hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
部位特異的in vivo光架橋実験によるSecトランスロコンの網羅的相互作用解析

バクテリアのタンパク質膜透過に関与するSectranslocon成因子間の相互作用を網羅的に解析する事を目的として、これら構成因子をターゲットとしたin vivo光架橋実験を進めた。この手法は、生きた細胞内でのタンパク質間の一時的かつ機能的な相互作用をモニター出来る画期的な系として最近多くの成果が報告されつつある。我々はこれまでに、本手法を用いて、モータ因子SecAと膜透過チャネルSecY間の詳細な相互作用を明らかにすると共に、SecGを対象とした解析から、新規膜タンパク質YfgMの存在を見いだしている。本年は、タンパク質膜透過能の昂進に関与するSecDFに着目し、最近等研究室により明らかとなった立体構造情報に基づいて、SecDFの分子表面に位置するアミノ酸残基を光反応性のアミノ酸アナログパラベンゾイルフェニルアラニン(pBPA)に改変した変異型SecDFタンパク質を作製して網羅的な解析を進めている。これまでの所、SecDの6番目の膜貫通領域内にpBPAを導入した際に特異的な架橋複合体が形成できる事を確認している。現在、架橋相手の同定を進めている。タンパク質膜透過チャネルSecYEGは、モータ因子SecA ATPaseと相互作用し、細胞質で新規に合成されたタンパク質の効率よい膜透過を可能としている。しかしながら、SecYEGと他のSec因子との相互作用に関する知見は限られている。研究代表者は、本研究の主題である部位特異的in vivo光架橋実験法を、膜透過チャネルの中心因子SecYの細胞質領域に対して適応し、SecAとの相互作用に関わる領域をアミノ酸残基レベルで明らかにした。加えて、SecAの特異的な阻害剤を用いた解析から、SecAはATP加水分解サイクルに応答して、SecYとの相互作用を変化させていることも見いだした。このように、部位特異的in vivo光架橋実験は、生きた細胞内でのタンパク質問相互作用を高分解能でモニターできるだけでなく、細胞内の動的変化も検出できる画期的方法といえる。今年度は、膜透過チャネル内の補助因子SecGを標的とした系統的なin vivo光架橋実験を行った。その結果、SecGの細胞質ループ領域が、SecA, SecYの両分子と近接していること、その位置関係が、SecAのATP加水分解サイクルにより変化する事を見いだした。SecG分子内のSecA近接部位を示した最初の例となる。ATP加水分解に応答したSecA-SecG間の相互作用変化は、SecGのタンパク質膜透過促進の分子機構を考える上で有力な情報となり得る。加えて、既存のSec因子に対する抗体とは反応しない新たな架橋複合体の存在を見いだした。タグ配列を利用した親和クロマトグラフィーによりこの架橋複合体を精製し、質量分析法と組み合わせた解析から、SecG分子と近接している新たな膜タンパク質因子YfgMを同定した。現在YfgMの機能解析を進めている。
大脳皮質-視床投射結合のシナプス特性と時空間制御機構の解明

目的:視床投射神経細胞には、末梢からの感覚情報を受け取る上向性シナプスと大脳皮質からのfeedbackシナプス(皮質視床シナプス)の二つの主な興奮性シナプスが存在している。両シナプスは生理機能的にそれぞれ、driverとmodulatorとして働いていると考えられているが、そのシナプス基盤は明らかでない。我々は、それらのシナプス特性を詳細に解析し、特に、グルタミン酸受容体の構成成分に着目し、カイニン酸受容体電流の解析と、その機能的意義について解析した。成果と考察:以下のことが明らかになった。1.視床シナプスEPSCではカイニン酸受容体成分が存在するが、内側毛帯シナプスには存在しない。2.皮質視床シナプスEPSCはNMDA受容体成分がAMPA受容体成分より極めて多く存在するが、内側毛帯シナプスEPSCではその逆である。3.皮質視床シナプスではlate-persistent発火を示すが、内側毛帯シナプスではonset-transient発火を示す。4.皮質視床シナプスのlate-persistent発火の形成はNMDA受容体に大きく依存し、カイニン酸受容体は修飾的な作用がある。内側毛帯シナプスのonset-transient発火の形成はAMPA受容体に主に依存している。投射細胞はT-typeカルシウムチャンネルにより、発火モードを過分極の場合(-70mV以下)はバーストモード、脱分極の場合(-50mV付近)はトニックモードに変化する。そして一般的に、トニックモード時に末梢からの感覚情報を正確に大脳皮質に伝えるとされている。以上の知見と今回の結果を総合的に考えると皮質視床シナプスEPSCは比較的キネチックスの遅い、NMDA受容体やカイニン酸受容体成分が有意に存在することから、大脳皮質は高頻度で活動すれば、投射神経細胞に対して、ゆっくりとした脱分極を惹き起こすし、バーストからトニックモードに移行するように働くと想像される。一方、内側毛帯シナプスはキネチックスの早いAMPA受容体成分が多いため、末梢からの情報をタイミングを合わせて情報を大脳皮質に伝える働きをしていると考えられた。この研究成果は現在J.Physiol.に投稿中(under revision)である。平成15年度は、皮質-視床feedbackシナプスの伝達特性を明らかにするため、スライス標本を用いて、バレル皮質を刺激し視床VPL核投射神経細胞からEPSCを記録した。このEPSCは純粋なAMPA受容体の反応よりdecay time constantが遅く、薬理学的実験より30%あまりがkainate受容体によるEPSCの成分であることが分かった。現在、末梢から視床への脊髄視床路シナプスの入力と皮質視床シナプスの両方が同一の投射細胞から記録できるスライス標本を開発し、安定した記録が取れる段階に至っている。今後はこれら二つのシナプス伝達特性を詳細に解析し、シナプス特性を規定する分子を明らかにするとともに、お互いのシナプスの干渉作用つまり、どのようなタイミングで二つのシナプス入力が入ると、どのような出力になるかをシナプス可塑性も含めて解析したい。これらの成果は、視床における感覚情報処理機構を知る上で要の研究と考える。また、発達段階において、これらシナプスがどのように発達し機能的に成熟していくかについても明らかにしていきたい。大脳皮質-視床へのfeedback投射の空間支配を観察するために、本助成金でMED 64を購入したが、解析しうる充分な結果を得られていない。原因は現在使用している視床のsliceの皮質との結合が不十分か、もしくはsliceでの電気的極性ベクトルが同じ方向を向いていないかなどであり、現在解剖学的手法も取り入れて検討中である。反対に、視床から大脳皮質への投射支配については、MED64にて時空間的興奮伝播過程が記録できている。平成13年から14年までの研究で痛覚情報処理に皮質視床シナプスが関わっていることを明らかにした。感覚情報は末梢から情報は内側毛帯シナプスを介してVB核投射細胞に入力する。一方、皮質からは大量のフィードバックシナプス(皮質視床シナプス)が入力している。感覚情報は内側毛帯シナプスの入力が皮質視床シナプス入力と連合して情報処理をしていると考えられる。しかしながら、これらシナプスの特性を詳細に解析した報告はなく、不明な点が多い。研究代表者は視床VB核投射神経細胞のシナプス解析に着手し、視床水平断標本において、内側毛帯シナプスと皮質視床シナプスのEPSCsを同一のVB投射細胞から記録する方法を確立した。マウスVPL核投射細胞において、皮質視床シナプスのEPSCsに、NMDA受容体、AMPA受容体に加えてカイニン酸受容体成分が存在することを見出した。一方、末梢からの感覚情報を受ける内側毛帯シナプスEPSCには、カイニン酸受容体成分は存在しなかった。カイニン酸受容体は、AMPA受容体に比べてdecay time constantが遅いため、高頻度のシナプス入力で内向き電流は加算され、非常に大きな興奮性を標的細胞に与えると考えられる。さらに、マウス体性感覚野の5-6層の神経細胞では、カイニン酸受容体のGluR5-7遺伝子が有意に高く発現しており、皮質視床シナプスの前終末にも、カイニン酸受容体が存在すると推定する。従って、皮質視床シナプスの前後シナプスに存在するカイニン酸受容体が、入力頻度を感知して、精巧に感覚情報のゲインをコントロールしている可能性がある。一部の成果は、北米神経科学会等に発表し、現在論文にまとめているところである。

