hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超対称性理論における模型構築および場の理論の研究

今年度はLarge Hadron Collider (LHC)実験において、非常に重要な発見がなされました。素粒子の標準模型においてヒッグス粒子が現在まで唯一未発見でしたが、LHCにおいてヒッグス粒子と解釈可能な新粒子が発見されました。さらにその粒子の質量はおよそ125GeV程度であるということも決定されています。もしこれがヒッグス粒子であるなら、この発見は超対称模型に大きな影響を与えます。超対称標準模型においては、125GeVのヒッグス粒子の質量を最も単純に説明するには超対称パートナーの粒子の質量が従来期待されていた質量より重い10TeV程度である必要があります。その一方で、超対称性模型の一つとして低エネルギーゲージ伝達機構というものが知られています。通常の超対称模型はグラビトンの超対称パートナーであるグラビティーノが初期宇宙において様々な問題を引き起こしますが、グラビティーノが16eVより軽いときはそのような問題は無いことが知られています。低エネルギーゲージ伝達機構は16eVより軽いグラビティーノを実現できるほぼ唯一の機構でありますが、しかしグラビティーノが16eVより軽いと、単純な模型では超対称パートナーの質量が10TeVほど重くなれないことが知られていました。私は低エネルギーゲージ伝達機構において125GeVのヒッグス質量が実現する方法を研究しました。その方法の一つは超対称標準模型に新たなシングレット場を導入することです。従来行われてきた導入法では低エネルギーゲージ伝達機構において125GeVのヒッグス質量を説明できないことを示すと同時に、導入法を少し変更すれば125GeVヒッグスを実現できることを示しました。ヒッグス質量125GeVを説明する別の方法として、理論が強結合である場合も調べました。このようなときは、まず強結合の効果で超対称パートナーの質量が10TeVになりうることを示し、さらには強結合な低エネルギーゲージ伝達機構において、従来知られていなかった効果によってヒッグス質量が大きくなることを発見しました。
涙液分泌における腸内細菌の役割

ドライアイ治療の新規アプローチとして、涙液分泌と腸内細菌の関係性を検討した。C57BL/6マウスを用いて通常飼育、豊かな環境での飼育、ストレス負荷を行い、飼育環境の違いによる腸内細菌の変化を検討した。また腸内細菌が涙液分泌量に与える影響を観察するため、マウスに抗生剤を経口投与し、マウスの涙液分泌量の変化を検討した。その結果、飼育環境の違いによって腸内細菌叢の構成が異なること、マウスへの抗生剤投与によって涙液分泌量が変化することが明らかになった。これらより、マウスにおいて飼育環境の違いは腸内細菌叢の構成を変化させる要因となり、腸内細菌叢の構成と涙液分泌量には関連性があることが示唆された。近年ドライアイの患者数は増加傾向で深刻な問題となっており、眼の局所的アプローチだけではなく全身的アプローチが必要であると考えている。腸内細菌は消化管のみならず脳や神経系とも関連していることが多数報告されており、腸内細菌が涙液分泌にも関連しているのではないかと考えた。腸内細菌と涙液分泌の関係性を明らかにするために、C57BL/6マウスを用いて通常飼育、広いケージにおもちゃなどを入れた豊かな環境での飼育を行い、飼育環境の違いによる腸内細菌叢の変化を検討した。さらにこれらのマウスにストレス負荷を行い、涙液分泌量の変化及び腸内細菌叢の変化を検討した。また腸内細菌が涙液分泌量に与える影響を観察するため、C57BL/6マウスに抗生剤を4週間経口投与し、抗生剤を投与したマウスの涙液分泌量の変化及び腸内細菌叢の変化を検討した。これらより、通常飼育と豊かな環境での飼育では腸内細菌叢の構成が異なること、ストレス負荷を行うことで涙液分泌量が減少し、腸内細菌叢の構成が変化すること、マウスを事前に豊かな環境で飼育をしておくことでストレス負荷による涙液分泌量の減少が抑制されることが明らかになった。また、マウスに経口投与する抗生剤の種類によって涙液分泌量が異なること、豊かな環境で飼育することによるストレス負荷に対する涙液分泌量減少の抑制効果が見られないことが明らかになった。これらの結果より、マウスにおいて飼育環境の違いやストレス負荷は腸内細菌叢の構成を変化させる要因となり、腸内細菌叢の構成と涙液分泌量には関連性があることが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。眼科29年度が最終年度であるため、記入しない。
形態形成シグナルの機能多様性が生じるしくみ

動物の発生過程のさまざまな局面で、シグナル分子は繰返し使われている。本研究では、WntやFGFシグナルの機能多様性が生じる分子機構を解析する方法論の確立を日指して、これらシグナルによって発現が調節される遺伝子(以下、標的遺伝子と呼ぶ)の同定と機能の解析を行った。Wntシグナルの標的遺伝子は少なくとも4つ同定した。その一つは転写制御因子CRTR1をコードし、腎臓や唾液腺などの外分泌性器官の導管部で特異的に発現していた。CRTR1機能欠損マウスでは、これら器官の導管部の成熟に異常が認められ、生理的な機能も損なわれていた。したがって、WntシグナルはCRTR1の発現を介して、外分泌性器官の導管の成熟を制御するものと考えられた。また、FGFの標的遺伝子として、ショウジョウバエのhairyタンパク質と類似なher13.2をゼブラフィッシュにて同定した。her13.2の発現は未分化体節細胞でFGFにより特異的に誘導され、体節の周期性獲得に必須であることが明らかになった。以上の結果、発現領域や機能の異なる標的遺伝子が多数同定され、シグナルの機能の多様性を分子レベルで解析する上での基盤が整った。一方、転写調節因子T(Brachyury)の発現はWntやFGFシグナルにより原口周囲に特異的に誘導される。我々は原口周囲以外にもこれらシグナルが活性化している中脳後脳境界部でTを異所的に発現するゼブラフィッシュ突然変異体を複数発見した。これら変異体ではシグナルにより特定の標的遺伝子を特定の領域においてのみ活性化させるメカニズムに異常を呈していると考えられる。そこで、表現型が明瞭な3系統に着目し解析を進めたところ、,すべての系統において、この表現型が母性遺伝することが示された。したがって、シグナルの標的遺伝子の発現特異性には、受精卵中に存在する母親由来の因子が必要であることが初めて明らかになった。Wnt,BMP,FGFといった分泌性シグナルタンパク質は、脊椎動物の発生過程において時間的にも空間的にもさまざまな場所でくりかえし使われることが次第に明らかになって来た。しかしながら、その機能は受容する細胞や組織ごとに大きく異なる。この違いを生み出す大きな要因として、それぞれの場合で誘導される遺伝子(標的遺伝子)が異なることが考えられる。そこで、標的遺伝子の細胞・組織特異的な発現誘導の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、本研究では2つの異なるアプローチをとっている。その一つは、複数の組織で誘導のされ方が異なる標的遺伝子を同定し、その発現誘導機構を明らかにしようというものである。我々はマウスの胚性幹細胞を用いてWnt蛋白質の刺激により発現量が変動する遺伝子を複数同定してきた。本年度は、そのうちの3つの遺伝子について解析を進め、マウス個体内での発現を明らかにすると同時に、Wnt遺伝子機能欠質型変異体において発現が抑制されていることを明らかにした。したがって、実際のマウスの発生過程においてもこれら遺伝子が領域特異的にWntシグナルによって制御されることが示された。一方、もう一つのアプローチとして、すでにWntやFGFシグナルの標的遺伝子であることがわかっているBrachyuryに着目して、その領域特異的誘導に異常を呈する突然変異体をゼブラフィッシュを用いてスクリーニングしている。本年度はその変異体の性状をさまざまな領域特異的分子マーカーにより解析し、これら変異体においてBrachyury遺伝子が本来の発現場所とは異なる中脳・後脳境界部の特定領域に異所的に発現することを明らかにした。

