hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
染色体維持におけるヘテロクロマチンの機能

メチル化されたK9が存在しない出芽酵母では、異種的に発現したHP1タンパク質のヒンジ領域中の特定アミノ酸配列が細胞核へ局在することにより、生育阻害が生じる可能性を見出した。さらに、ChIP-Seq法により、HP1がK9メチル化非依存的に結合する出芽酵母クロマチン領域とその特徴を明らかにした(須賀)。【2】非コードDNAによるヘテロクロマチン化の解析(担当:古賀)ヨザルは夜行性であり、ヘテロクロマチンが視細胞の核で凝集し、これがレンズとしてはたらいて視力の向上をもたらすことが知られている。ヨザルの染色体には大量の構成的ヘテロクロマチンがある。これが凝集の主体となっているという仮説を立てて、視細胞の核でのこのヘテロクロマチンの所在を調べた。核の中央部に凝集しているという結果を得た。この結果は上記の仮説を支持する。【非コードDNAと高次クロマチン化の構造基盤の解明】1)本年度はHP1のM期特異的なリン酸化の動態を解析した。細胞周期を同調させたヒト培養細胞を用いてリン酸化HP1の挙動を解析したところ、HP1のリン酸化がM期の指標であるヒストンH3S10のリン酸化に先行して起きること、またリン酸化HP1がクロマチンから遊離していることを見出した(中山・中川)。2)ヒトHP1αを出芽酵母で異種的に発現した際に観察される生育阻害について、関与するHP1αのアミノ酸残基を同定した。また、H3K9メチル化酵素であるClr4を出芽酵母に導入し、HP1結合の変化を検出した。さらに再構成ヌクレオソームによる解析から、ヒストンH4のN末端テール領域が、ヌクレオソーム間の相互作用において2つの機能領域に分けられることを発見した。3)昨年度までに、Mis18複合体の構成因子であるMis18a-Mis18bについて低分解能の結晶を得ていた。本年度は、もう一つの構成因子であるMis18BP1の新規機能ドメインの構造を決定し、そのドメインに結合する因子の同定を行った。また、昨年度までに得られていた部分構造の分解能を改善するため、Mis18BP1含む三者複合体の再構成系を確立した。【非コードDNAによるヘテロクロマチン化の解析】昨年度までに、OwlRepが他の反復配列とともにヘテロクロマチンによるレンズ部位に存在することを見出していた。本年度は、それぞれの反復配列の核内分布を3次元FISHで調べ、OwlRepがレンズ本体を形成していること、かつてセントロメとして機能していた別の反復配列がレンズ形成の補助的役割を果たしていること、現在セントロメアとして機能する反復配列はレンズ形成に寄与していないことを明らかにした。以上から、3種類の反復配列の相互作用が進化的に短い期間でのレンズ獲得をもたらしたと推測される。染色体の機能ドメインは反復配列などの非コードDNAによって形成され、ヘテロクロマチンと呼ばれる高次のクロマチン構造がその機能に重要な役割を果たしている。ヘテロクロマチンには特徴的なヒストンのメチル化が存在し、その修飾を認識するHP1タンパク質が重要なことが明らかにされているが、非コードDNAとヘテロクロマチン化との関連には不明な点が残されている。
船舶システムにおけるHUMAN PERFORMANCEの把握,推定に関する基礎研究

本年度は,昨年度製作した船体動揺模擬装置(乗心地シミュレ-タ)を用いて船酔,乗り心地に関する基礎実験を行い,装置の動特性の計測,実験方法に関する検討,シミュレ-タの機能,性能の把握,調整を行った。装置の外形,仕様,制御方式,動特性等については研究成果報告書に詳しく述べられる。装置の駆動は3本のシリンダ-によって行われるが,制御系の特性から,高周波の衝撃的振動が残るため,更に制御方式に検討を加えねばならない.また,横揺れに関しては動揺中心が固定点であるため船体の横揺れと異なった動揺となっている。装置に横移動機能を追加して動揺中心を可変とする必要のあることがわかった。基礎実験として,0.1 Hz,0.2 Hz,0.3 Hzの横揺れ状態における船酔の実験を行った。1名の被験者に対してはそれぞれの動揺周波数に対して30分間計測を行った。横揺れを対象とした理由は,装置の制御に問題があるため,上下揺れを30分間持続できないためである。計測は,キャビンの動揺加速度(3軸),動揺角速度,各シリンダ-の変位,被験者の頭部加速度(3軸),表情及び顔面温度分布(装置は富士通研究所より借用)である.また,実験開始前,終了後に血圧,脈拍,体温の計測を行いその変化を調べた.実験中は,5分間隔で乗り心地,酔いの程度について被験者との対話,アンケ-ト用紙への記入を通じて行われた。実験結果の分析は現在進行中である,顔の表情,顔面温度分に関しては,ビデオ信号の画像処理を行う必要があるので,現在処理プログラムを開発中である。また解析にはファジイ理論の適用を考えている。医学関係の研究者との情報交換を通じて,脳波,心電,筋電,発汗の計測が不可欠であることがわかった。本年度は研究の第一歩として乗物酔い,乗心地に関する文献解題,航海時のアンケ-ト調査および乗心地シュミレ-タ-の設計,製作を行った。乗物酔いに関しては、文献の多くでは“吐く"を意味し、一部では“吐き気を催す"と定義されていることが明らかとなったが、その閾値は明確ではなく本研究で明らかにする必要があると考える。また,船体動揺の影響は上下加速度が重要であるとする文献が多いが,乗船者へのアンケ-ト調査(兵庫県海洋大学,おりえんとびいなす)によれば横揺が原因として最も重要であった。動揺の閾値との関連をも含めて未解決の部分の非常に多いことが判明した。乗心地シミュレ-タ-の設計,製作に関しては,予算的な制約が非常に大きく,最初の研究計画とはかなり規模,機能,性能の縮少を余儀なくされた。即ち,移動式より半固定可搬式への変更,動揺の自由度5より3(上下揺,縦揺,横揺)への減少,油圧制御方式の変更,計測設備の減少,等である。しかし,基本的な動きに関しては確保できる装置の設計,製作を行った。設計変更が多いため納入が遅れ,本年度は装置の基本動作の確認を行うだけに留めざるを得なかった。また,本研究の主題の1つである計量化の困難な乗心地の計測,解析評価に関してはFuzzy理論の適用が可能であることが明らかなって来たが,適用例は皆無であるので今後の成果に期待が持てそうである。人体内の生理水(血液,リンパ液)の動きと外的加速度との関連についてはモデル化を進めており,シミュレ-タを用いた実験を計画している。
糸球体腎炎におけるテネイシンの役割の解析

