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ブランデンシュタイン家所蔵シーボルト書簡の調査解読研究

最終的に対象資料の系統的な整理、解読、翻刻、翻訳によってシーボルト来日の経緯や動機、滞在中の活動状況をより明確にするのみならず、19世紀前半の出島オランダ商館の役割、オランダ領東インド政庁の対日政策の内容、さらには日本における日蘭交渉の実態を明らかにすることを目指している。本年は昨年に引き続き1822年度に関する対象資料の系統的な整理と1823年度分の対象資料の文書群からの抽出、資料作成をおこなった。本年度実施した研究調査の主たる内容は下記の通りである。(1)1822年度分の対象資料の系統的な整理を昨年度に引き続き行い、書簡中に現れる人物の特定とその人物データベースの構築に着手した。(2)あらたに1823年度に関する対象資料を文書群より抽出し、書簡12通のうち5通と書簡に添付された目録1点を解読、翻刻し、最終的に和訳をおこなった。(3)書簡中に現れる人物の特定や、交友関係、社会状況を理解するための基礎資料を国内外の図書館、資料館等で閲覧し、必要なものは収集した。(4)対照資料の状態(紙質、サイズ、紙の透かし等)の調査や破損、変色のため原資料でしか判読できない箇所を解明するため研究責任者(宮坂)ならびに研究分担者(石川)が現地調査をおこなった。(5)本年度よりデジタルカメラによる撮影を導入した。このことにより対象資料の破損部分やシミ、文字の重なった部分についての解読が飛躍的に容易になった。(6)翻刻ならびに翻訳文を公表するため、長崎市シーボルト記念館『鳴滝紀要』第13号に掲載するための原稿を作成した。なお本稿は平成15年4月刊行予定である。本研究の目的は、シーボルトのドイツにおける末裔であるフォン・ブランデンシュタイン家に残されたシーボルト関文書中の未解読私信のうち1821年より1831年までの資料を抽出し、整理、解読、翻訳、翻刻を行うものであり、最終的には私信の系統的な整理によりシーボルトの来日の動機と目的、滞在中の調査、研究活動、出島オランダ商館の役割、オランダ領東インド政庁の対日外交政策の内容を明らかにすることにある。本年度実施した研究調査は以下の通りである。(1)ブランデンシュタイン家文書に含まれる1823年,1824年分の対象資料の抽出と資料作成を行った。(2)作成した資料よりテキストの解読、翻刻ならびに翻訳を行った。本年度は独文、7通の翻刻、邦訳ならびに注釈用テキストの作成を完了した。(3)解読作業に際しマイクロフィルムならびにマイクロフィルムからの複写では判読不能な箇所について、宮坂、ノイマンが所蔵先を訪問し、解読、確認作業を行った。(4)書簡中に表れる人物の特定や、交友関係、人的ネットウーク、社会状況を理解するための資料集、を行うために宮坂ならびにノイマンがドイツで現地調査を行った。(5)日本滞在中交流した日本人蘭学者の基礎資料調査、収集のため宮坂が高野長英記念館(岩手県水沢市)で現地調査を行った。(6)翻刻、翻訳文を公表するため、長崎市シーボルト記念館『鳴滝紀要』第14号掲載用原稿を作成した。なお、本稿は平成16年4月刊行予定である。
X線を用いた分析の帯電補償に関わる厚膜Si酸化膜中の励起電子の輸送機構の研究

(1)試料: p型のSi(100)基板上に,ドライ熱酸化によってSiO2膜を成膜した.膜厚は光電子の平均自由工程(数数10 nm)より大きく一般には表面帯電が起きると予想される0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmとした.これらを購入した後に,試料の裏面に形成された酸化膜をドライエッチングで除去した.(2)X線照射時のSiO2/Si試料の基板電流の評価:放射光施設UVSORの真空チャンバーで,準備した試料にX線(Si1s吸収端をまたぐ1820, 1850, 1880eV:SiO2膜への侵入長さがそれぞれ7.2, 2.2, 2.3μm)を入射角度0度で照射して,基板電流を測定した.基板電流はX線照射直後から時間とともに変化したので,時間の関数として測定した.入射X線強度は,試料直前に設置したAuメッシュとアース間を流れる電流でモニターして,試料間・測定間の比較のための補正に用いた.(3)結果1:基板電流のX線照射直後からの変化量はX線のエネルギーによって大きく異なった.また,変化量はSiO2膜厚が増えるとともに増大した.X線エネルギー1880eVの場合,そのX線侵入深さ(約2.3μm)と等しい膜厚まで単調に増大して飽和した.これらの観測結果は,帯電補償に関わるSi基板からSiO2表面へ向かう電子の輸送量が, X線侵入長とSiO2膜厚との両者に依存することを示している.(4)結果2:一方,SiO2/Si試料にX線を照射した際にSiO2表面から放出される電子数と,Si基板から上地SiO2膜へ注入される電子数を、Henkeの個体表面からの2次電子放出数に関する理論を応用して推定することを試みた.今後,これまで行ってきた表面電位測定ならびに基板電流測定で観測された帯電補償現象の考察に利用する予定である.これまでの表面電位測定ならびに基板電流測定で観測された帯電補償現象の特徴をより明確にするために実験を継続するとともに,考察に利用する予定の理論計算の精度を向上させる.(1)試料: p型のSi(100)基板上に,ドライ熱酸化によってSiO2膜を成膜した.膜厚は光電子の平均自由工程(十数nm)より大きく一般には表面帯電が起きると予想される0.52.3 μmとした.試料の裏面に形成された酸化膜を,ドライエッチングで除去した.(2)XPS時間依存測定によるSiO2膜/Si基板の表面電位の評価:準備した試料にX線(Al Kα: 1486.6 eV)を照射して,SiO2薄膜のSi2pスペクトルのピークエネルギーを時間の関数として測定した(XPS時間依存測定). Si2pスペクトルのピークエネルギーはSi酸化膜トラップ準位が正孔を捕獲(内部帯電)すると正の方向にシフトしていくのでX線照射時間の関数としてSi2pピークエネルギーを測定することで初期の表面ポテンシャル,すなわち表面帯電状態を求めた.(3)SiO2薄膜の表面電位はSiO2膜厚が1μmまでは0Vと一定で,膜厚がさらに増えると最大で1Vまで増加した.Si基板上に形成した膜厚1μmの熱酸化膜を用い,X線の入射角を変化させた時の表面電位の測定では,最大3Vにまで表面電位は増大しており,それより小さいことからも,自己帯電補償が起きていることがわかった.(4)これは,SiO2膜厚を増加させると,表面からの電子放出量がほぼ一定であるのに対して,基板からの電子注入量が減少したためと考えられる.表面からの電子放出量と基板からの電子注入量をモデル化して算出したところ,前者より後者が小さくなると表面電位が上昇(表面帯電)すると整理できることが示唆された.2017第78回応用物理学会秋季学術講演会、2018第65回応用物理学会春季学術講演会にて発表。(1)試料: p型のSi(100)基板上に,ドライ熱酸化によってSiO2膜を成膜した.膜厚は光電子の平均自由工程(数数10 nm)より大きく一般には表面帯電が起きると予想される0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 μmとした.これらを購入した後に,試料の裏面に形成された酸化膜をドライエッチングで除去した.(2)X線照射時のSiO2/Si試料の基板電流の評価:放射光施設UVSORの真空チャンバーで,準備した試料にX線(Si1s吸収端をまたぐ1820, 1850, 1880eV:SiO2膜への侵入長さがそれぞれ7.2, 2.2, 2.3μm)を入射角度0度で照射して,基板電流を測定した.基板電流はX線照射直後から時間とともに変化したので,時間の関数として測定した.入射X線強度は,試料直前に設置したAuメッシュとアース間を流れる電流でモニターして,試料間・測定間の比較のための補正に用いた.(3)結果1:基板電流のX線照射直後からの変化量はX線のエネルギーによって大きく異なった.また,変化量はSiO2膜厚が増えるとともに増大した.X線エネルギー1880eVの場合,そのX線侵入深さ(約2.3μm)と等しい膜厚まで単調に増大して飽和した.これらの観測結果は,帯電補償に関わるSi基板からSiO2表面へ向かう電子の輸送量が, X線侵入長とSiO2膜厚との両者に依存することを示している.

