hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロラクチン研究の新展開：その起源と多機能化をもたらした要因の解明

本研究は、水電解質代謝や生殖活動を含めて300以上もの生物学的機能が知られる多機能ホルモン、プロラクチン(PRL)の起源と進化を理解することを目的としている。軟骨魚類においてすでにPRLとその受容体が存在することを明らかにし、その作用が脳下垂体における傍分泌作用であることも見出した。また、両生類のウシガエルでは、魚類PRLのオルソログであるPRL1Bが幼生期に、四肢動物PRLのオルソログであるPRL1Aが変態最盛期以降に高い発現を示し、分子進化と機能の進化との間の関連が示唆された。特異的な抗体やイムノアッセイなどの実験系も確立し、ノックアウト系統の作出も進めている。我々は2015年にゾウギンザメの研究から、初めて軟骨魚類にもプロラクチン(PRL)が存在することを発見した。しかしながらゾウギンザメのゲノムからはプロラクチン受容体と考えられる遺伝子を発見できなかった。プロラクチンは真骨魚類において淡水適応に重要な役割を果たすことが知られているため、サメ類でほぼ唯一淡水環境にも適応できる広塩性種であるオオメジロザメに注目した。RNAseqを行った結果、脳下垂体からゾウギンザメと同様PRL1の発現が確認された。また、やはり脳下垂体のRNAseqからPRL受容体と考えられる遺伝子も発見された。PRL産生細胞は脳下垂体前葉端部に存在し、その数はゾウギンザメと比べて明らかに多かった。PRL受容体の発現は脳下垂体で最も高く、腎臓でも発現が検出された。成長ホルモンの受容体は別に存在したため、この受容体がPRL受容体である可能性は極めて高い。in situ hybridizationにより、脳下垂体でのPRL受容体の発現は、PRL産生細胞あるいはその近傍の細胞であることもわかった。真骨魚類のティラピアでもPRL細胞に受容体が発現し、自己分泌作用を持つことが近年報告された。オオメジロザメでも同様の作用を持つ可能性が考えられる。一方で、腎臓ではin situ hybridizationが成功しておらず、腎臓における作用は今後の課題である。また、予備的ではあるが、円口類にもプロラクチンが存在する可能性も見出している。両生類においては、魚類型と四肢動物型の2つのプロラクチンの存在を確認できた。これら2つのプロラクチン遺伝子が、幼生期から脳下垂体で発現していることもわかり、それぞれの発現部位と発現量の変化を現在調べているところである。軟骨魚類に関しては、広塩性のオオメジロザメをモデルとすることで、軟骨魚類で初めてプロラクチン受容体を発見し、脳下垂体においてプロラクチンの自己分泌あるいは近傍に存在する細胞への傍分泌作用を持つことを見出すことができた。軟骨魚類の比較ゲノム解析によって、他の軟骨魚にもプロラクチンとその受容体が存在するであろうこともわかりつつある。また、予備的ではあるが、円口類にもプロラクチンが存在する可能性を見出しており、プロラクチンの起源と進化については当初の計画以上に進んでいる。一方で、プロラクチン受容体が腎臓でも発現しているが、その発現部位についてはまだ明らかにできていない。また、プロラクチンタンパク質生成についても進行中であり、機能解析という点では若干当初の計画よりも遅れている部分もある。それゆえ、全体としてはおおむね順調に進展している。本年度は、軟骨魚類におけるプロラクチン受容体の発現分布、プロラクチン遺伝子の進化、両生類におけるプロラクチンとその受容体、について研究を進めた。昨年度に軟骨魚類で初めてオオメジロザメから見出したのに続き、トラザメのゲノムシーケンス、RNAseqによりプロラクチン受容体を見出し、その発現がオオメジロザメと同様に脳下垂体と腎臓のみであることもわかった。脳下垂体では、内部に存在する脳室様構造を裏打ちする上皮細胞あるいはその近傍にホルモン産生細胞ならびに受容体発現細胞が存在し、脳下垂体内部でパラクリン様の機能を持つこと、他の魚類とはその機能が大きく異なることが示唆された。進化に関しては、一部のヤツメウナギでもプロラクチン様の遺伝子を発見した。これまで、円口類には成長ホルモンのみが存在し、プロラクチンやソマトラクチンなどのファミリー内の遺伝子重複と分化は真骨魚類以降に起こったと考えられていた。軟骨魚類に存在しただけでなく、円口類ですでに重複と分化が起こり、円口類ではその後多くの種で遺伝子を失ったと考えられる。両生類については、ウシガエルPRL1Bの全長配列を取得し、発現解析を行った。成体では1Aだけが下垂体前葉のみで発現し、幼生では1Aと1Bの両方が脳下垂体前葉で発現していた。1Bの発現は前変態期や変態始動期で高く、変態最盛期には低値となり、幼生型と成体型という我々の仮説を支持する結果であった。これらの結果は、特異的抗体を用いる免疫組織化学によりタンパク質レベルでも確認された。抗原ペプチドまたは抗体をユーロピウムで標識し、競合法またはサンドイッチ法による免疫測定系の開発も進めた。ウシガエルPRL1AのRIAに近い感度の測定系が確立でき、変態期に注目して血中濃度の測定を行っている。

また、両生類のウシガエルでは、魚類PRLのオルソログであるPRL1Bが幼生期に、四肢動物PRLのオルソログであるPRL1Aが変態最盛期以降に高い発現を示し、分子進化と機能の進化との間の関連が示唆された。特異的な抗体やイムノアッセイなどの実験系も確立し、ノックアウト系統の作出も進めている。プロラクチンタンパク質の生成、抗体の作製、ならびにノックアウト系統の作製を進める。また、28年度は軟骨魚類で希少な広塩性種であるオオメジロザメを用いることで、初めてプロラクチン受容体を発見できた。また、狭塩性のゾウギンザメと比較して、オオメジロザメの下垂体でのプロラクチン産生細胞は明らかに多かった。そこで、29年度にはさらに希少な淡水生軟骨魚類である淡水エイを対象に加えることで、真骨魚類でプロラクチンの最も重要な機能である淡水適応に、軟骨魚類のプロラクチンも関わるのかどうかを検討する。淡水エイを調べることによって、末梢器官でのプロラクチンの役割を明らかにできるのではないかと期待している。また、円口類に本当にプロラクチンが存在するのかどうかについても、引き続き検討を進め、プロラクチンの起源と多機能化の過程を明らかにしていく。魚類生理学、比較内分泌学次世代シーケンサーによるRNAseq解析を行い、中間データを得たものの、開始できた時期が予定よりも遅かったために、最終データが得られておらず薬品類の支払が29年度にずれ込むこととなった。また、プロラクチン生成後の抗体作製を予定していたが、まだ抗体の作製に至っていないため。RNAseqについては29年度の早い時期に最終データが得られる予定であり、速やかに物品費として支出する。29年度には、抗体作製を行う予定。
染色体維持・伝達におけるヘテロクロマチンを構成する3種類のHP1の役割分担

