hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
混濁流ベッドフォームの形成メカニズム

また,既存の密度流実験と開水路ベッドフォームの観測結果を収集し,開水路と密度流におけるベッドフォームの形成条件の違いを検討した.形成条件比較の際には,流れの水理条件を示す無次元パラメーターを用いた.さらに,平成30年度は開水路ベッドフォームの定義の再検討を行い,その予察的な結果を国際学会(American Geophysical Union Fall Meeting)にて発表した.平成30年度に行った密度流実験の結果に加え,既存の密度流実験と開水路ベッドフォームの観測結果を収集し,開水路と密度流におけるベッドフォームの形成条件の違いを検討した.形成条件比較の際には,流れの水理条件を示す無次元パラメーターを用いた.結果として,以下のことが明らかになった.(1)本実験の結果は,既存の密度流実験の結果と整合的であった.そして,(2)実験条件を表すパラメーターとして層平均値を用いた場合は,密度流ベッドフォームの安定領域は開水路ベッドフォームの安定領域とは大きく異なっていた,一方,(3)下層平均値を用いて実験条件を表した場合は,密度流ベッドフォームの安定領域は開水路ベッドフォームの安定領域とよく一致した.このことは,開水路と異なり密度流の場合は流れ全体ではなく下層のみがベッドフォームの形成に影響しているかもしれないことを示している.すなわち,開水路ベッドフォームの安定領域図を密度流堆積物に適用した場合,復元された水理条件は密度流の下層の状態を表している可能性がある.従来の解釈では,十分な検証もなしに,密度流ベッドフォームの形成条件は開水路と同じとみなされてきたが,本研究の実験結果はこれを否定するものであった.さらに,開水路と同様の速度構造を示しているのは密度流の下層部のみであるため,この下層部の水理条件に着目すれば開水路とほぼ同じ無次元水理条件でベッドフォームができていることも明らかになった.これらの成果は博士課程のメインテーマである混濁流の2層浅水流モデルの開発,および混濁流ベッドフォーム形成プロセスの解明に繋がるものである.現時点の結果として,密度流下層の水理条件を示すパラメーターを用いた場合に,密度流ベッドフォームの形成条件が開水路ベッドフォームの形成条件とよい一致を示すということが明らかになった.今後の方針として挙げられるのは,(1)安定領域図に用いる無次元数の見直し,および(2)密度流の二層流浅水方程式モデルを開発すること,の二点が挙げられる.まず(1)については,先行研究において開水路の水理条件を示す無次元数を含め,最適な無次元数を模索することで,密度流ベッドフォームの安定領域を十分に記述できると考えられる.(2)については,日本地球惑星科学連合2018年大会での成果発表を踏まえ,引き続き数値モデル開発に取り組んでいく.成果の公表については,本研究での実験結果を,実験実施の際に滞在した研究グループの成果報告会にて発表し,有意義なコメントを頂くことができた.また,報告会以降の成果や進捗を,2019年9月に開催されるInternational Association of Sedimentologists(国際学会,ローマ)で発表する予定である.また,研究成果をまとめた論文を英文国際誌へ投稿するべく,研究指導者と議論を重ねながら原稿を執筆している.
脳腫瘍に対する音響化学療法に関する基礎的研究

音響化学療法耐性脳腫瘍の存在とその機序を明らかにするためα2MR/LRPの発現が異なるヒトグリオーマ腫瘍細胞で検討した。音響化学療法による殺細胞効果は、α2MR/LRPが発現しているU251MG細胞において有意に増強されたのに対し発現のないU105MG細胞では増強効果は少なかった。RAPによりα2MR/LRPの結合を阻害することによりU251MG細胞における音響化学療法の殺細胞増強効果は抑制された。腫瘍細胞の形態変化は、α2MR/LRPが発現しているU251MG細胞において顕著であったのに対して、発現のないU105MG細胞では乏しかった。これらの結果はα2MR/LRPの発現の有無が音響化学療法の治療感受性に関与することを示すものと考えた。音響化学療法の抗腫瘍効果のメカニズムに関して、血液脳関門(BBB)に与える影響を電子顕微鏡を用い組織学的に検討した。超音波照射により辺縁部および中心部で血管周囲に変性した細胞がみられ、神経突起は膨化し、毛細血管内皮細胞の細胞質の膨化、ミトコンドリアの膨化、飲み込み小胞の増加、血管内皮細胞の細胞膜の断裂がみられた。これらの所見は、照射中心においてより高度であった。以上の所見より音響化学療法における血管透過性亢進は、tight junctionの離開ではなく、内皮細胞の細胞膜の断裂、飲み込み小胞の増加が主たるものと考えた。今回の実験で音響化学療法は、直接腫瘍細胞破壊による抗腫瘍効果のみならずBBBが破壊されことにより腫瘍細胞浸潤部への抗癌剤の組織進達度を上げる可能性が示唆された。今後化学療法の有効性を高めることが期待される。音響化学療法耐性脳腫瘍の存在とその機序を明らかにするため、平行超音波によりヒトグリオーマ細胞株U105MGおよびU251MGの2種類の腫瘍細胞についてα2MR/LRP(α2マイクロブリン受容体/LDL受容体関連蛋白)の発現の差、RAP(Receptor-associated protein)によるPhotofrin(Pf)との結合阻害が音響化学療法の効果におよぼす影響を検討した。α2MR/LRPの発現は、U105MG細胞ではみられず、U251MG細胞では著明であった。超音波単独照射群、Pf10分間併用群とも照射時間の増加につれて生細胞率は低下し、単独群とPf併用群に有意差がみられた。α2MR/LRPに特異的に結合するRAPを用いて、Pfとα2MR/LRPの結合を拮抗的に阻害させた場合の治療効果は、U105MG細胞およびU251MG細胞ともに照射時間が延長するにつれ単独群、Pf併用群ともに生細胞率は減少したが有意さはみられず、Pfの増感作用が阻害された。超音波照射による細胞形態の走査型電顕上の変化は、microvilliの脱落、bleb、gap形成であるが、U251MG細胞は、単独群に比べPf併用群で細胞破壊像が強く、U105MG細胞ではその変化の差はあまり強くなかった。α2MR/LRPが発現している細胞で殺細胞効果は有意に増強されたのに対し、発現のない細胞では増強効果は少なく、またPfとα2MR/LRPの結合を阻害することにより音響化学療法の殺細胞効果は抑制され、α2MR/LRPの発現の有無が本療法の治療感受性に関与することが判明した。今回音響化学療法の抗腫瘍効果のメカニズムに関して、血液脳関門(BBB)に与える影響に着目し、電子顕微鏡による組織学的検討を行った。ウイスターラット脳に、確実に限局した破壊巣が形成される100W/cm2-5分と、破壊巣が軽微な100W/cm2-3分に設定し、音響化学物質としてローズベンガル10mg/kgを超音波照射5分前に投与した。

