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高感度の電気化学免疫化学発光法によるGefitinib血清診断システムの開発

本成18年度までに申請者の研究室で開発し,現在,間質性肺炎の診断と疾患活動性の血清マーカーとして我国の医療保険で診断薬として承認されているKL-6分子に反応するオリジナルのモノクローナル抗体を用いてECLLAを用いた測定系を構築した。KL-6は膜タンパク質であるMUC1ムチンの一部を詩織するものであり,間質性肺炎め診断や活動性に有用なマーカーとして臨床応用されているが,本年度はKL-6には多様な抗原性を示す多様な亜分子が存在し,肺癌特異性を高めたKL-6亜分子としてSLAK(セレクチシリガンドを有するKL-6亜分子:CA19-9とKL-6でサンドイッチされる分子)を見出し,SLAKはKL-6よりも強力な肺癌の予後因子であることを報告した(Inata J, et. al. Int J Cancer, 2007)一方で,MUC1はEGFRと結合すること,MUC1の発見がEGFR依存性のシグナル伝達を促進することが報告されている。本年度は,血清KL-6値のEGFR-TK1治療における有用性を検討を行い,血清KL-6値がEFGR-TKIに体する治療効果ならびに予後の治療前予測に有用であることを明らかとした(Ishikawa N, et. al.,Int J Cancer,2008)。さらにEGFR-TKIによる治療開始後2週間での血清KL-6値変化が,EGFR-TK1治療の反応性ならびに癌の再燃の早期検出に有効であることを明らかとした。続いて,ルテニウムと抗体の結合比率に関して,概ね至摘条件を設定することが出来た。今後は,SLAK値のEGFR-TKI治療における有用性の検討を行う予定である。本課題は血清診断により、Gefitinibによる治療効果を受けうる患者を最大限に抽出可能な測定系を構築することを目指している.平成18年度には,電気化学発光免疫測定法(Electrochemiluminescence immunoassay : ECLIA)による測定系の確立を行った.ECLIAは従来の酵素抗体法に比べて,極めて微量な物質を検出することが可能で,しかも反応時間の短縮が可能である.第一反応として磁気感応性ビーズにより固相化したモノクローナル抗体と検体を反応させる.第二反応としてはルテニウムで標識した目的のタンパクに対する抗体を反応させる.第三反応としてはサンドイッチ状に結合したルテニウム標識モノクローナル抗体に電極上でエネルギーを加えることにより,ルテニウム錯体が発光する.本邦でECLIAを研究開発に用いているのは広島大学分子内科学教室のみであり,その調整と測定法における指摘条件の検討に予想以上の時間がかかった.まず,申請者の研究室で開発し,現在,間質性肺炎の診断と疾患活動性の血清マーカーとして我国の医療保険で診断薬として承認されているKL-6分子に反応するオリジナルのモノクローナル抗体を用いて予備検討を試みた.その結果,1)ビーズとモノクローナル抗体の結合比率,2)ルテニウムと抗体の結合比率に関しては,概ね至摘条件を設定することが出来た.現在,Amphiregulin, TGF-αなどのモノクローナル抗体による測定系の構築中であるが,平成19年度前半には完成する予定である。Gefitinibが投与された症例の血清サンプルも約100症例以上すでに蓄積しており、測定系が出来次第、検討を行い、研究の総括を行いたいと考えている。
炭疽菌の病原因子発現制御機構に関わる転写調節因子の分子機能の解明

炭疽菌の病原性は毒素や莢膜代謝酵素の発現の有無に規定される。AtxAは炭疽菌の病原因子の発現調節を転写レベルで担うタンパク質で、炭疽菌の病原性に重要な役割を果たすと考えられている分子である。しかしながら、AtxAの病原遺伝子転写調節機構の詳細はいまだ明らかではない。本研究においては、これまでにAtxAとDNAの相互作用に着目し、Bacterial One Hybird法を用いたin vivoの相互作用解析から、AtxAによる転写調節がDNA配列依存的な負の調節機構に拮抗することで行われる可能性を示した。今年度はAtxA分子とDNAの間に生じる相互作用を、組み換えAtxAタンパク質を用いたin vitroの実験系で評価した。大腸菌の発現系を用いて組み換えAtxAタンパク質を作製、精製し、ゲルシフトアッセイによる結合の評価を行った。ゲルシフトアッセイでは、AtxAがDNAと配列非依存的に複合体を形成する像を得た。この結果はAtxAがDNAの配列非依存的に結合することを示唆するものである。また、表面プラズモン共鳴を利用した相互作用の検討も進めている。今後の検討課題として共結晶X線構造解析を用いた結合モデルの評価が必要と考えられる。本研究の成果は炭疽菌の病態発現機構の理解において重要な意義を持つと考えられる。また、多種の病原細菌においても構造に類似性を持つ転写因子が発見されている。本研究は病原細菌の病態発現機構の一般的な理解につながるものと考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
能動視覚による動的な空間知覚と立体形状認識機構の解明とその応用システムの構築

人間の能動的な視覚機構の数理的な構造、特に注視のための身体運動と眼球運動の視覚情報処理における役割と、立体形状知覚センサーとしての仕掛けを解明を目的として、その機構を模した自らも高速で移動したり首を振ったりできる能動的な搭載カメラによって、刻々変化する空間環境をとらえ、カメラの置かれている空間や対象の形状を実時間で認識するシステムを構築した。さらに、このとき、このような目的で認識にとってよりよい画像を得るような運動をカメラ自らが想起して行動するための、能動視覚の基本原理を確立した。本年度は、特に次の3つのシステムの構築を目指し、一部を実現した。(1)能動カメラによる追跡に基づく高速移動体の実時間形状認識システム-たとえば、移動ロボットの前方を横切る物体、監視カメラの前方を横切る車両などの立体形状を実時間で認識する(2)協調する複数カメラからの画像の統合による移動体、静止物体の実時間形状認識システム-人間の両眼を模した2台のカメラが注視点をそろえて協調して対象の動きをとらえ、形状を計測する(3)能動的にカメラを移動させながら撮影した多方向からの画像による高精度形状認識システム-自由にカメラを移動させながら対象を撮影し、得られた画像系列から対象の立体形状を再現するそして、これらの成果を統合し、人間の視覚情報処理における眼球の能動制御の仕掛け、能動視覚をもつロボットにおけるその視覚による空間知覚と運動制御を考察した。
木質バイオマス資源を用いたポーラスナノカーボン材料の創製

