hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
川崎病患児における細菌叢の経時的変動解析

9)20)他も多く、感染症との関連が疑われている。次世代シークエンサーによる網羅配列解読による病原体候補の検索を行ったところ、川崎病急性期の血清より腸内細菌叢を構成するグラム陰性菌、その他抗酸菌の核酸塩基配列が検出された。これまでに、川崎病患児群の血清からグラム陰性菌由来のLPS (Lipopolysaccharide)が有意に検出され、LPSの病態への関与を示唆する報告や、川崎病遠隔期でBCG由来のHeat Shock Protein 65に対する抗体価の有意な上昇を認め、抗酸菌群の関与を示唆する報告21)があり、網羅配列解読による検索結果はこれらを支持するものである。これまでの成果により川崎病患児の血清に内在する微生物群が明らかになり、病原体候補カタログを作成できた。さらに、川崎病患児の腸内や咽頭に内在するあらゆる病原体を網羅的に把握するため、メタゲノム解析を行った。腸内環境については、川崎病遠隔期や対照群健常児ではBifidobacterium属を主体とする類似した環境にあったが、川崎病急性期の腸内にはBifidobacterium属が少なく患児毎にそれぞれ異なる特徴的な様相を呈していた。咽頭環境についても、川崎病急性期群と対照群では異なった傾向が見られた。また、一部患児の腸内・咽頭からはウィルス配列(ヒトアデノウィルス・WUポリオーマウィルス)が検出された。川崎病急性期の腸内や咽頭では健常なバランスが破綻し乱れた様相を呈していた。患児個々の病態を経時的に追加して得られる縦断的な情報を併せることで、知見が拡張され病態の究明が期待される。患児P7の川崎病急性期の腸内にはStreptococcus属が非常に多かったが(細菌配列1,906,171readsのうち1,463,295reads(77%))、これは他の児の腸内フローラだけでなく咽頭フローラと比較しても非常に特異な組成であった。川崎病患児のT細胞レセプター(TCR)レパートリーはスーパー抗原特異的なレパートリーと類似しており、TCRのVβ2遺伝子を強く発現させるグラム陽性菌(Streptococcus属・Staphylococcus属)が分離されたといった過去の報告から、スーパー抗原活性を持つ細菌の川崎病への関与も示唆されるが、P7の腸内フローラはこれらの報告を支持し得る興味深い結果である。分離したレンサ球菌株のゲノム情報から説明することが困難な状況であるが、細胞毒性および動物実験の準備が整ってきたため、今後の課題として評価検討して行きたい。科研費申請以前から病院との連携体制がとれており、倫理申請等の手続きが既に完了していたことや検体確保が比較的スムースに執り行うことができたため、網羅配列解読へ迅速に進むことができた。また、網羅配列解読による解析システムがひと通り構築済みであったことも幸いし、解読後の作業に労する時間を短縮することができた。これら検体確保と解析システムの充実が、計画段階以上に迅速に遂行できた理由である。患児8名の治療前後における腸内フローラ解析が終了したが、本計画中に20名の追加検体を得ることができた。これら検体の追加解読を行い、より重厚なデータをもって川崎病に関連する細菌種の同定を行う予定である。また、患児P7の川崎病急性期の腸内にはレンサ球菌属が非常に多く、菌株を複数分離している。分離したレンサ球菌株の細胞毒性および動物実験により準備が整ってきたため、今後の課題として評価検討して行きたい。
核融合炉液体増殖材料配管における多機能性セラミックコーティングの開発

D-T核融合実用炉における液体リチウムブランケット概念を成立させるためには、MHD圧力損失の低減、配管に対する腐食低減、及び配管からのトリチウム透過漏洩速度の低減が重要な検討課題であり、これらを解決する有力な手段として多機能性セラミックスコーティングを配管構造材料表面に施す事が考えられている。本研究では、核融合炉液体リチウムブランケット配管被覆候補素材について、各種被覆作成手法にて、その多機能性を保持させたまま薄膜化する事を目標とした。本年度は、耐腐食性、高絶縁性、水素透過低減能保持の観点から、昨年度までに選定した酸化エルビウムに注目し、寿命評価の基礎研究としてその液体リチウム中でのわずかな腐食のメカニズム解明及び、各種パラメータを変更した際の重水素透過試験を実施した。液体リチウム中での酸化エルビウムのわずかな腐食は、酸化エルビウムの還元ではなく酸化によって生成するリチウムエルベートと考えられる物質を含む腐食生成物層が発生し、その腐食生成物の状態によっては、リチウムの流動による侵食が容易に起こるというメカニズムによるとわかった。水素透過防止能の測定は、透過の上流側に水素もしくは重水素を用い、わずかに透過してくる水素同位体を圧力変化等によって捉える方法にて、すでに昨年度試作した装置を用いて実験を行った。水素透過が大幅に上昇する大きな原因は膜のミクロな剥離であった。基盤酸化物が剥離の原因になること、微細構造を持つ中間層が生成させた場合には剥離が防止されることがわかった。常温では観測不可能なクラックに起因すると考えられる水素透過速度の上昇も発生した。剥離やクラックを抑えた場合、被覆内結晶粒界拡散律速を示唆する測定結果を得た。薄膜の水素透過防止能の基盤依存性はほとんどなく、熱膨張によるクラックや膜厚、また結晶性が水素透過防止能に大きく影響する事がわかった。D-T核融合実用炉における液体ブランケット概念を成立させるためには、液体金属を強磁場下で流動させる際に発生するMHD圧力損失の低減、配管に対する腐食低球、及び配管からのトリチウム透過漏洩速度の低減が重要な検討課題であり、これらを解決する有力な手段としてセラミックスコーティングを配管構造材料表面に施す事が考えられている。本研究では、コーティング候補素材を種々の手法にて薄膜化し、その諸物性の測定を行うと共に、絶縁性、耐腐食性、トリチウム不透過性といった特性を明らかにして機能発現メカニズムを明らかにする。平成17年度は、PVD法の一種であるプラズマスパッタ法を用いて酸化エルビウムコーティングを試作し、さまざまなパラメータ下で作成したコーティングについて結晶性、不純物濃度、絶縁性等を測定と共に、この絶縁性測定、熱サイクル試験、水素透過試験を行った。その結果、コーティング自体は高温液体リチウム中での化学安定性を示したものの、高温におけるコーディング中応力緩和による基盤との密着性低下に伴う一部の剥離が発生する事により、液体リチウムを電極として用いた絶縁性試験及び水素透過試験において十分な向上は観測されなかった。一方、PVD法の一種であるアークソースプラズマ蒸着法によってさまざまなパラメータ下で酸化エルビウムコーティングを試作すると共に、蒸着反応試験法による酸化カルシウムコーティングの試作を行った。これらについては、液体リチウム中での高温長時間の共存性を示すと共にし、酸化カルシウムコーティングについては液体リチウム中での高絶縁性を達成した。これらの成果については日本原子力学会及び、米国で開催された核融合炉材料国際会議にて公表した。本年度は昨年度に引き続き、多機能性コーティング作成法の高度化を進めると共に、作成したコーティング材について液体リチウム中での共存性試験を実施した。また、作成したコーティング材にっいて水素透過試験体系の設計製作を行い、初期的な水素透過試験結果を得た。コーティング作成の高度化については、作成したコーティングについて、結晶性、不純物濃度、絶縁性等を詳細に測定し、その結果からコーティング作成条件の高度化を進める事によって行った。アークソースプラズマ蒸着法の作成条件の高度化にっいては、酸化エルビウムコーティングの膜質が、作成時のバイアス電圧は結晶性向上に影響なくむしろ高電圧では膜の破壊を進めること、作成時の基盤温度が500°C以上で良好な結晶性を得ることなどを明らかにした。さらに、これらのコーティングについて液体リチウムへの浸漬試験を進め、結晶性の向上により耐食性が向上すること、液体リチウム温度の上昇により若干の共存性の低下が見られること、コーティングの電気抵抗値は試験後も高い値を保っていることなどを明らかにした。また、高度化したコーティングの水素透過抑制にっいて実験し、コーティングを行わないバナジウム合金基盤やステンレス基盤より36桁低い水素透過速度係数を得た。さらに、配管への施工が容易なコーティング手法による酸化エルビウムコーティングの作成法として、蒸着反応試験法及びsol-gel法による酸化エルビウムコーティングの作成条件の調整を進め、現在までに、蒸着反応試験法にて得られたコーティングについては高い耐食性を、sol-gel法によって得られたコーティングについては、高い水素透過抑制能を得ている。なお、本課題による主な成果発表は、国内学会及び国際学会において発表を行った。