超音波単独照射群は同量の生食塩水を投与し、コントロールとして超音波も照射せず、ローズベンガルも投与しないモデルも作成した。血液脳関門を評価するため超音波照射15分前に、2%エバンスブルー溶液2ml/kgを投与し、2.5%グルタール液で潅流固定し脳を摘出した。樹脂に包埋後、超薄切切片を作成し組織変化を走査型電子顕微鏡を用い検討した。超音波単独照射群では照射辺縁部は細胞の形態は保たれていたが、中心部では血管周囲の神経突起の膨化、毛細血管内皮内皮細胞の細胞質膨化、飲み込み小胞の増加がみられた。音響化学療法を行ったものは、照射辺縁でも中心でも血管周囲に変性した細胞がみられ、神経突起は膨化し、毛細血管内皮細胞の細胞質の膨化、ミトコンドリアの膨化、飲み込み小胞の増加、血管内皮細胞の細胞膜の断裂がみられた。これらの所見は照射中心においてより強い変化であった。今回の結果から、音響化学療法における血管透過性亢進は、細胞膜障害、飲み込み小胞の増加によることが明らかとなった。今回の結果より音響化学療法における血管透過性亢進は、tight junctionの離開ではなく、内皮細胞の細胞膜の断裂、飲み込み小胞の増加によることがあきらかとなった。音響化学療法を悪性神経膠腫の治療に応用することにより、直接腫瘍細胞破壊による抗腫瘍効果のみならず抗癌剤の組織進達度を上げる可能性が示唆され化学療法の有効性を高めることが期待される。
犬尿道における非アドレナリン非コリン性神経の局在の解明

1)神経切離実験による非アドレナリン非コリン性(NANC)神経の局在の解明雌成犬で片側の下腹神経、骨盤神経を切離、2週後に尿道の右、左半で平滑筋標本を作製した。ノルエピネフリン(NE)に対する濃度反応曲線は神経切除側、健側で有意差はなかった。NE10^<-5>Mによる前収縮下で経壁電気刺激を行ったところ周波数依存性のNANC弛緩反応がみられ、この弛緩はNOS阻害剤のL-NAMEで抑制された。この反応には切除側、健側間で有意差はなかった。2)非NO弛緩反応の神経伝達物質犬尿道の平滑筋切片に対する高頻度(16Hz,32Hz)の電気刺激ではL-NAMEで抑制されない持続性の弛緩が残存した。テトロドトキシン(TTX)3×10^<-7>Mの存在下ではすべての弛緩は抑制された。尿道平滑筋切片に対するCGRP,ATP,PACAP,GABAの投与では有意な弛緩は得られず、SP投与では収縮がみられた。VIP投与では濃度依存性に弛緩がみられた。しかし、この弛緩はTTX抵抗性であった。VIPの拮抗剤VIP10-28の存在下では高頻度(16Hz,32Hz)の電気刺激による弛緩反応を抑制できなかった。3)カプサイシン感受性知覚神経の関与NE10^<-5>Mによる前収縮下でカプサイシン5×10^<-6>Mを投与したところ弛緩反応がみられた。このカプサイシンによる弛緩はTTXで抑制されなかった。しかし、L-NAME存在下では弛緩は抑制された。NK1受容体拮抗薬RP67580,NK2拮抗薬L659877,CGRP(8-37),VIP(10-28)は有意な抑制効果を示さなかった。まとめ犬尿道のNANC神経の局在はこの実験では解明できなかった。非NO弛緩反応の神経伝達物質を確定することはできなかった。尿道のカプサイシン感受性知覚神経の刺激で尿道平滑筋が弛緩し,これはNO系を介することが示された。
筋緊張性ジストロフィー原因遺伝子産物・ミオトニンキナーゼの機能発現様式と病態解析

筋緊張性ジストロフィー症の原因遺伝子産物・ミオトニンキナーゼの実体とその作用機構を明らかにする目的で、ウサギ骨格筋のミクロゾーム画分調製途上で検出されたH1ヒストンキナーゼの精製とその性質について検討した。活性を含む分画をDEAE-Sephacel、H1histone-Sepharose、hydroxylapatiteの各カラムを通し、最終的に収率81%で543倍まで精製した。この標品を用いてゲル濾過法と活性ゲル法で分子量を推定すると4.5-5.0万との値が得られた。またH1ヒストンを基質とした燐酸化反応では既知のプロテインキナーゼの活性化因子によっては顕著な影響を受けず、阻害剤の効果ではプロテインキナーゼC(PKC)の阻害ペプチドとカゼインキナーゼIの阻害因子によって活性低下が認められた。次に基質特異性について検討したところ本酵素はH1ヒストンの他、ミエリン塩基性蛋白質、S6蛋白由来ペプチドをよく燐酸化し、その基質スペクトラムはPKCとよく一致した。そこで一次元及び二次元のペプチドマップ法でH1ヒストン由来の燐酸化ペプチドを分離しそのオートラジオグラムを比較したところこれもPKCを用いて得られた結果と類似していた。さらにこのH1ヒストンキナーゼはPKC同様H1ヒストンのC末端側のセリン残基を燐酸化していた。これらの結果は今回精製した酵素がPKCの触媒部位を含むフラグメントである可能性を示唆しているが、必ずしも性質が一致しない点も認められる。今後特異的な抗体の使用あるいは直接の一次構造の解析等によってこのキナーゼを同定するとともにその天然基質の解析が大きな課題である。筋緊張性ジスロフィー症は常染色体優性の様式で遺伝する筋肉疾患であり、最近その発症と関係の深い候補遺伝子が単離された。さらにコードされる蛋白質は蛋白質燐酸化酵素であることが示唆されているが(ミオトニンキナーゼ)、その実体は明らかでない。そこで我々はこの酵素をウサギ骨格筋から精製し、その特徴を明確にすることを試みた。その結果、ホモジネートの7,000g__-沈澱画分を可溶化したフラクションにH1ヒストンキナーゼ活性を認めた。基質非存在下で[γ-^<32>P]ATPと反応させると電気泳動上分子量7万付近に放射性蛋白バンドが検出され、さらにペプチド抗体を用いた解析でも同様のバンドが認められた。この値は遺伝子構造から予想される完全長の分子の大きさに近いことからさらに精製を進めた。DEAE-Sephacelカラムクロマトグラフィーで得られた3つのピークの内最も活性の高い2番目のピークをさらにH1ヒストンセファロースカラム、ヒドロキシアパタイトカラムで精製し、収率20%で,比活性は約100倍まで上昇した。この酵素の分子量を計算すると約48,000となり精製開始時の予想よりやや小さい値となっている。またAキナーゼの阻害剤によって活性は影響を受けないが、Cキナーゼの阻害剤では抑えられた。しかし環状ヌクレオチドやカルシウム・燐脂質・ジアシルグリセロールは直接活性には影響を及ぼさなかった。これらの結果は精製したH1ヒストンキナーゼがCキナーゼと類似している可能性を示唆しているが、本来ミオトニンキナーゼは構造的にAキナーゼやCキナーゼと関連のあることが指摘されており、今後特異性の明確な抗体の使用により決着をつけたい。本酵素の基質特異性についても併せて解析していく予定である。筋緊張性ジストロフィー症の原因遺伝子産物と考えられているミオトニンキナーゼの実態と役割を明らかにする目的で、平成8年度はウサギ骨格筋の顆粒画分を調製する過程で検出されたHlヒストンキナーゼの部分精製を試みた。

