hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心不全進行における低酸素環境と組織幹細胞システムの意義

食生活の欧米化、高齢化に伴い心不全患者数は急増しているが、病態メカニズムは未だ不明な点が多い。我々は心不全時に発現が変化する因子が心筋、心臓幹細胞システムにどのような影響を与えるのか検討をした。まずいくつかのラット心不全モデルを用いて、共通して発現が亢進する因子としてペリオスチンを見出し、そのC末端側に存在するアイソフォームの機能検討を行った。結果、心筋細胞のアポトーシスを誘導するアイソフォームが確認でき、選択的中和抗体を作成し、心筋梗塞モデルでの有効性を証明した。残念ながらいずれのアイソフォームも心臓再生には関与していなかったが、今後は独自に作成した中和抗体の臨床応用を目指す予定である。不全心内に存在する、低酸素環境が組織修復に与える影響を検討するため、高血圧による圧負荷モデル(食塩感受性Dahlラット、SHRラット)およびラット大動脈縮窄モデルに低酸素マーカーであるPimonidazole (60mg/kg)を腹腔内投与し、2時間後にsacrificeし、解析を行っている。また心不全病態の進行と伴に左室毛細血管数の減少が予測され、免疫染色を用いて検討を行っている。各心不全モデル(急性心筋梗塞モデル、大動脈縮窄モデル、動静脈シャントモデル)を用いて、心臓内低酸素環境の広がりを評価している。また、これらの心不全モデルにおいて、心機能の増悪する心不全代償期から非代償期にかけて発現が亢進する因子を探索している。これらの因子のうち、発現が著明に亢進する分泌たんぱく質としてペリオスチンたんぱく質を見出した。この因子は低酸素環境、左室伸展刺激下で主に線維芽細胞より分泌され、心筋接着を弱め心筋細胞死を誘導し心臓拡張を引き起こしていることが明らかとなった。さらにこのたんぱく質のC末端領域には4つのスプライシングアイソフォームが存在しており、各バリアントのノックアウトマウスモデルを作成し、現在心不全モデルでの心機能を解析中である。これまでのところペリオスチンエクソン17のノックアウトマウスでは心臓の繊維化が抑制され、梗塞内残存心筋量が増えること、ペリオスチンエクソン21ノックアウトマウスでは血管新生が抑制され、心機能が悪化することが明らかとなった。また全てのペリオスチンノックアウトマウスにおいて骨髄幹細胞由来マスト細胞の成熟が阻害され、脱顆粒現象が抑制されていることも分かっている。今後は独自に作成したペリオスチン中和抗体による心臓リモデリング抑制作用を検討すること、またより安全で選択性の高い治療としてエクソンスキップ法の導入を考えている。同時にこれら治療法による心臓再生の可能性について検討を行っている。計画は順調に遂行されているラット心不全モデルを用いて、心臓組織低酸素下で発現亢進する因子として分泌タンパク質ペリオスチンを見出した。ペリオスチンはC末端側に4つのスプライシングアイソフォームを有し、正常状態ではエクソン17および21のない一番短いアイソフォームが主に発現し、心不全非代償期にはエクソン17を含有するアイソフォームの発現が上昇していた。そこでまず、ペイオスチンエクソン17ノックアウトマウスおよびエクソン17に対する選択的中和抗体を作成した。心不全モデル(大動脈縮窄モデル、および心筋虚血モデル)を作成し、心機能・心臓炎症線維化マーカー、再生心筋について検討を行い、以下の治験を得た。ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して心機能が維持され、組織線維化が抑制されていた。またエクソン17中和抗体を用いた系でもエクソン17ノックアウトマウスで観察された心臓保護作用が確認された。しかしながら、再生心筋(BrdU陽性心筋細胞)の割合は変化を認めなかった。不全心筋において低酸素心臓幹細胞の割合が増えるが、ペリオスチンの選択的阻害では分化方向に誘導できなかったことが予想される。さらに、心臓内肥満細胞がペリオスチンを強発現し、ペリオスチンエクソン17ノックアウトにより成熟肥満細胞の脱顆粒が抑制されていた。未成熟肥満細胞はペリオスチンの発現が弱く、ペリオスチンが肥満細胞の成熟・分化・機能獲得にも影響していると考えられた。RNA-seqを用いた解析では、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウスで特にNF-kB経路が抑制されていることも明らかとなった。今後はペリオスチン以外のスプライシングバリアントスイッチが引き起こす病態形成について、網羅的な解析を予定している。初年度の計画はおおむね順調に進展できているものと考えられる。我々は4つあるペリオスチンの各スプライシングバリアントごとにノックアウトマウスを作成した。今後はこれらのマウスに心不全モデルを作成し、骨髄由来幹細胞、心臓内組織幹細胞機能と心臓再生能について検討する予定である。同時に安全で選択性の高い治療法の確立を目指している。循環器初年度の計画はおおむね順調に進展できているものと考えられるので、当初の予定通りH27年度の研究を遂行する。

また、私たちは代償期から非代償期への移行をregulationする物質の探索を行っており、Periostinおよびproteoglycan 4をターゲットに心不全治療の確立を目指している。これらの因子が低酸素環境により誘導されることはすでに証明されており、組織幹細胞とのクロストークを明らかにしたい。研究は予定通り進んでいる。残高は、次年度の研究をより発展させるため、試薬の購入に使用する。次年度分と合算し、物品購入等にあてるため。次年度分と合算し、研究用試薬・抗体の購入に使用する。次年度分と合算し、抗体・試薬の購入に使用する。
鉱山廃棄物の持続的な安定化に向けた有害金属の微生物ー鉱物相互作用の解明

猛毒のヒ素などの有害金属は世界で最も被害の深刻な汚染物質の一つであり、鉱山開発など人為的な汚染源や、鉱物や採掘ずりからの溶出など自然汚染源からも環境に放出され、長期的な安定化が望まれている。本研究では、有害金属動態プロセスのモデル化と安定化技術への応用を目指し、鉱山廃棄物の有害金属挙動に影響する微生物-鉱物相互作用を解明する。特に、深刻な健康被害を引き起こすとして重要汚染物質に指定されているヒ素とアンチモンに着目し、鉱山廃棄物の有害金属動態プロセスに微生物作用を組み込んだ包括的モデルを構築し、固定化に寄与する新規微生物機構を同定するとともに、長期的安定性の評価を実施する。
協同的な推敲におけるピアの実在性の役割とその影響過程の解明

