hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗結核ワクチン効果の増強を目指した結核菌/BCGによる防御免疫制御機序の解明

BCG接種したマウスでは結核菌に対する強い感染防御が発現すると共に、その防御免疫応答が過剰に働かないようにするための制御機序が誘導されることが示されている。本研究では、この制御機序について解析を行った。マウスにBCGを接種し、8週後の脾T細胞をin vitroでPPD刺激した。その際、様々な抑制性シグナル経路に対する抗体を添加し、どのような制御機序が関与しているのかをIFN-g産生を指標にして調べた。脾T細胞をPPDで2日間刺激してBCG特異的なエフェクターT細胞およびエフェクターメモリーT細胞機能の制御機序について調べたところ、IL-1a、IL-1b、IL-1R1、CTLA-4やTim-3に対する抗体処理ではIFN-g産生量に影響はなかった。一方、抗PD-1抗体を添加した場合には著明なIFN-g産生の増強が認められた。従って、PD-1シグナル経路はエフェクターT細胞の機能を抑制することでBCG感染後期の免疫制御に関与することが示された。さらに、セントラルメモリーからエフェクターT細胞への分化に対する各抑制性シグナル経路の影響を調べるため、BCG感作マウスより得られた脾T細胞を各種抗体存在下にPPDで5日間刺激してT細胞分化を誘導した。このT細胞機能をPPDの再刺激に対するIFN-g産生応答を指標にして解析した結果、抗PD-1抗体処理はT細胞機能に影響を及ぼさなかったが、抗Tim-3抗体によりIFN-g産生量が増強されることが示された。一方、C3およびI型IFNに対する抗体で処理した場合にIFN-g産生が抑制されたことから、これらを介したシグナル経路もBCG感染後期のT細胞分化の制御に関与することが示唆された。これらの結果から、抗結核感染防御に関与するT細胞の機能制御にはエフェクターT細胞の機能発現とその分化誘導の局面でそれぞれ異なる様々な制御機序が関与することが示された。
改良型蒸発法を用いた森林土壌および風化基岩層の降雨浸透・貯留機構の解明

昨年度の研究で風化花崗岩のボーリングコアに加工を施すことで改良型蒸発法を適用し、不飽和水文特性を計測することに成功した。しかし蒸発法に共通する問題点として、供試体内に発生する水流フラックスが非常に小さいため湿潤領域の高い透水係数が計測できず、また実験に要する時間が27日と長いため多数の供試体計測に手間がかかっていた。当該年度に実施した研究では、上記の問題点を解決するために湿潤領域をワンステップ流出法で、乾燥領域を蒸発法でそれぞれ計測する組み合わせ手法を開発した。水分特性曲線ならびに不飽和透水曲線は、二手法の切り替え点(圧力-60 cm付近)においてデータの連続性を保ちながら良好に計測され、そのうえで実験に要する日数を約二分の一に短縮することができた。野外で採取した供試体に対してこの新手法を用いた計測を進めており、良好なデータが蓄積されてきている。森林土壌の水分特性だけでなく不飽和透水係数を多点で計測する事例は労力と時間の問題からまれであるが、両者を計測することで水を保持する土壌間隙の連結特性(間隙径分布・屈曲度等)を算出することができる。本研究では改良型蒸発法ならびに新たな組み合わせ手法により多点計測を迅速に行うことが可能となり、土壌間隙連結特性の空間分布を把握することが可能となった。さらにこれまで計測例が極めて少なかった風化基岩に対しても同様の計測を行うことが可能となった点に大きな意義がある。本手法を用いた計測を進めていくことで、森林の水源涵養機能を決める重要なパラメータでありながら不明な点の多かった間隙連結特性の分布メカニズムを、土壌発達と基岩風化過程の両面から理論的に明らかにできる点に大きな重要性がある。研究成果の項目で述べたように改良型蒸発法とワンステップ流出法の組み合わせ手法を開発し実用化したことで、土壌・基岩の不飽和水文特性データを効率的に蓄積できた。今年度行うデータ解析のスムーズな進捗が期待できる。野外観測については後述するように当初の方針を修正したこともあり観測開始には至っていないが、既に作業を進めており今年度中の十分なデータ取得が期待できる。以上から、進捗状況は概ね順調といえる。前年度に開発した組み合わせ手法を用いて森林土壌ならびに風化基岩の不飽和水文特性を測定・解析し、間隙連結特性の空間分布メカニズムを明らかにする。野外観測については当初の予定を変更し、ボーリング孔は掘削せず基岩断面の露頭を利用して、横方向からドリルで穴を開けテンシオメータと水分計を挿入して観測する。これにより基岩マトリックス部分と亀裂部分の水分浸透を区別して観測でき、基岩内の不飽和鉛直浸透過程をより実態に即して把握することが可能となる。以上の知見をもとに森林土壌風化基岩を連続的に扱った一次元浸透モデルを作成する。計算手法やパラメータの決定方法を最適化したうえで様々な降雨や初期条件を想定したシミュレーションを行い、降雨浸透・貯留機構の定量的評価を行う。当該年度に実施した研究では、風化花崗岩のボーリングコアに加工を施すことで改良型蒸発法を適用し、不飽和水文特性を計測する新たな手法を開発した。具体的には、まずボーリングコア(直径5 cmの円柱)を10 cm程度に切断して一回り大きいアクリルパイプに入れ、シリコンを流し込んで周囲の隙間を埋めた。シリコンの硬化後、コアをパイプごとチップソー切断機で長さ6 cmにカットすることで供試体を作製した。風化の進んだ花崗岩は脆く構造が崩れやすいが、本手法では周囲のパイプとシリコンで固定するため、岩の構造を崩さず理想的な状態で切断することが可能である。さらに側面からドリルで穴を開け、テンシオメータを挿入して蒸発法試験を行い、不飽和水文特性(水分特性・不飽和透水曲線)を計測した。水分特性曲線は飽和から-500 cmの圧力レンジで良好に計測され、有効間隙率は0.1以下と非常に小さい傾向を示し、曲線に従来の数値モデルをフィッティングすることができた。また不飽和透水曲線も同様の圧力レンジで良好に計測された。従来モデルから推定した曲線に比べ、特に乾燥領域で透水性が高い結果となり、土壌を対象とした従来モデルが風化花崗岩にはそのまま適用できないことが示唆された。森林の水源涵養機能に大きな役割を果たすとされる風化基岩に対し、不飽和水文特性の直接的な計測を行った例は極めて少ない。理由は先述したサンプリングの難しさと、迅速な計測手法の不足による。本研究では独自のサンプリング方法と、申請者らの開発した改良型蒸発法を応用することでそれらの問題を解決し、風化基岩の不飽和水文特性の計測が容易になった点に意義がある。本手法を用いた計測を進めていくことで、経験モデルでしか説明されてこなかった基岩層への雨水浸透・貯留過程が、厳密な数値計算により再現可能となる点に大きな重要性がある。研究成果の項目で述べたように、風化基岩のボーリングコアをもとに供試体を作製する手法を開発し、改良型蒸発法を用いて不飽和水文特性を測定することが可能となった。一連の手法は本研究遂行のための根幹をなす技術であり、これが良好に開発されたことで今後の研究のスムーズな進捗が期待できる。また、供試体となるボーリングコアは十分な量を入手することができた。以上から、進捗状況はおおむね順調といえる。