今後は、皮質視床シナプスのカイニン酸受容体によるシナプス入力のゲインコントロールの研究を進める予定であり、また、炎症性疼痛時にこのようなシナプス入力がどのように変化するのか、mGluR1の寄与を含めて研究する予定である。目的:視床投射神経細胞には、末梢からの感覚情報を受け取る上向性シナプスと大脳皮質からのfeedbackシナプス(皮質視床シナプス)の二つの主な興奮性シナプスが存在している。両シナプスは生理機能的にそれぞれ、driverとmodulatorとして働いていると考えられているが、そのシナプス基盤は明らかでない。我々は、それらのシナプス特性を詳細に解析し、特に、グルタミン酸受容体の構成成分に着目し、カイニン酸受容体電流の解析と、その機能的意義について解析した。成果と考察:以下のことが明らかになった。1.視床シナプスEPSCではカイニン酸受容体成分が存在するが、内側毛帯シナプスには存在しない。2.皮質視床シナプスEPSCはNMDA受容体成分がAMPA受容体成分より極めて多く存在するが、内側毛帯シナプスEPSCではその逆である。3.皮質視床シナプスではlate-persistent発火を示すが、内側毛帯シナプスではonset-transient発火を示す。4.皮質視床シナプスのlate-persistent発火の形成はNMDA受容体に大きく依存し、カイニン酸受容体は修飾的な作用がある。内側毛帯シナプスのonset-transient発火の形成はAMPA受容体に主に依存している。投射細胞はT-typeカルシウムチャンネルにより、発火モードを過分極の場合(-70mV以下)はバーストモード、脱分極の場合(-50mV付近)はトニックモードに変化する。そして一般的に、トニックモード時に末梢からの感覚情報を正確に大脳皮質に伝えるとされている。以上の知見と今回の結果を総合的に考えると皮質視床シナプスEPSCは比較的キネチックスの遅い、NMDA受容体やカイニン酸受容体成分が有意に存在することから、大脳皮質は高頻度で活動すれば、投射神経細胞に対して、ゆっくりとした脱分極を惹き起こすし、バーストからトニックモードに移行するように働くと想像される。一方、内側毛帯シナプスはキネチックスの早いAMPA受容体成分が多いため、末梢からの情報をタイミングを合わせて情報を大脳皮質に伝える働きをしていると考えられた。この研究成果は現在J.Physiol.に投稿中(under revision)である。
脳神経系における組替え体CNRゲノミック遺伝子の検索と解析

CNR遺伝子のゲノム組み換え体の単離を目的として,CNR遺伝子の定常領域をプローブとして用いマウス脳由来ゲノムライブラリーのスクリーニングを行った。その結果,IgGやTCRと類似したCNR組み換え体は得られなかったが,cDNAと同じ配列のイントロンを欠いたCNR遺伝子(v6)が単離された。このイントロンレスCNR遺伝子は28SrRNA遺伝子を分断するように挿入しており,境界領域には5塩基のダイレクトリピートが存在し,10個の点突然変異が見られた。これらの特徴から,このイントロンレスCNR遺伝子はCNR mRNAのレトロトランスポジションにより生じたと考えられる。v6以外のCNR遺伝子についても同様にレトロ転位したイントロンレス遺伝子が存在するかどうかを検討するために,ゲノムDNAを鋳型として用いてPCRによる検出を試みた。各可変領域エキソンにおける共通配列と定常領域エキソンに設計したプライマー(ゲノム上のプライマー間の距離は200kb)を用い,マウスのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行ったところ,脳組織ゲノムDNAを用いた場合のみ,v1からv12の全てのCNR遺伝子のイントロンレスパラログをPCR増幅体として得ることができた。一方,精巣などの脳組織以外のゲノムDNAを用いた場合はPCR増幅体は得られなかった。脳特異的に発現する遺伝子が一世代の間にレトロ転位を受けるという例は,始めての知見である。また,興味深いことに,このイントロンレスCNR遺伝子の検出には個体差が見られ,同系統(C57BL/6)の30個体のマウスのうち9個体(30%)でイントロンレスCNR遺伝子を脳組織特異的に検出できたが,残りの21個体では全く検出できなかった。この同系統マウスにおける個体差は,レトロトランスポジションの起こる頻度が低く,イントロンレスCNR遺伝子の存在がある個体の一部の神経細胞に限られることを反映していると考えられる。
プラスチドゲノムの転写後制御因子に関する研究

