hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セリンプロテアーゼのタンパク質基質認識メカニズムの解明

セリンプロテアーゼはコラーゲンなどの難分解性タンパク質を分解することから、産業廃棄物利用や血栓症および神経疾患への応用に期待されている。本研究では、Streptomyces omiyaensis由来セリンプロテアーゼ(SOT)をモデル酵素として、高次構造を有するタンパク質基質に対する本酵素群の認識メカニズムを明らかにすることを目的とした。RIBSシャフリング法を用いた詳細な解析により、SOTのTyr71がタンパク質基質の高次構造の認識に、Arg72がコラーゲンとの結合に、Lys217とAla221がフィブリン分解に寄与する残基であることを明らかにした。近年、セリンプロテアーゼはコラーゲン、カゼイン、フィブリン、プリオンなどの難分解性タンパク質を分解することから、産業廃棄物利用や血栓症および神経疾患への応用に期待されている。しかし、本酵素群の高次構造を有するタンパク質基質に対する認識メカニズムは未だ明らかになっていない。そこで本研究では、研究代表者が見出した高活性なコラーゲン分解酵素であるStreptomyces omiyaensis由来セリンプロテアーゼ(SOT)をモデル酵素として取り上げ、基質高次構造の認識メカニズムを明らかにし、血栓症やアルツハイマー病等の難分解性タンパク質を原因とする疾患への応用を目指した研究を行っている。これまでにSOTはStreptomyces griseus由来Trypsin (SGT)と77%の相同性を持つにも拘らず、タンパク質基質の高次構造の認識に違いがあることを見出している。本年度は、これらのタンパク質基質の認識の違いに寄与する残基の特定を行った。RIBSshuming法を用いて、SOTとSGTのキメラライブラリーを作成し、タンパク質基質に対する活性を比較した結果、アミノ酸領域52-72が高次構造の認識に関与することが示唆された。さらに、変異体を用いた詳細な解析により、Tyr71がタンパク質基質の高次構造の認識に寄与する残基であることを明らかにした。この残基は、蛍光スペクトルおよびCDスペクトルの解析結果から酵素自身の構造にも大きな影響を与えることが示唆された。SGTの立体構造に基づくSOTのホモロジーモデリングの結果、Tyr71は立体構造上で触媒部位から離れていることがわかった。セリンプロテアーゼはコラーゲンやフィブリンなどの難分解性タンパク質を分解することから、産業廃棄物利用や血栓症等の疾患への応用に期待されている。そこで本課題では、我々が見出した高活性なコラーゲン分解酵素であるStreptomyces omiyaensis由来セリンプロテアーゼ(SOT)をモデル酵素とし、基質高次構造の認識メカニズムを明らかにすることを目的とした。前年度は、SOTとタンパク質基質の認識が異なるStreptomyces griseus由来Trypsin (SGT)とを用いてキメラライブラリーを作製し、Tyr71がSOTのタンパク質基質の高次構造の認識に寄与する残基であることを明らかにした。本年度は、タンパク質基質との結合性に関わる残基を特定するために、不活性型キメラおよび変異体酵素を作製し、表面プラズモン共鳴法により、原繊維状コラーゲン(タイプI)、網目構造状コラーゲン(タイプIV)、およびフィブリンとの結合性を解析した。その結果、SOTのArg72がコラーゲンとの、Lys217およびAla221がフィブリンとの結合において重要な残基であることがわかった。また、SGTのLeu71とGln172をそれぞれTyrとArgに置換した変異体は、タイプIVコラーゲンに対する活性が顕著に増大した。さらに、Ala217とArg221をそれぞれLysとAlaに置換した変異体は、フィブリン分解活性が5倍向上した。立体構造上では、Arg72は触媒部位から比較的近い所、Tyr71は離れた所、Lys217とAla221はC末のα-ヘリックス上に位置していた。Tyr71は近傍にTrp83が位置しており、互いに相互作用できる距離にあることから、このTrp83を介して、Asp82付近の環境が変化し、それによって高次構造を有する基質に対する分解活性が変化したと考える。
糖担持ブロックテロマ-自己組織化膜上における認識応答

界面における糖の認識結合過程は、生命現象にとって必須なものである。本研究では、複数のテロマ-ブロックを有する糖担持高分子からなる自己組織化膜上における分子認識現象を検討した。まず、マクロイニシエーター法により糖担持ブロックテロマ-を調製し、これを吸着させた界面における分子認識過程を、エバネッセント波を利用した多重全反射蛍光(MIRF)法を用いて検討した。さらに、糖担持高分子鎖を含むジスルフィド化合物を銀コロイド分散液とインキュベートし、糖を担持した高分子自己組織化膜で修飾された銀コロイド粒子を得た。表面増強ラマン(SERS)法により、高分子鎖のコロイドへの結合部位(C-S-Ag)近傍のC-C結合がgauche型をとっていることがわかった。この糖担持高分子鎖自己組織化単分子膜とレクチンCon Aを混合した際には、その濁度変化速度と、グルコース担持高分子とガラクトース担持高分子の混合比率との間には、直線関係がみられた。金蒸着膜上においても同様の手法により糖担持高分子自己組織化単分子膜が形成され、その上におけるレクチンによる糖の認識・結合、及び低分子糖の存在による糖担持高分子・レクチン複合体の解離が、高感度反射測定法(IR-RAS)により確認された。また重合開始・連鎖移動・停止剤機能を同時に有するベンジル-N,N-ジエチルジチオカルバメート(BDC)基を担持したリン脂質型のイニファータ-を用い、ラジカルリビング重合法により、重合度と組成の制御された糖担持あるいは情報応答性ブロックテロマ-を親水性部に有する新規脂質分子を得た。
ゲノムアレイを用いた先天異常症の効率的診断法の確立と疾患特異的構造異常の検索

