hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深海熱水噴出孔のフジツボ亜綱エボシガイ亜目Neolepasの分類と系統

深海熱水噴出孔のエボシガイ亜目Neolepas属の模式種N. zevinae、N. rapanuii(以上東太平洋)、およびN. osheai(南西太平洋、その後Vulcanolepas新属に収容された)の3集団、伊豆小笠原海嶺の明神海丘、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺、伊是名海穴、鳩間海丘、第四与那国海丘(以上北西太平洋)、マヌス海盆(西太平洋)、北フィージー海盆、ラウ海盆(以上南西太平洋)、インド洋、からの合計15集団の形態の記載、比較、分類を行った。最初の冷湧水性エボシガイ類となるAshinkailepas seepiophilia新属新種を記載した(Yamaguchi, Newman & Hashimoto 2004)。またその分類群を熱水域(北伊平屋、明神)に発見記載した。またエディソン海山(Luecolepas longa新属新種)(西太平洋)、スンダ海溝(2番日の冷湧水性)、マリアナ背弧海盆から同様な分類群が新たに得られ、それらについても研究した。分子系統学的研究として、DNA分析可能(下線付き、北伊平屋は同所性の2分類群を使用、東太平洋の地Neolepasと南西太平洋のVulcanolepasはDNA分析可能な標本を持たない)な7集団標本を用いてミトコンドリアDNAの16SrRNA、12SrRNA遺伝子の塩基配列に基づき系統関係を解析した。"Neolepas"(東太平洋のNeolepasを含まない無名の分類群)属およびAshinkailepas属はそれぞれ単系統をなした。"Neolepas"属は、共通の祖先からインド洋集団とその他の集団(エディソン、スンダ、マヌス、北伊平屋)とに分岐した。後者の集団は、エディソン集団(Luecolepas longa)を含み、かつ遺伝的距離がエディソンとマヌスとは0、前者とスンダ、北伊平屋は0.8%小さいために同属と考えられる。0.8%の遺伝的距離はそれらの間に遺伝子交流の存在を推定させる。またAshinkailepasの北伊平屋および明神の間で同様に遺伝的距離0であり、同様に両集団間で遺伝子交流の可能性が推定された。つまりそのことは分散過程を考える上で重要で、深海熱水・冷水分類群のインド洋・南西太平洋起源の可能性が明らかになってきた。2004年9月23日11月10日南太平洋ラウ海盆およびハブル海盆で「しんかい6500」による潜航調査を行った。その際採集されたラウ海盆およびハブル海盆からVulcanolepas osheaiの形態とDNAの解析を行った。これらの分類群は、DNA資料として初めてのもので、それらを用いた以下の研究が可能となった。深海熱水噴出孔のエボシガイ亜目Neolepas"属"は、模式種のN.zevinae(東太平洋EPR)、Vulcanolepas, osheai(かつてNeolepas属に収容されていた南西太平洋ラウおよびハブル海盆)集団、冷湧水性エボシガイ類となったAshinkailepas seepiophiliaの初島沖集団(同種の熱水集団として伊豆小笠原海嶺の明神海丘、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺)、冷湧水性のLuecolepas longa(エディソン海山)(西太平洋)(同熱水集団のマヌス海盆(西太平洋))、および同冷湧水性Luecolepas別種のスンダ海溝(北インド洋)、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺(北西太平洋)集団のDNAの分析と系統解析を行った。それらの分類群は、現在では4つの別属に分けられているが、本研究の出発時点では単一のNeolepas属であった。
DnaK分子シヤペロンによるDNA複製開始タンパク質の活性化過程の解明

DnaK分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)が細胞内で合成途中のポリペプチドやタンパク質のfoldingや分解,サブユニットの会合,膜透過などに働くことは良く知られている,これら分子シャペロンにはDNA複製開始因子や転写因子の活性化・不活性化を助ける機能もあるが,その機能タンパク質の調節因子としての作用機構の詳細は解明されていない.大腸菌ミニFの系はこの研究のモデル系として優れている.我々はこれまでに,各分子シャペロンが,RepEの活性化に必須であること,RepEの単量体はイニシエーターとして,二量体はrepE遺伝子のリプレッサーとして機能すること,in vitroでRepE二量体から単量体への変換はDnaK分子シャペロンに担われていることなどを明らかにした.本研究の目的はこの変換機構を分子レベルで明らかにすることで,今年度は次のような成果が得られた.凝集しやすく結晶化が困難である全長RepE二量体について,昨年,オペレータとの複合体の結晶を得たが,タンパク質調製法と結晶化法を工夫することによって,X線回折実験が可能な結晶の調製に成功した.構造解析は,単量体RepE-iteron複合体の構造をモデル分子とする分子置換法で初期位相を決定し,結晶構造の精密化を完了した.その結果,二量体RepE-operator複合体においてもC末ドメインによって共通8塩基対が認識されている一方,N末ドメインはDNAと全く接触せずに,二量体境界面を形成していることが明らかになった.また,二量体と単量体の結晶構造の比較から,両ドメイン内部には構造変化が確認されないものの,ドメイン間の相対配置が大きく異なっていることもわかった.ドメイン間をつなぐリンカー領域ならびにその周辺領域に,DnaKおよびDnaJが相互作用すると予想される配列があった.二量体から単量体への変換による複製開始機能の発現,分子シャペロンの作用機構について議論した.DnaK分子シャペロン(DnaK,DnaJ,GrpE)は細胞内で合成途中のポリペプチドやタンパク質のfolding,サブユニットの会合,膜透過,分解等に働く.同時に,複製開始因子や転写因子の活性化を助ける機能も持つが,これらの作用機構の詳細は明らかにされていない.大腸菌ミニFのDNA複製開始系はこの研究の一つのモデル系として優れている.われわれはこれまでに,DnaK分子シャペロンがミニFのDNA複製開始タンパク質RepEを活性化するのに必須であること,RepEの単量体がイニシエーター,二量体がrepE遺伝子のリプレッサーとして機能すること,in vitroでRepEの安定な状態は二量体であり,二量体から単量体への変換はDnaK分子シャペロンによって行われること,DnaKとRepEが複合体を形成することなどを明らかにした.本研究は,この変換機構の詳細を分子レベルで明らかにすることを目的とするが,今年度の成果は次のものである.1)RepEの合成過程でのシャペロンの関与の検討と結晶化条件検索を目的として,in vitroでrepE遺伝子からRepEタンパク質を合成する系を構築するための予備実験を行った.2)DnaK分子シャペロンとの相互作用ができないRepEの変異体の解析を行った.変異体のリプレッサー活性は正常であるが,イニシエーター活性は不活性であり,二量体は形成できるが,単量体への変換が正常でないことが示唆された.3)構造決定を目的として,RepE二量体とオペレータとの複合体を調製し,いくつかの結晶化条件で予備的な結晶を得ることに成功した.今後,すでに分離したRepE変異体の解析の結果を考慮し,RepE-DnaKまたはDnaJとの複合体の結晶化・構造解析を行い,DnaK分子シャペロンによるRepE二量体から単量体への変換機構を分子レベルで解明する.DnaK分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)が細胞内で合成途中のポリペプチドやタンパク質のfoldingや分解,サブユニットの会合,膜透過などに働くことは良く知られている,これら分子シャペロンにはDNA複製開始因子や転写因子の活性化・不活性化を助ける機能もあるが,その機能タンパク質の調節因子としての作用機構の詳細は解明されていない.大腸菌ミニFの系はこの研究のモデル系として優れている.我々はこれまでに,各分子シャペロンが,RepEの活性化に必須であること,RepEの単量体はイニシエーターとして,二量体はrepE遺伝子のリプレッサーとして機能すること,in vitroでRepE二量体から単量体への変換はDnaK分子シャペロンに担われていることなどを明らかにした.本研究の目的はこの変換機構を分子レベルで明らかにすることで,今年度は次のような成果が得られた.凝集しやすく結晶化が困難である全長RepE二量体について,昨年,オペレータとの複合体の結晶を得たが,タンパク質調製法と結晶化法を工夫することによって,X線回折実験が可能な結晶の調製に成功した.構造解析は,単量体RepE-iteron複合体の構造をモデル分子とする分子置換法で初期位相を決定し,結晶構造の精密化を完了した.その結果,二量体RepE-operator複合体においてもC末ドメインによって共通8塩基対が認識されている一方,N末ドメインはDNAと全く接触せずに,二量体境界面を形成していることが明らかになった.

