hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地中海東岸地域における都市の形成と展開

テルの上段東北部の「城門地区」では、「城門遺構」とそれに重なる建築遺構の関係と年代を明らかにすることを目的とした調査をおこなった結果、「城門遺構」が少なくとも後期青銅器時代には使用されていたことを確認することができた。斜面東側に設定した調査区では、オリーブ油搾油施設(石囲遺構)の精査をおこなった。テル北側下段テラスの調査区では、調査区の土層観察用のアゼを除去して、調査区全体の精査をおこなった結果、鉄器時代1期のオリーブ油搾油施設(石囲遺構)が確認され、遺構内部から多数の炭化オリーブ種実が発見された。以上、今年度をもって、前期青銅器時代からローマ時にいたる居住史を明らかにすることを目的としたテル・レヘシュの発掘調査は一区切りがつくことになり、今後、当該地域における都市や集落の形成、展開過程、文化交流の歴史のなかに、位置づけをおこなってゆくことが課題となる。本研究課題は、イスラエル、下ガリラヤ遺跡に所在するテル・レヘシュ遺跡の発掘調査を軸に、当該地域における青銅器時代・鉄器時代・ローマ時代に至る都市の形成と発達の過程を実証的に跡づけようとするものであるが、本年度は、研究の最終年度にあたるため、テル・レヘシュの発掘調査はおこなわず、補足的な調査と関連研究に集中した。夏期に、本研究の代表者(桑原)と分担者1名(日野)が現地に約2週間の渡航をおこない、調査資料が保管されているキブツ・エン・ドールに滞在しながら、現地協力者のイツィク・パズ博士とともに、前年度までに実施した発掘調査による出土資料の調査(実測や写真撮影などの追加作業)と調査記録についての検討作業をおこない、報告書作成のための打ち合わせなどをおこなった。また、テル・アヴィブ大学を訪問し、考古学研究所・図書館において関連文献を閲覧し、研究所の研究者とテル・レヘシュ出土土器について意見交換をおこなった。一方、国内においては、テル・レヘシュの発掘調査報告書の作成に向けて、データの整理や分析作業を継続し、出土資料や土器などの資料については、各研究分担者が手分けをして検討をおこなった。5月に立教大学で開催された国際会議"Perspecitve from the Perifery-Galilee in the Cultural Changes through Ages"では、研究代表者の桑原が、テル・レヘシュ遺跡の発掘調査成果を報告したが、駐日イスラエル大使ニシム・ベントリット氏も来聴し、また、来日した海外各地の研究者と本研究の成果をめぐって議論をおこなうことができた。このように、当研究の成果は研究者のみならず、国際的な文化交流としても注目されていて、国際的な文化交流・文化貢献の意義もあるテル・レヘシュ遺跡の発掘調査を新たな体制で再開することが大きな目標であるといえる。
完全非接触浮上型フライホイールによる可搬型マイクロ電力貯蔵装置の試作と評価

フライホイール型電力貯蔵装置の概念設計を基に,フライホイール型電力貯蔵装置の試作を行った。また,電力貯蔵装置全体は真空容器内で固定支持する必要があり,冷却を効率良く行うために装置と容器との断熱法について検討・評価した。真空容器は非常に重く危険であるため,ステンレスワイヤと滑車とによる吊り下げ機構を設計・試作した。また,安全面を考慮して,2重の吊り下げ機構を採用した。試作したマイクロ電力貯蔵装置の構造評価を行った。まず,各種結線のため利用したフィードスルーを取り付け,真空容器内の真空度を評価した。その結果,使用したフィードスルーは真空環境での使用が可能であることが分かった。次に変位センサ,真空漏れに関係のない部品などを真空容器内に入れて真空度の評価を行った。さらに,超電導体を入れる冷却容器の真空漏れを真空容器内で1個ずつチェックした。以上の確認が終わった段階で,液体窒素を導入した状態での真空漏れをチェックした。最後に,マイクロ電力貯蔵装置全体を真空容器内に入れて,真空装置内での真空漏れをチェックした。その結果,本装置で真空環境が得られることが判明した。マイクロ電力貯蔵装置の空気中での評価・検討を行った。まず,メカニカルな位置決め機構を用いてフライホイール付きロータの中心軸合わせを行った。この場合,ラジアル方向の位置合わせのみを考えた。次に,空気中で超電導磁気軸受の磁場中冷却を行うことによって,メカニカルな位置決め機構の動作実験を行った。最終的には,フライホイール浮上までの一連の作業を真空容器内で行う必要があることから,これらの実験機構や手順を評価・検討し,浮上に成功した。フライホイール軸中心設定後,超電導磁気軸受の磁場中冷却状況,軸受剛性,ロータの加振特性などの評価・検討を行った。更に,フライホイールの回転減衰時におけるエネルギー損失に視点を置いて蓄積エネルギーの評価・検討を行った。具体的には,超電導磁気軸受のみを用いた場合におけるフライホイールのエネルギー損失の評価・検討を行った。また,同時にフライホイールの振動特性も評価・検討した。はじめに,真空容器と真空装置の試作を行った。真空排気装置は市販品を用い,真空容器は設計・試作を行った。真空容器内外の電気的な入出力を行うフィードスルーは全部で6ヶ所用意し,電磁石とセンサーのための電流端子,真空装置用の測定子,熱電対のために用いた。真空排気装置は真空容器下部から取り付け,ロータリーポンプとターボ分子ポンプで高速かつ高真空まで排気出来るようにした。新しく試作予定のフライホイール型マイクロ電力貯蔵装置の概念設計に必要な基礎データの収集を行った。具体的には,先ず,真空装置のみでの真空度評価を行った。このとき,目標到達真空度の10^<-5>Paレベルに到達した。次に,超電導体の冷却容器の真空容器内における評価を行った。冷却用構造材としては主に銅を用いた。評価項目としては,高真空に耐えてしかも変形しない冷却容器構造と材質を見出す必要があった。更に,先の構造を基に作製された超電導体の冷却ホルダーを用いて,真空中における超電導体の冷却温度の評価を行った。その結果,支持構造が小さい場合は,30K程度の到達温度が得られた。これらの結果は,高真空中でのフライホイール浮上だけでなく,その他の構成要素の設計に役立てる。