本研究では、WntやFGFのようなシグナルの機能の多様性が生じる分子メカニズムを解析することを目的として、Wntシグナルによって発現が調節される遺伝子(以下、標的遺伝子と呼ぶ)の発現制御機構と機能の解析を行うとともに、標的遺伝子の発現制御に異常を示す突然変異体に着目し、その原因遺伝子の同定を行っている。Wntシグナルの標的遺伝子は遺伝子トラップ法とマイクロアレイ法を用いることにより複数の遺伝子を同定しているが、そのうちの一つに腎臓や唾液腺などの外分泌性器官において管構造を形成する上皮細胞で特異的に発現していることが明らかになったclone43遺伝子がある。今年度はその機能解析を個体レベルで行うことを目的として、この遺伝子の機能が欠質した変異体マウスを作製し、解析を行った。その結果、これら器官の分化に異常が認められ、その生理的な機能が損なわれていた。したがって、Wntシグナルはこの遺伝子の発現を介して、外分泌性器官の管の分化を制御しているものと考えられた。一方、マウスの初期発生過程においてWntシグナルは原口(原始原条)周囲や神経管背側といった複数の領域で発現しており、その機能も多岐にわたる。転写調節因子T(Brachyury)はWntシグナルの標的遺伝子であるが、Wntシグナルによるこの遺伝子の転写活性化は原口周囲において特異的であり、Wntシグナルが活性化されているその他の領域では発現が認められない。これに対して、我々は系統的な遺伝学的スクリーニングが可能なゼブラフィッシュを用いて突然変異体のスクリーニングを行い、T(Brachyury)を原口周囲以外にも異所的に発現する変異体を多数獲得することに成功した。今年度はこれら変異体の原因遺伝子を同定を目的として、ポジショナルクローニングを進めた。本研究では、WntやFGFシグナルの機能多様性を生み出す分子機構を解析する方法論の確立を目指して、これらシグナルによって発現が調節される遺伝子(以下、標的遺伝子と呼ぶ)の同定と機能の解析を行った。これまでWntシグナルの標的遺伝子を少なくとも4つ同定したが、その一つは転写制御因子CRTR1をコードし、腎臓や唾液腺などの外分泌性器官の導管部で特異的に発現していた。CRTR1機能欠損マウスでは、これら器官の導管部の成熟に異常が認められ、生理的な機能も損なわれていた。今年度はさらに分子レベルでの詳細な解析を行い、CRTR1が異なる器官の導管部の成熟過程で一群の共通の遺伝子の発現を制御することを見い出した。したがって、WntシグナルはCRTR1の発現を介して、導管の成熟に必須な一群の遺伝子の発現を制御するものと考えられた。また、FGFの標的遺伝子として、ショウジョウバエのhairyタンパク質と類似なher13.2をゼブラフィッシュにて同定した。her13.2の発現は未分化体節細胞でFGFにより特異的に誘導され、体節の周期性獲得に必須であることが明らかになった。以上の結果より、シグナルの機能の多様性を分子レベルで解析する上での基盤が整った。一方、転写調節因子T(Brachyury)の発現はWntやFGFシグナルにより原口周囲に特異的に誘導される。
小脳プルキンエ細胞樹状突起分岐形成に関与する遺伝子群の単離と機能解析

本年度は昨年度に引き続きプルキンエ細胞の樹状突起形成期に特異的なcDNAサブトラクトライブラリーの構築とクローンの単離を目指した。また、この研究計画遂行中に非必須アミノ酸であるL-セリンがプルキンエ細胞や海馬錐体細胞の強力な生存促進因子であることを見い出したことから、中枢神経系でL-セリン輸送に関わると推定されるトランスポーター分子をRT-PCR法で単離することを試みた。その結果、これまでにセリン輸送能を持つことが知られているトランスポーターASCT1以外に、脳では発現していないと報告されていたsystem B-like中性アミノ酸トランスポーターの新しいサブタイプを培養小脳神経細胞BNAから初めて単離することに成功し、その構造解析を行なった。(論文投稿準備中)。このcDNAクローンをHEK細胞に導入して安定発現株を得ると、セリンなどの中性アミノ酸輸送活性がベクターのみの対照に比べ4-6倍増加していた。さらに、この分子のユニークな基質特異性としてグリシンの輸送活性を持つことも見い出した。また発達過程での発現パターンをNortern Blottingによって検討すると、出生直後に最も高い発現が観察された。以上の結果から、この新規トランスポーター分子が発達中の中枢神経系において中性アミノ酸輸送を担っているものと予想された。現在この新規トランスポーターとASCT1の脳内での発現分布をin situ hybridizationによって詳細に比較検討中である。また樹状突起形成期特異的クローンの単離と構造解析も平行して継続中である。本年度は申請者の得たこれまでの知見を踏まえ、プルキンエ細胞の樹状突起形成期に特異的なcDNAサブトラクトライブラリーの構築を目指した。まず、培養小脳神経細胞からのtotal RNAの抽出条件を検討した。種々の方法を用いたが、結果的に酸性グアニジン処理後、酸性フェノール抽出を行なうと最も効率よくtotal RNAを回収できた。しかし、初代培養系であることからRNAの回収量は少なく、従来の方法でcDNAライブラリーを合成するに充分なmRNAを集めることが困難であった。そのため、testerとdriverの細胞から調製したライブラリーを実際にハイブリダイズさせ、発現に差のないmRNAを除くphysical subtraction法によるcDNAライブラリー作製は断念せざるおえなかった。そこで、近年Diatchenkoらにより開発されたPCRを用いた方法を導入してcDNAサブトラクトライブラリーの作製を試みた。培養後7日と14日目の小脳初代培養神経細胞から調製したtotal RNAをそれぞれdriverとtesterにした。total RNAから逆転写反応後、PRCによってcDNAを合成し、さらにtester由来のcDNAにPCRによって増幅可能な配列を持つアダプターをライゲーションした。このcDNAにPCRによって増幅可能な配列を持つアダプターをライゲーションした。このcDNAをアダプターを持たないdriver由来cDNAとハイッブリダイズさせ、その後PCRによってdriver由来cDNAとハイブリダイズしていないtester特異的cDNA断片を増幅した。サブトラクション効率を、解糖系酵素であるG3PDHがPCRによってバンドが検出できるサイクル数から検定してみると、G3PDHをcDNA断片の存在比は、サブトラクション後では、サブトラクション前の少なくとも400倍に激減しており、この一連の操作によって樹状突起形成期特異的cDNA断片が濃縮しているものと予想された。今後このcDNAからライブラリーを調製後、testerおよびdriver cDNA断片をプローブとしてスクリーンし、樹状突起形成期特異的クローンの同定と塩基配列解析を行なう予定である。(論文投稿準備中)。
ミトコンドリア活性酸素発生制御モデルマウスを用いた加齢性疾患発症メカニズムの解析