染色体構造異常診断型アレイであるGenome Disorder Arrayの臨床的有用性の検討と既知染色体微細欠失重複症例の除外を目的に染色体構造異常診断型アレイを作成しスクリーニングを行ってきた。診断用アレイ用のBACの新たに選択しGenome Disorder Array version 3.0の構成を決定した。このアレイは、富士フィルムからGD700として発売され、(株)BMLでの受託研究検査として採用されるに到った。患児の表現型(phenome)の記載は、原因遺伝子未単離の既知疾患の診断とともに、新しい疾患概念の構築につながる可能性がある。少数チームでこのシステムに登録された症例のphenomeの検討を行うとともに患探索型アレイによる疾患特異的ゲノム構造異常の検索行い3つの新規疾患単位を提唱することができた。診断用アレイで異常を検出は検出できなかった症例のから平成20年度は、アジレント社の244Kアレイで13例を平成21年度はアフィメトリクスの2.7Mオリゴアレイで10症例解析を行ったが、明らかな異常を検出できなかった。関連施設との症例収集は、この3年間で281例となり、バンキングも同時進行しており解析可能な状態になった。染色体構造異常診断型アレイであるGenome Disorder Arrayの臨床的有用性の検討と既知染色体微細欠失重複症例の除外を目的に染色体構造異常診断型アレイによるスクリーニングを行ってきた。これまでの使用経験からBACの選択と新しい染色体欠失症候群の搭載の検討を行いGenome Disorder Array version 3.0の構成を決定した。これには、既知の微細欠失症候群、サブテロメア、セントロメアに対応する合計650のBACを搭載している。平成20年8月からコンソーシウム内での共用を始めた。患児の表現型(phemme)の記載は、原因遺伝子未単離の既知疾患の診断とともに、新しい疾患概念の構築につながる可能性がある。そのため参加施設に共通のphenome解析シートが必要である。平成18年度には、web上での登録可能なように暗号化処置を施し、検体の臨床情報収集システムを立ち上げた。平成20年度は、少数チームでこのシステムに登録された症例のphenomeの検討を行い新規疾患単位と考えられえる症例の検討を行い報告した。平成21年3月の段階で、登録症例数は、450症例を越え、バンキングも進行している。これまで解析した症例から原因遺伝子が特定されたものを報告した患児の表現型(phenome)の記載は、原因遺伝子未単離の既知疾患の診断とともに、新しい疾患概念の構築につながる可能性がある。平成20年度から、少数チームでこのシステムに登録された症例のphenomeの検討を行い新規疾患単位と考えられえる症例の検討を行っている。平成21年年度は、BACアレイで異常を検出は検出できなかった症例のから10症例を選択して、アフィメトリクスの2.7Mオリゴアレイでの検討を行ったが、明らかな異常を検出できなかった。平成22年3月の段階で、登録症例数は、500症例を越え、バンキングも進行している。昨年(株)BMLでの受託研究検査として採用されるに到った診断用のBACアレイGenome Disor der Array version 3.0は、研究での初期スクリーニングとして使用した。疾患探索型アレイでの検討は、WGA-4500を使用して東京医科歯科大学稲澤研究室で継続的に行っている。本研究での収集検体を含めた536症例のアレイ解析結果については、詳細な解析を行い病的CNVの検出頻度と特徴を報告した(JHG 2011)。また15番染色体長腕欠失例での心疾患合併の有無と欠失領域との関連についてアレイを用いて検討し、心疾患の成立に関する仮説を提唱した(EJMG 2011)患児の表現型(phenome)の記載は、原因遺伝子未単離の既知疾患の診断とともに、新しい疾患概念の構築につながる可能性がある。平成22年度は、本研究の最終年度にあたり、症例検討会を1月に東京医科歯科大学で行った。

症例検討の内容は、スタンドアローンのデータベースとして、大阪府立病院機構大阪府立母子保健総合医療センターに移管設置することになり設置を完了した。
サイトカイン刺激による正常ヒト造血幹細胞の細胞運動の分子機序解明

申請者は,通常運動しないとされている造血幹細胞(CD34陽性細胞)が特定のサイトカインで運動能を獲得することを見いだしている。サイトカインにより正常ヒトCD34陽性細胞が偽足形成を起こし,共焦点レーザー顕微鏡で偽足構造がF-actinから成ることを示した。細胞運動に関与すると考えられるアクチン細胞骨格の再構築が起こっていると考えられる。生きた細胞の運動解析の実験系をCD34陽性細胞に至適化するため,ヒト末梢血好中球を用いて諸条件の検討を行った。サイトカイン・Toll-like receptor agonist・カルパイン阻害剤による好中球の細胞運動を,ビデオ顕微鏡を用いて経時変化を解析した。MAPK阻害剤,ROCK阻害剤,PI-3 kinase阻害剤,抗インテグリン抗体で細胞運動が障害された。このことはMAPK,ROCK,PI-3 kinase及びインテグリンが好中球の細胞運動に深く関わることを示唆している。サイトカインによる好中球アポトーシスに関与するJNKの役割を解明した。サイトカインによる好中球の活性酸素産生・細胞運動に対するCalcium Channel Biockerの阻害作用を解明した。申請者は、造血幹細胞が多数占める正常ヒトCD34陽性細胞がサイトカインのSCFにより偽足形成を起こすことを見いだしている。しかし、TNF及びGM-CSFではこの現象は起こらない。運動しないと考えられているCD34陽性細胞が特定のサイトカインで運動能を獲得することを示している。共焦点レーザー顕微鏡で偽足構造はF-actinから成ることを示した。アクチン細胞骨格の再構築がCD34陽性細胞の形態変化に関与し、更には細胞運動にも関与すると考えられる。Ras類似低分子量G蛋白質Rhoはエフェクター分子であるROCK及びmDia1を介してアクチン細胞骨格を制御し、細胞運動・細胞接着・細胞形態変化に関与する。CD34陽性細胞の運動、特にF-actinから成る細胞構造体形成におけるRho及びRho関連分子の機能解析を進めている。生きた細胞め運動解析の実験系をCD34陽性細胞に至適化するため、ヒト末梢血好中球を用いて諸条件の検討を行った。サイトカイン添加により好中球が細胞運動を開始した。ビデオ顕微鏡を用いて好中球のサイトカインによる細胞運動能の経時変化を解析した。MAPK阻害剤、ROCK阻害剤、PI-3kinase阻害剤、抗インテグリン抗体で細胞運動が障害された。このことはMAPK、ROCK、PI-3kinase及びインテグリンが好中球の細胞運動に深く関わることを示唆している。
小学校社会科における知識を活用する力を育む学習材と授業モデルの開発

1研究目的習得した知識を効果的に活用する基盤として知識を整理する観点に着目し,空間軸,時間軸,社会軸をもとにその視点形成を育むための学習材や授業モデルを開発する。2研究方法(1)学習材を選択し,知識を整理する観点を意識して課題解決できるよう知識の構造化を図った。(2)各学年の授業モデルを複数開発し,児童の実態や新指導要領の内容に応じたモデルを実践した。(3)知識を整理する観点や活用する力を高めたか,ルーブリック評価を基にその有用性を考察した。3研究成果(1)具体事象から社会の仕組みを捉えさせる上で,時間軸や空間軸を意識させることは有効である。(1)「地域の伝統や文化を守り育てる仕組みを学ぶ」中学年の授業モデル広島市で行政や企業が支援して黒鯛栽培を行う理由について,現在と過去の食生活や風習等をもとに調べ,広島市の食文化を守り育てる活動を捉えた後,広島市以外の事例(高知県馬路村のゆず等)で習得した知識を活用し,地域の伝統や文化を守る仕組みとして一般化できた。(2)「ロングセラー商品が売れ続ける仕組みを学ぶ」5年食品工業の授業モデルかっぱえびせんに着目し,長年売れ続ける理由を現在と過去の材料や味等をもとに調べ,嗜好の変化等を捉えて商品を変え続ける企業努力を捉えた後,現在流通している他地域の同製品や他社製品について,習得した知識を活用して調べ,ロングセラー商品が成り立つ仕組みを捉えた。(3)「地図の情報から地域の様子や歴史を学ぶ」の中・高学年の授業モデル(一例)北九州市に工業地帯が存在し衰退した理由を,他の工業地域の地図や北九州の昔の地図と比較して考えることで,平野の少なさ,川の少なさ,炭鉱の閉鎖などの条件を捉えた。(2)知識を整理する観点の育成は思考力,表現力等,知識を活用する力を高めるのに効果的だが,軸だけでなく,着目する視点やそれらを繋ぐ関連性も同時に育成する必要がある。
非マメ科栽培植物に窒素固定力を付与するための戦略の策定

