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大腸癌におけるｍｉＲＮＡ発現がマイクロサテライト不安定性によりうける影響

近年、癌遺伝子や癌抑制遺伝子として機能するmiRNAが存在し、その発現異常が発癌に関与することが明らかとなった。大腸癌においてmiRNAの発現クラスターはマイクロサテライト不安定性(MSI)の有無により、全く異なることが示されている。われわれはmiRNAの成熟過程においてMSIによる遺伝子変異がmiRNAの構造変化をもたらすかをヘアピンループの自由エネルギーの変化を中心に検討した。結果、MSIによる静的変異はmiRNAの発現に直接的な影響を与えない可能性が示唆された。MSIを有する消化器癌ではフレームシフト変異を頻発するが、DICERと複合体を形成するTRBP遺伝子やAGO2遺伝子のフレームシフト変異が報告されている。これはmiRNA成熟プロセスにMSIが関与している事を示しており、結果としてmiRNAの全体的な機能低下、ひいては癌の発生・進展に重要な関与をしているものと考えられる。この変異が実際にmiRNA発現に影響しているかについて検討した。我々はmiRNAの成熟過程におけるMSIの影響につき、以下の仮説を立てた。「仮説-II」TRBP遺伝子やAGO2遺伝子のフレームシフト変異がPre-miRNAの生成に影響を与える。「仮説-III」スプライシング配列周辺のマイクロサテライトの変異がmiRNAの結合を阻害に影響する。スプライシング配列周辺のマイクロサテライトの変異がmiRNAの結合を阻害に影響するかを検討するため、まづ初めにスプライシングを制御するRNA配列5`および3'スプライス配列、ブランチ部位周辺の配列、エキソン内やイントロン内に存在するスプライシングエンハンサー配列あるいはスプライシングサイレンサー配列(ESE,ISE)(ESS,ISS)近傍のマイクロサテライトをESE finderよりピックアップした。次ぎに、その位置に対応するマイクロサテライトおよびSNPsをBlast、JSNPをもちいて検索したが、miRNAの結合部に一致する変異を認めず、この配列はむしろ保護されていると考えられた。昨年までのMSI近傍の静的変異による2次構造の変化がmiRNAの切り出しに影響与えないこと、DICERと複合体を形成する各遺伝子の変異率の低さ、そして今回の結果を勘案すると、現状ではmiRNA発現に対してMSIの影響は大きくはなく、むしろ保護的に働いている可能性が示唆された。腫瘍外科「仮説-I」MSI近傍の静的変異による2次構造の変化はprimary-miRNAの切り出しに影響を与えないことを証明した。しかし最近、甲状腺乳頭癌においてKIT遺伝子の3'UTRに存在する遺伝子多型がmiR-146あるいはmiR-222の結合エネルギーを大きく変化させたとの報告もあり、さらに多くのmiRNAについて検討する必要があるかもしれない。「仮説-II」TRBP遺伝子やAGO2遺伝子等のフレームシフト変異がPre-miRNAの生成に影響を与えるかを検討したが、有意な相関関係は認めなかった。「仮説-I」MSI近傍の静的変異による2次構造の変化はprimary-miRNAの切り出しに影響を与えないことを証明した。本年は研究の効率をあげるため、文献的検討とDATABASE検討を中心に選択するmiRNAの絞り込みに時間をかけた。26年度は「研究III」について検討を行う予定である。スプライシングを制御するRNA配列5`および3'スプライス配列、ブランチ部位周辺の配列、エキソン内やイントロン内に存在するスプライシングエンハンサー配列あるいはスプライシングサイレンサー配列(ESE,ISE)(ESS,ISS)近傍のマイクロサテライトをESE finderよりピックアップする。その位置に対応するマイクロサテライトおよびSNPsをBlast、JSNPをもちいて検索し、HCT116およびLoVo等のMSI-H細胞株とMSS細胞株、さらには臨床検体を用いて同遺伝子の変異をキャピラリー・シークエンサーを用いたSSCP法にて判定後、MSI-H細胞株とMSS細胞株でのmiRNA発現をリアルタイムPCRを用いて解析する。26年度は「研究-III」について検討を行う予定である。本年度までの2年間で共同研究者による支出が無かったこと、旅費を使用しなかったことにより50万超の予算が次年度使用額となった。

来年度は、26年度は「研究-III」について検討を行う予定である。スプライシングを制御するRNA配列5`および3'スプライス配列、ブランチ部位周辺の配列、エキソン内やイントロン内に存在するスプライシングエンハンサー配列あるいはスプライシングサイレンサー配列(ESE,ISE)(ESS,ISS)近傍のマイクロサテライトをESE finderよりピックアップする。その位置に対応するマイクロサテライトおよびSNPsをBlast、JSNPをもちいて検索しHCT116およびLoVo等のMSI-H細胞株とMSS細胞株、さらには臨床検体を用いて同遺伝子の変異をキャピラリー・シークエンサーを用いたSSCP法にて判定後、MSI-H細胞株とMSS細胞株でのmiRNA発現を解析する予定である。次世代型シーケンサーが導入され使用コストが予想より上昇したためこれに次年度使用額を充当致します。経費活用の予定は当初の計画から大きな変更はない。経費の内容の多くは消耗品であり、内訳は細胞培養に関わる培地類また遺伝子検索に関わる試薬、および免疫組織学的染色のための交抗体類、試薬類が大部分を占める。これらは研究を進めるうえで必須のものである。旅費は関連学会への参加のためである。詳細は以下に記載する。・消耗品中の薬品および実験器具は、遺伝子抽出作業、cDNAクローニング、抗体作製、免疫組織化学、培養細胞株を用いた解析などを行うにあたり月100,000250,000円で概算している。・成果発表のため旅費について、各年度あたり国内3ー4回、海外1回を想定している。・全経費の90%を超える費目はない
喉頭知覚受容器の形態形成機構