プラスチドの遺伝情報発現系を構成する因子の多くは核ゲノムにコードされている。我々は、転写後過程に関与するRNA結合タンパク質とその遺伝子を単離し、その構造と機能を解析した。1.タバコの緑葉より、葉緑体RNA結合タンパク質とそのcDNA5種(cp28,cp29A,cp29B,cp31,cp33)を単離した。いずれも、トランジトペプチド、酸性アミノ酸に富むドメインと、それに続く2個のRNA結合ドメイン(約80アミノ酸)よりなる。葉緑体への輸送実験により5種とも葉緑体へ移行するタンパク質である。in vitroでの核酸結合能は、いずれもポリ(G)とポリ(U)と強く、RNA結合ドメイン1個でも結合能を有している。また、2個のRNA結合ドメインが強く核酸に結合するためにはドメイン間のスペーサーの存在が必須である。10種のRNA結合ドメインの配列をもとにその系統樹を作製したところ、3グループに分かれることが示された。2.上記の5種のRNA結合タンパク質の遺伝子を単離した。いずれも4個のエキソンと3個のイントロンよりなり、イントロンの位置は同じである。cp33遺伝子のみは転写量も少なくTATA-lessプロモーターであった。3.5種のRNA結合タンパク質を大腸菌で合成すると共に各々の抗体を作製した。5種の合成タンパク質は、いずれも成熟tRNAを除くすべてのプラスチドRNAと結合性を持っていたので、配列特異性はないものと考えられる。単離葉緑体より抽出液を調製し、抗体を用いてRNA結合タンパク質を除去して、プラスチドRNAのプロセシングや翻訳を調べると、いずれも活性が上昇する、従って、プラスチドDNAより転写されたRNAがまずRNA結合タンパクと結合し、mRNAの保存やリボゾームへの受渡しに関与することが考えられ、RNA結合タンパクがプラスチド内でのRNA分子のパーティショニングの役割を果たしている可能性が高い。プラスチドは光合成お物質生産を担う植物特有のオネガネラで独自のゲノムと完結した遺伝情報発現系をもつ。プラスチド遺伝子の発現制御は主として転写後(RNAレベル)で行われる。そこで、我々は転写後調節に関与すると考えられるRNA結合タンパク質を単離し、その遺伝子の構造と発現様式および機能の解析を進め、初年度は以下の成果を得た。1)タバコ葉緑体の3種類の葉緑体RNA結合タンパク質(リボヌクレオプロテイン)cp28、cp31、cp33を無細胞RNAータンパク質合成系で合成し、それぞれの核酸歩合能を調べた。3種のタンパク質とも1本鎖DNAと強く結合するが、特にポリ(G)とポリ(U)と高い結合特異性を示した。2)RNA結合タンバク質cp31の遺伝子を単離して、その全塩基配列を決定した。この遺伝子は4個のエキソンと3個のイントロンよりなり、転写開始後は翻訳開始点より168bp上流に存在する。転写産物の中にはオルタナティブ・スプライシングによるものは含まれていない。Nicotiana sylvestrisの核ゲノムにはこの遺伝子は1コピ-存在することが明らかとなった。3)新たに2種の葉緑体RNA結合タンパク質cp29Aとcp29Bを同定し、各々のcDNAと遺伝子を単離・解析した。両者ともトランジト・ペプチド、酸性ドメイン、2個のRNA結合ドメインを持っていた。また両遺伝子は4個のエキソンと3個のイントロンより構成されていた。4)以上5種のcpタンパク質に存在する10種のRNA結合ドメインの構造が明らかになったので、その系統樹を作製した。

我々は、転写後過程に関与するRNA結合タンパク質を単離し、その遺伝子の構造と発現様式及び機能を解析した。1.タバコ葉緑体RNA結合タンパク質cp29A遺伝子を単離して全塩基配列を決定した。この遺伝子は749bp,258bp,303bpの3個のイントロンを含み、これを除いたリーデングフレームは291コドンより成っている。転写開始点は近接する2ヶ所よりなり、それぞれ前方にTATAボックス様配列が存在する。2.葉緑体RNA結合タンパク質は1個の酸性ドメインと2個のRNA結合ドメインよりなる。その核酸結合能を調べるため、cp29AとBより各種の欠失変異蛋白を作製し、それぞれの核酸結合能を測定した。いずれも、酸性ドメインを除くと、元の蛋白に比べ結合能が高まった。RNA結合ドメインは1個でも元の蛋白(2個)に比べ弱いがポリGとポリUに結合することから、このドメイン1個で、RNA結合性を持つと考えられる。スペーサーはあってもなくてもRNA結合ドメイン1個の結合能に関係しない。しかし、RNA結合ドメイン2個を結合した蛋白(スペーサーがない)も1個のドメインと同じ結合能であった。このことはスペーサーがRNA結合ドメインの結合能の加算効果に必須であることを示す。3.葉緑体伸長因子FF-Tuの2種の遺伝子(tufAとtufB)は、異なった転写様式を示すことを明らかにした。また、葉緑体リボソーム蛋白質についてもL28のcDNAを単離・解析した。1.RNA結合蛋白cDNAの単離:葉緑体RNA結合蛋白のRNA結合ドメインの配列をもとに、いくつかのcDNAを単離したが、ほとんど既知の5種のものであった。しかし3種の新しいRNA結合蛋白のcDNAを得た。これらのcDNAから推定される蛋白(RGP-1a,1b,1c)は1個のRNA結合ドメイン(80アミノ酸)をN-端末側に、グリシン・リッチ・ドメイン(61-78アミノ酸)をC端末に持っており、ポリ(G)とポリ(U)に高い親和性を示した。しかしこれらの蛋白はトランジット・ペプチドを持たないため核・細胞質系で作用しているものと予想される。転写産物は、葉、根、花や培養細胞に存在するが、特に根にpre-mRNAが多く蓄積している。いずれの遺伝子に対しても5'スプライス部位の異なるオルタナテイブ・スプライシングmRNAが検出された。2.作用部位の特定:5種のRNA結合蛋白はいずれも強い配列特異性を示さないことが各種結合実験で明らかになった。3.RNA結合蛋白遺伝子の解析:RNA結合蛋白cp33遺伝子を2倍体タバコのN.sylvestrisより単離・解析したところ、885bp、1187bpと78bpの3個のイントロンを含んでいた。cp33遺伝子はシングルコピー遺伝子で、その転写開始は開始コドン前方22180bpの領域内の少なくとも8ケ所から起こり、TATAボックス様配列が見いだされないことから、この遺伝子はTATA-lessプロモーターを持つと考えられ、ハウスキーピング遺伝子と予想される。
慢性骨髄単球性白血病の病態解明と治療標的の探索

