hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
三次元的パターンマッチング法等の応用による土器製作者個人の高確度同定法の開発

本年度は、これまでに得られた土器製作者個人の同定法に関する各種のデータについて、様々な角度から検討を行い、必要なものに関しては追加・補足的な実験・観察等を実施することで、一定の成果を挙げるよう努めた。印象材を用いたレプリカ法や、土器調整痕の製作実験等、多角的な検討を実施し、弥生土器以外の土器についても調査・実験を行って、これまで開発してきた方法の拡張性・一般性についての確認と、適用可能範囲について考察した。また、タイ北部で伝統的土器製作に関する海外現地調査を実施した。この調査は、研究室では得がたい実際の場面での確認という意義をもち、利き腕の異なる製作者間の差、同一素地・同一工具を用いた製作者間の差などについて、良好な条件の下に観察・実験・検証を行うことができた。同調査では、個体間・個人間での胎土の違いや個人内での一致度に関する貴重な所見も得ることができた。なお、身体技法の一致度の評定については一層研究を深める必要があるが、タイでの民族考古学的調査による成果のほか、現物及び実験製作品の顕微鏡観察によって、工具の運動方向等に関するかなり確実な推定が行えることを見出した。以上の研究から、弥生土器等のハケメをはじめとする土器表面の微細痕跡については、開発した「断面高解像度スキャニング法」によるマッチングは、同一工具の同定に極めて有効であることが確信できる。本研究によって、従来、土器製作者の個人同定には条件の整った土器しか使用できないという限界を超え、弥生土器をはじめとする無文傾向の著しい土器についても個人同定を行うことが可能という明るい見通しを得るに至った。このことは、考古学及び関連分野に、過去の個人を基軸とする新しい領域を確立することに役立つものと考える。ハケメを中心として、土器の調整技法に関する復元実験を行った結果、ハケメ工具の土器に対する角度等によって痕跡に差異が生じることなどを確認した。また、ミガキ技法においても利き腕や土器と身体の位置関係などの身体技法が、土器表面に痕跡としてどのように残るかを実験的に確認した。さらに、シリコン印象材を用いた高精度のレプリカ法による土器表面の微細痕跡の型取りについては、乾燥・焼成等の条件を変えた復元実験品による検討によって、土器の収縮による影響やマッチング時の補正方法について重要な示唆が得られた。弥生土器や、伝統的製作法によるタイ、フィジーの現代土器などでもレプリカ法を実施したが、複数のレプリカ断面をマイクロスコープで観察したのち、断面からイメージスキャナによって得られた高解像度画像を画像処理ソフト上でマッチングさせる方法を開発した。その有効性が確認できたことは大きな成果である。これによって、従来のような土器表面の観察や、歪みのある拓本・写真等の平面的比較に頼るサンプル間の比較よりも、格段に精度の高いマッチシグが可能となったと自負している。また、土器のサイズや厚さの検討、胎土分析なども併せて行い、各方法間での有効性の比較も行った。上記の現代土器についての蛍光X線分析による胎土分析では、製作者個人間で土器素材の調整に伴い化学特性に微差がみられる場合があることを確認した。これによって、蛍光X線分析による胎土分析が個人研究にも貢献しうることを示したことになる。そのほか、実際の遺構から出土した土器群中から同一個人による製品を抽出する初期的な実験も試み、従来の方法を含む様々な方法を適用した。これにより微細痕跡のマッチング法による結果と身体技法や胎土の類似度との間に共通性がみられることも確認した。これは土器製作者個人の高確度同定法の開発をめざす本研究にとって重要な成果である。本研究は、分析的手法を用いて多角的に土器製作者個人を同定する方法の開発を行うものであり、前年度に継続して資料収集と調査・実験を実施した。土器表面にみられる製作工具痕における同一工具の同定法については、初年度の同一個体内での痕跡の同定などの基礎的研究を踏まえ、異なる個体間での痕跡の同定に拡張して実験・検討を行った。使用した方法は、レプリカ法による痕跡の転写とそのデジタル画像データによるマッチングのほか、工具痕のつき方に関する実験、蛍光X線分析による胎土分析などである。弥生土器のほか東南アジア・フィジーの土器を対象とした。レプリカ法では断面をマイクロスコープを用いて観察等し、断面から得られた高解像度画像を画像処理ソフト上でマッチングさせる方法を前年度開発したが、高解像度画像の歪み補正に関する検討・実験の結果、より有効なマッチングを行うことができた。こうして、同一個体内だけでなく個体間でも同一工具を確認する方法をさらに洗練できたのは大きな成果である。また、同時製作だが製作者が異なる個体間において蛍光X線分析を実施するなどして、製作者による胎土調整の違いなどに起因する個人差の把握も試みたが、胎土調整のクセが検出できる場合があることも確認できた。さらに、個人同定の判別効率を確認するため、実験製作品などを用いてブラインド・テストを試みた。レプリカ法では概ね良好な成績が得られた。工具痕の観察から身体技法を復元することも一定程度可能であることもわかった。ただし、同一工具であっても異なる部位を使用した場合や、同一部位でも極端に違う角度で施したものなどは、同一工具痕を他の工具と判別する可能性があることもわかった。こうした成果をもとにすれば、個人同定法の方法論の基本的な確立が可能であるという確信が得られつつある。

本年度は、これまでに得られた土器製作者個人の同定法に関する各種のデータについて、様々な角度から検討を行い、必要なものに関しては追加・補足的な実験・観察等を実施することで、一定の成果を挙げるよう努めた。印象材を用いたレプリカ法や、土器調整痕の製作実験等、多角的な検討を実施し、弥生土器以外の土器についても調査・実験を行って、これまで開発してきた方法の拡張性・一般性についての確認と、適用可能範囲について考察した。また、タイ北部で伝統的土器製作に関する海外現地調査を実施した。この調査は、研究室では得がたい実際の場面での確認という意義をもち、利き腕の異なる製作者間の差、同一素地・同一工具を用いた製作者間の差などについて、良好な条件の下に観察・実験・検証を行うことができた。同調査では、個体間・個人間での胎土の違いや個人内での一致度に関する貴重な所見も得ることができた。なお、身体技法の一致度の評定については一層研究を深める必要があるが、タイでの民族考古学的調査による成果のほか、現物及び実験製作品の顕微鏡観察によって、工具の運動方向等に関するかなり確実な推定が行えることを見出した。以上の研究から、弥生土器等のハケメをはじめとする土器表面の微細痕跡については、開発した「断面高解像度スキャニング法」によるマッチングは、同一工具の同定に極めて有効であることが確信できる。本研究によって、従来、土器製作者の個人同定には条件の整った土器しか使用できないという限界を超え、弥生土器をはじめとする無文傾向の著しい土器についても個人同定を行うことが可能という明るい見通しを得るに至った。このことは、考古学及び関連分野に、過去の個人を基軸とする新しい領域を確立することに役立つものと考える。
就労糖尿病患者の生活時間のマネジメント力を活用した保健指導システムの普及と評価