周生期ラット喉頭粘膜の神経終末における高親和性ニューロトロフィン受容体(TrkA, TrkB, TrkC)と低親和性受容体p75NTRは、葉状神経終末に加えて上皮内自由神経終末でも免疫組織化学的分布が認められた。出生直後では、粘膜下組織にTrkB陽性神経線維が散在性に認められ、生後5日齢(P5)ではTrkBに加えてTrkAの陽性神経線維も認められた。P14以降で初めて上皮内TrkA陽性およびTrkB陽性の自由神経終末が確認できたが、神経全般を染色するprotein gene product 9.5(PGP9.5)陽性の自由神経終末が出生直後に既に出現することと比較すると、出現は遅く数も少ない。TrkC陽性の自由神経終末は観察されなかった。粘膜上皮に散在する特殊感覚上皮細胞や味蕾においてもTrkA, TrkB, TrkCが発現した。特殊感覚上皮細胞はPGP9.5染色では胎生期から陽性細胞の分布が認められるが、TrkA, TrkB, TrkCはP5から陽性細胞が認められた。TrkBは少なくとも8週齢まで陽性細胞の分布が確認できたが、TrkAおよびTrkBでは陽性非感覚線毛上皮細胞によって反応の有無を確認するのは困難であった。披裂軟骨部に存在する未来はP9で初めて確認されたが、P14まではTrkAおよびTrkB陽性の味蕾下神経叢と味蕾内神経線維に陽性反応が認められた。3週齢以降の味蕾ではTrkA, TrkB, TrkC陽性の味細胞が認められた。以上の結果は投稿準備中である。以上のようにニューロトロフィン受容体は喉頭粘膜における知覚構造の発達に関与すると考えられたが、非感覚線毛上皮等でも強い発現が認められたため、遺伝子およびタンパク質解析を試みたが解析は困難であった。周生期ラット喉頭粘膜における葉状神経終末の形態変化の詳細をPGP9.5に対する免疫染色で検索し、さらに高親和性受容体であるチロシンキナーゼ受容体(tyrosine kinase receptor; Trk)と低親和性受容体であるp75NTRニューロトロフィン受容体の分布を明らかにした。PGP9.5による染色では、P3までは陽性神経線維が粘膜固有層に認められるのみで、P5で葉状神経終末が観察された。P5の葉状神経終末においては末端膨大部の形態が単純であったが、P11で末端膨大部が拡張し8Wまで基本的な構造は変わらなかったTrkAに対する染色では、P5から8Wの末端膨大部にドット状のTrkA陽性反応が認められ、終末に向かう軸索の周囲に弱いTrkA陽性反応が認められた。TrkBに対する染色では、P5以降で終末に向かう軸索と末端膨大部付近の細く枝分かれした軸索に陽性反応が認められた。さらに、少数のTrkB陽性の斑状の構造が末端膨大部が認められた。TrkCに対する染色では、P14までは葉状神経終末においてTrkC陽性反応は認められなかったが、3W以降のラットでまれに葉状神経終末領域に斑状の陽性反応が認められた。p75NTRでは、軸索の神経周膜細胞に陽性反応が認められ、P5からは終末領域の上皮下結合組織、P11からは終末領域の上皮細胞にも陽性反応が認められた。葉状神経終末の軸索にはTrkBが、葉状末端膨大部にはTrkAが存在することから、軸索の伸張と末端膨大部の発達には各々TrkBとTrkAが関与することが示唆された。TrkCは末端膨大部で弱い反応が認められたので、TrkAと強調して末端部形成に作用している可能性がある。また、p75NTRは主に神経周膜細胞に存在することから、終末周囲の環境維持に関与すると考えられた。

以上のようにニューロトロフィン受容体は喉頭粘膜における知覚構造の発達に関与すると考えられたが、非感覚線毛上皮等でも強い発現が認められたため、遺伝子およびタンパク質解析を試みたが解析は困難であった。
ニューカマーの子どもたちに対する教育支援の研究-大都市圏におけるフィールド調査から-

平成9年度から10年度にかけて、われわれは首都圏の3つの地域(東京都新宿区・神奈川県横浜市・同大和市)を選定し、ニューカマーの子どもたち(東アジア系・インドシナ系・日系南米人)が比較的多く在籍する小・中学校で参与観察を中心とするフィールド調査を実施した。その結果明らかになったのは、次のような点である。1)自治体によって、ニューカマーの子どもたちに対する支援方策がまちまちであること。初期適応指導や日本語指導の具体的形態やその整備の度合いは、自治体によって大きな差異・格差があった。それに大きな影響を与えている要因は、当該自治体の外国人政策の有無・財政的状況なのである。2)地域・学校によって、彼らが置かれた状況は全く異なること。上の結果として、日本の学校に入ってくるニューカマーの子どもたちにとって、どの地域のどの学校に入るかという偶然的な事情が、彼らの学校適応のありようを大きく規定しているという事実が把握できた。3)滞日年数や将来展望によって、日本の学校への適応形態が大きく異なること。他方で、彼らのエスニック・バックグラウンドの違いによって、彼らの日本社会へ求めるものが異なり、そのことが彼らの適応状況に多大な影響を及ぼしていることがわかった。本年度は、いくつかの自治体(東京都新宿区・豊島区・神奈川県横浜市・川崎市・大和市)の行政担当者に対する聴き取り調査を実施したのち、平成9年9月から、首都圏の3つの地域(新宿区・横浜市鶴見区・大和市)の地域を選定し、ニューカマ-の子どもたちが在籍する小学校でフィールドワークを展開した。1)自治体によって、ニューカマ-の子供たちに対する支援がまちまちであること。初期適応指導や日本語指導の具体的な形態や、その整備の度合いは、自治体によって大きな差異・格差があった。それに大きな影響を与えている要因としてあげられるのは、自治体の外国人政策の有無・財政的指置の軽重などである。その結果として、日本の学校に入ってくるニューカマ-の子弟にとって、どの地域のどの学校に入るかという半ば偶然的な事情が、彼らの学校への適応、ひいては日本社会への適応のありようを大きく規定している実情が把握できた。3)滞日年数や将来展望によって、日本の学校への適応形態は大きく異なること。他方で、彼らのエスニックな背景の違い(中国系か、南米系か、インドシナ系かなど)によって、彼らが日本社会へ求めるもの内容が大きく異なり、そのことが彼らの適応形態に多大な影響を及ぼしていることがわかった。今後は、現在進行中の第一段階のフィールドワーク(平成9年9月10年3月)によって得られたデータの分析を行い、本年10月に予定されている日本教育社会学会において、その成果を発表する予定である。また合わせて、同年秋以降に実施予定の、第二段階のフィールドワークの計画を策定する。平成9年度においては、首都圏の3地域(東京都新宿区・神奈川県横浜市・神奈川県大和市)を調査フィールドとして設定し、同年秋より各地域の特定の小学校において、フィールドワークを行った。その成果は、翌年11月に開催された日本教育社会学会において報告されている(発表タイトル「見えない外国人ーニューカマーと学校文化」)。見いだされた結果として注目されるは、いずれの小学校においても、ニューカマーたちの存在が見えにくいことであった。これには、彼らの同化を促進しようとするわが国の学校文化のみならず、彼らを特別扱いをせず、問題は個人の努力によって解決可能だとする、教師たちの教育観が大きくかかわっていることが示唆された。平成10年度の秋以降、調査は第二段階を迎えており、現在各地で、ニューカマーの親たち(中国・韓国などの東アジア系、ブラジル・ペルーなどの南米系、ベトナム・カンボジア・ラオスのインドシナ系)を対象としたインタビュー調査が継続中である。
孫が作る高齢者向け電子ゲーム機器の組立キットの開発と、ものづくり教育

