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RNF213遺伝子変異陰性もやもや病患者における新規感受性遺伝子の同定

RNF213遺伝子とは別の新規感受性遺伝子を検索するためには、このRNF213遺伝子に変異を持たない患者を抽出する必要がある。そのため、収集した患者サンプルについてRNF213遺伝子の全コーディング・エクソンをリシーケンシングし、変異の有無を確認した。この行程で、未報告のRNF213遺伝子レア・バリアントを見出したので論文報告した(Hum Genome Var. 2018;5:17060.など)。また、多数の日本人患者でRNF213遺伝子型を決定できたので、臨床像との関連も精査して論文報告も行っている(J Neurosurg. 2018; 129,563-565.など)。東アジア人患者では創始者変異p.R4810K(c.14429G>A、rs112735431)が最も高頻度に検出されるが、これ以外のレア・バリアントを持つもので重篤な臨床経過をたどる例もあるため、もやもや病患者でRNF213遺伝子検査を行う場合には全コーディング領域のリシーケンシングが必須であると考えられた。RNF213遺伝子変異陰性の家系から同定に至った新規感受性遺伝子CCER2(J Stroke Cerebrovasc Dis. 2017;26:150-161)については、さらなる症例の積み重ねによる検証が必要であるため、リシーケンシングによる変異患者の検索を継続して行った。現在までに発端者180例および対照109例でのリシーケンシングを終え、病的なCCER2変異を患者6家系から検出している。対照からは病的変異は1例も検出されていないので、CCER2遺伝子の関連は有意である(Fisher's exacttest P<0.01)。RNF213およびCCER2遺伝子のどちらからも病的変異が検出されなかった家系でについては、全エクソームシーケンシングによる更なる感受性遺伝子の検索を行っている。もやもや病は両側内頸動脈の進行性狭窄とそれに伴う異常血管増生により、脳卒中やてんかんを引き起こす難治性疾患である。多因子遺伝性疾患であり、日本人もやもや病患者では、感受性遺伝子RNF213の変異がおよそ80%で検出される。残り20%の患者でも家族歴陽性例、小児発症例がRNF213変異陽性例と同程度観察されることから、未知の感受性遺伝子の存在が示唆されており、これを特定するのが本研究の目的である。初年度である本年度は、まず、我々の先行研究(J Am Heart Assoc. 2015; 4(5). pii: e001862.)でRNF213遺伝子解析を行なった103例のもやもや病患者から得られた、2つのRNF213変異陰性患者家系に注目した。一方は家系内に3名の罹患者を有す家系、もう一方は、一卵性双生児の片方が患者でもう片方が健常のdiscordant monozygotic twinsである。罹患者、非罹患者を含めてサンプリングを行ない、全例で全エクソームシーケンスを施行した。双生児解析では残念ながら有望なde novo変異は検出されなかったが、2つの家系でともに機能障害性変異を来す遺伝子がただ一つだけに絞り込まれた。染色体19q13.2に位置するCCER2遺伝子である。N末端にシグナルペプチドを持つ分泌タンパクで、いずれの家系の変異においても蛋白の異常凝集を来す可能性がin silico解析により示唆された。そこで、さらに患者135例と対照199例でCCER2遺伝子のリシーケンスを行ない機能的レアバリアントの関連解析を行なったところ、有意な関連が認められ、患者特有の機能的変異が他にも2種類検出された。RT-PCRにより臓器局在をみてみると、CCER2は胎児脳特異的に発現しており、もやもや病の有望な新規バイオマーカーと考えられた。新規感受性遺伝子を特定し、日本脳卒中学会の学術誌に論文報告も行なっている。もやもや病感受性遺伝子RNF213が特定されて以降、これをもとに本疾患の発症機序の理解が進み、新たな治療法の開発へも発展していくことが期待されていたが、実際にはその道のりはまだ厳しい。これを打開する方策のひとつとして、新規の感受性遺伝子が特定できれば新たな視点で病態にアプローチできると考え、研究を実施してきた。これまでに、RNF213遺伝子の感受性バリアントが陰性の2家系において、全エクソーム・シーケンシングによる網羅的探索を行い、胎児脳特異的に発現する分泌蛋白をコードするCCER2遺伝子の特定に至った。変異により脳脊髄液中に分泌されたCCER2分子が異常凝集し、これが脳主幹動脈の狭窄に影響するという機序が想定され、有望な脳脊髄液バイオマーカーとなりうる可能性も考えられた。しかしながら、この遺伝子変異を有する患者の頻度は極めて低い。すなわち、RNF213バリアント陰性もやもや病患者においては高度な座位異質性が存在しており、さらなる患者サンプルの集積が必要であると考えられた。そのため、本年度はサンプル取集の対象を類もやもや病などの近縁の疾患群にも広げてRNF213遺伝子全域のリシーケンシングを行い、RNF213バリアント陰性患者の蓄積を行った。その過程で、類もやもや病患者においても高率にRNF213感受性バリアントが陽性になることを見出し、また、未報告のRNF213バリアントもいくつか報告することができた。RNF213遺伝子とは別の新規感受性

遺伝子特定のため、RNF213遺伝子に感受性バリアントを持たない患者サンプルの収集を継続している。しかし、日本人患者ではその頻度は極めて低いため。RNF213遺伝子とは別の新規感受性遺伝子を検索するためには、このRNF213遺伝子に変異を持たない患者を抽出する必要がある。そのため、収集した患者サンプルについてRNF213遺伝子の全コーディング・エクソンをリシーケンシングし、変異の有無を確認した。この行程で、未報告のRNF213遺伝子レア・バリアントを見出したので論文報告した(Hum Genome Var. 2018;5:17060.など)。また、多数の日本人患者でRNF213遺伝子型を決定できたので、臨床像との関連も精査して論文報告も行っている(J Neurosurg. 2018; 129,563-565.など)。東アジア人患者では創始者変異p.R4810K(c.14429G>A、rs112735431)が最も高頻度に検出されるが、これ以外のレア・バリアントを持つもので重篤な臨床経過をたどる例もあるため、もやもや病患者でRNF213遺伝子検査を行う場合には全コーディング領域のリシーケンシングが必須であると考えられた。RNF213遺伝子変異陰性の家系から同定に至った新規感受性遺伝子CCER2(J Stroke Cerebrovasc Dis. 2017;26:150-161)については、さらなる症例の積み重ねによる検証が必要であるため、リシーケンシングによる変異患者の検索を継続して行った。現在までに発端者180例および対照109例でのリシーケンシングを終え、病的なCCER2変異を患者6家系から検出している。対照からは病的変異は1例も検出されていないので、CCER2遺伝子の関連は有意である(Fisher's exacttest P<0.01)。RNF213およびCCER2遺伝子のどちらからも病的変異が検出されなかった家系でについては、全エクソームシーケンシングによる更なる感受性遺伝子の検索を行っている。CCER2変異もやもや病患者もまた稀であり、RNF213変異陰性もやもや病患者の遺伝的背景はかなり異質性が高いと考えられる。未解析のRNF213変異陰性家系がまだ残っており、また、サンプル収集継続によりその数も増えてきているので、引き続き全エクソームシーケンスによる探索を継続する。CCER2遺伝子については胎児脳特異的に発現する分泌蛋白であることから、要望なバイオマーカーの可能性があるので、機能解析を検討する。まずは、患者脳脊髄液を用いて免疫ブロット法による検出を行なう。臨床研究の倫理承認のもと患者脳脊髄液のサンプリングを実施している。RNF213遺伝子やCCER2遺伝子のスクリーニングには前年度までサンガー法を用いていた。特にRNF213遺伝子では68個のエクソンがあり、その全域に対してサンガー法を行うのに多く労力が必要であった。そのため、本年度からはベンチトップ型次世代シーケンサーIonPGM(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)の使用を開始した。効率の良いアッセイプロトコールが策定できたので、今後もこれを十分に活用し、CCER2遺伝子変異型のもやもや病患者の抽出と、全エクソームシーケンシングや全ゲノムシーケンシングに供する患者サンプルを選定していく。消費税により端数が生じたため。
健康寿命延伸物質（カロリー制限模倣物）の探索とその応用

