hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規細胞内輸送調節分子を介した疼痛制御機構の解明

このPRIPを介した反応は、KCC2のリン酸化状態を制御することにより発現することを解明した。さらに、前年度の解析により、細胞内亜鉛濃度を制御するZNT1の発現減少がKCC2の発現を抑制することを明らかにした。このZNT1発現抑制に伴う、KCC2の発現抑制は、細胞内亜鉛濃度の上昇に伴う転写制御因子の変動を介したカスケード反応であり、最終的にはBDNFの発現上昇によるKCC2発現抑制であった。本年度は、KCC2発現抑制による細胞内変化について、急性切片を用いて詳細に検討を加えた。その結果、ZNT1発現抑制モデル動物における脊髄では、KCC2の機能が明らかに減弱しており、この結果細胞内クライドイオン濃度が上昇していることが明らかとなった。さらに、難治性疼痛の直接の発症原因がKCC2機能抑制である点が共通することから、PRIPとZNT1との関連性について検討をおこなった。PRIPがKCC2のリン酸化状態を制御し、ZNT1が転写制御因子活性を介した反応であるため、直接的な関連性は認められないと考え、カスケード反応段階におけるクロストークの可能性を検討したが、明確な相互作用の可能性を見出すことができなかった。しかしながら、細胞内亜鉛濃度の変動が神経障害性疼痛の発症に深く関与しており、この亜鉛濃度の制御にZNT1発現量変動が重要な点を明らかとした。新規細胞内輸送調節因子であるPRIPの遺伝子欠損動物では,坐骨神経部分結紮法を用いて作成した神経障害性疼痛モデルの疼痛が抑制されることが明らかとなった.この機序は,細胞内クロライドイオン濃度を制御する輸送体であるKCC2のリン酸化状態を制御することにより,細胞膜上の発現を制御することであった.KCC2の発現減少は,細胞内クロライドイオン濃度の上昇を誘発し,その結果抑制性シグナルの変調が発生し,神経障害性疼痛が発症する.PRIP欠損は,坐骨神経部分結紮誘発性の脊髄KCC2発現減少を抑制することにより,疼痛発症・維持に拮抗することを明らかにした.本年度は、新たな候補分子の解析をはじめた。この候補分子自体と疼痛発症の関連性については、順調に解析を進めることが出来た。しかしながら、PRIP分子との関連性については、難航している。神経科学新しい候補分子としてZNT1に注目して解析を進めているが、PRIP分子との関連性については、明らかとなっていない。この点について、解析を進めていきたい。また、PRIP分子との関連性が見出せない場合でも、ZNT1および細胞内亜鉛イオン濃度が神経障害性疼痛発症メカニズムに関与する可能性は高く、この点について研究成果として発表する予定である。PRIPによる疼痛制御機構を検討するためには,そのパートナータンパク質の同定が必要である.本研究では,初年度でそのパートナータンパク質を同定することができた.このことにより,本年度は,より詳細な検討をおこなうことが出来た.この結果,PRIPとKCC2との関係および疼痛制御機構について,研究としてまとめることができた.
大きた配位空間をその内部にもつナノ構造多核金属錯体の合成と生体高分子の分子認識

6-HPAの二核鉄錯体1とH_2O_2との反応によってパーオキソ二核鉄錯体2が生成する事は、UV-visおよびCSIマススペクトルから明らかにされている。そこで、本年度は錯体2の共鳴ラマンスペクトルを詳細に検討し、その構造を推定した。2の共鳴ラマンスペクトルは870cm^<-1>にvo-oのバンドを示した。この値はL. Que等のパーオキソ二核鉄錯体[Fe_2(O)(O_2)(6-Me_3-TPA)_2](ClO_4)_2(3)の848cm^<-1>よりも約20cm^<-1>高波数であるが、一般的なμ-1,2-パーオキソ錯体の値(880-900cm^<-1>)よりは低波数である。2と3のvo-oが低波数に現れるのはオキソ架橋によってFe-Fe間距離が短くなりFe-O-O角が小さくなる事による。6-HPAの様々なオキソ架橋錯体を合成して、その結晶構造を調べたところ、6-HPAの錯体は対応するTPAの錯体と比べてFe-Fe間距離が大きい事がわかった。従って、2が3よりも大きなO-O振動バンドの値を示すのは、6-HPA配位子によってFe-Fe間距離が伸びてFe-O-O角が大きくなったためと考えられる。さらに、アルケンのエポキシ化反応について、反応機構を明らかにするための研究を行った。パーオキソ錯体2を生成させ、これにアルケンを加えても、分解速度は全く加速されなかった。一方、錯体1と1当量のH_2O_2とを用いてtrans-β-methylstyleneと反応させたところ、加えたH_2O_2あたりほぼ定量的にエポキシドが生成した。これらの結果は、2がエポキシ化の直接の活性種ではなく、2から活性種が生成する反応が律速段階であり、活性種は用いたH_2O_2あたりほぼ定量的に生成する事を示している。我々は昨年度の同位体ラベルの研究から2から活性種としてジオキソ-μ-オキソ二核鉄(IV)錯体4が生成する事を推定しており、本年度の結果と矛盾しない。また、共鳴ラマンスペクトルの結果は、2のFe-Fe間距離が伸びている事を示唆しており、2は活性種を生成しやすい優れた機能モデルであるといえるかもしれない。
変形性関節症は高齢者の生活の質を脅かす運動器疾患であるが、その病態は未知な部分が多い。我々は軟骨細胞自身の関節恒常性維持への関わりは限定的であり、関節の置かれた状況を感知し必要なシグナルを発信するといった、関節全体を統率する制御システムが存在すること、そしてその本体は滑膜に存在する組織幹細胞であると仮説を立て、本研究を計画した。本研究ではマウスおよびヒト臨床検体を用いた様々な実験系や最新の解析手法を駆使して、関節における組織幹細胞の役割の解明に挑む。
分子間および分子内電荷移動状態の直接観測とその溶媒効果

本研究では電子励起状態で電荷移動反応や水素移動反応をを示す錯体もしくは分子について、負イオンを起点としてその溶媒和クラスターの光電子スペクトルを測定し、電荷移動状態の電子物性の溶媒効果を明らかにすることを目的として、研究を遂行した。電子励起状態の電子物性の溶媒効果を解明する上では、溶媒和分子数を制御してその電子および振動構造を定量的に調べることが重要である。本研究では負イオンからの光電子分光を用いて、質量選別によって組成を分離することを可能とし、さらに単一成分のクラスター負イオンの光電子スペクトルを測定して、中性状態の電荷移動状態とその振動構造をサイズ毎に追跡した。その具体例として、7-アザインドールの2量体とその水錯体を取り上げた。7-アザインドールの2量体には、水素移動反応を起こす反応性2量体と非反応性2量体とが共存すると考えられ、その構造に興味がもたれてきた。早大理工の藤井らによる赤外スペクトルの測定では、非反応性2量体には水分子が含まれることがわかってきた。本研究では、7-アザインドール2量体およびその水錯体の負イオンの光電子スペクトルを測定し、電子親和力を決定するとともに、光電子スペクトルの励起波長依存性を測定した。その結果、7-アザインドール2量体負イオン自身の励起状態でも水素原子移動反応を起こし、7-アザインドール2量体の水錯体は芳香族環に水2量体が付着した構造をとることがわかった。また、水分子の溶媒和によって電子状態が2000cm^<-1>程度ずつ変化することから、7-アザインドールの非反応性2量体は、芳香族環上に水分子を有するために水素原子移動反応が阻害されるものと結論した。
歯科衛生士学生教育におけるコミュニケーション・スキルの定着に関する研究

