hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
S.mutansの新奇なグルカン結合蛋白質発現調節機構の解明

筆者はStreptococcus mutansのグルカン依存性凝集に関与するグルカン結合タンパク質をコードするgbpC遺伝子を同定していた.このグルカン依存性凝集という現象はある種のストレス条件下で培養されたときのみに認められるので,従来は,S.mutansはこの現象を示さないとされていた.筆者はグルカン依存性凝集に関与する遺伝子群を同定するため,インテグレーションベクターの一つであるpVA891をS.mutansの染色体にランダム挿入し,この現象を示さなくなった変異株をスクリーニングした.この方法でpVA891はキャンベル型の相同組換えによりホスト染色体DNAに挿入されその部位に存在する遺伝子を失活する.しかし,我々が得たほとんどの変異株ではキャンベル型の挿入失活は起こってなく,染色体DNAに再配列が認められた.しかも,それらのグルカン依存性凝集を示さなくなった変異株は完全なgbpC遺伝子を保持しており,染色体DNAに大きな重複が生じていた.そしてこの重複がこの形質の変化に関与していると考えられた.筆者はこの重複領域を解析することにより,S.mutansの任意の領域に大きな重複を導入出来ることを見いだした.そしてこの方法を用いて,60kbという大きな領域から,gbpC遺伝子を調節する690bpの一つの遺伝子gcrRを同定した.この遺伝子は2成分制御系のレスポンスレギュレータであった.筆者はまた,S.mutansをキシリトール共存下で繰り返し継代培養を続けると強いグルカン依存性凝集を起こすポビュレーションが生じるという新しい現象を見いだした.この現象はgbpC遺伝子発現が構成的になり且つ約20倍に強発現していたことにより起こっていること,レポーター遺伝子を用いて明らかにした.更に興味深いことは,このポビュレーションは蔗糖存在下の試験管壁付着能が振とう培養すると減少していたという点である.これはプラークからS.mutansを除去するキシリトールの作用の一つかもしれない.筆者はStreptococcus mutansのグルカン依存性凝集に関与するグルカン結合タンパク質をコードするgbpC遺伝子を同定していた.このグルカン依存性凝集という現象はある種のストレス条件下で培養されたときのみに認められるので,従来は,S.mutansはこの現象を示さないとされていた.筆者はグルカン依存性凝集に関与する遺伝子群を同定するため,インテグレーションベクターの一つであるpVA891をS.mutansの染色体にランダム挿入し,この現象を示さなくなった変異株をスクリーニングした.この方法でpVA891はキャンベル型の相同組換えによりホスト染色体DNAに挿入されその部位に存在する遺伝子を失活する.しかし,我々が得たほとんどの変異株ではキャンベル型の挿入失活は起こってなく,染色体DNAに再配列が認められた.しかも,それらのグルカン依存性凝集を示さなくなった変異株は完全なgbpC遺伝子を保持しており,染色体DNAに大きな重複が生じていた.そしてこの重複がこの形質の変化に関与していると考えられた.筆者はこの重複領域を解析することにより,S.mutansの任意の領域に大きな重複を導入出来ることを見いだした.そしてこの方法を用いて,60kbという大きな領域から,gbpC遺伝子を調節する690bpの一つの遺伝子gcrRを同定した.この遺伝子は2成分制御系のレスポンスレギュレータであった.筆者はまた,S.mutansをキシリトール共存下で繰り返し継代培養を続けると強いグルカン依存性凝集を起こすポビュレーションが生じるという新しい現象を見いだした.この現象はgbpC遺伝子発現が構成的になり且つ約20倍に強発現していたことにより起こっていること,レポーター遺伝子を用いて明らかにした.更に興味深いことは,このポビュレーションは蔗糖存在下の試験管壁付着能が振とう培養すると減少していたという点である.これはプラークからS.mutansを除去するキシリトールの作用の一つかもしれない.S.mutans(109cS株)は,亜致死濃度の抗生物質などの他、ストレス応答あるいは熱ショック応答を誘導するような色々な条件でグルカン依存性凝集を起こす.また、蔗糖PTS(ホスホトランスフェラーゼ系)遺伝子群の近傍に存在する大腸菌のアンチタ-ミネータコンプレックスを形成するNusB蛋白質の遺伝子ホモローグを失活してもこの菌はグルカン依存性凝集を起こす.その機構を明らかにするための本年度の研究計画は,1)gbpC遺伝子発現のモニターと2)gbpC遺伝子領域はインタクトであるにもかかわらずグルカン依存性凝集能を失った変異株の変異遺伝子領域を解析することであった.1)についてはRT-PCRによりgbpC遺伝子のmRNAを検出することができ,上記培養条件やnusB失活により,あきらかにgbpC遺伝子発現が上昇していたのが確認できた.従って,上記培養条件の刺激がある経路(細胞内の情報伝達経路)を通り,このGbpC蛋白質の発現へ至ると考えられ,NusBホモローグがその経路のどこかで関与し,GbpC蛋白質発現をdown regulateしていると考えられた.2)についてはパルスフィールドゲル電気泳動を用いた変異株の変異遺伝子領域を解析した結果,それらの株の染色体上で共通して,50kb以上のかなり大きい領域の重複がおこっていたことが見いだされた.一般の6塩基認識の制限酵素による分解後のゲル電気泳動とサザン分析では,この重複領域があまりに大きかったため全く同じ泳動パターンになってしまい,その検出は不可能であった.それらの変異株において重複のおこっていた両端の部位をマッピングすることにより,重複の起こった共通領域を20kb以下にまで限定することができた.