慢性骨髄単球性白血病(CMML)は血液がんの一種であり、極めて予後が悪い疾患である。疾患特異的な人工多能性幹細胞(iPS細胞)化技術を用いたCMMLの新規疾患モデルを用いて、網羅的遺伝子解析から病態形成に関わる候補遺伝子SLITRK4を同定し、ノックアウト・転写抑制実験を通して治療標的となりうることを示した。また、Gene Set Enrichment Analysisを用いた解析から、CMML細胞が健常細胞と比較して細胞骨格に関わる遺伝子群を高発現していることを確認した。正常iPS細胞においてはCLISPR/Cas9システムを用いたSLITRK4のノックアウトクローンを得ることができなかった。そこで正常iPS細胞と慢性骨髄単球性白血病(CMML)由来iPS細胞にそれぞれレトロウイルスベクターを用いてSLITRK4の転写抑制実験を行ったが、本来であれば不死化することが予測される、scramble配列に対するノックダウンベクターを感染させたCMML由来iPS細胞で不死化が確認されず、トランスダクションによるウイルス毒性の影響が考えられた。現在は、iPS細胞を血球分化した後にノックダウンする方法やレンチウイルスベクターを用いたノックダウン方法に切り替え、解析を進めている。正常マウスの骨髄より採取した幼若造血細胞にレトロウイルスベクターを用いてSLITRK4を導入し半固形培地で培養したが、コロニー形成能や長期間増殖能には変化が見られなかった。また、細胞形態や表面抗原を解析したが、コントロールと比較して違いを認めなかった。細胞株OCI-AML2、OCI-AML3、MOLM13、THP1においてSLITRK4が高発現していることを確認できたため、以上の4つの細胞株を用いてレトロウイルスベクターによる転写抑制実験を行った。OCI-AML3においては細胞増殖抑制効果が見られたため、下流シグナルの探索としてmRNAを抽出し遺伝子発現プロファイルを確認している。また、CMML症例の患者検体を3例収集し、単核球分離後に凍結保存した。一部からCD34陽性細胞をソートし、RNAを抽出した後にcDNAへ逆転写しSLITRK4の発現量を調べたところ、健常検体のCD34陽性細胞と比較して発現が高いことを確認できた。当初計画していたレトロウイルスベクターを用いた方法では、iPS細胞での転写抑制実験がうまくいかなかったが、iPS細胞を血球に分化した後にノックダウンする方法やレンチウイルスベクターを用いた方法を使うことにより克服することができそうである。また、骨髄異形成症候群モデルであるNHD13マウスが使用可能となったため、マウス造血器腫瘍モデルを用いた機能解析を進めることができる。また、SLITRK4は細胞内ドメインにチロシン残基を有し、何らかのシグナル伝達に関与している可能性が考えられた。SLITRK4の過剰発現の系を用いて、MAPK/Erk経路やPI3K/Akt経路などのシグナル伝達系のリン酸化について調べたが特に変化は見られなかった。他のSLITRKfamilyにおいてPTPδやTrkBなどの分子との関係が示唆されている報告があることから、これらの分子との結合やリガンド刺激によるシグナル伝達経路の変化について解析を進めている。CMML-HPCとNormal-HPCにおける遺伝子発現についてのGene Set Enrichment Analysisを用いた解析から、CMML-HPCでは細胞骨格に関わる遺伝子群が高発現していることを確認した。今後の研究では、この細胞骨格に関わる遺伝子群がCMMLにおいてどのように病態形成に寄与しているかを明らかにし、治療標的となりうるかを調べることとする。骨髄異形成症候群モデルのトランスジェニックマウスを用いてSLITRK4の機能解析を進めるとともに、引き続きSLITRK4の下流シグナルの探索を進める。SLITRKファミリーは一回膜タンパク質であり、SLITRK4も細胞内において足場タンパク質と共在していることが考えられる。CMML由来iPS細胞を血球分化した造血前駆細胞と健常対照を用いて、足場タンパク質の有無や共在の有無を免疫染色で確認する。引き続き臨床検体を収集し、治療標的が定まった時点でこれらの試料を用いて検証を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。造血器腫瘍29年度が最終年度であるため、記入しない。
多発性骨髄腫に対するHDAC阻害療法の最適化の検討

昨年度の研究で明らかになった、HDAC阻害薬処理による多発性骨髄腫細胞株のNKG2DリガンドMICAの発現上昇についてその分子メカニズムを解明した。IMiDs (immunomodulatory drugs)はcereblonと結合して標的分子であるIKZF1のpolyubiquitin化・プロテアソームによるタンパク質分解を誘導して抗骨髄腫効果を示す。我々はHDAC阻害でIKZF1のmRNAが低下し転写レベルで発現が抑制されることを見出した。IKZF1はMICA発現のnegative regulatorであることが知られており、HDAC阻害によるIKZF1 IKZF1の発現低下を介してMICAの発現が増強する可能性が示唆された。HDAC阻害薬は抗CD38抗体であるdaratumumabに加えて抗SLAMF7抗体elotuzumabのADCC活性を増強した。HDAC阻害薬、AKT阻害併用はc-MYCの低下を介して相乗的に抗骨髄腫効果を示した。HDAC阻害によりマクロファージによる貪食阻害に重要なCD47の発現低下を認めた。また、CD47の低下は、AKT阻害薬併用で増強した。cereblonノックダウンでレナリドマイド耐性を獲得した細胞株に対してもHDAC阻害薬やAKT阻害薬の併用は相乗効果を示した。これらの細胞株でMICAの上昇、IKZF1の低下を認め、HDAC阻害薬はcereblon非依存性にIKZF1低下やMICA増強を誘導することが示唆された。HDAC阻害薬はプロテアソーム阻害薬・IMiDsと異なる作用機序でこれらの薬剤抵抗性の症例にも奏功する可能性が期待される。今年度の研究により、HDAC阻害薬処理による多発性骨髄腫細胞株のNKG2DリガンドMICAの発現上昇の分子メカニズムが明らかとなった。さらに、複数の抗原に対する抗体療法においてHDAC阻害薬による免疫賦活化が明らかとなり、HDAC阻害薬と抗体薬の併用という新しい治療法の開発につながる成果と考えられる。HDAC阻害薬がcereblon非依存性にIKZF1低下やMICA増強を誘導する知見はIMiDs抵抗性の症例に対するHDAC療法の有効性を示唆する。今年度の研究ではHDAC阻害薬の中でも汎HDAC阻害薬に加えてHDAC6阻害薬でもMICAの発現上昇を介した免疫の賦活化が示された。再発難治骨髄腫の治療として汎HDAC阻害薬のpanobinostatがボルテゾミブ・デキサメタゾンとの併用(FVd療法)で実臨床に導入された。FVd療法はボルテゾミブ投与歴を有する症例でも有効な場合があるが、重篤な副作用により投与継続が困難となることが多い。panobinostatの一標的であるHDAC3は筋肉の糖代謝で重要な役割を果たす(Hong et al., Nature Medicine 2017)。PanobinostatはIC50数nMと強力にHDAC3を抑制することから重篤な疲労感などの副作用につながる可能性が考えられる。HDAC6阻害薬はHDAC3の阻害強度がIC50数十nMで、HDAC3抑制に伴う副作用が少なく高い治療効果が得られる可能性が期待される。本研究の成果を基に低分子化合物を利用して抗腫瘍効果・免疫賦活化を同時に実現してCAR-T療法などの細胞療法よりも安価にdouble refractory症例に有効で副作用の少ない治療法の確立を目指す。これまでの研究成果で得られた知見について、ヒト臨床検体を用いて同様に解析を行う。特に、レナリドミドに耐性の症例を含む難治性の症例検体を当院、日本赤十字医療センター、NTT東日本関東病院、日本医科大学病院などから収集し解析する。臨床検体の収集・及び解析については当施設で倫理申請を行い承認されている。抗体とHDAC阻害剤の併用効果をin vivoで評価するため、骨髄腫マウスモデルでの評価系の確立を目指す。ADCC活性の検討のため、免疫系を含むヒト造血組織を再現したマウスでヒト骨髄腫を再現したマウスモデルの作製を試みる。新生児期にNOGマウスに健常人由来CD34陽性細胞と症例由来骨髄腫細胞を移植する(Ishikawa et al., Blood 2005)。樹立されたマウス骨髄腫モデルを用いてHDAC阻害剤と抗体の併用療法の効果について検討する。NOGマウスは補体活性を欠失しており、CDC活性の解析は骨髄腫細胞株をSCIDマウスに移植するxenograft mouse modelで解析する。これまでの研究成果について論文発表を行う。多発性骨髄腫の新規治療戦略としてCD38抗原の認識抗体ダラツムマブなどの抗体療法が注目されている。NK細胞などのエフェクター細胞は、骨髄腫細胞表面のCD38抗原と結合したダラツムマブのFc部分とFc受容体を介して結合することにより活性化されて骨髄腫細胞に対して細胞傷害活性を示す(ADCC活性)。ADCC活性の活性化には、骨髄腫細胞でのNK細胞の細胞傷害活性の標的抗原の発現変化が重要な役割を果たす。また、ADCC活性に加えて骨髄腫細胞に結合した抗体が補体を活性化して骨髄腫細胞に細胞傷害活性を示すCDC活性も抗骨髄腫作用を担う。一方、骨髄腫細胞表面に発現するCD55, CD59は補体の作用を減弱しCDC活性を阻害すると考えられる。

