hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
窒化ニオブを用いたジョセフソン接合とその集積化技術の開発

一方、100個のものに対して4.2Kで2.8%、10Kで4.4%となった。標準偏差値としては、必ずしも充分小さいものが得られているとはいえない。さらに、温度上昇に伴いばらつきが大きくなる傾向がみられ、この原因の究明とばらつきの更なる改善が必要であることがわかった。
レーザによる直接描画法を用いた光センサの試作

本研究では,研究代表者が行ってきた,ガラス表面上への金属配線を行う研究の基礎データを参考に,レーザを用いて,ガラス上にシリコンウエハを接合しパッケージ,デバイスを作製するために以下の点を評価することを目的とした.(1)シリコンウエハの接合を更に調査し,付着強度等を評価する.(2)接合の際に,シリコンウエハとガラスとを完全に付着させると汚染などの問題が起きる.そこで,完全な付着をさけるために,レーザを用いてシリコンウエハに微小な凸形状を作製する.(3)ガラスは透明なため,レーザによる加工は困難であるが,レーザによる加工ができれば,本研究上非常に有益である.そこでレーザによるガラスの加工についても検討する.その結果(1)ガラス板とシリコン板を重ねてガラス側からレーザ照射することで両者を接合できた.また十分な接合強度を持っていると明らかになった.(2)・適切なレーザ出力,走査速度,レンズを選ぶことにより,シリコン表面に形状変化を起こさずに非照射部分とは性質の異なる照射線を生じさせることができた.照射線はDash液やKOH水溶液に対するマスクとなるとして機能し,表面に微小な凸形状を形成できた.この照射線は大気中のみならず液体,気体の様々な雰囲気において大気中と同じ条件で生じさせることができた.(3)・水滴をレンズとして使用する方法を提案し,レーザ加工に適用,石英ガラス内部に穴あけすることで,その可能性を示した.・ガラス表面に水を結露させることで,加工に必要なフルエンスの式位置を下げることができると共に加工を高速化できた.本研究では,研究代表者が行ってきた,ガラス表面上への金属配線を行う研究の基礎データを参考に,レーザを用いて,ガラス上にシリコンウエハを接合しパッケージ,デバイスを作製するために以下の点を評価することを目的とした.(1)シリコンウエハの接合を更に調査し,付着強度等を評価する.(2)接合の際に,シリコンウエハとガラスとを完全に付着させると汚染などの問題が起きる.そこで,完全な付着をさけるために,レーザを用いてシリコンウエハに微小な凸形状を作製する.(3)ガラスは透明なため,レーザによる加工は困難であるが,レーザによる加工ができれば,本研究上非常に有益である.そこでレーザによるガラスの加工についても検討する.その結果(1)ガラス板とシリコン板を重ねてガラス側からレーザ照射することで両者を接合できた.また十分な接合強度を持っていると明らかになった.(2)・適切なレーザ出力,走査速度,レンズを選ぶことにより,シリコン表面に形状変化を起こさずに非照射部分とは性質の異なる照射線を生じさせることができた.照射線はDash液やKOH水溶液に対するマスクとなるとして機能し,表面に微小な凸形状を形成できた.この照射線は大気中のみならず液体,気体の様々な雰囲気において大気中と同じ条件で生じさせることができた.(3)・水滴をレンズとして使用する方法を提案し,レーザ加工に適用,石英ガラス内部に穴あけすることで,その可能性を示した.・ガラス表面に水を結露させることで,加工に必要なフルエンスの式位置を下げることができると共に加工を高速化できた.半導体素子,液晶表示体をはじめとして,多くの電子機器の配線にはフォトリソグラフィーが用いられている.この方法では,配線基板全体に配線材料を成膜した後,フォトレジストによるマスキングを利用して不要部分のエッチングを行なう.集積度の高い素子の作製法として無くてはならない手法である.しかし,集積度がそれほど大きくない場合には成膜された大部分を溶出除去しなければならず,無駄が多い欠点も併せ持つ.電子デバイスの製作過程では,ウエハ上に製作された多数のチップは分割され,パッケージされて製品となる.とりわけ光学デバイスでは,光学窓を組み込む等の工程が必要である.したがって,所望の箇所を接合したり,配線したりすることができれば,新しい素子の作製方法として適用される可能性も大きい.ところで,代表者は1995年よりレーザ加工を研究の1つの柱としてきた.この研究の中で,金属粉末を載せたガラスに下方よりレーザ照射することで,ガラスを透過したレーザ光を金属粉末・ガラス界面で吸収させことでガラス表面上に金属配線を行う手法を開発した.本研究では,これまでのガラス表面上への金属配線を行う研究の基礎データを参考に,電子デバイスのパッケージングに適用できる,さらに微細な金属配線を実現する手法,条件を明らかにすることを目的の1つとしている.この結果ソーダガラス・石英ガラスに銅を堆積できることがわかり,マスクを使うことなく,電気回路を描画出来ることがわかった.電子デバイスの製作過程では,ウエハ上に製作された多数のチップは分割され,パッケージされて製品となる.とりわけ光学デバイスでは,光学窓を組み込む等の工程が必要である.したがって,ウエハやガラスの所望の箇所を接合したり,配線したりすることができれば,新しい素子の作製方法として適用される可能性も大きい.そこで,本研究ではガラスを基板として用い,ガラスの透明性を生かして,ガラス上に配線を行ったり,シリコンウエハーを接合することで,光学的なセンサーを作製する方法を考案その可能性を検討すると共に,液体の表面張力を利用したレンズ形状の形成についても検討した.1.金蔵粉末をのせたガラス上に下方からアルゴンイオンレーザを照射することで,ガラス上に金属粉末を溶融させ,電気配線を作製した.

その結果,銅,アルミニウムをソーダガラス,パイレックスガラス,石英ガラス上に堆積でき,電気伝導性を有していることが明らかになった.配線の太さは50マイクロメートル程度,電気伝導性はアルミニウム,銅の場合でそれぞれ長さ1mm当たり,0.017-0.64Ω,0.0014-0.2Ωであった.この手法により,ガラス上に配線を施し,簡単な回路を作製できた.2.金属粉末の代わりに,シリコンウエハーをのせ,同様にアルゴンイオンレーザを照射することで,ガラスとシリコンウエハーを接合できた.また,その際,ガラスを予熱することでクラックの生成をおさえることが出来た.3.グリセリンと水といったお互い不溶な2液の界面に光硬化性樹脂を浮かべるとレンズ形状を形成する.そこに,紫外線を照射することでレンズ形状を作成できる.その曲率は液間の界面張力によって決まるため,界面張力を変化させることで曲率を変化させられる.以上のことから,これらを組み合わせることで光センサデバイス作製の可能性が明らかになった.
スーパーコピュータ用自動並列化コンパイラに関する研究

