hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳動脈瘤コイル塞栓術時の瘤内における血栓形成の術前予測シミュレータ構築

治療用コイルが密に留置された脳動脈瘤について,瘤内の血流場を高効率かつ高精度に解析可能な数値流体計算フレームワークを構築したとともに,コイル塞栓後における瘤内での血栓形成を現象論的に表現する数理モデルを構築した.構築した計算フレームワークにより,コイルの充填率や空間分布が瘤内の血流動態に与える影響を統計的に明らかにし,さらに血栓形成の数理モデルを組み込むことで,瘤内の血栓形成の度合に対するコイル分布形状の影響をコンピュータ上で表現することに成功した.平成28年度において,1コイル塞栓された脳動脈瘤内の血流場に対する大規模症例解析にむけた,簡便かつ高速な数値流体計算ソルバの開発および,2コイル塞栓後の瘤内における血栓形成の現象論的モデリングの2つを行った.コイル塞栓後の脳動脈瘤内部では,複数のコイルが絡み合う複雑な形状をとる.そのため,有限要素法・体積法での解析に必要な非構造格子生成の人的コストが大きく,多数症例の解析は困難だった.この問題に対処するため,コイル塞栓瘤内の流体領域を直交格子上に陰関数として表現し,有限差分法による数値流体計算ソルバを開発した.これにより流体計算における格子生成を完全に自動化することに成功した.開発したプログラムはMPIとopenMPのハイブリッド並列化に対応しており,簡便かつ高速な流体計算が可能となった.構築した数値流体計算ソルバを用いて,コイル塞栓瘤内における血栓形成の現象論的モデルの開発を行った.このとき,血流のせん断率の減少による血栓形成と,血栓の形成による血流への流体抵抗の増加をともに表現することを考えた.血流中におけるせん断率の減少と血栓の体積率との関係をヘビサイド関数により表した.さらに,血栓形成が生じた流体領域を均質な多孔質体領域としてモデル化し,血流中の血栓の体積率に応じて流体抵抗が増加すると現象論的にモデル化した.開発した数値流体計算ソルバに対して,構築した血栓化のモデルとの連成計算を行った結果,コイルの分布によっては瘤全体の血栓化が不完全となる症例が見られ,これは臨床での観察結果とよく一致した.結輪として,平成28年度は1の目標である数値流体計算ソルバ開発,2の血栓形成モデルの構築までを達成できた.平成29年度では,開発したシミュレータを複数症例に対して適用し,脳動脈瘤に対するコイル塞栓治療の機序解明に向けた物理的考察を行う.当初の計画通り,複雑なコイル形状を含む瘤内血流動態を安定かつ簡便に解析可能な数値流体計算ソルバの開発に成功した.さらに開発した数値流体計算ソルバを用いて,コイル塞栓後における脳動脈瘤内の血栓形成の現象論的モデリングを行い,血栓形成と血流動態との相互依存を数理モデルにより表した.計算結果は臨床での観察所見とよく一致しており,コイル塞栓後における瘤内血栓化の機序解明に向けて,開発した一連のソルバおよびモデリングの有効性を確認できた.平成28年度に構築した,コイル塞栓された脳動脈瘤内における血流解析のための計算フレームワークを用いて,瘤内のコイルの局所的な充填率の違いが血流の滞留度合に与える影響について検討した.脳動脈瘤患者のCT画像をもとに作成した2例の脳動脈瘤形状に対し,コイル挿入の数値シミュレーションを複数回実施し,各症例について50例の異なるコイル分布形状を得た.挿入するコイルは全例について同一のものとし,コイルの充填率が臨床において適切な値の範囲(>25%)となるよう設定した.この全例について直交格子法を用いた数値流体計算を行い,コイル塞栓後における瘤内の血流場を得た.脳動脈瘤内における血流の滞留度合を評価する流体力学的指標として,コイル塞栓前後における瘤内血流の運動エネルギの変化率に着目した.局所的なコイル充填率として,瘤と母血管との境界面から0.5 mmずつ区間を分割した各領域におけるコイルの充填率を求め,この値と瘤内血流の運動エネルギの変化率を比較した.結果として,母血管からの距離が0-0.5 mmの領域において,局所的なコイル充填率と瘤内血流の運動エネルギ変化率には有意な負の相関が生じ,この傾向は,瘤のネック部から中心部に近づくにつれて小さくなった.この結果は,コイルが密に充填されている場合でも,ネック領域におけるコイルの留置が不十分であれば,瘤内の運動エネルギが十分に減少せず,瘤全域の血栓化,ひいては長期間の瘤塞栓が達成されない可能性を示唆している.今後はさらに平成28年度に構築した血栓形成の現象論的モデルを血流解析へ組み込むことで,コイル留置による瘤内血流の滞留から血栓化,最終的な塞栓に至る一連の機序を表現できる.以上より,本研究では脳動脈瘤に対するコイル塞栓術の治療機序を説明する計算フレームワークを構築し,その有用性を示すことに成功した.治療用コイルが密に留置された脳動脈瘤について,瘤内の血流場を高効率かつ高精度に解析可能な数値流体計算フレームワークを構築したとともに,コイル塞栓後における瘤内での血栓形成を現象論的に表現する数理モデルを構築した.構築した計算フレームワークにより,コイルの充填率や空間分布が瘤内の血流動態に与える影響を統計的に明らかにし,さらに血栓形成の数理モデルを組み込むことで,瘤内の血栓形成の度合に対するコイル分布形状の影響をコンピュータ上で表現することに成功した.

平成28年度に開発した数値流体計算ソルバおよび血栓形成の数理モデルを用いて,患者個別に最適なコイル塞栓術の診断・治療手法を提供するフレームワークを構築する.コイル挿入の際の挿入条件やコイルの物性を変化させ,血流-血栓形成連成解析の試行実験を反復して行う.瘤全体の血栓化が達成される場合において,コイル塞栓による瘤内の血流動態の変化を流体力学的観点から検討するとともに,その際のコイルの状態を定量的な評価指標を用いて調べる.患者別に得られた結果を統計的に評価することで,患者特異の病態に依存せず,瘤全体の血栓化を達成するための条件群を模索する.29年度が最終年度であるため、記入しない。計算バイオメカニクス29年度が最終年度であるため、記入しない。
心臓発生過程の心内膜床形成でおこる心内皮形質転換で浸潤を誘導する転写因子の探索

