hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生得的学習障害モデルマウスに対する生化学的検討

ddYマウスの一部には生得的学習障害があり、この学習障害はIgGの糖鎖と関りがあること、及び学習障害のないマウスIgGの投与により学習障害が是正されることが判明している。そこで学習障害マウスの電撃ストレスによるニューロトランスミッター及びステロイドホルモンの変化とIgGの糖鎖構造の変化の関係を高速液クロとレクチンを用いて、ELISA法によって解析、及び投与されたIgGの糖鎖がいかなるメカニズムで脳機能に影響を与えるかの解析を行い、以下の成果を挙げた。1.正常マウスと学習障害マウスの全血清中の糖鎖構造比は異なっていた。2.特に、血脳関門と関連の深いルイス-X構造については、学習障害マウス-Xは正常マウスのそれと比べて、糖鎖修飾が著しかった。3.一方、ヒト精神発達遅延者の一部にも学習障害マウスと同様なルイス-Xに対する糖鎖修飾がみられた。4.ルイス-Xの機能から推量して、血小板由来成長因子-BB(PDGF-BB)が学習障害マウスの脳機能に直接影響するのではないかと考え、学習障害マウスにヒトPDGF-BBを投与した。PDGF-BBは用量依存的に学習障害マウスの学習能力を改善した。なお、1.2.3は4との関連が未だ不明確である。しかし、この関連は糖鎖構造と脳機能の関係について、非常に重要な意味をもつものと思われる。今後、より突っ込んだ研究が必要であり、かつその研究も進めている。
粒子衝突および加熱における高配向性セラミックス膜の創生

本研究では、エアロゾルデポジション(AD)法によって結晶方位の揃った高配向なセラミックス膜を実現させるとともに、衝突による成膜に用いた粒子の塑性変形や破壊、高温での変形や成膜後の熱処理に基づいた結晶配向(集合組織)の形成の解明を試みている。さらには、結晶配向が膜の力学特性や耐磨耗性に与える影響についても明らかにすることも試みている。基材としては、SiCやSKH51高速度工具鋼あるいはMoなどを用いており、また、原料粉末(粒子)としては、α-Al2O3やTiN、TiC、WC、ZrB2粉末を用いている。粒径としては粉末の種類に依存するものの、概ね0.2 2.0 nm程度の粒子を用いている。AD法によって結晶方位の揃った高配向なセラミックス膜を実現させるにあたって、種々の条件、特に、キャリアガスのガス種や粒子の寸法、速度、衝突角度、試料とノズル間の距離、膜厚、スキャン速度、加熱温度および成膜後の熱処理温度と時間などの条件と形成される組織や結晶配向との関係について実験的に検討をしている。また、成膜により得られた組織および集合組織の結果から、集合組織の形成にあたって、1)粒子の衝突による塑性変形であるすべり変形、すべり変形+双晶変形、あるいは、破壊、2)基材加熱に伴う粒子の高温変形による動的再結晶、あるいは、3)粒子変形後の熱処理によるひずみ誘起による静的再結晶に起因するのかについて調査をしている。さらには、得られた結晶配向が膜の力学特性や耐磨耗性に与える影響について検討し、結晶配向度と特性の関係を実験的に確認している。昨年度は、α-Al2O3やTiN、TiC粉末を中心として成膜を行った。また、一部、ZrB2粉末を用いた成膜も実施した。α-Al2O3粉末の場合、室温にて成膜を実施すると結晶粒径が20nm程度と微細ではあるものの緻密質かつ結晶質な膜が形成した。基板の加熱により、結晶粒径の寸法は概ね変化はないものの、一部、空隙が存在する不均一な組織が形成する領域も見られた。膜の集合組織に関しては、ガス種およびガス流量によらず、(0001)面が成膜面に15度程度傾いた繊維集合組織が形成されることが見出された。また、ガス流量の増加に伴って、集合組織が発達することも見出された。集合組織の形成がα-Al2O3のすべり系の活動に起因するかを確認するため、簡易的な手法としてシュミット因子を用いて形成される集合組織の極の集積の位置が、変形の安定方位であるかを推定した結果、各すべり系における臨界分解せん断応力を考慮に入れれば、ほぼ同様の集合組織となるため、得られた集合組織は粒子の基材衝突時の変形によって形成されることが推定された。TiN、TiC粉末の場合は、粉末の乾燥環境によって形成される膜の組成が変化する問題が発生した。しかしながら、不活性環境下において処理を行うことによって、そのような変化をEDXレベルでは検出できない状況にすることができた。そのため、成膜にあたって、粉末の乾燥環境が非常に影響する場合があることを新たに見出すことができた。形成される膜は緻密質かつ結晶質であり、形成される集合組織は、非常に弱いながらも変形の安定方位と考えられる方位に主成分の集積が見られた。微小硬度計による硬さ試験では、いずれの膜においてもバルク体よりも低いヤング率が得られた。結晶粒径の寸法が小さいためと考えているが、今後、より詳細な確認を行っていく。また、スクラッチ試験を実施し、評価を行った。本年度は、前年度に引き続き、α-Al2O3やTiN、TiCそしてZrB2粉末を中心に試料作製、評価を実施する。α-Al2O3粉末については、特に成膜後に熱処理を実施し、膜組織の変化および結晶配向の変化について評価を実施していく。熱処理は、大気あるいは真空中で1000°C1400°C, 10200時間の範囲で実施する予定である。集合組織の評価は、さらに一歩進め、結晶粒の変形の連続性を満足させる変形モデル(テイラーモデル)を用いて集合組織形成を検討する。現状、すべり変形のみの考慮であるが、すべり変形と双晶変形の両方が活動した場合について、臨界分解せん断応力の各すべり系による違いも考慮して集合組織の形成を検討する。ブリネル圧子の押込みおよびスクラッチ試験による膜の特性、膜/基材界面の定性的な剥離特性評価と磨耗試験を行い、組織や配向との関連についても継続的に実施する。とくに、基板加熱および熱処理を実施した試料に対しても行っていく。TiN、TiC、ZrB2粉末の場合についても同様に、引き続き、室温にて成膜を実施するとともに、基板加熱による成膜も行い再現性を確認するとともに、熱処理にともなう、膜組織の変化と結晶配向の変化について評価を行っていく。さらには、集合組織形成の検討を行うとおともに、膜の力学特性の評価について実施していく。