平成18年度は、「急速加熱法を用いて調製した木質炭素化物の多孔質性の検討およびその応用用途開発」をテーマに研究を遂行した。多孔質炭素材料は、高電気伝導率、軽量、耐熱・耐薬品性など優れた特徴を有し、吸着材や触媒担体の基盤材料として有用である。一般に、マクロポーラス炭素材料の合成は、ポリウレタン等の多孔体材料や、セルロース等の繊維材料に熱硬化性樹脂等に浸透・硬化させ、炭素化する複数の工程から成る。著者らは、製造コストの低い単一工程である急速加熱法を用いることで、木質バイオマスから3Dネットワーク構造体を有し、均一な多孔質性も有するマクロポーラス炭素材料を合成することに世界で初めて成功した。これにより、再生可能な木質バイオマス資源を原料とする低コストマクロポーラス炭素材料の合成が可能になった。これらをまとめ、「Macroporous carbon prepared by flash heating of sawdust」としてCarbonに投稿し、すでに掲載されている。また、本マクロポーラス炭素材料は、高空隙かつ高強度であることが確認された。これは、3Dネットワーク構造体であることに由来している。このような合成時の昇温速度の変化に伴う強度および空隙率の特性変化について検討した結果をまとめ、「A Characterization on Mechanical Property of Macroporous Carbon Prepared by Flash Heating of Sawdust」としてCarbonに投稿予定である。また、本マクロポーラス炭素材料を基礎材料とすることで、賦活処理による比表面積の向上、本材料をテンプレートとしたポーラスメタルの合成手法の確立といったより付加価値の高い高機能性材料の創製を検討した。本年度は、当初の計画通り、「急速熱分解法により調製した木質炭素化物の炭素構造の解析と形成過程の解明」をテーマに研究を遂行した。原料、加熱温度、昇温速度、反応時間、雰囲気条件のような諸パラメーターが急速熱分解試料の炭素構造に及ぼす影響を明らかにした。これに加え、原料中に含まれる微量元素が炭素構造発達の触媒として働くことが確認された。そこで、当初の予定を繰り上げ、「触媒添加条件下で調製された急速熱分解木質炭素化物の構造解析」をテーマに研究を遂行した。炭素六角網面の積層構造形成の触媒となる鉄を添加することで、通常の低速熱分解法に比べ、急速加熱法の方が10分の1程度の添加触媒量で同等の触媒効果が得られることが示された。来年度は、本年度得られた成果を元に鉄以外の触媒作用を持つニッケルやコバルト等の添加を試み触媒効果の向上および触媒の分散性を検討するとともに、得られた炭素材料の物理特性を明らかにすることで、応用技術開発を目指す。本年度は、「触媒および水熱条件下で調製された急速熱分解木質炭素化物の構造解析」をテーマに研究を遂行した。急速加熱法により調製した木質炭素化物の炭素構造は、低速加熱法を用いた場合と比べて、炭素六角網面およびその積層構造が発達する。そこで、炭素構造を発達させる触媒の添加、あるいは水熱条件下で、急速加熱法を用いた場合の相互作用を検討した。炭素六角網面の積層構造形成の触媒となるFe、NiやCoを少量添加することで、低速加熱法に比べ、急速加熱法の方が10分の1程度の添加量で同等の触媒効果が得られた。また、水熱条件下でも同様の効果が得られた。しかし、触媒や水を多量に投入すると、主反応であるラジカル反応が阻害され、急速加熱法による炭素構造変化は見られなくなった。これらの研究結果は、国際学会6th International Wood Science Symposium(バリ、インドネシア)、および第3回木質炭化学会研究発表会(東京)にて研究報告を行った。以上の研究結果に加えて、急速加熱法を用いて調製した木質炭素化物のマクロポーラス性について検討した。マクロポーラス炭素材料は、高電気伝導率、軽量、耐熱・耐薬品性など優れた特徴を有し、吸着材や触媒担体の基盤材料として有用である。マクロポーラス炭素材料の合成は、一般に、ポリウレタン等の多孔体材料や、セルロース等の繊維材料に熱硬化性樹脂等に浸透・硬化させ、炭素化する複数の工程から成る。急速加熱法を用いると、単一の工程で、3Dネットワーク構造体を有するマクロポーラス炭素材料が得られることが上記の研究から示された。そこで、そのポーラス性を分析した。これらをまとめ、雑誌論文として「Macrostructure Wood Carbon structed by 3-dimentional members」としてCarbonに投稿する予定である。

また、本マクロポーラス炭素材料は、高空隙かつ高強度であることが確認された。これは、3Dネットワーク構造体であることに由来している。このような合成時の昇温速度の変化に伴う強度および空隙率の特性変化について検討した結果をまとめ、「A Characterization on Mechanical Property of Macroporous Carbon Prepared by Flash Heating of Sawdust」としてCarbonに投稿予定である。また、本マクロポーラス炭素材料を基礎材料とすることで、賦活処理による比表面積の向上、本材料をテンプレートとしたポーラスメタルの合成手法の確立といったより付加価値の高い高機能性材料の創製を検討した。
アジア的医療施設の発展方向に関する研究

人口の都市への集中化・核家族化が進む中で、日本人の生活環境は劇的な変化を遂げてきた。これまで医療の現場は自宅が主流であったものが、診療所・病院等の施設主導型になり、フォーマルセクターでの医療が当然のこととなった。本研究では明治維新以来西欧文化の影響を受けてきた医療施設の今後のあり方を模索すべく、過去の事例および周辺のアジア諸国で行われている医療とその療養環境を分析し,アジア的視点から見た日本の医療施設評価を行った。本研究では戦後も引き続き離島などで多く見られた自宅での分娩例を文献から挙げ、医療施設と在宅との相違を検討した。在宅分娩の減少は医療ニーズの変化と共に分娩まわりの環境をハイテク化させ、周産期死亡率の減少に貢献したものの、「産む側の主体性」を低め、積極的に周囲の療養環境を自らの手で構築してゆく手だてを取り去った。伝統、家族との関わりなど、これまで療養環境に見られた従来型のものが希薄になり、地域性が薄れたことが特徴である。在日アジア系外国人の入院体験者インタビューから、彼らが療養中困難としたものは付き添いの制限、食事の選択のなさ等、直接的に医療に関わる問題ではなく、多分に文化的なものであった。これらの項目は「癒しの環境」を考慮した際に、国籍を問わず優先度の高いものであり、療養環境の改善は家族的・家庭的なものの介在の余地が指摘された。本研究により、アジア的家族観の再検討が療養環境の改善につながるものであることが判明した。
運動開始日の違いが及ぼすラット脳外傷後の脳機能改善効果に関する研究

