hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト早期老化症状を呈するklotho欠損動物を用いた和漢薬の老化に対する研究

よって品質の再現性を示すために,当帰芍薬散の成分解析をHPLC/ダイオードアレイ/MSを用いて行った.当帰芍薬散は,当帰,芍薬,川〓,沢瀉,白朮,茯苓の6生薬より構成され,昨年度までに当帰芍薬散エキス中に含まれる20個の化合物を特定した.また,当帰芍薬散に含まれるPaeoniflorinの定量を行い,当帰芍薬散エキス1g中に含まれるPaeoniflorinの含有量(g/mL)は,2.51×10^<-2>±1.10×10^<-3>であることが分かった.今年度は,当帰芍薬散エキスに含まれる芍薬由来Albiflorinの定量を行った.Albiflorinは芍薬500gからメタノール,クロロホルムを用いて単離・精製されたもの(4mg)を用いた.Albiflorinはメタノールに溶かし標準溶液を調整し,凍結乾燥させた当帰芍薬散エキスは水に溶かし遠心分離・濾過して調整を行った.検量線は,標準溶液を段階的に希釈し,各濃度3回ずつHPLC/ダイオードアレイ/MSを用いて定量,254.4nmにおけるピーク面積の平均値によって作成した.このような手法で測定した結果,当帰芍薬散エキス1g中に含まれるAlbiflorinの含有量(g/mL)は,2.98×10^<-3>±8.50×10^<-4>であることが明らかとなった.研究代表者の異動,産休・育児休暇による研究の中断のため.育児休暇後、研究環境の体制作りを進めることが先決である.また,論文投稿の際に研究で用いる薬剤の具体的なプロファイルが求められるようになったため,当所の申請内容にさらに追加実験が必要となった.この状況に対応しながら(研究は進行中)計画を遂行していく予定である.
英国ＲＡ会員ジェイムズ・バリーの研究―十八世紀愛蘭出身カトリック画家の精神と芸術

本研究課題遂行により、日本ではーイギリス文化圏でさえー「忘れられたロイヤル・アカデミシャン」であったジェイムズ・バリーについて、その生涯と作品モチーフの一端が明らかとなった。特にこの画家が、18世紀アイルランド南部都市コークに生まれたカトリックであり、同郷の「崇高の美学者」エドマンド・バークに見初められ、彼の財政的支援のもと、ロンドンそしてフランス・イタリアでの画家修業へといたった経緯は詳細に解明をみた。作品に即して言えば、「抑圧されたアイルランド」を描くその精神は、バーク美学の「崇高」とも呼応する。他方で、彼の描く歴史的人物は、解剖学的知見に裏打ちされた大陸での古代彫像研究の賜物であった。研究第二年目H25年度は、第一年目に刊行したジェイムズ・バリー論考「パトロン政治家バークを描くジェイムズ・バリー忘れられた十八世紀アイルランド人画家の葛藤ー」(『人間科学研究(広島大学大学院総合科学研究科紀要I)』第7巻, H24年12月, pp.1-24)をもとに、(日本)美学会、日本イギリス哲学会、日本18世紀学会、日本アイルランド協会等に所属する関連分野の専門家たちにひろく配布・公開し、その批判を仰ぐことに注力した。さらにH25年度成果としては、バリーのパトロンであり、上記論考でも言及したエドマンド・バークの記述(友人リチャード・シャクルトンへとの往復書簡)を通じて、18世紀当時のアイルランドの精神風土を探ることも論考として成果を得た。「E・バークのカレッジ在学期における〈ダブリンの憂欝〉あるいは〈バリトア幻想〉と文芸趣味の実践的醸成ーキルデアの親友クエーカーR・シャクルトン宛書簡からー」(日本アイルランド協会編『エール(アイルランド研究)』第33号, H26年3月, pp.196-214)である。本稿により、バリーとバークの故地である南部都市コークと、首都ダブリン(ならびに、18世紀アイルランドのクエーカー教徒の故地キルデア州バリトア)の文化風土との対照性が明らかにされた。バリーによる絵画実践とバークによる理論の結節点として、H24年度の上記論考でも言及した「ケルト的崇高」(あるいは「アイルランド的想像力」)という概念にかんしては、「アイルランド映画」の分析をおこなった別の論考、「映画『フィオナの海』にみる〈海〉と〈妖精〉の語り口ー異界交流、あるいはアイルランド美学の伝統ー」(文芸学研究会編『文芸学研究』第17号, H25年3月, pp. 1-35)を上梓。これにかんしてもH25年度中に、上記関連学会の専門家たちの意見を仰いだ。初年度のH24年度は、研究資料の収集・整理、研究成果の(中間)報告、研究者間の情報交換迅速化を図るため、最新型の軽量ノートPCを購入した。このPCを駆使し、主として以下の具体的な作業1. 3.をおこなった。1.2012年11月24日ー25日、日本アイルランド協会主催、2012年度アイルランド研究年次大会(於滋賀大学)に参加し、【単独研究発表】「親友シャクルトン宛書簡にみるカレッジ期のE・バークーバリトア幻想、あるいはダブリンの憂欝ー」をおこなう。これとともに、研究課題にかかわる情報交換をアイルランド研究の専門家たちとおこなった。2.2012年12月、H23年度1年間のダブリン・トリニティ・カレッジでの在外研究成果と、本年度の科研費助成の結果として収集・整理できた研究成果(一部)を、【単著原著論文】「パトロン政治家バークを描くジェイムズ・バリー忘れられた十八世紀アイルランド人画家の葛藤ー」、広島大学大学院総合科学研究科編『紀要I「人間科学研究」』、第7巻、1頁ー24頁、2012年12月、というかたちで公刊した(※所属機関HP上でも全文公開中)。なお、本論文は、ジェイムズ・バリー研究の日本初の成果だと思われる。3.2013年3月8日ー15日、アイルランド共和国ダブリンへと研究調査・情報交換のため渡航。トリニティ・カレッジ、国立図書館、国立美術館、ヒューレイン美術館へと趣いた。当地では、バリーの絵画《海から現れたヴィーナス》(於ヒューレイン)を実地調査したり、バリー最初の稀少伝記本や18世紀に刊行された新聞・雑誌等を調査した。本調査渡航では、トリニティ・カレッジ(アイルランド史)のルイス・カレン名誉教授やヒューレインのマルガリータ・カポック(コレクション担当)学芸課長、在愛日本大使館文化担当(美術史)ルース・スター氏などと直接情報交換をおこなう機会も得ている。【意義と今後の課題】以上のような調査継続と「中間報告的」成果発表(国際学会での)で最終年度を迎えた。

