hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
渦鞭毛藻における麻痺性貝毒生合成遺伝子の解析とその防除に関する分子生態学的研究

麻痺性貝毒は世界的規模の様相を呈し、食品衛生や増養殖業に深刻な問題となっている。本研究は貝毒原因渦鞭毛藻の貝毒生合成系およびそれに関わる遺伝子をDNAレベルで解明し、貝毒生産の真の起源を明らかにするとともに、そのDNAプローブを開発し、貝毒生産者の生態を解明し、貝毒の防止の方策を立てることを目的として行った。先ずこれら渦鞭毛藻が雌雄異株であることから接合によって雑種1代の貝毒組成の解析を行い、貝毒の生合成に関わる遺伝子が本藻の染色体にあることを明らかにした。ついで、この貝毒生合成に関わる酵素のうち、ゴニオトキシンGTX2とGTX3のカルバモイル基にSO_4基を付加してC1+C2に変換する硫酸基転移酵素を、大量培養したGymnodinium catenatumの無細胞抽出液を各種カラムクロマトガラフィーにかけ精製した。その酵素はGTX2+3とサキシトキシンSTXのみを認識するが、GTX1+4やneoSTX等の1位に水酸基を有するものを基質として認識しなかった。ゲル濾過とSDS-PAGEによる分子量59kDaのサブユニットからなる約125kDaのホモダイマーであること、硫酸基供与体としてPAPSのみを特異的に認識し、APSやMgSO_4を供与体としなかった。活性はMg^<++>により促進され、反応の至適温度は25°C、至適pHは6であった。本酵素の画分は電気泳動的には単一バンドに精製されたので、N末端アミノ酸分析を行ったが、末端がマスクされていて結果を得ることが出来なかった。本研究は渦鞭毛藻Alexandriumの生産する麻痺性貝毒の生合成に関わる遺伝子を解明し,貝毒の防止のための方策を立てることを目的として行なう。本年度の研究実績の概要は下記の通りである。1)雌雄異株であるAlexandriumtamarenseおよびA.catenellaからそれぞれ雑種第1代(F1)を得て,麻痺性貝毒の成分組成(STXnやGTXn)を表現型形質として親株のそれと比較し貝毒伝達がメンデルの法則によることを明らかにし,本貝毒の生合成に関与する系が染色体にあることをつきとめた。2)A.catenellaおよびA.tamarenseの代表株の大量培養を行ない,細胞を破砕後粗酵素液を作り,STXを基質として反応させ,その反応産物をHPLC蛍光分析にて測定した。その結果,A.tamarense151株の粗酵素系の反応でSTXからGTX5が検出された。このほか未同定のピークが検出された。この粗酵素液は脂質(渦鞭毛藻特有)などがHPLCを妨害することから粗酵素液の前処理の検討を種々行ない,アセトン粉末および透析一硫安分画のいずれも一長一短であり,さらに検討が必要となった。3)A.catenellaおよびA.tamarenseの大量培養を行なって藻体を集め,核DNAの分離・精製を行なった。渦鞭毛藻のDNA抽出は他の真核生物や原核生物と異なり,抽出の際,多糖,脂質の除去が困難で,試行錯誤を重ねた末に確立された。4)A.catenellaおよびA.tamarenseからSTXやGTX欠損突然変異株を作成するために,紫外線照射,エチレンブロマイド,5-ブロモウシシル,ニトロリグアニジンを使用した。その結果,紫外線照射によって親株の麻痺性貝毒の成分組成と異なる突然変異株1株を得たが,今後,多くの分離を必要とする。本研究は有毒渦鞭毛藻

Alexandrium属やGymnodinium catenatumの生産する麻痺性貝毒(PSP)の生合成や転換に関わる酵素とその遺伝子を解明し、DNAプローブの開発により迅速かつ高感度のモニタリングにより貝毒防止のための一助となることを目的として行なう。本年度の研究は、PSP硫酸基転移酵素の検索・精製と有毒種を識別可能な遺伝子領域の特定に重点を置き下記のような研究実績を得た。(1)大船渡湾産のA.tamarense、浦ノ内湾産のA.catenellaおよびスペイン、ビゴ湾産のG.catenatumの大量培養を行い、藻体を破砕後硫安処理を行いDEAE-セルロースカラムにかけたところ、A.catenellaおよびG.catenatumの吸着画分にSTXからGTX5を、またGTX2+3からC_1+C_2を生じる硫酸基転移活性を見い出した。他の基質(neo STX,GTX1+4)に対しては活性が認められなかった。最大の活性を示したG.catenatumについては、MonoQ,Superose 6により精製を進めたが、電気泳動的にはまだ数本の蛋白バンドが認められた。本活性は硫酸基供与体としてPAPS(3'-phos-phoadenosine 5'-phosphate)に依存し、反応にMg^<2+>を要求した。また分子量は約120kDaで、反応の至適pHは6.0、至適温度は35°Cであった。(2)A.tamarenseおよびA.catenellaから全DNAの分離・精製法を確立し、近年分子系統分類に用いられる5.8SrDNAとそのスペーサー(ITS)領域をPCR法により増幅し、クローニング後多くの株でシーケンスを行い比較検討を行った。その結果、本領域とりわけITS領域には種内変化は殆どないが種間においては多くの塩基置換が起こっていることから、種特異的な塩基配列を含むことが強く示唆された。そこで現在他のAlexandrium属においても本領域のシーケンスを行っており、有毒種に特異的なDNAプローブとして極めて有力と考えられる。麻痺性貝毒は世界的規模の様相を呈し、食品衛生や増養殖業に深刻な問題となっている。本研究は貝毒原因渦鞭毛藻の貝毒生合成系およびそれに関わる遺伝子をDNAレベルで解明し、貝毒生産の真の起源を明らかにするとともに、そのDNAプローブを開発し、貝毒生産者の生態を解明し、貝毒の防止の方策を立てることを目的として行った。先ずこれら渦鞭毛藻が雌雄異株であることから接合によって雑種1代の貝毒組成の解析を行い、貝毒の生合成に関わる遺伝子が本藻の染色体にあることを明らかにした。ついで、この貝毒生合成に関わる酵素のうち、ゴニオトキシンGTX2とGTX3のカルバモイル基にSO_4基を付加してC1+C2に変換する硫酸基転移酵素を、大量培養したGymnodinium catenatumの無細胞抽出液を各種カラムクロマトガラフィーにかけ精製した。その酵素はGTX2+3とサキシトキシンSTXのみを認識するが、GTX1+4やneoSTX等の1位に水酸基を有するものを基質として認識しなかった。ゲル濾過とSDS-PAGEによる分子量59kDaのサブユニットからなる約15kDaのホモダイマーであること、硫酸基供与体としてPAPSのみを特異的に認識し、APSやMgSO_4を供与体としなかった。活性はMg^<++>により促進され、反応の至適温度は25°C、至適pHは6であった。本酵素の画分は電気泳動的には単一バンドに精製されたので、N末端アミノ酸分析を行ったが、末端がマスクされていて結果を得ることが出来なかった。