本研究は,複数の書き手がお互いの書いた文章を読んでコメントし合うピアレビュー方式(peer-review style)の活動(協同的な推敲)を行う際に,書き手とピアとが時間および対話の空間を共有する距離にいること(物理的実在性)が推敲過程および推敲した文章にどのような影響を及ぼしているのか,またピアの物理的実在性と書き手が心的に表象するピアの存在(心理的実在性)など書き手の認識とがどのように関連するのか,ピアの実在性が協同的な推敲においてもつ役割とその影響過程とについて解明することを目的としている。平成30年度は,前年度までの研究成果を踏まえ,物理的実在型ピアレビューにおいて,書き手としての思考態度(mindset)の変化にピアの実在性がどのようにかかわるのかを論考した。継続したピアレビュー活動の前後に行った調査結果より,ピアレビュー活動は推敲や推敲後の文章に直接影響を与えるだけでなく,書き手としての思考態度の涵養にもつながっていることが示唆された。例えば,読み経験が豊富な参加者は,読み手を想定した小論作成や推敲についての自由記述は事前事後ともに少ないが,事後の記述では書き手としての思考態度をより体系的に言語化していた一方,読み経験が豊富でない参加者は,読み手を想定した自由記述が事後に増え,書き手としての思考態度が形成されつつある様子がうかがえた。このほかに,ピアが必ずしも同じ空間と時間とを共有しない状態でのピアレビュー活動を行い,事前事後の調査も実施した。このデータの分析は平成31年度に行う予定である。ピアおよびピアレビュー活動がもつ文章や推敲への直接的な効果だけでなく,参加者の書き手としての思考態度にも効果をもつことが一定程度確認できた。また,ピアが必ずしも同じ空間と時間とを共有しない状態でのピアレビュー活動を行い,事前事後の調査データも収集できた。平成31年度は,前年度に収集した,ピアが必ずしも同じ空間と時間とを共有しない状態でのピアレビュー活動および事前事後の調査のデータを分析する。その結果と,前年度までに得られた従来の物理的実在型のピアレビュー活動での知見とを比較することで,ピアの実在性/心理的実在性を参加者はどう認識しているのかを検討する。以上と,これまでの研究成果を踏まえ,ピアが物理的に不在であっても参加者にとって心理的実在性をもちうるための要件について調べるために,ピアの物理的実在と参加者にとっての心理的実在性とを操作したピアレビュー活動についての調査を行う。これにより,心的に表象されるピアの存在(心理的実在性)がどのように保障可能なのか,またその役割や影響の様相についてさらに精緻化および体系化を試みる。本研究は,複数の書き手がお互いの書いた文章を読んでコメントし合うピアレビュー方式(peer-review style)の活動(協同的な推敲)を行う際に,書き手とピアとが時間および対話の空間を共有する距離にいること(物理的実在性)が推敲過程および推敲した文章にどのような影響を及ぼしているのか,またピアの物理的実在性と書き手が心的に表象するピアの存在(心理的実在性)など書き手の認識とがどのように関連するのか,ピアの実在性が協同的な推敲においてもつ役割とその影響過程とについて解明することを目的とする。平成28年度は,ピアが目前にいて場を自分と共有する文脈で,複数の書き手がお互いの書いた文章(新書を読んでのレポートを想定)を読んでコメントし合うという,ピアレビューを用いた協同的な推敲を複数回行った後のアンケート調査を通じて,ピアの存在を参加者はどうとらえていたのかについて検討した。その結果,参加者は「新たな視点や意見を提示する存在としてのピア」「持続的に利用可能な資源としてのピア」としてピアをとらえており,実際に作文/推敲過程においてもピアのコメントや小論を参照していた。また,「実名でも匿名でもなく筆名で存在するピア」との心理的距離は多くの参加者にとって適度であり,「リアルな読み手/書き手としてのピア」は参加者が内化しモデルとして利用していた。これらの知見から,ピアレビューを用いた協同推敲は,自分の小論の評価や推敲のためのオプションがピアから得られることだけが評価されているのではなく,物理的な時間と対話の空間とを自分と共有するリアルなピアがおり,そのリアルなピアが自分の書いた小論のリアルな読み手・レビュアーであるという実感が参加者に肯定的な影響をもつと推察される。ピアレビュー方式(peer-review style)の協同的な推敲において,時間および対話の空間を共有する距離にピアがいる場合,参加者はピアの存在や影響などをどのように認識しているのかについて,その概略を明らかにし,得られた知見を国際学会および論文にて発表した。

平成29年度は,前年度の研究成果を踏まえて,同じ空間と時間とに書き手/読み手とそのピアが物理的に実在する設定でのピアレビュー(物理的実在型ピアレビュー)について,課題の本の数や種類を変えたうえで,ピアが推敲過程に与える影響についてさらに検討した。その結果,上述の設定にて繰り返し行った協同推敲活動の効果として「読み手に対して適切に伝えられる文章になっているか」により配慮するようになったことが示された。同時に,最初から反対意見や異論に対して説得するという文脈での小論作成は当初と比較し,あまり意識されなくなっていった。課題の本に依存する部分もあるのかもしれないが,事前に書き手がもっていた「説得」という文脈での小論作成から,事後には,まず自分の主張を明確にしたうえで,それを適切な表現にして,実際の読み手に理解してもらう必要があるという認識に至った書き手が多かったことが示唆された。課題の本の数や種類を変えたうえで,ピアが推敲過程に与える影響や役割についてさらに検討し,物理的実在型ピアレビューについて前年度までの知見に加えうる新たな知見が得られたため。本研究は,複数の書き手がお互いの書いた文章を読んでコメントし合うピアレビュー方式(peer-review style)の活動(協同的な推敲)を行う際に,書き手とピアとが時間および対話の空間を共有する距離にいること(物理的実在性)が推敲過程および推敲した文章にどのような影響を及ぼしているのか,またピアの物理的実在性と書き手が心的に表象するピアの存在(心理的実在性)など書き手の認識とがどのように関連するのか,ピアの実在性が協同的な推敲においてもつ役割とその影響過程とについて解明することを目的としている。平成30年度は,前年度までの研究成果を踏まえ,物理的実在型ピアレビューにおいて,書き手としての思考態度(mindset)の変化にピアの実在性がどのようにかかわるのかを論考した。継続したピアレビュー活動の前後に行った調査結果より,ピアレビュー活動は推敲や推敲後の文章に直接影響を与えるだけでなく,書き手としての思考態度の涵養にもつながっていることが示唆された。例えば,読み経験が豊富な参加者は,読み手を想定した小論作成や推敲についての自由記述は事前事後ともに少ないが,事後の記述では書き手としての思考態度をより体系的に言語化していた一方,読み経験が豊富でない参加者は,読み手を想定した自由記述が事後に増え,書き手としての思考態度が形成されつつある様子がうかがえた。このほかに,ピアが必ずしも同じ空間と時間とを共有しない状態でのピアレビュー活動を行い,事前事後の調査も実施した。このデータの分析は平成31年度に行う予定である。ピアおよびピアレビュー活動がもつ文章や推敲への直接的な効果だけでなく,参加者の書き手としての思考態度にも効果をもつことが一定程度確認できた。また,ピアが必ずしも同じ空間と時間とを共有しない状態でのピアレビュー活動を行い,事前事後の調査データも収集できた。平成29年度は,前年度の研究成果を踏まえて,課題状況を異なる設定にするが対象・方法ともに前年度の研究に準じた設定,すなわち時間と対話の空間を共有する状況でのピアレビューを用いた協同推敲(物理的実在型ピアレビュー)を行い,ピアが推敲過程に与える影響や役割についてさらに検討し,さらなる精緻化と体系化とを図る。平成30年度は,前年度までの研究成果をまとめて,物理的実在型ピアレビューにおいて,ピアは推敲の過程にどのような影響を与え,文章にどのような効果をもつのか,そして書き手の抱くピアの心理的実在性や認識にどのように関連するのかを論考する。
人工知能を活用した地域在住高齢者の運動機能診断と運動機能向上システム開発