本研究ではパノビノスタット(汎HDAC阻害)、ロミデプシン(HDAC1-3阻害)、ACY-1215(HDAC6阻害)などの各種HDAC阻害剤処理によるNK細胞の細胞傷害活性の標的抗原(MICA/MICB、ULBP-2/5/6)及びCD55, CD59の発現変化をU266, KMS-11, KMS-18, KMS-12PE, RPMI8226などの骨髄腫細胞株で解析した。その結果、HDAC阻害により骨髄腫細胞でMICA/MICB, ULBP-2/5/6の発現増加及びCD55, CD59の発現低下が誘導されることを明らかにした。これらの発現変化にはセリン/スレオニンキナーゼのAktが関与することが示唆された。さらに、ダラツムマブのADCC及びCDC活性がHDAC阻害により増強することが示された。以上の結果から、ダラツムマブなどによる抗体療法においてHDAC阻害剤の併用で治療効果が増強し抵抗性の克服をもたらす可能性が示された。HDAC阻害薬に加えてAkt阻害薬の併用も抗原変化に関わることも明らかになった。H29年度の研究計画であげられた、パノビノスタット、ロミデプシン、ACY-1215処理によるNK細胞の細胞傷害活性の標的抗原、CD55, CD59の発現をU266, KMS-11, KMS-18, KMS-12PE, KMS-26, RPMI8226などの骨髄腫細胞株で解析する計画については、各クラスのHDAC阻害剤でMICA/MICB、ULBP-2/5/6の発現が上昇し、CD55, CD59が低下することを見出した。MICA発現上昇の分子機構についてもmRNAが上昇し、エピジェネティクスによる制御機構が明らかになった。さらに、骨髄腫細胞株にレンチウイルスを用いてルシフェラーゼ発現ベクターを導入し、ADCC活性(エフェクター細胞を含む健常者末梢血単核球存在下で治療抗体とコントロール抗体で細胞傷害活性を比較)とCDC活性(複数人の健常者血清とその非働化血清存在下で治療抗体による細胞傷害活性を比較)を評価する系を確立した。これらを用いてHDAC阻害剤によりADCC, CDC活性が増強することを明らかにした。以上からH29年度のHDAC阻害による骨髄腫細胞に対する腫瘍免疫応答の変化の解析についてはおおむね順調に進展し、今後の解析がさらに進むことが期待される。一方、PPP3CAによるNF-kBシグナルの活性化機構の解明は必ずしも、仮説を裏付けるデータが十分得られていないのが現状である。昨年度の研究で明らかになった、HDAC阻害薬処理による多発性骨髄腫細胞株のNKG2DリガンドMICAの発現上昇についてその分子メカニズムを解明した。IMiDs (immunomodulatory drugs)はcereblonと結合して標的分子であるIKZF1のpolyubiquitin化・プロテアソームによるタンパク質分解を誘導して抗骨髄腫効果を示す。我々はHDAC阻害でIKZF1のmRNAが低下し転写レベルで発現が抑制されることを見出した。IKZF1はMICA発現のnegative regulatorであることが知られており、HDAC阻害によるIKZF1 IKZF1の発現低下を介してMICAの発現が増強する可能性が示唆された。HDAC阻害薬は抗CD38抗体であるdaratumumabに加えて抗SLAMF7抗体elotuzumabのADCC活性を増強した。HDAC阻害薬、AKT阻害併用はc-MYCの低下を介して相乗的に抗骨髄腫効果を示した。
複雑な結晶構造を有するベリリウム金属間化合物における水素同位体照射効果