健康寿命延伸物質候補の多くは、従来は試行錯誤によって発見された健康に良い影響を与える物質を種々の視点で解析し、長い時間をかけて評価されてきた。しかし、健康寿命延伸物質候補を効率よく見出す探索系の開発については、これまで十分に検討がなされてこなかった。本研究では、まず、マウス脾臓T細胞を用いて健康寿命延伸物質候補を植物由来化合物から効率よくスクリーニングする。免疫学分野の実験系をスクリーニングに活用するという独自性が、本研究の一番の特徴である。次に、その候補物質の抗炎症作用と代謝改善作用を株化培養細胞を用いて検討する。さらに、モデル動物を用いてその物質の健康寿命延伸効果を確認する。
曲率を制御した足場材料によるin vitro 3次元微小血管新生モデルの構築

本研究は、曲率を微細に制御した足場材料を用いて、生体外(in vitro)で3次元的な微小血管新生をモデル化することを目的とした。研究実施期間(2年間)において、まず、足場材料の曲率によって血管内皮細胞の血管内皮成長因子(VEGF)に対する血管新生応答を制御できることを証明し、さらに見出した最適な曲率を持った血管足場を微細に設計することで、長く・成熟した血管新生モデルの構築を行った。構築したモデルにおいて血管新生の様子を詳細に画像化し、初めて微小な血管新生の形態変化を捉えることに成功した。H28年度は、足場材料の曲率によって、血管内皮細胞の成長因子に対する血管新生応答を制御可能であることを証明することを目的とし、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いて様々な曲率(大きさ、向き)を持った微小血管を作製し、血管内皮成長因子(VEGF)に対する応答を調べた。具体的には、PDMSでデバイスを作製し、そこに足場となるコラーゲンゲル流路を作成した。この流路を作製した際に、コラーゲンゲル中に挿入するニードルの直径を120, 200, 300マイクロメートルと変化させ、直径の異なる微小血管を作製した。作製した流路へHUVECsを導入し、ゲル表面に接着・伸展させて管腔構造を持つ微小血管を形成させた。この微小血管に、血管内皮細胞の増殖と血管新生を誘導する血管内皮成長因子(VEGF)を0または50 ng/mLとなるように添加し、7日間培養して時間経過による変化を明視野顕微鏡および、光コヒーレンストモグラフィを用いて観察した。すると、血管径が小さい直径120, 200マイクロメートルの微小血管の方が、より血管を新生しやすいことが明らかとなった。培養後、パラホルムアルデヒドで固定、蛍光修飾ファロイジンで細胞骨格のアクチンを染色し、共焦点レーザー顕微鏡で新生血管の管腔構造を観察し、各観察法にて得られた画像を比較した。形成された新生血管は、中に管腔を有する生理的な血管新生であることが確認できた。さらに複数(n=3)の微小血管で新生血管の全体的な長さおよび内腔の大きさを経時的に測定した。また、血管の直径および体積も経時的に測定し、血管の直径(=曲率)と血管新生および血管径の変化の関係を比較したところ、血管径が小さいほど、血管径および体積の変化率が高いことが明らかとなった。本知見により、曲率によって血管内皮細胞の成長因子に対する血管新生応答が変化することが証明された。本年度の目標に掲げた「足場材料の曲率によって、血管内皮細胞の成長因子に対する血管新生応答を制御可能であることを証明する」ことは、予定通り遂行でき、次年度の基盤知見となる、血管新生に適した曲率の情報を得ることができた。加えて、光コヒーレンストモグラフィ観察技術と組み合わせることで得たモデルシステムと血管新生の定量評価の研究成果を、Scientific Reports誌に投稿・受理された。これは、計画よりも詳細な研究データを得ることができたためであり、本研究は計画以上に進展している。2年目であるH30年度は、1年目で証明した、血管新生に適した曲率面を構築可能な小さい直径(120-200マイクロメートル)の微小血管を用いて、より生理的な血管新生現象を生体外(in vitro)で自在にモデル化できるか検討した。1周皮細胞との共培養による、長く・成熟した血管新生モデルの構築細い(直径200マイクロメートル以下)微小血管を構築することで血管内皮成長因子(VEGF)に応答した血管新生を効率的に誘導可能なことを証明できたため、より長く・成熟した血管新生プロセスのモデル化が可能ではないかと考え、周皮細胞であるペリサイトとの共培養系を検討した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)と一緒にペリサイトを導入すると、自発的に血管内皮細胞層の外側(細胞外マトリックス側)にペリサイトが接着した二層構造を形成し、周皮細胞が血管内皮の周囲に裏打ちするような、体内で見られる構造を形成することを明らかとした。ペリサイト共存下では、血管内皮細胞単独に比べ、VEGFに応答して新生した血管が長く、また新生血管の周囲にもペリサイトがサポートしている様子が観察され、さらに、血管から外へ物質が漏れ出す血管透過性も抑制できることを明らかとした。以上から、血管内皮細胞と周皮細胞共培養系によって長く・成熟した血管新生モデルが構築可能であることが証明できた。2構築したin vitro3次元血管新生モデルの有用性評価血管新生現象では、先端細胞(tip細胞)と柄細胞(stalk細胞)の遊走によって血管が新生していくことが知られているため、まず免疫染色することにより、新生させた血管がtipおよびstalk細胞によって構築されていることを確認した。さらに、微小血管モデルの培地中に血管新生阻害薬を添加すると、VEGF存在下でも血管新生が抑制されることを確認し、薬剤スクリーニングなどにも利用可能であることを実証した。

