hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
層状フィードフォワードネットワークによる相関の強い確率分布の学習

本研究では相関の強い確率分布の学習における確率ニューロンからなる層状フィードフォワードネットワークの能力を体系的に研究し,学習能力を向上し,実用問題への応用の可能性を開くことを目的としたが,研究成果の概要は以下の通りである.1)学習係数の自動調整本研究で用いる確率的ニューロンからなるフィードフォワードモデルは優れたスケーラビリティを示すことが多いが,逆XOR問題の学習ではニューロン数が大きくなると学習が振動する現象が多く見られた。そこで,前後する学習過程におけるパラメータの変化の内積から学習係数を自動調整することにより,大きなニューロン数に対しても学習が改善され,実用へ近づいた.2)グラフィックシミュレータの作成逆XOR問題を学習可能なネットワークの理論的に予測された最小構造は入力層,中間層,出力層のニューロン数が(2-4-2)である.ところが,非対称な確率分布の逆XOR問題に対する数値計算の結果(1-1-2)構造のネットワークでも学習が可能であることが分かった.そこで,学習過程を追いながら,シナプス結合の強さと閾値の変化やニューロン状態のスナップショットを表示や,ある時間幅での各ニューロンの出力の平均値をグラフィカルに表示して,各ニューロンの学習の様子と役割を解明するためのグラフィカルシミュレータを作成した.これにより,各ニューロンがどのように学習に寄与しているのかを解明することが出来るようになった.本研究では相関の強い確率分布の学習における確率ニューロンからなる層状フィードフォワードネットワークの能力を体系的に研究し,学習能力を向上し,実用問題への応用の可能性を開くことを目的としたが,研究成果の概要は以下の通りである.1)学習係数の自動調整本研究で用いる確率的ニューロンからなるフィードフォワードモデルは優れたスケーラビリティを示すことが多いが,逆XOR問題の学習ではニューロン数が大きくなると学習が振動する現象が多く見られた。そこで,前後する学習過程におけるパラメータの変化の内積から学習係数を自動調整することにより,大きなニューロン数に対しても学習が改善され,実用へ近づいた.2)グラフィックシミュレータの作成逆XOR問題を学習可能なネットワークの理論的に予測された最小構造は入力層,中間層,出力層のニューロン数が(2-4-2)である.ところが,非対称な確率分布の逆XOR問題に対する数値計算の結果(1-1-2)構造のネットワークでも学習が可能であることが分かった.そこで,学習過程を追いながら,シナプス結合の強さと閾値の変化やニューロン状態のスナップショットを表示や,ある時間幅での各ニューロンの出力の平均値をグラフィカルに表示して,各ニューロンの学習の様子と役割を解明するためのグラフィカルシミュレータを作成した.これにより,各ニューロンがどのように学習に寄与しているのかを解明することが出来るようになった.1)余剰なニューロンに対するスケーラビリティの改善と非対称確率分布の逆XOR問題の学習一般に与えられた問題が複雑になるほど,事前に最小のネットワーク構造や最適なニューロンの数を予測することは困難になる.従って,学習が可能な最小構造または最も効率よく学習できる最適なニューロン数に対して十分に余剰なサイズのネットワークを準備せざるを得ないが,その際,システムサイズを必要以上に大きくしても学習が阻害されない能力(スケーラビリティ)が重要となる.本研究で用いる確率的ニューロンからなるフィードフォワードモデルは優れたスケーラビリティを示すことが多いが,逆XOR問題の学習ではニューロン数が大きくなると学習が振動する現象が多く見られた。そこで,前後する学習過程におけるパラメータの変化の内積から学習係数の大きさを自動調整することにより,大きなニューロン数に対しても学習が安定して進むことが分かった.2)確率分布を学習するのに必要なネットワークの最小構造の解明対称な確率分布の逆XOR問題が学習可能なネットワークの理論的に予測された最小構造は入力層,中間層,出力層のニューロン数が(2-4-2)である.ところが,非対称な確率分布の逆XOR問題に対する数値計算の結果(1-1-2)構造のネットワークでも学習が可能であることが分かった.そこで,学習過程を追いながら,シナプス結合の強さと閾値の変化を表示したり,ニューロン状態のスナップショットを表示したり,ある時間幅での各ニューロンの出力の平均値をグラフィカルに表示して,各ニューロンの学習の様子と役割を解明するためのグラフィカルシミュレータを作成した.これにより,各ニューロンがどのように学習に寄与しているのかを解明することが出来るようになった.相関の強い確率分布の学習問題は,意味の抽出,意味の相関,確率的連想,翻訳,1つの結果から複数の原因の確率的推計などの実用問題に多く見られる。例えば,翻訳には正確な意味の解釈を必要とするが,1つの単語は複数の意味を持ち,1つの単語の意味は周りの文章の影響を受け,他の単語の解釈にも影響する。申請者らは確率的ユニットからなる層状フィードフォワードニューラルネットワークを用いると,相関の強い確率分布の学習が可能であることを数値計算などで実証してきた。ここでは相関の強い確率分布の学習における確率ユニットからなる層状フィードフォワードネットワークの能力を体系的に研究し,学習能力を向上し,実用問題への応用の可能性を開くことを目的とする。平成19年度においては,平成18年度の成果を基に「文脈の意味の解釈に応用する」研究を行った.例えば「リゾート地で遊ぶ」と言う文章が与えられた場合,「リゾート」の解釈として「海」と「山」があり,「遊ぶ」の解釈として「泳ぐ」と「キャンプ」があるとする.

通常では「海で泳ぐ」か「山でキャンプ」と解釈することが妥当であろう.しかし文脈の前後に「臨海キャンプ場」や「高原の湖」などの表現があった場合には,「海でキャンプ」や「山で泳ぐ」という解釈の可能性が高まる.このような相関の強い連想の確率的解釈の実用性を評価した.結果として,確率的ユニットからなる層状フィードフォワードニューラルネットワークは文脈の意味の解釈に応用することが可能であるが,日常会話に適用するには膨大な語彙の収容が必要となり,実装に向けた検討が必要であることが分かった.相関の強い確率分布の学習問題は,意味の抽出,意味の相関,確率的連想,翻訳,1つの結果から複数の原因の確率的推計などの実用問題に多く見られる.例えば,翻訳には正確な意味の解釈を必要とするが,1つの単語は複数の意味を持ち,1つの単語の意味は周りの文章の影響を受け,他の単語の解釈にも影響する.申請者らは確率的ユニットからなる層状フィードフォワードニューラルネットワークを用いると,相関の強い確率分布の学習が可能であることを数値計算などで実証してきた.ここでは相関の強い確率分布の学習における確率ユニットからなる層状フィードフォワードネットワークの能力を体系的に研究し,学習能力を向上し,実用問題への応用の可能性を開くことを目的とする.平成20年度においては,平成18年度及び平成19年度の成果を基に,学習のスケーラビリティの改良を行った.このような相関の強い連想の確率的解釈の実用性において,膨大な数の確率的ユニットの互いに連関を学習する必要があるが,従来の確率的層状フィードフォワードニューラルネットワークにおいては,日常会話における膨大な語彙の収容能力には及ばず,ユニット数が500個程度を越えると,急速に学習が不安定になり,学習能力を失ってしまった,今回,学習係数の自動調整機能を導入することにより,学習のスケーラビリティを大幅に改良し,4,000個を超える数のユニットにおいても学習が可能となり,実用問題へ大きく近づいた.
移植後拒絶反応におけるOGG1の役割

