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地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取り組みに関する研究

「地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取り組みに関する研究」では、平成12(2000)年度15(2003)年度の4年間、居住条件不利地域の典型的地域として長崎県五島地域を選定して、五島地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の具体的活動を五島列島の主島の福江島・中通島および小離島を調査対象地として、以下の調査研究を実施した。まず、社会学を中心にした島嶼社会研究およびEUの政策等を含む居住条件不利地域に関する理論的整理および居住条件不利地域における福祉社会の形成のエージェントに関する分析視角の検討を行なった。その結果として、居住条件不利性の要因および住民ニーズに対応した生活拠点施設の多機能化の傾向を明らかにした。次に、居住条件不利地域の中でも著しい不利地区で、高齢化が著しい小離島に居住している高齢者の生活実状の把握を目的にして、小離島住民調査を実施した。そして、その結果として、生活サービスへの高齢者の高いニーズや生活拠点施設の「隠れた」地域役割等を明らかにした。さらに、居住条件不利地域において高齢者が保持する社会関係が制度化することで、福祉社会の担い手が形成される事例の調査を実施した。その結果として、地縁関係および類縁関係・サービス関係の制度化の状況、そして寄り合い関係の制度化の可能性等を明らかにした。そして、これらの調査研究および研究成果を基にして、科学研究費補助金研究成果の報告書である『五島列島の高齢者と地域社会の戦略』を著している。地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取り組みに対する一連の研究において、平成12年度は、研究対象地とする居住条件不利地域に関して離島地域を選定して、文献研究及び実地調査を実施した。そのうち文献研究としては、まず、島嶼地域を研究対象とする社会学領域の先行研究を収集・整理した。その結果、島嶼地域研究の学史的展開の把握および島嶼地域における様々な居住条件不利性(日本の各地で発生した地域問題がさらに振幅して発生する島嶼地域の要因)の手がかりを見出すことができた。また、島嶼地域に関して、調査対象地を長崎県五島地域に選定するとともに、五島地域に関する文献の収集を五島地域・長崎県・福岡市・東京都で実施した。五島地域を対象とする実地調査に関して、ヒアリング調査および調査票調査を実施した。ヒアリング調査に関して、行政機関・行政関連機関・地域機関・地域の住民組織等、そして、宗教組織に対して実施した。介護保険法の施行前後にあたったが、五島地域では民間営利組織の参入がほとんど見られず、非営利組織による在宅福祉サービスがカバーしている状況で明らかになった。とりわけ、カトリック系の宗教法人の活動展開に地域の特徴が見出せた。また、地域の生活拠点機関である郵便局等による付加的サービス提供(居住条件不利地区に居住する独居高齢者等への声かけ・買い物代行など)が明らかになった。さらに、地域住民に対する調査票調査を実施して、居住条件不利地域の住民生活の状況、とりわけ高齢者独居世帯・高齢者夫婦世帯の生活状況の把握をめざした。現在、この調査票調査の結果については集計中である。なお、平成13年度も、島嶼社会を対象とする調査を継続する予定である。とりわけ、郵便局等の地域の生活拠点機関による対応、宗教組織による対応の把握をめざしている。地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取組みに対する一連の研究において、平成13年度は、前年度の成果に基づいて、島嶼地域(長崎県五島地域)における居住条件不利性の克服をめざす具体的活動に対する調査を行なった。まず、文献研究としては、東京都および長崎市において文献資料の収集・複写および情報収集を実施した。この研究に基づいて、地域杜会の生活拠点機関(郵便局・市役所支所等)が地域住民のニーズに対応するために、本来業務に付加して多様なサービスを提供する「多機能化」の側面を把握する視角を明確にした。そして、ヒアリング調査および調査票調査を内容とする地域調査で得た情報に基づいて、地域杜会の過疎化・高齢化に対する地域社会の積極的な対応として、非営利主体の一つである集落組織(町内会)による高齢者福祉施設づくりの経緯およびその意義を検討した。現在、居住条件不利地域の住民生活調査の結果を取りまとめている。

この調査を通して、居住住民の定住志向が非常に強いことが明らかになった。そして、こうした住民の定住を可能にするために、地域の生活拠点機関・地域サービスを維持していくことが地域課題の一つであることが判明した。さらに、行政設置型・民間設置型の施設づくりが困難な中で、五島地域においてカトリック修道会による高齢者福祉施設づくりが進んでいる状況についても、現在、研究中である。平成14年度は、この2点について調査・研究を進めて、成果を出すつもりでいる。「地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取組みに関する研究」では、平成14年度も、前年度の成果に基づいて、居住条件不利地域(長崎県五島地域)の高齢化に対する地域社会・地域組織の具体的活動を把握するために、引き続き調査対象地を五島列島の福江本島および小離島に設定して、調査・研究を実施した。まず、五島地域の中心地区(福江本島)で、ITを用いた地域振興および小離島高齢者の生活サポートをめざす市の施設(福江市IT振興センター)を運営しているNPOの活動展開をヒアリングするとともに、五島地域の高齢者の日常の社会関係を「寄り合い関係」と仮称し、その関係の特徴と機能に関する参与観察調査を実施した。また、小離島に関して、高齢化の進行する小離島(福江市椛島)を選定し、全島民(中学生以下を除く)を対象にした住民生活調査を実施した。この調査を通して、住民の高い定住志向、交通手段をもたない高齢者の生活ニーズ、そして、地域の生活拠点施設(郵便局・市役所支所・商店・診療所等)が地域住民のニーズに対応するために、本来業務に付加して移様なサービスを提供する「多機能化」の状況を把握した。他に、東京都で、文献資料の収集・複写および情報収集を実施した。なお、科学研究費補助金による研究の最終年の平成15年度は、3年間におよぶ調査・研究のまとめを中心に研究を実施する。その際補足調査を中心とした研究活動も実施し、年度内の研究報告書をめざしたい。地域の高齢化に対する地域社会・地域組織の認識と取り組みに対する一連の研究において、平成15年度は、平成12年度14年度の研究成果の生理および島嶼地域(長崎県五島地域)における細く調査を実施した。補足調査は、地域住民の高齢化への対応を中心市街地商店街の活性化策の一つとして実施した福江商工会議所および福江TMOのコミュニティバス・サービスに対して行なった。この調査を通して、地域住民の高齢化に対応して商店街が、いわば、「コミュニティ・ビジネス」の側面と強めている状況が明らかになった。また、本研究の成果に関して、これまで発表してきた論文を整理・加筆を行ない、現在、400字詰原稿用紙で約500枚の研究報告書を作成中である(平成16年4月中に発行予定)。
G蛋白を介するTGF-βの細胞外基質産生制御に関する研究

