hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規骨形成タンパク質(BMP-3b)の生体における生理作用及び作用機序の解明

1.申請者らが固定した新規骨形成タンパク質BMP-3bの機能解明を目的にリコンビナントタンパク質を調製を試みた。(1)リコンビナントタンパク質の精製従来の方法でのリコンビナントタンパク質の取得では、発現量とプロセシング効率が悪く(8lの培養上清から50μg)、実用的な実験検討が困難であったので、新たな調製方法を検討した。その結果、同族のBMP-2のプロ体とBMP-3bの成熟体部分を結合させ、さらに、プロセス部位直後にFLAGを結合したキメラタンパク質をコードする発現ベクターが最適であった。このベクターをCHO細胞にトランスフェクションし、血清含有培地にてリコンビナントタンパク質を分泌させると、極めて効率的にしかも容易にリコンビナントタンパク質が得られた(8lの培養上清から0.8mg)。(2)リコンビナントタンパク質の確認リコンビナントタンパク質100ngをウエスタンブロッティングにて検出したところ、予想通り、13kDの大きさのBMP-3bであることを確認した。また、ブロットしたタンパク質のN末端配列解析からも、予想された位置でプロセシングされたBMP-3bであることを確認した。2.初代骨芽細胞培養系におけるBMP-3b遺伝子の発現調節の検討を行ったところ、以下のような結果を得た。(1) BMP-3b遺伝子の発現は、株化している骨芽細胞様細胞では検出できなかったが、分化状態を維持している初代培養骨芽細胞においては、多量に発現していることを確認した。(2) BMP-3b遺伝子の発現量は、初代培養骨芽細胞の長期培養による分化の進行状態(アルカリカリフォスファターゼ活性の増加及び石灰化を伴う)に応じて、顕著に増加した。(3)また、BMP-3b遺伝子は、初代培養骨芽細胞をBMP-2(骨形成促進因子)で刺激することにより(アルカリカリフォスファターゼ活性及び石灰化が亢進する)、その発現量が約7倍に増加した。(4)一方、増殖因子であるTGF-β1での刺激により(アルカリフォスファターゼ活性及び石灰化が強力に抑制される)、BMP-3b遺伝子発現は、迅速かつほぼ完全に抑制された。以上の結果より、BMP-3bは、高度に分化した骨芽細胞において、重要な機能を有するタンパク質であることが示唆された。1.申請者らが同定した新規骨形成タンパク質BMP-3bの機能解明を目的に、リコンビナントタンパク質を調製を試みた。(1)リコンビナントタンパク質の精製リコンビナントタンパク質をCHO細胞の8リットルの培養上清よりヘパリンセファロース、ConAセファロースにて精製を行った。成熟タンパク質ダイマーには糖付加されておらずConAセファロースには結合しなかった。ConAセファロースに結合するBMP-3bは前駆体タンパク質(前駆体部分に糖付加)と成熟タンパク質とのヘテロダイマーであったので、この前駆体BMP-3bを成熟体にするため、トリプシンにより消化を行った。この精製により最終的に成熟タンパク質として50マイクログラムを得た。2.リコンビナント標品を用いてBMP-3bのin vitroでの生理活性を検討した。(1)1.で調製したリコンビナントタンパク質を用いて各種動物細胞におけるBMP-3bの作用を検討した。細胞として骨芽細胞系,上皮細胞系,繊維芽細胞系併せて6種類の細胞にて検討した。その結果、骨芽細胞系細胞においてその増殖に変化させる活性を示した。3.初代骨芽細胞培養系におけるBMP-3b遺伝子の発現調節の検討を行った。(1)BMP-3bの遺伝子発現調節を培養細胞系で検討するにあたって、細胞レベルで発現の多い、骨組織,血管,小脳の各種株化および初代培養細胞におけるBMP-3b遺伝子の発現を検討した。その結果、初代頭蓋骨由来骨芽細胞でのみ、その発現が確認できた。その他の株化培養細胞系では、ノーザンブロッティングでの検出感度以下の発現量であった。このことから、本遺伝子は組織レベルあるいは初代培養細胞レベルといった分化レベルの極めて高い状態でのみ発現しており、各細胞の分化の維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。(2)分化,増殖に強く関わっていることが知られている因子の初代骨芽細胞系におけるBMP-3b遺伝子の変化を検討した。本細胞系で増殖促進作用のある、TGF-beta,PDGF,FOSは顕著にBMP-3b遺伝子の発現を抑制した。この因子はいずれも本細胞の骨芽細胞マ-カであるアルカリフォスファターゼ活性を抑制していた。以上のことより、BMP-3b遺伝子は分化状態から増殖状態へ移行するとその発現が抑制されることが明らかになった。この結果は、3-(1)の結果と一致するものである。今後は上記細胞において、様々な活性測定系で検討しBMP-3bの生理作用を明らかにすると共に、本遺伝子の発現調節をプロモーター活性を測定することにより詳細に検討し、その発現調節機構解明に取り組んで行く予定である。

このベクターをCHO細胞にトランスフェクションし、血清含有培地にてリコンビナントタンパク質を分泌させると、極めて効率的にしかも容易にリコンビナントタンパク質が得られた(8lの培養上清から0.8mg)。(2)リコンビナントタンパク質の確認リコンビナントタンパク質100ngをウエスタンブロッティングにて検出したところ、予想通り、13kDの大きさのBMP-3bであることを確認した。また、ブロットしたタンパク質のN末端配列解析からも、予想された位置でプロセシングされたBMP-3bであることを確認した。2.初代骨芽細胞培養系におけるBMP-3b遺伝子の発現調節の検討を行ったところ、以下のような結果を得た。(1) BMP-3b遺伝子の発現は、株化している骨芽細胞様細胞では検出できなかったが、分化状態を維持している初代培養骨芽細胞においては、多量に発現していることを確認した。(2) BMP-3b遺伝子の発現量は、初代培養骨芽細胞の長期培養による分化の進行状態(アルカリカリフォスファターゼ活性の増加及び石灰化を伴う)に応じて、顕著に増加した。(3)また、BMP-3b遺伝子は、初代培養骨芽細胞をBMP-2(骨形成促進因子)で刺激することにより(アルカリカリフォスファターゼ活性及び石灰化が亢進する)、その発現量が約7倍に増加した。(4)一方、増殖因子であるTGF-β1での刺激により(アルカリフォスファターゼ活性及び石灰化が強力に抑制される)、BMP-3b遺伝子発現は、迅速かつほぼ完全に抑制された。以上の結果より、BMP-3bは、高度に分化した骨芽細胞において、重要な機能を有するタンパク質であることが示唆された。
免疫抑制剤服用小児における歯肉増殖症の発症メカニズムの解明と予防プロトコルの確立