1.腎炎ラット糸球体におけるテネイシンの発現の解析WKY系ラットに坑GBM抗体を投与して作成した半月体性腎炎実験モデルにおけるテネイシンの発現の時間経過を詳細に検討した。同モデルにおいては抗体投与後3-4日までに蛋白尿が出現し、その腎機能も低下して腎不全に陥る。組織学的には、3日目には細胞性半月体が既に観察され、4週目には間質の変化も顕著となる。抗体投与後3日目には糸球体周囲のテネイシンの発現が亢進するとともに、半月体内にもテネイシンが観察された。4週目には間質にもテネイシンの発現が強く観察されるようになった。間質のテネイシンはその後も強い発現が続いたが、半月体のテネイシンは8週目以降次第に減少した。3-7日目のテネイシンmRNAは主にボ-マン嚢上皮細胞内に認められ、糸球体周囲及び半月体のテネイシンは同細胞により産生されることが示唆された。2.invitroにおけるテネイシンmRNAの発現培養糸球体細胞によるテネイシンの産生を蛋白質及びmRNAのレベルで検討した。坑テネイシン抗体を用いた抗体染色により、単離糸球体を培養してoutgrowthしてくる細胞にテネイシンの発現が観察された。また培養糸球体由来の上皮細胞(バーマン嚢上皮細胞あるいは足細胞)及び培養メサンギウム細胞のmRNAを調製し、ノーザンブロット法を行ったところ、両細胞においてテネイシンmRNAの発現が観察された。これらの結果から、糸球体固有の細胞が、テネイシン産生能を有することがわかった。
二段階抽出法の漸近有効性と多群判別問題への応用および非正規分布への拡張について

逐次解析法の第一人者E.J.Dudewicz(Syracuse大学,U.S.A.)との意見交換によって、新しいタイプの二段階法を開発することに成功した。さらに、九州大学との意見交換によって、この二段階法が、2つの正規母集団の平均の差について固定された大きさの推測を正確に与え、漸近有効性と漸近最適性を有することが証明された。以上の結果は、論文2に纏められた。新しいタイプの二段階法は、Stein型の二段階法で言えば、タイプIに対応するものであると見ることもできる。この意味で、Stein型のタイプIIに対応する新しい二段階法も考えられる。これについては実際に定式化し、しかも多変量データに対する二段階法に拡張することにも成功し、有効性において論文2の結果を改良することが、熊本大学との意見交換によって証明された(投稿中)。2つの多変量正規母集団の平均に関する多重比較の方法は図書1で与えた通りであるが、母集団の個数が3つ以上になると、推測に必要な標本数は著しく増加する。しかしながら、共分散行列に何らかの構造が仮定できる場合、構造に適した二段階法を開発することで、標本数の増加を抑えることが可能であることが証明された(投稿中)。この結果の多群判別問題に対する有効性は、九州大学や広島大学との意見交換によって進められている。二段階法における正規性の仮定を、推定量の独立性に関する条件にまで緩めても、手法の本質を損なうことがないことを論文3で述べた。これによると、非正規分布への拡張として、二母数指数分布を仮定した母集団選択の問題が議論できる。論文1では、二母数指数分布の2つのパラメータに関して、同時に母集団選択を行うことを可能にする二段階法を提案し有効性を証明した。
時価情報の開示効果の実証分析に銀行の有価証券含み益情報と株価の関係

本研究では、1990年3月決算期から95年3月決算期のデータを用いて、銀行の利益情報とわが国銀行株価の関係を、時価開示と利益操作の視点から分析した。1990年3月決算期から、邦銀では有価証券の時価開示が始まり、投資家は、歴史的原価による銀行利益が有価証券含み益の増減分だけ補正して期待を形成できることとなった。この時価開示による利益の補正が銀行株価に適切に反映しているかが問われる。銀行では、1992年3月決算まで、配当性向40%を限度としなければならないとする最高配当性向基準があった。また、93年決算期以降、大蔵省との協議をベースに段階的に不良債権の大規模な処理が進められている。この配当性向基準を満たすため、また不良債権処理のため、銀行は実質的にキャッシュフローを伴わない自由裁量項目(例えばクロス売買による証券売却益)を操作し公表利益を作り上げていたと考えられる。この利益操作は、株式市場で投資家に見抜かれているかが問われる。手法としては、Barth(1994)等の時価開示を含む銀行決算と株価の関係の研究を、主としてJones(1991)等の発生項目による利益管理の研究の視点から拡張する。発生項目と株価の関係に関する先駆的研究が、最近、Beaver=Engel(1996),Sloan(1996)等により発表された。本研究の独自性は、時価開示、発生項目の両者を同時にとりあげ、パネル手法を用いて分析するところにある。1990年3月のデータで分析した結果、有価証券含み益を補正し、さらに自由裁量項目操作前に公表利益をもどした操作前の「本来の」利益が、公表利益よりも株価にやや強く影響を及ぼしていた。利益操作の一部は見抜かれていた。また、投資家は有価証券含み益を含む時価開示情報を評価しており、この情報は株価に強く反映していた。本研究では、時価情報の開示の株価への効果を実証的に吟味する。具体的には、平成2年から始まったわが国銀行の有価証券含み益の開示と銀行株価の関係を分析している。銀行では、90年3月決算期から上場有価証券の時価情報の開示が開始された。本研究では、Barth(1994)等を検討し、モデルを定立し、この開示が、銀行株価に適切に反映されているかが問われる。平成7年度の研究では、都長信銀21行を対象に、90年3月決算期から11期の半年データと6年の年データを収集し、パネル分析を導入し、モデル定立のための分析を進めた。また、最終の分析にむけデータ収集の範囲を全銀行に拡張し、その作業のほぼ2分の1を完了した。業務利益、BIS自己資本、貸倒引当金、各種の予想利益などデータ項目を幅広く追加し、各項目と株価との関係をテストした。その結果、株価と利益、株価と含み益に明確な正の関係が認められた。つまり、本研究での基本モデル部分がほぼ固まってきた。モデル定立では、Barthモデルが否定されるか、大幅に修正されるであろう.ただ、都長信銀21行の分析結果であり、全上場銀行でもこの関係が安定して認められるかは、8年度のより詳細な研究を待たねばならない。これに並行して、8年度に向け、実証用のフル・データの整備を進めた。中間決算と予想情報等に手入力データがあるため、補助者にデータ収集を依頼した。データ収集作業の大半の時間は、手入力の作業にさかれた。本年度中にほぼ5割のデータが入力された。

