hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「不登校」児家族に関する社会学的研究

担任教員を調査対象者にして得られた「不登校」児童生徒のデータをもとに、「不登校」児家族の現状、「不登校」タイプと家庭背景との関連を明らかにした。加えて、学校と地域関係機関との効果的な連携の在り方について検討した。その結果、家庭背景に応じた「不登校」支援が必要であり、「不登校」児童生徒への支援のみならず、対応の中心となっているとりわけ母親への支援が重要であることが示唆された。また、効果的な連携を進めていくには、コーディネーターの存在と学校教職員、地域関係機関の専門職者双方の時間的ゆとり、学校教職員が地域関係機関を気軽に訪問できる体制づくりの必要性が示唆された。本研究ではこれまでの「不登校」研究において「不登校」児家族の実態が一部の家族のみを対象にしそ明らかにされてきたことから「不登校」児家族の全体像を明らかにし,必要な「不登校」支援策を包括的に提示するために,小中学校の教員(担任教師)を対象に質問紙調査を実施した。本調査においては岐阜県内にある2つの市町村教育委員会から協力を得られ,質問項目として「不登校」タイプ,保護著の子どもの教育への関心,家族関係,暮らし向き,「不登校」問題への家庭と学校の対応をもとに調査票を作成した。本調査の調査手続きについては,以下に記載の通りである。調査協力の得られた教育委員会が,平成19年度調査実施の時点において管轄する小中学校の「不登校」「不登校」傾向にある児童・生徒数を推計し,質問紙調査への回答が可能な担任教師の人数を予測した上で2008年3月に調査票を各小中学校に配布し,回収を行った。本研究ではこうした手続きを経て調査を計301部配布し、回収率は73.4%であった。現在,本調査データの分析を行っているところであり,本調査で得られたデータをもとにして「不登校」研究に新たな知見を提示するとともに,家庭・学校における「不登校」問題への実践的な支援策を提示していきたい。なお,本調査で「不登校」「不登校」傾向の児童・生徒とは,調査時点で年間30日以上欠席している児童・生徒,及び保健室登校などの別室登校や適応指導教室に通っている児童・生徒,年間日未満の欠席であっても頭痛や微熱状態が続いている,遅刻が多いなど,「不登校」傾向にあると担任教師やその他の人々がみなした児童・生徒を指す。平成19年度に「不登校」「不登校」傾向の児童生徒の担任であった教師を調査対象にして得られた児童生徒とその家族に関するデータをもとに、「不登校」タイプによる家庭背景の相違などについて分析を行った。その結果、特筆すべき点として、(1)ひとり親家庭の比率が18.1%を占め、そのうち母子家庭の比率が16.3%と極めて高く、その中でおおよそ半数の母子家庭が経済的に困窮していること、(2)わが子の「不登校」への対応の中心は大部分が母親であり、そのうち約半数の母親が相談する人やわが子の「不登校」に-緒に対応する人がおらず、孤立していること、が明らかになった。また、(3)経済的に裕福な家庭ほど保護者の「不登校」対応への熱意が高いこと、及び一緒にわが子の「不登校」に対応する人がいること、(4)保護者がわが子の「不登校」対応に熱意が高いほど保護者の「不登校」対応に関わっての疲れの程度が高いこと、が明らかになっている。「不登校」タイプと家庭背景との関連については、(5)経済的に裕福な家庭や子どもの教育に熱心な家庭、保護者の「不登校」対応への熱意が高い家庭、保護者が「不登校」に関わる知識・情報を多く所有している家庭ほど、子どもは自らの時間を主体的に創出していく「安心空間志向」の「不登校」タイプとなる傾向にあること、(6)子どもの教育に熱心な家庭ほど、「不登校」状態にあることを後悔する「自我防衛」の「不登校」タイプとなる傾向にあること、その逆に、(7)子どもの教育に熱心でない家庭ほど、今後の方向性を持つことができない「方向喪失」の「不登校」タイプや学校文化から一線を画した「離脱志向」の「不登校」タイプとなる傾向にあること、が見出された。今後は、これらの知見を踏まえて、「不登校」児童生徒とその家族を中心に学校や地域関係諸機関に求められる支援方法について検討していく。
焦点切除術における高周波振動を含むセボフルラン賦活術中皮質脳波の有用性

側頭葉てんかんに対して慢性頭蓋内脳波記録により発作焦点を同定,内側あるいは外側側頭葉てんかんと診断.切除術中にセボフルラン濃度を変化させ0.5および1.5MACの術中皮質脳波を記録.0.5,1.5MACそれぞれの濃度での側頭葉内側と外側のスパイク出現率および,0.5から1.5MACに増加させた際の増加率を測定.0.5から1.5MACに増加させた際の増加率は,内側側頭葉てんかん群で5.22倍となり,外側側頭葉てんかん群に比較して有意に高かった(P=0.001).セボフルラン濃度上昇によりスパイク出現頻度が上昇するが,その増加率が高い場合,内側側頭葉てんかんである可能性が高いと言える結果であった.側頭葉てんかんに対して慢性頭蓋内脳波記録により発作焦点を同定,内側あるいは外側側頭葉てんかんと診断.切除術中にセボフルラン濃度を変化させ0.5および1.5MACの術中皮質脳波を記録.0.5,1.5MACそれぞれの濃度での側頭葉内側と外側のスパイク出現率および,0.5から1.5MACに増加させた際の増加率を測定.0.5から1.5MACに増加させた際の増加率は,内側側頭葉てんかん群で5.22倍となり,外側側頭葉てんかん群に比較して有意に高かった(P=0.001).セボフルラン濃度上昇によりスパイク出現頻度が上昇するが,その増加率が高い場合,内側側頭葉てんかんである可能性が高いと言える結果であった.側頭葉てんかん手術において,自動スパイク検出ソフトウェアで計測したセボフルラン賦活術中皮質脳波上のスパイク検出率が慢性頭蓋内脳波記録の代替として適切かどうか評価を行った【方法】側頭葉てんかんに対して頭蓋内電極留置術を行った16例(海馬硬化症4,腫瘍3,海綿状血管腫2,皮質形成異常7(うちMRI無病変4))を対象とした.慢性頭蓋内脳波記録により発作焦点を同定,内側あるいは外側側頭葉てんかんと診断(それぞれ8例).切除術の開頭前にセボフルラン濃度を変化させ,慢性頭蓋内脳波記録を行った同一の電極で0.5および1.5MACでの術中皮質脳波をそれぞれ10分間記録.自動スパイク検出ソフトReveal (Persyst Development Corp.)を用いて,全体の80%以上のスパイクが検出される電極を決定(側頭葉内側最大2,外側最大8電極),10分間あたりのスパイク検出数を電極数で除した数字をスパイク出現率とした.それぞれの濃度での側頭葉内側と外側のスパイク出現率および,0.5から1.5MACに増加させた際のスパイク増加率を測定した.【結果】内側側頭葉てんかん群と外側側頭葉てんかん群で,0.5,1.5MACの内外側のスパイク出現率に有意差はなかった.0.5MACから1.5MACに増加させた際の増加率は,内側側頭葉てんかん群で5.22±2.20倍となり,外側側頭葉てんかん群(1.64±1. 10)に比較して有意に高かった(P<0.01).【考察】セボフルラン0.5および1.5MAC賦活下術中皮質脳波のみで側頭葉てんかんの内外側焦点を区別することは困難であったが,セボフルラン濃度上昇によりスパイク出現頻度が増加するが,その増加率が高い場合,内側側頭葉てんかんである可能性が高いと言える結果であり,増加率に注目すると術中皮質脳波が側頭葉てんかんの焦点同定に有用である可能性がある.本研究では側頭葉てんかん手術において,自動スパイク検出ソフトウェアを用いて計測したセボフルラン賦活術中皮質脳波におけるスパイク検出率が慢性頭蓋内脳波記録の代替として適切かどうか評価した.【方法】側頭葉てんかんに対して頭蓋内電極留置術を行った16例(海馬硬化症4例,腫瘍3例,海綿状血管腫2例,皮質形成異常7例(うちMRI negative4例))を対象とした.慢性頭蓋内脳波記録により発作焦点を同定,内側あるいは外側側頭葉てんかんと診断(それぞれ8例).切除術開頭前にセボフルラン濃度を変化させ慢性頭蓋内脳波記録を行った同一の電極で0.5MACおよび1.5MACの術中皮質脳波をそれぞれ10分間記録.自動スパイク検出ソフトReveal (Persyst Development Corp.)を用いて,全体の80%以上のスパイクが検出される電極をそれぞれの患者で決定(側頭葉内側最大2,外側最大8電極),10分間あたりのスパイク検出数を電極数で除した数字をスパイク出現率とした.0.5MAC,1.5MACそれぞれの濃度での側頭葉内側と外側のスパイク出現率および,0.5MACから1.5MACに増加させた際のスパイク増加率を測定した.【結果】内側側頭葉てんかん群と外側側頭葉てんかん群で,0.5MAC,1.5MACの内外側のスパイク出現率に有意差はなかった.0.5MACから1.5MACに増加させた際のスパイク増加率は,内側側頭葉てんかん群で5.22±2.20となり,外側側頭葉てんかん群(1.64±1.10)に比較して有意に高かった(P<0.01).【意義】セボフルラン0.5MACおよび1.5MAC賦活下術中皮質脳波のみで内側側頭葉てんかんと外側側頭葉てんかんを区別することは困難であるが,セボフルラン濃度上昇によるスパイク出現頻度の増加率が高い場合,内側側頭葉てんかんである可能性が高いと言える.てんかん外科現在上記の内容を論文投稿中である.