ウイスターラットオスを用いてPneumatic control injury deviceにて脳外傷受傷ラットを作製し受傷後にトレッドミルの運動開始日を損傷後、0日(直後;直後群)、1日(1日後群)、3日(3日後群)、7日(7日後群)、14日(14日後群)、21日(21日後群)を作製し、その強制トレッドミル運動を7日間連続で行った。その強制運動終了した。その後、記憶学習実験としてwater mazeテストを行った。1日、3日後及び14日後群で有意な記憶学習の回復が見られた。しかしながら14日、21日後群では有意な差が見られなかった。組織脳外傷モデルラットを順次、屠殺し、その17日後群の高次脳機能改善効果が確認された組織を用いて、脳外傷部周囲の神経細胞や神経線維を中心に連続切片を作製し、神経再生や修復について組織学的な観察評価を行った。その結果、神経再生の指標であるBrdU,神経幹細胞のnestin及び神経新生のDCXについて有意な細胞数の増加が見られた。今後、NeuN,酸化ストレスの指標として8-OHdG, 4-HNE,アポトーシスの誘導をssDNA等の免疫染色を行い神経再生の効果を確認する。もう一方で、脳損傷部周囲組織からmRNA、タンパク質を抽出し、bFGF, NGF, BDNF,IGF1, GH等の神経再生や修復に関わる発現についての測定しする。脳損傷部周囲での過酸化脂質量としてマロンジアルデヒド(MDA)の測定、酸化ストレスの評価を行う。さらにクリオスタットにて20&micro;mの凍結切片を作製し損傷辺縁より幅1mmさらにその外側1mmの範囲をそれぞれマイクロダイゼクション法にて組織を採取し、プロテオーム解析を行い、さらにGeneChip Systemを用いてマイクロアレイ解析を行う。このような総合的な評価を行い脳外傷後の最適な運動開始日を調べる。ラットの高次機能障害の測定や切片作製に非常に時間がかかりやや遅れている。もう一方で、脳損傷部周囲組織からmRNA、タンパク質を抽出し、bFGF, NGF, BDNF,IGF1, GH等の神経再生や修復に関わる発現についての測定する。ウイスターラットオスを用いてPneumatic control injury deviceにて脳外傷受傷ラットを作製し受傷後にトレッドミルの運動開始日を損傷後、0日(直後;直後群)、1日(1日後群)、3日(3日後群)、7日(7日後群)、14日(14日後群)、21日(21日後群)に変えて、その強制運動を7日間連続でを行う。強制運動終了後、water mazeテスト等を行い、運動開始日の違いによる高次脳機能障害の改善効果を確認する。脳外傷モデルラットを順次、屠殺し、高次脳機能改善効果が確認された組織を用いて、脳外傷部周囲の神経細胞や神経線維を中心に連続切片を作製し、神経再生や修復について組織学的な観察評価を行う。さらに、その連続切片を用いて神経再生の指標であるBrdU、神経新生のDCX、NeuN,酸化ストレスとそて8-OHdG, 4-HNE,アポトーシスの誘導をssDNA等の免疫染色を行い運動開始日の違いによる神経再生の効果を確認する。もう一方で、脳損傷部周囲組織からmRNA、タンパク質を抽出し、神経再生に必要であるbFGF, NGF, BDNF, IGF1, GH等の神経再生や修復に関わる発現についての遺伝子及びタンパク質のを測定し、その差を評価する。加えて脳損傷部周囲での過酸化脂質量としてマロンジアルデヒド(MDA)の測定、酸化ストレスの評価を行う。脳外傷モデルラット作製と高次脳機能改善効果の測定に時間が費やされてた。そのために計画計画が少し遅れている。ラット作製や高次機能効果の測定が遅れたので組織学的検討等が遅れ進行している。

組織脳外傷モデルラットを順次、屠殺し、その17日後群の高次脳機能改善効果が確認された組織を用いて、脳外傷部周囲の神経細胞や神経線維を中心に連続切片を作製し、神経再生や修復について組織学的な観察評価を行った。その結果、神経再生の指標であるBrdU,神経幹細胞のnestin及び神経新生のDCXについて有意な細胞数の増加が見られた。今後、NeuN,酸化ストレスの指標として8-OHdG, 4-HNE,アポトーシスの誘導をssDNA等の免疫染色を行い神経再生の効果を確認する。もう一方で、脳損傷部周囲組織からmRNA、タンパク質を抽出し、bFGF, NGF, BDNF,IGF1, GH等の神経再生や修復に関わる発現についての測定しする。脳損傷部周囲での過酸化脂質量としてマロンジアルデヒド(MDA)の測定、酸化ストレスの評価を行う。さらにクリオスタットにて20&micro;mの凍結切片を作製し損傷辺縁より幅1mmさらにその外側1mmの範囲をそれぞれマイクロダイゼクション法にて組織を採取し、プロテオーム解析を行い、さらにGeneChip Systemを用いてマイクロアレイ解析を行う。このような総合的な評価を行い脳外傷後の最適な運動開始日を調べる。ラットの高次機能障害の測定や切片作製に非常に時間がかかりやや遅れている。モデル作製に時間を費やし少し遅れ気味である。現在は、モデル作製も追いつき高次脳機能改善効果について測定している途中である。今後はモデルラットを順次、屠殺しその組織を作製し神経の再生や修復を確認する予定である。また、外傷周囲の組織からmRNAやたんぱく質を抽出し、神経再生に関わる遺伝子、たんぱく質の発現を調べる。また、マイクロダイゼクション法にて組織を採取し、プロテオーム解析を行い、さらにGeneChip Systemを用いてマイクロアレイ解析を行う。このような総合的な評価を行い脳外傷後の最適な運動開始日を調べ、最適な運動開始日を検討したい。もう一方で、脳損傷部周囲組織からmRNA、タンパク質を抽出し、bFGF, NGF, BDNF,IGF1, GH等の神経再生や修復に関わる発現についての測定する。脳外傷モデルラット作製に時間を費やしてしまい、進行状況が少し遅れたため、ラット購入費用、高次脳機能測定に関する費用、脳外傷後の組織学的検討に使用する使用額が少なかった。順次、脳外傷モデルの作製量が追いつき、高次脳機能測定や組織学的検討を行う予定であるために使用計画に準じて進みつつある。機能障害の測定や切片作製に時間がかかり、抗体や消耗品の購入が遅れた為に使用額の差額が生じた。
セルフヘルプ・フォーカシングの開発的研究