昨年度の研究で風化花崗岩のボーリングコアに加工を施すことで改良型蒸発法を適用し、不飽和水文特性を計測することに成功した。しかし蒸発法に共通する問題点として、供試体内に発生する水流フラックスが非常に小さいため湿潤領域の高い透水係数が計測できず、また実験に要する時間が27日と長いため多数の供試体計測に手間がかかっていた。当該年度に実施した研究では、上記の問題点を解決するために湿潤領域をワンステップ流出法で、乾燥領域を蒸発法でそれぞれ計測する組み合わせ手法を開発した。水分特性曲線ならびに不飽和透水曲線は、二手法の切り替え点(圧力-60 cm付近)においてデータの連続性を保ちながら良好に計測され、そのうえで実験に要する日数を約二分の一に短縮することができた。野外で採取した供試体に対してこの新手法を用いた計測を進めており、良好なデータが蓄積されてきている。森林土壌の水分特性だけでなく不飽和透水係数を多点で計測する事例は労力と時間の問題からまれであるが、両者を計測することで水を保持する土壌間隙の連結特性(間隙径分布・屈曲度等)を算出することができる。本研究では改良型蒸発法ならびに新たな組み合わせ手法により多点計測を迅速に行うことが可能となり、土壌間隙連結特性の空間分布を把握することが可能となった。さらにこれまで計測例が極めて少なかった風化基岩に対しても同様の計測を行うことが可能となった点に大きな意義がある。本手法を用いた計測を進めていくことで、森林の水源涵養機能を決める重要なパラメータでありながら不明な点の多かった間隙連結特性の分布メカニズムを、土壌発達と基岩風化過程の両面から理論的に明らかにできる点に大きな重要性がある。研究成果の項目で述べたように改良型蒸発法とワンステップ流出法の組み合わせ手法を開発し実用化したことで、土壌・基岩の不飽和水文特性データを効率的に蓄積できた。今年度行うデータ解析のスムーズな進捗が期待できる。野外観測については後述するように当初の方針を修正したこともあり観測開始には至っていないが、既に作業を進めており今年度中の十分なデータ取得が期待できる。以上から、進捗状況は概ね順調といえる。今年度は、入手したボーリングコアを用いて20個程度の供試体を作製し測定する。その過程で、風化レベルの異なる岩に対して測定方法を適宜アップグレードしていく必要があると予想される。またX線を用いた岩石の化学分析についても同時に進めていく。これらの室内実験の進捗に応じて、野外ボーリング掘削と野外観測を開始する。また、風化基岩に対して蒸発法試験を適用するのは本研究が初めての事例であり、既往研究と同様の精度が得られるかどうかの保証がない。そこで浸透計算モデルを用いた数値実験を行い、どのような蒸発速度・圧力レンジ下で精度が保証されるか厳密な検討を行う必要がある。前年度に開発した組み合わせ手法を用いて森林土壌ならびに風化基岩の不飽和水文特性を測定・解析し、間隙連結特性の空間分布メカニズムを明らかにする。野外観測については当初の予定を変更し、ボーリング孔は掘削せず基岩断面の露頭を利用して、横方向からドリルで穴を開けテンシオメータと水分計を挿入して観測する。これにより基岩マトリックス部分と亀裂部分の水分浸透を区別して観測でき、基岩内の不飽和鉛直浸透過程をより実態に即して把握することが可能となる。以上の知見をもとに森林土壌風化基岩を連続的に扱った一次元浸透モデルを作成する。
微生物が生産する機能性糖鎖の抗ガン剤、免疫調節剤への利用

我々は、種々の糖鎖がはたす生物学的役割りを主に病因とのかかわりを中心に研究している。まずポリシアル酸について、N-CAMの構成成分としての役割り以外にある種のガン細胞で転移の初期段階である血管内皮細胞とガン細胞の接着に重要であると示唆された。そこでシアル酸の分解酵素を大腸菌に感染するファージから精製、また遺伝子をクローン化した。このシアリダーゼはファージ由来の酵素としてはきわめて特異で、非還元末端より3糖単位でシアル酸を分解することがわかった。また分子量は630kDの4量体酵素であること、各サブユニットは分子量120kDの前駆体として合成されプロセッシングされることがわかった。一方、我々は連鎖球菌Streptococcus agalactiaeが、ガン抗原シアリルルイス糖鎖のアナログであるシアリルラクトサミンのポリマーを生産することを見出し、この糖が結合するセレクチンの免疫細胞に対する効果を調べた。抗L-セレクチン抗体が直接リンパ球を活性化するか検討したが、単独ではリンパ球の増殖を誘導しなかった。セレクチンの天然のリガンドの一種とされるスルファチドも同様であった。しかし、抗セレクチン抗体及びスルファチドは培養初期においてリンパ球を凝集させたことから、セレクチンによるシグナルがリンパ球の細胞接着を調節することが示唆された。この凝集は細胞内のカルシウムイオンの濃度変化を阻害する薬剤により完全に阻害されたことから、カルシウム関連シグナルの関与が推察された。一方、Tリンパ球を刺激する抗CD3抗体、ブドウ球菌スーパー抗原は単独で増殖をひきおこすが、この増殖応答は抗セレクチン抗体、スルファチドによりさらに強められることが観察された。この際インターフェロンγの産生も強められることが認められた。これらの結果よりセレクチン及びそのリガンドがリンパ球活性化の調節に関与していることが示唆された。シアリルルイス糖鎖アナログのポリマーであるB群連鎖球菌Streptococcus agalactiae Ia及びIb株のきょう膜多糖の免疫系に対する効果を調べた。S.agalactiaeの型特異的多糖をゲルろ過及び陰イオン交換クロマトで精製し、マウス脾臓及びリンパ節より分離した細胞に添加した。0.041μg/mlの濃度範囲で脾臓及びリンパ節の細胞とも1050倍増殖能が上がったが、Ib株多糖の方が効果が高かった。一方、脾臓由来の細胞についてインターロイキン2、抗体生産、インターフェロンγの生産に対する微生物糖鎖の効果を検討したところ、Iaの方が効果が高く0.2μg/mlの濃度でこれらの生産を10倍以上増加させた。一方、マウスセレクチンに対する抗体によりこのような効果が観察されないことから、微生物糖鎖が結合する細胞表面分子はセレクチンではなく、他の受容体に結合しこのような効果がでるものと推察された。微生物糖鎖はシアリルルイス糖鎖アナログが500以上つながった平均分子量500kDaのポリマーであり、高濃度で若干の細胞毒性がある。そこでShingobacteriummultivorum由来のエンド-β-ガラクトシダーゼを精製しIa株糖鎖を切断して平均分子量3070kDaのオリゴマー(シアリルルイス糖鎖アナログ3070)に部分分解した。この糖鎖のガン細胞と血管内皮細胞の接着(ローリング、がん転移の初期段階)に対する効果を検討したところ、もとの高分子糖鎖に較べ飛躍的に接着阻害効果が向上した。