本研究は、生活時間のマネジメントといった側面から、就労している2型糖尿病患者をサポートするためのシステムを構築し、保健指導従事者に普及するものである。生活時間のマネジメントといった視点から保健指導を行うことで、患者のセルフケア能力を高めることが今までの調査で明らかになった。そこで、開発した保健指導方法を普及するために、実際に保健指導を実施している医療従事者に、活用性について調査を行いたいと考える。食事や運動といった従来からある視点に“時間"という対処の視点を組み入れることで、新たなセルフケア獲得方法の提案をしたい。
複雑系解析、深層学習を用いた心房細動の電気生理学的機序の解明

心房細動(AF)中においての左房および肺静脈の興奮は、ランダムなのか、カオスなのか、複雑系解析手法を用いて解析した。当院でAFに対し肺静脈隔離術(PVI)を施行した65症例(67±10歳、男性44症例、発作性AF[PAF]39症例)に対し、プロトコル通りに局所電位を記録、自己相関関数およびフラクタル次元といったカオス解析を行った。自己相関関数とは、局所電位を時間tだけ徐々にずらし、もとの波形との相似性を評価する方法である。値は-11をとり、1は完全一致、-1は完全裏一致、また0は無関係であることを表す。波形に規則性があると、自己相関関数も周期性を示し、カオスやランダムであると、すぐに0へと収束する。フラクタル次元は、その局所電位波形は何次元で説明されるか、ということを評価する。整数でなく次元が高値であるほど、カオス性が高いことを示す。まずPAF症例のPVでは、持続性AF(PeAF)と比較し、有意に自己相関関数に周期的である頻度が高かった(41% vs 8%, P=0.004)。このことから、PAFにおいてPeAFと比較し、高頻度にPVからの規則的なdriverが見られることを示唆した。さらに、この手法は非PVに存在するdriverつまり"non-PV foci"を検出できる可能性も示唆した。続いて、PeAFではPAFに対し、LA本体でのフラクタル次元が高値であった(2.9±0.5 vs 2.7±0.3, P=0.02)。このことからPeAFでのLAリモデリングの進展が示唆され、フラクタル次元解析によるLAリモデリング評価の可能性が示唆された。さらに、PVI後にAFが持続した症例では、PVI前と比較し、LA本体で自己相関関数での周期的な波形に変化しており、こういった症例への新しいLAへの追加焼灼の可能性が示唆された。この結果を第83回日本循環器学会において口述報告した。当初、本研究は前半1年で心房細動がカオスであるか、ランダムであるかの解明をいろいろな複雑系解析手法を用いて行い、後半1年で、カオスであった場合、その機序または規則性の解明を行う予定である。今回のアプローチは完全に前例のない独創的な手法であるため、手探り状態であった。実験計画に示したような多くの解析手法を試したが、自己相関関数やフラクタル次元解析が心房細動の局所電位の解析に対し有用であることが示された。これをもとに、2019年度は、カオスの裏に隠された規則性を、具体的に証明する手法を確立したいと考えている。そのためにはAIおよびディープラーニングが必要であると考えている。ただ、これらの分野もいまだに発展途上の分野であり、これらの手法を使用した解析ソフトについて、十分に検討を重ねて購入したいと考えている。心房細動中の局所電位はカオスであり、特に発作性心房細動患者では肺静脈から、自己相関関数の規則的な波形が認められ、また左房本体の電位において、持続性心房細動患者のそれと比べて、カオス性が低かった。このことから左房リモデリングが進行するとカオス性が高くなることが示唆された。しかしながら、カオスの背景に隠れた規則性を解明するまでには至っていない。そのため、今後はこのカオスの裏の規則性をAIやディープラーニングと行った手法を用いて解明したいと考えている。具体的にはWolfram社のMathematicaを使用し、教師なし学習を行う。さらに並行して、この自己相関関数やフラクタル次元を、アブレーション時にリアルタイムに算出し、その結果を指標に、左房への追加アブレーションを行い、アブレーションによる心房細動の停止の有無を前向きに評価していきたいと考えている。

さらに、PVI後にAFが持続した症例では、PVI前と比較し、LA本体で自己相関関数での周期的な波形に変化しており、こういった症例への新しいLAへの追加焼灼の可能性が示唆された。この結果を第83回日本循環器学会において口述報告した。当初、本研究は前半1年で心房細動がカオスであるか、ランダムであるかの解明をいろいろな複雑系解析手法を用いて行い、後半1年で、カオスであった場合、その機序または規則性の解明を行う予定である。今回のアプローチは完全に前例のない独創的な手法であるため、手探り状態であった。実験計画に示したような多くの解析手法を試したが、自己相関関数やフラクタル次元解析が心房細動の局所電位の解析に対し有用であることが示された。これをもとに、2019年度は、カオスの裏に隠された規則性を、具体的に証明する手法を確立したいと考えている。そのためにはAIおよびディープラーニングが必要であると考えている。ただ、これらの分野もいまだに発展途上の分野であり、これらの手法を使用した解析ソフトについて、十分に検討を重ねて購入したいと考えている。心房細動中の局所電位はカオスであり、特に発作性心房細動患者では肺静脈から、自己相関関数の規則的な波形が認められ、また左房本体の電位において、持続性心房細動患者のそれと比べて、カオス性が低かった。このことから左房リモデリングが進行するとカオス性が高くなることが示唆された。しかしながら、カオスの背景に隠れた規則性を解明するまでには至っていない。そのため、今後はこのカオスの裏の規則性をAIやディープラーニングと行った手法を用いて解明したいと考えている。具体的にはWolfram社のMathematicaを使用し、教師なし学習を行う。さらに並行して、この自己相関関数やフラクタル次元を、アブレーション時にリアルタイムに算出し、その結果を指標に、左房への追加アブレーションを行い、アブレーションによる心房細動の停止の有無を前向きに評価していきたいと考えている。当初、2018年度にカオス解析ソフトを購入し、心房細動中の局所電位がカオスなのか、ランダムなのかを解析し、その結果をもとに2019年度ではAIやニューラルネットワークのソフトを購入し、局所電位の規則性を解明するという予定であった。しかしながら、後者のソフトが予定よりも高値であったため、2018年度のカオス解析ソフトを自己負担で購入、2019年度のソフトに充てることに変更した。後者のソフトを今年度は慎重に吟味し、購入予定である。
静脈を動脈化する手法の開発とその臨床への応用