この領域はnusB部位から60kb程離れた領域であり,ここにもう一つGbpC蛋白質発現を調節している遺伝子の存在が推定された.S.mutans(109cS株)は,亜致死濃度の抗生物質などの他,ストレス応答あるいは熱ショック応答を誘導するような色々な条件でgbpC遺伝子を発現してグルカン依存性凝集を起こす.昨年度までの研究により,gbpC遺伝子がインタクトであり且つグルカン依存性凝集をおこさない遺伝子重複変異株を得ていること,複数のそれら変異株においてその重複領域に共通した領域のあることが分かり,その共通領域にgbpC遺伝子の発現調節を担っている遺伝子が存在することが推定されたこと,等からその共通領域を20kb以下にまで限定した.そこで今年度の目標はその領域を更に狭め関与遺伝子を同定することであった.この過程で,パルスフィールド電気泳動法を用いた染色体DNAの詳細な解析の結果,重複の起こる状況をうまく説明できるある一つの機構を提案することが出来るに至った(JapaneseJournal of Oral Biology 40:506-514,1998に報告).その結果,前述の共通領域に存在すると推定されたある未知遺伝子の重複によるその機能亢進により,gbpC遺伝子発現が抑制されるという推定が,より確度の高いものであると考えられた.そして前述の約20kbのほぼ中央にgbpC遺伝子の発現調節を担っている一つのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定することが出来た.このORFのコードするアミノ酸配列の相同性検索より,これは,細菌で普遍的に認められる二成分制御系のレスポンスレギュレータホモローグであることがわかった.しかし,二成分制御系のもう一つの構成要素であるセンサータンパク質,をコードすると思われる領域はこのORFの周辺には存在しなかった.今後はこのセンサータンパク質の同定とこのレスポンスレギュレータホモローグのgbpC遺伝子に対する発現制御様式を明らかにする.S.mutansは色々なストレス条件でgbpC遺伝子を発現してグルカン依存性凝集を起こす.昨年度までの研究から,gbpC遺伝子の発現調節を担っている一つの遺伝子gcrRを同定することが出来た.更にこのgcrR遺伝子産物が実際にgbpC遺伝子発現を調節しているか否かをin vitroおよびin vivoで観察するため,大腸菌におけるgbpCのレポーター遺伝子の構築及びS.mutansでのモニター株構築を試みた.複数のレポーター遺伝子を用いこれを行ったが,用いた遺伝子によってはgbpC遺伝子の発現を正しくモニターすることができないことが分かり,本菌においては現在の所lacZ遺伝子のみがこの目的に使用できるレポーター遺伝子であると考えるに至った.そしてこのモニター株での観察から,gcrR遺伝子欠失変異株は構成的にgbpC遺伝子を発現すること,S.mutansはキシリトール存在下で長く継代培養していると,gbpC遺伝子が構成的に強発現している株が現れること等が見いだされた.
RNAの相同性からみたヒトおよび動物ロタウイルス遺伝子の多様性の解明

ロタウイルスの自然界での生態を解明することは、ロタウイルスワクチン開発の上で必須のことであると考えられる。本研究の目的は、ヒトおよび動物に由来するロタウイルスの遺伝子の多様性をgenogroup(遺伝子の相同性に基づく分類)の立場から見て明らかにすることと、この多様性の形成に、ロタウイルスの種間伝播(interspecies transmission)すなわちロタウイルスが種の異なる宿主に感染することが関与しているのか、またそのような種間伝播はどのような程度で起こっているのかということを解明することである。(1)過去の8年間の疫学的研究の際に集めた511検体のロタウイルス陽性検体の64%にあたる328検体について遺伝子RNAのelectropherotypeをしらべ、22のelectropherotypeを決定した。これらのウイルス遺伝子RNAを、RNAーRNAハイブリディゼ-ション法により調べたところ、ヒトロタウイルスWa株、KUN株およびAUー1株をプロトタイプとする3つのgenogroupに分類されることを明らかにした。また、まれではあるが、このようなgenogroupの間でreassortmentをおこしたと考えられる株の存在も明らかにした。(2)7つの種の異なる宿主に由来する14株のロタウイルスの遺伝子RNAを、RNAーRNAハイブリディゼ-ション法により調べたところヒトロタウイルスとは異なるgenogroupが存在することを明らかにした。しかし興味深いことに、ヒトおよびネコに由来する一部のロタウイルス株が例外的に同一のgenogroupに属していることが明らかになり、ヒトロタウイルスと動物ロタウイルスとの間で伝播が起こっていることを強く示唆する証拠が得られた。本研究により、ヒトロタウイルスと動物ロタウイルスとの遺伝子レベルでのかかわりが明らかになった。ロタウイルスの自然界での生態を解明することは,ロタウイルスワクチン開発上必須であると考えられる。本研究の目的は,ヒトおよび動物に由来するロタウイルスの遺伝子の多様性と,この多様性の形成にロタウイルスの種間伝播(ロタウイルスが種の異なる宿主に感染すること)が関与しているのかどうかということを解明することである。このために,ロタウイルスの遺伝子をRNAーRNAハイブリディゼ-ションでしらべることにより相対的な遺伝子の相同性に基づく“ゲノグル-プ"という概念を導入することが必要であることを提唱してきた。ロタウイルスの遺伝子の多様性の解明のために,われわれが過去10年間に自分たちで分離した株あるいは他の研究者が分離した株を分与されたものなど,現在広く承認されている全ての血清型(serotype)を含む76株を解析の対象にした。このうち平成2年度の研究では,ヒトロタウイルスが,それぞれWa株(血清型1,亜型II,long RNAパタ-ン),KUN株(血清型2,亜型I,short RNAパタ-ン)およびAnー1株(血清型3,亜型I,long RNAパタ-ン)をプロトタイプとする3つのゲノグル-プからなることを明らかにした。このことはわれわれの仮説通り,ロタウイルスの遺伝子構成はランダムに入り乱れず,11分節の遺伝子がともに進化している(coーevolve)していることを示唆している。一方,ロタウイルス野外株の中には明らかにこのようなゲノグル-プ間でおこった遺伝的組換え現象(genetic reassortment)によっておこったと考えられるものが存在することを明らかにした。さらに興味あることにヒトおよびネコに由来する一部のロタウイルス株が例外的に同一のゲノグル-プに属していることが明らかになり,種間伝播が進化の途上であったと推定される分子レベルでの証拠が得られた。

本研究の目的は、ヒトおよび動物に由来するロタウイルスの遺伝子の多様性をgenogroup(遺伝子の相同性に基づく分類)の立場から見て明らかにすることと、この多様性の形成に、ロタウイルスの種間伝播(interspecies transmission)すなわちロタウイルスが種の異なる宿主に感染することが関与しているのか、またそのような種間伝播はどのような程度で起こっているのかということを解明することである。このような目的を達成するため、平成3年度では、特に、ヒトロタウイルスと動物ロタウイルスの遺伝子レベルでの相対的相同性について検索した。すなわち、7つの種の異なる宿主に由来する14株のロタウイルスの遺伝子RNAをRNAーRNAハイブリディゼ-ション法を用いて調べたところ、同一の動物種に由来するロタウイルスの遺伝子レベルでの相対的相同性は、異なる動物種に由来するロタウイルスどうしの遺伝子レベルでの相対的相同性よりも明らかに高いことがわかった。このことは、一般的にいって、動物ロタウイルスがヒトロタウイルスとは異なるgenogroupに属していることを意味している。しかし興味深いことに、ヒトおよびネコに由来する一部のロタウイルス株が例外的に同一のgenogroupに属していることが明らかになり、ヒトロタウイルスと動物ロタウイルスとの間で伝播が起こっていることを強く示唆する証拠が得られた。
ルミネッセンス計測に基づく流砂系土砂移動と歴史津波の推定手法の構築