また,二量体と単量体の結晶構造の比較から,両ドメイン内部には構造変化が確認されないものの,ドメイン間の相対配置が大きく異なっていることもわかった.ドメイン間をつなぐリンカー領域ならびにその周辺領域に,DnaKおよびDnaJが相互作用すると予想される配列があった.二量体から単量体への変換による複製開始機能の発現,分子シャペロンの作用機構について議論した.
一細胞解析を目指したマルチオミクス解析手法の開発

本研究では、単一細胞を対象としたシングルセル転写開始点解析、エピゲノム解析(オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析)手法の基盤技術開発を行った。DNAメチル化については、単一細胞におけるバイサルファイト反応の制御を厳密に行うことが困難であり、安定的にデータを産生することが可能な実験系の構築開発をすることができなかったが、その他の項目については実験系を確立し、多くの研究者に対して共同研究の形でデータを提供することができた。すでに実施可能であった単一細胞でのRNA Seq解析と併せて、単一細胞マルチオミクス解析のモデル解析を試行することができたと考えている。本研究では、単一細胞レベルの解析に応用可能な転写開始点解析、エピゲノム解析(オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析)手法の基盤技術開発を行う。今年度行った技術基盤開発から、ATAC法を援用する形式で、単一細胞エピゲノム解析が可能となった。また転写開始点解析についても試行的実験には成功しており、現在、その再現性およバルク細胞を用いた手法とのデータの互換性についての検証を行っている。実際に開発された系を用いて、実際に肺腺癌培養細胞における遺伝子発現制御の多様性についての解析を行った。PC9細胞をはじめとする6種類の細胞株について、単一細胞エピゲノム解析を行ったものである。先行研究において単一細胞トランスクリプトーム解析から見出された細胞間での多様性は、転写制御領域でのオープンクロマチン形成の多様性としても反映されていた。見出されたそれぞれの階層での多様性がどのように相互に関連しているのか、トランスクリプトームレベルで細胞間多様性の高い遺伝子とオープンクロマチンレベルでのそれとの比較等、現在、さらに詳細は解析を進めている。また、それぞれの細胞びドライバー変異に対応する分子標的薬を作用させ、発現多様性の観点からその薬剤応答性についての観察も開始した。一方で、単一細胞メチル化解析については、微量化についての基礎実験が難航している。シークエンス鋳型を調整するために効率的な工程の確立を依然として模索している状況である。これについては次年度以降の課題として素反応課程の検証から再検討を行っている。単一細胞におけるオープンクロマチン解析については、フリューダイムC1システムを援用する形式で反応系を開発、実装し、実際にデータ産生に至ることができた。6種類の肺腺癌細胞種について100細胞での単一細胞エピゲノムデータを取得した。これらについてバルク細胞との比較を行ったところ、良好な再現性と一致率で計測を行うことができていることが確認された。開発された反応系は、申請者らが別途行っている技術提供の枠組みの中で研究者コミュニティに提供すべく、現在、対象とする課題の選定を行っている。多様な系での応用を通じて、さらに頑強なシステムを構築できると考えている。転写開始点解析については、C1システムでの実装に先立って、外部試験管の系での微量化についての検討を行った。Clontech社の提供するSmarter Systemを用いることで、効率よく転写開始点近傍の配列を取得することが可能となった。確立されたプロトコールをC1システム上に実装し、鋳型の調整を行い、シークエンス解析を進めている。得られる結果について、別途作成したバルク細胞からの解析結果と転写開始点位置、発現量についての異同を比較解析する予定である。単一細胞オープンクロマチン構造解析については、開発された方法論を用いて実際のデータ取得を開始した。現在までに収集された肺腺癌由来細胞株における単一細胞オープンクロマチン解析結果から、トランスクリプトーム上で見られた細胞間での発現多様性は、そのプロモータ領域でのオープンクロマチン形成の点でも反映されていることが確認された。現在、細胞間での遺伝子発現の多寡がその転写制御領域のオープン構造について、どの程度相関するのか、またその多様性が抗がん剤刺激によりどの程度、変化するのかについて関連データの取得を完了しており、解析を開始したところである。本研究では、単一細胞解析に応用可能な転写開始点解析、エピゲノム解析(オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析)について、多層オーミクスの各階層で基盤技術開発を行ってきた。これまでに、RNA解析、転写開始点解析についてはその基礎検討を完了し、また今年度、ATAC法を援用する形で初めて単一細胞におけるエピゲノム計測を、高い再現性と信頼度をもって行う実験系を確立することに成功した。その再現性よびバルク細胞により得られたデータとの互換性について、高い信頼性を示しており、十分に実用に耐える方法論の開発に成功したと考えている。開発された手法を用いて、がん細胞単一細胞における転写制御ネットワークの多様性の解析を行い、興味深い知見を得ている。さらに、これらの手法を技術基盤に、いくつかの共同研究を開始しており、多くの実験系においての実用を開始している。データの公開体制に整備についても概ね、目途を立てることができた。単一細胞多層オーミクスデータを格納するデータベースおよびデータを表示するウェブブラウザの準備が整っている。今年度、夏からを目途に、基礎検討の過程で産出されたデータから初めて、順次産出される順次一般にデータ公開を行う予定である。DNAメチル化解析については、昨年度までに十分に再現性の高い方法を確立することができなかった。これについて、現在、化学反応系から酵素反応系での素反応系の変換を試みている。最終年度にあたり、DNAメチル化解析が可能となれば、当初、計画したすべての多層オーミクスの階層について単一細胞での計測が可能となる。昨年度までに確立された単一細胞オーミクス計測系について実際にデータの取得を行った。

