hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音樂運動療法検証から発展させた五感刺激心拍リズム1/fゆらぎ解析法の適用拡大

そこで本年度は新たなデータ収集の一方で、昨年度までに得られ保存しでいた各種元データの中から、音樂に対する情動反応を中心に、主として認知応答反応としての心拍リズムの中に含まれでいるはずのこれら情動反応を抽出できる指標で検討を重ねた。その結果、従来の自律神経機能である交感神経、副交感神経機能と共に、自律神経バランス指数という新たな指標を案出することに成功、種々検討を重ねた結果、上記情動反応を評価可能な指標となりうることを突き止め、そのことに関する論文も海外誌「J Clin Monit Comput」に投稿、採用された。今後多くの研究者の注目を得るのを期待しでいる。そして引き続きこの新しい心拍リズム変動解析による情動反応評価法を利用してICUで死亡直前の患者の脳の状態(所謂臨死体験中の幻想現象類似)を探るため、レム睡眠時の夢や全身麻酔中のパラメータ、音楽の心地よさのデータとも対比し、未だ知られていない上記現象解明も試みた。この目的には長時間心拍変動収集にはアクテイブトレーサ(AC301A)を用いて連続24時間以上計測した複雑かつ膨大な時系列データの解析を進め、日本集中治療医学会学術集会で報告、また日本麻酔科学会学術集会では音樂情動反応を著名に示した症例に関しでの上記解析方法並びに脳波によるその裏附けデータを含めて報告することができた。今回の研究では、特に喜怒哀楽などの感情変化が心臓リズムに影響することに注目して来た。これは近年進歩した脳画像など大掛かりな機器を用いなくても、或る種の脳機能や情動反応などが心拍リズム解析法に工夫を凝らせば数値化できる可能性を意味している。そこで脳の認知を心拍リズム変動として伝達する自律神経に注目し、その新しい解析法を模索してきた結果、やすらぎ波動の1/fゆらぎ理論の考え方を応用した心拍変動の1/fゆらぎ応用解析法を考案するに至った。研究最終年度ではその計測対象領域を拡大し、この心拍リズムを1/1000秒の精度で採取するソフトMemCalc Systemを用い、新たにバランス指数という指標を算出した。これでもって認知情動反応'こころ'の変動を見出せる可能性を発表した。そのため先ずは健常人ボランティアに対する対照データの採取、急性・慢性意識障害患者等に対する音楽聴覚刺激や足裏知覚帯刺激チャレンジ法など、刺激に対する反応の強弱から残存するバイタリティの程度、意識・情動反応のレベルを、さらには難治疼痛患者に対する音樂の癒し効果も検討し、科学的判定評価法のデータ蓄積をはかった。具体的には、データ上ICUで死亡直前の患者の脳の状態(臨死体験現象など)が一種の情動反応を呈しているのではという推測値が得られ、アクテイブトレーサ(AC301A)で連続24時間以上測定して得た正常人のレム睡眠時の夢に現れる情動現象と対比する研究、そして全身麻酔中の無意識状態における心拍リズム変動解析結果など、数値上この新たに提案した4種類の情動反応パラメータ(バランス指数Balance index)の意義を各種学術集会において発表してきた。
IKdelay電流のKATP非依存性インスリン分泌への関与と新規GLP-1経路

膵β細胞の電位依存性K+チャネル電流(IKdelay)はグルコース刺激時のインスリン分泌に重要な働きをしている。この電流はβ細胞が活動電位を発生している時のみ開口している。IKdelayは高グルコース還流下で電流は増加するがそれは陽電位側でみられる。負電位域では逆に減少している。この負電位側は活動電位発生時のIKdelayが関与する膜電位領域であるので生理的にはこちらの方が重要である。グルコース濃度が減少するとIKdelayは逆に増加した。グルコースを低下させる代わりに代謝をFCCPやAMPPNP、ATPフリー液で抑制しても同様のIKdelayの増加がみられた。またalkaline phosphataseで細胞内適用すると同じ電流変化がみられた。Kv2.1チャネルをHEK293細胞に発現させて同様の代謝抑制をするとKv2.1チャネル電流は負電位側で電流増加がみられた。従って、β細胞で観察したIKdelayの変化はKv2.1チャネル電流の代謝性調節の結果でありその制御にはチャネルのリン酸化・脱リン酸化が関与していると思われた。これらの結果はGLP-1作用にKv2.1チャネルが関与していることを示唆している。ブドウ糖刺激インスリン分泌機構には現在2種類の機序が知られている。(1)ATP感受性K^+チャネル(KATP)依存性と(2)KATP非依存性経路である。(2)の経路では受容体刺激(GLP-1やGIP刺激)の結果産生されるcAMPによるインスリン分泌増強も含まれる。この機序には複数の因子が知られていて、細胞内Ca^<2+>濃度の増加を介する(プロテインキナーゼA;PKAの活性化と蛋白リン酸化過程を含む)、あるいはcAMP-GEF系を介し、て分泌を増強する説が知られている。本研究ではcAMPシグナルの下流に細胞膜のK+チャネル(IKdelay)の活性変化が関与していることを明らかにし、GLP-1の作用機序に新機軸を加えることが目的である。本年度確認できた本研究の成果は:1.チャネル電流はブドウ糖濃度を低下させるとその活性が低下する2.チャネル電流はブドウ糖濃度を増加させるとその活性が増加する3.ここで影響を受けているチャネルはKv2.1チャネルであることがわかった4.これらのブドウ糖によるチャネル活性化調節にはATPが重要である5.さらにチャネルのリン酸化も重要であることが示唆された6.cAMPについてはチャネルには抑制的に作用しているIKdelay電流(以下Kvチャネル電流)のグルコース代謝依存性について研究した。以下の研究成果を得た。Kvチャネル電流は1.グルコース代謝でチャネル活性が調節されている2.グルコース濃度上昇で活性増加がみられるがこれは膜電位が陽電位側でみられる3.陰電位側ではむしろ活性の減少がみられた4.これはチャネルの活性化曲線がグルコース濃度増加で陽電位側へシフトするためであった5.このシフトはMgATP依存性であった6.このシフトはチャネルリン酸化が関与していることが示唆された7.グルコース刺激電気活動活性化時にもKvチャネル活性の調節が観察されたKdelay電流(以下Kvチャネル電流)のグルコース代謝依存性について研究した。Kvチャネル電流は1.グルコース代謝でチャネル活性が調節され、低グルコースで電流増加がみられる。2.グルコース濃度上昇で活性増加がみられるがこれは膜電位が陽電位側でみられる。3.高グルコースで、負電位側ではむしろ活性の減少がみられた。4.これはチャネルの活性化曲線がグルコース濃度増加で陽電位側へシフトするためであった。5.このシフトはMgATP依存性であった。6.このシフトはチャネルリン酸化が関与していることが示唆された7.グルコース刺激電気活動活性化時にもKvチャネル活性の調節が観察された。8.脱リン酸化阻害剤ではこれらの現象(低グルコースで電流増加)が見られなかった。9.脱リン酸化には細胞内Ca^<2+>濃度増加が関与していた。10.この脱リン酸化酵素はカルシニューリンと思われた。以上より、β細胞のKvチャネルはチャネル蛋白のリン酸化と脱リン酸化によって調節を受けているが、この蛋白はKv2.1チャネルである。その重要な調節因子は細胞内Ca^<2+>である。チャネルは基本的にはリン酸化されており、Ca^<2+

