hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新生児期遺伝子治療におけるアデノ随伴ウイルスベクターの体内動態と治療効果

[目的]古典型フェニルケトン尿症(PKU)をモデルに、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子治療法を開発している。今年度は、これまでの基礎検討に基づき、治療用遺伝子であるフェニルアラニン水酸化酵素(PAH)遺伝子を搭載したAAVベクターをPKUモデルマウスに投与して、AAV8型キャプシド、および自己相補型ゲノムの採用による効率改善を解析した。[結果](1)成体PKUマウスにおいて、対照のAAV5/PAHは、雄PKUマウスでは1×10^<13>particles(pc)以上で長期間、雌PKUマウスでは1×10^<14>pcで一過性に血中フェニルアラニン(Phe)を正常化した。これに対しAAV8/PAHは、雄では1×10^<12>pcで長期間、雌では1×10^<14>pcで一過性にPheを正常化した。すなわち、AAV8はAAV5に比べ10倍以上効率が高かった。(2)自己相補型AAV8/PAHは、雄では1×10^<11>pcでPheを正常化した。雌では1×10^<12>pcで正常化、1×10^<11>pcでも長期間Pheを治療域に低下させた。ゲノムの自己相補型化による効率改善も10倍以上だつた。(3)新生仔PKUマウスに自己相補型AAV8/PAHベクターを投与した。肝への5×10^<11> pc直接注入ではPheの低下は見られなかった。2×10^<12>pc静注後1-2ヶ月は血中Pheの低下傾向が見られたが(無治療個体の20mg/dL以上に対し15mg/dL程度)、それ以降は無治療レベルになった。[考察]AAV8型キャプシドと自己相補型ゲノムの組合せにより、成体PKUマウスに対しては、従来型AAV5ベクターに比べて100倍以上の効率改善を達成し、これまで治療の困難だつた雌でも十分な効果が得られた。しかし新生仔マウスにおいては有意な治療効果が得られず、さらなるベクター改良が必要と考えられた。小児期に発症する多くの遺伝性代謝疾患は、早期に治療を開始する必要がある。我々はフェニルケトン尿症(PKU)マウスをモデルに、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子治療法を開発中であり、成体PKUマウスの治療実験には成功している。そこで、より早期の根治を目指してマウス新生仔での実験を開始した。今年度は、現在臨床で使われているAAV2型より肝臓への遺伝子導入効率が高いといわれるAAV5型ベクターについて、マウス成体と新生仔における遺伝子導入効率ならびに体内動態を比較検討し、以下の結果を得た。(1)ヒト凝固第IX因子(hFIX)遺伝子発現AAV5ベクター(AAV5/hFIX)をマウス新生仔に投与した場合、腹腔内投与の方が静脈内投与より遺伝子導入効率が高かった。(2)AAV5/hFIXを成体に腹腔内投与するとhFIXの発現に大きな性差(雄>>雌)が認められた。一方、体重あたり同量のAAV5/hFIXを新生仔に腹腔内投与した場合、hFIXの発現は雄雌とも同程度で成体雄に投与した時よりも高く、より長期間持続した。(3)AAV5の体内分布を知るため、lacZレポーター遺伝子を搭載するAAV5ベクター(AAV5/lacZ)を成体と新生仔に腹腔内投与した。8週後屠殺して各臓器におけるlacZ発現を調べたところ、主な発現の場は腹膜だった。発現の程度は、新生仔投与後のマウスでは雄雌とも非常に高く、成体投与後の雄にて少量、成体投与後の雌では殆どゼロであった。(4)レポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を搭載するベクター(AAV5/Luc)を腹腔内投与して、その発現をin vivo追跡する実験でも、AAV5/lacZ投与実験と同様の結果を得た。結論として、新生仔へのAAV5投与は成体への投与より効果が高く、性差の問題を回避する手段としても有効と考えられる。

(3)新生仔PKUマウスに自己相補型AAV8/PAHベクターを投与した。肝への5×10^<11> pc直接注入ではPheの低下は見られなかった。2×10^<12>pc静注後1-2ヶ月は血中Pheの低下傾向が見られたが(無治療個体の20mg/dL以上に対し15mg/dL程度)、それ以降は無治療レベルになった。[考察]AAV8型キャプシドと自己相補型ゲノムの組合せにより、成体PKUマウスに対しては、従来型AAV5ベクターに比べて100倍以上の効率改善を達成し、これまで治療の困難だつた雌でも十分な効果が得られた。しかし新生仔マウスにおいては有意な治療効果が得られず、さらなるベクター改良が必要と考えられた。
地方都市における「街なか居住」実現に向けた基礎的研究-高齢社会対応の新たな集合住宅施策の必要性と可能性-

