hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトのカテゴリ化能力の起源に関する実証的研究

これらの結果は,ヒト以外の霊長類の長期記憶を改めて確認するものであるとともに,ニホンザルが見た目の変容を伴う動的な対象についても,その情報を長期間保持することを示す.本研究は,ヒト以外の霊長類における長期記憶の新たな証拠を提供する点で,彼らの記憶能力に関するさらなる理解に貢献すると考える.本研究では,チンパンジー・ニホンザルにおける物理的事象の認識について検討した.物理的認識はヒト乳幼児認知研究の主要な課題のひとつであり,その様相・発達過程については実験的示唆が多く得られている.対して,ヒト以外の霊長類,とくにマカク類,においては検討すべき点が多い.実験にはヒト乳幼児研究にならい注視時間を指標とした期待違反事象課題を用いた.この課題では,物理法則に合った正事象と法則に違反した違反事象とが提示され,被験体が違反事象に対して有意な選好を示すかどうかが評価される.本研究では,物理的支持事象における法則(対象は土台からの適切な支持を失うと,空中にはとどまらず落下する)の理解に焦点を当てた.とくに,支持事象の基本法則である「(1)対象と土台の接触の必要性」,そして事象におけるより詳細な属性である「(2)支持の方向性(対象支持における垂直方向からの土台による作用の必要性)」と「(3)接地量(対象と土台の十分な接地量の必要性)」の3点について検討した.京都大学霊長類研究所のチンパンジー7個体,同所および玉川大のニホンザル4個体を対象に実験を行った結果,両種において,(1)および(3)での違反事象への有意な選好が見られた.つまり,これらの事象における物理法則の認識を示す証拠が得られた.ただし,(2)についてはそのような証拠は得られなかった.これらの結果は,マカクを含むヒト以外の霊長類が外界の事象を物理法則にのっとって認識していることを示唆する.その一方で,ヒト以外の霊長類が部分的にヒトとは異なる認識を発達させた可能性が示された.その要因の解明については今後の検討が待たれる.ヒト以外の霊長類がどのように外界を認識し,外界に関するどのような知識を持つのか,またそれがヒトとどのように類似し,また異なるのかを種間比較研究を通じて明らかにすることで,ヒトの認知の特徴の更なる理解が得られると考える.
ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)に関連した喉頭腫瘍に対する喉頭局所免疫の関与

喉頭乳頭腫、喉頭癌および喉頭良性疾患において、HPV陽性腫瘍に対する喉頭局所免疫である抗体の証明を行った。喉頭分泌液および静脈血中の各免疫グロブリン(IgM、IgG、IgA、分泌型IgA)濃度、総タンパク質濃度、Cytokeratin19fragment濃度を測定した。さらに、腫瘍と特異的HPV抗体の局在解明を試みた。結果、疾患の内訳は喉頭癌12例、喉頭乳頭腫4例、他の喉頭疾患15例であった。HPV陽性例は31例中6例あった。内訳はHighRisk型(すべて16型DNA)が3例ですべて喉頭癌(T1a:1例、T2:2例)であり、LowRisk型が3例ですべて喉頭乳頭腫であった。本検討での喉頭癌からのHPV陽性率は12例中3例の25%であった。HPV陽性6例はHPV陰性25例に対して各分泌液組成の濃度が高い傾向があり、特にS-IgAにおいて有意差を認めた。喉頭癌例は非喉頭癌例に対して、分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。HPV陽性例の分泌液中のS-IgA濃度上昇していたという結果は、喉頭局所でのHPV感染に対する抗原抗体反応と考えられた。また、HPV陽性喉頭癌3例はHPV陰性喉頭癌9例に対して、各分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。HPV陽性癌腫の発現により粘膜免疫が活性化し、異物排除や治癒機転として強く発現していることが示唆される。少なくともHPVの喉頭上皮内への進入や喉頭感染後の播種に対して、S-IgAは活性化し抑制的に働いていると考えられる。喉頭上皮および上皮下でのHuman papilloma virus(HPV)抗原抗体反応を病理組織学的および免疫学的の両側面から証明することを目的に研究を開始した。研究対象におけるHPV陽性例は31例中6例であった。6例の内訳は、HPV DNAのHigh Risk型が3例ですべて喉頭癌(T1a : 1例、T2 : 2例)であり、Low Risk型が3例ですべて喉頭乳頭腫であった。喉頭癌からのHPV陽性率は、12例中3例の25%であった。免疫学的検討では、HPV陽性6例はHPV陰性25例に対して各分泌液組成の濃度が高い傾向があり、特にSecretary(S)-IgAにおいて有意差を認めた。また、喉頭癌例は非喉頭癌例に対して、分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。さらに、HPV陽性喉頭癌3例はHPV陰性喉頭癌9例に対して、各分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。本研究は、S-IgAが少なくともHPVの喉頭上皮内への進入や喉頭感染後の播種に対して活性化し抑制的に働いていることを示した。本研究は、喉頭局所でのHPV感染やHPV陽性癌腫の発現により粘膜免疫が活性化し、異物排除や治癒機転として強く発現していることを裏付ける根拠といえる。研究成果は論文としてJ Laryngol Otolに出版した。喉頭乳頭腫、喉頭癌および喉頭良性疾患において、まずHPV陽性腫瘍に対する抗体の証明を行った。また、腫瘍と特異的HPV抗体の局在解明を試みた。喉頭分泌液および静脈血中の各免疫グロブリン(IgM、IgG、IgA、分泌型IgA)濃度、総タンパク質濃度、Cytokeratin 19 fragment濃度を測定した。

内訳はHigh Risk型(すべて16型DNA)が3例ですべて喉頭癌(T1a : 1例、T2 : 2例)であり、Low Risk型が3例ですべて喉頭乳頭腫であった。本検討での喉頭癌からのHPV陽性率は12例中3例の25%であった。HPV陽性6例はHPV陰性25例に対して各分泌液組成の濃度が高い傾向があり、特にS-IgAにおいて有意差を認めた。喉頭癌例は非喉頭癌例に対して、分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。HPV陽性例の分泌液中のS-IgA濃度上昇していたという結果は、喉頭局所でのHPV感染やまた、HPV陽性喉頭癌3例はHPV陰性喉頭癌9例に対して、各分泌液組成の濃度が高い傾向にあった。HPV陽性癌腫の発現により粘膜免疫が活性化し、異物排除や治癒機転として強く発現していることが示唆される。少なくともHPVの喉頭上皮内への進入や喉頭感染後の播種に対して、S-IgAは活性化し抑制的に働いていると考えられる。腫瘍と特異的HPV抗体の局在解明のために2重染色を行い良好な結果が出つつあるが、high risk HPV喉頭癌の症例数が意外に少ない。症例数を増やす必要がある。喉頭乳頭腫および喉頭癌からのHPVに対する特異的HPV抗体の証明を行う。それぞれHPV 8-VLP (Virus- Like Particle)およびHPV 16-VLPを抗原とした抗体価測定ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法で証明し、抗HPV- 8抗体および抗HPV-16抗体の存在とHPVの局在を対比し解析する。この際、H.E.染色した喉頭大切片スライドで腫瘍と正常組織が混在した部分を確認しておく必要がある。これら抗HPV-DNA抗体と前年度に行っているHPV-DNAの局在を2重免疫染色にて対比し、両者の関連性を証明する。また、再発性乳頭腫に対しては使用適応の範囲内でHPVワクチンを使用する。投与前後における抗原抗体反応に関しては前述の方法を用いて、HPVワクチン使用例との間の相違点を検討する。可能であればワクチンの局所注入を行ない切除後の喉頭乳頭腫および癌の再発抑制の可能性についての検証を行なう。ワクチンの使用においては、抗体価上昇を確認するまでの間に約半年の時間を要すると思われる。確認の時点で腫瘍が消失している場合は、血清および分泌液中の抗体価測定のみを行なうことで研究結果が得られる以上の作業は、すでに当研究室内に設置した検査・解析装置で可能である。一般病理用容器や試薬などの消耗品の購入や採取組織のSRL(外注)依頼を行うことで研究を実施できる。特に、VLPとワクチンの購入には1検体当り約6万円の費用が掛かる(10検体での実験を予定している)。
幼児性健忘における歯状回成熟度の意義の解明

