hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グレリンの生理作用を応用した新しい循環器疾患治療法の開発

グレリンは国立循環器病研究センターの寒川賢治所長らによって発見された胃から産生される摂食亢進ホルモンである。我々はこれまでにグレリンを心筋梗塞モデルに投与することで病態が改善することを報告した。我々は今回の研究で、内因性グレリンの心筋梗塞モデルにおける病態改善作用・グレリンが交感神経抑制・副交感神経賦活化を介して心筋梗塞・心肥大の病態を改善すること・グレリン受容体アゴニストであるヘキサレリンが心筋梗塞の病態を改善すること明らかにした。これらの知見は、グレリンのみならずグレリン受容体アゴニストも循環器疾患治療薬となり得る可能性を示すものである。グレリンは成長ホルモン分泌刺激作用を持つ内因性ペプチドホルモンである。グレリンは主として胃内分泌細胞で産生され、摂食亢進・体重増加・消化管機能調節・エネルギー代謝調節に重要な作用を持つ。胃から分泌されたグレリンの情報は、迷走神経求心路を介して視床下部に伝達され、上記の生理作用発現に至る。その後、グレリンが自律神経調節作用(交感神経活性抑制・副交感神経活性賦活化)を有することが明らかとなったことから、我々は循環器疾患モデル動物におけるグレリン投与の治療的効果を検討した。その結果、冠動脈結紮直後にグレリンを単回皮下注射することで致死性不整脈が減少し、急性期死亡が明らかに抑制されること、慢性期心機能が顕著に改善することを報告した。グレリンの受容体(GHS-R)は、間脳の摂食中枢や下垂体の他、心臓迷走神経終末にも存在することから、申請者らは心筋梗塞急性期のグレリン投与が、心臓迷走神経求心路を介して交感神経抑制に働いた結果、致死性不整脈出現が抑制された機序を提唱している。そこで2014年度、当初の計画に沿って急性心筋梗塞モデルにおけるグレリン投与の心保護作用のメカニズムを調べる目的で、合成GHS-Rであるヘキサレリンをマウスに投与し、グレリン投与と同様な効果が得られるか、つまりグレリンが心筋梗塞に対する保護的効果を発揮する上で、GHS-Rに結合することがどれほどの意義を持つのかについて調べた。結果、心筋梗塞モデル作製急性期にヘキサレリンを経口投与すると、グレリンを投与した場合と同様に、梗塞作製2週間後における左室機能は対照群に比べて明らかに改善し、テレメトリーによる心電図記録から解析した交感神経活性は対照群に比べて低下・副交感神経活性は増加していた。以上の実験結果から、グレリンが保護的効果を発揮する上で、GHS-Rは重要な役割を担っていることが明らかとなった。本結果は、英文専門誌に投稿し、採択された。グレリンは成長ホルモン分泌刺激作用を持つ内因性ホルモンである。グレリンは主として胃内分泌細胞で産生され、摂食亢進や体重増加、消化管機能調節などエネルギー代謝調節に重要な作用を有する。一方これまでの我々の研究により、グレリンが自律神経活性調節を介した心保護作用を有することが明らかとなった。平成25年度はグレリンの自律神経調節作用が心臓局所における慢性炎症に与える影響に注目し、実験を行った。モデルとして横行大動脈結紮による圧負荷心肥大モデル(TACモデル)を使用した。野生型マウス(WT)およびグレリン欠損マウス(グレリンKO)にTACを作製し、2日後・2週間後・12週間後、血漿中における炎症性サイトカインを測定したところ、いずれの時点においても、IL-6・IL-1βの濃度はグレリンKOでWTよりも有意に高値であった。心臓重量やエコーで評価した左心室壁厚は、いずれもWTに比較しグレリンKOで増加していた。さらに心電図テレメトリーによる自律神経機能解析を行ったところ、TAC作製2日後・2週間後・12週間後のいずれの時点においても、グレリンKOではWTに比較し副交感神経活性の有意な低下が認められた。なお、交感神経活性には両群間で差を認めなかった。次に、グレリンKOにアセチルコリン受容体アゴニストであるニコチンを飲水投与して副交感神経を活性化したところ、TAC作製による心肥大および血漿中IL-6・IL-1βの濃度は、いずれも有意に改善・低下した。以上の結果は、グレリンが副交感神経活性を調節することで心臓局所の炎症を改善し、心臓リモデリングを抑制することを示唆するものである。本実験結果をまとめた論文はアメリカ心臓協会の学会誌であるHypertension誌に投稿し、掲載されることが決定している。グレリンは成長ホルモン分泌刺激作用を持つ内因性ペプチドホルモンであり、主として胃内分泌細胞で産生される。その後グレリンが自律神経調節作用を有することが明らかとなったことから、我々は循環器疾患モデル動物におけるグレリン投与の治療的効果を検討した。結果、冠動脈結紮直後にグレリンを単回投与することで致死性不整脈が減少し、急性期死亡が抑制されることなどを報告した。しかしグレリンの循環器疾患に対する治療的効果の詳細なメカニズムは不明であり、本研究課題を立案した。2014年度は、グレリンが心筋梗塞に対する治療的効果を発揮する上で、その受容体であるGHS-Rに結合することが重要であることを明らかにした。2015年度は、心肥大モデルに対するグレリンの治療的効果を、メカニズムを含めて検討した。結果、グレリンは副交感神経活性を賦活化することで、心肥大の原因となる炎症性サイトカインの産生を抑制していることが明らかとなった。最終年度は、グレリンがどの細胞におけるGHS-Rに結合することで治療的効果を発揮しているかについて検討した。

