hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中枢神経細胞におけるK^+チャネル密度と性質を調節する分子機構に関する研究

この結果はドーパミン欠損動物での結果と異なる。その原因として、ドーパミン欠損動物では、発生の初期からドーパミンが欠損していることが考えられる。また、発生の各段階でドーパミン受容体の発現が異なり、それによって、K^+電流に対するドーパミンの効果が異なることも考えられる。そこで、現在ドーパミン受容体サブタイプ特異的作用薬を用いた探索を行っている。関連した研究でドーパミンD4受容体の機能について知見(青崎敏彦博士のグループとの共同研究)が得られたので、論文にまとめた(研究発表)。神経細胞の発火パタンはその細胞の持っているイオンチャネルによって決定される。チャネルの機能を決定する因子はチャネルの密度と性質であるが、神経細胞はどのようにこれらの因子を調節して正常な機能を実現しているのかは明らかになっていない。本研究代表者らは、線条体コリン作動性ニューロンをモデルに、K+チャネルの密度と性質が発達過程において調節される機構について調べてきた。今回はコリン作動性ニューロンK+チャネルの再分類と機能について調べた。mRNAの発現パタンを知るために、単一細胞RT-PCR法を用いて調べた結果、すべてのコリン作動性細胞がKv1.1を、80%の細胞がKv1.2を、そして25%の細胞がKv2.1を発現することが分かった。また、kv3.1とKv3.2の発現が認められなかった。一方、線条体スライスにおいて、TEAの投与でコリン作動性ニューロンの発火パタンが変化し、遅延整流性電流がコリン作動性ニューロンの発火パタンに重要な働きをしていることが分かった。mRNAと電流の対応関係を調べるために、急性単離したコリンニューロンを用いて、電流を薬理学的に分類することを試みた。Kv1電流を阻害する薬品としてデンドロトキシンが知られているが、それをコリンニューロンに与えたところ、顕著な効果が認められなかった。しかし、一過性のA型電流を阻害する薬品として知られている4-APを低濃度で与えると、素早く活性化し、ゆっくり不活性化する電流が阻害された。この電流は海馬等のニューロンで見つかっていたD電流の性質によく似ている。TEAで阻害された電流はいわゆる古典的な遅延整流性電流であって、D電流に比べると、ゆっくり活性化し、ゆっくり不活性化した。このように、コリン作動性ニューロンに遅延整流性電流とA電流以外に、新たにD電流の存在が明らかになった。よって、A電流とKv4、D電流とKv1、遅延整流性電流とKv2と、それぞれ対応する可能性が示唆された。
冗長性を持つ高安全・高性能ロボットシステムの制御系設計

平成26年度の成果として、まずは冗長性を持つ多剛体系の新たな制御アルゴリズムにつき下記の冗長性解消法の検討が挙げられる。ロボットアームの制御の分野で、従来もっとも良く知られた冗長性解消法は2-ノルム最適化に基づくMoore-Penroseの擬似逆行列法であったが、その従来法の限界を克服する方法論として以下の3つの方法を提案し検討した。C. 2-norm最適化と∞-norm最適化の2つの方法を切替える方法:これは、特に二関節筋相当のアクチュエータを持つ2リンクのロボットハンドなどの生体機構と類似のハードウェア構成を持つアクチュエータ冗長性の解消法として有用である。本方法における制御入力の連続性も数学的に証明されている。その実験的検証は、現在後輩の大学院生に引き継いで継続して作業している。つぎに、新たな駆動機構の提案として、ヒトの構成に似たばね定数が可変なアームの駆動機構の実装方法を検討した。アクチュエータ数を節約しつつヒトのアームと似た可変ばね定数と二関節同時駆動の可能な力伝達の機構を設計しロボットアームに実装した。その設計どおりの性能が出ていることを実験を通じ確認し、その理論的背景、設計法とともに対外発表文献にまとめた。26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、当該特別研究員Dr. V. Salvucciが学位論文以来継続的に検討してきた、二関節筋と単関節筋を双方装備し駆動冗長性を持つアームの構造において先端力の方向制御を見通し良くし、大きさを最大化するアクチュエータの最適駆動パターンを、各種評価基準(ノルム)の最適化という視点から整理した。そして、人の構造と筋駆動の特長を、歩行などの動的作用に有効に活かす方法を理論的に議論した。そして、人の構造を越えた一般的なロボット多自由度アームシステムにおける静力学的計算および運動制御のケーススタディを数値計算を通じて、特別研究員の提案する∞ノルムに基づく冗長性解決方法の利点の定量化を行った。これらの成果を2013年3月にイタリアで開催されたメカトロニクスの国際会議発表し、また、以前から査読プロセスにかかっていた米国電気学会のメカトロニクスのソサイエティへの投稿論文が掲載決定となった。さらに、研究室所属の修士学生との議論を通じて、Bounded-Effort Pseudo-lnverse resolution (BEPI)という新たな冗長性解決方法を提案し、それらの理論的比較検討を進めつつある。平成25年度は平成24年度から持ち越したロボットアームの設計・製作を行った。2つの一関節筋相当の駆動機構および1つの二関節筋相当の駆動機構を、3つのモータとワイヤによる結合で実現するハードウェアを製作した。そして、研究者の提案する可変剛性を実現するアクチュエータを用いた形で、二関節筋を用いたロボットアームの駆動実験を行った。具体的には、二関節筋相当のアクチュエータの等価的な剛性を変化させることで、ロボットアームの挙動にどのような影響があるかを、解析し、その計算結果を実験的に検証した。さらにこれまで提案されてきたロボットアームの駆動冗長性の解消方法として、2ノルムに基づく方法、∞ノルムに基づく方法、CGIと呼ばれる方法の3つの長短を理論的に比較をした。そして、各々の長所の良い所取りをするような連続的なモード・スイッチ法を提案し、数学的解析によりその有用性を証明した。そして、上記の連続的なモード・スイッチ法の実装を上記のロボットアームに行い、製作したロボットアームに適用した。まずは準静的なゆっくりとした駆動で、基本的な狙いが満たされることを確認した。さらに、より高速な駆動を指向し、アームやモータの動的な挙動を計測、記録解析した。その際の電力の流れも解析した。これらの作業を通じて、研究者の提案する冗長性解消のための3つのモードを連続的に切り替える方法の実現可能性と実際的な有用性を確認した。当初計画と比べ、実験準備とそれに伴う物品購入が十分に進んでいない点で若干の遅延がある。