さらに,浮上力の温度依存性に関して,評価する方法を考案中である。先に行った装置設計のための基礎実験結果を基に,マイクロ電力貯蔵装置の概念設計を行った。試作するマイクロフライホイールの軸構造として,現在使用している超電導磁気軸受とほぼ同じ構造を採用した。剛性強化のためフライホイール強制変位機構を考案した。まず,前年度中に行ったフライホイール型電力貯蔵装置の概念設計を基に,フライホイール型電力貯蔵装置の試作を行った。また,電力貯蔵装置全体は真空容器内で固定支持する必要があり,冷却を効率良く行うために装置と容器との断熱法について検討・評価した。真空容器は非常に重く危険であるため,ステンレスワイヤと滑車とによる吊り下げ機構を設計・試作した。また,安全面を考慮して,2重の吊り下げ機構を採用した。試作したマイクロ電力貯蔵装置の構造評価を行った。まず,各種結線のため利用したフィードスルーを取り付け,真空容器内の真空度を評価した。その結果,使用したフィードスルーは真空環境での使用が可能であることが分かった。次に変位センサ,真空漏れに関係のない部品などを真空容器内に入れて真空度の評価を行った。さらに,超電導体を入れる冷却容器の真空漏れを真空容器内で1個ずつチェックした。以上の確認が終わった段階で,液体窒素を導入した状態での真空漏れをチェックした。最後に,マイクロ電力貯蔵装置全体を真空容器内に入れて,真空装置内での真空漏れをチェックした。その結果,本装置で真空環境が得られることが判明した。マイクロ電力貯蔵装置の空気中での評価・検討を行った。まず,メカニカルな位置決め機構を用いてフライホイール付きロータの中心軸合わせを行った。この場合,ラジアル方向の位置合わせのみを考えた。次に,空気中で超電導磁気軸受の磁場中冷却を行うことによって,メカニカルな位置決め機構の動作実験を行った。最終的には,フライホイール浮上までの一連の作業を真空容器内で行う必要があることから,これらの実験機構や手順を評価・検討し,浮上に成功した。フライホイール軸中心設定後,超電導磁気軸受の磁場中冷却状況,軸受剛性,ロータの加振特性などの評価・検討を行った。更に,フライホイールの回転減衰時におけるエネルギー損失に視点を置いて蓄積エネルギーの評価・検討を行った。具体的には,超電導磁気軸受のみを用いた場合におけるフライホイールのエネルギー損失の評価・検討を行った。また,同時にフライホイールの振動特性も評価・検討した。
オレフィン、一酸化炭素、アンモニアからのアミド合成反応

オレフィン、一酸化炭素、アンモニアからアミド及びニトリルを合成することを目的として、オレフィンの中で最も基本的な分子であるエチレンを用い、常圧下で反応を行った。各種の金属アンミン錯イオンをシリカに担持した触媒を調製し、本反応に活性を示す金属種の探索を行った。触媒活性の序列は、Ru≫Rh≫Pt>Pdであり、Cu及びCoは活性がないことが分かった。各種Ru前駆体をシリカに担持して触媒活性を調べた結果、[Ru(NH_3)_5N_2]^<2+>または[Ru(NH_3)_6]^<3+>をイオン交換法により担持した触媒が最も高活性であり、Ru_3(CO)_<12>やRu(acac)_3を含浸担持した触媒の活性は前者の1/3程度、RuCl_3を担持した触媒は全く活性を示さないことが分かった。[Ru(NH_3)_5N_2]^<2+>を前駆体として担体の影響を検討した結果、Y型ゼオライトに担持した触媒は活性が高く、プロピオンアミド及びニトリルの合計の生成速度はシリカ担持触媒に比べ2.6倍となった。シリカ担持触媒ではアミドとニトリルがほぼ等量生成するが、固体酸であるY型ゼオライトやシリカ・アルミナに担持した触媒では高選択的にプロピオノニトリルが生成した。末担持のシリカ・アルミナをシリカ担持Ru触媒の下流に充填し反応を行った。その結果、プロピオノニトリルはRu上で生成したアミドが担体上で逐次的に脱水することにより生成することが分かった。担持Ruの触媒活性の前処理、反応温度依存性及び担持Ru触媒昇温脱離測定等を検討した結果、プロピオンアミド及びニトリルを与える活性種は、金属Ruではなく、Ruアンミン錯体のアンミン配位子と原料の一成分である一酸化炭素が部分的に交換した錯体であることが示唆された。ゼオライト担持触媒が高活性を示したのは、この活性種がゼオライト細孔内にイオン交換サイトに安定に保持されるためだと考えられる。
日本における臓器移植:特に腎移植および生体肝移植への精神医学的接近法の設定

生体部分肝移植及び死体腎移植、生態腎移植の移植前及び移植後の面接、心理テストを通じて、日本における臓器移植の精神医学的接近法について研究を行なった。生体部分肝移植については、症例数が少なく、明確なデータが統計学的に結論付けることが出来るほどに至っていない。腎臓移植患者においては新たな患者及びこれまでの患者を検討することによって移植術後の精神症状発現のリスクファクターについて徐々に明らかになった。特にコーネルメディカルインデックス(CMI)の領域IIIおよび領域IVに術前有ったものや術後直後に行われた同じテストによって同じ領域にあるものあるいは術後のテストによって潜在的怒りを示すものが術後に抑うつ、不安ないし不安発作あるいは強い不眠を訴えてリエゾン精神科医による精神療法および薬物治原を要した患者が統計学的に有意に多く存在したことがわかり、このことについて平成15年5月に沖縄で開かれる第44回日本心身医学会総会にて報告予定である(抄録は採用決定済み)。また、移植術前と移植後でのCMIの結果との比較では術前より術後の結果の方がむしろより有意差が強く出ている結果に注目した。これは、質問紙形式の心理テストの限界を示すもので、福西らの先行研究では質問紙法ではなく描画法の方がうおり患者が抱える潜在的な問題をより明確に示すとされている。そこでわれわれも、移植術の前後でHTPテスト(ハウス・ツリー・パーソンテスト)を施行しそのデータを蓄積中である。また、これらのデータで予測しうる精神障害は反応性抑うつや不安、不眠と言った領域の精神障害で、妄想、譫妄なとのよりハードな精神症状の予測因子になっていない可能性が考えられ、これまでにはない予測因子の考察をしなければならないと思われた。最後に、移植を取り巻く患者や家族の認識次第では移植が中止になる場合があり、第14回総合精神病院医学会総会にて「心理社会的問題により生体腎移植に至らなかった3例」を報告した。生体部分肝移植については、症例数が少なく、明確なデータはまだ出るに至っていない。腎移植患者におけるエゴグラムテストとその経過との関連について移植前のエゴグラムテストの結果が移植後における医療スタッフの対応を示唆すると言う所見を2001年9月、第53回日本心身医学会東北地方会(青森市)にて発表した。また、2001年11月に新潟で行なわれた第14回日本総合病院精神医学会において、生体腎移植を予定されながら実際には実施に至らなかった3例を通して、腎移植における精神的な問題を指摘した。精神科医の移植における介入の時期・程度がさまざまな力動が働く生体腎移植において大きく影響を与え、精神科医のリエゾン的介入が腎移植のかなり以前から持続的に必要であることを報告した。臓器移植精神医学における大きな研究テーマが、移植後の精神障害の出現を移植前に何らかの方法で事前にチェックできないかと言うものであるが、この点で移植前後に行なわれたCMIテストの結果の分析が示唆を与えた。生体腎移植後前のCMIで神経症判別領域の重症度が重症であるほど移植術後の易怒性の出現頻度が増加すると言うデータを得た。移植術の前の不安が高いほど家庭内の葛藤を抱きやすく術後も残存しやすい。これらが周囲への敵意となり、易怒性として現れるものと思われる。このため移植スタッフは移植の前後を通してレシピエントの心理社会的背景を理解し、スタッフ自身の陰性感情の出現に留意してレシピエントと接することが必要であることを、2002年1月札幌における第6回日本心療内科学会学術大会にて発表した。以上平成13年度の研究実績の概要を述べたが、特に移植における術前の不安と術後の易怒性の関係については、これまでの研究がほとんどないため、更に研究を積み重ねていく予定である。