精神的敗北感と認知的柔軟性に着目したうつ病とパニック症の個人認知行動療法の比較

うつ病、及び、パニック症の被験者にマニュアルに沿った認知行動療法を専門の訓練を受けたセラピストによって実施した。また、症状評価尺度、精神的敗北感尺度、認知的柔軟性尺度を介入前、介入後に実施し、うつ病とパニック症の症状評価尺度(BDI-II,PDSSーSR)、精神的敗北感尺度、認知的柔軟性の変化の仕方を比較検討した。その結果、うつ病はマニュアルの後半で、うつ症状尺度、精神的敗北感尺度、認知的柔軟性尺度が改善を示した。一方、パニック症はマニュアルの前半で、パニック症状尺度、精神的敗北感尺度、認知的柔軟性尺度が改善した。平成27年度では、本研究に同意が得られた、うつ病及び、パニック症の被験者に認知行動療法マニュアルに沿った週1回50分の認知行動療法(12週16週の介入、12週間の経過観察を期間を経て試験終了となる)を専門の訓練を受けた臨床心理士等のセラピストによって、実施した(うつ病の被験者は現時点でも介入を実施中)。うつ病の認知行動療法マニュアルの概要は1心理教育、2症状の概念化、3治療目標の設定、4行動活性化、5自動思考の同定、6イメージの同定と再構成、7対人関係の解決、8問題解決法、9初期記憶の同定と関連するイメージの書き換え、10スキーマの同定と修正、11再発予防であった。パニック症の認知行動療法マニュアルの概要は1心理教育、2症状の概念化、3安全行動と注意の検討、4破局的な身体感覚のイメージの再構成、5注意トレーニング、6行動実験、7身体感覚イメージと結びつく記憶の書き直し、8「出来事の前後で繰り返しやること」の検討、9最悪な事態に対する他者の解釈の検討、10残っている信念・想定の検討、11再発予防であった。うつ病の被験者の認知行動療法を現在も実施中であるため、評価尺度のデータ収集が遅れているため。本研究に同意が得られた、うつ病、及び、パニック症の被験者に認知行動療法マニュアルに沿った週1回50分の認知行動療法(12週16週の介入、12週間の経過観察を期間を経て試験終了となる)を専門の訓練を受けた臨床心理士等のセラピストによって実施した。さらに、有効性・安全性評価のための評価尺度(1うつ病の重症度測定:Hamilton Depression Scale(HAM-D)、2パニック症の重症度測定:日本語版Panic Disorder Severity Scale(PDSS)、3精神的敗北感の測定:Mental Defeat Scale(MDS)、認知的柔軟性尺度の測定:Co gnitive Flexibility Scale(CFS))を介入前(0週)、介入後(12-16週)、経過観察(24-28週)を実施した。研究開始当初は、認知行動療法による介入前と介入後で、うつ病とパニック症のそれぞれの症状評価尺度(HAM-DとPDSS)及び、精神的敗北感尺度と認知的柔軟性尺度の変化の傾向を比較検討することを一度に実施する予定であった。しかし、より詳細に各々の疾患の精神病理的特徴と、認知行動療法がどのように効果を示すかを明らかにするために、1認知行動療法によるうつ病の症状改善の仕方、及び、精神的敗北感、認知的柔軟性の変化の特徴、2認知行動療法によるパニック症の症状改善の仕方、及び、精神的敗北感、認知的柔軟性の変化の特徴、を明らかにすることを目指した。その結果、1に関しては、認知行動療法プログラムの後半で、うつ症状、精神的敗北感、認知的柔軟性が改善を示した。一方、2は認知行動療法プログラム前半で、パニック症状、精神的敗北感、認知的柔軟性が改善を示した。研究開始当初は、認知行動療法による介入開始前と介入終了後で、うつ病とパニック症のそれぞれの症状評価尺度(HAM-DとPDSS)及び、精神的敗北感尺度と認知的柔軟性尺度の変化の傾向を比較検討することを一度に実施する予定であった。しかし、より詳細に各々の疾患の精神病理的特徴を明らかにするために、1認知行動療法によるうつ病の症状改善度及び精神的敗北感、認知的柔軟性の変化の特徴、2認知行動療法によるパニック症の症状改善度及び精神的敗北感、認知的柔軟性の変化の特徴、3うつ病とパニック症の精神的敗北感、認知的柔軟性の変化の傾向の比較検討、という3段階で研究を進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。認知行動療法28年度が最終年度であるため、記入しない。
エネルギーセンサーによるクロマチンダイナミクス制御機構の解明

AMPキナーゼ(AMPK)は、細胞内のエネルギーセンサーとして代謝、細胞増殖、リプログラミングに重要な役割を担う。インシリコ解析からヒストン脱メチル化酵素JMJD1AはAMPKのモチーフを複数有していることから、AMPKによるJMJD1Aリン酸化の可能性を解析した。インビトロアッセイではJMJD1Aタンパク質はAMP依存的にリン酸化されることがフォスタグゲルやAMPK基質抗体などによって明らかとされた。さらにリン酸化プロテオミクス解析から十数個のセリン・スレオニン残基のAMPKによるリン酸化部位を同定した。内在性JMJD1AのAMPKによるリン酸化アミノ酸残基特定はいまだ途上にある。グルコースの取り込みを傷害するため、細胞培地からグルコースを取り除いた状態や、2-deoxy-gluoose (2DG)を細胞培地に添加しグルコースの取り込みを阻害した状態に置いた細胞を用意した。これに対しヒストン脱メチル化酵素JMJD1Aが特異的にリン酸化されるかの検討を行った。この結果、AMPキナーゼでリン酸化された部位を検出するAMPKリン酸化抗体での検出が安定して得られず、系の再見直しを行った。1細胞種と飢餓刺激の検討。まず、細胞の種類を検討したところHeLa細胞ではAMPKの活性がうまく取れないという既報もあり、前駆脂肪細胞を使う系に変更した。ポジティブコントロールとなるアシル-CoAカルボキシラーゼなどのリン酸化はグルコース除去培地などでリン酸化が確認され、グルコース除去の刺激は入っていることが認められた。2リン酸化検出系の検討。フォスタグゲルを用いてリン酸化される系で確実にリン酸化されるかの再検討を行った。