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保育士・教員養成における歌唱教育に資する子どもの自発的歌唱に関する研究

保育士・教員養成におけるより良い歌唱教育の根拠として「子どもがいかに歌おうとするか(子どもの自発的歌唱)」に関する研究をおこなった。乳幼児の5パターンの3音等時の音声について「長さ」「高さ」「抑揚」の三つの要素を変化させた加工音声を作成し,聴取実験をおこなった。その結果,短い音声より長い音声が,また低い音声よりは高い音声が,そして音声の末尾が上昇している音声が,歌らしく聞き取られることを明らかにした。また、韻律的分析に加えて音響的分析をおこない、音質評価システムによる非定常ラウドネス解析から、うた度の高い音声はシャープネスがラウドネス増大時に相対的に低い傾向を見出した。本研究「保育士・教育養成における歌唱教育に資する子どもの自発的歌唱に関する研究」は、それまで3年間同じメンバーの研究グループでおこなってきた「保育士・教員養成における音声・歌唱教育に資する乳幼児音声の分析的研究」の成果を発展させる研究であり、まず一方向として、これまでおこなってきた乳幼児音声の音響的分析をさらに詳細におこなうことを、さらに一方向として、これまで分析してきた月齢よりも少しずつ年齢をあげる、あるいはポイントを絞ってバリエーションを探るという二方向の方法論を用いて研究を発展させることを計画している。発展的研究の第一年目である当該年度では、上記両方向性をそれぞれ前進させた。第一の方向性については、これまで分析の題材としてきた3音音声の聴取テストにおける「うたと聞こえる」上位10位と下位10位の音声について、以下の通り結果をまとめた。(1)音声長:上位10位の音声長は下位10位の音声長と比較して有意に長い(p<.001)。(2)抑揚:上位10位に多く見られた音声の最後(3音目)が高くなるパタンが下位10位ではみられなかった。(3)音高・ピッチレンジ:上位10位の音声の方が3音の平均ピッチが高く、ピッチレンジが広いが、有意差はなかった。第3音については上位10位が有意に高かった(p<.005)。(4)末尾の上昇に関して特徴の異なる3種の事例を検出した。次に第二の方向性であるバリエーションについては、3音の最終部分が上昇する音声において、少なくとも3種のバリエーションが見られ、乳幼児の音声表現の多様性についてさらに検討する必要があることが確認された。子どもにとってのより良い音楽的環境(歌唱について)を考える上でのエビデンスを得、保育士・教員養成に資するという目的のため、乳幼児の音声、および自発的歌唱の音響的分析を継続して行っている。乳幼児の音声のうち、うた度(うたらしく聞こえる)評定の高い音声とうた度評定の低い音声の比較を行った結果、うた度の高い音声は、音声長が長く、比較的末尾が上昇している傾向がみられた。さらに、この評定に用いた音声の合成音声(3種の音声長、3種の末尾、2種の音高)を作成し再度評定を行った結果、生音の場合と同様、音声長が長く、末尾が上昇し、また音高が低いよりは高い音声のうた度が高いという結果が得られ、これを論文にまとめた。その他、幼児が「おかあさん」と発している音声(自発的歌唱音声を含む)の韻律的な特徴(音声長、シラブル長、ピッチの最高値、最低値、ピッチレンジ、抑揚など)を測定し、幼児の音声のバリエーションを明らかにした。幼児の音声は、非常に幅広い表現の中にあっても、多くは日本語の特徴を保持していることがわかった。これらの、子どもがどのように歌うようになっていくかを知る手がかりとして得られた知見を学会や講座で発表・紹介した。本年度から、自発的歌唱の延長線上にある「わらべうた」を幼稚園・小学校において用いる実践を行い、その後、当初の目的であった、授業外で自由にわらべうた遊びをする様子が見られるようになっている。また、ことばの豊かな表現として「オノマトペ」を用い、音声表現と身体表現を同時に行う実践も試みており、27年度にはこの実践についても考察を行いたい。26年度までに分析した乳幼児の歌唱様音声に関する研究をさらに進め,「うた」であると聞こえることの音声的特徴として,韻律的特徴に加え音響的特徴について分析をおこなった。これまで「3音音声」の聴取調査に基づく研究によって,「うた」は「ことば」と比較して,音声長が長い(定常に延ばされている),また末尾が上がることが多いという結論を得ていたが、「おかあさん」と発声している音声を用いた聴取テストの分析においても,うた評価の高い音声は相対的に短い機嫌良の範疇にありながら長い音声であり,「おかあさん」の語アクセントが下降しているにも関わらず,末尾の上昇傾向を含んでいた。これらにより,本研究において,歌うことと引き延ばし,末尾の上昇は関わりが大きいことを明らかにすることができた。これに加えて,ラウドネスとシャープネスの関係を音響分析した結果から,機嫌の悪い「おかあさん」と発声している音声は,機嫌良く「おかあさん」と発声している音声と比較して,1スペクトル変化が顕著である,2高い周波数成分が比較的多く含まれている,3周波数成分が重層的に現れている,また4シャープネスがラウドネス増大時に相対的に高いという特徴を持っていることを明らかにした。これらの研究により、音声の感情性を音響的に示す手がかりを得ることができたと考える。