セルフヘルプ・フォーカシングとしてつぼイメージ・フォーカシングと風景天気法フォーカシングの教示と体験を検討し、セルフヘルプ技法としてかなり有効であることが示唆された。特に風景天気法フォーカシングに注目し、風景天気法フォーカシングよる風景天気図の評定尺度(風景天気図尺度VMS、3因子)を作製し、風景天気図からフォーカシング体験の効果を検討すると、2回目の風天図では感情性、漸進性、力動性が促進していた。セルフヘルプ技法としてのフォーカシングの可能性に注目して、フォーカサー(フォーカシングをする人)が一人でも、パートナーと二人でも、あるいは小グループでも行えるセルフヘルプ・フォーカシングの開発と実施マニュアルを作製することが最終の目的である。1.セルフヘルプ技法として用いる場合のフォーカシングの体験やプロセスの特徴および問題点を明確にし、どのような内容と手順でフォーカシングを学ぶ(教授・学習する)とよいかを検討した。2.セルフヘルプ・フォーカシングとしての可能性がある(1)風景天気表現法フォーカシングと(2)つぼイメージ・フォーカシングをとりあげ、それぞれの教示とふりかえり用紙を工夫し、それらの教示を用いてこれらのフォーカシングを一人で実施してもらった。その体験をふりかえり用紙に記述してもらい、その体験記述内容を分析して、これらのフォーカシングの体験の特徴や内容を明らかにした。こうして風景天気表現法フォーカシングとつぼイメージ・フォーカシングは、セルフヘルプ技法としてかなり有効であることが示された。より安全に効果的に行うためには、さらに教示や実施上の工夫や改良が必要であるので、検討を続けている。3.風景天気表現法フォーカシングは2回実施することを原則にしているが、この2回の風景天気画の変化を評定する尺度を作成するべく取り組んでいる。評定に用いる項目を特定するために、評定尺度の信頼性を検討している。セルフヘルプの方法としてのフォーカシングの可能性に注目して、フォーカサー(フォーカシングをする人)が一人でも、パートナーと二人でも、あるいは小グループでも行えるセルフヘルプ・フォーカシング法の開発と実施マニュアル及び評定尺度などを作成することが最終の目的である。1.セルフヘルプ技法として用いる場合のフォーカシングの体験やプロセスの特徴および問題点を明確にし、風景天気法とつぼイメージを併用するフォーカシングをとりあげて検討を続けてきた。2.大学生を対象とした研究においてセルフヘルプ・フォーカシングとしての風景天気法フォーカシングとつぼイメージ・フォーカシングが、セルフヘルプ技法としてかなり有効であることが明らかにされた。さらに教示や実施上の工夫や改良について検討を行った。3.特に一般的にフォーカサーがセルフヘルプの方法として取り組みやすいのは風景天気法フォーカシングと思われるので、風景天気法フォーカシングに注目してさらに検討を行った。風景天気法フォーカシングでは2回続けて実施することを原則にしているが、この2回の風景天気画の変化を評定する尺度(VMS)の作成を行った。さらに評定尺度の信頼性の検討を行った。2回の風景天気図の変化や体験的効果についても検討を行っている。特に風景天気法フォーカシングは、他の発達段階(子どもや高齢者)、様々な不適応群及び他の文化圏の人びとの理解や心理的援助においても適用可能な有効なツールになると考えられる。
有機分子触媒を用いる高効率的炭素ラジカル生成法の開発

酸化還元反応は有機合成において最も基本的な反応のひとつである。酸化還元反応には、もともと酸化還元能が高い、すなわちエネルギーの高い反応剤を使用することがほとんどである。しかしながら、それらの多くは酸化数を変化させることが容易な金属元素を含有している。コストや後処理の問題を考慮すると、他の酸化還元剤または触媒の開発は依然重要な課題である。光は再生可能エネルギーとして考えることができ、有機合成において魅力的なエネルギー源である。これまでに数多くの光化学反応が開発されているが、いずれも高価な遷移金属を含有する錯体であり、実用的とは言えない。今回我々は、高価な金属を含有しない長寿命かつ高エネルギーの励起状態を形成する光触媒の開発を目指し、カルバゾールを基盤とする有機分子を合成した。その結果、長寿命の電荷分離状態を形成するカルバゾールー安息香酸一体型分子をみいだした。すなわち、通常数ナノ秒程度の時定数(寿命)を有するカルバゾール単体に対して、この一体型分子は、数百ナノ秒という時定数を示した。さらにこの分子をアルキルハライドの光還元反応の触媒として用いたところ、通常のカルバゾールの場合と比較して、顕著に高い活性を示すことを明らかにした。金属を含有しない有機分子を触媒として用い、不活性なアルキルブロミドの還元を光化学的に行った初めての例である。種々の実験結果により、この一体型分子の高い触媒活性は、空間的に離れた電荷分離状態を形成することに起因することを証明することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。ラジカル分子は高い反応性を示すため、豊富な反応形態がこれまでに報告されている。その中でも炭素フリーラジカルは、有機合成において最も重要な炭素原子上での変換反応を提供するため合成化学上有用な化学種であり、国内外問わずその生成法や反応性に関して多くの研究がなされている。一般的なアルキルラジカル生成法は、ハロアルカンまたはキサンテートにスズラジカルを作用させる方法である。また、電子不足芳香族エステルに光を作用させる方法も知られている。いずれの場合も、アルコールから誘導される活性化体を基質として用いるため原子効率の観点から課題を残しており、有害なスズ試薬を当量以上用いる点も改善するべき大きな問題である。そこで我々は、光エネルギーを有効に利用して、この課題を解決できないかと考え、そのために必要な有機分子触媒の開発を行っている。我々はアルコールを系中で触媒的に活性化することができれば一段階でのアルキルラジカル生成が可能になると考えた。そこで、異なる種類の触媒三者、すなわち安息香酸類縁体、エステル化触媒、光触媒、を同時に用いる検討を行っている。本年度、安息香酸は一当量用いるものの、触媒量のエステル化触媒とカルバゾールを用いてワンポットでのアルコール還元反応を行うことができた。しかしながら、一段階での触媒的アルコール還元反応は、一当量の安息香酸を用いても、13%の収率にとどまった。現在はこの分子の物理的性質や光学的性質を調べている。すでに新たな有機分子触媒を設計、合成し、その応用まで行っている。当初目標としていたカルバゾール、安息香酸の一体型分子を数種類合成した。その分子の、X線結晶構造解析、過渡吸収、吸光スペクトルなどを測定し、単独のカルバゾールにはない性質を発見することができた。触媒の光学的性質、物理的性質を調べるためには、他研究室にしかない分析機器を使用する必要があり、その点が研究を進めるうえでの律速となる時がある。しかし、共同研究者と密なディスカッションを常に行っており、新反応を開発する、既存の触媒と異なり活性種の寿命の長い触媒を創製するなど、当初の計画以上に研究は進展していると自己評価できる。現在のところ順調に研究が進行している。現在、設計した触媒分子のうち50%ほどの合成はすでに完了している。

残りの50%の分子を速やかに合成する予定である。また、合成したすべての触媒分子に対して、吸光スペクトル、蛍光スペクトル、過渡吸収、サイクリックボルタんメトリー測定を行い、性質を明らかにする予定である。触媒分子の応用としては、これまでに困難とされていた低い還元電位を持つ化合物(すなわち還元されにくい分子)の還元反応に挑戦する予定である。たとえば、臭化アルキルや臭化アリールは光化学的に還元されにくい化合物であるため、モデル基質として検討を行っていく予定である。その際、得られた情報は触媒設計にフィードバックし、電子状態や立体的因子を種々変化させ、触媒分子の構造の最適化を図る予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
急性期病院に入院中の認知症高齢者に対する効果的ケア・パッケージの開発