その結果、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、燐酸カルシウムゲル吸脱着法により、分子量が約5万で環状ヌクレオチドやCa^<2+>によってその活性に影響を受けない酵素を分離した。そこで平成9年度は本酵素の触媒作用の特性を明らかにすることを試みた。Hlヒストンの燐酸化アミノ酸の分析よりセリン残基の燐酸化が確認されたので、この酵素は蛋白質セリン・スレオニン酵素の一種であることが明らかとなった。そこでこのカテゴリーに属する燐酸化酵素の典型的な基質である各種ヒストン、ミエリン塩基性蛋白、カゼイン、リボソームS6蛋白由来ペプチド、Na^+チャネル燐酸化部位由来ペプチド等を基質としてその特異性を解析した結果、Hlヒストンの他のミエリン塩基性蛋白、S6蛋白由来ペプチド、Na^+チャネル由来ペプチド等を燐酸化しそのスペクトラムはプロテインキナーゼC(PKC)と類似していることが判明した。そこで一次元及び二次元のペプチドマップ法で燐酸化ペプチドのオートラジオグラムを比較したところPKCのそれとよく一致することが示された。これらの結果は今回精製したHlヒストンキナーゼがPKCの触媒部位を含むフラグメントに対応する可能性を示唆しているが、必ずしも一致しない性質も認められ今後のさらに詳細な解析が必要となった。
制御性Ｔ細胞コントロールのためのイムノサイトカインの創製と最適化デザイン

制御性T細胞(Treg)は、免疫の抑制性制御を担うリンパ球であり、Treg機能を自在にコントロールすることができれば、免疫難病などの新規治療薬の開発につながると期待される。そこで本研究は、Tregの効率的な増幅・活性化を可能とする医薬品候補、あるいは研究ツールの開発を目的に、TNFR2に対するリガンドの結合とTNFR2のクラスタリングを可能とする新規モダリティ分子の創製を試みるものである。具体的には、研究代表者らがこれまでに見出してきた、Tregの機能制御分子としてのTNFR2に関する知見と、独自のタンパク質機能改変体創製技術や抗体工学技術を基に、TNFR2アゴニストタンパク質と抗TNFR2-scFv(single-chain Fv)抗体から構成されるイムノサイトカイン(TNFR2-IC)の創製を目指す。平成30年度は、TNFR2-ICの創製を進め、下記の成果を得た。1タンパク質機能改変技術によるTNFR2選択的アゴニストタンパク質の作製研究代表者らがこれまでに確立してきた、ファージディスプレイ法に基づくタンパク質機能改変技術により、ヒトTNFR2選択的に作用するアゴニストTNF変異体及びマウスTNFR2選択的に作用するアゴニストTNF変異体の創製を試み、有望な候補クローンを選別した。23量体TNFの一本鎖化の検討TNF-αは、通常ホモ3量体として存在しするが、本研究で創製を目指すイムノサイトカインの組換えタンパク質を効率よく作製するためには、単鎖ペプチドからなるタンパク質が望ましい。そこで、TNFモノマーをペプチドリンカーで連結したsingle-chain TNFが創製できるか検討した。その結果、哺乳類発現系によりsingle-chain TNFが適切に発現・精製できること、また、生物活性も三量体型と比べて大きな違いがないことを確認できた。平成30年度では、TNFR2アゴニストTNF変異体の取得、single-chain TNFの創製確認ができており、計画通りに進捗しいると考える。引き続き研究代表者と分担研究者で連携しつつ、研究室の所属学生にも研究協力してもらいながら、研究の推進に努める。物品の調達額を予定よりも節約できたことと、予定していた出張が不要となったことにより執行予算が計画よりも少なかったが、その分、次年度での実験計画を拡充して実施することとした。
有機無機ハイブリッドデンドリマー：自己集積型ナノ粒子孤立内包ハイブリッド超格子

