hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
早期発症側彎症のモデルD4ST1欠損型エーラスダンロス症候群の臨床的・基礎的検討

当院通院中のDDEDS患者における脊椎病変の包括的調査を行った。対象は、受診歴のある11家系12患者(男性5人、女性7人、平均年齢13.4歳)で、全脊椎X線を含めた脊椎画像検査により、脊柱変形の程度・継時的変化などについて調査を行った。また、脊椎矯正術を行った1例に関して骨組織の精査を行った。結果、12例中8例(66.7%)に側弯を認めた。そのうち45°を超えるような側弯は1例のみであった。また12例中5例(41.7%)に胸腰椎以降部における後弯を認め、12例中3例で50°以上の高度胸腰椎移行部後弯を認めた。胸腰椎移行部高度後弯を認めた全例で胸椎前弯を認めた。自然経過では、成人後に後弯角20°未満であったが、その後後弯が増強した症例があった。頚椎についての検討では、12例中6例(50.0%)で頚椎後弯を認めた。20°以上の胸腰椎移行部後弯を認めた全例で頚椎後弯を認めた。12例中2例(16.7%)に環軸椎亜脱臼を認めた。12例中10例(83.3%)に頚椎の椎体縦長変形を認めた。手術検体において、骨組織のHE染色上明らかな異常を認めなかった。骨形態計測上、腸骨基準値で見た場合、骨量関連や類骨関連、吸収関連のパラメータは低値であり、椎骨の骨代謝はlowturnover傾向であることが示唆された。本研究は、mcEDS-CHST14の脊椎病変に関する世界初のシリーズであり、ヒトの椎体形成および脊椎カーブの維持においてデルマタン硫酸が重要な役割を果たしていることが示された。以上の成果を日本整形外科学会、日本人類遺伝学会等で報告を行い、論文作成し公表した。また、手術症例の一例について、二期的手術を行うことで良好な成績が得られたため中部整形災害外科学会において症例報告を行った。臨床結果について日本整形外科学会、日本脊椎脊髄病学会、中部整形災害外科学会で発表を行った。論文がAmerican journal of medical genetics part Aに採用され公表された。学会での研究結果の発表を行い、広く公表する予定。手術献体が確保できれば、骨形態等の評価をさらに進め病態解明を目指す。本研究はD4ST1欠損に基づくエーラスダンロス症候群の患者のQOL/ADLを低下させる最も重要な症状である脊柱後側弯症に関する臨床的・基礎的研究からなる。臨床的研究として、国内外症例の大規模調査に基づき本症における脊椎病変の自然歴・診療指針を構築すること、基礎的研究として患者及びノックアウトマウスの病理学的・生化学的検討からその発症機序を探索することが目的である。本年度は臨床的研究として、信州大学医学部附属病院に受診歴のある国内患者9家系10人の脊椎病変を解析し、症例のまとめをおこなうことができた。6人(60%)に10°以上の側彎が、同じく6人(60%)に10°以上の後彎が認められた。2人が胸腰椎移行部の重度後彎により外科的治療を要した。5人(50%)に頸椎後彎が、2人(20%)に環軸椎亜脱臼が、そして、8人(80%)に頸椎変形が認められた。以上、本症候群における脊椎病変の特徴及び頻度、自然歴の一端を明らかにした。また基礎的研究として、ノックアウトマウスサンプリングの作出状況を確認しながら、骨格CT、骨病理など骨格所見を収集する準備を行った。また本疾患患者に対して後方矯正固定手術を2期的に行った。手術時に骨組織、筋組織をはじめとした検体を採取し、生化学、病理学的に解析可能なように処理・保存を行った。今後病理組織学的な評価を行い、本疾患における脊柱変形発症にかかわる組織を確認する準備ができた。信州大学医学部附属病院に受診歴のある国内患者9家系10人の脊椎病変を解析し、6人に10°以上の側彎が、同じく6人に10°以上の後彎が認められた。5人に頸椎後彎が、2人に環軸椎亜脱臼が、そして、8人に頸椎変形が認められた。以上、本症候群における脊椎病変の特徴、自然歴の一端を明らかにした。また、ノックアウトマウスサンプリングの作出状況を確認しながら、骨格CT、骨病理など骨格所見を収集する準備を行った。本疾患に対する後方矯正固定術を実施し、骨組織を含めた検体を採取することができた。今後病理的に解析できるよう処理を行い保存した。患者の脊椎病変解析を継続し、得られたエビデンスを国際誌に発信すること、ノックアウトマウスが安定的に作出されるようになった段階で、ノックアウトマウスの脊椎病変に関する放射線学的、病理学的検討を行うことであった。患者の脊椎病変は論文作成中であり、ノックアウトマウスの骨格所見収集の準備を行ってきたことから、達成状況はおおむね順調といえる。

対象は、受診歴のある11家系12患者(男性5人、女性7人、平均年齢13.4歳)で、全脊椎X線を含めた脊椎画像検査により、脊柱変形の程度・継時的変化などについて調査を行った。また、脊椎矯正術を行った1例に関して骨組織の精査を行った。結果、12例中8例(66.7%)に側弯を認めた。そのうち45°を超えるような側弯は1例のみであった。また12例中5例(41.7%)に胸腰椎以降部における後弯を認め、12例中3例で50°以上の高度胸腰椎移行部後弯を認めた。胸腰椎移行部高度後弯を認めた全例で胸椎前弯を認めた。自然経過では、成人後に後弯角20°未満であったが、その後後弯が増強した症例があった。頚椎についての検討では、12例中6例(50.0%)で頚椎後弯を認めた。20°以上の胸腰椎移行部後弯を認めた全例で頚椎後弯を認めた。12例中2例(16.7%)に環軸椎亜脱臼を認めた。12例中10例(83.3%)に頚椎の椎体縦長変形を認めた。手術検体において、骨組織のHE染色上明らかな異常を認めなかった。骨形態計測上、腸骨基準値で見た場合、骨量関連や類骨関連、吸収関連のパラメータは低値であり、椎骨の骨代謝はlowturnover傾向であることが示唆された。本研究は、mcEDS-CHST14の脊椎病変に関する世界初のシリーズであり、ヒトの椎体形成および脊椎カーブの維持においてデルマタン硫酸が重要な役割を果たしていることが示された。以上の成果を日本側弯症学会、日本人類遺伝学会等で報告を行い、現在論文投稿中である。患者の脊椎病変及び骨組織をまとめ論文投稿中の段階となっているため。当院通院中のDDEDS患者における脊椎病変の包括的調査を行った。以上の成果を日本整形外科学会、日本人類遺伝学会等で報告を行い、論文作成し公表した。また、手術症例の一例について、二期的手術を行うことで良好な成績が得られたため中部整形災害外科学会において症例報告を行った。臨床結果について日本整形外科学会、日本脊椎脊髄病学会、中部整形災害外科学会で発表を行った。
乾癬皮膚におけるGlis及びWntについての研究