【研究内容】本研究は、高齢者の老化防止のための電子ゲーム機器の組立キットを開発したものである。そのためのハードウエアおよびプログラムを設計、製作した。電子ゲーム機器は、高校生がプログラム学習で最初に勉強する「LEDの点灯」を基本に設計した。製作は、回路図をCADで描き、プリント基板を自作した。開発成果物はまとめて特許出願した。【ものづくり教育】設計、製作や販売を通して高校生のものづくり教育を実践した。具体的には本校のパソコン同好会(部員7名)に対して開発コンセプトの説明から始まって、設計・製作・商品化するまでの体験を通して技術の素養やビジネスの仕組みを身につける活動をした。特に、基板を製作することや、電子回路を組立てること、オシロスコープの使い方などを体験させた。また、C言語でプログラムを作成することで、MPUの使い方、機能を理解させた。また、グループで議論することにこだわり、よい試作品を改良していくための試作品検討会を開き、次の試作品への改良を図った。さらに、本校の系列の専門学校であるユマニテク医療福祉大学校で検討会を持った。そこでは福祉の専門家からのアドバイスを受けた。一連の活動をまとめ愛知工業大学主催の高校生のサイエンスコンテスト(AITサイエンス大賞)で発表を行なった。【本研究のコンセプト】本研究のコンセプトは孫(小中高校生)が電子ゲーム機器を作り、それを祖父母にプレゼントして両者の絆を深めてもらう所にあった。もちろん孫世代は電子工作を通して電子機器の理解が深まる。一方、高齢者は贈られたゲームをすることで老化防止に役立てることができる。単純なゲームではあるが、可愛い孫からのプレゼントであるので積極的な使用が期待できる。これを商品化するアイディアを県内の大学が主催するビジネスプランコンテストに応募した。残念ながら入賞は出来なかったが、生徒はビジネスの仕組みに興味を持った。
仙髄をモデルとした脊髄の基本的神経回路網の解明

仙髄より下位の脊髄には単純系から複雑系へ移行するという特徴がある。本研究では,これを最も単純な末端部から順に上位髄節へと解析を進め,脊髄灰白質の基本的な神経回路構築を明らかにするという目的で,免疫組織化学,神経切断実験,順行性・逆行性トレーサ実験等を組み合わせ,光学および電子顕微鏡による解析を行った。1.仙髄および脊髄円錐部の細胞構築と線維連絡ラットの脊髄円錐は仙髄(S1-S4)下部とそれに続く尾髄(Co1-Co3)で構成されている。尾髄Co3より下位では,前根・後根が無いうえに前角の運動神経細胞も存在せず,小型神経細胞が中心管周囲に少数存在し,その多くは一酸化窒素合成酵素(NOS)陽性細胞であることが明らかになった。神経線維はCGRP,SP,ENK,NPY陽性線維が他のレベルの脊髄背側部で見られるような分布パターンを示し,5-HT,TH陽性線維が灰白質全体に分布しているが,L6脊髄の切断ならびにL5以下の後根切断実験により,これらの神経線維は,感覚性のCGRP陽性線維を除いて,仙髄より下位に存在する脊髄内在性神経由来であることが明らかになった。トレーサ実験では,仙髄下部と脊髄円錐末端部で相互の線維連絡があり,それにNOS陽性神経が関与していることが明らかになった。脊髄円錐末端部の小型神経細胞は陥入した核を有し,その一部はNADPH-diaphorase(NOS神経マーカー)陽性で,ENK,SP,5-HT陽性神経終末と接しており,主に樹状突起近位部にENK,SP陽性シナプス入力が認められた。2.終糸の構造と細胞構築ラットの終糸は脊髄円錐の末端部から第4尾椎まで,全長約6.5cmにおよぶ。従来,終糸の尾側部は索状の結合組織になると一般的に考えられていたが,最末端まで中心管を形成する上衣細胞層とごく僅かな神経要素で構成されていることが明らかになった。また,終糸尾側部では,中心管の内腔が急に膨んで嚢胞状となり,憩室状の突出や上衣細胞層の不連続部位の出現など特異的な構造が認められた。以上の結果は,脊髄円錐から終糸末端に至るまで,脊髄の基本的構造が連続して存在することを明らかにしたもので,終糸の特異的な構造の更なる解析は,脊髄の構築を発生学的に考察する上でも重要と考える。仙髄には単純系から複雑系への移行を示すという特徴がある。本研究は,これを最も単純な末端部から順に上位髄節へと解析を進めることにより,脊髄灰白質の基本的な局所神経回路構築を明らかにしようとするものである。本年度は主に脊髄末端部から仙髄中位についての解析を行い,以下のことが明らかになった。1.神経細胞構築(ニッスル染色およびPGP9.5免疫染色による観察)ラット脊髄末端部(Co2,3)の灰白質は後角と中心管周囲の中間質に相当する部分から成り,運動神経細胞および前角は無い。