ベリリウム金属間化合物は照射下においても格子間原子の二次元集合体の形成が行われにくく、試料中を動き回る格子間原子の濃度が高い水準で保たれる。格子間原子の濃度が高いと原子空孔濃度は必然的に下がり、原子空孔集合体、つまりボイドの形成が行われにくくなる。これが、水素同位体の捕獲機構に大きな影響を与えている。本年度は、Be_12Tiにおける独特の欠陥形成挙動本計算では実験結果を理解するために、以下のような欠陥反応仮定を仮定し、計算機シミュレーションを行った。(1)照射によって試料中に導入された点欠陥は試料中に一様に導入される。カスケード損傷の効果は考慮しない(2)これらの点欠陥は熱的に移動することが可能である。(3)試料中を移動している原子空孔と格子間原子が結合すると消失する。また、これらの点欠陥が表面などの欠陥に対するシンクに到達した場合も消失する。(4)格子間原子は二次元的に集合して転位ループを形成する。(5)転位ループからの格子間原子の熱的な解離は無視する。なお(4)については転位ループを形成する場合と形成しない場合の双方について考慮した。モデリング計算の結果、転位ループが形成される状況下では、格子間原子は転位ループに優先的に捕獲されていく。その結果、試料中に原子空孔が大量に蓄積されることになる(例えば1dpaのときの濃度が10<-2>である)。一方転位ループが形成されない状況を仮定した場合、1dpa程度の照射では原子空孔の濃度も10<-4>程度に留まる。空孔集合体の発生・成長のメカニズムは複雑ではあるが、試料中における原子空孔濃度がある程度の水準に達する必要があることは十分に理解されており、この条件下では空孔集合体が形成されにくいことは明らかである。以上の結果より、Be_<l2>Tiにおいてボイドが形成されにくい本質的な原因について解釈することができた。すなわち、Be_<l2>Tiは結晶構造が複雑であるため転位ループがまったく形成されない。転位ループが存在しないと試料中を動き回る格子間原子の濃度が高い水準で保たれる。格子間原子の濃度が高いと原子空孔濃度は必然的に下がり、原子空孔集合体、つまりボイドの形成が行われにくくなると考えられる。今年度は中性子照射下におけるベリリウム金属間化合物の水素同位体捕獲特性の予測を目標とした各種実験及び計算機によるシミュレーションを行った。試料は高温等方加圧(HIP)法製Be12Ti(BeO : 1.32wt%)を使用した。試料を加工後、高エネルギーイオン発生装置を用いて重イオン照射を行い、その後透過型電子顕微鏡による内部微細組織観察をおこなった。Be12Tiの結晶粒径は数100nmから数μm程度であり、Be12Tiの単相組織であった。また、一部の領域で双晶境界が観察された。また、結晶粒内には潜在欠陥はほとんど存在していなかった。2.4MeVのCu2+を室温で1, 5dpaまで照射しても、試料内部に転位ループ・ボイドなどの欠陥は一切観察されなかった。調査した限りでは、他種の金属材料及びその合金においては、1dpa以上の照射領域では必ず転位ループやボイドが形成されることと比較すると、極めて特異な現象である。このことはBe12Tiの複雑な結晶構造(tI26)と関係すると考えられる。この現象を解明するための一つの手段として、反応速度論を用いた計算機シミュレーションを行った。計算の詳細は割愛するが、転位ループが形成されると仮定して計算を行った場合、照射領域に多量の原子空孔の蓄積が見られるが、転位ループの安定成長が行われない状況を想定した計算を行うと、試料中における原子空孔の濃度が著しく低減化される。以上の結果より、Be12Tiにおいてボイドが形成されにくい本質的な原因について解釈することができる。すなわち、Be12Tiは上記したように結晶構造が複雑であり転位ループがまったく形成されない。このメカニズムは、当然、水素同位体の捕獲機構にも大きな影響を与えていると予測される。
炎症性メディエーターによるDRGニューロンの感作メカニズム

炎症性疾患において、局所に多数の炎症性メディエーターが放出され、その近傍にある感覚神経を刺激あるいは感作させることで、炎症性疼痛を引き起こす。本研究は炎症性メディエーターブラジキニンやトリプターゼなどによる疼痛関連受容体(TRPA1及びP2X3)の機能増強機構を解析し、炎症性疼痛の発症における疼痛関連受容体感作のメカニズムを解明した。主な研究成果として、(1)ブラジキニンやPAR-2受容体アゴニストによるTRPA1及びP2X3チャネルの活性増強を明らかにした。(2)機能増強メカニズムには細胞内PKAやPLCが重要な役割を担っていることを解明した。(3)TRPA1やP2X3チャネルを介した疼痛行動がPAR-2アゴニストによる増強効果がIn vivoレベルにおいて確認された。これらのデータによって炎症性疼痛発症の新しい分子メカニズムが明らかになった。炎症性疾患において、局所に多数の炎症性メディエーターが放出され、その近傍にある感覚神経を刺激あるいは感作させることで、炎症性疼痛が引き起こされる。本研究は炎症性メディエーターによるTRPA1など疼痛関連受容体の機能調節に着目し、炎症性疼痛の発症メカニズムにおける疼痛関連受容体感作の役割を解明することを目的とする。H20年度の研究期間内に以下の実験を行った:2.行動学実験で炎症性疼痛の発生過程における疼痛関連受容体の関与を確認した。炎症性メディエーターを足底注射し、TRPA1やP2X3のアゴニスト注射で惹起される痛み行動の変化を観察した。3.リン酸化MAPKやc-Fosなど神経活性化マーカーを用いて、炎症時の疼痛関連受容体の関与を確認した。P2X3及びTRPA1のアゴニストを足底注射し、ラットDRGおよび脊髄後角ニューロンに発現するリン酸化ERK、c-Fosを免疫組織化学法で検証した。以上の研究結果を北米神経科学学会などの学会や論文にて発表した(次ページの研究成果参照)。本研究は炎症性メディエーターによる疼痛関連受容体の機能調節に着目し、炎症性疼痛の発症メカニズムにおける疼痛関連受容体感作の役割を解明することを目的とする。H21年度の研究期間内に以下の実験を行った。炎症性メディエーターによるP2X3チャンネル機能調節の解析(Patch Clamp法)まずラット後根神経節初代培養神経細胞を用いて実験を行った。α,βmethylene-ATPによって惹起した内向き電流を、whole cell patch clamp法で測定した。その後炎症性メディエーターである活性物質(Bradykininとtrypsin,SL-NH2)をアプライしながら、ATP電流を測定し、増強の有無を検討した。SL-NH2やtrypsinなどPAR2のアゴニストはα,βmethylene-ATP電流をpotentiateすることが明らかにした。アゴニストやcurrentの特性からP2X3チャンネル電流であることを推定した。つぎに、P2X3の下流シグナルを応じて、PKC,PKA,MAPKなどのinhibitorやactivatorを投与し、PAR-2とP2X3間のシグナル伝達経路を同定した。α,βmethylene-ATPによるP2X3チャンネルの活性増強効果はPKAおよびPKCのinhibitorによって完全にblockされることを見いだした。さらにPKAやPKCのactivatorは直接P2X3チャンネルの活性を増強するデータが得られた。以上の結果から炎症性疼痛の発症メカニズムとして、プロテァーゼに介したATP受容体の機能亢進が関与する可能性が示唆された。本研究は炎症性メディエーターによる疼痛関連受容体の機能調節に着目し、炎症性疼痛の発症メカニズムにおける疼痛関連受容体感作のメカニズムを解明することを目的とする。H22年度の研究期間内に昨年度続き以下の実験を行った:炎症性メディエーターによるTRPA1とP2X3チャンネル機能調節のメカニズムを解明した(1)まず、transfectしたHEK細胞にPAR2アゴニストなどの炎症性メディエーターを処理し、免疫沈降法を用いて、TRPA1とP2X3のタンパク質を抽出し、セリン、スレオニンのリン酸化抗体を用いたWestern Blot法で、炎症性メディエーターによるリン酸化変化の有無を検討した。結果は予測に反してリン酸化変化は認められなかった。

