hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子スピン共鳴法(ESR)による未反応二重結合量の測定

常滋化(キセノンランプ照射)にともなう光重合型コンポジットレジンのラジカル発生挙動(発生速度、飽和到達時間、減衰)について検討後、各種条件下でその発生するラジカル量をESRスペクトル強度から計算し、その結果から未反応二重結合量を算定した。臨床的に一定時間(2060秒間)光照射した各種レジン硬化体から新たなラジカルの発生が見られ、かなり多くの未反応二重結合(1040%)が存在していることがわかった。また、硬化体の発生ラジカルを保存条件を変え、経時的に調べると発生量に違いがあった。保存条件によって、後重合の進度が異なり、自然光、太陽光、室内光に暴露されるとかなり重合が進むことがわかった。次年度は、未反応二重結合量と残留モノマー量、溶出モノマー量との関係について検討する。今年度は前年度の研究(未反応二重結合の測定方法、各種環境下での未反応二重結合量)についてさらに詳細に検討し、また未反応二重結合量と溶出モノマー量との関係についても調べた。二次照射で増加したボリマーラジカル量が未反応二重結合から発生したラジカルであると仮定し、この増加ラジカル量より未反応二重結合量を計算した。以下次の式によって未反応二重結合量を求めた。M=|(Ia-Ib)/I0|x100M:未反応二重結合量(%)、Ib:前照射直後の試料から得られたESR強度、Ia:前照射した試料の二次照射後の最大ESR強度、I0:未照射の試料から得られた最大ESR強度1060秒間照射した試料の未反応二重結合量は、照射が長いほど減少した。10秒照射で70%、20秒照射で58%、60秒照射でも30%もの高い値を示した。また、照射後、24時間経ってから未反応二重結合量を調べた結果、10秒照射で約55%、20秒照射で47%の値を示しており、10分後の測定した場合に比べ減少傾向がみられた。特に、照射時間が短いほどつまり未反応二重結合が多い試料ほど未反応二重結合量の減少量が多いことがわかった。これは、照射後も重合が進行していることを示している。未反応二重結合量の経時的変化は、10分後では58%、24時間後では47%に減少し、さらに1週間後には32%まで減少した。その後、徐々に減少しており、4週間以後も減少する傾向を示した。37°C、水中下でも室温、大気中の場合と同様の傾向が見られたがは24時間後に40%に、4週間後に28%に減少し、室温の場合に比べ減少する割合は高かった。また、水中と大気中での環境下ではあまり大差はないことがわかった。室内放置(室内光下)による未反応二重結合量の変化は、放置後から減少し始め、6時間で約半分に減少した。この時点でかなり硬化した状態になっていた。48時間では18%まで減少し、2週間後で5%になり、その後も、僅かながら減少傾向が見られた。溶出モノマー量は、未反応二重結合量が多いほど増加するが、ある程度少なくなると溶出しなくなった。すなわち、ペンディング二重結合の状態で存在していることがわかった。
損傷臓器の治癒再生を促進する分泌性タンパク質の解析

筋ジストロフィーモデルマウスmdxでは、壊れた骨格筋繊維がただちに再生するため、筋ジストロフィー患者でおこる加齢依存的な運動能の重篤な低下には至らない。我々は、mdxマウスでは損傷臓器の治癒再生を促進する分子機構が働いているとの仮説を立て、mdxマウス骨格筋でが発現高進している分泌性タンパク質として、Frizzled related protein 2(FRP2)、およびマクロファージ走化性因子BRAKを同定した。FRP2はハブ毒注射により破壊された骨格筋の再生過程で大きく発現誘導され、さらにsiRNAを用いて筋芽細胞内のFRP2発現をノックダウンしたところ、急速な細胞死がおこった。したがって、FRP2タンパク質を損傷部位に投与することは、局所的な幹細胞・前駆細胞のプールを増加させ、結果として治癒促進につながる可能性がある。しかし、FRP2遺伝子のトランスジェニックマウスの筋再生能はコントロールマウスと差がなかった。筋損傷によって十分量の内在性FRP2が局所的に誘導されているものと推察される。一方、BRAK-KOマウスとmdxマウスとの2重変異マウスを作出したところ、このマウスでは血中クレアチンキナーゼ(CK)値がmdxマウスより低下していた。しかし、物理的な筋再生モデル実験においては、BRAK-KOマウスの筋再生能に変動はなく、骨格筋内のマクロファージ数にも顕著な差が観察されなかった。BRAK-KOマウスは特に雌においてコントロールマウスより体重が軽いため、CK値の低下はむしろ個体のエネルギー代謝と関連している可能性が高い。現在詳細な解析を続行している最中であるが、BRAKの生理的役割の解明は、個体のホメオスタシスにおけるマクロファージ系ケモカインの新しい機能解明につながると期待される。筋ジストロフィーモデルマウスMdxでは、壊れた骨格筋繊維がただちに再生するため、筋ジストロフィー患者でおこる加齢依存的な運動能の重篤な低下には至らない。我々は、Mdxマウスでは損傷臓器の治癒再生を促進する分子機構が働いているとの仮説を立て、Mdxマウス骨格筋でが発現高進している分泌性タンパク質として、Frizzled related protein 2(FRP2)、およびマクロファージ走化性因子BRAKを同定した。まずFRP2は初代筋芽細胞のアポトーシスを抑制したため、FRP2を骨格筋に強制発現させたトランスジェニック(Tg)マウスを2系統樹立した。しかしハブ毒の筋内注射による筋破壊からの回復度に大きな差は観察されなかった。FRP2は筋破壊により急速に発現誘導されるため、TgマウスでのFRP2量が既に飽和している可能性がある。次に、BRAK遺伝子を欠損するノックアウト(KO)マウスを新しく作出した。BRAK-KOマウスをMdxマウスと交配し、筋変性度の指標である血中クレアチンキナーゼ(CK)活性を定期的に測定していったところ、BRAK(-/-)Mdxマウス群の方がBRAK(+/-)Mdxマウス群よりCK値が有意に低下していた。この事実は、当初の予想に反してBRAKはMdxマウスの骨格筋変性を悪化させる因子である可能性を示唆する。Mdxマウスでは、筋膜のジストロフィン複合体に結合して存在する一酸化窒素(NO)合成酵素が消失するために、NO産生が局所的に低下してマクロファージの攻撃を受けやすいとの報告がある。本研究で作出した遺伝子改変動物を用いたより詳細な解析によって、損傷臓器の治癒再生におけるFRP2とBRAKの機能を明らかにしていく予定である。
非持異的免疫抑制性モノクロ-ナル抗体の開発