現在高周波振動を測定できる術中脳波計を導入して1年経過,症例数も徐々に蓄積しつつあり,今年度は,あらたに脳波解析ソフトウェアを導入し,術中皮質脳波における高周波振動に関する研究を開始する予定.脳波解析プログラムを今年度購入したが,高周波振動を解析するためにはあらたなな解析可能なソフトウェアを購入する必要がある.今年度の直接経費では足らず,次年度に交付される直接経費に加えてようやく購入できるため.高周波振動解析ソフトウェアを購入する.
薬剤抵抗性カブリダニ類の検索とハダニ類の生物的防除への利用

ハダニ類における薬剤抵抗性の急速な発達は、薬剤によるハダニ類の防除を困難にしており、理想的防除法として農薬と天敵の併用が望まれている。本研究はハダニ類の天敵のなかで、土着天敵の主要種、ケナガカブリダニの利用に関するもので、全国のリンゴ園・ナシ園・カンキツ園・茶園および施設ブドウなど、薬剤散布園と施設園芸における薬剤抵抗性カブリダニ個体の発現の実態と分布について調査した。次いで、採集・増殖させた薬剤抵抗性系統を用いてハダニ類の総合防除を成功させるための基礎的研究である。1.カブリダニ科のうち、日本産の代表的な普通種の学名を再検討した。ケナガカブリダニはAmblyseius longispinosus(Evans)、ニセラーゴカブリダニはA.eharai Amitai et Swinskiが正しい。2.北海道のリンゴ園と関東地方のナシ園のケナガカブリダニは、今のところ薬剤抵抗性の発達の程度が低い。しかし、鳥取県のナシ園のケナガカブリダニは有機リン殺虫剤にかなり高い抵抗性があった。3.静岡県の薬剤散布茶園では、ケナガカブリダニが多発生し、カンザワハダニの生物的防除に有効に働いていることが明らかとなった。その理由は、茶園のケナガカブリダニは有機リン剤、カーバメイト系殺虫剤に極めて強い抵抗性を獲得していることによる。4.中国・四国・九州地方のカンキツ園や施設栽培ブドウより採集したケナガカブリダニ、ニセラーゴカブリダニ、コウズケカブリダニAmblyseius sojaensis Eharaの薬剤抵抗性には産地によって変異があることが判明した。ケナガカブリダニではサリチオン剤に対してかなり感受性の低い系統があって、ハダニの生物的防除に利用できる可能性があると考えられた。5.薬剤散布環境下におけるハダニと天敵カブリダニ類の相互作用系を記述するシステムモデルを開発した。
皮膚接触不要の無意識・無拘束な心疾患検査を可能とする光センシングシステム