心内膜床形成過程で間葉を誘導する転写因子について、sox9に注目し解析を試みた。ニワトリ胚の心内膜床形成過程でsox9遺伝子は心内皮細胞と間葉細胞に発現し、sox9遺伝子の機能阻害は心内皮細胞の間葉への分化を抑制した。また心内皮細胞へのsox9の遺伝子導入は遊走を誘導したが、間葉を形成しなかった。しかし、転写因子slugをsox9とともに導入すると間葉が形成された。sox9はslugと協調的に心内皮細胞の上皮-間葉形質転換過程を制御する因子である可能性が高い。これまでに研究代表者は心内膜床形成でおこる上皮-問葉形質転換でのTGFβファミリーの働きに注目し、その分子機構を明らかにしてきた。研究代表者は胚心臓に発現する遺伝子の網羅的解析を行い、心内膜床形成領域特異的に発現する遺伝子を同定した。生物検定の結果、転写因子sox9は心内皮細胞に形質転換の初期形態(細胞同士の分離、遊走)を誘導した。しかし細胞外基質内部への「浸潤(完全な間葉化)」を誘導することはできなかった。研究代表者はこのことから別の転写因子の存在を予想している。本研究の目的は、心内皮細胞の形質転換で「浸潤」を誘導する転写因子を明らかにすることである。心内皮細胞の間葉への形質転換は(1)細胞の肥厚、(2)細胞同士の分離、(3)細胞の遊走、(4)ゴルジ体の局在化、(5)細胞突起の形成、(6)浸潤、の段階を経て完了する。sox9は心内皮細胞の「分離、遊走」を誘導したが「浸潤」を誘導することはできなかった。この結果から本研究では「浸潤」を誘導する転写因子を同定したい。本年度は、浸潤の誘導に関与すると予想している候補遺伝子のタンパク質を生物検定で人工的に発現させるため、候補遺伝子の全長クローニングを行った。マウス胚心内膜床形成領域特異的に発現する転写因子のニワトリ相同遺伝子を、データベースで照合し、PCR法を用いて単離し、塩基配列を決定した。この結果、slug、sox11、twist、Id14、smad6、HeyL、Hand2、GATA4、klf2の全長遺伝子を得た。これまでに胚心臓に発現する遺伝子の網羅的解析を行い、心内膜床形成領域特異的に発現する遺伝子を同定している。心内膜床形成に関してこれらの遺伝子の機能を調べたところ、転写因子のsox9は心内皮細胞に形態変化を誘導した。この心内皮細胞の変化は、心内膜床を形成するときにおこる上皮-間葉形質転換の初期段階の変化と似ていた。この過程においてsox9は心内皮細胞の「分離、遊走」を誘導したが、細胞外基質内部への「浸潤(完全な間葉化)」を誘導することはできなかった。本研究では「浸潤」を誘導する転写因子を同定したい。前年度は、浸潤の誘導に関係していると予想している候補遺伝子12種類をクローニングした。今年度はこれらの遺伝子の機能を調べることを目的として、候補遺伝子を発現ベクター(pCS2+)に組み込んだ。次に、これらの遺伝子をsox9とともにカチオン性脂質を用いて、器官培養している心内皮細胞に遺伝子導入した。2448時間培養後、顕微鏡下でその形態変化を観察し、遺伝子機能を検討した。その結果、sox9とslugを同時に遺伝子導入すると、心内皮細胞は形質転換し、ゲル内に浸潤した間葉が形成されることが明らかになった。さらに、このとき生じた間葉細胞には、間葉の指標となるα平滑筋アクチンの発現も誘導されることが分かった。胚心臓に発現する遺伝子の網羅的解析を行い、心内膜床形成領域特異的に発現する遺伝子を同定した。心内膜床形成に関してこれらの遺伝子の機能を調べたところ、転写因子のsox9は心内皮細胞の形態変化を誘導した。この形態変化は、心内膜床形成過程でおこる上皮-間葉形質転換の初期段階に類似していた。心内皮細胞の間葉への形質転換は、(1)細胞の肥厚、(2)細胞同士の分離、(3)細胞の遊走、(4)ゴルジ体の局在化、(5)細胞突起の形成、(6)浸潤、の段階を経て完了する。

このことから、sox9は心内皮細胞の「分離、遊走」に関係するが、sox9単独では細胞外基質内部への「浸潤(完全な間葉化)」を誘導できないと考えられた。本研究では「浸潤」を誘導する転写因子の同定をこころみた。本年度までに浸潤の誘導に関係していると予想した候補遺伝子12種類を単離し、3次元培養系を用いてスクリーニング行った。その結果、心内皮細胞にsox9とslugを同時に遺伝子導入すると、ゲル内に浸潤した完全な間葉が形成されることが明らかになった。本年度は、sox9がin vivoの心内膜床形成に必要な因子であるかどうかを検討するため、sox9の機能阻害実験を行った。房室管の器官培養系で培養液中にsox9に対するsiRNAを投与したところ、間葉形成は阻害された。以上の結果から、心内膜床形成過程おいてsox9は間葉形成に必要であり、心内皮細胞(上皮)の間葉化の初期段階を制御している可能性が高い、と考えられた。
アニマシー知覚に基づいた自閉症児童における社会認知特性の解明と支援方法の構築

アニマシー知覚とは、観察対象の形態的特徴にかかわらず、その動きからある行動や行為のような生物性情報を認識する現象である。このことは、我々ヒトにおける他者の行動や行為の認識が、運動情報の知覚に根ざすことを示している。近年活発に研究されている自閉症では他者の行動や行為のような社会的刺激の認知に変容がみられることが知られており、その基礎的過程の解明は重要である。また自閉症における認知的・神経学的変容を明らかにする足がかりとして、障害モデルとして利用可能なヒト以外の動物における行動学的実験系を確立することは不可欠である。本研究では、自閉症者の学習支援と並行し、ヒト以外の霊長類であるニホンザルを対象としたアニマシー知覚を分析した。採用第2年度では、自作の学習支援プログラムにより、自閉症当事者個々人へ適した支援を行った。特に社会的コミュニケーションスキルの向上を目的として、他者の行動を模倣するという課題を実施した。数回に渡る課題実施の結果、笑っている様子を示す場合では大きく口を開けるなど、表情の模倣に一部改善がみられ、訓練の有効性がみとめられた。またサルを対象とした研究では、ニホンザルにおけるアニマシー知覚を分析した。アニマシー知覚とは、物体運動から目標指向性のような、他の生き物の行動予測に必要な情報を認識することである。報告者は、ヒトの幼児期においてみられるリーチング反応のような、アニマシー知覚を生じる物体運動への特異的な反応がサルにおいてもみられるということを発見した。またさらなる実験では、サルがヒトと同様に、刺激中の文脈に依存して目標試行的な物体運動を認識していることを見出した。これらのことは、ニホンザルが自閉症モデル動物として適していることを示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。われわれは幾何学図形など、非生物のうごきからも追跡や喧嘩などの社会的意図や目的を知覚する(アニマシー知覚)。一方で自閉症ではこの知覚に困難さを示すため、アニマシー知覚研究は、病態の理解と社会的認知における運動情報の役割を解明するために重要である。第1の研究では、アニマシー知覚と言語能力の発達、および運動の物理特性検出の関係について、定型の子どもと成人を対象に分析した。実験では2図形が追跡-逃避を表す動画を呈示し、運動物体の擬人的/物理特性それぞれを同定する課題を実施した。その結果、擬人的特性の同定では子どもと成人とで差がみられず、物理特性については成人で特に素早い応答がみられた。またWISC-IVの結果との比較から、子どもの擬人的特性の同定では、言語能力の発達と正の相関がみられた。以上により、運動情報に基づく擬人的な特徴の検出は子どもにおいてすでに獲得されており、言語能力に依存することが示唆された。また成人では、物理特性の検出が特に発達していることが示された。第2の研究では非ヒト動物を対象にアニマシー知覚を分析した。自閉症の病態理解にはモデル動物を用いた研究が必要であるが、非ヒト動物における当該知覚特性は不明であった。特に非ヒト動物はアニマシー知覚を行わず、運動の持つ物理特性のみを知覚している可能性があった。そこで実験では、ニホンザルを対象に2図形による追跡動画の弁別を訓練し、このことをテストした。追跡運動では物体の軌跡間に高い類似性と近接性が生じるが、サルはこれらの特性を個別に利用して弁別しなかった。さらに弁別学習が形態情報へ般化するか検討したところ、追跡者の体軸が逃亡者に向いている場合、その動画が追跡運動と判断される頻度が高かった。サルは図形へ目標帰属を行っており、それに基づいて弁別していたことが示唆された。このことからサルはアニマシー知覚を可能であると考えられる。