本研究の目的は、培養normal rat kidney cell(NRK)における細胞外基質-特にフィブロネクチン-の産生に対するTGF-βの作用が、G蛋白を介するかどうかを検討するとともに、その産生を阻害する方法を開発することにあった。NRKにおけるフィブロネクチンの産生は、TGF-βにより濃度依存性に増加し、この作用には細胞増殖を伴わないことが確認された。また、この作用は100nM百日咳毒素(PTX)により阻害されなかったことより、PTX非依存性であった。この作用機序をさらに検討するため、各種G蛋白(Gs,Gi2,Go,Gq)のαサブユニットの細胞内ドメインのアミノ酸配列を工夫し、化学的に1520個のペプチドを合成した。培養normal rat kidney cell(NRK)に対するTGF-βの作用を分泌されるフィブロネクチンの量を指標に、各々の合成ペプチドによる阻害作用を検討したところ、Goαの細胞内ドメインのペプチド(NNIQVVEDAVTDIIIANNLRGC)に阻害作用が認められた。このペプチドによる阻害作用は濃度依存性であり、500pM TGF-βの作用に対するEC50は1μMであった。この時点で、NRKにおいてTGF-βによるフィブロネクチン産生促進作用には、Goが関与している可能性がある。ただし、この22個のペプチドが培養上清から細胞内に取り込まれる必要がある。この問題をクリア-するために、FITCを標識したペプチドを投与し、細胞内の局在を確認した。また、このアミノ酸配列を認識するcDNAを作製し、lipofectinを用いてtransfectし、細胞内で発現させることによりペプチドの阻害作用を確認した。よって、この合成ペプチドによりTGF-βによる細胞外基質産生促進作用を制御できる可能性があり、この作用が特異性をもつかどうかが今後の課題である。本研究の目的は、正常ラット腎間質由来の線維芽細胞(NRK細胞)における細胞外基質-特にフィブロネクチン(FN)産生に対するTGF-βの作用が、G蛋白を介するかどうかを検討することにある。今年度は、まずNRK細胞におけるFN産生はTGF-βにより濃度依存性に促進され、この作用には細胞増殖の増加を伴わないことを確認した。また、百日咳毒素(PT)依存性のGiやGoを介するかどうか検討したところ、TGF-βによるFN産生促進作用は100nMのPT、5時間処理により抑制されなかったことより、PT非依存性であった。Nishimotoらの報告(J.Biol.Chem.269:13756,1994)に準じてGs,Gi2,Goのαサブユニットの細胞内ドメインを合成し、その作用を検討したところGoα内のシークエンス(NNIQVVEDAVTDIIIANNLRGC)にTGF-βによるFN産生促進作用を阻害する効果が確認された。よって、現時点ではNRKにおけるFN産生に対するTGF-βの作用には、PT非依存性のGoが関与している可能性が大である。今後は、このペプチドによる作用が特異的なものかどうか検討するため、このシークエンスをコードするcDNAを合成する。さらに、それをNRK細胞にtransfectすることにより蛋白が発現していることを確認した上で、TGF-βの作用を阻害するかどうか検討する予定である。平成7年度の結果をふまえて、各種G蛋白(Gs,Gi2,Go,Gq)のαサブユニットの細胞内ドメインのアミノ酸配列を工夫し、化学的に1520個のペプチドを合成した。

このペプチドによる阻害作用は濃度依存性であり、500pM TGF-βの作用に対するEC50は1μMであった。この時点で、NRKにおいてTGF-βによるフィブロネクチン産生促進作用には、Goが関与している可能性がある。ただし、この22個のペプチドが培養上清から細胞内に取り込まれる必要がある。この問題をクリア-するために、FITCを標識したペプチドを投与し、細胞内の局在を確認した。また、このアミノ酸配列を認識するcDNAを作製し、lipofectinを用いてtransfectし、細胞内で発現させることによりペプチドの阻害作用を確認した。
高専生の特徴を生かした効果的な英語語彙学習のための調査研究

本研究は、英語学習の基本となる語彙学習に焦点をあて、より効果的な語彙獲得のための学習方法や指導方法を実証することを目的として、調査研究を主として行った。語彙学習は、普段の授業では、指導する時間がなかなかとれず、小テストを実施することで、各学習者の自学習として取り扱う形になってしまう。本研究では、語彙学習の時間を授業に組み入れ、「書く」「読む」指導を中心に実施した結果、特に低学年には語彙習得とその後の学習に効果があることが明らかになった。本研究は、英語学習の基本となる語彙学習に焦点をあてた調査研究を主として行い、より効果的な語彙獲得のための学習方法や指導方法を実証することを目的にしている。今年度は、研究実施計画に沿った、次にあげる2つの調査研究を主に行った。調査研究(1)COCET3300(語彙集、オンライン語彙学習サイト)に不足している点を明確にする。調査研究(2)異なる語彙学習の方法による学習意欲や語彙力の相違点を明らかにする。これらの調査で対象にしたのは、本研究者が授業を担当している本校1、2年生の学生である。学習者は、この一年間、OCET3300を使って語彙学習を実践してきた。1年生→語彙集は使わず、オンライン語彙学習サイトのみの学習。定期的な小テストなどは行わない。2年生→オンライン語彙学習サイトの他、語彙集を与え、前・後期で16回の定期的な小テストを実施。両学習者とも、オンライン語彙学習を長期(夏季、冬季)休暇の課題とし、獲得したスコアを英語の平常点に加点した。両学者に対し、上記にあげた調査に関するアンケート調査を学年末に行った。また、本研究者が授業で直接関わる中で、両学習者の学習方法を比較した結果、次のようなことが明らかになった。パソコンを使って語彙学習を行うのは、学習者がとりかかりやすいという点で動機づけとしてはいいが、単調になりがちで、継続して続けるには指導者側がいろいろ工夫しなければならない。また、パソコンを使える環境を設定しなければならない。そういう点では、ちょっと時間が空いた時にすぐとりかかれる語彙集の方が、手軽に学習できるというメリットがある。語彙集には、その単語を用いた例文や解説が提示されているので、単に、単語のみを学習していくオンライン学習より、その語の使い方などが学習でき、記憶の保持にも効果があったようだ。どちらの学習方法を用いるにせよ、(特に高専生のように英語に対して苦手意識を持っている学生が多い)学習者にとって、語彙学習を継続的に効果的に行っていくには、指導者側のさまざまな工夫が必須で、他の要素(読む、聞くなど)と上手に関連づけた総合的な学習方法を考案することが重要であると改めて感じた。本研究は、英語学習の基本となる語彙学習に焦点をあて、より効果的な語彙習得のための学習方法や指導方法を実証することを目的としておこなった。平成17年度に、科研費プロジェクトメンバーの一員として共同研究に携わり、その研究成果として理工系学生のための語彙集、『COCET3300』を出版した。本研究では、その改訂版である『COCET2600』を使用し、本研究者が担当する学習者(高専2年生)を対象にして調査を行った。語彙学習は、授業中に指導するというよりも、単語テストを実施するために範囲を決め、各個人の自学習として取り扱われることが一般的であるが、「その場限りのテストのための勉強」になりがちで、その後の語彙の定着につながっていないことが明らかになった。そこで、本研究では、語彙学習のための時間を7、8分程度、授業時間の中に取り入れ、「書く」作業を中心に指導した結果、特に低学年には効果的であった。語彙学習の定着を促すため、「書く」に加え、「読む」(発音練習)作業を実施したり、テスト範囲のワークシートを配布し、テスト当日に提出を義務付けることなどを継続して行い、年度末のアンケート調査を分析した結果、より多くの学習者が語彙学習の意義を実感し、今後の語彙学習の動機づけにつながったことが明らかにされた。本研究では、全国の高専を訪問し、各高専の地域性が与える学習環境と学生の英語学習や英語能力との関連性を明らかにするという調査研究もあったが、この調査は、本研究者の自己都合で出張に出かけることが不可能で、満足のいく結果がでていない。訪問という形はとれなかったが、メールで問い合わせたり、研究会などで会った先生方に簡単なアンケートを依頼するという調査で補ったが、実際に各高専を訪問し、そこの学生にインタビューをすることを目的としているので、今後の研究調査として継続していく予定である。一つめの調査研究である「より効果的な語彙獲得のための学習方法や指導方法」について、本研究者の学習者を対象にして行った。