前年度の先進事例の実態調査を受け、平成16年度には、大きく3つのアンケート調査を実施している。一つは東北地方に存在するすべての都市の都市計画担当者を対象とした、コンパクトシティ戦略および街なか居住施策に対するアンケートである。10万人以下の都市においては、依然として郊外拡大が継続されており、また、農業従事者による農地転用要求により、街なか居住施策の有効性が担保できない状況が明らかになった。また、10万人以上の都市においては、住宅マスタープランや中心市街地活性化基本計画と連動する形で、コンパクトな都市計画マスタープランが策定されてはいるものの、具体的な街なか居住施策がとられている自治体は非常に少なく、掲げる目標と実際の施策との整合性があまりとれていない現状がある。一方で、昭和4050年代に郊外に住宅地を求めた世帯の今後の住み替え需要と、街なか居住施策との関連性を探る目的で、現在、都市計画マスタープランにおいて、コンパクトなまちづくりを目指す八戸市郊外の住宅団地を対象とした住民アンケート調査を実施している。アンケートの冒頭では、特に将来的な危惧を抱いておらず住み替えをほとんど意識していない回答が大半であるものの、質問項目が進んで行くにつれて、将来に対する不安が増大していくこととなり、街なかの集合住宅居住を希望するものの、現在所有する住宅をどのような形で処分していくかが未知数であるために、現実的に住み替えを志向できない状況が明らかになった。また、郊外の市営住宅居住者に対して実施したアンケート調査に於いては、街なかの公営住宅の必要性と家賃との関連性についての意識を問うている。しかし、特に郊外の市営住宅階層は、長期的な居住を続ける高齢者層が多く、そのような郊外居住者の住み替え需要よりも、結婚や転勤等により新たに登場する若年層の需要に対応した公共住宅供給の必要性が明らかになった。平成15年度は、街なか居住に関する先進例として注目されている東北の地方都市における事例を調査対象として、集合住宅の供給者サイド(行政、民間業者、地主等)に対するヒアリング調査を実施している。対象者は、以下の通りである。○住宅行政担当者・・・秋田市、仙台市、弘前市、飯田市、国土交通省東北地方整備局○民間住宅業者・・・四国に本社を持つ大手マンションディベロッパー、東京の不動産販売会社○地主等・・・秋田仲小路モール、いわき市シティハイツ、飯田まちづくりカンパニー、仙台市グッドライフ長町、弘前市大町住宅一方で、マンション需要者側に対する調査として、青森市駅前に誕生したマンション居住者に対するヒアリング調査、および東北初の借り上げ公営住宅として弘前に存在する大町住宅の居住者に対するアンケート調査を、実施している。先進事例に共通する特色として、街なかに居住空間を確保するだけではなく、建物内部における新たな生活スタイルの確立のための空間の複合化があげられる。それは、福祉、医療、あるいは教育文化部門との複合として、街なかに新しい生活拠点を生み出すことに成功している。また、居住者アンケート調査から得られた知見として、街なか居住を選択した居住者のライフスタイルは、以前に増して、中心市街地依存型に移行していることが明らかとなっている。しかし、利便性が様々なサービスの享受のみを利点として住環境そのものを軽視した建築物が登場しつつあり、公的な財政支援という形で質の高い居住空間を生み出した大町住宅の事例では、居住者の満足度がかなり高いものの、その他に現実に登場しつつある多くの都市の街なかマンションについては、やや懸念が残ることが、業者ヒアリングからも指摘されている。

また、10万人以上の都市においては、住宅マスタープランや中心市街地活性化基本計画と連動する形で、コンパクトな都市計画マスタープランが策定されてはいるものの、具体的な街なか居住施策がとられている自治体は非常に少なく、掲げる目標と実際の施策との整合性があまりとれていない現状がある。一方で、昭和4050年代に郊外に住宅地を求めた世帯の、今後の住み替え需要と街なか居住施策との関連錬成を探る目的で、現在、都市計画マスタープランにおいてコンパクトなまちづくりを目指す八戸市郊外の住宅団地を対象とした住民アンケート調査を実施している。アンケートの冒頭では、特に将来的な危惧を抱いておらず住み替えをほとんど意識していない回答が大半であるものの、質問項目が進んで行くにつれて、将来に対する不安が増大していくこととなり、街なかの集合住宅居住を希望するものの、現在所有する住宅をどのような形で処分していくかが未知数であるために、現実的に住み替えを志向できない状況が明らかになった。また、郊外の市営住宅居住者に対して実施したアンケート調査に於いては、街なかの公営住宅の必要性と家賃との関連性についての意識を問うている。しかし、特に郊外の市営住宅階層は、長期的な居住を続ける高齢者層が多く、そのような郊外居住者の住み替え需要よりも、結婚や転勤等により新たに登場する若年層の需要に対応した公共住宅供給の必要性が明らかになった。
スウェーデンでの気球実験による硬X線偏光観測と高感度な焦点面偏光計の開発

本研究の目的は、国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer(PoGOLite, PoGO+)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体の偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実施するために、焦点面に置く偏光計を開発することであった。2013年にPoGOLite、2016年にPoGO+を放球に成功し、それぞれ数日1週間にわたってパルサー星雲「かに星雲」とブラックホール連星系「はくちょう座X-1」の偏光観測を実施することができた。また焦点面に置く小型偏光計のため、シンチレータを光検出器(Si-PM)で読み出す回路を作成した。本研究の目的は、日米欧の国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer(PoGOLite)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体からの本格的な偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実現するために、焦点面に置く偏光計をスウェーデンチームと共同で開発することである。今年度は2013年67月にスウェーデン・キルナにあるEsrange気球実験場に滞在し、PoGOLite検出器のフライトを成功させることに尽力した。6月中にフライトの準備を完了させ、その後に天候を待ち、7月12日に放球した。7月26日にロシア・ノリリスク近郊に着陸するまでの2週間にわたって、グリーンランド、カナダ、ベーリング海峡の上空を高度40km近くを保ったままフライトさせることに成功し、北極圏を周回する長時間フライトを達成することができた。ロシアからの戻ってきた検出器のデータ解析は現在進行中である。望遠鏡の焦点面に置く新しい検出器には、小型でかつ常温でも利用可能な光半導体検出器であるMulti-Pixel Photon Counter(MPPC)の利用を考えている。実際に偏光計において、入射光子の散乱体となるプラスチックシンチレータ、吸収体となるBGOやCsI(Tl)、GAGGシンチレータの読み出しを行った。今後は、回路の最適化などを行い、実際の偏光計として性能を発揮できるかどうかの検討を進めていく。本研究の目的は、日米欧の国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer (PoGOLite)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体からの本格的な偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実現するために、焦点面に置いく偏光計をスウェーデンチームと共同で開発することである。今年度は、2016年夏にスウェーデン・キルナにあるEsrange気球実験場から再度PoGOLite気球を打ち上げる可能性が高まったため、前回の2013年のフライト時から検出器に改良を加えるべくPoGOLiteチーム内で様々な基礎実験が行われた。その中で、我々は高速中性子の非弾性散乱に起因したバックグランドを除去できるよう、読み出し回路の高速化を担当した。以前のチーム内での実験から、ガンマ線と高速中性子の信号は70MHz以上のADCサンプリングレートがあれば、80%のガンマ線信号を保ったまま80%の中性子バックグランドを除去できるという見積もりがある。そこで我々は、従来の37.5MHzのサンプリングレートを、現状の8チャンネル入力を同時処理できるADCでもっとも高速な部類にあたる100MHzでサンプリングできる目途を立てた。またADCサンプリングの前段にあるアナログ回路についても、100MHzのサンプリングに最適な状況になるよう、あらためて回路パラメータを見直しも実施した。本研究の目的は、日米欧の国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer (PoGOLite)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体からの本格的な偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実現するために、焦点面に置く偏光計をスウェーデンチームと共同で開発することである。今年度は、2016年夏にスウェーデン・キルナにあるEsrange気球実験場から再度PoGOLite気球を打ち上げられることが決定したため、PoGOLiteチーム内で前回2013年に放球した検出器の改良を行った。その中で、我々は高速中性子の非弾性散乱に起因したバックグランドを除去できるように、読み出し回路のサンプリングレートを37.5MHzから100MHzに高速化した。また回路素子の最適化も行い、電力も約3/4に削減することにも成功した。検出器全体の組み上げも順調に進んでおり、2016年夏に予定通りに放球できる予定である。将来、望遠鏡の焦点面に置くことを想定した新型の偏光計については、小型な光検出器として近年新しく開発されたSi-PM(もしくはMPPC)検出器を利用し、入射した硬X線・ガンマ線の散乱体となるプラスチックシンチレータの読み出しについて実験を行った。その結果、-10°Cの環境下で55Feの5.9 keVのX線が検出でき、5 keV程度まで低いスレッショルドを達成できることを実証することができた。2016年のPoGOLiteの再フライトへ向け、担当している読み出し回路の高速化を完了した。また将来計画に向け、偏光計の中で散乱体として利用するプラスチックシンチレータをSi-PM検出器で読み出す実験を完了した。本研究の目的は、日米欧の国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer(PoGOLite、PoGO+)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体からの本格的な偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実現するために、焦点面に置く偏光計をスウェーデンチームと共同で開発することである。今年度は、スウェーデン・キルナにあるEsrange気球実験場から、気球を再度打ち上げ天体観測を実施した。