採用第1年度においては、自閉症のアニマシー知覚を明らかにする足がかりとして定型発達者を対象とした実験を実施した。また予備調査として、自閉症児童の学習支援を通して個々人の認知・行動特性の観察を行った。自閉症では様々な症候のみられる患者を包括的に分析することが重要であり、個々人に適した実験環境や課題を用いなければならない。本研究を推進している京都大学霊長類研究所認知学習分野では、自閉症者を対象とした学習支援教室のNPO法人発達障害療育センターを運営している。この活動を通して自閉症者の学習支援を行い、研究を実施する際に必要な患者個々人の認知・行動特性について詳細な観察を行っている。採用第1年度では、教室の生徒それぞれに適した自作のコンピュータソフトウェア教材を用いた支援を行い、学習の困難さと教材の効果についての観察を行った。また観察の結果を参考にアニマシー知覚についての実験環境と課題の作成を行った。本研究を推進している研究室では、ヒトを対象とした研究だけでなく、非ヒト霊長類の研究を実施可能なことも特色の一つである。採用第1年度では自閉症者の学習支援および研究環境構築と並行し、ヒト以外の霊長類であるニホンザルを対象とした研究を推進している。ニホンザルを始めとしたマカク種はヒトの認知・神経基盤を分析する上で重要なモデル動物であり、自閉症のモデル動物による研究のためにも、行動実験のプロトコルを構築することは重要である。したがって採用第1年度では幅広い動物種へ適応可能な行動学的実験課題を確立し、ニホンザルのアニマシー知覚を明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策としては、採用第1年度で自閉症児童を対象に実施した観察の結果をもとに、自閉症者におけるアニマシー知覚について本実験を行う。さらに第1年度で得られた、非ヒト霊長類のアニマシー知覚の結果について自閉症者においても検証し、非ヒト霊長類との比較を行う。第1年度では、ニホンザルにおいて運動の学習が形態情報から影響を受けることが示唆されたが、自閉症において同様の特性がみられるかは不明であり、検証する必要がある。また子どもと成人を対象に実施した発達研究の知見から、擬人的な特性の言語ラベリングについて自閉症者を対象に分析を行う。自閉症者のアニマシー知覚においては、観察された動画に対応する社会的意図や目的について、適切な言語をラベリングすることが困難であることが考えられる。このことを分析するため、昨年度用いた実験を自閉症者に対して実施し、言語能力と課題成績との関係性を検討する。さらに言語学習によってアニマシー知覚が改善するかを検討し、自閉症者の社会的認知について支援法構築を試みる。
形式言語およびオ-トマトンの代数的研究

1.有限バイプレフィクス・コ-ドの一種であるエレメンタリ-・コ-ドに付随する群に関する結果を、田中源次郎氏(広島修道大学)との共同研究により得た。論文を準備中であり、さらに共同研究が進展中である。これは研究代表者の強連結オ-トマトンとその自己同型群に関する研究の成果を利用したものである。2.有限生成自由半群上の(演算とコンパティブルな)全順序に関する種々の結果を、小林美治氏(徳島大学)斉藤立彦氏(下関水産大学校)らとの共同研究で得た。数編の共同および単独の論文を準備中であり、共同研究が進行中である。この研究は順序半群・順序群等の順序代数系の研究と数学的に密接な関連があるほか、計算機数学において種々の書き換えシステムの理論に応用されるものと期待される。3.ディスジャンクティブ言語と正規言語との関係およびディスジャンクティブ言語と文脈自由言語との関係に関する結果を研究分担者および石〓然氏(台湾・中興大学)との共同研究で得た。4.研究分担者はThierrin氏・Jurgensen氏(カナダ西オンタリオ大学)・石〓然氏・田中源治郎氏らと主として言語とコ-ドに関する種々な結果を得てこれを発表している。
Trudinger-Moser不等式に関連する変分問題とコンパクト性の研究

Trudinger-Moser不等式に関連する変分問題、楕円型方程式、Trudinger-Moser型汎関数に関するプロファイル分解の研究を行う。変分問題に関しては、最大化関数の存在・非存在を分ける境界の本質的な条件を明らかにする。変分問題の研究に関連して、楕円型方程式の研究も行い、方程式の可解性の研究及び解の定性的研究を行う。Trudinger-Moser汎関数のコンパクト性の観点から、非コンパクトの要因となる性質を明らかにするプロファイル分解の研究も行う。
リネッジ生存癌遺伝子TTF-1/NKX2-1の肺腺癌における役割のシステム的理解