これまでの語彙学習は、授業中に指導するというよりも、単語テストを実施するために範囲を決め、各個人の自学習として実践してきたが、「その場限りのテストのための勉強」となりがちで、語彙の定着につながっていないことが明らかにされた。そこで、本調査では、語彙学習のための時間(7,8分)を授業時間の中に組み入れ、「書く」作業を中心に行うように指導した。特に低学年には効果的であることが明らかになった。次年度の調査では、「書く」に加え、「読む」ことも実践し、より効果的な語彙の定着を目指すつもりである。本年度予定していた二つめの調査研究は、全国の高専を訪問し、実際にそこの高専の学生にインタビューなどを行い、各高専の地域性(学習環境)と学生の英語学習や英語能力との関連性を明らかにするものであった。この調査は、本研究者が出張に行くことができず、メールや電話での先生方とのやりとりのみしかできなかった。次年度に実施するためのより具体的な計画をたて、準備することができたので、次年度は、実際にこの計画を実行していく。本年度は、途中で中断していた研究を年度途中から再開し、それまで取り組んでいた状況などが異なっていたこともあり、なかなか計画通りに調査や研究を進めることができなかった。次年度は、本年度にやり残している調査を早めに仕上げ、本年度の調査を計画的に進め、本研究の集大成となるようしっかり取り組んでいきたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。年度途中の8月に育児休暇から復帰し、研究も再開させたが、慣れない育児と仕事との両立で、毎日の授業を行うことがせいいっぱいになってしまい、研究に費やす時間がなかなか取れなかった。それに加え、当初の計画で行う予定だった学習者の調査は、対象となる学生を授業担当者としてもつことができず(後期から授業を担当することになったこともあり)、実践できなかった。さらに、WEB教材の廃止や語彙集の改訂などもあり、当初計画していた調査での使用教材も変更する必要があり、その切り替え準備に時間を割いてしまった。24年度からは、各高専を訪問し、高専の地域性や学生のおかれた学習環境と英語を学習する動機や実際の学習実態を調査する予定であったが、宿泊を伴う出張することができず、メールや電話での調査となってしまい、必要なデータがまだ不十分な状態である。前年度にやり残した調査を早めに終え、研究最終年度となるH25年度は、高専関係の学会を中心とした研究会でその成果を発表したり、冊子にまとめて各高専へ配布するなど、本研究成果の集大成を行うつもりである。今年度取り組む調査は以下のような時期や期間で実施する予定である。新年度の授業が始まる前までに、改定された語彙集の学習の進め方や各学年の学習する単語の割り振りを行い、WEB教材への登録などを済ませる(4月初旬)。提案する語彙学習を学生に実施し(4月から2月初旬まで)、4回の中間・定期試験(6月中旬、9月末、11月末、2月初旬)のテストの成績をデータ化(2月末まで)し、語彙学習に関するアンケートを学生に実施(学年末試験終了後の2月中旬)する。学生の成績のデータやアンケートから得られた回答を分析し、新しく提案する語彙指導の効果と学習の成果を実証し、冊子などにまとめ、研究発表の準備などを進める(3月中)。また、夏休み(7、8月)の長期休暇中に、実際に各高専を訪れ、学生や先生方に直接インタビューなどを実施する調査を計画している。
チロシン特異的ホスファターゼSHP-2を介した成長軟骨制御機構の解明

SHP-2は主としてMAPK (Erk)活性の陽性調節因子として機能すると考えられている。SHP-2活性の変化によりMAPK活性も変化し、成長障害に至るという作業仮説を検証するため以下の実験を行った。(a)軟骨細胞分化の検討ATDC5細胞に野生型SHP-2およびNS、LS患者より同定したSHP-2変異(D61N、Q510E)をアデノウイルスベクターにより強制発現後、軟骨細胞初期分化マーカーである転写因子sox9のmRNAをreal-time PCRで定量したところ、いずれの変異によってもsox9 mRNAの発現は増加した。一方sox9/sox5/sox6複合体により発現が増加することが知られているcol2a1 mRNAには明らかな増加が認められなかった。col2a1プロモーター下にルシフェラーゼを挿入したベクターを用いたレポーターアッセイでも、野生型SHP-2、D61NまたはQ510E変異SHP-2いずれによっても明らかな増加は認められなかった。短期間で軟骨分化を促進させるAlginate bead培養系を用い、軟骨細胞後期分化マーカーであるColXの発現を検討したところ、野生型SHP-2、D61NまたはQ510E変異SHP-2のいずれを導入してもColX mRNAの発現は抑制された。(b)シグナル伝達経路(MAPK系)の検討ATDC5細胞に野生型、変異SHP-2をアデノウイルスベクターにより強制発現後、FGF2添加によるMAPK活性を詳細に検討したところ、低濃度(50pg/ml)でMAPK活性はD61N変異により増強、Q510E変異により抑制された。(c)軟骨細胞増殖の検討野生型、変異SHP-2導入後、細胞数をカウントしたが、変異による細胞増殖への影響は認められなかった。以上より変異SHP-2はMAPKを介さない経路で主に軟骨分化を阻害していることが示唆された。(1)変異SHP-2恒常発現細胞株、アデノウイルスベクターの作製SHP-2変異の軟骨に対する作用およびその分子基盤を検討するため、軟骨細胞のすべての分化段階を再現できるマウス軟骨細胞由来ATDC5細胞株を用い、Noonan症候群・LEOPARD症候群患者より同定したSFP-2変異の恒常発現株作成を試みた。しかし、導入した変異に関わりなく個々のクローンの形態にばらつきが認められ、遺伝子導入による効果を上回ると考えられたため、恒常発現細胞株の樹立は断念した。アデノウイルスベクターによる遺伝子導入ではWestern blot法により、タンパクの発現が確認された。それぞれの変異タンパクを免疫沈降後、ホスファターゼ活性の変化を測定したところ、予想通り活性の上昇する変異が認められた。その一方で予想に反し、活性の低下する変異も認められた。(2)軟骨細胞の分化・増殖・アポトーシスおよびそのシグナル伝達経路の検討アデノウイルスベクターを用い、ATDC5細胞に各種変異SHP-2を強制発現し、BrdU取り込みにより細胞増殖能を検討したところ、定常状態においてホスファターゼ活性に関わりなく細胞増殖促進効果が認められた。また、変異SHP-2導入により、FGF2添加によるMAPK活性化は影響を受けなかったが、インスリン添加によるMAPK活性化は減弱する傾向が認められた。軟骨分化については、短期間で分化を促進させることが知られているAlginate bead培養系を用い、ColX発現を指標として分化を評価する実験系を確立した。(3)軟骨細胞の細胞運動、細胞骨格およびそのシグナル伝達経路の検討変異SHP-2導入したATDC5細胞では、野生型SHP-2導入時と比較し、細胞質の収縮および多数の糸状仮足が認められた。(a)軟骨細胞分化の検討軟骨細胞のすべての分化段階を再現できるマウス軟骨細胞由来のATDC