歯科衛生士学生に対するコミュニケーション教育後の教育効果の持続性について調査研究を行った。歯科診療における保護者とのコミュニケーション能力の向上を目的として,歯科衛生士学生30名に対し行動科学的トレーニングを行った。従来の講義形式の教育のみならず,ビデオテープやロールプレーを用いたシミュレーション型のトレーニングを行った結果,コントロール群の歯科衛生士学生30名と比較しトレーニング群の方が平均スコアーが高く,両群間に5%の危険率で有意差を認めた。さらに,臨床実習終了後に,両群の学生に「保護者とのコミュニケーション技能評価尺度」による評価を再度行った。また,実際の小児歯科診療における歯科医療面接(インタビュー)を実施した。歯科衛生士役の学生の医療面接技術の修得の評価を,面接の進め方と面接で得られた情報についての両面から行った。この評価においては,津田が開発した「医療面接評価シート」を使用した。その結果,コントロール群と比較しコミュニケーション教育群の学生の方が,保護者とのコミュニケーション技能評価の平均得点が高く,両群間に5%の危険率で有意差を認めた。また,両群における歯科医療面接評価を比較検討した結果,面接で得られた情報については有意差は認められなかったが,面接の進め方においてコミュニケーション教育群の方が平均評価得点が高く,5%の危険率で有意差を認めた。これらにより,歯科衛生士学生に対するコミュニケーション教育後の教育効果が持続されていることが示唆された。小児歯科診療における保護者とのコミュニケーションに関する行動科学的トレーニングの効果について,質問紙調査法により検討を行った。対象は本学に在籍する歯科衛生科学生で,コントロール群30名とコミュニケーション教育群30名の総計60名とした。保護者とのコミュニケーション教育を行う前に,「保護者とのコミュニケーション技能評価尺度」を用いて,両群のコミュニケーション能力をコントロールのデータとした。先ず,コミュニケーション教育群には,保護者との対応技術項目に関するセミナーおよび紙上応答訓練を行った。次に,歯科衛生士役が保護者との対応を行っているシミュレーション場面を,シナリオに基づいてロールプレーを行い,スーパーバイザーを配置した小グループ形式のもとに,フィードバック・セッションを行った。メンバーからのフィードバックは,歯科衛生士役の対応のポジティブな面のみに焦点をあて,肯定的評価を行なった。対応に関する課題や問題点は,歯科衛生士役自身において把握・検討を行う問題解決型学習を実施した。コミュニケーション教育群では教育実施後に,「保護者とのコミュニケーション技能評価尺度」による評価を行った。コントロール群においても再度,2回目の調査を実施し評価を行った。尚,1回目の評価点は両群間において同等になるように抽出し,統計学的に有意差が無いように設定した。そして,2回目における両群の評価点の平均を統計学的に比較検討し,コミュニケーション教育の効果について検討を行なった。その結果,トレーニング群とコントロール群間において,1回目の平均スコアーには統計的有意差が認められなかったが,2回目の評価においてはトレーニング群の方が平均スコアーが高く,両群問に5%の危険率で有意差を認めた。以上の事より,歯科衛生士学生に対する保護者とのコミュニケーション能力の向上を目的とした行動科学的トレーニングの有効性が示唆された。

その結果,コントロール群と比較しコミュニケーション教育群の学生の方が,保護者とのコミュニケーション技能評価の平均得点が高く,両群間に5%の危険率で有意差を認めた。また,両群における歯科医療面接評価を比較検討した結果,面接で得られた情報については有意差は認められなかったが,面接の進め方においてコミュニケーション教育群の方が平均評価得点が高く,5%の危険率で有意差を認めた。これらにより,歯科衛生士学生に対するコミュニケーション教育後の教育効果が持続されていることが示唆された。
就学前後の子どもの読み能力の熟達化過程

就学前後の2年間にわたり,子ども達の読み能力の熟達過程を縦断的に検討した。昨年度(1993年度)は,大阪府下の公・私立幼稚園児,および公立保育園児70名を対象として,夏,および冬に個別実験を行った。これらの子ども達は次年度に同一の公立小学校に就学する予定の子ども達であった。本年度はこうした子ども達,つまり,大阪府下の公立小学校の1年生を対象として,夏,および冬の2回,読みに関連する諸能力を調べた。従って,本年度科学研究費補助金の援助のもとに行われたのはこれら一連の縦断研究の後半部分にあたるものであった。子ども達に行った課題はそれぞれの時期ごとに若干異なるが,大きく2つのカテゴリに分類することが出来る。ひとつは文字の読み,及びその効率性に関するものである。つまり,子ども達がどの程度効率よく(流暢に)文字を符号化出来るようになるのか,ということである。ふたつめのカテゴリに属する課題は,符号化が行われた後の文章の処理の効率性に関わる課題である。より具体的に言うならば,言語的な情報が作動記憶内でどの程度効率的に処理されているのか,また,それを規定する要因が発達的にどの様に変化するのかを明らかにするための課題であった。主要には次の様な結果が得られた。(1)いずれのカテゴリの課題も子ども達の読み能力と密接に結びついており,(2)文字の読みの効率性は実際に文字が読めるようになってからの期間を反映する。少なくとも文字が読めるようになって1年間はそれが文章の理解能力を制約するものとなっている。(3)それに比べると,文章の処理の効率性は文字の読みの習得時期との関連性はうすく,調査期間を通じて一貫して読み能力を規定するものとなっていた。
Fluidityの発現要因および臨床的意義の検討と転倒予防プログラムの立案

