hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語母語話者による英語の主語・動詞・時制に関わる文法規則の習得と使用

パイロット実験の実施については、当初予定よりやや遅れ、計画の一部の領域でしか実施していないが、半面、タイ王国タマサート大学とのコロキウムを実施するなど、第二言語習得研究モデルの基盤となるさまざまな言語を母語とする学習者からのデータ収集については、当初予定よりも進展が大きい。実験のマテリアル作成についても、未完成の部分はあるものの、当初よりも課題を絞って研究を進める体制ができた。2019年度中には、心理言語学的実験のうち、すべてのパイロット実験を終え、英語母語話者ならびに日本語を母語とする英語学習者からのデータ収集を終える予定である。また、理論・モデル化の面では、数回の打ち合わせを通して、分散形態論に基づくモデルの基盤ができたため、非常に進展は大きかったといえる。当初計画通り、コーパス及び心理言語学実験に基づくデータ収集を行う。2019年度には日英語の詳細な記述、モデルの考察を実施するとともに、その理論的考察に基づいて、仮説を立て、第二言語コーパス(CHILDES、ICNALE)の分析を行う。また、コーパス分析と並行して、実験ソフトSuperLabを用いた、反応及び正答率に基づく仮説検証が可能な実験を完成し実施する。また、文献研究については、各言語現象の主担当、副担当を中心に、引き続き研究を進める。第二言語習得モデルの文献研究とその検討は研究開始から終了まで全員で取り組む。データ収集については、コーパス分析では上述のi)-v)について、例えば、過去時制と動詞のもつ相との関係など、素性、語彙項目、形態統語操作と表面的形態統語現象との関連を考慮しつつ、調査・分析を行う。心理言語学実験では素性、語彙項目、操作とそれらが反映される現象を記述し、日英語の比較に基づいて仮説を立て、SuperLabによるオンライン読解による文法性の敏感度測定(moving windowsによる文法文と非文法文の読解時間の差の測定)の実験を実施する。その結果に基づいて、より言語学的に緻密な記述に基づく、反証可能性のある新しいモデルを提案する
脂質ナノキャリアーの粘膜ワクチンアジュバントとしての IL-6 産生機構の解明

本研究はDOTAP/DC-cholより構成される正電荷リポソームの経鼻投与における粘膜ワクチンアジュバント機構に関して,抗原の取り込み, IL-6産生細胞の同定とIL-6の役割についてマウスを用いて検討を加えたものである.DOTAP/DC-cholのアジュバント作用の一因として, NALT樹状細胞への抗原であるOVAの取り込み量が増加すること,およびIL-6が産生されることによりIL-6受容体を発現するCD11b陽性細胞が抗原特異的IgA産生細胞へと分化することを明らかとした。また、Nasal PassageでのIL-6産生にGM-CSFが深く関与する結果を得た。申請者らは正電荷脂質であるDOTAPおよびDC-Cholで構成される正電荷リポソーム自身が粘膜免疫賦活化作用を有し,そのアジュバント作用発現にIL-6が必須のサイトカインであることを既に明らかにしている.本正電荷リポソームのマウス鼻腔内投与後のIL-6産生誘導機構を明らかにする目的で,当該年度はIL-6産生細胞の同定を試みた.初回免疫7日後に追加免疫することでnasal passageにおけるIL-6濃度が顕著に増大した.nasal passageの単核球を調製し,FACSで細胞内IL-6濃度を測定したところCD4陽性細胞であるT-細胞群でIL-6陽性細胞数の増大が観察され,本リポソーム投与によるIL-6産生細胞はT-細胞であると推定した.DOTAPおよびDC-Cholで構成される正電荷リポソームのアジュバント効果発現に強く関与するIL-6の産生細胞を明らかにしたことは意義深いと考える.さらに,本リポソーム投与群においてCDllb細胞数が増大し,CD11b細胞はIgA産生細胞へと分化誘導されたことから.リポソーム投与によりT-細胞から産生されたIL-6がCDllb細胞をIgA産生細胞へと分化させている可能性を示唆する新たな興味深い結果を得た.以上得られた結果は,現在論文として投稿準備中である.また,脾臓のT-細胞を調製し,DOTAPおよびDC-Cholで構成される正電荷リポソームによるIL-6産生機構の解明を試みたが,本リポソームは直接T細胞に作用しIL-6産生を誘導する知見は得られなかった。鼻腔投与後,リポソームは樹状細胞に効率よく取り込まれる知見を当該年度得ていることから,本リポソームによるT-細胞からのIL-6産生誘導に,樹状細胞をはじめとする抗原提示細胞の関与が示唆され,次年時以降の検討事項とした.申請者らは正電荷脂質であるDOTAPおよびDC-Cho1で構成される正電荷リポソームが粘膜免疫賦活化作用を有し,そのアジュバント作用発現にIL-6が必須のサイトカインであることをこれまでに明らかにしている.申請者は本正電荷リポソームのマウス鼻腔内投与後のIL-6産生細胞の同定を試みた.リポソーム投与後7日目にnasal passageにおけるIL-6濃度が顕著に増大したことから,nasal passageの単核球を調製し,FACSで細胞内IL-6濃度を測定したところCD4陽性細胞であるT-細胞群でIL-6陽性細胞数の増大が観察され,本リポソーム投与によるIL-6産生細胞はT-細胞であると推定した.また,本リポソーム投与群においてnasal passageにおけるCD11b細胞数が増大し,CD11b細胞はIgA産生細胞へと分化誘導されたことから,リポソーム投与によりT-細胞から産生されたIL-6がCD11b細胞をIgA産生細胞へと分化させている可能性を示唆する新たな興味深い結果を得てきた。さらに,鼻腔投与後,リポソームは樹状細胞に効率よく取り込まれる知見を得ていることから,本リポソームによるIL-6産生誘導に,樹状細胞をはじめとする抗原提示細胞の関与が示唆された.当該年度は,DOTAPおよびDC-Cho1で構成される正電荷リポソームによるIL-6産生機構の詳細をGM-CSFに注目し検討を加えた.マウスnasalpassage細胞に市販のGM-CSFを添加したところ,有意に高いIL-6産生が認められた.さらに,MACSシステムを用いてnasal passage細胞をnon-T細胞群とT-細胞群に分画し,GM-CSFを添加によるIL-6の産生を検討したところnon-T細胞群からIL-6産生が認められた.また,本リポソームをマウス経鼻投与し,nasal passageにおいてGM-CSFの誘導が観察されることを,mRNAおよびタンパクレベルで明らかにした.これらの知見から,DOTAPおよびDC-Cholで構成される正電荷リポソームによるIL-

