hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳血管障害研究の新展開【脳血管障害とＣＣＮファミリー分子ＣＹＲ６１】

細胞膜透過性蛋白、11Rを用いた蛋白テラピーの併用:岡山大学大学院医歯薬学総合研究科・細胞生理学、松井秀樹教授らは、世界に先駆けbeta galactosidaseレポーター蛋白と融合させた、細胞膜透過性蛋白、11Rをラット髄腔内に投与することにより脳神経細胞内に外来蛋白質を発現させることに成功しているが、11R-各種蛋白質融合蛋白(ヘムオキシゲナーゼ-1、superoxide-dismutase、TGF- beta、low-density lipoprotein receptor、endothelial NOS、あるいはsuperoxide-dismutaseをCYR61と併用させて、より強力治療効果を期待する。分泌蛋白CYR61と血管内治療を組み合わせた治療の可能性も模索する。つまり、イヌ脳動脈瘤、脳動静脈奇形モデルやウサギ頚動脈狭窄モデルにおいてプラチナコイルに分泌蛋白CYR61を融合させ、血管内皮の増殖作用より脳動脈瘤、脳動静脈奇形を塞栓する試みや、動脈硬化を強く抑制する分泌蛋白CYR61とステントの融合による内頚動脈狭窄病変の実験的治療を試みる。統計学的データ解析を行い、学会発表・論文投稿する。1)脳血管攣縮モデル、動脈硬化ウサギモデル、もやもや病モデルにおいて、分泌蛋白CYR61の発現について調べる。(担当伊達、黒住、杉生)2)In vivoにおいて、CYR61を強発現または抑制することにより、それぞれのモデルに対してどのような影響があたえられるかについて検討する。(担当伊達、黒住、小野)3)頭蓋内動脈硬化の予防効果や動脈硬化病変の変化などについて検討をおこない、血管内皮細胞増殖因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)と分泌蛋白CYR61をもやもや病モデルに投与し、血管新生の可能性についても検討する。(担当伊達、黒住)本研究に於いて発生する経費は、犬、ウサギ、猫、ラット、マウスの細胞の培養・維持、タンパク定量や免疫染色用の抗体やキットなど、研究に直結してくる消耗品が大半を占める。また、脳血管障害の分野は、神経科学の分野の中でも日進月歩の感があり、各種関連学会に参加して脳血管障害についての知識を最新のものに保つ必要があり、小額の旅費は必要である。これら全ては研究に必要不可欠なものであり、研究経費として妥当性もある。本研究に於いて発生する経費は、犬、ウサギ、猫、ラット、マウスの細胞の培養・維持、タンパク定量や免疫染色用の抗体やキットなど、研究に直結してくる消耗品が大半を占める。
腎ネフロンに作用するアセチルコリンの分泌経路に関する研究

腎臓に作用するアセチルコリン(ACh)の由来を解明する為、ラット腎臓における副交感神経系および非神経性AChの局在を神経組織学的に検討した。腎神経標識の結果、腎臓へは交感神経節以外を由来とする神経線維は検出されなかった。一方、ACh合成酵素mRNAおよびタンパク質が皮質集合管にみられたが、その分布は偏在性を示した。以上から腎臓では非神経性AChが優位であるが、その発現は限定的であることが示唆された。腎ネフロンに作用するアセチルコリン(ACh)の由来およびその作用機序を明らかにする目的で、1)腎実質内に存在する非神経性ACh分泌細胞の存在の可能性および2)迷走神経などのコリン作動性遠心性神経の投射の可能性の2点を仮定して実験を行った。腎実質のACh関連因子をRT-PCR法で確認したところACh合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)、小胞性ACh輸送体、および高親和性コリン輸送体の存在が確認された。次に組織切片上でのChAT mRNAの発現をin situハイブリダイゼーションにて確認したところ、皮質集合管に陽性反応が認められた。さらに、抗ChAT抗体を用いた免疫組織化学法では、皮質集合管の主細胞のうちおよそ15%にChAT陽性反応がみられた。これらの反応は局所的ではあったが、少なくとも腎臓の副交感作用のうちの一部はこれら非神経性細胞によって支配されていると考えられる。神経標識法では、過去の研究(Norvell & Anderson,1983;Gattoneら,1986)の問題点を明らかにするべく、延髄へのHRPの注入および腎皮質へのFluoro-goldの注入を試みたが、明確な腎副交感神経線維を確認することはできなかった。このことからも腎副交感神経の投射量が非常に少ないことが示唆された。しかしながら注入トレーサーの種類、注入の方法および量についてはいくつかの改良点も考えられたことから、今後さらに検討する余地があると思われる。本年度は主にACh産生細胞の同定をACh合成酵素であるcholine acetyltransferase(ChAT)の組織内分布と細胞内局在を調べた。ChAT陽性細胞は皮質集合管主細胞に分布していたが、これは副交感神経節後ニューロンがほとんど認められない腎臓においてAChの供給源となりうることを示唆している。しかしながら、その発現細胞数は全腎集合管主細胞の15%程度であり、髄質集合管ではほとんど認められなかった。このことから、腎臓の非神経性AChの産生はネフロンで偏りがみられ、恐らく局所的な作用経路をもつと考えられる。さらに、集合管主細胞におけるChATの局在は管腔側膜にみられたことから、集合管腔にAChが放出される可能性が考えられた。AChの受け手であるムスカリンACh受容体(mAChRs)の発現の検討を行った。ラット腎上皮系細胞株NRK-52E細胞には恒常的にmAChRサブタイプのM1RとM4Rが発現していた。ACha gonistであるcarbacol刺激によりNRK-52E細胞にATP感受性K+チャンネル(Kir6.1)が発現することが分かった。Antagonistによる受容体阻害実験により、Kir6.1はM4Rの活性化によって発現調節されていることが明らかとなった。また、同一リガンドに対する競合的な複数の受容体サブタイプがネフロンに存在することは、AChの作用がより複雑に制御されていることを示唆する。また、ラット腎組織でのM4Rの局在は、近位尿細管および集合管管腔側に認められた。受容体発現がネフロン管腔側膜にみられたことは、AChの作用経路として集合管管腔が利用されている可能性を状況的に裏付けるものである。神経トレーサーを用いた迷走神経投射ニューロンの検索では、腎臓への明確な線維は確認できなかった。恐らく分布神経はほとんど存在しないか、極めて少ないと考えられた。本年度は、腎上皮系培養細胞NRK-52E株を用いて、アセチルコリン(ACh)のアナログであるカルバコール(CCh)の作用を詳細に検討した。NRK-52E細胞は恒常的にM1受容体およびM4受容体を発現している。CCh刺激により、これらの受容体に加え、M2受容体の発現が誘導された。M2受容体の発現は、アトロピンまたはtropicamideにより特異的に阻害されたことから、M2受容体の発現はM4受容体の活性化カスケード下流に存在していることが示唆された。また、CCh刺激により、ATP感受性カリウムチャンネルKir6.1の発現が誘導された。そして阻害実験によりKir6.1もまたM4受容体活性により制御されていることが明らかとなった。Kir6.1の発現は、M2受容体特異的阻害剤

