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多孔性無機陰イオン交換体の細孔制御及び過塩素酸イオンの選択的捕捉技術に関する研究

陽イオン交換性を持つ層状アルミノケイ酸塩のモンモリロナイトの層間に、塩化ヘキサデシルピリジニウムを陽イオン交換量よりも過剰に挿入することによって陰イオン交換性が発現した。この塩化ヘキサデシルピリジニウム担持モンモリロナイトの過塩素酸イオンの交換容量は1.02 mmol/gとなり高い交換量を示した。また、ガラスカラムにこの陰イオン交換体を充填し、過塩素酸イオンを添加した水道水を流して過塩素酸イオンの濃度変化を調べたところ、少なくとも吸着剤体積の4,000倍量の排出液において、過塩素酸イオンは検出限界濃度(0.01 mg/L)以下に低減できた。本研究では、過塩素酸イオンを選択的に吸着する多孔性鉄系水酸化物の開発ために、細孔の縦方向のFe(OH)6八面体の連結数をm、横方向をnとして[m×n]と表記した場合に、[2×3]または[3×3]の細孔構造を持ち、かつ、陰イオン交換性を有する新規多孔体の合成を目指す。本年度は、既知の[2x2]トンネル構造を持つ鉄系水酸化物(アカガナイト)の合成条件を変えて新規な多孔体の合成を試みるとともに、イオン交換性を持たない層状鉄系水酸化物(レピドクロサイト)にイオン交換性を付与する方法、透過電子顕微鏡による細孔構造の観察法について検討した。塩化鉄の加水分解により合成されるアカガナイトの原料に硫酸鉄や硝酸鉄を用いたり、反応溶液の反応温度やpHを変えて合成したが、[2×3]や[3×3]の細孔構造は形成しなかった。一方、イオン交換性を持たないレピドクロサイトの原料となる塩化鉄の一部をオキシ塩化ジルコニウムに変えて合成したサンプルは、溶液中において過塩素酸イオン、リン酸イオン、臭素イオン、硝酸イオン、硫酸イオンを吸着することがわかった。ジルコニウムの含有量が高いほど陰イオンの吸着量が高く、特に、リン酸イオンに対しては1mmol/g以上の吸着量を示した。透過電子顕微鏡による細孔構造の観察方法の検討は、合成アカガナイトを用いて行った。合成アカガナイトは長さ100200nm、幅1020nmのロッド状粒子であり、透過電子顕微鏡内でサンプルを傾斜して粒子の長軸方向から観察することで細孔の構造を観察できることを確認した。また、観察時の電子線照射に伴う結晶構造の崩壊はなかった。本研究では、過塩素酸イオンを選択的に吸着する多孔性の鉄系水酸化物を開発するために、細孔の縦方向のFe(OH)6八面体の連結数をm、横方向をnとして[m×n]と表記した場合に、[2×3]または[3×3]の細孔構造を持ち、かつ、陰イオン交換性を有する新規多孔体の合成を目指す。本年度は、鉄系層状複水酸化物(Lepidocrocite、γ-FeOOH)の層を構成するFe(III)の一部をZr(IV)に置換してイオン交換性を発現させ、各種オキソ酸イオンに対する交換特性を調べるとともに、合成物を水熱処理して新規な細孔構造の構築を試みた。その結果、レピドクロサイトのFeの一部をZrに置換したイオン交換体(Zr置換率520%)の各種陰イオンに対する分配係数(Kd)は、Zrの置換率に関係なくリン酸・硫酸>硝酸>過塩素酸の順であったが、Zrの置換率が高いほど過塩素酸イオンに対する分配係数は高くなることがわかった。一方、Fe(III)の一部をZr(IV)に置換してイオン交換性を発現させたレピドクロサイトを塩化マグネシウム溶液中で水熱処理し[2×3]または[3×3]の細孔構造の構築を試みたが、細孔構造は構築されなかった。そこで、鉄系以外の種々の層状化合物についても過塩素酸イオンの捕捉剤への応用について予備検討を行った。その結果、層状アルミノケイ酸塩鉱物であるモンモリロナイトの層間に塩化ヘキサデシルピリジニウムを過剰にイオン交換した化合物が過塩素酸イオンに対して高い交換特性を示すことがわかった。各種オキソ酸イオンに対する分配係数は過塩素酸>硝酸>硫酸>リン酸となり、過塩素酸イオンに対して高い分配係数を持つ陰イオン交換体の合成に成功した。本研究は、近年、健康リスク因子として人体への有害性が指摘されている過塩素酸イオンを選択的に捕捉するための無機陰イオン交換体を開発するとともに、過塩素酸イオンを添加した水道水中の過塩素酸イオン濃度を20 ppb以下まで低減する技術を開発するものである。昨年度、層状構造を持つモンモリロナイトの層間に塩化ヘキサデシルピリジニウムを挿入した化合物が、過塩素酸イオンに対して高い分配係数を示すことを明らかにした。そこで、今年度は、水道水中の過塩素酸イオンを塩化ヘキサデシルピリジニウム担持モンモリロナイトで捕捉し、どの程度まで過塩素酸イオン濃度を低減できるかを調べた。

バッチ法での吸着実験の結果、イオンクロマトグラフィー法による検出限界(10 ppb)以下まで過塩素酸イオン濃度を低減でき、本研究の目標値である20ppb以下を達成した。この過塩素酸イオン低減技術の上水処理への応用性について検討するため、カラム法による評価を行った。カラム実験は、塩化ヘキサデシルピリジニウム担持モンモリロナイトをガラスカラムに充填し、過塩素酸イオン濃度が500 ppbになるように調整した水道水を流し、カラムからの排出液をフラクションコレクターでサンプリングした。サンプリングした溶液の過塩素酸イオン濃度を調べたところ、吸着剤の充填体積(1 BED)の4,000倍の体積(4000 BED)以上、イオンクロマトグラフィー法では検出されず、10 ppb以下に低減できることがわかった。また、初濃度が約2,000 ppbであった硝酸イオン濃度も、1,500 BEDまで、20 ppb以下に低減した。硝酸イオンは、過塩素酸イオンと同様に、健康リスク因子の1つである。当該化合物を用いることによって、過塩素酸イオンと硝酸イオンを同時に除去できことから、上水への応用性は高いと考えられる。過塩素酸イオンの選択的捕捉剤の開発のために多孔性の鉄系水酸化物の合成を試みているが、現在のところ多孔化には成功していない。一方、過塩素酸イオンに対して高い選択性を示す層状化合物の合成に成功している。24年度が最終年度であるため、記入しない。イオン交換性を発現させた層状鉄系水酸化物を前駆体に用いた細孔構造構築のための合成条件を詳細に検討する。また、過塩素酸イオンに対して高い選択性を示した塩化ヘキサデシルピリジニウム担持モンモリロナイトについては、過塩素酸イオンを添加した模擬飲料水を用いてどの程度まで過塩素酸イオンを低減できるかをバッチ法で評価し、過塩素酸イオン捕捉剤としての応用について検討する。
心房細動の発症におけるp53-miR34a-SIRT1フィードバック回路の役割

