hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子シャペロンＨＳＰ９０を基盤とする細胞癌化機構の解析

DNAポリメラーゼ・イータ(Polη)は,損傷のないDNAを鋳型として大変誤りがちなDNA合成を行い,免疫グロブリン遺伝子領域の体細胞突然変異の生成にも寄与する。Polηが活性化するためには分子シャペロンHSP90との相互作用が必須であり, HSP90阻害剤は,Polηの構造を不安定にし,がん細胞の増殖を抑制するものと考えられている。本研究では,完全長ヒトPolηを精製した。また,抗ウサギPolηの特異的な抗体を得た。HSP90はPolηの安定化に寄与すること,膠芽腫で核周辺にHSP90とPolηの強い相互作用が確認できた。上衣腫では,HSP90とPolηの相互作用は検出できなかった。高発がん性遺伝疾患である色素性乾皮症バリアント群の責任遺伝子産物は,DNAポリメラーゼ・イータ(Polη)であり,Polηは主要な紫外線損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体を鋳型として正しいヌクレオチドを重合し,忠実なTLSを担い,細胞や個体の紫外線抵抗性の獲得,発がん防御に重要な役割を果たしている。またPolηは,損傷のないDNAを鋳型として大変誤りがちなDNA合成を行い,免疫グロブリン遺伝子領域の体細胞突然変異の生成にも寄与する。これまでの報告から,Polηが活性化するためには分子シャペロンHSP90との相互作用が必須であることが示唆されている。また,17-AAGのようなHSP90阻害剤は,Polηの構造を不安定にし,結果としてがん細胞の増殖を抑制するものと考えられている。本研究では,PolηとHSP90のタンパク質間相互作用の生理的意義を明らかにし,TLS因子の制御機構,および染色体サイクルに関連した未知の機能の解明に繋げたいと考えている。そこで今回は,完全長ヒトPolηの構築,および精製を試みた。Polηは非常に不安定なタンパク質であるが,C末端にHis-tag付加することにより,Polηの精製に初めて成功した。その結果,HSP90はPolηの安定化に寄与すること,神経膠腫の中でも最もがんの悪性度が高い膠芽腫で核周辺にHSP90とPolηの強い相互作用が確認できた。一方,悪性度の低い上衣腫では,HSP90とPolηの相互作用は殆ど検出できなかった。正常細胞内でHSP90が癌を抑制する機能と,癌細胞内で癌の悪性度に関与する機能に関して,以下の様な仮説を立案した。1細胞の癌化に伴い,分子シャペロンが複合体を形成し,癌抑制遺伝子p53の変位型と結合し,変位型p53をアンフォールドし,さらにHSP90が野生型p53への正しい変換を試み,細胞の癌化を阻止する。2上記機構が破綻した場合には,癌細胞を悪性化する酵素の一つであるPolηの活性化には,HSP90が単独,またはシャペロン複合体との相互作用が必須となり,(Polηの非活性化状態→活性化状態),結果として癌を悪性化する。癌細胞内では変異タンパク質が粗製濫造されるため,分子シャペロンも正常細胞とは異なる構造や機能を有する可能性が大きい。3正常細胞内のHSP90と癌細胞内のHSP90に対する17-AAGの親和性の相異は,Polηに結合するHSP90の構造変化(シャペロン複合体形成の結果?)によるものである。4正常細胞でp53と結合するHSP90と,癌細胞内のPolηに結合するHSP90は,構造様式やクライアントタンパク質の制御様式が異なる。以上を予測して研究を実施した。本研究では,細胞の癌化に伴う分子シャペロンHSP90・p53・Polηとの相互作用機構を解析した。HSP90とPolηの相互作用をプルダウンアッセーで確認できた。また,HSP90とp53の相互作用に於いて,正常p53と変異p53ではHSP90十の相互作用に差があることが判明した。引き続き,癌細胞内での相互作用を解析している。本研究では,細胞の癌化に伴う分子シャペロンHSP90の制御機構を,生化学的に明らかにする。癌抑制遺伝子p53とHSP90の相互作用,及び癌の悪性度を規定する分子DNA Polymerase η(Polη)とHSP90の相互作用を明らかにし,正常細胞と癌細胞におけるHSP90の役割分担を解明する。具体的には癌の種類や悪性度とHSP90の相関,及び,HSP90・p53・Polηとの相互作用を解析する。すなわち,正常細胞における癌抑制遺伝子p53のHSP90による制御機構,癌細胞におけるHSP90とPolηの相関と生理機能を解析する。

「p53が如何にして細胞の癌化を抑制するのか」,また「癌の悪性度(ステージ)を規定するPolηはHSP90により如何なる制御を受けるのか」を解明する研究内容である。従来癌研究は,癌遺伝子等からのアプローチが殆どであり,分子シャペロンHSP90を基盤とする本申請研究は極めて独創的であり,予想される結果とインパクトは極めて高い。本申請研究は,細胞の癌化機構の本論を解析できる可能性が極めて高い。現時点では,in vitroの系での研究結果を得ており,今後,in vivoでの実際の病変組織を用いて解析することにより,本申請研究の成果が確認できる。細胞の発癌実験としては,発癌剤のみ,イニシエーター+プロモーターの2段階投与でも確認する。細胞の癌化に伴い,細胞の明確な形態変化が確認され得る。また,ソフトアガーでのコロニー確認や,fociの数を確認するのと同時に,そのfociをクローニングして,ソフトアガーや造腫瘍性で悪性度を検討する。これら化学物質の長期投与により,癌化誘導細胞内のHSP90の存在様式を解析すると共に,細胞癌化のどの段階で分子シャペロン複合体が形成されるのかを明らかにする。細胞癌化過程に於いて,どの段階でHSP90-p53とHSP90-Polη複合体が形成されるのかを,免疫沈降法等で明らかにする。化学発癌物質(イニシエーター,及びプロモーター)投与細胞における,HSP90の存在様式の解析イニシエーターとしては,ベンゾピレンとメチルコラントレンを使用する。細胞内に取り込まれたベンゾピレンは,酸化時には大きな付加物としてDNAに結合するため塩基間の対合が出来なくなり,この障害を乗り越える際に誤った塩基が取りこまれ変異ができ,その結果,癌細胞に変わるものと考えられている。メチルコラントレンなどの化学発癌剤はミトコンドリアに強い親和性を示すことが報告されており,mtDNAはミトコンドリア内で酸化的リン酸化により常に発生する活性酸素種にさらされており,その修復機構が十分でないことから突然変異が発生・蓄積しやすいと推察されている。これらのことからmtDNAに突然変異が蓄積することによって細胞が癌化すると言う『癌ミトコンドリア原因説』が提唱されている。プロモーターとしてはリトコール酸(LCA)とOkadaic acidを使用する。LCAは肝毒性があり,腸に癌を誘発する可能性が報告されている。また,Okadaic acidは非TPAタイプのプロモーターとして知られているため使用する。発癌性のない物質としては,カプロラクタムを使用する。カプロラクタムは,ヒトに対しておそらく発癌性はないものと考えられている。正常細胞である正常ブタ腎臓近位尿細管細胞LLC-PK1細胞やマウス線維芽細胞(Neuro 2A)等に,発癌イニシエーターとして報告されているベンゾピレンとメチルコラントレン処理を施すことによって,癌化を誘導作用させ,細胞の形態変化等を観察する。プロモーターとしてリトコール酸や,Okadaic acidを細胞内に投与し,正常細胞から癌細胞への誘導を試みる。
卵と母体のCross talk