基材としては、SiCやSKH51高速度工具鋼あるいはMoなどを用いており、また、原料粉末(粒子)としては、α-Al2O3やTiN、TiC、WC、ZrB2粉末を用いている。粒径としては粉末の種類に依存するものの、概ね0.2 2.0 nm程度の粒子を用いている。AD法によって結晶方位の揃った高配向なセラミックス膜を実現させるにあたって、種々の条件、特に、キャリアガスのガス種や粒子の寸法、速度、衝突角度、試料とノズル間の距離、膜厚、スキャン速度、加熱温度および成膜後の熱処理温度と時間などの条件と形成される組織や結晶配向との関係について実験的に検討をしている。また、成膜により得られた組織および集合組織の結果から、集合組織の形成にあたって、1)粒子の衝突による塑性変形であるすべり変形、すべり変形+双晶変形、あるいは、破壊、2)基材加熱に伴う粒子の高温変形による動的再結晶、あるいは、3)粒子変形後の熱処理によるひずみ誘起による静的再結晶に起因するのかについて調査をしている。さらには、得られた結晶配向が膜の力学特性や耐磨耗性に与える影響について検討し、結晶配向度と特性の関係を実験的に確認している。昨年度は、α-Al2O3やTiN、TiC粉末を中心として成膜を行った。また、一部、ZrB2粉末を用いた成膜も実施した。α-Al2O3粉末の場合、室温にて成膜を実施すると結晶粒径が20nm程度と微細ではあるものの緻密質かつ結晶質な膜が形成した。基板の加熱により、結晶粒径の寸法は概ね変化はないものの、一部、空隙が存在する不均一な組織が形成する領域も見られた。膜の集合組織に関しては、ガス種およびガス流量によらず、(0001)面が成膜面に15度程度傾いた繊維集合組織が形成されることが見出された。また、ガス流量の増加に伴って、集合組織が発達することも見出された。集合組織の形成がα-Al2O3のすべり系の活動に起因するかを確認するため、簡易的な手法としてシュミット因子を用いて形成される集合組織の極の集積の位置が、変形の安定方位であるかを推定した結果、各すべり系における臨界分解せん断応力を考慮に入れれば、ほぼ同様の集合組織となるため、得られた集合組織は粒子の基材衝突時の変形によって形成されることが推定された。TiN、TiC粉末の場合は、粉末の乾燥環境によって形成される膜の組成が変化する問題が発生した。しかしながら、不活性環境下において処理を行うことによって、そのような変化をEDXレベルでは検出できない状況にすることができた。そのため、成膜にあたって、粉末の乾燥環境が非常に影響する場合があることを新たに見出すことができた。形成される膜は緻密質かつ結晶質であり、形成される集合組織は、非常に弱いながらも変形の安定方位と考えられる方位に主成分の集積が見られた。微小硬度計による硬さ試験では、いずれの膜においてもバルク体よりも低いヤング率が得られた。結晶粒径の寸法が小さいためと考えているが、今後、より詳細な確認を行っていく。また、スクラッチ試験を実施し、評価を行った。本年度は、前年度に引き続き、α-Al2O3やTiN、TiCそしてZrB2粉末を中心に試料作製、評価を実施する。α-Al2O3粉末については、特に成膜後に熱処理を実施し、膜組織の変化および結晶配向の変化について評価を実施していく。熱処理は、大気あるいは真空中で1000°C1400°C, 10200時間の範囲で実施する予定である。
びまん性汎細気管支炎の免疫学的・遺伝学的検討

1.びまん性汎細気管支炎(DPB)に対するエリスロマイシン(EM)の作用機序の免疫学的検討(1)末梢血活性化リンパ球に対するEMの効果未治療のDPB患者において、EMによる治療の前後、末梢血中の活性リンパ球の比率をHLA-DRをマーカーとしてFACSにて検討した。その結果、未治療例で高値であった活性化T細胞比率はEM治療により著明に低下し、EMによる活性化リンパ球抑制の可能性が示唆された。(2)ラット肺胞マクロファージのLTB_4産生能に対するEMの効果EMの免疫系への作用を検討する一端として、ラット肺胞マクロファージ(PAM)のLTB_4産生能に対するEMの効果を検討した。EMは100Mg/mlの濃度で6時間の培養により、LTB_4産生を有意に抑制した。(3)14員環系マクロライド、ロキシスロマイシンの効果EMと同じ14員環系マクロライドであるロキシスロマイシンも、EMと同様に未治療DPBに対して著効を示した。(4)シェーグレン症候群の末梢血活性化リンパ球へのEMの効果。肺病変を有するシェーグレン症候群に対してEMの長期投与を行い、前後での活性化リンパ球比率を末梢血において検討した所、DPB例と同様に活性化リンパ球の低下が認められた。2.DPB患者家族のHLA抗原の検討同胞内にDPB患者又は副鼻腔炎(慢性)を有する患者の存在する6家系32名についてHLA抗原の検討を行った。患者以外の慢性副鼻腔炎症状を有する例は32名中13名であったが、そのすべてが、当該家系のDPB患者の有するハプロタイプと同じハプロタイプを有していた。この事実は、DPBの疾患感受性遺伝子(の一部)が、HLA抗原遺伝子の近傍に存在することを強く示唆すると考えられた。1.びまん性汎細気管支炎(DPB)に著効を示すエリスロマイシン(EM)の作用機序から逆に、DPBの病因を推定する目的で、未治療DPB患者のEM使用前後の末梢血リンパ球のサブセットを検討した。その結果、未治療DPB患者では、末梢血中の活性化Tリンパ球の割合が健常人に比し増加しており、特にLeu2a^+の活性化サプレッサ-・サイトトキシックT細胞の増加が顕著であった。さらに、EM使用1ヶ月後、これらの活性化T細胞の割合は減少した。このことから、DPB患者では、何らかの免疫学的過剰反応性が存在し、EMはこれを抑制することにより効果を示している可能性が示唆された。2、血清アデノシン・デアミナ-ゼ(ADA)活性値は、リンパ球活性化の1つの指標とも考えられることより、DPB患者においてADA値を測定した。19例のDPB患者において、11例ではADA値は正常範囲内であったが、8例(42%)においては、異常高値を示した。これらの結果はEMの使用の有無とは関係がなかった。さらに数を増やして検討する必要があるが、この結果もDPB患者における1つの免疫異常のあらわれとして重要であると考えられた。3.家系内に明らかなDPB患者と、不全型ともいえる患者が妹姉である某家系について、HLA抗原の検討を行い、慢性副鼻腔炎をもつ者には同じ抗原が存在することを見出し、さらに調査を続行中である。4.海外のDPB例の調査に関しては、現在、台湾の呼吸器科医師に、当該患者の有無を問い合わせ中で、今後台湾への調査行を予定している。1.エリスロマイシンのびまん性汎細気管支炎(DPB)に対する作用機序の基礎的検討。

