hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血性心疾患の周術期管理に有用な薬剤の評価に関する研究

本年は主にin vitro(摘出心潅流モデル、乳頭筋モデル)の実験によりこれら薬剤の心拍数、心収縮力、心筋酵素消費量に及ぼす影響、麻酔薬との相互作用について検討し、虚血性心患者の周術期管理に有利な薬剤を評価した。モルモット摘出心灌流モデル(Langendorff)を用いてカテコラミン類とPDE阻害剤について心臓への力学的、代謝的効果について検討した。1.虚血性心疾患の手術時のモデルとして、ランゲンドルフ法によるモルモット摘出心を用い、吸入麻酔薬付加、低冠血流量モデルをin vitroで再現した。2.上記モデルにおいて、古典的なカテコラミン類、およびPDE阻害薬のアムリノン、新しいDPE阻害薬のOPC-18790を心収縮力、酵素消費量等の点で比較、検討した。結果1.現在までの評価では、PDE阻害薬は虚血時の心収縮力を低濃度のカテコラミンと同等に増加させることが判明した。また、その時の心拍数の増加はPDE阻害薬はカテコラミンと比べ、少なかった。2.ただし、酵素消費量に関しては、大きな差がなく、さらなる研究が必要と思われる。摘出心灌流モデルを用い、ドーパミン(以下DOA)、アムリノン(以下AMR)と新しいPDEIII阻害剤であるOPC18790(以下OPC)とについて、低冠潅流量モデルにおける左心機能、心筋酸素消費量に及ぼす影響について検討した。モルモット40匹の摘出心臓をランゲンドルフ回路を用いて37°C、Kebs-Henseleit液にて、灌流圧70mmHgで大動脈より逆行性に冠動脈を灌流した。左室内へラテックスバルーンを挿入し、左室圧測定用とし、肺動脈起始部直上でカニュレーションし、冠静脈洞からの灌流液を採取した。実験手順としては1)灌流圧70mmHgで灌流、2)低灌流(50mmHg)10分間、3)次いで、OPC群10匹-OPCを10-5M、AMR群10匹-アムニリン10-4M,DOA群10匹ドーパミン2×10-6Mの3群に分け、それぞれ10分間持続投与した。4)その後、灌流圧70mmHgに復帰させ10分間維持した。Contorol群(10例)として同様の実験手順を薬剤なしで行った。これらの薬剤の濃度は、dp/dtmaxを指標として50%増加する濃度をそれぞれの濃度反応曲線より得て等効果量とした。測定項目はHR、左室収縮期圧、dp/dtmax、冠潅流量、酸素消費量、酸素摂取率で1)4)の終了時期に測定した。HRは低状態灌流での薬剤投与により、AMRのみが15%増加を示した。左室収縮力は低冠灌流圧により左室圧、dp/dlmaxとも10%減少し、この減少を3薬とも同程度に拮抗した。冠灌流圧を70mmHgから50mmHgに低下させたことにより30%減少し、この減少はAMR、OPC投与により回復したが、DOAでは冠灌流量の増加は認められなかった。また、いずれの灌流圧でもPDEIII阻害薬はcontrol,DOAよりも冠灌流量を増加させた。酸素消費量は低冠灌流に伴い20%減少したが、いずれの灌流圧でもcontrolを含めた4群間では有意差は認められなかった。酸素摂取率は低灌流により12%増加した。薬剤投与によりPDEIII阻害薬2群では710%低下したが、DOAは7%増加した。群間比較でもPDE阻害薬2群はcontrol、DOA群に比べ、いずれの灌流圧でも1430%の低下を示した。冠灌流量の増加作用はPDEIII阻害薬で認められたが、DOAでは認められず、酸素供給の点で前者は優れていた。全ての時点で酸素摂取量については、4群間で有意差は認められなかったが、冠灌流量増加による酸素供給量増加のための酸素摂取率の低下がPDEIII阻害薬2群で認められ、虚血状態での使用の優位性が示唆された。
骨粗しょう症予防に向けた野菜の積極的利用による食生活デザイン

野菜や果物の摂取量と骨粗しょう症の罹患率には負の相関がみられることが疫学調査により報告されており、いくつかの野菜やハーブにおいては骨吸収抑制作用が動物実験を用いた研究で報告されている。本研究では、私たち日本人が日常よく食する野菜の骨代謝、とくに骨形成に対する作用について動物系および培養細胞系を用いて調べ、野菜の積極的摂取による骨粗しょう症の予防効果について明らかにすることを目的とした。培養細胞系については今年度も引き続きマウス由来の骨芽細胞様細胞を用いて、昨年度動物実験に用いたキャベツ、玉ねぎ、にんじん、しょうがなどの10種の野菜の溶媒抽出物の骨形成促進効果について検討した。細胞増殖については顕著な増殖促進を示す野菜は認められなかった。骨形成に関わる因子に及ぼす影響については小松菜、玉ねぎなどにおいて骨形成を促進する傾向が認められた。またその効果はすでに知られている骨形成促進因子であるビタミンCなどと協調して増進される傾向であった。さらに玉ねぎの成分のひとつであるケルセチンについても検討したところ、骨形成促進効果が認められた。今後さらに詳細な検討が必要である。また、動物系の実験については、卵巣摘出手術を施したマウス(骨粗しょう症モデル)を用いて野菜の成分のひとつであるビタミンCを飲料水に添加し、ビタミンCを積極的に摂取した場合の骨代謝への影響を調べた。ビタミンCの積極的摂取により骨重量が改善する傾向がわずかながら認められた。今後実験条件を変えてさらに検討を行う必要があると考えられた。日本人の食生活において野菜摂取の不足が問題となっている。野菜には葉菜類に多く含まれるカルシウムのほか、ビタミンC、ビタミンK_1や各種フィトケミカルなど骨代謝への関与が指摘されている食品成分が豊富に含まれている。これまでにも野菜や果物の摂取量と骨粗しょう症の罹患率には負の相関がみられることが疫学調査により報告されている。さらに玉ねぎをはじめとしたいくつかの野菜や一部の西洋ハーブにおいては骨吸収抑制作用が動物実験において報告されている。国内において生産量の高いこととよく用いられる香味野菜であるという観点から、キャベツ、玉ねぎ、にんじん、小松菜、長ねぎ、ピーマン、大根、きゅうり、青しそ、しょうがを野菜試料として選択し実験に用いた。まず動物系の実験として、卵巣摘出手術を施したマウス(骨粗しょう症モデル)を用いて上述した野菜の混合凍結乾燥粉末を添加した飼料を与えて飼育し、骨代謝への影響を調べたが、骨密度等の骨代謝に改善は認められなかった。今後さらに実験条件を修正して検討を行う必要があると考えられた。また、培養細胞系についてはマウス由来の骨芽細胞様細胞(骨形成を担う細胞)を用いて、上述した野菜の溶媒抽出物の骨形成促進効果についての検討を実施中である。野菜抽出試料の添加濃度など条件を変えて、細胞増殖および骨形成に関わる因子に及ぼす影響を調べている。骨形成促進作用の認められる野菜試料もあったことからさらに確認を行っている。
環境ストレスに応答する脳内カンナビノイドシステムの解析

