hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本各地域に合った渇水緩和対策の提案～ダムか人工林間伐か?～

森林は「緑のダム」と呼ばれ,森林管理によってダムによる水資源確保を代替できるとの主張がある.本研究では,この主張を検証した.国内45のダム流域のうち,森林管理による渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加を上回っていたものは6流域であり,残りの39流域では森林管理による渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加を下回っていた.したがって,上記の主張はほとんどの場合正しくないことがわかった.森林は「緑のダム」と呼ばれ,森林管理によってダムによる水資源確保を代替できるとの主張がある.本研究では,この主張を検証した.国内45のダム流域のうち,森林管理による渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加を上回っていたものは6流域であり,残りの39流域では森林管理による渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加を下回っていた.したがって,上記の主張はほとんどの場合正しくないことがわかった.本研究は、日本全国の各地域を対象に、ダム・人工林間伐による渇水時の流量増加を定量化し、各地域に合った渇水緩和対策を提案するものである。本研究は2つのプロセスからなる.まず,ダムの渇水時流量増加を算定する方法はすでに確立しているので、この方法を全国の多目的ダムの流量データに適用して、ダムによる渇水時の流量増加を定量化する。つぎに、これまでに森林水文の分野で蓄積されてきた流量データを収集して、渇水時流量と年流量の対応関係をモデル化し、すでに定量化している間伐による年流量の変化とあわせることで、間伐による渇水時流量の変化を定量化する。平成20年度は、前者のプロセスを完了させ、また、後者のプロセスにおいて必要となる森林流域の流量データの収集を行った。前者のプロセスについては,すでに開発した,ダムの渇水緩和機能評価方法を全国のダムに適用した.その結果,一般にダムの容量が大きいほど渇水緩和効果が大きいという結果が得られた.後者のプロセスについては,間伐に伴う流量変化を調べた計測研究が文献を収集し、平成21年度に行われるモデル化のためのデータを取得した。また,間伐の渇水緩和機能への影響に大きく影響する蒸散量について,九州大学御手洗水流域において計測を行い,本研究で構築されるモデルの適用可能性を検証するデータを取得した。本研究は、日本全国の各地域を対象に、ダム・森林管理による渇水時の流量増加を定量化し、各地域に合った渇水緩和対策を提案するものである。平成20年度には,全国の45のダムについて,ダムによる渇水時流出量の増加の定量をすでに行っていた.平成21年度には,森林管理による渇水時流出量の増加を算定すたるモデルを作成し,それを上記の45のダム流城に適用した.45のダム流域のうち,森林管理による渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加を上回っていたものは6流域であり,残りの39流域では森林管理による渇水時流出畳の増加がダムによる渇水時流出量の増加を下回っていた.さらに25流域については,森林管理による渇水時流出量の増加が,ダムによる渇水時流出量の増加の20%以下であった.このような結果から,森林管理による渇水時流出量の増加はダムに及ばないことが多いことが明らかとなった.従来,森林管理による渇水時流出量の増加を算定する計測研究は数多ぐ行われてきた.しかし,それらの研究では,計測された渇水時流出量の増加がダムによる渇水時流出量の増加と比較されることがなかった.このため,水資源確保において,森林管理がほかの方法に比べてどの程度有効か明らかでなかった.これは,ダムによる渇水時流出量の増加の算定法の確立,森林管理による渇水時流出量増加のモデル化が成功していなかったからである.本研究はこの2点において成功をおさめ,水資源確保における森林管理の有効性を明らかにした初めての研究である.
有機金属錯体反応場の高次制御と触媒機能

触媒的シリル化反応中間体の構造と反応性に関して,以下の研究成果を得た.1.cis-およびtrans-PtMe(SiPh_3)(PMe_2Ph)_2(1,2)とアセチレンや一酸化炭素等の不飽和小分子との挿入反応について検討し,アセチレンは白金-ケイ素結合へ,一方、一酸化炭素やイソニトリルは白金-炭素結合へ,それぞれ元素特異的に挿入することを見いだした.また錯体の立体配置(シスおよびトランス)が錯体の挿入反応性を決定する重要な因子であることを見いだした.すなわち白金-ケイ素結合へのフェニルアセチレンの挿入反応ではシス錯体1のみが挿入反応性を示したのに対して,白金-炭素結合への挿入反応ではトランス錯体2がシス錯体1と比べて圧倒的に高い反応活性を示した.2.cis-PtMe(GePh_3)(PMe_2Ph)_2(3)を合成し,そのX線結晶構造ならびに還元的脱離反応に対する反応性を対応するシリル(メチル)白金錯体(1)と比較検討した.反応速度論的検討により,錯体1および3はともにジフェニルアセチレン共存下においてPMe_2Ph配位子とジフェニルアセチレンの配位子交換反応によって生成する[PtMe(MPh_3)(PMe_2Ph)(PhC≡CPh]型中間体から還元的脱離反応を起こすことが分かった.またシリル錯体1の方が還元的脱離反応に対してはるかに活性であることを明らかにした.3.ルテニウム触媒存在下,シリルアセチレンの1,2-シリル基転位を伴う新規触媒的環化カルボニル化反応を見いだした.4.触媒的シリル化反応と類似の触媒的ボリル化反応中間体である,ビス(ボリル)白金錯体を合成単離し,そのX線結晶構造を明らかにした.触媒的シリル化反応中間体の構造と反応性に関して,以下の研究成果を得た.1.cis-およびtrans-PtMe(SiPh_3)(PMe_2Ph)_2(1,2)とアセチレンや一酸化炭素等の不飽和小分子との挿入反応について検討し,アセチレンは白金-ケイ素結合へ,一方、一酸化炭素やイソニトリルは白金-炭素結合へ,それぞれ元素特異的に挿入することを見いだした.また錯体の立体配置(シスおよびトランス)が錯体の挿入反応性を決定する重要な因子であることを見いだした.すなわち白金-ケイ素結合へのフェニルアセチレンの挿入反応ではシス錯体1のみが挿入反応性を示したのに対して,白金-炭素結合への挿入反応ではトランス錯体2がシス錯体1と比べて圧倒的に高い反応活性を示した.2.cis-PtMe(GePh_3)(PMe_2Ph)_2(3)を合成し,そのX線結晶構造ならびに還元的脱離反応に対する反応性を対応するシリル(メチル)白金錯体(1)と比較検討した.反応速度論的検討により,錯体1および3はともにジフェニルアセチレン共存下においてPMe_2Ph配位子とジフェニルアセチレンの配位子交換反応によって生成する[PtMe(MPh_3)(PMe_2Ph)(PhC≡CPh]型中間体から還元的脱離反応を起こすことが分かった.またシリル錯体1の方が還元的脱離反応に対してはるかに活性であることを明らかにした.3.ルテニウム触媒存在下,シリルアセチレンの1,2-シリル基転位を伴う新規触媒的環化カルボニル化反応を見いだした.4.触媒的シリル化反応と類似の触媒的ボリル化反応中間体である,ビス(ボリル)白金錯体を合成単離し,そのX線結晶構造を明らかにした.
法隆寺献納宝物と正倉院宝物の源流に関する調査研究-とくに東南アジアに遺存する彫刻・工芸作品を中心に-

