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抗リン脂質抗体症候群におけるB細胞をターゲットとした新規治療法の開発

抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗リン脂質抗体の存在により,反復性血栓症・不育症を来す自己免疫疾患であるがその根治療法は確立していない.本研究において,実験的APSモデルマウスを用い, B細胞を傷害することにより抗リン脂質抗体の発現抑制・臨床症状の発症を抑制可能であることが確認された.以上の検討結果より, B細胞発現抑制療法により, APSの病態制御が可能である可能性が示唆された.抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗リン脂質抗体の存在により,反復性血栓症・不育症を来す自己免疫疾患であるがその根治療法は確立していない.本研究において,実験的APSモデルマウスを用い, B細胞を傷害することにより抗リン脂質抗体の発現抑制・臨床症状の発症を抑制可能であることが確認された.以上の検討結果より, B細胞発現抑制療法により, APSの病態制御が可能である可能性が示唆された.抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗体依存性自己免疫疾患であると考えられることから,抗体産生細胞であるB細胞を選択的に傷害しで抗リン脂質抗体の産生を抑制することにより,免疫不全などの副作用も少ない根治的治療法が確立できる可能性がある。そこで,実験的APSモデルマウスに対し,マウス抗マウスCD20モノクローナル抗体(MB20-11)を投与し,B細胞をターゲットとしたAPSに対する新規治療法の可能性を明らかにすることを目的とし,研究を進めている。平成19年度はWild typeの6週齢C57BL/6マウスにFreund adjuvantを加えたβ_2-GPI 20μgを後足底部に皮下注射し,4週間後,同量のβ_2-GPIをboosterとして皮下投与することによりマウスAPSモデルを作成した。上記APSモデルマウスに対し,マウス抗マウスCD20抗体であるMB20-11 150μgをマウス尾静脈より静脈投与した。生理的食塩水静脈投与群を対照群とした。APSモデルマウスはβ_2-GPI初回投与4週後より血小板減少,APTTの延長傾向を示し,812週後にその変化は最大となり,また抗カルジオリピン抗体(aCL)も有意に上昇した。β_2-GPI初回投与と同時にMB20-11を投与すると8週後の血小板減少,APTT延長,aCL上昇は有意に抑制された。血中B220陽性B細胞はMB20-11投与翌日に測定感度以下となり,このB細胞の消失は8週間持続した。以上の結果より,抗リン脂質抗体の産生およびこれに伴う血液学的異常にはB細胞による抗体産生能が必要であり,B細胞を制御することにより本疾患の根治療法につながる可能性が示唆された。抗リン脂質抗体症候群(APS)は抗体依存性自己免疫疾患であると考えられることから,抗体産生細胞であるB細胞を選択的に傷害して抗リン脂質抗体の産生を抑制することにより,免疫不全などの副作用も少ない根治的治療法が確立できる可能性がある.そこで,実験的APSモデルマウスに対し,マウス抗マウスCD20モノクローナル抗体(MB20-11)を投与し,B細胞をターゲットとしたAPSに対する新規治療法の可能性を明らかにすることを目的とし,研究を進めている.平成19年度は抗リン脂質抗体の産生およびこれに伴う血液学的異常にはB細胞による抗体産生能が必要であり,B細胞を制御することにより本疾患の根治療法につながる可能性が示唆された.そこで平成20年度は実験的APSモデルマウスにMB20-11投与16週後より4週間隔でB細胞数,APTT, aCL, aCL/β_2GPIを測定しB細胞除去療法による抗リン脂質抗体産生抑制効果が持続する期間を検討した.その結果,B細胞はMB20-11投与20週後から出現し,投与30週後には投与前値に復した.一方,血小板数,APTTは投与40週まで正常値を維持し,aCL,aCL/β_2GPIは投与20週より上昇傾向を示したものの40週後まで,投与前値より有意に低値を示した.以上の結果より本モデルにおいてはB細胞除去療法がAPSの痕治療法となりうる可能性が示唆された.
腫瘍免疫反応におけるT細胞のアポトーシス抑制経路の解明

癌治療には癌細胞自身の細胞死を誘導する方策と免疫細胞など宿主側の抗腫瘍効果を担う免疫細胞群の細胞死を防ぐ方策の両者が必要である。免疫遺伝子治療は上記両機能を合わせ持つ可能性がある。IFN, IL-12が持つ腫瘍免疫誘導能を用いれば生体の免疫能を強く賦活し抗腫瘍作用を誘導できる。これら強いCTL誘導にはT細胞自身のアポトーシスの抑制がT細胞の生存を延長させている可能性が高い。その効果がmemory phaseでのT細胞にも影響を与え、腫瘍再発や遠隔部腫瘍への効果にも深く関連しているものと推察される。サイトカインとアポトーシスの関連が注目されているが、癌に対する腫瘍免疫という側面から宿主T細胞のアポトーシスについてはいまだ不明な部分が多い。このモデルでアポトーシス制御経路のシグナルを解明することによって、癌に対する宿主免疫細胞のアポトーシスと免疫反応のメカニズムを明らかにできる。本年度、癌細胞に対するサイトカイン遺伝子導入アデノウイルスの抗腫瘍効果と腫瘍細胞のアポトーシスにおよぼす影響と作用機序をin vitroで検討するとともに、AdIL-12, AdIFN-βの抗腫瘍効果をMTS assayを行い検討した、さらにp53遺伝子の表現系の異なる大腸癌細胞株HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)、SW480やその正常株CCD-18Co等に対し上記ベクターを使用し各種癌細胞へのp53の関与を検討した。また各細胞群でTUNEL assayを行いapoptotic cellの割合を検討した。さらに腫瘍特異的CTLを回収しMHC-1, MHC-II発現の検討しannexin V-FITC, PI-FITCによるFACSを行い、サイトカイン遺伝子導入アデノウイルスを使用した際の生体免疫担当細胞のアポトーシスの関与を研究した。IFN, IL-12などサイトカインが持つ腫瘍免疫誘導能を用いれば生体の免疫能を強く賦活し抗腫瘍作用を誘導できる。これら強い,CTL誘導にはT細胞自身のアポトーシスの抑制がT細胞の生存を延長させている可能性が高い。またその効果がmemory phaseでのT細胞にも影響を与え、腫瘍再発や遠隔部腫瘍への効果にも深く関連しているものと推察される。IFN, IL-12などのサイトカインは生体のホメオスタシスの維持に必要不可欠な分子であり、強い免疫賦活作用を示し抗ウイルス、抗腫瘍効果を持つ。TakaokaらはIFNによるp53蛋白発現誘導を報告した(Nature.2003 July 16)。これらサイトカインとアポトーシスの関連が注目されているが、癌に対する腫瘍免疫という側面から宿主T細胞のアポトーシスについてはいまだ不明な部分が多い。このモデルでアポトーシス制御経路のシグナルを解明することによって、癌に対する窄主免疫細胞のアポトーシスと免疫反応のメカニズムを明らかにできる。本年度、癌細胞に対するサイトカイン遺伝子導入アデノウイルスの抗腫瘍効果と腫瘍細胞のアポトーシスにおよぼす影響と作用機序をin vitroで検討した。AdIL-12,AdIFN-βの抗腫瘍効果をMTS assayを行い検討した。現在p53遺伝子の表現系の異なる大腸癌細胞株HCT116 p53(+/+)、HCT116 p53(-/-)、SW480やその正常株CCD-18Co等に対し上記ベクターを使用し、各種癌細胞へのp53の関与を検討している。IFN,IL-12が持つ腫瘍免疫誘導能を用いれば生体の免疫能を強く賦活し抗腫瘍作用を誘導できる。p53遺伝子の表現系の異なる大腸癌細胞株HCT116 p53(+/+)、HCT116 p53(-/-)、SW480やその正常株CCD-18Co等に対し上記ベクターを使用し各種癌細胞へのp53の関与を検討した。さらに腫瘍特異的CTLを回収しMHC-I,MHC-II発現の検討しannexin V-FITC, PI-FITCによるFACSを行い、サイトカイン遺伝子導入アデノウイルスを使用した際の生体免疫担当細胞のアポトーシスの関与を解明する。

