hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リン脂質を介した新しい小胞体ストレス応答メカニズムの解明

マリネスコシェーグレン症候群の患者で見られるSIL1遺伝子の変異では小胞体ストレス応答の上昇が認められることが分っていることから、INPP5K遺伝子変異による骨格筋での小胞体ストレス応答の上昇が、先天性筋疾患の一因であることが示唆された。また、INPP5KによるPI(4)P産生と細胞内のカルシウム動態が大きく関わることが示唆された。細胞内カルシウム濃度の上昇がINPP5Kの酵素活性を上昇させ、また、PI(4)P産生によって細胞内へのカルシウム流入が低下することも明らかになった。小胞体ストレス応答は小胞体内カルシウム濃度に依存することから、INPP5Kによる細胞内カルシウム制御が、小胞体ストレス応答制御の直接的な原因であることが示唆された。以上の結果はPI(4,5)P2ホスファターゼの中でもINPP5Kに特異的な現象であったことから、INPP5Kによる細胞内の局所的なPI(4)P産生が起こっていると考えられる。本研究はホスホイノシタイド代謝を介した小胞体ストレス応答制御を目的としているが、現在INPP5KによるPI(4)P産生が小胞体ストレス応答を制御しているところまで明らかとなった。小胞体ストレスそのものを減少させているメカニズムを明らかにすることによって、ホスホイノシタイドを介した新しい小胞体ストレス制御機構が明らかになると考えている。ホスホイノシタイドはシグナル伝達物質としてのみならず、細胞内小器官や細胞骨格の制御を介して細胞の形や性質を決定する分子としても機能している。私はホスホイノシタイドホスファターゼによる脱リン酸化によるホスファチジルイノシトール3,4ー2リン酸[PI(3,4)P2]やホスファチジルイノシトール-4-1リン酸[PI(4)P]の能動的な産生が、細胞の性質の決定に重要な役割を果たしていることを明らかにした。具体的には、乳がん細胞の運動能や浸潤転移能のコントロールにおいて、5-ホスファターゼSHIP2によるホスファチジルイノシトール3リン酸(PIP3)の脱リン酸化とPI(3,4)P2の産生が大きな役割を持つことを示した。また、ホスホイノシタイドおよびホスホイノシタイドホスファターゼの役割はがん細胞の性質によっても大きく異なることを明らかにした。実際にがん細胞やがん種に依存して、ホスホイノシタイドホスファターゼ分子の発現や翻訳後修飾が非常に多様に制御されていること、ホスホイノシタイドホスファターゼ分子はがん抑制遺伝子としても、同時にがん遺伝子としても機能し得る非常に面白い性質を持つ分子群であること明らかにした。この分野は非常にがん研究においても重要なトピックであり、この分野における現在の研究状況を総説としてseminars in cancer biology誌に発表した。また、ホスホイノシタイドホスファターゼSKIPおよびPIPPの分子レベルでの解析を行い、これらのホスファターゼが小胞体上におけるホスホイノシタイド代謝を行っていることを明らかにした。小胞体におけるホスホイノシタイドの役割に関しては未解明な部分も多いため、今後さらなる詳細な機能解析を行う必要がある。がん細胞における局所的なホスホイノシタイドのリン酸化
オリオン座OB la.b領域における輝線星の分布と星生成過程の研究

本研究はオリオン座の広い天域にわたって水素Hαに輝線を示す輝線星のサ-ベイを実施しそれに基づいてオリオン領域における星形成過程を解明しようとするものである。この目的に沿って観測および観測結果の考案を行ない次の成果が得られた。(1)木曾観測所のシュミット望遠鏡により4天域について実施したサ-ベイ観測が終了し、10°x10°の領域に合計1099個の輝線天体を検出した。その内688星が本サ-ベイによる新しい検出であり、そのほかに14個の非恒星状天体も発見された。これらの輝線星は位置、明るさの測定を行なってカタログを作成した。(2)輝線星のうちのサンプルについてストロムロ山天文台における分光観測を実施し、輝線星の分光分類および輝線強度測定を行なって、これらのサンプル星の殆んどすべてが小質量の前主系列星であるT Tau型星であることを見いだした。これによりオリオン座の広い領域、特にオリオン暗黒星雲帯の西側にT Tau型星が広く分布することが判明した。(3)分光観測の結果を用いて作成されたHR図上の分布をみると、前主系列星としての輝線星は年令に大きな幅を持つことを示す。これはOBアソシエ-ション星、暗黒星雲、分子雲などと比較してこの領域における星形成過程に重要な課題を提供するものである。(4)OB星についてはWarren,Hesser(1977a,b;1978)による詳細な観測デ-タとの比較を行ない、オリオン領域における大質量星(OB星)小質量星(輝線星)の分布の相違から、両者の生成過程を単一の初期質量関数で説明するのは困難であることを示した。これらの成果は順次論文として公表の予定である。
光化学系IIの修復におけるサイクリック電子伝達の役割解明

