hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新視角に基づく竹島/独島の総合的研究

いわゆる'竹島問題'では不可視な対象となっているが、竹島という'存在'によって影響を受けざるを得ない人々・地域がある。本研究は、かかる人々・地域に注視しつつ、竹島を考察した。現在、日韓間に生じている日本海西部海域の漁業実態を見る限り、仮に領有権紛争が「いずれかの望む通りに」、「解決」されたとしても、それは漁業問題の解決を意味しない。新視角に基づく竹島の総合的検討の結果、漁業問題と領土問題の交錯した状況を浮き彫りにすることとなったということが、本研究の概括的な結論であるいわゆる'竹島問題'では不可視な対象となっているが、竹島という'存在'によって影響を受けざるを得ない人々・地域がある。新視角に基づく竹島の総合的検討の結果、漁業問題と領土問題の交錯した状況を浮き彫りにすることとなったということが、本研究の概括的な結論である本研究課題は、(1)従来研究成果の新資料による再検証と空白の穴埋めによる日韓両国政府・関係自治体の竹島に対する取り組みの史的解明と、(2)地域・人々と竹島との関係性、認識に深く密接する李承晩ラインの宣布による拿捕、近現代欝陵島漁業の実態解明という新研究の展開の大きく二つの実証研究、さらにこれらの研究蓄積に日ソ(ロ)、韓ソ(ロ)間の漁業秩序形成史とその過程における緊張・協力関係の分析を加味して日本海の共同利用の可能性を展望するという目的を有する。その初年度である平成22年度は、第一に、島根県所蔵竹島関連簿冊(33点)の分析により、関係自治体の戦後における竹島に対する取り組みの史的解明を進め、論考にまとめた。第二に、既収集資料の分析に予備的な現地調査による知見を加味し、近代初頭の欝陵島社会の実態解明を行い、これを論考にまとめるとともに、関連国際フォーラムで研究報告を行った。第三に、対象時期の欝陵島社会史関連の統計を作成・整理し、公表した。第四に、韓国での資料発掘により、欝陵島にまつわる朝鮮総督府公文書及び李承晩ライン関連の韓国政府公文書を新たに入手した。第五に、日ソ(ロ)、韓ソ(ロ)間の漁業秩序形成とその過程における領土問題との交錯状況をまとめた研究報告を学内で開催された日ロ研究者間によるワークショップで行った(この成果は、ロシア海洋大学出版会より平成23年度中に刊行予定である)。概ね以上の成果が挙げられる。本研究課題は、(1)従来研究成果に対する新資料による再検証と空白の穴埋めによる日韓両国政府及び関係自治体の竹島/独島に対する取り組みの史的解明と、(2)地域・人びとと竹島/独島との関係性、認識に深く密接する李承晩ライン宣布による拿捕、近現代欝陵島漁業の実態解明という新研究の展開の大きく二つの実証研究、さらにこれらの研究蓄積に日ソ(ロ)、韓ソ(ロ)間の漁業秩序形成史とその過程における緊張・協力関係の分析を加味して、日本海/東海の共同利用の可能性を展望するという目的を有す。その第二年度目にあたる平成23年度は、第一に、国内及び韓国数か所の本格的な現地調査と資料実見調査を敢行した。そこでは、十数名に及ぶ漁業者・漁業関係者、欝陵島友会メンバー、行政官吏らに対する比較的長時間のヒアリング、『昭和八年島行政一班欝陵島』などの新資料の発掘に成功した。第二に、既収集資料の分析に立脚し、日韓両国政府及び関係自治体の戦後における竹島/独島に対する取り組みの史的考察をさらに進め、研究代表者が組織する日韓若手研究者らによる研究会でその研究報告を行うとともに、論考にまとめ公表した。また、この成果は、韓国で開催された国際学術大会においても研究報告の形で公表した。第三に、植民地朝鮮期の欝陵島における日本人社会の一端を明らかにする論考をまとめ、自治体(島根県)が組織する研究会の最終報告書の一部として公表した。第四に、200カイリ漁業水域設定前後の日韓ソによる日本海/東海の漁業秩序形成過程とその後の漁業実態を論考にまとめ公表した。概ね以上のような研究の成果が挙がった。本研究課題は、第一に、研究代表者による従来研究成果(若手研究B、課題番号:19730128)に対して、その後発掘を進めてきた新資料による再検証と、研究の空白の穴埋めによって、日韓両国政府及び関係自治体の竹島/独島に対する取り組みの史的解明を図ること、第二に、「竹島/独島」という存在を抱える地域・人びととそれとの関係性、認識に深く密接する、いくつかの史的展開(李承晩ライン宣布による拿捕、近現代欝陵島漁業)の実態解明という新研究の展開を図ること、の大きく二つの実証研究、さらにこれらの研究蓄積に日ソ(ロ)、韓ソ(ロ)間の漁業秩序形成史とその過程における緊張・協力関係の分析を加味して、日本海/東海の共同利用の可能性を展望するという目的を有する。その最終年度にあたる平成24年度は、第一に、国内及び韓国数か所の補足的な現地調査と資料実見調査を敢行した。

そこでは、日本海/東海地域の漁業従事者・関係者、植民地時代からの欝陵島在住者らに対するヒアリングを行うとともに、植民地朝鮮期欝陵島の教育関係文書などの新資料の発掘に成功した。第二に、本研究課題の遂行によって得られた成果を公表するために、国内外研究協力者とともに最終的な成果報告会を実施した(島根県立大学)。第三に、本研究課題の遂行によって得られた成果を広く公表するために、韓国欝陵島、東京で開催された学会・シンポジウムに赴き、研究報告を行った。第四に、とくに本研究課題の遂行によって著しく研究の進展した近現代欝陵島の研究成果については、これをブックレットにまとめた。概ね以上のような研究の成果が挙がった。当初の研究計画の妥当性、研究協力者との良好な意思疎通と情報交換、ヒアリング対象者に対する事前の連絡体制の整備、十分な実見資料調査の下準備などにより、当初の研究計画はほぼ完璧に遂行することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の最終年度である平成24年度は、国内外における追加・補足的な現地調査と最終的な研究の取りまとめが課題となる。現地調査については、その目的と内容、実施の準備が既に整っており、計画の変更・問題点は今のところ皆無である。最終的な研究成果の取りまとめも、既に研究材料が整い、その精読も順調で、さらにヒアリング・実見資料調査を通じて得た録取記録、各種統計資料も順調に整理が進んでおり、所期の目標は達成する見込みである。
神経突起成長におけるNotchと低分子量G蛋白質との機能的関連についての解析