肺腺癌由来培養細胞数5種類を用い、抗がん剤作用下で単一細胞に惹起される発現制御多様性を計測、解析した。その結果、AURK遺伝子を中心とする転写ネットワークが、DUSP1遺伝子を中核とするネットワークと強調することにより、少数の細胞で細胞死を抑制するメカニズムの活性化が起こることが明らかとなった。同メカニズムにより細胞死を免れた細胞が抗がん剤耐性獲得細胞の発生母地として機能するとすれば非常に興味深いと考え、現在、一連の検証実験を行っている。これらの観測について、再現性、整合性が確認され次第、論文発表の形で成果を公開する予定である。また、全データについても、今年度、単一細胞多層オーミクスデータを格納するデータベースおよびデータを表示するウェブブラウザから公開する予定である。この枠組みについても別途、開発が最終段階にあり、夏頃を目途に公開可能な体制整備が完了すると考えている。本研究では、単一細胞レベルの解析に応用可能な転写開始点解析、エピゲノム解析(オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析)手法の基盤技術開発を行った。これを用いて遺伝子の発現量および転写制御機構の細胞間多様性について網羅的な記載を試みた。基盤技術の構築については、DNAメチル化等の一部技術については、安定的な実験系の確立には至らなかったものの、その他の項目については基盤技術を確立することができた。また、構築された技術基盤を多くの研究者に共同研究の形で提供することができた。申請者自身でも構築された実験系を用いて、がん細胞における遺伝子発現の揺らぎについての解析を行った。解析にはヒト肺腺がん由来培養細胞株および抗がん剤耐性を獲得したその分離株を用いた。抗がん剤には、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤GefitnibおよびRET融合遺伝子に有効性を持つマルチチロシンキナーゼ阻害剤vandetanibを用いた。前者については感受性細胞としてPC9細胞株、耐性細胞としてH1975細胞株を、後者については、感受性細胞としてLC2/adを、また感受性株については当研究グループで樹立したLC2/ad-R細胞株を用いた。特にLC2/ad-R細胞株については、エキソーム解析から相互にほぼ同一のゲノム配列を有しながらも、一部の遺伝子について遺伝子発現量が単一細胞間で顕著な多様性を示すことを明らかにした。PC9細胞及びH1975細胞における薬剤刺激時の細胞応答から、薬剤感受性株においては、細胞集団中に数%の頻度の細胞において、DUSP遺伝子等の細胞の休止化に関連する遺伝子の発現誘導が惹起されることが観察された。また、公共がんゲノムデータベースTCGAを用いて臨床肺腺がんにおいて同様のプロファイルを検索したところ、生存予後に劣る症例について同様の遺伝子発現制御の切り替えが行われている可能性が示唆された。本研究では、単一細胞を対象としたシングルセル転写開始点解析、エピゲノム解析(オープンクロマチン解析とDNAメチル化解析)手法の基盤技術開発を行った。
歯牙形成を司る骨、軟骨誘導因子同定に向けた包括的アプローチ

歯牙形成を制御機構する遺伝子を網羅的に解析、同定するため、本研究では胎児マウス顔面骨からgene chip、プロテオミクス、differential displayによるスクリーングを2年間にわたり行った。その結果Notch1が一過性に発現上昇することを同定した。Notch1の骨芽細胞分化に及ぼす影響はその細胞内ドメインを用いて調べられているが、リガンドであるDelta, Jaggedの関与については依然不明である。平成16年度で我々はNotch1はDelta1,Jagged1とともにマウス大腿骨に作製した骨欠損部の修復過程で強く発現することを確認したため、骨芽細胞の細胞分化に及ぼす影響をC3H10T1/2,MC3T3-E1,C2C12等の細胞を用いて検討した。野生型Notch1とその活性型細胞内ドメイン、Delta1,Jagged1を一過性過剰発現させると、培養細胞のBMP-2によるALP活性の上昇を増強した。Real-time PCRによる検討でALP以外にもosteocalcin, osterix, runx2等の発現も同様に増強させた。またDelta1-,Jagged1-Fcリコンビナント蛋白をprecoatした場合にも同様な結果が得られ、長期培養では石灰化を誘導し、移植実験ではBMP2による異所性骨化を促進した。一方、インヒビターや、ドミナントネガティブ型の細胞外Notch1の過剰発現、あるいはNotch1 siRNA等を用いた場合は、BMP-2によるこれら因子の発現やALP活性は抑制された。Notch1とBMP2のクロストークメカニズムを各種プロモーター活性や標的遺伝子発現の誘導から検討した。その結果、機能的Notch1のシグナルはBMP2のシグナル伝達に必須であることが明らかになった。歯胚発生から歯の成熟までの歯牙形成過程は様々な分泌蛋白や転写因子群により制御される。本研究では最新の研究解析技法を取り入れ、歯牙形成制御機構を遺伝子レベル、蛋白レベルの両面から包括的、統合的に解析することであり、新たな転写因子の同定を視野に入れた調節因子群の時間、空間的制御機構を明らかにする。まず胎児マウス顔面骨からレトロウィルス系のcDNA発現ライブラリーを作製した。これをC3H10T1/2細胞に遺伝子導入し、G418により安定発現株を作製した。そしてBMP-2やデキサメサゾン存在下に培養することで骨芽細胞に分化誘導させた後、アルカリフォスファターゼ染色を行ったところ、染色性が亢進した5種と逆に低下した3種の細胞株を得た。ウィルスDNAを分離精製し、導入された遺伝子を解析した結果、染色性が低下した細胞株にはN端が欠損したRunx2遺伝子を同定した。他の遺伝子については、まったく新規のものも含まれており、現在解析中である。一方、Runx2(-/-)マウス頭頂骨から樹立した2種類の骨芽細胞様細胞株はBMP-2存在下に異なった反応を示し、Runx2の下流に新たな転写因子の存在を示唆させる。そこでDNAチップを用いてディファレンシャルスクリーニングを行った。現在まで約40種のBMP-2特異的に発現上昇するクローンを得たが、これらすべてのクローンについて胎生期も含めた骨組織における発現をノーザンブロット、in situハイブリゼーションで検討中である。歯牙形成を制御機構する遺伝子を網羅的に解析、同定するため、本研究では胎児マウス顔面骨からレトロウィルス系のcDNAライブラリーを作製し、発現スクリーングを行った。そしてBMP-2やデキサメサゾン等で骨芽細胞に分化誘導させた際に、アルカリフォスファターゼ活性を亢進させる遺伝子としてNotch1を同定した。

