hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
競技者養成の「場」の構造変動と文化的再生産に関する社会学的研究

次に「学校運動部」と「民間スポーツクラブ」の競技者の文化資本の形成過程に関する調査はサッカーについて予備的に実施していたため、他の種目の競技者に調査を実施する前に初年度は、両スポーツ競技者養成「場」の指導者に着目し、スポーツ価値意識ならびにスポーツ観、両「場」に関するイメージ等の調査をまずもって民間スポーツクラブ指導者を対象に実施した。郵送法により実施し、330部を回収。現在データ解析を行っているところであるが次年度に学校運動部を対象に調査を実施し詳細な比較分析を行う予定である。本研究は、スポーツ競技者養成の「場」のなかでも学校運動部と民間スポーツクラブに着目し、両者を自ら相対的自立性の獲得(正統性の形成)のために独自に再生産戦略システムを有する「場」として捉え、それぞれ異なる「場」の文化的再生産を主にハビトゥス形成とその「場」の有する再生産戦略との関係で検討することを目的としている。この目的の達成のために本年度は主に以下のことを実施した。まずわが国の学校運動部について、本年度は、全国高等学校体育連盟および(財)日本中学校体育連盟の成立過程を歴史社会学的に考察することを目的として、その資料収集に務めるとともに、その変容過程をスポーツ界ならびに教育界の象徴闘争のプロセスとして把捉しつつ、社会的動向、社会的心性の変容と関連づけながら検討を行った。現在、それぞれの連盟毎に分析を継続しているところであるが、今後それぞれの連盟間の関連性を含め学校運動部とスポーツ界の構造変容を検討していく予定である。次に「民間スポーツクラブ」の「場」をめぐる再生産戦略プロセスを明らかにするために、民間スポーツクラブの指導者に着目し、昨年度に回収を終えていたサッカーの指導者のデータに加え、民間スポーツクラブを中心に競技者養成が行われている水泳、体操競技の指導者に対する社会調査を実施。調査においては、質問紙を用いた郵送法により実施した。ここではスポーツ価値意識も含め、主に指導者が有する「学校運動部」および「民間スポーツクラブ」の社会的表象(イメージ)に焦点を絞り、既に実施した両下位「場」の選手の有する社会的表象(イメージ)との比較検討を行っており、現在、民間スポーツクラブにおける相対的自立性の獲得に向けた再生産戦略との関連で検討しているところである。本研究はスポーツ競技者養成の「場」のなかでも学校運動部と民間スポーツクラブに着目し、両者を自ら相対的自立性の獲得(正統性の形成)のために独自に再生産戦略システムを有する「場」として捉え、それぞれ異なる「場」の文化的再生産を主にハビトゥス形成と再生産戦略との関係で検討することを目的として行った。本年度の主な結果は、以下の通りである。まず、わが国における競技者養成の「場」の構造変動に関わる学校運動部と民間スポーツクラブの戦後制度史の整理分析を行った。その際,(財)全国高等学校体育連盟および(財)日本中学校体育連盟の成立過程を踏まえつつ,1964年の東京オリンピックを契機とする民間スポーツクラブの誕生及びその成立プロセスの分析を行った。民間スポーツクラブは、学校運動部を対象化しつつ、自らの相対的自律性の獲得にむけた象徴闘争を惹起させており、その基盤に<競技力>という文化資本とその隠蔽のメカニズムの存在が示唆された。さらに「民間スポーツクラブ」の「場」をめぐる再生産戦略プロセスを明らかにするために、民間スポーツクラブの指導者に着目し、民間スポーツクラブを中心に競技者養成が行われている水泳、体操競技、サッカーの指導者に対する社会調査を実施、分析を行った。
ヒト唾液腺導管樹立細胞を用いたシェ-グレン症候群の診断応用

シェ-グレン症候群(SjS)は、病理組織学的には、唾液腺、涙腺の導管および腺房内の著しいリンパ球浸潤を特徴とし、やがて腺房の破壊、萎縮により、外分泌機能が低下することによって乾燥症状を呈する。このような変化は、その機序に免疫機構の異常が存在することが指摘され、患者血清中に出現する抗唾液腺管抗体(ASDA)、抗核抗体(ANA)等の自己抗体は、疾患特異抗体として診断上注目を集めてきた。従来、ASDA、ANAの蛍光抗体法による検出には、ヒト、ラット、マウス等の組織凍結切片がsubstrateとして用いられてきたが、この方法は作業の煩雑性、対応抗原として一定条件を得ることの困難性、非特異的反応が強い等の数々の問題点があった。そこで、我々は、唾液腺培養細胞に腫瘍ウィルスであるSV40を感染させて、トランスフォ-メ-ション細胞を作り、クロ-ニングをして樹立したヒト唾液腺導管樹立細胞(HSD細胞)をsubstrateとして用い、SjS血清を反応させ、蛍光抗体間接法によりASDAとANAの検出を行った。その結果、1.ASDA陽性率は、確実例78%、疑い例0%であった。2.小唾液腺導管周囲のリンパ球浸潤が高度な症例では、ASDA、ANA陽性率が高かった。3.ANA陽性率は、確実例87%、疑い例5%であり、ANA染色パタ-ンも明瞭で、斑紋型、均質型、辺縁型の3型に分類できた。4.ANA斑紋型陽性率と小唾液腺病理所見、耳下腺造影所見、唾液分泌量、口腔乾燥症状等の臨床検査所見との間には、明確な関連性がみられた。以上の結果より、HSD細胞をsubstrateとする新しいASDA、ANAの検出法は、検出感度が高く、観察条件にも優れ、SjSの血清学的診断にきわめて有用であることが確認された。シェーグレン症候群(SjS)、病理組織学的には唾液腺、涙腺などの導管および腺房周囲の著しいリンパ球浸潤を特徴とし、やがて腺房の破壊、萎縮により外分泌機能が低下することによって乾燥症状を呈する。このような変化は、その機序に免疫機構の異常が存在することが指摘され、患者血清中に高率に出現する抗唾液腺管抗体(ASDA)、抗核抗体(ANA)などの自己抗体は、疾患特異抗体として診断上注目を集めてきた。従来、ASDA、ANAの検出は、凍結組織標本を用いて行われてきたが、この方法は作業の煩雑性、対応抗原として一定条件を得ることの困難性、非特異的反応が強いなどの数々の問題点があった。そこで今回は、唾液腺培養細胞にSV40を感染させ、トランスフォーム細胞を作製し、さらにクローニングして樹立したヒト唾液腺導管樹立細胞(HSD細胞)をsubstrateとして用いた。これにSjS患者確実例23例、疑い例21例の血清を反応させ、螢光抗体間接法によりASDA、ANAの検出を行い、各種臨床検査所見との関係を総合的に比較検討した。その結果、1.ASDA陽性率は確実例78.3%、疑い例0%であった。2.小唾液腺導管周囲のリンパ球浸潤が高度な症例ではASDA陽性率が高かった。3.ANA陽性率は確実例87.0%、疑い例4.8%であり、ANA染色パターンは、斑紋型、均質型、辺縁型の3型に分類できた。4.ANA陽性率は小唾液腺導管周囲のリンパ球浸潤が進む程高かった。5.小唾液腺病理所見、耳下腺造影所見、唾液分泌量、口腔乾燥症状の程度とANA斑紋型陽性率との間には、明らかな関連性がみられた。