世界的に激化する海岸侵食を解決するためには、山地から河川・沿岸域を含む広域流砂系の土砂の移動量を高い精度で捉えることが不可欠である。本研究では、流砂・漂砂の分析に世界で初めてルミネッセンス計測を導入し、長期にわたって広域で生じる土砂移動の追跡を可能とする技術を確立した。さらに、これを粒子露光モデルなどと組み合わせることにより、流砂系の土砂フラックス推定精度を飛躍的に向上させた。これらをもとに沿岸砂質堆積物の堆積年代と起源を科学的に推定し、歴史津波の同定に応用する科学的な手法を開発し、その妥当性を現地調査により確認した。世界的に激化する海岸侵食を解決するためには、山地から河川・沿岸域を含む広域流砂系の土砂動態を正しく把握し、抜本的な対策を検討することが重要であるが、土砂の流れを高い精度で捉えることは困難である。本研究では、流砂・漂砂の分析に世界で初めてルミネッセンス計測を導入し、長期にわたって広域で生じる土砂移動を追跡可能とする。これを粒子露光モデルなどと組み合わせることにより、流砂系の土砂フラックス推定精度を飛躍的に向上させる。これらをもとに沿岸砂質堆積物の堆積年代と起源を科学的に推定し、歴史津波の同定に応用する。昨年度までの地中探査レーダーや堆積構造分析などの予察的な研究成果に基づき、本年度は津波堆積物の判別が困難な砂丘海岸として,鳥取県米子市から境港市にかけての弓浜半島海岸を対象とし,ルミネッセンス分析の有効性を検討した.同海岸においては,17世紀始めから1923年頃までのおよそ300年間,中国山地の各所で盛んに行われた「鉄穴(かんな)流し」により日野川からの土砂供給が人為的に増加したが,その後鉄穴流しの衰退により供給土砂が減少し,河口両岸の日吉津海岸および皆生海岸では海岸侵食が深刻な問題となっている.このような海岸地形の長期変動も考慮したうえで,歴史津波の影響を分析した。江戸時代後期の古地図分析や熱ルミネッセンス測定の結果をもとに,弓浜半島海岸における200年程度の時間スケールの土砂移動形態と,日野川の流路変動などに伴う大規模な海岸変形を推定することができた.また、米子空港東の地中コア試料の砂質堆積物を熱ルミネッセンスを用いて分析し,1833年の庄内沖地震による津波と整合的な年代が得られた.これにより、津波堆積物の判別が困難な砂丘地の海岸などにおいても、ルミネッセンス測定によって,津波堆積砂層の判別と歴史津波の年代推定が可能であることが示された.平成24年度は、流砂系表層堆積物の採取と一部の試料に対するルミネッセンス計測を実施した。さらに、砂粒子露光モデルを構築し、露光率の評価を介して海岸線遡上帯の浜漂砂におけるルミネッセンス計測結果の定量的な活用手法を構築した。海岸侵食が深刻化している宮城県仙台平野荒浜地区とリアス式海岸のポケットビーチである岩手県吉里吉里地区において、地中探査レーダーによる調査を実施し、堆積構造を把握した。どちらの地点も2011年東北地方太平洋沖地震津波の浸水区域であり、流砂系堆積物に加えて、津波堆積物も採取できるものと期待された。長さ約2mのハンディジオスライサを鉛直に貫入させることにより、数年から数千年の時間スケールの土砂移動過程を反映する堆積物コアを採取することができた。コア試料は軟X線撮影装置などで堆積構造を分析した後、鉛直方向に細かくスライスしたうえでレーザ粒度計で粒径分布を計測した。さらに、C14年代分析により、どちらも3,000年程度の堆積物であることを確認した。さらに、スライスした各層から暗室にて薬品処理・重液分離などにより石英・長石粒子を抽出し、ルミネッセンス計測用の試料を調製した。試料の一部を既有のルミネッセンス分析器により計測し、これらをC14年代分析結果と比較することにより、歴史津波の年代同定におけるルミネッセンス分析の有用性を検討した。沿岸における砂粒子露光モデルに関しては、沿岸漂砂の移動過程のモデル化に整合した露光モデルを構築した。同モデルを適用すれば、従来定性的な議論のみであったルミネッセンス計測結果の解釈において、土砂移動量の定量的な評価を行うことが可能となる。モデルの内容と妥当性に関して、国際学術雑誌に投稿中である。平成24年度には、仙台平野や吉里吉里における津波堆積物に含まれる長石粒子に対してOSL分析を実施し,津波堆積砂の堆積年代を推定できることを示した.また、平成25年度には、津波堆積砂の判別が困難な砂丘海岸として,鳥取県米子市から境港市にかけての弓浜半島海岸を対象とし,ルミネッセンス分析の有効性を検討した。平成26年度には、米子における試料の追加分析を行うとともに、1833年の庄内沖地震に対して提案されている波源を用いて、津波計算を実施した。球面座標系における広領域の伝播計算(計算格子は30秒)を,高解像度の計算領域(計算格子20m)に接続した.接続部の水深は70m程度である.津波波源には,相田(1989)による1833年庄内沖地震を想定した断層モデル(A1, A2, Bの3種類)を用いた.また,狭領域の地形は伊能図(1807年測量)の地形を復元して用いた.