本研究ではSit-to-Walk task(STW)におけるfluidityの発現要因を検討したのち、高齢者の転倒予防につながるプログラムを立案することが目的である。その基礎となるデータ収集として、人工膝関節置換術(TKA)後患者を対象とした調査を開始した。現在、15名のTKA後患者について、fluidityおよびfluidityの発現要因として考えられる関節可動域、下肢筋力、基本的移動能力(歩行能力、起立・着座能力)、バランス能力を手術後から退院に至るまでの縦断的変化の測定を完了した。対象者は目標数に達していないが、現有データでは、基本的な移動能力及びバランス能力とともに退院時でのfludityの上昇が認められる。快適速度および最大速度でのSTWにおけるfluidityについて比較すると、術後早期に比べ、退院時点においてfluidityの差が大きくなっており、STW施行時の冗長性を示している。特別な介入をしていない中でのこの上昇は、TKA後患者の適応能力を示し、研究開始当初の仮説を支持するものと考える。これまでのfluidityについての研究は横断的調査に限られ、経時的な変化を示した研究はこない。本研究で経時的変化を示すことはfluidityの臨床的意義と考え得る潜在的な転倒リスクの評価や、転倒予防のための具体的介入プログラムの立案につながるものと考えられる。今後も予定数まで対象者のリクルート、測定を継続するが、これらのデータは今後の研究の対象となる地域在住高齢者との比較対象として十分使用可能なデータであると考えられる。予定通りの測定が開始できた。これまでの解析では仮説通りの結果となっている。fluidityの発現要因の検討のためTKA後患者の測定を継続し、統計学的な分析を行う。同時に地域在住高齢者を対象とすることを念頭に、より簡易なfluidity測定法となりうる加速度計によるfluidityの評価の妥当性を示す。データ解析に要するコンピュータについて、既存のものを使用できたため、新規購入を見送った。次年度以降必要となるため、この分を充てる。また、測定に要する人件費、学会発表のための旅費、論文投稿費用として使用する。
日常的な食品素材を用いた高フラボノイド食摂取と生体内抗酸化指標の関連に関する研究

エネルギー、PFC比等を整え、フラボノイドを豊富に含む高フラボノイド食を設計・調製し、健常学生7名を対象に食事由来フラボノイドの体内動態について検討した。また、本食および対照群として低フラボノイド食をBMI25以上の肥満者6名にクロスオーバーで1週間継続摂取させ、高フラボノイド食の短期継続摂取が炎症マーカーに与える影響を検証した。高フラボノイド食摂取後は血中フラボノイド濃度の有意な上昇がみられ、摂取9時間後も血中に存在することが示された。また、BMI30以上の著しい肥満者において、高フラボノイド食摂取後に血球細胞中のTNF-αなどの炎症性サイトカインの遺伝子発現量低下が確認された。ポリフェノールの一種であるフラボノイドは、様々な機能性を有することから日常的な摂取による疾病予防効果が期待されている。しかし、ヒトでの食事由来フラボノイドによる機能性評価に関する報告は少ない。本研究の目的は、食事による機能性成分の摂取のあり方を提案するため、高フラボノイド食の調製に必要なデータベース作成と、短・中期的な高フラボノイド食の継続摂取による疾病リスク低減効果を小規模ヒト介入試験により検証することである。平成25年度は、(1)食材の調理過程におけるフラボノイド含有量の変化(2)ヒト試験に用いる高フラボノイド試験食の開発と妥当性の検討を行った。試料食材を生およびゆで、煮、焼き、炒め調理後、凍結乾燥、酵素加水分解処理し、代表的なフラボノイドアグリコンをHPLCにより測定してフラボノイド含有量の変化傾向を調べた。生に比べてゆで、焼き、炒め調理では有意に減少し、その減少幅には違いがみられた。高フラボノイド試験食は、食事摂取基準に基づき、フラボノイド含有量を高める食材・調理法を選択的に取り入れた複合食とし、9モデル食を作製した。料理単位で前述と同様にフラボノイド含有量を測定した。さらに、Folin-Ciocalteu法による総ポリフェノール量の測定、DPPHによる抗酸化活性の測定を行った。4種類のモデル食のフラボノイド含有量推定値は、先行研究の日本人のフラボノイド推定摂取量の約3倍であり、高フラボノイド試験食として妥当と判断した。また、料理中のフラボノール類は抗酸化活性と正の相関を示したが、イソフラボン類、フラボン類では相関がなかった。フラボノイドは、抗酸化活性に大きく寄与するフラボノール類と、寄与は少ないが、その他の機能性を有するフラボン類、イソフラボン類に分類できること、高フラボノイド食の立案には、異なるフラボノイドを含む食品を組合せて調製すべきであることが示唆された。フラボノイドは様々な機能性を有し、疾病予防効果が期待されている。本研究の目的は、食事による機能性成分の摂取のあり方を提案するため、食材別・調理法別のフラボノイド含有量のデータベース作成と、高フラボノイド食の継続摂取による疾病リスク低減効果を小規模ヒト介入試験により検証することである。平成26年度は、(1)尿中フラボノイド濃度の測定方法の確立、(2)高フラボノイド食摂取による尿中フラボノイド濃度の経時変化、(3)血漿中フラボノイド濃度の測定方法の検討を行った。被験者はいずれも静岡県立大学の健康な学生(21-22歳)である。尿中フラボノイド濃度は、尿を酵素加水分解処理しSep-Pak C18にて抽出後、LC/MSを用いてフラボノイドアグリコンとして測定した。高フラボノイド食摂取による尿中フラボノイド濃度の経時変化は、試験初日にフラボノイド低減食を3食摂取してウォッシュアウトとした後、2日目の朝食に高フラボノイド食を摂取し、昼食と夕食に再びフラボノイド低減食を摂取した。尿サンプルは、2日目の朝食前(0時間)、朝食摂取後から6時間後(0-6時間)、6時間後から12時間後(6-12時間)、12時間後から24時間後(12-24時間)の4区分で蓄尿し収集した。その結果、6-12時間で最もフラボノイド濃度の濃い尿が検出された。これは、Mullen W.ら(2006)、Xu X.ら(1994)が報告しているタマネギ等の単体摂取におけるフラボノイドの尿中排泄時間よりも後ろにシフトしていた。本研究におけるフラボノイドは複合食中の調理物として摂取しており、食品単体の摂取よりも吸収に時間を要したと推察される。今回の結果より、フラボノイド含有量を高めた食事由来のフラボノイドが生体内で吸収されること、複合食中のフラボノイドは食品単体の場合に比べ、摂取後の吸収が遅れる可能性があることが示唆された。フラボノイドは様々な機能性を有し、日常的な摂取による疾病予防効果が期待されているが、ヒトでの食事由来フラボノイドによる機能性評価に関する報告は少ない。本研究の目的は、食材別・調理法別のフラボノイド含有量のデータ蓄積と、高フラボノイド食の継続摂取による疾病リスク低減効果を小規模ヒト介入試験により検証することである。平成27年度は、(1)血中フラボノイド濃度の測定方法の確立、(2)高フラボノイド食単回摂取によるフラボノイド類の体内動態の検討、(3)高フラボノイド食継続摂取における生体内抗炎症効果の検討、(4)食材別・調理法別のフラボノイド含有量の測定を行った。血中フラボノイド濃度は、血漿を酵素加水分解処理し、酢酸エチルにて抽出後、LC/MSにてフラボノイドアグリコンを測定した。

