hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エクジステロイドリン酸化酵素の精製と遺伝子解析

エクジソンリン酸化酵素Ecdysone kinase(EKinase, ATP : ecdysone phosphotaansferaseは,遊離型エクジソンを基質としてエクジソン22リン酸(E22P)の生合成を触媒する酵素である.この酵素は,今のところ昆虫のみで見出されたユニークな酵素であるが,酵素化学的な解析はほとんど行われていない.そこで本研究は,リン酸抱合体生成の生理的な意義を明らかにすること,リン酸化酵素の精製と遺伝子の解析を目的として行われた.まず,E22Pの生理活性を調べるためにカイコのエクジステロイドレセプター(BmEcR/BmUSP)を遺伝子工学的に合成し,レセプターとE22Pの親和性を他のエクジステロイドのそれと比較した.その結果,E22Pの親和性はエクジソンの約3%,20-ヒドロキシエクジソンの約0.02%であった.この結果は,E22Pは不活性型であることを示している(Makka et al.,2002).この結果と,カイコの卵巣に大量に蓄積したE22Pが卵へ移行し胚発生の最中に脱リン酸化されること(Yamada and Sonobe, 2003)と合わせて考えると,リン酸抱合体はホルモンの貯蔵的役割を担っていると考えてよさそうである.次に,EKinaseの測定法を確立し,カイコの卵巣を材料として精製を試みた.EKinaseは可溶性画分に存在し,陰イオン交換,金属キレート,ゲルろ過,アフィニティーなどのクロマトグラフイーにより精製が進められた(眞下・園部,2003).現在まで,電気泳動的に単一のバンドに精製できたが,時間的な都合で遺伝子解析までは至らなかった.エクジソンリン酸化酵素Ecdysone kinase(EKinase, ATP : ecdysone phosphotaansferaseは,遊離型エクジソンを基質としてエクジソン22リン酸(E22P)の生合成を触媒する酵素である.この酵素は,今のところ昆虫のみで見出されたユニークな酵素であるが,酵素化学的な解析はほとんど行われていない.そこで本研究は,リン酸抱合体生成の生理的な意義を明らかにすること,リン酸化酵素の精製と遺伝子の解析を目的として行われた.まず,E22Pの生理活性を調べるためにカイコのエクジステロイドレセプター(BmEcR/BmUSP)を遺伝子工学的に合成し,レセプターとE22Pの親和性を他のエクジステロイドのそれと比較した.その結果,E22Pの親和性はエクジソンの約3%,20-ヒドロキシエクジソンの約0.02%であった.この結果は,E22Pは不活性型であることを示している(Makka et al.,2002).この結果と,カイコの卵巣に大量に蓄積したE22Pが卵へ移行し胚発生の最中に脱リン酸化されること(Yamada and Sonobe, 2003)と合わせて考えると,リン酸抱合体はホルモンの貯蔵的役割を担っていると考えてよさそうである.次に,EKinaseの測定法を確立し,カイコの卵巣を材料として精製を試みた.EKinaseは可溶性画分に存在し,陰イオン交換,金属キレート,ゲルろ過,アフィニティーなどのクロマトグラフイーにより精製が進められた(眞下・園部,2003).現在まで,電気泳動的に単一のバンドに精製できたが,時間的な都合で遺伝子解析までは至らなかった.エクジソンリン酸化酵素Ecdysonekinase(Ekinase),ATP : ecdysone phosphotaranferaseは,遊離型エクジソンを基質としてエクジソン22リン酸(E22P)の生合成を触媒する酵素である.この酵素は,今のところ昆虫のみで見出されたユニークな酵素であるが,酵素化学的な解析はほとんど行われていない.そこで本研究は,リン酸抱合体生成の生理的な意義を明らかにすることと,リン酸化酵素の精製を目的として行われた.まず,E22Pの生理活性を調べるためにカイコのエクジステロイドレセプター(BmEcR/BmUSP)を遺伝子工学的に合成し,レセプターとE22Pの親和性を他のエクジステロイドのそれと比較した.その結果,E22Pの親和性はエクジソンの約3%,20-ヒドロキシエクジソンの約0.02%であった.この結果は,E22Pは不活性型であることを示している。この結果と,カイコの卵巣に大量に蓄積したE22Pが卵へ移行し胚発生の最中に脱リン酸化されること(Yamada and Sonobe et al.,2001)と合わせて考えると,リン酸抱合体はホルモンの貯蔵的役割を担っていると考えてよさそうである.次に,EKinaseの測定法を確立し,カイコの卵巣を材料として精製を試みた.EKinaseは可溶性画分に存在し,陰イオン交換,金属キレート,ゲルろ過,アフイニテイーなど各種クロマトグラフィーにより精製が進められた.現在まで,電気泳動的にほぼ単一のバンドに精製出来たが,まだ多少の夾雑物を含んでいるため,さらに精製を進める予定である.エクジソンリン酸化酵素Ecdysone kinase (EKinase, ATP : ecdysone phosphotaranferase)は,遊離型エクジソンを基質としてエクジソン22リン酸(E22P)の生合成を触媒する酵素である.この酵素は,今のところ昆虫のみで見出されたユニークな酵素である.

そこで本研究は,エクジソンリン酸化酵素の酵素化学的な解析,精製遺伝子の解析を目的として行われた.まず,EKinaseの測定法を確立した.すなわち,基質として[^3H]Eを用い,ATPをリン酸供与体とし,生成された[^3H]E22Pをシリカカラムを用いて分離し,放射活性を測定した.この酵素は可溶性画分に存在し,最適pHは7.5,最適反応温度は36°Cであった.次に,酵素をBlue Sepharose, Chelating Sepharose, Superdex 200pg, MonoQなどにより精製した.ゲルろ過(Superdex 200pg)と陰イオン交換クロマト(MonoQ)にかけると,酵素活性は急激に低下することから,精製・純化は困難であった.結局,出発材料を多くして(約300gの卵巣),電気泳動(SDS-PAGE)で単一のバンドに精製できた.酵素の分子量はSDS-PAGEで約30KDaと推定された.この結果はゲルろ過で得た値とほぼ敵していた.精製標品をトリプシンで分解し,得られたペプチドのアミノ酸配列を解析したところ,カイコの卵黄タンパク質の一種である30Kタンパク質が混在していることが判明した.現在,HydroxyapatiteやATP-agaroseなどを用いて精製を継続中である.
統合失調症における脳脂質代謝の視覚的網羅解析

