として、同館学芸員の柳川英司氏による現地見学会を開催したことは、特筆できる成果である。また、代表者である二本松は長野県佐久市の新海三社神社、小海町の松原諏方神社などでの祭祀調査により、中世の諏訪信仰の在地展開について研究が進んだ。研究代表者(二本松康宏)と共同研究者(永松敦、中澤克昭、二本松泰子)を中心とする「中世前期諏訪信仰研究会」の定例会を開催した。第7回例会/2016年6月26日(日)/上智大学/研究発表「仙台藩の鷹匠と諏訪伝承」二本松泰子。第8回例会/2016年9月11日(日)13日(月)/宮崎・鹿児島地域における諏訪信仰と「諏訪縁起」をめぐるフィールドワーク。第9回例会/2017年3月25日(土)/上智大学/研究発表「大祝信重解状をめぐって」二本松泰子。研究会を通じて本課題のテーマの一つである『諏訪上社物忌令』『大祝信重解状』『陬波私注』『陬波御記文』の精読を進めてきた。その結果、従来は鎌倉時代とされていた『諏訪上社物忌令』と『大祝信重解状』の成立が南北朝時代室町時代にくだることがおよそ明らかとなった。

また『諏訪大明神絵詞』が信州の諏訪大祝家に伝わる伝承・信仰というよりも、新興の京都諏訪氏による独自圏的な成立であることも見えてきた。また在地の諏訪信仰から中世的な信仰の様相を検証するために、諏訪大社上社(諏訪市・茅野市)、神長官守矢史料館(茅野市)、御射山(長野県原村)、松原諏方神社(長野県小海町)、南方神社縁起(鹿児島県湧水町)、都城市歴史資料館(都城市)などでの実地調査を実施した。そうした調査と検証により、従来は鎌倉時代に遡るとされてきた諏訪信仰の地方展開が南北朝時代室町時代にくだることもおよそ明らかとなりつつある。こうした結果に対応するため、「中世前期諏訪信仰研究会」は「中世後期諏訪信仰研究会」として発展的に改組し、南北朝時代室町時代における諏訪信仰の生成について研究を進めてゆくこととなった。なお、「中世前期諏訪信仰研究会」としての3年間の研究成果を公表するために、二本松康宏を編者とする論集『諏訪信仰の歴史と伝承』の刊行を予定している。中世前期の諏訪信仰は、種々多様な文化伝承を媒体として流布・展開した。本研究では、その実相を解明するため、当時における諏訪信仰の主流を担った信州・諏訪上社の大祝諏訪氏に関わる伝承について考察した。まずは、『諏訪上社物忌令』や『大祝諏訪信重解状』などといった、鎌倉時代に成立した大祝家ゆかりの文献類を再検討した。さらには、大祝家文書に含まれる新出のテキストについても調査を進め、大祝家独自の諏訪伝承の諸相や当家と関わる信仰文化の実情を明らかにした。都合4回のミーティングを重ねることで、これまで解明されていなかった「中世前期の諏訪信仰」を研究してゆく上での課題が明らかとなってきた。とくに袮津宗伸氏(10月25日(土))、村石正行氏(1月24日(土))、細川重男氏(3月27日(金))らをゲストスピーカーとして招聘できたことは、研究の進展に極めて意義があった。研究費の執行開始が7月からとなってしまったため、年度内の日程調整ができず、諏訪地域における研究会としての実地調査ができなかった。ただし、二本松康宏、永松敦は個人活動として、同地域および周辺地域におけるフィールドワークをおこなっている。研究成果(論文)は『諏訪信仰の中世』(福田晃・徳田和夫・二本松康宏編、三弥井書店、2015年6月刊行予定)等において発表する。長野県小海町の松原諏方神社における御射山祭をめぐって記録的調査を進める予定である。また、個々の研究テーマにもとづく研究成果をまとめ、課題最終年度に向けて論集『中世前期における諏訪信仰の総合的研究』(仮題)の編集・執筆を開始する予定である。