主記憶共有マルチプロセッサシステム上でのFortranプログラムの並列処理では、従来よりマルチタスキングやマイクロカスキングなどの手法が用いられてきた.しかし,マルチタスキングでは,ユーザによる並列性指定が困難である,osコールなどによるスケジューリングオーバーヘッドが大きい等といった問題がある.マイクロタスキングは,最も広く用いられてきたループ並列化手法であるが,イタレーション間にまがる複雑なデータ依存やループ外への条件分岐によって並列化できないループが以前存在する.これらに対して当研究者当は、マクロデータフロー処理手法を提案した.マクロデータフロー処理手法では,コンパイラがプログラムを粗粒度タスクへ分割し,粗粒度タスクの最早実行可能条件を解析することにより粗粒度のアスク間の並列性を自動抽出する.コンパイラが各ソースプログラム専用に生成したスケジューリングルーチンを用いることで,スケジューリングオーバーヘッドを抑えることができる.また,マクロデータフロー処理を行なう場合,各データをデータ転送を最小化するよう考慮し,各プロセッサ上のローカルメモリに配置(データローカライズ)することによって,より効率の良い並列処理が可能となる.プロトタイプマルチプロセッサイステムOSCAR上での性能評価では,マクロデータフロー処理による粗粒度タスクの有効な並列処理を確認できた.また富士通VPP-500、Alliant FX/4、KSR1、NEC Cnju-3等,商用マルチプロセッサシステム上での性能評価でも,従来手法であるマルチタスキングおよびマイクロスタキングに比べ,マクロデータフロー処理の方が高い並列性の抽出が可能であることが分かった.さらに,それらの評価から従来手法に比べて低オーバーヘッドな処理を行なうことが可能で,プログラムの実行速度が向上することも確認された.主記憶共有マルチプロセッサシステム上でのFortranプログラムの並列処理では、従来よりマルチタスキングやマイクロカスキングなどの手法が用いられてきた.しかし,マルチタスキングでは,ユーザによる並列性指定が困難である,osコールなどによるスケジューリングオーバーヘッドが大きい等といった問題がある.マイクロタスキングは,最も広く用いられてきたループ並列化手法であるが,イタレーション間にまがる複雑なデータ依存やループ外への条件分岐によって並列化できないループが以前存在する.これらに対して当研究者当は、マクロデータフロー処理手法を提案した.マクロデータフロー処理手法では,コンパイラがプログラムを粗粒度タスクへ分割し,粗粒度タスクの最早実行可能条件を解析することにより粗粒度のアスク間の並列性を自動抽出する.コンパイラが各ソースプログラム専用に生成したスケジューリングルーチンを用いることで,スケジューリングオーバーヘッドを抑えることができる.また,マクロデータフロー処理を行なう場合,各データをデータ転送を最小化するよう考慮し,各プロセッサ上のローカルメモリに配置(データローカライズ)することによって,より効率の良い並列処理が可能となる.プロトタイプマルチプロセッサイステムOSCAR上での性能評価では,マクロデータフロー処理による粗粒度タスクの有効な並列処理を確認できた.また富士通VPP-500、Alliant FX/4、KSR1、NEC Cnju-3等,商用マルチプロセッサシステム上での性能評価でも,従来手法であるマルチタスキングおよびマイクロスタキングに比べ,マクロデータフロー処理の方が高い並列性の抽出が可能であることが分かった.さらに,それらの評価から従来手法に比べて低オーバーヘッドな処理を行なうことが可能で,プログラムの実行速度が向上することも確認された.主記憶共有マルチプロセッサシステム上でのFortranプログラムの並列処理では、従来よりマルチタスキングやマイクロタスキングなどの手法が用いられてきた。マルチタスキングでは、ユーザが粗粒度タスク間の並列性を指定し、OSなどが実行時にタスクをプロセッサに割り当てる方式がとられていため、ユーザによる並列性指定が困難である、OSコールなどによるスケジューリングオーバーヘッドが大きいといった問題がある。マイクロタスキングは、最も広く用いられてきたループ並列化手法であるが、イタレーション間にまたがる複雑なデータ依存やループ外への条件分岐によって並列化できないループが依然存在する。これらに対して当研究者等は、マクロデータフロー処理手法を提案している。本手法では、コンパイラがプログラムを粗粒度タスクへ分割し、粗粒度タスクの最早実行可能条件を解析することにより粗粒度タスク間の並列性を自動抽出する。コンパイラが各ソースプログラム専用に生成したスケジューリングルーチンを用いることで、スケジューリングオーバーヘッドを抑えることができる。プロトタイプマルチプロセッサシステムOSCAR上での性能評価ではマクロデータフロー処理による粗粒度タスクの有効な並列処理を確認できた。またAlliant FX/4、TITAN3000V等、商用マルチプロセッサシステム上での性能評価でも、マクロデータフロー処理が、従来手法であるマルチタスキングおよびマイクロタスキングより、プログラムの実行速度の向上が確認された。主記憶共有マルチプロセッサシステム上でのFortranプログラムの並列処理では、従来よりマルチタスキングやマイクロタスキングなどの手法が用いられてきた。マルチタスキングでは、ユーザが粗粒度タスク間の並列性を指定し、OSなどが実行時にタスクをプロセッサに割り当てる方法がとられていため、ユーザによる並列性指定が困難である、OSコールなどによるスケジューリングオーバーヘッドが大きいといった問題がある。

また、マクロデータフロー処理を行なう場合、各データをデータ転送を最小化するよう考慮し、各プロセッサ上のローカルメモリに配置(データローカライズ)することによって、より効率の良い並列処理が可能となる。プロトタイプマルチプロセッサシステムOSCAR上での性能評価ではマクロデータフロー処理による粗粒度タスクの有効な並列処理を確認できた。また富士通VPP-500、Alliant FX/4、KSR1等、商用マルチプロセッサシステム上での性能評価でも、マクロデータフロー処理が、従来手法であるマルチタスキングおよびマイクロタスキングに比べ高い並列性の抽出が可能であり、また低オーバーヘッドな処理を行なうことが可能で、プログラムの実行速度が向上することが確認された。主記憶共有マルチプロセッサシステム上でのFortranプログラムの並列処理では、従来よりマルチタスキングやマイクロタスキングなどの手法が用いられてきた。マルチタスキングでは、ユーザが粗粒度タスク間の並列性を指定し、OSなどが実行時にタスクをプロセッサに割り当てる方式がとられていたため、ユーザによる並列性指定が困難である。OSコールなどによるスケジューリングオーバーへッドが大きいといった問題がある。マイクロタスキングは、最も広く用いられてきたループ並列化手法であるが、イタレーション間にまたがる複雑なデータ依存やループ外への条件分岐によって並列化できないループが依然存在する。これらに対して当研究者等は、マクロデータフロー処理手法を提案している。本手法では、コンパイラがプログラムを粗粒度タスクへ分割し、粗粒度タスクの最早実行可能条件を解析することにより粗粒度タスク間の並列性を自動抽出する。コンパイラが各ソースプログラム専用に生成したスケジューリングルーチンを用いることで、スケジューリングオーバーヘッドを抑えることができる。プロトタイプマルチプロセッサシステムOSCAR上での性能評価では、マクロデータフロー処理による粗粒度タスクの有効な並列処理を確認できた。また富士通VPP-500、Alliant FX/4、KSR1、NEC Cenju-3等、商用マルチプロセッサシステム上での性能評価でも、従来手法であるマルチタスキングおよびカイクロタスキングに比べ、マクロデータフロー処理の方が高い並列性の抽出が可能であることが分った。
音響・調音データベースに基づくバイオフィードバックによる英文リズム学習方法の開発