これまでの研究結果を保育士教員養成に生かすために昨年度から実施している「わらべうた」実践や絵本のオノマトペを表現に発展させる実践は、継続しておこなっており、この実践から得られた、ことばのリズムと身体表現の関係における問題点などについて発表をおこなった。乳幼児の歌唱様音声の韻律的・音響的特徴に関する研究成果をまとめることができた(ベビーサイエンス15号など)。また子ども自発的な発声や歌唱を生かした保育・教育をおこなう実践(わらべうたとオノマトペを用いた実践)の回数を増やし,これらの映像分析から,実践の有用性と課題を示すことができた。本研究では、乳幼児の自発的な音声、および子どもの自発的歌唱を音声学的、音響的に分析し、ことばとうたの差異を聴取テスト等によって明らかにしたのち、「歌うこと」の音声的実態を解明し、「ことばを歌う歌唱(歌詞と旋律が結びついている歌唱)」やその元となる音声を子どもたちの素地として保育・教育の中で生かす方策を検討してきた。乳幼児音声データべース(NTT)の音声分析、および母子コミュニケーションの映像分析において明らかにしてきた歌唱様音声、自発的歌唱の実態に基づき、最終年度において我々は、日本語の表現拡大としての「かけ声」「唱えことば」「オノマトペ」「わらべうた」を用いた保育・教育の実践をおこなった。幼稚園と小学校において、わらべうたからの自発的表現、絵本の中のかけ声やオノマトペから音声身体表現を生み出す、また新たなオノマトペを創造するなどのプログラムを計画、実践し、結果を検討して、これについて発表、論文執筆をおこなった。これらの実践と発表により、日本語獲得児の表現活動の可能性とその指導のためのより良い方法論、教員の指導力の要件等について考察を加えた。子どもたちの音声表現の素地としてあるべき日本語の表現拡大の方向性、およびその表現における諸要素の関連性について、また保育・教育現場での実践の方法論についてこれまでの研究において明らかにしてきたが、保育士・教員養成においてこれらの研究結果をどのように汎化していくか、今後も継続して検討する必要がある。保育士・教員養成におけるより良い歌唱教育の根拠として「子どもがいかに歌おうとするか(子どもの自発的歌唱)」に関する研究をおこなった。乳幼児の5パターンの3音等時の音声について「長さ」「高さ」「抑揚」の三つの要素を変化させた加工音声を作成し,聴取実験をおこなった。その結果,短い音声より長い音声が,また低い音声よりは高い音声が,そして音声の末尾が上昇している音声が,歌らしく聞き取られることを明らかにした。また、韻律的分析に加えて音響的分析をおこない、音質評価システムによる非定常ラウドネス解析から、うた度の高い音声はシャープネスがラウドネス増大時に相対的に低い傾向を見出した。歌唱様音声の解析によって、「歌唱様」であることの韻律的特徴を示すことができた。当初計画していた歌唱様音声と自発的歌唱の連続性については、両音声のデータの抽出は進めているが比較、分析は27年度に行う予定である。研究成果を保育・教員養成に資するため、実践から得られた成果をもとに方法論をまとめる計画を進めている。今後、実践の映像分析を進めて問題点を明らかにし、より良い指導方法等をまとめていく予定である。音楽教育学26年度にやり残した、歌唱様音声と自発的歌唱の連続性に関する研究を行う。また、わらべうたとオノマトペを用いた授業実践の意義について考察し、まとめたいと考えている。第1年目である当該年度は、3年間の前研究をどのように発展させるかについて、当初検討に時間を要した。
追跡調査からみた腰椎椎間板ヘルニアの疾患感受性遺伝子の解明

目的:1)multidetector CTを用いて全脊椎におけるOPLLの実態調査、2)OPLLにおける全身の骨化巣の広がりと関連する全身因子、3)軟骨細胞におけるミード酸の役割の検討。結果:1)頚椎OPLL患者53.8%に胸椎および腰椎レベルのOPLLが、頚椎OPLL患者64.6%に胸椎および腰椎レベルのOLFが認められた。胸椎および腰椎OPLLは頚椎OPLLの連続型・混合型に合併する頻度が高く、広範な骨化巣は女性に多い。2)OPLL患者では血中脂肪酸のうちミリスチン酸、パルミチン酸が有意に高く、ミード酸は差がない。3)ミード酸の骨・軟骨代謝の役割は先行研究以上の結果は得られず断念した。【背景】腰痛の頻度は極めて高いが、その7080%が原因不明な非特異的腰痛とされ、診断や治療に難渋することがある。椎間板は非特異的腰痛の原因となる組織とされてきたが、その病態や経過に関しては不明な点が多い。今回我々は、若年者における椎間板変性をMRIで評価し、その自然経過に関して検討した。【方法】1996年から2003年まで本学看護学科に入学した看護学生のうち学生時に初回のMRI撮影を行い、就労後に2回目のMRI画像を入手可能であった86人を対象とした。椎間板変性の評価はL1/2からL5/S椎間板までの5椎間板をSchneiderman分類に従って評価し、そのgrade(14)の合計を点数化し、増加したものを椎間板変性の進行と定義した。初回撮影時に変性が全くなかった群(A群)と変性を認めていた群(B群)で変性進行に差があるかを検討した。【結果】86人のうち3人が男性、83人が女性で、MRI初回撮影時の平均年齢は20.9±0.40歳、平均経過観察期間は9.81±3.51年であった。初回撮影時の平均点数は5.64±0.86、2回目撮影時の平均点数は、6.37±1.30であり、有意差を認めた(p= 0.00045)。A群は58人であり、そのうち19人(32.8%)は変性の進行を認めた。B群は28人であり、そのうち18人(64.3%)は更なる変性の進行を認め、B群で有意な椎間板変性の進行を認めた(p= 0.0057, OR=3.69)【考察】腰痛の原因ともなりうる椎間板変性の発生因子には加齢、肥満、喫煙、スポーツによる力学的負荷といった環境的要因に加えて遺伝的要因もあると報告されている。今回の研究において20歳代前半で椎間板変性を有する場合、有しない者と比較し3.7倍椎間板変性が進行する結果が得られた。このことから椎間板変性が進行しやすい集団が存在する可能性が示唆された。【背景】椎間板は非特異的腰痛の原因となる組織で病態や経過に関しては不明な点が多い。我々は若年者の椎間板変性をMRIで評価し、その自然経過・変性進行に関する要因を検討した。また椎間板変性の進行と腰痛の関連についても調査した。【方法】本学の看護学生(1996年-2003年)のうち学生時に初回のMRI撮影を行い、就労後に再度MRI画像を入手可能であった86人を対象とした。椎間板変性の評価はL1/2からL5/S椎間板までの5椎間板をSchneiderman分類に従って評価した(grade(1-4)の合計を点数化,増加を椎間板変性進行と定義)。初回に変性が全くない群(A群)と変性を認めた群(B群)で変性進行を比較検討した。【結果】86人(3人男性、83人女性)の初回の平均年齢は20.9±0.40歳、平均経過観察期間は9.81±3.51年であった。初回の平均点数は5.64±0.86、2回目の平均点数は6.37±1.30であり、有意差を認めた(p=0.00045)。A群58人中19人(32.8%)は変性の進行を認めた。B群28人中18人(64.3%)は更なる変性の進行を認め、B群で有意な椎間板変性の進行を認めた(p=0.0057,OR=3.69)【考察】椎間板変性の発生因子に環境的要因と遺伝的要因ある。20歳代前半で椎間板変性を有する場合、有しない者と比較し3.7倍椎間板変性が進行する結果が得られた。よって椎間板変性が進行しやすい集団が存在する可能性が示唆された。また、妊娠経験群と妊娠非経験群との間で椎間板変性の進行に差は見られなかった。さらに椎間板変性の進行と特定の遺伝子多型について有意な関連は発見されなかった。以上を受け、これまで看護学生時代(平均20.5歳)に腰椎MRIを撮像した352人の椎間板変性程度と腰痛について調査した。その結果、L4-5椎間板における椎間板変性が腰痛と関連があり、Schneiderman分類で2度以上の椎間板変性があると3.09倍腰痛を有しやすいことが分かった(p=0.002, CI=1.36-7.04)。