同意の得られた4-12歳の被験者(CsA-G群:シクロスポリンを服用し歯肉増殖を有する者、CON-NG群:薬物を服用しておらず歯肉増殖のみられない者)のプラークを採取し、7種の口腔常在菌のプライマーを用いてPCR法にて細菌の検索を行った。また、同サンプルを患者向け細菌検査(GC Corp.)に解析を依頼し、結果を比較した。ラボでのPCRでは7サンプル全てで歯周病菌が検出されたが、患者向け細菌検査では1サンプルのみで歯周病菌が検出された。ラボでのPCRで歯周病菌が検出されても、歯周病の病態を把握するレベルではないことが、結果が異なった理由と考える。今後は被験者数を増やし、シクロスポリン服用の有無、歯肉増殖の有無での口腔細菌層の違いを比較し、副作用の発症と細菌との関連性を解明したい。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が、期間内に予定数に達していない。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が予定数に達していない為、関連歯科医院施設として国立成育医療研究センターに研究協力を依頼し、倫理委員会の承諾を得た。免疫抑制剤であるシクロスポリンは、臓器移植における拒絶反応の抑制やネフローゼ症候群の治療で投与され、治療効果が高い反面、その副作用に悩まされるケースが多い。本研究は、シクロスポリンを服用する小児において、その副作用である薬物性歯肉増殖症の発症メカニズムを解明するため、対象となる患者のプラーク細菌を微生物学的に解析することとした。そのため、小児被験者から採取したプラーク細菌を同定する方法を確立することを目的とし、研究を行った。本研究では、小児被験者から採取したプラーク細菌を、PCRにより同定する方法を確立できた。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が期間内に予定数に達していない。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が期間内に予定数に達していないため、関連歯科医院の施設を増やすことで、被験者数を増やし、シクロスポリン服用の有無、歯肉増殖の有無での口腔細菌層の違いを比較し、副作用の発症と細菌との関連性を解明したい。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が期間内に予定数に達さなかった。次年度は被験者を増やし、微生物学的解析と病理学的解析の試薬、免疫抗体等に使用する。口腔サンプルの採取と臨床検査データの収集が期間内に予定数に達さなかった為、次年度は関連歯科施設を増やし、微生物学的解析と病理学的解析の試薬等に使用する。
在地生業創成による社会的弱者層支援と資源・生態系保全の両立に向けた実践的地域支援

本研究は、ベトナム中部をフィールドに、山岳少数民族の世帯とともに、在来資源の活用による生業多様化を通じて、生計の向上と生態環境の保全の両方を図る在地生業の形成を目的とした。消滅の危機に瀕しているミニブタ在来種やアフリカ原産の家禽ホロホロ鳥の現地に適合した飼養モデルを開発し、普及段階に入った。アカシア造林地での小規模養蜂の活性化、山野草の栽培化、草木染め、内水面養殖の改良可能性の検討を行った。本研究は、対象地域の在来資源や在来技術の活用による生業多様化を通じて、生計の向上を図り同時に生態環境の保全をねらうものである。特に、貧困地域であるベトナム中部をフィールドに、社会的弱者層(山岳少数民族、小規模農民、経済的貧困者など)により実施可能な技術論や生業の創成を目指す。平成24年度の取り組みとその成果は、以下のとおりである。1)在来ミニブタ飼養モデル:ホンチャ県ホンティエン・コミューンの協力農家とともに、在来ミニブタ(22頭)の生産圃場の運営を始めた。現地で入手可能な飼料と囲い込み放牧形態の飼養法の効果を確認しつつ、運営資金確保のための生産・販売と遺伝資源の保全の両立を果たしている。付近の住民、近隣農村および買い取り業者の関心が高い。2)ホロホロ鳥飼養モデル:ホンチャ県ホンティエン・コミューンの協力農家とアルーイ県ホンラム・コミューンのフエ農林大学山間部演習施設内で、現地の飼料とネット囲いを用いたホロホロ鳥の飼養を行なった。アフリカ原産の家禽で放し飼いを基本とするが、居住地や農地(菜園)が密に分布している状況や小規模農民の屋敷地では、このような集約的な飼養方が適している。鶏の致死率の高い疾病にり患せず、現地飼料を食し、食肉は比較的高値で取引される。有精卵の有償頒布による普及が始まった。3)小規模養蜂:広大なアカシア造林地が広がり、農薬散布をする果樹園がないベトナム中部は、養蜂の潜在的適地である。フエ市への販路形成とともに、小規模養蜂の技術適用と担い手育成を進めている。4)萌芽的な在地生業の創成:山野草(クレソン、シダ類など)の栽培化、草木染め、野生蜜蜂の粗放的養蜂、内水面養殖の改良可能性の検討を進めている。5)フエ大学名誉教授号:本研究のみの成果ではないが、平成25年4月にフエ大学名誉教授号を受けた。最終年となる平成25年度の取り組みとその成果は、以下のとおりである。1)在来ミニブタ飼養モデル:ホンチャ県ホンティエン・コミューンの協力農家とともに、在来ミニブタの生産圃場の運営を始めた(常時20頭前後の頭数を維持しつつ、剰余分を頒布)。近隣農村および買い取り業者の関心が高い。フエ市への販路形成とともに、小規模養蜂の技術適用と担い手育成を進めた。4)萌芽的な在地生業の創成:山野草(クレソン、シダ類など)の栽培化、草木染め、野生蜜蜂の粗放的養蜂、内水面養殖の改良可能性の検討を進めた。特に、貧困地域であるベトナム中部をフィールドに、社会的弱者層(山岳少数民族、小規模農民、経済的貧困者など)により実施可能な技術論や生業の創成を意識する。