構築したモデルにおいて血管新生の様子を詳細に画像化し、初めて微小な血管新生の形態変化を捉えることに成功した。今後は、1年目で血管新生に適した曲率であると証明したより小さい直径(120マイクロメートル)の微小血管曲率を使って、in vitroモデルの血管新生を自在に制御できるか検討し、さらにこのシステムを用いることで生理的な血管新生現象を様々な血管内皮細胞でモデル化できるか確認する。曲率を利用した血管新生部位を空間的に制御可能なin vitroモデルの作製と、構築したin vitro3次元血管新生モデルの有用性評価の2項目で検討する。具体的には、血管新生に適した高い曲率を用いて、微小血管を取り巻く足場材料の幾何学的な形をデザインし、血管新生部位を空間的に制御できるin vitro血管新生モデルを構築する。基本となる微小血管は血管を新生させないように大きな血管径(>300マイクロメートル)に設定し、流路の一部が血管新生に高い曲率を持つような流路を設計する。この流路はsugar waxで凹凸をつけたニードルを用いて作製する。このゲル流路にHUVECsを導入し、微小血管を形成させ、VEGFを添加して、高い曲率を配置した部位から血管が新生するか検討する。次に、先端細胞(tip細胞)と柄細胞(stalk細胞)の遊走によって新生していくため、本モデルの血管新生が同様に起こっているか、新生部位をタイムラプスで観察すると共に、tip細胞とstalk細胞を免疫染色して確認する。また、血管新生にはVEGFのみでなく、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)が大きく関わっていることから、VEGFとMMP共存下で血管新生が活性化(促進)するか、さらに、MMP共存条件においても曲率による制御が可能か検討する。さらにこの曲率を利用したin vitro血管新生モデルが他の血管内皮細胞に対しても有効か、ヒト冠状動脈内皮細胞(HCAECs)、ヒト肺動脈内皮細胞(HPAECs)を用いて評価する。29年度が最終年度であるため、記入しない。生体材料学29年度が最終年度であるため、記入しない。
筋型カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼIの異常に基づく発症機構

細胞内の長鎖脂肪酸の分解は主にミトコンドリアのマトリックスにおいて行われる.しかし、ミトコンドリア内膜はほとんど全ての分子に対して不透過性を示すため、脂肪酸はそのままではマトリックスに移行することができない.カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)は長鎖脂肪酸のアシル基をカルニチンに転移するタンパク質で、この働きにより長鎖脂肪酸はマトリックスへ移行することが可能となる.これまでの研究から、CPT Iには組織分布および酵素的性質の異なる2種のアイソフォーム、肝型と筋型の存在が示唆されていたが、タンパク質の単離精製が困難なことから脂肪酸代謝の盛んな心臓や骨格筋に発現している筋型アイソフォームの一次構造は明らかとされておらず、cDNAや遺伝子の単離も行われていなかった.申請者らは、筋型CPT IをコードするcDNAおよび遺伝子の単離と構造解析を世界に先駆けて行った.その結果、ヒト筋型CPT I遺伝子は10kbpで、772のアミノ酸は19のエクソンに分断されていること、本遺伝子の翻訳開始コドンを含むエクソンの上流にはアミノ酸をコードしないエクソンが2つ存在し、これら2つのエクソンは択一的でそれぞれから転写が開始されていることを明らかとした.また本遺伝子のすぐ上流に、機能的に関係のないコリン/エタノールアミンキナーゼ(CK/EK)遺伝子が同じ方向で存在することを明らかとした.さらに、上流に存在するCK/EK遺伝子が筋型CPT I遺伝子の転写に対してエンハンサー様の影響を与えており、この作用には種差が存在する可能性を見いだした.また、ヒトの場合、CK/EKのmRNAが筋型CPT IのmRNAと連結している、すなわち2つの遺伝子がオーバーラップしていることを見いだした.今後は、CK/EK遺伝子と筋型CPT I遺伝子の関係をさらに明らかとし、筋型CPT I遺伝子の発現調節機構の解明を行う.細胞内の長鎖脂肪酸の分解は主にミトコンドリアのマトリックスにおいて行われる.しかし、ミトコンドリアの内膜はほとんど全ての分子に対して不透過性を示すため、脂肪酸はそのままではミトコンドリア内膜を通過しマトリツクスに移行することが出来ない.カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)は長鎖脂肪酸のアシル基をカルニチンに転移するタンパク質で、この働きにより長鎖脂肪酸はマトリックスへ移行することが可能となる.これまでの研究結果から、CPT Iには、発現している組織および酵素的性質の異なる2種のアイソフォーム、肝型と筋型の存在が示唆されていたが、タンパク質の単離および精製が困難なことから脂肪酸代謝の盛んな心臓や骨格筋に特異的に発現している筋型アイソフォームに関する研究、特にそのcDNAや遺伝子の単離は全く行われていなかったため、アミノ酸一次構造はもとより、その遺伝子構造や発現機構は全く明らかとされていなかった.申請者らは、ラット褐色脂肪組織cDNAライブラリーから筋型CPT IをコードするcDNAの単離に成功し、続いてヒトの本タンパク質をコードするcDNAを単離しその構造を明らかとした.さらにヒトの筋型CPT Iをコードする遺伝子を単離解析した結果、本遺伝子はおよそ10kbpで上流領域にはアミノ酸に翻訳されない2つの択一的なエクソンが存在しそれぞれから転写が開始されること、これらエクソンのすぐ上流には他のタンパク質をコードする遺伝子領域が存在するという特徴的な構造を有していることを明らかとした.現在、このような構造を有したヒト筋型CPT Iの遺伝子構造、特に上流領域の構造の意義を明らかとするため、ラットおよびマウスの遺伝子上流領域の構造解析を行っている.これらを比較し、種間の相違点を明らかとすることで、本遺伝子の発現機構の特徴を明らかとすることが可能となると考えている.細胞内の長鎖脂肪酸の分解は主にミトコンドリアのマトリックスにおいて行われる.しかし、ミトコンドリア内膜はほとんど全ての分子に対して不透過性を示すため、脂肪酸はそのままではマトリックスに移行することができない.カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)は長鎖脂肪酸のアシル基をカルニチンに転移するタンパク質で、この働きにより長鎖脂肪酸はマトリックスへ移行することが可能となる.これまでの研究から、CPT Iには組織分布および酵素的性質の異なる2種のアイソフォーム、肝型と筋型の存在が示唆されていたが、タンパク質の単離精製が困難なことから脂肪酸代謝の盛んな心臓や骨格筋に発現している筋型アイソフォームの一次構造は明らかとされておらず、cDNAや遺伝子の単離も行われていなかった.申請者らは、筋型CPT IをコードするcDNAおよび遺伝子の単離と構造解析を世界に先駆けて行った.その結果、ヒト筋型CPT I遺伝子は10kbpで、772のアミノ酸は19のエクソンに分断されていること、本遺伝子の翻訳開始コドンを含むエクソンの上流にはアミノ酸をコードしないエクソンが2つ存在し、これら2つのエクソンは択一的でそれぞれから転写が開始されていることを明らかとした.また本遺伝子のすぐ上流に、機能的に関係のないコリン/エタノールアミンキナーゼ(CK/EK)遺伝子が同じ方向で存在することを明らかとした.さらに、上流に存在するCK/EK遺伝子が筋型CPT I遺伝子の転写に対してエンハンサー様の影響を与えており、この作用には種差が存在する可能性を見いだした.また、ヒトの場合、CK/EKのmRNAが筋型CPT IのmRNAと連結している、すなわち2つの遺伝子がオーバーラップしていることを見いだした.今後は、CK/EK遺伝子と筋型CPT I遺伝子の関係をさらに明らかとし、筋型CPT I遺伝子の発現調節機構の解明を行う.
心臓興奮光学マッピングハイブリッドシステムの開発および不整脈時膜電位解析