本研究では,単分散性に優れた磁性・半導体ナノ粒子と液晶性有機デンドロンとを共有結合的にハイブリッド化することにより,ナノ粒子をコアとした“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"を構築した.得られたハイブリッド材料について,その自己組織構造の相転移を誘起し,メタマテリアルとしての人工機能のON-OFFに繋がる材料開発を行った.その結果,CdSナノ粒子をコアとする“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"は自己組織構造由来の蛍光特性を示すことが明らかとなり,超格子構造の形成がメタマテリアル特性のON-OFF制御に極めて有益である事を見出すことができた.本研究では,単分散性に優れた磁性・半導体・強誘電体・導電性球状ナノ粒子と液晶性有機デンドロン分子とを共有結合的にハイブリッド化することにより,ナノ粒子をコアとした“液晶性有機無機デンドリマー"を構築することを第一の目的としている.その手法としてまず,ナノ粒子の粒径とデンドロンの世代を制御することで,様々なサイズの“液晶性有機無機デンドリマー"を合成する.次いで,バイモーダルな粒径からなる液晶性有機無機デンドリマー"を混合することで複合超格子を構築し,メタマテリアル特性を示す有機無機ハイブリッド材料を得る.さらには,得られた“液晶性ナノ粒子孤立内包ハイブリッド超格子"構造の相転移を誘起し,メタマテリアルとしての人工機能のON-OFFに繋がる材料開発を行う.本課題では,アミノ基を有する液晶性有機デンドロンと表面カルボキシル基を有する無機ナノ粒子とのアミド化が鍵となる.そのため,単分散性に優れた表面カルボキシル基修飾半導体および磁性ナノ粒子の合成法確立は不可避である.そこで本年度は,研究協力者と連携し,主に錯体熱分解法によりその合成に取り組んだ.磁性ナノ粒子としてFe3O4ナノ粒子,半導体ナノ粒子として表面カルボキシル基修飾CdSナノ粒子について着目し,それらの合成を行ったところ,当初の目的通り,単分散性に優れたナノ粒子を得ることができた.さらに,アミノ基を有するデンドロンの表面修飾を行う手法の開発を行った.その結果,ナノ粒子表面へのデンドロン修飾量を段階的に制御しつつ密に導入する手法を開発することができた.次年度は得られた成果を基に,ナノ粒子から成る超格子構造の形成に取り組む予定である.本研究では,単分散性に優れた磁性・半導体・強誘電体・導電性球状ナノ粒子と液晶性有機デンドロン分子とを共有結合的にハイブリッド化することにより,ナノ粒子をコアとした“液晶性有機無機デンドリマー"を構築することを第一の目的としている.その手法としてまず,ナノ粒子の粒径とデンドロンの世代を制御することで,様々なサイズの“液晶性有機無機デンドリマー"を合成する.次いで,バイモーダルな粒径からなる液晶性有機無機デンドリマー"を混合することで複合超格子を構築し,メタマテリアル特性を示す有機無機ハイブリッド材料を得る.さらには,得られた“液晶性ナノ粒子孤立内包ハイブリッド超格子"構造の相転移を誘起し,メタマテリアルとしての人工機能のON-OFFに繋がる材料開発を行う.本課題では,アミノ基を有する液晶性有機デンドロンと表面カルボキシル基を有する無機ナノ粒子とのアミド化が鍵となる.そのため,単分散性に優れた表面カルボキシル基修飾半導体および磁性ナノ粒子の合成法確立は不可避である.そこで本年度は,研究協力者と連携し,主に錯体熱分解法によりその合成に取り組んだ.磁性ナノ粒子としてFe3O4ナノ粒子,半導体ナノ粒子として表面カルボキシル基修飾CdSナノ粒子について着目し,それらの合成を行ったところ,当初の目的通り,単分散性に優れたナノ粒子を得ることができた.さらに,アミノ基を有するデンドロンの表面修飾を行う手法を確立した.さらに,ナノ粒子表面へのデンドロン修飾量を段階的に制御しつつ密に導入する手法を開発することができた.昨年度は未修飾デンドロンの除去が問題となったがその改善も進み,次年度,最終年度に向け,ナノ粒子から成る超格子構造の形成に取り組む予定である.本研究では,単分散性に優れた磁性・半導体・強誘電性ナノ粒子と液晶性有機デンドロンとを共有結合的にハイブリッド化することにより,ナノ粒子をコアとした“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"を構築する事を第一の目的とした.その手法としてまず,ナノ粒子の粒径とデンドロンの世代を制御することで,様々なサイズの“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"を合成する.次いで,バイモーダルな粒径からなる“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"を混合することで複合超格子を構築し,メタマテリアル特性を示す有機無機ハイブリッド材料を得ることを第二の目的とした.さらには,得られた“液晶性ナノ粒子孤立内包ハイブリッド超格子"構造の相転移を誘起し,メタマテリアルとしての人工機能のON-OFFに繋がる材料開発を行うことを最終的な目標とする.本課題では,アミノ基を有する液晶性有機デンドロンと表面カルボキシル基を有する無機ナノ粒子とのアミド化が鍵となる.そのため,単分散性に優れた表面カルボキシル基修飾半導体および磁性ナノ粒子の合成法確立は不可避である.そこで本研究では,研究協力者と連携し,主に錯体熱分解法によりその合成に取り組んだ.この際,CdSナノ粒子,Fe3O4ナノ粒子に着目し,これらの合成を行ったところ,当初の目的通り,単分散性に優れたナノ粒子を得ることができた.この際,それぞれの粒子表面上にカルボキシル基を導入する手法を確立し,その導入量を段階的に制御できる手法を確立した.

さらに,アミノ基を有するデンドロンの表面修飾法および修飾量の段階的な制御法を開発することができた.CdSナノ粒子をコアとする“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"は自己組織構造由来の蛍光特性を示すことが明らかとなり,超格子構造の形成がメタマテリアル特性のON-OFF制御に極めて有益である事を見出すことができた.本研究では,単分散性に優れた磁性・半導体ナノ粒子と液晶性有機デンドロンとを共有結合的にハイブリッド化することにより,ナノ粒子をコアとした“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"を構築した.得られたハイブリッド材料について,その自己組織構造の相転移を誘起し,メタマテリアルとしての人工機能のON-OFFに繋がる材料開発を行った.その結果,CdSナノ粒子をコアとする“液晶性有機無機ハイブリッドデンドリマー"は自己組織構造由来の蛍光特性を示すことが明らかとなり,超格子構造の形成がメタマテリアル特性のON-OFF制御に極めて有益である事を見出すことができた.当初の計画では,平成26年度は,有機無機ハイブリッドデンドリマーの構築にあった.特に,量子ドットもしくは磁性ナノ粒子をコアとする有機無機ハイブリッドデンドリマーの合成法の目処が立ち,いずれも順調に進展し,さらにデンドロン修飾によりナノ粒子への流動性の付与についても確認されていることから,おおむね順調に進展していると判断した.27年度が最終年度であるため、記入しない。化学平成26年度までに,有機無機ハイブリッドデンドリマーの構築が可能である事を見出すことができた.しかしながら,特に,磁性ナノ粒子からなる有機無機ハイブリッドデンドリマーに関しては,得られるナノ組織構造に関する精密な解析に至っていないのが現状である.最終年度は,量子ドットおよび磁性ナノ粒子の混合に取り組むことを想定していることから,その前段階である磁性ナノ粒子からなるハイブリッドデンドリマーのナノ組織構造解析は急務である.当初の計画では,有機無機ハイブリッドデンドリマーのコアとなる磁性および半導体ナノ粒子の合成と,得られたナノ粒子表面上へのデンドロン修飾が平成25年度の目的であった.いずれも順調に進展し,さらにデンドロン修飾によりナノ粒子への流動性の付与についても確認されていることから,おおむね順調に進展していると判断した.27年度が最終年度であるため、記入しない。当初物品費にて購入を予定していた分取GPCシステム用カラムにつき,事前実験を行ったところ,目的に十分たる性能が発揮されなかったため,昨年度に引き続き現在,精製条件につき再評価を行っている.再評価ができ次第,適切な物品を購入するための費用に充当すべく,次年度使用額が発生した.状況に応じ,精製装置をカラムクロマトグラフィーから先進分離機に変更する検討も行っている段階である.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度に確立した手法を以ても,機能性ナノ粒子の段階的なサイズ制御と表面カルボキシル基修飾はそれなりの困難を伴うことが予想される.そこで研究代表者は,別途開発してきた独自技術である機能性ナノ粒子表面の均一シリカ修飾法に着目しその開発を行う.
膝神経節におけるTRP受容体ファミリーの機能解析