仙髄下位(S5,Co1)のレベルから運動神経細胞が現れるが前角の発達は悪い。仙髄中位(S3,4)では運動神経細胞の数が増し,前角の構造が備わる。2.神経線維および神経終末(免疫組織化学染色と脊髄の横断実験,後根切断実験による観察)1)一次感覚神経入力の指標としてのCGRP陽性線維は,後角表層部から基部に向かって分布するが,L5脊髄の横断では変化せず,L5以下の後根切断により脊髄末端部で消失し,仙髄中位および下位では減少する。SP陽性線維も同様であるが,後根切断により脊髄末端部で消失しない内在性線維が後角基部に存在する。2)下降性入力の指標としての5-HT陽性線維は,灰白質全体に分布し,特に運動神経細胞の周囲で密である。L5脊髄の横断により,仙髄下位から中位において5-HT線維は減少し,運動神経細胞周囲から消失するが,脊髄末端部では全体的に微増を示し,内在性線維の存在を示唆している。TH陽性線維も量的には少ないが,ほぼ同様な分布とL5脊髄横断による変化を示す。3)内在性神経線維の指標としてのENK, NPY陽性線維は,仙髄(S35)において,後角表層および後角縁から中心管背側部に向かって密に分布するが,脊髄末端部では中心管背側部のものが無い。ENK陽性線維は更に中間質および前角にも広く分布するが,それに相当するNPY陽性線維は無い。また,これらの線維はL5脊髄の横断により変化しない。その他,VAChTやNOS陽性細胞および神経線維においても,髄節レベルによって分布の違いが認められる。3.仙髄下位と末梢神経支配との関連性(尾部末梢神経支配の免疫組織化学観察)1)尾筋腱鞘の血管において,ENK含有交感神経支配が特異的に認められる。仙髄には単純系から複雑系への移行を示すという特徴がある。本研究は,これを最も単純な末端部から順に上位髄節へと解析を進めることにより,脊髄灰白質の基本的な局所神経回路構築を明らかにしようとするものである。ラット脊髄の末端(Co3以下,脊髄円錐部)は前根,後根がないうえに前角の運動神経も存在しない。この比較的単純な解剖学的特性は,脊髄介在神経の基本的な神経調節機構を明らかにする上で有効と考え,本年度は,主に脊髄円錐部の神経細胞構築と上位脊髄との線維連絡について解析を行った。1.神経細胞構築脊髄円錐末端付近では,中等大の神経細胞が中心管の周囲に少数存在し,それらの多くは一酸化窒素合成酵素(NOS)陽性細胞であった。神経線維の分布は,CGRP,SP,NPY,ENK陽性線維が脊髄背外側部で他のレベルの後角表層に分布するようなパターンを示し,NPY,ENK陽性線維が側索の後部に,5-HT,TH陽性線維が側索の中間部に密に分布していた。L6脊髄の切断では,これらの神経線維の分布に大きな変化を認めないが,L6以下の後根切断により脊髄背外側部のCGRP陽性線維が消失し,SP陽性線維は減少した。2.逆行性トレーサ実験脊髄円錐末端部からの逆行性トレーサ実験により,23節レベル上位までの中心管周囲および前角基部領域の神経細胞が標識され,その中にNOS陽性細胞も認めた。逆に,仙髄(S3,4)からの逆行性トレーサにより標識された脊髄円錐末端部の神経細胞にもNOS陽性細胞が認められた。3.順行性のトレーサ実験順行性のトレーサを仙髄末端部に入れると,標識された軸索突起が34節レベル上まで後索を通って上行し,中心管背側から中心管の近くに分布していた。これらの結果は,NOS神経細胞を含む脊髄中心管周囲のインターニューロン群に対する入力と,出力のパターンを示すものと考えられる。
気相成長法による配向性平面六方晶窒化ホウ素薄膜の研究

将来的な高性能グラフェンデバイス製造を目し、電子状態に関する無干渉な基板としての六方晶窒化ホウ素(h-BN)の薄膜成長技術の開発を目的とし、気相成長法により大面積高品質の薄膜成長を目指した。特に高品質膜を得るための単結晶粒界の制御(大きさと配向)を可能とする薄膜成長条件の最適化を図った。窒素源としてアンモニア、ホウ素源としてジボランを用いた化学気相成長(CVD)法により、1300°Cを越える高温成長条件において、良質なh-BNホモエピタキシャル膜を得ることができた。平成23年度は、既存の窒化ホウ素のための化学気相成長装置を改造および整備した。本装置は、III族原子供給源としてのジボラン(B2H6)およびV族原子供給源としてアンモニア(NH3)を用い、基板温度を最高1000°C以下にて成長させる装置であり、既存の特殊材料ガス供給系および排気ガス除害装置に接続されている。震災以後、点検保守をされていなかったので、配管の気密試験および排ガスセンサーなどの正常動作点検などを慎重に進める必要があった。また、成長時の基板温度の最適化を図るために従来1000°C以下での条件に限られていた基板加熱装置を改造し、新たにヒータ加熱装置を導入しアンモニアガス雰囲気下で1000度以上での成長ができるようにした。新たに導入したヒータ式加熱装置は、業者の動作保証は1000°Cであるが、アンモニアガス雰囲気中で1300°Cまで対応ができるものである。基板温度により成長表面状態および不純物取り込みが大きく変化する傾向があるので、現在最適化を行っているところである。また、基板導入用の真空室を新たに設けるためにターボ分子ポンプを導入した。成長室の真空雰囲気を壊さずに試料の出し入れができるので、運用効率が上がるのみならず、不純物制御にも効果が期待できる。六方晶窒化ホウ素の基板応用面では、スピン流によるグラフェンシートの磁化や特異なホットキャリアの振る舞いの発見などグラフェン2次元電子系基礎物理の進展におおいに寄与した。六方晶窒化ホウ素基板は窒素原子とホウ素原子のsp2構造からなる2次元平面結晶構造は原子層面上に非結合状態等を持たず、かつ絶縁体であるので、グラフェンの電子物性を調べるのには好適な場を提供することができることを数多くの実験で検証している。本年度は、平成24年度に設計・開発した赤外線レーザーによる直接基板加熱機構を駆使し、1000°C以下の低温成長から1300°Cを越える高温成長まで広範囲な基板温度における成長を試み、基板温度と結晶性などの関係を明らかにした。特に高圧下における温度差法により得られた単結晶六方晶窒化ホウ素基板を用いたホモエピタキシャル成長の結晶成長条件の最適化を行い、良好なエピタキシャル成長が得られる成長条件を見いだした。このホモエピタキシャル成長においては、高温下、特に1300°Cにおける成長により良好な薄膜成長が達成されていることを顕微ラマン散乱分光法により確認した。一方、六方晶窒化ホウ素はグラファイトと類似の結晶構造を持つ絶縁体であり、この六方晶窒化ホウ素原子層を用いたグラフェンの基板としての応用研究はさらに研究が進んだ。対向する六方晶窒化ホウ素層により絶縁保護されたグラフェンは理想に近い均一な二次元電子ガス状態を保つが、このグラフェンに1次元(ライン)接触させた金属電極を取り付けると、他の物質系では得られない高いキャリア移動度を室温で観測することができることを見いだした。対照的に、グラフェンと六方晶窒化ホウ素を原子配列のレベルで配向させ積層するとグラフェン電子構造の変調現象も観測でき、グラフェンと六方晶窒化ホウ素の組み合わせはその層間相互作用を制御することができる興味ある物質系であることが明らかとなった。今後の応用の上でエピタキシャル成長の重要性が広く認識され、今後の大きな課題である。1.六方晶窒化ホウ素の化学気相成長装置のさらなる改造と最適化平成23年度に改良した基板加熱装置による成長条件の最適化を行った結果、該装置の常用基板温度1000°Cから最高到達温度1300°C近辺における成長結晶において、より高温になるほど結晶性の向上がみられることが表面顕微鏡観察やラマン散乱分光法などの方法により分かった。特にホモエピタキシャル基板を成長基板に用いるとこの温度領域では異常結晶粒子の成長が観察され、さらなる高温成長が望ましいことが示唆された。そこで平成24年度には常用温度1300°C、最高到達温度1500°Cを得られるように赤外線レーザによる直接基板加熱機構を設計開発した。本原理によるレーザ加熱装置は市販のものが存在するが、到達温度が不足や基板加熱サイズの不適合などの理由によりそのまま導入することは出来ないので、光学系の設計を検討し必要部品を入手するなどして、装置を自作することにより所定の温度動作を達成した。

