hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FRETイメージングと圧力生理学の融合で探る膜タンパク質のダイナミクス研究

酵母細胞膜上のPma1タンパク質のクラスター化を解析するため、Cy3,Cy5標識したモノクローナル抗体で細胞を免疫染色し、アクセプターフォトブリーチング法でFRETを測定した。その結果、予想に反し多くのPma1分子はランダム分布する傾向にあった。細胞を高圧にさらすと、Pma1はランダム分布からクラスター形成に幾分移行することがわかった。しかし、共焦点レーザー顕微鏡を用いたFRET計測においては、測定誤差が非常に大きく統計処理に耐えるデータを得ることが未だできていない。新たな方向性を見いだすため、DNAマイクロアレイ法を用い、Pma1の遺伝子を始めどのような遺伝子が高圧により活性化するのかを調べた。その結果、PMA1の転写レベルは高圧下でほとんど変化しなかったが、細胞壁タンパク質をコードするDAN/TIRファミリーの遺伝子に著しい発現上昇が見られた。これらは通常の培養条件下では発現しておらず、低酸素によって誘導される。こうした遺伝子が高圧で誘導された点は興味深い。低酸素は脂肪酸アシル鎖の飽和化を促進するため、生体膜流動性の低下という観点からは高圧条件に近いと言える。さらにDAN/TIRファミリー遺伝子は低温でも誘導された。従って、生体膜の動態変化をきっかけとして、それをシグナルとする伝達経路が存在し、酵母遺伝子発現のリモデリングがなされた可能性がある。未知なる膜センサータンパク質の存在を示唆する結果であり、そのクローニングのツールとして圧力が利用可能なことを示している。脂質マイクロドメイン(ラフト)は、機能タンパク質がスフィンゴ脂質やエルゴステロールとともに形成するクラスターで、出芽酵母では数種の膜タンパク質のラフト局在が示唆されている。しかし、それらが生細胞内で真にクラスター化しているかどうかは不明である。本研究課題ではFRET(蛍光エネルギー移動)計測を利用し、ラフトマーカーの一つ、H^+-ATPase Pmalの細胞膜上での分散状態を調べた。計画当初はPmalをYFPおよびCFP融合タンパク質として発現させ、FRETを計測する予定だったが、これら2種類のタンパク質の存在比を任意に変えるのが困難なことが判明した。そこで、HA-Pmalをゲノム上に持つ菌株を入手し、市販の抗HAモノクローナル抗体を用いる戦法に変更した。Cy3,Cy5標識キットを用い、このモノクローナル抗体1分子当たり12個のCy3またはCy5が結合したフラクションをゲル濾過で抽出した。HA-Pmal細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、様々な量比で混合したCy3標識抗HA抗体とCy5標識抗HA抗体で細胞を染色した。次いで、共焦点レーザー顕微鏡FV-500(オリンパス)のもと、Cy5のブリーチするのCy3の蛍光強度を定量した(アクセプターフォトブリーチング法)。現在のところデータの振れは大きいものの、FRET効率はCy5蛍光強度に依存し、Cy3:Cy5強度比には依存しないことがわかった。このことは、細胞膜上でオリゴマーを形成するという生化学的知見に反し、クラスター化したPmalの割合は低く、多くの分子はランダムに分布すること示唆している。今後はデータの振れを取り除くこと、ならびに圧力や温度、化学物質などラフト構造に影響する条件がHA-Pmalの分散状態にどのような効果を及ぼすのかを調べ、Pmalのダイナミクスを解明する予定である。
動的可変バス結合並列計算機上で幾何学問題を解く並列アルゴリズムの研究

動的可変バス結合並列計算機上で幾何学問題を解くアルゴリズムのシミュレーションをワークステーション上の開発を行なった。そのシミュレータを用いて、近接点問題に関する効率良いアルゴリズムの開発を行なった。その結果、平面上にn個の点が与えられたときに、各点からもっとも近い点を見つける効率よいアルゴリズムを得ることができた。そのアルゴリズムは、プロセッサ台数がn×nの時に、定数時間で、各点からもっとも近い点を見つけることができる。さらに、このアルゴリズムをサブルーチンとして用いることにより、n個の点のRNG(Relative Neighbourhood Grahp)もプロセッサ台数がn×nの時に、定数時間で、各点からもっとも近い点を見つけることができることを示した。また、MST(Minimum Spanning Tree)もn×n^2個のプロセッサを用い、定数時間で求められることを示した。また、シミュレーションを用いて、行最小値問題を解く並列アルゴリズムのプロラミングを行ない、性能評価を行なった。行最小値問題とは、大きさn×nの行列が与えられたときに、その行ごとの最小値を求める問題である。行最小値問題は、様々な幾何学アルゴリズムでサブルーチンとして用いられる重要な問題である。プロセッサ台数がn×n動的可変バス結合並列計算上で、O(loglogn)時間で行最小値問題を解く並列アルゴリズムを得ることができた。また、n頂点のリストランキングがプロセッサ台数がn×n動的可変バス結合並列計算上で、O(log^*n)時間で求められることを示した。また、確率的手法を用いて、O(1)の期待時間でリストランキングが行なえることを示した。
歯科用金属アレルギー診断における金属刺激リンパ球幼若化試験

皮膚粘膜疾患患者で皮膚貼付試験陽性44名、皮膚貼付試験陰性の学生45名より採集したリンパ球を用い,使用頻度の高い歯科用金属皮膚貼付試験検査用金属試薬(0.05%HgCl_2,5%NiSO4,0.2%HAuCl_4,2%CoCl_2,1%PdCl_2,4%K_2Cr_2O_7)を抗原し50倍・250倍・1250倍・6250倍・31250倍・156250倍の6段階に希釈した濃度系列をおけるリンパ球の反応について検討を行った。HgCl_2:陽性・陰性群間に6250倍250倍希釈時(P<0.05)に有意差を認めた。診断上250倍のデータが重要と思われた。また、50倍希釈時にはリンパ球幼若化反応の著明な亢進が認められた。NiSO_4:陽性・陰性群間に31250倍(P<0.05)、6250倍、1250倍、250倍,最大値(P<0.01)に有意差を認めた。診断時には50倍のデータ値が有用と考えた。1250倍、リンパ球に対して非特異的に幼若化を亢進が認めた。しかし、50倍希釈においてリンパ球幼若化反応の強い抑制が認められた。HAuCl_4:陽性、陰性群間に156250倍、6250倍(P<0.05)、最大値、50倍希釈時(P<0.01)に有意差を認めた。診断上では50倍希釈時が有用と考えられた。CoCl_2:陽性、陰性群間に156250倍(P<0.05)、31250倍6250倍1250倍希釈時と最大値(P<0.01)に有意差を認めた。診断上6250倍、最大値が有用と考えられた。250倍50倍,特に50倍希釈においてリンパ球幼若化に対する抑制作用が認められた。PdCl_2:陽性、陰性群間に最大値(P<0.05)に、250倍希釈時(P<0.01)に有意差を認めた。診断上250倍が、最大値より有用と考えられた。50倍希釈においてリンパ球に対する幼若化反応が抑制が認められた。学生Volunteerの皮膚貼付試験陰性者、皮膚貼付試験陽性者、患者皮膚貼付試験陽性者との3群で比較する。皮膚貼付試験を電子カメラで規格的に撮影し、色彩の変化の判定をより厳格に比較する。リンパ球幼若化試験を施行し、今回は、培養日数を3日と6日培養とし、その3群間で比較し皮膚貼付試験の成績と比較する。患者においては、皮膚貼付試験による感作金属を口腔内から除去し、その前後でリンパ球幼若化試験を検討する。臨床症状の推移を観察し金属除去の有効症例、無効症例と比較する。