一方、理論的検討は順調に進み、さらに、大学院生との協力の中で、新たな研究計画策定時にはなかった新たな方法論も提案でき、その具体的検討を進め数ヶ月内の対外発表を目指した数値的評価の作業が進んでいるため。前年度の設計の遅延を、本年度前半に回復し、原理実証のためのロボットアーム試験装置を設計、組み立てして、駆動制御方法の種々の検証実験を、着実に進めることができている。また、その過程で冗長性の解消法として、複数の既提案の方法を連続的にわたるという新たなアイデアを数学的解析に基づいて提案し、その有用性、実現性を検証するという当初の予定になかった成果も得られている。それらの成果は7件の、国際会議論文として公開されている。以上の事実から、研究目的を達成すべく、現段階で概ね順調に進展していると判断できる。二年度目は、上述の初年度における検討で得られた理論的手法の数値的評価を継続的に進めると共に、その理論的準備の上に、当初計画から若干遅延の見られる、二足歩行ロボット試験機設計作業を行い、その製作作業に着手する。そして、エネルギー消費が小さく上体の上下及び前後加速度の脈動が小さい、受動歩行に準じた歩行制御を実装するとともに、筋冗長性の意味と複の数のノルム最適化に基づく駆動パターンの実装試験をお行う。それらの作業を通じて、人間らしく自然で、エネルギー効率と安定性の良い方向動作の実現、実験的検証を目指す。また、適宜その成果の国際学会などで公開にも努力する。今後は当初目標を意識いつつ、意識しつつ、ロボット・アーム試験装置の改良を行いながら、提案する二関節筋相当の駆動機構を持つロボットアームの制御系の冗長性解消法を含む設計法の検討と、その利点の実験的検証を、残り数ヶ月の期間に進めていく。
エンドセリンの細胞レベルでの作用機序と合成と分泌機構に関する研究

エンドセリン(ET)の細胞レベルでの作用機序を解明する目的で血管培養細胞を用いて,レセプタ-とその情報伝達系を検討し,ETー1の合成,分泌機構を解明するために,培養内皮および非内皮細胞を用いて検討した。またヒトの病態下でのETー1の動態をRIAによりETー1様免疫活性(LI)を測定した。血管平滑筋細胞にはETー1に特異的レセプタ-が存在し,フォスファテジ-ルイノシント-ル(PI)応答を促進して,細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させる結果,筋収縮が生じる。ETー1の活性発現には分子内の2個所のSーS結合ならびにC末端(特にTrp^<21>)の疎水性アシノ酸の存在が重要である。血管内皮細胞にはETー3に特異的レセプタ-が存在し,百日咳毒素感受性GTP結合蛋白と共役してPI応答が惹起され,細胞内Ca^<2+>が上昇する。ETー3は内皮由来弛緩因子(EDRF)の産生を促進する。以上のことからETー1は血管平滑筋に直接作用して収縮を,ETー3は内皮を介して弛緩を引き起こし,両者の相互作用によって血管のト-ヌスが制御されているものと考えられる。血管内皮細胞によるETー1の産生,分泌はアンギオテンシンやバゾプレッシンによって促進され,その細胞内情報伝達にはPI応答による細胞内Ca^<2+>とCキナ-ゼの活性化が重要な役割を果している。内皮細胞以外,腎糸球体メサンジウム細胞,尿細管細胞,癌上皮細胞でもETー1遺伝子の発現とその合成,分泌が認められる。このことはETー1が血管収縮因子としてのみならず,増殖因子としてパラクリンあるいはオ-トクリンの機能を果している可能性が考えられる。ヒト血中のETー1ーLIは種々の心血管糸疾患で上昇し,特に高血圧,血管変縮,血管障害の発症,進展機構に一部関与している可能性がある。またヒトの尿や随液中にもETー1ーLIが存在することから,腎や中枢神経系におけるETー1の生理的ならびに病態生理学的役割が注目される。エンドセリン-1(ET-1)は血管平滑筋細胞(VSμc)に特異的受容体が存在し、細胞内遊離Ca^<2+>濃度(〔Ca^<2+>〕i)を著増させる。そこで種々のET-1アナログを用いてVSμcでの受容体結合能と〔Ca^<2+>〕i反応を検討した結果、ET-1分子内に存在する2箇所のS-S結合およびN末端およびC末端の存在が作用発現に必要であることが明らかとなった。また蛇毒のサラフォトキシン(STX)SbbもET-1受容体へ結合し、〔Ca^<2+>〕iを上昇させるがその作用はET-1より弱かった。STXとET-1の構造類似性から、STXがET-1受容体へ直接結合するためと推定される。ET-1は血管収縮作用のみならず、VSμcのDNA合成を著明に促進する。ET-1は他の成長因子であるEGFと相乗的に作用するが、DNA促進作用はCa^<2+>拮抗剤によって完全に抑制された。

以上の事実からET-1は動脈硬化の血管障害発生に関与する増殖因子である可能性が示唆される。我々はET-1に特異的なradioimmuunoassay(RIA)を開発し、正常ヒト血中にET-1が存在するか否かを検討した結果、微量(1pg/ml)のET-1様免疫活性が検出された。したがってET-1は循環ホルモンとして生理的あるいは病態生理学的役割を担っている可能性が強い。ET-1は血管内皮細胞で合成、分泌されているが、我々は非内皮細胞である腎上皮細胞(LLCPK、MDCK)からもET-1が多量に合成、分泌されていることを見い出した。この事実はET-1が単に血圧調節のみならず、腎機能の調節にも関与する局所ホルモンである可能性を示唆する。エンドセリン(ETー)アイソペプチドのうちETー1およびETー3レセプタ-の性状とその情報伝達系を血管平滑筋細胞および内皮細胞を用いて検討した。ETー1の合成と分泌機構は血管内皮以外の種々の培養上皮細胞を用いて解析した。最後にヒトの血中でのETー1様免疫活性の変化を各種病態で測定し,同時に尿や髄液中での存在の有無も検索した。血管平滑筋にはETー1に特異的なレセプタ-が存在し,アフィニティラベリングで分子量が5万の単一蛋白であった。ETー1レセプタ-はETー2とは同じ親和性を示すが,ETー3やbigETー1とは僅かの結合を示すに過ぎない。ETー1レセプタ-はフォスファチジ-ルイノシト-ル(PI)代謝廻転を促進し,細胞内Ca^<2+>を上昇させて収縮を引き起こす。一方血管内皮にはETー3レセプタ-が存在し,ETー1との親和性は弱い。ETー3レセプタ-は百日咳毒素感受性GTP結合蛋白と共役して,PI応答を惹起し,細胞内Ca^<2+>を上昇させる。ETー3は内皮細胞でプロスタサイクリンや内皮由来弛緩因子(EDRF)の産生を促進する。以上の事実から,ETー1は平滑筋に直接作用して収縮を,ETー3は内皮を介して弛緩を引き起こし,両者は相互に血管ト-マスを調節しているものと考えられる。血管内皮以外,腎系球体メサンジウム細胞や尿細管細胞,上皮癌細胞などでETー1の遺伝子の発現とその産生と分泌が証明された。したがってETー1は血管作動因子としてよりも,多彩な細胞での増殖因子としてパラクリンあるいはオ-トクリンの機能を果している可能性が強い。最後にヒトの高血圧,慢性腎不全,血管炎,レイノ-症候群での血中ETー1は上昇しており,高血圧や血管障害の発症や進展機構におけるETー1の病態生理学的役割が考えられる。また血中以外に,尿中や髄液中にもETー1様免疫活性が存在し,特に腎炎では尿中ETー1排泄が増加していた。今後腎や脳におけるETー1の生理的役割の解明が待たれる。
交通事故発生要因の解明に向けた個別車両データに基づく走行軌跡推定に関する研究

