hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
枯草菌細胞膜糖脂質の環境ストレス応答における役割の解明

枯草菌はその細胞膜に糖転移酵素UgtPによって合成される3種類の糖脂質を持っている。ugtP遺伝子を破壊し糖脂質を欠損させた細胞では細胞外ストレス応答因子であるExtraCytoplasimicFunction (ECF)シグマ因子(SigM, SigV, SigX)が恒常的に活性化している。ECFシグマ因子は普段,膜タンパク質であるアンチシグマによって捕縛され活性が抑制されている。SigVは細胞壁分解酵素であるリゾチームに応答し,その活性化機構はSigVの特異的アンチシグマRsiVがRIP経路と呼ばれる多段階のプロテアーゼカスケードによって分解されるというものである。しかしRIPプロテアーゼの1つであるRasPを欠損していても, SigVは糖脂質欠損に応答し活性化した。また,糖脂質欠損株ではRsiVレベルに変化はなく分解は起きていなかった。一方で,あらかじめRsiVを欠損させておくとSigV活性に糖脂質欠損の影響は見られなくなった。これらの結果は,糖脂質欠損によるSigVの活性化機構はRIP経路を介したRsiVの分解とは異なる機構によることを示している。さらに, RsiVの細胞外ドメインを糖脂質欠損には応答しないRsiWの細胞外ドメインと交換したキメラタンパク質は糖脂質欠損に応答しなかった。また, RsiVの66番目のアラニンをトリプトファンに置換した変異RsiVも糖脂質欠損には応答しなかった。これらの結果より,糖脂質欠損によるSigVの活性化機構は, RsiVの細胞ドメインから始まる立体構造変化であることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。枯草菌はその細胞膜に糖転移酵素UgtPによって合成される3種類の糖脂質,モノグルコシルジアシルグリセロール,ジグルコシルジアシルグリセロール,トリグルコシルジアシルグリセロール,を持っている。これらの結果は,糖脂質欠損によるSigVの活性化機構はRsiVの分解とは異なる機構によることを示している。さらに, RsiVの細胞外ドメインを糖脂質欠損には応答しないRsiWの細胞外ドメインと交換したキメラタンパク質を用いた解析から, RsiVの細胞外ドメインが糖脂質欠損の感知に必要であることが明らかになった。この結果より,糖脂質欠損によるSigVの活性化機構は, RsiVの細胞ドメインから始まる立体構造変化である可能性が示唆された。また,異種細菌由来の糖脂質合成酵素遺伝子を用いた解析から,アンチシグマの機能に必要な糖脂質分子種がモノグルコシルジアシルグリセロールであることを特定することができた。糖脂質欠損によるSigVの活性化が, RIP経路とは別のメカニズムであることを, RasPとUgtPの2重欠損株におけるSigV活性の解析およびアンチシグマRsiVの動態解析から明らかにすることができた。さらに, RsiVの細胞外ドメインを糖脂質欠損には応答しないRsiWの細胞外ドメインと交換したキメラタンパク質を用いた解析により,糖脂質欠損をRsiVの細胞外ドメインが感知することを示すことができた。一方で, RsiWの細胞内ドメインを持ったキメラをRsiW欠損株において発現させたところ,アンチSigWとして機能しなかったため,キメラタンパク質発現コンストラクトを変更する必要があると判断し,再構築した。また,ナノディスク形成に必要な骨格タンパク質MSPを大腸菌で発現させ,精製した。

さらに, RsiVの細胞外ドメインを糖脂質欠損には応答しないRsiWの細胞外ドメインと交換したキメラタンパク質は糖脂質欠損に応答しなかった。また, RsiVの66番目のアラニンをトリプトファンに置換した変異RsiVも糖脂質欠損には応答しなかった。これらの結果より,糖脂質欠損によるSigVの活性化機構は, RsiVの細胞ドメインから始まる立体構造変化であることが示唆された。再構築したキメラタンパク質が機能的かどうかを確認し, RsiVの細胞外ドメインが感知した糖脂質欠損という情報を細胞内に伝達する仕組みを明らかにする。ナノディスク再構成系の技術習得を兼ねてスウェーデンのウメオ大学に留学し, SigVとRsiVの相互作用に与える糖脂質の影響をin vitroで解析する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
加齢に伴う身体能力の自己認識低下が心身機能に及ぼす影響とその脳機能特性の検討

申請者のこれまでの研究から、高齢者は若年者に比べ自己の跨ぎ越し能力を過大評価する傾向にあり、高齢者の転倒原因の一因が低下した身体能力の過大評価にある可能性が示唆された。H25年度は、高齢者の跨ぎ越し能力とその自己評価が加齢とともにどのように変化するかについて明らかにすることを目的とし、3年間の追跡調査を行った。本研究では、自己能力評価の課題として跨ぎ越し判断テストを行った。跨ぎ越し判断テストでは、参加者の7m前方に跨ぎ越し用のバーを水平に設置し、その高さを上下に変化させ、実験参加者がそれを跨ぎ越せると思う最大の高さを跨ぎ越し判断の最大値(予測高)として測定記録した。その後、実際にその高さのバーを跨ぎ越させ、予測高と実際に跨ぎ越せた最大の高さ(実測高)との差を求め、自己能力評価と実際の能力との乖離(評価エラー)がどの程度であるかを推定した。初回調査では跨ぎ越し判断テストを80名の高齢者に実施し、その3年後に同一参加者を対象に同様の跨ぎ越し判断テストを追跡調査として実施した(追跡調査時の参加者は71名)。初回調査時の跨ぎ越し判断テストでは9,8%の高齢者が予測高を跨ぎ越すことができなかったのに対し、追跡調査時には過大評価者は25.3%に増加した。したがって、3年間で高齢者の自己能力評価は過大評価傾向に偏向することが示唆された。予測高と実測高の各平均値の3年間の推移を検討したところ、実測高は3年間で有意に低くなったのに対し、予測高は逆に有意に高くなった。これは、3年間で跨ぎ越し動作に関する身体能力が低下し、それと並行して運動能力自己評価に関わる認知能力も衰え、その結果、過大評価の方向に偏向する傾向が増大したことを示唆している。(抄録なし)本研究は、高齢者の跨ぎ越し動作における自己の身体能力に関する評価(自己能力評価)の正確性が、高齢者の生活や心身機能にどのような影響を及ぼすか明らかにし、その脳機能的背景を、PET(Positron Emission Topography)を用いて明らかにすることを目的としている。H23年度は、高齢者の跨ぎ越し動作における自己能力評価の正確性と転倒経験の関連性を大規模サンプルにより横断的に検討した。本研究で用いた跨ぎ越し判断テスト(自己能力評価検査)では、参加者の7m前方に跨ぎ越し用のバーを水平に設置し、上下に移動させ、実験参加者が跨ぎ越せると思う最大の高さを跨ぎ越し判断の最大値(予測高)として測定記録した。その後、実際にその高さのバーを跨がせ、実際に跨ぎ越せた最大の高さ(実測高)を測定した。実験には494名の健常高齢者および71名の若年者が参加した。予測高と実測高を比較した結果、若年者では予測高を全員が実際に跨ぎ越せたのに対し、11.4%の前期高齢者および32.5%の後期高齢者は予測高を実際には跨ぎ越すことができなかった。さらに過去1年間に転倒を経験している高齢者(転倒群)と非経験者(非転倒群)における予測高と実測高を比較したところ、予測高には両群間に有意な差が認められなかったのに対し、実測高では転倒群が非転倒群に比べ有意に低い実測高を示したことが明らかとなった。したがって、転倒経験者は自身の身体能力の低下を的確に認識することができず、結果的に跨ぎ越し能力を過大評価していた可能性がある。また、転倒群では予測高を跨ぎ越せない高齢者(跨ぎ越し能力を過大評価)が非転倒群に比べて有意に多いことも示され、高齢者の転倒原因の一因が身体能力の低下の誤認識(過大評価)にある可能性が示唆された。並行して、跨ぎ越し判断テスト参加者を対象にPETを用いて脳機能画像データを収集し、現在までに96名のデータを得た。データ解析が終了次第、跨ぎ越し判断テストとの関連性を検討する予定である。H24年度は、H23年度に確認された高齢者の跨ぎ越し動作における過大評価傾向がどのような要因に関連しているかを、知覚・認知機能、性格特性、生活状況から明らかにすることとした。209名の健康な高齢者を対象に健康状態(既往歴など)および外出頻度を聴取し、認知機能の検査を行った。これらの調査・検査の後、自己能力評価検査である跨ぎ越し判断テストを行った。跨ぎ越し判断テストでは、参加者の7m前方に跨ぎ越し用のバーを水平に設置し、上下に移動させ、実験参加者が跨ぎ越せると思う最大の高さを跨ぎ越し判断の最大値(予測高)として測定記録した。その後、実際にその高さのバーを跨がせ、実際に跨ぎ越せた最大の高さを測定した。結果、跨ぎ越し判断テストの評価エラーと有意な相関が認められた項目は外出頻度のみであった。