本研究では、1990年3月決算期から95年3月決算期のデータを用いて、銀行の利益情報とわが国銀行株価の関係を、時価開示と利益操作の視点から分析した。1990年3月決算期から、邦銀では有価証券の時価開示が始まり、投資家は、歴史的原価による銀行利益が有価証券含み益の増減分だけ補正して期待を形成できることとなった。この時価開示による利益の補正が銀行株価に適切に反映しているかが問われる。銀行では、1992年3月決算まで、配当性向40%を限度としなければならないとする最高配当性向基準があった。また、93年決算期以降、大蔵省との協議をベースに段階的に不良債権の大規模な処理が進められている。この配当性向基準を満たすため、また不良債券処理のため、銀行は実質的にキャッシュフローを伴わない自由裁量項目(例えばクロス売買による証券売却益)を操作し公表利益を作り上げていたと考えられる。この利益操作は、株式市場で投資家に見抜かれているかが問われる。手法としては、Barth (1994)等の時価開示を含む銀行決算と株価の関係の研究を、主としてJones (1991)等の発生項目による利益管理の研究の視点から拡張する。発生項目と株価の関係に関する先駆的研究が、最近、Beaver=Engel (1996). Sloan (1996)等により発表された。本研究の独自性は、時価開示、発生項目の両者を同時にとりあげ、パネル手法を用いて分析するところにある。1990年3月から95年3月のデータで分析した結果有価証券含み益を補正し、さらに自由裁量項目操作前に公表利益をもどした操作前の「本来の」利益が、公表利益よりも株価にやや強く影響を及ぼしていた。投資家は時価開示をある程度評価しており、また利益操作の一部は見抜かれていた。
人間言語における数詞の統語構造と再帰メカニズムの研究

本研究課題では琉球語那覇方言,Dagaare語,日英語等,複数の異なる系統の言語の数詞システムを比較し自然言語の数詞の統語構造が加算演算子に大きく依存していることを明らかにした.また加算演算子は併合統語操作が直接的に適用された結果であるという提案をした.数詞における離散無限性の表れ方は,いわゆる1+1+1...のような後者関数のシステムでもなく,全ての自然数に対して同じ数の全く異なる種類の数詞を割り当てるシステムでもなく,加算・乗算演算と限られた数の基数を基にしたシステムであり,それは経済性と外在システム(記憶等)の相反する要請に対して認知システムが生み出した最適解であるという分析を提示した.1年目は基礎的研究期間と位置づけ、加算演算子(&)との関連から等位構造のメカニズムに関する研究を集中的に検討しそれぞれの言語の等位構造も記述するとする研究実施計画に基づき、本年度は数表現の統語構造を探る第一段階として、人間言語の等位接続構造の詳細な類型論的研究を行った。また、琉球語(首里方言)は2014年3月に一週間に渡りフィールドワーク研究を行った。本年度の研究の結果として:1人間言語の加算演算子が関わる等位接続構造においては、語順の主要部パラメータが普遍的に主要部先行(head-initial)であること。2等位接続において[& NP NP]という語順パターン(そしておそらくは[NP NP &]という語順パターンも含まれる)の存在が汎言語的に認められないという事実は、上記の語順パラメータと移動操作の相互作用から自然に説明することができること。が明らかになった。本年度扱った言語においてはいずれも名詞等位接続詞と数詞表現で用いられる加算演算子との間に類似性が見られたことから、数詞表現の統語構造を明らかにする上で本年度の研究成果は重要な1歩であると結論づけることができる。尚、上記研究結果は第88回アメリカ言語学会にてCoordination and the Head Parameterとして発表(ポスター発表)し、ホームページ上に公開している。本研究期間中には、加算演算子(&)と選言的演算子(or)の比較から、選言的演算子と疑問標示との統語的関係の研究も行った。この成果に関しては"Disjunction and Question in Dagaare"として2015年10月に国際学会での発表が決定している。最終年度である平成27年度は,複数の異なる系統の言語(日本語,英語,Dagaare語,琉球語那覇方言)の数詞のシステムを比較し,多くの言語で自然言語の数詞の統語構造が加算演算子に大きく依存していることを明らかにした.さらに加算演算子は併合統語操作が直接的に適用された結果であるという提案をし,自然言語の数詞がなぜ離散無限性を示すのかという問いに対し,併合操作の関与を具体的に明らかにした点で意義があると考えられる.その離散無限性の表し方は,いわゆる1+1+1+1...のような後者関数のシステムでもなく,また全ての自然数に対して同じ数の全く異なる種類の数詞を割り当てるシステムでもなく,加算演算と限られた数の基数を基にしたシステムであり,それは経済性と外在システム(記憶等)の相反する要請に対して認知システムが生み出した最適解であるという分析を提示した.また数詞は統語構造上は代名詞根要素と同一のカテゴリーに属する一方で,類別詞は代名詞根に後続する要素(名詞クラス要素)と同一のカテゴリーに属しているという分析を提示した.以上の本研究課題の3年間の研究成果をまとめ「自然言語の数詞とシンタクス」として論文を出版した.尚,本論文は日本語で執筆されているため,内容を大幅に拡充した英語論文を執筆中である.また本研究課題から新たに名詞構造内の数,性,人称を表す要素の分布とその普遍性に関して興味深い現象が明らかになった点において,数詞のメカニズムの解明にとどまらず,今後性,名詞クラス,類別詞の統語構造の研究につながる重要な基礎も築いたと言える.本研究課題では琉球語那覇方言,Dagaare語,日英語等,複数の異なる系統の言語の数詞システムを比較し自然言語の数詞の統語構造が加算演算子に大きく依存していることを明らかにした.また加算演算子は併合統語操作が直接的に適用された結果であるという提案をした.数詞における離散無限性の表れ方は,いわゆる1+1+1...のような後者関数のシステムでもなく,全ての自然数に対して同じ数の全く異なる種類の数詞を割り当てるシステムでもなく,加算・乗算演算と限られた数の基数を基にしたシステムであり,それは経済性と外在システム(記憶等)の相反する要請に対して認知システムが生み出した最適解であるという分析を提示した.予定通り日英語および琉球語(首里方言)・Dagaare語の数詞のシンタクスの研究が進展した。また本研究プロジェクトから名詞句内構造や疑問文と選言的演算子の関係の研究など、他現象への広がりも見られたのは当初の予定になかった成果と言える。理論言語学本年度はこれまで2年間で得られたデータを分析し理論化した上で国際的ジャーナルに投稿することを最終目標とする。予定通り等位接続構造の研究が進展し、学会発表を行うことができた。3月に行った沖縄フィールドワーク研究およびウィーン大学におけるAdams Bodomo氏とのDagaareに関する研究の支出精算が2015年度の処理扱いとなったため、次年度使用額が発生した。さらに等位接続構造の詳細な研究を推進する一方で、明らかになった等位接続構造に基づき、日本語、琉球語(首里方言)、英語、Dagaare語の数詞表現の統語構造を明らかにしていく予定。

今年度の使用計画には影響なく、当初の計画通り研究を遂行する予定である。3月に行ったフィールドワーク研究に関する旅費精算が2014年度の処理扱いとなったため、次年度使用額が発生した。次年度使用額は未精算額のみであるため、今年度の使用計画に影響はしない。当初の計画通り、研究を遂行する予定である。
集中治療室入室患者に対する映像療法によるせん妄発症予防効果