統合失調症を罹患していた方の死後脳において、脂質代謝に関する解析を実施した。蛋白質同時解析では、脂質代謝に関わる酵素群など、重要なタンパク質について、先端技術を用いて死後脳組織を解析した。さらに病態の鍵となると予想される脂質分子については、精密解析の結果に基づいて、質量顕微鏡データを再検討し、詳細に解析した。マルチプレックス法を用いて脂質代謝関連酵素のタンパク質濃度定量解析を、福島県立医科大学神経精神医学講座内の精神疾患死後脳バンクから得られた精神疾患死後脳サンプルにて実施する作業を進めている。今年度の成果としては依然準備段階ではあるものの、平成26年度以降の成果につながる見込みが得られている。本研究では,これまであまり注目されてこなかった脳内脂質の種類,分布と代謝の観点から統合失調症の分子病態を解明していくことであり,平成26年度にはマルチプレックス法による脂質代謝関連タンパク質を死後脳にて多項目同時測定を実施する準備が整った.マルチプレックス法についてはメルクミリポア社のLuminex 200を用いる予定であったが,オリジナルの測定系確立は難航したため,まずはELISA法などで標的タンパク質を絞った解析を進めて行くこととした.また,Luminex 200の活用については既に系が確立されたキットを用いることによって,関連分子の解析を進めることとした.予備的解析結果自体も,研究発表の価値が高いことから,既に得られているデータについても論文作成は同時に進めている.国内外の学会に参加して関係する研究の最先端の情報を収集し,さらにこの課題の中途の成果の発表を通しての議論や,同じ研究室の研究者だけに留まらず,関連分野の研究者との打ち合わせや関連文献を集めての調査研究からも一定の成果を得た.また,この研究の遂行のためには統合失調症当事者の生の声を直接確認する臨床及び,精神疾患死後脳集積過程への関与が不可欠であるが,関連する書籍も研究し,臨床実務,研究倫理,継続的な研究実施のための研究費の取り扱いや,実地の医療が抱える問題点も精査し,研究成果を現場にフィードバックしていくためにはどのように研究を進めるべきかにも着目して行った.これらの成果に基づき精神疾患での脳内の解析でこれまであまり注目されていなかった系の詳細解明を明らかにすべく,現実的に絞り込まれたマルチプレックス法での測定にて,統合失調症の脳脂質動態の解明を実際の病態の現場である精神疾患の死後脳を用いて明らかにしていくための進展が得られた.本研究の目的は、患者さんにとって生活の質の低下や、社会的な影響が大きいにも関わらず、病態が不明で決定的な治療方法に欠けている統合失調症について、根本的な問題点を解決することにある。統合失調症の病気の本態は、その症状が精神症状であるため、脳が病気の現場と考えられるが、脳の主要構成成分は脂質であるにも関わらず、その本態はこれまであまり注目されていなかった。本研究では、様々な社会的な問題から研究に用いることに制限がある統合失調症患者さんの死後脳を、倫理的にも社会的にも問題がない形で最新の分析機器を駆使して研究・解析した。最終年度にあたっては、前年度までに進めてきた調査に基づいて、同時多項目解析のマルチプレックス法などによる蛋白質発現解析を進めた。研究期間全体を通して、特に脂質代謝に関連する重要な酵素を多項目に渡って測定し、SNPs解析データとも比較可能にした。質量顕微鏡解析での成果とともに、統合失調症の脂質異常の病態の一部を明らかにした。今後は、これまでのデータを一塩基多型の網羅的データと比較することで、脳内の脂質代謝とそれに関連する蛋白質発現を一塩基多型から予測すること(ジェネティックニューロパソロジー)に展開していくことが求められるため、実際の臨床現場で採血検査などを通じて脳内の分子発現・代謝経路の状況を予測するテーラーメード医療を目指す成果が引き続きこの研究の実績から生まれることが期待できる。当初の予定では平成26年度までにある程度の実験を終えて,平成27年度は必要に応じた追加実験と,解析結果の検討,発表準備の予定であったが,実際に解析すべき分子はまだ多く,平成27年度にはむしろ測定・解析を中心にする必要があるため.神経精神医学平成27年度で解析結果を検討する予定であったが,むしろ精力的にデータを集めることにより,研究成果の最大化を目指す.研究成果を学会や論文にて発表する準備は遅れることになるが,最終的に得られる成果は逆に大きくなることが期待できる.当初の予定ではマルチプレックス法による脂質代謝関連酵素の多項目同時測定を平成25年度中に終了する予定だったが、測定に必要な抗体の特性が合わない面があるなど再検討が必要であり、本測定はこれからとなっているため。本年度までに測定・解析の準備に多くの時間とコストがかかっているため,実際に本研究での中心的なデータは平成26年度までで得られる予定となっていたものが平成27年度にずれ込んでいることから,平成27年度に多くの助成金を使用することになったため.マルチプレックス法による脂質代謝関連酵素の多項目同時測定に必要な抗体を再検討した上で、本測定に進む予定である。平成26年度、平成27年度に予定していた研究内容を有機的に検討し直すことで、実験の遅れは取り戻して行く予定となっている。

平成27年度に,これまでの準備や事前の調整,情報収集にて得られている実績に基づき,元々支出の中心を占めるLuminex試薬による測定などでタンパク質測定を実施し,統合失調症死後脳における脂質代謝系の実態を解析していく.マルチプレックス法による脂質代謝関連酵素の多項目同時測定の本測定に入る前の準備段階で抗体の選定に想定以上の時間がかかっており、平成25年度に予定していた本測定まで進んでいないため。平成26年度に本測定も実施し、さらに周辺実験も総合的に進めることで、実験の遅れを取り戻すことになるため、次年度使用額を有効に活用して次年度以降の研究が遂行される見通しである。
川崎病の病態における好中球細胞外トラップ（NETs）の関与とその制御機構の解明