本研究では、生体周囲の衣類を伝播する拡散光に着目して、長期間計測の壁となるセンサ装着の煩わしさをなくし、光計測により無拘束・無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目的として、光センシングを邪魔する媒質の影響解明や補正法の開発を行った。その結果、光源近傍の測定値を基にして適切な補正を加えることにより生体組織の血液量や酸素濃度が精度良く得られることが示された。これは、院内のベッドサイドや薄着での就寝時などに、長時間NIRS計測が可能となることを示唆するものである。これらの成果は、心疾患関連の健康管理だけでなく、自律神経活動や情動把握等の幅広い応用も期待できる。本研究では無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目指している。心疾患には何の前兆もなく突然死に至るケースが多くあり、長期間長時間の生体データロギングが有力な防止手段となりうる。生体周囲の衣類を伝播する拡散光に着目して、長期間計測の壁となるセンサ装着の煩わしさをなくし、無意識、無拘束、無侵襲的に血液循環機能検査が可能なシステムを創出し、心疾患等の早期発見や健康管理に貢献する手法を見出すことを目的としている。本年度は布繊維媒質及び空気層ギャップのNIRS計測への影響を補正する手法を確立するために、光伝播の理論解析と装置開発、基本特性試験を行った。(1)理論解析:生体組織中の光伝播解析においてはモンテカルロ法を用いた。布、空気、表皮、真皮、脂肪、筋肉の層構造を考慮し、各層の厚みや光学定数が測定値に及ぼす影響を定量的に把握した。可視と近赤外領域(5001300 nm)の解析を進め、効果的なセンサ配置決定法を探索し、浅層と深層の定量法(主に誤差の補正法)を検討した結果、布媒質の波長依存性が酸素飽和度に数十%もの影響を及ぼす条件も存在することが明らかとなった。(2)装置開発:空間分解計測装置として多波長LEDを光源に使用し、光センサを光源から2つの距離に配置して、表層の厚みなどに応じて最適な距離の受光データを選択して測定できるようにした。送受光部と信号処理回路は、これまでに組織酸素計測で蓄積した技術をベースとして電子回路基板を試作した。装置のセンシング部の光伝播が理論モデルとよく一致するよう精密な加工を行い、フレキシブル基板技術を用いて小型・集積化も進め、利便性も向上させた。また、ノイズの混入しやすい回路を無線で切り離すなど精度向上のための設計と試作を行い、良好な測定精度と利便性を備えたセンサモジュールを開発した。本研究では,無拘束・無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目指している。本年度は光によるヘモグロビン濃度計測の高精度化を目指して,布媒質の影響をファントム実験で詳しく検証した。まず、理論による計測特性の解析を試みた。生体組織中の光伝播解析においてはモンテカルロ法を用いた。可視と近赤外領域の解析を進め、送受光器間距離による変化、浅層と深層の定量法を検討した結果、送受光器間距離を58mm程度として布媒質の光学定数を推定したうえで、3035mm程度離間したセンサの情報を補正することが測定に適していることが明らかとなった。次に、血液を用いたファントム実験を行った。光計測は空間分解法の原理に基づいている。多波長LEDを光源に使用し、光センサを光源から2つの距離に配置して、表層の厚みなどに応じて最適な距離の受光データを選択して測定できるようにするともに、血液の濃度や散乱体量を変化させながら実験できるようにした。また、血液の酸素化状態は血液ガス分析装置で確認した。その結果、表層の光学定数の推定が酸素飽和度の定量化に必須であり、それに適したセンサ配置なども明らかとなった。本研究では,光計測により無拘束・無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目指している。心疾患には前兆もなく突然死に至るケースが多くあり、長期間長時間の生体データロギングが有力な防止手段となりうる。前年度までに布媒質を介したヘモグロビン濃度計測の高精度化を目指してファントム実験と理論解析で検証してきた。本年度は、さらに多様な条件でのファントム実験とヒト実測で計測特性を解析した。生体模擬試料に対して多様な材質と色の布媒質を接着して近赤外光オキシメトリを行った結果、白以外の色の濃い布など近赤外領域の光に対して強い影響を与える布では、厚みが0.2mm程度であっても著しい減光で測定が困難であった。また、空洞が多く不均質性の高い布は、測定値のばらつき増加の要因となった。

これに対し、白色や淡色の厚み2mm程度までの媒質であれば、適切な補正を加えることにより生体組織の酸素濃度が精度良く得られることが示された。これは、淡色シャツでの日常動作時や薄着での就寝時に長時間NIRS計測が可能となることを示唆するものである。ヒト実測では前腕を対象として動静脈閉塞試験を行い、酸素飽和度への布媒質の影響を検証した結果、理論やファントム実験と同様の傾向が観測された。布媒質によって最大40%程度もの誤差が生じることも明らかになり、実際の組織における影響を定量的に把握することができた。これらの結果は布媒質の影響補正法を確立するうえで重要な知見になると考えられる。多様な条件でのファントム実験とヒト実測を目標としており、その計画通りに実験を実施し、定量的知見を得るところまで至っており、今後の補正法検討のための基礎データを十分に得ることができているため。本研究では、光計測により無拘束・無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目指している。心疾患には前兆もなく突然死に至るケースが多くあり、長期間長時間の生体データロギングが有力な防止手段となりうる。生体周囲の衣類を伝播する拡散光に着目して、長期間計測の壁となるセンサ装着の煩わしさをなくし、無意識、無拘束、無侵襲的に血液循環機能検査が可能なシステムを創出し、心疾患等の早期発見や健康管理に貢献する手法を見出すことを目的としている。前年度までに、布媒質を介したヘモグロビン濃度計測の高精度化を目指してファントム実験と理論解析、前腕での実測で検証してきた。本年度は、多様な条件でのファントム実験とヒト実測で計測特性を解析して、介在媒質の種類や厚み等を把握して補正する手法についても探究した。生体模擬試料に対して多様な材質と色の布媒質を接着して可視光・近赤外光の分光計測を行った結果、吸収スペクトルの形状ではなく、光源近傍における光量の空間的傾きの後方散乱スペクトルに着目することで、綿とポリエステルの混合割合による光散乱特性の差異を検出できることが示された。さらに、厚みについても判定可能であることが示唆された。これらの結果から、光源近傍の測定値を基にして適切な補正を加えることにより生体組織の血液量や酸素濃度が精度良く得られると考えられる。これは、院内ベッドサイドや淡色シャツでの日常動作時、薄着での就寝時に長時間NIRS計測が可能となることを示唆するものである。また、布媒質の他にゴムや樹脂媒質の特性を検証した結果、それらの媒質の差異の把握も可能であることが示され、センサの防護層や絆創膏などの介在物があっても利便性を損なうことなくオキシメトリ計測できることが推察された。これらの成果は光を用いた生体計測における布等の妨害媒質の影響補正法を確立するうえで重要な知見になると考えられる。本研究では、生体周囲の衣類を伝播する拡散光に着目して、長期間計測の壁となるセンサ装着の煩わしさをなくし、光計測により無拘束・無意識に心疾患の兆候を検出可能とするための基礎技術開発を目的として、光センシングを邪魔する媒質の影響解明や補正法の開発を行った。その結果、光源近傍の測定値を基にして適切な補正を加えることにより生体組織の血液量や酸素濃度が精度良く得られることが示された。これは、院内のベッドサイドや薄着での就寝時などに、長時間NIRS計測が可能となることを示唆するものである。これらの成果は、心疾患関連の健康管理だけでなく、自律神経活動や情動把握等の幅広い応用も期待できる。
生化学的観点からみた胎児発育と発育障害