まず神経細胞・骨髄細胞特異的GHS-Rノックアウトマウスに心筋梗塞モデルを作製して術後2週間の生存率を検討したところ、骨髄細胞特異的GHS-Rノックアウトマウスでは対照群と同程度であったのに対し、神経細胞特異的GHS-Rノックアウトマウスでは対照群よりも低値であった。さらに交感神経・副交感神経特異的GHS-Rノックアウトマウスについても同様の検討を行い、副交感神経特異的GHS-Rノックアウトマウスでは対照群よりも生存率が低下することを見出した。本課題により、グレリンは主に副交感神経におけるGHS-R受容体を介して循環器疾患モデルの病態を改善することが明らかとなった。本結果はグレリンを臨床応用するにあたって大変重要な基礎的データであり、その意義は大きい。グレリンは国立循環器病研究センターの寒川賢治所長らによって発見された胃から産生される摂食亢進ホルモンである。我々はこれまでにグレリンを心筋梗塞モデルに投与することで病態が改善することを報告した。我々は今回の研究で、内因性グレリンの心筋梗塞モデルにおける病態改善作用・グレリンが交感神経抑制・副交感神経賦活化を介して心筋梗塞・心肥大の病態を改善すること・グレリン受容体アゴニストであるヘキサレリンが心筋梗塞の病態を改善すること明らかにした。これらの知見は、グレリンのみならずグレリン受容体アゴニストも循環器疾患治療薬となり得る可能性を示すものである。我々は2014年度の検討で、グレリンの心保護作用における受容体(GHS-R)の重要性を明らかにし、神経特異的GHS-R欠損マウスを作製した。神経特異的GHS-R欠損マウスは対照マウスに比較し体重が軽いことを見出していたが、2015年度はさらに詳細な表現型解析を行った。結果、tail-cuff法により測定した血圧は両群間に差を認めなかった。代謝機能や摂食量・飲水量・運動量に関しては、神経特異的GHS-R欠損マウスでは対照マウスに比較し酸素消費量・二酸化炭素排泄量・エネルギー産生量・呼吸商が有意に低下していたが、摂食量・飲水量・運動量には差を認めなかった。血液データでは、神経特異的GHS-R欠損マウスでは対照マウスに比較し中性脂肪が高値を示したほか、レプチン濃度が高値であった。アディポネクチン濃度には差を認めなかった。Sacrificeして臓器重量を測定したところ、体重補正した心臓重量・腎臓重量は、神経特異的GHS-R欠損マウスで有意に小であった。さらに我々は「研究実績の概要」に記載したように、グレリンが副交感神経活性を調節することで心臓局所の炎症を改善し、心臓リモデリングを抑制することを示した。以上のことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断するに至った。特記事項なし医歯薬学神経特異的GHS-R欠損マウスの基本的な表現型解析は終えた為、今後は本マウスに心筋梗塞モデルを作製し、対照マウスと生存率・慢性期心機能等を比較検討することで、グレリンの心保護作用における神経GHS-Rの重要性を明らかにしたいと考えている。すでに我々はpreliminaryな検討を開始しており、神経特異的GHS-R欠損マウスの冠動脈結紮による心筋梗塞モデル作製後の生存率は、対照マウスよりも低い傾向にあるというデータを得た。
ミクログリアを標的にした神経回路再編を伴う慢性痛の発症メカニズムの解明

中枢性脳卒中後疼痛(central post-stroke pain: CPSP)は、主に視床出血などで誘発され、軽度な触覚刺激に対して激しい痛み(アロディニア)が長期間持続する重篤な後遺症である。近年、臨床的および実験的観察に基づいて、CPSPの発症メカニズムを説明するために、神経間の異常なネットワーク形成や免疫細胞の役割が重要視されている。そこで本研究では、視床出血後の中枢神経回路障害におけるミクログリアの役割を解析し、CPSPの発症メカニズムを解明することを目指している。我々は、これまでの研究で、末梢組織からの感覚情報を大脳皮質に伝える一部の視床ニューロンでは回路再編が起こること、そして脳内の免疫細胞であるミクログリアの除去により回路再編と疼痛関連行動が生じないことを明らかにしてきた。本年度では、これらの結果に基づき、視床出血後のマウスの大脳皮質体性感覚野からRNAを抽出し、次世代シークエンサーによる網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、ミクログリア由来の回路再編に関わる遺伝子を同定することができた。そして、脳内のミクログリアにおいて、同定した遺伝子がコードするタンパク質の発現をFlow cytometryにより解析したところ、出血後のマウスではそれらのタンパク質が増加していることを確認した。これらの実験結果は、視床出血後の疼痛関連行動や回路再編が認められる病態では、ミクログリアを介した分子メカニズムが寄与することを示唆している。当初の計画では、体性感覚野におけるミクログリアをCell sorterにより単離し、回路再編を促す因子をReal-time PCRにより解析する予定であった。しかしながら、想定していたミクログリア由来の回路再編を促す遺伝子の発現が増加していなかったため、次世代シーケンサーを用いたRNA-seq解析を行った。その結果、ミクログリア由来の回路再編に関わる遺伝子の同定に至り、またそれらの遺伝子がコードするタンパク質の発現がミクログリアで増加していることを確認できたため、本年度における研究はほぼ計画通りに進めることができたと判断できる。今後は、同定したミクログリア由来の回路再編を促す候補遺伝子に焦点を当て、それらの遺伝子のノックダウンまたはノックアウトマウスを用いて出血後の回路再編における影響を検証すると共に、DREADD (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)システムを用いて疼痛関連行動における回路再編(視床ニューロン)の機能解析も進める。
メタボリック症候群と前立腺癌に関与するＦＧＦの分子機構解明と新たな治療戦略確立