陸上植物において、過剰な光エネルギーを熱として放散する熱放散(Non photochemical quenching, NPQ)は、サイクリック電子伝達により誘導され、強光下での光合成に重要である。我々はシアノバクテリアのNPQに重要なオレンジカロテノイドプロテインの欠損株および過剰発現株を作製し、NPQレベル、PSII光阻害等について解析した。その結果、細胞内のオレンジカロテノイドプロテインレベルが高いほど高いNPQを示し、光阻害に耐性を示した。この結果は、Plant Cell and Physiology (2019) 60, 367-375に掲載された。これまでに、オレンジカロテノイドが強光からの光化学系の保護に寄与することは示されていたが、そのメカニズムは議論があった。我々の結果は、オレンジカロテノイド依存的なNPQが、活性酸素種の一種である一重項酸素の発生を抑えることで酸化ストレスに弱い翻訳伸長反応の保護につながり、その結果として光阻害につながったことを示した。さらに、サイクリック電子伝達に関与するPGR5, NdhSの単独欠損変異株および二重変異株を作製し、変異が光化学系の光阻害へ与える影響を解析したところ、いずれの欠損変異もPSII, PSI光阻害への影響はなかった。一方野生型では、光条件が強光へとシフトする際にサイクリック電子伝達活性が増加する光活性化が観測されたが、この光活性化はPGR5を欠損すると見られなかった。加えて、この光活性化に伴い細胞内ATPレベルが増加する可能性が示唆された。これらのことから、PGR5は環境変動時のサイクリック電子伝達のファインチューニングを介して細胞のホメオスタシスに寄与している可能性が考えられる。光合成電子伝達は、2つの光化学系(PSII, PSI)を用い酸素発生とNADPH, ATP生成を伴うリニア電子伝達と、PSIのみを用いATPのみを生成するサイクリック電子伝達の2つのモードがある。PSIIは強光による失活(光阻害)に陥った際にサイクリック電子伝達がATP合成を促進することで、光阻害からの回復に何らかの役割を果たしていることが予測される。そのため本研究の目的は、光阻害の緩和に重要なPSIIの修復に果たすサイクリック電子伝達の役割を解明することである。平成28年度は、サイクリック電子伝達活性が増加する条件の特定、その条件下でのATP合成能およびPSII修復能の評価、サイクリック電子伝達関連遺伝子の欠損変異体の作製を目指して解析を行った。まず、シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC. 6803)におけるサイクリック電子伝達測定方法を確立した。さらに、細胞に比較的強い光(200 μmol photons m-2 s-1)を照射することにより、サイクリック電子伝達活性が増加すること(光活性化)を見出した。サイクリック電子伝達関連遺伝子の欠損変異体の作製については、Synechocystisにおけるサイクリック電子伝達に関連する遺伝子pgr5, ndhSのうち、pgr5の欠損株を単離し解析を行っている。pgr5欠損株では、弱光下では際立った表現型を示さなかったが、光照射時のサイクリック電子伝達の光活性化が起こらなかったことから、pgr5は真核生物での報告と類似して、サイクリック電子伝達の活性調整に重要であることが考えられる。今後は、欠損株におけるATP定量やPSIIの修復について評価するとともに、ndhS欠損株およびpgr5/ndhS二重欠損株が得られ次第解析を行う。当該研究は主に研究代表者が一人で遂行しているが、変異株作製については研究協力者である卒研生の協力のもと、分光学測定については、Bailleul博士(フランス国立科学センター)の助言のもと行っている。研究の計画および遂行は、西山佳孝教授の助言のもと行っており、進捗速度としては概ね良好である。計画している欠損株の単離が完了すると、解析はよりスムーズに進捗すると考えられる。PSIIが強光による失活(光阻害)に陥った際に、サイクリック電子伝達がATP合成を促進することで、光阻害からの回復に何らかの役割を果たしていることが予測される。平成28年度は、サイクリック電子伝達活性が増加する条件の特定、その条件下でのATP合成能およびPSII修復能の評価を目指し、サイクリック電子伝達関連遺伝子の欠損変異体の作製に取り組んだ。また、シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC. 6803)におけるサイクリック電子伝達測定方法を確立した。平成29年度は、サイクリック電子伝達因子であるPGR5, NdhSの欠損株および二重欠損株(Δpgr5, ΔndhS, Δpgr5ΔndhS)を単離し、サイクリック活性増加条件の特定、PSIおよびPSIIの光阻害とATP合成能において解析を行った。細胞に比較的強い光(200 μmol photons m-2 s-1以上)を照射することにより、サイクリック電子伝達活性が一過的に増加すること(光活性化)を見出した。さらにこの光活性化は、PGR5依存的であることを明らかにした。Δpgr5, ΔndhS, Δpgr5ΔndhSにおけるPSIIおよびPSII光阻害の程度は野生型と有意な差はなかった。

しかしながら、変動光下での生育が野生型より遅れたことから、真核生物での報告と類似してpgr5は、サイクリック電子伝達の活性調整に重要であることが示唆された。当該研究は主に研究代表者が一人で遂行しているが、変異株作製については研究協力者である卒研生の協力のもと、分光学測定については、Bailleul博士(フランス国立科学センター)の助言のもと行っている。研究の計画および遂行は、西山佳孝教授の助言のもと行った。進捗速度としては概ね良好であった。得られた変異株を解析した結果、変異株での表現型は著しくはなかったもののサイクリック電子伝達活性の定量的な評価やサイクリック電子伝達因子が光強度変動時のサイクリック電子伝達活性調節に関与することが示唆された。陸上植物において、過剰な光エネルギーを熱として放散する熱放散(Non photochemical quenching, NPQ)は、サイクリック電子伝達により誘導され、強光下での光合成に重要である。我々はシアノバクテリアのNPQに重要なオレンジカロテノイドプロテインの欠損株および過剰発現株を作製し、NPQレベル、PSII光阻害等について解析した。その結果、細胞内のオレンジカロテノイドプロテインレベルが高いほど高いNPQを示し、光阻害に耐性を示した。この結果は、Plant Cell and Physiology (2019) 60, 367-375に掲載された。これまでに、オレンジカロテノイドが強光からの光化学系の保護に寄与することは示されていたが、そのメカニズムは議論があった。我々の結果は、オレンジカロテノイド依存的なNPQが、活性酸素種の一種である一重項酸素の発生を抑えることで酸化ストレスに弱い翻訳伸長反応の保護につながり、その結果として光阻害につながったことを示した。さらに、サイクリック電子伝達に関与するPGR5, NdhSの単独欠損変異株および二重変異株を作製し、変異が光化学系の光阻害へ与える影響を解析したところ、いずれの欠損変異もPSII, PSI光阻害への影響はなかった。一方野生型では、光条件が強光へとシフトする際にサイクリック電子伝達活性が増加する光活性化が観測されたが、この光活性化はPGR5を欠損すると見られなかった。加えて、この光活性化に伴い細胞内ATPレベルが増加する可能性が示唆された。これらのことから、PGR5は環境変動時のサイクリック電子伝達のファインチューニングを介して細胞のホメオスタシスに寄与している可能性が考えられる。当初の研究計画通り遂行する予定であるが、当該課題で扱う生物をシアノバクテリアのみならず緑藻クラミドモナスも使用する。理由としては、クラミドモナスのサイクリック電子伝達変異株を入手し、当該研究計画で述べた解析を行っていたところ、強光下での光化学系Iの失活が顕著であることを見出した。そのため、サイクリック電子伝達が光阻害の緩和に果たす役割を明らかにするために、クラミドモナスを用いた解析も取り入れることにした。得られた変異株の解析については概ね終了しているため、現在は得られた研究成果を論文に投稿するべく準備しているところである。
乳幼児監視のための呼吸循環系指標の無拘束計測とエピソード記録法に関する研究