(2)同じくtransfectしたHEK細胞を用い、TRPA1とP2X3の膜たんぱくを抽出し、Western Blot法にて炎症性メディエーターによるタンパクの膜移行の有無を確認した。TRPA1について膜移行が確認でき、PAR2シグナルによる機能増強のメカニズムの一因であることを示唆した。P2X3について有意な膜タンパクの変化が認められなかった。In vivo疼痛行動実際を用いて、疼痛発症における細胞内シグナリングの関を明らかにしたパッチクランプ法で確認できたチャンネル活性増強に関わる細胞内シグナリングをin vivoで確認した。ラットの足裏にAITCやα,βmethylene-ATP注射による疼痛行動は、PLC, PKA, PKCのシグナルによって増強されるかどうかを確認した。何れのキナーゼのinhibitorおよびactivatorの単独投与によって疼痛行動が有意に変化しなかったが、PKAとPKCのactivatorの協働増強効果が認められた。
前駆細胞をターゲットとした多発性骨髄腫の新たな分子標的療法の開発

多発性骨髄腫は治癒の難しい難治性造血器腫瘍であり、新たな治療法の開発が望まれている。最近の幹細胞生物学の進歩により、治癒を目指すためには、骨髄腫前駆/幹細胞(myeloma stem/progenitor cell : MSPC)を標的にした治療法の開発が必須である。本研究においては、MSPCの増殖に必須のNF-kB阻害活性を有する生理活性物質1'-acetoxychavicolacetate(ACA)を構造展開させTM233を合成した。TM233はACAよりも強力なNF-kB阻害活性を有し、骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導した。さらに、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞のアポトーシスも誘導し、将来の臨床応用が期待された。さらに、金製剤オーラノフィンはJAK/STAT系シグナルとNF-kB阻害を介して骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導した。骨髄腫前駆細胞の同定に関して種々検討した結果、in vitroおよびin vivoにおいてclonogenic骨髄腫細胞はCD138陰性の形質細胞分画の中に存在することが明らかになった。今後は、さらにMSPCに対するTM233やオーラノフィンなどの生理活性物質の直接的な効果を検証する予定である。本研究は、これまで明らかでない骨髄腫前駆細胞を明らかにし、それらを標的にした新たな治療法を開発し、多発性骨髄腫の治療成績を向上させる事を目的としている。骨髄腫前駆細胞の増殖にはNF-κB活性が必須と考えられるため、まず新たなNF-κB阻害剤の開発を行った。生理活性物質1'-acetoxychavicol acetate (ACA)にNF-κB阻害活性があることを見いだしているが、ACAは種々の骨髄腫細胞の増殖を細胞周期G1期に停止させ、アポトーシスを誘導した。臨床応用を目的としてACAを構造展開して得られた化合物について、定量的構造-活性関係解析(QSAR)により、ACAよりもさらにNF-κB活性抑制効果の強い化合物を精製し、いくつかの候補化合物を得る事ができた。また、金製剤auranofin (AF)は用量依存性に種々の骨髄腫細胞株および患者骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導することを明らかにした。AFは骨髄腫細胞の増殖に必須なIL-6シグナル下流のJAK2/STAT3のリン酸化を阻害し、STAT3のMcl-1への転写活性を抑制し、骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導する事を見いだした。骨髄腫細胞U266にMcl-1を強制発現させるとAFによるアポトーシス誘導はキャンセルされた。したがって、AFはMcl-1をターゲットとして骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導すると考えられた。さらに、AFはp65の核内移行を阻害する事によりNF-κB阻害活性を有することも合わせて明らかにした。ACAおよびAFによる骨髄腫細胞のアポトーシス誘導には活性酸素(ROS)は関与していなかった。当該年度はさらに、以上の知見を骨髄腫前駆細胞において検証するために、患者骨髄腫細胞からMACSを用いてCD138分画を単離する系を立ち上げた。本研究の目的は、治癒の難しい難治性造血器腫瘍の治療成績の向上を目的に、いまだ明らかでない骨髄腫前駆細胞をターゲットにした新たな分子標的療法を開発することにある。癌幹細胞あるいは前駆細胞の増殖には転写因子NF-κBの活性化が必須であり、また骨髄腫細胞の増殖にも必須の分子であるために、新たなNF-κB阻害剤の開発を行ってきた。生理活性物質1'-acetoxychavicol acetate(ACA)にNF-κB阻害活性があることは既に明らかにした。今年度は、さらに優れたNF-κB阻害剤を開発するためにACAを構造展開し得られた種々の化合物のHL-60細胞の増殖抑制を指標とした定量的構造-活性関係解析(QSAR)にて新たな低分子化合物TM233を合成分離した。TM233は骨髄腫細胞に対してACAよりはるかに優れたNF-κB阻害活性を有し、骨髄腫細胞の細胞死を誘導することにより増殖を抑制した。さらに、その作用機序はNF-κBの細胞質から核への移行阻害であることが明らかになった。興味深いことにTM233はカスパーゼ非依存性に骨髄腫細胞の細胞死を誘導した。プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブはNF-κB阻害活性を有し

すでに臨床応用されている。しかしながら、継続して使用することによりボルテゾミブ耐性が誘導されることが問題である。TM233はボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞に対しても細胞死を誘導することが可能であり、現在その詳細な作用機構を解析している。また、患者骨髄腫細胞よりMACSを用いて分離したCD138陽性細胞に対するTM233の作用およびその分子作用機構についても継続して検討しており、次年度の課題としたい。本研究は、いまだ治癒の難しい多発性骨髄腫の治療成績の向上を目的に、これまでにない骨髄腫前駆細胞をターゲットとした新たな分子標的療法を開発することである。骨髄腫前駆細胞の同定に関して種々検討した結果、in vitroおよびin vivoにおいてclonogenic骨髄腫細胞はCD138陰性の形質細胞分画の中に存在することが明らかになったが、詳細に関しては今後の検討が必要である。一般にがん幹細胞の増殖には転写因子NF-κBが重要な役割を果たすことが知られているため、われわれの同定した新規NF-κB阻害剤1'-acetoxychavicol acetate(ACA)を構造展開して得られたさらに強力なNF-κB阻害活性を有するTM233の骨髄腫細胞への影響とその作用機構の詳細について検討した。TM233は骨髄腫細胞の増殖を抑制し、細胞死を誘導した。NF-κB阻害の他に骨髄腫細胞の増殖に必須なIL-6シグナル伝達経路を阻害することを見いだした。すなわち、TM233はIL-6受容体下流のJAK2およびSTAT3のリン酸化を抑制し、IL-6のシグナルをブロックすることで骨髄腫細胞の細胞死を誘導することを見いだした。さらに、TM233は実臨床でも用いられているプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブ耐性細胞に対しても、その増殖を抑制し細胞死を誘導した。現在、臨床的にはボルテゾミブによる末梢神経障害などの有害事象や耐性化が問題になっており、TM233は新たなNF-KB阻害剤として今後の臨床応用が期待される。今後は、さらに骨髄腫前駆細胞に対するTM233の直接的な効果を検証する予定である。
寄生蜂類カイロモンの化学生物学