平成23年度の取り組みとその成果は、以下のとおりである。1)関連基礎情報の収集、調査対象地域および実証試験地の設定:ベトナム中部トゥアティエンフエ省のホンチャ県とアルーイ県を主な対象地域とし、地域住民の参加を得て、幾つかの実証試験サイトを設営した。連携機関であるフエ農林大学から所蔵する電子地図や衛星画像、統計資料などの提供を受けた。2)ミニブタ在来種に関するフィールド調査:調査対象地域では、在来種がほぼ消滅し、ラオス国境を越えて運ばれるミニブタを飼養するケースがほとんどであることが分かった。口蹄疫汚染国であるラオスからの在来種の移入やその研究は、法令に抵触する恐れがあるので断念した。一方、国内のカンナム省やクアンガイ省にはミニブタ在来種が残っており、後述する飼養トライアルではこれらの地域からのミニブタを使うこととした。3)研究成果の社会実装:生業多様化支援に関する学術成果(在来ミニブタの飼養、ホロホロ鳥の飼養、アカシア林での養蜂、山間部での温帯作物栽培、森林に自生する野草の栽培化など)を研究代表者らがフエ農林大学とともに提案し採択されたJICA草の根パートナー型技術協力事業「ベトナム中部・自然災害常襲地のコミュニティと災害弱者層への総合的支援(平成22年10月平成25年9月)」に取り込んだ。共同研究機関であるフエ農林大学の協力により、在来種を用いたミニブタ飼養、ホロホロ鳥飼養、養蜂など放牧性小家畜を組み込んだ複合的生業モデルの形成に関する実証試験は順調に進展している。得られた成果は、JICA草の根パートナー型技術協力事業「ベトナム中部・自然災害常襲地のコミュニティと災害弱者層への総合的支援(平成22年10月平成25年9月)」に素早く取り込み、地域住民の暮らしに資することを意識した。応用実践(開発・実証と普及)に重きを置きつつも、関連投稿論文数4件、口頭発表(特別セミナー)1件を得たことから、研究は概ね順調に進展していると考えられる。共同研究機関であるフエ農林大学の協力により、対象地域と実証試験を行なう村落の設定や実施体制、安全対策が十分に整った。口蹄疫汚染国であるラオスに隣接する地域であるため、ミニブタ在来種の分布に関するフィールド調査や遺伝資源保全のための飼養トライアルを今一度見直す必要に迫られている。一方で、国内他省に現存する在来種を用いたミニブタ飼養、ホロホロ鳥飼養、養蜂など放牧性小家畜を組み込んだ複合的生業モデルの形成に関する実証試験は順調に進展している。平成25年度(最終年度)は、開発・実証が進んでいる新規の在地生業(ミニブタ飼養、ホロホロ鳥飼養、養蜂)を地域住民に普及する仕組みを整える他、現地の教育研究機関、行政府および援助団体への技術情報の提供を進める。萌芽的な在地生業および技術要素(クレソンやシダ類など山野草の栽培化、草木染め、内水面養殖の改良、木酢液の製造と養豚における成長ホルモン・抗生物質の多投の抑制、野生蜜蜂の粗放的養蜂)に関する実証的調査を進め、適宜、従来の生業システムへの織り込みを試みる。挑戦的萌芽研究における一連の成果や経験を、他機関による援助案件や他研究者との共同研究(新規提案を含む)、研究代表者による別研究(基盤A)に積極的にフィードバックする。生業多様化支援に関する学術成果(在来ミニブタの飼養、ホロホロ鳥の飼養、アカシア林での養蜂、山間部での温帯作物栽培、森林に自生する野草の栽培化など)をJICA草の根パートナー型技術協力事業「ベトナム中部・自然災害常襲地のコミュニティと災害弱者層への総合的支援(平成22年10月平成25年9月)」に適宜取り込むようにする。並行して、これらの応用実践の事例を用いて、地域住民が新たな取り組みを受容し継承するための要件を探る研究へと展開する。
代数的推論に基づく算術から代数への移行過程に関する記号論的研究

本研究の目的は,代数的推論と記号論の観点から小学校算数の数と計算領域にかかわる内容の教材開発及びその実験授業を行うことをとおして,小学校算数から中学校数学への移行過程について,特に数と計算・式の領域に関する移行過程について明らかにすることである。その結果,次のような成果を得た。(1)図式的推論の観点から代数的推論をとらえ直したこと,(2)第2学年の教材開発及び実験授業によって児童の代数的推論の様相や統語論的認識から意味論的認識への移行の様相を明らかにしたこと,(3)第3学年の教材開発及び実験授業によって児童の乗法と除法の相互関係の認識の様相を明らかにしたこと。本研究は,小学校算数における数と計算領域から中学校数学における数と式領域への移行過程を,代数的推論の観点から明らかにすることを目的としてる。特に,小学校低・中学年段階において代数的推論を促進することに焦点化している。25年度は,小学校第2学年における「加法と減法の相互関係」の単元に関する教材開発と実験授業を行うことを計画した。その結果,代数的推論を観点として開発した教材の有効性を確かめることができた。具体的には,代数的推論によって児童の式の見方が高まることが明らかになった。代数的推論については,はじめに,児童は具体に基づく代数的推論によって新しく学ぶテープ図の規約性を協定化し,加法と減法の反義性を認識した。次に,いわゆる逆思考の問題を学ぶ中で,異なる見方から導かれる式の違いによって児童は葛藤を生じたが,抽象に基づく代数的推論と具体に基づくものとの相互作用によってその葛藤を解消し,加法と減法の同義性を認識した。また,このような代数的推論の様相から,式に対する語用論的認識から意味論的認識の様相も明らかになった。式も言語であるから,式をその運用の中で認識している語用論的認識と,その意味を認識している意味論的認識があり,その移行の様相は次のようである。最初の語用論的認識は,問題の状況の中にいる「私(児童)」が,その答えを求めるための道具として式を用いている状態である。そして,この単元のはじめに図的表現によって視覚的に反義性が認識される。しかし,逆思考の問題を考えることによって,式の見方の多義性が認識され,それらの見方から求答式と関係式が導かれる。これらの式は,同じ問題から導かれたものであるから同じ意味を有しているはずなので,それらの式及びそれぞれの式の見方の関係性について考えることで代数的推論が働いて,それらの式の理解が深まり,式の同義性が認識される。24年度は,本研究の初年度ということから,代数的推論や記号論に関する文献の収集及びこれまでの授業データを整理し,それら収集・整理した資料の分析・考察を行うことを計画した。その結果,代数的推論に関しては,操作的表現や図的表現などの「具体に基づいた代数的推論」と数や演算の性質などの「抽象に基づいた代数的推論」があり,小学校段階では抽象に基づいたものから推論させると困難であり,具体に基づいた代数的推論をいかに活用していくかが重要であることを明らかにした。また,代数的推論を図式的推論(diagrammatic reasoning)の観点からみてみると,代数的推論は図式的推論とみなすことができる。したがって,その前提となっている表現の「構成規則」と「操作規則」に従って推論が進行することになる。この観点から,操作的表現と図的表現に基づく推論に関しては,その表現の規約性が重要になるが,本来,これらの表現は無規約的なものである。そのため,これらの表現における規約性とは何か,それをどのように付与させるか,ということが重要となる。さらに,以上の考察をふまえ,小学校第二学年の「加法と減法の相互関係」の単元について,代数的推論を促進させる授業構想案を検討した。26年度は,第3学年に関する実験授業を実施し,それと第2学年実験授業のデータを分析・考察し,研究全体を総合的に考察することを計画した。まず,第3学年におけるわり算の単元で,乗法と除法の相互関係を認識するような教材を開発し,それを用いて実験授業を行った。その結果,乗法と除法の相互関係については,単元をとおして「1つ分」を基にその関係を認識できていた。