この研究では、マメ科植物の共生的窒素固定に関わる遺伝子群を植物と根粒菌(茎粒菌も含む)の双方で分離および構造解析を行い、最終的には非マメ科栽培植物に根粒形成能を付与し、窒素固定能を付けさせることが目的である。これまでの経過から、本年度はこれまでの研究を続けるとともに、今後の方向性についても考察した。実験については、根粒感染初期におけるデファレンシャルディスプレイを中心に行った。根粒感染のごく初期に発現が促進される遺伝子群は初期ノジュリンと呼ばれており、enod40やenod12などいくつかの遺伝子が分離されている。しかし、その機能はまだ十分に解明されていない。一方、根粒形成初期に発現が抑制される遺伝子も根粒形成の解明にとって重要であるが、これまでのところほとんど分離されていない。セスバニアは根粒感染部位が特定できる植物であり、根粒形成のごく初期に発現が制御される遺伝子の分離には都合がよい植物である。そこで、セスバニアのmRNAを用いてデファレンシャルディスプレイを行い、これらの遺伝子の分離を試みた。根粒感染と非感染植物でPCRにおいて増幅の違いが見られるDNA約80の塩基配列を解読した結果、多くのものは機能不明であるが、ストレス誘導タンパク質HSP70や薬剤耐性に関与するmultidrug resistance-associated proteinなどいくつかの注目される遺伝子が確認できた。一方、将来の研究の方向性については、全国的な共同研究体制の確立が必要であると考え、東北大学遺伝性態研究センター、農林水産省農業生物資源研究所、国際キリスト教大学理学部などと連携をとることが約束された。
2000℃級ガスタービン用先進的フィルム冷却の流動伝熱場の基礎データベースの構築

低速伝熱風洞を用いて、風洞の底辺に2種(円孔、シェイプト孔)のフィルム冷却模型を装着して実験を実施した。フィルム冷却空気と主流の定常・非定常の3次元混合場の状況および壁面におけるフィルム冷却効率に関する定量的測定を実施した。混合場の3次元的速度分布をLIF、PIV瞬時・同時計測を行った。また同時刻の時間平均されたフィルム冷却効率をPSPを用いて測定した。さらに申請者等が開発したLESに基づく解析を実施し測定データとの比較により解析精度の向上を図った。伝熱風洞で測定されたデータは、フィルム冷却孔形状、主流の条件と共に、数値解析の検証用データベースとして活用を図る目的で公開データとして整備した。2000C級のフィルム冷却は、その孔形状最適化および、それを適用する場の多用性と、現象が複雑な壁近傍における主流との非定常混合であることから非常に困難である。最小量のフィルム冷却空気で、壁面上に最適なフィルム冷却膜を形成する手法の構築を目指して、フィルム冷却空気と主流との混合の3次元流動場の詳細な測定と、その解析に関する初年度の研究を実施した。実験には、フィルム冷却孔としては典型的な30°傾斜した円孔フィルム1種と、円孔フィルム出口を流れ方向に15°、スパン方向両側にそれぞれ15°開いたシェイプトフィルム孔の計2種を用いた。測定方法には、H23-25年度科研基板研究Cで開発したアセトンLIF法を空間アセトン濃度分布の測定に、またオリーブ油微粒子を粒子マーカに用いたPIV法を空間速度分布の測定に適用した。さらに壁面のフィルム冷却効率をPSPを用いて測定した。瞬時場の結果とそれから得られる平均場の測定結果を用いて、アセトンの濃度変動のRMS(Root Mean Square)値を求めた。このRMS値からフィルム冷却空気と主流の混合が行われている詳細なメカニズムおよび領域が明らかになり、また主流乱れに強く依存することが明らかになった。数値解析の研究では、非定常乱流場が解析可能なLarge Eddy Simulationに基づく数値シミュレーションプログラムの開発を行った。またこのプログラムを用いてフィルム冷却空気に旋回を付加する新方式のフィルム冷却の数値解析を実施した。タービン翼エンドウォール内部で互いに交差する2本の傾斜衝突噴流により,内部冷却を兼ねつつフィルム冷却空気に旋回を付加する方式を対象として,キャビティ内部の旋回流を含めたLES解析を実施し,フィルム冷却性能の向上メカニズムの解明を試みるとともに,実験データとの比較を行った。平成26年度に引き続き、円孔およびシェイプトフィルム冷却孔の2種の伝熱模型を用いて、フィルム冷却空気の旋回強度をパラメータに、冷却壁面上のフィルム冷却効率をPSPで、また主流の混合の流動場をアセトンLIFとPIVで計測した。レーザ光学システムを流れ方向に自動トラパースする装置を導入して、連続した3次元的な流動場の測定を実施した。フィルム冷却孔形状に関しては、従来のシェイプト孔の形状を保った状態で、シェイプト孔の空間体積が大幅に大きくした深掘りシェイプト孔を考案し、同様の測定を行った。その結果、深掘りシェイプトフィルム孔は、従来のフィルム冷却孔の効率に比べて、約40%高い効率を示すことが明らかになった。一方アセトンLIFの定量測定法を、メタンを燃料とする予混合燃焼の反応を伴うガス燃料と空気の混合流動場に適用した。その結果酸素濃度が不均一な場での反応面の形状は,均一な場での反応面の形状に比較して,複雑な形状を示すことが明らかになった。また数値解析の分野では、平成26年度に開発したLarge Eddy Simulationに基づく数値シミュレーションプログラムの改良および機能の追加を行った.具体的には,実際のフィルム冷却で重要なパラメータとなる主流高温ガスとフィルム冷却空気の密度比を考慮するため,既存の非圧縮性流体解析プログラムに低マッハ数近似による解析ルーチンを導入し,主流とは密度が異なる冷却空気を用いたフィルム冷却の数値シミュレーションの実施を可能とすると共に、本プログラムを用いてシェイプトフィルム冷却孔を用いたフィルム冷却の数値解析を行った.冷却空気と主流の密度比をDR = 1.0とDR = 2.0とした数値解析を実施し,密度比がフィルム冷却効率に及ぼす影響を検討した.その結果、密度比のフィルム冷却空気と主流との混合状態への影響が明らかになった。円孔フィルムと典型的なシェイブトフィルム孔の2種の模型を用いて、さらにシェイプトフィルム孔の形状を保ったままでシェイプト空間体積が大幅に拡大させた深掘りシェイプトフィルム孔について、フィルム冷却空気の旋回強さをパラメータに、壁面上におけるフィルム冷却効率をPSPで、主流とフィルム冷却空気の3次元混合場をLIFとPIVで測定した。H27年度はレーザ光学システムを流れ方向に自動トラパースする装置を導入して、流れ方向の各2次元断面のLIFに関するデータを取得することによって、3次元の立体的なデーター取得出来た。これにより、フィルム冷却空気と主流の3次元混合場の詳細な流動場に関する基礎データの一部が取得できた。予混合燃焼場の燃料と燃焼用空気の混合場およびその後の燃焼場の定量的測定にアセトンLIFが適用可能かを調べるため実施した、測定では局所酸素濃度に依存した反応面の形状変化が観察され、アセトンLIFを反応面の詳細な測定に適用することが出来る(燃焼面までで燃焼後は別の測定方法が必要である。現在の研究ではOHラジカルの測定を試行している。)可能性を示した。フィルム冷却のフィルム冷却空気と主流との乱流混合場の数値解析では平成26年度に開発したLarge Eddy Simulationに基づく数値シミュレーションプログラムの改良および機能の追加を行った。