(4)結果2:一方,SiO2/Si試料にX線を照射した際にSiO2表面から放出される電子数と,Si基板から上地SiO2膜へ注入される電子数を、Henkeの個体表面からの2次電子放出数に関する理論を応用して推定することを試みた.今後,これまで行ってきた表面電位測定ならびに基板電流測定で観測された帯電補償現象の考察に利用する予定である.プラズマCVDSiO2膜で同様の実験を行ったところ,表面電位は熱酸化膜とは異なった.この新たな知見を手がかりに,平成30年度は研究を進める.これまでの表面電位測定ならびに基板電流測定で観測された帯電補償現象の特徴をより明確にするために実験を継続するとともに,考察に利用する予定の理論計算の精度を向上させる.
リチウムチオラートのダブルマイケル付加による閉環反応の開発

本研究では、優れた求核剤であるチオールをリチオ化して活性化し、これをビスα,β-不飽和エステルとマイケル-マイケル反応させて立体選択的に閉環体を得ることを目的として実験を行った。また、硫黄以外の求核剤として、リチウムペルオキシド、有機リチウム種に注目し、これらと不飽和エステルとの立体選択的共役付加反応について検討した。さらに、マイケルアクセプターとしてニトロオレフィンに注目し、有機リチウムのニトロオレフィンへの共役付加反応についても検討した。その結果、以下の成果を得ることができた。(1)リチウムチオラートを開始求核剤とする、ビスα,β-不飽和エステルの立体選択的閉環反応を開発できた。すなわち、リチウムチオラートの共役付加によって生じるリチウムエノラートを、分子内のもう一つの不飽和エステルで補足することにより、立体選択的に閉環体を収率良く得ることができた。(2)リチウムペルオキシドを求核剤とする、α,β-不飽和エステルの触媒的エナンチオ選択的エポキシ化反応を開発できた。すなわち、触媒量の外部キラル配位子とリチウムペルオキシドの存在下、不飽和エステルをヒドロペルオキシドと反応させると、高エナンチオ選択的にエポキシ体を収率良く得ることができた。(3)有機リチウムを開始求核剤とする、ビスα,β-不飽和エステルの立体選択的閉環反応を開発できた。すなわち、外部キラル配位子の存在下、有機リチウムをビスα,β-不飽和エステルと反応させると、有機リチウムの共役付加に引き続く分子内マイケル反応によって、閉環体が高エナンチオかつジアステレオ選択的に得られることを見出した。(4)ニトロオレフィンをマイケルアクセプターとする、有機リチウムの立体選択的共役付加反応を開発できた。すなわち、環状ニトロオレフィンに有機リチウムを反応させると、極めて高ジアステレオ選択的に付加体が得られることを見出した。さらに、この反応を鍵とする天然物の全合成を達成し、本反応の合成化学的有用性を明らかにすることができた。以上の結果を得た。本研究では、リチウムチオラートのビスα,β-不飽和エステルへのダブルマイケル反応による閉環反応の開発を目的として研究を行った。また、リチウムチオラート以外の求核剤であるリチウムペルオキシドや有機リチウムへの本方法論の適用可能性について検討した。さらに、ビスα,β-不飽和エステル以外のマイケルアクセプターとしてニトロオレフィンを選択し、本反応の基質一般性の確立を目指した。その結果、以下の成果を得た。(1)キラルなリチウムチオラートを開始求核剤とするω-オキソ-α,β-不飽和エステルのマイケル-アルドール型タンデム閉環反応の開発に成功した。すなわち、D-樟脳スルホン酸から誘導したキラルなチオールのリチウム塩をα,β-不飽和エステルに共役付加させ、生じるリチウムエノラートを分子内のアルデヒドで捕捉すると、三連続不斉点を有する閉環体が高収率かつ高エナンチオおよびジアステレオ選択的に得られた。(2)リチウムチオラート以外の求核剤としてリチウムアルキルペルオキシドに注目し、これをα,β-不飽和エステルと反応させて触媒的不斉エポキシ化反応を開発した。キラル配位子の添加によって反応加速と立体制御を同時に達成できることが分かった。さらに、キラル配位子を触媒量に減らしても高エナンチオ選択的に反応は進行し、触媒反応へと展開することが出来た。(3)ビスα,β-不飽和エステル以外の基質としてニトロオレフィンに有機リチウムを化学選択的に共役付加させた。得られた付加体を分子内のα,β-不飽和エステルにマイケル付加させることにより、立体選択的な連続的閉環反応を開発した。本反応を鍵工程としてリコランの合成を達成することができ、その合成化学的有用性を明らかにすることができた。

すなわち、環状ニトロオレフィンに有機リチウムを反応させると、極めて高ジアステレオ選択的に付加体が得られることを見出した。さらに、この反応を鍵とする天然物の全合成を達成し、本反応の合成化学的有用性を明らかにすることができた。以上の結果を得た。
バルザックと文芸誌の詩学（1833-1836年）