Notch1はマウス大腿骨に作製した骨欠損部の修復過程でも発現しており、そのリガンドであるDelta1,Jagged1とともに免疫染色で発現分布を検討すると、いずれも骨欠損作製5日後に集積した未分化間葉系細胞に強く発現し、共焦点顕微鏡で共発現が確認された。そこで骨芽細胞の細胞分化に及ぼす影響をC3H10T1/2,MC3T3-E1,C2C12等の細胞を用いて検討した。野生型Notch1とその活性型細胞内ドメイン、Delta1,Jagged1を一過性過剰発現させると、培養細胞のBMP-2によるALP活性の上昇を増強した。Real-time PCRによる検討でALP以外にもosteocalcin,osterix,runx2等の発現も同様に増強させた。Delta1-,Jagged1-Fcリコンビナント蛋白をprecoatした場合にも同様な結果が得られた。一方、インヒビターや、ドミナントネガティブ型の細胞外Notch1の過剰発現、あるいはNotch1 siRNA等を用いた場合は、BMP-2によるこれら因子の発現や酵素活性は抑制された。現在Notch1の作用メカニズムを特にBMP-2シグナル伝達経路とのクロストークの観点から解析中である。歯牙形成を制御機構する遺伝子を網羅的に解析、同定するため、本研究では胎児マウス顔面骨からレトロウィルス系のcDNAライブラリーを作製し、発現スクリーングを行った。これをC3H10T1/2細胞に遺伝子導入し、G418により安定発現株を作製した。そしてBMP-2やデキサメサゾン等で骨芽細胞に分化誘導させた際に、アルカリフォスファターゼ活性を亢進させる遺伝子としてNotch1を同定した。Notch1はそのリガンドであるDelta1,Jagged1とともにマウス大腿骨に作製した骨欠損部の修復過程で強く発現していた。そこで骨芽細胞の細胞分化に及ぼす影響をC3H10T1/2,MC3T3-E1,C2C12等の細胞を用いて検討した、野生型Notch1とその活性型細胞内ドメイン、Delta1,Jagged1を一過性過剰発現させると、培養細胞のBMP-2によるALP活性の上昇を増強した。またDelta1-,Jagged1-Fcリコンビナント蛋白をprecoatした場合にも同様な結果が得られ、長期培養では石灰化を誘導し、移植実験ではBMP2による異所性骨化を促進した。一方、インヒビターや、ドミナントネガティブ型の細胞外Notch1の過剰発現、あるいはNotch1 siRNA等を用いた場合は、BMP-2によるこれら因子の発現やALP活性は抑制された。Notch1とBMP2のクロストークメカニズムを各種プロモーター活性や標的遺伝子発現の誘導から検討した。その結果、機能的Notch1のシグナルはBMP2のシグナル伝達に必須であることが明らかになった。
分子インプリント法による新規機能性高分子膜の開発とその応用

分子インプリント法による高分子膜の機能化について昨年度に引き続き検討を行った。手法としては、我々がすでに開発した相分離法を利用し、ポリアクリロニトリル共重合体に種々の官能基を導入し、これを溶媒に鋳型分子と一緒に溶かし、これをキャストした後に、貧溶媒中で凝固させる手法を導入した。これによりピリジル基を導入したポリアクリロニトリル膜は、カルボン酸基では認識できなかったカフェイン分子を選択的に認識できることが明らかになった。現在、この認識能が、どんな相互作用で起こっているのかを、認識特性の尾感度依存性を測定することにより評価している。さらに、ポリアミドが水素結合の編み目を形成していることに着目しこれを利用したアミノ酸の認識を試みている。鋳型分子としては、グルタミンを使用し、これに構造の類似したグルタミン酸、および、システインを認識させた結果、グルタミンを高選択的にポリアミドに取り込むことを見いだした。またこのポリマーは、アミノ酸のラセミ体も区別できることが判明し、汎用高分子の高機能化に道を開くものとして大変興味深い。さらに最近では、ダイオキシン骨格を有するジヘンゾフラン化合物の認識能を有する汎用高分子の探索を行っており、これを高選択的に吸着するポリマーとしてポリスチレンやポリスルホンのような芳香族基を有するポリマーが有効であることを見いだしてきた。さらに、吸着するだけではこれらのポリマーの廃棄に問題を生じるためにこれに分解機能を持たせた触媒型分子インプリント膜の開発を現在検討しているところである。これらの認識実験には、溶質濃度を測定して結合量を算出する間接的な評価法をこれまで用いてきたが、本研究の助成により水晶振動法を適応し、QCMによる高分子分子インプリント膜の評価を確立することも行っている。これにより分子認識特性が容易に評価できるようになりさらに、芳香族基やピリジル基の蛍光の消光実験と合わせることにより基質認識能の動力学的な評価の確立が可能となった。またQCMを用いたカフェインの選択認識インプリント高分子の認識機構についても検討し、鋳型を抽出後のポリマーと水の相互作用状態に基質が水と置き換わるような吸熱過程で進むことが示された。本研究では分子インプリント法を高分子膜の作製過程に適応し、これまでにない全く新しい分子認識膜の開発に成功した。この分子認識膜の作製にはポリアクリロニトリルを溶媒にとかし、これをキャストし、非溶媒浴内で凝固する相分離法を応用した。この際に、鋳型分子であるテオフィリン分子を含んだポリマーキャスト液を用いることで、ポリマー凝固の際に、鋳型分子の形を凝固ポリマー内に形成することができることを、鋳型分子の明らかにした。抽出後に、再び、テオフィリンを取り込ませることにより明らかにした。ここで、ポリアクリロニトリルに鋳型分子であるテオフィリンと水素結合を形成できるアクリル酸やメタクリル酸を共重合したホリアクリロニトリルを相分離に用いた場合に、鋳型分子の高効率な取り込みが発現できることを見いだした。さらに、このポリアクリロニトリル共重合体の膜は、多孔性特性を有するために分離膜としても応用でき、分子篩特性と分子刷り込み認識特性を合わせ持つ機能膜であることが示された。また、テオフィリン以外の基質では、化学構造が類似しているカフェイン他、5種類の基質選択制についても詳細に検討した結果、いずれも高い選択制を有することがわかった。