>依存性に脱リン酸されるとチャネル蛋白の活性化曲線が左方(負電位側)へシフトすることでチャネル電流の増加がみられる。このことはグルコース刺激によるβ細胞インスリン分泌に対してはnegative feedback作用と考えられ、インスリン分泌においては重要な働きであることが示唆される。この脱リン酸化酵素はカルシニューリンが考えられる。β細胞は複数の種類のKvチャネルが発現しているが、HEK293細胞にKv2.1チャネルを発現させても同様な結果を得ていることから、上記のような仮説がさらに支持されたものと考えている。
植物の環境適応におけるバクテリア型緊縮応答の果たす役割

緊縮応答はもともと原核生物に普遍的に保存された遺伝子発現、タンパク質機能調節機構であるが、近年のゲノム解析の進展により、この因子が植物のゲノムに保存されていることがわかってきた。しかしその機能はほとんどわかっていない。本研究では、モデル植物シロイヌナズナを材料に、植物型緊縮応答に関する知見を得ることを目標に研究を進めた。その結果、植物の緊縮応答は、1)葉緑体の遺伝子発現調節、2)葉緑体の正常な形成、に重要な働きをすることがわかった。緊縮応答と呼ばれる原核生物に普遍的に見られる生理応答が葉緑体に保存されており、植物の示す様々な高次機能を調節することがわかってきた。多くの原核生物ではこの因子は必須なものであるため、植物細胞内でも重要な働きをしていると思われるが、その機能はよくわかっていない。その制御機構のメカニズムを明らかにすることを目標に研究を進めた。遺伝学的解析シロイヌナズナのゲノムには原核生物型緊縮応答因子と相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子が4つある(RSH1,RSH2,RSH3,CRSH)。今回カリフラワーモザイクウイルス由来35Sプロモーター下流にRSH3遺伝子を繋いだコンストラクトを、野生型シロイヌナズナに導入することで、RSH3を過剰に発現する組換植物体を得た。得られた組換植物体は野生型に比べ薄緑色であり、クロロフィル量が大きく減少していた。また葉緑体の構造を電子顕微鏡で観察したところ、チラコイド膜の発達が遅延しており、野生型とはかなり異なる形態であった。このことから、植物の緊縮応答は正常な葉緑体の発達に重要な役割を果たすことがわかった。局在/発現解析シロイヌナズナのRSH2とRSH3タンパク質にGFPを融合したコンストラクトをタマネギの表皮細胞に導入し、その組換タンパク質の細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、葉緑体に加えミトコンドリアへの局在が観察され、緊縮応答がミトコンドリアにおいても機能する可能性が示唆された。また緑藻クラミドモナスのゲノムには緊縮応答因子をコードする遺伝子は1つだけであるが、その局在を同様のGFPコンストラクトで解析したところ、葉緑体だけに局在した。このことからミトコンドリアへの局在は高等植物でのみ行われる可能性が考えられた。シロイヌナズナのゲノムには原核生物型緊縮応答因子と相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子が4つある(RSH1,RSH2,RSH3,CRSH)。昨年度までに、カリフラワーモザイクウイルス由来35Sプロモーター下流にRSH3遺伝子を繋いだコンストラクトを、シロイヌナズナに導入することで、RSH3を過剰に発現する組換植物体を得た。今年度は、このRSH3過剰発現体の解析を重点的に進めた。まず電子顕微鏡でRSH3過剰発現体の葉緑体構造を観察したところ、野生型と比べ、一細胞当たりの葉緑体数に変化は無かったが、個々の葉緑体が萎縮していることがわかった。このことから植物の緊縮応答は正常な葉緑体の発達に重要な役割を果たすことがわかった。またこの過剰発現体が薄緑色の表現型を示すのは、この葉緑体の発達不全が原因と考えられた。次にRSH3過剰発現体における、葉緑体遺伝子の転写産物(mRNA)および葉緑体遺伝子翻訳産物(タンパク質)量をそれぞれ、リアルタイムPCRおよびウエスタンブロッティングで解析した。その結果、この過剰発現体では、葉緑体遺伝子のmRNA量が全体的に減っていることがわかった。しかしながら、そのタンパク質量の変動は遺伝子によりばらつきが見られた。このことから、葉緑体の緊縮応答は、葉緑体ゲノム上のほとんどの遺伝子の転写と翻訳両方を調節すること考えられた。
鉄系超伝導体超薄膜における巨大熱電応答

