hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
染色体置換マウスを用いた唾液分泌能の個体差と齲蝕感受性に関与する遺伝因子の探索

平成28年度には関連する動物実験計画について、所属機関の倫理審査委員会への審査申請を行い、計画通りコンソミックマウスとその親系統であるマウスC57BL/6系統とC3H系統を対象として、唾液分泌促進薬(ピロカルピンおよびカルバコール)を利用した刺激唾液分泌量の測定を行い、それぞれの系統で有意に唾液分泌量が異なることを明らかにした。さらに平成31年度までに完成を目指す、コンジェニックマウス(染色体特定領域組換えマウス)の作製に着手し、平成28年度に第2番染色体の遠位側約1/4の領域を組換えた個体を作製し、齲蝕感染実験に利用できる個体数を得ることができた。コンジェニックマウスは複数の系統を作製する計画となっており、平成28年度に完成した遠位組換個体の他に、近位を組換えた個体についても作製が進行しており、平成29年中には齲蝕感染実験に利用できる個体数を得られる見込みである。平成28年度計画に立案した通りコンソミックマウスの唾液分泌量および成分の違いの調査を行った。生後40日齢のB6、C3H及びコンソミックそれぞれ雄5匹、雌5匹、計10匹を対象に投与3分後から8分後までの計5分間の唾液を口腔内からピペットマンにて採取し、唾液の重量を測定し一元分散で統計処理を行った。その結果、C3Hが119.1±3.8μg、コンソミックマウスが73.9±3.3μg、B6が45.4±6.0μgであり、それぞれの分泌量には有意差が確認された。これらの唾液分泌量と齲蝕スコアは相関性が見られ、唾液分泌量の違いがマウスの齲蝕感受性に関与していることが示唆された。成分については現在解析が進行中である。更に平成31年度までに行う予定である、第2番染色体上の特定領域をさらに詳細に組換えたマウス(コンジェニックマウス)を作成の作製も進行している。これまでに、第2番染色体上で利用できるDNAマーカーを調査し、約20Mbp間隔でD2Mit237、D2Mit90、D2Mit126、D2Mit100、D2Mit107、D2Mit226、D2Mit200の7マーカーが利用できることが判明した。コンソミックマウスのオスとC57BL/6系統メスを交配して雑種個体および戻し交配個体を作製し、その個体の遺伝子型を7つのマーカーを利用して調査した。多重交差の有無の確認を行い、第2番染色体上の特定領域がC57BL/6由来となった個体を選別し、同じ領域が組換わった個体同士の交配にてホモ型コンジェニックマウスを作製した。現在、第2番染色体動原体から163Mbpに位置するD2Mit226と179Mbpに位置するD2Mit200の間がC3H由来の染色体に置換したホモ型個体を得ている。本研究では、歯の齲蝕症(虫歯)に対する感受性の異なる2系統のマウスから樹立された第2番染色体コンソミックマウスを利用し、唾液分泌量及び成分の違いの調査、唾液腺中のアセチルコリンレセプターのクラスタリング状態の観察、コンソミックマウスの耳下腺及び顎下腺中の遺伝子発現の網羅的調査、第2番染色体上の唾液分泌能に関与する領域の同定を行い、齲蝕感受性に関する宿主の遺伝要因とその機能の解明を行うものである。平成28年度には唾液分泌に関する調査、平成2829年度には免疫染色によるアセチルコリンレセプターの解析とマイクロアレイによる遺伝子発現の調査、そして平成31年度までに染色体の特定領域を置換したコンジェニックマウスを作成する計画を立案し、現在進行している。平成29年度には、平成28年度に作成した第2番染色体の遠位側約1/4の領域を組換えた個体に加えて、2種類のコンジェニックマウスの作成を行った。平成29年度に作成した個体は、第2番染色体中央部の約2/3または1/3の領域を組換えた個体である。
カルポニン欠損マウスを用いた血管肥厚モデルの解析

本研究は、血管の器官培養法を用いて、PDGFによって誘導される血管組織の形態および機能変化を、h1-カルポニン(CP)欠損マウスと正常マウスの血管とで比較検討することにより、増殖性血管病変でのカルポニンの病態生理的役割を明らかにすることを目的としたものである。初年度は基礎的な知見として、血管ならびに他の平滑筋の収縮性におけるカルポニンの意義についての解析を行ったが、研究は望外の発展を見せ、カルポニンが平滑筋収縮機構におけるラッチ機構をになう蛋白質であることを発見できた。概要は以下の通りである。野生型マウス(+/+)及びh1カルポニン遺伝子欠損マウス(-/-)由来の大動脈をKClで刺激すると、同程度の収縮張力が発生した。刺激後初期及び、後期でそれらのクロスブリッジの活性を検討すると、+/+は後期でその活性が低下しラッチ状態を示したが、-/-は後期になってもクロスブリッジの活性は高いままであった。なお、KClによる細胞内Ca^<2+>濃度、ミオシンリン酸化量の変化には両者で違いは認められなかった。また、輸精管平滑筋をKClで刺激すると細胞内Ca^<2+>濃度、リン酸化ミオシン量とも両者で同程度に上昇したが、最大筋短縮速度が-/-で有意に上昇していた。以上の成績から、h1カルポニンがミオシンのアクチンからの解離を抑制することによって平滑筋収縮安定期のクロスブリッジ活性を低レベルに押さえていることが示唆され、ラッチ機構を担う蛋白質であることが証明された。カルポニン欠損の血管を用いて、器官培養法によりPDGFや胎仔血清の作用を見るという研究には至らなかったが、その前段階の基礎的研究として、ウサギ腸間膜動脈およびラット尾動脈を用いた研究を公表できた(論文リスト参照)。本研究は、血管の器官培養法を用いて、PDGFによって誘導される血管組織の形態および機能変化を、h1・カルポニン(CP)欠損マウスと正常マウスの血管とで比較検討することにより、増殖性血管病変でのカルポニンの病態生理的役割を明らかにすることを目的とする。本研究は2年計画で実施されるが、本年度はその初年度に当たり、基礎的な知見として、血管ならびに他の平滑筋の収縮性におけるカルポニンの意義についての解析を行い、以下の成績を得ることが出来た。1)CP+/+マウス、マウスCP-/-から摘出した輸精管を用い、等張性KCI溶液で刺激すると、立ち上がりの速い収縮(peak収縮)を発生した後、静止張力よりわずかに高い持続性収縮を発生した。Peak収縮時におけるforce-velocity関係をisotonic quick release法で求めると、unloaded shortening velocityがCP-/-マウスで有意に大きかった。2)抗ミオシン抗体を用いたウェスタンブロット法で20kDaミオシン軽鎖のリン酸化量を測定したところ、静止状態、KCI刺激後8秒、15分後において、CP+/+マウスおよびCP-/-マウス間でミオシンリン酸化量に違いは認められなかった。3)胸部大動脈を用いKCI溶液で標本を刺激するとCP+/+マウス、CP-/-とも持続性の収縮を発生した。4)KCI収縮後5分後にisometric quick releaseを行うと収縮の回復はCP-/-マウスのほうがCP+/+マウスより速かった。以上の結果より、平滑筋収縮においてカルポニンにはクロスブリッジの回転を抑制する機能を担うことが明らかとなった。次年度はカルポニン欠損の血管を用いて、器官培養法によりPDGFや胎仔血清の作用を見ることになるが、その基礎的研究として、ウサギ腸間膜動脈を用いた2つの研究論文を公表できた(論文リスト参照)。