本年度は、耐腐食性、高絶縁性、水素透過低減能保持の観点から、昨年度までに選定した酸化エルビウムに注目し、寿命評価の基礎研究としてその液体リチウム中でのわずかな腐食のメカニズム解明及び、各種パラメータを変更した際の重水素透過試験を実施した。液体リチウム中での酸化エルビウムのわずかな腐食は、酸化エルビウムの還元ではなく酸化によって生成するリチウムエルベートと考えられる物質を含む腐食生成物層が発生し、その腐食生成物の状態によっては、リチウムの流動による侵食が容易に起こるというメカニズムによるとわかった。水素透過防止能の測定は、透過の上流側に水素もしくは重水素を用い、わずかに透過してくる水素同位体を圧力変化等によって捉える方法にて、すでに昨年度試作した装置を用いて実験を行った。水素透過が大幅に上昇する大きな原因は膜のミクロな剥離であった。基盤酸化物が剥離の原因になること、微細構造を持つ中間層が生成させた場合には剥離が防止されることがわかった。常温では観測不可能なクラックに起因すると考えられる水素透過速度の上昇も発生した。剥離やクラックを抑えた場合、被覆内結晶粒界拡散律速を示唆する測定結果を得た。薄膜の水素透過防止能の基盤依存性はほとんどなく、熱膨張によるクラックや膜厚、また結晶性が水素透過防止能に大きく影響する事がわかった。
マウス乳癌ウィルスLTRより翻訳されるORF蛋白の生物学的性状の解析

1.ORF蛋白の精製.ORF遺伝子にβーgalactosidase遺伝子を融合,これを大腸菌内で発現せしめて生化学的手段により精製した.2.抗ORF血清の作製.上記融合蛋白で家兎を免疫,その抗血清からβーgalactosidase親和カラムを素通しL融合蛋白親和カラムに結合するORF特異抗体分画を得た.3.ORF高度発現系の樹立. RSVLTR又はマウス乳癌ウィルス(MMTV)LTRの下流に,C3Hマウス又はGRマウス由来のMMTVORF遺伝子を接続し,PSv2neoプラスミドに組込んで,マウス正常乳腺細胞株C57MG又はネコ腎細胞株CRFKにトランスフェクトし,ネオマイシン抵抗クロン20株を単離した.このうち,MMTVーLTRを用いたコンストラクトをCRFKに導入した場合,最も多くのORFmRNAが検出され,Northern法で1.5kbのORFmRNAバンドが同定された.但しcisに位置するSV40エンハンサーの影響か,デキサメサゾン(Dx)によるORFmRNAの増強は二倍程度と弱く,又,read through産物と推定される3kbのRNAが多量に認められたため,MMTVーLTR/ORFとPSV2neoとをC57MG又はCRFKにcoーtransfectした系を確立中である. Dx反応性の高い系が得せれつつある.4.リンパ性白血病に随伴するMMTVのORF変異. DBA/2マウスの自然発症リンパ性白血病7株全例において,MMTVのextra provirus cooiesの出現とそのLTRu_3領域の欠損とを確認した.精査した1例ではその欠損はU_3領域の6701020bpに及んでいた.これはC57BlマウスのELー4白血病で,TPAでORF蛋白の発現を増強した際,ORFmRNAが約1.0kbと小さいこととよく対応している.5.今後の研究計画.リンパ性白血病のMMTVに欠損があることは,ORF蛋白にも相当の欠損があることを意味し,これがMMTVの乳腺よりリンパ球への組織親和性の転換と白血病原性とに関与している可能性が高い.今後は非欠損性ORF蛋白との対比において,これらの性状や細胞内局在の解明に全力をあげたい.6.その他,MMTVLTRとの比較のため,ジャコウネズミの乳癌ウィルスのLTRの構造を記載した.本LTR中にORFは認められなかった.1.ORF蛋白の精製.ORF遺伝子にβーgalactosidase遺伝子を融合,これを大腸菌内で発現せしめて生化学的手段により精製した.2.抗ORF血清の作製.上記融合蛋白で家兎を免疫,その抗血清からβーgalactosidase親和カラムを素通しL融合蛋白親和カラムに結合するORF特異抗体分画を得た.3.ORF高度発現系の樹立. RSVLTR又はマウス乳癌ウィルス(MMTV)LTRの下流に,C3Hマウス又はGRマウス由来のMMTVORF遺伝子を接続し,PSv2neoプラスミドに組込んで,マウス正常乳腺細胞株C57MG又はネコ腎細胞株CRFKにトランスフェクトし,ネオマイシン抵抗クロン20株を単離した.このうち,MMTVーLTRを用いたコンストラクトをCRFKに導入した場合,最も多くのORFmRNAが検出され,Northern法で1.5kbのORFmRNAバンドが同定された.但しcisに位置するSV40エンハンサーの影響か,デキサメサゾン(Dx)によるORFmRNAの増強は二倍程度と弱く,又,read through産物と推定される3kbのRNAが多量に認められたため,MMTVーLTR/ORFとPSV2neoとをC57MG又はCRFKにcoーtransfectした系を確立中である. Dx反応性の高い系が得せれつつある.4.リンパ性白血病に随伴するMMTVのORF変異. DBA/2マウスの自然発症リンパ性白血病7株全例において,MMTVのextra provirus cooiesの出現とそのLTRu_3領域の欠損とを確認した.精査した1例ではその欠損はU_3領域の6701020bpに及んでいた.これはC57BlマウスのELー4白血病で,TPAでORF蛋白の発現を増強した際,ORFmRNAが約1.0kbと小さいこととよく対応している.5.今後の研究計画.リンパ性白血病のMMTVに欠損があることは,ORF蛋白にも相当の欠損があることを意味し,これがMMTVの乳腺よりリンパ球への組織親和性の転換と白血病原性とに関与している可能性が高い.今後は非欠損性ORF蛋白との対比において,これらの性状や細胞内局在の解明に全力をあげたい.6.その他,MMTVLTRとの比較のため,ジャコウネズミの乳癌ウィルスのLTRの構造を記載した.本LTR中にORFは認められなかった.
曲がった時空、境界のある時空の物理から見る、超弦理論の特異な性質