また、これらのデータで予測しうる精神障害は反応性抑うつや不安、不眠と言った領域の精神障害で、妄想、譫妄なとのよりハードな精神症状の予測因子になっていない可能性が考えられ、これまでにはない予測因子の考察をしなければならないと思われた。最後に、移植を取り巻く患者や家族の認識次第では移植が中止になる場合があり、第14回総合精神病院医学会総会にて「心理社会的問題により生体腎移植に至らなかった3例」を報告した。
ルテニウム酸化物超伝導体のバルク・表面における電子・スピン状態の解明

本研究は、トポロジカル超伝導体として期待されるルテニウム酸化物超伝導体(Sr2RuO4)の電子・スピン状態を明らかにし、スピン三重項超伝導の表面・界面で起こりうる新奇量子現象を理解するための基盤を形成することを目的とする。近年、角度分解光電子分光(ARPES)を用いたSr2RuO4の電子状態の研究では、表面状態と予測される新しい電子状態が観測され、注目を集めている。その起源としては、ラシュバ効果、表面下層の電子状態が挙げられているが、コンセンサスが得られていない。また、Sr2RuO4では強磁性・反強磁性磁気揺らぎの存在が中性子散乱で報告されているが、磁気揺らぎに由来したバンド構造の折れ曲がり(キンク構造)をARPESで観測した例も、フェルミ面のスピン状態を決定した例もない。本研究では(1)表面電子状態の起源の解明、(2)磁気揺らぎを媒介としたキンク構造の検証、さらには(3)Sr2RuO4の電子状態だけではなくスピン構造を明らかにすることを目的として、高分解能ARPES測定および高分解能スピン分解ARPES測定を行った。その結果、新しい表面電子バンドに関しては、表面層に由来する表面再構成バンドよりも経時変化が著しく、表面下層の電子状態による解釈が難しいことがわかった。また、高分解能ARPES測定から、磁気揺らぎの存在する低エネルギー領域(10meV以下)にキンク構造が存在することが示唆された。今後、酸素同位体効果も含めて、キンク構造の起源の同定を行う予定である。また、高分解能スピン分解ARPES測定からは、バルクの電子状態において、面内のスピン偏極度の観測に成功した。この結果は、スピン・軌道相互作用による解釈が難しいことから、その起源に関して更なる検証が必要である。さらに、本新学術領域メンバーと新たに共同研究を開始し、その準備を着実に進めることが出来た。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、トポロジカル超伝導体として期待されるルテニウム酸化物超伝導体(Sr2RuO4)の電子・スピン状態を明らかにすることにより、スピン三重項超伝導の表面・界面で起こりうる新奇量子現象を理解するための基盤を形成することを目的とする。また、Sr2RuO4では強磁性・反強磁性磁気揺らぎの存在が中性子散乱からは報告されているが、磁気揺らぎに由来したバンド構造の折れ曲がり(キンク構造)をARPESで観測した例はない。さらにフェルミ面のスピン状態に関しての報告例もない。そこで本年度は(1)表面電子状態の起源の解明、(2)磁気揺らぎを媒介としたキンク構造の検証、さらには(3)Sr2RuO4の電子状態だけではなくスピン構造を明らかにすることを目的として、高分解能ARPES測定および高分解能スピン分解ARPES測定を行った。その結果、新しい表面電子バンドに関しては、表面層に由来する表面再構成バンドよりも経時変化が著しいことから、表面下層の電子状態による解釈が難しいことがわかった。これらの結果は、Sr2RuO4のスピン三重項超伝導の機構とも関連する重要なものと考えられることから、次年度も引き続き検証を進める予定である。

また、高分解能スピン分解ARPES測定からは、バルクの電子状態において、面内のスピン偏極度の観測に成功した。この結果は、スピン・軌道相互作用による解釈が難しいことから、その起源に関して更なる検証が必要である。さらに、本新学術領域メンバーと新たに共同研究を開始し、その準備を着実に進めることが出来た。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究申請時に掲げた4つのテーマのうち、3テーマに関して研究が進捗し、研究目的に合致するような興味深い成果が得られている。従って、本研究はおおむね順調に進展していると判断できる。研究申請時には(1)表面バンドの起源の解明、(2)ラシュバ効果の検証・スピン構造の決定、(3)準粒子と磁気励起間の結合の検証、(4)軌道角運動量の構造決定、の4つのテーマを推進するとしていた。しかし、スピン分解ARPES測定を行うためのマシンタイムが年度あたり1-2週しか確保できないことから、(4)軌道角運動量の構造決定に関しては残念ながら見送ることとし、(2)ラシュバ効果の検証・スピン構造の決定にスピン分解ARPESのマシンタイムを充てる予定である。一方で、通常の高分解能ARPESを用いて推進可能な、新しい共同研究テーマを2件ほど、本新学術領域内の研究者と進める予定である。
粘菌細胞の分化過程における遺伝子発現の制御