子宮内胎児発育は, (1)胎児固有発育能力,(2)子宮・胎盤血流による酸素・栄養基質供給に依存する.(1)染色体異常・先天異常・子宮内感染などによる胎児発育因子障害,(2)子宮胎盤血流不全による慢性胎児仮死が発生すれば子宮内胎児発育遅延(IUGR)が発生する.われわれは, (1)前者を超音波胎児スキャン, TORCHスキャン,羊水浮遊細胞染色体検査法などで, (2)後者を超音波ドプラ法,胎児心拍数陣痛計測法,胎児プロファイリング法,母体尿・血中エストリオール値,母体血中ひと胎盤ラクトーゲン値,胎児経皮酸素・炭酸ガス・pH測定法などで,出生前診断,胎児評価,さらに出生前治療法の効果判定を行った.その結果, (1)これら生化学・生物理学指標で胎児発育と発育障害が的確に評価できることが判明したが,さらに新しい臨床指標として, (2)超音波ドプラ法で母体子宮・胎児臍動脈血流量を測定して病的基準を確立し, (3)胎児に応用可能と考えられた生体スペクトロフォトメトリー法を利用して新生児の経皮的ビリルビン測定を行い,この方法により将来胎児経皮酸素モニタリングが可能であることを確認し, (4)電極を胎児先進部に装着することによって連続的に分娩中における胎児呼吸ガス値を測定して,胎児生化学モニタリング法と胎児心拍数陣痛計測法とを比較検討した.基礎研究においては, (5)子宮内胎児は分娩ストレスに耐えるために肝臓・心臓など体組織にグリコーゲンを蓄積して,カテコールアミン分泌や無酸素症の直接刺激で著明な嫌気性解糖代謝が亢進するが, (6)出生後の新生児(仔)では豊富な酸素供給によって糖新生系代謝が亢進していることが判明し, (7)子宮内胎児(仔)発育遅延が発生するとはじめは酸素活性亢進により代償するが,次第にエネルギー産生系の消耗によって適応不全が起こり,胎児(仔)が死亡したり,脳神経系後遺症が発生することなどが明かとなった.子宮内胎児発育は, (1)胎児固有発育能力,(2)子宮・胎盤血流による酸素・栄養基質供給に依存する.(1)染色体異常・先天異常・子宮内感染などによる胎児発育因子障害,(2)子宮胎盤血流不全による慢性胎児仮死が発生すれば子宮内胎児発育遅延(IUGR)が発生する.われわれは, (1)前者を超音波胎児スキャン, TORCHスキャン,羊水浮遊細胞染色体検査法などで, (2)後者を超音波ドプラ法,胎児心拍数陣痛計測法,胎児プロファイリング法,母体尿・血中エストリオール値,母体血中ひと胎盤ラクトーゲン値,胎児経皮酸素・炭酸ガス・pH測定法などで,出生前診断,胎児評価,さらに出生前治療法の効果判定を行った.その結果, (1)これら生化学・生物理学指標で胎児発育と発育障害が的確に評価できることが判明したが,さらに新しい臨床指標として, (2)超音波ドプラ法で母体子宮・胎児臍動脈血流量を測定して病的基準を確立し, (3)胎児に応用可能と考えられた生体スペクトロフォトメトリー法を利用して新生児の経皮的ビリルビン測定を行い,この方法により将来胎児経皮酸素モニタリングが可能であることを確認し, (4)電極を胎児先進部に装着することによって連続的に分娩中における胎児呼吸ガス値を測定して,胎児生化学モニタリング法と胎児心拍数陣痛計測法とを比較検討した.基礎研究においては, (5)子宮内胎児は分娩ストレスに耐えるために肝臓・心臓など体組織にグリコーゲンを蓄積して,カテコールアミン分泌や無酸素症の直接刺激で著明な嫌気性解糖代謝が亢進するが, (6)出生後の新生児(仔)では豊富な酸素供給によって糖新生系代謝が亢進していることが判明し, (7)子宮内胎児(仔)発育遅延が発生するとはじめは酸素活性亢進により代償するが,次第にエネルギー産生系の消耗によって適応不全が起こり,胎児(仔)が死亡したり,脳神経系後遺症が発生することなどが明かとなった.臨床実験としては、1.平均妊娠週数32.8週において胎児超音波計測を施行して、大横径、腹囲及び推定胎児体重によって子宮内胎児発育遅延と診断された150例の妊婦について、血漿エストリオール【E_3】濃度、尿中【E_3】濃度および血漿ひと胎盤ラクトーゲン(hPL)濃度をそれぞれRIA法、帝国臓器【E_3】キット法およびRIA法で測定した結果、平均血漿【E_3】が75.2mg/ml、尿中【E_3】が19.4mg/day、血漿hPLが8.8μg/mlと、いずれも正常妊娠の正常域下限値であった。これら150例を経口的にAllylestrenil30mg/dayを投与した投与群75例と投与しない対照群75例に分け、6週後に再計測した結果、対照群で血漿【E_3】111.9mg/ml、尿中【E_3】23.4mg/day、血漿hPL9.1μg/mlであったのに対して、投与群で血漿【E_3】154.2mg/ml、尿中【E_3】31.8mg/day、血漿hPL11.7μg/mlと推計学的に有意に増加し、また超音波胎児計測値、出生体重も有意に増加して、Allylestrenolの胎盤賦活効果を認めた。

2.このような子宮内胎児発育遅延を示す妊娠において超音波ドプラー血流計を用いて子宮弓形動脈、胎児大動脈および胎児臍帯動脈の血流波形を求めた結果、やがて胎児発育遅延を発症する妊婦においては妊娠2832週頃から、母体の子宮胎盤血行および胎児の胎盤血行のいずれも末梢血管抵坑が増加し、ついで生化学的胎盤機能値が低下し、やがて胎児発育遅延が発症することが明らかとなった。このため胎盤における血管抵坑を減少させることにより胎児発育遅延は予防できるものと考えられた。3.動物実験においては、胎児発育障害は慢性低酸素症によって発症すると考えられたため、モルモット胎仔、新生仔および成獣につき肝灌流実験を行い、無酸素症・カテコールアミンの負荷を行った結果、胎仔は成獣に比べて肝代謝が未熟な一方、肝内蓄積グリコーゲンは無酸素症・カテコーラミン負荷で分解、糖として放出、無酸素症に対する耐性の増加を助け、ひいては胎児発育遅延の病因となっていることが判明した。
人工膝関節の最適形状設計に関する研究