(3)については、静岡県立大学のBMI25以上の男性(26-50歳)6名を被験者とし、2日間のウォッシュアウト後、7日間は高フラボノイド食またはフラボノイド低減食(対照)を継続的に摂取した。試験はクロスオーバーにて実施した。ウォッシュアウト後および7日間の継続摂取後に採血を行った。高フラボノイド食摂取前と比較し、摂取後では血中フラボノイド濃度の有意な上昇がみられた。また、血球細胞中のTNF-αなどの炎症性サイトカインの遺伝子発現量をRT-PCRにて測定したところ、BMI30以上の肥満者において、高フラボノイド食摂取後にこれらの遺伝子発現量が低下していた。肥満者の生体内は慢性的に炎症性サイトカインの発現量が高まっていることが報告されている。それゆえ、本試験のBMI30以上の肥満者では高フラボノイド食摂取による抗炎症効果が効きやすい状態であったと推察される。以上より、フラボノイド含有量を高めた食事を継続的な摂取は、肥満のような慢性的な炎症状態において抗炎症効果を発揮する可能性が示唆された。エネルギー、PFC比等を整え、フラボノイドを豊富に含む高フラボノイド食を設計・調製し、健常学生7名を対象に食事由来フラボノイドの体内動態について検討した。また、本食および対照群として低フラボノイド食をBMI25以上の肥満者6名にクロスオーバーで1週間継続摂取させ、高フラボノイド食の短期継続摂取が炎症マーカーに与える影響を検証した。高フラボノイド食摂取後は血中フラボノイド濃度の有意な上昇がみられ、摂取9時間後も血中に存在することが示された。また、BMI30以上の著しい肥満者において、高フラボノイド食摂取後に血球細胞中のTNF-αなどの炎症性サイトカインの遺伝子発現量低下が確認された。H26年度は、尿中のフラボノイド濃度の測定方法を確立させ、複合食からのフラボノイド摂取時における尿中フラボノイド排泄量について経時的に測定を行い、体内動態を調べた。以上については概ね達成している。また、平成25年度に学内の研究倫理審査基準の変更によって実施できなかった被験者の採血については、医療機関での実施体制が整い、血液サンプルの収集を始めることができた。現在、血漿フラボノイド濃度の測定方法について、条件を変化させて精度を高めるための検討を行っている。(研究計画3)しかし当初は、フラボノイド含有量が一定以上の食材について、調理法別にフラボノイド含有量および抗酸化活性の変化傾向を検討し、データベース作成を継続していく予定であったが、年度の途中でサンプル調製に用いる機器(真空ポンプ)に不具合が生じ、数ヶ月間にわたりサンプル調製ができなかった。その結果、食材別・調理法別のフラボノイド含有量のデータベース化については計画よりも遅れている。現在は修繕が完了し、再び実験を進めている。(研究計画1)なお、研究計画2(試験食の妥当性の検証)については平成25年度中に達成している。実践栄養学現在、機器の修理は完了し、食材の調理法別のフラボノイド含有量および抗酸化活性の測定について、サンプルの収集を再開したところである。今年度中にこれらの測定とデータの整理を行い、フラボノイド含有量が一定以上の食材における、調理法によるフラボノイド量および抗酸化活性の変化についてデータベース化を行う予定である。血漿中のフラボノイド濃度については、現在、測定精度を高めるための検討を重ねている。
能動的DNA脱メチル化を介したメモリーB細胞分化制御

これまでの解析で、Tet2、Tet3分子それぞれの欠損によって、免疫後のプラズマ細胞への分化が部分的に抑制されていることが明らかとなったため、Tet2、Tet3共欠損マウスを作製することによって、これら分子の機能重複について解析を行った。それぞれの単欠損に比べて、二重欠損条件下においては、ほぼ完全にプラズマ細胞の分化が抑制されていることが明らかとなった。また、胚中心B細胞分化についても同様に解析を実施したところ、やはり、二重欠損B細胞においては、分化抑制が認められた。一方で、Tet分子欠損によって細胞分裂が抑制されているわけではないことから、Tet分子は、B細胞の末梢リンパ組織における機能分化に重要な役割をになっていることが明らかとなった。さらに、これまでに、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損マウスにおいて、自己免疫性炎症症状の発症が明らかとなっており、その疾患症状の惹起には、T-B相互作用が必須であることが示唆されていた。このT-B相互作用が、抗原依存的であるかについて解析するため、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損条件下において、さらにB細胞特異的にMHC class II分子を欠損させたマウスを作製したところ、ほぼ完全に炎症症状は抑制された。また、B細胞もしくは、CD4T細胞の抗原受容体の特異性ををそれぞれ、自己抗原と関係のないHEL、もしくはOVAに固定したところ、やはり同様に、自己免疫性炎症の抑制が認められた。したがって、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損マウスにおける自己免疫疾患惹起には、なんらかのセルフ抗原、ネオセフル抗原を介したT-B相互作用が必須であることが明らかとなった。本研究計画申請で述べた通り、DNA脱メチル化酵素であるTetのB細胞における役割を解明する為、B細胞特異的にCreリコンビナーゼが発現するCD19creマウスとTet floxマウスを交配することにより、B細胞における各Tet分子の機能の解析を試みた。まず、Tet1, Tet2, Tet3をそれぞれ単独で欠損したマウスにおける骨髄中のB細胞初期分化を検討したが、顕著な異常は見られなかった。また、末梢リンパ組織におけるB細胞を解析したところ、Tet2欠損もしくは、Tet3欠損マウスでそれぞれ、脾臓のmarginal zone (MZ) B細胞の割合、絶対数が、3割程度減少していることが、明らかとなった。一方で、B220陽性CD93陰性画分に存在し、CD23、補体レセプター共陰性の未成熟型B細胞[Double negaive (DN)未成熟B細胞]の割合、絶対数が、微増していることが示された。この傾向は、週齢を経たマウスで顕著であった。以上のことから、Tet2、Tet3は、重複した機能があることが示唆された。よって、それら二重欠損マウスの作製を試みた。同様に解析した結果、B細胞初期分化は、ほぼ正常であったが、脾臓、リンパ節の腫脹が認められた。血中抗体価を測定したところ、IgG1、IgAは、野生型と比べて減少し、他のアイソタイプ抗体に関しては、増加を示した。さらに、末梢におけるB細胞集団について解析したところ、MZB細胞は、ほぼ消失し、一方で、DN未成熟B細胞は、著明に増加していることが明らかとなった。また、Tet欠損B細胞の細胞表面分子の発現パターンを解析することによって、これらB細胞は、副刺激分子の発現が亢進しており、活性化型の形質を有することが明らかとなった。研究実績の概要で述べた通り、Tetファミリー分子は、重複した役割を持っているものと考えられる。また、我々の実験結果から、Tet2、Tet3の二重欠損マウスは、自己免疫様の形質を呈することが分かってきた。B細胞特異的マウスモデルでこのような急性自己免疫様症状を示すモデルは、ほとんど見当たらない。よって、Tetは、B細胞のホメオスターシス、自己寛容に重大な役割を担っていることが明らかになりつつある。昨年度の研究実績で述べた通り、B細胞特異的DNA脱メチル化酵素Tet2, Tet3二重欠損マウスにおいて、自己免疫様炎症が認められた。今年度の解析で、B細胞だけでなく、活性化T細胞の増加に加え、Th1、Tfh細胞等のエフェクター細胞分化の亢進が認められた。これらリンパ球の活性化、分化が、いかに引き起こされるか検討する為、炎症自然発症後、抗体投与によってB細胞または、T細胞を枯渇させたところ、カウンターパートのリンパ球数は、それぞれ激減することが明らかになった。よって、リンパ球の異常活性化、分化には、T-B相互作用が必須であることが明らかとなった。さらに、自己免疫炎症の引き金となる分子機序について検討する為、炎症成立前において、Tet欠損によって発現変動する遺伝子をRNAsequencing法により同定した。T-B相互作用に関与するサイトカイン、共刺激分子に着目したところ、Tet欠損によって、唯一、共刺激分子CD86の発現が亢進していた。CD86と重複した機能を持つCD80とCD86に対する中和抗体カクテルの投与により、リンパ球の異常活性化を含めた炎症応答が部分的に抑制された為、おそらく自己免疫炎症の成立にはCD80/86が、必要であることが示唆された。