2.六方晶窒化ホウ素を基板に用いた二次元原子層物理の展開六方晶窒化ホウ素基板は窒素原子とホウ素原子のsp2構造からなる2次元平面結晶構造は原子層面上に非結合状態等を持たず、かつ絶縁体であるのでグラフェンの電子物性を調べるのに好適な場を提供することができる。本年度は、特にグラフェンのヘテロ接合による新しい物性の探索を昨年に継続して行い、バリスティックにサイクロトロン運動する電子の振る舞いの観測や、六方晶窒化ホウ素原子層とグラフェン原子層の格子定数の違いにより生成したモアレパターンによるあらたなディラックポイントの生成の発見などグラフェンにおける新しい知見を得た。研究代表者らの研究機関は茨城県にあり、震災の影響は0ではなかったが、研究遂行に必要な安全措置として重要な排ガス除害装置および特殊材料ガス供給系に大きな損傷はなく、ほぼ計画通りに成長装置の改造および立ち上げを達成している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、赤外線レーザ加熱装置導入により六方晶窒化ホウ素薄膜成長に必要な基本的な装置条件の整備を達成している。その上で、多種多様な成長条件および成長基板における成長に挑戦しており、最終年度を迎えて技術的に大きな進展が期待できる。高純度窒化ホウ素の成長には、基板温度の最適化が必要で、現在の1300°Cでもまだ必要十分であるとは言いがたいことがわかってきた。これ以上の温度を得ようとすると通常のヒータ加熱では難しく、また誘導加熱では装置に大幅な改造を必要とする。そこで今年度は赤外線レーザによる加熱方式を検討および導入することを計画している。本装置の導入により幅広い温度領域でいろいろな成長条件を試すことができる。本年度は、平成24年度に設計・開発した赤外線レーザーによる直接基板加熱機構を駆使し、1000°C以下の低温成長から1300°Cを越える高温成長まで広範囲な基板温度における成長を試み、基板温度と結晶性の関係を明らかにする。具体的には顕微ラマン散乱分光法やカソードルミネッセンス法などを用い不純物や構造の評価を行い、結晶成長条件の最適化を図る。また、これまでいろいろな基板上への育成を行った結果から、基板選択が面方位制御上重要なことが明らかになっている。そこで、昨年度に引き続き高圧法による高純度バルク単結晶を用いたホモエピタキシャル成長や、モリブデン単結晶を用いた配向性薄膜成長を試みることにより新たな結晶成長機構を探索し、高純度で原子層平面が得られる条件を見いだす。特にホモエピタキシャル成長においては、結晶成長温度1000°Cと1300°C近辺での成長試料では、あきらかに異常成長粒子の生成状態が異なる。そこでラマン散乱分光法などを用いて、結晶性の評価をするとともに成長機構の解明をはかる。
マウス遺伝的カタラクトのポジショナルクローニング

わが国で発見されたマウスの遺伝的カタラクトRupture of lens cataract(RLC)ならびにNakano cataract(NCT)の原因遺伝子をポジショナルクローニングし、レンズの臓器形成、透明性維持機能にかかわる遺伝子の同定を行なった。精細マッピング結果に基づき、理化学研究所で開発されたマウス全長cDNAライブラリーの中のマップ位置に存在するcDNAクローン多数の塩基配列を決定し、正常マウスcDNA塩基配列と比較した結果、RLCでは第14染色体rlc1で9アミノ酸の欠損を見出した。この欠損は関連マウス系統では認められず、ポリモルフィズムでない。Nct1のコードする蛋白のC末ペプチドに対する抗体を作成し、これが110k Daの分子量をもち、免疫組織化学的にレンズ上皮細胞や、神経系などの組織にユニークな分布を示すことが判った。発病の分子機構を解析している。一方、NCTでも同様のアプローチを行なった結果、第16染色体のNct1で13塩基の欠損を発見し、ナカノマウス由来レンズ上皮細胞株NK11(NEIより供与)においても保存されていることを確認した。NCTとMSMとの交配系の表現型を精細に解析するとレンズの混濁様式、発病潜伏期間について2つの亜型が観察された。連鎖解析の結果、病型を修飾する2つのモディファイアー-遺伝子座を第3、10染色体上にマップした。我々の一連の研究はレンズの生理的機能保持機構の理解を独創的な立場から進めるものである。これらの遺伝子座が原因遺伝子であることをさらに確認する目的でレスキュー実験ならびにノックアウトマウスの作成が進行中である。わが国で発見された2つのマウスの遺伝的劣性カタラクト、PLCとNCTのポジショナルクローニングを進めている。RLC(Rupture of lens cat aract)はレンズ後極付近の皮質線維の変性、カプセルの断列によりレンズが破綻し核が後方に逸脱するもので、責任遺伝子座を第14染色体28.5 cMの約0.2 cMにマップした。マップ位置、ならびにコンゲニックマウス間のレンズ蛋白に対する同種抗体による解析からPyk2をその候補遺伝子として研究を進めてきたが、確証が得られなかったので、理化学研究所ゲノム解析センターと共同し、同所が開発した全長cDNAエンサイクロペディアにより約20の候補を定め、レンズでの発現、塩基配列の両面から検索を進めている。一方、NCT(Nakano cat aract)はレンズ内にNa/K pumpに対する内因性抑制ペプチドが形成されることによるosmotic cat aractと考えられている。NCTについてはMSM系との1000頭のバッククロスにより第16染色体41 cM付近のマップ位置を0.7 cMまで絞り、上記同様の検索を進めている。BALB/cマウスを背景とするNCT congenic系では発病が遅く瀰漫性のレンズ混濁を来すバリアント型となる。戻し交配系における病型の分離に着目し、連鎖解析がら病型を決定する2つの修飾遺伝子を第3,第10染色体上にマップした。第3染色体上にはNa/K pumpのα鎖遺伝子があり、NCTの発生機構に重要な示唆を与えている(投稿中)。これらの研究はレンズの構造、透明性保持、水分維持機構の分子生物学的機構の解明に貢献するアプローチである。マウスの2つの遺伝的カタラクトRupture of lens cataract (RLC)およびNakano cataract (NCT)について原因遺伝子のポジショナルクローニングを行った。RLCは常染色体単一劣性遺伝子による変異で生後35日以降、レンズ後縫合のレンズ線維の変性、脱離により後極で破綻がおこりレンズ核の逸脱をみる。ゲノムワイド解析により第14染色体28.5cMにマップされた。

