hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カルシウム動員性細胞内情報伝達の脱感作に対する生理的阻害機構の解析

モルモット盲腸紐平滑筋を用いたこれまでの解析から、ムスカリン受容体に強い刺激を加えると、受容体を介したカルシウム動員性細胞内情報伝達過程の各段階で複合的に脱感作性変化が進行するが、これらの脱感作の進行を阻害する生理機能(脱感作進行阻害性再感作)も同時に作動することを実証し、細胞応答が脱感作と再感作の相反する二重機構により制御されていることを初めて明らかにした。当該年度は、これらの二重制御機構に蛋白質燐酸化反応がどのように関与しているのかを明らかにする目的で、受容体・G蛋白質レベルでの脱感作/再感作に対する非特異的プロテインキナーゼ阻害薬H7の作用を調べた。その結果、(1)受容体自身の機能低下は、刺激初期に迅速に作動するH7感受性(かつカルシウム依存性)脱感作機構と、刺激後期に持続性に作動するH7非感受性(かつカルシウム非依存性)脱感作機構の異なる2つの機構により誘発されること、(2)G蛋白質自身の機能低下は、刺激初期に迅速に作動するH7感受性(しかしカルシウム非依存性)脱感作機構と、刺激後期に持続性に作動するH7感受性(かつカルシウム非依存性)脱感作機構の異なる2つの機構により誘発されること、(3)受容体・G蛋白質レベルでの再感作は、刺激初期のH7感受性脱感作が進行した場合にのみ誘発されることが明らかとなった。以上の結果から、H7感受性プロテインキナーゼおよびH7非感受性機構が脱感作の誘発・維持に複雑に関与すること、また、H7感受性蛋白質燐酸化反応の解除(例えば、プロテインホスファターゼの活性化)により再感作が誘発される可能性が示唆される。今後、脱感作/再感作に関与するプロテインキナーゼ/プロテインホスファターゼを特定していくことにより、細胞応答の制御機構の詳細を把握し、それが更に、脱感作に起因する疾病・老化・薬物治療効果低下に対する新対処法に結び付くことが期待される。
癌遺伝子解析によるヨード摂取が甲状腺癌発生にあたえる影響の研究

背景:甲状腺癌の発生は、食物からのヨード摂取が関わっていると言われており、数十年前より食塩に無機ヨードを加えるようになった欧米では、甲状腺癌の発生形式が変化した。現在なお深刻なヨード摂取不足地域からは、高頻度の予後不良な甲状腺癌の報告があり、これらの地域からの標本を用い地域差による比較検討が必要であると考えた。実施経過:1997年1月3日より1月12日まで高度のヨード不足地域を抱えるパキスタンイスラム共和国を訪問した。パキスタン駐在大使を通じ、前PIMS(Pakistan Institute of Medical Science)院長Mushtaq教授を紹介されPIMSとの協同研究の承諾を得た。さらにZrina内科学教授、Anwaru-Haque病理学教授の協力を得てパラフィン包埋標本を日本へ持ち帰った。また外科医師の協力で、訪問中の手術症例より新鮮標本を得る機会も得たが、凍結材料の入手や運搬に関わる規制により今回は断念した。対象:パキスタンより得た、全8症例(甲状腺濾胞癌5例、乳頭癌2例、髄様癌1例)、計23検体を対象とし、以前より継続していた米国人症例93例、日本人症例56例との比較検討を試みた。結果:1)疫学的検討:今回得た8症例はPIMSでのある一定期間の手術症例であるが、その組織別頻度(濾胞癌62.5%、乳頭癌25%、髄様癌12.5%)は長期間を通じての頻度とほぼ同様とのことであり、日本での頻度(濾胞癌5-15%、乳頭癌80-90%、髄様癌2-5%)に比べ大きな差異を認めた。2)組織学的検討:乳頭癌症例を含め、全体に被膜や血管への浸襲傾向が強く、リンパ管浸襲が少ない、日本人症例とちょうど逆の傾向を認めた。3)分子生物学的検討:標本の保存法の問題と思われるDNAの破損より、検体からのDNA抽出やPCR増幅が難航中である。現在まで評価できたpgp.Gi2.H・ras遺伝子では点変異を認めず、日本人症例や米国人症例と同様であった。考察:疫学的にも組織学的にも甲状腺癌とヨード摂取の関わりは強く示唆されるが、今回は8症例と対象が少なく、統計学的検証には不足しており、症例数の追加が必要とされる。遺伝子学的には以前報告のあるK-rasや申請者が今まで報告してきたN-ras、最も予後に重要なp53での検討が難航している。今後、保存、輸送方法を考え、新鮮な検体を用いて検討してゆきたい。
反芻胃プロトゾアのホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼに関する研究

ホスホエノールピルビン酸ホスホムターゼ(C-Pムターゼ)は、反芻胃プロトゾアをはじめ多くの下等生物に含まれる新しい酵素である。これは解糖系とC-P化合物代謝系とを結ぶ鍵酵素と考えられているがその実態は不明である。そこで、反芻胃プロトゾアにおける本酵素の機能を明らかにするため、これを精製し、性質を調べようとした。1.C-Pムターゼの定量法:本酵素によりホスホエノールピルビン酸(PEP)からホスホノピルビン酸(PnPY)を生成させ、これをジニトロフェニルヒドラゾン誘導体として高速液体クロマトグラフィーで分離する化学定量法の改良を図り、分析を24時間で完了し、定量限界を50pmolに下げることができた。また、酵素定量法も検討し、生成PnPYをpH7.2、アスパラギン酸の存在下、アスパラギン酸トランスアミナーゼでアミノ化し、この際生じるオギザロ酢酸をNADH存在下、リンゴ酸脱水素酵素で定量する方法を開発した。さらに、これらとは逆の反応を利用し、pH7.6においてPnPYからPEPを生成させ、これをADPとNADH存在下、ピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素で定量する方法を検討し、毎分10nmolのPEP生成を測定することができた。2.C-Pムターゼの精製と性質:めん羊の反芻胃から常法により混合プロトゾアを集め、超音波破壊後、可溶画分を硫安塩折すると、活性は60-80%飽和沈澱画分に集まった。これをゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーに附し、活性を約200倍に濃縮したが、電気泳動的には、まだ不純であった。活性発現にはMgイオンが要求された。上記の硫安沈澱画分を陰イオン交換樹脂により分画後、化学定量法とPnPら合成の逆反応を利用した酵素定量法とによって測定すると、酵素活性値は異なり、C-Pムターゼには2種以上存在することが示唆された。
イネのミトコンドリア遺伝子の発現と雄性不稔