外出頻度を高外出頻度群(1日に1回以上の外出)と低外出頻度群(2,3日に1回以下の外出)の2群に分けて比較したところ、低外出頻度群は高外出頻度群に比べて予測高を跨ぎ越せなかった者の割合(過大評価者)が有意に高いことが明らかとなった。これは外出頻度(身体活動頻度)の低下に伴い、運動機能の低下の程度を再認識する場が減少するため、結果として能力評価が過大評価傾向に偏向したものと推察される。加えて、追加調査にて高さ知覚の正確性や心理特性(衝動性、うつ傾向など)といった要因との関連性についても検討したが過大評価傾向との関連は認められなかった。したがって、現時点までの調査結果では、高齢者の過大評価傾向に強く関連する要因は外出頻度のみであり、一般的な認知機能、知覚機能、性格特性の関与は低いものと推察される。申請者のこれまでの研究から、高齢者は若年者に比べ自己の跨ぎ越し能力を過大評価する傾向にあり、高齢者の転倒原因の一因が低下した身体能力の過大評価にある可能性が示唆された。H25年度は、高齢者の跨ぎ越し能力とその自己評価が加齢とともにどのように変化するかについて明らかにすることを目的とし、3年間の追跡調査を行った。本研究では、自己能力評価の課題として跨ぎ越し判断テストを行った。跨ぎ越し判断テストでは、参加者の7m前方に跨ぎ越し用のバーを水平に設置し、その高さを上下に変化させ、実験参加者がそれを跨ぎ越せると思う最大の高さを跨ぎ越し判断の最大値(予測高)として測定記録した。その後、実際にその高さのバーを跨ぎ越させ、予測高と実際に跨ぎ越せた最大の高さ(実測高)との差を求め、自己能力評価と実際の能力との乖離(評価エラー)がどの程度であるかを推定した。初回調査では跨ぎ越し判断テストを80名の高齢者に実施し、その3年後に同一参加者を対象に同様の跨ぎ越し判断テストを追跡調査として実施した(追跡調査時の参加者は71名)。初回調査時の跨ぎ越し判断テストでは9,8%の高齢者が予測高を跨ぎ越すことができなかったのに対し、追跡調査時には過大評価者は25.3%に増加した。したがって、3年間で高齢者の自己能力評価は過大評価傾向に偏向することが示唆された。予測高と実測高の各平均値の3年間の推移を検討したところ、実測高は3年間で有意に低くなったのに対し、予測高は逆に有意に高くなった。これは、3年間で跨ぎ越し動作に関する身体能力が低下し、それと並行して運動能力自己評価に関わる認知能力も衰え、その結果、過大評価の方向に偏向する傾向が増大したことを示唆している。当初は高齢者300名を目標対象者数としたが、2012年3月までに約500名の高齢者データを収集し、目標を大幅に上回る大規模サンプルによる高い信頼性のもとに、高齢者の跨ぎ越し動作における能力評価の正確性と転倒経験の関連性を横断的に検討することができた。したがって、本研究はおおむね順調に進行しているといえる。200名を超えるデータから高齢者の跨ぎ越し動作における過大評価の一因を明らかにすることができた。また、H25年度終了予定の追跡調査に関しても順調にデータ収集が進んでおり、十分に信頼性の高い資料が得られている。今後は高齢者の跨ぎ越し動作における過大評価と転倒発生の因果関係を検討するため、跨ぎ越し判断テスト参加者に対し追跡調査を行う。並行して、高齢者の自己能力評価の正確性と脳機能との関連性を検討するため、PETデータの収集および解析を進める。当初計画では、自己能力評価の正確性と脳機能との関連性を検討のためにPETとfMRIの両者を用いることを予定していたが、予算面や研究補助員等の確保の面で支障が出て来ることが予想され、PETのみを用いることとした。PETは全脳を均一に再現性良く定量的に計測できる点に特徴があり、本研究における脳機能の検討にはよく適しており、fMRI測定を省いても特に大きな支障は生じない。H25年度は対象者に対する追跡調査を完了させ、跨ぎ越し能力とその自己評価が加齢とともにどのように変容していくのかを明らかにしていく予定である。
細胞防御クロライドイオンチャネルのGTP結合蛋白による調節