(1)複数台の高速度デジタルビデオによるマッピングシステムの製作心室頻拍・細動の成因とされるスパイラルリエントリは,中心位置が一定せず,回転しながら旋回するようなさまよい運動を起こすことが知られている.従来のカメラを用いた光学マッピングシステムは一方向からのマッピングを行っていたため,不整脈中の細胞膜興奮伝播を観測しても,興奮波を短時間しか追従できないことがあった.本システムは2台の高速度デジタルカメラにより観察した個々の活動電位マップ合成する手法により,正面部のみならず側壁も観測領域に含めた,1.4倍の広領域において心筋細胞膜活動電位をマッピングすることを可能とした.その結果,Figureof8型や異なる方向から進行してきた複数波面が衝突する様子を観測することが可能となり,興奮様式の停止機序を詳細に分類することが可能となった.(2)膜活動電位リアルタイム解析システム活動電位計測中に,光学計測の特徴である再分極面を時刻基点とし,細胞膜の興奮からの回復程度を考慮して刺激印加が可能な,活動電位フィードバック刺激システムを開発した.同システムは活動電位の回復仮説に基づいた回復曲線をDynamic pacing下に数秒数分で検出が可能であり,動的な刺激及び記録・解析システムを統合した環境の開発によって,除細動刺激シミュレーションの検討が可能となった.また,抗不整脈投与後の回復特性変化など,同一エピソードに頻繁な解析が必要とされる電気生理学実験に貢献するものといえる.(1)複数台の高速度デジタルビデオによるマッピングシステムの製作心室頻拍・細動の成因とされるスパイラルリエントリは,中心位置が一定せず,回転しながら旋回するようなさまよい運動を起こすことが知られている.従来のカメラを用いた光学マッピングシステムは一方向からのマッピングを行っていたため,不整脈中の細胞膜興奮伝播を観測しても,興奮波を短時間しか追従できないことがあった.本システムは2台の高速度デジタルカメラにより観察した個々の活動電位マップ合成する手法により,正面部のみならず側壁も観測領域に含めた,1.4倍の広領域において心筋細胞膜活動電位をマッピングすることを可能とした.その結果,Figureof8型や異なる方向から進行してきた複数波面が衝突する様子を観測することが可能となり,興奮様式の停止機序を詳細に分類することが可能となった.(2)膜活動電位リアルタイム解析システム活動電位計測中に,光学計測の特徴である再分極面を時刻基点とし,細胞膜の興奮からの回復程度を考慮して刺激印加が可能な,活動電位フィードバック刺激システムを開発した.同システムは活動電位の回復仮説に基づいた回復曲線をDynamic pacing下に数秒数分で検出が可能であり,動的な刺激及び記録・解析システムを統合した環境の開発によって,除細動刺激シミュレーションの検討が可能となった.また,抗不整脈投与後の回復特性変化など,同一エピソードに頻繁な解析が必要とされる電気生理学実験に貢献するものといえる.
プソイドペプチドを含むプロテア-ゼ阻害剤の分子設計

まず、本研究の推進にあたり、ペプチドの加水分解遷移状態の代表的なアナログであるhydroxyethylene dipeptide isostereの立体選択的新規合成法を検討した。スズ化合物(1aーc)にTiCl_4を,次いでTi(OPr^i)_4を加えると相当するtitanium homoenolate(2aーc)が生成する。これにαーamino aldehyds(3aーc)を反応させると相当するラクトン体(4)が立体選択的に(erythro;threo>10:1)生成した。4(R_1=Me,...Me,R_2=iーBu)を5に誘導した。in situで生成する6aーcを3a,bと反応ると7aーdがerythro;threo>10:1で生成した。erythro体を2行程でthreo体(8)に変換した。これらの反応を応用して9から10aーcを合成した。一方、エステル(11aーc)をDIBALーHで遷元、次いでoneーpot法でブテニル化し,12aーcを立体選択的に得た。OHをTBDSで保護した後,二重結合をRucl_3ーNaIO_4で酸化,脱保護により13に誘導し,13から定量的に14を得た。ここで合成した4,13を用いて標題の研究推進のため種々のペプチド誘導体の合成を検討している。
分裂酵母のRAS情報伝達系に関わる新たな因子の解析

分裂酵母のRasはフェロモンの情報伝達に関与し、ras1欠失株は有性生殖不能になる。これまでに高発現することによりrasをバイパスする遺伝子としてbyr2やbyr1が単離されてきている。今回、Rasの周辺や下流にはまだまだその調節に関わる新しい因子が存在すると考え、遺伝学的なアプローチをとった。我々が単離した有性生殖が昂進しているsam変異の内2株はras1欠損に対して優性の性質を示す。sam変異のうち優性1株より、ゲノムライブラリーを構築し、ras1欠損株の胞子形成不能をバイパスできる遺伝子でsla1と呼ぶLaタンパク質のホモログ遺伝子を単離した。Laタンパク質はヒトの自己免疫疾患の抗原として知られ、RNAの安定化や翻訳制御に関与していると考えられる。興味深いことにこのsla1はC末端コード領域を欠損しているときに活性を示し、その領域にはNLS(核移行配列)が存在していることが判明した。つまり核移行の有無が活性に大きく影響を及ぼすことを見いだした。さらにras欠損株の機能をバイパスする変異株として得られた劣性変異を相補する遺伝子として14-3-3のホモログをコードするrad25を得た。rad25の破壊株は胞子形成が昂進していること、逆にrad25を高発現させると胞子形成率の低下を示すことが判明した。もう1つの14-3-3のホモログとして知られるRad24についても同様の結果が得られた。Rad24,Rad25がツーハイブリット法や免疫沈降法によりByr2に結合することを見いだした。さらに活性化状態のByr1はRad24,Rad25の影響を受lナないことなどから分裂酵母では14-3-3がByr2を負に制御していることが判明した。酵母のRasはフェロモンの情報伝達に関与し、ras1は欠失株は有性生殖不能になる。有性生殖が昂進しているsam変異の内2株はras1欠失に対して優性の性質を示した。sam変異のうち優性1株より、sla1と呼ぶヒトの自己免疫疾患の抗原として知られるLaタンパク質のホモログ遺伝子を単離した。sla1はras欠損株の胞子形成不能をバイパスできる遺伝子で、Ras情報伝達系路の下流に位置するものであると考えられた。興味深いことにこのsla1はC末端コード領域を欠損しているときに活性を示し、その領域にはNLSが存在していることが判明した。Rad24,Rad25がByr2に結合すること、活性化状態のByr1はRad24,Rad25の影響を受けないことなどから分裂酵母では14-3-3がByr2を負に制御していることなどが分かった。