近年、好中球細胞外トラップ(neutrophil extracellular traps, NETs)という新たな細胞外殺菌機構が発見され、核内のクロマチンで構成される網目状の構造物に好中球elastase(NE)やmyeloperoxidase(MPO)などの抗菌蛋白を付着させて細胞外に放出することによって病原微生物を捕捉・殺菌するとされる。この過程は従来のnecrosisやapoptosisとは異なるタイプの細胞死ということでNETosisと名付けられた。NETosisに伴って細胞外に放出されたDNAやヒストン及び抗菌蛋白は生体防御機構に関与する反面、強力な組織傷害性を発揮することも知られている。NETsの放出によって血管内皮細胞傷害が引き起こされるとともに、血小板が活性化されて血栓形成の原因となりうる。我々は、川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するため、1まずKD急性期の患児から分離した好中球をin vitroで培養し、HoechetによるDNA染色、MPO染色、NE染色によってNETs形成数を蛍光顕微鏡でカウントした結果、KD急性期のNETs形成は回復期や健常コントロールに比較して有意に高値を認めた。2次に、NETosisに伴い細胞外に放出されたcell-free DNAを培養上清から精製し、DNA中のハウスキーピング遺伝子であるリボヌクレアーゼPを標的としたリアルタイムPCRを実施してcell-free DNAの絶対定量を行った結果、KD急性期は健常コントロールに比較して有意に高値であった。3さらに、NETosisに伴い細胞外に放出されたDNAに付着した好中球エラスターゼを培養上清から抽出し、NEを標的としたELISAで測定した結果、同様にKD急性期は健常コントロールに比較して有意に高値であった。川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するためには、KD急性期の患児の末梢血から分離した好中球をin vitroで培養し、免疫染色(HoechetによるDNA染色、MPO染色、NE染色)する必要がある。好中球の寿命は短いため採血後すぐに処理する必要があり、夜間や休日等に入院した患児からの検体を得られない場合がある。また、KD患児のほとんどは1歳前後の乳幼児であるため、1回の採血量は数mlに限られ、十分な好中球数を得られない場合も多い。当院では年間40例近いKD患児の入院があるが、現時点で得られたデータは28例前後である。さらに、対照群として健常コントロール群が必要になるが、informed consentを得る必要があるため、現時点では数例のみである。従って、現時点では論文にまとめるまでの症例数には達しておらず、3年目が終了した現在までの進捗状況は、当初の計画に比べて「遅れている」。研究自体は良好な結果が得られつつあるため、基本的な方針は今後も変更しない予定である。研究の対象患児数がなかなか集まらない現状に対する方策として、1研究グループとして、夜間や休日等に入院した患児からの検体にも対応できる体制を作る、2周辺の関連病院や医療機関に協力を呼び掛けてKDの検体を得る、3対照群である健常コントロール群のデータ数を増やすことを考えている。さらに、平成30年度から研究助手を雇用して、研究全体の進行を早めている。好中球の病原体処理機能として貪食作用が知られているが、近年Brinkmannらは核内のクロマチンで構成される網目状の構造物に好中球elastase(NE)やmyeloperoxidase(MPO)などの抗菌蛋白が付着した好中球細胞外トラップ(neutrophilextracellular traps, NETs)を細胞外に放出することによって病原微生物を捕捉・殺菌するという新たな細胞外殺菌機構を発見した。NETosisに伴って細胞外に放出されたDNAやヒストン及び抗菌蛋白は生体防御機構に関与する反面、強力な組織傷害性を発揮する。我々は川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するため、KD急性期患者の末梢血から分離した好中球をin vitroで培養し、HoechetによるDNA染色、MPO染色、NE染色によってNETs形成を観察した。その結果、KD急性期でNETs形成を認めたが、KD回復期や健常コントロールでは認めなかった。さらにNETsの定量として、培養上清中のcell-freeDNAのリアルタイムPCR、NE/DNA複合体のELISAを実施したところ、KD急性期および回復期から分離した好中球を培養したものでは、健常コントロールのものと比べて、いずれも高い傾向にあった。さらに急性期と回復期との比較では、急性期のものがより高い傾向にあった。以上から、KD急性期から回復期にかけてNETs形成が亢進しており、KD血管炎の病態にNETsが深く関与していることが示唆された。川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するためには、KD急性期患者の末梢血から分離した好中球をin vitroで培養して、免疫染色(HoechetによるDNA染色、myeloperoxidase(MPO)染色、elastase(NE)染色)する必要がある。

当院では年間40例近いKD患児の入院があるが、現時点で得られたデータは10数例のみである。さらに、KDの対照群として健常コントロール群が必要になるが、informed consentを得る必要があるてめ、現時点では数例のみである。従って、現在までの進捗状況は、当初の計画に比べて「やや遅れている」。近年、好中球細胞外トラップ(neutrophil extracellular traps, NETs)という新たな細胞外殺菌機構が発見され、核内のクロマチンで構成される網目状の構造物に好中球elastase(NE)やmyeloperoxidase(MPO)などの抗菌蛋白を付着させて細胞外に放出することによって病原微生物を捕捉・殺菌するとされる。この過程は従来のnecrosisやapoptosisとは異なるタイプの細胞死ということでNETosisと名付けられた。NETosisに伴って細胞外に放出されたDNAやヒストン及び抗菌蛋白は生体防御機構に関与する反面、強力な組織傷害性を発揮することも知られている。NETsの放出によって血管内皮細胞傷害が引き起こされるとともに、血小板が活性化されて血栓形成の原因となりうる。我々は、川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するため、KD急性期の患児から分離した好中球をin vitroで培養し、HoechetによるDNA染色、MPO染色、NE染色によってNETs形成数を蛍光顕微鏡でカウントした結果、KD急性期のNETs形成は回復期や健常コントロールに比較して有意に高値を認めた。次に、NETosisに伴い細胞外に放出されたcell-free DNAを培養上清から精製し、DNA中のハウスキーピング遺伝子であるリボヌクレアーゼPを標的としたリアルタイムPCRを実施してcell-free DNAの絶対定量を行った結果、KD急性期は健常コントロールに比較して有意に高値であった。さらに、NETosisに伴い細胞外に放出されたDNAに付着した好中球エラスターゼを培養上清から抽出し、NEを標的としたELISAで測定した結果、同様にKD急性期は健常コントロールに比較して有意に高値であった。川崎病(Kawasaki disease, KD)の病態におけるNETsの関与を検証するためには、KD急性期の患児の末梢血から分離した好中球をin vitroで培養し、免疫染色(HoechetによるDNA染色、MPO染色、NE染色)する必要がある。好中球の寿命は短いため採血後すぐに処理する必要があり、夜間や休日等に入院した患児からの検体を得られない場合がある。また、KD患児のほとんどは1歳前後の乳幼児であるため、1回の採血量は数mlに限られ、十分な好中球数を得られない場合も多い。当院では年間40例近いKD患児の入院があるが、現時点で得られたデータは20例前後である。さらに、対照群として健常コントロール群が必要になるが、informed consentを得る必要があるため、現時点では数例のみである。
固体NMRイメージングプローブの開発と高分子材料への応用