2013年のPoGOLiteよりも偏光計の検出部、読み出し回路などを改良したため、ミッション名をPoGO+とあらためている。2016年7月12-18日の7日間にわたってフライトさせ、ゴンドラと検出器の両方をほぼ順調に動作させることができたため、パルサー星雲「かに星雲」とブラックホール連星系「はくちょう座X-1」の観測に成功した。このフライトデータは現在解析中であり、論文として投稿予定である。打ち上げ前の5-6月に現地で行った地上キャリブレーションの結果は、すでに論文として受理されている。我々の偏光計は検出器自体を1秒に1°(6分間で360°)回転させ、検出器の異方性をキャンセルする設計になっている。これにより、ゴンドラに組み上げた最終状態において、無偏光(線源)を照射することで、モジュレーションカーブの系統誤差がほぼゼロ(0.10+-0.12)%に抑えられていることが実証された。また線源の散乱光を利用した偏光データの実測から、「かに星雲」が100%偏光していた際には、PoGO+偏光計ではモジュレーションカーブに(41.75+-0.85)%の振幅として検出されることをキャリブレーションすることができた。本研究の目的は、国際研究チームでスウェーデンからPolarized Gamma-ray Observer(PoGOLite, PoGO+)気球を打ち上げ、硬X線帯域において天体の偏光観測を実施することと、将来の望遠鏡と組み合わせた高感度観測を実施するために、焦点面に置く偏光計を開発することであった。2013年にPoGOLite、2016年にPoGO+を放球に成功し、それぞれ数日1週間にわたってパルサー星雲「かに星雲」とブラックホール連星系「はくちょう座X-1」の偏光観測を実施することができた。また焦点面に置く小型偏光計のため、シンチレータを光検出器(Si-PM)で読み出す回路を作成した。2016年のPoGOLiteの再フライトへ向け、担当している読み出し回路の高速化に目途を付けることができた。2016年度は、PoGOLite気球の再フライトを成功させ、取得データから観測天体における偏光信号の有無について結論を出す。28年度が最終年度であるため、記入しない。X線ガンマ線宇宙物理学2015年度は、これまでの基礎実験で得た回路パラメータから、実際に読み出し回路を製作する。完成した回路は、スウェーデンへ持ち込み検出部と組み合わせて、1つの検出器として動作するように完成させる。またスペアの回路を利用し、実際にガンマ線と高速中性子を地上で照射することで、両者の弁別の精度を検証する。今年度に予定通りPoGOLite気球実験の放球を行うことができた。また将来を見据えた検出器の開発も進められている。2016年夏にPoGOLite気球実験の再フライトを実施できることが決定したため、実験場のあるスウェーデンへの旅費が必要になったため28年度が最終年度であるため、記入しない。
頭頸部扁平上皮癌におけるＥＧＦＲインヒビター耐性機構の解明とその克服法