また、T細胞依存的免疫応答におけるTetの役割を解析する為、ハプテン特異的B細胞受容体を発現し、タモキシフェン投与によって、遺伝子欠損を誘導できるTet2/3 flox,R26ERT2Cre, B1-8マウスを作成し、解析を実施した。その結果、NPCGG alumで免疫後に誘導されるプラズマブラスト分化が減弱していることが明らかになった。よって、Tetは、T細胞依存的液性免疫応答において、プラズマ細胞分化に重要な役割を担っていることが示唆された。B細胞特異的Tet欠損マウスは、B細胞が起点となって自己反応性の劇症型炎症を呈する他に報告がないマウスモデルである。我々の研究結果から、本マウスモデルにおいて、いかに免疫細胞の異常活性化が引き起こされるのかについての細胞レベルのメカニズムが明らかになった。また、この炎症反応は、T-B相互作用が起点となっているが、その責任分子についても部分的に明らかとなっている。これらの知見に基づいて、さらに解析を進めることで、末梢B細胞の自己寛容についての新規分子機構が明らかになるものと考えられる。また、T細胞依存的免疫応答においても、Tetのプラズマブラスト分化における役割が示唆されており、TetのB細胞自己寛容、または、末梢分化における役割が着実に明らかにされている。これまでの解析で、Tet2、Tet3分子それぞれの欠損によって、免疫後のプラズマ細胞への分化が部分的に抑制されていることが明らかとなったため、Tet2、Tet3共欠損マウスを作製することによって、これら分子の機能重複について解析を行った。それぞれの単欠損に比べて、二重欠損条件下においては、ほぼ完全にプラズマ細胞の分化が抑制されていることが明らかとなった。また、胚中心B細胞分化についても同様に解析を実施したところ、やはり、二重欠損B細胞においては、分化抑制が認められた。一方で、Tet分子欠損によって細胞分裂が抑制されているわけではないことから、Tet分子は、B細胞の末梢リンパ組織における機能分化に重要な役割をになっていることが明らかとなった。さらに、これまでに、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損マウスにおいて、自己免疫性炎症症状の発症が明らかとなっており、その疾患症状の惹起には、T-B相互作用が必須であることが示唆されていた。このT-B相互作用が、抗原依存的であるかについて解析するため、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損条件下において、さらにB細胞特異的にMHC class II分子を欠損させたマウスを作製したところ、ほぼ完全に炎症症状は抑制された。また、B細胞もしくは、CD4T細胞の抗原受容体の特異性ををそれぞれ、自己抗原と関係のないHEL、もしくはOVAに固定したところ、やはり同様に、自己免疫性炎症の抑制が認められた。したがって、B細胞特異的Tet2、Tet3共欠損マウスにおける自己免疫疾患惹起には、なんらかのセルフ抗原、ネオセフル抗原を介したT-B相互作用が必須であることが明らかとなった。我々の実験結果から、Tetは、B細胞のホメオスターシス、自己寛容の維持に必須な役割を担っているようである。当初の計画では、B細胞の末梢分化に焦点を当て、その機能を解析する予定であった。これまでの実験結果を考慮すると、予備実験で得られたデータは、Tet欠損による二次的効果によるものである可能性も示唆される。
胃・腸管系新規プロテアーゼの系統的検索,生理的意義・構造機能相関の解析

2.十二指腸cDNAライブラリー(ラット)よりエンテロペプチダーゼcDNAを単離,クローン化し、その全一次構造を塩基配列より推定し、三本鎖構造を明らかにした。3.大脳膜分画(ブタ)よりプロガストリン(88-101)ペプチドを選択的に分解する新規な膜結合性金属プロテアーゼを単離,精製し、分子的,酵素的諸性状を明らかにした。4.肝臓ミクロソーム(ラット)の膜結合性セリンプロテアーゼのペプチド鎖構成および部分アミノ酸配列を明らかにし、これが従来cDNAレベルから存在が予想されていたヘプシンと同一酵素であることを初めて証明した。5.胃粘膜(カメおよびマグロ)よりペプシノーゲンを単離,精製し、諸性状を検索するとともに、マグロの主成分の全一次構造を蛋白化学的手法で明らかにした。6.正常の血清(ヒト)中のα_2マクログロブリンが有意量のトリプシン様セリンプロテアーゼを含むことを明らかにし、生理活性ペプチド等の分解に関与する可能性を示唆した。7.膵臓(ブタ)トリプシンおよびα-キモトリプシンの特異性のpH依存性を検索し,高アルカリ性(pH13)において、トリプシンはArg-X結合を,α-キモトリプシンはPhe-X結合を選択的に切断することを示した。8.上記研究と関連して、卵胞液フォリプシンおよびプロリルエンドペプチダーゼ(ブタ),Aspergillusniger酸性プロテアーゼB,シグナルペプチダーゼ(E.coli)およびブロメラインインヒビターについて関連研究を行った。1.ブタ胃幽門部粘膜より新規のエンドペプチダーゼを単離,精製し諸性質を検索した。本酵素は分子量約37,000のセリンプロテアーゼであり,種々のペプチドへの作用特異性を調べたところ,VIP(Vasoactive Intesfinal Polypeptide)をかなり特異的に分解するユニークな作用を有し,Ghi-Met結合を主に切断することが判明した。活性発現に界面活性剤の存在を必要とすることから膜結合性のプロテアーゼであると考えられる。本酵素はまたβ-アミロイドペプチドのGln-Lys結合にもかなりよく作用することが知られたが,その特異性の発現には基質ペプチドのP_1部位のみならず,周辺の二次構造も関係することが推定された.2.ブタ胃幽門部粘膜のミクロソーム分画よりトリプシン(膵)と同様な性質を持つエンドペプチダーゼを単離,精製し,gastric trypsinと命名した。本酵素は酵素的にも構造的にもほとんど膵トリプシンと区別し難い性質を持つが,膜結合性を持つ点で異なっている.トリプシンが細胞内で見つかった最初の例であり,細胞内トリプシンとしての新しい機能が推定された.3.ラットのエンテロペプチダーゼcDNAをクローニングし,その塩基配列を決定し,1058アミノ酸残基からなるプロエンテロペプチダーゼの全一次構造を推定した。この結果,プロ酵素は,プロセンシングより,ブタエンテロペプチダーゼについて本研究者が明らかにした結果と同様,ミニ鎖,軽鎖,重鎖の三本鎖構造となることが推定された。またmRNAの組織分布の検索から小腸において特異的に発現されていることが示された.上記研究と関連して,大腸菌シグナルペプチダーゼの発現と部位特異的変異と化学修飾法によるFrp300の活性発現における重要性の証明,ブタ卵巣セリプロテアーゼFollipsinの基質特異性の検索,クロコウジカビプロクターゼBのcDNAクローニング,プロクターゼBの熱高性解析,ブロメラインインヒビターの一次構造および^1H-NMRによる二次構造の解析などを行った。1.ブタ胃幽門部粘膜より精製したVIP特異的分解プロテアーゼおよび細胞内トリプシンについて、さらに詳しい分子的、酵素的性質の検索を行った。2.上記研究との関連において、ブタ大脳膜分画よりプロガストリン(88-101)ペプチドを選択的に分解する新規な膜結合性金属プロテアーゼを見出し、精製と性状検索を行った。