本研究は、急性期病院に入院を余儀なくされた認知症高齢者が、回復のために必要な安静を保ちながらも、適度な日中の刺激を得られたり、それを通して夜間の良眠が計れるような看護援助についてケア・パッケージを提案するものである。この看護援助は一般の看護師でも実施することができ、援助の効果が得られることを通して、看護師自身も無理なく認知症高齢者の入院中の看護援助ができることをめざしている。
へき地小規模学校のための造形支援プログラムの研究

本研究では、「へき地小規模校のための造形支援プログラム」運営し、その結果を考察した。考察結果は以下の通りである。J.レイヴらの正統的周辺参加理論を援用して、教員養成プログラムとして検討した。正統的周辺参加理論は、従来から考えられていた教員養成の学習目標に新たな視点を加えるものである。それは、教員養成とは、教員志望学生が教師コミュニティに参加する社会的実践行為であるとする視点である。この視点は教員養成の学習目標を、「いかに教員としての身体、教員としての頭脳を生成させるか」から、「いかに教員コミュニティ(共同体)への参加の度合いを高めるか」へと移行させる。そこで教員志望学生が小学校への造形的支援を通して「教師コミュニティ」へ参加するプロセスを示した。造形的支援とは小規模小学校での学芸会(学習発表会)に使われる背景画制作である。この制作のプロセスでは、教員志望学生が様々な要素(依頼演目、関連資料、用具、材料、児童が演目に持つイメージ)を集め、検討し、再構成することで造形的に「可視化」するプロセスであるといえる。可視化の段階はいくつかに分かれているが全体の展望をもって制作するというよりは、局所的に問題・課題を解決し「可視化」する局所的な開示であった。結果として以下の知見を得た。「造形支援プログラムでは、教員志望学生がへき地小規模校の児童と対話を行いながら作品を完成した。この制作を通してのねらいは、学生達が、それぞれの持つ多重成員性を生かし、児童達との交流を深める"社会的実践として表現の場"を生成することである。」本研究では、「へき地小規模校のための造形支援プログラム」運営し、その結果を考察した。」本研究では、「へき地小規模学校の児童生徒」と「教員志望学生」とが、造形的対話を通して、造形イメージの生成と造形作品制作を共同で行うプログラムを開発する。プログラムは、(1)造形的対話ステップ、(2)造形作品制作ステップ、(3)作品の提供ステップを含み、本年は(1)を中心に全体のアウトライン形成を行った。具体的には以下の通りである。(1)相互対話プログラムの開発を行った。このプログラムは、の段階を経て、相互のイメージの理解を図るもので、平成13年8月に北海道旭川美術館でのギャラリートークを通してその有効性の検討を行った。事例研究としてのプログラム運営では、「同一イメージを共有する」ことより「両者が、それぞれのイメージを取り入れて、当初のイメージを再構築し強化する」が、情意レベルでの他者理解に発展することが確認された。この点で、相互対話プログラムは概ね良好な結果が得られたとした。(2)Webを通して、「学習発表会背景画」のイメージの共有化を図り、その結果を基に制作を行った。平成13年10月に遠隔地の児童(東神楽町立志比内小学校)を対象として、イメージ共有Webを制作し、運営した。このWebでは、学校側から示された演目と、児童の大枠のイメージを手がかりに、教員志望学生により資料収集と背景画モデルの作成、その提示、児童との対話を行い、イメージを共有した。このWeb運営を通して、相互理解が深まり、情意レベルでの他者理解に有効であるとの結論を得た。(3)イタリア共和国において、作品解釈に関する資料を収集した。特に異文化理解としての作品解釈(非キリスト教文化圏への作品紹介)の面からの、平成14年2月に文献・映像資料を収集した。資料は整理中ではあるが、理解を促すための様々な努力が、他者との相互理解を目指す方法として、本研究に直接の示唆を与えることが明らかになった。本研究では、「へき地小規模学校の児童生徒」と「教員志望学生」とが、造形的対話を通して、造形イメージの生成と造形作品制作を共同で行うプログラムを開発する。プログラムは、(1)造形的対話ステップ、(2)造形作品制作ステップ、(3)作品の提供ステップを含み、本年度は(2)を中心に研究を進めた。(1)昨年度に開発した「相互対話プログラム」を運営し、その結果を造形作品制作に反映させる研究を行った。

研究方法は学生による造形作品の制作プロセスを記述し、参与観察を通して、その有効性を検討した。この制作は汎用PC利用と大型プリンター出力を前提としたものである。また、有効性は、「相互対話プログラムによる相互理解、演目理解内容」を制作物として表現し、その理解の質が深まつたか否かとした。考察結果として、コラージュ技法を用いた制作が中心となり、素材イメージの重なりによりテーマを表現した。この技法では、素材イメージの収集が重要となり、テーマに沿った収集が可能な場合に良い結果が得られた。従って、素材イメージのデータベースを準備し活用することが有効であると考察した。(2)全体プログラムの運営を通して、「教員養成プログラム」として視点が重要となってきた。学校に対する造形的支援を「短期的な無償の労働奉仕」を超えて、教員養成プログラムとして位置づけるためには、以下の観点が必要であると考察した。・本プログラムで獲得した技能が、教育現場でいかに機能するか。・養成段階、初任段階、熟練段階といった全体的な職能発展プロセスを明確にする概念構成。(3)対話的作品鑑賞の資料収集を行った。テートモダンにおける作品提示方法とプラド美術館における方法との比較から、テートモダンが示す発展的な鑑賞方法のプロセスを理解することができた。この方法を、学生と児童生徒の対話的鑑賞に援用することで、演目に対する理解が深まると考察した。本年度は、「へき地小規模校のための造形支援プログラム」運営し、その結果を考察した。本プログラムの対象となった学生は、北海道教育大学旭川校教員志望学生1年生から4年生、15名であり、フィールドとして北海道内の小規模へき地校3校と北海道内美術館1館にてプログラムを運営した。考察結果は以下の通りである。平成14年度では、J.レイヴらの正統的周辺参加理論を援用して、教員養成プログラムを検討した。正統的周辺参理論は、従来から考えられていた教員養成の学習目標に新たな視点を加えるものである。それは、教員養成とは、教員志望学生が教師コミュニティに参加する杜会的実践行為であるとする視点である。この視点は教員養成の学習目標を、「いかに教員としての身体、教員としての頭脳を生成させるか」から、「いかに教員コミュニティ(共同体)への参加の度合いを高めるか」へと移行させる。そこで教員志望学生が小学校への造形的支援を通して「教師コミュニティ」へ参加するプロセスを示した。造形的支援とは小規模小学校での学芸会(学習発表会)に使われる背景画制作である。この制作のプロセスは、教員志望学生が様々な要素(依頼演目、関連資料、用具、材料、児童が演目に持つイメージ)を集め、検討し、再構成することで造形的に「可視化」するプロセスであるといえる。可視化の段階はいくつかに分かれているが、全体の展望をもって制作するというよりは、局所的に問題・課題を解決し「可視化」する局所的な開示であった。制作した学生は、様々な局所的な開示をおこなって作品を完成させたが、そのプロセスは異なっていた。その中では、以下の3グループが確認された。(1)教師コミュニティ参加グループ、(2)
巻貝の異常巻き生成実験と成長解析-進化における発生的制約の役割-