前年度の研究成果として、非特異的にヒトMLCを抑制するような因子を産生するハイブリド-マ細胞を得ることが出来た。今年度の継続研究として、得られた免疫抑制性因子の解析を行った結果、培養上清の免疫グロブリンの含有量が微量なためか、サブクラスを同定することが出来ず、また培養継続により求める免疫抑制性因子活性も弱まっていくことが分かった。結局、求めている非特異的な免疫抑制性因子を作製することは不可能であった。その理由は、免疫寛容状態にある死体腎移植患者と言えども、ドナ-に特異的な免疫抑制性因子の産生が主体であり、ドナ-に無関係な非特異的な因子は産生されてはいるものの極めて微量であり、クロ-ニングを繰り返してモノクロ-ナル抗体産生ハイブリド-マの作製をしていく段階でも、強い方の特異的な因子を産生するような細胞に置き換えられていった可能性も考えられる。免疫寛容状態にある移植患者は約10年前の移植症例であり、ドナ-の脾臓より得ているリンパ球の保存状態が悪く、また免疫抑制剤による影響のない、この患者の移植前のリンパ球も以前に行った抑制性T細胞と抗イディオタイプ抗体の証明のためにすべて使用されており、特異的な免疫抑制性因子の証明も不可能である。免疫寛容状態にある腎移植患者の未梢血リンパ球に、微量ではあるが、非特異的な免疫抑制活性のあるものが含まれていることは間違いなく、将来の技術進歩とともに、求めるような非特異的な免疫抑制性モノクロ-ナル抗体が同定出来るように、今後とも研究を継続させたい。免疫抑制剤の投与なしに良好な移植腎機能を保っている死体腎移植症例より得られた末梢血リンパ球とマウス骨髄腫細胞(P3U1)とを、ポリエチレングリコ-ルを用いて細胞融合を行った。96穴マイクロプレ-トでのHAT培地(ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミジンを含んだ培地)選別法により得られたハイブリド-マの増殖ウエル数は約60%で、良好な融合率であった。ウエルの半分程度にハイブリド-マのコロニ-が増殖した時点での培養上清を採取し、ヒトMLC中に添加し、その抑制程度を測定した。MLCは非特異的な23の系を同時に行い、全体で200μlの培養アッセイ中に、得られた上清を5、10、および20μl初めより添加した。この時期になるとハイブリド-マの増殖力は速く、コロニ-を48穴プレ-トに移すようにした。MLCの結果が6日後に判明するが、全ての系で抑制に働いている因子を培養上清中に放出しているハイブリド-マを対象に、限界希釈法によるクロ-ニングを行った。この時のMLC抑制の程度を50%以上のものとし、クロ-ニング後については80%以上のものとした。限界希釈法では、100ウエルあたり30個の細胞が入るように調整したが、実際の増殖率は96穴1プレ-トあたり515ウエルであった。より強い非特異的な抑制効果のある培養上清を同様な方法でスクリ-ニングし、クロ-ニングを繰り返した。3回のクロ-ニングを経て、つまり4回のMLCアッセイ中に添加することにより、求められるモノクロ-ナル抗体を産生すると思われるハイブリド-マ株2種類を得ることが出来た。これまでが現在までに行った実験結果であり、今後この培養上清の性質、安定性などを調べることにしている。またこの間、重要と思われるハイブリド-マを全て液体窒素にて凍結保存してある。前年度の研究実績として,免疫寛容状態にある死体腎移植患者の末梢血リンパ球由来の融合細胞を作製し,その中からその培養上清に非特異的なMLC抑制活性を有する因子が含まれるようなハイブリド-マをクロ-ニングすることが出来た。

2種類の非特異的MLC抑制性モノクロ-ナル抗体を産生するハイブリド-マは,4回のヒト非特異的なMLCアッセイ中に添加した結果,連続して強い免疫抑制活性を示し,その間にモノクロ-ナル抗体作製としては十分と思われる3回の厳密なクロ-ニングを行っている。それらのハイブリド-マを培養し続けるとともに液体窒素タンク中に凍結保存し,また得られた培養上清の保存を行った。まず,モノクロ-ナル抗体としての培養上清の性質について調べたところ,抗体の含有量が非常に微量なためか,免疫グロブリンの同定までには至らなかった。ハイブリド-マ細胞は増殖率も良く,どうして抗体量が不十分であったかは不明である。2種類のみでなく,クロ-ニング途中の培養上清を含めて10種類以上に試みたが,すべて免疫グロブリンの同定は不可能であった。得られたハイブリド-マが産生する培養上清の免疫抑制性因子としての安定性の検討では,3回の厳密なクロ-ニングを行い,単一の細胞由来のハイブリド-マと考えられるが,以後の培養上清を用いてのMLC添加実験では抑制程度が弱まり,免疫抑制性因子としての活性は長期に培養を継続させた結果、除々に失活してしまった。得られたハイブリド-マはモノクロ-ナル抗体を産生していると考えられたが,免疫グロブリンの含有量も微量で安定性も弱く,今回の研究では,モノクロ-ナル抗体としての非特異的な免疫抑制性因子を作製することは不可能であった。
青少年の薬物乱用に関するモニタリングとデータアーカイブ構築