低分子量Gタンパク質Rac1、Cdc42の軸索成長に関する機能の違いを細胞生物学的レベルで解析するために、ショウジョウバエ胚の初代培養を行い、神経突起の形態を比較した。神経細胞特異的にDrac1活性化型を発現させると神経突起は短くなりその先端に葉状突起様構造と太く短い仮足様突起が形成され、Dcdc42活性化型を発現させると神経突起は短くなり、その先端に大きな葉状突起様構造と細く長い仮足様突起が形成された。ファロイジンを用いてアクチン線維を可視化すると、Drac1活性化型の発現によって生じた太く短い仮足様突起に強いアクチン線維のシグナルが観察された。さらにアクチン線維の重合を阻害するサイトカラシンを作用させるとそれぞれに特徴的な形態が消失した。またDcdc42活性化型を過剰発現させた神経突起はサイトカラシンを作用させない場合に比較して濃度依存的に伸長する傾向があったが、Drac1活性化型を過剰発現させた神経突起にはその傾向がなかった。これらの結果は、Drac1の活性化がアクチン線維の強い重合を引き起こし、神経突起の柔軟性を低下させて神経突起の伸長能力を阻害するのに対し、Dcdc42活性化は神経突起の先端において葉状突起様構造や仮足様突起の形成を促進することで神経突起の伸長を阻害するものの、伸長能力そのものを阻害しているわけではないことを示唆した。さらに神経回路形成における機能を見るために、生体の中枢神経系の表現型を比較した。その結果、Dcdc42の活性化とDcdc42の不活性化は異なった表現型を示し、活性化の場合の表現型はroundabout(robo)変異体の表現型に類似していた。これらの結果は、Roboを介する成長円錐内でのシグナル伝達の下流に主にDcdc42が機能しているという可能性を示している。
院政・鎌倉時代における国家的法会の基礎的研究

1.顕密体制論が定説化した現在にあっても、中世国家が宗派・寺院をどのように編成・配置したかは、なお不明な点が多い。そこで本研究では、北京三会・三講など中世前期の国家的法会の実施・運営過程の分析を行うことによって、この課題にアプローチしようとした。史料の収集については、法会の実施時期の史料はかなり収集できたが、法会の準備段階については、日記史料の検索がなお不十分である。たいへん手間のかかる作業であるが、諸々の俗権力との交渉を分析するには、この方面の作業をさらに進展させる必要がある。2.三講の出仕僧は証義・講師とも興福寺僧が最も多く、中世興福寺の地位からして、やや意外である。これは延暦寺・東大寺・園城寺とは異なり、興福寺だけが顕教僧のみで構成されていた特殊性に起因していよう。3.中世僧綱所・法務を中世仏教行政の総攬者と見るか否かで、私を含め論争が行われてきたが、その機能の形骸化を改めて確認した。特に綱所が東寺の他、仁和寺・延暦寺・南都に設置されている事実は、寺社勢力の分裂の結果、統合機能を果たすべき綱所が空中分解したことを物語っていよう。5.以上の研究成果の内、一部は拙著『日本中世の社会と仏教』の新稿論文「中世宗教史研究の課題」に発表し、また一部は同書旧稿論文への加筆という形で発表した。
古太平洋における生物礁の枠組み構造とその変遷

本研究では,石炭紀ジュラ紀に古太平洋域の大陸縁海・島弧・大洋海山で形成された生物礁を対象として,その堆積相や生物相の調査・解析を行い,生物礁の時空分布を把握するとともに,生物礁の形態・生物群集構成・枠組み構造について,地質セッティングと時代ごとにその傾向や特徴を検討した.その上で,背景にある古気候・古海況・海水準変動などの外的要因と生物大量絶滅や礁生態系などの内的要因ついて,全地球的な観点と地域的な観点の両面から考察を深めた.結果は,以下の通りにまとめられる.1)古太平洋域の生物礁は,古地理的に偏在した分布傾向を示す.これは形成当時の古気候モードに加えて,大陸地塊の配置や表層暖流系と湧昇流の卓越に起因する.また,現在の偏在は形成時のプレートの分割配置とその後の移動を反映している.2)古太平洋域の生物礁は地史的にみて発達・衰退に偏りがある.これは生物大量絶滅に関係するとともに,当時の大陸地塊と海流系の変化も反映している.3)大洋海山や島弧の生物礁は,大陸縁海のものより,小規模な形態・堅固な枠組み構造・多様度の高い生物群集構成などの特徴を示し,特に石炭紀前期やペルム紀中期にその傾向が強い.これは形成場の地形や海況(波浪・潮流)が異なることに加えて,当時の表層暖流系・湧昇流および海水準変動が影響している.4)古太平洋域とテ-チス海域の生物礁とを較べた場合,各地質時代で違いが認められ,特に石炭紀・ペルム紀で大きな相異がある.これは当時の大陸地塊の配置による古海流系の違いを反映している.5)個々にみた場合,島弧や大洋海山の生物礁の中には,当時の生物礁としてはきわめて特異なものがいくつか含まれ,生物礁の進化上で重要な証拠となりうる.本研究では,石炭紀ジュラ紀に古太平洋域の大陸縁海・島弧・大洋海山で形成された生物礁を対象として,その堆積相や生物相の調査・解析を行い,生物礁の時空分布を把握するとともに,生物礁の形態・生物群集構成・枠組み構造について,地質セッティングと時代ごとにその傾向や特徴を検討した.その上で,背景にある古気候・古海況・海水準変動などの外的要因と生物大量絶滅や礁生態系などの内的要因ついて,全地球的な観点と地域的な観点の両面から考察を深めた.結果は,以下の通りにまとめられる.1)古太平洋域の生物礁は,古地理的に偏在した分布傾向を示す.これは形成当時の古気候モードに加えて,大陸地塊の配置や表層暖流系と湧昇流の卓越に起因する.また,現在の偏在は形成時のプレートの分割配置とその後の移動を反映している.2)古太平洋域の生物礁は地史的にみて発達・衰退に偏りがある.これは生物大量絶滅に関係するとともに,当時の大陸地塊と海流系の変化も反映している.3)大洋海山や島弧の生物礁は,大陸縁海のものより,小規模な形態・堅固な枠組み構造・多様度の高い生物群集構成などの特徴を示し,特に石炭紀前期やペルム紀中期にその傾向が強い.これは形成場の地形や海況(波浪・潮流)が異なることに加えて,当時の表層暖流系・湧昇流および海水準変動が影響している.4)古太平洋域とテ-チス海域の生物礁とを較べた場合,各地質時代で違いが認められ,特に石炭紀・ペルム紀で大きな相異がある.これは当時の大陸地塊の配置による古海流系の違いを反映している.5)個々にみた場合,島弧や大洋海山の生物礁の中には,当時の生物礁としてはきわめて特異なものがいくつか含まれ,生物礁の進化上で重要な証拠となりうる.古太平洋域で形成されたと考えられる日本列島の後期古生代中生代各紀の古生物礁を研究対象として、その分布・規模・化石内容に関する野外調査と化石種・内部構造に関する室内での検討を行った。調査対象としたものは、南部北上帯石炭紀日頃市層・同鬼丸層・飛騨外縁帯青梅石灰岩(以上、石炭紀)、南部北上帯坂本沢層・同岩井崎石灰岩層・同薄衣礫岩ブロック(以上、ペルム紀)、渡島帯上磯石灰岩(三畳紀)、南部北上帯相馬層群・北部北上帯尻屋石灰岩・常呂帯北見相内石灰岩(以上、ジュラ紀)に含まれるバイオリサイトである。調査・検討の結果、1)海山起源の付加体地質区の石灰岩体では、縁辺の生物礁またはラグーン内のマウンドの生物礁である、2)大陸縁辺島孤起源である南部北上帯の石灰岩では、陸棚上のマウンドや小規模なパッチ状コロニーまたはバンク上の生物礁である、3)現世と類似した明瞭な枠組み構造をもつ生物礁は、ペルム紀(サンゴ礁)とジュラ紀(サンゴ-層孔虫礁)に認めらる、ことが明らかとなった。また、日本列島の後期古生代中生代の石灰岩中の造礁性生物化石およびバイオリサイト関する文献を収集・整理した。合わせて、これまでデータベースとして報告された世界の他地域の古生物礁と予察的に比較した。その結果、4)日本列島の古生物礁の生物構成内容は、大きくみて、石灰紀前期、石灰紀後期ペルム紀前期、ペルム紀後期、三畳紀、ジュラ紀によって異なり、これは世界的な傾向に一致する、