播種後7日目のイネ(日本晴)の芽生えから、ミトコンドリアを単離後、ミトコンドリアRNAを抽出し、すでに構築してあるミトコンドリアゲノム全体をカバーするクローンバンクのDNAをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションをおこなった。その結果、イミネトコンドリアゲノム全体の大まかな転写地図が完成し、少なくとも27種、36個の転写単位が存在することがわかった。この結果からイネのミトコンドリアゲノム上には、特に転写活性の高い領域が存在するわけではなく、全体にわたって一様に転写されていることがわかった。今後、より詳細な転写地図を作るとともに、雄性不稔細胞質のミトコンドリアゲノム全体にわたる転写物との差異を見いだす。ミトコンドリア呼吸系を構成するタンパク質で核ゲノムにコードされているもののうち、cytochrome bc_1複合体の構成タンパク質の一つであるRieske型鉄イオウタンパク質(RISP)の2種のcDNA(RISP1,RSIP2)、およびF_1-ATPaseのδ′サブユニットをコードするcDNAをクローンニングし塩基配列を決定した。ゲノミックサザンの結果、RISPについては2コピー、δ′サブユニットについては4コピー以上がイネ核ゲノム上に存在することが示唆された。これらのクローンをプローブとしてノーザン解析を行ったところ、RISP1、δ′サブユニットともに減数分裂期の幼穂で強く発現しているのがわかった。このことは、核にコードされたミトコンドリア呼吸系の遺伝子が協調的に発現していることを示唆している。RISP2についてはどの組織でも発現は弱く、発芽初期の根においてわずかに発現しているのが確認された。
ラット脊椎固定モデルにおける新しいビタミンＥ誘導体の骨癒合能の検討

BMPとBisphoshonate投与時の骨融合(脊椎固定)への影響や、当大学で開発させたビタミンE誘導体の担体としての有効性と安全性を検討するためにラット脊椎固定モデル、ラット大腿骨骨折モデルを確立した。その結果、BMPとBisphoshonate投与時の方が骨の癒合、形成が良かった。これより、この組み合わせが、骨癒合を促進させ脊椎固定術に有用な可能性が示唆され、将来的な臨床応用が期待される。ビタミンE誘導体の骨誘導能の評価及びBMPの担体としての効果を検討するためにラット脊椎固定モデル、ラット大腿骨骨折モデルを確立した。また、ビタミンE誘導体との親和性の高いマテリアルを検討するために様々なマテリアルと様々な濃度のビタミンE誘導体、BMPを癒合させ担体としての能力を検討した。その結果、Medgelとの相性が良いことが判明した。ビタミンE誘導体以外の試薬も検討し動物実験を施行した。ラット脊椎固定モデルはラットの背部を約4cm切開し傍脊柱筋を筋膜から切開しL4, L5の脊椎横突起を展開した後、横突起間にマテリアルを置いた。ラット大腿骨骨折モデルはラットの大腿外側部を約4cm切開し大腿外側広筋を筋膜から切開し大腿骨を展開した後にボーンソーにて骨折させ、それをK-wireにて骨接合し、骨接合部にマテリアルを置いた。マテリアルを移植し6週間後にラットをsacrificeし移植した脊椎や大腿骨を摘出した。徒手骨癒合試験後に、X線撮影し、H.E染色による病理組織標本を作製した。また、マイクロCT検査やバイオメカニカルテストを施行した。レントゲン像から骨癒合の判定の有無と、さらに病理組織標本から組織学的骨融合評価、架橋形成、骨陵の大きさ、細胞浸潤の程度など検討した。マイクロCT検査にて新生骨の詳細な検討とバイオメカニカルテストにて癒合した骨の力学的強度を検討した。その結果、ビタミンE誘導体以外に高脂血症薬のシンバスタチンが骨形成能を持つことが示唆された。さらなる検討が必要となり、現在、追加実験中である。結果が判明し次第に、国内、国外の学会に発表し学術誌に投稿する予定である。また、ビタミンE誘導体との親和性の高いマテリアルを検討するために様々なマテリアルと様々な濃度のビタミンE誘導体を検討した。その後に動物実験を施行した。その結果、さらなる検討が必要となり、現在、追加実験中である。マテリアルを移植し6週間後にラットをsacrificeし移植した脊椎を摘出した。また、マイクロCT検査を施行した。マイクロCT検査にて新生骨の詳細な検討した。その結果、ビタミンE誘導体以外に高脂血症薬のシンバスタチンが骨形成能を持つことやBMP-2とZoledronic acid(ZA)の相互効果が示唆された。医歯薬学当初期待していた骨誘導能がビタミンE誘導体に乏しく、他の様々な試薬を検討している。そのため、追加の動物実験が必要である。

ビタミンE誘導体の骨誘導能の評価及びBMPの担体として、ラット大腿骨骨折モデルを用いて検討した。マイクロCT検査にて新生骨の詳細な検討とバイオメカニカルテストにて癒合した骨の力学的強度を検討した。その結果、骨癒合率が予想より低く、さらなる検討が必要となり、現在、追加実験中である。高脂血症薬のシンバスタチンが骨形成能を持つことが示唆され、追加の動物実験、及び評価をしていく予定である。ラット脊椎固定モデルにおける新しいビタミンE誘導体による新生血管の検討とラット大腿骨骨折モデルにおける新しいビタミンE誘導体の効果の検討を実験数を多くして行う。当初の計画より、動物実験の計画が遅れており、動物や試薬の購入を次年度行い物品費を使用する必要がある。成果を考察したり発表するために学術集会、会議に出席する旅費、成果を発行する出版費用が必要である。実験を施行し、各種評価を行い、当初の計画を遂行するため物品費を使用する。また、その成果を考察したり発表するため学術会議に出席しプレゼンテーションを行う。ラット脊椎固定モデルにおける新しいビタミンE誘導体による新生血管の検討上記1.ー3.までは同様の操作をおこなう。(ラット各群10匹)手術8週後に、麻酔下に開腹し下大静脈に26ゲージ針を留置後、2500単位のヘパリンを静脈内投与しつぎにIndian Ink 50mlを130mmHgで静脈内に投与する。その後、脊椎を摘出し,透明標本を作製する。評価は専用ソフトNS2K-Proを用いて、単位面積当たりの黒さを数値化し、各群において統計学的検討を行う。、
静脈認証技術を血行モニタリングへ応用するための基礎的研究