metoctramineには影響を受けなかったため、Kir6.1の発現はM2受容体とは異なるカスケードかもしくはKir6.1の活性化によりM2受容体が誘導されたと推測される。一方で腎臓に投射する副交感神経の存在の可能性を検討するため、腎神経叢の直接標識を試みた。腎神経にマイクロカプセルを装着し、逆行性トレーサーであるFluorogoldを充填することで、腹膜や腎周辺組織からの非特異的取り込みを排除した。その結果、副交感神経の中枢である延髄迷走神経背側運動核や疑核および仙髄中間帯には陽性細胞は認められなかった。このことから、腎臓へ投射するこれらの中枢からの副交感神経線維はほとんど存在しないことが明らかとなった。腎臓における非神経性AChの分泌を皮質集合管主細胞が担っていることを明らかにした。また、これまで考えられていなかった、ネフロン管腔を経由するACh作用経路の可能性を示唆することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。腎臓におけるAChの動態をさらに詳細に検討する必要がある。すなわち、(1)これまで見つかったACh産生領域以外ではAChの供給はどのように行われているのかという点、そして(2)新たに明らかになった腎上皮細胞における複数のmAChRサブタイプの発現とカリウムチャンネルの制御について検討していく必要がある。また、コリン作動性ニューロンの投射の可能性については、これまでの研究ではネガティブな結果が得られるのみであったため、過去の文献に照らしてもその存在は否定的にならざるを得ない。よって、最終年度の研究自体は上記の非神経性ACh細胞の解析に比重をおくことになるだろう。
新規リン脂質代謝酵素ＧＤＥ５の生理機能の解明、およびその応用

新規なリン脂質代謝酵素であるGDE5の脂肪細胞分化における役割について明らかにした.GDE5は脂肪細胞分化に伴って発現が誘導された.GDE5をノックダウンした際に脂肪細胞分化が抑制された.さらに,GDE5の発現抑制は,脂肪細胞分化初期において重要な一過性の増殖であるclonal expansionを抑制していた.GDE5は脂肪細胞内のglycerophosphocholine(GPC)を特異的に分解し,GDE5をノックダウンした場合には細胞内のGPC濃度が著しく上昇した.GDE5は細胞内GPC濃度の調節を介して浸透圧バランスを調整し,細胞増殖を調節する新規標的因子であると考えられた.脂肪細胞の分化・成熟過程におけるGDE5の生理的役割について解析を行った.脂肪細胞内に中性脂肪の蓄積が認められるが,その脂肪滴の成長に伴って表面積が増大することから,表層のリン脂質一重層のphosphatidylcholine (PC)の生合成が深く関与し,PC合成のための細胞内のcholine (Cho)の供給が重要であると考えられている.そこで本研究では脂肪細胞におけるChoの供給経路に着目し,新規リン脂質代謝酵素であるGDE5によるglycerophosphocholine (GroPCho)の分解によるChoの供給,および生理的役割に関する検討を行った.細胞内Cho,およびPCの分解産物であるGroPChoの定量系をHILICを用いたLC/MS法により確立した.動物細胞で発現させたGDE5はin vitroの酵素反応においてGPCを基質として分解し,Choを産生した.マウス前駆脂肪細胞株3T3-L1においてGDE5をノックダウンさせたところ,細胞内のGroPCho濃度は5.6倍に上昇したことから,3T3-L1細胞内においてGDE5はGroPChoを分解することでChoの供給経路としての役割を担うことが示唆された.さらに3T3-L1細胞の脂肪細胞分化にともなってGDE5はRNAレベル,およびタンパク質レベルにおいて著しく増加し,また脂肪細胞の分化誘導に関わるPPARγのアゴニストであるTZDの添加によってもGDE5の発現上昇がみられ,脂肪細胞分化・成熟においてChoの供給経路としてのGDE5の重要性が示唆された.また,GDE5をノックダウンさせた際に,3T3-L1細胞の分化開始時のclonal expansionが抑制されたことから,GDE5によるCho供給を介したPCの生合成が阻害された可能性が示され,脂肪細胞の増殖におけるGDE5の新規な生理的役割が示唆された.肥満時の白色脂肪細胞では,中性脂肪を蓄積する脂肪滴の表層のリン脂質や細胞容積の増加を伴って,形質膜のリン脂質の主成分であるphosphatidylcholine(PC)の合成量が増加するために,材料であるcholineの需要が高まると考えられており,cholineの供給は脂肪細胞分化において重要な調節ポイントであることが予想される.最近見出したリン脂質代謝酵素glycerophosphodiester phosphodiesterase 5(GDE5)は,細胞内のglycerophosphocholine(GPC)を分解し,cholineを供給する細胞質酵素であり,cholineはkennedy pathwayを介してPCの合成に利用されると考えらえる.また最近,マウス前駆脂肪細胞株3T3-L1細胞の分化誘導に伴ってGDE5の発現量の増加を見出したことから,新規choline供給経路としてのGDE5の脂肪細胞分化における意義を明らかにした.3T3-L1細胞の脂肪細胞分化過程における細胞内GPC量をLC/MS法を用いて測定したところ,GDE5の発現上昇に伴って細胞内GPC量の減少が確認され,GDE5のcholine供給経路としての役割が示唆された.さらに,3T3-L1細胞においてsiRNA法を用いてGDE5の発現を抑制したところ,脂肪細胞分化の著しい阻害が認められ,clonal expansionと呼ばれる一過性の細胞増殖を抑制した.GDE5遮断時には,PC量に差は認められず,細胞内のGPC量の10倍以上の著しい蓄積が認められた.GPCは細胞内有機浸透圧性物質としての生理的な役割が報告されており,またGDE5の遮断をした際に培養液中のLDH活性の増加が認められたため,GDE5遮断による脂肪細胞の増殖抑制効果には,浸透圧バランスの破綻が関わる可能性が示唆された.新規なリン脂質代謝酵素であるGDE5の脂肪細胞分化における役割について明らかにした.GDE5は脂肪細胞分化に伴って発現が誘導された.GDE5をノックダウンした際に脂肪細胞分化が抑制された.さらに,GDE5の発現抑制は,脂肪細胞分化初期において重要な一過性の増殖であるclonal expansionを抑制していた.GDE5は脂肪細胞内のglycerophosphocholine(GPC)を特異的に分解し,GDE5をノックダウンした場合には細胞内のGPC濃度が著しく上昇した.GDE5は細胞内GPC濃度の調節を介して浸透圧バランスを調整し,細胞増殖を調節する新規標的因子であると考えられた.以前、培養筋芽細胞株C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、myogeninの発現や筋管形成が著しく促進することを明らかにしていることから、GDE5の発現抑制による骨格筋細胞の分化誘導効果のメカニズムの解明に着手した。まず、GDE5が細胞内のglycerophosphocholine(GroPCho)を分解し、choline(Cho)を生成する可能性について、LC/MS法を用いた細胞内GroPCho、およびChoの測定系を構築した。C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、細胞内のGroPChoは著しく蓄積し、さらにChoは減少したことから、in vitroのみならず、細胞内においてもGroPChoからChoへの変換に関与することが示された。