静脈は従来バイパスグラフとしてよく用いられるが、長期にわたる開存が期待できない。これは動脈系と静脈系の血管の性質の相違によるものと考えらる。本研究は、静脈系と動脈系の内皮細胞の分化調節メカニズムの相違を分子レベルで明らかにし、それに基づいて、自己の静脈を動脈に変換する手法を開発することを目的とする。我々は最近、動脈と静脈の分化のkey regulatorと考えられる転写因子Cardiac hairy like factor(CHF)をクローニングした。ゼブラフィッシュではangioblastはdefaultとしては静脈に分化するが、Notchシグナルの存在下では、その下流のCHFのhomologが活性化され、静脈に分化するための遺伝子発現を抑制することにより動脈への分化を促進することが明らかになっている。そこでまずCHFを発現するアデノウイルスを作成し、このアデノウイルスをヒト臍帯静脈内皮細胞に感染させるとEphB4の発現は微増したが、動脈の表現型を示すまでには至らず、ほ乳類では他の因子も静脈の動脈化に重要であると考えられた。次にNotchシグナルの血管内皮での調節機序について検討した。その結果Notch1と4、Delta4、Jagged1が血管内皮で発現していた。Delta4は静脈系の血管内皮ではVEGFにより発現が上昇したが、動脈系の内皮細胞ではVEGFにより発現の変化はなかった。その発現調節メカニズムをさらに検討するためにヒトDelta4遺伝子の5'隣接領域7kbをクローニングしルシフェラーゼ遺伝子に結合したレポーターを作成した。このレポーターはヒト臍帯静脈内皮細胞ではVEGFにより活性が上昇したが、大動脈内皮細胞では上昇しなかった。現在VEGFへの反応性に重要なエレメントを同定中である。この部位に結合するタンパクを同定することにより、静脈の動脈化に重要な物質が明らかにできると期待できる。マウス胎児のpara-aortic splanchnopleural mesoderm(P-Sp)領域の器官培養は、in vitroにおいて中胚葉細胞の血管内皮細胞への分化を観察できる良い培養系である。現在このP-Sp培養系を用いて、血管内皮細胞がどのようにして、動脈系、静脈系に分化して行くのかを、Ephrin-B2、EphB4をマーカーとして解析中である。これらの実験で同定された因子を用いて静脈の動脈化に応用する予定である。これは動脈系と静脈系の血管の性質の相違によるものと考えられる。我々は最近、動脈と静脈の分化のkey regulatorと考えられる転写因子cardiac hairy like factor(CHF)をクローニングした。そしてangioblastはdefaultとしては静脈に分化するが、Notchシグナルの存在下では、その下流のCHFが活性化され、静脈に分化するための遺伝子発現を抑制することにより動脈の分化を促進することが明らかになっている。そこでまずNotchシグナルの血管内皮での調節機序について検討した。次にCHFより発現が誘導または抑制される遺伝子を同定するためにCHFを発現するアデノウイルスを作成した。このアデノウイルスをヒト臍帯静脈内皮細胞に感染させ、発現の変化する遺伝子を同定しその機能について解析中である。現在マイクロアレイで同定された遺伝子についてこのP-Sp培養系を用いて、血管内皮細胞がどのようにして、動脈系・静脈系に分化して行くのかを、Ephrin-B2、EphB4をマーカーとして解析する準備中である。平成16年度はこのようにして明らかになった動脈と静脈の分化の分子メカニズムを応用して、静脈内皮細胞を動脈内皮細胞へ形質変換する手法の開発をめざす。

その発現調節メカニズムをさらに検討するためにヒトDelta4遺伝子の5'隣接領域7kbをクローニングしルシフェラーゼ遺伝子に結合したレポーターを作成した。このレポーターはヒト臍帯静脈内皮細胞ではVEGFにより活性が上昇したが、大動脈内皮細胞では上昇しなかった。現在VEGFへの反応性に重要なエレメントを同定中である。この部位に結合するタンパクを同定することにより、静脈の動脈化に重要な物質が明らかにできると期待できる。マウス胎児のpara-aortic splanchnopleural mesoderm(P-Sp)領域の器官培養は、in vitroにおいて中胚葉細胞の血管内皮細胞への分化を観察できる良い培養系である。現在このP-Sp培養系を用いて、血管内皮細胞がどのようにして、動脈系、静脈系に分化して行くのかを、Ephrin-B2、EphB4をマーカーとして解析中である。これらの実験で同定された因子を用いて静脈の動脈化に応用する予定である。
バイオ燃料の大規模生産に対する環境経済学的分析:社会メタボリズム型モデルの応用

次の3つの基準(criteria)について、それぞれの基準に属する複数の指標(Indicators)を選択し、それらを利用して、総合的評価を試みた。1.規模なバイオ燃料生産を実行するためには、労働投入量がどの程度必要になるのか?先進国の現在のエネルギー消費水準を満足するためには、平均エネルギー消費(総エネルギー消費量を、人口に8,760時間を掛けたもので割った値)の1000倍を超えるエネルギー生産性を実現する必要があるのである。バイオ燃料が自立的であるためには不可欠な条件である。また、現在の先進国では人ロの半分しか経済的活動に従事していないこと、余暇時間の拡大により、総時間の20%しか経済活動に利用されていないことなども考慮しなければならない。2.大規模なバイオ燃料生産を実行するためには、どの程度の土地が現在使用されている産業分野と競合するのか?先進国においては、本来は土地生産物であったものが、工業生産によって生産されている事実が忘れられる傾向にある。例えば、多くの窒素肥料は化石燃料により生産されているが、それをバイオ燃料で生産するようになれば、人ロの3分の1の食料生産に必要な窒素肥料が不足するといわれている。土地利用の制約がどのようなものになるか定量的に分析した。3.大規模なバイオ燃料生産の環境負荷への影響はどのようになるか?地球温暖化の影響を食い止めるために、バイオ燃料の生産を促進するのが得策であるという意見もあるが、バイオ燃料の生産から、消費、廃棄のすべての段階においての環境負荷ライフサイクルアセスメントが必要である。次の2点について社会メタボリズム型エネルギー分析モデルと利用レて研究した。1.大規模なバイオ燃料生産を実行するためには.労働投入量がどの程度必要になるのか?先進国の現在のエネルギー消費水準を満足するためには、平均エネルギー消費(総エネルギー消費量を、人口に8,760時間を掛けたもので割った値)の1.000倍を超えるエネルギー生産性を実現する必要があるのである。また、現在の先進国では人口の半分しか経済的活動に従事していないこと、余暇時間の拡大により、総時間の20%しか経済活動に利用されていないことなども考慮しなければならない。さらに、エネルギー部門には総時間のたった1%しか利用できない。このような要因をこの基準の中で考察する。2.規模なバイオ燃料生産を実行するためには、どの程度の土地が現在使用されている産業分野と競合するのか?先進国においては、本来は土地生産物であったものが、工業生産によって生産されている事実が忘れられる傾向にある。例えば、多くの窒素肥料は化石燃料により生産されているが、それをバイオ燃料で生産するようになれば、人口の3分の1の食料生産に必要な窒素肥料が不足するといわれている。土地利用の制約がどのようなものになるか定量的に分析する。これらの研究成果は、平成18年度の成果として次の専門雑誌に掲載された。次の4つの基準(criteria)について、それぞれの基準に属する複数の指標(Indicators)を選択し、それらを利用して、総合的評価を試みた。2.大規模なバイオ燃料生産を実行するためには、どの程度の土地が現在使用されている産業分野と競合するのか?