アノマリーは場の理論において非常に重要かつ有用な概念である。その一つの応用として't Hooftアノマリー整合条件がある。これは大域的対称性に対する背景ゲージ場(曲がった時空を含む)を導入したときのアノマリーは繰り込み群で不変な量であるという性質である。そのため、強結合の場の理論の相構造を調べる際の強力なツールとなっている。我々は、この't Hooftアノマリー整合条件を用いて強結合のゲージ理論の相構造の解析を行った。最近有用性が発見された高次形式対称性を含むような't Hooftアノマリーを考えることにより、新たな知見が得られた。特に、ゲージ群がSU(6)で3階反対称テンソルのWeylフェルミオンを一つ含むような理論では、フェルミオンの双一次形式は凝縮しないが、カイラル対称性は破れるという、エキゾチックな性質を持つことが分かった。また、アノマリーに関してドメインウォールを持つような系での指数定理について引き続き研究を行った。従来からSPT(Symmetry Protected Topological)相とその境界の理論に関してはAtiyah-Patodi-Singer(APS)の指数定理が関係すると考えられていた。しかしAPS指数定理に現れる境界条件は非局所的であり、物理的にSPT相に現れる境界条件とは異なっている。前年度、我々は質量の符号が反転するようなドメインウォールを考えることにより、物理的な境界条件は自然に現れ、フェルミオン行列式の符号に現れる指数はAPS指数と同じものであることを示した。この研究をさらに推し進め、曲がった時空も含めて一般化し、その数学的な証明に向けて研究をすすめている。今年度は境界や欠陥をもつ場の理論に関してアノマリーの観点から研究を進めてきた。曲がった時空、あるいは境界や欠陥をもつ時空の場の理論に関して、アノマリーの観点は強力なツールを与えることを再確認し、興味深い成果を得ることができた。また、強結合の場の理論を解析するツールとしての't Hooftアノマリー整合条件、特に高次形式対称性を含むものが有用であることが分かり、実際に4次元のゲージ理論に関する非自明な結果を得た。以前から続けている境界や欠陥のある共形場理論の研究も同時に進行している。特に大きなNの手法を欠陥のある共形場理論に適用することを考え、試行錯誤をしている最中である。これまでの研究を通じてアノマリーの観点は非常に有用であることが分かったので、続けてこの方面の研究を続けていく。特に欠陥と関係が深い高次形式対称性を含むようなアノマリーに注目し、その流入や指数定理などについて調べる。また、't Hooftアノマリー整合条件を用いた解析も続けていく。特に有限温度系に適用することは興味深く、新たな結果を出せることが期待できる。また、以前から続けている境界や欠陥のある共形場理論へのアプローチも続けていく。特にアノマリーの観点からの研究と合わせることにより、ブレイクスルーがあることを期待している。最近ローレンツ計量の場合の反転公式が発見され、共形場理論の様々な新しい定理を生み出している。これを境界や欠陥のある共形場理論に応用することにより新たな結果が期待できる。4次元のN=4超対称ゲージ理論を境界を持つリーマン面でコンパクト化して得られる2次元の共形場理論について調べた。これまで4次元のN=4超対称ゲージ理論を閉じたリーマン面でコンパクト化する場合、ツイストと呼ばれる操作の仕方によって2次元でN=(4,4)、N=(2,2)、あるいは、N=(0,2)の超対称性が残る場合があることが知られていた。我々は、それぞれの場合に対して、リーマン面に境界を導入し、超対称性を保つような境界条件について考察した。その結果、それぞれのツイストの仕方の場合に、半分の超対称性を残す境界条件を得ることができ、二次元でそれぞれN=(2,2)、N=(1,1)、N=(0,1)の超対称性を保つことを明らかにした。これらの理論は低エネルギーで2次元の超共形場理論になる。この超共形場理論についてさらに研究をすすめた。特にN=(2,2)超共形場理論の場合はアノマリーの考察によって、中心電荷を求めることができる。我々は、この解析を行い具体的に中心電荷をゲージ群の次元と境界のあるリーマン面のトポロジーの情報を用いて書き下した。そこからそれがCalabi-Yau多様体をターゲット空間とするシグマ模型であることが示唆される。我々は得られるシグマ模型についてさらに解析を進めた。また、最近3次元以上の共形場理論において、対称性やユニタリー性をもちいて共形場理論の物理量を求める手法が大きく進展している。我々はこの手法を境界や欠陥のある共形場理論に適用した。特に4-ε次元での解析的なアプローチで余次元2の欠陥のスペクトルを調べた。これについては、現在さらに進行中である。境界のあるリーマン面でコンパクト化して得られる共形場理論に関して順調に進展しており、成果を発表している。また、境界や欠陥のある共形場理論に関しても新しい手法を用いて現在研究は進展している。局所的なスケール変換で不変な場の理論は共形場理論と呼ばれる。弦理論において共形場理論は非常に重要な役割を果たす。例えば弦の世界面を記述する場の理論は共形場理論であり、その共形対称性が時空の意味での運動方程式になる。また弦理論の興味深い一つの側面であるAdS/CFT対応は、弦理論と共形場理論の対応である。