乳幼児突然死症候群(SIDS)は乳幼児に何の予兆、既往歴のないまま突然の死をもたらす疾患であり、その原因は未だに不明である。最近、託児所で圧迫死と見られる事故で乳幼児が亡くなるという事件があったが、原因が特定されておらずSIDSとして判定されている場合もあり、事故死なのか病死なのか判断がつかない場合も多い。このような託児所等での事故を未然に防ぐためには、普段から乳幼児の健康モニタリングや監視が必要である。本研究では家庭や託児所でのケアを目的とした無拘束心拍、呼吸信号および体動のエピソードを記録するシステムを構築することを目的とした。乳幼児の生活の場であるベッドにPVDFケーブルセンサを内蔵し、無意識無拘束下で心拍数や呼吸数、および体動などの記録が行われる自動計測システムの開発を行った。呼吸や心拍動に伴う胸郭の動きをセンサで捉え、蓄積電荷を電流電圧変換した後、信号をA/D変換した。データはディジタルフィルタを通し心拍、呼吸信号を抽出した。8チャネルのPVDF信号の中から自動的に最適なセンサを選択し、呼吸は15秒毎、心拍は5秒毎にフィルタ通過後の信号の自己相関を求め、呼吸数と心拍数を自動計測した。体動があった場合にはCCDカメラが作動して寝相をキャプチャし、タイムスタンプ画像データとしてファイリングする。また、フィルタ抽出された呼吸波形がファイルに記録され睡眠時無呼吸の有無もオフラインで検索できるようにした。心電図ならびに呼吸流量計を用いた同時計測から、10分間の平均呼吸数で-4.9±3.4%(平均±標準偏差)、平均心拍数で0.0±3.0%の誤差で計測可能であった。また、睡眠時のデータを健康成人で計測したところ、10%程度明らかに検出誤差と思われるデータが出力されるものの、十分モニタリング可能であることが示された。今後乳幼児の計測を行い実用化に向けて検討する。乳幼児突然死症候群は乳幼児に何の予兆、既往歴のないまま突然の死をもたらす疾患であり、その原因は未だに不明である。危険因子として疑われている原因の1つに「うつ伏せ寝」による窒息死がある。託児所で圧迫死と見られる事故で乳幼児が亡くなるという事件があったが、事故死なのか病死なのか判断がつかない場合も多い。このような事態を防ぐためには、普段から乳幼児の健康モニタリングや監視が必要である。乳幼児の主要な生活の場であるベッドに健康管理指標のためのセンサを内蔵し、無意識無拘束下で心拍数や呼吸数、および体動などの記録が行われる自動計測システムの開発を行った。センサとして高分子圧電ケーブル素子を用い、体幹をスライスするような形にベッド上に8本取り付けた。サンプリングしたデータはディジタルフィルタを通して心拍、呼吸信号を抽出した。8チャネルの信号の中から自動的に最適なセンサを選択し、呼吸は15秒毎、心拍は5秒毎にフィルタ通過後の信号の自己相関を求め、呼吸数と心拍数を計測した。体動があった場合には高感度CCDカメラが作動して寝相をcaptureし画像データとしてファイリングする。今回は成人被験者10名を対象に検証実験を行ったところ、安静状態では体位によらず呼吸および心拍数をモニター可能であった。

10分間の平均値を対照値と比較したところ、呼吸数で平均-4.9±3.4%、心拍数で0.0±3.0%であった。また、睡眠時のデータを計測したところ、6時間以上に亘って計測可能であることが示された。今後よりロバスト性を高めるためにソフトウェアの改良を図り、乳幼児の計測を進める予定である。乳幼児突然死症候群(SIDS)は乳幼児に何の予兆、既往歴のないまま突然の死をもたらす疾患であり、その原因は未だに不明である。最近、託児所で圧迫死と見られる事故で乳幼児が亡くなるという事件があったが、原因が特定されておらずSIDSとして判定されている場合もあり、事故死なのか病死なのか判断がつかない場合も多い。このような託児所等での事故を未然に防ぐためには、普段から乳幼児の健康モニタリングや監視が必要である。本研究では家庭や託児所でのケアを目的とした無拘束心拍、呼吸信号および体動のエピソードを記録するシステムを構築することを目的とした。乳幼児の生活の場であるベッドにセンサを内蔵し、無意識無拘束下で心拍数や呼吸数、および体動などの記録が行われる自動計測システムの開発を行った。センサとしてPVDFケーブルを用いた。呼吸や心拍動に伴う胸郭の動きをセンサで捉え、蓄積電荷を電流電圧変換した後、信号をA/D変換した。データはディジタルフィルタを通し心拍、呼吸信号を抽出した。8チャネルのPVDF信号の中から自動的に最適なセンサを選択するコードを開発した。呼吸は15秒毎、心拍は5秒毎にフィルタ通過後の信号の自己相関を求め、呼吸数と心拍数を自動計測した。体動があった場合にはCCDカメラが作動して寝相をキャプチャし、タイムスタンプ画像データとしてファイリングする。また、フィルタ抽出された呼吸波形がファイルに記録され睡眠時無呼吸の有無もオフラインで検索できるようにした。心電図ならびに呼吸流量計を用いた同時計測から、呼吸数で平均-4.9±3.4%、心拍数で0.0±3.0%の誤差で計測可能であった。また、睡眠時のデータを成人ならびに乳幼児で計測したところ、10%程度明らかに検出誤差と思われるデータが出力されるものの、十分モニタリング可能であることが示された。
アルツハイマー型痴呆脳におけるアミロイドP成分の遺伝子発現と沈着機序の検討

アミロイドP成分(APC)の遺伝子発現部位をヒト肝臓とヒト脳内において検討するために,APCのc DNAに相補的なリボプローブを作成してこれにdigoxigeninを結合し,このプローブを用いてin situhybridization法を組織上で行った。その結果アルツハイマー型痴呆(ATD)ならびに正常対照脳内においてAPCのmRNAの出現を遺伝子レベルにおいて確認した。また免疫組織化学によって老人斑中でのAPCの分布はほぼアミロイドβ蛋白の分布と一致することを確認した。さらにATDならびに正常対照脳組織において皮質の神経細胞を中心にAPCのmRNAを検出したことからATDにおける老人斑・神経原線維へのAPCの沈着は脳組織自体で作られたAPCである可能性が高いと思われた。ATDならびに正常対照脳においてAPCのmRNAの出現部位および出現強度に大きな相違いは認められなかった。ATD患者と対象郡において脳脊髄液のAPCの濃度を測定した結果,2群間で有意差は認められなかった。しかしATD郡においてAPCの脳脊髄液中濃度と認知機能の指標であるMMSEの得点に相関が認められた。この結果を理解するために同じ群を対象に可溶性アミロイド前駆蛋白(sAPP)とタウ蛋白を測定し,APCとの関係を検討した。結果は両者共にAPCとの相関を認めなかった。この結果よりATDおけるAPCの関与はsAPPやタウ蛋白の関与とは直接的な関係ではない可能性が高いことが判明した。またAPC血中濃度や脳脊髄液中濃度と,全身性アミロイドーシスとの関連が深い血清アミロイドAにおける血液中濃度および脳脊髄液中濃度をATD患者と対象群において測定し検討したところ有意な差は認めず、APC沈着が全身性アミロイドーシスにおけるアミロイド沈着とも違った機序で沈着している可能性が示唆された。本年度においてはアルツハイマー型痴呆(ATD)において脳内異常構造物である老人斑と神経原線維に存在するアミロイドP成分の出現の由来を検討した.これまでアミロイドP成分は人の肝臓でのみ産生されると言われてきたが,老人斑と神経原線維の両者に沈着するアミロイドP成分が果たして肝臓で作られ血液を介してのみ脳内に出現したと考えるのか,または脳内でも産生され沈着しているのかはこれらの異常構造物の出現機序とも関係し興味深いと考えられる.これまでのアミロイドP成分に対する抗体を用いた検討だけではアミロイドP成分がどこで産生されているのかは判明しなかった.今回,我々はアミロイドP成分の遺伝子発現部位をヒト肝臓とヒト脳内において検討するために,アミロイドP成分のcDNAに相補的なリボプローブ(約300bp)を作成してこれにdigoxigeninを結合し,このプローブを用いてin situ hybridization法を組織上で行い,ATDならびに正常対照脳内においてアミロイドP成分のmRNAの出現を遺伝子レベルにおいて確認した.また免疫組織化学によっては老人斑中でのアミロイドP成分の分布はほぼアミロイドβ蛋白の分布と一致することを確認した.今回の検討でATDならびに正常対照脳組織において皮質の神経細胞を中心にアミロイドP成分のmRNAを検出したことからATDにおける老人斑・神経原線維へのアミロイドP成分の沈着は脳組織自体で作られたアミロイドP成分である可能性が高いと思われた.現段階の症例においてはATDならびに正常対照脳においてアミロイドP成分のmRNAの出現部位および出現強度に大きな相違は認められなかった.次年度以降はアミロイドP成分のmRNAの発現部位の詳細を検討するとともに症例数を増やし,また免疫染色とも組み合わせてアミロイドβ蛋白との関連もさらに検討していく予定である.