神経細胞には活動の強弱によりシナプス強度や神経細胞そのものの興奮性が変化する「ホメオスタティック可塑性」という現象があることが知られている。光遺伝学によって海馬歯状回の神経細胞の興奮性を操作することでホメオスタティック可塑性を引き起こすことができれば、歯状回の成熟度についても変化を引き起こすことができると考えられる。本研究は、幼児性健忘が海馬歯状回の未成熟によって引き起こされており、海馬歯状回の成熟度が記憶の安定性を決める因子であるという仮説に基づいて行った。光遺伝学による歯状回特異的な神経活動操作が記憶の安定性にどのような効果を及ぼすか検討した。Cre-loxPシステムを用いて光感受性タンパク質であるチャネルロドプシン2 (ChR2)を歯状回特異的に発現させてマウスの歯状回にin vivoで局所的に光刺激を与え、マウスに各種の記憶課題を行わせた。また、アデノ随伴ウィルスベクターによる海馬歯状回への遺伝子導入についてもプロトコルを確立した。光依存性に活性化する酵素の一種を海馬歯状回特異的に発現させ、自由行動下に光刺激によって活性化させることができた。この刺激は短期記憶の成績には影響を与えなかったが、酵素が活性化されたマウスでは長期記憶の成績が有意に向上していた。つまり、長期記憶の安定化が見られた。今後は、これまでに得られた成果を元に海馬歯状回の成熟度と記憶の安定性についてより詳細な検討を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、光遺伝学による歯状回特異的な神経活動操作が記憶の安定性にどのような効果を及ぼすか検討した。具体的にはCre-loxPシステムを用いて光感受性タンパク質であるチャネルロドプシン2(ChR2)を歯状回特異的に発現させてマウスの歯状回にin vivoで局所的に光刺激を与え、マウスに各種の記憶課題を行わせた。刺激後に学習課題のトレーニングを行った場合、今回用いた刺激条件では、記憶の安定性に影響を及ぼすという結果は得られなかった。しかし、刺激を学習課題のトレーニング直後に行う場合では同じ強度の刺激であっても記憶を不安定にする効果があると示唆される結果が得られた。また、本年度はアデノ随伴ウィルスベクターによる海馬歯状回への遺伝子導入についてもプロトコルを確立した。今後は、これまでに得られた成果を元に海馬歯状回の成熟度と記憶の安定性についてより詳細に検討を行う。当初の研究実施計画では平成28年度から29年度にかけて、1歯状回顆粒細胞の選択的興奮性操作が脳成熟度に及ぼす効果の解析、2幼若期に歯状回を成熟させ幼児性健忘への影響を検証する予定であった。このうち1については既に予備的なデータを得ている。2については29年度に重点的に行う予定である。したがって本研究課題はおおむね順調に進展している。本年度までに光遺伝学による歯状回特異的に神経活動を引き起こし、歯状回の成熟度を変化させる手法が確立された。今後はこのシステムを活用し、歯状回の成熟度と記憶の安定性についての検討を行う。また、これまでは遺伝子組換えマウスの交配によって海馬歯状回にChR2などを発現させていたが、来年度は本年度確立させたアデノ随伴ウィルスを用いた発現系も用いる。
教師用RCRTを活用した荒れた学級への支援介入プログラムの開発

教師の子どもに対する視点を理解することで担任教師の学級経営支援ができるのではないかと考えた。「教師用RCRT (Role Construct Repertory Test)」という方法を使い教師の「子どもに対する視点」を把握できることは先行研究(浦野,2001)により明らかであったが、従来の実施方法は高度なデータ処理や専門家によるコンサルテーションを必要としていた。そこで、専門的な知識を持たない教師であっても比較的簡単に実施し、結果を理解することができるような方法の改良・開発が必要であると考え、教師用RCRTの応用的な実施方法の検討を含めた支援介入プログラムを開発することを本研究の目的とした。プログラムにおいてQ-U(QUESTIONNAIRE-UTILITIES)で学級の状態をアセスメントした上で、教師用RCRTを実施した。その実施においては従来の教師用RCRTに教師の意図的方向付けを把握する川元版教師用RCRTを加えた。その結果、産出されたコンストラクト・抽出された因子の内容が二つの教師用RCRTにおいて違いがあった。また、教師内地位指数(順位)でも大きなズレを示す児童が存在することも確認された。分析データから教師自身の視点を把握、二つの因子分析の比較と教師内地位指数から学級の荒れを防ぐための方法を検討した。その結果、教師内地位指数の範囲外の児童及び気になる児童について継続観察をすることとなった。継続観察以後、Q-Uの学級生活不満足群が減少し学級生活満足群が増えるなど、教師内地位指数の差から抽出された子ども及び学級全体が良好な結果へと変化していた。また、教員の感想からも、自分の視点を知ることで教師としての視野が広まり学級経営がやり易くなったという意見が多く出された。
電弱相転移期に於けるCPの破れとバリオン数生成