またリンパ球の一種でガンの免疫療法や移植の拒否反応に重要なナチュラルキラー細胞に対するこれら微生物糖鎖の効果を検討したところ、Ia株糖鎖が細胞障害活性を弱く阻害することが判明した。今後免疫抑制剤として使用できるか検討する予定である。我々は、種々の糖鎖がはたす生物学的役割りを主に病因とのかかわりを中心に研究している。まずポリシアル酸について、N-CAMの構成成分としての役割り以外にある種のガン細胞で転移の初期段階である血管内皮細胞とガン細胞の接着に重要であると示唆された。そこでシアル酸の分解酵素を大腸菌に感染するファージから精製、また遺伝子をクローン化した。このシアリダーゼはファージ由来の酵素としてはきわめて特異で、非還元末端より3糖単位でシアル酸を分解することがわかった。また分子量は630kDの4量体酵素であること、各サブユニットは分子量120kDの前駆体として合成されプロセッシングされることがわかった。一方、我々は連鎖球菌Streptococcus agalactiaeが、ガン抗原シアリルルイス糖鎖のアナログであるシアリルラクトサミンのポリマーを生産することを見出し、この糖が結合するセレクチンの免疫細胞に対する効果を調べた。抗L-セレクチン抗体が直接リンパ球を活性化するか検討したが、単独ではリンパ球の増殖を誘導しなかった。セレクチンの天然のリガンドの一種とされるスルファチドも同様であった。しかし、抗セレクチン抗体及びスルファチドは培養初期においてリンパ球を凝集させたことから、セレクチンによるシグナルがリンパ球の細胞接着を調節することが示唆された。この凝集は細胞内のカルシウムイオンの濃度変化を阻害する薬剤により完全に阻害されたことから、カルシウム関連シグナルの関与が推察された。一方、Tリンパ球を刺激する抗CD3抗体、ブドウ球菌スーパー抗原は単独で増殖をひきおこすが、この増殖応答は抗セレクチン抗体、スルファチドによりさらに強められることが観察された。この際インターフェロンγの産生も強められることが認められた。これらの結果よりセレクチン及びそのリガンドがリンパ球活性化の調節に関与していることが示唆された。
幼虫特異的に発現する犬糸状虫抗原遺伝子の転写制御因子に関する研究

我々は、犬糸状虫症患者血清と反応するimmunodominant antigenをコードするcDNA (cD34)およびゲノムDNA (Dg2)をクローニングし、この遺伝子は幼虫特異的に発現するstage-specificityを示すことを以前報告した。Dg2の発現制御機構を解析するために必要な上流領域をクローニングするため、新たに作成したgenomic DNA libaryをcD34のexon1およびexon2の一部を含むDNA断片をプローブとしてスクリーニングを行ったところ、5つの陽性クローンが得られた。制限酵素地図を作成したところ、これらはすべて同一の遺伝子であることが判明した。これらのうち2つのクローンより8268bpの塩基配列(DgK)および転写開始点の解析を行ったところ、転写開始点より149bpを除くexon領域の配列はDg2と同じであるにも関わらず、exonの長さ、intronの位置と配列に大きな違いが認められた。ミクロフィラリア、雄および雌成虫より抽出したゲノムDNAを用いたSouthern blot解析およびDg2とDgKに共通なプライマー(長さの異なるintronを挟む)を用いたPCRの結果から、Dg2とDgKは同時には存在せず、ファミリーを構成していないと考えられた。次ぎに、DgKの発現制御機構を解析するため、^-1837から^+1329の領域をCaenorhabditis elegans用レポーターベクター、pPD21.28へ組み込んだプラスミドを作成した。これをC.elegansへ微注入し、11日後にlacZ染色を行ったところ、消化管において特異的に発現している個体が認められた。このことから、C.elegansの系は寄生線虫の遺伝子解析にも利用できるものと思われる。犬糸状虫抗原遺伝子(Dg2)のstage-specificな発現機構の解析が本研究の目的であるが、Dg2には転写開始点から151の位置までの領域しか含まれていないため、さらに上流領域をクローニングする必要があると思われた。そこで、新たにgenomic DNA libraryを作成し、exon 1の領域をプローブとしてスクリーニングを行った。得られた5つの陽性クローンについて制限酵素地図を作成した結果、すべて同じ遺伝子であることが確かめられた。これらを制限酵素で処理した後exon 1の領域をプローブとしてSouthern解析を行い、強くハイブリダイズするDNA断片の一部の塩基配列を解析したところ、Dg2とは異なる配列が見出された。これまでに解析した2974塩基に含まれる4つのexonの配列はDg2と97%の相同性を有するにも関わらず、exonの長さ、そしてintronの位置、長さおよび配列に大きな違いが認められた。exonの配列はDg2とほぼ同じであることから、今回得られたクローンは偽遺伝子ではなくファミリーの一つであると考えられる。現在、この遺伝子が機能していることを確かめるため、primer extensionによる発現様式の確認を行っている。犬糸状虫由来遺伝子の機能解析を犬糸状虫の無細胞転写系を用いて行う予定であったが、幼虫を大量に得ることが非常に困難であるため、C.elegansの無細胞転写系の利用を検討している。線虫類の無細胞転写系の報告はこれまで皆無であったが、1995年にC.elegansで初めて報告され、ヘテロの系ではあるが犬糸状虫抗原遺伝子の機能解析にも利用出来ることが期待される。現在、大量培養したC.elegansより虫卵を回収し、転写活性を有するnuclear extractの調製を試みている。我々は、犬糸状虫症患者血清と反応するimmunodominant antigenをコードするcDNA(cD34)およびゲノムDNA(Dg2)をクローニングし、この遺伝子は幼虫特異的に発現するstage-specificityを示すことを以前報告した。