1.皮膚疾患におけるGlis1の発現前年度作成した抗体を用いて正常皮膚、尋常性乾癬、有棘細胞癌、基底細胞癌などにおけるGlis1の発現を検討した。尋常性乾癬の表皮の顆粒層付近ではGlis1の発現はみられたが、正常皮膚の表皮では発現はみられなかった。基底細胞癌では発現がみられなかったが、有棘細胞癌の一部では発現がみられた。Western Blotでは、同じ抗体を用いて、TPA添加による培養皮膚角化細胞のGlis1発現が増強することが確認できた。2.Glis1ノックアウトマウスを用いた解析当初予想していたようなTPA塗布による表皮の反応性についてはGlis1ノックアウトマウスとWild typeのマウスとに異なる点はなかった。次に、創傷治癒に関して、Glis1ノックアウトマウスとWild typeのマウスとについて検討し、Glis1ノックアウトマウスにおいて創傷治癒の遅延が起こっている可能性が示唆された。昨年、Glis1高発現細胞を用いてcDNA microarrayを行った結果より、NotchリガンドがあるJagged1がGlis1の発現と関連がある可能性が明らかになり、尋常性乾癬の皮膚等でJagged1の発現を解析した。さらに、Jagged1の発現を、培養表皮角化細胞、三次元培養皮膚、ヒトの正常あるいは疾患の皮膚などで確認し、Glis1の発現との関連性について検討した。4.Glis1タンパクの細胞内動態抗Glis1抗体を用いた実験によって、今までのTagに対する抗体を用いたGlis1の細胞内分布とは異なった結果が得られ、細胞内に分布するnativeのGlis1タンパクの動態と人工的に発現させたGlis1タンパクとの相違が明らかになった。1.Glis1の発現を皮膚疾患で確認する。Glis1の皮膚での発現を明らかにするためにGlis1のC末端領域を大腸菌にて合成し、そのタンパクを用いて抗Glis1ポリクローナル抗体を作成した。得られた抗体はwestern blot及びimmunocytochemistryにおいてケラチノサイトあるいはCHO細胞に高発現させたGlis1を認識した。また、免疫組織化学によって、尋常性乾癬を含めたいくつかの皮膚疾患で発現していることが確認できた。今後、免疫組織化学では、サンプルの数と種類を増やし、疾患特異性を確認する予定である。Glis1高発現細胞を用いた実験からケラチノサイトの分化にGlis1が関与することが明らかになった。現在、in vivoにおけるGlis1の機能を確認するために、Glis1ノックアウトマウスの皮膚を用いてGlis1の機能を解析予定である。3.Glis1の標的遺伝子を同定する。Glis1高発現細胞とコントロールの細胞をcDNA microarrayで比較し、いくつかの遺伝子の発現の違いを見いだした。Northern Blotにて発現の違いを確認中である。さらにタンパクレベルで確認できた遺伝子については、Glis1の高発現している乾癬の表皮においても発現が誘導されているかどうかを確認する予定である。4.乾癬皮膚で高発現、あるいは発現が低下しているWntを同定する。乾癬皮膚から抽出したRNAからcDNAを合成し、degenerate primerを用いたRT-PCRを用いて、特定のWntが減少していることを明らかにした。タンパクレベルでの確認を検討中である。
小胞体膜タンパクの樹状突起とスパインでの挙動

これまでに培養海馬神経細胞の樹状突起で1型IP3受容体に特異的なアクチン骨格依存的な側方拡散制御を見いだした。IP3受容体がシナプス可塑性に重要な働きをしている小脳プルキンエ細胞のスパインでもこの様な機構が働いていれば、アクチン骨格を介して活動依存的にIP3受容体の側方拡散の度合いを変化させ、スパインにIP3受容体を止めおくことによリスパイン内部のCa2+放出活性を調節し、ひいてはシナプス可塑性を制御している可能性がある。これを検討するためにプルキンエ細胞樹状突起に蛍光タンパクを融合した小胞体膜タンパクを遺伝子銃を用い発現させ、二光子励起顕微鏡を用い蛍光退色回復(FRAP)法により、小胞体膜タンパクの移動速度を解析した。プルキンエ細胞樹状突起でのIP3受容体各タイプとSERCAタンパクの拡散速度を測定した。内在性の1型IP3受容体の影響を避けるため、3型IP3受容体の拡散速度の計測のためには1型IP3受容体ノックアウトマウスを用いた。IP3受容体の拡散速度はSRCAより遅く、やはリアクチン骨格依存的であったが、海馬とは異なり1型と3型のIP3受容体の間の差はなかった。この結果は、IP3受容体は樹状突起幹部と同様に、アクチン骨格依存的な側方拡散制御機構があるが海馬神経細胞とは異なる機構によることを示唆する(投稿準備中)。次にスパインと樹状突起間でのIP3受容体とSERCAタンパクの移動速度を検討した。そのために異なる蛍光波長の蛍光タンパクをそれぞれのER膜タンパクに融合した遺伝子を同時に小脳切片中のプルキンエ細胞に発現させ、両者のスパインと樹状突起間での拡散速度の差を検討した。その結果、IP3受容体はスパインでもSERCAより拡散速度が遅いことが明らかとなった(投稿準備中)。更に、この拡散速度の差に活動依存性があることが明らかになりつつある。スパイン内部でのアクチン骨格再構成に伴いIP3受容体のスパインへの動員に変化が起これば、スパイン内部でのCa^<2+>放出活性の増減に直接影響し、ひいてはシナプス可塑性を制御する可能性がある。これを検討するために脳切片中の樹状突起に蛍光タンパクを融合した小胞体膜タンパクを遺伝子銃を用い発現させ、二光子励起顕微鏡を用い蛍光退色回復(FRAP)法により、スパインと樹状突起間の小胞体膜タンパクの移動速度を解析している。スパインでもIP3受容体とSERCAポンプタンパクの移動速度にやはり差がありそうな結果を得つっあり、現在更に検討を加えている。IP3受容体欠損マウスのプルキンエ細胞樹状突起の形態の観察から、IP3受容体の機能がプルキンエ細胞樹状突起の形態形成に大きく関与していることを明らかにした(Hisatsune et al.)。種々の実験結果から、興味深いことにプルキンエ細胞樹状突起の形態形成に関与しているのは、顆粒細胞川に発現している1型IP3受容体であることが判明した。顆粒細胞のIP3受容体の活性により、顆粒細胞からのBDNF放出が制御されており、BDNFがプルキンエ細胞の形態を決定づけていた。I型IP3受容体はシナプス後部のプルキンエ細胞のみならず、シナプス前部の顆粒細胞でも重要な機能を担っていることが明らかになった。また、IP3受容体のIP3結合部分と蛍光タンパクのFRETを基にしたIP3指示薬を新規に開発した(Matsu-ura et al。)。神経細胞樹状突起内でのIP3動態の測定には非常に興味が持たれており、強力なツールとして用いることが出来る。
実体モデルを用いた手術シミュレーションのためのシステム構築