本研究では、加齢性疾患の発症における酸化ストレス障害の寄与を明らかにすることを目的とした。ミトコンドリアでの活性酸素発生量を制御したモデルマウスを用い、胎児期から老齢期に至るまでの表現型解析を実施し、酸化ストレス障害に起因する生体組織機能の加齢変化を追跡した。その結果、酸化ストレスに起因する生体機能異常として1低出生体重児出産、2涙腺炎症によるドライアイを伴う加齢性角膜疾患の亢進、3脳海馬領域でのグリア環境の変容、4習慣性流産や母体死の発生、5持続性高血糖症を確認した。今後、これらの分子機構解明により、生体の加齢変容を予防する手段の端緒が得られると期待する。1)初産妊娠率・出産率低下における酸化ストレス影響の解明において、ミトコンドリア酸化ストレス障害は排卵数の低下・精子運動能の低下・血小板増加を伴う不育症・習慣性流産を引き起こすことを明らかにした。本成果によりTet-mev-1マウスの晩発モデル動物としての可能性を示した。2)低出生体重児成人後の糖尿病・動脈硬化症発症メカニズムの解析において、ヒトと同様に、低出生体重仔として産まれたTet-mev-1マウスの壮年期において、解離性大動脈瘤および膵臓・肝臓での炎症像を確認した。このことから、成獣後に生活習慣病(糖尿病や動脈硬化症など)を発症していることが示唆された。3)学習記憶能力およびNeurogenesisの変化に伴う神経変性疾患発症メカニズムの解明において、Tet-mev-1マウスでの脳海馬領域においてミトコンドリア活性酸素発生量の増加を確認し、海馬依存的な学習記憶能力が若齢期において亢進し、壮齢期では低下していることを明らかにした。この成果は、ミトコンドリア活性酸素が負の要因ばかりでなく、正の要因として働くことを動物個体レベルで世界に先駆けて明らかにするものである。4)ミトコンドリア活性酸素の細胞内シグナル伝達への作用機序とその影響の解析において、Tet-mev-1マウスで過剰発現していたA-Raf蛋白質の機能解析を行った。A-Rafは、神経分化刺激後にミトコンドリアへと移行し、ピルビン酸脱水素酵素複合体(PDC)の活性中心PDHBサブユニットと結合することを明らかにした。この成果は、A-Rafが、神経分化に必要なエネルギー代謝を制御し、ミトコンドリアから一過的で爆発的な活性酸素シグナルを生じさせる新規因子であることを示唆する世界初のものとなった。1、初産妊娠率・出産率低下における酸化ストレス影響の解明において、ミトコンドリア酸化ストレスを負荷したTet-mev-1マウスで脾臓重量の増加、末梢血中好中球率の増加、胎盤でのIL-8の増加・Flt-1の減少を確認し、ミトコンドリア酸化ストレス増加と炎症の慢性化との相関が明らかにされ、不育症・習慣性流産の解明の一端を担う成果が得られた。現在、論文を執筆中である。2、低出生体重児成人後の糖尿病・動脈硬化症発症メカニズムの解析において、ミトコンドリア酸化ストレスを負荷したTet-mev-1マウスで空腹時を含めた慢性的な持続性高血糖が確認された。現在、ミトコンドリア酸化ストレスと持続性高血糖と細動脈硬化症との相関を確認するための実験を行っている。3、学習記憶能力およびNeurogenesisの変化に伴う神経変性疾患発症メカニズムの解明において、脳海馬組織切片培養での蛍光化学標識解析を行った結果、壮年期のTet-mev-1マウスの神経細胞特異的にミトコンドリアO_2^<・->の発生量と蓄積量の増加が確認された。一方、若齢期のTet-mev-1マウスでは発生量のみで増加が確認され、学習記憶能力の向上に寄与していることが示唆された。さらに、その他のROS産生は、神経細胞以外のグリア細胞において確認され、コントロールマウスと比較して、若齢期のTet-mev-1マウスではその蓄積量は少なく、壮年期において増加していることが確認された。現在、レドックスシグナルの関与を解析している。4、ミトコンドリア活性酸素の細胞内シグナル伝達への作用機序とその影響の解析において、ストレス応答性MAPKシグナル伝達系タンパク質の活性変化を確認したところ、phopho-JNK1,2/3存在量は壮年期のTet-mev-1マウスで増加し、一方、phosbho-p38存在量は若齢期のTet-mev-1マウスで低下していることが確認され、逆相関的に学習記憶能力に寄与していることが示唆された。また、壮年期のTet-mev-1マウスでは、ピルビン酸脱水素酵素を活性化するA-RAF存在量が増加しており、脳内グリア環境の悪化に伴うエネルギー代謝異常を補う変化が確認された。