カルポニン欠損の血管を用いて、器官培養法によりPDGFや胎仔血清の作用を見るという研究には至らなかったが、その前段階の基礎的研究として、ウサギ腸間膜動脈およびラット尾動脈を用いた研究を公表できた(論文リスト参照)。
天然抗酸化性物質の単離と酸化防止機構の解明

食品の品質劣化、変敗は主に食品中の脂質の酸化によって生ずる過酸化脂質に起因する。また生体内においてもこの過酸化脂質は老化や発ガンにかかわると言われている。本研究は食品の保存性、貯蔵性を高める観点から、安全な、効果の高い抗酸化性物質を単離し、構造解析することを目的とした。人類が食用にしてきた植物に注目し、とくに香草系香辛料を選んだ。本年度はオレガノ(Orignum vulgare L.)の極性の高い抽出区分から抗酸化性物質を単離した。具体的には、オレガノの乾燥葉を塩化メチレン、メタノールで抽出し、後者の水溶性区分を精製した。抗酸化活性をロダン鉄法、TBA法で測定してモニターしながら、前記区分をポリアミドを用いたクロマトグラフィで精製し、新規化合物(1)、プロトカテキュ酸、コーヒー酸、ロスマリン酸の活性化合物を単離した。この精製過程で本研究設備備品の液体クロマトグラフ、フラクションコレクターおよびクロマトカラムはおおいに役立った。化合物(1)はmp 204205°Cの無色針状結晶で分子式【C_(20)】【H_(22)】【O_(10)】であった。IR,【^1H】-NMR,【^(13)C】-NMR,MSなどによる機器分析、加水分解物、誘導体の解析により、本化合物を4-β-D-glucopyranosyloxybenzyl 3,4-dihydroxybenzoateと決定した。また合成によってこの構造を確認した。本化合物の抗酸化活性はα-トコフェロールよりも強く、合成抗酸化剤のBHA,BHTとほぼ同等であった。オレガノに共存するヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシケイヒ酸類、フラボノイドとともに抗酸化能が発揮され、保持されていると考えられる。ひきつづき、活性化合物の検索および単離化合物と脂質との相互作用を検討しており、さらに酸化抑制作用のみならず、広く生体における機能を解明していきたい。
SOX転写因子群による中枢神経系の分化と領域化をゼブラフィッシュを用いて解明する

これまでに、グループB1 sox遺伝子(sox2,sox3,sox19a, sox19b)の機能を阻害するために、モルフォリノオリゴヌクレオチドを作製し、その影響を調べた。その結果、4つのグループB1 sox遺伝子を同時に阻害した(ノックダウンした)胚において、明らかに重度な影響が見られた。これまでの結果から、group B1 sox遺伝子が初期の神経系の形成に重要であり、グループ内でほぼ共通の役割を担っているということを明らかになった。本年度の研究によって新たに以下のことを明らかにした。1.ウェスタンブロッティング法を用いて、ノックダウン胚で標的遺伝子のタンパク質量が実際に低下していることを確認した。2.ノックダウンの影響は、グループB1 sox遺伝子のmRNAを共導入することによって緩和された。4つの遺伝子の内、どのmRNAを共導入しても同様に緩和されることを明らかにした。3.ノックダウン胚の影響を詳細に解析するために、in situハイブリダイゼーション法を用いて、既知の様々な遺伝子の発現がどのように変化しているかを調べた。4.ノックダウン胚では、グループB1 sox遺伝子(sox2,sox3,sox19a, sox19b)の発現量が増加していることがわかった。5.bmpの発現が低下しているように思われ、75% epiboly期の胚において、将来表皮になる領域で発現する遺伝子の発現領域が縮小していた。6.将来感覚器になる領域(prepracodal領域)特異的に発現する遺伝子の発現が異所的に観察され、その発現量も低下していた。7.前頭部領域において、いくつかの遺伝子で著しい発現の変化が見られた。8.ノックダウン胚において、中胚葉領域特異的に発現する遺伝子の発現を調べたところ、変化は見られるものの、その変化は劇的なものではなかった。以上の結果から、グループB1 sox遺伝子が発生の初期の段階で中枢神経系の形成、特に頭部前側領域の形成において、重要な役割を担っていることが明らかになった。1.ゼブラフィッシュ胚におけるsox遺伝子の発現領域を、中枢神経系特異的に発現する既知のマーカー遺伝子の発現領域と比較し解析した。これにより様々な発生段階において、sox遺伝子群が中枢神経系のどの領域で発現しているのかを詳細に明らかにした。また中枢神経系のそれぞれの領域で、各sox遺伝子がどのような重なり合いを持つかを明らかにした。2.mRNAをマイクロインジェクションし、sox遺伝子を過剰発現させた胚に見られる影響を調べた。sox遺伝子を過剰発現させた胚では、原腸貫入が終了し、体節形成期に発生が進む頃に多くのembryoが致死になった。また、致死にならず発生が進んだembryoでは、(1)体幹部が短い。(2)単眼・無眼になる。(3)体軸が二股に分かれる。といった影響が見られた。sox遺伝子の過剰発現によって発生の初期の段階から異常が現れることから、初期の発生においてsoxタンパク質の量やその分布が重要である可能性が考えられた。3.morpholino及びgripNAをマイクロインジェクションし、sox遺伝子の活性をノックダウンした胚に見られる影響を調べた。sox遺伝子をノックダウンした胚では、(1)原腸貫入が正常に起こらない。(2)尾部の形成が正常に起こらない。(3)前脳及び中脳領域に欠失が見られる。(4)眼が正常に形成されない。(5)網膜の色素細胞が正常に形成されない。(5)yolkが正常にくびれない。sox遺伝子の活性のノックダウンにより、中枢神経系の形成に重要な原腸貫入の異常、脳領域における欠失、網膜及び眼の形成異常などの影響が見られたことから、sox遺伝子が中枢神経の形成に重要な働きを担っていることが明らかになった。1.ゲノムの比較から、魚類特異的なグループB1 sox遺伝子であるsox19a/bが哺乳類のSox15とオーソログの関係にあることを明らかにした。2.グループB1/Gに属するsok遺伝子が、もともとは共通の一つの遺伝子から二度の倍加を経て生じたことを明らかにした。3.ルシフェレースアッセイを用いて、それぞれのsox遺伝子に対するモルフォリノオリゴヌクレオチドが、標的遺伝子特異的な阻害効果を示すことを明らかにした。4.一つの標的遺伝子に対して、二種類のモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いることで、阻害効果は相乗的に高くなることを明らかにした。5.グループB1 sox遺伝子が、初期の中枢神経系の発生において、サブファミリーとして共通の役割を持っているのか、個々のsox遺伝子として単独の役割を担っているのかを明らかにするため、sox2/3/19a/19bのそれぞれ及び複数同時にノックダウンを行い、以下のことを明らかにした。(1)四つのsox遺伝子を同時にノックダウンした胚では、神経組織の形成が著しく損なわれた。(2)一つのsox遺伝子を残して、三つのsox遺伝子を同時にノックダウンした胚では、組み合わせに関わらず、残したsox遺伝子の発現している領域では神経組織の欠損がほとんど見られなかった。(3)一つのsox遺伝子を単独でノックダウンした胚ではほとんど影響が見られなかった。