本研究代表者らはこれまでの研究でマウス心移植モデルを用いた実験で、炎症反応が急性拒絶反応に関与していることを示し、炎症性サイトカインは虚血再灌流障害や、同種免疫反応に関与していることを示してきた。これらの研究成果に基づき、本研究は虚血再灌流障害に着目し、8-oxoguanine DNA glycosylase(OGG1)と拒絶反応について解明することを目的とし実施された。臓器虚血の過程でreactive oxygen species(ROS)が生成され、塩基などを損傷し、臓器障害が惹起する。この損傷されたDNAを除去修復するのがOGG1である。まず、マウス心移植急性拒絶モデルを作製し、C57BL/6 (H-2b)の同種間の心移植モデルでの虚血の評価とOGG1の発現を検討し、一定の目途をつけることができることができた。ついで心移植とそれに伴うOGG1の役割を評価するため、OGG1ノックアウトマウスを用いた異所性心移植モデルを確立した。このモデルを用いて、移植心の生着率と組織学的、免疫組織学的に解析した。また慢性期移植後21日、42日に摘出した移植心において、両群での組織学的、免疫組織学的解析を行っている。申請者らはこれまでにマウス心移植モデルを用いた実験で、炎症反応が急性拒絶反応に関与していることを報告している。炎症性サイトカインは虚血再灌流障害や、同種免疫反応に関与しているが、今回は虚血再灌流障害に着目し、8-oxoguanine DNA glycosylase(OGG1)と拒絶反応について解明することとした。OGG1ノックアウトマウスを用いた異所性マウス心移植モデルを用いてOGG1の拒絶反応に対する作用機序を究明する。本年度は、6週から8週の雄のOGG1ノックアウトマウス(C57BL/6 (H-2b)バックグランド)をドナー、BALB/c (H-2d)マウスをレシピエントに用い、腹部への異所性心移植モデルを作成した。また、コントロール群として、C57BL/6 (H-2b)マウスをドナー、BALB/c (H-2d)マウスをレシピエントとしたMHCフルミスマッチモデルを作成するした。更にコントロール群のドナーに術前よりOGG1を投与したOGG1投与群を作成し、生着率を比較検討した。このコントロール群においては、移植後6日から10日で移植心は拒絶されるので、移植後5日に犠牲死させ移植心と脾臓を摘出する。摘出した移植心は、2分割しパラフィン包埋標本、凍結標本とした。HE染色にて炎症細胞浸潤や心筋傷害の程度を観察し、Rejection Score(を用いて比較検討した。モデル作成技術の取得とその確立に時間を要した。しかし、現在では、モデル作成成功率は90%と上昇しており、この問題は解決できたと考えている。そのため、今後当初計画していた組織学的比較、免疫組織学的検討、RT-PCRについては今年度行っていく予定である。研究代表者らはこれまでにマウス心移植モデルを用いた実験で、炎症反応が急性拒絶反応に関与していることを報告している。平成27年度は、6週から8週の雄のOGG1ノックアウトマウス(C57BL/6 (H-2b)バックグランド)をドナー,BALB/c(H-2d)マウスをレシピエントに用い、腹部への急性期異所性心移植モデルを作成した。また、コントロールして、C57BL/6 (H-2b)マウスをドナー、BALB/c (H-2d)マウスをレシピエントとしたMHCフルミスマッチモデルを作成した。モデル作成成功率の安定が必要と考えられたため、平成28年度は、引き続き急性期異所性心移植モデルの作成を行い、生着率を検討した。当初の予定では平成28年度には急性期拒絶反応モデルと並行して、慢性拒絶反応モデルに対する解析を行う予定であった。しかし、成績のばらつきがあり、さらなるモデル作成の成功率の向上が必要であった。モデル確立の取得に時間を要したが、現在モデル作成率は良好となった。炎症性サイトカインは虚血再灌流障害や、同種免疫反応に関与しているが、今回は虚血再灌流障害に着目し、8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)と拒絶反応について解明することとした。

この損傷されたDNAを除去修復するのがOGG1である。OGG1ノックアウトマウスを用いた異所性マウス心移植モデルを用いてOGG1の拒絶反応に対する作用機序を究明する。平成27年度は、6週から8週の雄のOGG1ノックアウトマウス(C57BL/6 (H-2b)バックグランド)をドナー,BALB/c(H-2d)マウスをレシピエントに用い、腹部への急性期異所性心移植モデルを作成した。また、コントロールして、C57BL/6 (H-2b)マウスをドナー、BALB/c ( H-2d)マウスをレシピエントとしたMHCフルミスマッチモデルを作成した。平成28年度は、コントロール群のドナーに術前よりOGG1を投与したOGG 1投与群を作成し、生着率を比較検討した。平成29年度は、急性期および慢性期異所性心移植モデルの作成を行い、生着率の比較、組織比較、免疫学的検討、PT-PCRを施行している。当初の予定では平成29年度には急性期拒絶反応モデルと並行して、慢性拒絶反応モデルに対する解析を行う予定であった。急性期モデル確立の取得に時間を要したが、モデル作成率は良好となった。しかし慢性期モデルの確立取得にはまだ時間が必要である。本研究代表者らはこれまでの研究でマウス心移植モデルを用いた実験で、炎症反応が急性拒絶反応に関与していることを示し、炎症性サイトカインは虚血再灌流障害や、同種免疫反応に関与していることを示してきた。これらの研究成果に基づき、本研究は虚血再灌流障害に着目し、8-oxoguanine DNA glycosylase(OGG1)と拒絶反応について解明することを目的とし実施された。臓器虚血の過程でreactive oxygen species(ROS)が生成され、塩基などを損傷し、臓器障害が惹起する。まず、マウス心移植急性拒絶モデルを作製し、C57BL/6 (H-2b)の同種間の心移植モデルでの虚血の評価とOGG1の発現を検討し、一定の目途をつけることができることができた。ついで心移植とそれに伴うOGG1の役割を評価するため、OGG1ノックアウトマウスを用いた異所性心移植モデルを確立した。このモデルを用いて、移植心の生着率と組織学的、免疫組織学的に解析した。また慢性期移植後21日、42日に摘出した移植心において、両群での組織学的、免疫組織学的解析を行っている。今後は昨年度行うことができなかった急性拒絶反応におけるOGG1の関与について勧める。具体的には、モデル作成および生着率の比較、組織学的比較、免疫組織学的検討、RT-PCRを行っていく。その後慢性拒絶反応モデルにおけるOGG1の関与についても同様に解析を行う予定である。現在、急性期モデルに対して、生着率の比較、組織比較、免疫学的検討、PT-PCRを施行している。平成29年度は急性期モデルと並行して、慢性期モデルについても計画を進めていく予定である。また、虚血再灌流障害におけるOGG1の関与についてもC57BL/6 (H-2b)の同種間の異所性心移植モデルを作成し、虚血再灌流後のOGG1の変化について検討していく予定である。
固体炭素源を用いた2源スパッタリング法による硬質炭化物薄膜の高速成長

