hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植可能な真の代替肝臓の開発を目指した胆汁産生と排泄機能復元への挑戦

【背景】肝再生医療の実現化に胆汁産生と排泄機能は必須の課題である。しかし、これまでに有効な手段は示されていない。脱細胞化骨格は、生体組織から細胞を洗浄除去することで得られる立体構造であり、我々はこの骨格内に充填した肝細胞が体内に移植後に胆汁産生を開始することを見出したが、排泄経路の再生には至っていない。今回、ラットの分離新鮮胆管上皮細胞を用いて骨格内での胆管構造再生の可能性について検証した。【目的】ラット肝臓の門脈・胆管アクセスを確保して脱細胞化し部分肝に成形した。別のラットの肝臓から理工学部の須藤研の協力を得て、胆管樹枝状構造から分離した新鮮胆管上皮細胞を脱細胞化肝臓の胆管に注入し、経門脈的または経胆管的に循環培養を行った。培養後の胆管構造をHE染色、サイトケラチン19(CK19)による免疫染色および蛍光標識細胞を用いた三次元画像解析によって評価した。【結果】経門脈的に循環培養を行った細胞と比較して、最適化した経胆管的循環培養法を用いた細胞はより多く胆管上皮細胞が胆管内壁に生着し、三次元解析で立体的樹状構造を示した。更に本手法を用いてブタ肝臓骨格でも同様に胆管の立体構造の構築が可能であった。【結語】ラットおよびブタの肝脱細胞化骨格内の残存胆管構造において、胆管上皮細胞の生着と立体構造の構築が確認された。一方、胆汁の排泄自体は未確認であり、生体内における長期的な胆管上皮細胞の生着も検証が必要である。今後、各種細胞と共培養した上で生体内でのグラフト機能を検討していく。理工学部の須藤らの協力の元、新鮮胆管上皮細胞の分離技術を確立し、脱細胞化骨格へ注入、培養する条件(速度、細胞数、圧)を最適化し得た。確立した手法を用いて、当初予定通り分離した新鮮胆管上皮細胞を、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認し得た。また更に他の肝構成細胞(肝細胞・血管内皮細胞)と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価することができた。これらの結果は、2019年3月の日本再生医療学会にて報告を行い、これまで困難であった胆管の樹枝状構造を再現したことで、多くの反響をいただいた。まず初年度として結果をまとめ学会発表レベルの成果として創出できたことは、おおむね順調な研究の進展状況を表していると考えている。2018年度の結果を踏まえて、胆管上皮細胞を肝臓骨格内でより長期に培養し、胆汁産生や細胆管発生、微絨毛の発現を含めた胆管上皮細胞の機能的再生を継時的に検証し、まず新鮮細胞を用いた基礎的エビエンスを蓄積する。その後、東京大学の宮島らの協力を得て、ヒトiPS細胞から分化誘導した結果得られた成熟胆管上皮細胞を、2018年度に確立した手法を用いて、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認する。また更に他のヒトiPS細胞由来肝構成細胞(iPS由来肝細胞・iPS由来血管内皮細胞)と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価する。まずラットの小スケールでiPS細胞の注入による評価を行ったのち、スケールアップしたブタ骨格を用いて同様の胆管構造の復元が可能かどうかを検証する。

確立した手法を用いて、当初予定通り分離した新鮮胆管上皮細胞を、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認し得た。また更に他の肝構成細胞(肝細胞・血管内皮細胞)と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価することができた。これらの結果は、2019年3月の日本再生医療学会にて報告を行い、これまで困難であった胆管の樹枝状構造を再現したことで、多くの反響をいただいた。まず初年度として結果をまとめ学会発表レベルの成果として創出できたことは、おおむね順調な研究の進展状況を表していると考えている。2018年度の結果を踏まえて、胆管上皮細胞を肝臓骨格内でより長期に培養し、胆汁産生や細胆管発生、微絨毛の発現を含めた胆管上皮細胞の機能的再生を継時的に検証し、まず新鮮細胞を用いた基礎的エビエンスを蓄積する。その後、東京大学の宮島らの協力を得て、ヒトiPS細胞から分化誘導した結果得られた成熟胆管上皮細胞を、2018年度に確立した手法を用いて、脱細胞処理したラットおよびブタ骨格に残存する胆管構造から注入し、立体構造を共焦点顕微鏡で確認する。また更に他のヒトiPS細胞由来肝構成細胞(iPS由来肝細胞・iPS由来血管内皮細胞)と共に三次元循環培養装置内で培養し、内部構造を経時的に評価する。まずラットの小スケールでiPS細胞の注入による評価を行ったのち、スケールアップしたブタ骨格を用いて同様の胆管構造の復元が可能かどうかを検証する。ブタ胆管上皮細胞への注入と条件検討の部分で、予定よりも少額の培養関連試薬で実行可能であったため、わずかに研究費に余剰が発生した。この余剰額を次年度に使用することで、ブタの胆管上皮細胞の注入実験回数を増やし、また評価系をより充実化すること(病理学的、電子顕微鏡など)が可能となるため、本実験の結果の確実化がさらに期待できる。以上のように研究をより加速・充実化するために剰余額を次年度に有効に活用する予定である。
三重鎖DNA形成のメカニズムとアンチセンスとしての応用