理化学研究所マウス全長cDNAライブラリーからマップ位置にあたるクローン多数の塩基配列を決定した結果、細胞内シグナル分子Rlc1(仮名)に9アミノ酸欠損をもたらす塩基欠損をみつけた。この欠損はRLCミュータント特異的で、原因遺伝子であることをIn vivoレベルで確認を進めている。一方NCTは常染色体単一劣性遺伝子による変異で生後21日以降、レンズのNa/K ATPase活性を阻害する内因性ペプチドが形成される結果発病するOsmotic cataractである。1000頭の戻し交配マウスを解析した結果、第16染色体40cMに原因遺伝子がマップされた。これについても理化学研究所マウス全長cDNAライブラリーからマップ位置にあたるクローン多数の塩基配列を決定した結果、細胞内シグナル分子Nct11(仮名)のイントロン内に13塩基の欠損をみつけた。Nakano mice由来レンズ上皮細胞株NK11でもこの欠損を保存していた。原因遺伝子であることをIn vivoレベルで確認を進めている。この検索の過程で戻し交配世代のカタラクトは表現型、発病時期の異なる2型があり、第3、第10染色体上の修飾遺伝子によることが示された。
多量体アポ蛋白Mを用いたHDLの多面的効果の臨床検査医学への導入

HDLは従来コレステロール逆転送における抗動脈作用はよく知られているが、近年は抗酸化作用や抗炎症作用といった多面的効果が注目されている。また、スフィンゴシン1-リン酸(S1P)がHDLのApoMに結合していることが明らかとなったことでHDLの多面的効果がS1Pの生理活性作用に由来するものであると考えられている。我々はHDLの翻訳後修飾が及ぼす影響を調べるために、メチルグリオキサール(MG)を用いて糖化HDLを作成した。はじめに、ウエスタンブロッティング解析を施行したところ、MG濃度依存的にApoMの多量体化が引き起こされていることが明らかとなった。さらに、S1PアナログのC_<17>S1Pを用いて糖化HDLのC_<17>S1Pへの親和性を確認したところ、糖化HDLではC17S1Pへの親和性が有意に低下していることが明らかとなった。これらの実験から、多量体化ApoMがS1P親和性に影響していることが考えられた。次に、多量体化ApoMの形成機序を明らかにする実験を行った。まず、糖鎖切断酵素(PNGase F、Glycosidase、Neuraminidase)で処理したところ、ApoMの糖鎖切断は確認できたが、多量体化ApoMは分解されなかった。次に、終末糖化産物(AGEs)の形成阻害剤として知られるaminoguanidine(AG)、L-arginine、alagebriumを用いたところ、いずれのAGEs形成阻害剤においても多量体化ApoMの産生が抑制された。したがって、多量体化ApoMにはAGEsの形成が関与していると考えられた。このことから、AGEs形成阻害剤を用いることで糖化HDLにおけるC_<17>S1P親和性が改善することが予測された。しかしながら、AGEs形成阻害剤添加糖化HDLにおけるC_<17>S1P親和性は改善しなかった。この原因を明らかにする目的で二次元蛋白電気泳動を施行した。糖化HDLで認められるバンドは酸性側に移動しているが、AGEs形成阻害剤添加糖化HDLにおいてはバンドの移動は認めなかった。しかしながら、わずかな多量体化ApoMが検出された。このことは、わずかな多量体化ApoMの存在がS1P親和性の低下を示唆している。したがって、多量体化ApoMの検出はHDLの質的評価をするために有用であると考えられる。
βブロッカーは敗血症患者の救命率を高める-擬似ラットモデルでの検討

本研究は,βブロッカー(エスモロール)持続投与が腹膜炎惹起敗血症ラットにおける敗血症病態の進行を修飾し,さらには予後を改善するか否かを検討する目的で行った.前年度,申請者らはβブロッカーの持続投与により腹膜炎惹起敗血症ラットの生存時間が有意に延長することを見出した.本年度はその機序解明を目的として,同モデルで腹水及び動脈血中の炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-1β),HMGB-1測定を行い,さらに敗血症の進行に重要な役割を担うbacterial translocationに焦点を当て,PCR法を用いて腸管膜リンパ節,肝臓,脾臓及び動脈血中への細菌移行の発生頻度を検討した.実験動物を無作為に対照群(生理食塩水)及びエスモロール群(塩酸エスモロー:15mg/kg/hr)に割り付け,上記項目について評価した.その結果,腹水中のIL-1β,HMGB-1は2群間で差がなかったものの,エスモロール群では対照群と比較して,腹水中のTNF-α濃度は有意に低値であった(P<0.05),一方,血液中の炎症性サイトカイン,HMGB-1は両群共に検出限界値以下であった.Bacterial translocationの陽性率は,両群の全ての臓器において有意を認めなかったが,腸管膜リンパ節ではエスモロール群で陽性率が低い傾向にあった(66%versus87%).以上より,βブロッカーの持続投与は,TNF-αを中心とした炎症反応を少なくとも局所レベルで抑えることで敗血症の進行を遅延した可能性が高く,同時に腸管壁防御機構の破綻を抑え,腸間膜リンパ節へのbacterial translocationの発生を軽減する可能性が示唆された.申請者らは、敗血症ラットに対するβブロッカーエスモロール持続投与が、心機能を保持し炎症性サイトカインTNF-α放出を抑えることを報告した(Crit Care Med2005;33:2433)。本研究初年度であり、研究目的である「βブロッカー(エスモロール)持続投与による死亡率への影響を検討する」実験計画を遂行した。敗血症ラットに対するβブロッカーエスモロール投与量は心拍出量への効果を含め特定していた(Crit Care Med2005;33:2294)が、3群間での死亡率は統計学的処理も複雑となることから、実績のあるエスモロール投与量の中間である15mg/kg/hrを採用した。従来の方法にしたがい、全身麻酔下に頚動脈頚静脈にカテーテルを留置し、頚背部より体外に出してラット用回転式シーベル装置に装着する。その後、開腹して盲腸穿孔法により腹膜炎を惹起し、閉創する。腹膜炎を惹起しているため、鎮痛薬として塩酸ブプレノルフィン持続投与を行う。全身麻酔覚醒後、ラットは意識下に飼育ケージ内を自由に動くことが可能となる。その後、無作為にコントロール群(生食投与2mL/kg/hr)、エスモロール群(15mg/kg/hr)の2群に分け、経静脈的持続投与をそれぞれ開始する。動脈圧をモニターし、継続的にデータ保存、動脈圧が消失した時刻を検証できるように設定した。本年度は盲腸穿孔による腹膜炎モデル作成に関する研究者の手技安定を図ると共に、βブロッカー至適投与量を再検討し、その結果15mg/kg/hr群を採用することとした。ラットに腹膜炎惹起後、エスモロール投与群と非投与群に無作為に分け、その後の血圧、心拍数、生存時間、動脈血液ガス分析値を比較検討した。中間解析結果として2群間に血圧、乳酸値に差は認めないものの、心拍数は投与群で低下する一方、生存時間が投与群で延長する傾向を示した。この結果は、「βブロッカー持続投与が敗血症における生命予後を改善する」という仮説を裏付けるものであり、標本数増加とその機序解明に向けた研究計画を継続する。本研究は,βブロッカー(エスモロール)持続投与が腹膜炎惹起敗血症ラットにおける敗血症病態の進行を修飾し,さらには予後を改善するか否かを検討する目的で行った.前年度,申請者らはβブロッカーの持続投与により腹膜炎惹起敗血症ラットの生存時間が有意に延長することを見出した.本年度はその機序解明を目的として,同モデルで腹水及び動脈血中の炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-1β),HMGB-1測定を行い,さらに敗血症の進行に重要な役割を担うbacterial translocationに焦点を当て,PCR法を用いて腸管膜リンパ節,肝臓,脾臓及び動脈血中への細菌移行の発生頻度を検討した.実験動物を無作為に対照群(生理食塩水)及びエスモロール群(塩酸エスモロー:15mg/kg/hr)に割り付け,上記項目について評価した.その結果,腹水中のIL-1β,HMGB-1は2群間で差がなかったものの,エスモロール群では対照群と比較して,腹水中のTNF-α濃度は有意に低値であった(P<0.05),一方,血液中の炎症性サイトカイン,HMGB-1は両群共に検出限界値以下であった.