膜の赤外吸収測定の結果は、カルボキシル基とテオフィリンの7位窒素原子の水素原子間の水素結合が、分子刷り込みにもまた、抽出後の基質分子取り込みにも作用していることが証明された。この結果は、水素結合能力を持たないカフェインの取り込みがこの分子認識膜では大変に低いことも説明できた。さらに、興味深いことに、アクリル酸とメタクリル酸の分子認識特性を比較した場合、テオフィリン刷り込み膜の場合には、ウラシルのような水素結合性のテオフィリンよりも分子サイズの小さな基質認識特性に差異が生じた。この結果は、メタクリル酸のメチル基の立体障害性がより高度な認識特性を発現できることを示唆している。現在、この結果を詳細に検討していると共に、アクリロニトリルの重合時に鋳型分子を共存させた場合についても検討している。分子インプリント法による高分子膜の機能化について昨年度に引き続き検討を行った。手法としては、我々がすでに開発した相分離法を利用し、ポリアクリロニトリル共重合体に種々の官能基を導入し、これを溶媒に鋳型分子と一緒に溶かし、これをキャストした後に、貧溶媒中で凝固させる手法を導入した。これによりピリジル基を導入したポリアクリロニトリル膜は、カルボン酸基では認識できなかったカフェイン分子を選択的に認識できることが明らかになった。現在、この認識能が、どんな相互作用で起こっているのかを、認識特性の温度依存性を測定することにより評価している。さらに、ポリアミドが水素結合の編み目を形成していることに着目しこれを利用したアミノ酸の認識を試みている。鋳型分子としては、グルタミンを使用し、これに構造の類似したグルタミン酸、および、システインを認識させた結果、グルタミンを高選択的にポリアミドに取り込むことを見いだした。またこのポリマーは、アミノ酸のラセミ体も区別できることが判明し、汎用高分子の高機能化に道を開くものとして大変興味深い。さらに最近では、ダイオキシン骨格を有するジベンゾフラン化合物の認識能を有する汎用高分子の探索を行っており、これを高選択的に吸着するポリマーとしてポリスチレンやポリスルホンのような芳香族基を有するポリマーが有効であることを見いだしてきた。さらに、吸着するだけではこれらのポリマーの廃棄に問題を生じるためにこれに分解機能を持たせた触媒型分子インプリント膜の開発を現在検討しているところである。これらの認識実験には、溶質濃度を測定して結合量を算出する間接的な評価法をこれまで用いてきたが、本研究の助成により水晶振動法を適応し、QCMによる馬分子分子インプリント膜の評価を確立することも行っている。これにより分子認識特性が容易に評価できるようになりさらに、芳香族碁やピリジル基の蛍光の消光実験と合わせることにより基質認識能の動力学的な評価の確立も可能であると思われ、現在検討しているところである。
マーモセット脳内におけるドーパミン受容体の分布: PETによる定量評価

生後1. 5歳以上のコモンマーモセットを対象に、ドーパミン受容体の放射性リガンドを用いて、PETによるスキャンを行った。その結果、線条体で高いD1およびD2ドーパミン受容体結合能が示されるとともに、大脳皮質にも、D1およびD2受容体の分布が認められた。また、その分布が部位によって異なることも確認できた。これらによって、マーモセットの脳内ドーパミン受容体分布のPETによる定量評価法の確立し、データベース作成のための基礎データが収集できた。本研究の目的は、マーモセット脳内ドーパミン受容体の分布をPETにより定量評価し、基礎データを収集することにある。そのために、初年度である22年度には、ドーパミンD1およびD2受容体の放射性リガンドを使い、それぞれの受容体の分布・密度を定量評価する方法を確立することを目指した。これまでに、生後1.5歳以上のコモンマーモセット(Callithlix jacchus)8頭を対象に、PETによるスキャンを行った。PETスキャンは、Siemens社製の動物用高解像度PET装置(microPET Focus 220)を使用して行った。D1受容体の放射性リガンドには[^<11>C]SCH23390を用い、D2受容体には[^<11>C]FLB457と[^<11>C]Racloprideを使用した。さらに、8頭のうち7頭は、MRIによって脳の構造画像も収集した。残る1頭のMRIも近目中に撮像する予定である。詳しい定量的解析はこれからとなるが、今年度の成果によって、マーモセットを用いてドーパミン受容体の分布を調べるための、基礎的な方法は確立されたといえる。今年度に確立した技術を用いて、来年度に本格的な定量化を行い、他の霊長類からのデータと比較するなど、より包括的な研究へと展開していく計画である。霊長類ではドーパミンとその受容体は、認知・行動の諸過程に重要な役割を果たしており、そのシステムの異常は、精神・神経疾患や発達障害と深く関連している。本研究の成果は、高次脳機能の統合的理解や精神・神経疾患のメカニズムの解明、ひいては、治療や予防につながるものと期待される。そのために、ドーパミンD1およびD2受容体の放射性リガンドを使い、それぞれの受容体の分布・密度を定量評価する方法を確立することを目指した。これまでに、生後1.5歳以上のコモンマーモセット(Callithlix jacchus)9頭を対象に、PETによるスキャンを行った。D1受容体の放射性リガンドには[11C]SCH23390を用い、D2受容体には[1C]FLB457と[1C]Racloprideを使用した。さらに、これらの個体からは、MRIによって脳の構造画像も収集した。今年度の成果によって、マーモセットの脳内ドーパミン受容体分布のPETによる定量評価法の確立と、それによるデータベース作成のための基礎データが収集できた。この成果に基づいて、他の霊長類のデータとの比較や、生後発達過程にあるマーモセットのデータとの比較など、より包括的な研究へと展開していくことが可能となる。
GDNF組換アデノウイルスを用いた運動神経変性疾患の遺伝子治療に関する研究

グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)は,運動ニューロンに対して強力な神経栄養活性を有することから,運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対する治療効果が期待されている.本研究では,GDNFの遺伝子導入によるこれらの病態の治療の可能性を追求する目的で,GDNF組換えアデノウイルスを作製し,成熟ラットの運動ニューロン損傷モデルに対する治療効果について検討した.成熟Fischer344雄ラットの右顔面神経あるいは第7頚髄神経根を引き抜き除去したのち,傷害側の茎乳突孔あるいは椎間孔にヒトGDNF組換えアデノウイルス(AxCAhGDNF),β-galactosidase(gal)組換えアデノウイルス(AxCALacZ)またはPBSを接種した.AxCALacZ投与群では,傷害側の顔面神経核,脊髄前角運動ニューロンがβ-galで明瞭にラベルされ,組換えウイルスによって同ニューロンに外来遺伝子を導入し得ることが示された.AxCAhGDNF投与群では同ニューロンがGDNF免疫染色で強陽性となり,RT-PCRで傷害側脳幹,脊髄組織にヒトGDNF mRNAの発現を認めた.2-8週後,灌流固定Nissl染色ののち顔面神経核,前角運動ニューロンの数を算定したところ,PBSおよびAxCALacZ投与群では,引き抜き損傷後2-8週で障害側顔面神経核,脊髄前角運動ニューロンの明瞭な脱落を認めたが、AxCAhGDNF投与群では運動ニューロンの脱落が有意に抑制された.また,AxCAhGDNF投与により傷害側運動ニューロンにおけるコリンアセチル転移酵素免疫反応性が改善,一酸化窒素合成酵素活性が抑制された.本研究により,成人における運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対するGDNF組換えアデノウイルスを用いた遺伝子治療の有効性が示唆された.グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)は,運動ニューロンに対して強力な神経栄養活性を有することから,運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対する治療効果が期待されている.本研究では,GDNFの遺伝子導入によるこれらの病態の治療の可能性を追求する目的で,GDNF組換えアデノウイルスを作製し,成熟ラットの運動ニューロン損傷モデルに対する治療効果について検討した.成熟Fischer344雄ラットの右顔面神経あるいは第7頚髄神経根を引き抜き除去したのち,傷害側の茎乳突孔あるいは椎間孔にヒトGDNF組換えアデノウイルス(AxCAhGDNF),β-galactosidase(gal)組換えアデノウイルス(AxCALacZ)またはPBSを接種した.AxCALacZ投与群では,傷害側の顔面神経核,脊髄前角運動ニューロンがβ-galで明瞭にラベルされ,組換えウイルスによって同ニューロンに外来遺伝子を導入し得ることが示された.AxCAhGDNF投与群では同ニューロンがGDNF免疫染色で強陽性となり,RT-PCRで傷害側脳幹,脊髄組織にヒトGDNF mRNAの発現を認めた.2-8週後,灌流固定Nissl染色ののち顔面神経核,前角運動ニューロンの数を算定したところ,PBSおよびAxCALacZ投与群では,引き抜き損傷後2-8週で障害側顔面神経核,脊髄前角運動ニューロンの明瞭な脱落を認めたが、AxCAhGDNF投与群では運動ニューロンの脱落が有意に抑制された.また,AxCAhGDNF投与により傷害側運動ニューロンにおけるコリンアセチル転移酵素免疫反応性が改善,一酸化窒素合成酵素活性が抑制された.本研究により,成人における運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対するGDNF組換えアデノウイルスを用いた遺伝子治療の有効性が示唆された.グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)は,運動ニューロンに対して強力な神経栄養活性を有することから,運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対する治療効果が期待されている.本研究では,GDNFの遺伝子導入によるこれら病態の治療の可能性を追究する目的で,GDNF組換えアデノウイルスを作成し,成熟ラットの運動ニューロン損傷モデルに対する治療効果について検討した.ヒト脳・培養アストロサイトよりクローニングしたGDNF cDNAを発現ユニットとして,アデノウイルス・ゲノムからE1A,E1B,E3遺伝子を欠損したウイルスDNAをもつ発現コスミドカセットpAxCAwtに組込んだ.このコスミドカセットDNAと親ウイルスDNAを293細胞にco-transfectし,得られたウイルス液を293細胞で継代し精製ウイルスAxCAhGDNFを得た.運動ニューロン損傷モデルとして,成熟Fisher344雄ラットの右第7頚髄神経節を前・後根を含め引き抜き除去したのち,局所の椎間孔にAxCAhGDNFあるいはPBSを浸したgelfoamを留置した.2-8週後,灌流固定し第7頚髄の凍結連続切片を作成,Nissl染色ののち前角運動ニューロンの数を算定した.PBS投与群では,引き抜き損傷後2-8週で障害側前角運動ニューロンの明瞭な脱落を認めたが,AxCAhGDNF投与群では神経細胞脱落が有意に抑制された.また,AxCAhGDNFの投与により,傷害側前角運動ニューロンにおけるcholine acetyltransferase免疫反応性の低下が抑制された.本研究により,運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対するGDNF組換えアデノウイルスを用いた遺伝子治療の有用性が示唆された.成体ラット顔面神経核運動ニューロン死に対するグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)組換えアデノウイルスベクターの治療効果について検討した.12週齢Fisher344雄ラットの右顔面神経を引き抜き除去したのち,傷害側の茎乳突孔にヒトGDNF組換えアデノウイルス(AxCAhGDNF),β-galactosidase(gal)組換えアデノウイルス(AxCALacZ)またはPBSを注入した.

AxCALacZ投与群では,傷害側の顔面神経核運動ニューロンがβ-galで明瞭にラベルされ,組換えウイルスによって同ニューロンに外来遺伝子を導入し得ることが示された。AxCAhGDNF投与群では同ニューロンがGDNF免疫染色で強陽性となり,RT-PCRで傷害側脳幹組織にヒトGDNF mRNAの発現を認めた.顔面神経核を含む脳幹組織では常にGDNF受容体(GFRα1,Ret)mRNAが検出され,組換えウイルス接種が顔面神経核運動ニューロンでの外来性ヒトGDNFの産生を誘導し,autocrineあるいはparacrineな形で同ニューロンに対する神経栄養効果が発現されると考えられた.そこで,引き抜き損傷2-4週後,顔面神経核の運動ニューロン数を算定したところ,PBS投与群(4週後対照の28.5±3.9%),AxCALacZ投与群(32.4±4.3%)では障害側顔面神経核運動ニューロンの脱落を認めたが,AxCAhGDNF投与群(59.4±2.8%)では脱落が顕著に抑制された.また,AxCAhGDNF投与により傷害側運動ニューロンにおけるコリンアセチル転移酵素免疫反応性が改善,一酸化窒素合成酵素活性が抑制された.本研究により,成人における運動神経損傷や運動ニューロン疾患に対するGDNF組換えアデノウイルスを用いた遺伝子治療の有効性が示唆された.
中国、雲南省における鉱床の分布特性