本研究は、19世紀フランスの作家バルザック(1799-1850年)の創作を同時代の文芸誌との関わりにおいて考察する試みである。本研究の対象とする1833年から1836年までの期間は、バルザックが文芸誌に向けた「コント」と題された短編作品の創作から意識的に離れ、『十三人組物語』(1833-1834年)『ゴリオ爺さん』(1835年)『谷間の百合』(1835-1836年)などの中・長編作品の執筆に舵を切り、「コント作家」から「小説家」へと自らの作家像を作り変えようとしていた時期にあたる。その一方で、バルザックと文芸誌の関係は継続しており、これらの中・長編作品もコントと同じように文芸誌を初出としている。本研究では、文学研究に軸足を置きながら、出版文化史研究の問題設定、手法を取り入れ、創作と出版の両面から文学作品にアプローチし、この時期のバルザックの創作が同時代の文芸誌といかなる関係を切り結んでいたのかを多方面から明らかにした。本研究の主な成果としては、資料収集と研究発表をあげることができる。資料収集としては、フランス国立図書館での資料調査などを通じて、一次文献として1833年から1836年までの期間にバルザックが寄稿を行なった文芸誌を網羅的に収集することに成功したほか、古典的研究書から最新の研究まで、多くの研究文献を取り揃えることができた。研究発表としては、バルザック作品の読解分析を中心に、口頭発表、研究論文や一般書の執筆を通じて研究成果の公表につとめた。また、研究期間中には学会、研究会等に参加し、日仏両国の研究者との交流の機会を持ち、議論を行う中で研究の意義を再認識し、研究の重要性をさらに高めていく努力を行なった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究「バルザックと文芸誌の詩学(1833-1836年)」は、19世紀フランスの作家バルザック(1799-1850年)の1833年から1836年にかけての創作を同時代の文芸誌との関わりにおいて考察することを主眼としている。これまでの文学研究においては、作品を一個の完成品として「静的」に捉える傾向が強く見られたが、本研究では出版文化史研究の手法、成果を踏まえつつ、作品をその創作段階から「動的」に捉え、作品本来の力学を歴史的に検証する。平成29年度は、おもに1830年代フランスの文芸誌の調査、収集を行った。資料の多くはフランス国立図書館に所蔵されており、インターネットサイトからのダウンロード、複写依頼、現地での調査を通じて、『パリ評論Revue de Paris』『レコー・ド・ラ・ジューヌ・フランスL'Echo de la Jeune France』『クロニック・ド・パリChronique de Paris』『ヨーロッパ文芸Europe litteraire』の複写を入手することができた。バルザックが寄稿を行なっていたこれらの文芸誌を通覧することによって、『十三人組物語』や『ゴリオ爺さん』といった重要作品を、刊行当時のヴァージョンで分析することが可能となっただけでなく、同時代の出版文化の大きな流れの中に作品を位置付け直し、バルザックの創作と「文芸誌の詩学」との関係を問うための準備が整ったといえる。本研究の内容、方針については、資料調査、収集のために赴いたフランスで、バルザックを中心とする19世紀フランス文学・出版文化史研究を牽引するジョゼ=ルイス・ディアズ教授(パリ第7大学名誉教授)、マリ=エヴ・テランティ教授(モンペリエ大学)と意見交換を行う機会に恵まれた。その際、本研究の意義、重要性に対して両教授から評価を受けた。以下にあげる理由により、現在までの研究は「おおむね順調に進展している」と自己評価することができる。1.資料収集について:本研究の一次資料となるのは19世紀前半の貴重な文字資料であり、その多くがフランス国立図書館に所蔵されている。そのため、日本からの資料収集には困難が伴うことが予想された。しかし、一部の資料は電子ファイルとして無料公開されており、容易に入手できた。その他の資料も、有料ではあったが複写資料として電子ファイルを入手することができた。いずれの場合も、複写資料の多くは解像度の高い電子ファイルであり、コンピューターやタブレットによる閲覧が可能であるため、研究を円滑に進めることができた。その他の資料に関しても、国内外の図書館、書店を利用しながら、質の高い研究文献、翻訳文献などを入手することができている。2.資料の分析、読み込みについて:年間を通じて本研究を遂行するに足る時間を確保することができている。現在、収集した一次資料の分析、読み込みを行なっている最中であるが、本研究の柱となる1833年から1836年にかけてのバルザックの作品についてはすでに通読することができており、研究発表の準備を進めている。3.研究成果の公表について:平成29年度から、勤務先である東京大学の言語態研究会において「文芸誌を再考する」と題したワークショップを主催し、今年度も継続して活動を行なっている。2017年12月には「文芸誌を再考するーバルザックと文芸誌の詩学「序論」」と題した研究発表を行った。今後も所属学会での口頭発表、大学紀要論文執筆などを通じて、研究成果の公表を積極的に行なっていく予定である。

本研究は、19世紀フランスの作家バルザック(1799-1850年)の創作を同時代の文芸誌との関わりにおいて考察する試みである。本研究の対象とする1833年から1836年までの期間は、バルザックが文芸誌に向けた「コント」と題された短編作品の創作から意識的に離れ、『十三人組物語』(1833-1834年)『ゴリオ爺さん』(1835年)『谷間の百合』(1835-1836年)などの中・長編作品の執筆に舵を切り、「コント作家」から「小説家」へと自らの作家像を作り変えようとしていた時期にあたる。その一方で、バルザックと文芸誌の関係は継続しており、これらの中・長編作品もコントと同じように文芸誌を初出としている。本研究では、文学研究に軸足を置きながら、出版文化史研究の問題設定、手法を取り入れ、創作と出版の両面から文学作品にアプローチし、この時期のバルザックの創作が同時代の文芸誌といかなる関係を切り結んでいたのかを多方面から明らかにした。本研究の主な成果としては、資料収集と研究発表をあげることができる。資料収集としては、フランス国立図書館での資料調査などを通じて、一次文献として1833年から1836年までの期間にバルザックが寄稿を行なった文芸誌を網羅的に収集することに成功したほか、古典的研究書から最新の研究まで、多くの研究文献を取り揃えることができた。研究発表としては、バルザック作品の読解分析を中心に、口頭発表、研究論文や一般書の執筆を通じて研究成果の公表につとめた。また、研究期間中には学会、研究会等に参加し、日仏両国の研究者との交流の機会を持ち、議論を行う中で研究の意義を再認識し、研究の重要性をさらに高めていく努力を行なった。今後の研究の推進方策としては、まず、初年度に収集した一次資料、二次資料の読み込みをさらに進め、口頭発表や論文を通じて、研究成果の公表に努める。2018年6月には日本フランス語フランス文学会全国大会において、バルザック『ゴリオ爺さん』を取り上げる研究発表を行う予定である。1835年3月刊行の『ゴリオ爺さん』は1834年12月から翌年2月にかけて『パリ評論』誌に連載され、翌3月には同誌に「序文」が掲載されたという出版の経緯がある。また『ゴリオ爺さん』は、「再登場人物」を介して、1832年9月10月に『パリ評論』誌に掲載された『捨てられた女』『ざくろ屋敷』、当初『パリ評論』に掲載が予定されていながら1833年4月に『レコー・ド・ラ・ジューヌ・フランス』に部分掲載された『斧に触れるな』の三作とも密接に結びついており、創作段階から文芸誌と切り離せない関係にある。発表では、この当時の文芸誌の重要な読者層となり始めていた女性読者の存在に目を向けることによって、『ゴリオ爺さん』のクライマックスをなすボーセアン夫人の最後の夜会に、バルザックが「罪を犯した女たち」を再登場人物として登場させたことの意義を明らかにしたい。研究成果の公表と並行して、今後は1830年代に相次いで創刊された「女性雑誌」を新たな調査、収集の対象としたい。『女性新聞Journal des femmes』『家庭の母La Mere des familles』『女性の助言者Conseiller des femmes』といった女性雑誌は、批評記事やバルザックをはじめとする男性作家への働きかけを通じて、同時代の文学の動向に大きな影響を与えたことが知られている。文芸誌と女性雑誌を併読することによって、バルザックがその中心に身を置いていた1830年代の出版メディアの様相を立体的に捉えていくことが可能になるだろう。
内耳カルシウム制御に関する新たな分子機構の解明