遺伝情報を担う染色体上の重要な構造としてDNAが密に折りたたまれて凝縮しているヘテロクロマチンが知られています。このヘテロクロマチンの構成タンパク質であるHP1にはよく似た三種類(a、b、g)があり、それぞれ異なる機能を発揮しています。本研究によりそれぞれのHP1に結合するタンパク質を同定したところ、1)多くのタンパク質が同じ様式でHP1に結合している事、2)HP1と結合タンパク質との働きを制御するPOGZというタンパク質が存在すること、3)全てのHP1に結合するタンパク質、それぞれのHP1にのみ結合するタンパク質が存在する事、を明らかにしました。本研究課題は、プロテオミクスを用いた蛋白質の網羅的な同定、定量技術を交えてヘテロクロマチンの構成因子として知られているHP1結合蛋白質を解析し、α、β、γのそれぞれのサブタイプが、1)どの因子と、2)細胞周期のどの時期に、3)染色体上のどの領域において、相互作用しているかを網羅的に明らかにすることにより、その結果を基軸としてHP1が染色体の維持・伝達において如何に寄与しているかについて、ヒト培養細胞を用いてアプローチするものである。本年度は、HP1がどのような因子と結合しているのかについて、HP1の変異と定量プロテオミクスによる解析を行った。具体的には、Flagタグした野生型、変異HP1αの発現を誘導できるヒト293細胞株を樹立し、Flag抗体による免疫沈降を行った。免疫沈降産物をプロテオミクスを用いて解析したところ、Mis12、CAF1、KAP1に加えて、Aurora B、BorealinなどCPC複合体の構成因子やPOGOなど新規HP1結合因子を含む60種類以上のタンパク質を同定した。同定した全てのHP1結合因子はCSDに結合し、HP1のダイマー形成が必要であることが示唆された。CAF1やKAP1などの多くの因子はHP1結合コンセンサスを介してHP1と結合しており、HP1のダイマー形成により生じる疎水ポケットの形成に必要なアミノ酸の変異により結合できなくなる。しかしながら、この変異に影響を受けないPOGOなど数種類の因子が存在することが明らかとなり、疎水ポケットを介さない新たな結合様式の存在が示唆された。また、ある種のヒストン修飾酵素などは、ヒストンH3のテールの認識と結合に関与しているCDのアミノ酸の変異に影響を受けた。このことから、CSDだけでなくCDもHP1と相互作用因子との結合様式に何らかの関わりがあることが示唆された。昨年度までに、新規HP1結合因子を含む85種類以上のタンパク質を同定した。85種類のHP1結合蛋白質のうち21種類はKRABdomainをもつzincfinger蛋白質であったことから、HP1を基点としたKRAB-zincfinger蛋白質ネットワークの存在が示唆された。KRAB-ZNFタンパク質の1つZNF483について相互作用因子の網羅的な同定を試みたところ、HP1に結合するコリプレッサーであるTIF1βが効率よく検出されたが、一方で、ZNF483以外のKRAB-ZNFタンパク質およびHP1は同定されなかった。逆に、FLAGタグしたTIF1βを安定発現するヒト293細胞を樹立し、免疫沈降を行ったとごろ、HP1と結合しているものを含む約40種類のKRAB-ZNFタンパク質が同定された。また、HP1も効率よく共精製されていることがわかった。これらの結果より、HP1には多種類のKRAB-ZNFタンパク質が結合するが、KRAB-ZNFタンパク質問できは相互作用しないこと、そしてTIF1βに複数のKRAB-ZNFタンパク質が同時に結合するのではなく、それぞれのKRAB-ZNFタンパク質とTIF1βとが1対1で相互作用していることが示唆された。また、TIF1βは多くの種類のKRAB-ZNFタンパク質と相互作用していることがわかった。このことからHP1と多数のKRAB-ZNFタンパク質の相互作用は直接的ではなくHP1と結合するTIF1βを介して行われていることがわかった。HP1は、TIF1βのように多種類のタンパク質と結合することができるタンパク質と直接結合することにより、HP1自身の局在や機能に多様性を付加しているものと考えられた。さらに、HP1の3つのサブタイプ特異的な結合因子を探索するために、HP1βとHP1γについて初年度HP1αと同様に様々な変異蛋白質を発現する細胞株を構築した。昨年度までに、HP1α結合因子を約100の同定し、そのうち21種類がKRAB domainをもつzincfinger(KRAB-ZNF)タンパク質であった。当該年度は、HP1βとHP1γについても結合因子を同定したところ、HP1αと同様にそれぞれ100種類以上の結合タンパク質を見いだした。

そのうち、50種類は全てのサブタイプに共通の因子であったが、残りの50種類については、それぞれの因子特異的あるいは、3種類のうち2種類に特異的に結合する因子であることが分かった。このサブタイプによる結合因子の違いがそれぞれのサブタイプの局在あるいは機能の違いに貢献していることが強く示唆された。興味深いことに、HP1βには、DNA複製に関与するポリメラーゼ複合体、ヒストンシャペロン、クロマチンリモデリング複合体が見いだされ、HP1αあるいはHP1γとの機能の違いが示唆された。また、KRAB-ZNFタンパク質は、その種類によって結合するサブタイプが異なることが明らかとなった。KRAB-ZNFタンパク質はTIF1βを介してHP1と結合することが知られている。当該年度の解析により、HP1とTIF1βとの結合にはHP1のサブタイプによる特異性がないこと、TIF1βとKRAB-ZNFタンパク質との結合にもKRAB-ZNFタンパク質の種類による特異性がないことが明らかとなった。これらのことから、それぞれの種類のKRAB-ZNFタンパク質はTIF1βと複合体形成することにより、結合するHP1のサブタイプへの特異性を獲得することが示唆された。これらの知見は、3種類のHP1が如何にそれぞれ異なる機能を獲得しているのかを解明する手がかりになると思われる。
新奇な熱電材料設計：ナノサイズ格子の原子配置ランダム化による移動度向上機構の検討