住民検診は共通のアンケート用紙を用いて名古屋大学整形外科グループ(脊椎検診、膝検診)及び高次脳機能グループ(認知機能診)によって行った。2018年6月29-30日に70名(平均年齢73歳)の内科検診、運動器検診、高次脳機能検診を行った。さらに8月27-30日に570名(平均年齢65歳)の内科検診、運動器検診、高次脳機能検診を行った。ロコモティブ症候群とフレイルも評価した。1か月後に各々結果説明会、講演会、医療相談を行った。柏原検診は運動介入と高次脳機能介入を行った。運動介入は、いきいき健康教室(膝腰教室)を35名に行った。また芸術教室(貼り絵、ぬいぐるみ)を10名に対して行った。具体的には午後1時30分から1時間毎週3か月間(9月から12月)行った。運動内容は1カピバラ健康体操(体幹運動、関節、脊椎の運動を組み合わせたもの)と大学周囲のウオーキングを行った。膝や腰が痛くても参加を許可した。歩行前には関節の可動域運動やストレッチングを行った。8割以上参加できたのは30名だった。3か月の12月に運動器と高次脳機能評価を行った。最終評価を25名に対して行った。10m歩行速度とTUGは有意差はないが改善した。ロコモ検査も改善していた。芸術教室も運動器検診を行った。芸術群では運動機能の改善は見られなかった。昨年度と合わせた運動機能ロコモ検診の結果を日本整形外科学会で報告した。インターネットのSkypeを利用した運動指導を5名に4日間朝に行った。全て運動指導は可能であった。問題はタブレット操作を5名中3名は困難であった。2名はタブレットを指示によって使えた。今後はインターネットへのアクセス方法を考える必要がある。カピバラ体操の具体化とプロ指導ビデオを作製予定である。健康づくり体操のカピバラ体操は有用性の検証を行いビデオによる方法を考えている。2019年度は柏原検診と八雲検診を行う。柏原検診は3年目となり市の広報誌に4月に運動教室開催を案内して検診への150名参加募集する。八雲検診は八雲町保健福祉課や町民ドックボランティアとの協力のもとに8月30-9月1日に600名募集する。内科検診、運動器検診、高次脳機能検診を行う。柏原検診は運動介入と高次脳機能介入を行う。運動介入は、いきいき健康教室(膝腰教室)と芸術教室(陶芸)をおこなう。運動内容は1カピバラ健康体操(体幹運動、関節、脊椎の運動を組み合わせた運動の確定とビデオ作成)と大学周囲のウオーキングを行う。3か月の12月に運動器と高次脳機能評価を行う。iPadを持ちいた指導方法は実用的ではないことが判明した。Webによる運動機能の医療相談およびプロモーションビデオの提供方法を検討する。

健康づくり体操のカピバラ体操は有用性の検証を行いビデオによる方法を考えている。2019年度は柏原検診と八雲検診を行う。柏原検診は3年目となり市の広報誌に4月に運動教室開催を案内して検診への150名参加募集する。八雲検診は八雲町保健福祉課や町民ドックボランティアとの協力のもとに8月30-9月1日に600名募集する。内科検診、運動器検診、高次脳機能検診を行う。柏原検診は運動介入と高次脳機能介入を行う。運動介入は、いきいき健康教室(膝腰教室)と芸術教室(陶芸)をおこなう。運動内容は1カピバラ健康体操(体幹運動、関節、脊椎の運動を組み合わせた運動の確定とビデオ作成)と大学周囲のウオーキングを行う。3か月の12月に運動器と高次脳機能評価を行う。iPadを持ちいた指導方法は実用的ではないことが判明した。Webによる運動機能の医療相談およびプロモーションビデオの提供方法を検討する。共同研究者の旅費と物品費は2019年に支出予定になります。
高性能拡大伝熱管の開発に関する基礎的研究

高性能の拡大伝熱管としてデイフューザ流路の適用を考え、デイフューザ広がり角θ、および種々の流路入口状態による熱的性能比の検討および伝熱促進機構を解明するために以下のような装置を用い実験を行った。実験装置は広がり角、アスペクト比が容易に変化できるように二次元ディフューザとした。両側壁の伝熱板はスパン長さ500mm,流れ方向長さ1000mmの大きさで、その表面は30μmのステンレス箔をはり付けた熱流束一定のものとした。壁面温度測定用の熱電対は流れ方向に50mm間隔、伝熱板中心部(x=490,510mm)にスパン方向に10mm間隔で埋め込まれている。後者の熱電対はなく離・再付着領域の熱伝達率、またたて渦による温度変化のスパン方向分布を知るためのものである。本実験は第1段階として、アスペクト比3,θ=8°,15°に限定し、流れ方向およびスパン方向の局所熱伝達率および流れ場(静圧分布,壁面まさつ力)を測定した。なおこの場合の入口幅は100mmである。片面の非加熱部の長さ【X_0】を0,5,10,15,20mmにして、伝熱板を下流にずらしつつ、流速をU=5,10,15,20,30,40,50m/sの場合について局所値が測定された。θ=15°の場合、僅かに偏流を起こしており、両壁面に差異が見られるが、局所値は滑面の平板境界層内の熱伝達率Nux=0.0296【Rex^(0.8)】【Pr^(0.6)】によく一致した。流速が大きくなるにつれて、平板の値からの差異が生じ、その差異はRex【>!=】3×【10^5】で起る。またスパン方向の分布は中央部が小さい値を元す。θ【<!=】15°では、僅かな偏流を伴うものの静圧分布、壁面まさつ力などの流れ場は滑面平板境界層における値と余り変らない。ただ広がり角θ【<!=】15°で、減速流れであるにもかかわらず、下流の局所値は平板の値に比べて余り低くなってない。このことは伝熱管として有望である。はく離・再付着が顕著となるθが大きい場合については現在実験中である。
高血圧における腎糸球体・尿細管機能異常の糸細胞生物学ならびに分子生物学的解明