固体NMRイメージングプローブ(検出器)を製作を行い、運動性の悪い高分子材料の^<1)>HNMRイメージング画像を観測し、高分子材料の物性・機能についての三次元立体解析を行い高分子材料研究の重要な方法論として確立することを本研究課題の目的としている。分子運動が悪い高分子材料のNMRシグナルは大変ブロードとなりNMRイメージング画像の分解能が極端に悪くなる。このために、本研究ではシグナルがブロードの原因となる双極子相互作用を消去するためのプローブを作成した。このプローブの性能テストもかねて高分子ゲル材料の電場印加による収縮過程を、^1HNMRイメージング画像を測定し画像解析を行うことにより明らかにした。また、開発した固体NMRイメージングが高分子材料の研究に優れた方法であることが明かとなった。今後の発展が大いに期待される。固体NMRイメージングプローブ(検出器)を製作を行い、運動性の悪い高分子材料の^1HNMRイメージング画像を観測し、高分子材料の物性・機能についての三次元立体解析を行い高分子材料研究の重要な方法論として確立することを本研究課題の目的としている。固体NMRイメージングプローブ(検出器)を製作を行い、運動性の悪い高分子材料の^1HNMRイメージング画像を観測し、高分子材料の物性・機能についての三次元立体解析を行い高分子材料研究の重量な方法論として確立することを本研究課題の目的としている。分子運動が悪い高分子材料のNMRシグナルは大変プロードとなりNMRイメージング画像の分解能が極端に悪くなる。このために、本研究ではシグナルがプロードの原因となる双極子相互作用を消去するためのプローブを作成した。
スラヴ語スラヴ文学比較対照研究の課題と方法

本研究は次の2つの研究課題に従って進められた。1.第13回国際スラヴィスト会議への日本代表団派遣の企画、海外研究者とのネットワーク維持・確立。2.日本におけるスラヴ語学文学研究の総括、ならびに今後の課題の検討。1.による成果:平成14年は日本代表団の構成についてグループごとに検討を重ね、同年10月に研究集会を開催し概要を決定した。これに基づき、佐藤純一氏(国際スラヴィスト会議幹部会理事)の協力のもと、中島が日本スラヴィスト協会事務局として、開催地事務局との連絡等の任に当たることになった。平成15年3月に派遣研究報告論文を含む論文集を公刊し、大会参加の準備が整った。平成15年8月、リュブリヤナ(スロヴェニア)において大会が開催され、佐藤純一団長ならびに本研究組織より中島、佐藤(昭裕)、三谷、村田、伊東の5名の報告者が派遣された。代表団の報告はいずれも各国より高い評価を受けた。また幹部会においても、アジアからの唯一の参加国として積極的関与を求められた。同年10月に報告会を開き、総括と今後の課題の検討を行った。2.による成果:平成14年、15年はグループごとに研究作業とデータ収集にあたり、16年1月に中島と佐藤が全体の集約を開始、同年4月、文献目録の編集方針を決定した。データ補充のため、同年7月我国当該分野研究者約150名に研究業績に関するアンケートを実施、9月までに約8割から回答を得た。同年10月に全体の編集作業を開始、平成17年2月に「日本におけるスラヴ語学文学研究1999-2003」を公刊した。この成果をWeb上で公開する準備も同時に進められたが、検索システムの効率化について未解決の問題があり、今後の研究に引き継がれた。本研究組織は次世代研究者の養成ならびに、スラヴ出身の若手日本研究者の指導・支援にも積極的に関わり、今後の研究発展の基礎が確立した。本研究の目的のうち平成14年度に実施を予定したものは、1.平成15年夏にスロヴェニアで開催される第13回国際スラヴィスト会議で研究報告を行う5名の報告者の研究について、共同で検討・討議を行う、2.上記の5報告を含む欧文論文集を編集刊行する、3.最近5年間の日本におけるスラヴ語学・文学研究の成果集約の準備作業、の3点である。1.については、まず、報告予定者5名の報告を中心とした研究集会を10月と12月に行い、各自の発表研究の内容について検討・討議を行った。同時に、日本におけるスラヴ研究の総括と今後の可能性についても報告を行い、活発な議論が交換された。2.については、国際スラヴィスト協会における報告者の最終決定が例年にくらべ大幅に遅れたため・各報告者の執筆・校閲作業は終えたものの、編集作業が完了せず、刊行は平成15年度に延期された。2.については、各分野ごとに準備作業が進められた。特に、若手研究者の協力を得て、今後の資料統括やデータベース作成法の検討が進み、その実験的作業に取りかかる事ができた。これらの作業は平成15年度に本格的に移される予定である。以上のほかに、本研究グループの幅広い専門と広い地域性という利点を生かして、我国で語学文学研究に従事するロシア・東欧諸国出身の若手研究者との情報交換の機会が拡がり、彼らが進める日本語とスラヴ言語・文学の対照的研究に対する支援ネットワークを構築することができた。