三年間の研究課題の遂行により、日本ではーじつは世界的にもーほとんど知られていなかったバリーの生涯と活動の一部が陽の目を見たと思われる。ただし残された課題は以下である。(1)収集資料のさらなる解析・整理による包括的なバリー研究論文・書籍の刊行、(2)バリー周辺の18世紀アイルランド画家の掘り起こし、(3)「美術批評家」としての評価など。そのうえで(4)抑圧表象を描く「崇高」画家としての比較研究(東アジア圏も視野に入れた)も期待されよう。美学・芸術学・表象文化論H25年度は、当初予定していたアイルランド現地調査・情報交換をおこなうことができなかった。それは、拠所なき私的事情(妻の第二子妊娠・出産と育児補助必要性の出来)による。H24年度は、年度末までアイルランドでの現地調査ならびの情報交換の時間を作ることができなかった。しかしながら、科研費助成以前からの関連する研究課題への取組み(基礎的な下準備)もあり、研究課題の「18世紀の忘れられたロイヤル・アカデミシャン」画家ジェイムズ・バリーについて、おそらく本邦初となる大部(約400字×90枚)の紹介論文(「研究実績概要」参照)を上梓することができた。また、年度末での一週間の滞在とはいえ、現地アイルランドでの調査に赴いたことで、新たな現地専門家との交流ならびに情報交換、さらに新たな研究資料の渉猟も可能となった。初年度H24年度の研究進展は、おおむね順調といえよう。基金化制度の利点を活かし、H26年度に繰り越したH25執行予定分予算(現地調査と国際学会参加・発表など)、H25年12月頃までに、当初予定の調査計画を可能な限り実施するべく善処したい。現在のところ、H26年7月上旬開催予定の韓国・テグ(嶺南大学)での東方美学会での研究課題をめぐる口頭発表、8月中旬下旬もしくは9月上旬でのアイルランドおよびイギリスなどでの現地調査・研究情報交換の実施を考えている。研究2年目に当たるH25年度は、1)研究資料の継続的な「収集」と「分析」、そしてさらなる研究成果の「公開」へむけての努力が主要な課題となる。これは、研究3年目以降のジェイムズ・バリー研究成果の包括的・網羅的な公開(関連専門図書の出版や、展覧会の開催へ向けての関係研究者等との接触・相談など)へ向けての下準備となる。したがって、H25年度は具体的に、アイルランドならびにイギリス、北米、西ヨーロッパなどを中心とする地域での、ジェイムズ・バリー絵画コレクションにかんする実地調査や専門研究者との情報交換をいっそう推進するようなネットワーク作りが重要となる。こうした作業と並行して、適宜、中間報告的な研究成果を内外の研究者に発信することもまた、本研究遂行にあたり、研究課題をめぐる世界レヴェルでの研究水準を知るためにも必要不可欠であろう。H25年度初めに妻の第二子妊娠が発覚し、H25年度内は、大学学務を除く日常生活における多くの時間を、妻の介助・新生児の育児に費やす必要が生じたため(第二子は、H25年12月誕生)。こうした事態は、本研究課題申請時点では予測困難なだった。H26年度経費へと繰り越した残額は、そのほとんどが、アイルランド・イギリスを中心とする長期の海外での現地調査や研究情報交換、ならびに、国際学会への参加などの経費として計上したものだった。
骨髄由来抑制細胞をターゲットとした悪性黒色腫新規免疫療法の開発

腫瘍内MDSC、腫瘍随伴マクロファージのマウス黒色腫における抗腫瘍効果はPD-L1の発現のみでなくマクロファージから産生されるケモカインの変化が重要であることが明らかとなった。ケモカインの変化により、腫瘍内に導入される制御性T細胞の比率が大きく変動し、抗腫瘍効果に大きな影響を与えること、マクロファージが治療のターゲットとなりうることを明らかとした。この結果は2015年、Oncoimmunologyに掲載されている。さらにマクロファージからのこれらケモカインの産生が人で検証し、2015年にJ Invest Dermatolに2報、2016年にExp Dermatolに2報報告した。本研究は骨髄由来抑制細胞をターゲットとした新規悪性黒色腫を目的とし、現在、マウスモデルとヒトの検体を用いて研究を行っている。マウスでは、B16F10モデルを用いてin vivoにおける各種治療群のMDSCのフェノタイプへの影響を検討し、現在臨床で使用されているダカルバジンやイミキモドが腫瘍内、脾臓内のMDSC上のPD-L1の発現を抑制することにより、抗腫瘍効果をもたらすことが明らかになった。これは、2013年国際研究皮膚科学会で発表を行い、現在PLOS ONE投稿中である。また、制御性T細胞に発現する分子のひとつが、MDSCのPD-L1の発現を制御していることがin vitroでmRNAレベルで明らかになったため、現在蛋白レベルや生体内で同様の現象が生じているか、確認中である。ヒトの検体を用いた研究では、腫瘍随伴性マクロファージの存在を多種の皮膚悪性腫瘍内で証明し、それらへの治療薬の影響をヒトの末梢血由来のマクロファージを用いて解析を加えた。現在までのところ、血管肉腫における新規免疫療法の開発につながりうる基礎データを2013年にClinical Developmentl ImmunologyとDermatologyに掲載、乳房外パジェット病の補助療法になりうる基礎データをClinical Developmental Immunologyに掲載、ボーエン病の病態へのマクロファージの関与をActa DermatoVenereologicaに掲載、ランゲルハンス組織球症に対する新規治療経験をActa Dermatovenereologicaに掲載した。現在、乳房外パジェット病に対する新規免疫療法の基礎データをJournal of Investigtive Dermatologyに、マクロファージをターゲットとしたメルケル細胞癌に対する免疫療法の基礎データをDermatologyに投稿中である。本研究は骨髄由来抑制細胞(MDSC)をターゲットとした新規悪性黒色腫を目的とし、現在、マウスモデルとヒトの検体を用いて研究を行っている。マウスB16F10モデルでは、インターフェロンベータが腫瘍内のMDSCが産生する制御性T細胞関連ケモカインを抑制することを明らかにした。また、インターフェロンベータがエフェクター細胞上のPD-1を増加させるため、これを抗PD-1抗体で抑制したところ、インターフェロンベータのB16F10に対する治療効果が飛躍的に上昇した。これは、臨床における悪性黒色腫の新薬である抗PD-1抗体の治療効果を飛躍的にのばす可能性を秘めている。現在、Oncoimmunology (IF 6.28)にminor revision中である。また、同様にイミキモドのB16F10腫瘍内のMDSCに対する効果も検証し、イミキモドが循環血液中のMDSCと腫瘍内のMDSCの双方に影響があることを明らかにした。現在、引き続き更なるイミキモドの抗腫瘍効果とMDSCの関係につき研究中である。ヒトの検体を用いた研究では、lymphomatoid papulosisにおけるM2マクロファージの分布について、Acta Derm Venereol (IF4.24)に掲載されたこと、皮膚有棘細胞癌の化学療法がマクロファージ、制御性T細胞に与える影響について、Dermatology(1.68)に掲載されたことを始め、国際誌に12本論文を掲載した。現在、乳房外パジェット病におけるM2マクロファージの関与をJ Invest Dermatol (IF 6.31)に二報、minor revision中である。本研究は骨髄由来抑制細胞(MDSC)をターゲットとした新規悪性黒色腫治療法の開発を目的として、マウスと人の細胞を用いて研究を行った。本研究により、腫瘍内でMDSCから分化する抑制型マクロファージである腫瘍随伴性マクロファージ(TAMs)が、インターフェロンベータにより成熟過程で抗腫瘍型マクロファージに分化することを明らかにした。また、同時にインターフェロンβが腫瘍内浸潤リンパ球上のPD-1の発現を上昇させるため、抗PD-1抗体を併用したところ、マウス悪性黒色腫モデルにおいて、強い抗腫瘍効果をもたらすことが明らかになった。これを臨床応用するため、ヒト単球由来マクロファージを用いて、インターフェロンβがマウスと同様にケモカインプロファイルを抗腫瘍型に変化させることを明らかにした。以上をOncoimmunology (IF 6.266)に掲載した。さらに臨床応用を目指し、現在、上記研究を医師主導臨床研究として、東北大学病院倫理委員会の承認のもと、phase 1b研究を行っている。他に、乳房外パジェット病におけるTAMsの役割の検討をJournal of Investigative Dermatology(IF:7.216)に2報、Experimental Dermatology(IF:3.762)に1報、菌状息肉症におけるTAMsの役割の検討をExperimental Dermatology(IF:3.762)に1報、報告している。腫瘍内