言語リズムの音響・調音的特徴を三次元磁気計測装置・ビデオデータを用いて調べ、英語学習者に効果的なフィードバックを与えるためのより深い理解を得られた。日本人・中国人話者と英語話者の違いを精査し、顎の開閉度がリズム構造を作っていることを報告した。日本語と中国語では顎の開きによる音節ストレスが、特に句末や発話末で(おそらく句頭も)、大きくなる傾向が見られるが、英語のストレスは階層構成となっており、各音節は特定のストレスを持っている。本研究の結果から、第二言語習得においては、母語と異なるリズムパターンを作り出すため、調音メカニズムを「再教育」(再訓練)することが重要である。研究第1年目は、文のストレスとリズムの音響および調音的特徴とそれらの第二言語習得への応用について調べた(Erickson, 2013)。また英語独特のリズムの習得方法を開発するための基礎データとして、北陸先端科学技術大学院大学(石川)において三次元磁気計測装置Electromagnetic Articulatograph (EMA)のデータ収集・解析、会津大学(福島)においてビデオデータの収集・解析を主に実施した。具体的には(1)英語リズムの調音上の相互関係の調査、(2)日本語リズムの調音上の相互関係の調査、(3)母音の質が顎の開閉度と母音のneutralizationアルゴリズムに与える影響、(4)調音パターンに基づく韻律境界の調査、(5)ビデオ録画中の皮膚の伸縮の問題、および(6)調音フィードバックの研究を行った。末光は発音学習の促進を目的として、EMAを用いて、学習者の調音情報をリアルタイムに視覚フィードバックでき、目標音のための学習者固有の調音ターゲットを同時に提示可能なシステムを開発した。これを日本語母語話者が発音を苦手とするアメリカ英語母音/ae/の発音学習に適用してその効果を検証した。その結果、10分程度の発音訓練を行うだけで訓練前後の調音位置が変化し、発話音声が音響的に改善される(ネイティブ話者の音響特徴に近づく)ことが確かめられた。またウィルソンは、舌の動きの違いは、話者の発音の違いに直接影響することから、超音波を用いた舌の断面映像を使用し、英語母語話者と日本人話者の発音の違いを舌の動きから抽出し数値化する実験を行った。これにより、英語母語話者の舌の動きを日本人話者の舌の動きと直接比較することができるようになり、日本人が苦手とする英語らしい発音ができるようになるための指導に役立てられると考えられる。言語学(音声学)北陸先端科学技術大学院大学でのEMAのデータ収集およびその解析、会津大学(福島)にけるビデオデータの収集およびその解析が実施できたため。また、成果の一部を国内外の学会で発表できたため。今年度は研究代表者、分担者の本務の日程の関係で、予定していた実験の一部が実施できなかったことが最も大きな理由である。また、学会発表の際、同行する予定の分担者が参加できなかったため。研究第2年目は、北陸先端科学技術大学院大学でのEMAのデータ収集とその解析、および会津大学でのビデオデータの収集とその解析を継続して行う。これにより、日本人英語話者と北米英語母語話者の調音リズムパターンをより詳しく分析し、比較していく。またビデオと超音波による顎と舌の動きのデータの同時採取を行い、費用や設備面で継続的使用が困難なEMAの替わりに、将来的により低コストで使用可能と思われる教材を作成するための準備を行う。また、当初の計画に沿い、中国人話者のデータの採取を行う予定である。次年度は研究最終年度にあたることから、当初予定していた実験をすべて行う予定である。また、学会発表も積極的に行う予定をしている。会津大学においてビデオデータ収集・解析に使用するためのコンピュータの購入を今年度は行わなかったため(データ量は来年度以降大幅に増える予定)。また実験に必要な備品(センサーその他)の一部が今年度は間に合ったため、その費用を使用しなかったため。また予定されていた研究代表者と分担者による打ち合わせを、実験や学会発表で数名が集まった際に行い、電話・メールでも行ったため、旅費の一部を使用しなかった。会津大学におけるビデオデータ収集・処理・解析に使用するためのコンピュータを購入する予定である(備品)。また実験に必要な備品(センサーその他)を購入する予定である(備品)。また、本研究の理論的枠組みはC/D Model (Fujimura, 2000)に基づくが、その藤村氏に直接専門的アドバイスを受ける予定である(謝金)。また国内外の学会で成果の発表を継続して行う予定である(旅費)。
インスリンシグナルが嗅上皮障害後の再生過程に与える影響の検討

インスリン産生が低下した糖尿病マウスを用いて、嗅上皮障害後の再生過程を観察した。各時間経過後(メチマゾール障害後3、7、14、28日)に脳をパラホルムアルデヒドで還流固定し、5μmの厚みで嗅上皮冠状断を作製し、嗅上皮の厚み、嗅細胞数を糖尿病マウスと正常マウスで比較した。インスリンは膵臓β細胞から産生されるため、このβ細胞を選択的に破壊するストレプトゾトシンをC57BL/6マウス(10週齢♂)に投与し糖尿病マウスを作成した。ストレプトゾトシンを120mg/kgを3日間腹腔内に投与すると、投与したマウスの80%近くでI型糖尿病マウスの基準となる空腹時血糖250mg/dl以上を達成できた。次に糖尿病マウスあるいは正常マウス(コントロール)に対して、嗅毒性物質であるメチマゾール75mg/kgを腹腔内に投与した。メチマゾールで嗅上皮を障害すると、数日で新生嗅細胞が再生、分化し、障害後7-14日で成熟嗅細胞が出現し始め、障害後28日には、嗅細胞数、嗅上皮の厚み、成熟嗅細胞数が、障害前のレベルにまで回復していた。しかし糖尿病マウスでは、障害後14日以降で、インスリン分泌が正常なコントロールマウスと比較して嗅上皮が薄く、嗅細胞数が減少していた。さらに成熟嗅細胞の指標となるOlfactory marker protein(OMP)陽性細胞数もコントロールマウスと比較して有意に減少していた。細胞死のマーカーであるカスパーゼ3染色を行うと、障害後14日目で陽性細胞数が増加していた。以上の実験を通して、新生嗅細胞は、障害後14日以降にインスリンシグナルに依存して再生・成熟することを確認した。免疫染色では、ほとんど失敗することなく想定した結果が得られた。解析時間も予想した以上に短時間で終了した。今後、以下の2点を証明するために当初予定した計画通りに実験を進める。1.適切な時期にインスリンシグナルを受けないと、新生嗅細胞は成熟せずに細胞死に陥る。2.適切な時期(障害後7-14日)にインスリンを補充することで、障害後の嗅上皮再生遅延は代償される。以上の実験を通して、新生嗅細胞は、インスリンシグナルに依存して再生・成熟することを確認した。計画通りに研究は行われ、予想通りの研究結果が得られている。