細胞性粘菌の細胞は集合して組織を形成すると、2種類の細胞(予定柄・予定胞子細胞)に分化する。我々は、予定胞子細胞の分化にともなって特異的に転写を開始する2つの遺伝子(Dp87とSp96)の転写調節機構を調べているが、本研究で次のことが明らかになった。1、Dp87のDNA5'上流域に転写調節に関与するシス領域が存在するが、そこに塩基配列特意的に結合する核内因子とSp96とDNA5'上流域に存在するシス領域に結合する因子が同じ因子である可能性がゲルシフト法を用いた実験から示唆された。さらにそれぞれの結合領域を同定する実験からこの因子はACACCCという塩基配列を認識する可能性が示唆され、これが他のいくつかの予定胞子細胞で特異的に発現する遺伝子の転写調節領域にも存在することが明らかになった。2、組織を分散するとこれらの遺伝子の転写は直ちに停止し既に存在していたmRNAは速やかに壊れていく。しかし、細胞外からcAMAを与えると細胞表面のcAMPレセプタ-を介して刺激が細胞内に伝わり転写が再開しmRNAも再び蓄積する。この過程で上記の核内因子がどの様な挙動を示すかをゲルシフト法で調べたところ転写状態に関係なく因子は存在し特異的にDNAに結合しうることが解った。3、いかなる細胞内信号伝達系を介して細胞外cAMPは転写の調節やmRNAの安定化を行なうのかを、種々のcAMPアナログや細胞分化に影響する薬剤、細胞内信号伝達系の阻害剤を用いて調べた。その結果、細胞表面のcAMPレセプタ-を介した刺激は、細胞のアデニレ-トシクラ-ゼを活性化し細胞内cAMP濃度を上昇さすことでmRNAを安定化することが明らかになった。一方、同じ刺激が細胞内Caイオンを増やすことで転写を引き起こすことも示唆された。
大規模複雑構造物に適用可能な外力同定を援用したモデルベース診断手法の開発

機械・構造物の状態監視・診断は,持続可能な社会の構築のために非常に重要な技術である.異常診断においては,一般的には測定点数が多い方が診断精度は良いと考えられるが,センサー数を劇的に増加させることは現実的ではない.本研究では,外力同定を援用したモデルベース診断手法において,モード解析を利用して仮想的に測定点を増やす方法を提案した.その方法は,実測された応答変化量を数学モデルに基づく応答変化量に変換してから,固有振動モードで展開する方法である.そして,単純なはり構造物に対し,提案手法が同定精度へ及ぼす影響を数値シミュレーションと実験で調査したところ,提案手法の有効性を示すことができた.逆問題のためのモード解析法の構築に関して,昨年度は,測定点と同じ数の振動モードで応答を展開し,近似的に全自由度の応答を得る方法について,数値的な検討を行ったが,実験データを模擬する方法に問題が残った.そこで本年度は,乱数を用いて数値シミュレーションにおける実測データを構築して検討を行った.その結果,若干測定精度が悪くても,測定点数を増やすことで診断精度を維持できることがわかった.次に,実際の異常診断において,少ない測定点のデータから仮想的に測定点数を増加させる方法を構築した.得られる測定データは,正常時と異常発生時の,測定点における応答である.加振方法はランダム加振を採用するので,適当な周波数範囲のデータが得られている.そして異常状態と正常状態の応答変化量を用いて診断を行うため,応答変化量を仮想的に増加させることが必要である.そのため以下の方法を構築した.初めに正常状態の数学モデルを構築する.初期段階の数学モデルは,計測された形状や標準的な特性値によって構築する.今回採用した診断対象物の場合,振動試験のための加振機を診断対象に取り付ける部分の剛性の影響が不明確であるため,全ての測定点の,全ての周波数の応答が平均的に一致するように数学モデルを修正した.この時,実測値とシミュレーション値には差異があり,両者の比率を計算しておく.次に,実測の応答変化量に,先ほど計算した比率を作用させ,シミュレーションの応答変化量を推定する.この値は測定点でしか得られないので振動モードで展開し,近似的に全自由度の応答変化量を得る.このようにして仮想的に測定点数を増加させ,既に構築している異常診断手法で異常発生位置の推定を行ったところ,同定結果の平均値は従来と同様,十分正確であることがわかった.特徴的なことは,そのばらつきが非常に小さく,実際に適用する場合は非常に信頼性が向上することがわかった.機械・構造物の状態監視・診断は,持続可能な社会の構築のために非常に重要な技術である.異常診断においては,一般的には測定点数が多い方が診断精度は良いと考えられるが,センサー数を劇的に増加させることは現実的ではない.本研究では,外力同定を援用したモデルベース診断手法において,モード解析を利用して仮想的に測定点を増やす方法を提案した.その方法は,実測された応答変化量を数学モデルに基づく応答変化量に変換してから,固有振動モードで展開する方法である.そして,単純なはり構造物に対し,提案手法が同定精度へ及ぼす影響を数値シミュレーションと実験で調査したところ,提案手法の有効性を示すことができた.初めに,逆問題のためのモード解析法の構築を行った.逆問題(診断)においては,応答は限られた点でしか測定されず,測定点数と同じ数の振動モードで応答を展開し,近似的に全自由度の応答を得る.この逆問題のためのモード解析法では,測定点のみは正しい応答が再現されるという特徴がある.理論的な構築は完了したので,少ない測定点数から全自由度の応答を近似した際の誤差評価を数値例によって行った.このとき,数学モデルから得られた厳密な応答に混入させる誤差について検討した.今回は,応答の有効数字を変化させる方法を採用したが,応答の再現精度に及ぼす影響が非常に大きいため,仮想的な誤差の混入を実現する方法については,さらなる検討が必要であることがわかった.次に,局所的な異常の発生を,仮想的な外力の作用と見なし,異常発生位置の推定を行った.実際に測定された少ない数の応答データから推定する場合,モード解析を利用して仮想的に測定データを増やして推定する場合を,数値例によって比較・検討した.このとき,異常の発生位置,応答データの精度を種々に変化させて,推定精度を調べた.その結果,異常発生位置の違いが推定精度へ及ぼす影響は少なく,同程度の精度の応答データを用いれば,同程度の精度で異常発生位置が推定できることがわかった.また応答データの精度がよい方が,異常発生位置の推定精度は良いことがわかった.しかし,モード解析を利用して仮想的に応答データを増やした場合でも,異常発生位置の推定精度は大きくは改善されなかった.これは誤差を含んだ測定データの作成方法に原因があると考えられるので,今後の検討が必要である.【平成26年度に実施した研究の成果】少ない測定点のデータから仮想的に測定点数を増加させる方法を構築し,数値シミュレーションで妥当性を確認したので,初めに実験によって実際への適用性を検証した.そのため種々の構造物の基本部材である,単純なはり構造物を対象とした実験装置を構築した.