5)枠組み構造としてみた場合、日本列島の石炭紀前期・ペルム紀後期・ジュラ紀の各生物礁は、同時代の生物礁の中では特異なものである、ことが明らかとなった。古太平洋(パンタラッサ海)海域で形成されたと考えられる日本列島の後期古生代中生代各紀の古生物礁を研究対象として,その分布・規模・化石内容に関する野外調査と化石種・内部構造に関する室内での検討を,昨年度に引き続いて行った.野外調査の対象は,南部北上帯日頃市層,同高清水山層,秋吉帯青海石灰岩(以上石炭紀),南部北上帯岩井崎石灰岩(ペルム紀),渡島帯上磯石灰岩,秩父帯田穂石灰岩(以上三畳紀),秩父帯鳥巣石灰岩(ジュラ紀)である.調査検討の結果,1)付加体地質区の海山縁辺相の古生物礁は比較的堅固な構造を持つ,2)島弧起源の古生物礁は礁マウンドの構造を示す,3)古生物礁の付随堆積相は時代によって異なる.ことが明らかとなった.日本列島の後期古生代中生代の古生物礁の生物群集構成と枠組み構造について整理し,それらと世界各地の同時代の生物礁との比較検討を行った.その結果,1)生物群集構成の時代変化は汎世界的な傾向とほぼ合致する,2)石炭紀前期,ペルム紀後期,ジュラ紀の各生物礁の枠組み構造はより堅固である,ことが明らかとなった.さらに,北米西岸アラスカやオーストラリア東部などの古太平洋域で形成された古生物礁を比較整理した結果,1)古太平洋の生物礁は世界の同時代の生物礁に較べて,より多様な生物群集とより堅固な枠組み構造を示す,2)環太平洋地域における各時代の古生物礁の分布は地域によって偏りがあり,これは当時の海洋プレートの分割配置を示している,ことが明らかとなった.
明治・大正・昭和初期の英語教科書の計量的分析

平成14年度においては、主として次の2種の研究活動を行った。(1)英語教科書のコーパス作成、および、作成したコーパスを用いた教科書の計量的分析・比較、そして、(2)英語教科書の発達に関する総合的分析。(1)のコーパス作成とその計量的分析に関しては、現在、Barnes著New National Readers、岡倉著The Globe Readers(前5巻)、Palmer著The Standard English Readers(全5巻)、文部省(外山正一)著『正則英語読本』(全5巻)、文部省(Dening)著English Readers : The High School Series(全5巻)、竹原常太著The Standard English Readers(全5巻)のコーパス作成と計量的分析を完了している。また、New Jack and Betty(中学校、開隆堂)、New High School English(高等学校、開隆堂)、Sunshine English Course(中学校・高等学校、開隆堂)の計量的分析も完了している。分析の視点は、(1)リーダビリテイ(可読性)(Flesch Reading EaseおよびFlesch-Kincaid Grade Level)、および、(2)語彙の頻度(総語数、異語数および異語/総語数の比率)である。これらの成果の一部はすでに各種学会において口頭発表されており、すでに、「戦後英語教科書の量的分析」(中村愛人、小篠敏明他3名著、『日本教科教育学会誌』25・2(2002),61-68)と題する論文として公刊され、他は現在、論文化の途上にある。(2)の英語教科書発達史の分析では、過去3年間の間に分析したデータを使用し、また、各種教科書の質的分析も加え、日本における教科書発達通史の素描を試みた。これらの成果は「英語教科書簡の変遷と展望」(小篠敏明著、『英語と英語教育』6(2001),1-10)、「文法統制から見た英語教科書発達通史の試み」(小篠敏明著、『英語と英語教育』7(2002),1-20)と題して論文として公刊され、また、『明治・大正・昭和初期の英語教科書に関する研究』(小篠敏明・中村愛人共著、渓水社、2001、190ページ)と題して専門書として出版されている。初年度である平成12年度においては、主として次の3種の研究活動を行った。(1)明治・大正・昭和初期の英語教科書に関する情報の収集、(2)英語教科書のテキストのコーパス作成、(3)作成したコーパスを使った教科書の計量的分析・比較。教科書の調査・収集は全国各地の図書館および古書店にて行い、現在、資料作成中である。コーパス作成については、次の3セットを完了している。(1)HaroldE.Palmer著The Standard English Readers(SER)(開拓社、1926)全10巻、(2)岡倉由三郎著The Globe Readers(GR)(大日本図書、1907)、全5巻、および(3)Barnes著National Readers(NR)(A.S.Barnes & Co.,1983,1984)、全5巻。このうち、SERとGRについては、コーパスの作成と計量的分析を行い、その成果を日本教科教育学会第26回全国大会(上越教育大学)にて口頭発表した。分析の視点は、(1)リーダビリティ(読み易さ)