本研究は二次元熱電半導体材料の研究・探索を行う。本研究の対象物質であるFeSeは、FeとSeから構成される層がファンデルワールス力で積み重なる理想的な二次元層状構造をとる。このFeSeの単層膜は超伝導転移温度が60100ケルビンにも達する高温超伝導体であることが知られている。すなわち、熱電特性と電気伝導特性の両面で優れた二次元熱電材料である可能性がある。平成30年度は、イオン液体中におけるFeSe薄膜および関連物質の熱電効果測定を中心とした研究を行った。より具体的には、以下の研究を行った。1) FeSe薄膜に対してイオン液体中で電気化学エッチングを行い、薄膜試料の厚みを制御しながら熱起電力の測定を行なった。イオン液体の凍る200ケルビンでは、試料の厚みの減少とともに熱起電力が大きく増大し、最大でエッチング前の100倍程度に達することがわかった。また、試料を薄くしていくとFeSe薄膜は高温超伝導状態になるため、高い電気伝導度も示すようになる。これらの特徴は、大きな熱電出力因子(熱起電力の二乗に比例し、また電気伝導度に比例する)を得る上で有利な性質である。実際に出力因子の温度依存性を測定したところ、超伝導転移温度直上の50ケルビンにおいて、最大の出力因子を示すことがわかった。2)本研究ではFeSe薄膜は酸化物基板上に成膜される。上記1)で報告した高い熱起電力に対する基板の影響を検討するため、二種類の酸化物基板を用いた実験を行なった。一つはSrTiO3基板、もう一つはKTaO3基板である。それぞれの基板上に厚さ20ナノメートル程度のFeSe薄膜を成膜し、電気化学エッチングを行いながら熱起電力を測定したところ、どちらの基板上でも膜厚の現象に伴う熱起電力の増大を観測した。すなわち、熱起電力の増大は基板の影響ではなく、薄膜物質の電子状態の変化が原因であることがわかった。平成30年度には、本研究課題で最も重要と位置付けているFeSe極薄膜の熱電効果測定を大きく進展させることができた。イオン液体中で薄膜試料をエッチングしながら熱電効果測定を行うことで、熱電特性の詳細な膜厚依存性を明らかにした。また、室温付近から10ケルビンの温度範囲において熱電特性の温度依存性を調べることで、最大の出力因子を明らかにすることができた。さらに、研究の過程で、熱起電力の測定値における基板の影響の有無をしらべる必要が出てきた。そのため、二種類の基板上にFeSe薄膜を成膜し、それらの熱起電力測定を行なったところ、基板の影響は無視できることがわかった。この追加実験の結果が得られたことで、本研究課題の結果の正当性が一層確かなものになった。このように、平成30年度の研究計画に含まれている実験を、おおよそスケジュール通りに進めることができたため、本研究の進展具合は「当初の計画どおりに進展している」と考えている。平成30年度は順調に研究を行うことができ、これまでの研究計画は予定通りに進行していると考えている。平成31年度の実験は、平成30年度までの結果を土台とするものであるが、いまのところ計画の変更などの問題はない。平成31年度は前年度までと異なり、超伝導マグネットを用いた強磁場中での測定を開始する。そのため、新しい測定プログラムの構築や、トランジスタのデバイス構造の変更が必要になる。このようなセットアップの構築を31年度前半で完了させ、31年度後半は試料の測定に集中する。また、協力体制については、研究代表者と分担者は電子メールや電話での日常的なディスカッションを行う環境にあり、また学会等での出張先では積極的に直接顔をあわせてディスカッションを行った。平成31年度は最終年度であるので、研究目標の達成へむけて研究スピードを加速させるためにも、お互いの実験施設に出向いたディスカッションの回数を増やし、また定期的に行う。平成31年度も研究者間の密な交流を継続する。本研究は、大きな熱電効果を有する二次元材料の研究・探索を行うものであり、近年精力的に研究が進められている層状カルコゲナイドの中でも特に、高い超伝導転移温度を示すFeSe薄膜および関連物質に注目する。イオン液体を用いた電気二重層トランジスタ構造を用いて、電気化学反応によりサブナノメートル厚みのFeSe超薄膜を作り出し、熱輸送特性の系統的な測定を行う。平成29年度は、申請書に記載した研究計画に従い、イオン液体中におけるFeSe薄膜の熱電効果測定を中心とした研究を行った。1FeSe薄膜をチャネル物質とする電気二重層トランジスタを作製し、イオン液体中でFeSe薄膜の熱電効果測定を行った。イオン液体を通してFeSe薄膜に正電圧を印加すると、薄膜表面に多量(1平方cmあたり10の14乗のオーダー)の電子を蓄えることができる。この表面電子ドーピングにより、FeSe薄膜の超伝導転移温度を10 K以下から約40 Kまで上昇させた。この、超伝導転移温度の上昇は、FeSeに存在するホールと電子のフェルミ面のうち、ホールバンドを埋め尽くした状態に対応すると考えられる。電子ドープを行いながら熱電効果を測定したところ、フェルミ面の再構成に伴い熱電効果が上昇することを発見した。2電気化学的エッチングを行うにあたり、イオン分子の構造の影響を系統的に調べた。

その結果、イオン分子の構造や価数を変えると、エッチングの進行のスピードや、試料表面に静電的に蓄積される電子キャリアの数が大きく変化することが分かった。特に、二価カチオンを含むイオン液体を用いると、一価のイオン液体に比べて超伝導転移温度が10K程度の大幅な増大を示すことを発見した。今年度に行った研究成果は、国内学会・国際学会等様々な場所で発表した。また、上記1は成果を論文雑誌に投稿中であり、2は論文として出版した。平成29年度の研究計画は、「FeSe薄膜におけるイオン液体中での熱電効果測定を中心とした研究」であった。申請者は上記「研究実績の概要」に報告したように、申請書に記載した研究計画に従って研究を遂行した。主な結果は、FeSe薄膜をチャネル物質とする電気二重層トランジスタを作製し、イオン液体中でFeSe薄膜の熱電効果測定を行ったところ、キャリア数の増加に伴う超伝導転移温度や熱電効果の増大を観測したことである。さらに、本研究では固液界面でに電気化学反応を積極的に利用するが、この反応を起こす場であるイオン液体の分子構造が化学反応に与える影響を調べることができた。29年度の研究計画に含まれている実験を、おおよそスケジュール通りに進めることができたため、本研究の進展具合は「当初の計画どおりに進展している」と考えている。平成29年度の実験結果の一部はすでに論文として発表することが出来ており、また別の論文一報が投稿中である。さらに、日本物理学会・応用物理学会など国内学会、国際学会、アメリカ物理学会、また研究会、ワークショップにおいて本研究の成果の一部を報告した。平成30年度の研究は、平成29年に行った実験を関連物質に適用する実験が含まれるが、平成29年度の研究が計画通りに進んだため、スムーズに30年度の研究に移行できる状況である。本年度(30年度)も申請書に従った計画的な研究を行う予定である。本研究は二次元熱電半導体材料の研究・探索を行う。本研究の対象物質であるFeSeは、FeとSeから構成される層がファンデルワールス力で積み重なる理想的な二次元層状構造をとる。このFeSeの単層膜は超伝導転移温度が60100ケルビンにも達する高温超伝導体であることが知られている。すなわち、熱電特性と電気伝導特性の両面で優れた二次元熱電材料である可能性がある。平成30年度は、イオン液体中におけるFeSe薄膜および関連物質の熱電効果測定を中心とした研究を行った。より具体的には、以下の研究を行った。1) FeSe薄膜に対してイオン液体中で電気化学エッチングを行い、薄膜試料の厚みを制御しながら熱起電力の測定を行なった。イオン液体の凍る200ケルビンでは、試料の厚みの減少とともに熱起電力が大きく増大し、最大でエッチング前の100倍程度に達することがわかった。また、試料を薄くしていくとFeSe薄膜は高温超伝導状態になるため、高い電気伝導度も示すようになる。これらの特徴は、大きな熱電出力因子(熱起電力の二乗に比例し、また電気伝導度に比例する)を得る上で有利な性質である。実際に出力因子の温度依存性を測定したところ、超伝導転移温度直上の50ケルビンにおいて、最大の出力因子を示すことがわかった。2)本研究ではFeSe薄膜は酸化物基板上に成膜される。上記1)で報告した高い熱起電力に対する基板の影響を検討するため、二種類の酸化物基板を用いた実験を行なった。
小児のための無拘束・非接触な睡眠検査方法に関する研究

