hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PET画像・MR画像融合システムの開発

PET画像は、体内の代謝・血流量分布等を可視化できるため、脳梗塞・心筋梗塞などの診断のみならず、正常者の各器官における生理代謝機能の基礎研究分野においても重要な手段となっている。ところが、今までのPET装置では観測対象とする活性化部分微小体積中のカウントが周囲組織と平均化されることで低下する現象(部分体積効果)が現れ、計測の定量性がそこなわれていた。本研究では、このようなボケを修復するためのデコンボリューション操作を逆問題解析用のニューラルネット構造で実現し、逆問題解析の際に現れる不適切性を、MR画像から得られる脳内構造(灰白質、白質、脳脊髄液等の分布)についてのアプリオリ情報、および同一組織、特に白質内では、血流量の空間分布は比較的滑らかに変わるという条件を加味して適切化することで解決した。特に、後者の滑らかさの表現としては、通常行われているTikhonovの正則化に対し「動的正則化」の概念を提案し、この種の逆問題解決に有効に機能することを基本的な逆問題、ファントムデータ、およびPET実データについて確認した。また、MR情報を有効に利用するためには、MR画像から、灰白質、白質等を切り出すいわゆるセグメンテーションの高精度自動化が必須技術となるが、本研究ではこの面についても種々の方式を検討し、脳のMR画像から灰白質、白質、脳室などの組織の認識・分離をBPネットを用いて自動化することが出来た。特に、MR画像から組織分離に有効な特徴量を抽出するにあたっては、ベクトル量子化と事後確率による評価法を組み合わせたVQCC法を提案し、より少ない素子数のネットワークで効果的に組織分類するための方針を明らかにすることができた。さらにはこの特徴量選択について遺伝的アルゴリズムを導入し、より適切な指標を短時間で選択できるようになった。最後に以上の要素技術を統合することでMR画像とPET画像を融合するネットワーク動作の確認をおこない、その有効性を確認した。本年度は、PET画像・MR画像融合ネットをハードウエア化するうえで不確定であった以下2点について具体的手法を確立することができた。(1)MR画像上の組織分類の自動化:本システムを正確に動作させるためには灰白質、白質及び、骨、骨髄等、頭部を構成する各要素の正確な分類が不可欠である。このような画像の領域分割の自動化を行う場合には、各微小領域に対して定義される多数の特徴パラメータの中から領域分割に重要な少数組のパラメータを選定する必要がある。本研究では、ピクセル値の平均、分散、対称性クラクタル次元等多数の特徴パラメータの中から34個の組合せを選び、各々の組の特徴空間がパターンの分類に対してどの程度有効かを評価するためにConditional Class Entropy(CCE)を評価し、CCE値の最も低い組合せを採用し、これらの特徴をもとに、BPネットで処理することにより、上記組織分類の完全自動化が可能になった。なお、CCE評価には特徴空間のベクトル量子化を行うことで効率よく特徴量の評価が可能なことを明らかにした。(2)PET画像の3次元デコボリューション:本年度は今まで1枚のPET原画像に対して1枚のMR画像を対応させ、結果として1枚の鮮鋭化されたPET画像を得る方法であったものに加え、2枚のMR画像から得た情報をもとに1枚の原PET画像をZ方向に隣り合う2枚のPET画像として分離する操作が可能であることを示した。この方法はPET画像がZ方向について低い分離能しか持ち得ないことが原因で縮退していた画像を、より細かいピッチで観測可能なMR画像から得られるアプリオリな知識をもとに分離するもので、特にZ方向での変化の激しい脳幹部及び第3脳室近傍の画像分解能を大幅に改善することができた。

本研究ではPET画像のボケを修復する過程で生じる不適切性を排除するために可能な限りアプリオリ情報を用いることを意図している。前年度の研究で明らかになったように、MR画像情報から得られる組織情報(灰白質、白質、脳脊髄液等の分布)をネットワーク構造の中に組み込むことで、解の限定はある程度可能であるが、解の安定科を計るために利用できるもうひとつのアプリオリな情報としては、解の関数の滑らかさの情報がある。これは、血流を対象としたPET画像では血流分布の空間的分布の滑らかさに相当し、数学的にはTikhonovの正則化として定式化される。特に、ネットワークインバージョンを用いて逆問題を解くという枠組みのなかでは、誤差エネルギー関数に、滑らかさを評価する正則化項を付加するという形でこの情報が生かされる。本年度は、主としてとはネットワークインバージョンの逐次更新過程の中でこのような正則化を行うにあたり、正則化項のパラメータが誤差項の収束に伴い変化すべきであるという「動的正則化」の手法を新たに提案し、その有効性を基礎的な逆問題の例を用いて明らかにした。また、PET画像の修復に対して動的正則化手法が具体的にどのように生かされるかについても擬似ファントムデータを用いて従来法との差を明らかにするとともに、正常被験者について心理負荷を与えて実測した脳のPET画像についても実験的検証を行いほ本法の有効性を確認した。
化石骨含有コラーゲンに対する続成作用とその炭素同位体比への影響に関する研究

本研究では、炭素・窒素同位体比の測定における骨含有コラーゲンの抽出精製法に関して検討した。昨年度の分析結果では、ロシア・ピョートル大帝時代のボイスマン2遺跡出土の人骨試料の場合、ゼラチン分画のみならず、抽出分画と残査も、C/N比が約3.2で炭素含有率が40%以上というコラーゲンの判断基準を満たしていることが明らかになった。しかし、この遺跡では、主なタンパク資源がC3植物と海獣であったため、炭素同位体比と窒素同位体比に相関が認められた。この相関が保存されていたのはゼラチン分画のみである。そこで本年度は、同一遺跡集団内における炭素・窒素同位体比の相関関係という視点からコラーゲンの保存状態および続成作用のプロセスについて検討した。分析に供した試料は以下のとおりである。縄文時代中期:向台(8)、弥生時代(1)大境(4)、瓜郷(1)、岩津保(5)、安房神社(5)、大浦山(5)、アバチク洞窟(1)、里浜(3)。縄文時代に属する向台貝塚では、ボイスマン2遺跡同様に炭素・窒素同位体比に強い相関がみられた。この場合もC3植物と海産物の間での変動であるが、ボイスマン2遺跡に比べると明らかに植物よりの分布であった。一方、弥生時代の試料では、大浦山遺跡と安房神社遺跡の2集団では有意な相関が見られたが、他の遺跡ではそのような相関は認められなかった。現状では限られた分布例のため、今後の検討が引き続き必要となるが、沿岸に立地した遺跡の場合、植物と海産物の両方をタンパク質源として用いる例が一般的であり、両者の相関がコラーゲン保存状態のパラメータになる可能性がある。今後、人骨と木炭の放射性炭素年代の比較などを考慮して検討を続けたい。本研究では、炭素・窒素同位体比の測定における骨含有コラーゲン抽出・精製法に関して検討した。具体的にはセルロース半透膜を用いることによって水に可溶となったコラーゲン分画を回収し、その炭素・窒素安定同位体比、炭素・窒素含有率、炭素/窒素比を測定し、水不溶性分画・それを加熱し精製したゼラチン分画および残渣と比較した。試料としてロシア太平洋沿岸のBoisman2遺跡出土の人骨試料を使用した。コラーゲンに関してはC/N比が約3.2で炭素含有率が40%以上という値を目安にして抽出物がコラーゲンであることを確認する。今回の結果ではゼラチン分画が最も良い成績を示すが、残渣および可溶分画も基準を満たしている。一方で可溶性分画は基準を満たすものは無い。安定同位体比をみると、δ^<13>C値では可溶性分画が低い値を示しているのに対し、他の3分画は1%_0以下の変動で互いに強く相関した。この3分画ではゼラチン分画が最も高い値を示し、ついで不溶性分画、残渣の順で低くなる。これは不溶性分画と残渣に土壌有機物が残存している可能性を示唆する。一方、δ^<15>N値では明らかな精製の効果は認められないが、ゼラチン分画のみでδ^<13>C値とδ^<15>N値の間で比較的強い相関が認められ、この人類集団が植物と海獣・大型魚類の2つの食料資源を利用したことを示す。しかし、他では相関が認められず、窒素同位体比に関してもゼラチン化が有効に機能している考えられる。したがって、炭素・窒素同位体分析にはゼラチン化による精製が不可欠であるといえる。可溶性分画に関しては窒素でも同位体比が大きく異なり安定同位体比の測定には適さないが、可溶性分画における値の相違は土壌有機物の混入によるものでなく、アミノ酸組成の変化よる可能性も考えられるので^<14>C測定に関しては今後の検討を要する。来年度は土壌有機物の混入量と微量元素含量の関係を調べる計画である。