これは,この段階から数直線図を用いた効果が現れたと考える。しかし,等分除と乗法との関係は,「見る方向」が「逆」であると認識しており,包含除と乗法との関係は,「操作」が「逆」であると認識していた。また,等分除と包含除の相互関係の認識にも深化がみられた。具体的には,数直線図と関連づけたことと乗除の逆思考の問題を取り上げたことによって,等分除と包含除は違うけど同じ図になるという認識や,求める場所が違っても図が同じという認識,式は同じだけど分け方が違うという認識などがみられた。そして,この授業のデータと第2学年の授業(加法と減法の相互関係)のデータとを総合的に考えると,代数的推論の様相と式の見方に関する様相とに共通点はもちろんみられたが,相違点もみられた。相違点がみられた要因は,発達段階的なものかもしれないが,加減と乗除という構造の違いによるものとみなすことができるので,今後,そのような構造の違いについての考察も必要となるであろう。数学教育学交付申請書に記載した25年度の研究実施計画と照らし合わせると,本年度はほぼその計画通りに進めることができた。ただし,小学校第二学年の乗法に関する実験授業は実施しなかった。昨年度のカリキュラムの検討に若干の遅れがあり,場合によってはこの実験授業を行わないことを視野に入れて進めていくこととしていたので,そのように判断した。しかし,それ以外では順調に研究が進展していると判断できるため,「おおむね順調に進展している」と評価できる。交付申請書に記載した24年度の研究実施計画と照らし合わせると,本年度はほぼその計画通りに進めることができた。ただし,小学校低・中学年の数と計算領域のカリキュラムの検討に関しては,低学年(第二学年)の一部の検討だけにとどまっており,第二学年の乗法の導入場面や中学年(具体的には第三学年)の乗法と除法の相互関係の検討には至らなかった。本研究の今後の推進については,25年度の研究実施計画がおおむね順調に進展していることから,当初の26年度の研究実施計画に従っていきたい。本研究の今後の推進については,24年度の研究実施計画が順調に進展していることから,当初の25年度の研究実施計画に従っていきたい。ただし,カリキュラムの検討に関して若干の遅れがあるため,場合によっては,第二学年の乗法の導入に関しては実験授業を行わないことを視野に入れて進めていく。該当なし
生体高分子分析をめざす高分解能多重周回タイプ飛行時間型質量分析計の開発

13年度は生体高分子の検出に先立ち、多重周回型飛行時間質量分析計の第2号機の開発に取り組んだ。実施した主な内容は、トロイダル電場用電源の整備、電子イオン化法によるイオン源の取り付けとイオンビームの引き出し確認、イオン検出器の性能試験等である。またイオンの周回を制御する電子機器の整備も行った。その結果イオンの周回は200回以上が安定して得られることが確認できた。このことにより第1号機で多数の4重極レンズを用いた光学系でえられた軌道安定性がわずかトロイダル電場4個で構成する第2号機でも達成できることを理論だけでなく実験的にも証明することができた。またそれに伴う質量分解能はCO-N2ダブレットを用いて30,000が確認できた。この分解能は比較的安定してえられており、再現性も確認している。またこの値は当面目標としている生体高分子の測定にも十分な値である。14年度は生体高分子用イオン源の導入を行った。ESIイオン源は既存の磁場型装置でのテストを行い、正常にイオンが発生していることを確認した。しかし飛行時間型装置との結合は専用のイオンストレージ装置を必要とするため、イオンストレージ装置の開発とともに今後の課題となった。その一環としてイオントラップ装置の開発もおこなった。一方、MALDIイオン源は比較的簡単に結合できるため、まず、この研究を重点的に行った。まずMALDIイオン源を製作し、イオンが得られることを確認した。イオン源は市販のFABイオン源を改造したものであり、やや操作性の難があったが、マトリックスを工夫することにより安定したイオン化が可能となった。その結果、アンジオテンシン等のアミノ酸のイオン化と質量分析に成功した。質量分解能20,000以上が得られており、市販の大型装置と同等以上の性能が小型多重周回タイプ飛行時間型質量分析計装置で得られることを実証できた。今年度は生体高分子の検出に先立ち、多重周回型飛行時間質量分析計の第2号機の開発に取り組んだ。それは昨年度までに装置本体(真空装置、分析電場、イオンミラー等)はすでに製作済みであったが、イオンビームを用いた性能確認の段階までは達していなかったためである。またそれに伴う質量分解能はC0-N2ダブレットを用いて30,000が確認できた。本装置はイオンミラーも備えているが、ミラー用電源の整備も行いミラーの性能確認も行った。以上の結果、当初期待していたイオン光学的性能の確認は終了できた。ただ今年度イオン検出器の飽和による安定同位体比測定の精度悪化を見出したが、これは今後の研究に重大な影響があると考え、検出器の性能確認を急速計画することとし、当初予定していた生体高分子用イオン源の導入は来年度以降とすることとした。現在このイオン検出器の問題に取り組んでいる。

実施した主な内容は、トロイダル電場用電源の整備、電子イオン化法によるイオン源の取り付けとイオンビームの引き出し確認、イオン検出器の性能試験等である。またイオンの周回を制御する電子機器の整備も行った。その結果イオンの周回は200回以上が安定して得られることが確認できた。このことにより第1号機で多数の4重極レンズを用いた光学系でえられた軌道安定性がわずかトロイダル電場4個で構成する第2号機でも達成できることを理論だけでなく実験的にも証明することができた。またそれに伴う質量分解能はCO-N2ダブレットを用いて30,000が確認できた。この分解能は比較的安定してえられており、再現性も確認している。またこの値は当面目標としている生体高分子の測定にも十分な値である。14年度は生体高分子用イオン源の導入を行った。ESIイオン源は既存の磁場型装置でのテストを行い、正常にイオンが発生していることを確認した。しかし飛行時間型装置との結合は専用のイオンストレージ装置を必要とするため、イオンストレージ装置の開発とともに今後の課題となった。一方、MALDIイオン源は比較的簡単に結合できるため、まず、この研究を重点的に行った。その結果、アンジオテンシン等のアミノ酸のイオン化と質量分析に成功した。質量分解能20,000以上が得られており、市販の大型装置と同等以上の性能が小型多重周回タイプ飛行時間型質量分析計装置で得られることを実証できた。尚、この成果は投稿準備中である。
金属-金属結合を有する有機金属化合物の合成とその結合の性質

1315族同種金属インターエレメント結合を有する)化合物の効率的な合成法の開発、およびそのインターエレメント結合の本質の解明とその結合を有する化合物の反応性を究明することを目的とする研究を行った。種々フェニルスズ化合物以外のアリールスズ(Ar_3SnX)1、フェニルゲルマニウム(Ph_3GcX)2、アリールアンチモン(Ar_2SbX)_3などの有機典型金属化合物を用いる同種インターエレメント化合物の簡便な合成法を検討した。アルカリ(土類)金属(Wurtz coupling)や金属ヒドリドを用いない簡便な還元的ホモカップリング法としての電解反応を検討した。その結果、ヘキサトリルジスタンナン(Tol_3SnSnTol_3)4、ヘキサフェニルジゲルマン(Ph_3GeGcPh_3)5、テトラアリールジスチビン(Ar_2SbSbAr_2,N=Ph,Tol)6が、それぞれX=OAc,SArの対応する原料1,2,3を用いた時、比較的収率良く得られることが解った。電解反応で、この種の有機金属化合物がカップリングすることは、電気化学的分析によって1960年代にすでに知られていたが、それらは電気によって促進される一種のWurtz couplingであり、そこでは水銀、カドミウムなどの陽極金属は消費された。また最近でも、マグネシウム電極、銀電極を用いるカップリング反応が報告されている。これらも同様に、一種のWurtz couplingである。これに対して、本研究は配位子Xの陽極酸化の対反応としての陰極での還元的カップリング反応と言う観点で従来の電解カップリング反応とは趣を異にするものである。
分子オーダーの流体潤滑膜のレイアレング現象に関する研究