正常子宮内膜における遺伝子発現を、腺細胞部と間質部に分離し比較検討した。増殖期、分泌期それぞれの時期の子宮内膜をmicrodissectionの手法を用い腺細胞部と間質部に分離し、RNAを抽出する。逆転写後microarrayの手法により約1200個の遺伝子発現を比較した。増殖期子宮内膜においては合計26個の遺伝子に変化が認められた。14個は腺細胞部に、12個は間質部に強く発現していた。これらのうち上位2つの遺伝子に関しては定量的PCRの手法を用いmicroarrayの正当性を確認した。間質部に発現していた12個の内Decorinという遺伝子に着目しその発現を検討したところエストロゲンにより増加することが認められた。また、免疫組織化学的染色においても増殖期子宮内膜の間質部に強い発現を認めた。分泌期子宮内膜においては合計28個の遺伝子に変化が認められた。15個は腺細胞部に、13個は間質部に強く発現していた。増殖期と同様にこれらのうち上位2つの遺伝子に関しては定量的PCRの手法を用いmicroarrayの正当性を確認した。現在、腺細胞に着目し増殖期と分泌期における遺伝子発現の差異を検討中である。子宮内膜は腺細胞と間質細胞に分けられるが、このそれぞれの細胞間での相互情報伝達が子宮内膜の増殖や卵の着床及び浸潤に大きな役割を担っている事が示されている。しかし実際には腺細胞と間質細胞の役割を区別し正確に知ることは困難であった。今回の実験において、増殖期子宮内膜より得られた標本を用い、Laser Microdissection(LMD)法で腺細胞および間質細胞を分離回収し、Microarrayを用いそれぞれの遺伝子発現を比較検討した。十分な説明とインフォームドコンセントを得た後、増殖期子宮内膜を採取、洗浄後直ちにイソペンタン中で凍結包埋し、-80°Cにて保存した。組織は薄切後LMDにて腺細胞と間質細胞を別々に回収した。RNAを抽出し逆転写後PCRにて増幅、放射性元素とハイブリダイゼーションしMicroarrayに供した。その結果、腺細胞においてはHeat shock proteinやProteinase inhibitorの強発現を認め、間質細胞では細胞外マトリクスの構成成分であるDecorinやDiscoidin receptorなど増殖に関与する蛋白の強発現を認めた。さらに増殖期子宮内膜を分離し、間質細胞を培養した。この培養細胞にエストロゲンを添加しDecorin mRNAの発現を定量的PCRにて解析したところ、エストロゲン添加によりDecorin mRNAの発現の増加を認めた。また、MPAを添加したものではDecorin mRNAの発現に影響を認めなかった。このことよりDecorinはエストロゲン依存性にその発現がコントロールされている可能性が示唆された。さらに月経周期におけるステロイドの変化を加味するとDecorinはステロイド存在下に子宮内膜の増殖に関与している可能性が示唆された。
生物モデルの確率微分方程式とその数値計算

ゾウシムシの膜電位のゆらぎに関するセミナーを生物学者と共に引き続き継続中であるが、離散モデルとしてのイジングモデルの研究において、instaneously quenched Ising modelを1次元ランダムウォークとして解析し、1段を形成する確率や山の消滅確率などの結果を名市大紀要に報告した。生物モデルの研究に関連して、実験科学者との討論から実験データの解析のための手法を開発した。これはフーリエ級数では確定することができない特異点(不連続点や極値の点)を求めるため、Y.MeyerのAnalysing Waveletを具体的に構成し、その局所性を利用してn個のデータから時系列関数を補間する方法である。このためには高速計算機の利用が不可欠であり、UNIXによるソフトパッケージを開発し、この応用例として体育学での身長の時系列データの解析に適用した(OR学会等で発表)。数理科学に関するセミナー(第2回PMSセミター)として、“計算可能性理論と解析学"をメインテーマとして研究会を主催し、各地の研究者との交流を行い、その報告集をまとめた。教育の分野では、確率空間を離散型に限定することにより、確率論の初歩から先端分野であるイジングモデルの応用としての巡回セールスマン問題までをシミュレーションにより理解できる本を出版した。更に、この著書などを用いた確率統計の教育について研究会を行い、教育工学として計算機を用いた確率論・統計学の講義方法に関する報告をCAI学会で行った。
完全分散型P2Pネットワークのピアの自信度に基づいた信用可能性の研究