一方、弥生時代の試料では、大浦山遺跡と安房神社遺跡の2集団では有意な相関が見られたが、他の遺跡ではそのような相関は認められなかった。現状では限られた分布例のため、今後の検討が引き続き必要となるが、沿岸に立地した遺跡の場合、植物と海産物の両方をタンパク質源として用いる例が一般的であり、両者の相関がコラーゲン保存状態のパラメータになる可能性がある。今後、人骨と木炭の放射性炭素年代の比較などを考慮して検討を続けたい。
フランスならびにイタリアにおける国家の非宗教性原則の運用と文化の多様性

本研究においては,フランスとイタリアにおける国家の非宗教性原則の解釈・運用に関する特質が提示された。フランスについては,当原則が,国家の中立性の名の下に,マイノリティによる基本権保障の要求を疎外する機能を果たしうるが,それでもなお,社会における文化的多様性と両立しうる柔軟な理念として運用されうることが結論づけられた。イタリアについては,特に憲法裁判所判例の分析から,当原則を公共空間における信教の自由の積極的行使と不可分のものとして構成する傾向性が摘出された。2008年度においては,フランスにおける失業問題や移民の受入れ問題を背景とした社会的排除の問題を憲法学上の人権論の観点から是正するための理論を探究するという観点から,フランスにおける国家の非宗教性原則と現代社会における文化的多様性との関係について,関連文献の収集・検討および他の憲法研究者との議論から以下の考察上の成果を得ることができた。まず,フランスにおける国家の非宗教性原則が共和主義を実現する際に果たしてきた歴史的役割を跡づけることにより,特に教育における国家の非宗教性原則の機能を「反省的疎隔化」の促進に求めるという観念に到達した。また,国家の非宗教性原則は,そのような「反省的疎隔化」作用という意義を有しつつも,文化的・宗教的アイデンティティの多元性に適応しうる原則として想定されうるという解釈の正当化を試みた。この視点においては,国家の非宗教性原則は,国家と教会の分離という体制の下,信仰に対する処遇上の平等と信仰上の表現の自由を保存する術として再解釈される。さらに,国家の非宗教性原則と平等原則との関係についても考察を行い,共同体に留保された集団的諸権利の保障を要求する多文化主義と,個人の人格の発展を生活上のすべての局面において権利として普遍的に尊重しようとする文化的諸権利の承認との区別を前提として,国家内の文化的諸集団がもつアイデンティティに対する法的承認は,諸個人間の平等な自由の尊重に適合的であるとの結論を導き出した。総じて,以上の考察により,フランスにおける国家の非宗教性原則,およびその思想的基盤を提供する共和主義の概念につき,それらが現代社会における文化的多様性と両立しうる柔軟な理念として運用されうるという再構成の契機を示すことができた。なお,かかる研究成果の一部は,下記研究発表の内容に反映されている。2009年度においては,イタリアにおける失業問題や移民の受入れ問題を背景とした社会的排除の問題を憲法学上の人権論の観点から是正するための理論を探究するという観点から,イタリアにおける国家の非宗教性原則と現代社会における文化的多様性との関係につき研究を行い,関連文献の収集・検討および他の憲法研究者との議論に基づき,以下の考察上の成果を得ることができた。まず,国家の非宗教性原則が包摂されるイタリア共和国憲法を解釈する前提として,欧州連合における政治的統合が進行している状況下でイタリア共和国憲法の運用がいかなる対応を求められているのかという見地において,欧州連合レベルにおける基本権保護に関しイタリア共和国憲法が有する特質を摘出することにより,国家の非宗教性原則の解釈に影響を及ぼす宗教的多元主義を始めとする憲法上の基本原則の意義を明らかにした。この考察を出発点として,国家の非宗教性原則を体現する共和国憲法上の諸規定の解釈・運用につき調査を行った。その結果,主として,第一に,共和国憲法制定の審議を行った制憲議会において,信教の自由ないし国家の非宗教性原則をもって,国家と宗教との関係に関する規律,宗派間の平等,各宗派がもつ自治の内容といった争点をめぐり,いかなる解決が企図されていたのかという視点,第二に,共和国憲法体制下における憲法訴訟の運用において,憲法裁判所は,教育現場における十字架像の掲示や訴訟における宣誓義務等の具体的事例を通じ,国家の非宗教性原則の内容をいかに画定してきたのかという視点につき,イタリアでの議論を整理することができた。かかる議論の整理により,イタリアにおける国家の非宗教性原則の運用が,公共空間における教会の役割を排除しないという点において,当該原則の母国たるフランスと著しい相違を呈するという研究の方向性が展望されている。2010年度においては,フランス並びにイタリアにおける失業・移民問題等を背景とした社会的排除の現象を基本的人権論の観点から是正するための理論を探究するという視点から,フランス並びにイタリアにおける国家の非宗教性原則と現代社会における文化的多様性との関係につき研究を行い,関連文献の収集・検討等に基づき,以下の考察上の成果を得ることができた。フランスについては,2004年に公教育において生徒に対し宗教的標章の着用を禁止する法律,2010年に公共空間において特に信仰上の理由に基づき自己の容貌を隠蔽することを禁止する法律が制定されたことにより,フランス流の共和主義の根幹を成す国家の非宗教性原則をさらに堅持する姿勢をフランス政府が打ち出したことが確認された。