sam変異のうち優性1株より、ゲノムライブラリーを構築し、ras1欠損株の胞子形成不能をバイパスできる遺伝子でsla1と呼ぶLaタンパク質のホモログ遺伝子を単離した。Laタンパク質はヒトの自己免疫疾患の抗原として知られ、RNAの安定化や翻訳制御に関与していると考えられる。興味深いことにこのsla1はC末端コード領域を欠損しているときに活性を示し、その領域にはNLS(核移行配列)が存在していることが判明した。つまり核移行の有無が活性に大きく影響を及ぼすことを見いだした。さらにras欠損株の機能をバイパスする変異株として得られた劣性変異を相補する遺伝子として14-3-3のホモログをコードするrad25を得た。rad25の破壊株は胞子形成が昂進していること、逆にrad25を高発現させると胞子形成率の低下を示すことが判明した。もう1つの14-3-3のホモログとして知られるRad24についても同様の結果が得られた.Rad24,Rad25がByr2に結合すること、活性化状態のByr1はRad24,Rad25の影響を受けないことなどから分裂酵母では14-3-3がByr2を負に制御していることなどが分かった。
健康・医療を重点とした野宿者への包括的支援をめざす調査及び公-民協働に関する研究

1)京都市、東京都、福岡県におけるホームレス支援団体の活動実態を調査研究した。2)京都市内で生活するホームレスの人々への聞き取り調査および相談会開催を通じて、ホームレスの人々の健康状態及び医療上の問題を調査した。1)の調査により、もし複数の民間支援団体の間で協力関係がうまく築けるならば、包括的なホームレス支援も不可能ではないことを示唆している点で重要であることがわかった。2)の調査では、ホームレスの人々が抱える複合的な困難の一端が、特に健康医療問題を通して、ケアに到達できない悪循環の様相や医療対応策からの遺漏として、その実態が明らかになった。京都市内や周辺には、ホームレス支援を行う群小の諸団体が、多数存在する。これら諸団体の独自のこだわりや共通の目標を意識しながら、私たち(現研究代表者・研究協力者グループ)は、平成18年より、医療系専門職のネットワーク化を念頭において、動き出していた。助成金を得た平成19年度は、引き続き、まず、支援団体や当事者の会との協力関係の中で、民間サイドからの支援の状況を、踏み込んで看取し、全体を俯瞰することに努めた。その結果、研究代表者・研究協力者の呼びかけによって、団体間の寄り合い(隔月)、医療を主眼とした健康・よろず相談会(年1回)、アウトリーチ型医療支援(毎月)が実現し、継続的に、活動や記録(資料)の蓄積を行っている。二月には、研究者や全国の支援団体が集まるシンポジウムにおいて、私=研究代表者は、京都の現状と特質を報告した。その後、東京(NPO法人「もやい」)と九州([北九州ホームレス支援機構])を訪問し、リーダー層のヒアリングのほか、参与観察をおこなった。これらは、東西の代表的な支援団体とみなしうるため、当事者との関係性を含め、モデル典型例として、考察を行ったものである(概要を知るためのプレ訪問)。三月には、健康・医療問題を中心にした、当事者へのヒアリング調査を行い、当事者の会や支援者の協力のもと、元野宿者を含めて45名分を終了した。その目的は、おもに、身体の全体状況、退院後の生活保護の継続性、路上からの医療サービスの利用実態を知るためである。それらの分析と報告会・研究会への展開は、20年度の課題である。以上第3回「健康よろず相談会」の開催と、京都市の行政関係者・民間医療関係者へのヒヤリングを通して、路上生活者の健康状態、医療サービスへのアクセス上の問題及び退院後の処遇について調査した。当市では、小規模な多数の団体が個別に活動しており、当事者にとっても支援サービスの全容がつかみづらい。行政も、支援団体との協働をはかることを含めて、支援サービスのグランドデザインを描けているとは言い難い。当事者の健康問題に即してみれば、精神も含め疾病を抱えている人が多く、ホームレス状態が長く続くほど、病院や公的機関の敷居は高くなり、医療券が取得し易いにも拘らず罹患しても病院に行かず、支援サービスの利用や生活保護申請への足も遠のく、といった悪循環に陥る。いったん入院しても、行政と病院側との齟齬や本人の理解・表現能力の問題も絡み、退院後必ずしも居宅保護へ移行する訳ではない。ホームレス状態から脱却するための歩みには、このように疾病一つをみても、通常では想像し難い多種多様なリスクや困難が重層的・複合的に付き纏う、という実態が明らかになった。特に、疾病を抱えている当事者の問題は、より深刻である。ヒヤリングによれば、行政は当事者が退院と同時に生活保護停止になることの重要性は認識していても、その実態を十分把握してはおらず、労働組合においても、「(退院即生活保護の停止は)あり得ない」という反応である。従って、入退院に際しても、支援者による後見人的な帯同は、当事者の利益擁護の点から、決定的であることが明らかである。医療券発行は、一説では70年代から、遅くとも80年代半ばから行われている。しかし、当事者には、少なからず知的障害・精神障害の縁辺者がいることを勘案すれば、医療券発行の狭間で疾病者が十分救済されず、むしろエアポケットになっている可能性があることが、判明した。(775字)
抑圧突然変異体を用いた細菌鞭毛形態形成の制御機構の研究