他のレベルの椎間板変性は腰痛との関連が見られなかった。目的:1)multidetector CTを用いて全脊椎におけるOPLLの実態調査、2)OPLLにおける全身の骨化巣の広がりと関連する全身因子、3)軟骨細胞におけるミード酸の役割の検討。結果:1)頚椎OPLL患者53.8%に胸椎および腰椎レベルのOPLLが、頚椎OPLL患者64.6%に胸椎および腰椎レベルのOLFが認められた。胸椎および腰椎OPLLは頚椎OPLLの連続型・混合型に合併する頻度が高く、広範な骨化巣は女性に多い。2)OPLL患者では血中脂肪酸のうちミリスチン酸、パルミチン酸が有意に高く、ミード酸は差がない。3)ミード酸の骨・軟骨代謝の役割は先行研究以上の結果は得られず断念した。医歯薬学これまで以下のことが達成できた。1)80名を超える学生を平均9.8年フォローアップできた。人数は当初予想していたものをやや下回っている。できれば100名を検討したいと考えている。これからも学生時代にMRIを撮像している対象者にコンタクトをとり、同意を得た上で研究に協力して頂くように努めたい。フォローアップ期間が9.8年であったことは非常に評価できる点であると考えている。若年者に対するおよそ10年に渡るフォローアップはこれまで例がないこと、また椎間板変性が進行するであろうと予想される十分な期間を経ていることがその理由である。3)腰痛に関するデータを採取できた。対象者全員からアンケートにより腰痛に関するデータを採取した。学生時代にも同様な腰痛に関するアンケートを施行しており、これを比較することで有用な情報が得られると考える。今後は椎間板変性の進行と腰痛の関連について検討して行きたい。対象者の数を増やしデータの正確性を期したいと考えている。今後の研究として主に以下の2つを考えている。1)MRIによって評価された椎間板変性の進行が腰痛と関連しているか?腰痛に関するアンケート調査を分析し、腰痛がフォローアップ期間に増悪しているか否かを調査する。そのデータと椎間板変性の進行の有無の関連を調べ、椎間板変性が進行する際に腰痛が生じているか否かを検討する。2)椎間板変性進行に関する疾患感受性遺伝子を探る。対象者からはすべて同意のもとに学生時代にDNAが採取されている。これを用いて疾患感受性遺伝子を検討する。これまでに我々はADR、AGC、CLIP、COL9、ASPN、SKT、CHS3の遺伝子が腰椎椎間板疾患(腰椎椎間板変性およびヘルニア)に関連することを報告している。これらはすべてSNP(single nucleotide polymorphism)の検討である。このデータを基にさらに新規の遺伝子を含めて、椎間板変性進行に関する疾患感受性遺伝子を探ることを計画している。当初の計画通りに進行しているが、集まった対象者は86名と目標としていた100名を下回ったことから使用額に余りが生じた。今後は以下のように使用する予定である。1)対象者をできるだけ増やすための資金:学生名簿を使用して直接対象者に連絡をしていた。今後はネット等の通信網を活用し、数を増やしたいと思っている。よってそのための謝金、MRI撮像費が必要である。2)椎間板変性進行に関する疾患感受性遺伝子を探るための資金:これまでに報告がある疾患感受性遺伝子を対象者で調べて、椎間板変性の進行についてもこれらのSNPは関連性があるか否かを探る。また新規の遺伝子もあわせて検討したいと考えている。3)学会発表および論文作成のための資金:これまでのデータは昨年全国学会(日本腰痛学会)で発表を行った。
水素のみを副生成物とする炭素-炭素結合生成反応の開発

平成24年度は本研究の最終目標である水素のみを副生成物とする触媒的炭素-炭素結合生成反応の開発を、前年度に開発した一価のイリジウム-ジエン触媒と三価のロジウム-シクロペンタジエニル触媒を用いて行った。その結果これまでに報告例の少ないフェロセン誘導体の炭素-水素結合活性化反応の開発に成功した。一価のイリジウム-ジエン触媒を用いた場合、ピリジル基を配向性置換基として持つフェロセン誘導体の炭素-水素結合を活性化することに成功し、この活性化によって生じる三価のイリジウム-フェロセニル-ヒドリド中間体がアルケンやアルキンとの反応によって1,2,5-三置換フェロセン誘導体を与えることを見出した。また配向性置換基としてピリジル基より嵩高いイソキノリル基を用いることによって面不斉を有する1,2-二置換フェロセン誘導体を高選択的に合成することに成功した。この反応を光学活性ジエン配位子を用いることで理論上、工業的に重要な光学活性1,2-二置換フェロセン誘導体を合成することができる。また、ボスフィンオキシドを配向性置換基として用いた場合にも面不斉を有する1,2-二置換フェロセン誘導体を高選択的に合成することに成功した。ホスフィンオキシドはシラン化合物により容易に有用なホスフィン配位子に化学変換することができるため、この手法は光学活性ホスフィン配位子の合成に利用できる。三価のロジウム-シクロペンタジエニル触媒を用いた場合、HBF_4の存在下イミノ基を配向性置換基として持つフェロセン誘導体の炭素-水素結合を活性化し、イソシアネートとの反応によって高収率で1,2-二置換フェロセン誘導体を与えることを発見した。また配向性置換基として光学活性なオキサゾリル基を用いた所、この触媒系が高ジアステレオ選択的に光学活性1,2-二置換フェロセン誘導体を生成することを発見した。この反応によって生成するアミド基を還元することで光学活性な二座のアミン配位子の合成に利用できる。これら二つの反応はホスフィン配位子を用いる必要がないため、アミン配位子の存在下でも炭素-水素結合活性化反応を進行させる可能性があり、今後の研究において利用できる。平成23年度前半は本研究の最終目標である水素のみを副生成物とする触媒的炭素-炭素結合生成反応の開発を、これまでの研究で用いられてきた一価のイリジウム触媒とホスフィン-アミン配位子を用いて行った。その結果、ボスフィン-アミン配位子の存在下では想定反応機構の最初のステップである基質の炭素-水素結合活性化反応が進行しないということが分かった。そこで平成23年度後半はホスフィン配位子を用いない高活性な炭素-水素結合活性化触媒を開発することを目的として、これまでに報告例の少ないフェロセン誘導体の炭素-水素結合活性化反応の開発に取り組んだ。まず、ホスフィン配位子の代替としてシクロペンタジエニル配位子(Cp*)を用いた触媒系の探索を行った所、三価のカチオン性ロジウム触媒である[RhCp*(OAc)2(H20)]がイミノ基を配向性置換基として持つフェロセン誘導体の炭素-水素結合を活性化し、イソシアネートとの反応によって高収率で1,2-二置換フェロセン誘導体を与えることを発見した。この反応は酸化的付加を伴わない、求電子置換反応による炭素-水素結合活性化反応であると考えられる。一方で、ホスフィン配位子の代替としてジエン配位子を用いた触媒系の探索を行った所、一価のカチオン性イリジウム触媒である[Ir(cod)2]BARFがピリジル基を配向性置換基として持つフェロセン誘導体の炭素-水素結合の活性化し、アルケンやアルキンとの反応によって1,2,5三置換フェロセン誘導体を与えることを見出した。また、この反応の反応機構解析を低温NMRを用いて行ったところ、予想される基質のイリジウムへの配位に続く基質の酸化的付加によるイリジウムヒドリド種の観察に成功した。さらに、このヒドリド種がアクリル酸エチルと反応し触媒反応で観察されたものと同じ生成物を与えることも確認できた。これら二つの反応はポスフィン配位子を用いる必要がないため、アミン配位子の存在下でも炭素-水素結合活性化反応を進行させる可能性があり、今後の研究において利用する。また、ボスフィンオキシドを配向性置換基として用いた場合にも面不斉を有する1,2-二置換