TTF-1リネジ生存がん遺伝子の標的として同定したROR1受容体型チロシンキナーゼ(RTK)のコンディショナルKOマウスと、変異EGFRトランスジェニックマウスを樹立し交配して、ROR1の肺腺がんの発生・進展における重要性をマウス個体レベルで明らかとした。また、ROR1がキナーゼ活性非依存的にカベオラ形成に必須なCAV1蛋白の発現維持を通じ、EGFR以外のRTKの生存シグナルの維持にも関わることを発見した。一方、システム生物学的アプローチを用いたTTF-1の機能解明においては、TTF-1の遺伝子発現制御に関わる新規遺伝子MXTNを同定し、その転写制御モジュレーターとしての機能を明らかとした。我々はTTF-1/NKX2-1をリネジ生存がん遺伝子として同定し、その生存シグナルをROR1受容体型チロシンキナーゼ(RTK)が担うことを明らかとしてきた。ROR1fl/flマウスの樹立を完了しCAG-Cre-ERとの交配を行って、タモキシフェン投与によるコンディショナルノックアウトマウスを作製した。SP-Cプロモーター制御下に肺特異的に変異EGFRを発現して肺腺癌を発症するトランスジェニックマウスを樹立し、ROR1コンディショナルノックアウトマウスとの交配を進めている。また、インビトロの機能解析では、ROR1がEGFRのみならず、種々のRTKの活性化に関連する自己リン酸化の維持に必要なことを明らかとした。ROR1のキナーゼ活性への依存性や、機能ドメイン等について検討を進めつつある。TTF-1/NKX2-1の転写制御ネットワークのシステム的理解を進めるべく、ドキシサイクリン添加により発現誘導可能な正常気道上皮株1株及び肺腺癌細胞株3株を作成した。発現誘導後の遺伝子発現プロファイルの網羅的解析データをもとに、TTF-1/NKX2-1による転写制御活性を反映する遺伝子モジュールを規定した。肺癌腫瘍組織のmRNAとマイクロRNA双方のマイクロアレイ解析データセットを用いて、患者組織中でTTF-1/NKX2-1による転写制御活性と相関する遺伝子群を同定した。また、スーパーコンピュータ上のSiGN-BNソフトウェアを用いて推定した発現制御ネットワークから、TTF-1/NKX2-1サブネットワークを抽出した。これらの検討結果と統合的に解析を進めるべく、TTF-1/NKX2-1のChIP-chip解析及びChIP-seq解析を進めつつある。TTF-1リネジ生存癌遺伝子の標的として肺腺癌の生存シグナルを担うROR1について、CAGプロモーターにより発現制御されるCre-ER融合遺伝子のトランスジェニック(TG)マウスと、Ror1遺伝子のイントロン2とイントロン4にloxP配列を挿入したマウスを交配して、Cre-loxPシステムを利用したRor1コンディショナルノックアウト(KO)マウス(Ror1flox/flox-Cre)の樹立を進めた。さらに、肺特異的なSPCプロモーター下に変異型ヒトEGFR cDNAを繋いで樹立したTGマウスと交配して、Ror1flox/flox-Cre-mutEGFRマウスを得た。ROR1をタモキシフェン投与によってKOし、変異EGFRによる肺腺癌の発生における役割の検討を進めつつある。また、インビトロの機能解析で、ROR1がEGFRのみならず、種々のRTKからの生存シグナルの維持に重要であり、それにはキナーゼ活性非依存的な機能が関与していることを示唆する成果を得つつあり、詳細な分子機序の解明を目指した検討を進めつつある。また、スーパーコンピュータ京とSiGN-NNSRを用いた全ゲノム的な遺伝子発現制御ネットワーク推定によって、TTF-1との発現制御関係が示唆される遺伝子候補の探索を、我々自身のデータセットと、TCGAの公開データセットのそれぞれを用いて進めた。両データセットに共通し、また、京とGIMLETを用いて進めたTTF-1による遺伝子発現制御のモジュレーターの探索においても有意であった、機能未知な遺伝子(modulator X of TTF-1/NKX2-1, MXTNと命名)に着目して機能解析を開始した。本研究課題は、TTF-1の生存シグナルを担うROR1が、肺腺癌の発生において果たす役割を、個体レベルでの検討を相当に進捗させることができた。ヒト肺腺癌におけるドライバー変異である変異Egfrによって肺腺癌を発症するTGマウスの生存率が、Ror1のコンディショナルKOによって有意に延長することを示す結果を得つつある。我々のこれまでの研究成果は、TTF-1が肺腺癌の発生・進展に対して、ポジティブにもネガティブにも働き得ることを示している。したがって、TTF-1による遺伝子発現制御の全貌を明らかとするには、ゲノム上の全遺伝子を対象としたシステム生物学的な発現制御ネットワークの描出が果たす役割は極めて大きい。本年度の研究の進展によって、TTF-1との発現制御関係が示唆される遺伝子候補群の中には、これまで全く機能が明らかとなっていないMXTN遺伝子も含まれており、今後の分子生物学的な検証の成果を期待させる、大きな進捗が得られた。TTF-1の生存シグナルを担うROR1受容体型チロシンキナーゼ(RTK)について、コンディショナルノックアウトマウスを用いた個体レベルの機能解析と、主としてインビトロの生化学的解析による分子レベルの機能解析の双方において、順調な進捗を得ることができた。肺特異的なSP-Cプロモーターによる変異EGFRのトランスジェニック(TG)マウスと、Ror1コンディショナルノックアウト(KO)マウス(Ror1flox/flox-Cre)を樹立・交配して得たRor1flox/flox-Cre-

mutEGFRマウスにおいて、CT画像において腫瘍が未発生と考えられた8週齢からオイル(コントロール)またはタモキシフェンの投与を開始した。その結果30週齢の時点で、オイル投与群(n=6)においては僅か17%の生存率であったのに比し、タモキシフェン投与群(n=9)では100%が生存しており極めて有意な生存期間の延長がみられ、ROR1は肺腺癌の発生・進展において重要な役割を持つ分子であることが個体レベルで確認された。また、肺腺癌細胞株を用いたインビトロの解析において、ROR1がキナーゼ活性非依存的に、カベオラの構造蛋白であるCAV1の発現維持を通じて、多様なRTKの活性化と生存シグナルの維持に重要な役割を担っており、ROR1の抑制が他のRTKを介したバイパスシグナルによるEGFR-TKI耐性株にも有効な可能性を見出した。システム生物学的なアプローチによって、TTF-1による遺伝子発現制御の調節に関わる機能未知な遺伝子として探索・同定したMXTN遺伝子が、TTF-1による標的遺伝子MYBPHの転写活性化を抑制することを見出した。また、MXTNが、TTF-1のDNA結合能を抑制することによりMYBPHの発現を負に制御しており、また、癌細胞の運動能に対して促進的に機能することが明らかとなった。TTF-1リネジ生存がん遺伝子の標的として同定したROR1受容体型チロシンキナーゼ(RTK)のコンディショナルKOマウスと、変異EGFRトランスジェニックマウスを樹立し交配して、ROR1の肺腺がんの発生・進展における重要性をマウス個体レベルで明らかとした。また、ROR1がキナーゼ活性非依存的にカベオラ形成に必須なCAV1蛋白の発現維持を通じ、EGFR以外のRTKの生存シグナルの維持にも関わることを発見した。一方、システム生物学的アプローチを用いたTTF-1の機能解明においては、TTF-1の遺伝子発現制御に関わる新規遺伝子MXTNを同定し、その転写制御モジュレーターとしての機能を明らかとした。ROR1コンディショナルKOマウスと、肺特異的なSPCプロモーターによって変異型ヒトEGFR発言するTGマウスと樹立・交配して、Ror1flox/flox-Cre EGFRmマウス得て進めつつある、肺腺癌の発生において果たすROR1の役割の個体レベルでの検討を進める。とくに、腫瘍の個数、体積、マウス個体の生存率等を指標とした検討とともに、ROR1下流のシグナリング関連分子の免疫染色等を含む病理形態学的解析も進めたいと考えている。また、インビトロの解析が示すROR1のキナーゼ活性非依存的な多種のRTKの活性化維持の分子機構の詳細にも迫っていきたい。また、システム生物学的なアプローチによって探索・同定した機能未知なMXTN遺伝子に着目し、詳細な分子細胞生物学的な解析を進めて、そのTTF-1の発現制御機構において果たす役割を多面的に検討して行きたいと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生物学TTF-1/NKX2-1遺伝子の生存シグナルを担うROR1受容体型
女性生殖器細胞のアポトーシス調節機構:その局所・内分泌因子と細胞間相互作用の解析