心房細動の発症には心房の電気的および器質的なリモデリングが関与するが、その分子生物学的機序は解明されていない。我々は心房細動動物実験モデルを作成し、心房細動リモデリングにおけるp53-miR34a-SIRT1フィードバック回路の関与を検討した。心房細動の発症は心血管合併症のリスクの増加や生命予後の悪化に関連するが、抗不整脈薬による心房細動の停止および予防には大きな限界があり治療の有効性は未だに不十分である。治療成績向上のために発症機序のさらなる解明が不可欠である。心房細動の発症において心房の機能的および組織学的な変化“リモデリング"が重要な役割を持つ。発症機転の上流に位置する心房リモデリングを抑制し心房細動発症を予防する“アップストリーム治療"の効果に期待がもたれる。本研究は、イヌ疾患モデルを用いて心房細動の電気的および構造的基質の進展機序における、p53-miR34a-SIRT1フィードバック回路の役割を、電気生理学的、組織学的、および分子生物学的に明らかにし、またp53-miR34a-SIRT1フィードバック回路への介入による心房細動抑制の可能性を探索し、その成果によって心房細動の発症機序の解明および今後の心房細動治療の発展に寄与する事を目的とする。当該年度(平成27年度)は動物実験モデルを用いた実験を施行し、従来の検討と矛盾しない実験結果を得た。すなわち高頻度の心房ペーシングにより、偽薬対照群では左心機能の低下とともに、心房有効不応期の短縮、心房内伝導時間の延長、そして心房細動持続時間の延長が確認されたが、アンジオテンシン-II受容体拮抗薬投与群では、それらの変化が抑制され軽減された。さらに両群の心房組織を用いた分子生物学的検討を行い、偽薬対照群では心房組織におけるp53の発現低下とトランスフォーミング増殖因子(TGF)-β1の発現上昇がみられるのに対し、アンジオテンシン-II受容体拮抗薬投与群ではそれらの変化が抑制される事を確認した。これらの結果は本研究の仮説である心房細動リモデリングの細胞内伝達機序におけるp53の関与を示唆する所見である。当該年度(平成27年度)は、予定外の支出(動物用人工呼吸器の老朽化に伴う破損および修理の不可能による新規購入の必要性)による実験動物購入資金の不足などの事情により、実験の進行が遅れたため、現時点ではまだ統計学的検討に十分な頭数のデータが得られず、まだ論文や学会での発表には至っていない。次年度以降に予定通りの実験を実施し十分なデータを得たのちに論文や学会に発表する。当該年度(平成28年度)は前年度(平成27年度)動物実験モデルを用いた実験を施行し、従来の検討と矛盾しない実験結果を得た。当該年度(平成28年度)は、順調に実験を実施し、予定していた動物実験を概ね終了した。また組織学的および分子生物学的検討も行い、結果を別記の論文で発表した。次年度は追加の分子生物学的検討を行い、さらに詳細な病態機序を解明する。

本研究は、イヌ疾患モデルを用いて心房細動の電気的および構造的基質の進展機序における、p53-miR34a-SIRT1フィードバック回路の役割を、電気生理学的、組織学的、および分子生物学的に明らかにし、またp53-miR34a-SIRT1フィードバック回路への介入による心房細動抑制の可能性を探索し、その成果によって心房細動の発症機序の解明および今後の心房細動治療の発展に寄与する事を目的とする。当該年度(平成28年度)は前年度(平成27年度)動物実験モデルを用いた実験を施行し、従来の検討と矛盾しない実験結果を得た。すなわち高頻度の心房ペーシングにより、偽薬対照群では左心機能の低下とともに、心房有効不応期の短縮、心房内伝導時間の延長、そして心房細動持続時間の延長が確認されたが、アンジオテンシン-II受容体拮抗薬投与群では、それらの変化が抑制され軽減された。さらに両群の心房組織を用いた分子生物学的検討を行い、偽薬対照群では心房組織におけるp53の発現低下とトランスフォーミング増殖因子(TGF)-β1の発現上昇がみられるのに対し、アンジオテンシン-II受容体拮抗薬投与群ではそれらの変化が抑制される事を確認した。これらの結果は本研究の仮説である心房細動リモデリングの細胞内伝達機序におけるp53の関与を示唆する所見である。心房細動の発症には心房の電気的および器質的なリモデリングが関与するが、その分子生物学的機序は解明されていない。我々は心房細動動物実験モデルを作成し、心房細動リモデリングにおけるp53-miR34a-SIRT1フィードバック回路の関与を検討した。次年度以降の計画通りに実験を推進する。上記の次年度の計画通りに実験を推進する。循環器内科当該年度(平成27年度)の実験に必要な物品の購入経費として約1,000,000円の支出を予定していたが、実験を進めながら必要な物品を購入したところ、実際の支出は961,619円に収まったため、残った38,381円は次年度(平成28年度)の実験の経費として繰り越した。当該助成金は、翌年度分として請求した助成金と合わせて、実験に必要な物品の購入に使用する。翌年度(平成28年度)も当該年度(平成27年度)と同様にin vivo実験を施行する。助成金は実験動物、実験器具、消耗品などの物品の購入に使用する。
出血性ショック後の循環動態への末梢神経の関与とその制御