頭頸部扁平上皮癌患者に対する治療の進歩にもかかわらず、その生存率は有意に改善されていない。それゆえ、今回、私はアフリカの食物Mundulea sericea由来の天然物デグエリンの抗腫瘍効果を調査した。デグエリンは舌癌由来細胞株においてEGFで活性化されたAKTを阻害することに伴いアポトーシスを誘導することを示した。また、デグエリンは舌癌由来細胞株においてIGF1R-AKT pathwayを抑制することによりアポトーシスを誘導することを示した。IGF1R-AKT pathwayがEGFR阻害剤耐性機構の一つであると推察されているため、デグエリンがEGFR阻害剤耐性を克服する可能性が示唆された。研究の目的:われわれは、今まで、頭頸部扁平上皮癌におけるEGFR阻害剤の主な耐性機構として、1、EGFRとIL6 ReceptorとのSTAT3を介してのCross Talkの存在、2、EGFRとIGF1RとのAktを介してのCross Talkの存在が考えられることを示した。今まで、デグエリンは、癌細胞株において、STAT3とAktのリン酸化を阻害することが示されている。こいいうわけで、われわれは今回、頭頸部扁平上皮癌細胞株に対するEGFR阻害剤とデグエリンの併用療法の可能性につき検討した。1、デグエリンは頭頸部扁平上皮癌細胞株に対して、viabilityを抑制させ、細胞死を誘導した。2、その細胞死がapoptosisかnecrosisかを見極めるために、Annexin V染色を施行し、デグエリンは、時間依存性にapoptosisを誘導した。3、flow cytometryにより、細胞周期を計測し、デグエリンは、時間依存性にsub G1 arrestを誘導し、2の結果と矛盾しないものとなった。今後の課題1、デグエリンが頭頸部扁平上皮癌細胞株に対してAKTおよびSTAT3のリン酸化を抑制するか否かを調べる2、EGFR阻害剤とデグエリンの併用療法が、頭頸部扁平上皮癌細胞株に与える影響について調べる。また、相加または相乗効果という結果であったならば、その機序につき検討し、その結果を国際学会発表および英文論文という形で世界に向けて情報を発信する。1.デグエリンはSCC-4細胞において、燐酸化型AKT蛋白発現を抑制した。2.デグエリンはSCC-4細胞において、燐酸化型ERK蛋白発現を抑制した。3.デグエリンはSCC-4細胞において、燐酸化型IGF1R蛋白発現を抑制した。4.デグエリンはSCC-4細胞において、Total EGFR蛋白発現を抑制した。5.SCC-4細胞には、constitutiveに燐酸化型EGFR蛋白発現は検出されなかった。6.デグエリンのSCC-4細胞に対するアポトーシス誘導能に、燐酸化型AKT蛋白発現の抑制あるいは、燐酸化型ERK蛋白発現の抑制どちらが関与しているかを調査するため、我々はSCC-4細胞に対して、選択的PI-3 kinase/AKT inhibitorであるLY294002と、選択的MEK inhibitorであるU0126を使用した。その結果、LY294002により燐酸化型AKTを阻害するとアポトーシスの指標であるcleavage-PARPの発現が上昇し、一方、U0126により燐酸化型ERKを阻害するとcleavage-PARPの発現が上昇しなかった。これらの結果は、デグエリンのアポトーシス誘導能に、燐酸化型ERKの阻害よりむしろ燐酸化型AKTの阻害が関与していることを示している。7.デグエリンはHSC-4細胞において、EGFで刺激されたAKTの活性化を阻害することに伴いアポトーシスを誘導した。以上の結果から、デグエリンは、頭頸部扁平上皮癌においてEGFR-AKT pathwayおよびIGF1R-AKT pathwayを抑制することにより、アポトーシスを誘導することが示唆された。目的:頭頸部扁平上皮癌では、EGFRが高発現しており、またEGFRの高発現と予後との相関関係が言われている。しかしながら、EGFRインヒビター単剤での奏効率は決して高いとはいえない。そこで我々は、頭頸部扁平上皮癌におけるEGFRインヒビター耐性機構の解明とその克服法について検討した。方法:1、対象は当科にて加療した頭頸部扁平上皮癌86例である。手術もしくは生検にて採取された検体は、速やかにー80度で保存し、その後DNAを抽出した。

Cycleave PCR法にて、EGFR sensitive mutationといわれている、EGFRのexon19の欠失およびL858, G719X, L861Qの点突然変異の検出を試みた。2、CycleavePCR法にて、EGFR resistant mutationといわれている、EGFRのT790M変異の検出を試みた。3、頭頸部扁平上皮癌におけるEGFRインヒビター耐性機構の解明とその克服法につき、過去の文献を基に、仮説化した。(文献review)結果1、頭頸部扁平上皮癌において、EGFR sensitive mutationは検出されなかった。(0/86)2、頭頸部扁平上皮癌において、EGFR resistant mutationは検出されなかった。(0/86)3、頭頸部扁平上皮癌において、EGFRとIGF1Rとの、PI3kinase/Akt pathwayを介したcross talkの存在、また、NFkBとSTAT3とのcross talkの存在がEGFRインヒビター耐性機構の主であると仮説化した。考察、今後の課題:以上の結果より、頭頸部扁平上皮癌におけるEGFRインヒビター耐性機構として、EGFR遺伝子変異よりは、むしろ、EGFRを取り巻くsignalingとそのcommunicationの存在が考えられた。私は、現在、NHO東京医療センター聴覚平衡覚研究室所属の医師として科学研究費を取得しているが、常勤先は、那須赤十字病院耳鼻咽喉科であり、普段は臨床を施行している。そして週1回研究日を取得しており、週1回、研究を施行しているので、やや遅れている。本研究に沿った、国際学会での発表、英文での総説、および依頼英文著書の執筆という点では満足であるが、肝心の細胞株での研究が、まだデグエリン単剤での効果のデーターしか、でていないのが現状である。依頼著書、依頼の総説などと、実際の実験とのバランスをいかにとっていくかが、今後の課題である。前記の理由で、本研究はやや遅れているが、私は、本年6月から、奥羽大学歯学部医療総合学講座に准教授として赴任予定でありますので、6月以降、週5日または6日研究に従事できる予定であり、下記の研究目標を是が非でも完逐させる予定である。デグエリンが、頭頸部扁平上皮癌細胞株に対して、細胞障害作用を有しているデータはすでに持っている。ゆえに1、その細胞障害作用がアポトーシスによるものか、それともネクローシスによるものかを調べる。2、アポトーシスによるものであるならば、その機序を調べる。(EGFR下流にあるMAPK, STAT3,AKTの活性に対するデグエリンの影響を調べる。)3、EGFRインヒビター+デグエリン添加により、デグエリンがEGFRインヒビターの増殖抑制効果を増強させるか否か調べる。4、デグエリンによる増感効果が認められたとしたら、その機序を調べる。(デグエリン添加により、EGFRインヒビター耐性因子といわれているcyclin D1,cortactin,およびEMTに与える影響について調べる。)1、デグエリンが頭頸部扁平上皮癌細胞株に対してAKTおよびSTAT3のリン酸化を抑制するか否かを調べる2、EGFR阻害剤とデグエリンの併用療法が、頭頸部扁平上皮癌細胞株に与える影響について調べる。また、相加または相乗効果という結果であったならば、その機序につき検討し、その結果を国際学会発表および英文論文という形で世界に向けて情報を発信する。
脊髄性筋萎縮症原因遺伝子産物によるmRNA前駆体制御機構の解析