1)子宮筋腫の発育と性ステロイドホルモン:増殖期ならびに分泌期の正常子宮筋と子宮筋腫組織における細胞増殖能をPCNA発現態度より免疫組織学的に検討したところ,正常子宮筋細胞に比して子宮筋腫細胞においてPCNA発現は高く,子宮筋腫細胞でのPCNA発現は増殖期に比して分泌期に高いことが観察された.子宮筋腫細胞培養系を用いて性ステロイドの細胞増殖に及ぼす影響をPCNA蛋白発現より検討すると,estradiolおよびprogesterone添加により子宮筋腫細胞のPCNA蛋自発現は増加した.またestradiolは子宮筋腫細胞におけるEGF受容体発現を増強するのに対し,progesteroneはEGF産生を増強することより,estradioとprogesteroneは補完的,協調的に作用してEGF-EGF受容体系を刺激することが明らかとなった.他方,子宮筋腫細胞ではBcl-2蛋白によるアポトーシス抑制機構の存在が示唆され,子宮筋腫細胞でのBcl-2蛋白発現は増殖期に比して分泌期に増強すること,さらに子宮筋腫細胞培養系でprogesteroneがBcl-2蛋白の発現を大きく高めることから, progesteroneはアポトーシス抑制を介して子宮筋腫発育に関与する可能性が示唆された.2)卵巣顆粒膜細胞の増殖能とアポトーシス:卵巣顆粒膜細胞培養系を用いて,培養顆粒膜細胞の増殖能をPCNA発現態度より検討したところ,FSH,EGFならびにIGF-I添加により培養顆粒膜細胞のPCNA発現は増強した.一方,培養顆粒膜細胞におこるアポトーシスをin situ DNA 3′-end labeling法で検討するとFSHあるいはIGF-I添加により培養顆粒膜細胞のアポトーシスを抑制され,TGFβあるいはTNFα添加により培養顆粒膜細胞のアポトーシスは促進された.つまり,卵胞発育・閉鎖において,FSH,IGF-I,EGFはfollicle survival factorとして働くに対し,TGFβ,TNFαはatretogenic factorとして働くと考えられた.1)子宮筋腫の発育と性ステロイドホルモン:増殖期ならびに分泌期の正常子宮筋と子宮筋腫組織における細胞増殖能をPCNA発現態度より免疫組織学的に検討したところ,正常子宮筋細胞に比して子宮筋腫細胞においてPCNA発現は高く,子宮筋腫細胞でのPCNA発現は増殖期に比して分泌期に高いことが観察された.子宮筋腫細胞培養系を用いて性ステロイドの細胞増殖に及ぼす影響をPCNA蛋白発現より検討すると,estradiolおよびprogesterone添加により子宮筋腫細胞のPCNA蛋自発現は増加した.またestradiolは子宮筋腫細胞におけるEGF受容体発現を増強するのに対し,progesteroneはEGF産生を増強することより,estradioとprogesteroneは補完的,協調的に作用してEGF-EGF受容体系を刺激することが明らかとなった.他方,子宮筋腫細胞ではBcl-2蛋白によるアポトーシス抑制機構の存在が示唆され,子宮筋腫細胞でのBcl-2蛋白発現は増殖期に比して分泌期に増強すること,さらに子宮筋腫細胞培養系でprogesteroneがBcl-2蛋白の発現を大きく高めることから, progesteroneはアポトーシス抑制を介して子宮筋腫発育に関与する可能性が示唆された.2)卵巣顆粒膜細胞の増殖能とアポトーシス:卵巣顆粒膜細胞培養系を用いて,培養顆粒膜細胞の増殖能をPCNA発現態度より検討したところ,FSH,EGFならびにIGF-I添加により培養顆粒膜細胞のPCNA発現は増強した.一方,培養顆粒膜細胞におこるアポトーシスをin situ DNA 3′-end labeling法で検討するとFSHあるいはIGF-I添加により培養顆粒膜細胞のアポトーシスを抑制され,TGFβあるいはTNFα添加により培養顆粒膜細胞のアポトーシスは促進された.つまり,卵胞発育・閉鎖において,FSH,IGF-I,EGFはfollicle survival factorとして働くに対し,TGFβ,TNFαはatretogenic factorとして働くと考えられた.ヒト胎盤絨毛組織において、幹細胞である細胞性栄養膜細胞から分化し、母体脱落膜深部へ侵入する細胞集団は絨毛外栄養膜細胞と称される。この絨毛外栄養膜細胞の脱落膜深部への侵入と、apoptosisとの関わりを調べるため、胎盤組織切片上で、アポトーシス特有のDNA断片化とapoptosis関連因子であるbcl-2蛋白、Fas/Fas ligandの発現態度を検討した。DNA断片化はin situ DNA 3′-end labeling法によって調べ、絨毛外栄養膜細胞の同定はhPLとcytokeratinの免疫染色により行った。bcl-2蛋白は絨毛外栄養膜細胞に局在し、その発現レベルは脱落膜組織の浅部で強く、深部で減弱することを認めた。一方、FasとFas ligandの発現は脱落膜組織の浅部で弱く、深部へ進むにつれて増強した。正常末期胎盤の絨毛外栄養膜細胞でのDNA断片化は脱落膜組織の浅部に比較し、脱落膜組織の深部で有意に高かった。このことより、絨毛外栄養膜細胞にはbcl-2によるapoptosis抑制機構が存在し、また脱落膜深部に到達した絨毛外栄養膜細胞ではFas/Fas ligand発現を介してapoptosisが起ることが示唆された。他方、我々はBcl-2蛋白が子宮筋腫細胞に強く発現することを報告してきた。今回Bcl-2蛋白がTNFαによるアポトーシス誘導を抑制することに着目し、子宮筋腫細胞でのTNFαの発現とH202発生下の子宮筋腫細胞アポトーシス誘導系でのTNFα発現を調べ、子宮筋腫細胞アポトーシスへのTNFαの関わりを検討した。