1.実施した調査研究の内容本研究の最終年度にあたる今年度は、以下のような調査研究を行なった。(1)文献史・資料および写真資料等の整理本年度の訪問地(タイ・ベトナム・インドネシア)に関する関係作品、制作技法、材料等について、前年度に引き続き、国内外の関連史資料を収集しカード化して整理した。(2)現地調査(訪問先の詳細は調査研究実績の項に記載)現地調査は、AEの5班に分かれて実施した。各調査とも現地で可能な限り詳細な調書を作成し、併せて写真撮影(制作技法に関してはビデオ撮影も援用)を行なった。A班-彫刻、金工の各分担者で構成。タイとインドネシアの各国立博物館及び関連遺跡、寺院において調査研究を行なった。B班-陶磁の分担者で構成。インドネシアの各国立博物館及び関連遺跡において調査研究を行なった。C班-漆工の分担者で構成。タイとベトナムの各国立博物館及び作業所において調査研究を行なった。D班-染織の分担者で構成。タイとインドネシアの各国立博物館及び作業所において調査研究を行なった。E班-交渉史の分担者で構成。(3)現地調査資料の整理と考察(2)の現地調査で得られた調書、写真資料等をカード化して整理し、(1)で得られた史資料と比較検討しながら、各班ごとに考察を行なった。(4)研究会毎月1回、日時および発表者を定め、各分野の研究成果の報告ならびに現地調査にむけての情報交換を行なった。(5)外国人研究分担者の招聘タイ国芸術局次長ニコム・ムシガカマ氏を招聘し、奈良・正倉院事務所、奈良国立博物館、東京国立博物館および関連諸機関を訪れ、法隆寺献納宝物・正倉院宝物とその関連遺品を調査し、タイ国内の遺品との比較検討を行なった。(6)研究総括研究分担者全員の参加により、2年間の調査研究の総括を行ない問題点を検討するとともに、調査研究成果を報告書にまとめて公開した。2.新たに得られた知見(1)彫刻関係では、タイとインドネシアの国立博物館や寺院に所蔵される石仏、金銅仏、押出仏、セン仏のなかに、法隆寺献納宝物中の金銅仏や押出仏の様式的源流となる遺品を多数見いだすことができた。(2)木漆工関係では、正倉院宝物の漆胡瓶との関連で前年度に引き続き、タイの籃胎漆器の巻き上げ技法の解明に努めたほか、ベトナムにおいて両宝物中の螺鈿技法との関連性が注目される作例を見いだした。(3)染織関係では、タイにおいては前年度同様、両宝物中の広東裂と密接な関わりをもつ多色の絣織の調査研究を深め、さらにインドネシアの中部ジャワを中心に両宝物中の纈染との関連で見逃せないバテイックの制作過程の詳細を記録した。(4)金工関係では、ジャカルタ国立博物館でインドネシア中部ジャワのウオノボヨやウオノソボ等で発見された89世紀に遡る数百点にのぼる膨大な金銀および青銅製品を前年度に引き続き調査し、とくに水瓶、鋺、合子および香炉等の制作技法には両宝物中の仏具の制作技法と密接な関連性があることがあきらかとなった。(5)交渉史関係では、前年度に文献史的側面から足がかりを固めたシュリーヴィジャヤ王国の建国地と推定されるインドネシア・スマトラ島パレンバン付近の現地調査を行ない、プレ・ヒンドゥー期の巨石文化やシュリーヴィジャヤ王国期の可能性もあるヒンドゥー・仏教並存期の遺跡などに関する史資料を収集した。

(6)研究総括研究分担者全員の参加により、2年間の調査研究の総括を行ない問題点を検討するとともに、調査研究成果を報告書にまとめて公開した。2.新たに得られた知見(1)彫刻関係では、タイとインドネシアの国立博物館や寺院に所蔵される石仏、金銅仏、押出仏、セン仏のなかに、法隆寺献納宝物中の金銅仏や押出仏の様式的源流となる遺品を多数見いだすことができた。(2)木漆工関係では、正倉院宝物の漆胡瓶との関連で前年度に引き続き、タイの籃胎漆器の巻き上げ技法の解明に努めたほか、ベトナムにおいて両宝物中の螺鈿技法との関連性が注目される作例を見いだした。(3)染織関係では、タイにおいては前年度同様、両宝物中の広東裂と密接な関わりをもつ多色の絣織の調査研究を深め、さらにインドネシアの中部ジャワを中心に両宝物中の纈染との関連で見逃せないバテイックの制作過程の詳細を記録した。(4)金工関係では、ジャカルタ国立博物館でインドネシア中部ジャワのウオノボヨやウオノソボ等で発見された89世紀に遡る数百点にのぼる膨大な金銀および青銅製品を前年度に引き続き調査し、とくに水瓶、鋺、合子および香炉等の制作技法には両宝物中の仏具の制作技法と密接な関連性があることがあきらかとなった。(5)交渉史関係では、前年度に文献史的側面から足がかりを固めたシュリーヴィジャヤ王国の建国地と推定されるインドネシア・スマトラ島パレンバン付近の現地調査を行ない、プレ・ヒンドゥー期の巨石文化やシュリーヴィジャヤ王国期の可能性もあるヒンドゥー・仏教並存期の遺跡などに関する史資料を収集した。1.研究の進展状況本年度は,主として(1)タイ・カンボジア・ラオス・インドネシア・マレーシアの作品に関する文献史・資料及び写真資料等の収集整理,(2)彫刻,工芸,交渉史の各分野に関する研究成果の報告と情報交換のための国内での研究会,(3)上記5ケ国における現地調査(調査研究実績の項に記載)をそれぞれ行ない,いずれも円滑に進捗している。2.新たに得られた知見(1)彫刻関係では,タイとカンボジアの国立博物館や寺院に所蔵される石仏,金銅仏,押出仏,〓仏のなかに,法隆寺献納宝物中の金銅仏や押出仏の様式源流となる遺品を多数見いだすことができた。(2)木・漆工関係では,正倉院宝物の漆胡瓶との関連で,タイで籃胎漆器の竹の巻き上げ技法解明にかかわる技術を見出した。同じくタイで,法隆寺・正倉院両宝物中の撥鏤関係遺品として,8世紀代の撥鏤製櫛の所在を確認した。(3)染織関係では,タイやラオスで法隆寺・正倉院両宝物中に含まれる広東裂と密接に関連する多色の絣織や人物,象などの文様を確認した。さらにタイ・ラオスとも,現代の寺院荘厳に用いられる幡に,法隆寺・正倉院両宝物の幡と関連する形式の幡があることを確認した。(4)金工関係では,ジャカルタ中央博物館で1990年にインドネシア中部ジャワのウオノボヨで発見された89世紀に遡る数百点に及ぶ膨大な金銀製品を調査し,とくに水瓶や鋺,香炉などは,法隆寺・正倉院両宝物中の仏具の源流を考えるうえで見逃せない重要な作品群とみなされた。(5)交渉史関係では,文献から遅くとも7世紀後半には現在のインドネシアのスマトラ島パレンバン付近に建国していたと推定されるシュリーヴィジャヤ王国について,ジャカルタ中央博物館所蔵の碑文を調査することにより文献史的側面からの足がかりを固めることができた。
スペクトリン様蛋白質のシナプス形成における役割に関する研究