若者の喫煙,飲酒を含む薬物乱用は変化するので繰り返し調査をしてモニタリングを行うことが必要である.本研究では,日本とアジアの青少年の薬物乱用の実態を調査し,データ・アーカイブを構築した.得られた結果は以下のようである.(1)日本の青少年の喫煙,飲酒経験は連続して低下しており,2009年の時点でのこれまで1度でも喫煙経験した者の割合は13.1%,飲酒生涯経験率は56.7%であった.(2)何らかの違法薬物を一度でも経験した者は2009年,男子1.1%,女子で0.6%であった.(3)日本を含むアジア諸国の青少年の違法薬物乱用経験は欧米に比べて著しく低い.(4)日本の高校生のほとんどは,薬物乱用の危険性をよく理解し,乱用に拒否的な態度をもつ.(5)以上をまとめデータ・アーカイブを構築するとともに,その重要性を指摘した.若者の喫煙,飲酒を含む薬物乱用は変化するので繰り返し調査をしてモニタリングを行うことが必要である.本研究では,日本とアジアの青少年の薬物乱用の実態を調査し,データ・アーカイブを構築した.得られた結果は以下のようである.(1)日本の青少年の喫煙,飲酒経験は連続して低下しており,2009年の時点でのこれまで1度でも喫煙経験した者の割合は13.1%,飲酒生涯経験率は56.7%であった.(2)何らかの違法薬物を一度でも経験した者は2009年,男子1.1%,女子で0.6%であった.(3)日本を含むアジア諸国の青少年の違法薬物乱用経験は欧米に比べて著しく低い.(4)日本の高校生のほとんどは,薬物乱用の危険性をよく理解し,乱用に拒否的な態度をもつ.(5)以上をまとめデータ・アーカイブを構築するとともに,その重要性を指摘した.本研究は,我が国に国際的に通用する青少年を対象とした喫煙,飲酒を含む薬物乱用に関する時系列的モニタリングとデータ・アーカイブシステムを構築することを目的とし,4年間の計画のもとで進めるものである.初年度である,本年度は,(1)計画全体の細部について検討し,各年度の調査研究内容を確定した.その際,調査データの公開,データ・アーカイブに収録するためのメタ・データのフォーマット,収録日程などを定めた.(2)高校生を対象に,喫煙,飲酒を含む薬物乱用とその背景要因についての全国調査を実施した.この調査は,本研究班が実施してきた高校生を対象とした全国調査の第3回目の調査となるものである.調査は,第1回および第2回と同一の方法で無記名の質問紙法により行った.第1回,2回と同様に対象者校を層別1段集落抽出法にて無作為抽出した.高校数は104校.各学校の全学年・全クラスの生徒を対象とした.質問紙は,基本的に第1回,第2回と同じとし,アメリカMFS, EU ESPAD (European School Survey Project on Alcohol and other Drugs)と比較できる内容とし,総質問数は104項目とした.調査は2009年10月から2010年2月の期間に実施した.今回は新型インフルエンザ流行により,休校措置中の高校があり,調査期間を延長した.また,前2回にくらべて調査協力校数が減少した.調査協力校は59,総回収数(協力生徒数)は,29,273人,有効回答数は29,201であった.(3)現在個人別のデータ入力の80%が完了した.(4)並行して,共同研究者のネットワークを通じて国内外の関連調査データを検索し,データ・アーカイブへの収録依頼を進めた.本研究は,青少年の喫煙,飲酒を含む薬物乱用に関して時系列的モニタリングを行い、国際比較可能なデータ・アーカイブシステムを構築することを目的とする。本年度は,以下の結果を得た:(1)全国の5,977の高等学校から無作為に抽出した116校の生徒を対象として調査した。116の高等学校のうち、50.8%にあたる59校の協力が得られ、その29,273人の生徒について調査を実施した。有効回答は、29,114であり、これを集計の基礎とした。(2)高校生の違法薬物経験率(生涯経験率)は、大麻についてみると、1年生で0.3%、2年生で0.3%、3年生で0.5%であった。薬物別にみると、有機溶剤がやや多い傾向があるが、大麻、有機溶剤(シンナー等)、覚せい剤、MDMA(エクスタシー)乱用の頻度に大きな差はない。最近の他の調査結果と比較すると、高校生の違法薬物乱用経験率は、中学生と変わらず、18-22歳の青少年より低かった。(3)学校基本統計に基づく高校生の人数をもとに薬物乱用を経験している生徒の人数を推定すると、高校生では、大麻乱用経験者12.387人、有機溶剤(シンナー等)乱用経験者16,160人、覚せい剤乱用経験者11,018人、MDMA乱用経験者9,282人であった。(4)諸外国と比較すると、我が国の高校生の違法薬物経験率は、欧米諸国に比べて著しく低く、特に大麻乱用は、米国や欧州諸国に比べて2桁近く低くかった。(5)これまで一度でも、違法薬物乱用を経験した高校生は、2006年調査では2004年調査にくらべて増加したが、2009年調査では全体として減少した。この傾向は、男子、女子とも見られた。

(6)次年度に向けて、アジア諸国のうち、信頼できる調査が行われていないベトナムについて共同研究計画を作成し,質問紙内容を確定した。本研究は、青少年の喫煙、飲酒を含む薬物乱用に関して広範囲かつ時系列的モニタリングを行い、国際比較可能なデータアーカイブを構築することを目的とする。本年度はベトナムにおける調査を中心に以下の成果を得た:(1)ベトナムにおいて、高校生を対象に喫煙、飲酒、薬物乱用の実態と背景要因と考えられる生活習慣等に関して、調査紙法による大規模調査を実施した。(2)調査対象は1518歳の高校生とし、調査対象高等学校数30校、総生徒数6,887人について調査を行った。(3)ベトナム高校生の喫煙経験率(生涯経験率)は13.1%、飲酒経験率(生涯経験率)は6.16%であった。(4)ベトナム高校生の違法薬物の生涯経験率(これまで一度でも経験したことがある)はそれぞれ、有機溶剤0.6%、大麻2.0%、覚せい剤1.3%ヘロイン0.5%であった。これらの結果からベトナムの高校生の喫煙、飲酒及び違法薬物乱用経験率は我が国や韓国とほぼ同じレベルで、欧米に比べて低いことが明らかとなった。しかし、ベトナムでは有機溶剤乱用率が低い一方、覚せい剤やヘロイン乱用経験者が存在するなど、我が国とは異なった特徴も見られた本研究の目的は,我が国の青少年の薬物乱用問題を多角的にかつ時系列的に継続してモニタリングし,薬物乱用に関する総合的なデータ・アーカイブシステムを構築することである。最終年度である平成24年度は、以下の成果を得た。1.4年間の調査結果にこれまで本研究班が蓄積したデータを加え、時系列的分析を行い、我が国の高校生の薬物乱用のトレンドを明らかにした。すなわち、高校生の喫煙、飲酒経験は連続して低下しており、2009年の時点での生涯喫煙経験率(これまで1回でも経験した者の割合)は13.1%,飲酒生涯経験率は56.7%であった。一方、違法薬物については、全体として低率ではあるが、2004年から2006年にかけて増加し、2009年では低下した。何らかの薬物を一度でも経験した者は2009年、男子1.1%、女子で0.6%であった。各薬物の乱用経験もほとんどの薬物で2009年は低下したが、女子のMDMA乱用経験のみは低率ではあるが2009年にむしろ増加した。2.韓国及びベトナムにおいて同様に調査を行い、我が国および欧米などの国々と比較した。喫煙経験はベトナム高校生は13.6%と我が国とほぼ同率であったが、韓国はこれより高く30.3%であった。飲酒率は、ベトナム62.7%,韓国61.6%であり、我が国の56.7%よりやや高い。両国の違法薬物乱用経験は欧米に比べて著しく低いが、我が国より高い。最も広く乱用が行われている大麻生涯経験率はベトナム2.0%,韓国0.7%,日本0.4%であり、これに対して米国の17歳では45.5%であった。3.薬物の危険性に対する知識、乱用に対する態度を分析し、我が国の高校生のほとんどがその危険性よく理解し、乱用について拒否的な厳しい態度をもつことが明らかになった。4.上記をまとめ報告書を作成するとともデータ・アーカイブを構築した。青少年の薬物乱用の実態とその背景要因について、国際比較を行うために本年度はベトナムで大規模調査を実施した。社会主義国での調査には困難が伴うが現地の協力を得て実施できた。本調査によって、ベトナムの青少年の薬物乱用の実態を初めて明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、平成21年度から24年度の4年間の計画である。これまで順調に研究を進めることができ、平成24年度は最終年度となる。
情報量フィードバックによるヘリコプターの衝突回避制御則に関する研究