本酵素は分子量約76,000で、プロガストリンペプチドのほか、BAM-12Pおよびブラジキニンをかなり時異的に分解することが判明した。最適pHは6.5で、活性発現に0.001%以上の界面活性剤の存在を必要とした。本酵素は神経ペプチドやペプチドホルモンの前駆体のプロセシングに関与している可能性がある。3.ラット肝臓ミクロソームの膜結合性セリンプロテアーゼの精製法を改良し、そのペプチド鎖構成および部分アミノ酸配列の検索を行い、これが従来cDNAレベルから存在が予想されていたが正常組織からは単離されていなかったヘプシンと同一物であることを始めて証明した。4.本研究に関連する研究として、カメ(Triorix sinensis)およびマグロ(Thunnus thynuus orientalis)の胃粘膜よりペプシノーゲンを精製し、諸性状を検索した。カメペプシノーゲンは9個のイソ型に分離し、一部は糖を含んでいた。1個のイソ型のcDNAを単離し、分析したところ、構造的にはA型ペプシノーゲンに属することが判明した。一方、マグロペプシノーゲンについては、主成分についてタンパク化学的手法により全一次構造を決定し、37残基のプロ配列と323残基のペプシン部分からなることを示した。一次構造的にはA型ペプシノーゲンに近く、サブサイト域を中心に特徴的な配列を持つことが明らかになった。5.正常のヒト血清中のα2マクログロブリンが有意の量のトリプシン類似セリンプロテアーゼを含むことを明らかにし、その基質特異性が従来既知のトリプシン型プロテアーゼとは異なることを示した。この結果は、この酵素が血中において生理活性ペプチドの分解に関与する可能性を示唆している。6.ブタ卵胞液よりプロリルエンドペプチダーゼを精製し、性状を肝酵素と比較、検索した。7.高アルカリ性(pH12.8)において、トリプシンはArg-X結合のみを、またαキモトリプシンはPhe-X結合を選択的に切断することを示した。
日本語学習活動を核とした移住労働者の社会的統合―ベトナム人技能実習生を事例に

本研究では、日本の企業や地域社会で実施されている日本語学習活動を、外国人技能実習生をめぐる課題の解決策のひとつとして位置づけ、その意義を明らかにしようとした。得られた主な知見は、以下の通りである。第1に、企業が日本語学習や帰国後就労の支援に尽力している場合、日本での就労経験に対する技能実習生の満足度は高い。第2に、帰国後、日本で修得した技能や日本語能力を活用して再就職できた元技能実習生の場合、来日前よりも職業的地位が上昇する傾向にある。一方、経験と能力に見合った就職先のない人も多い。第3に、過疎化が進む中山間地域で、地域住民と積極的に関わった技能実習生は、日本語の能力を高める傾向がある。本研究の目的は、日本の企業や地域社会で実施されている日本語学習活動を、国境を越えて移住してきた短期滞在の外国人労働者、とりわけ外国人技能実習生をめぐる課題の解決策のひとつとして位置づけ、その意義と活動の成立条件を明らかにすることにある。そのために、ベトナム人技能実習生(以下、「技能実習生」)を事例として取り上げ、技能実習生の就労先企業や居住地域のほか、ベトナム社会における調査を実施する。初年度である平成27年度は、技能実習生に関連する先行研究の検討とベトナム社会に関する資料の収集を行いつつ、調査の基本的枠組みの構築を図った。これをふまえて、技能実習生の就労状況や企業の海外進出動向を把握するため、岡山県内で技能実習生を受け入れている企業、および岡山県内の企業の海外事業展開支援を実施している岡山県産業労働部に対するインタビュー調査を実施した。これに加えて、ベトナムを3回訪問した。現地では、1ベトナムに帰国した元技能実習生を対象とする生活構造についてのインタビュー調査、2ベトナム・ダナンの日本語学校および高校における海外就労や職業観についての質問紙調査、3ベトナム・フエ近郊の農村および漁村における生活動向についてのインタビュー調査を実施した。以上の調査研究の結果、近年、技能実習生の就労領域はますます拡大しており、地方中小都市や中山間地域でも技能実習生が増加する傾向にあることが明らかとなった。また、グローバル化が進展するなか、ベトナムと日本の経済的社会的関係はますます強化されつつあり、こうした動向を背景に、ベトナム人の日本に対する関心や日本語習得意向が急激に高まっていることが示唆された。さらに、ベトナムの農家や漁家が、グローバルに流通する作物であるゴム・アカシアの栽培やエビの養殖に従事することによって、経済的状況が大幅に向上していることも明確となった。平成27年度は、先行研究や関連資料をふまえた技能実習生制度の再検討のほか、技能実習生の就労先企業やベトナムにおける予備的調査の実施を当初から計画しており、これらをほぼ予定通り遂行することができた。まず、日本での調査について述べると、技能実習生の就労先企業では、技能実習生受け入れの経緯や職場における技能実習生と日本人従業員の関係に関するデータを収集した。また、岡山県産業労働部マーケティング推進室では、海外事業展開の支援状況や今後取り組むべき課題などについて詳しい情報を得ることができた。また、ベトナムでの調査については、駄田井の勤務先である岡山大学がフエ大学と大学間交流協定を締結しているため、調査の実施に必要な多くの支援を受けることができた。それによって、現地の農村や漁村に関する基礎データの収集と農家や漁家の個票作成が可能となった。さらに、二階堂の知人を介して、元技能実習生や現地の日本語学校関係者に対する調査を行うことができた。これらの調査から得た情報や人脈は、次年度における本調査実施のための土台となりうるものであり、現時点において、本研究はほぼ順調に進行しているといえる。2年目となる平成28年度は、技能実習生の就労状況や日本語能力の習得に関わる活動の現状、企業の技能実習生受け入れをめぐる方針や取り組みの状況、および技能実習生受け入れに関わる自治体の対応などについて、幅広くデータを収集することに努めた。具体的には、静岡県浜松市における技能実習生受け入れ機関、企業、日本語教室を開催している市民ボランティア団体、および浜松国際交流協会に対する調査、岡山県美作市における企業、技能実習生との交流活動を進めている市民ボランティア団体、および美作市役所に対する調査を行ったほか、愛媛県内や宮城県内においても技能実習生受け入れ機関や企業を対象とするインタビュー調査を実施した。これに加えて、ベトナムを2回訪問した。現地では、1ベトナムに帰国した元技能実習生を対象とする生活構造についてのインタビュー調査、2ベトナム・フエ大学における海外就労や職業観についての質問紙調査、3ベトナム・フエおよびバンメトートにおける海産物や農産物の生産状況や日本との関連に関するインタビュー調査などを実施した。以上の調査をふまえると、技能実習生の帰国後を見据えた技術指導や日本語学習支援の仕組みを、企業、受け入れ機関、市民団体、行政が協働して整備することが喫緊の課題である。現行の外国人技能実習制度において、こうした視点は希薄であり、そうした仕組みづくりの実現に向けた条件の索出が求められる。平成28年度は、上記した通り、国内における調査とベトナムにおける調査を実施した。これらは、当初から計画していたものに加えて、データ収集の過程で新たな調査が必要であると判断して行われたものである。