糸球体血行動態や尿細管機能は高血圧の発症・維持のみならず、腎障害の進展様式にも重要である。本研究においては糸球体血行動態に重要な輸入細動脈を我々が開発した単離灌流法を用いて研究するとともに、水電解質の排泄の調節に重要なプロスタグランディン(PG)について検討した。1)糸球体輸出入細動脈微小灌流実験では、20-hydroxyeicosatetraenoic acid(20-HETE)のウサギ輸入細動脈への作用を検討した。その結果、輸入細動脈で20-HETEが有意な収縮を起こすためには輸入細動脈のbasal toneの上昇が必要であり、その作用には内皮依存性で一部はシクロオキシゲナーゼによる2-HETEの代謝に依存していることが明らかとなった。高血圧発症期には腎における20-HETEの産生増加と輸入細動脈のtoneの上昇が生じている。今回の検討結果から、この両者が相乗的に作用して輸入細動脈が収縮する結果、腎血管抵抗が上昇して高血圧が発症する可能性が示唆された。2)カルシウム拮抗薬は臨床の場で最も頻用されている降圧薬である。我々の研究でカルシウム拮抗薬は輸入細動脈を拡張させるが、輸出細動脈は種類により差があることが示された。輸入細動脈が拡張するため、全身血圧が糸球体に伝わり易くなるため、糸球体内圧をコントロールして腎保護作用を期待するためには全身血圧も充分にコントロールする必要があると考えられる。3)トロンボキサン受容体(TXR)cDNAラット腎よりクローニングし、受容体が糸球体遠位尿細管に存在すること、及びTXRの遺伝子は染色体7q11に存在することを解明した。4)腎PGEの受容体EP_3及びEP_<3B>はそれぞれcAMPの低下及びカルシウムの上昇を介して、水・ナトリウム利尿に関与すること及び、EP_3遺伝子は2q44-45の遺伝子座にあることが解明された。その結果、輸入細動脈で20-HETEが有意な収縮を起こすためには輸入細動脈のbasal toneの上昇が必要であり、その作用には内皮依存性で一部はシクロオキシゲナーゼによる20-HETEの代謝に依存していることが明らかとなった。2)我々はトロンボキサン(TX)受容体cDNAについてラット腎よりクローニングし、そのmRNAの局在が糸球体にあることを示した。また、TX受容体に対する抗体を作製し、この抗体を用いてさらに蛋白レベルでTX受容体発現を腎において検討し、発現が糸球体のみならず皮質尿細管にも存在している可能性を報告した。さらに、TX受容体遺伝子は、染色体7q11に存在していることも明らかとした。一方、腎TX合成系については、TX合成酵素cDNAについてもクローニングし、その構造と発現について検討を加えた(投稿準備中)。以上のように、分子生物学的方法によりTX系の幾つか分子について、構造、発現を解明し、その分子基盤を明らかにした。3)腎プロスタグランジン(PG)の尿細管作用をクローン化したPG受容体(EP_3受容体)cDNAを用いて検討し、EP_<3A>及び受容体EP_<3B>

受容体は、それぞれサイクリックAMPの低下作用及び細胞内カルシウムの増加作用を介して、水ナトリウム利尿作用を示す可能性について示された。また、EP_<3B>受容体遺伝子は2q44-45の遺伝子座にあることがマッピングされた。一方、腎電解質調節に関与するイオンとしてC1イオンチャンネルに着目し、その一つをクローニングし、このC1イオンチャンネルのmRNA発現がEP_<3B>受容体mRNAと局在が共通していることを明らかにしている。糸球体高血圧は腎機能障害を進展させるため、そのコントロールは腎保護をめざした治療に重要である。本年度は、糸球体血圧をコントロールするのに重要な糸球体輸入・輸出細動脈を単離灌流して実験を行った。特に高血圧症治療に我国で最も使用されているカルシウム拮抗薬が、糸球体の血行動態にどのような影響を与えるかを検討した。ニフェジピン(Nif)、ニカルジピン(Nic)又はマニジピン(MA)をノルエピネフリン(NE)であらかじめ前収縮させた輸入動脈に投与すると、三者とも血管拡張を起こした。一方、輸出細動脈を糸球体を通して灌流(順行性灌流)し、NEで前収縮した標本では、NifやNicは血管内径を変化させなかったが、MAは有意な血管拡張をするため、MAが糸球体で血管拡張物質の合成を刺激し、それが輸出細動脈へ到達してその効果を発揮している可能性がある。そこで、輸出細動脈を末梢側から逆行性に灌流して、糸球体の影響を取り除いてMAの効果を検討した。この標本でもやはりMAは輸出細動脈を拡張させたが、その拡張反応は順行性灌流と比較して低下していた。すなわち、MAによる輸出細動脈の拡張は直接作用と糸球体を介するものの両方によると考えられる。また、順行性灌流において、一酸化窒素(NO)やプロスタグラディン(PG)を阻害してもMAの作用には影響せず、NOやPG以外の何らかの物質がMAの輸出細動脈拡張作用に関与していると考えられる。以上、カルシウム拮抗薬は、輸入細動脈を拡張するため全身血圧が糸球体内に伝わりやすくなるため、腎保護作用を得るためには、全身血圧を十分にコントロールすることが必要と考えられる。また、カルシウム拮抗薬の中でも種類によっては輸出細動脈を拡張するものもあることが判明した。
MAbによる生理活性配糖体の簡易検出・単離法及び小型化抗体遺伝子に関する研究

本研究では生理活性を持つ生薬由来配糖体(ニンジンのジンセノシド、甘草のグリチルリチン、大黄のセンノシド類、柴胡のサイコサポニン類、サフランのクロセチン配糖体)をターゲットとして、それらに対するモノクローナル抗体(MAb)を作成してきた。それらを用いて高感度で特異性の高いアッセイ法を確立してきた。また、ソラソジン配糖体に対する抗体産生ハイブリドーマから小型化抗体遺伝子を作成し、小型化抗体(scFV)の作成に成功した。ジンセノシド(G)に関してはGRb1,GRg1それぞれに対するMAbを作成し、新免疫染色法としてイースタンプロテイング法を確立した。本法により坑GRb1,GRg1MAbを用いた2重染色に成功した。本法によるとGRb1系統のGは青色、GRg1系統はピンク系統に染色される。従って発色とRf値によりGの構造を容易に類推することを可能にした。その他の配糖体についても同様な開発に成功した。MAbを装着したアフィニテイーカラ厶の作成に成功した。坑GRb1MAbの場合、ニンジンエキスをカラムに付し、洗浄液、溶離液の順に添加すると、洗浄液によりGRb1以外の成分と過剰のGRb1が溶出する。次に溶離液によってGRb1のみが溶出し、ワンステップ単離に成功した。また、洗浄液中のG類はカラムを繰り返すことによりGRb1とGRcを分離可能なことが明らかとなった。scFV遺伝子をハイブリドーマからmRNAを抽出し、転写酵素でcDNAとし、プライマーによりMAbの可変部分、VH, VL遺伝子をクローニングした。両者をリンカーで結合し、プラスミッドに挿入し、発現ベクターに組み換え、大腸菌でscFVタンパクを発現した。本遺伝子をソラソジン配糖体を産生するナス科植物へ導入し、ソラソジン配糖体の高含有株(約3倍)を作出した。本研究のターゲットである配糖体類に関してはポリクローナル抗体の成功例はあるがモノクローナル抗体(MAb)に関してはほとんど見られてないのが現状である。これは一般に抗原中のハプテン数の確定が困難であったため、容易に適切な抗原を作成することが出来なかったことによるものと推察される。我々は世界に先駆けてMALDI-MSによりハプテン数を容易に確定する手法を確立し、この結果当研究室では確実な免疫化が成されるようになった。本研究では人参サポニンの1つであるジンセノサイドRb1やナス科植物のソラソジン配糖体、甘草のグリチルリチン、サフランのクロシン等に対するMAbを作成し、それらを用いた再現性良好で高感度のアッセイ系を構築した。またアフィニティークロマトを作製し、ワンステップの単離を行った。一方抗ソラマルジンMAb産生ハイブリドーマから常法により小型化抗体(scFV)遺伝子を作製し、大腸菌に形質転換し、scFVを100mg/l培地発現する系を開発した。本研究では生理活性を持つ天然由来配糖体(人参のジンセノシド,甘草のグリチルリチン,大黄のセンノシド類,柴胡のサイコサポニン等)に対するモノクローナル抗体(MAb)を作製し,高感度かつ再現性の高い手法を開発してきた。また,ソラソジン配糖体に対するMAb産生ハイブリドーマから小型化抗体を作製してきた。ジンセノシドに対してはジンセノシドRb1,Rg1それぞれに対するMAbを作製し,それらを用いたウエスタンブロテイングを行い,二重染色に成功した。