したがって、共形場理論を深く理解することは、AdS/CFT対応を通じて弦理論を理解することにつながる。共形場理論の様々な要素の中でも私が特に注目したのは、共形不変な欠陥である。一共形不変な欠陥は、AdS/CFT対応を通じて様々な「ブレイン」に対応する。弦理論において高次元に広がった物体であるブレインは非常に重要な役割を果たしてきた。共形場理論における欠陥を調べることにより、このブレインを理解することができる。最近3次元以上の共形場理論において、対称性やユニタリー性をもちいて共形場理論の物理量を求める手法が大きく進展している。その中でもRychkovとTanによって始められた新しいε展開の方法は計算もやさしく、共形場理論の構造を解析的な側面から理解できる興味深い手法である。我々はこの手法を境界や欠陥のある共形場理論に適用した。特に4-ε次元でWilson-Fisher共形場理論における、余次元2のツイスト欠陥上の局所演算子のスペクトルを調べた。我々が得た結果は従来のFeynman図を用いた計算と完全に一致し、Rychikov-Tanの手法が妥当であることを支持するものである。続けて、境界や欠陥のある共形場理論に新しい手法を適用し研究は進展している。一つの方法として余次元2のツイスト欠陥に対してlarge Nを用いた解析を現在研究中である。また、大きなスピンのセクターを調べる方法も有用と思われるが、これも現在進行中の研究である。場の理論での重要な概念の一つにアノマリーがある。特に、大域的対称性に対する背景ゲージ場(曲がった時空を含む)を導入したときのアノマリーは't Hooftアノマリーと呼ばれ、繰り込み群で不変な量であるため、理論の相構造を調べる際の強力なツールとなる。またアノマリー流入現象など、境界や欠陥を考える際にも重要な役割を果たす。近年物性理論においてSPT相(Symmetry Protected Topological phase)が注目を浴びている。特にその境界に現れる理論のアノマリーを用いてSPT相を分類する方法が有力である。このため、これまで注目されることが少なかった様々なアノマリーに関する理論が急速に進展している。アノマリーに関して特に重要な数学的概念の一つが指数定理である。特にSPT相とその境界の理論に関してはAtiyah-Patodi-Singer(APS)の指数定理が関係すると考えられている。しかしAPS指数定理に現れる境界条件は非局所的であり、物理的にSPT相に現れる境界条件とは異なっている。そこで我々は質量の符号が反転するようなドメインウォールを考えた。この場合、物理的な境界条件は自然に現れる。さらにこのような系のフェルミオン行列式の符号に現れる指数はAPSの指数と同じものであることを示した。SPT相の境界の理論にはアノマリーがあるが、そのさらに境界は存在することが出来ない。このため、アノマリーがあることと境界が存在することが出来るかどうかは深い関係があると考えられている。
マウスおよびヒトiPS細胞から肝細胞への分化誘導

本研究は体細胞から樹立された多能性幹細胞であるiPS細胞を用い、肝細胞への分化能力を検討することを目的としている。平成21年度に、(1)ヒトiPS細胞からin vitroで肝細胞を分化誘導するための至適条件の確立(2)in vitroで分化誘導を行った肝細胞に対する機能評価の2点について検討を行った。当初、平成22年度の目標として、このヒトiPS細胞由来肝細胞を肝障害モデルマウスに移植する実験を計画していた。肝細胞様に分化したヒトiPS細胞のみを選別するために、セルソーターを用いた肝細胞マーカーによるポジティブセレクションを計画したが、想定した肝細胞表面マーカーであるASGRの抗体での標識がうまくいかずに移植実験まで進めることは困難となった。ただ、分化誘導実験の過程で、複数のヒトiPS細胞クローンを用いて肝分化誘導の実験を行うと、起源が同じロットのヒト線維芽細胞であるにもかかわらず、分化しやすいクローンと分化しにくいクローンがあり、ヒトiPS細胞クローン間で肝細胞への分化能力に差があるという興味深い知見が得られた。そこで、平成22年度の新たな実験計画目標として、(1)複数のヒトiPS細胞株間における肝分化能力差の比較検討を行うこととした。特に同一ドナーの線維芽細胞由来の複数のiPS細胞は初期化に用いたレトロウイルスの挿入という違いはあるものの、基本的には同一の遺伝子配列を有しているため、観察されたヒトiPS細胞株間の肝分化能の差はエピジェネティック修飾の違いによる、との仮説を立てた。評価法としては、肝臓の発生に深く関係する複数の転写因子を選び、そのプロモーター領域のDNAメチル化解析をパイロシークエンスを用いて行った。平成21年度の計画として、(1)ヒトiPS細胞からin vitroで肝細胞を分化誘導するための至適条件の確立(3)セルソーターを用いた未分化細胞除去法の確立の3点を挙げた。まず(1)に関して、ヒトES細胞からin vitroで肝細胞を誘導する既報の培養プロトコールを参考とし、ヒトiPS細胞から肝細胞を分化誘導するプロトコールを作製した。分化誘導後のヒトiPS細胞はヒトES細胞を使用した場合と同様に、肝初代培養細胞様の形態を示した。(2)に関して、肝細胞様に分化したヒトiPS細胞はRT-PCRおよび免疫染色にて肝細胞マーカーの発現を示した。またPAS染色による糖産生能、アルブミン分泌能、アンモニア代謝能、CYP活性などの肝細胞特有の生理学的機能を有することも確認された。当初、分化誘導後の細胞集団の中に未分化iPS細胞の残存が危惧されたため、(3)「未分化細胞除去法の確立」を計画として挙げた。ところが実際に分化誘導の実験を行ってみると、現在使用しているプロトコールにおいては、肝細胞様に分化した細胞以外の細胞は未分化iPS細胞であることはまれで、多くは間葉系細胞の特徴を有する細胞であることがわかった。現在、肝細胞様に分化したヒトiPS細胞のみを選別するために、セルソーターを用いた肝細胞マーカーによるポジティブセレクション、間葉系マーカーによるネガティブセレクションを検討している。
身近な自然の「資源としての面」への気づきを促す、系統的な環境教育教材群の開発

1.教材開発とカリキュラム開発の関係について検討し、両者の関係を踏まえた環境教育教材開発と環境教育カリキュラム開発の方策について、試案を提出した。2.「環境教育カリキュラムの骨組み」と「自然からのものづくり教材」の関係について検討を行い、自然からのものづくり教材をその中に位置づけた「三つの段階から成る環境教育カリキュラムの骨組み」の試案を提出した。3.自然からのものづくり教材開発のため、次の項目について素材研究を行った。(1)身近な土からの土器づくり、(2)身近な自然物からのガラスづくり、(3)砂鉄からの鉄づくり、(4)土の、生ゴミを分解するはたらきや可燃性ガスを発生させるはたらきの活用、(5)火起こし材としての石と植物の利用、(6)ダイズと海水からの豆腐づくり、(7)植物や土を使った絵の具づくり、(8)植物や土を使ったクレヨンづくり、(9)身近な野草からのでんぷん取り、(10)セイヨウカラシナからの油および石けんづくり、(11)野草からの堆肥づくり、(12)トウガラシの多様な利用、(13)ヒマワリの多様な利用、(14)ナンキンハゼからのロウソクづくり、(15)タブやそのほかの植物からの線香づくり、(16)ミミズの生ゴミを分解するはたらきの利用、(17)動物の糞の多様な利用、(18)木の揺れの、音楽素材としての利用。4.これらの素材研究によって開発された教材について、国公私立の幼稚園、小学校および中学校で授業実践を行った。5.これらの成果について、日本理科教育学会の全国大会および近畿支部大会において、また京都府下および大阪府下の国公私立学校、および韓国、中国、ドイツの教育関係者を対象にした懇談会・研修会・講演会において報告するとともに、意見・情報の交換を行った。環境教育のカリキュラム構築を視野に入れた環境教育教材(活動教材)の開発を目指す研究の一環である。このうち「自然と生活のつながりの理解を促す教材」、特に「'身近な自然'に対する理解を、'資源'という面から促す教材」の開発に、本研究の第一の目標を置いた。このような教材の作成には2つのタイプの教材-「A.身近な自然の'存在'自体への気づきを促すことに重きを置いた観察教材」と、「B.身近な自然を原料や材料に用いた物づくり教材」-を組み合わせることが必要である、という考えのもと、1年目の今年は、次のように研究を進めた。1.Aタイプの教材開発の候補となる素材を身近な自然から、Bタイプの教材の候補となる素材を生活用品から、それぞれ抜き出して整理した。2.AタイプとBタイプの既開発教材のサーベイを行い、それらについて、上記1との関係を整理した。3.Aタイプ,Bタイプのそれぞれについて、教材開発研究、あるいはその基礎としての素材研究を進めた(Aタイプとしては、草本植物の観察。樹木の観察、ドングリの観察、地面の観察、昆虫の幼虫の観察、チョウの飛び方の観察、コンテナビオトープ・ビーカービオトープの観察、【triple bond】など;Bタイプとしては、野草からのでんぷんとり、陶器づくり、納豆づくり、ろうそくづくり、砂鉄からの鉄づくり、クレヨンづくり、線香づくり、茶づくり、餅づくり、アルコールづくり、炭づくり、【triple bond】など)。これらの成果の一部は、日本理科教育学会の大会(全国大会および近畿支部大会)等で報告した。