また、GDE5の発現抑制においてrapamycinの投与によってmyogeninの発現や筋管形成が抑制され、GDE5の発現抑制による筋分化促進作用におけるmTOR系の関与が示唆された。さらに、DNA microarray法を用いて、C2C12細胞におけるGDE5の発現抑制によって、IGF2遺伝子やproteoglycan遺伝子の著しい発現誘導が認められた。一方、動物細胞におけるGDE5の過剰発現によって,GroPChoの分解活性を確認しており、GDE5のN末端にHis tagあるいはstrep tagを融合させてHEK293T細胞で過剰発現させ,アフィニティ精製を試みたが、組換えGDE5タンパク質の精製は困難であった。そこで、天然型組換えGDE5タンパク質を発現させ、イオン交換クロマトグラフィーによって部分精製を行い、GroPChoの分解活性の確認が終了した。同組換えGDE5タンパク質のGroPChoの分解活性を利用して,化合物のスクリーニングに着手する予定である.GDE5の酵素活性の阻害を指標としたスクリーニング系の確立については,動物細胞で発現させたGDE5タンパク質の不安定性により研究を進める上で大きな問題が生じた.しかしながら,脂肪細胞の分化・成熟過程におけるGDE5の生理的な役割についての興味深い知見が見出された.脂肪細胞の分化過程におけるGDE5の発現を確認し,またPPARγのリガンド添加によっても発現量が増加し,脂肪細胞分化における生理的役割が示唆された.さらにLC/MS法の応用によって脂肪細胞内のglycerophosphocholine (GroPCho),およびcholine (Cho)濃度の測定が可能となり,GDE5の発現抑制により,著しい濃度変化が引き起こされることが明らかとなり,脂肪細胞におけるGDE5の生理作用が見出された.また,GDE5を発現抑制させた際に,3T3-L1細胞の分化開始時のclonal expansionが抑制され,GDE5の酵素活性による細胞内Cho供給を介したPCの生合成が阻害されたと考えられ,脂肪細胞の増殖におけるGDE5の新規な生理作用が強く示唆された.肥満白色脂肪組織では,脂肪細胞の肥大だけでなく,脂肪細胞の増殖による細胞数の増加が重要な要因であると考えられていることから,GDE5の肥満過程における病態因子としての可能性が示唆された点は極めて大きな成果であると考えられる.培養筋芽細胞株C2C12細胞のGDE5の発現抑制による筋分化誘導効果のメカニズムの解明において、遺伝子解析など順調に推移している。一方、LC/MS法を用いたglycerophosphocholine(GroPCho)、およびcholine(Cho)の測定系の構築を行った。本測定系によって細胞内におけるGroPChoからChoへの変換にGDE5が関与することが示され、筋細胞分化との関連性について貴重な情報を与えるものであり、また阻害物質のスクリーニング法においても利用可能であり、大きく貢献するものである。
近現代における在中国公使館・領事館に関する研究

本研究は日本の在中国公使館・領事館に関する実態解明を行うことによって、近現代における日本の対中政策を解明しようとする。1.今年度は引き続き在中国公使館と領事館に関する基礎資料を調査し、領事館が不平等条約、租界および進出企業との関係を解明し、その歴史的変容と役割を明らかにしようとした。2004年9月、香港、北京を現地調査し、中国第一歴史档案館のほかに、香港政府档案処歴史档案館で日本占領下の香港と日本の関係について史料を収集した。日本、アメリカおよび中国で行った史料調査に基づき、在中国公使館と領事館の設立経過、領事館の管内事情、さらに領事館と日本進出企業、軍との関係を解明し、その全体像を概括した。2.明治4年(1871年)の「日清修好条規」の締結経過と意義を検討し、これに関する北京公使館と上海領事館の設立を考察した。この研究は、まず「日清修好条規」の締結背景を国際関係の視点から検討した。そして明治4年(1871年)柳原前光が上海へ赴き、和親条約の提出や李鴻章との交渉などの通商予備交渉の経過を考察した。また明治4年(1871年)伊達宗城、柳原前光と李鴻章との間で行った条規の締結過程を明らかにし、さらにアメリカなどの干渉による条約修正の提出や条規批准書の交換にいたる過程を検討した。最後に冊封体制下におけるこの条約の意義と、朝鮮、琉球問題との関係を解明した。また、北京公使館と上海領事館の設置と史的展開を解明した。3.間島総領事館を中心に旧満州地域における日本の領事館に関する実態解明を行った。間島総領事館どのように開設されたのかということを、統監府臨時間島派出所と比較しながら、韓人裁判権問題に重点を置き、間島協約の締結とあわせてその史的展開を解明した。これにより間島をめぐる日本政府の対清政策を解明するともに、対中進出の拠点としての領事館の位置付けを明らかにした。このほかに、外務省外交史料館に所蔵する『各国事情関係雑纂支那ノ部』に基づき、奉天領事館をはじめ、吉林、哈爾濱、安東領事館に関する史料を収集し、旧満州地域における領事館の実態解明を試みた。
数値等角写像とその応用

1.与えられた幾つかのJordan閉曲線の外側の無限遠点を含む非有界な多重連結領域から円弧スリット領域への数値等角写像の方法を提案し,数値実験的にその有効性を検証した(研究発表欄:天野,1995a).具体的には,代用電荷法によって1対の共役な調和関数を複素対数ポテンシャルの1次結合で近似して,問題の等角写像の近似写像関数を構成する.この等角写像は渦点と障害物を伴う2次元ポテンシャル流に関係し,応用上も重要である.また,これと双対な問題である放射スリット領域への数値等角写像の方法を提案したが,これは悪条件問題に帰着することがわかった(天野,投稿中).この等角写像は湧出点または吸込点と障害物を伴う2次元ポテンシャル流に関係し,応用上も重要である.2.与えられたJordan閉曲線の内部,外部または2つのJordan閉曲線で囲まれた有界な2重連結領域からそれぞれ単位円の内部,外部または円環領域への数値等角写像の方法について,可能な幾つかの定式化を理論と数値実験の両面から比較し,いづれの定式化を選択すべきであるかを明らかにした.具体的には,近似写像関数の表現形式によって,計算手順の統一性,座標系からの独立性,数値写像の精度において,ある定式化は他方より優れていることがわかった(研究発表欄:天野,1995bc,1994ab).3.以上は代表者による研究実績であるが,これ以外にも,研究発表欄のような7編の論文が分担者によって発表されている。または,発表予定である。
定期借家方式による民家再生システムの社会実験と検証

