hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線による分裂期チェックポイント異常を介したアポトーシスの誘発機構

3SB細胞とJurkat細胞に見られた速やかなアポトーシス誘発が浮遊培養細胞に共通した性質かどうか確かめるため、浮遊培養したHeLa SC細胞に紫外線を照射し、アポトーシス誘発動態とミトコンドリアを介したアポトーシスシグナル伝達について調べた。その結果、HeLa SC細胞は遅延型のアポトーシスを示すものの、HeLa S3細胞に比べてアポトーシスに特徴的な核の分断化とDNA鎖切断が高頻度に生じることがわかった。しかし、この浮遊培養細胞はHeLa S3細胞と同様にcaspase3様の活性がなく、caspase阻害剤(Z-VAD-FMK)を処理してもDNA鎖切断が観察されたことから、これらの遅延型アポトーシスの誘発はcaspasaeに依存しないことが判明した。一方、アポトーシス誘発はApaf-1を主構成因子とするapoptosomeによって制御されているので、両細胞種でのapoptosome構成因子の違いを調べる実験を開始した。まず、ヒトApaf-1遺伝子をクローニングし、結合タンパク質を分離するためのタグ(FLAG及びHA)遺伝子を結合して各細胞にトランスフェクトした。その結果、種々のApaf-1遺伝子導入細胞が得られ、一部の細胞では導入遺した伝子産物が検出できた。これまで本研究では、放射線に対する細胞応答反応として細胞周期進行停止とアポトーシス誘発に注目し、それぞれに関わるシグナル分子の同定をその機能解析を行ってきた。特に、がん抑制遺伝子産物p53が両反応において重要な働きを果たしていることが知られているので、分裂期チェックポイントに関与するaurora kinase Aとp53との関係について解析した。まず、p53がaurora kinase Aの基質となりうるかどうか調べたところ、この酵素はp53の315番目のセリンを特異的にリン酸化すること、その結果としてp53がMdm2により容易に分解されることがわかった。興味あることに、315番目のセリンをアラニンに変えたp53を発現させるとG2/M期細胞の集積がおこった。また、細胞内のaurora kinaseAを枯渇させるとアポトーシス高感受性となり、逆にその発現量を上昇させるとp53量が低下した。このことはp53を介してaurora kinase AがG2期からM期への細胞周期進行を制御すると同時に、アポトーシス誘発にも密接に関与していることを示唆する。一方、放射線応答性の細胞内シグナル因子を同定するため、紫外線及びγ線照射されたJurkat細胞においてどのようなタンパク質発現パターンを示すかを二次元電気泳動法により調べた。まず、未照射細胞と紫外線照射後3時間目の細胞について比較したところ、量的に差の見られるタンパク質スポットに加え、紫外線照射細胞において新たに複数のスポットが出現した。同程度の致死効果を示すγ線を照射した場合では、これとは異なったタンパク質発現パターンを示すので、両放射線で活性化されるシグナル伝達因子が異なる可能性が高い。
超強磁場・極低温・高圧下での電気的・磁気的測定のための非金属製圧力セルの開発

一般に重い電子系の磁気秩序温度は数K,超伝導転移温度は1K程度と低いのに対し,磁気的な性質が変化する磁場は数数十Tと高い。このような系の研究にはパルス強磁場を用いた数十Tの磁場が必要となる。パルス強磁場で大きな問題となるのは,渦電流による発熱である。これが重い電子系の強磁場・極低温・高圧実験を困難なものとしている。そこで,本研究では,1K以下の極低温・40Tを超えるパルス強磁場下で数GPaの圧力を発生できる圧力セルの開発を目指した。その結果,1.5K,60Tで4GPaの圧力を発生できる圧力セルの開発に成功するとともに,CeRh2Si2における4f電子の局在的性質と遍歴的性質の分離に成功した。本研究では,f電子系強相関物質が示す新規量子相を探索するために,広範囲の温度・磁場・圧力相図の研究を可能とするパルス強磁場を用いた数十Tの磁場中でも極低温・高圧実験を可能とする圧力セルの開発をめざしている。パルス強磁場下での圧力セルでは,うず電流の発熱が低温で問題となる。そこで本年度は,ブリッジマン型アンビルセルを用いて,アンビルとガスケットの非金属化を行った。これまではアンビルにタングステンカーバイトWC,ガスケットにBeCu-MP35Nのハイブリッドガスケットを用いて,極低温で6GPa程度での実験を行ってきた。本研究では,WCをジルコニアアンビルに変え,ガスケットをパイロフェライトとした。方式を変更するため,アンビルのデザイン,ガスケットの最適条件をさぐり,現在の所,3GPaまでは支障なく実験できるようになった。破壊テストを今後行い,最高圧力を確かめる。その前に,実際に興味ある対象物質で実験を行った。対象としたのは,CeRh2Si2である。CeRh2Si2は36Kのネール温度を有し,約1GPaの臨界圧力で常磁性体となる。常圧ではHc=26Tの磁場で,反強磁性の磁気モーメントが強磁性的にそろう。本圧力セルを用いて,フランス・トゥールーズのパルス強磁場施設で,W. Knafo博士と共同実験を行い,圧力下でメタ磁性の変化を調べた。その結果,0.6GPaまでは,常圧と同様のメタ磁性が観測されるが,それ以上の圧力では,重い電子系に由来するメタ磁性HMへとクロスオーバーしていくことが明らかとなった。次年度は,圧力・磁場・温度の詳細を明らかにしていく予定である。また,新たに開発した圧力セルでは,1.6Kの低温でも,パルス上昇中では温度上昇の影響をかなり押さえることに成功したが,パルスの下りで温度上昇の影響が表れた。今後この点の改善も行っていく予定である。CeRh2Si2のようなイジング型の反強磁性体では,磁場は反強磁性秩序を破壊したり(H=Hc),また偏極した常磁性状態を誘起する(H=Hm)。これら二つの現象は,1次のメタ磁性転移を伴なって同時に起きる場合もあれば,反強磁性秩序の破壊が,磁場誘起のメタ磁性よりも低い磁場で起きることもある。CeRh2Si2では,これが同時に起きている。一方,常磁性体CeRu2Si2にRhをドープした系では,反強磁性秩序が誘起されるとともに,HcとHmの分離が観測されている。ドーピングに比べて圧力は,反強磁性セリウム化合物を量子臨界点へと導く上でクリーンな手段である。圧力はHmを増大させる一方,Hcを減少させ,HmとHcの分離を引き起こすものと期待される。これをCeRh2Si2で検証すべく,本研究では,パルス強磁場を用いた数十Tの強磁場中でも極低温・高圧実験を可能とする圧力セルの開発をめざしている。昨年度の非金属アンビルおよびガスケットの開発に引き続き,本年度は,フランスCEAのD. Braithwaite博士と協力し,アンビルを支える圧力セルの本体にスリットを4箇所入れ,渦電流の発生を抑えた圧力セルの製作を行った。その結果,4.5 GPaの高圧力,1.5 Kの極低温,60 Tの強磁場での実験が可能となった。この圧力セルを用いて,トゥールーズのパルス強磁場施設で,W. Knafo博士とCeRh2Si2のメタ磁性の研究を行った。Pc=1GPaより低圧では,一つの鋭いメタ磁性がHcで観測される。Hcは加圧とともに減少していく。しかしながら,Pcに近い圧力では,Hcより低い磁場にブロードな肩構造がH=Hmで磁気抵抗に観測された。