本研究の目的は、最小超対称標準理論を含む電弱理論のtwo-doublet Higgs模型において、電弱相転移が一次転移である場合に形成される泡の近傍でのCPの破れを力学的に決定し、生成されるバリオン数を評価することであった。相転移温度でのHiggsとgauge場の力学は、第0近似ではその温度での有効ポテンシャルを含む古典的運動方程式で決まると考えられるが、two-doublet Higgs模型での有限温度有効ポテンシャルの信頼できる計算はないので、symmetric phaseとbroken phaseのlocal minimaを持ちgauge invarianceと矛盾しないという要請を満たす4次までの多項式で表される一般的なポテンシャルを考え、それに対する運動方程式の幾つかの数値解を得た。但し、Higgs場の絶対値は2つの相を繋ぐkinkの形をしているとした。理論の作用にCPの破れを顕に含まない場合について、有効ポテンシャルのパラメータによって以下のような解が可能であることを示した:1.brokenphaseで自発的CPの破れが起こっているとき、そのCP位相が十分小さい場合はkink likeにsymmetric phaseの0であるCP位相と繋がっている解があり、CP位相がO(1)ならば単調ではあるがkink likeにはならない。2.broken phaseでもsymmetric phaseでもCP位相は0であるが、その間の領域でnonzeroになる。これは自発的CPの破れを空間依存性を持つ場合に拡張したものであり、broken phaseでのCPの破れがないので実験による拘束も受けない。3.brokenphaseではCP位相がπでsymmetric phaseでは0である解。これも実験的制限は受けずに大きなCP位相を生じる可能性がある。この中でも2.の境界条件ではCP位相がずっと0であるtrivial solutionも可能であるが、CPの破れた解の方がエネルギーが小さくバリオン数生成には効くと考えられる。また、これらの解ではCP位相がO(1)になることは容易に起こり得る。そのために生成されるバリオン数を評価するのに我々が定式化した摂動論的方法は用いられなくなるので、数値的方法であるがどの様なprofileに対しても任意の精度で計算できる方法を開発した。(投稿中)本研究の目的は、最小超対称標準理論を含む電弱理論のtwo-doublet Higgs模型において、電弱相転移が一次転移である場合に形成される泡の近傍でのCPの破れを力学的に決定し、生成されるバリオン数を評価することであった。(投稿中)
日本における自然出生力の再現のためのシミュレーションプログラムの開発-徳川期から大正期の人口を対象として-

本研究は、日本の歴史人口学において、長い間未解決であった問題を取り扱った。それは、宗門改帳における出生の過少記録に関する問題である。この問題は、宗門改帳から乳児死亡率だけではなく、出生率をも正確に推計することを妨げており、日本の歴史人口学の発展のネックとなっていた。乳児死亡率の推計については、宗門改帳からの情報だけではなく、明治・大正期の人口動態統計を使い、宗門改帳から引き出される乳児死亡に関する指標を初年死亡率と定義して、それと乳児死亡率との関係から乳児死亡率を推計した。この方法を東北地方の村の宗門改帳に応用してみたところ、妥当な推計値が得られ、この方法の妥当性が確認された。この方法は簡潔で、多くの計算を必要としないので、他地域の宗門改帳にも簡単に応用することができるのが利点である。宗門改帳における出生の過少記録のレベルの推計については、現実的な再生産モデルをもとにしたマイクロシミュレーションの手法を用いた。シミュレーションの結果、出生の過少記録のレベルは乳児死亡率のレベルと正の相関関係があるが、徳川時代の乳児死亡率のレベルでは、宗門改帳に記録された出生は、実際の出生よりも15パーセントから18パーセント程度過少に記録されている可能性が高いことが判明した。近年の歴史人口学の研究では、このレベルを20パーセントと仮定することが多かったが、本研究の結果からすると、この仮定はやや過大に見積もられているという結論が導き出された。本研究では、シミュレーションを使って、宗門改帳の記録日により、出生の過少記録のレベルが大きく影響されるのかどうかという問題についても検証した。この問題に対する結果は否定的なもので、宗門改帳の記録日の違いは、懸念されるほどには出生率の推計値に影響を与えないことがわかった。最後に、異なるサイズの小集団における出生率の変動を実験的に検証してみた。この結果は、小集団の出生率の変動に関するひとつの指標を与え、断片的な宗門改帳を扱う際の助けとなるであろう。
インドネシアの水産開発に関する社会経済学的研究

本年度は平成8・9年度の成果を踏まえ、次の分野で研究を深め、過去3年間の研究成果を総括した。1.マングローブ林との共生を目指すシルボカルチャーの研究過去において、エビ漁業振興のために多くのマングローブが伐採されてきたが、最近では、環境に対する認識が高まり、1994年以降マングローブ林との共生を目指すエビの養殖(シルボカルチャー)が政府主導で行われ、2年間の準備期間を経て、民営化が図られている。その実態を明らかにすることが本研究の目的である。2.漁村における資本形成の研究これまで小規模漁業者は信用も担保も無く、低利の政府系の融資を受けることすら難しかった。そのような中で、彼等がどのようにして資本形成をしてきたかを明らかにすることが本研究の目的である。3.経済危機下の水産政策に関する研究インドネシアは1997年8月に始まった経済危機に今も直面している。この経済危機の中で外国資本に対する依存度の少なかった農業と水産のみが、経済成長を続けている。特に、水産は資源に余裕があり、輸出産業としても重要であるばかりでなく、雇用吸収力も大きいので期待されている。その結果、1977年10月以降、小規模漁業者で協同組合に加入している者は協同組合銀行や政府系企業から始めて担保無しで低利の借金ができろように成った。インドネシアにおける漁業の近代化と水産開発は当該国の政府によって急速に進められようとしている。日系の水産関係企業も多く進出して当該国の水産開発の促進に重要な役割を果している。バリー島の南端にはマグロ漁業の根拠地があり、近隣諸国からの8090トンのマグロ船の水揚げ港になっていう。おもな漁場はバリー島南部からジャワ島南部の海域で、航海日数は約1か月間であるがその間に刺し身用のマグロは鮮度が目玉なので度々帰港しては陸揚げされては日本へ空輸されている。鮮度の落ちたものは罐詰加工用にまわされる。ジャヤカルタに事務所を持つ日系企業が多いが、イリヤンジャヤのソロンを根拠地としてエビトロールを営んでいる。日本からのマグロ中古船を使用するものが多い。しかし現地では修理の部品の調達が困難であったり、技術者も集めることが難しいことなどから、養殖業に切り換える企業が増大している。おもにジャワ島の東部やカリマンタンに養殖場を持ち、対日輸出用のブラックタイガ-などを養殖している。これには多くの現地人が雇われ、人件費が安いことで何とか経営が成り立っている。漁港などのインフラ整備が日本に比べるとかなり遅れていたが、最近では地方拠点都市にも漁港が整備されてきた。漁業関連産業が成立し易い基礎が整ってきたが、ただ沿岸漁業は地域によってかなり相違があり、スマトラ島北端のバンダアチェ周辺の漁村では、伝統的な沿岸漁業に関する自主規制が働いており、資源管理上は大いに役立っている。政府もこうしたインフォーマルな漁業規制をしだいに評価するようになった。日本製の船外機をとり付けただけの漁船が多い地域もある。漁獲量は増大したが、陸揚げする漁港施設の整備が立ち遅れ、岸壁や漁船の係留場などは殆ど整備されていない漁港も見られる。一般に製氷工場はかなり見られるようになったが、加工施設の整備が今後の大きな課題になっている。本年度は昨年度の成果を踏まえながら、次のような分野での研究を進めた。1水産インフラントラクチャーの地方分散の実態とその社会経済効果漁港施設や市場流通施設の建設が全国的に進み、漁業生産の商業化に大きな契機を与えるとともに、全国的な水産物市場流通のネットワークが形成されている実態を明らかにした。中部ジャワのプカロガン、ダガ-ルを中心に調査を実施したが、施設の小規模化が進んでおり、運営主体をめぐって大きな転換期にあることがわかった。2ジャワ水産物流通の実態と市場における人間諸関係国内流通を対象とする水産物流通が輸出市場と切り離されて成立している様相を明らかにし、産地市場にみられる人間諸関係を経済的な視点から検討した。従属的で排他的な性格があるが、他面ではきわめて競争的であることもわかった。国内外需要の拡大によって、市場流通をめぐる人間関係はダイナミックに変わってゆく。3日系水産物輸出企業の輸出対応と地域漁業アジア規模で生じている国際分業化の進展のなかで、日系水産物輸出企業は、インドネシア投資を位置づけていた。これらの企業は現地の地域漁業の展開に大きな影響を与えている。ジャワ島チラチャップでは、カンターパートとなる現地企業を通して、沿岸零細漁民の使用する漁具・漁法に変化が生まれ、輸出品の対象となる魚種の市場流通が様変わりし始めていた。地域漁業の輸出志向型への展開が見られた。4沿岸域資源管理をめぐる新たな動き中部ジャワの一部ではエビ養殖業の粗放化への回帰と、マングローブ林との共生を目指した動きを調査した。(シルボカルチャー)。生産性は高くないが、新たな沿岸域の管理方法として注目される。スマトラ島バンダ・アチェでは、近年注目されているパングリマ・ラウトと呼ばれる伝統的漁業管理方式について引き続き調査した。漁村内の階層部分や漁業種類の多様化が進むにしたがって形骸化しつつあることが明らかとなった。