5細胞に野生型SHP-2およびNoonan症候群、LEOPARD症候群患者より同定したSHP-2変異をアデノウイルスベクターにより強制発現後、軟骨細胞初期分化マーカーである転写因子sox9のmRNAをreal-time PCRで定量した。野生型SHP-2の強制発現によりsox9 mRNAの発現は増加し、この効果は機能獲得型のD61N変異、および機能喪失型(優位阻害型?)のQ510E変異いずれによっても増強された。また、sox9により転写活性が促進されるcol2alプロモーター下にルシフェラーゼを挿入したベクターを用いたレポーターアッセイでも同禄に、野生型SHP-2によりルシフェラーゼ活性の増加が認められ、この効果はD61NおよびQ510E変異により増強された。以上よりNoonan症候群、LEOPARD症候群ではSHP-2変異により軟骨細胞のsox9の発現量が増加し、正常な軟骨分化・成長を阻害する可能性が示唆された。(b)シグナル伝達系路の検討
多数の分子複合体からセントロメア自己抗原を選択誘導する刺激応答の解明

セントロメア抗体の産生機序、ひいては強皮症の発症病理の解明のため、何故40種類以上の蛋白複合体から、一部の蛋白のみが選択的に自己抗原足りえるのか、差別化の刺激応答を解明することが研究のテーマであった。3種の主要セントロメア自己抗原とは異なり自己抗原としての報告が殆ど見られない9種の蛋白について、多数例の患者自己抗体を用いて反応性を調べたが、陽性例は僅かにとどまることが確認された。今のところその差別化要因は明らかになっていない。抗セントロメア抗体は強皮症患者血清中に存在する自己抗体の対応抗原として有名であるが、その産生機序については不明である。従来、患者自己抗体を利用して、cDNAライブラリーをスクリーニングする手法等により代表的なセントロメア自己抗原として3種類の自己抗原CENP-A, -B, -Cが同定されてきた。近年、セントロメア抗原の新たな同定法としてプロテオミクスが導入され、多数の新規セントロメア抗原が同定されるに至った。今年度の研究では細胞周期を通じてセントロメアに局在することが新たに判明したCENP-H, -I, -K, -L, -M, -N,-O, -T, -Uの9種類の蛋白について、大腸菌発現リコンビナント蛋白を精製し、患者抗セントロメア抗体の反応をウエスタンブロットやELISA法により調べた。強皮症をはじめとする多数の自己免疫疾患患者血清や健常人血清について検討した結果、これまで私たちが詳細に検討してきた自己抗原CENP-A, -B, -Cとの反応性に対して、プロテオミクスで発見された上記9種の蛋白については、ごく少数例の反応性しか認められず、反応する血清も抗セントロメア抗体陽性例に限られた。その中で、CENP-Oに非常に強く反応した血清が1例(他にも弱く反応する血清が4例)存在した。この症例は典型的な限局型強皮症を長年罹患、経過観察中に急速に皮膚硬化の範囲が進行して、びまん型強皮症に進展したという非常に珍しい症例であった。上記9種類の、いわゆるセントロメアの"マイナー自己抗原"に対する反応性の違いで、抗セントロメア抗体陽性例のさらなる病型分類や、ある特定の症状との関連付けができる可能性を示唆したといえよう。上記の結果は国際専門誌Journal of Rheumatologyに受諾、出版が予定されている。従来、患者自己抗体を利用して、cDNAライブラリーをスクリーニングする手法等により代表的なセントロメア自己抗原として3種類の自己抗原CENP-A,-B,-Cが同定されてきた。プロテオミクス解析により細胞周期を通じてセントロメアに局在することが新たに判明したCENP-H,-I,-K,-L,-M,-N,-O,-T,-Uの9種類の蛋白については、CENP-Oについてはごく少数例が反応することが明らかになったが、それ以外の蛋白については、ほとんどの血清が反応しなかった。これまで、傍セントロメア領域に存在するといわれているヘテロクロマチン蛋白1(HP1)についても、反応性の有無を調べるべく、抗体測定系としてのELISAを確立することに成功し、これまでの報告に比して、抗セントロメア抗体に抗HP1抗体が並存する割合は高いことが判明した。さらにはほとんどの抗セントロメア抗体が反応するCENP-A,-B,-Cに関しては、反応性の強弱を判定する必要性から、これら3種類のメジャーエピトープ部分の計5箇所の領域についてもそれぞれのELISAを確立できた。これらは、各蛋白に対する患者間の反応性の差異を詳細に検討できるのみならず、各種蛋白との相互作用が予想される分子による高原性の変化などを調べていく上で重要な研究手段となりうると考える。強皮症患者において、皮膚硬化範囲の比較的狭いタイプに見出される自己抗体である抗セントロメア抗体は診断において重要な血清学的マーカーとなっている。その対応抗原である染色体セントロメア領域は数多くの蛋白による複合体から成ることがわかってきた。従来から判明しているセントロメアの主要自己抗原はセントロメア蛋白(CENP)-A,-B,-Cの3種類の他に、近年のプロテオミクス解析により新規に同定されたセントロメア蛋白に対する反応性を、多数の自己免疫疾患患者血清や健常人血清について検討した。CENP-H,-I,-K,-L,-M,-N,-O,-T,-Uの9種類について、大腸菌発現リコンビナント蛋白を精製し、患者抗セントロメア抗体の反応をウエスタンブロットやELISA法により調べたところ、CENP-0に対して数例の陽性例が見つかったものの、他のCENPに対する自己抗体は殆ど検出されなかった。