サルモネラの鞭毛は基体・フック・繊維の3つの部分構造からなる運動器官であり、20種類以上の蛋白質分子が重合してできた高次構造体である。その形態形成には40個近い遺伝子の機能が必須であるが、これらの遺伝子産物の中には、鞭毛遺伝子の発現調節因子や鞭毛構造体の構成素材であるもののほかに、鞭毛構成素材の分子集合の調節因子として機能しているものも存在するはずである。しかしこれまでのところ、蛋白質分子集合の調節因子であることが証明されている遺伝子産物は皆無に等しい。ところでfliDは繊維の、fliKはフックの形成に必須の遺伝子として知られているが、これらの遺伝子産物はそれぞれの構造の構成素材蛋白質ではないことから、これらの遺伝子産物はそれぞれの構造体の構成素材蛋白質であるフック蛋白質(FlgE)やフラジェリン(FliC)の分子集合を制御する調節蛋白質である可能性が高い。この点を明らかにする目的でfliDおよびfliKのNull突然変異体から抑圧突然変異体を単離することを試みた。fliD突然変異体からは、多数の抑圧突然変異体が単離されたが、いずれもその抑圧効果はきわめて低かった。これらの抑圧変異点を導入を用いて決定したところ、fliD遺伝子のすぐ近傍に位置づけられた。fliDの下流にはこれと同一オペロンを形成する機能未同定の翻訳枠が3つ存在していることから、これらの翻訳枠のどれかがこの抑圧機構に関与しているものと考えられ、fliDオペロンの遺伝子群は共同してフラジェリン分子の集合を制御しているものと推定される。一方fliK突然変異からは3つの抑圧突然変異体が単離され、導入やクロ-ニングによる解析の結果flhB遺伝子内に起こった突然変異であることが判明した。これまでflhB遺伝子の機能は基体形成の初期反応に関与すると考えられてきたが、フック形成にも重要な役割を演じている可能性が高くなった。
属性叙述を含めた包括的なテンス・アスペクト体系の解明

日本語の時間に関する表現(テンス・アスペクト)は、出来事を述べる文(事象叙述文)においては体系の整理がかなりの程度進められている一方で、恒常的な性質を述べる文(属性叙述文)における体系は、まだ十分に明らかになっていない。本研究は、テイルの形式に着目し、事象叙述と属性叙述を通して統一的にとらえられるテイル形の意味を明らかにすることによって、事象叙述文だけでなく属性叙述文も含めた包括的なテンス・アスペクトの体系を解明するものである。
染色体分配を司る微小管ダイナミクスとそれを制御するOrbitネットワークの解明

真核生物に保存されているOrbit/CLASPタンパクは、紡錘体微小管の先端にチューブリン分子を付加する。ショウジョウバエのOrbitは細胞分裂の進行に伴い、核膜周辺の小胞体、中心体、キネトコア、スピンドル微小管、収縮環へと局在を変化させ、染色体分配、細胞質分裂の進行に中心的な役割を演じる。本研究では、染色体ダイナミクスを制御するOrbitを中心とするネットワークを明らかにするために、これと相互作用するタンパクのプロテオーム解析、および網羅的な遺伝学スクリーニングをおこなった。初期胚の抽出液からGST-Orbitと共沈するタンパクの質量分析をおこなった結果、non-muscle Myosin II heavy chain(MyosinII)、CopIαsubunit、βスペクトリン、哺乳類のNuMaに類似なToucan、Dyneinheavy chain(Dhc64C)、CLIP190などが同定された。このうちMyosinIIは、Orbitとともに細胞分裂後期に分裂溝予定域に集積すること、この集積はOrbitに依存することを見出した。Orbitは収縮環を構成するアクトミオシンの形成に必須な役割を演ずる。CopIの構成成分δ、γは、胚期の細胞質分裂に必須なことを明らかにした。CopIは微小管に依存して細胞膜成分を分裂溝に運搬している可能性が考えられた。また、ダイナアクチンのdominant negative変異G1が複眼原基の細胞内でorbitと強い遺伝学的な相互作用を示すことをみいだした。この結果は、細胞分裂においてDynein heavy chainとOrbitとが密接に相互作用することを示唆している。Orbitは、分裂後期Aにおいてキネトコアに局在するが、そこでDhcと相互作用して染色分体が極方向に移動するのに重要な役割を演ずる可能性が示唆された。微小管結合タンパクOrbitは、紡錘体微小管の先端にチューブリン分子を付加する活性を持ち、これが染色体の動き等を生み出す微小管ダイナミクスの原動力になっている。そのorthologueは広く真核生物に保存されている。orbit突然変異体では、分裂中期における染色体の整列、後期における分配、そして細胞質分裂の開始も異常となる。Orbitは、細胞分裂の進行に伴い、紡錘体微小管の他に中心体、キネトコア、セントラルスピンドル上にも局在が認められる。FRAP実験の結果から、このタンパクは細胞分裂装置と細胞質との間を行き来している動的なタンパクであることが明らかとなった。Orbitは、分裂期を通じて微小管ダイナミクスの制御に中心的な役割を演じるが、細胞分裂の各ステージに特異的な染色体などの動きが生みだされるためには、Orbitに加えてこれと相互作用するタンパクの役割が重要と考えられる。Orbitと相互作用するタンパクを同定するために、プロテオミクス解析をおこなった。大腸菌で発現させたGSTタグつきのOrbitを初期胚抽出液中に添加してGSTプルダウンをおこなった。共沈されたタンパクをSDS-PAGE後、検出されたポリペプチドをLC-MS/MSにて解析し、マスコットサーチによりタンパクの同定を試みた。その結果、Orbit結合タンパクの候補として、non-muscle myosin II heavy chain、細胞皮層のタンパクであるβスペクトリン、Toucanタンパク、Dynein heavy chain (Dhc64C)などが同定された。これらのタンパクとOrbitとの関連を確かめるために、現在、Orbitとの免疫共沈、細胞内共局在、遺伝学的相互作用の解析をおこなっている。さきに、雄減数分裂細胞においてOrbitがその分裂後期にセントラルスピンドルから収縮管上に移動することをみいだした。この細胞では、中心体より伸長した星状体微小管の+端が細胞皮層に接触した位置で分裂溝の陥入が開始される。Orbitは微小管の+端に集積されるが、このときOrbitを介してMyosin IIと微小管系が相互作用し、それが収縮管形成のトリガーとなるというモデルが考えられた。

Orbitは、分裂後期Aにおいてキネトコアに局在するが、そこでDhcと相互作用して染色分体が極方向に移動するのに重要な役割を演ずる可能性が示唆された。
唾液中のバイオマーカーを指標としたストレスー体内時計ー疾病の相互関係の解明