具体的には中央付近を導電式加振器でランダム加振し,4つのセンサーで加速度を計測した.正常状態と,重りを付加した異常状態の測定を行い,その差から重りの付加位置を同定した.測定データを4つのみ用いる従来手法と,仮想的に増加させる提案手法による同定結果を比較したところ,数値シミュレーションほどばらつきは小さくなかったが,精度の良い同定結果を得ることができた.更に,提案した手法を板構造物に適用した.ここではこれまでに提案してきた手法を改良し,内力同定を行うこととした.数値シミュレーションと,実験による検証を行った.その結果,内力同定が精度良く行えることが確認され,内力の作用位置を見落とした場合の検証方法も確立することができた.【研究期間全体を通じて実施した研究の成果】(A)逆問題のためのモード解析法及び仮想的に測定点を増加させる方法の構築:実測の振動振幅と数学モデルによる振動振幅の比率を利用することで,測定されていない場所の振動振幅が精度良く再現できることがわかった.(B)外力同定を利用した異常診断手法の改良:仮想的に測定データを増加させることで,数値シミュレーションにおいては,従来手法よりもばらつきの少ない同定結果を得ることができた.実験的には従来手法よりややばらつきの小さな同定結果を得ることができた.(C)内力同定を利用した異常診断手法の構築:複雑な構造物に対して,精度良く内力同定を行う手法を構築するとともに,内力の作用位置を見落とした場合の検証方法を確立した.工学逆問題のためのモード解析法の構築,仮想的に測定点を増加させる方法,およびそれを利用した異常診断について理論的な構築が完了し,実測データを用いた検証も完了した.ただし異常原因は一つであり,診断対象は単純なはりである.異常原因が複数ある場合への展開は理論的な構築は完了している.またH25, 26年度で診断対象を二次元的構造物,空間構造物へ適用することになっており,その準備も既に進んでいるので,計画通りに進んでいると考えられる.逆問題のためのモード解析法の構築,仮想的に測定点を増加させる方法,およびそれを利用した異常診断について理論的な構築は完了した.数値例において,誤差の混入方法について検討課題はあるが,本研究の本質ではなく,計画通りに進んでいると考えられる.当初の計画通りに研究を進める.初めに,異常原因が複数ある場合の診断方法を数値的および実験的に検証する.この研究課題は,近年注目されている外力の伝達経路解析(TPA)にも強く関係する.次に,これまでに提案した手法を平面構造物(二次元的構造物),空間構造物(三次元構造物)に適用し,最後に結果の総括を行う.そして,これまでに構築した,外力同定を援用した機械・構造物の異常診断手法の大規模複雑構造物への展開過程で生じる諸課題の解決手段の完成度,診断精度,適用性などを総合的に検証する.当初の計画通りに研究を進める.初めに,複数の外力同定問題に対する定量的な評価方法の構築を行う.複数の位置に異常がある場合へ展開するための外力同定法を構築するため,研究代表者が提案した外力分布の同定手法を応用する.
C-末端アンカー型膜蛋白質の小胞体膜挿入機構

本研究ではC-末端アンカー型膜蛋白質であるHPC-1/syntaxin 1A(HPC-1)の局在化機構をCOS細胞発現系を用いて調べ、以下の結果を得た。1.野生型HPC-1とC-末端疎水性領域の23アミノ酸残基を欠失させたHPC-1Δ266-288(Δ266-288)をCOS細胞に発現させた。細胞内局在を細胞分画法で調べたところ、野生型は膜画分にΔ266-288は可溶性画分に検出された。このことから、HPC-1のC-末端疎水性領域が膜挿入に関与することが確認された。また間接蛍光抗体法では、野生型およびΔ266-288はそれぞれゴルジ領域・細胞膜と細胞質に局在することが明らかになった。2. HPC-1の膜トポロジーと細胞内輸送経路を調べるために、ウシ・オプシンの糖鎖付加配列を含む21アミノ酸残基をC-末端に融合したHPC-1/OP3を作製した。COS細胞に発現したキメラにはEndo H感受性の糖鎖が付加された。このことから、HPC-1の疎水性領域は膜を貫通していることが明らかになった。また、間接蛍光抗体法での結果と照らし合わせると、HPC-1はまず小胞体に挿入された後、分泌経路を経て細胞膜に到達することが示唆された。3. HPC-1の小胞体膜移行配列を調べるため、HPC-1のC-末端33または24アミノ酸残基を大腸菌のマルトース結合蛋白質(MBP)のC-末端に融合したキメラを作製した。COS細胞に発現したMBPが細胞質に局在するのに対し、二種類のキメラは野生型HPC-1と同じくゴルジ領域と細胞膜に局在した。さらにオプシンの糖鎖付加配列を融合したMBP/HPC-1キメラもEndo H感受性の糖鎖が付加された。この結果は、小胞体膜移行および組み込みにはHPC-1のC-末端24アミノ酸残基で充分であることを示している。今年度は細胞膜に局在する膜蛋白質であるHPC-1/syntaxin 1A(HPC-1)の局在化機構をCOS細胞発現系を用いて調べ、以下の結果を得た。2.HPC-1の膜トポロジーと細胞内輸送経路を調べるために、ウシ・オプシンの糖鎖付加配列を含む21アミノ酸残基をC-末端に融合したHPC-1/OP3を作製した。

また、間接蛍光抗体法での結果と照らし合わせると、HPC-1は生合成後、まず小胞体に挿入され分泌経路を経て細胞膜に到達することが示唆された。3.HPC-1の小胞体膜移行配列を調べるため、HPC-1のC-末端33または24アミノ酸残基を大腸菌のマルトース結合蛋白質(MBP)のC末端に融合したキメラを作製した。COS細胞に発現したMBPが細胞質に局在するのに対し、二種類のキメラは野生型HPC-1と同じくゴルジ領域と細胞膜に局在した。さらにオプシンの糖鎖付加配列を融合したMBP/HPC-1キメラもEndo感受性の糖鎖が付加された。この結果は、小胞体膜移行および組み込みにはHPC-1のC-末端24アミノ酸残基で充分であることを示している。今年度は小胞体に局在するC-末端アンカー型膜蛋白質であるミクロゾーム型アルデヒド脱水素酵素(msALDH)の局在化機構をCOS細胞へのマイクロインジエクション系を用いて調べ、以下の結果を得た。1.緑色蛍光蛋白質(GFP)およびGFPとmsALDHのC-末端35アミノ酸残基(膜貫通領域と小胞体移行配列を含む)のキメラ(GFPALDH(35))をCOS細胞に発現させ、それらの細胞内局在を細胞分画法で調べた。その結果、GFPは細胞質画分にキメラはミクロゾーム膜画分に分布することがわかった。またCCDカメ4ラを用いて観察したところ、野生型およびキメラは、それぞれ細胞質と小胞体に局在することが明らかになった。2.野生型およびキメラの組み換え蛋白質を調製した。それらををCOS細胞にマイクロインジェクションし、CCDカメラを用いて細胞内局在を調べると、インジエクション直後細胞質に分布していたキメラは6時間後(37°C条件下)に小胞体に移行することが明らかになった。これに対してGFPは細胞質に留まったままであった。さらに、免疫電顕法を用いてこれらの結果を確認した。3. GFPALDH(35)の小胞体移行は37°C条件下では1時間以内に起こることが判明した。また、マイクロインジエクション後細胞を4°Cに置くとGFPALDH(35)の小胞体移行は観察されず、この反応は温度依存性であることがわかった。4. ATP-γSとGTP-γSはGFPALDH(35)の小胞体移行を阻害した。これらの結果より、GFPALDH(35)の小胞体移行反応はエネルギー依存性であることおよびGTP結合蛋白質が関与することが示唆された。
マイクロアレイによる遺伝子発現情報に基づく肺気腫遺伝子の検索