ラットの肺胞マクロファ-ジをin vitroで培養し、エリスロマイシンのロイコトリエンB_4産生能に及ぼす効果を検討した。エリスロマイシンと5時間培養することにより、ラット肺胞マクロファ-ジのLTB_4産生能は有意に減少することが認められた。この事はエリスロマイシンの免疫抑制性の働きの一端を示すとも考えられた。2.EMのDPBに対する機序検討の一端として、EMと同じ14員環系マクロライド、ロキシスロマイシン(RXM)の効果の検討。未治療のDPB患者4例に,RXMの常用量の1/2を長期投与し(6ヶ月)、自・他覚症状,XーP,CT,呼吸機能の著明な改善をみた。16員環系マクロライドのジョサマイシンはDPBには無効との報告があり、EMの作用は14員環系に共通のものである可能性も示唆される。3.EMのDPBに対する作用機序解明の一端として、肺病変を伴う、シェ-グレン症候群の患者に対してEMの少量長期投与を行った。その結果、未梢血レベルでのT細胞活性化がEM長期投与により抑制されるとの結果を得た。この事実もEMの免疫抑制性の作用機序を示唆するものと考える。4.DPB家族のHLA解析.DPB患者の家族9名(うち慢性副鼻腔炎3名有)のHLAの検討を行った。現在結果について詳細に解析中である。
イオン照射法によるシリコンカーバイドの照射クリープ機構に関する研究

シリコンカーバイドは高温強度特性に優れるため、原子炉材料としての使用が構想されている。課題は、中性子照射下で低温(400°C)から照射クリープ変形をきたすことであり、これが炉の運転温度を制限する要因になりうる。しかし、提案者は、照射クリープが照射線量に対して敏感に反応する時期は、照射のごく初期のみでありそれ以降は飽和傾向を示すことを報告した。この温度では、照射で形成された5nm程度の格子間原子型の転位ループが支配的な損傷微細組織ですが、ループの優先形成結晶面の同定により、応力が緩和する方位に配列することを見いだしました。これは、安定な微細組織によりクリープも制限されることを示している。シリコンカーバイド(SiC)は高温強度特性に優れる低放射化材料であるため、原子炉材料として使用することが構想されている。課題は、中性子照射下では変形・破壊応力以下でも低温から照射クリープによる変形をきたすことであり、これが炉の運転温度を制限する要因になりうることである。当初、照射線量に対して敏感に反応する時期は、照射のごく初期のみでありそれ以降は飽和傾向を示すと予測しており、これを証明することを第1の目的に、なぜそうなるかを明らかにすることを第2の目的し設定していた。24年度は、照射下で応力を負荷するための試料ホルダの作製、および、照射実験を完了した。また、400°Cから800°Cの照射温度での加速器実験の結果から、1dpaまでの線量で照射クリープがほぼ飽和することを見出した。また、各温度で、照射クリープひずみはスウェリングと線形関係を示すことを明確にした。25年度は400°Cから1000°Cまでの照射温度範囲(100°Cステップ)において最大で3dpaまでの条件で、照射クリープひずみはスウェリングと線形関係を示すことを明らかにした。電子顕微鏡観察から、照射クリープの主要因の一つはフランク転位ループの異方分布にあること、すなわち、応力軸に近い法線ベクトルを持つループが優先的に生成していることによることを見出した。また、核融合環境で想定される核変換ヘリウム生成の模擬であるヘリウムイオン同時照射により、照射クリープに及ぼすヘリウム効果として、クリープひずみを低下させる結果を示した。得られた照射クリープひずみのデータは、SiC/SiC複合材料の各要素(繊維・マトリックス・界面層)間での照射中の寸法変化の差に起因する材料内部の残留応力状態変化の計算に用いられる試みがすでになされており、ITER BA活動などを通じてその結果生じる強度変化の予測にまで拡張される予定である。シリコンカーバイド(SiC)は高温強度特性に優れるため、原子炉材料として使用することが構想されている。課題は、中性子照射下で低温(400°C)から照射クリープによる変形をきたすことであり、これが炉の運転温度を制限する要因になりうる。当初、照射線量に対して敏感に反応する時期は、照射のごく初期のみでありそれ以降は飽和傾向を示すと予測しており、これを証明することを第1の目的に、なぜそうなるかを明らかにすることを第2の目的にしていた。現在までに、照射下で応力を負荷するための試料ホルダの作製、および、照射実験をほぼ完了した。また、上記の各温度で、照射クリープひずみはスウェリングと線形関係を示すことを明確にした。電子顕微鏡観察から、照射クリープの主要因の一つはフランク転位ループの異方分布にあること、すなわち、応力軸に近い法線ベクトルを持つループが優先的に生成していることでることを見出した。当初の目的は、(1)照射クリープの線量依存性についてしらべることと、(2)照射クリープメカニズムの解明であった。1年目に実施予定であった(1)に関しては、0.001dpaから3dpaまでの間で、断続的に照射クリープを測定し、ひずみが飽和傾向を示すことを確認した。また、次年度以降の予定であった(2)に関しても、電子顕微鏡により、転位ループの異方性がそのメカニズムの一端を担うことをすでに確認している。また、当初にはなかったヘリウム効果に関する情報も得られた。照射クリープひずみとスウェリングに線形関係があること、また、その比例定数が照射温度によって決まることは、ある意味意外なことであり、より詳細なメカニズム解明は、この関係にあると考えている。今後は、より低線量で照射クリープひずみとスウェリングを測定し、線形関係が損傷初期(損傷初期に照射クリープの主要因と思われる転位ループの核などの形成が頻繁に起こる)においても維持されているのかどうかを詳細に調べる予定である。

SiCのスウェリングの原因は点欠陥とSIAクラスターの蓄積によるが、これと比較することにより、上記を含めた照射クリープメカニズムのさらに詳細な情報が得られると考えている。また、照射の途中(すなわち、SIAクラスター核生成が終了した段階)で応力を負荷するなど、変則的な照射も計画している。次年度以降も、引き続き照射実験を行うため、加速器の使用料は必ず必要な費用である。また、高純度SiCの調達および試験片加工(外注)も必要に応じて実施する。平成25年度は国際学会(中国・ICFRM16)における発表も予定している。また、微細なSIAクラスターの直接観察を行う場合は、米国・ウィスコンシン大の電子顕微鏡を使用する予定である(昨年も観察を実施している)。
創薬と遺伝子改変技術を用いたNa^+/Ca^<2+>交換輸送体の生理・病態学的役割の解明