大腸菌から精製したタンパク質ではin vitroキナーゼアッセイでバンドのシフトが検出されたが、内在性のJMJD1Aのリン酸化検出をフォスタグゲルで検出することはできなかった。さらに、ソディウムバナデートやβグリセロフォスフェートなどの脱リン酸科酵素阻害剤の検討も行った。結論として細胞におけるJMJD1Aはすでに各種キナーゼによりすでに複数個所がリン酸化されていることが質量分析から見いだされることから、そもそも細胞内のJMJD1Aは追加のリン酸化が見いだせない可能性も示唆された。3グルコース除去についての検討。培地とともに通常添加するFBSにそもそもグルコースが入っているため、これをBSAに置換したが、シグマと和光純薬の製品で脂肪酸などの含有純度がことなり、和光純薬製品では脂肪酸の影響が否定できないこと見出した。研究担当者が変わった段階で実験の再現が取れなくなった。この原因として、再現がとれるウィンドウ幅が狭く、相当の最適化をしなくてはならないことが挙げられた。また質量分析の系についても再度検討が必要となったため。AMPKは細胞内のATPの減少を増加に転じさせるように代謝のスイッチを切り換えるセンサーとして機能し、酵素、転写因子をリン酸化し制御する。JMJD1Aヒストン脱メチル化酵素がAMPKの基質としてリン酸化しうる知見を得たため、まずこれを検証することを行った。1in vitroの系では、AMPKリコンビナントタンパク質はJMJD1Aの30近いセリンスレオニンをリン酸化した。これは質量分析による解析であるがフォスタグを用いた検出系でもバンドのシフトが見られ、リン酸化が検証された。2一方、細胞の系では、検出系が困難となってしまっており再現が困難な状況に陥っている。そこで、ドミナントポジティブなAMPKをトランスフェクションすることによって検出するタンパク量を増やしてリン酸化を検出する試みを行っている。3リン酸化をみるのが困難なため、遺伝子発現でAMPKとの関連を検証する実験系を作った。細胞培地からグルコースを除去した培地で時間経過を追い、標的となり得る遺伝子を解析した。FGFなどが時間依存的に上昇することが再現よく見られた。JMJD1Aがノックダウンされた細胞ではこの上昇がみられず、JMJD1Aの下流にある標的遺伝子であることが予測される。ベージュ化脂肪細胞の分化でもFGFはJMJD1A依存性に誘導され、また、肝臓でのFGFの発現もJMJD1A依存性が見られており、絶食に伴うFGFの上昇がJMJD1Aを介したものである知見を得つつある。培地からグルコースのみならず、ピルビン酸やグルタミンのようなTCA回路に入り得る養分を欠乏させるなどの検討も行っている。1In vitroキナーゼアッセイとフォスタグゲルでの解析。上記の可能性を検討するため、全長JMJD1Aのリコンビナントタンパク質をSf9細胞から精製し、λPP脱リン酸化酵素で処理したタンパク質に対し、in vitroキナーゼアッセイを行い、フォスタグゲルでリン酸化されることを解析する。2リン酸化部位を質量分析から同定する。

上記1で得られるリコンビナントタンパク質をリファレンスとして、細胞でのグルコース飢餓時のJMJD1Aのリン酸化部位の同定を試みる。この際λPPを除くため、ゲルろ過分離、バナジウム酸塩イオンによる阻害、50mMEDTA存在下で65°Cで1時間過熱することでも失活させるなど考慮する。3in vitro mutagenesisにより、すでに導入した各種アラニンスキャニング変異体を細胞でにトランスフェクションし、AMPKリン酸化抗体で細胞での検証を行う。4また、リン酸化のポジティブコントロールとしてアドレナリン刺激でリン酸化するプロテインキナーゼA(PKA)のリン酸化部位を用いる。5動物の絶食下と摂餌下における肝臓、脂肪組織のJMJD1Aを免疫沈降し、質量分析で解析する。代謝医学・分子生理学研究の進捗が遅れており、次年度の実験に使用するため1In vitroキナーゼアッセイとフォスタグゲルでの解析2リン酸化部位を質量分析から同定3アラニンスキャニング変異体細胞を用いた解析
生物生産,調整加工における自動化とロボットに関する研究

先進諸国が直面している農業の就労人工の激減対策,及び省エネルギ,危険回避,経済性などの一つの解決技術として,従来より自動化,ロボット化に関して個々の研究が行われている.今回,農業機械学主催の国際シンポジウムを企画するにあたり,生物生産から調製加工までの分野における農業機械部門の総合的な自動化技術の現状を明らかにするため;a)エネルギ;b)農業機械;c)施設園芸;d)食品;e)バイオテクノロジーなどの応用分野,及び;f)センサ;g)アクチュエータ;h)制御;i)アルゴリズム;j)システムモデル;k)シミュレーションの自動化基礎技術の両面について,研究分担者(計10名)で内容を分担し,技術現状が最も端的に現れる例として,国際シンポジウムに投稿された論文の参考文献を全て調査した.その結果,各種応用分野での自動化ロボット化を促進する基本技術の役割に関する流れ,最近のセンサなど自動化に関する要素技術の開発動向及びそれらの実機への適用性評価の事例出典が明確となり,上記の区分ごとに詳細に見ることで対象とする分野の現状が把握可能であることが判明した.この成果は,シンポジウム時に参加者への参考資料として貢献することが明らかであるため特に冊子に印刷し,11月に開催するシンポジウム当日に配布することとした.先進諸国が直面している農業の就労人工の激減対策,及び省エネルギ,危険回避,経済性などの一つの解決技術として,従来より自動化,ロボット化に関して個々の研究が行われている.今回,農業機械学主催の国際シンポジウムを企画するにあたり,生物生産から調製加工までの分野における農業機械部門の総合的な自動化技術の現状を明らかにするため;a)エネルギ;b)農業機械;c)施設園芸;d)食品;e)バイオテクノロジーなどの応用分野,及び;f)センサ;g)アクチュエータ;h)制御;i)アルゴリズム;j)システムモデル;k)シミュレーションの自動化基礎技術の両面について,研究分担者(計10名)で内容を分担し,技術現状が最も端的に現れる例として,国際シンポジウムに投稿された論文の参考文献を全て調査した.その結果,各種応用分野での自動化ロボット化を促進する基本技術の役割に関する流れ,最近のセンサなど自動化に関する要素技術の開発動向及びそれらの実機への適用性評価の事例出典が明確となり,上記の区分ごとに詳細に見ることで対象とする分野の現状が把握可能であることが判明した.この成果は,シンポジウム時に参加者への参考資料として貢献することが明らかであるため特に冊子に印刷し,11月に開催するシンポジウム当日に配布することとした.
