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パルブアルブミンおよびアセチルコリンを機軸とした前脳基底核局所回路機構の解析

パルブアルブミン(PV)-Creマウスの前脳基底核にCre依存的チャネルロドプシン(ChR2)発現アデノ随伴ウィルスベクター(AAV)を注入することにより前脳基底核PV含有GABA作動性ニューロンのみにChR2を発現するマウスを作製した。ジャクソン社(米国)よりPV-Creマウスを購入し、脳定位固定装置を用いて前脳基底核にAAVを注入した。AAV注入3週間後に前脳基底核を含む冠状断急性脳スライスを作製し、ChR2に付随するenhanced yellow fluorescent protein(EYFP)の発現を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。注入時期および座標の検討を行ない、生後3週齢前後にAAVを注入することにより前脳基底核でのEYFPの発現が安定して見られた。AAVChR2が注入3週間後に、EYFP発現ニューロンおよび軸索周辺のニューロンからパッチクランプ法を用いて青色光誘発性抑制性シナプス後電流(IPSCs)が記録され、機能的なChR2が発現していることを確認した。次に、PV含有GABA性ニューロンからアセチルコリン性ニューロンへのGABA性入力を記録するために、前脳基底核におけるアセチルコリン性ニューロンのマーカーであるCy3-labeled anti-murine NGFrを脳室内に注入した。注入1日後から前脳基底核内にCy3の傾向が確認され、アセチルコリン性ニューロンの同定が可能となった。そして、同定したアセチルコリン性ニューロンから青色光誘発性抑制性IPSCsがゆうはつされ、さらに、ムスカリン受容体を介するIPSCs抑制作用が認められた。理由前脳基底核内のPV含有GABA性ニューロンーアセチルコリン性ニューロン間のシナプス伝達機構を精密に解析するためには、これら2つのタイプのニューロンを精密に同定した上でパッチクランプ解析を行なうことが不可欠である。本研究課題では、この目的を達成するために、研究代表者が確立した前脳基底核内のアセチルコリン性ニューロンの同定法をPV-Creマウスに適用して2種のニューロンに異なる蛍光を発現させることに成功した。さらに、同定されたアセチルコリン性ニューロンから青色光誘発性IPSCsを誘発し、ムスカリン受容体を介する修飾作用の解析を開始することができた。1)青色光誘発IPSCsに対するムスカリン受容体を介する修飾作用に関して、作用部位、イオン機構および生後発達変化の解析を行なう。2)ムスカリン受容体には、膜表面のみではなく、細胞内にも存在するサブタイプが報告されており、中枢シナプス伝達修飾における機能は興味深い。そこで、今回同定された、前脳基底核内のパルブアルブミン含有ニューロンからアセチルコリン性ニューロンへのシナプス伝達における細胞内ムスカリン受容体の機能解析を行なう。その際、膜透過性および不透過性のムスカリン受容体アンタゴニストが、有力な薬理学的toolとなる。パルブアルブミン(PV)-Creマウスの前脳基底核にCre依存的チャネルロドプシン(ChR2)発現アデノ随伴ウィルスベクター(AAV)を注入することにより前脳基底核PV含有GABA作動性ニューロンのみにChR2を発現するマウスの作製を試みた。AAVChR2が注入3週間後に、EYFP発現ニューロンおよび軸索周辺のニューロンからパッチクランプ法を用いて青色光誘発性抑制性シナプス後電流(IPSCs)がきろくされ、機能的なChR2が発現していることを確認した。注入1日後から前脳基底核内にCy3の傾向が確認され、3日目以降は徐々に蛍光の退色がみられた。前脳基底核内のPV含有GABA性ニューロンーアセチルコリン性ニューロン間のシナプス伝達機構を精密に解析するためには、これら2つのタイプのニューロンを精密に同定した上でパッチクランプ解析を行なうことが不可欠である。これによって、以降の電気生理学的解析が円滑に進むと期待される。

注入時期および座標の検討を行ない、生後3週齢前後にAAVを注入することにより前脳基底核でのEYFPの発現が安定して見られた。AAVChR2が注入3週間後に、EYFP発現ニューロンおよび軸索周辺のニューロンからパッチクランプ法を用いて青色光誘発性抑制性シナプス後電流(IPSCs)が記録され、機能的なChR2が発現していることを確認した。次に、PV含有GABA性ニューロンからアセチルコリン性ニューロンへのGABA性入力を記録するために、前脳基底核におけるアセチルコリン性ニューロンのマーカーであるCy3-labeled anti-murine NGFrを脳室内に注入した。注入1日後から前脳基底核内にCy3の傾向が確認され、アセチルコリン性ニューロンの同定が可能となった。そして、同定したアセチルコリン性ニューロンから青色光誘発性抑制性IPSCsがゆうはつされ、さらに、ムスカリン受容体を介するIPSCs抑制作用が認められた。理由前脳基底核内のPV含有GABA性ニューロンーアセチルコリン性ニューロン間のシナプス伝達機構を精密に解析するためには、これら2つのタイプのニューロンを精密に同定した上でパッチクランプ解析を行なうことが不可欠である。本研究課題では、この目的を達成するために、研究代表者が確立した前脳基底核内のアセチルコリン性ニューロンの同定法をPV-Creマウスに適用して2種のニューロンに異なる蛍光を発現させることに成功した。さらに、同定されたアセチルコリン性ニューロンから青色光誘発性IPSCsを誘発し、ムスカリン受容体を介する修飾作用の解析を開始することができた。今後はアセチルコリン性ニューロン(赤色蛍光)からホールセル記録を行ない、PV含有GABA性ニューロン(黄緑色蛍光)に光刺激を与えることによって青色光誘発性IPSCsを誘発して、伝達機構および生理活性物質による修飾機構を解析する。克服すべき一つの問題は、記録時にはマウスが生後6週齢以上に達しているため、スライス標本上に健常なアセチルコリン性ニューロンが少なくなっていることである。このことによる実験効率低下を防ぐために、1)AAVを注入するマウスの週齢を少しでも若くすることを試みる。2)スライス標本作成のためのクレブス液の組成を検討する。研究代表者は、成熟げっ歯類の線条体ニューロン等のために、スライス作製用クレブス液の組成を改良した経験を有する。1)青色光誘発IPSCsに対するムスカリン受容体を介する修飾作用に関して、作用部位、イオン機構および生後発達変化の解析を行なう。2)ムスカリン受容体には、膜表面のみではなく、細胞内にも存在するサブタイプが報告されており、中枢シナプス伝達修飾における機能は興味深い。そこで、今回同定された、前脳基底核内のパルブアルブミン含有ニューロンからアセチルコリン性ニューロンへのシナプス伝達における細胞内ムスカリン受容体の機能解析を行なう。その際、膜透過性および不透過性のムスカリン受容体アンタゴニストが、有力な薬理学的toolとなる。初期のスライス標本上の染色検討に時間をかけたため、PV-Creマウス購入・使用のペースが当初の予定をやや下回った。
20世紀前半の日本で行われた朝鮮・韓国人の音楽公演活動に関する研究