対象:学生Volunteer80名と歯科用金属アレルギー患者2)皮膚貼付試験陽性群、皮膚貼付試験陰性群の2群10例より採血を行う。3)歯科用金属によるリンパ球幼若化試験を行う。試薬を使用し6段階に希釈し、培養日数は3日と6日の両方行いその差異をみる。4)患者においては、皮膚貼付試験陽性を示した金属に関して同様にリンパ球幼若化試験を行う。5)患者の口腔内金属分析、口腔内金属の除去を行い経過観察する。6)患者の治癒した時点で、再度リンパ球幼若化試験を行う。皮膚粘膜疾患患者で皮膚歯貼付試験陽性44名、皮膚貼付試験陰性の学生45名より採集したリンパ球を用い,使用頻度の高い歯科用金属皮膚貼付試験検査用金属試薬(0.05%HgCl_2,5%NiSO 4,0.2%HAuCl_4,2%CoCl_2,1%PdCl_2,0.4%K_2Cr_2O_7)を抗原し50倍・250倍・1250倍・6250倍・31250倍・156250倍の6段階に希釈した濃度系列をおけるリンパ球の反応について検討を行った。HgCl_2:陽性・陰性群間に6250倍250倍希釈時(P<0.05)に有意差を認めた。診断上250倍のデータが重要と思われた。また、50倍希釈時にはリンパ球幼若化反応の著名な亢進が認められた.NiSO_4:陽性・陰性群貫に31250倍(P<0.05)、6250倍、1250倍,250倍,最大値(P、0.01)に有意差を認めた、診断的には50倍のデータ値が有用と考えた。1250倍、リンパ球に対して非特異的に幼若化を亢進が認めた。しかし。50倍希釈においてリンパ球若化反応の強い抑制が認められた。HAuCl_4:陽性、陰性群間に156250倍、6250倍(P<0.05)、最大値、50倍希釈時(P<0.01)に有意さを認めた。診断上では50倍希釈時が有用と考えられた。CoCl_2:陽性、陰性群間に156250倍(P<0.05)、31250倍6250倍1250倍希釈時と最大値(P<0.01)に有意差を認めた。診断上6250倍、最大値が有用と考えられた。250倍50倍,特に50倍希釈においでリンパ球幼若化に対する抑制作用が認められた。PdCl_2:陽性、陰性群間に最大値(P<0.05)に、50倍希釈時(P<0.01)にに有意差を認めた。診断上250倍が、最大値より有用と考えられあた。50倍希釈においでリンパ球に対するの幼若化反応が抑制が認められた。
鳥類前肢の指の本数・アイデンティティーの決定メカニズム

本年度は、鳥類の前肢(翼)の指の本数を3本にする発生メカニズムの解明を中心に研究を進めていくことにした。具体的には、1鳥類前肢の指の本数を決定している分子メカニズムの解明2ANZでの細胞死抑制3国内外での学会発表と、本研究に関する論文作成以上の3つを研究実施計画として設定した。1については、BMPシグナリング経路を抑制する特定のタンパク質であるNOGGINタンパク質の添加を行った。しかし、指の本数の変更という、予測した結果が得られなかったため、研究を中止した。また、"BMPシグナリングの下流因子であるリン酸化smadの状態を、3本指の翼と4本指の足とで比較していくといった実験"については行わなかった。2については、研究実施計画に記載したBrdUとZ-VADに加え、Pifithrin-αという細胞死抑制剤を用いた。BrdU、Z-VAD、Pifithrin-αを様々な濃度と効果時間でニワトリ胚に滴下した。しかし、多くのニワトリ胚がこれらの薬剤に作用させた後に致死となった。生存したニワトリ胚も、ANZでの細胞死は抑制されておらず、指の本数の変更も見られなかった。3については、国内学会で1つ発表を行い、国際雑誌で1本の論文を発表した。また、大学院の研究の締めくくりとして、博士論文を作成した。この他、研究実施計画に記載した内容とは別に、4ニワトリ前肢では、ANZとは別に、AERという組織でも非常に早い時期から細胞死が起こることを示した。そして、53本指のニワトリ前肢は4本指のニワトリ後肢よりも指を形成する領域が小さく、それはAERの前側が退縮していく現象に起因することを、定量的なグラフを用いて示した。4と5の結果については国際雑誌、博士論文内で発表している。(抄録なし)鳥類前肢の指の本数を決定しているメカニズムの解明について、当初予定していたRCASウィルス法を当研究室で確立し、Sp8、Sp9,p35、Bc12遺伝子をニワトリ胚肢芽に過剰発現させた。しかし、当初予測していた、形態などの変化を見出すことができなかった。そのため、代用法として、特定のタンパク質をニワトリ胚肢芽に添加し、作用させることにした。過去のマウスを用いた知見から、肢芽に発現するBmpファミリーの遺伝子の機能を抑制することによって、同様の変化を得ることができると予測された。そこで私は、BmpファミリーのアンタゴニストであるNOGGINタンパク質をニワトリ胚前肢芽に添加し、Bmp遺伝子の機能の抑制を試みた。この結果、ニワトリ胚前肢芽に、過剰な指様の突起が形成された。また、ニワトリ胚前肢芽では本来細胞増殖しない部分での、細胞の大きな広がりも観察された。このような変化が、どのようなメカニズムで引き起こされているのかを詳細に解析し、これまでの結果と合わせて論文をまとめていくことが、平成25年度の課題となる。フレームシフトについては、当初予定していたZPAの可視化が困難であると判明したため、予定していた実験を見合わせた。しかし、古生物学と本研究とを融合させた解析から、鳥類は、進化のどのような過程でフレームシフトが引き起こされたのかを議論・考察し、論文として発表した。国内外での学会発表は、予定していた発表内容を変更したものの、計画通り計2回行った。論文執筆に関しては、研究の遅延のため、必要な実験を行いつつ、現在も論文を執筆中である。しかし、上記の通り、別の内容で論文を発表した。