この研究はアルツハイマー型痴呆(ATD)の患者脳内に出現する老人斑や神経原線維変化の代表的な構成要素のひとつであるアミロイドP成分と,ATDの病因・病態との関連を検討するためにアミロイドP成分の遺伝子や蛋白の発現分布や脳内動態を総合的に検索し,ATD脳中におけるアミロイドP成分の出現機序や,出現の意味,その果たす役割などの解明を試みるものである。本年度はATD患者脳脊髄液中のアミロイドP成分の濃度をELISA法を用いて測定することにより,ATDにおけるアミロイドP成分の全身動態を探り,アミロイドP成分の脳内への出現機序ならびに沈着機序を検討した。今回の研究において72例のATDと9例の対照群において脳脊髄液中のアミロイドP成分濃度を測定した結果、ATD群と対照群との間に有意な差は認められなかった。しかしATD群において認知機能の指標であるMMSE(mini mental state examination)の得点と脳脊髄液中のアミロイドP成分濃度の間に相関が認められた。この結果から脳脊髄液中のアミロイドP成分濃度の測定がATDの認知機能の評価のマーカーになり得る可能性が示唆された。しかし、これまでに我々は血液中のアミロイドP成分濃度がATD群において有意に減少していることを報告したことを考慮すると、脳脊髄液中へのアミロイドP成分の移行はATDにおいても大きな変化はなかったため脳内におけるAPの動態についてはさらなる検討を要すると考えられた。また同時にATDならびに正常対照脳内においてアミロイドP成分の産生を遺伝子レベルにおいて確認するためにdigoxigeninを結合したリボプローブを用いたin situ hybridization法によるmRNAの検出をATDならびに対照症例にての検索をさらに増やしている。この研究はアルツハイマー型痴呆(ATD)の患者脳内に出現する老人斑や神経原線維変化の代表的な構成成分であるアミロイドP成分と,ATDの病因・病態との関連を検討するためにアミロイドP成分の遺伝子や蛋白の発現分布や脳内動態を総合的に検索し,ATD脳中におけるアミロイドP成分の出現機序や,出現の意味,その果たす役割などの解明を試みるものである。昨年度はATD患者と対象群において脳脊髄液のアミロイドP成分の濃度を測定した結果,2群間で有意差は認めなかった。しかしATD群においてアミロイドP成分の脳脊髄液中濃度と認知機能の指標であるMMSE(mini mental state examination)の得点に相関が認められた。これらの結果を理解するために本年度は同じ群を対象に脳脊髄液中の老人斑形成並びに神経原線維変化と関係が深い可溶性アミロイド前駆体蛋白(sAPP)とタウ蛋白を測定し,アミロイドP成分との関係を検討した。結果はsAPPとタウ蛋白は共にアミロイドP成分との相関を認めなかった。さらにMMSEの得点との相関をsAPPとタウ蛋白で検討したが,有意な相関は認めなかった。以上の結果よりATDおけるアミロイドP成分の関与はsAPPとタウ蛋白の関与とは直接的な関係ではない可能性が高いことが判明した。
不斉光学機能部位を有する人工レセプター:新しい不斉認識型光学レセプターの分子設計

申請者は不斉光学機能部位を有する人工レセプターの分子設計指針を得る目的でRu(bpy)_3^<2+>の持つ“光学機能"と“不斉"に着目し、まずは、化合物1, [Ru(bpy)_2(bpy-calix[n]arene)]^<2+>,の合成を通じてRu(bpy)_3^<2+>とレセプター基体であるカリックスアレーン類との機能連携について知見を得た。合成は次の様に、カリックスアレーン類と4-ブロモメチル-4'-メチル-2,2'-ビピリジンをK_2CO_3存在下、DMF中で反応させて得られた配位子をcis-Ru(bpy)_2Cl_2・2H_2Oと加熱攪拌させ、その後アニオン交換を施す事により、対応する1を得た。化合物1a(n=4)はCH_3CN-CH_3OH (1:1v/v)中、453.5nmを励起光として、592.4nmに^3MLCTに帰属される発光ピークを示すが、興味あることに、ゲスト種としてのアンモニウム塩の添加は発光強度の増大を誘起した。この変化は連続変化法から1:1錯体の形成によってもたらされている事が示唆され、会合定数Kは807±26.1M^<-1>であることがわかった。対照実験の結果より、この現象はカリックスアレーンがRu錯体の発光のquencherとして機能していることを強く示唆しており、新しい人工光学レセプターへの創製に向けた極めて重要な性質といえる。この成果は第12回ホスト・ゲスト化学研究会、及び日本化学会第70春季年会(4G512)にて報告の予定である。今後、これらレセプターを水溶性にして、光学分割を施し、標題レセプターに仕上げる所存である。
水媒体中での極性ビニルモノマー類のアニオン重合