1.マングローブ林との共生を目指すシルボカルチャーの研究過去において、エビ漁業振興のために多くのマングローブが伐採されてきたが、最近では、環境に対する認識が高まり、1994年以降マングローブ林との共生を目指すエビの養殖(シルボカルチャー)が政府主導で行われ、2年間の準備期間を経て、民営化が図られている。その実態を明らかにすることが本研究の目的である。2.漁村における資本形成の研究これまで小規模漁業者は信用も担保も無く、低利の政府系の融資を受けることすら難しかった。そのような中で、彼等がどのようにして資本形成をしてきたかを明らかにすることが本研究の目的である。3.経済危機下の水産政策に関する研究インドネシアは1997年8月に始まった経済危機に今も直面している。この経済危機の中で外国資本に対する依存度の少なかった農業と水産のみが、経済成長を続けている。特に、水産は資源に余裕があり、輸出産業としても重要であるばかりでなく、雇用吸収力も大きいので期待されている。その結果、1977年10月以降、小規模漁業者で協同組合に加入している者は協同組合銀行や政府系企業から始めて担保無しで低利の借金ができろように成った。
骨巨細胞性病変の解析による、骨代謝シグナルネットワークの解析

デノスマブ(ヒト型抗RANKLモノクローナル抗体製剤)が骨巨細胞腫の治療薬として用いられるようになったが、治療後の骨形成を含む劇的な病理組織像の変化の詳細はこれまでに解明されていなかった。近年発見された、骨巨細胞腫の特異的遺伝子異常と病理組織像を統合的に解析することで、腫瘍および骨代謝経路のメカニズムの一端を解明することを目指した。デノスマブ治療前後の病理組織検体を比較して検討した。治療後の組織像では破骨型巨細胞の消失およびNFATc1(破骨細胞分化マーカー)の陰性化がみられた。一方、H3F3A変異は治療前後で一貫して検出され、免疫染色でもH3.3 G34W陽性細胞およびRUNX2陽性単核細胞が一貫して観察された。さらに蛍光免疫組織化学により、RUNX2とH3.3 G34Wの共発現・CD68とH3.3 G34Wの相互排他的発現を証明した。従来から骨巨細胞腫の単核細胞には、1腫瘍性間質細胞(RUNX2やOsterixなどの骨芽細胞系マーカー性)と2単球系細胞(CD68陽性)の2種類が存在すると報告されていた。一方で、HE像から2種類の単核細胞を認識することはおよそ不可能であり、病理医にとっては納得しがたい説であったと言える。今回の研究により、腫瘍細胞の本体は上記の「1骨芽細胞系マーカーを発現する細胞」であることが、病理医にも納得できる形で確認され、長年続いていた議論に対する結論を示すことができたと考えられる。また、デノスマブ治療後にみられる骨は形を変えた腫瘍細胞が形成していることが示され、治療効果の評価には慎重を要することが示唆された。RANK/RANKL系は破骨細胞分化誘導に関連することが知られており、骨リモデリングによる恒常性維持において重要な役割を担っている。本研究では、ヒト骨巨細胞腫に抗RANKL阻害剤デノスマブが投与された後の特異な組織像に着目し、骨代謝シグナルネットワークの一端を解明を試みた。ホルマリン固定パラフィン包埋された病理検体を用いた。骨巨細胞腫と生検材料で診断され、デノスマブ治療後に掻把された7例をリストアップした。免疫組織化学的に骨芽細胞分化マーカー(Runx2)、破骨細胞分化マーカー(NFATc1)の治療前後での発現の変化を検討した。RANKの下流で活性化すると予想されるNFκB(p65)の発現についても検討した。いずれの抗体も、核の陽性像を有意とした。全例(7/7)とも、デノスマブ治療後は、骨巨細胞腫に特徴的な単核細胞および多核巨細胞が完全に消失していた。そのかわりに、1紡錘形細胞が錯綜するように増殖する線維組織球腫様の像、2網目状の線維骨がひろがる像、の2種類が主に観察され、3両領域の移行像もみられた。免疫組織化学的には、治療前後ともにRunx2は半数程度の単核細胞に陽性を示した。NFATc1は治療前に単核細胞および多核細胞に陽性を示したものの、治療後は陰性であった。NFκB(p65)は治療後も陽性であった。デノスマブにより、破骨型巨細胞の消失・破骨細胞分化マーカーNFATc1の陰性化がみられ、破骨細胞分化が著しく抑制されることが確認された。また、骨は線維骨であり、成熟した層板骨がみられないことから、リモデリングによる骨の成熟には破骨細胞が必要であることが示唆された。RANKシグナルの下流で発現の影響を受けると予想されたNFκB(p65)に関しては、予想に反して発現が保たれており、破骨細胞分化においては別の経路が存在する可能性が示唆された。骨の病理組織検体を用いる研究のため、免疫組織化学的検討や遺伝子変異の検討においては、適した方法で脱灰操作が行われている必要がある。コアとなる症例(デノスマブ治療前後の骨巨細胞腫)に関しては計画時に予想した症例数がおおむね確保できているが、対照症例に関しては予想よりも若干少なかった。過去の検体は検討に適さない脱灰操作がされているため、今後大幅に症例数が増えることはない。確保された症例数の範囲では、免疫組織化学的検討は順調に実施された。また、変異遺伝子解析のプライマーを作成し、パイロット的検討も開始することができた。本研究では、ヒト骨巨細胞腫の治療として抗RANKL阻害剤デノスマブが投与された後の特異な病理組織像に着目し、骨代謝シグナルネットワークの解明を試みた。骨巨細胞腫と生検で診断され、デノスマブ治療後に掻把された9例をリストアップし、ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを収集した。組織像、免疫組織化学的染色による骨芽細胞マーカー(RUNX2)・破骨細胞マーカー(NFATc1)・最近明らかとなった遺伝子変異特異的マーカー(H3.3G34W)発現を治療前後で詳細に観察した。いずれの抗体も核陽性像を有意とした。また、サンガー法を用いて、腫瘍特異的な遺伝子変異(H3F3A)の有無を調べた。デノスマブ治療により全例(9/9)で同様の変化がみられた。破骨型巨細胞の消失・破骨細胞マーカーNFATc1の陰性化が確認された。