Na^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)は、イオン濃度勾配および膜電位に依存して細胞内外のCa^<2+>とNa^+を交換輸送するトランスポーターである。この輸送体には、心筋に豊富に発現するNCX1、脳・骨格筋に特異的に発現するNCX2およびNCX3の3種の分子種が存在する。本研究では、特異的なNCX阻害薬およびNCX遺伝子改変マウスを用いて、この輸送体が関わる細胞生理及び病態を解明し、このNCX阻害薬の薬物治療応用への可能性を追及することを目的とした。NCX阻害薬(KB-R7943とSN-6)の作用特性を解析したところ、KB-R7943はNCX3に選択性が高く、SN-6はNCX1に選択性が高いことが分かった。そこで、NCX1/NCX3のキメラ解析を行ったところ、両阻害薬は異なる部位に作用することが示された。また、変異解析から、両阻害薬はNCXの活性制御機構の一つであるNa不活性化と関連することが示唆された。KB-R7943を用いた薬理学的な機能解析から、KB-R7943は正常時の心機能や血圧に影響を与えずに、心臓や腎臓の虚血再灌流障害を顕著に改善させる効果を有することが明らかになった。また、NCX1ノックアウトマウスを作成しその機能解析を行ったところ、ヘテロ変異型マウスの心臓および腎臓において虚血再灌流障害が起こりにくいことを見出した。これらの結果は、種々臓器の虚血再灌流時にNCXを介する過剰なCa^<2+>流入が起こり、組織障害が引き起こされることを示すとともに、NCX阻害薬が虚血再灌流障害の予防薬・治療薬として有望であることを示唆している。今後、同様の手法を用いて、他の病態とNCX1の関係を明らかにして行きたいと考えている。本研究では、最近我々が見出した特異的なNa^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)阻害薬KB-R7943およびその新規誘導体を用いて、この輸送体が関わる細胞生理および病態を解明し、この阻害薬の薬物治療応用への可能性を追求する。また、分子生物学的なアプローチとして、各NCX遺伝子を欠損させたES細胞およびマウスを作成し、各NCXの分化・発生並びに生体レベルにおける機能評価をおこなう。本年度に行なった薬理学的な機能解析から、KB-R7943は正常時の心機能や血圧に影響を与えずに、心臓や腎臓の虚血再灌流障害を著明に改善させる効果を有することが明らかになった。また、NCX1ノックアウトマウスを作成しその機能解析を行なったところ、ヘテロ変異型マウスの心臓および腎臓において虚血再灌流障害が起こりにくいことを見出した。これらの結果は、種々臓器の虚血再灌流時にNCXを介する過剰なCa^<2+>流入が起こり、組織障害が引き起こされることを示している。さらに、NCX阻害薬が虚血性臓器障害に対する予防薬・治療薬の有力な候補となり得ることを示唆している。今後、この阻害薬とノックアウトマウスを用いて、他の様々な病態を解析し、さらに新しい機能的知見を見出していきたい。また、NCXの構造およびイオン輸送機構に関して変異機能解析を行ない、この輸送体がポアループを持つ9回膜貫通型の構造であることを明らかにし、またそのポアループ領域に存在する輸送イオンや阻害薬の結合に関わる重要なアミノ酸を同定した。

また、リン酸化を介する輸送体制御系について検討を行い、この制御系には直接的な輸送体のリン酸化は関与せず、XIP領域と相互作用する細胞内制御因子が関与することを見出した。現在、この活性制御機構の分子機構を解明するため、この制御因子をクローニングし、輸送体との結合様式、活性化に及ぼす影響を検討中である。Na^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)は、イオン濃度勾配および膜電位に依存して細胞内外のCa^<2+>とNa^+を交換輸送するトランスポーターである。この輸送体には、心筋に豊富に発現するNCX1、脳・骨格筋に特異的に発現するNCX2およびNCX3の3種のアイソフォームが存在する。本研究では、特異的なNCX阻害薬およびNCX遺伝子改変ミマウスを用いて、この輸送体が関わる細胞生理及び病態を解明し、このNCX阻害薬の薬物治療応用への可能性を追及することを目的とした。これまでに、我々はNCX3に選択性を有するNCX阻害薬KB-R7943を開発しているが、本年度において、NCX1に選択性を有する阻害薬SN-6を見出した。この作用部位をNCX1/NCX3のキメラ解析により検討したところ、KB-R7943とは異なる部位であることが示された。また、変異解析から、KB-R7943およびSN-6の阻害活性はNCXの活性制御機構の一つであるNa不活性化と関連することが示唆された。これら阻害薬はNCXの生理機能を解析する薬理学的ツールのみならず、活性制御機構を解析するプローブとしても有用であると考えられた。また、本年度において、NCX1トランスジェニックマウスの開発に取り組み、これまでに2系統の樹立に成功した。さらに、NCX2ノックアウトマウスの開発にも取り組み、キメラマウスを作成する段階にまできた。現在、既に保有しているNCX1ノックアウトマウスとNCX1トランスジェニックマウスを用いて、心臓、脳および腎臓の虚血再灌流障害モデルを作成中である。これまでの結果から、NCX1遺伝子改変マウスでは各臓器の虚血再灌流障害の感受性が変化していることが示された。また、NCX阻害薬が虚血再灌流障害を抑制することも観察した。これらのことは、NCX阻害薬が虚血再灌流障害の予防薬・治療薬として有望であることを示唆している。今後、同様の手法を用いて、他の病態とNCX1の関係を明らかにして行きたいと考えている。
末梢血を用いた液体生検としての胃癌HER2遺伝子増幅解析法の開発