最終年度にあたる当該年度には、交付申請時の研究計画に従い、厳密に研究を実施した。本研究は、加齢性疾患の発症における酸化ストレス障害の寄与を明らかにすることを目的としてきた。ミトコンドリアでの活性酸素発生量を制御したTet-mev-1モデルマウスを用い、胎児期から老齢期に至るまでの表現型解析を実施し、酸化ストレス障害に起因する生体組織機能の加齢変化を追跡した。具体的には、1)初産妊娠率・出産率低下における酸化ストレス影響の解明において。ミトコンドリア酸化ストレスが脾臓重量の増加・血小板増加・胎盤での血管形成異常を伴い習慣流産と母体死の危険因子になることを明らかにした。現在、当該テーマ学術論文を校正中である。2)低出生体重児成人後の糖尿病・動脈硬化症発症メカニズムの解析において。加齢依存的に異常集積するリンパ球のサブタイプ特定を実施し、リンパ球集積の亢進機序の一端を明らかにした。現在、特定されたサブタイプの細胞特性をin vitro培養系にて解析し、動脈硬化症との関連を検討している。3)学習記憶能力およびNeurogenesisの変化に伴う神経変性疾患発症メカニズムの解明において。壮年期マウスの海馬領域で活性酸素種の蓄積が優位に増加し、JNK/SAPKによるレドックスシグナルの活性化が確認された。これに伴い、アストロサイト細胞骨格タンパク質GFAP量の減少によるグリア環境の変容が確認された。しかしながら、神経変性疾患に見られる症状は確認されなかったことから、ミトコンドリア由来酸化ストレスによる脳内グリア環境の加齢変容について現在論文作成中である。4)ミトコンドリア活性酸素の細胞内シグナル伝達への作用機序とその影響の解析において。前年度に引き続き、A-Rafタンパク質による神経分化過程におけるミトコンドリア酸化ストレスの作用機序について学術論文を作成し、現在投稿中である。当該年度では、1)初産妊娠率・出産率低下における酸化ストレス影響の解明において、母体での血小板増加と脾臓重量の増加、胎盤でのFlt-1タンパク質減少による血液血管異常が酸化ストレスを起因とする習慣性流産の原因であることを明らかにし、当該Tet-mev-1マウスが習慣性流産モデルとして有用であることを示す成果を得た。今後の解析により、不育症・習慣性流産の分子機序を明らかにする成果が期待される。2)低出生体重児成人後の糖尿病・動脈硬化症発症メカニズムの解析において、末梢血分析の結果から、加齢依存的なリンパ球数の減少に伴う好中球率優位な炎症の慢性化が、持続性の低酸素環境を誘導し、空腹時を含めた慢性的な持続性高血糖を惹き起こしていることを示唆する成果を得た。今後の詳細な解析により、生活習慣病リスクファクター解明の一端を担う成果が得られると期待している。3)学習記憶能力およびNeurogenesisの変化に伴う神経変性疾患発症メカニズムの解明において、アミロイドβの蓄積や神経細胞死、乳酸アシドーシスが確認されない壮年期のTet-mev-1マウスにおいて、ミトコンドリア酸化ストレスによるグリア環境の破綻が長期記憶形成異常を惹起していることを確認した。本成果により、ミトコンドリア酸化ストレスが加齢性記憶障害を惹起していることを示唆する成果を得た。今後、加齢性記憶障害の分子機序を明らかにする成果が期待される。
炎症性腸疾患における３型自然リンパ球と樹状細胞の機能解明

ILC3特異的にDll1を欠損している遺伝子改変マウスとしてRORγt Cre Dll1 floxedマウスを使用し解析した。遺伝子改変マウスと野生型マウスとの間に有意な差を認めなかったため、トランスクリプトーム解析などコストが大きい実験は見合わせることにした。並行して行っていた実験系でILC3特異的に遺伝子Xを欠損しているマウスにおいて、今回注目しているDll1の発現が低下していることが判明した。Dll1のみならずLTi細胞に特異的な他のタンパク質の発現も低下しており、Xを介したシグナルがLTi細胞特異的なタンパク質の発現に必須であることが予測された。そこで研究対象となるマウスをILC3特異的X欠損マウスとし、LTi細胞の分化や機能について腸管に限定せずに考えた。ILC3特異的X欠損マウスについては腸間膜リンパ節のLTi細胞に対してRNA-seq解析を実施し、LTi細胞に特異的な遺伝子の発現の低下を認めた。発現低下を認める遺伝子のうち、発現量が比較的高く、かつ低下率が高い転写因子Aに注目した。この転写因子AがLTi細胞のマスター転写因子である可能性を期待し、転写因子Aのノックアウトマウスを作製し解析した。結果は残念ながらLTi細胞に発現している機能性分子の発現低下は認めず、LTi細胞の分化に必要な転写因子ではないという結論に至った。ILC3におけるXの役割の深い理解のためにXのリガンドであるYについても研究する必要があった。Yは膜結合型と可溶型の両方の活性型を持つが、それぞれの役割を検索する必要があったため可溶型Yを選択的に欠損しているマウスを新たに作製した。この新たに作製した可溶型Y欠損マウスは定常状態では検索する限りでは野生型と差がなかったが、興味深いことに、がんの骨転移においては病態の悪化を抑制するという結果が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に則り、ILC3特異的にDll1を欠損している遺伝子改変マウスとしてRORγt Cre Dll1 floxedマウスを使用し解析した。1.DSS投与時の体重減少、死亡率の比較。2.フローサイトメトリーを用いた免疫関連細胞の定量的評価。3.腸管組織のサイトカインやIgA, IgG, IgM抗体のELISA法での定量的評価。4.免疫染色による組織学的評価(特にcryptopatchやILF)。上記を実施した。ここまでの評価で遺伝子改変マウスと野生型マウスとの間に有意な差を認めなかった。さらに驚くべきことにDll1のみならずLTi細胞に特異的なMHCIIやLTβなど他のタンパク質の発現も低下しており、Xを介したシグナルがLTi細胞特異的なタンパク質の発現に必須であることが予測された。そこで研究対象となるマウスをILC3特異的X欠損マウスとし、LTi細胞の分化や機能について腸管に限定せずに考える方針とした。ILC3特異的X欠損マウスでは便中のIgA coated Bacteriaの割合が多い傾向にあったため、既報にあるようにLTi細胞に発現しているMHCIIの低下によって腸炎惹起性の腸内細菌が増加している可能性を考え、サンプル数を増やし再現性を確認するとともに便中細菌のDNAのPCRを行い同定を試みている。XのリガンドであるサイトカインYは膜結合型と可溶型の両方の活性型を持つが、それぞれの役割を検索する必要があったため可溶型Yを選択的に欠損しているマウスを新たに作製し解析している。当初予想していたよりも幅広く研究成果が得られている。特にILC3におけるXを介したシグナルの重要性は今回の研究の要になると思われる。XのリガンドであるサイトカインYは膜結合型と可溶型の両方の活性型を持つが、それぞれの役割を検索する必要があったため可溶型Yを選択的に欠損しているマウスを新たに作製した。この新たに作製した可溶型Y欠損マウスは定常状態では検索する限りでは野生型と差がなかったが、興味深いことに、ある病態モデルにおいては病態の悪化を抑制するという結果が得られた。この結果は海外学術雑誌へ現在投稿中で、研究全体としても概ね順調に進展していると言える。

ILC3特異的X欠損マウスについては腸間膜リンパ節のLTi細胞に対してRNA-seq解析を実施し、LTi細胞に特異的な遺伝子の発現の低下を認めた。発現低下を認める遺伝子のうち、発現量が比較的高く、かつ低下率が高い転写因子Aに注目した。この転写因子AがLTi細胞のマスター転写因子である可能性を期待し、転写因子Aのノックアウトマウスを作製し解析した。結果は残念ながらLTi細胞に発現している機能性分子の発現低下は認めず、LTi細胞の分化に必要な転写因子ではないという結論に至った。ILC3におけるXの役割の深い理解のためにXのリガンドであるYについても研究する必要があった。Yは膜結合型と可溶型の両方の活性型を持つが、それぞれの役割を検索する必要があったため可溶型Yを選択的に欠損しているマウスを新たに作製した。この新たに作製した可溶型Y欠損マウスは定常状態では検索する限りでは野生型と差がなかったが、興味深いことに、がんの骨転移においては病態の悪化を抑制するという結果が得られた。当初の計画に加えて遺伝子改変マウスを2種類新規に用意して研究を進めており、データが積み重なるにつれ、腸管免疫や炎症性腸疾患に限定されない方向へ考察できるようになってきた。現在行っている炎症性腸疾患の実験モデルだけではなく、自己免疫性関節炎や腫瘍免疫に関係したモデルも組み立てて行く予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞分裂に係わるシグナル伝達機構の研究