6産生にGM-CSFが深く関わることが示唆された.以上得られた結果は現在論文として投稿論文作成申である。申請者らは正電荷脂質であるDOTAPおよびDC-Cholで構成される正電荷リポソームが粘膜免疫賦活化作用を有し,そのアジュバント作用発現にIL-6が必須のサイトカインであることをこれまでに明らかにしている.さらに,本正電荷リポソームによるIL-6産生機構の詳細をGM-CSFに注目し検討を加えた.マウスnasalpassage細胞に市販のGM-CSFを添加したところ,有意に高いIL-6産生が認められた.さらに,本リポソームをマウス経鼻投与し,nasal passageにおいてGM-CSFの誘導を,mRNAおよびタンパクレベルで明らかにした.これらの知見から,本正電荷リポソームによるIL-6産生にGM-CSFが深く関わることが示唆された.当該年度, DOTAP/DC-chol投与によるIL-6産生細胞に関して検討を加え, CD4陽性T細胞であることを示唆する結果を得た.さらにDOTAP/DC-cholによって増加するCD11b陽性細胞にIL-6受容体が発現することを明らかとした.CD11b抗原は一般に樹状細胞やマクロファージ, B細胞などに発現していることから, CD11b陽性細胞におけるこれらの細胞表面抗原の発現について検討したところ,全て低レベルであった.腸管などの粘膜には, B220発現が低レベルである特殊なB1細胞が存在することが報告されていることから, B1細胞の表面抗原であるCD5の有無について検討し, CD5を発現しないB1細胞である可能性が示唆された.さらにDOTAP/DC-chol投与群において増加したCD11b細胞はIgA産生細胞へと分化が誘導されたことから, DOTAP/DC-chol投与によりCD4陽性T細胞からIL-6が産生され, IL-6受容体を発現するCD11b陽性細胞がIgA産生細胞へと分化する可能性が示唆された.申請者はこれまで正電荷リポソームの粘膜免疫アジュバント機構に関して検討を加え,(1)IL-6産生誘導,(2)GM-CSFの誘導,(3)リポソームの取り込みにNALT樹状細胞の関与,(4)IgA産生におけるCD11b細胞の関与を明らかにするなど,ほぼ満足すべき進捗状況にあると判断するが,成果としての論文投稿が遅れている.24年度が最終年度であるため、記入しない。本正電荷リポソームの粘膜免疫賦活化にIL-6の産生誘導が重要な役割を果たしており,その産生にGM-CSFが深く関わることを示唆する結果を得た.当該年度は,抗GM-CSF抗体を用いIL-6産生におけるGM-CSFの関与,およびGM-CSF産生細胞を同定し,本正電荷リポソームによる粘膜免疫賦活化機構の全貌を明らかにする.さらに,IL-6産生能を指標に種々の正電荷脂質からなるリポソームの粘膜免疫アジュバント開発につなげる.また,これまで得られた結果も含め3報の論文として纏める.24年度が最終年度であるため、記入しない。
太陽コロナにおける爆発的エネルギー解放過程に関する統一的分岐理論

本研究においては,太陽コロナにおける爆発的エネルギー解放過程を最小エネルギー解の分岐と遷移のダイナミクスとして統一的に理解するための理論研究を行った。特に、本年は研究実施計画に基づきTaylorの変分原理から求まる、線形無力平衡配位の安定性解析、およびそこで見い出された不安定性の非線形ダイナミクスに関する数値シミュレーションを実施した。その結果、以下の事項が明らかにされた。1.磁気ヘリシティがrotオペレターの非結合固有値に対応する臨界ヘリシティよりも大きい場合、太陽コロナにおける線形無力配位は複数の解に分岐する。この時、エネルギーの高いブランチは抵抗性MHDモードに対して不安定である。2.この不安定性の成長が非線形領域に達すると、磁気ループ中央に電流シートが形成され、磁気再結合を結果する。磁気再結合はテイラー状態の分岐理論が予言するように磁気ループを上下に分離する。3.磁気再結合における電流シートの長さは幾何学的制約から磁気ループの幅程度であり、電気抵抗に寄らない。一方、その幅は電気抵抗の平方根に比例する。また、電流シート上の最大加熱率も電気抵抗に寄らない。4.真空磁場に光球面運動によって徐々に磁気ヘリシティを注入した場合、不安定性と磁気ヘリシティ注入の競争過程として、ダイナミクスが決められる。それゆえ、磁気レイノルズ数が大きいほど大量の磁気ヘリシティ注入が行われ、その後の磁気再結合によるエネルギー解放はより爆発的に実現される。以上の結果は、太陽フレアの爆発性を分岐解の遷移として一般的に理解する事が出来る可能性を強く示唆している。重力効果を含めた拡張された分岐理論の構築は時間的制約から将来に持ち越された。
デフォルトモードネットワークの動作原理と機能解明

本研究ではデフォルトモードネットワーク(DMN)がどのいった行動や脳機能を担うのか、DMNが他の神経機構とどのように関連しているか、の二つのアプローチで調べることでDMNの成因や機構を明らかにすることを目的とする。初年度は、基盤技術としての安静時脳活動・DMNの測定・解析技術の開発を鋭意すすめた。特にマカクサル脳において安静時脳活動機能的MRIを収集する技術(RF受信コイルの条件設定、撮像シーケンス)ならびにネットワーク解析の技術の最適化と開発をすすめ確立した。撮像シーケンスにはマルチバンドEPIシーケンスを用いて時間解像度0.75秒、空間解像度1.25mmの高い分解能のデータを取得した。空間解像度の決定には、マカクサル脳の皮質厚を計測し半球内の皮質厚分布を基に算出した。また麻酔状態や覚醒状態における脳安静状態のデータ取得を行うための技術も構築し、データ取得を開始した。安静時脳活動MRIデータに最も問題となる、ノイズ除去のための技術を開発し、機械学習の技術を用いて精度高い自動ノイズ分類器とノイズ除去技術を、マカクサル用に構築することができた。さらに臨床的に使用される薬剤を用いて、ドパミン機能やセロトニン機能を修飾した際の安静時脳活動データを取得するために実験をすすめ、今後、ネットワークの複雑性とドパミン機能やセロトニン機能との関連性を明らかにする解析を行うこととした。今後更なる詳細かつ高度な解析を行うことでDMNと神経伝達物質機能との関連性を明らかにすることができると考えている。データ収集技術や解析技術にはいくつかの問題や課題が生じたが、一つ一つ着実に克服しおおむね順調に進展している。今度解析の高度化と必要に応じて追加データ収集・解析を進める。
シェイクスピア悲劇の主人公達が有していた道化的性格の究明