日本文学これまでと同じように年度内に4回のミーティングを開催し、それぞれの研究課題について多角的な意見交換を進めてゆく。諏訪地域の博物館や資料館とも連携し、中世考古学の視点から諏訪信仰の祭祀の実態を考える機会を設ける。個人の研究成果として全員が何らかのかたちで研究論文を発表する。平成28年度に本課題をテーマとした学術集会もしくはシンポジウムの開催を目指し、その企画をすすめる。平成27年度は「中世前期諏訪信仰研究会」の例会を2回しか設けることができなかったため、ゲスト講師への謝金が残余してしまった。研究会として長野県諏訪地域での実地調査に取り組む予定であったが、平成26年度はそれができなかった。平成28年度は例会を予定どおり開催し、ゲスト講師への謝金を含めて、予定にどおりに執行する。平成27年度には長野県諏訪地域での実地調査の実施に使用する予定である。
リン脂質の膜配向性制御とアクチン細胞骨格系制御機構に関する研究

真核細胞の生体膜を構成するリン脂質は脂質二重層の内外で非対称に分布しており、この非対称性は膜上に存在するリン脂質輸送体によって形成・維持されている。そのひとつであるアミノリン脂質輸送体(APLT)はリン脂質を膜外層から内層に輸送することが知られているが、その細胞内機能はほとんど分かっていない。私はこの疑問を解決すべく、真核細胞のモデル系である出芽酵母を用いて実験を行った。私は、出芽酵母の出芽過程で極性成長部位の細胞膜に主に局在しているAPLTであるDnf1とDnf2に着目して研究を進めた。通常酵母は、先ず芽を頂端成長により伸長させ、ある程度伸長すると等方性に膜成長を変化させ、結果として娘細胞は楕円形となる。しかし興味深いことにDnf1とDnf2が機能しない細胞では、膜成長の方向性が正常に変換されず、娘細胞は通常より細長い形態を示した。さらにAPLTによって輸送され、一般に膜内層に多く分布しているフォスファチジルエタノールアミン(PE)が、頂端成長部位の細胞膜上では外層に多く露出していた。この露出は等方性の膜成長をしている時期にはみられなかった。一方Dnf1とDnf2が機能しないとき、通常等方性の膜成長をするような時期になっても芽の先端でPEの露出がみられた。この頂端成長部位の特殊な膜領域直下には、極性形成を制御する重要な分子のひとつであり、アクチン細胞骨格の形成に関与するsmall GTPaseであるCdc42が集積していた。以上の結果から、PEを含めたリン脂質がDnf1やDnf2によって膜内層に再分布されると、膜直下のCdc42やアクチン細胞骨格の再編成が起こり、膜成長の方向性が変化していると考えられる。このように本研究は、APLTによる膜リン脂質の非対称性変化が細胞極性形成を制御する分子機構の一端を世界で初めて示した。一般に真核生物の生体膜脂質二重層はその内外で様々な脂質が非対称に分布しており、その非対称性の形成、維持には能動的に脂質を内外に運ぶ輸送分子が働いていると考えられている。例えばアミノリン脂質トランスロケース(APT)は外層(細胞外側)から内層(細胞質側)ヘリン脂質を運ぶ働き(フリップ活性)があることが示唆されている。近年高等動物では、リン脂質の膜非対称性の変化が細胞極性形成に重要な役割を果たしていることが示唆されている。しかしその詳細な分子機序についてはほとんど分かっていない。本研究は、真核生物のモデル系として出芽酵母を用い、リン脂質の膜配向性制御とアクチン細胞骨格系制御機構との関連を明らかにすることを目的としている。本年度において以下に示す成果が得られた。1.出芽酵母はその出芽過程で、最初芽を一定方向に伸長(頂端成長)させ、ある程度芽が成長すると等方性の成長をするようになる。この成長の変化は、出芽酵母おいて細胞極性形成に中心的な役割を果たすアクチン細胞骨格の再分布によって支えられている。