コア採取地点の当時の標高は現在より約1m低かったと推定されることから,海岸線付近の標高を1m低下させ,さらに伊能図における海岸線位置までを勾配約1/150の一様勾配斜面として、地形を復元して計算に用いた.地中コア試料は現在の海岸線から約420m離れたところで採取したものであるが,津波発生当時の復元地形においては、同地点まで津波は遡上しなかった.コア採取点付近の海浜地形と津波による最大シールズ数の分布を計算したところ、波源モデルA2においては,汀線付近を中心にシールズ数が0.5以上となる領域があり,この領域では大量の土砂が移動していることが明らかとなった.コア採取点付近には海岸に向けて20m格子の地形では表現しきれない規模の小河川が存在するなど復元地形の不確実性も考慮すると,1833年の庄内沖地震による津波が弓浜半島海岸の汀線付近に遡上し,局所的に氾濫した可能性があるものと推量された.世界的に激化する海岸侵食を解決するためには、土砂の生産源である山地から、河川・沿岸域を含む広い流砂系の土砂動態を正しく把握し、抜本的な対策を検討することが重要であるが、土砂の流れを高い精度で捉えることは困難である。本研究では、流砂・漂砂の分析にルミネッセンス計測を導入し、長期にわたって広域で生ずる土砂移動を追跡可能とする。これを粒子露光の数値モデルなどと組み合わせることにより、流砂系の土砂フラックスの推定精度を飛躍的に向上させる。平成27年度は、宮崎大学との合同調査を実施し、宮崎県一ツ瀬川河口周辺の試料採取・分析を実施した。同試料は、河口に設置された導流堤の上手側と下手側のそれぞれで採取したものであり、近年の土砂堆積・海岸侵食過程を分析できることが期待される。試料のルミネッセンス分析は一部を残して現在までにほぼ終了しており、河川からの土砂供給や導流堤建設の影響を定量的に議論できる知見が得られている。その成果の一部は、土木学会論文集に投稿中である。宮崎大学では、同一試料に対して鉱物特性の分析を実施しており、流砂系の起源を示唆する興味深い結果が得られつつある。研究の最終年度である今年度は、さらに情報交換を緊密にして、有機的な連携のもとで、それぞれの研究を相乗的に推進させることを目指す。これまでに、仙台平野と吉里吉里における津波堆積物のルミネッセンス分析(H24)、米子海岸における海浜砂のルミネッセンス分析(H25-26)、一ツ瀬川河口周辺のルミネッセンス分析(H27-28)などを実施し、本研究の目的である、ルミネッセンス計測手法の確立、砂粒子露光モデルに基づく土砂フラックス推定技術の開発および歴史津波の同定への活用については、最終年度を前にした現時点ですでに、当初目的をほぼ達成する成果が得られている。以上より、本研究課題の進捗状況については、「おおむね順調に進展している」と評価するのが妥当である。海岸侵食が進む宮崎海岸の北部に位置する一ツ瀬川河口域において,土砂動態を解明した.過去の地形図及び航空写真による汀線の抽出を行い,近年の深浅測量結果から導流堤周辺の地形変動を分析した.次に河口両岸の表層土砂試料および河口部鉛直コア試料に対して,粒度分布や長石粒子のルミネッセンス強度を計測し,それらと土砂動態の関連を議論した.航空写真分析では、導流堤建設前には河口位置が南北に大きく変動していたことや、建設後には、左岸側で顕著な堆積が見られることが確認された。すなわち,沿岸漂砂の上手側にあたる導流堤左岸近傍には,捕捉された沿岸漂砂とともに一ツ瀬川から供給された細砂が地中深くまで均質に堆積しているのに対し,侵食が進む右岸側では河川供給土砂の堆積は少なく,約千年程度前の堆積土砂を含めて過去の海浜地形が侵食されつつあり,細砂層と粗砂層の互層が形成されていることが明らかとなった.
超免疫不全マウスを用いた膠芽腫に対する免疫細胞およびPD-1阻害薬併用療法の開発

膠芽腫は現在の標準治療である手術、放射線療法、化学療法をもってしても予後不良の腫瘍である。一方で膠芽腫に対する免疫療法として細胞傷害性細胞、とりわけγδT細胞やNK細胞と呼ばれるMHC(major histocompatibility complex)非拘束性キラー細胞を用いた治療法が現在注目されており、我々のグループもその治療効果を報告してきた。ただ、γδT細胞やNK細胞をもってしても、がん細胞自体が免疫抑制系を利用してがんに対する免疫監視機構から逃避すると、その効果は減弱される。そこで我々は、近年注目されているチェックポイント阻害剤である抗PD-1抗体とγδT細胞・NK細胞を併用することにより、治療効果の相乗効果を検討する。平成28年度の実験で得られたNK細胞のPD-1発現および膠芽腫細胞株のPD-L1発現結果を踏まえて、平成29年度ではin vitroにおいて、膠芽腫細胞株に対するNK細胞と抗PD-1抗体の抗腫瘍効果の相乗効果についてapoptosisを踏まえて検討をおこなった。また、NK細胞と同様の実験系を用いてγδT細胞のPD-1発現、抗PD-1抗体併用における抗腫瘍効果を検討した。結果、NK細胞投与群およびγδT細胞投与群いずれにおいても、U87MG細胞株およびT98G細胞株に対する抗PD-1抗体によるアポトーシス誘導効果は認めなかった。平成30年では、膠芽腫細胞株であるU87MGを用いたNOGマウスへの皮下腫瘍モデルで、NK細胞と抗PD-1抗体を併用することによる抗腫瘍効果を検討した。結果、コントロール群とNK細胞移植群およびNK細胞/抗PD-1抗体併用群との間に、overall survivalに有意差がみられたが、NK細胞移植群とNK細胞/抗PD-1抗体併用群との間には有意差がみられなかった。膠芽腫は現在の標準治療である手術、放射線療法、化学療法をもってしても予後不良の腫瘍であり、新たな治療法が切望されている。一方で膠芽腫に対する免疫療法として細胞傷害性細胞(キラー細胞)、とりわけγδT細胞やNK細胞と呼ばれるMHC(major histocompatibility complex)非拘束性キラー細胞を用いた治療法が現在注目されている。そこで我々は、近年注目されているチェックポイント阻害剤である抗PD-1抗体とγδT細胞・NK細胞を併用することにより、治療効果の相乗効果を検討することとした。これまでに平成28年度において、ヒト膠芽腫由来細胞株であるU87MGならびにT98Gの細胞株を10%FBS含有DMEM培地にて37°C、5%CO2、湿度100%の環境で培養を行った。また健常人末梢血よりLymphoprepを用いた比重遠心分離法によって単核細胞を分離する。MACSを用いて特定の細胞集団を除去し、高濃度IL-2を含む含有AIM-V培地にて培養を開始する。以降、細胞の増幅培養に際してはIL-2含有AIM-V培地にて増幅培養を行う。培養開始ならびに培養1日目、3日目、5日目、7日目、14日目、28日におけるNK細胞におけるPD-1の発現を、フローサイトメータを用いて解析した。U87MGならびにT98GについてはPD-1のリガンドであるPD-L1の発現を同様に解析を行った。昨年度は、条件設定に時間を要し、γδT細胞系の実験ができておらず、追加で実験予定である。一方で膠芽腫に対する免疫療法として細胞傷害性細胞(キラー細胞)、とりわけγδT細胞やNK細胞と呼ばれるMHC(major histocompatibility complex)非拘束性キラー細胞を用いた治療法が現在注目されており、我々のグループもその治療効果を報告してきた(J Neuro-oncol. 2014Jan;116(1):31-9)。平成28年度の実験で得られたNK細胞のPD-1発現および膠芽腫細胞株のPD-L1発現結果を踏まえて、平成29年度ではNK細胞と膠芽腫細胞株との共培養下でのPD-1の発現について検討を行った。またin vitroのおいて、膠芽腫細胞株に対するNK細胞と抗PD-1抗体の抗腫瘍効果の相乗効果についてapoptosisを踏まえて検討をおこなった。それぞれの膠芽腫細胞株では、PD-L1の発現は確認できるものの、我々が独自の培養方法で培養を行っているNK細胞のPD-1発現が予想よりも低いことが分かった。そのため、条件の調整等に時間を要したため実験計画より多少の遅延が生じしている。