癌治療には癌細胞自身の細胞死を誘導する方策と免疫細胞など宿主側の抗腫瘍効果を担う免疫細胞群の細胞死を防ぐ方策の両者が必要である。免疫遺伝子治療は上記両機能を合わせ持つ可能性がある。IFN, IL-12が持つ腫瘍免疫誘導能を用いれば生体の免疫能を強く賦活し抗腫瘍作用を誘導できる。これら強いCTL誘導にはT細胞自身のアポトーシスの抑制がT細胞の生存を延長させている可能性が高い。その効果がmemory phaseでのT細胞にも影響を与え、腫瘍再発や遠隔部腫瘍への効果にも深く関連しているものと推察される。サイトカインとアポトーシスの関連が注目されているが、癌に対する腫瘍免疫という側面から宿主T細胞のアポトーシスについてはいまだ不明な部分が多い。このモデルでアポトーシス制御経路のシグナルを解明することによって、癌に対する宿主免疫細胞のアポトーシスと免疫反応のメカニズムを明らかにできる。本年度、癌細胞に対するサイトカイン遺伝子導入アデノウイルスの抗腫瘍効果と腫瘍細胞のアポトーシスにおよぼす影響と作用機序をin vitroで検討するとともに、AdIL-12, AdIFN-βの抗腫瘍効果をMTS assayを行い検討した、さらにp53遺伝子の表現系の異なる大腸癌細胞株HCT116p53(+/+)、HCT116p53(-/-)、SW480やその正常株CCD-18Co等に対し上記ベクターを使用し各種癌細胞へのp53の関与を検討した。また各細胞群でTUNEL assayを行いapoptotic cellの割合を検討した。さらに腫瘍特異的CTLを回収しMHC-1, MHC-II発現の検討しannexin V-FITC, PI-FITCによるFACSを行い、サイトカイン遺伝子導入アデノウイルスを使用した際の生体免疫担当細胞のアポトーシスの関与を研究した。
運動が小児の体温調節機能の発達を促進するか

本研究では,小児期の体温調節反応の変化について検討し,機能そのものに変化があるのか,あるいは機能の発現様式に差異が生じているのかなどをあきらかにするとともに,運動の実施が小児期の体温調節機能の発現に影響を与えているかについて検討を加えた.実験は,人工気候室において環境温を直線的に上昇させる条件(20°Cから35°Cに30分間で上昇,湿度は50%,気流は0.2m/sec以下)を設定した。被験者は,小学校の体育の授業以外に運動を実施していない1012歳の男児6名(非運動時)と少年サッカークラブに在籍する1011歳の男児4名(運動群)であった.実験中の着衣は,Tシャツと半ズボン,裸足とした.測定は,1)皮膚温10点:30秒ごと(前額,胸部,上腕,前腕,手背,手指先,大腿,下腿,足背,足指先),2)直腸温:30秒ごと,3)深部体温:5分ごと(前額),4)血流量(前腕部),5)全身発汗量(実験前後の体重変化),6)心拍数:30秒ごと,7)温熱感(9尺度):5分ごと,9)耳内温:5分ごと,以上の項目を実施した.運動群のうち2名は,明らかな肥満児であった(体脂肪率37%).非肥満の運動群の2名は,非運動群とほぼ同様な皮膚温変動を示していたが,肥満の運動群では,本実験条件下において直腸温も高いレベルで推移し,手足の皮膚温も最初から高いレベルで変動するなど,体温変動が環境温の変動に追従した変化を示しにくい傾向が示唆された.日常定期的な運動を実施している者とそうでない者においては,環境温の変動に対する体温変動に明らかな違いは見出せなかったが,肥満児では,2035°C程度の環境温変動に対しては,末梢部の皮膚温もあまり変動を示さなかった.この点に関しては,体脂肪が多く身体の断熱性に優れているからなのか,あるいは末梢部の皮膚血管反応性に差異があるからなのか今後さらに検討する必要がある。
相互作用に伝送遅延を含む結合振動子群に生じる安定化現象の解析とその応用