海棲巻貝サザエ約300個体について、殻の成長方向に障害物(シリコンゴム)を付着させる実験を行った結果、殻の成長に、次のような迂回反応が認められた。1.障害物が成長ルートの上部(殻頂側)に存在するとき、殻口は障害物に衝突する直前に下方(反殻頂)側に向き、障害物を下から迂回し、迂回後に再び上方に向かって成長する。2.障害物が成長ルートの下部(反殻頂側)に存在するとき、殻口は障害物に衝突後、一時前方への成長を停止し、その間殻口が外側に膨張する。その後、下方迂回をしつつ障害物を乗り越える。この二つの迂回パタンはともに、殻成長の方向を決定するのに、頭足塊が殻口の外に伸びる方向が強く関与していることを示唆している。このことを証明するために、あらかじめ内在的に決定されている付加殻の成長形が、頭足塊の伸び方向によって変形されるという、単純な数値計算上のモデルを立て、殻成長と障害物への反応をシミュレーションした。その結果、1.付加殻の成長形がたとえ巻き成長にあらかじめ決定されていなくても、頭足塊による変形によって、巻貝類が一般的に有する規則的な密巻き螺旋成長を生成できることが示された。2.この頭足塊による変形のみで生成された殻成長パタンは、障害物に対する下方迂回パタンを示すことも示された。以上の実験とシミュレーションの結果から、巻貝類の殻の巻き方には、殻口(直接的には殻を作り出す外套膜組織)に対する頭足塊の力学的な押し付け効果が、重要な影響を与えていることが明らかとなった。このことから、頭足塊と殻口との接触が避けられない生息姿勢で殻を成長させる巻貝類が、螺管どうしが重なる、密巻き型の巻き方しか有さないという形態進化のパタンを、古典的な適応進化の結果とする解釈ではなく、むしろ巻き方進化における発生上の制約として解釈することができる。今年度は、以下の2つの作業に着手した。それぞれの成果を報告する。2)観察結果と比較する。その結果を報告する。1)飼育観察受精後810月齢のサザエの正常な巻き成長を妨害するシリコン片を付着させ、海水を循環させた水槽にて飼育した。飼育個体は、300個体(うち200個体は前年度から)で、一年で約1巻き成長し、それらは以下のような異常巻き成長を示した。・すべての個体で、付着物の迂回は、下方(殻底方向)迂回であり、迂回後再び上方(殻頂方向)に巻き戻るパタンが認められた。・ほぼ正常な巻き方に復帰したのち(一部縫合線位置がずれる)、一巻き前の迂回開始地点に再び到達したとき、再度下方に成長する傾向が認められた。2)プログラム開発Visual C++にて殻成長解析のために、以下のモデュールを開発した・殻口面を基準面とし、付加される殻の成長ベクトル場を代表するパラメタを用い、巻貝殻の成長パタンを再現するモデュール・殻を支える足の付着位置(殻軸筋)、匍匐時の足の背部が殻と接触する位置を指定し、匍匐時(あるいは足を出しての停止時)に、殻を安定に支える姿勢を再現するモデュール・体層の凹凸(螺肋や棘など)を探知し、殻がオーバーラップする位置を決定するモデュール次年度以降、これらのモデュールを組み合わせ、実際のサザエの成長をシミュレートし、実験で形成された巻き異常を説明することを試みる。今年度の研究により以下の成果を得た。

現在、論文作成中である。1)サザエによる付着物実験継続飼育していた付着実験用のサザエは、ほとんどの個体が、付着迂回からさらに半1巻きほど成長し、昨年度報告した以下のパターンがさらに強く一般的な傾向であることが確認された。<殻表面の予定被覆部に付着させた障害物に対する、一般的な迂回反応>1)付着物直前で下方(殻頂と反対側)に迂回開始、2)迂回終了後に上方回帰、3)ほぼ正常な縫合線付近まで復帰し、4)1巻き後に下方迂回開始時の螺管に到達し、再度下方迂回、5)そしてその後さらに上方回帰し、6)また正常縫合線付近に復帰する。2)殻成長のシミュレーション用プログラムの開発昨年より開発を継続していたシミューレーション用プログラム(C言語)がほぼ完成した。シミュレーションの結果、以下のような機構で巻貝類が殻を成長させているときに、上述した迂回パターンを説明することができることが分かった。<殻の成長機構>結論)1.巻貝類の殻の巻く方向は、足収縮筋が外套膜を押し付ける場所に主に依存して決定される。2.殻内部の軟体部(内臓塊など)の成長(細胞増殖)パターンは、内在的(遺伝的)に決定されている部分は小さく、むしろ殻成長を補完しながら従属的に決定されている。3.匍匐型の巻貝類では足が外套膜を常に強く押し付けているため、螺層の離れた緩い巻き成長(disjuncted coiling)は行えない。これは固着型巻貝でのみ実現可能である。平成12から13年度にかけ、サザエ(巻貝類)の正常な殻成長方向(正常な巻き方)を妨害する障害物(シリコンゴムまたは殻片)を殻に接着させ、そのときの成長異常(異常巻き)パタンを類型分類した。また平成13年度より、殻成長を解析するコンピュータプログラム(C言語)の開発に着手し、そのフレームワークを完成した。本年度は、そのプログラムに、巻貝類の発生・成長に関する生物学的な仮定を設定し、殻成長を解析するコンピュータモデルとして再構築した。再構築したコンピュータモデルの主要な手順は、以下の通りである。1.巻貝類が殻を成長させるときの姿勢を、巻貝類が底質を葡匐あるいは定着している姿勢であると仮定し、殻内部の頭足塊の位置を計算する。2.計算された頭足塊位置から、頭足塊が殻口縁のどこで殻成長の前線を押し付けているのかを推定する。3.この押し付けによる付加殻の変形の度合いに、一定の仮定を設けることにより、頭足塊押し付けを内包した、殻成長をコンピュータ上で再現する。このコンピュータモデルを用いた解析の結果、"殻成長方向を決定する要因を、軟体部の内在的な成長パラメタ(intrinsic growth parameters)と、頭足塊の押し付け効果(head-foot effect)に分けて解析したとき、まったく巻き成長の効果を持たない内在的な成長パラメタを用いたとしても、頭足塊の押し付け効果のみにより、巻貝類が一般的に有する規則的な巻き成長を生み出すことができ、さらに障害物に似せた殻上の突起を迂回するという実験で得られたパタンを再現することもできた。"このことから、巻貝類の巻き成長パタンを支配しているのは、内在的な成長パラメタではなく、むしろ頭足塊の押し付け効果であると結論できる。
機能性RNAが細胞間を伝搬する分子機構の解明