初演舞台ではリチャード・バーベッジが演じたハムレット、オセロー、マクベスなどのシェイクスピア悲劇の主人公達は、道化的な性格をその核とする人物として演じられていた。しかし、18世紀後期を契機としてその様相が色褪せ、19世紀以降のロマン主義批評によって脚色され、その結果として、悲劇的人物の枠においてその存在が規定されるに至ったと考えられる。平成20年度は、特に、オセローとハムレットに注目し、その道化的性格の分析を行った。特に後者ついての考察を深めてゆく過程で、シェイクスピアが提示する"conscience"(良心)が、悲劇的人物像の内面性を特徴付ける意識であると同時に、道化の特質であるvice的な性格を特徴付ける意識でもあるという興味深い事実に気がついた。そのような理由から、今年度は、オセローとハムレットの性格研究を遂行する傍ら、ハムレットの"conscience"の二面性について詳しく調べ、第61回日本英文学会中国四国支部大会にて研究発表を行った。また、その内容を所属先の学科紀要である『広島女学院大学英米言語文学研究』に研究成果として報告した。論考では、ハムレットの憂鬱の背後に見える"conscience"は、ハムレットの行動を、聖なる方向へと向かわせていると同時に、(二人の友人を死に至らしめる行動などの)悪事へと駆り立ててもいるという事実を論じている。本助成による研究の目的の一つが、ハムレットなどの悲劇的人物が初演当時に有していた道化的な性格の究明であるが、現在では想像もつかないものが、道化的性格を示唆する記号であることが、古典文学研究ではよくある。本年度の研究成果は、その表題だけを見れば、一見、研究課題から乖離しているように見える。しかし、それは、悲劇的人物の有していた道化的性格を示唆する記号解読の一つとして数えられる。昨年度に引き続き、シェイクスピア劇の初演舞台にてリチャード・バーベッジが演じた悲劇的主人公であるハムレット、マクベス、そしてオセローの三人の人物像を中心に、その道化的性格に関しての考察を深めた。そのうち、オセローの人物像に関する論考を、第62回日本英文学会中国四国支部大会(平成21年10月24日、於鳥取大学)にて「道化的存在としてのオセロー」と題して口頭発表し、その原稿に修正を加えたものを「道化的人物としてのオセロー」と題して『東洋大学人間総合科学研究所紀要』第12号(平成22年3月発行)pp.77-97に寄稿した。また、本論考の草稿段階のものを、シェイクスピアと現代作家の会(平成21年9月14日、於広島修道大学)において口頭発表する機会を得て、会員の方々から忌憚のない意見やフィードバックを頂戴した。本論考では、『オセロー』をその祝祭劇としての構造に注目してテクスト分析し、本劇において主人公オセローが道化的な役割を演じている事実を指摘した。ロマン主義以降の批評言説においてシェイクスピア悲劇像の塗り替えが行われ、その過程で、悲劇の人物像も大きく塗り替わったことは、先人たちの研究からも、また、私個人のこれまでの調査からも明らかなことである。ロマン主義批評の伝統を継承する現代の人物批評が目をつむってきた一つの事実について、本研究を通じて確認することができたと考えている。なお、本助成金による2年間の研究成果を、現在、全6章立ての英文論文の体裁にまとめている。遅くとも平成23年度にはそれを公表できる予定である。本年度公表した研究成果は、その一つの章となる重要な部分である。
視索前野性的二型核形成過程の可視化による性分化機構の解明

視索前野性的二型核は雄で有意に大きい神経核として知られているが、その性差形成機構については、周生期のステロイドホルモンが重要であることを除いて良くわかっていない。本研究ではステロイドホルモン受容体遺伝子プロモーター遺伝子改変ラットを用いてこの神経核をGFP蛍光で可視化し、その性差形成過程をin vivoおよびin vitro両面から詳細に検討することで、神経核形成時の細胞移動がホルモンの調節を受け、雄性化を引き起こすことを示した。本研究の目的は、最近社会的な問題となっている性同一性障害に代表される脳の性分化異常の治療法や予防法の確立を念頭に、雄で有意に大きい神経核である視索前野性的二型核(SDN-POA)をモデルとしてその形成過程を可視化し、脳の性分化機構の解明を目指すものである。SDN-POAの雄性化にはエストロゲンが重要な役割を演じているが,SDN-POAの可視化には我々の作出したエストロゲン受容体遺伝子プロモータートランスジェニックラットが活用できることを報告し、生きた状態でSDN-POAをEGFPにより可視化できる特徴を利用することでSDN-POA形成過程をin vitroで観察することを試みた。すなわち、胎生18日齢脳スライス切片を培養し、EGFP蛍光を指標にして1時間毎のタイムラプス撮影を行うことで、in vitroにおいてEGFP発現細胞の集団形成が確認され、この集団はSDN-POAマーカーであるカルビンディンを発現し,培養液中へのエストロゲン添加によりそのサイズが大きくなることからSDN-POAと同等のものであることが示された。培養液中に添加したpropidium iodideを指標にすると細胞死はエストロゲンの有無で差がなく、従来言われていた性分化機構における細胞死制御の重要性を否定する結果となった。一方でダイナミックな細胞移動によりSDN-POA形成がなされ、特に集団を形成後、集団の中での移動方向にエストロゲンが影響を与えている可能性が示唆され、詳細な検討を行っている。本研究の目的は、雄で有意に大きい神経核である視索前野性的二型核(SDN-POA)をモデルとして、その形成過程を可視化し、脳の性分化機構の解明を目指すものである。前年度までに我々の作出したエストロゲン受容体遺伝子プロモータートランスジェニックラット(ER-GFPラット)がSDN-POAの可視化を実現し、スライス培養法とタイムラプス撮影により、SDN-POA形成過程の可視化を現実のものとした。今年度はin vitroにおけるSDN-POA形成過程のみならず、in vivoでの検討を行った。すなわち、胎仔脳における組織学的な検討を行い、E18には分界条床核(BNST)領域でGFPの発現が観察されること、E21にSDN-POAでのGFP発現が観察されることが示され、in vitroの結果と一致することがわかった。また性差形成に重要なERα発現がGFP発現細胞でなく、その周囲に観察され、SDN-POA周囲の細胞が性分化機構に果たす役割という新規な考えを提唱することになった。また、ER-GFPラットが性差の存在するBNST主部を特異的に可視化しうるという結果も得られ、SDN-POAのみならず、BNST主部についても、性差形成機構について検討が可能となった。これら性差の存在する神経核の機能としては性指向性に着目して検討を行い、性成熟期のステロイドホルモンが性指向性決定に重要であることを見出した。以上の結果は第89回日本生理学会大会で報告した。現在、性指向性とSDN-POAおよびBNST主部との関係について、cFos発現に伴いRFPを発現するトランスジェニックラットとER-GFPラットのダブルトランスジェニックラットを作出し、検討を進めているところである。本研究の目的は、性同一性障害に代表される脳の性分化異常の予防法確立を念頭に、雄で有意に大きい神経核である視索前野性的二型核(SDN-POA)や分界条床核(BNST)をモデルとして、その形成過程を可視化し、脳の性分化機構の解明を目指すものである。これまでに我々の作出したエストロゲン受容体遺伝子プロモータートランスジェニックラット(ER-GFPラット)によりSDN-POAとBNSTの可視化を実現し、組織学的検討とスライス培養切片のタイムラプス撮影により、in vivoおよびin vitroでのSDN-POA形成過程の可視化を現実のものとした。今年度は性差形成に重要なERα発現とSDN-POAおよびBNSTとの関係について詳細に検討した。C末端を認識する抗体を用いた場合、周生期のERα発現はGFP発現細胞でなく、その周囲の細胞の核に観察されたが、N末端を認識する抗体を用いた場合、SDN-POAニューロンの核外にシグナルが見られ、出生後徐々に核にシグナルが移行することが観察された。ERαには各種バリアントが知られていることから、これら神経核の性分化機構には、周囲のERα陽性細胞からの影響のみならず、SDN-POAにおけるERαのスイッチングが関係すると考えられた。