本研究課題において、水を溶媒として用いた新しいビニル重合系の開発を行っている。特に、ルイス酸として、水中でも失活せず、モノマーのカルボニル基を活性化できる金属トリフラート類を用い、適宜ルイス塩基を添加することで、高活性化を目指した。具体的には、Ph3Pをルイス塩基に、Sn(OTf)2もしくはCu(OTf)2をルイス酸に用い、水中室温にて、メタクリル酸2-メトキシエチルの重合反応が進行し、高収率で数平均分子量(Mn)が数万以上のポリマーが得られることを見出した。溶媒効果を検討したところ、様々な有機溶媒よりも水が最も良好な溶媒であった。アクリル酸2-メトキシエチル、アクリル酸ブチル、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、アクリルアミド、4-ビニルピリジンも同様の系で重合反応が進行した。アクリルアミドは水素移動重合ではなく、ビニル重合体が得られた。モノマー適用範囲の広い触媒系であることが明らかとなった。(メタ)アクリル酸エステルはCu(OTf)2が、アクリルアミド類はSn(OTf)2が最適なルイス酸であった。その中でも特に、アクリル酸2-メトキシエチルは高活性であり、5mol%のルイス酸と塩基の組み合わせで、3分で重合が完結し、Mn=93,000、Mw/Mn=4.0のポリマーが得られた。ルイス塩基(Ph3P)のモル量を増加させると分子量が低下した。また、MALDI-TOF-MS測定から、Ph3P末端が観察されたことから、Ph3Pが開始剤として機能していることが分かった。上述の通り、水溶媒中における新規重合系の開拓に成功した。具体的には、1)重合条件の最適化により水中、室温にて予想以上に高活性で高速な重合系であること、2)モノマー適用範囲が広く比較的低反応性のビニルピリジンでも重合反応が進行すること、3)Ph3Pが開始剤として機能していることを明らかにした。1年間で研究を大きく進展させることができている。モノマーの適用範囲の拡張と重合の高活性化を引き続き検討する。さらに、重合機構の解明を行う。特に、活性種が初期に考えていたアニオン種であるのか、もしくはラジカル種であるかを明らかにする。今年度の実験において、高速な重合系であることが分かったが、このことからフリーラジカルが成長種である可能性も考えられる。このために末端構造の解析やラジカルやアニオン重合補足剤やRAFT試薬の添加などの実験を行う。特に重合補足剤の添加実験においては、それ自身がルイスペア触媒と反応しない試薬を選択する必要がある。合成実験に必要な試薬・溶剤類の消耗品費、測定機器利用料の一部を、学内の競争的資金や財団からの寄付金で賄うことができたため。
環境に優しい薄板構造物の溶接変形予測および歪取り方案創成

船の建造においてブロックの寸法精度は、部材精度、組立精度、溶接変形、歪取りなど複数の要因に影響を受け、溶接変形や座屈のような非線形現象の累積が最終的なブロック精度を決定しているためにるため、その予測は難しく熟練を必要とする。したがって、溶接組立精度を予測するためには、船体ブロックのように大型構造物における非線形現象を直接、詳細かつ逐次的に追跡する必要があるが既存の有限要素法では不可能である。そこで、本研究ではこれらの非線形性に対応するため、固有変形、理想化構造要素、界面要素という概念あるいは方法を導入することにより大型ブロック全体の溶接組立変形が予測できる方法を開発した。船は、小組立、大組立、ブロック搭載と部品を順次溶接により組立てることにより建造される。このような組立法の場合の溶接組立変形は、溶接や線状加熱による局部収縮と部材間の位置合せ誤差やギャップ矯正が原因となって生じる。そこで本年度は位置合せやギャップ矯正が考慮できるように平成24年度に開発した理想化構造要素に界面要素を組合せた溶接組立変形予測プログラムを開発し、その動作確認を行った。また、板厚が異なる突合溶接継手および隅肉溶接継手を対象に溶接および歪取を目的とした線状加熱によって発生する横収縮、横曲り、縦収縮などの固有変形を3次元熱弾塑性FEM解析により求め固有変形のデータベースを構築した。なお、FEM解析の結果から固有変形を求める方法として、塑性歪を積分する方法や逆解析を用いる方法などが提案されているが、前者については隅肉溶接の場合に生じる積分領域の曖昧さ、また後者については端部影響の分離が困難であると言う問題が有り、これらを回避するために計算機上で溶接部を切出す方法を考案した。FEM解析から得られた固有変形の精度を実験計測との比較により検証した。さらに溶接変形を平成24年度に開発したCCDカメラ映像を用いた画像計測法により計測した。平成24年度は、船などの大型薄板溶接構造物の溶接組立工程で生じる変形を座屈変形も含めて短時間に予測することを目的に、縦横のスティフナーに囲まれたパネルが1要素で表現できる理想化構造要素を開発した。この要素は、形式的には溶接による局部収縮が表現できる4節点アイソパラメトリック・シェル要素であるが、高次モードの座屈変形が表現できるように、面外変形成分を三角関数展開した内部変数を含む要素である。なお、面外変形成分のみについてのみ高次項を考慮しているため、座屈変形に対してロッキング現象が生じるので、これを回避するために、座屈の駆動力となる非線形ひずみ成分に関しては、要素内平均を用いて剛性評価を行った。この理想化構造要素のアスペクト比を変化させながら一軸圧縮、二軸圧縮および剪断荷重を与えてその座屈荷重および座屈後の挙動の妥当性を検証した。さらに16.4m×16.4mの大型デッキパネルの溶接組立の問題を通常の4節点シェル要素(47360要素)と理想化構造要素(810)を用いて解析し後者の場合には計算時間が1/501/20に短縮できた。また、溶接固有変形のデータベースに関しては、上記の大型デッキパネルを対象に構築を行った。溶接変形の計測については、CCDカメラの画像データを用いた手法の開発を行った。本研究の目的は、船の建造において問題となる溶接組立時の変形を予測し船体ブロック精度の向上を実現することであり、特に、板厚が薄い自動車運搬船、客船、艦艇などのデッキに発生する座屈型の溶接変形について、その発生を予測し、さらに防止対策を講じるための簡便な手段を提供することを目的とする。そのために、固有変形、理想化構造要素、界面要素という概念あるいは方法を適用することにより大型ブロック全体の溶接組立変形が予測できる方法を開発した。具体的には、溶接変形は熱弾塑性現象であるという生成プロセスに注目すると非線形問題であるが、結果に注目すると溶接線近傍に生じる局部収縮すなわち固有ひずみに集約できるので、熱弾塑性FEMを用いて固有ひずみを計算し、さらにこれを積分することにより横収縮、縦収縮、角変形などの固有変形を求め固有変形データベースを構築した。理想化構造要素は、船体などの薄板構造の最終強度解析の手段として提案されたものであり、1パネルの座屈/塑性崩壊現象が1個の有限要素を用いて表現できる点が特徴である。本研究では、パネルの座屈現象に加えて補強材との溶接における溶接変形が固有変形を通して再現できる理想化構造要素を開発した。さらに、界面要素は面と面の相互作用を表すために研究代表者らが提案した要素で、亀裂進展問題などに用いられる。本研究では、ブロック建造時に順次組み付けられる部材間の関係を表すためにこれを導入し、部材間の関係が組立時において互いに自由な状態、仮付け状態、完全に接合された状態と変化する過程が表現できるとともに、部材間に生じたギャップの矯正や組立順序が寸法精度に及ぼす影響の検討が可能なブロック組立変形予測法を開発した。