当該研究は集中治療室入室患者のせん妄発生に対する映像療法の効果を検証するものであり、重要であるのは、せん妄の評価・判断とそれに対する効果の評価であると考えている。当初から評価予定であった血中コルチゾール、メラトニンに加え、唾液中のオキシトシンの採取を追加することで、よりストレスや身体反応の評価の精度を高めるとともに、未だ議論の多い身体へのせん妄による影響についての見聞を深めることにつながると判断した。さらに、せん妄の評価・判断は問診や客観的評価によるスコアリングによる定性的な基準が多いなか、せん妄・睡眠の評価をより正確で再現性の高いものにするために簡易脳波測定を追加する方針とした。後者については精神科医や認定看護師による意見をもととしており、彼らと議論の時間を持ち、この研究から得られる結果だけでなく、実働においても活かせるべく、手段について検討した。これを受けて各専門分野の看護師や救急救命医からも、よりよい研究遂行・評価のために、意見を集め、介入を依頼するなどし、研究開始の前に十分な検討を重ねることとなった。これらの、追加に必要な準備を整えるため、より時間を要することとなった。また、それまでにも研究に必要な物品および人的準備・環境調整などに時間がかかっており、現在は未だ研究の成果を分析できるまでのデータ収集が十分に取得できていないが、その準備は2018年度の間に整えることができ、また、当初の計画に加えてより有効な研究となるための検討の時間を得、今後の研究の施行にむけることができた。研究に必要と考えられる評価・判断ツール等の再考を加えたことで、その交渉や改めての研究計画の調整・検討に時間をかけた。結果、追加となった事項を含めた準備により時間が必要となり、また、人事異動による現場の人員不足も重なり、研究施行と実臨床の同時並行が困難となった時期もあり、想定していたよりも物的・人的な準備に時間を要していたために研究開始に未だ至っていない。2018年度の間に追加点も含めた準備を整えてきており、他専門分野や他職種とのコミュニケーションも十分に得られた。今後は研究の実働を開始し、データ収集とその評価を計画に沿って進めていく所存である。しかしながら、今後も人員的な変化が大きいことが予測されるため、可能な限り効率的で再現性の高い方法を都度評価・検討し、実働開始後は円滑なデータ収集・解析を行うべく、現在も議論を重ねているところである。研究計画をもとに、機材準備の相談および、病棟でのせん妄に関する評価法・評価状況の把握・確認を行った。本研究ではせん妄状況をISDSCでスコア化しており、その病棟間によらない共有・周知・実践がまず必要である。また、せん妄についての体内物質評価項目として、改めてオキシトシンの測定を検討中であり、その必要機材の確認と共に、biomakerとしての位置づけについて評価中である。研究計画をもとに、機材準備の相談は進行したが、環境変化及び人員変化等により、実際の購入・設置・開始には至っていない。今後は、各種評価・確認・作業法の普及をしながらも、実践を見据えてモニター設置等を行い、研究導入を開始することが早急な目標であると考えている。

しかしながら、今後も人員的な変化が大きいことが予測されるため、可能な限り効率的で再現性の高い方法を都度評価・検討し、実働開始後は円滑なデータ収集・解析を行うべく、現在も議論を重ねているところである。2017年度は現状把握と研究のために必要な評価等の普及・共有の確認にあてられたため、実際の金銭的負担は生じていない。今後、それに伴った人件費等を実業と別途選定する予定である。研究進行が遅れており、研究に必要な物品の購入予定は今後も生じる予定である(具体的には映像療法に必要な映像、データ管理に必要なPC、データ解析の外部委託、研究結果の公表に必要な学会参加費・校正費等に伴うコストである)。
バイオメカニクスに基づく単心室患者の血栓症の進展予測と投薬計画

血流の影響を考慮して心臓大血管系の血栓形成のバイオメカニクスシミュレーション法を開発した.単心室症での術式として,心房・肺動脈連結法(APC法)と大静脈・肺動脈連結法(TCPC法)を対象とし,両術式による血流動態の違いと,血流に応じた血栓形成過程の違いをシミュレーションによって定量的に示した.さらに,抗血栓薬の薬効シミュレーションモデルを開発し,投薬量およびその投薬タイミングが抗血栓性に与える影響を検討した.一方,血栓形成バイオメカニクスモデルの高精度化を目指して,赤血球および白血球の変形運動メカニズムを検討した.血流の影響を考慮して心臓大血管系の血栓形成のバイオメカニクスシミュレーション法を開発した.単心室症での術式として,心房・肺動脈連結法(APC法)と大静脈・肺動脈連結法(TCPC法)を対象とし,両術式による血流動態の違いと,血流に応じた血栓形成過程の違いをシミュレーションによって定量的に示した.さらに,抗血栓薬の薬効シミュレーションモデルを開発し,投薬量およびその投薬タイミングが抗血栓性に与える影響を検討した.一方,血栓形成バイオメカニクスモデルの高精度化を目指して,赤血球および白血球の変形運動メカニズムを検討した.単心室症では,異常に形成された血栓が心房,心室や肺動脈で観察されることが多い.その理由は,血流の流体力学的な挙動が正常な心機能のそれと大きく異なるためと考えられるが,血栓形成と血流挙動との関係は明らかでない.本研究では,単心室症における血流の流体力学的挙動とその影響下における血栓形成現象を,計算力学シミュレーションを通じて明らかにし,さらに,血栓形成予測,薬効評価,および投薬の最適化を行う方法論の確立を目指す.今年度は,単心室症における血栓形成シミュレーションモデルの構築について,下記の項目を実施した.1.心臓大血管スケールの血栓形成について,血球成分より十分大きいスケールに対する血栓形成の現象論モデルについて,幾つかの種類を定式化し,二次元数値シミュレーションによってその特性を検証した.血栓形成の機序には,静脈血栓のそれを想定した.その結果,最大せん断速度とその持続時間を血栓形成の閾値として使うモデルが,血球スケールより十分大きいスケールの血栓形成を粒子法でシミュレートするために有用であることが分かった.2.単心室症における代表的な術式である心房・肺動脈連結法(APC法)と大静脈・肺動脈連結法(TCPC法)を対象とし,簡易な二次元血流路モデルを作成し,血流路形状の違いに応じた血流の流体力学的な挙動を調べた.さらに,血栓形成シミュレーションによって,血流の流体力学的挙動に応じた血栓形成挙動をシミュレートした.その結果,APC法に比べると,TCPC法では血流の停滞が少ないために血栓形成リスクが下がる可能性が示唆された.3.血栓形成で重要となる各血球の力学挙動を理解するために,実験と計算の両面から,白血球の能動的運動および赤血球の受動的運動のメカニズムを調べた.その結果,力学モデリングに必要な幾つかの物理特性とそれに応じた力学的振る舞いが明らかになった.単心室症では,異常に形成された血栓が心房,心室や肺動脈で観察されることが多い.その理由は,血流の流体力学的な挙動が正常な心機能のそれと大きく異なるためと考えられるが,血栓形成と血流挙動との関係は明らかでない.本研究では,単身室症における血流の流体力学的挙動とその影響下における血栓形成現象を,計算力学シミュレーションを通じて明らかにし,さらに,血栓形成予測,薬効評価,および投薬の最適化を行う方法論の確立を目指す.今年度は,血栓形成シミュレーションの高度化と薬効モデリングを以下のように行った.1.心臓大血管に対する医用画像ベースト三次元形状モデルの試作し,粒子法による三次元血流シミュレーションを実施可能であることを確認した.2.高せん断速度域における活性化を考慮した動脈血栓モデルを定式化し,同モデルがin vitro実験における血栓形成挙動を首尾良く再現することを示した.3.制御された流れ下における血栓形成挙動を詳細に観察するために,微小流路観察システムを試作し,流路内部における疑似血液の凝固過程を調べた.局所的な流れの違いが血栓形成に影響を与えることを確認された.4.抗血栓薬として,抗凝固薬および血栓溶解薬の2種類を考えて,それぞれについて,数理モデル化を行い,計算機シミュレーションを用いてモデルの基本的な特性を明らかにした.バイオメカニクス当初の予定にしたがって,ほぼ順調に進んでいる.今年度は以下の予定で行う.1.模擬血液を用いたin vitro血液灌流実験を,微小流路と落射蛍光顕微鏡システムを用いて行う.これにより,心臓大血管の形状を模擬した流路内部に模擬血液および蛍光粒子を灌流させて,流路内部における血栓様の凝集塊を時空間的に観察する.流速,レイノルズおよび流路形状を流れのパラメタとし,パラメタに依存した血栓様凝集塊の形成過程を示す.2.三次元流路形状を医用画像から,境界条件を全身循環マルチスケールモデルから,それぞれ作成し,単心室症の血流路における詳細な流れ挙動と,それに応じた血栓形成過程を明らかにする.得られた結果を臨床観察と比較して,モデルの現象記述能力を確認しながら,シミュレーションモデルとモデルパラメタの帰納的な同定を行う.3.血栓形成モデルにおいて,血栓様の凝集塊の内部結合強さは,ばね力によって決定される.