スパッタ法で炭化物薄膜を成長させる場合、金属ターゲットをArと炭化水素の混合ガスで反応性スパッタする方法が広く用いられる。しかし、この方法では、ターゲット表面上に形成するスパッタ速度の遅い炭化物のために膜形成速度を大きくすることが困難である、いわゆるヒステリシスのために反応ガス流量で反応ガス分圧を制御し難く再現性が悪いなどの欠点があり、これらが実用化を妨げている。我々は、スパッタ法で炭化物薄膜を成長させる別の方法として、炭素も金属と同様に固体ターゲットのスパッタにより基板上に供給する方法を提案する。本研究では、この方法でTiC薄膜だけでなくTi/C、TiC/Ti及びTiC/C多層薄膜の形成を行い、周期構造を持たせることによる薄膜の高性能化についても検討する。まずTiおよびCの2つのスパッタ源を用いて同時スパッタによるTiC_x薄膜の作製を試み、化学量論組成を有する結晶性のTiC薄膜を安定に成長できる条件を明らかにした。この結果をもとに、交互スパッタにより膜厚比1:1のTi/C、TiC/TiおよびTiC/C多層薄膜の作製した。その結果、Ti/CおよびTiC/C多層膜では1.7nm以下の非常に短い周期構造を実現できたが、TiC/Ti多層膜では2.6nm程度までしか多層構造を確認できなかった。また、Ti/C多層膜では周期が2nmより短くなると硬度が急激に高くなる挙動が、TiC/Ti多層膜では周期を短くするにつれて硬度が増加するHall-Petch的な傾向が認められた。これに対し、TiC/C多層膜では、周期が短くなるとともに高度が低下することがわかった。この現象は、薄膜中に生じたマイクロクラックによるものと推察される。さらに、Ti/C、TiC/TiおよびTiC/C多層構造の熱的な安定性を評価した結果、真空中ではTiC/C多層膜が、大気中ではTiC/Ti多層膜が最も安定であることが明らかとなった。これは、C原子単体の層を含む場合、600°C以上になると大気中の酸素と反応し易いためと考えられた。スパッタリング法でTiCなどの炭化物薄膜を成長させる場合、金属ターゲットをArと炭化水素の混合ガスで反応性スパッタリングする方法が多く用いられる。しかし、この方法ではターゲット表面上にスパッタ速度の遅い炭化物が形成するため、膜形成速度を大きくすることが困難である。また、反応性スパッタリングでは、いわゆるヒステリシスのために反応ガス流量で反応ガス分圧を制御し難く再現性が悪いという欠点もあり、これらが実用化の妨げとなっている。我々は、スパッタリング法で炭化物薄膜を成長させる別の方法として、炭素も金属と同様に固体ターゲットのスパッタにより基板上に供給する方法を提案する。本研究では、この方法でTiC薄膜だけでなくTi/C、TiC/TiあるいはTiC/C多層薄膜の形成を行い、周期構造を持たせることによる薄膜の高性能化についても検討することを目的とした。本年度は、まずTiおよびCの2つのスパッタ源を用いて同時スパッタによるTiCx薄膜の作製を試み、その構造や組成と機械的性質の評価を行った。その結果、薄膜の組成は各ターゲットへの投入電力の比で精度良くコントロールでき、投入電力比Ti : C=1:2の条件においてほぼ化学量論組成を有する結晶性のTiC薄膜が成長することが明らかとなった。

また、化学量論組成のTiC薄膜において最も良い機械的性質を示すことがわかった。一方、これらの結果をもとに、交互スパッタリングにより膜厚比1:1のTi/C多層薄膜の作製を試みた結果、1.1nm程度の非常に短い周期構造を有する薄膜を成長させることが可能であることを見出した。この場合、各層はアモルファス状となっていることもわかった。また、この多層膜では、周期が2nmより短くなると硬度が急激に高くなる挙動が認められた。これらの結果の一部は、2001年9月に開催された金属学会においてすでに発表済みである。スパッタリング法でTiCなどの炭化物薄膜を成長させる場合、金属ターゲットをArと炭化水素の混合ガスで反応性スパッタリングする方法が多く用いられる。しかし、この方法ではターゲット表面上にスパッタ速度の遅い炭化物が形成するため、膜形成速度を大きくすることが困難である。また、反応性スパッタリングでは、いわゆるヒステリシスのために反応ガス流量で反応ガス分圧を制御し難く再現性が悪いという欠点もあり、これらが実用化の妨げとなっている。我々は、スパッタリング法で炭化物薄膜を成長させる別の方法として、炭素も金属と同様に固体ターゲットのスパッタにより基板上に供給する方法を提案する。本研究では、この方法でTiC薄膜だけでなくTi/C、TiC/TiあるいはTiC/C多層薄膜の形成を行い、周期構造を持たせることによる薄膜の高性能化についても検討することを目的とした。本年度は、昨年度のTiC単層薄膜、Ti/C多層薄膜の結果をもとに、TiC/TiおよびTiC/C多層薄膜の作製と評価に取り組んだその結果、TiC/C多層薄膜では1.7nm程度までの非常に短い周期構造を実現できたが、TiC/Ti多層膜では2.6nm程度までしか多層構造を確認できなかった。また、TiC/Ti多層膜の硬度は、周期を短くするにつれて増加するHall-Petch的な傾向が認められた。これに対し、TiC/C多層膜では、周期が短くなるとともに高度が低下することがわかった。この現象は、薄膜中に生じたマイクロクラックによるものと推察される。さらに、Ti/C、TiC/TiおよびTiC/C多層構造の熱的な安定性を評価した結果、真空中ではTiC/C多層膜が、大気中ではTiC/Ti多層膜が最も安定であることが明らかとなった。これは、C原子単体の層を含む場合、600°C以上になると大気中の酸素と反応し易いためと考えられた。
ポリ塩化ダイオキシンの酵素的分解系の開発と応用