細胞形質膜上のAPTが機能せず、リン脂質の膜非対称性が崩れる遺伝子変異株(lem3遺伝子欠損株)では、アクチン細胞骨格の再分布が正常に起こらず、等方性の成長が長く続くことに野生型より細長い形態になる。このアクチン細胞骨格の再分布の異常と一致して、様々なアクチン細胞骨格制御因子が等方性の成長をするような時期になっても頂端成長に特徴的な局在を示すことが明らかとなった。2.lem3遺伝子欠損株を用いた解析から、アクチン細胞骨格制御因子の一つで、アクチン細胞骨格形成に重要な役割を果たす低分子量蛋白質であるCdc42が、なんらかのかたちで細胞形質膜上のリン脂質の膜非対称性の変化の影響を受けていることが示唆された。3.上記内容を第78回日本生化学会大会で発表(口頭発表)した。

以上の結果から、PEを含めたリン脂質がDnf1やDnf2によって膜内層に再分布されると、膜直下のCdc42やアクチン細胞骨格の再編成が起こり、膜成長の方向性が変化していると考えられる。このように本研究は、APLTによる膜リン脂質の非対称性変化が細胞極性形成を制御する分子機構の一端を世界で初めて示した。
小細胞肺癌特異的に発現するCADM1バリアントを分子標的とする転移抑制法の開発

小細胞肺がんは非常に進行が早く、転移しやすい悪性度の高いがんである。その高転移能に着目し、その分子機構を解明し、転移抑制を目指すための基礎的検討を行った。このCADM1を強制発現させた小細胞肺がん細胞は腫瘍形成能が亢進することから小細胞肺がんの悪性増殖・転移能と強く相関している可能性が示唆された。更に小細胞肺がんにおけるCADM1の下流分子経路としてPI3K経路が関与している可能性を見出した。小細胞肺がんでは高頻度に細胞接着分子TSLC1/CADM1の特異的スプライシング・バリアントの過剰発現が認められるが、その病理学的実態と機能は、未だ不明である。本年度は、CADM1を介してSCLCが悪性増殖・転移能を獲得する分子機構とその抑制手段を明らかにすることを目的として以下の実験をおこなった。まず、ATL同様、SCLC細胞においてもCADM1とTiam1との相互作用が見られるかを免疫沈降実験で検討したところ、SCLC細胞株においては、Tiam1との結合が認められなかった。次にTiam1の類似分子であり同様にPDZドメインを有するTiam2との相互作用を検討した。Tiam2は11種類のSCLC細胞株においてRT-PCR法およびウエスタンブロッティング法により7種類の細胞株において発現が認められた。内在性Tiam2およびCADM1との免疫沈降実験を行ったところ、結合は認められなかった。そこでTiam2の報告されている3つのスプライシングバリアントのcDNAを外因性に発現するプラスミドを作成し、SCLC細胞に発現させたうえでCADM1との結合を免疫沈降実験で見たところ、結合は認められず、また免疫染色において細胞内における局在を比較したところどちらの分子もフィロポディア様の細胞局在を示すものの、共局在は認められなかった。以上のことから、SCLCにおいてはATLと異なり、CADM1は、Tiam/Racとは異なる分子経路に関与していることが示唆された。SCLC細胞株ではc-Metの高発現が認められるが、CADM1非発現SCLC株にSCLC特異的CADM1バリアントを外因性に発現する安定細胞株を作成したところ、c-Metの増幅が認められた。現在、c-Metの下流分子についても検討を行っている。小細胞肺がん(SCLC)の高転移能に着目し、その分子機構を解明し、転移抑制を目ざすための基礎的検討を行った。