加圧によりHcとHmが一致したのち,ブロードなピークとして,Hmがさらに増大していくことを見出した。これらの結果は,当初の期待を裏付ける結果である。固体物性当初は,初年度は圧力セルの開発までを予定していたが,新しいタイプの圧力セルの開発が進展したのみでなく,連携研究者のW. Knafo博士の協力もあり,CeRh2Si2のメタ磁性に関して,興味深い研究結果を得ることができた。また,連携研究者のD. Braithwaite博士と共同で,圧力セル本体の温度上昇を抑えるデザインについても,方向性が定まったので,次年度での研究計画の方向性が明らかとなった。また,今回のブリッジマン型圧力セルの開発過程により,より大型の試料での実験が可能となるピストンシリンダー型セルの開発についても,パルス強磁場用のデザインのアイデアが固まった。今後,極低温・パルス強磁場・圧力下の磁化測定を進めることができると期待される。CeRh2Si2のメタ磁性に関しては,局在磁気モーメントのスピン方向転換によるメタ磁性と,CeRu2Si2で議論されているような重い電子系のメタ磁性のデカップリングを観測することに成功した。今後,f電子の局在性と遍歴性の二重性の議論に発展すると期待できる。今後は,まず本年度作製した圧力セルの改良をさらに進める。アンビルおよびガスケットまわりのデザインおよび圧封に関しては,確立することができた。今後の改善としては,圧力セル本体の発熱を押さえることにある。その方策の一つとしては,圧力セルのうず電流が流れる経路を押さえるため,窓をつくる。これにより強度は犠牲になるが,強度と温度上昇を押さえることに関しての最適条件を探る。また,圧力セル本体として,金属とプラスティックのハイブリッド化を図る。今年度はプラスティックのみの圧力セルも作製したが,ブリッジマン方式では,プラスティックだけでは強度が足りないことが明らかとなった。そこで,ハイブリッド化により,さらに温度上昇を抑えることを目指す。また測定対象としては,結晶構造に反転対称性を持たない圧力誘起超伝導体CeTX3 (T: Co, Rh, Ir; X : Si, Ge)がある。中でもCeIrSi3は,50 Tでも壊れない反強磁性と40 Tを超えると推測される大きな上部臨界磁場磁場Hc2を有している。そこで,反強磁性体CeIrSi3の(T , H, P )相図に関して,特に強磁場領域を探索する。図2 (a)に,Hc2の温度依存性を示す。超伝導転移温度Tcは約1.5 Kと低いが,Hc2は強結合的に降温とともに大きくなり,超伝導マグネットで実現可能な磁場を大きく超え,Hc2(0)は40 Tを超えそうである。この強磁場領域のHc2を調べたいと考えている。また,CeRhIn5ではCeCoIn5やCeIrIn5に対して,H ∥[001]とH ⊥[001]方向でHc2の異方性が逆転している。これには磁場誘起反強磁性相と磁場中での量子臨界点が関与していると考えられる。このような系の実験も進めたいと考えている。
分子内水素結合を利用した新しい高分子3次元構造の設計と機能予測

本企画調査班は12名(6大学、1(独)研究所、1民間研究所)からなり、当初から分子内水素結合の利用によって鎖状分子の分子設計に新たな局面が開けるのではないかという認識を共有していた。内外の研究情報を持ち寄って検討の結果、共通の目標に向かって共同研究を実施に移すべきであるとして、以下の手順で11月に平成16年度科学研究費補助金特定領域研究に申請を行なった。<1>第1回ワークショップ(平成15年8月1日、東京工業大学)基盤研究(C)企画調査の各メンバーが、それぞれの専門領域の視点で分子内および分子間水素結合について意見を述べ、さらに共通の課題である新規分子設計における水素結合の利用という観点から検討を行った。特定領域研究申請に値するテーマであるという認識のもとで、拡大メンバーによるシンポジウムを企画することとした。<2>第1回シンポジウム「水素結合の分子戦略」(平成15年10月18日、東京工芸大学)バランスの取れた共同研究の構築を念頭に、水素結合の解析、応用に関心のある研究者を招き、講演、討論を行った。結論を受けて、平成16年度科学研究費補助金特定領域研究に「水素結合の戦略的利用による新しい分子構造・分子集合構造設計概念の確立」と題する申請を提出した。12の計画研究を機能、利用、解析の3班に分け、班内、班間で自由に共同研究が組めるような運営を目指すとした。<3>第2回シンポジウム「水素結合」(平成16年1月31日・2月1日、虎ノ門パストラル)11月に提出した科学研究費補助金特定領域研究の採否に関わらず、実質的に共同研究を推し進めるべく、「水素結合」と題する2日間のシンポジウムを開催した。活動をまとめて報告書を作成した。
コケ植物を用いたABA、低温および浸透圧応答の統合的制御に関する基礎研究

植物は、乾燥や低温などの環境変化にさらされると、内生アブシジン酸(ABA)のレベルを上昇させ、ストレスによる細胞の損傷を防いでいる。しかし、これら環境変化の感知機構や、シグナルを統合して制御する仕組みは不明である。本研究では、ヒメツリガネゴケで同定されたABAやストレスシグナルの統合的制御に関わるRaf様プロテインキナーゼの機能解析、特に活性の制御機構と下流因子解析を中心に研究を進めてきた。Raf様プロテインキナーゼARKの活性に必須であることが明らかとなったSerのリン酸化について、抗ARK抗体やリン酸化に特異的な抗体を用いて変動を解析した。ARKのリン酸化はABAにより亢進することが明らかとなっているが、高浸透圧処理によっても活性化することがわかった。ARKは高浸透圧処理により2段階の活性化を受け、リン酸化の変動は下流因子であるSNF1様プロテインキナーゼ(SnRK2)の活性変化と相関があった。ABA欠損株ではARKリン酸化の高浸透圧応答がほとんど見られず、高浸透圧応答に内生ABAを必要とすることが明らかとなった。被子植物では3つあるSnRK2サブグループのうち、サブグループIIIのみをもつコケ植物のSnRK2の機能とARKとの関わりについて解析した。コケSnRK2(PpSnRK2AD)四重変異株を用いた解析からは、サブグループIII SnRK2が陸上植物のABA応答における原型的な分子種であることが示唆された。また、リン酸化プロテオム解析から、コケのABA応答におけるARK-SnRK2の主要な役割が示唆された。ARKはPpSnRK2BおよびPpSnRK2DのActivation loop内の特異的なセリン残基をリン酸化し、その特異性はサブグループIII SnRK2のActivation loopに保存されたアミノ酸配列に強く依存することが示された。ストレス応答に関わる遺伝子のゲノム編集株の作出とその評価をすることができた。苔類のABA受容体であるMpPYL1のゲノム編集株の解析から、数多くのLEA遺伝子や乾燥耐性獲得時に見られるショ糖の蓄積がABA特異的に制御される膜輸送体によって行われていることが示唆された。結果の一部は2つの論文にまとめることができた。ARKの機能解析については、ARKの欠失解析と相互作用タンパク質の解析から活性と相互作用の関係を明らかにする。これまでに取得したコケ変異株のゲノム解析を進め、相補実験やゲノム編集により責任因子を同定する。ARK相互作用因子として同定した候補については、遺伝子を改変した形質転換体におけるABA応答やストレス応答変化を調べる。また、ARKとの関わりをキナーゼアッセイなどにより解析し、ABAおよび環境ストレス応答性に関わる新規シグナル経路の解明を目指す。
沖合の大規模Wave farmの最適設計技術に関する研究