ただ、γδT細胞やNK細胞をもってしても、がん細胞自体が免疫抑制系を利用してがんに対する免疫監視機構から逃避すると、その効果は減弱される。そこで我々は、近年注目されているチェックポイント阻害剤である抗PD-1抗体とγδT細胞・NK細胞を併用することにより、治療効果の相乗効果を検討する。平成28年度の実験で得られたNK細胞のPD-1発現および膠芽腫細胞株のPD-L1発現結果を踏まえて、平成29年度ではin vitroにおいて、膠芽腫細胞株に対するNK細胞と抗PD-1抗体の抗腫瘍効果の相乗効果についてapoptosisを踏まえて検討をおこなった。また、NK細胞と同様の実験系を用いてγδT細胞のPD-1発現、抗PD-1抗体併用における抗腫瘍効果を検討した。結果、NK細胞投与群およびγδT細胞投与群いずれにおいても、U87MG細胞株およびT98G細胞株に対する抗PD-1抗体によるアポトーシス誘導効果は認めなかった。平成30年では、膠芽腫細胞株であるU87MGを用いたNOGマウスへの皮下腫瘍モデルで、NK細胞と抗PD-1抗体を併用することによる抗腫瘍効果を検討した。結果、コントロール群とNK細胞移植群およびNK細胞/抗PD-1抗体併用群との間に、overall survivalに有意差がみられたが、NK細胞移植群とNK細胞/抗PD-1抗体併用群との間には有意差がみられなかった。今後、γδT細胞を用いたPD-1発現の検討を行い、in vitroでの膠芽腫細胞株に対する抗PD-1抗体による腫瘍殺傷効果の検討を行う。さらに、上記に実験結果を踏まえて、NOGマウスを用いたin vivo系の実験をすすめる予定である。今後は、NK細胞およびγδT細胞と抗PD-1抗体をin vivoで投与することよる抗腫瘍効果の検討を行う。U87MGもしくはLN-18を最適量NOGマウスの皮下に移植後、以下の4群に分けて尾静脈もしくは腹腔より投与する。Group 1対照群:PBS投与、Group 2 Nivolumab(抗PD-1抗体)投与群: 2mg/kgGroup 3 NK細胞投与群: 1 X 107細胞、Group 4 Nivolumab、NK細胞投与群:1 X 107細胞膠芽腫由来細胞株を移植後14日目にNivolumabを投与する。Nivolumabはその後1週間間隔で計4回投与する。NK細胞は14日目に投与し、その後NK細胞は1週間間隔で計4回投与する。必要に応じてIL-2を全群に対して追加投与することも考慮する。平成28年度の研究状況から残金があった。実験器具の購入に端数が生じたため、次年度繰り越すこととしたため。今年度での実験に必要である試薬、器具などを購入に充てる予定である。
スズメダイの藻類栽培における多様性と地理的変異、それらの多種共存に果たす役割

魚類における藻食への適応とその多様化、それが多種共存に果たす役割を明らかにすることを目的とした。各地でなわばり性藻食スズメダイ計5種について調査した結果、スズメダイの藻園管理は種ごとに集約的から粗放的まで勾配があり、狭い藻園ほど侵入者の追い払いを徹底的に行い、藻園が広くなるほど侵入者の追い払いにコストをかけないことがわかった。タンガニイカ湖の藻食シクリッド科魚類では、適応放散の過程で、まず摂食様式を多様化させ、さらに生息場所を特殊化させて異なる餌ニッチへの分化を成し遂げ、多種共存が可能となっていることが分かった。太平洋の沿岸域に広く生息するなわばり性藻食魚類をモデルとし、その藻類利用・管理様式の多様化が多種共存を可能としているという仮説の検証を目的とする。鹿児島県奄美大島と高知県横浪半島、インドネシアスラウェシ島でなわばり性スズメダイそれぞれ4種と1種、2種について水中ビデオカメラを用い行動記録を行い、またなわばり内に繁茂する藻類群落の採集を行った。その結果、スズメダイの藻園管理は種ごとに集約的から粗放的まで勾配があることが分かった。クロソラスズメダイが最も集約的で、最も狭い藻園を、除藻し、全ての侵入者を排除することで維持しており、一方セダカスズメダイが最も粗放的で、広いなわばりを、侵入者をほとんど追い払うことなく維持しており、ルリホシスズメダイとキオビスズメダイ、フチドリスズメダイは中間的であった。藻園の面積と、藻園への侵入者の追い払いの頻度は負の相関関係にあることが分かり、すなわち、狭い藻園ほど侵入者の追い払いを徹底的に行い、一方藻園が広くなるほど侵入者の追い払いにコストをかけないことがわかった。多量の映像データが得られているため、これらを解析することで、スズメダイの藻園管理行動における地理的変異と、他種との藻園管理におけるニッチ分割を明らかにすることができると考えている。また、オーストラリアのARC Centre of Excellence for Integrated Coral Reef StudiesのDaniela M. Ceccarelli博士と共著でスズメダイの藻園管理についての総説原稿を作成した。アフリカタンガニイカ湖に生息する藻食魚をモデルとし、その藻類食への適応と、多様化が多種共存を可能としているという仮説の検証を目的とする。アフリカ大地溝帯の古代湖群では、シクリッド科魚類の顕著な適応放散がみられる。藻類食魚もTropheini族をはじめ4つの族で独立に進化し、著しい多様化が見られる。これらシクリッドはサンゴ礁のスズメダイ科とは姉妹群にあたり、かつ独立に藻類食を進化させており、これらの系を比較することで藻類食の進化について一般化して論じることが可能となる。タンガニイカ湖で、2010年に行った藻食シクリッド類の野外観察と、採集した胃内容となわばり内の藻類のサンプルを用い、次世代シーケンサーを用いたメタゲノミクス解析を行ったところ、これら藻食シクリッドでは、摘み取り食からすき取り食が進化して両者が多様化し、摘み取り食者種間では利用する底質と水深を違え、すき取り食者種間では水深を違えていることが分かった。異なる水深帯のなわばり内に成立する藻類群落は異なり、さらにシクリッドが藻類を選択的に利用することで、種ごとに異なった藻類を主な餌としていた。同様のサンプルについて炭素、窒素安定同位体比解析を行ったところ、なわばり内の藻類群落の炭素安定同位体比の値は水深が深くなるほど低くなることが分かり、魚体の値はなわばり内の藻類群落の値と強い相関があり、種間で異なる水深帯の光合成産物を主に利用していることが分かった。このように、藻食シクリッドは、適応放散の過程でまず摂食様式を多様化させ、さらに生息場所を特殊化させて異なる餌ニッチへの分化を成し遂げ、一つの岩礁上での多種共存が可能となっていることが分かった。太平洋沿岸域に広く生息するスズメダイ科魚類と、アフリカタンガニイカ湖に生息するシクリッド科魚類を対象とし、その藻食への適応には様々な特殊化、多様化がみられる、それが生態的に類似した近縁種の多種共存を可能にしている、という仮説の検証を目的とした。奄美大島と高知県横浪半島、インドネシアスラウェシ島でなわばり性スズメダイ計5種について水中ビデオカメラを用い行動記録を行い、またなわばり内の藻類群落の採集を行った。その結果、スズメダイの藻園管理は種ごとに集約的から粗放的まで勾配があり、藻園の面積と、藻園への侵入者の追い払いの頻度は負の相関関係にあり、狭い藻園ほど侵入者の追い払いを徹底的に行い、一方藻園が広くなるほど侵入者の追い払いにコストをかけないことがわかった。タンガニイカ湖のシクリッドについて、採集した胃内容物となわばり内の藻類のサンプルを用い、アンプリコンメタゲノミクス解析を行ったところ、これら藻食シクリッドでは、摘み取り食から梳き取り食が進化して、摘み取り食者種間では利用する底質と水深を違え、梳き取り食者種間では水深を違えていた。安定同位体比解析の結果、なわばり内の藻類群落の炭素安定同位体比の値は水深と相関し、魚体はなわばり内の藻類群落の値と強い相関があり、種間で異なる水深帯の光合成産物を利用していた。