まず、SCLCに特異的に発現するCADM1のスプライシング・バリアント8/9がSCLC手術組織35例中10例(29%)に発現すること、SCLC細胞16例中、壁非依存性増殖を示す14例全例で発現するのに対し、壁依存性増殖を示す2例では全く発現しないことを確認した。次いで、CADM1非発現SCLC細胞にCADM1を導入すると、ヌードマウス皮下における腫瘍原性を有意に促進すること、一方CADM1高発現SCLC細胞で、siRNAによりその発現を抑制すると、スフェロイド様増殖が部分的に抑制されることを見出し、CADM1バリアント8/9がSCLC特異的な診断、治療マーカー候補であることを示した(文献1)。次に、SCLC細胞におけるCADM1下流分子経路に着目して、ATL細胞で同定したCADM1下流因子で、RAC活性化機能を有するTiam1とその類似分子Tiam2の発現を検討したところ、CADM1と相関する発現様式を認めたが、免疫沈降法によるCADM1とTiam1、Tiam2との結合は見出せなかった。一方、固相化CADM1上での細胞伸展性を指標とする独自の検索法により、CADM1経路阻害因子として同定したPI3K阻害剤LY294002について、SCLC細胞への効果を検討したところ、一定の増殖抑制効果を示し、また、CADM1からPI3Kに至る経路上の分子群についてもSCLCで高発現することを見出した。しかしPI3K阻害剤のSCLC細胞に対する効果は、他の腫瘍細胞と差異を認めないことから、さらなる特異的な治療が必要であることが示唆された。また、レチノイン酸がCADM1遺伝子の転写を活性化すること(文献2)、乳癌ではCADM1が癌抑制的に機能することを報告した(文献3)。
電子スピンエコー(ESE)法によるポリアセチレンの電子状態の研究

不融不溶のため、分析が容易でないポリアセチレンのキャラクタリゼーションの手法をCP-MAS【(13)_C】高分解能NMRを中心として確立した。この手法によって、ポリアセチレン試料を検定したところ、室温で短時間空気に接触したのみでかなりの劣化が進むことが見出された。この事実は物性測定に用いられるポリアセチレン試料は常にキャラクタリゼーションを行い、劣化の有無、程度を確認する必要があることを示す。電子スピンエコー(ESE)法によって、ポリアセチレンのスピン-格子緩和時間【T_(1L)】,スピン-スピン緩和時間【T_2】を決定し、同一試料について定常法による測定値と比較した。その結果、二つの方法で決定された値は一致しなかった。この事実は、定常で、緩和曲線,線巾から上記緩和時間を決定する際に用いられる仮定がポリアセチレンには適合しないことを意味し、ESE法による測定値が信頼できることを示す。これ迄の測定値の多くは定常、によることを想起すれば、この結論は重要である。【T_(1L)】と【T_2】との温度変化を、77Kから350Kへの温度域にわたって測定した。【T_(1L)】は温度と共に減少するのに対し、【T_2】はこの温度域ではほぼ一定であることが見出された。この事実は、ESRで検知されるポリアセチレンの不対電子はimmobileであり、局在化していることを示唆している。この結果は又、ベクトル飽和移動が検知された事実からも支持される。一方、ポリアセチレンの電気伝導に寄与する伝導電子は極めてmolileであることが知られている。ポリアセチレンにおいては伝導電子と不対電子は異なると考えられる。即ち、ESEで得られた緩和挙の実験はポリアセチレンの不対電子が炭素数約14程度の狭い範囲内に局在化していると考えるSuらのモデルを支持している。
食道腺癌発がんへのレプチンの関与について