真核細胞の細胞分裂は染色体複製の完了に始まり、染色体の凝縮、核膜の崩壊から、染色体の分離、細胞質の分裂、娘細胞での核形成へと続く一連の動的な過程であり、その制御機構の解明は生命現象を理解する上で最も重要な課題の一つである。これまでに細胞分裂を制御するリン酸化酵素の存在が知られているが、最近の研究から、細胞膜近傍を起点とするシグナル伝達経路において極めて重要な機能を持つリン酸化酵素が分裂期に強く活性化されることが明らかになり、細胞外刺激に応答するシグナル伝達機構と細胞分裂の制御機構が密接に関連していることを示唆しており、細胞分裂機構の解明には両機構を統合的に理解することが必要と思われる。そこで、細胞周期分裂期に於いて細胞周期に依存してチロシンリン酸化されるシグナル伝達分子の検索を行い、チロシンキナーゼの下流で機能するシグナル分子として同定したDokが細胞分裂期に極めて強くチロシンリン酸化されることを発見した。また、その優性阻害性(dominant negative)変異体の過剰発現が細胞分裂の中期以降においてアポトーシスあるいは細胞分裂の破綻(catastrophe)を招くという予想外の知見を得た。さらに、Dokの優性阻害性変異体が、G1期あるいはS期においては核内に局在することも判明した。以上の結果は、Dokが細胞周期の進行に深く関与していることを示唆しており、Dokは重要な生理機能を担っていると推測された。そこで、Dok遺伝子欠損マウスの詳細な解析を行った。その結果、Dok欠損マウスはヒトの慢性骨髄性白血病に類似した病状を呈し、骨髄球はアポトーシス感受性が亢進していることが判明した。したがって、生体においてDokは細胞増殖つまり細胞周期の制御に重要であることが明らかになった。本年度の研究において得られた結果は以下の通りである。細胞周期分裂期に於いて細胞周期に依存してチロシンリン酸化されるシグナル伝達分子の検索を行い、チロシンキナーゼの下流で機能するシグナル分子として同定したDokが細胞分裂期に極めて強くチロシンリン酸化されることを発見した。Dokのリン酸化と局在の変化と細胞周期制御との関連は不明であり、来年度の課題としてさらに検討する予定である。細胞ゲノム複製のモデルとしてEpstein-Barr(EB)ウイルスの潜伏感染複製起点oriPを用いて、シグナル伝達と細胞周期制御の関連を検討する実験を行った。その結果、ゲノム複製起点oriPの活性がp38 MARKによって抑制されることを発見した。来年度にはp38 MARKのG1/S期における標的分子の同定と細胞周期制御における機能を解明する。

真核細胞の細胞分裂は染色体複製の完了に始まり、染色体の凝縮、核膜の崩壊から、染色体の分離、細胞質の分裂、娘細胞での核形成へと続く一連の動的な過程であり、その制御機構の解明は生命現象を理解する上で最も重要な課題の一つである。これまでに細胞分裂を制御するリン酸化酵素の存在が知られているが、最近の研究から、細胞膜近傍を起点とするシグナル伝達経路において極めて重要な機能を持つリン酸化酵素が分裂期に強く活性化されることが明らかになり、細胞外刺激に応答するシグナル伝達機構と細胞分裂の制御機構が密接に関連していることを示唆しており、細胞分裂機構の解明には両機構を統合的に理解することが必要と思われる。そこで、細胞周期分裂期に於いて細胞周期に依存してチロシンリシ酸化されるシグナル伝達分子の検索を行い、チロシンキナーゼの下流で機能するシグナル分子として同定したDokが細胞分裂期に極めて強くチロシンリン酸化されることを発見した。また、その優性阻害性(dominant negative)変異体の過剰発現が細胞分裂の中期以降においてアポトーシスあるいは細胞分裂の破綻(catastrophe)を招くという予想外の知見を得た。さらに、Dokの優性阻害性変異体が、G1期あるいはS期においては核内に局在することも判明した。以上の結果は、Dokが細胞周期の進行に深く関与していることを示唆しており、Dokは重要な生理機能を担っていると推測された。そこで、Dok遺伝子欠損マウスの詳細な解析を行った。その結果、Dok欠損マウスはヒトの慢性骨髄性白血病に類似した病状を呈し、骨髄球はアポトーシス感受性が亢進していることが判明した。したがって、生体においてDokは細胞増殖つまり細胞周期の制御に重要であることが明らかになった。
マスカット・ベーリーAワインの品質向上に関する革新的技術開発