胃粘膜恒常性維持におけるムチン糖鎖の役割の解明

マウス胃粘膜の2つの部位(胃体部および幽門部)からムチンを調製し,アルカリ還元法と無水ヒドラジン法で糖鎖を得,質量分析計により解析した。ヒドラジン法においては,方法の最適化を図り,マロン酸を反応に共存させることにより,糖鎖の分解が抑えられることを見いだした。確立した方法で,胃体部と幽門部のムチン糖鎖を比較した結果,部位特異的な糖鎖の存在が明らかとなった。この違いが,糖鎖改変時に幽門部でのみ発がんが起こることに関係していると考えられた。当初の計画に基づいて,マウス胃の体部および幽門部からムチンを抽出,精製後,糖鎖を調整し,両者の違いについて質量分析計を用いて詳細に解析した。具体的には,C57BL/6,オス,7週齢のマウスの胃粘膜をトライトンX-100およびジチオスレイトールを含むグアニジン塩酸溶液で抽出し,抽出液をゲルろ過カラム,塩化セシウム密度勾配超遠心により処理し,精製ムチンを得た。エタノール沈殿で脱塩後,水素化ホウ素ナトリウムの存在下でアルカリ分解して糖鎖を得,イオン交換カラムにより,中性糖鎖と酸性糖鎖に分画した。得られた糖鎖を,完全メチル化後,マトリックス支援飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF-MS)を用いて解析した。その結果,胃体部と幽門部では,胃ムチンの中性糖鎖に,サイズ分布の違いが見られることがわかった。しかし,糖鎖分子種には大きな違いは認められなかった。一方,酸性糖鎖については,胃体部にほとんど認められないのに対し,幽門部では有意に多い糖鎖が認められた。構造については,現在解析中である。もう一つの予定項目であるムチン糖鎖プローブについては,蛍光標識糖鎖の調製法の予備的な検討を行った。未だ確立はしていないが,調製法について,今後に期待を抱かせる結果が出つつある。当初の計画に基づいて,ムチン糖鎖プローブの開発を行った。具体的には,還元末端が還元性を保持している糖鎖の調製法の検討を行った。モデル糖タンパク質として,市販の豚胃ムチンを部分精製したもの,および子牛血清フェツインを用いた。ムチン糖鎖の切り出し条件として,当初の計画に基づいて,気相でのヒドラジンによる処理を採用し,同時に起こる分解(ピーリング)の抑制条件を検討した。その結果,弱酸であるマロン酸を反応系に添加するとピーリングが抑制されることを見いだした。糖鎖の切り出し反応条件について詳細に検討し,10μモルが至適量であることがわかった。また,マロン酸以外の弱酸にも同じ抑制効果があるが,マロン酸が最も効果的であることも見いだした。この方法が,ラット胃ムチンの糖鎖に応用できるかを検討したところ,マロン酸を加えない反応条件では,ほとんどの生成物が分解産物であったのに対し,マロン酸を加えた場合には,多くの分解無しの糖鎖が得られることが明らかになった。以上の結果は,これまで困難とされてきた、還元性を保持するムチン型糖鎖が調製可能になったことを示す。この成果を基に,糖鎖の異性体分離など,今後の検討課題を遂行する予定である。前年度に見いだした,ヒドラジンとマロン酸を用いた,分解抑制条件下でのムチン糖鎖切りだし条件の検討を更に行った。すなわち,モデル糖タンパク質として,子牛フェツインと豚胃ムチンを用いてのヒドラジン処理における,気相と液相の比較実験,必要マロン酸量の確認実験,マロン酸以外の弱酸の影響の確認実験などである。十分な再現性を認め,成果を論文としてまとめ,印刷,公表されるに至った。その結果を基に,さらに分解の少ない条件の検討を行い,10 μmolマロン酸の存在下,60°C,6時間の気相ヒドラジン処理が,収量は落ちるものの,グライコーム解析には適していることを明らかにした。更に,得られた還元末端が還元性を保持している糖鎖を用いて,プレートへの結合条件の検討を行った。しかし,未だ十分な系を確立するには至らず,検討中である。また,現在得られている糖鎖は単体とは言い難く,複数のHPLCを組み合わせて異性体を分離するという当初の課題についても検討を始めたところである。前年度までに見いだしたムチン糖鎖を分解抑制下で調製する方法を論文としてまとめるに当たり,さらなる確認実験を重ねたために時間を要したが,印刷,公表されるに至った。このため,次の課題としていた糖鎖の異性体分離の開始が遅れたが,得られた糖鎖をプレート上に固定化する予備実験を行うなど,新たな取り組みもできたので,標記の進捗状況とした。既に論文(Anal Biochem 496, 35-42, 2016)にて公表したムチン糖鎖切り出し条件のさらなる検討の結果,10μmolマロン酸の存在下,60°C,6時間の気相ヒドラジン処理により,ムチン糖鎖が最少の分解で切り出されることを,前年度に見出した。そこで,本年度,この条件で切り出したムチン糖鎖を蛍光標識後,親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)で分析して得られるグライコームが,従来行われている還元アルカリ分解で得られた糖鎖のメチル化体の質量分析で得られるグライコームと同じであるかどうかを,ラット胃から精製したムチンを材料にして検討した。

その結果,両者は良い一致を示し,開発した方法により,ムチン糖鎖のグライコミクス解析が可能であることが明らかとなった。さらに,前者の方法では,後者の方法では困難な糖鎖の異性体も解析できることを見出した。蛍光標識した糖鎖の解析には,取り扱いに若干の注意を要するヒドラジンの代わりに,アンモニア等のアルカリを使用する方法も報告されている。そこで,それらの方法との比較を行った結果,アルカリを用いる方法では,分解によって生じるアーティファクト糖鎖が混在することが明らかとなった。それらは,ムチン糖鎖のグライコミクス解析を誤らせる可能性があることも見出した。以上の結果は,論文としてまとめ,現在,投稿中である。ムチン糖鎖取得法がほぼ確立されたので,当初の目的である部位特異的糖鎖の発現場所を特定する検討を開始した。部位特異的糖鎖を認識する抗体の探索を行うために,糖鎖をプラスチックプレートに固定し,反応する抗体を得ることを試みた。上記ヒドラジン法で得られた糖鎖にアントラリロイルヒドラジンを反応させて生じた生成物をプレートに結合する検討を行い,実験系をほぼ確立した。現在,抗体の探索実験を行っている。マウス胃粘膜の2つの部位(胃体部および幽門部)からムチンを調製し,アルカリ還元法と無水ヒドラジン法で糖鎖を得,質量分析計により解析した。ヒドラジン法においては,方法の最適化を図り,マロン酸を反応に共存させることにより,糖鎖の分解が抑えられることを見いだした。確立した方法で,胃体部と幽門部のムチン糖鎖を比較した結果,部位特異的な糖鎖の存在が明らかとなった。この違いが,糖鎖改変時に幽門部でのみ発がんが起こることに関係していると考えられた。当初の計画における目標の1つが,おおむね達成された。