ラットの皮弁血管を遮断する簡易的な閉塞モデルで皮弁静脈の変化を観察した。Wistar系ラットの腹部島状皮弁を挙上し、皮弁を栄養する血管(大腿動静脈)を遮断(クランプ)し、赤外線カメラで皮弁観察を行った。血管の閉塞前、動脈のみの閉塞、静脈のみの閉塞、動静脈の閉塞の閉塞に応じた皮弁の血管像データの比較を行い、特徴の抽出を行った。結果、茎の動静脈の閉塞による皮弁内の血管の特徴的な変化をとらえることができた。動脈のみの閉塞では、皮弁の血管は太く鮮明化するが、血管そのものは蛇行しないで直線的である。静脈のみの閉塞では皮弁の血管は太く鮮明化しかつ大きく蛇行する。動脈及び静脈の閉塞では血管は蛇行するが、血管の太さはそれほど増加しない。ただし、この特徴は血管の一部を閉塞させる血管狭窄モデルでは確認できなかった。最終年度ではコンピューターの目(Computer Vision)に血管の特徴量をとらえさせることを目指し、数値解析ソフトウェアであるMatlabで画像の鮮明化及び画像の特徴量抽出のプログラム開発を行った。血管の特徴的な変化をコンピューターで認識させるためには、血管の形状変化を数値化する必要がある。河川の屈曲の程度を表す、蛇行率を採用したところ、静脈の閉塞の判定については有効であった。動脈の閉塞の判定については血管の変化が少なく、研究期間内では有用な数値化を見いだせなかったため、今後の課題となる。しかしながら、考案したアルゴリズムによる血行モニタリングは、血管の形状という大きなデータ量(2次元行列)から血管閉塞を判定する点で、1つの対象変数(1次元)で血管閉塞の判定を行う酸素飽和度などを用いる方法よりも信頼性の高い方法となりうる。マイクロサージャリーで悲願である移植組織の血行の連続モニタリングデバイスの実現にとどまらず、臨床医学で組織の血流の評価が必要となる他分野への貢献が期待できる。つぎにラットの皮弁血管をクランプさせる簡易的な閉塞モデルで皮弁静脈の変化を観察し、画像データの収集を行った。Wistar系ラットの腹部の島状皮弁を挙上し、皮弁を栄養する血管(大腿動静脈)を摘む(クランプ)など条件を変えて赤外線カメラによる皮弁観察を行った。血管の閉塞前、動脈のみの閉塞、静脈のみの閉塞、動静脈の閉塞に応じた皮弁の血管像変化の検出を試みたが、ラットの血管が人間に比して細く、開発したMatlabプログラムでは十分な血管の検出が困難であった。ラットの週齡、赤外線照明の仕方及び顕微鏡カメラの変更やMatlabプログラムの改変などを通じてラット皮弁モデルのさらなる開発が必要である。ヒトの手背及び足背を対象にMatlabによる血管検出のプログラムの作成まで順調であった。実際にラットの皮弁の静脈を赤外線カメラで検出しようとすると、ラットの血管がヒトに比して細すぎるため開発したプログラムによる血管検出が困難であった。ラットの皮弁血管を遮断する簡易的な閉塞モデルで皮弁静脈の変化を観察し、画像データの収集を行った。Wistar系ラットの腹部の島状皮弁を挙上し、皮弁を栄養する血管(大腿動静脈)を遮断する(クランプ)条件を変えて赤外線カメラによる皮弁観察を行った。結果、茎の動静脈の閉塞による皮弁内の血管の特徴的な変化が以下のように明らかとなった。静脈のみの閉塞では皮弁の血管は太く鮮明化し、かつ大きく蛇行する。さらに、実際の臨床条件に近い皮弁モデルを作成し、皮弁静脈のモニタリングを経時的に行って、考案したアルゴリズムが有効であるかを検証した。血管狭窄モデルについては皮弁血管の変化をとらえることができなかったが、血管が閉塞した場合はアルゴリズムが有効であることが判明した。加えてコンピューターの目(Computer Vision)に血管の特徴量をとらえさせることを目指し、MathWorks社の数値解析ソフトウェアであるMatlabで画像の鮮明化及び画像の特徴量抽出のプログラム開発を行った。考案したアルゴリズムを血行モニタリングに応用することで、高次元で血管閉塞の判定を下せると考えられる。また今日の静脈認証デバイスは非接触型で小型化されており、本研究で明らかにされる血管閉塞による静脈変化のアルゴリズムをこれらの高度な技術に加えて巧妙に転用することで、信頼性が高く簡便な連続モニタリングデバイスを生むことができると考えられる。これにより遊離組織移植にとどまらず、組織の血流の評価を行う臨床全般への貢献が期待できる。茎の動静脈の閉塞によるラット皮弁内の血管の特徴的な変化が明らかとなった。さらに、実際の臨床条件に近い皮弁モデルを作成し、皮弁静脈のモニタリングを経時的に行い、考案したアルゴリズムの有効性の検証がなされた。

動脈のみの閉塞では、皮弁の血管は太く鮮明化するが、血管そのものは蛇行しないで直線的である。静脈のみの閉塞では皮弁の血管は太く鮮明化しかつ大きく蛇行する。動脈及び静脈の閉塞では血管は蛇行するが、血管の太さはそれほど増加しない。ただし、この特徴は血管の一部を閉塞させる血管狭窄モデルでは確認できなかった。最終年度ではコンピューターの目(Computer Vision)に血管の特徴量をとらえさせることを目指し、数値解析ソフトウェアであるMatlabで画像の鮮明化及び画像の特徴量抽出のプログラム開発を行った。血管の特徴的な変化をコンピューターで認識させるためには、血管の形状変化を数値化する必要がある。河川の屈曲の程度を表す、蛇行率を採用したところ、静脈の閉塞の判定については有効であった。動脈の閉塞の判定については血管の変化が少なく、研究期間内では有用な数値化を見いだせなかったため、今後の課題となる。しかしながら、考案したアルゴリズムによる血行モニタリングは、血管の形状という大きなデータ量(2次元行列)から血管閉塞を判定する点で、1つの対象変数(1次元)で血管閉塞の判定を行う酸素飽和度などを用いる方法よりも信頼性の高い方法となりうる。マイクロサージャリーで悲願である移植組織の血行の連続モニタリングデバイスの実現にとどまらず、臨床医学で組織の血流の評価が必要となる他分野への貢献が期待できる。照明やカメラの変更やプログラムの改善を検討していく。また、ラットの皮弁血管がヒトで機能していたプログラムに認識されない原因として、ラットの血管がヒトに比して小さすぎることの他に、麻酔下のラットの体温が低下し血管収縮が起きていることが考えられた。ラットが十分に大きくなる週齢までまち、ラットを暖めるなどして血管をできるだけ拡張させるなど条件の変更を行い、ラット皮弁モデルの確立を模索していく。すでに判明したアルゴリズムをコンピューターの目(computer vision)でとらえるための、プログラムの模索をさらに行う。血管変化画像を抽出し、画像サンプルをコンピューターで学習させ、分類器を作成する。特徴の抽出にはオブジェクトの検出に適した勾配方向ヒストグラム(HOG)特徴を検討している。観測システムの改善のため、新たな物品の購入を検討しているが、十分にまとまった資金とならないため。当該実験について、ラットの使用数などの合理化が行えた。今後は判明したアルゴリズムをコンピューターの目(computer vision)でとらえるための、プログラムの模索をさらに行う。その上で、研究成果を雑誌論文として投稿を行う。時年度の交付金と併せて観測システムの構築に必要な物品の購入にあてる予定である。
感情障害に対するスポット尿を用いたデキサメサゾン抑制試験の有用性について