胃は強酸を分泌し、食物の消化を行う。胃粘膜には自己を消化しない自己防御機構が存在すると考えられている。とりわけ、胃酸分泌細胞は胃粘膜防御機構の司令塔と呼ばれている。しかし、この細胞がどのような細胞防御機構を有するか不明であった。本申請者らは、ウサギ胃酸分泌細胞に電気生理学的手法であるパッチクランプ法を適用し、細胞の基底側膜(血流側膜)に細胞防御機能に直接かかわる塩素イオンチャネルが存在することを発見した(J.Physiol.1992 and 1993)。すべての細胞は自らの生命維持機構として、細胞内の電位を外に対して負の値に保つ。ウサギの胃酸分泌細胞の膜電位はこの塩素イオンチャネルにより支配されていることがわかった。即ち、この塩素イオンチャネルはハウスキーピングチャネルとして機能する。PGE_2によりこの塩素イオンチャネルのオープニングは活性化した。即ちPGE_2は細胞の膜電位を安定化する。他方、GTPγSをパッチクランプ法により胃酸分泌細胞内に投与すると、この塩素イオンチャネルは閉鎖した。平成6年度においては、GTPγSによる塩素イオンチャネル閉鎖機構について研究した。その結果、百日咳毒素非感受性のGTP結合蛋白質が細胞内にス-パオキシドアニオン(O_2^-)を発生させることがわかった。さらに、このO_2^-がH_2O_2や・OHラジカルを発生させチャネルに損傷を与えるのではなく、O_2^-自身がセカンドメッセンジャーとして作用していることを突き止め、その成果をJ.Biol.Chem.(1994)に発表した。このEditorより、“I am pleased to saythat all now rank your manuscript witha very highpriority and recomend publication."という評価をわざわざいただいた。
植物の３次元形状モデリングのための基盤技術の開発

植物の3次元形状モデリング手法を確立することを目的とする.能動的3次元センサを用い,同一の植物の3次元形状モデルを時系列を追って計測して植物の成長をモデル化する.本申請では,植物の3次元形状の成長による微小変形を捉えるために必要な計測精度を達成する計測条件を明らかにすること,局所的に剛体に近似できる領域に分割してモデリングを行うこと手法を開発すること,植物の生物学的特徴に基づく特徴点の抽出方法とその特徴点を時系列で対応づける手法を開発することを目指す.植物の3次元形状モデリング手法を確立することを目的とする.能動的3次元センサを用い,同一の植物の3次元形状モデルを時系列を追って計測して植物の成長をモデル化する.本申請では,植物の3次元形状の成長による微小変形を捉えるために必要な計測精度を達成する計測条件を明らかにすること,局所的に剛体に近似できる領域に分割してモデリングを行うこと手法を開発すること,植物の生物学的特徴に基づく特徴点の抽出方法とその特徴点を時系列で対応づける手法を開発することを目指す.
発がんプロモーター作用の研究:特に細胞間連絡及びアポトーシス阻害の意義と相互関連

本研究は発がんプロモーター作用を構成する二つの要となる事象、「ギャップ結合細胞間連絡(Gap junction intercellular communication:GJIC)の阻害」と「アポトーシスの抑制」の意義並びにそれらの相互関連性について調べることを目的としてきた。本研究の中心的成果は、エピジェネティック発がんモデル物質としての過酸化水素のGJIC阻害とアポトーシス誘導がMAP kinase系のGSHの減少とリンクしていることの示唆を得て、成果を投稿段階まで達したことである。併せて、この研究課題では、in vitro系では(1)同じくエピジェネティック発がんモデル物質のペンタクロロフェノールをとりあげ、アポトーシス誘導遺伝子v-mycを導入したラット肝培養細胞株(WB-myc細胞)を標的とした実験系、in vivo系では(2)p53欠失マウスにおけるアポトーシス阻害下でのギャップ結合の検討、(3)GJIC関連遺伝子のknockout(KO)動物(コネクシン(Cx)32-KOマウス、Cx43-KOマウスなど)を用いたアポトーシス研究などが検討され、逐次in vivoならびにin vitroの実験系の樹立、当該動物の利便を図り、この領域での研究基盤を飛躍的に発展させた。尚、このプロジェクトから派生した独自研究で、Cx32遺伝子欠失マウスでは、造血幹細胞数が野生型に比べて少なく、このものを受け手とした脾コロニーアッセイでは、同じ野生型の骨髄細胞から形成される脾コロニーの数が少ないことなど、Cx32の骨髄における機能発現の可能性を初めて見いだされた。本研究は、発がんプロモーター作用を構成する二つの要となる事象、「ギャップ結合細胞間連絡(GJIC)阻害」と「アポトーシス阻害」の意義ならびにそれらの相互関連性について調べることを目的としている。今年度はin vitro培養細胞系において、発がんプロモーターのモデル化合物としてペンタクロロフェノール(PCP)を用い、1)このものによる両事象の阻害性、ならびにそれぞれの事象の制御に関わる分子種(p53,Bcl-2,connexin)の発現変化を解析し、さらに2)両事象の阻害に関わるシグナル伝達系の一つとして、MAPK経路の関与について検討した。以下に結果の概略を記す。1)PCPによるGJIC阻害とアポトーシス阻害の関連性アポトーシス誘導性遺伝子v-mycを導入したラット肝培養細胞株(WB-myc細胞)にPCPを処理した結果、このものによりアポトーシスの阻害ならびにそれに先行するGJIC阻害が起こることを明らかとした。またアポトーシス阻害要因としては、アポトーシス誘導性のp53発現の減少、ならびにGJIC阻害要因としてconnexin43の発現抑制の関与が示唆された。2)PCPによるMAPKの活性化ラット肝培養細胞(WB細胞)にPCPを処理した結果、初期(3時間以内)のGJIC阻害と併行してMAPK(ERK, p38)の活性化が認められた。しかしこの阻害に対して、MEK阻害剤処理による軽減は見られず、MAPK経路が初期に起こるGJIC阻害の直接要因ではない可能性が示唆された。しかし長期処理で起こるconnexinの減少を伴うGJIC阻害(8時間以降)、ならびアポトーシス阻害機構への関与の可能性については、さらに詳細な解析を必要とすると考えられる。本研究は発がんプロモーター作用を構成する二つの要となる事象、「ギャップ結合細胞間連絡(Gap junction intercellular communication:GJIC)の阻害」と「アポトーシスの抑制」の意義並びにそれらの相互関連性について調べることを目的としている。昨年度までに、ras導入肝細胞株や、myc、Bcl-2高発現細胞株(ミシガン州立大学)を用い、カテキン類など、日常物質の癌抑制効果(ソウル大学)や、in vitroでの相互のリンクについて明らかにしてきた。さらに、引き続き個体レベルでの相互関係を検討する目的で、コネクシン(Cx-)32遺伝子欠失マウス(ドイツ、K.Willecke博士由来)やCx43欠失マウス(米国、C.Lo博士由来)の供与を受けた。

Cx32遺伝子欠失マウスでは、造血幹細胞数が野生型に比べて少なく、このものを受け手とした脾コロニーアッセイでは、同じ野生型の骨髄細胞から形成される脾コロニーの数が少ないことなど、Cx32の骨髄における機能発現の可能性を初めて見いだした。本年度は、Cx32の造血幹細胞での機能を解析する目的で、Cx32遺伝子欠失マウス骨髄細胞で骨髄再建し、メチルニトロソウレア(MNU)による発がん実験を行った。Cx32遺伝子欠失マウス由来骨髄細胞で再建したマウスにも、野生型骨髄再建マウスでも、MNU処置群には共に胸腺リンパ腫などの血液腫瘍が発症し、その発症時期に差異はなく、頻度にも大きな違いを認めない。ところが、Cx32遺伝子欠失マウス骨髄細胞と野生型の骨髄細胞を同数混合して再建した群に発生した腫瘍を観察すると、その比率は圧倒的にCx32遺伝子欠失マウス由来(7/8)であった。この結果は、Cx32の機能不全が何らかの発がん機構に関わることを示唆する。
摩擦を利用した金属板材の金型フリー加工法の開発