HER2遺伝子の数が増える(遺伝子増幅)ことによるHER2分子の活性化は胃癌悪性化の原因となる。現在手術時組織の胃癌HER2遺伝子増幅症例で、再発時に分子標的治療薬を用いた治療を行うが、HER2陽性と診断されても、全ての癌細胞でHER2増幅が起こるわけではなく、手術時HER2陰性と診断されても、数少ない陽性細胞がその後増殖した場合には有効であるはすの薬の効果が見込めるのにも関わらず使えない。血液中癌由来DNAからDroplet digital PCRを用いてHER2遺伝子増幅を判定する方法は、低侵襲で高感度、高精度な検出を可能にし、再発モニター治療効果マーカーになる可能性がある。通常のIHC(+FISH)法によるHER2診断を行った胃癌患者52名と健常対照者40名を対象とし、腫瘍ならびに末梢血よりDNAを抽出した。HER2増幅解析の参照遺伝子の探索を目的として、各種胃癌細胞株や臨床検体を用いた解析を行いribonuclease P RNA component H1 (RPPH1)が最適参照遺伝子として選択された。続いて、血漿HER2増幅値(血漿HER2:RPPH1比)と通常IHC(IHC2+の場合はFISHも施行)による診断結果との比較検討を行い、両者間に相関を認め、感度・特異度は0.539・0.967であった。また、血漿HER2増幅値とTrastuzumab併用化学療法による治療効果との間に相関も認めた。一方、長期フォローアップ症例においては、血漿HER2増幅値の術後の速やかな低下を確認し、再発症例については、同値がTrastuzumabの治療効果と相関して推移する傾向を認めた。また、Droplet Digital PCR法による解析では、前述のreal time PCR法による解析に比較して高い安定性を示し、感度も高かった。胃癌術後再発例の検討では,切除標本においてHER2陰性胃癌と診断された症例においても、血漿HER2増幅値の陽転化が疑われる症例が存在し、これらの症例において癌の進展に伴い血漿HER2 ratioが継続的に上昇する傾向を認めた.当初、Real time PCR法を用いた解析を行い、Digital PCR法との比較も行ったが、その優位性を確認することはできなかった。しかしながら、続いて行ったDroplet digital PCR法では、高い安定性と感度が確認されたため、今後は同手法を用いて解析症例を増やす予定である。非侵襲的で繰り返し施行可能なLiquid biopsyとしての胃癌血漿遊離DNA中HER2増幅の臨床的意義を報告してきた。今回、前年度までの研究結果をもとに、絶対定量が可能なDroplet digital PCR (ddPCR)を用いて胃癌再発患者を中心に治療モニタリングマーカーとしての臨床的有用性を検討した。対象は30例の健常者、60例の胃癌患者とし、末梢血からの血液サンプルを採取した。胃癌患者については術前と、術後半年毎の血液サンプルから遊離DNAを採取した。HER2の参照遺伝子としてribonuclease RNA component H1 (RPPH1)を用いて、血漿HER2増幅はddPCRを用いたHER2:RPPH1 ratio (HER2 ratio)で算出した。胃癌患者の中で再発を来した17例に関しては治療経過中の血漿HER2 ratioのdynamicsを検討した。血漿HER2増幅のcut-off値は健常者HER2 ratioのmean+2SDを用いた。血漿HER2 ratioは組織HER2ステータスとの有意な相関を認め(p < 0.001)、感度・特異度はそれぞれ0.733、0.933であった。術後モニタリングが可能であった症例に関しては、組織HER2陽性例であった4例において血漿HER2 ratioは治療効果と相関して推移する傾向を示した。組織HER2陰性例においては13例中7例において再発時のHER2 ratioが陽転化し、その後も継続的な上昇を示す傾向を認めた。ddPCRを用いた非侵襲的で繰り返し施行可能な血漿HER2 ratioモニタリングはリアルタイムな患者病態の把握を可能にし、術後治療中患者に対してより多くの治療選択を提示出来る可能性がある。今後臨床応用に向けて更なる研究基盤の確立が必要である。前年度の研究結果をもとにddPCRを用いた解析を引き続き行なったが、再現性を持って患者HER2ステータスを反映している可能性があると考えられた。また絶対定量が可能であるため、今後他施設で行うにあたっても同手法での再現性が得られる可能性が高いと考えられた。Droplet digital PCR (ddPCR)を用いて胃癌再発患者を中心に治療モニタリングマーカーとしての臨床的有用性を検討した。術後モニタリンクが可能であった症例に関しては、組織HER2陽性例の4例において血漿HER2 ratioは治療効果と相関して推移する傾向を示した。

組織HER2陰性例においては13例中7例において再発時のHER2 ratioが陽転化し、その後も継続的な上昇を示す傾向を認めた。血漿HER2が増幅している肝転移症例のHER2 IHC scoreの検討を計画し前向きに症例集積を試みたが、胃癌肝転移切除症例が少ないため症例集積が困難であった。血漿HER2増幅を認めていないが、経過中に肝転移を来し切除施行した症例5例の肝転移巣のIHC HER2 scoreを検討したがいずれも陰性であり、これらの症例については原発巣と転移巣との不一致を指摘することはできなかった。今後臨床応用に向けて更なる研究基盤の確立が必要である。HER2遺伝子の数が増える(遺伝子増幅)ことによるHER2分子の活性化は胃癌悪性化の原因となる。現在手術時組織の胃癌HER2遺伝子増幅症例で、再発時に分子標的治療薬を用いた治療を行うが、HER2陽性と診断されても、全ての癌細胞でHER2増幅が起こるわけではなく、手術時HER2陰性と診断されても、数少ない陽性細胞がその後増殖した場合には有効であるはすの薬の効果が見込めるのにも関わらず使えない。血液中癌由来DNAからDroplet digital PCRを用いてHER2遺伝子増幅を判定する方法は、低侵襲で高感度、高精度な検出を可能にし、再発モニター治療効果マーカーになる可能性がある。前年度の知見を基に、本年度は以下の研究課題について検討を行う予定である。1)進行・再発胃癌における血漿HER2増幅解析のコンパニオンマーカーとしての有用性の検討:HER2陽性進行胃癌とHER2陽性再発胃癌を対象として、治療前の血漿HER2増幅解析結果とTrastuzumabによる治療効果との比較検討から同手法の治療効果予測マーカーとしての有用性を検討する。2)血漿HER2増幅解析法の治療モニタリングマーカーとしての有用性の検討:HER2陽性胃癌における血漿HER2増幅定量値の推移と治療効果との相関について比較検討し、同手法のモニタリングマーカーとしての有用性を検討する。3)血漿HER2増幅解析における治療バイオマーカーとしての研究基盤の確立:切除標本でHER2陰性胃癌と診断され、再発時の血漿HER2増幅解析が陽性となった症例に対して、再発巣の組織採取ならびに同組織中のHER2状態の解析を行う。逆に、HER2陽性胃癌の再発時の血漿HER2陰性化症例についても再発巣の組織採取を試み、組織中のHER2診断を行う。これらの結果から血漿HER2診断の妥当性を検証し、血漿HER2増幅解析の治療バイオマーカーとしての研究基盤の確立を目指す。血漿HER2増幅解析に置ける治療バイオマーカーとしての研究基盤の確立切除標本でHER2陰性胃癌と診断され、再発時の血漿HER2増幅解析が陽性となった症例に関して、再発巣の組織採取並びに同組織中のHER2ステータスの再検を行う。またHER2陽性胃癌の再発時の血漿HER2陰性化症例についても再発巣の組織採取を試みて組織中のHER2診断の再検を行う。
自閉症モデル動物を用いたシナプス機能の修復の研究