本研究では車両感知器などによる交通データを用いて,高速道路上の交通状態の時空間変動を可能な限り記述・再現する方法論を開発し,それを用いて交通事故発生前後の交通状況を把握することを目的とする.具体的には,次の2課題について取り組んできた.1)広く普及しているループコイル式の車両感知器より得られる車両通過時のパルスデータを用いて,異なる2地点間を通過する車両をマッチングする手法を構築した.2)フィードバック法である拡張カルマン・フィルタと,マクロ交通シミュレーションであるブロック密度法を組み合わせることでフィードバック型交通状態推定手法を構築し,事故発生状況分析への適用性についても確認した.高速道路上に広く設置されている車両感知器は時間的には連続に交通状況を把握可能であるが,空間の面では感知器の設置個所の状況把握ができるのみであり,道路上のあらゆる場所で起きうる事故に対応した形で,交通状況を把握するためには,非観測部分を観測データおよびシミュレーション技法等で推測することが必要と考えられる.本研究では定常的に収集される車両感知器などによる交通データを用いて,高速道路上の交通状態の時空間変動を可能な限り記述・再現する方法論を開発し,それを用いて交通事故発生前後の交通状況を把握することを目的とする.具体的には,次の2課題について取り組む.1)広く普及しているループコイル式の車両感知器より得られる車両通過時のパルスデータを用いて,異なる2地点間を通過する車両をマッチングする手法を構築する.2)フィードバック法である拡張カルマン・フィルタと,マクロ交通シミュレーションであるブロック密度法を組み合わせることでフィードバック型交通状態推定手法を構築し,事故発生状況分析への適用性についても確認する.なお1)については,車両マッチングの結果,2地点間の旅行時間の計測が可能となるともに,マッチング精度が相当程度確保されれば,車両マッチングの失敗により,突発事象の発生を検知できる可能性がある.25年度はフィードバック法である拡張カルマン・フィルタとマクロ交通流シミュレーションモデルであるブロック密度法を組み合わせることでフィードバック型交通状態推定手法を構築する.その際,道路勾配が交通状態に及ぼす影響を考慮するため,ブロックごとに勾配を設定し,交通密度・速度の関係式を変化させることによって勾配の影響を考慮する.ケーススタディを通じて,本交通状態推定手法の事故発生状況分析への適用性について検討を行った.その結果,追突事故分析,インシデント検知への本手法適用の有用性は示された.本研究では車両感知器などによる交通データを用いて,高速道路上の交通状態の時空間変動を可能な限り記述・再現する方法論を開発し,それを用いて交通事故発生前後の交通状況を把握することを目的とする.具体的には,次の2課題について取り組んできた.1)広く普及しているループコイル式の車両感知器より得られる車両通過時のパルスデータを用いて,異なる2地点間を通過する車両をマッチングする手法を構築した.2)フィードバック法である拡張カルマン・フィルタと,マクロ交通シミュレーションであるブロック密度法を組み合わせることでフィードバック型交通状態推定手法を構築し,事故発生状況分析への適用性についても確認した.24年度は定点観測個別車両データに基づく交通事故多発区間における交通流特性の把握,および,個別車両データに基づく車両走行軌跡復元・推定アルゴリズムの開発を行ってきた.まずは提案アルゴリズの妥当性を検証するためのフィールドデータの収集を,阪和自動車道,名神高速道路などで実施するとともに,個別車両データを含む各種データを一元管理するためのデータベースを構築した.交通事故発生リスクに影響を与える要因について共分散構造分析などの統計解析を行い,定量的に因果構造の把握を試みた.その結果道路線形・構造は交通状態に影響を及ぼし,交通状態は事故発生に有意な影響を及ぼすことから,道路線形・構造も間接的に事故発生に影響することを確認した.2つめのテーマとしては,個別車両データに基づく車両走行軌跡推定アルゴリズムの構築を行った.具体的には,精度検証用データセットの整理を行い,その後,本提案手法において中核をなす車両マッチング手法の高度化,及び走行軌跡補完のため,カルマンフィルターによるパラメータ更新を組み込んだミクロ交通流モデルの構築に取り組み,最終的に個別車両データから車両走行軌跡を推定する体系的枠組みの構築を試みた.本研究課題では,次の3テーマに2カ年で取り組む予定である.1)ループコイル式の車両感知器により収集される,定点観測個別車両データに基づき,交通事故多発区間における交通流特性を把握するとともに,事故発生メカニズムに関する仮説を抽出する.2)個別車両データに基づき道路線形に整合する車両走行軌跡を復元・推定するアルゴリズムを開発し,それを活用して交通事故発生時における交通状況を推定するための方法論を確立する.3)交通事故発生要因を解明し,その緩和に向けたハード的・ソフト的交通事故対策案を提案し,評価する.このうち,24年度は1)および2)の一部に取り組むこととしており,研究実績の概要でも記述の通り,100%とは言えないが,1)および2)の2テーマに概ね78割は実施されており,25年度も継続的に取り組むことで,ほぼ当初予定通りの成果が現時点では見込むことができるので,概ね順調と判断した.25年度は,テーマ2の後半とテーマ3に取り組むとともに,研究全体の総括を行う.まず,テーマ2の後半として,昨年度に構築した車両走行軌跡推定アルゴリズムを実観測データへ適用し,その推定精度検証を行う.

この際,推定精度を向上するため,適宜アルゴリズムの修正,及び援用するミクロ交通流モデルの再検討を行う.また,24年度より継続して収集していた車両感知器による個別車両データの内,当該区間において交通事故を観測した際のデータを選別するとともに,事故調書データ・CCTVカメラ画像データなどと照合し,個別車両データ中の事故車両の特定を進める.加えて,事故発生時には,当該車両は対象区間上流側の車両感知器では観測されるものの,下流側では観測されないとの特性がある.一方で,車両走行軌跡推定アルゴリズムでは上下流地点で車両が同定されている必要がある.このギャップを埋めるための合理的な方法について検討し,事故解析に適用可能とするための車両軌跡推定アルゴリズムの拡張を行う.テーマ3として,テーマ2において構築した車両軌跡推定アルゴリズムを実際の交通事故発生時のデータに適用し,事故発生状況における車両走行軌跡を復元する.この所作を,観測されたすべての交通事故を含む個別車両データに適用し,復元された軌跡データに基づいて交通事故発生要因の解明,交通事故を誘引する前兆現象を特定する.また,得られた知見に基づき,インフラ側,及び交通管制側の両側面から交通事故を予防,発生件数を抑制するための方策について検討する.なお,本研究課題を学術,実務の両面から有為なものとするため,研究代表者,分担者による研究打合せを行い,内部チェックを行うとともに,研究フィールド提供者としての西日本高速道路(株),データ収集協力者としての住友電気工業(株)との共同研究体制の枠組みを活用して,研究内容の確認,進捗管理を行う事とする.25年度の研究費は,主に研究代表者,分担者で進捗報告・管理を行うための打合せの旅費,成果報告のための学会参加旅費および参加費,データ解析補助のための謝金および収集データや分析結果の保存などのためのメディアの購入などから構成されている.
新規シグナル蓄積型マイトファジープローブ発現マウスでパーキンソン病発症機構に迫る