今年度の研究では20世紀前半日本で行われた朝鮮・韓国人の音楽活動に関して日本・韓国に残された新聞や雑誌記事、写真・SPレコードなどの資料を収集、分析、そして関係者とのインタービューを行った。又、朝鮮・韓国人の音楽活動の日本公演が韓国近代音楽史、公演文化史、そして在日朝鮮・韓国人の音楽文化に与えた影響について考察した。その具体的な研究成果は次のようなものである。・20世紀前半日本で行われた朝鮮・韓国の音楽公演を主に担当していた妓生の公演への参加者、参加経緯、公演内容、公演場所が分かるようになった。日本で開催された博覧会等の舞台、日本各地の劇場舞台等で行われた妓生の公演は、近代芸術として当時朝鮮で創作された樂曲が含まれていたにも関わらず、古典的、女性的なイメージのみが強調された。・1920年代、朝鮮の宮廷音楽が日本で紹介され、学者、芸術家等の注目を引くようになり、1930年代以降には多様な朝鮮・韓国の音楽が日本で公演された。その背後には学問的な関心や、伝統の保存を目的とする以外に、市場開拓というレコード産業の影響もあった。・20世紀前半日本で行われた朝鮮・韓国の音楽公演は近代朝鮮に新しく流入された劇場文化に合うよう、伝統音楽を再創作する過程に影響を与えた。その一例として朝鮮の貴族音楽の正樂が日本公演をきっかけとして公演音楽化されたことが揚げられる。以上述べたように、本研究は朝鮮・韓国の伝統音楽の近代化に日本で行われた朝鮮・韓国の音楽公演が与えた影響を明らかにした。このような研究の意義は韓国近代音楽文化に対しての新たな論議の場を開拓した事にあろう。更に本研究は、音楽を通し、20世紀前期日本の文化が外国文化に接触(contact)し、いかにして影響を与えたかに関する考察となり、近代アジア国家の間に起きた文化交流と音楽の変化に関する論議としてその重要性が認められる。今年度の研究では20世紀前半日本で行われた朝鮮・韓国人の音楽活動に対して日本・韓国に残された文献調査、分析、そして関係者とのインタービューを行った。その研究成果はつぎのようなものである。・20世紀前半の日本で行われた朝鮮・韓国音楽家の公演活動は時期、又、公演目的に関しても三つに分けられる。まず第一は1900年代から1930年代まで日本で開かれた博覧会に参加した朝鮮妓生(キセン)の公演活動、第二は1929年以降にレコードの吹き込みのために来日した朝鮮音楽家の公演活動、第三は1940年代から本格化された朝鮮舞踊の日本公演に同伴した音楽家の公演活動である。このような研究成果は、日本での朝鮮・韓国音楽家の活動に関する論議を具体的に進めるために必要である。・19世紀後半から20世紀まで開かれた日本各地の様々な博覧会に朝鮮館が設置され、朝鮮妓生(キセン、近代朝鮮・韓国の各種宴会で音楽を担当した女性)、そして音楽家が参加し朝鮮文化の紹介の一環として朝鮮音楽公演を行った。早くに1903年に大坂で開かれた第五回内国勧業博覧会に朝鮮妓生が参加し、歌舞を行う予定で来日した記録がある。日本の博覧会の参加のため来日した朝鮮妓生は当時漢城巻番(クォンボン、朝鮮キセンが所属する組合)、東莱巻番などの所属巻番単位であった。そして、当時の博覧会に参加した朝鮮妓生(キセン)の公演種目は朝鮮の宮中歌舞は勿論、釜山(プサン)など朝鮮地方の歌舞にまで及んでいた。彼らが公演活動を行った場所は博覧会場の朝鮮館のほか、露天広場などであり、本格的な音楽・舞踊公演のため建てられた演芸館、奏楽堂ではなかったため、朝鮮妓生の歌舞公演は当時の日本人の観点からみると、芸術の披露ではなく、他国の文化紹介のイベント性が高かったと思われる。即ち、この研究成果を通し、"博覧会用の朝鮮音楽"としての観点で、当時公演された朝鮮妓生の音楽を考えなければならないことが分かった。

以上述べたように、本研究は朝鮮・韓国の伝統音楽の近代化に日本で行われた朝鮮・韓国の音楽公演が与えた影響を明らかにした。このような研究の意義は韓国近代音楽文化に対しての新たな論議の場を開拓した事にあろう。更に本研究は、音楽を通し、20世紀前期日本の文化が外国文化に接触(contact)し、いかにして影響を与えたかに関する考察となり、近代アジア国家の間に起きた文化交流と音楽の変化に関する論議としてその重要性が認められる。
泌尿器科癌の発生リスクおよび治療反応性に関与する遺伝子多型に関する解析

尿路性器系には様々な病理組織学特徴や異なった治療反応性を示す多様な悪性腫瘍が発生するが、本研究では、このような多様な尿路生殖器癌の発生リスクや各種の治療反応性に関連する遺伝子多型を検討することを目的とする。膀胱癌に関しては、浸潤性膀胱癌の術前化学療法の有効性予測に関する他施設前向き研究を開始した。また、膀胱癌の多型解析を行いCCND1多型が上皮内癌の発生と有意に関連していることが明らかとなった。腎細胞癌でも。CCND1のA/A遺伝子型はG/Gに比較して約1.7倍腎細胞癌のリスクが高いことが明かとなった(95%CI:1.03-2.82)。本研究の結果は、CCDN1遺伝子の腎細胞癌や膀胱癌の発生における重要性を示唆し、今後のさらなる研究の重要性を示すものである。前立腺癌に関しては、IGF-I遺伝子のCA repeats多型に関する解析を行った結果、19回のCA repeatsのアレル頻度が前立腺癌と肥大症に有意に高く、このアレルをホモで持つ場合には、前立腺癌で3.36倍(95%IC:1.30-8.67)、肥大症で3.56倍(95%CI:1.32-9.46)とリスクが上昇することが明らかとなった。本研究成果は、IGF-Iをターゲットとした前立腺癌治療戦略においてひとつの可能性を指し示すものと思われる。腎細胞癌でも。
抗酸化剤は局所麻酔薬の神経毒性を軽減するか

リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果を明らかにする.水棲カタツムリを用い,平成18年度と同じ方法で中枢神経を培養し実験した.1)リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果:単体の中枢神経細胞を条件培養液の入ったMED64ディッシュにて培養する.1224時間後に,倒立顕微鏡を用い,伸びた神経突起と,その先端の成長円錐を確認する.デジタルカメラで観察記録する.その後,MED64で活動電位を記録した.ディッシュ内のリドカイン濃度をそれぞれ100μM,1mM,10mM,100mMにし,30分間MED64で細胞体,神経突起,成長円錐の活動電位を記録する.その後,倒立顕微鏡を用い,各濃度の細胞体,神経突起,成長円錐を観察する.同様に重亜硫酸ナトリウム濃度を0.002,0.02,0.2,2%にし観察記録する.次に,局所麻酔薬と重亜硫酸ナトリウムの混合液を用いて実験を行い比較検討する.2)細胞内カルシウム濃度の測定:ディッシュ内に10μMの蛍光プローブFura-2AMを加え,60分間放置しwash-outする.ディッシュ内に1)で明らかになった,クロロプロカイン,リドカインが培養細胞を破壊する,あるいは電気生理学的に変化を生じた濃度を加え,細胞内カルシウム濃度の変化を測定する,重亜硫酸ナトリウムを加えることで細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制できるか,そのときの細胞内カルシウム濃度の変化を比較する.中枢神経細胞のMED64ディッシュでの培養が難しく,細胞体と神経突起の活動電位は計測できるが,成長円錐の活動電位が計測できない.リドカイン,重亜硫酸ナトリウムとも,細胞体および神経突起に対し,濃度依存的に細胞毒性を生じる傾向にある.重亜硫酸ナトリウムによる細胞保護効果を示したデータは収集できなかった.MED64ディッシュの電極の凹凸が神経細胞の定着および成長に障害となっているため、ディッシュコーティングの更なる改良が必要である。リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果を明らかにする.本実験では当教室の実験室で飼育している水棲カタツムリを用い,中枢神経を培養する.1)リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果:単体の中枢神経細胞を条件培養液の入ったMED64ディッシュにて培養する.1224時間後に,倒立顕微鏡を用い,伸びた神経突起と,その先端の成長円錐を確認する.デジタルカメラで観察記録する.その後,MED64で活動電位を記録した.ディッシュ内のリドカイン濃度をそれぞれ100μM,1mM,10mM,100mMにし,30分間MED64で細胞体,神経突起,成長円錐の活動電位を記録する.その後,倒立顕微鏡を用い,各濃度の細胞体,神経突起,成長円錐を観察する.同様に重亜硫酸ナトリウム濃度を0.002,0.02,0.2,2%にし観察記録する.次に,局所麻酔薬と重亜硫酸ナトリウムの混合液を用いて実験を行い比較検討する.2)細胞内カルシウム濃度の測定:1)と同様に中枢神経細胞を培養する.ディッシュ内に10μMの蛍光プローブFura-2AMを加え,60分間放置しwash-outする.ディッシュ内に1)で明らかになった,クロロプロカイン,リドカインが培養細胞を破壊する,あるいは電気生理学的に変化を生じた濃度を加え,細胞内カルシウム濃度の変化を測定する,重亜硫酸ナトリウムを加えることで細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制できるか,そのときの細胞内カルシウム濃度の変化を比較する.Fura-2による蛍光は,340/380nmの光を与え510nmの励起光を測定することで細胞内カルシウム濃度を測定する.中枢神経細胞のMED64ディッシュでの培養が難しく,細胞体の活動電位は計測できるものの,神経突起、成長円錐の活動電位が計測できない.細胞体に対し,リドカイン,重亜硫酸ナトリウムとも,濃度依存的に細胞毒性を生じる傾向にある.今後,神経突起,成長円錐に対してのデータを収集する予定である.リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果を明らかにする.水棲カタツムリを用い,平成18年度と同じ方法で中枢神経を培養し実験した.1)リドカインの神経毒性に対する重亜硫酸ナトリウムの効果:単体の中枢神経細胞を条件培養液の入ったMED64ディッシュにて培養する.1224時間後に,倒立顕微鏡を用い,伸びた神経突起と,その先端の成長円錐を確認する.デジタルカメラで観察記録する.その後,MED64で活動電位を記録した.ディッシュ内のリドカイン濃度をそれぞれ100μM,1mM,10mM,100mMにし,30分間MED64で細胞体,神経突起,成長円錐の活動電位を記録する.その後,倒立顕微鏡を用い,各濃度の細胞体,神経突起,成長円錐を観察する.同様に重亜硫酸ナトリウム濃度を0.002,0.02,0.2,2%にし観察記録する.次に,局所麻酔薬と重亜硫酸ナトリウムの混合液を用いて実験を行い比較検討する.2)細胞内カルシウム濃度の測定:ディッシュ内に10μMの蛍光プローブFura-2AMを加え,60分間放置しwash-outする.ディッシュ内に1)で明らかになった,クロロプロカイン,リドカインが培養細胞を破壊する,あるいは電気生理学的に変化を生じた濃度を加え,細胞内カルシウム濃度の変化を測定する,重亜硫酸ナトリウムを加えることで細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制できるか,そのときの細胞内カルシウム濃度の変化を比較する.中枢神経細胞のMED64ディッシュでの培養が難しく,細胞体と神経突起の活動電位は計測できるが,成長円錐の活動電位が計測できない.

リドカイン,重亜硫酸ナトリウムとも,細胞体および神経突起に対し,濃度依存的に細胞毒性を生じる傾向にある.重亜硫酸ナトリウムによる細胞保護効果を示したデータは収集できなかった.MED64ディッシュの電極の凹凸が神経細胞の定着および成長に障害となっているため、ディッシュコーティングの更なる改良が必要である。
コイネー・フルフルデ語による都市居住マンダラ山地出身者の民間説話研究

フィールドワークの前後、国内においては、現地で収集された資料を文字化した。文字化されたものは、そのモチーフ、話型などの比較をおこなった。同時に、すでに出版されているマンダラ山地民の社会・文化にかかわる書籍、研究論文などをよみ、今後の問題点をあきらかにした。そのうち資料としてまとまりのあるマタカム族の民間説話の「コイネー・フルフルデ語」のテキストを完成し、その英文のレジュメを作成した。この資料に関しては、北部カメルーンのフルベ族の民間説話との比較研究をおこなった。また、このテキストをもって、フィールドにのぞんだ。フィールド調査は、二度、雨期明けの一月から二月にかけておこなった。フィールド調査では、西部のマンダラ山地民、すなわち、マンダラ、マダ、ムヤン、ズルゴ族などの資料もあつめた。トコンベレ、モラ、マルアなどで、インフォーマントから直接民間説話の収集をおこなった。かれらのフルフルデ語学習歴をしるために、民間説話と同時に語り手たちのライフストーリーもあつめた。北部カメルーンの都市だけでなく、マンダラ山地民の出身地の村落なども、物質文化や精神文化をしるために、訪問調査をおこなった。とくに、イスラム化されていないかれらの村落には、さまざまな民間信仰につかわれる事物があるので、そういったものには、注意をはらった。帰国後、ある種のものに関しては、内容を理解するのが困難だから、収集した民間説話は、現地において、文字化の一歩手前の状態、すなわち、外部のものには、わからない表現、とくに、歌などの徹底的な聞き取りをおこなった。いままで、収集整理された資料を方向所としてまとめて、国立民族学博物館調査報告として、出版の準備をすすめている。この研究で得られた資料は、データ・ベースとして、インターネットで公開する予定である。本年度は、国内資料をつかった文献学的調査とカメルーン北部におけるフィールド調査をおこなった。国内資料としては、すでに収集されている北部カメルーンのマタカム族、ムヤン族、ズルゴ族、マダ族などの録音資料と出版物があげられる。録音資料は文字化できるものは、文字化をこころみた。文字にできないものは、現地のフィールドワークのさい、文字化をした。すでに、国内で文字化したものについても、再度インフォーマントとともに、内容把握と正確な記述を追求した。マンダラ山地の民族は、コイネー・フルフルデ語が上達したといっても、植物名、動物名などについては、なかなか適当なフルフルデ語の単語をさがすことができないのが、常であるので、動植物名の同定には、さらに研究をつづけなくてはならない。今回の調査で感じたことは、マンダラ山地民のコイネー・フルフルデ語と都市居住の若年層のフルベ族のコイネー・ルフルフデ語が酷似していることと、公用語のフランス語の影響が無視できないということである。昔話の内容からすると、やはり、山地民の語る物には、都市居住のフルベ族のあいだではきけないものがいまでも多数あるということがいえる。今回、継続調査をしてきたマタカム族のインフォーマントが、あらたな昔話を数十話かたってくれた。合計すると、一人で、三百話ほどかたったことになる。昔話が都市居住者のあいだでも、綿々とかたりつがれていることの証左となる。都市居住者の民族アイデンティティーは、なかなか外部のものには、わからないが、かれらのネットワークにのることができれば、これからの調査も容易になるとかんがえられる今回つよく感じたのは、山地民の昔話のキーワードが、「肉」、「イヌ」、「変身」などであるということをつけくわえたい。国内においては、昨年度収集された資料を文字化し、モチーフ、話型などの比較をおこなった。