前立腺全摘除術により得られた前立腺癌組織においてFGF19、FGF21陽性群が、術後生化学的再発が有意に高く、Gleason scoreが高い症例が多く、FGF19、FGF21陽性がそれぞれ術後生化学的再発の独立した予測因子となりうることが明らかとなった。LNCaP、PC3ではFGF19の添加によって細胞増殖の促進とEMTマーカー群の誘導が認められ、FGF19陽性群の組織ではEMTマーカーの高発現が認められた。血清FGF19/21濃度はメタボリック症候群と相関しており、また、FGF19濃度はGleason score8以上と関連していることが明らかとなった。昨年度に引き続き、前立腺全摘除術により得られた前立腺癌組織についてFGF19、FGF21、に対する抗体を用いた免疫組織化学染色をさらに検体数を増やし抗体を変えて行い、1FGF19サブファミリーの発現と再発、再燃の有無などの臨床経過や患者の基礎疾患の有無、病理組織学的所見との関連について検討した。FGF19は正常前立腺上皮、高分化癌組織に比較して分化度の低い癌組織で発現の上昇がみられた。また、FGF19陽性、FGF21陽性はFGF9陽性と同様に術後生化学的再発の独立した予測因子となりうることが明らかとなった。前立腺癌細胞株LNCaP、DU145、PC3について、FGF19、21ならびにFGF9を添加した状態での細胞増殖への影響をMTT assayで解析、さらにこれらFGFファミリーの刺激により誘導される分子群についてウェスタンブロット法により解析した。FGF19刺激ではFGF9で刺激した場合と同様に、細胞増殖能の促進、抗アポトーシス効果、上皮間葉移行の促進がみられ、IGF添加によるこれらの作用の相加相乗効果が確認されたのに対し、FGF21刺激ではこれらの効果はみられず、FGF19サブファミリーの中でもFGF19とFGF21では異なる分子機構が存在する可能性が示唆された。ELISA法による血清FGF19/21濃度の測定を行い、血清FGF19/21濃度とメタボリック症候群との関連が確認された。これまでの研究成果の一部は、第72回日本癌学会学術総会(札幌)、国際泌尿器科会議(SIU、バンクーバー)で発表した。前立腺全摘除術により得られた前立腺癌組織についてFGF19、FGF21、FGFR2-4に対する抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、1FGF19サブファミリーおよび受容体の発現と再発、再燃の有無などの臨床経過や患者の基礎疾患の有無、病理組織学的所見との関連について検討した。FGF19は正常前立腺上皮、高分化癌組織に比較して分化度の低い癌組織で発現の上昇がみられ、肥満度の高い症例では発現上昇が著明かつ高頻度であった。前立腺癌細胞株LNCaP、DU145、PC3について、FGF19、21ならびにFGF9を添加した状態での細胞増殖、細胞浸潤能への影響さらにFGFR2-4を安定発現することによる細胞増殖能、MTT assayならびにmatrigel invasion assayで解析、さらにこれらFGFファミリーの刺激やFGFR2-4導入により誘導される分子群についてウェスタンブロット法により解析した。FGF19、21刺激ではFGF9で刺激した場合と同様に、細胞増殖能、細胞浸潤能の促進がみられた。FGF9刺激によりVEGF、MMP2の発現誘導が認められたのに対し、FGF19、21刺激ではこれらの分子群の発現誘導は明らかではなく、FGF19サブファミリーでは他のFGFファミリーとは異なる分子機構阿存在する可能性が示唆された。これまでの研究成果は第71回日本癌学会総会、第100回日本泌尿器科学会総会、107th Annual Meeting of the American Urological Associationにおいて発表した。泌尿器科学肥満、メタボリック症候群と関連するFGF19、FGF21の発現が、ヒト前立腺がん組織において確認され、術後生化学的再発との関連が示唆された。細胞株を用いた実験ではFGF19、FGF21では異なる分子機構の存在が示唆され、その下流分子の探索のためにさらなる研究が必要である。現在、ELISA法による血清FGF19/21濃度の測定を行っており、メタボリック症候群と血清濃度との関連が確認されてきているが、前立腺癌組織での発現所見との関連を明らかにするにはさらに濃度測定時の条件を考慮した状態での再検が必要と考えられる。また、α/β-Klothoの発現解析が未だ行われておらず、今後の課題である。肥満、メタボリック症候群と関連するFGF19の発現が、ヒト前立腺がん組織において確認され、臨床像や肥満の有無との関連が示唆される所見が得られた。さらにFGF19の前立腺癌細胞株の浸潤増殖能への効果を明らかにすることができた。また、FGF19サブファミリーが従来のFGFファミリーとは異なる分子機構を有することを示唆するデータも得られており、その下流分子の探索のためにさらなる研究が必要である。

一方で、FGFRファミリーの中には免疫組織染色での検討がまだ不十分な分子もあり、異なる抗体を用いた検討なども要すると思われる。これまで前立腺癌細胞ならびに限局性前立腺癌組織におけるFGF19、FGF21の分子機構に焦点を当てて研究を進め、FGF19、FGF21の前立腺癌の増殖や進展への関与を明らかにしてきた。FGF19、FGF21がホルモン様作用を有し、局所のみならず血液を介して全身に広範囲に作用しうることが報告されていることなどを考慮し、今年度は進行がん症例における血清濃度や癌組織における発現についても検討する予定である。血液検体は広島大学病院泌尿器科で前立腺針生検施行前に採取し凍結保存している検体を用いた研究がすでに倫理委員会の承認を得ている。さらに前立腺癌細胞株に対するFGF19、FGF21刺激とIGFをはじめとするリン酸化シグナル、アンドロゲンレセプターシグナルへの効果についてウェスタンブロット法、ルシフェラーゼアッセイによりそれぞれ解析する。ヒト前立腺癌組織および前立腺癌細胞株におけるα/β-Klothoの発現解析を免疫組織染色ならびにリアルタイムPCR法によりそれぞれ行う。これまでの研究で、肥満、メタボリック症候群と関連するFGF19、FGF21が前立腺癌の増殖や進展に関与している可能性を示唆するデータを得ていること、FGF19、FGF21がホルモン様作用を有し、局所のみならず血液を介して全身に広範囲に作用しうることが報告されていることなどを考慮し、広島大学病院泌尿器科で前立腺針生検施行前に採取し凍結保存している患者血液検体において、FGF19、FGF21の血清濃度をELISA法を用いて測定し、生検結果、患者の基礎疾患の有無、臨床経過との関連について検討する。血液検体は倫理委員会の承認を得た本研究計画の内容に基づいて患者に説明、同意を得た上で採取・保存している。さらに前立腺癌細胞株に対するFGF19、FGF21刺激による細胞周期制御やアポトーシス、IGFをはじめとするリン酸化シグナル、アンドロゲンレセプターシグナルへの効果についてウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ルシフェラーゼアッセイによりそれぞれ解析する。ヒト前立腺癌組織および前立腺癌細胞株におけるα/β-Klothoの発現解析を免疫組織染色ならびにリアルタイムPCR法によりそれぞれ行う予定である。平成25年度に交付予定の直接経費150万円は、細胞生物学的実験、免疫組織染色、リアルタイムPCR法における消耗品費に加え、FGF19、FGF21を測定するためのERISAキットの購入にあてる。本研究費で対応可能である。
価値多元化社会における徳と教育:古代ギリシア徳倫理学と現代リベラリズムの観点から

