hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
5-アミノレブリン酸を用いた抗がん剤誘発腎障害に対する新規予防法の開発

胃癌の治療に用いられるシスプラチンの腎毒性を防ぐために大量輸液・強制利尿が行われQOL低下を招く。5-アミノレブリン酸(ALA)は多くの生理作用を示すが、シスプラチン腎障害ラットモデルでALAの腎障害抑制効果が報告された。我々はALAによる新規腎障害予防法の確立を目指し臨床第I相試験を開始した。対象:切除不能・再発胃癌症例。主要評価項目:腎障害防止補助剤としてのALAの安全性。副次評価項目:腎障害抑制効果。方法:ショートハイドレーション法によるSP療法に加えALAを内服。安全性評価、外来移行率、相対用量強度を算出。【結果】2017年12月現在8例登録。Grade3以上の有害事象は認めず。【臨床試験新規腎障害予防補助法としてのALAの安全性の確立】先行研究として、「切除不能または再発胃癌患者に対するショートハイドレーション法を用いたS-1+CDDP(シスプラチン)の認容性試験」(川崎医科大学倫理委員会承認000869-1号UMIN臨床試験登録UMIN000007409号)を行ってきたが、本年度予定登録症例数に達し、検討項目の解析に入った。引き続き行われる本臨床試験は、ショートハイドレーション法を用いたS-1+CDDPに加え、新規腎障害予防法としてALAを併用し、腎障害予防補助法としてのALAの安全性を示すものである(川崎医科大学倫理委員会承認001847号)。ショートハイドレーション群とショートハイドレーション+ALA群間で治療前後の腎機能障害をはじめとした有害事象の発生率に差が無いことを証明する。S-1+シスプラチン+ALA併用;S-1をday1から21日間連日投与、CDDP 60 mg/m2をday8に投与。5-ALAリン酸1回100 mgを朝昼晩3回内服。CDDP投与4日前のday4からCDDP投与日(day8)を含めてday16まで内服。S-1はday1から21日間連日経口投与。2週間の休薬期間を含めて5週を1コースとする。2コース目以降実施基準をみたす症例についてS-1+CDDP+ALA療法のShort hydrationを行う。倫理委員会承認を受けて本年度より症例登録を開始した。【非臨床試験(動物実験)ALAによるシスプラチン腎障害の抑制効果の検証】ラット腎障害モデルに対して、大量補液とALA投与が同様の病理学的機序でラットモデルにおいて腎障害を防止し得るかどうかを検索する。シスプラチンを腹腔内投与したラットをコントロール群、ハイドレーション群、ALA投与群の3群に分けるが、本年度は各群の条件設定を行った。当初の計画通り、本年度より症例登録を開始した。同意書を取得し、実施基準をみたす症例に対して、S-1+CDDP+ALA療法のShort hydration療法を開始している。【臨床試験:新規腎障害予防補助法としてのALAの安全性の確立】本臨床試験は、ショートハイドレーション法を用いたS-1+CDDP療法に5-アミノレブリン酸(ALA)を併用し、腎障害予防補助法としてのALAの安全性を示す(川崎医科大学倫理委員会承認001847号)。ショートハイドレーションにより得た安全性に加えて、ALA群においてシスプラチン治療前後の腎機能障害をはじめとした有害事象発生率に差が無いことを示す。S-1+シスプラチン+ALA併用;S-1をday1から21日間投与、CDDP 60 mg/m2をday8に投与。5-ALA 1回100 mgを朝昼晩3回内服。2週間の休薬期間を含め5週を1コースとし、2コース目以降実施基準をみたす症例についてS-1+CDDP+ALA療法のShort hydrationを行う。倫理委員会承認を受けて症例登録を開始した。現在ALA投与による明らかな有害事象は報告されていない。本年度も引き続き症例登録を推進していく予定である。【非臨床試験:ALAによるシスプラチン腎障害の抑制効果の検証】ラット腎障害モデルに対して、大量補液とALA投与が同様の病理学的機序でラットモデルにおいて腎障害を防止し得るかどうかを検索する。シスプラチンを腹腔内投与したラットをコントロール群、ハイドレーション群、ALA投与群の3群に分けるが、本年度は各群の条件設定に引き続き、非臨床試験における有害事象の定量化とその解析手技の確定を行っている。当初の計画通り、症例登録を開始した。同意書を取得し、実施基準をみたす症例に対して、S-1+CDDP+ALA療法のショートハイドレーション法を開始している。試験中止を検討するようなALAによる明らかな有害事象は報告されていない。【臨床試験:新規腎障害予防補助法としてのALAの安全性の確立】胃癌の治療に広く用いられているシスプラチンは腎毒性が強く、これを防ぐための大量輸液および強制利尿が行われており、悪心・嘔吐などの有害事象と共に治療中のQOL低下を招く。5-アミノレブリン酸(以下5-ALA)はヘム化合物の前駆体として重要な物質で、多くの重要な生理作用を示す。ラットを用いたシスプラチン腎障害モデルにおいて5-ALAがシスプラチンによる血清BUNおよびクレアチニン上昇を抑制し病理学的尿細管障害を抑制することが報告された。

我々はALAを用いて従来の大量輸液療法をQOLの面から凌駕し得る新規腎障害予防法を確立することを目指して臨床第I相試験を開始した。【主要評価項目】腎障害防止補助食品としての5-ALAの安全性,【副次的評価項目】腎障害抑制効果【対象】切除不能または再発の胃癌症例,プラチナ製剤に対して一次治療, PS 0-2, 3ヶ月以上の生存が期待される症例,主要臓器機能が保たれている,以上の適格基準を満たす症例を登録。【方法】TS-1 80 mg/m2 day1-21、CDDP 60 mg/m2をday 8に投与。5-ALAリン酸として300 mgをシスプラチン投与4日前のday4から16まで内服。CDDP投与時の輸液はショートハイドレーション法を実施。SP療法は最大6コースとし、安全性の評価(CTCAE version4.0)、外来移行可能と判断した率、相対用量強度(RDI)の算出を行う。【結果】2017年12月現在で8例登録された(男性6名女性2例年齢64-78歳平均71.1歳)。ショートハイドレーション法に5-ALAを加えた切除不能・再発胃癌患者に対するSP療法において重篤な腎機能障害を含めGrade3以上の有害事象は認められていない。現在多施設共同研究として症例登録を進めている。胃癌の治療に用いられるシスプラチンの腎毒性を防ぐために大量輸液・強制利尿が行われQOL低下を招く。5-アミノレブリン酸(ALA)は多くの生理作用を示すが、シスプラチン腎障害ラットモデルでALAの腎障害抑制効果が報告された。我々はALAによる新規腎障害予防法の確立を目指し臨床第I相試験を開始した。対象:切除不能・再発胃癌症例。主要評価項目:腎障害防止補助剤としてのALAの安全性。副次評価項目:腎障害抑制効果。方法:ショートハイドレーション法によるSP療法に加えALAを内服。安全性評価、外来移行率、相対用量強度を算出。【結果】2017年12月現在8例登録。Grade3以上の有害事象は認めず。川崎医科大学倫理委員会承認をうけ、初年度は安全性を重視して主幹施設である川崎医科大学附属川崎病院で症例登録とプロトコル治療を開始した。今後は計画通り多施設共同研究として、切除不能または再発胃癌患者に対するショートハイドレーション法を用いたS-1+CDDPの認容性試験に参加している他施設に本試験の参加を募り、早期に目標症例数(40例)の達成を目指す。非臨床試験においては、ラット腎障害モデルに対して、大量補液とALA投与が同様の病理学的機序でラットモデルにおいて腎障害を防止し得るかどうかを検索するため、早急に基礎データの解析を進める。川崎医科大学倫理委員会承認をうけ、初年度は安全性を重視して主幹施設である川崎医科大学附属川崎病院で症例登録とプロトコル治療を開始したが、本年度以降は多施設共同研究として、切除不能または再発胃癌患者に対するショートハイドレーション法を用いたS-1+CDDPの認容性試験に参加している他施設に本試験の参加を募り、早期に目標症例数の達成を目指す。
神経回路網形成におけるApontic/Trachea defectiveの役割