核酸の塩基及びバックボーンへの化学修飾が三重鎖の安定性と配列特異性に及ぼす効果を調べるため、実験と計算の両面から解析を行った。実験ではこれまでに、バックボーン及び塩基に対する種々の化学修飾を施した修飾核酸について、三重鎖形成の平衡熱力学量や速度定数などを測定した。これらの解析の結果、化学修飾の効果は塩基よりもバックボーンに対するほうが大きかった。このことから、核酸の構造だけでなく、その柔軟性などの物性に対する影響の重要性が示唆された。このメカニズムを原子レベルでさらにくわしく調べるため、核酸の性質と化学修飾の効果について計算機シミュレーションを行った。対象とする核酸としては通常のDNA、バックボーンを修飾したphosphorothioate DNA、RNA、Omet-DNAなどについて考察した。これらの修飾核酸の計算を行うためまず、ab-initio量子化学計算により原子の部分電荷分布を求めた。化学修飾によって核酸の電荷分布が大きく変化することが示され、化学修飾が核酸の構造、エネルギーや物性に影響することが推察される。そこで、修飾核酸について、核酸の構造と物性の計算を行った。これらの計算のために、構造サンプリングアルゴリズムを新たに開発した。まず、化学修飾に伴う電荷分布の変化についての基礎計算などを行った。この方法を用いて、核酸の平均構造やそのまわりの揺らぎなどの熱力学量を計算し、化学修飾がどのような影響を及ぼすかを調べた。これらの計算より、核酸の修飾の部位に依存して構造やコンフォメーションの柔軟性が変化することが明らかになった。このことは、これらの分子レベルでの性質が三重鎖の安定性と配列特異性にも重要な役割を果たすことが示唆される。また、三重鎖に結合すると考えられている蛋白質としてMAZ転写因子のDNA結合能や機能活性の解析を行った。核酸の修飾により、がん遺伝子産物で転写因子であるMybの結合や活性を修飾することも試みた。三重鎖の安定性と配列特異性に対する核酸の化学修飾の効果を調べるため、まず、バックボーン及び塩基に対する種々の化学修飾を施した修飾核酸を合成、精製した。これらの核酸を用いて、これまでに我々が三重鎖形成の研究に新たに開拓したフィルター結合法やカロリメトリー法などの方法を用いて、三重鎖形成の熱力学量(結合の自由エネルギー、エントロピー、エンタルピー、熱容量変化など)及び速度定数(会合速度定数、解離速度定数)を測定した。この結果、核酸バックボーンに対するある種の化学修飾、特に、phosphorothioation、が三重鎖形成の熱力学定数及び速度定数に大きな影響を与えることがわかった。これらの結果を分子レベルで解釈するため、核酸のさまざまな性質と化学修飾の効果を計算機シミュレーションにより解析した。X線解析により得られている核酸の構造をもとに計算機上でいくつかの化学修飾を導入した構造を作成し、量子化学計算により電荷分布や構造変化、それに伴うエネルギーなどの評価を行った。その結果、ある種の化学修飾により電荷分布が大きな影響を受けることがわかった。現在、構造変化の精密な計算を行っているが、これらの化学修飾により核酸のバックボーンの構造や柔軟性などの性質が大きく変化することが予想される。今後、これらの点を明らかにするため、さらにくわしい実験的理論的解析をすすめ、化学修飾が三重鎖形成にどのように影響を与えているかを詳しく解析する。前年度に引き続き、三重鎖の安定性と配列特異性に対する核酸の化学修飾の効果を調べるため、バックボーン及び塩基に対する種々の化学修飾を施した修飾核酸について、三重鎖形成の熱力学量(結合の自由エネルギー、エントロピー、エンタルピー、熱容量変化など)を測定した。

一方、速度定数(会合速度定数、解離速度定数)も核酸の安定性と特異性について重要な情報をもたらすが、これまではフィルター結合法と共鳴ミラー法を用いて測定してきた。今回新たに、適定型力口リメトリー、蛍光偏光解消法及びゲルシフトアッセイを用いて速度定数をより正確に求めるプロトコルの開発を行った。これらの方法を実際に修飾核酸に適用し、速度定数の評価を行った。一方、核酸の性質と化学修飾の効果を計算機シミュレーションにより解析した。修飾核酸のひとつであるphosphorothioate DNAアナログについて量子化学計算を行い、電荷分布や構造変化、それに伴うエネルギーなどの評価を行った。一方、化学修飾が核酸の物性にどのような変化を引き起こすかを調べるため、通常のDNA、バックボーンを修飾したphosphorothioate DNA、RNA、Omet-DNAなどについて計算機によるコンフォメーション解析を行った。これらの計算結果より、化学修飾が核酸のバックボーンの構造や柔軟性などの性質に影響を与えることがわかった。今後もこれらの実験的理論的解析をすすめ、化学修飾が三重鎖形成にどのように影響を与えているかを詳しく解析する。核酸の塩基及びバックボーンの化学修飾が三重鎖の安定性と配列特異性に及ぼす効果を調べるため、バックボーン及び塩基に対する種々の化学修飾を施した修飾核酸について、三重鎖形成の平衡熱力学量(結合の自由エネルギー、エントロピー、エンタルピー、熱容量変化など)及びカイネティックス(会合速度定数、解離速度定数)を測定した。測定方法としては、適定型カロリメトリー、フィルター結合法、共鳴ミラー法、蛍光偏光解消法、ゲルシフトアッセイなどの方法を組み合わせて行った。これらの解析の結果、化学修飾の効果は塩基よりもバックボーンに対するほうが大きかった。このことから、核酸の構造だけでなく、その柔軟性などの物性に対する影響の重要性が示唆された。このメカニズムをさらにくわしく調べるため、核酸の性質と化学修飾の効果について計算機シミュレーションを行った。対象とする核酸としては通常のDNA、バックボーンを修飾したphosphorothioate DNA、RNA、Omet-DNAなどについて考察した。方法としては、ab-initio量子化学計算による電荷分布や構造変化、それに伴うエネルギーの計算、新たに開発した構造サンプリングアルゴリズムを用いたコンフォメーション解析などを行った。これらの計算より、化学修飾によって核酸の電荷分布、構造やコンフォメーションの柔軟性に大きな変化がもたらされることが明らかになった。このことは、これらの分子レベルでの性質が三重鎖の安定性と配列特異性にも重要な役割を果たすことが示唆される。核酸の塩基及びバックボーンへの化学修飾が三重鎖の安定性と配列特異性に及ぼす効果を調べるため、実験と計算の両面から解析を行った。実験ではこれまでに、バックボーン及び塩基に対する種々の化学修飾を施した修飾核酸について、三重鎖形成の平衡熱力学量や速度定数などを測定した。
体腔器官の分子移植による細菌の構造と機能の大規模改変とその応用

細菌細胞表層は、微細な構造と機能を除いて構造的・機能的に均一かつ固定的と想定される。しかし、Sphingomonas属細菌においては、細胞表層分子の再編によって細胞表層に巨大な孔「体腔」が形成されることを見出し、微生物の形態形成と細胞表層の構造と機能に関して新たな局面を拓いた。この開閉自在の体腔は、メソソームやエンドサイトーシスの形成と機能、更にはそれらの分子進化の理解にも関わる重要な内容を有している。また、本申請研究では、体腔を他の細菌に分子移植する、つまり器官の移植による大規模な細胞改変技術の確立を目指した。その結果、体腔は同じ属の細菌には効率よく分子移植できることを明らかにした。移植された細胞では巨大な体腔が形成され、アルギン酸、ダイオキシン、ポリプロピレングリコール、ポリデキストロースなど、分子サイズと分子構造を問わず体腔から丸呑みされ、細胞内で効率よく分解されることを明らかにした。環境有害物質の分解は、基本的には強い分解能を有する微生物の選択に依拠しているが、環境有害物質の分子サイズや溶・不溶的多様性に十分対応するものではない。しかし、分子移植した体腔は、低分子物質から不溶性顆粒をも含めた巨大物質を呑み込む能力を有することから、体腔の分子移植によって創成される細菌は、バイオレメディエーションの画期的な発展を促す可能性を示唆した。特に、ダイオキシン分解能を有するSphingomonas wittichii RW1に体腔を移植することにより、ダイオキシンを格段に強く分解する菌株を育種された。ただ、体腔の移植は現段階ではSphingomonas属細菌に限定されるが、新たにAgrobacterium属細菌にも分子移植できる可能性を明確にした。これにより、全ての細菌に体腔を分子育種する基本的条件の設定に目途が付いた。スフィンゴモナス(Sphingomonas)属細菌A1株は、細胞表層に物質輸送に関わる巨大な孔「体腔」を形成する。この孔を様々な他の細菌に分子移植することによって、物質輸送の改善された、つまり細胞表層の構造と機能が大幅に改善された細菌の育種が期待される。体腔は、ABCトランスポーター[ABCタンパク質(S)と透過酵素(M1とM2)から成る]によってその形成が支配されており、S、M1、或はM2の遺伝子を破壊するとアルギン酸資化能も体腔形成能も失われる。このことから、体腔を含めた「超チャネル」の"分子移植"の可能性が示唆された。そこで、ダイオキシン(ジベンゾフラン)分解菌であるSphingomonas witthii RW1、ポリプロピレングリコール分解菌であるSphingomonas subartica、及びポリデキストロース分解菌であるSphingomonas sunguisにA1株の「超チャネル」関連遺伝子を導入した結果、巨大な体腔が、しかも構成的に形成された。そして、体腔を移植された細胞は、野生株の倍近い速さで上記物質を分解する能力を獲得した。この結果は、体腔が分子サイズ(低分子、高分子)や分子形態を問わず、任意の物質の膜透過を促進することを示しており、体腔の分子移植が細胞表層機能の改変に極めて有用であることが明らかになった。ただ、移植された体腔のような巨大分子器官は宿主(レシピエント)の細胞骨格に組み込まれるため、器官供与体(ドナー)と宿主との遺伝学的、構造学的相性などが問題になると考えられる。それは今後の問題として、この"器官の分子移植"は、今後の細胞機能改変の有用な手段になると考えられた。また、体腔を移植したRW1株は、土壌中に添加したダイオキシンも高い効率で分解した。この結果、体腔の分子移植菌を環境浄化に十分適用できることが示された。ただ、遺伝子組換え菌であるため、その実際的な応用にはその安全性など検討すべき事項が残されている。