今回、ラット逆流性食道炎モデルに近年肥満関連の発癌に関与しているとされるレプチンを持続投与することで内臓脂肪型肥満者の体内環境を再現し、食道下部における炎症・発癌へのレプチンの関与を検討した。結果、レプチンの急性暴露では有意な炎症増強は認めず、今後はレプチンの慢性暴露モデルで発癌機序を検討する予定である。実際のヒト逆流性食道炎、バレット食道、および食道腺癌患者の血中レプチン濃度を測定したところ、逆流性食道炎の段階から高濃度のレプチンに暴露されることが、バレット食道、さらに食道腺癌に至る危険因子であることが示された。今回の結果は今後の食道腺癌発癌機序の解明の一助になる成果であった。今回、研究期間を通じてラット逆流性食道炎モデル(REモデル)にleptinを持続投与することで内臓脂肪型肥満患者の体内環境を再現し、食道下部における炎症へのleptinの関与を検討した。加えて実際のヒト逆流性食道炎、Barrett食道、および食道腺癌患者の血中leptin濃度を測定し、ヒトでの発癌への関与についても検討した。ラットモデルに関しては主に平成25年度の検討でcontrol群(N=10)とleptin持続投与群(N=10)で体重増加率は有意差なく、食道の傷害面積にも有意差はなかった。手技的な問題もあるためさらなる検討が必要ではあるが、leptinの急性暴露モデルでは傷害に有意な差は認めなかったため、発癌に関与する持続的なleptin暴露モデルとしてBarrett食道モデルでの検討を進めており、これによりleptinの発癌への寄与解明に貢献できると考えられた。ヒト検体における検討では平成24年度はcontrol群でBMIとleptin濃度が正の相関を示すことを確認したが、平成25年度の検討では、全例男性でBMIを可能な限りマッチさせたcontrol群(N=23)、逆流性食道炎(RE)群(N=10)、Barrett食道群(N=11)、食道腺癌群(N=10)とでleptin濃度を比較したが、control群(3.0±1.5 ng/ml)と比較してRE群(5.5±2.7 ng/ml)、Barrett食道群(7.3±5.1 ng/ml)でleptin濃度が有意に高く(それぞれP<0.01)、食道腺癌群(4.8±3.9 ng/ml)ではcontrol群と比較してleptin濃度が高い傾向にあった(P=0.06)。RE群、Barrett食道群、食道腺癌群の間の比較では有意な差は認めなかった。今回の検討にて逆流性食道炎の段階から高濃度のleptinに持続的に暴露されることが、Barrett食道、さらにBarrett腺癌に至る危険因子であることが示された。今後の食道腺癌発癌メカニズムの解明の一助になる成果であった。近年欧米を中心に食道腺癌(Barrett癌)の発生が急速に増加しており、前癌状態であるBarrett食道、さらにその前駆状態と考えられるびらん性食道炎とともに肥満、特に内臓脂肪型肥満との関連が報告されている。内臓脂肪型肥満は腹圧上昇による酸・胆汁酸逆流のriskになるだけでなく、脂肪細胞自体から分泌されるレプチンなどの生理活性物質(adipokine)を介した炎症や発がんへの関与が指摘されている。今回、ラット逆流性食道炎モデル(REモデル)とBarrett食道モデル(BEモデル)にレプチン持続投与することで内臓脂肪型肥満患者の体内環境を再現し、食道下部における炎症や発がんへのレプチンの関与を検討することを目的とした。また、加えて実際のヒトBarrett患者や食道腺癌患者の臨床検体を用いて内臓脂肪型肥満の程度や血中レプチン濃度と、食道腺癌の臨床学的悪性度、がん抑制遺伝子の発現・変異、組織のレプチンレセプター(ObR)発現との関与についての検討を計画した。動物実験モデルに関しては現段階で、まだminipump埋め込みによるレプチン持続投与が可能なまでに至っていないが、次年度にデータを得るだけの準備は整っている状態である。