本研究では、従来装置より、格段に小型で小さい係留力、高効率という優れた特性を持つ浮体式振動水柱型(Oscillating Water Column: OWC)波力発電装置“後ろ曲げダクトブイ(Backward Bent Duct Buoy,以後BBDB)を構成単位とした沖合の大規模Wave farm建設を目指し、不規則な波浪中における浮体運動、空気室内の空気圧力変動、空気タービン特性、係留系特性を同時に考慮できる新しい最適設計手法を開発した。(1) BBDBの発電性能評価のためのシステムシミュレーション手法の開発本研究では、通常用いられる浮体の動揺によるメモリー影響に、従来示されていなかった空気室内の空気圧力のメモリー影響を考慮した浮体の運動方程式を用いた。空気圧力のメモリー影響は、空気室内水面に単位圧力を作用させた周波数領域でのラディエーション問題の解の畳み込み積分として表現した。空気室内の水面変化の時系列も畳み込み積分で表現した。空気室内の空気の運動に関する基礎式として、連続の式と熱力学保存則を用いる。また、タービンについては、波力発電に多用されるウェルズタービンに比べて、高トルクで広い流量係数(=軸流速度/ロータの周速度)の範囲で高効率特性を持つとして、研究分担者である瀬戸口が開発した案内羽根付きの衝動型タービンを用い、システムシミュレーションに、このタービン特性を考慮した。(2)中型BBDB模型の水槽実験上記システムシミュレーションの検証と、浮体、タービン、発電機の効率的な組み合わせを検討するために、既に、佐賀大学海洋エネルギー研究センターで所有する長さ2.5m、幅2.29mの浮体に、直径0.25mの衝動タービンとコアレス発電機を搭載した中型模型を用いて、詳細な水槽実験を行った。(1) BBDBの発電性能評価のためのシステムシミュレーション手法の改良昨年度作成したシミュレーションプログラムの改良を行った。本研究では、通常用いられる浮体の動揺によるメモリー影響に、従来示されていなかった空気室内の空気圧力のメモリー影響を考慮した浮体の運動方程式を用いた。空気圧力のメモリー影響は、空気室内水面に単位圧力を作用させた周波数領域のラディエーション問題の解の畳み込み積分として表現した。おおよそ計画通りに進行しているため。渦度を未知量とした性能解析手法(渦積分方程式法)を開発した.1流速を求めるBiot-Savartの式に相当する第1の積分方程式、2渦度を求める第2の積分方程式、3圧力、位置エネルギー及び運動エネルギーの和で表される総エネルギーに関する第3の積分方程式を用いて、Rayleigh流れ、振動平板上の粘性流れ等の一次元流れの計算を行い、解析解との比較を行い、この計算法の有効性を確認した。また,“粘性流体を対象とした、渦法による2次元浮体構造物の非線形波浪中挙動解析法"を提案(永田、今井他:2015, 2017)して、没水平板の鉛直運動、係留された矩形や三角形断面浮体の波浪中運動、浮体式の振動水柱型波力発電装置BBDBの波浪中挙動と一次変換効率(波パワーから空気パワーへの変換効率)に関する計算結果と実験結果と比較することにより、提案した計算手法の有効性を示した。Yeungら(2002)と同様に、流れ関数と渦度を未知量として扱うが、1渦度の粘性拡散の計算に、Yeungら用いたRandom-Walk法よりも精度の良いCore-Spreading法を用いる、2物体境界面からの渦度の発生方法に関しては、滑らかな物体表面については渦層モデル、物体の角部についてはVorticity sheddingモデルの2つを併用する、3物体表面に働く流体圧力の計算には、Uhlman (1992)によって提案された、粘性流体の基礎式から導かれた“総エネルギーに関する境界積分方程式"を用いる、の改良を加えた。おおむね順調に進展している(1)BBDB性能評価のため,ポテンシャルベースの数値計算法を開発した.線形係留された3次元BBDBの6自由度運動、空気室内の空気圧力と温度、タービンの回転角速度に関する同数の式が各時刻に解いて行く基本的な計算プログラムを作成した。中型模型に関する実験結果との比較では、BBDBの運動時に発生する浮体端部からの渦によるエネルギーロスの影響の考慮が必要であることが分かった。(2)従来の振動水柱型波力発電装置では空気タービン模型に関する風洞試験を行い、それに発電機特性(二次変換)を追加考慮して、装置全体の発電性能評価を行っていたが、この方法では、装置全体の最適化のための構成要素(浮体形状やタービン緒元等)のマッチングが困難であった。そこで,装置全体の模型を製作し、入射波の周期や波高、空気室形状、タービン形状、発電機を変化させ、それらが発電効率に及ぼす影響を調べた。本実験から、装置の各変換過程での変換効率を含め、装置全体の最適化のための構成要素(浮体形状やタービン緒元等)のマッチングに関する実験データを得ることができた。