難分解性の有機ハロゲン化合物の分解を触媒する酵素の開発を目的として研究を実施した。難分解性のフルオロ酢酸を分解する細菌を土壌から単離し、本菌からフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒する酵素、フルオロ酢酸デハロゲナーゼを単離し他。本酵素はクロロ酢酸やブロモ酢酸には作用したが、炭素鎖長が3以上の基質には作用しなかった。一方、2-クロロプロピオン酸を炭素源とする培地でスクリーニングを行い、湖水から分解菌を単離した。本菌から精製した酵素、DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは2-クロロプロピオン酸のD-体、L-体のいずれにも作用し、これらの加水分解的脱ハロゲン反応を触媒した。また、種々のハロ酢酸の他、2-クロロプロピオン酸アミドにも作用し、これらの加水分解的脱ハロゲン反応を触媒した。酵素全長をコードする遺伝子の全塩基配列を決定し、906塩基からなるOFRの存在を明らかにした。推定される遺伝子産物は301アミノ酸残基からなり、推定分子量は34,049で、精製酵素の電気泳動によって求めた分子量と良く一致した。さらに、DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの反応機構を解析した。H_2^8Oの中でのシングルターンオーバー酵素反応において、^<18>Oが生成物に取り込まれることを質量分析によって明らかにし、本酵素反応では溶媒の水分子が直接基質を求核攻撃することによって脱ハロゲン反応が進行することを示した。このことは、H_2^<18>O中でマルチプルターンオーバー酵素反応を行った際に、酵素分子に^<18>Oが取り込まれないことも確認された。Pseudomonas putida PP3由来のDL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの諸性質を明らかにするとともに反応機構を解析した。本酵素は種々の2-ハロ酸のみならず、2-クロロプロピオンアミドや2-プロモプロピオンアミドの脱ハロゲン反応をも触媒した。これらの酵素反応生成物が乳酸アミドであることをNMRで確認し、本酵素が直接、2-ハロ酸アミドに作用することを示した。H_2^<18>O中でのシングルターンオーバー酵素反応において、^<18>Oが生成物に取り込まれることを質量分析によって明らかにし、本酵素反応では溶媒の水分子が直接基質を求核攻撃することによって脱ハロゲン反応が進行することを示した。このことは、H_2^<18>O中でマルチプルターンオーバー酵素反応を行った際に、酵素分子に^<18>Oが取り込まれないことからも確認された。さらにPseudomonas sp.YL由来のL-2-ハロ酸デハロゲナーゼの反応機構についても検討を加えた。本酵素反応では、その第一段階でAsp10が基質のα-炭素を求核攻撃してハライドイオンが脱離するとともに酵素と基質からなるエステル中間体が生成し、次いで、これが加水分解されて2-ヒトロキシ酸が生成するとともにAsp10が再生する。野生型酵素の結晶を基質L-2-クロロプロピオン酸にソークすることによって、生成物D-乳酸と酵素との複合体の結晶構造解析を行った。その結果、Asp10の側鎖がAsp180の側鎖と水素結合していることが明らかとなった。このことは、エステル中間体の加水分解を行う水分子がAspl80によって活性化されていることを示唆している。また、基質のアルキル基が疎水性ポケットで認識ざれ、結合安定化されることが判明し、この部位の改変で、本酵素の基質特異性を改変できるものと考えられた。離分解性の有機ハロゲン化合物の分解を触媒する酵素の開発を目的として研究を実施した。

離分解性のフルオロ酢酸を分解する細菌を土壌から単離し、本菌からフルオロ酢酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒する酵素を単離した。本酵素はクロロ酢酸やブロモ酢酸には作用したが、炭素鎖長が3以上の基質には作用しなかった。一方、2-クロロプロピオン酸を炭素源とする倍地でスクリーニングを行い、湖水から分解菌を単離した。本菌から精製した酵素は2-クロロプロピオン酸のD-体、L-体のいずれにも作用し、これらの加水分解的脱ハロゲン反応を触媒した。また、種々のハロ酢酸の他、2-クロロプロピオン酢アミドにも作用し、これらの加水分解的脱ハロゲン反応を触媒した。精製酵素のアミノ末端配列、および内部アミノ酸配列を解析し、これに基づいて、PCRクローニング用のプライマーを設計した。ゲノムDNAを鋳型とするPCRで、本酵素遺伝子の断片を取得した。さらに、カセット法により、酵素全長をコードする遺伝子を単離した。全塩基配列を決定し、906塩基からなるORFの存在を明らかにした。推定される遺伝子産物は301アミノ酸残基からなり、推定分子量は34,049で、精製酵素の電気泳動によって求めた分子量と良く一致した。これらの酵素は、難分解性有機ハロゲン化合物の分解のみならず、有機ハロゲン化合物の変換による物質生産にも有用であると考えられる。
新規分子が制御する癌細胞転移、増殖機構の解明研究