また、ヒト検体における検討では基礎データとして、逆流性食道炎やBarrett食道を有さないcontrol群(N=62)のBMI、レプチン濃度測定を行い、BMI22未満と22以上でわけた比較でも(3.2±1.6 vs 7.6±6.4 ; P<0.01)、BMI25未満と25以上でわけた比較でも(4.1±3.0 vs 11.4±7.8 ; P<0.01)、既報のごとく有意にBMI高値者でレプチン濃度が高いことが証明された。今後このデータをBarrett食道患者や食道腺癌患者検体との比較データに用いる予定である。動物実験モデルに関しては1)麻酔器の不備が判明し、ラット用麻酔器具を一式購入・調整が必要だったこと、2)検討に耐えうる処置後の生存期間が安定して得られなかったこと、この2つの理由でminipumpを挿入したレプチン持続投与の検討にうつれなかった。そこでもともと次年度に行う予定の臨床検体を用いたレプチン濃度測定を開始し、control群でのレプチン濃度測定を行い、現在Barrett食道患者や食道腺癌患者検体を集め、測定・検討する予定である。レプチン持続投与の動物実験モデルを開始する予定である。ラット腹部にminipumpを埋め込んで、1)生理食塩水の持続投与を行うcontrol群、2)レプチン持続投与群、3)NO曝露群、4)レプチン持続投与+NO曝露群の4群にわけて、それぞれラット逆流性食道炎モデルとラットBarrett食道モデルにおいて、炎症・発癌に関して(サイトカイン(IL-6、IL-8)やがん抑制遺伝子(p53、p16)の発現・変異など)検討する。臨床検体に関しては実際のBarrett食道患者や食道腺癌患者検体におけるレプチン濃度とBMI、臨床学的悪性度との関係、さらにアディポネクチンやレジスチンなどに関しても同様の検討を行う予定である。次年度使用額は、当初計画していたレプチン持続投与ラットモデルでの検討を次年度に延期することによって生じたものであり、延期したレプチン持続投与ラットモデルでの検討に必要な経費として平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。
石灰質有孔虫のバイオミネラリゼーションの細胞生物学的解明

バイオミネラリゼーションは生物が硬組織を沈着する生物過程である.本研究では海洋の主要な炭酸塩生産者である有孔虫類の石灰化過程について細胞生物学的な解明を目指した.多重染色実験系が確立したカルシウム,pHに加え,マグネシウム,ミトコンドリア,ゴルジ体などを組み合わせた観察を実施した.石灰化中のミトコンドリアプローブの観察など実施した.ラマン顕微鏡の導入によって,生体内で進行する石灰化過程にある結晶を鉱物学的観点から観察ができるようになった点は画期的である.バイオミネラリゼーションは生物が硬組織を沈着する生物過程である.本研究では海洋の主要な炭酸塩生産者である有孔虫類の石灰化過程について細胞生物学的な解明を目指した.多重染色実験系が確立したカルシウム,pHに加え,マグネシウム,ミトコンドリア,ゴルジ体などを組み合わせた観察を実施した.石灰化中のミトコンドリアプローブの観察など実施した.ラマン顕微鏡の導入によって,生体内で進行する石灰化過程にある結晶を鉱物学的観点から観察ができるようになった点は画期的である.本年は海洋の主要な炭酸塩生産者の一つである有孔虫の細胞内pHと、環境のpHの環境に着目し実験を実施した。浮遊性有孔虫を海水のpHが低下したとき、細胞内のpHがどのような影響を被るかを検討した。海水のpH条件を7.5,7.9,8.1の三条件とし、pH変動を蛍光で示すHPTSという試薬を取り込ませて観察した。その結果、意外なことに細胞内のpHは類似の傾向であった。