感覚神経終末に存在するTRPV1受容体は、マウス出血性ショック後の循環動態に関与し、最終的に24時間後の生存率に影響を与える因子の一つであることが証明された。特に心収縮力と腎臓における臓器血流の調整にTRPV1受容体が関与する可能性が示唆された。手術後管理のうち、循環不全の早期回復が重要だが、末梢循環動態生理における"末梢神経系"の役割は不明である。昨年度、我々はラット、マウスの順に小動物での出血性ショックモデル作製を確立させた。続いて、末梢知覚神経に存在するTRPV1受容体のノックアウト(KO)マウスを手に入れ、繁殖させた。その後、Wild typeとKO typeのマウスを用いて、出血性ショック蘇生後24時間の生存率を評価した。Wild typeでは10%しか生存しなかったが、KO typeは40%であった。Wild typeと比較するとKO typeでは、出血性ショック後の蘇生により平均血圧の回復が認められた。またショック前と蘇生直後における臓器血流を測定すると、Wild typeでは、特に肝臓・脾臓・下大静脈の臓器血流が著明に低下認め、生存率に差が生じる原因の一つに、末梢循環不全が示唆された。今後は、KO typeの蘇生直後の臓器血流と、24時間生存し得たWild/KOマウスの24時間蘇生後の臓器血流を測定し、生存率への影響をさらに検討する。今年は特に、動物用超音波装置を用いた心機能評価(蘇生直後の心収縮力や心拍出量を測定)を行い、循環動態を総合的に検討する予定だが、KO typeマウスの1回当たりの繁殖数が当初の予想より少なく、in vivo実験が予定より遅れた点が昨年度の反省点である。今年も、KO typeマウスの繁殖状況に合わせて、動物実験を継続することになる。今年はさらに、昨年度からすでに採取・保存してある血液および組織を用いて、炎症性サイトカイン変化や炎症性の組織変化を検討する。また、昨年今年と得られた成果を、来年度開催される国際学会(Annual Conference On Shock)に投稿し、発表をめざす。昨年度、我々は末梢知覚神経に存在するTRPV1受容体のノックアウト(KO)マウスを手に入れ、繁殖させた後、Wild typeとKO typeのマウスを用いて、出血性ショック蘇生後24時間の生存率を評価(Wild typeでは20%しか生存しなかったが、KO typeは70%)した。本年度は、まず出血性ショック後の心機能を評価することで、生存率への関与について評価した。具体的には、動物用超音波検査装置を用いて、ショック後の心収縮力や心拍出量を相対的に測定したところ、Wild typeとKO typeで明らかな差を認めなかった。つまり生存率への心機能の関与は少ないものと判断した。次にショック後の末梢血中の赤血球数変化を検討した。結果は、両者に明らかな差を認めず、貧血の程度が生存率に関与している可能性が除外できた。現在は、Evans blueを用いた血管透過性の変化を検討することで、末梢循環不全が生存率に関与するか否か評価することが目的である。今後は、KO typeマウスの繁殖状況に合わせて、動物実験を継続することになる。血管透過性にWild typeとKO typeで差が認められれば、組織中の循環不全の有無を組織学的評価を行う予定である。さらに、昨年度からすでに採取・保存してある血液および組織を用いて、炎症性サイトカイン変化や臓器の免疫組織学的検討を追加する。以上の結果をもって、来年度(2013年)開催される国際学会(Annual Conference On Shock)において発表するとともに、論文作成と投稿を行う予定である。手術後に認める循環不全における“末梢神経系"の役割は不明である。我々は末梢知覚神経に存在するTRPV1受容体のノックアウト(KO)マウスと、Wild type (WT)マウスの比較実験を今年も引き続き行った。出血性ショック蘇生後24時間の生存率(Wild typeで20%、KO typeは70%)に寄与するTRPV1の機序として、昨年は心機能に着目し、動物用超音波検査装置を用いた検討を行い、KO群ではショック後早期から駆出率の改善効果が、さらに後期には心拍出量がWT群に比べて有意に改善することを確認し、TRPV1の心機能への関与が示唆された。本年度はまず末梢循環動態評価として、1Blood flow meter FLO-N1を用いた血流測定と、2Evans blueを用いた血管透過性の変化を検討した。

通常出血性ショックにより血流は低下し、血管透過性は亢進するが、KO群ではショック後早期から、腎臓での血流低下と血管透過性亢進が有意に抑制された。さらに下大静脈血流の低下も抑制される結果を得た。下大静脈の血流低下が抑制されることで心拍出量の改善効果につながると考えられた。腎臓において血流ならびに血管透過性に差が認められたため、組織学的評価を行った。腎臓組織の1組織学的変化、2TRPV1受容体の発現分布、3TRPV1受容体から分泌される神経伝達物質の分布をそれぞれ検討したが、結果として両群間に明らかな差を認めることはできなかった。以上の結果をもって、今年度5月に開催された国内学会(日本外科学会)および6月にU.S.A.(San Diego)で開催される国際学会(Annual Conference On Shock)において発表するとともに、論文作成と投稿を行う予定である。・動物用超音波検査での心機能評価のための手技が予想以上に困難だったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在検討中の、末梢血管の透過性の結果で、両者(Wild typeとKO type)で差が認められれば、最終検討課題である臓器の組織学的検討と末梢血の炎症性変化の評価を行って、研究は一区切りできると考える。
ピロロ〔2,3,4-kl]アクリジン骨格を有する生理活性天然物の合成

最近10年余りの間に,海洋生物からユニークな骨格をもつ含窒素縮合多環芳香族アルカロイドが単離され,細胞毒性などの生物活性を示すことが明かになった.既に,我々はこれらの天然物の多くが分子内にイミノキノリンキノン構造を有することに着目して合成研究を行ない数種の天然物の合成を達成し,更に生物活性を検定した.本研究では,これらの研究結果を基盤として縮合多環芳香族アルカロイドmeridine及びcystodamineの合成を行うと共にplakinidine Cが有する新規骨格pyrrolo[2,3,4-kl]acridine(1)及びbenzo[b]pyrrolo[4,3,2-de][1,10]phenanthrolin-8(11H)-one(2),並びにそれらの誘導体の効率的な合成法を確立して新しい生理活性物質を創製することを目的とした.2.o-Aminoacetophenoneとo-bromonitrobenzeneから4-amino-9-methylacridineを経由して全収率32.4%で7-methylbenzo[b][1,10]phenanthrolin-4(1H)-one(3)を合成できた.しかし,3から2を合成することは困難であることが分かった.近年、海洋生物から種々の含窒素縮合多環芳香族化合物が単離されている。plakinidine A-Cは文献上未知のpyrrolo[2,3,4-kl]acridine骨格を含むアルカロイドで、細胞毒性、駆虫作用、及び逆転写酵素阻害活性を示す興味ある化合物である。本研究では、新規骨格であるpyrrolo[2,3,4-kl]acridine(1)、及び骨格に1を含むbenzo[b]pyrrolo[4,3,2-de][1,10]phenanthroline(2)及びそれらの誘導体の効率的な合成法を確立してplakinidine A-Cの全合成を行い、新しい生理活性物質を創製することを目的とした。なお、溶媒留去などの実験操作は真空ポンプを使用して行い、排水中への有機溶媒の混入を防ぐことができた。1. m-bromonitrobenzeneとo-aminoacetophenoneから得た2-acetyl-3'-nitrodiphenylamineを酸性条件下で加熱すると目的とする1-nitro-9-methylacridine(3)と、3-nitro-9-methylacridine(4)を生成した。副生成物(4)はジオキサン中二酸化セレンで3-nitro-9-formylacridineに酸化されたが、3は同条件でアルデヒドに酸化されなかった。反応条件を検討して3を1-nitro-9-formylacridineに変換し、ニトロ基の還元、閉環を行い、1を合成する予定である。2. 1.と同様の反応で4-nitro-9-methylacridine(5)を合成した。5のニトロ基をアミノ基に還元し、オルトギ酸メチル中でメルドラム酸と反応させ、5-[[(9-methylacridin-4-yl)amino]methylidene]-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione(6)を収率よく得ることができた。6のニトロ化を収率よく行う方法を検討中である。更に3工程の反応でplakinidine Cの骨格であるbenzo[b]pyrrolo[4,3,2-de][1,10]phenanthrolin-8(11H)-oneを合成する計画である。本研究では、新規骨格であるpyrrolo[2,3,4-kl]acridine(1)、及び骨格に1を含むbenzo[b]pyrrolo[4,3,2-de][1,10]phenanthroline(2)及びそれらの誘導体の効率的な合成法を確立してplakinidine A-Cの全合成を行い、新しい生理活性物質を創製することを目的としている。1.m-bromonitrobenzeneとo-aminoacetophenoneから9-methyl-1-nitroacridineを経て1-acetylamino-9-