MDSC、腫瘍随伴マクロファージのマウス黒色腫における抗腫瘍効果はPD-L1の発現のみでなくマクロファージから産生されるケモカインの変化が重要であることが明らかとなった。ケモカインの変化により、腫瘍内に導入される制御性T細胞の比率が大きく変動し、抗腫瘍効果に大きな影響を与えること、マクロファージが治療のターゲットとなりうることを明らかとした。この結果は2015年、Oncoimmunologyに掲載されている。さらにマクロファージからのこれらケモカインの産生が人で検証し、2015年にJ Invest Dermatolに2報、2016年にExp Dermatolに2報報告した。上記のごとく、マウスの実験系では、現在1報が投稿中で、現在minor revisionを控えている。また、ヒトの研究ではマクロファージ関連の論文が査読性、impact factorのある国際誌に3本掲載され、また、2報が投稿中で、現在minor revisionを控えている。今後、さらにマウスとヒトの双方の研究を進める予定である。皮膚科今後、現在再投稿準備中の論文3本を完成させるとともに、マウスの研究においては、さらに腫瘍内の骨髄由来抑制細胞への各種治療の影響を検証すること、ヒトの研究では悪性リンパ腫における抑制型マクロファージの研究を進め、完成させる予定である。これらの結果を臨床で悪性黒色腫の治療への適応をめざし、さらにヒトでの安全性を高めるための基礎研究を進める予定である。上記のごとく、マウスの実験系では予定通り国際誌に一報投稿できた。また、ヒトマクロファージの検討に関しては現在マクロファージ関連論文が5報、査読性があり、impact factorの存在する国際誌に掲載された。今後、マウス、ヒトと双方の研究を更に進める予定である。今後、マウスの骨髄由来抑制細胞の検討は、これまでに制御性T細胞により抑制型分子が増強することが確認されたため、その分子を実際にin vivoで抑制した場合の腫瘍増殖への影響、さらには、骨髄由来抑制細胞のフェノタイプへの影響やサイトカイン産生能への影響を検討する。さらに、これまで、ヒト皮膚悪性腫瘍においては、多岐の癌腫にわたり、骨髄由来抑制細胞と同義である腫瘍随伴性M2マクロファージが存在することを確認していることから、この分子がヒト皮膚悪性腫瘍においてどの癌腫において存在するかを検討し、将来的に根治が困難な癌腫における新規治療の開発における基礎データとする予定である。
強力な鎮痛作用を示す新規オピオイド受容体核酸リガンドの創製と分子作用機序の解明