我々は精神科領域におけるスポット尿を用いたデキサメサゾン抑制試験の有用性について検討を行ってきた。予備的研究として外来通院中のラピッドサイクラ-の患者にスポット尿によるデキサメサゾン抑制試験を試みたところ、ステイトマーカーとして有効である可能性を示唆する結果が得られた(Biological Psychiatry 38,128-130,1995)。本研究では対象を感情障害に広げ従来の血中コルチゾールを用いたデキサメサゾン抑制試験と、スポット尿を用いたデキサメサゾン抑制試験を平行して行い、その感受性、特異性を検討した。今回の研究の結果はスポット尿によるDSTにおいて2日目8時、16時でのコルチゾール/クレアチニン比(C/CR)がうつ病での生物学的指標として非常に有望である可能性を示唆した。特に2日目16時のC/CRは非抑制群と抑制群のみでなく、非抑制群と健常者群でもほとんどオーバーラップを認めなかった。これらの結果より従来の血中コルチゾール測定によるDSTよりC/CRを用いた方がより感受性が高いのではないかということが示唆された(Biological Psychiatry in press,1996)。今後の展開としては今回の方法をより多数例の患者で試みる必要があるとともに、他の精神疾患の患者においても試みることで感受性、特異性の検討を行う必要があると思われた。
高等植物の偏差成長分子機構の分子遺伝学的研究

オーキシンによる胚軸の偏差成長反応はオーキシン応答性転写調節因子ARF7とオーキシン早期誘導性遺伝子IAA19によって調節されていると考えられる。偏差成長におけるIAA19の機能を明らかにするために、IAA19のT-DNA挿入系統を2系統単離してその偏差成長反応を調べた。その準備として、IAA19の全長cDNAを単離し、その遺伝子構造を調べた。その結果、IAA19のプロモーター領域には、TATAボックスの上流にオーキシン応答性シス因子が3コピー存在することが分かった。挿入系統の一つは、このシス因子の中にT-DNAが挿入しており、ノーザン解析ではオーキシン処理の有無にかかわらず、ほとんどmRNAシグナルは検出されなかった。他方の系統では、T-DNAはドメインIVの前半に挿入されていて、野生型より長いmRNAが検出され、そのレベルはオーキシン処理によって増加した。この結果は、後者の系統では途中に終止コドンが入ったmRNAが形成されていることを示している。これら2系統について、胚軸の屈地性、屈光性や暗所でのフック形成を調べた。屈光性については、標準的な光強度からその1000分の1の微弱な光強度の範囲で反応を調べた。屈地性については、弱い重力刺激に対する反応を調べるために45度や22.5度回転した場合の反応も調べた。しかし、いずれの場合もこれらの反応は野生型と有意な差はなかった。以上の結果は、これら挿入系統は遺伝子破壊を起こしていない可能性も示唆しており、ORFの上流部に挿入された系統を今後調べる必要があることが示された。
ネオ・セルフの遺伝子解析

特定のHLAアレルとの関連性が示されている疾患は100種以上に及ぶが、「なぜHLAと疾患が関連するのか?」という疑問は長年未解決のままである。本研究班では、NGSの革新的技術を駆使し、「ネオ・セルフ」に起因する疾患発症機序を明らかにすることに挑戦している。ネオ・セルフ形成に関わる先天的および後天的な遺伝要因をゲノム研究の観点から包括的に理解する類似研究はなく、本国がこの分野での主導権を握る上での急務の課題である。本年度では、健常者406検体を用いてHLA遺伝子全長の塩基配列を決定し、非同義置換を含む数多くの新規多型を検出した。封入体筋炎や抗PD-1抗体阻害薬関連筋炎について特定のHLAアレルとの関連性を明らかにした。骨髄移植ドナー161検体を用いたRNA発現量のアレル間比較を実施し、RNA発現量に基づく新たな分類体系を整備し、それに基づくRNA発現量と移植成績との関連性を精査することが可能になった。さらには、HLA領域における転写制御領域も含めた解析から詳細な遺伝子型-表現型の関連の構造を解明することを目指し、1細胞RNA-seqによるHLAアレルの発現解析、ナノポアシークエンサーを用いたHLAタイピングおよびHLAハプロタイプ構造解析の開発を進めた。具体的には、ナノポアシークエンサーからのロングリード情報から転写調節として個々のHLAアレルとそれぞれのシス転写制御領域の相を考慮した解析が可能となった。また、1細胞RNA-seqにより各HLA遺伝子のアレル特異的は発現バランスを1細胞ごとの異質性も考慮して検討することが可能となった。NGSによる疾患ゲノム解析の種々の手法を開発し、それらを活用しているため、概ね順調に進展していると言える。また、研究開始当初からの目的に変更は無く、大きな計画変更も無い。研究開始当初からの計画の一つであるネオ・セルフ現象を理解するための遺伝子解析手法開発として、RNA発現に影響を及ぼすDNA多型の特定が可能な実験系の構築、RNA発現に影響を及ぼす多型の特定、ロングリードによる遺伝子と転写調節領域を相として解析することでシス調節を明らかにする手法、および細胞間異質性も考慮した1細胞RNA-seqにより各HLA遺伝子のアレル間の発現バランスを細胞ごとに解析する手法を進めた。前年度に引き続きRNA発現量の差異を規定する多型や変異の特定をHLA-C以外のHLA座にも展開させると共に前年度までのデータからHLA Expressionタイピングの開発を進める。これにより疾患解析や移植医療にて使用されているHLA DNAタイピングと統合することにより、多型とRNA発現を融合させた本研究班独自のHLAタイピング法を提唱したい。また、この方法を駆使しながらAMLやATLなどの白血病細胞や筋炎における遺伝子発現に重要な役割を担うネオ・セルフ生成の遺伝要因をHLA多型とRNA発現の両面から明らかにすることを目指す。遺伝子型-表現型関連構造からのネオ・セルフメカニズムの理解と病態制御計画:MHC-PheWASから明らかになった遺伝子型-表現型の関連の構造はどのように機能的し、なぜ疾患発症に至るのか、ゲノムDNA、RNAおよび転写制御メカニズムを明らかにするためのエピジェネティック解析を統合したオミックス解析手法により明らかにしたい。1細胞RNA-seqによりHLA遺伝子およびその関連分子の発現を1細胞レベルで解析し、細胞間の異質性も含めて解析することが可能となることから、今後、本手法を用いた解析で、ネオ・セルフに起因する疾患の発症機序を理解がさらに進むことが期待できる。再生不良性貧血(AA)を対象にNGSによるHLA対立遺伝子のゲノムDNAおよびRNAを解析した。6p染色体ヘテロ接合欠失(6pLOH)を有する43人の患者を含む312人のAA患者のHLA対立遺伝子喪失頻度を検討した。失われたハプロタイプに含まれるHLA対立遺伝子は、HLA -B *40:02が最も高頻繁に欠失していた。また、B4002(- )、A(+)の顆粒球におけるHLA-B *40:02のディープシーケンスの結果、15人の患者すべてにて、フレームシフト、ナンセンスおよびスプライス部位突然変異などの様々な体細胞突然変異を明らかにした。さらに抗原提示に関与していないHLA-B *40:02のα3領域におけるミスセンス変異は、B4002( - )顆粒球を有する3人の患者のB4002(+)顆粒球においてのみ検出された。6pLOHまたは遺伝子突然変異のいずれかまたは両方の結果としてHLA-B *40:02分子を欠く白血球の顕著に高い罹患率は、HLA-Bアレルを介した造血幹/前駆細胞による細胞傷害性T細胞への抗原提示がAAの発症機序となっている可能性を示唆した。NGSによる疾患ゲノム解析のためのリソースを整備したこと、疾患ゲノム解析の手法を開発し、その有用性を実証したことからおおむね順調に進展していると考えられる。