シナプス部の基本構成蛋白質が明らかになってきたが、各蛋白質の機能と蛋白質間の相互作用、さらにその機能である神経伝達や神経可塑性については殆ど分かっていない。私たちは、シナプス部に大量に存在するカルスペクチン(カルモデュリン結合スペクトリン様蛋白質)を発見した。この蛋白質は細胞膜を裏打ちし、アクチンとの接点となり、トランスメンブランコントロールや、特殊な細胞膜構造体形成に関与していると考えられる。カルスペクチン-アクチン相互作用の制御機作を解明するため、以下の実験を行なった。粗カルスペクチン分画(主にカルスペクチン=アクチン複合体)はアクチンを架橋し粘度を上昇させるが、【Ca^(2+)】・カルモデュリンにより抑制される。赤血球スペクトリン-4.1蛋白質-アクチン系の【Ca^(2+)】制御もカルモデュリンと4.1蛋白質の相互作用を制御していることを明らかにした。この系でスペクトリンをカルスペクチンに置き換えても、【Ca^(2+)】感受性を示した。実際、粗カルスペクチン分画中に4.1蛋白質抗体と交叉する蛋白質を見いだした。以上のことから、カルスペクチン・アクチン間の【Ca^(2+)】・カルモデュリンによる感受性因子は、4.1蛋白質あるいはその関連蛋白質と考えられる。また、神経伝達機構で注目されているシナプシンIがアクチン・カルモデュリンと結合することも見い出した。シナプス膜分画で発見したカルモデュリン結合蛋白質の1つサイトシナリンは、アクチンの粘度を上昇させ、微小管重合を促進し、カルスペクチンと結合することから、神経細胞骨格の制御蛋白質として機能していることが期待される。
非視覚の光受容におけるオプシンの分子特性と機能の関係

松果体オプシンであるパラピノプシンの分子特性に基づく光受容およびUV光と可視光の比率の検出(色検出)について、ゼブラフィッシュを用いて解析し、以下の結果を得た。(1)色(波長)検出に関わる解析:(i)自然環境のUV光と可視光の強度変化を模倣した刺激を行い、パラピノプシンのみを用いた色検出が可能であるのかを、二光子励起レーザー顕微鏡を用いたイメージングにより詳細に検討した。その結果、夏の午後6時における日向と日陰でのUV光と可視光の比率の差異を検出できることを見出した。(ii)野生型およびパラピノプシン遺伝子破壊個体を用いて、神経節細胞と脳全体を対象としたカルシウムイメージング解析を行った結果、さらなる解析が必要であるものの、数個の神経節細胞を経て脳内の限られた部位の少数の細胞に、松果体光受容細胞から色検出情報が投射している可能性が示唆された。(iii)野生型、オプシン遺伝子破壊個体、眼球除去個体について、明暗やUV光と可視光の比率を変化させた条件下での行動を解析した。その結果、パラピノプシンについては、その光受容が関与する可能性がある行動をいくつか選別でき、今後の解析対象を見出せた。また、1つの松果体オプシン遺伝子破壊個体について、野生型と比較して、特徴的な行動変化を発見した。(2)副松果体の光受容細胞の役割の解析:(i)副松果体のパラピノプシン発現細胞において、パラピノプシンの発現は手綱核の非対称性形成の後であることが示唆された。すなわち、パラピノプシンの光受容が非対称性形成に関与する可能性は低いことが示唆された。(II)副松果体のパラピノプシン発現細胞にはGタンパク質であるトランスデューシンの発現量が非常に少ないことを見出した。したがって、副松果体においてはパラピノプシン細胞が直接手綱核に投射しているものの、光依存的なシグナルを伝達している可能性は低いと考えられた。副松果体に関する研究は、パラピノプシンが副松果体の光受容に関与しない可能性があるなど、想定外の発見があったものの、松果体については、色検出情報の脳への投射解析が順調に進んだことから、概ね順調に進展していると自己判断した。副松果体のパラピノプシンや他のオプシン発現細胞の光応答をカルシウムイメージングにより捉えるとともに、今年度、「パラピノプシンの光受容が関与する行動」の候補として選別した行動について、さらに詳しく解析し、パラピノプシンが受容するUVと可視光の比率情報が関与する生理機能について明らかにする。さらに、今年度の結果を踏まえ、脳全体を対象とした、カルシウムイメージング解析を行う。具体的には、パラピノプシンの分子特性(bistable nature)に依存する光応答を光受容細胞に発生させる光条件において、そのパラピノプシン依存的応答を発生する神経節細胞と脳内細胞を同定する。動物は多様な光受容タンパク質(オプシン)を用いて光を受容し、その情報を視覚や生体リズムの調節等の視覚以外(非視覚)の機能に利用している。本研究では、松果体の「UV光と緑色光の波長識別」と副松果体の「UV光受容」に注目し、オプシンが持つ分子特性と波長識別機能やUV光受容の役割との関係を明らかにすることを目的として、以下の解析を行った。波長識別に関わる解析:(1)視覚で働く視細胞と松果体の光受容細胞が電気的な応答を発生するメカニズムを比較するために、鍵となるcGMP分解酵素(PDE)を両者の間で比較することは重要である。そこで、松果体光受容細胞で機能しているPDEをRNAシークエンスにより解析し、複数種類のPDEを見出した。また、松果体オプシンの分光学的解析を詳細に行い、緑色感受性オプシンの詳細な性質を明らかにした。(2)波長識別の生理機能を理解するために、光受容細胞から脳内領域への波長識別情報の伝達について解析を試みた。GCaMPを光受容細胞、神経節細胞あるいは脳全体に発現させた個体を用いて、UVと緑色光の波長成分の変化に伴う、神経終末のカルシウム濃度変化(活動)を、多光子励起レーザー顕微鏡を用いて蛍光イメージングできる実験系を構築することができた。さらに、次年度以降の解析のために、脳全体にGCaMPを発現しているゼブラフィッシュにおいて、2種類の松果体オプシン遺伝子が破壊されている系統を作製した。副松果体の光受容細胞の役割の解析:ゼブラフィッシュ卵を、受精後直ちに、通常の光条件下、完全暗黒下、UV光下で飼育し、手綱核で発現する左右性決定に関わる分子の発現量が、光条件の影響を受けるのかを検討した。その結果、上述の光条件において、左右の非対称性の大きな違いが生じないことが明らになった。松果体の波長識別を行う光受容細胞において、カルシウム感受性の蛍光タンパク質であるGCaMPが発現し、かつその細胞に含まれるオプシンの遺伝子を破壊した系統の確立を完了した。さらに、多光子顕微鏡によるカルシウムイメージングの実験系を確立し、次年度以降の研究の基礎を作ることができたため、概ね順調に進展していると判断した。オプシンの分子特性と松果体波長識別及び副松果体光受容細胞に関わる解析を行い、以下の結果が得られた。・情報伝達の解析:松果体のRNAシークエンスにより見出したcGMP分解酵素(PDE)について、そのサブユニットの1つに関して、数種類の遺伝子を得た。また、in situ hybridizationによる局在解析に進むことができた。