特に,国家の非宗教性原則のそれらの立法化に関し,かかる立法政策をもって,寛容の理念を内包した国家の非宗教性原則の概念を創出する外観は用意されたが,公役務の中立性や公序の維持の名の下に文化的マイノリティ集団による基本的自由への権利要求を疎外する機能を果たす平等原則の固守が図られた,というフランス社会の現状が摘出された。イタリアについては,欧州連合レベルにおける基本権保護に対しイタリア共和国憲法が有する特質を提示するという見地に基づき,宗教的多元主義を始めとする憲法上の基本原則の意義を明らかにした。この作業を出発点として,国家の非宗教性原則を具体化する共和国憲法規範の解釈・運用につき調査を行い,イタリアの憲法判例並びに憲法学説においては,諸個人による信教の自由の行使を公共空間において容認するという点で,国家の非宗教性原則を信教活動に関する諸個人積極的自由と不可分のものとして構成する傾向が認められるという,当該原則の母国たるフランスとの比較法研究上の対照が導出された。
地方公共団体と大学の設置形態に関する研究-財源問題を中心にして

本研究は2カ年にわたる調査研究であり、地方公共団体における大学の設置形態を財源の問題から明らかにすることを目的として行われた。初年度、2年度ともいくつかの大学や都道府県および市の大学担当部局あるいは課に出掛け、資料収集を行うとともに聞き取り調査を行った。またいくつかのアメリカの州立大学の財政状況について資料収集を行った。収集した資料や聞き取り調査の結果を分析して報告書にまとめた。2カ年の調査研究により得られた結果は主に次のとおりである。すなわち、地方公共団体は地域のニーズ、特に地元の高校生の進学、生涯学習の機会の提供、あるいは地域の活性化のために大学設置、あるいは誘致を強く望んでいる。そのための大学設置の形態としては公立大学の設置、公私協力方式による私立大学の誘致および国立大学の設置や誘致があるが、地方財政の厳しい状況のなかでもっとも活用されているのが私立大学の誘致である。ただし地方公共団体からの多額の出費を伴う私立大学の誘致には法制上、あるいは住民感情の上からも問題があることが見い出された。公立大学の設置は公私協力方式による私立大学の設置に比べて財政的リスクも少なく、地域の多様なニーズを充足しているとの結果が見られた。公立大学については一部事務組合や広域連合による大学も設置されるなどその要望が強いことが見い出された。ただしそうした新しい形態の大学設置については中心となる都市の財政的負担が多く、市町間の予算も煩瑣で複雑であるという運営上の諸問題があり、そうした形態による大学設置も大きな財政上の問題があることが明らかになった。また一般的に公立大学の場合には財源不足の状況にある。かくて地方に大学を設置し、誘致する場合には財源問題が決定的に重要であるとの結論を下した。2ヵ年継続研究の初年度にあたる本年度は、地方公共団体における大学の設置形態の状況を把握するために東京,札幌,仙台,徳島,博多などの各地の国立大学や研究所に調査・研究旅行に出かけ資料収集を行うとともに、関係者から聞きとり調査を行った。そうした資料収集や聞きとり調査の過程で地方公共団体は地域の活性化のために大学誘致を強く望んでおり、国立大学の設置が難して状況では、公私協力方式による私立大学の誘致を可能な形態として考えていることが明らかになった。しかしながら、公私協力方式のあり方にも相当の地方税歳入を充てることにも法制上、また住民感情の上からも問題のあることが見出された。また財政的余裕のある府県では、自ら公立大学を設置するところもあるが、地方公共団体の財政力により授業料に大幅に依存した形で大学を設置したところもあれば、授業料にあまり依存しなくても大学を設置したところもあり、さまざまであるが、財政貧困な地方公共団体においては公立大学への補助金要請が強いことが見出された。資料収集については、特にアメリカ合衆国の州立大学の設置形態に関する資料収集を行ったが、アメリカの州立大学は連邦政府や私的財団からの補助金や援助のほかに、自らの基本財産で管理運営されていることが明らかにされた。基本財産についてはわが国の国公立大学の財源として構想されてもよいと考えられる。収集した資料は研究補助員の補助を得て、文献の整理を行うとともに、購入したパーソナルコンピュータにより統計的処理を行い、分析を進めている。2ヵ年継続研究の最終年度にあたる本年度は、東京、博多、仙台、山形、函館、青森などの各地の国公立大学や研究所に調査旅行に出掛け資料収集を行うとともに関係者から聞き取り調査を行った。特に本年度は一部事務組合立の公立大学、広域連合立の公立大学を中心として調査を行い、それ独自では大学の設置が認められない一般市における大学設置の取り組みを調査した。その過程で広域連合立の公立大学が設置されるなど地域の実情に即した、より柔軟な対応を可能とする大学設置の方向があることが見出された。

ただそこにおいても一部事務組合立の公立大学設置の場合と同じく、中心となる都市の財政的負担が圧倒的に多く、また市町間の予算事務も煩瑣で複雑であるという運営上の諸課題が見出された。ただこうした課題はあるにせよ、公私協力方式による私立立大学設置は公私大学の誘致に比べて財政的リスクも少なく、また地域の活性化につながるとの結論が導かれた。以上の公立大学を中心とした調査に加えて、公私協力方式により設置された私立大学の状況について奈良県、宮城県などいくつかの大学や県当局に出掛け、聞き取り調査を行った。その結果、地域のニーズ、特に地元の高校生の進学ニーズを充たしている大学、地元に生涯学習の機会を提供している大学は成功しているのに対して、地元のニーズに応えていない大学は次第に定員割れを起こしていることが見出された。後者の場合には地元住民から行政責任(アカウンタビリティ)を問う声があがっているところもある。以上のような本年度の調査も踏まえて2ヵ年にわたる調査をまとめて研究成果報告書を作成し、そこで地方に大学を設置する場合に財源問題が決定的に重要な要因であるとの結論を下した。
イオン液体を移動相とするＨＰＬＣ：難溶性高分子の溶液物性解析・制御