本研究の目的は,結合振動子群に発生する安定化現象の工学的応用を見据え,振動子群に所望の現象を発生させる相互作用の解析・設計である.研究員は,数ある安定化現象の中で,振動停止現象に着目し,この現象を発生させるための相互作用の設計をおこなってきた.前年度の研究において未解決の問題は以下の2点である.問題1「振動子間の相互作用に含まれる伝送遅延が,振動子の周期に比べ相対的に長い場合,振動停止現象を誘発できない」,問題2「全振動子間で伝送遅延が等しいという仮定の下でのみ研究をおこなってきた」.実システムでは,振動子間の物理的距離や信号の伝播速度により,伝送遅延が長くなる場合も想定されるため,問題1の解決は必要不可欠である.また,実システムにおいて,全ての振動子間で伝送遅延が等しいという状況は考えにくいため,問題2についても考慮する必要がある.本年度は,上記に述べた問題1および2の解決を目的とし,研究を遂行した.問題1の解決にあたっては,時変遅延結合に着目した.本結合方法が複雑なネットワーク構造でも有効であることを解析的に証明し,ロバスト制御理論を駆使することで,伝送遅延の長さに依存しない相互作用の設計手順の提案に成功した.問題2の解決にあたっては,直積ネットワークに着目した.本ネットワークの性質を利用すれば,ネットワークを細分化して,解析が容易におこなえる.伝送遅延の異なりが,安定性にどのような影響を与えるのかを,数値的に検証した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,以下の仕様(b), (c)に着目し,結合振動子群に振動停止現象を誘発する相互作用の設計を検証した.仕様:(b)様々な要素に対応する;(c)大規模なシステムにも対応可能にする.・仕様(b)について振動子間の相互作用に不安定なダイナミクスを挿入することで,振動停止現象の奇数制約が解消できることを発見した.これにより,これまでは振動停止の誘発ができなかった結合振動子群に対しても,誘発可能になった.まずは,最も簡単な2個の振動子が結合した系で,不安定なダイナミクスの挿入により奇数制約が解消できることを確認した.次に,リング状に振動子を結合した系を考え,同様に奇数制約の解消を確認した.しかし,現状の相互作用では,振動子の数とそれらを結ぶ結合の本数が等しいネットワーク構造でないと奇数制約を解消できない.したがって,ネットワーク構造に依らず,奇数制約を解消できる相互作用の提案が,今後の課題である.また,上記の研究では,解析を簡単にするため,相互作用に伝送遅延を考慮していない.今後,伝送遅延を考慮した結合振動子モデルで奇数制約の解消を考える必要がある.・仕様(c)についてロバスト制御理論のパラメトリックアプローチを利用し,振動停止現象を誘発する相互作用の設計手順を提案した.この手順に従い設計された相互作用は,ネットワークの構造や振動子の数に関係なく振動停止現象が誘発可能である.したがって,本設計手順は,ネットワーク構造などが未知の大規模で複雑なシステムにも適用可能である.ただし,この設計手順は,奇数制約を満たす振動子から構成される結合振動子へは,適用できない.今後,上記の仕様(b)に関する研究と合わせて,設計手順の改良を考える必要がある.本研究の目的は,結合振動子群に発生する安定化現象の工学的応用を見据え,振動子群に所望の現象を発生させる相互作用の解析・設計である.研究員は,数ある安定化現象の中で,振動停止現象に着目し,この現象を発生させるための相互作用の設計をおこなってきた.前年度の研究において未解決の問題は以下の2点である.問題1「振動子間の相互作用に含まれる伝送遅延が,振動子の周期に比べ相対的に長い場合,振動停止現象を誘発できない」,問題2「全振動子間で伝送遅延が等しいという仮定の下でのみ研究をおこなってきた」.実システムでは,振動子間の物理的距離や信号の伝播速度により,伝送遅延が長くなる場合も想定されるため,問題1の解決は必要不可欠である.また,実システムにおいて,全ての振動子間で伝送遅延が等しいという状況は考えにくいため,問題2についても考慮する必要がある.本年度は,上記に述べた問題1および2の解決を目的とし,研究を遂行した.問題1の解決にあたっては,時変遅延結合に着目した.本結合方法が複雑なネットワーク構造でも有効であることを解析的に証明し,ロバスト制御理論を駆使することで,伝送遅延の長さに依存しない相互作用の設計手順の提案に成功した.問題2の解決にあたっては,直積ネットワークに着目した.本ネットワークの性質を利用すれば,ネットワークを細分化して,解析が容易におこなえる.伝送遅延の異なりが,安定性にどのような影響を与えるのかを,数値的に検証した.本研究の課題は,以下の3仕様を満たす設計手法の提案である.仕様:(a)外乱やノイズに対して頑強にする;(b)様々な要素に対応する;(c)大規模なシステムにも対応可能にする.このうち,現在までに課題(b),(c)の検討が大方できているため,研究の進捗は順調である.27年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに,仕様(b)を満たす相互作用を提案したが,まだ以下のような問題点がある.現状の相互作用では,振動子の数とそれらを結ぶ結合の本数が等しいネットワーク構造でないと奇数制約を解消できない.したがって,ネットワーク構造に依らず,奇数制約を解消できる相互作用の提案が,今後の課題である.

また,上記の研究では,解析を簡単にするため,相互作用に伝送遅延を考慮していない.今後,伝送遅延を考慮した結合振動子モデルで奇数制約の解消を考える必要がある.また,仕様(c)を満たす相互作用の設計手法の提案を行ったが,まだ以下のような問題点がある.現在の設計手法では,奇数制約を満たす振動子から構成される結合振動子へは,適用できない.今後,上記の仕様(b)に関する研究と合わせて,設計手順の改良を考える必要がある.また,現在までに考慮できていない仕様(a)に関しても,同期現象の初期値領域に関する先行研究等を参考にして,今後検討してきたい.27年度が最終年度であるため、記入しない。所属研究室では,学生の成果や発表などをwebページにまとめて掲載している.
現代日本における文化的価値序列の二重性に関する調査研究

本研究は、このような視点を念頭におきつつ、現代日本の文化的状況を明らかにすることを目的とし、大学生(茶道修練者と一般学生との対照2グループ)ならびに茶道修練者を対象とした以下のようなアンケート調査を実施した。現在は、調査結果をもとに「茶道の位置づけ」を考量した現代日本の文化的価値序列の規定要因の分析とともに、男性文化、女性文化の構成プロセスや構成要素等の解析を行っている。(1)調査期間1995年12月(2)調査方法大学生(一般):集合調査法茶道修練者(学生含む):配票ならびに郵送調査法を併用(3)調査項目文化的環境、教育水準(両親・配偶者含む)、余暇活動状況、文化資本状況、家元(組織)に対する認識やイメージ等に加え、茶道修練者に対しては加入動機や活動状況、満足度等に関する設問を行った。(4)サンプル数と回収率大学生(一般):421票配布のうち完全回収票数346票、82.2%茶道修練者:(学生)254票/397票、64.0%(一般)309票/530票、58.3%本研究は、このような視点を念頭におきつつ、現代日本の文化的状況を明らかにすることを目的とし、大学生(茶道修練者と一般学生との対照2グループ)ならびに茶道修練者を対象とした以下のようなアンケート調査を実施した。(4)サンプル数と回収率大学生(一般):421票配布のうち完全回収票数346票、82.2%茶道修練者:(学生)254票/397票、64.0%(一般)309票/530票、58.3%
多国籍企業における国際課税要因が資本市場に与える影響について