さらに、これら藻食シクリッドの魚体輪郭と歯顎について幾何学的形態計測を用いて種間比較を行った結果、口の付く位置、口が開く方向、および消化管の長さが多様化していた。このように、藻食シクリッドは、適応放散の過程で、まず摂食様式を多様化させ、さらに生息場所を特殊化させて異なる餌ニッチへの分化を成し遂げ、多種共存が可能となっていることが分かった。魚類における藻食への適応とその多様化、それが多種共存に果たす役割を明らかにすることを目的とした。各地でなわばり性藻食スズメダイ計5種について調査した結果、スズメダイの藻園管理は種ごとに集約的から粗放的まで勾配があり、狭い藻園ほど侵入者の追い払いを徹底的に行い、藻園が広くなるほど侵入者の追い払いにコストをかけないことがわかった。タンガニイカ湖の藻食シクリッド科魚類では、適応放散の過程で、まず摂食様式を多様化させ、さらに生息場所を特殊化させて異なる餌ニッチへの分化を成し遂げ、多種共存が可能となっていることが分かった。本研究は、なわばり性藻食魚をモデルとし、その藻食性への様々な適応が、藻食魚の多種共存を可能にしているという仮説の検証を目的としている。今年度はアフリカ東部、大地溝帯に位置するタンガニイカ湖の藻食性シクリッド科魚類について、自身が2010年にザンビア国ムプルング周辺、カセンガポイントで16種のシクリッドを対象に行った現地調査と採集で得たデータとサンプルを用いて、次世代シーケンサーを用いたメタゲノミクス解析と、炭素、窒素安定同位体比解析を行った。それにより、藻食シクリッドでは同一の生態型を持つ複数種はそれぞれ数mの範囲の生息水深帯に特殊化しており、それぞれの生息水深の生産物を利用して分化し、共存していることが明らかになった。これらの結果をそれぞれの論文にまとめ、一報は学術誌に発表、もう一報も学術誌に受理されることができた。生態学タンガニイカ湖のシクリッド科魚類と、太平洋のスズメダイ類について、引き続き藻類食への様々な適応と、それが可能とする多種共存のメカニズムについての研究を続ける。太平洋のスズメダイ類については、藻園管理行動の記録、解析を行い、またなわばり内のサンゴや藻類の組成を調べ、藻園の利用・管理行動の種間の多様性と、種内における地理的変異について明らかにしていく。タンガニイカ湖のシクリッド類については、生息水深の分化についてさらにデータ解析を進めるとともに、シクリッド類の頭部形態や顎骨格形態、消化管長など、機能形態について幾何学的形態計測法などを用いて定量化して比較し、藻類食への適応と多様化の過程で、シクリッド種にどのような適応が見られ、どのように生息する水深帯を分化しているのかを明らかにする。最終的にサンゴ礁のスズメダイとタンガニイカ湖のシクリッドという二つの独立に藻類食を獲得した系の比較を行い、水域の一次生産者、藻類と、それを食べる藻食魚との関係性のネットワークにおける相違点と共通点を明らかにする。本研究は太平洋の沿岸域に広く生息するなわばり性藻食魚類をモデルとし、その藻類利用・管理様式の多様化が多種共存を可能としているという仮説の検証を目的としている。今年度は計5種の藻園管理行動について、複数地点で調査を行い、多数の動画データを得ることができた。またその解析も進み、種によって藻園利用・管理様式が多様であり、それは単位面積当たり高い労力をかけて、狭い藻園を維持する集約的管理から、単位面積当たりにかける労力は低く、広い藻園を維持する粗放的管理までと多様であることを示すことができた。想定より多くの動画サンプルを得ることができたため、今後はこの解析を進めていく。
気管支喘息の全ゲノム関連解析:基盤構築と情報公開

小児アトピー性喘息患者942名vs成人コントロール2370名の55万SNPの全ゲノム関連解析を行った。55万SNPのうち、常染色体に存在し、かつminor allele frequencyが0.01以上のSNPは453,047個であった。さらに、コントロールにおけるHardy Weinberg平衡がP<0.0001である1,170SNPを除外し、最終的な解析データとした。一次解析におけるGenomic Inflation factorは1.053であった。アレル頻度の比較では、6番染色体短腕のHLA領域で強い関連が認められた(P=7.7×10-9)。そのほかにも2番染色領域、12番染色体領域にP<1×10-7が存在した。HLA領域のSNPと小児アトピー性喘息との関連については独立した症例対照サンプルおよび家系サンプルにおいても追認されている(P<0.05)さらに健康成人76名を対象としてHuman 610Quadを使用してタイピングを行い、別の研究成果として得られているCD4陽性T細胞およびCD14陽性モノサイトの網羅的遺伝子発現データ(イルミナHuman Ref8)と遺伝子型データを統合したデータベースの構築を情報支援班の支援を受けて作成しており、今後公開予定としている。小児アトピー性喘息患者170名を対象にイルミナのHuman Hap 550Duoを用いて約55万SNPの遺伝子型決定を行った。全サンプルの平均Call rateは99.7%であり、良好なタイピング結果が得られた。サンプルの階層化について検討するためにこれらのタイピングデータから約10万SNPについて各個人の遺伝子データを抽出し、PLINK(Purcell, et.al, 2007)およびEIGENSTRAT(Price, et.al, 2006)を用いて解析した。サンプル中にはクラスターから大きく外れる個人は存在しなかったが、近親者である可能性があるサンプルが2組検出されたため、それらのサンプルのうちの1名をランダムに除外した。同じイルミナのアレイでタイピングされた他施設の小児アトピー性喘息399名と健康日本人成人で喘息のない964名のデータと統合し、X^2検定による解析を行った。また、公表されている日本人コントロール934人の遺伝子型頻度(JSNP550typed)のアレル頻度も参考とした。一次解析の結果(小児アトピー性喘息患者567名vs成人コントロール964名の55万SNPのGWAS)では55万SNPのうち、mimor allele frequencyが0.01以上のSNPは455,056個であった。アレル頻度の比較では、6番染色体短腕のHLA領域で最も強い関連が認められた(P=2.3x10^<-8>)。そのほかにも私たちか過去に小児アトピー性気管支喘息全ゲノム連鎖解析で強い連鎖を報告した5番染色体長腕領域においてもP<1x10^<-4>の関連が認められるSNPが複数認められた。そのほか20番染色体長腕領域の複数のSNPがP<1x10^<-4>の関連が認められたが、これは遺伝子が存在しない領域であった。
ドローンを使った水田生物の生息環境解析における空間ギャップの解消

