hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PI3 KおよびERKパスウエイを標的としたKRAS変異腫瘍に対する新規治療開発（国際共同研究強化）

2018年4月から10月末までノバルティスバイオメディカル研究所に滞在し共同研究を遂行した。ERKシグナルを標的とするMEK阻害薬を投与すると受容体の活性化が誘導され、その結果ERKシグナルが再活性化されることから、受容体からERKシグナルに至る経路を遮断することを試みた。化合物・発現抑制スクリーニングなどを用いた結果から、アダプタータンパクであるSHP2を標的とすることでMEK阻害薬投与後のERKシグナルの再活性化が抑制されることを見出した。このため、ノバルティスが開発したSHP2阻害薬SHP099とMEK阻害薬の併用療法について、細胞株、ゼノグラフトモデル、患者由来ゼノグラフトモデルを用いて評価を行い、その有効性を示した。また、PI3KシグナルについてもSHP2阻害薬を併用することにより活性化抑制されていた。しかしながら、同様の報告が2018年5月から7月にかけてNature Medicine誌をはじめとして計4本報告されたことから、現在はSHP2阻害薬がMAPKシグナルの再活性化を抑制するメカニズムについて解析を行っている。また、KRAS変異腫瘍に対する免疫療法の有効性については、ノバルティス社が持つスクリーニングの結果から、免疫療法の効果を減弱する候補因子を抽出し、現在解析を行っている。一方、KRAS腫瘍の研究を行っている研究者と交流を行うことにより、ERKパスウエイの制御について、KRASの下流に位置するBRAF変異腫瘍をモデルに検討する国際共同研究を開始した。BRAFのホットスポット以外に変異を有する大腸がんが、受容体の影響を受けるかどうかについて日米5000例を超える大腸がん症例を用いて検討を行い、Class 3と呼ばれるBRAF変異を有する大腸がんでは抗EGFR抗体が有効である可能性を示し、現在投稿中である。KRAS変異腫瘍に対するSHP2阻害薬とMEK阻害薬の有効性について実証したが、他グループに先んじられてしまった。このため、SHP2がERKシグナルを活性化するメカニズムについて詳細な解析を追加する必要が生じ、論文の投稿が遅れている。KRAS変異腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強・減弱する因子の同定については、ノバルティス社が持つスクリーニングシステムを活用することで、標的の候補が複数認められている。この中にはPI3Kシグナル、ERKシグナルにより活性が制御されるものが含まれており、本基課題と合わせた検討が可能になってきている。BRAF遺伝子にホットスポットであるV600以外の変異(non-V600変異)を有する腫瘍の解析については、KRAS研究者と交流することで新たに生まれた共同研究である。受容体とERKシグナルの関係を解析することでKRAS変異腫瘍に対する新規治療開発にもつながる研究である。こちらについては、BRAF non-V600変異大腸がんに対する抗EGFR抗体の有効性について、変異の種類がClass 3であれば抗EGFR抗体が有効である可能性を初めて示すなど、想定以上の成果が得られている。SHP2の機能解析に時間を要することおよびKRAS変異腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害薬の効果増強・減弱因子について解析を追加する必要があることから、研究計画の一年延長を申請した。SHP2の機能解析については、ERKシグナルを抑制後に活性化する受容体が上皮系の性質を持つKRAS変異腫瘍ではERBB3、間葉系の性質を持つKRAS変異腫瘍ではFGFR1であることを基課題の研究成果として示していることから、SHP2とERBB3およびFGFR1の関係性について明らかにし、論文投稿を行う。免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強・減弱する因子については、ヒトおよびマウス由来KRAS変異細胞株を用いた検討とマウス同種移植モデルを用いた検討をノバルティスバイオメディカル研究所と共同で行う予定である。BRAFnon-V600変異腫瘍において受容体がERKシグナルに与える影響の解析については、non-V600変異のうちClass 3変異であれば抗EGFR抗体が有効である結果が既に得られており、2019年度中の論文化を目標とする。内定年度:2015本研究課題の目的である、MEK阻害薬とFGFR阻害薬の併用療法の有効性の証明については順調に進捗している。一方で、国際共同研究については、Engelman氏がハーバード大学からノバルティス社に移動したため、共同研究者には変更がないものの共同研究先を変更する必要が発生した。マウス実験(ヒトゼノグラフトモデル)については、ハーバード大学の研究施設で行う予定としていたが、ノバルティス社はヒトゼノグラフトモデルを1000以上の樹立・保有しており研究の遂行には問題がないものと考えられた。また、ノバルティス社は、FGFR阻害薬、MEK阻害薬についても複数の承認薬および開発中の化合物を保有していることから、KRAS変異肺がんに対するFGFR阻害薬とMEK阻害薬の併用療法の有効性の評価について、より実際の臨床試験に近い形での評価が可能になると考えられた。さらに、ノバルティス社は多数の低分子化合物ライブラリーを保有している。FGFR阻害薬とMEK阻害薬の併用療法の有用性はこれまで明らかにしてきたところではあるが、評価に用いたKRAS変異肺がん細胞株のうち4株では併用効果を認めないなど、無効な一群が存在することがすでに明らかとなっている。これらの腫瘍における抵抗性の解明、および新規治療の開発に、低分子化合物ライブラリーを用いた解析が有用であると考えられる。以上から、共同研究先をノバルティス社に変更し、Engelman博士およびノバルティス社のRAS研究チームとも研究の方向性について打ち合わせを行った。