いくつかの研究成果のうち、その中で代表的な成果は次の通り2つある。1つには、わが国企業の利益や法人税の海外流出に対抗する移転価格税制について注目しているが、その適用は社会の関心が高く、移転価格税制の適用で資本市場は統計的に有意なネガティブ反応を示す。そこでわれわれは資本市場が移転価格税制の適用に対して示す反応の背景を明らかにするために検討を行った。今ひとつは資本剰余金配当に対する資本市場の反応に注目したが、資本剰余金配当を実施する企業の中で新興市場における当該配当の実施企業は、資本剰余金配当を行うべきではないと結論した。平成24年度の研究成果は以下の3つに分類される。1つ目として研究代表者と研究分担者の内、大沼・加藤両氏の3名によって前年度から引き続き移転価格税制についての新聞報道と企業評価の関連性について検証を行っている。研究成果は日本管理会計学会2012年度年次全国大会(平成24年8月26日於国士舘大学)において報告を行った。前年度までに移転価格税制に関する新聞報道は投資家による強いマイナス評価を被ることを実証している。この結果を受けて平成24年度は資本市場の反応を累積させた累積超過収益率(Cumulative Abnormal Rate of Return :CAR)を利用し、当該指標に対して法人のいかなる経営・財務属性が反応を引き起こす原因となるのかについて統計的に検証した。その結果、無形資産や実効税率および企業統治に関する変数等がこれらの反応と有意に関係することが確認された。また2つ目の成果として、平成20年度証券税制が投資家にいかなる影響を与えたのかについてイベントスタディによって検証した。そして分析対象法人の財務状況に応じて当該証券税制改正報道の株価に対する感応度の相違を突き止めている。本研究は当該証券税制の改正に注目し、当該情報の資本市場への投入を契機として高配当性向法人が好感されると予想した。分析結果によれば、高配当性向法人はPBRや流動比率が悪化するほど高評価され、他方低配当性向法人は利益成長性が悪化しても固定長期適合率が相対的に高く維持されていれば高評価されることが判明した。3つ目に資本剰余金を原資とした配当を行った場合の資本市場の反応をイベントスタディによって分析した。資本剰余金配当は債権者保護の観点から問題含みの制度である一方で投資家は歓迎を示すとの結果を導出した。しかし実際のところ当該制度が乱用されないのは課税の仕組みによると結論づけている。平成25年度の研究成果は以下の4つに分類される。1つ目の研究成果として研究代表者と分担者(大沼・加藤両氏)によって移転価格税制に関連する研究課題で論文(「移転価格税制の適用と資本市場の評価に関する実証研究」)の執筆を行った。当該研究では移転価格税制の適用によって資本市場には単なる追徴課税や巨額な事務コストへのネガティブ反応を超えた企業行動への強い不信が発生すると推論している。検討の結果、無形資産や実効税率,企業統治に関する変数がこれらの反応と有意に関係することが検証された。2つ目の研究成果として研究代表者と分担者(大沼氏)によって連結納税制度に関連する研究課題で論文(「連結納税制度の採用インセンティブとコーポレート・ガバナンス、及び租税負担削減行動との関連性」)の執筆を行った。当該研究では現状において連結納税制度の採用企業数が非常に少ないことに注目しており、この原因を究明することによって同制度を採用する企業の特性を描出する。検討の結果、1取締役会の独立性が高くそれでいて規模の小さい、役員の平均年齢の若い企業、2繰越欠損金の多い企業、3子会社の業績は好調なものの親会社の業績が振るわない企業グループは連結納税制度採用の可能性が高いことを明らかにした。3つ目の研究成果として(本研究申請の直接的な課題ではないが、)研究代表者によって資本剰余金配当に対する課税制度に関連する研究課題で論文(「資本剰余金配当実施法人の実態と投資家の選好」)の執筆を行った。当該研究ではその他の資本剰余金を原資とした配当(資本剰余金配当)の実施に注目し、主に1当該配当に対する投資家の反応についての再検証と、2資本剰余金配当を実施する法人群の財務的特性を明らかにした。4つ目の成果として税務行動研究会(平成25年8月19日北海道大学経済学部棟1階113演習室)の北海道大学開催が挙げられる。平成23年度は研究代表者と研究分担者の内、大沼・加藤両氏の3名によって移転価格税制についての新聞報道と企業評価の関連性について検証し、研究成果を第23回税務会計研究学会(平成23年10月2日(日)於名古屋経済大学)において報告を行った。分析視角は、移転価格税制の運用について税務当局から更正や還付の指摘を受ける企業に対し、市場はどのような評価を下すかを、株価データを利用して検証した。

本研究ではFama-Frenchの3ファクターモデルを用いてイベントスタディを実施し、移転価格税制の運用に関して税務当局から更正を指摘される企業は、強いマイナス評価を受けることが明らかになった。平成24年度は研究実施計画に沿って、市場からのマイナス評価が企業の税務状況、コーポレート・ガバナンス構造と系統的に関係するかを検証する計画である。また大沼氏と共にストック・オプションと税務状況の関連性について分析を行い、ストック・オプションについての交付条件と市場評価の関連性を中心に検証を行った。具体的な研究成果としては、ストック・オプションが給与所得であるのか、一時所得であるのかについて2種類の判決が下されたそれぞれの判決公表日における株式市場超過リターンは、ストック・オプションの交付条件と有意に関連することが明らかになった。株式市場では、上述の関係を透徹してストックオプション導入企業が評価されていると考えられる。もう一つの研究プロジェクトとして櫻田研究室に所属する大学院生である中西良之氏との共同研究において論文「外国子会社利益の国内環流に関する税制改正と市場の反応」をまとめた。同論文では税制改正が資本市場に与える影響についてイベントスタディを試みており、第20回租税資料館賞(本賞)を受賞している。平成26年度の研究成果は以下の通り、4つに分類される。1つ目の研究成果として、昨年度に研究代表者と分担者・大沼氏が執筆し、リジェクトされた論文「連結納税制度の採用インセンティブとコーポレート・ガバナンスとの関連性」について、再考を試み、他誌に査読論文としてアクセプトした点が挙げられる。2つ目の研究成果として、研究代表者が「資本剰余金配当の実施を歓迎する投資家の着眼点と当該配当実施企業の財務的特性」を執筆し、査読論文として刊行予定(掲載許可の決定済み)となった点が挙げられる。本論文は、資本剰余金配当実施の情報を得た後に、投資家が当該企業に下す評価の着眼点として、当該資本剰余金配当の実施企業が新興銘柄か否か、またそれらがより多く自己株式を保有するか否かに注目するとした。また同時に資本剰余金配当を実施する新興銘柄は、資本市場における株価維持を目的として自己株式を保有する可能性が認められ、これらの実態に対して問題提起をしている。3つ目の研究成果として、研究代表者と分担者・大澤氏が「高率な純資産減少割合を伴う資本剰余金配当の異質性について」を執筆し、査読論文として刊行された点が挙げられる。資本剰余金配当に対する課税は資本の払戻しに対する課税といえ、類似の事例として自己株式の取得に対する課税と毎月分配型投資信託の特別分配金に対する課税が挙げられる。本稿では、これらの課税制度を比較しながら現行配当課税を批判し、プロラタ計算によらない配当課税の提案を試みた。4つ目の研究成果として、研究分担者・大沼宏氏による単著『租税負担削減行動の経済的要因ー租税負担削減行動インセンティブの実証分析』が同文館より刊行された点が挙げられる。当該書籍には、研究代表者が第6章と第8章における、また研究分担者・加藤氏が第6章における研究成果に貢献することができた(同書「あとがき」238頁参照)。税務会計前年度における研究成果であり、第20回租税資料館賞を受賞した研究成果
不登校の一要因となる教師の強制的コミュニケーション・スタイルの分析