以上の実験を通して、新生嗅細胞は、障害後14日以降にインスリンシグナルに依存して再生・成熟することを確認した。免疫染色では、ほとんど失敗することなく想定した結果が得られた。解析時間も予想した以上に短時間で終了した。今後、以下の2点を証明するために当初予定した計画通りに実験を進める。1.嗅上皮障害後の新生細胞の機能代償は、インスリンシグナルが低下した糖尿病マウスにおいて破綻する。2.適切な時期にインスリンシグナルを受けないと、新生嗅細胞は成熟せずに細胞死に陥る。1.適切な時期にインスリンシグナルを受けないと、新生嗅細胞は成熟せずに細胞死に陥る。2.適切な時期(障害後7-14日)にインスリンを補充することで、障害後の嗅上皮再生遅延は代償される。当初想定していた以上に進展することができた実験系があった。特に嗅上皮での免疫染色では、少ない試薬数で十分な実験結果が得られ、試薬の購入費用を抑えることができたため。実験の失敗が少なく、当初の予定より少ない実験回数で結果を得ることができた。その分の予算が次年度分で発生した。
鞭毛運動における屈曲面決定機構

ウニ精子の頭部に強制的に振動を加えると、鞭毛の屈曲面が外部から加える振動の方向に応じて容易に可逆的に変化(回転)する。本研究では以下に述べるように、新しい除膜方法の開発などを初めとする技術的改良により、屈曲面決定機構について重要な知見を得るに至った。1.実験方法の開発としては、先ず振動装置の改良を行い、高精度の制御のできるものを得た。次に除膜方法の改良を行った。従来のトリトンモデルを用いた頭部強制振動実験では、生きた精子と同様の結果を得ることはできなかったが、CHAPS(0.04%)/Nonidet P-40(0.01%)を用いる新しい方法によって作製したモデルは、生きた精子と同様に屈曲面の回転を示した。2.実験結果:精子の頭部に振動を加え、振動の周波数・振幅・方向を変化させ、その時の鞭毛運動の波形変化を高速度ビデオに記録し解析を進めた。生きた精子も除膜後ATPで再活性化した精子も3080Hzという広い範囲の周波数の振動に同期して安定した鞭毛運動を行った。振動面を90°変化させると、屈曲面は本来の面からそれに垂直な面へと瞬時に変化した。振動面を除々に変化させていくと屈曲面はそれに伴って最高11回転まで変化した。振動面を変化させる方向が頭部からみて反時計回りの場合には、振動停止後に振動面の回転とほぼ同数の屈曲面の逆回転がみられた。時計回りに振動面を変化させた後では、自発的逆回転は起りにくいが、この時軸糸内構造は壊れているわけではないらしい。また、ポリスチレンビーズを軸糸に付けて実験を行った結果、屈曲面の回転中に軸糸自体は回転していないらしいことがわかった。以上の結果は、ウニ精子鞭毛は、屈曲面の可塑性を示し、その可塑性は運動機構自体の特質ー即ち「9+2」構造における滑りのパターンの制御機構のもつ可塑性と密接に関連していることを示唆している。現在、滑りのパターンの制御に係る軸糸内構造要素について引き続き検討を進めている。今年度は,以下に示す2つの方向から研究を進め,次のステップに進むために重要な知見を得た.1)ウニの精子の頭部を保持して,さまざまな周波数・振幅で振動を加えるための装置を作製した.予備実験の段階で開発した装置では,振動の方向を変えると振幅等が安定しないなどの問題があった.そこで,用いる圧電素子を変えるなどして, x・y・zの3方向振動型の装置と, x軸・y軸の2方向成分を変化させることのできる,振動方向回転実験専用の装置とを開発した.これにより精度の高い制御が可能となった.2)上記の装置を用いて,ウニの生きた精子および除膜後ATPで再活性化した精子を用いて,それらの頭部に振動を加え,さらに振動の面を変化させた.このときの鞭毛運動の波形変化を高速度ビデオに記録し解析を進めた結果,振動面を変化させる方向によって,可逆的に逆回転が起こる場合と起こらない場合とがあるらしいことがわかった.また,可逆的な逆回転は,振動面を連続的に810回転させても起こった.

可逆的回転が起こるかどうかは,振動面を変化させる方向と,変化の速度とによって影響を受ける.以上のような成果をふまえ,可逆的回転数に限界があるのか,また軸系内の屈曲形成機構を壊さずに振動面を回転させることができる方向が一定しているのかどうかについて,今後さらに定量的解析を進め,鞭毛運動における屈曲面決定機構の解明を目指す.鞭毛の新たな除膜法を開発し、これを用いて作製した除膜モデルについて実験を行い、屈曲面決定機構に関するいくつかの重要な知見を得た。1.新しい除膜鞭毛の開発:単一の精子頭部を微小ピペットで吸引して保持し、このピペットを強制的に振動させ、さらに振動の方向を変化させてこの時の屈曲面の変化を解折した。振動面の変化に伴う屈曲面の回転は、従来のトリトン処理により除膜した鞭毛でもある程度の回数まで観察されたが、生きた精子のように安定して510回転の変化が起るということはなかった。そこでいくつかの界面活性剤を用いて鞭毛モデルを作り、頭部強制振動に対する反応性を調べた結果、両性イオン性界面活性剤のCHAPSとNonidetP-40を含む除膜溶液で処理した精子が良い反応性を示すことがわかった。2.CHAPSモデルを用いた強制振動の実験:CHAPSモデルは、1mMATPを含む再活性化溶液中で3540H_Zで鞭毛運動を行う。頭部を40H_Zで振りながら振動面を徐々に変化させていくと、鞭毛の屈曲面は、生きた精子の時と同じく、最高11回転まで変化した。そして振動停止後にはこの回転数とほぼ同回転数の屈曲面の逆回転が起った。この逆回転運動は、振動面を精子頭部からみて反時計回りに変化させた時に常に観察され、時計回りに変化させた時には、初めに振動面とともに変化した屈曲面の回転数の約3割しか戻らなかった。除膜鞭毛にポリスチレンビーズを付けて屈曲面の回転を観察したところ、ビーズは屈曲面が回転しても回転しないことがわかった。これらの結果は、屈曲面の変化は、軸糸内の微小管間のすべり量のパターンの変化によって引き起こされることを強く示唆する。
水・物質輸送-生物動態連成系としての河川生態系の物質循環機構に関する研究