ある種の癌細胞では、PI(3,4,5)P3関連経路(PI3K-Akt経路)が活性化しており、癌細胞増殖や転移能亢進の要因となっている。本研究では、PI3K-Akt経路の制御が破綻し増悪化した乳癌細胞BT-549の転移がPRIPの発現によって抑制できるか検討した。BT-549にPRIP1を導入し、ヌードマウスの側腹部乳房近傍の皮下脂肪内に移植し、in vivoリアルタイムイメージングを行った。移植後5週間すると、コントロール群はリンパ節への転移が顕著に観察されたのに対して、PRIP1を導入した細胞群はリンパ節への転移が抑制された。この結果は、PRIPが癌転移抑制に効果があることを示唆している。PLC-related catalytically inactive protein (PRIP) knockout MEFを用いた実験により、PRIPが細胞膜PI(3,4,5)P3の調節タンパク質でありPI(3,4,5)P依存的な細胞移動やAkt経路のシグナリングを制御していることを見出した。ある種の癌細胞では、このようなPI(3,4,5)P3関連経路(PI3K-Akt経路)が活性化しており、癌細胞増殖や転移能亢進の要因となっている。本研究において我々はPI3K機能亢進が確認されている乳腺癌細胞MCF-7にPRIPを導入し、PRIPを恒常的に発現するMCF-7細胞株を樹立した。MTTアッセイによって細胞増殖を調べたところPRIP発現によって細胞増殖が抑制されることがわかった。Random migration assay、wound healing assayによって細胞の移動能を評価したところPRIP発現によって細胞移動が抑制されることがわかった。またウエスタンブロッティングによってPI3K-Aktシグナル経路の活性を調べたところPRIPを発現させた細胞ではこの経路が抑制されていることが明らかとなった。これらの結果は、PRIPが癌細胞の増悪化を抑制する新たな分子であることを示唆している。PI3K機能亢進が確認されている癌細胞におけるPRIPの細胞生物学的な機能解析は予定通り終了することができた。さらにPI(3,4,5)P3代謝酵素PTENの減少によりPI(3,4,5)P3量が恒常的に増加している乳腺癌細胞BT-549に外因性PRIPを発現させた細胞株も作製中であり、当初の予定通りに進んでいるため。我々は、PLC-related catalytically inactive protein (PRIP)が新規の細胞膜PI(3,4,5)P3の調節タンパク質であり、PI(3,4,5)P3依存的な細胞移動やAkt経路のシグナリングを制御していることを見出した。本研究では、PI3K-Akt経路の制御が破綻し増悪化した癌細胞の転移がPRIPの発現によって抑制できるか検討した。PTENの欠失によってPI(3,4,5)P3量が恒常的に増加している乳癌細胞BT-549にDsRed2-PRIP1を導入し、PRIP1を恒常的に発現し、かつ蛍光を発することでマウス生体内においてその局在をトレースすることのできる細胞株を樹立した。この細胞をヌードマウスの側腹部乳房近傍の皮下脂肪内に移植し、in vivoリアルタイムイメージングを行い、転移の様子を調べた。移植後1週間では、DsRed2ベクターを導入した細胞(コントロール)とDsRed2-PRIP1を導入した細胞はともに移植部位近傍で観察され、その蛍光強度(細胞数に依存)は同程度であった。移植後5週間すると、コントロール群はリンパ節への転移が顕著に観察されたのに対して、DsRed2-PRIP1を導入した細胞群ではリンパ節への転移が抑制された。このDsRed2-PRIP1を恒常的に発現するBT-549細胞はin vitro random migration assayにおいても顕著に細胞移動が抑制され、PI3K活性も低下していることが明らかとなった。これらの結果は、PRIPによるPI3K制御が癌転移抑制に効果があることを示唆している。作製したPRIPを安定発現するMCF-7を免疫不全マウスに投与し、肺や骨への転移能を生体レベルで評価する。また、この細胞を免疫不全マウスの皮下に投与し増殖能を評価する。細胞生物学免疫不全マウスを用いた動物実験の許可が下りるのが遅れ、マウスの購入費と維持費に関する支払い分が余ったため。免疫不全マウスを用いた動物実験の許可が下りたので、マウスの購入費と維持費に当てる。
プリオン病の新規病態として発見した細胞膜蛋白質の小胞輸送障害のメカニズム解明

我々は、プリオンの分解を促進する分子として、蛋白質輸送関連分子ソーチリンを同定した。ソーチリンは、正常プリオン蛋白質及び異常プリオン蛋白質の両者と結合し、両者の分解を促進した。しかし、プリオンが感染すると、ソーチリンはリソゾームでの分解が促進され低下することが分かった。また我々は、ノックアウトマウスはコントロールマウスと比べて早期にプリオン病を発症し、早期に死亡することを明らかにした。脳内の異常プリオン蛋白質の蓄積は、ノックアウトマウスでは早期から検出できた。以上の結果から、プリオンはソーチリンの発現を低下させることにより、自己増殖していることが示唆された。我々は、以前、プリオンが神経細胞に感染すると、プリオンは主にリサイクリングエンドソームに蓄積しポストゴルジ小胞輸送を障害し、その結果細胞膜蛋白質の細胞膜発現を低下させることを報告した。本研究では、我々が見出したプリオンのリサイクリングエンドソーム蓄積によるポストゴルジ小胞輸送障害がプリオン病の神経細胞死などの病態に関与するのか明らかにすることを目的とする。また本研究では、遺伝性プリオン病でもポストゴルジ小胞輸送が障害されているのか検討する。さらに本研究では、プリオンによるポストゴルジ小胞輸送障害の分子メカニズムを解明するために、これに関与する分子の検索も行なう。プリオンによるポストゴルジ小胞輸送障害がプリオン病の病態に関与するのか明らかにするために、まず、プリオン感染により細胞膜発現低下が認められた蛋白質(プリオン蛋白質、アトラクチン、インスリン受容体)の過剰発現Tgマウスを作製する。次に、これらのTgマウスにプリオンを感染させプリオン病の病態が改善されるのか検討する。我々は、プリオン蛋白質過剰発現Tgマウスを既に所有していたので、プリオンを感染させた。現在、これらのTgマウスの経過を観察している。また、アトラクチンおよびインスリン受容体Tgマウスに関しては、既にコンストラクトの作製が完了し、受精卵への注入も完了した。アトラクチンTgマウスに関しては、仔が生まれたところである。インスリン受容体Tgマウスに関しては、仔が生まれるのを待っているところである。また、遺伝性プリオン病モデルとなるTgマウスの作製を行なうために、コンストラクトの作製を行なっている。さらに、現在、プリオン蛋白質と結合する新規の小胞輸送関連分子を同定したところである。今後も、本研究の最終目的に向かって、これらの研究を精力的に継続していく。申請者らは、プリオンが神経細胞に感染すると、細胞膜蛋白質の細胞膜への輸送が障害され、細胞膜における細胞膜蛋白質の発現が低下し機能不全に至ることを見出し、細胞膜蛋白質の輸送障害が感染性プリオン病の病態に関与する可能性を示した。もし細胞膜蛋白質の細胞膜発現の低下が感染性プリオン病の病態に関与していれば、細胞膜蛋白質を過剰発現させることで細胞膜発現を上昇させると、プリオン病の病態が少しでも改善されるはずである。そこで申請者らは、申請者らが細胞膜発現の低下を確認した細胞膜蛋白質(インスリン受容体(IR)とアトラクチン(ATT))の過剰発現Tgマウスを作製しプリオンを感染させ、コントロールマウスと比較して、病態に違いがないか解析することにした。現在、IRのTgマウスについては、founderマウスが3匹生まれ、そのなかの1匹は系統化できず、また1匹は脳内にIRを発現しておらず、残りの1匹につては現在系統化中で、脳内発現を確認する予定である。ATTのTgマウスに関しては、founderマウスが3匹生まれ、現在系統化中である。遺伝性プリオン病でも細胞膜蛋白質の輸送障害が共通の病態メカニズムであるのか明らかにするために、遺伝性プリオン病のTgマウスモデルの作製を行ない、細胞膜蛋白質の細胞膜発現が低下しているのか解析することにした。現在、founderマウスが6匹生まれ、1匹は事故のため死亡し、その他に関しては系統化中である。また、プリオンによる細胞膜蛋白質の小胞輸送障害のメカニズムを解明するために、プリオンと結合する蛋白質輸送関連分子を同定した。この分子はプリオン感染により発現が低下し、またこの分子を強制的に過剰発現させるとプリオンの産生が低下した。今後、この分子がプリオンによる小胞輸送障害に関与するのか解析する。細胞膜蛋白質の細胞膜発現の低下が感染性プリオン病の病態に関与するのか明らかにするために、申請者らが細胞膜発現の低下を確認した細胞膜蛋白質(インスリン受容体(IR)とアトラクチン(ATT))の過剰発現Tgマウスを作製しプリオンを感染させ、コントロールマウスと比較して、病態に違いがないか解析する計画であったが、現在、両者のTgマウスとも系統化中であり、やや遅れている。また、遺伝性プリオン病でも細胞膜蛋白質の輸送障害が共通の病態メカニズムであるのか明らかにするために、遺伝性プリオン病のTgマウスモデルの作製を行ない解析する計画であったが、現在、Tgマウスの系統化中であり、やや遅れている。プリオンによる細胞膜蛋白質の小胞輸送障害のメカニズムを解明するために、プリオンと結合する蛋白質輸送関連分子を同定した。実際、この分子はプリオン感染により発現が低下し、またこの分子を強制的に過剰発現させるとプリオンの産生が低下した。今後、この分子がどのようにプリオンによる小胞輸送障害に関与するのか解析する予定であり、順調に進行している。以上総合すると、やや遅れていると判断した。