次の三つの立場から基礎的研究を進めた。1.コミュニケーション用テキスト教材を開発し、実際に講義で使用し、演習用教材に適することを確認した。2.不登校を予防するために教員養成段階で利用可能な『教師学』に着目して、その利用可能性を検証した。短期間の集中講義でも重要な概念の7割近くで効果を上げることができた。しかし行動の四角形という概念の習得は困難であることが分かった。また、やる気を引き起こすメッセージとして、わたしメッセージが有効であり、その発言のためには教育観を変更する必要のあることが分かった。3.小学生1213人、中学生1170人、高校生444人、そしてこれらの学習者を教える小学校教師50人、中学校教師97人、高校教師63人に対して行ったアンケート調査の結果から、(1)教師と学習者の間には、学習指導と生徒指導の見方・考え方について、不一致度が見られた。不一致度は校種が上がるほど大きくなった。質問項目77項目において、小学校で平均して1.23倍、中学校で1.59倍、高校で2.37倍の違いがあった。特に、小中高校に共通な項目は、「教師が児童・生徒から何かを得ようとする態度が少ないこと」であった。(2)学習指導では、教師が児童・生徒の興味の持てる例を上げることが少ないことであった。(3)教師によるひどい言葉は少なく、代わりに疑いの言葉が教師から発せられていると、学習者が捉えていることが分かった。(4)教師が学習者の声を聞くということも少なく、学習者は教師に耳を傾けて欲しいと願っていることが分かった。平成9年度は、言語的メッセージを主とする教師の強制的なコミュニケーション・スタイルと、指導観、そして、これらに対する児童の受容とを、同時に取り扱う目的で、教師の授業場面における生の発言ではなく、教師の発言を文字化したものとして学級通信記事を取り上げ、実験を進めた。本研究上、依拠した考え方は、『教師学』(T.Gordon(1985),近藤千恵(1993)における「わたしメッセージ」(教師の気持ちの素直な発言)と「あなたメッセージ」(教師の権威的機能を反映した強制的発言)である。これら2種類のメッセージは、教師と児童の間で、問題状況に応じて、教師のコミュニケーション・スタイルが強制的になったり、そうでなくなったりするものであり、「不登校はどの児童にも起こりうる」に対応して、「どの教師にも不登校の児童を作りやすい」というものを、理論的に説明しているものであり、本研究に最も適した理論として採用した。高校生185名、大学生54名を被験者として、学級通信記事の表現を強制的な「あなたメッセージ」から、そうでない「わたしメッセージ」に変更する実験をした結果、高校生や大学生が、教師に対する親近感を増すこと、強制されているというよりも、むしろ、自主的で積極的なやる気を引き起こすことを実証することができた。また、「わたしメッセージ」への変更のためには、メッセージを発する気持ちの在り方、つまり、教育観のような、教師が児童に対して抱く人間観の方を深く認識することの方が、表現そのものの変更を容易にすることが示唆された。平成10年度は、小・中学生を対象にして、現在収集を続けている授業記録の中から、教師の強制的コミュニケーション・スタイルに相当する部分を抽出し、非言語的メッセージを含んだ形での教師の強制的コミュニケーション・スタイルの受容について調べる予定である。平成9年度は、小・中・高等学校およびそのクラス担任教師の両者を対象にして、教師のコミュニケーション・スタイルに関するアンケート調査を実施した。調査の目的は、授業中における教師自身の教授コミュニケーション行動に対する意識と、そのクラスの児童・生徒の担任教師のコミュニケーション行動に対する意識との関連を探ることである。

アンケートに取り上げた項目は全部で77項目で、その内容は、(1)学習指導にかかわる事項、(2)人間関係にかかわる事項A(教師から児童・生徒への声かけや教師の素直な感情表現を中心とするもの)、(3)人間関係にかかわる事項B((2)以外の教師と児童・生徒の交流を中心とするもの)、(4)教師から学習者への具体的は発言、である。調査対象者は、小学校3校(36クラス約1260名)、中学校4校(34クラス約1190名)、高等学校2校(14クラス約350名)である。現在データの分析中である。中学校教員は小学校教員と比べると、児童・生徒に対して「うれしい」や「悲しい」といった感情表現において乏しく、1%水準において差のあることが分かる。また、生徒への挨拶・声かけにおいても、差のあることが分かる。平成10年度は、データ分析の結果にもとづき、報告書を作成する。標記の研究課題名のもとで三つの立場から基礎的研究を進めた。1.大学の教員養成学部で使用可能なコミュニケーション用テキスト教材を開発した。テキストは「言葉の意味を作るのは受け手である」を学生自身が導けるような演習用教材である。2.不登校を予防するために大学の授業で教授可能な、トマス・ゴードンにより開始され近藤千恵氏によって我が国に広められている『教師学』に着目して、その利用可能性を検評した。次のことが分かった。(1)「あなた」を主語とする「あなたメッセージ」よりも、「わたし」を主語とする「わたしメッセージ」は学習者のやる気を引き起こす。これは学級通信の記事や『教師学』のテキスト講読の両方を通じて可能である。(2)わたしメッセージの表現のためには、教育観を変える必要がある。(3)教師学の4日間の集中講義でも重要な概念の7割近くで効果を上げることが可能である。しかし行動の四角形という概念の習得は困難であった。3.小学生1213人、中学生1170人、高校生444人、そしてこれらの学習者を教える小学校教師50人、中学校教師97人、高校教師63人に対して行ったアンケート調査の結果から次のことが判明した。(1)教師と学習者の間には、学習指導と生徒指導の見方・考え方について、不一致度が見られた。不一致度は校種が上がるほど大きくなった。質問項目77項目において、小学校で平均して1.23倍、中学校で1.59倍、高校で2.37倍の違いがあった。特に、小中高校に共通な項目は、「教師が児童・生徒から何かを得ようとする態度が少ないこと」であった。(2)学習指導では、教師が児童・生徒の興味の持てる例を上げることが少ないことであった。(3)教師によるひどい言葉は少なく、代わりに疑いの言葉が教師から発せられていると、学習者が捉えていることが分かった。(4)教師が学習者の声を聞くということも少なく、学習者は教師に耳を傾けて欲しいと願っていることが分かった。
新抽出剤による高レベル放射性廃棄物からのアクチニド元素の精密分離