数値溶接力学前倒しの形で平成24年度から着手した理想化構造要素と界面要素を組合せた溶接組立変形予測プログラムの開発を平成25年度に完了できた。また、固有変形については、溶接に加えて歪取りを目的とした線状加熱についても固有変形データベース構築に着手することができた。理想化構造要素と界面要素を組合せた溶接組立変形予測プログラムの開発は平成25年度に実施予定であったが、前倒しで平成24年度に一部実施した。なお、固有変形データベース構築については、対象を大型パネル構造に限定して実施した。固有変形に関しては、入熱が低減可能な断続溶接継手および歪取りに用いられる線状加熱を対象に固有変形データベースを構築する。平成25年度に開発された溶接組立変形予測プログラムと構築された固有変形データベースを用いて、スティフナーにより補剛されたパネルから構成される平面および立体ブロックを対象に、溶接組立変形、特に座屈の発生を予測する。予測の妥当性を検証するため、造船所において溶接変形を実測し予測値と比較する。さらに、断続溶接の採用や組立順序の最適化による座屈変形低減効果をシミュレーションにより評価する。止むを得ず発生する座屈変形については、効果的な歪取り方案をシミュレーションにより検討する。上記の検討に基づき提案された溶接組立変形低減対策および歪取り方案の効果を確認するため、実現可能な範囲で造船所での建造に適用を試みる。理想化構造要素の開発は、当初の計画通り進んでいるが、より高精度な要素の開発にも力を割きたい。該当なし
核融合プラズマ中の燃料粒子分布の多様性と循環の理解

本研究は制御熱核融合において燃料となる水素同位体、灰であるヘリウムおよび不純物の混合がもたらす粒子分布の多様性の起源を理解すること、それをもとに燃焼率の最大化を指標として燃料循環の最適化シナリオを提案することを目的としている。整備を進めた基幹となる二つの計測系に計画通りの進展があった。バルク電荷交換分光システムでは、バルクイオンと中性粒子ビームとの間の荷電交換反応によって放出されたHαおよびDα線のスペクトルを再現することによって、水素と重水素の高温成分の強度から水素と重水素の密度比の空間分布を得ることができた。マイクロ波ドップラー反射計では、新しく二つの周波数コムを用いて、乱流の半径方向相関長の観測が可能となり、軽水素プラズマに対し重水素プラズマにおいては相関長が短くなっていること、すなわち乱流構造が細分化していることを明らかにした。これらの整備した計測からの新しい知見を活かし、特に水素同位体、すなわち水素プラズマと重水素プラズマの輸送特性の異同を問う実験を大型ヘリカル装置(LHD)において行い、実験結果の解析を進めた。水素・重水素の比較から、広く受け入れられているイオンのジャイロ半径長の乱流スケールがもたらす輸送モデルを検証した。熱輸送に関しては電子系では水素放電で改善が認められ、モデルとの不一致が確認された。一方、粒子閉じ込めについては重水素放電において、やや劣化することが認められたことは、このモデルの予測する傾向と合致している。これらの実験研究と並行して、フローとストックの概念からなるシステムダイナミクス解析手法を整備し、原型炉を想定した核燃焼運転において、ヘリウム灰による燃料希釈やリサイクリングの影響を含めて、燃料トリチウム量の炉中での追跡を行う計算を可能とした。以上のこれらの研究実績に関する発表を国内学会、国際会議で行った。研究基盤となる実験環境のうち、バルク荷電交換分光とマイクロ波ドップラー反射計の高度化整備を進めた。研究実績の概要にあるように、この二つの計測器から新しい実験観測結果が得られつつある。バルク荷電交換分光では水素と重水素の密度比、およびヘリウムイオンの空間分布が決まった手順に沿って得られるまでに至っている。さらに、高い波長分解能を持たせる改良に着手しており、より精度の高い水素・重水素の分離が可能となることが見込まれる。マイクロ波ドップラー反射計では、フィルタの増強および高速サンプリングにより空間観測点を増やす改良を進めている。周波数スイープのシステムと周波数コムを組合せて運転する試みも実施しており、合わせて、時空間分解能の大きな改善が期待できる。実験では、真空容器壁の調整を図り、リサイクリングとガスパフの制御による場のプラズマの水素同位体純度を確保し、これに対して異なる水素同位体をペレットとして注入する実験手法の有効性が確認できてきた。平成30年度には、場が水素環境である状況で水素および重水素ペレットを入射する実験、言い換えれば水素プラズマ中での水素および重水素イオンの輸送を調べる実験を実施することができた。以上のようにLHDをプラットフォームとした実験研究の推進については当初の計画通りである。また、原型炉を想定した燃料循環のシステムダイナミクス解析もフローとストックの概念に基づいた手法開発を進めている。既に、燃焼プラズマのパワーバランスと燃料循環について燃料希釈とリサイクリングを含めて解析ができるところまで整備まで進んでいる。一方、研究目標の達成には付加的な部分ではあるが、国際協力で進めるドイツ・W7-X実験については、昨年度も報告したように実験計画の遅延により、当初計画からやや後退することは否めない。以上の点を勘案して、総合的におおむね順調と自己評価した。この2年間の計画実施によって本研究課題の目標を見通すことができてきている。これらを反映・応用して、2019年10月から翌年2月にかけて予定されているLHDの実験期間中に水素・重水素比較実験を実施し、目標達成に向けて実験結果の解析を進める。特に、10月の実験開始前に以下を実施する。(1)ペレット入射装置については計画を満足できる性能を実現できているが、一方、既存設備に経年劣化が見られる。限られた実験時間を有効に行えるよう整備を進めるとともに、固体水素ペレット粒子数についての較正を行う。また溶発過程を高速で分光測定するための計測準備を行う。(2)荷電交換分光では、高い波長分解能を持つ新しい分光系を稼働させ、動作確認を行う。(3)ドップラー反射計では微細化した乱流構造を観測するための、周波数広帯域化や周波数スイープと周波数コムとの組合せなどの改良を継続する。また、平成30年度に実施した水素環境での水素・重水素ペレット入射実験の解析を進める。2019年度にはこの実験と相補的な重水素環境での実験を中心としつつ、昨年度の実験結果を拡充するための実験を遂行する。これらの実験からペレットの溶発および燃料供給効率、水素イオンと重水素イオンの分布および輸送特性とともに、乱流揺動の相関長の異同を評価する。原型炉における燃料循環のシステムダイナミクス解析においては、リサイクリング影響についての検討を進めるとともに、燃料水素同位体の輸送の違いおよびその比の制御を取り込めるよう手法の開発を進める。これらの実験およびシミュレーション研究の成果を国内外の学術会合で発表することによって議論を深めるとともに、大規模ジャイロ運動論シミュレーション、統合シミュレーション、炉設計、W7-X実験との比較および反映などの観点から関係者と議論を行うことによって、今後のまとめに向けた収束と新たな展開について検討する。