脊髄性筋萎縮症(SMA)は、Survival motor neuron 1(SMN1)の欠失・変異によりSMN蛋白質の減少が生じる。SMAでは、SMNは同染色体上にあるSMN2 mRNAからも翻訳されるが、その前駆体のexon7スキッピングが惹起され翻訳された蛋白質はその機能を失う。本研究では、SMNの発現変化による内在SMN2mRNAの制御機構ついて調べた。その結果、SMA患者由来細胞に外来SMN1 mRNA導入後8hにおいて、トータルの内在SMN2 mRNAの発現と内在SMNの発現亢進が観察された。このことからSMNの発現変化によりSMN2発現の転写活性が亢進することが示唆された。脊髄性筋萎縮症(SMA)の原因遺伝子は第5番染色体に位置しているsurvival of motor neuron 1(SMN1)であり、この遺伝子の変異・欠失がその病態と関連することが報告されている。一方、同染色体上の同じ遺伝子産物を翻訳するSMN2遺伝子が存在し、この塩基配列はSMN1とエキソン・イントロンを含み5つの塩基の違いのみである。SMA患者では、SMN2mRNA前駆体がスプライシング機構により、50-90%の割合でエキソン7のエキソンスキッピングを生じ、生産されたmRNAやその翻訳産物は不安定で機能しないことが報告されている。そのスプライシングパターンによるSMN蛋白質の発現がSMA患者の病態にどのような影響を及ぼすのかは明らかにされていない。本研究年度において、正常ヒト皮膚線維芽細胞、Type I SMA患者由来皮膚繊維芽細胞、HeLa細胞、胚性腫瘍由来細胞NTERA-2,神経芽細胞腫SK-N-SH細胞におけるSMN2 mRNA前駆体のスプライシングのパターンをRT-PCR法及びSMN2エキソン8の特異配列を切断する制限酵素(DdeI)処理法を用いて分析した。その結果、正常ヒト皮膚線維芽細胞、HeLa細胞では、SMN1 mRNAの発現が高く、SMN2の発現レベルは低く、エキソン7のスキッピングはほとんど見られないことが明らかとなった。さらに、Type I SMA患者由来皮膚細胞の2つの株を用いて検討した結果、SMN2の発現レベルとスプライシングパターンが異なることを見出した。現在、スプライシングアッセイ法を構築中であり、SMN発現ポリオウイルスベクターを用いて継時的にSMN蛋白質を発現させ、独自に開発したSMN蛋白質測定法(特許出願中)を駆使して、SMN蛋白質がSMN2 mRNAの発現とスプライシングパターン変化への影響を調べている。本年度は、外来からのSMN蛋白質発現によるSMN2 exon7スプライシング制御メカニズムを解析するために、ベクターによる導入後の正常ヒト由来線維芽細胞及び脊髄性筋萎縮症患者由来線維芽細胞(2株)を用いて解析を行っている。外来から導入されたSMN蛋白質をウエスタンブロット法で確認し、経時的にトータルRNAを回収し、スプライシングアッセイ法としてRT-PCR法を確立し、内在のSMN2 mRNAのスプライシングを評価した。その結果、正常ヒト由来線維芽細胞では、SMN1/2 mRNAのスプライシングには影響が見られなかった。一方、脊髄性筋萎縮症由来細胞では、導入8hで内在全長のSMN2の発現増加傾向が見られたが、現在詳細に調べている。さらに、導入されたSMN蛋白質はGFPとの融合蛋白質であるので、蛍光顕微鏡下で可視化できる。発現したSMN-GFPはSMN蛋白質複合体(gem構造)またはCajal小体様の形態が観察されたため、HeLa細胞、正常ヒト線維芽細胞、脊髄性筋萎縮症由来線維芽細胞の内在のgem形成能を抗SMN抗体、抗gemin3抗体を用いた免疫組織染色法で調べたところ、SMN蛋白質の高い発現であるHeLa細胞、正常ヒト線維芽細胞ではgem構造であることがわかり、脊髄性筋萎縮症由来線維芽細胞では内在のSMN蛋白質の量に依存することが明らかとなった。そこで、HeLa細胞を用いて、gem構造またはCajal小体を変化させる因子や低分子化合物を探索する系を確立した。この系を用いてgem構造またはCajal小体を変化させる因子や低分子化合物のスクリーニングを開始し、スプライシングに影響するかどうか検討中である。本年度は、正常ヒト線維芽細胞及び脊髄性筋萎縮症患者由来細胞を用いた外来からのSMN蛋白質発現系によるSMN2スプライシング系を構築し、経時的なスプライシング状態を解析できるようになった。より感度の良いレポーター遺伝子を導入したスプライシングアッセイ系の確立は遅れているが、並行してSMN蛋白質複合体の挙動とスプライシングへの影響を解析することを進めていく。本年度及び研究期間全体を通して、SMN蛋白質の発現によるSMN2 pre-mRNA exon7スプライシング制御メカニズムを解析するために、SMN蛋白質の測定法、SMN1/SMN2mRNAを区別する方法やスプライシングアッセイ法などを駆使して研究を行ってきた。前年度までに、外来から導入したSMN蛋白質を発現させ、その細胞のトータルRNAを用いたRT-PCR法を用いてSMN2の発現レベルの解析を行っていた。本年度では、正常ヒト皮膚線維芽細胞やSMA患者由来線維芽細胞を用いて得られたPCR産物をSMN2 exon8特異的に切断する制限酵素Dde Iを用いて、SMN1/SMN2 mRNAの区別を行い、制限酵素処理されたSMN2mRNAの発現レベルを調べた。また、外来から導入しGFP-SMNを発現させた脊髄性筋萎縮症(SMA)患者由来線維芽