大麻主要成分(Δ9-tetrahydrocannabinol:THC)は、生体内の大麻受容体を介し、様々な薬理作用を示す。こうした大麻受容体を介したカンナビノイドシステムの精神・神経系に対する作用は、様々な伝達物質を調節し、中枢性に起こる情動行動を制御する。環境の変化が精神的ストレスとなる場合、カンナビノイドシステムは種々の神経伝達物質の遊離を調節する役割を果たし、情動を統括していると考えられる。本年度は、環境ストレスが情動に与える影響を前年度得られた超音波発声の測定を基盤として、観察した。本実験は、ラットを単独隔離飼育による社会性ストレス、温度ストレス、新奇環境ストレスの各環境ストレス条件下に置き、その情動変容を超音波発声で測定し、評価した。実験は、Wistar系ラットを用い、各環境ストレス条件下に置き、超音波発声および行動変化を観測した。ラットが発声する超音波は、超音波解析ソフトであるSono trackを用いて解析した。その結果、単独飼育による社会性ストレス条件下に置いたラットは、50kHzの超音波を発生した。このとき、単独隔離飼育によりみられる攻撃性の亢進が確認された。また、温度ストレス条件下に置いたラットは超音波をほとんど発声しなかった。このとき、温度ストレスに対する不快感や防御反応を示す行動が観察された。新奇環境ストレス下に置いたラットは、50kHzの超音波を発声した。また、この発声は1時間後に再び新奇環境と同様の環境に置いたとき、発生頻度が減少した。以上の結果から、環境ストレスが情動に与える影響は、各環境ストレスに特徴を示すことが確認された。よって、超音波発声を用い、環境ストレスの作用を解析することは、環境ストレスが情動に与える影響を観察するのに有用な評価方法であることが示唆された。また、本研究で得られた成果は国立精神神経センターの部会で発表した。こうした大麻受容体を介した精神・神経系に対する作用は、様々な伝達物質を調節し、中枢性に起こる情動行動を制御する。このように大麻受容体は、シナプスにおける情報伝達機構の調節を行っており、大麻受容体と生体内の大麻受容体リガンドから成り立つ系はカンナビノイドシステムと呼ばれ、精神・神経系の調節に関与すると考えられる。本研究課題は精神・神経系のカンナビノイドシステムが果たす環境ストレスへの情動適応への役割を解明し、成果を利用した創薬や大麻乱用の拡大抑止を目的としている。本年度は、THCの基本的な情動的作用を超音波発声解析により、評価した。実験は、Wistar系ラットを用い、THC 0.3,1,3 mg/kgを腹腔内投与し、その60分後に風圧0.3MPaの12秒間の空気刺激を与えた後、超音波発声および行動変化を5分間測定した。その結果、THC非投与時、ラットは空気刺激を与えても超音波をほとんど発声しなかった。一方で、THC投与後、空気刺激を与えると、2025kHzの超音波を発声した。以上の結果から、THCは被刺激性を亢進することが超音波発声を解析することで、確認できた。また、成熟ラットにおける2025kHzの超音波発声は不快な情動を表していることが報告されている。

よって、超音波発声を用いて、THCの作用を解析することは、THCが情動に与える影響を観察するのに有用な評価方法であることが示唆された。本研究で得られた成果は大麻抑止の目的で、国立精神神経センターの部会で発表した。本年度は、THCが情動に与える影響を評価する手段として、超音波発声を用いた解析法を確立した。この成果は、次年度、実施する環境ストレスに対するカンナビノイドシステムの応答を評価する手段として用いる。また、本年度の研究により得られたエビデンスは、第25回(平成23年度)薬物依存臨床医師研修会・第13回(平成23年度)薬物依存臨床看護等研修会/国立精神・神経センターにて、表題「大麻によって発現する動物の異常行動」として、発表した。研修会を通して、和田清先生をはじめとする専門家の方々と意見交換を行った。また、研究代表者が開講している福岡大学新入生を対象とした「健康と医療(アルコール・薬物依存)」にて、成果を活用し、大麻乱用の抑止に努めた。単独隔離飼育することで環境ストレスを与えたラットは、THCを投与することで、攻撃行動が誘発する。本年度確立した超音波発声を指標とする情動行動の解析法を用い、単独隔離飼育などの環境ストレスがTHCの薬理作用に与える影響を測定する。一方、環境ストレスがカンナビノイドシステムに与える影響を、大麻受容体の変化や内在性リガンドを測定することで、検討する。また、今年度同様、得られた成果をもとに大麻抑止の目的で情宣活動を行う。次年度の研究費は、今回、見られたTHCによる被刺激性の亢進作用が単独隔離飼育などの環境ストレスによって影響を受けることを確認する。本年度得られたラットの超音波発声を利用した情動行動の評価法を利用し、実験を行う。これらの実験は、研究代表者の所属機関である福岡大学に設置されているsono trackやGC-MSなどの現有設備にて、遂行可能であるため、設備備品については特に使用しない。本年度研究経費として、消耗品費900千円を使用する予定である。研究計画の環境ストレスによるカンナビノイドシステムの変化を解析するために必要となる分子生物学研究試薬、GC-MASS用試薬や大麻受容体関連試薬に600千円、実験動物の購入(餌代などを含む)に300千円計上した。これらの経費により、平成24年度に本件研究を遂行する予定である。この他、研究成果発表費用に旅費、論文の校閲費および印刷費として、200千円を使用する予定である。
高血糖の母親から生まれた仔の心臓におけるエピジェネティクスコードの解析