本研究は、環境教育教材のうち、「A.身近な自然の'存在'自体への気づきを促すことに重きを置いた観察教材」と、「B.身近な自然を原料や材料に用いた物づくり教材」に重きを置き、教育実践を視野に入れた、それらの開発と系統化を目指している。今年度は、次のように研究を進めた。1.上記のAとして、コンテナビオトープ(プランタービオトープ)について様々な角度からの教材開発(いくつかの土の種類で比べる、雨のかかり具合など設置環境を変えて比べる、など)(山木ほか2003、塩見ほか2003)、それらの小学校における教育実践(元生ほか2003、木村ほか2003)、チョウを手がかりにした自然観察教材の開発(矢野ほか2003)、その小学校における教育実践(松林ほか2003)、さらに野菜を手がかりにした自然観察教材の開発(山本ほか2003)等を行った。2.Bとしては、ガラスづくり(谷口ほか2003)、納豆づくり(長谷川ほか2003)、油づくり(伊藤ほか2003)、かつお節づくり(小池ほか2003)、染色(濱ほか2003)について教材開発を行った。ガラスづくりに関し簡単に記す。ソーダ石灰ガラスについては、SiO_2として身近にある砂や岩石、Na_2CO_3としてワカメやアオサを燃やした灰、CaCO_3として鶏卵の殻、はまぐりの貝殻等をそれぞれ用い、硼珪酸ガラスについては、原料のうちのSiO_2に身近な砂や岩石を用いて試み(熱源はガスバーナー)、様々な色のガラスがつくれることが分かった。3.このような教材を開発していくことの、環境教育・理科教育にとっての意義・役割について、考察・検討した(広木2003a, b)。今年度は、環境教育の基本柱である「自然と人間生活とのつながりへの気づき」を促す活動教材の開発研究を、前年度までの素材研究の成果と環境教育先進国と言われるドイツの事例とを踏まえて、次のA、B2つの点に重きを置いて行った。それらの教材を、幼稚園、小学校、中学校における教育実践を踏まえて改良した上、環境教育カリキュラムを編成していく観点から整理した(下記の14)。A.「身近に自然の営みが存在すること」自体への気づきを促すことB.身近な自然の、`資源'という面からの気づきを促すこと1.Aの点に重きを置いた教材として、土の観察、ドングリの観察、昆虫の幼虫の観察、チョウの飛び方の観察、コンテナビオトープ・ビーカービオトープの観察、...等を、Bの点に重きを置いた教材として、土からの土器づくり、土からの可燃性ガス生成、砂からのガラスづくり、砂鉄からの鉄づくり、海水からのにがりづくり、ドングリや野草からのでんぷんとり、木の実からのろうそくづくり、草木からのクレヨンや線香づくり、鶏糞からの炭づくり...等を開発した。2.これらの開発教材を、資源の存在場所(生物圏、岩石圏、水圏、気圏、水圏)の観点と、生活の中での用途(食生活、衣生活、住生活、遊び、文化活動、等)の観点から分類・整理し、これら教材を組み入れた環境教育カリキュラムの骨組み試案を提出した。3.開発した教材およびカリキュラム骨格について、京都府下の小中学校教諭対象の研修会、京都府理科教育推進協議会、守口市環境教育協議会において紹介や情報交換を行い、また、京都教育大学附属幼稚園、京都市立松尾小学校、宇治市立笠取小学校、京都教育大学附属桃山小学校、宇治市立北宇治中学校等で授業実践を行った。それら実践を踏まえて教材の改良を行った。4.以上の成果について、日本理科教育学会の全国大会および近畿支部大会等で報告した。また、中国上海において、教育従事者や大学院生への講演を行い、情報交換を行った。
イノシトールリン脂質が制御する形態形成