P2Pシステムは、構成要素のプロセスが対等(peer)な完全分散型システムである。ここでは、各ピアが自律的に意思決定を行うために知人ピアから情報を取得せねばならない。本研究では、ピアは「個人」のモデルを考え、「人間関係」の考察をもとに議論し定式化を行った。本研究では、信用可能な知人ピアの評価のみを取り入れることにより、誤ったまたは古い評価を除外する方式を考案し評価を行った。この結果、Flooding方式に対して、信用可能性の高いピアにのみメッセージを伝播していく方式が有効であることを示した。peer-to-peer(P2P)システムでは、どのコンピュータも自律的に相互接続できる開放性と大規模性を特徴とする分散システムである。これまでの情報システムで議論されてきたシステムの信頼性、可用性、安全性等の議論を、P2Pシステムに適用することは大規模性と開放性の点から困難となってきている。本研究では、こうした大規模分散型システムとしてのP2Pシステムのモデルとピア間の協調動作方式について考察を行なうものである。完全分散型P2Pシステムでは、各ピアは知人ピアと通じてシステムの状態を把握する必要があるが、知人ピアをどのように信用するかを決定することが重要である。知人ピアの信用可能性の評価方法として評判(reputation)では、誤った評判も取り入れられてしまう危険性がある。これに対して、本研究では、信用可能なピアの評価のみを取り入れることにより、誤ったまたは古い評価を除外することを試みるものである。また、センサーネットワークでは、センサノードはバッテリの強弱、ノイズ、センサの精度等により種々の振る舞いを行なう。どのセンサノードの値を信用するかという問題に本研究成果を利用し、センサノード故障の発見方法も研究する。本年度は、P2Pモデルのアーキテクチャ、信用可能性、自信度についての研究を行なった。アーキテクチャでは、コントローラの存在しない完全分散型のアーキテクチャを考察した。ピア間での信用可能性、自信度についての考察を行い、ファジー論理の適用を試みた。特に、この考察を用いて、ピア間の合意プロトコルを研究し、論文として発表を行った。また、センサー・アクター・デバイス・ネットワークを対象として、信用可能性の一部の概念であるフォールトトレラントな機能を検討し、論文として発表を行った。情報システムの重要な形態として、対等なプロセス(ピア(peer))から構成されるpeer-to-peer(P2P)型モデルがある。P2Pシステムは、開放性と、大規模性、自律性を特徴とする分散システムである。本研究では、こうしたP2Pシステムのモデルとピア間の協調動作方式について考察を行なうものである。本研究課題では、完全分散型の大規模P2Pシステムで、各ピアが、他のビアをどのように信用するかについて、人間関係の考察をもとに議論し定式化することを目的としている。人間観の振舞いをいかに定式化し、コンピュータに取り組んでいくかが主要なテーマとなる。本研究は、flooding等の種々のアルゴリズムにより発見された目標オブジェクトを操作するためにアクセス権のあるピアを発見しアクセス権を獲得するかについて議論している。知人ピアの信用可能性(trustworthingess)の評価方法としては、Webのランク付けの中で議論されている。しかしながら、誤った評判も取り入れられてしまう危険性がある。これに対して、本研究では、信用可能な知人ピアの評価のみを取り入れることにより、誤ったまたは古い評価を除外する方式を考案し評価を行った。さらに、知人ピアについて自分で得た信用可能性と他のピアの信用可能性が異なっていることがある。このとき、自分の信用可能性に自信をもてるかどうかが重要となる。本研究では、知人ピアとの更新時間、重新頻度をもとに自信度を求める方式を研究した。また、ピア間の合意形成過程に信用可能性を適用し、通信メッセージ数を減少し有効に合意を行える方式を考案した。情報システムの重要なモデルとしてpeer-to-peer(P2P)型モデルがある。P2Pシステムは、中央制御機構がなく、構成要素のプロセスが対等(peer)な完全分散型システムと考えることができる。本研究では、こうした完全分散型のP2Pシステムでは、各ピアは、自律的に意思決定を行うために、知人ピアからネットワーク内のオブジェクト(計算資源)についての情報を取得せねばならない。このために、各ピアが他のピアをどのように信用するかが重要な課題となる。また、これまでに、ネットワーク内の目標オブジェクトを発見するためのflooding等の種々のアルゴリズムが研究されてきているが、本研究では、発見された目標オブジェクトを操作するためにアクセス権のあるピアを発見しアクセス権を獲得するかについて新たに議論している。知人ピアの信用可能性(trustworthiness)の評価方法は、Webのランク付けの中で議論されている。しかしながら、誤った評判も取り入れてしまう危険性がある。

これに対して、本研究では、信用可能な知人ピアの評価のみを取り入れることにより、誤ったまたは古い評価を除外する方式を考案し評価を行った。さらに、知人ピアについて自分で得た信用可能性と他のピアの信用可能性が異なっていることがある。このとき、自分の信用可能性に自信をもてるかどうかが重要となる。本研究では、知人ピアとの更新時間、更新頻度をもとに自信度を求める方式を研究した。また、ピア間の合意形成過程に信用可能性を適用し、通信メッセージ数を減少し有効に合意を行える方式を考案し、その評価を行った。この結果、Flooding方式に対して、信用可能性の高いピアにのみメッセージを伝播していく方式が有効であることを示した。
高齢者の地域ケアに関する疫学的研究

本研究は、大都市近郊に位置する老人保健施設(老健施設)入所者の特性とその家族の介護意思や家族との交流状況を観察することにより、地域ケア、在宅ケアについて考察したものである。対象者は121人の入所者とその家族である。入所者は、高年齢の女性で、自立度が低く(ランクB,C53%)、痴呆は68%の者にあった。家族状況としては、子供数は比較的多いが(2人以上71%)、入所前の世帯は独居(40%)が多かった。入所者は病院からの入所が多く(60%)、病院への退所が多かった(53%)。入所者の55%は6ヶ月以上の長期入所になっていた。介護者は主に娘と嫁で、自分自身健康と感じている者が多く、介護者の63%は仕事をしていた。しかし、副介護者のある者(28%)は少なかった。面会回数は保護者の居住地が老健施設と同じ市であることや保護者が配偶者である場合には多い傾向を示すが、子供数や退所先とは関係なかった。一方、正月時の帰宅に関しては(外泊)、帰宅者と帰宅しなかった者との間において、老人の心身状況や家庭内介護力に有意の差は認められなかった。介護者の介護希望先は、家庭に19.4%、病院に55.5%、特別養護老人ホームに25.1%であった。家庭への希望は少ないことを示していた。入所者が独居世帯の介護者は介護先を特別養護老人ホームに、2世代、3世代世帯は病院に希望する割合が多かった。介護希望先が家庭に関連する要因には、痴呆がない、介護者の就労がパートである、副介護者がいる、保健婦の訪問指導のサービスを利用したことがあるなどの項目があげられた。以上の結果から、入所時の面会回数や外泊、入所先、子供数などの要因は家庭への退所に関連してなかった。入所者は、比較的子供数が多いに関わらず、独居世帯で、病状は固定しているが、心身状態が低く、長期入所になっている者が多く、介護者も家庭への退所を希望する者が少なかった。このことから、本調査は要介護老人に安心した生活を過ごさせれる場所、ケアハウスやケア付き住宅などの施設が必要であるとともに、在宅生活を基本にして、老健施設、ショートステイやデイサービスE型などの施設サービスと組み合わせた複合的なケア体系の必要性を示唆している。大都市近郊で精神病院に付設し、平成6年7月30日に開所した老人保健施設の1年間に入退所した利用者の心身および入退所状況を調べると共に、その介護者の介護意識を入所期間中のアンケート調査より解析した。