昨年までに報告したオートファジーマウスと同様に、個体レベルでの観察が可能な、誘導型マイトファジープローブ発現ノックインマウスを用いた、各器官でのタモキシフェンによるプローブ発現状況を解析した。解析の結果、脳以外の器官では望むとおりのタモキシフェンに制御された発現誘導が確認され、プローブによるマイトファジーの可視化、解析が可能であることが示されたが、残念ながら脳ではタモキシフェンによる誘導前からプローブが発現しており、すでにシグナルを蓄積してしまっている(このプローブはシグナル蓄積型であるため、観察するまでのマイトファジーシグナルを溜め込んでしまう)ので解析には不向きであることが示唆された。この原因についてであるが、今回使用したB6.Cg-Tg(UBC-Cre_ERT2)Ejb_jマウスのERT2-Creが器官特異的に核に漏れ出し、Creを切断してプローブの発現をONにしてしまっている可能性が考えられる。週齢や、飼育方法などの検討を行ったが、根本的な改善は見られなかったので、脳に関してはこのマウスでの観察は断念し、他の誘導系(テトラサイクリン誘導システム、他のERT2-Creマウスとの掛け合わせなど)を利用したマウスの作製を検討している。このマウスで解析可能な脳以外の器官に関してはこのまま観察を進め、各器官でのマイトファジー検出能を確認した後に、能以外の器官でのマイトファジー研究を行う研究室と共同研究を進める予定である。【in vitro】作製した新規オートファジー、マイトファジープローブを用い、培養細胞レベルでのオートファジー、マイトファジーを可視化し、解析を行った。また、マウス胎児から取得した神経初代細胞系を用い、様々な試薬でマイトファジーを誘導、観察を行った。これらから得られた結果から、このプローブは、1.強い蛍光を呈し、様々な観察が容易である。2.オートファジー前後で蛍光特性が大きく変化し、検出が容易である。3.このプローブ自体が細胞毒性を持たない。4.マイトファジープローブは良好なミトコンドリア局在を示し、細胞質由来の偽陽性の結果を生じる可能性が少ない。5. PFA固定後もその蛍光特性変化は維持されており、(特に個体での)観察が容易。と当初の期待に沿うものであった。【in vivo】個体レベルでの観察が可能な誘導型ノックインマウスを作製中である。このマウス作製に用いたES細胞を使用し、誘導系が正確に働くことを確認してある。作製後、全身性にERT2-Creを発現するマウス(B6.Cg-Tg(UBC-Cre_ERT2)Ejb_j、米国ジャクソン研究所より購入)と掛け合わせ、来年度より繁殖、解析を開始予定である。さらにこのオートファジー、マイトファジープローブを発現するウイルスを作製し、マウス個体に導入、オートファジー、マイトファジーを誘導し、個体レベルでの観察を行っている。ノックインマウスの作製に手間取っており、この分野での進捗が遅れている。その他の細胞を用いた実験、ウイルスを用いた実験はほぼ予定通り進んでいる。様々な細胞種で解析を行い、各細胞種でのオートファジー、マイトファジーの程度、誘導条件の差異などを検討した。また、マイトファジープローブを用い、Parkinの発現の有無によるマイトファジー誘導量の多寡などを検討した。【in vivo】個体レベルでの観察が可能な誘導型オートファジープローブ発現ノックインマウスを作製し、各器官でのプローブ発現状況を解析した。解析の結果、いくつかの器官では望むとおりの発現誘導が確認され、プローブによるオートファジーの可視化、解析が可能であることが示されたが、ある器官では誘導前からプローブが発現しており、オートファジーシグナルを蓄積していたため解析には不向きであることが示唆された。この原因についてであるが、今回使用したB6.Cg-Tg(UBC-Cre_ERT2)Ejb_jマウスのERT2-Creが問題の器官では核に漏れ出し、Creを切断してプローブの発現をONにしてしまっている可能性が考えられる。このマウスで解析可能な器官に関してはこのまま観察を進めていく予定であるが、解析困難な器官に関しては他の誘導系の利用を検討している。また、誘導型マイトファジープローブ発現ノックインマウスに関しては現在作製中で未検討であるが、オートファジー発現マウスと同様の問題が生ずると考えられるため、こちらも他の誘導系の利用を進める予定である。ノックインマウスの誘導系に問題が発覚し、この分野での進捗が遅れている。

この原因についてであるが、今回使用したB6.Cg-Tg(UBC-Cre_ERT2)Ejb_jマウスのERT2-Creが器官特異的に核に漏れ出し、Creを切断してプローブの発現をONにしてしまっている可能性が考えられる。週齢や、飼育方法などの検討を行ったが、根本的な改善は見られなかったので、脳に関してはこのマウスでの観察は断念し、他の誘導系(テトラサイクリン誘導システム、他のERT2-Creマウスとの掛け合わせなど)を利用したマウスの作製を検討している。このマウスで解析可能な脳以外の器官に関してはこのまま観察を進め、各器官でのマイトファジー検出能を確認した後に、能以外の器官でのマイトファジー研究を行う研究室と共同研究を進める予定である。本研究のプローブは良好に働いており、このままデータを取り続けて論文化を目指す。また、ノックインマウスの検定後は、様々な研究室と共同研究を進めるべく学会等でこのプローブの周知を図る予定である。本研究のプローブ自体は良好に働いており、このままデータを取り続けて論文化を目指す。この誘導型オートファジープローブ発現ノックインマウスで解析可能な器官に関してはこのまま観察を進める。解析困難な器官に関しては他の誘導系(ドキシサイクリン誘導系など)の利用を検討する。この金額で購入できる物品がなく、あまりが出てしまいました少額なのですぐ使用します少額なので速やかに使い切ります
専門職教育者のIPE（異業種連携教育）基盤型研修プログラムの実践開発研究