その結果、TNFαが子宮筋腫細胞で発現し、その発現レベルは分泌期に比して増殖期に高く、妊娠時子宮筋腫細胞で観察されなかったこと、また筋腫細胞培養系でのH202によるアポトーシス誘導に伴い筋腫細胞でのTNFα産生が増強したことより、子宮筋腫細胞でのアポトーシス調節因子としてのTNFαの役割が示唆された。CDDPによるアポトーシス誘導経路を検討する目的で、CaSki細胞におけるCDDP添加後のFas/Fas ligand発現態度を検討した。CaSki細胞の無血清培養系にCDDPを添加し、CaSki細胞でのFas蛋白の発現に及ぼすCDDPの影響を免疫染色法ならびにWestern blot法で経時的に検討し、Fas ligand蛋白の発現に及ぼすCDDPの影響を免疫染色法で経時的に検討した。また、CDDP添加6時間後のCaSki細胞からtotal RNAを抽出し、CaSki細胞のFas ligand mRNA発現に及ぼすCDDPの影響をNorthern blot法で検討した。CaSki細胞の細胞質にはFas蛋白とFas ligand蛋白の局在を認め、CDDP添加24時間後と48時間後において、添加群では非添加群に比して、CaSki細胞内Fas蛋白とFas ligand蛋白の発現が共に増加することを認めた。またCaSki細胞内には2.0KbのFas ligand mRNAの発現を認め、CDDP添加群では非添加群に比しFas ligand mRNA発現が増加することを認めた。CDDPはCaSki細胞でのFas/Fas ligand蛋白ならびにFasligand mRNAの発現を増加させたことより、CDDPによる子宮頚部扁平上皮癌細胞のアポトーシス誘導は、Fas/Fas ligand系を介して起こることが示唆された。他方、多くの悪性腫瘍細胞ではテロメラーゼ活性の上昇によって細胞寿命が延長することが知られるが、抗癌剤の抗腫瘍効果とテロメラーゼ活性との関連については明らかでない。そこで子宮頚部扁平上皮癌細胞株(CaSki)のin vitro培養系で、高用量CDDP添加に伴う細胞増殖能、アポトーシス発現、ならびにテロメラーゼ活性に与える影響を明らかにしようとした。その結果、CDDP添加6時間後より培養CaSki細胞のBrdU陽性率は低下し、アポトーシス陽性細胞率が増加した。他方、細胞数はCDDP添加48時間後より減少を示した。CaSki細胞のテロメラーゼ活性はCDDP非添加群では不変であったのに対し、CDDP添加群では添加12時間後より低下の傾向を示し、CDDP添加48時間後には有意に低下することを認めた。CDDPは、添加6時間後よりCaSki細胞増殖能の低下と同時にアポトーシスを惹起させ、CDDP添加12時間後よりテロメラーゼ活性を低下させた。これらの事実より、CDDPの抗腫瘍効果は、添加後早期に起こるアポトーシス、並びにアポトーシスに遅れて起こるテロメラーゼ活性低下に伴う分裂寿命の延長抑制による可能性が示唆された。
超高速磁化制御によるテラヘルツ領域巨大光効果

1.磁性材料における超短パルス光の照射による高効率テラヘルツ発生の原理と応用磁性半導体GaMnAsにフェムト秒パルス光を照射することで生じる、磁化と相関を持つ高効率テラヘルツ光パルスの発生を観測してきた。昨年度に引き続き、偏光依存性やサンプル方位依存性、励起強度依存性など系統的な実験を行った。その結果を踏まえ、内部磁化によって加速される光励起キャリアが双極子放射によってテラヘルツ波を発生する、という観点からこの放射メカニズムの解明を進めた。2.テラヘルツ光の磁場成分による強磁性体の磁化制御テラヘルツ磁場成分による磁化制御実証のため、高強度テラヘルツパルス光発生の準備を進め、また高い周波数で応答する磁性体の探索を行った。特に、昨年度と異なり磁気異方性の小さな物質に着目して、各種磁性共鳴を利用する実験の可能性を検討した。さらに、テラヘルツ時間領域分光法の特性を生かすことで、このような物質系を利用するコヒーレント光学現象の新しい検証法への応用を探った。強磁性を示す遷移金属酸化物や強磁性半導体ではその磁性発現が得意な電子構造に由来している。このような磁性と電子構造が強く相関する状況では、光による電子系の励起によって磁化を制御することができる。光を超短パルス光とすると、磁化がそのパルス幅程度で急峻に変化する可能性がある。本研究では、光照射による磁化変化に注目し、次の2項目について研究を進めた。(1)超短パルス光の照射によって生じる急峻な磁化変化を利用した高効率テラヘルツ発生法:強磁性状態の磁性半導体(Ga_<-1-x>Mn_xAs:Tc110K)にフェムト秒パルス光を照射したところ、強いテラヘルツ光信号を観測した。テラヘルツ光の強度の温度依存性から、放射強度が磁化と相関があることを発見した。励起光強度依存性、入射角度依存性、偏光依存性などの系統的な実験を行い、その放射機構の解明を進めた。強磁性相の光励起現象について、超高速磁化制御、遠赤外電磁波制御機能の両面から考察を行い、最適な対象物質の検討をおこなった。(2)テラヘルツ光の磁場成分による強磁性転移:強磁性体を強磁性発現の限界領域に制御し、テラヘルツ光の磁場成分によって磁化発現のトリガーをかける実験を行った。我々の研究室で開発した高強度テラヘルツ電磁波(繰り返し1キロヘルツ、パルス幅1ピコ秒程度)を、空中を伝播する磁場パルスと見立てこれによる磁化の制御を実証するための実験を行った。磁化の測定は光学領域の磁気カー効果を利用し、物質系はハーフメタル強磁性体として知られ、磁気異方性の大きなLa_<1-x>Sr_vMnO_3を用いた。しかし、現状のテラヘルツ磁場パルスでは、磁気的相転移の観測には至らなかった。励起磁場パルス強度や磁化変化の検出系の改良点や、より敏感な応答を示す材料の検討を行った。その結果、磁気異方性の小さな物質のほうがより高速に応答する可能性があるのではないかという可能性を得た。
インターフェロン遺伝子転写調節因子の高次構造と制御塩基配列認識機構の研究

大腸菌に産製させた、112残基からなる塩基配列特異的DNA結合活性を持つIRF-2のDNA結合ドメインについて、主として均一^<15>Nラベル、均一^<15>N/^<13>Cラベルした試料を用いて、ほぼ全ての主鎖の^1H、^<15>Nおよび^<13>C核のシグナルの帰属を終了した。また、側鎖に関してもかなりの部分の^1H、^<15>Nおよび^<13>C核のシグナルの帰属を行った。現在、まだ計算中であり立体構造決定にはまだ至っていないが、2次構造は決定された。その結果、IRF-2のDNA結合ドメインは4本のβストランドからなる反平行βシートと3本のαヘリックスからなることが判った。3本のαヘリックスともβシートの片側に折り畳まれている事も決定された。
ロドコッカス・エクイ生菌免疫における特異免疫消失機序の解明