まず、グローバル化の時代における国家と教育のあり方をテーマにした三つの最新の論考を取り上げ、比較検討した上で、価値観の多元化がますます進むグローバル化の時代にふさわしい市民的徳性と市民性教育についての提言を行う研究を行い、その成果を「グローバル化の時代における国家と教育」という論文として発表した。本論文では、市民教育で何らかの社会変革プロジェクトを扱う場合には、そのプロジェクトを批判的に検討する能力も育成すべきことを明らかにした。また、英米圏の教育哲学研究の現状に照らしながら、これまでの研究について、その背景や具体的な研究成果、進行中の研究の内容などを総括する研究を行い、「価値多元化社会における徳と教育-規範的教育哲学の試み-」という論考にまとめた。それから、基礎学力を身につけさせるとともに、格差の拡大や階層化の進行を防ぎ、機会均等の実現に寄与するという学校教育の社会的役割に照らして、日本の学校教育の現状を評価する研究を行った。その研究成果を「学校教育の社会的役割」という論考にまとめた。さらに、多文化社会の進展に対する対応として、市民性教育に求められている役割を日英の実践例などをもとに考察し、「多文化社会と市民性の育成」という論考にまとめた。これら二つの論考は、『基礎教育学』という共著の中で発表している。最後に、幼稚園や保育所といった就学前教育機関において、環境教育を実践する指導者を育成するためのプログラムの開発に協力し、その成果を「幼稚園及び保育所における環境教育の指導者養成プログラムの開発」という共著論文にまとめた。まず、徳倫理学に基づく道徳教育が価値多元化社会で実行可能かどうかを検討した論考を、編者であるJoseph Dunne及びPadraig Hoganによる詳しい紹介、コメントを付した上で、Education and Practiceという専門書の形で出版した。また、徳の働きとしての感情と道徳的判断力、それに徳の一種としての実践理性(充実した生き方を自ら考え、反省し、追及する能力)とそれぞれの教育についての研究を行い、「美的なものと道徳」という論文にまとめた。その際、英国ロンドン大学で在外研究を行った利点を生かし、価値多元化社会の英国の学校教育の実践例を多数紹介、分析した。この論文は近く、『道徳教育の可能性』という書籍の形で出版される予定である。この研究成果を踏まえる形で、現在、Educating Virtues and Emotionsという論文を執筆しており、近く国際学術誌に投稿予定である。さらに、わが国における道徳教育の最先端の研究を批判的に検討し、自らの研究を相対化させる研究を行い、「道徳的規範を伝達することは必要か?」という論考にまとめた。この論考は『近代教育フォーラム』という学会誌に収録予定である。まず、日英の状況を比較しながら、博物館や学校で世代間の記憶をつなぎ、回想を共有することを通じて、現代の価値多元化社会を担う市民を形成する可能性を検討する研究を行い、「市民形成と記憶:日英の比較を中心に」という論考にまとめ、国立歴史民俗博物館で行われた国際セミナーで発表した。本論考では、シティズンシップの意味を整理した上で、英国の市民性教育の現状と背景を明らかにした。そして、ヴィヴ・ゴールディングの実践例を批判的に検討した上で、社会に存在している多様なアイデンティティへの理解や多文化社会への理解を深めさせ、寛容と相互尊重という徳を身につけさせる場合に、世代間での回想が市民形成に役立つことを明らかにした。また、人格の完成が現代の価値多元化社会における教育目的として適切かどうかを検討する研究を行い、その成果の一部を『現代と教育』という論文集に寄稿した。本論考では、人格の完成という教育目的が、多様な立場や価値観が共存し得るような全体の枠組みとして、かなりの程度適切であることを明らかにした。そして、人格の完成を教育目的として認めた上でも、人間の備えている能力の内、とくにどの能力を選択して育成すべきかがあらためて問題になることを指摘し、その選択の基準として「子ども一人ひとりが(自身にとって)充実した生き方を追及し、幸せな人生を送る上で重要な能力かどうか」を提案した。そして、学校教育を通じて育成すべき「重要な能力」には、正義感や寛容、勇気、ケア、実践理性、政治的徳性などが含まれることを示唆した。それから、ハリー・ブリッグハウスや宮寺晃夫など、現代リベラリズムの立場に立つ教育哲学者の研究を参考にしながら、日英の学校選択制の是非を検討する研究を行い、「学校選択と社会正義-リベラリズムの観点から」という論考にまとめた。本論考は『教育哲学の再構築』という学術書の1章として出版予定である。

さらに、多文化社会の進展に対する対応として、市民性教育に求められている役割を日英の実践例などをもとに考察し、「多文化社会と市民性の育成」という論考にまとめた。これら二つの論考は、『基礎教育学』という共著の中で発表している。最後に、幼稚園や保育所といった就学前教育機関において、環境教育を実践する指導者を育成するためのプログラムの開発に協力し、その成果を「幼稚園及び保育所における環境教育の指導者養成プログラムの開発」という共著論文にまとめた。
蛍光共鳴エネルギー転移を応用したイノシトール三リン酸の細胞内動態のイメージング

蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)を利用してイノシトール1、4、5-三リン酸(IP_3)のバイオイメージングを試みた。1)Cyan Fluorescent Protein (CFP)の遺伝子の3'末端にYellow Fluorescence Protein (YFP)の遺伝子を融合させ、さらにその5'末端に細胞膜局在シグナル遺伝子を融合させたCFP-YFP融合タンパク質発現ベクターを作成した。2)RatのIP_3受容体タイプ3(IP_3R type 3)をテンプレートとして、PCRを用いてIP_3Rのリガンド結合ドメインをコードする遺伝子断片を作成した。3)IP_3Rの遺伝子断片をCFP-YFP融合タンパク質の発現ベクターに挿入し、CFP-IP_3Rリガンド結合ドメイン-YFPを細胞膜に発現させるベクターを作成した。4)融合タンパク質をヒト耳下腺培養細胞(HSY細胞)に発現させ、425nmの励起光でCFPを励起したところ480nmのCFPの蛍光に加えて、525nmのYFPの蛍光が認められた。このことからCFP-IP_3Rリガンド結合ドメイン-YFP融合タンパク質でFRETが起こっていることがわかった。5)融合タンパク質発現細胞をサポニンで穿孔し、IP_3で刺激したところ、IP_3の濃度に依存したFRET効率の変化(YFP蛍光の減弱)が認められた。以上の結果から、FRET現象を利用したIP_3の可視化プローブの作成が可能であることが示唆された。1.GFPで標識したPLC-PHドメインを培養細胞(HSY細胞、MDCK細胞)に発現させ、細胞膜GFPの細胞質へのトランスローケーションからIP_3産生をモニターした。アゴニスト刺激によりわずかな分布変化が観察されたが、その反応は必ずしも明確ではなかった。2.IP_3の可視化の予備実験として、Yellow CamereonをHSY細胞に発現させ、FRETによる細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]I)の測定を行った。ATPやイオノマイシンで刺激したところ、カルシウム・オシレーションや持続的な[Ca^<2+>]Iの上昇が観察された。3.PKCαの遺伝子の5'末端と3'末端に、それぞれCFPとYFPの遺伝子を融合させたキメラタンパク発現ベクターを作成した。このベクターを用いて融合タンパク質(CY-PKCα)をHSY細胞に発現させた。イオノマイシンでCY-PKCα発現細胞の[Ca^<2+>]I上昇させると、CY-PKCαが細胞膜へ移動し、それに伴ってCY-PKCαの分子間FRETによりCFP/YFPの蛍光比が低下した。CY-PKCをαはPKCαの分子構造の変化の解析には適さないと考えられるが、分子間相互作用の解析に利用できる可能性がある。
ラジカル重合における立体構造と分子量の精密制御