G Protein Coupled Receptors (GPCRs)を標的とするDNAアプタマー創製を目的とし、GPCRsの生理機能を活用した新規探索法を開発した。本探索法は、探索感度と探索効率においてCell SELEX法を凌駕する技術であることが明らかとなった。本探索法を利用して、鎮痛関連GPCRsであるオピオイド受容体(MOR)を認識するDNAアプタマーを探索した結果、Apt-MORと命名したDNAアプタマーを得た。Apt-MORは、MORに対して特異的かつ高親和性に結合し、アゴニスト活性を示した。従って、新規探索法とApt-MORは、鎮痛創薬技術開発に資する有用なツールとなり得る。本研究は、G蛋白質共役型受容体に結合する核酸リガンドの探索同定を行うために開発した新規探索法の高感度化を実現し、本探索法を用いたモルヒネ鎮痛効果を凌駕する高親和性核酸リガンドの創製と分子作用機序の解明を目的として実施する。本年度は、第1段階として、新規探索法のプロトタイプの高感度化を実現するため、探索方法の至適化条件の決定、本探索法の基盤原理に関する実験的検証を進めた。本探索法の至適条件を決定後、同至適条件で調整した細胞外分泌膜小胞を免疫電顕法により解析した結果、過剰発現させたMOR受容体を内包する細胞外分泌膜小胞の存在とその生化学的および形態学的特性を明らかにすることに成功し、当該探索法が基盤原理に基づいて機能することを実験的に確認した。また、至適化条件検討の過程で、物理化学的特性を保持したインタクトな細胞外分泌膜小胞の新規精製法の開発に至り、特許出願準備中である。第2段階として、トラサイクリン依存性にMOR受容体を発現誘導可能な293細胞株を用い、40塩基の任意配列を含む全長76塩基の合成一本鎖DNAラブラリーからMOR受容体結合DNAリガンドの同定を本探索法により試みた。その結果、本探索法を用いた3回のセレクションにより、CEll SELEX法による24回のセレクションにより取得した高親和性MOR受容体結合DNAリガンド(Apt-MOR)ならびに新規DNAリガンドの同定に成功し、本探索法の有用性を実証した。またApt-MORがモルヒネと同程度のcAMP抑制効果を有することを細胞培養系にて明らかにした。第3段階として、Apt-MORの高機能化に取り組み、リガンド特性を維持する最小ループ構造を明らかにした。また、昆虫細胞発現系に至適化したDNAコドンを有するMOR受容体発現ベクターを構築し、Apt-MOR1/MOR受容体複合体の立体構造解析のための準備を実施した。本年度は、概ね当初の研究計画通りに順調に進展したが、高機能化DNAリガンド(Apt-MOR)の鎮痛効果に関する行動薬理学的解析を行うには至らなかった。これは、新規探索法の至適化条件検討実験が、物理化学的特性を保持したインタクトな細胞外分泌膜小胞の新規精製法の開発と当該精製法の特許出願に発展したためである。本成果は、当初全く予定していなかったものであったが、新規探索法の問題点の把握や技術改良、さらには次世代型探索技術開発等に繋がるものであり、次年度の開発研究を効率的に進展させる上で重要なものとして位置付けられる。本研究は、G蛋白質共役型受容体がリガンドと結合すると細胞内に速やかに取り込まれるエンドサイトーシス現象と細胞外膜小胞として分泌される現象に着目して開発した新規核酸リガンド探索法の確立と高機能化を進めるとともに、本探索法を用いたモルヒネ鎮痛効果を凌駕する高親和性核酸リガンドの創製と分子作用機序の解明を目的として実施した。本年度は、昨年度にCell SELEX法と新規探索法の両方法で同定することに成功したMOR受容体結合DNAリガンド(Apt-MOR)のMOR受容体結合特性を細胞結合実験により解析した。その結果、Apt-MORは、MOR受容体に対して少なくとも100 nM未満の親和性で結合すること、30塩基長以下に短鎖化することが可能であることが明らかとなった。次に、新規探索法の高感度化を実現するために細胞外分泌現象を精査したところ、一般に流布している膜小胞精製法では、膜小胞の生物物理化学的特性は完全に失われることを見出した。膜小胞の生物物理化学的特性は、新規探索法の高感度化を実現する上で極めて重要であると考えられたことから、細胞外分泌時点における生物物理化学的特性を保持した膜小胞の調整を可能にする新規膜小胞調製法を新たに考案して国内外特許出願を実施した。

また、本膜小胞調製法により調製した膜小胞を免疫電子顕微鏡にて解析した結果、Apt-MORは粒径50 100nm程度の膜小胞の膜表面に発現するMOR受容体に結合していること、細胞情報間伝達能を有する膜小胞であるエキソソームとは生物物理化学的特性が明らかに異なる膜小胞群に結合している可能性を強く示唆する結果を得た。尚、Apt-MOR・MOR受容体複合体の立体構造解析は、Sf9昆虫細胞発現系の条件検討に時間を要し解析には至らなかった。また鎮痛機能解析は、新規膜小胞調製法の開発を優先したために解析には至らなかった。平成28年度は、前年度に引き続いて、新規探索法の改良(次世代シークエンサーを用いた網羅的核酸リガンド配列プロファイリング技術解析の開発)とApt-MORの高機能化(安定性向上)を実施する。また、新たに挑戦的課題として位置付けている2課題、1Apt-MORの薬理作用の解析、2Apt-MOR/MOR受容体分子複合体の立体構造解析を推進する。具体的には、課題1に関しては、中枢神経系の痛み制御領域(中脳灰白質等)にApt-MORを脳内微量投与することによって鎮痛作用をホットプレート法やテイルクリック法を用いた行動薬理学的指標により解析すると共に、養細胞系にてモルヒネ等の代表的MOR受容体アゴニストとApt-MORの薬理作用(cAMP応答性等)を培比較検討することにより、Apt-MORの薬理学特性を解明する。一方、課題2に関しては、既報に準じてsf9昆虫細胞系を活用したMOR受容体強制発現系を構築し、可溶化MOR受容体を用いたApt-MOR/MOR受容体分子複合体の分子間相互作用をNMR構造解析法等により解析し、Apt-MORのMOR受容体結合部位とその分子相互作用機構を明らかにする。尚、NMR立体構造解析の専門家である連携研究者の協力の下で調整したApt-MOR/MOR受容体分子複合体の立体構造解析を進める。神経分子薬理学
イネの根系発達を制御する遺伝子の機能解析と分子機構の解明

物質生産向上には、作土からの水分や栄養吸収を促進させることが有効な方法の一つである。すなわち、これらの吸収を担っている根を拡大させることで、作物の生産性の向上が期待される。しかし、作物の根の発達を制御している遺伝子やその機構は、ほとんどわかっていない。そこで、申請者は、物質生産が低下したイネの自然突然変異系統を単離し、根系の形との関連を調査するとともに、原因遺伝子の同定を行った。作物の物質生産向上には、作土からの栄養吸収を促進させる必要がある。イネにおいては、栄養吸収を司る根系の発達程度とバイオマス量の間には、正の相関関係が認められている。イネバイオマス量の向上には、より根系を発達させ、養分吸収を促進させることが有効な方法の一つである。根系の発達を制御している遺伝子の単離を行うために、物質生産能が低下し、根系の発達が低下したrbm1変異体を用いて、ポジショナルクローニングを行った。rbm1変異体とインド型品種とのF2個体を、土耕法及び水耕法で栽培した。土耕法で栽培したところ、rbm1変異体と同様な表現型を示す個体の選抜は困難であった。そこで、水耕法で栽培したF2個体の根長を指標として、表現型の判別を行った。F2世代の4,000個体の表現型を決定し、マッピングを行ったところ、rbm1変異体の原因遺伝子を、33kbの領域に絞り込んだ。この領域には、機能未知の3遺伝子の存在が示されており、これらの構造遺伝子領域に関して、塩基配列比較解析を行った。その結果、rbm1変異体においては、1つの遺伝子の構造領域に約2kbの欠損が認められた。この遺伝子のプロモーター領域役3kbと構造遺伝子領域約4kbを、野生型の染色体DNAを鋳型として、PCR法により、単離した。遺伝子機能相補性を検定するために、先のDNA断片を挿入したバイナリーベクターを作製し、形質転換植物作製の準備を行っている。また、この遺伝子は根において、高く蓄積していることも判明した。以上の結果から、本研究において、根系の発達を制御している遺伝子の同定が行われ、作物の根系発達の制御機構の一端が解明されることが期待される。この遺伝子の遺伝的多様性を検討するために、焼き畑によるイネ栽培が行われているラオス共和国のイネ品種の塩基配列比較解析を行っている。研究は、ほぼ計画通り順調に進んでいる。イネにおいては、養分吸収を司る根系の発達程度とバイオマス量の間には、正の相関関係が認められている。しかしながら、現在までに、作物の根系を制御している遺伝子は、殆ど明らかとなっていない。そこで、根系を制御している遺伝子の単離、同定を目指し、物質生産能が低下し、根系の発達が低下したrbml変異体を用いた解析を行った。ポジショナルクローニング法により、rbml変異の原因遺伝子が示唆された。この遺伝子のプロモーター領域約3kbと構造遺伝子領域約4kbを、野生型の染色体DNAを鋳型として、PCR法により、単離した。遺伝子機能相補性を検定するために、先のDNA断片を挿入したバナリーベクターを作製し、形質転換植物作製を行った。その相補性試験の結果、rbml変異体の表現型が回復することが確認された。当該遺伝子の機能を推定するために、既知の領域との相同性を検索したところ、当該遺伝子には、既知の配列が認められなかった。よって、当該遺伝子は、生物において、未だ機能が推定されていない新奇な機能をゆうする遺伝子であることが示唆された。当該遺伝子の特性を明らかにするために、時期、器官における蓄積量を定量解析したところ、生育期間を通して、根の伸長帯で多く蓄積していることが明らかとなった。このことより、当該遺伝子は、根の伸長を制御していることが示唆された。
胎児期の栄養制御と出生後の甲状腺操作によるブタにおける筋線維数と筋線維型の改変