(Flesch Reading EaseおよびFlesch-Kincaid Grade Level)、および(2)語彙の頻度(総語数、異語数、および異語数/総語数の比率)である。ともに日本人学習者を対象にした検定教科書であるが、一方は英国人専門家、他方は日本人専門家によるもので、両者は対照的な特徴を持っていると考えられている。分析の結果、次のことが判明した。(1)総語数、異語数ともにSERが圧倒的に多く、パーマーの教科書が分量、語彙においてより難しい教科書である。(2)一方、総語数に対する異語数の割合はSERの方が低く、パーマーの方が学びやすい。(3)リーダビリティーにおいては、GRのほうがSERより読みやすく、易しい文章である。平成13年度においては、主として次の3種の研究活動を行った。(1)明治・大正・昭和初期の英語教科書に関する情報の収集、(2)英語教科書のテキストのコーパス作成、(3)作成したコーパスを使った教科書の計量的分析・比較。教科書の調査・収集は全国各地の図書館および古書店にて行い、現在、資料作成中である。コーパス作成については、次の3セットを完了している。(1)HaroldE. Palmer著The Standard English Readers (SER)(開拓社、1926)、全10巻、(2)岡倉由三郎著The Globe Readers (GR)(大日本図書、1907)、全5巻、および(3)Barnes著National Readers (NR)(A. S. Barnes & Co.,1883,1884)、全5巻。この件については、すでに昨年度において一応作成済みだったが、その後データに暇疵が見つかり、分析の精度に問題が生じたため、更に綿密な確認を行い、完成度を高めた。このコーパスを使って3教科書の計量的分析を行い、その成果を日本英語教育史学会第17回大会(2001年5月20日、於広島大学大学院)および日本英語教育史学会月例研究会(2001年11月18日、於拓殖大学)にて口頭発表した。分析の視点は、(1)リーダビリティー(読み易さ)(Flesch Reading EaseおよびFlesch-Kincaid Grade Level)、および(2)語彙の頻度(総語数、異語数、および異語数/総語数の比率)である。3種類とも日本人学習者により使用された教科書であるが、SERは英国人専門家、GRは日本人専門家によるもの、NRは米国人専門家によるものである。(1)総語数、異語数はNR、SER、GRの順で多く、母国語話者による教科書(NR、SER)が難しい教科書である。日本人によるGRは総語数、異語数ともに少ない。(2)一方、総語数に対する異語数の割合はNR、SER、GRの順で低く、母国語話者による教科書(NR、SER)が学びやすい。(3)リーダビリティーにおいては、NR、GRのほうがSERより読みやすく、易しい文章である。平成14年度においては、主として次の2種の研究活動を行った.
高度情報化と視聴覚メディアの大衆化

本研究は平成5年度より、第一群5班の計画研究「情報化と大衆文化」(代表・佐藤毅一橋大学教授)から、研究のテーマを視聴覚メディア領域に絞って深めるため独立して応募したものである。平成6年度の目的およびその研究業績の概要は以下の通りである。主に、ふたつの研究領域に重点をおき、ひとつは、光ディスクやマルチメディア・システムなどニューメディアへの音楽映像産業、興業娯楽産業、情報通信産業の対応を分析することで、技術改新と文化変容の現状を明らかにし、その問題点を解明すること。もうひとつは、従来の視聴覚メディア研究においては若年令層における問題のみ重視される傾向があるのに対し、それらと対象的な高年齢者層におけるメディア・リテラシーの障害や「有害環境」問題に関してもアンケート調査を実施した。調査結果の詳細な分析は目下進行中である。第一の研究領域では、(a)平成3年度より継続している「情報化と大衆文化」班内での研究の継続として、光ディスクやISDNを利用することで著しく発展したレーザー・カラオケ、通信カラオケの実態調査を行った。黒田勇編著『オフメディア・オンメディア』(法律文化社)はその研究業績のひとつであり、また、子どもをぐる空間とメディアについての「有害環境」の分析を進めた研究協力者・永井良和『子どもというレトリック』(青弓社)も公刊された。さらに、協力者・富田英典『声のオデッセイ』(恒星社厚生閣)は電話メディアに関する若年層の利用形態を実証的に分析した意欲的試みである。第二の高齢者層の情報機器利用実態調査は津金澤・立木・佐藤が中心となり、宝塚市の「シルバ-ネット」(高齢者を対象にしたパソコン通信網)をはじめ周辺地域の高齢者約300名を対象に、アンケート調査を実施した。その詳細については、目下集計が終了した段階で、データの分析を進めている。
ヒトES・iPS細胞由来腎臓・血管前駆細胞と脱細胞化技術の融合による新規腎臓再生