1.抗APT/TDF抗体で幼虫の脳を染色して共焦点顕微鏡を用いて観察後、三次元像を構築した。その結果、APT/TDFは特定のニューロンで働くのではなく、神経回路網形成においてより一般的な役割を果たしていることが示唆された。2.TDF/APTを眼で強制発現すると、著しいrough eye表現型を示した。この結果から、TDF/APTが視神経の形成のおいても役割を果たしている可能性が提起された。4.mbf1欠失変異株では、apt/tdf変異株と同様にCNSと気管の回路網形成に異常を示すが、トランスジーンからMBF1を供給するとこの表現系がレスキューされた。前年度に得られた結果と総合してCNSと気管の回路網形成において、MBF1がAPT/TDFのコアクチベーターとして働くと結論し、論文にして発表した(Liu et al. Development 130:719-728,2003)。我々は転写制御因子とTATAボックス結合タンパク質(TBP)の間を仲介して転写を活性化するコアクチベーターMBF1を発見し、ショウジョウバエを用いてその個体レベルでの機能を解析してきた。その結果、MBF1と相互作用する因子のひとつとしてApontic(APT)/Trachea defective(TDF)を同定した。APT/TDFは中枢神経系(CNS)、末梢神経系(PNS)や呼吸器官である気管(Trachea)で発現している。我々はapt/tdf変異株でCNSと気管のネットワーク形成に異常が生じることを見出した。本研究ではAPT/TDFの機能解析を通して神経と気管のネットワーク形成に共通した基本的な機構の解明をめざす。本年度の研究から以下の成果が得られた。1.抗APT/TDF抗体と全てのニューロンの核を染色する抗ELAV抗体、もしくは全てのグリア細胞の核を検出する抗REPO抗体で野生株の胚を二重染色したところ、CNSとPNSいずれについてもほとんどのニューロンとグリアがAPT/TDFを発現していることが判明した。このことは、APT/TDFが神経回路網形成において基本的な役割を果すことを示唆している。2.APT/TDFの認識する塩基配列を同定した。3.APT/TDF結合配列-1acZ融合遺伝子を導入したtransgenic f1yを作製し、APT/TDFとその結合配列に依存して1acZが発現することを示し、APT/TDFが転写活性化因子であることを明らかにした。4.mbf1欠損変異株では、APT/TPFによる転写活性化が著しく低下した。5.APT/TDFを唾腺で強制発現すると、唾腺染色体上でAPT/TDFとMBF1が共局在することを示した。6.CNSと気管のネットワーク形成において、apt/tdfとmbf1遺伝子間に遺伝学的相互作用を見出した。これらの結果は、CNSと気管のネットワーク形成において、MBF1がAPT/TDFのコアクチベーターとして働くことを示している。
北海道東部における雪氷災害のマイクロ波遠隔計測および予測システムの開発

大雪災害時における広範囲の安全な積雪調査方法として、可搬型マイクロ波放射計を用いた遠隔および面的な積雪状況の観測手法を検討した。従来マイクロ波計測装置は大型であり、衛星、航空機による観測しか実施されていなかったが本研究では可搬型マイクロ波放射計を用いた雪氷観測手法の開発を行った。屋内外の観測実験より、マイクロ波放射に影響する積雪・結氷・融解パラメターを計測し(湖や港湾部の結氷も含む)、基礎データの取得を目指した。この研究はそのような内部構造変化を検出することをめざした。検出のための観測技術の開発とともに、積雪層の数値シミュレーションも行った。北見工大で積雪層構造の予測モデルを作成し、改良を進めた。北見を中心に北海道数地点でモデルの検証が行なわれその結果、積雪深は比較的どの地域でも良子であり、北見の断面観測との比較では、雪温はモデルの方が低温であったものの密度はよく一致し雪質についても、しもざらめ化をよく表現できていた。さらに、道内各地の積雪気象データとの比較を行い、道東ではほぼ良好な結果を得たが、根室など沿岸部の強風域では積雪の特性、強風の影響、積雪・降雪観測計への捕捉率の低下などで検討すべき点が見つかっている。降雪時に、本州では気温や地温の影響により積雪開始や融解時に誤差が生じ易く、豪雪地帯ではAMeDASデータだけでは判断できない積雪の誤差が生じている。マイクロ波放射計、積雪変化シミュレーションという最薪の計測・解析技術を使用して、遠隔計測とモデル計算という現在の進展が著しい技術を組み合わせた新しい雪氷情報取得をめざした。大雪災害時における広範囲の安全な積雪調査方法として、可搬型マイクロ波放射計を用いた遠隔および面的な積雪状況の観測手法の開発を開始した。小型軽量化されたマイクロ波放射計の作成により、マイクロ波放射特性に影響する積雪・結氷・融解パラメターを計測し(湖や港湾部の結氷も含む)、精度の高い遠隔・非破壊観測のための基礎データの取得を開始した。三菱特機システム(株)にて、フィールド観測用小型マイクロ波放射計の作成を行ない、積雪域における検定試験や寒冷環境における野外観測の耐寒性能の確認を行なった。屋外設置用の簡易観測基盤を用いて、積雪観測、海氷観測の現場実施性能を確認し、さらにフィールド観測の機動性を高めるために機器および観測台座の検討を行なっている。大学敷地内で行なわれている積雪観測のデータによる積雪の変質、融解などの情報とマイクロ波観測結果の対比を行なった。沿岸結氷の検出・変化の観測をめざして、海上保安庁の砕氷船「そうや」によるオホーツク海の海氷パトロールにて砕氷船上でのマイクロ波放射計の取り付け可能性、データ取得などについて、基礎的な実験を行なった。沿岸や船舶からの観測の際には塩分を含んだ湿雪の着雪の影響を受けないようにすることが必要であるなど、改良に向けての現場情報を収集した。国内でも最も寒冷域である北海道東部の雪氷特性として、積雪層下部の脆弱な霜ザラメ層の発生検出などは雪崩防災上重要であり、検出のための観測技術を開発をめざし、積雪層の数値シミュレーションと組み合わせる。北見工大で積雪層構造の予測モデルを作成し、改良を進めている。積雪構造の数値モデルの性能として、道内各地の積雪気象データとの比較を行い、道東ではほぼ良好な結果を得たが、根室など沿岸部の強風域では積雪の特性、強風の影響、積雪・降雪観測計への捕捉率の低下などで検討すべき点が見つかった。フィールド観測用小型マイクロ波放射計を使用して積雪域における検定試験や寒冷環境における野外観測の耐寒性能の確認を行なった。大学敷地内で行なわれている積雪観測のデータ年よる積雪の変質、融解などの情報とマイクロ波観測結果の対比を行なった。沿岸結氷の検出・変化の観測をめざして、2007年2月に海上保安庁の砕氷船