3D実体モデルを用いた手術シミュレーションを約50例に対して行った。内訳は、脳腫瘍摘出術約20例、脳動脈瘤クリッピング術約20例、その他(微小血管減圧術、先天性疾患など)10例であった。いずれも臨床上、術野の解剖を理解する上で有用であった。シミュレーションは、(1)従来のモデルと、それに対応する(2)手術操作に直接関与しないものをあえて省略したモデルおよび(3)観察できない部分を見ることができるモデルを用意して行った。並行して、上記(1)(2)(3)モデルの評価を行った。具体的には、使用者から以下の点を聞き取り記録した。術野の解剖(構造)の理解のしやすさ、操作性、人体とモデルの質感の異同、シミュレーションと実際の手術の異同、総合的な有用性、改良すべき点、などである。臨床上の有用性は上記(3)(2)(1)の順に高い評価が得られた。また、若手医師の手術トレーニングに用い、脳圧排、くも膜剥離などの項目ごとに習熟度(所要時間、操作の的確さ、など)を評価し、経時的変化を分析した。上級医の指導の下操作を繰り返すことにより、習熟度は向上した。また、認知心理実験として、モデルとモニター上の3D画像を観察した際の立体認知度の違いを計測した。さらに、神経生理実験として、(1)負荷なしおよび(2)指定された解剖学的構造を指し示すtask中のNIRS(Near-InfraRed Spectroscopy)測定を行った。これらに関しては、有意な結果が得られなかった。ここまでの成果は、後記の論文・学会にて発表した。3D実体モデルを用いた手術シミュレーションを約40例に対して行った。内訳は、脳腫瘍摘出術約20例、脳動脈瘤クリッピング術約10例、微小血管減圧術4例、先天性疾患4例などであった。シミュレーションは、(1)従来のモデルと、それに対応する(2)手術操作に直接関与しない構造をあえて省略したモデルおよび(3)観察できない部分を見ることができるモデルを用意して行った。また、若手医師の手術トレーニングに用い、脳圧排、くも膜剥離などの項目ごとに習熟度を評価し、経時的変化を分析した。この結果は、Journal of Surgical Educationに発表した(印刷中)。認知心理実験(モニター上の3D画像と、それに対応する実態モデルを複数個用意し、両者の異同を判別する実験)の準備として、モデル作製の過程で作成されるモニター上の3D画像を編集しており、約10例分を完了した。また、実験に用いる上記以外のtaskの候補を挙げ、最終的に用いるtaskを選択しつつ、実験に用いる装置のテストを行っている。さらに、神経生理の予備実験として、(1)負荷なしおよび(2)指定された解剖学的構造を指し示すtask中のNIRS(Near-InfraRed Spectroscopy)測定を行った。従来の方法によるモデル作製は実績があるので問題なく進捗している。本研究では、比較検討のために同一症例に対して複数のモデルを作製している。したがって、症例当たりの作製時間はやや長時間を費やしている。現行モデルの評価は以前より行っているので、同様の方法で大きな問題はなく進捗している。心理実験および神経生理学実験は機器およびモデル等の準備と予備実験の段階であるが、問題なく進行している。今後予定通りの実験が行える見通しがついた。また、モデルの材質改良のための調査を行っている。特に、軟質素材の開発を行っている業者に試作品を用意してもらい、改良のためのディスカッションを10回程度行った。【実体モデルの観察とモニター上の画像の観察との間での認知特性に違いに関する認知心理実験】認知心理実験に用いる脳動脈瘤モデルおよび統制実験用の意味のない立体モデルを合わせて約100体作製して、追加の予備実験を行った。その結果をもとに実際の実験に用いるモデルを選出した。【実体モデルの観察とモニター上の画像の観察との間での脳機能特性に違いに関する光トポグラフィー装置(NIRS)による脳活動計測】優位側頭頂葉後頭用(角回近傍)の活性が実体モデルの方が強いとの仮説を立てて研究を開始したが,違いが予測したほど明瞭でなかった。このため、まずは活性化に差が出そうな部位を網羅的に検知することにした。また、有効な分析を行うべく、主成分分析の手法についての検討を行った。【現行の実体モデルによる手術シミュレーションと臨床的評価】実体モデルを約30例、40体作製して脳血管障害・脳腫瘍などの手術シミュレーションおよびトレーニングを行うとともに評価を行った。評価項目を追加し、最終的に差が出やすい項目への絞り込みを行った。【新たなモデルの作製と神経生理学的評価による現行モデルに比した優位性の検証】複数の新規モデルを作製した。特に、寒天・ゼラチン混合ゲルを用いた新たな手法での脳腫瘍モデル作製に成功した。【研究結果の発表および平成30年度の見通し】ここまでの成果は平静29年度に別記の論文・学会にて発表した。以上の結果、予定の症例数が集まれば有意な結果が導き出せる見通しがついた。

モデル作製と臨床応用は問題なく進捗している。心理実験と神経生理学実験は、機器の不調等により十分な数のデータが蓄積できていない。3D実体モデルを用いた手術シミュレーションを約50例に対して行った。内訳は、脳腫瘍摘出術約20例、脳動脈瘤クリッピング術約20例、その他(微小血管減圧術、先天性疾患など)10例であった。いずれも臨床上、術野の解剖を理解する上で有用であった。シミュレーションは、(1)従来のモデルと、それに対応する(2)手術操作に直接関与しないものをあえて省略したモデルおよび(3)観察できない部分を見ることができるモデルを用意して行った。並行して、上記(1)(2)(3)モデルの評価を行った。具体的には、使用者から以下の点を聞き取り記録した。術野の解剖(構造)の理解のしやすさ、操作性、人体とモデルの質感の異同、シミュレーションと実際の手術の異同、総合的な有用性、改良すべき点、などである。臨床上の有用性は上記(3)(2)(1)の順に高い評価が得られた。また、若手医師の手術トレーニングに用い、脳圧排、くも膜剥離などの項目ごとに習熟度(所要時間、操作の的確さ、など)を評価し、経時的変化を分析した。上級医の指導の下操作を繰り返すことにより、習熟度は向上した。また、認知心理実験として、モデルとモニター上の3D画像を観察した際の立体認知度の違いを計測した。さらに、神経生理実験として、(1)負荷なしおよび(2)指定された解剖学的構造を指し示すtask中のNIRS(Near-InfraRed Spectroscopy)測定を行った。これらに関しては、有意な結果が得られなかった。ここまでの成果は、後記の論文・学会にて発表した。現行モデルの評価を集計し、共通の改良点を決定する。その結果をもとに、平成29年度は、現行モデルと改良モデルの両者を用いた手術シミュレーションを行う。心理実験および神経生理学実験を計画に従い本格的に行う。すでに予備実験では予想された結果を得たので、客観的なデータを出すべく、症例数を増やす予定である。研究計画の変更はない。また、解決すべき新たな課題もない。計画通り研究を推進する方針である。データ集積に努めるとともに、データ不十分な場合も想定して解析方法を再検討する。機器の一部が未購入のため。また、消耗品の年度内必要量が予定よりも少なかったため。当初予定していたレーザースキャナーの性能につき再検討した結果、他機種のほうがより有用である可能性があると判断した。その結果、機種選定に時間がかかりいまだ購入していない。また、立体モデル作製の効率が上がったため、消耗品の消費量が当初の計画を下回った。以上の残金については、平成30年度にはレーザースキャナー購入および消耗品の購入に充てる計画である。特に後者は改良立体モデルを複数作製する必要があることから、計画をうわあ割る可能性が高いと見込まれる。次年度に使用する。具体的には、3Dスキャナー購入および3Dモデルの材料購入など。
分子動力学法によるガラス構造とフッ化物イオン伝導のシュミレーション