methylacridine(3)を合成した。3をジオキサン中、二酸化セレンで酸化すると2-acetylpyrrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-one(4)が生成し、4を酸で処理してpyrrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-one(5)を得た。5の1への変換を検討している。2.1.と同様の反応で9ーmethylー4ーnitroacridine(6)を合成した。6のニトロ基をアミノ基に還元し、オルトギ酸メチル中でメルドラム酸と反応させ、5-[[(9-methylacridin-4-yl)amino]methylidene]-2,2-dimethyl-3,-dioxane-4,6-dione(7)を得た。7を無水酢酸中、硝酸カリウムでニトロ化すると5-[[(9-methyl-1-nitroacridin-4-yl)amino]methylidene]-2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione(8)が収率よく得られた。8の熱閉環は不成功であったので、8のニトロ基をアミノ基に還元してから閉環する方法を検討中である(7は熱閉環して7-methylbenzo[b][1,10]phenanthrolin-4(1H)-oneを生成する)。近年,海洋生物から種々の含窒素縮合多環芳香族化合物が単離されている。plakinidine A-Cは文献上未知のpyrrolo[2,3,4-kl]acridine骨格を含むアルカロイドで,細胞毒性,駆虫作用,及び逆転写酵素阻害活性を示す興味ある化合物である.本研究では,新規骨格であるpyrrolo[2,3,4-kl]acridine(1),benzo[b]pyrrolo[4,3,2-de][1,10]phenanthrolin-8(11H)-one(2)(plakinidine A-Cの骨格)及びそれらの誘導体の効率的な合成法を確立して新しい生理活性物質を創製することを目的としている.1.4-Amino-9-methylacridine(3)から合成した7-methylbenzo[b][1,10]phenanthrolin-4(1H)-one(4)をニトロ化すると,8-ニトロ体(14%)と11-ニトロ体(43%)が生成し,目的とする6-ニトロ体は得られなかったので4から2を合成することは困難であることが分かった.2.1-Amino-9-methylacridine(5)から合成した2-acetylpyrrolo[2,3,4-kl]acridin-1(2H)-one(6)をニトロ化すると5-ニトロ体(7)が生成し,7のニトロ基をアミノ基に還元し,オルトギ酸メチル中でメルドラム酸と反応させ,5-[[(2-acetyl-1-oxo-1,2-dihydropyrrolo[2,3,4-kl]acridin-5-yl)amino]-methylidene]
鳥類の脳内浸透圧受容体と下垂体神経葉ホルモンの分泌調節機構

浸透圧受容体が脳に存在し、浸透圧の上昇などを感知して抗利尿ホルモンあるいはアンギオテンシンIIなどを分泌を刺激することは、概念的には古くから言われているが実体は未だ明らかではない。アクアポリン(AQP)は細胞膜にある水を通過させるチャンネルであり、様々な器官に存在する。28kDaのチャンネルを形成するタンパクが初めてAQPとして同定された。AQP4は、広く体の中で分布するがそのmRNAの発現は中枢神経では他の組織に比べ10倍以上高い。in situハイブリダイゼーションの結果、ラットの脳で脳室周囲器官やSON、PVNなどの存在した。AQP4のこの分布は、何らかの生理的な機能を示唆する。鳥類においては、AQPが現在までにどのタイプもクローニングされていない。申請者は、AQPを鳥類で最初にクローニングするとともにこの遺伝子発現をしらべ、浸透圧調節との関係で生理的作用を調べるために本研究を行った。ニワトリの視床下部からtotalRNAを抽出し、そのtotal RNAを逆転写酵素によりcDNAを合成した。このcDNAを用いて、PCRを行った。プライマーは、ヒトのAQP4から作成した。このPCR産物をTAベクターにサブクローニングし、シークエンスした。艀化後2日齢のヒヨコを一日絶水したのち、脳を取り出しtotal RNAを抽出し、RT-PCRにより絶水した場合とコントロールにおける視床下部におけるAQPの遺伝子発現を比較した。約368bpのPCR産物の塩基配列が決まり、この塩基配列をホモロジー検索したところ、ヒトやマウスのAQP4と非常に高い相関が得られた。したがって、このPCR産物は、ニワトリにおけるAQP4であると考えられた。まだ、塩基配列が一部しか決められていないので、現在RACE法を用いて5'と3'末端の塩基配列の決定を進めている。AQP4の遺伝子発現は、絶水することで遺伝子発現が高くなる傾向がみられた。したがって、このクローニングされたAQP4が、ニワトリにおいて何らかの浸透圧調節に関与している可能性が示唆された。哺乳類において、アクアポリンは水チャンネルとして同定され、腎臓などにおいて機能の研究が進んでいる。このアクアポリンのサブタイプであるアクアポリン4(AQP4)は、脳内に存在し水分のセンサーとして調節に関与しているのではないかと考えられている。鳥類においては、アクアポリンの研究は進んでおらず何も報告がされていない。本研究では、ニワトリの脳のAQP4をクローニングし、その局在性を明らかにし、AQP4が浸透圧受容体であるかどうかを明らかにしようとするものである。哺乳類などのクローニングされた塩基配列から、プライマーを設計する。そして、ニワトリの視床下部から抽出したRNAを逆転写しDNAにしたのち、哺乳類から決めたプライマーを用いてPCRを行い、PCRサンプルを電気泳動し一つのバンドが確認し、プラスミッドにサブクローンし、塩基配列を調べた。この塩基配列が、相同性などから哺乳類のAQP4と非常に相同性が高いものであることであることから、この遺伝子断片はニワトリのAQP4であることが示唆された。今後、AQP4であるならば3'-RACEあるいは5'-RACEの方法を用いてAQP4の塩基配列の全長を決定し、また浸透圧などの生理的条件を変化させた場合の遺伝子発現を調べる予定である。