プリオン蛋白質の結合分子として同定したソーチリンのプリオン病における役割を明らかにするために、ソーチリン欠損マウス及びコントロールの野生型マウスにプリオンを脳内接種した。その結果、ソーチリン欠損マウスはコントロールマウスより早期にプリオン病を発症し、早期に死亡した。またウェスタンブロッティングでは、異常プリオン蛋白質がソーチリン欠損マウスの脳内では、早期から蓄積していた。また免疫組織化学の結果、異常プリオン蛋白質の蓄積は、ソーチリン欠損マウスの脳内で早くから広範囲にみられた。これらの結果は、ソーチリンが異常プリオン蛋白質の産生を抑制する機能を有するという我々のプリオン感染細胞を用いたこれまでの結果と一致するのもであり、個体内でもソーチリンはプリオン病を抑制することを明らかにした。また我々は、アトラクチンやインスリン受容体などの細胞膜蛋白質の細胞膜発現がプリオンが感染すると低下することを見出し、この発現低下が神経細胞死に関与する可能性を提唱した。この可能性を調べるために、アトラクチンやインスリン受容体の過剰発現トランスジェニックマウスを作製することにした。その結果、アトラクチンのトランスジェニックマウスでは、2系統においてライン化に成功した。インスリン受容体のトランスジェニックマウスでは、1系統でライン化に成功した。今後、これらのマウスにプリオンを感染させ、これらの分子のプリオン病における役割を解析する。さらに、家族性プリオン病でものアトラクチンやインスリン受容体などの細胞膜蛋白質が発現低下するのか調べるため、家族性プリオン病のトランスジェニックマウスの作製も行なった。1系統でライン化に成功した。今後、このマウスを用いて、アトラクチンやインスリン受容体などの細胞膜蛋白質の細胞膜発現が家族性プリオン病でも低下するのか解析する。我々は、プリオンの分解を促進する分子として、蛋白質輸送関連分子ソーチリンを同定した。ソーチリンは、正常プリオン蛋白質及び異常プリオン蛋白質の両者と結合し、両者の分解を促進した。しかし、プリオンが感染すると、ソーチリンはリソゾームでの分解が促進され低下することが分かった。また我々は、ノックアウトマウスはコントロールマウスと比べて早期にプリオン病を発症し、早期に死亡することを明らかにした。脳内の異常プリオン蛋白質の蓄積は、ノックアウトマウスでは早期から検出できた。以上の結果から、プリオンはソーチリンの発現を低下させることにより、自己増殖していることが示唆された。プリオンによるポストゴルジ小胞輸送障害がプリオン病の病態に関与するのか明らかにする研究のために、平成26年度中に、プリオン感染により細胞膜発現低下が認められた蛋白質(プリオン蛋白質、アトラクチン、インスリン受容体)の過剰発現Tgマウスの作製を完了する予定であったが、コンストラクトの作製に時間がかかり現在も継続中である。プリオン蛋白質過剰発現Tgマウスに関しては、我々は既に所有していたので、プリオンを感染させ、現在、これらのTgマウスの経過観察を行なっている。アトラクチンおよびインスリン受容体Tgマウスに関しては、既にコンストラクトの作製が完了し、受精卵への注入も完了した。
臨床検体由来Bacillus属分離率施設間比較による院内感染対策の指標作成

2008年から2014年のJANIS検査部門データによると、Bacillus属の分離数には医療機関間の顕著な差異があり、かつ夏に増加する明確な季節性が存在する。しかしBacillus属は菌種同定未実施株が多く、Bacillus属分離率が高くても、B. cereusによるものか、B. subtilisなど他菌種によるものかの鑑別はJANISデータ上できなかった。臨床分離株におけるB. cereusの割合を明らかにするため、2017年から2018年度末にかけ、研究協力医療機関3施設より臨床検体から分離されるすべてのBacillus属の分与を受け検討した。Bacillus属におけるB. cereusは、2017年は2施設の182株中31株(17%)であったが、2018年は3施設の204株中14株(7%)と減少した。2018年はBacillus属の各医療機関での分離数も2017年にくらべ約30%程度減少しており、主に5月から9月の夏季の分離数の減少によるものであった。同定菌種名を含まないBacillus属の分離数であってもその高低はB. cereus分離数と相関しうる可能性があり、季節性を考慮したうえでその推移を評価し、増加時には環境やリネン類の取り扱いを見直すことが有用と考えられた。また、B. cereusによる重篤な院内感染事例のほとんどが日本からの報告であり、その要因としてST1420の関与が示唆された。ST1420は新規に登録されたSTであり炭疽菌に最も近いCereus III lineageに属する。また国内の大規模な院内感染事例ではST1420を含むB. cereusが分離されていた。Bacillus属分離数の多い施設では積極的に菌種同定を行い、B. cereusであればさらにそのST型を解析することで、重篤例を含む院内感染の発生予防に寄与できる可能性が示唆された。厚生労働省医政局にJANIS検査部門の研究用データ利用申請を行い2000年から2015年7月までのデータを入手した。今年度はデータのクリーニングおよび解析方法の検討のため、2014年1年間分のデータを解析した。2014年のデータには998医療機関由来の6,789,132株の情報が含まれており、うち0.8%にあたる54,429株がBacillus属であった。Bacillus属として報告された株のうち41,565株(76.4%)は菌種名の登録がなかった。Bacillus cereusは6,988株(12.8%)で、Bacillus subtilisが5829株(10.7%)、残り47株がおそらく誤入力と思われるBacillus anthracisであった。998病院のうち、134病院(13.4%)ではBacillus属の分離がなく、457病院(45.8%)ではB. cereusとして報告された菌の分離がなかった。血液髄液検体に限定した場合、987病院より陽性菌株349,333株が登録されており、うち9,816株(2.8%)がBacillus属であった。菌種が同定されていないのは5030株(51.2%)、B. cereusが3740株(38.1%)、B. subtilisが1037株(10.6%)であった。987病院のうち236病院(23.9%)では血液髄液検体よりBacillus属の分離がなく、さらにB. cereusに限ると543病院(55.0%)では分離がなかった。100床あたりの分離株数は、中央値が0に対し、75%タイル値が0.875株、90%タイル値が2.4株、最大値が15.2株と偏った分離を示していた。Bacillus属全体で見ても同様の傾向がみられており、血液髄液検体よりBacillus属が一定数分離される医療機関は全体の10%未満と限定的である事が示唆された。JANISデータの研究利用の承認に想定よりも時間がかかり、解析可能なデータが入手できたのが2015年になってしまったため、十分なデータ解析期間を確保できなかった。また、2010年以降のJANIS検査部門の参加医療機関が急激に増加していたため、データサイズが想定よりも大きく、解析用のパソコンの性能を向上させる必要が生じ、その入手調整に時間を要した。厚生労働省院内感染対策サーベイランス(JANIS)事業、検査部門の2008年2014年の入院患者由来検体を対象として解析を行った。Bacillus属菌は7年間にのべ4105医療機関由来の131,346検体より分離されていた。検体の種類として血液、糞便、呼吸器系、その他がそれぞれ約1/4ずつであった。菌種別では、B. cereusが21.0%、B. subtilisが7.8%で同定がなされていないのが71.1%であった。菌種の同定率と割合は検体によって大きく異なり、血液検体では55.3%が同定され、9割がB. cereusであった。一方、糞便や呼吸器検体では同定率は15%前後のみであった。