妊娠中に母親が糖尿病であると子宮内は高血糖状態にさらされ、生まれた子は心血管合併症が発症する確率が高くなる。そこで妊娠期に高血糖を呈する糖尿病妊娠モデルラットを作成し、生まれてくる仔の心臓における影響を検討した。その結果、生まれた仔の心臓では糖化が亢進し、NF-κBやIL-6などの炎症シグナルが増加することでAktなどのインスリンシグナル異常やGLUT4の膜への取り込みが抑制されており、インスリン抵抗性が起きていることが明らかになった。しかし、糖尿病母ラットが妊娠中にエイコサペンタエン酸を摂取することで、これらの異常が改善されることを明らかにした。胎児期の高血糖が生まれてきた仔の心臓の分子シグナルの異常を引き起こすことから、心臓の発生過程でゲノム上のエピジェネティクスコードが書き換えられた可能性が考えられる。本研究は新生児の心臓から単離した初代心筋培養細胞を用いて、仔に伝わるエピジェネティクスコードを下記の手法により解明することを目的とする。モデル動物として、妊娠4日目にストレプトゾトシンを尾静脈に投与し作成し、糖尿病に妊娠モデルラット(母ラット)を作成した。母ラットには、妊娠中にPBSあるいはEPAをそれぞれ与え、生まれた子供を実験に用いた。生まれた仔から心臓を24時間以内に摘出し、初代心筋培養細胞を作成した。心臓をトリプシンおよびコラゲナーゼ処理して得られた細胞群からdifferental adhesion法により分離して得た初代心筋細胞をM199培地にて培養した。この細胞を用いて検討した結果、Aktに関連するシグナルは、コントロールラットより低下したが、親のEPA投与により増加した。また、IDMの心臓では、多くのタンパク質の糖化(AGEs化)が促進されたが、親のEPA投与によりAGEs化を抑制した。これらのことから、子宮内が長期間に渡り高血糖に曝されることにより起こるタンパク質のAGEs化が、シグナルに関わる酵素の機能を阻害する事でインスリンシグナル異常を引き起こし、EPAはこのタンパク質のAGEs化を抑制することでインスリンシグナル異常の改善効果を示す可能性が示唆された。妊娠中に母親が高血糖状態であると、生まれてきた子供には様々な合併症が見られる。とりわけ、心血管系の合併症では心筋肥大症が、胎児期の血糖管理により発症する可能性が報告されている。糖尿病母体から生まれた子供で見られる心疾患の臨床報告は数多くあるものの、分子レベルでの機能解明に至る研究はほとんど行われていない。そこで、著者らは妊娠期に高血糖を呈する動物モデルを作成し、妊娠中に母親が高血糖に曝されることで、生まれてくる仔の心臓にどのような異常が見られるかについて分子レベルでの検討した。糖尿病妊娠ラットを用いて、妊娠期間中、EPAを胃ゾンデにて経口投与し、生まれた仔の心臓から単離培養した初代心筋培養細胞について、インスリンシグナル伝達系に与える影響を調べた。EPAを摂取した仔の初代心筋培養細胞では、インスリンシグナルの異常やGLUt4の細胞膜への取り込みが改善された。さらに、糖尿病妊娠ラットの仔においては、様々なタンパク質がAGEs化され、酸化ストレスであるreactive oxygen species(ROS)が細胞内で発生していることが明らかになった。また、子宮内高血糖環境によるエピジェネティクスに関して検討を行ったところ、糖尿病ラットの仔の心臓ではヒストン3のK4及びK9のメチル化が促進し、それらに対応するメチラーゼの遺伝子発現も有意に上昇していた。しかし、妊娠期にEPAを摂取する事でヒストン3のK4及びK9のメチル化が抑制された。初代心筋培養細胞を用いた解析により、シグナル異常は子宮内高血糖が引き起こすAGEsやROSによる慢性炎症とエピジェネティクスによる複合的な要因により引き起こされ、EPAがそれらを改善する可能性が示唆された。当初の実験計画の通り進んでいる。妊娠中に母親が糖尿病であると、子宮内は高血糖状態にさらされる。その結果、胎児は発生段階で酸化ストレスによりインスリン抵抗性が惹起され、心血管合併症が発症する確率が高くなることが報告されているが、そのメカニズムは十分に理解されていない。我々は妊娠期に高血糖を呈する動物モデルを作成し、妊娠中に母親が高血糖に曝されることで、生まれてくる仔の心臓にどのような異常が見られるかについて、心臓から単離した初代心筋培養細胞を用いて検討した。さらに妊娠中の母ラットに魚油を摂取させることで生まれた仔の心臓に与える影響を検討した。その結果、糖尿病母ラットから生まれた仔の心臓ではAktに関連するインスリンシグナルが阻害され、糖の取り込みも低下していた。また、様々なたんぱく質が糖化されており、インスリンシグナル異常を引き起こす原因であると考えられた。また、AGEs化や酸化ストレスの主な原因物質の一つである活性酸素種(ROS)や炎症性シグナル分子のNF-κB、TNFαやIL-6の遺伝子発現レベルが、糖尿病母ラットの仔で上昇していた。エピジェネティクス制御の一つであるヒストンコードに関する検討を行った結果、ヒストン3のK4及びK9のメチル化が促進されていた。しかし、妊娠期にEPAを摂取する事でインスリンシグナル異常やたんぱく質の糖化などの異常は改善された。初代心筋培養細胞を用いた解析により、子宮内高血糖がもたらすシグナル異常はAGEsやROSによる慢性炎症とエピジェネティクスによる複合的な要因により引き起こされ、妊娠中のEPA摂取により改善する可能性が示唆された。この研究は研究課題をほぼ達成しているが、ヒストンコードに関して再実験をし、EPAがエピジェネティクス制御に与える影響を詳細に検討したい。糖尿病の母親から生まれた子供では、さまざまな新生児合併症が報告され、心疾患などが原因による突然死が起こることが報告されている。

これまで我々の研究では、糖尿病母ラットから生まれた子供の心臓への影響を、糖尿病妊娠モデル動物を用いて検討した。その結果、胎児期に高血糖に曝された子は、見かけ上は正常でも、心臓の分子シグナル異常や心筋機能に重要な遺伝子の発現低下が亢進していることを見つけた。本研究ではなぜこれらのシグナル異常がもたらされるのかについて検討を行った。糖尿病妊娠モデルラットを用いて、妊娠期間中は普通食とし、n-3系不飽和脂肪酸のエイコサペンタエン酸(EPA)を胃ゾンデにて毎日経口投与し、生まれた仔について解析した。新生児の心臓およびそれらの心臓から単離培養した初代心筋培養細胞について、インスリンシグナル伝達系に与える影響を調べた。妊娠中にEPAを摂取した糖尿病ラットから生まれた仔の心臓およびその心臓から単離培養した初代心筋培養細胞では、インスリシグナルの異常が改善されていた。たんぱく質の糖化(AGEs化)について検討したところ、さまざまなたんぱく質が糖化されていることが明らかになった。また、活性酸素種(ROS)や炎症性シグナル分子のNF-κB、TNFαやIL-6の遺伝子発現レベルが、糖尿病ラットの仔で上昇していた。しかし、妊娠期にEPAを摂取する事でインスリンシグナル異常やたんぱく質の糖化などの異常は改善された。初代心筋培養細胞を用いた解析により、子宮内高血糖がもたらすシグナル異常はAGEsやROSによる慢性炎症により引き起こされ、妊娠中のEPA摂取により改善する可能性が示唆された。妊娠中に母親が糖尿病であると子宮内は高血糖状態にさらされ、生まれた子は心血管合併症が発症する確率が高くなる。そこで妊娠期に高血糖を呈する糖尿病妊娠モデルラットを作成し、生まれてくる仔の心臓における影響を検討した。その結果、生まれた仔の心臓では糖化が亢進し、NF-κBやIL-6などの炎症シグナルが増加することでAktなどのインスリンシグナル異常やGLUT4の膜への取り込みが抑制されており、インスリン抵抗性が起きていることが明らかになった。しかし、糖尿病母ラットが妊娠中にエイコサペンタエン酸を摂取することで、これらの異常が改善されることを明らかにした。H26年度に計画していた実験をほぼ行うことが出来た。糖尿病モデルラットの心臓から単離した初代心筋培養細胞を用いて、子宮内高血糖環境によるエピジェネティクスに関して検討を行う。さらに、これまでの子宮内高血糖状態を培養系で再現するために、ラット心筋芽細胞株を用いた実験系を確立し、心筋芽細胞から心筋細胞の分化過程で培地中のグルコース濃度を正常状態と糖尿病状態に変化させて培養を行い、EPAの効果を検討する。方法として、ラット心筋芽細胞株H9C2を、高グルコース(500mg/dL)あるいは低グルコース(150mg/dL)に調整した培地で培養し、詳細な解析を行う。これまでに作成した初代心筋培養細胞を用いて、エピジェネティクス制御に関わるシグナルを検討する。
レプリコンを用いたC型肝炎ウイルスNS5A蛋白の抗インターフェロン機構解析