CMPOという新しい抽出剤を使用し、それによるネプツニウム(Np)の抽出分離性能として、抽出反応式を解明するとともに添加するTBPの影響を検討した。1.Np(V)抽出の化学量論式Np(V)の分配比(D_<Np>)の硝酸濃度依存性より、低硝酸濃度では硝酸濃度の上昇によりD_<Np>も急速に増加するが、0.3M以上の領域では、硝酸との抽出競合によりD_<Np>の変化にプラトが観測され、硝酸濃度が3M以上では、Np(V)の不均化反応によりD_<Np>の上昇が見られた。2M硝酸におけるD_<Np>のCMPO濃度依存性より、D_<Np>がCMPO濃度の2乗に比例することがわかった。CMPOによりNpO_2^+を抽出した場合、電荷の中性が保たれなければならないことから、NpO_2^+1に対しNo_3を1同時に抽出する必要がある。従って、CMPOによるNp(V)の抽出反応の化学量論性は以下の式によって記述されることが明らかにされた。0.2Mおよび0.4M CMPOにおけるD_<Np>のTBP濃度依存性より、0.2M CMPOでは、TBP添加によりD_<Np>が減少しTBP濃度が0.5Mで最小値をとり、その後TBP濃度の上昇に伴いD_<Np>は増加することがわかった。0.4M CMPOでは、TBPの添加によってD_<Np>は減少するが、その後はほぼ一定値を示した。TBPの添加によるD_<Np>の減少は、TBP中のP=O基の塩基度の関係でCMPOと水素結合を起こすためであると考えられる。すなわち、多量に添加されたTBP中のP=O基が、CMPO中のP=O基あるいはC=O基と水素結合または双極子-双極子結合によって相互作用し、その結果Np(V)とCMPOとの相互作用が阻害されたものであることを明らかにした。
２光子励起蛍光寿命画像法を用いた膜融合関連蛋白の構造と機能解析

膜融合は伝達物質の放出やホルモン分泌をはじめとする生理機能に深くかかわる現象である。今回は2光子励起蛍光寿命画像法と遺伝子工学的な蛋白蛍光標識法を併用し、膜融合にかかわる蛋白質SNAREの複合化を生きた細胞内で定量し、融合過程に伴う構造変化をとらえた。大脳シナプス前終末では強い複合化が認められ、SNAP25のリンカーを介したSNARE複合体のオリゴマー化が超高速の放出を裏付けると考えられた。また、複合化率は放出確率に関連することが示唆された。一方、安静時の膵内分泌細胞では複合化はほとんどおきておらず、カルシウムをはじめとする分泌刺激が到来後してはじめて複合化するものと考えられた。大脳皮質培養神経の軸索終末と膵島標本において、細胞膜側SNARE(t-SNARE)と小胞膜側SNARE(v-SNARE)の複合化を、分子間FRETプローブと2光子励起蛍光寿命画像法で調べた。分子のN末(細胞質側)標識プローブ発現時には、神経終末では約30%の複合化率を認めたのに対し、膵島標本では複合化は0ー5%程度と有意に抑制されていることを認めた(論文投稿中)。さらに、神経においては、30%のうち10%は膜融合後のcis-SNARE構造が反映されていることを突き止め、残りの20 %が開口放出の準備段階に当たるtrans-SNARE構造を反映することを明らかにした。CA1海馬スライス標本でさらなる検討を進めた結果、シナプス前部のSNARE複合化は、シナプス後部構造スパインのサイズと相関した。一方、シナプス前部の放出確率をシナプス後部におけるカルシウムイメージングで検討した結果、大きなスパインに面するシナプス前部において、より大きな放出確率が見られた。これらの事実より、SNAREの複合化率は放出確率に関与することが示唆された。さらに我々はSNAP25欠損マウスより単離培養した神経標本に、蛍光標識したSNAP25分子やSNAP25の各種変異体を導入し、蛍光標識体のみが膜融合に機能する環境を作った。そして、伝達物質放出のキネティクスとSNAP25の複合化構造の関連を、パッチクランプ法と蛍光寿命画像法を組み合わせて解析した結果、アクティブゾーンではSNAP25のひとつのαヘリックスは他のSNAP25分子のαヘリックスと複合化するdomain swapping構造が形成されされている可能性のあるデータを得ている。生体標本でtrans-SNAREとcis-SNAREを区別して定量する方法を初めて確立し、論文報告した(Nature Commun.2015 Takahashi et al.)。ラットの大脳皮質単離培養標本にSyntaxin1のC末(細胞外領域)とVAMP2のC末(顆粒内領域)に、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす組合わせの色素を結合させ、蛍光寿命計測系を用いて分子間複合化率を測定した。膜融合後に形成されるcis-SNARE複合化量を選択的に検出でき、神経終末で約20%と推定された。一方、両分子のN末(共に細胞質領域)を標識し、FRETを計測すると、cis-SNAREとtrans-SNARE双方の形成量が反映され、神経終末で約30%の複合化率が示された。この差にあたる10%こそが膜融合の準備過程を形成するtrans-SNAREの形成率を反映すると考えられた。この測定法を差分法(subtraction method)と名付けた。一方、軸索と神経終末の間のシグナルを比べると、C末標識の際(cis-SNARE複合化の検出)には両者に差がなく、N末標識時には10%の差があったことから、cis-SNAREはブートンで形成後、素早く軸索に拡散することが予想され、Sucrose刺激実験でその動態を観察した。テトロドトキシン処理により神経活動を止めると、軸索の複合化率が処理時間依存的に減り、trans-SNAREの形成量は不変であった。以上より、軸索と神経終末のFRETシグナルの差からtrans-SNARE形成量を割り出すことが可能となり、勾配法(gradient method)と名付けた。インスリンを分泌する膵島の他、PC12細胞でも安静時のシグナルを検討し、顆粒膜に発現するVAMP2を巻き込む複合化は少ないことを見出した。シナプス前終末と内分泌細胞の間には、放出速度の違いが大きくあるが、SNARE分子の複合化様式や程度の違いにより一部説明できる結果を得た。内分泌組織では安静時SNAREの複合化率が極めて少なく、分泌過程においてその変化が観察できると考えられ、その実験系を並行して構築中である。さらに、神経細胞ではSNAP25の複合化においてリンカーを介した多量体形成が示唆されるデータがあり、こちらもFRETや電気生理の実験結果が得られ、論文準備中である。SNAP25のオリゴマー化がマウス神経細胞における超高速の伝達物質放出に重要であることを、2系統のSNAP25変異体を用いて証明した。実験ではSNAP25欠損マウスから単離培養した大脳皮質神経細胞を用いた。FRETプローブとして、ドナー色素をN末に結合させたmturquoise(mtq)-SNAP25と、アクセプター色素を第二αヘリックスの直前に挿入したSN1-Venus(Ven)-SN2の二種を基本形とした。両者のFRETは、2光子励起蛍光寿命画像法を用い、軸索終末領域で計測した。通常は約15%の結合率を示し、免疫組織染色で、シナプス前終末分子:Basoonと共局在した。第一にSNAP25のC末欠損体でプローブを作成した。