本研究は、河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し、生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにするものである。(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構、(2)河川水、地下水間での水・物質輸送機構、(3)藻類、水生昆虫、魚類による生物生産と物質輸送機構を解明し、(4)各サブプロセスを統合した流れ・物質輸送・生物動態の連成解析モデルを構築して、それぞれの要素間の相互の関係を記述した.本研究は,河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し,河川生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにすることを目的とする.この最終目的を達するため,河川の水・物質循環を構成する主要な要素として,河川水・地下水の流れ,土砂輸送,有機物・栄養塩輸送,河畔植生,藻類,水生昆虫,魚類,土壌微生物を取り上げ,(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構の解明,(2)藻類,水生昆虫,魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送機構の解明により,それぞれの要素間の相互の関係を記述する.本研究は、河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し、生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにするものである。(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構、(2)河川水、地下水間での水・物質輸送機構、(3)藻類、水生昆虫、魚類による生物生産と物質輸送機構を解明し、(4)各サブプロセスを統合した流れ・物質輸送・生物動態の連成解析モデルを構築して、それぞれの要素間の相互の関係を記述した.本研究は,河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し,河川生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにすることを目的とする.この最終目的を達するため,河川の水・物質循環を構成する主要な要素として,河川水・地下水の流れ,土砂輸送,有機物・栄養塩輸送,河畔植生,藻類,水生昆虫,魚類,土壌微生物を取り上げ,それらの要素間の相互の関係を定量化する.以下では,平成19年度の実施計画として挙げた下記3点に関する成果について解説する.(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構の解明および(2)河川水,地下水間での水・物質輸送機構の解明河川水・伏流水の流れ,河道内砂州の地形,栄養塩・有機物の変化に関する現地観測を実施するとともに,河畔植生を対象とした飼育実験を企画して,河畔植生の成長と栄養塩吸収の関係を明らかにした.ここで得られた知見により,河畔植生の成長効果を組み入れた水・物質収支モデルにおいて不可欠なパラメータが設定される.また,現地観測で採取された水質サンプルについては,有機物・栄養塩量の計測を行い,水位計測から推定される地下水流動と組み合わせて,地下水による物質輸送量を定量化した.(3)藻類,水生昆虫,魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送機構の解明河川水中において,流れ,有機物栄養塩量,付着および浮遊藻類量,底生生物量,魚類量調査を実施した.本年度は,藻類の生産活動や,これを餌とする底生生物の生息場所特性に関する成果を報告した.既に発表した成果や関連する調査の成果は,河川水内での生物生産と物質輸送機購を結びつけるモデル開発の端緒となるものである.本研究は,河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し,河川生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにすることを目的とする.この最終目的を達するため,河川の水・物質循環を構成する主要な要素として,河川水・地下水の流れ,土砂輸送,有機物・栄養塩輸送,河畔植生,藻類,水生昆虫,魚類,土壌微生物を取り上げ,それらの要素間の相互の関係を定量化する.本年度は,河川内での生物生産と物質輸送機構を結びつけるモデル開発に着手しており,具体には以下の3点に関する研究を実施した.(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構の解明(2)河川水,地下水間での水・物質輸送機構の解明河道内の水流,土砂の移動,河畔植生の消長を表現可能な準2次元数値モデルを開発し,木津川砂州河道における検証を行った.本数値モデルは,河道内地形(景観)の変遷を追跡しながら水・土砂の通過フラックスを評価するものであり,有機物・栄養塩輸送機構解明のために不可欠な基盤となるものである.(3)藻類,水生昆虫,魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送機構の解明河川感潮域を澪筋,ワンドなどの典型的な景観に分類したうえで,汽水性二枚貝が浮遊性藻類を濾過摂食する過程に着目し,これらの成長過程を数値的に追跡しながら各景観における水質浄化能評価を行った.また,中流域の河道内砂州において,チドリに代表される鳥類の営巣場などを対象とし,冠水頻度と植生の有無などの表層景観の差異に基づく生態的機能の評価手法を提示した.

本研究は,河川の流れ・物質輸送・生物動態の相互作用を解明し,河川生態系が河川の水・物質循環に果たす役割を定量的に明らかにすることを目的とする.この最終目的を達するため,河川の水・物質循環を構成する主要な要素として,河川水・地下水の流れ,土砂輸送,有機物・栄養塩輸送,河畔植生,藻類,水生昆虫,魚類,土壌微生物を取り上げ,それらの要素間の相互の関係を記述する.本年度は昨年度に引き続き,河川内での生物生産と物質輸送機構を結びつけるモデル開発を進めており,具体には以下の2点に関する研究を実施した.(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構の解明植生の繁茂が進行している砂州や植生が繁茂していない砂州を含む約10km程度の砂河川区間に着目し,植生の繁茂状況と洪水時の冠水頻度から景観を区分するとともに,各ユニットにおける生物の生息適性,脱窒・硝化,有機物・栄養塩の捕捉といった生態的機能の評価を行った.また,特徴の異なる砂河川,礫河川のそれぞれにおいて,植生域変遷とそれに伴う砂州の発達,砂州内の土砂捕捉効果についてモデル化を行った.(3)藻類,水生昆虫,魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送機構の解明ワンドを有する感潮河川において,水辺,澪筋といった特徴的な景観における現地観測結果に基づき,生息する底生動物の群集構造から生息場所を類型化し,各類型の物理特性を考察することで,生物生産に必要な物理条件を明らかにした.本研究は(1)河畔植生の効果を取り入れた水・土砂・有機物・栄養塩輸送機構の解明、(2)河川水、地下水間での水・物質輸送機構の解明、(3)藻類、水生昆虫、魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送機構の解明、(4)各サブプロセスを統合した流れ・物質輸送・生物動態の連成解析モデルの構築と物質循環解析、といった4つのサブテーマに分割して実施するものである。本年度については、(1)、(2)を統合した数値モデルの構築、さらに、ここでのシミュレーションを踏まえた(3)の適用により、(4)の生態系統合モデルを開発した。(1)、(2)河畔植生の効果を取り入れた、河川水-地下水間での水・物質輸送機構のモデル化本サブテーマ群では、前年度までに実施した地形、栄養塩・有機物環境の変化に関する現地調査による成果から、河川水-地下水挙動、植生の生長、地形変動、栄養塩輸送に関する影響を組み込んだ水・物質輸送モデルを開発し、各種の境界条件を制御した感度分析を数値的に実施した。(3)藻類、水生昆虫、魚類を中心とした河川水内での生物生産と物質輸送に関する数値解析本サブテーマでは、前年度までに開発した生物動態モデルを進展させ、粒状有機物、栄養塩、付着および剥離藻類量、水生昆虫生物体量といった指標を出力結果とする生物群集の動態解析を実施した。(4)各サブプロセスを統合した流れ・物質輸送・生物動態の連成解析モデルの構築と物質循環解析上記(1)(3)のモデルの結合度、汎用性を高めることにより、河川・流域における流れ・物質輸送・生物動態の連成解析モデルを構築し、総合的な物質循環の動態解析を試みた.
オイルボディを介した新規の生理的役割