顔面神経の神経枝である、鼓索神経が障害されると三叉神経支配の舌知覚に異常が出る事を確認した。この知覚異常をモノフィラメント圧痛計と2点間の識別能を調べるディスククリミネーターによって定量化し、術後の機械刺激に対する閾値が術前に比べて上昇していることを確認し、鼓索神経の障害こそが痺れの原因である事が判明した。また膝神経節におけるTRPファミリーの発現変化は有意ではなかった。平成2122年における当科での耳手術症例数338例であった。その内訳は、真珠腫性中耳炎147例、慢性化膿性中耳炎99例、耳硬化症が12例であった。耳硬化症の術後の味覚障害が回復する過程を、実際の耳手術患者の術前、術後の電気味覚検査を使って確認し、ラット鼓索神経切断モデルにおいて神経栄養因子(BDNF, GFRα1, GFRα3)の発現が上昇する事を、国際学術誌(Acta Otolaryngology)に発表した。また日本では経験することが難しい側頭骨の解剖を学ぶために、米国ジアトルで開かれたJAPANlab2009セミナーに参加し、顔面神経、三叉神経および鼓索神経の解剖と走行をより詳しく習得することができた。また顔面神経の神経枝である、鼓索神経が手術によって侵襲される事で、三叉神経支配の舌知覚に異常が出る事を確認した。この知覚異常をモノフィラメント圧痛計と2点間の識別能を調べるディスククリミネーターによって定量化し、術後の機械刺激に対する閾値が術前に比べて上昇していることを確認した。これは非炎症耳において鼓索神経が損傷される事により、鼓索神経から三叉神経に入る神経線維の枝を介して三叉神経節で何らかの発現変化が起こっているものと推測している。今後はラット鼓索神経障害モテルにおいて、三叉神経や三叉神経節において、機械刺激受容体であるTRPV1やTRPA1などの発現変化を確認する予定である。また真珠腫性中耳炎や慢性中耳炎などの炎症が存在する中耳炎では、術前の炎症によって鼓索神経が障害される事によって、非炎症耳に比べて有意に術前の電気味覚検査閾値が上昇している事を確認した。平成22年から平成23年に行なった耳手術症例は350例であり、うち半分以上が真珠腫性中耳炎であった。これらの症例では鼓索神経を切断もしくは障害される事が多く、術後に電気味覚検査で閾値が上昇する。我々は以前に真珠腫性中耳炎や慢性中耳炎などの炎症が存在する中耳炎では、術前の炎症によって鼓索神経が障害される事によって、非炎症耳に比べて有意に術前の電気味覚検査閾値が上昇している事を確認した。術前の味覚障害のない患者でこの電気味覚検査が術後上昇する患者では舌のしびれを有意に訴える事が判明した。顔面神経の神経枝である、鼓索神経が手術によって侵襲される事で、三叉神経支配の舌知覚に異常が出る事を確認した。従来、舌の知覚神経は三叉神経であって味覚は顔面神経分枝の鼓索神経が支配しているとされていたが、我々の研究では術後の三叉神経閾値と術後の舌の痺れ感の間に有意な関係はなく、鼓索神経の障害こそが痺れの原因である事が判明した。またラット鼓索神経障害モデルにおいて、三叉神経や三叉神経節において、機械刺激受容体であるTRPV1やTRPA1などの発現変化を確認したが、有意ではなかった。これらの結果の一部について平成22年の耳科学会(松山)やDresdenでのCHEMOSENSATION(国際学会)で発表した。
天然水中における太陽光誘起不安定化学種の同定と定量

天然水表層では太陽光の照射によって活性酸素種が発生することが指摘されている。とくに溶存有機物に富む沿岸海域では、日照強度の高い晩春期から夏期において、300nMに達する過酸化水素が発生することが、過去の実験からわかっている。本研究では、天然水中に発生する活性酸素種として、過酸化水素の他有機過酸化物、ヒドロキシラジカル、スーパーオキシド陰イオン、一重項酸素など単寿命化学種の同定と定量を目指した。すなわち河川水、海水、及びフミン酸溶液について、太陽光シュミュレーター照射により活性酸素種を発生させ、単寿命の活性酵素種について測定する方法を検討した。有機過酸化物については、すでに開発した過酸化水素のブローインジェクション分析法を活用し、添加するカタラーゼを1000ないし5000ユニットまで増やし、過酸化水素の量から差し引く方法を開発した。またヒドロキシラジカルについては、ベンゼンから生じるフェノールをHPLCで定量する方法を検討した。本研究の主要な部分は、ヌーパーオキシド陰イオンの測定法についての検討である。生化学の分離で開発された、乳酸脱水素酵素(LDH)-NADH法、ニトロブルー・テトラゾリウム法、テトラニトロメタン法を検討した。この結果は天然水のキセノンランプによる光照射について、LDH-NADH法について、マトリックスの単純な河川水でスーパーオキシド陰イオンの生成が認められた。一方アルカリ性ルミノール化学発光については、フローインジェクションシステムでの測定迅速化を図ったが、金属イオンの効果をマスクするなどの方法によって、測定が可能となる結果が得られた。太陽光が天然水に照射すると、スーパーオキシド陰イオン、OHラジカル、過酸化水素、有機過酸化物等の活性酸素種が発生する。このうち過酸化水素は最終反応生成物であり、p-ヒドロキシフェニル酢酸のペルオキシダーゼ存在下での2量化反応により測定してきた。本年度の成果として、瀬戸内海海水における有機過酸化物の測定結果を発表した。これは上記の方法で試料にカタラーゼを500unit及び50000unit添加してその差から有機過酸化物量を見積もるもので、100300nMの濃度であった。一方スーパーオキシド陰イオンやOHラジカルは、不安定かつ短寿命であるため、その測定法の確立が必要である。さらに活性酸素生成反応の初期には、溶存有機物(例えばフミン酸)が光励起され水和電子が放出される過程が存在するとされる。こうした過程を含めて、天然水中で進行する光反応素過程を明らかにすることを目的とした。測定法の開発として本年度行ったのは、スーパーオキシド陰イオンである。この方法は、チタン(IV)-ポルフィリン錯体(Oxo{5,10,15,20-tetra(4-pyridyl)porphyrinato}titanium(IV))が硫酸酸性(濃度:1M)下で過酸化水素と結合して450nmに吸収を与えることを利用するものである。試料にスーパーオキシドディスムターゼ(300unit/mL)を添加したもの及び無添加の試料との差を取ることにより定量するもので、実験室レベルでの光照射実験からは、0.1μMのスーパーオキシド陰イオンが十分測定できる。実際の海水(天然水)に試すのは今後の課題であるが、沿岸海水についてスーパーオキシド陰イオンの反応生成物である過酸化水素が、最大400nM以上発生することから考えて、本法は現場測定に十分対応できるものであると考える。天然水に太陽光が照射されると、溶存有機物(フミン酸など)が励起され、水和電子が発生し、これが溶存酸素と反応してスーパーオキシド陰イオンに変化する。スーパーオキシド陰イオンは数秒の寿命で過酸化水素に変換されていくとされる。本年度はとくにスーパーオキシド陰イオンの測定に焦点を絞り、測定法の検討を重ねた。試料は広島市を流れる太田川、東広島市を流れる黒瀬川および瀬戸内海西部について豊潮丸航海で採取し、ガラスフィルター(Advantec GC-50,保留粒子径0.50μm)でロ過したものを、凍結保存しながら逐次使用した。