すなわち、周囲のpH条件によらず石灰化中の細胞内のpHは9前後まで高まっていた。一方で、別の実験で殻の成長を比較したところ、pH条件が低いほど、期間中に付加したチャンバーの数や、一つ一つのチャンバーの大きさに違いが見られ、pHが低いほど殻が小さくなる傾向が見られた。有孔虫細胞内の環境を保つために、より多くのエネルギーを費やしており、そのため成長に差が出ることが示唆される。現在国際的な社会問題となっている海洋酸性化がこのまま進行すると、有孔虫の成長、ひいては生産量に大きな影響が出ることも懸念される。本成果は国内外の学会で発表し、大変高く評価された。また、新規にラマン分光顕微鏡を導入した。これによって有孔虫類が石灰化する際に、微細な部位で結晶化がどのように進行するか具に観察することができるようになる。本年は震災の影響もあり納品が遅れたが、来年度から他の分析法と組み合わせ、石灰化過程の解明に供する。本年は海洋の主要な炭酸塩生産者の一つである有孔虫を使って、石灰化時の細胞内小器官(ミトコンドリアおよび細胞内骨格)と細胞内のカルシウム、マグネシウムの局在、pHの分布を観察した。カルシウムとpHについては同時観察ができるようになった。これによって有孔虫細胞が石灰化時のどのタイミングでカルシウムを取り込み、pHを変化させるのかを組み合わせて観察ができるようになった。その結果、従来の観察ではわからなかった、細かい順序が見えるようになり、従前の考察とは異なった新しい知見が得られた。有孔虫類は石灰化時にい型となる有機膜を展開する。個々に石灰化が始まるのであるが、その時pHが上昇するが、細胞内部から供給されるカルシウムは限定的であった。ある程度殻の形が格好になってくると、細胞内部のカルシウム濃度が増し、細胞の内外を活発に移動し始める。特に殻の外側に移動する様子がはっきりと見て取れた。このような機序については未だ知られておらず、大変重要な結果が得られたと考えている。また、マグネシウムの観察からも興味深いことがわかってきた。有孔虫殻のマグネシウム含有量は過去の水温計として利用されている。このマグネシウムがどのように殻に取り込まれるかは多くの研究者の興味となっている。観察の結果、細胞内のマグネシウムの分布はカルシウムと全く異なっていた。いつ、どのタイミングで取込みが起こっているかを明確にすることが今後の課題である。昨年度導入したラマン分光顕微鏡を用いた観察では、まずは化石有孔虫を用いて殻内の微小領域(1マイクロメートルオーダー)における結晶系の違いについて定性的な分析に成功した。あわせて、TEMを使った細胞生物学的解析を推し進めるため、凍結置換処理法の有用性を確認した。バイオミネラリゼーションは生物が硬組織を沈着する生物過程である.本研究では海洋の主要な炭酸塩生産者である有孔虫類の石灰化過程について細胞生物学的な解明を目指した.本年度までに,多重染色実験系が確立したカルシウム,pHに加え,マグネシウム,ミトコンドリア,ゴルジ体などを組み合わせた観察をこころみた.石灰化中のミトコンドリアプローブの観察など実施した.今後さらに詳細な議論をするためには透過型電子顕微鏡観察との組み合わせが不可避であるとの感触を得た.ラマン顕微鏡の導入によって,生体内で進行する石灰化過程にある結晶を鉱物学的観点から観察ができるようになった点は画期的である.得られた成果について.EGU(2012年4月), JpGU(2012年5月),ASLO(2012年6月)などの国内外学会で口頭発表を行ったほか,研究代表者が組織委員会に参加したLiving foraminifera field workshop (2012年7月,沖縄・横須賀)で詳細を報告し議論し,関連研究者から高く評価された.