同時に、すでに出版されているマンダラ山地民の社会・文化にかかわる研究論文などをよみ、今後の問題点をあきらかにした。「コイネー・フルフルデ語」のテキストの英文のレジュメを作成し、比較可能な資料にした。そのあと、北部カメルーンのフルベ族の民間説話との比較研究をした。その比較資料をもって、フィールドにのぞんだ。フィールド調査は、雨期明けの一月から二月にかけておこなった。フィールド調査では、西部のマンダラ山地民、すなわち、マンダラ、マダ、ムヤン、ズルゴ族などの集中する、トコンベレ、モラ、マルアなどで、インフォーマントから直接民間説話の収集をおこなった。かれらのフルフルデ語学習歴をしるために、民間説話と同時に語り手たちのライフヒストリーもあつめた。北部カメルーンの都市だけでなく、マンダラ山地民の出身地の村落なども、物質文化や精神文化をしるために、訪問調査をおこなった。とくに、イスラム化されていないかれらの村落には、さまざまな民間信仰につかわれる事物があるので、そういったものには、注意をはらった。帰国後、いくらがんばっても、内容を理解するのは、困難だから、収集した民間説話は、現地において、文字化の一歩手前の状態、すなわち、外部のものには、わからない表現、とくに、歌などの徹底的な聞き取りをおこなった。いままで、収集整理された資料を報告書としてまとめて、国立民族学博物館調査報告として、出版の準備をすすめている。この研究で得られた資料は、データ・ベースとして、インターネットで公開する予定である。
バイオマス資源生産を目指した水面被覆植物とイネとの共存生態系の構築

イネ単作が主流である水田に、環境負荷の低減と系の複雑化を目的として、水面被覆植物を導入した共存生態系を提案した。本研究では施肥量同一の水田において、水面被覆植物の栽植密度を変化させた際の共存生態系の応答を、生育量、群落構造、収量の面から調査した。水面被覆植物のモデルにはホテイアオイを供試した。イネの栽植密度を22.2株/m^2に統一し、ホテイアオイを22.2、16.7、11.1、5.6、0株/m^2に植栽した区に加え、ホテイアオイのみを11.1株/m^2に植栽した区の計6試験区を3反復の乱塊法で実施した。ホテイアオイの栽植密度の増加に伴い、イネの籾収量は減少したが、共存生態系全体の炭素固定量は増加した。その回帰直線の傾きは、籾収量、炭素固定量ともにホテイアオイ密度11.1株/m^2を境に変化した。イネ籾収量の減少は、m^2当たり穂数と一穂穎花数の減少に起因していた。また、ホテイアオイの栽植密度の増加に伴い、イネの炭素固定量は減少するもののホテイアオイの炭素固定量が増加したため、共存生態系全体では炭素固定量が増加した。さらに籾の窒素含有率はホテイアオイの栽植密度の増加に伴って減少したが、これは窒素の吸収量と光合成産物の転流量の減少が原因であると考えられた。イネのLAIは、移植後6週目からホテイアオイの密度による差が見られた。さらに、群落内の相対照度においても、ホテイアオイの栽植密度による差が見られ、群落内の光環境の違いが示唆された。以上の結果より、ホテイアオイの栽植密度の増加は、資源競合を激化させ、イネの収量を減少させた反面、系全体の炭素固定量を増加させた。さらに本実験の条件下におけるホテイアオイの最適栽植密度は11.1株/m^2付近にあるものと推測された。これまで系の複雑化を嫌って進化してきた近代農業が本質的にもつ問題点を克服し、持続性を前提とした新たな作物生産システムを構築していく際のオプションを用意する目的で、本研究ではホテイアオイを水面被覆植物として積極的に水田に導入した場合の影響を調べることにした。2002年に筑波大学農林技術センター内の水田で行った実験では、処理区として、(1)慣行栽培の無処理区(CC)、ホテイアオイ導入した(2)低密度区(LD)、(3)高密度区(HD)を各3反復で設けた。ホテイアオイはLD区ではイネの半分の密度、HD区ではイネと同じ密度とした。実験の結果、わら重はCC区とLD区がともにHD区より増加し、精籾重はCC区がLD区とHD区より増加した。イネが固定した炭素量はCC区とLD区がHD区より多く、ホテイアオイが固定した炭素量はHD区がLD区より多くなった。以上のことから、<イネ+ホテイアオイ+雑草>合計の単位面積当たり炭素固定量としては、LD区とHD区が、CC区より多くなった。

ホテイアオイを水田に導入したことによる得失の一端が明らかになったが、その中でホテイアオイ導入による負の影響はLD区がHD区よりも小さく、炭素固定量はLD区とHD区間準差がみられなかったことから、LD区でより顕著な導入効果が認められた。本年度の実験から、(1)養分競合の回避、(2)ホテイアオイの最適密度の探求、(3)空間の住み分け、(4)水質浄化効果の検証、(5)ホテイアオイの雑草化の追跡などが今後の課題として考えられた。なお、同時並行で行っている水田からの温室効果ガス発生と制御、とくに炭素循環ついてはほぼ期待した通りの結果が得られたが、ここでは紙数の関係から詳細を割愛する。イネ単作が主流である水田に、環境負荷の低減と系の複雑化を目的として、水面被覆植物を導入した共存生態系を提案した。本研究では、施肥量同一の水田において、水面被覆植物の栽植密度を変化させた際の共存生態系の応答を、生育量、群落構造、収量の面から調査した。水面被覆植物のモデルにはホテイアオイを供試した。イネの栽植密度を22.2株/m^2に統一し、ホテイアオイを22.2、16.7、11.1、5.6、0株/m^2で栽植した区に加え、ホテイアオイのみを11.1株/m^2に栽植した区の計6試験区を、3反復の乱塊法で実施した。ホテイアオイの栽植密度の増加に伴い、イネの籾収量は減少したが、共存生態系全体の炭素固定量は増加した。その回帰直線の傾きは、籾収量、炭素固定量ともにホテイアオイ密度11.1株/m^2を境に傾きが変化した。イネの籾収量の減少の原因は、m^2当たり穂数と一穂頴花数の減少が原因であると考えられた。またイネの炭素固定量は減少するものの、ホテイアオイの炭素固定量が増加したため、共存生態系全体では炭素固定量が増加した。さらにイネの籾の窒素含有率はホテイアオイの栽植密度の増加に伴って減少したが、これは窒素の吸収量と光合成産物の転流量の減少が原因であると考えられた。イネのLAIは移植後6週からホテイアオイの密度による差が見られた。さらに、群落内の相対照度においても、ホテイアオイの栽植密度による差が見られ、群落内の光環境の違いが示唆された。以上の結果より、ホテイアオイの栽植密度の増加は資源競合を激化させ、イネの収量を減少させた反面、系全体の炭素固定量を増加させた。さらに本実験の条件下におけるホテイアオイの最適栽植密度は11.1株/m^2付近にあるものと推測された。
原子核反跳による宇宙暗黒物質の直接探索