測定には生化学で用いられる手法についてまず検討した。まずLDH(乳酸脱水素酵素)-NADH法といわれるもので、この反応はLDHとNADHの複合体にスーパーオキシド陰イオン(以下O_2^-と略)加えると、O_2^-によりNADHが酸化するのを、NADHの340nmの吸収の減少によって測定するものである。この方法で測定を行ったところ、キセノンランプによる1時間の光照射によって高純水(Milli-Q水)で大きな吸収の減少がみられたのに対し、太田川、瀬戸内海では減少は小さかった。次にニトロブルーテトラゾリウム(NTB)還元法を試みた。NTBのアルカリ性下でのO_2^-の還元によるブルーホルマザンの量を、560nmでの吸光度の増加で測定する。然しこの方法もEDTA・2Naの有無にかかわらず光照射の影響は、見られなかった。さらにテトラニトロメタンのO_2^-による還元による366nmの吸収を調べたが、高純水よりも海水・河川水の方がわずかに吸収が多かった。結局こうした生化学的方法よりもルミノールを用いる化学発光法が優れていることがわかった。システムとしては、化学発光管にフローインジェクションシステムを直結したものを用い、光照射後直ちに化学発光測定することによって、天然水中でO_2^-が発生していることをスーパーオキシドジスムターゼを用いて実証した。
光応答機能性ゲル・脱窒脱リン・メタン脱窒プロセスを統合した新AOAシステム

従来、リン・窒素の生物学同時除去法として嫌気-無酸素-好気(A2O)法が用いられてきたが、本研究では、Post-denitrification法としてのAOAシステムの開発を目指している。その基礎研究として、硝化菌包括固定化担体としての光応答機能性ゲルの利用、脱窒条件下での脱リンの促進、メタンを用いた脱窒の試みについて検討した。(1)光刺激応答性ゲルの物性と硝化促進:光応答機能性ゲルとして、クロロフィリン(CH)を導入たイソプロピルアクリルアミド(NiPAAm)を検討した。光刺激に応じたCHによる局所熱生成により、NiPAAm-CHゲルの膨潤・収縮現象が観察された。5CHのCH濃度条件下で、また、体積相転移温度に近い34°Cの温度条件下で非常に大きな体積変化がおきることが確認され、この条件下において、連続光刺激により3倍程度の膨潤率が繰り返し期待できた。硝化活性の促進も確認されたものの、しかしながら、その活性化の理由としては、体積相転移による効果よりも、CH導入にともなう化学的影響や熱力学的影響によるものであると推察された。(2)脱窒条件下における脱リン:AO法汚泥及びA2O法汚泥を用いて、脱窒脱リン活性の有無を検討したところ、明らかに両汚泥にその活性が認められた。同時に、脱リン脱窒活性が優れているほど、亜酸化窒素の生成が抑制される傾向にあった。(3)メタン脱窒の可能性:窒素及びリンの同時除去を行う際、下水中の有機物量が律速となることから、嫌気性汚泥消化過程でふんだんに生成される、Cl化合物であるメタンを唯一の炭素限とする脱窒を試みた。従来、リン・窒素の生物学同時除去法として嫌気-無酸素-好気(A_2O)法が用いられてきたが、本研究では、Post-denitrification法としてのAOAシステムの開発を目指している。(2)脱窒条件下における脱リン:AO法汚泥及びA_2O法汚泥を用いて、脱窒脱リン活性の有無を検討したところ、明らかに両汚泥にその活性が認められた。(3)メタン脱窒の可能性:窒素及びリンの同時除去を行う際、下水中の有機物量が律速となることから、嫌気性汚泥消化過程でふんだんに生成される、C_1化合物であるメタンを唯一の炭素限とする脱窒を試みた。

(1)光刺激応答性ゲルの物性と硝化促進:光応答機能性ゲルとして、クロロフィリン(CH)を導入たイソプロピルアクリルアミド(NiPAAm)を検討した。光刺激に応じたCHによる局所熱生成により、NiPAAm-CHゲルの膨潤・収縮現象が観察された。5CHのCH濃度条件下で、また、体積相転移温度に近い34°Cの温度条件下で非常に大きな体積変化がおきることが確認され、この条件下において、連続光刺激により3倍程度の膨潤率が繰り返し期待できた。硝化活性の促進も確認されたものの、しかしながら、その活性化の理由としては、体積相転移による効果よりも、CH導入にともなう化学的影響や熱力学的影響によるものであると推察された。(2)脱窒条件下における脱リン:AO法汚泥及びA2O法汚泥を用いて、脱窒脱リン活性の有無を検討したところ、明らかに両汚泥にその活性が認められた。同時に、脱リン脱窒活性が優れているほど、亜酸化窒素の生成が抑制される傾向にあった。(3)メタン脱窒の可能性:窒素及びリンの同時除去を行う際、下水中の有機物量が律速となることから、嫌気性汚泥消化過程でふんだんに生成される、Cl化合物であるメタンを唯一の炭素限とする脱窒を試みた。
核内受容体-転写共役因子相互作用による脳発達調節機構と環境化学物質による修飾作用

標記課題について甲状腺ホルモン(TH)-TH受容体(TR)系をモデルに解析した。先天性甲状腺機能低下ラットは新奇環境下で多動を示した。原因はTH低下で生じたβtubulin発現抑制による黒質から線条体へのdopamine輸送低下だった。小脳細胞の初代培養系では,THにより突起伸展が生じ,この作用は環境化学物質(ポリ臭素化ジフェニルエーテルPBDEなど)により抑制された。この際,PBDEは受容体-転写共役因子結合を変化させずTR自体をDNAから解離させることで転写を抑制した。甲状腺ホルモンを始めとする脂溶性ホルモンは核内受容体(NR)を介し標的遺伝子発現を調節する。また,環境化学物質の中にもNRに作用するものがある。発達期の中枢神経系では特定の臨界期にホルモン感受性が上昇し脳発達に重要な機能をはたす。作用機構は明らかではないが,NRや転写共役因子の相互作用によりホルモン感受性が調節されていることが我々の先行研究からわかってきている。そこで本研究では中枢神経系発達におけるリカンドーNR-転写共役因子ネットワークによる調節機構を動物実験,細胞生理学的実験,in vitro実験により統合的に解析する。本年度は以下のような結果を得た。課題1遺伝子変異動物を用いて受容体・共役因子機能変化に伴う行動や遺伝子発現変化を解析:本年度はrdwラットを用いて行動解析と脳内カテコルアミン濃度変化を解析し、行動は多動を示すこと、ならびに脳内のカテコルアミン濃度に変化がみられることを明らかにした。課題2培養神経細胞における受容体・転写共役因子相互作用による細胞機能変化の解析:小脳プルキンエ細胞初代培養系を確立し、甲状腺ホルモンにより樹状突起進展が生じること、および環境化学物質(ポリ臭素化ジフェニルエーテル)により樹状突起伸展が抑制されることが明らかになった。課題3クロマチン免疫沈降法による核内受容体・転写共役因子のDNA結合の経時的解析:脳を始め各組織に発現しエストロゲンの作用に重要なアロマターゼ遺伝子のプロモーターを用い、クロマチン免疫沈降法によりプロモーター領域に転写因子RORαの結合部位があることを明らかにし、論文発表した。そこで本研究では中枢神経系発達におけるリガンド-NR-転写共役因子ネットワークによる調節機構を動物実験,細胞生理学的実験,in vitro実験により統合的に解析する。課題1遺伝子変異動物を用いて受容体・共役因子機能変化に伴う行動や遺伝子発現変化を解析:昨年度に引き続き,rdwラットを用いて行動解析と脳内カテコルアミン濃度変化を解析しデータを増やした。行動は多動、脳内(線条体)のカテコルアミン濃度は低下することがわかった。また,周産期PCB投与でも同様の変化が生じる事がわかった。課題2培養神経細胞における受容体・転写共役因子相互作用による細胞機能変化の解析:小脳プルキンエ細胞初代培養系をもちいて解析し,いくつかの臭素化環境化学物質により甲状腺ホルモンによる樹状突起伸展が抑制されることが明らかになった。また,小脳顆粒細胞の凝集細胞培養系も確立し,解析を始めた。課題3クロマチン免疫沈降法による核内受容体・転写共役因子のDNA結合の経時的解析:クロマチン免疫沈降法ではバックグラウンドが出てしまい、多くの系で解析が止まってしまった。現在,通常の免疫沈降法を用いて結合の解析をおこなっている。課題1遺伝子変異動物を用いて受容体・共役因子機能変化に伴う行動や遺伝子発現変化を解析:本年度もrdwラットを用いて多動発現の機序を調べたところ,脳内チュブリン発現が低下し,ドーパミンの黒漆から線条体までの輸送が阻害されている事が明らかとなった。課題2培養神経細胞における受容体・転写共役因子相互作用による細胞機能変化の解析:小脳プルキンエ細胞