近年、InterProfessional Educationが専門職の養成・研修に導入されてきた。多職種連携の円滑な業務遂行を目指す「IPW直結型IPE」に対し、本研究では「交流型IPE」に注目した。同IPEでは、業務と直接関係のない時間と場所で、専門職者/専門職教育者が個人として異なる業種・職種とノンフォーマル・インフォーマルに交流し、自他の専門職(性)やその実践的課題について学び合う。海上保安官・薬剤師・保育士教育者、医学教育・企業教育担当者で組織されたIPEチームは、ワークショップの企画・運営と省察から、研究論文3、研究ノート4、実践報告・コラム各1、学会報告2を生み出した。本研究は、異なる業種の専門職者が連携して行う教育活動(Interprofessional Education)の発想に基づく専門職教育者研修プログラム開発を目的とするものである。初年度の平成26年度は、「専門職教育」研究会を立ち上げ、京大や学外、海上保安大学校などで、各自の専門職養成教育についての相互プレゼンテーションや議論、訪問見学、ウェブ上でのチャット会議、KJ法を用いたメンバー内ワークショップ、議題を定めたフリーディスカッションなどを実施した。海上保安大学校では、学内や資料館の見学に加え、練習船に同乗・見学し、教官から実際の訓練に関わる報告とレクチャーを受け、意見交換を行った。またこれらを研究ノートなどの形でまとめて活字論稿として共有している。他大学等への訪問や実践見学はかなわなかったが、チャット会議の実践は、互いの距離が離れたところで仕事をする専門職教育者同士が、ネット上で自由な意見交換を行うことのできるツールであることを実践的に明らかにできた。この点で、当初は予定しなかった形態ではあるが、本テーマの実践研究成果としては大きなものであった。このように、本研究においては異なる専門職同士が、特定のテーマに関わって互いにどのような考え方や価値観にたっているかを自由に伝え合うツールの開発や実験を各々の場面で行っており、次年度はそのような成果を取りまとめながら、公開研究会や公開ワークショップなどの形で、メンバー以外の専門職者と共有していく予定である。当該年度の研究活動は、IPE公開ワークショップの実施に向けた入念な企画と準備、当日の運営、全体会・グループディスカッションの記録整理、企画運営者・参加者としての振り返り、フォローアップ調査の方法検討などに集中した。公開ワークショップは2015年10月18日、本科研メンバーによる関西IPE研究会・京大教育学研究科教育実践コラボレーションセンター主催で、京都大学芝蘭会館で開催された。テーマは「InterProfessional(多職種連携・異業種交流)からプロフェッショナリズムを考えるー木に関わる専門職の協業を手がかりに」として、従来IPEの主流を占めた医学・医療関係者に加え、より多様な専門職が他職種とともに全く異なる領域の専門職の仕事に触れ、意見交換することで、専門職の自覚や多職種連携への認識の深まりを目指した。午前中は「木に関する専門職」(林業従事者、建築家、工務店経営者)から「協業」に関わる話題提供を受け、午後はコメンテーター(薬剤師・学芸員)の提起をもとに、4グループで「プロとして働く」「プロとともに働く」をテーマに議論を行った。一般参加者は、薬剤師、助産師、弁護士、行政書士、菓子職人、消防士、編集者、元英語教師、元システム・エンジニアなど18人で、活発な議論が展開され、参加者アンケートでも高い評価が得られた。同ワークショップ後、約10回のチャット会議(Googleハングアウトを使用)を開催し、当日の音声記録・文字起こし記録を手がかりとした振り返り作業やフォローアップに関わる意見交換を行っている。ワークショップ参加者を対象とするフォローアップ調査を、2016年5月に実施の予定である。それを踏まえて登壇者のインタビュー、さらに企画・運営を担当した研究会メンバーの振り返りディスカッションを行い、2016年度の後半には、IPE基盤型専門職研修プログラムの開発作業に取り組む予定である。IPE基盤型専門職研修プログラムの目指すべき方向とあり方について、研究会メンバーが実際に公開ワークショップを企画・運営するに至る議論や登壇者との事前打ち合わせ、スケジュールの具体的展開に関わる一連の準備作業の中で、専門職自身にとってのIPEの意義や特色について多くの検討を重ねることができ、メンバーの共通理解とIPEの多面的・創造的な教育可能性を見出すことができた。また当日のワークショップの各プロセスや各場面での参加者の経験と認識の変容について、全音声記録と文字起こし記録を丁寧に読む作業と今後行うインタビューから考察し、IPE基盤型のプログラムを通して参加者の学びをどう促進・発展させられるかを検討することが、最終目的のプログラム開発に中核的意味をもつとの認識が共有され、その作業が順調に進んでいるため。近年、医療福祉分野の専門職教育の養成・研修に、InterProfessional Educationが導入されてきた。多職種連携の業務の円滑な遂行を目指す「IPW直結型IPE」に対し、本研究では「交流型IPE」に注目した。このIPEは、業務の遂行とは直接に関係のない時間と場所において、専門職者/専門職教育者が個人として、異なる業種・職種とのインフォーマルな交流の中で自他の専門職(性)やその実践的課題について学び合うIPEを指す。本科研の課題は、新人育成などの課題を共有する専門職教育者のための研修プログラムを、このような交流型IPEのあり方や強みを基盤に、IPEメンバーが自ら実践・開発することであった。

本研究会は、海上保安官・薬剤師・保育士養成の教育者、医学教育・企業教育に携わった経験者により組織されたIPEチームとして、2年目のワークショップの企画・運営を契機に、「プログラム開発」の作業の中で、「企画者が一番学ぶ」という気づきの獲得など認識の深まりが得られ、当初の「挑戦的萌芽」研究としての構想をいい意味で「裏切り」乗り超える成果が得られた。研究成果は、研究論文3本、研究ノート4本、実践報告1本、コラム1本、学会報告2本(うち国際学会1本)であった。今後、交流型IPEを身近で気軽に展開するには、HPを活用した次のしくみの構築が必要である。まず横断的な複数領域でIPE活動に多少とも関心のある希望者がアクセスできるIPEデータベースを用意し、希望者個人が活動意思の程度、および希望する活動形態や場所、頻度、規模などを登録する。それを統括する主宰側は一定の人数を確保した段階で提出されたデータをもとにマッチングを行い、いくつかのIPE活動のメニューとリソースを対象者に提供する。各IPEグループが発足し、独自の活動を選択しながら軌道に乗るまで、主宰側が必要な支援を行うというものである。近年、InterProfessional Educationが専門職の養成・研修に導入されてきた。多職種連携の円滑な業務遂行を目指す「IPW直結型IPE」に対し、本研究では「交流型IPE」に注目した。同IPEでは、業務と直接関係のない時間と場所で、専門職者/専門職教育者が個人として異なる業種・職種とノンフォーマル・インフォーマルに交流し、自他の専門職(性)やその実践的課題について学び合う。海上保安官・薬剤師・保育士教育者、医学教育・企業教育担当者で組織されたIPEチームは、ワークショップの企画・運営と省察から、研究論文3、研究ノート4、実践報告・コラム各1、学会報告2を生み出した。研究会は十分に機能しており、次年度の公開イベントなどに向けた活動が展開されている。上述のような見通しをもち、以下のような研究活動を予定している。1インタビュー調査(当日参加者・登壇者)、2音声・文字おこし記録の精読作業とそこから読み取れることに関わる議論、3企画・運営者としての振り返りのディスカッション、4以上を通しての、公開ワークショップから抽出できるIPE的要素とその活用に関する総括的な議論、5参加者へのフィードバックとしての「日々の自己省察のためのパソコン壁紙」の作成・配布、6IPE基盤型専門職研修プログラムの開発作業・7同プログラムの提案、解説・資料を所収する『IPE基盤型専門職教育ハンドブック』の作成・刊行、8学会発表、9共同論文の執筆・投稿など。生涯教育学次年度の研究の方向性としては、今年度の成果を踏まえた発展的な取り組みを行いたいと考えている。第一に、「専門職教育」研究会の継続的実施が挙げられる。とりわけ、同研究会は、異業種専門職者の相互交流的な活動についての実験的取り組みをも柱と考えているため、ウェブ上のサイトなど、さまざまなツールを活用した多様な活動を進めていきたい。第二に、公開ワークショップないし研究会の実施である。
InvivoRNAサイレンシング法を活用した哺乳類卵胞発育の人為的制御技術の創出