オキシフルオロシリケートガラス(CaF_2-CaO-SiO_2)についてX線光電子分光法および^<29>Si MAS-NMR分光法をあわせてガラス網目骨格構造とフッ化物イオンの化学状態を明らかにし、さらに分子動力学的にフッ化物イオンの自己拡散係数を求め、ガラス組成および構造との関連を明らかにした。CaF_2-CaO-SiO_2系ガラス及びCaF_2結晶のFls光電子スペクトルを測定した結果、FlsXPSピーク位置はSi-F結合で存在していると考えられるSiO_2+Fガラスでは687.1eVにみられ、CaF_2結晶では684.3eVに見られた。CaF_2-CaO-SiO_2系ガラスではそれより低エネルギー側の683.6eVに見られた。ガラス中のフッ素の化学状態は、これまでSi-F結合とCa-F結合の二種類が存在すると報告されてきたが、ほとんどがCaF_2結晶中のCa-F結合状態で存在している。^<29>Si MAS-NMRスペクトルにおいてガウス関数によりSiO_4四面体の重合度の異なる構造単位Q_n(n :架橋酸素数)に帰属されるピークを分離し、それぞれのピーク面積百分率を求めた。構造単位Q_2の割合がCaF_2の含有量の増加にともなって僅かに増加するが網目骨格はほとんどQ_2で構成されている。ガラス網目骨格はフッ化物イオンによって直接修飾されておらず、Q_2から構成される網目骨格の間隙にフッ化物イオンとカルシウムイオンから構成されるCaF_2クラスターが存在していると考えられる。このCaF_2クラスターの存在は粒子間相互作用に、Gilbert-Ida-Busing型二体ポテンシャルを用いた分子動力学計算によって得られた構造モデルにおいても支持された。オキシフルオロシリケートガラスにおいては、CaF_2含有率がCaF_2クラスターの連結性と可動イオン数を支配しており、CaO/SiO_2比に支配される網目骨格の連結性を低めればCaF_2クラスターの連結性が高まり、フッ化物イオンの自己拡散係数が増加することを示唆した。一方、網目骨格の局所構造はCaO/SiO_2比に支配されていることを明らかにした。
大腸癌の高温・化学・照射療法に関する臨床的および実験的研究

直腸癌の術後再発形式は局所再発が50%以上を占め、手術成績の向上のためには局所再発の防止が重要である。このため従来より術前あるいは術後の放射線療法や化学療法を加えた併用療法が施行されているが、われわれは、これらに相乗効果があるとされる温熱療法を併用し、術前高温・化学・照射療法(Hyperthermo elemcrodiotherapy,HCR療法)として、食道癌において良好な成績を得ている。そこで本治療法を直腸癌にも臨床応用し、現在までに36例に施行した。X線学的治療効果において64%の症例に有効な治療効果を得、さらに病理組織学的には、約70%の症例に中等度以上の奏効を得ている。また現在までに術前HCR療法を施行した症例において、術後局所再発を認めていない。次に、直腸癌組織の術前生検材料を用い、SDI法を応用した温熱感受性試験を施行した。直腸癌においては、温熱+放射線照射併用群で有意に高い治療効果を得た.さらに臨床効果での相関をみると約80%の症例に温熱感受性試験と治療効果の間に相関が認められた。臨床的には研究開始より現在までに直腸癌症例27例に対し、術前高温・化学・照射療法を施行し、局所的には大変良い結果を得ている。治療スケジュールは、術前2週間にわたり温熱療法は4回、放射線療法は合計30Gy、化学療法は当初は5-FUの静注、現在はHCFUの経口投与を併用し、治療終了710月後に切除手術を施行するものである。温熱療法は内腔温熱治療装置(Endoradiotherm 100A)を用い、内腔電極を使用することにより、radiofrequency波で加温することより行った。1回の温熱療法は腫瘍表面温度で4245°C、3040分加温を目標としている。放射線照射は外照射で、線質はリニアック(6MV X-ray)で、1.5Gy/Fr朝・夕2回/日、週10回で総量20回30Gyにて行った。現在までに解析し得た17例について、特に組織学的にその効果をみると、53%の症例で著効が得られていた。特に全く癌細胞が消失していた例が3例みられ、今後に期待を抱かせた。また壁在リンパ節転移巣が完全に消失した例も経験しており、直腸癌切除後の局所再発防止の可能性が一般と現実的になったと考える。臨床的に大きな副作用は経験しておらず、2例に軽度の白血球減少をみたのみであり、低位前方切除施行例でも縫合不全は経験していない。以上の結果は「Dis. Colon Rectum」誌と「外科治療」誌に近々発表される予定である。しかし、その一方でいくつかの問題点が明らかとなった。1つは術前治療効果が腫瘍発育先進部で不安定な事、2つめは実際に加温する際、アプリケーターの不十分な装着により加温が十分でない症例のみられることである。次年度はこれらの点を中心に更に研究をすすめたい。一方、実験的には腹腔内リンパ節モデルの作成は手技上の問題が解決されておらず、今後は動物の種を変える等の処置が必要と思われる。臨床的には現在までに直腸癌症例32例に対し、術前高温・化学・照射療法を施行し、局所内には大変良い結果を得ている。治療スケジュ-ルは、術前2週間にわたり温熱療法は4回、放射線療法は合計30Gy、化学療法はHCFUの経口投与を併用し、治療終了710月後に切除手術を施行するものである。放射線照射は外照射で、線質はリニアック(6MV Xーray)で、1.5Gy/Fr朝・夕2回/日、週10回で総量20回30Gyにて行った。現在までに解析し得た22例について、特に組織学的にその効果をみると、50%の症例で著効が得られていた。特に全く癌細胞が消失していた例が6例みられ、今後に期待を抱かせた。