この染色法は発色の色彩によってアグリコンの確定を,バンドのRf値により糖の数を特定出来る画期的な手法である。本手法を応用して人参や竹節人参の成分の特定を行った。大黄のセンノシド類,柴胡のサイコサポニン等に付いても高感度の分析法を構築した。小型化抗体遺伝子を植物へ導入することにより、抗体と2次代謝産物とのコンプレックスを生成し、より多量の2次代謝産物を生産蓄積するというアイディアに基ずくものである。Agrobacteriumに組み換えるために、まず大腸菌でのscFVの発現系を構築した。抗ソラソジンMAb産生ハイブリドーマからmRNAを抽出し、逆転写によりcKNAを合成したVHとVLの可変部分に相補的なプライマーを用いてPCRを行いVH,VLを増幅した。VH,VLをペプチドリンカーにより連結しscFV遺伝子を構築する。このものをpET-28aベクターへ組み換えた。本ベクターを大腸菌BL21に形質転換し大量発現系を構築し、IPTGの添加によりscFVを発現させた。本法によれば培地100nl当たり約100mgのscFVが得られる。現在scFV遺伝子をAgrobacteriumに組み換え,組み換え植物体で発現させることによりソラソジン配糖体の生合成をコントロールし、高含有株を作出すべく実験を進めている。本研究では生理活性を持つ生薬由来配糖体(ニンジンのジンセノシド、甘草のグリチルリチン、大黄のセンノシド類、柴胡のサイコサポニン類、サフランのクロセチン配糖体)をターゲットとして、それらに対するモノクローナル抗体(MAb)を作成してきた。それらを用いて高感度で特異性の高いアッセイ法を確立してきた。また、ソラソジン配糖体に対する抗体産生ハイブリドーマから小型化抗体遺伝子を作成し、小型化抗体(scFV)の作成に成功した。ジンセノシド(G)に関してはGRb1,GRg1それぞれに対するMAbを作成し、新免疫染色法としてイースタンブロテイング法を確立した。本法により坑GRb1,GRg1MAbを用いた2重染色に成功した。本法によるとGRb1系統のGは青色、GRg1系統はピンク系統に染色される。従って発色とRf値によりGの構造を容易に類推することを可能にした。その他の配糖体についても同様な開発に成功した。MAbを装着したアフィニテイーカラムの作成に成功した。坑GRb1MAbの場合、ニンジンエキスをカラムに付し、洗浄液、溶離液の順に添加すると、洗浄液によりGRb1以外の成分と過剰のGRb1が溶出する.次に溶離液によってGRb1のみが溶出し、ワンステップ単離に成功した。また、洗浄液中のG類はカラムを繰り返すことによりGRb1とGRcを分離可能なことが明らかとなった。scFV遺伝子をハイブリドーマからmRNAを抽出し、転写酵素でcDNAとし、プライマーによりMAbの可変部分、VH, VL遺伝子をクローニングした。両者をリンカーで結合し、プラスミッドに挿入し、発現ベクターに組み換え、大腸菌でscFVタンパクを発現した。本遺伝子をソラソジン配糖体を産生するナス科植物へ導入し、ソラソジン配糖体の高含有株(約3倍)を作出した.
有機電極反応過程のフーリェ変換赤外(FTIR)分光学的研究

本研究では、FTIR法を用いてinーsituに電極/電解液界面の電気化学測定を可能にする装置を組み立て、いくつかの電極反応過程に適用し次の様な知見を得た。1.市販の偏光反射赤外スペクトル測定用アクセサリーを工夫することでFTIR法を用いた電極界面スペクトルの測定装置を組み立てた。測定上の重要なポイントは、高感度検出器の使用と適切なセルの作製にある。本研究で構成した装置を用いてCN^-やFe(CN)X^<4-13->_6系の測定を行い、本装置が正常に作動していることが確かめられた。2.CーN伸縮振動に注目して、いくつかの金属シアノ錯体の界面電気化学測定を行なった。WおよびM_0シアノ錯体では中心金属の3価又は4価の酸化状態に、CN伸縮振動はほとんど影響されない。C_0シアノ錯体の場合も酸化体、還元体のCーN伸縮振動を区別して捕えることが困難であった。一方、金電極上では、シアノ錯体の酸化還元とともに金シアノ化合物の生成が認められた。特に、Au(CN)X^-_2の酸化反応は、過剰のCN^-が酸化され、Au(CN)X^-_2ー2e+H_2O→AuCN+CNO^-+2H^+となることが明らかになった。3.電極表面に生成した薄膜のうち、厚みのあるものについては赤外反射スペクトルが得られた。本研究では、メチルビオローゲンの還元によって生じる薄膜およびチトクロムCの薄膜について、電極電位による膜の状態変化を示すスペクトルを得た。その他、機能性電解重合膜や炭酸ガスの還元反応に関する赤外分光学的知見を得た。4.しかし、電極界面に存在する単分子層の吸着種の情報を得るためには測定装置の光学系の改良による空気中の水蒸気やCO_2によるノイズの低減や各種変調法の導入が必要である。本研究では、有機化合物の電極反応の詳細を解明するため、電極表面を主にFTIR法によって分子レベルで精査し、表面化学種の同定、存在状態、物性変化などを直接検出して、その知見の増大を計ることを目的としている。当該年度の研究成果は次の様に要約される。1.in-situ測定セルの最適化:本研究ではFTIR装置と測定セルをマッチングさせ、目的の情報が得られるシステムを構成することが最も重要な課題となる。種々の試行錯誤を経て、厚い【C_a】【F_2】窓材を用いた独自の測定セルを完成させた。2.FTIRシグナル測定:上記セルを用いて、電解重合ポリピロール膜の電位によるアニオンのドーピング、脱ドーピング過程がin-situで捕えられた。また、炭酸ガスの還元過程に関連したギ酸の電極表面での吸着状態に関するin-situシグナルが電位の関数として得られた。さらに、生体分子機能修飾電極表面の評価と関連して、チトクロムCの速い電子移動が可能な機能性電極表面では、チトクロムCは見立った構造上の変化がないが、裸の金属電極表面に直接吸着したチトクロムCは、蛋白部分の構造変化が認められ、他のSERS法などで得られた結果とのよい対応性を示した。3.問題点と課題:しかし、本研究において用いたSet upでは、1μm程度の厚さの電極表面薄層に関する知見は容易に得られるものの、さらに分子レベルでの情報を得るため10003000回程度の積算を行い、差スペクトルを取る方法が必要であった。