3次元構造を有する腎臓再生を実現するための基盤となる研究を行うため、ヒトES/iPS細胞から尿細管細胞への分化誘導方法の検討をkidney specific protein (KSP)を指標に行った。GSK 3β阻害剤および尿細管分化培地を用いた2段階のシンプルな培養方法により尿細管細胞へ分化誘導し、抗KSPモノクローナル抗体を用いて尿細管細胞の純化を行った。KSP陽性細胞は尿細管細胞の機能を有し、Wnt4およびマウス胎児腎との3次元培養により、尿細管管腔構造を形成した。これらの結果は、KSP陽性細胞が純化された尿細管細胞であることを示し、今後の腎臓再生のツールとして期待される。医学的および医療経済的な問題となっている透析医療の解決策の1つとして腎臓再生療法の開発が期待されている。しかしその一方で、腎臓は複数の種類の細胞から成る複雑な三次元構造を持ち、培養皿で腎臓全体を形成することは極めて困難である。そこで、申請者らはヒト胚性幹細胞(embryonic stem cell: ES細胞)およびヒト人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)から尿細管前駆細胞を分化誘導し、三次元構造を有する腎臓再生の基盤を構築することを目的に研究を進めている。具体的な研究項目は、1ヒトES/iPS細胞から腎系譜への分化誘導法の確立、2尿細管前駆細胞の同定及び純化法の構築、3三次元構造を有する腎臓再生のための足場の検討、4腎臓再生の足場への尿細管・血管前駆細胞の注入方法の検討、の4つである。第一に、尿細管細胞に発現が特異的なKidney specific protein(KSP)を指標に、尿細管前駆細胞への分化誘導法を検討した。GSK3β阻害薬を用いて中間中胚葉への分化誘導を促進させ、その後EGFを含む低血清培地により上皮化を促進した。そこで、申請者らの研究室で独自に作成した抗KSPモノクローナル抗体を用いてFlow Cytometryを行い、約5%のKSP陽性細胞の純化に成功した。尿細管は管腔側と血管側という極性をもった構造であるため、KSP陽性細胞を用いてin vitroで管腔構造形成を行い、尿細管細胞に特異的なマーカーの発現を確認した。以上の結果より、これまでにヒトES/iPS細胞由来KSP陽性細胞が尿細管前駆細胞としての特性を有している可能性を見出した。申請者らはヒト胚性幹細胞(embryonic stem cell: ES細胞)およびヒト人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell: iPS細胞)から尿細管前駆細胞を分化誘導し,三次元構造を有する腎臓再生の基盤を構築することを目的に研究を展開した.まず第一に,尿細管細胞に発現が特異的なKidney specific protein (KSP)を指標に,尿細管細胞への効率的な分化誘導法の確立を目指した.ヒトES/iPS細胞はGSK3β阻害剤を用いた3日間の培養により原条へ分化し,その後EGFを含む低血清培地での7日間の培養により中間中胚葉,さらには尿細管細胞へと分化した.申請者らの研究室で独自に作成し,ヒト尿細管細胞を特異的に認識することを確認した抗KSPモノクローナル抗体を用いたFlow cytometryにより,約5%のKSP陽性細胞の純化に成功した.KSP陽性細胞は,尿細管細胞の機能的な特徴であるγ-glutamyl transferase活性を有した.また,分泌糖タンパクで,腎臓の発生において,尿細管形成に必須の因子であるWnt4の強制発現細胞株であるNIH3T3-Wnt4細胞とのマトリゲルを介した共培養によって、KSP陽性細胞は,MEGALIN, AQP1,2陽性の管腔構造を形成した.さらに,マウス胎仔腎臓由来細胞とのorganoid cultureにより, flow cytometryによりソーティングしたヒトES細胞(KSP+/TRA1-60 negative)はKSP/lotus tetragonolobus lectin陽性の管腔構造を形成した.これらの結果により,純化したKSP陽性細胞は尿細管細胞であり,管腔構造形成により成熟尿細管の形質を獲得することが示された.3次元構造を有する腎臓再生を実現するための基盤となる研究を行うため、ヒトES/iPS細胞から尿細管細胞への分化誘導方法の検討をkidney specific protein (KSP)を指標に行った。これまでにヒトES/iPS細胞からKSPを指標に尿細管前駆細胞への分化誘導法を確立すべく、共培養系を用いた誘導方法や、種々の誘導因子の分化誘導における効果を調べた。さらに、独自に作成した抗KSPモノクローナル抗体を用いて、ヒトES/iPS細胞由来KSP陽性細胞の純化を行い、管腔構造の形成に成功した。現在はKSP陽性細胞が尿細管前駆細胞としての特性を有するかを検討するために、KSP陽性細胞により形成される管腔構造の形態的、機能的な評価をすすめている。

腎臓再生KSP陽性細胞への分化誘導をより効率的に行い、純化したKSP陽性細胞を尿細管細胞として機能的に成熟させる方法を検討する。そのために、マウス腎虚血・再灌流モデルを用いた解析結果をもとに、新規の尿細管分化・再生因子を同定する。また、純化したKSP陽性細胞の特性の検討を形態・機能の両面から進めていく。同時に、腎臓の三次元構造再生の足場として考えている腎臓骨格を保持した状態で細胞成分を取り除いた脱細胞化腎の作成を開始する。平成26年度はヒトES/iPS細胞からKSPを指標に尿細管前駆細胞への分化誘導法を確立し、独自に作成した抗KSPモノクローナル抗体を用いて、ヒトES/iPS細胞由来KSP陽性細胞の純化を行った。さらに、KSP陽性細胞による管腔構造の形成に成功した。平成27年度はKSP陽性細胞が尿細管前駆細胞としての特性を有するかを検討するために、KSP陽性細胞により形成される管腔構造の形態的、機能的な評価をすすめていく。また、小動物から摘出した腎臓を三次元構造再生の足場にするための脱細胞化技術を確立、脱細胞化腎へヒトES/iPS細胞由来腎臓・血管前駆細胞を注入する際の分化段階や注入方法を検討する。研究経費の主要な用途は消耗品である。今までの研究経費の使用状況から、ヒトES/iPS細胞の維持や分化誘導に必要な誘導因子などの細胞培養試薬、Flow cytometryを用いた細胞選別のための抗体、PCR、Western blotなどのための一般試薬、培養用フラスコ、ディッシュなどのプラスチック器具などの購入が必要である。また、脱細胞化した腎臓を作製するための、動物代、動物投与用試薬、動物維持費も必要となる。研究成果を公表する論文への投稿料も想定される。
CAD/CAM用ブランク評価に関する基礎的研究