初代培養系に続き,顆粒細胞の集積培養系や,小脳アストロサイトの培養系を確立し、甲状腺ホルモンにより神経線維の伸長が変化したり,アクチン重合が変化する事を明らかにした。また環境化学物質やリポ多糖によりこれらが変化することも明らかになった。課題3クロマチン免疫沈降法による核内受容体・転写共役因子のDNA結合の経時的解析:甲状腺ホルモンの新たな標的遺伝子として,Na-K ATPaseβを同定し、甲状腺ホルモン応答配列を含む領域を同定した。現在領域中の応答配列を確定する実験を行っている。課題1遺伝子変異動物を用いて受容体・共役因子機能変化に伴う行動や遺伝子発現変化を解析した。先天性甲状腺機能低下症を示すdual oxidaseノックアウトマウス小脳,および変異甲状腺受容体をプルキンエ細胞特異的に発現するマウスを用いて,甲状腺機能低下に伴う行動変化(日内行動量やロータロッドなど)を解析した。そして明らかな小脳および大脳発達異常がある事を明らかにした。また,同様に先天性甲状腺機能低下症を示すサイログロブリン遺伝子発現異常ラット(rdw)を用いて同様の実験を行った。行動解析に加え,生化学的な解析も行い,ドーパミンの黒質から線条体までの輸送が障害されいてる事を明らかにした。さらに,発達期ラットに水酸化PCBを投与し,多動を生じる事を確認した。課題2培養神経細胞や小脳スライス標本における受容体・転写共役因子相互作用による細胞機能変化の解析した。マウス小脳スライス標本を用いて,パッチクランプによる細胞膜興奮性の変化を調べた。そしてPurkinje cell-pararllel fiberシナプスにおいて神経伝達の異常がある事を明らかにした。課題3クロマチン免疫沈降法による核内受容体・転写共役因子のDNA結合の経時的解析した。近年開発されたクロマチン免疫沈降法により,核内受容体・転写共役因子と応答配列との結合の経時的変化を解析し,どの受容体や共役因子が転写調節に関与しているのか同定する。神経細胞での解析が困難だったため,神経細胞と同様に膜の興奮により細胞の特性が変化する骨格筋をモデルとして用いて実施した。そしてNa-K ATPase遺伝子に甲状腺ホルモン応答配列を同定し,甲状腺ホルモン受容体が結合している事を同定した。動物モデルを用いた解析については,新たな遺伝しか異変動物も導入し,また,行動解析も順調に進んでいる。細胞培養系もラットからマウスへと移行が順調に進んでおり,当初の目的の達成及び新たな研究計画の策定も視野に入れる事が可能である。ChlPアッセイについては多少遅れており,平成24年度中の達成を目指している。24年度が最終年度であるため、記入しない。核内受容体を介する脳発達調節に関し,神経機能発達をより詳細に解析する事を目指している。核内受容体は転写調節因子であり,従来は標的遺伝子のmRNAレベルでの発現調節に解析が留まっていたが、今後はタンパクレベルでの発現の解析、およびそれを受けた機能的な変化を中心に解析を行っていきたい。
新生児低温療法施行児におけるプロバイオティクス使用の有用性に関する検討

現在わが国では、中等度以上の低酸素性虚血性脳症の新生児に対して死亡率及び神経学的予後を改善するというエビデンスのもと、新生児低体温療法が普及してきている。THのプロトコールが標準化される一方で、経腸栄養管理について統一された指針はなく、経腸栄養開始の遅れなどの臨床経過が生体代謝や腸内細菌叢へ及ぼす影響が懸念される。そこで、THを要したHIEにおける栄養状態の評価やプロバイオティクス使用の効果について、腸内細菌叢、新しい脂肪酸代謝指標、短期及び長期発達予後との関連を検討することを目的とし、臨床研究、およびモデルラットを用いた動物実験を計画した。
網膜色素変性、加齢黄斑変性への小胞体ストレスの関与とそれを標的とした治療法の研究