近年,小児においても,睡眠の質と量が低下することによる昼間の不注意や多動性などの行動障害が知られているが,適切な治療により行動は改善するといわれている.しかし,既存の検査方法では拘束感が強いため,本研究では動画像の差分処理に着目し,小児のための無拘束・非接触な睡眠検査方法の確立を目指した.大阪大学医学部附属病院小児科外来に来院した睡眠障害を主訴とする患者60名程度に対し,PSG検査とビデオの動画像計測を行った.(大阪大学医学部の倫理委員会に申請,許可を取得)この中から,臨床医の判断により,睡眠ポリグラフの結果が正常に近く,かつ動画像に保護者の写りこみがない症例を抽出した.この結果,解析対象は18例となった.この18例の解析対象において動画像から算出した体動とPSGから判定された睡眠ステージを比較した.全ての被験者において睡眠ステージの変化に伴い,差分画像による体動量が変化しており,睡眠-覚醒サイクルと連動して体動量は増減していた.睡眠ステージ毎に,差分画像による体動の割合を算出した結果,WAKE>stage1>REM>stage2>stage3>stage4となり,拘束的な手法で計測された睡眠時の体動に関する先行研究と一致した.以上のことから,差分画像による体動の値を用いることで,睡眠ステージを推定できる可能性が示唆された.また,特殊な臨床例として,パラソムニア(睡眠随伴症,REM睡眠行動異常症)と診断された7歳男児の体動回数の変化を試験的に調べたところ,REM期の体動が他の症例と比較して非常に多く,診断前のスクリーニング検査としても使用できる可能性を示した.近年,小児においても,睡眠の質と量が低下することによる昼間の不注意や多動性などの行動障害が知られているが,適切な治療により行動は改善するといわれている.しかし,既存の検査方法では拘束感が強いため,本研究では動画像の差分処理に着目し,小児のための無拘束・非接触な睡眠検査方法の確立を目指した.大阪大学医学部附属病院小児科外来に来院した睡眠障害を主訴とする患者60名程度に対し,PSG検査とビデオの動画像計測を行った.(大阪大学医学部の倫理委員会に申請,許可を取得)この中から,臨床医の判断により,睡眠ポリグラフの結果が正常に近く,かつ動画像に保護者の写りこみがない症例を抽出した.この結果,解析対象は18例となった.この18例の解析対象において動画像から算出した体動とPSGから判定された睡眠ステージを比較した.全ての被験者において睡眠ステージの変化に伴い,差分画像による体動量が変化しており,睡眠-覚醒サイクルと連動して体動量は増減していた.睡眠ステージ毎に,差分画像による体動の割合を算出した結果,WAKE>stage1>REM>stage2>stage3>stage4となり,拘束的な手法で計測された睡眠時の体動に関する先行研究と一致した.以上のことから,差分画像による体動の値を用いることで,睡眠ステージを推定できる可能性が示唆された.また,特殊な臨床例として,パラソムニア(睡眠随伴症,REM睡眠行動異常症)と診断された7歳男児の体動回数の変化を試験的に調べたところ,REM期の体動が他の症例と比較して非常に多く,診断前のスクリーニング検査としても使用できる可能性を示した.
脳スライス培養系を用いた神経-グリア-内皮細胞連関におけるケモカイン分子機能解析

脳は、神経細胞、アストロサイト、ミクログリア、脳微小血管内皮細胞(Brain Microvascular Endothelial Cell;BMEC)など多種の細胞で構成されており、これら細胞間のクロストークにより、BMEC間のタイトジャンクションを基盤としたBBB特有のバリア機能が形成・調節されている。本研究では、神経細胞傷害時における神経-グリア-BMEC間の相互作用によるBBB機能変化のメカニズムを詳細に解析するための実験系として、神経-アストロサイト共培養系とBMECを、多孔質膜を隔てて配置したin vitro BBBモデルを確立した。神経-アストロサイト-BMEC共培養モデルでは、BMEC単独培養系及びアストロサイト-BMEC共培養系よりもTEERが高く、BMEC単独培養系よりもFITC-dextranの透過性が低かったことから、作製したBBBモデルがBMEC単独培養系やアストロサイト-BMEC共培養系よりも高いバリア機能を有していることが示された。また、NMDA処置後48時間以降にTEERの有意な減少とFD40透過性の増大が見られたことから本BBBモデルは、傷害された神経細胞とBMECとの相互作用あるいは神経細胞傷害により活性化したアストロサイトとBMECとの相互作用によるBBB機能変化のメカニズム解明に応用できる実験系であることが示唆された。さらに、NMDAによる神経細胞傷害時におけるBBBの強度低下及び透過性亢進と、血管内皮細胞のタイトジャンクションタンパク質の局在変化の関連について調べたところ、ZO-1やoccludinにおいて、NMDA処置後に細胞膜局在が低下し、細胞骨格局在が増加していた。神経細胞傷害によるBBB機能低下におけるケモカインの役割は今後の検討課題である。本研究では、神経細胞傷害時の神経-グリア-血管内皮-白血球相互作用を解析するためのインビトロ実験系を構築し、「神経細胞傷害→グリア細胞活性化→血管内皮透過性亢進→白血球浸潤」という脳内炎症様反応におけるケモカイン分子の役割を明らかにすることを目的としている。研究計画では神経-グリア相互作用のコンポーネントとして脳スライスを用いる予定であったが、脳スライス培養系では均一な遺伝子導入が難しく、また、今後の解析に遺伝子工学的手法が必須であることを考慮し、神経-グリア相互作用のコンポーネントとして神経-アストロサイト共培養系を用いることにした。今年度の研究により、予定している細胞支持体(多孔質膜)に対して、神経-アストロサイト共培養および脳血管内皮細胞培養を行うのに適したコーティング方法を検討し、それぞれの細胞培養系に適したコーティング法を見いだした。さらに、神経-アストロサイト共培養系と脳血管内皮細胞培養系を立体的に配置し培養するための多孔質膜コーティング方法について現在検討を進めているところである。一方、培地組成に関しては、神経細胞、アストロサイト、脳血管内皮細胞の3種類の細胞が生存可能であることに加え、正常脳内で見られるようにグリア細胞を低い活性化状態に維持することを目的に、使用する血清等に関して、神経細胞と血管内皮細胞の生存ならびにアストロサイトの活性化を指標として検討を進めている。
阻害剤・タンパク質複合体の分子科学計算による定量的構造活性相関手法の構築