これにより、彼らの母国における諸研究の動向・課題等に関する情報収集がより円滑に進むようになったことは、本研究にとっても非常に有意義であった。平成15年度の研究実績は、以下の2点にまとめられる。1)国際スラヴィスト会議への参加:第13回国際スラヴィスト会議は15年8月、スロヴェニアで開催され、本研究代表者中島、および研究分担者の佐藤、伊東、三谷、村田の計5名が報告を行った。これに先立ち準備作業として、5名の研究発表内容を検討し、意見交換を行った。開催国事務局における参加人数確定の遅れのため、昨年度に予定していた報告論文集は、研究分担者の研究論文も含めて15年7月に刊行された。代表5名の研究報告は高い評価を得、我国スラヴ研究の実績アピールに貢献した。研究内容は勿論であるが、少ない割当て人数の中で、発表分野・研究対象言語等のバランスの良さが評価され、またパソコンを効果的に活用した発表の技術的レヴェルの高さも注目された。今回は韓国・中国・インドなど、他のアジア諸国の参加がなく、欧米・アジア間の情報収集ならびに発信地としての我々の役割が改めて認識された。研究報告者に加えて、本研究の基礎確立に尽力された佐藤純一団長(東京大学名誉教授)他の参加者も積極的に討論に参加し、各国研究者との情報交換を積極的に行った。理事会においても日本の実績は高く評価され、今後の協会運営について客観的視点から意見を表明し、注目された。帰国後10月に研究集会を行い、会議の報告を行うとともに、今後の活動について検討を行った。2)スラヴ研究文献目録刊行準備作業:15年度は昨年に引き続き研究分担グループごとに、最近5年間の我国における主要スラヴ研究の動向の整理・総括を行った。文献目録の発表については、従来のような印刷物だけでなく、Webサイト上での公開が必要不可欠である、との認識を確認し、中島・佐藤を中心として、ホームページ開設のための準備作業を前進させた。この作業については、本研究の研究補助者である若手研究者の支援を得、技術的にも大きな進展があった。この成果は来年度の活動に生かされる予定である。平成16年度の研究事業は以下の3項目に従って進められた。1.最近5年間の我国スラヴ研究文献目録の刊行2.左記文献目録のWeb上での公開3.2008年国際スラヴィスト会議に向けての国内研究組織、及び海外連携ネツトワークの整備(1)1989年より5年ごとに刊行されてきた文献目録は、本研究が引き継ぎ最終年度に公表すべき重要業務であり、初年度より各研究グループごとに調査が進められていた。平成16年度はデータ拡充の為、7月に我国スラヴ研究者約150名に対しアンケートを実施、9月までに約8割から回答を得た。各研究分担者が、専門的に関わるスラヴ諸国での研究動向に注意しつつ各業績の評価・検討を行い、12月初めにグループごとの結論を得た。中島と佐藤がこれを集約し、1月半ばに最終稿を決定、研究補助者の協力を得て編集作業を開始し、2月末に「文献目録・日本におけるスラヴ語学文学研究1999-2003」を完成した。(2)上記編集作業に際し若干の問題点が明らかになり、本データのWeb上での公開については尚慎重に検討すべきとの結論を得た。問題点の主たるものは、多様化した我国スラヴ研究成果の分類に関するもので、Web上での公開に際して必要不可欠となる検索システムの充実を図る為、印刷刊行を優先させてデータの確定を行い、それを基に1年後の完成を目途にシステム構築研究を続けることになった。
湿式デシカント・ヒートポンプ・ハイブリッドシステムの研究

従来のヒートポンプエアコンでは,蒸発器の冷媒温度を室内空気の露点以下に下げて除湿を行っているが,この方式は成績係数(COP)の低下を招いている.冷房において温度低下(顕熱除去)と除湿(潜熱除去)を別の機構で行う湿式デシカント・ヒートポンプ・ハイブリッド空調システムを実用化するための基礎研究を行った.顕熱除去を電動ヒートポンプで行い,その排熱を利用して湿式デシカントシステムを運転して潜熱除去を行うもので,省エネルギー性,室内空気の除菌など多くの利点を持つ.湿式デシカントを空調システムとして用いる場合,顕熱処理のプロセスを考える必要がある.ここではヒートポンプで冷却を行いその排熱を利用する.ハイブリッドには顕熱負荷処理のプロセスによって二つのモデルがあり,溶液によって除湿と冷却を同時に行う方式モデルと顕熱負荷をプロセスとして分離する方式である.熱力学的な性能シミュレーションを行った結果,SHF0.4付近では冷凍機と湿式デシカントの冷却,加熱量の比が一致し最も熱効率のよい状態で運転でき,このときのCOPは8.5程度,通常の空調条件下(SHF:0.75)でもCOPは5程度となり,他の空調システムと比較しても非常に優れた性能を示すことが明らかになった.個人住宅の全館空調に外調機として本システムを利用することを想定し,吸収器や再生器の詳細設計を行った.気流に吸収溶液の液滴が同伴されると,空気流路の腐食を招くので,液滴が飛散しないような構造と気流パラメータを採用し,性能を維持しながら体積を最小にする構造を明確化した.従来のヒートポンプエアコンでは,蒸発器の冷媒温度を室内空気の露点以下に下げて除湿を行っているが,この方式は成績係数(COP)の低下を招いている。冷房において温度低下(顕熱除去)と除湿(潜熱除去)を別の機構で行う湿式デシカント・ヒートポンプ・ハイブリッド空調システムを実用化するための基礎研究を行う。顕熱除去を電動ヒートポンプで行い,その排熱を利用して湿式デシカントシステムを運転して潜熱除去を行うもので,省エネルギー性,室内空気の除菌など多くの利点を持つ。研究で提案するハイブリッドシステムは,湿式デシカント空調機部とヒートポンプ部から構成されている。ヒートポンプの凝縮器ででる排熱を湿式デシカントの熱源として利用している。湿式デシカントで生成された乾燥空気(温度は35°C程度)をヒートポンプの蒸発器に導いて顕熱冷却する。室内空気の湿度は湿式デシカントで処理し,顕熱はヒートポンプで処理することによって省エネルギー化が図られている。室内空気や換気外気は塩化リチウム水溶液を通るので,そのときに殺菌される。平成17年度は,さまざまなシステムフローについてモデル化を行い,その性能シミュレーションを行った。湿式デシカントには多様なシステムフローが考えられ,用途に応じて適宜選択することになる。必要な除湿性能に対して,デシカントの再生温度や熱交換性能をパラメータとして検討を行い,平成18年度に試作する機器の基本設計を行った。成果の一部は平成18年度に学会発表する予定でいる。従来のヒートポンプエアコンでは,蒸発器の冷媒温度を室内空気の露点以下に下げて除湿を行っているが,この方式は成績係数(COP)の低下を招いている.冷房において温度低下(顕熱除去)と除湿(潜熱除去)を別の機構で行う湿式デシカント・ヒートポンプ・ハイブリッド空調システムを実用化するための基礎研究を行った.顕熱除去を電動ヒートポンプで行い,その排熱を利用して湿式デシカントシステムを運転して潜熱除去を行うもので,省エネルギー性,室内空気の除菌など多くの利点を持つ.湿式デシカントを空調システムとして用いる場合,顕熱処理のプロセスを考える必要がある.ここではヒートポンプで冷却を行いその排熱を利用する.ハイブリッドには顕熱負荷処理のプロセスによって二つのモデルがあり,溶液によって除湿と冷却を同時に行う方式モデルと顕熱負荷をプロセスとして分離する方式である.熱力学的な性能シミュレーションを行った結果,SHF0.4付近では冷凍機と湿式デシカントの冷却,加熱量の比が一致し最も熱効率のよい状態で運転でき,このときのCOPは8.5程度,通常の空調条件下(SHF:0.75)でもCOPは5程度となり,他の空調システムと比較しても非常に優れた性能を示すことが明らかになった.個人住宅の全館空調に外調機として本システムを利用することを想定し,吸収器や再生器の詳細設計を行った.気流に吸収溶液の液滴が同伴されると,空気流路の腐食を招くので,液滴が飛散しないような構造と気流パラメータを採用し,性能を維持しながら体積を最小にする構造を明確化した.
新たな神経細胞死カスケードの解明-有棘赤血球舞踏病遺伝子の分子生物学的研究-