以上の結果より、HSD細胞をsubstrateとする新しいASDA、ANAの検出法は、検出感度が高く、観察条件にも優れ、SjSの血清学的診断にきわめて有用であることが確認された。シェ-グレン症候群(sjs)患者の血清中には、抗唾液腺管抗体(ASDA)、抗核抗体(ANA)等の自己抗体が効率に出現し、それらの検査は、診断、病勢、予後の判定に重要な意義がある。近年、蛍光抗体法による自己抗体の検出には、ヒト培養単層細胞が最も適したsubstrateとされており、ANAの検出にはヒト喉頭癌由来細胞が頻用され始めているが、ASDAの検出に適したヒト培養細胞は、これまでみいだされていなかった。そこで、我々はASDAおよびANAの検出をより正確かつ簡便に行うことを目的とし、唾液腺培養細胞に腫瘍ウイルスであるSV40を感染させトランスフォ-メ-ションしたコロニ-細胞を作り、クロ-ニング細胞より樹立したひと唾液腺導管樹立細胞(HSD細胞)を用いて、ASDAとANAの検出を行った。今年度、新たに当科に来院したsjs患者も加え、これら自己抗体と小唾液腺病理所見、耳下腺造影所見、唾液分泌量、口腔乾燥症状等の各種臨床検査所見との関係を検討したところ、前年度の結果と同様に、ASDAとANAは、sjs疑い例に比べ確実例で陽性率が高く、ASDAおよびANA斑紋型と病理検査所見との間には、明確な関連性がみられた。また、小唾液腺病理所見で、リンパ球浸潤パタ-ンがび慢性である症例と導管周囲にfocalな像を呈する症例のいずれにおいても、これら自己抗体の陽性律に明確な差はなく、陽性率は浸潤のパタ-ンより程度に関与していること、腺房の破壊が大きい症例で陽性率が高いことが明らかとなった。さらに、ASDAと他の抗細胞質抗体との鑑別のためにヒト胎児肺裁縫(HEL細胞)を用いて比較検討したところ、HSD細胞においてASDA陽性と判定された症例がHEL細胞において陰性を示し、HSD細胞の抗細胞質抗体は唾液腺管上皮を対応抗原とするASDAであることが確認された。現在、ASDA発現機序の解明を目的とし、小唾液腺に浸潤するリンパ球動態の解析、HLA-DR抗体とASDAとの関連性について研究を進めている。
非変性2次元電気泳動と質量分析の結合による高能率タンパク質情報収集システムの構築

ヒト血漿タンパク質の非変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いず、縦横38mm、厚み1mmの平板ゲル上に2次元分離する)によるパターンと、部分的変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(非変性条件の等電点電気泳動とSDSゲル電気泳動を組み合わせ、同じマイクロサイズの平板ゲル上に分離する)によるパターンを比較することによって、タンパク質問相互作用の存在を確認した。また、これらパターン上でのタンパク質(非変性条件157スポット、部分的変性条件175スポット)について、網羅的に質量分析による構造解析を行った。質量分析による構造解析には、主としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計MALDI-TOFMSとデータベース検索によるペプチドマスフィンガープリント法を用いた。これらの構造解析結果を比較した結果、非変性条件の2次元ゲル電気泳動と部分的変性条件の2次元ゲル電気泳動の組み合わせのみによって、ヒト血漿タンパク質の(相互作用による複合体形成状態を含む)存在状態を解析することができることが明らかになった。2次元ゲル電気泳動法は従来完全変性-還元条件で行われてきたが、質量分析によるタンパク質同定法の進歩により、研究代表者らが開発した非変性条件の2次元ゲル電気泳動は、さらにその有用性が高まったと考えられる。ヒト血漿タンパク質の非変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いず、縦横38mm、厚み1mmの平板ゲル上に2次元分離する)によるパターン上でのタンパク質(157スポット)について、網羅的に質量分析による構造解析を行った。その結果、非変性条件の2次元ゲル電気泳動で分離されたタンパク質スポットのうち約半数は、2種以上のポリペプチドを含むことが明らかになり、タンパク質間相互作用による複合体形成が示唆された。そこで、非変性マイクロ2次元ゲル上のスポットのうち、ポリペプチド相互作用が予想されたスポットについて、これをゲルから切り出し、すでに研究代表者らが方法を確立したアルカリ抽出法でタンパク質を抽出し、3次元目の電気泳動(SDSゲル電気泳動)を行うことによって成分タンパク質/ポリペプチドを分離し、さらに質量分析(MALDI-TOFMS)によって同定する方法を確立した。この方法によって、ヒト血漿タンパク質におけるタンパク質相互作用の詳細がさらに明らかになった。ヒト血漿タンパク質を非変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いず、縦横38mm、厚み1mmの平板ゲル上に2次元分離する方法、Type-Imicro 2-Dと呼ぶ)で分離し、色素染色で検出されたすべてのタンパク質スポット(157スポット)について、質量分析によるポリペプチドの同定を行った。ついで、非変性条件のマイクロゲル等電点電気泳動のあと、2次元目にSDSを含むマイクロ平板ゲルを用いて2次元分離(Type-II micro 2-Dと呼ぶ)し、染色したところ、2次元とも非変性条件にしたときとスポットの分布状態が大きく異なっていた。この違いの原因を明らかにするために、Type-IImicro 2-Dゲル上のすべての染色スポットについて、Type-I micro 2-Dゲルと同様に質量分析によるポリペプチドの同定を行った。その結果、2種のゲルの間でのスポットの対応付けが可能になり、非変性条件でタンパク質/ポリペプチド相互作用により高分子量を示すタンパク質あるいはタンパク質複合体が、SDS存在下で解離する様子を解析することができた。また、非変性条件での分離においては、常に低温(4°C程度)を保ち、分離過程でのタンパク質のプロテアーゼによる分解を抑えるよう注意が必要であることが明らかになった。
糖尿病の脳における脂質代謝異常のメカニズム解明とその是正