CaSRの内耳における役割は現在までほとんど知られていない。我々はこれまでCaSRの内耳における発現を検討し、ウエスタンブロット及び免疫染色にて蝸牛のラセン軸動脈、ラセン靭帯への発現を発見した。本研究では内耳における薬理学的な機能解析として、内耳への局所的な薬剤投与の行い聴覚への寄与を検討する。またノックアウトマウスを用い、CaSRが内外リンパ液におけるCa2+ホメオスタシスでどのような位置づけを有するのか、Ca2+ホメオスタシスに寄与しているとして、治療起点として有望かといった、生体内での生理的・病理的な条件下でのCaSRの機能を解析する。
イエシロアリの病気感染抵抗行動に見られる情報伝達機構

本課題における取り組みから、複眼は退化し単眼しか持たないために視力の極端に低いシロアリが、generalistの匂いに対して、他の昆虫より100倍から1000番ほど敏感な化学物質受容器を有していることを明らかにした。その結果、菌由来揮発成分においては、シロアリに忌避である物質一物質を見つけた。さらに、病原菌シグナルとネストメイトシグナルでは、病原菌シグナルの方が優勢であることを明らかにした(以上、論文投稿中)。また調査の過程における成果より、国内国際学会における葉っぱ用及び論文発表を行った。本研究は、昆虫病原性糸状菌を用いる生物的防除の可能性の追求を目的とし、昆虫の病原微生物感染抵抗システムにおいて知覚ー行動がどのようにリンクしているか解明することを目指している。モデル昆虫であるシロアリは、家屋の害虫として駆除を目的に多くの応用研究がなされてきたが、基礎生理学的な面における知覚能力や学習能力はほとんど何もわかっていない。将来的に社会性昆虫を対象とした生物的防除手法を確立することを目指す本研究では、これまで調査されてこなかった知覚と行動をつなぐリンクを明らかにするために、イエシロアリのコミュニケーションによる知覚情報伝達を調査する。平成24年度の研究成果として、昆虫の病原菌知覚のシグナルの一つである可能性が高い、病原菌由来揮発性物質の同定をGC/MS分析により進めた。その過程で同定された菌由来揮発性物質を用いて行動実験を行ったところ、イエシロアリがきわめて微量な揮発物質まで行動決定の要因として知覚することができることが明らかになった。さらに,透過型電子顕微鏡による家詩をあり触覚上感覚網の観察を続けている。国内学会としては, 2012年7月に比較生理生化学会、また2013年3月に日本応用動物昆虫学会にて研究成果を発表した。国際学会としては,8月に国際無脊椎動物病理学会(アルゼンチン)のシンポジウムにて招待講演を行った。たまアウトリサーチ活動として、2012年8月に、LAPAN(インドネシア)にて研究内容を紹介した。本年度は、これまでモデル昆虫として用いてきたイエシロアリだけでなく、キイロショウジョウバエを用いた菌由来味覚物質知覚についての調査を合わせて行い、病気感染抵抗行動に知覚が重要であることを、遺伝子レベルで示唆することに成功した。継続的に行った、イエシロアリ知覚情報のうち嗅覚に着目したこれまでの研究成果としては、ネストメイト存在時と存在しない時におけるイエシロアリの行動選択における変化を調査し、現在論文を投稿中である。本年度の研究目的は1菌由来匂いシグナルのうち、情報伝達の要になっている菌由来物質を同定することと、2生物的防除における、微生物生物的防除資材に応用可能な知覚情報伝達阻害について検討することであったが、1においては、昆虫種ごとに要となる物質は異なるかもしれないこと、ただ、菌知覚においては化学シグナルが重要であろうことが示唆された。また、2においても匂いへの馴化が起きる物質と起きない物質、また昨年までの成果から、菌由来物質に含有される誘引物質および忌避物質が絞られ、応用面での利用が期待できる。特質すべきものとしていては、グルーミング行動に関する総論を、国際的に著名な研究者と連名で発表できた。参加学会は、国内学会では、2014年3月に日本応用動物昆虫学会にてシロアリにおける研究成果を発表した。国際学会では、2013年9月にESITO(European society of taste and olfaction)に参加し遺伝子関連の研究成果を発表した。また、2013年11月にパリ日本人研究会にてセミナーを行った。平成24年度の研究成果として、昆虫の病原菌知覚のシグナルの一つである可能性が高い、病原菌由来揮発性物質の同定をGC/MS分析により進め、その過程で同定された菌由来揮発性物質を用いて行動実験を行ったところ、イエシロアリがきわめて微量な揮発物質まで行動決定の要因として知覚することができることが明らかになり、また各物質に対して、微量濃度の刺激で誘導された反応は忌避や誘因といった相反する行動であった。こうした、予測しない結果を得て、研究に新たな可能性が広がったこと、また、国際学会のシンポジウムに招待されるなど、国際社会の関心を引く発表を続けることができていることから、研究および成果発表の両面で、本課題は順調に発展していると考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の研究成果として、病原菌由来揮発性物質の同定を進め、同定された菌由来揮発性物質に対してイエシロアリがきわめて微量な揮発物質まで行動決定の要因として知覚することができることが明らかになった。この成果を受けて、平成25年度は、情報伝達の仕組みを読みたくための行動実験系を、ショウジョウバエやハチなどを用いて行われている化学物質を使った学習実験系およびゴキブリの行動実験系をモデルに確立したい。

また、ごく微量濃度の揮発性物質に反応することが明らかになったことから、こうしたデータを積み重ね、家屋における木材保存の一環として、菌由来揮発性物質を含む新規材料の開発などを試みたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
「不登校」児・家族への包括的支援に関する研究：学校・家庭・地域関係機関の役割