本研究では、ナノサイズのカゴ状構造を有するBa-Ga-Snクラスレート半導体において、ホスト格子を形成するIII族元素とIV族元素の配置がランダムであるにも関わらず熱電材料として高い可能性を有することに注目し、更にランダム性が増すような元素置換をすることで、熱電性能の向上を行う可能性について検討した。具体的にはゲスト原子のダブル置換およびホスト原子のダブル置換をそれぞれ行い、理論的に電子構造計算および計算されたバンド構造を用いた熱電性能解析を行った。また、実験的には、理論的に熱電性能の向上が期待される物質に対して、材料合成および熱電特性測定を行った。H24年度は1)カゴ状物質でタイプVIII構造を持つ4元系クラスレートBa-Ga-Sn系について、実験において観測されているGe置換による熱電性能の向上と混晶化の関連性を調べるため、Ge置換による熱電性能変化の機構について輸送解析を行い検討を行った。また、ホストサイトにおける2)ランダムポテンシャルの効果を調べるため、ホストサイト原子の配置について引き続き検討を行った。具体的に、1)については、Ge原子がクラスレート構造のホストサイトの一部を置換することが予想されている。しかし、Ge原子がクラスレート構造内のどのホストサイトに入るかは明確になっていなかった。このため、まず、電子構造計算を進めるにあたり、Ga-Ge-Snがどのように配置するかを、全エネルギーの計算により調べた。この結果、タイプVIII構造に存在する4種類のホストサイトのなかで、Ga原子の場合と同様に2aサイトおよび、8cサイトに占有されやすいことが分かった。また、Ge原子はSn原子のサイトを置換することを反映し、三元系であるBa-Ga-Snにおいて、Gaサイトへの影響は小さくSnサイトをGeに置換するモデルが実験結果と整合性が高い結果が得られることが分かった。この、配置モデルに基づき、バンド構造を行い、熱電物性評価を行った。焼結体では、Ge置換により、Seebeck係数が大きく変化することが示されているが、計算では、Seebeck係数への影響が小さいことが分かった。2)については、従来の原子間モデルを改善し、長距離相互作用を考慮した配置モデルによる計算手法の開発を行った。本研究ではカゴ状構造を持つクラスレート半導体Ba-Ga-Sn系に注目し、その熱電構成能化の検討をホストサイトのランダム性に注目し検討を進めてきた。H25年度はこの系の熱電特性と強い相関を持つGa配置において分布のゆらぎの検討を進めた。これまでに、このゆらぎの検討はGa間の最近接モデルにより検討行っている。クラスレート半導体ではホストサイトにGa/Snが同程度に近い比率で混在する。一方、Gaイオンは隣接することを嫌い、互いに避け合う傾向を持つ。このため、Ga分布ゆらぎが強く抑制されている可能性を検討したが、ほとんど抑制されていない結果となった。このことに基づき、更にモデルの精度を高めるため、イオンモデルによるクラスレート半導体Ba-Ga-Sn系におけるホスト構造の計算を行った。まずは、このイオンモデルに必要なパラメータについては、第一原理電子構造計算手法を用い決定した。イオン間の相互作用については、周りのイオンによるスクリーニングの効果を取り入れた誘電率を計算し、それを用いた。短距離相互作用に起因するパラメータは全エネルギーから算出した。構築されたイオンモデルを用い、ホスト構造に対するシミュレーションを行った。計算には熱平衡を仮定したモンテカルロ法を用い、融点付近の温度を平衡温度した。この計算結果からまずは単位格子スケールでGa分布ゆらぎの大きさを見積もったところ、完全なランダム配置の場合や最近接モデルの場合と比べゆらぎが強く抑制され、長距離相互作用がホスト構造に大きく影響を及ぼしていることが明らかになった。更に大きなスケールでは、Ga分布に対する粗視化スケールの長波長極限でゆらぎが消失することを見いだした。このことは、この系の熱電性能の高性能化と強く関連することが期待される。平成23年度は混晶系の電子構造探査を主体に研究を進めることとした。クラスレートでは、ホストサイドでIV族/III族の混晶化が必要であり、スーパーセルのアプローチと仮想結晶近似のアプローチで進めた。スーパセルのアプローチではダブル置換に対する元素配置を決める必要がある。これについて妥当なモデルの選定とモデルによる配置計算を進めた。一方で、ダブル置換がバンド構造におよぼす影響の特徴をつかむため、スーパーセルと仮想結晶近似のハイブリッド的な方法を用い、Al/Gaダブル置換による効果を確認した。また、ゲスト系に対するダブル置換効果の計算も行った。具体的な結果について、以下に示す。ホストサイトのIII族/IV族配置について、タイプI構造およびタイプVIII構造に対する配置をIII族元素間の最近接相互作用モデルを用いて計算した。ここでは、各サイトにおけるIII族占有とIV族占有に対する占有エネルギー差およびIII族元素の最近接相互作用の大きさを第一原理計算による計算結果から見積もった。現在モデルの構築段階にあり、ホストサイトに対しては2元系での配置を調べた。

2元系では最近接相互作用モデルである程度実験と整合性のある結果が得られ、最近接相互作用モデルの有効性が確認された。更に、占有エネルギーの一部をパラメータとして変化させた場合、変化させたサイトのみならず全体の配置があるパラメーター値で大きく変化し、ホスト元素の種類により配置が大きく換わる可能性を示唆する結果が得られた。電子構造計算については、Ba-Al-Ga-Sn系について計算を行った。計算ではIII族配置により大きくバンド構造が変化する結果となっている。しかし、Ba-Ga-Sn系では構造緩和によりバンドギャップなどの違いが小さくなる傾向が得られた経緯があり、更なる計算が必要である。今年度予定していた、4元系クラスレート系の熱電物性評価については、予定通り進んでいる。一方、ポテンシャル評価については予定より遅れているが、時間のかかっていた原子間ポテンシャル評価の目処が立ち、今後順調に進展する予定。ダブル置換系の原子配置について、計算に必要なデーター取得に時間がかかっている。今後の研究については、実験研究と理論研究の相互連携をはかり、未解決課題の確認とそれに対する対応を進め、研究目的の達成に向けた取り組みを行う。III族配置については、当初予想していなかった振る舞いが現れるなど、配置モデルの決定の重要性が増している。このため、引き続き検討を進める。また、電子構造に加え、散乱機構について検討を進める。熱電国際会議など熱電分野での主要学会での参加費用および計算規模の拡大に対処するための計算環境強化を研究進捗に応じ行う。計算サーバートラブルにより、計算環境の強化を行った。これにより、当初予定していたストレージ系の導入を延期し、H24年度予算と合算し導入する。
放射線応答における細胞内小器官のシナジー効果