血液検体と糞便呼吸器検体(非無菌検体)からの100床あたりのBacillus属菌を医療機関ごとに比較したところ、相関は認めなかった。季節性について検討すると、B. cereusは血液、呼吸器、糞便とどの検体も夏季にピークを示した。B. subtilisはいずれの検体においても明確な季節性は認めなかった。Bacillus属菌全体では、検体によって異なり、血液、呼吸器系では夏季に多いが、糞便検体ではその傾向は見られず、血液、呼吸器検体由来のBacillus属菌ではB. cereusの、糞便検体ではB. subtilisの占める比率が高いことが推察された。B. cereusの血流感染症に明確な季節性を認めたこと、セレウス食中毒の9割が夏季に発生していること、また、文献的にはB. cereus血流感染症の侵入門戸として腸管が主に指摘されていることから、カテーテル管理や採取時の汚染とは異なる要因の存在も考えられた。当初の研究計画ではB. cereusの分離数を検体種別、医療機関別に比較する予定であったが、非無菌検体では7割以上で種レベルの同定がなされておらず、B. cereusの分離株数が極めて小数となってしまい、解析不可能であった。そのため、種レベルの同定を行っていない株も含めたBacillus属の分離株での比較を行わざるを得なかった。またBacillus属としてまとめた場合も、医療機関によっては分離数が極めて少なく、定量的に比較することが困難であった。一定の割合でBacillus属が分離されている医療機関に絞り、血液検体と糞便呼吸器検体(非無菌検体)からの100床あたりのBacillus属菌の分離率を比較したが、両者には相関は認められ無かった。そのため、非無菌検体のBacillus属菌分離数から血流感染のハイリスク医療機関を推測することは困難と考えらえた。非無菌検体から分離された場合に感染症の起因菌として可能性が低くなるBacillus属菌のような菌種の場合、非無菌検体からの分離は培養陰性として扱われ、株情報をJANISに登録していない医療機関が存在する可能性も示唆された。また、分離株として登録されていた場合も、Bacillus sp.として登録され菌種同定がされていない株が大半をしめ、血液検体であっても半数は菌種の同定がされていなかった。B. cereusとB. subtilisは病原性や生物学的特性が大きく異なるため、この2菌種を合わせて解析することの有意性は低いと思われ、種レベルの同定情報を含むデータの解析が必要と思われた。院内感染対策サーベイランス事業(JANIS)検査部門データベースを用いて国内の入院患者からのB. cereusの分離状況、特にその季節性と分離検体の関係を検討した。全提出検体数に占める対象菌陽性検体数を対象菌の分離率と定義し、検体種類別に月別分離率を求め、5カ月中央移動平均により季節性を評価した。2008年から2014年の、のべ4,105医療機関の入院患者に由来する検体を対象とした。Bacillus属菌の分離検体の内訳は血液24.5%、糞便26.5%、呼吸器23.4%であった。一方、B. cereusに限った検体別内訳は血液49.5%、糞便4.9%、呼吸器7.4%と血液に多かったがB. subtilisは分離検体に大きな偏りはなかった。B. cereusの月別分離率は、血液検体、糞便検体、呼吸器検体ともに8月をピークとする季節性を認めた。一方、B. subtilisに関してはいずれの検体でも明確な季節性を認めなかった。Bacillus属菌全体では、血液検体、呼吸器検体が8月をピークとする季節性を認める一方、糞便検体に季節性を認めずB. cereusの季節性がBacillus属菌の季節性の主な要因と考えられた。都道府県別のB. cereusの月別分離率を検討したが、季節性に地域差は認めなかった。
クロス及びマルチカップリング反応の高効率触媒系の構築と高度制御