9に記載した通り、RCASウィルス法を用いた遺伝子発現系による、当初予測された結果を得ることができなかったためである。平成24年度は、実験時間の多くを、このRCASウィルス法の確立とそれを用いた実験に費やしたため、研究に大きな遅れが生じた。本研究では、鳥類の指の本数の決定と、指のアイデンティティーに関する発生メカニズムを解明することが目的である。しかし、研究の遅れが生じていることから、平成25年度は、指の本数の決定について、主に研究していきたい。それは、指のアイデンティティーに関する研究については、9で述べた通り、古生物学との融合研究に方向性が変更されており、この研究については当研究室の、私を含む複数のメンバーで研究を進めることになったためである。本年度は、鳥類の指の本数決定に関する発生メカニズムに関して、過去の実験結果と平成25年度に得る結果をまとめて、論文を発表する。(抄録なし)
鍼による化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)の予防メカニズム

パクリタキセル(抗癌剤)は乳ガンなどの悪性腫瘍に対して大変期待されている化学療法の一つである。その一方で副作用として手足のしびれをはじめとする“末梢神経障害"が高頻度に生じる。そこで鎮痛作用や自律神経機能調節作用があるといわれる鍼療法を抗癌剤による末梢神経障害に対して応用し、その効果を検討した。これまで我々は鍼刺激のCIPN抑制に関与が予想される生体機序の探索を目標にパクリタキセルによる末梢神経障害モデルを用いて検討を行ってきた。パクリタキセルを5週齢の雄ラットの腹腔内に注射して末梢神経障害モデルを作製し、足三里(ST-36)へ鍼刺激を施行した。電子痛覚測定装置(Von Frey 2390)をはじめとする動物行動試験を中心に末梢神経障害の評価を行い、神経過敏性(アロディニア)の出現を観察した。また同動物から脊髄および末梢神経を採取し、免疫染色法により、アロディニアに関与するグリア細胞の発現を観察するとともに末梢神経(坐骨神経)内の血管新生および後根神経節における遺伝子発言について観察を行った。その結果、鍼刺激によりパクリタキセル投与群で好発する機械的刺激に対するアロディニアの抑制、坐骨神経に対応する脊髄高位レベルでの脊髄後角アストロサイト出現の抑制が再現された。またNOS阻害薬(L-NAME)の前投与で鍼刺激効果が阻害されたことからパクリタキセルによる末梢微小循環の阻害との因果関係が示唆された。そこで神経ー血管ユニットの観点から検討した結果、パクリタキセルによる坐骨神経内の血管形成阻害が鍼刺激により改善することが判明し、同モデルにおいて後根神経節における血管新生因子(VEGF)の発現に影響した可能性が示唆された。平成30年度は、上記内容を踏まえ学術雑誌への投稿準備を行った。国際学会発表後、発表内容を総論としてとりまとめる企画が立ち上がり、当初の予定通りに計画が進行しなかったが、当該の報告において質疑応答の議題に上がった内容を踏まえこれまでの成果を再検討することに時間を要した。化学療法誘発性末梢神経障害に対する鍼刺激の抑制効果に神経血流および血管新生の関与が示唆された。また刺激を受けた神経においてどのような生体分子の変化が行われているかについての検討を加え、そこで化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)に対する鍼の効果に影響する可能性のある生体システムと脊髄内のグリアの発現・活性との関連性を研究成果として総合的に評価・報告することを計画している。【目的】パクリタキセル(抗癌剤)は乳ガンなどの悪性腫瘍に対して大変期待されている化学療法の一つである。その一方で副作用として手足のしびれをはじめとする“化学療法誘発性末梢神経障害(CIPN)"が高頻度に生じる。【方法】パクリタキセルによる末梢神経障害モデルを用いて機械的刺激に対する動物行動試験および免疫組織学検討により鍼刺激の効果に関する検討を行った。パクリタキセルを5週齢の雄ラットの腹腔内に注射した末梢神経障害モデルを作製し足三里(ST-36)へ鍼刺激を施行した。鍼刺激の施行時期を化学療法の前から施行する群と化学療法による末梢神経障害(アロディニア症状)が出現する3週間後から開始する群で比較検討したところ、化学療法の前から鍼治療を開始した際にアロディニア症状の出現が抑えられる結果が得られ、CIPNに対しての鍼治療の予防的処置の有効性が確認された。また被験動物のアロディニア出現時の脊髄グリア細胞の発現に関して、ミクログリアおよびアストロサイトの出現時期の異同について検討し、他の末梢神経障害同様にCIPN症状が慢性化するにつれてアストロサイトの出現が増加していく傾向が認められた。また予防的な鍼治療によりCIPN出現を抑制した被験動物におけるアストロサイトの出現の有意な減少が認められ、CIPNに対する鍼治療の神経学的な関与が推察された。以上の結果については、全日本鍼灸学会および日本生理学会において発表した。本年度は、先行研究していた検討内容を踏襲する内容であったため、研究がスムーズに進行した。昨年度に続き、パクリタキセルによる末梢神経障害モデルを用いて検討を行った。また同動物から脊髄および末梢神経を採取し、免疫染色法により、アロディニアに関与するグリア細胞の発現を中心に観察を行った。その結果、パクリタキセル投与群で好発する機械的刺激に対するアロディニアは、鍼刺激の早期開始により抑制されることが示された。また坐骨神経に対応する脊髄高位レベルでの脊髄後角アストロサイトの出現について鍼刺激群で優位に抑制されていた。また神経障害時に出現するTRPV4を確認したところ当該モデルの坐骨神経上において好発することを確認した。