項目(a)「PI(3,5)P2とPI(4,5)P2の局在解析」について,PI(3,5)P2プローブとして,2種類目を作製し,根毛の伸長の各過程におけるPI(3,5)P2の局在のイメージングに成功した.項目(b)「ROP10に関する機能解析」について,ROP10はPI(3,5)P2の他にPI3P, PI4P, PI(4,5)P2に結合能をもつことがわかった.さらに,FAB1とROP10が直接結合すること,FAB1ノックダウンによってROP10は細胞膜から細胞質に局在が変化すること,逆に,ROP10のドミナントネガティブ体でFAB1の側面細胞膜局在が細胞質に変化したこと,などが確かめられ,直接結合するFAB1とROP10は局在が互いに依存的であることがわかった.項目(c)「ICR1に関する機能解析」については,FAB1/PI(3,5)P2の根毛側面形態の制御に対するICRファミリーの関与の可能性から,ICR2,3, 4, 5についても,Crisper/Cas9によってノックアウト変異体を作製し,ICR2とICR4のノックアウト変異体で波状根毛の表現型を確認した.さらに,ICR2やICR4に,Citrineを融合させたタンパク質を発現するラインを作製し観察したところ,ICR2もICR4も根毛の側面細胞膜に局在していた.項目(d)「PI(3,5)P2と微小管の関係をイメージング」について,PI(3,5)P2欠乏条件のとき,根毛の表層微小管は極端に断片化し,GFP-EB1bで標識した微小管プラス端は極端に減少していた.FAB1は根毛の表層微小管を制御すると共に,根毛の側面の二次細胞壁の形成も制御することが明らかとなったが,実際,FAB1ノックダウンによって根毛の側面の堅さが通常の半分程度になっていることを,原子間力顕微鏡を用いて根毛の側面強度を直接物理的に測定することで確かめた.項目(a)から(d)について,2年間もしくは3年間で行う予定であった計画はすべて完了したほか,当初の研究項目に記載のなかった「原子間力顕微鏡による根毛の側面の強度測定」や「PI(3,5)P2の量的関係と根毛の形態形成の数理モデルによるシミュレーション」「一次細胞壁と二次細胞壁の詳細な解析」などに成功した.このように,現時点で,当初の研究計画を大幅に超えて,研究が進行している.根毛の側面形成を制御するPI(3,5)P2と先端成長を制御するPI(4,5)P2の領域をわける因子について研究を進める.具体的には,ホスホリパーゼDやホスホリパーゼCの局在解析,変異体解析,イノシトールリン脂質の結合特異性に関する解析を中心に行う.また,根毛における二次細胞壁形成のための成分を分泌する機構についても研究を進める.具体的には,SNARE分子の同定を行う.申請者は,以下の解析を行った.項目(a)「PI(3,5)P2とPI(4,5)P2の局在解析」について,根毛の伸長開始,伸長中,伸長終了時のライムラプスで,ホスファチジルイノシトール3,5二リン酸[PI(3,5)P2]とPI(4,5)P2の根毛における局在変化をモニタリングし,局在解析を完了した.項目(b)「ROP10に関する機能解析」について,ROP10はPI(3,5)P2に結合することを証明したほか,PI(3,5)P2合成酵素であるFAB1はタイプIIROPであるROP10と,PI(4,5)P2合成酵素であるPIP5KはタイプIROPであるROP2と特異的に結合することによって,これら4者が細胞膜に局在することを見出した.また,ROP10とFAB1は互いに依存的な関係にあることも明らかにした.すなわち,FAB1のノックダウンではROP10は細胞膜に局在できず,ROP10のドミナントネガティブ体では,FAB1は細胞膜に局在できないのである.項目(c)「ICR1に関する機能解析」について,FAB1や微小管と相互作用があることを確認したICR1の根毛特異的ノックダウン変異体EXPA7>>icr1-amiRNAはFAB1のノックダウン変異体と同様に波状の表現型であったことから,FAB1/PI(3,5)P2の根毛の側面形態の制御にICR1とそのファミリーが関与していると考えた.項目(d)「PI(3,5)P2と微小管の関係をイメージング」について,FAB1ノックアウト時やROP10のノックダウン時のときの微小管は,繊維構造が崩れフラグメント化していることを明らかにした.また,微小管のプラス端標識のGFP-EB1bの観察から,FAB1のノックダウン時に微小管のプラス端が不安定になることを証明した.さらに,FAB1ノックダウンでは一次壁ではなく二次壁の形成に欠陥があることを明らかにした.項目(a)から(d)について,2年間もしくは3年間で行う予定であった計画がすべて完了したほか,当初の研究項目に記載のなかった「AFMによる根毛の側面の強度測定」や「PI(3,5)P2の量的関係と根毛の形態形成の数理モデルによるシミュレーション」「一次細胞壁と二次細胞壁の詳細な解析」などに成功した.このように,現時点で,当初の研究計画を大幅に超えて,研究が進行している.項目(a)「PI(3,5)

P2とPI(4,5)P2の局在解析」について,PI(3,5)P2プローブとして,2種類目を作製し,根毛の伸長の各過程におけるPI(3,5)P2の局在のイメージングに成功した.項目(b)「ROP10に関する機能解析」について,ROP10はPI(3,5)P2の他にPI3P, PI4P, PI(4,5)P2に結合能をもつことがわかった.さらに,FAB1とROP10が直接結合すること,FAB1ノックダウンによってROP10は細胞膜から細胞質に局在が変化すること,逆に,ROP10のドミナントネガティブ体でFAB1の側面細胞膜局在が細胞質に変化したこと,などが確かめられ,直接結合するFAB1とROP10は局在が互いに依存的であることがわかった.項目(c)「ICR1に関する機能解析」については,FAB1/PI(3,5)P2の根毛側面形態の制御に対するICRファミリーの関与の可能性から,ICR2,3, 4, 5についても,Crisper/Cas9によってノックアウト変異体を作製し,ICR2とICR4のノックアウト変異体で波状根毛の表現型を確認した.さらに,ICR2やICR4に,Citrineを融合させたタンパク質を発現するラインを作製し観察したところ,ICR2もICR4も根毛の側面細胞膜に局在していた.項目(d)「PI(3,5)P2と微小管の関係をイメージング」について,PI(3,5)P2欠乏条件のとき,根毛の表層微小管は極端に断片化し,GFP-EB1bで標識した微小管プラス端は極端に減少していた.FAB1は根毛の表層微小管を制御すると共に,根毛の側面の二次細胞壁の形成も制御することが明らかとなったが,実際,FAB1ノックダウンによって根毛の側面の堅さが通常の半分程度になっていることを,原子間力顕微鏡を用いて根毛の側面強度を直接物理的に測定することで確かめた.項目(a)から(d)について,2年間もしくは3年間で行う予定であった計画はすべて完了したほか,当初の研究項目に記載のなかった「原子間力顕微鏡による根毛の側面の強度測定」や「PI(3,5)P2の量的関係と根毛の形態形成の数理モデルによるシミュレーション」「一次細胞壁と二次細胞壁の詳細な解析」などに成功した.このように,現時点で,当初の研究計画を大幅に超えて,研究が進行している.いままでの研究成果を論文として出版することを目指す.さらに,根毛の側面形成を制御するPI(3,5)P2と先端成長を制御するPI(4,5)P2の領域をわける因子について研究を進める.具体的には,ホスホリパーゼDやホスホリパーゼCの局在解析,変異体解析,イノシトールリン脂質の結合特異性に関する解析を中心に行う.また,根毛における二次細胞壁形成のための成分を分泌する機構についても研究を進める.具体的には,SNARE分子の同定を行う.根毛の側面形成を制御するPI(3,5)P2と先端成長を制御するPI(4,5)P2の領域をわける因子について研究を進める.具体的には,ホスホリパーゼDやホスホリパーゼCの局在解析,変異体解析,イノシトールリン脂質の結合特異性に関する解析を中心に行う.また,根毛における二次細胞壁形成のための成分を分泌する機構についても研究を進める.具体的には,SNARE分子の同定を行う.
吸入麻酔薬の抗侵害作用におけるノシセプチン受容体の役割に関する研究