本研究は,植物のオイルボディに局在する膜タンパク質の研究を行い,オイルボディが担う様々な生命現象の解明することを目的としている.前年度までに,シロイヌナズナ種子のオイルボディに蓄積しているOLE1を用いて,新たな形質転換技術であるFAST法(Fluorescence-Accumulating-Seed Technology法)を確立した.本年度はイネおよびダイズの種子で機能するプロモーターの下流でオレオシン-GFP融合遺伝子を誘導するコンストラクトを作製し,イネおよびダイズに形質転換した.その結果,それぞれの種子において実体顕微鏡下で蛍光を観察できたことから,幅広い作物へのFAST法の適用が可能になると考えている.またFAST法ではT1種子集団から形質転換種子を簡便に単離できるため,T1植物が致死になる形質転換体であっても,発芽時点からの比較観察が容易となる.シロイヌナズナのQa-SNARE SYP2の多重変異体や多重ノックダウン植物は,種子を付ける段階まで生育できず,解析が非常に困難であったが,FAST法を利用することで,多重ノックダウン植物を容易に観察できた.私は葉型オイルボディの形成機構を探るために,CL03-GFP融合タンパク質をCL03自身のプロモーターにより誘導する形質転換シロイヌナズナを葉型オイルボディのマーカーラインとして,葉型オイルボディの形成に異常を示す変異体のスクリーニングを行った.本年度はleaf oil-body-protein accumulation (loa)変異体のうち,loa3に関して遺伝子歩行によるラフマッピングにより変異の位置を絞り込んだ後,次世代シーケンサー(Solid)により全ゲノムシーケンスを行った.その結果原因遺伝子の候補を4つ見つけることに成功した.本研究では,植物のオイルボディ膜タンパク質について,その生理機能を解明することを目標としている.シロイヌナズナ種子のオイルボディ膜タンパク質・オレオシンの機能解析について,オレオシンのノックアウト種子では,オイルボディが巨大化しやすくなり,種子の凍結耐性を失うことを見出した.この研究成果をThe Plant Journalに発表した.オレオシンの研究を進めるにあたって,シロイヌナズナ種子型オイルボディに大量に蓄積しているOLE1について,新たな成果が得られた.OLE1プロモーターの下流においてOLE1とGreen Fluorescent Protein(GFP)の融合遺伝子をつないだコンストラクト(pOLE1::OLE1-GFP)を作製した.このコンストラクトをシロイヌナズナに形質転換したところ,蛍光実体顕微鏡下で形質転換体種子のGFP蛍光を観察することが可能であることを見出した.このことを利用し,pOLE1::OLE1-GFPを形質転換の選抜マーカーとして,種子のGFP蛍光を指標にして形質転換体を選抜する系を確立した.F__-luorescence A__-ccumulating S__-eed T__-echnology(FAST法)と命名し,学会誌に投稿中である.オイルボディ膜タンパク質CLO3は,アブシジン酸に応答して発現する葉型オイルボディタンパク質である.CCLO3プロモーターの下流においてCLO3とGFPの融合遺伝子をつないだコンストラクト(pCLO3::CLO3-GFP)をシロイヌナズナに形質転換したところ,アブシジン酸処理をした場合でのみ,GFPの蛍光が観察された.このことを利用して,pCLO3::CLO3-GFP植物体に変異原処理を行い,アブシジン酸処理を行わない状態でもGFP蛍光が見られる変異体をスクリーニングした.現在2ラインの変異体系統が得られており,今後は原因遺伝子の特定を行う予定である.これらの変異体は,アブシジン酸による応答に異常があると考えられ,植物のストレス応答において,重要な役割を担う遺伝子の発見につながると考えている.本研究は,植物のオイルボディに局在する膜タンパク質ファミリーの解析を行うことで,オイルボディが担う様々な生命現象の解明することを目的としている.オレオシンの研究を進める中で,オレオシン1(OLE1)をバイオツールとして使用する方法を確立した.従来の薬剤による形質転換体選抜法の欠点を克服した形質転換シロイヌナズナ作製法をFAST法(Fluorescence-Accumulating-Seed Technology法)と命名し,10種類のFASTベクターを作製した.FAST法では,OLE1-GFPを選抜マーカーとして用いる.実体顕微鏡下でOLE1-GFP蛍光を発する種子を選抜することで,形質転換第一世代(T1)の種子集団からT1ヘテロ接合種子を選抜することが可能になる.さらに,形質転換第二世代(T2)の種子集団からGFP蛍光を強く発する種子を選び取ることで,T2ホモ接合種子を99%以上の確率で選抜できた.FAST法により形質転換シロイヌナズナの作製が容易になり,シロイヌナズナの基礎研究に大きく貢献できるものと考えている.この研究成果をThe Plant Journalに発表した.葉がストレスを受けると細胞内に葉型オイルボディが形成される.葉型オイルボディ局在タンパク質であるカレオシン3(CLO3)を用い,CLO3プロモーターの下流においてCLO3とGFPの融合遺伝子をつないだコンストラクトを作製し(pCLO31::CLO3-GFP),葉型オイルボディのマーカーラインとした.葉型オイルボディの形成機構を探るために,pCLO31::CLO3-GFP植物体にEMS変異原処理を行い,葉型オイルボディが異常蓄積する変異体を4ラインを単離した.