その一方で、骨芽細胞マーカーRUNX2および変異特異的マーカーH3.3G34Wの発現が一貫してみられ、サンガー法でも一貫して変異が確認された。組織像の劇的な変化は腫瘍細胞の消失を意味しないことが明らかとなった。破骨細胞消失後も変異が検出されることから、破骨細胞は腫瘍細胞ではないことが確認された。非腫瘍性の破骨細胞が、骨代謝ネットワークを介して多数動員されていることが示唆された。変異特異的な免疫組織化学抗体が確立されたことにより、その抗体を用いた発展的検討をすすめることができた。サンガー法による遺伝子変異解析結果とあわせて、より正確なデータが収集できた。デノスマブ(ヒト型抗RANKLモノクローナル抗体製剤)が骨巨細胞腫の治療薬として用いられるようになったが、治療後の骨形成を含む劇的な病理組織像の変化の詳細はこれまでに解明されていなかった。近年発見された、骨巨細胞腫の特異的遺伝子異常と病理組織像を統合的に解析することで、腫瘍および骨代謝経路のメカニズムの一端を解明することを目指した。デノスマブ治療前後の病理組織検体を比較して検討した。治療後の組織像では破骨型巨細胞の消失およびNFATc1(破骨細胞分化マーカー)の陰性化がみられた。一方、H3F3A変異は治療前後で一貫して検出され、免疫染色でもH3.3 G34W陽性細胞およびRUNX2陽性単核細胞が一貫して観察された。さらに蛍光免疫組織化学により、RUNX2とH3.3 G34Wの共発現・CD68とH3.3 G34Wの相互排他的発現を証明した。従来から骨巨細胞腫の単核細胞には、1腫瘍性間質細胞(RUNX2やOsterixなどの骨芽細胞系マーカー性)と2単球系細胞(CD68陽性)の2種類が存在すると報告されていた。一方で、HE像から2種類の単核細胞を認識することはおよそ不可能であり、病理医にとっては納得しがたい説であったと言える。今回の研究により、腫瘍細胞の本体は上記の「1骨芽細胞系マーカーを発現する細胞」であることが、病理医にも納得できる形で確認され、長年続いていた議論に対する結論を示すことができたと考えられる。また、デノスマブ治療後にみられる骨は形を変えた腫瘍細胞が形成していることが示され、治療効果の評価には慎重を要することが示唆された。今後は随時症例を増やすとともに、腫瘍特異的遺伝子変異(H3F3A遺伝子の変異)に関しての検討を実施中である(一部のデータを先行して国際学会で発表した)。免疫組織化学的検討結果とあわせて、デノスマブ治療後の骨形成の意義、治療効果の判定に関して考察をすすめる予定である。症例数をさらに増やすとともに、デノスマブ治療期間短縮例に関して、治療効果の違いを検討する予定である。また、変異特異的抗体陽性細胞の局在の詳細な観察を実施中であり、先行データを国際学会で発表した。本年度の研究を遂行するための試薬のいくつかは研究室に常備されていたものを使用したため、予定よりも少ない支出であった。本年度は遺伝子変異特異的な免疫組織化学マーカーが確立されたことにより、変異細胞の局在を比較的安価な免疫組織化学で代用することが可能となった。したがって予定より少ない支出であった。次年度は骨代謝経路に関して、計画当初よりも多数の発現解析を実施する予定のため、本年度の繰り越し分が必要となる。次年度は治療前後での遺伝子発現の変化の検討を予定しており、本年度より高額な試薬や外注解析が必要になる。
ヒトiPS、線維芽細胞から直接誘導された神経細細胞におけるタウタンパク質の解析

タウタンパク質は、アルツハイマー病をはじめとする様々な神経変性疾患の患者脳内において蓄積することが知られているタンパク質であり、その蓄積と病態の進行は高い関連性があることが知られている。近年のアミロイドβを標的とした治験の失敗から、改めて、タウを標的とした治療薬の開発が注目を浴びている。これまでのアルツハイマー病の薬剤開発は主にマウスモデルなどを用いたものであり、そこにも治験の失敗の原因があると考え、我々はヒト細胞を用いたタウタンパク質の病態解析を目的として研究を行っている。ヒト細胞といえば、induced pluripotent stem cell (iPSC)細胞を用いた研究が多くなされているが、iPSC由来神経では、成人型のタウisoformの割合にはならないことが知られている。タウタンパク質は、主に6つのisoform(3R型と4R型が3つずつ)が成人脳では発現しているが、胎児脳では、最も短いisoform(3R型)しか発現しないことが知られていた。そこで我々は、試験管内において、成人型のタウisoformの割合、特に4R型タウの発現量を上昇させることを目標に研究を開始した。指標にしていた4R型タウの抗体の特異性が問題になることがわかったが、条件検討を重ねることにより、抗体の特異性を発揮出来る条件の特定に成功した。また、iPSC由来神経に加えて、iPSCを経由せずに、ヒト体細胞から直接神経細胞を誘導する系も目指し、miR9/124やBclxlなどの因子を導入することにより、線維芽細胞由来の神経細胞を誘導する系を確立することにも成功した。また、タウ遺伝子変異により引き起こされる家族性の神経変性疾患であるFTDP-17変異がタウオリゴマー形成に及ぼす影響に関しても検討し、FTDP-17変異がタウオリゴマー形成を増大させることを発見し、論文報告することが出来た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに、ヒトiPS細胞由来神経細胞においては、成人型タウisoformの発現量は非常に少ないと報告されていた。これは主に、ヒトiPS細胞由来神経細胞の成熟度が低い為であろうと考えられた。そこで本研究では、ヒトiPS細胞由来神経の成熟度を高めること、もしくは、ヒトiPS細胞を介さずに、ヒト線維芽細胞から直接、年齢依存的な変化を保存した状態の神経細胞を作成し、成熟した神経細胞の作出すること、また、それらにおけるタウタンパク質の発現パターンを解析することを目的としている。本年度は、正常人由来のヒトiPS細胞由来において、興奮性神経を誘導する転写因子を発現させ、興奮性神経を誘導した。さらに、成熟度を促進させる特殊な培地等も用いることにより、タウタンパク質の発現、および、成人型タウisoformの発現を確認した。さらに、成人型タウの発現をさらに高める為に、種々の培養条件を試し、成人型のタウの発現が低酸素条件において、劇的に高まることを発見した。全てのタウ関連神経変性疾患は、大人型のタウが発現している状態で起こること、また、変性した神経細胞において沈着してくるタウは、多くが成人型のタウのみであるか、それらを多く含むことを考え併せると、ヒト細胞を用いたタウタンパク質の神経変性疾患への寄与を研究する上で、非常に重要な進展が得られたと考えられる。今後は、さらに線維芽細胞から直接誘導された神経細胞におけるタウタンパク質の発現パターンを解析し、それらに対する年齢依存的変化も検討する予定である。当初は、ヒトiPS細胞由来神経において、成人型タウの発現を上昇させることが難しく、線維芽細胞からの直接誘導によって、成人型タウの発現上昇を狙っていたが、ヒトiPS細胞由来神経においても成人型タウの発現上昇を達成した為。