Dg2の発現制御機構を解析するために必要な上流領域をクローニングするため、新たに作成したgenomic DNA libraryをcD34のexon1およびexon2の一部を含むDNA断片をプローブとしてスクリーニングを行ったところ、5つの陽性クローンが得られた。制限酵素地図を作成したところ、これらはすべて同一の遺伝子であることが判明した。これらのうち2つのクローンより8268bpの塩基配列(DgK)および転写開始点の解析を行ったところ、転写開始点より149bpを除くexon領域の配列はDg2と同じであるにも関わらず、exonの長さ、intronの位置と配列に大きな違いが認められた。ミクロフィラリア、雄および雌成虫より抽出したゲノムDNAを用いたSouthern blot解析およびDg2とDgKに共通なプライマー(長さの異なるintronを挟む)を用いたPCRの結果から、Dg2とDgKは同時には存在せず、ファミリーを構成していないと考えられた。次ぎに、DgKの発現制御機構を解析するため、1837から+1329の領域をCaenorhabditis elegans用レポーターベクター、pPD21.28へ組み込んだプラスミドを作成した。これをC.elegansへ微注入し、11日後にlacZ染色を行ったところ、消化管において特異的に発現している個体が認められた。このことから、C.elegansの系は寄生線虫の遺伝子解析にも利用できるものと思われる。
非体育系大学における学生アスリートの実態と学習支援体制に関する研究

本研究は、近年増加傾向にある非体育系大学における学生アスリートに対する大学の学習支援体制について調査したものである。調査の結果、我が国においてはいまだ学生アスリートを対象とした学習支援を組織化した取り組みはほとんど見られない。しかし、北米などの大学においてはかなり体系化された学習支援システムが確立されておりアスリート学生が学業とスポーツの両立に効果をあげていることが明らかになった。平成21年度は研究の基盤となる資料の収集と視察見学・インタビュー調査を行った。国内外の大学における学習支援に関する資料、アスリート学生に関する資料収集は電子情報を中心に行った。体育学部を持たない大学が国内トップレベルで活躍するアスリート(アスリート学生)をどのような形でどの程度の数入学許可をしているのか、また入学時の条件(奨学金等)、入学後の学習面でのサポートの有無については各大学の入学案内、入試資料、関係者からのヒアリングにて情報を収集した。またカナダにおいて、学力も学生アスリートの競技レベルも高いブリティッシュコロンビア大学を訪問し、施設見学に加え、アスリートデパートメント部長、学習支援プログラム担当者に対して、アスリート学生への学習支援体制についてのインタビュー調査を行った。平成22年度で質問紙での調査を予定しており、そのための準備調査であったが、体育系学部をもたずに積極的にアスリートを受け入れる大学は多くあったが、入学の基準、条件などはあまり明確でないことがわかった。また、入学後の学習支援についてはアスリート学生に特化した参考文献はほとんど皆無であり、体系的な取り組みはほとんどなされていないことがわかった。米国のNCAAのようなアスリート学生に対して学業の維持を義務付ける横断的なシステムがない我が国においては、競技や大会、合宿などに忙しいアスリート学生がしっかり学業をおさめられるか否かは各大学の責任とサポートの体制にゆだねられていると言える。しかし、現在、過去において学習面における大学側の積極的なサポートはあまりみられなかった。本研究において体育系学部をもたない大学におけるアスリート学生の状況や学習支援の現状を明確にすることは、将来的に大学におけるアスリート学生への学習支援システムの構築のために必要であると考える。平成22年度は昨年度に引き続き、大学における学生アスリートの学習支援体制についての先行研究を収集整理した。国内ではほとんど先行研究がみらなかったため、アメリカ、カナダ中心に海外の先行研究の収集整理に努めた。その中で明らかになったのは、北米の大学の多くは大学のAthletic Departmentとは独立した学生アスリート専門の学習支援組織を持ち、トレーニングを受けた専任のスタッフと学部生・大学院生のチューター達が学生アスリートの学習支援を行っている。また、新入生の義務補習に加え、学生のGPA(Grade Point Average)を基準にある一定の基準以下の学生は強制的に呼び出し補習を課している。またUniversity of Central FloridaなどのようにOnline Tutoringで自宅や遠征先からでも学習支援サービスを利用できる体制を整えている大学もあった。またthe National Association of Athletic Academic Advisors(N4A).という学生アスリートの学習支援を専門に行うスタッフの全米組織があり、様々な情報共有、研修、カンファレンスなどを行っており大学間での情報共有もスムーズであることがわかった。また、実際にアメリカの大学の視察・インタビュー調査も行った。学生アスリートの学習支援で効果をあげているUniversity of Central Florida、多くの学生アスリートを抱え組織的に学習支援を行っているTemple University、学力も競技レベルも高いUniversity of Pennysylvania、こじんまりしたミッション系のVillanova大学を訪問し、学生アスリート支援についてのインタビュー調査と視察を行った。また同時に組織のミッション、ビジョンや学習指導のマニュアル、学生チューターの研修資料などを収集した。
昆虫永続伝搬性病原微生物のトランスジェネシス技術の開発

ファイトプラズマ等の昆虫媒介性細菌は多くが難培養性であり逆遺伝学的手法が利用できないため研究が困難である。本研究では、ファイトプラズマをモデルとして、昆虫永続伝搬性細菌の逆遺伝学的解析を可能にする新たな技術の構築を目的として研究を行った。まず、ファイトプラズマのプラスミドについてシャトルベクターに利用するため、複製に必要最小限な領域の絞り込みをおこなった。また、昆虫宿主、植物宿主の両宿主において安定的に発現すると考えられるファイトプラズマのプロモーター領域を特定した。さらに、シャトルベクターを構築するとともに、ファイトプラズマ細胞内にマーカー遺伝子を組み込むための遺伝子カセットを構築した。本研究は、ファイトプラズマの培養系・形質転換系の確立に向けた基盤を構築することを目的としている。ファイトプラズマは複数種類の染色体外DNAを有するため、これらが形質転換系のシャトルベクターに利用可能かどうかを検討した。申請者の過去の研究により、OYファイトプラズマが有する全ての染色体外DNAがクローン化され、塩基配列が解読されている。OYファイトプラズマは、ウイルス型の複製酵素を持つ「染色体外DNA(EcDNA)」と、バクテリア型の複製酵素を持つ「プラスミド」の2種類に大きく分けられる。プラスミドのほうがサイズがコンパクトである点や、複製量が多いことを考慮し、本研究ではプラスミドをシャトルベクターに利用するため、複製に必要最小限な領域の絞り込みをおこなった。その結果、複製酵素遺伝子を含むわずかな塩基配列のみからなる、従来の半分程度のサイズでも複製可能となる見込みが得られた。この成果により、プラスミド上に、複製に不要な領域の代わりに外来遺伝子を多数搭載するための目処が立った。また、ファイトプラズマゲノム上にコードされる遺伝子のうち、発現量の多い遺伝子についてプロモーター解析をおこなった結果、昆虫宿主、植物宿主の両宿主において安定的に発現すると考えられるプロモーター領域を特定することができた。このプロモーター領域はシャトルベクター搭載した外来遺伝子を高発現させるために活用できると考えられた。本研究は、ファイトプラズマ等の難培養性植物病原細菌の培養系・形質転換系の確立に向けた基盤を構築することを目的としている。申請者の過去の研究により、タマネギ萎黄病(OY)ファイトプラズマが有するすべての染色体外DNAがクローニングされ、塩基配列が解読されている。OYファイトプラズマは、ウイルス型の複製酵素を持つ「染色体外DNA(EcDNA)」と、バクテリア型の複製酵素をもつ「プラスミド」の2種類に大きく分けられる。それらのうち、プラスミドのほうがサイズがコンパクトであり複製量が多い。これまでに、プラスミドに関して複製酵素遺伝子を含む部分配列からなる複製の最小単位を特定した。また、昆虫宿主、植物宿主の両宿主において安定的に遺伝子発現が可能なファイトプラズマプロモーター領域を特定した。今回、これらの成果を利用して、シャトルベクターを構築するとともに、ファイトプラズマのゲノムにマーカー遺伝子を組み込むための遺伝子カセットを構築した。マーカー遺伝子としては、蛍光タンパク質や抗生物質耐性タンパク質をコードする遺伝子を用いることとし、いずれもファイトプラズマのゲノム情報にもとづいて使用コドンの最適化をおこない、ファイトプラズマ細胞内において高効率に翻訳され発現するようにした。農学今年度の研究において実施予定であったプラスミドの最小化について達成した上、高発現遺伝子のプロモーター領域についても特定できたため、実験の進捗は順調であると言える。昨年度特定したファイトプラズマの最小化プラスミドと大腸菌のプラスミドを融合させることによりシャトルベクターを作成する。さらに、薬剤耐性マーカーなどの外来遺伝子を高発現プロモーター領域とともに導入することにより、シャトルベクターを構築する。おおむね計画通りに執行しており、問題はない。次年度の計画通りに執行する。
国際理解の視点に立った東アジア交流史教材の実践と普及に関する研究