立体的に嵩高い2級および3級アルキル基の導入反応、ジエンやアルキン等の不飽和炭化水素を組み込む多成分カップリング反応、化学的に不活性なC-F, C-OおよびC-H結合の切断を伴ったクロスカップリング反応など、遷移金属触媒を活用した炭素-炭素結合生成の新手法を種々開発すると共に、アニオン性遷移金属錯体を鍵活性種とする触媒反応の新分野を開拓した。また、有機金属試薬、有機カルコゲンおよびハロゲン化物の付加反応を開発し、炭素骨格とヘテロ原子官能基を炭素ー炭素不飽和結合に一挙に導入する触媒反応を開発した。さらに、電子的および構造的な柔軟性を有する遷移金属錯体を活用した新触媒反応を開発した。遷移金属触媒を用いる結合生成反応は、最も重要な合成手段の一つであり、近年目覚ましい発展を遂げている。しかしながら、この分野に於いても未解決の課題も多い。これを基質という視点から見ると、一つは炭素骨格の構造に由来するものであり、例えばアルキル金属錯体からのβ水素脱離が速いため、遷移金属錯体を利用して飽和の炭素鎖を導入する事は一般に困難と考えられてきた。もう一つはヘテロ原子の性質に起因するものである。炭素と同族のケイ素を例に挙げれば、Si-Cl結合を遷移金属で切断することは困難であり、汎用的なケイ素化試剤であるクロロシランをシリル化剤とする遷移金属触媒反応の例は少ない。この様に、合成化学の分野に於いても、早期の解決が望まれている課題は多い上記の背景のもと、本研究では遷移金属触媒反応の試剤として、従来は利用することが困難と考えられてきた、アルキルハライド、クロロシラン、有機カルコゲン化合物や種々のヘテロ原子化合物を、カップリング反応の基質として含むし新しい触媒反応系の開発を目的とする。その研究対象としては、置換反応のみではなく、不飽和結合への付加を含多成分カップリング反応も含め、効率的な反応制御による有用な合成反応の創出を目指す。また、本研究目的達成の一つの指針として、アニオン性遷移金属錯体を活性種とする触媒反応の構築、および構造的および電子的に柔軟な配位子を利用する触媒反応の効率化を目指す。本年度は、種々の均一系金属触媒を用いることにより、ハロゲン化アルキルや、グリニヤール試薬、有機亜鉛試薬等の有機基をアルキンやジエン、エンインなどの不飽和結合に付加させる反応の開発を行った。例えば、Pd触媒存在下、アレンとグリニャール試薬とクロロシランを室温で反応させると、アレンの中心炭素にグリニャール試薬由来の有機基、末端炭素にシリル基が導入され、アリルシランが得られることを見いだした。同様の反応をクロロシランの代わりにハロゲン化アルキルやトシラート等のアルキル化剤を用いて行うことにより、グリニヤール試薬とアルキル化剤由来の二っの有機基をアレンに位置選択的に付加させることができる。Ag触媒と1,2-ジブロモエタンを組み合わせて用いることにより、末端アルキンへのグリニャール試薬の位置選択的付加反応を開発した。この反応は、級数の高いアルキルグリニャール試薬を用いると特に効率良く進行した。また、この付加体を種々の親電子剤で捕捉した。本触媒反応は末端アルキンの代わりにエンインを用いても効率よく進行することを明らかにした。Ni触媒を用いる反応として、ビニルグリニャール試薬の二量化を伴う、環状エーテル類とのカップリング反応を開発した。また、dppb存在下、アルキンあるいはエンインとハロゲン化アルキルと有機亜鉛試薬との3成分カップリング反応を開発した。更に、チタノセン触媒存在下、ビニルグリニャール試薬とハロゲン化アルキルとの反応を行ったところ、ビニル基の二量化を伴うアルキル化が進行し、アリルグリニャール試薬が選択的に得られることを見出した。この生成物をケトンなどの種々の親電子剤により捕捉した。本反応の機構を検討し、ジビニルチタノセン錯体を経て生成するブタジエン錯体へのアルキルラジカルの付加により進行する機構を提案した。ハロゲン化アルキルとグリニャール試薬とのクロスカップリング反応において、ビスアリルNi錯体の触媒能を検討し、合成化学的応用面の展開を図った。その中で、ブタジエンを添加剤とする反応系について官能基選択性を明らかにした。また、ビスアリルNi錯体として最も単純な(C3H5)2Niを用いると、低温下でもクロスカップリンが効率よく進行し、官能基としてメチルケトンユニットを有する基質にも適用できることを明らかにした。これらの知見を踏まえ、アルキル鎖を有する天然物合成への応用およびその類似体の合成への展開を開始した。また、種々のアリール基を有する鉄錯体を合成し、ハロアルカン類のクロスカップリング反応の触媒として機能し得る可能性を示した。

コバルト錯体を用いる、アルキル基クロスカップリングに付いても検討し、コバルト系で一般的なラジカル機構ではなくイオン機構で反応が進行している可能性が高いことを明らかにした。更にNi錯体を用いる、ハロゲン化アルキル、有機金属試薬、アルキンル類の3成分カップリング反応や、銀触媒を用いるアルキンへのアルキル化反応を開発した。更に、1,2-ビスチオカルボニル化合物、ビスアミド化合物、テトラエン類を合成し、配位子としての可能性を検討した。また、カルコゲン化合物を基質とする反応として、チオエステルやチオアミド、ならびに対応するセレン・テルル化合物とアルキンおよびアレンとの反応を検討した。その結果、PdやPtを触媒とする、分子間ならびに分子内付加反応を開発した。更に、同様の付加反応がラジカル中間体を経ても進行することを明らかにすると共に、この反応では位置選択制が、触媒反応と異なることを明らかにした。本研究では、遷移金属錯体を触媒とするクロスカップリング及び多成分カップリング反応の開発を目指しており、本年度は下記の触媒反応系について重点的に検討した。(1)ニッケル触媒を用いるクロスカップリング反応の反応機構の詳細を解明するため、理論計算により各反応中間体および遷移状態の構造とエネルギーを求めた。種々のジアリル配位子について計算を行い、理想的な配位子構造に関するデータを蓄積し、触媒反応の効率化を目指して実験化学的にフィードバックできる重要な結果を得た。また、少量のNiおよびPdを含む金属酸化物ペロブスカイトをNiおよびPdの供給源として用いるクロスカップリング触媒計を開発し、低濃度の触媒でも効率よく反応が進行することを明らかにした。また、溶出したNi触媒のTONは10000000近くに達することを示した。(2)アルキル基を導入する多成分カップリング反応としては、銀触媒を用いるアルキン類へのアルキルハライドを伴う、ビニルグリニャール試薬の簡便な合成法を開発した。本法を用いると、末端アルキンとアルキルはライド及びアルキルグリニャール試薬から温和な条件下でビニルグリニャール試薬を調整することが可能で有り、本法で生成させたビニルグリニャール試薬がアリールハライドとのクロスカップリング反応に支障なく利用できることを示した。(3)アルキル基を導入する多成分カップリング反応として、パラジウム触媒を用いる事により、アルキンに硫黄官能基とイミド基を付加させる触媒系を開発した。この反応はCF3を導入する手法としても有用であることを示した。また、パラジウム触媒を用いる事により、アルキンへの一酸化炭素によるカルボニル化を伴ったフェノールの付加反応を開発した。(1)銅触媒を用いたクロスカップリング反応により立体的に嵩高い2級アルキルハライド類の利用を可能とした。銅触媒はアルキル-アルキルクロスカップリング反応に高い触媒活性を有しており、触媒回転数40万回を達成した。また、多成分カップリング反応として銅触媒を適当な条件で前処理することにより、ブタジエンに対してアルキルフルオライド由来のアルキル基とグリニャール試薬由来の水素が1,2-付加し、分岐構造を有する末端オレフィンが得られることを明らかにした。