今後は、ヒトiPS細胞由来神経と共に、線維芽細胞から直接誘導された神経細胞においても、タウタンパク質の発現パターンを解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
連続的Michael反応を基盤とした多置換ビシクロ骨格のワンポット構築法の開発

2-シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との連続的なMichael反応によるビシクロ[3.3.1]ノネノン骨格の構築法について検討した。まず、シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との段階的なMichael反応によるビシクロ化合物の構築を検討した。シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との分子間Michael反応により環化前駆体を合成した。テトラブチルアンモニウムブロマイド(TBAB)、炭酸カリウムにより環化前駆体の分子内Michael反応を行うと、カルボニル基のα位で環化反応が進行しビシクロ化合物が得られた。次に、ビシクロ化合物のワンポット構築法について検討した。シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との分子間Michael反応により環化前駆体を系中で発生させた後、反応溶液にTBAB、炭酸カリウムを加え分子内Michael反応を行うとビシクロ化合物が得られた。シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との連続的Michael反応によるビシクロ化合物の構築法は、段階的に行つてもワンポットで行っても同程度の収率でビシクロ化合物を与えることがわかった。シクロヘキセノン誘導体とアクリル酸誘導体との連続的Michael反応によるビシクロ化合物構築法における立体選択性を検討するため、環化前駆体の分子内Michael反応について非経験的分子軌道計算を行った。その結果、分子内Michael反応は環化前駆体から発生するエノレートの最高被占軌道の係数が一番大きいカルボニル基のα位で進行し、イス型遷移状態を経てビシクロ化合物を与えるととがわかった。Michael供与体として2,4-ジオキソシクロヘキシルカルボン酸エステルを用いるとワンポットでアダマンタン化合物が得られることがわかった。
シナプス小胞放出ダイナミクス(確率・多重性・同期性)の制御分子基盤

ラット小脳顆粒細胞(上向性線維)の2回連続刺激(ペアパルス刺激)に伴い、分子層介在ニューロンから記録される興奮性シナプス後電流(EPSC)の2回目EPSCの振幅値と減衰時定数(τ)が一過性(30-100ミリ秒)に増大する現象を発見した(ペアパルス増強:paired-pulse facilitation,PPF)。キネティクス解析、シミュレーション解析ならびに薬理学的検討を行い、(1)振幅PPFはシナプス小胞の放出確率と放出多重性が増大したこと、(2)減衰時間PPFは放出多重性増大に伴い大量に放出された伝達物質グルタミン酸がシナプス外領域に拡散・蓄積したことにより引き起こされたことを示唆する結果を得た。小脳顆粒細胞(上向性線維)の2回連続刺激(ペアパルス刺激)に伴い、分子層介在ニューロンから記録される興奮性シナプス後電流(EPSC)の2回目EPSCの振幅値と減衰時定数が一過性に増大する現象を発見した(ペアパルス増強)。これらペアパルス増強の発現機序を明らかにするため、EPSCのキネティクスを初期相、ピーク相、減衰相に分けて詳しく解析した。2回目EPSC(刺激間隔:30ミリ秒)では、刺激からEPSC開始までの反応潜時が1回目EPSCよりも顕著に短縮していた。一方、EPSC開始点からピークまでの到達時間は延長していた。また、EPSC減衰相について、二重指数関数を適用して急速減衰成分(τ_<fast>)と緩徐減衰成分(τ_<slow>)に分離して解析を行い、減衰時間のペアパルス増強はτ_<slow>の構成比率(%_<slow>)増大により惹起されていることを見出した。さらに薬理学的手法を用いて、ペアパルス増強の分子基盤について検討を行った。グルタミン酸輸送体阻害薬TBOAは、τ_<show>と%_<slow>を共に増大させて減衰時間のペアパルス増強を昂進した。一方、グルタミン酸受容体の低親和性競合阻害薬γ-DGGは、振幅のペアパルス増強を促進すると共に、%_<slow>を減少させて減衰時間のペアパルス増強を減弱した。こうした観察結果に基づき、(1)振幅増大はシナプス小胞の放出確率と放出多重性が増大したこと、(2)減衰時間増大は放出多重性増大に伴い大量に放出された伝達物質グルタミン酸がシナプス外領域に拡散・蓄積したことにより引き起こされたと結論した。引き続き、活動電位の連続発生がEPSCキネティクスを変化させる分子的背景(Ca^<2+>チャネル、内在性Ca^<2+>緩衝システム、グルタミン酸輸送体の関与)を追究すると共に、脳の情報処理プロセスにおいて活動依存性の短期シナプス伝達増強が担う生理的役割を明らかにしようと検討を進めている。昨年度、ラット小脳顆粒細胞軸索(上向性線維)の2回連続刺激(ペアパルス刺激)に伴い、分子層介在ニューロン(籠細胞、星状細胞)から記録される興奮性シナプス後電流(EPSC)において、2回目EPSCの振幅値(peak amplitude)と減衰時定数(decay-time constant,τ)が一過性に増大することを報告した(ペアパルス増強)。薬理学実験の結果から、(1)振幅増大は、シナプス小胞の放出確率と放出多重性が増大したこと、(2)減衰時間増大は、放出多重性増大に伴い大量に放出された神経伝達物質(グルタミン酸)がシナプス外領域に拡散・蓄積したことにより惹起されたと推定している。また、こうした発現メカニズムは、コンピュータシミュレーションを用いたキネティクス解析によっても強く支持された。今年度、ペアパルス増強の分子基盤を追究する過程で、G_<i/o>共役型受容体が仲介するシナプス前抑制に多様性があることを発見した。第1のタイプにはGABA_B受容体、代謝型グルタミン酸受容体(グループ3)、アデノシンA1受容体などが属し、受容体の活性化に伴いEPSCの振幅が減弱するとともに減衰時間のペアパルス増強は消失した。一方、第2のタイプにはカンナビノイドCB1受容体が属し、減衰時間のペアパルス増強に影響することなくEPSC振幅を減弱させた。G_<i/o>共役型受容体が仲介するシナプス前抑制には、複数の発現メカニズムが存在することを示唆している。シナプス前抑制における多様性とシナプス小胞放出確率/放出多重性制御機構の分子的連関を明らかにするため、現在も引き続き薬理学的・組織学的手法を用いた検討を行っている。
摂食行動と時間記憶:室傍核組織培養系を用いた記憶形成と保持機構の解析