本研究は制御熱核融合において燃料となる水素同位体、灰であるヘリウムおよび不純物の混合がもたらす粒子分布の多様性の起源を理解すること、それをもとに燃焼率の最大化を指標として燃料循環の最適化シナリオを提案することを目的としている。初年度の平成29年度は研究連携者と共に研究の基盤となる実験プラットフォームの整備を進めた。基幹機器は水素同位体をプラズマに注入する固体水素ペレット入射装置、プラズマ中のイオン種別密度を計測する荷電交換分光、密度揺動の長距離相関分布を計測するドップラー反射計の3つである。ペレット入射装置は既存設備を調整し、軽水素および重水素を個別に入射できる運転手法を確立した。これにより、プラズマ燃料供給効率に関する初期実験を核融合科学研究所で稼働中の大型ヘリカル装置(LHD)において実施できた。荷電交換分光法では新規の高性能CCD検出器の動作確認を行った。さらに、上記のペレット入射初期実験において、この計測法によって水素・重水素別の密度を全空間ではないが得られることを検証することができた。ドップラー反射計ではマイクロ波周波数コムを用いた開発を進めた。この計測のデータ解析方法の高度化を図るプログラム開発を行い、ペレット入射に伴うLHDプラズマ中の電場振動現象を観測することができた。さらに、長距離トロイダル相関を調べるための新型計測器開発において、わずかに周波数をずらした2台の周波数コムを用いることにより、より多数の空間点を観測できるシステム設計の指針が得られた。以上のこれらの研究実績に関する発表を国内学会、国際会議で行った。また、これらの実験研究の整備とともに、水素燃料同位体の比率が核融合燃焼およトリチウム増殖比に与える影響を調べるため、燃料循環をシステムダイナミクスとして解くモデルの検討を開始した。4年計画のうち初年度に当たる平成29年度においては研究基盤となる実験プラットフォームの整備に注力した。研究実績の概要にあるように、基幹となる固体水素ペレット入射装置、荷電交換分光、ドップラー反射計の3つの機器の整備が順調に進み、その動作検証を行うことができた。既に、固体水素ペレット入射については重水素と軽水素の個別入射制御、荷電交換分光においては主イオンである重水素と軽水素イオン密度の分離測定、ドップラー反射計においては多数空間点観測を可能とする周波数コム帯域拡大の効果検証まで進捗した。特に、ヘリウムと水素の荷電交換光が計測できる2波長分光器の高度化のためCCD検出器の動作検証が進んだこと、また、長距離トロイダル相関を調べるための新型計測器開発において、わずかに周波数をずらした2台の周波数コムを用いることにより中間周波数帯を従来の20GHzから500MHzまで低減できることを確認し、より多数の空間点を観測できるシステム設計の指針が得られたことは今後の展開を明るくしている。粒子輸送への同位体効果を調べる実験を固体水素ペレット入射を用いて初期的ではあれ、実施できたことも大きい。これらはLHDをプラットフォームとした実験研究の遂行については当初の計画通りである。
三次元ＣＴを用いた現代日本人骨格の形態学的特徴に関する研究

画像診断装置であるCT(computed tomography)は、従来、生体の病変を描出することに主眼がおかれていた。しかし近年、CT撮影で得られたデジタルデータであるDICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)データを加工する技術が飛躍的に進歩したことで、従来は応用されることがほとんどなかった骨格形態に関する研究に、CTを用いることができるようになった。日本人の平均身長は戦後、大きく伸びたことが知られており、また、皮膚の上から計測した身体部位の長さ等、形態学的特徴に関する研究はなされているものの、皮膚等の軟部組織を除いた骨格自体に関する研究は限定的であった。また、従前は解剖という手段でしか骨形態を明瞭に目視し計測することはできなかったが、CTで撮影した日本人の骨形態は、コンピューター画像処理技術によって、明瞭に三次元画像化することが可能となったため、本研究では現代の日本人を対象に、全身をCTで撮影し、その形態学的特徴を明らかにすることを目的とした。研究期間中、CT撮影によって得られたDICOMデータを、専用のプログラムで三次元画像に再構成し、さらにその画像を解析し、得られたデータを分析している。今後、CT撮影症例数をさらに増やし、日本人骨格の形態学的特徴を、より明瞭にしてゆく計画である。また、本研究者は日本人以外の骨格に関する形態学的特徴を、海外の研究者らと、同様の手法を用いて共同で研究しており、今後は、日本人だけでなく、国際間において、人種によってどのような骨格における形態学的特徴が有るのかを明らかにすることができると考えている。近年、法医学・病理学・解剖学の分野で、遺体をCT撮影し、体内の構造や病態、死因を究明する研究が進展している。遺体は、生体と異なり、エックス線被曝による癌発生のリスクが無いことから、生体では事実上不可能であった高線量エックス線による高解像度な全身撮影が可能である。また、骨格に関する研究において、従前の手法では、多数の遺体を解剖して骨を剖出しなければならず、解剖の手間がかかるだけでなく、遺族からの承諾を得ることが困難であり、多数の症例を集めることが困難であった。このような状況にあって、近年、急速に進歩している画像診断技術を、遺体に応用することで、いままではできなかった多数の遺体症例から、骨格に関する情報を得ることができるようになった。本研究は、現代日本人の遺体を多数扱う法医学分野において、遺体をCT撮影し、得られたCT画像をコンピューター上で三次元化して、骨格形態を画像化し、現代日本人の世代別の標準的骨格像を明らかにしようとするものである。特に、近年増加している高齢者の若かった頃の骨格・体型を推定する数式を、本研究により得られると期待している。具体的には、比較的若い成人と高齢者の遺体をCT撮影し、剖検することなく全身の骨格像をコンピューター上で三次元画像化し、大腿骨、脛骨、上腕骨、頭蓋骨といった各骨の長さ等を測定し、身長・年齢別グループにわけて比較検討する。この研究により、法医学の白骨鑑定に役立つ身長推定式が確立できるだけでなく、栄養学における高齢者の栄養アセスメント(高齢者が若かった頃の身長を現在の体型から推定する方法)、人類学における身長と骨長の相関性に関する研究が飛躍的に発展すると考えている。CT撮影の対象となる遺体は、現代日本人が異状死として死亡することで法医学症例となる。そのため、異状死の症例数を予測することは極めて困難である。現在までにCT撮影を実施できたのは9症例であり、次年度に撮影する症例数が増えることを期待している。平成23年度に引き続き、遺体をCT撮影後、法医解剖を実施し、CT画像データと実測データの蓄積をし、それぞれのデータを比較検討する。また症例数を増やすために、解剖学の献体をあわせて撮影予定である。平成23年度に引き続き、遺体CT撮影に必要な遺体用の車載型CTをレンタルする予定である。また、学術集会に参加し、本研究に役立つ情報を収集する。
コナガの殺虫剤抵抗性の分子機構に関する研究