我々はC型肝炎ウイルス(HCV)における非構造蛋白NS5Aの構造がインターフェロン抵抗性、およびウイルス増殖を規定していることを明らかにしてきた(NS5A-ISDR;インターフェロン感受性決定領域)。しかしながら、HCV増殖におけるNS5Aの機能解析は、従来効率的な培養細胞におけるHCV複製系が存在しなかったことから困難であった。このような中で近年、細胞内における効率的な培養系であるHCVレプリコン系が開発された。一方、HCVレプリコンとして機能するHCV株は限られていたが、本研究において我々は新たなHCVレプリコンを日本で単離されたウイルス株、HC-J4株より独自に構築した。その結果、HC-J4株においても細胞内増殖するHCVレプリコンを構築可能なこと、一方レプリコンの増殖にはNS5Aの変異が必須なことを明らかとした。次にインターフェロン治療効果の異なる症例から得られた様々なNS5A配列、あるいは臨床的解析からインターフェロン感受性に関連すると予想されたNS5Aにおける特定のアミノ酸変異を導入した様々なHCVレプリコンを作成し、レプリコンの増殖能変化について検討した。その結果、変異の導入によってHCV増殖効率は様々に変化したが、NS5A-ISDRに変異が多いほどレプリコン増殖能は高まった。さらに臨床的観察からインターフェロン増殖に強く関連すると予想された1アミノ酸変異の導入によってもレプリコン増殖は劇的に高められ、NS5Aの配列はin vivoとin vitroで強く関連していることが明らかになった。さらに我々はHCVレプリコン増殖を可能にする細胞側因子を明らかにするため、ナイーブなHuh7細胞、レプリコン増殖細胞、およびインターフェロンによりレプリコンを除去したHuh7細胞において発現の異なる遺伝子群をマイクロアレイ等による網羅的解析によって検討した。その結果、レプリコン増殖細、レプリコン除去細胞において著明なインターフェロン誘導遺伝子群(ISG)の低下を認め、レプリコン増殖にはISGの低下が必須と考えられた。多数のISGのなかでHCV増殖制御に重要な遺伝子を明らかにするため、18種類のISG発現ベクターを作成し、個々の遺伝子のHCV増殖制御における役割を検討した。その結果、現在までに抗ウイルス効果を示す蛋白として報告のないIFI-6-16、GBP-1、IFI-27の3つの遺伝子が強い抗HCV効果を呈することが明らかとなった。Genotype1bおよび2aからなるHCV repliconを恒常的に発現する培養肝細胞を確立し、さらに複製発現を解析するために改良を加えたHCV replicon発現定量システムを作成した。Genotypeの相違によりウイルス増殖能およびインターフェロン反応性が異なることを明らかとした。さらに、臨床的にはインターフェロン耐性を示すISDR野生型のNS5A蛋白、およびインターフェロン感受性を呈するISDR変異型NS5A蛋白のHCV replicon増殖に対する作用やインターフェロンに対する反応性を解析し、repliconにおいてもinterferon感受性は臨床症例と同様にISDRの構造に規定されることを明らかとした。インターフェロンは依然としてHCV治療の中心であるが、その抗HCV作用の機序は全く解明されていない。それが、インターフェロン投与による非特異的副作用、あるいは治療効果の限界といった臨床的に大きな問題を打破できない原因となっている。

チンパンジーでのHCV感染実験をDNA microarray解析した報告によると、HCV感染に伴い肝蔵内で発現の変化する遺伝子群は極めて限定されており、しかもその主要なものは約30種類からなるインターフェロン誘導遺伝子群であることが明らかとなり、これらの遺伝子のいずれかがインターフェロンによるHCV増殖抑制に中心的な役割を果たしていると考えられる。HCV replicon複製細胞にこれらのインターフェロン誘導遺伝子を個々に発現させてHCV replicon複製能の変化を測定することにより、インターフェロン投与により非特異的に発現する遺伝子の中で、特にHCV増殖抑制に関与しているインターフェロン誘導遺伝子を同定した。その結果、個々のISGsの抗HCV効果には多様性があり、6-16およびGBP1が特に強い抗HCV効果を持つことを明らかとした。●インターフェロンによる抗HCV Replicon効果の解析siRNA(small interfering RNA)によるインターフェロンeffector蛋白のknock down解析siRNAは二本鎖RNAによる遺伝子サイレンシング技術であり、細胞内で全く毒性を示さずに標的遺伝子発現を制御することができる。当研究室においてはすでにsiRNA技術は導入済みであり、HCVゲノムの特定部位に対するsiRNAを作成し、HCV repliconの増殖抑制効果を確認している。この技術により平成15年度の研究で同定された抗HCV作用を有するインターフェロンeffector蛋白の発現を遮断し、インターフェロンによる抗HCV replicon効果が実際に当該遺伝子を介していることを確認した。具体的には抗HCV replicon効果を示す、GBP-1、IFI-6-16、IFI-27の発現抑制によりHCV増殖が亢進することを明らかとした。インターフェロンによる抗HCVReplicon効果に対するNS5A蛋白の作用の解析臨床的にインターフェロン抵抗性および感受性を示すHCVより同定したNS5A-ISDRのアミノ酸変異をHCV replicon遺伝子に導入、in vitroでのHCV増殖能とそれぞれのアミノ酸変異との関連を解析した。その結果、臨床的なインターフェロン感受性とHCV増殖能との間には密接な関連のあることが明らかとなった。
インフルエンザウイルス感染動態解析用マウスの作出