次に、自己抗原であるセントロメア蛋白と非自己抗原であるセントロメア抗原との差別化をもたらす細胞刺激を解明するために、各種CENPの遺伝子を導入した培養細胞を用いて、各種薬剤による小胞体ストレス誘導や紫外線刺激によるアポトーシス誘導時におけるCENPの局在と発現の変化を蛍光顕微鏡により、また抗体を所有するCENPに関しては遺伝子未導入の培養細胞を用いた蛍光抗体法により調べたが、自己抗原群と非自己抗原群を明らかに差別化するような因子は同定できなかった。そこで、次にCENP-Bと特異的に結合する配列を持ったアルフォイドDNAと、その配列を持たないアルフォイドDNAの血清中の存在比をRT-PCRを用い抗体陽性者と陰性者で調べたところ、抗体陽性者に結合配列を持ったDNAが陰性者に比べて多く存在する傾向を認めた。今後、症例数を増やして検討を重ね、抗体産生に重要な因子を探っていきたい。
ヒト化マウス作製技術により明らかにする脳神経系発生発達多様性の分子的基盤

ヒトでは遺伝情報を書き換えることはできないが、実験用マウスではゲノム編集を行うことができ、脳活動・行動様式へのゲノム改変の影響を調べることによって、「個性」を客観的・科学的に理解する手段となる。この研究では、家族や仲間同士のコミュニケーションを促進するホルモンとして知られるオキシトシンに着目し、脳内でオキシトシンを受け取る受容体の発現変化と脳活動の関わりを、ゲノム編集技術を駆使して解析する。
ヒルシュスプルング病および類縁疾患の乳歯歯髄幹細胞を用いた新規治療法の開発

小児期に発症し蠕動不全のため機能的腸管不全をきたす疾患に、ヒルシュスプルング病とその類縁疾患がある。このうち、腸管神経節細胞僅少症(本症)は神経節細胞は存在するもののその数が少なく、腸管運動不全をきたす難病であり、現在唯一の根治術は小腸移植であるが、強い拒絶反応から本邦での実施は容易ではない。小腸移植に代わる新規治療法として我々は再生医療に注目した。脱落乳歯より抽出した細胞を投与することで、腸管の運動を改善させることができれば、この病気を治すことができる。現在われわれは動物倫理に則った上で行っている実験において本症モデル動物に対して腸管の運動の改善に成功した。本研究における対象疾患のうち,Hypoganglionosisを最初の研究対象とした.Hypoganglionosisは正常腸管に比べ病理組織学的に腸管神経節細胞が数的に少なく,神経叢の面積も小さいため腸管機能不全を呈す疾患である.また,H病の原因としてエンドセリン受容体タイプBの欠損がいわれているが,そのエンドセリン受容体タイプBのmRNAの発現量低下を先天的に認める近交体系マウス(Japanese Fancy 1;JF1)をHypoganglionosisモデルマウスとして用いた.JF1マウスはwild typeのマウスに比較して体重が少なく,その腸管神経叢の神経線維の密度が低く,その程度は近位空腸に比較し遠位結腸で統計学的に有意であることが知られている.結果,統計学的有意差は得られなかったものの結腸に対するAChE染色にて神経線維の密度の上昇及び神経叢の面積の増大,HE染色にて神経節細胞数の増加を認めた.また,食事・水分摂取量には継時的変化はなかったがSHED投与を行っていないcontrol群に比較し,静注群では体重増加を認めた.以上より,SHEDを静注したことにより病理組織学的に腸管神経の改善傾向が得られ,臨床的には体重増加傾向が得られた可能性が示唆される.平成25年度に実施した研究成果の意義・重要性SHEDを静脈的に全身投与することで腸管神経叢に対し病理組織学的な改善傾向、及び体重増加という臨床的な改善傾向を認めた.腸管機能不全に対しSHED投与が有効である可能性を示唆しえた結果として重要性がある.H26年度の研究実施計画に記した1)歯髄幹細胞から腸管神経系細胞への分化誘導に関して、その前段階実験として、未分化の歯髄幹細胞をヒルシュスプルング病類縁疾患(H類縁)モデルマウスに投与し、その効果を臨床的・病理組織学的・電気生理学的に解析を行った。その結果、下記3)に示す如く極めて示唆に富む結果を得たため、分化誘導に関する実験は本研究系に引き続き遂行する予定と変更した。2)免疫寛容性の検討に関しては当該年度には実施することはできなかった。3)H類縁モデルマウスに歯髄幹細胞を投与した結果、臨床的所見として、phenotypeの改善、糞便数の増加を認め、病理組織学的評価としては、神経節細胞数の増加を認め、また、投与した幹細胞の腸管における生着を確認した。電気生理学的評価においても、腸管収縮能及び弛緩能の改善を認めた。この効果は、投与後約3か月より現れ始め、約3ヵ月間効果を認めたと思われる。色素経口による腸管蠕動試験は未実施であるが、蛍光標的試薬を用いた腸管蠕動試験に関して現在実験系の確立を行っている。4)本治療の適応基準の検討に関しては、九州大学病院小児外科及び関連病院参加で行われる合同症例検討会にて症例の共有を定期的に行い、H23-25年度厚労省難治性疾患等克服研究事業(田口班)から得られる全国調査をもとに検討を続けている。小児外科学分野研究計画・方法のH25年度の方針として,モデルマウスを用いた細胞移植の効果の検討に関しては見解を得,神経ネットワークの再生の可能性を見出すことができたが,細胞の生着に関しては未だ確認できていない.細胞生着の有無に関して病理組織学的検討(免疫組織化学)による解明を現在遂行中である.生理学的な腸管機能の解析に関しては下記の推進方策の如く現在,準備を進めているところである.その他の項目である1)乳歯幹細胞から神経節細胞・グリア細胞・Cajal細胞への分化誘導,2)誘導細胞の免疫寛容性の検討(in vitro)に関しては現在未着手であり,次年度に着手及び見解を得る予定である.AChE染色にて神経線維の密度及び面積の増加及びHE染色にて神経節細胞数の増加傾向という結果を得たが,その成果が,SHED由来細胞の生着であるのか,マウス由来の細胞の増加であるのか未確認である.