極性イオン液体はセルロースを常温で溶解できる唯一の溶媒であることから、植物バイオマスのエネルギー変換用の溶媒として非常に注目されている。エネルギー変換のはじめのステップとして、「バイオマスからのセルロース類の抽出」が挙げられる。その際に抽出条件と抽出されてきたセルロース類の分子量との相関については調べられていない。そこで我々は様々なバイオマス(小麦外皮、エゾマツ、ミズナラ)からイオン液体を用いてセルロース類・リグニンを抽出し、これまでに開発してきたイオン液体を移動相とする高速クロマトグラフィー(HPILC)で分子量分布を測定した。小麦外皮から1-エチル-3-メチルイミダゾリウムメチル亜リン酸塩([C2mim][(MeO)(H)PO2])を用いて小麦外皮からセルロースを抽出し(25120度、2時間)、HPILCによってその分子量分布を調べた。その結果、UV検出器ではシグナルがあまり検出されず、RI検出器で観測されたシグナルはほとんどセルロース類であることが示された。25度では比較的低分子量のセルロース類のみが少量得られたが、昇温させることで高分子量のセルロース類が多量に得られることがわかった。リグニンについては、昇温により抽出量が主に変化することがわかった。また、高温によるリグニンの分解についても確認された。また、抽出時間の影響についても検討を行った(抽出温度:80度)。抽出時間が長くなるにつれて抽出量が増大した。また、高分子量のセルロース類の割合が増大することが分かったが、その影響については抽出温度による影響よりも小さいことがわかった。リグニンについても抽出時間が長くなるにつれて抽出量が増大することが示された。木質バイオマスについては、小麦外皮よりもコンポーネントを抽出しづらく、相対的にリグニンが多く抽出されることがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。イオン液体はセルロースを温和な条件で溶解できる唯一の溶媒であり、現在セルロース系バイオマスを効率的にエネルギー変換するための溶媒として注目されている。セルロース系バイオマスのエネルギー変換は、バイオマスからのセルロースの抽出、セルロースの分解反応を経て行われる。しかしながら、イオン液体中での分解反応を分子量分布の観点から分析する手法がなかった。これまでに我々は、セルロースを溶解するイオン液体を移動相とするHPLC(HPILC)を構築することで難溶性のセルロースの分子量分布を測定できることを明らかとしている。そこで、HPILCを応用し、イオン液体中でのセルロースの分解反応を解析した。はじめに、セルロースの分解反応をモニタリングするためのHPILCのセットアップを行った。分解したセルロースのモデルとして、セルロースとオリゴ糖(1、2、4、6糖)の混合サンプルを測定した。その結果、当初の条件ではブロードなピークが得られるのみであったが、温度、カラム長、流速のパラメーターについて検討することで最適条件を決定した。その結果、それぞれのピークを確認することができ、セルロースの分解反応を解析するためのシステムを構築できた。次に、セルロースの分解反応を直接解析した。分解法は酸や酵素による触媒添加系とは異なり、組成の変化なしで分解が可能な超音波を選択した。その結果、超音波の照射時間と分子量分布の変化から、従来から言われているランダムな機構の分解がはじめて詳細に確認された。これらの結果から、HPILCは単純に分解の効率を評価するのみならず、イオン液体中での分解メカニズムの解析へと迫ることができる唯一の手法であることが示された。そのため、イオン液体中での高効率な分解反応の達成へと大いに貢献できる。そこで我々は小麦外皮からイオン液体を用いてセルロース類を抽出し、これまでに開発してきたイオン液体を移動相とする高速クロマトグラフィー(HPILC)で分子量分布を測定した。植物バイオマスの主成分はセルロース類およびリグニンであり、リグニンのみがUV吸収をもつ。そこでUV検出器と示差屈折率検出器を直列で用いてセルロース類とリグニンを区別しながらの検出を行った。移動相であるイオン液体はUV吸収をもつが、300nmの波長を利用することで、リグニンを検出できた。実際に小麦外皮から抽出した成分の分析を行った結果、セルロース類とリグニン由来のピークを確認できた。温度を25°Cから120°Cまで変化させて抽出を行い、測定を行った。その結果、低温では高分子量のセルロースを抽出することができず、高温にするほど高分子量のセルロースも抽出できることが分かった。また、80°Cにおいて抽出時間を変化させると、抽出されてくるセルロース類の分子量は変化せず、その抽出量が抽出時間に応じて増大することが分かった。

そこで我々は様々なバイオマス(小麦外皮、エゾマツ、ミズナラ)からイオン液体を用いてセルロース類・リグニンを抽出し、これまでに開発してきたイオン液体を移動相とする高速クロマトグラフィー(HPILC)で分子量分布を測定した。小麦外皮から1-エチル-3-メチルイミダゾリウムメチル亜リン酸塩([C2mim][(MeO)(H)PO2])を用いて小麦外皮からセルロースを抽出し(25120度、2時間)、HPILCによってその分子量分布を調べた。その結果、UV検出器ではシグナルがあまり検出されず、RI検出器で観測されたシグナルはほとんどセルロース類であることが示された。25度では比較的低分子量のセルロース類のみが少量得られたが、昇温させることで高分子量のセルロース類が多量に得られることがわかった。リグニンについては、昇温により抽出量が主に変化することがわかった。また、高温によるリグニンの分解についても確認された。また、抽出時間の影響についても検討を行った(抽出温度:80度)。抽出時間が長くなるにつれて抽出量が増大した。また、高分子量のセルロース類の割合が増大することが分かったが、その影響については抽出温度による影響よりも小さいことがわかった。リグニンについても抽出時間が長くなるにつれて抽出量が増大することが示された。木質バイオマスについては、小麦外皮よりもコンポーネントを抽出しづらく、相対的にリグニンが多く抽出されることがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。1つ目の課題「セルロースのモデルを用いたHPILCのセットアップ」および2つ目の課題「イオン液体中でのセルロースの分解反応の解析」を達成し、論文化することができた。高分子から低分子まで同時に観測できるシステムを構築できたことから、3つ目の課題「植物バイオマスから抽出したセルロースの解析」に対しても測定を行う前段階まで進捗した。最終年度へ向けて、当初の計画である「イオン液体を移動相とするHPLCを用いたバイオマスからの抽出物の解析」を行うための準備を整えることができた。さらに、極性イオン液体をNMRの解析用の溶媒としても適用し、セルロースとイオン液体間の相互作用を直接的に調べるためのシステムを構築した。そのシステムを用いてイオン液体の強力な水素結合能を評価した。3つ目の課題「植物バイオマスから抽出したセルロースの解析」について実際に測定を行う。イオン液体はこれまでと同様1-ethyl-3-methyl-imidazolium methylphosphonateを用い、針葉樹、広葉樹、草本類から抽出したセルロース類の分子量分布を測定する。すでに小麦外皮については検討をはじめており、今後は植物バイオマスの種類(草本類、針葉樹、広葉樹)を変えて測定を行う。また、バイオマスの部位(葉、樹皮、根など)ごとにイオン液体を用いて抽出操作をおこない、抽出条件と得られる分子量分布との相関について検討を行う。方法論は既に確立したため、問題点はない。
好塩基球のプロテアーゼアレルゲン・センシング機構の研究