有棘赤血球舞踏病(chorea-acanthocytosis)は、神経精神症状に加え有棘赤血球症を示す遺伝性神経変性疾患である。遺伝形式は常染色体劣性で、その遺伝子座位は染色体9q21への連鎖が確認されていた。今回我々は、3家系4患者を経験し、遺伝子連鎖解析で遺伝子候補領域を狭め、病因遺伝子をポジショナルクローニング法で同定した。発見した病因遺伝子CHACは新規遺伝子で、コードされる遺伝子産物をchoreinと命名した。Choreinは、3,095個のアミノ酸からなり、24%の親水基を持つアミノ酸から成るpI5.58の蛋白質と予想された。CHAC遺伝子のノーザンブロツトでは、約10kbpの主要なバンドは、神経系のみならず、筋肉、心筋、腎臓など多臓器で発現していた。ヒトゲノム計画で報告された配列NT_008343と合わせて解析すると、CHAC遺伝子は、69個のエクソンから構成されていた。患者は、cDNAでは260bp・遺伝子DNAでは60番と61番のエクソンを含む5,937bpが欠失している変異対立遺伝子をホモ接合性に持ち、この欠失によりフレームシフトを引き起こし、C末端の271残基が形成されず、truncated form(切断型)となることが予想された。100名の日本人、74名のヨーロツパ系の健常対照者では同様の欠失のある対立遺伝子を認めなかったため、この欠失は疾患特異的と思われた。Choreinは、これまで報告されているDrosophila melanogasterのCG2093やCaenorhabditis elegansのT08G11.1、Saccharomyces cerevisiaeのVPS13、Schizosaccharomyces pombe等の構造蛋白質と相同性が高かったが、高等動物ではいまだ確認されていない新規のカテゴリーに属すると考えられた。
アレンのペリ環状反応を機軸とする不斉合成

1.申請者は、アレン分子の軸不斉に基づく面選択的Diels-Alder反応の不斉合成への応用のため、光学活性アレン酸ジエステルと種々の環状ジエンのDiels-Alder反応を検討し、光学活性ビシクロ付加体の選択的合成をすでに公表している。光学活性ビシクロ付加体は光学活性天然物の良い合成素子であり、今回海洋性多環式インドール化合物シストリケントリンBを標的化合物とし、その合成を検討した。(S)-アレン酸ジメンチルエステルとシクロペンタジエンとの分子間Diels-Alder反応により得られる光学活性付加体を用いて、光学活性アレニックジエナミドへと変換した。さらにその分子内Diels-Alder反応を用いてシストリケントリンBの合成中間体である光学活性四環性インドール化合物の合成に成功した。これは数行程で標的化合物へと変換できる。2.Koizumiらの方法を用いた光学活性シストリケントリンBの合成も同時に検討し、合成中間体である光学活性四環性インドール化合物の合成に成功した。3.生理活性の評価、抗腫瘍性活性の発現メカニズムの研究のため、(R)-アレン酸ジメンチルエステルとシクロペンタジエンとの分子間Diels-Alder反応により得られる光学活性付加体を用いて、天然シストリケントリンBの対掌体の合成を目指し、合成中間体である光学活性四環性インドール化合物を合成した。
鳥類と霊長類の知覚統合過程に関する比較認知科学的研究