細胞において、ウエスタンブロット法により内在のSMN蛋白質の発現が亢進することが示唆された。そこで、内在のSMN2 mRNAの発現およびexon7のスキッピングに対する影響を調べたところ、GFP-SMN蛋白質の発現する8hにおいて内在のトータルSMN2 mRNAの発現が増加することが明らかとなった。さらに、スプライシングアッセイ法として、レポーターアッセイ法の構築が遅れたので、リアルタイムqPCR法によるアッセイ法に切り換え、同実験を行ったところコントロールのGFPを発現させた細胞に比較してGFP-SMNを発現した細胞では、全長のSMN2 mRNAの発現が2.5倍上昇した。一方、exon7のスキッピングしたSMN2Δ7も1.4倍と上昇した。これらの結果から、外来からのSMN蛋白質の発現による内在SMN蛋白質の発現増加は、SMN蛋白質のSMN2mRNAの転写促進機能を有することが示唆された。脊髄性筋萎縮症(SMA)は、Survival motor neuron 1(SMN1)の欠失・変異によりSMN蛋白質の減少が生じる。SMAでは、SMNは同染色体上にあるSMN2 mRNAからも翻訳されるが、その前駆体のexon7スキッピングが惹起され翻訳された蛋白質はその機能を失う。本研究では、SMNの発現変化による内在SMN2mRNAの制御機構ついて調べた。その結果、SMA患者由来細胞に外来SMN1 mRNA導入後8hにおいて、トータルの内在SMN2 mRNAの発現と内在SMNの発現亢進が観察された。このことからSMNの発現変化によりSMN2発現の転写活性が亢進することが示唆された。各種細胞のSMN1/2のスプライシングパターンが順調に解析でき、現在その定量解析を進めている。さらに、新規SMN蛋白質測定法の開発も進行中でより詳細にSMN蛋白質の発現レベルを解析できるようになった。スプライシングアッセイ系の構築がやや遅れているが、他のアッセイ法も検討しているのでおおむね順調に進展している。今後、内在のSMN蛋白質の発現量が異なる脊髄性筋萎縮症患者由来細胞を用いてSMN2スプライシングパターンを経時的に詳細に調べる予定である。さらに、SMN蛋白質の発現導入により構築されるgem構造とスプライシンングへの影響を調べるために、培養細胞系を用いてスプライシング因子、gems構造に影響を及ぼす因子や化合物の探索を行い、スプライシング制御への影響を解析する予定である。公益財団法人微生物化学研究会微生物化学研究所ホームページhttp://www.bikaken.or.jp細胞生物学今後、SMN2スプライシングパターンを解析するスプライシングアッセイ法を構築し、外来からの遺伝子導入や薬剤による継時的なSMN蛋白質を発現させ、独自に開発したSMN蛋白質測定法(特許出願中)を駆使して、SMN蛋白質がSMN2 mRNAの発現とスプライシングパターン変化への影響を調べる予定である。さらに、SMN2mRNA前駆体のスプライシング制御に関わる分子の解析を行う予定である。購入予定だった細胞培養用プレートを物品費として購入する際、目的のロットの在庫切れで購入が遅れ、さらに値段の高騰により購入残額が足りなくなったため。
地球GISに基づく土地被覆変動の監視

1.一年間12カ月分のmonthly GVIデ-タに対しクラスタ-分析を適用することにより、植生の季節変動パタ-ンの相違から土地被覆分類を行うことが可能である。本研究では地球の全陸域を13のカテゴリ-の分類できた。2.地球の全陸域を1度メッシュでカバ-する既存の土地被覆デ-タを教師として、一年間12カ月分のmonthly GVIデ-タを最尤法分類した結果、氷、熱帯林、ツンドラ、砂漠が90%以上の正解率で、常緑針葉樹林、サバンナが70%以上の正解率で分類できることがわかった。3.太陽天頂角がGVIデ-タに及ぼす影響の度合をLOWTRAN7を用いて明らかにした。太陽天頂角が90度に近づくに従って、太陽天頂角による影響の補正が難しくなることがわかった。4.NOAAー9とNOAAー11とでは観測時刻が異なり従って太先天頂角が異なるためNDVI値に変化があることがわかった。また同じNOAAー9でも全陸域のGVIデ-タの年毎のヒストグラムを比較すると明らかに傾向的な変化がある。年毎の土地被覆の変化を抽出するためには先ずこれらのデ-タの変化を補正する必要がある。今後課題としてつぎのことがあげられる。1.上記4に述べたように、GVIデ-タを補正し、土地被覆の変化抽出を行う。2.GVIデ-タ以外にAVHRRチャネルデ-タ、標高デ-タ、緯度情報等を併用した土地被覆モニタリングの可能性を調べる。
非線形ロバスト制御系設計手法の開発及び機械系への応用

1.多軸機構をもつシステムの同期制御理論と応用まず、設計理論として、並列構造を基本とした積分器嵌め込み型制御、LQ最適型制御、H∞外乱抑制型制御等の制御方式を対案し、これらの設計手法に、パラメータが未知の場合と不可検出外乱を有する場合、適応機能を導入する改善手法を提案し、並列型構造をベースにする同期制御器設計理論をほぼ完全にまとめることができました。また、これらの手法を半導体露光装置の同期制御へ応用し、コンピュータシミュレーションと当研究室に実験設備において、実験検証を行いました。この研究で獲られた結果は、平成14年度の日本SICE学術講演会で発表し、現在国際学術誌への投稿論文を作成中です。2.ツインジャイロアクチュエータの同期制御ツインジャイロによって駆動されるシステムにおいて、ジャイロの同期回転を実現するための非線形制御手法を開発し、コンピュータシミュレーションによって宇宙構造物における応用実験を行いました。本研究は、同類の研究成果の中で、制御対象の非線形特性を近似なく完全に扱った論文としては、初めての結果となります。この研究結果は平成15年度自動制御連合講演会にて発表し、帰国後も共同研究を進める予定です。3.空気圧サーボシステムの適応制御手法とその応用空気圧によって駆動されるサーボ系において、作業環境などの制限から生じる静摩擦特性に対する適応補償手法を提案し、空気調整弁の位置きめ制御に応用し、実験室にて実機実験を行いました。この研究成果は平成15年度SICE学術講演会で発表しました。この他に、平成14年はアメリカフロリダで開かれた非線形制御に関する国際会議に出席して、関連の論文発表を行い、日本でも電気学会の研究会などで論文発表を行いました。また、研究期間中は、当研究室の大学院博士前期課程の院生2名と卒業研究の学生と協力体制を組んで研究を進め、研究室の他のスタッフとも良好な協力関係を築くことができたことを記しておきます。同期制御手法の開発とX-Yステージにおける応用まず、状態方程式によって表される制御対象に対して,同期制御系の設計手法を提案した。この同期制御手法は,従来よくあるマスター・スレーブ式構造から、パラレル型に変更し,同期化誤差を設計仕様に陽に反映させることによって,同期化精度を向上させる発想に基づいたものであり、制御器は状態フィードバックをベースに、適応機能を持つ同期化制御補償を導入することによって構成される。また、状態フィードバックゲインの選択には,以下二通りの手法を用いることを提案した。(1)LQ最適レギュレータ設計手法(2)H∞混合感度関数準最適化設計(3)単純比例ゲインなお、上記提案した設計手法は、日本のある大手半導体露光装置メーカーが開発現場で使用している多自由度ステージのシミュレータを用いてシミュレーションを行い、現在使用している制御系より良い制御性能が確認できた。摩擦特性を伴う空気調整弁の制御手法の開発機械系などによく見られる非線形不確かさとして静摩擦特性が挙げられる。本研究では,静摩擦特性が顕著に現れる空気圧調整弁を対象に、未知外乱が加わる場合のロバスト制御手法を開発し,産業現場で広く使われる実際の製品を用いて、実験による検証を行った。
部分構造合成法を応用する新しい構造と振動制御系の同時最適設計に関する研究