まず、日本での調査について述べると、静岡県浜松市では、調査への協力者に恵まれ、日本語教室の実施状況やその意義などについて検討することができた。また、岡山県美作市では、企業のほか、自治体が技能実習生の受け入れや技能実習生と地域住民の交流事業に積極的に取り組んでいることが明らかとなり、中山間地域における技能実習生の受け入れに関して、多くの示唆を得ることができた。また、ベトナムでの調査については、駄田井の勤務先である岡山大学がフエ大学と大学間交流協定を締結しているため、調査の実施に必要な多くの支援を受けることができた。それによって、現地の漁村に関する基礎データの収集と、フエ大学の学生に対する質問紙調査の実施が可能となった。さらに、バンメトートにおいて、帰国した元技能実習生が就労する農業法人に対する調査を行ったことにより、農業を介したベトナムと日本の連携および農業技術移転を通した国際貢献の可能性について、検討する機会に恵まれた。以上から、本研究はほぼ順調に進行しているといえる。本研究の目的は、日本の企業や地域社会で実施されている日本語学習活動を、国境を越えて移住してきた短期滞在の外国人労働者、とりわけ外国人技能実習生をめぐる課題の解決策のひとつとして位置づけ、その意義と活動の成立条件を明らかにすることにある。そのために、ベトナム人技能実習生(以下、「技能実習生」)を事例に、技能実習生の就労先企業やベトナムにおける調査を実施した。最終年度の平成29年度は、前年度に続き、技能実習生の就労状況や日本語能力の習得に関わる活動の現状、および企業の技能実習生受け入れに向けた取り組みについて調査したほか、とりわけ技能実習生受け入れに関わる自治体の対応について、データ収集に力を入れた。具体的には、岡山県赤磐市における技能実習生受け入れ企業、岡山県の美作市役所と総社市役所、島根県庁および同県出雲市、広島県安芸高田市役所を対象とするインタビュー調査を実施した。また、技能実習生のほか、ベトナム人介護福祉士の受け入れを進める岡山県総社市の福祉施設においても、技能実習生の受け入れに向けた今後の展望について聴き取り調査を行った。これに加えて、ベトナムを2回訪問した。現地では、1ベトナム・フエにおける海産物や農産物の生産状況と村落の変容に関するインタビュー調査、2ベトナム・ホーチミン近郊で環境保全型農業の実践と日本向け農産物加工品の製造を行っている日系企業におけるフィールドワークを実施した。以上の調査から、企業が技能実習生の日本語学習支援や帰国後就労支援に尽力している場合、日本での就労経験に対する技能実習生の満足度は高く、技能実習生と企業関係者の間に信頼関係が築かれる傾向にあることが示唆された。また、ベトナムでは安全・安心な農水産物の需要が高まるとともに、持続可能な農漁業の展開が推進されており、有機農法の技術指導を通じた国際貢献の可能性があることも知見として得られた。
非線形反応拡散方程式による直線状界面の解析

この研究は放物型で二変数の反応拡散方程式を詳しく調べることで二相問題の境界面現象を解明しようとしたものです。方程式としては化学や生物学に現れる活性因子と抑制因子の混合系を対象とし、界面の形としてはもっとも単純な直線状のものを考えます。従来の研究で界面が不安定である場合に、界面の厚さをあたえる方程式の微小パラメーターと最不安定波長との関係があたえられてきました。ここで最不安定波長とは、不安定な界面に外部から微小摂動が加えられたときに現れる特徴的な波長をいいます。この研究では方程式への微小パラメーターの入り方を変えることという工夫をすることにより、次の事実が新たな知見として得られました。1.直線状界面の安定性の判定条件は方程式の微小パラメーターと本質的に独立にあたえられ得ることがわかった。2.1の工夫のもとで界面の不安定である場合の最不安定波長もこの微小パラメーターと独立にあたえられることがわかった。すなわち、界面の安定性というものは、界面の厚さ(または、それをあたえる方程式の微小パラメーター)と独立に定義できるものであることをすくなくとも直線状界面に関しては確かめたといえます。これにより、厚さゼロの境界面を扱うには方程式はどうあるべきかについて一つの示唆が得られました。
「大望遠鏡の観測装置」国際会議にかかわる総合研究