GFPをコードしたインフルエンザ遺伝子様組換えRNAを発現する遺伝子組換えマウスを作出するため、プラスミドを構築した。プラスミド導入培養細胞へ野生型ウイルスを感染させると、GFPが発現した。プラスミド転写領域のDNAをマウス受精卵に導入し、導入遺伝子陽性マウス3系統を得た。各系統のマウス個体ならびに尻尾由来初代培養細胞に野生型ウイルスを感染させたが、GFPは発現しなかった。本研究の完遂には、プラスミド転写領域の改変が必要と考えられた。公衆衛生上重要なウイルスの多くは、レポーター遺伝子を安定的に発現する組み換えウイルスが作出され、その生体内感染動態の解明に利用されてきた。一方インフルエンザウイルスは、遺伝子複製時の変異率の高さや、分節遺伝子のウイルス粒子内取り込み機構の繊細さ・複雑さのため、野生型ウイルスが持つ本来の感染細胞指向性や感染動態のダイナミズムを反映する組み換えウイルスが作出できなかった。インフルエンザウイルスRNA(vRNA)は、細胞にとって無害で、ウイルス由来のRNAポリメラーゼ蛋白質群によってのみ転写・翻訳される。そこで本研究では、組換えウイルスの代わりに、生体を構成する各細胞内でレポーター遺伝子をコードした組み換えインフルエンザvRNAを強制発現するトランスジェニックマウス(Tgマウス)の作出を試みた。まず、インフルエンザウイルスの人工合成技術(リバースジェネティクス法)をもとに、GFP遺伝子をコードした組み換えインフルエンザvRNAの発現プラスミドを構築した。このプラスミドを培養細胞へ導入し、野生型ウイルスを感染させると、感染細胞特異的なGFP遺伝子の発現が確認された。次に、プラスミドの転写部位を含む2本鎖DNAをC57BL/6マウスの受精卵に導入し、仮親マウスに移植した。この受精卵を移植した仮親マウスより生まれた70匹のF0マウスのうち、7匹の個体の尻尾からGFP遺伝子が検出された。さらに、これらF0マウスを野生型マウスと交配して生まれたF1マウスのうち、3系統の個体にGFP遺伝子が受け継がれていた。そこで、各系統のF1マウス個体、ならびにその尻尾から樹立した初代培養細胞に野生型ウイルスを感染させたが、ウイルス感染細胞内におけるGFP遺伝子の発現は確認できなかった。以上の結果から、今回作出したTgマウス体内では、組み換えインフルエンザvRNAが発現していない可能性が示唆され、本研究の完遂には、プラスミド転写部位の改変が必要と考えられた。一方インフルエンザウイルスは、人類史上最も精力的に研究されてきた病原体のひとつであるにもかかわらず、遺伝子複製時の変異率の高さや、分節遺伝子のウイルス粒子内取り込み機構も繊細さ・複雑さのため、野生型ウイルスが持つ本来の感染細胞指向性や感染動態のダイナミズムを反映する組み換えウイルスを作出することができなかった。本研究では、ウイルスそのものの遺伝情報を書き換える代わりに、生体を構成する各細胞内にレポーターインフルエンザvRNAを強制発現する、トランスジェニックマウス(Tgマウス)を作出する。レポーター遺伝子をコードした組み換えインフルエンザvRNA(1本鎖・マイナス鎖RNA)は、細胞にとって無害で、vRNAの転写・翻訳に必要な3種類のRNAポリメラーゼ蛋白質群が供給されない限り、レポーター遺伝子を発現しない。この組み換えvRNAを発現した細胞にインフルエンザウイルスが感染すると、ウイルス由来のRNAポリメラーゼ蛋白質群が組み換えvRNAを転写・翻訳し、レポーター遺伝子が発現する。そのため、このTgマウスにウイルスを感染させ、その臓器や細胞を蛍光顕微鏡やフローサイトメーターにより継時的に検出・追跡することで、生体内におけるウイルス感染の時間的・空間的な拡がりを解析することができる。また、vRNAの転写・翻訳機構は、A型インフルエンザウイルスに広く保存されているため、本研究で作出するTgマウスは、理論上あらゆるA型インフルエンザウイルスの解析に応用でき、病原性の異なるウイルス株間での感染動態も容易に比較できる。組み換えvRNA発現用コンストラクトの構築、ならびに検討は予定通りに完了し、東京都医学総合研究所の小原道法先生ならびに多屋長治先生のご支援の下、平成24年7月より、Tgマウスの作出ならびにマウス系統の樹立を進めている。これまでに5匹のF0 Tgマウスが得られており、このうち3系統は、挿入した組み換え遺伝子が子孫に伝わることも確認した。これまでのところ、マウスの発育や産子数にも大きな影響は見られておらず、今後の研究の遂行にも支障はない。各マウス系統から繊維芽細胞を樹立し、in vitroのウイルス感染実験を行って、レポーター遺伝子の発現強度やウイルス増殖効率を指標にしながら、本研究の遂行に最も適したマウス系統を選抜する。次に、マウス馴化インフルエンザウイルス実験室株であるWSN株やPR8株を用いたin vivo感染実験を行い、レポーター遺伝子とウイルス蛋白質の発現部位が一致することを確認して、本Tgマウスの有用性を示す。
腸管グルカゴンの機能及び糖新生器官としての腸管の役割の解明