本研究の目的は,CAD/CAM用セラミックス材料の辺縁再現性を評価するブランクの評価基準の確立である.双円錐を組み合わせた試験片形態でCAD/CAM用ジルコニアブランクの辺縁再現性を評価したところ,辺縁のチッピング数は面間角度と辺縁部の厚さの増加によって減少した。また,単純に切削条件を統一した切削試験の結果でブロックの特性を評価することに問題があった.辺縁再現性と機械的特性との関連性は,靱性が曲げ強さよりも関連があると考えられた.異なったCAMソフトを用いると同一製品間での辺縁再現性に違いが見られ,辺縁再現性にはソフトの性能も要因と考えられた。以上を踏まえ,評価方法の開発を継続する予定である。初年度は歯科CAD/CAM用ジルコニアブランクについて評価することとした。鋭利な辺縁部の再現性を評価するために双円錐を組み合わせた試験片形態を考案した。すなわち,底面の直径を12.0mm、底角を7.5、15、20、30°とする円錐の底面を張り合わせた双円錐を3個作成し、その中心を一致させ、それぞれ直交させたものを,3次元形状設計ソフト(FreeFormModelingPlusV12.0)を用いて作製した。双円錐の辺縁部の面間角度は15、30、40、60°である。次に双円錐の辺縁に厚みを付与する目的で、実験1と同様の形態の双円錐に直径12.0mm、厚さが0.2、0.3、0.4mmの3種類の円板を挟んだものを設計した。条件は面間角度15、30、60°の3つとした。試験片データはデンタルCAMソフトウェアを用い、コネクタピンを水平面双円錐の辺縁部に3箇所付与し、1か所は双円錐辺縁部と接触するように付与した。切削加工はデンタル用切削加工機にて行った。使用材料は2種類の切削加工用ジルコニアブランクスを用いた。円錐間に円板を挟まない試験片では,全ての部位でチッピングが認められた。ジルコニアディスクの種類による差は認められず、コネクタピンに近接した部位で最も多くチッピングが見られた。円錐間に円板を含むことでチッピングの数は少なくなり、主に双円錐が接する部位で観察された。いずれのジルコニアブロックでもチッピング数は双円錐の形態で異なり、面間角度または円板の厚みの増加によって減少した。円板の厚みが0.4mmまたは面間角度60°の試験片ではチッピングがほとんど見られなかった。今後は製品間の違い、加工機の違いがあるかの検討と、辺縁再現性と他の物性値との比較を行う予定である。平成27年度は,先年度で考案した試験片形態を用いて歯科CAD/CAM用ジルコニアブランクの辺縁再現性について評価をおこなった。特に問題となる辺縁部での再現性を評価するために,先年度の試験片形態と同様,すなわち面間角度7.5、15,30°とした双円錐に厚さが0.2、0.3、0.4mmの円板をはさんだものをそれぞれ直交して組み合わせた試験片形態を用いて、デンタル用切削加工機にて切削加工を行った。使用材料は先年度の2種類に切削システムの異なる1種類を加え3種類の歯科CAD/CAM用ジルコニアブランクを用いて,それぞれの切削システムで切削した試験片を比較検討したところ,円板厚さが薄く,辺縁部が鋭い場合では製品間でチッピング数に差があることが認められた.しかし,同一形態の試験片を各製品のそれぞれの専用切削システムで行ったものを比較した場合には,切削システムが異なるとチッピングの数や表面形状に大きな差が見られることがわかった.そのため,切削機と切削ソフトを同一とした場合の比較が必要と考えられた.そこで,すべての製品で同一の切削条件にて辺縁再現性の比較を試みるため,切削用NCデータ作成ソフト,切削機および切削条件を統一して切削試験を行ったが,同一切削条件においては,異なった切削システムで行った製品では専用切削システムで行った場合とは結果が若干異なっていた.このことは各切削システムにおいてはブロックに至適な切削条件を与えられているため,単純に同一条件での切削試験の結果でブロックの特性を評価することには問題があることが示唆された.今後は,試験片の切削後の辺縁形態の評価だけではなく,半焼結ジルコニアブランクの機械的性質を調べるとともにそれらとの関係性について検討を行う予定である.歯科CAD/CAM用ジルコニアブランクをメーカー指定と異なった切削システムを用いて切削した場合,当初一部の製品で切削用バーが破折する現象がおき,一部の試験の進捗に遅れが生じた.しかし,その後切削用NCデータ作成ソフトが改良され,そのような現象は改善されて起こらなくなったため,その後は順調に試験が行えた.本研究の目的は,CAD/CAM用セラミックス材料同士を比較できる新しい評価方法と評価基準の確立を目指すことであった.初年度はCAD/CAM用ジルコニアブランクについて,双円錐を組み合わせた試験片形態を考案して切削試験を行い,辺縁の再現性を評価した.いずれのジルコニアブランクでも辺縁のチッピング数は双円錐の形態で異なり、面間角度または辺縁部の厚さの増加によって減少することがわかった。研究2年目では,CAMソフト,切削条件を統一して切削加工を行った。

その結果,各製品の辺縁再現性は,異なった切削システムで行った製品では専用システムで行った場合とは若干異なっており,単純に同一条件での切削試験の結果でブロックの特性を評価することには問題があった.研究最終年では,辺縁再現性と機械的特性との関連性を調べるとともに,2種類のCAMソフトを用いてその違いによる辺縁再現性の比較を試みた.機械的特性では,被削性が大きいものが必ずしもチッピングの発生が多いわけではなかった.曲げ強さおよび靱性とチッピング数との関係では,どちらも値が小さい製品ではチッピングが起こりやすい傾向が見られたが,その関係は明瞭ではなかった.しかし,靱性の方が曲げ強さよりもチッピングとの関連があると考えられた.CAMソフトの違いによる比較では,2種類のCAMソフトで同一製品間での辺縁再現性に違いが見られた.これにより辺縁再現性にはソフトの性能も大きな要因となると考えられた.今回の研究では,新しい評価方法と評価基準を確立するまでには至らなかったが,今回得られた成果により,考案した評価試験形態の有用性は確認することが出来た.現在ISO/Tc106/SC9 Dental CAD/CAMsystemでZirconia Blocksに関する規格が提案されているが,さらにその評価方法に寄与できる試験条件,評価方法の開発を継続している.本研究の目的は,CAD/CAM用セラミックス材料の辺縁再現性を評価するブランクの評価基準の確立である.双円錐を組み合わせた試験片形態でCAD/CAM用ジルコニアブランクの辺縁再現性を評価したところ,辺縁のチッピング数は面間角度と辺縁部の厚さの増加によって減少した。また,単純に切削条件を統一した切削試験の結果でブロックの特性を評価することに問題があった.辺縁再現性と機械的特性との関連性は,靱性が曲げ強さよりも関連があると考えられた.異なったCAMソフトを用いると同一製品間での辺縁再現性に違いが見られ,辺縁再現性にはソフトの性能も要因と考えられた。以上を踏まえ,評価方法の開発を継続する予定である。初年度として,市販CAD/CAM用ブランクの切削加工を新たに考案した試験片形態により行うことにより,それぞれの製品で切削性に差があることが認められ,製品間での比較が可能であることが示唆された.これは,本研究の目的であるCAD/CAM用ブランクの切削性評価の規格を確立する上で重要な成果であり,今後の研究の進展の足がかりとなったと考える.辺縁におけるチッピングの形成にはブランクの仮焼結度、加工ソフトウエアによる加工圧や加工スピード、切削用ツールが影響することが考えられるのでこの点について検討する。また、ブランクの辺縁再現性と曲げ強さや弾性係数等の物性値との比較を行う予定である。歯科理工学辺縁におけるチッピングの形成にはブランクの仮焼結度、加工ソフトウエアによる加工圧や加工スピード、切削用ツールの形態が影響することが考えれらるので,この点について検討する。切削試験時に,NC作成ソフトの違いによって切削ツールが試験中に折損したことにより,切削ツールの購入数を予定数より多く購入したため,購入予定のディスク数を調整する必要が生じた.
ヒトiPS細胞由来肝細胞を用いたin vitro胆汁うっ滞型肝障害試験法の構築