(3)前年度までに開発した渦法を用いてBBDBに働く漂流力を計算し、特定の波周波数帯で、BBDBが波上側へ移動する(負の漂流力)現象を表現できることがわかり、漂流力係数についても実験値とよく一致することがわかった。本研究では、従来装置より、格段に小型で小さい係留力、高効率という優れた特性を持つ浮体式振動水柱型(Oscillating Water Column: OWC)波力発電装置“後ろ曲げダクトブイ(Backward Bent Duct Buoy,以後BBDB)を構成単位とした沖合の大規模Wave farm建設を目指し、不規則な波浪中における浮体運動、空気室内の空気圧力変動、空気タービン特性、係留系特性を同時に考慮できる新しい最適設計手法を開発した。おおよそ計画通り進捗しているため。(1)漂流力計算法の開発後ろ曲げダクトブイ型波力発電装置のシステムシミュレーションを行うためには、周波数領域でのBBDBに働く漂流力係数が必要となる。ここでは、周波数領域でのBBDBの浮体運動計算ツールをベースに、空気室の影響を考慮した漂流力計算プログラムを作成する。計算プログラムは、遠場法と近場法の2種類を作成する。計算法の検証は、3次元BBDBを対象に漂流力実験を実施して、得られた実験結果と計算結果の比較により行う。(2)渦積分方程式法による波浪変形計算法の改良波浪変形計算法を引き続き改良する。非圧縮粘性流体の解析には、通常、微分型表示された連続の式とNavier-Stokes方程式を基礎式として、これを差分法や有限要素法を用いて得方法が用いられる。申請者らは、既に、粘性流体の関する積分型の境界値問題を導き、Navier-Stokes方程式の新しい数値解析法(渦積分方程式法)を提案し、低レイノルズ数のHagen-Poiseulle流や一様流中の円柱に働く粘性流体力の計算を行い、その有効性を確認している。本計算法は次の特徴をもつ。1流速、渦度、圧力に関する3種類の積分方程式を時系列的に解く新しい方法である、2渦粒子法で課題である渦の拡散も正確に扱うことができる。3空間微分を含まない。空間に関する微分演算を積分演算に置き換えるので、不規則な要素分割が可能である。この方法による自由表面境界処理法を改良し、波浪伝搬問題をより高精度に解けるようにする。昨年度までに研究を更に進め、浮体式振動水柱型波力発電装置BBDBをさらに高性能化するとともに、BBDBを構成単位とした沖合の大規模Wave farm建設を目指して、必要な数値解析技術、最適設計技術を開発する。また、装置の性能把握と解析法の検証のための水槽実験も併せて行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。海洋工学(1)漂流力計算法の開発後ろ曲げダクトブイ型波力発電装置のシステムシミュレーションを行うためには、周波数領域でのBBDBに働く漂流力係数が必要となる。計算法の検証は、3次元BBDBを対象に漂流力実験を実施して、得られた実験結果と計算結果の比較を行うことにより行う。
アジア圏域途上国における農産物流通近代化のための実践課題に関する研究

農産物流通近代化の課題として、カンボジアの野菜産地からの流通広域化のためには、産地仲買人の販売代金を堅実かつ迅速に回収するとともに、その資金繰りを容易にする金融機能を内包すること、タイにおける野菜農家への買い叩きの問題を解消するため、より広範な市況情報を農家に伝達し、販売先の選択に役立てること、ミャンマーにおいて米の輸出拡大のためには、年によって変わる輸出業者への輸出許可証の分配や輸出割当量についての不確実性を除去すること等が挙げられる。本年度の研究実施計画は、「国内需給の空間均衡状態の定量的・視覚的把握-市場間統合・分断の計量分析」であった。対象市場はカンボジア国内に分散する野菜卸売市場11カ所であり、当該市場価格はカンボジア農林水産省マーケティング局から入手した2002年から2006年の月別卸売価格を利用した。プノンペンにあるデウムコア市場とその他の10県にある市場間の統合・分断の程度が明らかになったが、以下に要点をまとめる。(1)キャベツ、白菜、きゅうり、だいこん、トマトの品目別にみると、市場間の組み合わせ10個のうち市揚間統合が達成されているのは、キャベツ3市場間、白菜5市場間、きゅうり4市場間、だいこん4市場間、トマト1市場間であった。特にトマトは輸送中の品質保持が難しい品目であり、これらの流通は円滑となっていないことが明らかである。(2)市場間の距離に着目すると、プノンペンのデウムコア市場に最も近いカンダル県のタクマオ市場では、すべての品目について、2番目に近いカンポンチャム県のバンコック市場でもトマト以外の品目について市場間統合が達成されている。しかしながら、プノンペンの市場とその他の県の市場間は分断されているケースが多くなっている。(3)カンボジアの野菜の国内流通はプノンペン周辺の限られた地域でのみ円滑であり、国内全土に及んでこれを達成するためには、道路網の整備、輸送中の品質保持の向上等が必要であると考えられる。本年度はミャンマーにおける豆類の輸出拡大の阻害要因の存在と国内市場への影響を明らかにした。ミャンマーとインドは消費者嗜好の類似性、低い輸送費用や迅速な供給が可能であるといった条件のもと、双方は主要な貿易相手国(ミャンマーが輸出国、インドは輸入国)である。しかし、そこにはインドにおける最低価格支持制度、輸入に課せられる高い税金と輸出禁止措置、ミャンマーにおいても高い輸出税、固定的な為替レートといった貿易阻害要因が存在する。これらの阻害要因により自由貿易の場合と比べて、インドにおいては国内価格を高位に保ち、ミャンマーからの輸入量を抑制する効果があること、ミャンマーにおいては国内価格を低位に保ち、国内需要量を高める効果があること、経済厚生の観点からみれば、ミャンマーでは生産者より消費者にとって望ましい状態にあることを考察した。また、ミャンマーの国内価格はインドの国内価格に影響を及ぼすが、その逆は成立しない。これはインドのミャンマーへの輸入依存度が相対的に高いことを示している。この結果はインドにおけるミャンマーからの豆類の輸入量は全体の約90%を占めるが、ミャンマーからインドへの輸出量は全体の約60%であり、他にもインドネシア、マレーシア、シンガポール等の輸出先国を有する事実と整合的である。本研究で農産物流通近代化の過程において国内需給安定の次の目標と位置づけた輸出拡大は、ミャンマーでは自国の輸出税を削減することにより可能となる。また、インドにおける輸入税の削減や最低価格支持制度の撤廃によりさらに促進されると考えられる。本研究の目的は、途上国での農産物流通開発を念頭におきながら、農産物流通近代化のための実践課題を解明することである。それを実証するために計量分析、現地事例分析による接近及び解明を試みるものであった。本年度の実施計画は、(1)農業関連産業の活性化等がどのように農業・農業関連産業の付加価値形成に帰着するのかそのメカニズムを明らかにすること、(2)前年度までの分析結果とこれまでの申請者の研究蓄積をベースにアジア圏域途上国の農産物流通において流通機能構築の求められる部分、流通機能高度化の課題、その実現可能性などについて考察することとした。以上に基づき、カンボジアにおける青果物流通の実態調査を実施した。(1)の計画に対して、カンボジアで野菜の加工はほとんどみられないが、原料ダイコンを農家から購入し、漬けものや切干加工し、独自に店を構え、消費者に販売する家族経営の事例があった。ダイコンの皮むき、カット等は家族や雇用された近隣の住民によってなされる労働集約的な加工である。このような事業形態は、ダイコンの需給調整、加工事業による新たな付加価値形成と雇用の場の提供に貢献していることを明らかにした。(2)に対しては、卸売業者から小売業者への農産物の売掛金の回収が遅延化しており、卸売業者が迅速な支払いを求める農家からの買取りに苦慮している事例があった。このような状況で農家の所得向上や卸売業者が費用を要する広域流通を担う主体となることを阻害している。これは平成19年度に定量的に明らかにした農産物の地域間需給不均衡を招いている一つの要因と考えられ、改善が求められるところであると考察した。
電界励起によるZnS薄膜における発光中心へのエネルギ-遷移過程と純青色発光素子