本研究の目的である情報量フィードバックを用いた衝突回避制御とは、周辺領域に存在する航空機の有無を判断する情報量を航空機の位置制御にフィードバックする制御である。より確実な情報を得るために、情報量のダイナミクスを利用して積極的に位置を変更し、不確定情報を低減することにより衝突の危険性を回避する制御手法である。要求された情報量を確保する経路をフィードバックで得ることにより、危険を回避することができる。研究は段階を経て進められ、それぞれの成果を蓄積して、最終的なヘリコプタの衝突回避側に至った。第1段階では、情報の獲得がフィードバックで可能であることを示した。1入力の固定翼機モデルで確認して、2入力のヘリコプタへ応用した。第2段階では、衝突回避則を組み込んで、安全性の向上を確認した。この段階も、固定翼機からヘリコプタへ至る成果を積み上げた。最終結果は良好に得られ、平成20年度に成果発表を行う予定である。さらに発展して、最適な回避経路を数値計算により求め、得られた最適経路に追従して、安全な回避を行う制御系の設計を試みた。そのために、実時間で最適経路を求める計算アルゴリズムの検討を行った。通常の最適経路を求めるアルゴリズムでは、繰り返し計算が必要であり、経路が確実に得られる保証が低い。それに対して本研究で用いたアルゴリズムは、定積分で経路を求めるホモトピー法である。非線形問題を近似せずに経路を得るために、有限回の計算量であるだけでなく、解が得られる範囲が広い特徴があることが研究成果として示された。本研究の目的のひとつである情報量フィードバックを用いた衝突回避制御とは、周辺領域に存在する航空機の有無を判断する情報量を航空機の位置制御にフィードバックする制御である。より確実な情報を得るために積極的に位置を変更し、不確定情報を減らして衝突の危険性を回避する制御手法である。研究の初年度である本年度はソフトウエア環境の整備に重点が置かれ、制御系設計ツールで設計された制御系をシミュレーションツール上で実施するなど基本動作を確認した。最適軌道計算では、個人的に開発し使用している傾斜法をオペレータ負荷の低減を目的とした改良のほかに、搭載性を考慮してホモトピー法によるアプローチを開始した。当手法は二点境界値問題で与えられる最適解の必要条件を、差分方程式により非線形連立方程式へ変換して解くものである。非線形問題を近似せずに解を得るため、定積分で最適解が得られ、有限回の計算量で解が得られる特徴がある。定積分実行中に発生する特異点を回避する定式化を提案し、随伴変数の初期仮定解を自動で求めるアルゴリズムの検討を行った。その結果、初期仮定解を最適解近傍に設定する必要など間接法特有の問題点は指摘されたものの、当初の目的である解法の確立は達成できた。次年度以降は本手法を用いてヘリコプタの最適回避軌道の生成を試み、良好な結果が得られれば、搭載を考慮した実用例を試みる。数値流体解析の面では、非構造格子を活用した計算手法の精度に関する研究発表を行ったほかに、次年度以降に向けてのソフトウエアの開発を進めた。

それに対して本研究で用いたアルゴリズムは、定積分で経路を求めるホモトピー法である。非線形問題を近似せずに経路を得るために、有限回の計算量であるだけでなく、解が得られる範囲が広い特徴があることが研究成果として示された。さらに、随伴変数の初期仮定解が必要な間接法から、物理量のみを仮定すれば解が得られる直接法のアルゴリズムの開発に着手した。それらの実証のために、ヘリコプターの剛体運動方程式を用いたシミュレーションツールを作成し、搭載を考慮した応用例を求める準備を行った。さらに、屋内で飛行可能な模型ヘリコプターを整備し、画像情報を用いた制御実験を行う準備も並行して行った。これらの成果を次年度は統合して、数値シミュレーションによる実証と模型実験による実証を並行して行う計画である。本研究の主目的である惰報量フィードバックを用いた衝突回避制御とは、周辺領域に存在する航空機の有無を判断する情報量を航空機の位置制御にフィードバックする制御である。より確実な情報を得るために、情報量のダイナミクスを利用して積極的に位置を変更し、不確定情報を低減することにより衝突の危険性を回避する新たな制御手法である。要求された情報量を確保する経路をフィードバックで得ることにより、安全に危険を回避することができる。この制御方針を数値計算により実証することを目的として研究を進めた。まず、第一段階として、情報量のダイナミクスから要求された情報量を確保する制御系設計を行った。ヘリコプタの進行方向に安全を確保するための領域を設定し、障害物等で情報が得られない領域を除くことで、得られた情報量を定義する。その情報量がヘリコプタの速度並びに方位角が変化することにより変化するダイナミクスを導き、これから要求された情報量を獲得する制御系を導出した。数値計算結果は任意の情報量が獲得可能であることを示した。次に、回避則を組み込み、情報量獲得の有効性を確認した。情報量を獲得することで安全な衝突回避が可能であることを示した。回避の安全性を表す最接近距離は、情報量の獲得を行うことで2倍にも増加することが確認された。さらに、屋内で飛行可能な模型ヘリコプタを整備し、画像情報を用いた制御実験を行う準備も並行して行った。ヘリコプタの飛行は周囲の風等の影響を受け得やすいため、実フライトによる実証を行うためである。実際の飛行実験は将来の課題として残されている。
卵巣癌の腹水産生・腹膜播種のメカニズムとその制御

3種のヒト卵巣癌細胞株HTBOA, HNOA, AMOC-2における遺伝子発現をNorthern blot, RT-PCR法により解析した.それらの細胞生物学的特性を解析するためにヌードマウスを用いたヒト卵巣癌腹水モデルを作成した。その結果,AMOC-2では、血管新生因子であるVascular endothelial growthfactor (VEGF)の発現はみられなかったが、E-Cadherinは発現していた。この細胞はIn vivoでは腹水産生がみられず、単一の大きな腫瘍を腹腔内に形成した。VEGFを発現するHTBOAとHNOAはマウスに著明な腹水を形成した。HNOAはE-Cadherinの発現がみられず早期に腹膜播種病変を形成した。これらの結果からVEGFは卵巣癌の腹水産生に関与し、E-Cadherinは腹膜播種病変の形成に関与していることが示唆された。さらにCMVプロモーターをもつpcDNA3に組み込んだVEGFのアンチセンスプラスミドを作成しHTBOA細胞に遺伝子導入した。その結果、腹水産生を短期的に抑制することができた。さらにHTBOAの分子生物学的特性を解析するために、VEGFレセプターのflt-1,KDRの発現を調べた。HTBOAはflt-1を発現しており、VEGFアンチセンスにより増殖抑制がかかることよりVEGFのautocrine loopの存在が示唆された。また、HTBOAにおけるVEGF発現のホルモン調節についても検討した。HTBOAはゴナドトロピン放出ホルモンレセプター(GnRH-R)を発現しており、GnRHアゴニスト投与による腹水産生の抑制効果をマウスモデルを用いて検討した。その結果、GnRHアゴニスト投与により腹水産生の抑制が見られた。これが、GnRH-Rを介した直接作用かエストラジオールの抑制によるものかは現在検討中である。ヒト卵巣癌細胞株HTBOAにおける遺伝子発現をNorthern blot,RT-PCR法により解析した.その結果,HTBOAは血管新生因子であるVascular endothelial growthfactor(VEGF)とそのレセプターであるflt-1の両者を発現していることが明らかになった.さらにこの細胞はゴナドトロピン放出ホルモンレセプター(GnRH-R)も発現していた.5-6週齢のヌードマウスに1x107個のHTBOA細胞を腹腔内に接種した実験モデルを使用した。このモデルでは約2週間で高率に血性の腹水を産生した.VEGFを産生するHTBOAが形成した腫瘍は微小血管数が他の細胞に比べて増加していた.マウスに産生した腹水中のVEGF濃度をELISA法により定量したがHTBOAマウスの腹水のVEGFは高濃度であった.さらに腹水中のVEGFの血管透過性亢進能を調べるために、色素漏出による血管透過性の評価としてMile's assayを行い血管透過性が亢進していることを証明できた.また,癌細胞接種週間後よりGnRHアゴニストの投与を開始し対照群と腹水の産生量、腹腔内腫瘍の量、腸間膜への播種病変の数を調べた.コントロール群では8/10のマウスに腹水を産生させたのに対して,GnRHアゴニスト投与群では2/10のマウスにのみ腹水を認めた.このようにヒト卵巣癌の腹水産生にはVEGFが重要な役割を担っていることが明らかになった.現在,HTBOA細胞におけるVEGFの転写制御について解析中である.3種のヒト卵巣癌細胞株HTBOA, HNOA, AMOC-2における遺伝子発現をNorthern blot, RT-PCR法により解析した.それらの細胞生物学的特性を解析するためにヌードマウスを用いたヒト卵巣癌腹水モデルを作成した。
カイニン酸てんかんモデルによる海馬錐体細胞のApoptosisへの誘導