ロドコッカス・エクイ生菌による能動免疫の効果は免疫後2週間以内という極めて短い期間で消失してしまう。その原因を探るために、今年度は種々の表面マーカー分子の発現をフローサイトメトリーで調べることでT細胞の活性化とその後の消長を追跡した。また、Th1系の細胞を抑制することが知られているIL-10などがこの現象に関与していないかも併せて検討した。(1)マウス体内で免疫後IL-10が作用する時期について検討するため、免疫マウスに抗IL-10抗体を投与する時期を免疫1時間前、免疫1及び2週目と変えて強毒株死菌、リステリア死菌及び抗CD3抗体刺激により培養したマウス脾細胞から産生されるサイトカイン量を測定した。IFN-γ産生量は免疫1時間前投与マウスと免疫2週目投与マウスでIL-10未投与マウスに比べると、高濃度に検出されたが、特に免疫2週目投与マウスでIL-10未投与マウスに比べIFN-γ産生量は2倍になった。TNF-α産生量は免疫1時間前に抗体を投与したマウスでIL-10未投与マウスと比べ2700pg/ml前後と最も高濃度に検出された。IL-12産生量は免疫1週目に抗体を投与したマウスでIL-10未投与マウスに比べ、最も高濃度に検出された。(2)T細胞自体の活性に関する検索:T細胞が活性化した時に増加するCD44と減少するCD62L表面抗原と、免疫成立時に分化するメモリー細胞で減少するCD45RB表面抗原について検討した結果、CD62Lの発現率は正常マウスに比べ免疫1週目マウス脾細胞で減少したことにより、T細胞の活性化が確認されたが、免疫3週目マウス脾細胞で正常マウスと比較して変化が見られなかった。また、その他の表面抗原の免疫期間による変化は確認されなかった。これらの結果から、免疫成立時のメモリー細胞への分化が行われず、またT細胞の免疫3週目以降の活性化が消滅している可能性があると思われた。本年度は平成12年度研究計画に従い、以下の実験を行った。1.ロドコッカス・エクイ強毒株をマウスに投与し、感染の各時期の内因性のサイトカインをELISA法により測定した。その結果、IFN-γは菌数が最高値となった感染後4日目において脾臓・血清いずれにおいても最高値を示した。TNF-αは菌数の増減と平行して変化した。IL-4およびIL-10は検出限界以下であった。2.免疫7日目、14日目のマウス脾細胞を正常な別のマウスに移入し、強毒株で攻撃したところ、免疫1週目のマウス脾細胞を移入したマウスでは対照群と比較して脾臓の生菌数が約10分の1となっていた。しかし、免疫14日目のマウス脾細胞を移入したマウスでは対照群と菌数に差が無く、免疫効果の持続はみられなかった。3.強毒株感染後経時的に脾細胞を調製し、死菌刺激下で培養し産生されるサイトカイン量をELISA法により測定した。その結果、IFN-γとTNF-αは感染後7日目のマウス脾細胞で最高値を示し、その後減少した。

IL-10およびIL-12は検出限界以下であった。以上の結果から、ロドコッカス・エクイに対する宿主の防御応答は持続せず、菌のクリアランスと共に消失することが、脾細胞のサイトカイン産生や脾細胞の移入実験においても確認することができた。メモリー細胞への分化阻害、メモリー細胞の死滅、応答細胞のアナジー等が原因として考えられるため、今後それらの可能性を検討していく予定である。ロドコッカス・エクイ生菌による能動免疫の効果は免疫後2週間以内という極めて短い期間で消失してしまう。その原因を探るために、平成13年度は種々の表面マーカー分子の発現をフローサイトメトリーで調べることでT細胞の活性化とその後の消長を追跡した。また、Th1系の細胞を抑制することが知られているIL-10などがこの現象に関与していないかも併せて検討した。(1)マウス体内で免疫後IL-10が作用する時期について検討するため、免疫マウスに抗IL-10抗体を投与する時期を免疫1時間前、免疫1及び2週目と変えて強毒株死菌、リステリア死菌及び抗CD3抗体刺激により培養したマウス脾細胞から産生されるサイトカイン量を測定した。IFN-γ産生量は免疫1時間前投与マウスと免疫2週目投与マウスでIL-10未投与マウスに比べると、高濃度に検出されたが、特に免疫2週目投与マウスでIL-10未投与マウスに比べIFN-γ産生量は2倍になった。TNF-α産生量は免疫1時間前に抗体を投与したマウスでIL-10未投与マウスと比べ2700pg前後と最も高濃度に検出された。IL-12産生量は免疫1週目に抗体を投与したマウスでIL-10未投与マウスに比べ、最も高濃度に検出された。(2)T細胞自体の活性に関する検索:T細胞が活性化した時に増加するCD44と減少するCD62L表面抗原と、免疫成立時に分化するメモリー細胞で減少するCD45RB表面抗原について検討した結果、CD62Lの発現率は正常マウスに比べ免疫1週目マウス脾細胞で減少したことにより、T細胞の活性化が確認されたが、免疫3週目マウス脾細胞で正常マウスと比較して変化が見られなかった。また、その他の表面抗原の免疫期間による変化は確認されなかった。これらの結果から、免疫成立時のメモリー細胞への分化が行われず、またT細胞の免疫3週目以降の活性化が消滅している可能性があると思われた。
高周波四重極電極による高強度重イオンビーム捕獲の研究

発生したレーザーブラズマ中の重イオンビームを空間電荷効果の限界まで高周波四重極によって捕獲するため、計算機によるシミュレーションと実験による検証を行った。この結果、炭素4価の高強度ビームに対応する加速電極及びプラズマ引き出し装置を設計開発に成功し、平成16年7月の段階で30mAの電流強度を得る事に初めて成功した。更にイオン引き出し部分の改良、その他最適化によって電流最高強度を更新しつづけており、現在65mAの強度を発生している。この成果を8月にドイツで行われた線形加速器国際会議(LINAC2004,Lubeck)で報告した。また同会議のイオン源サマリーで全く新しい高強度重イオン発生方法として取り上げられた。高周波四重極電場の強度と捕獲される重イオンの電流量との関係を実験的に調べた。また、捕獲された重イオンの空間電荷効果と四重極電場の収束力による捕獲電流限界について計算機シミュレーションにより検証を行った。この結果、電極間電圧が120kV時に於いて、炭素4価ビームが最も効率良く捕獲される事が実験的に示され、計算結果とも一致した。また、炭素6価ビームのみを効率良く捕獲するためには、電極間電圧を63kVにすれば良い事が分かった。純度の高い多価イオンビームを高強度に発生捕獲する方法を確立したと言える。また、プラズマの膨張速度のみを利用して四重極電極間に重イオンを入射し、パルス幅を大幅に引き伸ばす事に成功した。1μ秒のパルスビーム幅が10μ秒程度に拡大する現象を実験的に確認出来た。これは、大型シンクロトロンなどの要求性能を満たすものである。理化学研究所の10ジュール炭酸ガスレーザーと300mJYAGレーザーを用いて、レーザープラズマに含まれる重イオンの組成、パルス時間内でのその変化を調べた。この結果、運転の容易なYAGレーザーでも短パルスながら高電荷の重イオンが効率良く生成できることが判った。現在利用可能なレーザー装置でも金属ターゲットを用いることによって100mA以上捕獲出来る可能性がある。必要とされるビームパルス幅を得るには、従来、固体ターゲットとイオン引きだし部分(本研究では高周波四重極加速器の入り口部分)との距離を調整することによって行われてきたが、空間電荷効果を考慮した計算機シミュレーションを通じて静電レンズを配置することによって効果的にイオン引き出しを行い高密度状態の重イオンビームを輸送できる可能性を示した。このシミュレーションを基に電極部分を現在、製作している。イオン捕獲装置として高周波四重極共振器用の加速電極を設計した。捕獲後の加速軸方向の空間電荷反発力を観察するために加速電極に無変調な部分を設けた。四重極型共振器は、一般に普及している4ベイン型ではなく、4ロッド型である。4ロッドタイプの高周波四重極は非対称な共振構造からダイポール成分が発生しやすく、さらに、レーザー収束用ミラーの共振器に対する影響を考慮する必要があるため、詳細な3次元高周波電場計算を行う必要があった。そこで、既存の高周波電磁場解析ソフト(Soprano/OPERA3D, Microwave Sutdio)を用いて共振構造の解析を行った。これらの結果を踏まえて高周波加速電極を製作し空洞共振器に設置した。発生したレーザープラズマ中の重イオンビームを空間電荷効果の限界まで高周波四重極によって捕獲するため、計算機によるシミュレーションと実験による検証を行った。