上述のごとく、本研究課題の目的であるMEK阻害薬とFGFR阻害薬の併用療法の有効性の証明については順調に進捗する一方で、共同研究先の変更が必要となったため共同研究の開始については遅れている。ノバルティス社が持つ豊富なリソースを本研究に活用することが重要と考えられ、調整を進めているところである。2018年4月から10月末までノバルティスバイオメディカル研究所に滞在し共同研究を遂行した。ERKシグナルを標的とするMEK阻害薬を投与すると受容体の活性化が誘導され、その結果ERKシグナルが再活性化されることから、受容体からERKシグナルに至る経路を遮断することを試みた。化合物・発現抑制スクリーニングなどを用いた結果から、アダプタータンパクであるSHP2を標的とすることでMEK阻害薬投与後のERKシグナルの再活性化が抑制されることを見出した。このため、ノバルティスが開発したSHP2阻害薬SHP099とMEK阻害薬の併用療法について、細胞株、ゼノグラフトモデル、患者由来ゼノグラフトモデルを用いて評価を行い、その有効性を示した。また、PI3KシグナルについてもSHP2阻害薬を併用することにより活性化抑制されていた。しかしながら、同様の報告が2018年5月から7月にかけてNature Medicine誌をはじめとして計4本報告されたことから、現在はSHP2阻害薬がMAPKシグナルの再活性化を抑制するメカニズムについて解析を行っている。また、KRAS変異腫瘍に対する免疫療法の有効性については、ノバルティス社が持つスクリーニングの結果から、免疫療法の効果を減弱する候補因子を抽出し、現在解析を行っている。一方、KRAS腫瘍の研究を行っている研究者と交流を行うことにより、ERKパスウエイの制御について、KRASの下流に位置するBRAF変異腫瘍をモデルに検討する国際共同研究を開始した。BRAFのホットスポット以外に変異を有する大腸がんが、受容体の影響を受けるかどうかについて日米5000例を超える大腸がん症例を用いて検討を行い、Class 3と呼ばれるBRAF変異を有する大腸がんでは抗EGFR抗体が有効である可能性を示し、現在投稿中である。KRAS変異腫瘍に対するSHP2阻害薬とMEK阻害薬の有効性について実証したが、他グループに先んじられてしまった。このため、SHP2がERKシグナルを活性化するメカニズムについて詳細な解析を追加する必要が生じ、論文の投稿が遅れている。KRAS変異腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害薬の効果を増強・減弱する因子の同定については、ノバルティス社が持つスクリーニングシステムを活用することで、標的の候補が複数認められている。この中にはPI3Kシグナル、ERKシグナルにより活性が制御されるものが含まれており、本基課題と合わせた検討が可能になってきている。BRAF遺伝子にホットスポットであるV600以外の変異(non-V600変異)を有する腫瘍の解析については、KRAS研究者と交流することで新たに生まれた共同研究である。受容体とERKシグナルの関係を解析することでKRAS変異腫瘍に対する新規治療開発にもつながる研究である。
PLD法による二酸化チタン(TiO_2)ナノクラスター光触媒作製プロセスの開発

本研究では、現有のパルスYAGレーザに高周波バイアス電源や永久磁石等を併用したパルスレーザデポジション(PLD)装置を用いて、光触媒として有望であるTiO_2ナノクラスターを作製した。さらに、XPS、GXRD、SEM、AFMやPL法等を用いて、ナノクラスターの特性を調べた。また、作製したTiO_2ナノクラスター光触媒の水質改善効果を検討した。さらに、現有のマルチチャンネル分光分析装置でプラズマの発光分光分析を行いプラズマ温度や発光種を明らかにすることにより、ナノクラスターの特性とプロセスプラズマ特性の関係及び水質改善効果の関係を定量的に検討し、TiO_2ナノクラスター光触媒の最適作製プロセスを開発することを目的に研究を行った。その結果、以下のことがわかった。1)現有のPLD装置を用いて、TiO_2ナノクラスター堆積条件を変化し、TiO_2ナノクラスターをSi基板やコーニングガラス基板上に作製できた。2)作製したナノクラスターの特性をGXRD、FE-SEM、AFM、XPS、FT-IR分析装置やPL法により定量的に分析した結果、基板温度Tsを制御することによりアナターゼ型もしくはルチル型のTiO_2ナノクラスターを作製できることが明らかとなった。3)酸素ガス圧力によりTiと0の組成比は変化し・酸素ガス圧力P_<02>=10Pa以上で化学量論的組成のTiO_2ナノクラスターが得られることが分かった。4)作製したアナターゼ型TiO_2ナノクラスターを水処理装置に使用し、水質改善効果を定量的に検討し、水質改善効果があることを確認した。5)可視光応答型の窒素ドープTiO_2ナノクラスター作製に成功し、ナノクラスター特性と水質改善効果の関係を検討した。上記の結果をIPS14やASIPS等の国際会議や応用物理学会全国大会等で発表した。
チンパンジ-の行動生態学的研究(第3次)

平成元年度の野外調査は、タンザニアのマハレ山塊国立公園のチンパンジ-、ザイ-ルのワンバにおけるボノボ(ピグミ-・チンパンジ-)、コンゴのンドキ森林のチンパンジ-とゴリラを対象とした。タンザニアでは、離乳期の母子間葛藤、互酬的行動の成立過程、老齢個体の行動特微、寄生虫と薬草の採集など、ザイ-ルではボノボの雄間関係、コンゴでは主としてゴリラとチンパンジ-の採食競合の研究をおこなった。タンザニアでは、塚原高広がチンパンジ-の大人雄を対象として、毛づくろいの成立に至る行動連鎖とどのような組合せで互酬性が成立しているかを調べた。浜井美弥は、0才から2才までの離乳以前の子をもつ雌を追跡した。西田利貞は、離乳期の赤ん坊2頭と離乳前の3才の赤ん坊を観察した。マイク・ハフマンは腸内寄生虫を調べるため糞を、また摂取量がきわめて少ないので薬草の可能性のある食用植物を化学分析のために採集した。寄生虫の同定はすでにおわり、植物は京大農学部で分析中である。また、分配の互酬性を調べるため全員が可能な限り狩猟行動と分配のデ-タを収集した。老齢個体についても各自が機会あり次第観察した。エデウス・マサウェは広域の分布調査をおこなった。ワンバでは、五百部裕が大人雄の個体追跡をおこなった。ンドキでは黒田末寿がチンパンジ-を、西原智昭がゴリラを対象に採食行動のデ-タを収集した。結果は以下のとうり。1.離乳と関連する母性行動はまだ子が小さいときに始まるが、激しい母子間葛藤は母親が出産後最初の発情を示したときに始まる。激しい葛藤の開始は、生後36カ月から66カ月と個体により異なるが、母親が老齢だと開始が遅れる。野外では動物園のチンパンジ-より、成長も母子葛藤も遅く起こることが明らかになった。2.離乳期の母子間葛藤は、(1)母親が授乳を拒否したとき、(2)子の運搬を拒否したとき、(3)子の採食を妨害したとき、(4)母親が子を放置して歩み去ったとき、(5)発情した母親が交尾したとき、などに起こった。赤ん坊は母親に対し不満を表明する音声を発したり、かんしゃく行動を示した。母親の宥めの行動として抱きしめ、授乳、毛づくろい、子との交尾があった。一方、母親による食物分配も頻繁に見られた。3.年令の近い大人雄の間では、毛づくろいは互酬的・相互的になる傾向があり、若い大人雄はたとえ順位が低くても年長の大人雄を一方的に毛づくろいする傾向が強かった。4.第一位雄は、毛づくろいをお互いに頻繁におこなった同盟者の雄たちや血縁者、配偶関係にあった雌たちに肉を分配し、ライバルである第二位の雄や若い大人雄にはほとんど分配しなかった。それゆえ、第一位雄の肉の分配行動は、連合戦略であると考えられた。5.チンパンジ-の腸内寄生虫は雨期に増加し、アスピリア、ヴェルノニア等の薬草利用の頻度も雨期に増加した。それゆえ、薬草の一部は寄生虫駆除の機能をもっている可能性があることがわかった。6.ライオンがチンパンジ-を食べるという証拠が初めて発見された。また、同じ群れの赤ん坊を殺し、食べるという共食い行動の6例目が観察された。7.母親を失った3頭の孤児のうち、1頭(雌)は兄を、2頭(雄・雌)は主として大人の雄を追従していた。毛づくろいの相手も同様であった。雄の孤児は、母親の友人の雌を追従することも多かった。8.絶威したと考えられていたカボゴ岬などいくつかの地域で、チンパンジ-が分布しているのが確認された。9.ボノボの大人雄の優劣順位には、母親が存在が大きな影響力をもっていることがわかった。また、ボノボの雄間の結びつきはチンパンジ-のそれより弱いことがわかった。10.コンゴのンドキ森林では、チンパンジ-とゴリラの食物は大幅に重複しており、採食競合が起こっていることが示された。低地ゴリラはとくに乾期から雨期の変わり目には果実に依存していた。11.ビデオ録画テ-プ25巻が得られた。行動連鎖や手の一側優位性の分析などに利用する予定である。