(カイニン酸てんかんモデルの作成)雄Wistar系ラットを用い、ネンブタール麻酔下、定位的に外径0.6mmのステンレスパイプを左扁桃核に刺入しデンタールセメントにて頭蓋に固定した。1週間以上の回復期間を置いて、無麻酔・無拘束下に外筒に沿って0.3mmのステンレスパイプ(内筒)を挿入し、リン酸緩衝液に溶解したカイニン酸を1ug/u1徐々に注入した(5分間)。このモデルは、カイニン酸注入後1725日で自発性辺縁系発作が誘発され、23カ月で二次性全般化発作を来すようになる。病理学的には扁桃核の局所性壊死と周囲のグリオーシスの他に、海馬の主としてCA3と部分的にCA4に神経細胞の脱落を認める。(Apoptosisの検出)上記カイニン酸てんかんモデルラットの海馬を経時的に摘出し、錐体細胞由来の核DNAがヌクレオソーム単位で断片化(fragmentation)されるか否かをアガロースゲル電気泳動法により解析を行った。ネンブタール痲酔下、生理食塩水にて灌流し摘出した脳を約1mm間隔でスライスし、手術用顕微鏡下に海馬をCA1・2、CA3・4に分離させ凍結保存する。カイニン酸注入後1h,3h,6h,12h,24h,2日,3日,4日後に各々2匹分の海馬よりDNAを抽出し電気泳動を行ったがfragmentationは観察されなかった。現在、5日目以降について検索中である。
居住空間構成法による図式の発達に関する研究

居住空間構成法および描画を用いて、幼稚園児に自分の好きな幼稚園を制作してもらう実験を、3年間にわたり延べ70回行った。それと同時に風景構成法も行った。彼らの居住空間構成法作品の分析、および描画や風景構成法との比較から以下のような知見が得られた。1.居住空間構成法の空間構成は、構造化された意味のある場を持たないものと持つものという二つに大きく分けることができた。また作品群は、「原初的」「場の発生」「囲いと場の共存」「壁による全体統括」の四つの段階に大別することができた。これら居住空間構成法の空間構成から、園児らの心の中にあると想定される偏在、一様分布、正面性保持、方向性保持、原初的囲い、列状、家具類のみで場を構成する図式、完全囲いや完全囲い群を構成する図式、全体を包括的に囲う図式、室や廊下や玄関によって全体を構成する図式を抽出した。2.描画の作品群は居住空間構成法に対し、「原初的」「構成的萌芽」「構成化」「空間的統括」の四つの段階に大別することができた。居住空間構成法の空間構成と描画の特徴との比較により、それぞれの表現技法を越えたところで、両者に共通の図式を取り出すことができる。比較により、構造化前における囲う図式、同じものを繰り返し配置する図式、ものを自分に対面させて配置する図式、空間構成や表現様式が共に構造萌芽する図式、内外空間を区別する図式、建物やその内部空間などを典型的記号で示す図式、空間全体を統括する図式を抽出した。3.風景構成法の作品構成が、居住空間構成法や描画とやおおよそ対応していることが判明した。居住空間構成法は、著者らの開発によるもので、1/50の家具や人形、モジュール化された様々の大きさの壁などをホワイトボード上に配置して、具体的な生活空間を被験者に自由に表現してもらう方法である。その目的は治療ではなく、生活空間の潜在的な図式の解明にある。ホワイトボード上に具現化された道具の、構造化された配置、空間構成から、その背景にある潜在的な図式を解明する。本研究はこの方法によって3才から6才までの幼稚園児、約30人による約40回ほどの実験を行い、その結果を考察した。実験結果の作品から感じられる特徴的な空間構成には以下のものがあった。偏在、一様分布、原始的囲い、正面性保持、方向保持、列状、家具による場の構成、出入り口的壁、衝突的壁、連続的壁、不完全囲い、完全囲い、不完全室群統括、包括的室、室群統括、廊下のある室群統括などの空間構成である。以上の空間構成を顕現させた諸々の図式とその互いの関係は以下の通りである。1)場の意味が構造化されていない時の図式については、以下のものがある。道具の分布に関する偏在と一様分布、道具の方向に関する、正面性保持、ボードの枠の方向性保持がある。また原始的囲い、列状は分裂病者や知的障害児と同様に現れる。2)場の意味が構造化されている時の図式には以下のものがある。家具による大小様々な場の構成、これに壁が衝立や出入り口として、或いは壁のままL字型、コ字型に組み合わされる図式、さらにこの形式で広い範囲の複雑な空間まで構成されるものもある。全体を包括的に囲う図式もある。一方、家具によらず壁を抽象的に組み合わせて、最初から室や室群、さらに玄関や廊下によって全体を構成する図式がある。居住空間構成法は著者らの開発したもので50分の1の家具や人形、モジュール化された様々な大きさの壁などをホワイトボード上には配置して、具体的な生活空間を被験者に自由に表現してもらう方法である。