本研究の目的は、細胞内小器官の間に放射線ストレス応答に関する協調(シナジー)効果があるかどうかを探ることにある。私たちはATP生産を担うミトコンドリアに着目し、その動態変化をライブセルイメージングにより追跡する手法を確立した。さらに放射光X線マイクロビームを利用して細胞の部分照射を行った後、その活性部位の変化を観察した。その結果、細胞質のみに照射することで遅延的な活性部位の増加が生じることを見出したが、核が照射されることでこれが阻害された。以上の結果は、細胞小器官の間に、放射線ヒットの情報を伝達するシナジー効果が存在することを示唆している。本年度はATP生産の要であるミトコンドリアの形態や機能の放射線照射による変化を追跡するための実験手法の確立を目指した。動物培養細胞をX線照射した後に、ミトコンドリアを特異的に染色する蛍光試薬で処理することで、顕微鏡下で培養しながら継時観察するための条件を検討した。また、得られたミトコンドリア動態の変化を解析する方法の検討も行った。ミトコンドリアを特異的に赤に染色する試薬であるMitotracker Redを用いた断片化の観察に加え、ミトコンドリア膜電位に依存して蛍光色が変わるJC-1も利用することで活性部位の位置の変化も観察した。ヒトやマウスの正常細胞に対して照射し、24時間ごとにミトコンドリアの断片化を観察するとともに、膜電位を250秒間タイムラプス観察し動画を作成した。得られた動画像を元に、ミトコンドリア活性部位(膜電位が高い部位)の移動速度を数値化することで動態変化の解析も行った。照射すると細胞周期が停止した上でミトコンドリアの断片化が起こること、さらに活性部位は照射後24時間から48時間にかけて空間位置を大きく変える現象があることが明らかになった。これらの成果は国際会議(HITSRS2013、千葉)で発表し、またミトコンドリアの断片化などの構造変化の知見については、マイクロドジメトリーの国際会議(MICROS2013,イタリア)において発表しProceedings(査読付き論文)として投稿中である。本年度検討した実験条件を元に、次年度はX線マイクロビーム照射による細胞質あるいは細胞核のみの部分照射による効果のライブセル観察を行う。昨年度は、細胞内小器官の中でも特にATP生産を担うミトコンドリアに着目し、これを特異的に蛍光染色した上で、ヒトやマウスの細胞全体に通常のX線を照射した後のミトコンドリア動態変化を、ライブセルイメージングにより追跡する手法を確立した。その成果は、本年度になって査読付き論文(Noguchi et al. Radiation Protection Dosimetry)として受理された。さらに放射光X線マイクロビームを利用して、ミトコンドリアが存在する細胞質のみ、あるいは細胞核のみ、さらには細胞全体を照射する実験を、KEK・PFのBL-27Bを利用して実施した。ヒト繊維芽細胞(BJ1 hTERT Fucci)へ6Gy相当のX線マイクロビームを照射した後、ミトコンドリア活性の指標となる膜電位に依存して異なる蛍光を発色する試薬を用いてミトコンドリアを特異的に染色することで、照射によるその動態変化のタイムラプス観察を行った。その結果、細胞核照射及び細胞全体照射では、照射後24時間の観察時間内では、活性部位の面積はコントロールとの差はなかった。一方細胞質照射では、活性部位の面積の優位な増加が起こり、照射後24時間に遅延的なミトコンドリアの活性化が引き起こされることが示唆された。以上の結果から、核が照射されDNAが損傷を受けることで、ミトコンドリア活性を抑える何らかのシグナルが核からミトコンドリアへ伝達された可能性が示された。ミトコンドリアの照射によって引き起こされる二次的な事象が、細胞核やその他の細胞小器官に放射線ヒットの情報を伝達するシナジー効果が存在することを示唆する結果を得ることができた。放射線生物物理学JC-1染色した細胞内ミトコンドリアは、連続観察を行うと次第に退色して行くため、観察時間や観察時の露光量などの検討に多くの時間を割いた。ミトコンドリアそれ自体が数分の間に激しく運動すると共に、膜電位の高い部位もミトコンドリア上をスライドする現象が見られた。これらのミトコンドリアのダイナミックな変化を観察するために、現状での最適条件として、照射後一定時間毎に250秒間の観察を行い、観察の直前に蛍光試薬を加えることとした。当初の計画通り観察条件が整い、順調に研究が進展していると判断した。本年度検討した最適な実験の条件により、次年度は放射光X線マイクロビームの照射実験への移行する。

実験を行う放射光施設である高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーには、連続して継時観察するための顕微装置が整備されていない。そこで、本年度使用した蛍光顕微鏡をフォトンファクトリーに移設して実験を行う予定である。その際にマイクロビーム照射用顕微ステージと観察用蛍光顕微鏡の細胞位置座標を同期する必要がある。両顕微装置の間で位置決めが精度よく行うための、照射用細胞ディッシュホルダーを新たに開発する予定である。
プロテインキナーゼCの時空間シグナリング機構(ターゲティング機構)の解明