申請者は、前年度に吸入麻酔薬の最小肺胞濃度(minimum alveolar concentration : MAC)に対するノシセプチン系の関与を検討する目的で、ノシセプチン受容体ノックアウトマウスで各種吸入麻酔薬のMACを検討した。その結果、ノシセプチン受容体ノックアウトマウスの各種揮発性吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルレン、セボフルレン)のMACは、野生型と欠損型の間で差は認められなかった。次に、吸入麻酔薬の中で最も鎮痛作用が強く、その作用は内因性オピオイドに関係していると言われている亜酸化窒素の鎮痛作用を検討するために、tail-flick testを用いて野生型と欠損型で比較した。その結果、野生型にでは潜時の延長が認められず、欠損型で延長していた。次に、前年度に求めた1MACのハロセンを、上記のノックアウトマウスに吸入させた。平衡に達したところで、侵害刺激として腹腔内酢酸投与(内臓痛モデル)を行った後、断頭により採血を行った。また、同様にtail-flick testで用いた濃度の亜酸化窒素下でも腹腔内酢酸投与による侵害刺激を与えた後に断頭による採血を行った。現在、ストレスホルモンとして血中ノルエピネフリン、ACTH、バソプレッシンを特異的なRIAを用いて測定中である。結果として、ハロセンの場合、野生型と欠損型に有意差はなく、亜酸化窒素では野生型よりも欠損型でストレスホルモンの分泌が抑制されている事が予想させる。このことは、tail-flick testにおける結果と矛盾しないと思われる。以上の結果は、ハロセンを代表とする揮発性麻酔薬の作用にはノシセプチンは関与しないのに対して、亜酸化窒素はその鎮痛作用の機序にノシセプチンが関与している可能性を示唆するものであると考える。申請者は吸入麻酔薬の最小肺胞濃度(minimum alveolar concentration : MAC)に対するノシセプチン系の関与を検討する目的で、ノシセプチン受容体ノックアウトマウスで各種吸入麻酔薬のMACを検討した。雄性マウスを円筒状のチャンバー内に置き、一方から吸入麻酔薬を投与した。平衡に達したところで、ワニグチクリップを用いてマウスの尾をクランプした。体動の有無を観察し、動かなければ吸入濃度を1020%下げ、動けば1020%上げ、同様に実験を行った。以上のような方法で濃度幅を狭めていき、動く濃度と動かない濃度の中間をその個体のMACとした。その結果、ノシセプチン受容体ノックアウトマウスの各種吸入麻酔薬(ハロセン、イソフルレン、セボフルレン)のMACは、野生型と欠損型の間で差は認められなかった。現在、吸入麻酔薬の中で最も鎮痛作用が強く、その作用は内因性オピオイドに関係していると言われている亜酸化窒素のMACを、野生型と欠損型で測定しているところである。また、ノシセプチンはモルヒネの耐性の形成に関与する実験結果が報告されていることから、亜酸化窒素の急性耐性においてもノシセプチンが関与している可能性がある。現在、亜酸化窒素の鎮痛作用における急性耐性を検討するために、tail-flick testを用いて野生型と欠損型で比較検討中である。一方、野生型と欠損型マウスの大脳皮質膜画分において、それぞれノシセプチンで受容体結合実験を行い、野生型でノシセプチン受容体は発現しているが、欠損型マウスにはノシセプチン受容体が発現していないことを確認した。また、申請者らは、すでにラット大脳皮質シナプトソームからのグルタミン酸放出をノシセプチンが抑制するという結果を得ているが、現在マウスでも同様の方法で比較検討中である。
1型インターフェロンの関節リウマチにおける役割と治療標的分子としての可能性

今年度はまず昨年度の実験結果、すなわち1型インターフェロンはIL-6の発現を介して炎症に寄与しており、またその上流分子の中ではとくにIRF-3が関与している可能性があることに基づき、裏付けるための実験を行なった。別の系のOA患者由来の細胞を対照群として同様の実験を行なったが、同様に1型インターフェロンはIL-6の発現を介して炎症に関与していること、またその上流分子の中ではとくにIRF-3の関与が大きいことが示唆される結果が得られた。この結果をもとに学会発表準備を進めたが、ターゲットとしていたアメリカリウマチ学会の抄録締切には間に合わず、次年度の同学会への投稿を目標とすることとした。またそれと平行して論文作成も進める予定である。実験については順調に経過したが、学会発表ならびに論文作成が遅れている。これは研究責任者である私が2018年4月に職場が変わった影響で実験頻度が低下し、実験の結果がそろったのが目標とする学会の期限に間に合わなかったことが大きい。残っている標本を用いて、さらなる裏付けの実験を行う。具体的にはもう一度RA群とOA群の比較検討のため細胞に刺激を与えた後のIFNの推移をPCRやELISAを用いて調べる。さらにこれまで得られているデータに新規データを加えて、統計解析を行う。これまでの研究結果から最終的に得られた知見をまとめ、ターゲットとする学会での発表ならびに論文作成・投稿を行っていく予定である。今年度は主に2種類の実験系を計画し施行した。1)ヒトのcell lineであるTHP-1を用いた実験として、(1) IFNalpha/be-taを添加しその影響をみる、(2) TLR3のligandであるpolyI:C、TLR4のligandであるLPSを添加し擬炎症状態としたのち、IFNalpha/betaの発現をみる。2)患者由来のサンプルであるヒト軟骨・滑膜細胞ならびに関節液・血液を用いた実験として、(1)リウマチ(RA)患者と変形性関節症(OA)患者それぞれから採取した関節液・血液中のIFNalpha/be-taをELISAで測定する、(2)ヒト滑膜・軟骨細胞を培養し、TNFalpha、ILー6、IFNalpha/be-taの発現をみる。結果1)(1)THP-1は定常状態ではTNFalpha、ならびにIFNalpha/be-taの発現は乏しかった。ここにrecombinant IFNalpha/be-taを添加したところ、TNFalphaの発現が増加した。(2) polyI:Cの添加によりIFNalpha/be-taの発現増加が見られた。さらにLPS添加においてもIFNalpha/be-taの発現増加が見られた。結果2)(1)OA患者においては関節液・血液中にIFNalpha/be-taは出ていなかった。一方RA患者においては濃度に個体差があるものの一定以上の値で測定可能であった。サンプル採取当時の血清学的所見との関連を調べたところ、リウマチ因子のみ統計学的な関連が認められた。(2)ヒト滑膜・軟骨細胞中のTNFalpha、IL-6をreal time PCRで測定したところ、TNFalphaは測定限界以下であった。これはおそらくいずれの個体もRAが寛解または低疾患活動性状態であったからと考えられる。一方でIL-6は多くの個体で高発現していた。当初立案した計画通り、初年度はヒトcell lineとヒト由来の細胞を用いた予定通りの実験を遂行できた。結果も現時点では概ね仮説通りであると考えられる。今年度はまず昨年度の実験結果に基づき、1型インターフェロン(IFN)の上流分子の絞り込みを行い、IRF-3、IRF-7を目的分子とし今後の実験を行うこととした。まずはそれぞれに対するsiRNAを作製し、これを用いて患者由来のサンプルであるヒト軟骨・滑膜細胞に対しノックダウンを導入し、細胞の状態変化や各サイトカインの増減を測定した。細胞中分子の定量にはreal time PCRを、上清中分子の定量にはELISAを用いて測定した。対照としてOA患者由来の軟骨・滑膜細胞を用意し、RA患者由来の細胞と同様の実験を行なった。結果として、IRF-3をノックダウンすることによりIL-6の発現が増加したが、IRF-7をノックダウンした系では優位な変化が得られなかった。ノックダウン後IFNalpha/be-taを添加するとコントロール、IRF-3ノックダウン、IRF-7ノックダウンの全ての系でIL-6の発現が増加した。これは細胞、上清ともに同様であった。一方TNFalphaはどの系においても大きな変化は見られなかった。OA患者由来の細胞においてはTNFalphaの発現は見られず、IL-6の発現は見られたがRA患者由来の細胞に比し有意に少ない量であった。このことからRA患者において、1型インターフェロンはIL-6の発現を介して炎症に寄与していることが示唆され、またその上流分子としてとくにIRF-3が関与している可能性が考えられた。また滑膜細胞と軟骨細胞ではほぼ同様の結果が見られたが軟骨細胞の方がよりノックダウンによるIL-6の発現量の変化が大きく出る傾向にあった。当初立案した計画通りの実験を概ね遂行できたと考える。別の系のOA患者