・松果体オプシンの分子特性と波長識別機能の関連:ゼブラフィッシュの松果体オプシンの内の1つに代わり、視覚オプシンを発現させたゼブラフィッシュ変異体について、その系統を確立した。二光子励起レーザー顕微鏡によるカルシウムイメージング等で、松果体オプシンの分子特性と細胞応答との関係を調べたところ、比較的強い光条件下では、1つのオプシンにより、波長識別がなされていることが示され、予想外の結果が得られた。・UV光/緑色光の波長識別の生理機能の解析:順行性や逆行性のトレーサー実験により、松果体から脳内の様々な部位へと神経投射していることがわかった。GCaMP(GCaMP6s)脳全体に発現させた個体を用いて、上述の投射部位について、UVと緑色光の波長成分の変化に伴う、神経終末のカルシウム濃度変化(活動)を、二光子励起レーザー顕微鏡を用いた蛍光イメージングにより詳細な解析が可能となった。・松果体の光受容細胞の役割に関する解析:ゼブラフィッシュ卵を、受精後直ちに、様々な光条件下で飼育し、副松果体からの入力がある手綱核での左右性決定に関わる分子の発現量と光条件との関係を解析した結果、手綱核の形態的な左右非対称性と光条件の関係について、野生型やパラピノプシン欠損個体においては、明確な関係がないことが示唆された。副松果体には異なるオプシンが発現していることを見出したので、両方のオプシンを欠損した個体での解析が必要であることが明らかになった。副松果体での光受容細胞の機能解析がやや遅れているが新たなオプシンの発現を見出し、より厳密な解析が行える状況が整った。また、松果体オプシンと視覚オプシンを入れ替えた変異体の解析から、1つの光受容細胞でも波長識別が可能であるという新規の予想外の発見があり、今後の研究の展開が期待できる。以上のことから、全体として、おおむね順調であると自己評価した。研究実績の概要オプシンの分子特性と松果体波長識別及び副松果体光受容細胞に関わる解析を行い、以下の結果が得られた。・情報伝達の解析:松果体波長識別に関わる光受容細胞の情報伝達系について解析し、視覚(眼)の場合と比較した。ゼブラフィッシュでは、パラピノプシンは、色覚に関与する錐体細胞のGタンパク質であるトランスデューシン2(Gt2)と共局在しているが、cGMP分解酵素(PDE)も錐体型のものと共局在していることを見いだした。一方、錐体型のGtを持たないヤツメウナギの場合は、視覚と同一のGタンパク質およびPDEと共局在・共役していることを見出した。・松果体オプシンの分子特性と波長識別機能の関連:前年度に作製した松果体オプシンの内の1つに代わり、視覚オプシンを発現させたゼブラフィッシュ変異体を用いて、松果体光受容細胞のカルシウムイメージング解析を行った。その結果、松果体オプシンの分子特性が波長識別応答に必須であり、また光受容細胞に視覚オプシンにはない明順応効果をもたらすことが分かった。・UV光/緑色光の波長識別の生理機能の解析:比較的弱い白色光条件下おいて、松果体細胞がUV光と可視光の識別を行えることを明らかにした。また、脳に投射すると考えられる神経節細胞からカルシウムイメージングにより波長対比応答を記録することに成功した。副松果体の光受容細胞の役割に関する解析:副松果体に存在するパラピノプシン発現細胞の神経活動をカルシウムイメージングにより記録する方法を確立した。
ポリフェノールを応用した生活歯髄切断材料の開発

本研究はカテキンを利用した生活歯髄切断材料を開発することを目的として行った。SDラットの上顎臼歯に対して生活歯髄切断を行った。全身麻酔下で歯冠部歯髄を切断後、酸化亜鉛ユージノールセメントに各濃度のエピガロカテキンガラートを添加し、切断面を覆った。カテキン濃度0.1%ではコントロール(カテキン濃度0%)と比較して炎症性細胞浸潤の変化は軽度であった。カテキン濃度1.0%と5.0%では炎症性細胞浸潤は減少していた。続いてStreptococcus mutansに対する抗菌作用について検討した。カテキンの濃度が0.01%の場合、培養24時間後ならびに48時間後の細菌量が約半分程度抑制されていた。近年、ホルモクレゾール(FC)の発がん性が指摘され、生活歯髄切断はFC法ではなく、水酸化カルシウム法が主に用いられるようになった。しかし、その効果はFC法と比較して弱く、必ずしも予後に満足が得られるとは言えない。そこで本研究の目的は、ポリフェノールを使用した新たな生活歯髄切断材料の開発とした。ポリフェノールは様々な植物に色素や苦味の成分として含まれており、その作用が注目されている。ポリフェノールの一種であるカテキンはワインやお茶に多く含まれ、強い抗酸化作用を有することが報告されている。また、同じくポリフェノールの一種であるタンニンはラット歯髄由来細胞において、COX-2mRNAならびにタンパク質の発現を抑制することにより、プロスタグランジンE2の産生を減少させ、歯冠修復材料抽出液によって惹起された炎症を抑える働きを有することが明らかになっている。今年度はカテキン(エピガロカテキンガラート)を利用したin vivoの実験系を主に行った。緑茶の主な有効成分であるカテキンを酸化亜鉛ユージノールセメントに添加し、6週齢のSDラットに生活歯髄切断した後、カテキン含有酸化亜鉛ユージノールセメントで歯髄を被覆した。生活歯髄切断後1週間ならびに1か月における組織学的評価において、コントロールである酸化亜鉛ユージノールセメント(カテキン非含有)と比較して、炎症性細胞の減少が認められた。また、カテキンの濃度の上昇に伴いその効果が増強することがわかった。in vivoの実験系は順調に進んでいるのに対して、in vitroの実験系があまり進んでいないが、こちらはin vivoと比較して時間をかけずに進めることができるため、全体としてはおおむね順調に進んでいると考えられる。乳歯や幼若永久歯に対してう蝕が歯髄にまで達した場合に生活歯髄切断法が用いられることがある。現在は水酸化カルシウム法が主に用いられているが、その効果は必ずしも高いとはいえない。ポリフェノールの一種で緑茶などに含まれるカテキンは強い抗酸化作用を有することが報告されている。また、同じくポリフェノールの一種であるタンニンはラット歯髄由来細胞において、COX-2mRNAならびにタンパク質の発現を抑制することによりプロスタグランジンE2の産生を減少させ、歯冠修復材料抽出液によって惹起された炎症を抑える働きを有することが明らかになっている。今年度は昨年度に続きカテキン(エピガロカテキンガラート)を利用したin vivoの実験系を主に行なった。酸化亜鉛ユージノールセメントにカテキンを各濃度(0,0.1,1,5%)添加し、6週齢のSDラットに対して生活歯髄切断を行い切断面に貼付したところ、以下の結果を得た。コントロール(カテキン0%)において多くの炎症性細胞浸潤が認められた。1%ならびに5%のカテキンを添加することにより、炎症性細胞浸潤減少することが確認された。ALP染色を行なったところ、明らかにALP活性が認められる部位はなかった。また、TRAP染色を行なったところ、一部でTRAP陽性細胞が確認され、硬組織吸収像が認められた。今後はヒト抜去歯から歯髄由来細胞を採取し、カテキンを作用させてカテキンの作用機序を解明していく。必要な倫理審査は昨年度取得している。in vivoの実験系は概ね順調に進んでいる。in vitroの研究についても、ヒト歯髄細胞取得の倫理申請は無事に取得でき、実行するのみとなっている。ポリフェノールは様々な植物に色素や苦みの成分として含まれており、その作用が注目されている。ポリフェノールの一種であるカテキンはワインやお茶に多く含まれ、強い抗酸化作用があることが報告されている。7週齢のSDラットの上顎臼歯に対して生活歯髄切断を行った。全身麻酔下で歯冠部歯髄を切断後、酸化亜鉛ユージノールセメントに各濃度のエピガロカテキンガラート(0.1%、1.0%、5.0%)を添加し、切断面を覆った。さらに上部は即時重合レジンで封鎖した。1週間後、上顎臼歯にHE染色組織切片標本を作製し、観察した。続いてエピガロカテキンガラートの抗菌作用を評価するために、Streptococcus mutansをTY培地で増殖させる時の培地中にカテキンを含有させた場合について検討した。エピガロカテキンガラートの濃度が0.01%の場合、培養24時間後ならびに48時間後の細菌量が約半分程度抑制されていた。さらに、カテキンを持続的に作用させるために、材料にカテキンをチャージする機能を付与することを検討した。