妊娠2550日目の母豚に、アルギニンとグリシンを強化した飼料を給与した。さらに、出生後の産子に、1日齢から3週間、甲状腺ホルモンT4と抗甲状腺剤PTUを経口投与した。アルギニンとグリシンを強化した飼料の給与で、1日齢の産子の胸最長筋のミオシン重鎖タンパク質(MHC)の遺伝子発現量が影響をうけた。また、甲状腺ホルモンが、出生後のブタの胸最長筋の1型筋線維の割合を調節していることが明らかになった。【方法】同腹2日齢の雄子豚5頭を対照区、低T4投与区、高T4投与区、低PTU投与区、高PTU投与区に割り振った。試験期間は3週間とした。実験1:T4ナトリウム塩をエタノールに溶解し、低T4ならびに高T4投与区にそれぞれ10ug/kg、20ug/kgを毎日皮下注射した。低PTUならびに高PTU投与区には、それぞれ2mg/kg、4mg/kgのPTUを10mlの蒸留水に懸濁して毎日経口投与した。実験2:T4、PTUともに市販の経口投与用のカプセルを使って投与した。実験2ではT4、PTUともに投与量を高くし、T4を40および80ug/kg、PTUを4および8mg/kg投与した。T4の調整方法は実験1と同じ、PTUは粉末のままカプセルに詰めて投与した。(2)MHCタンパク質に対する抗体を用い、豚の胸最長筋および菱形筋の凍結切片上のMHCが検出可能か、免疫染色を行った。抗体の希釈倍率、抗原抗体反応の時間を決定した。【結果1(1)実験1:血漿T3濃度に処理の効果はなかった。一方で、血漿T4濃度に対する処理の効果が認められ(P<0.05)、T4投与によって血漿T4濃度が対照区の約2倍に上昇、PTU投与によって血漿T4濃度が対照区の50%程度に低下した。実験2:80ug/kgのT4投与によって血漿T3濃度が約2倍に上昇、PTU投与によって血漿T3濃度が1/5程度に低下し、処理によって血漿T3濃度が変化する傾向が認められた(P<0.10)。実験1と同様、T4濃度は処理によって変化し(P<0.05)、T4投与で血漿T4濃度は約3倍に上昇し、PTU投与で血漿T4濃度は1/8程度に低下した。以上の結果から、実験2の投与方法を採用することとした。(2)I型のMHCに対する抗体、I、IIa、IIbに反応する抗体を用いて免疫染色を行い、それぞれ抗体の希釈倍率、抗原抗体反応時間を決定した。本研究は、ブタにおける「筋線維数を増やす技術」、「筋線維型を変化させる技術」の開発に向けて、胎児期のエネルギーの増給(=妊娠中の雌豚へのエネルギーの増給)、出生直後の子豚の甲状腺ホルモン濃度操作の有効性を検証することを目的としている。平成23年度は、アミノ酸(アルギニンとグリシン)を強化した飼料を、妊娠雌豚へ慣行量の1.5倍となるように増給するとともに、産子の甲状腺状態の操作を実施した。方法:妊娠中の雌豚の妊娠25日目から50日目まで、慣行飼料と比較してアルギニンが2倍、グリシンが1.8倍の濃度になるように調整した飼料を、日本飼養標準に示された給与量の1。5倍給与した。妊娠124日目、51日目から分娩までは、慣行飼料を日本飼養標準に示された量給与した。対照区の豚には、日本飼養標準に示された量の慣行飼料を、妊娠期間を通じて給与した。雄の産子を3頭選び、対照区、甲状腺ホルモンT4投与区、抗甲状腺剤PTU投与区に割り振り、3週齢に達するまで飼育した。T4とPTUは経口投与し、各々の投与量はT4が80ug/kg体重、PTUが8mg/kg体重とした。各区2反復とした。結果:試験区の一腹の生時体重は14.1kgと21.3kg、対照区は11.9kgと13.2kgであり、試験区の方が重かった。また、試験区の1頭は18頭分娩した。結論を出すには反復数が少ないが、妊娠中期にアルギニンとグリシンを強化した飼料を増給すると、産子数、一腹の生時体重が大きくなる可能性がある。また、産子の血漿中の甲状腺ホルモンT3とT4の濃度は、対照区、甲状腺ホルモンT4投与区、抗甲状腺剤PTU投与区の順に、T3(ng/ml):1.2,2.3,0.3、T4(ug/ml):5.4,18.8,0.6であり、T3にもT4にも処理の効果が認められた(P<0.01)。産子の筋肉の組織化学的検討は今後実施する予定にしている。アルギニンを0.76%、グリシンを0.55%含む