またこの反応はNOS阻害薬(L-NAME)の前投与で阻害されたことからパクリタキセルによる末梢微小循環の阻害との因果関係が示唆され、これまでの我々の検討結果を含め、日本東洋医学会において報告を行った。本年度はこれらの結果を国際自律神経学会におけるシンポジウムで報告する。本年度は、先行研究していたin vivoでの検討内容を踏襲する内容であったため、研究がスムーズに進行した。また平成29年度に予定していた神経血流に関する検討について予備的検討を行うことができた。パクリタキセル(抗癌剤)は乳ガンなどの悪性腫瘍に対して大変期待されている化学療法の一つである。その一方で副作用として手足のしびれをはじめとする“末梢神経障害"が高頻度に生じる。そこで鎮痛作用や自律神経機能調節作用があるといわれる鍼療法を抗癌剤による末梢神経障害に対して応用し、その効果を検討した。平成29年度は、針刺激のCIPN抑制に関与が予想される生体機序の探索を目標にパクリタキセルによる末梢神経障害モデルを用いて検討を行った。パクリタキセルを5週齢の雄ラットの腹腔内に注射して末梢神経障害モデルを作製し、足三里(ST-36)へ鍼刺激を施行した。電子痛覚測定装置(Von Frey 2390)をはじめとする動物行動試験を中心に末梢神経障害の評価を行い、神経過敏性(アロディニア)の出現を観察した。また同動物から脊髄および末梢神経を採取し、免疫染色法により、アロディニアに関与するグリア細胞の発現を観察するとともに末梢神経(坐骨神経)内の血管新生および後根神経節における遺伝子発言について観察を行った。その結果、鍼刺激によりパクリタキセル投与群で好発する機械的刺激に対するアロディニアの抑制、坐骨神経に対応する脊髄高位レベルでの脊髄後角アストロサイト出現の抑制が再現された。またNOS阻害薬(L-NAME)の前投与で鍼刺激効果が阻害されたことからパクリタキセルによる末梢微小循環の阻害との因果関係が示唆された。そこで神経ー血管ユニットの観点から検討した結果、パクリタキセルによる坐骨神経内の血管形成阻害が鍼刺激により改善することが判明し、同モデルにおいて後根神経節における血管新生因子(VEGF)の発現に影響した可能性が示唆された。これらの検討結果は、国際自律神経学会において報告を行った。本年度は、先行研究してサンプリングを済ませていたin vivoでの検討内容を踏襲する内容であったため、研究に関してスムーズに進行した。また平成28年度から進めていた神経血流に関する検討について確認することができた。ただし国際自律神経学会発表後、発表内容を総論としてとりまとめる企画が立ち上がり、当初の予定通りに計画が進行しなかったが、当該の報告において質疑応答の議題に上がった内容を踏まえこれまでの成果を再検討することに時間を要したため当初の計画から若干遅れている。
明清交替期における琉球国の対中国朝貢貿易の研究

今回の研究課題は,時代的には明末清初期の研究であるが,この時代は何分うち続く戦乱によって政情が不安定をきわめていて,それが原因して基本史料類は皆無に近い状態である。そのようなことから,この分野の研究はいまだに未開拓のままで終っている。そのため,空白の部分を解明すべく関係史料の調査発掘を最後の最後までひたすらつとめてきたのであった。その結果,つぎの三史料を発掘することができた。第一点は鹿児島市の木脇家に伝存する「肥後守祐昌様琉球御渡海日記」という古記録である。この史料は明末期のもので,その内容は政治,経済,文化の万般にわたって記されていて,そのときの薩流関係を通じて明清国の動静を知ることの出来るきわめて貴重な資料となっている。つぎの二点は研究課題とは直接結びつくものではないが,関係史料として今後大いに活用されるところの琉球国使節の江戸三附参府時の記録すなわち「琉球人参府記」(嘉永三年庚戌年)である。本史料は旧小倉藩藩主の小笠原家文庫(福岡県行橋市)に所蔵されているもので,従来まったくしられていなかった新発見の史料である。研究課題に基づく関係史料を追い求めていた最中に偶然見つけ出した貴重な新史料であった。最後の一点は,琉球の朝貢貿易時の最重要輸出品の一つである昆布史料の発掘である。昆布はそもそも北海の海産物の一つで,江戸時代の北前船が北海道から日本海を南下して運んでいたが,薩摩の海商らは北陸地方(富山)までやってきて,そこで昆布を買い求め,そして,南の琉球に運送していたのであった。富山市の隠田家に所蔵されている隠田家文書中からこの「昆布の道」を解明し得たことは,さらに今後の進貢貿易研究に寄与するところ大であるといえよう。以上の三史料は今回の成果として明記しておきたい。明清交替期における琉球国の対中国朝貢貿易の研究は、琉球国と中国との関係史の中ではきわめて重要な分野でありながら、これまで他の領域と対比したとき、この分野の研究は大いに遅れているのが現状である。その理由は中国王朝(明・清)の興亡と交替という複雑な時代に、当時の琉球が何れの王朝に帰属するかの二者択一を逼られていたことから、それに関する正確な資料があまり遺されていないことに原因していた。この分野の解明には根強く関係資料の発掘収集に努めることが何よりも重要である。そのため今年度は意欲的に各地の研究機関を訪れて資料の発掘に努力したが、その結果、鹿児島の木脇家に所蔵されている「肥後守祐昌様琉球御渡海日記」の貴重資料を調査収集することが出来た。その他福岡県行橋市の同県立豊津高等学校(育徳館)に関連琉球資料があることが分かり、次年度再調査することを計画している。以上のように、今年度は研究計画書に明記したように九州地区(九大文化史研究施設、同図書館、長崎県立図書館、鹿児島県の各機関)と関西地区(京大図書館、天理大学図書館、大阪市史編集室等々)を中心としてその他山口県立文書館などを訪れて貴重資料の発掘収集を行うなどきわめて有意義であった。次年度はこれらの研究機関以外の各地の機関や旧家および各寺社などへの調査を予定している。そしてここに発掘した資料に基づいて必ずや新しい研究成果が出せるよう努めたいと考えている。

標記の研究課題に基づいて今年度は昨年鹿児島の木脇家で発掘収集した貴重史料の「肥後守祐昌様琉球御渡海日記」をほぼ解読整理をしている段階である。今年度は富山市の隠田家に所蔵されている中国への輸出(朝貢物)品の一つである昆布資料の調査発掘に成功し、次年度もさらに継続調査をしたいと考えている。その他、関西地区(京都大学図書館、天理大学図書館、大阪市史編集室等その他)と北九州地区(九州大学図書館、九州大学文化史研究施設、長崎県立図書館)と南九州地区(鹿児島、宮崎県)の各研究機関を訪ねて関係資料の発掘収集に努めるべく計画を立てている。以上のごとく、今年度は富山市の隠田家に所蔵されていた朝貢品の一つである昆布資料の発掘と昨年鹿児島で発掘した木脇文書の整理に努めている。これらの資料を基礎にして必ずや新しい研究成果が出せるよう努めたいと考えている。標記の研究課題に基づいて、今年度はこれまで調査してきた関係各機関をさらに追跡調査することに励んだ。なかでも最も期待していた富山市の隠田家に伝存する朝貢品の一つである昆布史料は昨年以上の新史料の発見は見られず、ほとんどが19世紀以後に片寄っていて研究課題から少しく離れた輸出品であることが判明した。そのようなことから昨年鹿児島市で発掘した木脇家に所蔵されていた『肥後守祐昌様琉球御渡海日記』という明末清初に相当する難解な古記録の解読に励み、漸く本史料を活用し得る段階にいたった。因に本年度追跡調査を行なった各機関を明記すると次のごとくである。長崎県立図書館、九州大学九州文化史研究施設、天理大学図書館、関西学院大学図書館、堺市博物館、大阪大学図書館等々の各機関で調査を実施した。
木造継手仕口の機械加工化による現場施工の変化に関する研究