「不登校」児と家族にとって「不登校」がいかなる困難な問題状況、社会的な排除や孤立状況を招来しているかを家庭背景に着目し明らかにし、学校・家庭・地域関係機関の役割を追究することを試みた。結果、「不登校」のきっかけには主に人間関係のトラブルや課題があり、これらの課題を所有したまま「不登校」後を過ごす姿があった。また、家族が「不登校」児に過剰な配慮で関わりながら、低学力や家庭の経済的困難から「不登校」後の進路を描けない、進学を断念せざるを得ないという問題を背負いつつ今の自分を変えるべく試行錯誤している彼らの姿もあった。現在、これらの結果から学校・家庭・地域関係機関が果たす役割について検討している。平成25年度は、「不登校」児家族の実態に関する学会発表、及び「不登校」支援の現状と課題を明らかにするための聞き取り調査実施に向けて調査票の作成を行った。学会発表では、親の会に参加する「不登校」児家族(保護者)の「不登校」対処の内実から、家族(保護者)が「不登校」問題に対しどのような親役割を果たしているのかを検討した。その結果、母親/父親たちは、子どもの意思を尊重することを中心に子どもを守る母親/父親となり、子ども中心の夫婦関係となっていることが明らかになった。子育てを家族の責任、親の責任とする言説のもとで、子どもに寄り添い、子どもを守るという親役割が強固となり、家庭内はより子ども中心の関係へと移行する。「不登校」児への支援体制の構築が大きく望めない分、親が変わること、親が家族関係を変えることが求められる。保護すべき子どもを中心に家族関係を変容させていく親の会の対処のあり方には、家族に責任を委ねる現代社会の特徴が映し出されていると言える。親のみに「不登校」への対処を一任するのではなく、「不登校」児の社会的自立に向けて関係機関が連携した包括的なつながりのある支援を早急に具体化していくことが求められることを指摘した。また、「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査実施に向けて調査票を作成し、対象者に調査協力を依頼した。同時に、包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査実施に向けて調査票を作成し、調査協力を依頼した。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査を実施した。また、包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査を実施した。包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査を実施した。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査、包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査の実施が遅れていることによる。本研究では、「不登校」がどのような困難な問題状況をもたらしているのかを家族の対処能力を含めて明らかにするために、「不登校」経験者5名と家族(母親)6名を対象に聞き取り調査を2014年2016年に実施した。その結果、「不登校」経験者への聞き取り調査からは、「不登校」のきっかけには何らかの人間関係上のトラブルや課題があり、これら人間関係上の課題を所有しながら「不登校」後を過ごす姿があった。そして、こうした課題を克服する契機として、「不登校」後に自身のことを受け止め、支えとなる家族や家族外の理解者の存在や自己表出する経験などがあり、そこには、「不登校」を肯定的に捉えようとするアイデンティティ形成の萌芽、「不登校」後を前向きに歩もうとする姿があった。ただし、学校に行かなかったことによる低学力の問題や協調性の不足といった人間関係での悩みを抱えているケースもあった。家族(母親)への聞き取り調査からは、親子関係がより「不登校」の子どもを中心とした関係となり、過剰な配慮でもって母親のみならずその他の家族員(父親、きょうだいなど)が関わっている実態があった。また、自身のことを受け止め、支えとなる家族や家族外の理解者の存在や自己表出する経験などにより、「不登校」後を前向きに歩もうとする姿があった。ただしこうした過程において、低学力の問題や人間関係上の困難、家庭の経済的困難から、「不登校」後の進路を描くことができない、あるいは進学を断念せざるを得ないケースもあった。現在は、これらの結果をもとに学校・家庭・地域関係機関が果たす役割について、包括的に「不登校」支援を行っている地域への聞き取り調査結果を踏まえて検討している。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査、及び包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査の実施が遅れていることによる。「不登校」

経験者と保護者各4名を対象にした聞き取り調査、「不登校」支援機関2機関の視察と関係者への聞き取り調査を実施し、結果をもとに学校・家庭・地域関係機関の役割を検討し、包括的な「不登校」支援システムを提案する。教育社会学「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査、及び包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査を順次実施する。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査の実施において、調査対象者の選定、調査対象者から調査実施の同意を得るのに予想以上に時間がかかった。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査、及び包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査の実施が遅れているため、調査関係旅費と調査対象者への謝金の支払いが計画通りになされていないことによる。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査、及び包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査を順次実施し、計画通りに研究費を使用する。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査を、調査協力の同意が得られた対象者から順次進めていく。また、包括的に「不登校」支援を行っている関係部署・団体への聞き取り調査についても、同意が得られた部署・団体から調査を順次進めていく。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査の実施が予定より遅れているため、調査実施場所までの旅費と調査対象者への謝金の使用がなされていないことによる。「不登校」経験者と保護者対象の聞き取り調査を計画的に進め、平成25年度予算として計上した研究費を適切に使用する。
核ゲノムデータを用いた条鰭類の系統解析に向けて：相同遺伝子選定パイプラインの構築