市販の繁殖雌豚用飼料に、アルギニンとグリシンの濃度が、それぞれ1.5%あるいは1.0%となるように、2つのアミノ酸を強化した。LW交雑種の雌豚に、妊娠25から50日目の期間、上記の強化飼料を慣行量の1.5倍量給与した(n=2、強化区)。対照区には市販飼料を慣行量給与した(n=2)。妊娠25日目までと51日目以降は、すべての豚に市販飼料を慣行量給与した。分娩後、1日齢の産子から胸最長筋を採取した。さらに各腹の産子から生時体重に基づいて3頭選び、1頭に甲状腺ホルモン・サイロキシンを80μg/kg体重、1頭に抗甲状腺剤プロピルチオウラシル(PTU)を8mg/kg体重、3週間毎日経口投与して、終了時に胸最長筋を採取した。採取した胸最長筋のMHCの各アイソフォームのmRNA発現量を測定した。平成23年度の飼養試験から得られた成績とあわせて、産子の生時体重、一腹産子数、3週齢までの日増体量のデータを整理した。生時体重は強化区の方が0.1kg重く(1.3kg vs 1.4kg)、一腹産子数は強化区の方が1頭多く(14頭vs 15頭)、日増体量は強化区の方が18g/d高かったが、有意差は検出できなかった。平成23年度の飼養試験から得られた産子の胸最長筋とあわせて、MHCの各アイソフォームのmRNA発現量におよぼす影響を整理した。1日齢の産子の胸最長筋のMHC2a型と2x型のmRNA発現量は、強化区の産子のほうが高かった(P<0.05)。3週間の甲状腺操作は、MHC1型、2a型、2b型のmRNA発現量を変化させ(P<0.05)、1型と2a型はPTUの投与で発現量が高くなり、2b型はPTUの投与で発現量が低くなった。妊娠中期にアルギニンとグリシンを強化した飼料を増給すると、産子数、一腹の生時体重が大きくなる可能性が示唆されている。産子の筋肉の組織化学的検討が未着手であるが、方法はすでに取得しているので今後速やかに実施できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に変更の必要は無い。産子の筋肉の組織化学的検討を早急に実施するとともに、各処理が最低4反復となるように、飼養試験を実施する。
財務会計情報の利用と経済的影響に関する日・米・英・比較実証研究

本研究では,財務会計情報が情報の利用者(企業をとりまく各種利害関係者)と提供者(企業経営者)の意志決定,あるいは彼らへの所得と負担の配分に,どのような影響をもたらすかを,日本,アメリカ,イギリスにおける公企業,公益事業の再編成(reorganization)の際の会計の役割を事例にして考察した.ここで再編成の際の会計に着目したわけは,再編成の折に採用される会計方法なり会計情報の利用のあり方いかんが,そこでの焦眉の問題である累積債務や累積欠損の負担の配分に重要な影響を及すからである.1.アメリカの公益事業については, 1940年代に規制機関(FPC, SEC等)の主導のもとにすすめられた固定資産と資本の相関的な引き下げ運動をとりあげ,それが異種株主間での損失負担ならびに需要者の料金負担をどのように裁定することになったかを考察した.2.わが国に関しては,旧国鉄の分割・民営化の際の長期債務の負担配分の問題をとりあげ,会計データを用いた当の長期債務累積の原因分析をつうじてこそ,公正な負担配分が可能となるはずのものであることを論じた.3.イギリスについては,鉄鋼公社(British Steel Corporation)の経営・財政の破綻の経緯と再建策につき,わが国の旧国鉄との類似性に注目しながら,そこで会計情報が果した役割を検討した.特にそこでは,過年度の経営戦略の失敗を認めたうえでの資産と資本の下方修正による財政再建か,それとも過年度の経営戦略の失敗を不問にしたままでの工場閉鎖という形での財政再建かという対立の構図を明らかにし,後者の再建策が強行される過程で会計情報が果した役割(経営政策正当化機能)を検討した.なお,公益事業の他に銀行業における財務会計情報の役割についても研究したが,わが国における保有国債の評価基準を考察するにとどまり,米・英にまで研究を広げるには至らなかった.本研究では,財務会計情報が情報の利用者(企業をとりまく各種利害関係者)と提供者(企業経営者)の意志決定,あるいは彼らへの所得と負担の配分に,どのような影響をもたらすかを,日本,アメリカ,イギリスにおける公企業,公益事業の再編成(reorganization)の際の会計の役割を事例にして考察した.ここで再編成の際の会計に着目したわけは,再編成の折に採用される会計方法なり会計情報の利用のあり方いかんが,そこでの焦眉の問題である累積債務や累積欠損の負担の配分に重要な影響を及すからである.1.アメリカの公益事業については, 1940年代に規制機関(FPC, SEC等)の主導のもとにすすめられた固定資産と資本の相関的な引き下げ運動をとりあげ,それが異種株主間での損失負担ならびに需要者の料金負担をどのように裁定することになったかを考察した.2.わが国に関しては,旧国鉄の分割・民営化の際の長期債務の負担配分の問題をとりあげ,会計データを用いた当の長期債務累積の原因分析をつうじてこそ,公正な負担配分が可能となるはずのものであることを論じた.3.イギリスについては,鉄鋼公社(British Steel Corporation)の経営・財政の破綻の経緯と再建策につき,わが国の旧国鉄との類似性に注目しながら,そこで会計情報が果した役割を検討した.特にそこでは,過年度の経営戦略の失敗を認めたうえでの資産と資本の下方修正による財政再建か,それとも過年度の経営戦略の失敗を不問にしたままでの工場閉鎖という形での財政再建かという対立の構図を明らかにし,後者の再建策が強行される過程で会計情報が果した役割(経営政策正当化機能)を検討した.なお,公益事業の他に銀行業における財務会計情報の役割についても研究したが,わが国における保有国債の評価基準を考察するにとどまり,米・英にまで研究を広げるには至らなかった.
三次元ボリュームデータの精度評価の為の骨等価ファントム作成に関する研究