本研究では、フッ化カルシウムシンチレーション検出器(以下CaF_2検出器)を使用し、検出器中の^<19>Fと暗黒物質の弾性散乱による反跳エネルギーの検出を通して探索を行うことを目的としている。一般的にシンチレーションを利用する場合、ガンマ線などで較正した電子換算エネルギーと原子核による反跳エネルギーの間には消光係数を介した関係があり、実際に観測される反跳エネルギーを知るためには消光係数を測定することが不可欠である。今年度の研究では、暗黒物質と^<19>F原子核の散乱による反跳エネルギーを較正するため、単色中性子ビームを使用して^<19>F原子核のCaF_2検出器中での消光係数を測定した。検出器は、発光材で活性化していないCaF_2検出器(以下CaF_2(pure))を使用し、反跳エネルギー100keV(実際にWIMPsとの散乱で得られる反跳エネルギーの領域)付近で14%程度であり、エネルギーが減少するに従って大きくなることがわかった。この結果は一般的に使用されるユーロピウム活性化CaF_2検出器(CaF_2(Eu))と同程度の値である。これによりCaF_2(pure)検出器が暗黒物質直接探索において有力な検出器であることを証明することに成功した。また、暗黒物質探索においてはバックグラウンドとなるガンマ線と原子核反跳の事象の弁別能力の向上が、バックグラウンドの低減化を実現し、感度の向上に直接結びつく。重イオンビームならび大強度ガンマ線源を利用してCaF_2(pure)シンチレーション検出器の発光波長の粒子依存性を調べ、粒子によって発光波長に大きな違いがあることを確かめた。WIMPsによる原子核反跳は低エネルギー領域での検出が不可欠である。本研究においては電子エネルギー換算で5keVのエネルギー領域の検出を目指しており、そのために必要な光電子数の検出を可能にするために、光電子増倍管では検出の難しい、CaF_2検出器の紫外領域の発光波長を波長変換剤により可視光領域に変換する必要がある。今年度の行なった予備実験によって、最適な波長変換剤の濃度を決めることに成功し、また、CaF_2検出器を沈めている液体シンチレーターの性能(発光量、透過度)の評価から、1keVあたり1個の光電子の検出が可能であることを確かめることができた。同時に、バックグラウンドの低減化を実現するためにCaF_2検出器の結晶化に使用するパウダー中に含まれる放射性不純物の分析をGe半導体検出器を使用して行ない、数種類の候補の中から最高純度の原料を選定した。選定した原料を、さらに高純度化するために原料の純化に取り組み、これまでのところ一定の成果を得ている.WIMPsによる原子核反跳は低エネルギー領域での検出が不可欠である。昨年度の引き続き液体シンチレーターの性能評価を継続して行い検出器からの光検出量に影響を与える液体シンチレーター中での光の減衰長を測定した。その評価から現在建設中の検出器に対しては十分満足できる性能が得られる事を確認した。同時に、バックグラウンドの低減化を実現するためにCaF_2検出器の結晶中に含まれる放射性不純物が測定感度に与える影響を見積もるための、シンチレーション光の伝搬に関するモンテカルロシミュレーションプログラムを新たに開発した。そのコードを使用して事象の位置の再構築の精度の評価を行ない、10センチメートル角の結晶中で起こった事象を90%の効率で認識できるという結果を得た。
術後痛モデルにおけるモルヒネ耐性の脊髄への影響に関する研究

雄ラットを対象としクモ膜下腔にカテーテルを留置しモルヒネを投与することによりモルヒネ耐性モデルを作成した。コントロール群では生理食塩水を投与した。モルヒネの5日間連続投与の後にモルヒネ負荷試験を行なったところ行動学的手法において疼痛刺激に対する耐性形成が認められることがわかった。これらのモルヒネ耐性群およびコントロール群ラットにおいて、椎弓切除をおこない細胞外電極を用いて単一脊髄後角細胞の神経発射活動を導出し、侵害刺激に対する誘発活動や機械的非侵害刺激に対する受容野の面積変化の記録をおこないデータを収集した。さらに皮膚受容野の中心において皮膚およびその直下の筋膜に切開を加えこれを縫合し術後痛を形成させて侵害刺激に対する誘発活動や機械的非侵害刺激に対する受容野の面積変化の記録をおこないデータを収集した。しかし今年度までのところでは統計学的に検討をおこなえるだけのデータ数には未だ不十分なこともありモルヒネ耐性群とコントロール群との間に有意な差を認めるには至らなかった。このため上記に引き続きおこなう予定であったモルヒネ耐性群とコントロール群におけるモルヒネ投与時の脊髄後角細胞の電気活動についてのデータ収集にまでは至っていない。以上今年度までの研究では、モルヒネ耐性形成において鎮痛効果の低下とともに知覚過敏が関与するのではないかという我々の仮説を支持するだけの結果を示すには至らなかった。今後さらにデータ数を重ね統計学的解析をおこない我々の仮説に対する検証を引き続きおこなっていく予定である。本年度の研究では、雄ラットを用いてくも膜下腔にカテーテルを留置しモルヒネを投与することによりモルヒネ耐性モデルを作成している。コントロール群においては生理食塩水を投与している。モルヒネの5日間持続投与の後にモルヒネ負荷試験をおこなったところ、耐性形成が認められた。これらモルヒネ耐生群およびコントロール群ラットにおいて、椎弓切除をおこない細胞外電極を用いて単一脊髄後角細胞の発射活動を導出、熱刺激、機械刺激に対する誘発活動や、機械的非侵害刺激に対する受容野の記録をおこない、データを収集中である。現在までのところではデータの数がまだ不十分なこともあり、モルヒネ耐性形成において鎮痛効果の低下とともに知覚過敏が関与するのではないかという我々の仮説を支持するだけの結果を示すには至っていない。今後さらにデータ数を重ね解析を進めたいと考えている。15年度の研究では、昨年度に引き続き雄ラットを用いてくも膜下腔にカテーテルを留置しモルヒネを連続的に投与することによりモルヒネ耐性モデルを作成している。モルヒネの5日間連続投与の後にモルヒネ負荷試験をおこなったところ、行動学的には耐性形成が認められている。昨年度は、これらモルヒネ耐性群およびコントロール群ラットにおいて、椎弓切除をおこない細胞外電極を用いて単一脊髄後角細胞の発射活動を導出し、熱刺激、機械刺激に対する誘発活動や、機械的非侵害刺激に対する受容野の記録をおこない、データを収集していた。昨年度までのところではデータの数がまだ不十分なこともあり、モルヒネ耐性群とコントロール群との間に十分なる差異を認めるに至らなかった。このため今年度は、昨年度の研究内容を引き続き実施すると共に、モルヒネ耐性群およびコントロール群においてモルヒネ投与時の脊髄後角細胞の電気活動についてのデータを収集中である。しかし、モルヒネ耐性形成において鎮痛効果の低下とともに知覚過敏が関与するのではないかという我々の仮説を支持するだけの結果を示すには至っていない。
AIDを選択した親と生れた子どもが共に幸せになるための情報提供に関する研究