PKCの多彩な機能は、10種類以上のサブタイプが各々独自の機能を種々の細胞内で発揮するためと考えられているが、「どのサブタイプが、どこで」、「どのような機序で」、「どの細胞機能に」関与しているかは未だ明らかではない。我々は、GFP融合PKCを用いた検討により、PKCには種々に刺激に応じて異なる蛋白質へターゲットする機構(ターゲティング機構)があることも報告し、このターゲティング機構が神経可塑性においても重要であることを示唆してきた。本年度の研究において種々のPKCターゲティング機構における分子メカニズムについて解析した。その結果、1)脂質メッセンジャーであるアラキドン酸およびセラミドはPKCepsilonおよびPKCdeltaのC1Bドメインに作用し、サブタイプ特異的にゴルジ体にトランスロケーションさせること、2)deltaPKCは、セラミドの刺激によって特異的にゴルジ体にターゲティングし、同時にチロシンリン酸化によって活性化されること、つまり、このセラミドによるdeltaPKCの活性化機構は、ホルボールエステルにより細胞膜へのトランスロケーションを伴う活性化機構とは全く異なっており、それにより導かれる細胞応答も異なっていること、3)deltaPKCの細胞膜へのターゲティングにより細胞死が誘導されるが、その機構においてdeltaPKCの活性化は不要であること、4)siRNAにより種特異的にPKCサブタイプをノックダウンすることが可能となったこと、5)マクロファージによるドン食作用におけるPKCepsilonの作用について、報告した。これらの結果より、酵素の活性化とは関係なくPKCターゲティングが生理機能をもつこと、および、このPKCのターゲティングがPKCの多岐にわたる機能の分子基盤になっていることを示唆した。さらに、GFP標識した各PKCサブタイプを脳部位特異的、時期特異的に発現可能なトランスジェニックマウスを作成し、各脳部位でのPKCのターゲティングと電気生理現象の関連を解析を可能とした。生組織におけるPKCターゲティングは培養細胞において観察されたものと異なっていることから、PKCの機能を解明するためには、生組織を用いたより生理的な条件下でのPKCターゲティングの検討が必要であることが示唆された。PKCの多彩な機能発現の基礎となっているPKCサブタイプのターゲティング機構を解明し、巧妙に調節された細胞内伝達の分子メカニズムを明らかにすることを目的とし、研究を行い、以下のような結果を得た。1)deltaPKCは、セラミドの刺激によって特異的にゴルジ体にターゲティングし、同時にチロシンリン酸化によって活性化されることを示した。このセラミドによるdeltaPKCの活性化機構は、ホルボールエステルにより細胞膜へのトランスロケーションを伴う活性化機構とは全く異なっており、それにより導かれる細胞応答も異なっていた。つまり、HeLa細胞においては、セラミドは細胞のアポトーシスを引き起こすのに対して、ホルボールエステルはG2/M期での停止を起こした。2)アラキドン酸によりepsilonPKCはゴルジ体へのトランスロケーションするが、deltaPKCはトランスロケーションしない。このトランスロケーションには、epsilonPKCのC1Bドメインが必須である。また、セラミドによっては両サブタイプがゴルジ体にトランスロケーションするが、この現象には両サブタイプのC1Bドメインが重要である。3)DGKがPKCのターゲティングのスイッチオフに深く関与し、免疫沈降法やFRETを用いた解析によりDGKとPKCが直接結合することを見出した。

4)tTA-TetOpシステムを用いて、小脳プルキンエ細胞、海馬錐体細胞などにGFP標識各PKCサブタイプを発現誘導可能なマウスの作製に成功した。作製したGFP標識PKC発現トランスジェニックマウスの脳スライスを用いて、PKCターゲティングを観察した結果、脳スライスにおけるPKCターゲティングは、培養細胞あるいは初代培養神経細胞におけるターゲティングと異なっている事が明らかとなった。PKCの多彩な機能は、10種類以上のサブタイプが各々独自の機能を種々の細胞内で発揮するためと考えられているが、「どのサブタイプが、どこで」、「どのような機序で」、「どの細胞機能に」関与しているかは未だ明らかではない。我々は、GFP融合PKCを用いた検討により、PKCには種々に刺激に応じて異なる蛋白質へターゲットする機構(ターゲティング機構)があることも報告し、このターゲティング機構が神経可塑性においても重要であることを示唆してきた。本年度の研究において種々のPKCターゲティング機構における分子メカニズムについて解析した。その結果、1)脂質メッセンジャーであるアラキドン酸およびセラミドはPKCepsilonおよびPKCdeltaのC1Bドメインに作用し、サブタイプ特異的にゴルジ体にトランスロケーションさせること、2)deltaPKCの細胞膜へのターゲティングにより細胞死が誘導されるが、その機構においてdeltaPKCの活性化は不要であること、3)siRNAにより種特異的にPKCサブタイプをノックダウンすることが可能となったこと、4)マクロファージによるドン食作用におけるPKCepsilonの作用について、報告した。これらの結果より、酵素の活性化とは関係なくPKCターゲティングが生理機能をもつこと、および、このPKCのターゲティングがPKCの多岐にわたる機能の分子基盤になっていることを示唆した。さらに、GFP標識した各PKCサブタイプを脳部位特異的、時期特異的に発現可能なトランスジェニックマウスを作成し、各脳部位でのPKCのターゲティングと電気生理現象の関連を解析を可能とした。生組織におけるPKCターゲティングは培養細胞において観察されたものと異なっていることから、PKCの機能を解明するためには、生組織を用いたより生理的な条件下でのPKCターゲティングの検討が必要であることが示唆された。
サル下側頭葉皮質における視覚的物体認知表現機構についての光計測法による解析

下側頭葉皮質は物体認知に関わる中枢経路の最終段階に位置している。今までの研究で、下側頭葉皮質ニューロンは、中程度に複雑な図形特徴に応じること、また、よく似た図形特徴に応じるニューロンが集まってコラムを形成していることが示されている。普段目にしている物体にはさまざまな図形特徴が含まれるので、物体像は、下側頭葉皮質では、いくつかの異なる図形特徴に応じるコラムの活動の組み合わせによって表現されていると予想された。しかし、以前までの電気生理学的方法では、それを直接示すのは困難であった。本研究では、イメージングの手法を用いてこの問題にアプローチした。麻酔下のマカクサルにさまざまな視覚刺激を与えたときの下側頭葉皮質表面の神経活動を光計測法を用いて二次元的に記録し、その応答特性を検討した。具体的には、複雑な物体像を部分に分割し、複雑な物体像そのものやその一部分を取り除いたもの、あるいは部分の空間配置をかえたものを視覚刺激として用いた。光計測法の結果、物体の部分的な特徴に応答するコラムや、物体の全体的な形状に応答するコラムがあることが分かった。細胞外活動記録法により、コラム内のニューロンの応答特性を詳細に検討したところ、前者のタイプのコラムから記録したニューロンは物体の中にその特徴があるといつも応答した。従って、このようなコラムはある特定の図形特徴の存在を示すのに役立っていると考えられる。後者のタイプのコラムから記録したニューロンは、細かい形状や色には選択性が低いが、部分の配置に対する選択性が高かった。このようなコラムは物体像の部分と部分の空間的関係を表現するために必要なコラムであると考えられる。以上により、物体像は部分的な図形特徴を決める神経細胞群とその配置を決める神経細胞群の組み合わせにより表現されていることが示唆された。
ポリエチレングリコールを用いた機能性血中滞留形リポソームの開発