二本鎖RNAやマイクロRNAを始めとする機能的RNAは、標的となるRNAの配列特異的に遺伝子の発現を抑圧する働きを有する。すなわち、これら機能的RNAはRNA干渉(RNAi)を引き起こす。機能的RNAは基本的には細胞内で働く分子であるが、一部は細胞外へ放出され、細胞非自律的に遺伝子発現調節を担うことが知られる。こうした特性があるため、病気の原因となるような遺伝子の発現を抑えるような目的で機能的RNAは核酸医療薬へ応用できる可能性を秘めている。しかし、生体内で機能的RNAの多くがどのように細胞外へ放出され、それが細胞によってどのように取り込まれるかについては未だ不明な点も多く、核酸医薬品への応用は十分に進んでいない。線虫C. elegansでは、二本鎖RNAが細胞間を伝播して、RNAiが全身性に生じる。この点に着目して、二本鎖RNAの伝播機構を理解するべく、RNAiにより引き起こされる表現型の強弱を指標に機能性RNAの細胞間伝播に関わる遺伝子の探索を行ってきた。順遺伝学的なスクリーニングによって、これまでに細胞内の小胞に局在するある種の亜鉛輸送体が機能性RNAの取り込み過程に必要であることを明らかとしてきた。この亜鉛輸送体は、酵母からヒトまで広く保存されており、ヒトではユビキタスに発現している。線虫で、発現レポーターを作成し、その発現を調べたところ、腸管や咽頭で強く発現するが、上皮など、それら以外の組織でも広く発現することが明らかとなった。本研究では、亜鉛輸送を手がかりに、二本鎖RNAが細胞間伝播する分子メカニズムを明らかにしていく。これまでに、国際学会(East Asia worm meeting, FAOPS2019やEurope worm meeting)でポスター発表を行ってきた。East Asia worm meetingでは、ポスターアワードを受賞した。線虫C. elegansにおいて、亜鉛輸送体は、亜鉛を細胞質側へ取り込むタイプの輸送体が14種類、逆に細胞外へ放出するタイプのものが14種類存在する。同定した亜鉛輸送体以外でも同様な働きがあるかどうかという点に迫るべく、これら全遺伝子のノックアウト線虫を用いて、それらの変異体におけるRNAi効率を検証する実験を計画した。遺伝子ノックアウトには、既に日本国内のナショナルバイオリソースプロジェクトや海外のKOコンソーシアム(アメリカ合衆国およびカナダ)で単離されているもので半数近くの遺伝子をカバーすることができたが、残りの遺伝子については、CRISPR/Cas9法にて、独自に遺伝子欠失株を作成した。興味深いことに、遺伝学的スクリーニングによって得られた輸送体遺伝子以外の変異体では、いずれの株においてもRNAi効率に異常は認められなかった。したがって、本研究の遺伝学的スクリーニングで得られた亜鉛輸送体はユニークな働きを有する可能性がある。その一方で、哺乳類細胞などでは、一部の亜鉛輸送体は機能的重複をしていることが知られる。他の亜鉛輸送体の変異体でRNAi効率に異常が生じなかったのは、亜鉛輸送体間の機能的な重複による可能性も否定できない。本輸送体の細胞内局在に関して、これまでに、腸管での解析を行ってきた。解析には、本輸送体遺伝子のプロモーター下に本遺伝子のコーディングシークエンスとtagRFPを融合させたコンストラクトを線虫に発現させることで解析した。一連のオルガネラマーカーとの重ね合わせ実験にて、詳細な局在を決定したところ、腸管では、主に後期エンドソームに局在することが明らかとなった。上皮でも同様の実験を行い、同じく後期エンドソームに局在するという結果を得た。上記のように、亜鉛輸送体遺伝子の網羅的な解析では、本研究で得られている亜鉛輸送体がユニークな働きを有する可能性が示唆された。一方で、輸送体間の機能的重複により、RNAi効率に異常が認められなかった可能性もある。今後の予定として、哺乳類で機能的重複が指摘されているZnTの多重変異体を作成し、その株におけるRNAi効率を検証する。また、分子メカニズムに関して、十分な見解は得られていない。線虫C. elegansでは外来性RNAと内在性RNAi (endogenous RNAi)がアンタゴニスティックに機能することが知られる。このため、endogenous RNAIが破綻すると、外来性RNAiの効率が上昇し、一見外来性RNAiを抑圧する因子の異常が生じているように見える可能性がある。そこで、本研究で追求している遺伝子の変異体の表現型がendogenous RNAiの破綻による可能性を検証する。具体的には、endogenous RNAi経路の変異体で生じる別の表現型(温度感受性の不稔)が追求している遺伝子変異体においても生じるかという点を調べる。また、変異体におけるendogenous RNAi経路の標的遺伝子の発現がどうなっているかという点を定量的RT-PCRにより検証する。加えて、RNAiの取り込み過程に関わる可能性を調べるべく、擬体腔に二本鎖RNAをインジェクションして、変異体でRNAiの効率が上昇している否かを調べる。二本鎖RNAの取り込みに関わる可能性が生じた際には、各種オルガネラマーカーの分布様式を変異体と野生型で比較することで、小胞輸送のどの過程に影響がでているかを推定する。また、インジェクションRNAi法を用いて、亜鉛やそのキレーターがdsRNAの取り込みやRNAi効率にどのような影響を及ぼすかという点についても解析する。近年、dsRNAやmicroRNAなどの機能性RNAが細胞間を伝播し細胞非自律的に遺伝子の発現調節を担うことが知られるようになり、新しい細胞間情報伝達機構として注目されている。しかし、細胞外の機能性RNAが伝播する分子機序について十分な理解はなされていない。