以上のことから、グループB1 soxは初期の神経系の形成に重要であり、グループ内でほぼ共通の役割を担っているということが明らかにした。これまでに、グループB1 sox遺伝子(sox2,sox3,sox19a, sox19b)の機能を阻害するために、モルフォリノオリゴヌクレオチドを作製し、その影響を調べた。その結果、4つのグループB1 sox遺伝子を同時に阻害した(ノックダウンした)胚において、明らかに重度な影響が見られた。これまでの結果から、group B1 sox遺伝子が初期の神経系の形成に重要であり、グループ内でほぼ共通の役割を担っているということを明らかになった。本年度の研究によって新たに以下のことを明らかにした。1.ウェスタンブロッティング法を用いて、ノックダウン胚で標的遺伝子のタンパク質量が実際に低下していることを確認した。2.ノックダウンの影響は、グループB1 sox遺伝子のmRNAを共導入することによって緩和された。4つの遺伝子の内、どのmRNAを共導入しても同様に緩和されることを明らかにした。3.ノックダウン胚の影響を詳細に解析するために、in situハイブリダイゼーション法を用いて、既知の様々な遺伝子の発現がどのように変化しているかを調べた。4.ノックダウン胚では、グループB1 sox遺伝子(sox2,sox3,sox19a, sox19b)の発現量が増加していることがわかった。5.bmpの発現が低下しているように思われ、75% epiboly期の胚において、将来表皮になる領域で発現する遺伝子の発現領域が縮小していた。6.将来感覚器になる領域(prepracodal領域)特異的に発現する遺伝子の発現が異所的に観察され、その発現量も低下していた。7.前頭部領域において、いくつかの遺伝子で著しい発現の変化が見られた。8.ノックダウン胚において、中胚葉領域特異的に発現する遺伝子の発現を調べたところ、変化は見られるものの、その変化は劇的なものではなかった。以上の結果から、グループB1 sox遺伝子が発生の初期の段階で中枢神経系の形成、特に頭部前側領域の形成において、重要な役割を担っていることが明らかになった。
緑膿菌性角膜炎におけるエラスターゼ及びMMPの動態と役割

緑膿菌性角膜炎における潰瘍形成の主たる病原因子はプロテアーゼであると考えられる。その中でも緑膿菌エラスターゼとMMPの動態と役割について検討した。まず、臨床分離株の緑膿菌を実験動物の角膜に接種して角膜炎を惹起させ、角膜内に産生されるプロテアーゼをゼラチン及びカゼイン・ザイモグラフィーを用いて解析した。その結果、種々のmatrix metalloproteinase(MMP)及び分子量24-27kDaのカゼイナーゼが検出された。MMPにはMMP-2(ゼラチナーゼA)、MMP-9(ゼラチナーゼB)及び、それらの活性型、分子量200kDa以上のゼラチナーゼが認められた。しかし、緑膿菌由来のエラスターゼは検出されなかった。これらのプロテアーゼの由来を調べるため、角膜実質細胞を培養し、その培養上清中のプロテアーゼを解析したところMMP-2が検出され、さらに、緑膿菌エラスターゼを添加するとMMP-2、MMP-9及びそれぞれの活性型が検出された。また、好中球由来のプロテアーゼを解析したところ、MMP-9、分子量200kDa以上のゼラチナーゼ、さらには分子量24-27kDaのカゼイナーゼが検出された。さらに、免疫染色(ABC法)にて角膜内のエラスターゼの局在を調べたところエラスターゼが検出できた。以上の結果より、緑膿菌性角膜炎における潰瘍形成にあずかるプロテアーゼは菌、角膜細胞及び好中球由来であり、前駆体のMMPは緑膿菌エラスターゼによって活性化されることが分かった。臨床分離株の緑膿菌をモルモット角膜に接種すると24時間以内に輪状膿瘍を伴った潰瘍病変を生じた。潰瘍病変を生じた角膜を切除し、ホモゲネートした後、SDSで抽出した上清中のプロテアーゼをザイモグラフィーで解析したところMMP-2(ゼラチナーゼA)やMMP-9(ゼラチナーゼB)とそれぞれの活性型が検出された。また、低分子カゼイナーゼも検出された。これらのプロテアーゼの由来を調べるため、兎角膜実質細胞(ケラトサイト)を培養し、培養上清を同様にザイモグラフィーで解析したところ、MMP-2の発現をみた。その培養系に緑膿菌の病原因子(エラスターゼ、アルカリプロテアーゼ等)を添加するとMMP-2の発現亢進に加え、MMP-9が新たに発現された。さらに、緑膿菌エラスターゼを添加した場合はそれぞれの活性型が検出された。好中球抽出液中のプロテアーゼを同様に解析したところ、MMP-9とその重合体と思われるMMP、低分子カゼイナーゼが検出された。これらの実験結果から緑膿菌エラスターゼが感染局所においても角膜細胞や浸潤してきた好中球より放出されたMMPを限定分解して活性化していることが推測される。この仮説をinvivoで証明するには緑膿菌エラスターゼが感染局所で産生されていることを証明する必要がある。感染局所でのエラスターゼの産生・局在を調べるには免疫組織化学が感度が高く有用である。そこで、緑膿菌エラスターゼの精製を試みた。緑膿菌を培養し、その培養上清をフィルターにて除菌し、さらに、硫安沈殿およびアセトン沈殿、イオン交換クロマトグラフィーにて緑膿菌エラスターゼの粗酵素液を得た。現在、アフィニティークロマトグラフィーとゲル濾過により精製を進めている。今後、緑膿菌エラスターゼの精製標品に対する抗体を作製し、実験的緑膿菌性角膜炎でのエラスターゼの局在を免疫組織化学(ABC法)により、調べる予定である。精製した緑膿菌エラスターゼを用いて兎を免疫し、特異抗体を得た。