ただ、体腔の移植は現段階ではSphingomonas属細菌に限定されるが、新たにAgrobacterium属細菌にも分子移植できる可能性を明確にした。これにより、全ての細菌に体腔を分子育種する基本的条件の設定に目途が付いた。
造血幹細胞ニッチとしてのヒト胎盤の役割

本研究の目的は、マウス・ヒト胎盤造血幹細胞の性質と、それを取り囲むニッチによる造血幹細胞制御機構を解明する事である。1)マウス胎盤に存在する造血幹細胞の特徴各発生段階における胎盤造血幹細胞の分布を検討するため、抗c-Kit抗体及び抗CD34抗体を用いて免疫染色を行った。またフローサイトメトリーを用いて造血幹細胞集団であるCD31,CD34,c-kit陽性細胞群を純化し、Ki-67抗体で染色することにより細胞周期が動いているか検討した。更にこれら細胞を採取し、コロニーアッセイ法を用いて造血前駆細胞活性を評価した。造血幹細胞のクラスター数はE11.5に多く、その絶対数はE12.5に多いことがわかった。またE11.5に比べてE12.5の方が細胞周期に突入している細胞が少ないことがわかり、細胞の形態に関しては、E11.5の方がいびつな形態をとるなど明らかな違いがあることが判明した。またコロニーアッセイ法によりE12.5の方が造血前駆細胞を多く含むことがわかった。2)遺伝子改変マウス胎盤における造血活性c-Myb KOマウス胎仔における造血幹細胞クラスターは正常個体よりも多くの細胞が集塊を形成する像が認められたが、その意義は検証出来ていない。3)胎盤造血幹細胞ニッチの分子的基盤c-Kit陽性造血幹細胞クラスターを取り囲むニッチ細胞を採取し、細胞刺激因子の発現をreal-time PCRで検討した。TPO、G-CSFなどの発現は認められず、SCFのみが高値を示したことから、胎盤造血幹細胞の発生・増幅制御にはSCFが重要な事が示唆された。
スカルン鉱物の水と炭酸の分析

元素分析計は本来有機物の化学分析を行うための装置であるが,この装置を使用して鉱物試料中の炭素,水素,窒素,硫黄の含有量の測定を行うことを目的とした.有機物および無機物の標準試薬を分析し,装置の分析精度と正確な値を求める方法を決定した.鉱物の標準試料を用いて,その分解温度と助燃剤の必要性の有無,含有量と分析に必要な試料の量,他の元素の存在の影響の度合などを検討した.その結果を種々の鉱物試料の分析に利用した.その結果を次に示す.1.今回元素分析計で行った鉱物中の水と炭酸の含有量の測定結果は,既に湿式分析法で測定されているものに良く一致した.2.スカルン鉱物について含水量を強熱減量や熱分析の結果から求めて報告しているものについて,元素分析計で水素の量を測定し,良く一致する結果あるいはより理論値に近い値が得られた.3.元素分析計を使用すれば少量の試料で測定できるので,今まで純粋な試料についての分析値が得られていなかった鉱物について含水量の測定を行うことができた.4.化学組成の正確な分析値の報告されていなかった鉱物について,EPMAと元素分析計を併用することによって化学組成をはっきりさせ,化学式を確立した.5.混合物について,混在している鉱物の種類によっては,元素分析計での測定によって混合の割合を計算することができ,目的の鉱物の組成を決定できた.元素分析計は本来有機物の化学分析を行うための装置であるが,この装置を使用して鉱物試料中の炭素,水素,窒素,硫黄の含有量の測定を行うことを目的とした.有機物および無機物の標準試薬を分析し,装置の分析精度と正確な値を求める方法を決定した.鉱物の標準試料を用いて,その分解温度と助燃剤の必要性の有無,含有量と分析に必要な試料の量,他の元素の存在の影響の度合などを検討した.その結果を種々の鉱物試料の分析に利用した.その結果を次に示す.1.今回元素分析計で行った鉱物中の水と炭酸の含有量の測定結果は,既に湿式分析法で測定されているものに良く一致した.2.スカルン鉱物について含水量を強熱減量や熱分析の結果から求めて報告しているものについて,元素分析計で水素の量を測定し,良く一致する結果あるいはより理論値に近い値が得られた.3.元素分析計を使用すれば少量の試料で測定できるので,今まで純粋な試料についての分析値が得られていなかった鉱物について含水量の測定を行うことができた.4.化学組成の正確な分析値の報告されていなかった鉱物について,EPMAと元素分析計を併用することによって化学組成をはっきりさせ,化学式を確立した.5.混合物について,混在している鉱物の種類によっては,元素分析計での測定によって混合の割合を計算することができ,目的の鉱物の組成を決定できた.1.岡山県備中町布賀および広島県東城町久代に産するトバモライト族鉱物(トバモライト,単斜トバモライト,プロンビ-ライト,リバーサイドアイト,大江石)の産状を調査し,鉱物の採集を行った.2.各トバモライト族鉱物の合成できる条件を決めつつある.特に,単斜トバモライトと大江石については今までに合成したという報告がないが,合成の可能な条件が明らかになりつつある.また,X線を用いた結晶構造解析に使用するために,適当な大きさの結晶を合成できる条件を検討している.3.天然のトバモライト族鉱物の化学分析を行いつつある.電子プローブ微小部分析計により,カルシウム,シリカ,アルミニウムの含有量を決定し,鉱物種による系統的な違いを検討している.含水量については,元素分析装置の設置,テスト分析,標準物質の定量分析を行い,測定が可能になった.4.元素分析計により,エトリンジャイト族鉱物の含水量,含炭酸量,含硫酸量の測定を行う準備が整った.1標準物質としてみょうばん石,鉄みょうばん石,ソーダみょうばん石,トーマス石,方解石,あられ石,チリ硝石などを用い,水,炭酸,硫酸,硝酸の含有量を測定し,分析の精度を確かめた。2岡山県備中町布賀および広島県東城町久代に産するトバモライト族鉱物の分析を行い,含水量はプロンビ-ライト,大江石,トバモライト,単斜トバモライトの順に少なくなっていることを決定した。3布賀産の硼酸塩鉱物であるニフォントバイト,オルシャンスカイト,ベーカーライト,フロロバイトの含水量を正確に決定した。4砂岩,泥岩,花崗岩,玄武岩,石灰岩などの岩石の含水量,炭酸含有量を正確に測定した。5ラズ-ライト,エトリンジャイト,トーマサイトなど,水や硫酸の含有量に変化のある試料を採集し,分析できるように分離した。1.元素分析計により,鉱物中の炭酸,水,硝酸,硫酸の含有量を分析する際に,標準的な使用方法にさまざまな工夫を加えて標準物質を分析した.その結果,精度の良い分析が行えるようになった.2.標準物質のシスチン,アセトアニリド,スルファニルアミド,スルファチアゾール,アントラセン,ジフェニルチオ尿素,スルフォナ-ルを分析し,良好な結果を得た.3.天然産の試料のうち化学組成的に均質で良質な結晶の得られた方解石,シデライト,石膏,アポフィライト,トバモライト,スコータイト等を分析し,良好な分析結果を得た.