人工膝関節をより長寿命化するためには,その寿命の決定因子である各種動作によって生じる力学的状態を把握する必要がある.よって本研究では最も一般的な歩行動作中において人工膝関節が受ける力学的状態の算出とその影響の検討を行った.まず歩行動作中の膝関節の動きを検討するために,下肢全体を2次元でモデル化し,歩行解析の測定値を入力条件として,各下肢関節の外力モーメント,膝関節の外力を算出し,さらにこれらの値より最適化手法を用いて,歩行動作時の膝関節接触反力ならびに接触位置を計算した.計算に際し,人工膝関節の接触面形状,特に両コンポーネントの拘束度による膝関節動作への影響を検討するために,接触面の拘束度が低い表面置換型と,対照的な形状を持つ円筒面型について解析・検討を行った.その結果,表面置換型では膝関節の接触位置が大きく後方に移動し,円筒面型においては接触位置は全く移動しないが,垂直,水平両関節反力が大きくなることがわかった.ついで,求められた接触条件を荷重入力条件として人工膝関節装着脛骨の応力解析を行った.歩行動作中における骨セメントと骨との界面上の応力値の変動を評価した結果,関節面形状ならびに十字靭帯有無の違いにより生じた接触位置ならびに接触力の差により,表面置換型では脛骨前後部の皮質骨部分で,また円筒面型では中央部の海綿骨部分でそれぞれ大きな応力値を生じることがわかり,これらの違いがコンポーネントのゆるみに影響を及ぼしていると考えられる.なお実際の膝運動は3次元的に動いており,膝の回旋,内反・外反などの3次元運動がゆるみに及ぼす影響を検討するため,実験ならびに解析を3次元に拡張する予定であったが,当初使用を予定していた実験装置が使えなくなり,現在やっとその代替装置が使えるようになった状態で,この3次元解析の結果はまだ出ていない.よってこれらの検討は今後の課題とした.歩行動作における膝関節の動きを検討するために,下肢全体,ならびに膝関節に関連している靱帯,筋等を2次元でモデル化し,歩行解析の測定値を入力条件として,運動方程式を逆問題として解くことにより,各下肢関節の外力モーメント,膝関節の外力を算出し,さらにこれらのモーメントと外力より最適化手法を用いて,歩行動作時の各筋力ならびに膝関節接触反力,接触位置を計算するプログラムを開発した.このプログラムにより人工膝関節の接触面形状,特にこの形状による両コンポーネントの拘束度による膝関節動作への影響を検討するために,現在一般的に使用されている拘束度が低い表面置換型人工膝関節と,対照的な形状を持つ円筒面型人工膝関節について解析を行った.その結果,表面置換型人工膝関節では膝関節の接触位置が大きく後方に移動することがわかり,円筒面型人工膝関節においては,両接触面の適合性により接触位置は全く移動しないが,表面置換型人工膝関節と比較して垂直,水平両関節反力が大きくなることがわかった.これらの接触条件の差が実際の脛骨コンポーネントのゆるみに対して及ぼしている影響を考察するために,さらに求められた接触条件を荷重入力条件として,人工膝観察装置脛骨の応力解析を行った.人工関節のゆるみは骨セメントと骨との界面から生じるので,歩行動作におけるその界面上の応力値の変動を評価したが,その結果,関節面形状ならびに十字靱帯有無の違いにより生じた接触位置ならびに垂直,水平接触力の差により,表面置換型人工膝関節では脛骨前後部の皮質骨部分で,また円筒面人工膝関節では中央部の海綿骨部分でそれぞれ大きな応力値を生じていることがわかり,これらの違いがコンポーネントのゆるみに影響を及ぼしていると考えられる.人工膝関節をより長寿命化するためには,その寿命の決定因子である各種動作によって生じる力学的状態を把握する必要がある.よって本研究では最も一般的な歩行動作中において人工膝関節が受ける力学的状態の算出とその影響の検討を行った.まず歩行動作中の膝関節の動きを検討するために,下肢全体を2次元でモデル化し,歩行解析の測定値を入力条件として,各下肢関節の外力モーメント,膝関節の外力を算出し,さらにこれらの値より最適化手法を用いて,歩行動作時の膝関節接触反力ならびに接触位置を計算した.計算に際し,人工膝関節の接触面形状,特に両コンポーネントの拘束度による膝関節動作への影響を検討するために,接触面の拘束度が低い表面置換型と,対照的な形状を持つ円筒面型について解析・検討を行った.その結果,表面置換型では膝関節の接触位置が大きく後方に移動し,円筒面型においては接触位置は全く移動しないが,垂直,水平両関節反力が大きくなることがわかった.ついで,求められた接触条件を荷重入力条件として人工膝関節装着脛骨の応力解析を行った.歩行動作中における骨セメントと骨との界面上の応力値の変動を評価した結果,関節面形状ならびに十字靭帯有無の違いにより生じた接触位置ならびに接触力の差により,表面置換型では脛骨前後部の皮質骨部分で,また円筒面型では中央部の海綿骨部分でそれぞれ大きな応力値を生じることがわかり,これらの違いがコンポーネントのゆるみに影響を及ぼしていると考えられる.なお実際の膝運動は3次元的に動いており,膝の回旋,内反・外反などの3次元運動がゆるみに及ぼす影響を検討するため,実験ならびに解析を3次元に拡張する予定であったが,当初使用を予定していた実験装置が使えなくなり,現在やっとその代替装置が使えるようになった状態で,この3次元解析の結果はまだ出ていない.よってこれらの検討は今後の課題とした.
リポタンパク質受容体が関与する多様な細胞機能の分子機構解明

リポタンパク質受容体遺伝子ファミリーは、脂質代謝以外の細胞機能にも関与することが知られている。ApoER2とVLDLRは、神経発達に、LRP5は形態形成、糖代謝、骨代謝に関連することが示唆されている。しかし、これらは欠損マウスの表現型の結果であり、機能発現の詳細な分子機構は不明な点が多い。本研究はプロテオーム解析により分子機構の詳細な情報を明らかにし、その情報を用いて機能分子を設計することにより、リポタンパク質受容体が担う細胞機能を制御することを目的とした。プロテオーム解析により、細胞内でリポタンパク質受容体と結合する複数のタンパク質を確認し、リポタンパク質受容体の機能発現に関与すると考えられる2つのアダプタータンパク質の同定に成功した。同定したアダプタータンパク質がリポタンパク質受容体の機能発現にどの様な影響を与えるかを調べるために、RNA干渉法を用いてリポタンパク質受容体と同定したアダプタータンパク質をノックダウンさせた動物細胞株を作製し解析したところ、wntシグナル伝達に関与することが示唆された。Wntシグナルは形態形成などの様々な生命現像に関与しており、本研究により同定したアダプタータンパク質の機能分子を設計すれば、wntシグナル伝達を介したリポタンパク質受容体の機能を制御できると考えている。今後、同定したアダプタータンパク質とリポタンパク質受容体が相互作用する重要な分子構造を決定し、機能分子設計の基礎的な知見を明らかにしていく予定である。低密度リポタンパク質受容体(LDLR)は、構造が類似した複数の遺伝子が単離され、LDLR遺伝子ファミリーを形成し、リポタンパク質受容体がリポタンパク質代謝以外の細胞機能に関与することが示唆された。しかし、これらは欠損マウスの表現型の結果であり、機能発現の詳細な分子機構は不明である。本研究では、プロテオーム解析により分子機構の詳細な情報を明らかにし、その情報を用いて機能分子を設計することにより、リポタンパク質受容体が担う細胞機能を制御することを目的とした。リポタンパク質受容体のcDNAの組み換えアデノウィルス体を作製し、正常マウスと受容体欠損マウスまたは初代培養細胞に投入し、加増発現系を確立した。初代培養細胞での発現と細胞内局在をRT-PCRまたは免疫ブロット法により確認した。正常マウスと受容体欠損マウスの組織または初代培養細胞からタンパク質を分離後、架橋剤で架橋させ、SDS-PAGEとイミュノブロットを行うことにより相互作用するタンパク質を確認した。相互作用するタンパク質はアフィニティカラムにより精製し、二次元電気泳動により分離することにより、リポタンパク質受容体と結合するタンパク質を特定した。特定したタンパク質のスポットを切り出しトリプシンで消化し、MALDI-TOF-MSにより解析することによりタンパク質の同定を行った。現在、同定した蛋白質の発現と機能について解析を行っている。低密度リポタンパク質受容体(LDLR)は、生体内脂質のホメオスタシスにおいて重要な役割を担っている。近年、LDLRと類似した構造を有する複数のリポタンパク質受容体が単離され、LDLR遺伝子ファミリーを形成し、リポタンパク質受容体が脂質代謝以外の細胞機能に関与することが示唆された。本研究はプロテオーム解析により分子機構の詳細な情報を明らかにし、その情報を用いて機能分子を設計することにより、リポタンパク質受容体が担う細胞機能を制御することを目的としている。平成16年度にはリポタンパク質受容体と結合するタンパク質を数種類同定しており、本年度は同定したタンパク質とリポタンパク質受容体の結合を再確認するために同定したタンパク質が過剰発現する動物細胞株やタグ付きの融合タンパク質の作製を行った。また、同定したタンパク質がリポタンパク質受容体の機能発現にどの様な影響を与えるかを調べるために、RNA干渉法を用いてリポタンパク質受容体をノックダウンさせた動物細胞株を作製した。今後、作製した動物細胞株やタグ付きの融合タンパク質を用いて相互作用を解析し、リポタンパク質受容体の機能発現にどのタンパク質がどのように影響しているかをin vitroとin vivoで解析することにより、詳細な分子機構を明らかにして行く予定である。
腸管発癌におけるセリンプロテアーゼ活性制御の意義に関する研究