また、分配の互酬性を調べるため全員が可能な限り狩猟行動と分配のデ-タを収集した。老齢個体についても各自が機会あり次第観察した。エデウス・マサウェは広域の分布調査をおこなった。ワンバでは、五百部裕が大人雄の個体追跡をおこなった。ンドキでは黒田末寿がチンパンジ-を、西原智昭がゴリラを対象に採食行動のデ-タを収集した。結果は以下のとうり。1.離乳と関連する母性行動はまだ子が小さいときに始まるが、激しい母子間葛藤は母親が出産後最初の発情を示したときに始まる。激しい葛藤の開始は、生後36カ月から66カ月と個体により異なるが、母親が老齢だと開始が遅れる。野外では動物園のチンパンジ-より、成長も母子葛藤も遅く起こることが明らかになった。2.離乳期の母子間葛藤は、(1)母親が授乳を拒否したとき、(2)子の運搬を拒否したとき、(3)子の採食を妨害したとき、(4)母親が子を放置して歩み去ったとき、(5)発情した母親が交尾したとき、などに起こった。赤ん坊は母親に対し不満を表明する音声を発したり、かんしゃく行動を示した。母親の宥めの行動として抱きしめ、授乳、毛づくろい、子との交尾があった。一方、母親による食物分配も頻繁に見られた。3.年令の近い大人雄の間では、毛づくろいは互酬的・相互的になる傾向があり、若い大人雄はたとえ順位が低くても年長の大人雄を一方的に毛づくろいする傾向が強かった。4.第一位雄は、毛づくろいをお互いに頻繁におこなった同盟者の雄たちや血縁者、配偶関係にあった雌たちに肉を分配し、ライバルである第二位の雄や若い大人雄にはほとんど分配しなかった。それゆえ、第一位雄の肉の分配行動は、連合戦略であると考えられた。5.チンパンジ-の腸内寄生虫は雨期に増加し、アスピリア、ヴェルノニア等の薬草利用の頻度も雨期に増加した。それゆえ、薬草の一部は寄生虫駆除の機能をもっている可能性があることがわかった。6.ライオンがチンパンジ-を食べるという証拠が初めて発見された。また、同じ群れの赤ん坊を殺し、食べるという共食い行動の6例目が観察された。7.母親を失った3頭の孤児のうち、1頭(雌)は兄を、2頭(雄・雌)は主として大人の雄を追従していた。毛づくろいの相手も同様であった。雄の孤児は、母親の友人の雌を追従することも多かった。8.絶威したと考えられていたカボゴ岬などいくつかの地域で、チンパンジ-が分布しているのが確認された。9.ボノボの大人雄の優劣順位には、母親が存在が大きな影響力をもっていることがわかった。また、ボノボの雄間の結びつきはチンパンジ-のそれより弱いことがわかった。10.コンゴのンドキ森林では、チンパンジ-とゴリラの食物は大幅に重複しており、採食競合が起こっていることが示された。低地ゴリラはとくに乾期から雨期の変わり目には果実に依存していた。11.ビデオ録画テ-プ25巻が得られた。行動連鎖や手の一側優位性の分析などに利用する予定である。
モンゴル語のコピュラ・存在動詞の研究