ヒトiPS細胞から肝細胞への分化は、本研究室の25日間分化誘導プロトコール(PLoS One., 9; e104010, 2014)に沿って培養した。分化20日目に、I型コラーゲンをコートした培養皿に播種し、4時間後、グロースファクターリデュースト(GFR)マトリゲルで覆うサンドイッチ培養法を行った。サンドイッチ培養後、明視野にて経日的に毛細胆管が形成した。mRNA発現量において、サンドイッチ培養後3日目において、NTCP、MRP2、BCRPはヒト初代肝細胞(48時間)とほぼ同等の発現量を示したが、BSEPやMDR1は低値であった。ウェスタンブロット法によるタンパク定量において、MRP2タンパク量はサンドイッチ培養によって、HPHs(0時間)とほぼ同等の発現量まで増加しまた、免疫染色では、細胞膜への局在も観察された。毛細胆管指標マーカーであるradixinも染色した。そして、MRP2、NTCP/BSEPの機能に関して、蛍光基質であるCDFDAやTauro-nor-THCA-24-DBDを用い評価したところ、インセルアナライザーによりCDFが毛細胆管に蓄積する様子が観察された。さらに、BSEPなどの阻害剤として知られているCyclosporin AによりTauro-nor-THCA-24-DBDの取り込みが阻害され、排泄トランスポーターだけでなく、NTCPにも機能が備わっていることも確認した。22化合物を100倍のヒト血清濃度胆汁酸(BAs)の存在下または非存在下で24時間同時暴露することによる細胞毒性評価を行った結果、7化合物において、胆汁酸存在下で細胞毒性を有意に引き起こした。これらの結果から、ヒトiPS細胞由来肝細胞のサンドイッチ培養により胆汁うっ滞型肝毒性が評価できる可能性が示唆された。医薬品開発における毒性評価は、必須項目であり、肝臓における医薬品候補化合物がどの程度の毒性を有するのかをより詳細に予測するために非常に重要である。そこで、申請者は、サンドイッチ培養法におけるヒトiPS細胞由来肝細胞を用いて、毒性試験への応用を可能かつ既存に類を認めないin vitro薬剤性胆汁うっ滞型肝障害試験法の確立を目的とした。未分化コロニーの占める割合が70%のヒトiPS細胞に、activin A、dimethyl sulfoxide(DMSO)、dexamethasone(DEX)、hepatocyte growthfactor(HGF)、oncostatin M(OSM)を順次添加し、さらに、低分子化合物であるvalproic acid(VPA)を用いることで、効率よく肝細胞への分化誘導を行った。その過程で、毛細胆管形成率を向上させるために、I型コラーゲンとGFR-マトリゲルの細胞外マトリックス(ECM)の組み合わせを用いたサンドイッチ培養法を取り入れた。その結果、明視野にて、胆管腔の形成が認められた。また、胆汁酸排泄トランスポーターであるmultidrug resistance-associated protein (MRP)2タンパク量は、Westan blot法にて、サンドイッチ培養後3日目から、ヒト初代肝細胞と同程度に発現していた。この時、取り込み・排泄トランスポーターであるOrganic Anion Transporting Polypeptide(OATP)1B3、bile salt export pump(BSEP)、MRP2、胆管マーカーとして知られるRadixin(RDX)は、免疫染色法にて、極性、機能の伴ったトランスポーターであることを確認した。したがって、胆汁うっ滞毒性評価系モデルの作製には、サンドイッチ培養後3日目が適切だと判断した。今年度行う研究に関しては、問題なく順調に進行している。

トランスポーターによる取り込み・排泄能の指標として、蛍光基質であるTauro-nor-THCA-24-DBDや5 (and 6)-Carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (CDFDA)を用い、胆管腔を維持するために必要なタイトジャンクション機能をCa2+/Mg2+存在の有無によって調節しながら薬物の取り込み・排泄量を評価するBiliary Excretion Index(BEI)法にて算出する。さらにそれぞれの阻害剤であるMK571やシクロスポリンA(CsA)などを加えることにより、定性評価を行う予定である。また、サンドイッチ培養したヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞に、外部から胆汁酸と肝障害を引き起こす薬剤を同時に24時間暴露し、培地中の乳酸脱水素酵素(LDH)漏出にてin vitro薬剤性胆汁うっ滞型肝障害評価系の構築を行う予定である。この際、サンドイッチ培養したヒトiPS細胞由来肝細胞様細胞に外部から添加する胆汁酸濃度は、調製したヒト血清胆汁酸濃度とCsA添加群または非添加群における差から判断する予定である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
髄外造血モデルを用いた新規ニッチ細胞の同定と性状解析

造血幹細胞の未分化性・多分化能の維持はニッチという微小環境によって制御されており、骨髄内では骨芽細胞が様々な機能を担っている。造血は脾臓などでも髄外造血という形で起こるが、髄外造血の維持機構については不明な点が多い。そこで我々は、実験的に髄外造血を起こすCFU-Spleenモデルと大理石病モデルを用い、髄外造血の脾臓の解析を行った。その結果、造血幹細胞(HSC)マーカーを示す細胞のいくつかは巨核球様の細胞(MLCs)に隣接している事あを明らかにした。さらにこれらの細胞は造血ニッチ関連マーカーが陽性であり、分取し共培養することで、HSCの増殖を促進する事が明らかとなった。【研究の目的】造血幹細胞は多分化能と自己複製能を有した細胞であるが、その機能維持にはニッチの存在が必要と考えられている。骨髄に履いては骨芽細胞がそのニッチとして機能している事が示唆されているが、脾臓などの他の器官でのニッチについては不明な点が多い。そこで我々は、脾臓などの髄外造血モデルを用いて骨髄以外のニッチ細胞の同定を試みた。その結果、脾臓に於いて巨核球様(MLCs: Megakaryocyte-like cells)の細胞が造血幹細胞近傍に存在し、様々なニッチに関わる分子を発現している事を明らかにした。またin vitroで造血幹細胞の増殖を促進する事が明らかとなった。【研究結果】そこでMLCsの分子基盤を明らかにする目的で髄外造血モデル及びCFU-Sモデルを用いてMLCsを単離し、cDNAを合成しDNAマイクロアレイ解析を行い、MLCsに高発現する分子を多数同定した。MLCsは造血幹細胞(LSK細胞)移植後8日目には赤脾随内に集合し、SDF-1やOPN、N-cadherinなどを発現することが明らかとなった。GFPマウスより分取したLSK細胞の追跡の結果、多くのGFP陽性LSK細胞がMLCs細胞近傍に存在している事が明らかとなった。そこで、MLCをCFU-S8の脾臓及び通常の脾臓より分取し、KSL細胞と共培養した結果、CFU-S8由来のMLC細胞は、KSL細胞の維持と増殖に寄与している事が明らかとなった。また、同様の細胞が放射線照射後や抗がん剤投与後の骨髄再建が起きる時にも認められる事から、MLCが一過性のニッチ形成のみならず、再建時においても重要な役割を示す事が示唆された。これらの結果より、脾臓内では血管内皮などに加え、MLC細胞などが様々なCytokineを産生し造血幹細胞の増殖に寄与している事が明らかとなった。造血幹細胞は多分化能と自己複製能を有した細胞であるが、その機能維持にはニッチの存在が必要と考えられている。そこでMLCsの分子基盤を明らかにする目的で髄外造血モデル及びCFU-Sモデルを用いてMLCsを単離し、cDNAを合成しDNAマイクロアレイ解析を行い、MLCsに高発現する分子を多数同定した。MLCs特異的分子を用いてその発生機序を解析した結果、X線照射後1日の脾臓において既にMLCsの増殖が認められた。またこれらのMLCsは造血幹細胞(LSK細胞)移植後8日目には赤脾随内に集合し、SDF-1やOPN、N-cadherinなどを発現することが明らかとなった。また、殆どのMLCs細胞はGFP陰性で、レシピエント細胞より分化している事が明らかとなった。さらにこれらの細胞集団は通常の巨核球とは明らかに異なる遺伝子発現プロファイルを有している事が明らかとなった。また、様々な腫瘍モデルにおいてもMLCを確認し、現在、役割について解析中である。