(1)現場施工での継手・仕口の機械化の現状と将来の展望木造住宅を生産している企業の中から,継手・仕口の機械化を積極的に行なっている,大手・中規模・小規模工務店に対して,また,それらの工務店に機械を供給している機械メーカーに対してヒヤリングを行なった.その結果,多くの工務店では,在来の継手・仕口による構法に対して依然として高い信頼性を置いており,その機械化においても,可能な限り在来に近いものを機械化のシステムラインによって実現しようとしている傾向が強いことがわかった.また,現場作業員に対してもヒヤリングを行なったが,そこでも同様に,機械化によって簡易化された継手・仕口が高い信頼性を獲得するにいたってはいない傾向がみられた.しかし,その現場作業員の傾向に対応するための各企業の再教育システムなどの導入については,あきらかな傾向が認められたとはいえず,いまだ各企業の試行錯誤の段階にあるようである.現実の機械化への現場作業の対応の現状をあきらかにしていくのは,今後の課題であるといえる.(2)継手・仕口の機械化による簡易化の現状(1)でヒヤリングを行なった各企業より入手した施工図面より継手・仕口部分を抽出し,従来より行なっているPHF記号表現(日本建築学会計画系論文報告集No.350参照)によって記号化し,その類型化を行なった.その結果,実際に機械化の対象となっている継手・仕口のタイプを抽出することができた.(3)まとめ以上により,木造継手・仕口の機械加工化による変化,および,それがもたらす現場施工の変化の傾向をあきらかにし,将来の展望に対する考察を行なった.(1)現場施工での継手・仕口の機械化の現状と将来の展望木造住宅を生産している企業の中から,継手・仕口の機械化を積極的に行なっている,大手・中規模・小規模工務店に対して,また,それらの工務店に機械を供給している機械メーカーに対してヒヤリングを行なった.その結果,多くの工務店では,在来の継手・仕口による構法に対して依然として高い信頼性を置いており,その機械化においても,可能な限り在来に近いものを機械化のシステムラインによって実現しようとしている傾向が強いことがわかった.また,現場作業員に対してもヒヤリングを行なったが,そこでも同様に,機械化によって簡易化された継手・仕口が高い信頼性を獲得するにいたってはいない傾向がみられた.しかし,その現場作業員の傾向に対応するための各企業の再教育システムなどの導入については,あきらかな傾向が認められたとはいえず,いまだ各企業の試行錯誤の段階にあるようである.現実の機械化への現場作業の対応の現状をあきらかにしていくのは,今後の課題であるといえる.(2)継手・仕口の機械化による簡易化の現状(1)でヒヤリングを行なった各企業より入手した施工図面より継手・仕口部分を抽出し,従来より行なっているPHF記号表現(日本建築学会計画系論文報告集No.350参照)によって記号化し,その類型化を行なった.その結果,実際に機械化の対象となっている継手・仕口のタイプを抽出することができた.(3)まとめ以上により,木造継手・仕口の機械加工化による変化,および,それがもたらす現場施工の変化の傾向をあきらかにし,将来の展望に対する考察を行なった.
ランタノイドアルコキシドおよびアミドを用いる新規アニオン重合系の開発

近年、有機合成化学の分野において、種々の希土類錯体を用いた有機反応開発が盛んに行わなれ、多くの成果が報告されてきている。特にランタノイド(III)アルコキシド類は、Kagan、柴崎らを中心に数多くの研究が成されてきており、不斉合成触媒へ応用されるなど、非常に興味深い反応剤の一つであるといえる。本研究では、有機合成の分野で一般的に用いられているKaganらの方法により調整したランタン(III)およびセリウム(III)トリイソプロポキシドを用い、極性ビニルモノマーに対する重合活性、選択性について検討を行った。その結果、この反応剤は、メタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、アクリルアミド等に対して重合活性を示し、例えば、MMAの重合では、重合は速やかに進行すること、得られたポリマーは80%前後のmm含量を有し、比較的広い分子量分布を示すことなどの特徴が認められた。また、代表的な金属アルコキシドであるリチウムイソプロポキシドとは全く異なる重合活性を有していることがわかった。さらに、重合活性種、重合機構等を明かにするため、開始剤として用いたランタノイド(III)トリイソプロポキシドの詳細な分析を行った。ICP,UV等による分析の結果、ランタノイド(III)アルコキシドを中心とするクラスターが重合活性種となっていることが示唆された。さらに、本重合反応系についてGC,GC-MSおよびNMR等による分析を行ったところ、極めて微量ながら、アセトンが検出されたことから、本重合の開始反応がMeerwein-Ponndorf-Verley還元機構で進行していると考えられる。
ボードレールと「詩人の形象」の問題:19-20世紀における文学の社会的機能の研究

申請者は、19年度から研究課題「ボードレールと詩人の形象の問題:19-20世紀における文学の社会的機能の研究」において、フランス近代詩人ボードレールをひとつのモデルケースとして「詩人の形象」という問題を19世紀の歴史とのコントラストのもとに明らかにしようと努めてきた。本年度は、昨年度の業績(フランスの歴史家フランソワ・アルトーグの主著『「歴史」の体制現在主義と時間経験Regimes d'historicite. Presentisme etexperiences du temps』の全訳および解説)をふまえて、文学と歴史理論の関係、近代の「本来的経験」(それらはしばしば文学によって媒介される)の危機といった問題を、さらに広い視野で総括した。具体的には、2010年3月フランスでの在外研究において、国立大学図書館にて19-20世紀におけるフランスおよびドイツ思想・文学に関する資料収集をおこなった。また、社会科学高等研究院においてアルトーグ教授の仕事および滞在した社会科学高等研究院の思想史的位置づけについて論じたものとして「いま歴史を語るということ」という論文を季刊誌『環』夏号(2009年)に発表した。その他、東京大学総合文化研究科COEプログラムUTCPにおける研究会「イメージの作法」に定期的に参加し、参加者とともに、今後後の新たな人文研究の可能性(文学、歴史、社会・政治思想を含む領域横断的な学問環境の確立)を討議・模索した。フランス・ロマン主義文学が担った社会的機能とその変容について「ボードレールにおける詩人と群衆:フランス・ロマン主義文学の社会的機能とその変容に関する一考察」と題し日本フランス語フランス文学会秋季大会にて口頭発表を行った。文学史家ポール・ベンシューの著名なラーゼにあるように、文学とはフランス革命によって教会権力が失墜した「世俗化」の時代において宗教的権威を担うものであり、その背景には、神という超越性か制度時に保証されなくなった時代にいかに個人と社会との間の有機的連結を保つかという問いがあった。ここからフランス・ロマン主義文学の社会的機能を規定されるが、ロマン主義の第一世代に遅れてやってきたボードレールにおいては芸術による社会と個人の「綜合」はもはや不可能でありそのようなアポリアに対してボードレールはその詩学を通してひとつの応答を行った。後期の散文詩「群衆」のなかで語られるのは、群衆と一体化する詩人の姿である。しかし、真の群衆経験は、群衆によって詩人の優位が脅かされる経験であり、そこでは群衆はもはや自然のように物言わぬ「一魂(マッス)」であることをやめる。本発表においては、このような群衆経験の両極性をエゴーとボードレールの群衆経験の差異から明らかにした。フランソワ・アルトーグの主著『「歴史」の体制現在主義と時間経験Regimes d'historicite. Presentisme etexperiences du temps』の全訳および解説を藤原書店から刊行した。本書および同教授の仕事の理解を通して、「詩人の形象」という問題を19世紀の歴史主義とのコントラストのもとに明らかにすることができた。また、同年12月4日から13日まで、初邦訳の刊行に合わせて日仏会館の招聘により来日した著者の三都市(京都・東京・福岡)での五つの講演に関して、来日日程の立案・調整および同行者として報告書を発表した(月刊「機」2009年204号、藤原書店刊行)。また、東京大学総合文化研究科COEプログラムUTCPにおける研究会「イメージの作法」に定期的に参加し、11月21日のシンポジウム「イメージの作法-権力と表象」にて口頭発表「表象の危機としての群衆経験-ボードレール「現代生活の画家」をめぐって」を行い、それをもとに論文「表象の危機としての群衆経験-ボードレール「現代生活の画家」をめぐって」、「表象文化論研究8イメージの作法-権力と表象」(2009年3月、東京大学総合文化研究科超域文化科学専攻表象文化論コース発行、P.38-53)を発表した。なお、繰り越し分として、2009年5月フランスでの在外研究において、国立大学図書館にて19-20世紀におけるフランスおよびドイツ思想・文学に関する資料収集、社会科学高等研究院ゼミ訪問を行った。
高齢者の身体活動量維持のためのM-Testを用いたセルフマネジメントに関する研究