7残基欠損体では結合率に変化は見られず、9残基欠損体では結合率が有意に減弱した。この際、20Hz電気刺激を与えてシナプス伝達(IPSC)を計測すると、Δ9変異体では第一刺激による伝達が見られず、刺激を反復させると遅れた伝達が検出された。また、刺激後伝達までの潜時はΔ9で有意に延長した。以上より、SNAP25のC末はSNAP25のオリゴマー化(domain-swapping構造形成)に必要で、速い伝達物質放出に関与することが示唆された。第二に、SNAP25の二つのヘリックスを連結するリンカーの延長変異体を作成した。12残基20残基延長体のいずれも、結合率は対照と同等だった。しかし、IPSCは、10残基以上の延長で有意な遅れが検出された。また、第一回刺激におけるIPSCの振幅も、10残基以上の延長で有意に減弱した。以上より、リンカーを延長させてもドメイン構造は構成されるが、適切なリンカー長が速い放出を起こすのに必須で、それは融合細孔を取り巻くSNARE複合体間(SNAP25リンカー領域)の張力に反映されると考察された。膜融合は伝達物質の放出やホルモン分泌をはじめとする生理機能に深くかかわる現象である。今回は2光子励起蛍光寿命画像法と遺伝子工学的な蛋白蛍光標識法を併用し、膜融合にかかわる蛋白質SNAREの複合化を生きた細胞内で定量し、融合過程に伴う構造変化をとらえた。大脳シナプス前終末では強い複合化が認められ、SNAP25のリンカーを介したSNARE複合体のオリゴマー化が超高速の放出を裏付けると考えられた。また、複合化率は放出確率に関連することが示唆された。一方、安静時の膵内分泌細胞では複合化はほとんどおきておらず、カルシウムをはじめとする分泌刺激が到来後してはじめて複合化するものと考えられた。複数種類の細胞や異なる組織(培養細胞あるいはスライス標本)を用いて、蛋白の複合化・構造と機能との関連を多層的に調べる作業を行っている。ウィルスベクターを用いた遺伝子導入技術やSNARE蛋白欠損動物からの細胞培養技術の確立に大学院生が成功している。シナプス前終末においてSNAP25リンカー領域を介した多量体形成を論文作成にあたり、必要な追加実験を行うとともに、膵島・PC12細胞などにおける分泌刺激後に起こるSNARE複合化生成につきケイジドカルシウム試薬と蛍光寿命測定法を組み合わせた新しい実験系を構築し、知見を集める予定である。生理学定量的な分泌誘導を行うために、新規のケイジドカルシウム試薬の利用を検討している。より大きなカルシウム上昇を神経細胞に与えることによりIPSCのみならずEPSCで機能評価を行う計画も持っている。また、インスリン細胞における検討も進めるとともに、副腎髄質細胞株:PC12での予備実験も開始しており、比較対象としながら研究を継続して遂行する。平成27年度後半は、ウィルスベクターを新規に作製する必要が少なくなり、分子生物学試薬や細胞培養用品などの消耗品の消費が少なくなった。旅費を少なく抑え、実験用消耗品の購入量が抑制されたことが原因と考えられる。
リペ多糖刺激を介して血管内皮細胞で発現する組織因子の分子機能解析

先ず従来から知られているヒト、マウスのTFの塩基配列をもとに、17mer、20merのオリゴヌクレオチドプライマー2種を作製し、ウシ副腎皮質cDNAライブラリーを鋳型にPCR反応を行ない、491bpよりなるDNA断片を得た。この断片の塩基配列より、TFのcDNAの一部であることを確認後、プローブに用い100万個のクローンをスクリーニングし、約1.6kbよりなるポジティブクローンを一個得た。このクローンの末端塩基配列を決定したところ、開始Metコドンを含み、35残基のシグナル配列に続いて、ウシTFのアミノ末端配列がコードされていた。また、これまで報告されている3種のTFは全て260残基前後よりなることから、このクローンはウシ組織因子の全領域を含むと考え、全塩基配列を決定した。その結果、ウシTFは35残基のプレ配列を含む257残基から成る糖タンパン質であり、C末端領域に23残基の膜貫通ドメイン、さらに21残基の細胞質ドメインを含むことが明らかとなった。Asn型糖鎖は残基番号8と118、146の3ケ所に存在する可能性が強く、推定分子量は32,000と算出される。さらにこのcDNAを用い、酵母での可溶性TF(rsTF)を発現を試みた。重松が可溶性ヒトTFの発現に用いた方法に従い、pAM82にウシTFの細胞外ドメイン(1-213)を挿入した発現ベクターを構築した。このベクターを用いrsTFを発現させた結果、CM-Sepharoseカラムの1ステップだけで培地1リットルあたり約2mgのrsTFを得る事ができた。このrsTFはSDS-PAGE上、38kDaの単一バンドを示し、糖鎖の付加が予想された。また、アミノ酸分析、配列分析を行ったところ、cDNAの塩基配列より予想される結果と一致した。さらに、合成基質を用いたVII因子の測定系において、rsTFは天然ウシTFとほぼ同程度の増強効果を示し、VII因子-TFの分子間相互作用の研究に活用できることがわかった。
虚血および麻酔プレコンディショニングにおけるmPTP開口抑制のメカニズムの解明