本研究は, AIDで親になった不妊カップルが不妊であることやAIDを用いることで抱く不名誉や恥を軽減し,生れてくる子どもの出自を知る権利について積極的になるための適切な情報について、国内外の調査を実施考察し,以下の結果を得た。1) AIDで生まれた人の認識2) AIDカップルのコミュニケーションの特徴, AIDで父親になった男性の認識3)自助グループの実践活動本研究は, AIDで親になった不妊カップルが不妊であることやAIDを用いることで抱く不名誉や恥を軽減し,生れてくる子どもの出自を知る権利について積極的になるための適切な情報について、国内外の調査を実施考察し,以下の結果を得た。1) AIDで生まれた人の認識2) AIDカップルのコミュニケーションの特徴, AIDで父親になった男性の認識3)自助グループの実践活動国外調査では、2010年1月から非匿名制の配偶子提供を法制化したオーストラリア・ニューサウスウェルスにて、行政、不妊カウンセラーおよび不妊カップル、生まれた人の視点から法律施行前後で変化したこと、今後の課題について聞き取り調査を実施した。ニューサウスウェルス州政府(NSW)は、自身の意思が反映されないで生まれてくる子どもの「出自を知る権利」の保障を最優先すべく法制化に至ったが、最終的に親が子どもに告知するか否かに対しては個人的な問題であるという姿勢を示した。親が子どもに話してゆくための支援に対する具体策や予算は殆どないという。非匿名制の導入により、不妊カップルがドナーを家族・友人・近所・職場の人から探してくる体制が主流となり、カウンセラーは従来の不妊カップルへの心理者社会的支援、ドナーやドナーのパートナーへのカウンセリングの他、ドナーと不妊カップルのジョイントカウンセリングの開催など業務が拡大した。しかし、その予算は殆どなく、カウンセラ0の熱意で支えられている現状である。一方、当事者団体は、州内だけの問題にとどまらない点を指摘し、国としての法制化されなかった点で「理想的な改正でなかった」と評価していた。また、具体的な支援策、登録制度やカウンセリングサービスがなく、社会の認識を高めるためにも、AIDで親になった人、生まれた人の現状調査の必要性を指摘した。国内調査では、AIDで始めて父親になった男性を対象に、家族形成過程における体験についてインタビュー調査を行った。男性の語りから、「不妊の衝撃と妻への自責の念」「自身の気持ちを整理する」「妻と話し合い歩み寄る」「AIDをポジティブに捉える」「子どもとの関係から培われる父親としての自信」「夫婦が意思疎通していく努力」「父親としての確信の揺らぎ」が抽出された。国外の調査では、Ken Daniels氏(非配偶者間の生殖技術を利用しようとする患者や家族、生まれた子どもの調査に関する世界的一人者。ニュージーランド政府の生殖補助医療に関する政策づくりに貢献)を招聘し、ニュージーランドの実態について聞き取りを行った。ニュージーランドでは、親は自分の子どもに対してどのように家族が形成されてきたかオープンにする土壌がある。それは自然発生したものでなく、以下の点において教育的な啓蒙活動がされてきた(1.家族形成における生物学的・心理学的・社会学的アプローチー医師とカウウンセラーの共同2.「秘密にする・秘密をもつ」ことが家族機能を破壊するリスクをもつこと3.ベストな選択をし、選択した技術に対しては自信を持ち誠実な子育てをする-適切な情報と支援4.子どもが真実を知りたい本当の理由)。また、不妊カップルの自信は、当事者のみならずパートナー、属する家族、属する社会との関係性のなかで影響を受けると指摘した。国内の調査では、DIを選択した夫婦の体験に関する調査をグループインタビューで実施した。治療決定までは、「妻は夫ともに話し合いたい」、「夫はこの問題から距離を置きたい」に別れ、治療が開始してからは、「夫の治療への関心の低さが妻の夫への不満や不振感を増大」させ、子育てを開始してからは、「妻は遺伝的なつながりのない父子関係に不安」「夫は父親としての自信の揺らぎ」を感じていた。各々抱く不安や心配を「夫婦間、重要他者に吐露できない孤独やストレス」を高めていた。子どもへの告知を積極的に実施しているオーストラリアビクトリア州不妊治療局の地域教育を担当しているKate Bourne、米国で精子や卵子の提供者および異父母きょうだいを探すRDS(Donor Sibling Registry)のデレクターをしているWendy Kramerに自国における非配偶者間の生殖医療における実態と課題をインタビュー調査により得た。Kate Bourneはビクトリ・ア州の活動から、親や提供者へのインフォメーションだけでなく、産まれた人のニーズ(年齢や人生のイベントを考慮して)に合わせたフォロー体制を組織的に持つことの重要性、カウンセラーが仲介役で対面した提供者と生まれた人はその後、個々の体験の中で二者間の交流のルール(rules of engagement)を定めて継続的に交流し始めていること、ビクトリア州戸籍証にはDIで出生した事実がたどれるよう規定したことを述べた。一方州外・国外で治療をした人にこのサービスが適応できず、国・世界レベルでこの問題へ統一した対処が必須であると指摘した。RDSは現在34000人以上の会員がおり、11年の実績の中で約9000人以上の異父母きょうだいを繋げる活動を実施している。

RDSの調査では、生まれた人が提供者を探す主な理由は、自分自身の起源や祖先をより知りたい、医学情報を知りたい、提供者と関係性を築きたいがあり、提供者には親とは思えないが自身にとって大切な存在として認識しており、異父母きょうだいには近親者・仲の良い知人・親友と捉えて認識していた。また、レズビアンやシングル家庭と比較し異性カップルが子どもに事実を伝えない傾向にあること、斡旋業者や医療施設側の問題として提供者の遺伝疾患や提供回数について十分な検査・調査をしないこと、この実態を国が野放しにしている点について指摘した。本調査をふまえ、3年間に収集したデータを元にわが国の不妊カップルへの情報提供について検討し、情報提供資料作成を試みた。
動脈硬化患者におけるプロポフォール使用時の中心血圧低下の機序と予測因子