この結合は,実際の血栓においても血球と凝固因子の間で存在し,なおかつ,抗血栓薬が結合を阻害することが知られている.そこで,抗血栓薬の濃度Cを数理モデルの変数として導入し,血栓モデルのばね定数を濃度Cの関数とすることで,血栓の極近傍で作用する薬効をモデル化して,その基本的特性を検証する.4.血栓形成で重要となる白血球の能動的運動および赤血球の受動的運動のメカニズムを明らかにするために,実験および計算の両面から検討を進める.当該年度で支出予定であった実験装置関係の備品および消耗品が,別予算で支出となった.一方,旅費は当初予算より増額となった.その差引によって,次年度使用額が生じることとなった.当初予定より国外発表が1件増えたため,旅費に充当する予定である.
臨界現象としての地球の乱流ダイナモ

地球外核の流体運動は、乱流状態にあると考えられる。核内の乱流渦がそれぞれ局所的ダイナモを作ると仮定して、モデルを考えた。乱流渦のダイナモを単純化して一つのスピンと見なして、乱流渦間の磁気的相互作用を求め、全体のマクロな挙動を求めた。最も単純なモデルとして2次元正方格子上に乱流渦ダイナモを配置したモデルのマクロな磁場の挙動を計算した結果、この乱流ダイナモは、エネルギ-が低いと、磁気の向きが一定方向に固定されるが、エネルギ-が高くなると、逆転が起るようになることを示した。特にこの相転移の近傍では、逆転間隔のひん度分布がべき分布となること、又磁気の強度の分布は、正・逆方向にそれぞれ正規分布に近い分布となることを見出した。地球磁場の逆転間隔のひん度分布は、通例は指数分布と解釈されているが、過去165MAの逆転間隔すべての統計をとると、ひん度分布はむしろべき分布に近いことを見出した。上記のモデルの臨界点での性質はこれと一致する。又、地磁気逆転の従來のカオス・モデルは、どれも基本的な振動を持っていて古地磁気の観測と一致しなかったが、上記の単純モデルの強度変化は、古地磁気の強度変化の統計とも一致しているこのモデルに、地磁気逆転に伴うエネルギ-損失をとり入れると、モデルの状態は自然と相転移の臨界点に自己組織化されることを確かめた。このことは、何故地球磁場が、モデルの臨界的振舞いと似た挙動をするのかを無理なく説明している。今後、モデルを改良して、地面上に乱流渦ダイナモを配置した時、一様格子ではなくフラクタル格子上に配置した時、又磁気的相互作用だけでなく流体力学的相互作用も考慮した時のモデルの挙動を研究する予定である。
ランタニドを含む混合金属錯体の格子構造とランタニド-配位子間結合

平成6年度および平成7年度の本重点領域研究で、ランタニドを含むヘキサシアノコバルト(III)酸錯体の水和物を合成して、軽希土側(La,Ce,PrおよびNd)錯体では5水和物、重希土側(NdからLu)錯体では4水和物であり、水和数が変化する境界はNd錯体であることを明らかにした。本年度は、ヘキサシアノテトラブチルアンモニウム(TEA_3[Co(CN)_6])とランタニドの硝酸塩をメタノール(NeOH)に溶かして混合することにより、Ln[Co(CN)_6]・nMeOHを合成し、ランタニドイオンのイオン半径の収縮が、一連の錯体のメタノール溶媒和物の構造と性質にどのように影響を及ぼすかを検討した。合成した錯体の熱重量分析から、LaおよびCe錯体では2.5分子のMeOH溶媒和物、Pr以降の錯体では2.0分子のMeOH溶媒和物の生成されていることを確認し、Ce錯体が両者の境界となることを明らかにした。この結果は、水よりかさ高いメタノールが溶媒和する場合には、溶媒和数が減少するとともに、その境界がイオン半径の大きな軽希土側(Ce)に移動したものと考えられた。これら溶媒和物の脱溶媒過程を熱重量分析および示差走査熱量測定によって精査し、さらに、固相生成物の構造を赤外吸収およびラマンスペクトル、粉末X線回折測定によって調べて、ランタニドイオンと配位子の相互作用を、ランタニドイオンのイオン半径の収縮に基づき生じると考えられる次の二つの要因、(i)ランタニドイオンと溶媒和文子の相互作用が強化される傾向、および(ii)配位圏が縮小して配位構造が不安定化する傾向、から考察した。
新規リンパ球機能制御による喘息治療へのアプローチ