本研究は、ラジカル重合において分子量と立体構造の精密制御を可能とする重合系を新たに開発し、この重合法に基づき新規機能性高分子を設計・合成することである。とくに、これまでラジカル重合においては非常に困難であった立体構造と分子量の同時制御を可能とするラジカル重合系の開発に焦点を絞って研究を行う。本年度は、昨年度までの結果に基づき、N-ビニルピロリドン(NVP)のラジカル重合における分子量と立体構造の同時制御を目指した研究を引き続き詳細に検討した。ポリ(NVP)は、生体適合性ポリマーとして広く用いられているため、このポリマーの分子量や立体構造の制御が可能になると、より優れた機能性ポリマーの創出が可能となると期待される。分子量と立体構造の同時制御として、低温アゾ開始剤(V-70)を用い、可逆的付加開裂型連鎖移動(RAFT)剤としてキサンテート(PhCH(CH_3)SC(S)OC_2H_5)の存在下、(CF_3)_3COHのようなフルオロアルコール中、20°Cで重合を行うことにより、分子量(M_w/M_n1.3)と立体構造の制御された(r60%)ポリマーが得られた。種々の分子量(M_w=20,000-700,000)で立体構造の異なる(r=53-63%)ポリマーを合成し、ガラス転移温度(T_g)を測定した結果、同じ分子量ではシンジオタクチシチーが増加するとT_gが減少することがわかった。今後、ポリ(NVP)の物性の制御に有効であることが示された。本年度はさらに、立体構造を制御する新たな手法として、プロトンドナー(D)部位とアクセプター(A)部位を有するモノマーを合成し、これに相補的に相互作用する化合物を添加して重合することで、多重水素結合作用に基づく方法を検討した。その結果、アミドピリジル部位を有するDADモノマーの重合を、ADAタイプの添加物存在下で行うことにより、生成ポリマーのシンジオタクチシチーが48%から80%に向上することが明らかとなった。本手法は、立体構造制御の新しい手法として有効であることがわかった。ポリビニルアミドは、毒性が低い安全な機能性ポリマーとして、医薬用助剤、化粧品分野をはじめとする種々の分野で使用されている。中でも、N-ビニルピロリドン(NVP)は、ポリマーが水溶性を示すことから広く用いられているが、ラジカル重合によってのみポリマーを与えることから、これまで精密重合に関してほとんど報告されていない。そこで、本研究では、可逆的付加開裂型連鎖移動(RAFT)重合法を用いて、NVPのリビングラジカル重合を検討し、分子量の制御を試みた。さらに、ビニルエステル誘導体の立体構造制御に有効であったフルオロアルコール中での重合と組み合わせることで、分子量と立体規則性が同時に制御されたポリマーを与える立体特異性リビングラジカル重合を見出すことを目的とした。キサンテート(PhCH(CH_3)SC(S)OC_2H_5)存在下、AIBNを開始剤として用いて、60°CでNVPのラジカル重合を行うと、重合は速やかに進行した。生成ポリマーの分子量は、重合率に比例して増加し、キサンテート1分子から1分子のポリマーが生成すると仮定した計算値に良く一致した。また、ポリマーの分子量分布は狭く(M_w/M_n1.2)、以上より、リビングラジカル重合が可能であった。また、生成ポリマーの立体構造制御を目的として、種々のフルオロアルコール中での重合を検討したところ、ラセモ(r)含有量が増加する傾向が見られた。とくに(CF_3)_3COHを道井と場合に、最もr含有量の高いポリマーを与えた(r60%)。さらに、フルオロアルコール中でRAFT重合を行うことにより、分子量と立体規則性の同時制御を試みたところ、比較的分子量分布が狭く(M_w/M_n1.3)、同時にr含有量の高い(r60%)ポリマーが得られることを見出した。

今後、ポリ(NVP)の物性の制御に有効であることが示された。本年度はさらに、立体構造を制御する新たな手法として、プロトンドナー(D)部位とアクセプター(A)部位を有するモノマーを合成し、これに相補的に相互作用する化合物を添加して重合することで、多重水素結合作用に基づく方法を検討した。その結果、アミドピリジル部位を有するDADモノマーの重合を、ADAタイプの添加物存在下で行うことにより、生成ポリマーのシンジオタクチシチーが48%から80%に向上することが明らかとなった。本手法は、立体構造制御の新しい手法として有効であることがわかった。
熱流およびスピン流における多極子輸送現象の理論