このアクアポリンのサブタイプであるアクアポリン4(AQP4)は、脳内に存在し水分のセンサーとして調節に関与しているのではないかと考えられている。鳥類においては、アクアポリンの研究は進んでおらず何も報告がされていない。本研究では、ニワトリの脳のAQP4をクローニングし、その局在性を明らかにし、AQP4が浸透圧受容体であるかどうかを明らかにしようとするものである。ニワトリにおけるAQP4遺伝子の塩基配列の一部分を決定した。この遺伝子の発現が浸透圧調節に関与しているかどうか調べるために、ヒヨコを絶水させ浸透圧が上昇するときに視床下部におけるAQP4遺伝子の発現を調べた。その結果、AQP4遺伝子の発現が絶水により上昇することが明らかになり、このことはAQP4遺伝子発現が浸透圧調節の何らかの関係を持っていることを示唆した。今後さらに、AQP4遺伝子の全塩基配列をRACE法などを用いて決定すると共に、脳内の局所的なAQP4の遺伝子発現を調べ、さらに浸透圧刺激に対するAQP4遺伝子発現を詳細に調べることにより、浸透圧調節におけるAQP4遺伝子の役割を明らかにすることをさらに進める予定である。
リポポリサッカライドによるウシ卵胞構成細胞の機能障害の解明とその起因分子の探索

分娩後に起こる周産期病の一つである子宮内膜炎を患った乳牛では、卵巣機能や子宮機能の低下が認められ受胎率が極めて低い。その要因の一つとして死滅した感染細菌から放出されるリポポリサッカライド(LPS)の関与が上げられる。本研究では,子宮内膜炎のウシ卵巣内卵胞の各発育段階の卵胞液中にLPSが存在し,高いLPS濃度(>0.5 EU/ml)と低いLPS濃度(<0.5 EU/ml)の卵胞が存在することがわかった。特に,高LPS卵胞では繁殖に必須のステロイドホルモンの産生が抑制されていた。これらのことから,子宮内膜炎による繁殖性の低下は,LPSによる卵胞機能の抑制である可能性が示唆された。本研究は、子宮内膜炎罹患牛の感染細菌から放出されるリポポリサッカライド(LPS)の卵巣機能への影響を解析するため、卵胞構成細胞である顆粒層細胞および卵胞膜細胞のステロイド産生能におけるLPSの影響を解析した。本年度においては、食肉処理場で採取した子宮内膜炎牛の卵巣および子宮を用いて、卵胞内LPS濃度およびステロイドホルモン濃度を測定したところ、高濃度のLPSを含有していた卵胞ではステロイドホルモン濃度が低下していた。さらに、顆粒層細胞におけるステロイドホルモン合成酵素の遺伝子発現も低下していた。この結果は、LPSが直接的に卵胞の機能に影響していることを示している。次に、大卵胞および小卵胞からそれぞれ卵胞膜細胞を採取してステロイド合成能に対するLPSの影響をみたところ、プロジェステロン産生およびアンドロステンジオン産生は対照区に比べ、LPS処理区で有意に減少した。また、これらのホルモンの合成に関与するStARおよびCYP17遺伝子発現は、対照区に比べLPS処理区で有意に減少した。さらに、卵胞膜細胞の増殖能に対するLPSの影響をみてみたところ、LPSによる効果は認められなかった。これらの結果から、卵胞膜細胞におけるLPSの効果として、1)プロジェステロンおよびアンドロステンジオン産生を抑制すること、2)関連酵素群の遺伝子発現も抑制することが明らかとなった。以上のことから、子宮内膜炎の牛では、LPSが卵胞内に到達し、卵胞構成細胞である卵胞膜細胞の機能を阻害している可能性が示されたと同時に、LPSは直接卵胞機能に影響していることが明らかとなった。本研究は、子宮内膜炎罹患牛の感染細菌から放出されるリポポリサッカライド(LPS)の卵胞機能への影響を解析するため、卵胞構成細胞である顆粒層細胞および卵胞膜細胞の黄体化におけるステロイド産生能に対するLPSの影響を解析した。本年度の研究では,これまでに本研究室で作出検討してきた排卵前の大卵胞から分離・採取した顆粒層細胞および卵胞膜細胞を用いた体外培養系の黄体化への分化誘導システムを用いて,LPSの影響を詳細に解析した。大卵胞から採取した顆粒層細胞を黄体化誘導培地で黄体化を誘導し,黄体化に伴って活発に分泌されるプロジェステロン濃度を経時的に測定した。LPSの処理は,黄体化誘導前,黄体化時期および黄体化誘導前から黄体化時期の3つのフェーズを設け,各フェーズのプロジェステロン濃度を調べたところ,いずれのフェーズにおいてLPSの影響は認められなかった。同様の実験を卵胞膜細胞を用いて行ったところ,黄体化誘導前から黄体化時期にかけての長期間のLPS処理が,プロジェステロン濃度を低下させることが明らかとなった。さらに,プロジェステロン産生に関与する酵素であるStARおよび3β-HSDの遺伝子発現およびタンパク質発現を解析したところ,LPSはこれら両因子の遺伝子発現には影響しないが,タンパク質発現を抑制することが明らかとなった。これらの結果から,LPSは顆粒層細胞の黄体化には影響しないが,卵胞膜細胞の黄体化を障害すること,さらにプロジェステロン産生関連因子のタンパク質発現を阻害することが明らかとなった。以上のことから,LPSは卵胞発育のみならず,卵胞膜細胞の黄体化を阻害することにより,卵巣機能の障害を引き起こしている可能性を示唆しており,このことが妊娠黄体あるいは性周期中黄体の不形成を誘導しているのかもしれないことが示唆された。本年度においては、小卵胞あるいは大卵胞から採取した顆粒層細胞のエストラジオール産生およびプロジェステロン産生におけるLPSの影響を解析した。