糖鎖の異性体分離など,残された検討課題を遂行し,当初予定した糖鎖プローブの作成を完成させる。ノックアウト実験が行えるマウスの胃粘膜を用いて,体部と幽門部のムチン糖鎖の違いを明らかにし,論文としてまとめる。糖鎖生物学,糖鎖化学,生化学糖鎖の異性体分離など,検討課題を遂行し,糖鎖プローブの作成法を完成させる。次に,得られた糖鎖プローブを用いた解析を行う。当初の計画における目標が,おおむね達成された。前年度購入予定機器が,大学向けサービスキャンペーンによって初年度に購入できたため余裕が生じ,その分を今年度に繰り越しできたため。今年度購入予定の機器が,大学向けサービスキャンペーンによって前年度に購入できたため余裕が生じた。また,予定していた論文投稿が次年度になった。論文作成費用(英文校正,投稿料)および,物品費として使用予定である。得られた部位特異的な糖鎖について,更なる詳細な構造解析を行う。ムチン糖鎖プローブの作成については,調製法を確立する。極めて少額のため,更なる物品の購入はしなかった。物品費として使用する。
クロマチンリモデリング因子による高品質iPS細胞の作製方法の確立

人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)は分化細胞に3つまたは4つの転写因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)を導入することにより樹立され、現在iPS細胞を用いた再生医療などが期待されている。しかしながら現状ではマウス、ヒトともに樹立されたiPS細胞の分化能力などの幹細胞の性質・品質は不均一であり、iPS細胞を臨床応用する際に重大な問題点となっている。本研究では卵母細胞特異的に発現し、クロマチンリモデリング因子として知られているリンカーヒストンH1fooをコードしている遺伝子であるH1fooを、上記転写因子とともにマウスおよびヒト分化細胞に導入することで、より質の高いiPS細胞を安定的に効率良く作製する方法を確立する。高品質iPS細胞においては、安定的に高効率の心筋細胞分化が実現され、再生医療の発展に貢献することができる。iPS細胞の質に関しては、染色体の安定性、遺伝子変異の有無、分化多能性に関して議論がなされてきた。またマウスES細胞並みの高品質ヒトiPS細胞として、naive iPS細胞に関する研究もなされてきた。本研究においては、再生医療の実現を念頭に置き、通常の体細胞からiPS細胞を作製する方法に導入する遺伝子を追加することにより、iPS細胞の品質向上を行ってきた。マウス体細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4、Sox2、Klf4と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立し、同iPS細胞の高品質の確認を行ってきた。マウス細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4, Sox2, Klf4(以下OSKと記載)と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立する。H1fooをマウス成体尾部線維芽細胞で強制発現させたところ、ES細胞様iPSコロニーの出現を認めた。iPS細胞の樹立効率は非常に高く、また同iPS細胞におけるNanog陽性コロニー数もおおく、高品質なiPS細胞が効率的に作成されていることが示唆された。またiPS細胞のin vitro多分化能の評価として胚様体形成能の比較検討を行い、胚様体数、デジタル光学顕微鏡による胚様体面積の定量測定とそのバラつきについて比較検討を行った結果、ばらつきが少なく一様な分化傾向を示すことが示された。さらなる分子生物学的解析を行い、詳細な検討を行っている。作成されたiPS細胞をコントロールとともに、網羅的遺伝子解析による検討を行い、bioinformatics解析を行い、詳細な分子機序を解明する。また同様の方法がヒトiPS細胞を作製する際にも適応できるかを検討する。同方法で作成されたヒトiPS細胞に関しても、染色体の安定性、増殖能、分化能等を検討し、その品質を確認する。人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)は分化細胞に3つまたは4つの転写因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)を導入することにより樹立され,現在iPS細胞を用いた様々な臓器再生の臨床応用が期待されている.しかしながら現状ではマウス、ヒトともに樹立されたiPS細胞の分化能力などの幹細胞の性質は不均一であることがiPS細胞の臨床応用における重大な問題点となっている.本研究では卵母細胞特異的に発現し、クロマチンリモデリング因子として知られているリンカーヒストンH1fooをコードしている遺伝子であるH1fooを、上記転写因子とともにマウスおよびヒト分化細胞に導入することで、より質の高いiPS細胞を効率良く作製する方法を確立し,高効率の心筋分化を実現することで再生医療の発展に貢献することを目的とする.iPS細胞の質に関しては,染色体の安定性、遺伝子変異の有無、分化多能性に関して議論がなされてきた.またマウスES細胞並みの高品質ヒトiPS細胞として、naive iPS細胞に関する研究も散発的になされてきた。本研究においては、再生医療の実現を念頭に置き、通常の体細胞からiPS細胞を作製する方法に導入する遺伝子を追加することにより、iPS細胞の品質向上を図る。マウス体細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4、Sox2、Klf4と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立し、同iPS細胞の高品質の確認を行ってきた.今後も、その詳細な分子機序を解析し、また高品質ヒトiPS細胞の樹立を行っていく.マウス細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4, Sox2, Klf4(以下OSKと記載)と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立する.H1fooをマウス成体尾部線維芽細胞で強制発現させたところ,ES細胞様iPSコロニーの出現を認めた.iPS細胞の樹立効率は非常に高く、また同iPS細胞におけるNanog陽性コロニー数もおおく,高品質なiPS細胞が効率的に作成されていることが示唆された.またiPS細胞のin vitro多分化能の評価として胚様体形成能の比較検討を行い,胚様体数,デジタル光学顕微鏡による胚様体面積の定量測定とそのバラつきについて比較検討を行った結果,ばらつきが少なく一様な分化傾向を示すことが示された.これらの詳細な解析を継続していく.人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)は分化細胞に3つまたは4つの転写因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)を導入することにより樹立され、現在iPS細胞を用いた再生医療などが期待されている。