重症糖尿病モデルマウスの脳において、ステロールセンサー分子SCAPが減少していることを発見した。脳でSCAPを完全に欠損したマウスは脳が小さく、出生直後に呼吸できず死亡した。脳でSCAPを半分欠損したマウスは死亡せず成長し、脳のコレステロール合成が糖尿病マウスと同程度に低下していた。脳の海馬を電気的に刺激した際の電位変化(長期増強)が糖尿病動物で減弱することが知られている。この半分欠損マウスも糖尿病の場合と同じように減弱し、認識・記憶能の障害を認めた。以上の結果から、糖尿病に伴う認知機能低下の新規メカニズムとして脳におけるSCAPの減少が関わる可能性を報告した。糖尿病マウスの脳では種々のステロール含量が減少しているにも関わらずSREBP-2経路が抑制されていることからステロールセンサーの異常を疑った。STZ糖尿病マウスの脳組織を用いて、SREBP-2前駆体と複合体を形成するステロールセンサー分子SCAPを定量したところ、STZ糖尿病マウスの大脳皮質および視床下部においてSCAPタンパク質が減少していることを発見した。Nestin-CreTgマウスとSCAPfloxマウスを交配し、脳特異的SCAP欠損マウスを作製した。脳特異的SCAPホモ欠損マウスは自発呼吸開始を認めず全て出生直後に死亡した。ホモ欠損マウスの脳では顕著なグリオーシスを認めた。脳特異的SCAPヘテロ欠損マウスは出生後も生存し、STZ糖尿病マウスと同様に、大脳皮質および視床下部においてSREBP-2経路の遺伝子発現が約20%減少しており、脳におけるコレステロール合成も29%低下していた。海馬スライス電気生理で刺激後LITPがSTZ糖尿病と同様著明に減弱していた。新奇物体認識試験の結果、対照マウスは新奇物体を好んで探索するのに対し、脳特異的SCAPヘテロ欠損マウスは学習済み物体と新奇物体を探索する時間に差を認めなかった。上記結果を論文投稿し、現在revise実験中である。ヒト成人では全身のコレステロールの約25%が脳に局在し、その95%以上は脳自身によって合成される。我々は糖尿病の脳で核型SREBP-2が減少しコレステロール合成が抑制されていることを以前に報告した(Suzuki et al. Cell Metabolism, 2010)。糖尿病マウスの脳では種々のステロール含量が減少しているにも関わらずSREBP-2経路が抑制されていることから本研究ではステロールセンサーの異常を疑った。Nestin-Cre TgマウスとSCAP floxマウスを交配し作製した脳特異的SCAPホモ欠損マウスは、自発呼吸開始を認めず全て出生直後に死亡した。脳特異的SCAPへテロ欠損マウスは出生後も生存し、STZ糖尿病マウスと同様に、大脳皮質および視床下部においてSREBP-2経路の遺伝子発現が約20%減少しており、脳におけるコレステロール合成も29%低下していた。海馬スライス電気生理で刺激後LTPがSTZ糖尿病と同様著明に減弱していた。新奇物体認識試験の結果、対照マウスは新奇物体を好んで探索するのに対し、脳特異的SCAPへテロ欠損マウスは学習済み物体と新奇物体を探索する時間に差を認めなかった。糖尿病に伴う認知機能低下の新規メカニズムとして脳におけるSCAPタンパク質の減少を提唱する上記の結果を、論文として報告した(Suzuki et al. PLoS Biology, 2013)。論文の完成に向けて順調に推移している。24年度が最終年度であるため、記入しない。アストロサイト特異的かつ時期特異的なSCAP欠損マウスを作製するためにGFAP-CreERTマウスをドイツKirchhoff研から分与を受け、現在個体作製中である。
ニクソン,レーガン,クリントン政権期における連邦補助金改革の実証的研究

1930年代のニューディール期以来一貫して増大してきた、州・地方政府に対する連邦補助金は1970年代から今日までに、いくつかの重要な改革・再編を経験することになる。第1の重要な再編は、ニクソン政権期における歳入分与制度の成立である。第2の重要な改革・再編は、レーガン政権下で実行された連邦補助金の大胆な削減と補助金の統合である。第3の重要な再編は、クリントン政権下におけるAFDCの打ち切りとTANFへの転換であった。もちろん、以上の3つの改革・再編はアメリカ連邦補助金発展史におけるエポック・メーキングな出来事であるが、それらは補助金制度の枠内で孤立して生じたのではなく、アメリカの戦後政治経済の大きな変化のなかで生じた。本報告は、その政治経済の変化を福祉国家システムの変化という視角から捉えている。それゆえ、補助金制度の改革の評価も戦後アメリカ福祉国軍システムの改革・再編という観点から行っている。このような観点こそが本報告の最大の特徴である。このような観点からすると、1960年代の「偉大な社会」はアメリカ福祉国家システムの進展として、そしてニクソンの新連邦主義はそれに対する批判として捉えることができる。しかし、ニクソン政権期における一般歳入分与制度の成立は、アメリカ福祉国家の縮小というよりは1つの発展として見なすほうがよい。それに対して、レーガンの補助金政策はアメリカ福祉国家の発展を正面から攻撃しようとするものであった。実際に、1981年OBRAはこのレーガンの望み(補助金の削減と統合)を一部実現させた。レーガンはその後項入分与制度を廃止するなど補助金の削減に成功したが、特定補助金の大幅削減や統合がその後繰り返されたわけではなかった。クリントン政権下で成立した福祉改革法は、1935年社会保障法以来の伝統をもつ特定補助金であるAFDCに終止符を打ち、それに代えてTANFと呼ばれるブロック補助金を設けた。これは就労義務の強化や受給期間の制限など母子家庭を中心とした福祉受給者にとって厳しい内容となっていた。以上見てきたような、80年代以降の一連の補助金改革の結果、大都市中心部と都市貧困者の抱える問題はいっそう悪化することになったし、このことは今後も続く可能性が高い。本年度は、ニクソン新連邦主義構想の中心政策である特定歳入分与提案がどのように実行されたかについて研究した。特別歳入分与提案とは、都市コミュニティ、農村コミュニティ、教育、マンパワー訓練、法律執行、運輸に関わる129件もの目的別補助金を、6件の「特別歳入分与」に統合するという大掛かりなものであった。しかし、このうちブロック補助金化に成功したのは、都市コミュニティと職業訓練の分野のみであった。統合失敗の原因を明らかにするために、教育と農村開発の2つの事例研究をおこなった。教育補助金における統合失敗の最大の要因は、教育者を中心とした利益集団が特定補助金を強く擁護し、その要求に民主党が支配する下院教育・労働委員会、上院労働・公共福祉委員会が応えたためであった。農村コミュニティ開発特別歳入分与に対する利益集団と議会委員会の対応も教育歳入分与提案のばあいとほぼ同様のものであった。特定補助金擁護の基本的な論理は、どちらのぱあいも「特定補助金システムは現実には、地域によるコントロールを強化している」というものであった。