金型を用いないで摩擦を利用した金属板の加工法である摩擦撹拌インクリメンタルフォーミング法を開発し,この加工が可能な専用の加工機を製作した.室温では加工が難しいAZ31,AZ61,AZ80マグネシウム合金やA5052,A2017アルミニウム合金および純チタン板を成形した.またこの加工プロセスについてコンピュータシミュレーションを行った.金型を用いないで摩擦を利用した金属板の加工法である摩擦撹拌インクリメンタルフォーミング法を開発し,この加工が可能な専用の加工機を製作した.室温では加工が難しいAZ31,AZ61,AZ80マグネシウム合金やA5052,A2017アルミニウム合金および純チタン板を成形した.またこの加工プロセスについてコンピュータシミュレーションを行った.本研究の目的の一つに摩擦撹拌インクリメンタルフォーミング専用加工機の開発があるが,加工機の設計のために加工する材料の強度を知る必要がある.そこで精密万能試験機を導入し,AZ系マグネシウム合金板,2000系アルミニウム合金板および純チタン板の引張試験を行い,加工機設計のための基礎データを得た.また,現有のNC工作機を使用してAZ系マグネシウム合金板,2000系アルミニウム合金板および純チタン板の成形条件を探索した.さらに成形したマグネシウム合金板,アルミニウム合金板および純チタン板の金属組織を顕微鏡観察を行った結果,マグネシウム合金とアルミニウム合金は結晶粒がナノサイズまで微細化しており,摩擦撹拌現象が発現していることが確認されたが,純チタンについてはほとんど結晶粒が微細化しておらず,摩擦撹拌現象が発現されていなかった.そのため,マグネシウム合金とアルミニウム合金は従来の加工法では成形が難しい形状にまで成形ができたが,純チタンについては従来の加工法と成形限界はほとんど変わっていなかった.純チタンについてはさらに工具の形状や回転数などを変更して摩擦撹拌現象が発現するような条件を引き続き探索する必要がある.摩擦撹拌現象が発現した場合は,マグネシウム合金,アルミニウム合金板ともにスプリングバックが非常に小さくなるが,摩擦撹拌現象が発現しなかった場合は加工後のスプリングバックが大きく目的の成形形状とはならなかった.本年度は摩擦撹拌インクリメンタルフォーミング専用加工機の開発,成形条件と成形精度の関係調査,成形中の温度分布・ひずみ分布に関するシミュレーションをおこなった.(1)加工機の開発自動XYステージとボール盤を組合わせ,加工機を製作した.構造的にはまだ不十分なところがあり,剛性が低いため,次年度に改良を行う必要がある.(2)成形条件と成形精度の関係A5052アルミニウム合金板を行う際に,新たな加工条件として工具送り方向と工具回転方向の関係を入替えることにより,加工部の工具と板材の相対速度を変化させた.その結果,見かけの工具送り速度と工具回転数で整理するのではなく,工具と板材の相対速度が直接的に成形性に影響を及していることが確認された.また,成形限界が大きくなる条件では成形精度も相関して良くなることが確認された.(3)成形中の温度分布・ひずみ分布のシミュレーション商用の塑性加工専用有限要素解析ソフトSimufact.formingを用いてA5052アルミニウム合金板を加工するシミュレーションを行った.計算結果の信頼性を確認するため計算と同条件で実験を行った-計算結果と実験結果では定性的に一致したが,温度は絶対値が計算値の方が高くなった.しかし,急激に温度が変化する加工部の温度は実験では求めることが難しく,特にその最大値を求めることは難しい.計算では非常に短時間の最大温度まで求めることができ,計算の有用性が確認された.また,すくライブ土サークル方を用いて板材のひずみ分布を求めた.通常のインクリメンタル成形と同様にサイン則が成立しており,計算結果と実験結果は一致した.また,試験片断面の形状と計算により求めた形状もよく一致した.これらの結果から,シミュレーションはよく加工現象を再現できていると考えられる.(1)加工機の開発自動ステージをX,Y,Z軸を各2組を組合わせ,板材の表面,裏面から板材を取り外すことなく別々に加工できる加工機を製作した.その結果シングルポイントインクリメンタルフォーミングだけでなくダブルポイントインクリメンタルフォーミングも1台の機械で行うことができるようになった.(2)工具姿勢が成形条件に及ぼす影響A5052アルミニウム合金板を行う際に,加工初期は工具と板材の接触角度が小さく,工具周速度の不足によって十分に工具による加熱・撹拌ができない点を解消するため,あらかじめ工具を傾斜させて加工を行った.その結果成形限界を向上することはできないが,工具移動速度を速くしても加工可能な成形範囲が拡大した.(3)成形中の加工部温度の測定熱電対や放射温度計などでは,板材が工具と接触して変形している部分の温度を測定することはできなかったが,工具自身と板材は異種金属であるため工具と板材の接触による熱起電力を利用して,工具ー被加工材熱電対法により加工部温度を測定した.従来板材の裏側に熱電対を付けたり,放射温度計で測定していた場合450°C程度であったが,本測定法により580°Cまで上昇していることが確認された.(4)成形プロセスのシミュレーション商用の塑性加工専用有限要素解析ソフトSimufact.formingを用いてA5052アルミニウム合金板を加工するシミュレーションを行った.

計算パラメータを最適化することにより,昨年度までは工具を20mm移動する部分しか計算できなかったが,より短い時間で50mmまで計算することが可能になり,温度分布計算結果は(3)で実験により測定した温度と一致した.これらの結果から,シミュレーションはよく加工現象を再現できていると考えられる.加工機の開発は行ったがまだ改良の余地があり少し遅れているが,成形条件と成形精度の関係はほぼ予定通に進捗しており,シミュレーションは実験との比較もできており計画異常に進展しているため.24年度が最終年度であるため、記入しない。加工機の改良を行い,さらに厳しい条件でも加工が可能なようにする必要がある.またシミュレーションもまだ定性的には一致しているが定量的には十分に一致していないところもあり改良が必要である.板材内部のいろいろな応力やひずみ,温度などの分布の分析も進める必要がある.24年度が最終年度であるため、記入しない。
燐光現象を利用した低温場の高速測定技術の構築とその光アニールプロセスへの応用