また,日本地球惑星科学連合のレター(JGL)において,研究内容を紹介した.国際誌への投稿を準備している.研究の進捗については,海洋研究開発機構の各種対外向けイベントの場面でポスター紹介に取り上げられたり,機構研究チームのwebページを始め,自身のツィッター,Facebookなどでインターネットを介してタイムリーに報告し,広く社会に還元することに務めた.震災の影響で遅れも心配されたが、研究支援者を雇入れ、効率的にデータを取得することが出来る体制を構築することができたため、概ね順調に進展していると考えられる。今後も目的に向けて研究を推進する。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究は計画通り遂行している。特に実験について順調に進んでいる。本研究計画事業についての研究体制の構築は完了しており、今後もこのペースで研究を推進する。論文として成果を報告するため、執筆上必要な論文校閲などを活用する。
機能性ヒトリコンビナントミニコラーゲン開発の基礎的研究

ミニコラーゲンcDNAを設計し,哺乳動物細胞に遺伝子導入,得られた蛋白は温度安定性もあり,蛋白を培養フラスコに塗布し,培養軟骨細胞,骨芽細胞様細胞を培養すると増殖能が優位に増加した.培養軟骨細胞をMicromass culture法にて軟骨塊を形成させると,塗布したフラスコで培養した細胞は,軟骨塊の直径が約2倍となった.蛋白の凍結乾燥で黄白色の線維状ミニコラーゲンが得られ, h-BMPのDDSとして使用すると,異所性骨化が確認された.機能性ヒトリコンビナントミニコラーゲンは再生医療のスキャフォールドとして有用であることが示された.ミニコラーゲンcDNAを設計し,哺乳動物細胞に遺伝子導入,得られた蛋白は温度安定性もあり,蛋白を培養フラスコに塗布し,培養軟骨細胞,骨芽細胞様細胞を培養すると増殖能が優位に増加した.培養軟骨細胞をMicromass culture法にて軟骨塊を形成させると,塗布したフラスコで培養した細胞は,軟骨塊の直径が約2倍となった.蛋白の凍結乾燥で黄白色の線維状ミニコラーゲンが得られ, h-BMPのDDSとして使用すると,異所性骨化が確認された.機能性ヒトリコンビナントミニコラーゲンは再生医療のスキャフォールドとして有用であることが示された.ヒトtype I procollagen遺伝子のcDNAからサブクローニングしたcDNAカセットの作製、三本鎖の一連のD-periodsを限定する4.4ブロックの234アミノ酸と78アミノ酸の二つ(D2,D3)を欠損させた新規のリコンビナントtypeI procollagenhomotrimer cDNA(ミニリコンビナントtype I procollagen cDNA)を作製した.次年度はN末端,C末端プロペプチドの切断酵素の検討,テロペプチド消化の検討,再生医療スキャフォールドとしての形態,微細構造解析,賦形化の検討を行い,行う予定である.前年度に作製し,最も温度安定性の高かった(2)N-telopeptidepropeptide, D1, D4, D4, D4, D4.4, C-telopeptidepropeptideをSW-1353 chondrosarcoma cellに遺伝子導入,遺伝子強制発現させた.スクリーニングで選択された強発現細胞のcell factoryシステムによる大量培養を行い,培養上清を回収した.培養上清中のフィブロネクチン,IV型コラーゲンを除去するためカラム精製を行い,リコンビナント蛋白を回収,酢酸緩衝溶液に溶解,C-proteinase, N-proteinase,ペプシン処理後,凍結乾燥した.凍結乾燥処理時間が24時間では黄白色の線維状ミニコラーゲンを,48時間以上行うと線維状からパウダー状へと容易に崩壊した.黄白色の線維状ミニコラーゲンを走査型電子顕微鏡にて観察すると,コラーゲン細線維がネットワークと一部不規則なハニカム構造が観察された.ヒトリコンビナントbone morphogeneticprotein (BMP)のドラッグデリバリーシステム(DDS)として,黄白色の線維状ミニコラーゲンとパウダー状ミニコラーゲンを使用,ポジティブDDSコントロールとしてゼラチンカプセル,ネガティブコントロールとしてゼラチンカプセルのみを使用した.ヌードマウス大腿筋膜下へそれぞれ移植したところ,術後2週間で,BMP5μg+黄白色の線維状ミニコラーゲン,BMP5μg+パウダー状ミニコラーゲン,BMP5μg+ゼラチンカプセルで異所性骨化が確認された.骨形成量はBMP5μg+黄白色の線維状ミニコラーゲン,BMP5μg+パウダー状ミニコラーゲンがともに良好であったが,パウダー状ミニコラーゲンでは骨が分散する傾向が認められた.今回作製した機能性ヒトリコンビナントミニコラーゲンは再生医療のスキャフォールドとして有用であることが示された.