初年度と2年度目に引き続いて、baj-の各用法のデータをネイティブスピーカーへの面接調査により収集した。特に、「テンス・アスペクトを表す分析的な表現」の後部要素として用いられるbaj-に関して多くのデータを集めることができた。「baj-の直前の動詞(=テンス・アスペクトを表す分析的な表現の前部要素)」と「baj-(=後部要素)」のそれぞれが取りうる動詞語尾は複数ある。そこで、両者がとる語尾を変化させることで網羅的なデータ収集を行なった。同時に、前部要素の動詞の種類にも着目した。また、2年度目と同様、baj-に関連する文法事項(所有表現やヴォイス等)のデータも収集することができた。さらに、問題となる表現の前後の文脈を確認する目的でコーパスも利用した。こうして得られたデータ、及び、初年度と2年度目の考察に基づき、用法の分類の見直しと用法間の関係の考察を行なった。その際、名詞や形容詞の直後に現れるbajna(baj-の一形式で、「非過去」を表す終止語尾-naを伴うもの)の位置付けが特に問題になった。先行研究では、名詞や形容詞の直後に現れるbaj-は、コピュラ動詞として扱われてきた。確かに、bajna以外のbaj-の諸形式については、この分類は適切であると思われる。しかし、名詞や形容詞の直後に現れるbajnaに関しては、むしろ、モダリティを表す他の文末小辞と同列に扱った方が適切な場合があると考えられる。日本及びモンゴルでネイティブスピーカーに面接調査を行ない、データの収集・分析をした。主に以下の点について考察した。現在時のコピュラは現れる場合と現れない場合があり、コピュラの有無によって文の表わす意味が異なることがある。本研究ではまず、コピュラbajnaが主節に現れた場合に表わす意味を、「主語の人称」及び「述語が名詞句であるか形容詞句であるか」に着目して考察した。また、従属節における現在時のコピュラに関しても調査を行なった。その結果、従属節におけるコピュラの現れ方が、主節におけるそれとは異なっていることが分かった。例えば、これまで得られたデータを見る限りでは、従属節において述語が名詞句である場合、コピュラが現れる例を見つけることができなかった(主節においては、述語が名詞句である場合コピュラは現れうる)。また従属節において、述語が形容詞句である場合には(主節の場合と同じように)コピュラが現れる場合と現れない場合があるが、コピュラの有無が主節動詞のテンス・アスペクトと相関していると考えられる例がある。これについてはより多くのデータを集め記述を進めていきたい。さらに、テンス・アスペクト表現中で用いられるbajnaについても考察を行った。「テンス・アスペクト表現中で用いられるbajna」がbajnaの他の用法との関連で論じられることはこれまであまりなかったが、調査の結果、「テンス・アスペクト表現中で用いられるbajna」はbajnaの他の用法と並行的に捉えられる部分がある事が分かった。これらの考察結果は来年度開催される学会等で発表する予定にしている。今年度はコピュラ・存在動詞baj-の用法間の関係や、従来のbaj-の用法分類の妥当性等について研究を進めた。昨年度の研究で、baj-の記述に当たって「主語の人称」「述語が名詞句であるか、それとも形容詞句であるか」「baj-が現れるのが主節中であるか、従属節中であるか」等の点に着目する必要性が明らかになったので、これらの点に注意しながら研究を進めた。また、baj-と関連する文法事項(所有表現やヴォイス等)の調査も行なった。データはモンゴル(2006年78月及び2007年23月の2回)と日本でネイティブスピーカーに面接調査を行なって得た。研究成果の一部は2回の国際学会で発表した。第9回国際モンゴル学者会議(2006年8月10日、モンゴル国立大学)では「動詞述部中の補助動詞で用いられるbajnaの用法と、他の用法との関連」(原題はモンゴル語)という題で発表した。ここでは、「テンス・アスペクト表現中で用いられる」bajna(baj-の一形式)が「話者の発見」を表す場合がある事実を示し、baj-の「テンス・アスペクト表現中で用いられる用法」と「モダリティを表す用法」の関係を論じた。また、第7回ソウル国際アルタイ学会(2006年9月26日、ソウル大学)では"Factors relevant to the use of the present tense copula bajna in Mongolian"という題で発表した。この発表では、従来の分類で「コピュラの用法」に当てはまるとされていたbajnaの用例を「話者の発見を表すもの」「一時的状態を表すもの」「典型的繋辞として用いられるもの」の3つに分類した。そしてこの3項目の特徴を「主語の人称」及び「述語が名詞句であるか、それとも形容詞句であるか」という2つの観点から論じた。「baj-の直前の動詞(=テンス・アスペクトを表す分析的な表現の前部要素)」と

「baj-(=後部要素)」のそれぞれが取りうる動詞語尾は複数ある。そこで、両者がとる語尾を変化させることで網羅的なデータ収集を行なった。同時に、前部要素の動詞の種類にも着目した。また、2年度目と同様、baj-に関連する文法事項(所有表現やヴォイス等)のデータも収集することができた。さらに、問題となる表現の前後の文脈を確認する目的でコーパスも利用した。こうして得られたデータ、及び、初年度と2年度目の考察に基づき、用法の分類の見直しと用法間の関係の考察を行なった。その際、名詞や形容詞の直後に現れるbajna(baj-の一形式で、「非過去」を表す終止語尾-naを伴うもの)の位置付けが特に問題になった。先行研究では、名詞や形容詞の直後に現れるbaj-は、コピュラ動詞として扱われてきた。確かに、bajna以外のbaj-の諸形式については、この分類は適切であると思われる。しかし、名詞や形容詞の直後に現れるbajnaに関しては、むしろ、モダリティを表す他の文末小辞と同列に扱った方が適切な場合があると考えられる。
キメラ培養系を利用したヒト破骨細胞共存培養分化系確立の試みと分化メカニズムの解析

キメラ培養系においてマウス骨髄由来単球系細胞は培養中に消失した。培養系にM-CSFを添加すると単球系細胞は生存したが、TRAP陽性多核細胞にはならなかった。このことからヒト滑膜線維芽細胞は破骨細胞の生存因子・分化因子を十分産生していないと考えられた。実際この培養系にM-CSFとRANKLを共に添加すると、TRAP陽性の多核細胞が誘導された。意外なことに滑膜線維芽細胞はM-CSFを骨芽細胞に遜色ないレベルで産生しており、M-CSF以外の生存因子の存在が示唆された。更に骨芽細胞・滑膜線維芽細胞共に高濃度のOPGを産生しており、これは異所性の破骨細胞分化を抑制するメカニズムの可能性がある。関節リウマチ(RA)では破骨細胞が骨破壊に寄与すると考えられている。破骨細胞は前駆細胞と骨芽細胞の共存培養によりin vitroで分化させることが可能だが、関節滑膜には骨芽細胞が存在しないためRAでは滑膜線維芽細胞が骨芽細胞と同様の役割を担って破骨細胞分化を誘導することが想定されている。本研究ではヒトの共存培養系に準じた系として、マウス骨髄細胞由来破骨細胞前駆細胞とヒト滑膜線維芽細胞によるキメラ共存培養を行い上記の仮説を検証することを目的としている。この実験が可能と考えられる根拠は、マウス破骨細胞前駆細胞がヒトのM-CSFおよびRANKLにより破骨細胞に分化するという実験事実である。方法としてはマウス共存培養と同じ条件でRA患者滑膜由来の滑膜線維芽細胞とマウス破骨細胞前駆細胞を培養し7日後にTRAP陽性の多核細胞の有無を観察した。その結果、キメラ共存培養ではそもそもマウス由来細胞の生存が維持されなかった。この系にヒトM-CSFを添加するとマウス由来細胞は生存したが、TRAP陽性多核細胞は分化しなかった。M-CSF/RANKLを添加して初めてTRAP陽性多核細胞が分化した。滑膜線維芽細胞培養上清に含まれるM-CSFの濃度は極めて低く、またRANKLシグナルを阻害するOPGの濃度はマウス骨芽細胞に比べて著明に高値であった。このことから、骨芽細胞と異なり滑膜細胞はM-CSFの産生能が低く、またOPG産生能が高いため破骨細胞の誘導能が低いことが考えられる。当初の計画通りキメラ共存培養系の基本的な実験を遂行しデータを得ることが出来た。マウス共存培養と同じ条件でRA患者滑膜由来の滑膜線維芽細胞とマウス破骨細胞前駆細胞を培養し7日後にTRAP陽性の多核細胞の有無を観察した。実際、滑膜線維芽細胞培養上清に含まれるM-CSFの濃度は極めて低値であった。マウス破骨細胞前駆細胞の代わりにRaw 264.7細胞を用いたところ、この細胞はM-CSF非依存性のため生存可能であったが、破骨細胞様細胞は分化しなかった。上記の結果を踏まえ、キメラ培養系にM-CSF/RANKLを添加して初めてTRAP陽性多核細胞が分化した。また滑膜線維芽細胞培養上清に含まれるOPG(RANKLシグナルを阻害する囮受容体)の濃度はマウス骨芽細胞に比べて著明に高値であった。このことから、骨芽細胞と異なり滑膜細胞はM-CSFの産生能が低く、またOPG産生能が高いため破骨細胞の誘導能が低いことが考えられた。当初の計画通りキメラ共存培養系の基本的な実験を遂行し、ヒト滑膜細胞とマウス骨芽細胞の性質の異同が明らかとなった。これまでの結果で、RA患者滑膜由来の滑膜線維芽細胞とマウス破骨細胞前駆細胞を共存培養し7日後にTRAP陽性の多核細胞の有無を観察したところキメラ共存培養ではそもそもマウス由来細胞の生存が維持されなかった。更にキメラ培養系にM-CSF/RANKLを添加して初めてTRAP陽性多核細胞が分化した。このことから、骨芽細胞と異なり滑膜細胞はM-CSFの産生能が低く、またRANKL産生能に比べてOPG産生能が高いため破骨細胞の誘導能が低いことが考えられた。