心筋保護作用が知られているSTAT3と,心筋障害に関与していることが知られているCyclophilinD (CypD)の心筋細胞内での関係について検討した.STAT3の種々のリン酸化変異型を作成しCypDとの結合を調べたところ,すべての変異型とCypDは結合を認めた,心筋細胞株虚血再灌流モデルにおいてプロポフォールおよびその溶媒脂肪乳剤添加の虚血または虚血再灌流による心筋細胞死への効果を検討したところプロポフォールおよび脂肪乳剤は細胞死を抑制することがわかった.虚血時にプロポフォールおよび脂肪乳剤がCypDのたんぱく質発現を減少させ心筋障害を減少している可能性が示唆された.本年度は主に心筋細胞株における虚血再灌流モデルの確立とmPTP関連分子であるCyclophilinDの生化学的相互作用分子の解析を行った。(1)予備実験心筋細胞株H9C2および低酸素チャンバーを購入し、H9C2細胞を低酸素状態+低血清培地で培養し,人為的に虚血状態に近いモデルを作り、これが確かに虚血モデルであることを虚血時に発現するタンパク質で確認した。このモデルにおいて,虚血侵襲後高血清培地に戻し、高酸素状態で培養することにより虚血再灌流のモデルを作成した。またH9C2細胞からミトコンドリア分画を抽出する予備実験を行いミトコンドリアに特異的に局在するタンパク質の発現によって確かに抽出できていることを確認した。(2)mPTP構成要素CypDと種々の分子の相互関係の実験mPTP構成要素で、心筋障害、アポトーシスに重要な役割を果たす分子であるCyclophilinDと心筋保護作用を示す種々の分子における生化学的な相互作用についてMBPプルダウンアッセイを用いて検討した。結果、CyclophilinDが心筋保護作用をもつことが知られており、近年ミトコンドリア内で呼吸鎖を活性化させるとわかってきたstat3が生化学的に結合することを見出した。(3)CyclophilinDとSTAT3の細胞内局在、およびその麻酔薬による変化CyclophilinDはミトコンドリア内膜に局在しmPTP開口につづく心筋のapoptosisに深く関与しているが、CyclophilinDおよびSTAT3の局在が麻酔薬により変化するかどうかを検討した。セボフルランを臨床的濃度で培地に加えて蛍光顕微鏡で観察したが変化はみられなかった。虚血モデル、および虚血再灌流モデルの確立、また、ミトコンドリア分画の抽出実験操作に習熟するのに予想より大幅に時間がかかった。STAT3のリン酸化に関与していると考えていたPKCεは心筋細胞株においては,その発現とSTAT3のリン酸化には相関は認められなかった.STAT3の種々のリン酸化変異型を作成しプルダウンアッセイを行いCypDとの結合の有無について検討を行ったが、CypDはSTAT3の恒常的リン酸化型または非リン酸化変異型にかかわらず結合が認められた.むしろ,予想に反してセリンの非リン酸化型においてCypDとの結合が強い傾向が認められた.次に,心筋細胞株虚血再灌流モデルにおいてプロポフォールおよび溶媒コントロールとして脂肪乳剤添加を行い,虚血による細胞死に対する効果を検討した.LDHアッセイによりプロポフォールおよび脂肪乳剤の添加が細胞死を抑制することがわかった.つぎに,細胞内のたんぱく質発現について検討した.プロポフォールを添加した心筋細胞では虚血にともなってCypDのたんぱく質発現が低下しているのが認められた.脂肪乳剤添加では虚血再灌流にともないプロポフォールよりもCypDたんぱく質発現の低下がより強く認められた.プロポフォールの心筋保護効果は脂肪乳剤によるものである可能性が高いと考えられた.また,虚血プレコンディショニングを行ったものにおいてはCypDのたんぱく質発現にコントロールと比べ大きな差は認められなかった.今回はmPTP構成要素であるCypDとSTAT3という分子を中心に,麻酔薬とくにプロポフォールに注目して麻酔プレコンディショニングと虚血プレコンディショニングを比較し機序について解析を行った.これら二つの機序がまったく異なる可能性が示唆された.プロポフォールによるプレコンディショニングはおもに脂肪乳剤によるものである可能性が高いと考えられた.さらに,STAT3たんぱく質が虚血心筋ミトコンドリア内でのDNA転写制御において重要な役割を果たしている可能性を検討する予定である.心筋保護作用が知られているSTAT3と,心筋障害に関与していることが知られているCyclophilinD (CypD)の心筋細胞内での関係について検討した.STAT3の種々のリン酸化変異型を作成しCypDとの結合を調べたところ,すべての変異型とCypDは結合を認めた,心筋細胞株虚血再灌流モデルにおいてプロポフォールおよびその溶媒脂肪乳剤添加の虚血または虚血再灌流による心筋細胞死への効果を検討したところプロポフォールおよび脂肪乳剤は細胞死を抑制することがわかった.虚血時にプロポフォールおよび脂肪乳剤がCypDのたんぱく質発現を減少させ心筋障害を減少している可能性が示唆された.今後は、CyclophilinDがSTAT3の各種リン酸化isoformとの相互作用の程度の比較や種々の分子との相互作用の解明を行う。特に心筋保護、アポトーシスに深く関与している分子STAT3との相互作用を中心に心筋保護作用の分子メカニズムを解明する予定である。
神経回路形成に関わる神経突起の伸長における性ステロイドホルモン作用の解析

Steroid starvation下に培養したヒトneuroblastomaのcell lineである、SH-SY5Y細胞に、10nMのエストロゲン(E)、酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)、プロゲステロン(P)を添加してから24時間後に神経突起を有する細胞数を調べた。その結果、E添加により神経突起を有する細胞数が有意に増加し(p<0.01)、この作用はPの併用では抑制されなかったが、MPAの併用により有意に抑制された(p<0.01)。Eにより誘導される神経突起を有する細胞数の増加は、エストロゲン受容体拮抗薬であるICI182,780、およびPI3 kinase inhibitorであるLY294002により抑制されたが、ERK inhibitorであるPD98059では抑制されなかった。Eによる神経突起伸長作用はMPAにより抑制されるが、プロゲステロン受容体阻害剤であるRU486を併用投与するとMPAの抑制作用がキャンセルされた。Eは添加後5分後にAktのリン酸化を促進し、この作用をPの併用では抑制しなかったが、MPAの併用では抑制することが明らかになった。また、Eは添加後5分でRac1、Cdc42を活性化した。この作用についてもAktと同様に、Pは抑制しなかったが、MPAが抑制することが明らかになった。また、EはRhoAを投与後5分で不活化し、この作用はMPAの併用によりキャンセルされることが明らかになった。さらに、SH-SY5Yにdominant-negative (DN) Rac1またはDN Cdc42を導入すると、Eによる神経突起伸長が抑制されることが明らかになった。SH-SY5Y細胞においてエストロゲンによる神経突起の伸長には、Estrogen→ER→PI3-k/Akt→Rac1、cdc42の活性化→RhoAの不活化→神経突起伸長という経路が存在することが示された。また、MPAはEの作用をキャンセルするが、Pは抑制しないことから、Pに近い作用が期待されている、合成プロゲスチン製剤であるジェノゲストについて現在検討中である。Steroid starvation下に培養したSH-SY5Y細胞に、10nMのエストロゲン(E)、酢酸メドロキシプロゲステロン(MPA)、プロゲステロン(P)を添加してから24時間後に神経突起を有する細胞数を調べた。