日本人に高頻度なHLAアレル、計253種類の塩基配列を遺伝子全領域レベルで決定した。同種造血幹細胞移植に伴う急性GVHDはHLA-DPB1のエキソン3 - 3'UTRがリスクとなることを明らかにした。NGSによる各HLA座のアレルごとのRNA発現解析法を開発し、HLA-DRAを除けば1.3-7.3倍のRNA発現量のアレル間差異があることを明らかにした。このアレル間差異はin vitro実験でも再現性があることを実証した。日本人(n=1,120)の33個のHLA遺伝子のNGSによる高解像度HLAタイピングとそれらの連鎖不平衡構造を元にHLA imputationのためのリファレンスを作成した。日本人集団における膨大なGWASデータ(n=166,190)のSNPデータからHLA imputationを実施し、52の表現型において顕著な遺伝子型-表現型の関連を同定した。HLA領域における多型情報およびHLA遺伝子間の相関ネットワーク解析から、複数のHLA遺伝子による構造パターンが異なる表現型間で共有されることを見出した。AA患者白血球におけるHLA片アレル分子欠損を対象にNGS解析からHLA-Bアレルを介した造血幹/前駆細胞による細胞傷害性T細胞への抗原提示がAAの発症機序となっている可能性が示唆された。NGSによる疾患ゲノム解析の手法を開発し、その有用性を実証しつつあるため、概ね順調に進展していると言える。また、研究開始当初からの目的に変更は無く、大きな計画変更も無い。ところが、この2年間の研究成果から見えてきたのは、HLA領域のゲノム多様性と疾患の関連は当初の予想よりも複雑であるということであった。関連する疾患とHLA領域全体で推定される遺伝的効果および各HLA遺伝子間の遺伝的相関ネットワーク解析から、表現型に共有される複数のHLA遺伝子による構造パターンが見出された。この複雑さは当初から予測しており、HLA領域の網羅的なゲノム情報、転写制御を含む機能的な多型情報、HLAハプロタイプを考慮したRNA-seqによるトランスクリプトーム解析、ATAC-seqによるオープンクロマチン領域解析、DNAメチル化解析を視野に入れた計画としていた。トランスクリプトームおよびエピジェネティック形質は組織・細胞特異性があるため、当初の計画に加えて細胞間異質性も考慮した一細胞レベルでの解析も検討している。特定のHLAアレルとの関連性が示されている疾患は100種以上に及ぶが、「なぜHLAと疾患が関連するのか?」という疑問は長年未解決のままである。本研究班では、NGSの革新的技術を駆使し、「ネオ・セルフ」に起因する疾患発症機序を明らかにすることに挑戦している。ネオ・セルフ形成に関わる先天的および後天的な遺伝要因をゲノム研究の観点から包括的に理解する類似研究はなく、本国がこの分野での主導権を握る上での急務の課題である。本年度では、健常者406検体を用いてHLA遺伝子全長の塩基配列を決定し、非同義置換を含む数多くの新規多型を検出した。封入体筋炎や抗PD-1抗体阻害薬関連筋炎について特定のHLAアレルとの関連性を明らかにした。骨髄移植ドナー161検体を用いたRNA発現量のアレル間比較を実施し、RNA発現量に基づく新たな分類体系を整備し、それに基づくRNA発現量と移植成績との関連性を精査することが可能になった。
B細胞初期分化過程の研究

ヒトやマウスにおいてB細胞は骨髄内で恒常的に生産されているが、B細胞も含めて骨髄内での恒常的造血システム維持のために必要な分子機構について明らかにする目的でいくつかの研究所と共同研究を行った。計画は一年で終了したが、現在までに得られた成果を元に、今後も人的交流は行わないものの共同実験は継続しており、この多分長期にわたる協力関係の契機を与えていただいた本研究助成に感謝する。さて、今回の研究のもっとも大きな成果は、骨髄での恒常的造血にとって中核的役割を果している二つの系が明らかに出来た事である。先ず、林眞一はこの研究計画が開始された直後に、大理石病の原因遺伝子明らかにすることに成功し、この結果を元にジャクソン研究所のL.D.Shultz博士との共同研究を行い、この突然変異マウスについて組識学的な解析を行った。この結果、MーCSFとその受容体であるcfmsは、従来考えられていたような成熟マクロファ-ジの増殖維持系としての重要性よりも、骨髄腔を形成して造血の場を維持するために必須の系であることが明らかになった。骨髄内で造血を維持するためには先ず骨髄腔を形成することが必要であると言う単純な事実を考えると、今回の我々の結果は造血システムの基本論理を理解するための重要な手がかりを与えたと言える。一方、骨髄腔が形成されても、ここで造血幹細胞の自己再生が維持されないことには恒常的造血は有り得ない。この分子機構を明らかにするために、我々はまず造血系に発現しているもう一つの受容体型チロシンキナ-ゼcーkitとそのリガンドであるSCFに着目して研究を始めた。実際には、cーkitに対するモノクロ-ナル抗体を作成し、この抗体を使って、cーkitの機能を阻害することによって、成熟マウス体内でのこの分子の機能を調べることを試みた。幸い、この研究が開始された直後にcーkitに対するモノクロ-ナル抗体が作成できたため、B細胞を含むいくつかの血液細胞系列の細胞株についての研究を行っている、アラバマ大学Max D.Cooper博士、及びバ-ゼル研究所のR.Palacios,Fritz Melchers,Ton Rolling博士らとの共同実験を開始した。直接我々も参加したこの研究のは、現在も継続中で、論文として一部がようやくまとまりつつある段階ではあるが、リンパ球も含む全ての血液細胞系列の初期分化の過程の自己再生には、cーkitとそのリガンドが必須のシステムとして重要な役割を演じていると言うことが明らかになった。ただ、この結果は、主にバ-ゼル研やアラバマ大学で開発されてきた細胞株についての事で、実際に同じ事が成熟マウス内でも起こっているのかに関しては、生体内に抗体を投与する実験を我々の研究所で続けることにより明らかにしていく必要があると考えている。これらの結果をまとめると、造血システムを次のようにとらえられるのではないかと考えている。現在、造血に関与する分子として20近いサイトカイんが明らかにされ、その遺伝子も既にクロ-ニングが終っている。しかし、この様に多くの分子を造血システムにどの様に配置すればよいのかに関しては明確な考えが殆どまとめられておらず、「サイトカインネットワ-ク」と言う曖味な既念の元に理解しようとする試みがある程度である。しかし、我々の研究結果は、造血システムは数層の階層構造を形成しており、受容体型チロシンキナ-ゼとそのレセプタ-であるcーkit/SCF,cーfms/MーCSFがこの階層構造の下部構造として位置づけらる事を示唆している。即ち、全ての血液系列細胞に共通の自己再生維持システムがcーkit/SCF系であり、この自己再生に必要な場を骨髄内に準備するシステムとしてのcーfms/mーCSF系である。従って、その他の造血因子はこの中核構造の上部に位置して、造血に可塑性を保証する機構として働いていると考えられる。この様な階層構造が造血系の必然的帰結であるかどうかについては、今後造血系の発生過程や、進化過程を検証するな化で明らかになって行くと考えられるが、いくつかの研究グル-プの共同研究を可能にしていただいた本助成がこの方面への研究の発端になったことは確信している。