ナチュラルヘルパー細胞(NH細胞、別名:2型自然リンパ球、ILC2)は、インターロイキン-33(IL-33)刺激により活性化され、喘息の発症に関与することが示唆されている。IL-33とIL-33受容体の結合を阻害する分泌型ST2は、その特性から、NH細胞が関連するアレルギー反応を防ぐ作用があるものと考えられた。本研究では、単離したマウス肺NH細胞だけでなく、喘息モデルマウスの肺のNH細胞に対しても、IL-33の働きを制御してアレルギー反応を抑制することを明らかにした。インターロイキン-33(IL-33)は、アレルギー亢進作用を持つサイトカインであり、IL-1ファミリーに属する。新規リンパ球・ナチュラルヘルパー細胞(NH細胞、別名:2型自然リンパ球,ILC2)は、IL-33刺激により活性化され、喘息の発症に関与することが示唆されている。申請者は、以前の研究において、IL-33とIL-33受容体の結合を阻害する抑制因子・分泌型ST2を見出した。その特性から、分泌型ST2には、NH細胞が関連するアレルギー反応を防ぐ作用があるものと考えられた。本研究は、肺NH細胞および喘息モデルマウスを用いて、分泌型ST2のアレルギー反応抑制作用を明らかにすることを目的としている。今年度は、肺NH細胞において、IL-33刺激による細胞増殖やサイトカイン産生に対して分泌型ST2がどのように影響するかを検討した。マウス分泌型ST2は、発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、培養上清から精製した。NH細胞は、BALB/cマウスの肺からセルソーターによりソーティングした。マウスIL-33は市販品を用いた。分泌型ST2有無の条件下において、IL-33でNH細胞を刺激した後、細胞と培養上清を回収した。IL-33で刺激したNH細胞では、細胞の巨大化、細胞増殖の促進、細胞表面抗原の発現増加、IL-5とIL-13産生の増加などが認められた。分泌型ST2を事前に添加した場合には、これらのIL-33刺激によるNH細胞の活性化は抑制された。一方、加熱変性した分泌型ST2には、抑制効果が認められなかった。また、分泌型ST2のみの添加では、NH細胞に変化は認められなかった。以上の研究から、分泌型ST2が、IL-33作用を抑えるデコイ受容体として機能し、NH細胞の活性化抑制に有用なことを明らかにした。新規リンパ球・ナチュラルヘルパー細胞(NH細胞、別名:2型自然リンパ球, ILC2)は、IL-33刺激により活性化され、喘息の発症に関与することが示唆されている。平成26年度のin vitro実験において、分泌型ST2が、IL-33作用を抑え、NH細胞の活性化抑制に有用なデコイ受容体として機能することを明らかにした。平成27年度は、精製した分泌型ST2を喘息モデルマウスに投与し、喘息病態に対する効果を調べた。対照群の喘息モデルマウスにはPBSを投与した。分泌型ST2投与群では、PBS投与群と比較して、1)肺胞洗浄液(BALF)中の好酸球数、2)BALFおよび血清Th2サイトカイン濃度、3)気道炎症、などに減弱が認められた。以上の結果は、分泌型ST2に喘息病態を悪化させるアレルギー反応を抑制する効果があることを示唆している。今後は、喘息モデルマウスの肺NH細胞について評価する予定である。平成27年度の計画案通り、分泌型ST2を喘息モデルマウスに投与し、喘息病態について肺や血清を中心に調べた。しかしながら、年度途中の飼育施設の利用制限により、喘息モデルの作製に遅れが生じた。そのため、喘息モデルマウスの肺NH細胞についての解析が遅れている。本研究は、肺NH細胞および喘息モデルマウスを用いて、分泌型ST2のアレルギー反応抑制作用を明らかにすることを目的とした。前年度までに、野生型マウス(BALB/c系統)から単離した肺NH細胞を用いて、IL-33刺激により誘導される細胞の増殖、細胞表面抗原の発現増加、IL-5とIL-13の産生増加などが、分泌型ST2の事前添加によって抑制されることを明らかにした(Biochem Biophys Rep, 5:401-407, 2016)。

また、喘息モデルマウスに分泌型ST2を点鼻投与することにより、肺胞洗浄液(BALF)中の好酸球数の増加、Th2サイトカイン産生の亢進、気道炎症の悪化が抑制されることを明らかにした。本年度は、喘息惹起後の肺NH細胞の活性化などをフローサイトメトリー法により調べた。分泌型ST2を投与したマウスでは、PBS投与群に比べて、喘息惹起によって誘導される肺NH細胞数の増加、および肺NH細胞内IL-5とIL-13の発現が抑制されていた。これらの結果は、投与された分泌型ST2が、肺NH細胞の働きを抑えたことを示唆している。申請者は本研究を通して、分泌型ST2が、in vitroだけでなく、喘息モデルマウスにおいてもNH細胞の活性化抑制に有用なデコイ受容体となりうることを明らかにした。ナチュラルヘルパー細胞(NH細胞、別名:2型自然リンパ球、ILC2)は、インターロイキン-33(IL-33)刺激により活性化され、喘息の発症に関与することが示唆されている。IL-33とIL-33受容体の結合を阻害する分泌型ST2は、その特性から、NH細胞が関連するアレルギー反応を防ぐ作用があるものと考えられた。本研究では、単離したマウス肺NH細胞だけでなく、喘息モデルマウスの肺のNH細胞に対しても、IL-33の働きを制御してアレルギー反応を抑制することを明らかにした。平成26年度の計画案通りに実験を遂行し、分泌型ST2が、IL-33の結合を阻害し、マウス肺NH細胞の活性化を抑制することをin vitroにおいて明らかにした。次年度の実験準備も始めていることから、順調に進展しているものと考えられる。平成27年度までに、分泌型ST2を喘息モデルマウスに投与する治療的実験により、分泌型ST2が喘息病態を悪化させるアレルギー反応に対して抑制効果を示すことを明らかにした。しかしながら、IL-33に応答してアレルギー反応を誘導する肺NH細胞の活性化については明らかになっていない。そこで平成28年度は、分泌型ST2を投与した喘息モデルマウスにおいて、肺NH細胞の活性化が抑制されているかをフローサイトメトリー法により明らかにする。生化学平成26年度の結果から、分泌型ST2は、生体内においても、肺NH細胞の活性化を抑制するものと期待できる。平成27年度は、分泌型ST2を喘息モデルマウスに投与する治療的な実験を行い、血清と肺を中心に喘息病態を調べる。喘息モデルマウスは、BALB/cマウスに、卵白アルブミン(OVA)を腹腔内投与して感作後、点鼻によりOVAを曝露して作製する。対照群は、OVAの代わりに生理食塩水を腹腔内投与する。分泌型ST2またはPBS(対照群)の投与は、OVA点鼻の30分前に点鼻により行う。最後のOVA点鼻から24時間後に、血清、気管支肺胞洗浄液(BALF)、肺を採取する。血清とBALFでは、サイトカインと免疫グロブリンの濃度、炎症性細胞数とその種類をELISA法や細胞染色法により検討する。肺では、フローサイトメトリー法による肺NH細胞の検出と、組織染色法により炎症の程度を評価する。平成27年度は研究計画の70%程度は終了したが、喘息モデルマウスの肺NH細胞の解析が遅れているため、次年度への期間延長が生じた。平成26年度は研究計画が順調に進み、当初の予想よりも少ない予備実験で本実験に移行し遂行することができたため、次年度使用額が生じた。平成28年度は、喘息モデルマウスを中心にした解析を行うため、マウスの購入費と維持費に使用する。
エピタキシャル電極を用いたリチウム電池正極界面反応機構の解明