また壁在リンパ節転移巣が完全に消失した例も経験しており、直腸癌切除後の局所再発防止の可能性が一段と現実的になったと考える。臨床的に大きな副作用は経験しておらず、2例に軽度の白血球減少をみたのみであり、低位前方切除施行例でも縫合不全は経験していない。以上の結果は「Dis.Colon Rectum」誌と「外科治療」誌に発表済みである。この術前治療の有効性を施行前に予想できれば、臨床的に更に一段前進した治療が行えると考えられる。そこで、生検で採取した癌細胞に対し、in vitroのクエン酸脱水素酵素抑制試験を、熱(43°C)と放射線に対し行い、実際の臨床成績との相関をみることを開始している。このpreliminary studyについては、Dis.Colon Rectum誌に投稿中である。直腸癌の術後再発形式は局所再発が50%以上を占め、手術成績の向上のためには局所再発の防止が重要である。このため従来より術前あるいは術後の放射線療法や化学療法を加えた併用療法が施行されているが、われわれは、これらに相乗効果があるとされる温熱療法を併用し、術前高温・化学・照射療法(Hyperthermoenemcradiotherapy,HCR療法)として、食道癌において良好な成績を得ている。そこで本治療法を直腸癌にも臨床応用し,現在までに36例に施行した。X線学的治療効果において64%の症例に有効な治療効果を得、さらに病理組織学的には、約70%の症例に中等度以上の奏効を得ている。また現在までに術前HCR療法を施行した症例において、術後局所再発を認めていない。次に、直腸癌組織の術前生検材料を用い、SDI法を応用した温熱感受性試験を施行した。直腸癌においては、温熱+放射線照射併用群で有意に高い治療効果を得た。さらに臨床効果での相関をみると約80%の症例に温熱感受性試験と治療効果の間に相関が認められた。
放射線教育のためのプラスチック板を用いた可視化計測技術の検討と利用

プラスチック板を用いた放射線教育方法を提案し,小学・中学・高校生向けの出前授業および一般向けの公開講座を行い,教育効果の検討を行った。霧箱には劣るがプラスチック板を用いた実験も受講者の興味を引くことができたことから,放射線への関心を高める教材として効果が期待できることがわかった。また,プラスチックは穴が開くという現象を観測することができるので放射線の危険性やエネルギー性に対する高い学習効果が期待できることがわかった。現在の放射線教育に最も利用されている実験装置は霧箱であるが,霧箱は実験前にドライアイスの事前準備が必要である点や装置が不安定である等の欠点もある。そのため,教育現場で利用するには測定原理が単純かつ安定的に放射線の可視化が可能であり,また放射線の危険性が実感できるような装置が望ましい。そこで本研究では,可視化原理が安定しているプラスチック板を用いた可視化計測技術に注目した。平成24年度には,授業時間内での実験を考慮してプラスチック板のエッチング条件の検討を行ったところ1単位時間(50分)以内に顕微鏡で観測できる大きさのエッチピットを形成するには,95 °Cの30 % KOH水溶液で3040分エッチングすれば十分であることがわかった。また,光学顕微鏡よりも安価な計測機器として小型のモバイル顕微鏡およびスキャナを提案し,十分に放射線計測が可能であることを確認した。毒物及び劇物取締法の規制対象外濃度である5 %KOH水溶液でエッチングを行ってもエッチピット直径は小さいが観測することは可能であることがわかった。平成25年度には,このプラスチック板を用いた放射線可視化計測方法の教育実践として小学・中学・高校生向けの出前授業および一般向けの公開講座を計8回行い,受講者217人,アンケート回答者118人を得た。このアンケートにより教育効果の検討を行った。プラスチックを用いた実験は霧箱と同様に可視化を行うことができるので興味を引きやすかったのではないかと思われる。現在の放射線教育に最も利用されている実験装置としては,霧箱(ドライアイスを用いて放射線を可視化する装置)がある。しかし霧箱は実験前にドライアイスの事前準備が必要である点や装置が不安定(容器内温度とエタノールの過飽和の管理が必要)である等の欠点もある。またこの方法は放射線によってプラスチックに穴があくという目に見える物理的現象を観測するので放射線の力(エネルギー性),危険性といった放射線の性質についても学習が可能である。しかし,この方法を教育現場で利用するには「計測するまでに時間を要する」,「計測に高価な顕微鏡を用いる」,「劇物である化学薬品が必要である」という問題点を検討する必要がある。本研究では上記3つの問題点を解決する方法を提案し,実験時間,装置価格,安全性の面で検討を行った。1単位時間(50分)以内に顕微鏡で観測できる大きさのエッチピットを形成するには,95 °Cの30 % KOH水溶液で40分エッチングすれば十分である。光学顕微鏡よりも安価な計測機器として小型のモバイル顕微鏡およびスキャナを提案し,十分に放射線計測が可能であることを確認した。しかし,実験効率を考えれば30 % KOH水溶液を使う方が妥当である。今後はこの方法を用いて,大気中の環境放射線(222Rnなど)を測定する教育実践を試み,その効果を検討する予定である。プラスチックを用いた教育方法の構築については概ね完了しており,あとは小中学校などで教育実践を試み,その効果を検討する段階に入っている。1件ではあるが既に小学校での教育実践も行っており,成果が得られている。その他,学会発表にて優秀ポスター賞を受賞,理科教材コンテストに応募し敢闘賞を受賞するなどの社会・国民に研究成果の発信も行っており,順調に成果が得られている。本研究代表者の所属している舞鶴高専は,全国の高専の中でも原子力発電所に2番目に近い高専であり,現在稼働中の原子力発電所からは1番近い高専である。そのため,本校学生および近隣住民の原子力・放射線に対する意識も高い。平成25年度からは,プラスチックを用いた放射線教育の実践を舞鶴高専近郊の小中学校を対象に行う。さらには岐阜高専などの4高専と連携予定があり,各高専に試料や教育方法を提供するともに,各地でもプラスチックを用いた放射線教育の施行を行う予定である。

測定対象の放射線は,放射性物質サンプル(ユークセン石,マントル等)あるいは大気中の環境放射線(222Rnなど)を利用する。特に環境放射線を測定する事は教育的効果が高い。環境放射線を測定する場合は,事前にプラスチックを測定したい場所(例えばグラウンドなど)に1週間放置しておき,回収後に化学エッチングして教育実験を行う。最終的には,提案した放射線教育方法の効果について評価し,その有用性と問題点について学会発表や研究論文として発表を行なう。さらには,より高度な高専生向けの実験(ラザフォード後方散乱の観測実験)などの応用についても検討する。該当なし
蛋白質の翻訳後修飾と細胞内シグナル伝達に関連した因子の構造基盤