創薬ターゲットとして重要となる幾つかの亜鉛含有タンパク質とその一連の阻害剤と系を対象にQM/MM法、非経験的フラグメント分子軌道法等の分子科学計算を用い、両者の分子間相互作用エネルギーを評価し、自由エネルギー変化の加成性と線形性に基づく新しい定量的構造活性相関(QSAR)手法であるLinear Expression by Representative Energy terms (LERE)-QSAR解析を適用した。その結果、実験的アプローチや従来の古典QSAR解析からは得ることが困難な原子・電子レベルでの阻害メカニズムを定量的に議論し、亜鉛原子の持つ役割の類似・相違点を系統的に明らかにした。平成23年度に引き続き、薬物-受容体相互作用の原子・電子レベルからの理解と創薬に資することを目的として、両分子の複合体構造に対する分子科学計算・シミュレーションの遂行およびそれらに立脚した新しい定量的構造活性相関(Quantitative Structure-Activity Relationship; QSAR)解析の提案を目指し、亜鉛含有タンパク質を解析対象とし、非経験的フラグメント分子軌道法および拡張Born理論を用いて、両分子間の複合体形成に関わる自由エネルギー変化の代表エネルギー項の詳細解析に基づくQSAR解析を行った。平成24年度は新たな亜鉛含有タンパク質として、がんやリウマチに関与するマトリックスメタロプロテアーゼ-9 (Matrix Metalloproteinase-9; MMP-9)とその一連の阻害剤を解析対象に加え、前年度までの解析対象である炭酸脱水酵素(Carbonic Anhydrase; CA)・阻害剤系における解析結果との比較を行った。この結果、下記の(1)-(3)を明らかにし、従来の古典QSAR解析に対し、薬物-受容体の相互作用の観点から阻害剤の活性強度の変化をより明確に理解することができた。(1)両解析系ともに実測の全自由エネルギー変化は、結合相互作用エネルギー、水和および解離自由エネルギー変化の代表エネルギー項を用いて定量的かつ高精度に再現可能である。(2)両解析系ともに活性中心に存在する亜鉛と阻害剤との結合相互作用・水和自由エネルギー変化の寄与がタンパク質中の他のアミノ酸残基からの寄与に比べて顕著に大きい。(3) CA・阻害剤系では、結合自由エネルギー変化よりも水和・解離自由エネルギー変化が、一方MMP-9・阻害剤系では、水和・解離自由エネルギー変化よりも結合自由エネルギー変化がそれぞれの複合体形成において支配的要因である。(1)結合相互作用エネルギーの評価にHartree-Fock (HF)法のエネルギーに古典的な分散力エネルギー補正を行った新規HF-Dtq法を考案した。(2)水和自由エネルギー変化の評価に量子/古典化学的連続体モデルのハイブリット法を導入した。上記(1), (2)の有用性は、生体高分子・薬物分子との相互作用を想定した多様なモデル系を用いて検証を行い、化学的精度と計算コストの両面から実用的な予測が可能であることを確認した。これらの改良型LERE-QSAR解析を亜鉛原子を活性部位に含有する炭酸脱水酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ-9, -13、TNF-α変換酵素、ならびにヘム鉄を含有するチトクロームP450とこれらタ金属タンパク質に対する一連の阻害剤との複合体系へ適用した。その結果、それぞれの系において、複合体形成に伴う実測の自由エネルギー変化を高精度に再現するとともに、各金属タンパク質に対する阻害剤の作用メカニズムの類似・相違点を物理化学的にも妥当な解釈に基づき原子・電子レベルで定量的に説明し、金属原子の持つ役割を系統的に理解することができた。薬物-受容体相互作用の原子・電子レベルからの理解と創薬に資することを目的として、両分子の複合体構造に対する分子科学計算・シミュレーションの遂行およびそれらに立脚した新しい定量的構造活性相関(Quantitative Structure-ActivityRelationship; QSAR)解析の提案を目指し、亜鉛含有タンパク質である炭酸脱水酵素とその阻害剤である一連のベンゼンスルホンアミド誘導体を解析対象とし、非経験的フラグメント分子軌道法および拡張Born理論を用いて、両分子間の複合体形成に関わる自由エネルギー変化関連項の詳細解析とQSAR解析を行った。この結果、実測の全自由エネルギー変化は、結合、水和および解離自由エネルギー変化を用いて定量的に説明可能であることを示し、特に、両者の複合体形成においては、結合自由エネルギー変化よりも水和・解離自由エネルギー変化が支配的要因であることを明らかにした。本解析では、従来の受容体情報を含まない古典QSAR解析に対し、薬物-受容体の相互作用の観点から、従来のQSAR解析において頻繁に使用されるHammett σおよび疎水性置換定数πが持つ物理化学的意義を明確に示すことができた。

また、薬物分子と受容体タンパク質中のペプチドモデルを想定して、それぞれ一連のacetophenone置換体とN'-methyl acetamideを使用し、両者の分子間相互作用エネルギーの構成成分を分割解析した結果、静電相互作用、電荷移動、分極、交換反発の相互作用エネルギー成分および溶媒和自由エネルギーがいずれもσと良好な線形関係にあることを示し、本来σは化合物の単独状態時における置換基の電子的効果を表しているにも関わらず、分子間相互作用を通してその効果が反映されていることを定量的に明らかにできた。前年度の推進方策として、本申請課題で提案する新しいQSAR手法の適用範囲の可能性と予測精度、創薬への応用の可能性についての検証を目的とし、より多くの解析系への方法論の適用を行う予定であった。実際に平成24年度は、前年度までのCAに加えてMMP-9を新たな対象とする解析を遂行し、両タンパク質に対する阻害剤の作用メカニズムに関する共通点・相違点を定量的に明らかにし、その結果は学術論文として発表することができた。また、タンパク質のような生体巨大分子においては、水和自由エネルギー変化の評価方法・定量的精度が問題となるが、連続溶媒和モデルによる非経験的分子軌道法(量子力学計算)や一般化Bornモデル(古典力場計算)、ならびに新しい試みとして両者のハイブリット法など複数の方法に基づく比較評価を行い、その妥当性について検証を行った。研究代表者本人が頸髄損傷により平成24年10月11日から平成25年2月3日までの間、入院・療養を余儀なくされており、この間は引き続き研究補助者(大学院生)の協力により研究を推進し、学会等での成果発表を代理で行った。結果として、当初予定していた研究成果の発表のための学会等への参加ならびに物品等の購入による研究経費の使用ができず、431,520円の未使用額が生じた。現在、研究延長申請を行い平成25年度中に研究の遂行と残り経費の執行に努力する。以上から、おおむね順調に進展している。平成23年度は、当初計画の新しい定量的構造活性相関法の基盤構築およびその検証までを亜鉛含有タンパク質である炭酸脱水酵素とその阻害剤である一連のベンゼンスルホンアミド誘導体を解析対象として行うことができた。同時に、従来の古典的定量的構造活性相関解析法との比較から、本解析方法が原子や電子レベルでの定量的な詳細情報を与えるなどの優位性を確認することができた。さらに、阻害剤が同族体の場合においては、静電相互作用エネルギー変化と水和自由エネルギー変化の間に一般に逆相関が成立することなど一連の阻害剤とそれらの標的タンパク質間相互作用エネルギーの内訳にいくつかの線形関係が存在することが古典的定量的構造活性相関の成立基盤であることを確認した。また、フラグメント分子軌道法を用いた金属含有タンパク質と薬物分子の相互作用解析を行うための新たな解析法を提案し、炭酸脱水酵素中の亜鉛原子の役割を定量的に明らかにすることができ、他の金属含有タンパク質との相互作用解析へも応用可能であることを示した。以上から、当初計画にしたがっておおむね順調に進展している。現在までに、CAやMMP-9を解析対象に新しいQSAR手法の適用を行ってきた。
自己免疫性脳炎の発症機序の解明と新しい治療法の開発