1.硫化亜鉛薄膜を母体とする薄膜エレクトロルミネッセンス素子における発光中心の励起過程を明らかにするため、種々の素子を製作しその特性を測定したところ、以下の結果を得た。(1)硫化亜鉛薄膜を母体とする薄膜エレクトロルミネッセンス素子における発光の過渡的振舞いは、フォトルミネッセンスの振舞いと同様であった。(2)発光中心からの発光は、可視域全体に広がる硫化亜鉛母体の発光の減衰の過程で現われる。(3)熱処理温度の異なるエレクトロルミネッセンス素子の特性から、発光中心の励起に母体の再結合が関与している可能性が示された。(4)発光中心の励起過程を理解する上で有効と思われる結果が、エレクトロルミネッセンスに及ぼす紫外光照射効果において観測された。(5)これらの結果から、エレクトロルミネッセンス素子における発光中心の励起は母体からのエネルギ-伝達によるものと考えられる。2.励起機構を考慮してTm^<3+>イオンを添加した青色発光エレクトロルミネッセンス素子を製作し、以下に示す結果を得た。(1)発光中心として、TmFx中心よりもTmOF中心が効率的である。(2)禁制帯の広い母体を用いると、Tm^<3+>イオンからの発光は短波長側で優勢となる傾向が観測された。1.ZnSを母体材料に用いた薄膜電界発光(エレクトロルミネッセンス:EL)素子における発光中心へのエネルギ-遷移過程と添加微量酸素の果たす役割を明らかにするために、発光中心化合物の種類(Mn,TbF_x,TbSF,TbOF)および発光層の成膜条件を変えた素子を製作し、時間分解発光スペクトル、発光過渡特性ならびにEL発光に及ぼすZnSのバンドギャップに相当するHeーCdレ-ザの325nm光照射効果等について検討した結果、次の様に考えることができる。(1)価電子帯からの電子の供給を枯渇させないことが、電子の衝突励起によるZnS母体の十分なイオン化とそれに引き続く発光中心へのエネルギ-伝達に寄与する再結合に有効に作用する。(2)等電子的なMnあるいはTbX(X=F,SF,OF)を発光中心として用いることにより、トラップとして、移動度の小さい自由正孔をすばやく減少させる役割を果たし、高輝度化に寄与する。TbOFの効率が良いのは、酸素の電気陰性度が大きいためトラップの捕獲断面積が増加することによる。2.色純度が良いにもかかわらず十分な輝度の得られていないTm化合物添加ZnS EL素子を各種成膜条件で製作した結果、以下の知見が得られた。(2)発光中心にTbOFを用いるとTmF_xに比して多少輝度の増加が観測される。(3)ZnS母体にTm^<3+>イオンをより良く拡散させるには更に電荷補償イオン(Bi他)の添加が有効である。硫化亜鉛薄膜を母体とする薄膜エレクトロルミネッセンス素子における発光中心の励起過程を明らかにし、この結論をふまえて、未だ得られていない色純度の良い高輝度青色発光素子を得ることを目的に研究を進め以下に示す結果を得た。1.熱処理温度の異なるZnS:Mn,ZnS:TbF_x素子の発光過渡特性を比較することにより、発光中心の励起に母体からのエネルギ-伝達が関与している可能性の強いことがわかった。2.発光中心濃度の異なるZnS:Mn,ZnS:TbF_x素子における発光の過渡的振る舞いからも、発光中心の励起に母体からのエネルギ-伝達が関与していることが確認できた。3.発光中心の励起過程を解明する上で有効と思われる結果が、ELに及ぼす光照射効果において観測された。5.EL素子の励起機構に母体からのエネルギ-伝達が関与していることが確認されてきたので、発光中心の励起に寄与する母体の再結合エネルギ-を大きくすることを考え、禁制帯幅の広い母体材料を用いることを試みたところ、ランタニドイオンの短波長側の発光遷移が観測されることを見いだした。

また、Tmを添加した青色発光素子の母体材料として禁制帯幅の広い材料が適していることを確認しており、本研究においてこれらの結果を基に素子の設計を進めている。また、EL素子の励起機構の詳細な点についても現在検討を行っている。
子宮体癌における間質-腫瘍相互作用の臨床的意義の解明と新規分子標的の探索

これまで悪性腫瘍の再発を予測する上で間質の遺伝子発現を対象にした報告は少なく,特に癌実質および間質の発現プロファイルを同時に解析した報告は存在しない.本研究では,子宮体癌において癌実質だけでなく間質における遺伝子発現が予後と相関することを明らかにした.選別した全遺伝子のうち11遺伝子の発現が,子宮体癌の癌実質および間質で共通して再発と関連しており,これらの遺伝子については癌-間質相互作用の関与が示唆された.これまで悪性腫瘍の再発を予測する上で間質の遺伝子発現を対象にした報告は少なく,特に癌実質および間質の発現プロファイルを同時に解析した報告は存在しない.本研究では,子宮体癌において癌実質だけでなく間質における遺伝子発現が予後と相関することを明らかにした.選別した全遺伝子のうち11遺伝子の発現が,子宮体癌の癌実質および間質で共通して再発と関連しており,これらの遺伝子については癌-間質相互作用の関与が示唆された.子宮体癌において,間質-腫瘍相互作用の観点から予後(癌の再発)と関連する遺伝子を同定し,さらに化合物アレイを用いて子宮体癌の新規分子標的薬発見の可能性を探索することを目的として,平成22年度は以下の検討を行った.【対象と方法】1.対象:子宮体部類内膜腺癌60例.年齢の中央値は55才(25-81才),進行期(I期:31,II期:4,III期:20,IV期:5)を対象とした.全例で標準手術が実施され,術後化学療法は50例で施行され,38例が無病生存中であった.全症例の観察期間の中央値は1,830日(120-3,375日)であった.2.アレイ解析:子宮体癌凍結組織60例を用いて,マイクロダイセクションを施行し癌実質および間質よりRNAを抽出後,アレイ解析に供した.Microarray tipはHumanRef-8 BeadChip(Illumina社製)を使用し,Whole-GenomeDASL Assayにて解析した.3.再発に関与する遺伝子の抽出:再発群と無再発群で発現の異なる遺伝子を,再発をイベントとしたCox単回帰にて癌実質および間質毎に抽出した(p<0.0005).【結果】再発群と無再発群で発現が異なる遺伝子は,癌実質および間質それぞれで88個,57個が抽出された(p<0.0005).その内訳は,それぞれシグナル伝達系:22個(25%)16個(28%),細胞発育:5個(6%),5個(9%),代謝:13個(15%),6個(11%)などであり,両群で差を認めなかった.また,11個は実質および間質の両者で共通しており,これらは癌-間質相互作用の関与が示唆された.平成23年度は,前年度に抽出した癌の再発に関与し,かつ癌-間質相互作用の関与が示唆される遺伝子に焦点をしぼり機能解析を進め,さらには化合物アレイを用いた新規分子標的のスクリーニングを施行する予定である.子宮体癌の発現解析を実施し予後(癌の再発)を規定する遺伝子を探索する目的で,60例の子宮体癌を対象として,癌組織をマイクロダイセクションにより癌実質および間質に分離しRNAを抽出し,それぞれでマイクロアレイ解析を施行した.続いて,再発群と無再発群で発現の異なる遺伝子を,再発をイベントとしたCox単回帰にて癌実質および間質毎に抽出した(p<0.0005).再発群と無再発群で発現が異なる遺伝子は,癌実質および間質それぞれで88個,57個が抽出された(p<0.0005).その内,11個は実質および間質で共通していた。その内訳は,それぞれシグナル伝達系:22個(25%),16個(28%),細胞発育:5個(6%),5個(9%),代謝:13個(15%),6個(11%),核酸代謝:8個(9%),5個(9%)および免疫系:2個(2%),3個(5%)であり,両群で差を認めなかった.次に,抽出した遺伝子セットを候補変数とし,再発を結果変数としたロジスティック回帰による変数選択を行い再発予測モデルの構築をおこなった.構築したモデルを用いて各個人の再発率を予測し,再発率が0.5以上であれば再発高リスク群と判定して実際に観測された再発と,予測された再発の一致率をもって正診率を算出した.再発予測モデルは癌実質4遺伝子,間質3遺伝子にて構築した.再発を予測できる正診率は,それぞれ66%,73%であった.また予後不良群および良好群でのprogression free survival(PFS)は,癌実質モデルを使うと667日vs3,318日(p<0.001),間質モデルを使うと862日vs3,137日(p<0.001)であった.これまで悪性腫瘍の再発を予測する上で間質の遺伝子発現を対象にした報告は少なく,特に癌実質および間質の発現プロファイルを同時に解析した報告は存在しない.本研究では,癌実質だけでなく間質においても遺伝子発現と予後が相関することを明らかにした.選別した全遺伝子のうち11遺伝子が癌実質および間質で共通して再発と関連しており,これらの遺伝子については癌-間質相互作用の関与が示唆された.
ナノスケール構造制御機能材料の開発