蛋白質の翻訳後修飾は,細胞内シグナル伝達や細胞機能の制御において重要な役割を果たしている.本研究では,まず,炎症反応にかかわるシグナル伝達因子cGAMPの産生酵素cGASの構造解析を行い,そのDNA結合特異的な活性化の構造的メカニズムを解明した.また,われわれはNF-κB経路におけるシグナル伝達の制御にかかわる因子A20の亜鉛フィンガーモチーフと直鎖状ユビキチンとの複合体の構造を解明し,その制御メカニズムを明らかにした.そして,TBF-βシグナル経路にかかわるdnHLH蛋白質HHMの結晶構造解析を行い,その自己阻害型構造を明らかにした.蛋白質の翻訳後修飾は,細胞内シグナル伝達や細胞機能の制御において重要な役割を果たしている.本研究では,まず,炎症反応にかかわるシグナル伝達因子cGAMPの産生酵素cGASの構造解析を行い,そのDNA結合特異的な活性化の構造的メカニズムを解明した.また,われわれはNF-κB経路におけるシグナル伝達の制御にかかわる因子A20の亜鉛フィンガーモチーフと直鎖状ユビキチンとの複合体の構造を解明し,その制御メカニズムを明らかにした.そして,TBF-βシグナル経路にかかわるdnHLH蛋白質HHMの結晶構造解析を行い,その自己阻害型構造を明らかにした.細胞内シグナル伝達ネットワークは,蛋白質のさまざまな翻訳後修飾によって制御されている.そして近年の研究により,これら様々な翻訳後修飾は,癌,心血管疾患,神経変性疾患,自己免疫疾患から感染症に至るまでの,多くの病因・病態に関与していることが分かってきた.特に,これらのシグナル伝達ネットワークを理解するためには,その構築基盤となっている因子の相互作用を立体構造情報に基づいて解明することが必須である.本計画ではそのような分野の中から,特に重要であると考えられるターゲット,HTLV-Tax蛋白質,TRAF6,などのNF-kB経路,MAPK経路等に関わる因子の構造解析を,計画班間との共同研究により遂行する.また,当研究室で進行中のプロジェクト(転写制御因子HHM等)も推進する.現在,HHMに関しては単独の構造解析が完了している.HHMは2つのヘリックスバンドルがV字型に配向した新規の構造を取ることが明らかになった.HLHモチーフを持つ領域は,このV字構造の内側に埋め込まれるように存在しており,従来解明されているDNA結合複合体のHLHモチーフとは全く異なった構造を取っていた.明らかになったHHM単独の構造はHHMと転写因子の非特異的な会合を防ぐ自己阻害状態であり,本来のターゲット転写因子が存在するときのみHLH領域が露出して,そのDNA転写活性を阻害するというモデルを提唱した.現在,仮説を検証するためのin vitro, vivoでの機能解析実験が進行中である.HTLV-Tax蛋白質に関しては,従来発現自体が困難であったが,真核細胞の系を用いて大量発現に成功し,さらに,NF-kB経路の因子であるNEMOと複合体を作ることを検証した.今後,他の因子も含め,複合体の構造解析を目指す.細胞内シグナル伝達ネットワークは,蛋白質のさまざまな翻訳後修飾によって制御されている.そして近年の研究により,これら様々な翻訳後修飾は,癌,心血管疾患,神経変性疾患,自己免疫疾患から感染症に至るまでの,多くの病因・病態に関与していることが分かってきた.特に,これらのシグナル伝達ネットワークを理解するためには,その構築基盤となっている因子の相互作用を立体構造情報に基づいて解明することが必須である.本計画ではそのような分野の中から,特に重要であると考えられるターゲット,HTLV-Tax蛋白質,TRAF6,などのNF-kB経路,MAPK経路等に関わる因子の構造解析を,計画班間との共同研究により遂行する.また,当研究室で進行中のプロジェクト(転写制御因子HHM等)も推進する.現在,HHMに関しては単独の構造解析が完了している.HHMは2つのヘリックスバンドルがV字型に配向した新規の構造を取ることが明らかになった.HLHモチーフを持つ領域は,このV字構造の内側に埋め込まれるように存在しており,従来解明されているDNA結合複合体のHLHモチーフとは全く異なった構造を取っていた.明らかになったHHM単独の構造はHHMと転写因子の非特異的な会合を防ぐ自己阻害状態であり,本来のターゲット転写因子が存在するときのみHLH領域が露出して,そのDNA転写活性を阻害するというモデルを提唱した.現在,仮説を検証するためのin vitro,vivoでの機能解析実験が進行中である.HTLV-Tax蛋白質に関しては,従来発現自体が困難であったが,真核細胞の系を用いて大量発現に成功し,さらに,NF-kB経路の因子であるNEMOと複合体を作ることを検証した.今後,他の因子も含め,複合体の構造解析を目指す.細胞内シグナル伝達ネットワークは,蛋白質のさまざまな翻訳後修飾によって制御されている.そして近年の研究により,これら様々な翻訳後修飾は,癌,心血管疾患,神経変性疾患,自己免疫疾患から感染症に至るまでの,多くの病因・病態に関与していることが分かってきた.特に,これらのシグナル伝達ネットワークを理解するためには,その構築基盤となっている因子の相互作用を立体構造情報に基づいて解明することが必須である.cGASはそのような修飾シグナルに関わる因子の一つであり,ウイルス由来のDNAを認識することで活性化し,ATPとGTPからcyclic GMP-AMPを産生する酵素である.cyclic GMP-AMPはSTINGに結合し,下流へとシグナルを伝えることでI型インターフェロンの産生を促す.

このようにcGASはウイルス感染の初期に応答して,宿主の免疫系を活性化する重要な酵素であるにも関わらず,どのようにcGASがウイルスDNAを認識しているかについては不明であった.そこで本研究ではX線結晶構造解析の手法を用いてcGASの立体構造を決定し,cGASによるDNA認識機構を原子分解能レベルで解明した.さらに,解明した構造に基づいた生化学的,細胞生物学的解析を行うことで,cGASはジンクフィンガー,および,正電荷の溝を介してウイルスDNAを認識し,cyclic GMP-AMPを産生することで免疫を活性化することが明らかとなった.脱ユビキチン化酵素A20がC末端のzincfinger 7(ZF7)を介して直鎖状ポリユビキチンに結合することでNF-κB活性化を抑制することを,生化学的な解析,および,細胞生物学的な解析により明らかにした.A20 ZF7-直鎖状ユビキチン複合体のX線結晶構造を決定し,その直鎖状ジユビキチン認識機構を明らかにした.構造情報に基づいて機能解析を行い,A20がZF7を介して直鎖状ポリユビキチンと結合しTNF受容体へと集積することでNF-κB経路を制御するという新たな分子機構を明らかにした.さらに,本研究の結果から,A20 ZF7と直鎖状ポリユビキチンとのあいだの結合の不全はB細胞リンパ腫惹起と関連することが示された.細胞内シグナル伝達ネットワークは,蛋白質のさまざまな翻訳後修飾によって制御されている.そして近年の研究により,これら様々な翻訳後修飾は,癌,心血管疾患,神経変性疾患,自己免疫疾患から感染症に至るまでの,多くの病因・病態に関与していることが分かってきた.特に,これらのシグナル伝達ネットワークを理解するためには,その構築基盤となっている因子の相互作用を立体構造情報に基づいて解明することが必須である.cGASはそのような修飾シグナルに関わる因子の一つであり,ウイルス由来のDNAを認識することで活性化し,ATPとGTPからcyclic GMP-AMPを産生する酵素である.cyclic GMP-AMPはSTINGに結合し,下流へとシグナルを伝えることでI型インターフェロンの産生を促す.このようにcGASはウイルス感染の初期に応答して,宿主の免疫系を活性化する重要な酵素であるにも関わらず,どのようにcGASがウイルスDNAを認識しているかについては不明であった.そこで本研究ではX線結晶構造解析の手法を用いてcGASの立体構造を決定し,cGASによるDNA認識機構を原子分解能レベルで解明した.さらに,解明した構造に基づいた生化学的,細胞生物学的解析を行うことで,cGASはジンクフィンガー,および,正電荷の溝を介してウイルスDNAを認識し,cyclic GMP-AMPを産生することで免疫を活性化することが明らかとなった.他に病原菌が有するcyclic GMP-AMP産生酵素DncVの立体構造解析も行い,ヒトcGASとの構造比較を行うことで,DncVとcGASの基質・産物特性のメカニズムを解明した.26年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。転写制御因子
慢性期の統合失調症患者における嚥下障害