カテキンをチャージする機能を付与するために、nano porous silica(NPS)を材料に添加して、添加した場合としない場合で比較した。その結果、NPS含有材料はそうでないものと比較して多くのカテキンをチャージし、徐々にリリースすることが確認された。抗菌作用や抗炎症作用を有するカテキンと、カテキンを多く含有することができて徐々にリリースすることを可能とするNPSの応用により、新しい生活歯髄切断材料が開発されることが示唆された。本研究はカテキンを利用した生活歯髄切断材料を開発することを目的として行った。SDラットの上顎臼歯に対して生活歯髄切断を行った。全身麻酔下で歯冠部歯髄を切断後、酸化亜鉛ユージノールセメントに各濃度のエピガロカテキンガラートを添加し、切断面を覆った。カテキン濃度0.1%ではコントロール(カテキン濃度0%)と比較して炎症性細胞浸潤の変化は軽度であった。カテキン濃度1.0%と5.0%では炎症性細胞浸潤は減少していた。続いてStreptococcus mutansに対する抗菌作用について検討した。カテキンの濃度が0.01%の場合、培養24時間後ならびに48時間後の細菌量が約半分程度抑制されていた。現時点で研究を進める上で問題点はないが、今後は、組織学的観察と並行し、ラット歯髄より細胞を採取し、分子生物学的手法を用いた解析を進めることにより研究のスピードアップを図る。組織学的観察を進めながら、ヒト歯髄由来の細胞を利用した分子生物学的解析を進める。小児・障害者歯科消耗品の使用頻度が想定よりもわずかに少なく、その分使用額が少なくなったため。消耗品の使用頻度が想定よりもわずかに少なく、その分使用額が少なくなったため。in vitroの研究が進め、消耗品の購入にあてる。In vitroの研究を進め、消耗品の購入にあてる。
求電子型フッ素化剤光反応による機能デバイス半導体表面の三次元形状創成加工

プロジェクター縮小光学系を使用し、N-フルオロピリジニウム塩を用いた光エッチングにより、シリコン表面に凸型球面形状を形成した。プロジェクター縮小光学系を使用した光エッチングを用い、縦方向曲げ構造を有するシリコン光導波路を形成し、曲げ構造による横方向導波路を通った光の縦方向伝送を実証した。多光束干渉系を開発し、三光束干渉系を用いた光エッチングにより、格子状のシリコン表面テクスチャを形成した。プロジェクター縮小光学系を用いて、シリコンウェハのN-フルオロピリジニウム塩による光エッチングを行い、球面凸型シリコン基板を製作し、シリコンの凸型球面加工が可能であることを明らかにした。凸型球面加工光照射強度分布パターンを表計算ソフトウェアを用いて数値化し、プログラムを用いてグレースケール表現画像を作成した。シリコン(100)ウェハを紫外線オゾン洗浄、希フッ酸洗浄し、シリコン表面にN-フルオロピリジニウム塩を液状で塗布し、プロジェクター縮小光学系を用いて光強度分布パターン画像を投影した。シリコンの光エッチング後、アセトン中超音波洗浄によりN-フルオロピリジニウム塩を除去した。球面凸型シリコン表面の三次元形状を走査型白色干渉計を用いて測定し、表面の形状精度を明らかにした。形状精度の最高最低差(Peak to Valley)値、二乗平均平方根(Root Mean Square)値は、球面と球面頂点を通る断面との交線の曲率半径に依存しないことを見いだした。光エッチング前後のシリコン表面マイクロラフネスを走査型原子間力顕微鏡を用いて測定し、光エッチングにより表面マイクロラフネスが増大しない条件を明らかにした。光エッチング後のシリコン表面形状を走査型電子顕微鏡を用いて測定し、表面形状の光照射強度依存性を明らかにし、光エッチングに適した光照射強度を確認した。N-フルオロピリジニウム塩の核磁気共鳴測定により、構造が異なるN-フルオロピリジニウム塩のフッ素化力の強弱を明らかにした。フッ素化力が強いとシリコンの光エッチング速度が速いことを明らかにし、光エッチングに適したN-フルオロピリジニウム塩を確認した。プロジェクター縮小光学系を用いて光照射強度分布パターンを投影し、シリコン・オン・インシュレータウェハのシリコン層、シリコン・オン・クォーツウェハのシリコン層のN-フルオロピリジニウム塩による光エッチングを行い、シリコン表面の曲面形状を走査型白色干渉計を用いて測定し、シリコンの曲面形状加工が可能であることを明らかにした。ウェハを硫酸・過酸化水素水洗浄、希フッ酸洗浄し、シリコン表面にN-フルオロピリジニウム塩を液状で塗布し、プロジェクター縮小光学系を用いて光照射強度分布パターン画像を投影した。光エッチングによりシリコン表面を曲面形状加工したシリコン・オン・インシュレータウェハ、シリコン・オン・クォーツウェハ基板の側面から波長1.52μmのレーザー光を基板表面に平行にシリコン層に導入し、シリコン曲面形状部の基板裏面からの出射光を測定し、シリコン曲面加工部を光導波路縦方向曲げ部として光が伝搬することを明らかにした。基板の横方向から縦方向への光伝搬は、光配線への応用上重要である。二光束干渉光学系、多光束干渉光学系を構築し、干渉縞を形成して干渉縞の制御法を開発した。二光束干渉光学系は、中心波長が785nmの波長安定化半導体レーザー、ビームスプリッター、ミラーを用いて構築し、二光束干渉縞を観察した。多光束干渉光学系は、レーザー、多光束干渉用ハーフミラーを用いて構築し、二光束干渉縞、三光束干渉縞を観察した。光導波路半導体の曲面加工については、プロジェクター縮小光学系を用いて光照射強度分布パターンを投影し、シリコン・オン・インシュレータウェハのシリコン層、シリコン・オン・クォーツウェハのシリコン層のN-フルオロピリジニウム塩による光エッチングを行い、シリコン表面の曲面形状を走査型白色干渉計を用いて測定し、シリコンの曲面形状加工が可能であることを明らかにした。半導体光導波路の分析・解析においては、ウェハ基板の側面から波長1.52μmのレーザー光を基板表面に平行にシリコン層に導入し、シリコン曲面形状部の基板裏面からの出射光を測定し、シリコン曲面加工部を光導波路縦方向曲げ部として光が伝搬することを明らかにした。多光束干渉による半導体表面テクスチャ形成の研究においては、二光束干渉光学系、多光束干渉光学系を構築し、干渉縞を形成して干渉縞の制御法を開発した。光エッチングにより形成した縦方向曲げ構造により、横方向から縦方向への光伝送を実証した。プロジェクター縮小光学系を用いた光エッチングによる基板の垂直方向の曲面加工とリソグラフィ・ウェットエッチングを用い、横方向光導波路の一方の端部の形状が曲面の縦方向曲げ構造を有する光導波路を形成した。導波路の端部側面から波長1.52μmの半導体レーザー光を基板表面に平行にシリコン導波路に導入し、縦方向曲げ構造部の基板裏面からの出射光強度を光検出器で測定した。シリコン・オン・インシュレータウェハ、シリコン・オン・クォーツウェハ、バルクシリコンウェハ基板上に形成した縦方向曲げ構造を有するシリコン光導波路の光伝送出力を検出した。縦方向曲げ構造を形成していない導波路の出力は検出限界未満であった。基板の横方向から縦方向への光伝送は、三次元光配線への応用上重要である。シリコンウェハ上のN-