約200人の日本人喫煙者において、COPDの進展を抑制的に作用すると考えられているTGF-β1の1塩基多型(-509C/T)と(869C/T)をRFLP法により決定し、その頻度を検討し、肺機能指標との関連について解析した。-509Tアレル頻度はCOPD群49.2%、対照群55.8%と対照群で高い傾向を唱認めたが、869Cアレル頻度はCOPD群48.9%、対照群52.5%と差を認めなかった。肺機能指標とはいずれも有意な相関を認めなかった。日本人ではCOPD群、対照群ともに欧米人より頻度が高い傾向にあり、これらの結果、TGF-β1多型の日本人におけるCOPDへの関与は相対的に少ないものと考えられた。次に気道上皮細胞の接着、増殖、アポトーシスに関与し、COPDの病態を修飾する可能性があるE-Cadherinについて、転写効率に影響を与えるE-Cadherinプロモータ領域の1塩基多型(-160C/A)をRFLP法により決定し、その頻度を検討し、肺機能指標との関連について解析した。さらにSilvermanらが報告したSERPINE2遺伝子について、ARMS法とシークエンスにより、その頻度を検討した。SERPDE2遺伝子1塩基多型rs6747096Cアレルの頻度はCOPD群で33.3%、対照群で20.6%とCOPD群で高い傾向を認めた。現在肺機能指標との関連について解析中である。肺気腫7例と対照喫煙者4例、非喫煙者4例のマイクロアレイにより得られたデータで遺伝子発現を比較した。まず、機能的候補遺伝子については(1)オキシダント・アンチオキシダント関連遺伝子計60遺伝子(2)アポトーシス関連遺伝子Bcl-2 family 13 caspasefamily 10 IAP (inhibitor of apotosis)family 6 HSP (heat shock protein)family 32 BAG family 3 apotosis転写因子調節因子34計98遺伝子(3)プロテアーゼ・アンチプロテアーゼ遺伝子MMPs11TIMPs 4 Cathepsins 12 Cystatins 5計32遺伝子について検討した。glutathion peroxidase 1,2やsuperoxide dismutase 2など多くのアンチオキシダント遺伝子の発現が肺気腫肺で喫煙者肺よりも亢進していた。アポトーシス促進作用を有するBax, Bakの発現も肺気腫で高い傾向を認めたが、アポトーシス抑制作用を有するBcl-xL、c-IAP2やICADの発現も肺気腫で高い傾向を認めた。また、DNA断片化に関与するCADの発現も低下傾向であった。caspaseの発現には一定の傾向を認めず、death ligand経路を介するcaspase2は肺気腫で高い傾向を示したが、ミトコンドリア経路で重要なcaspase9の発現は肺気腫ではむしろ低下傾向であった。Caspase8非依存性アポトーシス経路としてのASKやJNKの発現は変化を認めなかった。プロテアーゼ・アンチプロテアーゼ遺伝子ではMMP7,9,11、TIMP2、cathepsin C, D, K, S, W, Z、cystatin A, B, Fが肺気腫で高い傾向を認めた。MMP15の発現だけは肺気腫で低下していた。MMPs、TIMPsについては肺組織から分離したRNAを用い、Real time-PCR法により、マイクロアレイによる遺伝子発現の変動傾向を検証してみた。TGF-β遺伝子多型で気腫性変化の関連について検証してみた。位置的候補遺伝子の検討では、Silvermanらが報告したSERPINE2遺伝子をはじめ、2q染色体を中心に遺伝子多型を検出中である。
ソノプラズマの効率的生成技術の確立