それに対して、コミュニティ開発と職業訓練の分野で統合が成功したのは、統合の対象となった既存のプログラムに対して多くの人が幻滅していたこと、地方のマイノリティ集団やコミュニティ集団の孤立、各都市市長の影響力の拡大によるところが大きい。本年度の研究の結果、ニクソンのブロック補助金化政策の成功・失敗の行く末は、統合の対象となった補助金の過去の実績、個別補助金を取り巻く利益集団のあり方によって強く規定されていることがより明瞭になった。本年度は、3年度に及ぶ研究計画の一環として、クリントン政権下における最も重要な補助金改革である1996年個人責任・勤労機会法(福祉改革法と略す)について研究した。福祉改革法は、1935年社会保障法以来の伝統をもつAFDCに終止符を打ち、それに代えて「貧困家庭一時援助」(TANF)と呼ばれるブロック補助金プログラムを設けたものである。TANFにおいては、AFDCに較べて、(1)個人に対するエンタイトルメントを否定している、(2)就労に対する要求が厳格になったことが特徴として指摘しうるがで、補助金改革の視点からは、州の裁量が格段に強くなったことが重要である。この福祉改革の一般的背景としては、AFDC受給者数の増大、公的扶助支出の増大、財政赤字削減圧力があったが、補助金制度改革という観点から無視できないことは、この時期すでに公的扶助政策についての変化がウェイバー獲得プロセスを通じて(1988年家族援助計画法がプロセスを促進した)各州レベルで生じつつあったということである。福祉受給率の低下に見られるように、就労促進を目的とした改革は今のところ成功しているように見えるが、最近の景気後退によって失業率が上昇し、それに伴い福祉受給者数が上昇せざるを得なくなったとき、この福祉改革の真価が問われるであろう。というのは、不況によって州財政が逼迫するようになると、TANFが定額のブロック補助金であることに起因する潤沢な追加財源が可能としている、児童ケア、雇用助成金、職業訓練のようなサービスの継続が今後も可能かどうかは疑問であるからである。ニクソンの新連邦主義構想と補助金政策の歴史的評価は難しいけれど、客観的に見れば、ニクソン政権は、一般歳入分与制度の成立、州・地方政府に対する連邦規制の増大が示すように福祉国家的な連邦補助金拡大基調を基本的には容認した政権であったといえる。国全体をおおう財政緊縮ムードのなかで連邦補助金の増大基調をはじめて逆転したのはカーター政権であった。この低下傾向を加速化し,定着させたのがレーガン政権であった。レーガン政権下の補助金改革の特徴は、「偉大な社会」期に創設された都市のインフラ投資、財政援助(一般歳入分与の廃止)、社会サービスに対する大胆な削減であった。「アメリカの未来に投資する」必要性を強く訴えたクリントン政権下においてもこの都市プログラムに対する連邦補助金の縮小傾向は逆転しなかった。それは「財政赤字削減優先主義の政治」が都市プログラムの再生を不可能にしてしまったからである。同政権は、連邦政府、中心都市、郊外自治体の新しい政治的協調形態を形成するために柔軟性をもった都市補助金プログラムを創設しようとしたが、それは成功しなかった。
Pseudo-hapticsを用いた実世界における精密作業の支援

本研究では複数の種類の作業において視覚的誤差の拡大提示によって擬似触力覚が生起され,実空間の作業精度が向上することがわかった.どちらの作業でも精度が向上する最適な拡大率は2.0-2.5と考えられ,それ以上では作業時間の増加や逆に精度の悪化などの弊害があることも示唆された.この値は他の作業でも有効となる可能性がある.今後の展望として,目標動作を自動推定する技術と組み合わせ自由な動作へ応用する,視覚変化と誘導の関係を明らかにし任意の誘導を可能にするなどが考えられる.また,訓練装置としての利用も期待出来る.本年度は,Pesudo-hapticsの実空間での作業支援の一例として,描画支援を考え,目的の描画経路とペン先との位置のずれを目標経路に対して法線方向に拡大して表示することによって作業精度を向上させるMRシステムを提案し,検証を行った.まず,MR環境に比べ外乱が少ないディスプレイとペンタブレットを用いたVR環境において,提案システムが139mmの直線の描画と直径72 mmの円の描画で作業精度を向上させるか評価実験を行った.その結果,直線の描画ではgain = 3.0, 4.0で,円の描画ではgain = 1.5, 2.0, 3.0で精度が有意に向上した.その一方で作業時間についてはgainが大きくなるにつれ長くなる傾向が見られ,作業時間の増加を抑えつつ描画の精度を向上させる最適なgainは2.0から3.0の間であることを示唆した.その結果を踏まえ,HMDを用いたMR環境においても作業精度が向上するか評価実験を行い,長さ150 mmの直線描画と直径72 mmの円の描画の双方において誤差の二乗和(score)が最大で50パーセント減少した.直線描画においては誤差の二乗和の減少はgain = 2.0で50パーセントに達しそれ以上gainを大きくしても50パーセント以上の改善は見られなかった.円の描画においては二乗和の減少はgain= 2.5で50パーセントに達しそれ以上gainを大きくしてもやはり50パーセント以上の改善は見られなかった.また,gainを大きくするにつれ作業時間は増加する傾向が見られた.作業時間の増加を抑えつつ作業精度を改善させるgainとして,直線描画においてはgain = 2.0,円の描画においてはgain = 2.5付近が最適であると考えられる.前年度に得られた知見に基づき,適切な視覚フィードバックを実装して,細かな作業の精度を向上させるシステムの改良を行い,評価実験を行った.また,主観評価に加え,タスク評価を通して作業にかかる時間や成功率,誤操作率等を用いた効果の定量的な計測を行った.前年度は単純な描画経路に限定されていた描画作業であったのに対し,本年度は,多様な作業を実現するため,直線,曲線に加え,角を含むタスクについても視覚フィードバックのアルゴリズムを提案し実装をおこなった.提案システムを用いて,定量的な評価を行うことで,描画において必要となるすべての要素に対して,提案手法の有効性を明らかにするとともに最適なフォードバックゲインを明らかにすることができた.これにより,作業経路の単純な作業だけではなく,任意の直線,曲線,角の組み合わせについて視覚フィードバックをかけることで,様々な描画作業において,その精度を向上させるための視覚フィードバックの生成手法を確立できたと考えられる.本研究提案している,MR空間内において描画作業時のユーザの手の動きを視覚的に変化させることで視触覚間相互作用(Visuo-haptics)を生起し,触覚提示装置なしで実空間での精密描画作業を支援するシステムを構築するための,手法の体系化を行うことができた.描画作業を,直線,曲線,角の三要素に分解し,それぞれについて必要な視覚フィードバックの設計と実証を行うことができ,その結果,多様な描画作業への支援が可能になったと考えられる.本研究では,MRを利用した視覚変化によって実空間での精密作業中に擬似触力覚を生起させることで作業の精度向上を図る手法とシステムを提案している.ユーザはMR環境下で作業を行い,実空間の動作が目標動作からそれたとき,誤差が拡大するように映像に変化を加えて提示する.それにより,その方向に擬似触力覚が生起され,ユーザは反射的にその力に抗うように手に力をいれてしまい,結果として誤差が縮小する方向に実空間の動作が補正されると考えている.本年度は,提案手法が身体の回転運動の精度を要する作業の支援に有効か検証する実験を行った実証システムには,カジュアルな撮影に使用されるケースを想定し,一般的なスマートフォンのカメラを用いた.撮影中,光軸回りの水平のずれを内蔵の姿勢センサで検知し,画面映像をずれが拡大する方向に回転して表示する.本手法で水平取りの精度が向上するか検証実験を行った.ずれの拡大率(gain)は1.0から0.5刻みに4.0までで,各gain 2回ずつを1セットとし3セット撮影させた.セット中のgainの順番はランダムとし,セット間には1分間の休憩を設けた.撮影中の回転角のずれを二乗し足したものをscoreとし精度の使用し,被験者間の個人差をなくすため,視覚変化なし(gain=1.0)の時を基準に正規化した.視覚変化なしと比較し,gainが2.0, 2.5のとき精度が有意に改善し,3.5以上で有意に悪化した.以上より水平取りのずれ補正においてgainは2.0から2.5が適切と考えられる.この結果は,前年度までの描画作業の精度向上を対象としたシステムと同様のgainが,精度向上に有効であることを示しており,それ以上では作業時間の増加や逆に精度の悪化などの弊害があることも示唆された.