フルオロピリジニウム塩に金属探針を接触させ、シリコンと塩に電圧を印加し、塩に正の電圧を印加することによりエッチング速度が増加することを明らかにした。シリコンから塩への電子の供給量が増加することにより、塩からシリコンへのフッ素の供給量が増加し、エッチング速度が増加したと考えられる。多光束干渉光学系による干渉縞の制御法を活用し、光エッチングによりシリコン表面に規則的なテクスチャを形成できることを実証し、テクスチャ形状の制御法を開発した。多光束干渉光学系は、中心波長が785nmの波長安定化半導体レーザー、多光束干渉用ハーフミラーを用いて構築し、三光束干渉縞を観察した。表面の形状は、走査型白色干渉計を用いて測定した。1回の光照射により断面が波型のラインが形成され、続けてシリコンウェハを90°回転させた光照射によりテクスチャが格子状に形成されることを明らかにした。プロジェクター縮小光学系を使用し、N-フルオロピリジニウム塩を用いた光エッチングにより、シリコン表面に凸型球面形状を形成した。プロジェクター縮小光学系を使用した光エッチングを用い、縦方向曲げ構造を有するシリコン光導波路を形成し、曲げ構造による横方向導波路を通った光の縦方向伝送を実証した。多光束干渉系を開発し、三光束干渉系を用いた光エッチングにより、格子状のシリコン表面テクスチャを形成した。半球面凸型半導体基板の製作については、プロジェクター縮小光学系を用いて光強度分布パターンを投影し、シリコンのN-フルオロピリジニウム塩による光エッチングを行い、球面凸型基板を製作し、シリコンの凸型球面加工が可能であることを明らかにした。半球面凸型半導体表面の分析においては、走査型白色干渉計を用いて球面凸型シリコン表面の三次元形状を測定し、表面の形状精度を明らかにした。光エッチング前後のシリコン表面マイクロラフネスの変化を走査型原子間力顕微鏡を用いて測定した。光エッチング現象の解析においては、フッ素化剤であるN-フルオロピリジニウム塩の核磁気共鳴測定により、N-フルオロピリジニウム塩のフッ素化力を明らかにし、フッ素化力とシリコンの光エッチング速度との相関を明らかにした。半導体光導波路の解析を継続して遂行する。光エッチングメカニズムの解明を推進する。特に、シリコンウェハ上のN-フルオロピリジニウム塩に金属探針を接触させ、シリコンと塩に電圧を印加し、エッチング速度との相関を明らかにし、光エッチングメカニズムを解明する。また、多光束干渉による半導体表面テクスチャ形成の研究を継続して実施する。特に、多光束干渉光学系による干渉縞の制御法を活用し、光エッチングによりシリコン表面に規則的なテクスチャを形成できることを実証し、テクスチャ形状の制御法を開発する。28年度が最終年度であるため、記入しない。工学研究を研究計画通りに遂行する。光導波路半導体の曲面加工を推進する。特に、シリコン・オン・インシュレータウェハのリソグラフィ、シリコン層のエッチングを行い、直方体形状のシリコン光導波路を形成し、プロジェクター縮小光学系を用いて直方体端の光エッチングを行い、曲面形状、また平面状の斜め側面形状を形成する。また、半導体光導波路の分析・解析を行う。
樹脂酸類の生物変換とその多角的利用

沈香の生成に微生物が関与していることに着目し、沈香生成菌と考えられているカビ及びバクテリヤ51種類を選び、デヒドロアビエチン酸、ファルネソ-ル、ネロリド-ル、テトラリン、ヌ-トカトン、カウレンなどを基質として微生物変換を行った。デヒドロアビエチン酸では2ー位、7ー位、16ー位の水酸化がそれぞれ高収率で起こることを見出した。ファルネソ-ルではIFO7706(Fusarium oxysporumf)により3,7,11ートリメチルー2,6,10ードデカトリエン酸が、IFO3521(Pseudomonas aureofaciens)により3,7,11ートリメチル2,10ードデカトリエン1,7ージオ-ルが高い選択性で得られ、合成法としても利用できることを示した。ネロリド-ル、テトラリン、カウレンについては良い結果は得られなかった。テトラリン、カウレンについては基質が水に溶けないことに問題があり、水酸化、リン酸エステル化によって水溶性として変換を行いたいと考えている。ヌ-トカトンについては現在生成物を分離、構造決定を行っている。またデヒドロアビエチン酸の液晶としての利用の可能性を見るためにデヒドロアビエチン酸の化学変換を行い、デヒドロアビエチン酸の13ー位のアミノ基への変換及び各種置換フェノ-ル類とデヒドロアビエチン酸のエステルを合成し、液晶性を検討している。また、資源開発の目的で松柏類の樹脂成分の検索をコウヤマキ、白松について行い、とくにコウヤマキについては日本列島の日本構造線と成分の相関について調査を行っている。沈香の生成に微生物が関与していることに着目し、沈香生成菌と考えられるカビ及びバクテリヤを22種類を選び、デヒドロアビエチン酸,フアルネソ-ル、ネロリド-ル、テトラリンなどを基質として変換を試み、デヒドロアビエチン酸はIFO4400により7位の水酸化が、またIFO8835では7位にケト化が起ること、また、ファルネソ-ル、ネロリド-ルを基質とした場合には、IFO7706によってファルネソ-ルの6位の二重結合に水の付加がおこり、ワ-ヒドロキシル体が、またIFO3521によって末端水酸基の炭素の酸化が高い選択性でおこり、合成法としても利用できることを見出した。ネロリド-ル,テトラリンでは見るべき結果は得られなかった。デヒドロアビエチン酸誘導体の液晶としての利用の可能性を見るためにデヒドロアビエチン酸の化学変換を試みデヒドロアビエチン酸の13位をアミノ基に変換し、更にPーアルコキシベンザルデヒドとの反応により、Pーアルコキシベンジリデン13ーアミノデヒドロアビエチン酸を合成し液晶性の検討を行った。資源開発の観点から、松柏類の成分について再検討を加えることゝし、白松、コウヤマキについて成分検索を行った。とくにコウヤマキについては化学的分類の観点から、日本構造線と分布しているコウヤマキの成分に関しておゝよそ3つのタイプに分けられることを見出した。ファルネソ-ルではIF07706(Fusarium oxysporumf)により3.7,11ートリメチルー2,6,10ードデカトリエン