既存の非圧縮性流体解析プログラムに低マッハ数近似による解析ルーチンを導入し,主流とは密度が大きく異なる冷却空気を用いたフィルム冷却の数値シミュレーションの実施を可能となった。アセトンLIF法を用いたフィルム冷却の混合場の濃度分布測定データとの比較により良い一致を示した。低速伝熱風洞を用いて、その底辺にフィルム冷却模型2種(円孔、シェイプト孔)を装着して実験を実施した。フィルム冷却空気と主流の定常・非定常の3次元混合場および壁面のフィルム冷却効率に関する詳細な測定を行った。申請者等が開発したLIFおよびPIVを用い,主流とフィルム冷却空気の3次元混合場における瞬時の速度・アセトン濃度(温度に相当)分布を同時計測するとともに,光学系を流れ方向にトラバースすることで時間平均値の三次元場を定量的に測定した。また、測定壁面上の空間における3次元速度分布、アセトン濃度分布を測定する同時刻に壁面上におけるフィルム冷却効率をPSPで定量的に測定した。主流の一部を、フィルム冷却孔内でフィルム冷却空気と混ぜて少ないフィルム冷却空気量においてもフィルム孔から吹き出すフィルム冷却空気の体積流量を増加させ高いフィルム冷却効率を達成する深掘りシェイプトフィルム孔のフィルム冷却効率を測定し、従来のフィルム冷却孔よりも約100%高い事を確認した。フィルム冷却空気のフィルム冷却孔下流近傍のアセトン濃度の測定から、主流の一部がフィルム孔キャビティー内で混合する事によって高い効率を達成していることを明らかにした。3Dプリンターによるタービン翼冷却構造の製作が進めば、更に高いフィルム冷却効率を有する形状の可能性を明らかにした。数値解析では申請者等が開発したLarge Eddy Simulationに基づく解析を実施した。低マッハ数近似による解析ルーチンを導入し,主流とは密度が異なる冷却空気を用いたフィルム冷却の数値シミュレーションの解析精度向上を図った。風洞実験で測定されたデータは、フィルム冷却孔形状、主流入り口条件などのデータと共に、数値解析の検証用データーベースとして寄与するため公開データとして整備した。低速伝熱風洞を用いて、風洞の底辺に2種(円孔、シェイプト孔)のフィルム冷却模型を装着して実験を実施した。フィルム冷却空気と主流の定常・非定常の3次元混合場の状況および壁面におけるフィルム冷却効率に関する定量的測定を実施した。混合場の3次元的速度分布をLIF、PIV瞬時・同時計測を行った。また同時刻の時間平均されたフィルム冷却効率をPSPを用いて測定した。さらに申請者等が開発したLESに基づく解析を実施し測定データとの比較により解析精度の向上を図った。伝熱風洞で測定されたデータは、フィルム冷却孔形状、主流の条件と共に、数値解析の検証用データベースとして活用を図る目的で公開データとして整備した。
終末糖化産物の新規オンライン高感度分析法の開発と多面的な生体ストレス評価への応用