実際、骨芽細胞培養上清からはRANKLが検出されたが滑膜細胞培養上清からは検出されなかった。これは予想通りであったが、意外なことに前者にも後者と同様に高濃度のOPGが検出された。このことから骨芽細胞の産生する可溶性RANKLの多くはOPGにより中和されていることが示唆される。それにも関わらず骨芽細胞の共存培養型で破骨細胞が観察される理由として、骨芽細胞の発現する膜型のRANKLが重要な役割を果たすという仮説を立てている。即ち、骨芽細胞の産生するOPGは、骨芽細胞から離れた場所で破骨細胞が分化しないように制御するメカニズムではないかと考えている。キメラ培養系においてマウス骨髄由来単球系細胞は培養中に消失した。培養系にM-CSFを添加すると単球系細胞は生存したが、TRAP陽性多核細胞にはならなかった。このことからヒト滑膜線維芽細胞は破骨細胞の生存因子・分化因子を十分産生していないと考えられた。実際この培養系にM-CSFとRANKLを共に添加すると、TRAP陽性の多核細胞が誘導された。意外なことに滑膜線維芽細胞はM-CSFを骨芽細胞に遜色ないレベルで産生しており、M-CSF以外の生存因子の存在が示唆された。更に骨芽細胞・滑膜線維芽細胞共に高濃度のOPGを産生しており、これは異所性の破骨細胞分化を抑制するメカニズムの可能性がある。RAにおいて骨破壊が起きていることは臨床的な事実であり、今回のin vitroの系とは乖離が見られる。In vivoにおける細胞やサイトカインの挙動を解析することは難しいが、培養条件の変更や、第3の細胞の添加などを通じてRAの病態をシミュレートすることを目指す。今後キメラ共存培養系の解析からヒト単球系細胞と滑膜細胞の共存培養へ移行する。フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いた滑膜細胞のサブポピュレーション解析も行う予定。免疫学ほぼ予定通りに使用しているが海外学会参加を延期したことなどが影響している海外学会出席を延期したため海外学会参加あるいは受託の解析費のいずれかに使用する予定今年度のヨーロッパリウマチ学会出席に充てる予定。
低品位銅スクラップの精製に関する基礎実験

1.比較的純度の高い銅スクラップ中の不純物元素を酸化除去する目的で、坩堝に不純物元素を添加した銅とスラグを入れ、空気を吹き込む酸化精製実験を行った。この結果は以下の様である。(1)不純物の酸化物の融点が銅の融点より高い鉄、亜鉛、コバルト、ニッケルは、溶剤を添加しない酸化だけで、これらの不純物を固体酸化物として除去分離出来る。(2)酸素との親和力の大きい不純物である亜鉛、鉄、コバルト、錫を酸化除去する際、過剰に酸化し過ぎると、銅中の酸素濃度の増加のため不純物元素が銅中で安定になり除去し難くなる。(3)不純物元素と酸素との親和力が銅と酸素の親和力に近い、ニッケル、ビスマスはこの酸化により機分除去出来るものの、完全に除去することは出来なかった。2.低品位銅スクラップから酸化により不純物元素を除去することは効率が悪いので、スクラップ中の銅を濃縮する実験を行った。スクラップ中の主要な不純物である鉄を分離するもので、その原理は次の様である。炭素飽和下でCu-Fe-C3元系融体は、鉄が富化した溶鉄相と銅が富化した溶銅相の二液相に分離するので、低品位含銅鉄スクラップを炭素飽和下で溶解し、主要不純物の鉄を溶鉄相に分離し、下層に濃縮した銅を回収するものである。この実験の結果を要約すると次のようである。(1)溶鉄相と溶銅相が密度差で上下二液層に明瞭に分離し、鉄が富化した溶鉄相の組織は、91.1%Fe-4.7%Cu-4.2%であり、銅が富化した溶銅相の組成は96.7%Cu-3.3%Feであった。(2)この二液分離を利用すると、10%銅を含むスクラップから60%の銅が回収でき、20%銅を含むスクラップからは80%の銅が、また30%の銅を含むスクラップからは90%の銅が回収できる。鉄、亜鉛、錫、鉛、コバルト、ニッケル、砒素、アンチモン、ビスマスの不純物を含む銅スクラップを坩堝で溶解した後、FeO_x-SiO_2-CaO-Cu_2O系スラグを添加しつつ、溶銅中にアルミナ管で空気を吹き込む不純物を酸化させる実験を行った。前記の不純物のうち、鉄、亜鉛、錫、コバルトの大部分はこの方法で大部分酸化除去出来ることが明らかになった。鉛とニッケルは酸化精製により幾分除去出来るが、完全に分離するまでには至らなかった。砒素は酸素ポテンシャルを上げ、Cu_2O-CaO系スラグを添加すると除去出来た。スラグに入った砒素の大部分は固体の3CaO・As_2O_5の形態とみられる。アンチモンも塩基性のCu_2O-CaO系スラグを添加することにより幾分除去できる。ビスマスはいずれのスラグを用いても、酸化除去出来なかった。前記の不純物元素の熱力学的性質、及びスラグと溶銅間の分配平衡データから次のことが指摘できる。1.不純物の酸化物の融点が銅の融点より高い鉄、亜鉛、コバルト、ニッケルは、溶剤を添加しない酸化だけで、これらの不純物を固体酸化物として除去分離出来る。2.酸化精製温度は低い程よい。