膵及び膵外グルカゴンの発現の確認に、プログルカゴン遺伝子のプロモーター下に蛍光蛋白Venus(YFP)を発現するマウス(mGlu Venusマウス)を用いた。膵外グルカゴンが存在する臓器として、プログルカゴン遺伝子が多く発現している腸管に着目した。対照群として正常耐糖能mGlu Venusマウス、糖尿病モデルマウスとしてmGlu VenusにSTZを投与したmGluVenus LD-STZ、mGlu Venus HD-STZを用いた。膵、胃、小腸を摘出後、酸エタノール法でタンパクを抽出し、受容体を介した方法を用いてグルカゴンを測定した。LD-STZは血糖値が上昇する前に各臓器を摘出し、測定に用いた。今回グルカゴン測定に用いた受容体を介した方法ではグルカゴンとオキシントモジュリンは同等の反応性を示しているため、グルカゴンとオキシントモジュリンを区別することができない。今回糖尿病モデルとして用いたSTZマウスで増加した腸管グルカゴン量の増加の一部はオキシントモジュリンである可能性は否定できない。グルカゴンとオキシントモジュリンは共にpro-glucagonから生成されるが、前者はPC2、後者はPC1/3によってスプライシングされるという点が異なる。単離した腸上皮細胞にYFP陽性細胞が存在していることをフローサイトメトリーで確認している。そこでグルカゴンとオキシントモジュリンを区別するため、今後フローサイトメトリーで解析したYFP陽性細胞を回収し、発現しているタンパクを解析する必要性があると考えられた。所属施設の変更に伴いマウスや細胞を移動させる必要があり、一時作業が進められない時期があったため、当初の予定よりも進行が遅れている。正常耐糖能マウスにおいての解析が終了後、糖尿病モデルマウスにおいても同様に順次行っていく予定である。解析を進めていくにあたって手技の習熟が必須であるため、技術の習得が不十分である場合は、熟練者が在籍している他施設での研修も予定する。正常耐糖能mGlu Venusマウスから胃、十二指腸及び小腸を摘出した。蛍光顕微鏡下で十二指腸及び小腸にはYFP陽性細胞が発現していることを確認できたが、胃にはほとんど発現が確認されなかった。対照群として用いたC57BL/6マウスの腸管ではYFPの発現を確認できなかった。mGluVenusマウスから摘出した小腸をコラゲナーゼで処理した後、懸濁液をセルストレーナーで濾過し、腸上皮細胞を採取した。採取した腸上皮細胞をフローサイトメトリーで解析し、蛍光顕微鏡で確認したYFP陽性細胞が自家蛍光ではなく、腸管に存在していることが確認された。今後フローサイトメトリーで解析したYFP陽性細胞を回収し、発現しているタンパクを解析する予定である。膵においても正常耐糖能のmGlu Venusマウス及びC57BL/6マウスから摘出し、蛍光顕微鏡下でYFP陽性細胞がmGluVenusマウスの膵に発現していることを確認している。開腹したマウスの総胆管からコラゲナーゼを注入し、膵全体にコラゲナーゼを行き渡らせた後に摘出した。摘出した膵をインキュベーション後ピペットで懸濁し、懸濁液から膵島を顕微鏡下で回収した。更に回収した単離膵島からYFP陽性細胞を特異的に回収するため、単離膵島をEGTAで処理し、YFP陽性細胞を回収した。今後膵のYFP陽性細胞についてもフローサイトメトリーで解析する予定である。腸上皮細胞及び膵島単離に伴う手技が今回初めて行うものであったため、手技の習熟度が低く、当初の予定よりも進行が遅れている。

所属施設の変更に伴いマウスや細胞を移動させる必要があり、一時作業が進められない時期があったため、当初の予定よりも進行が遅れている。正常耐糖能マウスにおいての解析が終了後、糖尿病モデルマウスにおいても同様に順次行っていく予定である。解析を進めていくにあたって手技の習熟が必須であるため、技術の習得が不十分である場合は、熟練者が在籍している他施設での研修も予定する。当初の予定より進捗状況に遅れがみられているため、当該助成金が発生した。今後は今年度解析を行っていなかったRNA抽出、遺伝子発現の解析や糖尿病モデルマウスの購入等にも新たに費用を使用する予定である。
疾患感受性細胞である脳ペリサイトの機能異常による2型糖尿病の進展機構

本研究は、「疾患感受性細胞」として脳ペリサイトを捉え、本細胞が高血糖状態を感知し、血液脳関門・脳神経細胞機能を障害することにより、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求した。(1)肥満・高血糖状態では、血液脳関門機能が障害される(2)脳ペリサイトは、グルコース濃度に応じてMMP-9を産生する(3)常態化では脳ペリサイトは視床下部神経のインスリン感受性調節および摂食調節に寄与することが判った。以上、高血糖に伴う脳ペリサイト由来因子の変化が、糖尿病病態下における血液脳関門機能異常および視床下部神経のインスリン抵抗性形成に関与する可能性がある。2型糖尿病における脳血管障害や認知機能障害などの中枢機能障害の発症に脳血糖調節機能不全が関与すると考えられる。本研究は、「疾患感受性細胞」として脳ペリサイトを捉え、本細胞が高血糖状態を感知し、サイトカインやケモカインなどの液性因子を放出して血液脳関門・脳神経細胞機能を障害することにより、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求する。本研究は糖尿病治療における新たな治療標的を提示しようとするものである。(1)糖尿病病態下におけるグルコール脳内取り込み量の変化;high fat diet負荷した2型糖尿病マウスにおいて、正常マウスと比較してグルコースのBBB透過量が減少することが明らかになった。グルコーストランスポータGLUT1の発現量に変化は認められなかった。(2)脳ペリサイトMMP-9産生に対する高血糖の影響;TNF-αによる脳ペリサイトからのMMP-9産生は、high glucose負荷により増加した。(3)視床下部神経のインスリン感受性に対する脳ペリサイトの影響;インスリン感受性は、視床下部神経細胞にインスリンを負荷し、細胞内情報伝達物質Aktの活性化を指標に評価した。脳ペリサイト培養液を視床下部神経細胞に処理した後にインスリンを負荷すると、インスリン刺激に伴うAkt活性化が上昇した。この結果は、脳ペリサイトが、視床下部神経のインスリン感受性の調節に寄与することを示唆するものである。以上、高血糖に伴う脳ペリサイト由来因子が、糖尿病病態下における視床下部神経のインスリン抵抗性形成に関与している可能性が考えられる。2型糖尿病における脳血管障害や認知機能障害などの中枢機能障害の発症に血糖調節脳機能不全が関与すると考えられる。本研究は、「疾患感受性細胞」として脳ペリサイトを捉え、本細胞が高血糖状態を感知し、サイトカインやケモカインなどの液性因子の放出を介して血液脳関門・脳神経細胞の機能障害を誘発することにより、糖尿病病態の形成・進展を担う可能性を追求する。脳ペリサイトが高血糖状態下でTNF-α刺激に高感度に応答しMMP-9を分泌することを前年度明らかにした。本年度は、高血糖状態下における脳ペリサイトのMMP-9分泌に関する機構を明らかにする。TNF-α刺激によるMMP-9分泌に対するP-gp (P-glcorotein)阻害作用;脳ペリサイトのTNF-α誘発性MMP-9分泌は、P-gp阻害剤であるcyclosporin A,tacrolimusおよびverapamil併用により濃度依存的に減少した。これら阻害剤併用時の細胞内MMP-9蓄積量は濃度依存的に増加していた。これらの結果は、脳ペリサイトからのMMP-9放出機構においてP-gpが促進的に働いていることを示唆している。脳ペリサイトにおけるP-gp発見;Western blot法を用いて脳血管内皮細胞および脳ペリサイトのP-gp発現を確認した。脳血管内皮細胞と比較して発現量は低いものの、脳ペリサイトにもP-gpが発現していることが明らかになった。以上、本年度は、脳ペリサイトに発現が認められたP-gpが、高血糖状態下におけるMMP-9分泌機構に関与する可能性を提起した。常態下では脳ペリサイトは自身が産生・分泌する液性因子を介して視床下部神経のインスリン感受性を亢進する一方で、高血糖状態下ではTNF-a刺激に高感度に応答して細胞外基質分解酵素MMP-9を分泌する。その分泌機構にP糖タンパク質(P-gp)が関与することを過年度までに明らかにした。これらの結果は脳ペリサイト由来液性因子は視床下部神経細胞機能を制御し、この異常化が糖尿病病態の形成・進展に関わる可能性を示唆している。