平成4年度では初年度に引続いてナノ構造特殊材料の創製を試み、詳細な特性評価をを行った。また、新しいナノ構造評価装置として低温走査"力"顕微鏡、原子アトム・プローブ分析装置の開発製作を開始した。各研究班の主な成果は以下のごとくである。研究班1では、新しいナノスケール物質として鉄と銀クラスターを複合堆積させたグラニュラーマテリアルの作製に成功し、この磁性材料が約40%の巨大磁気抵抗効果(GMR)を示すことを見出した。研究班2では、波長可変のフェムト秒レーザー光の設置を終え、マトリックス中に埋め込まれた各種金属或は半導体クラスターの磁気的及び非線形光学的物性を解析した。特にアルカリ金属クラスターを内包したゼオライト化合物が強磁性を示すことを明らかにした。研究班3では、室温で単斜晶、高温になると六方晶に変態する新ゼオライトを合成した。また、スパッタ法でA1-A1Nのナノ粒子分散複合材料の膜を合成することに成功した。この膜は原料Nの量を調節することにより、A1-A1Nの傾斜膜にもなり、今後A1材へのコーディング材としての利用が期待できる。研究班4では、C60、C84等のフラーレンクラスターをシリコン、銅結晶表面に結晶薄膜として配列蒸着し、その吸着初期過程における構造と電子状態を調べた。また原子配列同定アトムプローブ装置を開発し、磁性材料のナノ構造評価を行った。研究班5では、硫黄、セレンクラスターを溶媒抽出法により生成し、グラファイト表面に規則正しく吸着配列させることに成功した。またレーザーアブレーション法を用いてナノスケールサイズの巨大炭素クラスターを生成する方法を開発した。更にこれらの配列クラスターの電子機能素子への応用を踏まえ、走査トンネル顕微鏡の探針による変形、移動などの操作を行う方法を見出した。
アセトアミノフェン中毒における拮抗剤、毒物性代謝産物の動態に関する研究

アセトアミノフェンは強力な鎮痛解熱薬としてアスピリンに代わり広く使用されており、市販の感冒薬に含まれているために、入手は容易である。しかしながら、比較的少量で致死的な肝障害を来しうることが注目されている。アセトアミノフェンはそのものに毒性があるのではなく、その中間代謝産物であるN-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI)が生体内の活性化合物、還元型glutathione (GSH)が枯渇すると肝臓の種々のたんぱく質と不可逆的な結合を起こすことにより毒性を発生すると考えられている。我々は、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)による血液中のNAPQI検出に関する検討を行ない、重要な知見を得た。すなわち、NAPQIは、急速に活性SHなとと結合するか、極めて不安定な物質であるため、直接検出することは困難である。しかし、NAPQIと生体内活性SHのGSHの共有結合物(GS-APAP)は比較的容易にLC/MSにより検出できることを認めた。我々はNACもLC/MSで検出を試みたところ、その特異的質量分析シグナルを捕らえることに成功した。症例が搬入された際には、搬入時の血液、拮抗剤投与後、経時的に血液中のアセトアミノフェンの分析を行ったが、臨床症例は予定より少ない数であった。また、血液浄化法を要する重症症例は搬入されなかったために、血液浄化法に伴うアセトアミノフェン、その代謝産物の経時的変化を観察することは出来なかった。拮抗剤としてムコフィリンを経管的に胃内に投与し、治療前後の上記アセトアミノフェンの濃度を治療の前、後で測定したので、これらの結果につき報告する。提出した計画書に従って、アセトアミノフェン、Nアセチルシステイン、Nアセチルベンゾキノンイミンの標品を入手した。これを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、液体クロマトグラフィー質量分析装置(LCMS)にかけて、そのクロマトグラフィーパターンをライブラリーとして分析機に記憶させ、定量分析を可能にした。患者が搬入された際には経時的に、血液中のアセトアミノフェンとNアセチルベンゾキノンイミンの定量を行うとともに、拮抗剤N-アセチルシステイン、または血液吸着による治療によって、これらの濃度がどのように推移してゆくかを測定する事にしているが、科研費の交付以降、アセトアミノフェン中毒患者が無く、ごく最近ようやく一例が搬入されたのみである。この症例について検体を分析し、妥当なデータを得ているが、まだわずかに一例のみであり、解析には至らない。今後、まずは症例を重ねなければならない。この一年間(正確には科研費交付決定後の7ヶ月間)のアセトアミノフェン症例は例年に比べて極端に少なかったが、この状況が今後も続くとは考えて居らず、今後例年の頻度で症例が搬入されれば、症例が蓄積できるものと考えている。症例が搬入された際には、搬入時の血液、拮抗剤投与後、経時的に血液中の各成分の分析を行う。拮抗剤投与はムコフィリンを経管的に胃内に4時間毎に投与する。必要に応じ4時間毎にこの検査を繰り返す。また、多量服毒により血液浄化法を導入する際には、吸着カラムの前、後の血中濃度をも測定をもする予定にしている。肝機能検査としては、アセトアミノフェン中毒において、AST、ALT、LDHといった従来のいわゆる肝機能検査で把握されるよりも、肝ミトコンドリアが早期に障害を受け、肝ミトコンドリア機能を反映するAKBRが敏感な指標となりうる。そのため、肝ミトコンドリア機能の指標としてAKBRをも測定して行くことにしており準備は整っている。アセトアミノフェン(APAP)中毒患者は、治療法としてのN-acetyl-L-cysteine (NAC)療法が注目されている。APAP中毒の作用機構はすでに解明されつつあり、APAP有毒中間代謝産物、N-acetyl-p-benzoquinone