以上の結果は第90回日本生理学会大会で報告した。また、ER-GFPラットが性差の存在するBNST主部を特異的に可視化しうるが、出生日エストロゲン投与では完全な雄性化が見られず、テストステロン投与で雄性化が観察されたため、SDN-POAとは異なり、アンドロゲンの直接作用による性分化機構が示唆された。以上、ER-GFPラットを用いることでSDN-POAおよびBNSTの可視化を実現し、周生期の性差形成機構をin vivoおよびin vitroで可視化することに成功し、その詳細を検討しうるモデルが確立された。23年度の研究計画に則り、胎仔脳におけるEGFPおよびERα発現について知見が得られ、性指向性とSDNやBNSTとの関係についても結果が得られつつある。またER-GFPラットがBNSTのマーカーになることも明らかとなったため、順調な進展だと判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は性差形成機構としての細胞移動制御をエストロゲンがどのように調節しているのか、細胞内および細胞外での分子に着目して研究を進める。またSDN-POAおよびBNSTの性指向性に対する役割を明らかにし、その神経回路や膜特性について検討を加える予定である。
フローボリューム波形解析による気道アレルギー高感受性者スクリーニング法の確立

[研究目的]呼吸機能からみた気道アレルギーの高感受性者のスクリーニング法が確立されておらず、開発したFV波形解析法(RAT-FEV1% diagram)により、免疫アレルギーを主体とする気道アレルギー高感受性者のスクリーニング法を確立する。[研究経過]平成7年度には、二次肺機能検査受診及び血清総IgEの測定者(150名)のうち解析可能な非喫煙者(16名)及び喫煙者(46名)に対して、RAT-FEV1% diagramと血清総IgE値による検討を行った。また、緑黄野菜摂取と両者の関係についても検討した。その結果、RAT-FEV1% diagramのbiological lineと血清総IgE値の間に関連が認められた。また、緑黄野菜の摂取量がRAT-FEV1% diagram上の軌跡に影響することが示唆された。平成8年度には、一次肺機能検査と血清総IgE値測定を行った35才以上の男性705名(A-line 421名,B-line 284名)を対象として喫煙別・指導区分別・biological line別(A-,B-line)に検討を行った。その結果、非喫煙者では、指導区分A-BではA-,B-lineいずれも、血清総IgE値≦100IU/mlの群では61.4-69.6%であったが、指導区分C-Dで血清総IgE値≦100IU/mlの群は,A-line54.3%にたいし,B-line40.0%、61.4-69.6%であった。喫煙者のB-lineでは、血清総IgE値≧100IU/mlの割合が増加する蛍光であった。平成9年度には、FV波形解析有効であった35才-59才の男子従業員1177名(非喫煙者442名、喫煙者735名)を解析対象として、喫煙週間の有無別にRAT-FEV1% diagramのbiological lines(A-,SA-,B-,SB-,R-line)と、血清総IgE値、喫煙習慣との関係に付いて検討した。その結果、非喫煙者のA-,SA-lineでは、IgE<100の割合は63.3%,58.8%に対して、B-,SB-lineでは、34.2%,34.5%と低率であり、A-,SA-lineとB-,SB-lineでは分布の割合が異なっていた(x^2=28.21)。喫煙者の血清総IgE<100の割合をみると、A-,SA-lineでは48.5%,61.5%であるが、B-,SB-lineではそれぞれ28.3%,25.7%と低率であった。逆に、血清総IgE≧100の割合はA-,SA-lineで51.5%,38.5%、に対してB-,SB-lineでは71.7%,74.3%と増加していた(x^2=45.44)。RAT-FEV1% diagramのbio-logical lineと血清総IgE値との関係をみると、中高年非喫煙者のA-,SA-lineとB-,SB-lineでは、血清総IgE<100血清総IgE≧100の比率が異なり、喫煙者ではB-,SB-lineの血清総IgE≧100の比率が増加している。したがってFV波形解析により気道アレルギーを主体とする高感受性者の一次スクリーニング評価法として意義がある。

その結果、非喫煙者のA-,SA-lineでは、IgE<100の割合は63.3%,58.8%に対して、B-,SB-lineでは、34.2%,34.5%と低率であり、A-,SA-lineとB-,SB-lineでは分布の割合が異なっていた(x^2=28.21)。喫煙者の血清総IgE<100の割合をみると、A-,SA-lineでは48.5%,61.5%であるが、B-,SB-lineではそれぞれ28.3%,25.7%と低率であった。逆に、血清総IgE≧100の割合はA-,SA-lineで51.5%,38.5%、に対してB-,SB-lineでは71.7%,74.3%と増加していた(x^2=45.44)。RAT-FEV1% diagramのbio-logical lineと血清総IgE値との関係をみると、中高年非喫煙者のA-,SA-lineとB-,SB-lineでは、血清総IgE<100血清総IgE≧100の比率が異なり、喫煙者ではB-,SB-lineの血清総IgE≧100の比率が増加している。したがってFV波形解析により気道アレルギーを主体とする高感受性者の一次スクリーニング評価法として意義がある。我々はこれまでに、Flow-volume曲線の波形解析として1秒率と共に、A-,B-,S_A-,S_B-,R-lineから成るR_<AT>-FEV_<1%> nomogramを開発し、気道過敏性素因と喫煙習慣の分離抽出を試みてきた。1.中高年非喫煙者に対する緑黄野菜摂取状況別のR_<AT>-FEV_<1%> nomogramと血清総IgE値との関係(1)緑黄野菜摂取の多い群でA-,B-lineの軌道を示す例が多いが、少ない群ではS_A-,S_B-lineの軌跡を示す例が多い。2.中高年喫煙者に対する緑黄野菜摂取状況別のR_<AT>-FEV_<1%> nomogram(1)喫煙指数(ブリンクマンインデックス(BI))250以上500未満、500≦BI<750群の何れでも緑黄野菜摂取の多い群は少ない群に比べR_<AT>>0の範囲に位置する割合が多かった。(2)500≦BI<750群では緑黄野菜摂取の多少に拘わらず、B-,S_A-,S_B-lineの近傍に位置し、判別が困難である。以上より、中高年非喫煙者及び250≦BI<500の喫煙群では気道アレルギー高感受性者スクリーニングが有用であり、緑黄野菜摂取状況の把握が有用と考えられる。しかし、BI≧500の喫煙者群では判別困難な例が多い。今年度研究成果の発表第68回日本衛生学会(1996,札幌)で、発表予定である。演題名「気道過敏性-高感受性群の新スクリーニング法としてのR_<AT>-FEV_<1%> nomogram」
ガルニエ系,および退化ガルニエ系の有理解の決定と,変換群の構造