高周波四重極電場の強度と捕獲される重イオンの電流量との関係を実験的に調べた。また、捕獲された重イオンの空間電荷効果と四重極電場の収束力による捕獲電流限界について計算機シミュレーションにより検証を行った。この結果、電極間電圧が120kV時に於いて、炭素4価ビームが最も効率良く捕獲される事が実験的に示され、計算結果とも一致した。また、炭素6価ビームのみを効率良く捕獲するためには、電極間電圧を63kVにすれば良い事が分かった。純度の高い多価イオンビームを高強度に発生捕獲する方法を確立したと言える。また、プラズマの膨張速度のみを利用して四重極電極間に重イオンを入射し、パルス幅を大幅に引き伸ばす事に成功した。1μ秒のパルスビーム幅が10μ秒程度に拡大する現象を実験的に確認出来た。これは、大型シンクロトロンなどの要求性能を満たすものである。
in vitroにおけるPGC産生および分化のための新規培養系開発

卵子のもつ生物学的・医学的価値は極めて大きく、体外培養で卵子を産生する手法の開発は長い間望まれていました。本研究では種々の培養条件を検討することにより世界で初めて、多能性幹細胞(ES細胞およびiPS細胞)から卵子までのすべての過程を培養皿上で行う卵子産生培養システムを構築しました。この培養システムで得られた卵子は、受精により個体にまで発生しました。この方法では成体のマウスの尻尾の組織由来のiPS細胞からも機能的な卵子を得ることができました。体外培養下で多能性幹細胞から卵子に至る過程は、生体内の卵子の形成過程を概ね踏襲しており、改善点はあるものの、培養モデルとして十分に有用と考えられます。本研究は体外培養における配偶子産生系の構築とそれを用いて配偶子産生メカニズムを解明することである。具体的にはES/iPS細胞から始原生殖細胞を介して卵子(および精子)を分化誘導する培養系を開発する。また始原生殖細胞の分化に必要である遺伝子Ovolの機能を培養系を用いて解明する。本年度の研究によりES細胞から分化誘導した始原生殖細胞(PGCLCs)を体外培養により成熟した卵子まで分化させることに成功した。この方法ではPGCLCsを雌の胎仔生殖巣の細胞と長期に共培養し、その過程で様々な培養条件を変化させることにより、成熟卵子にまで分化させた。その過程において、胎仔の生殖巣の細胞は顆粒膜細胞および莢膜細胞に分化し、形態的には極めて体内にある卵胞構造と類似していた。また本年度の研究により、Ovolのファミリー遺伝子Ovol1, Ovol2, Ovol3を単独または全てを欠損させたES細胞を作製した。このES細胞にはPGCLCsへの分化がモニターできるBlimp1-mVenus/Stella-ECFPが組み込まれている。Ovolファミリー遺伝子を欠損させたES細胞からPGCLCsを分化誘導させた結果、Ovol2遺伝子を欠損させた細胞株においてPGCLCsへの分化の阻害が認められた。またOvolファミリーをすべて欠損させたES細胞では、PGCLCsへの分化阻害の程度はOvol2遺伝子を単独で欠損させたものと比べて、特に変化は認められなかった。このことよりOvol2は始原生殖細胞のごく初期に必要である可能性と、Ovol1やOvol3との機能的補完はなく、単独で機能している可能性を示した。本計画研究の目的は、第一にマウスの多能性幹細胞(ES/iPS細胞)を起点とした配偶子産生系(特に卵子産生系)を再現する体外培養方法を構築すること。第二に開発した体外培養系を利用して、in vivoでは細胞数が少なく解析が難しいPGCsの維持機構について他の計画研究班と協力して解析を行い、PGCsの維持を制御するために種間で保存されている遺伝子ネットワークを同定することである。平成26年度までにES細胞から分化誘導した始原生殖細胞を胚齢12日目の雌生殖巣の体細胞と共培養させることにより、成熟卵子の作製に成功した。RNA-seq解析により、これらの培養過程で得られる始原生殖細胞、2次卵胞中の卵母細胞および成熟卵子の遺伝子発現は体内のそれぞれの卵母細胞系列と極めて良く似ていることが明らかになった。これらのことから卵子産生系の構築は得られた成熟卵子の機能性の検証のみとなった。次に小林班との共同研究により、ショウジョバエOvoのマウスホモログであるOvol遺伝子のPGCsにおける機能について体外培養系を用いて解析している。現在までに、すべてのOvolファミリー(Ovol1, 2, 3)はPGCsの初期分化段階で発現していること、さらにOvol2遺伝子はOvol2a, 2b, 2cのスプライシングバリアントがあるが、これらのうちOvol2aと2bがPGCsの初期過程で発現していることを明らかにした。それぞれのノックアウトES細胞の解析の結果、Ovol2とOvol3のノックアウトES細胞からの始原生殖細胞の分化が阻害されていることが明らかとなった。平成26年度ではすべてのOvolファミリーのノックアウト(TKO)ES細胞の作製と解析を行った。またTKO細胞にそれぞれのOvol遺伝子を補完したES細胞を作製した。本研究は特に多能性幹細胞を用いた卵母細胞系列の分化培養系の構築において、当初の計画を上回るペースで進展している。平成26年度までにES細胞から分化誘導した始原生殖細胞を胚齢12日目の雌生殖巣の体細胞と共培養させ、様々な培養条件を並行して検討することにより成熟卵子の作製に成功した。体外培養で得られた多能性幹細胞由来の卵母細胞系列における遺伝子発現をRNA-seq解析により体内のものと比較すると、予想以上に高い相同性が認められた。また卵母細胞の産生効率は極めて安定的に再現され、一度の培養実験で約200-400個の成熟卵子が得られるようになった。ショウジョバエOvoのマウスホモログであるOvol遺伝子のPGCsにおける機能について体外培養系を用いて解析している。平成26年度において、Ovol-TKO ES細胞(OvolファミリーすべてをノックアウトしたES細胞)を用いた分化誘導研究において、Ovol2やOvol3の単独ノックアウトよりもTKO ES細胞では始原生殖細胞の分化が阻害されていることが明らかとなった。このことはOvol2とOvol3の機能冗長性を示唆するものであった。またOvol-TKO ES細胞にそれぞれのOvol遺伝子やバリアントを導入したES細胞を作製している。これによりそれぞれ遺伝子/バリアントの単独の機能について解明できることが期待される。