当施設の1年間の利用状況は、入所者121名、退所者56名(46%)であった。対象者は、男性40名(33%)、女性81名(67%)、平均年齢は81歳、日常生活自立度判定基準BやCの者53%(国:42%)、軽度以上の痴呆を有する者68%(国:70%)、自力歩行者32%と心身状態が低い者が多かった。世帯構成では独居世帯が40%(国:18%)と最も多く、3世代世帯は35%(国:56%)。利用者の平均実子数は2.7人であった。利用者の保護者の約90%は市内および市内周辺の都市に在住していたが、面会数は週1回程度であった。これらの結果は大都市近郊の本施設の利用者は実子数が比較的多いにもかかわらず独居者が多く、家族交流が少ない群であることを示していた。利用者の入所前の生活場所は家庭からの入所が36%、病院から59%、他の老健から5%、退所した56人の退所先は家庭25%、病院61%、福祉施設14%で、老健が位置づけられている病院から入所し家庭に退所した者は5%(6人)、家庭から入所し家庭に退所した者が6%(7人)いた。入退所状況で、病院から病院へのケースが最も多く、3ケ月以上本施設に在所している者は病院から入所した者が多かった。このことは病院と老健とのいわゆるキャッチボールになっている可能性が危惧される。これらの介護者に利用者の退院後の介護希望場所を訪ねた結果、自宅19%、病院56%、特別養護老人ホーム25%と大部分の者は施設希望であった。介護希望場所に影響を与える因子には、介護者の仕事時間、保健婦指導の有無、痴呆の有無、利用者との続柄などがあげられた。以上の結果から、本施設の利用者は、比較的近くに親族が居住しているけれども、入所前は実子数の多寡にかかわらず独居者が多く、面会などの家族交流が低いことから、退所後の家庭内介護力は確保できにくいことが示唆される。一方、介護者の介護意識としては病院や老人ホームでの生活を期待している。つまり、これらの利用者は心身機能が向上しても自宅退所は厳しい状況にあり、本施設は病院から家庭への中間施設としての役割は低いことが明らかであり、このような高齢者の住処となる収容施設が必要であることを示していた。これらの結果は第54回公衆衛生学会総会、山形市(平成7年10月)、第66回日本衛生学会、札幌市(平成8年5月)に発表、1年間の現状を老人保健施設の実態調査第1号として報告書を作成した。大都市近郊における老人保健施設(老健施設)に入所している老人の心身状況、入退所状況、家族との面会や自宅への外泊状況について調査した。その後面会回数に影響をおよぼす要因について検討した。1.入所者は、寝たきりの者が52.9%、痴呆症状を有する者が72.7%、入所前の世帯構成は独居が39.7%を占めていた。2.退所者の退所先は病院が61.4%、家庭が24.6%で家庭への退所が低く、入所期間の長期化が認められた。3.在所者の3分の1は正月時に帰宅した。帰宅者と帰宅しなかった者との間において、老人の心身状況や家庭内介護力に有意の差は認められなかった。4.面会回数は保護者の居住地が老健施設と同じ市であることや保護者が配偶者である場合には多い傾向を示すが、子供数や退所先とは関係なかった。以上の結果から、入所時の面会回数や外泊、退所先、子供数などの要因は家庭への退所に関連してなかった。入所者は、比較的子供数が多いにもかかわらず、独居世帯で、病状は固定しているが、心身状態が低く、長期入所になっている者が多かった。このことから、本調査は要介護老人に安心した生活を過ごさせれる場所、ケアハウスやケア付き住宅などの施設が必要であるとともに、在宅生活を基本にして、老健施設、ショートステイやデイサービスE型などの施設サービスと組み合わた複合的なケア体系の必要性を示唆している。新ゴールドプランのもとで、老人保健施設(以下老健施設と呼ぶ)数は年々増加しているが、一方では、入所期間の長期化や家庭復帰が困難となり、家庭以外に退所する例も少なくない。
中脳ドパミン神経細胞を選別するための新規表面抗原の同定

Floor plateマーカーであるCorinと中脳マーカーであるLmx1aを組み合わせた細胞選別技術の開発によって、中脳型ドパミン神経前駆細胞に発現する細胞表面抗原マーカーとしてLrtm1 (Leucine-rich repeats and transmembrane domains 1)を同定した。LRTM1によって選別したヒトiPS細胞をパーキンソン病モデルラット脳内に移植すると、移植後3ヶ月目から薬剤を用いた旋回運動の評価で有意に症状改善を認めた。同時期の脳組織を免疫組織学的手法により検証したところ、生着細胞数はLRTM1陽性群で少ないのに対し(未選別群; 1,321,000細胞vs. LRTM1陽性群; 163,000細胞vs. LRTM1陰性群; 1,601,000細胞)、ヒト由来ドパミン神経細胞の数はLRTM1陽性群で有意に多いことが分かった(未選別群; 11,000細胞vs. LRTM1陽性群;44,000細胞vs. LRTM1陰性群; 5,000細胞)。さらに選別後のヒトiPS細胞が霊長類動物の脳内において成熟分化するのかを検証するために、選別後1日、7日、14日、21日目の細胞をカニクイザルの脳内に移植した。移植後3ヵ月の時点で腫瘍化を認めた個体は無く、選別後1日目の移植群を除くすべての群で細胞の生着が認められた。また生着したドパミン神経細胞の数は選別後14日の移植群に高い傾向が示唆された(7日間; 70,400細胞vs.14日間; 245,200細胞vs. 21日間; 149,300細胞)。今回の研究によりLRTM1を用いた細胞選別によってドパミン神経前駆細胞を濃縮できることが示された。そして選別後の細胞を脳内に移植すると、機能的ドパミン神経細胞に成熟分化することが明らかとされた。27年度が最終年度であるため、記入しない。パーキンソン病に対するヒト多能性幹細胞を用いた細胞移植治療法開発を目指し、1.ドパミン神経前駆細胞マーカーによる細胞選別技術の開発と2.既存薬剤投与によるドパミン神経前駆細胞の生着促進技術開発を掲げ研究を実施した。1.ラミニン511-E8コーティングを施したディッシュ上で12日間培養したヒトES細胞(KhES-1)もしくはiPS細胞(1039A1)を抗LRTM1抗体で選別後に16日間培養を行うと、LRTM1陽性分画の約45%がTH陽性の成熟ドパミン神経細胞に分化することが分かった。本細胞を6-OHDA投与によって作製したパーキンソン病モデルラット脳内に移植し、3ヵ月後に生着細胞の評価をした。その結果、LRTM1陽性群の約25.9%がTH陽性の成熟ドパミン神経細胞に分化したのに対し、未選別群では約0.3%だけであった。本研究成果は、単一マーカーによる細胞選別でドパミン神経前駆細胞が濃縮できる一方、造腫瘍性細胞を取り除けることを明らかにした点である。移植実験を通して細胞選別の有用性が示せたことは、今後の細胞移植治療の発展に寄与するものと考えられる。2.他家移植または異種移植の際に免疫抑制が必要となるが、その副作用によりホストもしくは移植片への影響が無視できない(Guoら、2007年)。今回の実験では最初に、移植細胞に対する薬剤の有効性を評価するため、免疫抑制が不要なX連鎖重症複合免疫不全症ラットを用いた評価系を確立した(Samataら、2015年)。本研究成果は、免疫抑制が不要なモデルラットを作製することで、薬剤の有効性を適切に評価できる実験系を構築した点にある。これはパーキンソン病のみならず、様々な分野で汎用性があるという点で医学研究の発展に寄与するものと考えられる。