一方、骨髄腔が形成されても、ここで造血幹細胞の自己再生が維持されないことには恒常的造血は有り得ない。この分子機構を明らかにするために、我々はまず造血系に発現しているもう一つの受容体型チロシンキナ-ゼcーkitとそのリガンドであるSCFに着目して研究を始めた。実際には、cーkitに対するモノクロ-ナル抗体を作成し、この抗体を使って、cーkitの機能を阻害することによって、成熟マウス体内でのこの分子の機能を調べることを試みた。幸い、この研究が開始された直後にcーkitに対するモノクロ-ナル抗体が作成できたため、B細胞を含むいくつかの血液細胞系列の細胞株についての研究を行っている、アラバマ大学Max D.Cooper博士、及びバ-ゼル研究所のR.Palacios,Fritz Melchers,Ton Rolling博士らとの共同実験を開始した。直接我々も参加したこの研究のは、現在も継続中で、論文として一部がようやくまとまりつつある段階ではあるが、リンパ球も含む全ての血液細胞系列の初期分化の過程の自己再生には、cーkitとそのリガンドが必須のシステムとして重要な役割を演じていると言うことが明らかになった。ただ、この結果は、主にバ-ゼル研やアラバマ大学で開発されてきた細胞株についての事で、実際に同じ事が成熟マウス内でも起こっているのかに関しては、生体内に抗体を投与する実験を我々の研究所で続けることにより明らかにしていく必要があると考えている。これらの結果をまとめると、造血システムを次のようにとらえられるのではないかと考えている。現在、造血に関与する分子として20近いサイトカイんが明らかにされ、その遺伝子も既にクロ-ニングが終っている。しかし、この様に多くの分子を造血システムにどの様に配置すればよいのかに関しては明確な考えが殆どまとめられておらず、「サイトカインネットワ-ク」と言う曖味な既念の元に理解しようとする試みがある程度である。しかし、我々の研究結果は、造血システムは数層の階層構造を形成しており、受容体型チロシンキナ-ゼとそのレセプタ-であるcーkit/SCF,cーfms/MーCSFがこの階層構造の下部構造として位置づけらる事を示唆している。即ち、全ての血液系列細胞に共通の自己再生維持システムがcーkit/SCF系であり、この自己再生に必要な場を骨髄内に準備するシステムとしてのcーfms/mーCSF系である。従って、その他の造血因子はこの中核構造の上部に位置して、造血に可塑性を保証する機構として働いていると考えられる。この様な階層構造が造血系の必然的帰結であるかどうかについては、今後造血系の発生過程や、進化過程を検証するな化で明らかになって行くと考えられるが、いくつかの研究グル-プの共同研究を可能にしていただいた本助成がこの方面への研究の発端になったことは確信している。
樹状突起交差忌避の分子機構およびその生理学的意義の研究

樹状突起の交差忌避を調節する分子シグナルの全容を明らかにする目的で、樹状突起の交差忌避に必要なタンパク質Espinasに結合する分子を、IP-MS法を用いて探索した。その結果、カルシウム結合タンパク質であるCbp53Eが同定された。Cbp53Eに対する抗体を作成して免疫染色を行うと、Cbp53Eが神経細胞に広く発現していることが分かった。Cbp53Eの機能を調べるために、我々はCbp53Eの機能欠失型変異ショウジョウバエを作製した。このCbp53E変異体では、樹状突起が交差する異常が見つかった。さらに、変異体でCbp53Eを発現させると交差異常が回復したことから、Cbp53Eが樹状突起の交差忌避に必要であることが確かめられた。Cbp53Eは哺乳類のカルシウムバッファータンパク質のホモログである。神経細胞に生じる一過的なカルシウム上昇を測定したところ、Cbp53E変異体ではカルシウム上昇の時間パターンが異なることが分かった。このことから、Cbp53Eにもカルシウムバッファーとしての性質が保存されていることが分かった。カルシウムバッファータンパク質が、神経細胞の形態に影響を及ぼすという報告はこれまでにない。これは、我々の実験系のような高解像度の観察が、これまでの研究では行われていなかったからかもしれない。本研究課題は平成24年度が最終年度であるが、今後も我々は研究を継続し、樹状突起の交差忌避に本当にカルシウムシグナルが関与してるのかどうかを詳しく調べていきたい。哺乳類では、カルシウムシグナルによって樹状突起の伸長が制御されているという例があることから、我々の仮説が有望であると考えている。樹状突起の交差忌避現象を制御する分子機構について、これまでの解析結果をまとめた論文を投稿した(現在、改訂作業中)。本論文中では、7回膜貫通型カドヘリン分子Flamingo(Fmi)が、樹状突起の交差忌避の制御に必要であることを報告した。これまでFmiの下流のシグナル伝達機構についてはほとんど明らかになっていなかった。本論文では、PET-LIMドメインタンパク質Espinas(Esn)がFmiに結合することを示し、細胞内におけるFmiのシグナル伝達機構を解明する糸口を開いた。Fmiのシグナル機構を詳細に解明する目的で、Esnに結合する分子の探索を、免疫沈降法と質量分析法を組み合わせて行った。得られた候補因子について、RNAiや変異体を用いたスクリーニングを行った結果、機能喪失/低下によって、顕著な樹状突起の交差異常を示す因子を同定した。今後、この分子について解析を進めていくことで、樹状突起の交差忌避現象を制御する分子機構について、さらに詳しく理解を深めることができると期待する。樹状突起の交差を防ぐ校正機構は、多くの種の神経細胞で普遍的に見ることができる。このことは、通常起こらない樹状突起の交差が、神経細胞の生理的機能に何らかの影響を与える可能性を示唆する。これを検証する目的で、個体の行動パターン分析と単一神経細胞の活動測定を行う準備を進めている。個体の行動パターン分析については、これまでに幼虫の蠕動運動をビデオ記録するモジュールと、パラメーター抽出のワークフローを開発した。予備的な実験から、樹状突起の交差忌避に異常のある変異体で、幼虫の行動パターンの変化が検出された。単一細胞の活動測定については、現在、刺激同時観察を行うためのニポウディスク方式共焦点顕微鏡に赤外線レーザーを組み合わせた装置を構築中である。樹状突起の交差忌避を制御する分子機構について、これまでの解析結果をまとめた論文を発表した。本論文では、7回膜貫通型カドヘリン分子Flamingo (Fmi)とその結合分子Espinasが、樹状突起の交差忌避の制御に必要であることを明らかにした。樹状突起の交差忌避に関わる分子シグナルをさらに詳細に研究するため、Espinasに結合する分子の探索を行った。具体的には、エピトープタグを付加したEsnタンパク質をショウジョウバエ成虫脳に発現させ、その破砕液を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物に含まれる全タンパク質を質量分析によって決定し、Esn結合タンパク質の候補を同定した。これらの候補についてRNA干渉法によりノックダウンを行って、樹状突起の形態形成にどのような影響が生じるかを調べた。これらの実験の結果から、我々はあるカルシウム結合タンパク質に注目した。このタンパク質の発現を抑制すると、fmi変異体やesn変異体と同様の樹状突起交差異常が見られた。RNA干渉法では遺伝子発現を完全に抑えられていない可能性が危惧されたので、この遺伝子の突然変異体の分離を行った。近傍にトランスポゾンが挿入された系統を用いて、部分的染色体欠失系統を分離した。今後はこの突然変異体を用いて実験を行っていく。さらに、このタンパク質に対する抗体を調製した。この抗体を用いて抗体染色を行ったところ、ニューロンのタイプによって発現レベルに差異があることが分かった。個々のニューロンの樹状突起のパターン(樹状突起の総延長や分岐の複雑度)と発現レベルの間に対応関係があるかどうかは興味深いところである。また変異ニューロンの表現型を発現レベルと対応づけて解析したい。われわれが樹状突起の交差忌避の研究モデルに用いているショウジョウバエの幼虫のクラスIV daニューロンは、高温・痛覚刺激に反応することが知られている。そこで、顕微鏡下にマウントした幼虫個体に対して赤外線レーザー照射することによって局所的な温度上昇を惹起し、その際のニューロンの応答を、蛍光タンパク質をベースとしたカルシウムプローブによって捉えることを考えた。