自閉スペクトラム症の表現型と、シナプス密度もしくはシナプスの安定性の障害は、密接な関係にあると考えられているが、その詳細な因果関係は明らかになっていない。そこで、我々はげっ歯類よりもヒトに近い自閉症モデルマーモセットを用いて生きた状態で2光子顕微鏡を使用してシナプスの安定性を評価する系を立ち上げることを試みている。自閉症の中核症状に対する効果があるとされる試薬を投与することによって、シナプスの安定性と自閉スペクトラム症の表現型の関係を明らかにし、治療法の改良・開発に繋げたいと考えている。本年度は2光子顕微鏡によるタイムラプス蛍光観察の条件検討を行い、最大3ヶ月以上にわたって同一樹状突起をマーモセットでイメージングすることに成功した。具体的には、研究分担者の冨田・菅野らのグループや理研のグループから蛍光タンパク質等を発現するAAVの供与を受け、マーモセット大脳皮質で発現することをまず確認した。次に手術法や観察用チャンバー、観察用対物レンズの選定などの最適化を行った。マーモセットのシナプス後部である樹状突起スパインの生成消滅率を求めるべく現在データを集めている。オキシトシンなどの試薬を鼻腔から投与するための馴化も進めている。一方、自閉スペクトラム症モデルマーモセットの表現型を評価するための条件検討も開始した。マーモセットにおいてもげっ歯類と同様行動試験によってモデル個体と定型発達個体との差異が観察されているが、実験者の長期間にわたる手技訓練も必要であり、馴化などに要する実験期間も長くかかるので、試薬による治療効果の評価が難しくなる。そこで我々はマーモセットの鳴き声(コール)による社会的な交信(鳴き交わし)を用いて自閉スペクトラム症的な表現型を評価する試みを開始した。録音した鳴き声を聞かせることによって擬似的な社会的交信を発生させ、表現型の評価を実施する。・当初の予定通り、マーモセットにおいて数ヶ月以上の期間にわたって同一の樹状突起を連続してイメージングする条件についてほぼ確立し、生成消滅率の評価を開始している。(2019年度日本神経科学学会にて発表準備中)。・自閉スペクトラム症の症候の程度を評価するために、社会性に関係があるとされる大脳皮質前頭前皮質樹状突起スパインの生成消滅率と社会性の変化を同時に評価する試みを開始している。・マーモセット2光子イメージングの最適化:同一の樹状突起スパインをほぼ再現性よくイメージングすることが可能となってきたが、無菌手術をより徹底しさらに再現性を向上させる。また軸索のイメージングとオプトジェネティクスによる活性化の最適化に着手する。この方法を用いてシナプス可塑性刺激後のシナプス安定性についても評価を実施する。・マーモセットの社会性の評価:マーモセットのコールを用いた社会性の評価に関しては2019年度に本格化させる。録音環境への馴化等の最適化を実施する。・試薬を用いた自閉症治療の試み:自閉スペクトラム症の中核症状に効果があるとされるオキシトシンのシナプス安定性もしくはマーモセット社会性に対する効果について上記の方法を用いて試験する。その後GABA作動性薬などの評価に移行する。・その他:最近、腸内細菌が自閉症様の症候におよぼす効果についていくつかのグループから報告があり、腸内環境を変化させることで自閉症の症候が操作できる可能性が示された。そこで我々のマーモセットを用いた実験系でも治療前後や実験の経過にしたがって次世代シークエンスによる腸内環境のモニターを実施し、シナプスの安定性や表現型の変化と付き合わせて評価する。

・当初の予定通り、マーモセットにおいて数ヶ月以上の期間にわたって同一の樹状突起を連続してイメージングする条件についてほぼ確立し、生成消滅率の評価を開始している。(2019年度日本神経科学学会にて発表準備中)。・自閉スペクトラム症の症候の程度を評価するために、社会性に関係があるとされる大脳皮質前頭前皮質樹状突起スパインの生成消滅率と社会性の変化を同時に評価する試みを開始している。・マーモセット2光子イメージングの最適化:同一の樹状突起スパインをほぼ再現性よくイメージングすることが可能となってきたが、無菌手術をより徹底しさらに再現性を向上させる。また軸索のイメージングとオプトジェネティクスによる活性化の最適化に着手する。この方法を用いてシナプス可塑性刺激後のシナプス安定性についても評価を実施する。・マーモセットの社会性の評価:マーモセットのコールを用いた社会性の評価に関しては2019年度に本格化させる。録音環境への馴化等の最適化を実施する。・試薬を用いた自閉症治療の試み:自閉スペクトラム症の中核症状に効果があるとされるオキシトシンのシナプス安定性もしくはマーモセット社会性に対する効果について上記の方法を用いて試験する。その後GABA作動性薬などの評価に移行する。・その他:最近、腸内細菌が自閉症様の症候におよぼす効果についていくつかのグループから報告があり、腸内環境を変化させることで自閉症の症候が操作できる可能性が示された。そこで我々のマーモセットを用いた実験系でも治療前後や実験の経過にしたがって次世代シークエンスによる腸内環境のモニターを実施し、シナプスの安定性や表現型の変化と付き合わせて評価する。主たる理由:国内学会(日本神経科学学会)において情報収集する予定であったが、実験を優先して実施すべきと判断し参加を取りやめた。消耗品費を他の研究費から充当し物品を共用した。使用計画:2018年度と同様、試薬等の消耗品や特注品の購入にあてる。微生物ゲノム検査などの外注費用が新たに必要となって来ているので、そちらにも充当する見込み。
ランタノイドを触媒とするアミノアシル転移反応のモデル系構築

2,2'-ビピリジンの6,6'-位にフェニルアラニンおよび安息香酸とのアミド結合を持つ6-benzoylamino-6'-Phenylaranylamino-2,2'-bipyridine(1)は、メタノール中30°Cで、ランタニド塩化物([Ln3^+]/[基質]=0.2)が存在すると、フェニルアラニン側アミド結合が加溶媒分解を受けてアミノ酸メチルエステルとなる。反応速度は金属および基質濃度の各一次に比例し(v=kapp[Substrate][Ln^<3+>])、水が共存すると大きな反応阻害を受ける。しかし、乾燥メタノール中ではkapp=20-30 M^<-1>と極めて速く、温和な条件下でメタノール水酸基への効率の良いアミノアシル転移反応が進行する。また片側だけアミド結合を持つ基質やβ-アミノ酸とのアミド結合を持つ基質は反応せず、多座キレート形成可能な構造およびアミドに隣接するα位炭素上のアミノ基が反応に寄与することも明らかになった。各種の希土類イオン存在下で同様の反応を行ったが、Sc(III)を除く他のイオンでもアミノ酸エステルの生成が認めら、エタノール溶媒中でも同じくアミノアシル転移反応が進行した。以上の結果に基づき、上記のアミノアシル転移反応の反応機構を考察した。
前頭前野機能障害における病態解明に関する神経心理学的研究