機能性酸化物の大気圧下での低温製膜プロセスの実現に向けて、塗布光照射法では、ナノ秒の紫外エキシマパルスレーザーを塗布膜に照射した時の光結晶成長機構の解明が重要な課題である。そこで、本研究では、低温ほど信号強度が増大する燐光現象に着目し、高速測定で実績のある放射測温と組み合わせることにより、レーザー照射時の温度場の定量的理解を目指した。温度場はレーザー照射数の増大に連れて大きく変化することなど光結晶成長機構に関する理解が進んだ他、燐光寿命からレーザー照射時の温度場の推定が可能であることを確認できた。機能性酸化物の大気圧下での低温製膜の実現に向けて期待されている塗布光照射法では、紫外パルスレーザー照射時の光結晶成長機構の解明が重要であり、高速温度測定による光-熱反応の定量化が求められてきた。初年度は、従来の高速温度測定に実績のある熱放射光を利用した温度計測法を精緻化することにより、放射測温における温度計測下限値を見積もるとともに、温度校正がその成否の鍵となることから、温度校正方法の確立に向けて取り組んだ。具体的には、現有の放射光測定システムが直流信号に対応していないため、時定数を再検討し、測定が可能なように測定システムを改良した。さらに、簡易に温度校正が可能なよう、管状炉とラックを組み合わせた可動式の校正炉を構築し、頻度高く温度校正が行える体制を整えた。この校正炉を市販の放射温度計と開発した放射光測定システムによって計測することによってその互換性をとった。その結果、計測下限として1100K程度まで測れていることが明らかになり、これは過去のITOの冷却曲線から推定した計測下限とよい一致を示していた。また、これまでは単色の放射温度計であったが、二色に分光することによって、二色温度計の原理により、温度計測を行い、これまでの測定条件においては、単色の温度計測の結果が妥当であることを確かめた。一方で、スズ酸化物を用いて計測した例において、単色放射温度計では説明のつかない現象が観察された。蛍光現象が影響していると考えられるが、より精査が必要である。機能性酸化物の大気圧下での低温製膜の実現に向けて期待されている塗布光照射法では、エキシマレーザーなど紫外パルスレーザー照射時の光結晶成長機構の解明が重要であり、高速温度測定による光-熱反応の定量化が求められてきた。その定量化に向けて、ナノ秒レベルでの高速温度測定法の確立を目指してきた。前年度の研究において、従来計測していた放射温度に蛍光信号が含まれている可能性が示唆された。そこで、本年度は、温度計測の妥当性、実プロセスとの相関をとるためにこれまでの複雑酸化物系に加えて、組成の影響を極力排除するために、単純酸化物系であるスズ酸化物を選定し、中心材料として計測に取り組んだ。塗布光照射法における酸化スズ膜の光結晶化過程においては、初期の塗布膜厚がレーザー照射時の結晶化に大きな影響を与えることを確認した。ただし、得られた結晶相は純粋なSnO2相とは異なっており、レーザー照射時の還元の影響が考えられた。結晶相の同定に加えて、引き続き結晶条件の最適化が必要である。その際に得られる検出光については、膜厚、レーザーフルエンス(強度)によって、最大強度、ピーク数、減衰挙動が異なることを確認した。基材の影響、初期膜厚の影響を系統的に調査した結果、従来の数値計算で予測されるよりも強く基材の影響を受けている可能性が示唆された。得られた検出光から放射温度成分と蛍光成分を分離し、温度計測に結びつける必要性が課題として明らかになった。当初想定していた、Y2O3:Eu3+系での計測に対して、単純酸化物系であるSnO2系での計測実験が中心となった。塗布光照射法における光結晶成長機構の解明に向けて、ナノ秒という高速度域での温度測定の確立が重要であり、その目的達成のためには、得られた信号の精緻な解析が必要である。本解析に時間を要しているが、対象材料からの目的とする信号の十分な強度は得られており、目的達成に向けて、順調に進展できていると考える。機能性酸化物の大気圧下での低温製膜プロセスの実現に向けて期待されている塗布光照射法では、紫外のエキシマパルスレーザーを照射した時の光結晶成長機構の解明が重要である。しかしながら、パルスレーザー照射時のナノ秒オーダーでの温度変化を高速測定する技術が確立されていなかったことから、その光-熱反応の定量的な評価が困難であった。そこで、本研究では、低温ほど信号強度が増大する燐光現象に着目し、高速測定で定評のある放射測温と組み合わせることにより、塗布光照射法下における紫外パルスレーザー照射時の温度場の定量的理解を目指した。スズ酸化物の光結晶化過程において、パルスレーザー照射時の最高到達温度がレーザー照射数とともに大きく変化することを見出した。興味深いのは、レーザー照射数初期過程においては、レーザーフルエンスに最高到達温度が強く依存するのに対し、後半の結晶化が進んだ過程では、基材の材質に強く依存することであった。本結果は、結晶化プロセスが、皮膜の緻密化する初期過程と、結晶化がおきていく後半の過程に分けられることを示唆している。一方で、ユーロピウムをドープしたイットリウム酸化物を用いることで、レーザーを照射した時の燐光を測定し、その燐光の減衰曲線から、プロセス温度を見積もったところ、1000 K程度の温度場であることが推定された。

絶対値の精度については今後も検討が必要であるが、放射温度測定では困難であった低温場での温度測定の可能性を見出すことができたことは重要な進歩である。機能性酸化物の大気圧下での低温製膜プロセスの実現に向けて、塗布光照射法では、ナノ秒の紫外エキシマパルスレーザーを塗布膜に照射した時の光結晶成長機構の解明が重要な課題である。そこで、本研究では、低温ほど信号強度が増大する燐光現象に着目し、高速測定で実績のある放射測温と組み合わせることにより、レーザー照射時の温度場の定量的理解を目指した。温度場はレーザー照射数の増大に連れて大きく変化することなど光結晶成長機構に関する理解が進んだ他、燐光寿命からレーザー照射時の温度場の推定が可能であることを確認できた。塗布光照射法における光結晶成長過程の解明に向けて、ナノ秒という高速度域での温度測定を確立することが重要であったが、単色温度計測に加え、二色温度計測を新たに加え、これまでの計測の妥当性を確認できたこと、また、あらたに温度校正システムを見直し、菅状炉を用いた精密温度校正が可能になったことにより、絶対温度についても一定の測定精度が得られたことは大きな成果である。また、提案する燐光寿命を用いた温度計測に関しても、計測シグナル中に蛍光と考えられるシグナルを検出できたことから、順調に展開できていると考える。昨年度に引き続き、スズ酸化物系の材料について、検出光から放射温度成分と蛍光成分の分離に取り組む。解析の相当の時間を要するため、プロセス解析については、産総研土屋哲男副センター長と、データ解釈については、燐光計測に実績のある産総研の染矢聡グループ長と連携していく。また、レーザープロセスに実績のある芝浦工大の湯本敦史先生のグループとさらに連携を深め、マンパワーをかけていく。また、蛍光成分の同定のため、Y2O3:Eu3+をターゲット材料として用い、燐光計測と放射温度計測の両輪により、ナノ秒温度計測法を確立するとともに、塗布光照射法の光結晶成長機構の解明をおこない、当該課題の達成を目指す。また、本手法は、低温計測法としても有効であるため、研究が順調に進展した場合には、溶射、エアロゾルデポジション法という他のセラミックスコーティング手法における高速温度計測法にも積極的に展開を図りたい。セラミックコーティング今後は、放射温度計による計測に加えて、燐光現象を利用した温度計測に取り組む。まずは、測定対象である蛍光材料に粉末、もしくは、粉末を固めたバルク体を用い、エキシマレーザーを照射した時の燐光を検出し、その燐光プロファイルの形状観察に注力し、高速測定に必要な知見を収集する。具体的には、Y2O3:Eu3+をターゲット材料として用い、蛍光最大強度、燐光寿命、最大強度到達時間の三つを導出し、温度換算を行う。これらのデータ解釈については、連携研究者の産総研の染矢聡博士と連携して行う。温度換算が可能となったのちは、実際の塗布光照射法下での温度計測を行い、光結晶成長過程の解明を目指す。また、本手法は、原理的には、他のプロセスにも適用が可能であるため、他のレーザープロセスへの適用として、あらたに芝浦工大の湯本敦史先生のグループとの連携や、高速プロセスである溶射プロセスへの適用として、溶射分野の国内外の研究者との連携も積極的に取り組んでいきたい。主として、エキシマレーザー用の消耗品として計上していたネオンガスが高騰したため、今年度は購入を見送らざるをえなかった結果、次年度使用額が生じた。
多指ハプティックインターフェイスによる手技伝達に関する研究