その目的は治療ではなく、被験者の生活空間にかかわる潜在的な図式の解明にある。ホワイトボード上に具現化された空間構成の構造や内容から、人間が空間を認知する時の基本的な図式やその発達過程を明らかにする。本研究はこの方法にもとづいて3歳から6歳までの幼稚園児の実験を行い、その結果を考察したものである。本年度は昨年度までの40人の幼稚園児に加えて、さらに20人の実験を追加した。これにより従来の結果をより詳細に検討し、なおかついくつかの新たな知見を付加した。本年度までに判明したことは、以下の通りである。空間構成にはほぼ発達の順に、偏在、一様分布、原始的囲い、正面性保持、方向保持、列状、家具場、出入口的壁、衝立て的壁、連続的壁、不完全囲い、完全囲い、包括的囲い、室群統括などの多様な構成があることが判明した。これらの構成は以下の諸段階に、分類される。原初的段階には、偏在や一様分布、正面性保持、原始的囲い、列状など。次に家具による場の構成の段階がある。ここでは壁を衝立などの具体的なものとして使用し、やがて壁の抽象的操作によって室を構成する段階がある。さらに廊下が室を結ぶ統合的段階に発達することを明らかにした。さらに幼稚園の描画、風景構成法などの実験を併用した。その結果描画による空間構成と居住空間構成法のそれが大まかに対応していることが判明した。筆者が開発した居住空間構成法を用いて、幼稚園児に自分の好きな幼稚園を制作してもらう実験を行った。本年度は昨年度までの60人の幼稚園児に加えて、新たに10人の実験を追加した。さらに昨年度からはじめた描画や風景構成法との比較考察も行った。彼らの居住空間構成法作品の分析および描画や風景構成法との比較から、新たに以下のような知見が得られた。1.描画の作品群は、なぐり描きや円を反復する「原初的」段階、円を組み合わせた人物画や四角・三角などの幾何学的図形を反復する「構成的萌芽」の段階、四角・三角などの幾何学的図形を組み合わせた組立画や三角屋根の家の様式、四角の中に要素を描く四角領域などが描かれ内外空間が区別される「構成化」の段階、地面を表す基底線や平面図的様式が描かれ要素間相互の関係付けがなされる「空間的統括」の段階の四つに大別することができた。これら描画の作品特徴は、居住空間構成法の空間構成に対応することが明らかとなった。居住空間構成法の空間構成と描画の特徴との比較により、それぞれの表現技法を越えたところで、両者に共通の図式を取り出すことができる。比較により、構造化前における囲う図式、同じものを繰り返し配置する図式、ものを自分に対面させて配置する図式、家具類の関係や幾何学的線の組合せによる描画など構造的関係性が萌芽する図式、内外空間を区別する図式、建物やその内部空間などを典型的記号で示す図式、空間全体を統括する図式を抽出した。2.風景構成法との比較により、居住空間構成法で「囲い」が出てくる、あるいは描画で内外空間が区別されるようになると、風景要素間の関係が発生するという対応が判明した。
抗菌性ペプチドをベースとした世界初のエンドトキシンショック治療薬の開発

抗菌性ペプチド・タキプレシンIの1位のリシンをアルギニンに置換したK1R-タキプレシンIをFmoc固相法で合成し、DMF溶液中で3当量のポリエチレングリコール(PEG)化試薬と50°C、10時間反応させ、平均分子量1万と、2万のPEGをN末端に付加した。まず、大腸菌由来リポポリサッカライド(LPS)への結合性をトリプトファンの蛍光変化を指標として、K1R-タキプレシンIと比較した。結合定数はK1R-タキプレシンIが10^7M^-1ののオーダーであったのに対し、PEG修飾体では1/10に低下した。次に、RAW264.7マクロファージに対する細胞毒性をWST-1法で調べたところ、K1R-タキプレシンIが5μM以上の濃度で強い細胞毒性を示したのに対し、PEG修飾体は、PEG分子量依存的に細胞毒性が低減した。平均分子量2万の修飾体では、100μMでもほとんど毒性を示さなかった。最後に、エンドトキシンショックの治療効果の指標となるLPS刺激による炎症性サイトカイン・TNFαの産生に及ぼすペプチドの効果をRAW264.7マクロファージを用いて調べた。K1R-タキプレシンIは5μMの濃度で、ほぼ完全にTNFα産生を抑制したが、PEG修飾体では、PEG分子量依存的に効果が減少し、平均分子量2万の修飾体では、ほとんどTNFα産生抑制作用を示さなかった。以上から、タキプレシンIのPEG修飾によって治療係数はあまり改善されないことが明らかになった。抗菌性ペプチド・タキプレシンIの毒性を軽減するため、N末端にポリエチレングリコール(PEG)修飾を行うが、タキプレシンIは1位にリシンを含むため、リシン側鎖にもPEG修飾が起こる可能性がある。そこで、1位のリシンをアルギニンに置換したKIR-タキプレシンIをFmoc固相法で合成し、大腸菌由来リポポリサッカライドへの結合性をトリプトファンの蛍光変化を指標として、タキプレシンIと比較した。結合定数はいずれも10^7M^<-1>のオーダーであったことから、K1R-タキプレシンIをベースとし、PEG修飾を行うこととした。K1R-タキプレシンIを平均分子量2万のPEG化試薬とジメチルホルムアミド中で反応させ、逆相HPLCとイオン交換クロマトグラフィーで精製した。平均分子量1万のPEG化試薬を用いた場合には、精製が困難であったため、合成法を再検討中である。一方、抗菌性ペプチドがほ乳類細胞に及ぼす毒性の詳細な機構を明らかにするため、最も代表的な抗菌性ペプチドであるマガイニン2とCHO細胞との相互作用を調べた。マガイニン2は巨大な孔を細胞膜に形成し、膜脂質のフリップフロップを引き起こして、細胞毒性を発現することが分かった。さらに、従来から溶血性を持たないとされたマガイニンに溶血性があることも見いだした。また、マガイニン2の種々の誘導体を合成し、生物活性を評価したところ、抗菌力を保持したまま細胞毒性を低減させるには、正電荷を増やすと同時にプロリンを導入することが有効であることを明らかにした。
科学技術社会論と技術者倫理学を統合するための科学哲学的研究

今年度は、工学教育と技術者教育のあり方の比較検討と、技術者倫理事例の科学技術社会論による分析を中心に研究し、その成果を論文および共著書として発表した。1.『科学技術社会論』第3号に掲載された論文では、これまで工学教育が学問の伝授として行なわれてきたのに対し、技術者教育では専門職の育成が必要になり、専門職倫理である技術者倫理の教育が重要になることを指摘した。さらに、技術者倫理教育に科学技術社会論が必要なことを、技術者倫理のあり方をその成立期から近年まで詳しく分析することで明らかにした。3.『社会と倫理』17号に掲載された論文では、技術者倫理の典型事例を、科学技術社会論を用いて社会的文脈に位置づけて検討した。そこから、公衆の安全・健康・福祉という技術者倫理の理念を技術者が実践するには、閉ざされがちな組織構造に外部の視点を導入することによって、事故につながる技術的逸脱を標準化してしまわないようにすることが重要だと指摘した。4.『誇り高い技術者になろう』で担当した章においては、有名事例の科学技術社会論による分析を教材化し、公衆への責任を技術者が果たすためには、日常的な業務の中に潜んでいる技術災害に繋がりかねない事項の芽を摘んでおくことが重要である、という知見を紹介した。今年度の補助金は、これらの研究を遂行するために、技術者教育・技術者倫理学・科学技術社会論にかんする文献購入費、論文を発表する学会参加のための旅費、研究の成果を蓄積するコンピュータのための設備備品費に主に当てられた。
都市計画の遺産的価値継承を狙いとした社会的プレゼンテーション手法の構築