中国雲南省のように,大縮尺の地形図が手に入らない地域での位置決めにGPSを利用するため,その精度を3地域で確かめた.対象とした地点あるいは地域は,(2)定点として,地形図から位置(緯度・経度)が最も性格に読みとれる東京大学工学部の建物,(2)日本国内における地質調査を念頭において,鹿児島県の菱刈鉱山周辺,および(3)地形図が入手できない中国雲南省である.定点における測定では,各測定値は真の位置から半径100mの円内に納まり,平均値は真の位置から30mしかずれていなかった.実際の野外で,GPSで決められた位置と地形図から読み取られた位置との偏差は,300m程度である.定点における測定に較べて誤差が大きいのは,地形図からの位置の読み取りにも誤差が含まれるためである.地形図が入手できない地域では,同一点において得られた複数の測定値の再現性で精度を評価した.4個の衛星が捕らえられて受信状態がよい場合は±100mの精度で,また受信状態が悪い場合は±300mの精度で測定値は再現さる.一方,3個の衛星しか補えられない場合の精度は±1000mである.これらの誤差の値から,地球科学データが通常の処理で地図に表示される場合,GPSは十分な精度の位置座標を与えると結論できる.世界における鉱物資源の存在量等を予測するためには,各鉱種について品位-鉱量関係を求め,それから得られるモデルが利用される.ところで,中国の雲南省というように,ある限られた地域にこの品位-鉱量関係を適用すると,同一の鉱種に属する鉱床の数が少ないため,統計処理上,特異なデータの存在が,その結果に大きく影響を与える.そこで,複数の鉱種をまとめて利用できるように,鉱石価値-鉱量モデルを作成し,その有効性を検討した.その結果,W+MoとPb+Zn鉱床の鉱石価値-鉱量関係はよい直線性を示した.また,塊状硫化物,正マグマ成,漂砂,斑岩,交代,層準規制型鉱床もよい直線性を示した.したがって,これらの鉱床は1つの母集団に属するとして,統計的処理ができる.これに対して,解析に利用したすべての鉱床をまとめた場合は,2つの指数関数の組合せで近似される.同様の傾向は,Cu+W+Mo,Cu+Pb+Zn,Au+Ag鉱床,および鉱脈型と不整合関連型の鉱床で見られた.したがって,これらの鉱種あるいは鉱床型の鉱床は高価値グループと低価値グループに分けられる.中国の金資源について,品位-鉱量の関係を調べた.全体としてみると,30ppm以上の高品位鉱床,30-3ppmの中品位鉱床,3ppm以下の低品位鉱床に分けられる.高品位鉱床の対数累積鉱量は品位が低下してもほとんど増加しない.一方,中品位鉱床では,品位の低下とともに,対数累積鉱量は直線的に増加する.さらに,低品位鉱床では,鉱量の急激な増加が見られる.全資料の65%を占める初生鉱床の品位-鉱量関係は,2つの指数関数の組み合わせで説明できる.このモデルにもとづく推定鉱量と実際の鉱量との相関係数は0.990である.砂鉱床も2つの指数関数の組み合わせで説明でき,そのときの相関係数は0.986である.なお,高品位鉱床と低品位鉱床の境は1ppmである.初生鉱床および砂鉱床を近似する4つの指数関数を組み合わせると,実際の鉱量と近似計算され得た鉱量の相関係数は0.994である.初生鉱床のうち18%が産出する金は,副産物である.したがって,それらは金品位は低いが鉱量が大きい.これと低品位の砂鉱床が全鉱床の品位-鉱量図における低品位部の急傾斜の原因である.雲南省の鉱床については,収集した資料のデータベース化を進めている.このデータベース化が終了したら,前述の鉱石価値-鉱量モデルをこの地域に適用して,この地域の資源量の予測作業を行う予定である.中国雲南省のように,大縮尺の地形図が手に入らない地域での位置決めにGPSを利用するため,その精度を3地域で確かめた.対象とした地点あるいは地域は,(2)定点として,地形図から位置(緯度・経度)が最も性格に読みとれる東京大学工学部の建物,(2)日本国内における地質調査を念頭において,鹿児島県の菱刈鉱山周辺,および(3)地形図が入手できない中国雲南省である.定点における測定では,各測定値は真の位置から半径100mの円内に納まり,平均値は真の位置から30mしかずれていなかった.実際の野外で,GPSで決められた位置と地形図から読み取られた位置との偏差は,300m程度である.定点における測定に較べて誤差が大きいのは,地形図からの位置の読み取りにも誤差が含まれるためである.地形図が入手できない地域では,同一点において得られた複数の測定値の再現性で精度を評価した.4個の衛星が捕らえられて受信状態がよい場合は±100mの精度で,また受信状態が悪い場合は±300mの精度で測定値は再現

さる.一方,3個の衛星しか補えられない場合の精度は±1000mである.これらの誤差の値から,地球科学データが通常の処理で地図に表示される場合,GPSは十分な精度の位置座標を与えると結論できる.世界における鉱物資源の存在量等を予測するためには,各鉱種について品位-鉱量関係を求め,それから得られるモデルが利用される.ところで,中国の雲南省というように,ある限られた地域にこの品位-鉱量関係を適用すると,同一の鉱種に属する鉱床の数が少ないため,統計処理上,特異なデータの存在が,その結果に大きく影響を与える.そこで,複数の鉱種をまとめて利用できるように,鉱石価値-鉱量モデルを作成し,その有効性を検討した.その結果,W+MoとPb+Zn鉱床の鉱石価値-鉱量関係はよい直線性を示した.また,塊状硫化物,正マグマ成,漂砂,斑岩,交代,層準規制型鉱床もよい直線性を示した.したがって,これらの鉱床は1つの母集団に属するとして,統計的処理ができる.これに対して,解析に利用したすべての鉱床をまとめた場合は,2つの指数関数の組合せで近似される.同様の傾向は,Cu+W+Mo,Cu+Pb+Zn,Au+Ag鉱床,および鉱脈型と不整合関連型の鉱床で見られた.したがって,これらの鉱種あるいは鉱床型の鉱床は高価値グループと低価値グループに分けられる.中国の金資源について,品位-鉱量の関係を調べた.全体としてみると,30ppm以上の高品位鉱床,30-3ppmの中品位鉱床,3ppm以下の低品位鉱床に分けられる.高品位鉱床の対数累積鉱量は品位が低下してもほとんど増加しない.一方,中品位鉱床では,品位の低下とともに,対数累積鉱量は直線的に増加する.さらに,低品位鉱床では,鉱量の急激な増加が見られる.全資料の65%を占める初生鉱床の品位-鉱量関係は,2つの指数関数の組み合わせで説明できる.このモデルにもとづく推定鉱量と実際の鉱量との相関係数は0.990である.砂鉱床も2つの指数関数の組み合わせで説明でき,そのときの相関係数は0.986である.なお,高品位鉱床と低品位鉱床の境は1ppmである.初生鉱床および砂鉱床を近似する4つの指数関数を組み合わせると,実際の鉱量と近似計算され得た鉱量の相関係数は0.994である.初生鉱床のうち18%が産出する金は,副産物である.したがって,それらは金品位は低いが鉱量が大きい.これと低品位の砂鉱床が全鉱床の品位-鉱量図における低品位部の急傾斜の原因である.雲南省の鉱床については,収集した資料のデータベース化を進めている.このデータベース化が終了したら,前述の鉱石価値-鉱量モデルをこの地域に適用して,この地域の資源量の予測作業を行う予定である.近年人工衛星を利用する位置決め技術(GPS: Global Positioning System)が開発され,一般化してきている.そこで,この技術を中国雲南省における地質調査に利用した.雲南省は面積が38万km^2,このうち94%が山岳地帯で,6%が平地である.主な都市あるいは町と鉱山,およびこれらを結ぶ道路の途中の184箇所で,GPSによる位置決めを合計201回行なった.これらの場所のほとんどは,山の斜面であった.GPSでは4個の衛星を使えって位置決めを行なうことを標準とする.しかし,3個の衛星しか使えなくても,位置決めはできる.今回の調査では,なるべく4個の衛星によって位置を決めるよう努力した.しかし,山岳地帯では尾根や樹木で,都市部では建物で衛星が隠され,全測定の約30%では3個の衛星しか捉えられなかった.位置決めを行なった184箇所のうち,9箇所では時間あるいは日を変えて測定した.その結果よると,GSPによる位置決め精度は,4個の衛星が捕捉され,しかも再現性のよい所で100m以下,悪い所で300m以下,3個の衛星しか使えない場合,2000m以下である.かなり多くの地点が,山腹だったため2個以下の衛星しか捕まえられず,位置決めができなかった.しかし,これらの地点でも,測点から200mも離れると,3個以上の衛星を捕まえることができた。したがって,このような測点でも歩測をGPSを組み合わせることにより,位置が決められる.
コンテクスト情報を利用した情報管理機構とコンテクスト情報操作言語設計に関する研究