医療における触診や鋏・メスなどの道具を操作する手技は、熟練を要する。手技の学習では、見様見真似が伝統的手法であるが、訓練者には難しい。この問題の解決に向けて、バーチャルリアリティ環境に生体モデルを構築した手技の学習システムの研究があるが、これまで5本の指を対象とした研究は皆無である。こうした背景をもとに、多指ハプティックインターフェイスによる手技伝達に関する基礎的な研究を行ない、人間の指先での3次元的な力の知覚能力を明らかにし、人間とインターフェイスのダイナミックスを考慮した制御法、手技の伝達に効果的な手法、道具デバイスの可操作性を最適とする装着法、摩擦を考慮した触覚レンダリング法等を研究開発した。1.人間の力覚の空間的認知能力の評価手技の伝達では、人間の空間的な力に対する方向と大きさの感度などの認知能力を評価する必要がある。そこで、人間の力覚の空間認知能力を実験評価し、角度認識に対する絶対平均誤差は垂直方向で16度、水平方向で20度、相対角度認識では基準の角度付近では誤差が小さく基準から離れるにつれ誤差が大きくなること等の力覚特性が明らかとなった。2.力覚提示法と5本指による評価実験熟練者と訓練者の5本指の位置と指先力を画像で表示すると、訓練者にとって注視する箇所が多くなり、力覚の学習が難しい。そこで、操作者に熟練者の力を短い時間提示し、残りの時間は訓練者の操作力を提示する方法の有効性の検証に向けて、熟練者の力を提示する時間、提示の周期、誤差に応じた提示方法等を5本指で詳細に基礎実験を行った。その結果、連続的な力と断続的な力に対する知覚能力に大差がないことが明らかとなり、提案手法が効果的である見通しを得た。3.没入型立体画像ディスプレイの構築バーチャルリアリティ環境での触診訓練システムでは、訓練者の手の位置に仮想物体を提示できることが望ましい。そこで、操作者の手先に仮想物体が投影される大型の没入型立体画像ディスプレイを試作構築し、実験環境を整備した。4.柔軟物体の摩擦を考慮した有限要素法による触覚レンダリング有限要素法による触覚レンダリングは、静的な力学関係をもとに変位と力を計算するが、摩擦が考慮されていない。このため、よりリアルな触感の提示に向けて、摩擦を考慮した触覚レンダリングのアルゴリズムを開発中である。5.インターフェイスのダイナミックスを考慮した力覚提示制御手技の伝達において(2)項で示した手法を実現するには、高い力応答特性が求められる。第一段階として、インターフェイスのダイナミックスを考慮した力覚提示制御法を実験的に評価し、良好な結果を得た。1.力覚の認知能力の評価:熟練者の指先の空間的な位置と力の3次元の認知能力を実験評価した。その結果、指の前面方向は高い精度で力の大きさを認識するが側面方向では減少することを明らかにした。2.力覚・視覚提示法と5本指による評価実験:手技の伝達では熟練者の指先の空間的な位置と力を同時に提示するが、情報量が多くなると操作者は混乱する。指先に目標カベクトルを事前に提示する方法の効果を実験的に検証した。その結果、少ない指では効果的であったが、5指では効果が減少した。3.柔軟物体の表面摩擦を考慮した有限要素法による触覚レンダリング:従来、柔軟物体を対象とした摩擦力の触覚レンダリング法は、変形による影響で動摩擦を正しく提示できていなかった。動摩擦における物体表面上の接触点を正確に導出するアルゴリズムを開発し,肝臓モデルでの実装によりその有効性を検証した。4.人間の指の動特性を考慮した力覚提示制御:手技の伝達では、インターフェイスに高い力応答特性が求められるが、系の動特性は人間の指とインターフェイスのダイナミックスの影響を受ける。今年度は、インターフェイスのダイナミックスを補償する動的制御法を提案し、その有効性を検証した。5.遠隔での手技伝達におけるシステム構成:遠隔にいる操作者を対象とした手技伝達では、通信遅れを考慮する必要がある。従来はVRシミュレーションをサーバのみで行っていたが、サーバのみならず各クライアントでも行うシステムを提案し、実験により通信遅れによる不安定化を減少させることを検証した。6.指腹部に力覚を提示するデバイスの研究:触診等では指先のみならず指腹部も力覚の提示が求められる。そこで、小型デバイスを試作し、指腹部の9箇所に力覚を提示できるようにした。物体操作の評価実験では、指先のみと比較して装着が煩わしくなるが、物体操作における臨場感が向上した。立体画像ディスプレイを用いた触診の手技伝達システムの構築:前年度に試作した立体画像ディスプレイと今年度に試作した指腹部に力覚を提示するデバイスを用いて生体の臓器や乳房の触診訓練システムを構築した。