また生着したドパミン神経細胞の数は選別後14日の移植群に高い傾向が示唆された(7日間; 70,400細胞vs.14日間; 245,200細胞vs. 21日間; 149,300細胞)。今回の研究によりLRTM1を用いた細胞選別によってドパミン神経前駆細胞を濃縮できることが示された。そして選別後の細胞を脳内に移植すると、機能的ドパミン神経細胞に成熟分化することが明らかとされた。1.ラミニン511-E8を用いた分化誘導法(特許出願)とLRTM1を用いた細胞選別技術(特許出願)を組み合わせることで、ドパミン神経前駆細胞を濃縮することに成功した。LRTM1陽性分画をパーキンソン病モデルラット脳内に移植すると、移植後3ヵ月の時点で腫瘍化は認められず、移植片の約1/4が成熟ドパミン神経細胞に分化することが示された(現在論文投稿準備中)。2.X連鎖重症複合免疫不全症ラットを用いた細胞移植実験系を構築した。これにより細胞移植後の免疫抑制の必要性がなくなり、移植片を適切に評価することが可能となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。LRTM1を用いた細胞選別でドパミン神経前駆細胞の濃縮に成功した。今後は移植細胞の有効性を明らかにするため、パーキンソン病モデルラットを用いた、長期間の運動機能評価を実施する予定である。
多様体の幾何学的諸構造と関連分野の研究

今年度の研究項目は、1.変換群の位相的・関数論的研究,2.複素多様体および対称空間の研究,3.作用素環の研究,4.整数論的関数の研究,5.近似理論の研究の5項目であった。1.内田は、球面上に非コンパクトリイ群の実解析的作用を与える一つの方法を発見し、この構成法の有効性を示す具体例について詳細な研究を行い、「群作用をもつ多様体の幾何構造」研究会で発表した。仲田は、不連続群の極限点集合のハウスドルフ次元を評価する研究を行い、成果をまとめている。2.大池は、複素超曲面のユークリッド空間への高次埋入について研究し、北大紀要への掲載が決まっている。井伊は、リイ群のハミルトン作用から定まるハミルトン力学系の完全積分可能性について研究し、数学会年会で発表した。3.河村は、位相力学系に付随する【C^*】-環の線型表現について研究し、力学系の不動点集合と表現の既約性との関連を調べ、関数解析日米セミナー等において発表した。中里は、局所コンパクト群における不変消散作用素が一径数半群を生成するための必要十分条件を求めることに成功し、関数解析研究会で発表した。以上の研究は、いずれも今後一層の展開が期待されるものである。研究項目の4,5については、年度内に成果を挙げるに至らなかった。
3重鎖DNA安定化能を有するポリカチオングラフト共重合体の設計

親水性の高分子鎖をポリカヂオン側鎖に導入したポリカチオングラフト共重合体を設計し、そのDNAとの相互作用を詳細に検討してきた。その過程で多糖であるデキストランをグラフト化したポリリジン(PLL-g-Dex)が、DNAと見掛け上可溶性の複合体を形成し、さらにグラフト率の高いグラフト共重合体は、DNA間の2重鎮あるいは3重鎖形成を阻害することなくその形成を安定化する機能を有することをpoly(dA)・poly(dT)2重鎮およびpoly(dA)・2poly(dT)3重鎮の融解曲線解析より明らかにした。3重鎮形成法は2重鎮DNAである遺伝子自体を標的としその機能を制御する手法としての展開がなされている。そこで、本研究ではラットI型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域を標的配列とし、3重鎮形成性オリゴヌクレオチドを設計し、その3重鎖形成能をゲル電気泳動度シフトアッセイにより解析した。フーグスティーン型の水素結合を介して形成される3重鎮DNAは、酸性pHでは、極めて良好な3重鎮を形成するものの、生理pHではほとんど3重鎖形成は見られなかった。一方、同様な条件でグラフト共重合体を存在させることにより、生理pHでも3重鎮が形成されることがわかった。一方、3重鎖DNAのもう一つのモチーフである逆フーグスティーン型の水素結合を介した3重鎮形成は、細胞内濃度のカリウムイオンの存在により強く阻害される。しかし、グラフト共重合体を存在させることにより、カリウムイオンの阻害効果をほぼ完全に克服できることがわかった。グラフト共重合体のこのような3重鎖DNA安定化機能は、他の安定化剤に比べ極めて高く、3重鎮DNA形成を利用した遺伝子発現制御法を実現に近づける上で貴重な知見が得られた。3重鎖形成の不安定性の主な原因は、3重鎖形成に伴うリン酸アニオン間の静電的反発による。3重鎖に対して高い安定化効果を発現させ得る安定化剤として、ポリアミン類に比べより多価のカチオンであるポリカチオン誘導体に着目して検討を加えた。ポリカチオン/DNA複合体の溶解性を向上し、ポリカチオンとDNAとの相互作用を制御する方法として、DNAと相溶性が低く且つ親水性の高分子鎖をポリカチオン側鎖に導入したポリカチオングラフト共重合体を設計した。そのDNAとの相互作用を詳細に検討した結果、多糖であるデキストランをグラフト化したポリリジン(PLL-g-Dex)が、DNAと見掛け上可溶性の複合体を形成し、さらにグラフト率の高いグラフト共重合体は、DNA間の2重鎖あるいは3重鎖形成を阻害することなくその融点を高める機能を有することを見いだした。さらに、グラフト共重合体は生理的イオン強度下においても既知の安定化剤に比べより効率的に3重鎖を安定化することを明らかにした。そこで、実際的な標的遺伝子としてI型コラーゲンのプロモーター部位近傍のDNA配列を標的2重鎖として、3重鎖形成安定化能をゲルシフトアッセイで検討した結果、グラフト共重合体はフ-グスティーン型、逆フ-グスティーン型いずれの3重鎖に対しても高い安定化能を発現することが明らかになった。
ヒトプロテイン1構造遺伝子の多型性と病態解析