現時点で、クラスIV daニューロンに赤外線レーザーの照射することで、活動電位に由来すると考えちれるカルシウム上昇を観測することが出来ている。この系を用いれば、樹状突起の交差異常がニューロンの生理的機能にどのような影響を与えるかを測定することが可能であると考えている。野生型のクラスIV daニューロンにどのような情報処理特性が備わっているかを解析した上で、FlamingoやEspinasなどの樹状突起の交差異常が頻発する変異体を用いて、ニューロンの生理的機能に変化が生じていないかを調べる計画である。樹状突起の交差忌避を調節する分子シグナルの全容を明らかにする目的で、樹状突起の交差忌避に必要なタンパク質Espinasに結合する分子を、IP-MS法を用いて探索した。その結果、カルシウム結合タンパク質であるCbp53Eが同定された。Cbp53Eに対する抗体を作成して免疫染色を行うと、Cbp53Eが神経細胞に広く発現していることが分かった。Cbp53Eの機能を調べるために、我々はCbp53Eの機能欠失型変異ショウジョウバエを作製した。このCbp53E変異体では、樹状突起が交差する異常が見つかった。さらに、変異体でCbp53Eを発現させると交差異常が回復したことから、Cbp53Eが樹状突起の交差忌避に必要であることが確かめられた。Cbp53Eは哺乳類のカルシウムバッファータンパク質のホモログである。神経細胞に生じる一過的なカルシウム上昇を測定したところ、Cbp53E変異体ではカルシウム上昇の時間パターンが異なることが分かった。このことから、Cbp53Eにもカルシウムバッファーとしての性質が保存されていることが分かった。カルシウムバッファータンパク質が、神経細胞の形態に影響を及ぼすという報告はこれまでにない。これは、我々の実験系のような高解像度の観察が、これまでの研究では行われていなかったからかもしれない。本研究課題は平成24年度が最終年度であるが、今後も我々は研究を継続し、樹状突起の交差忌避に本当にカルシウムシグナルが関与してるのかどうかを詳しく調べていきたい。哺乳類では、カルシウムシグナルによって樹状突起の伸長が制御されているという例があることから、我々の仮説が有望であると考えている。樹状突起の交差忌避を制御すると考えられる新規因子について、変異体の作製と抗体の調整を完了させた。これは当初の予想を上回る早さであった。また抗体に関して有用なものを手にすることができた。表現型の解析で多少難航しているが、観察のための細胞形態マーカーを工夫することで乗り越えられると考えている。全体として、予想した通りの進捗状況である。神経細胞の生理的機能の解析のためのイメージングの系についても、順調に機器のセットアップと調整が完了した。当初、データの取扱いに困惑したが、自分たちでプログラムを作成することで、データの評価や定量法に道筋が立った。今後は比較検討のために、データを蓄積する作業を行っていく方針である。
国際化とスポーツ政策