フェロセン誘導体を高選択的に合成することに成功した。ホスフィンオキシドはシラン化合物により容易に有用なホスフィン配位子に化学変換することができるため、この手法は光学活性ホスフィン配位子の合成に利用できる。三価のロジウム-シクロペンタジエニル触媒を用いた場合、HBF_4の存在下イミノ基を配向性置換基として持つフェロセン誘導体の炭素-水素結合を活性化し、イソシアネートとの反応によって高収率で1,2-二置換フェロセン誘導体を与えることを発見した。また配向性置換基として光学活性なオキサゾリル基を用いた所、この触媒系が高ジアステレオ選択的に光学活性1,2-二置換フェロセン誘導体を生成することを発見した。この反応によって生成するアミド基を還元することで光学活性な二座のアミン配位子の合成に利用できる。これら二つの反応はホスフィン配位子を用いる必要がないため、アミン配位子の存在下でも炭素-水素結合活性化反応を進行させる可能性があり、今後の研究において利用できる。当初の研究計画にあったイリジウム触媒とホスフィン-アミン配位子を用いた反応系では目的とする反応が進行しないということが判明した。しかしながらその後、ホスフィン配位子を用いない反応系の開発に成功し、今後この反応形を用いて最終目標である水素のみを副生成物とする触媒的炭素-炭素結合生成反応の開発を行うことができると考えているため。今後は発見されたロジウムとイリジウム触媒を用いた反応の開発を行う。ロジウム触媒に関してはヒドリド源としてR3SiHやHBpinを用いることによって最終目標が達成できると考える。イリジウム触媒に関してはジエン配位子をエン-アミン配位子に置き換えることによって生成するイリジウムヒドリド種からの水素の生成を促進すると考える。この場合、生成する水素が配位子を水素化してしまう可能性がある。この問題点は水素受容体としてH-Ir-N-H種に対する反応性が高いアセトンを溶媒として用いることによって回避できると考える。
分類空間のホモトピー論

平成9年度平成10年度において、研究代表者および分担者全員が研究課題に直接・間接に関連する研究活動を精力的に行った。その成果として様々な結果が研究論文や講演等のかたちで表わされた。ここでは、それらについて概説する。研究代表者はホモトピー論的手法によるLie群論の一般化可能性に関する研究を行った。分類空間の代数構造、幾何構造及び位相構造についてコホモロジー論等を用いて調べた。具体的には、分類空間のカテゴリーでのペアリングの理論の研究を継続し、p-コンパクト群、特にp-toral群の持つ特別な性質についての研究結果を得た。この研究は、群の積からの準同型に関するホモトピー論的特徴付けとなるもので、ある種の写像空間に関する情報がその応用として得られる。その内容は、weak epimorphismの場合に得られた結果を2通りの方法でmonomorphismの場合に拡張することや、コンパクトLie群とp-コンパクト群の写像空間レベルでの差異に関する研究などであった。BGのp-完備化のループ空間がp-compact toral群であるための必要十分条件を得た。また、K-理論を用いて、ユニタリー群の分類空間のコホモロジー論とWeyl群の関係、そしてSteernod代数上のunstable algebraの実現問題についての研究結果も得た。更に、有限loop空間の位相的性質に着目して、主にfake Lie群などを調べるgenus問題を研究した。また、分担者3名は、Whitehead積の一般化とペアリングの間のtransformationという概念の導入と応用およびその双対、情報幾何において、確率分布の空間に与えられる幾何構造、Coxeter群のコホモロジー、閉曲面の写像類群とその部分群のコホモロジーなどをそれぞれ研究した。これらの研究は分類空間のホモトピー論の研究にとって重要であった。上記の諸問題に関する研究の結果、研究代表者および分担者を著者・共著者とする13編の論文が完成した(うち9編既出版,4編刊行予定)。「分類空間のホモトピー論」に関する研究をこのように進展させることができたのは2年間の科学研究費補助金の賜である。その支給に対し深く感謝する。研究代表者および分担者全員が研究課題に直接・間接に関連する研究活動を精力的に行った。分類空間の代表的構造及び位相的構造についてファイバー空間のコホモロジー論等を用いて調べた。具体的には、分類空間のカテゴリーでのpairingの理論の研究を継続し、p-コンパクト群、特にp-toral群の持つ特別な性質についての研究結果を得た。その内容は、weak epimorphsimの場合に得られた結果をmonomorphsimの場合に拡張することなどであった。

上記の問題や一般化されたWhitehead積及びCoxeter群のコホモロジーに関する研究の結果、研究代表者・分担者を著者・共著者とする6編の論文・プレプリントが完成した(うち3編既出版、2編刊行予定)。「分類空間のホモトピー論」に関する研究をこのように進展させることができたのは科学研究費補助金の賜である。その支給に対し深く感謝する。研究代表者および分担者全員が研究課題に直接・間接に関連する研究活動を精力的に行った。その成果として様々な結果が研究論文や講演等のかたちで表わされた。ここでは、それらについて概説する。研究代表者はホモトピー論的手法によるLie群論の一般化可能性に関する研究を行った。分類空間の代数構造、幾何構造及び位相構造についてコホモロジー論等を用いて調べた。具体的には、分類空間のカテゴリーでのペアリングの理論の研究を継続し、p-コンパクト群、特にp-toral群の持つ特別な性質についての研究結果を得た。この研究は、群の積からの準同型に関するホモトピー論的特徴付けとなるもので、ある種の写像空間に関する情報がその応用として得られる。その内容は、weakepimorphismの場合に得られた結果を2通りの方法でmonomorphismの場合に拡張することや、コンパクトLie群とp-コンパクト群の写像空間レベルでの差異に関する研究などであった。また、K-理論を用いて、ユニタリ一群の分類空間のコホモロジー論とWeyl群の関係、そしてSteernod代数上のunstable algebraの実現問題についての研究結果も得た。更に、有限loop空間の位相的性質に着目して、主にfake Lie群などを調べるgenus問題を研究した。また、分担者3名は、ペアリングの間のtransformationという概念の導入と応用、情報幾何において、確率分布の空間に与えられる幾何構造、閉曲面の写像類群とその部分群のコホモロジーなどをそれぞれ研究した。上記の諸問題に関する研究の結果、研究代表者および分担者を著者・共著者とする9編の論文が完成した(うち6編既出版、3編刊行予定)。
化学トレーサーによる深層循環の解析