哺乳類の卵胞退行機構には顆粒層細胞のアポトーシスが深く関与していることが明らかとされているが、卵胞退行過程で顆粒層細胞にアポトーシスを誘起するトリガー因子、細胞内シグナル伝達経路については未解明な点が多い。そこで本研究では哺乳類卵胞選択を制御している因子を探索し、その因子の遺伝子の発現をRNAサイレンシング法にて特異的に抑制し、アポトーシスを停止させることで、卵胞選抜を人為支配することを試みた。ブタ卵巣ではFasligand(FasL)/Fasが顆粒層細胞アポトーシスを誘起していることを明らかにし、FasL/Fas系の細胞シグナル伝達に関与するブタFas-associated death domain(FADD ; GenBank accession no.AY519264)ならびにcaspase-8(AY519263)のクローニングを行いそれらの発現ベクターを構築し、ヒト、マウス、ブタ顆粒層細胞由来の培養細胞にそれぞれ過剰発現させたところアポトーシス誘導能を有することを明らかにした。培養顆粒層細胞においてcaspase-8の阻害因子であるcFLIPを過剰発現させるとFas誘導性アポトーシスを阻害し、siRNAにより発現抑制すると、有意に細胞死が誘導された。現在アポトーシス誘導性の転写因子・FOXO3aによる顆粒層細胞死の発現抑制を解析中である。いずれもこれまでのところ初代培養ブタ顆粒層細胞においては遺伝子導入効率が非常に低く、in vivoでの顆粒層細胞の細胞死制御には至っていないが、今後遺伝子の導入方法を検討していく予定である。哺乳類卵巣卵胞の選抜を人為的に支配する技術の確立の第一段階として、卵胞制御に深く関わっている、アポトーシスシグナル伝達因子であるブタCaspase-8、FADD(Fas Associated Death Domain)のクローニングを行った。その結果ブタCaspase-8は1431bp、476aa。FADDは636bp、211aaであった。またブタとヒトとの相同性はCaspase-8で71.8%、FADDで74.4%、マウスとの相同性はそれぞれ63.4%と63.5%あった。解析した遺伝子とGFPを共に組み込んだプラスミドベクターを作製し、培養顆粒層細胞にトランスフェクションした。Caspaseインヒビターであるp35遺伝子を共発現させたものとGFP陽性細胞の数を比較することにより細胞死誘導能を検討したところ、ブタcaspase-8、ブタFADDともにヒト由来、マウス由来の培養顆粒層細胞でアポトーシス誘導能が確認でき、アポトーシス伝達因子の種を越えた高い保存性が認められた。発現効率は細胞によって異なったが、初代培養顆粒層細胞での発現効率はかなり低いため今後の検討が必要とされる。さらに細胞死受容体を介したアポトーシス制御因子の一つであるBidのブタ卵巣におけるmRNAならびにタンパクの発現変化を調べたところBid mRNAは顆粒層細胞にのみ局在がみられ、mRNA、タンパクともに健常卵胞の顆粒層細胞において高く発現し、退行に従い発現が減少していった。このことより卵胞退行に従い、Bidが活性型のtBidに変換されミトコンドリアにアポトーシスを誘導していると考えられる。またブタBid遺伝子もCaspase-8、FADDと同様ヒト、マウス由来の顆粒層細胞でアポトーシス誘導能が確認できた。
紀伊半島の筋萎縮性側索硬化症多発地域における神経生理学的研究

平成12年度は、紀伊半島筋萎縮性側索硬化症(ALS)多発地域における、筋萎縮性側索硬化症(ALS)/パーキンソニズム痴呆複合(parkinsonism-dementia complex:PDC)患者、通常のALS患者、パーキンソン病(PD)患者と健常人を対象として、以下の神経生理学的検討を行った。1.末梢神経伝導検査疾患特異性はなく、すべての患者において健常対照群と同じ結果が得られた。患者および健常対照群に同様の方法で検査を行った。導出された波形の潜時や振幅に疾患特異性のある有意な差はなかった。N20-P25頂点間振幅の変化について検討し、大脳感覚野の抑制機構の異常について検討した。その結果、ALS/PDC患者、特に痴呆症状があるものや家族歴があるもので、抑制の程度が正常対象と比べて有意に弱く、大脳感覚野皮質内抑制機構に異常があると推測された。ALS、PD患者では、健常対照群と優位な差はかった。・3の結果が、疾患の神経病理学的な異常とどのように関連しているかについては今後の検討が必要であると考える。・今後、大脳運動野の機能評価も行っていく予定である。
磁気式3次元モーションセンサシステムの試作と未踏問題への応用