自動車用途に向けて高出力化か望まれているリチウムイオン二次電池の電極反応機構解明を目指し,特に反応の律速が存在する正極と電解液の固液界面に着目した.層状岩塩型、スピネル型、オリビン型の各実用電極について,(1)エピタキシャル薄膜電極による均一な固液界面の構築,反応を単純化し、(2)放射光X線表面回折法,中性子反射率法により電極再表面(数nm)の構造変化、価数変化をその場観測により検討した.(1)パルスレーザー堆積法を用いたエピクキシャル薄膜の作製条件を検討し,結晶の質、方位,膜厚を制御した薄膜の作製に成功した.薄膜界面の同定はX線反射率法,AFM,SEM観察により行い,解析に理想的な二次元界面を有することを明らかにした。(2)エピタキシャル薄膜電極とその場観察用電気化学セルを用いて、固液界面挙動の検討を行った。放射光X線表面回折測定は,大型放射光施設SPring-8 BL14を使用して,7/27-7/31の4日間行った.X線の入射角を変化させることで,表面からの深さ方向の構造変化の検出に成功し,電池反応中に最表面構造が再配列することを明らかにした.さらに薄膜格子を基板により規制することで,リチウムイオンの拡散方向を制御出来る可能性を見いだした。中性子がX線よりリチウムイオン変化の検出に優れていることを利用して,電池反応中の電極電解質界面のリチウムイオンの動き検出を試みた.その結果,界面構造が大きく変化することを明らかにした.中性子を用いたリチウム電池電極/電解質界面のその場観測はこれまでに例がない.In situ中性子反射率法は電池反応場におけるリチウムイオンの動きだけでなく,電気二重層の形成過程を調べる上でも有用な測定方法になると考える.自動車用途に向けて高出力化か望まれているリチウムイオン二次電池の電極反応機構解明を目指し,特に反応の律速が存在する正極と電解液の固液界面に着目した.層状岩塩型、スピネル型、オリビン型の各実用電極について,(1)エピタキシャル薄膜電極による均一な固液界面の構築,反応を単純化し、(2)放射光X線表面回折法,中性子反射率法により電極再表面(数nm)の構造変化、価数変化をその場観測により検討した.(1)パルスレーザー堆積法を用いたエピクキシャル薄膜の作製条件を検討し,結晶の質、方位,膜厚を制御した薄膜の作製に成功した.薄膜界面の同定はX線反射率法,AFM,SEM観察により行い,解析に理想的な二次元界面を有することを明らかにした。中性子がX線よりリチウムイオン変化の検出に優れていることを利用して,電池反応中の電極電解質界面のリチウムイオンの動き検出を試みた.その結果,界面構造が大きく変化することを明らかにした.中性子を用いたリチウム電池電極/電解質界面のその場観測はこれまでに例がない.In situ中性子反射率法は電池反応場におけるリチウムイオンの動きだけでなく,電気二重層の形成過程を調べる上でも有用な測定方法になると考える.
シロイヌナズナナチュラルバリエーションによる根銅耐性重要遺伝子の決定

本研究では、農耕地への蓄積が懸念されている、銅の過剰害に対する耐性機構を調べるために、シロイヌナズナの品種間遺伝解析を行った。銅は、動物性堆肥(主に豚の排泄物から作られる堆肥)や古典的な殺菌剤であるボルドー溶液(硫酸銅と石灰の混合物)に含まれるため、循環型農業での蓄積が懸念されている。ところで、平成20年度に明らかにしたように、銅輸送に関わる重要分子(例えば転流に関係するHMA5銅輸送ATP加水分解酵素)の能力は、銅耐性を決定する重要因子である。しかし、この機構で説明できる系統の数は限られており、耐性差をもたらしている他の機構が存在すると考えられた。そこで、平成21年度は平成20年度に引き続いて、アソシエーション解析を実施して、銅耐性が過酸化水素耐性やカドミウム耐性と似た遺伝構造を持つことを突き止めた。この解析は、ごく最近報告されたゲノムワイドな遺伝子多型をもとに統計的に推定する方法で、アソシエーション解析の例としては極めて早い報告となった。この解析に加えて、3組のRIラインを用いたQTL(量的遺伝形質)解析から、同モデル(過酸化水素耐性と共通すること)がシロイヌナズナの系統間差を説明できるものであることを裏付けた。このモデルは、予備的に調べたイネにおける実験から作物の品種間にも適合する可能性が高く、分子育種(マーカーアシスト選抜や、遺伝子組換え育種)により、作物の銅耐性を向上させる基礎的な知見を提供することができた。根の銅ホメオスタシスの分子生理学的な理解を深めるとともに品種改良に直結する、銅ホメオスタシス構成分子の多型と銅耐性品種間差の関係を、シロイヌナズナのナチュラルバリエーション研究により解明することを目的として以下の2点を明らかにした。1)QTL解析で用いたLer/Cvi RILsの親系統であるLer-2とCvi-1のAtHMA5アミノ酸多型解析を行った結果,感受性アクセッションであるCvi-1に2つのアミノ酸置換(S178L, N923T)が認められた.酵母を用いた相補性試験により,銅輸送機能を欠損するアミノ酸残基の置換(N923T)がわかった.また,耐性および感受性を含む40のアクセッション間には7か所にアミノ酸の多型が存在し,その配列から7つのハプロタイプに分類された.植物を用いた相補性試験により,銅感受性アクセッション, Chi-2の感受性は, AtHMA5のアミノ酸残基の置換(P262L)に起因していることがわかった.Cvi-1およびChi-2の置換部位は,植物種だけでなく原核生物から真核生物に至るまで広く保存されるP-type ATPaseのモチーフ[CPC(x)6P, N(x)6YN(x)4P]内に存在しており, AtHMA5の機能低下を引き起こしている.シロイヌナズナに存在する銅耐性ナチュラルバリエーションの一因として, AtHMA5が関与していることが明らかとなった.2)AtHMA5の発現は根部に特異的であり,その発現は銅ストレス条件下(1.3μM CuSO4)で誘導された.また, GUSレポーター遺伝子を用いた発現解析により,根の基部における恒常的な発現が認められた.銅ストレス条件下では,その発現が基部においてより中心柱付近に偏る傾向がみられ,根端における発現誘導が起こった.この発現誘導は,銅イオン特異的に速やかに行われた.これらのことから、AtHMA5は、通常、根部から地上部への銅の移行を担っており、銅ストレス条件下では、発現部位の調節によって根部に蓄積する銅の無毒化に貢献していることが明らかとなった.本研究では、農耕地への蓄積が懸念されている、銅の過剰害に対する耐性機構を調べるために、シロイヌナズナの品種間遺伝解析を行った。
自殖性アスパラガスの雄性種子生産への利用と両性花形成を誘導する分子機構の解明