しかしながら現状ではマウス、ヒトともに樹立されたiPS細胞の分化能力などの幹細胞の性質・品質は不均一であり、iPS細胞を臨床応用する際に重大な問題点となっている。本研究では卵母細胞特異的に発現し、クロマチンリモデリング因子として知られているリンカーヒストンH1fooをコードしている遺伝子であるH1fooを、上記転写因子とともにマウスおよびヒト分化細胞に導入することで、より質の高いiPS細胞を安定的に効率良く作製する方法を確立する。高品質iPS細胞においては、安定的に高効率の心筋細胞分化が実現され、再生医療の発展に貢献することができる。iPS細胞の質に関しては、染色体の安定性、遺伝子変異の有無、分化多能性に関して議論がなされてきた。またマウスES細胞並みの高品質ヒトiPS細胞として、naive iPS細胞に関する研究もなされてきた。本研究においては、再生医療の実現を念頭に置き、通常の体細胞からiPS細胞を作製する方法に導入する遺伝子を追加することにより、iPS細胞の品質向上を行ってきた。マウス体細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4、Sox2、Klf4と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立し、同iPS細胞の高品質の確認を行ってきた。マウス細胞においてレトロウイルスベクターを用いてiPS細胞樹立時にOct4, Sox2, Klf4(以下OSKと記載)と共にH1fooを強制発現させてiPS細胞を樹立する。H1fooをマウス成体尾部線維芽細胞で強制発現させたところ、ES細胞様iPSコロニーの出現を認めた。iPS細胞の樹立効率は非常に高く、また同iPS細胞におけるNanog陽性コロニー数もおおく、高品質なiPS細胞が効率的に作成されていることが示唆された。またiPS細胞のin vitro多分化能の評価として胚様体形成能の比較検討を行い、胚様体数、デジタル光学顕微鏡による胚様体面積の定量測定とそのバラつきについて比較検討を行った結果、ばらつきが少なく一様な分化傾向を示すことが示された。さらなる分子生物学的解析を行い、詳細な検討を行っている。作成されたiPS細胞をコントロールとともに,網羅的遺伝子解析による検討を行い,詳細な分子機序を解明する.また同様の方法がヒトiPS細胞を作製する際にも適応でいるかを検討する.ヒトiPS細胞に関しても,染色体の安定性,増殖能,分化能等を検討し,その品質を確認する.作成されたiPS細胞をコントロールとともに、網羅的遺伝子解析による検討を行い、bioinformatics解析を行い、詳細な分子機序を解明する。また同様の方法がヒトiPS細胞を作製する際にも適応できるかを検討する。同方法で作成されたヒトiPS細胞に関しても、染色体の安定性、増殖能、分化能等を検討し、その品質を確認する。
Gas6/AxlシグナルによるRSV感染に伴う免疫応答の制御機構の解明

Respiratory syncytialvirus (RSV)は、そのコンポーネントタンパクのひとつであるGタンパクによりTh2免疫応答を誘導する。これが従来のRSVワクチン(ホルマリン固定不活化RSV: FI-RSV)接種後のRSV感染に伴う喘息様のアレルギー応答の誘導の原因である。一方これまでの本研究では、RSV感染やFI-RSV接種によりgrowth arrest-specific 6 (Gas6)が産生されることを明らかにした。これらの機構として、Gタンパクが樹状細胞に作用するとGas6が産生され、その受容体であるAxlを介してTh2免疫応答であるアレルギー性気道炎症を誘導することを示した。世界的に安全かつ有効なRSVワクチンの開発には至っていないが、これまでに我々が見出した結果から、Axlを標的としたアレルギーを誘導しないワクチン接種法の開発ができるのではないかと予想した。そこで、Axl阻害剤であるBGB324を抗原(FI-RSVやリコンビナントRSV Gタンパク)と混合したものを接種し、その後RSVに感染させると、アレルギー性気道炎症はほとんど誘導されなかった。しかも阻害剤接種群ではIgG2産生の促進と、ウイルスの複製の抑制がみられた。すなわち、Axl阻害剤はアジュバント様の効果を示し、RSVの抗原に関わらず安全性と有効性を担保した新規ワクチン接種法の開発につながることを示唆した。また我々は、RSV感染重症患者の血中には、pre型fusion (pre-F)タンパクに対するIgGが多く存在するが、Gタンパクに対するIgGはほとんど存在しないことを明らかにした。一方、RSV非感染者は、Gタンパクに対するIgGを多く持つことを見出した。すなわち、RSVのGタンパクに対するIgGを誘導するワクチン開発の意義を示唆した。世界的にはpre-Fタンパクに対する抗体を誘導するワクチンの開発が盛んに行われているが、Axl阻害剤をアジュバントとすれば、Gタンパクを抗原としたワクチン接種により、RSV感染に対してより防御能の高い抗体の誘導が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。RSVワクチン接種後RSVに自然感染するとアレルギー反応を誘導し、かえって病態を悪化させる。最近我々は、アレルギー性気道炎症を病態のひとつとする喘息のマウスモデルを用い、その誘導にgrowth arrest-specific 6 (Gas6)/Axlシグナルが関与することを示した。そこで、RSVワクチン(ホルマリン固定RSV: FI-RSV)接種後のRSV感染重症化モデル(FI-RSV VEDモデル)を作製し、上記シグナルの関与を検証することを目的とした。Gas6遺伝子欠損マウス、抗Axl抗体やAxl阻害剤投与は、それぞれコントロール群と比較して、喘息の病態を改善した。さらにGas6/Axlシグナル阻害は、RSV特異的IgE産生を抑制し、一方RSV中和抗体であるIgG2を多量に産生させた。以上の結果より、FI-RSV VEDは、Gas6/AxlシグナルがTh1免疫応答をTh2にシフトさせ、さらに樹状細胞の活性化抑制を誘導することにより生じる現象であることが示唆された。すなわち、Gas6/Axlをターゲットとすることにより、安全かつ有効なRSVワクチンの開発に繋がることが予想される。FI-RSV VED発症機構にGas6/Axlシグナルが関与し、そのメカニズムの一部を解明した。