酸が、IFO3521(Pseudomonas aureofaciens)により3,7,11ートリメチル2,10ードデカトリエン,1,7ージオ-ルが高い選択性で得られ、合成法としても利用できることを示した。ネロリド-ル、テトラリン、カウレンについては良い結果は得られなかった。テトラリン、カウレンについては基質が水に溶けないことに問題があり、水酸化、リン酸エステル化によって水溶性として変換を行いたいと考えている。ヌ-トカトンについて現在生成物を分離、構造決定を行っている.またデヒドロアビエチン酸の液晶としての利用の可能性を見るためにデヒドロアビエチン酸の化学変換を行い、デヒドロアビエチン酸の13ー位のアミノ基への変換及び各種置換フェノ-ル類とデヒドロアビエチン酸のエステルを合成し、液晶性を検討している。また、資源開発の目的で松柏類の樹脂成分の検索をコウヤマキ、白松について行い、とくにコウヤマキについては日本列島の日本構造線と成分の相関について調査を行っている。
火山噴煙の非定常3次元数値モデルの構築と防災利用に向けた簡易モデルの提案

爆発的な火山噴火では火山灰と火山ガスからなる噴煙が大気中へと放出される.本研究では,噴火の強さと噴煙高度の関係,及び,噴火の強さと火砕流の発生条件を3次元数値シミュレーションによって求めた.また,その結果を基に,大規模計算を行わなくても簡易に噴煙高度や火砕流発生条件を見積もれる1次元解析モデルを改良することに成功した.爆発的な火山噴火では火山灰と火山ガスからなる噴煙が大気中へと放出される.本研究では,噴火の強さと噴煙高度の関係,及び,噴火の強さと火砕流の発生条件を3次元数値シミュレーションによって求めた.また,その結果を基に,大規模計算を行わなくても簡易に噴煙高度や火砕流発生条件を見積もれる1次元解析モデルを改良することに成功した.火山災害において最も深刻な災害を引き起こすひとつである噴煙について,そのダイナミクスの理解と挙動の再現・予測を目的に数値シミュレーション研究を行った.爆発的火山噴火では,火山灰と火山ガスからなる噴煙が火砕流として周囲数十kmの範囲を荒廃させ,同時に噴煙からは多量の火山灰が周囲数百km,数千kmに降り積もる.爆発的火山噴火はピナツボ1991年噴火のような大規模噴火から毎年各地で起こるような小噴火まで様々な規模があり,噴火規模の指標となる噴出率の桁は6桁以上に及ぶ.特に,小中規模の噴火は,計算分解能と計算速度の関係から数値シミュレーションが難しい.本年度は,より小さな噴火の噴煙挙動を再現できる数値プログラムの開発を中心に行った.火口付近の細かな構造と噴煙全体の大きな構造を同時に再現するための一般座標系を組み込んだ新たな噴煙プログラムを作成した.その結果,ピナツボ規模の噴火から噴出率がその1000分の1程度の噴火までをシミュレーションすることが可能になった.また,火山噴煙ダイナミクスを主に支配すると考えられている乱流混合効率を数値計算結果から直接求めることに成功し,最近の室内実験研究等で示唆されていた乱流混合効率の局所的変化を噴煙の場合にも存在することを明らかにした.特に,火口付近で浮力が大きく変化するような領域では,単純なジェットやプルームよりも乱流混合効率が小さくなるため,防災上重要となる火砕流の発生条件にも大きく影響することが示唆された.最も深刻な災害を引き起こす自然災害のひとつである火山噴煙について,そのダイナミクスの理解と挙動の再現・予測を目的に数値シミュレーション研究を行っている.爆発的火山噴火では,火山灰と火山ガスからなる噴煙が火砕流として周囲数十kmの範囲を荒廃させ,同時に成層圏まで上昇した噴煙からは多量の火山灰が周囲数百kmの範囲に降り積もる.また,噴火の規模によってもその災害範囲は大きく変化するため,数オーダーに渡るスケールの現象を再現できる数値プログラムが必要となる.さらにそのプログラムによる数値シミュレーション結果から,噴火条件と噴煙防災の関係を防災上利用可能な単純な形で結びつけることが最終目標となる.1年目である平成20年度は,比較的計算量が小さな大規模噴火から膨大な計算量が必要となる。小中規模噴火までを再現できる数値プログラムを構築した.2年目である本年度は,作成したプログラムを用い,噴煙内部で起こる乱流混合の基礎的理解を目指した.数値計算の結果,小中規模噴煙における乱流混合効率は単純なジェットやプルームとは異なり,高度によって変化することが初めて判った.同時に,3次元シミュレーション結果を基に非常に詳細な渦の構造を可視化することで,乱流混合効率の変化が渦構造の変化に対応することを明らかにした.以上の結果は論文誌上に発表した.乱流混合効率の変化は噴煙が火砕流を発生させるか否かに密接に関係するため,最終年度の平成22年度に作成を予定している噴煙のレジームマップ(流れの相図)の理解に役立つと期待できる.爆発的な火山噴火では,火山灰と火山ガスからなる噴煙が大気中に放出され,大きな災害を引き起こす.噴煙が上空へと上昇すると非常に広範囲に降灰被害をもたらす.一方,噴煙が地表面を流れ下ると高温の火砕流となり,火山近隣を焼き尽くす被害をもたらす.したがって,火口での噴火条件が与えられた時に,噴煙の高度や拡大半径,火砕流の発生条件を予測することが防災上重要な問題となってくる.本プロジェクトでは,大規模数値計算に基づいて,火山噴煙ダイナミクスの理解とその防災利用を目的に研究を行った.前年度までに,大規模噴火から,膨大な計算量が必要となる小中規模噴火までを再現できる数値プログラムを開発し,噴煙高度や火砕流発生条件を支配する噴煙内部の乱流混合について非常に高精度の数値シミュレーションを行った.その結果,噴煙内部では高さによって乱流混合効率が異なることを明らかにした.特に,火口付近では混合効率が小さく,これまで予想されていたよりも火砕流が発生しやすいことが予想された.そこで,以上の結果を確かめるために,多数の大規模シミュレーションからなるパラメータスタディを系統的に行い,これまでにない詳細な火砕流の発生条件を成果として得た.さらに,噴出速度が音速を超えると噴煙内部に衝撃波構造が形成され,噴煙は大気を混合しにくい噴水構造をつくり,先行研究で示されたよりも火砕流が発生しやすいことを定量的に初めて示すことができた.
胆汁酸の機能解析を基軸とした肝線維化抑制に関連する新規標的因子の探求