4.みょうばん石族鉱物は,硫酸,アンモニアおよび水を種々の割合で含むので,みょうばん石,ジャロ-サイト,アンモンジャロ-サイト,ナトロアル-ナイトの分析を行い,各々の含有量について検討した.その結果,理想式からかなりはずれるもののあることが判明し,みょうばん石族鉱物の一般式について再検討の必要なことが明かになった.5.岡山県備中町布賀に産するシビルスカイトやオルシャンスカイトの分析を行い,その含水量として理論値に近い値を得た.6.エトリジャイト族の鉱物の分析を行い,種々の含水量,含炭酸量,含硫酸量の鉱物の存在を明かにし,EPMAによる分析の結果とあわせて,この族中の鉱物の化学組成を検討した.7.天然において,タケダアイトは部分的にオルシャンカイトと方解石の混合物に変質している.これはタケダアイトの加水反応であるとともに加炭酸反応であり,この混合物の含水量と含炭酸量を分析することによって,タケダアイトがオルシャンスカイトと方解石に変化している割合を決定した.
方形波電位パルス法によって作製したポーラス酸化物皮膜の構造制御と機能化

ステンレス鋼などのFe-Cr合金を硫酸中で方形波電位変調電解することによりポーラス構造を有する酸化物皮膜を形成することができる。成膜プロセスには2種類あり、クロムの活性態と不働態電位を繰り返し分極するアノード型、および過不働態と不働態電位とを交互に分極するカソード型それぞれによって、形態は類似しているが電気化学的性質の異なった皮膜を生成する。これらの皮膜の、電子的性質を電気化学インピーダンス法ならびに光応答電流法で検討したところ、インピーダンスから得られる界面容量については、アノード型では膜厚に比例して容量が増大することより皮膜を構成する微粒子の表面にて容量を発生し、かつこれらの粒子が相互に連結して下地合金との間に導電性を示す経路が存在することが明らかとなった。一方、カソード型では容量は下地鋼と同様で皮膜厚さに依存しなかった。従って、カソード型膜では構成する微粒子が下地との伝導性を持たずに堆積していることが分かった。一方、光励起によって生じる電子・ホール対の分離によって生ずる光電気化学応答については、アノード型皮膜では応答に厚さに対して極大を示した。これは、厚さの増大に対して電子・ホールが増大するが再結合確率も増大するためにこのような挙動を示したと思われる。一方、カソード型ではインピーダンス同様、厚さに依存しない光応答を示した。さらに同様のプロセスは他の合金系にも応用可能である。Fe一Ti合金上に厚いポーラスな構造をもつTiO_2皮膜の生成が可能なことを明らかにした。今後ポーラスな構造と電子的特性を生かした機能電極表面への応用が期待される。
シュートメリステムの機能に着目したイネの葉の分化機構の解明

本研究はイネにおける葉の分化機構をシュートメリステムとの関係で明らかにしようとしたものである。シュートメリステムの維持と葉の形態形成に関わるWAF1を同定した。WAF1は小分子RNAの制御に関わるものであった。葉原基分化の時間的制御に関し、PLA3遺伝子を同定した。PLA1,PLA2と同様に葉の成熟速度を制御するもので、葉原基の分化には既存の葉原基からのシグナルが重要であることを明らかにした。葉の背腹軸、左右軸、頂部-基部軸それぞれのパターン形成の変異体を同定し、原因遺伝子を明らかにした。pla3変異体の原因遺伝子のクローニングが終了し、glutamate earboxypeptidaseをコードすることを明らかにした。In situ hybridizationにより、PLA3遺伝子はシュートメリステムを含むほとんど全ての組織で発現するとこが明らかになった。PLA1,PLA2遺伝子はシュートメリステムでは発現せず、葉原基のみで発現することにより葉原基の分化抑制に関わっていると推定したが、PLA3タンパクは、シュートメリステムで直接葉原基の分化抑制を行っている可能性がある。pla3変異体は、葉間期以外にもシュートメリステムの維持の異常などを示すので、多面的な機能を持っていると考えられる。PLA1の弱い変異体であるpla1-4を変異原処理後、本年度M2集団を展開したところ、サプレッサー変異体の可能性のある系統が見つかったので、来年度以降解析する。葉の向背軸パターンが異常となるad11, ad12変異体の解析を進め、ADL1遺伝子がcalpain-like cysteine proteinaseをコードすることを明らかにした。その後、ADL1遺伝子の強いアリルを見いだし、胚でのシュートの分化、胚乳の糊粉層の分化も制御していることを明らかにした。幼猫致死となるfsm変異体の原因遺伝子はchromatin assemblyfactor-1(CAF-1).のp150 subunitをコードしており、多重蛍光in situ hybridization法をイネで確立することにより、FSM遺伝子がG2期の細胞で発現し、変異体では細胞周期(S期、G2期)が長くなっていることを明らかにした。しかも、細胞周期の延長によりメリステムへの細胞の供給が減少するにもかかわらず、葉原基の分化速度は変わらないため、メリステムの未分化細胞が消費され、メリステムが消失すると考えられた。変異原処理後のM2集団(約700系統)をスクリーニングし、幼猫致死となるものや幼猫のシュートの形態が異常となるものなど興味深い変異体が多数得られた。来年度以降解析を始める予定である。葉の極性に関与する変異体の遺伝子単離と表現型解析昨年度葉身が形成されず、葉鞘のみとなるneedle 1(ndll)変異体を同定した。これは第3葉くらいまで葉身のない葉を分化した後、葉身のある葉を分化するが、やがて枯死するものである。このような葉の基部一頂部パターンに異常を示す変異体はこれまで報告されていないので、葉のパターン制御機構を明らかにする上で非常に重要な変異体である。indica品種KasalathとのF2集団を用いてポジショナルクローニングを進めた結果、NDL1遺伝子は転写因子をコードしていることが明らかになった。現在発現パターンの解析などを進めている。シュートメリステムと葉原基発生の遺伝的制御機構の解明wavy leaf 1(waf1)は、発芽後波打つような異常な葉を形成するが、やがて枯死する変異体である。シュートメリステム(SAM)は扁平になり、その未分化細胞は失われる。葉間期は正常であるため、このことは、葉原基によりSAMの細胞が消費され、SAM自体が消失することを示唆している。WAF1遺伝子はシロイヌナズナのHEN1のオーソログで、small RNAの制御に関わっていることを明らかにし、論文として公表した。葉の成熟速度を負に制御し、その結果葉間期を正に制御するPLA2に関して、野生型にゲノム遺伝子を導入したハイコピー変異体を作成した。ハイコピー変異体は、葉間期が長くなるとともに、葉も長くなった。葉の変形である穎(外穎、内穎)も長くなリ(大きくなり)結果とりして種子も大きくなった。葉の極性に関与する変異体の遺伝子単離と表現型解析昨年度葉身が形成されず、葉鞘のみとなるneedle 1 (ndl1)変異体を同定した。このような葉の基部-頂部パターンに異常を示す変異体はこれまで報告されていないので、葉のパターン制御機構を明らかにする上で非常に重要な変異体である。