それはこれらの不純物と酸素の親和力が銅と酸素との親和力より大きく、酸素との親和力が大きい金属ほど低温で酸化されやすい為である。3.酸素との親和力の大きい不純物である亜鉛、鉄、コバルト、錫を酸化除去する際、過剰に酸化し過ぎると、銅中の酸素濃度の増加のため不純物元素が銅中で安定になり除去し難くなるごみ処理施設やシュレッダ-ダスト焼却施設等から出る焼却灰中の金属残渣等の低品位銅スクラップの発生が予想される。この低品位の銅スクラップを現行の銅製錬工程あるいは新規に開発されるスクラップ精製プロセスで直接処理することは効率が悪いので、スクラップ中の銅品位を高める方法の開発が望まれる。炭素飽和下でCu-Fe-C3元系融体は、鉄が富化した溶鉄相と銅が富化した溶銅相の二液相に分離する現象を利用し、低品位の含銅スクラップから銅を濃縮するための基礎的な坩堝実験を行った。1450K、温度の炭素飽和下で、この三元系融体は、溶鉄相と溶銅相が密度差で上下二液層に明瞭に分離することが確認された。鉄が富化した溶鉄相の組成は、91.1%Fe-4.7%Cu-4.2%Cであり、銅が富化した溶銅相の組成は96.7%Cu-3.3%Feであった。この二液分離を利用すると、溶銅相に入る銅は全て回収出来、溶鉄相に入る銅は全て損失すると仮定したとき、それぞれ10%、20%、30%の銅を含むスクラップからの銅の回収率は、60%、80%、90%である。この方法で回収される銅の品位は97%である。スクラップ中には銅、鉄の他種々の金属が含まれるので、この二液分離に及ぼすそれらの金属の影響を調べるため、アルミニウム、クロム、マンガン、硫黄、シリコンを添加し二液相の組成の変化を調べた。溶鉄相への銅の溶解度はスクラップからの銅の回収率に影響し、溶銅相への鉄の溶解度は回収される銅の品位に影響する。溶鉄相への銅の溶解度は溶鉄相への炭素の溶解度に直接関係することが明らかになった。炭素の溶解度が増すと銅の溶解度が減少し、銅の回収率を高くする。Cu-Fe-C3元系にクロム、マンガンを加えると溶鉄相への炭素の溶解度が増し、銅の溶解度は減少する。硫黄とシリコンは炭素の溶解度を減少させ、銅の溶解度を増加させる。
生体ナノ空間シナプスのためのバイオセンシング法の開発と脳機能計測への応用

生体ナノ空間シナプスを調べるためのバイオセンサーの構築を行い,実際に脳スライス中での計測について検討した.申請者らが開発してきたキャピラリー型グルタミン酸センサーを用いて,これを細胞外記録と組み合わせることにより,マウス脳スライス中でのグルタミン酸(前膜)ーfEPSP(後膜)レベルの同時測定法を開発した.さらに,この方法を,海馬の長期増強(LTP)に適用し,テタヌス刺激時のグルタミン酸濃度とLTP発現との間には相関があることを見出し,脳研究のための新ツールとして提案した.また,イオンチャネルを用いたナノ薄膜型(脂質二分子膜型)センサーの高効率構築のための基礎をつくった.生体ナノ空間シナプスを調べるためのバイオセンサーの構築を行い,実際に脳スライス中での計測について検討した.申請者らが開発してきたキャピラリー型グルタミン酸センサーを用いて,これを細胞外記録と組み合わせることにより,マウス脳スライス中でのグルタミン酸(前膜)ーfEPSP(後膜)レベルの同時測定法を開発した.さらに,この方法を,海馬の長期増強(LTP)に適用し,テタヌス刺激時のグルタミン酸濃度とLTP発現との間には相関があることを見出し,脳研究のための新ツールとして提案した.また,イオンチャネルを用いたナノ薄膜型(脂質二分子膜型)センサーの高効率構築のための基礎をつくった.マウス脳スライス標本中において,シナプス可塑性の代表例である長期増強(LTP)を誘導し,その際に放出されるグルタミン酸量について,申請者らが開発したキャピラリー酵素センサーを用いて評価した.申請者らはこれまでに,電気刺激下で放出されるグルタミン酸を脳スライス内で検出することに成功していたが,本年度はこれをシナプス可塑1生へと展開し,マウス海馬スライスにおいてLTPを誘導した際のグルタミン酸応答の変化について評価した.さらに,種々の阻害剤を投与してコントロール実験を行い,観測されたグルタミン酸の放出由来についても検証を行った.また,脳内計測が可能なキャピラリー型脂質二分子膜グルタミン酸センサーの開発を目指し,その課題となっている安定化脂質二分子膜へのイオンチャネルの包埋について検討を行った.チャネルタンパク質はリボソームに埋め込まれた状態で抽出されるので,チャネルの包埋のためにはチャネル含有リボソームを平面脂質二分子膜と効率よく融合(ベシクル融合)させる必要がある.本年度は,イオンチャネルとして心筋のhuman ether-a-go-go-related gene(hERG)チャネルを対象に,種々の物理的なベシクル融合促進因子について検討した.安定化脂質二分子膜としては,微細加工したシリコン基板中に形成した二分子膜を典型例として用いた.その結果,シリコンチップ中に形成した安定化脂質二分子膜中でのhERGチャネルの単一チャネル電流記録に成功した.マウス脳スライス標本中において,電気刺激によって放出されるグルタミン酸を,キャピラリー型酵素センサーを用いて評価した.その結果,電気刺激によって脳スライス中に興奮性後シナプス電位(EPSP)が誘起されるが,このEPSPと電気刺激とが,グルタミン酸センサーの電流値に大きな影響を及ぼすことが判明した.その理由として,EPSPの測定回路と,グルタミン酸センシングのための電気化学測定の回路とが,電気伝導性の脳スライスを介してつながってしまうことに由来することを,デバイスシミュレーションを用いて明らかにした.さらに,EPSPおよび電気刺激由来のノイズ成分を除去した真のグルタミン酸信号成分を抽出するための解析手法を創案するとともに,得られたグルタミン酸信号の信頼性について様々な刺激プロトコルを用いて検証した(論文投稿中).さらに,この手法を,シナプス可塑性の代表例である長期増強現象に適用し,長期増強の誘導前後におけるグルタミン酸放出量について評価した.また,脳内計測が可能なプローブ型の脂質二分子膜グルタミン酸センサーの構築を目指し,そのための課題となっている安定化脂質二分子膜へのイオンチャネルの包埋について検討を行った.チャネルタンパク質はプロテオリポソームに埋め込まれた状態で抽出されてくるので,チャネルの包埋のためにはチャネル含有プロテオリポソームを人工脂質二分子膜と効率よく融合(ベシクル融合)させる必要がある.安定化脂質二分子膜として,シリコン基板中に作製した微細孔中に形成した脂質二分子膜を典型例として用い,種々の物理的なベシクル融合促進因子について検討し,膜融合促進因子についての基礎知見を集積した.神経活動の計測において、前シナプスから放出されるグルタミン酸のレベルと、それに伴って誘起される後シナプスの活動レベルとを同時に記録することは、前膜ー後膜の活動レベルの相関を知るために重要である。本研究では、脳スライス中の神経活動における前シナプスおよび後シナプスの活動レベルを同時に測定できる方法の開発を行った。本研究室で開発してきたキャピラリー型酵素センサーを用いて、電気刺激によって後シナプス側に誘起される興奮性後シナプス電位(fEPSP)と、前シナプスから放出される神経伝達物質グルタミン酸の同時計測を行った。その結果、fEPSPとグルタミン酸の同時計測により、酵素センサーの側にアーティファクト電流が流れること、その由来がfEPSPに伴う容量性電流であることを明らかにし、アーティファクト電流が重畳しないファラデー電流の抽出法について提案した(論文業績1)。さらに、この方法を、神経可塑性現象の一種である長期増強現象(LTP)に適用した。