今後、生体の粘性、摩擦、ヤング率等のパラメータを調整する。(1)人間の指の動特性を考慮した力覚提示制御複数の指に同時に力覚を提示するときに、人間の指のダイナミックを考慮した力覚示制御の高精度化にむけ、人間の指のダイナミックスを考慮した補償制度を提案し、実験によりその有効性を確認した。(2)力覚・視覚の同時提示における認知能力の評価に基づく技能伝達の研究手技の伝達では、熟練者の指先の力を提示するが、人間がそれをどのように知覚するかは明らかではない。そこで、空間的な指先での力の認識能力を計測し、その諸特性を明らかにした。また、提示する力の目標値が大きく変化するとき、多指ハプティックインターフェイスHIRO IIIが振動的になる。この振動の低減方法を提案し、実験によりその有効性を確認した。(3)複数の道具デバイスを扱えるVR医療訓練システムの高度化鋏、メス、注射器などの複数の道具を扱えるVR医療訓練システムを構築するにあたり、道具が扱い易いことが望まれる。そこで、道具の可操作性を最大とする配置法を提案し、実験によりその有効性を検証した。ユーザー評価でも、操作性が改善されたことを示した。(4)VR触診訓練システムの高度化と評価乳癌触診訓練システムを題材に、掌や指腹部へのフィードバック制御が可能な力覚提示用小型デバイスを開発した。さらに、熟練者の手技のデータ蓄積、摩擦や粘性を考慮した各種の癌細胞を含む乳房の触診用レンダリング、高精度な力覚提示制御等の技術を統合してVR触診訓練システムを構築している。今後、その評価を行う。
植物性食品中の生体防御機構調節物質

1.目的食細胞由来のサイトカインは、炎症の初発、進展に大きく関与している。従って本研究は、炎症に関与するサイトカインの産生を抑制する物質を植物性食品に求めた。2.方法マウスに野菜汁を経口投与で与え、血中のサイトカイン(主として腫瘍壊死因子:TNF)レベルが低下するか調べた。3.結果サイトカインの産生抑制をみる系を確立した後、各種の野菜汁を調べたところ、シソやショウガが、TNFの産生を抑制することを見いだした。特にシソにおいては、0.2ml(約葉一枚)の1回投与でも有効であった。シソの種類についても検討したが、調べた範囲の5種類(赤シソ、青シソ)全てが有効であった。植物性食品が、生体防御機構を活性化する成分を含むことを既に明かにしているが、本研究で明かにしたように、植物性食品にはステロイドホルモン的な作用を示す物質が存在し、激しい炎症を抑制する可能性もあることを示唆しているといえよう。
ドイツおよびEuにおける労働者の個人情報保護

本研究は平成17年度において、平成16年度までの研究成果を基礎に、以下の点を明らかにした。すなわち、平成16年度までの研究成果において、(1)ドイツにおける個人情報保護が基本法1条1項及び同法2条1項から導き出された一般的人格権のひとつである「情報に関する自己決定権」(das informationelle Selbstbestimmungsrecht)に基礎づけられていること、(2)同権利の概念が定立されたのは個人情報のコントロールを本人の自己決定に委ねることが情報化社会における個人の自由を保障するための前提条件であると考えられていることを明らかにしたが、その成果を基礎に平成17年度においては、平成15年5月(平成17年4月施行)に日本において成立した「個人情報の保護に関する法律」(以下、個人情報保護法という)が日本の労働法のなかでどのような位置づけを与えられるべきかを検討した。そして、個人情報保護法について、(1)その保護法益を労働者の私生活領域の保護ではなく労働者の行為自由と捉えるのが適切であることを主張し、(2)個人情報保護法が規定する「許容生の要件」について解釈の試論を提示した。研究成果は、平成17年5月に行われた日本労働法学会109回大会において「ドイツにおける労働者の個人情報保護---労働法における『個人情報の保護に関する法律(平成15.5.30法57)』の位置づけのために」のテーマのもとで報告され、また、同タイトルで日本労働法学会誌106号(2005年、法律文化社)に公表された。平成16年度においては、以下の点について、明らかにした。すなわち、ドイツにおける個人情報保護は、基本法1条1項および同法2条1項から導き出された一般的人格権のひとつである、「情報に関する自己決定権」(das informationelle selbstbestimmungsrecht)に基礎づけられている。同権利の概念が定立されたのは、個人情報のコントロールを本人の自己決定に委ねることが情報化社会における個人の自由を保障するための前提条件であるという認識に基づいている。そして、研究テーマである労働者の個人情報保護に関しては、同権利が労使間において個人情報をめぐって生じる訴訟の際の解釈規範ともなっていることが明らかになった。現時点までに明らかにされた成果は、平成17年3月に行われた民主主義科学者協会法律部会主催の研究会(労働法部会)において報告された。また、平成17年5月には、日本労働法学会109回大会において、テーマ「ドイツにおける労働者の個人情報保護」の下、これまでの研究の内容を報告する予定である。
蛍光クエンチ解消原理の天然抗体への適用による革新的免疫測定法の開発

従来の免疫測定法には,測定に多数のステップと最低数時間の時間を要する問題があった。我々は最近,組み換え抗体を用いた蛍光免疫センサータンパク質Quenchbody (Q-body)の構築原理を見いだし,サンプルと混合するだけで低分子からタンパク質まで多くの目的物質(抗原)を蛍光検出することに成功した。今回,その動作原理を精査することで,組換え抗体のみならず天然抗体をもQ-body化しうる方法論を複数確立した。1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討本研究において我々は,サンプルと混ぜて蛍光強度を測定するだけで各種抗原を高感度に検出可能な蛍光免疫測定素子Q-bodyを,従来よりも簡便かつ迅速に構築する方法の開発と,こうして作製したQ-bodyの多項目同時解析への応用を目指している。その一環として,本年度は従来の蛍光標識法と異なる2種類の蛍光標識法の確立を試みた。最初に,最近報告されたRapoport試薬を用いたアミノ基転移反応を利用した,N末端ケトン化による組み換えFab断片のQ-body化を試み,これに成功した。従来のような修飾用のCys残基を持たないFab蛋白質に対し,そのN末端特異的にリンカー長の異なる2種類のTAMRA色素を導入したところ,その長さに応じて蛍光強度の抗原濃度依存性を観察できた。またこの際,N末端残基の違いを利用してH鎖選択的に色素を導入することができ,より高い応答を実現できた。続いて,抗体可変領域内部に存在する芳香族アミノ酸からなる核酸結合部位(Nucleotide binding site, NBS)に親和性を持つインドール酪酸IBAなどの複素環化合物とTAMRA色素との化合物を紫外線照射によりクロスリンクする方法により,一本鎖抗体,Fab断片,さらには天然抗体を蛍光標識することに成功し,抗原オステオカルシン依存的な蛍光応答を得た。26年度に成功した,膜タンパク質クローディン検出の成果を発展させ,27年度はがん細胞に過剰発現するHER2タンパク質のQ-bodyによる検出を試みた。Her2を認識する抗体Fab37をもとに,従来法によりQ-bodyを作製したところ,1 nM以下の検出限界で精製Her2タンパク質を最大4倍の蛍光強度で検出することに成功し,さらに洗浄操作なしでHER2発現細胞のみを30分以内に蛍光染色することに成功した。1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討N末標識法においては組み換えFab断片のQ-body化に成功したが,天然抗体の標識によるQ-body化には至っておらず,Q-body化のできた組み換え抗体と同じ配列を持つ天然抗体を用いて引き続き検討する。また光架橋法においては現在の所まだ標識率・応答性とも従来法によるQ-bodyより低い値となっており,来年度以降も引き続きプローブの構造と反応条件等について,条件検討を行う。予想以上に順調に推移しており,CDRにTrpの多い抗体ライブラリを作製し,そこから抗原結合抗体をファージ提示法により選択することで高性能なQ-bodyを構築できる可能性についても検討したい。本年度は従来の蛍光標識法と異なる3種類の蛍光標識法の確立を試みた。最初に,アミノ基転移反応を利用したN末端ケトン化による組み換えFab断片のQ-body化に関する論文をまとめ,続いて,抗体可変領域内部に存在する芳香族アミノ酸からなる核酸結合部位(Nucleotide binding site, NBS)に親和性を持つインドール酪酸とTAMRA色素からなるプローブを紫外線照射によりクロスリンクする方法により,抗ヒト血清アルブミン(HSA) IgGを蛍光標識することに成功し,HSA依存的な蛍光応答を得た。また修飾プローブをペプチド合成法で作製することで側鎖に電荷を導入して抗体との親和性を向上させ,修飾効率を向上させる検討を開始した。また新たに,最近発見された抗体L鎖結合タンパク質Protein Mを用いた蛍光プローブを用いて,抗体と混合するだけでQ-body化できる技術を構築した。2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用27年度に成功した,がん細胞に過剰発現するHER2タンパク質検出の成果を発展させ,28年度はQ-bodyによるがん治療を試みた。Her2認識Fab型Q-bodyのC末に9xArg配列を付加し,これにPolo-like kinase (Plk1)に対するsiRNAを作製したところ,洗浄操作なしでHER2陽性細胞のみを30分以内に蛍光染色することに成功したのみならず,3日間の培養後,HER2陽性細胞にてPlk1タンパク質の顕著な発現抑制と50%以上の細胞死誘導を確認した。1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討N末標識法においてはこれを論文化した。光架橋法においてはこれまで標識率・応答性とも従来法によるQ-bodyより低い値しか得られず,この改良法検討に少し時間を要したが,プローブ構造をペプチド骨格とすることで抗体との親和性を向上できる見込みがでてきた。また,抗体L鎖結合タンパク質Protein Mを蛍光修飾することで,抗体と混合するだけでQ-bodyを構築する技術を新規に構築した。2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用Q-bodyをがんの診断のみならず,siRNAとの複合化によりがん治療にも応用できる,という予想以上の結果を得ることが出来た。1.抗体タンパク質のQ-