そのうちの2つについては,マッピングにより原因遺伝子を同定した.残りのラインについても引き続き原因遺伝子の同定を目指す.本研究は,植物のオイルボディに局在する膜タンパク質の研究を行い,オイルボディが担う様々な生命現象の解明することを目的としている.前年度までに,シロイヌナズナ種子のオイルボディに蓄積しているOLE1を用いて,新たな形質転換技術であるFAST法(Fluorescence-Accumulating-Seed Technology法)を確立した.本年度はイネおよびダイズの種子で機能するプロモーターの下流でオレオシン-GFP融合遺伝子を誘導するコンストラクトを作製し,イネおよびダイズに形質転換した.その結果,それぞれの種子において実体顕微鏡下で蛍光を観察できたことから,幅広い作物へのFAST法の適用が可能になると考えている.またFAST法ではT1種子集団から形質転換種子を簡便に単離できるため,T1植物が致死になる形質転換体であっても,発芽時点からの比較観察が容易となる.シロイヌナズナのQa-SNARE SYP2の多重変異体や多重ノックダウン植物は,種子を付ける段階まで生育できず,解析が非常に困難であったが,FAST法を利用することで,多重ノックダウン植物を容易に観察できた.私は葉型オイルボディの形成機構を探るために,CL03-GFP融合タンパク質をCL03自身のプロモーターにより誘導する形質転換シロイヌナズナを葉型オイルボディのマーカーラインとして,葉型オイルボディの形成に異常を示す変異体のスクリーニングを行った.本年度はleaf oil-body-protein accumulation (loa)変異体のうち,loa3に関して遺伝子歩行によるラフマッピングにより変異の位置を絞り込んだ後,次世代シーケンサー(Solid)により全ゲノムシーケンスを行った.その結果原因遺伝子の候補を4つ見つけることに成功した.
Anthracycline系薬剤による心筋細胞のapceptosis出現の機序と交感神経系の関与に対する解明

心筋細胞培養および交感神経節との混合培養細胞にDaunorubicinを1μmolの濃度で添加し、TUNEL法によりapoptosisの陽性率を、またアガロースゲル電気泳動法にてDNAのladderingを確認した。TUNEL陽性細胞は交感神経支配を受けた心筋細胞に比し、交感神経支配を受けていない心筋細胞で有意に高い確率で認められた。一方、Daunorubicinの投与を受けていない群では、有意差は無く、apoptosisの出現も軽微であった。なお、TUNEL陽性細胞はDaunorubicin負荷後8時間ころより観察され、24時間がピークであった。しかし、交感神経支配の有無とTUNEL陽性細胞出現時間には差異は認められなかった。さらに、apoptosisの誘導機構に関与するとされているp53, Baxの発現を同じ培養細胞を用いて、経時的に検討した。その結果、Daunorubicin添加後約90分より、p53およびBaxともに両培養細胞でそれぞれup regulationが認められたが、両培養細胞間には有意差は認められなかった。一方、Daunorubicinを添加していない培養心筋細胞および混合培養細胞ではそれぞれのup regulationは認められなかった。また、apoptosisの実行過程に関与するとされているCaspase 3の発現を検討した。Caspase 3の発現はDaunorubicin添加後120分で両培養細胞において発現の亢進が認められた。さらに、その程度は交感神経支配を受けた心筋細胞に比し、有意に交感神経支配を受けていない心筋細胞で高かった。以上より、Anthracyclinによる心筋細胞障害としてapoptosisが関与していること、および交感神経支配によりその程度が減弱されることが解明された。さらにapoptosisが発現する機序に、p53、Baxの関与は少なく、実行過程にはCaspase3が深く関わっていることが示唆された。Anthracyclineによるapoptosisの誘導機構、決定機構および制御機構、また、apoptpsisの実行機構など心筋細胞のapoptpsisに至るまでの情報伝達経路の全容は未だ明らかにされていない.我々は心筋細胞のapoptpsisに交感神経系の関与があるのではないか、つまり交感神経支配を受けることにより神経成長因子などの増殖因子の働きによりapoptpsisは起こりにくくなるのではないかとの仮説を持ちその解明を行っている.実験動物:生後1日目のラット新生仔(未だ交感神経の支配を受けていない)実験方法および現在までの結果:心筋細胞培養および交感神経節との混合培養:ラット新生仔より心室を摘出し、心筋細胞を分離し、37°C、950/1O2,50/1CO2下にて培養した.また、交感神経節・心筋細胞との混合培養は、ラット新生仔の頚部交感神経節を摘出し、少量の培養液とともに培養孵卵器内にて約30分間培養する.その後、分離し、細胞数を1×105個/(培養液1ml)に調整した心筋細胞を同培養ディッシュに移し、混合培養をした.培養心筋細胞は培養3日目には心筋細胞が互いにconfluentとなり、拍動が認められ、また混合培養では同様に培養3日目には交感神経節よりaxonが伸び、いくつかの心筋細胞との間に神経・筋接合が完成した.位相差顕微鏡によるapoptpsisの検討:心筋単独培養細胞、および混合培養細胞にAnthracyclineであるアクチノマイシンDを1μg/(培養液1ml)の濃度で添加し、添加4時間後より1時間毎

経時的に位相差顕微鏡を用いてapoptpsisをおこしている細胞の割合を測定し、コントロールとしてアクチノマイシンD無添加の心筋培養細胞、混合培養細胞を用いて比較検討した.現在までの結果では心筋細胞単独の方が交感神経節との混合培養された心筋細胞よりもapoptosisを起こしやすい傾向にあることが確かめられた.さらに研究を進めているところである.心筋細胞培養および交感神経節との混合培養細胞にDaunorubicinを1μmolの濃度で添加し、TUNEL法によりapoptosisの陽性率を、またアガロースゲル電気泳動法にてDNAのladderingを確認した。TUNEL陽性細胞は交感神経支配を受けた心筋細胞に比し、交感神経支配を受けていない心筋細胞で有意に高い確率で認められた。一方、Daunorubicinの投与を受けていない群では、有意差は無く、apoptosisの出現も軽微であった。なお、TUNEL陽性細胞はDaunorubicin負荷後8時間ころより観察され、24時間がピークであった。しかし、交感神経支配の有無とTUNEL陽性細胞出現時間には差異は認められなかった。さらに、apoptosisの誘導機構に関与するとされているp53,Baxの発現を同じ培養細胞を用いて、経時的に検討した。その結果、Daunorubicin添加後約90分より、p53およびBaxともに両培養細胞でそれぞれup regulationが認められたが、両培養細胞間には有意差は認められなかった。一方、Daunorubicinを添加していない培養心筋細胞および混合培養細胞ではそれぞれのup regulationは認められなかった。また、apoptosisの実行過程に関与するとされているCaspase 3の発現を検討した。Caspase 3の発現はDaunorubicin添加後120分で両培養細胞において発現の亢進が認められた。さらに、その程度は交感神経支配を受けた心筋細胞に比し、有意に交感神経支配を受けていない心筋細胞で高かった。以上より、Anthracyclineによる心筋細胞障害としてapoptosisが関与していること、および交感神経支配によりその程度が減弱されることが解明された。さらにapoptosisが発現する機序に、p53、Baxの関与は少なく、実行過程にはCaspase 3が深く関わっていることが示唆された。
質量分析による軟骨基質構成分子網羅的解析の変性疾患、再生医学への応用