マスカット・ベーリーA(MBA)種赤ワインの品質向上を目的として、市販ワインにおけるγ-ラクトン類およびフラネオールの香気成分含有量を調査するとともに、γ-ラクトンの生成機構の解析およびワインの含有量に及ぼす醸造条件の影響について検討した。γ-ノナラクトンは、ブドウ品種間のリノール酸含有量の差異、発酵工程における果皮および種子の浸漬、ブドウの収穫時期および発酵に用いる酵母菌株の影響を受けて含有量が異なると推測される。さらに、新たに開発したMBAの副梢果房を用いる赤ワインの醸造方法は、γ-ノナラクトンおよびフラネオールの含有量を高め、ワイン品質の向上に有効であることを明らかにした。マスカット・ベーリーA(MBA)種ブドウは、我が国を代表する赤ワイン醸造用品種の一つであり、本種から醸造されるワインは、甘い果実様の香りを有することが特徴である。本研究では、MBA赤ワインの香りに寄与する香気成分の特定とそれらの含有量を高めたワインの新規醸造方法の開発を目的とする。本研究の成果は、今後、国外への輸出が見込まれるMBA赤ワインの品質向上に大きく貢献することが期待される。本年度は、市販MBA赤ワインの香りに寄与する成分を探索するとともに、ワイン醸造条件が香気成分の含有量に及ぼす影響について検討した。市販MBA赤ワイン20点の分析において、γ-nonalactone、γ-decalactoneのγ-ラクトン類の他、4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone、β-damascenoneの甘い香りを呈する成分が見出され、これらの含有量と閾値からMBA赤ワイン香気への寄与が推定された。4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanoneは全ての赤ワインにおいて閾値を大きく上回って含まれており、γ-ラクトン類は、同じMBA種ブドウから醸造されたロゼワインに比較して含有量が多いことが明らかとなった。また、これらの香気成分の含有量は、カベルネ・ソービニヨン種赤ワインと比較すると大きく異なり、ワインのタイプやブドウ品種に依存することが認められた。さらに、MBAを原料とするワインの試験醸造におけるこれらの香気成分の含有量は、ブドウの成熟の程度、発酵時のブドウの果皮や種の存在、微生物の種類などに応じて異なる可能性が認められたことから、今後詳細な検討を進めて行く予定である。これまでに、市販ワインの分析からγ-nonalactone、γ-decalactoneのγ-ラクトン類、4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone(フラネオール)がマスカット・ベーリーAワインの香りに寄与する可能性がある成分として見出され、これらの成分の含有量はワインのタイプによっても異なることを明らかにした。本年の研究では、γ-ラクトン類の生成機構の解明とワインの含有量に及ぼす醸造条件の影響について検討することを目的とした。最少培地あるいはブドウ果汁培地に不飽和脂肪酸(リノール酸)を添加した発酵試験において、γ-ラクトン類の生成が認められ、さらには発酵醪におけるブドウの果皮、種の存在がγ-ラクトンの含有量に影響を及ぼしたことから、ブドウに含まれる不飽和脂肪酸が発酵中にγ-ラクトンに変換されるものと推測される。また、2015年の小規模試験醸造において、製成ワインのγ-ラクトン類の含有量は、発酵に用いる酵母や乳酸菌の種類によって異なるばかりでなく、発酵温度やブドウの収穫のタイミング(ブドウの成熟度合い)によっても影響を受けることが示された。さらに、マスカット・ベーリーAの新梢を伸長初期に摘芯して副梢の発生を誘導し、副梢に果穂の形成を促すブドウ栽培方法を新たに考案した。本方法により栽培されるブドウは秋冷期に成熟することが特長であり、そのブドウを原料として醸造したワインはγ-ラクトンやフラネオールの含有量が一般的な栽培方法によるブドウを原料とした場合に比べて多いことが認められた。ブドウ成熟期の気温の違いがワインの香気成分に影響を及ぼしていると推測され、ワインの品質向上のための新たな方法として期待できるものと考えられる。γ-ラクトン類の生成機構の解明、γ-ラクトン類の含有量に及ぼす醸造条件の影響の解析については概ね計画通りの進捗である。また、マスカット・ベーリーAの新梢を伸長初期に摘芯して副梢の発生を誘導し、副梢に果穂の形成を促すブドウ栽培方法を考案した。そのブドウを用いたワインの醸造についても検討を行い、新規醸造方法の開発につながる取り組みが進みつつある。前年度までの研究結果を踏まえ、本年度はマスカット・ベーリーA(MBA)種ワインのγ-ラクトン類、特にγ-nonalactoneの生成機構を明らかにするために、ブドウに含まれる脂肪酸の解析を行った。また、ワインのγ-ラクトン類の含有量に及ぼすブドウ収穫時期の影響、新たに開発した栽培方法によるブドウを原料としたワインのγ-ラクトン類含有量およびワイン品質について検討した。ブドウの種子および果皮は、果汁と比較してリノール酸およびオレイン酸の不飽和脂肪酸が多く含まれていた。このことから、赤ワインは種子および果皮がγ-ラクトン類の前駆体と推定される不飽和脂肪酸の供給源となり、発酵前の搾汁によって種子および果皮が取り除かれるロゼワインと比較してγ-ラクトン類の含有量が多くなると考えられる。また、MBA赤ワインはカベルネ・ソービニヨン種と比較してγ-ラクトン類の含有量が少ないことが認められていることから、ブドウ品種間の不飽和脂肪酸含有量の差異についても併せて検討した。

さらに、ワインのγ-ラクトン類の含有量は、ブドウの収穫時期の影響を受ける可能性があることを前年度の試験において示したが、本年度の試験においても、遅い収穫時期のブドウから醸造したワインはγ-ラクトン類が多く含まれることを明らかにした。一方、新たに開発した副梢果房を利用して冷涼な晩秋にブドウの成熟期を変更する栽培方法から得られるMBAブドウを原料としたワインは、一般的な栽培方法によるブドウを原料としたワインと比較してγ-ラクトン類およびフラネオールの香気成分含有量が多く、色調も濃くなることが認められ、ワインの品質向上に有効であることが示された。マスカット・ベーリーA(MBA)種赤ワインの品質向上を目的として、市販ワインにおけるγ-ラクトン類およびフラネオールの香気成分含有量を調査するとともに、γ-ラクトンの生成機構の解析およびワインの含有量に及ぼす醸造条件の影響について検討した。γ-ノナラクトンは、ブドウ品種間のリノール酸含有量の差異、発酵工程における果皮および種子の浸漬、ブドウの収穫時期および発酵に用いる酵母菌株の影響を受けて含有量が異なると推測される。さらに、新たに開発したMBAの副梢果房を用いる赤ワインの醸造方法は、γ-ノナラクトンおよびフラネオールの含有量を高め、ワイン品質の向上に有効であることを明らかにした。香気成分の含有量が微量であり、夾雑物の影響もあったことから、GC-MS分析条件の検討に想定以上の時間を費やすことになった。このことが、当初の計画からの遅れにつながった。市販MBA赤ワインの分析における香気寄与成分の探索については概ね予定通りであり、γ-ラクトン類以外にも4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanoneやβ-damascenoneの香りへの寄与を推定することができた。また、香気成分の含有量に及ぼす醸造条件の影響の解析については、果皮や種の影響などを含めて、次年度につながる研究が実施できた。しかしながら、γ-ラクトン類の生成機構の解明については研究途中であり、早急に進めて行きたいと考える。これまでの研究結果を基に、最終年度では次の点を重点に行う。1.γ-ラクトン類の生成機構の解明(27年度からの継続)不飽和脂肪酸がγ-ラクトン類の前駆体である可能性が示され、ブドウの収穫時期がγ-ラクトン類の含有量に影響を及ぼしたことから、ブドウ成熟過程における不飽和脂肪酸含有量の変化を調査するとともに、γ-ラクトン類の含有量への影響を調査する。2.マスカット・ベーリーA副梢果房の利用による高品質ワイン醸造方法の開発2015年の試験において、マスカット・ベーリーAの副梢果房を用いて醸造したワインにγ-ラクトンやフラネオールの含有量が多いことが認められたことから、2016年においても同方法によるブドウ栽培を試みて再現性を調査する。さらに、副梢果房を用いたワイン醸造における酵母や乳酸菌の選択などの醸造条件の最適化を検討する。ワイン醸造学これまでの研究において、香気成分の含有量がブドウの成熟の程度、発酵時のブドウの果皮や種の存在、微生物の種類などによって異なる可能性が示されたことから、今後の研究においては以下を重点的に進める。1.γ-ラクトン類の生成機構の解明
機能増強させた細胞由来のエクソソームを用いたcell-free血管再生療法の開発