ストレスはバイオロジカルリズムを破綻させ、免疫力の低下や疾患リスクの増大を惹き起こす。本研究の目的は、唾液中のバイオマーカーの観点から、ストレスが生体リズムに与える影響を解析し、動物種の垣根を越えて使用できるストレスマーカーを見出すことである。マウスとサルを用いた検討から、ストレスは唾液中の免疫グロブリンAを低下させ、その日内リズムを破綻させる可能性が明らかとなった。唾液中の免疫グロブリンAは、生体リズムとストレス反応を同時にモニターできるバイオマーカーになり得るかも知れない。ストレスはバイオロジカルリズムを破綻させ、免疫力や運動能力に影響を及ぼし、疾患リスクを増大させる。しかし、ストレスの客観的な評価法は確立されておらず、ストレスとリズム障害、健康・疾患との関係は科学的に解明されていない。本研究では、マウスにおいてストレス性リズム障害を再現し、その分子病態メカニズムを解析するとともに、簡便かつ低侵襲な唾液中のバイオマーカーの変動を詳細に解析する。また、そこから見出されたバイオマーカーを他の動物種に適用できるか否かの検討を行う。ストレスー体内時計ー疾患の相互関係を明らかとし、動物種の垣根を超えて使用できるストレスと概日リズムの新規なバイオマーカーの確立を目指す。本年度は、当初の予定では次年度以降に実施する予定であったマウス以外の動物種における検討を前倒しして行った。新世界ザルのリスザル(Saimiri boliviensis;昼行性)およびヨザル(Aotus lemurinus;夜行性)において、in vivoにおいてサーカディアンリズムを継続的に記録することに成功した。今後は、飼育施設の照明の照度や光の波長を変化させたり、種々のストレスを負荷した際の唾液中のコルチゾール、アミラーゼ、IgAなどのバイオマーカーを順次測定していく予定である。また、マウスの飼育室およびサーカディアンリズムの測定環境も整えたため、マウスでストレス性リズム障害のモデルを構築し、そこで得られたデータを上記の新世界ザル2種類で比較検討していく予定である。異動先(現勤務地)にマウスの飼育施設が無かったため、平成27年度に実施予定であったマウスでの基礎的な検討は出来なかった。しかしながら平成27年度中にマウスの飼育施設およびサーカディアンリズムの測定機器類を整備したため、平成28年度以降にマウスでの検討を実施し、遅れは取り戻せると考えている。一方、平成28年度以降に実施予定であった他の動物種(ヨザル、リスザル)におけるin vivoでのサーカディアンリズム測定の一部を前倒しで実施し、興味深い知見が得られつつある。しかし、ストレスの客観的に評価する方法は確立されておらず、ストレス体内時計、健康、疾患との関係は科学的に解明されていない。本研究では、マウスのおいてストレス性リズム障害を再現し、その分子病態メカニズムを解析するとともに、簡便かつ低侵襲な唾液中のバイオマーカーの変動を詳細に解析する。また、そこから見出されたバイオマーカーを他の動物種に適応できるか否かの検討を行う。ストレスー体内時計ー疾患の相互関係を明らかとし、動物種の垣根を超えて使用できる新規なバイオマーカーの確立をめざす。本年度は、新世界ザルのリスザル(Saimiri boliviensis;昼行性)およびヨザル(Aotus lemurinus;夜行性)において、in vivoでサーカディアンリズム(活動リズムと体温リズム)を継続的に記録し、4時間おき6ポイント(ZT1,5,9,13,17,21)で唾液中のコルチゾールおよびメラトニン濃度をそれぞれ測定した。コルチゾールについては、唾液中でも明確な日内変動を示し、昼行性のリスザルと夜行性のヨザルで、逆位相になることが確認された。またリスザルおよびヨザルにおける時計遺伝子(Per1,Per2,Per3)のクローニングに着手し、ヨザルの時計遺伝子の部分配列を決定した。ヨザルについては、この部分配列を利用し、数本のヒゲ(無麻酔下)から時計遺伝子の変動をモニターすることに成功した。次年度は、ヨザルやリスザルにおいて、時差ボケモデルでの評価や給餌性ストレスの評価を実施し、マウスにおける同評価結果との比較を行う予定である。異動に伴い、当初計画していた動物種(ウマ)もしくは実験動物(PER2::LUCマウス)を用いた検討には変更が余儀なくされた。しかしながら、マウス飼育室を新設し(平成27年度)、新たな動物種(リスザル、ヨザルなどの霊長類動物)での検討の可能性を探索し(平成28年度)、新たな動物種でのサーカディアンリズムの測定システムをほぼ完備した。現在は、興味深い知見を得られつつある。しかし、ストレスを客観的に評価する方法は確立されておらず、ストレス、体内時計、健康・疾患との関係は科学的に解明されていない。本研究では、マウスにおいてストレス性リズム障害を再現し、その分子メカニズムを解析するとともに、簡便かつ低侵襲な唾液中のバイオマーカーの変動を解析する。ストレスー体内時計ー疾患の相互関係を明らかとし、動物種の垣根を越えて使用できるバイオマーカーの確立を目指す。本年度は、ニホンザルおよびアカゲザルに対して心理的・社会的要因を含むストレス(サルをホームケージから他室の個別ケージに一時的に移動させるストレス)を負荷した際の唾液中バイオマーカーの変動について検討した。

ストレス負荷の2日前と当日の同時刻に採取した血液と唾液中において、コルチゾール、アミラーゼ、免疫グロブリンA(IgA)、メラトニン、脳由来神経成長因子(BDNF)の測定を試み、コルチゾール、アミラーゼ、IgAの濃度の測定に成功した。このうちコルチゾールは、血漿中より唾液中においてより鋭敏にストレス反応を捉え得ることが示唆された。またストレス負荷による唾液中コルチゾール濃度の上昇に並行して、アミラーゼとIgAの濃度が減少することが明らかとなった。コルチゾール、アミラーゼ、IgAの変動は、アカゲザルにおいてのみ有意差が検出されており、唾液中バイオマーカーの観点からニホンザルとアカゲザルのストレス反応性の違いが示唆される結果となった。同時間帯にマウスに拘束ストレスを負荷した際にも唾液中のコルチゾール、アミラーゼ、IgAは同様の変動をみせており、これらは種差を越えて使用し得る唾液中ストレスバイオマーカーになり得るかも知れない。ストレスはバイオロジカルリズムを破綻させ、免疫力の低下や疾患リスクの増大を惹き起こす。本研究の目的は、唾液中のバイオマーカーの観点から、ストレスが生体リズムに与える影響を解析し、動物種の垣根を越えて使用できるストレスマーカーを見出すことである。マウスとサルを用いた検討から、ストレスは唾液中の免疫グロブリンAを低下させ、その日内リズムを破綻させる可能性が明らかとなった。唾液中の免疫グロブリンAは、生体リズムとストレス反応を同時にモニターできるバイオマーカーになり得るかも知れない。平成27年度に出来なかったマウスにおける基礎的データの収集とストレス性リズム障害のモデル構築は平成28度に実施する。また、サルを中心とした他の動物種における検討も継続して行い、マウスで得られたデータと比較検討する。平成28年度には出来なかったマウスでのストレス性リズム障害のモデル構築は、平成29年度に実施する。また、サルでのストレス性リズム障害のモデルでの検討も継続して行い、マウスで得らえれたデータと比較検討を実施する。動物生命科学本年度に実施した唾液中のバイオマーカー測定のうちBDNFについては、測定用のEIAキットがリスザル、ヨザルのいずれのBDNFにも交差しないことが判明したため、予備検討用の1キットのみしか使用せず、その結果、未使用額が生じた。テーマ開始時点には予定していなかった京都大学霊長類研究所の二ホンザルとアカゲザルを用いたバイオマーカー探索を次年度は実施することになったので、未使用額はその解析のための経費に充てることにしたい。
D-OCT血流計による網膜Neurovascular Unitの評価と臨床応用