本研究は、既存の国土に関する基盤情報(植生図、地形図などのGIS情報)と現地計測の間にあった環境データの空間ギャップを、ドローンによる空撮データで補完することで、より精緻に生物の分布パターンを把握する基盤技術の研究である。特に、水田環境の指標生物であり、生態的特性が異なるバッタとドジョウ、カエルをモデルケースとし、各種の生息ポテンシャルを予測・評価する数理モデル(生息適地モデル)を構築し、自然環境情報の空間スケールと解像度の違いが、生物の分布パターンの予測精度や予測の頑健性に及ぼす影響を明らかにする。今年度は、昨年度試行したSfM技術を用いた地形測量をより詳細に検証・検討するために、石川県能登半島(珠洲市)ほかの水田地帯において、ドローンによる空撮と植生把握、SfM技術を用いた地形測量を実施した。また、各調査地において水田生物(バッタとドジョウ、カエルなど)の調査を実施するとともに、水路・魚道ネットワークに関する空撮画像を取得した。さらに、水田生物の分布調査の結果(バッタ、ドジョウ、カエルの生息状況調査)と複数の空間スケールの環境基盤情報を基に、生息適地の予測モデルを試作した。この生息適地モデルには、統計モデルを用いたパターン解析の一種であり、ある環境条件下での生息可能性(ポテンシャル)を広範囲で評価・予測できる帰納的アプローチを採用した。次年度は、これらの局所スケールの生物情報・地理空間情報と、既存の国レベルの基盤地図情報を、GIS上でシームレスに統合し、試作した水田生物の生息適地モデルについて現地調査による検証を行い、ブラッシュアップを行う。昨年度(初年度)は、研究代表者の所属機関変更に伴って調査地の再選定と研究計画の練り直しの必要が生じ、当初想定していた春季の野外調査を実施することができなかった。そのため、今年度に、これらの野外調査を改めて実施することとなった。特に本研究において重要となるドローンによる空撮と植生把握、SfM技術を用いた地形測量については、今年度、複数の条件下で実施し、水田地域を対象に植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図の試作を行い、GISを用いて局所スケールの地理空間情報を整備した。今後は、平成30年度に引き続き、作成した調査対象地区の詳細な植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図ならびに、生物の分布予測モデル(生息適地予測モデル)の改良を目的として、現地調査(水田のバッタ、ドジョウ、カエルの生息状況調査)を実施する予定である。さらに、これらの調査結果をもとに、従来、別々に扱われてきた国土・景観スケールと局所スケールの地理空間情報に加え、その間にある情報の空間ギャップを補完し、空間ギャップが予測精度と頑健性に及ぼす影響を、複数の空間スケールで同時に評価を試みる。初年度は、研究代表者の所属機関変更に伴い、調査地の再選定と研究実施スケジュールの練り直しの必要が生じたため、研究の立ち上げに時間を要した。研究開始後は、本研究において重要となるドローンによる空撮と植生把握、SfM技術を用いた地形測量を予備的に実施し、水田地域を対象に植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図の試作を行い、次年度以降の技術的課題を明らかにした。また、これらの局所スケールの生物情報・地理空間情報と、既存の国レベルの基盤地図情報を、GIS上でシームレスに統合し、解析に使用するための準備を実施した。次年度は、これまでの成果を基に、各調査地において水田生物(バッタとドジョウ、カエルなど)の調査を実施するとともに、水路・魚道ネットワークに関する空撮画像を取得し、詳細な植生把握と地形測量を実施する。初年度は、研究代表者の所属機関変更に伴い、調査地の再選定と研究計画の練り直しの必要が生じた。このため、研究の立ち上げに時間を要し、当初想定していた春季の野外調査を実施することができなかった。そのため、これらの調査を改めて次年度に繰り越すこととした。それ以外の調査および分析については、特に本研究において重要となるドローンによる空撮と植生把握、SfM技術を用いた地形測量を予備的に実施し、水田地域を対象に植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図の試作を行い、次年度以降の技術的課題を明らかにした。

また、各調査地において水田生物(バッタとドジョウ、カエルなど)の調査を実施するとともに、水路・魚道ネットワークに関する空撮画像を取得した。さらに、水田生物の分布調査の結果(バッタ、ドジョウ、カエルの生息状況調査)と複数の空間スケールの環境基盤情報を基に、生息適地の予測モデルを試作した。この生息適地モデルには、統計モデルを用いたパターン解析の一種であり、ある環境条件下での生息可能性(ポテンシャル)を広範囲で評価・予測できる帰納的アプローチを採用した。次年度は、これらの局所スケールの生物情報・地理空間情報と、既存の国レベルの基盤地図情報を、GIS上でシームレスに統合し、試作した水田生物の生息適地モデルについて現地調査による検証を行い、ブラッシュアップを行う。昨年度(初年度)は、研究代表者の所属機関変更に伴って調査地の再選定と研究計画の練り直しの必要が生じ、当初想定していた春季の野外調査を実施することができなかった。そのため、今年度に、これらの野外調査を改めて実施することとなった。特に本研究において重要となるドローンによる空撮と植生把握、SfM技術を用いた地形測量については、今年度、複数の条件下で実施し、水田地域を対象に植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図の試作を行い、GISを用いて局所スケールの地理空間情報を整備した。今後は、各調査地において水田生物の調査を実施するとともに詳細な空撮画像を取得し、植生把握と地形測量を実施する。これらの局所スケールの生物情報・地理空間情報と、既存の国レベルの基盤地図情報を、GIS上でシームレスに統合し、解析に使用する予定である。具体的には、新たに現地調査(水田のバッタ、ドジョウ、カエルの生息状況調査)を実施し、それらとGIS上に整備した環境要因との関係性を統計モデル(生息適地予測モデル)によって推定し、生物の生息可能性の予測モデルの予測精度と頑健性を検証する。現地調査は、これまでに行われてきたコウノトリの餌場調査の方法に準拠し、10か所程度の水田で実施することを想定している。これにより、水田の指標生物の分布と個体数に対して、分類群ごとに相対的に重要な環境要因とその空間スケールを絞り込むことが可能になると考えている。今後は、平成30年度に引き続き、作成した調査対象地区の詳細な植生図と微地形図、水路・魚道ネットワーク図ならびに、生物の分布予測モデル(生息適地予測モデル)の改良を目的として、現地調査(水田のバッタ、ドジョウ、カエルの生息状況調査)を実施する予定である。さらに、これらの調査結果をもとに、従来、別々に扱われてきた国土・景観スケールと局所スケールの地理空間情報に加え、その間にある情報の空間ギャップを補完し、空間ギャップが予測精度と頑健性に及ぼす影響を、複数の空間スケールで同時に評価を試みる。初年度は、研究代表者の所属機関変更に伴い、調査地の再選定と研究実施スケジュールの練り直しの必要が生じた。このため、研究の立ち上げに時間を要し、当初想定していた春季の野外調査を実施することができなかった。そのため、これらの調査を改めて次年度に繰り越すこととしたため、それらの実施に見込んでいた旅費や物品費、謝金等の費用も翌年に繰り越すこととなり、次年度使用額が生じることとなった。
リーマン多様体の共形変形に於けるスカラー曲率の方程式に関する研究