次いで、モルモットにて実験的緑膿菌性角膜炎を作製し、経時的に眼球摘出を行い、組織学的に検討した。また、角膜内に産生される緑膿菌エラスターゼの局在を免疫組織化学(ABC法)にて検討した。さらに、経時的に角膜を切除し、角膜内に放出されたプロテアーゼをゼラチン・ザイモグラフィーおよびカゼイン・ザイモグラフィーにて解析した。その結果、緑膿菌(1X10^<4-5>CFU)接種後12-24時間に輪状腫瘍を伴った角膜潰瘍が惹起された。組織学的には、角膜実質の強い液化壊死、浮腫がみられ、実質組織内に多数の菌体が認められた。同時に、好中球を主体とする炎症細胞浸潤が認められ、輪状膿瘍部は好中球の集簇であった。ザイモグラフィーによる角膜内のプロテアーゼの解析ではMMP-2、MMP-9、さらに、それらの活性型、200kDa以上のゼラチナーゼ、さらには、25kDaのカゼイナーゼが検出され、これらのプロテアーゼは角膜細胞および好中球由来であることが判明した。一方、細菌由来のプロテアーゼは検出されなかった。しかし、免疫組織化学(ABC法)では緑膿菌エラスターゼの局在が認められ、角膜内で緑膿菌のエラスターゼが産生されていることが証明された。緑膿菌エラスターゼを兎やモルモット角膜に接種すると、短時間で液化壊死を伴った潰瘍を形成した。これらの事実から、緑膿菌性角膜炎での潰瘍形成には細菌、角膜細胞、さらには浸潤してくる好中球由来のプロテアーゼが関与していることが明らかになった。
重症脊髄損傷に対するナノテクノロジーと細胞シート工学のハイブリッド治療法の開発

完全離断型脊髄損傷モデルには欠損部を充填し神経再生の土台となるscaffoldの移植が必要である。軸索再生阻害因子であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解した、骨髄間葉系細胞と神経幹細胞との共培養シートを作成し、これを脊髄欠損部に移植することで、旺盛な軸索再生と再生軸索の髄鞘化、グリア瘢痕の形成を抑制し、運動機能改善を起こすことがわかった(現在論文投稿中)。しかし、細胞シート上での軸索の伸長は単一方向ではなく、蛇行しており、その伸長が最短ではなかった。軸索再生をより効果的に運動機能改善に結びつけるためには、最短かつ早期の軸索再生が必要であると考えた。そこで、配向性細胞シートの作成を試みた。細胞シートの基礎である骨髄間葉系細胞を格子状に配置した格子状細胞シートの作成を格子の大きさで幾度と試みたが、格子があることで強度が落ち、培養皿から剥がす際に構造が破綻してしまい不可能であった。格子の必要性は、細胞シート上に付着し培養される神経幹細胞が神経細胞へ分化し、格子に沿った最短での軸索再生を引き起こすことであったため、骨髄間葉系細胞シートに、cell fiber技術によって作製される神経幹細胞fiberを搭載し、配向性共培養細胞シートを作製している段階である。軸索再生を早期から促進し、かつ細胞シート内への進入を容易なものとするために、強い軸索再生効果をもつ神経栄養因子であるNT-3を細胞シートに搭載する必要があると考えた。その搭載方法はドラッグデリバリーシステムで用いられるナノカプセルに含有させ、細胞シートに搭載するものである。含有ナノカプセルの作製において、ナノカプセル様物質が得られているが、それにNT-3が含有されているか定かでなく、そのカプセルは非常に脆く、細胞シートに搭載する前の洗浄段階で容易に溶解してしまい、形状保持が困難である。現在、その形状保持方法を探索中である。研究計画では、完成した格子状細胞シートとその上で共培養された神経幹細胞、さらに、神経栄養因子搭載ナノカプセルを搭載した配向性ハイブリッド細胞シートをラットに移植し、その効果を検証するin vivoの段階であった。しかし、格子状細胞シートは、格子の大きさに影響される強度問題によって培養皿からシートで剥離することができていない。格子状細胞シートの意味は、その後に共培養される神経幹細胞の伸長方向を規定するためであった。そこで、格子状細胞シートの作製から、通常細胞シートに、cell fiber技術を用いた配向性神経幹細胞・神経前駆細胞を共培養することに計画を変更した。また、神経栄養因子含有ナノカプセルは易崩壊性であるため、脊髄移植後、最も必要とされる、移植後1週後までの形態維持が非常に困難であるため、現在形状保持方法を探索している。また、本研究課題の研究責任者である小生の海外留学が決まり、2018年度の途中より、渡米準備と渡米後の実験継続困難性を考慮にいれることで、実験を計画通りに遂行することが困難であったことも、研究計画から遅れている要因であると考えられる。当初予定していた格子状細胞シートの作製から変更し、現在cell fiber技術によって作成された神経幹・前駆細胞含有cell fiberを細胞シートに搭載することを行なっている。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが分解された骨髄間葉系細胞シートに搭載し、cell fiberとなった神経幹・前駆細胞が、再生軸索に配向性を与える代わりに、脊髄断端部、もしくは細胞シート入口部において、host axonとgrafted axon・neuronがsynapseを形成し、移植早期での電気的活動が頭側から尾側へと細胞シート移植部を通過するかを行なっていく。また、代わりとなることを確認していく。また、ナノカプセル作成においては、ドラッグデリバリーシステムで用いられるナノカプセルを作製しているホソカワミクロン社に作製委託をする。実験の再開については、本研究課題の研究責任者である小生の帰国後を予定としている。重症脊髄損傷の一つである離断型脊髄損傷では、脊髄欠損部が生じるため、脊髄再生のためには、再生軸索の足場となるスキャホールドが必要になる。スキャホールドが不要である、骨髄間葉系細胞(BMSC)を用いたBMSCシートを作製し、これに神経幹細胞(NSC)を共培養させて搭載させたBMSC/NSC教培養細胞シートを開発し、その軸索再生促進とグリア瘢痕(軸索再生阻害因子)形成抑制、後肢運動機能改善の効果を明らかにしたが、その効果は限定的であったため、細胞シートのさらなる改善が必要であると考え、より早い軸索再生を誘導し得る細胞シートの開発を計画した。細胞シートを格子状に作製することで軸索再生の早期伸長を期待し作製している。現在細胞接着阻害領域を格子状に設置したガラスボトムシャーレを作製しているが、格子を大きくしてしまうと細胞シートとしてシート状でのシャーレからの剥離が困難であり、どの大きさの格子がよいか検討を重ねている。今後は格子状細胞シートを作製し、完成した配向性細胞シートを用いてvivoでの移植実験を行う予定としている。また、神経栄養因子であるNT-3を使用したナノカプセルの作製を、乳酸・ポリグリコール重合体を用いて2重エマルション重合法を用いて行っている。ナノカプセル状の物質を得られてはいるが、それが生分解性を示すこと、NT-3を含有していることを確認している段階である。ナノカプセルが完成すれば、細胞シートに搭載し、ナノカプセル搭載細胞シートを用いたvivoでの移植実験を行う予定としている。配向性細胞シート作製とNT-