数理物理の分野で重要な方程式に,パンルヴェ方程式と呼ばれる6種類のものがある.これらの方程式は,正規形で書かれた2階の代数的常微分方程式で,パンルヴェ性(解の特異点で,その位置が初期条件に依存するものは極しかないという性質)を持つものを分類した結果,得られたものである.一方,これらの方程式は,4つの確定特異点と,1つの見かけの特異点を持つ線形方程式,およびその特異点を合流させて得られる線形方程式の,モノドロミー保存変形と呼ばれるものから得られることが知られている.木村弘信氏はこの結果をもとに,5つの確定特異点と,2つの見かけの特異点を持つ線形方程式,およびその特異点を合流させて得られる線形方程式のモノドロミー保存変形を考え,8種類の方程式系を導いた.(今日,パンルヴェ方程式を2変数にしたものと言えば,木村氏のこの8種類の方程式系を指すことが多いようである).研究代表者は,平成18年度の研究において,木村氏の導いた方程式系以外にも,パンルヴェ性を満たす2変数の方程式系があることを示した.より具体的に言うと,ポアンカレ・ランクが半整数の線形方程式のモノドロミー保存変形を考え,そこから得られる非線型方程式系をハミルトン系で記述し,その有理解を調べた.また,これらの有理解分布状況を調べることにより,どのような双有理な正準変換を施しても,研究代表者が導いた方程式系は,木村氏の8種類の方程式系に帰着しないことを示した.4つの確定特異点と1つの見かけの特異点を持つ2階のフックス型方程式,および,この方程式の確定特異点を,ポアンカレランクが整数となるように合流させていった方程式のモノドロミー保存変形により,II型からVI型までのパンルヴェ方程式が得られることが知られている.また,不確定特異点におけるポアンカレランクが非整数の場合を考えると,P_{III}(D_7),およびP_{III}(D_8)と呼ばれる新しいタイプの非線形方程式が得られることが知られている.さらに,5つの確定特異点と2つの見かけの特異点を持つ2階のフックス型方程式,およびこの方程式の確定特異点を,ポアンカレランクが整数となるように合流させていった方程式のモノドロミー保存変形により,退化ガルニエ系と呼ばれる非線型方程式系が得られることが知られている.これらのことを踏まえ,5つの確定特異点と2つの見かけの特異点を持つ2階のフックス型方程式を合流させて行って得られる線型方程式で,L(7/2,1),L(5/2,2),L(5/2,3/2)タイプと呼ばれるもののモノドロミー保存変形を考えた.この結果,2変数の非線型方程式系を得ることができた.また,この方程式系のハミルトニアンや,シュレジンガー変換も計算した.ただし,この非線型方程式が,退化ガルニエ系とどのような関係にあるか(たとえば,ある種の変数変換で移りあうのかなど)は現在調査中である.また,ほかのタイプの線形方程式L(5/2,1,1),L(2,3/2,1),L(3/2,3/2,1)のモノドロミー保存変形も,現在調査中である.数理物理の分野で重要な方程式に,パンルヴェ方程式と呼ばれる6種類のものがある.これらの方程式は,正規形で書かれた2階の代数的常微分方程式で,パンルヴェ性(解の特異点で,その位置が初期条件に依存するものは極しかないという性質)を持つものを分類した結果,得られたものである.一方,これらの方程式は,4つの確定特異点と,1つの見かけの特異点を持つ線形方程式,およびその特異点を合流させて得られる線形方程式の,モノドロミー保存変形と呼ばれるものから得られることが知られている.木村弘信氏はこの結果をもとに,5つの確定特異点と,2つの見かけの特異点を持つ線形方程式,およびその特異点を合流させて得られる線形方程式のモノドロミー保存変形を考え,8種類の方程式系を導いた.(今日,パンルヴェ方程式を2変数にしたものと言えば,木村氏のこの8種類の方程式系を指すことが多いようである).研究代表者は,平成18年度の研究において,木村氏の導いた方程式系以外にも,パンルヴェ性を満たす2変数の方程式系があることを示した.より具体的に言うと,ポアンカレ・ランクが半整数の線形方程式のモノドロミー保存変形を考え,そこから得られる非線型方程式系をハミルトン系で記述し,その有理解を調べた.また,これらの有理解分布状況を調べることにより,どのような双有理な正準変換を施しても,研究代表者が導いた方程式系は,木村氏の8種類の方程式系に帰着しないことを示した.
地域内マネーフローの向上に資する森林バイオマス利活用と観光産業との融合

エコツーリズムや温泉地観光など、国内の農山村では観光収入によるマネーフローに期待が寄せられている。そのため各地で観光プロモーション事業が盛んに行われている。しかし一方で、既存研究では、農山村では地域経済の中の観光産業の規模は思いのほか小さく、かつ暖房費や資材調達等がかかり、観光のために農山村に流入する金額よりも、域外に流出する額の方が大きいケースがみられる状況にあることが指摘されている。そのため本研究では、フィールド調査を行い、観光産業とバイオマス利活用との関係を整理し、明確にすることを通じて、農山村観光産業の規模を拡大しつつ、流入したお金の流出割合を減少させる社会システムのあり方を考察する。
体表面形状計測による肩甲骨を含む肩関節運動の測定精度改善と体幹運動の測定法の開発