高齢者の身体活動量維持のためには、高齢者の慢性的な運動器の痛みや違和感のセルフマネジメントが必要となる。M-Test(経絡テスト:The Meridian Test,Motion-induced somatic response Test)は、向野医師が考案した身体の評価方法で、東洋医学の概念である経絡を進展させ身体の動きを分析し、その結果に基づいた対処方法の選択ができ、簡便なため、高齢者自身が活用できる技術と考え用いた。【目的】高齢者が身体活動量維持のためにM-Testを用いてセルフマネジメントを継続していくためのモデルを構築することである。【平成27・28年度】高齢者の生活活動量維持のためのMーTestの有用性の検討を行った。A市元気高齢者28名の内、14名が非介入群、14名が介入群となり、介入群はM-Test結果に基づくM-Testストレッチを行い指導した。非介入群はM-Testストレッチの指導を行わず過ごしてもらった。介入前、介入後、2週間後の3時点において、足関節・膝関節可動域とTUG(Timed Up and Go)、M-Test、健康関連QOLSF-36を測定し、介入日から2週間、3軸加速度計の装着し評価した。次にM-Test技術獲得のための教育プログラムを作成し、M-Testを活用したセルフマネジメント技術獲得と継続のための健康サロンを12回開催した。ヘルス・ボランティアは、A病院で勤務する看護師や介護士述べ10名が参加した。高齢者のグループワークでの語り、M-Test高齢者版(M-Test所見用紙を高齢者用に作成したもの)を用いてM-Test測定とM-Testストレッチ、ヘルスボランティアの体験内容のインタビューで評価した。【平成29年度】ヘルス・ボランティアの養成と組織化に取り組み、高齢者が身体活動量維持のためのセルフマネジメントモデルを提案した。【目的】本研究の目的は、高齢者が身体活動量維持のためにM-Testを用いてセルフマネジメントを継続していくためのモデルを構築することである。本年度は、高齢者の身体活動量維持のためのM-Testの有用性を検討し、M-Testを活用したセルフマネジメント技術獲得と継続のために健康サロンを12回開催した。【方法】平成26年の研究結果を基に、A市元気高齢者28名の内、14名が非介入群、14名が介入群となり、介入群はM-Test結果に基づくM-Testストレッチを行い、指導し、2週間ストレッチを継続する、非介入群はM-Testストレッチの指導を行わず過ごしていただいた。その後、M-Test技術獲得のための教育プログラムを作成し、健康サロンを2箇所で12回開催した。介入研究に参加した方の声かけにより集まった方で途中参加も入れると、述べ30名であった。健康サロンのヘルスボランティアは当初の予定は看護学生であったが、継続参加が困難であり、継続して参加できるようにA病院(A市外)に依頼し、希望者を募り、病院で勤務する看護師や介護士に依頼し、途中参加も入れると述べ10名であった。グループワークでの語り、M-Test高齢者版(M-Test所見用紙を高齢者用に作成したもの)を用いてM-Test測定とM-Testストレッチ、ヘルスボランティアの体験内容のインタビューで評価した。本研究は福岡県立大学研究倫理委員会の承認を得て実施した。【結果】分析中であり、まとまり次第、雑誌論文等への発表の予定である。平成27年度の研究目的通りにすすんでいるが、有用性の評価方法、高齢者が身体活動量を維持するためのセルフマネジメント方法、ヘルスボランティアは当初の予定を変更して進めたため、おおむね順調に進展しているとした。【目的】健康サロンの維持とヘルス・ボランティアの養成と組織化をする。【方法・結果】1.健康サロンの継続。C市の2箇所で、参加者の継続希望があり、健康サロン絆を1回/月、1回当たり1時間で開催した。下半身のM-Testによって、痛みがあるところに効果があるストレッチを選択して、ストレッチを行うこと、正しいストレッチを行うこと、ストレッチを継続できているかをメンバー間で話し合い1ヶ月の効果を確認して、次の1ヶ月の目標をもつことの3つの目標を持って行った。毎回、正しいストレッチはできていたが、ストレッチをすることだけに着目し、M-Testによって、ストレッチを選択することによって、ストレッチを行い、ストレッチの効果を体感することが抜けるため、時間配分をかえて、ストレッチ後のM-Testを入れる時間を確保することにする。ストレッチにとどまらず、ツボ刺激に興味をもち、来年度も継続の意思を示し、参加者主体の健康サロンの運営に移行することになった。参加者は、「外を歩くことが苦にならなくなった。」、「これからの人生に希望が出てきた。」、「立てる時間が長くなり、台所仕事ができるようになった。」と語り、継続の刺激になっている。2.ヘルス・ボランティアの養成と組織化。C市にある病院看護部に働きかけ、看護師の方10名を対象にM-Testの研修会を開催した。結果は、効果は体感していたが、ヘルス・ボランティアとして参加までいたらなかった。参加者のうち、1名は、居住地で開催するのであれば参加するという意見があった。他の病院の看護部にも働きかけ、看護師に伝えてもらったが、参加まで至らなかった。