非経口的栄養摂取を受けている患者の臨床特徴を調査した研究は殆どない。岡山県下の精神科病院18病院が参加した。1ヵ月以上継続して非経口的栄養摂取を受けている者は221人で、そのうち187人(女性130人・男性57人)につき詳細な調査を実施した。平均年齢は78.3歳で、平均継続期間は29.8ヵ月であった。84人(44.7%)が、非経口的栄養摂取を2年以上続けていた。病名はアルツハイマー型認知症が78人(41.7%)、統合失調症が37人(19.8%)などであった。統合失調症などの精神疾患の患者でも、継続的な非経口的栄養摂取を受けている患者が少なくないことを世界で初めて明らかにした。ほぼ、順調に研究を進めているが、当初の計画と比較すると僅かに遅れている面もある。平成25年度は、研究の実施について、まず実態調査に関する研究の実施について、岡山大学病院の倫理委員会に申請を行った。具体的な内容としては、実際の岡山県内の精神科病院に入院中で、経口的には殆ど或いは全く食事を取ることが出来ず、非経口的な栄養摂取で生命維持を行っている入院患者を対象として、その実態を明らかにする調査とした。大学病院の倫理委員会で承認を得た後に、岡山県下の精神科病院を訪問して、担当となる医師および事務担当者に実態調査の概要を説明し、各病院での研究実施を進めていただくこととした。各病院での調査実施に目途が付いた段階で、時期を統一して(平成26年2月中旬)実態調査を行った。調査は無事に終了し、現在データを入力して、解析に取り掛かろうとしている処である。また、上記の実態調査に加えて、家族調査も実施するために、研究内容を倫理委員会に申請し承認を得たが、より充実した調査を行うために、現在、修正申請を検討している。ほぼ、順調に研究を開始しているが、当初の計画と比較すると幾らか遅れている面もある。初年度は、まず今までの研究概要を把握するために文献調査を行った。慢性期の統合失調症でみられる嚥下障害について、抗精神病薬投与によるサブスタンスPの低下と嚥下障害との関連を指摘した研究がみられた。ただ、抗精神病薬を中止しても続く慢性的な嚥下障害が、サブスタンスPの低下のみによって引き起こされているとは考えにくかった。症例報告としては、遅発性ジスキネジアやラビット症候群による嚥下障害例が報告されていた。ただ、それらの例では抗精神病薬の変更や抗コリン薬の追加により嚥下障害は軽快しており、嚥下障害は一時的な症候に過ぎなかった。一方、胃瘻を造設したり、長期に経鼻栄養を続けなければならない病態については、今までの文献では殆ど言及されていなかった。また、統合失調症という疾患自体が嚥下障害を引き起こしている可能性も指摘されており、病態の機序については現時点では不明と言わざるを得ないことが判明した。さらに、平成25年度以降に実施する調査の準備として、まず、岡山大学病院の倫理委員会に研究申請を行う準備を行っている。同時に、岡山県および近県の精神科病院を対象として、本研究について、その概要を説明し、各病院の倫理委員会に、研究内容の詳細を記載した研究計画書を提出し、研究実施の申請を行う準備を進めている。また、非経口的な栄養摂取を行っている患者を持つ家族の思いを明らかにすることを目的として、家族の意向調査も実施する予定であり、その準備を進めている。家族調査は、世界的に見ても殆ど行われておらず、臨床的な意義は大きいと考えている。平成25年度から26年度初めにかけて、岡山県内の精神科病院を対象として、経口的に殆ど或いは全く食事を取ることが出来ず、非経口的な栄養摂取で生命維持を行っている入院患者の実態を明らかにする調査を行った。岡山県下にある20の精神科病院のうち、18病院から本研究への参加協力を得た。平成26年2月17日時点で、1ヶ月以上、非経口的な栄養摂取を継続している入院患者を調査の対象とした。岡山県下の精神科病院が有する病床数(内科病床を除く)は5235床であり、その内4658床(89.0%)を調査対象とすることが出来た。その時点での入院患者数は18病院を合わせて4,101人(男性2,007人・女性2,094人)であり、1ヵ月以上に亘って継続的に非経口的栄養摂取を受けている入院患者は221人(全入院患者の5.4%)であった。この221人のうち,187人(女性130人・男性57人)について詳細な調査が行われた。187人の平均年齢は78.3+-11.0歳であり、非経口的な栄養摂取の継続期間は、平均29.8+-31.0ヵ月(中央値は20ヵ月)であった。非経口的な栄養摂取の方法としては、胃瘻101人(54.0%)、経鼻胃管69人(36.9%)、TPN16人(8.6%)、腸瘻1人(0.5%)であった。身体拘束については、165人(88.2%)は「全く拘束なし」であったが、1日の半分以上拘束されている者も19人(10.2%)認められた。