本年度は、脳ペリサイトによる視床下部神経制御のさらなる解明に焦点を当て、脳ペリサイト由来液性因子について、摂食および血糖調節に関わる視床下部神経への作用を調べた。(1)脳ペリサイトは摂食調節分子レプチンおよび血糖調節分子インスリンをほとんど発現しないことをPCR法およびELISA法で明らかした。しかし、(2)脳ペリサイト培養上清中で視床下部神経を培養すると、視床下部神経細胞のAMPKリン酸化が減少し、STAT3のリン酸化が亢進していた。また、(3)視床下部神経細胞のAktのリン酸化が亢進した。これらの結果はそれぞれ、レプチンおよびインスリンを直接視床下部神経細胞に負荷したときと同様の結果であり、脳ペリサイトがレプチン様およびインスリン様物質を産生・分泌し、視床下部神経機能を調節する可能性を示唆する。以上、脳ペリサイトによる視床下部神経制御機構が存在し、この破綻が肥満・高血糖など2型糖尿病の基盤病態を加速・進展すると考えられる。糖尿病病態下での血液脳関門・脳神経細胞機能障害における脳ペリサイトの役割を明らかにするため、脳ペリサイトの血液脳関門障害因子であるMMP-9分泌における高血糖の影響について検討した。本年度は、高血糖病態下における脳ペリサイトMMP-9分泌機構にP-gpが促進的に関与することを明らかにした点を考慮すれば、研究の進捗状況としておおむね順調と評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。高血糖病態下におけるMMP-9分泌機構についてさらに追究するとともに、記憶を担う海馬神経に着目し、その機能に対する脳ペリサイト由来液性因子(MMP-9を含む)の影響を明らかにする。これらの成果は「脳神経血管機構」の糖尿病病態における脳ペリサイトの役割の解明に繋がる「糸口」となる。
Xenopus卵のDNA複製におけるDNAひねり因子の機構に関する研究

DUFは、Xenopus卵抽出液から精製された因子で、二重鎖DNAに結合して、二重鎖に負のひねりを加えることによって、二重鎖を局部的に開く活性を持つ。抗-DUF抗体を用いてXenopus卵抽出液からDUFを除くと、卵抽出的のDNA複製活性が失われることから、DUFはDNA複製に必要な因子であることがわかった。また、cDNAクローニングの結果、DUFは、出芽酵母のCdc68pの類似体とSSRPl(HMGタンパク質の一種)とのヘテロニ両体であることがわかっている。Xenopus卵抽出液に除膜した精子頭部を加えると、DUFはDNA複製が起こる前に精子クロマチンに取り込まれることがわかった。さらに、卵抽出液中でファージDNAから形成されたクロマチンにもDUFが結合し、形成したクロマチン構造をゆるめる働きがあることがわかった(ヌクレアーゼ感受性試験の結果)。また、DUFはヒストンH2A、H2B、H3、H4と強い親和性を持っことがわかった。DUFはDNAのみならず、コアヒストンとも相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つと考えられる。現在、ヒトDUFの両サブユニットの発現を行い、DUFの再構成系を確立しつつある。再構成されたDUFを用いて、DUFとヌクレオソームとの相互作用を詳細に調べる予定である。Reinbergのグループによって発見されたFACTは、ヌクレオソーム構造を壊すことによってRNAポリメラーゼの進行を促進する働きを持つ因子であるが、最近の彼らの研究により、FACTがDUFと同じものであることがわかった。DUF/FACTは、クロマチンに作用することによって、DNA複製および転写を正に制御する機能を持つ重要な因子であると考えられる。
七宝焼き図案のデジタルアーカイブ実践と活用方法の検討

次の4つの項目について研究を進めた。1.紫外線による図案銀塗料の描画部分を抽出の精査、2.新規の図案の銀塗料描画部分を抽出する方法、3.田中樵山による図案デジタルアーカイブ、4.デジタルアーカイブ化に付帯する情報整理と、画像データベースのシステム設計。1.紫外線による図案銀塗料の描画部分を抽出では、図案内の銀塗料と白塗料の反射率が近いことで、銀線の抽出が困難になる課題に取り組んだ。方法は、紫外線の波長を変えて、デジタルカメラに内蔵されている紫外線・赤外線フィルターを取り外すことで、微細な反射の違いを強調する方法である。前述の方法では、多少の改善は見られたが十分な明瞭さを得るには至らなかった。2.新たな抽出方法では、銀塗料の透過性に注目して、上面から順光で照明を当てた図案の撮影画像と、背面から照明を当てた撮影画像の2つの画像を合成して、その差分から銀塗料による銀線の描画部分のみを抽出する方法である。この方法により、厚みのある銀塗料部分から、他の色味を除外することで七宝図案の銀線描画部分のみを抽出することができた。また、この方法は、1枚の図案に対して2回の撮影が必要なものの照明の工夫だけで実践できるため容易な方法として実践できるものである。3.田中樵山作の図案をデジタルアーカイブ化する過程では、図案の分類調査や半自動撮影システムを構築し、該当図案1,510枚のデジタイズを実践した。4.デジタルアーカイブ化に付帯する情報整理では製造現場で行われていた分類を参考にデジタル化した画像と紐付けを行い整理した。また、画像データベースのシステム設計として、整理した情報をもとに七宝図案の画像データベースを設計した。また現代の図案師が図案から直感的にタグ付けした情報をメタ情報としてデータベースに追加することでデータベースの使い勝手を向上させる手法を検討した。今年度は、前年度の研究計画で遅れの原因であった銀線部抽出手法の検討を進めることができた。合わせて図案のデジタル化やデータベース設計を実践した。現在はデジタルアーカイブ化の実装に着手している段階である。一方で、当初計画していた「国内外の現存する尾張七宝の製品と作品の調査」については遂行が困難な状況であるため、研究方針を変更する予定であるが、名古屋市博物館との連携により館内および、国内の尾張七宝製品や作品で現存するものについて調査を行える可能性がある。当初の七宝図案の画像データベースの設計に加えて、より図案資料を素早く見つけるための工夫として、直感的な情報として「色」「モチーフ」「備考」の3種類をメタ情報として図案ごとに記録し、以後の検索や分類時に利用する感性的な検索についても実装を行い、歴史的な資料アーカイブとしてだけでなく検索や分類を通じて七宝図案の画像データベースが図案師のデザインに活かされる支援システムの構築を目指す。1.画像データベースのスキーマの検討、2.名古屋市博物館との協力関係の構築、3.紫外線による銀線部抽出方法の再検討(デジタルカメラの)、4.閲覧アプリケーションにつながるソフトウェアの開発1.画像データベースのスキーマの検討では、七宝製品独自のスキーマをどのように構築するか他の美術品に関するアーカイブ例を参考にしながら、画像データベースの構築後、より有効に活用するためのスキーマのあり方について検討を行い、複数の項目を指定してモチーフや季節、用途を複合的に検索できる方法を明らかにした。2.名古屋市博物館との協力関係において、撮影後の図案のオリジナルをどのように保存するかについて関係構築を行った。撮影後のオリジナルの図案は、名護市博物館で保管を依託する運びとなった。また、図案のデジタルアーカイブに際して、スキーマの検討、撮影についても助力を得られる関係に至った。3.紫外線による銀線部抽出方法の再検討では、これまでの研究では紫外線の反射を撮影撮影することが確認できていたが、より明瞭に銀線部を撮影するために、カメラに内蔵されている色調整フィルターを取り除く方法を検討した。また紫外線の光源についても波長380nmの紫外光を発する蛍光球を使用していたが、細かく波長を出力できるLEDを検討した。4.閲覧アプリケーションにつながるソフトウェアの開発では、画像データベースを利用したソフトウェア開発を見越して、Swift言語の習得、モバイルデータベースRealmにおける活用手法の基礎技術習得を実アプリケーション開発を通じて行なった。開発したアプリケーションは、Apple Watchで計測した運動量をモバイルデータベースに記録した上で、Apple WatchならびにiPhoneで同期、表示を行いヒトの日々の健康管理に役立てようとするものである。以下の点で当初の計画に遅れが生じている.・図案の銀線部抽出のための撮影手法の検討に時間がかかってしまっている.・研究計画書作成時関わった研究協力者との人間関係が悪化し,その対応を行うことに時間を要し全体の進捗に影響がでた。