本研究は「定期借家方式による民家再生システム」を提案し、具体的再生手法の開発を行い、社会実験によりその有効性と可能性を検証したものである。提案システムに準ずる先進例を対象に、詳細調査によりその成果と課題を整理した。また民家再生の技術的課題である耐震補強法と床暖房手法の開発を行い、これらの成果を導入した民家再生プロジェクトを社会実験として実施し、提案システムと開発技術の有効性を検証した。I.「定期借家方式による民家再生システム」に準ずる先進的モデル事業を対象に、改修事例の詳細調査によりその成果と課題を整理した。(1)伝統的農家住宅を福祉施設に改修した事例の詳細調査を実施した。(2)子育て支援施設を対象に、農家住宅改修事例の使われ方調査を行った。(3)地域コミュニティ施設(環境学習拠点)及び飲食店舗として再生された施設を対象に、改修経緯・改修内容と共に、改修後の施設運用体制・行事企画内容と利用形態の調査を行った。(4)「ふるさと島根定住財団」の長期借り上げ型空き家活用事業を対象に、転入動機と就労形態、改修内容・コストと住まい方・居住環境評価の関係について詳細調査と分析を行った。II.農村地域における産業体験と連動した田園居住支援システムの実例調査により、UIターン者のための産業体験事業とその受け皿としての空き家活用法に関し、各自治体の事業の特徴と実績を整理した。産業体験事業はUIターンの動機付けの機会提供だけでなく、地域活性化や農林業等の後継者不足対策にも効果をもたらすことを示した。III.木造建築構法に対応した既往耐震診断手法の総括的整理を行った。常時微動計測を含む木造民家詳細実測調査データベースを用いて、柱・はり接合部、土壁等の構造性能を適切に仮定した、限界耐力計算により伝統木造住宅の構造性能を評価し、伝統民家の改修設計を行う際の耐震補強の必要レベルを推定した。伝統民家の水平加力実験による弾塑性域の耐力・変形性能の測定データをもとに、大地震時における伝統民家の終局耐力・変形性能の解析により、建物の耐力および剛性を算定し、これと建物の破壊モードを考慮した解析結果より剛性を算定し、伝統民家の構造性能を定量的に評価した。IV.空気流動モデルによる伝統民家の熱環境シミュレーション手法の開発を行い、冬季の室内熱環境に関し暖房方式や建具開閉による熱流動・熱損失を空気流動により予測した。また農家住宅を改修した伝統民家の夏季・冬季の熱環境計測により、室内熱環境の実態と改善課題と方法を検討した(1)街なか・田園居住支援システムによる空き家活用実験と検証:(1)民家再生プロジェクトを実施した。詳細実測調査と耐震診断・断熱性能評価を行い、改修計画策定を支援した。(2)伝統民家を高齢者福祉施設に改修した4事例を対象に、改修内容と管理運営形態のヒアリング調査を実施した。(3)農村地域の体験事業事例(島根県海士町)を選出し、体験者の参加動機、地域や体験受け入れ先の体制、体験プログラムの内容と成果、定住者の就労形態の実態調査と体験事業システムの評価を行った。(4)産業体験期間中並びに定住後の住宅確保を支援する自治体の取り組みを整理し、事例のヒアリング調査より、体験事業参加者及び定住者の住生活の実態を明らかにした。(2)伝統民家の耐震補強実験施工と性能検証:(1)二重落し込み耐力壁による補強効果の解析を行い、最適補強方法を構造計算により確定する手法を検討した。耐震補強に伴う改修コスト分析を行い、補強方法・部位・補強壁量及び改修コスト計算法を提案した。(2)落とし込み板壁構法による耐力壁補強を行った伝統民家を対象に、構造解析により耐震補強効果の検証を行った。(3)伝統民家の床暖房実験施工と性能検証:新規開発の中空パイプ方式床暖房システムの実家屋2例の冬季熱環境計測と性能検証を行った。S邸は2階6帖続き間和室部分に床暖房を敷設した畳床の暖房室で、伝統民家に多い畳居室の暖房改修の指針を得たる。K邸は昭和初期建築の伝統民家で、平屋食堂部分の床暖房室の熱環境計測と性能検証を行った。(1)空き家活用実験の検証(1)山口県の総合循環型福祉推進モデル事業による民家再生事例を対象に使われ方調査を行い、地域福祉施設としての民家改修型施設の空間性能評価を行った。(2)農村地域における改修費助成型と情報提供型空家活用システムのヒアリング調査を実施し、不動産業との連携方式の有効性を確認した。(2)既存壁面改修用耐力壁の水平加力試験と伝統民家耐震補強事例の構造解析(1)耐力壁の補強に焦点を絞り、伝統構法による既存壁面改修用試験体の水平加力試験を行い、弾塑性域の変形・耐力性能の解析を行った。(2)土壁補強・板壁補強・ダンパーを設置した伝統民家の耐震補強事例を対象に、構造解析により耐震補強効果を確認した。(3)伝統民家の床暖房実験施工事例の性能解析(1)中空パイプ方式床暖房システムの実家屋の冬季熱環境計測と性能解析を実施した。

K邸は伝統民家を高齢者福祉施設に改修した事例で、計測データをもとに食堂部分床暖房の性能解析を行い、補助暖房(エアコン)を併用することにより、早期に20度の定常状態を実現できることを確認した。(2)木製ペアガラスサッシと太鼓障子を組み合わせた伝統民家の開口部断熱改修事例を対象に、計測データをもとに断熱性能の解析を行い、木製ペアガラスと同等の断熱性能を有すことを確認した。
硝子体内投与薬物の眼組織障害の研究と臨床応用