ヒトプロテイン1(P1)は分子量14kDaの低分子糖蛋白で、肺クララ細胞蛋白(CC10あるいはCCSP),Uteroglobinと同一分子である。P1蛋白は肺クララ細胞、前立腺、子宮内膜などの上皮系細胞で産生され、血中、尿中、肺胞中(Bronchoalveolar lavage液)に分泌される。SNPsを有するgenomeDNAを増幅してpGL3-basicに組み込みLuciferase-reporterシステムを構築して,SNPsがP1構造遺伝子の発現に及ぼす影響を検討した。低濃度のInterferon-gamma添加時においてSNPsの違いによりP1構造遺伝子の発現量が有意に変動した。肺胞液中のP1濃度が低下していた。子宮内膜におけるP1の発現を検討した。分泌期での発現量が増殖期に比較して多く,また分化傾向を失うにつれ発現量が減少する傾向を示した。(1)DNAシークエンスにより新たに5箇所のSNPsを同定した。5`側転写調節領域(A-908G)、5`側非翻訳領域(報告済みのG38A)、エクソン1領域(G118A)、イントロン1領域(C1225T, G1226A)、イントロン2領域(C4777G)にSNPsを同定した。G-908AとG38Aには弱い相関が認められた。C1225TとC4777Gには強い相関が認められた。(2)G118AはP1タンパク分泌に関与するleader peptide様アミノ酸配列を変化させるSNPsである。P1タンパクの細胞外分泌に対するG118Aの影響を,強制発現のシステムで解析した。G118Aの塩基がAの場合(アミノ酸はアラニン),Gの場合(アミノ酸はスレオニン)と比較してP1分泌量が30%低下することを確認した。(3)IgA腎症と,G38AのアリルAが相関することを報告した。(4)サルコイドーシスと,A-908GのアリルGが相関することを報告した。2.ヒトP1と相互作用する因子(蛋白質)の同定leader sequenceを欠損させたヒトP1をbaitとして、two-hybrid法によりヒトP1と相互作用する蛋白質の同定を試みた,その結果,抗バクテリア作用を有するクリプチヂン類似ペプチド(CRP ; CRYPTDIN-RELATED PROTEIN),カルボキシペプチターゼEを同定した。3'末端に各SNPに相当する配列をもち長さの異なる2種類のタイピング用プライマーと1種類のコモンプライマーとの3種類のプライマーで通常のPCRを行なう。プライマーの3'末端が各SNPタイプに対応していると,そのSNPをコードするDNAの増幅が進行し,長さの異なる増幅産物が合成されていく。この増幅産物を通常のアガーロスゲルで電気泳動を行ない,エチヂウムブロマイド(EtBR)で染色してDNAバンドを検出しSNPを肉眼でタイピングする。実際には1回の反応で4ヶ所のSNPを同時に検出するために,4セット,合計12本のプライマーを用いてPCR(multiplex PCR)を行い,電気泳動を行なった。以上の結果からP1構造遺伝子のSNPはサルコイドーシスの診断に有用と考えられる。我々はヒトP1構造遺伝子のSMPをDNA direct sequencing法により検索して,既存のSNPを含めて6個所のSNPを同定した。これらのSNPを比較的手技が簡便で高価な機器を必要とせず安いランニングコストで解析できるように,multiplex allele specific PCR(MAS-PCR)を応用したSNPタイピング法を開発した。SNPを有するgenomeDNAを増幅してpGL3-basicに組み込みLuciferase-reporterシステムを構築して,SNPがP1構造遺伝子の発現に及ぼす影響を検討した。低濃度のInterferon-gammma添加時においてSNPにより発現量が有意に変動した。
細胞外マトリックスのインテグリンレセプターを介する肝増殖関連遺伝子の発現制御

種々の線維化状態を呈する慢性肝疾患患者の肝生検組織について免疫組織学的に検討したところ,線維化の程度に応じて肝組織内に細胞外マトリックス(フイブロネクチン、I、III、IV型コラーゲン、ラミニン、テネイシン)の沈着が増加する傾向が認められた。また,ヒト分離肝細胞を用いた検討では,この初代培養肝細胞でアルブミン、プレアルブミンが,蛋白およびmRNAで発現していることが確認された。次に,採取した肝生検組織について,各種インテグリンレセプター((VLA-1、2、3、4、5、6)の発現を検討した結果,これらは免疫組織化学的に肝実質細胞,肝内浸潤リンパ球、マクロファージで発現していることが確認された。また,肝生検材料からRNAを抽出し,マトリックス分解酵素(MMP-1)、TNF-α、IL-1、HGFのmRNA発現についてRT-PCR法で確認したところ,慢性肝炎では肝組織中でこれらのmRNAが発現し,これらの物質が肝の病態形成に関わっていることが示された。インテグリンレセプターを介した肝細胞増殖に関する機序を明らかにするための基礎的検討を行い、以下の新たな知見が得られた。尚、検討には診断時に施行した肝生検により得られた肝組織および経過観察中に採血が必要と思われた際に得た血清の一部を用いたが、その際に採取した検体の一部を本検討に用いることを患者に説明し承諾を得た。1肝細胞の細胞外マトリクスレセプター発現の解析慢性肝炎患者より得られた生検肝組織よりコラゲナーゼ処理により肝細胞を分離し、そのインテグリンレセプター発現をFACSを用いて解析したところ、VLA-2、-6の発現を認めた症例が多かったが、免疫組織学的検討ではそれらの分子の肝細胞上への著名な発現が認められず、FACS解析と免疫組織学的解析で結果に差異が認められた。また、FACS解析により肝細胞にVLA-2、-6の発現を認めた症例、認めない症例で肝組織内のコラーゲン、ラミニンの沈着の程度に差異があるか免疫組織化学的に検討したが、肝細胞上のVLA-2、-6の発現と肝組織内のコラーゲン、ラミニンの沈着の程度に相関性は認めなかった。2分離肝細胞を細胞外マトリックスコートセルウエアで培養した際の肝特異タンパクの遺伝子発現の解析VLA-2、-6の発現を認めた肝細胞、認めない細胞をそれぞれコラーゲン、ラミニンコートセルウエア、フィブロネクチンコートセルウエアで培養しアルブミン、αフェトプロテインの遺伝子発現量を比較検討した、明らかな差異は認めなかった。
網膜細胞のクローニングと増殖及び抑制因子の解析

温度感受性SV40 largeT抗原遺伝子を導入したマウスから、眼球を摘出し、RPE細胞を単離・クローニングした。当初、この単離した網膜色素上皮由来細胞(RPET細胞)に対する、ウシ神経網膜内在性の増殖因子もしくは抑制因子について、検討を行う予定であった。実際に、これまでの実験結果から、ウシ神経網膜抽出液はRPET細胞に対し、軽度ながら増殖効果が認められた。しかし、RPET細胞は通常の培養条件下では増殖せず、その生存・増殖には温度感受性SV40 largeT抗原遺伝子を導入したマウスの神経網膜細胞の培養上清(CM)が必要であった。ウシ神経網膜抽出液による増殖効果もこの培養上清の存在下でのみ観察され、ウシ神経網膜抽出液のみでは明らかな増殖効果は認めらなかった。また、CMの僅かな濃度変化によってその増殖効果が変動し、かつ胎生ニワトリ網膜色素上皮細胞を対象細胞とした場合に比較し、その効果は不安定であった。従って、RPET細胞を指標として、ウシ神経網膜抽出液中の新規の増殖因子を追求することは困難であると考えた。しかし、一方でCMに含まれるRPET細胞生存・増殖因子は、その効果が劇的であり、また、指標となる細胞と目的因子を含有している物質の由来組織がが同種のものであることから、より良い新規増殖因子検討の材料と考えられた。今後、我々は温度感受性SV40 largeT抗原遺伝子を導入したマウスから得た神経網膜を大量培養し、その培養上清(CM)を収集し、それに含まれるRPET細胞生存・増殖因子に対する検討を加えていきたいと考えている。SV40Large T抗原遺伝子導入マウスから得られた網膜細胞の混合培養から、ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、視細胞をクローニングし、それらの細胞に対する特異抗体を用い、細胞の同定が可能になった。クローニングした細胞を、33°Cおよび37°Cの2つの条件で成長曲線を調べたところ、安定した細胞の成長が得られる培養条件は33°Cが良いことが決定された。一方、牛眼からの抽出物が、網膜色素上皮細胞の成長に効果のあることがこれまでの実験で解っているので、この抽出物の中のどのような物質が成長に効果を発揮するのかを確認することを試みた。ホモジネートとした牛眼網膜を32000Gで遠沈して得られた抽出物を、種々の濃度の硫酸アンモニュームによって分画した。先ずどの分画のものが最も成長に効果があるのか、Chickの網膜色素上皮細胞を1%のfetal bovine serumと各分画とを含むMEM溶液にて培養した結果、3540%の濃度の分画が最も効果のあることが判明した。Sephadex G-100 column chromatographyにより、2560kDを含む分画が最も著しい成長効果を示した。この分画を更にDEAE-Sephadex A-25column chromatographyを用いて精製し、SDS電気泳動にかけたところ約35kDと43kDの2つのバンドが得られた。現在まで、chickの網膜色素上皮細胞にたいするこのサイズの成長因子に関する報告は無く、新しく発見された物質の可能性がある。ウシ神経網膜抽出液のみでは明らかな増殖効果は認めらなかった。