我々が独自に見出したパンチングメタル板援用ソノプラズマ生成装置においてソノプラズマが効率的に生成されるメカニズムを提案した。パンチングメタル板の穴部のエッジなどの尖った部分で種となる気泡が生成され,第一ビヤークネス力によって鉛直下方に輸送された後,超音波圧力場分布の極小値の位置にキャビテーションバブルとしてトラップされることにより,定在化したソノプラズマが得られるものと考えられる。本方式は高電圧を用いない液中プラズマの生成法としてユニークであり,各種のソノケミストリープロセスの高速化に活用できるものと考えられる。平成25年度には,平成24年度に信号が得られるようになった光波マイクロホンによる超音波圧力計測を継続し,信頼性の高い実験結果を得た。それによると,超音波圧力は水面から水深方向に減少する構造を持つが,極小点があり,極小点の位置とキャビテーションバブル(プラズマ)が定在する位置とがほぼ一致した。キャビテーションバブルの膨張・収縮運動を撮影したシャドウグラフ動画から,本装置で生成されるキャビテーションバブルには超音波圧力の低い方向に向かう第一ビヤークネス力が働くと考えるのが妥当であり,超音波圧力の極小点にキャビテーションバブルが補足されるものと考えられた。また,プラズマの発光(ソノルミネッセンス)画像を時間分解撮影し,プラズマの発光はキャビテーションバブルが存在する位置で強いこと,および,キャビテーションバブルが崩壊に向かう時刻にプラズマが発光することを確認した。さらに,超音波振動子での消費電力および吸収超音波電力を測定し,キャビテーションバブルが効率的に生成される条件では吸収超音波電力が大きいものの,その水深に対する依存性はキャビテーションバブルの生成効率の水深依存性より著しく弱いことがわかった。本装置内における超音波圧力分布に関する数値計算にも取り組み,初期的な結果を得た。以上の結果および平成24年度の研究成果を総合すると,容器および水からなるシステム全体が弱い共鳴条件にあり,水に吸収される超音波電力が大きい条件において,超音波圧力の高い水面付近にパンチングメタルを挿入することによりキャビテーションバブルの種を生成し,超音波圧力の空間分布に極小点を作ってそこにキャビテーションバブルを定在化させることが,本装置によってソノプラズマを効率的に生成できるメカニズムであると考えられた。本研究の目的は,超音波を用いて液体中にプラズマ(ソノプラズマ)を効率的に生成するための方法を開発することである。本計画の提案時に偶然的に見出された方法により何故ソノプラズマが効率的に生成されるのかに関するメカニズムを解明し,大型の装置を設計する際に有用な指針を得る。平成24年度には,研究計画調書に記載の研究項目のうち,ソノプラズマ生成の最適化およびキャビテーションバブルの可視化を実行した。また,研究計画調書を提出後に,「光マイクロホン」と呼ばれる測定技術を用いれば水中における超音波強度の空間分布を実測できることがわかったので,この方法を本研究室で実現し,実際にソノプラズマ生成装置中の超音波強度分布を測定した。超音波強度の実測が可能であれば,当初計画した円筒対象型ソノプラズマ生成装置の製作は不要と考え,経費を節減した。また,超音波圧力場の境界要素法計算は実測値が得られてから開始することとして,次年度以降の課題とした。研究の成果として,まず,水中に挿入するパンチングメタル(メッシュ)の位置と容器内に満たす水の水位について,ソノプラズマ生成に最適な条件を実験的に求めた。最適条件においてプラズマ生成空間をシャドウグラフ法で可視化し,高速度カメラを用いてキャビテーションバブルの運動を調べたところ,パンチングメタル付近でバブルの種が形成され,それがメタルから2mm程度離れた位置に移動して定在する様子が観測された。光マイクロホンの測定からは,バブルが定在化する位置において,超音波強度の分布に谷が形成されていることが見出された。以上のことから,パンチングメタル表面はバブルが形成されやすい環境であり,形成されたバブルの種が超音波のポテンシャルによって輸送され,超音波強度の谷に補足されてソノプラズマを生成するというプラズマ生成の描像が得られた。本計画の最終年度にあたる平成26年度には,研究計画調書に記載した研究事項のさらに先を行く研究課題として,本研究で開発した方法で生成されるキャビテーション気泡内で放電プラズマを生成する課題に取り組んだ。キャビテーション気泡雲の中に高電圧電源に接続した棒状電極を挿入したところ,その先端平板部に隣接するキャビテーション気泡の内部において,超音波の周期で点滅するグロー状の放電プラズマが生成された。放電が発生する空間を気泡が存在する空間と比較し,気泡間での放電の伝搬などに関する興味深い結果を得た。また,関連する研究として,液相レーザーアブレーションで生成したキャビテーション気泡内での放電生成実験を行い,気泡内における放電形成過程に関する基礎的な知見を得た。本装置内における超音波圧力分布に関する数値計算では,気泡の存在が超音波場を大きく変化させることを見出し,超音波圧力分布の完全解明に向けての課題を整理した。研究期間を通じての成果は以下のように総括される。

1)パンチングメタル板の挿入によりソノプラズマの生成効率を著しく高める方法を見出し,それを最適化した。2)光波マイクロホンを用いた超音波圧力分布計測およびキャビテーション気泡のシャドウグラフ動画撮影に基づき,本研究の方法によりソノプラズマの生成が効率化できるメカニズムに関するシナリオを構築した。3)本研究の装置における超音波圧力分布に関する数値計算を行い,気泡の存在による超音波場の変化などに関する知見を得た。4)本研究の方法によりソノケミストリープロセスの効率が飛躍的に高まることを実証した。5)本研究の方法で効率生成したキャビテーション気泡内で放電プラズマを生成することに成功し,ソノケミストリープロセスの非平衡化への道筋を示した。プラズマ応用工学本計画の提案時に偶然的に見出された方法により何故ソノプラズマが効率的に生成されるのかに関するメカニズムを解明するという目的に対して,平成24年度よりさらに進んだ理解を得ることができた。超音波圧力場の空間構造に関する数値計算についても初期的結果を得ており,来年度には所期の目的を達成できると考えられる。本計画の提案時に偶然的に見出された方法により何故ソノプラズマが効率的に生成されるのかに関するメカニズムを解明するという目的に対して,初年度の時点で,パンチングメタル表面はバブルが形成されやすい環境であり,形成されたバブルの種が超音波のポテンシャルによって輸送され,超音波強度の谷に補足されてソノプラズマを生成するというというシナリオを得ることができた。今後の検証は必要だが,本計画はおおむね順調に進展していると考える。ソノプラズマ生成のメカニズム解明に関する研究を継続するが,それに加え,ソノプラズマの応用創出にも取り組みたい。具体的には,ナノバブル生成装置とソノプラズマ生成装置を組み合わせることにより,ソノケミストリープロセスを著しく効率化する方式を研究する。また,本研究の発展として,キャビテーションバブルの内部に放電プラズマを生成することを着想しており,平成26年度に取り組みたい。今年度は設備備品の購入計画が無く,すべての予算を消耗品および旅費に充当する計画であったが,これらの経費が予定よりやや少なく推移したために,次年度使用額が生じた。ソノプラズマの効率的な生成メカニズムが解明されれば,それを検証するための装置設計・製作を行う予定であり,その経費に充当する。円筒対称型のソノプラズマ生成装置の試作を見送った経費を,ナノバブル生成装置とソノプラズマ生成装置を組み合わせて新規な応用を創出するための研究に充当する。その他に関しては,研究計画調書に記載のとおり,光学部品などの実験消耗品および旅費に支出する。
非典型的なＷｎｔ受容体Ｒｙｋシグナルによる骨代謝制御機構の解明