硝子体内薬物投与に起因する炎症が網膜色素上皮に与える影響を調べる為に、炎症性サイトカインの代表であるTNF-αについて調査・報告した。当教室で培養可能な極性をもった網膜色素上皮細胞のシートにTNF-αを暴露させると、細胞同士のタイトジャンクション(ZO-1)の破壊が認められた。さらに、TNF-αによるさまざまな細胞内シグナル伝達の中で、MAPキナーゼパスウェイが活性化されることにより、タイトジャンクションの破壊、すなわち外側血液網膜関門の破壊が引き起こされることが分かった。硝子体内薬物投与を行う、加齢黄斑変性やブドウ膜炎は疾患自体も炎症性サイトカインが関与しており、これらの疾患の理解にも今回の研究は有用であった。TNF-αが網膜色素上皮細胞シートに与える影響を初めて明らかにした研究である、論文発表も行った。(Shirasawa M, Sonoda S, Terasaki H, Arimura N, Otsuka H, Yamashita T, Uchino E, Hisatomi T, Ishibashi T, Sakamoto T. Exp Eye Res. 2013;27;110C:59-69)硝子体内薬物投与に起因する炎症が網膜色素上皮に与える影響を調べる為に、炎症性サイトカインの代表であるTNF-αについて調査・報告した。ラットの眼内にTNFα、トロンビンを注入し、網膜、脈絡膜アポトーシス型障害と非アポトーシス型障害のいずれが優位かについて、Clarkeの分類での1型から3型について調べた。マウスを麻酔後、トロピカミド点眼液で散瞳し、片眼にTNFα(500ng/眼)を30G針で網膜下注射を行った。もう片眼にはコントロールとしてPBSの注射を行った。トロンビンは、1・10U/眼の濃度で網膜下注射を行った。TNF注射群では、網膜・網膜色素上皮・脈絡膜の菲薄化を認めた。Tunel染色の結果では、TUNEL陽性細胞を多く認め、アポトーシス型の細胞障害を生じていることが示唆された。網膜色素上皮が菲薄化し不連続となっており、TNFαによって網膜色素上皮のバリア機能障害を示唆する所見と思われた。トロンビンにおいても網膜・網膜色素上皮・脈絡膜の菲薄化を認めた。TUNEL染色の結果からは、濃度依存的にアポトーシスを生じていた。低濃度では色素上皮の増殖性変化を認め、トロンビンが細胞増殖にも影響している可能性が示唆された。過去の報告では、TNFαがアポトーシス誘発の他、網膜色素上皮のバリア機能を低下させることが報告されている。今回の実験では、TNFα(500ng/眼)では、網膜・脈絡膜障害を強く認め、アポトーシス型の細胞障害が有意であった。トロンビンは、血液凝固系の重要な酵素であるが、その他にも細胞に様々な影響(増殖・遊走反応など)を与えることが報告されている。今回の濃度では、そのような影響よりは、アポトーシス型の細胞障害が有意であった。初年度の研究目的であるラットにおける眼内薬物投与の影響について調査を行った。TNFα、トロンビンの効果による網膜、脈絡膜、血管新生への影響がラットをもちいた実験により判明した。網膜色素上皮極性細胞を培養するシステムを構築したので、それを用いて硝子体内投与薬物が網膜色素上皮を通過するかどうか調査する。さらに硝子体内投与薬物によって生じる網膜障害、脈絡膜障害の治療ターゲットを絞り込む。その結果を用いて、抑制実験を行う。ターゲット分子により薬物送達方法は異なるが、siRNA、L-NAMEなどの薬剤、抗体などを用いる予定である。最初はin vitroの系を用いて、次にin vivoの実験系へ進む。上記実験に用いる薬物関連、実験器具、実験動物に150万円、成果発表の学会参加費に国内10万円、国外60万円、発表論文英文校正代に20万円を要する。
窒化物混晶半導体の物性評価

窒化物混晶半導体は,青色-紫外領域の発光材料として有望であるが,一般に行われているヘテロエピタキシャル成長においては基板と成長層の格子不整合,熱膨張係数差による応力の存在や転位の増殖など,デバイスの高性能化を目指すにあたり本質的な問題点を有する.本研究では,上記に示した問題点を解決するために,有機金属気相成長法(MOCVD法)により窒化物半導体を成長し,ラマン散乱法,フォトルミネッセンス法等の光学評価を用いて,その成長条件の最適化を図った。また,昇華法により成長させたバルクおよび厚膜窒化ガリウム上へMOCVD法によりホモエピタキシャル成長を試みた.その結果,ラマン散乱の偏光選択実験から,ホモエピタキシャル成長膜がサファイア上に成長されたヘテロエピタキシャル膜と比較してその結晶対称性に優れていること,フォトルミネッセンス測定から光学的特性が改善されること,透過型電子顕微鏡観察から転位密度の大幅な軽減がなされることを明らかにした.また,光励起による室温における誘導放出実験を行い,閾値励起光強度としてバルクおよび厚膜考えている試料に対してそれぞれ0.86,1.04MW/cm^2を得た.前者は,サファイア基板上にAINを用いて2段階成長したGaNのそれと同程度である.本実験試料では成長後特別な加工は施しておらず,共振面の平坦性の改善,反射効率の向上化等により閾値励起光強度の低減が期待されると考えている.以上の内容を論文として発表した.窒化物混晶半導体は,青色-紫外領域の発光材料として有望であるが,一般に行われているヘテロエピタキシャル成長においては基板と成長層の格子不整合,熱膨張係数差による応力の存在や転位の増殖など,デバイスの高性能化を目指すにあたり本質的な問題点を有する.本研究では,上記に示した問題点を解決するために,有機金属気相成長法(MOCVD法)により窒化物半導体を成長し,ラマン散乱法,フォトルミネッセンス法等の光学評価を用いて,その成長条件の最適化を図った。また,昇華法により成長させたバルクおよび厚膜窒化ガリウム上へMOCVD法によりホモエピタキシャル成長を試みた.その結果,ラマン散乱の偏光選択実験から,ホモエピタキシャル成長膜がサファイア上に成長されたヘテロエピタキシャル膜と比較してその結晶対称性に優れていること,フォトルミネッセンス測定から光学的特性が改善されること,透過型電子顕微鏡観察から転位密度の大幅な軽減がなされることを明らかにした.また,光励起による室温における誘導放出実験を行い,閾値励起光強度としてバルクおよび厚膜考えている試料に対してそれぞれ0.86,1.04MW/cm^2を得た.前者は,サファイア基板上にAINを用いて2段階成長したGaNのそれと同程度である.本実験試料では成長後特別な加工は施しておらず,共振面の平坦性の改善,反射効率の向上化等により閾値励起光強度の低減が期待されると考えている.以上の内容を論文として発表した.
エンドソーム膜タンパク質品質管理におけるE3リガーゼの役割