本研究の目的は,東アジアの交流史に着目して日中韓の研究者が共同開発した『国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発』(課題番号:24531177)の成果をさらに深めるとともに,それら教材の実践および普及を行なうことである。3年間の研究活動では,開発した教材の有効性を確かめるために日中韓の研究者が高校教師とともに授業を行い,教材内容や授業の様子をHPに掲載しその普及に努め,最終年度にその成果を『交流史から学ぶ東アジアー食・人・歴史でつくる教材と授業実践ー』(明石書店,2018年)として刊行した。本研究の成果は東アジアの隣国理解を深めることに貢献することが期待されている。本研究は,2012年から3年間にわたって,日中韓の6名のメンバーが集まって共同で教材開発を行い,それを『国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発』(科学研究費補助金基盤研究(C):24531177)としてまとめた研究成果を踏まえて,さらにその教材開発を進めて内容を深めるとともに,それら教材の実践および普及を行なうことを目的としている。2015年度は,計画された研究課題をおおむね順調に進めてきた(11.現在までの進捗状況,参照)。また,東アジアに対する理解を増進するために,教材内容や授業の様子をHP(http://www.juen.ac.jp/kaken/24531177/index.html)に掲載し,現在900人以上のヒット数をあげるなど,教材の普及にも成果をあげてきた。特に,研究協力者である蔡秋英が「箸食から考える日中韓食文化」のさらなる教材開発を進め,その有効性を確かめるための実践(広島県立戸手高校,2016年3月14日)を行い,研究メンバー全員で授業参観をし,教材内容や実践のさらなる発展に向けての検討を行った。またその成果を,すでに運用しているHP上で,教材や授業実践の様子を公開し,その普及を図った。2016年度は,これらの成果を踏まえて,1日本と韓国・中国の社会科教育の関係者や高校教員と積極的に連絡を取りながら,日本と韓国・中国の学校で開発した教材の内容や方法に関して実践での有効性を検討し,2東アジアに対する理解を増進するために,教材内容や授業の様子をHPに掲載し,開発した教材の普及を行なう計画である(12.今後の研究の推進方策等,参照)。こうした作業を通じて,東アジアの隣国理解を深め,国際理解を増進することが可能となり,東アジアに生きる生徒の認識変容を促すことが期待される。2015年度は,具体的には以下のような研究活動を通して,本年度の研究課題はおおむね順調に進めてきた。1.第一回目研究会(2015.8.1314:東京):研究を実施するに当たって,2012年度から行なわれてきた「国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発」(課題番号:24531177)の研究体制を中心に,学校現場での授業実践を行うため,日本と韓国の社会科教員を研究協力者として入れ,研究体制を再構築した。2.研究授業及び第二回目研究会(2016.3.1314:広島県福山市):1「箸食から考える日中韓の食文化」という主題で,広島県立戸手高等学校の蔡秋英(研究協力者)と立田教諭が研究授業を行った。二つの授業見学後に授業反省会を持ち,開発した教材の有効性を検討した。2研究会では,これから教材開発・改善,授業観察・実践,普及活動のため,開発した教材については随時,高校において授業実践を行ない,教材の有効性を検討しながら,さらに改良を加える。また今まで開発した教材に加えて,東アジアの交流史の教材をさらに開発することを確認した。4.研究に参加しているメンバーがそれぞれ論文投稿及び学会発表などを通して,各自の研究成果を発信してきた。本研究は,日中韓の6名の研究者が集まって,東アジアの人やモノの交流史に着目して共同で教材開発した『国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発』(科学研究費補助金基盤研究(C):24531177)の成果を踏まえて,さらにその教材開発を進めて内容を深めるとともに,それら教材の実践および普及を行なうことを目的としている。2016年度は,韓国と日本の高校において以下の二つの研究授業を行った。1「日本のカップ麺の味はなぜ地域によって異なるか東アジアにおける昆布の流通」(韓国・釜山大学校師範大学附属高等学校,2016年9月5日),2「東アジアの姓名から創始改名について考える」(日本・千葉県,2016年9月16日)。研究メンバーらは二つの授業参観後に授業反省会を持ち,教材内容や実践のさらなる発展に向けての検討を行った。このように2016年度は,計画された研究課題をおおむね順調に進めてきた(11.現在までの進捗状況,参照)。また,教材の実践および普及を増進するために,教材内容や授業の様子をHP(http://www.juen.ac.jp/kaken/24531177/index.html)に掲載し,2017年4月20日現在,1,111人のヒット数をあげるなど,教材の普及に成果をあげてきた。2017年度は,1さらなる研究授業を行い,その原稿の執筆に取り組む,2引き続き,教材内容や授業の様子をHPに掲載し,開発した教材の普及を行う,3これまでの成果をまとめて本の出版をする計画である(12.今後の研究の推進方崔等,参照)。