由来の細胞を対照群として同様の実験を行なったが、同様に1型インターフェロンはIL-6の発現を介して炎症に関与していること、またその上流分子の中ではとくにIRF-3の関与が大きいことが示唆される結果が得られた。この結果をもとに学会発表準備を進めたが、ターゲットとしていたアメリカリウマチ学会の抄録締切には間に合わず、次年度の同学会への投稿を目標とすることとした。またそれと平行して論文作成も進める予定である。実験については順調に経過したが、学会発表ならびに論文作成が遅れている。これは研究責任者である私が2018年4月に職場が変わった影響で実験頻度が低下し、実験の結果がそろったのが目標とする学会の期限に間に合わなかったことが大きい。次年度以降の研究計画は、当初立案した通り鍵を握る分子の絞り込みを予定している。候補となる分子はIFNalpha/be-taの上流分子である。ヒトcell lineまたはヒト滑膜・軟骨細胞を用いた実験系において、IFNalpha/be-taの上流分子でをノックダウンし、TNFalpha、ILー6などの炎症生サイトカインの発現に与える影響をみる。かつこれにIFNalpha/be-taを添加しレスキューされるかをみることを考えている。さらに今年度行った実験も含め各実験におけるnを増やすことと、ヒトcell lineを用いた実験系においては刺激後6h、24hにおける各分子発現の違いを検討する。またヒト由来サンプルを用いた実験ではIFNとIL-6との関連について掘り下げるため、カギとなる分子の候補を検討し、それらの添加、またはノックダウンを行いその結果について検討する。主にこれまでの研究結果を学会、雑誌等で発表するための準備・検討を行い、その過程で生じた細かい追実験を適宜行う予定。その後順次学会等で成果を発表していく。残っている標本を用いて、さらなる裏付けの実験を行う。具体的にはもう一度RA群とOA群の比較検討のため細胞に刺激を与えた後のIFNの推移をPCRやELISAを用いて調べる。さらにこれまで得られているデータに新規データを加えて、統計解析を行う。これまでの研究結果から最終的に得られた知見をまとめ、ターゲットとする学会での発表ならびに論文作成・投稿を行っていく予定である。実験に用いる試薬等の消耗品が、当初の予定より安く購入できた。また同じ研究室に所属する研究者が共同で使用できる試薬などを有効活用でき、結果として本研究資金から充当すべき費用が抑えられた。当初の実験計画で購入が必要と考えていた試薬が研究遂行の中で不要となり、その該当金額については今年度は使用しなかった。次年度に研究成果の発表のための旅費等に充当する予定。予定していた学会発表や論文作成ができず、それに当てる予定であった分が使用できず残ったため。次年度以降も今年度と同様またはそれ以上の実験を行う予定であり、試薬等の消耗品をより多く使用する予定である。また次年度は研究成果の一部を学会等で発表する予定であり参加費・旅費が必要となる。それらに充当する予定である。
感染・炎症における生体の恒常性維持に関する新概念の確立

平成19年4月20年3月までは、前年に引き続いて血管内皮増殖因子に対する自己抗体の研究を行った。健常者の血清中にVEGF-抗VEGF自己抗体複合体が存在していることを酸処理後、IgG精製することにより確認した。次に免疫複合体の解離条件の検討を行った。rVEGF-anti-VEGF mAb complexは、pH2.1-4.0で効率よく解離した。natural G-CSF-autoantibody complexはpH 2.1-3.0で解離し、解離効率はpH2.1が最大だった。alkali bufferは、複合体を解離させる力が弱かった。detergent(Urea, guanidine hydrochloride)は強力に結合を解離させるが、抗体が変性して結合力を失わせた。酸処理は、効率良く複合体を解離し抗体の結合力を保つが、ある低度の変性は起こる。我々の経験では、酸処理した抗体は数日静置すると凝集し、immunoblotを行うとbackgroundが高くなる。このため、酸処理の時間は出来るだけ短時間に留める必要があった。問題点は、強酸の処理(pH2.1)で、naturally present cytokine-autoantibody complexがどの程度解離するかが予測できないことである。以上の結果、自己抗体複合体が、解析した15例の健常者検体の全てより検出された。また、IVIGより精製した抗VEGF抗体の特異性は高く、リガンドとは、中等度の結合力(Kav:2.9nM)を示した。すでに特発性肺胞蛋白症の病因物質として患者の肺及び血液中に抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)中和自己抗体が大量に存在し、その定量法を報告した。さらに健常者の血清中にも微量の抗GM-CSF自己抗体がGM-CSFとの免疫複合体の形で存在していることを見出した。このようなサイトカイン自己抗体はTNF-α、interferon-γ、IL-10,IL-6などに対して健常者でも微量に認められる。我々は、健常者の血清中にはどのようなサイトカイン自己抗体が存在するか、またどのようにすれば効率よく検出するかを検討した。その結果、pH2.1-3.0で回収よく、抗原と抗体が解離することがわかり、さらにサイトカインをPVDF膜に転写することにより、immuno blot法により感度よく検出できることがわかった。サイトカイン自己抗体は、抗G-CSF,IL-2,IL-8,TNF-alpha,VEGF自己抗体は複合体の形で100%の人に存在、IL-4,6,10,IFN-gammaは個人差があり、抗IL-3,M-CSF,OPN自己抗体は誰にも検出されないという結果を得た。また、これらの抗体はサイトカインを特異的に認識することも確認できた。14人の健常者の血清、1ロットの免疫グロブリン製剤について酸処理-限外濾過処理法を行い、抗サイトカイン自己抗体の分布を調べたところ、抗G-CSF,IL-2,IL-8,TNF-alpha,VEGF自己抗体は複谷体の形で100%の人に存在、IL-4,6,10,IFN-gammaは個人差があり、抗IL-3,M-CSF,OPN自己抗体は誰にも検出されないという結果を得た。