アレルゲンであるパパインに対する好塩基球のセンサーのシグナル伝達について検討した。パパインに対する応答は活性化していない好塩基球では見られなかった。さらに、FcεRIを細胞表面に発現できないFcεRIβ鎖を欠損する好塩基球のパパイン応答性は、約50%の低下が見られた。従って、FcεRIはパパインセンサーとしての機能を持つが、それ以外の分子もまたセンサーとして機能しており、それらの応答性もFcεRIと同様な制御の下にあることが明らかになった。好塩基球のIL-4産生を誘導するプロテアーゼアレルゲン、パパインに対するセンサーのシグナル伝達について、FcRγ欠損マウス由来好塩基球にITAMを欠く変異FcRγを導入した場合には、野生型FcRγを導入した場合のようなパパイン反応性の回復が見られず、また野生型好塩基球にドミナントネガティブ型変異Sykを導入した場合にはパパイン反応性が低下したことから、確かにパパインセンサーのシグナル伝達にはITAM-Syk経路が関与していることが明らかとなった。好塩基球の発現するFcRγ-assocoiated receptorには様々なものがあると考えられるが、そのうちFcεRIのパパインセンサーとしての機能を検討した。FcεRIβ鎖を欠損するマウス由来の好塩基球はFcεRIを細胞表面に発現できない。この好塩基球のパパイン応答性は、野生型好塩基球に比較して約50%に低下していることが見いだされた。従って、FcεRIはパパインセンサーとしての機能を持つが、FcεRI以外の分子もまたパパインセンサーとして機能していること、すなわち好塩基球は複数のセンサーを用いてプロテアーゼアレルゲンの情報を感知していることが明らかとなった。通常、好塩基球が発現しないCD8分子の細胞外および膜貫通部をFcRγ鎖細胞内部分と融合させた分子を作成し、FcRγ欠損好塩基球に導入したところ、パパイン処理によるIL-4産生がわずかながら回復した。このことは、パパインセンサーは特定の分子ではなく、何らかの構造的特徴(現時点では不明であるが)を共有する一連の分子群によってその機能が担われているものと考えられる。好塩基球のIL-4産生を誘導することが知られているプロテアーゼアレルゲン、パパインに対するセンサーのシグナル伝達について検討を行った。パパイン刺激にはFcRγ分子が必要であるが、好塩基球に発現しており、かつFcRγと会合してIL-4産生刺激を伝達することが分かっている二つの受容体、すなわち高親和性IgE受容体FcεRIとIL-3受容体について、パパインセンサーとして機能できるか否かを検討した。IL-3で培養した直後の骨髄由来好塩基球ではIL-3に対する応答は見られないのに対して、同じ好塩基球はパパインに反応する。また、パパインに対する応答は、IL-3に応答出来る"starved"好塩基球では見られない。以上のことからIL-3受容体はパパインセンサーではないことが明らかとなった。一方、FcεRIを細胞表面に発現できないFcεRIβ鎖を欠損するマウス由来の好塩基球のパパイン応答性は、野生型好塩基球に比較して約50%に低下していることが見いだされた。従って、FcεRIはパパインセンサーとしての機能を持つが、それ以外の分子もまたセンサーとしてパパイン応答に貢献していることが明らかとなった。以上の結果は、FcRγに会合する分子すべてがパパインセンサーとして機能しうるのではなく、何らかの共通な特徴を持つ一群の分子群がセンサーとして機能しうることを示している。センサー機能に共通に求められる性質を明らかにすることで、プロテアーゼアレルゲンに対する応答を人為的に操作できる可能性がある。
代謝制御の理解に向けた試験管内代謝経路の構築と動態解析

代謝メカニズム解明に向けた手法として、試験管内で代謝経路を選択的に駆動させる「試験管内(in vitro)代謝経路」を構築し、メタボロミクスを基盤としたin vitro代謝解析手法を開発した。本手法を代謝フィードバックによる動態解析、および酵素エフェクター解析に応用し、大腸菌ペントースリン酸経路において、代謝物質(NADPH)による酵素アロステリック効果の同定に至った。試験管内代謝経路を用いた本法が、代謝メカニズム解明のための手法として有効なことを示した。代謝フィードバックやアロステリック制御など酵素活性レベルの調節は重要な代謝調節機構の一つである。しかし、酵素活性変化に由来する代謝調節を、細胞内で同様に起こるタンパク質の量的変化と区別して解析することは難しい。本研究は、代謝調節機構をシステマティックに解析可能な手法構築を目指した。手法は、代謝経路の機能ユニットを試験管内で構築し、その中の代謝物質動態をメタボローム解析することを基盤とした。試験管内代謝経路は、大腸菌由来の細胞抽出物、および対象代謝経路を駆動可能な最少の基質と補因子を混合して作成した。前年度までに、解糖系、ペントースリン酸経路、TCA回路、およびアミノ酸(セリン、トレオニン)合成経路を試験管内で駆動させることに成功した。また、アミノ酸合成経路の代謝フィードバックによる代謝摂動を解析し、手法の有効性評価を終えている。最終年度では、構築した試験管内代謝経路を、酵素活性化分子や阻害分子などの代謝調節物質(酵素エフェクター)を探索・機能同定することに応用した。代謝物質標準物質を酵素エフェクター候補物質として未知酵素エフェクターの探索を行い、ヌクレオチド合成の中間体物質(5-amino-4-imidazole carboxamide ribotide ;AICAR)が大腸菌糖新生の鍵酵素(fructose-1,6-bisphosphate ;F1,6BP)を阻害することを発見した。AICARは様々な生物で細胞機能調節分子として知られるが、大腸菌の糖代謝への関与は新しい機構である。大腸菌が細胞内でAICARを蓄積するメカニズムの詳細は解明されていないが、栄養条件の変化などストレス条件下で糖の利用を切り替えるための機構であることが示唆された。本研究で開発した手法は、酵素活性調節による代謝摂動解析や酵素エフェクター探索に有効なことが示された。低分子によるフィードバック制御やアロステリック制御は、酵素活性を直接的に調節して代謝を制御する機構として重要である。本研究は、試験管内(in vitro)代謝経路による代謝解析手法を確立し、未知の代謝メカニズムを明らかにするものである。今期間では、構築した試験管内代謝経路を酵素エフェクターの探索に利用することに成功した。試験管内代謝経路は、細胞抽出液から低分子画分を取り除いた酵素画分、および対象代謝経路を駆動させるために最少の基質と補因子を混合して作成した。これまでに、解糖系、ペントースリン酸経路、TCA回路、および2つのアミノ酸合成経路の試験管内代謝経路を構築した。最初に、すでに知見があるセリン合成系のフィードバック効果によって構築した手法を評価した。試験管内セリン合成系において、セリン添加後の経路内中間体代謝物質の時系列濃度変化を解析することで、セリンが合成系の最初のステップの酵素活性を阻害することを検証できた。トレオニン合成系のフィードバック効果についても同様に検証することができた。以上の評価より、構築した試験管内代謝経路が低分子による代謝制御機構の解明に有効であることを示した。次に、試験管内代謝経路を利用して、未知酵素エフェクターの探索を試みた。10個程度の代謝物質を含む化合物カクテルを中心炭素代謝の試験管内代謝経路に作用させ、経路内の中間体代謝物質の挙動に変動を来すエフェクター分子を探索した。この結果、イソクエン酸からTCA回路の酵素反応を介して生成したNADPHがペントースリン酸経路に作用することを見いだし、TCA回路とペントースリン酸経路の制御関係を説明することができた。NADPHのペントースリン酸経路の酵素への作用は既知であるが、この結果は試験管内代謝経路が未知酵素エフェクターの探索と代謝メカニズム解明に有効な手法であることを示唆するものである。試験管内代謝経路の構築の際、当初計画していた精製酵素の代わりに細胞抽出物を用いた。この変更により、操作をルーチン化するとともに、多くの代謝経路や生物種に適応可能な汎用性が高いシステムを確立できた。また、構築した試験管内代謝経路の評価には酵素阻害剤を利用する計画であったが、適当な阻害剤を複数入手することが困難と判明したので、これを生体代謝物質に変更した。代謝物質自体が酵素阻害剤として機能する例が多く知られることが理由である。以上のように当初の計画からいくつか手法を変更したが、23年度に予定していた試験管内代謝経路の構築とその反応系の確立、および24年度に予定していた応用利用としてエフェクター分子の探索を開始したので、計画はおおむね順調に進行していると判断した。試験管内代謝経路の応用利用を中心に推進する。すでに開始している代謝物質からの酵素エフェクター探索をさらに複数の代謝経路を対象に行い、未知酵素エフェクター作用を発掘する。