従って、RPET細胞を指標として、ウシ神経網膜抽出液中の新規の増殖因子を追求することは困難であると考えた。しかし、一方でCMに含まれるRPET細胞生存・増殖因子は、その効果が劇的であり、また、指標となる細胞と目的因子を含有している物質の由来組織がが同種のものであることから、より良い新規増殖因子検討の材料と考えられた。今後、我々は温度感受性SV40 largeT抗原遺伝子を導入したマウスから得た神経網膜を大量培養し、その培養上清(CM)を収集し、それに含まれるRPET細胞生存・増殖因子に対する検討を加えていきたいと考えている。
BMP2の血管新生に対する役割の解明とBMP2産生細胞による新しい骨再生法の開発

本実験では、血管内皮細胞・平滑筋細胞が骨延長においてBMP2を産生することを初めて示した。骨延長においては、まず周囲の軟部組織で血管新生がおきて、その血管でBMP2が産生され、骨形成に働くことが示唆された。また骨形成においては、血管由来のBMP2、周囲軟部組織由来のPIGFが大きな役割を占めるのではないかということも示唆された。申請時の平成23年度の計画について骨髄幹細胞におけるBMP2産生細胞のcharacterizationは、flowcytometryはうまくいったが、DDAOG基質を用いた実験がうまくいかず、characterizationには至っていない。うまくいかない原因を精査中であり、基質の問題なのかハードの問題なのかを検討し、今後再試験を行っていく予定である。骨延長モデルは、約8割の確率で作成可能となった。BMP2LacZマウスを用いた骨延長の実験では、骨延長におけるBMP2産生細胞を明らかにすることができた。経過観察中にBMP2を産生した細胞は、骨端部の軟骨細胞、骨切り部の軟骨細胞、骨芽細胞、そして周囲軟部組織内の血管内皮、血管平滑筋細胞と思われる細胞でBMP2の産生細胞が見られた。今後、免疫染色でこれらの細胞の詳細なcharacterizationを行っていく予定である。血管がBMP2を産生するという知見はこれまでになく新しく独創的であると考えられる。Real time PCRは、骨マーカー、血管マーカーを、骨切り部組織、その周囲軟部組織において検討し、骨延長の経過におけるこれらの遺伝子発現について一定の結果を得た。血管造影・uCTは、技術の習得に時間がかかり、nは少ないが、骨延長中における血管形成においては、周囲軟部組織から血管は形成され、徐々に骨切り部にも血管が形成されていくことが視覚的に観察可能であった。今後は、数を増やしより細かな検討をしていく予定である。組織、レントゲンにおいて、マウス大腿骨でも骨延長が可能であることを確認した。Micro CTでは、骨と血管の形成を3Dで別々に描出可能であった。血管の形成は、周囲軟部組織でより旺盛であり、大血管、小血管の順序で形成されていた。BMP2LacZマウスを用いた骨延長では、術後10日に、gap部の軟骨細胞の一部、gapに近いhost骨の表面にBMP2陽性細胞が見られた。興味深い事に、gap部およびその周囲軟部組織の血管にBMP2陽性細胞が見られた。術後20日には、gap部の骨細胞、軟骨細胞、周囲軟部組織を含め多くの血管においてBMP2陽性細胞が見られた。術後31日には、BMP2陽性細胞は、劇的に減少し周囲軟部組織に一部陽性細胞を認めるのみであった。BMP2陽性細胞は、大血管、中血管、毛細血管のどの大きさの血管においても認められた。また動脈、静脈のどちらにもBMP2陽性細胞を認めた。BMP2陽性細胞は、α-SMA、CD31でも陽性であり、LYVE1は陰性であった。つまり、血管においてBMP2は、血管平滑筋、血管内皮細胞において産生されていた。リンパ管内皮では産生されていなかった。Real time PCRでは、PIGFが延長仮骨内での発現の上昇を認めたが周囲軟部組織では発現の上昇は認めなかった。またリンパ系のマーカーの発現も認めなかった。骨延長においては、まず周囲血管でBMP2が産生され、骨形成に働くことが示唆された。DDAOG基質を用いたcell sortingがうまくいかなかった分、予定よりやや遅れていると考えられる。理由は、現在精査中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度予定した実験が、うまくいってない部分は、今年度の予定実験とあわせて今年度も引き続き行う予定である。研究計画の変更は行わず、遂行できるところまで順に行っていく予定である。
オスマン帝国=ヨーロッパ諸国間条約関係の歴史的展開