indica品種KasalathとのF2集団を用いてポジショナルクローニングを進めた結果、NDL1遺伝子は転写因子をコードしていることが明らかになった。現在発現パターンの解析などを進めている。シュートメリステムと葉原基発生の遺伝的制御機構の解明wavy leaf 1(waf1)は、発芽後波打つような異常な葉を形成するが、やがて枯死する変異体である。シュートメリステム(SAM)は扁平になり、その未分化細胞は失われる。葉間期は正常であるため、このことは、葉原基によりSAMの細胞が消費され、SAM自体が消失することを示唆している。MAF1遺伝子はシロイヌナズナのHEN1のオーソログで、small RNAの制御に関わっていることを明らかにし、論文として公表した。葉の成熟速度を負に制御し、その結果葉間期を正に制御するPLA2に関して、野生型にゲノム遺伝子を導入したハイコピー変異体を作成した。ハイコピー変異体は、葉間期が長くなるとともに、葉も長くなった。葉の変形である穎(外穎、内穎)も長くなり(大きくなり)、結果として種子も大きくなった。
魚類筋肉ミオシン軽鎖の一次構造特性と食品機能発現に関する研究

魚類普通筋ミオシン軽鎖は,電気泳動における分子量の違いから,高等脊椎動物と同じパターンを示す白身魚グループ(A1軽鎖>DTNB軽鎖>A2軽鎖),カツオ,マサバ等サバ科グループ(A1軽鎖>A2軽鎖>DTNB軽鎖)およびイワシ類・アジ類のグループ(A1軽鎖>A2軽鎖≒DTNB軽鎖)に分けられ,特に低分子の必須軽鎖(A2軽鎖)における種特異性が大きいことがすでに報告されている。このような種特異性の背景を探るために,まず各種魚類ミオシン軽鎖のcDNAクローニングを行い,それらの全一次構造を決定したところ,A2軽鎖のN-末端側の構造に魚種間で顕著な相違があることを演繹されるアミノ酸配列から明らかにした。つぎに,一次構造を決定した魚種(トビウオ,シログチ,カツオ,マサバ,マイワシ,マアジ)につき,大腸菌を用いて発現ミオシンA1およびA2軽鎖の精製を試みた。そのうち,発現タンパク質として効率よく精製できたシログチ・ミオシンA1およびA2軽鎖を用いて,別に調製したスケトウダラ・ミオシンとの間でハイブリダイゼーションを行い,ハイブリッド・ミオシンの生化学的性状を検討したところ,得られたスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA1軽鎖によるハイブリッド・ミオシンとスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA2軽鎖によるハイブリッド・ミオシンとの間に熱安定性の相違を認め,ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖はミオシン機能の発現において異なる影響をもたらすことを見出した。つぎに,従来ほとんど調べられていなかった魚類血合筋ミオシン軽鎖のcDNAクローニングを行い,普通筋ミオシン軽鎖との性質上の相違点を一次構造レベルで検討した。魚類の血合筋ミオシン軽鎖は,普通筋とは異なり2種類の軽鎖(D1およびD2)しか存在しない。その結果,魚類血合筋ミオシンD1軽鎖は普通筋ミオシンA1軽鎖が有するN-末端側の特異配列,いわゆるDifference peptideに極めて類似した構造を持っていたことから,機能的には普通筋ミオシンA1軽鎖と同等の性状を示すものと解釈されたが,その全一次構造を比較すると,普通筋ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖の中間タイプであることが認められたことから,血合筋ミオシンD1軽鎖は普通筋ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖の両方の役割を一手に担っている可能性も新たに示唆された。魚類普通筋ミオシン軽鎖は,電気泳動における分子量の違いから,高等脊椎動物と同じパターンを示す白身魚グループ(A1軽鎖>DTNB軽鎖>A2軽鎖),カツオ,マサバ等サバ科グループ(A1軽鎖>A2軽鎖>DTNB軽鎖)およびイワシ類・アジ類のグループ(A1軽鎖>A2軽鎖≒DTNB軽鎖)に分けられ,特に低分子の必須軽鎖(A2軽鎖)における種特異性が大きいことがすでに報告されている.このような種特異性の背景を探るために,各種魚類ミオシン軽鎖のcDNAクローニングを行い,それらの全一次構造を決定したところ,A2軽鎖のN-末端側の構造に魚種間で顕著な相違があることを演繹されるアミノ酸配列から明らかにした.そこで,すでに一次構造を決定した魚種(トビウオ,シログチ,カツオ,マサバ,マイワシ,マアジにつき,大腸菌を用いてまず発現ミオシンA1およびA2軽鎖の精製を試みた.その結果,トビウオおよびシログチなどの白身魚のミオシンA1およびA2軽鎖はともに効率よく大腸菌によって発現されるが,サバ科やイワシ・アジ類などにおいては発現効率が極めて悪いことがわかった.その原因については目下詳細な検討を行っている最中である.つぎに,発現タンパク質として精製できたシログチ・ミオシンA1軽鎖およびA2軽鎖を用いて,別に調製したスケトウダラ・ミオシンとの間でハイブリダイゼーションを行い,ハイブリッド・ミオシンの調製を行った.その結果,得られたスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA1軽鎖によるハイブリッド・ミオシンとスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA2軽鎖によるハイブリッドミオシンとの間に熱安定性の相違があることを見出した.現在,ハイブリッド・ミオシンの安定性におけるミオシン軽鎖のモル濃度依存性を調べている.魚類普通筋ミオシン軽鎖は,電気泳動における分子量の違いから,高等脊椎動物と同じパターンを示す白身魚グループ(A1軽鎖>DTNB軽鎖>A2軽鎖),カツオ,マサバ等サバ科グループ(A1軽鎖>A2軽鎖>DTNB軽鎖)およびイワシ類・アジ類のグループ(A1軽鎖>A2軽鎖≒DTNB軽鎖)に分けられ,特に低分子の必須軽鎖(A2軽鎖)における種特異性が大きいことがすでに報告されている。