小卵胞から採取した未成熟の顆粒層細胞を体外培養系にて成熟させる過程におけるLPSの影響をみたところ、エストラジオール産生は対照区に比べLPSの処理濃度が1.0, 5.0および10 μg/mlで有意に減少したのと同時に、このホルモン産生に必須の酵素であるアロマーゼの遺伝子発現も抑制した。一方、プロジェステロン産生はLPSによって抑制させることはなかった。また、顆粒層細胞数もLPSによって減少しなかった。LPS受容体であるTLR4, CD14およびMD2の遺伝子発現を解析したところ、いずれも因子もLPS処理により発現が増加した。大卵胞から採取した成熟顆粒層細胞において、エストラジオール産生は対照区に比べLPS処理区(10 μg/ml)で有意に減少したのと同時にアロマターゼの遺伝子発現も抑制した。細胞数およびプロジェステロン産生においては、LPSによる抑制効果は認められなかった。LPS受容体発現においては、LPS処理による影響は認められなかった。これらの結果から、顆粒層細胞におけるLPSの効果として、1)エストラジオール産生およびアロマターゼ遺伝子発現を抑制すること、2)細胞数およびプロジェステロン産生能には影響を与えないことが卵胞発育に関わらず共通の現象であることを明らかにした。以上、LPSは顆粒層細胞のエストラジオール産生を阻害することにより、卵巣機能を障害している可能性が示唆された。子宮内膜炎を引き起こす感染細菌から放出されるリポポリサッカライド(LPS)が卵巣機能に対して,どのような作用を有するのかを解析するため、雌動物の性周期中に形成される卵胞構成細胞である顆粒層細胞および卵胞膜細胞の黄体化におけるステロイド産生能に対するLPSの影響を検証した。これまでに本研究室で作出検討してきた排卵前の大卵胞から分離・採取した顆粒層細胞および卵胞膜細胞を用いた体外培養系の黄体化への分化誘導システムを用いて,継続的にLPSの影響を解析した。大卵胞から採取した顆粒層細胞を黄体化誘導培地で黄体化を誘導し,黄体化に伴って活発に分泌されるプロジェステロン濃度を経時的に測定した。LPSの処理は,黄体化誘導前,黄体化時期および黄体化誘導前から黄体化時期の3つのフェーズを設け,各フェーズのプロジェステロン濃度を調べたところ,いずれのフェーズにおいてLPSの影響は認められなかった。同様の実験を卵胞膜細胞にも行ったところ,黄体化誘導前から黄体化時期にかけての長期間のLPS処理が,プロジェステロン濃度を低下させることが明らかとなった。さらに,プロジェステロン産生に関与する酵素であるStARおよび3β-HSDの遺伝子発現およびタンパク質発現を解析したところ,LPSはこれら両因子の遺伝子発現には影響しないが,タンパク質発現を抑制することが明らかとなった。これらの結果から,LPSは顆粒層細胞の黄体化には影響しないが,卵胞膜細胞の黄体化を障害すること,さらにプロジェステロン産生関連因子のタンパク質発現を阻害することが明らかとなった。以上のことから,LPSは卵胞発育のみならず,卵胞膜細胞の黄体化を阻害することにより,卵巣機能の障害を引き起こしている可能性を示唆しており,このことが妊娠黄体あるいは性周期中黄体の不形成を誘導しているのかもしれないことが示唆された。生殖科学本年度の研究計画に沿って研究が進められていると考えられる。当該年度の研究計画に沿って研究が進められていると考えられる。
振動刺激によるブラキシズム治療装置の臨床応用

夜間睡眠時ブラキシズム抑制装置を臨床応用するため、過去に開発したデヴァイスを簡便に応用できるように改良した。改良の要点としては従来の装置がスプリントと一体型であったため、その製作が煩雑であった。そのため、センサ、バッテリ、振動子を別のパーツとして製作し、従来の臨床で用いられているスプリント上にアドオン出来る用にした。これによって個々の部品が故障した時の交換も容易になった。また、センサを補強するため、ケプラー腺維を表面に取り付けシリコンゴムの破損をできる限り防ぐようにした。これによって予備実験の結果10KgWの荷重量をかける咬断試験を行った結果、従来の物が約50回で咬断したのに対し200回以上の耐久性を示し、前述のパーツブロックに変更したことに伴う修繕性の改善と併せ、その臨床応用性は大幅に改善されたと考えている。振動によるブラキシズム抑制効果には長期間連続的に振動刺激を付与した場合、経時的に減少する傾向を認めるものもあり、連続的な使用は控え、通常のスプリントで起床時の筋痛、疲労感などを認める場合に使用することが望ましいことが示唆された。また、被験者によって個人差が異なり、振動刺激による抑制効果は個人差が大きいものと思われた。なお、本研究ではデータの記録にテレメトリを用い、記録装置も簡便なものを用いるなど患者の負担をできるだけ軽減したが、データ測定機関が1ヶ月あまりと長期に渡るため、被験者によっては中断せざるを得ないケースが数例あり、このような研究の課題と思われた。また、センサを補強するため、ケブラー腺維を表面に取り付けシリコンゴムの破損をできる限り防ぐようにした。今後は実際の臨床応用で最適な振動エネルギーを求めていく予定である。夜間唾眠時ブラキシズム抑制装置を臨床応用するため、過去に開発したデヴァイスを簡便に応用できるように改良した。
マイクロクラックフリーな表層の”なじみ”効果を利用した超長寿命摺動面の開発

摺動面の寿命を向上させるために、表面を鏡面に仕上げた“はじめからなじみ切った"摺動面、および表層に高さ10μm程度の凹凸を転写してから厚み10μmの潤滑膜を付与した“積極的になじませる"摺動面を製作した。前者の鏡面研削した円筒同士で摺動加速試験を行った結果、寿命が10倍程度長くなることが確認できた。2つめの犠牲膜付与加工を行った摺動面は、試験開始直後1分間で潤滑膜が剥がれることが分かった。これを解決するために、フィラーを添加した複合めっき膜付与で摺動面を強化した。直径数μmの粒子をめっき浴に混合することで、表面に10μm程度の凹凸ができ、従来のめっき膜よりも高い硬度を実現した。歯車や油圧モータ、軸受、シリンダ、などの摺動面は、潤滑油を付与しているが高い押付力と高い剪断力を課されている。ここでは、摺動を繰り返すうちに、表面の凸部同士が摩耗して平滑になる(いわゆる“なじみ")。だがこの間に、局所的だが大きな塑性変形によって、マイクロクラックが発生し、それが伸展して一部の表面が剥がれる。この不良は「ピッティング」と呼ばれ、トライボロジーの最大の問題点になっている。本研究はこのピッティング防止用として、マイクロクラック無しで“なじみ"が容易に生じるような、超長寿命の摺動面を提案する。具体的にひとつは、超精密加工を用いて、表層に残留圧縮応力を保ちながら表面を鏡面に仕上げた“はじめからなじみ切った"摺動面、もうひとつは表層に高さ10μm程度の凹凸を転写してから厚み10μmの潤滑膜を付与した“積極的になじませる"摺動面である。平成24年度は、二つめの犠牲膜付与加工を行った。摺動加速試験において、多くの種類の潤滑膜を試みたが、それらの柔らかい潤滑膜は開始直後1分間で剥がれてしまい、潤滑膜そのものよりも、成膜前に表面を荒らすためのエッチングやショットブラストの条件がその後の摩耗に影響した。また、潤滑液が局所的に切れて摩擦加熱されると、化学的な反応が生じて寿命がばらついた。この潤滑膜の直後のはがれ防止のためにも予め表面を剣山のように凹凸を付与しておくことが有効であると考えられる。また、凹凸のピッチが大きいと、力がかかる凸部の金属接触部と力のかからない凹部との間に剪断応力が働いてクラックが発生するため、ピッチを小さくする必要があることがわかった。平成25年度は、摺動面の強化のためにフィラーを添加した複合めっき膜付与を試みた。直径数μmの粒子をめっき浴に混合することで、表面に10μm程度の凹凸ができることがわかり、その条件の最適化を行った結果、従来のめっき膜よりも高い硬度を実現した。さらにめっき時に生じる空隙に潤滑膜としてフッ素樹脂を充填することで摩擦を低減し、磨耗に対する強度と弾力とを両立することに成功した。ここでは、摺動を繰り返すうちに、表面の凸部同士が摩耗して平滑になる(いわゆる"なじみ")。本研究はこのピッティング防止用として、マイクロクラック無しで"なじみ"が容易に生じるような、超長寿命の摺動面を提案する。