1. NPYmRNAの定量的PCR法による計測強い摂食惹起物質であり、時間記憶に関係すると考えられているニューロペプチドY(NPY)のmRNAを定量的に測定する方法を開発し、脳の特定部位におけるNPY合成の指標とした。すなわち、パルコビッツ法で採取した微量脳組織からRNAを抽出し、RT-PCR法にてNPYcDNAを得た。これをPCR法にて増幅するが、その際標識物質として蛍光色素を組み込んだ相補的なDNAプローベ(タックマン・プローベ)を用意し、PRC産物を発生する蛍光強度によって定量化した。2.弓状核及び孤束核におけるNPYmRNAと時間記憶室傍核に分布するNPYニューロンは弓状核および孤束核由来である。そこで、周期的制限給餌により時間記憶が形成されている状態で、両神経核におけるNPYmRNAの経時的測定を定量的PCR法を用いておこなった。その結果、孤束核では時間記憶を表す給餌前活動に一致してNPYmRNAの増加が認められ、NPY合成が促進されていることが示唆されたが、弓状核では給餌直前あるいは給餌直後にNPYmRNAの増加がみられ、孤束核とは時間的に異なる発現パターンを示した。時間記憶が形成されている状態での、NPYmRNAの脳内分布と時間的変動をinsitu hybridization法を用いて検討した。その結果、NPYmRNAは、弓状核、室傍核、大脳皮質、海馬などに強く発現したが、孤束核での発現は弱かった。弓状核でNPYmRNA発現は、給餌直前と直後に強く発現し、定量的PCRと同じ結果を示した。一方、孤束核でのNPYmRNA発現は対照群と差はなかった。室傍核におけるニューロペプチドY分泌脳内微小還流法をもちいてラット室傍核の組織間液を経時的に採取し、含まれるノルアドレナリン(NA)とニューロペプチドYをそれぞれ高速液体クロマトグラフィーおよびRIAで測定した。ラットの給餌を明期の2時間に制限する周期的制限給餌を2週間つづけると、給餌直前のノルアドレナリンおよびNPY分泌が自由摂食時に比較し有意に上昇するが、給餌後は自由摂食時のレベルの戻った。一方、2日間の絶食でも室傍核におけるNAおよびNPY分泌は上昇した。カテコールアミン作動性ニューロンの役割室傍核で分泌されるNPYは視床下部弓状核由来のものと、脳幹から上行するカテコールアミン作動性ニューロン由来のものがある。そこでカテコールアミン作動性ニューロンを選択的に破壊したラットを用いて室傍核NPY分泌を測定したところ、周期的制限給餌でみられた給餌直前の分泌亢進は認められなかった。一方、2日間の絶食によるNPY分泌の亢進はカテコールアミン作動性ニューロンを破壊したのちも認められた。ラット室傍核の細胞培養幼弱ラットの室傍核を分散培養し、培養液中に分泌されるコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)を測定した。自由摂食の母ラットから出生したラットでは、CRHに有意な変動は認められなかった。
生活習慣の乱れから起こるNAFLD/NASHの診断キットの開発

これまでに当研究室では、フルクトースによって糖化させた培養細胞から新規糖化蛋白質であるHNRNPMを同定してきた。NALFLD/NASH患者ではHNRNPMが糖化されることによって機能が損なわれることが考えられるため、HNRNPMの働きを抑制した細胞株を用いた実験を行った。HNRNPMの糖化によって細胞全体の遺伝子発現レベルの変化を調べた結果、138遺伝子の発現が1.5倍以上増加しており、100遺伝子の発現が1.5倍以上減少していた。これらの中には、バイオマーカーになりうる遺伝子や原因究明に繋がる遺伝子が存在していることが考えられる。今回、得られた候補遺伝子の中に、エキソソーム中に発現しているものもあった。エキソソームは唾液中にも存在していることから、唾液のサンプリングという非侵襲的な手法が利用できる。そこで、唾液から遺伝子を検出できるかを検討した。予備的な検討として、口内細菌であるミュータンス菌の検出系の構築を行った。この結果、遺伝子増幅法としてLAMP法を用い、培養方法を変更することで、約100分子の菌の存在を検出できる系を確立することができた。すなわち、LAMP法を応用することができれば、エキソソーム中に存在する遺伝子を容易に検出できることが期待できる。血管内皮細胞には、肝細胞から出される炎症性サイトカインから自分自身を守り、アポトーシスを防ぐ仕組みがある。血管内皮細胞に発現しているRASGRP2が、発変量変化の見られた遺伝子の中に見られた。この遺伝子について機能解析した結果、アポトーシスシグナリングの1つであるTNFαシグナリングに関与していることが明らかとなった。すなわち、NASHになりHNRNPMの働きが抑えられると、血管内皮細胞はRASGRP2の発現を誘導して自身のアポトーシスに対して抵抗性を示すように働くことが示唆された。HNRNPMが糖化されることによってmRNAへの結合能に変化が見られた候補遺伝子をRIP-Assay及びDNAマイクロアレイ解析を行い、162種類見いだした。これらのうち12種類の遺伝子産物は、細胞外へ分泌されることを見いだし、診断マーカーの候補になる可能性を示した。そこで、NASH病態モデルマウスの肝臓を用いて、12種類の中からNAFLD/NASH診断候補遺伝子を絞り込むこととしたが、これら12種類に発現量の変化が見られなかった。次に、HNRNPMの発現量を抑制するRNA干渉法を用いて、NAFLD/NASH関連遺伝子の選定を試みた。すなわち、RNA干渉によってHNRNPMの発現を抑制したヒト肝癌細胞株Hep3Bを用いてDNAマイクロアレイ解析した。この結果、166遺伝子が1.5倍以上増加しており、104遺伝子が1.5倍以上減少していた。これらの遺伝子について細胞内の局在について解析し、特に細胞外で機能すると同定された遺伝子のうち、発現が増加したものは10遺伝子あり、減少したものは4遺伝子見出された。今後、変化が見られた遺伝子の解析を進める予定である。特に、細胞外で働く遺伝子については、NASHのバイオマーカー候補遺伝子となる可能性があるため詳細な検討を行うつもりである。本年度では、NAFLD/NASH診断候補遺伝子の探索として、RIP-Assay及びDNAマイクロアレイ解析によって得られた162遺伝子の中から、ジーンオントロジー解析を行い、細胞外で働く遺伝子を12種類まで絞り込んだ。これら12種類の遺伝子に関して、コントロール及びNASH病態モデルマウスの肝臓を用いてqRT-PCRにより検討し、組織当たりの遺伝子発現量の変化を数値化して精査したが、これら12種類に発現量の変化が見られなかった。一方で、目標の達成に困難が生じたときの対応についても計画していた。すなわち、最終的に有意差のあるNAFLD/NASH特異的遺伝子が得られないことが想定される場合、別の方法を用いてNAFLD/NASH関連遺伝子の選定を行うこととしていた。この時のアプローチとしては、HNRNPMの発現量を抑制するRNAiを用いた方法であり、ピンポイントにHNRNPMのみの機能を減弱させることで見られる遺伝子発現量の差を検討することとした。本研究では、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)患者の早期発見のための非侵襲的なバイオマーカーの同定を目的としている。これまでに本研究室では、肝実質細胞株に生理的条件下に近いフルクトースを処理することで細胞内AGEsを多量に形成させることに成功している。さらに、フルクトース処理した細胞内に有意に増加されたAGEs化蛋白質を探索した結果、遺伝子発現に関与している蛋白質Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M (HNRNPM)を同定してきた。高フルクトースにさらされると、HNRNPMが糖化されることによってmRNAへの結合能に変化が起こり、下流に存在する遺伝子の発現が変化するのではないかと考え、HNRNPMの発現量を抑制するRNA干渉法を用いて、NAFLD/NASH関連遺伝子の選定を試みた。この結果、ノンコーディングRNAについて着目すると、発現量が増加した遺伝子は12遺伝子あり、減少した遺伝子は2遺伝子があった。