正の山皿不変量を持つコンパクト・リーマン多様体から有限個の点を除いた領域上で、非正かつ除いた各点の近傍で負の値をとり、しかも一定のオーダーで0に近付くような滑らかな関数を、スカラー曲線として実現するような完備共形計量の空間が、(0,+∞]^kでパラメトライズされる(kは点の個数)と言う事実を得た。これは、より一般の非線型二階楕円型方程式の、最大解と同じオーダーを持つ解に関する一意性定理から得られる。k=1についての結果を一般化したものであるが、そのためには、ある境界の連結成分またはある端に関しては、ディリクレ条件を科した条件付最大解に関連する一意性定理を示す必要があった。それはまた、より一般的な領域上での楕円型方程式の特異境界値問題の解の一意性にも応用された。その適用にあたっては、解に関する、ある程度精密な、しかし、これまで必要とされていたよりはかなりゆるい演騨的評価を、あらかじめ与えておく必要がある。その評価を行なうと同時に、いくつかの新たな非不祐定理も得られた。以上の結果は、論文“Uniqueness of solutions of an elliptic singular boundory value problem"としてまとめ、発表する予定である。さらに、上記の結果を、通常の境界条件と、最大オーダーの仮定或いは特異境界値とが泥石している場合に一般化して、非線型方程式の解空間を上手く記述する問題が、今後の研究課題として、残された。
アレルギー性炎症における結合織型肥満細胞エクトキナーゼの役割についての研究

K252bは、IgE依存性の肥満細胞株RBL-2H3細胞とヒト末梢血好塩基球細胞からのヒスタミン遊離を、用量依存性に抑制した。この、抑制効果は、10分前の前処置で見られるばかりでなく、抗原刺激後1-3分後の後処置においても、RBL-2H3細胞とヒト好塩基球細胞において認められた。K252bは、130kDAの細胞膜外のタンパクのリン酸化を抑制し、同時に、細胞外からのカルシウム流入を抑制した。いくつかのタンパク基質の候補のうち、カゼインとカゼインキナーゼIIのペプチドが、最も強くリン酸化された。こちらのカゼインとカゼインキナーゼIIのペプチドのリン酸化は、K252bによって抑制された。肥満細胞の細胞膜に存在するK252b感受性のエクトキナーゼは、細胞外から直接アクセスできる存在形態であり、感作され炎症反応の進行しているアレルギー疾患を抑制する治療薬開発のターゲットに成りうるる。アレルギー性炎症の効果相としては、アレルゲン特異的IgEが、肥満細胞のIgEレセプターに結合そして、架橋することより開始する。まず、肥満細胞膜におけるエクトキナーゼのの普遍的意義を検討するために、細胞非透過性のセリンスレオニンキナーゼ阻害薬であるK252bのヒスタミン遊離に及ぼす影響をみた。K252bは、抗原あるいはIgEレセプターに対するモノクロナル抗体刺激によるIgE依存性の肥満細胞株RBL-2H3細胞からのヒスタミン遊離を、用量依存性に抑制した(IC_<50>=0.5,0.2μg/ml)。一方、非特異的刺激であるカルシウムイオノフォアA23187による遊離には、効果が見られなかった。ヒト末梢血好塩基球細胞に及ぼす影響も検討した所、同様にIgE刺激による遊離への抑制効果(IC_<50>=1.5μg/ml)と非特異的刺激による遊離への効果なしの結果が得られた。この、抑制効果は、10分前の前処置(pretreatment)で見られるばかりでなく、抗原刺激後1-3分後の後処置(post-treatment)においても、RBL-2H3細胞とヒト好塩基球細胞において、認められた。これらのことは、IgEレセプター後の初期伝達に、エクトキナーゼが修飾因子として、関与していることを、示唆するとともに、細胞外から直接アクセスできる存在形態であること、感作され炎症反応の進行しているアレルギー疾患を、抑制する治療薬開発のターゲットに成りうることを、示している。このように、アレルギー性炎症の要である肥満細胞における役割を、確認し得た後、初期伝達機構としてのリン酸化とカルシウム流入に及ぼす影響、並びに、エクトキナーゼの分子的実体について、実験進行中である。IgEレセプター架橋後の初期伝達機構としてのK252bのリン酸化とカルシウム流入に及ぼす影響を検討した。K252bは、130kDAの細胞膜外のタンパクのリン酸化を抑制した。同時に、細胞外からのカルシウム流入を抑制した。さらに、酵素の基質特異性を注目して、RBL-2H3細胞の膜表面に存在するエクトキナーゼ活性について検討した。いくつかのタンパク基質の候補のうち、カゼインとカゼインキナーゼIIのペプチドが、最も強く[γ-^<32>P]ATPにてリン酸化された。こちらのカゼインとカゼインキナーゼIIのペプチドのリン酸化は、細胞膜不透過性の抑制剤であるK252bによって、完全に抑制された。ウェスタンブロッティングにて、膜画分とFc_∈RI複合体に分子量44-kDaのカゼインキナーゼIIのバンドを検出した。これらの結果より、肥満細胞の細胞膜に存在するK252b感受性のカゼインキナーゼIIは、IgEレセプター架橋に伴い、カルシウムチャネルの制御を介して、細胞内外の情報を中継することが推定される。