imine(NAPQI)が生体内の活性SH化合物、還元型91utathione (GSH)が枯渇すると肝臓の種々のたんぱく質と不可逆的な結合を起こすことにより毒性を発生すると考えられている。しかし、本療法に関する検査医学的マーカー、すなわちNAPQIの消長を判断するマーカーあるいはNACがNAPQIの毒性を中和していることを示すマーカーについては全く研究が進んでいないのが現状である。我々はNACもGSHと同様の活性SHを有する化合物であることに注目しNAPQIとNACを混合した後、LC/MSで検出を試みたところ、その質量分析シグナルを捕らえることに成功した。ELISA法により患者血中でのNAC-APAPやGS-APAPの動態と中毒について解析したい。このように、後しばらくの研究の積み重ねで本研究が完成すること、および本抗体の特許申請との兼ね合いがあるため、今回は測定方法についての報告は中間報告に留めたい。症例が搬入された際には、搬入時の血液、拮抗剤投与後、経時的に血液中の各成分の分析を行う。拮抗剤投与はムコフィリンを経管的に胃内に4時間毎に投与する。必要に応じ4時間毎にこの検査を繰り返す。また、多量服毒により血液浄化法を導入する際には、吸着カラムの前、後の血中濃度をも測定をもする予定にしており、若干例の検体を保管している。しかしながら、現時点では、症例が少なく、検体の集積が進んでいないのが現状である。アセトアミノフェン中毒の作用機構はすでに解明されつつあり、アセトアミノフェン有毒中間代謝産物、N-acetyl-p-benzoquinoneimine(NAPQI)が生体内の活性SH化合物、還元型glutathione(GSH)が枯渇すると肝臓の種々のたんぱく質と不可逆的な結合を起こすことにより毒性を発生すると考えられている。すなわち、本物質は生体内で還元型グルタチオン(GSH)やチオールを有する蛋白質と結合する。GSHはNAPQIと共有結合化合物を形成し、3'-GS-APAPやChenらの報告にある2'-GS-APAPとなる事は最近報告されたとおりである(Biochemistry 38:8159-66,1999)。今年度、液体クロマトグラフィー/質量分(LC/MS)による血液中のNAPQI検出に関する検討を行ない、重要な知見を得た。すなわち、NAPQIは、急速に活性SHなどと結合するが、極めて不安定な物質であるため、直接検出することは困難である。しかし、NAPQIと生体内活性SHのGSHの共有結合物(GS-APAP)は比較的容易にLC/MSにより検出できることを認めた。このGS-APAPはLC/MSのクロマトグラム上、近接した2種類のピークとして存在し(下図)、Chenの報告から、2'一体および3'一体と考えられた。さらに血液への添加実験でもGS-APAPを検出できた。さらにAPAP中毒治療薬であるN-acetyl-L-cysteine(NAC)についても同様の所見を得た。すなわち、我々はNACもGSHと同様の活性SHを有する化合物であることに注目しNAPQIとNACを混合した後、LC/MSで検出を試みたところ、その特異的質量分析シグナルを捕らえることに成功した。
アルキルチオリン酸エステルによるSH基修飾と毒性

市販の農薬マラチオンなどの中に不純物として含まれ、毒性が著しく高いO,O,Sートリメチルチオリン酸エステル(O,O,SーMe)の毒性発現機構を明らかにすることを目的として、本化合物と肝ミクロソ-ム(Ms)中の薬物代謝酵素蛋白のSH基との反応性を調べた。酵素としてはチトクロムPー450(Pー450)及びグルタチオンSトランスフェラ-ゼ(GST)を選び、まずこれらの酵素の精製を試みた。肝臓中には多種類のPー450が存在しているので、各種の誘導剤を前投与し、誘導されるPー450を電気泳動的に単一になるまで各種のクロマトグラフィ-を組み合わせて精製した。またMsーGSTについては、精製の報告が少ないので可溶化条件から検討し、酵素化学的に単一となるまで精製した。膜結合蛋白としてのMSーGSTは、そのSH基をSH試薬によって修飾すると酵素活性が著しく変化することが知られているが、本研究において可溶化精製した標品もこの性質を維持しているので、O,O,SーMeとMsーGSTとの反応性は、酵素活性の変化を指標として調べることが可能となった。その結果、O,O,SーMeは、フェノバルビタ-ルなどで誘導されるPー450分子種によって代謝をうけたのち、GSTのSH基と反応することが明らかとなった。現在までその代謝産物の化学構造は不明であり、その中間体は著しく不安定であるが、反応後のGSTを解析することにより、その実体が推測できる見通しがついた。またGSTの機能として、本酵素は単に解毒的反応を行うばかりではなく、膜輸送などの多様な生理的反応にも関与している蛋白であることが知られつつあり、O,O,SーMeの毒性発現も、GSTの持つこれら機能障害と密接に関連している可能性が示唆される。
頸部リンパ節転移に対するオーダーメイド画像診断システムの開発

前年度から引き続き,口腔癌からの頸部リンパ節転移に対するCT,MRIおよび超音波検査の診断基準の改訂を行い,その診断能の分析および改訂後の診断基準の診断限界を解析してきた。さらに,改訂後の診断基準の精度を向上させるために,また,本研究の目的である各個体の特性(性,年齢,口腔内の炎症所見,歯の状態,歯槽骨吸収の状態,原発巣の発生部位および進展範囲,原発巣の病理組織所見,等)を考慮したオーダメイドの診断基準の作成のためにさらなる統計学的分析を行ってきたが,前年度の報告でも述べたように各患者の個体差が大きく,その個体差を反映する画像所見の抽出および個体の緒条件と各画像所見との相関関係の分析に手間取っており,患者の個体の特性を考慮した画像診断基準の作成に苦慮しているのが現状である。なお,CT,MRIおよび超音波検査の画像所見を入力することにより,診断結果を自動的に表示すとともに,報告書を受け取った検査依頼者が直感的かつ読影報告書に記載された文書の誤読や勘違いを防ぐために,ビジュアルに表現された口腔癌の頸部リンパ節診断報告書の転移画像診断システムの構築については前年度の結果を踏まえ,すでにビジュアルな頸部リンパ節転移の関する診断結果をLAN上で配信し,ビジュアル化された診断情報の共有化についてはシステムの構築を行い,現在試験的運用を行っている。その試験運用の結果は良好であり,現在支障なく稼働している。
セリン-スレオニンキナーゼ型レセプターの細胞生物学的作用の研究