研究計画に基づき13の実験を行い、以下のような結果を得た。1.ポリエチレングリコール(PEG)リポソームの血中滞留性の最適化PEGとしては、分子量の異なる5種を用いた。PEGをリポソーム膜に導入するために、リン脂質誘導体とした。これら誘導体とリン脂質:CHよりリポソームを調製し、マウスに尾静脈投与して血液、肝臓、脾臓への分布を中心に調べた。特に、血中滞留量とその持続時間およびRES取り込み量を経時的に調べた。その結果、PC:CHリポソームではPEG5000が高い血中滞留性と低いRES取り込みを示した。DSPC:CHリポソームでは、低分子量のPEG1000またはPEG2000で高い血中滞留性を示した。いずれも、6mol%の付与量で、脂質組成により最適な分子量のPEGを選択する必要があった。PEGリポソームのRES回避は、マクロファージ取り込み回避であり、その結果血中滞留性が高くなることが明らかとなった。また、PEGリポソームのRES回避には、30nm以下のサイズであることが重要であった。このようにして、PEGリポソームの血中滞留性とRES回避性に対する最適条件を見い出すことが出来た。これを基礎とし、機能性血中滞留形リポソームの開発を行った。2.ドキソルビシン(DXR)封入徐放性PEGリポソームPEG1000:DSPC:CHリポソームにDXRを封入して、L1210担癌マウスに対する抗腫瘍効果を調べたところ、ほぼ完全な延命効果が認められた。これは血中滞留型リポソームから、DXRが徐放され、有効血中濃度を長時間維持した結果であった。コントロールのDSPC:CHリポソームでは、延命効果は観測されず、血中滞留性の効果は顕著であった。3.DXR封入温度感受性PEGリポソーム相転移温度41°CのDPPCを主構成成分とするリポソームにPEG1000を導入し、温度感受性血中滞留形リポソームを調製した。In vitroの放出実験において、41-43°Cで急激な内包DXRの放出が起こり温度応答特性を示した。マウス脚部に作成したcolon26固形癌部位を局所的に加温したところ、癌組織中のDXR濃度が、非加温時と比べると10倍ほど高くなった。また、コントロールの温度感受性リポソームと比較すると、癌組織中DXR濃度は、約3倍高かく、血中滞留化の効果が顕著に現れた。以上、申請時の研究計画を全て遂行できた。本実験結果は、次のテーマである、イムノ温度感受性長時間血中滞留型リポソームの開発に重要な知見を与えてくれる。
薬剤誘導性グレリン細胞腫瘍化マウスの作製-慢性薬理作用の解明と細胞株樹立

今回、作製を試みた薬剤誘導性のグレリン細胞腫瘍化マウスは、十分な発現レベルを得られず、グレリン細胞の腫瘍化を確認できなかった。しかし、従来から作製を試みてきた薬剤誘導性ではない、グレリン細胞腫瘍化マウスの作製に成功した。このマウスでは、最大で対照マウスの10倍程度の血中グレリン濃度の上昇を認めた。それに伴い、血清IGF-I値の上昇が認められ、血中グレリンの慢性的な上昇によりGH-IGF-I軸が刺激されたことが示唆された。今後、さらに細胞株の樹立を目指す。(1)コンストラクトの作製これまでの検討により、ヒトのグレリン遺伝子5'領域約4kbを用いた場合、少なくとも胃のグレリン細胞において遺伝子発現を誘導できることを確認していたため、遺伝子組換えにより、ヒトグレリンプロモーター約4kb下流にreverseテトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)を結合したコンストラクトを作成した(rtTa-Tg)。同時に、テトラサイクリン応答性因子(TRE)-CMVプロモーターの下流にSV40T抗原(Tag)を結合したコンストラクトを作成した(TRE-Tag Tg)。(2)マウスの作製C57BL6マウス受精卵へ精製したコンストラクトの断片をマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを作成した。トランスジーンの挿入の確認は、サザンブロット法により行った。結果、rtTa-Tgのファウンダーマウスを6匹、TRE-Tag Tgのファウンダーマウスを5匹得た。このうち、rtTa-Tgマウス2ライン、TRE-Tag-Tgマウス4ラインの交配繁殖に成功した。(3)ダブルトランスジェニックマウスの作製これらのマウスを繁殖し、ある程度増えたライン同士に関しては、rtTa-TgとTRE-Tag Tgの交配も開始し、一部ダブルトランスジェニックマウスの産出にも成功した。(3)ラインの選択これら、ダブルトランスジェニックマウスにドキシサイクリン負荷を開始している。血中グレリン濃度を指標として、腫瘍の発生を推し量る系の樹立を目指しているが、現在までのところ、明らかな、血中グレリン濃度の上昇は観察できていない。今後、さらにラインの組合せを変え、ドキシサイクリンの濃度、投与期間を調節することで、最適な組合せを見いだすことを目指す予定である。昨年度までに完成していた、rtTa-Tgマウス2ライン、TRE-Tag-Tgマウス4ラインを用いて、計8通りの組合せで、交配を行い、ダブルトランスジェニックマウスにドキシサイクリン負荷を行った。しかし、全ての組合せにおいて、胃グレリン細胞の増殖、血中グレリン濃度の上昇は認められなかった。ドキシサイクリン負荷により誘導されたSV40 T抗原の発現レベルが、細胞増殖を引き起こす域値に達していないことが示唆された。新たにダブルトランスジェニックマウスを作成し直すことは、費用、時間的問題から、困難であると判断し、薬剤誘導性はないものの、従来行ってきたグレリンプロモーター下流にSV40T抗原を結合させたコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスの作製を再び試みた。その結果、グレリン細胞の増殖は認められるが、腫瘍の進展が緩徐で、継代維持が可能である適度なSV40T抗原の発現レベルを持つラインの確立に成功した。このマウスでは、成長に伴って血中グレリン濃度が上昇し、最大で対照マウスの10倍程度の上昇を認めた。血中グレリン濃度の上昇に伴い、血清IGF-I値の上昇が認められ、血中グレリンの慢性的な上昇によりGH-IGF-I軸が刺激されたことが示唆された。今後、このマウスのグレリン細胞腫瘍より、細胞株を樹立しin vitroでのグレリン生合成、分泌調整機構の解明を目指す予定である。なお、今回の研究目的と直接の関連はないが、TRE-Tag-Tgマウスの中に、副腎に腫瘍が発生する1ラインを認め、小児癌の一種として知られる神経芽細胞腫に極めて類似した腫瘍であることを見いだしたため、論文報告している。
多項式環の部分環と自己同型の研究