1.エンドソーム局在E3リガーゼ変異体を用いた細胞内局在解析およびプルダウン解析の結果,N末端領域のパルミトイル化部位がエンドソーム局在E3リガーゼのエンドソーム局在を決定すること,また,N末近傍に存在するdisordered regionsが構造異常を持つ成熟型ΔF508-CFTRの認識に必要であることが明らかとなった.2.エンドソーム局在E3リガーゼ点変異体発現により,クラスリン依存性,および,非依存性エンドサイトーシスを受ける積み荷タンパク質のリサイクリングが阻害された.一方,エンドソーム局在E3リガーゼノックダウンは,積み荷タンパク質のリサイクリングに影響を与えなかった.透過電子顕微鏡解析の結果,エンドソーム局在E3リガーゼ点変異体発現により,エンドソームの形態異常が見られた.3.網羅的質量分析解析の結果,エンドソーム局在E3リガーゼと結合する多くの新規結合タンパク質を同定した.これらには,リサイクリングエンドソームに関わる分子郡が含まれていた.従って,エンドソーム局在E3リガーゼは,これらの因子を制御することで,エンドソーム区画の形態およびソーティング機能制御に関わる可能性が示唆された.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。1.エンドソーム局在E3リガーゼ変異体過剰発現実験の結果,RINGdomain,エンドソーム局在に関わるN末端領域,および中央部のunstructured領域がΔF508-CFTR膜発現抑制効果に必要であることが明らかとなった.さらに,pull-down assayおよびBiFC法の結果,ΔF508-CFTRとの相互作用にエンドソーム局在E3リガーゼのN末端領域が必要であることが明らかとなった.さらに,ノックダウン実験の結果,post-Golgi区画におけるエンドソーム局在E3リガーゼとΔF508-CFTRの相互作用は,Hsc70分子シャペロン非依存的であることが明らかとなった.2.ノックダウン実験の結果,エンドソーム局在E3リガーゼは,ΔF508-CFTRのエンドサイトーシスを阻害し,初期エンドソームからリソソームへの輸送を阻害した.しかしながら,エンドソーム局在E3リガーゼノックダウンは,トランスフェリン受容体やユビキチン結合アダプター依存的にエンドサイトーシスされるCD4TccUb(AllRΔG)のエンドサイトーシスは阻害しなかった.従って,エンドソーム局在E3リガーゼはエンドサイトーシスの分子機構自体には影響を与えないが,形質膜における異常タンパク質のユビキチン化を制御し,エンドサイトーシスを間接的に制御すると共に,初期エンドソームからリソソーム経路へのソーティングも制御する可能性が考えられた.次年度に行う予定である結合タンパク質探索や,精製タンパク質を用いたin vitroユビキチン化の再構成実験の準備が整ったため.1.エンドソーム局在E3リガーゼ変異体を用いた細胞内局在解析およびプルダウン解析の結果,N末端領域のパルミトイル化部位がエンドソーム局在E3リガーゼのエンドソーム局在を決定すること,また,N末近傍に存在するdisordered regionsが構造異常を持つ成熟型ΔF508-CFTRの認識に必要であることが明らかとなった.2.エンドソーム局在E3リガーゼ点変異体発現により,クラスリン依存性,および,非依存性エンドサイトーシスを受ける積み荷タンパク質のリサイクリングが阻害された.一方,エンドソーム局在E3リガーゼノックダウンは,積み荷タンパク質のリサイクリングに影響を与えなかった.透過電子顕微鏡解析の結果,エンドソーム局在E3リガーゼ点変異体発現により,エンドソームの形態異常が見られた.3.網羅的質量分析解析の結果,エンドソーム局在E3リガーゼと結合する多くの新規結合タンパク質を同定した.これらには,リサイクリングエンドソームに関わる分子郡が含まれていた.従って,エンドソーム局在E3リガーゼは,これらの因子を制御することで,エンドソーム区画の形態およびソーティング機能制御に関わる可能性が示唆された.計画通りに進展しており,今後も計画に従い研究を推進する.さらに,エンドソーム局在E3リガーゼの翻訳後修飾による活性制御の可能性が示唆されたため,その可能性についても今後追求していく.28年度が最終年度であるため、記入しない。
実際的な連続時間信号の標本化と再構成に関する理論的研究

階段状関数で駆動されるn次元連続時間線形動的システムの出力として再構成信号を得る再構成方式において、離散時間信号の値を原信号の線形汎関数として1標本化間隔の遅れ時間内に推定するという従来の方式に対して、遅れ時間を一般の遅れ時間m【greater than or equal】1へ拡張することによって、mが有限である限り実現可能であり、mが無限となる極限で理想的な最小2乗近似になるという理論を得た。誤差の最悪値を評価する指標をシステムパラメータから計算するための理論式を求め、シミュレーションによって、mを増大することによる近似精度の向上を確認した。再構成システムの回路実現は自明であり構造も極めて簡単である。標本化システム回路実現のために、定期的に状態を0にリセットする連続時間システムとして構成し、状態を標本化するというテクニックを用いる方法を考案した。その回路複雑さはmが小さい場合にはmに比例し、【greater than or equal】nの場合にnに比例する程度で頭打ちになるという特徴をもっている。また、本研究から派生した新たな問題として、文字を手書きする過程のペン先の位置として計測される連続時間信号を最適に標本化する方法、その応用として、手書き文字の特徴点の抽出法および連綿手書き風文字列の合成法が得られた。階段状関数で駆動される連続時間線形動的システムの出力として再構成信号を得る再構成方式において、離散時間信号の値を原信号の線形汎関数として1標本化間隔の遅れ時間内に推定する方式について、まず、制御理論でのH^∞理論に類似した最悪誤差の上限の評価式が得られた。この方式を拡張して、遅れ時間nが1の場合から一般の遅れ時間n【greater than or equal】1へ拡張するための最初のステップとなるn=2の場合の標本化システムが得られ、そのシミュレーションは、精度が向上することを示した。ディジタルシグナルプロセッサを用いて、連続時間音声信号を標本化するシステムの実機も作成した。n=1の場合には標本化システムを実現する簡潔な回路があったが、n=2の場合の回路の複雑さは2倍になることが明らかとなった。nを任意の自然数へ一般化することは、nが有限である限り実現可能であり、nが無限となる極限で理想的な最小2乗近似になるという理論を完結するために大事なことであるが、数式の複雑さのため、結論にまで至っていない。また、本研究から派生した新たな問題として、文字を手書きする過程のペン先の位置として計測される連続時間信号を最適に標本化するための理論が得られた。平成12年度は、nを任意の自然数へ一般化すること、および、上記の新たな問題の応用として手書き文字の特徴抽出法および手書き風文字列の合成法に取り組む予定である。
地域における育児に悩む母親のレジリエンス向上を図る前向き育児支援プログラムの活用