1.構造系と制御系の同時最適設計において設計変数の数を減らすことのできる新しいアルゴリズムを提案した。アルゴリズムは,設計目標に対する感度の高い分系を選択し,その分系を変更するという考え方に基づいている.ここでは設計対象の機械構造物全体(以後これを全系と呼ぶ)をいくつかの部分構造(以後これを分系と呼ぶ)に分割している.制御系については,各分系毎に複数のコントローラがあるものとする.分系の設計変数の値の変化に対して全系の評価関数の値の変化が大きな分系が,感度の高い分系であると定義した.このとき全系の構造系と制御系の評価関数が,分系毎の構造系と制御系の評価関数のそれぞれの和で表されるようにすれば,分系の評価関数の値の変化がそのまま全系の評価関数の値の変化となる。2.数値計算においてトラス構造の設計を行い,最適化で取り扱う設計変数を減らすことが可能であることを確認した.設計の個々の繰り返し過程で,構造系の評価関数に対する感度の高い分系を選択し,構造系の評価が向上するように構造と制御を変更している.同時に制御系の評価関数に対する感度の高い分系を選択し、制御系の評価が向上するように構造と制御を変更している.従って設計の個々の繰り返し過程では,少数の分系でのみ構造と制御の変更を行うことになり,実質的に取り扱う設計変数の数が設計変数の総数よりも少なくできた。3.従来の同時最適設計と新しい同時最適設計で設計したトラス構造の振動制御実験を行った.提案したアルゴリズムに基づいて,トラス構造物の構造と振動制御系の同時最適設計を行った.新旧2種類の同時最適設計で得られたトラス構造の制御性能はほぼ同じであり,提案した新しい同時最適設計法の有効性が確認できた.1.構造系と制御系の同時最適設計において設計変数の数を減らすことのできる新しいアルゴリズムを提案した。3.従来の同時最適設計と新しい同時最適設計で設計したトラス構造の振動制御実験を行った.提案したアルゴリズムに基づいて,トラス構造物の構造と振動制御系の同時最適設計を行った.新旧2種類の同時最適設計で得られたトラス構造の制御性能はほぼ同じであり,提案した新しい同時最適設計法の有効性が確認できた.
イタリア水稲生産技術の国内導入に対する経営的評価

イタリアの稲作では平均的な農業経営(43ha規模)で費用合計が65円/kgである。圃場を平らにする手段をしろかきからレーザーレベラへ転換したことにより、圃場1筆の拡大が容易であること、第二次世界大戦後の農地解放がなかったことを背景として、大規模化と省力化が進んだ。大規模化以外に種子、肥料、農機具が日本国内より低価格なこと、高密度の直播栽培と管理法の省力化が低コスト化の要因である。なお、現地では高密度播種条件でも倒伏を生じていない。本年はイタリアの水稲産地における現地調査に基づき,I日本より雇用労賃が高く,平均50ha程度のイタリア水稲作において,水稲生産費(1 kgあたりの費用合計)が日本に比べ約1/4程度に低い理由を解明した。IIイタリアの水稲生産技術のうち,日本において導入可能かつ効果のある技術を明らかにした。I.生産費が少ない要因:1種の単価が著しく安い.2肥料や農薬を中心に資材が安い(米国から輸出される際のFOB価格と比較すると,イタリアはFOB価格の平均に近い価格で生産者が入手しているが,日本は2倍近い.)3農機具費について,イタリアは規模が大きく,減価償却期間は11年とされており,実働は30年を超えることもあり10aあたりの農機具費は日本より割安.4建物費の位置づけが異なる.建物や乾燥調製施設が地主のものであり,農業経営者は地代を支払うと実質無料で建物を使用する制度となっている.5省力化が進み,労働時間が3.66時間/10aと日本よりもかなり少ない.時間あたりの雇用労賃自体は日本より実質高く,経営者の省力化への動機づけとなっており,圃場区画の拡大や大型機械による省力化に結びついています。以上,5点を指摘できる。II.Iの5の省力化に至る技術が,日本において導入可能かつ効果のある技術と考えられる.具体的には圃場均平と圃場の拡大を行うレーザーレベラー等の活用を基幹とした無代かきによる耕起整地部分の省力化,極めて高い直播適性を示す品種導入,の2点が考えられる.平成25年度の成果:研究結果を学術論文へ投稿し採択された.農業関係雑誌等に投稿した.また,北陸の40ha台の経営における生産費などを把握しイタリアと比較した.研究機関全体を通じた成果:平均的規模の稲作経営に対して作業実態調査を行い,生産費について日本の経営と比較し,玄米重1kgあたりの費用合計が60円/kg台(1EUR=130円として)と日本の平均経営に対して約1/4,点播直播を用い生産費低下を進めたモデルに対して約1/2であることを示した.具体的構成要素について,イタリアでは1kgの種子が100円以下と特に低い.農業機械費については,ブロードキャスタなど,畑作用の機械の汎用利用も生産費低下に貢献している.また,大規模化によるメリットがある.労働費については,雇用労賃単価が日本より実質高い一方で,一筆面積の拡大等によって労働時間は4時間以下と,日本より大幅に省力化されている.一筆面積の拡大にはレーザーレヴェラーが貢献している.代かき作業をレーザーレヴェラーによる均平へと代替することは,圃場の大区画化による日本の水稲生産費低下へのポイントと考えられる.また,イタリアの直播稲作は表面播種において出芽苗立ちが安定しており,その理由の一つは苗立ち時期の水管理が解りやすく明確になっていることにあることを示した.イタリアの稲作では収穫時にほとんど倒伏していないことが第二の特徴である.その理由は「コシヒカリ」等より高い耐倒伏性,個体密度の増加に応じて稈が短くなる傾向という品種特性を持っているためであり,それを高密度播種が引き出していることを解明した.研究の意義・重要性:農業経済学において初めてイタリア稲作の経営構造と技術構造を解明した.日本の直播稲作研究においては,イタリアの品種が高い耐倒伏性を有していること,それを高密度播種が引き出すという指摘は,有用な知見を提供した.イタリアの稲作では平均的な農業経営(43ha規模)で費用合計が65円/kgである。平成23年6月,日本農業経済学会にて,「イタリアにおける水稲栽培の現状と国内およびイタリアの生産費比較」として,当研究に関連したポスター報告を行った.本報告は,2011年度同学会ポスター賞を受賞した.本報告の目的は,一つは農業経済研究分野において最も最近に工藤寿郎が示したイタリアの水稲生産についての知見に,現在の知見を整理して更新すること,もう一つは日本における水稲生産費を減少させる上での技術的課題について,提示することである.工藤文献と現在のイタリアの水稲生産には,主に5点の差異が現れている.(1)イタリアの稲作経営の平均規模が50haに拡大したこと,(2)播種量が20kg/10a程度とかなり日本より多いこと,(2)圃場内にトラクタを進入させて追肥等を行うこと,