本研究では,条鰭魚類の系統関係を推定するのに適した遺伝子配列を,膨大なゲノムデータから選び出す解析パイプラインを構築した.パイプラインの作成は,洗練された分子系統解析の手法を組み合わせて,脊椎動物15種の全タンパク質遺伝子配列を解析することで達成した.種間でゲノム構造を比較したところ,条鰭魚類の中心をなす真骨魚類のゲノムは,進化の初期に生じた全ゲノム重複の直後に共通した構造をすでに形成していたと推察された.本研究の目的は,データベースに公開されている条鰭類数種のゲノムデータから,条鰭類の高次系統解析に有用な相同遺伝子を選定する解析パイプラインを構築する点にある.さらなる到達点として,魚類系統の解明に不可欠な条鰭類下位群数種のトランスクリプトーム(全mRNA)データを解読すること,そして,作成したパイプラインを用いて作成したデータベースと新たに得られたゲノムデータから有用な遺伝子を選抜して,下位条鰭類の時間軸付き系統樹を推定する,という点を上げている.交付申請書であげた研究計画案は,平成25および26年度の研究計画として,1.相同遺伝子選定パイプラインの完成,2.トランスクリプトームデータ解読,3.系統解析とデータの配信,であった.1.相同遺伝子選定パイプラインの完成:解析パイプラインで得られたデータを解析することで,パイプラインをより強化してほぼ完成させた.2.トランスクリプトームデータ解読:アロワナのトランスクリプトーム解読を行った.上記データベースで整理された魚類6種のアライメントデータと比較したところ,最先端の機器とされるIllumina社MiSeqであっても得られたデータは予想以上に精度が悪かった.3.系統解析とデータの配信:上記の理由より,本申請課題の最終目標である,トランスクリプトームデータを用いた下位条鰭類主要系統間の分子分析はまだ行っていない.一方で,データベース作成によって新たに浮上した研究課題である,「真骨魚類ゲノム進化の解明」に必要な解析をほぼ終えた.現在,この研究テーマに関する論文の執筆を進行中である.1.解析パイプラインの完成:条鰭類の高次系統解析に有用な相同遺伝子を選定する解析パイプランンを作成した.このパイプラインは,国際データバンクからBLAST検索によって得られた類似性の高いタンパク質遺伝子データについて遺伝子系統樹を構築し,四足類(Human, Chicken, Xenopus)と真骨類(Zebrafish, Cod, Medaka, Stickleback, Tetraodon, Fugu)の相同遺伝子を選定するものである.解析マーカを選定するだけでなく四足類と真骨類間の相同遺伝子を選び出すものであるため,系統解析だけでなく多くの比較ゲノム研究に有用なものである.2.データベースの完成:解析パイプラインによる解析を行い,四足類と真骨類からなる確実なオーソロガス遺伝子グループを7019見いだし,これをデータベース化した.これらのうち1040オーソロガス遺伝子グループでは真骨類特異的全ゲノム重複由来の重複遺伝子が残されていた一方で,残りの5979オーソロガス遺伝子グループは,Zebrafishが分岐する以前にパートナー遺伝子を失っていた.3.系統解析に有用な遺伝子:後者のグループで解析に用いた脊椎動物9種すべてが1つの遺伝子を保持していた1241オーソロガス遺伝子グループは,系統解析に有用な遺伝子グループと考えられる.得られた成果を,日本進化学会で発表した.この内容をさらに発展させたものを,現在論文としてまとめている段階である.井上潤.真骨魚類ゲノムの進化特性:トランスクリプトーム相同遺伝子データベースの構築.日本進化学会年会.首都大学東京(2012年8月).本研究課題の目的は,1)条鰭類ゲノムデータから高次系統の分子分析に有用なオーソロガス遺伝子を選定する解析パイプラインを構築する点にある.もしこの目的を達成した場合は,2)魚類系統の解明に不可欠な条鰭類下位群数種のトランスクリプトームデータを解読すること,そして3)パイプラインを用いて作成したデータベースとあたらに得られたゲノムデータから系統解析に有用な遺伝子を選抜して,下位条鰭類の時間軸付き系統樹を推定する,ことを目的とした.1) [相同遺伝子選定パイプラインの完成]前年度までに作成したパイプラインをいくつかのデータセットで解析を行い,より精度を上げた.2) [トランスクリプトームデータ解読]今年度は解析と論文作成に集中するために,データ解読は行わなかった.3) [系統解析とデータの配信]トランスクリプトームデータを用いた下位条鰭類主要系統間の分子分析は行っていない.一方で,新たに浮上した問題である「真骨類魚類ゲノム進化の解明」に関する解析を終えて,論文として投稿した.本研究課題は,核ゲノムデータを用いた条鰭類の系統解析に向けたデータ解析方法の開発を目標した.この最終目標に向けて,より短期的な目標として以下3点を掲げた:1)条鰭類ゲノムデータから高次系統の分子分析に有用なオーソロガス遺伝子を選定する解析パイプラインを構築する.2)魚類系統の解明に不可欠な条鰭類下位群数種のトランスクリプトームデータを解読する.3)開発したパイプラインを用いて解読したゲノムデータから系統解析に有用な遺伝子を選抜してデータベース化し,下位条鰭類の時間軸付き系統樹を作成する.1) [相同遺伝子選定パイプライン]信頼性の高いゲノムデータを解読するパイプラインを完成させた.2) [トランスクリプトームデータの解読]予備的な解析を行った結果,データ解読は将来的な課題として残すことにした.3) [系統解析とデータの配信]

データベースをウェブサイトから配信した.時間軸付き系統樹の作成と公開は将来の課題とした.以上の手順から得られた結果を論文としてまとめた.本研究では,条鰭魚類の系統関係を推定するのに適した遺伝子配列を,膨大なゲノムデータから選び出す解析パイプラインを構築した.パイプラインの作成は,洗練された分子系統解析の手法を組み合わせて,脊椎動物15種の全タンパク質遺伝子配列を解析することで達成した.種間でゲノム構造を比較したところ,条鰭魚類の中心をなす真骨魚類のゲノムは,進化の初期に生じた全ゲノム重複の直後に共通した構造をすでに形成していたと推察された.1) [相同遺伝子選定パイプラインの完成]達成した.2) [トランスクリプトームデータ解読]今年度は解析と論文作成に集中するため,および解析機器がまだ不十分であると判断したために,データ解読は行わなかった.3) [系統解析とデータの配信]トランスクリプトームデータを用いた下位条鰭類主要系統間の分子分析は行っていない.これは2の理由により,データがそろっていない為である.一方で,新たに浮上した問題である「真骨類魚類ゲノム進化の解明」に関する解析を終えて,論文として投稿した.この点では予想を上回る成果を得た.生物学1)[相同遺伝子選定パイプラインの完成]脊椎動物全体を視野に入れたパイプラインを作成中である.2) [トランスクリプトームデータ解読]一年間の延長を行ったので,下位条鰭類のいくつかの種についてトランスクリプトームデータの解読を計画している.3) [系統解析とデータの配信]2のデータ解読次第で系統解析を行う.論文として公開されればデータベースが利用可能になるため,ユーザーの要望に応える形に改善を行う.1.相同遺伝子選定パイプラインの完成:目的をほぼ達成した.「研究実績の概要」にもあげたように,解析パイプラインから得られたデータベースを解析することで問題点を明らかにし,これを解決することで解析パイプラインを完成させた.2.トランスクリプトームデータ解読:達成度は低い.「研究実績の概要」で示した理由により,データ解読を保留した.本年度は,トランスクリプトーム解読に必要なtotal RNAを,対象とする魚類集種から抽出するにとどめた.3.系統解析とデータの配信:系統解析については,2のデータが出そろった時点で行う.そのための準備となる解析パイプラインと解析環境のセットアップを行っている.真骨類ゲノム進化解析で用いたデータの配信準備は完了している.平成24年度の研究計画として,1.相同遺伝子選定パイプラインの強化,2.ゲノムデータ解読の準備をあげた.1.に関しては「研究実績の概要」にもあげたように,当初予想した以上の成果を上げることができた.
二枚貝中の麻痺性貝毒結合タンパク質の探索と同定