つぎに,一次構造を決定した魚種(トビウオ,シログチ,カツオ,マサバ,マイワシ,マアジ)につき,大腸菌を用いて発現ミオシンA1およびA2軽鎖の精製を試みた。そのうち,発現タンパク質として効率よく精製できたシログチ・ミオシンA1およびA2軽鎖を用いて,別に調製したスケトウダラ・ミオシンとの間でハイブリダイゼーションを行い,ハイブリッド・ミオシンの生化学的性状を検討したところ,得られたスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA1軽鎖によるハイブリッド・ミオシンとスケトウダラ・ミオシン重鎖-シログチ・ミオシンA2軽鎖によるハイブリッド・ミオシンとの間に熱安定性の相違を認め,ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖はミオシン機能の発現において異なる影響をもたらすことを見出した。つぎに,従来ほとんど調べられていなかった魚類血合筋ミオシン軽鎖のcDNAクローニングを行い,普通筋ミオシン軽鎖との性質上の相違点を一次構造レベルで検討した。魚類の血合筋ミオシン軽鎖は,普通筋とは異なり2種類の軽鎖(D1およびD2)しか存在しない。その結果,魚類血合筋ミオシンD1軽鎖は普通筋ミオシンA1軽鎖が有するN-末端側の特異配列,いわゆるDifference peptideに極めて類似した構造を持っていたことから,機能的には普通筋ミオシンA1軽鎖と同等の性状を示すものと解釈されたが,その全一次構造を比較すると,普通筋ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖の中間タイプであることが認められたことから,血合筋ミオシンD1軽鎖は普通筋ミオシンA1軽鎖とA2軽鎖の両方の役割を一手に担っている可能性も新たに示唆された。
要介護高齢者の家族における介護ストレスへの対処行動の精神的健康に及ぼす効果

介護ストレスに対して介護者がとる対処方略が、介護者自身の精神的健康にどのような影響を及ぼすかを検討した。我が国において、対処方略の精神的健康に対する影響は横断調査によっていくつか研究されているが、横断調査のみでは因果関係の方向性を特定できない。本研究では、縦断調査に基づいて、対処方略の5因子と燃えつきとの双方向の関係を検討し、因果関係の方向性の特定を試みた。東京都三鷹市の65歳以上の高齢者全数21,567人からスクリーニングした要介護高齢者1,379人の介護者を対象に1995年4月に訪問面接調査を行い、943人に調査を完了した。本研究の分析対象者はこれらの介護者を1年後に追跡調査して有効回答の得られた541人である。介護ストレスに対する対処方略は「介護に対するペース配分」「介護役割の積極的受容」「気分転換」「私的支援追求」「公的支援追求」の5因子(全16項目)から構成された。介護者の燃えつきは中谷(1992)の家族介謹MBIの下位尺度である「情緒的消耗」(8項目)と「離人化」(4項目)によって測定した。初回調査における高齢者のADL障害と認知障害、介護者の続柄、年齢、学歴、経済満足度は統制変数として用いた。対処方略の各因子と燃えつきの各下位尺度とのそれぞれの関係を縦断データの分析手法であるSYNCHRONOUS EFFECTSモデルによって分析した。分析の結果、対処方略と「情緒的消耗」との関係では、「介護におけるペース配分」と「介謹役割の積極的受容」は「情緒的消耗」によって減少させられた。「気分転換」は「情緒的消耗』を減少させ、「情緒的消耗」は「気分転換」を減少させるという双方向の関係がみられた。対処方略と「離人化」との関係では、「介謹役割の横極的受容」のみが「離人化」によって減少させられた。「私的支援追求」と「公的支援追求」は燃えつきの2因子と有意な関係はみられなかった。これらのことから「気分転換」という対処方略のみが燃えつきを減少させる効果をもつことが明らかになった。要介護高齢者の家族介護者の対処行動が精神的健康に及ぼす影響を検討するために、平成8年45月に三鷹市で実施した「高齢者の生活と福祉実態調査」に回答した65歳以上の要介護高齢者の介護者に対して、追跡調査を実施した。介護ストレスに対する対処行動は、「介護に対するペース配分」(「できる範囲で無理をしないようにお世話をする」等の3項目)、「介護役割の積極的受容」(「意志の疎通を図りお年寄りの気持ちを尊重する」等の4項目)、「気分転換」(「友人と会ったり自分の好きなことをしたりして気分転換をする」等の2項目)、「私的支援追求」(「お世話をしている人同士で励まし合う」等の3項目)、「公的支援追求」(「役所や医師・看護婦などの専門家に相談する」等の4項目)の5因子(全16項目)によって測定し、介護者の精神的健康は、燃えつきの程度を測定する尺度である家族介護MBIによって測定した。本年度は、熟練した調査員によって平成9年45月に訪問面接調査を実施し、回収された調査票からのデータ入力を終了した。現在、データクリーニングを進行中である。調査概要に関して述べると、追跡調査の対象者は初回調査に回答した介護者943人であった。その内、有効回答者(回収率)は835人(88.5%)で、高齢者の在宅介護を同一の介護者が継続しているもの620人、高齢者が入所あるいは死亡して現在は介護に携わっていないもの212人、高齢者は在宅で介護されているが介護者が変更されたもの3人である。未回答者は108人で、その理由は、介護者の拒否(49人)、不在(14人)、健康上の理由(14人)、死亡(7人)、転居(12人)、その他(12人)であった。

分析の結果、対処方略と「情緒的消耗」との関係では、「介護におけるペース配分」と「介謹役割の積極的受容」は「情緒的消耗」によって減少させられた。「気分転換」は「情緒的消耗』を減少させ、「情緒的消耗」は「気分転換」を減少させるという双方向の関係がみられた。対処方略と「離人化」との関係では、「介謹役割の横極的受容」のみが「離人化」によって減少させられた。「私的支援追求」と「公的支援追求」は燃えつきの2因子と有意な関係はみられなかった。これらのことから「気分転換」という対処方略のみが燃えつきを減少させる効果をもつことが明らかになった。
巨大空孔強磁性体の構築