本研究は、我が国の都市計画がこれまでにつくりだしてきた都市空間の遺産的価値を探求し、そうした遺産的価値を市民に対して伝えていく手法(本研究では「社会的プレゼンテーション手法」と呼ぶ)を実践的に構築し、把握することを目的としている。具体的には、中四国の地方都市を対象として、都市計画によって生み出された都市空間の遺産的価値を歴史的・技術的・空間的観点から評価し、シンポジウムや小冊子、Webサイトを通じてこれらを積極的にプレゼンテーションし、社会実験的にこれらの手法の有効性を検証することを狙いとしている。初年度となる本年度は、主に高松の都市計画史を対象とした史料調査を実施し、特に、現在の都市空間の基盤となる近世期の都市形成に着目した史料収集を行った。また、社会的プレゼンテーションの手法に関して、連動して研究活動を進めている「パブリック都市計画史の理論的・実践的探究」の一環として企画・実践された「アーバニズム・プレイス展2018」に参画し、実践的な知見を得ることができた。こうした研究実践を通じて、これまで歴史的に価値があると評価されてきた建物や施設単体のみならず、それらを包含し支えてきたインフラとしての都市空間に対する遺産的価値を再評価する運動に貢献したいと考えている。本研究では、中四国の地方都市のなかでも、高松、丸亀、今治を具体的な対象地として、都市計画の遺産的価値継承を狙いとした社会的プレゼンテーションの手法開発を実践的に研究していくことを念頭に置いて、研究活動に取り組んでいるところである。初年度は、研究対象地の都市計画史を把握することを目的として史料調査等を進めている。研究の進捗具合としては、おおむね計画通りであると考えている。初年度は、研究対象地の都市計画史を把握することを目的として史料調査等を進めているが、各都市における戦前都市計画関連史料は必ずしも豊富にあるわけではなく、研究対象を広げていくことは困難となってきた。そこで、今後の研究方針としては、価値継承を狙いとした社会的プレゼンテーション手法の研究に軸足を移し、欧米諸都市や国内都市・地域での事例調査・情報収集を行い、当面は高松を対象とした都市計画遺産の社会的プレゼンテーションに関して、地元との関係性構築や実験的な手法開発に関して調査を実施していく計画である。当初計画では高松、丸亀、今治を対象として検討を進めていたが、前述のとおり戦前期の都市計画史料が乏しいため、当面は高松を対象とした研究を進めている。そのため、当初の予定よりも費用がかからなかったため。
細胞分裂時の細胞形態変化を制御するメカノセンシングシステム

細胞は自分の形をモニターしており、変形し過ぎた場合にはそれを戻すようなフィードバック機構があるに相違ない。このような機構が細胞の形態を維持し、細胞質を等分に分割することを補償するシステムではないかと考え、本研究ではこの分子機構を解明することを目的として行なった。メカノセンサーとしてアクチン繊維が機能していること, PTEN,ミオシンが関与することが分かった。これらの異常は最終的に細胞質異常を引き起こす結果となった。このような機構が細胞の形態を維持し、細胞質を等分に分割することを補償するシステムではないかと考え、本研究ではこの分子機構を解明することを目的とする。1)細胞を細いガラス管で吸引した時、吸引された細胞質は吸引され続けるのではなく引き戻そうとする。この時、ミオシンが吸引された細胞質の先端に集合し、そのモーター活性が働いて引き戻す力を発生している。2)分裂細胞の上から寒天のシートをかけて物理的圧力を加えると分列面でのミオシンの集合量が増加する。3)発癌抑制因子であるPTENはミオシンと同じように分裂細胞では分裂面に局在がみられる。PTEN遺伝子欠損細胞では分裂面に集合するミオシン量が減少した。PTEN欠損細胞では吸引実験でミオシンの集合がみられない。また、ミオシンに先立ち吸引細胞質先端に集合することから、PTENはメカノセンシング時のミオシンの集合の制御する上位シグナルであると考えられる。4)最近、ミオシンの分裂面での滞在時間が極に比べ長いことがわかってきた。これがミオシンを分裂面に集合させるための1つの機構と思われる。連携研究者の上田との共同研究で、ミオシンの頭部のみを持ち、かつアクチンへの結合時間が長い変異ミオシンにGFPをつけた遺伝子をミオシン欠損の粘菌細胞で発現させた。このミオシンは野生型のミオシンよりも分裂面に多く局在した。分裂面の機械的な力とアクチンの構造、ミオシンの結合量には関連性があり、今後詳細に検討したい。細胞質分裂は細胞分裂にとって必須の過程であり、ほぼ100%の確率で細胞は細胞質分裂を成功させることができる。細胞が分裂を確実に成功できるのは、何重もの補償機構が働いているからであると考えられる。本研究では、細胞質分裂時の細胞質を等分に分配する機構として、ミオシンをメカノセンサーとしたメカノセンシング機構を提案する。センサーとしてのミオシン分子の作動機構、メカノフィードバックの機構について解明するとともに、細胞がどのように自分の形をモニターし、形態を維持しているかという細胞生物学の基本的なテーマの解明もめざすことを目的に研究を推進する。繊維化ミオシンの関与の検証ミオシンは双極性の繊維(ポリマー)を形成することで、アクチンと相互作用して細胞分裂のための力を出すことができる。ミオシンがセンサーとして働く揚合、アクチンと相互作用できる繊維状態である可能性が高い。繊維化は、ミオシンの重鎖のリン酸化によって調節されている。そこで、リン酸化ができないミオシンやリン酸化したのと同じような負電荷を与えた変異ミオシンをミオシン欠損細胞に形質導入し、メカノセンシングにミオシンのポリマー化が必要かどうか検証した。改変ミオシン分子による解析筋肉での実験からミオシンに張力がかかると、ATP分解サイクルのADP releaseが遅くなるため、アクチン繊維との結合時間が長くなることが知られている。これが張力に対する抵抗として働くと考えられている。ミオシン分子の持つこのようなメカノセンサーとしての働きが重要であるかを検証している。アクチン繊維がセンサーである可能性の検証アクチン繊維が張力を受けて伸びるとそのピッチが変化するが,その結果ミオシンとの相互作用が変化することで,ミオシンが結合しやすくなる可能性を新たに検討している。ミオシンS1のアクチンとの結合時間を長くなるように変異を起こさせた後GFPを結合させて細胞で発現させると,アクチン繊維とほぼ同じ分布を示すようになるが,Ratio imagingの結果,細胞内で張力を発生している場所でミオシンS1が多く局在することが分かってきた。細胞は自分の形をモニターしており、変形し過ぎた場台にはそれを戻すようなフィードバック機構があるに相違ない。このような機構が細胞の形態を維持し、細胞分裂時には細胞質を等分に分割することを補償するシステムではないかと考え、本研究ではこの分子機構を解明することを目的として行なった。3),発癌抑制因子であるPTENはミオシンと同じように分裂細胞では分裂面に局在がみられる。PTEN