Bacterial translocationの陽性率は,両群の全ての臓器において有意を認めなかったが,腸管膜リンパ節ではエスモロール群で陽性率が低い傾向にあった(66%versus87%).以上より,βブロッカーの持続投与は,TNF-αを中心とした炎症反応を少なくとも局所レベルで抑えることで敗血症の進行を遅延した可能性が高く,同時に腸管壁防御機構の破綻を抑え,腸間膜リンパ節へのbacterial translocationの発生を軽減する可能性が示唆された.
光によるリアルタイム蛋白質不活化法を用いた神経-グリア相互作用新規解析法の開発

神経細胞とグリア細胞は近接・接着部位に受容体、チャネル、トランスポーターなどの膜機能分子を集積し、相互に情報伝達や機能調節を行っている。その機能は多岐にわたり複雑な細胞形態・組織構築を背景にしているため、関連分子の探索・解析のためには相互作用している場において直接機能解析を行う新しいアプローチが必要とされている。我々が開発した蛍光色素標識抗体と光照射により特定の蛋白質を生細胞において不活性化するFluorophore-assisted light inactivation(FALI)は、このような解析に有用な研究方法と考えられる。本研究は、抗体ライブラリーを用いたFALIにより機能変化を起こす抗体クローンを選択することで新規の機能分子を探索する手法を神経・グリア細胞の膜ラフト集積蛋白質に応用するための基盤技術開発を目的としている。本年度は、1)昨年度準備したボスホパンテテイニルトランスフェラーゼによる抗体のポストラベルの標識条件・効率を検討した。蛍光色素標識のためには高濃度の基質を必要とし効率的にも劣ることが明らかとなったため、組換え抗体のin vitro翻訳時にフルオレセインを導入する方法を検討中である。これまで実績のあるβガラクトシダーゼを標的とした実験を進めている。2)抗体を介さずに細胞表面発現膜蛋白質に直接蛍光色素を導入して細胞を用いたFALIのコントロール実験を行うために、株化細胞、初代培養神経細胞における蛍光標識を行った。トランスフェクションにより培養細胞にSNAP, CLIPなどのポストラベル用タグを融合させた膜蛋白質を発現させ、細胞表面における蛍光標識の条件を検討した。モデル系を用いて標的蛋白質の不活性化を確認し、探索に適用するための条件設定を行う。神経細胞とグリア細胞は神経-グリア間接着部位に受容体、チャネルなどの膜機能分子を集積し、相互に情報伝達や機能調節を行っている。その機能は多岐にわたり複雑な細胞・組織構築を背景にしているため、関連分子の探索・解析のためには相互作用している場において直接機能解析を行う新しいアプローチが必要とされている。本研究は、抗体ライブラリーからFALIにより機能変化を起こす抗体クローンを選択して新規の機能分子を探索する手法を神経・グリア細胞の膜ラフト集積蛋白質に応用するための基盤技術開発を目的としている。本年度は、各過程の基礎的な条件検討を主に行い、以下のような結果が得られた。1.抗体ライブラリーの選択に用いるための脳組織由来ラフトの調製条件と固定化条件の検討を行った。2.組換え抗体発現後はポストラベル法によりフルオレセイン標識し光照射に用いる予定である。ポストラベルに必要な基質の合成・精製、組換え酵素の発現・精製を行い、蛍光色素標識が起こることをモデル系で確認した。現在、反応の至適条件を検討中である。3.ラットから神経細胞、グリア細胞の調製・培養を行い、グリア細胞・神経細胞共培養の条件を検討中である。今後、モデル系を用いて蛍光標識、光照射による標的の不活性化を確認し、探索に適用するための条件設定を行う予定である。
ヒト炎症性疾患におけるNKG2Dリガンドの発現と免疫監視回避機構の制御