先進国においては、本来は土地生産物であったものが、工業生産によって生産されている事実が忘れられる傾向にある。例えば、多くの窒素肥料は化石燃料により生産されているが、それをバイオ燃料で生産するようになれば、人口の3分の1の食料生産に必要な窒素肥料が不足するといわれている。土地利用の制約がどのようなものになるか定量的に分析した。3.大規模なバイオ燃料生産の環境負荷への影響はどのようになるか?地球温暖化の影響を食い止めるために、バイオ燃料の生産を促進するのが得策であるという意見もあるが、バイオ燃料の生産から、消費、廃棄のすべての段階においての環境負荷ライフサイクルアセスメントが必要である。上記の基準とのかかわりの中でこの基準を考察した。
MMP9を標的とした翼状片発症機構の解明と予防薬の開発に関する研究

我々の前回までの研究で、ヒト翼状片線維芽細胞においてMMP9を抑制することにより上皮間葉系移行に関与するalpha-smooth muscle action(αSMA)やperoxiredoxin (Prdx) 6遺伝子の発現も抑制される傾向にあり、MMP9抑制により翼状片発症伸展を予防できる可能性が示唆された。我々はMMP9抑制物質のノビレチンに注目し、その抑制効果についてヒト翼状片線維芽細胞を用いて検討した。ノビレチンは柑橘類の果皮等に多く含まれる有機化合物フラボンを骨格に持つポリメトキシフラボノイド(O-メチル化フラボノイド)の一種であり、ノビレチンの後発白内障抑制効果などの報告もされている物質である。スクリーニングしたフラボン化合物として4デメチルノビレチンを使用し、ヒト翼状片線維芽細胞に添加しUV-B紫外線照射(100mj)を行い照射前後でのMMP9阻害作用をリアルタイムRT-PCR法にて測定した。同様の方法で化合物ではないノビレチンを添加した場合においても検討した。結果、UV-B照射によりコントロール群はMMP9の発現が増加した。4デメチルノビレチンを添加した群は、照射前よりも照射後にMMP9発現抑制効果がみられた。ノビレチンを添加した群にはMMP9発現抑制効果はみられなかった。このことにより、ノビレチン化合物のMMP9抑制効果の可能性が示唆された。計画に沿って実験が遂行出来ている。他のフラボン化合物においても検討しヒト角膜上皮初代培養細胞なども用いMMP9抑制効果および細胞死抑制効果、EMTに対する影響を観察、測定を行い翼状片予防薬の開発に努める。H29年度に計画したヒト翼状片のグレード別、部位別のMMP9,KRT24発現変化については、MMP9はコントロールを1とした場合、翼状片頭部で753、翼状片体部で1075と多くのMMP9の発現を認めた。翼状片頭部と体部両方で発現は上昇しており有意差はなかった。翼状片グレード別においても全てのグレードで発現は上昇しており有意差はみられなかった。KRT24はコントロールを1とした場合、翼状片頭部で954.9、翼状片体部で195.4と頭部で有意に発現していた。また、翼状片グレード別においてグレード1で有意に発現が上昇していた。H29年度に計画した角結膜上皮細胞における遺伝子変化については、ヒト翼状片組織の採収は同意を得て、ヒト初代翼状片線維芽細胞の樹立に成功した。細胞形態はヒト培養結膜線維芽細胞の形態と類似し紡錘形をしており増殖力に長けていた。このヒト翼状片線維芽細胞へ紫外線(UVB)照射実験を行いKRT24とMMP9の発現をPCRにて検討した。結果、MMP9は紫外線照射強度に準じて発現の亢進を認めた。KRT24においては発現がみられなかった。これらの特徴はヒト培養結膜線維芽細胞と類似しており、今後翼状片研究を進めていく上で翼状片培養細胞は病態解明に活用可能である。また、MMP9をノックアウトした細胞の作製のため、ヒト翼状片線維芽細胞にsiRNA-MMP9をトランスフェクションし上皮間葉系移行に関与するalpha-smooth muscle action (αSMA)と酸化ストレスに関与するperoxiredoxin (Prdx) 6の発現をPCRにて検討した。結果MMP9抑制によりMMP9を抑制するとαSMAやPsdx6の発現も抑制される傾向にあった。このことはMMP9抑制により他の遺伝子を同時に抑制でき翼状片発症伸展を予防できる可能性が示唆された。計画に沿って実験が遂行できている。ノビレチンの新規フラボン誘導体のうちすでに合成が完了している30種類の新規フラボン誘導体を用い、MMP阻害作用を検討しフラボンの構造活性を明らかにする。

さらに、上記でスクリーニングしたノビレチンの新規フラボン誘導体を細胞に投与し、MMP9抑制効果および細胞死抑制効果、EMTに対する影響を観察、測定を行い翼状片予防薬の開発に努める。他のフラボン化合物においても検討しヒト角膜上皮初代培養細胞なども用いMMP9抑制効果および細胞死抑制効果、EMTに対する影響を観察、測定を行い翼状片予防薬の開発に努める。実験の一つを次年度にもう一度することになったため、試薬を購入する必要が生じた。次年度の実験に必要な試薬を購入する。
魚類の生育温度依存的なマクロ栄養素嗜好性制御メカニズムの解明