この値は他の作業でも有効となる可能性がある.本研究では複数の種類の作業において視覚的誤差の拡大提示によって擬似触力覚が生起され,実空間の作業精度が向上することがわかった.どちらの作業でも精度が向上する最適な拡大率は2.0-2.5と考えられ,それ以上では作業時間の増加や逆に精度の悪化などの弊害があることも示唆された.この値は他の作業でも有効となる可能性がある.今後の展望として,目標動作を自動推定する技術と組み合わせ自由な動作へ応用する,視覚変化と誘導の関係を明らかにし任意の誘導を可能にするなどが考えられる.また,訓練装置としての利用も期待出来る.本年度は,実空間においてもPseudo-hapticsの効果を生起する視覚フィードバックを生成するために,操作性を担保しながらも実世界の動きを空間的・時間的に変調して表示するためのアルゴリズムを構築し,それにより実世界での細かな作業の精度を向上させることが可能か検証した.実際に,描画作業の支援を対象として,目的の描画経路とペン先との位置のずれを目標経路に対して法線方向に拡大して表示することによって作業精度を向上させるMRシステムを提案し,検証を行ったところ,HMDを用いたMR環境下での描画作業において,目標経路とペン先との位置のずれを目標経路に対して法線方向に拡大して見せることで作業精度の向上が可能なことが示唆された.このことは,Visual hapticsが実空間での作業精度の向上に効果があることを示している.今後は,生理指標に基づく客観的評価を行い,精度だけでなくユーザに与える疲労度などの面に関してもユーザ腕部の筋電位等を用いることで評価する.もちろん,タスク評価を通して,作業にかかる時間や成功率,誤操作率等を用いた効果の定量的な計測も行い,様々な作業における視覚フィードバックの効果や適用可能場面を体系化し,ツールキット化して知見を共有可能にする.複合現実感本提案システムはペン先の目標となる描画からのずれを法線方向に拡大して視覚提示するため,目標となる描画を把握しておく必要がある.そこで,描画中の手の動きから最終的な描画目標を自動推定する技術と組み合わせることで,目標経路が分からない描画に対しても適用することを検討する.また,擬似触力覚を提示する視覚変化には本研究で検証したもの以外にも,描画経路の形状や速度に応じる動的なgainやずれの法線方向以外への拡大など様々な視覚変化が考えられる.今後は,どのような視覚変化がどのような誘導を引き起こすのかを明らかにし,それを上手く組み合わせることで,任意の誘導を引き起こす擬似触力覚場の生成が可能にすることを検討する.さらに,ユーザ一人ひとりの描画精度や描画速度などの個人差や使用状況において必要とされる描画精度に応じてパラメータを調整することで本システムの満足度を高めることも検討する.本年度は,研究内容について想像以上に反響があり,描画作業の多様性を実現するための手法の提案と実証を行い,より実用のための展開を行った.そのため,行動計測による定量評価や生理指標に基づく疲労度などの客観的評価をより多くの状況に対して行う必要があるため,次年度に回し評価実験を行うことになった.
シクロファンを分子基盤とした糖クラスターの設計と機能

1.糖クラスターの合成既に合成が確立しているラクトースクラスター及びマルトースクラスターに加えて、新たにセロビオース、メリビオース、イソマルトース及びオリゴ糖であるマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース誘導体をそれぞれ8つ有する糖クラスターの合成に成功した。2.溶液中から極性表面へのゲスト運搬長鎖アルキル基を有するOctakis-typeの糖クラスターは両親媒性の性質を示し、糖クラスターはシリカゲルや石英板などの極性表面に強く吸着することが紫外可視吸収スペクトルの測定からわかった。また、蛍光性色素などのゲストが水中に存在する場合にはホスト-ゲスト複合体を形成し、複合体のまま極性表面に吸着することから、水中から極性表面への有効なゲスト運搬系を構築できることが示された。3.リン酸化合物との相互作用糖クラスターの糖鎖の長さが伸びるに従って、糖クラスターのリン酸関連化合物に対する結合挙動が大きく異なることを見いだした。即ち、マルトペンタオースクラスターはリポース-5'-リン酸(RP)やモノヌクレオチドであるAMPに対して、多分子を極めて強く結合することがわかった。また、ポリヌクレオチドであるPolyAとも強く相互作用することが表面プラズモン共鳴法により明らかとなった。4.リポソームベシクルへの糖クラスターの固定化レセプターに対する認識部位を有するリポソームとして、糖クラスターのリポソームベシクルへの固定化が容易に行えることがわかった。
皮膚におけるロイコトリエンの合成・局在および機能の研究