HAI-1欠損マウスでは腸管発癌が亢進していたが、多段階発癌モデルマウスであるApcMin/+マウスモデルにおいてHAI-1とPAR-2を同時に欠損させると有意に腫瘍発生数が抑制された。HAI-1欠損ApcMin/+マウスでは、NF-kBシグナルが活性化しており、NF-kB阻害剤を投与すると、腫瘍発生数は有意に低下したが、HAI-1, PAR-2ダブル欠損ApcMin/+マウスではNF-kBシグナルの活性化が抑制されていた。これらのことから、HAI-1はPAR-2活性化酵素を制御することでNF-kBシグナル活性化を抑制し、腸管発癌を抑制していると考えられた。本研究は、細胞膜結合クニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターであるHepatocyte growthfactoractivator inhibitor type 1 (HAI-1)によるプロテアーゼ活性制御の腸管発癌における意義を明らかにすることである。H27年度は、HAI-1ノックアウト(KO)でみられる腸管発癌の亢進に、HAI-1標的プロテアーゼの基質であるProtease - activated receptor -2(PAR-2)が関与するかを確認するために、HAI-1,PAR-2ダブルKOマウスを作製した。まず、HAI-1 KOマウスと、HAI-1,PAR-2ダブルKOマウスの定常状態における腸管の表現型を解析したところ、両者に違いはみられなかった。次に、腸管発癌におけるPAR-2の関与を検討するため、これらのKOマウスを用いてアゾキシメタン、デキストラン硫酸(AOM, DSS)投与による炎症関連大腸化学発癌モデルと、多段階発癌モデルマウスであるApcMin/+マウスを作製した。現在、それぞれのマウスで各5匹程度のモデルマウスを作製したが、PAR-2発現の有無と腸管発癌との間に明らかな関与は認められなかった。次年度以降、さらにモデル数を増やし、両群の比較を行う予定である。また、HAI-1をほとんど発現していない大腸癌細胞株SW480細胞に、レンチウィルスを用いてHAI-1強制発現を行い、HAI-1発現の有無と癌細胞の悪性形質について検討を行った。SW480細胞にHAI-1を発現させると、増殖能は亢進したが、遊走、浸潤能は低下し、HAI-1が大腸癌細胞の浸潤を抑制する可能性が示唆された。腸管発癌モデルマウス作製、HAI-1発現を調節した大腸癌細胞株の樹立など、H27年度に計画していた内容は順調に進展している。しかし、HAI-1の標的酵素のPAR-2以外の基質についての検討はまだできておらず、次年度の課題である。Hepatocyte growthfactoractivator inhibitor type 1 (HAI-1)ノックアウト(KO)マウスでは腸管発癌が亢進している。その分子機序を解明するためにHAI-1 KOマウス及びHAI-1の標的酵素の基質であるProtease - activated receptor -2(PAR-2)とHAI-1のダブルKOマウスを用いてアゾキシメタン、デキストラン硫酸(AOM/DSS)投与による炎症関連大腸化学発癌モデルと、多段階発癌モデルマウスであるApcMin/+マウスの2つの腸管発癌モデルマウスを作製した。昨年度からさらにモデル数を増やし、腫瘍発生数を検討したところ、多段階発癌モデルマウスではPAR-2 KOにより、HAI-1 KOで増加した腫瘍発生数が抑制されることを見出した。AOM/DSSによる化学発癌モデルでは腫瘍発生数にPAR-2発現の有無は関連がみられなかった。また、HAI-1欠失ApcMin/+マウスにNF-kB阻害剤であるDHMEQを投与したところ、腫瘍発生数が有意に抑制された。これらの結果からHAI-1 KOマウスでは、PAR-2活性化によるNF-kBシグナル活性化により、腸管発癌が亢進している可能性が示唆された。大腸癌細胞株SW480を用いた検討では、HAI-1の強制発現および、HAI-1の類似蛋白であるHAI-2のノックアウト細胞株を樹立し、検討を行った。昨年度HAI-1を発現させると増殖能は亢進するが、遊走・浸潤能は低下することを見出したが、HAI-2ノックアウト株では増殖・遊走・浸潤能がすべて低下することがわかった。HAI-1欠失による腸管発癌亢進について、HAI-1標的酵素の基質であるPAR-2に着目し、実験を開始したが、KOマウスの結果から、HAI-1 KOによるPAR-2の影響を強く示唆する結果が得られており、当初の予定通りに進展していると考えられる。Hepatocyte growthfactoractivator inhibitor type 1 (HAI-1)ノックアウト(KO)マウスでは腸管発癌が亢進する分ことが報告されている。本研究の目的は、HAI-1欠損に伴い腫瘍形成が亢進する分子機序を解明することである。そのため、HAI-1の標的酵素の基質であるProtease - activated receptor -2(PAR-2)とHAI-1のダブルノックアウトマウスを作製し、昨年度に引き続き炎症関連大腸化学発癌モデルおよびAPCMin/+マウスを用いた腸管発癌モデルを用いて解析を行った。