本研究では、線虫における細胞非自律的なRNAi(全身性RNAi)という現象に着目し、細胞外dsRNAの取り込みと放出過程における小胞輸送経路の分子実体と役割を明らかにし、細胞がdsRNAを取り込む分子機序を解明することを目的としている。全身性RNAiに関与する新規因子を同定するために、線虫C. elegansを用いて順遺伝学的なサプレッサースクリーニングを行い、全身性RNAiが効きにくい変異体(rsd変異体)における全身性RNAiの不全を抑圧する遺伝子変異体を取得し、遺伝子マッピングやトランスジェニックレスキュー実験を行う事で、そのうちの一つの原因遺伝子を同定した。同定した遺伝子は金属イオンを輸送すると考えられる溶質輸送体であり、本輸送体の機能解析を中心に行い、本輸送体が細胞非自律的に機能する事を示唆する知見などを得た。機能性RNAの伝播に関わる新規因子として溶質輸送体を同定し、本輸送体を介した小胞輸送がdsRNAの伝播に関わる事を、The 7th Asia-Pacific Worm meetingにて発表した。現在、論文として発表する準備を行っている。同定した遺伝子がどこで機能するかという点を明らかにするべく、プロモーターにGFPを挿入したDNAを線虫に導入し、遺伝子発現様式を調べた(発現解析)。その結果、本分子が全身で広く発現することを見出した。また、本分子がdsRNAの取り込み細胞で必要か否かを組織特異的プロモーターを用いた遺伝子レスキュー実験やモザイク解析を行いて検証した(細胞自律性の検証)。一連の実験から、本分子が細胞非自律的に機能することを示唆するデータを得た。また、蛍光タンパク質を付けたコンストラクトを発現させ、厳密な細胞内局在も調べた(細胞内局在解析)。その結果、本分子は主に後期エンドソームに局在することが明らかとなった。加えて、変異体や過剰発現株における亜鉛濃度を亜鉛特異的蛍光プローブを用いて調べ、先行論文に準じて輸送体としての機能を評価したところ、本分子の機能喪失株では、細胞内亜鉛レベルが低下している可能性を支持する結果を得た。本分子と細胞内亜鉛レベルの関係性について、現在、別のレポーターを作成して条件検討及び解析を行っている。近年、二本鎖RNAやマイクロRNAなどの機能性RNAが細胞間を伝播し細胞非自律的に遺伝子の発現調節を担うことが知られるようになり、新しい細胞間情報伝達様式の一つとして注目されている。例えば、血中RNAの種類は癌など、疾患に伴って変化することが知られており、配列特異的な疾患マーカーや核酸医薬として、診断や治療戦略に新たな選択肢を提供する可能性が高い。しかし、細胞外に存在する機能性RNAが細胞間を移動する分子機序について十分な理解はなされていない。
細胞の致死回避に使われる染色体融合機構の解明

細胞の致死回避に使われる染色体融合現象を解析するには、それを実験的に再現し、コントロールできるアッセイ系が必要である。そのために本研究では当研究室で独自に構築された分裂酵母のセントロメア破壊アッセイ系を用いた。分裂酵母のセントロメアを人為的に破壊すると、大多数の細胞が染色体分配異常を起こし死に至るが、一部の細胞はセントロメアを欠失した染色体と無傷な染色体とが融合することで生き残る。セントロメアを破壊してから死ぬあるいは染色体融合を起こすまでの間にどのようなことが起こっているのかを調べた。まずセントロメア破壊後の染色体の挙動を調べると、予想どおり多くの細胞で染色体分配異常が生じており、それに伴う遺伝子の発現量の変動も観察された。また、DNA二重鎖切断修復関連因子にGFPタグをつけ、その挙動についても観察したところ、ドットの数に明らかな増加が見られた。これは染色体上に「傷」がたまっていることを意味していると考えられる。この結果はこれまでに得られているセントロメア破壊にともなって染色体が不安定化するという結果と一致する。さらに染色体末端の不安定化と染色体末端融合との関連を調べるために、染色体末端の不安定化が生じることで知られるテロメア保護タンパク質の変異株でセントロメア破壊実験を行った。その変異株では野生株よりも顕著に染色体融合が増加することが明らかとなった。加えて、染色体融合の頻度が増加する相同組換え関連因子の欠損株ではセントロメアの破壊なしに染色体末端が不安定化することを見出した。したがって、染色体融合が生じるまでの間に染色体分配異常と染色体不安定化が生じており、おそらくそれらが染色体融合の引き金となっているものと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。染色体末端間の融合は、染色体末端を保護するテロメア結合タンパク質の欠損や、老化によるテロメアの短小化などが引き起こす現象として知られている。しかしながら、染色体再編成を介して天然に起こる致死的状況を回避した細胞や個体では、テロメアの機能変化以外にも細胞内外の環境に応答した様々な反応が関与しているものと考えられる。本研究は正常なテロメア機能を持った細胞における染色体末端融合の分子機構を分裂酵母を用いて明らかにすることを目的とている。これまでに、染色体末端融合がサブテロメア領域で生じていることを明らかにしている。本年度はテロメアおよびその近傍に重点を置き、致死的状況に直面した細胞のテロメア長あるいはサブテロメア領域などについて解析を行った。致死的状況を導き、染色体末端融合を実験的に再現するアッセイ系としてセントロメア破壊アッセイ系を用いた。その結果、テロメア長の変化は染色体末端融合を誘導した場合でも野生株と変化は見られなかった。従って、染色体末端融合はテロメアの機能が維持されたままで生じているといえる。一方で、染色体末端融合により生き残った細胞は、サブテロメア配列に変化が見られるということを明らかにした。このことは染色体末端間の融合がよく知られているテロメアの短小化だけでなく、染色体末端の不安定化によっても引き起こされることを示している。現在、逆遺伝学的アプローチを用いて染色体末端融合に必要とされる因子の同定を試みている。染色体の未端は様々なタンパク質により保護されており、染色の未端がDNA二重鎖切断末端と間違えられることはない。そのため染色体末端間での融合は抑制されている。以前に当研究室では染色体に必須な領域であるセントロメアを染色体から取り除くと、テロメアが保護されているにも関わらず染色体末端間での融合が生じることを見出している。本研究ではそのような細胞の致死的な状況下での生き残り戦術として利用されている染色体間の融合メカニズムを解明することを目的とした。これまでに相同配列間で組換えが生じ、染色体融合が起きていることを明らかにしており、本年度はどのような因子がこの組換え反応に必須であるのかを同定するために実験を行った。DNA二重鎖切断の修復に関わる相同組換えや非相同末端連結に必要とされる因子の欠損株でセントロメア破壊を行ったところ、今回調べた全ての株から染色体末端間で組換わった生き残り株を単離することができた。おそらくこれは細胞の致死的な状況下での生き残りには既存のDNA二重鎖切断修復と同じ経路が用いられているわけではなく、全く未知の相同組換えあるいは複数の既存の経路が複雑に絡み合って用いられている可能性が示唆された。また昨年度明らかにした生き残り株でのサブテロメア領域の変化と今回調べた相同組換え因子との間にも関連があるようである。これは染色体末端間での融合とサブテロメア領域の変化の間にも関連があることを意味していると考えられる。