ロイコトリエン(LT)はアラキドン酸より合成され,そのうちLTB4は強力な白血球遊走作用により,またLTC_4, LTD_4は強力な血管透過作用,平滑筋収縮作用により皮膚においても蕁麻疹をはじめとして種々の皮膚疾患の成立に関係しているといわれている.私達はまずマウス皮膚においてリポキシゲナーゼ活性を検討した.マウス皮膚のアラキドン酸のリポキシゲナーゼによる主たる反応生成物は12-HETEであり, 15-HETEも少量認められたが, 5-HETEはきわめて少量であった.この反応系に5μMのAA861を添加するとこれらの生成は抑制された.また500mJ/cm^2の中波長紫外線を照射すると24時間後には,マウス皮膚の12-HETEの生成は約2倍増加したが,これは真皮に浸潤してきた好中球由来の可能性も考えられた.ついでマウスの耳にアラキドン酸を塗布し,誘発された炎症反応を耳の腫脹を計測することによって定量化し,マウスの耳LT量もラジオイムノアッセイにて測定し,種々のビタミンA誘導体(レチノイド)を投与したマウスについてそれらの薬物のアラキドン酸による炎症への影響を検討した.アラキドン酸塗布による耳の腫脹は,レチノイド投与群において著明に抑制された.またLTB4およびペプチドーLTは,アラキドン酸を塗布することにより,著明に上昇し,レチノイド投与により抑制された.免疫組織学的に皮膚におけるLTB4の局在も検討したが,抗体価の低さ,固定の困難さ等により,意味のある結果を得ることができなかった.ついで皮膚疾患とLTとの関連を調べるため,アトピー性皮膚炎患者の末梢血中の多核球のLTB4産生能を検討した.しかし成人の末梢PMNのA23187によるLTB4産生は,正常人とアトピー性皮膚炎患者に有意の差は認められなかった.このように皮膚においてLTの合成・機能,局在を研究することはその含有量が極めて少量のため困難なことであるが,今後より高度な分析法を用いて検討を続けていきたいと考えている.ロイコトリエン(LT)はアラキドン酸より合成され,そのうちLTB4は強力な白血球遊走作用により,またLTC_4, LTD_4は強力な血管透過作用,平滑筋収縮作用により皮膚においても蕁麻疹をはじめとして種々の皮膚疾患の成立に関係しているといわれている.私達はまずマウス皮膚においてリポキシゲナーゼ活性を検討した.マウス皮膚のアラキドン酸のリポキシゲナーゼによる主たる反応生成物は12-HETEであり, 15-HETEも少量認められたが, 5-HETEはきわめて少量であった.この反応系に5μMのAA861を添加するとこれらの生成は抑制された.また500mJ/cm^2の中波長紫外線を照射すると24時間後には,マウス皮膚の12-HETEの生成は約2倍増加したが,これは真皮に浸潤してきた好中球由来の可能性も考えられた.ついでマウスの耳にアラキドン酸を塗布し,誘発された炎症反応を耳の腫脹を計測することによって定量化し,マウスの耳LT量もラジオイムノアッセイにて測定し,種々のビタミンA誘導体(レチノイド)を投与したマウスについてそれらの薬物のアラキドン酸による炎症への影響を検討した.アラキドン酸塗布による耳の腫脹は,レチノイド投与群において著明に抑制された.またLTB4およびペプチドーLTは,アラキドン酸を塗布することにより,著明に上昇し,レチノイド投与により抑制された.免疫組織学的に皮膚におけるLTB4の局在も検討したが,抗体価の低さ,固定の困難さ等により,意味のある結果を得ることができなかった.ついで皮膚疾患とLTとの関連を調べるため,アトピー性皮膚炎患者の末梢血中の多核球のLTB4産生能を検討した.しかし成人の末梢PMNのA23187によるLTB4産生は,正常人とアトピー性皮膚炎患者に有意の差は認められなかった.このように皮膚においてLTの合成・機能,局在を研究することはその含有量が極めて少量のため困難なことであるが,今後より高度な分析法を用いて検討を続けていきたいと考えている.ロイコトリエン(LT)はアラキドン酸より合成され、そのうちLT【B_4】は強力な白血球遊走作用により、また【LTC_4】、【LTD_4】は強力な血管透過作用、平滑筋収縮作用により気管支喘息などの発症に重要な役割を果してきている。皮膚においてもLTが合成され、尋常性乾癬をはじめとして種々の皮膚疾患の成立に関係しているといわれている。我々は皮膚におけるLTの局在およびその機能を調べるためにまずマウス皮膚におけるリポキシゲナーゼ活性を検討した。酵素活性はマウス皮膚の20,000g上清を酵素とし、基質である[【^(14)C】]アラキドン酸と37°C10分反応させ、反応停止後、生成物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにて展開し、その放射能を液体シンチレーションカウンターにて測定した。皮膚のアラキドン酸のリポキシゲナーゼによる主たる反応生成物は12-HETEであり、15-HETEも少量認められたが、5-HETEは極少量であった。反応系に5μMのAA861を添加すると、これらの生成は著明に抑制された。

また50mJ/【cm^2】のUVB照射24時間後のマウス皮膚では12-HETEの生成は約2倍上昇したが、これは真皮に浸潤してきた好中球由来である可能性が強い。肥満細胞を先天的に欠いているW/Wマウスの皮膚でも正常マウスとタンパク当りのリポキシゲナーゼ活性の差はみられず、肥満細胞は皮膚全体のHETE合成に大きな関与はしていないと考えられた。またラジオイムノアッセイにて皮膚の【LTB_4】、【LTC_4】の定量を試みたが、有意の結果を得られなかった。これは血清等の材料と異なり、皮膚からのLTの抽出、分画の操作が困難であるためと考えられた。免疫組織化学的に皮膚における【LTB_4】の局在も検討したが、抗体価の低さ、固定の困難さにより、意味のある結果を得ることができなかった。このように皮膚においては5-リポキシゲナーゼの活性は弱く、検出するために工夫が必要であり、LTの定量、局在の検索も皮膚では困難な点が多く今後これらを克服していきたい。
有機フッ素化合物による地下水汚染の機構解明と対策技術の確立