このため長時間の測定中の種々の微小環境変化などがノイズとしてシグナルに乗り、一通りの目的の測定はできたものの、詳細な議論をするだけの情報とは言い難い面を残した。現在高感度検出器を導入中で、それを用いて得られる結果をも考慮して、本研究で得られた興味ある知見について詳細な議論を行なう。
カルシトニン遺伝子関連ペプチドによる心筋イオンチャネル機能調節の分子機序の解明

本研究では、哺乳類心筋細胞のカルシウム電流(I_<Ca>)および遅延性カリウム電流(I_K)それぞれに対するカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の作用の細胞内分子機序を探ることを目的として実験を行なった。また、本研究遂行中に付帯的事項として、最近心血管系における役割が注目され、選択的拮抗薬の開発が話題となっている生体内活性ペプチド、エンドセリンの電気生理学的作用に関し、極めて興味深い事実が判明した。1.CGRP作用のイオンチャネル特異性とそれに介在するcAMPの役割についての検討記録電極を通じてcAMPを細胞内へ直接投与し、I_<Ca>、I_K両電流に対する活性化作用を調べた。whole-cell clamp成立の瞬間からI_<Ca>とI_Kとの両膜電流の変化を観察した結果、(i)cAMPの細胞内灌流によりI_<Ca>、I_K共に活性化されるがその時間経過は前者が数10秒程度先行すること、(ii)cAMPの作用が平衡に達した時点では、I_<Ca>、I_K共に同程度の増大率に達することが明らかとなった。これらの結果は、cAMP以降両イオンチャネルに至る経路に、(1)介在する酵素(群)の反応速度に違いがあるか、或いは(2)それらの酵素(群)のcAMP感受性自体に差がある可能性を想定しなければ説明がつかない。この点につき、現在種々の濃度のcAMPあるいはAキナーゼの触媒サブユニットを細胞内に直接適用することによる両電流の増大率を定量的に検討中である。cAMPの細胞内局所濃度を光学的に測定する方法も検討中である。2.エンドセリン(ET)の心筋活動電位に対する作用とそのイオン機序エンドセリンは強力な心搏数増大作用および心収縮力増大作用を有することが知られているが、心筋活動の基礎をなす各種イオンチャネルの機能に対する作用は殆ど未解明である。本研究により、以下の事実が明らかとなった。ET-1は比較的低濃度より静止膜電位を過分極させ、活動電位の持続時間を短縮させた。この作用はBQ123で遮断されたことよりET_A受容体を介したものであると考えられた。この作用のイオン機序を膜電位固定法により解析した結果、ET-1はETA受容体を介して、I_<Ca>を抑制し、アセチルコリン性カリウムチャンネル(I_<K(ACh)>)を活性化させることが判明した。さらに、これらETの電気生理学的作用の細胞内機序につき、基礎的検討を加えた結果、GTP結合蛋白質および細胞内cAMPの産生制御の関与が示唆された。現在、これらの細胞内機序につき、引き続き更に詳細に検討中である。
岩石のダブルトーション試験におけるクラックの進展特性に関する研究

1)試料の用意大島花崗岩を用いてダブルトーション試験を行った.大島花崗岩の有する異方性を考慮し,異方性の主軸の方向に抜かれた3種類の岩石を用意しこれより,クラック進行方向と開口方向を考慮して6種類の試験片を用意した.なお当初の予定では,Westerly花崗岩についても同様の実験を行う予定であったが販売元の供給が停止しているためできなかった.2)無載荷状態におけるクラックの観察載荷に伴って生じたクラックと載荷以前から存在した先在クラックを区別するため,載荷前の供試体の表面を実体顕微鏡にて観察した.その際,同定を容易にするために岩石表面はダイヤモンドペーストで研磨した.3)弾性波速度の測定弾性波速度の測定は非破壊的に材料内部の情報を与えるので,岩石内の概略のクラック分布を推定するため載荷前に試料の弾性波速度を測定した.4)ダブルトーション試験の実施5)薄片の製作・観察実験に供した試験片を厚さ100分の2mmの薄片にし光学顕微鏡に観察し,写真撮影するとともに,クラック長や鉱物粒名などをディジタル量に変換しファイル化した.6)クラックの伸張特性の検討クラック経路の定性的把握に努めるとともに,ファイル化されたデータをマイクロコンピュータを用いて解析した.その結果載荷にともなって発生するクラックが鉱物粒内のあるいは鉱物粒界の相対的に強度の小さい部分を選択的に通過することが明らかになった.7)クラック経路の解析ディジタル化されたデータを用いてクラック経路のフラクタル次元を3通りの方法で求めた.1)試料の用意大島花崗岩を用いてダブルトーション試験を行った.大島花崗岩の有する異方性を考慮し,異方性の主軸の方向に抜かれた3種類の岩石を用意しこれより,クラック進行方向と開口方向を考慮して6種類の試験片を用意した.なお当初の予定では,Westerly花崗岩についても同様の実験を行う予定であったが販売元の供給が停止しているためできなかった.2)無載荷状態におけるクラックの観察載荷に伴って生じたクラックと載荷以前から存在した先在クラックを区別するため,載荷前の供試体の表面を実体顕微鏡にて観察した.その際,同定を容易にするために岩石表面はダイヤモンドペーストで研磨した.3)弾性波速度の測定弾性波速度の測定は非破壊的に材料内部の情報を与えるので,岩石内の概略のクラック分布を推定するため載荷前に試料の弾性波速度を測定した.4)ダブルトーション試験の実施5)薄片の製作・観察実験に供した試験片を厚さ100分の2mmの薄片にし光学顕微鏡に観察し,写真撮影するとともに,クラック長や鉱物粒名などをディジタル量に変換しファイル化した.6)クラックの伸張特性の検討クラック経路の定性的把握に努めるとともに,ファイル化されたデータをマイクロコンピュータを用いて解析した.その結果載荷にともなって発生するクラックが鉱物粒内のあるいは鉱物粒界の相対的に強度の小さい部分を選択的に通過することが明らかになった.7)クラック経路の解析ディジタル化されたデータを用いてクラック経路のフラクタル次元を3通りの方法で求めた.1)Westerly花崗岩および大島花崗岩を用いてダブルト-ション試験を行った.試験に当っては花崗岩の持つ異方性を考慮した.大島花崗岩については主軸に関して6通りのクラック経路を試験した.2)試験後の供試体を着色したシアノアクリレ-ト系の接着剤中に浸して浸潤させ引張側より岩石薄片を製作した.3)岩石薄片を光学顕微鏡で観察し,クラックの経路を粒内クラックおよび粒界クラックに分類した.さらに粒内クラックについては,鉱物粒の種類ごとに,粒界クラックについてはそのクラックに関連した鉱物粒の組み合わせによってクラック経路を分類した.4)以上の検討の結果,応力によって引き起こされるクラックの経路に鉱物粒の性質と関連した規則性が存在することが明らかになった.5)複雑なクラック経路を定量化するためにクラックの経路を読み取ってディジタル量に変換した.これより高速フ-リエ変換によってパワ-スペクトル密度を計算し,周波数領域でのクラック経路の特徴について検討した.6)さらに得られたスペクトルからフラクタル次元を計算しクラック経路を定量化した.フラクタル次元や得られた全デ-タの解釈は現在検討中である.7)ダブルト-ション試験によって得られたクラック経路と実際の破壊面の関連については今後表面粗さ計などを用いて解析を進める予定である.1)試料の用意大島花崗岩を用いてダブルト-ション試験を行った。大島花崗岩の有する異方性を考慮し,異方性の主軸の方向に抜かれた3種類の岩石を用意しこれより,クラック進行方向と開口方向を考慮して6種類の試料片を用意した.なお当初の予定では,Westerly花崗岩についても同様の実験を行う予定であったが販売元の供給が停止しているためできなかった.2)無載荷状態におけるクラックの観察載荷に伴って生じたクラックと載荷以前から存在した先在クラックを区別するため,載荷前の供試体の表面を実体顕鏡にて観察した.その際,同定を容易にするために岩石表面はダイヤモンドペ-ストで研磨した.3)弾性波速度の測定弾性波速度の測定は非破壊的に材料内部の情報を与えるので,岩石内の概略のクラック分布を推定するため載荷