一方で、FI-RSVあるいはRSVによるGas6誘導機構や、Gas6/AxlシグナルによるTh2免疫応答誘導機構は不明のままである。RSVはTh2免疫応答を誘導することが知られている。特にRSVのコンポーネントタンパク質のひとつであるGタンパク質がTh2免疫応答を誘導するとされてきた。一方これまでの本研究は、RSV感染やFI-RSV接種によりマウス肺においてGas6が産生されることが明らかにした。すなわち、RSVのGタンパク質がGas6を誘導することが予想された。結果、RSVのGタンパク質をマウスに免疫し、RSVを感染させると、FI-RSVと同様接種後のRSV感染に伴いアレルギー性気道炎症がみられ、同時に肺におけるGas6産生が有意に増加した。さらにin vitroの実験において、樹状細胞をGタンパク質で刺激するとGas6が産生された。以上の結果より、RSVのGタンパク質が樹状細胞のGas6産生を誘導し、RSV感染に伴いTh2免疫応答であるアレルギー性気道炎症をひき起こすことが示唆された。次に、Gas6標的細胞の同定を試みた。我々は以下の理由から2型自然リンパ球(ILC2)に注目した。1)RSV感染に伴いTh2サイトカイン(特にIL-5とIL-13)が産生される。2)RSVを感染させたマウスに抗Axl抗体を投与すると、上記Th2サイトカインの産生が抑制される。3)ILC2はAxlを発現する。マウスより単離したILC2にリコンビナントGas6を添加したところ、予想に反し、Th2サイトカインは産生されなかった。むしろ、IL-33刺激によりILC2から産生されるTh2サイトカインは、Gas6処理により抑制された。in vivoモデルおいて抗Axl抗体投与はIFN-g産生を強く誘導することより、間接的にGas6はILC2のTh2サイトカイン産生を抑制することが示唆された。RSVのGタンパク質からのシグナルによりGas6が産生されることを明らかにし、RSV感染による一部のアレルギー誘導機構が示された。しかし、Gタンパク質からGas6が産生されるまでの機構は不明のままである。

また、アレルギー性気道炎症の発症にILC2が関与することを示唆した。ただし、それは間接的な関与であり、詳細な機構の解明には至っていない。Respiratory syncytialvirus (RSV)は、そのコンポーネントタンパクのひとつであるGタンパクによりTh2免疫応答を誘導する。これが従来のRSVワクチン(ホルマリン固定不活化RSV: FI-RSV)接種後のRSV感染に伴う喘息様のアレルギー応答の誘導の原因である。一方これまでの本研究では、RSV感染やFI-RSV接種によりgrowth arrest-specific 6 (Gas6)が産生されることを明らかにした。これらの機構として、Gタンパクが樹状細胞に作用するとGas6が産生され、その受容体であるAxlを介してTh2免疫応答であるアレルギー性気道炎症を誘導することを示した。世界的に安全かつ有効なRSVワクチンの開発には至っていないが、これまでに我々が見出した結果から、Axlを標的としたアレルギーを誘導しないワクチン接種法の開発ができるのではないかと予想した。そこで、Axl阻害剤であるBGB324を抗原(FI-RSVやリコンビナントRSV Gタンパク)と混合したものを接種し、その後RSVに感染させると、アレルギー性気道炎症はほとんど誘導されなかった。しかも阻害剤接種群ではIgG2産生の促進と、ウイルスの複製の抑制がみられた。すなわち、Axl阻害剤はアジュバント様の効果を示し、RSVの抗原に関わらず安全性と有効性を担保した新規ワクチン接種法の開発につながることを示唆した。また我々は、RSV感染重症患者の血中には、pre型fusion (pre-F)タンパクに対するIgGが多く存在するが、Gタンパクに対するIgGはほとんど存在しないことを明らかにした。一方、RSV非感染者は、Gタンパクに対するIgGを多く持つことを見出した。すなわち、RSVのGタンパクに対するIgGを誘導するワクチン開発の意義を示唆した。世界的にはpre-Fタンパクに対する抗体を誘導するワクチンの開発が盛んに行われているが、Axl阻害剤をアジュバントとすれば、Gタンパクを抗原としたワクチン接種により、RSV感染に対してより防御能の高い抗体の誘導が期待される。FI-RSVあるいはRSVによるGas6誘導機構や、Gas6/AxlシグナルによるTh2免疫応答誘導機構を解明する。樹状細胞やILC2といった獲得免疫と自然免疫系のGas6標的細胞(Axl発現細胞)に注目し、RSV感染に伴う免疫応答制御機構を解明する。また、RSV感染患者におけるGタンパク質とGas6産生の関係を探ることにより、本研究をより有意義なものにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
特定糖タンパク質の可視化による”フコシル化タンパク質特異的極性輸送“仮説の検証

我々は、最近目的の糖タンパク質のうち、特定の糖を持つタンパク質のみを可視化する新技術の開発に成功した。そこで本研究では、この新技術を利用してフコースという単糖の修飾に依存的な極性輸送のメカニズム解明を目指した。基質となるアルファ-フェトプロテイン(AFP)の発現系を確立し、また肝細胞由来のHepG2細胞で極性輸送をモニターできることを確認したものの、アジド修飾糖の細胞への取り込みに問題があり、AFPの極性輸送のアッセイを確立するにはいたらなかった。今後この実験系がうまく動くためにはtransfectionの効率の向上、または修飾糖の取り込み効率の増加に工夫が必要である。糖鎖修飾は真核細胞のタンパク質にとって主要な翻訳後修飾の一つであり、様々な疾病において糖鎖構造の違いがタンパク質の機能や安定性の変化をもたらしている例が数多く報告されている。それゆえ、特定の糖鎖構造を持つタンパク質の動態解析は糖鎖依存的におこる生命現象を紐解く上で重要である。これまで、大阪大学の三善らによって糖タンパク質糖鎖の成分である“フコース"依存的なタンパク質の極性輸送機構の存在が示唆されているが、その分子機構の詳細は不明である。一方我々は、最近目的の糖タンパク質のうち、特定の糖を持つタンパク質のみを可視化する新技術の開発に成功した(Nature Commun. 3, 907 (2012))。そこで本研究では、この新技術を利用して糖鎖依存的な極性輸送のメカニズム解明を目指した。本年度はモデルタンパク質として、ヒトで分泌され、Fuc依存的な極性輸送が示唆されているα-フェトプロテイン(AFP)-GFPの融合タンパク質の発現系の確立を目指した。まず極性輸送アッセイの系の確立に向けてHepG2の極性化は達成できた。またAFP中には分子中にN型糖鎖付加部位(Asn251)を一か所だけ持つが、野生型のAFPと、AFPのN型糖鎖付加部位を欠損したAFP(N251Q)のC末にGFPをつけたコンストラクトを作成した。