本研究は自己免疫性脳炎(EAE)の発症機序の解明から新しい治療法開発を行ない、得られる情報をヒトの多発性硬化症(MS)の解明、治療法の開発に応用することを目的とする。1.炎症の初期反応としてセロトニンの動きをマイクロダイアリシス法を用いて解析したが有意の変化を見出せず、治療応用は出来なかった。2.ミエリン塩基性タンパク(MBP)のペプチド89-101に反応し脳炎を惹起するT細胞クローンをSJLマウスから樹立しそのT細胞受容体を解析した結果、Vβは多用であるがCDR3領域に保存された配列があることが分かった。この部位の合成ペプチドはEAEの臨床経過に変化を与えた。3.MBP89-101反応性脳炎誘起性T細胞が使用するVβ17aのCDR2部分合成ペプチドの接種はダブルネガティブサプレッサーを誘導した。このサプレッサークローンはEAEを抑制した。4.脳炎誘起性T細胞を活性化して動物に接種すると、ダブルネガティブの抗エルゴタイプサプレッサーが誘導された。このサプレッサーが認識するエルゴタイプ分子に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いてcDNAのクローニングを行っている。5.γδT細胞が認識するHSP65の発現をオリゴデンドログリアに見出した。一部は膜表面に発現していることが分かった。6.MS患者末梢血T細胞のプロテオリピッドプロテイン(PLP)に対する応答性を検討し、免疫優位部位を見出した。免疫優位部位反応性T細胞クローンのT細胞受容体を解析し、そのVβは多用であるが、CDR3領域に一定の興味ある配列を見出した。以上よりT細胞受容体およびエルゴダイプ抗原をターゲットとした新しい治療法の開発が可能であることが分かった。〈目的〉自己免疫性脳炎の発症機序の解明を目的として、実験的アレルギ-性脳脊髄炎(EAE)における炎症のmediator、炎症の初期反応をマイクロダイアリシス法にて解析する。今回は、Serotonin(5ーHT)の動向に焦点をあて解析した。〈方法〉実験には200ー250gの雌性Lewisラットを用いた。ネンブタ-ル(40mg/kg)麻酔下、脳定位固定装置を用いてbregmaより後方2mm、正中線より右2mm、深さ2mmの位置にガイドステンレス管(CMA12用ガイドカニュ-ラ、BAS社)を挿入し、デンタルセメントで固定した。48時間後、EAE群にモルモットMBPフラグメント68ー84(Sigma)100μgをCFAと共に感作した。Control群には何も感作は行なわなかった。透析液の回収は、無麻酔無拘束下ガイドステンレス管よりCMA/12マイクロダイアリシスプロ-ブ(BAS)を4mm脳内に露出させ、リンゲル液を2.5μl/minの流速で潅流して行なった。透析液は氷冷下に40分間(100μl)回収した。透析液の5ーHT並びにその代謝産物である5ーHIAAの量は、Neurochemにて測定した。〈結果〉今回用いた透析液の回収法では、殆どの5ーHTはその代謝産物である5ーHIAAとして回収された。Control群において透析液を経時的に回収したが、5ーHIAAの量に大きな変動はなかった(平均値;7.3±2.4ng/ml)。MBPを感作したモルモットから発病初日に透析液を回収したところ、5ーHIAA量はそれぞれ9.8、12.7、8.6、17.9ng/mlでControl群平均値比べ増加の傾向にあった。〈考察〉研究は未だ途中であり、結論には至っていない。

今後5ーHTの動向を把握する上で経時的なサンプリングが必須である。このような解析のこころみは新しく、EAE発症における5ーHTや他の炎症のmediatorの動向を明らかに出来ると考える。本研究は自己免疫性脳炎(EAE)の発症機序を解析し新しい治療法を開発することを目的とする。1)炎症の初期反応としてのセロメニンの動きをマイクロダイアリシス法により解析したが、有意の変化は見出さなかった。2)ミエリン塩基性タンパク(MBP)のペプチド89-101に反応し脳炎を惹起するT細胞クローンをSJLマウスから樹立しそのT細胞受容体を解析した結果、Vβは多様であるが、CDR3領域に興味深い保存されたアミノ酸配列があることが分った。この保存配列は種を越えて存在していた。この保存配列をもとにCDR3領域のペプチドを合成し、この接種によりEAEが抑制されるか否かの検討に着手した。3)MBP89-101反応性脳炎誘起性T細胞を活性化してマウス足蹠に接種すると所属リンパ節に活性化T細胞抗原を認識するCD4^-CD8^-すなわちdouble negative(DN)T細胞で抑制性の細胞が出現することが分った。このDNサプレッサーT細胞をクローニングしT細胞受容体を解析した所、Vβ17であることが分った。このDNT細胞はin vitroで脳炎誘起性T細胞のMBP89-101に対する反応を抑制し、in viroでそのEAEを抑制した。このようなDNサプレッサーT細胞の発見は初めてであり、自己免疫疾患に共通のものかどうか興味がもたれる。今後このようなT細胞を誘導活性化する機序の解明はEAEの治療法開発に有用であると思われる。4)最近熱ショック蛋白(HSP)が免疫系の標的抗原となり、自己免疫性疾患の発症機序に関与する可能性が指摘されている。本研究によりオリゴデンドログリアにHSPが発現されていることを示し、自己免疫性脱髄疾患の発症に関与する可能性を示した。今後γ8T細胞がHSP陽性オリゴデンドログリアを攻撃するか否かの検討が必要である。本研究は自己免疫性脳炎(EAE)の発症機序を解析し、新しい免疫療法を開発すること、得られる情報をヒトの病気多発性硬化症(MS)の解明、治療法開発に応用することを目的とする。1)昨年はSJL/Jマウス由来ミエリン塩基性タンパク(MBP)反応性脳炎誘起性T細胞クローンのT細胞受容体解析から、Vbeta使用は多様であるが、CDR3領域に保存された配列が見られることを見出した。そこで、CDR3領域の保存された配列をもとにペプチドを合成し動物に接種したところ、むしろ病気の悪化が見られた。このことは、この領域が重要な領域であることを意味しており現在病気を抑制する配列の検索をすすめている。2)SJL/Jマウスの脳炎誘起性T細胞クローンが使用するVbeta17aのCDR2ペプチドを動物に接種すると、クラスI拘束性ダブルネガティブサプレッサーが誘導され、そのラインの樹立に成功した。そのラインはin vivoで病気を抑えた。3)脳炎誘起性T細胞クローンを活性化して動物に接種すると抗エルゴタイプが誘導された。この抗エルゴタイプが認識する物質に体するモノクローナル抗体の作製に成功し、この抗体を用いて、その物質の解明に着手した。
ガン調節機能を有する多環式含窒素生体機能分子の実践的合成