具体的にひとつは、超精密加工を用いて、表層に残留圧縮応力を保ちながら表面を鏡面に仕上げた"はじめからなじみ切った"摺動面、もうひとつは表層に高さ10μm程度の凹凸を転写してから厚み10μmの潤滑膜を付与した"積極的になじませる"摺動面である。平成23年度は、摺動加速試験において、鏡面研削した円筒同士で摺動させてみたが、このとき、寿命は予想通り、10倍程度長くなった。しかし、試験直後は粗い面の円筒と同様に、金属接触が発生し、発生密度は低いがマイクロクラックも発生していた。つまり、金属接触したあと、5分と短時間で潤滑液の上に"浮上"したが、少なくとも5分間の"なじみ"が生じていたことは確かである。このとき、研削した円筒の真円度や回転の振れを測っていなかったが、摺動面はうねりながら接触した可能性があることがわかった。そして、最終的にはピッティングが発生した。鏡面研削加工の加工力で、少数でもマイクロクラックを発生し、それを表層に残したことが考えられる。以上の理由により、摺動面の表面の犠牲潤滑膜の生成工程の確立に時間を要したため、全体のスケジュールがやや遅れている。曲面に微細加工を施すために、リソグラフィ加工と機械加工を試している。前者は大面積への加工に時間がかかることと、大面積かつ曲面の場合は周辺で微細パターンの焦点が外れやすいこととが原因で、全面均一にパターン加工することが困難である。また、機械加工の場合は、歯車に用いられる鉄鋼材料に対する溝加工を行うと工具の磨耗が激しく全面均一な形状を維持するのが難しいということがわかった。以上の理由により、摺動面に微細形状を加工する工程の確立に時間を要したため、全体のスケジュールがやや遅れている。24年度において発生した、摺動面表層の犠牲潤滑膜の技術課題に対し、膜付け条件や母材表面凹凸形状の最適化を図り、犠牲潤滑膜を加工した摺動面の寿命評価を行う。その際、摺動抵抗に注目し、犠牲膜の磨耗メカニズムや接触面におけるメカニカルな現象解明を目指す。23年度において発生した、摺動面の加工の技術課題に対し、加工条件や使用工具の最適化を図り、微細形状を加工した摺動面の寿命評価を行う。また、表面に犠牲膜を付与した摺動面を用意し、同様に摺動面の寿命評価を行う。次年度の研究費は、表面凹凸形状を持つ摺動面の製作、犠牲膜を付与した摺動面の製作、および評価試験に充てる。前年度使用予定だった研究費は、その予備実験を行うための工具費、材料費、実験補助の人件費等に充てる。次年度の研究費は、犠牲膜を付与した摺動面の製作、評価に充てる。
超高精度プロテオーム解析を用いた圧迫性神経障害の新規血中バイオマーカーの確立

本研究は、超高精度プロテオーム解析によって脳脊髄液中に含まれるタンパク質を同定し、高齢者にみられる腰部脊柱管狭窄症の神経障害の定量化をおこなうことを目的としている。これまで専門医により脊柱管狭窄症と診断された9名より脳脊髄液を採取した。神経障害の程度は、Zurich Claudication QuestionnaireおよびNeuropathic Pain Symptom Inventoryを用いて評価した。対照群として、神経圧迫がないことが確認された脊柱側わん症患者(n=8)と間質炎膀胱炎患者(n=18)の脳脊髄液を用いた。高感度質量分析器を用いて網羅的にペプチドを同定し、腰部脊柱管狭窄症患者において、有意に増加あるいは減少しているタンパク質候補分子を28個得た。さらに結果の再現性を確認するために、新規に腰部脊柱管狭窄症患者(n=7)の脳脊髄液を採取し、初回の検索で候補とされた分子について定量をおこなった。その結果、腰部脊柱管狭窄症患者の脳脊髄液においては、対象群に比べ、Chromogranin-A (CGA), Thy-1 membrane専門医により腰部脊柱管狭窄症と診断され、脊髄造影検査をうけた9名より、脊髄造影検査時に脳脊髄液を採取した。また、日本語版がvalidation済のZurich Claudication QuestionnaireoyおよびNeuropathic Pain Symptom Inventoruも用いて、疾患の臨床的重症度を評価した。比較対象として、神経圧迫のない脊柱側わん症患者の脳脊髄液をもちいた。この2グループの検体(各9サンプル)について、高感度質量分析器を用いて、網羅的なタンパク質同定をおこなった。検体は、多量に含まれるアルブミンを除去する条件と、除去操作をおこなわない条件でおこなった。含有タンパク質は、全検体のミックスに対する比として評価した。さらに側わん症患者の年齢が若いことから、加齢による影響があることを考え、別のコントロール群として、比較的高齢である間質性膀胱炎患者から腰椎麻酔時に採取した脳脊髄液を用いて、再度測定をおこなった。測定の結果、腰部脊柱管狭窄症の患者において、有意に増加あるいは減少しているバイオマーカーの候補分子が30程度得られている。臨床検体を集め、実際に候補ペプチドを計測した。本研究の手法によって、患者群と対照群との比較が可能であることが確認できた。本研究は、超高精度プロテオーム解析によって脳脊髄液に含まれるタンパク質を同定し、高齢者にみられる腰部脊柱管狭窄症の神経障害の定量化をおこなうことを目的としている。専門医により腰部脊柱管狭窄症と診断された9名より、脊髄造影検査時に脳脊髄液を採取した。神経症状の程度は、validationがなされているZurich Claudication QuestionnaireおよびNeuropathic Pain Symptom Inventoryを用いて評価した。対照群として、神経圧迫がないことが確認された若年脊柱側わん症患者の脳脊髄液を用いた。まず、この2群の検体について、高感度質量分析器を用いて網羅的にペプチドを同定した。測定はアルブミンを除去する条件と除去操作を加えない条件の2通りでおこなった。含有タンパク質は全検体のミックスに対する比として評価した。さらに加齢による影響を考慮し、腰部脊柱管狭窄症患者の年齢に近い関質性膀胱炎患者から腰椎麻酔時に採取した脳脊髄液を用いて3群による比較をおこなった。測定の結果、腰部脊柱管狭窄患者において、有意に増加あるいは減少しているタンパク質候補分子が30程度得られている。現在、新規に腰部脊柱管狭窄症手術例の脳脊髄液を採取し、結果のverificationをおこなう準備を進めている。再現性が確認された分子については、より精度が高い定量的な分析をおこなう予定である。計測についてはおおむね順調に進展している。研究代表者が2017年2月に群馬大学へ転任したため、新たな倫理申請が必要となるなど研究環境の整備に時間を要している。その結果、腰部脊柱管狭窄症患者の脳脊髄液においては、対象群に比べ、Chromogranin-A (CGA), Thy-1 membrane今後は、1)各候補分子について精密定量をおこない、2)別の患者サンプルでも再現性があるか、を検討する予定である。現在候補としてえられた分子について、新たな検体で再現性が得られることを確認する。倫理委員会での承認がえられしだいverification studyをおこなう。