本研究は、国際スポーツ機構のネットワークに対する各国のスポーツ政策の関与と貢献の実体を明らかにすることにある。今回はヨーロッパ、米、アジア主要国の基本政策と重要課題を分析の対象とした。そこで得られた知見は以下の諸点である。1)国際スポーツ機構ネットワークへの関わりでは、イギリス、ドイツ、フランスなどを中心に各国でEUの統合を視野に入れたスポーツ政策(スポーツ振興常設委員会(CDDS))が検討されはじめており、EU内でのスポーツ政策の確立・実施に向けた具体的な計画が進んできている。この取組は、単にEU内だけの問題にとどまらず、そこでの動きは国際スポーツ機構全体に影響を及ぼしている。中でも、スポーツ選手と組織間の出場資格を巡るトラブルは、国家のボ-ダレス化、金銭授受、薬物使用などが進むにつれ多くなり、国際スポーツ仲裁裁判所(CAS)及びスポーツ仲裁国際理事会(ICAS)の存在意義を高め、権限強化を加速している。2)国際スポーツ科学ネットワークでは、国レベルよりも学会レベルでの対応が進んでおり、とりわけ北米の研究者グループのインターネットや電子メールを活用した研究情報の公開と交流が活発に展開されはじめてきている。3)国際スポーツビジネスネットワーク及び4)国際コミュニケーションネットワーク関係では、欧米やわが国などの技術的先進国の企業とスポーツ組織による様々なレベルでの関係が模索されている。なかでも、SPORTEL(国際テレビスポーツ会議)は、1990年以来、国際スポーツ競技連合(GAISF)との協力のもと、「スポーツとテレビの関係」を国際的なレベルで交流する機会として注目されている。各国のスポーツ政策は、上記のような国際スポーツ科学、機構、ビジネスなどのネットワーク化に対し、後方支援をより積極的に進める必要があることが判明した。今年度は、大量のデータ処理を可能にするパーソナルコンピューター(富士通FMVディスクパワー)及び周辺機器を購入し、これまでに集積した各国のスポーツ政策の現状についてのデータの再整理と分析に入ることができた。現在その作業中である。合わせて、インターネットによってドイツ連邦スポーツ科学研究情報ネットワーク及びヨーロッパ連邦文化科学教育ネットワークへのアクセスが可能となり、近く情報交換を開始する段取りを進めている。加うるに、秋と春の研究合宿では、日本とヨーロッパ及びアメリカのスポーツ政策研究とスポーツ社会学研究の動向を各分担者が報告しあい、現段階の水準と特徴をつかむことができた。この内容については、2ヵ月後に報告集としてまとめる予定で作業を進めている。本年度は、国際スポーツ機構のネットワークとして、IOC組織内及び国際スポーツ競技連盟(IF)内について、そのグローバルなレベルのネットワークの全容をほぼつかむことができた。国際スポーツ科学ネットワークについては、国際スポーツ史学会、国際スポーツマネージメント学会、国際スポーツ社会学会、国際スポーツ哲学学会などの学会を中心にしたネットワークをつかむことができた。また、国際スポーツビジネスネットワークについては、IOC内にあるOlympic Marketting and the new sources of financing commissionや、JOCのマーケッテング部の活動をつかみ、その他のコマーシャルベースの広告代理店(電通、博報堂、ISLなど)との関連をつかみつつある。各国のスポーツ政策については、今年度はイギリスを中心にヨーロッパの状態をつかむことに集中し、以下のような点が明らかになった。「ヨーロッパ評議会」のスポーツ政策は、ヨーロッパのスポーツ・フォー・オール政策をリ-ドしてきた。90年代以降、ヨーロッパ統合の地域経済活性化政策の一環であり、予算規模も強く、かなりの影響力を有するEUのスポーツ政策が活発化している。両者の重複や葛藤もあるが、こうして次第に全ヨーロッパのスポーツ政策調整機構が成立しつつある。特に70年代中ごろにヨーロッパを起源として世界に普及した「スポーツ・フォー・オール」はイギリスと「ヨーロッパ評議会」との連携の所産といえよう。また、EUからスポーツ施策への援助は自治体の政策を活性化させている。本年度は、前年度までになしえなかった国際組織や地域セクションの法令、財政、組織などについて、インターネットやCD-ROMなどを通して収集をおこなった。

特に、国際パラリンピック(IPC)や国際スポーツ仲裁裁判所に関するデータ入手により各国のスポーツ政策がこれらとどのような関わりをもっているか、その分析が可能となった。また、広がりつつある国際スポーツ科学・学会ネットワークの実態を把握することができた。それによれば北米を中心に組織化が進んでおり、ネットワークへの関心が高く、肥大化傾向にある。それ故ボランティアによる管理上の負担が増大し、スポーツ政策的な観点からの態勢づくりや財政的な援助が求められている点が明らかとなった。本年度は、研究の最終年であり、これまで収集し得た国際スポーツ機構・組織のネットワークに関わる資料的な整理及びそれらと各国スポーツ政策との関わりを春、秋の研究合宿において集中的に行った。そこでの検討作業において明らかになった点は、国際スポーツ機構や組織のネットワークに対する各国スポーツ政策の関与と貢献の実態が多様化しており、さらなる詳細な検討を要することであたった。またスポーツが国際化しネットワーク化が進むにつれ、選手とスポーツ組織の関係において金銭問題や参加資格問題などが人権問題に発展する傾向にあり、新たな問題として浮上してきており、これらの問題全体を視野に入れた検討が今後ますます必要であることが判明した。
強力な生理活性を有するイソキノリンアルカロイドの合成研究

レモノマイシンのテトラヒドロイソキノリン骨格の合成は、他の類似のアルカロイドにも適用可能な3つの鍵反応を用いる合成手法を確立することで達成した。即ち、ジケトピペラジンユニットとアルデヒドとを1つ目の鍵反応であるPerkin型縮合反応を行うことで、カップリング体を高収率にて得た。三重結合部位を部分還元することでアリルシランとし、次に2つ目の鍵反応である分子内Hosomi-Sakurai反応を行った。即ち、イミド部位を部分還元してヘミアミナールとした後、酸性条件に付すことで、イミニウムカチオンの生成、続くアリルシランからの環化が進行し、完全な立体選択性にてビシクロ[3.2.1]骨格を構築した。さらに、種々の変換によりアミノニトリル体へと導いた。次に3つ目の鍵反応であるシンナムアルデヒドを用いたPictet-Spengler反応により、単一のジアステレオマーとして目的の四環性化合物を得ることに成功した。以上、レモノマイシンの主骨格である四環性化合物の効率的合成法を3つの鍵反応を用いることで確立した。さらに、四環性骨格に対して、グリコシド化反応によりアミノ糖を導入した後、保護基の除去、アミナールへの変換、キノン体へと酸化することでレモノマイシンの全合成を達成した。エクテナサイジン743のテトラヒドロイソキノリン骨格である五環性骨格の構築法を、レモノマイシンの四環性骨格の合成法を応用することで確立した。まず、チロシンより調製したE環を有するジケトピペラジンと別途調製したアルデヒドをPerkin型縮合反応によりカップリングした。続いて、ヘミアミナールへと変換した後、酸性条件に付すことで位置選択的にPictet-Spengler反応が進行し、ビシクロ[3.3.1]骨格を有する化合物の合成に成功した。さらにアミノニトリルへと変換した後、Pictet-Spengler反応によりB環を構築することで目的とする五環性骨格の構築に成功した。3つの鍵反応を用いた合成法により、四環性、または五環性骨格を有する2つのテトラヒドロイソキノリンアルカロイドの効率的な主骨格の合成法を確立した。本研究において確立した方法論は、ジケトピペラジンユニットを変更することで、様々なテトラヒドロイソキノリンアルカロイドに対して幅広く適用可能と考えられる。これより、構造の複雑さ故に誘導体合成が困難であったテトラヒドロイソキノリンアルカロイドの詳細な構造活性相関研究を可能とし、新規リード化合物の創製へと繋がる成果を得た。これらの研究には、天然物合成を基盤とする創薬科学への学問的貢献が認められる。就職によりH25を辞退しましたレモノマイシンのテトラヒドロイソキノリン骨格の合成は、他の類似のアルカロイドにも適用可能な3つの鍵反応を用いる合成手法を確立することで達成した。就職によりH25を辞退しました