この点で,SHEDの作用として,1)細胞そのものの生着による効果,2)SHEDが分泌したtrophic factorによる効果であるのかを検討する必要がある.この検討に関して現在,免疫組織化学にて,HLA-ABC抗体を用いた評価,抗NeurofilamentM抗体・抗c-kit抗体・抗Hu C/D抗体・抗CD56抗体の各抗体においてそれぞれreactivityをヒトのみ及びマウスのみのものを用い評価する予定である.生化学的評価として,血液検査にて栄養の評価を行う予定であり,腸管機能の生理学的解析としてはオーガンバスを用いた評価の準備を進めている渦中である.オーガンバスは採取直後の腸管に電気刺激を与え得られた波形を記録するものであり,腸管の収縮及び弛緩の様子を視覚的にとらえることができる評価方法である.SHEDの神経系細胞への分化誘導及びSHED由来神経系細胞の免疫寛容性の検討に関しても,上記実験と並行し行ってゆく予定である.乳歯幹細胞から神経節細胞・グリア細胞・Cajal細胞への分化誘導,誘導細胞の免疫寛容性の検討(in vitro)に関して未着手のため細胞生着の有無に関して病理組織学的検討(免疫組織化学)による解明を遂行する
メンタルストレスで生ずる活性酸素種の同定と抗酸化物質によるストレス軽減法の検討

本研究の目的は非侵襲的で簡便に採取できる唾液を用いて、メンタルストレスに関与する活性酸素種(ROS)による酸化ストレスの直接的な抗酸化物質評価法を確立し、災害関連死を含めたメンタルストレスによる疾患予防に役立つ評価法の開発である。平成28、29年度にかけての検討から、健常被験者の唾液におけるROSの役割の解明のため、唾液による電子スピン共鳴(ESR)法を用いたROSの検出・同定を試み、健常被験者の唾液によるROS消去能は確認された。平成30年度ではさらに、安静時唾液中のROSの消去能は、刺激唾液と比較して、すべての経過時間において安静時唾液で有意に高い値を示した。このように唾液のROS消去能は安静時唾液と刺激唾液で違いがあることが明らかになった。すべてのROS消去能では、刺激唾液に比較して安静時唾液で高値を示した。すなわち、採取する唾液について安静時唾液、刺激唾液の鑑別が必要であり、また、採取後4 °C保管における安静時唾液48時間以内、刺激唾液24時間以内ではESR測定値に影響を与えないことが明らかとなった。これにより、被災地での唾液採取の条件を基準化でき、定期的、継続的な唾液中の抗酸化能のモニタリングによる避難所・仮設住宅における個々の被災者の酸化ストレス度の変動による生活習慣病の予防、災害関連疾患の早期発見につながるリスク評価への応用の可能性が示唆された。の結果から、平成29年度より、抗酸化物質のメンタルストレス由来ROSへの消去能の解析による抗酸化物質のスクリーニングをおこなった。有効な抗酸化物質の絞り込みを実施するための基礎的実験として、代表的な抗酸化物質であるアスコルビン酸の検討なども行い、アスコルビン酸の唾液中ROS消去活性を確認し、抗酸化物質のスクリーニングに唾液を用いたESR法が有用であることが確認された。インフォームドコンセントが十分に得られた健常被験者40名における活性酸素種(ROS)の役割の解明のため、唾液による電子スピン共鳴(ESR)法を用いたROSの検出・同定による酸化ストレス・抗酸化能評価を実施した。また、抗酸化効果を確かめるために顎機能運動であるガムチューイングの効果を調べた。ESR法を用いて、前処理凍結保存をした前記被験者の唾液中のROSであるスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素の検出を行った。これらのROSに特異的な各種スピントラップ剤によりトラップして安定なラジカル種にして検出するESRスピントラップ法を駆使して、これらROSの検出を行った。その結果、ROSであるスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素については通常のESRの感度では検出が難しかった。次に、先のESRスピントラップ法を駆使してROS産生系に対する唾液消去能の解析を行った。ROSであるスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素の消去能はそれぞれのROSを産生させる方法を用いてコントロールとし、この系に前記対象者の唾液を反応させて唾液中のスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素の消去能(抗酸化能)として解析した。今回の被験者の唾液を用いた結果ではESRによるROSであるスーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素についてはいずれも、産生系のコントロールに対して消去活性を認めた。しかしながら、これら唾液のROSにおいてガムチューイング抗酸化効果は確認されなかった。以上の結果から、今後、メンタルストレスのある患者に対するROSの検出・同定により、今回の健常者のデータと比較することで、本方法による唾液を用いた酸化ストレス・抗酸化能評価の資質について、検討を行う必要があることが示唆された。当初平成28年度の計画は神奈川歯科大学付属病院(障害者歯科外来)、鶴見大学付属病院(ドライマウス外来)で、心療内科または精神科でメンタルストレスによる精神疾患の診断を受けた患者および歯科医師によってMedically unexplained symptom (MUS)が認められた患者においてスクリーニンクされた患者を対象とする予定であった。しかしながら、電子スピン共鳴(ESR)法による唾液を用いた酸化ストレス・抗酸化能評価の資質評価のためには健常者のデータをとる必要があったので、これを平成28年度に実施した。このために当初平成28年度の計画が遅れたので、平成29年度に当初の計画通りの被験者に対して唾液を用いた酸化ストレス・抗酸化能評価の資質評価を行うつもりである。メンタルストレスは活性酸素種(ROS)による酸化ストレスが原因の1つであるが、直接的なROSの役割の解明とそれを消去・無毒化する抗酸化物質の評価はこれまで行われていない。このことから,本研究の目的は非侵襲的で簡便に採取できる唾液を用いて、これらメンタルストレスの直接的な酸化ストレス・抗酸化物質評価法を確立し、災害関連死を含めたメンタルストレスによる疾患予防に役立つ評価法の開発を目指している。平成28、29年度にかけての検討から、健常被験者の唾液における活性酸素種(ROS)の役割の解明のため、唾液による電子スピン共鳴(ESR)法を用いたROSの検出・同定を試みたが、直接的に唾液からROSの産生を検出するのは、現状のESRによる方法論では難しい現状が確認された。しかしながら、健常被験者の唾液によるROS消去能は確認された。この結果から、平成29年度に当初の計画にある抗酸化物質のメンタルストレス由来ROSへの消去能の解析による抗酸化物質のスクリーニングをおこなった。有効な抗酸化物質の絞り込みを実施するための基礎的実験として、代表的な抗酸化物質であるアスコルビン酸の検討なども行い、アスコルビン酸の唾液中ROS消去活性を確認した。