「そうや」によるオホーツク海の海永パトロールにて砕氷船上でのマイクロ波放射計の取り付け可能性、データ取得などについて、基礎的な実験を行なった。沿岸や船舶からの観測の際には塩分を含んだ湿雪の着雪の影響を受けないようにすることが必要であるなど、改良に向けての現場情報を収集した。大雪災害時における広範囲の安全な積雪調査方法として、可搬型マイクロ波放射計を用いた遠隔および面的な積雪状況の観測手法の開発を行なった。マイクロ波放射特性に影響する積雪・結氷・融解パラメターを計測し(湖や港湾部の結氷も含む)、精度の高い遠隔・非破壊観測のための基礎データの取得している。国内でも最も寒冷域である北海道東部の雪氷特性として、積雪層下部の脆弱な霜ザラメ層の発生検出などは雪崩防災上重要であり、検出のための観測技術の開発をめざし、積雪層の数値シミュレーションと組み合わせる改良を進めている。さらに雪氷からのマイクロ波放射について、ドイツで開発されたマイクロ波放射数値モデル(MWMOD)を用いて、成長する薄氷からのマイクロ波放射を計算し、結氷実験と比較した。海氷成長の検出に有効なデータが得られている。本研究で目的としている大雪災害時における広範囲の安全な積雪調査方法として使用可能な可搬型マイクロ波放射計を用いた積雪状況の観測手法について開発すすめた。本研究では衛星観測などで使用されるマイクロ波放射計を小型軽量化したものを使用し、マイクロ波放射特性に影響する積雪・結氷・融解パラメターを計測し(湖や港湾部の結氷も含む)、精度の高い遠隔・非破壊観測のための基礎データを得た。低温実験室における積雪、融解、水皮膜路面の状況によるマイクロ波放射の変化を観察した。大学構内の積雪フィールドでもマイクロ波放射計を使用して積雪域における検定試験や寒冷環境における野外観測を行なった。沿岸結氷の検出・変化の観測をめざして、2008年2月に海上保安庁の砕氷船「そうや」によるオホーツク海の海氷パトロールにて砕氷船上でのマイクロ波放射計の取り付け可能性、データ取得などの観測・実験を行ない、結氷状態により変化するマイクロ波放射の基礎情報を得た。理論的にマイクロ波放射を計算するために、マイクロ波放射の数値モデル(MWMOD)を用いている。このモデルでは多重構造を持つ積雪・氷層からのマイクロ波放射を計算することが可能である。ただし、変動する積雪中の温度分布と湿潤状態が複雑な場合は、より現実的な値を入れる必要がある。大学構内における積雪観測上で入力パラメターとなる積雪構造の観測データを蓄積した。沿岸結氷にかかわるオホーツク海沿岸部の湖では、氷上に多雪がある場合については複雑になる。北海道東部のサロマ湖における積雪の観察を行い、温度、湿潤状態、内部状況を確認をおこないより現実的な氷上積雪データを取得した。
歩行困難な高齢者に対する歩行機能の回復をめざした足浴ケアの検証

高齢者は活動量の減少により廃用症候群に陥りやすく、特に歩行が困難となった場合は、寝たきりになる可能性が高い。これを防ぐために、足浴の温熱効果が下肢筋力やバランス能の向上に有効なのではないかと考え、入院中の高齢者に対して6週間の足浴を実施した。測定項目は、下肢筋力を反映する足指力、握力、足底荷重値であった。足浴介入後、立位を保てる群の荷重バランスには改善傾向が見られた。しかし支えなしで立位が取れない群は、足浴前の測定が低いうえ、足浴後の荷重バランスは悪化傾向が疑われた。このことから自力で立位を保てるレベルの高齢者に対しては、足浴が歩行機能回復に有効である可能性が示唆された。【研究の目的】高齢者は活動量の減少により廃用症候群に陥りやすく、特に歩行が困難となった場合は、寝たきりになる可能性が高い。これを防ぐために、歩行困難な高齢者の歩行機能を回復させるケアが重要であると考える。本研究においては、足浴の温熱効果に着目し、歩行困難な高齢者に対する歩行機能の回復をめざした足浴ケアの検証を行う。【研究計画】1)研究デザイン:足浴介入実験を実施する。研究期間は、6週間のコントロール期間とその後に続く6週間の足浴介入期間より構成される。それぞれの期間の前後で測定を行い、比較検討する。足浴介入期間は、1週間に2回の足浴を実施する。2)被験者:研究の同意が得られた歩行機能回復のための援助を受けている歩行困難な入院高齢者30名。対象となる被験者には、研究の趣旨、研究目的、研究方法を文書にて説明し、本人および家族の同意を文書にて得る。その際、研究の参加は自由であること、参加しなくとも不利益はないこと、研究の途中辞退も可能であることを明確に伝える。またデータは匿名であること、結果は公表することを説明する。なお除外対象者は、意思の疎通が困難である者である。3)研究期間および場所:研究期間は、平成24年12月平成25年2月である。研究場所は本学の系列病院である。4)測定項目:足指把持力と握力および足底圧と荷重バランスを測定する【研究実績】平成24年末に流行したノロウイルス感染症対策のため、予定より遅れた平成25年1月から足浴介入実験を開始し、現在も継続中である。被験者は27名の入院高齢者である。このうち6名が実験が終了している。また9名が退院や全身状態の悪化により研究参加が中止となった。8名が現在介入実験中であり、4名は今後実験開始予定である。辞退者は出ていない。今後は、全被験者の介入終了後にデータを解析し結果を検討していきたい。【研究目的】高齢者は活動量の減少により廃用症候群に陥りやすく、特に歩行が困難となった場合は、寝たきりになる可能性が高い。これを防ぐために、歩行困難な高齢者の歩行機能を回復させるケアが重要であると言える。本研究においては、足浴の温熱効果に着目し、歩行困難な高齢者に対する歩行機能の回復をめざした足浴ケアの検証を行った。【研究方法】研究は、それぞれ6週間のコントロール期間と足浴介入期間より構成され、両期間の前後で歩行機能を推測する項目の測定を行った。なお足浴の直接の温熱効果を避けるため、足浴介入後の測定は1週間の間隔をあけた。被験者は、研究同意が得られた歩行が困難な入院中の高齢者23名であった。歩行機能を推測するための測定項目は、筋力(握力、下肢筋力を反映する足指力)、足底荷重値および荷重バランス、立位姿勢であった。足浴は、6週間の足浴介入期間中に毎週2回計12回実施した。方法は、40±1°Cの温湯に足部を外踝上まで10分間浸漬した。分析にはSPSSを用い有意確率5%、有意傾向10%とした。【倫理的配慮】研究者の所属期間の研究倫理委員会の承認を得て実施した。被験者と家族から文書にて同意を得た。【研究成果】すべての日程に参加し、且つすべての項目が測定できた被験者は10名(年齢80±8.3歳)であった。足浴介入期間終了後、足指力が増加しており有意な傾向があった。荷重バランスの左右差は小さくなっていたが有意差はなかった。足浴介入後の足指力と荷重バランスの相関に有意傾向が認められた。これらの結果は、温熱効果による下肢筋力の向上がバランス能に関連しているためと推測される。