本年度は、前年度において、麻痺性貝毒結合タンパク質候補として特定したトロポミオシンについて、実際に組織から精製し、毒への親和性を検証した。ホタテガイ外套膜から等電点沈殿や各種クロマトグラフィー等により、アイソフォーム混合物として得たトロポミオシンを使って、アフィニティーゲル上に結合させた毒への親和性を調べた結果、100mMNaClで溶出し、確かにゲルへの吸着を検出した。一方、毒を蓄積しない閉殻筋から精製したものは、吸着しなかった。また、トリプシン消化後のマスフラグメントとCD測定による二次構造の比較では、ともに両組織から精製したタンパク質に明確な違いはなかった。なお、毒の11位を介して結合させたSTX結合アフィニティーゲルに、ホタテガイ外套膜抽出液を供したところ、トロポミオシンも含めて、選択的な濃縮は検出されなかった。これまで、ホタテガイにおける毒の組織分布や種間での毒蓄積能の違いなど、その原因は不明であった。本研究により、どの組織にも普遍的に存在しているトロポミオシンが毒に親和性を示し、かつその親和性が組織間で異なることを見いだし、ホタテガイ組織における毒の組織分布に関わっている可能性を提示した。また、アフィニティーゲル上の毒との相互作用は弱く、特に、11位を含むC環部側を認識した。リガンドに毒の多様性を反映させるため、dcGTX2/3の13位にカルボン酸を導入した新規誘導体(HS・dcGTX2/3)を高収率で調製し、NMRによって、その構造を確認した。本誘導体をゲルへ導入することはできたが、実用には反応条件の改善が必要であった。以上から、毒結合アフィニティーゲルを使い、麻痺性貝毒結合タンパク質を探索する研究手法の有用性と方向性の正しさを示すことができた。今後は、特定したタンパク質の毒親和性の評価系の開発が重要な課題となる。2006年7月に採取した、岩手県大船渡湾産の毒化ホタテガイ(Patinopecten yessoensis)3個体を使って、麻痒性貝毒の組織分布(中腸腺、外套膜、エラ、閉殻筋、生殖巣、その他(水管、腎含む))を、蛍光化HPLCで調べた。各組織は、AOAC法に準じて、抽出液を調製し、分析用試料とした。その結果、毒量は中腸腺が最も多く(98nmol/g,58%)、主要毒は11位に硫酸エステル基をもつゴニオトキシン1/4(GTX1/4)とGTX2/3であった。サキシトキシン群(STX, neoSTX)も少量含んでいた。以下、外套膜(22%)、その他(15%)、生殖巣とエラ(3%)、閉殻筋(<1%)の順さあった。各組織の毒組成を比較したところ、中腸腺以外は、GTX2/3を主要毒としていた。なお、毒力も同じ比率であった。上記結果を踏まえて、麻痺性貝毒結合タンパク質の探索には、11位に硫酸エステル基をもつ毒誘導体を結合させたアフィニティーゲルが有効であると判断した。そこで、dcGTX2/3を出発原料とし、室温、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させ、dcGTX2/3のコハク酸誘導体を調製した。現在は、精製中である。次に、ホタテガイ体内における麻痺性貝毒結合タンパク質の探索を行なった。無毒ホタテガイと有毒ホタテガイを使い、実験対象組織には、毒を比較的高濃度に蓄積する外套膜を選んだ。dcSTX-アフィニティーゲルを使い、対照としてアセチル化ゲルを用いた。組織抽出液をゲルに供し、溶出タンパク質を比較した。SDS-PAGEによる比較の結果、無毒試料において、選択的に濃縮された数本のバンドを認めそのうちの一つが、筋収縮に関わる調節タンパク質であるトロポミオシンと同定した。現在、ホタテガイからトロポミオシンを精製し、真にSTX結合能を持っかどうか調べている。なお、有毒試料は元来、毒を含んでいるため、前処理法を検討する必要があると考えられる。最後に、実験に必要な出発原料であるdcSTXやGTX2/3を精製・単離した。その後、二種類Q毒誘導体(CET-STXとHS-dcSTX)を調製し、H19年度、結合タンパク質の探索実験を行うのに充分な基質量を確保した。

本研究により、どの組織にも普遍的に存在しているトロポミオシンが毒に親和性を示し、かつその親和性が組織間で異なることを見いだし、ホタテガイ組織における毒の組織分布に関わっている可能性を提示した。また、アフィニティーゲル上の毒との相互作用は弱く、特に、11位を含むC環部側を認識した。リガンドに毒の多様性を反映させるため、dcGTX2/3の13位にカルボン酸を導入した新規誘導体(HS・dcGTX2/3)を高収率で調製し、NMRによって、その構造を確認した。本誘導体をゲルへ導入することはできたが、実用には反応条件の改善が必要であった。以上から、毒結合アフィニティーゲルを使い、麻痺性貝毒結合タンパク質を探索する研究手法の有用性と方向性の正しさを示すことができた。今後は、特定したタンパク質の毒親和性の評価系の開発が重要な課題となる。
膵癌細胞の浸潤・転移に関わるメッセンジャーRNAを標的としたRNA干渉剤の開発

膵癌細胞に形成された葉状仮足(Lamellipodia)に運ばれる特定のメッセンジャーRNA (mRNA)が葉状仮足において局所翻訳されることにより、浸潤・転移が亢進する新しい機序を明らかにした。この機序に関わる19種類のmRNAを次世代シークエンサーにより網羅的に同定した。19種類のmRNAの葉状仮足における局所翻訳を抑制することができれば、膵癌細胞の浸潤を減少させ、遠隔転移を防ぐ可能性がある。本研究では、(1)膵癌細胞の浸潤・転移に関わっている19種類のmRNAを標的とするRNA干渉の一つであるsmall interfering RNA(siRNA)の同定、(2)経静脈的に投与されたsiRNAを膵癌細胞まで効率よく輸送するために、膵癌細胞膜上に高発現している葉酸レセプターに結合する葉酸ナノ粒子を用いたsiRNAデリバリーシステムの開発を目的とする。19種類のmRNAを標的とした葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子の付加された各siRNAを膵癌浸潤・転移マウスモデルに静注投与した。その結果、膵癌原発巣からの後腹膜浸潤と肺・肝臓への転移を抑制するsiRNAを同定することができた。葉酸ナノ粒子を付加したsiRNAをヒト膵癌浸潤・転移モデルマウスに静脈注射により投与した。葉酸ナノ粒子付加siRNAが、マウス膵臓内に形成された膵癌組織に集積することをインビボイメージングシステムにより確認後、膵癌原発巣からの後腹膜浸潤と肺・肝臓転移を抑制する効果を病理組織学的に評価した。その結果、浸潤・転移抑制効果の強いsiRNA配列を抽出することにより、RNA干渉剤開発の基盤データを得ることができ、順調に研究計画を遂行できている。マウスを用いた葉酸ナノ粒子付加siRNAの毒性試験を実施する:10週齢マウスから全血採取する。血清を除去し、血球をPBSで希釈する。葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子のみ、および葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加したスクランブルコントロールsiRNAをそれぞれPBSで希釈したマウス血球に添加し、37°Cで1時間インキュベートする。用いるナノ粒子の投与量を1mg/mLから10mg/mLの範囲で割り振る。OD測定を行い、赤血球溶血の有無を検討する。次に、6週齢ヌードマウスを用いた毒性試験を行う。葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子のみ、および葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加したスクランブルコントロールsiRNAの経静脈投与を1回/週の頻度で6週間行った後、全マウスから全血採取する。各群5匹にて実施する。血清を分離し、外注検査(和光)に提出する。肝・腎・膵機能検査を行い、PBSのみを投与したコントロール群(ヌードマウス5匹)と比較を行い、肝・腎・膵に機能異常が生じていないかを検討する。さらに、全血採取後にマウス重要臓器(脳・肺・肝臓・膵臓・腎臓・骨髄)を摘出し、ホルマリン固定する。ヘマトキシリン&エオジン染色を行い、組織標本を作成する。重要臓器に病理組織学的に異常がないかを調べる。予後不良である膵癌に対する手術以外の治療法は、最近エルロチニブや多剤併用抗癌剤療法が認可されたが、重篤な副作用が高頻度に出現し、理想的な治療法からは程遠い状況である。それぞれのmRNAに対するsiRNAを合成し、葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加した。細胞実験にてノックダウン効果を確認し、ヒト膵癌細胞株を膵臓に移植されたヌードマウスにそれぞれの葉酸ナノ粒子付加siRNAを1回/週の頻度で尾静脈へ静注投与した。4種類のmRNAに対するsiRNAが、後腹膜浸潤と肺・肝臓への転移を強力に抑制することを明らかにした。平成30年度に実施予定の4「マウスを用いた葉酸ナノ粒子付加siRNAの浸潤・転移抑制効果の検討」までを既に終了することができた。