Wntシグナルは、発生、恒常性維持、老化など多様な生命現象に関与する。RykはWnt受容体の最新のメンバーである。Rykは、Wntシグナル伝達様式の既存の分類に該当せず、その作用機構については不明な点が多い。Wntが関わる骨代謝調節にも、Rykが関与する可能性がある。本研究では、申請者が作製したRyk条件付遺伝子欠損(Ryk cKO)マウスを用いて、Rykの骨代謝における役割および作用分子メカニズムを解明した。Wntシグナルは多様な生命現象に関与し、その破綻は様々な病態をもたらす。Wnt受容体として7回膜貫通型Frizzledが10種類、1回膜貫通型LRP5, LRP6, Ror1, Ror2およびRykが存在する。Wntは、受容体を使い分けて複雑な生物学的プロセスを精緻に制御し、Rykはその一翼を担う。Wntシグナル伝達様式は古典経路と非古典経路に分類される。古典経路のは骨形成を促進し、非古典経路のWnt5a-Ror2シグナルは、研究協力者の小林らにより、破骨細胞分化を促進することが見出された(Nat Med 18:405, 2012)。一方、Rykシグナルは古典経路と非古典経路の双方に関与し、Rykは異端Wnt受容体と呼ばれる。異端のWntシグナルRykの骨代謝における役割は不明である。Ryk欠損(Ryk KO)マウスは生後1日で死亡するため、Ryk KOマウスを用いた骨代謝機能の解析は不可能であり、申請者が作製したRyk cKOマウスを用いてのみ可能である。これまでにRykは、神経ガイダンスを調節することが示されている(Nature 439:31, 2006)。Rykの生理作用における分子メカニズムは、神経と骨では異なり、状況に応じて多様である可能性がある。本研究は、骨代謝におけるRykの生理作用と分子メカニズムの解明を、国内外において唯一Ryk cKOを用いて行うものである。平成25年度は、実施計画どおり破骨細胞系列特異的Ryk cKOマウスの作製と解析を完了した。全身的なRyk KOマウスは、生後一日で死亡するが、このマウスにおいては破骨細胞数が減少した。しかし、破骨細胞系列特異的Ryk cKOマウスにおいては、特に骨代謝異常は認められなかった。Wntシグナルは発生、成体における恒常性の維持、老化など多様な生命現象に関与し、その破綻は様々な病態をもたらす。1回膜貫通型受容体には、Frizzledの共役受容体として機能するものと、単独で機能するものがある。このようにWntは、受容体の組合せを使い分けて複雑な生物学的プロセスを精緻に制御する。Rykはその一翼を担う。Wntシグナル伝達様式は古典経路と非古典経路の2種類に分類される。古典経路は骨形成を促進し,非古典経路のWnt5a-Ror2シグナルは、研究協力者の小林らにより、破骨細胞分化を促進することが見出された(Nat Med 18:405, 2012)。一方、Rykシグナルは古典経路と非古典経路の双方に関与し,Rykは異端(heretical) Wnt受容体と呼ばれる。Ryk欠損(Ryk KO)マウスは出生日に死亡するため、Ryk KOマウスを用いた骨代謝機能の解析は不可能であり、申請者が作製したRyk cKOマウスを用いてのみ可能である。前年度は,計画通り破骨細胞系列特異的RykcKOの作製と解析を完了した.全身的なRyk KOマウスは,破骨細胞数および骨芽細胞数の減少が認めらたが,破骨細胞系列特異的RykcKOにおいては,特に骨代謝異常は認められなかった.本年度(平成26年度)は,計画通り骨芽細胞系列特異的Ryk cKOマウスの作製および解析を行った.Wntシグナルは、発生、恒常性維持、老化など多様な生命現象に関与する。したがって、Wntシグナル調節機構の解明は、重要である。Wnt-Rykシグナルは、種を超えて神経ガイダンスを調節することが知られている。加えて、Wntが関わる骨代謝調節にも、Rykが関与する可能性がある。しかし、Rykシグナルの骨組織における生理作用については、全くわかっていない。本研究では、申請者が作製したRyk条件付遺伝子欠損(Ryk cKO)マウスを用いて、Rykの骨代謝における役割および作用分子メカニズムを解明することを目的とする。平成27年度は、申請書どおりに骨芽細胞(Ob)特異的Ryk cKO(Ob-Ryk cKO)マウスの解析を行った。Ryk cKOマウスの骨芽細胞におけるRyk遺伝子の欠損が確認された。Ryk遺伝子欠損マウスの骨芽細胞と骨髄間葉細胞の機能について解析したところ、骨芽細胞機能調節への関与が示唆された。

研究期間全般をとおして、おおむね予定通りに進行し、破骨細胞特異的RykcKOマウスおよび、Ob-Ryk cKOマウスの作製に成功し、両マウスの解析を行うことが出来た。その結果、Rykシグナルは、ホメオスタティックな条件下においては、破骨細胞の分化や機能調節への寄与が小さいことが示唆された。Wntシグナルは、発生、恒常性維持、老化など多様な生命現象に関与する。RykはWnt受容体の最新のメンバーである。Rykは、Wntシグナル伝達様式の既存の分類に該当せず、その作用機構については不明な点が多い。Wntが関わる骨代謝調節にも、Rykが関与する可能性がある。本研究では、申請者が作製したRyk条件付遺伝子欠損(Ryk cKO)マウスを用いて、Rykの骨代謝における役割および作用分子メカニズムを解明した。申請書に記した本年度に実施計画の実験はすべて実施し,骨芽細胞系列におけるRykの役割を明確に示すことが出来たため.分子生物学申請時の計画通り,以下の実験を実施予定である(1)リガンド依存的な(i)Rykのリン酸化、および(ii)Ryk相互作用因子の解析(i)Hisタグ付きRykを骨芽細胞または骨髄細胞に過剰発現させ、Wnt3aまたはWnt5aで刺激する。Cell lysateを用い抗His抗体にてRykタンパクを免疫沈降後、抗リン酸化Ser抗体、抗リン酸化Thr抗体もしくは抗リン酸化Tyr抗体を用いウエスタンブロットを行い、Rykがリン酸化されるか検討する。Rykのリン酸化が認められた場合、様々なRykの欠失変異体を作製し、Rykのリン酸化部位を同定する。(ii)(i)で同定したリン酸化部位の前後のアミノ酸配列についてdatabase上でモチーフ検索を行う。その結果を基に、Rykの相互作用因子の候補を絞る。これらの候補因子の抗体を購入し、免疫沈降法により実際に候補因子がRykと相互作用するか、検討する。(2)リン酸化アレイ解析によるRyk下流のシグナルカスケードの同定骨芽細胞系列特異的Ryk cKOマウスおよび野生型マウスの骨組織からタンパク質を抽出しそれぞれCy3またはCy5で蛍光標識する。これを抗体アレイ(Antibody array 500,クロンテック社)に供する。その結果より、Ryk cKOマウスにおいて傷害されているリン酸化カスケードを同定する。申請書に記した研究実施計画すべての実験を終了し、破骨細胞におけるRykの役割を明確に示すことが出来たため。遺伝子型判定用のDNA合成酵素や抗体が,定価より安い金額で購入できたためである申請書どおりに骨芽細胞特異的Ryk cKOマウスの解析を行う予定である。全身的なRyk KOマウスにおける骨形成の低下は、Rykの骨芽細胞系列への直接作用によるのか明らかにする。そのために、Cre-loxPシステムにより、骨芽細胞(Ob)特異的なOsterix発現制御下でRyk遺伝子を欠損させ、Ob-Ryk cKOマウスを作製し、解析を行う。まず、このOb-Ryk cKOマウスにおいて骨芽細胞特異的にRyk発現が抑制されているか、免疫染色により確認する。次に、骨組織形態計測、マイクロCTによる骨密度測定を行う。さらに、Ob-Ryk cKOマウスの骨由来RNAを用いたマイクロアレイ解析を行い、Ryk下流のシグナルカスケードを同定する。さらに、リガンド依存的な(i)Rykのリン酸化、および(ii)Ryk相互作用因子の解析を行う。