従来は計測できなかった対象の3次元の動きを幅広く計測できる新しい磁気式モーションセンサシステムを実現し,いくつかの分野で未解決であった重要な実問題への応用を図るため,本年度は次の課題に取り組んだ. 1(a)機械学習を用いた高速で安定な3次元位置計算アルゴリズムを検討し,また新たなバイラテラルフィルタを考案し,これらを実装した. 1(b)フリップ型励磁コイルとLC共振の原理による3次元モーションセンサシステムの試作のため,マニピュレータを購入し,準備を開始した. 2(a)マウスの行動計測の準備を行った.2(b)道具操作時の細かい手指運動のモーションデータベース構築とアニメーションの自動生成のために,限られた数の磁気式モーションセンサの出力を機械学習し,細かい手指の動作を行う手の代表点の位置・姿勢および各指の関節間の全部位の姿勢を推定する方法を提案した.磁気式モーションセンサにより,オクルージョンが生じる状況やグローブが使用できない状況でも対象の推定が可能である.機械学習のモデルには,2次元格子状に配置された磁気式モーションセンサの計測値を入力とするCNNのモデルを採用した.磁気式モーションセンサの7つのマーカを片手に装着し,別のセンサ出力を訓練標本として手の動き収集し,学習を行った.その結果,精度の高い推定が可能であると確認した.2(c)多関節物体の例としてRubic's Cubeをとりあげ,その運動計測結果から状態を推定する手法を検討した.これを新しい楽器のためのユーザインタフェースとして応用する試作を行った.2(d)流体の動きを直接計測するための準備を行った.概ね順調に進展している.機械学習部分に加え,性能が良いフィルタを実装することができた.特に問題はない.機械的に動作させる部分を個別に試作するのではなく,汎用のロボットを利用することにしたので,今後効率的に様々なアイデアを試すことができる.従来は計測できなかった対象の3次元の動きを幅広く計測できる新しい磁気式モーションセンサシステムを実現し,いくつかの分野で未解決であった重要な実問題への応用を図るため,本年度は次の課題に取り組んだ. 1(a)機械学習を用いた高速で安定な3次元位置計算アルゴリズムを検討し,また新たなバイラテラルフィルタを考案し,これらを実装した. 1(b)フリップ型励磁コイルとLC共振の原理による3次元モーションセンサシステムの試作のため,マニピュレータを購入し,準備を開始した. 2(a)マウスの行動計測の準備を行った.2(b)道具操作時の細かい手指運動のモーションデータベース構築とアニメーションの自動生成のために,限られた数の磁気式モーションセンサの出力を機械学習し,細かい手指の動作を行う手の代表点の位置・姿勢および各指の関節間の全部位の姿勢を推定する方法を提案した.磁気式モーションセンサにより,オクルージョンが生じる状況やグローブが使用できない状況でも対象の推定が可能である.機械学習のモデルには,2次元格子状に配置された磁気式モーションセンサの計測値を入力とするCNNのモデルを採用した.磁気式モーションセンサの7つのマーカを片手に装着し,別のセンサ出力を訓練標本として手の動き収集し,学習を行った.その結果,精度の高い推定が可能であると確認した.2(c)多関節物体の例としてRubic's Cubeをとりあげ,その運動計測結果から状態を推定する手法を検討した.これを新しい楽器のためのユーザインタフェースとして応用する試作を行った.2(d)流体の動きを直接計測するための準備を行った.概ね順調に進展している.機械学習部分に加え,性能が良いフィルタを実装することができた.特に問題はない.機械的に動作させる部分を個別に試作するのではなく,汎用のロボットを利用することにしたので,今後効率的に様々なアイデアを試すことができる.
操作可能なメタモデルによる日本固有の製造アーキテクチャの分析

本研究の目的は、さまざまな業種、業態ごとに特徴ある日本の製造業のありようを、その本質を失わないままいくつかの典型的な製造アーキテクチャとして普遍化しモデル化することで、それを操作分析可能な共通の知的財産とすることである。そして、それを日本の製造業のこれからの方向性を決定する際に利用可能なものにすることにある。製造アーキテクチャをモデル化する上で、本研究ではサプライヤー・メーカー・カスタマーといったモノの流れの軸と、開発・設計・計画・スケジューリング・指示・モニタリングといった情報の流れの2つの軸をベースに、その2つの軸の中心に位置する計画・スケジューリングに焦点をあて、研究を進めた。本年度(最終年度)は、これからの製造業のあり方として、APSという概念を中核にすえた製造アーキテクチャを議論した。研究代表者は研究分担者らとともに、新たにAPSの日本的な意味付けを行い、我が国製造業のしくみに適合したモデルとして再構成した。本研究で議論したAPSとは、生産計画やスケジューリングなどの時間軸を強く意識した意思決定により、顧客サービス、設計開発、そして製造や調達業務をダイナミックに連携させるしくみであり、変化を許容し、変化に対応することを主眼においたアーキテクチャである。具体的な研究成果としては、国内外で70件をこえる研究発表を行った。また、それら研究成果の産業界への普及のために、研究代表者らが中心として企画、運営しているPSLXコンソーシアムにおいて、国内の製造業関連ITベンダーや、SI企業らとともに、普及活動も進めた。本研究では、メタモデルという、各研究者単位で個々の研究目的に応じて使用されるモデルをさらに抽象化したモデルを提案するという大胆な試みを行い、日本的な製造業を総括するモデルの候補といえるものが得られた。本研究の目的は、業種・業態ごとに異なる日本の製造業における多様な製造プロセスを、その本質を失うことなく幾つかの典型的な製造アーキテクチャとしてモデル化することである。その結果、メタモデル化された製造アーキテクチャを操作・分析可能なレベルまで普遍化することにより、我が国製造業の共通知的財産としての活用が可能となり、生産活動のさらなる高度化に資することができる。上記の目的を達成するために、本年度(初年度)は我が国の基幹製造業である電気機械産業を中心に、それらの製造プロセスに典型的に存在する生産システムのモデル化に取り組んだ。具体的には、研究組織構成員全員でメタモデルの定義方法・メタモデルを構成する基本要素や各種の生産情報のパラメータ化(表現方法)・現実の製造業に見受けられる多様な製造アーキテクチャの記述方法について検討し、共同研究遂行上の基盤となる研究者間の共通認識と理解を確立した。この研究基盤の形成過程において、研究分担者各位がそれぞれの視点で国内製造企業数社に対して予備調査を実施し、製造プロセスの実態把握とモデル化のための手がかりを得た。実際に研究課題を実施するにあたり、地理的に分散した研究分担者間の交流や討論を容易にするために、WWW上での共同研究の仕組みを採用した。具体的には、本研究専用のWWWサーバーを研究代表者の所属機関に構築し、各研究分担者に対してはPC端末を設置した。これにより、円滑な情報交換と効果的な情報共有が可能となり、研究が推進された。本年度研究成果のとりまとめと次年度研究計画の確認のために、研究代表者主催による研究集会を平成15年3月上旬に開催した。この研究集会では、各研究分担者からの研究進捗状況の報告に加えて、生産システム研究の国内第一人者である研究者による最新の現状解説を受け、次年度の研究計画を決定した。

そして、それを日本の製造業のこれからの方向性を決定する際に利用可能なものにすることにある。製造アーキテクチャをモデル化する上で、本研究ではサプライヤー・メーカー・カスタマーといったモノの流れの軸と、開発・設計・計画・スケジューリング・指示・モニタリングといった情報の流れの2つの軸をベースに、その2つの軸の中心に位置する計画・スケジューリングに焦点をあて、研究を進めた。本年度(最終年度)は、これからの製造業のあり方として、APSという概念を中核にすえた製造アーキテクチャを議論した。研究代表者は研究分担者らとともに、新たにAPSの日本的な意味付けを行い、我が国製造業のしくみに適合したモデルとして再構成した。本研究で議論したAPSとは、生産計画やスケジューリングなどの時間軸を強く意識した意思決定により、顧客サービス、設計開発、そして製造や調達業務をダイナミックに連携させるしくみであり、変化を許容し、変化に対応することを主眼においたアーキテクチャである。具体的な研究成果としては、国内外で70件をこえる研究発表を行った。また、それら研究成果の産業界への普及のために、研究代表者らが中心として企画、運営しているPSLXコンソーシアムにおいて、国内の製造業関連ITベンダーやSI企業らとともに、普及活動も進めた。本研究では、メタモデルという、各研究者単位で個々の研究目的に応じて使用されるモデルをさらに抽象化したモデルを提案するという大胆な試みを行い、日本的な製造業を総括するモデルの候補といえるものが得られた。
細胞内シグナル伝達分子の単離とヒトがんにおける異常の解析