日常生活動作やスポーツ動作において,体幹と上肢の動きは,非常に重要である.体幹と上肢をつなぐ肩関節は,鎖骨,肩甲骨,上腕骨の動作から構成される.とくに肩甲骨は,体幹を構成する肋骨と体表の間を滑動する.そのため肩甲骨と皮膚面の位置関係は,上腕の動きにともない大きく偏位する.この皮膚の動揺が誤差の原因となり,肩甲骨姿勢の標準的な測定手法は,未だ確立されていない.そこで本申請では,無侵襲に肩甲骨姿勢を推定するため,サーフェースマップ法と肩峰マーカクラスタ法を組み合わせた方法を開発した.肩峰マーカクラスタ法を改良し任意の姿勢における肩甲骨の骨特徴点位置を推定した.それらの骨特徴点を初期値として,体表上に配置した複数のマーカから計測される体表面の形状に,骨特徴点を重ね合わせることで肩甲骨の姿勢を推定した.次に,提案する推定方法の精度を評価するために,空間上に均等に配置した25個の異なる上腕姿勢と,日常生活を想定した7つの上腕姿勢を計測し,提案する推定方法を用いて肩甲骨の姿勢を推定した.提案する推定方法の精度を評価するため,古くから報告され利用頻度が高い肩峰マーカクラスタ法と,近年に報告された回帰式を用いて肩甲骨姿勢を推定する回帰法の2つを比較対象とした.提案する推定方法は,回帰法と比較して,上腕挙上角90度以上でRMSEが増加したが,90度未満ではRMSEが減少した.また,提案する手法は,従来の肩峰マーカクラスタ法よりも精度が向上した.肩峰マーカクラスタ法とサーフェースマップ法を併用することで,肩甲骨姿勢を推定できることが明らかとなった.スポーツ動作において,肩関節を含む上体の使い方は非常に重要である.従来,肩甲骨の運動を無侵襲に計測することは困難であったが,申請者は背側の体表面形状を計測することで肩甲骨の位置と姿勢を無侵襲に測定してきた.申請者による従来の手法では,被検者の背側体表に2cm間隔で10列10行の合計100個からなるマーカを格子状に張る必要があり,測定の準備に非常に時間がかかるという欠点があった.そこで,平成28年度は,肩甲骨運動の無侵襲測定の精度向上に加えて,現実的に利用可能なレベルへの改良を目指して測定の簡略化を目的とした.そのため,マーカの間隔を3cmに増加し,6列6行の合計36個からなるマーカ格子として,肩甲骨周辺の体表面に貼り付けるマーカの個数を減少させた.また,脊椎周辺には,3列6行のマーカを胸椎に沿って貼付した.加えて,被検者の第7頚椎棘突起,胸骨上切痕,剣状突起,左右の上腕骨外上顆,上腕骨内上顆にもマーカを貼付した.加えて測定精度の向上を目的として,新たに肩峰上にジグを設置し,そのジグにマーカを3点貼付し,そのマーカ群も合わせて計測した.被検者は,健常な男性10名とした.対象動作は,上腕の内転・外転,上腕の屈曲・伸展,90度外転位における水平内転・水平外転,90度外転位における内旋・外旋とし,各運動において30度刻みで静止した姿勢を計測した.マーカ数を削減した結果,肩甲骨の姿勢推定誤差が増加する傾向であった.サーフェースマッピング法を用いて肩甲骨姿勢の推定精度を向上するためには,体表面形状の正確な計測が必要になる.しかしながら,体表上に貼り付けるマーカ(直径4mm)の間隔を2cm以下とした場合,所有するモーションキャプチャ・システムでは,スポーツ動作などの大きな動きにおいて,ノイズが多く実用的な解析が困難であった.またマーカ数が多いため測定に手間がかかり臨床現場での利用が困難である.そのため,本手法の簡略化を進める必要が生じた.そこで,マーカの間隔を3cmに増加し,肩甲骨姿勢の精度評価を試みた.完全には,解析が完了してない点と,少ない体表マーカから精度を向上する手法が確立できていないため,上記の区分とした.日常生活動作や,上肢を多用するスポーツにおいて,肩甲骨を含む肩関節の動作が非常に重要である.しかし肩甲骨は,体表下を滑るように動く.そのため,従来からスポーツ動作の測定に利用されている動作解析法を利用することが困難である.一般的には,骨特徴点上の皮膚に反射マーカを取り付け,そのマーカ位置を計測することで,対象とする骨の位置を計測する.しかし,前述したように,肩甲骨は体表下を滑るように動く,そのため肩甲骨の骨特徴点位置は体表マーカから測定することが困難である.そこで肩甲骨動作は,X線画像の利用や,体表外から肩甲骨に挿入したピンに取り付けたセンサにより計測がなされてきた.しかし,侵襲性が高く,日常生活動作やスポーツ動作の測定には利用が困難である.そこで,近年,体表面の形状を計測することで,肩甲骨の動作を無侵襲に推定する方法が開発されてきた.本申請は,この手法を用いた肩甲骨動作の推定精度の向上を目的としている.先行研究では,2cm間隔で10列10行の合計100個からなるマーカを体表面に貼付していた.

本申請において昨年度は,測定前の準備時間を削減し被検者への負担を減らすため,マーカ数を削減し,3cm間隔の6列6行(合計36個)からなるマーカ格子を利用した.しかし,マーカ格子がカバーする領域が減少したため推定精度が低下する傾向が見られた.そこで,本年度は,マーカ数を増加し,3cm間隔の7列7行(合計49個)とし,従来と同等の測定面積とした.体表面の測定範囲を増加したため,肩甲骨動作の測定範囲は従来と同様とできたが,体表面の分解能を3cmとしたため,肩甲骨動作の測定誤差は同様に増加する傾向にあった.肩甲骨の測定可動域を広くするため,昨年度より領域を拡大し,3cm間隔の7列7行(合計49個)としたことから,肩甲骨の動作範囲をカバーできた.そこで今年度は,データの評価用に,矢状面に沿った上腕の挙上運動(側方挙上)から,30度刻みで,矢状面に沿った上腕の挙上運動(前方挙上)までの,4つの挙上面(0度,30度,60度,90度)に対して,それぞれ,下垂位(0度)から最大挙上(180度)まで,30度きざみで,7姿勢(0度,30度,60度,90度,120度,150度,180度)を計測した.また,日常生活動作の評価として,手で口を押さえる,手で髪(頭部)を触る,手で背中を触る,手を側方に伸ばす,手を前方に伸ばす,矢状面と前額面の中間の挙上面(45度)において,45度と135度の上腕挙上を計測した.この日常生活動作に関する評価が完了していないため,上記の区分とした.日常生活動作やスポーツ動作において,体幹と上肢の動きは,非常に重要である.体幹と上肢をつなぐ肩関節は,鎖骨,肩甲骨,上腕骨の動作から構成される.とくに肩甲骨は,体幹を構成する肋骨と体表の間を滑動する.そのため肩甲骨と皮膚面の位置関係は,上腕の動きにともない大きく偏位する.この皮膚の動揺が誤差の原因となり,肩甲骨姿勢の標準的な測定手法は,未だ確立されていない.そこで本申請では,無侵襲に肩甲骨姿勢を推定するため,サーフェースマップ法と肩峰マーカクラスタ法を組み合わせた方法を開発した.肩峰マーカクラスタ法を改良し任意の姿勢における肩甲骨の骨特徴点位置を推定した.それらの骨特徴点を初期値として,体表上に配置した複数のマーカから計測される体表面の形状に,骨特徴点を重ね合わせることで肩甲骨の姿勢を推定した.次に,提案する推定方法の精度を評価するために,空間上に均等に配置した25個の異なる上腕姿勢と,日常生活を想定した7つの上腕姿勢を計測し,提案する推定方法を用いて肩甲骨の姿勢を推定した.提案する推定方法の精度を評価するため,古くから報告され利用頻度が高い肩峰マーカクラスタ法と,近年に報告された回帰式を用いて肩甲骨姿勢を推定する回帰法の2つを比較対象とした.提案する推定方法は,回帰法と比較して,上腕挙上角90度以上でRMSEが増加したが,90度未満ではRMSEが減少した.また,提案する手法は,従来の肩峰マーカクラスタ法よりも精度が向上した.肩峰マーカクラスタ法とサーフェースマップ法を併用することで,肩甲骨姿勢を推定できることが明らかとなった.精度向上のために,体表に貼付するマーカの間隔を狭くすることは,所有するモーションキャプチャ・システムの制約から困難であった.また,前述のように,体表面に貼り付けるマーカ数を増やすことは,測定時間の増加に繋がり被検者の負担を増加することになる.そのため,体表面に貼付するマーカの総数を削減しながら,肩甲骨姿勢の推定精度を向上する手法を検討する.測定において,被検者への負担を減らすことも,この申請の目的の一部である.そのため従来の2cmの格子間隔ではマーカ数が多くなり,被検者への負担が大きくなることから避ける必要があった.そこで,3cm間隔の7列7行(合計49個)のマーカを用いた体表面計測とした.これ以上マーカの格子間隔を広くする(4cmなど)ことは,著しい測定精度の低下が予想される.そのため,測定コストから考えて,3cm間隔が妥当と考えられる.しかしながら,これ以上格子間隔を狭められないことから,体表面の計測データだけから,肩甲骨の測定精度を向上させることは困難であると考えられる.
分子生物学的手法を用いた脳腫瘍発生機序の基礎的研究