本研究は,分子オーダーの流体潤滑膜におけるレイアリング現象について,その発生の要因を実験と理論との両面から解明することを目的に実施されたものである.通常,流体潤滑膜といえば流体の粘性力が支配的であり,レイノルズ方程式を解いて求められる圧力は,この流体粘性力に対抗する力である.ところが,2面間の距離が小さくなり,数ナノメータ或いはそれ以下になると,固体表面間に働くvan der waals力および溶媒和力の影響が無視できなくなる.van der waals力は2面間の距離が近づくと指数関数的に増加する引力であり,表面が平面,球面,円筒面などの様々な形状の場合には詳細に研究されている.一方で,溶媒和力は2面間に存在する流体分子の密度に依存する力であり,斥力と引力とを繰り返す周期的な力である.この周期はほぼ流体分子の大きさであり,表面距離の減少とともに振幅は指数関数的に増加する.ここでは,このレイアリング減少が微小な機械要素のしゅう動にどのような影響を与えるのかについて明らかにし,超薄膜流体潤滑現象の実現への寄与について,明確にすることを主目的として実施された.その結果,以下のことが明かになった.1)膜厚が液体分子直径の10倍以下程度になると従来の理論からずれ始め,膜厚の離散化が起こる.2)膜厚の離散化はほぼ介在液体分子直径の間隔,または構造力の周期と同じ間隔で起こる.3)構造力は滑りがある場合でも静的な場合とほぼ同じ大きさを示す.4)構造力は滑り速度に依存しない.5)ノルマルヘキサデカンでは膜厚の離散化は観察されない.本研究結果が分子オーダーの流体潤滑膜のレイアリング現象の解明に大いに貢献するものと確信する.本研究は,分子オーダーの流体潤滑膜におけるレイアリング現象について,その発生の要因を実験と理論との両面から解明することを目的に実施されたものである.通常,流体潤滑膜といえば流体の粘性力が支配的であり,レイノルズ方程式を解いて求められる圧力は,この流体粘性力に対抗する力である.ところが,2面間の距離が小さくなり,数ナノメータ或いはそれ以下になると,固体表面間に働くvan der waals力および溶媒和力の影響が無視できなくなる.van der waals力は2面間の距離が近づくと指数関数的に増加する引力であり,表面が平面,球面,円筒面などの様々な形状の場合には詳細に研究されている.一方で,溶媒和力は2面間に存在する流体分子の密度に依存する力であり,斥力と引力とを繰り返す周期的な力である.この周期はほぼ流体分子の大きさであり,表面距離の減少とともに振幅は指数関数的に増加する.ここでは,このレイアリング減少が微小な機械要素のしゅう動にどのような影響を与えるのかについて明らかにし,超薄膜流体潤滑現象の実現への寄与について,明確にすることを主目的として実施された.その結果,以下のことが明かになった.1)膜厚が液体分子直径の10倍以下程度になると従来の理論からずれ始め,膜厚の離散化が起こる.2)膜厚の離散化はほぼ介在液体分子直径の間隔,または構造力の周期と同じ間隔で起こる.3)構造力は滑りがある場合でも静的な場合とほぼ同じ大きさを示す.4)構造力は滑り速度に依存しない.5)ノルマルヘキサデカンでは膜厚の離散化は観察されない.本研究結果が分子オーダーの流体潤滑膜のレイアリング現象の解明に大いに貢献するものと確信する.通常,流体潤滑膜といえば流体粘性力が支配的であり,レイノルズ方程式を解いて求められる圧力はこの流体粘性力に対抗する力である.ところが,2面間距離が小さくなり,数ナノメータあるいはそれ以下になると固体表面間に働くvan der Waals力および溶媒和力の影響が無視できなくなる.van der Waals力は2面間距離が近づくと指数関数的に増加する引力であり,表面が平面,球面,円筒面などの様々な形状の場合に詳しく研究されている.一方,溶媒和力は二面間に存在する流体分子の密度に依存する力であり,斥力と引力とを繰り返す周期的な力である.周期はほぼ流体分子の大きさであり,表面距離の減少とともに振幅は指数関数的に増加する.さて,マイクロマシン,磁気ディスクシステムなど微小・繊細な機械要素が製造されてこのような現象は主として溶媒和力の影響で,流体分子が層状に整列するためであろうといわれているが,詳しいことは分かっていない.本研究ではこのような,分子オーダーの流体潤滑膜のレイアリング現象に着目して,その発生要因を実験的に明らかにすることを目的とする本年度はこのような目的の遂行のため,実験装置の設計製作を行った.微小なすべり速度で2面をしゅう動させ,この時の変位を高精度にて測定できる装置とした.本研究は,分子オーダーの流体潤滑膜におけるレイアリング現象につい,その発生の要因を実験と理論との両面から解明することを目的に実施されたものである.通常,流体潤滑膜といえば流体の粘性力が支配的でありねレイノルズ方程式を解いて求められる圧力は,この流体粘性力に対抗する力である.ところが,2面間の距離が小さくなり,数ナノメータ或いはそれ以下になると,固体表面間に働くvan der Waals力および溶媒和力の影響が無視できなくなる.

van der Waals力は2面間の距離が近づくと指数関数的に増加する引力であり,表面が平面,球面,円筒面などの様々な形状の場合には詳細に研究されている.一方で,溶媒和力は2面間に存在する流体分子の密度に依存する力であり,斥力と引力とを繰り返す周期的な力である.この周期はほぼ流体分子の大きさであり,表面距離の減少とともに振幅は指数関数的に増加する.ここでは,このレイアリング現象が微小な機械要素のしゅう動にどのような影響を与えるのかについて明らかにし,超薄膜流体潤滑現象の実現への寄与について,明確にすることを主目的として実施された.その結果,以下のことが明かになった.1)膜厚が液体分子直径の10倍以下程度になると従来の理論からずれ始め,膜厚の離散化が起こる.2)膜厚の離散化はほぼ介在液体分子直径の間隔,または構造力の周期と同じ間隔で起こる.3)構造力は滑りがある場合でも静的な場合とほぼ同じ大きさを示す.4)構造力は滑り速度に依存しない.5)ノルマルヘキサデカンでは膜厚の離散化は観察されない.本研究結果が分子オーダーの流体潤滑膜のレイアリング現象の解明に大いに貢献するものと確信する.
加温抗癌剤を用いた革新的な肝動脈化学塞栓術の開発