統合失調症を中心とした前頭前野機能障害の病態解明および前頭前野機能の役割とその神経基盤を明らかにすることを目標とした。健常者の記憶の意味組織化が左下前頭回の脳体積と関連しているが、統合失調症患者では異なることが明らかになった。脳機能画像によって、背外側前頭前野と内側前頭前野の機能の差異が、記憶機能や抑制機能から明らかになった。全般的に、前頭葉損傷患者における成績がより低下していることがうかがえるが、損傷部位によって低下する機能が異なることが示唆された。統合失調症を中心とした前頭前野機能障害の病態解明および前頭前野機能の役割とその神経基盤を明らかにすることを目標として、第1に、脳磁気共鳴画像(MRI)と神経心理検査双方を同一被験者に行い、前頭前野の下位領野の体積と遂行成績との関連を検討する。第2に、脳機能画像によって、前頭葉課題による前頭前野の脳活性部位を明らかにする。第3に局在病変のある前頭葉損傷患者、統合失調症および健常者に神経心理学的検査バッテリーを施行し、比較検討する。本研究では、統合失調症を中心とした前頭前野機能障害の病態解明および前頭前野機能の役割とその神経基盤を明らかにすることを目標として、第1に、脳磁気共鳴画像(MRI)と神経心理検査双方を同一被験者に行い、前頭前野の下位領野の体積と記憶遂行成績との関連を検討する。第2に、脳機能画像によって、記憶の組織化課題による前頭前野の脳活性部位を明らかにする。本年度は、記憶方略(記憶の組織化)の前頭前野脳形態学的特徴(脳体積)との関連の検討として、三次元MRIスキャンと単語記憶学習検査を行い、統合失調症患者35名、統合失調型障害患者25名および健常者19名のデータを収集した。得られた脳画像から、上前頭回、中前頭回、下前頭回、腹内側前頭皮質、眼窩前頭回、直回および全脳の体積測定を関心領域法によって行い、これらの体積と記憶の組織化指標との関連を検討した。結果、健常者では左下前頭回の灰白質体積と意味的クラスタリングとが正に相関していた。統合失調症患者では左眼窩前頭回の灰白質体積と意味的クラスタリングとが正に相関していた。統合失調型障害患者では、左下前頭回の白質体積と意味的クラスタリングとが負に相関し、系列的クラスタリングとが正に相関していた。このことから、健常者の意味組織化が左下前頭回の脳体積と関連しているが、患者では異なることが明らかになった。第2に、記憶組織化課題実施中の脳活動の計測(脳機能画像研究)として、健常者10名に全頭型光トポグラフィを用いて、記憶学習課題施行中の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの変化量の測定を行なった。結果、左下前頭部周辺の酸素化ヘモグロビンの変化量と記憶組織化指標との関連が認められ、単語を意味的に処理し、効率的に記憶するためにこの領域が重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、次年度は脳機能画像による精錬した検討に着手する予定である。本研究では、統合失調症を中心とした前頭前野機能障害の病態解明および前頭前野機能の役割とその神経基盤を明らかにすることを目標として、第1に、脳磁気共鳴画像(MRI)と神経心理検査双方を同一被験者に行い、前頭前野の下位領野の体積と遂行成績との関連を検討する。本年度は、近赤外線スペクトロスコピー(NIRS)を用いて、健常者について神経心理課題施行中の酸素化ヘモグロビン(oxyHb)と脱酸素化ヘモグロビン(deoxyHb)の変化量の測定を行なった。ひとつは系列動作課題(Fist Edge Palm task)を用いて実施したところ、前頭前野のoxyHb濃度がコントロール課題時よりも増加したことから、前頭前野の機能は系列動作課題遂行に強く関与していることが示唆された。ふたつ目に、メタ記憶と記憶方略の関連を検討し、記憶課題施行中のoxyHb濃度の変化量を調べた。その結果、メタ記憶は効果的な記憶方略を選択する過程に関与し、その脳内機構の特徴として、両側外側前頭前野の機能がメタ認知的コントロールに、両側内側前頭前野の機能がメタ認知的モニタリングに関与している可能性が示唆された。さらに、機能的脳磁気共鳴画像(fMRI)を用いて、心の理論課題施行中の健常者の脳活動の検討を試みた。その結果、内側前頭回、右中前頭回の賦活が認められた。第3に関して、前頭葉損傷患者および統合失調症患者に適用可能な前頭葉機能関連神経心理検査バッテリーを精錬させるために、まず健常者への実施を試み、また患者での検討を開始した。

次年度はさらに多くの対象者での検討を進める予定である。本研究では、統合失調症を中心とした前頭前野機能障害の病態解明および前頭前野機能の役割とその神経基盤を明らかにすることを目標として、第1に、脳磁気共鳴画像(MRI)と神経心理検査双方を同一被験者に行い、前頭前野の下位領野の体積と遂行成績との関連を検討する。第2に、脳機能画像によって、前頭葉課題による前頭前野の脳活性部位を明らかにする。第3に局在病変のある前頭葉損傷患者、統合失調症および健常者に神経心理学的検査バッテリーを施行し、比較検討する。本年度は、記憶の組織化の検討に関して、2021年度に実施した課題をさらに深めた課題を作成するために、抽象カテゴリーにおける単語の出現頻度の検討をおこない、25カテゴリーにおける抽象単語の出現率を明らかにした。さらに、Global-Local課題を用いて統合失調症患者における注意の移動の検討を行った。その結果、統合失調症患者では、GlobalからLocalよりもLocalからGlobalへの切り替えコストが健常者に比して大きく、LocalからGlobalへ視覚的注意を移動する過程での障害があることが示唆された。このことから前頭葉機能障害との関連が予測されている。本年度は他に情動処理系を抑制する前頭前野の脳活動を検出することが仮定される注意課題を作成し、健常者にこの課題施行中の機能的脳磁気共鳴画像(fMRI)を実施した。結果については解析中である。また、統合失調症患者と同様に前頭葉損傷患者に神経心理学的検査バッテリーを施行し、データを蓄積しているところである。本年度は、2022年度に実施した記憶の組織化の検討について、さらに深めるために記憶方略およびメタ記憶の関係を具象語と抽象語両方の単語学習課題を作成して検討を行なった。同時に前頭葉機能検査バッテリーを施行し、記憶方略およびメタ記憶と前頭葉機能との関連を検討してきている。さらに、本年度は情動処理系を抑制する前頭前野の脳活動を検出することが仮定される注意課題を作成し、健常者にこの課題施行中の機能的脳磁気共鳴画像(fMRI)を実施したデータについて解析を行なった。その結果、高不安者では脅威刺激に対する処理の促進が消失し、さらに情動処理系に対して抑制的に作用するとされる左前頭前野の活動が、不安得点が高いほど強くなることが示された。これらの結果により、脅威刺激が課題関連な場合には高不安者が脅威刺激に対する過剰な抑制を行なっている可能性が示された。さらに、近赤外線分光法を用いて、抑制課題を開発実施し、データ収集を行なってきている。
全NO関連物質の同時測定システムの開発