次に、これらの遺伝子が本当に発現量の増減が見られるかをRT-PCRにより確認する必要がある。減少が見られた2遺伝子については、プライマー等の条件が決まり実際に減少していることも確認できた。特に、発現量が減少した遺伝子については、Hep3B細胞をフクルトース処理することによっても発現量の減少が見られたことから、HNRNPMがフルクトースによって糖化されたことにより、これらの遺伝子の転写量が減少したことが考えられた。今後、NASHのバイオマーカー候補遺伝子となる可能性があるため詳細な検討を行う予定である。本年度では、NAFLD/NASH診断候補遺伝子の探索として、HNRNPMの発現をRNA干渉によって抑制することによって、138遺伝子が1.5倍以上増加し、100遺伝子が1.5倍以上減少することがDNAマイクロアレイ解析により明らかとなった。リキットバイオプシーによる診断のためには、細胞外に分泌される遺伝子(遺伝子産物)の同定が必要である。今回見出した遺伝子産物の細胞分布をジーンオントロジー解析によって調べた結果、発現が増加する遺伝子として16遺伝子が、減少する遺伝子として12遺伝子が細胞外へ分布することが見出された。さらに、ノンコーディングRNAについて着目すると、発現量が増加した遺伝子は12遺伝子あり、減少した遺伝子は2遺伝子があった。特に、減少が見られた2遺伝子のノンコーディングRNAについては、RT-PCRにより発現量の減少を確認でき、また、Hep3B細胞をフクルトース処理することによって発現量の減少が見られた。このことから、HNRNPMがフルクトースによって糖化されたことにより、これらの遺伝子の転写量が減少したことを示唆する結果が得られた。これまでに当研究室では、フルクトースによって糖化させた培養細胞から新規糖化蛋白質であるHNRNPMを同定してきた。NALFLD/NASH患者ではHNRNPMが糖化されることによって機能が損なわれることが考えられるため、HNRNPMの働きを抑制した細胞株を用いた実験を行った。HNRNPMの糖化によって細胞全体の遺伝子発現レベルの変化を調べた結果、138遺伝子の発現が1.5倍以上増加しており、100遺伝子の発現が1.5倍以上減少していた。これらの中には、バイオマーカーになりうる遺伝子や原因究明に繋がる遺伝子が存在していることが考えられる。今回、得られた候補遺伝子の中に、エキソソーム中に発現しているものもあった。エキソソームは唾液中にも存在していることから、唾液のサンプリングという非侵襲的な手法が利用できる。そこで、唾液から遺伝子を検出できるかを検討した。予備的な検討として、口内細菌であるミュータンス菌の検出系の構築を行った。この結果、遺伝子増幅法としてLAMP法を用い、培養方法を変更することで、約100分子の菌の存在を検出できる系を確立することができた。すなわち、LAMP法を応用することができれば、エキソソーム中に存在する遺伝子を容易に検出できることが期待できる。
Machado-Joseph病原因遺伝子(MJD1)の不安定性について

今回、我々はこれらの現象をspermレベルで、より直接的に証明することを目的として、MJD患者6名の計1036個のsingle spermのCAGリピート数の解析を行った。その結果、(1)EA-CGG/NA-GGG患者のspermは、EA-CGG/NA-CGG患者のspermよりもCAGリピート数の変化のvariance有意に高かった。(F-test、P<0.001)。(2)EAとNAの分離比は、629対407であり、Mendelの遺伝の法則から考えられる1対1の分離比から有意にずれていた(χ^2=47.57、P<0.0001)。(3)EAのmutationrateは88-99%で、白血球から抽出したDNAに比べて32%がexpansionを呈し、60%がcontractionを呈していた。NAのmutataion rateは0-4%であり、NAのうち最も短い14リピートは安定であった。以上、我々が臨床遺伝学的な観察により、報告してきたinter-allelic interactionとmeiotic driveの現象をspermレベルで、より直接的に証明することができた(現在投稿中)。MJD1の不安定性は、Huntington病、Kennedy病、Myotonic dystrophyなど他のトリプレット・リピート病と共通点や相違点があり、今後、トリプレット・リピート病原因遺伝子のMeioticおよびMeitoticな不安定性の機序につき、更なる検討を行う予定である。
ラットHUSモデルにおける新たな治療法の検討

HUS(溶血性尿毒症症候群)は,Vero toxinによる微小血管障害が病態と考えられている.この微小血管障害の発症に,Vero toxin取り込み細胞で蓄積した不良蛋白を取り除く細胞性免疫が関与しているのではないかと考え,ラットHUSモデルを使用して,この過剰な免疫応答システムを抑えることで効果的な治療を行えないか検討する.具体的には,病態の根本治療としての免疫抑制療法,そして支持療法としてのサイトカイン抑制療法を行うことで生存率および各種パラメーターによって比較検討を行っていく.HUS(溶血性尿毒症症候群)は,Vero toxinによる微小血管障害が病態と考えられている.この微小血管障害の発症に,Vero toxin取り込み細胞で蓄積した不良蛋白を取り除く細胞性免疫が関与しているのではないかと考え,ラットHUSモデルを使用して,この過剰な免疫応答システムを抑えることで効果的な治療を行えないか検討する.具体的には,病態の根本治療としての免疫抑制療法,そして支持療法としてのサイトカイン抑制療法を行うことで生存率および各種パラメーターによって比較検討を行っていく.