以上より立位困難な高齢者に対する定期的な足浴は歩行機能の維持回復に有効である可能性が示唆された。測定荷重値等その他データの詳細については現在分析中である。当初平成24年12月から足浴介入実験を開始する予定であったが、ノロウィロス感染症が流行し、本研究の協力病院では感染対策のための対策がとられていた。実験協力者である協力病院の看護部長と協議し、実験の開始を遅らせることとした。その後1月に入り、流行もやや落ち着きを見せ始めたため、1月末からの実験開始となった。計画では、冬季実験と夏季実験を行う予定であったが、足浴介入期が春期となった。外気温差による検討は難しくなったが、本来の目的を検討するには影響がないと考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、足浴介入実験を継続し、さらなるデータの収集にあたる方針である。介入実験終了後は、ただちにデータを解析し、結果を検討していくこととする。
海底洞窟貝類群の自然史科学的研究

1.パラオの海底洞窟から併来未知の殻形熊を示す奇妙な巻貝を発見し、新属新種(Pluviostilla palauensis)として報告した。2.生きた化石」貝類であるオウベッコウガキがインド・太平洋各地の海底洞窟に生息することを明らかにし、海底洞窟貝類群の種組成には地域性はあるものの、共通の種群が卓越することが示唆された。3.底洞窟に特有の巻貝類の一群ソビエツブ科巻貝2新属4新種を報告した。4.シラタマアマガイ属2新種を含む6種の殻体を検討し,コハクカノコガイ属と単系統群を構成することを明らかにし,コハクカノコガイ科を再定義した。5.コハクカノコガイ科の化石種を見いだし、同科は中新世にはすでに海底洞窟のような環境に適応していたことを明らかにした。6.海底洞窟からそれらはクチキレエビスガイ科Larochea亜科の新属・新種を記載した。Larochea亜科の諸種は深海に生息する種群であり、海底洞窟の貝類にしばしば見られる深海種との共通性がさらに確認された。7.海底洞窟から地上に続くanchialine環境、hyporeic環境、更に河川域からコハクカノコガイ類の2新属、多数の新種を見いだした。また、ジャマイカの巻貝1種がコハクカノコガイ属であることを明らかにした。8.沖縄本島の海底洞窟から微小甲殻類アミ目のHeteromysoides属の新種を見いだした.9.海底洞窟のシラタマアマガイ属とanchialine並びにhyporeic環境および河川域のコハクカノコガイ属諸種の解剖学的に検討し,殻体構造から示唆された両属の単系統性を支持する一方,海底洞窟→地下水域→河川域とうい新たな陸上進出の経路を初めて明らかにした.また、海底洞窟のシラタマアマガイとアマガイモドキを含めたアマガイ上目の28S rDNAの分子系統解析をおこない、同上目の進化史において少なくとも3回の陸上進出があり、シラタマアマガイを含むコハクカノコガイ科は新生代漸新世までには海底洞窟のような隠生的な環境に適応し、地下環境を通じて陸上河川域に進出した可能性を示した。1.熱帯浅海の海底洞窟から生きた化石生物を含む未知の生物は発見相次いでいる.本研究では,数年前にパラオの通称"シアーズトンネル"と呼ばれる海底洞窟から発見された奇妙な殻形態を示す巻貝を検討した.殻は成長の初期に平巻きで臍孔は大きく開き,成長に伴い螺層は前方に巻き,最終的には熱気球形となる.化石および現生のいかなる巻貝類にも知られていない殻形態である.未だ生体は採取されていないためその所属は不明であるが,殻体構造と胎殻の特徴からアマガイ目に類縁のある巻貝であることが明らかとなった.この巻貝を新属新種(Pluviostilla palauensis)として,貝類学雑誌に報告した.今後,この貝類の生体を見いだし,その所属を明らかにする必要が出てきた.2.海底洞窟の貝類群は地域性はあるものの,熱帯インド太平洋では類似の属種構成を示す.

これまでに採取したカキ類の同定作業を行った結果,沖縄で発見された生きた化石種のオオベッコウガキはインド太平洋の海底洞窟に広く生息することを明らかにした.3.海底洞窟に特徴的に産出する巻貝類の一つにソビエツブ科がある.これまでの研究代表者の調査研究で約20新種を見いだしているが,今回2新属(Tinianella, Ampullosansonia),4新種を発見し,分類学的に記載した.4.これまでの調査で,熱帯の海底洞窟にはアマガイ目の未知の種を発見している.現在これらの属種を分類学的研究を進めている.それらの起源を知るため,化石貝類の検討を行ったところ,エニウェトック環礁からかって報告された種の中に海底洞窟のアマガイ目の未知種に近縁なものを見いだし,新属新種(Pisulinella miocenica)として報告した.これは,海底洞窟に生息するPisulina属に近縁で,海底洞窟に知られる種に伴って産出し,このような貝類が新第三紀中新世に生息していたことが明らかとなった.1.南西諸島を含む熱帯インド・太平洋各地には,生きた化石種,あるいは未知の貝類が多数生息する.本研究では海底洞窟貝類群の起源を明らかにするため,これらの貝類の分類学的研究を進めている.本年度は,熱帯インド・太平洋の海底洞窟特有の巻貝類の1グループであるシラタマアマガイ属の殻体および軟体の解剖学的研究に関する成果が得られた.同属はこれまで現生種2種,化石種1種が知られ,アマガイ科クサイロカノコガイ亜科の1属とみなされていたが,殼体のSEMによる詳細な観察(殻構造,胎殻の形態など)の結果,新たな現生2新種と1未同定化石種が見いだされ,それらは河川域に生息するコハクカノコガイ類に近縁で,それらと同一の科(コハクカノコガイ科)を構成することが明らかとなった(Paleontological Research誌に掲載済み).また,シラタマアマガイ属とコハクカノコガイ属の諸種の解剖学的研究から,コハクカノコガイ属はシラタマアマガイ属から由来したことが明らかとなり,さらにコハクカノコガイ属は退化的な目を持つことから,海底洞窟→地下水域→河川域とうい新たな陸上進出の経路があることが明らかになった(Zoological Scripta誌に投稿中).2.本年度はもう一つの海底洞窟特有のクチケレエビスガイ科巻貝類の分類学的研究を進め,海底洞窟にのみ知られる1新属2新種を見いだした(The Veliger誌に投稿中).この新たな属は,クチケレエビスガイ科の深海域に知られるLarochea亜科の既知2属に近縁であることが明らかとなり,今後の解剖学的研究が進めば,新属の起源が解明される見込みである.1.海底洞窟は、海岸付近の様々な環境を経て、地上の地下水系に繋がっていることが多い。本研究では、海底洞窟からanchialineを経て地下水系に連続的は水系は、これまで知られていない生物の海から陸上への進出経路の一つと考えている。本研究では、鹿児島県上甑島の貝池の海岸を仕切る岩石州内部のanchialine環境、高知・愛媛両県の河川の河口付近の礫下からアマガイ上目コハクカノコ科の新種ツバサコハクカノコ(Neritilia mimotoi)を発見した。コハクカノコ科は、これまで河川の河口付近からかなり内陸部の岩石上に生息するものが知られていたが、岩石下の隙間やanchialine環境からは初めてである。2.本研究で調査した熱帯インド・太平洋の殆どの海底洞窟から産出する微少巻貝類の2種の殻および軟体を詳しく検討した結果、それらはクチキレエビスガイ科、Larochea亜科の新属・新種(Trogloconcha ohashii、Troglocancha tesselata)であることを明らかにした。
金属系アクアドライブシステムのためのトライボ電気化学溶出の定量評価