研究航海としては、1988年6月8日7月11日まで白鳳丸KH-88-3次航海を行い北太平洋、ベーリング海においてCTD観測、各種採水、粒状物採取、採泥を行った。これら試料の分析は各分担者によって現在進められている。さらに淡青丸を用いたKT-88-17次航海では東シナ海から海水試料を採取し、またKT-88-19次航海では公募班(代表平木)と協力して、栄養塩自動分析の比較を行い、新しい世代の核種の実用化のメドを得た。また1987年白鳳丸KH-87-2次航海で得られたかなりの試料について分析を完了し、いくつかの新しい知見を得た。まず沖縄舟状海盆深層水の化学的特徴をフィリピン海のそれと比較すると、温度、酸素、栄養塩はいずれもフィリピン海の深度約1000m付近に相当する均質は海水で占められているが、塩分は敷居深度より深いフィリピン海の深度約1500mに相当する。海盆深層水には^<137>Csが殆ど検出されないことから表層の海水が浸入しているとは考えられないので、深層水の形成過程について更に考察する必要がある。また東シナ海、黄海の^<228>Raと^<226>Raの分布を測定した。^<228>Ra/^<226>Ra比が陸棚の冷水では黒潮の表層水のそれに比し、40倍も高いことを利用し、対島暖流水の20%がこの陸棚の海水に由来していることをみつけた。その結果から東シナ海陸棚水の平均滞留時間は2、3年と計算される。また、沖縄周辺黒潮域の表層水では他の海域では見られない大きな^<210>Pbに対する^<210>Poの不足が観測されその原因究明が必要である。加速器を用いた^<14>C測定の成果としては、1968年採取の太平洋縦断面における試料の測定をほぼ完了し、1972-73年のGEOSECSの結果との対比が可能となった。この期間に大気から海洋へかなりの^<14>Cが移行していることが明らかになった。またPuについては、その存在状態や分析の際の同位体交換速度などに関して新しい進展がみられた。
GIS/RSを利用した東南アジアにおける急成長都市群の人口分布予測

高精細衛星画像データ(LANDSATやALOS)を用いて大都市圏および周辺地域における都市化度を時系列的に空間可視化し,その汎用的手法を確立した.さらに,大都市圏の拡大に伴う都市化地域の人口増を定量化し,その空間的メカニズムを探った.人口分布の空間的分散度は,Global Moran's I and Geary's Cなどの測度を用いて測定した.これらの指標は都市構造パターンの把握にきわめて有効であることが確かめられた.都市の緑度(グリーンネス)は,リモセン・データのNDVIから導出した.この尺度の活用は,植生が豊かな東南アジアの都市群では有効である.また,つくば市を事例にグリーンネスを把握する手法を開発するとともに,WebGISを構築し,公開した.2012年度はとくにこれまでの分析結果をまとめ,都市域確定に関する学会発表を行うとともに,リモートセンシング技術を活用した都市発展プロセスの把握方法について論文を執筆した.さらに,アムステルダムで開催されたWorld Geospatial Forum 2012において,都市地域における緑地環境,歩行環境(Walkability)を評価する手法の有効性について研究発表を行った(ルウイン担当).この発表で,我々はGeospatial World Excellence Awardを受賞した.WebGISを用いてその結果をリアルタイムで把握可能にし,一般市民が手軽に利用できるようにしたシステムを構築した点が評価された.また村山は,ドイツで開催されたIGCケルン大会において(8月25日から31日),構築したWebGISを地理学者に紹介し,好評を博した.東南アジアでは,農村から大都市への人口移動が加速しているが,この社会増加に自然増加(出産数の増加)が加わって,過剰都市化が大きな社会問題に浮上している.とくにプライメイトシティ,すなわち首位卓越都市では,急激な人口集中が交通混雑,土地の細分化,水資源の不足などの都市環境悪化をもたらし,アーバンスプロールやスラム化を引き起こしている.このような状況を踏まえ,本年度は,発展途上にある首位卓越都市ヤンゴンを対象に,1980年代以降の都市化の空間的プロセス解明を課題とした.具体的には,高精細衛星画像データ(LANDSATやALOS)を用いてヤンゴン大都市圏および周辺地域における住宅の水平的拡大,都心部における建物の垂直的拡大を時系列的に可視化することを目的に,現地で土地利用に関するフィールドワークを実施し,住宅立地や都市機能が集積するメカニズムをさぐった.さらに本年度は,リモートセンシングとGISを駆使して,土地利用の変化,緑地環境の変化,都市容積の変化などをLANDSAT衛星画像データから分析する手法を開発した.NDVIを算出し,それを地図化して空間分布を捉えるとともに,時系列分析により,緑地空間の変容を定量的に解析することが有効であり,人口密度の導出については,DEMとDSMとの差分から建物の高さを推定し,これを床面積に乗じて,建物の容積を推定する手法が効果的であることがわかった.本研究で確立した方法は,LWINと村山の共著で国際学術雑誌に投稿した.現在,市域の空間的範囲(境界)を確定する汎用的な方法を構築中であり,次年度は,大都市圏の拡大に伴う都市化地域の人口増とその空間的メカニズムを明らかにしたい.昨年度の研究計画を継続し,高精細衛星画像データ(LANDSATやALOS)を用いて大都市圏および周辺地域における住宅の水平的拡大,都心部における建物の垂直的拡大を時系列的に可視化する方法を検討した.さらに,今年度は大都市圏の拡大に伴う都市化地域の人口増とその空間的メカニズムを探った.2011年12月にはヤンゴンとバンコックに出向き,共同で土地利用変化に関するフィールドワークを実施し,大都市圏内で住宅立地や商業機能,工業団地などが集積していく過程をさぐった.また,市域の空間的範囲(境界)を確定する汎用的な方法も検討した.土地利用項目の変化にもとづき都市化の進展度が推定でき,GISとRSを併用して将来の人口分布が予測できる可能性を確認した.最近のリモートセンシング技術の進歩はめざましく,解像度の高い衛星画像データが安価に提供されるようになったが,これらのデータは,時には都市化や都市構造の研究に不向きの場合があることがわかった.高解像度故に建物周辺の施設や影がバイアスになり,建物分布を適格に表現できないことが多々みられた.適切な補正が求められることが明らかになった.土地利用の表現方法にはラスタ形式とベクタ形式が知られているが,発展途上国の都市化研究ではベクタ・データの入手は難しく,ラスタ形式のリモセンデータに頼らざるを得ない状況が浮かび上がった.都市化の速度や人口集積プロセスに関してはGISとRSを組み合わせたアプローチが欠かせない.共同研究の成果は地理情報システム学会および地球惑星科学連合大会で発表するとともに,IGISやCUESなどの国際学術雑誌に投稿し,受理された.高精細衛星画像データ(LANDSATやALOS)を用いて大都市圏および周辺地域における都市化度を時系列的に空間可視化し,その汎用的手法を確立した.さらに,大都市圏の拡大に伴う都市化地域の人口増を定量化し,その空間的メカニズムを探った.人口分布の空間的分散度は,Global Moran's I and Geary's Cなどの測度を用いて測定した.これらの指標は都市構造パターンの把握にきわめて有効であることが確かめられた.都市の緑度(グリーンネス)は,リモセン・データのNDVIから導出した.