24年度では、試験管内代謝経路と細胞内の代謝応答の相互解析により試験管内経路の有効性を検証することを計画した。当初の計画どおり大腸菌を用いて行うが、細胞刺激方法として計画した薬剤利用を検討すると同時に、試験管内経路の探索で新たに代謝物質から酵素エフェクターが発見された場合、このエフェクターの代謝への作用を大腸菌細胞レベルで検証することも検討する。次年度に使用する予定の研究費が生じた状況年度当初の計画時よりも、研究に必要な物品等の調達を安価に行うことができたこと、および研究計画の手法に関する軽微な変更に伴い、購入予定の試薬等をより安価なもので補うことができたために次年度に使用する研究費が生じた。また、購入予定の備品のカスタマイズに期間がかかり、初年度の購入に間に合わなかった。翌年度以降に請求する研究費と合わせた使用計画初年度からカスタマイズ中の備品を購入する。試薬等消耗品は必要時に購入する。2012年6月にアメリカで開催予定の国際学会に本研究課題に関する内容で演題投稿したので、参加費、海外滞在費用等の使用が予定される。年度末の国内学会に参加予定なので、旅費等を使用する。本研究課題に関する論文を作成中であり、この英文校正料金として謝金等を使用する。
光屈性の分子メカニズム解明:青色光受容体フォトトロピンによる小胞輸送制御

植物は動物のように食べ物を求めて動き回ることは出来ません。そのため植物は自分の生育する場所で、より効率よく栄養を得るために、自らの形態を変化させます。「光屈性」もそのような形態変化の一つで、光を求め、植物は光の方向に体を屈曲させます。では、どのように植物は光を感じ、どのような「しくみ」で屈曲させているのか。今回の研究では、その「しくみ」を構成する因子の一つが明らかになりました。平成20年度は、フォトトロピンを介しだ青色光情報伝達経路と光依存的な小胞輸送制御について明らかにするため、以下の研究を行った。(1) Arfが関与する分子機構と青色光情報伝達における小胞輸送の役割解明・光依存的細胞内局在変化と小胞輸送調節phot又はArfと蛍光蛋白質との融合遺伝子を植物細胞に導入し、両蛋白質の局在を観察した。その結果、既に報告されていた通りphotは青色光依存的にGolgi体に局在した。今回新たに、Golgi体局在を示すphotの蛍光とARF1の蛍光が一致することが明らかとなった。・Arf1の形質転換植物体とArf1遺伝子欠損植物体の生理機能解析Arf1やArf1のドミナント変異型(GTP又はGDP結合が固定した変異)の過剰発現植物体を作出し、それら植物体の生理機能を解析した。過剰発現することで、成長に著しく影響が出る可能性が考えられたので、誘導型プロモーターによる発現調節を行った。その結果、Arf1のドミナント変異型過剰発現植物体ではフォトトロピン応答が阻害されることが示された。この結果は、phot情報伝達系でArf1が機能しうることを示している。(2)青色光情報伝達系に特異的な小胞輸送の解明に向けた解析・Arf1と相互作用できないphot変異体の検索とその解析Arf1特異的に相互作用できないphot遺伝子内た変異を酵母Yeast-Two hybrid法にて取得した。その変異遺伝子を植物体に導入し、細胞内局在及び青色光応答を解析した結果、Arf1がphotの下流で機能することがより詳細に明らかとなった。フォトトロピン(phot)は青色光を感知し、光屈性・葉緑体定位運動・気孔開口を誘引する光受容体である。これまでに単細胞緑藻類から高等植物においてフォトトロピンの存在が報告され、様々な遺伝学的解析により同情報伝達経路に関与する因子が幾つか取得されている。しかし、相互作用因子を含めた詳細な分子機構に関しては未だ不明である。そこで、シロイヌナズナを用いてフォトトロピンを介した青色光情報伝達機構の解明に取り組んだ。先ず、フォトトロピンと相互作用する因子を酵母Two-hybrid法にて検索したところ、小胞輸送に関与する低分子量G蛋白質ARF1の取得に成功した。本研究課題では、ARF1の役割とその分子機構解明に焦点をあてることで青色光情報伝達系の分子機構の解明を行った。先ず、ARF1ドミナント変異の過剰発現植物におけるphot応答への影響を調べたところ、phot応答がこれら変異体発現により阻害されることが明らかとなった。さらに分子レベルでは、photによるARF1の制御機構を示す重要な証拠を得ることに成功した。これらの結果から、ARF1がphot情報伝達機構のシグナル因子であると示唆された。今後は、シロイヌナズナにおけるARF1を介した青色光応答の解析を詳細に行うことによって、小胞輸送の外環境による制御機構を解析する。これにより、細胞内の恒常性維持機構とストレス応答性情報伝達機構のクロストークについても明らかにできると考えている。
ナノギャップ電極による共役分子接合の電気伝導特性評価と単分子トランジスタへの応用