金属系アクアドライブシステムの使用環境となる水道水中及び純水中の腐食摩耗現象解明のため,ステンレス鋼を対象として,往復動摩擦摩耗試験器とインパクトフレッティング摩擦摩耗試験器による実験とシミュレーションを用いて検討を行った.実験及びシミュレーションより,純水や水道水程度の濃度の水環境中においても,化学的作用による摩耗量増加の影響を無視すべきでないという結果が得られた.金属系アクアドライブシステムの使用環境となる水道水中及び純水中の腐食摩耗現象解明のため,ステンレス鋼を対象として,往復動摩擦摩耗試験器とインパクトフレッティング摩擦摩耗試験器による実験とシミュレーションを用いて検討を行った.実験及びシミュレーションより,純水や水道水程度の濃度の水環境中においても,化学的作用による摩耗量増加の影響を無視すべきでないという結果が得られた.金属系アクアドライブシステムの使用環境となる水道水中での腐食摩耗現象解明のために重要となる金属表面の新生面の露出と再不動態化のモデル化を行うため,新生面の不動態化挙動に起因する電流-時間曲線モデルについて検討を行った.その結果,金属表面は非常に薄い少なくとも2層の不動態膜(Primary filmとSecondary film)とトライボ膜に覆われていると考えられ,ステンレス鋼においては対数則あるいは放物線則が適用可能であることがわかった.その測定方法には主にスクラッチのような機械的方法とポテンシャルステップ法のような電気化学的手法があるが,一致する場合と両者の差が大きい場合があり,その妥当性の検討が今後必要である.また,摩擦によって誘導されるひずみや温度上昇などの考慮も必要であり,温度上昇に関しては瞬間熱源の重ね合わせとアレニウスの式のような熱活性化過程で取り扱うことが可能であると考えられる。新生面の機械的露出を考える上で重要となる表面の微細凹凸を考慮した直接的接触問題解析のプログラム作成を行い,256×256グリッド程度のランダムな表面微細凹凸を考慮した接触問題における接触圧力分布,変形量,表面下応力分布等の計算が可能となった.また,ランダム表面のモデル化に関する研究を実施し,確率モデルにおけるパラメータと平均値・高さ分布について解析的に検討して関係式を導き,その妥当性を数値計算的に確かめた.金属系アクアドライブシステムの使用環境となる水道水中での腐食摩耗現象解明のために重要となる金属表面の新生面の露出と再不動態化のモデル化を行うため,往復動摩擦摩耗試験器とインパクトフレッティング摩擦摩耗試験器による実験と解析を用いて検討を行った.実験では,水道水と同程度の電気伝導率を有する硫酸ナトリウム水溶液と比較のために純水を用い,ステンレス鋼SUS604の摩擦・摩耗挙動を検討するとともに,三電極法を用いた電気化学的測定を行った.実験より,往復動摩擦摩耗試験器とインパクトフレッティング摩擦摩耗試験器の両方において,摩耗量は周波数の増加とともに指数関数的に減少するという結果が示され,研究代表者らが提案している腐食摩耗モデルを裏付ける結果が得られた.また,純水や水道水程度の濃度の水環境中においても,不動態膜の破壊と再生による摩耗量増加の影響を無視できないという知見を得た.電気化学的測定においては,新生面の露出による電位降下が測定された.また,解析においては摩擦環境下での材料の接触状態を詳細に把握するため,影響係数法を用いた粗さ接触解析プログラムを開発した.解析においては,並列化計算を取り入れるなどの高速化を行い,計算時間を約1/5程度に向上することができた.この解析プログラムにより,任意の三次元表面粗さ面の接触状態(接触圧力,変位,表面下応力)が解析可能となり,腐食摩耗現象における接触状態を詳細に把握できるようになった.
Siナノチューブの合成