歯科領域における微細な骨の破壊や変化がCTの3D表示や再構成画像で何処まで再現できるのかという基礎実験を行うべく、最適なファントムの作製を前年度行った。そして今年度は継続分として、完成したファントムを1mmおよび3mmでのヘリカルスキャンを行い、ワークステーションに転送し、再構成を行った。その結果、スライス厚が3mmの場合は等価材の厚さが5mm以下のものでは再構成画像を構築した際に情報の欠落が大きく臨床上の使用に耐えないものであった。従って、これ以下は1mmスキャンにて撮影し、再構成構築を行った。骨等価板の0.5mmと1mmにおいては再構成描出能が悪く、ほとんど構築不可能であった。また等価材の間隔が1mmの場合、等価板同士の画像情報がパーシャルボリューム効果により一塊となり構築された。次に3mm、5mmの厚さにおいては所々情報が欠落する部位もあったものの、ほぼ完全なかたちでの立体構築が可能であった。しかし、等価材の間隔が1mmの場合は同様に等価板同士の画像情報がパーシャルボリューム効果により一塊となり構築された。また、これらの結果は撮影条件を変えた場合でもほとんど変化が認められなかった。以上より、骨情報の場合、3mm以下の骨梁は描出されない可能性がある。しかし、3mm以上の厚さがあっても隣接する骨との間隔が1mm以上ないと正確な厚さとして構築されない可能性がある。また骨のみの立体構築においては撮影条件の変化ではほとんど構築画像に影響は与えない。歯科領域における微細な骨の破壊や変化がCTの3D表示や再構成画像で何処まで再現できるのかという基礎実験を行うべく、最適なファントムの作製を試みた。材質の検討には、CT値が極力骨に近く、可塑性にある程度富むものを選択する必要がある。その為、木材、石膏、アクリル板、レジン、ワックス、金属板など10数項目について検討した結果、市販の骨等価材が最も適していた。それ以外の材質では1mm以下に加工が不可能であったり、CT値が骨と懸け離れる為、今回の材質には使えなかった。次に骨等価材の形態の検討を行った。厚さについては材質の硬度の関係上、最低0.5mmの幅が限界であった。その為、0.5mm、1mm、3mm、5mmの厚さで30mm×30mmの板状に加工した材質を用意した。それをパーシャルボリユーム効果をさける為、1mm間隔におのおの3枚ずつ平行に並べる事とした。そして、再現性を持たせる為にアクリル棒を2本設置して、それに直径3mmの穴を開け、そこにCT本体の位置決め用ビームが通る様にした。これによりファントムをCT装置に対して乗直に設置でき、また再現性も持てるものと思われる。以上の検討をふまえた上で、業者に特注にてファントム作製を依頼した。完成したファントムはミリ単位の検討が可能で、再現性のあるものであり、これを水槽に埋没し、CT撮影を行ない、撮影データをコンピュータ上に転送して解析したところ今回の目的に耐えうる良好な結果を得た。来年度はこのファントムを用いより詳細な検討を行い、3DやMPRにおける歯科領域での信頼性の確立を行う予定である。
ホヤ中枢神経系における遺伝子調節ネットワークのモデル化と検証

ホヤ中枢神経系における遺伝子ネットワークの研究で、ホヤの原腸胚から尾芽胚期にかけて中枢神経系に発現する転写因子、およびシグナル分子の発現パターンを網羅的に調べた。その過程で、ADMPと呼ばれるBMP(骨形成タンパク)ファミリーに属するシグナル分子とそのアンタゴニストであるPinheadというベアの遺伝子について興味深い結果を得た。この2つの遺伝子はゲノム上で隣り合って並んでおり、一方が転写される時DNAループを形成することによって隣の遺伝子のエンハンサーを隔離し、もう一方の遺伝子が転写されないようにする。つまりPinheadはタンパク質レベルでのAdmpの抑制にくわえ, Pinhead遺伝子の転写によりADMP遺伝子の転写が直接的に抑制されるという二重の抑制機構をもっていた。平成25年度はこういった遺伝子の並びが他にもないか探索した。節足動物から脊椎動物までADMPとPinheadはゲノム上で隣り合って並んでいることから,この転写制御機構もっ遺伝子ペアは進化的に保存されている可能性が高いと考え、まず、ホヤにおいて脊椎動物(人、ゼブラフィッシュ、ゼノパス)、または節足動物(ハエ)とゲノム上の遺伝子の並びが保存されている個所(マイクロシンテニー)をリストアップした。その結果80か所近く存在することがわかった。このうちいくつかについて発現パターンを解析した結果、ADMPとpinheadのように相補的に発現している例を見出した。そのうちの一例は予定神経割球と表皮に互いに相補的に発現していた。この遺伝子ペアがADMPとPinheadのようにループを介して互いの発現を抑制しているのか調べるためにレポーターコンストラクトを作成し、その解析を行った。またそれと並行してモルフォリノオリゴを用いた機能阻害実験を行い、2つの遺伝子の機能面での関係を解析しつつあるところである。すでに論文になっているADMPとPinheadのマイクロシンテニーの解析をさらに発展させるために、同様の転写制御機構がどの程度広く使われているのか、解析を進めている。今のところ胚発生の時期に相補的に発現する遺伝子ペアを一つ見出し、その上流解析を行っているところである。2つの遺伝子のモルフォリノオリゴによる機能阻害実験も進めておりおおむね順調に進展しているといえる。(抄録なし)ホヤ中枢神経系における遺伝子ネットワークの研究で、ホヤの原腸胚から尾芽胚期にかけて中枢神経系に発現する転写因子、およびシグナル分子の発現パターンを網羅的に調べた。その過程で、AI)MPと呼ばれるBMP(骨形成タンパク)ファミリーに属するシグナル分子について興味深い結果を得た。この遺伝子は原腸胚期に中枢神経に発現するが、それに加え表皮にも発現する。ホヤのゲノム上でこのAI)MP遺伝子のとなりにpinheadとよばれる同じくTGFベータファミリーに属する遺伝子がコードされていた。そしてpinheadとADMPは互いに重なり合わず、ホヤの胚で相補的に表皮に背側、腹側に分かれて発現していることが明らかになった。調べてみると,PinheadはAdmpに特異的なアンタゴニストであり,ホヤにおいて表皮の腹側の領域の決定に必須であることが明らかになった.つまりADMPの機能を阻害すると腹側領域が消失し、逆にPinheadを機能阻害すると腹側領域が拡大する。さらに、共免疫沈降実験によりADMPとpinheadは結合することも明らかになった。また、Pinheadはこのタンパク質レベルでのAdmpの抑制にくわえ,Pinhead遺伝子の転写によりAdmp遺伝子の転写が直接的に抑制されるという二重の抑制機構をもっていた.この転写抑制はこの2つの遺伝子がゲノムにおいて隣接してコードされていることを利用していることが明らかになった(図)。転写による抑制機構が働いているというデータを補強するために、ゲノムの立体構造を調べる3C法(chromosome conformation capture)で調べてみた。すると、実際の内在的なゲノム上でも図のような構造をとっていることが明らかになった。