これまでにマウスで生育温度の違いが代謝の変動を導き,マクロ栄養素に対する嗜好性を変化させることを明らかにした.変温動物の魚類は生育水温の違いが直接代謝を変化させることから,マクロ栄養素嗜好性の変動を導くことが考えられる.昨年度までに小型実験魚における嗜好性評価系の確立を行った.そこで本年度はまず,昨年度確立した嗜好性評価系を用いて,ゼブラフィッシュにおける嗜好性の評価を行った.ゼブラフィッシュを高温飼育,至適温度飼育,低温飼育の3区に分け,高タンパク質飼料,高炭水化物飼料を作製し,嗜好性試験を行った.その結果,水温によって食欲の変動を導いただけでなく,至適水温以外ではタンパク質嗜好性が高まる傾向があったことから,生育水温の違いによってマクロ栄養素の嗜好性が異なることを示唆した.また,代謝を著しく変化させるモデルとして絶食させた個体を用いて嗜好性試験を行った.その結果,絶食によって味覚受容体mRNA発現量が増加したが,視床下部における炭水化物嗜好性関連因子mRNA発現量は減少した.同様に嗜好性の評価においては,スクロースへの嗜好性が亢進した一方,コーンスターチに対する嗜好性が低下した.また,哺乳類では,味覚受容体であるT1RsとT2Rsに共通の下流シグナル伝達因子TRPM5は温度感受性で,低温ほど活性化されにくく,感受性が低くなることが報告されている.また,哺乳類のT1Rsは甘味とうま味の受容体であるが,魚類ではアミノ酸に感受性の高い受容体であることが明らかになっている.そこでゼブラフィッシュのTRPM5および,その上流であるPOU2F3のゲノム編集によるノックアウトを試みた.ヘテロ二本鎖移動度分析によりDNA切断を確認したところ,50%の割合でノックアウト個体を得ることが出来た.今後,これらの個体を用いて嗜好性試験を行う.本年度は昨年度確立した蛍光色素を用いた嗜好性評価系を用いて水温の違いによる小型実験魚のマクロ栄養素嗜好性の違いについて検討した.その結果,生育水温の違いによってマクロ栄養素の嗜好性が異なることを示した.また,また,水温の違いは代謝の変動によるものと考え,代謝を著しく変化させるモデルとして絶食試験を行った.その結果,絶食によって味覚受容体mRNA発現量が増加したが,視床下部における炭水化物嗜好性関連因子mRNA発現量は減少した.同様に嗜好性の評価においては,スクロースへの嗜好性が亢進した一方,コーンスターチに対する嗜好性が低下した.このことから,絶食時に炭水化物嗜好性が低下すると同時に甘味嗜好性が向上すること,その機構には摂食嗜好性中枢の視床下部だけではなく,末梢である味覚受容体の発現も関与していることが示唆された.これらの結果について学会発表を行っている.また,TRPM5およびPOU2F3のノックアウト個体は手に入れたが,それを用いた嗜好性試験は来年度に持ち越した.また,HEK293細胞にゼブラフィッシュTRPM5チャネルを発現させ,魚類のTRPM5活性が温度依存的であるかを検討する予定であったが,TRPM5のin-fusion cloning用プライマーを設計したのみで,発現させた細胞を用いた試験は来年度以降に持ち越した.初年度産休を取得し初年度の途中からの事業開始となったため,やや遅れているとの判断に至った.今後は本年度明らかになった生育水温による嗜好性の変化を引き起こすメカニズムを詳細に検討していく.具体的には,魚類の味蕾は舌上皮のみならず,鰓耙や咽頭などにも存在していることが明らかになっていることから,それぞれの部位における発現量にも着目し,水温変化による嗜好性の応答が味覚受容体発現を介したものかを検討する.また,本年度同様生育水温によって発現量の異なるタンパク質および遺伝子にも着目し,二次元電気泳動や次世代シークエンスにより網羅的な解析を試み,味蕾および脳において水温変化によって変動する嗜好性制御関連因子の特定を目指す.さらに,予備的な検討により,アミノ酸の種類によっても嗜好性が異なる可能性を示したことからこれまでマクロ栄養素のみに着目していたが,生育水温の違いによるアミノ酸嗜好への影響についても検討する予定である.また,次年度以降に持ち越したTRPM5およびPOU2F3のノックアウト個体を用いた嗜好性試験を行う.これにより,生育水温の違いがどのシグナル伝達系に作用し,嗜好性の差異をもたらすのかを明らかにする.さらにHEK293細胞にゼブラフィッシュTRPM5チャネルを発現させ,魚類のTRPM5活性が温度依存的であるかを培地を異なる温度でインキュベートし,膜電位色素を用いて蛍光顕微鏡もしくは蛍光マイクロプレートリーダーにより評価する.本方法が難しい場合はカルシウムイメージング法を用いて検討する.これまでにマウスで生育温度の違いが代謝の変動を導き,マクロ栄養素に対する嗜好性を変化させることを明らかにした.変温動物の魚類は生育水温の違いが直接代謝を変化させることから,マクロ栄養素嗜好性の変動を導くことが考えられる.そこで本年度はまず,小型実験魚における嗜好性評価系の確立を目指した.魚類で味覚受容体発現解析を行うために味覚受容体発現組織である口腔や鰓を採取すると個体が死亡してしまう.しかしゼブラフィッシュは再生可能なひげ状の組織であるmaxillary barbel(MB)を有しており,味覚受容体発現があることが知られている.MBから味覚受容体発現量変化を測定することが可能であれば魚類個体を犠牲にすることなく継続的に発現量変化の測定を行うことが可能となるが,口腔組織や鰓と比較してMBでは味覚受容体発現パターンにどのような違いがあるのかについては明らかになっていない.そこでゼブラフィッシュのMBにおける味覚受容体発現について測定を行い,口腔・鰓組織における発現パターンと比較した.

その結果, MBにおいて各種味覚受容体の発現が確認された.MBの味覚受容体発現パターンは口腔や鰓とほぼ同じであった.また,飼育条件によって哺乳類と同様に味覚受容体の発現量増加が見られたことから,魚類の嗜好性制御機構解明にMBの有用性が示された.また,金魚を用いて,蛍光色素の標識による嗜好性の測定を行い,二瓶選択試験をモチーフとした魚類における嗜好性評価系の検証を行った.市販の小型魚用餌を波長が異なる2種類の蛍光色素で標識し,片方にはドジョウの忌避物質として知られるノナン酸を混合した飼料を作製した.その結果,金魚はノナン酸の摂食を忌避し,それを蛍光色素によるイメージングによって測定出来た.本法は小型の魚において嗜好性を調べる手法として有用であることが明らかになった.本年度は小型実験魚におけるマクロ栄養素嗜好性評価系の確立を目指し研究を行った.その結果,蛍光色素を用いて嗜好性評価系を確立することが出来た.哺乳類においては嗜好性制御機構の研究が進んでおり,その一部には味覚受容体の発現が関与することが知られているが,未だほとんど解明のなされていない魚類嗜好性制御メカニズムについて,ゼブラフィッシュを用い味覚受容体発現について研究を行った.まず,組織別味覚受容体発現の測定では,MBと口唇や鰓と発現パターンが同じであり口唇の代替として用いることが可能であることを明らかにした.また,飼育条件による味覚受容体発現変動試験では,絶食時における味覚受容体の発現量について,MBと口唇と苦味受容体発現パターンが類似していたことを明らかにし,魚類の嗜好性制御機構解明にMBの有用性が示された.これらの結果について学会発表を行っているが,水温変化による味覚受容体およびマクロ栄養素嗜好性への影響の解明および生育水温による嗜好性制御関連因子の網羅的解析については来年度に持ち越した.産休を取得したため年度途中からの事業開始となったため,やや遅れているとの判断に至った.これまでにマウスで生育温度の違いが代謝の変動を導き,マクロ栄養素に対する嗜好性を変化させることを明らかにした.変温動物の魚類は生育水温の違いが直接代謝を変化させることから,マクロ栄養素嗜好性の変動を導くことが考えられる.昨年度までに小型実験魚における嗜好性評価系の確立を行った.そこで本年度はまず,昨年度確立した嗜好性評価系を用いて,ゼブラフィッシュにおける嗜好性の評価を行った.ゼブラフィッシュを高温飼育,至適温度飼育,低温飼育の3区に分け,高タンパク質飼料,高炭水化物飼料を作製し,嗜好性試験を行った.その結果,水温によって食欲の変動を導いただけでなく,至適水温以外ではタンパク質嗜好性が高まる傾向があったことから,生育水温の違いによってマクロ栄養素の嗜好性が異なることを示唆した.また,代謝を著しく変化させるモデルとして絶食させた個体を用いて嗜好性試験を行った.
白血病細胞における転写因子GATA-2の転写調節機構の解析