最終年度は本計画をまとめる作業を進めた。なお、夏季(8月26日9月6日)にはトルコ共和国、イスタンブルにて2015年度の調査では収集できなかった資料の収集も行った。イスタンブルでは、大統領府オスマン文書館Cumhurbaskanligi Osmanli Arsivi(旧首相府オスマン文書館Basbakanlik Osmanli Arsivi)にて、資料の複写などを請求した。今回、2015年度の資料収集時はまだ利用できなかった、トプカプ宮殿博物館図書館・文書館所蔵の史料の一部が、電子データとして、大統領府オスマン文書館でも閲覧・複写可能となっていた。公開された資料の概要をサーベイし、いくつかは電子データとして入手できた。また2015年度も検討した諸外国台帳や君主書簡台帳についても再度閲覧し、前回に追加して電子データを収集することができた。研究成果の一部は愛知学院大学文学部紀要に、1675年対英カピチュレーションを対象とし、その歴史的変化をオスマン帝国の対外関係全体のなかでの位置づけを鑑みつつまとめた論文を上梓した。また現在、カピチュレーションの最恵国待遇条項をとりあつかった英文論文を作成中である。今後は、トルコで収集した資料と、イギリスの国立公文書館(The National Archives)やフランスの国立図書館(Biblioteque Naionale)で収集した資料とを、刊行条約集も参照しつつ、相互に対比させた分析を進め、オスマン帝国とヨーロッパ諸国間の条約関係についての実証研究を深化させ、国際法史や国際関係史の全体像のなかに位置付ける作業をさらに進展させていきたい。本計画初年度にあたる2014年度は、本研究の背景や基礎となる、国際関係史の理論についての文献調査や、オスマン帝国とヨーロッパ諸国間の基本条約集の読込み・再検討に着手する一方、夏期(8月10日8月24日)にイギリスにおもむき資料収集を行った。イギリスでは、国立公文書館、大英図書館、オクスフォード大学ボードリアン図書館で資料収集・調査を実施した。各文書館、図書館ではオスマン帝国歴代君主がイギリスの諸君主にあてた「条約の書(アフドナーメ)」=カピチュレーションのオリジナルで現存しているもの閲覧し、電子イメージとして保存できた。複数のカピチュレーションの英語訳の写しを閲覧することもでき、カピチュレーションが複製・使用されていたその方法についての理解が深まった。また、19世紀におけるイギリスを主軸とする自由貿易網形成との関連を検討し、カピチュレーションの通商条約への発展過程を、他地域との比較をつうじて明らかにするため、特に国立文書館において、オスマン帝国とイギリス間の通商条約のオリジナルのみでなく、19世紀半ばにイギリスが中国や日本、タイと締結した条約の批准書なども閲覧、デジタル写真による保存を行うことができた。研究の成果発表としては、夏期にイギリスで収集した資料の一部を利用した論文「1809年ダーダネルス条約の通商条項」が『愛知学院大学文学部紀要』第44号に掲載された。また1675年の対英カピチュレーションの諸条項に関する再検討をすすめており、論文にまとめて投稿予定である。本計画2年次にあたる2015年度は、昨年度に引き続き、国際関係史とくに国際法史の理論についての文献調査や、オスマン帝国とヨーロッパ諸国間の基本条約集の読込み・再検討を進める一方、夏期(8月10日8月24日)にはトルコ共和国イスタンブルにおもむき資料収集をおこなった。イスタンブルでは、首相府オスマン文書局Basbakanlik Osmanli Arsiviを中心に資料収集・調査を実施した。オスマン帝国歴代君主がヨーロッパ諸国の君主にあてた「条約の書(アフドナーメ)」=カピチュレーションの写しが記載されている『諸外国台帳Duvel-i Ecnebiyye Defterleri』(カタログ上は全113冊、ただし諸外国台帳ではないものも含まれている)や『君主書簡台帳Name-i Humayun Defterleri』全14巻を閲覧し、必要な部分を画像データとして入手することができた。研究成果の一部としては、昨年夏に収集した資料の一部を利用して、オスマン帝国下のエジプト・シリア、清朝中国、タイをめぐった19世紀の英外交官の即席から、これらの諸国とイギリスとの条約関係を分析した「ジョン・バウリングと通商条約の東西ー一九世紀半ばにおける自由貿易条約網展開の一断面ー」を執筆、本年7月に国際商業史研究会の論集のなかの一稿として刊行予定である。研究の基盤となる理論に関する文献の読込みや条約集の読解作業は順調に進行中である。また計画していたトルコでの調査も在イスタンブル首相府オスマン文書局にておおむね順調に実施することができた。ただし計画していたイタリアのヴェネツィアへの調査は本年度は実施できなかった。しかし調査予定だった資料の一部は、文書館のホームページで公開されており、それらを参照することができた。学会発表は行っていないが、国際商業史研究会論集執筆への参加という形で、研究成果の一部を執筆することもできた。よって2015年度をつうじ、本研究は順調に進展してきたと考える。本計画三年次にあたる2016年度は、昨年度に引き続き、国際法史の理論についての文献調査やオスマン帝国とヨーロッパ諸国間の基本条約集の読込み・再検討を進めた。また夏期(8月10日8月22日)にフランス、パリにおもむき資料収集をおこなった。パリではフランス国立図書館(Bibliotheque nationale de France)のリシュリュー館(Site Richelieu-Louvois)古文書局(Departement des Manuscrits)にて調査を行った。

パリでの調査にあたってはフランス外交史料館(Le centre des Archives diplomatiques de la Courneuve)等での調査もあわせて行いたかったが、期間が限られていたため国立図書館での調査に専念した。先行研究から、オスマン帝国からイギリスやフランスに与えられた「条約の書(アフドナーメ、カピチュレーション)」の原本は散逸したと知られているが、今回は同時代ないしその後にオスマン語でないしはフランス語訳で記された写しを閲覧また可能な範囲で撮影した。また関連資料についても同様に収集を行った。主な調査対象資料は古文書のトルコ分類(MS(manuscrits)-turc)分類およびトルコ分類補遺(MS supplement turc)の資料群である。今年度に収集した資料については今後初年度に収集したイギリスの資料を合わせて英仏のカピチュレーションを比較検討しその成果を学術論文等で発表予定である。研究成果の一部は国際商業史研究会の論集の一稿として2017年6月に刊行予定である(昨年度に刊行予定であったが、本年度に延期された)。研究の基盤となる理論に関する文献の読込みや条約集の読解作業は順調に進行中である。また計画していたフランスでの調査もパリのフランス国立図書館リシュリュー館でおおむね順調に実施することができた。学会発表は行っていないが、国際商業史研究会編集の論集への参加で研究成果の一部を加筆修正した形で執筆することができた。よって2016年度をつうじ、本研究は順調に進展してきたと考える。本計画4年次にあたる2017年度は、国際法史に関する文献や、オスマン帝国とヨーロッパ諸国間の条約集の読解を進めるとともに、これまで本計画で収集してきた資料の整理を行った。また夏期には(8月12日8月22日)にイギリス、ロンドンにて初年度(2014年度)に撮影の許可されていなかった資料の収集を行った。ロンドンでは今回は主に大英図書館(the British Library)にて調査を行ったが、調査期間中に国立公文書館(The National Archives)にも赴いた。国立公文書館所蔵の資料は閲覧者による研究目的のデジタル写真撮影が以前より許可されており、2014年度に多くの資料を写真データとして収集することができていた。しかし、大英図書館所蔵の資料の撮影は2014年度調査実施期間以後に許可された。限られた調査期間では、資料の分析を行うことが難しいため、2014年度に閲覧した資料やその際には閲覧しきれなかった資料もふくめ今回撮影を行った。参照した資料は主に大英図書館のアジア・アフリカ研究閲覧室(Asian and African Studies Reading Room)にて調査した。主な資料はオスマン帝国からイギリスに付与された「条約の書カピチュレーション(アフドナーメ)」である。長さが一メートル以上になる文書もあるため、いくつかに分けて撮影した。撮影の許可されていない資料もあったが、研究目的ということで撮影の特別許可を申請し、概ね受理された。