候補分子についてこれまでと別の検体でverificationをおこなうため、今年度は倫理委員会への申請、検体採取を主に行った。実際の測定はH30年度に入りおこなうため、次年度使用額が生じている。
自己組織化単分子膜を用いた無電解めっきによるsub-10nm薄膜の形成

有機シラン分子の自己組織化単分子膜を用いた表面修飾を利用した無電解めっきにより、ULSI内部配線用の銅拡散バリア層の形成を目指して研究を行って来た。近年のULSI内部配線の微細化に伴い、バリア層の厚さも更なる薄膜化が求められているため、本研究ではPdイオンによる触媒化の条件を見直し、現在得られているものよりもはるかに薄く均一な無電解めっき皮膜を得ることを目的として研究を行ってきた。Pdイオンによる触媒化を行ったときの、有機単分子膜上のアミノ基の状態に関する情報を得るため、多孔質シリコン基板上に有機単分子膜を成膜し、透過フーリエ変換赤外分光法(FTIR)により調べた。ここでは、基板として比表面積の大きい多孔質シリコンを用いることで、透過法による測定が可能となることを期待し、このような検討を行った。しかし、実際に得られた結果からは、有機単分子膜由来の各種振動ピークが見られたものの、アミノ基に関しては明確な情報を得ることは出来なかった。もともと、アミノ基の吸収自体がシャープなピークを表すものではなかったために有意な情報を得ることが出来なかったと考えられる。一方、従来用いている3-aminopropyltriethoxysilane(APTES)の代わりに、Pdイオンを吸着するサイトを分子内に多く持つ有機分子を用いた検討を行った。ここで用いた3-[2-(2-Aminoethylamino)ethylamino]propyltrimethoxysilane(TAMS)は分子内に窒素原子を3つ有する有機シラン分子である。その結果、TAMSを用いた場合には、基板に付与されるPdイオンの数がAPTESを用いた場合よりも数倍多くなることがXPSによる表面分析により確認された。さらに、NiBめっきを行った結果、10nm以下の膜厚においても非常に緻密なめっき皮膜を得ることに成功した。無電解めっきによるNiB合金皮膜のULSI内部配線用銅拡散バリア層への応用を目指して、アミノ基を有するシランカップリング剤による自己組織化有機単分子膜を用いた触媒化処理の研究を行っているが、近年のULSI内部配線の微細化に伴い、バリア層の厚さも更なる薄膜化が求められているために、現在の手法そのままでは急速な配線サイズの縮小についていけない状況である。本研究では、現在得られているものよりもはるかに薄く均一な連続膜を形成する無電解めっき皮膜を得ることを目的とし、有機単分子膜とパラジウムイオンによる触媒化処理の最適化に関する研究を行っている。パラジウム触媒化処理前後での有機単分子膜上のアミノ基の状態の変化を透過フーリエ変換赤外分光法に(FTIR)より調べるために、多孔質シリコンを基板に用いて測定を行った。その結果、アミノ有機単分子に起因する赤外吸収ピークは確認されたが、目的とするアミノ基に関連するピークが不明瞭であり、パラジウム触媒処理による有意な変化を判別することは出来なかった。さらに、ガラスビーズに有機単分子膜を修飾し、通常のパラジウム触媒化処理を行ったものを、透過電子顕微鏡により観察したところ、ガラスビーズ表面付近に還元析出したパラジウム金属と思われる格子像の他に、その周りを覆うように存在するゼリー状の物質が観察された。これはパラジウムの水酸化物が沈殿してガラスビーズ表面に付着したものと考えられる。この結果は、我々の触媒化浴の条件ではほとんどのパラジウムイオンが安定な水酸化物の状態で存在しているという熱力学的計算による結果と一致する。
SPHK/S1Pシグナリングによるβセクレターゼ制御機構の解析

高齢化社会を迎え、アルツハイマー病(AD)は大きな社会問題となっている。その発症機序には、β及びγセクレターゼによる2段階の切断によりAmyloid precursor protein (APP)から生じるAβ分子の患者脳内での蓄積が深く関与している。申請者らは脂質セカンドメッセンジャーとして機能することが知られるSphingosine-1-phoaphate (S1P)の産生酵素であるSphingosinekinase (SPHK)がβセクレターゼを介してAβ産生機構影響を与えることを見出していた。本年度は細胞内S1Pの量が実際にβセクレターゼ活性に影響して、AD発症に寄与する可能性があるか検討することを主眼として以下の研究を進めた。2.SPHKの過剰発現がAβ産生機構に与える影響の解析結果として分子機構の異なるS1P代謝酵素であるSGPL1、SGPP1の発現によりヒト由来のAβおよびβセクレターゼ産物であるβCTFの産生が有意に抑制されることを見出した。またSPHKの一つであるSPHK2の発現は酵素活性依存的にAβ、βCTF産生を増加させることが明らかになったこれらの結果から、これまでに明らかでなかったSPHK/S1Pシグナル、特に細胞内S1Pの量が神経細胞におけるβセクレターゼの活性を制御していることが示唆された。S1P量は免疫応答、神経細胞へのストレスなどにより影響をうける可能性があることから、AD発症機構に関与していることも考えられる。本研究成果から、今後SPHKおよびS1P代謝酵素をターゲットとしたAD根本治療薬の創薬につながることが期待される。