培養網膜色素上皮細胞(RPE)へのアミロイドβ負荷により血管内皮増殖因子(VEGF)の産生は増加するが、その際に小胞体ストレスマーカーも増加しており、これらは小胞体ストレスを抑制する薬剤である4-フェニル酪酸(PBA)により抑制可能であった。ドルーゼンの構成成分であるアミロイドβの負荷により網膜色素上皮(RPE)での血管内皮増殖因子(VEGF)産生が増加することが報告されている。平成21年度はin vitroにおいて、このVEGF産生増加への小胞体ストレスの関与の有無と、小胞体ストレスを抑制する4-フェニル酪酸(PBA)によりVEGF産生の抑制が可能であるかを検討した。最初にヒトRPE由来の培養細胞であるARPE-19を培養し、アミロイドβを加えた培養液に交換して24時間培養したものと、4-フェニル酪酸(PBA)を添加した培養液で14時間培養したのちに、アミロイドβを負荷したものの細胞と培養液を回収した。ELISA法にて培養液中のVEGF濃度を測定し、ウェスタンブロット法にて細胞ライセート中の小胞体ストレスマーカーであるGRP78/Bip、caspase12、コントロールとしてのGAPDHを検出した。ウェスタンブロッティングのバンドはスキャナでコンピュータに取り込み、SCION ImageによりGRP78/Bip、caspase12、GAPDHの相対値を計算した。結果であるが、アミロイドβ負荷により、コントロールと比較してVEGF、GRP78/Bip、caspase12の濃度は上昇しており、PBAの添加によりこれらは低下していた。なお、GRP78/Bip、caspase12の結果はGAPDHの結果で補正している。これらのことより、RPEへのアミロイドβ負荷によるVEGF産生の増加には、小胞体ストレスが関与していると考えられ、また、小胞体ストレスを抑制する薬剤によりRPEでのVEGF産生の抑制が可能であったから、小胞体ストレスを標的とした薬剤は加齢黄斑変性の予防に有用である可能性があると考えられた。現在、in vivoでの検討を開始しているところである。ドルーゼンの構成成分であるアミロイドβの負荷による網膜色素上皮(RPE)からの血管内皮増殖因子産生の増加には小胞体ストレスが関与することを我々は21年度の研究で見出した。22年度においてはRPEへのアミロイドβ負荷に伴う小胞体ストレスの発生について、さらに検討するとともに、その際のアポトーシスの有無と、小胞体ストレスを抑制する4-フェニル酪酸(PBA)によりこれらの抑制が可能であるかを検討した。最初にヒトRPE由来の培養細胞であるARPE-19を培養し、アミロイドβを加えた培養液に交換して24時間培養したものと、4-フェニル酪酸(PBA)を添加した培養液で14時間培養したのちに、アミロイドβを負荷したものの細胞を回収した。ウェスタンブロット法にて小胞体ストレスに伴うアポトーシスに関与するcaspase12、コントロールとしてのGAPDHを検出した。また一部の細胞については固定した後にGRP78/Bipに対する免疫染色、アポトーシスを検出するTUNEL染色を行った。結果であるが、アミロイドβ負荷により、コントロールと比較して活性型caspasel2、GRP78/Bipは増加しており、PBAの添加によりこれらは低下していた。またアポトーシスをおこした細胞の数についても同様の傾向がみられた。これらのことより、RPEへのアミロイドβ負荷は小胞体ストレスを発生させ、アポトーシスを誘発する可能性が考えられ、また、小胞体ストレスを抑制する薬剤によりこれらの抑制が可能であったから、小胞体ストレスを標的とした薬剤は滲出型、萎縮型の加齢黄斑変性の予防に有用である可能性があると考えられた。
ドイツ語の未来形の歴史的発達についての研究

ドイツ語の未来形は<werdenの直説法現在>+不定詞によって形成されるが、歴史的には<werdenの直説法過去>+不定詞という、現代ドイツ語では見られない特殊形態が未来形に先行して発達する。当該年度の研究においては、この二つの形式の間で、<werdenの接続法2式>+不定詞が発達したことが明らかになった。すなわち、1400年頃に<werdenの直説法過去>+不定詞が発達し、15世紀後半に<werdenの接続法2式>+不定詞が発達、16世紀前半に未来形の<werdenの直説法現在>+不定詞が発達するという順番で各形式が発達する。ここで問われるのは、<werdenの接続法2式>+不定詞の発達が未来形の発達に対していかなる意義を持つのかということであるが、先行して発達する<werdenの直説法過去>+不定詞は、中高ドイツ語においてよく用いられた<beginnenの直説法過去>+不定詞を雛形としており、意味的に制限されていた。すなわち、「言った」のような発言を表す場合、「見た」のようは認識を表す場合、「泣いた」のように理性では制御できない動作や感情を表す場合の三つの場合に用いられることがほとんどであり、beginnen「始める」の意味から通常想定される、例えば「食べ始めた」、「働き始めた」、「暮らし始めた」のような表現は見出されない。それに対し、<werdenの接続法2式>+不定詞においてはそのような意味的制限が見られず、さまざまな動詞の不定詞から作られ、このことが、<werdenの直説法過去>+不定詞から未来形の発達へと移る際の橋渡しの役割を果たした。その際、接続法2式が直説法過去と意味的にも形態的にも連続していることが有効に作用したことが明らかになった。これまでの研究においては、未来形の<werdenの直説法現在>+不定詞が発達する前に<werdenの直説法過去>+不定詞が発達し、後者が前者の発達に影響を与えたことは想定されていたが、その影響がどのようなものであったかは不明であった。当該年度の研究においては、その両形式の中間段階として<werdenの接続法2式>+不定詞の発達があったことが資料の調査により明らかになった。その際、<werdenの直説法過去>+不定詞には認められた意味的制限が<werdenの接続法2式>+不定詞においては解除されたということが重要である。すなわち、<werdenの直説法>+不定詞が「未来形」という時制になるためには基本的に不定詞の動詞の意味が制限されてはならない。<werdenの直説法過去>+不定詞は叙事的語りの地の文において、人間の行為であってもそれがあたかも自然現象のように生じたという自発的意味を表すのに用いられた。それに対し、<werdenの接続法2式>+不定詞は非現実の仮定の事態を表すのに用いられるので、特に自発的意味を表す必要はない。<werdenの接続法2式>+不定詞があらゆる種類の非現実の仮定の事態を表すということになると、<werdenの直説法現在>+不定詞があらゆる種類の「未来」の事態を表すのは自然な流れと言える。従来の研究ではwerden+不定詞がもともと開始を表すという説明にとどまっていたが、当該年度の研究により、werden+不定詞の発達の中に、werdenの直説法過去、接続法2式、直説法現在のそれぞれの発達段階が異なり、またそれぞれの間の意味的な連関が示されたことには大きな意味があると考える。ドイツ語の未来形の発達においてこれまで謎とされているのは、未来の事態を表す用法と現在の事態についての推量を表す用法の二つがどのような連関で生じたかであった。これまでの研究により、話法的意味が先行しそのあとで時制的意味が発達したというLeiss (1992)の仮説は正しくないということは明らかであるが、現在の推量の意味がどのようにして生じたかは不明なままであった。当該年度の研究では、<werdenの接続法2式>+不定詞の発達が未来時制の発達に大きく寄与したことが明らかになったが、<werdenの接続法2式>+不定詞が動詞の種類を選ばず、初期の段階ですでに動詞seinの不定詞をとることがあり、その意味が未来形における現在の事態の推量の意味に近似するということに鑑みると、時制的意味と話法的意味のどちらが先という問いの立て方が間違っている可能性が出てきた。新たな可能性として、時制的意味も話法的意味もどちらも<werdenの接続法2式>+不定詞との連動で、いわば同時に発達したということが考えられる。そこで今後は、この新たな可能性を、特に1500年頃の資料にもとづいて検証し、未来形の話法的意味の出現経緯を跡づけたい。そしてまた、未来形の発達が<werdenの直説法過去>+不定詞の衰退と連動していることについても、不定詞の動詞の意味的制限の観点から検証したい。ドイツ語の未来形と現在形の意味的相違を明らかにするために語りの現在形の特性を日本語と比較対照して分析し、ドイツ語の方が日本語よりも文の独立性が高いことを明らかにした。その結果を論文「日独語対照の観点から見た語りの現在形」として公刊した。