地域で育児している3歳児をもつ母親550名(回答率38.0%)を調査対象として分析した。母親の育児ストレスとレジリエンスは、負の相関関係にあることが明らかになった。また、母親のレジリエンス測定尺度は妥当性と信頼性を確認した。さらに育児困難な母親8名にトリプルPの講習会を実施した結果、受講前に比べて母親の育児不安や子どもの問題行動が減少する効果を得た。地域の保健師がトリプルP講習会を継続して実施できるように支援した。本研究の第1の目的である地域で育児している3歳児をもつ母親の育児ストレスとレジリエンス尺度の開発では、550名(回答率38.0%)の質問紙を回収し分析した結果、母親の育児ストレスとレジリエンスは、負の相関関係にあることが明らかになった。育児ストレスとレジリエンスを評価要因として使用できることを確認した。しかし、母親のレジリエンス測定尺度の作成においては、1回目の調査分析では、天井効果とフロアー効果のある項目が多くなったため、使用できない質問項目が多くなった。そこで、質問項目の回答を7段階評定に変更し、さらに質問項目の表現を微調整して、3歳児をもつ母親を対象に再度調査を行った。その結果、100名の回答を得たものを分析した結果、天井効果とフロアー効果のある項目が減少した。そこで因子分析を行い、3因子構成を確認し、尺度の妥当性と信頼性を検証した。本研究の第2の目的である地域でのトリプルPの実施では、昨年度トリプルPのファシリテータ資格を取得した分担研究者と研究協力者2名によって保健センターで指導している育児困難な母親8名に、トリプルPの講習会を試行した。その結果、受講前に比べて母親の育児不安や子どもの問題行動が減少する効果を得た。さらに、保健センターの保健師2名にトリプルPのファシリテータ資格を取得できるようにし、保健師主催のトリプルP講習会を継続して実施できるように支援した。3013年1月に6名の育児困難な母親を対象に保健師主催でトリプルP講習会を開催することになり、分担研究者が実施の助言者として参加して、地域での継続を確認した。上記の調査結果の一部は、論文作成し、調査結果は学会発表する準備を行うと同時に、調査結果およびトリプルPの試行状況を報告書にまとめ、研究協力が得られた3市の保健センターの保健師に配付した。今年度の第1目的の予備調査では、育児ストレスおよびレジリエンスに関する文献および学会等での情報収集を行い、育児中の親を対象としたレジリエンス尺度を作成するために、項目検討を行った。さらに、既存の育児ストレス尺度と属性を加えて、質問紙を作成した。調査に関しては、大学の倫理委員会に申請して了承を得た。調査は、大阪府下の3市の保健センターに協力の依頼を行い、3歳児半健診の際に調査票の配付を行うことを了解してもらった。2011年11月から2012年3月の期間に、3市の5か所で開催された3歳児半健診会場において、分担研究者と研究協力者は、健診に来られた母親を対象に、調査目的を説明した後、調査票を配付した。調査票は自宅に持ち帰り記載後、郵送してもらう方法で行った。また、分析を担当する研究代表者、分担研究者、連携研究者、研究協力者は、統計ソフトのスキルアップ講座を受講した。第2目的の次年度の地域で開催するトリプルP講習会の準備に関しては、トリプルPジャパン主催のファシリテーター養成講座に、2011年9月に分担研究者1名、2012年3月に研究協力者2名を受講させ、次年度の準備を整えた。また、認定資格のある研究代表者、連携研究者、分担研究者の3名は、10月のファシリテーター研修会に参加し、スキルアップに努めた。また、H市で開催されているトリプルP講習会に分担研究者1名、研究協力者2名を見学させてもらい、講習会の開催のためのスキルアップに努めた。今年度の第1目的のレジリエンス尺度の作成のための予備調査は、近隣の3市に協力要請を行い、調査票の配付の承認を得ることができた。調査は、健診に来られた1479名の母親に調査目的を説明した後、調査票を配付し、自宅に持ち帰り記載後、郵送してもらう方法で行った。調査票は、予定したよりも回収率が低く、分析に耐える人数を確保するために調査期間を延ばして対応した。その結果、560名(回収率37.9%)から回収することができた。有効回答は553名(有効回答率98.8%)であった。当初予定していた回答を確保することができたことから、当初の目的は達成できている。さらに、分析を担当する研究代表者、分担研究者、連携研究者、研究協力者は、統計ソフトのスキルアップを行い、分析に準備を整えている。データは、研究協力者によって入力している段階である。

第2目的の地域で開催するトリプルP講習会の準備では、トリプルPジャパン主催のファシリテーター養成講座に、分担研究者1名、研究協力者2名の計3名を受講させ、認定試験にも合格し、認定を得ることができた。研究メンバーは、ファシリテーター研修会やすでに実施されている他市の講習会の実際の見学によって、スキルアップができ、開催のノウハウを得ることができたことから、目的は予定通り達成できている。今年度の第1の目的のレジリエンス尺度の作成は、回収した調査票を分析し、信頼性および妥当性を確認する。調査は、他の要因との関連も分析し、学会発表および協力市の保健センターへの結果報告書を作成する。今年度の第2の目的は、地域で育児中の母親を対象としたトリプルP講習会を開催し、その前後のレジリエンスと育児ストレスの変化を把握することである。地域の研究協力者を募ったところ、調査協力してもらった3市のうちのI市保健センターから、トリプルP講習会を共同開催することを了承してもらえ、開催に向けて具体策を検討することになった。I市は、トリプリP講習会が未実施の地区であり、今後有効であればI市保健センターでも継続実施していく希望をもっている。I市保健センターの現在地域で実施している母親対象の育児プログラムのうち、夏に実施するセッションを研究者によるトリプルP講習会に振り替えて、試行することを検討することになった。研究目的を達成するために、(1)I市保健センターの保健師のトリプルPに関する理解を深める目的で、分担研究者が保健師対象の研修会を開催する。(2)夏のトリプルP講習会に参加する地域の母親の募集および会場の手配はI市保健センターで行う。(3)今後I市保健センターでの継続実施の基盤をつくるために、保健師2名をトリプルPジャパン主催のファシリテーター養成講座を受講してもらい、認定を得る。(4)夏のトリプルP講習会に参加する地域の母親の希望者が明らかになった段階で、受講前後の調査を行う。を実施する予定である。第1の調査結果の尺度分析および全体分析のために、情報収集および学会発表目的で旅費・参加費を使用する。また、結果報告書作成のための印刷費や郵送費の使用を予定している。また、事務用品等の購入も必要時行う。第2のトリプルP講習会の実施と前後の調査にために、(1)開催に関する打ち合わせおよび講習会開催のための出張費(2)トリプルP講習会で使用するテキストの購入(3)必要時子どもの保育のためのアルバイト雇用費(4)保健師のトリプルPジャパン主催のファシリテーター養成講座の受講費2名分(5)研究補助者による調査の入力のための人件費(6)スキルアップを目的としたファシリテーター研修会への参加費、の使用を予定している。
反芻家畜における妊娠認識・維持機構の解明-生殖器官のクロストーク概念の構築-