LTPを誘導するためのプロトコルとなるテタヌス刺激について、刺激下で放出されるグルタミン酸濃度を調べ、LTPが誘導される際にはテタヌス刺激時のグルタミン酸濃度が上昇し、LTPが誘導されない時にはグルタミン酸濃度が低い状態であることを見出し、LTPが発現するかどうかとテタヌス刺激時のグルタミン酸濃度との間に相関関係があることを報告した(論文業績2)。この他、脳内計測のためのプローブ型の脂質二分子膜グルタミン酸センサーの構築のための基礎検討も行った。すなわち、脂質二分子膜へのイオンチャネルタンパク質の包埋について検討し、一過性の強い刺激の付与によって、イオンチャネルの包埋確率を著しく向上させることに成功した(投稿準備中)。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオセンシング26年度が最終年度であるため、記入しない。LTP誘導前後におけるグルタミン酸放出量の定量については,予定通りに進んでおり,今後はコントロール実験を残すのみとなっている.また,イオンチャネルセンサーについても,当初の予定のグルタミン酸受容体ではないが,創薬において注目度の高いhERGチャネルの包埋に成功しており,生体チャネルの二分子膜中への包埋という点では順調に進んでいると考えられる.長期増強誘導前後におけるグルタミン酸放出量の定量については,二種の電気化学的測定法の融合に伴う相互干渉という予期せぬ事態に遭遇したが,その理由を明らかにするとともに新しいサイエンスを展開し,新しい測定法の創案に成功した.また,イオンチャネル型のセンサーについても,その最大の課題であった,イオンチャネルタンパク質の脂質二分子膜への高効率包埋についての糸口を見出しており,総合的にみて,おおむね順調に進んでいる.26年度が最終年度であるため、記入しない。LTP誘導前後におけるグルタミン酸放出量の定量については,コントロール実験を進め,その知見に基づいて,ナノセンサーの開発へと展開する.また,イオンチャネルの二分子膜への包埋について,さらなる効率化について検討を行い,キャピラリー型脂質二分子膜センサー実現に向けての基礎知見を集積する.シナプス可塑性発現時におけるグルタミン酸放出量の評価については,本年度創案した手法に基づいて,引き続き定量を行うとともに,種々の阻害剤を利用したコントロール実験を行い,放出源の確認も行う.また,イオンチャネルタンパク質の脂質二分子膜への効率的包埋については,今年度見い出した知見に基づいて検討を行い,新たなチャネルタンパク質組み込み法としての確立を目指す.ナノセンサーの開発と培養細胞系への展開についても引き続き検討を行う.26年度が最終年度であるため、記入しない。グルタミン酸放出量の定量についてのコントロール実験を進めるため,試薬や実験動物,実験用ガス,実験器具が必要となる.イオンチャネルの二分子膜への包埋についてはさならる条件検討が必要となるため,リボソームの浸透圧を測定する浸透圧計を購入し,融合条件を精査する予定である,科研費の適切な使用を心がけて節約に努めたところ、基金分に余剰が生じたために、翌年度への繰り越しとした。来年度の26年度は本科研費の最終年度となり、測定回数も大幅に増えると予想されるため、実験動物や、実験用ガス、金線、試薬等にかかる消耗品費の増大が考えられる。前年度からの繰り越し金は、その消耗品費として使用したいと考えている。
19世紀英国大衆演劇とその成立背景についての研究

2年にわたる本研究のまとめとして、2本の論文を刊行することができた。1つは本研究の全体を概観するものとして、「ヴィクトリア朝演劇研究序説」と銘打って、この2年間に得られた知見ならびに今後の課題について略述するもの、もう一つはディケンズの小説『ハード・タイムズ』に登場するある人物の言動の矛盾の原因を、この人物が子供の頃に親しんでいたと思われる大衆演劇の一種であるパントマイムの出し物の中に求め、そこからこの小説の意義を再評価しようとするものである。1999年7月に連合王国・ヨーク市で開催されたディケンズ・フェロウシップ国際大会では、主催者側の日程上の都合によりこのテーマに関する論文を読むことはできなかったが、その代わりにこの分野における権威ともいうべき数人のイギリス人研究者との知遇を得、今後の研究方向について極めて重要な示唆を得ることができた。すなわち、ヴィクトリア朝演劇の研究をするためには、台本の読み込み以上に、当時の観客層の好みを知ることが重要であること、また、近代的舞台装置が導入されることによって、役者や脚本以上に、それらの機械仕掛けをいかに駆使するかに興行収入が左右されるようになったということである。もちろん、そのようなことでヴィクトリア朝演劇が陳腐化されたばかりではなく、むしろ大衆向けに劇場が開かれてゆくことを通して、庶民の中に観劇を当たり前の娯楽として捉える層を増やすことができたことこそが、20世紀において社会主義的演劇人であるバーナード・ショウを生み出す素地になったのであり、結果的にイギリス演劇というものの裾野を拡大することに貢献したと言えるのである。今後はこのような観点から研究を進めていく予定であり、まずは劇場形態の変遷に的を絞ってみようと考えている。これまで我が国では本格的な研究がほとんど行われてこなかった19世紀イギリス大衆演劇の一次資料を収集することから本年度の研究は始まったが、予算内でほぼ所定の目的を達することができた。次にそれを実際に読み込む作業に着手したが、その途中に二つの学会発表を行う機会を得た。5月に「演技するディケンズ」と題する論文を京都大学で開催された日本英文学会第70回大会で口頭発表したが、これは、ヴィクトリア朝を代表する小説家であるチャールズ・ディケンズが、生涯を通して素人芝居や公開朗読などといったパフォーマンスに興味を抱き続けていた事実に着目し、当時の大衆演劇状況へも言及したものであった。6月にもディケンズの小説に関する口頭発表をディケンズ・フェロウシップ日本支部春季大会で行ったが、この中でもディック氏という狂人と作者との類似点を探りつつ、その幼少時の自己劇化癖を指摘した。以上の二つは既に活字論文として刊行済みである。この二つの研究発表とそれに対する出席者の質問などから、この分野に対する日本人英文学者からの関心は徐々に高まりつつあるものの、まだ作品が広く知られているわけではない事実を確認した。その後も引き続き入手した文献を読むという作業を継続して今日に至っている。目下抱えている問題点は二つある。一つは、このような大衆演劇を見ていた観客層について。内輪で行っていたような素人芝居の中から本格的役者志望の人物が登場することがあったように、観客の中にも潜在的役者志望者がいたはずであるが、この二種類の人々はどのような方面に吸収されていったのか。もう一つは、役者と脚本家の立場の逆転がこの時期に起こっているが、それは何を契機としたものなのか。この時期には役者の価値が相対的に低下し、逆に脚本家が脚光を浴びるという現象が起こる。この問題と産業革命爛熟期の識字率の上昇との関係についても考察してみたい。
幼児の遊びと手指の巧緻性の発達