【研究の目的】造血幹細胞は多分化能と自己複製能を有した細胞であるが、その機能維持にはニッチの存在が必要と考えられている。骨髄に履いては骨芽細胞がそのニッチとして機能している事が示唆されているが、脾臓などの他の器官でのニッチについては不明な点が多い。そこで我々は、脾臓などの髄外造血モデルを用いて骨髄以外のニッチ細胞の同定を試みた。その結果、脾臓に於いて巨核球様(MLCs: Megakaryocyte-like cells)の細胞が造血幹細胞近傍に存在し、様々なニッチに関わる分子を発現している事を明らかにした。またin vitroで造血幹細胞の増殖を促進する事が明らかとなった。【研究結果】そこでH23年度はMLCsの分子基盤を明らかにする目的で髄外造血モデル及びCFU-Sモデルを用いてMLCsを単離し、cDNAを合成しDNAマイクロアレイ解析を行い、MLCsに高発現する分子を多数同定した。MLCs特異的分子を用いてその発生機序を解析した結果、X線照射後1日の脾臓において既にMLCsの増殖が認められた。またこれらのMLCsは造血幹細胞(LSK細胞)移植後8日目には赤脾随内に集合し、SDF-1やOPN、N-cadherinなどを発現することが明らかとなった。GFPマウスより分取したLSK細胞の追跡の結果、多くのGFP陽性LSK細胞がMLCs細胞近傍に存在している事が明らかとなった。また、殆どのMLCs細胞はGFP陰性で、レシピエント細胞より分化している事が明らかとなった。これらの結果より、脾臓内では血管内皮などに加え、MLC細胞などが様々なCytokineを産生し造血幹細胞の増殖に寄与している事が明らかとなった。本研究では髄外造血など定常状態ではない造血に関し、新たな造血ニッチを同定し、その特性を解明する事を目的としている。本研究において我々は髄外造血機構を用いて、脾臓内に新たな巨核球様(MLCs: Megakaryocyte-like cells)の細胞がニッチ細胞の一つとして機能する事を示す事ができた。また予定通りMLCヲ分取し、分子基盤を解明する事で、巨核球との違い、他のニッチ細胞との違いも含め明らかにする事ができた。その中で、既存のニッチ分子が高頻度で発現している事を明らかにし、更に、in vitroでもKSLの維持と増殖に寄与していることを明らかにすることに成功した。また、CFU-Sのみならず、放射線障害や抗がん剤投与モデルにおける骨髄再建時にもMLCの出現が認められる事を発見した。また予定通り分子基盤を解明する事で、巨核球との違い、他のニッチ細胞との違いも含め明らかにする事ができた。今後は計画予定通り、これらのニッチ細胞において発現している分子のうち、新規のもの、未知のものについて、SiRNAを作製し、機能阻害をおこなった場合、KSLの維持においてどのような影響、特に細胞分化、Stemnessへの影響を検討し、新しいニッチ分子を同定する事を目的とする。また、ここまでのデータを論文として発表する準備を行っている。今後は計画予定通り、これらのニッチ細胞がどのような特性を持っているかを明らかにする。即ち、in vitroでMLCsを分離し、造血幹細胞と様々な条件で共培養した際、どのような分化を誘導するのか?を明らかにする。
二次代謝性配糖化酵素の機能解明を基盤とする新規生理活性分子の創製

本研究では、3種類の放線菌由来C-配糖化抗生物質を取り上げ、その配糖化様式の機構解析を進めることを基盤としている。ベンゾイソクロマンキノン(BIQ)系抗生物質生合成に関して以下の知見を得た。(1)メダマイシン(MED)に含まれるデオキシ糖アンゴロサミン(ANG)は、グルコース1リン酸を出発とした6段階の酵素反応によりヌクレオチド糖(NDP-糖)として生成される。Med-14Med-20の各遺伝子をpET系腸菌発現ベクターに挿入し、異種発現系を構築し、Med-17及びMed-18に機能発現に成功した。また、基本骨格生成に関わるMed-12の機能証明も達成した。(2)炭素鎖伸張から立体特異的閉環に関わる還元酵素RED1について、酵素化学的解析を行った。定法により大腸菌組換えタンパクを調製し、カラム精製した。また、本精製酵素液を用い、各種合成基質アナログとのin vitro反応を行った。酵素基質の消費速度並びに各種酵素学的kineticsパラメーターの測定結果から、RED1が認識する2環性中間体基質は、酵素タンパク結合型ではなくカルボン酸型である事が示唆された。この事からACTの生合成経路中においても、RED1が認識するのは酵素非結合型の2環性中間体であることが推察された。本知見は、BIQ配糖化の受容体構造の形成についての重要な知見である。(3)アクチノロジン(ACT)生合成に関わるactVA-5,6の遺伝子破壊体を作成し、菌体培養後の表現型や液体培養後の代謝産物のプロフィール解析からin vivoでの両酵素の機能を検討した。actVA-6単独の破壊体は野生株とほぼ同様の表現型を示し、ActVA-6のACT生合成への寄与は、少なくともin vivoではわずかであることが示唆された。一方、翻訳共役しているactVA-5,6を併せて破壊した菌体はACTの代わりに黄色色素を生産し、新規shunt productであるアクチノベリロンと構造決定した。この構造からAct-VA5のC-6酸化へ関与されること、C-3,C-15の還元反応が6位酸化の直前に生じることも示唆された。C-配糖化の受容体アグリコンの骨格形成に関して重要な知見を得たと考えている。当該年度は、ベンゾイソクロマンキノン(BIQ)系medermycin(MED)の生合成に含まれる炭素-炭素結合によるデオキシ配糖化を取り上げ、配糖化を司る生合成遺伝子の特定とその反応機構を生物有機化学的に解析することとした。MEDの構造中に含まれるデオキシ糖アンゴロサミン(ANG)は、グルコース1リン酸を出発とした6段階の酵素反応(Med-14,15,16,17,18,19,20)によりヌクレオチド糖(NDP-糖)として生成され、特異的C-配糖化酵素Med-8により糖転移が生じると考えられる。