3含有ナノカプセルの作製において、どちらも前例がないため、手探りの状態からの開始であった。配向性細胞シートの作製については、細胞接着阻害因子をどの大きさの格子状にシャーレに配置し、細胞接着部分の幅をどれくらいにすれば、細胞シートとして採取可能か不明であり、現在様々な大きさの格子・細胞幅で検討中であり、この検討にシャーレ作製期間も含めて時間を要している。ナノカプセルの作製も同様に、作製手技的な問題から、当初はカプセルの作製が出来ず、技術的な問題が生じていた。現在は、カプセル状物質の作製までは到達しているが、この物質が生分解性であること、この中にNT-3が含有されているかを確認しており、カプセル作製においても技術的な問題から時間を要している。今後は、配向性細胞シート作製とナノカプセル作製を再現性高く実施し、vivoでの移植実験を行っていく。完全離断型脊髄損傷モデルには欠損部を充填し神経再生の土台となるscaffoldの移植が必要である。軸索再生阻害因子であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを分解した、骨髄間葉系細胞と神経幹細胞との共培養シートを作成し、これを脊髄欠損部に移植することで、旺盛な軸索再生と再生軸索の髄鞘化、グリア瘢痕の形成を抑制し、運動機能改善を起こすことがわかった(現在論文投稿中)。しかし、細胞シート上での軸索の伸長は単一方向ではなく、蛇行しており、その伸長が最短ではなかった。軸索再生をより効果的に運動機能改善に結びつけるためには、最短かつ早期の軸索再生が必要であると考えた。そこで、配向性細胞シートの作成を試みた。細胞シートの基礎である骨髄間葉系細胞を格子状に配置した格子状細胞シートの作成を格子の大きさで幾度と試みたが、格子があることで強度が落ち、培養皿から剥がす際に構造が破綻してしまい不可能であった。格子の必要性は、細胞シート上に付着し培養される神経幹細胞が神経細胞へ分化し、格子に沿った最短での軸索再生を引き起こすことであったため、骨髄間葉系細胞シートに、cell fiber技術によって作製される神経幹細胞fiberを搭載し、配向性共培養細胞シートを作製している段階である。軸索再生を早期から促進し、かつ細胞シート内への進入を容易なものとするために、強い軸索再生効果をもつ神経栄養因子であるNT-3を細胞シートに搭載する必要があると考えた。その搭載方法はドラッグデリバリーシステムで用いられるナノカプセルに含有させ、細胞シートに搭載するものである。含有ナノカプセルの作製において、ナノカプセル様物質が得られているが、それにNT-3が含有されているか定かでなく、そのカプセルは非常に脆く、細胞シートに搭載する前の洗浄段階で容易に溶解してしまい、形状保持が困難である。現在、その形状保持方法を探索中である。研究計画では、完成した格子状細胞シートとその上で共培養された神経幹細胞、さらに、神経栄養因子搭載ナノカプセルを搭載した配向性ハイブリッド細胞シートをラットに移植し、その効果を検証するin vivoの段階であった。しかし、格子状細胞シートは、格子の大きさに影響される強度問題によって培養皿からシートで剥離することができていない。格子状細胞シートの意味は、その後に共培養される神経幹細胞の伸長方向を規定するためであった。
医学標本館における拡張現実感を用いた学習支援システムの開発

研究代表者の大学には医学標本館があり、ホルマリン液浸の医学標本が展示されている。見学時の標本の説明は、各標本の前に置かれたラベルと医学標本館対応の教職員の解説に頼っており、各見学者の知識レベルや専門分野の差異に合わせた説明は十分であるとは言えない。そのため、医学標本での効果的な学習を目指して、拡張現実感(AR, Augmented Reality)を利用した医学標本における学習支援システムの研究を進めてきた。本研究では見学者に適応的なARによる医学標本の学習支援システムの実現を目指し、以下の3つの機能を追加することを目的とする。1.光学透過型ヘッドマウントディスプレイを採用し、標本の質感を損なわずジェスチャ操作によるAR環境を構築する。2.システムの操作履歴や学習履歴を蓄積して見学者の専門性や知識レベルを推定し、見学者の専門性や知識レベルに合わせたAR情報の提示および見学ルートを推奨できるようにする。3.様々な形状やサイズの標本に対応するために複数のマーカを設定し、複数マーカによって提示される情報を自然に往来できるようにする。本年度は、光学透過型ヘッドマウントディスプレイを採用し、ジェスチャ操作機能の改良の検討を行った。光学透過型ヘッドマウントディスプレイに搭載されたデプスセンサを用いて直感的ジェスチャ操作機能を構築し、直観的ジェスチャによるラベル操作を実現した。また、その機能によるユーザ評価を進めた。大型の上半身標本や立体形状の胎児標本へのシステム拡張のため、複数マーカによる支援システムの開発を進めた。プロトタイプシステムによるユーザビリティおよび教育的評価によりヘッドマウントディスプレイによるシステムが最も有効であることが確認され、画面解像度やサイバーシックネスの問題も明らかになった。これらの研究成果を国際雑誌に投稿し採択された。本年度は、光学透過型ヘッドマウントディスプレイをシステムに採用し、開発を進めた。ヘッドマウントディスプレイに搭載されたジェスチャでは初心者には操作の習得が必要であり操作性が低かった。そこで直感的ジェスチャ技術を採用し、操作性向上を検討した。ユーザ評価により操作性向上を確認することができたが検出精度の問題等も明らかになった。この研究成果は、Anatomical Science Educationで原著論文として掲載された。AR情報についてジェスチャ操作機能の改良を進め問題点を解決していく方針である。様々な形状に対応するために複数マーカによるシステムの拡張を進めている。ARによる情報を自然に往来できるように開発を進めていく。医学標本に関するARコンテンツの設定が手動設定の部分が大きく製作者の負担が大きい。自動化できるような仕組みを構築していく。機械学習を用いてユーザの操作や学習履歴の情報からユーザの知識レベルを判断し、それに合わせた情報コンテンツを提供するシステムへ改良を行う予定である。人体構造に関する知識は医学教育の基礎知識として必要不可欠である。献体を用いた解剖による医学教育は社会状況や倫理的問題に十分配慮する必要があり、容易に提供できない。実物の臓器による医学教育を提供するために、医学標本を用いる方法がある。学生は医学標本を通して実物の臓器の構造や質感を見る貴重な経験をし、医学知識を深めることが可能である。しかし、見学時の標本の説明は、各標本の前に置かれたラベルと医学標本館対応の教職員の解説に頼っており、各見学者の知識レベルや専門分野の差異に合わせた説明は十分であるとは言えない。そのため、医学標本での効果的な学習を目指して、拡張現実感(AR: Augmented Reality)を利用した医学標本における学習支援システムの研究を進めてきた。初年度は、プロトタイプシステムを用いて被験者によるユーザビリティおよび教育的評価を実施した。それらの評価結果よりシステムの有効性・問題点を確認することができた。また、光学透過型ヘッドマウントディスプレイを導入し、AR情報の自動配置やジェスチャ操作機能の改良を行った。初年度は、学習支援システムのプロトタイプを用いて被験者実験によるユーザビリティ評価と教育的評価を実施した。ユーザビリティに関する評価結果からヘッドマウントディスプレイを用いたシステムが最も有効であることを確認し、画面解像度やサイバーシックネスの問題も明らかになった。教育的評価においては山梨大学医学部の先生方に監修を受けた医学標本の知識問題やアンケート調査から教育に関する評価を解析した。その結果、AR情報による学習支援が有効であることが確認できた。また、光学透過型ヘッドマウントディスプレイをシステムへ導入し、AR情報の自動配置の機能を追加し、システムの改良を進めた。