body化に関する検討本研究において我々は,サンプルと混ぜて蛍光強度を測定するだけで各種抗原を高感度に検出可能な蛍光免疫測定素子Q-bodyを,従来よりも簡便かつ迅速に構築する方法の開発と,こうして作製したQ-bodyの多項目同時解析への応用を目指した。その一環として,本年度は従来の蛍光標識法と異なる2種類の蛍光標識法の確立を試みた。最初に,抗体可変領域内部に存在する芳香族アミノ酸からなる核酸結合部位(Nucleotide binding site, NBS)に親和性を持つインドール酪酸-TAMRA複合体の光クロスリンクによるQ-body構築の論文をまとめた。またTrpとCysを末端にもつプローブのペプチド配列を工夫して抗体との親和性を向上させ,修飾効率を向上させた。さらに,抗体L鎖結合タンパク質Protein Mを蛍光プローブ(PM probe)として用いて簡便にIgGをQ-body化する技術の改良(蛍光蛋白質と融合させ,抗原料を二波長の蛍光強度比として測定できるようにする)を行った。2. Q-bodyの多項目同時解析への応用市販の抗ペプチドタグ抗体IgG数種をPM probeでQ-body化できるか試みた所,Targetタグ抗体で抗原応答が認められた。また手持ちの抗オステオカルシン抗体5種から,IgG添加で有意にクエンチするQ-body候補が3種認められた。そこで新規に抗原としてインシュリンとコルチゾール-BSAをマウスに免疫し,ハイブリドーマ各数クローンの作成を行った。今後これらをQ-body化し,マイクロプレートに配置あるいはバーコードビーズに固定化することで,目標が達成されると期待される。従来の免疫測定法には,測定に多数のステップと最低数時間の時間を要する問題があった。我々は最近,組み換え抗体を用いた蛍光免疫センサータンパク質Quenchbody (Q-body)の構築原理を見いだし,サンプルと混合するだけで低分子からタンパク質まで多くの目的物質(抗原)を蛍光検出することに成功した。今回,その動作原理を精査することで,組換え抗体のみならず天然抗体をもQ-body化しうる方法論を複数確立した。1.抗体タンパク質のQ-body化に関する検討においては来年度以降も引き続きプローブの構造と反応条件等について,条件検討を行う。2. Q-bodyの細胞イメージングへの応用においては,抗体ライブラリから抗原結合抗体をファージ提示法により選択することで高性能なQ-bodyを構築できる可能性の検討を開始する。さらにQ-bodyの利点が最大限に生かせる,洗浄が困難な細胞内抗原の検出系構築について検討する。3.診断用プロテインチップの構築
リンパ浮腫動物モデルの作成

生後12カ月のイヌ(ビ-グル犬)を用い、二次性リンパ浮腫作成を試みた。しかし、慢性リンパ浮腫肢の作成には長時間を要し、現在、浮腫発生の経過を観察中である。自家新鮮リンパ球、自家培養リンパ球などの各種リンパ球注入効果の比較及びアイソトープを用いたリンパ輸送障害の測定は、イヌ慢性リンパ浮腫生成を確認した後に行なう予定である。現在作成中のイヌ浮腫部より採取した浮腫液を用い、以下の結果を得た。1)イヌ浮腫液中のプロテアーゼ活性測定のスタンダード、プロトコールを作製中であり、イヌ慢性浮腫が出来上り次第、リンパ球注入による組織間質内蛋白分解能の検討を行なう予定である。2)我々が独自に開発したタンパク質分離法を用いて、組織間質タンパク質の分離範囲内に血清アルブミンが重ならない条件で、ヒト浮腫液タンパク質の分離解析を行えるようになった。その結果、ヒト血清中にはっきりと認められるアルブミン以外のタンパク質群が、浮腫液中ではほとんど存在しないことを見いだした。現在この一群のタンパク質がリンパ球動注によりどのような挙動を示すのか、また現在作成中のイヌ浮腫液との比較を検討中である。なお、浮腫液中に含まれるタンパク質の詳細な質的分析は、従来殆ど行なわれていない。その理由は、血清及び組織間質液中に多量の血清アルブミンが存在し、これによってアルブミン以外のタンパク質、特に微量のタンパク質がマスクされてしまい、検出が困難であったからである。3)イヌ浮腫液中のβ_2マイクログロブリン量をELISA法を用いて測定中である。しかし抗ヒトβ_2マイクログロブリンとの反応性が低く、現在感度を上げる方法を検討中である。