食用アスパラガスは雌雄異株植物であり,単性花は表現型に対向する性に関連する花器官の発育不全によって生じることがわかっている。すなわち,雄花では雌蕊の発育不全がおこり,雌花では雄蕊の発育不全が花の発育過程で起き,結果として単性花が形成される。アスパラガスの若い花芽を用いた先行研究において,雄性花のオーキシン濃度が雌性花より高く,アブシシン酸やサイトカイニンには差異が認められないことが明らかにされているが,花器官形成と成長調節物質代謝との関連についての研究は進んでいない。近年,内生サイトカイニン濃度がその分解系によって調節されている事例が増加しつつあり,サイトカイニンを介した花器官の形成制との関連が指摘されている。そこでアスパラガスの単性花形成と植物ホルモンとの関係を明らかにする目的で,花芽で発現するCytokinin oxidase/dehydrogenase(CKX)遺伝子を同定した。アスパラガス花芽で発現する2つのCKX遺伝子の発現量を定量PCRにより解析ところ,このうちの1つが強く発現していることがわかり,花芽の発達にともなう発現(転写量)の変動は,雌雄によって異なっていた。雌雄花芽の形成は花器官の発育不全によることから,花を解剖し、それぞれの花器官における発現量を定量するとともに,in situ hybridizationによって発現の局所性を調べた。その結果,雌雄によって発現量が顕著に異なる花器官部位が特定された。一方,アスパラガス花芽におけるサイトカイニン代謝の全体像を把握するため,イソペンテニール基の転移に関わる遺伝子,ならびに転移型サイトカイニンリボシドからリボースリン酸の除去に働く遺伝子を同定し,発現解析を行い,花器官分化との関連を調べている。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。アスパラガスの単性花は,対向する性の花器官の発育不全によって生じる。アスパラガスの若い花芽では,雄性花のオーキシン濃度が雌性花より高く,アブシシン酸やサイトカイニンには差異が認められないことが明らかにされているが,成長調節物質との関連についての研究は進んでいない。近年,サイトカイニンを介した花器官の形成制御に関する研究報告が見られ,加えて,内生サイトカイニン濃度が分解系によって調節されている事例が増加しつつある。そこでアスパラガスの単性花形成と植物ホルモンとの関係を明らかにする目的で,花芽で発現するCKX(cytokinin oxidase/dehydrogenase)の同定を試みた。アスパラガス雄性判別DNAマーカーAsp1-T7を含む領域をもとにデータベースを検索したところCKXと相同性の高い配列が検索された。この配列を手がかりに,PCRプライマーを作製し,cDNAの全長を増幅した。クローンから得られた塩基配列をもとに,アミノ酸配列を推定し,機能領域を検索した結果,CKXに共通して見いだされるFAD-bindingdomainおよびcytokinin-binding domainが見つかった。一方,花芽で発現している別のCKXを同定する目的で,既知CKX配列を参考にPCRプライマーを作製し,cDNAを増幅した。得られた塩基配列からアミノ酸配列を推定し,機能領域の検索を行ったところ,同様の機能領域が検索された。これら2つの遺伝子は雄性花芽および雌性花芽のいずれにおいても発現していた。縮重プライマーを用いたPCRでは,同定したCKX以外のcDNA断片が増幅したので,それらが雌性花芽あるいは雄性花芽のいずれかでのみ発現するCKX遺伝子に由来する可能性が示唆された。目的遺伝子の単離・同定手法が確立された。発現解析が可能となつた。雌雄花芽でのサイトカイニン分解酵素の発現をしらべる。
2D-DIGE技術を用いたADAHファミリープロテアーゼ標的分子の網羅的解析

私は膜貫通型で細胞外領域にプロテアーゼ領域を持つADAMファミリーメタロプロテアーゼによる膜蛋白質の選択的な分解とそれに伴う細胞外領域の可溶化(シェディング)に興味を持っており、新しいADAMファミリーの基質を探すために二次元電気泳動を用いたプロテオミクス技術によりスクリーニングを行っています。これまでの研究からグラム陰性菌の細胞壁成分であるLPSをマクロファージ細胞に加えた際にシェディングを受ける蛋白質として複数の二次元電気泳動上のスポットを見出していました。本年度はこれらのスポットから蛋白質の同定を行い、複数の膜蛋白質がLPS刺激を受けたマクロファージで選択的にシェディングされる事を明らかにする事が出来ました。これらの膜蛋白質の中にはこれまでADAMファミリーの基質とは報告されていない物も含まれており、プロテオミクス技術によるバイアスをかけないスクリーニングがADAMファミリーによってシェディングされる蛋白質を知る上で有効である事が示されました。またADAMファミリーによるシェディングがエンドサイトーシスに影響を与えるという予期しない事実を示唆する結果を得る事も出来ました。この結果は今回のスクリーニングがADAMファミリーの持つ新たな生理機能を明らかにする上でも極めて有効である事を示しています。今後同様のスクリーニングを他の系に応用する事によって、ADAMファミリーの役割を更に明らかにしたいと考えています。私はADAMファミリーと呼ばれる膜貫通型のメタロプロテアーゼによる膜蛋白質の選択的な切断とそれに伴う細胞外領域の放出(シェディング)に興味を持っており、ADAMファミリーによるシェディングへの理解を深めるために研究を進めています。本研究課題では特にマクロファージがLPS刺激を受けた際に誘導されるADAMファミリーにょるシェディングに注目しています。プロテオミクスの手法を用い、LPS刺激を受けたマクロファージでシェディングを受ける膜蛋白質をスクリーニングすることで、いまだ明らかにされていないADAMファミリープロテアーゼの標的分子を同定し、ADAMファミリーの機能に迫りたいと考えています。今回用いたプロテオミクス手法は2D-DIGE技術です。2D-DIGE技術とは二種類の蛋白質群を異なる蛍光色素でラベルした後に混合し、同時に二次元電気泳動を行ってから蛍光色素を読み取るという方法で、この技術を用いると二つの蛋白質群間で量の異なる蛋白質だけを浮き彫りにする事ができます。この方法を用いてシェディング前後の膜蛋白質群を比較すればシェディングを受ける蛋白質をスクリーニングできると考え実験を行いました。LPS刺激を受けたマクロファージ培養細胞の細胞膜蛋白質群と、ADAMファミリー阻害剤存在下でLPS刺激を受けたマクロファージ培養細胞の細胞膜蛋白質群を調整し、これらを2D-DIGE技術によって比較して、LPS刺激を受ける事でADAMファミリー依存的に量が減少する膜蛋白質を検索しました。その結果再現性良く目的の挙動を示す膜蛋白質を複数見いだす事ができました。更に培養上清を用いたスクリーニングも試みました。その結果複数の蛋白質がLPS刺激を受ける事でADAMファミリー依存的に培養上清に放出される事を確認する事ができました。これらの蛋白質の分子量は既知のADAMファミリー標的分子とは異なっており、新規の標的分子であると考えられました。