近年、磁石としての性質だけでなく、誘電特性、光応答性などの特性を有する機能性磁性体が注目されている。機能性の観点から、ゲスト分子を内包できるような空孔を有する分子磁性体は、そのゲスト交換による磁性制御や高機能化が可能となるため興味深い化合物群である。本研究課題では、これまで合成が困難であった1ナノメートル径程度の巨大な空孔を有し、かつ強磁性転移を示す分子磁性体の構築に成功した。本化合物のようなナノ孔を持った強磁性体を用いれば、ガスや溶媒などの小分子だけでなく、多様な機能性分子を内包するような全く新しい強磁性化合物群が創成できると考えられ、新規機能性磁性材料への展開が期待できる。本研究では、機能性ゲスト分子を内包可能な巨大な空孔を有する強磁性体の構築を目的としている。平成27年度は、1 nm径を超える巨大な空孔を有しかつ強磁性転移を示す分子磁性体の設計と構築を行った。強磁性転移を示す分子磁性体を構築するには、常磁性金属種間の磁気的交換相互作用が強く、また、常磁性金属種が密に集積していることが重要であることから、本研究では常磁性金属種がCN基など短い架橋配位子で架橋された金属集合体を研究対象とした。構築素子として、スピンを持った八配位金属酸イオンと遷移金属イオンのみを用い、非磁性の有機配位子は極力排除し、巨大な空孔を有する強磁性金属集合体を合成した。当初の計画通り、アセトン-水混合溶媒中で、八配位金属酸イオンと遷移金属2価イオンをゆっくり錯形成させると、赤色板状の微小結晶が得られた。研究室レベルでは測定困難な微小結晶であったため、高エネルギー加速器研究機構において、放射光を用いた単結晶X線構造解析を行ったところ、1 nmを超える空孔を有する3次元金属集合体であることが明らかになった。その3次元構造は、CN基によって架橋されたコバルト(II)とタングステン(V)が交互に集積した構造となっており、空孔には水分子が多量に存在していた。一部の非架橋CN基は、空孔に面しており、水分子と水素結合していた。得られた化合物の多結晶体の磁気特性を調べるため、温度依存性磁化を測定したところ、28 Kにおいて強磁性転移を示すことが明らかになった。以上より、本化合物は、1 nm径を超える巨大な空孔を有し、かつ強磁性を示す新規金属集合体であることが示された。本研究では、機能性ゲスト分子を内包可能な1 nm径を超える巨大な空孔を有する強磁性体の構築を目的としており、平成27年度は、その磁性体の設計と構築を行った。八配位金属酸イオンと遷移金属2価イオンとを構築素子として、それらをアセトン-水の混合溶媒中でゆっくり錯形成させることにより、1 nmを超える空孔を有する3次元金属集合体の合成に成功した。本化合物は微結晶として得られたため、研究室レベルのX線回折装置では単結晶構造解析が困難であったが、高エネルギー加速器研究機構の放射光を用いることにより、結晶構造を決定することができた。得られた化合物の構造は、CN基で架橋された3次元金属集積構造となっており、1方向に揃った巨大な空孔を有していた。この構造は、当初予定していた構造とほぼ同一であり、計画的に目的化合物を合成できたと考えられる。また、磁化率温度変化測定の結果より、本化合物が28 Kで磁気相転移を示す強磁性体であることも明らかになった。以上より、計画段階で予想していた構造とほぼ同一の巨大空孔を有する構造体を得ることに成功し、また、本化合物が強磁性を示すことも明らかにできたため、おおむね順調に進展していると考えられる。本課題は、機能性ゲスト分子を内包可能な巨大な空孔を有する強磁性体の構築を目的としている。初年度に、1 nm径を超える巨大な空孔を有し、かつ強磁性を示すCo-W金属集合体の合成に成功しており、平成28年度は、その合成手法の改善および物性測定等を行った。アセトン-水混合溶媒中で、塩化ルビジウム存在下、八配位金属酸イオンとコバルト2価イオンをゆっくり反応させると、一週間程度で茶色粉末と赤色板状結晶が析出するが、さらに23か月程度経過すると結晶生成が進み、赤色板状結晶が主な生成物となることが明らかになった。この赤色板状結晶は、微量のルビジウムイオンを含んでいるが、アセトン-水混合溶媒に数日浸し、洗浄することを2-3回繰り返すことで精製できることがわかった。以上の合成手法を用いることで、目的化合物の収率を55%と改善することに成功した。紫外可視吸収スペクトル測定では、配位子からタングステン5価イオンへの配位子-金属間電荷移動、コバルト2価イオンからタングステン5価イオンへの金属-金属間電荷移動およびコバルト2価イオンのd-d遷移が観測されたことから、本金属集合体に含まれるコバルトとタングステンの価数は、それぞれ2価と5価であることが明らかになった。また、本化合物の磁化の磁場依存性を測定したところ、保磁力5500 Oeを有していることが明らかになった。また、飽和磁化の値から、Co-W間には強磁性的相互作用が働き、Co(II)(S = 3/2)およびW(V)(S = 1/2)上の各スピンが平行に配列した強磁性相を有することが明らかになった。

本課題は、機能性ゲスト分子を内包可能な巨大な空孔を有する強磁性体の構築を目的としてとしており、平成27年度から平成28年度までに、その合成手法の確立、結晶構造の決定、磁気特性の評価を完了した。結晶構造解析、磁気測定の結果より、得られた化合物は1 nmを超える空孔を有する強磁性体であることが明らかになっており、当初の計画通りに研究計画が進んでいる。また、合成手法の改良により、収量を増やすことに成功しており、今後、ゲスト交換のスクリーニングを行うにあたって円滑に進められると考えられる。本研究課題は、機能性ゲスト分子を取り込むことが可能な巨大な空孔を有する強磁性体の構築を目的としている。平成28年度までに、1 nm径を超える巨大な空孔を有するCo-W金属錯体を合成し、キュリー温度29 K、保磁力5500 Oeを示す強磁性体であることを明らかにした。Co-W間に強磁性的相互作用が働き、Co(II)(S = 3/2)およびW(V)(S = 1/2)上の各スピンが平行に配列した強磁性相を有している。平成29年度は、合成手法改善により合成時間を短縮し、また、巨大空孔強磁性体の結晶溶媒の脱離に伴う構造および磁性変化を観測することに成功した。本錯体は、過剰の塩化ルビジウム存在下、八配位金属酸イオン水溶液とコバルト2価イオンアセトン-水混合溶媒を2層になるように静置し、茶色粉末生成を経て、通常23か月後に赤色板状結晶として得られるが、反応初期2層溶液をわずかにゆすることによって、反応が促進され、2ー3週間程度で目的の赤色板状結晶が得られることを見出した。当該Co-W金属錯体が有する空孔は合成時に使用したアセトンおよび水で満たされているが、真空引きをおこなったところ、大部分の溶媒が離脱し構造変化することがわかった。本錯体の結晶は、真空引き後もその結晶性を保っており、単結晶X線構造解析が可能であった。溶媒脱離後の結晶構造は、脱離前のフレームワークと同様であったが、空孔がほぼ閉じたような構造を有していることが明らかになった。この構造変化した錯体の磁気測定をおこなったところ、強磁性転移温度が29 Kから20 K程度まで変化することが明らかになった。近年、磁石としての性質だけでなく、誘電特性、光応答性などの特性を有する機能性磁性体が注目されている。機能性の観点から、ゲスト分子を内包できるような空孔を有する分子磁性体は、そのゲスト交換による磁性制御や高機能化が可能となるため興味深い化合物群である。本研究課題では、これまで合成が困難であった1ナノメートル径程度の巨大な空孔を有し、かつ強磁性転移を示す分子磁性体の構築に成功した。本化合物のようなナノ孔を持った強磁性体を用いれば、ガスや溶媒などの小分子だけでなく、多様な機能性分子を内包するような全く新しい強磁性化合物群が創成できると考えられ、新規機能性磁性材料への展開が期待できる。平成27年度において、巨大な空孔を有し、かつ強磁性を示す3次元金属集合体を計画通り得ることができたので、次年度は、この化合物を用いて機能性ゲスト分子の包接実験を行う。当該3次元金属集合体により構築される空孔は、非架橋のCN基が空孔内に面していると考えられ、極性の高い空間になっていると考えられる。したがって、取り込むゲストは水溶性の高い極性ゲストを選択する。しかしながら、対象としている金属集合体結晶が生成する母液は、現在、アセトン-水の混合溶媒であるため、この溶媒環境下では極性ゲストは溶媒側で安定化してしまい、金属集合体空孔内に極性ゲストを取り込ませるのは困難であると予想される。したがって、まずは得られた金属集合体結晶を極性の低い溶媒中に移した後、ゲスト取り込み反応を試みる。
中耳手術後の舌知覚障害と膝神経節におけるMAP kinaseの機能解析