1)マウスのES細胞はFlk-1陽性の血管前駆細胞に分化したあと、VEGFの作用の有無により、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞に分化する。血管内皮細胞と平滑筋細胞が共存する条件では潜在型TGF-βが効率良く活性化されることが知られている。この系においてTGF-βレセプターキナーゼの抑制剤であるSB-431542を添加したところ、血管内皮細胞の増殖とシート形成が著明に促進されることが明らかとなった。血管内皮細胞ではタイトジャンクションの形成に関わるclaudin-5の産生がSB-431542によって著明に上昇し、細胞と細胞の境界に集積している像が観察された。2)我々は、マウス間葉系前駆細胞C2C12とヒト間葉系幹細胞をBMP4で骨芽細胞へ分化誘導する系において、BMP4が内因性のTGF-βの作用を活性化してSmad6の発現を誘導し、その結果、Smad6がBMP4による骨芽細胞分化を抑制することを見いだした。SB431542は内因性のTGF-βの作用を抑制し、Smad6の発現を抑制した結果、骨芽細胞分化をBMP4と協調的に促進した。この結果は、TGF-βシグナルを制御することによってBMPシグナルを増強する可能性を示唆し、骨・軟骨再生医療に応用できると考えられた。3)我々はヒト微小血管内皮細胞(HMEC)とES細胞由来血管内皮細胞に対してBMP4がその増殖を強く促進し、アポトーシスを抑制することを明らかにした。BMP4の標的遺伝子を解析した結果、BMP4はId-1やVEGFR2、Tie-2の発現を亢進させ、さらにこれらの受容体のリン酸化を促進することが明らかとなり、BMP4による血管内皮細胞増殖促進作用はVEGF-A/VEGFR2とAngiopoietin-1/Tie-2シグナル伝達系を介していることが示唆された。血管新生は創傷治癒や癌の悪性化に重要な役割を果たしており、その分子機構の解明は血管再生療法の開発や癌治療へ応用されることが期待されている。近年、骨髄由来の末梢血中に存在するFlk-1等を発現する血管内皮前駆細胞(EPC)が血管内皮細胞(EC)と平滑筋細胞(SMC)へと分化することにより新生血管の形成に関与することが示された。TGF-βシグナル因子の欠損は血管発生の異常を引き起こすことが示されているが、我々はEPCの増殖・分化におけるTGF-β受容体セリンスレオニンキナーゼのシグナルの役割を検討するために、ES細胞由来のFlk-1陽性細胞が血管細胞へと分化する系を用いて検討を行った。TGF-βはALK-1受容体を介してSmad1/5をリン酸化しId-1などの標的遺伝子の発現を誘導する一方、ALK-5受容体を介してSmad2/3をリン酸化しPAI-1などの発現を誘導する。定量的RT-PCRにより、ES細胞由来のECにおいてはALK-1とId-1が、SMCにおいてはALK-5とPAI-1が優位に発現していることが示された。またTGF-βの添加やALK-1、5の活性型受容体の発現により、ECとSMCの数や割合が変化することが示された。さらにTGF-βの添加によりECでのclaudin-5の発現が減少し、内皮シート構造の形成が阻害されることが示された。

一方、TGF-β受容体セリンスレオニンキナーゼの抑制剤であるSB-431542はECの増殖とシート形成を促進し、より分化したECの形成に関与することが確認された。以上の結果により、未分化なEPCが血管へと分化する過程においてTGF-βセリンスレオニンキナーゼが血管細胞の増殖、分化、シート構造形成を調節していることが示唆された。1)マウスのES細胞はFlk-1陽性の血管前駆細胞に分化したあと、VEGFの作用の有無により、血管内皮細胞や血管平滑筋細胞に分化する。血管内皮細胞と平滑筋細胞が共存する条件では潜在型TGF-βが効率良く活性化されることが知られており、ES細胞の分化系においても潜在型TGF-βが活性化されている可能性がある。そこでこの系においてTGF-βレセプターキナーゼの抑制剤であるSB-431542を添加したところ、血管内皮細胞の増殖とシート形成が著明に促進されることが明らかとなった。また血管内皮細胞はSB-431542添加により分化した敷石状の形態を取ることが確認された。そこで、種々の血管内皮細胞マーカーの発現を検索したところ、タイトジャンクションの形成に関わるclaudin-5の産生がSB-431542によって著明に上昇し、細胞と細胞の境界に集積している像が観察された。この結果は内因性に産生されたTGF-βが血管内皮細胞の増殖や分化を抑制していること、TGF-βが作用するとclaudin-5の発現が低下し、血管内皮細胞のタイトジャンクションの形成が抑制されることを示唆するものであると考えられた。2)TGF-βは骨基質に豊富に含まれるが、その骨芽細胞分化に与える影響は促進と抑制の相反する報告が混在し、正確にはよく分かっていない。我々は、マウス間葉系前駆細胞C2C12とヒト間葉系幹細胞をBMP4で骨芽細胞へ分化誘導する系において、TGF-βシグナルが骨芽細胞分化にどのような影響を与えるかをSB-431542を用いて検討した。その結果、TGF-βは骨芽細胞に対して分化初期と成熟期で異なる作用を示すことを見いだした。この結果は、骨芽細胞の異なる分化段階でTGF-βシグナルを制御することを工夫すれば、BMPシグナルを増強する可能性を示唆し、骨・軟骨再生医療に応用できると考えられた。1)未分化なマウス胚性幹(ES)細胞の分化に与えるNodalやActivin、BMPなどのTGF-βスーパーファミリーの因子と、そのセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターの作用を研究した。その結果、抑制型SmadであるSmad7や、転写抑制因子であるc-SkiはES細胞の増殖を強力に抑制した。一方、NodalやActivinは無血清の条件でES細胞の未分化な状態を維持しつつ、増殖を促進することを明らかにした。一方、BMPはマウスES細胞に対して明らかな作用を示さなかった。2)血管内皮細胞と平滑筋細胞の相互作用を中心にセリン-スレオニンキナーゼ型レセプターの作用を明らかにすることを目的に研究を行なった。マウスES細胞由来の血管前駆細胞の分化に与えるBMPの作用を検討したところ、BMPの標的遺伝子であるId-1の発現亢進と細胞増殖促進が無血清の条件で見られた。さらに血管前駆細胞のアポトーシスはBMPによって抑制されることが明らかとなった。3)抑制型Smadの立体構造をもとに、セリン-スレオニンキナーゼ型レセプターと抑制型Smadがどのように相互作用するかを分子レベルで検討した。その結果、Smad7のL3 loopに相当する部分がTGF-βやBMPレセプターとの特異的結合に重要であることが明らかとなった。TGF-βレセプターとの結合にはL3loopを中心にいくつかの塩基性アミノ酸が重要であることが確認された。