(1)ヒメバチの一種Venturia canescensの産卵行動開発物質の解明貯穀害虫であるマダラメイガ類4種に共通して寄生するヒメバチの一種の産卵行動を解発させる寄主由来のカイロモンを、4種のそれぞれの寄主から精製した。カイロモンの骨格はすでに報告されている2-acy1-cyclohexane-1,3-dioneであったが、acyl基が4種の間で微妙に異なり、質的両的相違即ち種特異性があることを確認した。(2)ヒメバチの遠距離誘引物質の解明寄主由来の抽出物を与えるとヒメバチの行動が活発になる。活性物質を探索し、4-ノナノライドと同定した。活性試験を客観的に評価するため、触覚を材料に匂い物質による神経の興奮電位を計測するEAG法をヒメバチに応用する目的で改良した。試験したγ-ラクトンの中では4-ノナノライドが最も強力であり、EAG法が利用価値のあることを実証できた。(3)メイガコマユバチの寄主認識麻酔行動解発物質の解明ヒメバチと同様にマダラメイガ類を寄主とするコマユバチのカイロモンをスジマダラメイガを材料にして精製単離し、各種機器分析と化学反応を組み合わせて、その構造を9、10-ジヒドロキシ-シス-12-オクタデカン酸と決定した。合成物は天然物の1/10ではあるが顕著な活性を示した。なお協力物質の存在も予想されたが、この物質は動物由来としては最初の例である。(4)シバンムシアリガタバチのカイロモン近年都市部で大発生し重大な衛生害虫であるシバンムシアリガタバチの寄主探索確認カイロモンを、タバコシバンムシの蛹室より精製した。活性成分は複数であり、2成分について化学的性質が解明できた。1成分はステロイドの脂肪酸エステル、他の成分は分子中に3個以上不飽和二重結合を含むトリアシルグリセロールであった。メイガ科マダラメイガ亜科の貯穀害虫4種、スジマダラメイガ、ノシメマダラメイガ、スジコナマダラメイガ及びチャマダラメイガを寄生とするヒメバチの1種Venturia canescensが寄生を認識し、産卵行動を解発するカイロモン物質として、スジコナマダラメイガの大顎腺から7種の2-acylcyclohexane-1,3-dioneが既に判っている。一方このカイロモンが糞中にも存在することを認め、飼料として用いたコメヌカ20kg、チャマダラメイガを除く3種の糞各40l、チャマダラメイガの糞8lから、カイロモン成分を生物試験でモニターしながら、常法により精製し単離した。4種の糞から得たカイロモンは直接導入法による質量分析およびガスクロ質量分析法で調べたところ、すべて2-acylcyclohexan-1,3-dioneの同属体混合物であり、新規化合物として2-palmitoyl、2-stearoyl、2-arachidoyl吸び非共役2-hexadecadienoyl側鎖の同属体を同定できた。また種それぞれには量的及び質的な相違が認められ、生物活性には差がないが化学的には種特異性があることが判明した。在来種のスジマダラメイガとノシメマダラメイガの組成は非常に類似点が多いが、スジマダラメイガは2-arachidoylcyclohexan-1,3-dioneの存在が特徴的であった。ヨーロッパに主として分布するスジコナマダラメイガには【C_(16)】不飽和側鎖化合物が多く、南方系のチャマダラメイガには【C_(18)】不飽和側鎖の同属体が主成分で特徴的であった。

飼料のコメヌカ中には相当する分画に活性はなく、また機器分析でも同属体を認められず、天然物として特異な構造のこれら化合物は全て生合成されるものと判明した。またこのヒメバチは寄生発生場所に誘引され、探索行動を示す。この誘引性のカイロモンは糞の水蒸気蒸留留出物中に認められた。生物試験法を種々検討した結果、EAG法で安定して検知できる事が判明したので、精製を進めている。(1)ヒメバチの遠距離誘引物質の解明匂い物質を与えた際に発生する触角の神経興奮電位を計測するEAG法が当研究室でヒメバチの触角でも応用できるようになったので,このEAG法をモニターとして,マダラメイガ類幼虫の糞中に含まれる誘引性のカイロモンの抽出同定を行った.EAG活性はシリカゲルカラムでエステル分画とラクトン分画に認め,ラクトン分画から4-ノナノライドを同定した.類縁ラクトンを系統的に調べたところ4-ノナノライドが最も活性であった.エステル分画の活性物質について精製をすすめている.(2)バクガコマユバチとシバンムシアリガタバチの誘引物質両種の寄生蜂共に寄主の糞中に活性物質の存在が認められ,バタガコマユバチでは誘引され,産卵管を突き立て,アリガタバチでは誘引されて探索行動を示す.バクガコマユバチの誘引物質をスジマダラメイガの糞(10リットル)を集めて抽出し,クロマトグラフ法を繰り返して精製し,活性化合物のメチルエステルとして200mg単離した.現在構造の検討を行っている.シバンムシアリガタバチのカイロモンは現在精製中である.(3)バクガコマユバチ毒腺中の非蛋白性物質本種は外部寄生で,寄主を永久麻酔し産卵する.毒腺中の物質は蛋白質と言われているが,毒腺中に大量の無極性物質の存在を知った.バタガコマユバチの毒腺を集め,ヘキサンで抽出し,ガスクロ分析で7ピータを認めた.主成分は昆虫では初めてのジテルペン炭化水素(E,E)-7, 11, 15-trimethy1-3-methylene-hexadeca-1, 6, 10, 14-tetraeneと同定した.副成分として11-ethy1同族体を接触還元-質量分析およびNMRの結果から推定している.その他飽和直鎖のトリコサン,ペンタコサンおよびヘプタコサンを同定した.作用については検討を考えている.1)メイガコマユバチの寄主認識麻酔行動解発物質の解明重要な貯穀害虫メイガ科マダラメイガ亜科の4種共通に寄生するメイガコマユバチBracon hebetorは寄主の糞の抽出物を濾紙片を含ませて与えると、丹念に触角で触れて調べてやがて腹部を前方に曲げ、麻酔のための毒針を刺す行動を示す。このカイロモンを寄主認識麻酔行動解発物質と定義し、スジマダラメイガの糞20リットルを材料にヘキサン抽出し、クロマトグラフ法と誘導体化を組み合わせて単離(254mg、10^<-3>ug/濾紙片で活性)した。IRから-OHの存在を、NMRから二重結合の存在と鎖状化合物であることを、メチル化-アセチル化物の質量分析からカイロモンの分子量の知見が得られた。さらに機器分析と分解反応を組み合わせて、その構造を9,10-ジヒドロキシ-シス-12-オクタデカン酸と決定した。リノール酸を出発材料としてスレオ及びエリスロ体の9,10-ジヒドロキシ-シス-12-オクタデカン酸を合成した。合成物の活性は天然物の1/10ではあるが顕著な活性を示した。なお協力物質の存在も予想され、さらに詳細に検討したいと考えている。