多項式環に関して基本的な対象である部分環と自己同型を中心に研究し、部分環の有限生成性に関するヒルベルトの第14問題や、自己同型群の生成に関するTame Generators Problemなどにおいて、いくつかの新しい結果を得た。特に、自己同型群の研究では、最近、歴史的難問を解決したShestakovとUmirbaevの理論を、部分環の解析のために我々が独自に培った技術を応用して再構築した。それにより、多項式環の自己同型群の構造に関して、より精密で詳細な結果が得られた。多項式環の部分環の有限生成性に関するヒルベルトの第14問題や,多項式環の自己同型群の生成に関する問題に取り組んだ.前者について,多項式環のある微分作用素の核として得られる部分環の構造を研究し,その生成系に関する「Nowciki予想」に非常に簡明な証明を与えることに成功した.この微分作用素は「基本微分」と呼ばれる非常に基本的な対象だが,これまで「Nowicki予想」に対する分かりやすい証明法は無かった.後者についてはTame Generators Problemと呼ばれる問題に取り組んだ.これは,多項式環の自己同型群が「ある簡単な形の自己同型」だけで生成可能かを問う問題で,非常に難しいことで有名である.この問題の研究は,数年前にShestakovとUmirbaevが「永田予想」を解決したことで大きく進展したが,彼らの理論は難解なため,現在でも専門家の間でさえ広く理解されていないと言われている.我々はShestakovとUmirbaevの理論を,独自に開発した手法を用いて再構築し,理論の簡略化と一般化を行った.その結果,それまで存在するかどうか不明であった「IV型簡約可能自己同型」の非存在を立証することに成功した.この成果は直ちに論文にまとめ,国内外の専門家に伝達したところ,大きな反響があった.それ以外にも,多項式環の自己同型やヒルベルトの第14問題に関し,いくつかの新しい結果を得た.こうした成果の多くは,既に論文にまとめて国際的な専門誌に投稿したり,ウエブ上のプレプリント・アーカイブで発表したりした.また,国内外の様々な研究集会等でも広く公表した.ところで,我々の独自に編み出した手法は,この分野で標準的な代数幾何学的な手法とは一線を画するものであり,両者の接点を探ることが必要であると以前から考えていた.これに関し,2008年3月に関西学院大学で開催された「代数学研究会」で,アフィン代数幾何学の専門家たちと情報交換を行った.研究会は非常に有意義で,今後の研究に役立つ情報を得ることができた.前年度の研究で得られた成果を基礎に、多項式環の部分環と自己同型の研究をさらに発展させた。また、年度後半には2年間の研究を総括し、今後の研究の方向性を探った。前年度は、標数が零の体上の多項式環の自己同型群の構造について研究し、ShestakovとUmirbaevの理論の精密化と一般化を与えた。本年度はその成果を受け、標数が正の体上の多項式環の自己同型群の構造の解明に取り組んだ。標数が零の場合に比べ、標数が正の場合に有効な手法はそれほど多く知られていない。標数が零の場合には「解析的」な手法が極めて有効であり、ShestakovとUmirbaevの理論でも決定的な役割を果たした。そこで、そうした「解析的」な手法を、標数が正の場合にも適用できるようにするために、必要となる理論の整備に取り組んだ。一般に、標数が零の場合には、通常の微分法や積分法の理論の類似が成立する。しかし、標数が正の場合には、「指数が標数の倍数の単項式を微分すると0になる」という特異な現象が生じるため、「解析的」な手法の使用には様々な困難が伴う。それを回避するための方法として「高次微分」の概念に注目し、効果的な利用法を検討した。「高次微分」には合成関数の処理が複雑になるという致命的な短所がある。しかし、核の構造を分析することを手掛かりに、部分的な成果を得ることができた。また、異なる方向からのアプローチとして、2変数の場合のMakar-Limanovの結果に着想を得て、基礎体の標数に依存しない「イニシャル代数」の構造に関するある定理を証明した。その帰結として、古典的な結果であるvan der Kulkの定理の証明を簡略化した。また、3変数以上の場合を扱うための手がかりも得た。年度後半には、研究期間を通して得られた成果を再吟味し、今後の発展の可能性を探った。また、関連分野の研究集会で研究成果を幅広く公表するとともに、論文としてまとめて専門誌に投稿した。
脱神経筋の筋膜内への神経移植による筋機能の回復に関する研究

研究目的:知覚障害や運動障害を軽減させる新たな手術術式を確立する事を目的とし、脱神経筋の萎縮経過と再神経支配筋の回復経過について組織学的、組織化学的に検索する事を目的に研究を行った。実験方法:実験動物には日本白色種ウサギを用い、顔面神経表情筋枝の支配筋である頬骨耳筋を実験に用いた。正常な頬骨耳筋を対照に、実験1では支配神経に損傷を加えずに頬骨耳筋を露出した群、実験2として頬骨耳筋の露出に加え支配神経を切断し脱神経筋とした群、実験3として脱神経筋となった頬骨耳筋に対し、顔面神経口輪筋枝を移植し再神経支配筋とした群とした。検索方法:各実験群の頬骨耳筋を摘出し、H-E染色、Gomoriトリクローム染色、ATPase染色およびアセチルコリンエステラーゼ(AChE)染色を行い鏡検し、頬骨耳筋の筋線維タイプ構成比率について検索した。結果:対照と実験1の群では筋線維の萎縮や異常な組織所見はなく、実験2と実験3の群ではATPase染色によりタイプ2C線維の出現と筋線維の萎縮が確認できた。また、実験3では術後4週頃からタイプ2C線維の減少とともに、タイプ1線維や2線維が増加し、さらにAChE染色では神経筋接合部の活性が確認できた。交付申請書より変更した内容:申請では実験方法として脛骨神経支配のヒラメ筋と深腓骨神経支配の長鉦趾筋(EDL)を用いる予定であったが、ラット大腿部の解剖を行った結果、脛骨神経と深腓骨神経の完全な露出は不可能であった為、顔面神経表情筋枝の支配筋である頬骨耳筋を実験に用いた。研究目的:様々な侵襲によって神経支配が不明となり、感覚障害や運動障害を起こす場合がある。これらの障害を軽減させる新たな手段や術式を確立する事を目的とし、脱神経筋の萎縮経過と再神経支配筋の回復経過について組織学的、組織化学的に検索する事を目的に研究を開始した。実験および検索方法:実験動物には日本白色種ウサギを用い、顔面神経表情筋枝の支配筋である頬骨耳筋を実験に用いた。検索として実験後に頬骨耳筋を摘出し、H-E染色、Gomoriトリクローム染色およびATPase染色を行い鏡検し、頬骨耳筋の筋線維タイプ構成比率について検索した。交付申請書より変更した内容:申請では実験方法として脛骨神経支配とヒラメ筋と深腓骨神経支配の長趾伸筋(EDL)を用いる予定であったが、ラット大腿部の解剖を行った結果、脛骨神経と深腓骨神経の完全な露出は不可能であった為、顔面神経表情筋枝の支配筋である頬骨耳筋を実験に用いた。結果および展望:対照と実験1の群では筋線維の萎縮や異常な組織所見はなく、実験2と実験3の群ではタイプ2C線維の出現と筋線維の萎縮が確認できた。今後はこれらの検索を継続するとともに、アセチルコリン活性や免疫組織学的(NGF,PGP、Brdu)な検索と電気生理学的(筋電図)な検索を加える予定である。
悪性脳腫瘍局所免疫療法に関する抗腫瘍活性発現機序の解明