本研究の目的は加温した抗癌剤を用いて肝動脈化学塞栓療法(以下、TACE;transeーcatheter arterial chemoembolization)を行うことにより、既存のTACEよりも著しく高い抗腫瘍効果を得ることである。加温した抗癌剤(シスプラチン)を用いたTACEの方法の確立ならびに安全性と抗腫瘍効果を明らかにすることを目標としている。前年度に引き続き正常ウサギを用いた動物実験を行いその後VX2ウサギを用いた動物実験を行った。前年度の実験において正常ウサギに対して加温抗癌剤を用いたTACEを行い、それぞれ肝内組織の温度測定を行ったがいずれの群においても肝内組織の温度上昇は見られなかった。この原因は加温抗癌剤がカテーテル通過中に温度が低下する事と、抗癌剤の組織内停滞時間が短いためと考えた。これらを克服するために、脂溶性造影剤であるリピオドールを常温25°C、35°C、45°Cの3種類の温度に設定し、加温抗癌剤と混合した上で正常ウサギに対してTACEを行い、肝内組織の温度測定を行ったところ、肝内組織の温度上昇を認めた。従って抗癌剤の温度低下を防ぐためには加温したリピオドールと混合することが重要であることが判明した。引き続きウサギVX2肝腫瘍モデルを用いた実験を行い上記3種類の温度に加温した抗癌剤とリピオドールの混合液を用いてTACEを行ったところ、常温群よりも45°C群において抗腫瘍効果が高い傾向が得られた。また、いずれの群においても重篤な肝機能障害は認めなかった。本研究により加温抗癌剤を投与するためのシステムに関してある一定の成果は得られたものの、抗腫瘍効果に有意な差を得るにはいたらずまだまだ改善の予知があると思われた。今回は時間と予算の関係で断念したが、保温性の高いカテーテルを開発することができれば更なる良好な結果が得られるようになるのではないかと考えている。本研究の目的は、加温した抗癌剤を用いて肝動脈化学塞栓療法(以下、TACE; trancecatheter arterial chemoembolization)を行うことにより、既存のTACEよりも著しく高い抗腫瘍効果を得ることである。本研究期間内において、加温した抗癌剤を用いたTACEの方法の確立ならびに安全性と抗腫瘍効果を明らかにすることを目標としている。研究実施計画書に示した通り、平成28年度の目標は、加温抗癌剤の温度を低下させることなく腫瘍内に投与するシステムの確立を行うことであった。以下、研究成果について述べる。抗癌剤としては、肝細胞癌に対するTACEとして保険適応のあるシスプラチンを選択した。湯煎器を用いて、設定した数種類の温度にシスプラチンを加温し、シスプラチンの実際の温度を測定後、TACEで実際に使用しているマイクロカテーテルより注入した。カテーテルから流出されたシスプラチンの温度を測定し、カテーテル通過前後の温度差を確認することで、温度低下の程度を検討した。結果としては、温度低下はシスプラチンの注入前の温度と注入時間に依存していた。注入前の温度が高く、注入時間が長いほど温度低下の程度が大きかった。TACEの抗癌剤注入時間は、時に10分以上かかる場合もある。従って、加温抗癌剤の温度を保持するためには、投与温度を高く設定した方が良く、保温性のあるカテーテルを使用した方が良いとの結論に達した。引き続き、正常ウサギによる動物実験を開始したところであるが、まだ十分なデータを得るまでには至っていない。予定通りにカテーテル注入による温度低下の程度を理解するための実験は終了し、動物実験を開始し始めたところである。当初の予定では、平成28年度中に正常ウサギによる動物実験の大部分を終えている予定であったので、計画よりはやや遅れている。本研究の目的は、加温した抗癌剤を用いて肝動脈化学塞栓療法(以下、TACE; transe-catheterarterialchemoembolization)を行うことにより、既存のTACEよりも著しく高い抗腫瘍効果を得ることである。研究実施計画書に示した通り、平成29年度の目標は、正常ウサギによる動物実験により、加温抗癌剤を用いたTACEの安全性の評価と至適投与温度の決定を行うことであった。また、正常ウサギを用いた動物実験終了後には、ウサギVX2肝腫瘍モデルを用いた動物実験により、加温抗癌剤を用いたTACEの抗腫瘍効果と安全性を評価する予定であった。研究成果:正常ウサギ実験を行うにあたり、加温抗癌剤の温度として、常温(25°C)、35°C、45°Cの3種類を設定した。従来の研究によると、腫瘍を42.5°C以上に加熱すると、腫瘍細胞が傷害され、癌細胞生存率が著しく低下すると言われている。我々の以前の実験により、加温抗癌剤はカテーテル通過後に数°C程度温度低下することが判明したため、腫瘍到達時の加温合剤温度が42.5°C以上となるように、投与時の加温抗癌剤温度は42.5°Cよりも高め(45°C)に設定した。正常ウサギに対して上記3種類の加温抗癌剤を用いてTACEを行い、それぞれ肝内組織の温度測定を行ったが、いずれの群においても肝内組織の温度上昇は見られなかった。恐らく、加温抗癌剤の肝内組織への停滞時間が短く、肝内組織の温度上昇にまで至らないのではないかと考えた。

抗癌剤の組織内停滞時間を長くするための方法として、永久塞栓物質であるビーズや脂溶性造影剤であるリピオドールと混合してから投与する方法が考えられ、今後追加実験を検討している。一方、いずれの群においても肝機能障害は認めなかった。従って、上記設定した温度による加温抗癌剤投与は安全であると考える。現在、正常ウサギによる動物実験を行っている最中である。当初の予定では、平成29年度中に正常ウサギによる動物実験を終了し、ウサギVX2肝腫瘍モデルを用いた実験を開始する予定であったので、計画よりは遅れている。本研究の目的は加温した抗癌剤を用いて肝動脈化学塞栓療法(以下、TACE;transeーcatheter arterial chemoembolization)を行うことにより、既存のTACEよりも著しく高い抗腫瘍効果を得ることである。加温した抗癌剤(シスプラチン)を用いたTACEの方法の確立ならびに安全性と抗腫瘍効果を明らかにすることを目標としている。前年度に引き続き正常ウサギを用いた動物実験を行いその後VX2ウサギを用いた動物実験を行った。前年度の実験において正常ウサギに対して加温抗癌剤を用いたTACEを行い、それぞれ肝内組織の温度測定を行ったがいずれの群においても肝内組織の温度上昇は見られなかった。この原因は加温抗癌剤がカテーテル通過中に温度が低下する事と、抗癌剤の組織内停滞時間が短いためと考えた。これらを克服するために、脂溶性造影剤であるリピオドールを常温25°C、35°C、45°Cの3種類の温度に設定し、加温抗癌剤と混合した上で正常ウサギに対してTACEを行い、肝内組織の温度測定を行ったところ、肝内組織の温度上昇を認めた。従って抗癌剤の温度低下を防ぐためには加温したリピオドールと混合することが重要であることが判明した。引き続きウサギVX2肝腫瘍モデルを用いた実験を行い上記3種類の温度に加温した抗癌剤とリピオドールの混合液を用いてTACEを行ったところ、常温群よりも45°C群において抗腫瘍効果が高い傾向が得られた。また、いずれの群においても重篤な肝機能障害は認めなかった。本研究により加温抗癌剤を投与するためのシステムに関してある一定の成果は得られたものの、抗腫瘍効果に有意な差を得るにはいたらずまだまだ改善の予知があると思われた。今回は時間と予算の関係で断念したが、保温性の高いカテーテルを開発することができれば更なる良好な結果が得られるようになるのではないかと考えている。引き続き正常ウサギによる動物実験を継続する。シスプラチンの至適投与温度に関しては、今後の実験で検討していく予定である。保温性カテーテルの開発に関しても、今後実現性の可否を含めて検討していく予定である。引き続き動物実験を継続し、抗腫瘍効果と安全性の評価を行うことにより、シスプラチンの至適投与温度に関して検討していく予定である。また、保温性カテーテルの開発に関しても、引き続き今後実現性の可否を含めて検討していく予定である。当初予定していたよりハイスペックなPCの購入や平成29年度に予定していた海外出張が本年に前倒しになった関係で平成28年度の予算が足りなくなったため平成29年度予算より前倒し請求を行ったため差額が生じた。
永久磁石回転形磁気車輪の浮上力ペイロードの増大策について