エクソソームは全ての細胞から産生される脂質二重膜であり、現在の細胞移植のパラクライン効果の一つであり、エクソソーム単独の投与においても、血管新生能を有すると報告されている。また、エクソソームは免疫原性がないと報告されており、他家細胞由来のエクソソームを用いることができ、そのため、エクソソームを複数回投与することが可能である。本研究では、エクソソーム産生する細胞の機能を“低酸素プレコンディショニング法"で高め、その細胞から産生されるエクソソームが内包している、血管新生を誘導するタンパクおよびmicroRNAの内容物や量を変化させることで、血管新生能が高いエクソソームを誘導する方法を検討する。
生物攪乱の影響を受けない堆積速度測定法の開発

^<210>Pb法は、数十年百年スケールの堆積速度の算出に広く用いられている手法である。しかしながら、生物撹乱や鉛粒子の拡散に伴い、^<14>C濃度などによって測定された結果よりも速い値が見積もられるという問題も指摘されてきた。この問題に応えるために、堆積物中における^<210>Pbの総量から計算される壊変速度と水中からの^<210>Pbフラックスがバランスすることに基づいた、インベントリーモデル(wP=λΣ,w:沈降粒子の^<210>Pb濃度、P:堆積速度、λ:壊変定数、Σ:過剰^<210>Pbインベントリー)を提唱した。このモデルを検証するため、九州、上甑島貝池で堆積物を採取し、過剰型^<210>Pbプロファイルから求める堆積速度と、インベントリーモデルによって計算される堆積速度の比較を試みた。貝池をフィールドに選んだ理由は、湖底は一年を通して無酸素環境であることが知られており、生物による堆積物の撹乱が無いと考えられるためである。インベントリーモデルを滴用するには、水柱の沈降粒子の^<210>Pb濃度を知る必要があるため、本研究では湖水の大量濾過を行い、感度の高いβ線計測法によって沈降粒子の濃度測定を試みた。しかしながら、^<210>Pb濃度は予想以上に低く、検出器のバックグランドを上回る値を得ることが出来なかった。このため従来法と、^<137>Cs濃度の比較に加え、これまでに測定された堆積物中の有機炭素の^<14>C濃度分布の比較を行い、^<210>Pb法の妥当性を評価した。^<210>Pb法によって測定された堆積速度は、0.42cm/年となり、^<137>Cs濃度の核実験ピーク(1963年)から推測される堆積速度(0.420.5cm/年)と一致した。有機炭素の^<14>C濃度プロファイルからは、深さ17cm23cmの間に核実験起源の^<14>Cが検出された。この間に地上核実験が始まった1953年があるとすると、堆積速度は0.330.43cm/年と推測されるが、この値は^<210>Pb法、^<137>Cs濃度分布からの結果と調和的である。以上の結果から、生物撹乱が生じない環境では、^<210>Pb法を用いた堆積速度は信頼できることが示唆された。本研究では、堆積速度の測定と検討だけでなく、実際の湖底に海底現場観測装置を設置し、長期間の現場観測も行った。この装置は耐圧容器に組み込んだタイマーとデジタルカメラが自動的に海底現場を定期撮影するもので、貝池では、水中に生息する紅色硫黄バクテリアがマリンスノーを作り、大量に堆積していることが知られているが、今回の観測により、マリンスノーは時として幅1cm、長さ10cm以上の巨大粒子となること、一月で湖底に設置したスケールが全く見えなくなるほどの量が堆積していることが明らかになった。種々の堆積速度測定法と本装置を組み合わせることによって、より正確な堆積速度の測定や、堆積場の直接的な検証が可能になることが明らかになった。本年度は無酸素海洋における堆積過程の観察に焦点を絞り、長期観察に対応した現場型海底観測装置の開発と、同装置を用いた現場観測を行った。海底観測装置は既製品も存在するが、コストや規模が大きいため、湖や内湾で使用するには難があった。このため小型軽量、撮影タイミングをプログラムできること、一月以上の時系列観測に耐えられるバッテリーを搭載すること、かつ一人で係留・回収などのオペレーションが可能などの条件を満たす装置を新たに開発した。観測は湖水が海水と同じ塩分を示し、湖底が無酸素環境で知られる九州・上甑島貝池の湖心において長期間の時系列現場観測を行った。観測は2005年1月25日より3月4日までの計39日間にわたって行われ、計150枚の時系列写真を取得できた。この結果より、無酸素環境では水-堆積物境界を攪乱するような生物活動は確認されず、水中の酸素-無酸素境界に存在する光合成バクテリアが凝集して形成されたと考えられるマリンスノーが大量に堆積していることが確認された。またマリンスノーの中には、長さ数cm、幅1cmを超える巨大なものも見られ、これら大小のマリンスノーが湖底に降り積もることで堆積物表層の構造と、堆積物本体が形成されていく過程が明らかになった。また、インベントリーモデル検証のための鉛210濃度を測定するため、堆積物・沈降粒子の採取も行った。堆積物は乾燥・粉砕後容器に密封した状態で保存しており、容器内でウラン系列が放射平衡に達した後(1ヶ月後)に試料の測定に入る。沈降粒子については濾過により試料を集めており、適量を捕集した後にβ線カウンティングのための試料処理に入る予定である。カメラで確認された堆積の様子と、鉛210濃度プロファイルから求められる堆積速度、インベントリーモデルから求められる堆積速度を検討し、より正確な堆積速度の算出方法を評価する予定である。

しかしながら、生物撹乱や鉛粒子の拡散に伴い、^<14>C濃度などによって測定された結果よりも速い値が見積もられるという問題も指摘されてきた。この問題に応えるために、堆積物中における^<210>Pbの総量から計算される壊変速度と水中からの^<210>Pbフラックスがバランスすることに基づいた、インベントリーモデル(wP=λΣ,w:沈降粒子の^<210>Pb濃度、P:堆積速度、λ:壊変定数、Σ:過剰^<210>Pbインベントリー)を提唱した。このモデルを検証するため、九州、上甑島貝池で堆積物を採取し、過剰型^<210>Pbプロファイルから求める堆積速度と、インベントリーモデルによって計算される堆積速度の比較を試みた。貝池をフィールドに選んだ理由は、湖底は一年を通して無酸素環境であることが知られており、生物による堆積物の撹乱が無いと考えられるためである。インベントリーモデルを滴用するには、水柱の沈降粒子の^<210>Pb濃度を知る必要があるため、本研究では湖水の大量濾過を行い、感度の高いβ線計測法によって沈降粒子の濃度測定を試みた。しかしながら、^<210>Pb濃度は予想以上に低く、検出器のバックグランドを上回る値を得ることが出来なかった。このため従来法と、^<137>Cs濃度の比較に加え、これまでに測定された堆積物中の有機炭素の^<14>C濃度分布の比較を行い、^<210>Pb法の妥当性を評価した。^<210>Pb法によって測定された堆積速度は、0.42cm/年となり、^<137>Cs濃度の核実験ピーク(1963年)から推測される堆積速度(0.420.5cm/年)と一致した。有機炭素の^<14>C濃度プロファイルからは、深さ17cm23cmの間に核実験起源の^<14>Cが検出された。この間に地上核実験が始まった1953年があるとすると、堆積速度は0.330.43cm/年と推測されるが、この値は^<210>Pb法、^<137>Cs濃度分布からの結果と調和的である。以上の結果から、生物撹乱が生じない環境では、^<210>Pb法を用いた堆積速度は信頼できることが示唆された。本研究では、堆積速度の測定と検討だけでなく、実際の湖底に海底現場観測装置を設置し、長期間の現場観測も行った。この装置は耐圧容器に組み込んだタイマーとデジタルカメラが自動的に海底現場を定期撮影するもので、貝池では、水中に生息する紅色硫黄バクテリアがマリンスノーを作り、大量に堆積していることが知られているが、今回の観測により、マリンスノーは時として幅1cm、長さ10cm以上の巨大粒子となること、一月で湖底に設置したスケールが全く見えなくなるほどの量が堆積していることが明らかになった。種々の堆積速度測定法と本装置を組み合わせることによって、より正確な堆積速度の測定や、堆積場の直接的な検証が可能になることが明らかになった。
B型肝炎ウイルス感染による肝線維化進展、発癌機序の解析