12月に日本看護科学学会、M-Testを活用した高齢者健康サロンでの看護師ヘルス・ボランティア活動について交流集会を行い、A病院の看護部の協力を得ることになったが、下記の通り、1年間保留となった。健康教室に参加している高齢者、看護学生をヘルスボランティアとして養成する計画であったが、高齢者側はリーダーシップをとれる人材がなく、看護学生側は学業のため参加・継続することが困難であった。ヘルスボランティアの養成と組織化を促進するため、看護職によるヘルスボランティアの養成と活用に切り替えた。A病院看護部へ働きかけ、ヘルス・ボランティア確保、A病院が設置している地域包括支援センターに働きかけ、協力が得られたが、A病院看護部体制がかわり、1年後、開始できるかどうか検討することになった。【目的】健康サロンの維持とヘルス・ボランティアの養成と組織化をする。【方法・結果】1.健康サロンの継続。B市の2箇所で、参加者主体の健康サロンの運営ですすめた。1箇所は5名、もう1箇所は10名から2名増やし、12名で開催した。健康サロン絆を1回/月、1回当たり、90分で開催し、下半身のM-Testによって、痛みがあるところに効果があるストレッチを選択して、ストレッチを行うこと、正しいストレッチを行うこと、ストレッチを継続できているかをメンバー間で話し合い1ヶ月の効果を確認して、次の1ヶ月の目標をもつことの3つの目標を持って行った。毎回、M-Testによって、ストレッチを選択することによって、ストレッチを行い、ストレッチの効果を体感することが抜けるため、ストレッチ後のM-Testを入れた。メンバー間でツボシールを購入し、有効なつぼを指導し、ツボシールを貼れるようになっていた。2.ヘルス・ボランティアの養成と組織化。C市で開催している健康教室には、看護学生3名をヘルス・ボランティアとして参加(うち2名はM-Testの講義を受講)し、バイタル測定、グループでの話し合い、有効なツボをあて貼付することを行ったが、学業に影響がない時のみの参加となった。研究メンバーは常時2名(M-Test初級・中級セミナー受講)が参加した。病院からの看護職ボランティアの派遣は困難となり、C町の住民団体の協力を得て、C町の実態調査を行った。C町に在住している退職した看護職1名の参加があり、有効性を実感し、ヘルスボランティアとして協力を得られることになった。実態調査に参加したC町近隣に在住している看護学生(M-Testの講義を受講)、理学療法士がヘルス・ボランティアとしての協力することになった。看護職のヘルスボランティアの養成と組織化のため、看護職によるヘルスボランティアの養成と活用をすすめていたが、A病院看護部体制がかわり、検討結果、協力者の部署の移動もあり、研究協力が得られなくなった。新たなフィールドを開拓することになった。同時に、研究代表者が家族の介護、研究メンバーが産休となり、フィールド開拓とデータ収集が遅れた。高齢者の身体活動量維持のためには、高齢者の慢性的な運動器の痛みや違和感のセルフマネジメントが必要となる。
神経疾患の有効治療剤テトラヒドロビオプテリンの実用的合成法

安価な不飽和アルコ-ルを原料として、天然型の(-)-ビオプテリンの新規合成を行なった。即ち、プロパルギルアルコ-ルとアセトアルデヒドからアルド-ル反応、一級アルコ-ル部の酸化、および炭素一炭素三重結合の部分的接触水素添加により-4-ヒドロキシ-2-ペンテナ-ル誘導体を収率よく合成することができた。このペンテナ-ルのカルボン酸エステルに対して弱塩基性条件下で過酸化水素によるエポキシ化反応を行ない、2-ホルミル-3-(1-ヒドロキシエチル)オキシランに変化した。この反応の立体選択性(3-位と1-位の立体化学に基づくエリスロ/スレオ比)は、1-水酸基上のアシル基の影響を受け、酢酸エステルでは二つのジアステレオマ-がほぼ1:1で生成するが、アセトキシエティエン酸エステルでは(-)-ビオプレリンの合成に必要なエリスロ体が6:1で優先して生成することがわかった。このようにして得た光学活性なホルミルオキシランと2、4、5-トリアミノ-6-ブロキシピリミジンとの縮合ならびに脱保護により(-)-ビオプテリンを合成した。本合成法は、高価な天然糖に依存しないこと、極めて高い位置選択性をもつことなど、従前の合成法より優れており実用的合成法となり得る。なお、(-)-ビオプチリンから(6R)-テトラヒドロビオプテリンへの高選択的水素化法は報告者がすでに確立している。本研究で採用した縮合反応は、ジヒドロプリン型中間を経由する二つのシッフ塩基間の平衡、ならびにそのうちの一方だけからアミノ基の求核性の差に基づいて6-位置換プテリンへ位置選択的に閉環すること等を確認した。この合成法をさらに一般に拡張し、数種の6-ヒドロキシアルキルプテリン化合物を得た。これらプテリンのテトラヒドロ体の生理活性の研究を計画している。
表面-分子相互作用系の電子状態とメカニズム解析

本研究では表面と分子との特異な相互作用に焦点をあて,金属や半導体の表面と分子との相互作用,その代表例である固体触媒作用などに,理論的・分子工学的見地から光をあて,その電子過程の解明に基づいて,表面と分子の相互作用が関連する材料設計に有用な知見を見出すことを目的としている.ここでは,このような観点で行った研究のうち,次の2つの研究についてその概要を記す.1.水素分子とプラチナ・クラスターの相互作用プラチナ金属表面での水素分子の化学吸着のモデルとして,また小さな金属クラスターと水素分子の反応そのものに対する興味から,プラチナクラスターPtn(n=1, 2, 3)と水素分子の反応を理論的に研究した.その結果, Ptクラスターはn=1, 3のときH_2と反応し, H-H結合を解離するが, n=2のときはH_2との反応は起こらないことが示された.Pt原子では解離吸着に活性な状態は励起状態^1S(d^<10>)である. Pt_3に対する研究から,解離吸着した水素は容易に表面を移行し,またその際, Pt-Pt結合も安定であることが示された.吸着はPt_3のときでも,本質的には一個のPtによって起る事も分った.相互作用の局所性に基づくクラスターモデルは,クラスターの背後にある固体金属の影響を完全に無視しているため,電荷移動やスピン移動の大きな表面反応過程の研究には不充分である.表面-分子相互作用系をadcleusterと呼び,これが固体金属の電子浴に浸っていて自由に電子の交換を行っているモデルを提唱した.このモデルを用いて,パラゾウム表面における酸素分子の吸着過程を研究し,このモデルの有用性を確認した.本研究では表面と分子との特異な相互作用に焦点をあて,金属や半導体の表面と分子との相互作用,その代表例である固体触媒作用などに,理論的・分子工学的見地から光をあて,その電子過程の解明に基づいて,表面と分子の相互作用が関連する材料設計に有用な知見を見出すことを目的としている.ここでは,このような観点で行った研究のうち,次の2つの研究についてその概要を記す.1.水素分子とプラチナ・クラスターの相互作用プラチナ金属表面での水素分子の化学吸着のモデルとして,また小さな金属クラスターと水素分子の反応そのものに対する興味から,プラチナクラスターPtn(n=1, 2, 3)と水素分子の反応を理論的に研究した.その結果, Ptクラスターはn=1, 3のときH_2と反応し, H-H結合を解離するが, n=2のときはH_2との反応は起こらないことが示された.Pt原子では解離吸着に活性な状態は励起状態^1S(d^<10>)である. Pt_3に対する研究から,解離吸着した水素は容易に表面を移行し,またその際, Pt-Pt結合も安定であることが示された.吸着はPt_3のときでも,本質的には一個のPtによって起る事も分った.相互作用の局所性に基づくクラスターモデルは,クラスターの背後にある固体金属の影響を完全に無視しているため,電荷移動やスピン移動の大きな表面反応過程の研究には不充分である.表面-分子相互作用系をadcleusterと呼び,これが固体金属の電子浴に浸っていて自由に電子の交換を行っているモデルを提唱した.このモデルを用いて,パラゾウム表面における酸素分子の吸着過程を研究し,このモデルの有用性を確認した.
超高感度タンパク質ＮＭＲシグナル帰属技術