本研究により達成できた研究実績について以下に述べる.1.悪性脳腫瘍未治療例における腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のphenotypeおよび自己腫瘍細胞に対する細胞障害活性の検討未治療患者7症例の手術時摘出組織を用いて免疫組織化学的方法により, TILのphenotypeを検討した.TILは, Tリンパ球が主体, Bリンパ球は極少数であった.Tリンパ球亜群の検索ではC/S,H/Tリンパ球の両者が混在し浸潤していた.未治療患者8例の手術時摘出組織より不連続密度勾配法にてTILを分離し,自己腫瘍細胞に対する細胞障害活性を^<51>Cr release assayにより検討した.分離リンパ球は, Tリンパ球が主体であり, Bリンパ球は極少数であった.Tリンパ球亜群の検索ではC/S,H/T Tリンパ球の両者が認められた.TILの細胞障害活性は4例に認められ3.2%-24.0%であった.2.悪性脳腫瘍内OK-432局所投与例での検討7症例に, OK-432を局所投与し投与後の組織変化を経時的に検討した.局所投与後3日および7日目の組織ではOmmaya's tube周囲1-2cmの腫瘍組織は凝固壊死に陥り,著明なTリンパ球,多核白血球,マクロファージの浸潤を認めた.局所投与後14日目の組織では,凝固壊死巣と多数のTリンパ球浸潤を認めた. Tリンパ球亜群はいずれの時期においてもC/S,H/T Tリンパ球の両者が多数混在し浸潤していた.10症例に対し, TILの細胞障害活性を経時的に検討した.分離リンパ球はTリンパ球が主体であった.局所投与後3日では4例全例でTILの細胞障害活性を認め2.4%-5.9%であった.7日目では2例中1例に12.0%の細胞障害活性を認めた. 14日目では, 4例中3例に2.8%-20.4%の細胞障害活性を認めた.以上より, OK-432を腫瘍内局所投与すると3日目で腫瘍組織は凝固壊死に陥り,細胞障害活性を持つ多くのTリンパ球浸潤の誘導が示唆された.本研究により達成できた研究実績について以下に述べる.1.悪性脳腫瘍未治療例における腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のphenotypeおよび自己腫瘍細胞に対する細胞障害活性の検討未治療患者7症例の手術時摘出組織を用いて免疫組織化学的方法により, TILのphenotypeを検討した.TILは, Tリンパ球が主体, Bリンパ球は極少数であった.Tリンパ球亜群の検索ではC/S,H/Tリンパ球の両者が混在し浸潤していた.未治療患者8例の手術時摘出組織より不連続密度勾配法にてTILを分離し,自己腫瘍細胞に対する細胞障害活性を^<51>Cr release assayにより検討した.分離リンパ球は, Tリンパ球が主体であり, Bリンパ球は極少数であった.Tリンパ球亜群の検索ではC/S,H/T Tリンパ球の両者が認められた.TILの細胞障害活性は4例に認められ3.2%-24.0%であった.2.悪性脳腫瘍内OK-432局所投与例での検討7症例に, OK-432を局所投与し投与後の組織変化を経時的に検討した.局所投与後3日および7日目の組織ではOmmaya's tube周囲1-2cmの腫瘍組織は凝固壊死に陥り,著明なTリンパ球,多核白血球,マクロファージの浸潤を認めた.局所投与後14日目の組織では,凝固壊死巣と多数のTリンパ球浸潤を認めた. Tリンパ球亜群はいずれの時期においてもC/S,H/T Tリンパ球の両者が多数混在し浸潤していた.10症例に対し, TILの細胞障害活性を経時的に検討した.分離リンパ球はTリンパ球が主体であった.局所投与後3日では4例全例でTILの細胞障害活性を認め2.4%-5.9%であった.7日目では2例中1例に12.0%の細胞障害活性を認めた. 14日目では, 4例中3例に2.8%-20.4%の細胞障害活性を認めた.以上より, OK-432を腫瘍内局所投与すると3日目で腫瘍組織は凝固壊死に陥り,細胞障害活性を持つ多くのTリンパ球浸潤の誘導が示唆された.昭和61年度に達成できた研究実績について以下に述べる。1.ヒト大脳悪性脳腫瘍患者未治療例での浸潤細胞の検討未治療患者8例13標本を用いて免疫組織化学的方法により検索を行った。浸潤細胞は、腫瘍組織内の血管周囲に限局して認められ、T-cellが主体であった。B-cell,マクロファージ,NK細胞はいくつかの標本でごく少数認められるだけであった。Tリンパ球亜群の検索ではcytotoxio/suppressor,helper/inducer Tリンパ球の両者が混在し浸潤していた。Leu-3a/2a比は各症例により差がみられたが、健常人末梢血平均値に比べ低値を示す標本が多かった。2.悪性脳腫瘍内OK-432局所投与組織での検討ヒト大脳悪性脳腫瘍患者7例に、OK-432を局所投与し投与後の組織変化を経時的に検討した。

局所投与後3日および7日目の組織ではOmmaya's tube周囲1-2cmの腫瘍組織は凝固壊死に陥っており、著明なTリンパ球,多核白血球,マクロファージの浸潤を認めた。局所投与後14日目の組織では、凝固壊死巣と多数のTリンパ球浸潤を認めたが、多核白血球,マクロファージの浸潤はほとんど認められなかった。Tリンパ球数は未治療組織の約1000倍であった。Tリンパ球亜群の検討ではいずれの時期においてもcytotoxic/suppressor,helper/inducer Tリンパ球の両者が多数混在し浸潤していた。Leu-3a/2a比は未治療群同様各症例により差がみられたが、健常人末梢血平均値に比べ低値を示す標本が多かった。これらTリンパ球は細胞間相互作用により腫瘍細胞に免疫応答している可能性が示唆された。今後、浸潤細胞を腫瘍組織より取り出し、その機能を検討することによりOK-432局投与による抗腫瘍活性発現機序を更に詳細に解明する予定である。