転写因子GATA-2は血液細胞の発生・分化に関与し、特に、造血幹細胞や前駆細胞の増殖、自己複製には本因子の発現が必要で、その発現持続と白血病化との関連性が示唆されている。本研究では、GATA-2遺伝子が2つの選択的プロモーターによって制御されている、即ち、近位のIGプロモーターが殆ど全てのGATA-2発現細胞で働いているのに対し、遠位のISプロモーターの活性は造血組織だけに選択的に検出されるというこれまでの成果の上に立って、本遺伝子の転写調節機構、特にISプロモーター/エキソン領域について解析を行った。1)昨年に引続き遺伝子導入マウスを用いた造血組織における調節特性の検討をおこなった結果、IS第1エキソンの5'端に隣接する6 kbpの配列を導入遺伝子に含めると、β-ガラクトシダーゼあるいはGFPレポーター遺伝子が大動脈傍臓側板、AGM領域および神経組織で発現することが確認された。2)in situハイブリダイゼーション解析によれば、これらの組織の内因性GAIA-2の発現状況をレポーター遺伝子の発現が特異的に再現していた。3)AGM領域および胎児肝のGFP発現陽性細胞にはflk-1、c-kitおよびCD45抗原が同定され、GATA-2は未熟造血細胞で発現されていることが示された。4)6 kbp ISプロモター配列の5'側3.5kbpの領域はデオキシヌクレアーゼ高感受性部位の一つを含み、この領域を欠失させると、造血細胞における発現が全く消失した。以上により、発生初期に機能するGATA-2遺伝子の造血細胞特異的エンハンサーが、ISエキソンの5'側2.5kbp6.0kbpの範囲に存在することが実証された。なお、白血病細胞株UT-7およびM-TATでもISエキソンが実際に転写されていることが確認されたが、サイトカインの影響についてはさらに検討が必要である。
リン・カルシウム代謝異常による臓器線維化および血管石灰化の分子機構

体内のリン、カルシウムの代謝異常、特に高リン、高カルシウム状態は血管の石灰化と密接に関連している。本研究では高リン高カルシウム血症が血管石灰化を起こす分子機構について、特に酸化ストレスを介する血管石灰化機構との関連性について焦点を当てて研究を行った。培養平滑筋細胞を高リン培養液で7日間培養すると細胞内外に石灰化物質の沈着を起こすが、それと同時に細胞内酸化ストレス系シグナルであるKeap1/Nrf2が変動し、血管平滑筋細胞の石灰化に酸化ストレスが関係していることを見つけた。また細胞内に沈着した石灰化物質を除外するためのオートファジーと酸化ストレスシグナルとの関連性についても検索した。本研究の目的はリン・カルシウム代謝異常(特に高リン血症)における腎尿細管上皮細胞および血管平滑筋細胞内における遺伝子発現の変化を検索し、腎尿細管間質線維化および血管石灰化の分子機序を解明することであるが、本年度はまず高リン刺激による血管平滑筋細胞石灰化について研究を進めた。本実験の目的は腎不全における高リン血症状態において動脈中膜に石灰化をきたす機序を解明することである。動脈平滑筋細胞が高リンに暴露された時、細胞内に酸化ストレスが働いて石灰化をきたすことを仮説として考え、酸化ストレス防御機構である、Keap1-Nrf2シグナル経路の変動を検索した。実験の方法は培養ヒト大動脈平滑筋細胞に高リン・高カルシウム培地で3日、7日培養し、Keap1およびNrf2の変動を免疫組織化学およびreal-time PCRで検索した。さらに平滑筋細胞のマーカーであるαSMAおよび骨化マーカーであるALP、CBFA1、Osteopontinの変動を調べることにより、平滑筋細胞から骨芽細胞への細胞分化転換を観察した。また石灰化の程度はvon Kossa染色およびカルシウム沈着量を定量することにより観察した。再度実験を繰り返して確認する必要があるが、現在までに得られた結果の概略は高リン高カルシウム刺激は細胞内Keap1-Nrf2シグナルを亢進し、酸化ストレス系を活性化するということである。Nrf2は細胞質から核に移行し、酸化ストレス防御遺伝子を活性化する。今後酸化ストレス反応と石灰化の程度との相互関係について研究を進める予定である。大学院生を指導しながら実験を進めているが、大学院生の実験テクニックが未熟なため実験がスムーズに行えていないのが最大の理由である。ただ、徐々にであるが改善がみられており、初期の計画にまで到達する予定である。本年度は培養大動脈平滑筋細胞に石灰化が生じる条件設定を確立することから開始した。培養液中のカルシウム濃度を0.6mMと2.0 mMに固定して、リン濃度を3 mMにまで増加した。これ実験により培養大動脈平滑筋細胞が安定して石灰化を起こす濃度をカルシウム2.0 mMとリン濃度2.7 mMとした。この条件で大動脈平滑筋細胞を培養後3日、7日、9日で培養細胞を固定して免疫組織化学を行うか、細胞からRNAを抽出してreal-time PCRを行った。また細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロットを行った。本研究では血管平滑筋細胞のリン誘導石灰化における、酸化ストレスとオートファジーとの関連について特に焦点を当て行った。酸化ストレスについてはKeap1とNrf2およびNrf2の下流遺伝子であるNQO1とHO1に着目した。またオートファジーに関してはLC3とp62に着目し、酸化ストレスとの関連について検索した。血管平滑筋細胞の石灰化の程度はアリダリンレッド染色およびvon Kossa染色の強さを指標として判断した。蛍光免疫組織化学では石灰化の程度が強くなるに従って細胞質のKeap1の染色性が低下した。同時にNrf2は細胞質から核内に移行し、核内で沈着する様子が窺えた。しかしながらreal-time PCRによるmRNA量の定量では有意な変動は認められなかった。またp62では石灰化と共にタンパク量の増加がみられた。今後p62とKeap1, Nrf2との関連を検索し、血管石灰化におけるオートファジーと酸化ストレスとのクロストークを解明していく予定である。実験の条件が定まらず、基本的な条件設定からやり直す必要が生じたため、余分な時間を費やした。培養血管平滑筋細胞に高濃度のリンを暴露させた際に細胞内で起こる種々の遺伝子発現の変化について研究を行っている。特に今回は高リンにより誘導される細胞内石灰化と酸化ストレスとの関連に着目して研究を行った。酸化ストレスに反応する系としてはKeap1/Nrf2系に注目して、その発現をウエスタンブロットおよび免疫組織化学により観察し、石灰化病変との関連性を検討した。まず培養平滑筋細胞に高リン2.5 mMを暴露後3日、7日でKeap1とNrf2の発現を蛍光免疫組織化学、ウエスタンブロットおよび定量PCRで検索した。Keap1の発現はウエスタンブロットおよび定量PCRでは変化がみられなかったが、免疫組織化学では培養平滑筋細胞細胞質内で陽性像は減弱した。一方Nrf2は免疫組織化学でその反応性は増加し、陽性像が細胞質から核に移行した。定量PCRでもやや増加する傾向がみられたが、細胞質と核からそれぞれ蛋白を抽出して行ったウエスタンブロットでは明らかに核でNrf2蛋白の増加が認められた。またKeap1/Nrf2系シグナルの増加に伴ってHO1等の下流遺伝子発現の増加を定量PCRによって確認できた。