見学時の標本の説明は、各標本の前に置かれたラベルと医学標本館対応の教職員の解説に頼っており、各見学者の知識レベルや専門分野の差異に合わせた説明は十分であるとは言えない。そのため、医学標本での効果的な学習を目指して、拡張現実感(AR, Augmented Reality)を利用した医学標本における学習支援システムの研究を進めてきた。本研究では見学者に適応的なARによる医学標本の学習支援システムの実現を目指し、以下の3つの機能を追加することを目的とする。1.光学透過型ヘッドマウントディスプレイを採用し、標本の質感を損なわずジェスチャ操作によるAR環境を構築する。2.システムの操作履歴や学習履歴を蓄積して見学者の専門性や知識レベルを推定し、見学者の専門性や知識レベルに合わせたAR情報の提示および見学ルートを推奨できるようにする。3.様々な形状やサイズの標本に対応するために複数のマーカを設定し、複数マーカによって提示される情報を自然に往来できるようにする。本年度は、光学透過型ヘッドマウントディスプレイを採用し、ジェスチャ操作機能の改良の検討を行った。光学透過型ヘッドマウントディスプレイに搭載されたデプスセンサを用いて直感的ジェスチャ操作機能を構築し、直観的ジェスチャによるラベル操作を実現した。また、その機能によるユーザ評価を進めた。大型の上半身標本や立体形状の胎児標本へのシステム拡張のため、複数マーカによる支援システムの開発を進めた。プロトタイプシステムによるユーザビリティおよび教育的評価によりヘッドマウントディスプレイによるシステムが最も有効であることが確認され、画面解像度やサイバーシックネスの問題も明らかになった。これらの研究成果を国際雑誌に投稿し採択された。本年度は、光学透過型ヘッドマウントディスプレイをシステムに採用し、開発を進めた。ヘッドマウントディスプレイに搭載されたジェスチャでは初心者には操作の習得が必要であり操作性が低かった。そこで直感的ジェスチャ技術を採用し、操作性向上を検討した。ユーザ評価により操作性向上を確認することができたが検出精度の問題等も明らかになった。この研究成果は、Anatomical Science Educationで原著論文として掲載された。AR情報の自動配置機能の問題点を解決していく方針である。
高次コサイン関数を用いたブロックひずみの抑制

離散コサイン変換(DCT)を用いた画像符号化法によって低ビットレートで画像を符号化したときに、その再生画像でブロックひずみが発声するという問題がある。この問題を符号化データの受信側で解決する方法として、ブロック毎に低周波側のDCT係数の推定値を求める方法について検討した。この方法では、対象とするブロックと近傍の8ブロックを高次コサイン関数で近似し、その近似曲面を介してDCT係数の推定値を求めている。高次コサイン関数は24×24点の2D-DCTがもつ基底関数で定義する。そして、近似曲面の未知係数の決定にあたっては、量子化テーブルからDCT係数に関する制約条件を加えた2次計画問題として定式化した。すべてのブロックで近似曲面の次数を一定にして、上記の方法により低ビットレートで符号化したデータからの画像再生を行なったところ、近似曲面の次数が低い場合には画像平坦部に発生するブロックひずみを十分に抑制することができた。しかし、エッジ部分では逆量子化値が大きいDCT係数が比較的高次まで残るっているため、ブロックひずみの抑制効果が低くなっている。一方、近似曲面の次数を高くした場合にはエッジ部分でのブロックひずみは改善される。しかし、近似曲面の高次項の影響で、平坦部では画素値の変化を滑らかにすることが難しくなっている。このような結果から、近似曲面の次数を画像の局所的な特性によって変える必要があると分かった。ブロックに応じた近似曲面の次数を決定するための評価基準として、再生ブロックのラプラシアンや境界画素値の差分、情報量基準などについて検討したが、これまでのところ有効な基準は得られていない。また、DCT係数の推定値を求める際に平滑化後の境界画素値を利用することも予定していたが、十分に検討するまでには至らなかった。今後はこの条件も考慮し、ブロックに対して適応的に高次コサイン関数の次数を変化させて有効な推定値を求める方法へ導きたいと考えている。
イネ科作物の柔組織における大規模なプログラム細胞死の制御機構と生理的役割の解明

本年度においては,ソルガムの茎柔組織髄化におけるD遺伝子の関与を立証し,その機能や柔組織髄化の生理的役割を解明するための端緒として,まず,「D遺伝子の時空間的な発現量の変化」と「茎水分含量の低下を招く柔組織の髄化」との関連を調査した.その結果,乾性品種の成熟した茎の節間では,広範の柔組織で髄化が発生し,その進行に伴ってD遺伝子の発現量が大幅に上昇すること,さらにin situ hybridizationなどを用いた解析から,気体を内包した死細胞へ転換する直前の柔組織の細胞において,D遺伝子の転写産物が多量に蓄積することが判明した.一方,汁性品種のd領域断片(この断片には,D遺伝子の転写調節領域およびタンパク質コード領域の一部を含むゲノム欠失変異が存在)を,連続戻し交雑により,乾性品種へ導入することで作出した準同質遺伝子系統においては,D遺伝子の発現が消失し,柔組織の髄化もほとんど認められなかった.さらに,D遺伝子の下流で機能する遺伝子の絞り込みを行うべく,前述の乾性品種とその準同質遺伝子系統を対象に,成熟した茎の遺伝子発現の網羅的な比較を実施した.その結果,D遺伝子の発現の有無は,核酸やタンパク質の分解といった,細胞死の実行に関与することが予想される遺伝子群の発現の誘導と高い相関を示すことが明らかとなった.これらの結果から,ソルガムにおける茎柔組織の広範に渡る髄化,つまり大規模な細胞死の発生に,D遺伝子が関与する可能性が強く示唆された.前述の通り,本年度においては,茎柔組織髄化におけるD遺伝子の時空間的な発現パターンを精査し,さらに,網羅的な遺伝子発現解析から,D遺伝子の下流で機能する遺伝子群の絞り込みを行った.これらの項目については,順調に解析が進み,ソルガムにおける茎柔組織の髄化,すなわち大規模な細胞死の誘導において,D遺伝子は,そのスイッチ役としての機能を果たしているものと考えられた.また,茎柔組織髄化の生理的意義に関しては,乾性品種と乾性品種の準同質遺伝子系統を用いた,収量調査を実施したものの,現時点で,収量に関連する顕著な差は認められておらず,今後,栽培条件などを再検討したうえで,引き続き調査を行う予定である.これまでの研究成果から,D遺伝子は転写因子をコードする可能性が示唆されているため,D遺伝子の誘導的な発現が可能なシロイヌナズナ培養細胞株を材料に,まず,D遺伝子の発現が,全遺伝子の発現プロファイルや細胞の構造に及ぼす影響を精査する.これらの解析が順調に進めば,酵母や植物プロトプラストを用いたレポーターアッセイ系により,D遺伝子の転写活性やプロモーター結合活性を検証する予定である.さらに,D遺伝子の上流で機能する遺伝領域を特定するため,その発現量を指標としたQTL解析の実施を予定しており,解析に供するサンプルの準備を合わせて進める.また,イネDオルソログに関しては,予備的な解析の結果から,根の皮層組織において高い発現を示す可能性が示唆されており,今後は遺伝子破壊系統を作出し,その表現型を詳細に分析する予定である.本年度においては,ソルガムの茎柔組織髄化におけるD遺伝子の関与を立証し,その機能や柔組織髄化の生理的役割を解明するための端緒として,まず,「D遺伝子の時空間的な発現量の変化」と「茎水分含量の低下を招く柔組織の髄化」との関連を調査した.その結果,乾性品種の成熟した茎の節間では,広範の柔組織で髄化が発生し,その進行に伴ってD遺伝子の発現量が大幅に上昇すること,さらにin situ hybridizationなどを用いた解析から,気体を内包した死細胞へ転換する直前の柔組織の細胞において,D遺伝子の転写産物が多量に蓄積することが判明した.一方,汁性品種のd領域断片(この断片には,D遺伝子の転写調節領域およびタンパク質コード領域の一部を含むゲノム欠失変異が存在)を,連続戻し交雑により,乾性品種へ導入することで作出した準同質遺伝子系統においては,D遺伝子の発現が消失し,柔組織の髄化もほとんど認められなかった.さらに,D遺伝子の下流で機能する遺伝子の絞り込みを行うべく,前述の乾性品種とその準同質遺伝子系統を対象に,成熟した茎の遺伝子発現の網羅的な比較を実施した.その結果,D遺伝子の発現の有無は,核酸やタンパク質の分解といった,細胞死の実行に関与することが予想される遺伝子群の発現の誘導と高い相関を示すことが明らかとなった.これらの結果から,ソルガムにおける茎柔組織の広範に渡る髄化,つまり大規模な細胞死の発生に,D遺伝子が関与する可能性が強く示唆された.前述の通り,本年度においては,茎柔組織髄化におけるD遺伝子の時空間的な発現パターンを精査し,さらに,網羅的な遺伝子発現解析から,D遺伝子の下流で機能する遺伝子群の絞り込みを行った.これらの項目については,順調に解析が進み,ソルガムにおける茎柔組織の髄化,すなわち大規模な細胞死の誘導において,D遺伝子は,そのスイッチ役としての機能を果たしているものと考えられた.また,茎柔組織髄化の生理的意義に関しては,乾性品種と乾性品種の準同質遺伝子系統を用いた,収量調査を実施したものの,現時点で,収量に関連する顕著な差は認められておらず,今後,栽培条件などを再検討したうえで,引き続き調査を行う予定である.