NO由来のパーオキシナイトライトなどの活性酸化窒素種は、生体内のチロシン残基をニトロ化し、3-ニトロチロシンを生成する。このことを利用して、3-ニトロチロシンは生体内での活性酸化窒素種の指標として用いられてきた。これまでに、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や質量分析計などによる生体中3-ニトロチロシンの定量的検出法はいくつか報告されているが、装置の特殊性や、試料調整中の問題点から、いまだ信頼度が高く、広く応用可能な方法として確立されたものはない。そこで本研究では、従来法に比べ高感度、高特異的に生体試料の蛋白に存在する3-ニトロチロシンを定量的に検出できる新しいHPLC-電気化学検出法の開発を試みた。逆相HPLCによる分離後に2つの電気化学検出器を直列して設置し、上流測電極に-900mVの還元電圧により3-アミノチロシンに変換して、下流側電極に+300mVの酸化電圧を加え、下流側電極における酸化電流により検出する定量的測定法を開発した。生体蛋白中の3-ニトロチロシンは、蛋白を酵素的に加水分解したのち、同法を用いて定量し、同一試料中のチロシンとの比によりその生成を評価した。従来法と比較し、この測定系では3-ニトロチロシンの測定感度は5×10^<-15>molと非常に高く、還元電圧変更によるピーク消失により特異性も評価可能であった。また、低い測定電圧は夾雑ピークを減少させ、生体試料の測定でも安定した結果が得られた。我々はこの方法を用いて、マウスのインフルエンザ肺炎モデルの気管支肺胞洗浄液中の蛋白質や慢性閉塞性肺疾患患者の喀痰中の蛋白質から3-ニトロチロシンの検出・定量に成功した。尚、ウイルス肺炎モデルにNO合成阻害剤を投与したり、誘導型NO合成酵素(iNOS)欠損マウスを用いて本モデルにおけるNOの役割を検討した結果、NO産生が抑制されることにより(あるいは、NO産生が欠如することにより)、肺炎像の改善とともに有意な生存率の改善がもたらされ、このときの肺内のウイルス増殖は何ら変化を受けなかった。このことから、本病態においては、NOは生体内で有効な抗ウイルス作用を発揮することなく、パーオキシナイトライトなどの活性酸化窒素種に変換されることにより酸化ストレスあるいはニトロ化ストレスのメディエーターとして機能し、細胞傷害や組織障害をもたらすことが示唆された。さらに、活性酸化窒素種による生体内での核酸ニトロ化反応を解析するため、抗&ニトログアノシン特異抗体を作製し、インフルエンザウイルスおよびセンダイウイルス感染モデルにおける8-ニトログアノシン生成を解析した。その結果、免疫組織化学的解析によりウイルス感染マウスの気管支、細気管支上皮に強い免疫染色が認められ、生体内において8-ニトログアノシンが生成することが証明された。加えて現在、上記HPLC-電気化学検出法を8-ニトログアノシンの測定に応用することにも成功している。本研究により、NO関連物質測定の全システムがほぼ完成した。今後、各NO関連物質の同時検出システムの構築を行い、さらに様々な生体試料中の検出・定量に展開していく予定である。

このことから、本病態においては、NOは生体内で有効な抗ウイルス作用を発揮することなく、パーオキシナイトライトなどの活性酸化窒素種に変換されることにより酸化ストレスあるいはニトロ化ストレスのメディエーターとして機能し、細胞傷害や組織障害をもたらすことが示唆された。さらに、活性酸化窒素種による生体内での核酸ニトロ化反応を解析するため、抗&ニトログアノシン特異抗体を作製し、インフルエンザウイルスおよびセンダイウイルス感染モデルにおける8-ニトログアノシン生成を解析した。その結果、免疫組織化学的解析によりウイルス感染マウスの気管支、細気管支上皮に強い免疫染色が認められ、生体内において8-ニトログアノシンが生成することが証明された。加えて現在、上記HPLC-電気化学検出法を8-ニトログアノシンの測定に応用することにも成功している。本研究により、NO関連物質測定の全システムがほぼ完成した。今後、各NO関連物質の同時検出システムの構築を行い、さらに様々な生体試料中の検出・定量に展開していく予定である。一酸化窒素(NO)は内皮由来血管弛緩因子として機能するだけでなく、極めて多彩な生理・病理学的役割を演じていることが明らかにされつつある。また、NOは生体内に存在する種々の物質と相互作用し、様々なNO付加体や代謝物に変換されることがわかってきた。現在、NOの多彩な生物活性を解明するため、生体内で生じる種々のNO付加体/代謝物(関連物質)の分析システムの開発が重要な課題となっている。生体内で生じうるNO関連物質としては、例えば、NOの鉄付加体(ニトロシルヘモグロビンなど)、NOのアミン付加体(ニトロソアミン)、ニトロソチオール(RS-NO)および安定な最終酸化産物である亜硝酸イオンおよび硝酸イオン、さらには、NO由来の反応性窒素酸化物であるパーオキシナイトライトにより生ずるニトロチロシンなどのが挙げられる。これらのNO関連物質の中で、現在定量可能な代謝物は亜硝酸イオン/硝酸イオンやRS-NOのような一部の物質に限られており、これまで各々のNO関連物質のすべてを同時に測定することにより生体内のNO生成動態を詳細に解析した報告はない。これまでの研究で、我々は既ににニトロソチオールの検出システムを確立したが、本年度はさらに、HPLC-電気化学検出法を用いたニトロチロシン検出法を開発した。ニトロチロシンの電気化学検出法については、既に米国のESA社のクーロメトリー電極を用いた方法が一般に普及しているが、今回我々は、同様の電極を独自に開発しさらに加電圧の付加様式を工夫しこれまでの方法より、感度・特異性において格段と優れたシステムの開発に成功した。今後さらに、このシステムに我々が既に開発に成功している各種測定システムを組み込み合わせ、血液、尿、髄液その他の体液あるいは肺胞洗浄液などの臨床サンプル中のすべてのNO関連物質を各々別に、しかも同時に定量するシステムの確立を目指す。NO関連物質の中で、現在定量可能な代謝物は、亜硝酸イオン/硝酸イオンやニトロソチオールのような一部の物質にかぎられており、これまで各々のNO関連物質のすべてを同時に測定することにより生体内のNO生成動態を詳細に解析した報告はない。本研究では、生体試料中に存在する全NO関連物質の定量システムを開発することを目的とする。このため本年度は、NO由来の反応性窒素酸化物であるパーオキシナイトライト(ONOO^-)により生じる一連のニトロ化付加体であるニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトログアニンなどの化合物の検出システムを構築した。