平成30年度は、実施計画に基づき、開発した終末糖化産物(AGEs)の一斉分析法および既に開発しているストレスホルモン分析法を用いて、生活習慣との関連で糖化ストレスや慢性ストレスの評価法を検討した。また、タバコ煙曝露による糖化ストレスへの影響を評価するため、受動喫煙の実態をニコチンやコチニンをバイオマーカーとして測定した。さらに、糖化ストレスによる生活習慣病発症の要因として、AGEs生成モデルによる蛋白質と糖の加熱による生成、食品からのAGEs摂取を把握するため、食品試料中の含量を測定した。1.コルチゾール、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びメラトニンなどのストレス関連ホルモン類を分析対象として、インチューブSPME/LC-MS/MS法による毛髪分析法を検討し、pg/mgレベルで定量評価する方法を開発した。2.生活習慣のアンケートと毛髪中ニコチンやコチニン含量から、慢性的な受動喫煙によるストレスとの関連性を評価した。特に、煙のでない加熱式タバコによる影響を喫煙者及び受動喫煙者から解析した。3.アルブミンやヘモグロビンとグルコースを加熱すると、メイラード反応により、褐変化現象が観察され、蛍光測定や質量分析で、糖化が生じていることを確認した。また、食品中AGEsを測定した結果、醤油や味噌、海苔などに数百ngレベルのカルボキシメチルリジン及びピラリンが、またビールにもピラリンが高濃度に検出されたが、ペントシジンは鰹節やパンなどにわずかに検出された。本研究で開発した分析法を用いれば、煩雑な試料前処理を必要とせず、選択的かつ高感度な分析が可能であり、糖化ストレスによる健康影響や疾病診断などへの応用が期待される。また、AGEsの生成メカニズムnお解明やAGEsの分子種を特定することが可能である。AGEsの分析において、生体試料や食品試料を分析する場合、マトリックスの影響を受け、回収率が悪く正確に定量できない場合がある。これを補正するためには、安定同位体標識化AGEsが必要であるが、入手が困難であり、カルボキシメチルリジンのみ入手先が判明したが、輸入のため時間がかかった。そのため、一部計画を変更し、AGEsの生成メカニズムを解析すべく、モデル系で実験を行ったため、当初の計画通りには進まなかった。ボランティア健常人の生活習慣アンケート調査と、生体試料中の糖化ストレス及び酸化ストレス(生体ストレス)レベルを測定し、多面的な生体ストレス解析評価法としての有効性を検証する。また、AGEsの生成メカニズムを解析し、どのような条件でどのAGEが生成しやすいのか、またどのような食品にAGEsは多く含まれているのかを明らかにして、野菜などの抗酸化食品摂取による糖化ストレス防御など、食生活の改善や生活習慣の改善などにより糖化ストレス予防について考察する。また、最終年度に当たり、研究成果の取りまとめと学会発表、インパクトの高い英文ジャーナルへ論文として公表し、インターネットやマスメディアを通じて、社会・国民に向けてアピールする。平成29年度は、実施計画に基づき、糖尿病、動脈硬化症など老化関連疾患の発症、重症化因子として知られている終末糖化産物(AGEs)を一斉に解析するために、インチューブ固相マイクロ抽出(SPME)/液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)法による高感度なオンライン自動分析システムを考案開発した。1.カルボキシメチルリシン、ペントシジン、ピラリンなどの各種AGEsを分析対象として、インチューブSPME条件(キャピラリーカラムの種類、吸入/吐出回数など)を最適化したところ、検討したGCキャピラリーの中でCarboxen 1006 PLOTが最もよく、試料40 μLを200 μL/minの速度で25回繰返し吸入/吐出する時、効率よく抽出できた。2.インチューブSPME/LC-MS/MS法の分析条件検討の結果、InertSustainSwiftC18カラムを用いるとき、いずれの化合物も4分以内に一斉分析でき、ESIポジティブモードMRM検出により、1ー50 ng/mLの範囲で作成した検量線はいずれも相関係数0.995以上と良好な直線性を示し、pg/mLレベルで高感度定量できた。3.本法を用いて、非喫煙及び喫煙者の尿及び毛髪試料分析に適用した結果、少量の試料で再現性よく定量でき、非喫煙者に比べ喫煙者の尿及び毛髪中にカルボキシメチルリシンやピラリンが検出され、本研究で購入したAGE Readerを用いた分析法と良い相関性が得られた(R2=0.8948)。インチューブSPME/LCーMS/MS法による高感度なオンライン自動分析システムを開発する初期目標は達成されたが、マンパワー不足と装置の不具合で様々な試料への展開が不十分である。しかし、研究成果の一部は、学会等で発表した。

1.コルチゾール、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン及びメラトニンなどのストレス関連ホルモン類を分析対象として、インチューブSPME/LC-MS/MS法による毛髪分析法を検討し、pg/mgレベルで定量評価する方法を開発した。2.生活習慣のアンケートと毛髪中ニコチンやコチニン含量から、慢性的な受動喫煙によるストレスとの関連性を評価した。特に、煙のでない加熱式タバコによる影響を喫煙者及び受動喫煙者から解析した。3.アルブミンやヘモグロビンとグルコースを加熱すると、メイラード反応により、褐変化現象が観察され、蛍光測定や質量分析で、糖化が生じていることを確認した。また、食品中AGEsを測定した結果、醤油や味噌、海苔などに数百ngレベルのカルボキシメチルリジン及びピラリンが、またビールにもピラリンが高濃度に検出されたが、ペントシジンは鰹節やパンなどにわずかに検出された。本研究で開発した分析法を用いれば、煩雑な試料前処理を必要とせず、選択的かつ高感度な分析が可能であり、糖化ストレスによる健康影響や疾病診断などへの応用が期待される。また、AGEsの生成メカニズムnお解明やAGEsの分子種を特定することが可能である。AGEsの分析において、生体試料や食品試料を分析する場合、マトリックスの影響を受け、回収率が悪く正確に定量できない場合がある。これを補正するためには、安定同位体標識化AGEsが必要であるが、入手が困難であり、カルボキシメチルリジンのみ入手先が判明したが、輸入のため時間がかかった。そのため、一部計画を変更し、AGEsの生成メカニズムを解析すべく、モデル系で実験を行ったため、当初の計画通りには進まなかった。本年度が研究計画の2年目であり、初年度計画で目標が十分達成できなかった様々な生体試料への応用について再度検討する。そして、2年目の計画に従って、老化/疲労・ストレス、喫煙、飲酒・飲食、運動など生活習慣との関連をアンケート調査をもとに、酸化ストレス、糖化ストレスなど生体ストレスレベルを多面的に評価解析し、質的、量的変動から生活習慣との関連性を明らかにする。また、本年度は、確立した方法を用いて、AGEs生成メカニズムをタンパク質(アミノ酸)と糖との反応モデルを作成し、抗酸化食品など様々な食品成分による糖化抑制についても解析する。さらに、食品摂取状況から、どのような食生活が生体糖化ストレスレベルを促進あるいは抑制するのかを明らかにし、予防効果についても明らかにする予定である。ボランティア健常人の生活習慣アンケート調査と、生体試料中の糖化ストレス及び酸化ストレス(生体ストレス)レベルを測定し、多面的な生体ストレス解析評価法としての有効性を検証する。また、AGEsの生成メカニズムを解析し、どのような条件でどのAGEが生成しやすいのか、またどのような食品にAGEsは多く含まれているのかを明らかにして、野菜などの抗酸化食品摂取による糖化ストレス防御など、食生活の改善や生活習慣の改善などにより糖化ストレス予防について考察する。また、最終年度に当たり、研究成果の取りまとめと学会発表、インパクトの高い英文ジャーナルへ論文として公表し、インターネットやマスメディアを通じて、社会・国民に向けてアピールする。
新しい顔面神経麻痺治療への脱分化脂肪細胞由来cell extractの応用

顔面神経麻痺は表情筋の機能不全を伴い,発話や食事に影響を及ぼすことから患者QOLを著しく低下させる.そこで本研究では神経筋接合部の萎縮予防として脱分化脂肪細胞(DFATs)からcell extractを作製し,神経筋接合部へ投与することで顔面神経麻痺に対する新しい治療法の開発を目指す.近年,幹細胞を凍結・溶解して得られたcell extractによる臓器再生効果が報告されているが,DFATs由来cell extractを顔面神経再生に応用した研究はない.DFATs由来cell extractを顔面神経麻痺モデルへ移植し,神経筋接合部を中心とした運動神経の機能的・組織学的回復を評価する.顔面神経麻痺は表情筋の機能不全を伴い,発話や食事に影響を及ぼすことから患者QOLを著しく低下させる.そこで本研究では神経筋接合部の萎縮予防として脱分化脂肪細胞(DFATs)からcell extractを作製し,神経筋接合部へ投与することで顔面神経麻痺に対する新しい治療法の開発を目指す.近年,幹細胞を凍結・溶解して得られたcell extractによる臓器再生効果が報告されているが,DFATs由来cell extractを顔面神経再生に応用した研究はない.DFATs由来cell extractを顔面神経麻痺モデルへ移植し,神経筋接合部を中心とした運動神経の機能的・組織学的回復を評価する.
子どもの体力向上のための運動,遊び,健康生活習慣に関する研究