胚で産生されるインターフェロンτ(IFN-τ)は、反芻家畜の妊娠認識因子として広く知られているが、培養子宮上皮細胞へのアポトーシスを引き起こすことも報告されている。また、IFN-τと同様にI型IFNに分類されるIFN-αが組織や細胞のアポトーシスを誘導していることも報告されている。ウシ子宮内膜上皮細胞を用いてI型IFNによるアポトーシス誘導並びにプロジェステロン(P)による抑制作用について評価した。子宮内膜上皮細胞に、P、IFN-τ、およびIFN-αをそれぞれ48時間添加する区、またPとIFN-τまたはIFN-αを混合添加する区を設け、無添加区を対照区とした。実験終了後、コメットアッセイによりDNA損傷を解析した。IFN-τおよびαによって子宮内膜上皮細胞のアポトーシスが誘導された。一方、P添加による影響は見られなかった。また、IFN-τやαによって引き起こされたアポトーシスはPの添加によって軽減された。さらに、I型IFNによってアポトーシス関連遺伝子の発現量にも変化があった。すなわち、I型IFNによってアポトーシス促進因子の発現が増加し、反対に抑制因子の発現が減少することが明らかとなった。以上の結果から、ウシ子宮内膜上皮細胞でのアポトーシス誘導はI型IFNに共通した現象であり、Pにより抑制されることが示唆された。また、上記の細胞培養系で得られた実験結果を生体で検証するために、ウシと同じ反芻家畜であるヤギをモデルとして試験を行った。交配日または発情日を0日目とし、14日目に屠畜後子宮および胚を採取した。実験区は交配を行わず通常発情周期のグループ、交配後14日目に屠畜するグループ、そして交配後10日目にプロジェステロンの影響を除外するために、卵巣を除去し14日目に屠畜するグループに分類した。回収した胚を顕微鏡下で観察してみると、通常の妊娠グループと卵巣除去グループとの間に大きな差は見られず、この時期の胚の成長にはプロジェステロンの影響は少ないのかもしれない。妊娠認識機構の解明を進める上で、受精卵と直接接する母胎側の子宮内膜上皮細胞機能を解析することは非常に重要である。しかし、国内でのBSE発生以降、ウシの全頭検査の実施により検査終了後まで、採材した子宮を含めた生殖器官を食肉処理場から搬出することができなくなり、子宮内膜上皮細胞を新鮮な状態で入手するのが困難となったため、研究進捗が危惧されている。私は、胚移植を行う時のドナー牛から胚を回収する際の子宮灌流液中に含まれる子宮内膜上皮細胞に着目した。そして、子宮灌流液中のウシ子宮内膜上皮細胞が形態的にも機能的にも、これまで報告されている研究結果と同様の研究結果が得られた。これにより今回の方法で採取したウシ子宮内膜上皮細胞を用いて、BSE発生以前と同様に研究を行うことが可能となった。今回の試験:結果は、日本胚移植研究会で既に発表し、国内学会誌への投稿を予定している。近年、遺伝子発現制御技術としてRNA干渉(RNAi)が注目を浴びている。RNAiは簡便で高い効果が得られるので、特定遺伝子機能の解析や遺伝子治療を目的とした基礎研究など医学分野で利用が進んでいる。しかし、家畜繁殖分野でのRNAiを利用した遺伝子発現制御の研究はほとんど行われていない。今回、ウシ卵丘細胞を試験材料に用いて、生殖現象の中心的な調節因子であるプロスタグランジンを合成する酵素の1つであるシクロオキシゲナーゼ(Cox-2)遺伝子を標的として試験を行った。本試験は、遺伝子発現を抑制するために細胞に導入する二本鎖RNA(siRNA)の濃度およびsiRNAの導入時間を検討した。その結果、Cox-2遺伝子を特異的に抑制することに成功した。したがって、本試験により家畜の生殖器官の細胞において、RNAiを用いた遺伝子発現制御が可能であることが示された。今回の試験結果は、日本畜産学会で既に発表し、国際学会誌への投稿を予定している。胚で産生されるインターフェロンτ(IFN-τ)は、反芻家畜の妊娠認識因子として広く知られているが、最近培養子宮上皮細胞へのアポトーシスを引き起こすことも報告されている。子宮から採取した子宮内膜上皮細胞に、P(10ng/ml)、IFN-τ(100ng/ml)、およびIFN-α(500ng/ml)をそれぞれ48時間添加する区、またPとIFN-τまたはIFN-αを混合添加する区を設け、無添加区を対照区とした。また、IFN-τやαによって引き起こされたアポトーシスはPを添加することによって軽減された。

また、上記の細胞培養系で得られた実験結果を生体を用いて検証するために、ウシと同じ反芻家畜であるヤギを実験モデルとして試験を行った。交配日または発情日を0日目とし、14日目に屠畜後子宮および胚を採取した。実験区は交配を行わず通常発情周期のグループ、交配後14日目に屠畜するグループ、そして交配後10日目にプロジェステロンの影響を除外するために、卵巣を除去し14日目に屠畜するグループに分類した。回収した胚を顕微鏡下で観察してみると、通常の妊娠グループと卵巣除去グループとの間に大きな差は見られず、この時期の胚の成長にはプロジェステロンの影響は少ないのかもしれない。胚で産生されるインターフェロンτ(IFN-τ)は、反芻家畜の妊娠認識因子として広く知られているが、培養子宮上皮細胞へのアポトーシスを引き起こすことも報告されている。また、IFN-τと同様にI型IFNに分類されるIFN-αが組織や細胞のアポトーシスを誘導していることも報告されている。ウシ子宮内膜上皮細胞を用いてI型IFNによるアポトーシス誘導並びにプロジェステロン(P)による抑制作用について評価した。子宮内膜上皮細胞に、P、IFN-τ、およびIFN-αをそれぞれ48時間添加する区、またPとIFN-τまたはIFN-αを混合添加する区を設け、無添加区を対照区とした。実験終了後、コメットアッセイによりDNA損傷を解析した。IFN-τおよびαによって子宮内膜上皮細胞のアポトーシスが誘導された。一方、P添加による影響は見られなかった。また、IFN-τやαによって引き起こされたアポトーシスはPの添加によって軽減された。さらに、I型IFNによってアポトーシス関連遺伝子の発現量にも変化があった。すなわち、I型IFNによってアポトーシス促進因子の発現が増加し、反対に抑制因子の発現が減少することが明らかとなった。以上の結果から、ウシ子宮内膜上皮細胞でのアポトーシス誘導はI型IFNに共通した現象であり、Pにより抑制されることが示唆された。また、上記の細胞培養系で得られた実験結果を生体で検証するために、ウシと同じ反芻家畜であるヤギをモデルとして試験を行った。