本研究では単一分子デバイスの実現に重要な共役分子における電気伝導機構を解明することを目的とし、ナノギャップ電極を用いて共役分子ワイヤーの電気特性の温度依存性を評価した。共役分子ワイヤーでは電極-分子間の注入障壁が減少されることで電荷伝導が分子間ホッピングにより律速されることを示唆する結果が得られた。また、共役系高分子を用いたナノチャネル有機トランジスタを作製し、トランジスタ動作が可能であることを示した。単一分子デバイスの実現において,分子デバイスの基礎コンポーネントとなるπ共役分子を電極に接続した際の分子接合における電気伝導機構を明らかにしておくことは極めて重要である。本研究では,集束イオンビームエッチングにより精密に作製した数ナノメーター幅のナノギャップ電極を用いて,π共役分子ワイヤーによる分子接合を形成し,それらの電気伝導特性を詳細に測定することで,π共役分子接合の電気伝導機構を解明することを目的とする。分子接合による単分子トランジスタを試作し,基礎的なデバイス特性を明らかにすることを目標とする。ナノギャップ電極の作製を最適化することで,ギャップ近傍にサイドゲート電極を持ち,極めて先鋭な構造を有する幅5nm程度の金ナノギャップ電極を作製した。それらのナノギャップ電極を用いて,分子長約7nmの長鎖オリゴチオフェンによる分子接合を作製し,極低温領域から室温領域に渡って電圧電流特性を測定した。その結果,分子接合は線形的な電圧電流特性を示す傾向があることが分かった。その温度依存性を評価から,極低温ではトンネ/レ的な電気伝導を示し,温度上昇に伴って熱活性化型の電気伝導を示すことが分かった。その活性化エネルギーは数10 meV程度の極めて小さい値であることから,分子接合における電気伝導は電極から分子への注入よりも分子内でのホッピング伝導により律速されている可能性があることが分かった。本研究では、ナノギャップ電極を用いて、π共役分子ワイヤーによる分子接合を作製しπ共役分子接合の電気伝導機構を解明することを目的とした。本年度は、集束イオンビームを用いて作製した数nm幅のナノギャップ電極を用いて、チオフェンオリゴマーによる分子接合を作製し、電圧電流特性の温度依存性の評価を行った。その結果、分子接合は線形的な電圧電流特性を示し、低温領域ではトンネル伝導を示すが、高温領域では極めて活性化エネルギーの小さい電気伝導を示すことが分かった。分子共役長の増大により電極一分子間の注入障壁が減少し、分子間ホッピングにより電荷伝導が律速されることを示唆する結果が得られた。また、分子のトランジスタ動作に関する知見を得るため、幅数10nmのナノギャップ電極を用いてチオフェンポリマーを用いたナノチャネル有機トランジスタを作製し、電気伝導特性を評価した。電流電圧特性は空間電荷制限に起因した短チャネル効果により非線形性を示し、分子接合とは異なる特性を示すことが分かった。異なる電子状態を有したチオフェンポリマーを用いることで、線形的な電流電圧特性に変化し、30nm幅のチャネルを有した有機トランジスタでトランジスタ動作が可能であることを見出した。
腸上皮細胞のターンオーバーを制御する新規細胞外因子の同定とその機能解析

ヒトやマウスの腸上皮細胞は35日間の周期で恒常的に入れ替わり(ターンオーバー)が起きており、そのターンオーバーは腸上皮細胞の増殖、分化、移動、細胞死等により厳密に制御されることが知られている。しかしその一方で、生体内で腸上皮細胞のターンオーバーを制御する具体的な因子に関しては、未解明な点が多い。そこで本研究では腸上皮細胞のターンオーバーを制御する新規性の高い因子を探索するため、特に腸管内に存在する物質に着目した解析を行った。主な解析にはマウス小腸から単離した陰窩領域の初代培養で得られる腸オルガノイドを使用した。腸幹細胞を含む腸オルガノイドは腸上皮細胞の増殖や分化をex vivoで高度に再現しながら成長することが知られており、本研究では対象とする因子が腸オルガノイドの成長に与える影響について評価した。まず、本研究ではマウス盲腸より回収した盲腸内容物(腸管内の物質の凝集物として使用)中に腸オルガノイドの成長を著しく促進する物質が含まれることを明らかにした。また盲腸内容物の作用は、腸上皮細胞の増殖や分化を強く刺激する因子として知られる上皮成長因子(epidermal growth factor; EGF)とは異なる物質によるものであることも確認した。さらに盲腸内容物に含まれる物質中より、腸オルガノイドの成長促進に働く具体的な因子を探索したところ、候補の一つとしてリゾホスファチジン酸(lysophosphatidic acid; LPA)の可能性を見出した。現在これらの研究成果の一部について、学術論文として報告するための準備を進めている。
プロスタグランジンD2制御による虚血性脳損害治療法の開発

霊長類虚血性脳損傷モデルを用い,プロスタグランジンD2合成阻害剤の安全性と治療効果について検討した.その結果,副作用はなく,薬剤の安全性が確認された.再潅流後亜急性期(day 3)における脳浮腫軽減が薬剤投与群で見られた.また薬剤投与群で梗塞体積が6689mm3(ミリ立法メートル)でも生存した動物を1匹認めた(通常梗塞体積が5000mm3以上では動物は死亡する).以上の結果より薬剤の治療効果の可能性が示唆されたが,梗塞体積の減少,耐虚血体積の増加,高次脳機能の改善などの点については,両群間に統計学的有意差を認めるまでには至らなかった.霊長類虚血性脳損傷モデルを用い,プロスタグランジンD2合成阻害剤の安全性と治療効果について検討した.その結果,副作用はなく,薬剤の安全性が確認された.再潅流後亜急性期(day 3)における脳浮腫軽減が薬剤投与群で見られた.また薬剤投与群で梗塞体積が6689mm3(ミリ立法メートル)でも生存した動物を1匹認めた(通常梗塞体積が5000mm3以上では動物は死亡する).以上の結果より薬剤の治療効果の可能性が示唆されたが,梗塞体積の減少,耐虚血体積の増加,高次脳機能の改善などの点については,両群間に統計学的有意差を認めるまでには至らなかった.本研究の目的は、霊長類において虚血性脳損傷がプロスタグランジンD_2合成酵素阻害薬で改善するかどうかを明らかにすることである.本年度はカニクイザルを用いた中大脳動脈閉塞再灌流モデルの作成と薬剤投与の安全性について検討した.脳虚血モデルは脳血管内手術用マイクロカテーテルを中大脳動脈に留置して血流遮断することにより作成し(3時間),カテーテルを引き抜くことにより再灌流(血流再開)した.その結果,モデルの再現性はあったが,MRI上,虚血(脳梗塞)の広がりにばらつきがあり,虚血体積か5000mm^3を上回ると薬剤投与の有無にかかわらず脳ヘルニアを来して死亡する可能性が明らかとなった.来年度はさらに慢性期のデータを加え,これらを解析することにより薬剤効果(梗塞体積の減少,耐虚血体積の増加,高次脳機能の改善など)について検討する予定である.本研究の目的は、霊長類虚血性脳損傷モデルを用い,PGD2合成阻害剤を投与することにより,脳内に大量に存在する炎症メディエーターであるPGD2を制御し,脳虚血後の二次性脳損傷を軽減させる新しい治療法を開発することである.本年度はPGD2合成阻害剤のブラインド投与下に,カニクイザルを用いた脳梗塞モデル作成,MRI画像撮像,行動観察,神経機能記録,高次脳機能(空間記憶)測定を行った。モデルの作成は脳血管内手術用マイクロカテーテルを中大脳動脈に留置して血流遮断することにより作成し(3時間),カテーテルを引き抜くことにより再灌流(血流再開)した.これらの実験は医薬基盤研究所霊長類医科学センターの施設を用いて行われたが,予定動物実験は全て終了した.モデルの再現性はあったが,MRI上,虚血(脳梗塞)の広がりにばらつきがあり,MRIで急性期虚血体積が5000mm^3を上回った場合,脳ヘルニアを来して死亡した.キーオープンして薬剤投与群とコントロール群を比較した.観察した1ヶ月間については副作用を疑わせるような異常所見はなく,薬剤の安全性は確認された.血液検査の結果については解析中である.MRI画像データを検討したところ,再潅流後亜急性期(day3)における脳浮腫軽減が薬剤投与群の一部のケースで見られた.今後はこれらのデータや高次脳機能検査のデータを統計学的に処理し,治療効果(梗塞体積の減少,耐虚血体積の増加,高次脳機能の改善など)を確認するとともに組織学的検討を行う予定である.本研究の目的は、霊長類虚血性脳損傷モデルを用い,PGD2合成阻害剤を投与することにより,脳内に大量に存在する炎症メディエーターであるPGD2を制御し,脳虚血後の二次性脳損傷を軽減させる新しい治療法を開発することである.本年度はPGD2合成阻害剤のブラインド投与下に,カニクイザルを用いた脳梗塞モデル作成,MRI画像撮像,行動観察,神経機能記録,高次脳機能(空間記憶)測定を行った.モデルの作成は脳血管内手術用マイクロカテーテルを中大脳動脈に留置して血流遮断することにより作成し(3時間),カテーテルを引き抜くことにより再灌流(血流再開)した.その結果,MRI上虚血(脳梗塞)の広がりにばらつきがあったが,再現性のあるモデルを作成することができた.本モデルでは梗塞体積によって予後が大きく変わることが明らかとなっており.すなわちMRIで急性期虚血体積が5000mm3(ミリ立法メートル)を上回った場合は,通常脳ヘルニアを来して通常死亡する.キーオープンして薬剤投与群とコントロール群を比較した.観察した1ヶ月間については副作用を疑わせるような異常所見はなく,薬剤の安全性は確認された.MRI上,再潅流後亜急性期(day 3)における脳浮腫軽減が薬剤投与群の一部のケースで見られた.また6689mm3の梗塞体積があっても生存した動物を1匹認めたが,この動物は薬剤投与群であった.以上の結果より薬剤の治療効果の可能性が示唆されたが,梗塞体積の減少,耐虚血体積の増加,高次脳機能の改善などの点については,両群間に統計学的有意差を認めるまでには至らなかった.