こうした作業を通じて,東アジアの隣国理解を深め,国際理解を増進することが可能となり,東アジアに生きる子ども・生徒の認識変容を促すことが期待される。2016年度は,上記の【研究実績の概要】で記した研究の目的を達成するため,以下のような研究活動を通して,本年度の研究課題はおおむね順調に進めてきた。1.研究分担者・金ヒョン辰は東アジアにおける食文化の交流に関するさらなる教材開発を進め,その有効性を確かめるための実践「日本のカップ麺の味はなぜ地域によって異なるか東アジアにおける昆布の流通」(釜山大学校師範大学附属高等学校,2016年9月5日)を行った。2.研究分担者・國分麻里は日本の高等学校教諭と共同で教材開発をし,「東アジアの姓名から創始改名について考える」(2016年9月16日)の授業を行った。研究メンバーは二つの授業参観後に授業反省会を持ち,教材内容や実践のさらなる発展に向けての検討を行った。4.研究に参加しているメンバーがそれぞれ論文投稿及び学会発表などを通して,各自の研究成果を発信してきた。5.2017年度(最終年度)にこれまでの成果をまとめて出版するため,2017年3月5ー6日に高・國分・金が集まって「出版委員会」を発足し,その後,出版企画案,出版日程,執筆要領を作成して研究メンバーにメールで連絡し,執筆依頼をした。本研究は,日中韓の6名の研究者が集まって,東アジアの人やモノの交流史に着目して共同で教材開発した『国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発』(科学研究費補助金基盤研究(C):24531177)の成果を踏まえて,さらにその教材開発を進めて内容を深めるとともに,それら教材の実践および普及を行なうことを目的としている。科研費研究の最終年度である2017年度は以下のような活動を行ってきた。1さらなる研究授業を行い,その原稿の執筆に取り組んだ。2引き続き,教材内容や授業の様子をホームページ(http://www.juen.ac.jp/kaken/24531177/index.html)に掲載し,開発した教材の普及を行った。3これまでの成果をまとめて本の出版をすることに専念し、本の刊行を実現させた。特に3の場合、これまでの研究成果及び課題を全員で確認し,本年度の計画を立て、編集委員会を中心に原稿内容を綿密に検討し、メールなどを通して執筆者と意見交換を行いながら校正などを行った。その結果、2018年2月28日、『交流史から学ぶ東アジアー食・人・歴史でつくる教材と授業実践』(明石書店、全136頁)を刊行した。このように2017年度も,計画された研究課題をおおむね順調に進めてきた。また,教材の実践および普及を増進するために,教材内容や授業の様子を上記のHPに掲載し,2018年5月8日現在、1,251人のヒット数を挙げるなど、教材の普及に成果をあげてきた。以上のように、2017年度を含む3年間の研究活動は、東アジアの隣国理解を深め国際理解を増進し,東アジアに生きる子ども・生徒の認識変容を促すことに貢献することが大いに期待される。本研究の目的は,東アジアの交流史に着目して日中韓の研究者が共同開発した『国際理解の視点に立った東アジア交流史の社会科教材開発』(課題番号:24531177)の成果をさらに深めるとともに,それら教材の実践および普及を行なうことである。
メタボリックシンドローム治療に向けたベージュ細胞の基礎的研究

代謝活性のある褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞は、全身のエネルギー代謝にも関与している。肥満や加齢により褐色脂肪が消失した人においても、ベージュ脂肪細胞の誘導を促進することができ、肥満・メタボリックシンドローム治療の標的として注目されている。本研究で用いた肥満モデルラットは、若週齢より肥満・高血圧を呈し、ヒトメタボリックシンドロームと同様な病態を示す。このラットは、非肥満同胞と比較して褐色細胞の消失が大きく、白色脂肪細胞の著しい増加および肥大化が認められる。メタボリックシンドロームにおけるベージュ脂肪細胞の基礎的知見を得るため、当初の予定では、肥満モデルラットの脂肪細胞において、UCP1を発現する褐色細胞とベージュ細胞をRFPで永続的にラベルし、肥満に伴う脂肪細胞の機能形態変化を把握できるトランスジェニックモデルの作製準備をしていたが、台風の停電による機器トラブルでサンプルを消失したため、マイクロRNA(miRNA)や培養細胞を用いた基礎的検討を行うよう研究計画を変更した。miRNAはその標的mRNAに対して不完全な相同性をもって結合し、一般に標的遺伝子の3'UTRを認識して、標的mRNAを不安定化するとともに翻訳抑制を行うことでタンパク質産生を抑制する。肥満モデルラットの脂肪細胞においてプロファイリングを行った結果、肥満モデルラットではmiR-1188、138、143、466b-2の発現が非肥満と比較して抑制され、肥満における脂肪細胞の形態変化に関与が考えられた。また、ルイボス茶は、ポリフェノールを豊富に含み、その抗酸化作用や免疫活性作用が注目されている。ルイボス茶葉熱水抽出物は、白色脂肪細胞の分化抑制効果は認められなかったものの、褐色脂肪細胞特異的遺伝子であるUCP1の発現増加傾向が認められ、脂肪細胞の褐色化に有用な候補物質である可能性が示唆された。メタボリックシンドロームモデルラットSHRSP・ZFは、加齢にともない、高血圧・肥満が発症、重症化し、脳卒中を引き起こすヒトメタボリックシンドロームモデルである。近年、白色脂肪細胞中に熱産生能をもつ褐色様脂肪細胞(ベージュ細胞)が存在することが報告されている。本研究では、肥満進展における各種脂肪細胞(白色脂肪、ベージュ細胞、褐色脂肪)のメタボリックシンドローム病態への関与をしらべるため、基礎的検討として、肥満モデル動物の肥満進展に伴う脂肪細胞の変化をしらべた。SHRSP.ZFラットは、離乳後の4週齢より非肥満同腹子に比べて脂肪組織が多く、8週齢、12週齢と加齢につれてSHRSP.ZFラットは著しい脂肪組織の増加し、褐色脂肪細胞の形態学的解析から、肥満においては褐色脂肪細胞が白色化認められた。褐色脂肪細胞に特異的なUncoupling Proteinー1(UCPー1)の発現は、4週齢の時点で肥満動物では発現が減少傾向にあり、脂肪細胞の増加とともに褐色脂肪細胞の白色化が亢進していることが示唆された。脂肪細胞中のベージュ細胞の発現確認は進行中であるが引き続き、肥満モデル動物において、脂肪細胞分布について調べる予定である。モデル動物の脂肪細胞において、その褐色化誘導の反応性をしらべることは、肥満病態の改善に有用であると考えられる。当初の計画では今年度に脂肪細胞の単離・褐色誘導化をおこなうことになっていたが、条件検討に時間がかかっており、次年度に引き続きおこなうこととなった。トランスジェニックラットの作製準備は順調である。メタボリックシンドロームモデルであるSHRSP.ZFラットは、加齢に伴い、著しい肥満を呈し、ヒトメタボリックシンドローム病態の解析モデルとして有用である。脂肪組織が炎症や様々な病態に影響を与えることが報告されており、脂肪細胞の機能解析は病態予防・治療におてい重要である。本研究では、肥満進展における各種脂肪細胞の分布変化が認められ、メタボリックシンドローム病態への関与が示唆される。そこで、脂肪細胞の分布変化が与える影響をしらべるのに有用なトランスジェニックラット作製を試みた。トランスジェニックラット作製には、脂肪細胞特異的に発現する遺伝子組み換え体の作成が必要であるが、導入遺伝子のサイズが大きく、組み換え体作成に時間がかかり、動物への遺伝子導入は次年度に繰り越して行うこととなった。トランスジェニックラット作製に必要な遺伝子組み換え体の作成に時間を要した。しかし、今年度中に時間を要した問題点は解決でき、トランスジェニックラット完成に向けて調整中である。メタボリックシンドロームモデルラットSHRSP.ZFは、加齢に伴い、著しい肥満を呈し、ヒトメタボリックシンドロームの病態解明のために有用である。脂肪組織が脂肪組織が炎症や様々な病態に影響を与えることが報告されており、脂肪細胞の機能解析は病態予防治療において重要である。そこで本研究では、脂肪細胞の形態変化がメタボリックシンドローム病態に与える影響をしらべるにあたり有用なトランスジェニックラットの作製を試みることとした。トランスジェニックラット作成には、脂肪細胞と区的に発現する遺伝子組み換え体の作製が必要である。トランスジェニックラット作製のために脂肪細胞に特異的に発現する遺伝子組み換え体を準備したが、そのサイズが大きく、遺伝子導入が困難であることが明らかとなった。よって、用いる遺伝子領域を変更し、遺伝子組み換え体の作製方法を変更した。よって、新たな導入遺伝子組み換え体を準備し、動物への遺伝子導入を次年度に繰り越して行うこととなった。トランスジェニックラットに必要な遺伝子組み換え体の作製にあたり、問題が発覚したので作製方法を変更する必要があり、それにより実験は当初の予定よりやや遅れが生じている。