研究課題を遂行するために、発がんとのかかわりの深いWntシグナル伝達経路の制御機構と新規制御分子の探索を行い、下記の知見を得た。(1)β-カテニンの分解制御機構APCはAxinを介してGSK-3と複合体を形成しβ-カテニンのリン酸化を促進した。PP2AのBサブユニットはAxinに結合し、β-カテニン依存性のTcf-4活性化を促進した。PKAはβ-カテニンをリン酸化してβ-カテニンのユビキチン化を抑制し、β-カテニンを安定化した。したがって、Axin複合体中での構成分子のリン酸化と脱リン酸化はβ-カテニンの安定性を制御することが明らかになった。(2)Wntシグナルの新規制御分子の同定Dvl結合蛋白質としてIdax、βーカテニン結合蛋白質としてDuplin、Axin結合蛋白質としてAxamを同定した。これらの新規蛋白質はいずれもWntシグナルを制御した。これらのノックアウトマウスはいずれも致死的であり、発生生物学的に重要であった。(3)SUMO化によるWntシグナル伝達経路の制御Axamはβ-カテニン分解促進活性と脱SUMO化活性を有し、Axamによるβ-カテニン分解には脱SUMO化活性が必要であった。また、Tcf-4はSUMO化され、SUMO化はβ-カテニンによるTcf-4の転写活性を促進した。したがって、Wntのシグナル伝達にはSUMO化という翻訳後修飾も重要であることが明らかになった。(4)GSK-3結合蛋白質の同定と機能GSK-3結合蛋白質としてAKAP220とh-pruneを同定した。AKAP220はPKAとも結合して、GSK-3の不活性化を促進した。h-pruneは接着班に局在して、GSK-3と共に細胞運動を促進した。したがって、GSK-3は結合蛋白質により、その機能と活性が制御されることが明らかになった。(5)転移関連分子の機能上述した分子に関してヒトがん症例の免疫染色を行ったところ、h-pruneは大腸癌と悪性黒色腫で、Wnt-5aは大腸癌と膵癌に高頻度に発現していた。これらの発現は浸潤の程度とリンパ節転移との相関が高かった。これらの分子は転移と関連すると考えられた。本年度はまずWntシグナル伝達経路での癌抑制遺伝子産物APCのβ-カテニン分解における役割について、解析を行った。APCはAxinを介して蛋白質リン酸化酵素GSK-3と複合体を形成し、AxinはAPCを介してβ-カテニンと複合体を形成することができた。また、Axinに結合したGSK-3は、APCに結合したβ-カテニンをリン酸化した。したがって、APC/Axin複合体中で、GSK-3によるβ-カテニンのリン酸化が促進され、その結果、β-カテニンが分解されると考えられた。Axinの作用機構から、Axinが癌抑制遺伝子であると予想されていたが、実際に肝癌においてAxinの変異が報告された。Axinに変異のある症例ではAPCやβ-カテニンの変異は認められないが、β-カテニンは蓄積している。したがって、Axin、APC、β-カテニンのいずれか一つに変異が生じるとβ-カテニンの分解が抑制され、細胞が癌化すると考えられる。

Wntシグナル伝達経路の中ではGSK-3のみが酵母にも保存されている。GSK-3の新たな活性制御機構および作用機構を明らかにするために、出芽酵母に存在する4つのGSK-3ホモログ遺伝子全てを破壊した株を作製した。このgsk-3四重遺伝子破壊株は高温感受性を示し、bul変異株の高温感受性が多コピーのGSK-3遺伝子の導入により抑圧されたことから、GSK-3とBulとの相互作用が示唆された。そこで、GSK-3とBul-Rsp5系とが共通の蛋白質の分解に働くと考え、この蛋白質の同定を目的にgsk-3変異株およびbul変異株の温度感受性を抑圧する共通の遺伝子変異を探索した。その結果rog1変異を得た。パルスチェイス実験により、Rog1がGSK-3およびBul、Rsp5依存的に分解されることが明らかになった。これらの結果は酵母GSK-3が蛋白質分解に関与することを初めて示したものであり、gsk-3四重遺伝子破壊株が哺乳動物細胞GSK-3の機能解析にも有効であると考えられた。癌抑制遺伝子産物APCとAxinは複合体を形成して、本複合体中においてβ-カテニンの安定性が制御される。これまでに、私共はAxinに種々の蛋白質が結合することを見出してきたが、本年度はAxinに蛋白質脱リン酸化酵素PP2AのBサブユニツト(PR61)が結合することを明らかにした。PR61はβ-カテニン依存性のTcf-4活性化を促進した。カゼインキナーゼI(CKI)はDvlに結合して、両蛋白質が相乗的にβ-カテニンを安定化して、Tcf-4を活性化した。したがって、Wntのシグナル伝達には、リン酸化と脱リン酸化が種々のレベルで関与すると考えられた。新規Axin結合蛋白質Axamはβ-カテニン分解促進活性と脱SUMO化活性を有し、Axamによるβ-カテニン分解には脱SUMO化活性が必要であった。これらの結果は、Wntのシグナル伝達にはβ-カテニンのGSK-3によるリン酸化とユビキチン化以外にSUMO化という翻訳後修飾も重要であることが明らかになった。GSK-3の新たな活性制御機構および作用機構を明らかにするために、出芽酵母GSK-3遺伝子破壊株(Δgsk株)を作製した。このΔgsk株はガラクトース培地では成長が抑制された。Δgsk株の性質を多コピーで抑圧する遺伝子として、MSN2とPGM1を単離した。このうち、Msn2は種々のストレスに応答して核に移行し、STRE配列を認識して遺伝子発現を促進する転写因子である。Msn2の細胞内局在に関しては、野生型株とΔgsk株とでは変化は認められなかったが、Msn2のSTRE依存性の転写活性化能がΔgsk株で低下した。また、ガラクトース代謝に関係してSTRE配列を有するホスホグルコムターゼ(PGM)のmRNA量もΔgsk株では減少していた。Msn2とSTREの結合はGSK-3により増強された。これらの結果は酵母GSK-3がストレス応答に関与することを初めて示したものであり、Δgsk株が哺乳動物細胞GSK-3の機能解析にも有効であると考えられた。Wntシグナル伝達経路の異常においては、β-カテニンが安定化してTcfが活性化されることが知られている。