この尺度の活用は,植生が豊かな東南アジアの都市群では有効である.また,つくば市を事例にグリーンネスを把握する手法を開発するとともに,WebGISを構築し,公開した.2012年度はとくにこれまでの分析結果をまとめ,都市域確定に関する学会発表を行うとともに,リモートセンシング技術を活用した都市発展プロセスの把握方法について論文を執筆した.さらに,アムステルダムで開催されたWorld Geospatial Forum 2012において,都市地域における緑地環境,歩行環境(Walkability)を評価する手法の有効性について研究発表を行った(ルウイン担当).この発表で,我々はGeospatial World Excellence Awardを受賞した.WebGISを用いてその結果をリアルタイムで把握可能にし,一般市民が手軽に利用できるようにしたシステムを構築した点が評価された.また村山は,ドイツで開催されたIGCケルン大会において(8月25日から31日),構築したWebGISを地理学者に紹介し,好評を博した.昨年度から実施してきた衛星画像解析,フィールドワークによって,本年度はTsukuba Geoenvironmental Sciencesに研究成果を公表することができた.各種の衛星画像と建物データを組み合わせると,都市化の進展度を的確に推定できることが確かめられた.申請段階では,ビルや家屋など建物一つ一つの人口数を算出・予測し,都市人口密度の推定を目標に据えた.しかし,欧米諸国と異なり発展途上国では,建物が複雑に入り組み密集しており,的確に居住密度を導き出すのは容易ではないことが明らかになった.GIS・RSや衛星画像の利用は,ミクロ地域よりも,大都市圏全体,すなわちマクロ・メソスケールにおける人口の空間分布を推定するのにより威力を発揮すると考えられる.
中脳神経回路網の機能再生を目指した新規治療戦略の確立

パーキンソン病は、中脳ドパミン神経回路網の選択的な脱落・変性によって引き起こされる神経変性疾患であり、現行の医療制度では、薬物治療や脳深部刺激療法などの対処療法が主流であるが、幹細胞移植治療や遺伝子治療などの新しい治療法の開発が進んでいる。本研究課題では、このパーキンソン病の治療に焦点をあて、薬、多能性幹細胞およびin vivodirect reprogrammingを有機的に融合させた発想・手法をもとに、失われた中脳ドパミン神経回路網の機能的な再生および形態的な再生を促す新規治療法の開発となる基盤研究を進める。さらには将来の臨床応用へ向けた根拠となる基盤の創成を目指す。
急性炎症の初期免疫応答におけるNFkB経路と生体侵襲の評価

転写因子NFkBは、免疫応答や炎症、細胞増殖、細胞生存、癌化等の制御において中心的な役割を担う。本研究では、NFkBを介する炎症応答において細胞内二次メッセンジャ代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)が果たす役割を解析した。その結果、ζ型DGKノックアウト細胞をTNF-α刺激すると、1)NFkB p65サブユニットは迅速に細胞質から核内に移行する、2)p65のリン酸化が増加する、3)NFkB転写活性が亢進する、ことを明らかにした。これらの結果は、DGKζはNFkB経路に抑制的に働き、DGKζの発現減少により炎症応答が促進する可能性を示唆する。外科的手術、種々の要因による人工呼吸管理、および重症肺炎等において集中治療が選択される場合、その過程における生体炎症の程度が病態の予後に大きな影響を与えることが少なくない。現在の周術期モニターシステムは、薬物の投与時間と連動して血圧や血ガス等の変動を経時的にモニタリングすることを可能にしているが、惹起される炎症応答は個体により大きく異なるので、生体細胞を用いて炎症等を定量的に解析することが出来れば、生体急性炎症メカニズムの解明ひいては臨床応用に非常に有用と思われる。生体侵襲においては、炎症応答を司る主要転写因子NF-kB(Nuclear factor-kappa B)経路が重要な役割を果たす。申請者らの研究グループは細胞内情報伝達機構において、細胞内二次伝達物質ジアシルグリセロール(DG)のリン酸化酵素DGキナーゼ(DGK)に関する機能解析に従事してきた。本研究では、実験動物モデルを用いて臨床医学現場における周術期急性炎症応答をシミュレートし、DGKファミリーならびにNF-kBを指標として、生体急性炎症とその後の回復過程を解析するための実験を行う。まず本年度は、HeLa細胞およびマウス由来のマウス胎児線維芽細胞(MEF)を用いて、NFkB転写経路を解析する実験系を構築した。その結果、DGKζの発現を抑制することにより、NF-kB転写経路が活性化され、NF-kBにより転写調節を受けるTNFαやRANKLのmRNA発現が増加することを明らかにした。本研究では、炎症応答のマスター転写因子とされるNF-kBの制御機構について、申請者らがこれまで取り組んで来た細胞内情報伝達制御因子DGKファミリーに焦点を当て、急性炎症応答の分子機構の解明を目的としている。本年度は、これまで行って来た実験系を整理し、培養HeLa細胞におけるDGKζのノックダウン実験系およびDGKζ-KOマウスから作製したMEF細胞系を用いて、NF-kB経路解析のための実験系を構築した。まず、NF-kBの転写活性を担う主要サブユニットであるp65の細胞内局在解析、それを制御するIKK (Inhibitory kappa B kinase)の発現解析、そしてNF-kB転写活性を測定するルシフェラーゼアッセイ系を整備した。その結果、DGKζ発現減少により、NF-kB経路が活性化されることが明らかとなった。炎症応答は個体により大きく異なるので、生体細胞を用いて炎症等を定量的に解析することが出来れば、生体急性炎症メカニズムの解明ひいては臨床応用に非常に有用と思われる。生体侵襲においては、炎症応答を司る主要転写因子NF-kB経路が重要な役割を果たすことから、申請者らの研究グループは、細胞内二次伝達物質ジアシルグリセロール(DG)のリン酸化酵素DGキナーゼ(DGK)によるNF-kB制御機構を解明するため、生体急性炎症とその後の回復過程を解析するための研究を行ってきた。そして、ゼータ型DGK(DGKζ)の発現を抑制することにより、NF-kB転写経路が活性化され、その転写調節を受けるTNFαやRANKLのmRNA発現が増加することを報告してきた。本年度はさらに検討を進め、新規DGKζ結合蛋白として同定したNucleosome assembly protein 1 (NAP1) -like 1 (NAP1L1)およびNAP1-like 4 (NAP1L4)がNF-kB転写活性に対して及ぼす影響をsiRNAノックダウン実験により解析した。NF-kBはIkBαと結合し細胞質に係留されているが、TNF-α刺激によってIBαが分解されると核内に移行し、転写活性を発揮する。本年度の研究から、NAP1L1ノックダウン細胞においては、ルシフェラーゼアッセイにてNF-kB転写活性が減少することが明らかとなった。この時、ウェスタンブロット解析によりIkBα分解が抑制されることからNAP1L1の減少によりNF-kBは細胞質に係留されやすくなると考えられた。一方、NAP1L4ノックダウン細胞では、IkBα分解およびNF-kB転写活性に対する影響は認められなかった。以上より、DGKζ結合蛋白はNF-kBに対して異なる作用を及すことが明らかとなった。これまで、DGKζのノックダウン実験系およびDGKζ-KOマウスから作製したMEF細胞系を確立し、DGKζ発現減少によりNF-kB経路が活性化されることが明らかにしてきた。本年度はこれまでの研究を発展させ、新規DGKζ結合蛋白NAP1L1およびNAP1L4がNF-kB経路に及す影響を解析し、着実な進展が認められた。