2.新たな抽出方法では、銀塗料の透過性に注目して、上面から順光で照明を当てた図案の撮影画像と、背面から照明を当てた撮影画像の2つの画像を合成して、その差分から銀塗料による銀線の描画部分のみを抽出する方法である。この方法により、厚みのある銀塗料部分から、他の色味を除外することで七宝図案の銀線描画部分のみを抽出することができた。また、この方法は、1枚の図案に対して2回の撮影が必要なものの照明の工夫だけで実践できるため容易な方法として実践できるものである。3.田中樵山作の図案をデジタルアーカイブ化する過程では、図案の分類調査や半自動撮影システムを構築し、該当図案1,510枚のデジタイズを実践した。4.デジタルアーカイブ化に付帯する情報整理では製造現場で行われていた分類を参考にデジタル化した画像と紐付けを行い整理した。また、画像データベースのシステム設計として、整理した情報をもとに七宝図案の画像データベースを設計した。また現代の図案師が図案から直感的にタグ付けした情報をメタ情報としてデータベースに追加することでデータベースの使い勝手を向上させる手法を検討した。今年度は、前年度の研究計画で遅れの原因であった銀線部抽出手法の検討を進めることができた。合わせて図案のデジタル化やデータベース設計を実践した。現在はデジタルアーカイブ化の実装に着手している段階である。一方で、当初計画していた「国内外の現存する尾張七宝の製品と作品の調査」については遂行が困難な状況であるため、研究方針を変更する予定であるが、名古屋市博物館との連携により館内および、国内の尾張七宝製品や作品で現存するものについて調査を行える可能性がある。当初予定した海外調査については、予定されていた研究協力者の助力を得ることが難しくななったこと、また撮影方法の最適化の遅れを調整するため、調査については国内調査の比重を重きを置いて行うとともに,撮影手法の確立へ向けて注力する方向へ計画を変更する.当初の七宝図案の画像データベースの設計に加えて、より図案資料を素早く見つけるための工夫として、直感的な情報として「色」「モチーフ」「備考」の3種類をメタ情報として図案ごとに記録し、以後の検索や分類時に利用する感性的な検索についても実装を行い、歴史的な資料アーカイブとしてだけでなく検索や分類を通じて七宝図案の画像データベースが図案師のデザインに活かされる支援システムの構築を目指す。当初購入を予定していた3Dプリンタが,研究計画の進捗に遅れが生じたため,購入して検討に至らず,予算を繰り越した.概ね計画通り予算を執行した.
プロスタシンアクチベーターおよびインヒビターの網羅的解析による血圧調節機構の解明

私たちは上皮型Naチャネル活性化因子であるセリンプロテアーゼのプロスタシンに対するアクチベーターを同定し、プロテアーゼによる血圧調節機構の分子基盤を解明しようと考えた。ラット腎臓組織からzymography法を用いて、プロスタシンのアクチベーター活性を指標に30kDaのタンパク質の分離に成功した。LC-MS/MS法によりカリクレインであることが判明し、現在、カリクレイン-プロスタシンカスケードが上皮型Naチャネル活性に与える影響を検討中である。私たちはこれまでにセリンプロテアーゼのプロスタシンが、腎臓の上皮型Naチャネルを活性化し、生体のNa代謝制御に関与することを示してきた。多くの場合、プロテアーゼの活性はアクチベーターやインヒビターの存在により常に正および負の制御を受け、その拮抗関係により定常状態が成立している。この拮抗バランスが破綻したときに種々の疾患が生じると考えられている。今回私たちは、プロスタシンに対するアクチベーターおよびインヒビターを網羅的に同定することにより、プロテアーゼによるNa代謝および血圧調節機構の分子基盤を解明しようと考えた。まず、プロスタシンのアクチベーターを同定するために、ラット腎臓から組織抽出物を作成した。徳島文理大学の勝沼教授の開発したdouble-layer fluorescent zymography法を用いて、このサンプル中に含まれるプロスタシンアクチベーター活性を評価したところ、候補物質として分子量100kDa、75kDa、30kDa、20kDaの4つのセリンプロテアーゼが認められた。これらの4つめセリンプロテアーゼをイオン交換カラム、ベンザミジンアフィニティーカラム、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点電気泳動などを用いて分離を試みた。その結果、30kDaおよび20kDaのタンパク質の分離に成功し、LC-MS/MS法によりタンパク質を同定した。現在、その他の2つのタンパク質の同定を進めるとともに、同定した2つのタンパク質のプロスタシン活性に与える影響の確認および上皮型Naチャネルに与える影響などを検討中である。プロスタシンのアクチベーターを同定するために、ラット腎臓から組織抽出物を作成した。Double-layer fluorescent zymography法を用いて、このサンプル中に含まれるプロスタシンアクチベーター活性を評価したところ、候補物質として分子量100kDa、75kDa、30kDa、20kDaの4つのセリンプロテアーゼが認められた。これらの4つのセリンプロテアーゼをイオン交換カラム、ベンザミジンアフィニティーカラム、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点電気泳動などを用いて分離を試みた。30kDaのタンパク質はカリクレインであることが判明し、カリクレインとPro体の組換えプロスタシンを反応させると、プロスタシンをin vitroでプロセシングし、活性体へと変換することが明らかとなった。現在、カリクレイン-プロスタシンカスケードが上皮型Naチャネル活性に与える影響を検討中である。