本磁気車輪は,円形状に配置した永久磁石を導体板上で回転させて,反発型浮上力と推力を同時に発生させる電磁機器である。極数やポールピッチ,また回転方向磁束密度の空間分布が異なる5種類の永久磁石回転体を用いて,ペイロード,すなわち永久磁石の自重に対する浮上力について調べた結果,次のようなことが明らかになった。1.永久磁石回転体を導体板と平行に回転させて,浮上力発生装置として用いる場合,回転方向磁束密度分布の空間高調波成分は,反発浮上力にほとんど貢献しない。磁気車輪の場合は元来,浮上のための電力消費を少なくするために,磁束密度分布の空間基本波成分も,無効電力成分に貢献するような構造で使用している。したがって,空間高調波成分の調整による無効電力成分の変化の割合が小さいと考えられる。2.傾斜式磁気車輪の浮上力ペイロードは平行回転時の特性とほぼ同様で,磁束密度分布の空間高調波成分,極数,ポールピッチの影響は小さく,ほぼ永久磁石体積だけに依存する。これまでの実験の範囲においては,浮上力は永久磁石体積のほぼ1.54乗に比例している。これは,通常の電磁機器において相似・比例増加させた場合,温度上昇を無視するとトルクや出力は体積の4/3=1.33乗に比例するが,本磁気車輪の場合はそれ以上の増加率となる。3.偏い式磁気車輪においては極数が2極よりも4極の方が高ペイロード値が得られた。この方式では,永久磁石回転体領域を部分的に導体板と重ならせるが,重なり部分で有効に作用する磁束を低下させないために,適当に極数が多い方が有利になると考えられる。現段階では,磁気車輪の高性能化のための明確な方向は得られず,磁気車輪システム全体を考慮してさらに検討する必要がある。
細胞による基底膜識別機構とそれに共役した細胞内情報伝達機構の解析

インテグリンによる基底膜接着分子の識別機構に重点を置いて解析を進めた。基底膜に含まれているインテグリンリガンドは、ラミニンとRGD型接着分子に大別される。我々はラミニンのインテグリン結合活性に、α鎖だけでなく、β鎖とγ鎖も関与することを明らかにした。γ1鎖とγ2鎖には、C末端から3番目の位置にGlu残基が保存されている。我々はこのGlu残基を他のアミノ酸残基に置換するとラミニンのインテグリン結合活性がほぼ完全に消失ることを見出した。このGlu残基はγ3鎖には存在しないが、γ3鎖を含むラミニンアイソフォーム(ラミニン-213)はインテグリン結合活性をほぼ完全に欠失していた。これらの結果は、このGlu残基がインテグリン結合部位に存在する活性酸性アミノ酸残基であることを強く示唆している。一方、β鎖についても、β2鎖を含むラミニンアイソフォームは、β1鎖を含むアイソフォームよりもインテグリン結合活性が23倍強いことを見出した。β1鎖とβ2鎖の様々なスワップ変異体のインテグリン結合活性の解析から、β鎖のC末端側22アミノ酸残基がインテグリン結合活性の調節に関わることが判明した。これらの結果は、β鎖、γ鎖のC末端領域がα鎖のC末端領域と協同することにより、ラミニンのインテグリン結合部位を構築していることを示唆している。また、我々は基底膜の代表的なRGD型接着分子であるネフロネクチンに着目し、そのインテグリン結合特異性を解析した。その結果、8種類のRGD結合型インテグリンの中で、ネフロネクチンはα8β1に高い結合特異性を示すことを見出した。このα8β1結合活性は、RGD配列を含む分子中央部の領域でも確認され、糖鎖修飾の有無に依存しない。(1)インテグリンによる基底膜分字の識別機構:基底膜の主要な接着分子であるラミニンには、α鎖の異なる5種類のアイソフォームが存在する。我々は既にα5鎖およびα4鎖を含むアイソフォームの発現系を構築しているが、今回これに加えてα1鎖(ラミニン-111)、α2鎖(ラミニン-211)、α3鎖(ラミニン-332)を含むアイソフォームの発現系を構築した。発現させたアイソフォームは各α鎖に対する単クローン抗体を用いて精製した。また、基底膜に局在するRGD型接着分子であるネフロネクチン、MAEG、QBRICKの組換え蛋白質の発現系も併せて構築し、C末端に付加したFLAGタグを利用して各蛋白質を精製した。一方、これらの接着蛋白質を認識する細胞側受容体であるインテグリンに関しても、α5β1、α8β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5の発現系を構築した。α8β1に関しては、ネフロネクチンを含む様々なRGD型接着分子に対する結合親和性を測定し、α8β1がネフロネクチンに高い特異性をもって結合することを明らかにした。(2)基底膜結合型インテグリンを介するシグナル伝達機構の解析:ラミニン結合性インテグリンはテトラスパニンCD151と安定な複合体を形成することが知られている。我々はsiRNAでCD151をノックダウンすると、ラミニン上での細胞形態が変化し、細胞遊走が亢進することを見出した。また、CD151をノックダウンした細胞では、c-Src、パキシリン、FAKのチロシンリン酸化が低下していた。