東京都区部の被圧・不圧地下水及び湧水の53地点を対象に、13種類の有機フッ素化合物(PFCs)、並びに医薬品を分析し、これらの新規微量化学物質による地下水汚染の実態について明らかにするとともに、汚染源について考察をした。その結果、不圧地下水や湧水などから高濃度のPFCsが検出されたほか、比較的深い被圧地下水からもPFCsが検出され、東京の地下水は広範にPFCs汚染が進んでいることが明らかとなった。本研究は,有機フッ素化合物のうちペルフルオロアルキル化合物(PFAs)について,これまで報告事例が極めて少ない水道水源である地下水の汚染の実態を明らかにすることを目的としている。具体的には東京都区部の地下水中のPFAsを測定し,その発生期限と地下水中での挙動を明らかにする。平成19年度は,東京都区部の16の井戸水(不圧地下水)および湧水を採水し,LC/MS/MSを用いてperfluorinated surfactants(PFSs)を測定した。その結果,全ての地下水サンプルから,perfluorooctanesulfonate(PFOS)およびperfluorooctanoate(PFOA)を含む9種類のPFSsを検出した。この結果は,東京のような都市域の地下水が,PFSsによって広範な汚染を受けていることを示している。また,河刈水や下水,路面排水などと比べて,地下水はPFOSの濃度が比較的高かった。その原因は今のところ明確ではないが,PFOSの前駆物質からの分解過程が影響しているものと考えられる。また,短鎖のperfluorocarboxylates(PFCAs)は,地層中でわずかに除去され,PFCAsの除去率は分子量の増大とともに上昇することが明らかとなった。東京の地下水中のPFOS濃度は,井戸の設置場所により,また,帯水層により大きな違いがみられた。その原因については,今後さらに検討を進める必要がある。東京都区部の103地点で採取した地下水中の溶存鉄濃度と酸化還元電位(Eh)を測定した。本研究で測定した溶存鉄は,各種水質基準となっている総鉄に含まれる懸濁態の鉄を含まないことに留意を要するが,本研究の調査結果を水質基準値に照らすと,全体の55%(57地点)で溶存鉄が0.3mg/L(水道水質基準,工業用水道供給標準水質)を,全体の69%(71地点)で溶存鉄が1.Omg/L(冷凍空調機器用冷却水水質基準)を下回っており,多くの地点で各種の地下水利用が可能であると考えられた。特に,不圧地下水では武蔵野礫層,被圧地下水では上総層群を帯水層とする地下水において,溶存鉄が他の帯水層に比べて低かった。溶存鉄は酸化還元電位(Eh)と関連があり,武蔵野礫層や上総層群を帯水層とする地下水ではEhが比較的高く,溶存鉄濃度が低かった。一方,有楽町層や東京層を帯水層とする地下水ではEhが低く,鉄(II)を主形態として基準を超える溶存鉄濃度が観察されたため,こうした地城では使途に応じた適切な処理施設を設ける必要があると考えられる。これらの地下水サンプルのうち16サンプルについて、フッ素系の界面活性剤PFSsの分析を行ったところ、すべてのサンプルからPFSsが検出された。このうち、PFOSや短鎖のPFCAsが地下水から多く検出された。PFSsによる地下水汚染の起源としては、下水管などから浸出した下水が地下水へ浸透していることや、道路排水などが地下水に浸透していることなどが示唆された。PFOSやPFOAを始めとする有機フッ素化合物(PFCs)は水溶性の微量汚染物質であり,人への毒性や生態系への影響が懸念されている。今年度は東京都区部の不圧地下水・被圧地下水・湧水を広く採水し。PFCs汚染の実態を明らかにするとともに,水溶性で下水に由来する医薬品crotamitonと比較して検出されやすさを考察した。調査地点としては、東京都23区中19区で公共井(防災井戸など)及び私有井(浴場用井戸など)の計53地点(不圧地下水32地点,被圧地下水18地点,湧水3地点)にて地下水を採水した。これらの地下水サンプルに対して、有機フッ素化合物(PFCs)17種類の分析を行った。地下水における濃度はPFOSが最大987ng/L(中央値5.7ng/L),PFOAが最大1840ng/L(中央値8.5n/L),PFNAが最大620ng/L(中央値1.7ng/L),PFDAが最大34ng/L(中央値0.9ng/L)で検出された。測定したPFCsの合計濃度は最大1951ng/L(中央値35ng/L)であった。

今回測定した、東京都区部の地下水におけるPFOS,PFHpA,PFDA,PFUnDAの濃度の中央値は、既存の報告による全国一級河川より高濃度であった。特に、PFOS,PFOA,PFNA等の濃度が下水中の濃度を大きく超える地点があったことは、その理由は不明であるが、重要な結果であると考えられる。また、PFCsは不圧地下水と湧水において高濃度で検出されたが、被圧地下水においても検出された地点が存在した。地下水中のPFOSはcrotamitonより検出地点が多く,PFOS濃度とcrotamiton濃度の比率は、下水や河川と比べて地下水が高かった。
電気伝導性高融点ランタンクロマイとの高温熱電能

本研究の初年度に高温電測定可能な電気抵抗・熱電能測定装置を開発した。この装置を用いて研究を行なった。固相反応法を用いてLa_<1-x>Ca_xCrO_3,La_<1-x>Sr_xCrO_3、La_<1-x>Sr_xCr_<1-y>Mn_yO_3、La_<0.8>Sr_<0.2>Mn_<1-x>CuO_3などの試料を合成し、X線回折法により単相ペロブスカイト型構造であることを確認した。電気抵抗の組成依存性は、パーコレーション伝導機構を指示している。一方、電気伝導度の温度依存性はスモールポーラロンのホッピング伝導を支持している。これらの事実は、この物質の電気伝導はパーコレーションとスモールポーラロン伝導機構との複合系と考えられる。熱電能の測定結果はすべての試料で熱電能の符号は正であった。Heikesの式を用いて算出したポーラロン密度は、二価のイオンの置換で期待できる値のCa場合55%、Srで70%と少ない。さらに、磁化測定の結果よりCr^<+4>量は、2価のイオンの置換量から期待できる量のCaで58%、Srで67%ある事がわかった。この結果は、熱電能の結果より期待される量とほぼ一致する。これらを考慮すると、Cr^<+4>による電荷補償はCaの置換の場合が80%、Srの場合は85%、残りが酸素欠損でまかなわれる事がわかった。したがって、電気伝導はCrの価数と酸素欠損によるスモールポーラロン伝導とパーコレーション伝導の複合系である事がわかった。1.高温電気抵抗および熱電能測定装置(1)高温で調整雰囲気できる電気抵抗および、熱電能を測定する装置を開発制作した。本年度は1000°Cまでの電気炉を用いて新規作製した測定装置の動作確認と、新規に作製した測定解析用コンピュータプログラムの動作確認を完了した。(2)高温電気はケラマックス炉を用いる。炉の準備を現在進めており、平成11年度には使用できる見込みである。2.物質の合成条件の確立(1)合成条件の確立:熱電能の測定には単相の物質を使用する必用がある。そこで、LaCro_3をベースとし、Laの一部をCaやSrで置換した物質の合成条件を本研究予算で購入したボールミルを用い、再現性良く決定することができた。(2)構造の決定:現有設備のx線回折装置を用いて構造を決定した。必要な場合にはリートベルト法を用いて精密化を行った。その結果、Laの置換量、Caは0.4%、Srは0.3%まで単相のものを合成できることがわかった。また結晶構造は歪んだペロブスカイト構造を持つことを明らかにした。電磁特性上重要な酸素量については、合成時の質量変化および、密度測定により、ほぼ酸素欠損が見られない事がわかったが、酸素量の精密測定は平成11年度に行う予定である。3.電磁特性(1)電気抵抗の測定から、Ca置換の場合はスモールポーラロンのホッピング伝導と考えられるが、Sr置換の場合には金属伝導との複合伝導の可能性があることを新たに見いだした。(2)熱電能は、Ca置換の場合は符号が正で150μV/K、Sr置換の場合は符号が正で約70μV/Kと大きく,さらにともに温度依存性が小さく高温まで大きな値を示す事を新たに見いだした。これは新しい高温熱電材料の可能性を示している。