また、遠隔地からの唾液サンプル測定可能かどうかを確かめるために、冷凍保存時間の検討を行い、唾液中のROS消去能は冷凍保存48時間においても消去活性に影響がみられないことも確認した。以上の結果から、今後進める酸化ストレスが原因であるメンタルストレスのある患者に対する唾液中のROS消去能の評価により、これまでの健常被験者のデータと比較する臨床研究の基盤は整った。当初できるだけ早く、神奈川歯科大学付属病院(障害者・高齢者歯科)、鶴見大学付属病院(ドライマウス外来)で、心療内科または精神科でメンタルストレスによる精神疾患の診断を受けた患者および歯科医師によってMedically unexplained symptom (MUS)が認められた患者においてスクリーニンクされた患者を対象として、臨床研究を進める予定であった。しかしながら、電子スピン共鳴(ESR)法による唾液を用いた当初計画していた酸化ストレスの直接的な評価が難しく、測定可能であった抗酸化能評価の検討と採取条件の調整のための基礎的実験をおこなう必要があったため、これらの実験を平成29年度に実施した。このために、当初平成28年度以来の患者への臨床応用研究が遅れた。平成30年度にはこの遅れを取り戻すために、MUS患者を中心とした被験者や災害地の避難所・仮設住宅の被験者に対して唾液を用いた抗酸化能評価の資質評価をこれまでの健常人の実験データと比較検討して、臨床応用研究をおこなうつもりである。本研究の目的は非侵襲的で簡便に採取できる唾液を用いて、メンタルストレスに関与する活性酸素種(ROS)による酸化ストレスの直接的な抗酸化物質評価法を確立し、災害関連死を含めたメンタルストレスによる疾患予防に役立つ評価法の開発である。平成28、29年度にかけての検討から、健常被験者の唾液におけるROSの役割の解明のため、唾液による電子スピン共鳴(ESR)法を用いたROSの検出・同定を試み、健常被験者の唾液によるROS消去能は確認された。平成30年度ではさらに、安静時唾液中のROSの消去能は、刺激唾液と比較して、すべての経過時間において安静時唾液で有意に高い値を示した。このように唾液のROS消去能は安静時唾液と刺激唾液で違いがあることが明らかになった。すべてのROS消去能では、刺激唾液に比較して安静時唾液で高値を示した。すなわち、採取する唾液について安静時唾液、刺激唾液の鑑別が必要であり、また、採取後4 °C保管における安静時唾液48時間以内、刺激唾液24時間以内ではESR測定値に影響を与えないことが明らかとなった。これにより、被災地での唾液採取の条件を基準化でき、定期的、継続的な唾液中の抗酸化能のモニタリングによる避難所・仮設住宅における個々の被災者の酸化ストレス度の変動による生活習慣病の予防、災害関連疾患の早期発見につながるリスク評価への応用の可能性が示唆された。の結果から、平成29年度より、抗酸化物質のメンタルストレス由来ROSへの消去能の解析による抗酸化物質のスクリーニングをおこなった。
先天股脱保存療法後35年以上の経過からみた幼児期の変形と変形性股関節症の相関

1960年に猪狩らは、87例132関節の先天股脱の保存療法後5年以上経過した症例の検討をおこなった。また、久保谷は1980年、これらの症例をさらに追跡調査して、59例90関節の症例について報告した。今回は、さらにこれらの症例を追跡して、30例41関節(1例1関節はアンケート)について検討した。これらの症例の整復月齢は20.3±14.4カ月で、1957年の第1回調査時では10.3才、1977年の2回目には30.3才、最終調査時年齢の平均は、48.2才であった。最終調査時のレ線像では、ほぼ正常に近いと思われたものが9関節、前股関節症10関節、初期が7関節、進行期が4関節、末期が10関節であった。結論:1.30例41関節の先天股脱保存療法後40年以上経過した症例について検討した。2.10才頃のCE角が、将来を決定する可能性があることが示唆された。15°以下であれば補正手術を要する可能性は大きく、16°20°のときは、かなり長期に経過を観察する必要がある。3.最終調査時のレ線病期は、整復時年齢および脱臼度と良く相関していた。4.病期の進行は、閉経時期にほぼ一致した。5.健側のCE角は、患側に比較して良好だが、患側のCE角と似た傾向にあった。(目的)1960年に猪狩らは87例132関節の先天股脱保存療法5年以上経過した症例の検討を行なった。また、久保谷は1980年、これらの症例をさらに追跡調査して、59例90関節の症例を報告した。これらの症例は、現在、全て40歳をこえており、その股関節が如何に変化したかを調査しようとした。(方法)今回、われわれは、これらの症例に、アンケート調査と直接検診を依頼した。現在のところ、なんらかの接触を得た症例は20例であった。20例の中で、直接検診し得た症例は、17例で、3例はアンケートで回答をよせてきた。(結果)最終調査時年令の平均は48.9±5.0歳(最低42歳、最高59歳)であった。整復時月令の平均は23±13.9カ月であった。両側例は7例、右側例は5例、左側例は8例であった。整復前の脱臼度は、亜脱臼3関節、I度脱臼は10関節,II度脱臼は11関節,III度脱臼は3関節であった。これらの症例の1977年日整会股関節症判定基準の平均は83.5点が、今回では75.7点となった。これらの症例から、経過中に人工関節に置換された症例と、今回の点数が不明な2症例4関節を除外すると、1977年(平均30.8歳)では89.8±11.2点が、今回では76.8±15.7点となっていた。レ線学的には、前期股関節症4例5関節、初期5例5関節、進行期3例3関節、末期3例4関節で、1例2関節が人工関節に置換されていた。最終調査時のCE角の平均は11.9±11.8度、臼蓋角は45.4±3.7度であった。また、健側のCE角は25.4±9.8度、臼蓋角は40.2±4.7度であった。体重、身長を計測できた10症例では、体重-(身長-100)で計算すると、-2.5であり、軽い体重が外科的処置を免れてきたと考えられた症例もあった。23例32関節について予後調査できた。