他の動物胚と同じように、カタユウレイボヤの中枢神経系は外胚葉性の細胞である。中枢神経系が形成されていくもっとも初期の過程を網羅的遺伝子発現パターン解析によって研究していく中で、中枢神経系を含む外胚葉細胞の分化にAdmp(骨形成因子BMPのひとつ)が中心的な役割を持つ可能性を見出した。そこで、さらに詳しく解析した結果として、Pinheadと呼ばれるあたらしいAdmpアンタゴニストを同定し、PinheadとAdmpのかかわる新しい転写調節機構を明らかにした。当初の目標そのものを達成する成果ではないが、その研究成果は高く評価されており、ほぼ期待どおりの研究の進展があったと考える。すでに論文になっているADMPとPinheadのマイクロシンテニーの解析をさらに発展させるために、同様の転写制御機構がどの程度広く使われているのか、解析を進めている。今のところ胚発生の時期に相補的に発現する遺伝子ペアを一つ見出し、その上流解析を行っているところである。2つの遺伝子のモルフォリノオリゴによる機能阻害実験も進めておりおおむね順調に進展しているといえる。Pinhead遺伝子とAdmp遺伝子とがゲノムに並んで存在するという遺伝子の配置は,動物のゲノムにおいて広範囲に保存されており、Admp遺伝子もPinhead遺伝子も持っている動物では常にPinhead遺伝子のすぐ下流にAdmp遺伝子がコードされていた.メダカで同様な実験を行った結果、ホヤと同様の分子機構のはたらいていることが確認された.この遺伝子の並びはこれら遺伝子の機能に必要不可欠な役割をはたしており,それが進化において遺伝子の並びが高度に保存されてきた理由であろうと考えられた.通常,ゲノムにおける遺伝子の並びは進化の過程で比較的自由に変化すると考えられているが,このPinhead-Admp遺伝子クラスターのように高度に保存された遺伝子クラスターは少数ながら存在している.私が明らかにした分子機構が進化的な制約となりゲノムの進化に影響したものと考えられる.今後は進化的に保存された遺伝子の並びについて研究を進めていきたい。(抄録なし)
がん幹細胞を標的とする白金二核錯体のスクリーニング研究

近年、がんの再発・転移に、がん幹細胞が関与している可能性が示されている。がん幹細胞では、グルタチオン(GSH)の発現量が増大しており、その結果、がん幹細胞は抗がん剤に対して治療抵抗性を示す。研究代表者らは、テトラゾラト架橋白金(II)二核錯体(テトラゾラト架橋錯体)が、GSHによる解毒を受けにくく、シスプラチンに対して耐性を示すがんや、がん幹細胞に対しても有効である可能性を見出している。また、テトラゾラト架橋錯体は、大腸がんに対してin vivo抗腫瘍効果を発揮することが確認されている。本研究では、テトラゾラト架橋錯体のGSHとの反応性およびヒト大腸がん幹細胞に対する有効性を評価した。2017年度は、テトラゾラト架橋白金(II)二核錯体は、生理的条件下において、シスプラチンと比較して、GSHとの反応性が低いことを明らかにした。続いて、テトラゾラト架橋錯体のin vitro細胞毒性に対する細胞内GSH量の影響を調べるため、HCT116ヒト大腸がん細胞を用いて細胞内GSH量を増減させる条件検討を行い、細胞内GSH量を減少させる条件を決定した。2018年度は、シスタチオニンβ合成酵素遺伝子のノックダウンによって細胞内GSH量を増加させる条件検討を行ったところ、非処置群(対照群)と比較した場合に、細胞内GSH量が増加する条件を明らかにすることができた。また、ヒト大腸がん幹細胞を用いて、がん幹細胞塊の増殖抑制効果を評価した。フルオロメチル基を有するテトラゾラト架橋錯体において、がん幹細胞塊の形成数が減少したことから、がん幹細胞の増殖を抑制する可能性があることが示唆された。本研究で得られた知見は、テトラゾラト架橋錯体の構造最適化に有用であり、より有効な次世代白金制がん剤の候補化合物の創出に寄与すると考えられた。本研究の目的は、in vivo腫瘍縮小効果が認められているテトラゾラト架橋白金(II)二核錯体(テトラゾラト架橋錯体)の作用機序を明らかにし、より有効な次世代白金制がん剤の候補化合物の創出に繋げることである。研究代表者らは、テトラゾラト架橋錯体が還元型グルタチオン(GSH)による解毒を受けにくく、シスプラチンに対して耐性を示すがんや、がん幹細胞に対しても有効である可能性を見出している。そこで、本研究において、1H-NMRを用いてテトラゾラト架橋錯体と二当量のGSHの反応を経時的に観察したところ、生理的条件下において、テトラゾラト架橋錯体は、シスプラチンより遅くGSHと共有結合性付加物を形成することが示唆された。続いて、細胞内GSHレベルの異なる細胞に対するテトラゾラト架橋錯体のin vitro細胞毒性を調べるため、細胞内GSHレベルを変化させた細胞を準備した。まず、細胞内GSHレベルが高い細胞(GSH-rich細胞)の作製のため、HCT116ヒト大腸がん細胞において、シスタチオニンβ合成酵素(CBS)遺伝子のノックダウンを試み、CBS遺伝子のノックダウン効率をウェスタンブロットによって確認した。本法により細胞内GSHレベルが増加することが報告されている。現在までに、抗体の不具合等により、CBS発現量に関する結果は得られていない。GSH-rich細胞の作製と並行して、細胞内GSHレベルが低い細胞(GSH-poor細胞)を得るために、L-Buthionine (S,R)-sulfoximine(BSO)の暴露条件の検討を行った。BSOは細胞内GSHレベルを低下させることが一般的に知られている。比色法によって細胞内GSHの定量を行ったところ、細胞内GSHレベルを低下させるのに適したBSOの暴露条件を決定することができた。生理的条件下におけるGSHとの反応性に関する解析は、おおむね順調である。一方で、細胞内GSHレベルのin vitro細胞毒性に対する影響を調べる実験では、ノックダウンに関する好ましい結果が出ず、当初計画より時間を要しているため、やや遅れているとした。しかし、当初計画に加えて、BSO暴露によるGSH-poor細胞の準備も進めることとし、BSOの暴露条件の最適化ができた。また、引き続き、GSH-rich細胞を得るための条件検討を行っている。

また、ヒト大腸がん幹細胞を用いて、がん幹細胞塊の増殖抑制効果を評価した。フルオロメチル基を有するテトラゾラト架橋錯体において、がん幹細胞塊の形成数が減少したことから、がん幹細胞の増殖を抑制する可能性があることが示唆された。本研究で得られた知見は、テトラゾラト架橋錯体の構造最適化に有用であり、より有効な次世代白金制がん剤の候補化合物の創出に寄与すると考えられた。GSH-rich細胞を得るための条件が確立され次第、GSH-rich細胞を用いて、一連のテトラゾラト架橋錯体のin vitro細胞毒性および細胞内蓄積量を明らかにする。また、GSH-poor細胞においても同様の実験を行い、GSHとの反応性に関する解析結果と合わせて、総合的に、テトラゾラト架橋錯体のGSHによる解毒の受けやすさを評価する。さらに、細胞内GSH濃度が高いことが知られているがん幹細胞を用いて、テトラゾラト架橋錯体のがん幹細胞に対するin vitro細胞毒性評価も並行して行う。研究成果発表費用が予算額より下回ったため、残高が生じた。次年度の研究成果発表費用に充てる予定である。