超高齢社会により、内科的疾患を有する高齢者や障害者が歯科を訪れる機会が増えた。特に受療率が最も高い循環器疾患を合併した患者は歯科治療による疼痛や不安により、有害事象を起こしやすい。実際に治療中の偶発症として最も多いのは血圧上昇に起因した循環器イベントであると報告されている。そのため、このような患者では歯科ストレスを軽減し、急激な血圧上昇を抑える必要がある。特に循環予備力の低い患者においては、現在、歯科治療中に精神鎮静法や全身麻酔法が応用されるケースが多くなり、プロポフォールが広く利用されている。一方、プロポフォールはシステマティックな血圧を低下させることが知られている。もし、過度の血圧低下が中心動脈に起こると脳虚血、心筋虚血などのリスクが高まる可能性がある。ところが、プロポフォールが中心動脈圧に与える影響は不明である。そこで、本研究ではプロポフォール使用時に中心動脈圧がどのような変化をきたすか、中心動脈圧の構成要素である脈波がどのような影響を受けるかを評価する。本年度は、プロポフォールの使用により1中心動脈圧もシステマティックな血圧と同程度に低下をおこす、2動脈硬化度が高いほど低下度が大きい、3投与前の脈波伝播速度が速いと投与後の低下量が大きいという仮説を検証した。その結果、プロポフォール投与者における血圧低下は、上腕のカフで測定したシステマティックな血圧よりも中心動脈でより大きく低下していた。また、動脈硬化度の指標が高いものほど中心動脈圧の低下度が大きいかった。さらに、投与前の脈波伝播速度が速いものの方がより血圧低下が大きかったというデータを得た。これらは、歯科治療に静脈内鎮静法を応用する場合、前もって中心動脈圧低下やそれに起因する有害事象のリスクを知る情報となり得る。つまり、術前にそのリスクを回避するという意味で現在の超高齢社会における社会的意義は極めて高い。本年度の研究計画は概ね順調に進んでいる。当初、計画していた仮説の検証1中心動脈圧の低下、2動脈硬化度が高いほど血圧低下が大きい、3脈波伝播速度が速いほど中心動脈圧の低下が大きい、4脈波増大圧の減弱がおこる、5脈波伝播速度が低下する、6中枢性圧反射感受性が低下する、のうち当該年度に13までを検証し終えた。46の仮説は統計的なパワーを十分なものにするために、さらに対象患者を追加する必要がある。しかしながら、測定方法には大きく変更がないため、現在の状況から判断すると測定は停滞することなく行われると予想される。次年度はプロポフォールによる中心動脈圧の低下の原因(機序)について、より詳しく脈波成分を検討する予定である。つまり、上記の4脈波増大圧の減弱がおこる、5脈波伝播速度が低下する、6中枢性圧反射感受性が低下する、という仮説を検証する。次年度に行う上記の仮説の検証は静脈内鎮静法下での歯科治療中に測定する項目(血圧波形の記録)が含まれるため、歯科治療内容による影響があると思われる。そのため、それらの影響をアジャストする目的で対象患者を本年度よりも多く必要とする。一方、対象患者を最小限とするため十分なデータを得たと判断された時点で、その成果を発表し専門家の意見をいただく。その後に、より精度の高い研究とするため専門家の意見を取り入れ、追加実験を行う時間を設ける。また、論文執筆により社会還元していく予定としている。当初、計画していた仮説の検証

1中心動脈圧の低下、2動脈硬化度が高いほど血圧低下が大きい、3脈波伝播速度が速いほど中心動脈圧の低下が大きい、4脈波増大圧の減弱がおこる、5脈波伝播速度が低下する、6中枢性圧反射感受性が低下する、のうち当該年度に13までを検証し終えた。46の仮説は統計的なパワーを十分なものにするために、さらに対象患者を追加する必要がある。しかしながら、測定方法には大きく変更がないため、現在の状況から判断すると測定は停滞することなく行われると予想される。次年度はプロポフォールによる中心動脈圧の低下の原因(機序)について、より詳しく脈波成分を検討する予定である。つまり、上記の4脈波増大圧の減弱がおこる、5脈波伝播速度が低下する、6中枢性圧反射感受性が低下する、という仮説を検証する。次年度に行う上記の仮説の検証は静脈内鎮静法下での歯科治療中に測定する項目(血圧波形の記録)が含まれるため、歯科治療内容による影響があると思われる。そのため、それらの影響をアジャストする目的で対象患者を本年度よりも多く必要とする。一方、対象患者を最小限とするため十分なデータを得たと判断された時点で、その成果を発表し専門家の意見をいただく。その後に、より精度の高い研究とするため専門家の意見を取り入れ、追加実験を行う時間を設ける。また、論文執筆により社会還元していく予定としている。(理由)当初予定していた研究施設は内科的に健常な者に対して人工気候室内で行うものあったが、被験者の安全面と侵襲を最小限とすることを考慮し、診療室で処置を行うと同時に測定する計画に修正した。その変更により施設使用料がなくなったために未使用額が生じた。(使用計画)被験者の追加とそれによる消耗品の購入に充てる。また、海外での発表、及び論文執筆を行うにあたって、英文校正を依頼する。
主鎖に無機または金属元素を含む新しい高分子の合成

本研究は主鎖に無機または金属元素を含む新しい高分子の合成方法の確立を目的としたものである。始めに、ビスフェノールAジグリシジルエーテル(BPGE)とジクロロジフェニルシランとの重付加反応について検討を行った。この結果、触媒としてテトラブチルホスホニウムクロリド(TBPC)等の第四オニウム塩を用いた場合、この反応は室温下でもよく進行し、高分子量のポリシリルエーテルが定量的な収率で得られることが判明した。また、BPGEと種々のジクロロシラン化合物との重付加反応では、それぞれ対応する高分子量のポリシリルエーテルが得られた。またこの重付加反応ではTBPCが最も高い触媒活性を示すことも判明した。同様に第四オニウム塩を触媒として使用し、BPGEとジメチルゲルマニゥムジクロリドとの重付加反応を行った。この反応では、分子量20000以上のポリゲルミルエーテルが得られた。しかしながら、得られたポリゲルミルエーテルは湿気(水)に対して非常に反応性が高く、重合管から取り出したポリマーは、加水分解により急激な分子分子量の低下を起こすことも判明した。同様の反応を用いた、新しい耐炎性ポリマーの合成の観点から、BPGEとフェニルホスフォニルジクロリドとの重付加反応による、ポリホスホナートの合成について検討を行なった。この反応は上記のジクロロシランとの重付加反応とは異なり、室温ではほとんど進行しなかったが、90°Cでよく進行し、分子量約20000のポリマーが高収率で得られた。また、この反応の溶媒および溶媒効果等ついても詳細な検討を行った。
環境と空間認知の発達からみた幼児期における多様な動きの習得メカニズムに関する研究