フォノンホール効果は、非磁性絶縁体に温度勾配を与え、それと垂直な方向に磁場を与えたとき、この両者に垂直な方向に温度勾配が現れる現象である。我々は、この現象が大きな全角運動量を持つ重元素によるフォノンの共鳴散乱によることを2014年に示した。その後、2017年にBa3CuSb2O9(BCSO)でフォノンホール効果が報告された。BCSOには、スピン1/2のCuイオンが、蜂の巣状に並んでいるが、大きな全角運動量を持つイオンは含まれていない。これまでの研究で、六角形の中心に付加的なCuイオンの孤立スピンが僅かに存在し、低温での熱伝導率を支配していることが分かっている。本研究では、この孤立スピンがBCSOにおけるフォノンホール効果の鍵であることを示した。BCSOには、電子の時間スケールより遥かにゆっくりとした時間スケールの動的Jahn-Teller歪みがあることが報告されている。この歪みによって、孤立スピンを伴うCu六方晶の伸長が、四重極対称性を有する電荷の再分布をもたらすことを見出した。四極子は、格子歪みに結合することができる。これは、BCSOにおけるスピン-フォノン結合の起源である。このスピン-フォノン結合を通じて、スピンCu六方晶はスピン1/2クラスタによるフォノンのスキュー散乱が可能となる。つまり、孤立スピンを有するCu六方晶の拡張クラスタ多極子こそが、BCSOにおけるフォノンホール効果の起源なのである。このように、BCSOを対象として複数原子に亘る拡張された多極子とフォノンとの結合を評価し、熱流における多極子輸送現象の理論を構築した。29年度が最終年度であるため、記入しない。スピンホール効果は、電流を与えると、それと垂直な方向に磁気(スピン)分極が生じる現象である。この逆効果は、逆スピンホール効果と呼ばれ、今やスピントロニクスに不可欠な物理現象である。この起源には諸説あるが、外因性のスピンホール効果では、スピン軌道相互作用による多極子間の干渉として理解することが出来る。これまでは、主にプラチナが使われてきたが、電流・スピン流変換効率は数%程度にとどまっている。また、プラチナが高価なため、安価で変換効率の高い材料が強く望まれている。この課題を克服する方法として、安価で入手が容易な金属に、重い元素を微量加えることで、大きな効果と実用面の課題を克服しようとする研究が進展している。今年度は、鉄(Fe)を主な材料として、そこにタンタル(Ta)やイリジウム(Ir)などの重い元素を加えた合金のスピンホール効果の計算を行った。第一原理計算により鉄の電子状態および添加した元素と鉄原子との重なり積分を見積もり、局在状態と金属状態とが混成した模型(アンダーソン模型)を解く問題へと帰着させる。アンダーソン模型を、平均場近似や量子モンテカルロ法を用いて解くことで、スピンホール効果に対する電子相関の効果を調べた。その結果、Irを添加した系では、電子相関を取り入れることで、スピンホール効果で得られる電圧の符号が変わる結果となった。一方、Taでは、電子相関による符号の変化は現れなかった。この結果は、今後実験によって検証されることが期待される。本研究は、熱や磁気の輸送特性に関する理論研究を通して、多極子伝導系の新たな物理を開拓するものである。特に、多極子が熱流と磁性とを結びつける側面に着目して研究を進めてきた。その一つは、スピンホール効果である。金属に、微量の重い元素を加えた系のスピンホール効果について計算を進めてきた。元素依存性に加え、電子相関の効果を明らかにした。また、鉄にタンタル(Ta)やイリジウム(Ir)を添加した系で、異常ネルンスト効果の計算も行った。異常ネルンスト効果とは、磁化と垂直な方向に熱勾配を与えと、両者に垂直方向に電位差が生じる現象である。Taを添加した方が、Irよりも効果が大きくなることが分かった。異常ネルンスト効果については、更に計算をして検証を進める必要がある。

このように、BCSOを対象として複数原子に亘る拡張された多極子とフォノンとの結合を評価し、熱流における多極子輸送現象の理論を構築した。多極子が熱流と磁性とを結びつける一例として、熱ホール効果が挙げられる。この現象は、ある物質に温度勾配を与え、それと垂直な方向に磁場を与えたとき、両者に垂直な方向に温度勾配が現れるものである。金属中では、温度勾配で駆動された電子が、磁場下でローレンツ力を受け、熱ホール効果が生じるため、多極子は主な要因ではない。それに対して、絶縁体中では、電気的に中性なマグノンやフォノンが熱を運ぶため、ローレンツ力は無関係であり、多極子を通した磁場との結合が必要となる。フォノンによる熱ホール効果に関しては、非磁性絶縁体Tb3Ga5O12(TGG)で観測されている。最近、Ba3CuSb2O9(BCSO)で、広い温度領域で観測されている。TGGでは、Tbイオンが大きな全角運動量を持ち、その電気四極子がフォノンの散乱体となり、磁場下で非対称な共鳴散乱を誘起する。それに対して、BCSOには、スピン1/2のCuイオンが、蜂の巣格子状に並んでいるが、大きな全角運動量を持つイオンは含まれていない。従って、イオンの多極子で説明することはできず、クラスターなどの拡張された多極子を考えなければならない。今後、複数原子に亘る拡張された多極子とフォノンとの結合を評価し、熱流における多極子輸送現象の理論を構築する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
カリフォルニア大学発ベンチャー企業におけるスター・サイエンティストの役割の研究

スター・サイエンティストとは、卓越した研究業績を残す少数のサイエンティストのことを指す。通常の研究者に比べて多くの論文を出版し引用を集め、更に成長率の高いベンチャー企業を設立する傾向にあることが米国の1980年代のバイオテクノロジー分野において観察されている(Zucker & Darby)。本研究では、先行研究のフォーカスを広げ、2000年から現在までの間にサイエンティストが関与する研究分野全般におけるスター・サイエンティストの分析を行い先行研究の理論の一般化及び分野間の差異の分析を試みる。またカリフォルニア大学発ベンチャー企業データセット(2000年以降の特許ベースの全ベンチャー企業541社が含まれている)を活用し定量分析を行う。調査対象はカリフォルニア大学に限定されるものの、1) 2000年以降を対象としている、2)全研究領域を対象としている、という二つの側面において、スター・サイエンティスト研究の新しい領域を切り拓く。本研究では、2000年以降に設立されたカリフォルニア大学発の特許ベースのベンチャー企業に焦点を絞り、スター・サイエンティストの関与の有効性を検証する。この検証を行うことで、現在どのような分野でスター・サイエンティストの関与が有効に働いているか、加えてZucker教授らによる「スター・サイエンティスト」に関わる現象が1980年代のバイオテクノロジー分野における特異な現象なのか、それとも一般化可能なのかを明らかにする。初年度は、・関連研究調査と仮説のブラッシュアップ・スター・サイエンティスのデータセットの作成・基礎的な定量分析(スター・サイエンティストの成功への影響)を実施した。また共同研究者との連携によりサンディエゴ地域にフォーカスしたスター・サイエンティストの動向や特性について調査を行った。当初の計画通り、1年目の目標としていた以下の項目について達成している。・関連研究調査と仮説のブラッシュアップ・スター・サイエンティスのデータセットの作成・基礎的な定量分析(スター・サイエンティストの成功への影響)初年度の計画は概ね順調である。一方で、基礎的な定量分析は引き続き行う必要がある。特に先行研究の調査などを行う過程で、スター・サイエンティストの多様な定義の整理を行い、現在複数の定義の異なるスター・サイエンティストのリストを保持している。それぞれのスター・サイエンティストのリストを既存のデータセットと結合し、分析を進める必要がある。その他、2年目は定性研究として、スター・サイエンティストへのインタビューを行い、定量データの結果に基づいたtriangulationを行う予定である。そしてその成果を論文にまとめる予定である。使用額が多くなったため
文章理解および問題解決によって得られた知識の利用可能性を規定する要因について