手術後2週間以内に、41例中21例(51.2%)に味覚症状、24例(58.5%)にしびれ症状を認めた。味覚症状、しびれ両方を認めた例が17例(41.5%)、味覚症状のみが4例(9.8%)、しびれのみが7例(17%)、どちらも認めなかった例が13例(31.7%)であった。味覚症状の消失時期は、1年以内63.2%であった。一方しびれ症状の消失時期は1年以内91.3%であった。1ラット鼓索神経切断モデルを作成し、三叉神経節での変化を測定した、鼓索神経切断後の三叉神経節ではATF3、TRPV1受容体、GFAP、p-p38、p-ERKの発現変化は認められなかった。中耳手術で鼓索神経を損傷すると、術後患者は味覚障害や舌知覚鈍麻を訴えることがある。アブミ骨手術前後の味覚・知覚機能と、自覚症状の推移について検討した。当科でアブミ骨手術を施行した患者に術前後の味覚症状・しびれ症状の有無を聴取した。術前後にディスクリミネーター(R)を用いた2点識別閾検査、電気刺激装置(STG 4002(R),Multi Channel Systems, Germany)を用いた電気知覚検査、電気味覚検査(TR-06(R)、RION)を施行した。問診、検査施行時期は、術前、術後2週間以内、1か月後、3か月後、6か月後、1年後とした。患側の術前群と術後群、術後の健側群・患側群とでそれぞれの検査閾値を比較した。また、しびれの有無による術前後の検査閾値差についても検討した。術後2週間以内に、約50%に味覚症状としびれ症状を認めた。いずれも術後2週間以内に症状が出現した。味覚症状、しびれの両方を認めた例が40%、味覚症状のみが10%、しびれのみが15%、どちらも認めなかった例が35%であった。味覚症状、しびれ症状の有無を経時的に追跡した。味覚症状の消失時期は、1か月以内20%、3か月以内33.3%、6か月以内46.7%、1年以内60%であった。一方しびれ症状の消失時期は、1か月以内31.6%、3か月以内63.2%、6か月以内78.9%、1年以内89.5%であった。また、ラット鼓索神経切断モデルを作成し、膝神経節での温・冷覚、痛覚に関与するTRP受容体の発現変化と舌知覚鈍麻の関係について検討した。ナイーブラット膝神経節では、全神経細胞の11.4%、11.8%、0.5%がそれぞれTRPV1、TRPA1、TRPM8受容体を発現していたが、鼓索神経切断により各受容体発現はそれぞれ4.4%、3.9%、0%まで低下した。鼓索神経切断後の三叉神経節ではATF3、TRPV1受容体、GFAP、p-p38、p-ERKの発現変化は認められなかった。臨床データに関しては当初の予定通りに検討できており、データ解析を行っている状態である。一方で動物実験においては当初期待されたMAPKkinaseの発現、発現変化が見られなかったこともあり、現在臨床データを中心として英文原著を作成中である。味覚症状、しびれの両方を認めた例が17例(41.5%)、味覚症状のみが4例(9.8%)、しびれのみが7例(17%)、どちらも認めなかった例が13例(31.7%)であった。1年以内で比較すると、味覚症状と比較してしびれ症状が有意に改善する結果であった(p<0.05)。2点識別閾検査、電気知覚検査、電気知覚検査結果は、術前の健側群・患側群間ではすべての検査において有意差を認めなかった。一方、患側の術前群・術後群、術後の健側群・患側群間では、いずれの検討でも3種類すべてにおいて有意な閾値上昇を認めた。術後にしびれ症状を有した症例で、検査を施行できた症例に関しても、すべての検査で有意に閾値が上昇した。術後に有意な閾値上昇を認めた割合は、2点識別閾検査で8例(30.8%)、電気知覚検査で10例(38.5%)、電気味覚検査で16例(61.5%)であった。3か月以内のそれぞれの改善率は、2点識別閾検査で87.5%、電気知覚検査で57.1%、電気味覚検査で42.9%と、知覚検査と比較して味覚検査で改善率が低下する傾向にあった。ラット鼓索神経切断モデルを作成し、三叉神経節での変化を測定した、鼓索神経切断後の三叉神経節ではATF3、TRPV1受容体、GFAP、p-p38、p-ERKの発現変化は認められず、鼓索神経切断による三叉神経節の変化はないと考えられた。

味覚症状、しびれ両方を認めた例が17例(41.5%)、味覚症状のみが4例(9.8%)、しびれのみが7例(17%)、どちらも認めなかった例が13例(31.7%)であった。味覚症状の消失時期は、1年以内63.2%であった。一方しびれ症状の消失時期は1年以内91.3%であった。1ラット鼓索神経切断モデルを作成し、三叉神経節での変化を測定した、鼓索神経切断後の三叉神経節ではATF3、TRPV1受容体、GFAP、p-p38、p-ERKの発現変化は認められなかった。臨床データに関して現在解析、英文原著を作成中である。動物実験に関してはMAPKkinase以外の物質も視野に入れ、鼓索神経切断モデルでの分子生物学的発現変化を観察予定である。耳科学必要試薬、器具などを既存の物品で代用できたために差額が生じた。また当初予測された鼓索神経切断モデルにおいてMAPKkinaseの発現、発現変化が起こらなかったため試薬等購入の必要がなくなったため。