B型肝炎ウイルス(HBV)は肝臓に持続感染して慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進展する。本研究では主に細胞老化との関連に着目しウイルス持続感染による肝病態発症の分子機序を解明することを目標とした。老化関連疾患への関与が知られるサーチュイン遺伝子の発現抑制は肝星細胞の活性化や線維化関連遺伝子の発現レベルと関連していた。HBVは肝星細胞の活性化と関連していた。細胞老化アッセイからX蛋白と細胞老化との関連性が示唆された。CRISPR/Casシステムを用いたサーチュイン遺伝子ノックアウト細胞では、サーチュインの欠損はHBV複製に影響した。サーチュインはHBV関連肝疾患の病態に関与している可能性が示唆された。慢性B型肝炎の病態においては長年のウイルス持続感染経過において感染者の高齢化とともに肝線維化進行や肝機能低下、肝癌発生などが問題となっているが本研究では老化抵抗遺伝子サーチュイン(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性脱アセチル化酵素)の役割について解析するため培養細胞を用いた検討をおこなった。細胞は肝実質細胞である肝細胞および肝癌細胞、ヒト肝臓内線維化と関連する肝星細胞等を用いた。B型肝炎ウイルスは感染性ウイルス粒子のほかウイルス遺伝子複製細胞やウイルス蛋白発現細胞による検討を一過性発現あるいは安定発現下に行った。さらにC型肝炎ウイルス複製下の細胞(レプリコン細胞)との比較を行った。サーチュイン活性化ないし阻害作用を有する薬剤による細胞死について検討し各細胞における感受性を比較、それぞれの特性を明らかにした。また薬剤に対するウイルス複製能への影響を定量PCR法にて解析した。肝星細胞におけるウイルス遺伝子あるいは蛋白存在下におけるサーチュイン遺伝子発現(ヒトでは7種が同定されている)に及ぼす影響を定量PCRおよびウェスタンブロット法にて解析した。肝星細胞におけるサイトカイン産生(インターロイキン6, 8等)や線維化関連遺伝子(アルファ平滑筋アクチン、I型コラーゲン等)の発現に与える影響を定量PCR法にて明らかにした。また肝星細胞と肝細胞との共培養を行い、共培養下における肝星細胞への影響をB型肝炎ウイルスの存在下あるいは非存在下で比較した。さらに栄養飢餓状態における影響や亜鉛依存性脱アセチル化酵素との関連についても検討を行った。B型肝炎ウイルスは肝臓に持続感染し、炎症やストレス、加齢、遺伝要因などが複雑に絡みながら慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進展するが、本研究では主に細胞老化との関連に着目しウイルスの持続感染による肝病態発症の分子メカニズムを解明することを目標とした。そのためにウイルス感染細胞や肝癌細胞株を用いて老化関連候補因子であるサーチュインの影響に関する機能解析、サーチュイン遺伝子が肝線維化に関与する肝星細胞の活性化や線維化に与える影響についての解析、ウイルス感染マウスないしヒト肝組織検体を用いた老化関連遺伝子の発現解析を目的としている。本年度は前年度に引き続き肝細胞系や肝星細胞系を用いてサーチュインの機能解析を詳細に実施した。サーチュインノックダウンにより星細胞におけるアルファ平滑筋アクチンの発現量が変化し、サーチュインが星細胞の活性化に関与していることが示唆された。引き続きサーチュインノックアウト細胞の作製を開始した。ウイルス複製に与える影響についてウイルス遺伝子を導入した肝細胞系を用いて検討した。サーチュインノックダウンによりウイルス複製の変動がみられており次年度詳細を検討していく。肝細胞系を用いて細胞老化検討のための条件検討のうえB型肝炎ウイルスエックスタンパクを用いて細胞老化に与える影響を遺伝子発現、老化関連ベータガラクトシダーゼ染色により解析を行った。またウイルス感染細胞を用いて遺伝子発現を網羅的に測定し老化関連遺伝子における発現パターン解析等を行った。本年度はウイルス感染細胞や肝癌細胞株を用いてサーチュインの影響に関する機能解析、サーチュイン遺伝子が肝星細胞の活性化や線維化に与える影響についての解析などおおむね当初の実験計画に沿って遂行しているが、ノックアウト実験についてはクリスパーキャスナインシステム等のゲノム編集法を導入するなど一部計画に変更が生じた。B型肝炎ウイルス(HBV)は肝臓に持続感染して炎症やストレス、加齢、遺伝要因などが複雑に絡みながら慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進展する。本研究では主に細胞老化との関連に着目しウイルスの持続感染による肝病態発症の分子機序を解明することを目標として培養細胞系を用いた検討を行った。老化関連疾患への関与が指摘されている脱アセチル化酵素活性を有するサーチュイン遺伝子の発現抑制実験を行った。サーチュイン遺伝子が肝星細胞の活性化やサイトカイン産生、線維化関連遺伝子の発現レベルと関連していることが示唆された。HBV遺伝子およびタンパク発現実験の結果からHBVは肝星細胞の活性化に影響していると考えられた。染色体外性に環状DNAを自立複製することが可能な発現ベクターを用いた細胞老化の評価系を構築した。非組み込み状態におけるHBVタンパクの持続的な発現に対する細胞老化への影響について評価する上で有用な方法と考えられた。原核生物のもつRNA誘導型外来核酸分解機構であるCRISPR/Casに基づいたゲノム編集技術を用いてサーチュイン遺伝子ノックアウト細胞を作成した。RNAシークエンスの結果遺伝子ノックアウト細胞では野生型細胞と比較して特定の遺伝子セットに変動がみられ、遺伝子の機能を解明する上で重要な知見と考えられた。またサーチュインの欠損はHBV複製に影響していた。以上の検討結果からサーチュインはHBV関連肝疾患の病態に関与している可能性が示唆され、新規の治療的アプローチを考案する上で今後本検討の結果得られた知見の詳細な機序を解明していくことが必要と考えられた。