「大望遠鏡の観測装置」国際会議は、計画どおり別途経費により、平成6年10月4-6日に早稲田大学井深ホールにおいて、海外から53名、国内から83名の合計136名の参加を得て開催され、70件の口頭発表と12件のポスター発表が行われた。本総合研究では、この国際会議に向けて、我が国がハワイに建設中の8m大型光学赤外線望遠鏡に装着すべく観測装置とそれらによる観測的研究の内容を集中的に検討してきた。その結果、会議開催時までに(1)赤外線分光撮像装置(IRCS)と(2)OH夜光除去分光器(OHS)の2種類については科学目的及び基本設計についての評価が固まり、製作に進む決定を行った。上記国際会議での他国の大望遠鏡装置についての発表・討議や、我が国の検討発表に対するコメントを参考にして、会議終了後にも集中的検討を行った結果、さらに(3)微光天体分光撮像装置(FOCAS)、(4)中間赤外撮像分光装置(COMICS)、(5)高分散分光器(HDS)、(6)赤外恒星コロナグラフ(CIAO)、及び(7)主焦点広写野カメラ(PWC)の5種類の採用が決定された。本研究班を中心に検討してきたこれら7機種のうち、国際会議において最も関心を呼んだのはPWCで、今後の開発製作に大きな期待が寄せられた。またIRCSについては、種々検討の結果、ハワイ大学天文研究所と我が国の共同開発によって製作するという方針が決定された。これによって、1998/9年に予想されている「すばる」望遠鏡初期立ち上げ時に向けて装置開発製作の大綱が決定されたことになり、本研究の目標は達成された。
新技術を駆使した領域特異的なDNAメチル化の可塑性制御メカニズムの解明

dCas9をGfap遺伝子プロモーターに結合させる数種のコンストラクトを成熟神経幹細胞に導入したところ、dCas9の結合が転写開始点に近づくほど遺伝子発現が低下することが明らかとなった。以上の結果から、enChIP法をエピジェネティクス修飾誘導因子の探索に用いる場合、転写開始点近傍に結合するタンパク質の探索には不向きであることがわかった。しかし、本研究課題の中で、enChIP法が非常に高い領域特異性をもっていることも得られたことから、標的とする領域がプロモーター領域外や転写開始点から離れた領域である場合においては、結合タンパク質群の探索に十分に有効であることが示唆できた。個体を形成する多様な細胞種は、分化・産生の過程でそれぞれ異なるDNAメチル化状態を獲得する。DNAメチル化は転写抑制作用を有しており、各遺伝子プロモーター領域に細胞種特有のメチル化状態が形成されることで、独自の遺伝子発現パターンが形成される。DNAメチル化状態が遺伝子ごとに制御されることを考えると、DNAメチル化状態を領域特異的に制御するメカニズムが必要であると考えられるが、その分子メカニズムには未だ不明な点が多い。申請者はこれまでに、神経幹細胞のアストロサイトへの分化制御機構解明に向けた研究の中で、アストロサイト特異的遺伝子Gfapのプロモーター領域特異的にDNA脱メチル化を誘導する転写因子を同定したが、領域特異的メチル化制御の全体像を知るためには単一因子の解析では不十分である。しかし、数多く存在するDNA結合因子の中から領域特異性を制御する因子を同定するのは非常に困難であり、領域特異性を制御する因子を同定するためには、候補因子を網羅的に選出する方法の確立が必要であると考えた。そこで、近年開発された標的領域に結合している因子を網羅的に同定する手法(Fujita T et al,BBRC,2013)を応用し、エピジェネティクス修飾因子の領域特異性を制御する因子を探索しようと考えた。平成27年度の研究では、この解析に必要なコンストラクトの作製を行った。また、ES細胞を用いて、特定遺伝子のDNAメチル化が解除され、また元のコンディションに戻すとそのメチル化も回復される系を確立した。系の確立と、必要コンストラクトの作製が行えたため。胚性幹細胞が始原神経幹細胞へと分化していく際にDNAメチル化が誘導される遺伝子としてNanog, Oct4を同定し、始原神経幹細胞が成熟神経幹細胞へと変化してく際にDNAの脱メチル化が誘導される遺伝子としてGfap、S100bを同定した。次に、enChIPの有効性を調べるために、これらの遺伝子うちGfapに絞りdCas9をプロモーター領域へと結合させるコンストラクトを作成し、原始神経幹細胞へと導入後、DNAメチル化への影響を検討した。その結果、dCas9の結合によるDNAメチル化状態への影響は観察されなかった。Gfapの発現は原始神経幹細胞においては非常に低く、成熟神経幹細胞へと変化した際に開始される。dCas9の結合による遺伝子発現への影響を検討するために、dCas9をGfapプロモーターに結合させるコンストラクトを成熟神経幹細胞に導入し、遺伝子発現への影響を調べた結果、dCas9の結合により遺伝子発現が著しく低下することが明らかとなった。そこで次に、dCas9が結合するプロモーター領域内の位置を変え、dCas9の結合による遺伝子発現への影響が最小となる条件の探索を行った。その結果、dCas9の結合が転写開始点に近づくほど遺伝子発現が低下することが明らかとなった。しかしながら、本研究課題の中で、enChIP法が非常に高い領域特異性をもっていることも得られたことから、標的とする領域がプロモーター領域外や転写開始点から離れた領域である場合においては、結合タンパク質群の探索に十分に有効であることが示唆できた。1.領域特異的にDNAメチル化酵素の作用を阻害する因子の探索:Groundstateの胚性幹細胞を血清含有培地で3日間培養し、Nanog、Oct4のプロモーター領域を標的とするsgRNAをそれぞれ、dCas9と共に導入することでenChIP法により各遺伝子プロモーター領域に結合したタンパク質群を回収し、これらのタンパク質群を網羅的に同定する。2.領域特異的にDNAメチル化修飾を誘導する因子の探索:神経系への分化過程でNanog、Oct4のプロモーター領域特異的にメチル化修飾を誘導する因子の探索を行う。3.領域特異的にDNA脱メチル化を誘導する因子の探索:神経幹細胞は、発生が進行する、あるいは継代を重ねることでアストロサイトへの分化能を獲得した成熟神経幹細胞へと変化する。

申請者らは、この性質変化にアストロサイト特異的遺伝子のDNAメチル化が重要な役割を担っており、アストロサイトへの分化能獲得の際にアストロサイト特異的遺伝子(Gfap及びS100β)のプロモーター領域が脱メチル化されることを報告している。この現象を利用して、領域特異的にDNA脱メチル化を誘導する因子の探索を行う。4.各遺伝子プロモーター領域に特異的に結合する因子の選出:1ー3の検討により明らかとなった各遺伝子プロモーターに結合する因子群を比較し、それぞれの分化段階で、各遺伝子プロモーター領域特異的に結合している因子群を抽出する。5.領域特異的にDNAメチル化状態の変化を誘導する因子の同定:4の解析により選出された因子の中から、領域特異的にDNAメチル化状態の変化を誘導する因子を同定するために、領域特異的に結合していた因子の機能欠損を誘導する。これによるDNAメチル化状態の変化を調べ、機能欠損により着目した領域のDNAメチル化変化が失われる因子の探索を行う。神経科学実験計画に若干の遅れが生じたため。作製したコンストラクトのシークエンスの決定に使用する。