今年度、問題を解決し、トランスジェニックラット完成に向けて準備をすすめている。脂肪組織が様々な病態に影響を与えることが報告されており、脂肪細胞の基礎的検討は重要である。本研究では、肥満進展における脂肪細の分布メタボリックシンドロームモデルである肥満SHRSP.ZFラットでは、褐色細胞の白色化の亢進が示唆された。よって、脂肪細におけるベージュ脂肪細胞について検討したところ、痩せ型対照動物との差異が認められた。また、肥満に伴う脂肪細胞の変化を追跡を目的としたトランスジェニックラットの作製について、導入遺伝子組み換え体の作成を引き続き行なっているが、新たな導入方法を試み、進めている。次年度はこれらについて引き続き検討を進め、脂肪細胞の機能形態についての基礎検討とする。トランスジェニックラット作製に必要な遺伝子組み換え体の作成に時間を要した。また、エフォートの減少が生じる中、新たな方法での遺伝子組み換え体の準備をしているため、それに付随する研究について遅れが生じている。問題点は明らかになっているため、次年度は引き続き、その対処に取り組み、脂肪細胞の機能形態について研究を進める予定である。代謝活性のある褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞は、全身のエネルギー代謝にも関与している。肥満や加齢により褐色脂肪が消失した人においても、ベージュ脂肪細胞の誘導を促進することができ、肥満・メタボリックシンドローム治療の標的として注目されている。本研究で用いた肥満モデルラットは、若週齢より肥満・高血圧を呈し、ヒトメタボリックシンドロームと同様な病態を示す。このラットは、非肥満同胞と比較して褐色細胞の消失が大きく、白色脂肪細胞の著しい増加および肥大化が認められる。メタボリックシンドロームにおけるベージュ脂肪細胞の基礎的知見を得るため、当初の予定では、肥満モデルラットの脂肪細胞において、UCP1を発現する褐色細胞とベージュ細胞をRFPで永続的にラベルし、肥満に伴う脂肪細胞の機能形態変化を把握できるトランスジェニックモデルの作製準備をしていたが、台風の停電による機器トラブルでサンプルを消失したため、マイクロRNA(miRNA)や培養細胞を用いた基礎的検討を行うよう研究計画を変更した。miRNAはその標的mRNAに対して不完全な相同性をもって結合し、一般に標的遺伝子の3'UTRを認識して、標的mRNAを不安定化するとともに翻訳抑制を行うことでタンパク質産生を抑制する。肥満モデルラットの脂肪細胞においてプロファイリングを行った結果、肥満モデルラットではmiR-1188、138、143、466b-2の発現が非肥満と比較して抑制され、肥満における脂肪細胞の形態変化に関与が考えられた。また、ルイボス茶は、ポリフェノールを豊富に含み、その抗酸化作用や免疫活性作用が注目されている。ルイボス茶葉熱水抽出物は、白色脂肪細胞の分化抑制効果は認められなかったものの、褐色脂肪細胞特異的遺伝子であるUCP1の発現増加傾向が認められ、脂肪細胞の褐色化に有用な候補物質である可能性が示唆された。実験に使用する機械の故障により、予定していた実験ができず、研究としては予定よりやや遅れている。
プロバイオティクスを用いた放射線性腸管粘膜障害の改善と敗血症発症抑制効果の検討

本研究では、放射線障害により誘導されたanti-inflammatory cellsや急性期炎症性蛋白が腸管粘膜にどのような影響を与えるかについて、電子顕微鏡等を用いた直接的な画像評価を行うことを目的としている。マウスの小腸は他の消化管粘膜に比較してより放射線性障害を受け易いことが報告されている。本研究ではマウスの回腸への放射線照射およびbacterial translocationについて検討するものであるが、これまで申請者は114Gyまでの放射線照射量と回腸粘膜のダメージとの相関性について、組織学的な評価を行ってきた。現在は、腸管粘膜へのbacterial translocationの進展について、血中及び臓器内菌数の評価を画像的評価を行っている状況である。急性期蛋白であるオロソムコイドはIL-10陽性の抗炎症性単球の産生を誘導するが、これまでの検討で、放射線照射マウスにオロソムコイドの腹腔内投与を行ったところ、回腸の粘膜障害が改善される可能性が示唆され、オロソムコイドの抗炎症作用によってもたらされている可能性が示唆されている。今後、より多くのマウスを用いて検討を行い、オロソムコイドの腸管粘膜障害への修復機序について明らかにする方針である。現在、オロソムコイド投与群、非投与群で放射線障害を行い、腸管リンパ節内の自然免疫リンパ球や腹腔内に滲出するマクロファージなどについて、両群間で特徴を比較検討を行っている。同様に、プロバイオティクス投与によっても放射線照射による腸管障害が改善する可能性があり、プロバイオティクス投与群、非投与群で同様に検討を開始した。さらに、オロソムコイド血中濃度の変化や腸管組織でのオロソムコイド発現量の変化についても現在解析を行っている段階である。本研究では照射後よりマウスの飲料水にプロバイオティクスを混合して投与した群と非投与群に分けて、被曝後の感染予後や臓器内菌数について評価を行っているが、飲料水の接種量について個体差があると考えられるため、少数のマウスで得られた検討結果を複数回繰り返し再現性の有無について検討が必要な状況である。また、放射線障害を受けた腸管粘膜からのbacterial translocationの進展についても、マウス間で個体差が生ずるため、これによって敗血症の進行時期が一定しない可能性が考慮される。これについてもやはり同様の検討を複数回繰り返し、再現性の有無について検討が必要と考えている。放射線障害により誘導されたanti-inflammatory cellsや急性期炎症性蛋白が腸管粘膜にどのような影響を与えるかについて、電子顕微鏡等を用いた画像評価を組み合わせた検討はこれまで十分に行われておらず、本研究では免疫応答と実際の組織的ダメージの関連性について検討を行う。プロバイオティクスは腸管粘膜の保護・修復作用があり臨床的に広く用いられる薬剤であるが、本研究ではプロバイオティクスの投与により、放射線障害を受けたマウスの腸管粘膜が回復し、それによって腸管からのbacterial translocationを介した敗血症の発症抑制効果が得られるかについて引き続いて検討する。免疫細胞と放射線による腸管粘膜障害との関連性の評価並びに、プロバイオティクス投与による粘膜障害の改善の電子顕微鏡を用いた解析はこれまで行われておらず、独自的な試みとなる。放射線被曝下でのプロバイオティクスによる腸管粘膜修復作用、および最終的に敗血症の発症抑制効果が明らかとなれば、将来的に放射線障害を受けた患者の合併症予防において重要な意義を持つ研究となると考えられる。