原発性脳腫瘍である膠芽腫において、腫瘍抑制因子として知られるRASSF3の機能解析を行った。全gliomaにおけるRASSF3の発現解析により、RASSF3は腫瘍の悪性度に応じてその発現量が変化していることを発見した。またRASSF3の発現量は患者の生存期間に寄与していることを発見した。膠芽腫の検体から培養細胞を樹立した。分子細胞生物学的手法を用いてRASSF3の機能解析を膠芽腫細胞株であるU87MG細胞で行った。RASSF3は細胞死を誘導した。RASSF3の発現抑制は細胞死誘導を阻害し、細胞増殖を促進した。これはRASSF3が腫瘍抑制因子として機能していることを示す。本研究は、既に大腸がん細胞株、乳がん細胞株においてその腫瘍抑制因子としての機能が確立されているRASSF3という分子の機能解析を、脳腫瘍において検討するものである。肺癌におけるRASSF3の腫瘍抑制因子としての機能解析が行われ、これによるとRASSF3は肺癌においても腫瘍抑制因子として機能しており、特に移動能の獲得や臨床上での転移に関与していることが示されている。神経膠芽腫細胞株であるU87MG細胞にRASSF3を過剰発現させると、apoptosisが誘導された。またRASSF3の発現を抑制すると、UVで誘導される細胞死が部分的に抑制された。また、RASSF3を発現抑制すると、細胞増殖が亢進した。さらに、RASSF3の発現抑制は、UVによって生じるDNA損傷に対するDNA修復が遅延した。これらの結果は、RASSF3は神経膠芽腫においても同様に腫瘍抑制因子として機能していることを示唆する。さらに、現在RASSF3の発現抑制によって生じる遺伝子変化をmicroarrayを用いて評価している。また、樹立された細胞株をマウスの脳に移植する脳腫瘍モデルの作製は成功している。しかし、臨床検体を用いた発現解析検討や、RASSF3の発現抑制や過剰発現した細胞を用いたマウスの脳腫瘍モデルにおける機能解析は行っていない。本研究は、大腸癌細胞株、乳癌細胞株においてその腫瘍抑制因子としての機能が報告されているRASSF3(Ras-Association-Domain Family 3)の機能解析を、脳腫瘍において検討するものである。これに先立ち我々は、RASSF3が肺癌においても、移動能の獲得や臨床上の転移に関与していることを報告した。神経膠芽腫細胞株にRASSF3を過剰発現するとapoptosisが誘導され、逆にRASSF3を発現抑制するとUVによる細胞死が抑制された。またRASSF3を過剰発現すると細胞周期がG1/S期で停止し、RASSF3を発現抑制すると細胞増殖が促進された。さらに、RASSF3を発現抑制すると、UVによって引き起こされたDNA損傷に対する修復が遅延した。以上の結果は、、RASSF3は神経膠芽腫においても同様に腫瘍抑制因子として機能している事を示唆する。RASSF3の発現抑制が及ぼす影響を評価するため神経膠芽腫細胞株でRASSF3を発現抑制し、DNA microarrayを用いて全遺伝子の発現状況を評価したところ、いくつかのsignaling pathwayがRASSF3の発現抑制により影響を受けていることが分かった。現在RASSF3の過剰発現および発現抑制によりこれらの遺伝子の発現状況の変化をRT-PCRを用いて検討している。またこれらsignaling pathwayがRASSF3のもつ表現系にどのような影響を及ぼしているかを、knockdownすることで検討している。我々は、RASSF3(Ras-Association-Domain Family 3)が、大腸癌細胞株、乳癌細胞株において腫瘍抑制因子として機能していること、肺癌細胞株における移動能の獲得と肺癌の転移に関与していることを報告した。本研究はRASSF3が脳腫瘍において、腫瘍抑制因子として機能しているか否かを検討するものである。神経膠芽腫細胞株にRASSF3を過剰発現するとapoptosisが誘導され、RASSF3をsiRNA法により発現抑制すると紫外線照射による細胞死が抑制された。さらにRASSF3を発現抑制すると紫外線照射によって引き起こされるDNA損傷に対する修復が遅延した。以上の結果はRASSF3が神経膠芽腫においても同様に腫瘍抑制因子として機能していることを示唆する。RASSF3の発現抑制が及ぼす影響を評価するため神経膠芽腫細胞株でRASSF3を発現抑制し、DNA microarrayを用いて全遺伝子の発現状況を評価し、RASSF3により影響を強く受ける遺伝子を抽出した。さらにIngenuity Pathway Analysisを用いてRASSF3の発現抑制により影響を受けるsignaling pathwayをいくつか同定した。現在これらの遺伝子変化をRT-PCR法を用いて確認するほか、さらにこれらの遺伝子をsiRNA法を用いて発現抑制し、表現型の変化を観察してる。siRNA法による遺伝子抑制が十分に効果が得られないものがあり、CRISPRi法を用いて発現抑制を行う系を確立している。培養細胞を用いたRASSF3の機能解析は順調に行えている。特にmicroarrayを用いた遺伝子解析と、その結果をIngenuity Pathway Analysisを用いてnon-biasに、RASSF3との関連を示唆するsignaling pathwayを同定できたことが大きく研究を前進させたと考えている。更に、発現抑制を得るためCRISPRi法を既に確立した。siRNA法による発現抑制との結果を組み合わせることでより詳細に遺伝子発現変化による影響を評価することが出来るようになった。また、マウスを用いた脳腫瘍モデルを構築した。脳腫瘍モデルを用いたRASSF3の機能解析がまだ行えていない。