本研究は「子どもの体力低下要因について発育発達および社会生活的側面から体系的,総合的に調査研究し,体カ低下の要因」を究明することを目的とした先行研究プロジェクトを発展的に継承し,子どもの体力向上プログラムの実践的検証と,そのための運動,遊び,生活習慣改善に関する科学的根拠を総合的に解明するものであった.以下の4つのサブプロジェクトを実施した.課題a)走・跳・投などのスポーツに基礎的運動の成就と習熟を決定する主要動作実験協力校を依頼し,関連する単元で疾走向上プログラムを実践し,単元の前後に運動動作の成就と体力を測定した.構造方程式モデリングを適用して,小学生の疾走運動の成就と習熟を決定する主要動作と技能を分析した.課題b)健康のための体力つくり運動の運動特性と体力向上効果実験協力校を依頼し,体力つくりに関連する単元で体力向上プログラムを実践し,新体力テストを用いて体力測定を実施した.小学校と中学校での体力向上プログラムの効果を実践的に検証した.課題c)体力向上に有益な運動遊びの体力・運動特性基本運動の熟練者である体育専攻学生と未熟練者の一般学生男女を対象として,基本的運動遊びである蹴球の体力・動作・運動・戦術特性を検討するために,項目反応理論分析を適用して.蹴球動作・運動・戦術の成就と習熟のための達成度評価基準を分析した.課題d)体力向上のための主体的な生活習慣改善を決定する要因実験協力校を依頼し,体力つくりに関連する単元で体力向上プログラムを実践し,健康習慣,運動習慣,生活時間など健康生活に関する調査と体力測定を実施した.小学生と中学生の体力向上のための主体的な運動生活習慣の改善を決定する要因を分析した.本研究は「子どもの体力低下要因について発育発達および社会生活的側面から体系的,総合的に調査研究し,体カ低下の要因」を究明することを目的とした先行研究プロジェクトを発展的に継承し,子どもの体力向上プログラムの実践的検証と,そのための運動,遊び,生活習慣改善に関する科学的根拠を総合的に解明するものであった.以下の4つのサブプロジェクトを実施した.課題a)走・跳・投などのスポーツに基礎的運動の成就と習熟を決定する主要動作実験協力校を依頼し,関連する単元で疾走向上プログラムを実践し,単元の前後に運動動作の成就と体力を測定した.構造方程式モデリングを適用して,小学生の疾走運動の成就と習熟を決定する主要動作と技能を分析した.課題b)健康のための体力つくり運動の運動特性と体力向上効果実験協力校を依頼し,体力つくりに関連する単元で体力向上プログラムを実践し,新体力テストを用いて体力測定を実施した.小学校と中学校での体力向上プログラムの効果を実践的に検証した.課題c)体力向上に有益な運動遊びの体力・運動特性基本運動の熟練者である体育専攻学生と未熟練者の一般学生男女を対象として,基本的運動遊びである蹴球の体力・動作・運動・戦術特性を検討するために,項目反応理論分析を適用して.蹴球動作・運動・戦術の成就と習熟のための達成度評価基準を分析した.課題d)体力向上のための主体的な生活習慣改善を決定する要因実験協力校を依頼し,体力つくりに関連する単元で体力向上プログラムを実践し,健康習慣,運動習慣,生活時間など健康生活に関する調査と体力測定を実施した.小学生と中学生の体力向上のための主体的な運動生活習慣の改善を決定する要因を分析した.本研究の目的は子どもの体力向上プログラムの実践的検証と,そのための運動,遊び,生活習慣改善に関する科学的根拠を総合的に解明することであった.以下の4課題に焦点を当てた.課題a:基本的運動の動作成就の困難度から,基本運動における動作学習の階層的構造を解明する.対象:小学生各男女100人,計200人.測定:体育の学習指導要領に例示されている運動とスポーツの基本的運動の動作成就と体力特性を測定した.課題b:体ほぐしの軽運動の動作成就と体力特性からバランスボールを用いた「子どもの体力向上のための軽運動プログラム」を作成する.対象:基本運動の熟練者である体育専攻学生,各男女5人,計10人.実験:バランスボール運動の動作成就と体力特性を測定した.課題c:全国における運動遊びの系統的分類に基づいた運動遊びの運動特性,体力特性を調査し,体力向上のための運動遊び体系を解明する.対象:抽出された対象校における児童生徒12,000人.全都道府県教育委員会.調査1:課題dとともに運動遊び全国調査を準備した.地域と季節を考慮して調査時期を決定し,2年度に渡る.層化多段抽出により,小中高校の対象校を抽出した.調査系統は,都道府県教育委員会に依頼した.調査2:主要な運動遊びの方法を調査した.課題d:体力向上のための基本的生活習慣,内発的意欲,主体的態度,体力との関係を検証する.対象:小学1年生から高校3年生までの児童生徒12,000人.調査:課題cとともに全国調査を準備した.同一個人について,体力,生活習慣,運動・スポーツ活動の内発的意欲,主体的態度,達成満足感,自己認識などを調査した.層化多段抽出により,小中高校の対象校を抽出した.調査系統は,都道府県教育委員会に依頼した.対象者の同意:大学生対象者には実験の主旨を説明し,被験者として研究に参加することの同意を得た.