1.Siナノチューブ合成システムの試作:合成システムは、大電流密度イオン銃、金属蒸気源、4軸可加熱試料ステージをメインコンポーネントとする。イオン銃には、差動排気型マイクロビームイオン銃(MIED-IV;日本電子(株))を採用した。電流密度の最高値は2mA/cm^2以上に達した。金属蒸気源には、アークプラズマガン(APG;(株)ULVAC)を採用した。APGは、金属ターゲット周囲での局所的なパルスアーク放電を粒子放出の基本原理とし、放電を誘起するためのガス供給を必要としないことから超高真空作動が可能である。到達真空度は10^<-7>Paであり、合成中も10^<-6>Pa台の真空度の保持が可能であった。2.Siナノ構造の作製:本試作合成システムを用い、ナノチューブを始めとする、各種ナノ構造の作製を行った。触媒金属粒子供給速度(D)と飛来イオン速度(S)の比(D/S)には、チューブを初めとするナノ突起の合成を可能とする閾値が存在した。この閾値以下では、基板表面は、平坦構造、あるいは、ナノサイズのリップル構造を呈し、閾値以上では、基板温度制御によって、円錐状ナノ突起、ナノRod、ナノチューブの随意形成が可能であった。また、D/S比の制御によってこれらナノ突起のサイズ制御が可能であった。3.チューブ構造の応用展開:ナノチューブに特有の先鋭な先端構造の利点を生かすには、電界電子放射を基本原理とする微小電子源応用が最有力である。このための足場となる「チューブ構造からの電界電子放出基礎理論」を構築すると共に、チューブ族の一つ、カーボンナノチューブを用い、構築理論の妥当性の検証を行った。半導体材料でのボトムアップ型ナノ材料・構造作製はようやく緒についたばかりである。今後、本研究で得られた知見をさらに発展させ、複合ナノ材料・構造作製技術の開発に取り組む予定である。1.平成12年度研究計画(1)全体計画の討議:研究期間は3カ年であり、本年度が初年度である。速やかに全メンバーの会合を開き、試作装置の詳細を含め、本研究への取り組み全般について、十分な討議を行う。(2)実験システムの設計・制作:上記の討議結果を踏まえ、金属蒸気源、差動排気型大電流密度イオン銃、4軸可加熱試料ステージをメインコンポーネントとするSiナノチューブ合成システムの設計を行う。本体チャンバーは、ポンプ油成分フリーの、イオンポンプ排気による超高真空チャンバーとする。(3)全体システムの組み立て・調整:すべてのコンポーネントの到着を待って、全体システムの組み立て・調整を行う。2.成果概要(1)研究計画に則り、上述のメインコンポーネントから成る、Siナノチューブ合成システムの設計・製作・調整を行った。到達真空度は、現状では3x10^<-7>Pa(当初の計画通り)であるが、真空度は排気時間と共に向上することから、今後、真空槽が"枯れて"くれば、更に良い真空度での実験が可能となろう。金属蒸気源としては、クヌードセン・セルが一般的ではあるが、本研究には、高融点金属蒸気が必要であることから、アークプラズマ蒸着源を採用した。アークプラズマの発生はパルス的に行われ、従って、高真空での蒸着が可能であり、本研究の目的に合致した。イオン銃には、ターボ分子ポンプによる差動排気方式を採用し、得られた差圧は4桁に達した。従って、スパッタ中でも、チャンバーの圧力は、10^<-6>Pa台に保つことが可能であった。

電流密度の最高値は2mA/cm^2であった。4軸可加熱試料ステージには、加熱フィラメントによる傍熱加熱方式を採用し、600°C以上の試料加熱が可能であった。(2)応用探索の一環として、ナノチューブからの電界電子放射(FE)に関する理論解析を進め、すでに合成に成功している炭素ナノチューブからのFE特性解析にそれを適用すると共に、炭素ナノチューブからのFEを動作原理とするX線管を試作し、ナノチューブの実用材料としての有用性を示す事ができた。1.Siナノチューブ成長条件の確立:昨年度完成させた、金属蒸気源、差動排気型大電流密度イオン銃、4軸可加熱試料ステージ、ガス導入系をメインコンポーネントとする、「Siナノチューブ合成システム」を用い、ナノチューブの作製を行った。ナノチューブの合成には、触媒金属粒子供給、基板加熱が不可欠であった。基板温度500°Cで得られたチューブの直径は、現状では約400mであり、ナノサイズ化には、成長温度、粒子供給速度等の更なる最適化が必要であり、次年度の課題である。2.新奇形態・構造の探索:同装置を用い、化合物半導体のナノ構造作製を試みた。化合物半導体では、チューブ構造を呈するものは確認されなかったものの、ナノワイヤーの形成が認められた。現在、ワイヤー直径20nm程度以下の合成が容易であり、成長方向制御も可能である。化合物半導体の場合、半導体を構成する元素の一つが、ワイヤー成長時の触媒としての機能をも果たす場合があることが明らかにされ、従って、外部からの触媒金属供給がナノ構造発現の必要条件とは必ずしもなり得なかった。3.応用探索:一般的に知られる炭素ナノチューブ(CNTs)の場合、最も進んだ段階にある応用として、極微小電子源が挙げられる。本研究のナノチューブの場合、従来のSiテクノロジーが流用できることから、CNTsに比して、デバイス化に利点を有す。両ナノチューブの電子放射特性の比較実験が今後必要となることから、CNTsについても、任意の基板上への垂直配向成長条件を確立すると共に、ナノチューブからの電界電子放射(FE)特性に関する理論解析法を考案し、作製された垂直配向CNTsを用いて、理論の妥当性についての検証を行った。加えて、垂直配向CNTsを用い、FEを動作原理とするX線管の試作に成功し、ナノチューブの実用材料としての有用性を示した。1.Siナノチューブ成長条件の確立と発展:昨年度に引き続き、金属蒸気源、差動排気型大電流密度イオン銃、4軸可加熱試料ステージ、ガス導入系をメインコンポーネントとする、「Siナノチューブ合成システム」を用い、ナノチューブの作製を行った。触媒金属粒子供給速度(S)と飛来イオン速度(E)の比(S/E)には、チューブを初めとするナノ突起の合成を可能とする閾値が存在した。この閾値以上では、ナノ突起のサイズは段階的に変化し、従って、S/E比の制御によってナノ突起のサイズ制御が可能であった。また、基板温度制御によってナノ突起の形態制御が可能であった。2.触媒粒子無供給実験との比較:触媒金属粒子供給を伴わない場合、Si表面は、イオン照射に対して比較的平坦な浸食面を呈したが、照射条件によっては、ナノリップルの形成が認められた。リップルの稜線はイオン入射方向に垂直に形成され、高速Arイオン衝撃下では、リップルの平均波長(リップル頂点間の距離)はイオンエネルギーの増加と共に増加した。透過電子顕微鏡断面観察より、リップルは結晶層と外皮非晶質層より構成される
百万年以上にわたり組換えが抑制された染色体ゲノムの構造・動態解析