また、3例4関節はアンケート調査に応じ、2例2関節は途中経過がないが、たまたま当科外来を受診して診察を受けた。1例2関節はすでに当科にて人工関節に置換されていた。現在の調査状況について報告した。平成7年度の実績については、下記の如くである。1.第68回日本整形外科外科学会(横浜、会長;黒川高秀東京大学教授)において、"先天股脱保存療法後、40歳以上になった症例の検討"について講演した。なお、症例は20例であった。3.上記に関連する先天股脱の遺伝的要素を探るために、研究分担者の宍戸は第68回日本整形外科外科学会にて、"二親等以内に先天股脱患者を有する先天性股関節脱臼児の臨床成績の検討"を発表した。また、本研究に関連すると思われる演題、中塚らによる"Rb法により治療した片側先天性股関節脱臼の健側のX線学検討"、芳賀らによる"先天性股関節脱臼と股関節形態の遺伝性"などを聞いた。4.現在の成績26例36関節のアンケート調査を含めた症例では、平均整復時月齢は23.8±15.9カ月、前回調査時年齢の平均が30.5歳、最終調査時年齢は49.±4.7歳であった。日整会股関節症判定基準(以下JOA score)の平均は、前回調査時では88.2±15.4点、最終調査時では78.0±16.2点と劣化していた。X線学的には、アンケート調査の4関節を除いた32関節中、ほぼ正常が8関節、前期股関節症が6関節、初期股関節症が6関節、進行期股関節症が4関節、末期股関節症が8関節であった。5.平成8年度の目標さらに数人の現住所を確認したので、もう少し症例数を増やしたい。また、これらの症例の合計4回のX線から、20歳以下で観血的治療を施行すべきかどうかの境界線をみつけたい。その、定量的指標としては、X線学的指数については、最も一般的なCE角、臼蓋角、その他の指標としては体重とせいぜい職業であろうと考えている。理由は股関節専門医ではなく、一般の整形外科医が、股関節症への進展が危惧される患者を専門医に紹介するにあたって、患者の選択とその時期をより分かり易くしたいためである。1960年に猪狩らは、87例132関節の先天股脱の保存療法後5年以上経過した症例の検討をおこなった。また、久保谷は1980年、これらの症例をさらに追跡調査して、59例90関節の症例について報告した。今回は、さらにこれらの症例を追跡して、30例41関節(1例1関節はアンケート)について検討した。これらの症例の整復月齢は20.3±14.4カ月で、1957年の第1回調査時では10.3才、1977年の2回目には30.3才、最終調査時年齢の平均は、48.2才であった。最終調査時のレ線像では、ほぼ正常に近いと思われたものが9関節、前股関節症10関節、初期が7関節、進行期が4関節、末期が10関節であった。結論:1.30例41関節の先天股脱保存療法後40年以上経過した症例について検討した。2.10才頃のCE角が、将来を決定する可能性があることが示唆された。15°以下であれば補正手術を要する可能性は大きく、16°20°のときは、かなり長期に経過を観察する必要がある。3.最終調査のレ線病期は、整復時年齢および脱臼度と良く相関していた。4.病期の進行は、閉経時期にほぼ一致した。5.健側のCE角は、患側に比較して良好だが、患側のCE角と似た傾向にあった。
湖沼浮遊細菌群集の多様性が細菌－原生生物間の有機物伝達に果たす役割

細菌の増殖速度および原生生物による捕食速度とウイルス溶菌速度を同時に見積もることのできる改良希釈培養法と呼吸鎖キノン分析を組み合わせることで、亜集団の増殖および死滅速度を見積もることに成功した。実験の結果、細菌群集の増殖速度は、原生動物による捕食およびウイルスによる溶菌によって死滅する速度と、ほぼ釣り合うことが示された。自然細菌群集の死滅要因としては、様々な環境要因が考えられるが、琵琶湖の細菌群集は物理化学的な環境要因の変化によって死滅する前に、捕食と溶菌によって速やかに死滅していることが推察された。また、補食および溶菌による死滅様式は、亜集団によって異なるというよりは、密度依存的な補食と増殖速度依存的な溶菌で説明できることが示唆された。さらに、現場で優占する亜集団(ユビキノン-8および10含有細菌亜集団)は、速い速度で活発に増殖し、その後速やかに死滅することから、微生物ループにおける細菌群集を介する炭素流の大部分(約6割)を駆動していることが明らかとなった。一般に、淡水湖沼や河川ではBetaproteobacteriaに属する細菌が優占することが知られているが、この細菌群の多くはUQ-8を保持していることが報告されている。このことから、UQ-8保持亜集団は、淡水環境の微生物ループの炭素循環過程において重要な役割を担っていることが考えられる。本研究は、呼吸鎖キノンによって細菌群集を亜集団に分割することで、優占細菌亜集団と微生物ループにおける炭素循環との関係を明らかにした。本研究では琵琶湖の細菌群集を、呼吸鎖キノンを生物指標として亜集団分割し、個々のキノン含有細菌群の炭素バイオマス生産速度や高次栄養段階生物への有機物転換の違いを調査することで、有機物動態との連関を明らかにすることを目的としている。具体的には、(1)呼吸鎖キノンを用いた細菌炭素バイオマス量推定法の確立、(2)異なる呼吸鎖キノンを保持する細菌群バイオマスの時空間変動の調査、および(3)個々のキノン含有細菌群の増殖速度および死滅速度の調査、の3つの研究項目を設定している。特に、平成23年度は(1)(2)を重点的に行った。それぞれの研究項目の実施状況および得られた成果は以下のとおりである。研究(1)琵琶湖定点において10ヶ月にわたり、呼吸鎖キノン量と細菌の総細胞容量(従来の細菌バイオマスの指標)を測定し、関係を検証した結果、キノン量と細胞容量に高い相関関係(r^2=0.94)が見られた。また、現場から単離した異なるキノン種を持つ培養株数株において、細菌体キノン量と細菌体炭素量の比率と、細菌細胞容量と細菌体炭素量の比率を計算した結果、前者のほうが株間でのばらつきが小さいという結果が得られた。本研究は従来法と比較したはじめての研究であり、これらの結果は、呼吸鎖キノン分析が細菌体炭素バイオマス量の指標として十分信頼し得る方法であることを示している。研究(2)もっとも存在量が多かったユビキノン(UQ)-8は、深度と共に存在量が増加し、深水層においても顕著な季節変動性を示すという独特な時空間分布パターンを示した。UQ-8と硝酸態・亜硝酸態窒素濃度との間には正の相関関係(r^2=0.84)が見られた。UQ-8含有細菌群は、しばしば硝化細菌やアンモニア酸化細菌に見られることから、UQ-8含有細菌群が無機態窒素動態に関与して、琵琶湖の物質循環過程において主要な役割を果たしている可能性が考えられた。申請書において当初、1年目である平成23年度は、呼吸鎖キノンを用いたバイオマス推定手法の確立と現場における定点観測を計画していた。研究実績の概要に示した通り、その2つのサブテーマに関しては計画通りデータを取り終え、既に結果をまとめて国際学術誌へ投稿中である。

また、現場観測に関しては、当初計画していた表水層と深水層のみの採水に加え、鉛直採水も実施しており、ユビキノン8の特徴的な時空間分布パターンを捉えることに成功している。申請書における当初の研究計画では、従来の希釈培養法(Landry and Hassett 1982)とキノン分析を組み合わせることで、細菌の原生生物の捕食による死滅速度を見積もる予定であった。しかし、1年目の予備実験において、改良希釈培養法(Evans et al. 2003)と呼ばれる方法とキノン分析を組み合わせることで、細菌群集の増殖速度・捕食による死滅速度・ウイルス溶菌による死滅速度を同時に見積もることに成功した。そこで、細菌群集と微生物食物網の炭素動態をより詳細かつ正確に捉えることができる本方法を、研究(3)(研究実績の概要参照)に適用する予定である。