昨年度に引き続き、知覚統合過程についての研究をおこなった。第一に、形態知覚における大域的な統合処理の中間段階について検討するためGlassパターン刺激の知覚特性を調べた。実験では、昨年度までに明らかになったフサオマキザルにおける局所情報処理の優位性についてより詳細な検討を加えるため、局所的情報と大域的なパターンが同一刺激の中で競合する刺激をもちい、その分類の特性を調べた。結果、ヒトは大域的なパターンを優先して刺激を分類したのに比べ、フサオマキザルはより局所的な情報に依存した分類をおこなった。第二に、ヒトの身体図形の全体処理過程について、検討を加えた。昨年度までの研究から、フサオマキザルもヒト同様に、身体の形状を全体的に知覚統合処理していることの証拠として、身体図形弁別における倒立効果を示すことを明らかになっている。今年度は、この倒立効果が、特定刺激を用いた課題学習の過程に依存するアーチファクトではないことを示すため、同様に豊富な学習経験を経た類似の幾何的な図形をもちいて弁別実験をおこない、そのような刺激では倒立効果は生じないことを明らかにした。これらの成果はヒトとヒト以外の霊長類の知覚統合過程において異なる空間スケールをベースにしている一方で、身体図形のような社会的な刺激の処理には共通した統合の過程が存していることを示唆している。本年度は、フサオマキザル(Cebus apella)を対象に知覚統合過程についての研究をおこなった。これまで、ヒト以外の動物においては、視覚における空間的な統合能力はヒトと比べて低いとする報告が多くなされてきた。しかしながら、ヒトとヒト以外の動物で視知覚の統合過程が質的に異なっているのかどうか、その同異を直接検討した研究は少ない。本研究では、視覚刺激の空間統合過程について、以下二つの段階におけるオマキザルの知覚特性を検討した。まず第一に、形態知覚における大域的な統合処理の中間段階について検討するため、Glassパターン刺激の知覚特性を調べた。実験では、同時見本あわせ課題によって、同心円状、双曲線状、放射状、平行状のパターンのそれぞれとランダムなパターンとの弁別の成績を比較した。結果、平行パターンの検出は、双極線、放射の両パターンの検出よりも一貫して良い成績を示した。一方で、双極線、放射の両パターンの検出に比べ、同心円パターンの検出は一貫して良かった。これらの結果は、オマキザルの形態統合過程の中間段階における表現が、ヒトのそれと同様であること、しかし一方で、それら大域的な情報に比較してオマキザルの視知覚がヒトに比べ局所情報により強く依存していることを示唆している。第二に、より複雑な物体の形態統合処理について検討するため、ヒトの身体のCG刺激をもちいて身体姿勢の知覚について調べた。実験では、呈示される身体刺激の手または足の姿勢についての弁別成績を、正立刺激と倒立刺激で比較した。結果、オマキザルにおいても、ヒトの身体姿勢知覚における倒立効果がみられた。一方で、手足といった身体部位のみの刺激をもちいたり、見かけ上の「人らしさ」を損ねた刺激をもちいた場合には倒立効果はみられなかった。この結果は、オマキザルがヒトと同様に、身体の形状を全体的に知覚統合処理していることを示唆している。今年度は、昨年度に引き続き、フサオマキザル(Cebus apella)を対象に知覚統合過程についての研究をおこなった。実験では、局所的な方位の情報とそれらの統合による大域的な形態の情報を有するGlassパターン刺激について、部分的なノイズやギャップの挿入などの刺激操作を加えた際のパターン弁別の特性をフサオマキザルとヒトで比較した。結果、オマキザルの形態統合過程の中間段階における表現はヒトのそれと同様であること、またオマキザルの知覚は、大域情報との相対的な関係では局所的信号に依存していることを、あらためて確認した。第二に、円や放射といった幾何パターンに比べより複雑な物体の統合処理について検討するため、ヒトの身体のCG刺激をもちいて身体姿勢知覚の知覚特性について検討した。昨年度の研究から、フサオマキザルがヒトと同様に、ヒト身体の形状を全体的に知覚統合処理していることが示唆されている。今年度は、生物学的に可能な姿勢、不可能な姿勢をとるヒト身体形態刺激の弁別特性を調べることで、フサオマキザルにおける身体形態の全体処理に関わる規定因を探った。結果、フサオマキザルではヒト身体の生物学的可動域は視知覚処理に大きくは影響しないことが示された。

今年度は、この倒立効果が、特定刺激を用いた課題学習の過程に依存するアーチファクトではないことを示すため、同様に豊富な学習経験を経た類似の幾何的な図形をもちいて弁別実験をおこない、そのような刺激では倒立効果は生じないことを明らかにした。これらの成果はヒトとヒト以外の霊長類の知覚統合過程において異なる空間スケールをベースにしている一方で、身体図形のような社会的な刺激の処理には共通した統合の過程が存していることを示唆している。
ヒトAd4BP(SF-1)遺伝子の転写調節並びに関連疾患に関する研究

Ad4BP(SF-1)はステロイド合成酵素の転写調節因子としての作用のみならず、そのノックアウトマウスの解析から副腎、性腺の発生に不可欠の因子であることが明らかにされている、臨床的に先天性副腎低形成とゴナドトロピン単独欠損を合併する疾患が知られているが、本病態が、Ad4BP(SF-1)ノックアウトマウスの表現型と類似することから、我々は本病態がAd4BP(SF-1)異常症である可能性を考え、その解析を目的としてヒトAd4BP(SF-1)遺伝子のクローニングを行いその全構造を決定した。一方、Xp21領域から新しい核内受容体であるDAX-1遺伝子が同定され、X-連鎖型の本症の主たる原因遺伝子はDAX-1遺伝子であることが明らかとなり、我々も複数の患者に同変異を見い出した。我々は上記病態を呈しながらも、女性患者であることからDAX-1異常では説明し得ない3例の患者についてAd4BP(SF-1)異常症の可能性を考え、患者Ad4BP(SF-1)遺伝子の解析を行ったが、いずれの患者においても変異を見い出し得なかった。このことは、Ad4BP(SF-1)、DAX-1以外にも上記病態に関連する性分化因子が常染色体上に存在することを示唆する。我々はまた、ヒトAd4BP(SF-1)遺伝子のクローニングに伴い、同遺伝子の転写調節機構の解明を目的として同5'上流域の解析を試み、その基礎的発現にE-box配列が重要であることを見い出した。背景Ad4BP(steroidogenic factor-1、SF-1とも呼ばれる)はステロイド産生臓器特異的な各種ステロイド合成酵素の転写調節因子として作用するのみならず、ノックアウトマウスの成績から副腎、性腺の発生分化並びに下垂体ゴナドトロフの分化に必須の因子であることが判明している。一方、臨床的には先天性副腎低形成とゴナドトロピン単独欠損症を合併する疾患が知られており、我々は本疾患が病態的にAd4BPノックアウトマウスに類似する点に着目し、Ad4BP異常症である可能性を考えてきた。大多数の本症患者家系はX-連鎖劣性遺伝形式を示し、最近、Xp21領域から新しい核内遺伝子DAX-1が単離され、本症患者にも種々の変異が同定されることから、本症の主たる原因遺伝子はDAX-1遺伝子であることが判明している。しかしながらDAX-1遺伝子に異常の認められない症例や女性患者、常染色体劣性遺伝形式を示す本症患者も少数ながら報告されており、本症の原因がAd4BP異常症の可能性も含めたheterogeniousな病因から成り立つことは明らかである。研究実績:1)我々は本邦でははじめて2症例の本症男性患者のDAX-1遺伝子を解析し両患者ともにナンセンス変異を見い出した。うち1例は家系解析からde novoの点突然変異であることも明らかにした。2)Ad4BP異常症の可能性を臨床的に検討する目的で我々はヒトAd4BP遺伝子のクロニーングを行ない、その構造決定に成功した。ヒトAd4BP遺伝子は約30Kb長で、non-coding exon1を求めて7個のエクソンよりら構成されていた。蛋白コード領域は461アミノ酸より成り立ち、他種の同蛋白と極めて高度の保存性を示した。現在Ad4BP異常症と考えられる症例のAd4BP遺伝子異常の有無について検討中である。また5′非翻訳領域の解析により本遺伝子の転写調節機構の研究を進めている。