褥瘡は「有り」が23人(12.3%)、「無し」が164人(87.7%)であった。MMSE得点を見ると、0点が135人(72.2%)と全体の2/3以上を占めていたが、15点以上の者も10人(5.3%)認められた。患者の臨床像は非常に多様であった。「非経口的な栄養摂取を持続的に受けている患者」と一口に云っても、状態像は様々であるため、画一的に述べることは避けるべきである。岡山県内の精神科病院を対象として、非経口的な栄養摂取で生命維持を行っている入院患者の実態調査を行った。岡山県下にある20の精神科病院のうち、18病院から参加協力を得た。平成26年2月17日時点で、1ヶ月以上、非経口的な栄養摂取を継続している入院患者を調査の対象とした。岡山県下の精神科病院が有する病床数(内科病床を除く)は5235床であり、その内4658床(89.0%)を調査対象とした。その時点での入院患者数は18病院を合わせて4,101人(男性2,007人・女性2,094人)であり、1ヵ月以上に亘って継続的に非経口的栄養摂取を受けている入院患者は221人(全入院患者の5.4%)であった。この221人のうち,187人(女性130人・男性57人)について詳細な調査が行われた。187人の平均年齢は78.3+-11.0歳であり、非経口的な栄養摂取の継続期間は、平均29.8+-31.0ヵ月(中央値は20ヵ月)であった。非経口的な栄養摂取の方法としては、胃瘻101人(54.0%)、経鼻胃管69人(36.9%)、中心静脈栄養16人(8.6%)、腸瘻1人(0.5%)であった。対象患者の病名は、アルツハイマー型認知症が78人(41.7%)と最多であり、脳血管性認知症も26名(13.9%)を占めていたが、統合失調症の患者も37人(19.8%)認められた。統合失調症で、長期に非経口的な栄養摂取を受けている患者が居ることを明らかにしたのは、本研究が世界で初めてである(Hirao et al., 2016)。また、MMSE得点を見ると、0点が135人(72.2%)と多数であったが、15点以上の者も10人(5.3%)認められた。患者の臨床像は非常に多彩であり、「非経口的な栄養摂取を持続的に受けている患者」を一纏めにして画一的に述べることは避けるべきである。非経口的栄養摂取を受けている患者の臨床特徴を調査した研究は殆どない。岡山県下の精神科病院18病院が参加した。1ヵ月以上継続して非経口的栄養摂取を受けている者は221人で、そのうち187人(女性130人・男性57人)につき詳細な調査を実施した。平均年齢は78.3歳で、平均継続期間は29.8ヵ月であった。84人(44.7%)が、非経口的栄養摂取を2年以上続けていた。病名はアルツハイマー型認知症が78人(41.7%)、統合失調症が37人(19.8%)などであった。統合失調症などの精神疾患の患者でも、継続的な非経口的栄養摂取を受けている患者が少なくないことを世界で初めて明らかにした。平成24年度は今までの研究状況を把握するために文献調査を行った。慢性期の統合失調症でみられる嚥下障害について、抗精神病薬投与によるサブスタンスPの低下と嚥下障害との関連が指摘されていた。しかし、胃瘻を造設したり、長期に経鼻栄養を続けなければならない病態については、今までの文献では殆ど言及されていないことが明らかとなった。平成25年度から26年度初めにかけて「研究実績の概要」欄に記載したように、岡山県下の精神科病院を対象として、詳細な実態調査(横断研究)を行った。県下に20ある精神科病院のうち18病院が参加しており、非常に網羅的な調査を実施することができた。
パキシリンアイソフォームを介する接着・運動シグナルの統御機構の解析

正常な上皮細胞や内皮細胞は、増殖に伴う細胞運動を繰り返し、最終的にはカドヘリン分子を介する細胞同士が密接に接着した斉一な単層を形成する。培養された繊維芽細胞や間充織細胞もまた、カドヘリン分子を発現しないが、同様な斉一単層形成能を示す。この斉一単層形成能は、臓器や組織の構築やその維持に必須である。細胞運動は主にインテグリンによる細胞の細胞外基質への接着により担われる。従って、上皮細胞や内皮細胞の斉一単層形成過程には、インテグリンによる運動性形質とカドヘリンによる静止的形質との相互作用が関与し、両者の活性がうまく制御される必要がある。この点を解明する為、我々は、上皮間充織形質転換系を実験系に用い、この転換に伴う主要な生化学的変化を調べた。その結果、インテグリン裏打ち蛋白質であるパキシリンとp130Casのチロシンリン酸化が顕著な生化学的変化であることを見い出した。さらに、これらのリン酸化の役割を解析し、両者とも細胞の運動活性制御に密接に関連すること、さらには、両者は見かけ上、互いに反対の作用を及ぼすことを明らかにした。p130Casは他の研究グループも盛んに研究しているので、我々はそのリン酸化を独自に見つけたパキシリンに関してさらに詳しく解析を進めた。その結果、まず、パキシリンは細胞質内にかなり大きなプールが存在すること、繊維芽細胞においては、このプールは見かけ上、ゴルジ装置構造と大きくオーバーラップするものである事、パキシリンの細胞内局在には低分子性GTP結合性蛋白質の一員であるARF蛋白質の活性が深く関与すること、さらに、パキシリンに結合能を示し、ARFに対してGAP(GTPase-activating activity protein)活性を持つ,ARFGAP蛋白質、もしくはそれらのcDNAを数種類単離同定した。従って、インテグリン裏打ち蛋白質の細胞内局在性とダイナミクスは、単なる自由拡散過程によって担われているものではなく、ARFやARFGAP活性が深く関与する細胞内プロセスが存在する事が示された。また、パキシリンのリン酸化は細胞運動においてアクチン骨格の再構成や運動極性決定に深く関与することを示唆する結果を得ており、現在、パキシリン結合性ARFGAPの生理的役割との関連も含め、解析を進めている。

この点を解明する為、我々は、上皮間充織形質転換系を実験系に用い、この転換に伴う主要な生化学的変化を明らかにし、さらに、その過程を人為的に変異させることにより、インテグリンによる運動性に異常をきたし、その結果、カドヘリンによる細胞同士の接着が正常に形成されないことを明らかにした。インテグリンとカドヘリンとの相互作用機構の解明は細胞生物学における積年の問題の一つであり、現在より詳しい分子レベルでの解析を行っている。また、繊維芽細胞や間充織細胞においては「細胞運動の接触阻止」という現象が知られている。このことにより、これらの細胞も培養した時に、斉一層を形成し、このことは同時に細胞のホメオスタシスを理解する上で重要な点である。この点にアプローチができると思われる実験系も構築でき、現在、同様に解析を進めている。細胞運動にはインテグリンを介する細胞と外界との接着が重要である。細胞体の前方向への移動に伴い、細胞前部にインテグリン接着点が新たに形成される。インテグリンはその裏打ちに多種の蛋白質を会合することにより機能する。従って、細胞運動におけるインテグリン接着点の形成に際し、インテグリン裏打ち蛋白質の会合機序やその会合を制御するダイナミクスの理解は、細胞運動性制御の理解の一側面として重要であると考えられる。我々は、インテグリン裏打ち蛋白質の細胞内局在性とダイナミクスに関する制御機構を明らかにする為、インテグリン裏打ち蛋白質の一つであるパキシリンを解析の基盤として以下の様な結果を得た。なお、パキシリンはインテグリンシグナル伝達において、蛋白質間相互作用を介してアダプター分子として機能し、また、インテグリンとは恒性的に会合しているのではなく、活性化されたインテグリンに会合している事が良く示されていた為、本目的に叶うものとして選択した。一連の解析の結果、パキシリンは細胞質内にかなり大きなプールが存在すること、繊維芽細胞においては、このプールは見かけ上、ゴルジ装置構造と大きくオーバーラップするものである事、パキシリンの細胞内局在には低分子性GTP結合性蛋白質の一員であるARF蛋白質の活性が深く関与すること、さらに、パキシリンに結合能を示し、ARFに対してGAP(GTPase-activating activity protein)活性を持つ蛋白質、もしくはそれらのcDNAを数種類単離同定した。従って、インテグリン裏打ち蛋白質の細胞内局在性とダイナミクスは、単なる自由拡散過程によって担われているものではなく、ARFやARFGAP活性が深く関与する細胞内プロセスが存在する事が示された。また、今回明らかにしたパキシリン結合性ARFGAP蛋白質は、アクチン細胞骨格構造や細胞運動性制御にも関与することを明らかにした。