本研究は,子どもの体力向上プログラムの実践的検証と,そのための運動,遊び,生活習慣改善に関する科学的根拠を総合的に解明するものであった.検討課題は,a)走・跳・投などのスポーツに基礎的運動の成就・習熟を決定する主要動作,b)健康のための体力つくり運動の運動特性と体力向上効果,c)体力向上に有益な全国の運動遊びの体力・運動特性,d)体力向上のための主体的な生活習慣改善を決定する要因,の4課題に焦点を絞り,4つのサブプロジェクトを同時に実施する総合的研究プロジェクトであった.小学校年代では「運動ができるようになる発達過程」に焦点を当て,運動成就の適時年齢と系統的階層性を検討した.全国調査から体力つくりに有益な運動遊びの体系化を試みた.主体的に取り組む体力向上のための生活習慣改善を決定する要因を検討した.課題a:走運動の加齢に伴う運動成就・発達の系統的階層構造を検討した.実験:実験協力校に依頼し,小学生600人を対象として運動動作の成就度を測定し,加齢に伴う運動成就・発達の系統的階層構造を検討した.課題b:Gボールを用いた体ほぐしの軽運動の加齢に伴う運動特性と体力向上効果を検討した.実験:実験協力校に依頼し,小学生600人を対象としてGボール運動プログラムの実践し,加齢に伴う運動特性と体力向上効果を検討した.課題c:全国調査を準備し,遊びの系統的分類に基づいた遊びの運動・体力特性の構造を検討した.課題d:体力向上のための主体的な生活習慣改善を目的とした教育方法を検証した.調査:実験小学校に依頼し,小学生600人を対象とし「健康手帳」を使用し,生活習慣チェックを実施した.本研究は子どもの体力向上プログラムの実践的検証と,そのための運動,遊び,生活習慣改善に関する科学的根拠を総合的に解明するものであった.子どもの体力向上プログラム作成のために検証する科学的根拠は,a)走・跳・投などのスポーツに基礎的運動の成就・習熟を決定する主要動作,b)健康のための体力つくり運動の運動特性と体力向上効果,c)体力向上に有益な全国の運動遊びの体力・運動特性,d)体力向上のための主体的な生活習慣改善を決定する要因,の4課題に焦点を絞り,4つのサブプロジェクトを同時に実施する総合的研究プロジェクトであった.平成18年度では4つのサブプロジェクトの継続と,その成果に基づく体力向上プログラムの実践的検証を実施した.課題a:疾走運動の運動成就・発達の系統的階層性の検討と,それに基づく体力向上プログラムの根拠を検証した.実験:小学校に実験協力校を依頼し,小学生の疾走運動における主要動作と運動局面間における因果構造を検討し,疾走プログラムの根拠となる疾走動作構造を検討した.分担:尾縣課題b:体ほぐし運動の運動成就・発達の系統的階層性に基づく体力向上プログラムの効果を検証する.実験:実験協力校を依頼し,体力・運動能力つくりに関連する活動においてGボールプログラムを実践し,運動動作の成就度,体力を測定した.分担:長谷川.課題c:全国の運動遊びの系統分類と運動・体力特性の検証を継続した.実験:基本運動の熟練者である体育専攻学生男女100人,小学生100人を対象として,基本的運動遊びの動作特性,体力特性を検討した.分担:國土.課題d:体力向上のための主体的な生活習慣改善を目的とした教育方法を検討した.実験:小学校に実験協力校依頼し,関連する単元において体力・運動能力向上プログラムを実践した.体力,運動習慣,生活習慣を測定し,運動活動プログラムの効果を検討した.分担:西嶋.
反射・透過両モード測定による新しい超音波骨粗鬆症診断法に関する研究

本研究は、超音波による骨粗鬆症診断法の高精度化を目的として行った。1.逆フィルタ法によるパルス長の短縮ます、測定システム全体の伝達関数の周波数特性をネットワークアナライザを用いて測定して、それを縦続行列で表現し、つぎにこの縦続行列の逆行列を求めることによってシステムの周波数特性を補正するための逆フィルタを得た。さらに水槽実験を行って、受信信号に本手法を適用することによってパルス長が短縮されることを確認し、この補正法の有効性を明らかにした。2.超音波反射法による骨の厚さ測定踵に超音波を照射して反射波を測定し、皮膚表面からと骨表面からのパルスが分離できることを確認した。次に、踵を挟んで両側に配置した1対の超音波探触子を用いて、踵の両側から反射法により探触子と骨表面との間隔を測定し、これらの測定値を探触子の間隔から差し引くことにより骨の厚さをほぼ決定できることを確認した。シリコンゴムとベ-クライトからなるモデルについて水槽実験を行って、より正確な測定のためには、骨周囲の軟組織の音速を測定して、水と軟組織の速度の違いを考慮した補正する必要があることを明らかにした。3.超音波反射法による新しい診断法の検討反射係数を測定して骨の音響インピーダンスを測定・評価する方法において、これまで考慮されていなかった皮膚表面での反射損と軟組織内での伝搬損を補正して正確な音響インピーダンスを測定する方法を開発した。
凍結保存allograftによる肝動脈、上腸間膜動脈同時再建に関する研究

凍結保存graftを用い肝動脈、上腸間膜動脈を再建する場合の、ブタでの再建方法、感染下での凍結保存graftの安全性、術中肝虚血の軽減法とモニターにつきWister rat、ブタを用い検討した。1)ラット腹部大動脈をプログラムフリーズ後に-80°Cで凍結保存し、同系ラットに移植した。同時に盲腸穿孔結紮後摘出による汎発性腹膜炎を作成し、移植後1週、1月、3月でのグラフトの肉眼的、組織学的所見を検討した。全例で生存し、グラフトは開存し、膿瘍、血栓、仮性動脈瘤等は認めなかった。組織学的にもグラフトに移植に伴う変化は認めるが、腹膜炎による変化は認めなかった。2)ブタで肝動脈は再建可能であったが、上腸間膜動脈はリンパ管に厚く被われ、再建困難で、本実験には適さなかった。3)Wisterラットで肝を90分虚血した。1週生存率、再潅流後1時間と1週目の血清GOT、GPT、LDH、pH、IL-8、動脈血ケトン体比(AKBR)と肝の組織像と好中球浸潤数を求めた。コントロール(C)群、好中球に対するモノクローナル抗体Urge-8(50mg/Kg)投与群(U)、免疫抑制剤FK506(3mg/Kg)投与群(F)の間で比較検討した。1週生存率はC群で12/20(20匹中12匹生存)、U群で16/20、F群で15/19で、C群でやや低かった。再潅流1時間後にはC群はU、F群に比べ、GOT、GPT、LDH、IL-8が高く(P<0.01)、肝壊死、鬱血、細胞空胞化が強く、好中球浸潤数も多かった(P<0.01)。これらは1週後にはほぼ正常化した。4)肝虚血モデルで肝の組織酸素分圧は虚血を良く反映したが、肝障害の度合いは反映しなかった。以上より凍結保存動脈グラフトの腹膜炎時での安全性と肝虚血に対する好中球抗体、免疫抑制剤投与の有効性が証明され、肝動脈、上腸間膜動脈再建時への応用が期待できる。肝動脈,上腸間膜動脈根部の再建に凍結保存graftを用いる時の感染症に対する抵抗性を雄、8週齢、250gのWister rat、15Kgの食用ブタを用い検討した。1)ラット腹部大動脈グラフトの凍結保存:TC199(10%calf serum,10%DMSO,5%HEPES buffer添加)を加えたフリージングパックにラット腹部大動脈2cmを入れ、プログラムフリーザーにて-80°Cまで急速に冷凍するシステムを確立した。フリージング過程は良好で、グラフト凍結保存は成功した。2)凍結保存グラフトの移植:腹部大動脈を凍結保存1-2ヶ月後に解凍し、腹部大動脈に10-0糸にてマイクロ下の血管縫合を行い、安定した腹部大動脈移植モデルを作成し得た。