本研究の初年度に高温電測定可能な電気抵抗・熱電能測定装置を開発した。この装置を用いて研究を行なった。固相反応法を用いてLa_<1-x>Ca_xCrO_3、La_<1-x>Sr_xCrO_3、La_<1-x>Sr_xCr_<1-y>Mn_yO_3、La_<0.8>Sr_<0.2>Mn_<1-x>Cu_xO_3などの試料を合成し、X線回折法により単相ペロブスカイト型構造であることを確認した。電気抵抗の組成依存性は、パーコレーション伝導機構を指示している。一方、電気伝導度の温度依存性はスモールポーラロンのホッピング伝導を支持している。これらの事実は、この物質の電気伝導パーコレーションとスモールポーラロン伝導機構との複合系と考えられる。熱電能の測定結果はすべての試料で熱電能の符号は正であった。Heikesの式を用いて算出したポーラロン密度は、二価のイオンの置換で期待できる値のCa場合55%、Srで70%と少ない。さらに、磁化測定の結果よりCr^<+4>量は、2価のイオンの置換量から期待できる量のCaで58%、Srで67%ある事がわかった。この結果は、熱電能の結果より期待される量とほぼ一致する。これらを考慮すると、Cr^<+4>による電荷補償はCaの置換の場合が80%、Srの場合は85%、残りが酸素欠損でまかなわれる事がわかった。したがって、電気伝導はCrの価数と酸素欠損によるスモールポーラロン伝導とパーコレーション伝導の複合系である事がわかった。
ゲノム合成の基盤技術を自然界でのDNA水平伝播現象をもとに構築する

当該年度(2018年度)では、まずコンティグクローンを用いた枯草菌での効率の良いゲノム合成法を検討した。両端がオーバーラップするDNA断片を枯草菌の自然形質転換能を利用して相同組換えによって枯草菌ゲノム中に順次、連結させる手法は既に確立されている。本研究ではDNA断片を一度の形質転換で枯草菌細胞中に導入し枯草菌プラスミドとして構築できるか検証した。対象として、ガン関連遺伝子MYCのゲノム領域を両端が500bp700bp重複するように5つのコンティグDNA断片(2kb4kb)に分割し、PCRによりヒト培養細胞のゲノムを鋳型にして増幅した。またこれらが連結された後の両端の領域は、枯草菌プラスミド(枯草菌ー大腸菌シャトルプラスミド)ベクターと500bp700bp重複するように設計した。枯草菌プラスミドも直鎖状にして形質転換に用いるため、5つのコンティグDNA断片とベクターが連結されないと枯草菌のコロニーは形成されない。用いた枯草菌は代表的な168TrpC2株の誘導株で制限修飾系の遺伝子群が欠損しているRM125株を用いた。まず通常の自然形質転換法での導入を複数回試みたが、コロニーは得られなかった。その原因として、枯草菌細胞表層のDNAを取り込む装置が30個程度なため、ベクター込みで6つのDNAを同時に端から取り込む確率が低いことが考えられた。そこで別の形質転換法を検討した。枯草菌の場合、エレクトロポレーションでは条件検討が難しく、結果としてプロトプラスト法によって形質転換体が得られることが判明した。現在、コンティグDNAを効率良く連結できる条件を検討中。また効率化のための自殺遺伝子を用いたセレクション法としてmazF遺伝子を用いた方法を構築した。動物培養細胞への導入法については、まず通常の方法で導入・選択できるDNAを構築でき、現在溶菌法の適用条件を検討中。当該年度は、「コンティグクローン連結法」と「枯草菌から動物培養細胞への導入法」について検討した。その結果、興味深い問題点がいくつか判明した。「コンティグクローン連結法」については、通常の枯草菌の自然形質転換では確率的に難しいことがわかり、プロトプラスト法によってDNAを導入できる条件が明らかになった。しかしプロトプラスト法ではDNAが導入された後、相同組換えに必要なRecAと呼ばれるタンパク質の発現誘導が起こらないため効率が悪く、誘導型RecAを保持する枯草菌株が必要なことも判明した。自殺遺伝子mazFを用いたセレクション法はプロモーターを工夫することで温度感受性によって機能し、セレクションできることが確認できた。枯草菌細胞中での環状DNAを線状化する方法については、枯草菌で発現するI-SceIという切断酵素が使用可能であることがわかった。一方、「枯草菌から動物培養細胞への導入法」については、培養細胞中で発現し、機能できるセレクションマーカー(ピューロマイシン、GFPなど)を用いて、相同組換えによってヒト培養細胞のゲノム中に導入できるDNAの構築を実施した。まず通常の培養細胞導入法によって構築したDNA領域を実際にヒト培養細胞ゲノムに相同組換えで導入し、セレクションできることをGFPの発現やPCRなどによって確認でき、培養細胞導入法の系を立ち上げることができた。溶菌法による導入については、今年度行った条件では効率が悪いため、最適条件を検討中。以上、当初予定していた実験内容は一通り試みることができ、数々の問題点が明らかとなった。今年度はこれらの問題点の抽出が目的であり、この結果これらの解決策を検討することができた。以上のことから今年度は当初予定していた通りのペースで本計画が進行しており、おおむね順調に進展していると判断できる。初年度(2018年度)は、当初予定していた研究項目を全て実施することができ、想定通り数々の問題点を抽出することができた。この結果を受けて次年度(2019年度)は当初の予定通りこれらの問題点の解決を試みる。まず「コンティグクローン連結法」については、プロトプラスト法によって導入されたコンティグDNA断片を相同組換えで効率良く連結させるために、RecAと呼ばれる相同組換えタンパク質の誘導発現株の構築を目指す。すでにキシロースによってリプレッサーがはずれて高発現が可能な誘導型プロモーター配列のDNAを取得済みで、RecA遺伝子とつなぎ、枯草菌ゲノム中の在来生のRecAと置き換えることによって、誘導型RecAを保持する枯草菌株の構築を実施する。さらにセレクション効率を上げるべく、自殺遺伝子mazFとの併用セレクションも可能か試みる。供与コンティグDNAがPCRによって得たものではなく、プラスミドなどの環状DNAの場合、効率を上げるべく枯草菌細胞中で線状化する必要があるため、枯草菌細胞中で発現できるI-SceI遺伝子の活用も検討する。「枯草菌から動物培養細胞への導入法」については、枯草菌は大腸菌と違ってエンドトキシンが生産されないため、培養液中からエンドトキシンを除去する必要はない。この利点を最大限に生かして、DNA精製操作のない「溶菌法」によるヒト培養細胞への導入条件の確立を目指す。初年度において、セレクション法などを考慮した培養細胞へ導入可能な系が確立されているので、この系を用いて様々な導入法の検討を行う。以上の研究計画を実施し、初年度の問題点を解決し、「水平伝播を利用したゲノム合成技術の実用化」を目指す。