これまでコナガの合成ピレスロイド剤抵抗性にはナトリウムチャネルのアミノ酸変異による感受性の低下が関与していることを明らかにしてきた。本年度の解析により、抵抗性に関わる最も重要なアミノ酸変異はナトリウムチャネルのドメインIIS4-IIS6に存在するが、その領域は2つのオルタナティヴ・エキソン(18aおよび18b)によってコードされていることが明らかとなった。エキソン18aとエキソン18bの相同性は塩基配列およびアミノ酸レベルでそれぞれ79%、91%であった。両エキソンとも合成ピレスロイド剤抵抗性に関わるアミノ酸置換部位(T929I)を含んでいた。抵抗性系統ではエキソン18aには感受性型のスレオニンが、エキソン18bには抵抗性型のイソロイシンがコードされていた。一方、感受性系統にはエキソン18a、エキソン18bともにスレオニンがコードされていた。エキソン18aは全ての発育ステージにおいて恒常的に発現していた。エキソン18bの発現も全てのステージで認められたが、3齢および4齢幼虫における発現レベルは低かった。また、4齢幼虫および成虫におけるエキソン18bの発現レベルは胴体部よりも頭部において高かった。以上の結果より、オルタナティヴ・スプライシングは合成ピレスロイド剤に対する感受性の異なるナトリウムチャネルを組織特異的に生み出している可能性が示唆された。また、昨年度報告したコナガのクロルフルアズロン抵抗性に関わるGST-E遺伝子とは別のGST遺伝子(GST-S)を新たにクローニングし、全塩基配列を決定した。さらに、ノーザン解析を行い、発現解析を行った。その結果、GSTS遺伝子はクロルフルアズロン抵抗性には関与していないことが明らかとなった。著者はすでにコナガの合成ピレスロイド剤抵抗性にはナトリウムチャネル遺伝子の変異が関与していることを明らかしている(Tsukahara et al.,2003)。しかしながら、解析したナトリウムチャネル遺伝子は機能的に重要な領域に限られており、その他の領域の重要性については明らかとなっていなかった。そこで、本年度は、合成ピレスロイド剤抵抗性系統と感受性系統のナトリウムチャネル遺伝子の全塩基配列を決定し、新たな変異を見出す事を目的として、縮重プライマーを用いたPCRを行い、全長のクローニングを試みた。その結果、ナトリウムチャネル遺伝子のドメインIセグメント1からドメインIIセグメント6を網羅する領域の塩基配列を決定することができた。得られた塩基配列を両系統間で比較したところ、抵抗性系統ではドメインIII-IVリンカー領域とC末端領域において、アミノ酸置換を伴う変異が生じていることが明らかとなった。これらのアミノ酸置換は他の昆虫では報告がなく、合成ピレスロイド剤抵抗性に関与する新たな部位の発見である。しかしながら、本年度においては、当初の目的であったナトリウムチャネル遺伝子の全塩基配列を決定するにはいたらなかった。その理由はナトリウムチャネル遺伝子の3'末端領域がPCRでは増幅されないことであった。3'末端領域にはPCRによる増幅を阻害する強力な高次構造が存在しているのかもしれない。そこで、コナガのcDNAライブラリーを構築した。現在、構築したライブラリーを用いて、未決定となっているナトリウムチャネル遺伝子領域のスクリーニングを行っている段階である。また、次年度の研究計画となっている、コナガのIGR剤抵抗性の解析を行うために、insect growthresulator (IGR)の一種であるクロルフルアズロンを用いて感受性系統の選抜を開始した。昆虫の生活環のどこかを特異的に阻害してその成育を生理的に攪乱する薬剤を総称して昆虫成育制御剤(IGR)と呼ぶ。IGRのなかでもテフルベンズロン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロンなどの薬剤は昆虫のキチン合成を阻害することが知られている。本年度は、コナガのクロルフルアズロン抵抗性の分子機構について解析を行った。これまでコナガのクロルフルアズロン抵抗性には、carboxyamidaseが関与していることが報告されてきた。ところが、様々なコナガ系統のPxGSTE遺伝子の発現をRNAレベルで調べたところ、クロルフルアズロンと合成ピレスロイドの一種であるパーメスリンに抵抗性を示す系統において、PxGSTE遺伝子の発現が高まっていることが明らかとなった。一方、合成ピレスロイド剤の一種であるフェンバレレートのみに抵抗性を示す系統ではそのような高発現は認められなかった。このことは、高いPxGSTE遺伝子発現はクロルフルアズロン抵抗性に関与している可能性を示唆している。そこで、ストックカルチャー(NS系統)をクロルフルアズロンで選抜し、クロルフルアズロン抵抗性(CFR)系統を確立した。選抜後14世代目のCFR系統はNS系統に比べて11倍のクロルフルアズロン抵抗性を示した。また、CFR系統はNS系統に比べて2.3-2.5倍高いGST活性を示した。CFR系統とNS系統のPxGSTE遺伝子の発現を比較したところ、CFR系統で高い遺伝子発現が認められた。以上の結果より、コナガのクロルフルアズロン抵抗性にはPxGSTE遺伝子が関与していることが示唆された。さらに、CFR系統における高いPxGSTE遺伝子の発現がどのような機構によって付与されているかについても検討した。可能性としては1)遺伝子増幅、2)転位因子の挿入、3)遺伝子の変異、4)cis-acting factorの変異、5)trans-acting factorの変異が考えられたが、一連の解析の結果、trans-acting factorの変異が関与していることが示唆された。

これまでコナガの合成ピレスロイド剤抵抗性にはナトリウムチャネルのアミノ酸変異による感受性の低下が関与していることを明らかにしてきた。本年度の解析により、抵抗性に関わる最も重要なアミノ酸変異はナトリウムチャネルのドメインIIS4-IIS6に存在するが、その領域は2つのオルタナティヴ・エキソン(18aおよび18b)によってコードされていることが明らかとなった。エキソン18aとエキソン18bの相同性は塩基配列およびアミノ酸レベルでそれぞれ79%、91%であった。両エキソンとも合成ピレスロイド剤抵抗性に関わるアミノ酸置換部位(T929I)を含んでいた。抵抗性系統ではエキソン18aには感受性型のスレオニンが、エキソン18bには抵抗性型のイソロイシンがコードされていた。一方、感受性系統にはエキソン18a、エキソン18bともにスレオニンがコードされていた。エキソン18aは全ての発育ステージにおいて恒常的に発現していた。エキソン18bの発現も全てのステージで認められたが、3齢および4齢幼虫における発現レベルは低かった。また、4齢幼虫および成虫におけるエキソン18bの発現レベルは胴体部よりも頭部において高かった。以上の結果より、オルタナティヴ・スプライシングは合成ピレスロイド剤に対する感受性の異なるナトリウムチャネルを組織特異的に生み出している可能性が示唆された。また、昨年度報告したコナガのクロルフルアズロン抵抗性に関わるGST-E遺伝子とは別のGST遺伝子(GST-S)を新たにクローニングし、全塩基配列を決定した。さらに、ノーザン解析を行い、発現解析を行った。その結果、GSTS遺伝子はクロルフルアズロン抵抗性には関与していないことが明らかとなった。