本研究では、(1)膵癌細胞の浸潤・転移に関わっている19種類のmRNAを標的とするRNA干渉の一つであるsmall interfering RNA(siRNA)の同定、(2)経静脈的に投与されたsiRNAを膵癌細胞まで効率よく輸送するために、膵癌細胞膜上に高発現している葉酸レセプターに結合する葉酸ナノ粒子を用いたsiRNAデリバリーシステムの開発を目的とする。19種類のmRNAを標的とした葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子の付加された各siRNAを膵癌浸潤・転移マウスモデルに静注投与した。その結果、膵癌原発巣からの後腹膜浸潤と肺・肝臓への転移を抑制するsiRNAを同定することができた。葉酸ナノ粒子を付加したsiRNAをヒト膵癌浸潤・転移モデルマウスに静脈注射により投与した。葉酸ナノ粒子付加siRNAが、マウス膵臓内に形成された膵癌組織に集積することをインビボイメージングシステムにより確認後、膵癌原発巣からの後腹膜浸潤と肺・肝臓転移を抑制する効果を病理組織学的に評価した。その結果、浸潤・転移抑制効果の強いsiRNA配列を抽出することにより、RNA干渉剤開発の基盤データを得ることができ、順調に研究計画を遂行できている。1マウスを用いた葉酸ナノ粒子付加siRNAの毒性試験(担当;谷内、八幡): 10週齢マウスから全血採取する。血清を除去し、血球をPBSで希釈する。葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加したスクランブルコントロールsiRNAをそれぞれPBSで希釈したマウス血球に添加し、37°Cで1時間インキュベートする。OD測定を行い、赤血球溶血の有無を検討する。次に、6週齢ヌードマウスを用いた毒性試験を行う。葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加したスクランブルコントロールsiRNAの経静脈投与を1回/週の頻度で6週間行った後、全マウスから全血採取する。血清を外注検査(和光)に提出する。肝・腎・膵機能検査を行い、PBSのみを投与したコントロール群と比較を行い、肝・腎・膵に機能異常が生じていないかを検討する。さらに、全血採取後にマウス重要臓器(脳・肺・肝臓・膵臓・腎臓・骨髄)を摘出し、ホルマリン固定する。ヘマトキシリン&エオジン染色を行い、組織標本を作成する。重要臓器に病理組織学的に異常がないかを調べる。2膵癌浸潤・転移抑制効果の強い複数のsiRNAのカクテル化を行う(担当;谷内、八幡):マウス実験において浸潤転移抑制効果を認めたsiRNAに対し、葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子による修飾を行い、カクテル化する。ヒト膵癌浸潤・転移モデルマウスに投与する。マウス膵臓に移植したヒト膵癌組織からの後腹膜浸潤および肺・肝への転移が単独投与に比較して抑制効果が増強するかを検討する。抑制効果の強い上位のsiRNAを組み合わせてカクテル化を行い、最強の膵癌細胞浸潤・転移抑制効果のあるsiRNAの組み合わせを決定する。マウスを用いた葉酸ナノ粒子付加siRNAの毒性試験を実施する:10週齢マウスから全血採取する。葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子のみ、および葉酸-ポリエチレングリコール-陽イオン性ポリマーナノ粒子を付加したスクランブルコントロール
ニホンジカ個体郡の動態に関する遺伝生態学:多様性のDNA解析

(1)捕獲調査:集団サイズの異なる複数のニホンジカ個体郡を対象として、捕獲調査をおこなって遺伝子試料を採取した。採集地と標本数は、岩手県五葉山で78個体、宮城県金華山で56個体、鹿児島県種ケ島、沖永良部島および屋久島で計42個体、長崎県対馬で14個体であった。捕獲個体の性別、体重、推定年齢、妊娠の有無等を同時に記録した。(2)地域個体郡の遺伝的多様性の評価:個体郡の集団サイズと遺伝的多様性との関連を明らかにするために、捕獲して遺伝子試料をえたニホンジカ個体郡を調査対象として、DNAの変異を指標にして個体郡内多様度(intrapopulational diversity)を測定した。RAPD法をもちいて、それぞれの個体郡の遺伝的多様性の定量化を試みた結果、ニホンジカ個体郡の遺伝的多様性と集団サイズには負の相関があることが明らかになった。(3)個体郡内部構造の解析:RAPD法とDNAフィンガープリント法を併用して、単一個体郡の内部に、遺伝学的に区画化された部分構造が存在するか検証した。この調査においては、すでに繁殖率、生存曲線、群れ構造、家系構造などがある程度解明されている金華山島のホンシュウジカ集団を主な調査対象とした。その結果、これまで明らかにされてきた(南正人、高槻成紀ら、未発表)、金華山島ニホンジカ個体郡内部にみられるグループ構造(主として母系から構成される4つのグループ)ごとに、グループ内部の遺伝的多様性は低下していることが、明らかになった。このことは、金華山島のニホンジカ個体郡が、家系を中核として形成された数個の集団の集合体であることを、遺伝学的データから裏付けるものと考えられる。