これらのタンパク質は培養細胞中に発現することを確認したが、発現効率は期待よりかなり低かった。また、糖鎖の付加は確認出来た。また、分泌されるAFPを解析したところ、予想外に分子量の上昇がみられた。現在その原因を解析中である。そこで本研究では、この新技術を利用して糖鎖依存的な極性輸送をアッセイするシステムの開発を目指した。これまでアッセイの基質となるアルファ-フェトプロテインーGFP(AFP-GFP)の発現系を確立し、肝細胞由来であるHepG2細胞での発現に成功した。また、HepG2細胞を用いて、毛細胆管様構造ができることを既報どおり細胞の極性を保っていることを確認した。一方で細胞へのフコース修飾糖(アジ化フコース)の取り込みについてその効率が非常に低く、AFP-GFPを用いてFRETシグナルは確認できたものの、そのシグナルの特異性の確認や、ライブでのイメージングにはいたらなかった。今後この実験系を確立するためには、アジ化糖の取り込み効率を高める条件を探るとともに、AFP-GFPのトランスフェクションの効率を高めることが必要である。生物学実験系に用いるために作成したコンストラクトの発現効率が悪く、また予想外のタンパク質修飾が見られ、現在実験系の構築が思ったほど進んでいないのが現状である。今回発見された予想外のタンパク質修飾反応を明らかにするとおもに、AFPの発現系とAFPの極性輸送のアッセイ系を早期に立ち上げたい。研究費は順調に執行したが、未執行の予算が若干残ったので次年度に合わせて用いることとした。次年度消耗品の購入に使用する予定である。
家族法学におけるドメスティック・バイオレンスの横断的研究

本年度はDVの複合的構造と多機関連携による保護について、研究会、学会等で調査を行い、文献による研究を行った。DVには加害者と被害者との垂直関係だけではなく、子を巻き込み複雑な態様があることが明らかとなった。保護に関しては、児童虐待とは異なりDV事件は本人の意思に委ねられるため機関による支援が継続しないという問題があること、子がDVや虐待等で施設入所され親権の事実上の制限が行われているとき、児童相談所が法定代理についてどのように対応しているか、また親権制限時の未成年後見の申立てに消極的である理由について調査を行った。研究期間全体を通して、フィールド調査として米国ワシントンDCでDV裁判傍聴を行い、ヴァージニア州のディテンションセンター等施設を訪問して受刑者と家族との関わりを調査し、アメリカン大学ロースクールで複数の研究者と家族のプライバシー、ジェンダー、社会構造とDV等について議論を行った。滋賀県、大阪府の児童相談所、女性相談所を訪問し、児童虐待、DVに関する行政の取り組みについて調査を行った。警察・児童相談所・女性相談所等の多機関連携についての研究会、シンポジウムに参加し、報告、議論を行った。犯罪・社会学の見地からDVの原因、影響、支援について複数の学会・研究会で調査した。家族法分野の学会・研究会において、親子の交流や親権、ハーグ子奪取条約について調査、報告、議論を行った。文献調査として、法学のみならず社会学、臨床心理学、犯罪学、実態報告書等の欧文・和文の書籍、論文の調査、家族法に関する日米の裁判例、ハーグ子奪取条約に関する日本、諸外国の裁判例の調査を行った。以上の研究活動を通して研究期間中、論文等11編(図書掲載論文含む)を著し、シンポジウム報告1件、研究会報告1件、学会報告1件にて、法的課題、裁判実務の問題点、機関対応の開発余地の点等を明らかにした。ドメスティック・バイオレンス(DV)が、各事件の中でどのように影響しているかについて研究を行った。アメリカの児童虐待・ネグレクトの調査報告書によると、加害者にはDVがリスク要因となることが明らかにされている。2014年に死亡した146人の子の加害親はDVの加害者のみならず被害者であった。特にDV被害の影響で、子への身体的・精神的暴力、ネグレクトが誘発される場合がある。虐待後の親子再統合において、加害親のDV被害からの回復も視野に入れた取組みが必要であることが分かる。ハーグ子奪取条約に関しては、子の返還の例外となる「重大な危険」の事由(13条1項(b))に、DVが妥当するか否かが議論されている。アメリカではDV被害者が「明白かつ確信を抱くに足る証拠」によりその事実を証明しなければならない。Van de Sandeケースは、夫が妻を壁まで追い込み頭を殴打したり、首を絞めたり、階段の上から押したりという執拗かつ深刻な暴力があり、子の面前で妻を言葉汚く罵ったり、子どもの1人を折檻したことが証明され、裁判所は返還を拒絶した。Walshケースは、妻の顔面、胸、すねを打撲させたり、歯を折る等の暴力を頻繁に働いていた夫が、以前裁判所からのDV保護命令に背き、妻子のいる自宅に侵入したことから、1審では条件付き(アンダーテイキング)返還を認めたが、控訴審は子が重大な危険に曝される危険性があるとして、その決定を差し戻した。DV対策を条件に返還を認めた例もあるが、アンダーテイキングは返還国へ条件を課すものであり、外国裁判所への押しつけとなることから、実効性の点でも有効であるかは疑問となっている。DVには何より証拠と証明が鍵となる。一般に、親へのDVと子への加害は別物とされているため、DVがどのように子へ影響するのかについての証明を今後どのように構築をしていくかを検討していく必要がある。ドメスティック・バイオレンス(DV)要件が、家族法の各手続の中でどのように捉えられているかの研究成果として、初年度は、児童虐待手続について、「児童虐待に関するアメリカの法手続きーフロリダ州を例にしてー」社会安全・警察学第3号1-14頁(2017)を、「国際的な子の奪取の民事上の側面に関する条約」(以下、ハーグ子奪取条約)について、「アメリカにおけるハーグ条約の実務と監護権・面会交流」大谷美紀子・西谷祐子編著『ハーグ条約国内実施ガイドー子の奪い合い訴訟実務の考え方ー』(法律文化社、2017年10月発行予定)の各論文を執筆・発表した。研究者は、アメリカ家族法と日本家族法の比較研究を行っているため、その比較の対象は、本研究においてもアメリカ法となる。前者の研究については、過年度のアメリカ合衆国フロリダ州での児童虐待・ネグレクト裁判傍聴により知り得た知見を下に、全米の児童虐待・ネグレクト調査報告、および各州法、裁判例を調査し、日本の状況、法手続きと比較した。後者の研究については、アメリカにおけるハーグ子奪取条約マニュアル、各州法、判例法、およびハーグ子奪取条約判例データベース(INCADAT)による調査を行った。実務に関しては、ワシントンDCの裁判所でDVの裁判傍聴を行ったが、これについてはまだ論文としてはまとめておらず、今後の課題である。DVが家族事件に現れると、紛争性が高くなる。当該年度では、DVを含む高葛藤夫婦の面会交流、監護者・親権者指定事件について研究を行った。