炎症応答は個体により大きく異なるので、生体細胞を用いて炎症等を定量的に解析することが出来れば、生体急性炎症メカニズムの解明ひいては臨床応用に非常に有用と思われる。生体侵襲においては、炎症応答を司る主要転写因子NF-kB経路が重要な役割を果たすことから、申請者らの研究グループは、細胞内二次伝達物質ジアシルグリセロール(DG)のリン酸化酵素DGキナーゼ(DGK)によるNF-kB制御機構を解明するため、生体急性炎症とその後の回復過程を解析するための研究を行ってきた。これまでの研究により、1)ゼータ型DGK(DGKζ)の発現を抑制することによりNF-kB転写経路が活性化され、その転写調節を受けるTNFαやRANKLのmRNA発現が増加すること、2)新規DGKζ結合蛋白として同定したNucleosome assembly protein 1 (NAP1) -like 1 (NAP1L1)およびkNAP1-like 4 (NAP1L4)がNF-kB転写活性に対して及ぼす影響を解析した結果、NAP1L1ノックダウン細胞においては、ルシフェラーゼアッセイにてNF-kB転写活性が減少することが明らかとなった。本年度の研究では、このNFkB制御機構におけるNAP1L1の役割をさらに詳細に解析し、NAP1L1ノックダウン細胞では、TNFα刺激後、抗アポトーシス作用をもつMcl-1の遺伝子転写が選択的に抑制されること、そしてその結果、ミトコンドリア膜電位が減少しアポトーシスが促進することを新たに見出した。その他、NF-kBと同様に、炎症応答に重要な役割を果たすp53についても研究を進めており、NAP1L1およびNAP1L4がp53の選択的な細胞応答にも関与する可能性が示唆されてきた。転写因子NFkBは、免疫応答や炎症、細胞増殖、細胞生存、癌化等の制御において中心的な役割を担う。本研究では、NFkBを介する炎症応答において細胞内二次メッセンジャ代謝酵素ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)が果たす役割を解析した。その結果、ζ型DGKノックアウト細胞をTNF-α刺激すると、1)NFkB p65サブユニットは迅速に細胞質から核内に移行する、2)p65のリン酸化が増加する、3)NFkB転写活性が亢進する、ことを明らかにした。これらの結果は、DGKζはNFkB経路に抑制的に働き、DGKζの発現減少により炎症応答が促進する可能性を示唆する。今後は、DGKζに引き続き、DGKεとNF-kB経路の関連性を追求する予定である。すなわち、DGKεにおいても、ノックダウン細胞およびDGKε-KOマウスから樹立したDGKε-KO MEF細胞を準備し、NF-kB経路の詳細な検討を行う。また、個体レベルの応答を解析するために、KOマウスを用いた炎症モデルの予備実験も施行する。今後はさらに研究を進め、NF-kB経路に対するNAP1L1およびNAP1L4の作用の違いがどのようにして生じるのか、またNAP1L1によって制御されるNF-kB誘導遺伝子の同定を試みる予定である。麻酔科学NF-kB転写活性の測定に関連して、新規実験として取り組んだChiPアッセイの確立に時間を要してしまったため。
細胞分化・細胞増殖のリセット制御機構の解析

出芽酵母の二倍体細胞は減数分裂を行い、環境条件に耐性を持つ一倍体の子嚢胞子を形成する。この過程は、栄養増殖細胞が細胞形態のまったく異なる胞子へと変化する、酵母の細胞分化の過程で、定常期(静止期)の細胞で窒素源の枯渇が起きたときに開始し、500以上の胞子形成特異的な遺伝子が一定の順序で逐次的に発現することによって進行する。本研究は、出芽酵母をモデルとし、増殖から分化への切り替わりの機構を明らかにすることを目的としている。本年度の研究では、以下の点を明らかにした。(1)分化開始のキー遺伝子であるIME2の転写開始の制御における、クロマチン構造変換の機構を解析し、転写因子Ime1が結合するURS1配列の領域でのヒストンアセチル化がIme1の安定な結合に働き、きらにIme1がクロマチン再編因子RSCをリクルートしてTATA配列をマスクしていたヌクレオソームを移動させることで転写が開始することを明らかにできた。(2)URS1配列の領域のヒストンアセチル化は、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の存在下に起こることを発見し、この機構を解析した結果、HDACの活性を抑圧する機構が働いてヒストンアセチル化レベルの上昇が起こることを明らかにした。またこのHDACの構成的な存在は、IME2の発現のタイミングの決定に重要な働きをしていることを明らかにした。(1)分化開始のキー遺伝子であるIME2のクロマチン構造変換を介した転写開始の制御に、ヒストンアセチル化と、クロマチン再編因子RSCが重要な働きをすることを明らかにし、IME2プロモーター領域におけるクロマチン構造変化と、各転写因子がこの領域に結合する様態を明らかにできた。(2)RSCの活性サブユニット、Nps1の変異株、ならびにRSCの他の構成因子の変異株の解析から、RSCは初期遺伝子遺伝子群の活性化だけでなく、胞子形成過程の後期にも必要であることを見出した。(3)変異株の胞子形成過程における遺伝子発現を、マイクロアレイ法を用いて解析し、この株では中後期に発現し、胞子の形態形成に働く一群の遺伝子の転写が低下し、また後期に発現する遺伝子の発現時期が異常になることを明らかにした。
分裂酵母のオルガネラ輸送シグナルを用いた異種タンパク質生産システムの構築と実用化