ヒトNKG2Dリガンド発現と疾患との関連について,採取された病理検体およびTissue Microarrayを用いて,自己免疫疾患などの炎症性疾患,腫瘍性疾患の局所におけるNKG2Dリガンド発現パターンを解析した。上皮性腫瘍では,特異的なNKG2Dリガンド発現パターンは,大きく分けて3種類が示唆された。炎症性疾患では,標的臓器において特異的な発現パターンが示唆されたが,炎症の進行状況との関連を併せた検討を要する。ナチュラルキラー(NK)細胞を活性化するレセプターの1つであるNKG2Dは,本来腫瘍化や感染などのストレス負荷が加わった異常細胞で発現誘導されているNKG2Dリガンドを認識して直接的に傷害し排除する機能を有する。ヒトNKG2DリガンドであるULBP1-6などについては,その発現と疾患との関連性は不明点が多い。そこでヒト自己免疫疾患や移植関連疾患などの病理組織検体および患者血清におけるULBP蛋白の発現を検討し,疾患との関連性とその制御についての網羅的検討を行うことを目的として本研究は遂行されている。平成22年度は,ULBP1-6遺伝子を導入し発現させた細胞を作製して,パラフィン包埋されたヒト病理組織検体およびウエスタンブロッティングなどにも使用可能な抗ULBPポリクローナル抗体の作製を試み,作製された抗体についてその信頼性の確認を行ってきた。また現在市販されている種々の抗ULBP抗体について,パラフィン包埋されたヒト病理組織検体への使用の可能性についても初期検討を行ってきた。平成23年度は,これらの使用してきた抗体群を用いて,各種自己免疫疾患診断のために採取された検体に対して免疫染色を行い,NKG2Dリガンドの発現について検討する。また病変局所浸潤炎症細胞についても,特にNKG2Dを有するNK細胞やNKT細胞,abおよびgdT細胞の分布について免疫染色による細胞構成比の詳細な検索を行う。また種々のヒトEBV関連疾患について,それぞれの疾患におけるULBP4を中心としたNKG2Dリガンドの網羅的な発現プロファイルを解析検討する。さらに骨髄移植などの移植レシピエントに対して行われ得る拒絶反応や移植後炎症,CMVなどによる日和見感染症,移植片対宿主症候群(GVHD)などの病態の推移と,NKG2Dリガンドの発現の関連性を,経時的に検討する。ナチュラルキラー(NK)細胞の活性化レセプターの1つであるNKG2Dは,本来腫瘍化や感染などのストレス負荷が加わった異常細胞で発現誘導されているNKG2Dリガンドを認識して,直接的に傷害し排除する。そこで,疾患とその発現の強弱との関連に不明点が多いヒトNKG2DリガンドであるULBP1-6を主体として,ヒト自己免疫疾患などを代表とする種々の炎症性疾患および様々な腫瘍性疾患において,診断・治療目的で採取された病理組織検体およびTissue Microarrayを用いて,病変局所におけるNKG2Dリガンド発現パターンの解析を行った。この結果腫瘍性疾患については,種々の上皮性悪性腫瘍において多様なNKG2Dリガンド発現パターンを示し,腫瘍組織特異的なNKG2Dリガンドの発現パターンは,大きく分けてcommon ULBP(1,2/6,3,5)とULBP4,MICA/Bの3パターンに分類されることが示唆された。また炎症性疾患においては,標的となる組織において特異的なNKG2Dリガンドの発現パターンが示唆される結果が得られたが,炎症の病勢の進行状況との関連性を考慮した検討を要する。さらにNKG2Dを有する免疫担当細胞による免疫監視からの回避における分子機構の解明を目指して,NK細胞やNKT細胞,αβおよびγδT細胞をはじめとする局所浸潤炎症細胞の分布について,一部検体について免疫染色による検索を行った。浸潤細胞のpopulationやその傾向についてはさらなる検討を要する。
糖尿病性腎症の発症機構におけるマクロファージの役割の解明と治療への応用

我々は、糖尿病性腎症の成因に炎症メカニズムが関与するとする仮説を検証するために、科学研究費補助金を受けて、10年以上にわたって研究を進めてきた。その結果、糖尿病性腎症患者の腎組織にICAM-1をはじめとする細胞接着分子の発現の亢進とマクロファージの浸潤が見られること、糖尿病発症後きわめて早期にICAM-1の発現が起こり、ICAM-1がマクロファージの浸潤を誘導していることを明らかにした。さらに、ICAM-1ノックアウト(KO)マウスでは対照のwild typeマウスに比べて糖尿病発症後の腎組織におけるマクロファージの浸潤が極めて少なく、腎障害が有意に抑制されることが明らかになった。また、糸球体硬化が進行した時期のモデルである5/6腎摘出モデルにおいても、ICAM-1KOマウスではwild typeマウスに比較して糸球体硬化の進行が抑制されるという結果が得られた。次に、糖尿病性腎症の成因に関わる炎症関連分子を解明するとともに、新しい治療ターゲット分子を探索するために、ICAM-1KOマウスとwild typeマウスにストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルと5/6腎摘出モデルを作成して、DNAマイクロアレイを用いて腎組織における遺伝子発現プロファイルを経時的に比較した。その結果、osteopontinをはじめとする糖尿病性腎症の成因に関与すると考えられる炎症関連分子を同定することに成功した。我々はこれまで、糖尿病性腎症の成因にマクロファージの浸潤をはじめとする炎症メカニズムが関与するのではないかと考えて研究を行ってきた。さらに、ICAM-1 KOマウスではwild typeマウスに比べて糖尿病発症後の腎組織におけるマクロファージの浸潤が極めて少なく、アルブミン尿、糸球体肥大、メサンギウム基質の増加も有意に抑制されることが明らかになった。次に、我々は糸球体硬化が進行した時期のモデルとして5/6腎摘出モデルを用いることを計画し予備的実験を行った。その結果、ICAM-1 KOマウスではwild typeマウスに比較して、5/6腎摘出後の糸球体肥大と硬化の進行が抑制されるという結果が得られた。そこで、本研究では、糖尿病性腎症の進展過程にマクロファージがどのように関与するかを解明するとともに、新しい治療ターゲット分子を探索するために、ICAM-1 KOマウスとwild typeマウスにストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルと5/6腎摘出モデルを作成して、DNAマイクロアレイを用いて腎組織における遺伝子発現プロファイルを経時的に比較検討した。その結果、wild type糖尿病マウスでは、RANTES、MCP-2、osteopontinなどのケモカインや、炎症性サイトカインが増加しており、ICAM-1 KOマウスでは糖尿病発症後のこれらの炎症関連分子の発現が抑制されていることが明らかとなった。以上の結果より、糖尿病性腎症の進展過程に炎症メカニズムが関与することが強く示唆された。今後、これらの炎症関連分子の発現部位や発現時期を詳細に検討して、腎症の治療ターゲットを探索していく予定である。我々はこれまで、糖尿病性腎症の成因にマクロファージの浸潤をはじめとする炎症メカニズムが関与するのではないかと考えて一連の研究を行ってきた。

その結果、ICAM-1KOマウスではwild typeマウスに比較して、5/6腎摘出後の糸球体肥大と硬化の進行が抑制されるという結果が得られた。本研究では、ICAM-1 KOマウスとwild typeマウスにストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルと5/6腎摘出モデルを作成して、DNAマイクロアレイを用いて腎組織における遺伝子発現プロファイルを経時的に比較することにより、糖尿病の発症から糸球体硬化への進展過程に関与する遺伝子を解析した。その結果、糖尿病と5/6腎摘出モデルの両者の腎臓において、wild typeマウスでは発現が増加するがICAM-1 KOマウスでは発現増加が抑制される炎症関連遺伝子群を同定することが出来た。さらに、両モデルにおいて類似した発現パターンを示す数種類のケモカインや炎症性サイトカインなどの遺伝子を同定し、RT-PCRと免疫染色でその発現部位を同定した。これらの遺伝子は、糖尿病性腎症に対する新しい治療ターゲット分子となりうる可能性があると考えられる。