この高リン暴露による酸化ストレス反応の亢進と血管平滑筋細胞石灰化との関係を検索するため、Nrf2の阻害または亢進させた時、石灰化の程度がどう変化するかを検索した。その結果、siRNAによりNrf2阻害を行った時、石灰化の程度が増加したのに対し、Nrf2活性を亢進させると石灰化の程度が低下した。このことより、高リン刺激により起こる酸化ストレス反応の亢進は血管平滑筋細胞の石灰化を抑制する方向に働くことが考えられた。体内のリン、カルシウムの代謝異常、特に高リン、高カルシウム状態は血管の石灰化と密接に関連している。本研究では高リン高カルシウム血症が血管石灰化を起こす分子機構について、特に酸化ストレスを介する血管石灰化機構との関連性について焦点を当てて研究を行った。培養平滑筋細胞を高リン培養液で7日間培養すると細胞内外に石灰化物質の沈着を起こすが、それと同時に細胞内酸化ストレス系シグナルであるKeap1/Nrf2が変動し、血管平滑筋細胞の石灰化に酸化ストレスが関係していることを見つけた。また細胞内に沈着した石灰化物質を除外するためのオートファジーと酸化ストレスシグナルとの関連性についても検索した。とにかく実験を繰り返し、結果データをより確実なものにすることだけである。実験計画の変更は現在のところ考えていない。培養大動脈平滑筋細胞を用いた血管石灰化モデルにおいて、高リン刺激により細胞内で生じるオートファジーと酸化ストレスとの関連を検索していく。病理学細胞培養の条件設定などに時間を費やし、予定していた実験が十分にできなかったためと考える。次年度使用額として56,241円生じたが、これは可及的完全に使い切るように努力した結果生じた少量の余剰金であり、特に特段の理由があるわけではない。実験技術の向上がみられるため、抗体など実験試薬の購入を多く予定しており、次年度は限度枠内の予算を使用する計画である。ウエスタンブロット用の他のタンパクを認識する抗体の購入に当てたいと考えている。
マッシュアップを想定した複数教育コレクション提供サービスについての研究

既存のWeb APIに基づくマッシュアップを想定し、論文検索システムを連携する仕組みについて検討した。特に、論文の同定について着目し、教育研究論文索引とCiNiiとの論文単位のリンケージについて検討し、調査を行った。調査結果で得られたデータを元に、プロトタイプシステムを試作した。また、マッシュアップ実験の1つとして、任意のテキストを対象に、そのテキストに類似した文書の検索を実現する手法「ふわっと関連検索」を開発した。既存のWeb APIにもとづくマッシュアップを想定し、図書館蔵書検索、論文索引検索とを対応付けるようなプロトタイプシステムを試作した。ベースシステムとして、昨年度までの若手研究(スタートアップ)「図書館の情報提供システムにおける多言語アクセス:教育専門図書館を対象として」における研究成果として構築済のZ39.50/SRU/SRWによる『教育研究論文索引』検索サービスを流用し、これの拡張またはこれと連携を図れるようなシステム構成でプロトタイプ試作した。具体的にはZ39.50/SRU/SRWによる『教育研究論文索引』検索サービスの検索結果から、他の情報サービス(国立教育非策研究所附属図書館の蔵書検索システム(NIER-OPAC)、Webcat、DOAJJ)へのリンクを付加して、当該の検索結果へ辿れる機能を追加した。プロタイプシステム構築にあたっては、既存のシステムと連携するにあたっての困難がないか、レコード形式に問題はないか、基本的な構築手法と構築時の課題を整理した。他のシステムと連携するためには、他のシステムのレコード同士をつなげるための仕組み(リンケージ)について検討する必要があることが分かった。もともと個別に作成・提供してきたデータベースには共通のIDが付与されていないことは多々あるため、同定するための仕組みについて検討することが課題である。プロトタイプシステムでは、ISSNを使って他のシステムとの連携をはかった。ISSNのない雑誌についての連携や、個々の論文ごとの連携について検討する必要があることが分かった。1.論文情報システムのマッシュアップ既存のWeb APIに基づくマッシュアップを想定し、論文検索システムを連携する仕組みについて検討した。特に、論文の同定について検討し、教育研究論文索引(以降はEpiと呼ぶ)とCiniiとの論文単位のリンケージについて検討した。多少異なる記述があっても同一候補を提示する仕組み(iLinkage)を利用して、その候補の中から人手で同定判定を行った。約15万件件のうち、サンプル調査の結果を元に、約10万件を判定し約9万件が共通するレコードであった。これまで開発してきたプロトタイプシステムにこのデータを組み込み、EpiからCiniiへの論文リンクを実現した。2.ふわっと関連検索の開発どのようなマッシュアップ形態がありえるかについて検討した。マッシュアップ実験の1つとして、任意1のテキストを対象に、そのテキストに類似した文書の検索を実現する手法「ふわっと関連検索」を開発した。この手法は通常の検索システムが提供するキーワード検索機能だけを利用するため、既存のシステムに手を加える必要なく、API活用の利点をそのまま活かせ、容易に多くのシステムに対応可能にする。様々なWeb API(Cinii、Worldcatなど)に適用し、Webに公開した。公開から一カ月で2000件程度のアクセスを集め、有用性を認めた。また、ふわっと関連検索の検索結果および抽出キーワードをさらに外部公開するAPIも公開し、これを外部サイト上でそのまま利用できるようにした。図書情報、論文情報などWeb APIのマッシュアップ技術、適用例の情報収集のため、Code4Lib2010カンファレンスに参加した。参加して得られた情報は、日本のコミュニティでの共有を図るために、報告会を開催した。報告会はUstreamで配信、録画も行い、Webにおいて公開した。1.論文情報システムのマッシュアップ既存のWebAPIに基づくマッシュアップを想定し、論文検索システムを連携する仕組みについて検討した。前年度行った、教育研究論文索引とCiniiとの論文単位のリンケージについて検討をさらに進めた。昨年度と今年度の結果をまとめ、分析し、論文検索システムを連携する仕組みの実現の元となるデータを作成した。2.ふわっと関連検索の開発と評価昨年度開発した「ふわっと関連検索」の開発をさらにすすめた。「ふわっと関連検索」は、任意のテキストを対象に、そのテキストに類似した文書の検索を実現する手法である。新聞記事サイトに対するふわっと関連検索結果の評価実験を行い、その分析結果を発表し、その可能性を示した。図書情報、論文情報などWeb APIのマッシュアップ技術、適用例の情報収集のためCode4Lib2011カンファレンスに参加した。
口腔癌細胞におけるEMTマーカーとしてのZyxinの発現および機能について