霊長類医科学研究センターでの動物実験は全て終了し,データ収集は終了した.今後はデータ解析と組織学的検討およびまとめが残っている状態である.24年度が最終年度であるため、記入しない。MRI上の梗塞体積の経時的変化,神経機能および高次脳機能の変化および組織学的変化について,薬剤投与群とコントロール群で比較解析し,結果をまとめる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
タイプ3銅含有タンパク質の酸素結合挙動の研究

節足動物や軟体動物の血リンパ液中に存在するヘモシアニンはタイプ3銅含有タンパク質の一つであり、酸素運搬・酸素貯蔵タンパク質として知られている。酸素分子はヘモシアニンの銅複核部位に結合する。ヘモシアニンは高等動物において酸素分子を運搬するヘモグロビンと同様にアロステリック効果を有するが、ヘモシアニンのアロステリック効果には依然不明な点が多い。本研究では、フラッシュフォトリシス法などを用いてチチュウカイミドリガニヘモシアニンの酸素結合挙動を調べ、pHおよび乳酸の作用機構について新しい知見を得た。節足動物や軟体動物の血液中に存在するヘモシアニンはタイプ3銅含有タンパク質の一つであり、酸素運搬・酸素貯蔵タンパク質として知られている。ヘモシアニンの酸素結合には、同じく酸素分子を運搬するヘモグロビンと同様にアロステリック効果があるが、このアロステリック効果の詳しい分子機構は明らかにされていない。そこで本年度は、チチュウカイミドリガニヘモシアニンの酸素結合ダイナミクスを酸素濃度、pHを変化させて、フラッシュフォトリシス法により調べた。337nmに特徴的な強い吸収帯を有するオキシヘモシアニンに355nmのパルス光を照射すると、337nmの吸光度が瞬時に下がり、その後数10から数100μsの時間スケールで吸光度が回復した。このとき観測された吸光度の時間変化を指数関数でフィッティングすることにより酸素結合速度定数が求まった。pH6.5、高酸素濃度(酸素濃度50%以上)およびpH7.8では、光照射後の酸素結合による吸光度変化は1つの指数関数でフィッティングすることができ、酸素結合反応は一相で起こることが判明した。しかし、pH6.5、低酸素濃度(酸素濃度35%以下)での吸光度変化は一つの指数関数を用いてフィッティングすることができず、二つの指数関数を用いる必要があった。この原因はpH6.5、低酸素濃度では、ヘモシアニンが酸素結合速度の異なるRとTの混合状態にあるためと解釈した。これらの結果より、ヘモシアニンがRとTの混合状態にある場合でも、フラッシュフォトリシス法を用いることによりRとT状態の酸素結合挙動を分けて調べることが可能であることが示された。節足動物や軟体動物の酸素貯蔵および運搬を担っているHcの多量体は、ヘモグロビン(Hb)のように酸素結合に対して協同作用を示す。また、HcはHbと同様、pHにより酸素親和性や協同性が変化するボーア効果を有する。Hcによる酸素分子の脱着は、pHなどの環境の違いによるボーア効果を利用して効率的に行われる。節足動物由来HcはpHや乳酸の影響を受けて酸素親和性や協同性を変化させるが、HcにおけるpHや乳酸の効果の詳しい作用機構は明らかにされていない。Hcの紫外可視吸収スペクトルにおいて、乳酸添加による560nm付近の吸収帯の吸収極大波長はpH6.5、8.3いずれの場合も変化しなかった。この結果から、乳酸はoxyHcの活性部位構造に影響を与えないと推測された。次に、pH6.5において、乳酸濃度が約40mMになるまで乳酸の添加に伴いK_obsは増大したが、pH8.3では変化しなかった。この乳酸添加によるK_obsの増大量は、pHの上昇に伴い減少し、pH8.3ではほとんど変化しなかった。また、単量体CaeSS2では、乳酸添加によりK_obsは変化しなかった。次に、Hcと乳酸の相互作用をITCにより調べた結果、pH6.5とpH8.3で乳酸濃度約1mMで乳酸がHcに結合することが解った。pH6.5では高濃度の乳酸(20mM)添加により、さらに乳酸がHcに結合することが示唆された。低濃度の乳酸添加ではK_obsの変化は小さかったことから、この濃度での乳酸とHcの結合は酸素結合挙動に影響を与えず、pHが低いときのみ現れる高濃度領域での乳酸の結合が、K_obsの変化と関係していると解釈した。また、単量体CaeSS2は乳酸と結合しなかったことから、乳酸は四次構造変化を誘起することによりK_obsが増加すると推測された。