これまでの研究成果から,D遺伝子は転写因子をコードする可能性が示唆されているため,D遺伝子の誘導的な発現が可能なシロイヌナズナ培養細胞株を材料に,まず,D遺伝子の発現が,全遺伝子の発現プロファイルや細胞の構造に及ぼす影響を精査する.これらの解析が順調に進めば,酵母や植物プロトプラストを用いたレポーターアッセイ系により,D遺伝子の転写活性やプロモーター結合活性を検証する予定である.さらに,D遺伝子の上流で機能する遺伝領域を特定するため,その発現量を指標としたQTL解析の実施を予定しており,解析に供するサンプルの準備を合わせて進める.また,イネDオルソログに関しては,予備的な解析の結果から,根の皮層組織において高い発現を示す可能性が示唆されており,今後は遺伝子破壊系統を作出し,その表現型を詳細に分析する予定である.
連続分光観測による月二次地殻形成過程の解明:インパクトテクトニクスの役割

本研究の目的は,地上からの月面連続分光スペクトルを撮像する装置を開発して,これらを用いて月の表層岩石種の3次元マップを作成し,インパクトテクトニクスの観点から分類し,地殻・上部マントルの成層構造とその進化を明らかにすることであった。H15年度は,H14年度実施の連続分光装置の設計を基に,部材調達を実施し,分光器の製作,位置確認用ビューワー装置の設計・製作,ならびに,可視・近赤外領域の撮像装置を組み合わせた連続分光イメージング装置の構築ならびに,屋内の性能評価、月面テスト撮像による性能評価も実施した。光学系(天体望遠鏡(口径30cm, F5)+補正レンズ)を含めた月面連続分光撮像装置の月面空間解像度は,可視領域で9km(2.25km/画素),近赤外線領域で20km(10km/画素)となり,波長分解能は,8nm(可視領域0.75nm/画素,近赤外線領域3.2nm/画素)である。SNは,撮像画像を複数枚重ね合わせることにより200以上を確保できる。また、多数の撮像枚数に対しても対応可能なように,光学系・カメラセンサ・分光器の特性を除き有効な反射率を得るための取得データの一次処理(案電流・フラットフィールド補正・ビニング等)ルーチンプログラムを作成し,取得データ解析準備を整えた。狭帯域フィルターによる月面撮像を可視-近赤外線領域の6波長帯に対して実施し,補正用データベースも構築した。本年度の研究により、可視から近赤外の波長領域で同時に連続分光しイメージングする装置を用いて月面の撮像に成功し、月の海の領域の連続分光イメージが初めて取得できた。本研究の目的は、地上からの月面連続分光スペクトルの撮像により月表層岩石種マップを作成し、これをインパクトテクトニクスの観点から分類し、地殻・上部マントルの成層構造とその進化を明らかにすることである。本年度の実施項目は以下のとおりである。1.連続分光撮像装置の性能評価のまとめ:既存の二次元CCDカメラと分光器による撮像装置では性能が劣り利用不可という結果のため、別途連続分光装置の開発を実施した。(3へ)2.月面フィルタ分光イメージングの評価:月表層物質の特徴的波長帯である、450/750/950/1050/1250/1550nmのバンドパスフィルタを用いた月面イメージングを実施し、データ補正・モザイク化を実施し、各波長の反射率強度マップを作成した。現在、それらのデータを用いた月面物質同定の評価中である。3.月面連続分光撮像システムの構築:新規に連続分光イメージング装置の開発を実施した。天体望遠鏡が小さいため、グレーティングを用いたコンパクトな分光器の設計を行い、既存の2次元CCDカメラと組み合わせ、天体望遠鏡含めたインテグレーティドシステムを開発した。現在、連続分光器の部材発注は終了している。組み立て・性能評価の作業が次年度に移行した。4.月面連続分光撮像の実施(3の完成後次年度実施)5.取得データの処理解析データベースの構築:既存の月サンプルの連続分光データベース(ブラウン大学提供)から、データをダウンロードし、データベース構築の基礎データを入手した。次年度は、これを系統的にまとめ、撮像取得データの比較データとする。本年度は,昨年度実施の連続分光装置の設計を基に,部材調達を実施し,分光器の製作,位置確認用ビューワー装置の設計・製作,ならびに,可視・近赤外領域の撮像装置を組み合わせた連続分光イメージング装置としての組み立て製作・構築を引き続き実施し,装置を構築した。