本研究ではマウス17番染色体に位置する"数百万年の間、組換えが抑制された染色体領域"に着目し、その染色体ゲノムがどのように進化するかを調べることを目的とした。解析の結果、この領域には大規模な逆位が存在しており、その境界点近傍には重複、欠失等のゲノム再編成が認められた。また、この領域のゲノムクローンを単離し、解析した結果、逆位を持つゲノムの配列には、標準系統に比べ、非常に高頻度の一塩基遺伝子多型が検出されることがわかった。染色体の組換え(交叉)は遺伝的多様性を生み出す原動力であり、ゲノムの再編・進化にも重要な役割を持つものと考えられる。本研究では数百万年の間、組換えが抑制されたマウス17番染色体の染色体領域であるt-ハプロタイプの構造・配列解析を行い、その構造情報を得ることを第一義の目的とする。さらに、構造情報をもとに、組換えが関与しない場合の染色体の進化過程を追跡し、組換えの意義を染色体レベルで改めて評価することを試みる。今年度はインサートサイズが平均約100kbのt-ハプロタイプBACライブラリーを作製し,実際にt-コンプレックス領域のゲノムクローンの単離を行ってきた。同時にアレイCGHにより,C57BL/6(B6)ゲノムに比して,コピー数が変動している領域を向定した。この領域のBACクローンの単離を行ったところ,多コピーを示す領域からは他の部分と比べて,多数の陽性クローンが得られた。このことはアレイCGHの結果を裏付けるもので,この部分で重複や欠失等のゲノム再構成が生じていることが示唆された。今後は,さらにクローン単離を進めるとともに配列解析を含めた構造解析を行っていく。また,ゲノムマイクロアレイを用いたハイブリッドキャプチャーにより,t-コンプレックス領域を濃縮し選択的に単離する技術の確立を試み,実際に単離したDNAの配列決定を次世代シークエンサーを用いて行った。その結果,B6ゲノム配列との間に多数の遺伝子多型が存在する事を見出した。この方法により,約10倍程度の濃縮が可能となったが,今後さらに濃縮率を上げ,解析全体の効率を高めていく必要がある。今年度は、tw5ハプロタイプのホモ個体のゲノムDNAを用いて作製したBACゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、t-コンプレックス領域のゲノムクローンを単離した。また、このBACクローンの次世代シークエンサーによる配列決定を行った。さらにハイブリッドキャプチャーに用いるプローブ設計を行い、キャプチャー実験に用いるtw5以外のt-ハプロタイプマウスを入手し、DNAの調製を行った。アレイCGH実験に用いるマイクロアレイプローブを再設計し、新規のマイクロアレイを用いて、t-ハプロタイプゲノムと標準系統であるC57BL/6Jゲノムのコピー数の比較や、DNA再編成の有無を検討した。その結果、これまでに見出した大規模な重複、欠失が存在することが再確認されたが、見つかっていなかった多数の小規模なDNA再編成を見出すことにも成功した。この新規アレイを用いて3種類の異なるt-ハプロタイプゲノムを比較した結果、t-ハプロタイプ同志は標準系統に比べると相対的に似通った構造を持っているが、t-ハプロタイプ相互の間でも、大規模な重複あるいは欠失が存在することが確かめられた。このことから、染色体組換えが抑制された状況でも大規模なDNA再編成が生じ得ることが示唆された。染色体の組換え(交叉)は遺伝的多様性を生み出す原動力であり、ゲノムの再編・進化にも重要な役割を持つ。本研究では数百万年の間、組換えが抑制されたマウス17番染色体の染色体領域であるt-ハプロタイプの構造・配列解析を行い、その構造情報を得ることを第一義の目的としている。これらのBACクローンの一部の配列決定を行った。その結果、t-ハプロタイプのゲノム配列は、現在知られている実験標準系統(C57BL/6)の配列と比較した場合、非常に高頻度の一塩基遺伝子多型(SNP)が検出されることがわかった。現在、tw5以外のt-ハプロタイプゲノムとの比較、t-ハプロタイプ同志の比較を行っている。アレイCGH実験に用いるマイクロアレイプローブを再設計し、新規のマイクロアレイを用いて、t-ハプロタイプゲノムと標準系統であるC57BL/6ゲノムのコピー数の比較や、DNA再編成の有無を検討した結果、大規模な重複、欠失が存在することが確認された。

この再編成の位置より、t-ハプロタイプに存在する逆位の切断点の位置が推測された。また、大規模な再構成だけでなく、多数の小規模なDNA再編成も検出された。この新規アレイを用いて複数の異なるt-ハプロタイプゲノムを比較した結果、t-ハプロタイプ同志は標準系統に比べると相対的に似通った構造を持っているが、t-ハプロタイプ相互の間でも、大規模な重複あるいは欠失が存在することが確かめられた。このことから、染色体組換えが抑制された状況でも大規模なDNA再編成が生じ得る、あるいは進化の過程で再編成(逆位など)は複数回生じた、と推測された。
Candida酵母の炭素源分解に関与する一群の関連遺伝子の解析系の確立

本研究では,基礎研究上や応用上,興味深い酵母Camdida maltosaを対象とし,宿主-ベクター系を開発し,その系を利用して炭素源を変えた時に誘導される遺伝子やそのプロモーターを単離し,遺伝生化学的に解析すると共に,物質変換系としての利用の道を拓くことを目的とする.初年(昭和62年)度には, (i)本酵母の宿主-ベクター系を開発し,より利用しやすい系を完成させる. (ii)炭素源を変えた時に"on""off"される一群の遺伝子のプロモーターを単離するためのプロモータープローブベクターを開発する,の2点で成果を挙げることができた.(i)私はすでにC.maltosaで複製起点と成り得るARS領域を染色体DNAより単離している.この領域を用いヒスチジン要求変異株を相補するDNA断片を単離することができた.ARS領域とこの領域を用い, C.maltosaのヒスチジン要求株を宿主とする種々のベクターを構築した.これらベクターは今後,遺伝子やプロモーターのセルフクローニングのために有用である.(ii)炭素源を変えた時に発現する遺伝子のプロモーター群の単離のために, LEU2遺伝子を利用してプロモータープローブベクターを構築した.このベクターは,そのままではC.maltosaのロイシン要求生を相補することはできないが,ある炭素源を含む培地で培養した時に"on"になるプロモーターがLEU2遺伝子の上流に挿入された時には,ロイシン要求性を相補できる構造になっている.今後,このベクターを利用して炭素源により"on""off"されるプロモーターを単離し,非水溶生物質の転換に関与する異種DNAの発現系の構築を行う.本研究では,基礎研究上や応用上,興味深い酵母Camdida maltosaを対象とし,宿主-ベクター系を開発し,その系を利用して炭素源を変えた時に誘導される遺伝子やそのプロモーターを単離し,遺伝生化学的に解析すると共に,物質変換系としての利用の道を拓くことを目的とする.初年(昭和62年)度には, (i)本酵母の宿主-ベクター系を開発し,より利用しやすい系を完成させる. (ii)炭素源を変えた時に"on""off"される一群の遺伝子のプロモーターを単離するためのプロモータープローブベクターを開発する,の2点で成果を挙げることができた.(i)私はすでにC.maltosaで複製起点と成り得るARS領域を染色体DNAより単離している.この領域を用いヒスチジン要求変異株を相補するDNA断片を単離することができた.ARS領域とこの領域を用い, C.maltosaのヒスチジン要求株を宿主とする種々のベクターを構築した.これらベクターは今後,遺伝子やプロモーターのセルフクローニングのために有用である.(ii)炭素源を変えた時に発現する遺伝子のプロモーター群の単離のために, LEU2遺伝子を利用してプロモータープローブベクターを構築した.このベクターは,そのままではC.maltosaのロイシン要求生を相補することはできないが,ある炭素源を含む培地で培養した時に"on"になるプロモーターがLEU2遺伝子の上流に挿入された時には,ロイシン要求性を相補できる構造になっている.今後,このベクターを利用して炭素源により"on""off"されるプロモーターを単離し,非水溶生物質の転換に関与する異種DNAの発現系の構築を行う.
小腸冊子縁膜との相互作用を指標にした乳脂肪球膜糖タンパク質の生理機能解析