高分子量のタンパク質NMRシグナルを、より微量の試料を用いて帰属できるように2つの方法を開発した。まず、すでに我々が開発しているMAGICAL法について各種測定プログラムの改良を行い、測定感度を30%程度向上させることができ、低濃度の試料を短時間で解析することができるようになった。また、新たにメジャーコドンのtRNAとマイナーコドンのtRNAを使い分けることによるアミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識方法を開発した。これらの方法を用いることで従来のNMR解析方法に必要であったタンパク質濃度の1/100以下の濃度でシグナル帰属解析が可能になり、様々な分野への貢献が期待できる。タンパク質NMR解析を、1mg以下かつ10μM以下の濃度で可能にするために、我々が開発してきたMAGICAL法をさらに発展させるとともに、ピンポイントの安定同位体標識技術の開発を試みた。今年度は、以下のような研究成果が得られた。(1)MAGICAL法におけるパルスプログラムの改良我々が開発したMAGICAL法は、特殊な安定同位体標識を20通り行ったタンパク質試料を無細胞タンパク質合成系により調製し、2次元HN(CO)/HN(CA)/H(N)CA/H(NCO)CA/H(N)CO/H(NCA)COを測定することで従来法に必要な濃度の1/10程度の低濃度の試料を用いて、より高分子量のタンパク質NMRシグナルを簡便に帰属可能な方法である。本年度は、このMAGICAL法において、より高感度に測定ができるように各種測定プログラムの改良を行い、測定感度を30%程度向上させることができた。(2)ピンポイント安定同位体標識技術の開発アミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識方法の創製のために、タンパク質合成系において、メジャーコドンとマイナーコドンの切り分ける技術を開発している。本年度はこの目的のために必要な無細胞タンパク質合成系に使用する、大腸菌の各種アミノアシルtRNA合成酵素遺伝子、tRNA遺伝子およびtRNA修飾酵素遺伝子のクローニングを行い、ほぼ全ての対象遺伝子のクローニングと大量発現系構築を完了した。そして、メジャーコドンとマイナーコドンの切り分けの最初のターゲットであるロイシルtRNA合成酵素、イソロイシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNA合成酵素については、大量培養および高純度精製を開始した。本研究が進めば、従来のNMR解析方法に必要であったタンパク質濃度の1/100以下の濃度でシグナル帰属解析が可能になり、様々な分野への貢献が期待できる。タンパク質NMR解析を、1 mg以下かつ10 μM以下の濃度で可能にするために、我々が開発してきたMAGICAL法をさらに発展させるとともに、ピンポイントの安定同位体標識技術の開発を試みた。本年度は、イソロイシンのコドンについてメジャーコドンとマイナーコドンの切り分けを行い、高分子量タンパク質であるマルトース結合タンパク質(MBP, 387残基、分子量42,000)をターゲットとしてアミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識を試みた。イソロイシンのマイナーtRNAの遺伝子を用いて、RNAポリメラーゼを用いた転写反応によってtRNAの大量調製を行い、さらにtRNAの機能発現に必要なリシジンの修飾塩基を修飾酵素を用いて導入した。そして、これらの材料をもとに、様々なイソロイシンの部位にアミノ酸番号選択的に15N標識したイソロイシンを組み込み、1H-15NHSQCのNMR測定を行った。すでに、他の方法で帰属されたMBPの1H-15N HSQCスペクトルと比較したところ、狙った部位に正しく安定同位体標識イソロイシンが組み込まれていることを確認できた。以上のことより高分子量タンパク質の1H-15N HSQCシグナルの帰属に本研究の方法が有効であることが示された。本年度は、昨年度に引き続き、各種アミノアシルtRNA合成酵素を大腸菌による大量発現系を用いて大量培養を行い、精製を行った。特にメジャーコドンとマイナーコドンの切り分けの最初のターゲットであるロイシルtRNA合成酵素、イソロイシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNA合成酵素、伸長因子(EFーTu)の発現菌の大量培養および高純度精製を完了した。また、イソロイシンなどのアミノ酸に対応するマイナーtRNAの遺伝子を用いて、各種tRNAをRNAポリメラーゼを用いた転写反応によって大量調製を行った。

今年度はピンポイント安定同位体標識を行うモデルタンパク質としてFKBPを用い、アミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識を行った。メチル基を持つアミノ酸についてアミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識を試みたところ、我々の構築した系が問題なく適用可能なことが示された。また、無細胞タンパク質合成において伸長因子(EFーTu)を加えておくことによりアミノアシルtRNAの分解を抑えることができた。メチル基を持つアミノ酸をアミノ酸残基番号選択的に安定同位体標識することにより、従来の方法では帰属が困難であったメチル基由来のシグナルの帰属を10μM以下の試料濃度で簡単に行えることが示された。本研究が進めば、従来のNMR解析方法に必要であったタンパク質濃度の1/100以下の濃度でシグナル帰属解析が可能になり、様々な分野への貢献が期待できる。交付申請書に記載した実験計画はほぼ達成できているので、おおむね順調に進展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。ピンポイント安定同位体標識方法の開発については、タンパク質と薬剤の相互作用の解析などを念頭に置き、結合表面における疎水性相互作用に重要と考えられる、ロイシン、イソロイシン、メチオニンなどの疎水性アミノ酸のアミノ酸残基番号選択的標識方法の開発を先行させていきたいと考えている。ピンポイント安定同位体標識方法の開発については、タンパク質と薬剤の相互作用の解析などを念頭に置き、結合表面における疎水性相互作用に重要と考えられる、ロイシン、イソロイシン、メチオニンなどの疎水性アミノ酸のアミノ酸残基番号選択的標識方法の開発を今年度に引き続き先行させていきたいと考えている。