緑内障は網膜神経節細胞が喪失していく進行性の視神経変性疾患である。開放隅角緑内障は眼圧上昇がもっとも重要なリスクファクターとなるが、日本人に多数である正常眼圧緑内障(NTG)は眼圧は正常であるにもかかわらず発症する。眼圧以外の因子が関与する疾患と考えら、血流との関連が指摘されている。そこで我々はトプコン社との共同開発による新規ドップラーOCT血流計を開発し、半視野障害のNTG患者を対象に上下の網膜耳側動脈血流量(TARBF)、視神経乳頭周囲網膜神経節細胞層の厚み(RNFLT)やガングリオン細胞複合体の厚み(GCCT)、ハンフリー自動視野計による網膜感度(RS)を測定した。対象はNTG43眼、健常眼24眼である。視野障害のない半視野におけるTARBF[6.22 (4.21, 7.80) uL/min]は、視野障害のある半視野の網膜耳側動脈血流より高かった[3.40 (2.47, 4.35) uL/min, P<0.001]。しかし健常群の半視野よりは有意に低かった[8.18 (6.56, 10.08) uL/min, P<0.001]。視野障害のない半視野におけるRNFLTとGCCT[92 (83, 113) um and 90 (81, 102) um]は、視野障害のある半視野のRNFLTやGCCT[67 (52, 83)um and 75 (63, 82) um, P<0.001 for both]より高かった。視野障害のない半視野と健常群のRNFLTとGCCには有意差はなかった[107 (96, 123) um and 96 (90, 103) um, P=0.086 and P=0.231]。NTGでは視野異常や網膜の形態変化がない状態でも網膜血流の減少が認められた。ドップラーOCTによる網膜血流の評価は臨床上、早期のNTGを評価することに有用である。トプコン社との共同開発による新規ドップラーOCT血流計を使用し、病眼における検討を行った。ドップラーOCT血流計は網膜の血管血流を測定する機器である。これを使用し緑内障において半視野障害を伴う患者を対象に上下の網膜血流量と網膜神経節細胞層(RNFL)の厚みを測定した。緑内障眼(40眼)、正常眼(20眼)を対象とした。視野障害のある側に比べ視野障害のない方で、網膜動脈血流、RNFL厚ともに低下していることを示した。さらに、正常眼と視野障害のない緑内障眼においての比較でも、緑内障眼で動脈血流、RNFL厚ともに低下していることを示した。視野障害の程度と血流には相関がなく、RNFLと血流が相関した。以上の結果は緑内障という疾患が網膜の血管変化と関連していることを示している。トプコン社との共同開発による新規ドップラーOCT血流計を使用し、神経と血流の関係を評価するため、神経変性疾患である緑内障を対象にドップラーOCTによる血流量の評価を行った。ドップラーOCT血流計は数十マイクロの網膜動脈血管の血流量を自動で測定することが可能である。これを使用し緑内障において半視野障害を伴う患者を対象に上下の網膜耳側動脈血流量と上下の視神経乳頭周囲網膜神経節細胞層(cpRNFL)やガングリオン細胞複合体(mGCC)の厚み、ハンフリー視野計を用いた視野測定を行った。視野計測については上下半視野それぞれの網膜感度の平均で算出した。緑内障群(84眼)、健常群(52眼)を対象とし測定した。昨年度の研究報告より症例数の増加に伴い、解放隅角緑内障群(POAG)、正常眼圧緑内障群(NTG)の2群に緑内障群をわけ、NTGを中心として解析を行った。NTG群において、視野が正常な半視野に一致する網膜におけるパラメーター(血流量、cpRNFL、mGCC、網膜感度)は全て、視野が異常な半視野に一致する網膜より低下していた。次に健常群の半視野とNTG群において視野障害のない半視野を比較した。健常群における半視野と比較してNTG群では網膜耳側動脈血流量は優位に低下していた。しかし、cpRNFL、mGCC、網膜感度には有意差は認めなかった。以上からNTGにおいて、視野に異常がない状態から健常群に比べ動脈血流が低下してくことがわかった。臨床研究である人眼に対する研究は、問題なく進んでおり概ねデータは取得済みとなっている。基礎研究である動物に対する研究については、人とは違う光学システムが必要であり、ネコについては可能であるが、マウスについては測定できていない状況である。

そこで我々はトプコン社との共同開発による新規ドップラーOCT血流計を開発し、半視野障害のNTG患者を対象に上下の網膜耳側動脈血流量(TARBF)、視神経乳頭周囲網膜神経節細胞層の厚み(RNFLT)やガングリオン細胞複合体の厚み(GCCT)、ハンフリー自動視野計による網膜感度(RS)を測定した。対象はNTG43眼、健常眼24眼である。視野障害のない半視野におけるTARBF[6.22 (4.21, 7.80) uL/min]は、視野障害のある半視野の網膜耳側動脈血流より高かった[3.40 (2.47, 4.35) uL/min, P<0.001]。しかし健常群の半視野よりは有意に低かった[8.18 (6.56, 10.08) uL/min, P<0.001]。視野障害のない半視野におけるRNFLTとGCCT[92 (83, 113) um and 90 (81, 102) um]は、視野障害のある半視野のRNFLTやGCCT[67 (52, 83)um and 75 (63, 82) um, P<0.001 for both]より高かった。視野障害のない半視野と健常群のRNFLTとGCCには有意差はなかった[107 (96, 123) um and 96 (90, 103) um, P=0.086 and P=0.231]。NTGでは視野異常や網膜の形態変化がない状態でも網膜血流の減少が認められた。ドップラーOCTによる網膜血流の評価は臨床上、早期のNTGを評価することに有用である。上記論文作成中である。臨床研究については現状のデータで論文作成中であり、投稿していく。動物の測定については低いコストで測定できるシステムを構築し、測定系を確立していく段階である。基礎研究にかかる物品費が次年度に持ち越しとなりました。まだ論文投稿料、校正料が次年度に必要となります。また動物実験の継続を必要とするため翌年に計上致しました。動物実験にて動物費用がかかること、動物に合わせた測定システムの構築にも費用がかかることが予想され、本年度分を次年度に繰りこし利用する予定となっております。