当研究所で発見されたIL-6活性阻害剤マジンドリン類は、特異な3a-ヒドロキシフロインドリン骨格にジケトシクロペンテン部分がメチレン鎖で架橋した特徴的な構造を有している。我々は初めに、絶対配置を決定する目的で、すべての立体異性体の作り分け可能な全合成ルートの開発を行い、初の全合成を達成した。そして今回、大量合成に適した第2世代の全合成ルートの開発を行った。すなわち、一つ目の鍵反応は、光学活性な3a-ヒドロキシフロインドリンから導いたエステル体を用い、3a-ヒドロキシフロインドリン部分と金属によるキレーション構造を形成させ、酸クロライドとの反応面を制御した立体選択的アシル化反応により、ジケトシクロペンテン環上の4級炭素を選択的に構築した。そして、二つ目の鍵反応は、アリルシランを用いた分子内アシル化反応により一挙にジケトシクロペンテン部分を構築し、これにより計9ステップ、総収率は19%と短工程かつ高立体選択的な全合成ルートを確立した。これまでにこの合成法を用いて、マジンドリンを3g合成した。次に、この合成法を応用してジケトシクロペンテン環の側鎖を変換した誘導体を合成した。その結果、天然物より約4倍活性が上昇した誘導体(炭素鎖7)を創製することが出来た。また、マジンドリンAのラベル体合成を行い、マジンドリンAがgp130に特異性に結合することを明らかにした。さらに合成したマジンドリンAが、マウスを用いた骨粗鬆症モデルで有意に骨重量の減少を抑える事が明らかになった。
深海底地盤に隔離されたCO2ハイドレートの相転移を考慮したトラップメカニズム

2018年度は2017年度に引き続いて,二酸化炭素ハイドレート(CDH)含有地盤の強度-変形特性を表す弾塑性構成式の高精度化および,海底地盤不安定化現象に関する模型実験を実施した。まず構成式の高精度化については,CDH含有地盤間隙におけるハイドレート存在形態を考慮した弾塑性構成式を新たに提案した。これまでの研究によって,たとえCDHの含有量が同じであっても,CDH含有地盤の強度やダイレイタンシー特性が顕著に異なるということが既往の研究から明らかとなっており,その大きな原因としてハイドレート粒子の地盤間隙中の存在形態が指摘されていた。従来のCDH含有地盤の弾塑性構成式においては,CDH存在形態の違いによる力学応答の変化を考慮したものはなく,CDH含有地盤の強度変形特性をより精確に表現することが可能となった。さらに,CDH存在形態がせん断によって変化する現象も新たに構成式に取り入れた。CDH含有地盤に外力が作用すると,土粒子に固着していたCDHの破砕や剥離が起き,一時的に強度や剛性が急激に減少することがある。提案した構成式に存在形態の遷移を考慮することで,強度の最大値だけでなく,強度発現過程の再現も可能となった。また,昨年度に整備した模型実験装置を用いた海底地盤不安定化現象に関する実験を実施した。この実験では,海底地盤内でCDHが分解することを想定し,海底地盤を模擬した砂地盤に流体圧を加圧した際の地盤変形挙動の観察を行った。特に,海底地盤におけるGHの分解が大規模な海底地すべりを引き起こす可能性が指摘されているため,模型地盤を傾斜させ間隙流体圧上昇時の海底地すべり挙動について観察した。その結果,地盤内に不透水層が存在する場合に特に大規模な地すべりが発生し,また,地すべり発生の主な要因として間隙圧力の大きさだけでなく,地盤内に圧入される流体の流量も重要であることが明らかとなった。平成29年度は主にCDHがトラップされた海底地盤の構成式の開発および,CDH分解を模擬した海底地盤の不安定化現象に関する模型実験を実施した.まず,ガスハイドレートのモホロジーの違いに着目し,その初期割合を考慮した弾塑性構成式を新たに提案し,これがメタンハイドレート(以下MHと記す)および二酸化炭素ハイドレート(以下CDHと記す)といった種々のハイドレート含有地盤の三軸圧縮試験結果を統一的かつ精度よく再現可能であることを示した.さらに,CDH含有地盤のせん断に伴うモホロジー変化に着目し,ハイドレートの地盤間隙内における形態変化も考慮した構成式を開発した.また,あるハイドレート飽和率に対してCDHがトラップされる存在形態が変化することで,トラップされた地盤の強度やダイレイタンシーがどのように変化するのかを前述の提案した構成式を用いることによって感度分析的に検討した.次に,CDH分解を模擬した発生流体挙動の観察と地盤変動計測も実施した.海底地盤におけるCDH分解に伴う間隙水圧・間隙ガス圧の上昇における海底地盤の地すべりに注目し,模型実験を行った.海底地盤を模擬した模型内に10度および1度の斜面を形成し,斜面下から水圧をあたえた時の地すべり挙動を水中カメラの映像とPIV解析によって調査した.平成29年度は,ガス圧のコントロールは未だ難しいため,まずは水圧からの調査としている.実験の条件としては,水圧を与える位置を変化させることで過剰間隙水圧を与える位置を調節し,さらに地盤内への不透水層挿入の有無を変化させた.その結果,不透水層が無い地盤の場合は斜面法尻付近にボイリングが発生し,不透水層を有する場合は,間隙水圧を与える位置が局所的であっても不透水層に沿って地盤にすべりが確認された.また水圧を与える範囲が広いほど小さな水圧を与える段階ですべりが発生し,またすべりの規模が拡大した.当初予定していたCDH分解の要素試験は試験装置の整備等が必要であり、平成29年度に実施することはできなかった。平成30年度に実施できるように試験装置整備および実施日程の再調整が必要である。その代わり、CDH分解時の二酸化炭素ガスの発生に伴う海底地盤変形に関する模型実験を予定を早めて実施した。これに関しては、ガスを取り扱う現象はガス圧計測や発生する気泡の大きさのコントロールなど煩雑さを伴うため、平成29年度は基本ケースとして間隙水圧を与える模型実験を実施した。その結果、傾斜がおよそ10度の斜面において、斜面内に水や空気を通さない不透水層が存在する場合は、過剰間隙水圧が発生する場所が局所的であっても不透水層に沿って地すべりが発生することを明らかにした。また、解析コードの開発においてはガスハイドレート含有地盤の強度変形特性を統一的に表現可能な弾塑性構成式の開発を行なった.要素試験レベルでのCDH含有地盤の強度変形特性を精度よく再現することに成功した.今後二酸化炭素の相変化を考慮した支配方程式を定式化していく予定である.以上の理由により、当初の研究計画と比較して平成29年度に実施する内容から変更はあるものの、研究計画を前倒しすることで全体としては概ね順調に進めることができている。