APCMin/+マウスモデルにおいては、HAI-1とPAR-2を同時にKOすると、腫瘍発生数が有意に減少し、腫瘍サイズも小さくなることが明らかとなった。またHAI-1 KO APCMin/+マウスではNF-kBが活性化しており、NF-kB阻害剤を投与することにより腫瘍発生数が減少することを明らかにした。HAI-1とPAR-2ダブルKOマウスではNF-kB活性化が抑制されており、HAI-1 KOマウスにおける腸管発癌亢進のメカニズムの一つとしてHAI-1標的酵素によるPAR-2活性化に伴うNF-kB活性化が考えられた。炎症関連大腸化学発癌モデルにおいては、PAR-2の影響は見られず、化学発癌におけるHAI-1の意義についてはまだ不明である。また、HAI-1 KOマウスの腸管においてPAR-2を活性化する酵素の同定はまだ出来ておらず、今後の課題である。HAI-1欠損マウスでは腸管発癌が亢進していたが、多段階発癌モデルマウスであるApcMin/+マウスモデルにおいてHAI-1とPAR-2を同時に欠損させると有意に腫瘍発生数が抑制された。HAI-1欠損ApcMin/+マウスでは、NF-kBシグナルが活性化しており、NF-kB阻害剤を投与すると、腫瘍発生数は有意に低下したが、HAI-1, PAR-2ダブル欠損ApcMin/+マウスではNF-kBシグナルの活性化が抑制されていた。これらのことから、HAI-1はPAR-2活性化酵素を制御することでNF-kBシグナル活性化を抑制し、腸管発癌を抑制していると考えられた。HAI-1 KOマウスと、HAI-1,PAR-2ダブルKOマウスを用いて腸管発癌モデルを作製し、HAI-1KOマウスでみられた腸管発癌亢進にPAR-2が関与するかを検討した。現在のところ、両群5匹程度の比較ではあるが、PAR-2発現の有無による腫瘍形成数に明らかな違いは認められない。このことから、次年度以降、モデルマウスの数を増やして検討を続けながら、HAI-1の標的酵素のPAR-2以外の基質にも着目し、必要に応じて新たな遺伝子改変マウスの導入も検討する必要があると考えている。化学発癌モデルにおいて、HAI-1KOによる腸管発癌亢進の原因についてはまだ不明である。モデル数を増やして検討を続けるとともに、PAR-2以外のHAI-1標的酵素の基質にも着目し、まずは免疫染色やウェスタンブロットでその発現や活性化状態を確認する。実験病理学、分子生物学PCR装置の購入を予定していたが、別予算で購入したため、形上していた予算は消耗品に使用し、一部差額が生じた。学会発表のための旅費の1部を、別予算から算出したため、差額が生じた。平成28年度は動物実験の頭数を増やしていく予定のため、生じた次年度使用額はマウスに投与する阻害剤の購入にあてる計画である。使用するマウスのジェノタイピングのための費用にあてる計画である。
固体鏡式ボトルの超冷中性子貯蔵寿命改善の研究

固体鏡式における超冷中性子反射損失低減化の方策を適用した冷中性子ボトルを試作し、中性子貯蔵寿命の長い固体鏡式ボトル実験装置を作成し、これにより中性子の崩壊粒子の測定及び分析を行った。実験装置の作成に際し、京都大学原子炉実験所の研究用原子炉を用いて、(1)ボトル鏡面の不純物水素量の低減化を図り、(2)ボトルを構成する鏡面の接合部のすきまの影響の低減化を考慮し、(3)ボトルの中性子注入部及び取り出し部の影響を回転式弁やスライド式弁の効果を比較検討し、(4)中性子崩壊ボトルにおいて使用する中性子反射膜付きシリコン半導体式ベータ線検出器の貯蔵寿命への影響を検討することにより、貯蔵寿命100秒以上の中性子崩壊実験用ボトルの実現の可能性を見出すことが出来た。
Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞極性化における分子機構の解明

破骨細胞は骨を吸収する際、細胞骨格および膜構造を変化させ、極性化する。我々は、サイトカインWnt5aが破骨細胞に発現する共受容体Ror2を介して、破骨細胞の極性化と骨吸収活性を制御する分子機構について調べた。平成25年度から27年度の研究により、Wnt5a-Ror2シグナルが、アダプター分子Daam2を介して、Rho-Pkn3シグナル経路を活性化することで、破骨細胞の骨吸収を正に制御していることを明らかにした。破骨細胞は、極性化することで骨を吸収する。極性化に際して、アクチン骨格の再編成が生じ、これは、アクチンリングという形で観察される。我々は、サイトカインであるWnt5aを欠損した破骨細胞では、アクチンリングが形成されず、骨吸収活性が低下していることを見出していた。さらに、その下流で、低分子量Gタンパク質であるRhoが活性化されること、活性化には、受容体であるRor2が必要であることを見出していた。Rhoに関わるシグナル分子をより詳細に解析するため、平成25年度は、以下の研究を行った。1Wntシグナルの下流でRhoの活性化に関与する分子を探索した。これまでに他の生物では、Dishevelled-associated activator of morphogenesis (Daam)1が関与すると報告されているが、破骨細胞において、Daam1の発現は認められなかった。Daam1と同様にFHドメインを持つタンパク質の遺伝子について、リアルタイムPCRで発現を検討したところ、Daam2が破骨細胞分化に伴って発現してくることを見出した。Daam2に対するshRNAを破骨細胞に導入し、Daam2の発現を阻害したところ、Wnt5a刺激によるRhoの活性化が生じなかった。また、骨吸収活性も低下したが、恒常的活性型Rhoの発現により回復した。2Rhoの下流で働く分子について、既に報告されている13種類のタンパク質の遺伝子の発現をリアルタイムPCRで検討したところ、Protein Kinase N3 (PKN3)の発現が破骨細胞分化に伴い上昇することを見出した。PKN3に対するshRNAを破骨細胞に導入し、PKN3の発現を阻害したところ、骨吸収活性が低下した。この低下は、恒常的活性型Rhoを発現しても回復しなかった。Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞の極性化制御機構について、平成25年度には、Wnt5a-Ror2シグナルがアダプター分子であるDaam2を介してRhoを活性化することおよびRhoの下流で働く分子であるプロテインキナーゼN3(PKN3)を見出した。平成26年度は、PKN3の破骨細胞における役割を明らかにするために以下の実験を行った。1PKN3遺伝子欠損マウス(PKN3 KO)の骨について、マイクロCTおよび骨形態計測を用いて解析した。PKN3 KOの骨量は野生型マウス(WT)と比べて有意に増加していた。破骨細胞数および骨芽細胞数は差が無かった。吸収窩の深さはPKN3 KOで有意に浅く、また、骨吸収マーカーである血清CTXはPKN3 KOで有意に低値であった。骨形成速度には差が無かった。2PKN3 KOの破骨細胞および骨芽細胞について、in vitroでの解析を行った。PKN3 KOの破骨細胞は骨吸収活性が有意に低下していた。また、アクチンリングを形成している細胞数も減少していた。骨芽細胞を石灰化誘導培地で培養したが、ALP活性および石灰化に差は認められなかった。1、2より、PKN3 KOマウスは骨吸収活性の低下により骨量が増加することが示された。さらに、3PKN3がアクチンリング形成に関与するメカニズムを明らかにするため、破骨細胞におけるPKN3の局在を調べた。免疫染色を行おうとしたが、入手可能な抗体ではうまくいかなかった。そこで、緑色蛍光タンパク質Venusを融合したPKN3および赤色蛍光タンパク質DsRedを融合したアクチンを発現するアデノウイルスベクターを作成した。PKN3とアクチンは共局在することが明らかとなった。Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞極性化制御機構について、平成25年度には、Wnt5a-Ror2シグナルがアダプター分子であるDaam2を介してRhoを活性化していることおよびRhoの下流で働く分子protein kinase N3 (Pkn3)を見出した。平成26年度はPkn3の破骨細胞の骨吸収ににおける役割を明らかにするため、Pkn3遺伝子欠損(KO)マウスを解析し、骨吸収の低下により骨量が増加することを明らかにした。また、Venusタグ付きPkn3およびDsRedタグ付きβーアクチンを発現するアデノウイルスを作成し、破骨細胞にそれらのウイルスを用いて遺伝子発現させることで、Pkn3がβーアクチンと共局在することを明らかにした。これらの実績を踏まえて、平成27年度には、Pkn3がどのようにアクチンリング形成を制御するか明らかにするため、以下の実験を行った。Ror2を欠損した破骨細胞およびコントロールの破骨細胞にVenusタグ付きPkn3を発現させ、それぞれから細胞抽出液を調製した。抗Venus抗体を用いた免疫沈降法により、Pkn3と結合するタンパク質を調べた。コントロールの破骨細胞では、c-SrcおよびPyk2という、これまでに骨吸収に関連することが報告されているタンパク質が結合していた。しかし、Ror2を欠損した破骨細胞ではそれらの結合が認められなかった。