本研究は、環境(人的・物的)と空間認知の発達の視点から幼児期に獲得される多様な動きの習得メカニズムを検討するとともに、この時期に必要な多様な運動経験を促進させるための提言を示すために、以下の3点から検討することである。1)環境と多様な動きの獲得の関係に関して、戸外の自由な遊びの中での動きの習得過程の時系列的な変化を明らかにする2)幼児の空間認知能力の獲得と多様な動きの習得の関係を明らかにするために、空間認知の発達が影響する“おにごっこ"の中での子ども達の動きの変化と他児との間の関係を明らかにする3)幼児の多様な動きを引きだす環境の役割とそれに伴う空間認知能力の発達の関係を明らかにする本研究は、環境(人的・物的)と空間認知の発達の視点から幼児期に獲得される多様な動きの習得メカニズムを検討するとともに、この時期に必要な多様な運動経験を促進させるための提言を示すために、以下の3点から検討することである。1)環境と多様な動きの獲得の関係に関して、戸外の自由な遊びの中での動きの習得過程の時系列的な変化を明らかにする2)幼児の空間認知能力の獲得と多様な動きの習得の関係を明らかにするために、空間認知の発達が影響する“おにごっこ"の中での子ども達の動きの変化と他児との間の関係を明らかにする3)幼児の多様な動きを引きだす環境の役割とそれに伴う空間認知能力の発達の関係を明らかにする
ドナー由来線維芽細胞による眼移植片対宿主病の発症機構の解明と治療法の開発

ドナー由来線維芽細胞の細胞源を検討するためマウスGVHDモデルを用いた。培養を経ずに新鮮間葉系幹細胞(MSC)(Morikawa S, J Exp Med)及び新鮮造血幹細胞(HSC)(Matsuzaki Y, Immunity, 2004)を採取して移植し検討した。ミスマッチMSC移植では自己MSC移植に比較し、涙腺、肝臓、唾液腺、などに全骨髄細胞移植と同様の進行性の線維化を認めた。ドナーHSP47+GFP+MSCの集積についても慢性GVHD線維化部位で確認した。これらの結果はドナー由来ミスマッチMSCがドナー由来線維芽細胞の細胞源であり、慢性GVHDの線維化形成にかかわる可能性を示した。21年度はB10.D2(H-2d)マウスオスの骨髄細胞と脾臓細胞を、放射線照射後のBALB/c(H-2d)レシピエントマウスメスに移植し慢性GVHDモデルを作成した(Zhang Y, J Immunol.2002)。すでに涙腺、結膜、皮膚、肺、小腸、涙腺、唾液腺に人GVHD組織所見に酷似した経時的線維化の作成を確立し,毎回の移植において再現性を確認した。マウスGVHD涙腺導管周囲およびGVHD標的臓器各臓器にに多数のCD45陽性炎症性細胞浸潤を確認した。結膜排出導管周囲にコラーゲン産生細胞の指標のHSP47陽性線維芽細胞を検出し、同一部位にY-FISH signal陽性のドナー由来線維芽細胞を多数認めた。本研究で用いるマウス涙腺結膜組織には、今までに申請者が報告してきたGVHD病変の過剰な線維化、炎症性細胞浸潤、ドナー由来線維芽細胞の存在とその活性化の4点においてその所見が酷似して再現されていることを確認した。繰り返した実験で安定した結果が得られることを確認した。ドナー由来の線維芽細胞の細胞源の検証と眼GVHD発症と病態形成にかかわる役割について検証をすすめ線維芽細胞の細胞源について以下のように検証した。ドナー由来線維芽細胞の候補となる細胞源の除去移植を施行し細胞源除去を行わない標準の骨髄移植の移植前と3週と8週で比較解析し、単位面積あたりの線維化と線維芽細胞数の減少の有無および活性化の状態を比較した。その結果、各種幹細胞の除去移植をそれぞれ比較すると同種間葉系幹細胞除去移植を行うとGVHDの病的線維化が抑制されることが判明した。次に間葉系幹細胞が慢性GVHDの病的線維化に関与するか否かを検証するために、マウス骨髄中に存在する間葉系幹細胞を、単離してドナー間葉系幹細胞のみをドナー細胞から単離して移植し、標準の全骨髄細胞移植と比較した。その結果全骨髄移植と同様な線維化か生じることを確認した。間葉系幹細胞が慢性GVHDの発症の引き金になる可能性を見出しており、現在多方面からこの結果を検証している。病的線維化部位にはドナーとレシピエントの線維芽細胞がキメリズムを示しているため、レシピエント由来の細胞を検証し上皮由来線維芽細胞の存在も明らかにした。(Ogawa Y Shimmura S, et al. Am J Pathol 2009).間葉系幹細胞除去により大幅に線維化が抑制されることから上皮由来の線維芽細胞の活性化も同時に抑制する可能性がある。作成中のドナーB10.D2(H-2d)GFPマウスはバッククロスにより9代目をむかえており、準備段階で骨髄より、間葉系幹細胞、造血幹細胞、SP細胞をそれぞれ分離して、野生型ドナーマウスの全骨髄細胞と、GFPドナーマウスのGFP陽性各種骨髄幹細胞のそれぞれの分画を同時に移植し、準備段階として眼GVHD病変部でのGFP陽性骨髄幹細胞の局在、遊走部位および病態形成への経時的変化を検証中である。申請者は造血幹細胞移植患者涙腺GVHDと酷似する、マウスGVHDモデルを用いて、次の研究目標を達成することを目的とした。1)GVHDにおけるドナー由来線維芽細胞の細胞源の詳細な解明2)ドナー由来線維芽細胞による眼GVHDの発症機構と病態形成にかかわる役割3)GVHD炎症および線維化形成における分子機構の解明と治療法の開発GVHDにおけるドナー由来線維芽細胞の細胞源の解明に着手し、造血幹細胞、間葉系幹細胞由来である可能性を多方面から検討した。造血幹細胞、間葉系幹細胞のみを単離し、培養を経ずに新鮮間葉系幹細胞および造血幹細胞を移植して経過を観察した。レシピエントマウス涙液および組織学的検査による線維芽細胞の増殖過程の経時的解析によりGVHDによるドライアイや線維化の発症時期を正確に捉えることができた。

次に、ドナー由来線維芽細胞の候補となる細胞源の除去移植を施行し細胞源除去を行わない標準の骨髄移植と比較解析し、単位面積のドナー由来線維芽細胞数の減少の有無を比較した。代替の方法として、ドナーのB10.D2(H-2d)GFPマウス骨髄より、間葉系幹細胞、造血幹細胞、SP細胞をそれぞれ分離して、野生型ドナーマウスの全骨髄細胞と、GFPドナーマウスのGFP陽性各種骨髄幹細胞のそれぞれの分画を同時に移植し、眼GVHD病変部でのGFP陽性骨髄幹細胞の局在、遊走部位および病態形成への経時的変化を直接的に証明した。GFPとHSP47の共発現でドナー由来線維芽細胞を検出し、発症機構と遊走経路を含め解析した。病変部位に各種骨髄幹細胞をGFP細胞に置き換えて移植して、GFP陽性間葉系幹細胞由来の線維芽細胞が病変部位に多数集積していることが確認された。末梢血中のIL-6等のサイトカインの濃度は移植後3から4週時に著しい増加を認めた。造血幹細胞、間葉系幹細胞とGVHDの発症には関連性があると考えられた。今後発症時期の病態解明をすすめ、GVHDの治療や予防に貢献する可能性があると考える。