これまでの研究によって,たとえCDHの含有量が同じであっても,CDH含有地盤の強度やダイレイタンシー特性が顕著に異なるということが既往の研究から明らかとなっており,その大きな原因としてハイドレート粒子の地盤間隙中の存在形態が指摘されていた。従来のCDH含有地盤の弾塑性構成式においては,CDH存在形態の違いによる力学応答の変化を考慮したものはなく,CDH含有地盤の強度変形特性をより精確に表現することが可能となった。さらに,CDH存在形態がせん断によって変化する現象も新たに構成式に取り入れた。CDH含有地盤に外力が作用すると,土粒子に固着していたCDHの破砕や剥離が起き,一時的に強度や剛性が急激に減少することがある。提案した構成式に存在形態の遷移を考慮することで,強度の最大値だけでなく,強度発現過程の再現も可能となった。また,昨年度に整備した模型実験装置を用いた海底地盤不安定化現象に関する実験を実施した。この実験では,海底地盤内でCDHが分解することを想定し,海底地盤を模擬した砂地盤に流体圧を加圧した際の地盤変形挙動の観察を行った。特に,海底地盤におけるGHの分解が大規模な海底地すべりを引き起こす可能性が指摘されているため,模型地盤を傾斜させ間隙流体圧上昇時の海底地すべり挙動について観察した。その結果,地盤内に不透水層が存在する場合に特に大規模な地すべりが発生し,また,地すべり発生の主な要因として間隙圧力の大きさだけでなく,地盤内に圧入される流体の流量も重要であることが明らかとなった。今年度は我々が提案してきた弾塑性構成式を三軸試験のような要素試験結果のみだけでなく,実地盤の,境界地問題にも適用できるように改良していく.CDHがトラップされた海底地盤の変形を解くための手法としては,有限要素解析法を用いる.これまで,土骨格の変形ー間隙水および間隙ガス圧を連成した解析コードの開発を行ってきたが,CDH隔離後のトラップメカニズムをより精緻に解くためにはさらに二酸化炭素の科学的特性も考慮する必要がある.二酸化炭素の場合は水への溶解度が大きいことや,二酸化炭素ガスが液化する圧力条件も相対的に低い.そこで本研究ではCO2(気体)からCO2(液体)への相転移を考慮し,相転移の流体密度変化に伴う圧力変化および温度変化を数学的にモデル化する.さらに,昨年度同様に海底地すべりに関する模型実験を継続して実施していく.過去海底地すべりは1度に満たない低角度でもすべりが発生していることを踏まえ,今年度はさらに低角度の1°の斜面を形成し,10°の実験時と同じく過剰間隙水圧を与える位置と不透水層の有無を変化させた時にどのような反応を地盤が起こすのかを調査する.また1°の斜面形成をした実験より水圧計を地盤内に設置し,不透水層下への水の広がり,またどのような強さの過剰間隙水圧が地盤に与えられたときにボイリングや地すべりといった地盤挙動が発生するのかに特に注目して実験を行う.またその後は従来の目的通り海底地盤内でのガスハイドレートの分解を模擬し,水圧を与える代わりに空気圧をその圧力と与える範囲を調節し模型内地盤に与える実験を行う.現在はガス圧を調整する方法を模索している段階であり,調節をしたガス圧をさらに均等に地盤に広げる方法も検討する必要性がある.
ミトコンドリア動態制御におけるＡＡＡ　ＡＴＰａｓｅ　Ｃｄｃ４８ｐの機能

ミトコンドリアは,融合と分裂を頻繁に繰り返すことによって,ヒモ状のネットワーク構造を維持していると考えられている。私たちは,サイトゾルのAAAシャペロンであるCdc48pの機能欠損によって,ミトコンドリア形態が著しく変化することを見出した。この形態変化を詳細に解析したところ,ミトコンドリア融合反応に欠損があることがわかった。また,Cdc48pと強調して機能する因子を検索したところ,Shp1pの欠失によってミトコンドリア形態変化が見られたことから,Cdc48p-Shp1p複合体によって,ミトコンドリア融合反応が制御されていると考えられる。ミトコンドリアは,分裂と融合を繰り返しながらダイナミックにその形態を変化させる。形態変化の生理的な意義はよく分かっていないが,これに関わる因子の一部は神経変性疾患の原因因子としても同定されていることから,ミトコンドリアの形態維持機構は解明すべき急務の課題である。私たちはこれまでに,蛍光顕微鏡を用いた観察から,サイトゾルの必須AAAシャペロンであるCdc48pが,ミトコンドリアの正常な形態形成に必須であることを見いだした。さらに,Cdc48pの機能欠損がミトコンドリア形態に与える影響を詳細に調べるため,生理学研究所との共同研究によって,SEM連続断面観察を行った。この手法によって,細胞内の微細構造を3次元的に観察できる。その結果,Cdc48pの機能欠損によって,断片化したミトコンドリアが細胞の一部に集まっているが,それぞれ独立していることがわかった。したがって,Cdc48pはミトコンドリア同士の近接には不要だが,それに続く膜融合反応に必要であると考えられる。Cdc48pは,様々なアダプタータンパク質によって,その機能が制御されていると考えられている。ミトコンドリアに関連するアダプタータンパク質として,Vms1pがこれまでに同定されていた。しかし,出芽酵母Vms1p欠損株では,ミトコンドリア形態は正常であったことから,他のアダプター因子が関与していることが示唆された。そこで,Cdc48pのアダプタータンパク質を検索したところ,Shp1pおよびUbx2pの欠損株において,ミトコンドリア形態異常が観察された。形態変化の生理的な意義はよく分かっていないが,これに関わる因子の一部は神経変性疾患の原因因子としても同定されていることから,ミトコンドリアの形態維持機構は早期に解明すべき課題である。私たちは,サイトゾルの必須AAAシャペロンであるCdc48pが,ミトコンドリアの正常な形態形成に必須であることを見いだしている。しかし,出芽酵母Vms1p欠損株では,ミトコンドリア形態は正常であったことから,他のアダプター因子の関与が示唆された。これまで用いていた実験系では,更なる解析が困難であることが判明したため,新しい実験系の構築を行った。具体的には,染色体上のCDC48遺伝子をC末端にAIDデグロンタグ(auxinの添加によってタンパク質分解を誘導するタグ)を付加したCdc48-AIDを発現する遺伝子に置き換えた。auxinの添加によってCdc48-AIDは,野生型Cdc48pの1/20程度まで減少した。このとき,ミトコンドリアも異常形態を示した。平成25年度において,さらに解析をすすめ,Cdc48pによるミトコンドリア形態制御機構を解明する。これまで用いていた実験株では,更なる解析が困難であることが判明したため,より良い新しい実験系を構築する必要がでてきた。そのため,当初予定よりもやや時間がかかっている。これまでに,Cdc48pの機能欠損がミトコンドリア形態異常を引き起こすこと,および,ミトコンドリア融合反応に関わるFzo1pの分解が抑制されることを見出している。したがって,Fzo1pの分解をCdc48pが促進することによって,正常なミトコンドリア形態が維持されている可能性が示唆される。Cdc48pの機能は様々なアダプタータンパク質によって調節されていると考えられており,アダプタータンパク質はCdc48pと基質タンパク質とを繋ぐ役割も果たす。これまでに,Shp1pおよびUbx2pがCdc48pのミトコンドリア形態制御に関するアダプターとして機能している可能性が考えられた。そこで,これらの因子に注目して,Cdc48pによるFzo1pの分解のメカニズムを解明する。生化学や細胞培養,遺伝子工学などの実験に必要な消耗品が,研究の推進に必須である。また,学会発表のための旅費,論文投稿のための費用等が必要である。