インテグリン活性化抗体TS2/16を用いてインテグリンを強制的に活性化しても低下したチロシンリン酸化は回復しないことから、CD151の作用点はインテグリン自身のリガンド結合活性の制御ではなく、インテグリンより下流のシグナル伝達経路にあると推定される。インテグリンによる基底膜接着分子の識別機構に重点を置いて解析を進めた。基底膜に含まれているインテグリンリガンドは、ラミニンとRGD型接着分子に大別される。我々はラミニンのインテグリン結合活性に、α鎖だけでなく、β鎖とγ鎖も関与することを明らかにした。γ1鎖とγ2鎖には、C末端から3番目の位置にGlu残基が保存されている。我々はこのGlu残基を他のアミノ酸残基に置換するとラミニンのインテグリン結合活性がほぼ完全に消失することを見出した。このGlu残基はγ3鎖には存在しないが、γ3鎖を含むラミニンアイソフォーム(ラミニン-213)はインテグリン結合活性をほぼ完全に欠失していた。これらの結果は、このGlu残基がインテグリン結合部位に存在する活性酸性アミノ酸残基であることを強く示唆している。一方、β鎖についても、β2鎖を含むラミニンアイソフォームは、β1鎖を含むアイソフォームよりもインテグリン結合活性が23倍強いことを見出した。β1鎖とβ2鎖の様々なスワップ変異体のインテグリン結合活性の解析から、β鎖のC末端側22アミノ酸残基がインテグリン結合活性の調節に関わることが判明した。これらの結果は、β鎖、γ鎖のC末端領域がα鎖のC末端領域と協同することにより、ラミニンのインテグリン結合部位を構築していることを示唆している。また、我々は基底膜の代表的なRGD型接着分子であるネフロネクチンに着目し、そのインテグリン結合特異性を解析した。その結果、8種類のRGD結合型インテグリンの中で、ネフロネクチンはα8β1に高い結合特異性を示すことを見出した。このα8β1結合活性は、RGD配列を含む分子中央部の領域でも確認され、糖鎖修飾の有無に依存しない。
生物と環境水の酸素同位体比の相関と変動

1.骨試料がごく微量になると、有意に酸素同位体比の測定値が低下する。昨年度測定できなかった微量人骨試料について、今年度導入したロ-タリ-・エバポレ-タ-により、溶液を濃縮して測定する方法を検討した。これにより、骨試料として最低40mgで測定が可能となった。2.鯨の同一個体の骨と血液の酸素同位体比を測定した。その結果、骨と体内水の間の酸素同位体分別係数として、1.0191(±0.0002)という値が得られた。哺乳動物体内での、体液と骨の体温(37°C)における酸素同位体分別係数(哺乳動物一般に適応する基礎的数値)が世界に先駆けて、はじめて求められた。3.東釧路貝塚(60007000yrB.P.)、真脇遺跡(30004000yrB.P.)から得られた鯨骨化石の酸素同位体比は現在に向けて、上昇傾向を示している。このことは、温暖な縄文海進時に上限であった海水準が現在に向けて低下しているという定説を支持するとともに、その変動の見積もりに定量性を与えている。4.現生のアフリカ象に対して、野尻湖から発掘された3450048800yrB.P.( ^<14>C年代)のナウマン象化石の酸素同位体比は著しく低い値を示し、当時の気温は210°C低かったと推定された。同様に鹿化石(3800042000yrB.P、^<14>C年代)の酸素同位体比から、当時の気温は511°C低かったと推定された。5.鯨、象、鹿などの獣骨化石から、ある時期の環境水の酸素同位体比が限られた範囲内に推定されたので、気候変動の不確定要素が排除された。古人骨化石の酸素同位体比から、その集団の移住・拡散を追跡するための基礎が確立された。
ケロイド線維芽細胞におけるlncRNAの機能解析

ヒト正常皮膚およびケロイドから、初代線維芽細胞を培養した。マイクロアレイ法を用いて、遺伝子発現解析とlncRNA解析を網羅的に行った(n=2)。細胞外マトリックス分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-1, 3, 7, 10が発現低下を示しており、線維化の進行に関与すると考えられた。これらのMMPsはすべて、遺伝子マップ上、染色体11q22.2に位置している。そこで、染色体11q22.2付近に位置するlncRNAに絞りこんで解析を行った。正常皮膚線維芽細胞と比較して、ケロイドで発現変動の大きいlncRNAを抽出したところ、H19とLINC00900がそれぞれ23倍、7倍の発現上昇を示した。そこで、これら2つのlncRNAの線維化における役割に絞りこんで、調べていくことにした。現在、サンプル数を増やしてマイクロアレイ結果の検証を行うために、引き続き初代線維芽細胞を培養している。今後、遺伝子導入実験、遺伝子抑制実験により、これら2つのlncRNAの新たな機能を探っていく。今年度は、ターゲットlncRNAを絞り込むところまでを目標としていたため、おおむね順調に進展していると考えている。まず、サンプル数を増やし、定量的RT-PCRにてマイクロアレイ結果の検証を行う。ターゲットlncRNAの、ケロイドにおける発現変動が証明されれば、発現プラスミド構築へと進む。発現プラスミドを用いて、遺伝子導入実験を行う。ヒト正常皮膚線維芽細胞に過剰発現させることで、MMPsの発現変動を見る。また、MMPsの転写因子であるAP-1を介して調節している可能性が高いため、AP-1の抑制実験も組み合わせて検証していく。次に、ケロイド由来線維芽細胞を用いる。ターゲットlncRNAをsiRNAで抑制し、MMPsの発現が上昇するかを検証する。マイクロアレイの際、当初サンプル数が3ずつで計画していた。しかし、階層的クラスター分析により、発現パターンが大幅に異なるサンプルがあり、個体差が大きいためと考えられた。その結果により、マイクロアレイによる遺伝子発現解析のサンプル数を2ずつに減らした。そのため、予算の差額が生じた。しかし、個体差が予想以上に大きく、今後の実験では、サンプル数を予定よりも増やしていく必要性がある。そのため、今年度発生した差額分は来年度必要となることが予想される。
アパタイトセメントの硬化機構の解析および硬化時間短縮に関する研究

アパタイトセメントの硬化時間(現状では約30分以上)短縮を目的としてアパタイトセメントにおける硬化反応を熱力学的に解析、律速段階を検討した。熱力学分析のためにアパタイトセメントを蒸留水で懸濁液すると、懸濁液のpHが上昇し、またカルシウムイオン濃度もそれに伴い上昇した。一方、リン酸イオンは微量しか検出できなかった。アパタイトセメントの構成成分であるリン酸四カルシウムならびにリン酸水素カルシウムはそれぞれ加水分解すると下式のようにアパタイトを生成することが知られており、pHおよびカルシウムイオン濃度の上昇はリン酸四カルシウムの溶解が反応系に対して供給過剰になっている、つまりリン酸水素カルシウムの溶解が律速段階になっていることを示していた。リン酸水素カルシウムは主にリン酸成分を反応系に供給する役割を担っているので練和液をリン酸ナトリウム水溶液にすることによりリン酸水素カルシウムの溶解反応であった硬化反応の律速段階を解除した。新しい系におけるアパタイトセメント硬化時間を測定すると約5分であり当初の目的が達成できた。硬化時間を短縮したことにより、骨充填など迅速な硬化が必要とされる領域にもアパタイトセメントの適用が可能となった。新しい系におけるアパタイトセメント硬化体(迅速硬化型アパタイトセメント)の最終的な機械的強さは従来のアパタイトセメントのそれと同じであった。一方、迅速硬化型アパタイトセメントでは迅速な硬化のため、従来のアパタイトセメントには見られなかった初期機械的強さを有していることがわかった。