軟骨組織の主要構成成分としてタンパク質であるコラーゲンに加えて、コンドロイチン硫酸、などのグリコサミノグリカンがある。本研究は、加齢による運動器変性疾患におけるこれらの軟骨組織構成成分変化を質量分析法によって網羅的かつ定量的に詳細に検討することで疾患の病態生理解明と新規治療・予防法開発に資することが目的である。H30年度は、前年度までに確立した、質量分析によるGAGの定量、コラーゲン、エラスチンのクロスリンクの定量、組織のサーモリシンによる高温での可溶化法の3つを組み合わせて肥厚黄色靭帯の解析を試みた。黄色靭帯はエラスチンを大量に含む組織であるがコラーゲンも存在しており、肥厚においては軟骨化生が起こることが知られているがその定量的解析は行われていない。従来コラーゲンの定量に用いられてきた水酸化プロリンはエラスチンにも存在するため、黄色靭帯の解析においてはコラーゲン量の増減を適切に反映していない可能性がある。そこでコラーゲン、エラスチンのそれぞれに特異的なクロスリンクを測定して、水酸化プロリンとの相関を検討したところエラスチンでなく、コラーゲンに特異的なクロスリンクと正の相関を示すことが明らかになった。このことから過去の論文で用いられている水酸化プロリンの定量はコラーゲン量の変化を反映していると考えてよいが、より特異性の高いクロスリンクをそれぞれのタンパク質の指標として用いることで曖昧さを回避できる。軟骨組織の主要構成成分としてタンパク質であるコラーゲンに加えて、コンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンがある。平成28年度は、変形性関節症膝関節軟骨及び肥厚黄色靭帯からのグリコサミノグリカンの網羅的解析(GAGomics)を行う上でその再現性を高めるための組織可溶化法の検討を行い、従来法より高温で可溶化を行うことが有用である結果を得て学会発表した。またヒト腰部黄色靭帯のグリコサミノグリカン組成の解析に質量分析法が有用であること、及びその組成が特徴的であることをも報告している。これらの結果は、変形性関節症や黄色靭帯肥厚に限らず、他の軟骨組織の疾患や軟骨化生におけるグリコサミノグリカンの変化を解析する上で有用な手段となることが予想される。さらにコラーゲンの架橋部から生ずるピリジノリンとその誘導体、エラスチンの架橋部から得られるデスモシンとその誘導体を質量分析で定量する架橋解析の方法をこれらの標準品を用いて行った。コラーゲンは末端部で架橋を作ることで互いに結合してグリコサミノグリカンを緊縛していることから、架橋の状態を調べることが軟骨機能の分子レベルでの評価法の一つとしての有用性の有無を検討することの端緒についたと言える。変形性関節症膝関節軟骨及び肥厚黄色靭帯からのグリコサミノグリカンの網羅的解析を再現性に注意しつつ継続中である。コラーゲン及びエラスチンの架橋解析の条件設定を行っているところである。軟骨組織の主要構成成分としてタンパク質であるコラーゲンに加えて、コンドロイチン硫酸、などのグリコサミノグリカンがあり、コラーゲンは末端部で架橋を作ることで互いに結合してグリコサミノグリカンを緊縛している。一方エラスチンは黄色靭帯に特徴的に多くふくまれるたんぱく質であるがコラーゲンとは異なった架橋を形成する。本研究は、加齢による運動器変性疾患における軟骨組織構成成分変化を質量分析法によって網羅的かつ定量的に詳細に検討することで疾患の病態生理解明と新規治療・予防法開発に資することが目的である。例えば黄色靭帯肥厚の原因となりうる軟骨化生の有無をグリコサミノグリカンの網羅的解析に加えてコラーゲンとエラスチンの量的変動を調べることによって評価できる可能性がある。平成29年度は、前年度確立したコラーゲンの架橋部から生ずるピリジノリンとその誘導体、エラスチンの架橋部から得られるデスモシンとその誘導体を質量分析で定量する架橋解析法を、軟骨、血管、皮膚などコラーゲンとエラスチンが異なった割合で含まれる生体組織の解析に適用し、従来報告されているコラーゲン、エラスチンの含量に見合った結果を得たことで、この方法が生体組織の解析に応用できることを示した。またこの方法をラット関節軟骨に応用して発生過程におけるコラーゲン架橋の変化を明らかにした。これらはいずれも学会報告している。現在この方法を肥厚黄色靭帯の解析に応用中である。またこのような解析を行うための熱安定性プロテアーゼを用いた生体組織の完全可溶化法を論文として発表した。肥厚黄色靭帯及びラット発生過程の正常軟骨からのグリコサミノグリカンの網羅的解析に加えてコラーゲンとエラスチンの架橋解析を再現性に注意しつつ継続中である。

黄色靭帯はエラスチンを大量に含む組織であるがコラーゲンも存在しており、肥厚においては軟骨化生が起こることが知られているがその定量的解析は行われていない。従来コラーゲンの定量に用いられてきた水酸化プロリンはエラスチンにも存在するため、黄色靭帯の解析においてはコラーゲン量の増減を適切に反映していない可能性がある。そこでコラーゲン、エラスチンのそれぞれに特異的なクロスリンクを測定して、水酸化プロリンとの相関を検討したところエラスチンでなく、コラーゲンに特異的なクロスリンクと正の相関を示すことが明らかになった。このことから過去の論文で用いられている水酸化プロリンの定量はコラーゲン量の変化を反映していると考えてよいが、より特異性の高いクロスリンクをそれぞれのタンパク質の指標として用いることで曖昧さを回避できる。変形性関節症膝関節軟骨及び肥厚黄色靭帯の検体数を増やしてグリコサミノグリカンの解析を行う。コラーゲン及びエラスチンの架橋解析の条件設定後上記の検体に適用する。ウサギ再生軟骨へのグリコサミノグリカン及び架橋の解析は、検体量が不十分の場合、ラットを用いた正常軟骨の発生過程の解析を持って替える。運動器の変性性疾患として対象を肥厚黄色靭帯に絞って、軟骨再生との関連ではラット発生過程の正常軟骨を対象に、グリコサミノグリカンの網羅的解析に加えてコラーゲン及びエラスチンの架橋解析を行う。購入予定の輸入試薬の金額が変更となり、残額では購入できなかった。研究に必要な試薬、消耗品が前年度までに購入したものでまかなえた。旅費の航空券を正規料金ではない「早割」で購入できた。予定していたバイトをお願いすることがなかった。今年度設定した条件で、次年度は実サンプルを大量に測定する予定であるため、試薬、消耗品費として使用する予定である。次年度経費に組み込み、予定の試薬を購入する。