本研究では、氾濫する知的資源を有効に再利用するために、必要なものを多角的に探し出す手法のひとつとして、コンテクストを利用した情報管理・検索システムの構築を目指し、コンテクスト・モデルを定義し、これを管理・操作する言語の設計・実装し、コンテクスト情報を利用した情報管理機構の構築を行うことを目的とした。平成13年度は、コンテクスト情報にアクセスするためのインタフェースに重点をおいた。コンテクストモデルに基づく、情報アクセス空間を設計し、その基本アーキテクチャを提案した。また、これに基づき、3次元ソフトウェア開発システムIntelligentBox上に実装を行った。これにより、RDBに格納された、コンテクスト情報にアクセスしながら、必要な情報空間を生成し、データ探索可能なインタフェースを構築し、コンテクストに基づく情報探索支援の1手法として提案した。さらに、ギリシャのFORTH研究所で開発されているSIS(Semantic Index System)に基づく、博物館情報管理システムに対しても、同様の手法を適用し、SISに基づく情報空間の自動生成機構を実現して、異なるデータ・モデルにも対応できることを示した。本研究では、氾濫する知的資源を有効に再利用するために、必要なものを多角的に探し出す手法のひとつとして、コンテクストを利用した情報管理・検索システムの構築を目指している。本研究では、コンテクストを定義し、これを管理・操作する言語の設計・実装し、コンテクスト情報を利用した情報管理機構の構築を行う。平成12年度は、パリ南大学のスピラトス氏らの提唱するコンテクストの定義、及びQuery言語を基にしてコンテクスト情報DBのプロトタイプを作成した。さらに、これにアクセスするためのインタフェースとして、北海道大学で開発されたIntelligentPadを用い、コンテクスト情報そのもの、及び、コンテクスト情報の管理・検索機構をすべて、パッドと呼ばれるメディア・オブジェクトとして実現した。これにより、既存のIntelligentPadの機能に、コンテクスト情報管理・検索機構が導入され、IntelligentPadをベースにしたコンテクスト情報活動を可能とした。次に、コンテクスト情報に基づく情報アクセスのための3次元空間を設計し、これを3次元メディア・システムIntelligentBoxにて実装した。情報アクセス空間は、オブジェクト空間とコンテクスト空間から構成される。ユーザの情報アクセスは、これらの空間遊泳により、行うことができる。以上により、コンテクスト情報に基づく情報アクセスを支援する、2次元及び3次元のインタフェースの基本アーキテクチャを明らかにした。
分子ライブイメージングを用いた脳動脈瘤増大破裂機序の多面的解析と新規治療法の開発

現在までの知見から脳動脈瘤が脳血管壁の慢性炎症により制御される疾患であり同時に数値流体解析結果から血流による力学的負荷により病態が修飾されることが示唆されるが、炎症という生物現象と力学的因子という二つの要素がどのように融合し脳動脈瘤発生増大、特に破裂を惹起するのかは不明である。本研究は、げっ歯類脳動脈瘤モデル動物を使用し病変部を対象としたライブイメージング解析を駆使し脳動脈瘤進展破裂を担う力学的因子と脳動脈瘤壁内の炎症をはじめとする生物現象との連関を解明することを目的とし、脳動脈瘤進展破裂予防のための新規創薬標的を見い出し、霊長類脳動脈瘤モデルの確立と連動しながら、臨床への展開を目指す。
パッチクランプ法による細菌細胞のイオントランスポーターの解析

平成13年度末に東京大学分子細胞生物学研究所より譲り受けたパッチクランプシステムの再構築を行った。機器の老朽化などの理由により、すぐには使用できなかったが、修理を重ねた結果、システムとして稼動することができた。平成13年度に検討を行った宿主大腸菌の巨大化条件を用い、大腸菌Na^+-セリン共輸送系であるSstTの輸送活性をパッチクランプ法により測定した。さまざまな条件検討を重ねたが、現在までのところ、有意な輸送活性を捉えることはできていない。この原因として、SstTの発現量がまだ不足している、用いている大腸菌の細胞膜が特に脆弱である、などの理由が挙げられる。一方では大量発現したSstTの精製方法を確立し、幾つかの性質について調べた(Kim,2002)。上記SstTと共に、大腸菌多剤排出ポンプAcrABの活性をパッチクランプ法によって測定した。SstTで有意な活性が得られていない理由の一つは発現量が少ないことであるが、AcrABの場合、特別な大量発現プラスミドを構築しなくとも十分量のタンパク質が発現している。こちらも活性は捉えられていないが、条件検討を重ねれば活性を捉えることができると考えられる結果を得ている。一方で、いくつかの細菌から新規多剤排出ポンプの遺伝子クローニングを行った。腸内連鎖球菌、セラチア、緑膿菌、セパシアなどから得られたものについてその性質を解析した(Cheng2003,Lee2003)。パッチクランプ法によってイオントランスポーターの解析を行うために、宿主大腸菌の巨大化条件を決定した。さまざまな条件検討を重ねた結果、パッチクランプ法を適用するために十分な大きさ(直径10μm以上)にまで巨大化させることができた。目的のアミノ酸トランスポーターSstTを発現させた株も巨大化することに成功した。しかしIPTGによって発現を誘導してもSstTタンパク質があまり誘導されず、逆に誘導していない状態でも無視できないレベルで発現していた。これはSstTの発現調節が厳密にコントロールできていないことを意味し、現在用いているtrcプロモーターは上記培養条件においては不向きであることが示唆された。そこでアラビノースプロモーターを利用できるように系を再構築している。また一方では大量発現したSstTの精製方法を確立し、幾つかの性質について調べた(Kim, submitted)。Na+/薬剤排出タンパク質NorMについてはSstTの結果を元に今後行う予定にしている。その一方で、新たに2つのNa^+駆動性の多剤排出ポンプの遺伝子をクローニングし、その性質にいて調べた(Huda,2001,Chen,2002)。このう'ち一つは上記NorMと相同性が高い。これらについても同様にパッチクランプ法に適用できるよう、系を構築している。当初の研究計画では、パッチクランプ法による解析を東京大学にて14年度に行うと記述していた。しかし東京大学分子細胞生物学研究所より、パッチクランプシステム一式を譲り受けることができた。そこで現在、岡山大学で使用できるようにセットアップを行っている。進行状況から考えて13年度末あるいは14年度の早い段階で、使用可能となると予想される。このセットアップにかなりの時間が費やされているが、セットアップが完了すれば、14年度の計画を実行する予定である。