3)腹膜炎モデル作成:14G針で盲腸を穿孔結紮後、8時間後に壊死部盲腸切除、腹腔内清拭を行う汎発性腹膜炎のモデルで、ラットが生存可能で、グラフトが膿汁にさらされるグラフト感染実験モデルを作成した。4)腹膜炎での凍結保存グラフト感染の影響:腹膜炎下のグラフト移植後1週ー3月目に犠牲死させ、肉眼的、組織学的に観察した。ラットは全例生存し、血栓形成もなく、大動脈の開存率は100%であった。グラフト周囲に癒着はあるが、膿瘍形成、血栓、仮性動脈瘤等は認めなかった。グラフトの凍結保存に伴う変化は認めるが、腹膜炎の影響はなく、凍結グラフトは感染に抵抗が強かった。5)ブタ肝動脈から腹部大動脈の摘出:ブタで肝動脈、上腸間膜動脈を観察するに、肝動脈は剥離可能であるが、上腸間膜動脈は周囲にリンパ管、神経に被われ、ブタを生かした状態で剥離するのは困難であった。一方、肝動脈から腹部大動脈を摘出、凍結保存するのと、腹部大動脈ー肝動脈移植は可能であった。6)肝虚血における肝酸素分圧:ラットとブタの肝虚血実験モデルで肝の酸素分圧は虚血に伴い、変化した。酸素分圧測定は肝動脈の再建に伴う酸素化の状態をモニターするのに有用であった。目的:肝動脈、上腸間膜動脈の再建中に問題となる肝虚血が好中球抗体、免疫抑制剤の投与で軽減するか否か検討した。方法:肝虚血はYadavらの方法で、体重230-250gのWisterラットを用い、尾状葉、乳様突起、方形葉、右外側葉を切除し、残肝を各肝葉の肝門部にて90分クランプした。再潅流後1時間、1週目に採血し、血清GOT、GPT、LDH、pH、IL-8、動脈血ケトン体比(AKBR)を測定した。肝組織像とASD chloroacetateにより好中球を染色し、400倍の視野での肝の好中球浸潤数を求めた。コントロールのC群、好中球に対するモノクローナル抗体Urge-8(50mg/Kg)を再潅流前投与するU群、免疫抑制剤FK506(3mg/Kg)を虚血前投与するF群の計3群で比較検討した。1週間生存率、再潅流1時間、1週目の各種パラメーターを各6匹ずつ別個に実験を行った。また別の実験系で虚血前後の肝組織酸素分圧をラット、ブタでモニターした。結果:1週生存率はC群で12/20(20匹中12匹生存)、U群で16/20、F群で15/19で,C群で低い傾向にあった。再潅流1時間後にはC群はU、F群に比べ、GOT、GPT、LDH、IL-8が有意に高値をとり(P<0.01)、肝壊死、鬱血、細胞空胞化等が強く、好中球浸潤数も有意に高かった(P<0.01)。再潅流1週後にはほぼ正常に復した。虚血30、60、90分の肝組織酸素分圧はいずれの群でも前値の1/3-1/4に下がるが、再潅流後30、60分で速やかに前値に復した。肝組織酸素分圧は各群で差異は認めなかった。結語:以上より肝虚血の軽減には好中球抗体、免疫抑制剤の前投与が有効である事が示された。
AIRE発現細胞株を用いた自己抗原遺伝子の異所性発現の解析

自己免疫性多腺性内分泌不全症I型(APECED)は、AIRE遺伝子の突然変異により発症する。その発症メカニズムを解明するため、申請者は胸腺の中にごく僅かしか存在しないAIREを発現する細胞をマウスより株化しAIREの役割を探求している。このAire発現細胞株におけるAire遺伝子の発現を強制発現によって過剰にしたり、あるいはRNAiにより、ノックダウンすることに成功した。自己免疫疾患の中では珍しい常染色体劣性遺伝の単一遺伝子疾患であるAPECED(自己免疫性多腺性内分泌不全症-カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー)の原因遺伝子として同定された自己免疫調節遺伝子AIREは、組織特異的遺伝子の異所性発現を支配し、免疫学的寛容の成立に関与している。細胞内でAire蛋白と結合している未知蛋白質を共免疫沈降法で解析するためにマウスAire発現プラスミドを作成した。マウス胸腺由来のTotal RNAを用いて1st cDNA合成を行い、RT-PCR法により増幅したAireのコーディング領域を含むPCR産物をp3xFLAG-CMV-7. 1ベクターにクローニングし、N末端側にFLAGタグが融合されたAire蛋白を発現するプラスミドを構築した(p3XFLAG/N-Aire)。また、N末端側にStreptavidinタグとCalmodulinタグを融合したAire蛋白を発現するプラスミドpNTAP-B/Aireも構築した。Aire^+細胞にp3xFLAG/N-Aireを形質転換し、約7割の細胞にAireが強制発現される形質転換試薬(FuGENE6、Roche)と最適条件を求めた。さらにウエスダンプロッティング法と免疫細胞化学染色法により、作成した抗マウスAire抗体がAire蛋白を検出している事を確認した。現在、共免疫沈降によりAire蛋白複合体を回収するための細胞溶解や抗体反応の最適条件を検討中である。またAireの発現をノックダウンしたAire^+細胞株(以下Aire^<+low>細胞株)を新たに16株樹立した。このAire^<+low>細胞においては、いくつかの末梢組織特異的遺伝子の転写量が減少していた。自己免疫疾患の中では珍しい常染色体劣性遺伝の単一遺伝子疾患であるAPECED(自己免疫性多腺性内分泌不全症-カンジダ症-外胚葉性ジストロフィー)の原因遺伝子として同定された自己免疫調節遺伝子AIREは、末梢組織特異的遺伝子の異所性発現を支配し、免疫学的寛容の成立に関与している。マウス胸腺上皮細胞由来Aire^+細胞株におけるAireの発現をノックダウンするための標的配列をエキソン5、7(2つ)8、10、12と3'UTR上に7つデザインし、PENTR/H1/TOベクターに各オりゴヌクレオチドをクローニングした。さらにH1/TO pol lllプロモーター+各標的配列オリゴヌクレオチドのDNA断片を、Blasticidin耐性遺伝子をもつpLenti6/Block-iTDESTベクターにGatewayテクノロジーにてサブクローニングした。これらのプラスミドDNAをAire^+細胞に形質転換させた後、プラスミドが安定に導入されたAire^+細胞を約9日間で選択するためのBlasticidin最適培養条件を求めた。薬剤選択されたAire^+細胞において、どの標的配列が高いAireノックダウン効率を示すかを解析した。胸腺上皮細胞系と樹状細胞系Aire^+細胞において、エキソン12上の標的配列でそれぞれ57倍と500倍の高いノックダウン効率を示した。Aire^+細胞とAireを過剰発現させたAire^<+/high>細胞、AireをノックダウンしたAire^<+/low>細胞間における複数の末梢組織特異的遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCR法により比較解析した。