肝星細胞の活性化は肝線維化と密接な関係にあり、抗線維化治療の標的として注目されている。本研究では前年度に引き続き、肝星細胞活性化に対する胆汁酸の影響についてヒト初代培養星細胞(HHSteC)を用いて検討した。そこでHHSteCでLCA添加時にaSMAの遺伝子発現が減弱する分子機序を解析することにしたHHSteCにLCA 100uMを添加し、5,20,60分培養後のシグナル伝達に関わる蛋白リン酸化に関してWestern blottingで確認した。LKB-1, AMPK, AKT及びMAPKファミリーに属するERK1/2, JNK1/2, p38は5,20分でリン酸化を認めた。しかしながら、aRaf, cRaf, FAK, YAPはいずれの時間帯でも変化を認めなかったが、bRafのリン酸化、特に、抗がん剤の耐性に寄与すると考えられているスプライシングバリアント体のリン酸化が活性化が上昇していた。現在、活性化したシグナルと遺伝子発現や形態変化との関連を解析している。肝星細胞(HSC)の活性化は肝線維化と密接な関係にあり、抗線維化治療の標的として注目されている。胆汁酸は腸肝循環しており恒常性維持に寄与しているが、HSCへの影響に関して未知である。本研究ではHSC活性化に対する胆汁酸の影響をヒト初代培養星細胞(HHSteC)を用いて検討した。LCAはビタミンD受容体(VDR)と強い親和性があり活性化することが知られているので、HHSteCに1.25-(OH)2ビタミンD (VitD、100 nM)を添加、48時間培養後の遺伝子発現変化を定量的PCRで解析し、LCAの遺伝子変化と比較した。VitDはHHSteCのaSMA発現減弱させたが、PPARg発現増強させなかった。またVitDはVDRの標的遺伝子CYP24A1発現を増強させたが、LCAはCYP24A1発現を変化させなかった。以上よりLCAの遺伝子発現変動はVDR以外の因子を介して作用していると推定された。3つの胆汁酸類似化合物およびLCAのタウリン抱合体(TLC)についても同様に観察した。TLCはLCAよりも高濃度でaSMA発現減弱させた。興味深いことに化合物XはLCAよりも低濃度でaSMA発現減弱、PPARg発現増強させLCAよりも効果が強かった。他の化合物は変化させなかった。LCAとマグネットビーズの結合反応が想定以上に難しく、その最適条件を決定するために時間を要しているため。HHSteCに主要胆汁酸5種類を添加して培養したところ、HHSteCはリトコール酸(LCA)添加のみでスフェロイド様の形態変化を示し、定量的PCRでAlpha-Smooth muscle actin(aSMA)の発現減弱、Peroxisome proliferator-activated receptor g(PPARg)の発現増強を認めた。HHSteCにVDR, FXR, TGR5, PXRのアゴニストである1.25-(OH)2ビタミンD, FXR作動薬(Obeticholic acid, GW4064),タウロリトコール酸,リファンピシンを添加し、HHSteCのaSMA遺伝子発現を定量的PCRで確認したが、LCA添加時と同様の変化を認めるものがなく、LCA添加時にもこれらの受容体のターゲット遺伝子の発現変化が明らかではなかったことから、LCA添加時にHHSteCのaSMA遺伝子発現が減弱するメカニズムには新たな経路が関与していることが示唆された。そこでHHSteCでLCA添加時にaSMAの遺伝子発現が減弱する分子機序を解析することにした。HHSteCにLCA 100uMを添加し、5,20,60分培養後のシグナル伝達に関わる蛋白リン酸化に関してWestern blottingで確認した。しかしながらcRaf, FAK, YAPはいずれの時間帯でも変化を認めなかった。リトコール酸と結合する蛋白を同定するために、共沈降法を用いて目的蛋白を回収し、SDS-PAGEもしくはWestern blotting法を用いて目的蛋白を同定することを計画していたが、リトコール酸-マグネットビーズを用いた方法でリトコール酸に結合する新規たんぱく質の同定が困難で、他の方法で分子機序解析を行う方法を取ったため。

しかしながら、aRaf, cRaf, FAK, YAPはいずれの時間帯でも変化を認めなかったが、bRafのリン酸化、特に、抗がん剤の耐性に寄与すると考えられているスプライシングバリアント体のリン酸化が活性化が上昇していた。現在、活性化したシグナルと遺伝子発現や形態変化との関連を解析している。ここまでの実験結果よりLCAのHSC活性化抑制作用がVDRを介しているものではないことが示唆された。現在、LCAが作用する既知の因子(TGR5、PXR、FXR)について検証しており、確証実験を引き続き実施する。上記に加え、研究連携者が化合物Xに結合するタンパク質を同定に成功している手法、マグネットビーズと結合させたLCAとタンパク質を共沈降させて質量分析にて、LCAと結合するタンパク質を同定する。Western blotting法を用いてタンパク質を確証させる。同定されたタンパク質の活性化(もしくは阻害物質)をHHSteCに添加して、実際にHSC活性化(もしくは活性化抑制)されることを確認する。また同定されたタンパク質の活性化(もしくは阻害物質)を線維化動物モデルに投与して線維化が増悪(もしくは改善)することを確認する。更に肝硬変患者からHSCをLaser Microdissectionで単離し、同定されたタンパク質の発現を免疫染色もしくはWestern blottingで確認する。また血清ALT、総ビリルビン、血小板、アルブミンや線維化マーカーであるヒアルロン酸、IV型コラーゲン、M2BP糖鎖修飾異性体を測定し、肝内の同定された蛋白の発現量との相関関係をみる。本年度の研究からLCAの添加時にHHSteCの細胞接着間の結合が変化することが示唆された。特にLKB-1やAMPKなどはカドヘリンやインテグリンといった結合タンパク質のシグナルと関係しており、今後、定量的PCRでそれらのmRNA発現量を確認し、Western blottingでたんぱく質の発現量を確認して、HHSteCに発現する分子種を同定する。また、siRNAノックダウン法を用いて、LCAの作用にその結合たんぱく質が寄与しているか否かを検討する。本研究ではLKB-1やAMPK以外にもMAPKファミリーに属するERK1/2, JNK1/2, p38の蛋白リン酸化が確認されており、これらに関してもLCA作用との関連性について調べる。また、MAPKファミリーはインテグリンシグナルと深く関与しており、aSMAやPPARgの発現制御とインテグリンシグナルについて詳細に調べる。また同定されたたんぱく質の活性化物質(阻害物質)を線維化動物モデルに投与して線維化が増悪(もしくは改善)することを確認する。更に肝硬変患者の組織標本において同定たんぱく質の発現を免疫染色で確認する。また血清肝胆道系酵素、血小板、アルブミンや線維化マーカーであるIV型コラーゲン7S、M2BP糖鎖修飾異性体を測定し、同定された蛋白の発現量との相関関係をみる。LCAとマグネットビーズの結合反応が想定以上に難しく、その最適条件を決定するために時間を要したので、質量分析など次の実験に至らなかった。