前に試料の弾性波速度を測定した.4)ダブルト-ション試験の実施5)薄片の製作・観察実験に供した試験片を厚さ100分の2mmの薄片にし光学顕微鏡に観察し,写真撮影するとともに,クラック長や鉱物粒名などをディジタル量に変換しファイル化した.6)クラックの伸張特性の検討クラック経路の定性的把握に努めるとともに,ファイル化されたデ-タをマイクロコンピュ-タを用いて解析した.その結果載荷にともなって発生するクラックが鉱物粒内のあるいは鉱物粒界の相対的に強度の小さい部分を選択的に通過することが明らかになった.7)クラック経路の解析ディジタル化されたデ-タを用いてクラック経路のフラクタル次元を3通りの方法で求めた.
精巣捻転症における精巣温存率向上のための治療戦略

精巣捻転症は思春期に好発し、診断治療の遅れは精巣の喪失を来し得るため、臨床的にも社会的にも重要な救急疾患であり、精巣温存率の向上が急務の課題である。今回の研究では、1精巣捻転症のリスクを評価する一般医家向けのアプリケーションを開発し、2陰嚢冷却法+精巣白膜切開法+虚血ポストコンディショニング法という新しい治療戦略を導入することで、本疾患についての認知を高めて早期の受診・診断治療につなげ、これまで温存できなかった精巣の温存を試み、トータルで精巣温存率の向上につなげることを目標とする。
電圧比位相変換によるドリフトフリー物理計測

計測電圧と参照電圧の比を決定する新しい方法として、比/位相変換法を開発した。計測電圧と参照電圧とグランドレベルを周期的に順次切り替える事によって生成する階段状の信号を計測すると、ゲインとオフセットのドリフトが簡単に補正できる為、2点校正方法として有用である。階段状信号の位相を計算する事で2点校正を実現させる事ができる。但し、電圧計には固有の時間遅れがあり、そのドリフトが位相に現れてしまう。そこで、3倍高調波を利用してこの時間遅れを補正する事に成功した。また、階段状信号の高調波をキャンセルする事で電圧計(A/D変換器)の非線形性が低減できる事を発見した。基準電圧比源については、市販の安価な金属箔抵抗器を用いれば、特別な恒温環境を構築しなくても、100ppb程度の安定性が得られることが分かった。この事は抵抗器の公開された仕様からは明らかではなかった。また、研究費で購入したデジタルボルトメータを用いれば、100ppb以上の安定性を持つ電圧比計測ができることもわかった。したがって、本年度の段階ではデジタルボルトメータを基準にした誤差評価でよい。開始当初に試作済みであった電圧比ー位相差変換器は設計の仕様変更が容易では無かったので、再度回路設計をし、試作しなおした。その際、今度の設計変更を容易にするために、回路設計から試作までのプロセスをPC上で管理できるように、PCB設計のフリーソフトと安価な工作機械を導入し、切削基板が迅速に作成できる開発環境を得た。得られた回路に対してデジタルボルトメータで誤差を評価し、回路と解析方法の変更を繰り返した結果、誤差を数ppm以内に抑制し、その温度係数を1度あたり0.05ppm程度にすることに成功した。そのうちの一つの要点を挙げると、位相計算の際に搬送波の3次高調波成分の位相を用いることで誤差とそのドリフトを数10%程度に低減することに成功した。具体的には、1次高調波の位相差の25%を3次高調波の位相差で置換する事である。その数学的な根拠は理解できたが、この方法の更なる拡張については、装置全体の誤差評価の高精度化を待つ必要がある。誤差の非線形性についても評価した。誤差は5次関数でほぼ近似できた。しかし、その原因が電圧比ー位相差変換器にあるのか、後段のAD変換器側にあるのかはまだ評価していない。AD変換側にある非線形性は常時校正によって除去できることは申請書に記したとおりであるが、温度ドリフトは既に数時間の計測でも観測しにくい程度に低減しており、常時校正の必要性はまだ無いからである。電圧比を位相に変換することによって、ゲインやオフセットのドリフトが低減する事が分かった。しかし、この方法はスイッチングによって得られた階段状の信号形を評価する唯一の方法ではない。実験データを詳細に検討すると、各段毎の信号レベルを平均化して計算しても同様の効果が得られる事が分かった。そこで、本方式の優位性を再検討する事にした。検討の結果、階段状関数に含まれる高調波をキャンセルする事で非線形性が低減する事に思い至った。早速、2倍高調波をキャンセルするために、電圧比ー位相変換回路の後段増幅器を構成する反転増幅器に信号加算端子を追加し、FPGAの基準クロックと同期させたファンクションジェネレータによって生成した2倍高調波を加えた。ADコンバータの出力信号をフーリエ変換し、2倍高調波のパワーが120dB以下になるように加算する2倍高調波の振幅と位相を調整し、非線形性の低減効果を計測したところ、最大で6ppm程度あった非線形性誤差が2ppm以下程度まで低減された。この結果を理論的にシミュレートしたところ、ほぼ実験結果が説明できた。これは電圧比計測以外にも広く応用が可能な極めて一般化可能な方法論であり、例えば典型的には、ダブルビームによる分光計測に利用できる。また、今年度の実験では正確な電圧比の値として、市販のデジタルボルトメータの比計測機能を利用したが、このような高精度の比計測の基準がなくても、高調波キャンセルの有無による位相の変化から非線形性誤差を見積もる事ができる。この事を用いれば、計測器の多点校正も可能である。なんらかの方法で安定した階段状信号が生成でき、制御された高調波信号の加算によって高調波キャンセルが可能ならば、多点校正装置が実現できる。実際の計測時には任意の信号形に対応可能である。比計測によらず、多くの計測装置、センサーに適用できるはずである。◆意義:計測装置の非線形な特性は補正が難しく、誤差として扱われる事が多い。ランダム誤差とは異なり、データ積算によって低減できないので、計測の正確性を追及する上で、この影響を低減する事は非常に重要である。◆具体的内容:

本研究による比ー位相変換法はほぼ一定な信号Rと計測信号Sとゼロ点信号Oを周期的にスイッチする事で得られる階段状信号に対し、その幾つかの高調波をキャンセルする信号を加算する事によって非線形性(INL)を低減する方法である。最終年度は特に理論的な側面に進歩があった。理論の詳細は省略し、その意義を述べる。本方法では計測器の非線形性を計測と同時に低減できる(同時校正)が、2つの問題がある。1一つの高調波をキャンセルして得られる非線形性低減率は数10%に過ぎない。2実測時に位相計測するため、計測器の本来の応答周波数帯域を損ねてしまう。これらに対しては次のような解決策がある。A:特殊なバンドパスフィルタを設計して高調波除去に用いる。但し、適用範囲はINL < 100ppm程度である。B:非線形性のドリフトが大きくない場合、実測前に多点校正を行なう事ができる。校正用信号源(R,S,O)を準備する。S/Rに安定性は要求されない。この信号を比ー位相変換し、高調波キャンセルの有無による位相変化を計測しながら、比をスキャンする。得られた位相変化曲線を多項式近似し、理論に基づいて、元のINLを求める。実測時には、得られたINLを元にデジタル補正しながら計測する。◆今後:計測器の非線形性を取り除く事ができると、試料のわずかな非線形特性を検出できる。試料の非線形な光吸収はπ電子共役系で普遍的に見られるにも関わらず、その検出には特殊な高出力光源が必要とされる。低出力でわずかな非線形吸収が計測できるようになれば、キャラクタリゼーション手法として汎用できる。予想していたジッターノイズはそれほど本質的ではなく、元々の電圧計測器のノイズレベルに加えて、スイッチングノイズが全体のノイズレベルをほぼ決めているようである。このような事情により、予定していたオーディオ用録音機器の購入は見合わせた。一方、予定していた10ppbの安定性は実現していない。実現しなかった最大の理由は、安定性を計測する手段が得られていないためである。乾電池を電圧源にする方法は安定化に長時間の待ち時間を要するため、研究の効率が悪くなることが分かった。また、市販のデジタルボルトメータは仕様以上の安定性を示すことがわかったので、容易に本研究の優位性を示すことができないことが分かった。その意味では研究は遅れている。しかし、予定していなかった非線形性誤差の低減方法を考案し、実現する事ができた。これは非常に画期的な方法であり、非常に広い物理計測全体に亘る応用も見通すことができる。結論としては、全体として順調に進展していると言える。地球物性学本年度の研究成果により、非線形性を低減した電圧比計測が実現する見通しがついたので、これを市販のデジタルボルトメータに適用する事が考えられる。しかし、その場合でも得られた線形性を評価する方法が無い。市販の抵抗分圧器は高価であるのみならず、十分な性能を有していない。また、乾電池をベースにした電圧比発生源は安定化に時間が掛かるため、研究レベルにおいても実用的ではないことが分かった。そこで、最終年度においては、これらに代わる電圧比源の開発を行う。重要な課題は、CMRR(同相電圧除去比)の確保である。
異なる受容体のエンドサイトーシス経路を介するWntシグナルの制御機構

Wntシグナルに対して拮抗的に機能する分泌性蛋白質のDkk1は脂質ラフトに局在するLRP6を非脂質ラフト分画に移行させ、クラスリン依存性にLRP6のエンドサイトーシスを誘導することによりβ-カテニン経路を抑制した。一方、β-カテニン非依存性経路を活性化するWnt5aはRacを活性化するが、その活性化には共役受容体のRor1/2やアレスチンとクラスリン依存性のエンドサイトーシス経路が必要であった。以上の知見はエンドサイトーシスによるWntシグナル経路の活性制御機構の一端を明らかにしたものである。私共はWnt3a刺激によりLRP6受容体がカベオリン依存性に細胞質へ移行することやWnt3aによるβカテニンの蓄積にはLRP6の細胞質への移行が必要であることを明らかにしている。しかし、Wntが受容体に結合した後、多様な細胞内シグナル伝達を活性化する機序については明らかにされていない。そこで本研究において、Wnt3aとは生理活性の異なるWnt5aやWnt3aに対して拮抗的に機能する分泌性蛋白質のDickkopf1 (Dkk1)による受容体エンドサイトーシスとWntシグナルの活性制御の関連について解析した。その結果、Wnt5aはFrizzled2受容体のクラスリン依存性のエンドサイトーシスを誘導した。さらに、Wnt5a刺激によりRacが活性化されるがその活性化にはRor2やアレスチンとクラスリン依存性のエンドサイトーシス経路が必要であることを明らかにした。一方、Dkk1はlipid raftに存在するLRP6受容体をnon-lipid raftに移行させた後、クラスリンを介するエンドサイトーシスによってLRP6を細胞質に移行させることにより、βカテニン経路を抑制することを明らかにした。したがって、同一のWnt受容体においても細胞膜における局在やリガンドと受容体の組み合わせに加えて、異なるエンドサイトーシス経路によってWntシグナルの活性化が制御されることが示唆された。以上の知見は、エンドサイトーシスによるWntシグナル伝達経路の活性制御機構の一端を明らかにしたものである。私共はWnt3a刺激によりLRP6受容体がカベオリン依存性に細胞質へ移行し、Wnt3aによるβ-カテニンの蓄積にはLRP6の細胞質への移行が必要であることを明らかにしている。そこで、本研究においてWnt3aとは生理活性が異なり、β-カテニン非依存性経路を活性化するWnt5aによる受容体エンドサイトーシスとWntシグナルの活性制御の関連について解析した。さらに、Wnt5a刺激によりRacが活性化されるが、その活性化には共役受容体のRor2やアレスチンとクラスリン依存性のエンドサイトーシス経路が必要であった。したがって、Wnt5aはFz2のクラスリン依存性エンドサイトーシスを介してRacを活性化することが示唆された。また、β-カテニン非依存性経路を活性化するWntとしてWnt5aの他にもWnt11が存在するが、その生理機能は不明である。そこで、Wnt11の生化学的性状や細胞応答を明らかにするために、アフィニティカラムやゲルろ過カラムを組み合わせた数段階のクロマトグラフィーにより調製した分画を抗Wnt11抗体による検出とDv1のリン酸化、Racの活性化を指標に活性画分を検出し、Wnt11をほぼ同一蛋白質にまで精製する実験系を確立した。