本研究では、脂肪球膜(MFGM)糖タンパク質の生理機能を明らかにすることを最終目標とし、これらの糖タンパク質の構造解析、小腸冊子縁膜との相互作用、生合成、翻訳後修飾、など多方面から総合的に解析し、以下の成果を得た。(1)小腸冊子縁膜との相互作用:ウシ乳脂肪球膜タンパク質を非還元、非加熱条件で処理した後にSDS-PAGE、およびPVDF膜へ転写し、マウスおよびラットの小腸冊子縁膜と反応させ、冊子縁膜のアルカリフォスファターゼの活性染色により相互作用する分子を探索した結果、既知成分のMFG-E8およびブチロフィリンを含む数種のバンドが弱く染色された。調製した冊子縁膜のロットによって反応性が検出されない場合もあり、さらに測定系を改良して追試するが必要である。(2)MFGM糖タンパク質の糖鎖とその修飾酵素:MFGM糖タンパク質と小腸上皮との相互作用における糖鎖役割を解明するために、糖タンパク質糖鎖の合成に関与する糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素について研究した。ガラクトース転移酵素の高感度活性測定系を新たに確立して乳汁中での自発的ガラクトース転移反応を発見し、MFGM糖タンパク質がその標的基質となることを示唆した。(3)MFGM糖タンパク質の生合成とその制御機構:乳腺細胞におけるMFGM糖タンパク質の発現様式を解析し、高脂肪食により脂質の生合成が低下してもMFGM糖タンパク質の合成はほとんど変化しないことを明らかにした。また、MFG-E8に対して泌乳期特異的にO-型糖鎖付加ドメインが付与されることを発見した。さらにMFG-E8は精子頭部にも発現することを明らかにした。また、MFGM糖タンパク質の発現制御に関与すると推定されるシグナル分子の乳腺での発現変動や作用機構について解析し、乳腺特異的なプロテインフォスファターゼによる負の制御の可能性を示唆した。乳は、乳幼児などの未熟な消化器官によっても十分利用されるという、他の食品には無い特殊性を持つ。特に、乳汁中の脂肪は、他の食品脂肪と異なり、リン脂質や糖タンパク質からなる皮膜(脂肪球皮膜)で覆われ、乳汁中にエマルションとして分散して存在している。我々は、これまでの研究成果より乳脂肪球皮膜タンパク質は新生児腸管内での乳脂肪の消化・吸収に重要な役割を果たすという仮説を抱いている。本研究では、この脂肪球皮膜タンパク質を中心にして、小腸冊子縁膜に存在する膜タンパク質、糖脂質などの複合生体萬分子との特異的な相互作用を明らかにするために、上記乳タンパク質に対する冊子縁膜上のリガンドあるいは受容体分子を探索・同定することを目的とした。ヒトの乳汁と小腸冊子縁膜のモデルとして、マウス乳汁と小腸冊子縁膜およびラット小腸冊子縁膜を用いて研究を進めた。今年度は、まずマウスおよびラット乳脂肪球皮膜の調製を行った。泌乳期のマウスをネンブタール麻酔し、オキシトシンで乳汁の分泌を促進した後、搾乳した。採取した乳汁から、クリーム画分を分離した後、遠心分離と超音波処理を用いて脂肪球皮膜を調製した。調製した乳脂肪球皮膜標品に含まれるタンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、カゼインや乳清タンパク質の夾雑がない高純度の皮膜標品が得られたことを確認した。次に、マウスおよびラット小腸上皮冊子縁膜の調製を行った。

小腸上皮冊子縁膜は、哺乳期および離乳後のマウスおまびラット小腸より、2価陽イオンによる基底側膜小胞の選択的凝集を利用した遠心分離法を用いて調製した。得られた標品について、マーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性を測定し、冊子縁膜小胞が濃縮されていることを確認した。現在、小腸冊子縁膜を可溶化し、電気泳動・リガンドブロット解析によって乳脂肪球皮膜との相互作用を解析している。乳脂肪球皮膜(MFGM)タンパク質は新生児腸管内での乳脂肪の消化・吸収に重要な役割を果たすという仮説に基づいて、乳脂肪球皮膜糖タンパク質と小腸冊子縁膜との相互作用を解析した。MFGMタンパク質の中で、主要成分であるブチロフィリンとMFG-E8を大腸菌で組換え型タンパク質として発現させた。すなわち、ブチロフィリンの細胞外ドメイン、およびMGF-E8の2種のバリアントのcDNAをPCRで増幅し、大腸菌発現ベクター、pGFXに組み込んで、GSTとの融合タンパク質として発現させた。IPTGによる発現誘導後、菌体を回収して超音波により破砕し、遠心分離により不溶性および可溶性タンパク質を回収した。目的のGST融合タンパク質は不容性画分に存在したため、尿素で可容化して透析後、グルタチオンカラムで精製した。得られた組換えブチロフィリンとMFGM、さらにマウスミルクより分離したMFGM画分をPVDF膜にスロットブロットし、そこに哺乳期仔マウスより調製した小腸冊子縁膜小胞を反応させた。MFGMあるいは融合タンパク質に結合した冊子縁膜をそのマーカー酵素であるマルカリホスファターゼの活性染色により検出した。MFGMおよび融合タンパク質はいずれも弱いながら冊子縁膜結合活性を示し、対照として用いたGSTでは活性は認められなかったことから、MFGMは小腸冊子縁膜と相互作用を示すと推定し、さらに研究を進めた。MFGMおよび融合タンパク質を非還元下でSDS処理し、SDS-PAGEで分離後、PVDF膜に転写した。そこに冊子縁膜小胞を反応させ同様にアルカリホスファターゼ活性染色を行ったが、特定のバンドは検出されなかった。今後、アフィニティーカラムなどの未変性状態での相互作用の解析を行う予定である。本研究では、脂肪球膜(MFGM)糖タンパク質の生理機能を明らかにすることを最終目標とし、これらの糖タンパク質の構造解析、小腸冊子縁膜との相互作用、生合成、翻訳後修飾、など多方面から総合的に解析し、以下の成果を得た。(1)小腸冊子縁膜との相互作用:ウシ乳脂肪球膜タンパク質を非還元、非加熱条件で処理した後にSDS-PAGE、およびPVDF膜へ転写し、マウスおよびラットの小腸冊子縁膜と反応させ、冊子縁膜のアルカリフォスファターゼの活性染色により相互作用する分子を探索した結果、既知成分のMFG-E8およびブチロフィリンを含む数種のバンドが弱く染色された。調製した冊子縁膜のロットによって反応性が検出されない場合もあり、さらに測定系を改良して追試するが必要である。(2)MFGM糖タンパク質の糖鎖とその修飾酵素:MFGM糖タンパク質と小腸上皮との相互作用における糖鎖役割を解明するために、糖タンパク質糖鎖の合成に関与する糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素について研究した。ガラクトース転移酵素の高感度活性測定系を新たに確立して乳汁中での自発的ガラクトース転移反応を発見し、MFGM糖タンパク質がその標的基質となることを示唆した。(3)MFGM糖タンパク質の生合成とその制御