Actin重合促進タンパクであるZyxinは,アクチン重合と再構成を促進することにより,癌細胞自身の形態や運動性を変化させることからEMTへの関与が示唆されている.本研究は8種類の口腔ヒト扁平上皮癌培養細胞を形態別に分類し,EMT関連遺伝子およびZyxinの発現と細胞増殖能,運動能および浸潤能の関連について解析することを目的とした.上皮・間葉移行(Epithelial-mesenchymal transition:EMT)は,密に結合している上皮細胞が極性を失って運動性の高い間葉系細胞の形質を獲得する現象であり,癌細胞の浸潤,転移との関連性が注目されている.上皮細胞は、細胞間接着構造を介して互いに結合しており,adherence junctionではcadherinが互いに結合してactinと共に接着構造を構成している.Actin重合促進タンパクであるZyxinは,アクチン重合と再構成を促進することにより,癌細胞自身の形態や運動性を変化させることからEMTへの関与が示唆されている.本研究は8種類の口腔ヒト扁平上皮癌培養細胞を形態別に分類し,Zyxinの発言および機能について解析することを目的とした.8種類の口腔扁平上皮癌細胞株におけるEMTマーカーの検討により,細胞形態が紡錘型に移行するにつれてE-cadherinの発現が低下しN-cadherinとZyxinの発現が上昇したことから細胞接着が消失し上皮としての性質が失われることが確認された.また,Zyxinの発現をsiRNAを用いて抑制することにより,細胞の形態が変化するとともに増殖能,運動能および浸潤能が抑制されたことから,Zyxinはactin重合および再構成を促進し,癌細胞自身の形態を結合組織内の移動に有利な状態に変化させることが示唆された.SiRNA処理したHOC-313において,Zyxinによる細胞内actinの重合促進が細胞骨格再構成と運動の亢進に関わるか否かをRho familyタンパク発現にて検討したところ,CDC42, Rac-1において若干の発現抑制が認められ,さらにRac inhibitorを作用させるとZyxinの発現量が減少したことにより,Zyxinの発現はフィロポデイアおよびラメリポデイア形成に関与することが示唆された.Actin重合促進タンパクであるZyxinは,アクチン重合と再構成を促進することにより,癌細胞自身の形態や運動性を変化させることからEMTへの関与が示唆されている.本研究は8種類の口腔ヒト扁平上皮癌培養細胞を形態別に分類し,EMT関連遺伝子およびZyxinの発現と細胞増殖能,運動能および浸潤能の関連について解析することを目的とした.EMT(上皮ー間葉転換:epithelial-mesenchymal transion)は,極性をもつ細胞同士が密に結合している上皮細胞が,その極性を失って運動性の高い間葉系細胞の形質を獲得する現象であり,癌細胞の浸潤,転移との関連性が注目されている.上皮細胞は,tight junction,adherence junctionおよびdesmosomeなどの細胞間接着構造を介して互いに細胞結合しており,このうちadherence junctionではcadherinが互いに結合してアクチンと共に接着構造を構成している.EMTではこの接着構造が消失することによりアクチンストレスファイバーが再構築され,細胞は上皮としての性質を失う.一方で,adherens junctionsに存在するアクチン調節関連タンパク質であるZyxinは,アクチン重合および再構成を促進することにより細胞の形態を変化させることからEMTとの関与が示唆されている.われわれは口腔ヒト扁平上皮培養癌細胞8種類を形態別に分類し,EMT関連遺伝子およびZyxinの発現について検討したところ,細胞の形態が敷石状から紡錘形に変化するにつれて,上皮系マーカーであるE-cadherinの発現が抑制され,間葉系マーカーであるN-cadherinの発現が上昇することが確認された.また,形態が紡錘形に移行するにつれてZyxinの発現が上昇することを確認した.以上のことから本研究では細胞の形態変化に着目し,アクチン細胞骨格の再構成に関与しているタンパクの一つであるZyxinについて,口腔ヒト扁平上皮癌細胞における発現および機能を解析することにより,EMTにおけるZyxinの役割を解析することを目的とする.形態別に分類した口腔ヒト扁平上皮癌細胞を用いて,増殖能,運動能および浸潤能を比較し,Zyxin発現との相関関係について検討するとともに,Rho family (Rho, Rac, CDC42)の発現をwestern blot法にて検討したところ,gradeが上昇するにつれて浸潤能および運動能が増加することが確認された,また,Rho familyの発現量は.gradeが上昇するにつれて増加した.Zyxinの高発現が認められた細胞株に対してはsiRNAによるZyxinのノックアウトを行い,細胞増殖能,運動能,浸潤能をそれぞれcell count, scrach assay, invasion assayにて検討した結果,si-Zyxinはコントロールと比較すると,形態が紡錘形から多角形様に変化し,増殖能,運動能および浸潤能が抑制されることが確認された.さらには,si-Zyxinはコントロールと比較すると,ウェスタンブロットにてRac1およびCdc42の発現が抑制されることが確認された.一方で,apoptosisおよびcell cycleに変化は認められなかった.