さらに、オロソムコイド血中濃度の変化や腸管組織でのオロソムコイド発現量の変化についても現在解析を行っている段階である。本研究では照射後よりマウスの飲料水にプロバイオティクスを混合して投与した群と非投与群に分けて、被曝後の感染予後や臓器内菌数について評価を行っているが、飲料水の接種量について個体差があると考えられるため、少数のマウスで得られた検討結果を複数回繰り返し再現性の有無について検討が必要な状況である。また、放射線障害を受けた腸管粘膜からのbacterial translocationの進展についても、マウス間で個体差が生ずるため、これによって敗血症の進行時期が一定しない可能性が考慮される。これについてもやはり同様の検討を複数回繰り返し、再現性の有無について検討が必要と考えている。放射線障害により誘導されたanti-inflammatory cellsや急性期炎症性蛋白が腸管粘膜にどのような影響を与えるかについて、電子顕微鏡等を用いた画像評価を組み合わせた検討はこれまで十分に行われておらず、本研究では免疫応答と実際の組織的ダメージの関連性について検討を行う。急性期蛋白であるオロソムコイドはIL-10陽性の抗炎症性単球の産生を誘導するが、これまでの検討で、放射線照射マウスにオロソムコイドの腹腔内投与を行ったところ、回腸の粘膜障害が改善される可能性が示唆され、オロソムコイドの抗炎症作用によってもたらされている可能性が示唆されている。今後、より多くのマウスを用いて検討を行い、オロソムコイドの腸管粘膜障害への修復機序について明らかにする方針である。プロバイオティクスは腸管粘膜の保護・修復作用があり臨床的に広く用いられる薬剤であるが、本研究ではプロバイオティクスの投与により、放射線障害を受けたマウスの腸管粘膜が回復し、それによって腸管からのbacterial translocationを介した敗血症の発症抑制効果が得られるかについて引き続いて検討する。免疫細胞と放射線による腸管粘膜障害との関連性の評価並びに、プロバイオティクス投与による粘膜障害の改善の電子顕微鏡を用いた解析はこれまで行われておらず、独自的な試みとなる。放射線被曝下でのプロバイオティクスによる腸管粘膜修復作用、および最終的に敗血症の発症抑制効果が明らかとなれば、将来的に放射線障害を受けた患者の合併症予防において重要な意義を持つ研究となると考えられる。当該年度の期間中にX線照射装置の故障があり、この修理のために一定の費用支出が必要となった。修理費用の見積もり分を予算内から確保したところ、その残余が次年度使用額として発生することとなった。
炎症性サイトカインを用いた損傷の生活反応判定法の開発

損傷の生前死後の鑑別及び受傷後の経過時間の推定を行うためにinterleukin1(IL-1)を指標として、特に人屍例の損傷皮膚を用いてその応用性について検討を加えた。試料は、当法医学教室で行われた司法解剖剖検症例の内、6症例から採取した。ホルマリン固定後パラフィン包埋し、創面に対し垂直方向に厚さ6μmの連続切片を作製した。損傷皮膚組織中のIL-1の発現を調べるために抗ヒトIL-1α及びIL-1βpolyclonal抗体(ウサギ血清、Genzyme社)を一次抗体として、それぞれ1:100及び1:400に希釈したものを4°C一晩作用させ、以下ABC法(VECTOR社)によりDABを基質として免疫染色を行った。同時にHE染色も行い、組織学的観察を行った。6例中3例の刺創は、受傷後の経過時間が短時間(1530分程度)で創面と創縁付近の真皮層内に僅かな出血像が見られるのみであった。この内1例で真皮深部の結合組織内にIL-1β陽性を示す細胞が見られたが、他の2例ではIL-1の発現は見られなかった。受傷後12時間後に死亡した症例(刺創、入院治療)では、創縁付近に出血血液、リンパ球、単球等の細胞浸潤を著明に認めた。これら浸潤細胞の一部にIL-1β陽性細胞を多数認めた。しかしながら、IL-1αの発現は、観察されなかった。受傷後約1週間経過後に死亡した2症例(1例:皮下出血、1例:刺創、入院治療)の内、皮下出血において真皮深部の一部の小血管内皮にIL-1β陽性を示す他は、IL-1の発現は見られなかった。以上、IL-1は、外来刺激に対して表皮のケラチノサイトより分泌されると言われているが、今回の検索ではその結果は得られなかった。しかしながら、IL-1を用いた損傷の生活反応判定法への応用性については、受傷後短時間の損傷(1時間以内)を除けば、人屍例においても長時間経過した損傷(12時間程度)の受傷後の経過時間推定に応用可能であることが示唆された。損傷の生活反応判定の指標として炎症への関与が示唆されているサイトカインIL-1についてその応用性を検討した。(組織学的検索)マウス損傷皮膚(切創)を10%中性ホルマリン緩衝液にて固定した後、パラフイン包理し切片標本を作製した。HE染色により光顕レベルでの観察を行った。受傷後の経過時間に伴い損傷局所への炎症性細胞の浸潤がみられた。(免疫組織学的検索)IL-1にはIL-1αおよびIL-1β型が存在するので、今回は損傷局所のIL-1αの変化について検討した。前述のパラフイン切片に対して1:100に希釈したanti-IL-1αantibodyを作用させABC法により局所に発現するIL-1αを検出した。生前損傷として受傷直後5分、10、30、60分、2、4、6、8、16、24時間。一方、死後損傷として死後5分に成傷したものについて検討した。しかしながら、生前死後のIL-1αの発現の有意差が認められなかった。