(4)労働時間が平均23時間/ha程度へ低下したこと,特に播種は13分/haと,きわめて短時間である.(5)新たに寿司用など日本食に使用することを想定した水稲品種が現れていることである.イタリア式の水稲生産の導入によって,生産費減少を達成する上での技術的課題として,本報告では5点の課題の存在を提示した.(1)国内にて無代かき散播直播のメリットがどの程度得られるか把握すること,(2)多量の播種を実施する上で,種苗費の低下方法,(3)散播後に追肥等を行うことにトラクタを用いることによるメリットとデメリットの把握,(4)対応する雑草制御方法,(5)大型化したトラクタの踏圧の影響を把握すること,である.また平成24年3月,内部資料として,「北イタリアにおける低コスト直播稲作に関する報告書」を作成した.この資料は,23年度中に行った文献レビューの結果を反映させ,研究代表者が得た伊文の資料の一部を翻訳したもの,23年度のイタリアにおける調査時の生産者や研究者への聴取調査結果,未公開の報告論文を抄録したものである.3年間のうち2年目を終了した時点で,研究目標に上げた,「本研究は、国産米の生産費の低下のために、I日本より雇用労賃が高く、平均50ha程度のイタリア水稲作において、水稲生産費(1 kgあたりの費用合計)が日本に比べ約1/4程度に低い理由を解明する。IIイタリアの水稲生産技術のうち、日本において導入可能かつ効果のある技術を明らかにする。III試算とシミュレーションによって、これらを日本に導入した場合における、生産費が低下する効果を明らかにする。」のうち,IIIについて実際に回答を提示したため,順調と回答した.また,結果は学会発表が1回,農林水産省関連の機関紙に2回,農業経営者が読む商業誌へ3回発表し,現在投稿中の論文候補が1本あり,アウトプットも行なっている.必要な文献の翻訳が進んでいる.また,現地における生産者や,研究者との議論を通じて,イタリアにおける水稲生産に於いて,播種直後の管理作業について,日本における直播と比べて特徴があることが推察された.具体的には,代かきのあるなし,直播された種子の置かれる位置の差,除草方法の違い,である.24年度の現地調査において,把握すべきポイントが明らかになった.国内のリゾット用米品種生産者や,水稲直播を導入して飼料用米を低コストにて生産する農業経営に対する調査を行い,イタリアの生産の実態と比較する.さらに,試算等によって,新技術を日本に導入した場合における生産費が低下する効果等を明らかにする.24年度4月から6月に,イタリアにおける水稲生産の,初期管理作業を詳細に把握するため,現地調査を実施する.これによって,低コストなイタリアにおける散播直播が安定した結果を示す理由を解明する.本研究課題の推進のため,次年度の研究費は,交付申請時の計画どおり使用する。なお,次年度使用額91,651円は,研究費を効率的に使用して発生した残額であり,次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。具体的には,国内のリゾット用米品種生産者や,水稲直播を導入して飼料用米を低コストにて生産する農業経営に対する調査を行い,イタリアの生産の実態と比較する。さらに,試算等によって,新技術を日本に導入した場合における生産費が低下する効果等を明らかにする予定である。本研究課題の推進のため,次年度の研究費は,交付申請時の計画どおり使用する.なお,次年度使用額381,677円は,研究費を効率的に使用して発生した残額であり,次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する.
DNA分析による旋尾線虫亜目の幼虫type Xの種名の決定

旋尾線虫亜目の幼虫type Xの種名を決定するために亜目の中の各種寄生虫の18SrDNAの塩基配列を比較する方法を採用した。現在までにtype X幼虫、日本顎口虫成虫、ドロレス顎口虫成虫及び幼虫、犬フィラリア成虫、タラの精子のゲノミックDNAを抽出し、それらを6種類のプライマー(18SrDNAのなかで比較的保存されている部分)を用いてPCRを行い、18SrDNAの中央部約1.1kbを増幅させた。これらをシークエンスし、塩基配列を比較した所、1.同一属であるドロレス顎口虫と日本顎口虫は96%以上一致した。2.寄生虫とタラの精子ではかなり異なり、一致率75%であった。3.ドロレス顎口虫成虫と同幼虫ではほぼ一致した。これらの結果から、この18SrDNAのシークエンスを比較し、これを元にして系統樹を作製すればtype Xがどの科に属するかを推定することが可能になったので、現在さらに他の寄生虫を集め、DNAを抽出する段階にある。一方、短いプライマーを使ってRAPD PCRを行った所、顎口虫の親子の間ではバンドパタンが一致するのに対して、type X幼虫のバンドパターンは鯨に寄生していてtype X幼虫と形態的に非常によく似ているCrassi cauda grampicolaの成虫との間では異なり、少なくともtype Xの親ではないことが判明した。