これらのことから、Wnt5a-Ror2シグナルは、Pkn3とc-SrcおよびPyk2との結合を促進することで破骨細胞の骨吸収活性を調節する可能性が考えられる。破骨細胞は骨を吸収する際、細胞骨格および膜構造を変化させ、極性化する。我々は、サイトカインWnt5aが破骨細胞に発現する共受容体Ror2を介して、破骨細胞の極性化と骨吸収活性を制御する分子機構について調べた。平成25年度から27年度の研究により、Wnt5a-Ror2シグナルが、アダプター分子Daam2を介して、Rho-Pkn3シグナル経路を活性化することで、破骨細胞の骨吸収を正に制御していることを明らかにした。Rhoの下流で働く分子として見出したPKN3について、in vivoにおいても重要であることを示す結果を得ることができたため。生化学PKN3がアクチンと共局在することが明らかになったので、PKN3がどのようなタンパク質と相互作用しながらアクチン骨格を制御するかを調べる。具体的には、Venus-PKN3を発現した破骨細胞の細胞抽出液に抗Venus抗体を作用させて免疫沈降を行う。交付申請書に記載した計画に関しては、全て遂行できた。平成26年度、蛍光タンパク質を融合したPKN3およびアクチンを発現するアデノウイルスベクターの作成が予定より順調に進行したため。当初の計画では、作成までにもう少し試行錯誤が必要であると考え、アデノウイルスベクターの作成キット(20.1万円)、作成したベクターをトランスフェクション可能な状態にするための制限酵素(3万円)、増幅したウイルスを精製するキット(10.3万円)、精製したウイルスの量を測定するキット(4.3万円)(4点で計37.7万円)について2つずつ購入することを計画していた。しかし、1つずつ購入して始めた実験で作成に成功したので、2つ目を購入する費用が次年度使用額となった。当初の計画では、ドメイン欠失変異体を発現させることでアクチンリング形成に必要なドメインを同定することを考えていた。しかしながら、同定されたタンパク質であるPKN3のアクチン骨格との関連については、非常に情報が少ない。そこで、PKN3及びアクチンについて、それぞれ蛍光タンパク質と融合したタンパク質を発現するアデノウイルスベクターを作成し、破骨細胞のアクチンリング形成時にPKN3の局在がどのように変化するかをライブイメージングにより明らかにする。また、PKN3の遺伝子欠損マウスの骨及び血清中の骨代謝マーカーについて解析する。アデノウイルスベクターを作成するキットを一揃い購入可能な金額であるので、当初の予定よりも多くのアデノウイルスを作成可能である。平成26年度はVenusを融合した全長のPKN3を発現するアデノウイルスを作成した。平成27年度はVenusを融合したPKN3のドメイン欠失変異体(2種類)を発現するアデノウイルスベクターを作成し、それぞれの変異体をPKN3 KO破骨細胞に発現してアクチンリング形成および骨吸収活性が回復するかを明らかにする。物品費に関して、実験が想定したよりも順調に遂行されたため、当初予定していたよりも少ない出費で結果を出すことができた。昨今の細胞生物学系の発表においては、蛍光タンパク質と融合したタンパク質を用いたライブイメージングの手法が重視されている。
肝細胞癌個別化治療を目指したHOXB9によるEMT誘導と血管新生亢進について

肝細胞癌におけるHoxB9発現による血管新生亢進のメカニズムを明らかにし,肝細胞癌に対する個別化治療に対するバイオマーカーの確立を目指し,さらにはSorafenibの効果予測因子への応用を試みた。HoxB9発現量は肝細胞癌切除症例における無再発生存率に寄与する有意な独立因子であった.切除検体においてHoxB9と血管新生因子であるPDGF,PDGFR,VEGFなどは正の相関関係の傾向を認め、HoxB9高発現肝細胞癌細胞株において,siHoxB9によりHoxB9をKnock downすることにより,PDGF,PDGFR,VEGFの発現量は有意に低下し,さらにpMEKやpRafなども低下していた.肝細胞癌におけるHoxB9発現による血管新生亢進のメカニズムを明らかにし,肝細胞癌に対する個別化治療に対するバイオマーカーの確立を目指し,さらにはSorafenibの効果予測因子への応用を試みた。HoxB9発現量は肝細胞癌切除症例における無再発生存率に寄与する有意な独立因子であった.切除検体においてHoxB9と血管新生因子であるPDGF,PDGFR,VEGFなどは正の相関関係の傾向を認め、HoxB9高発現肝細胞癌細胞株において,siHoxB9によりHoxB9をKnock downすることにより,PDGF,PDGFR,VEGFの発現量は有意に低下し,さらにpMEKやpRafなども低下していた.【方法】12006年から2012年までの肝切除検体よりcDNAを抽出し,HoxB9の発現量と無再発生存・累積生存との関係性,血管新生因子やSorafenibの作用機序におけるSignatureの発現量との相関関係を検討する.2HoxB9高発現細胞株にsiHoxB9を導入しHoxB9をKnock downすることによって,血管新生因子やSorafenibの作用機序におけるSignatureの発現量との相関関係を検討する.【結果】HoxB9発現量は肝細胞癌切除症例における無再発生存率に寄与する有意な独立因子であった.また切除検体においてHoxB9と血管新生因子であるPDGF,PDGFR,VEGFなどは正の相関関係の傾向を認めた.さらにHoxB9高発現肝細胞癌細胞株において,siHoxB9によりHoxB9をKnock downすることにより,PDGF,PDGFR,VEGFの発現量は有意に低下し,さらにはpMEKやpRafなども低下していた.【結論】転写因子であるHoxB9は肝細胞癌において血管新生因子を亢進させることにより,癌悪性度を高めている可能性が示唆された一方,Sorafenibの作用機序であるSignatureを亢進させており,治療効果予測因子としてのバイオマーカーとなりうる可能性も同時に示唆された.【方法】HoxB9高発現細胞株にsiSMAD4を導入してSMAD4をKnockdownすることによってTGFb経路を遮断して、血管新生因子やSorafenibの作用機序におけるSignatureの発現量との相関関係を検討する。in vivo実験系の環境設定に時間・費用を要するため。当初の予定より、結果抽出に時間を要したため、学会発表などの旅費に使用する費用を使用しなかったため。今後は、学会発表などにも傾倒していく予定である。