本年度は、問題解決によって得られた知識がどのような場合に応用可能となるのか(すなわち、学習の転移が生ずるのか)を調べるため、中学1年生(207名)を対象として実験を行った。本研究で注目したのは、学習後に学習によって得た教訓を書き留める活動(教訓帰納)と、問題解決過程で問題状況を図に描いたり見通しを立てたりする活動(モニタリング)の効果である。実験では、被験者にある物理法則に関する問題を解かせて学習をさせ、その後、挿入課題(被験者の帰納的推論能力を測る課題)をはさんで、同じ物理法則に関する別の問題(応用問題)を解かせた。その際、学習後に教訓帰納を行う群と行わない群、および応用問題の解決過程でモニタリングを行う群と行わない群を設け、応用問題の成績に違いがあるかどうかを調べた。その結果、被験者の帰納的推論能力によって2つの活動の効果が異なり、帰納的推論能力の高い子どもは教訓帰納とモニタリングの両方を行うことにより学習の転移が相乗的に促進されるが、帰納的推論能力の低い子どもは両方を行ってもそのような相乗効果が現れないことが明らかとなった。前年度と本年度の研究成果は、2本の論文としてまとめられ、現在、科学研究費補助金研究成果報告書として印刷中であると同時に、学会誌に投稿予定である。また、来年度の学会で発表予定である。まず、テキストからの学習において得られた知識がどのような場合に応用できるようになるのかを調べるため、読み手が文章読解中に行う活動(疑問生成活動、批判生成活動、具体例生成活動)に注目して、それらの有効性について実験的に比較検討を行った。被験者(111名)は、ある文章(約1000字)を5分間読み、その後、(a)文章内容に対する疑問を記述する(疑問生成活動)、(b)文章の主張に対する批判を記述する(批判生成活動)、(c)文章内容に関する具体例を記述する(具体例生成活動)、(d)文章を繰り返し読む、のいずれかの活動を5分間行った。その後、被験者は、文章内容そのものの理解を測るための正誤判断課題と、文章内容を超えたより深い理解を測るための応用課題を行った。その結果、疑問生成活動はいずれの課題においても繰り返し読む場合と差がなく、文章理解における有効性が見出されなかった。批判生成活動は、正誤判断課題においては効果があったが、応用課題では効果が認められなかった。具体例生成活動はいずれの課題においても有効性が認められた。次に、問題解決によって得られた知識がどのような場合に応用できるのかを探るため、学習後に学習によって得た教訓を書き留める活動(教訓帰納)と問題解決過程で問題状況を図に描いたり見通しを立てたりする活動(モニタリング)に注目し、その有効性を実験的に検討した。被験者(106名)は、ある物理法則に関する問題を解いて学習し、その後挿入課題をはさんで、同じ物理法則に関する別の問題(応用問題)を解いた。その際、教訓帰納を行う群と行わない群、および応用問題の解決過程でモニタリングを行う群と行わない群を設け、応用問題の成績に違いがあるかどうかを調べた。その結果、学習後の教訓帰納も問題解決時のモニタリングも応用問題を解く際に効果があることがわかったが、教訓帰納とモニタリングの両方を行うと効果が薄れることがわかった。
合成ペプチドを用いた新たな歯周組織再生療法の試み

エナメルタンパク質のひとつであるエナメルシースプロテインは,主にエナメル質の小柱鞘の形成に係るタンパク質である。今までに,ブタエナメルシースプロテインがヒト歯根膜細胞(HPDL)細胞に対してセメント質様の硬組織形成能を持つということが歯周病モデル犬にて報告されている。そこで本研究では、歯周組織再生療法への応用を目指してエナメルシースプロテインの合成ペプチドを数種類作製し,これらのHPDL細胞に対する細胞分化誘導能活性を調べた。前年度、ヒトエナメルシースプロテインのC末端側アミノ酸配列から数種類のペプチドを合成し,これらの細胞分化誘導能をHPDL細胞が有するアルカリフォスファターゼ(ALP)活性の測定、リアルタイムPCRによる骨マーカー(OPN,OC,BSP)発現量の測定、石灰化誘導実験などを行って確認した。その結果、ペプチドの中でSDKPPKPELPGVDF(H-2)の配列が最も強いHPDL細胞の硬組織誘導形成能を有していることが判明した。これらの結果から論文の執筆を行い、J Periodontal Resへ投稿し、受理された。今までに,ブタエナメルシースプロテインがヒト歯根膜細胞(HPDL)細胞に対して細胞分化誘導能を持つということが報告されている。ヒトエナメルシースプロテインのC末端側アミノ酸配列から数種類のペプチドを合成し,これらの細胞分化誘導能をHPDL細胞が有するアルカリフォスファターゼ(ALP)活性の測定、リアルタイムPCRによる骨マーカー発現量の測定、石灰化誘導実験などを行って確認した。その結果、エナメルシースプロテインのペプチドがヒトHPDL細胞のALP活性を誘導することが示された。数種類のペプチドの中でSDKPPKPELPGVDF(H-2)の配列が最も強いALP活性の誘導を示した。リアルタイムPCRの結果ではH-2をHPDL細胞に添加すると骨形成マーカーであるOPN、BSP,OCの遺伝子発現は、ペプチド未添加群よりも添加群の方が強いことが判明した。また培養28日目には石灰化ノジュールも認められた。このことからH-2は,HPDL細胞に対して硬組織形成誘導能を有している可能性が判明した。今後,歯周組織再生治療薬として応用することを目的として動物実験をおこなっていく予定である。前年度、ヒトエナメルシースプロテインのC末端側アミノ酸配列から数種類のペプチドを合成し,これらの細胞分化誘導能をHPDL細胞が有するアルカリフォスファターゼ(ALP)活性の測定、リアルタイムPCRによる骨マーカー発現量の測定、石灰化誘導実験などを行って確認した。その結果、ペプチドの中でSDKPPKPELPGVDF (H-2)の配列が最も強いHPDL細胞の硬組織誘導形成能を有していることが判明した。2010年9月に掲載されている。現在、ヌードマウス皮下ヘアパタイトを担体とし、ヒト歯根膜細胞およびペプチド:SDKPPKPELPGVDF (H-2)を移植し、経過を追っている。動物実験は継続中である。
水晶体における血管新生抑制因子の探索と血管新生緑内障の新しい病態概念の確立