分裂酵母の異種タンパク質発現系を構築するために以下の成果を得た。(1)これまで使用されてきたウラシルやロイシンの分裂酵母栄養要求性マーカーの他に新たにリジン、アルギニン、アデニンなど複数の栄養要求性を保持した分裂酵母株を構築することができた。(2)分裂酵母のイオントランスポーターであるpmr1遺伝子を破壊した株を作成し、本破壊株が分裂酵母のN-結合型糖鎖のみならず、O-結合型糖鎖の付加にも欠損を示すことを明らかにした。また旭硝子の浜博士(分担者)との共同研究により、異種タンパク質をpmr1破壊株を用いて生産させたところ、実際に分泌生産が向上することが認められた。(3)分裂酵母のO-結合型糖鎖の付加に関与するマンノーヌ転移酵素遺伝子を3つ同定した。これらの遺伝子破壊株が胞子形成欠損や温度感受性など様々な表現型を示すことを明らかにした。また実際に細胞表層のO-結合型糖鎖の組成が野生株と異なっていることを確認した。(4)分裂酵母の液胞局在ATPアーゼの欠損株を取得した。本破壊株は液胞の酸性化に欠損を示し、液胞タンパク質輸送やエンドサイトーシスなどめ細胞内タンパク質輸送経路に欠損を示すことを明らかにした。(5)分裂酵母の全ゲノムから出芽酵母の液胞タンパク質輸送に関与するVPS遺伝子と相同性の高い遺伝子を同定して、これらの遺伝子破壊株を50以上作成した。またこれらの破壊株で液胞タンパク質が細胞表層へとミスソートしていることを確認した。阪井(分担者)らはCandida属酵母の主要なプロテアーゼであるプロテアーゼAとBを破壊した株を構築し、これらの株で異種タンパク質を生産した場合にはタンパク質の分解を抑えて生産性の向上が認められることを明らかにした。また高等動物のプロテアーゼであるカテプシンCを生産させてその細胞内局在などを明らかにした。竹川(代表者)らは分裂酵母においてカルボキシぺプチダーゼ(CPY)が液胞へと輸送される経路(CPY経路)以外にも液胞への輸送経路が存在するかについて解析を行った。出芽酵母における液胞膜局在タンパク質であるアルカリホスファターゼ(ALP)と相同性の高い遺伝子を分裂酵母ゲノムから見いだし、本遺伝子産物に特異的な抗体を作製して細胞内局在を間接免疫抗体染色法を用いて調べた。その結果、実際に液胞膜に本タンパクが局在することを明らかにできた。出芽酵母ではALPの液胞膜への局在はアダプチン複合体(AP-3複合体)が重要な役割を果たしていることが最近報告された。そこで分裂酵母のAP-3複合体のβ-アダプチンと高い相同性を示す遺伝子(SPAC23H3.5)を破壊した株を取得してALPの細胞内局在を調べた結果、本破壊株ではALPが正常に液胞へ局在していないことを明らかにした。またALPのN-末端付近のEXXXLLの2つのリジン残基を他のアミノ酸へ変更するとALPは液胞膜へと輸送されないことがわかり、分裂酵母の液胞膜タンパク質輸送においてもAP-3複合体が重要な機能を果たしており、またALPの液胞への輸送シグナルは細胞質側に存在するジリジン残基であることを明らかにした。阪井(分担者)はメタノール資化性酵母Candidaboidiniiでの異種タンパク質生産のため、メタノールで特異的に誘導される5つの遺伝子のプロモーター部分の解析を行った。

その結果、dihydroxyacetone synthase遺伝子のプロモーターがこれまで用いられているalcohol oxidase遺伝子プロモーターよりも強力であり、物質生産に応用可能であることを明らかにした。またD-amino acid oxidaseをC.boidiniiで過剰発現させた場合の最適条件の検討を行った。現在、分裂酵母での異種タンパク質発現への応用を試みている。竹川(代表者)らは分裂酵母の異種タンパク質発現系を構築する際に最も大きな問題である糖タンパク質糖鎖部分の構造と機能解析を行った。分裂酵母は出芽酵母では見られないガラクトース含有糖鎖を生産する。しかしながら最近の研究から分裂酵母のガラクトース鎖はアルファ結合で糖鎖に結合しているために高等動物には強いアレルギーを引き起こす可能性があることがわかってきた。そこで分裂酵母のガラクトース鎖欠損変異株の取得を試みた結果、gms1と名付けた遺伝子を破壊することで完全にガラクトース鎖の欠損した分裂酵母を初めて作りだすことができた。gms1破壊株は種々の薬剤に強い感受性を示したり、胞子形成過程に異常を生じることから分裂酵母のガラクトース鎖の機能を明らかにすることができた。その他、種々の分裂酵母糖鎖合成欠損株を取得することに成功し、現在旭硝子の浜(分担者)により異種タンパク質の生産条件について検討が行われている。また阪井(分担者)らはメタノール資化性酵母Pichiaのペルオキシソームが液胞へと輸送されて分解する過程について解析を行い、ペルオキシソームが液胞で分解されないpaz変異株を取得した。これらのpaz遺伝子の中には出芽酵母で液胞タンパク質輸送に必須な遺伝子として取得されたVPS遺伝子や自食作用に必須な遺伝子であるAPG遺伝子などが含まれていることを明らかにした。2002年の2月に分裂酵母の全ゲノムが報告され出芽酵母のタンパク質輸送に必須な遺伝子が分裂酵母にもほとんど存在することが明らかになった。そこで現在、分裂酵母のVPS遺伝子やAPG遺伝子と相同性の高い遺伝子を破壊することで、分裂酵母と他の酵母とのこれらの遺伝子の機能について比較検討を行っている。竹川(代表者)らは、分裂酵母の異種タンパク質発現系を構築するために以下の成果を得た。(1)これまで使用されてきたウラシルやロイシンの分裂酵母栄養要求性マーカーの他に新たにリジン、アルギニン、アデニンなど複数の栄養要求性を保持した分裂酵母株を構築することができた。(2)分裂酵母のイオントランスポーターであるpmr1遺伝子を破壊した株を作成し、本破壊株が分裂酵母のN-結合型糖鎖のみならず、0-結合型糖鎖の付加にも欠損を示すことを明らかにした。また旭硝子の浜博士(分担者)との共同研究により、異種タンパク質をpmr1破壊株を用いて生産させたところ、実際に分泌生産が向上することが認められた。(3)分裂酵母の0-結合型糖鎖の付加に関与するマンノース転移酵素遺伝子を3つ同定した。これらの遺伝子破壊株が胞子形成欠損や温度感受性など様々な表現型を示すことを明らかにした。また実際に細胞表層の0-結合型糖鎖の組成が野生株と異なっていることを確認した。(4)分裂酵母の液胞局在ATPアーゼの欠損株を取得した。本破壊株は液胞の酸性化に欠損を示し、液胞タンパク質輸送やエンドサイトーシスなどの細胞内タンパク質輸送経路に欠損を示すことを明らかにした。(5)分裂酵母の全ゲノムから出芽酵母の液胞タンパク質輸送に関与するVPS遺伝子と相同性の高い遺伝子を同定して、これらの遺伝子破壊株を50以上作成した。