一方、Xp21領域から新しい核内受容体であるDAX-1遺伝子が同定され、X-連鎖型の本症の主たる原因遺伝子はDAX-1遺伝子であることが明らかとなり、我々も複数の患者に同変異を見い出した。我々は上記病態を呈しながらも、女性患者であることからDAX-1異常では説明し得ない3例の患者についてAd4BP(SF-1)異常症の可能性を考え、患者Ad4BP(SF-1)遺伝子の解析を行ったが、いずれの患者においても変異を見い出し得なかった。このことは、Ad4BP(SF-1)、DAX-1以外にも上記病態に関連する性分化因子が常染色体上に存在することを示唆する。我々はまた、ヒトAd4BP(SF-1)遺伝子のクローニングに伴い、同遺伝子の転写調節機構の解明を目的として同5'上流域の解析を試み、その基礎的発現にE-box配列が重要であることを見い出した。
細胞内亜鉛のホメオスタシスと亜鉛フィンガーをもつ転写活性化因子の調節

平成7年度は、高毒性のコプラナーPCBである3,4,5,3′,4′-pentachlorobiphenyl (PenCB)を投与によって、顕著に発現量が低下した3種の酵素のうち炭酸脱水酵素(CA)とアルコール脱水素酵素(ADH)は、亜鉛酵素であることから、PenCBが細胞内亜鉛ホメオスタシスに影響するという申請者らの作業仮説が支持される結果となった。平成8年度は、PenCB投与によって発現量の顕著な低下が示唆されたラット肝細胞質ゾルの亜鉛酵素、ADHおよびCAについて更に詳細に検討した。1.ADHの酵素活性を測定した結果、PenCB処理群において有意に低下していた。このことは、本研究で産生したADHに対する特異抗体によるイムノブロットの結果からも支持され、活性の低下が酵素タンパク質の発現の抑制によることが明らかになった。最近、ADHがトリオースリン酸の代謝に関与することが示唆されていることから、その寄与の程度をADHの特異的阻害剤を用いて検討した。グリセルアルデヒド3ーリン酸からグリセロール3ーリン酸への代謝へのADHの寄与は約30%であることが明らかになった。PenCBは、糖新生の阻害を引き起こすことが知られているが、平成7年度に明らかにした肝アルドラーゼBの著しい抑制と併せて、中間代謝への影響が懸念された。そこで、トリオースリン酸代謝に関わる一連の酵素群の活性いついても検討を行い、これらの活性がいずれもPenCB処理によって有意に減少していることを見出した。2.CA isoformであるCA IIIに特異的な抗体を用いて行ったイムノブロットの結果から、酵素タンパク質の発現の抑制が起こっていることが明らかになった。CA IIIは、最近チロシンホスファターゼとして機能することが示唆されており、この結果はPenCBによるシグナルトランスダクションへの影響として非常に興味深い。平成7年度は、高毒性のコプラナーPCBである3,4,5,3',4'-pentachlorobiphenyl(PenCB)を投与によって発現量が顕著に低下する酵素が、ラット肝細胞質ゾルの亜鉛酵素であることを明らかにすることを目的とした。1.PenCBを投与したラットの細胞質ゾルタンパク質を2次元電気泳動に付して、対照群のラットの泳動像と比較した。分子量27kDaおよび2つの40kDaのタンパク質がPenCB投与群において、顕著に低下しているのを認めた。2.これらのタンパク質のバンドを切り出し、クリーブランド法に従ってin situでゲルのウェル内でタンパク質を消化し、電気泳動後、PVDF膜に転写し、アミノ酸配列を分析した。3.それらのタンパク質由来のペプチドの内部アミノ酸配列から、分子量27kDaが炭酸脱水酵素であることが明らかになった。また、40kDaのタンパク質はアルコール脱水素酵素およびアルドラーゼであることが推定された。4.アルドラーゼの酵素活性を測定した結果、PenCB処理群において有意に低下していた。5.アルドラーゼおよびアルコール脱水素酵素に対する特異抗体を、それぞれ産生した。これらを使用したイムノブロッティングの結果から、酵素タンパク質の発現量が低下していることを明らかにした。顕著に発現量が低下した3種の酵素のうち炭酸脱水酵素とアルコール脱水酵素は、亜鉛酵素であることから、PenCBが細胞内亜鉛ホメオスタシスに影響するという申請者らの作業仮説が支持される結果となった。平成8年度は亜鉛フィンガーをもつ転写調節因子の発現について検討する。平成7年度は、高毒性のコプラナーPCBである3,4,5,3',4'-pentachlorobiphenyl(PenCB)を投与によって、顕著に発現量が低下した3種の酵素のうち炭酸脱水酵素(CA)とアルコール脱水

素酵素(ADH)は、亜鉛酵素であることから、PenCBが細胞内亜鉛ホメオスタシスに影響するという申請者らの作業仮説が支持される結果となった。平成8年度は、PenCB投与によって発現量の顕著な低下が示唆されたラット肝細胞質ゾルの亜鉛酵素、ADHおよびCAについて更に詳細に検討した。1. ADHの酵素活性を測定した結果、PenCB処理群において有意に低下していた。このことは、本研究で産生したADHに対する特異抗体によるイムノブロットの結果からも支持され、活性の低下が酵素タンパク質の発現の抑制によることが明らかになった。最近、ADHがトリオースリン酸の代謝に関与することが示唆されていることから、その寄与の程度をADHの特異的阻害剤を用いて検討した。グリセルアルデヒド3ーリン酸からグリセロール3ーリン酸への代謝へのADHの寄与は約30%であることが明らかになった。PenCBは、糖新生の阻害を引き起こすことが知られているが、平成7年度に明らかにした肝アルドラーゼBの著しい抑制と併せて、中間代謝への影響が懸念された。そこで、トリオースリン酸代謝に関わる一連の酵素群の活性についても検討を行い、これらの活性がいずれもPenCB処理によって有意に減少していることを見出した。2. CA isoformであるCA IIIに特異的な抗体を用いて行ったイムノブロットの結果から、酵素タンパク質の発現の抑制が起こっていることが明らかになった。CA IIIは、最近チロシンホスファターゼとして機能することが示唆されており、この結果はPenCBによるシグナルトランスダクションへの影響として非常に興味深い。