αクリスタリンはいずれも、水晶体由来だけでなく硝子体中に存在する硝子体細胞が発現・分泌している可能性が示された。細胞増殖試験によってαBクリスタリンが増殖抑制効果を示す作用本体であるものの、αAクリスタリンとの相互作用により相乗的にVEGFによる新生血管の誘導を抑制しうることを示唆した。つまり、水晶体除去に起因する眼内環境の変化が硝子体細胞の恒常性を破綻させた結果、αクリスタリンの発現量が低下し、VEGF量とのインバランスが硝子体内への異常な血管形成を誘導すると考えた。本研究の目的は水晶体に血管新生抑制作用を有する因子が存在するかどうかを明らかとすることである。すでに研究期間内において、血管新生を抑制する因子であるアンジオスタチン(angiostatin),エンドスタチン(endostatin),TGF-βsなどのサイトカインが、白内障手術により水晶体を摘出された既往を有する患者の方が有しない患者から採取された前房水よりも多く存在することが明らかとなった。また、白内障手術の際に採取した水晶体前嚢および上皮細胞、水晶体皮質から血管新生抑制因子であるTenomodulinが検出された。房水からは検出されなかった。今後、白色家兎において片眼に水晶体摘出を行い、水晶体の有無による硝子体に含まれるサイトカインの発現量の違いを網羅的に解析する。すでに研究期間内において、白内障手術により水晶体を摘出された既往を有する患者と有しない患者から前房水を採取し、保存されている。血管新生を抑制する因子として、アンジオスタチン(angiostatin),エンドスタチン(endostatin),TGF-βs,maspin,ELR-CXCケモカインやインターロイキン-1,-12,-10, Chondromodulin-Iが候補として挙げられることが、in vitro解析により明らかとなっており、これらの因子が採取した房水にどれだけの濃度で存在しているか、ELISA法により定量すべく、現在予備実験を行っている。本研究の目的は、水晶体に存在すると考えられる血管新生抑制作用を有する因子を同定することである。家兎に対して水晶体摘出術を行い、術後に硝子体を採取し、術前後を比較した結果、αクリスタリンBが有意に低下することがウェスタンブロット、リアルタイムRT-PCRの解析により明らかとなった。強力な血管新生および血管透過性亢進を引き起こすことで知られる血管内皮増殖因子(VEGF)添加によって惹起されたヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)における細胞増殖を、αクリスタリンBは有意に抑制した。これらの結果から、血管新生抑制作用を有するαクリスタリンBが白内障術後に減少することで病的な血管新生が助長されることが示唆された。現時点では、実際にヒトにおいて水晶体摘出後に硝子体においてαクリスタリンBが減少しているかどうか、血管新生の認められない黄斑前膜を有する患者のうち、白内障手術の既往のある患者、既往のない患者との間で硝子体におけるクリスタリンBの発現量を計測、比較する解析を開始している。同時に、血管新生を認める増殖性糖尿病網膜症を有する患者群においても同様に白内障手術の既往のある群とない群との間で比較を行っている。これら臨床面での解析を本年度内に完遂する予定である。糖尿病網膜症の患者の水晶体を除去すると、血管新生緑内障や硝子体出血など血管が関与する疾患の併発をしばしば経験する。そこで本研究では、硝子体中において、水晶体除去前後で増減する因子の有無を調べ、その因子と血管新生との関係を検討した。無処理眼の硝子体から得られた多数のスポットのうち、4つが水晶体除去後の硝子体において完全に消失していた。質量分析の結果、3つがウサギαAクリスタリン、1つがウシ由来のタンパク質であることを示唆した。そこで我々はクリスタリンに着目した。αクリスタリンはファミリーを形成していることから、ホモログであるαBについても検討した。無処理眼の硝子体と水晶体除去後の硝子体でのαAおよびαBクリスタリンの発現をタンパク質および遺伝子レベルで検討したところ、いずれも水晶体除去後の硝子体において発現量が減少した。αBクリスタリンは細胞増殖抑制効果を示し、その効果はαAクリスタリンとの同時添加によってさらに強められた。しかし、αAクリスタリン単独では抑制効果を示さなかった。

つまり、水晶体除去に起因する眼内環境の変化が硝子体細胞の恒常性を破綻させた結果、αクリスタリンの発現量が低下し、VEGF量とのインバランスが硝子体内への異常な血管形成を誘導すると考えた。当初の予定通り、水晶体における血管新生抑制因子の同定、機能解析を達成している。予定を超えて実臨床における確認作業に進んでいると言えるが、論文作成におけるデータ収集にはまだ時間を要すると考えられる。眼科当初の予定通り、水晶体における血管新生抑制因子の同定という目的は達成されており、今後は臨床において実際に予測された量的挙動を示しているか、確認する工程に入る予定である。実際にヒトからサンプルを採取する際には、あらかじめ本学の医学部倫理審査委員会などに承認を求め、患者の同意のもとに施行する。血管新生抑制因子が前眼部に存在することを明らかにできている。候補となる蛋白の同定を目的とした網羅的な検索を目的とした実験も予定通り進行中である。血管新生を抑制する因子を網羅的に検出するには、膨大な房水量が必要となり、研究の進行に後れを来す恐れがあり、候補をまず絞り込んで定量解析を行う手法へと切り替えることで、予定通りの計画実行を遂行できている。平成27年度の研究終了時には差額は0となる予定であるが、研究の進行に予定外の事例が発生した場合を想定して余剰分を設定した。白色家兎における血管新生抑制因子の網羅的な同定を終了させ、実際にヒト水晶体において発現しているか、リアルタイムRT-PCRで確認を行う。候補となる因子に実際に血管新生を抑制する作用を有するかどうかを強制発現プラスミドを作成して確認する。患者から採取した房水における血管新生抑制因子の濃度を定量、水晶体摘出の既往により有意差があるかどうかを検討する。有意な差を認めた因子については、水晶体前嚢をサンプルとしてリアルタイムRT-PCRを行い、実際に遺伝子発現があるかを確認する。その後、候補となる因子に実際に血管新生を抑制する作用を有するかどうかを強制発現プラスミドを作成して確認する。追加実験が必要となった際の経費に充てる。予定通り計画が進行し、残高は比較的少額である。来年度の実験試薬等の購入に充てる。房水をサンプルとして候補因子の定量を行う上でのキットを購入する。また、研究成果を国内外の学会にて報告するとともに情報収集を行う。そのための旅費としても計上する。