さらに,屋内における性能評価も実施した。光学系(天体望遠鏡(口径30cm, F5)+補正レンズ)を含めた月面連続分光撮像装置の月面空間解像度は,可視領域で9km(2.25km/画素),近赤外線領域で20km(10km/画素)となり,波長解像度は,可視領域で10nm(2.3nm/画素),近赤外線領域で20nm(10nm/画素)である。SNは,撮像画像を複数枚重ね合わせることにより200以上を確保している。伴わせて,多数の撮像枚数に対しても対応可能なように,光学系・カメラセンサ・分光器の特性を除き有効な反射率を得るための取得データの一次処理(案電流・フラットフィールド補正・ビニング等)ルーチンプログラムを作成し,取得データ解析準備を整えた。狭帯域フィルターによる月面撮像を可視-近赤外線領域の6波長帯に対して実施し,補正用データベースを構築した。本年度の研究により,可視から近赤外の波長領域で同時に連続分光しイメージングする装置を用いて月面の撮像に成功し,月の海の領域の連続分光イメージが初めて取得でき,岩相マップへの道が開けた。
新規肝癌動物モデルとヒトNASH肝癌臨床検体を用いたNASH発癌機構の解明

本研究は,Nrf2およびp62を介したNASH肝発癌機構を明らかにすることを目的とする.そのために,1p62:Nrf2遺伝子二重欠失マウスとそれをベースにして作製した組織細胞特異的p62およびNrf2遺伝子レスキューマウスの表現型を比較し,組織別のNrf2とp62がどのように肝発癌に関与するか,2ヒト肝癌臨床検体を用いて,免疫組織学的解析を行い,Nrf2, p62がどのようにヒトNASH肝癌で発現し,肝癌の進行(予後)に関わるか,3肝細胞およびマクロファージ細胞(Kupffer細胞)を用いた細胞実験により,肝発癌シグナルにNrf2とp62がどのように関与するか,を明らかにする.本研究は,Nrf2およびp62を介したNASH肝発癌機構を明らかにすることを目的とする.そのために,1p62:Nrf2遺伝子二重欠失マウスとそれをベースにして作製した組織細胞特異的p62およびNrf2遺伝子レスキューマウスの表現型を比較し,組織別のNrf2とp62がどのように肝発癌に関与するか,2ヒト肝癌臨床検体を用いて,免疫組織学的解析を行い,Nrf2, p62がどのようにヒトNASH肝癌で発現し,肝癌の進行(予後)に関わるか,3肝細胞およびマクロファージ細胞(Kupffer細胞)を用いた細胞実験により,肝発癌シグナルにNrf2とp62がどのように関与するか,を明らかにする.
自閉スペクトラム症児への包括的言語発達支援プログラムの開発と評価

自閉スペクトラム症のある幼児(以下、自閉症児)が言語を獲得してゆく過程を、発達支援の効果を定量評価しながら総合的に明らかにする。同時に、自閉症児と「共に創る」言語システムを具体的に提案することを目的とする。(1)まず、「大人(セラピスト、保護者)」と「子ども」に対して、大学ラボと家庭での安定した言語的・非言語的相互作用をつくりあげ、実験的発達支援研究のプラットホームを確立した。自閉症児の事前・事後でのプロフィールの変化を、一般発達検査、行動検査、知覚・運動検査などを用いて評価した。発達支援として、「対人相互作用」、「楽しさの共有」、「随伴模倣と模倣」、「発信と受信の繰り返し」、「言語表出と理解の出現機会の設定」を組み込んだ支援を実施した。(2)直示的コミュニケーションや相互作用を繰り返すことが、共感から共創への基盤となるかについて、共同注意(応答型・始発型)に焦点を当て、その成立条件を、臨床実験的手法を用いて分析した。(3)言語獲得における模倣の効果を分析するため、モデル刺激の提示方法の効果を分析した。また、大人が子どもの動作と音声を模倣する「随伴模倣」が、子どもの動作と音声の発達促進にどのような効果をもたらすかを検討した。個人の中での身振りの階層とことばの階層がどのように統合されてくるかについて、俯瞰カメラを用いた行動の映像解析、視線の分析などによって、詳細に検討を行った。(4)研究の成果を、言語発達支援の実践現場で活用してもらうため、言語聴覚士、臨床心理士へのワークショップを定常的に行い、社会に研究成果を発信した。(1)生態学的空間での共同注意:実験者と参加児が1つの机に向かいあい、正面の共有空間とまわりの360度の共有空間を実験的にしつらえた。hand pointing条件では,実験者は手を参加児の前に出し,顔と視線は参加児に向けたまま,手と手首を使って絵カード刺激を指さした。その結果、子どもにとっての前方についての指さしに対応する刺激への反応はほとんどの子どもで成立したが、後方の絵カードへの正反応は低い値であった。このことから、生態学的空間が直示的コミュニケーションを制約している可能性が示唆された。また、発達年齢と共同注意との間で正の相関関係が見られた。(2)模倣による対人相互作用促進:模倣は、「動作模倣」から「対人相互作用」と「音声模倣」を経て、「言語理解」と「言語表出」につながる重要な役割をになっている。動作模倣の連続は、自閉症児の視線定位の持続、視覚運動協調の安定、相互引き込み、など相互作用の基盤を形づくると考えられる。そこで、モデル刺激を子どもの反応直後に即座に提示する0秒遅延条件と2秒後に提示する2秒遅延条件で、模倣反応がどのように変化するかを分析した。単一事例研究計画法を用いた分析の結果、時間当たりの模倣数の増加が観察され、それが対人相互作用の安定につながることがわかった。このような一定のリズムを持った刺激と反応の相互関係が「対人相互作用」や「音声言語」の促進をもたらすと考察した。(3)随伴模倣による音声言語の獲得研究:これまでの研究結果を受けて、「動作模倣」「音声模倣」「操作模倣」「模倣」「随伴模倣」「拡張随伴模倣」を組み込んだ発達支援技法をマニュアル化し、発達年齢の低い重度の無発語自閉症児に適用した。支援の結果、全ての参加児が模倣(動作・操作・音声)を獲得した。(1)2018年度には、共同注意から模倣に至る発達支援の効果を明らかにすることができた。今後は、その発達支援研究をさらに発展させて、言語理解、言語表出から対人的相互作用を促進するための条件を明らかにしていく予定である。特に、一定のリズムを持った音声(動作)刺激と音声(動作)反応の同期が「対人相互作用」や「音声言語」の促進をもたらすかを明らかにする。このデータをもとに、言語と動作の階層関係を分析する。(2)ペアレントトレーニングにより、一定の成果を得たので、遠隔地の家庭に対して、インターネットのテレビ会議システムを用いた遠隔地発達支援プログラムを実施し、効果評価を行う。言語発達支援におけるtelehealthの効果検証である。(3)心理言語学領域との共同研究として、自閉症児の言語獲得に及ぼす身ぶりや直示コミュニケーションの効果を分析する。(4)自閉症児とロボットのコミュニケーションの基礎データを蓄積し、発達支援ロボティックスという新たな融合領域を工学領域との共同研究によって切り開く。(5)研究の成果を、言語発達支援に活用してもらうため、言語聴覚士、臨床心理士、保育士、幼稚園教諭、療育士などへのワークショップを定常的に行い、社会に研究成果を発信する。その効果を、質的、量的に分析する。