また臨床検体における発現解析についても検討が行えていない。以上からおおむね順調に進展しているものと考える。我々は、RASSF3(Ras-Association-Comain Family 3)が、大腸癌細胞株、乳癌細胞株において腫瘍抑制因子として機能していること、肺癌細胞株における移動能の獲得と肺癌の転移に関与していることを報告した。本研究はRASSF3が脳腫瘍において、腫瘍抑制因子として機能しているか否かを検討するものである。膠芽腫細胞株にRASSF3を過剰発現するとapoptosisが誘導され、RASSF3をsiRNA法により発現抑制すると紫外線照射による細胞死が抑制された。またRASSF3を過剰発現すると細胞周期がG1/S期で停止し、RASSF3を発現抑制すると細胞増殖が促進された。さらにRASSF3を発現抑制すると紫外線照射によって誘導されるDNA損傷に対する修復が遅延した。RASSF3を発現抑制した膠芽腫細胞株の全遺伝子発現プロファイルをmicroarray法を用いて行うと、いくつかのシグナルパスウェイの活性化および非活性化が示唆された。さらに、The Cancer Genome Atlasを用いて、神経膠腫におけるRASSF3の発現を解析すると、RASSF3は悪性度の低い神経膠腫でより多く発現していた。またRASSF3の発現の少ない神経膠腫は、発現の高いものに比べ有意にその生存期間が短かった。以上の結果は、RASSF3が脳腫瘍においても腫瘍抑制因子として機能していることを示唆する。現在これらの結果の検証実験を行っており、同時に論文執筆を行っている原発性脳腫瘍である膠芽腫において、腫瘍抑制因子として知られるRASSF3の機能解析を行った。全gliomaにおけるRASSF3の発現解析により、RASSF3は腫瘍の悪性度に応じてその発現量が変化していることを発見した。またRASSF3の発現量は患者の生存期間に寄与していることを発見した。膠芽腫の検体から培養細胞を樹立した。分子細胞生物学的手法を用いてRASSF3の機能解析を膠芽腫細胞株であるU87MG細胞で行った。RASSF3は細胞死を誘導した。RASSF3の発現抑制は細胞死誘導を阻害し、細胞増殖を促進した。これはRASSF3が腫瘍抑制因子として機能していることを示す。培養細胞を用いたRASSF3の機能解析は順調に行われている。特にmicroarreyを用いた他の遺伝子発現状況の解析結果による、他のsignaling pathwayとのcross talkの検討が行えたことが、大きく研究を前進させたと考えられる。
グリアにおける抗うつ薬の神経栄養因子誘導作用に関連する新規標的分子の同定

グリアにおける抗うつ薬のモノアミン非依存性新規作用部位の同定を試みた。抗うつ薬→MMP活性化→FGF2 shedding→FGFR1,2活性化→ERK活性化→神経栄養因子発現までの経路を明らかにし、MMPやFGFRの活性化にかかわる分子が候補になると考えられた。一方、ビオチン化抗うつ薬の合成を行い、これをリガンドとして結合する蛋白質を分離して染色しバンドを同定できたが、再現性を検証中である。【成果】グリアにおける抗うつ薬の新規ターゲット分子の同定について、神経栄養因子の発現を指標として(1)機能的アプローチ(2)直接的アプローチの2方向から探索を行っている。本年度は以下のような成果を得た。(1)機能的アプローチ:抗うつ薬によるグリアにおけるグリア由来神経栄養因子(GDNF)の誘導作用のメカニズムとして、重要なチロシンキナーゼの一つである線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)を介していることを薬理学的に明らかにした。現在、siRNAや中和抗体を用いて抗うつ薬によるFGFRの活性化のメカニズムの詳細について検討中である。(2)直接的アプローチ:グリアにおいて抗うつ薬が直接ターゲットする蛋白を明らかにするために、アフィニティクロマトグラフィ法を用いる計画を立案した。アフィニティクロマトグラフィ法を行う際に、ビオチンーアビジンの極めて特異的な結合反応を用いることをアイデアとして考案し、実際、ビオチン化抗うつ薬を生成し、質量分析および核磁気共鳴などを用いて化学構造を確認した(国際特許出願中)。来年度は、この新規に生成したビオチン化抗うつ薬をリガンドとして、アビジン固定化ビーズと結合させて、その抗うつ薬リガンドに親和性のある蛋白質を回収し、電気泳動、アミノ酸解析を行い同定する予定である。【意義および重要性】グリアにおける抗うつ薬の新規ターゲットに関して、FGFRを介した分子機構であることが判明し、さらにアフィニティクロマトグラフィ法で使用するリガンドとしてビオチン化抗うつ薬を生成したことは、双方向のアプローチからターゲットを同定する第一段階が初年度で整った点で意義が高いと考えられる。グリアの主要な種類であるアストロサイトは高次脳機能に役割をもち、うつ病の病態・治療に関与する新しいターゲットの候補と推測されている。抗うつ薬のグリアにおける神経栄養因子増加作用の作用点を探索すれば、従来の神経系をターゲットとしたいわゆるモノアミン仮説を超えた創薬が可能となる。確立したグリア細胞assay系を利用して、抗うつ薬のモノアミン非依存性新規作用部位への機能的アプローチおよびビオチン化抗うつ薬を用いた沈降法によるターゲット蛋白探索の直接的アプローチの2つのアプローチを用いて双方向から抗うつ薬の新規作用部位にアプローチした。抗うつ薬によって、選択的に細胞内情報伝達系の重要なキナーゼ分子であるExtracellular signal-regulated kinase(ERK)およびチロシンキナーゼの急性の活性化がモノアミン非依存性に引き起こされることを明らかにし、チロシンキナーゼの種類として繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)が唯一重要であること、そのFGFリガンドが関与していることを明らかにした。直接的なアプローチとしては、アフィニティクロマトグラフィに用いるリガンドとしてビオチン化抗うつ薬を作成し、グリア細胞溶解液と反応させて、抗うつ薬に親和性の高い蛋白質を免疫沈降法で回収し、同定するものである。現在まで、ビオチン化抗うつ薬の合成、精製に成功した(国内特許申請中)。抗うつ薬によって、選択的にExtracellular signal-regulated kinase (ERK)およびチロシンキナーゼ繊維芽細胞成長因子受容体(FGFR)が活性化することを明らかにし、さらに抗うつ薬→MMP活性化→FGF2 shedding→FGFR1,2活性化→ERK活性化→神経栄養因子発現までの経路を明らかにした。このビオチン化抗うつ薬を用いてストレプトアビジンアガロースビーズとの沈降実験の基礎的検討を行った。しかしながら、このアガロースビーズでは、蛋白質の回収率が非常に低いため、現在は、他の磁気ナノビーズの使用へ変更し再検討し、その結果、良好な蛋白回収率が得られた。

そのため、この磁気ナノビーズを用いて、抗うつ薬と結合する蛋白質を免疫沈降後に回収し、電気泳動で分離して染色しreconfirmingバンドを同定できた。現在は、実験の再現性を検証中である。