1.研究目的本研究ではこれまで対象にされていなかった幼児における手指の巧緻性に注目し、幼児に適した計測方法を検討・実施し、幼稚園における3歳5歳児学年までの手指の巧緻性の発達傾向を明らかにするとともに、幼稚園生活における遊びと巧緻性の発達の関連について追究する。2.研究方法幼児の手指の巧緻性を測定する方法として、(1)おりがみ四角折り(2)マグネット移し(3)ひも結び(4)ビーズ通しの4種のテストを開発し実施した。対象は国立大学附属幼稚園の35歳児計147名。調査期間は2011年710月。遊びの傾向については保育者の聞き取り調査を実施し幼児の手指の巧緻性の発達傾向を、年齢差、男女差の発生要因から検討した。3.研究成果(1)年齢差:学年と月例の両面から検討した。全てのテスト項目において、学年があがるにつれて成績が上昇し、男女ともほぼ全ての項目で学年間の有意差は認められた。特に3歳児と4歳児学年及び男児の年齢差が顕著であった。マグネット移しとビーズ通しでは、月齢との相関性が高く、指先でつまむ作業における年齢差が高いことが明らかになった。(2)男女差:3歳児と4歳児学年では、全ての項目において、女児の方が有意に成績が高く、5歳児学年では男児の方が成績がよい項目が見られるようになり、男女差が縮小する傾向が見られた。この結果については、今回の調査対象者の特徴であるのか、幼稚園という集団生活での共通経験によるものであるのかなど対象児の生活活動や遊びの観察を継続し、今後の研究課題として検討する予定である。
シングルセル解析を進展させる環境微生物の機能推定技術の開発

汚染物質の浄化、地球温暖化ガスの固定、持続可能なエネルギーの創出に大きく関わる微生物資源を有効に利用するためには、さらなる微生物の理解が必要不可欠である。多くの微生物が人為的に分離培養できない現状において、近年発展著しい分子生物学的アプローチは有効である。さらに微生物細胞を遺伝子の運び屋として捉え、細胞のまま解析を行うシングルセル解析は、培養を伴わない解析手法として近年注目を集めている。本研究ではシングルセル解析のさらなる発展を目指し、細胞壁処理不要の新規な高感度FISH法であるin situ DNA HCR法を改変し、mRNAの検出に成功した。微生物の高感度検出技術の開発にむけてin situ HCR法の高感度化とアプタマーを用いた検出技術の開発を行った。in situ HCR法の高感度化については、分岐点(ブランチャー)の導入により、さらなる高感度化が達成できた。純粋菌株への適用を終え、環境サンプルへの応用を試みている。また標的分子数が少ないmRNAや機能遺伝子の検出に向けて、それらの存在量を任意に取り扱うことのできるClone-FISH法の検討を行った。アプタマーを用いた検出技術の開発については、SELEX法を用いたアプタマーの合成方法の最適化を行い、詳細な実験方法の検討を行った。これまでに報告されている方法を参考に、本研究のサンプルに合った試薬や道具の選定、反応時間の検討などを行った。当初見込んでいた検討項目に加えて、既報の方法では製造を終えた試薬などの利用があり、それらを最適化する検討が必要であった。in situ HCR法については、さらなる高感度化にむけてブランチャーの導入を行い、良好な結果を得ている。また、アプタマーを用いた新規検出技術に関しては、アプタマー合成方法の確立に向けて詳細な実験方法の検討が重なっため、進捗に若干の遅れがあるもののおおむね順調に進展していると考えている。今日、環境中の任意の微生物の生態を解明する方法として、培養法に依存しない分子生物学的手法を用いた解析技術の進展がめざましい。このような解析技術の中でも研究代表者は、環境中に生息する任意の微生物を視覚的に検出するfluorescence in situ hybridization (FISH)法の高感度化や技術的課題の解決に取り組み、その適用範囲を広げてきた。FISH法の技術課題の一つとして生菌を観察できないことが挙げられる。FISH法はサンプル前処理段階でサンプルを固定する工程が必須であり、この際に微生物は死滅してしまう。こうした課題を解決する方法として、研究代表者は、微生物の細胞外層のタンパク質などを標的分子として視覚化する技術を用いれば、生菌状態でも任意の微生物を検出できるのではないかと考えた。このコンセプトを可能にする一つの方法として研究代表者はアプタマーに注目していた。アプタマーは、数十塩基からなる一本鎖の核酸であり、自らが高次構造を形成することである特定の物質と高い親和性をもって結合することができる機能性核酸である。このアプタマーを用いて微生物を視覚的に検出する技術の開発を進めてきた。本研究では、E. coliを検出するアプタマーに我々の研究チームが開発した高感度FISH法であるin situ DNA-hybridization chain reaction (HCR)法を応用することで蛍光を高感度化しかつ均一化することを目的とした。結果、従来法の蛍光強度を超える感度が得られ、また得られる蛍光は菌体全体を覆うような均一なものであった。in situ HCR法とアプタマーを用いた二つの方法の開発を行い、純粋菌株を用いた検討段階での技術開発に成功した。今年度は、環境サンプルへの適用を目指し、さらに詳細な検討を行っていきたい。環境微生物学