遺伝子欠損細胞では分裂面に集合するミオシン量が減少する。PTEN欠損細胞では吸引実験でミオシンの集合がみられない。また、ミオシンに先立ち吸引細胞質先端に集合することから、PTENはメカノセンシング時のミオシンの集合の制御する上位シグナルであると考えられる。4)細胞分裂時,FRAPなどの結果から,ミオシンの分裂面での滞在時間が極に比べ長いこがわかった。これがミオシンを分裂面に集合させるための1つの機構と思われる。5)アクチン繊維は機械ストレスで伸長すると,ピッチが変化する。一方,この変化で,アクチン結合タンパク質はアクチン繊維結合が変化することが知られている。このことは,アクチン繊維がストレスセンサーとして機能する可能性を示唆している。そこで,ミオシシの頭部Slを細胞に発現させると,,S1はアクチンに近い分布を示すが,アクチンとのRatio像から細胞内でよりストレスを受けていると思われる部位,例えば分裂面などにS1がより集まる結果を得た。このことは,細胞内でアクチン繊維がストレスで伸長する部位にミオシンが集合できる可能性を示している。
エキソーム解析と細胞形質評価によるフックス角膜内皮ジストロフィの病因と病態の解明

本研究では、フックス角膜内皮ジストロフィ(Fuchs corneal endothelial dystrophy, FECD)の病因や病態の解明を目指し、日本人FECD患者55検体と対照群445検体による関連解析を実施した。その結果、既に白人で報告されているTCF4遺伝子上のバリアントは日本人ではバリアントではないことが判明した。一方、これまで報告されていない日本人固有のバリアントが存在するFECD関連領域を第6番染色体上に同定することに成功した。本研究成果は、人種間で発症機序が異なることが示唆されるFECDの病因/病態の解明に向けた基盤となる成果である。2015年3月末日時点において、ケース群由来の血液検体を58検体収集し、ゲノムDNAを抽出すると共に細胞株を樹立化した。ゲノムDNAは-80 ̊Cの超低温冷凍庫に、Epstein-Barr(EB)ウイルス感染により樹立した細胞株は2週間培養後に液体窒素タンクにそれぞれ保管を完了した。また、検体に付随する臨床情報については、全データを電子化し、データベースへの登録を完了した。一方、コントロール群の検体については、年齢が60歳以上で角膜に異常が認められず角膜内皮細胞密度が2,000 cells /mm2以上の検体を抽出した(目標検体数:約500検体)。更に、ケース・コントロール群由来のジェノタイプデータに基づくゲノムワイド関連解析の実施に向けて、Infinium HumanCoreExome BeadChipsを用いた実験データの取得およびデータ解析の環境整備を実施した。次に、整備した環境下においてコントロール群・48検体を用いて予備的な実験データの取得を試みた。その結果、全検体について精度の高い(call rate: ≥99.9%)ジェノタイプデータを取得することに成功した。今後は、ケース群の検体を引き続き収集していくと共に、順次次世代エキソームアレイによるジェノタイプデータの取得実験を行い、ゲノムワイド関連解析を実施していきたいと考えている。本年度は、Fuchs角膜内皮ジストロフィ(FECD)のゲノムワイド関連解析に向けて、イルミナ社のエキソームアレイ(Infinium HumanCoreExome BeadChip)を用いて、FECD患者・58検体および正常コントロール・470検体、総計528検体分のジェノタイプデータを取得し、高精度なジェノタイプデータの抽出を試みた。まず全血350 uLより全自動核酸抽出装置を用いてゲノムDNAを抽出した。次に、NanoDrop ND-1000により吸光度を測定し、ゲノムDNAの品質検定と定量を行った。いずれの検体も品質検定を通過したので、プロトコールに従い、ゲノムDNAを前処理した後にエキソームアレイにハイブリダイズした。16時間のハイブリダイゼーション後にアレイを洗浄・染色し、HiScanシステムのスキャナーを用いてスキャンした。最終的に、イルミナ社が供給しているソフトウェア・GenomeStudioを用いて、測定した蛍光強度データをジェノタイプデータに変換した。取得した生データから高精度なジェノタイプデータを抽出するため、以下の品質検定を実施した。まず、コールレートが99%以下の検体および臨床情報とジェノタイプ情報における性別判定不一致の検体は除外した。さらに、IBD/IBS解析を実施し、血縁関係が認められた複数の検体についてはその一部を適切に除外した。次に、バリアントのアノテーション情報を付加して、常染色体上、マイナーアレル頻度1以上、バリアントコールレート90%以上、コントロール集団中のハーディ・ワインベルグ平衡検定によるP値が0.005より大きいバリアントを抽出した。一連の品質検定の結果、最終的には総計505検体(FECD患者・55検体および正常コントロール・405検体)について、257,578バリアント/検体を獲得するに至った。フックス角膜内皮ジストロフィ(FECD)の原因究明を目的とした遺伝子解析としては、本研究の背景となった欧米における解析結果より、COL8A2、TGF4、TCF8などの候補分子が報告されている。本研究においては次世代エキソームアレイを用いたゲノムワイド関連解析により、日本人のFECD患者に固有な遺伝子上のバリアントを同定し、FECDの病因を究明することを1つの目的としている。一方、フックス角膜内皮ジストロフィの原因究明を目的とした遺伝子解析としてTCF4イントロンリピート配列解析の結果、TCF4イントロンにおけるTGCリピート配列の存在が欧米から報告されている。26年度には同分野の国際的競争の現状を鑑み、日本人の晩発型FECD症例におけるTGCリピート配列の解析を優先的に実施した。そのため、次世代エキソームアレイを用いたゲノムワイド関連解析への着手が遅れた。28年3月までに、総計505検体(FECD患者・55検体および正常コントロール・405検体)について、ジェノタイプデータを取得し、257,578バリアント/検体を獲得するに至っている。本研究は、他人種とは有病率や遺伝的背景が異なることが知られている日本人フックス角膜内皮ジストロフィ(Fuchs corneal endothelial dystrophy, FECD)患者に固有なバリアントを同定することでFECDの病因や病態の解明を目指している。昨年度までに、イルミナ社のエキソームアレイを用いて、523検体分のFECD患者および正常コントロール検体のジェノタイプデータを取得した。さらに厳格な品質管理により、最終的にFECD患者55検体と正常コントロール445検体について総計278,032バリアントのジェノタイプデータを厳選した。