hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液を用いた生体時刻測定法の確立

生体リズムに基づく革新的歯科医療実現のために、非侵襲かつ簡便な生体時刻測定法の確立を目的に、遺伝子発現プロファイルを指標としてマーカータンパクのスクリーニングを行い、ARRB1を同定した。本タンパクは多様な唾液試料を用いた解析においても概日リズム発現パターンを示し、本生体時刻測定法の有用性が示唆された。また、採取した唾液試料の保存には、4M尿素を含む緩衝液が適していることを発見した。唾液試料を用いたウェスタンブロット解析時の内部標準タンパクとしてActinが適していることを見出した。生体時刻測定に用いる唾液試料に関して、全唾液と純唾液が想定される。耳下腺唾液はカービーカップを用いて容易に採取できるが、解析に用いる量を採取するには時間がかかりすぎる。顎下腺や舌下腺は採取するために技術を要し、簡単に採取でいない。さらに口蓋腺、口唇腺などの小唾液腺は分泌量も少なく、採取も非常に困難である。全唾液は、採取が容易で、確実に採取できるが、口腔内微生物や白血球、食品由来のタンパク等が含まれており、夾雑物を除くために遠心分離やフィルターによるろ過等の前処理が必要となる。再現性良く生体時刻を測定するためには、採取時間が長いものは不適であることより、全唾液を用いることとして種々の条件について検討を行った。全唾液には多くのプロテアーゼが含まれており、特に口腔内炎症疾患を持つ患者はペプチダーゼの活性が上昇している。このため唾液採取後、低温保存するプロトコールや唾液タンパクの分解を防ぐRNAprotect Saliva reagent (Qiagen)の添加が有効であるとの報告がある。そこでRNAprotect Saliva reagent添加し保存、その後同唾液試料を用いてウェスタンブロット解析を試みたところ、保存試料そのままでは塩の析出が観察され使用できないことが判明した。そこでタンパク変性材として4M尿素を含む緩衝液を用いて唾液試料を保存し、ウェスタンブロット解析したところ、37°Cで24時間放置しても生体時刻マーカータンパク、βーアクチン共に継時的な分解は見られず、4M尿素を含む緩衝液が唾液試料の保存に適していることが判明した。これらの実験より、生体時刻測定のために採取された唾液試料の保存条件が確定され、今後多様な唾液試料を解析する際にも、試料間での試料取り扱いに起因する誤差を最小限にすることができるようになった。全唾液を生体時刻決定に用いる場合においても、体内時計による日内変動のみならず、個々の唾液腺の変動、食事やホルモン等の刺激、疾患、個体差により全唾液腺に含まれるタンパク組成は変動する。このため採取した全唾液において体内時計による変動以外のタンパク変動要因を補正する必要がある。そこで、このための内部標準マーカータンパクの同定を行った。同一人物で採取時間が異なる全唾液試料(AM 8:00とPM 8:00)2組に対してタンパク変性材として4M尿素を含む緩衝液を用いて全唾液試料を保存し、IgA, Lysozyme, Albumin, Fibronectin, Mucin, Amylaseをウェスタンブロット解析した。市販の抗体を用いて通常の実験方法(Nucleic Acids Res. 2012 Oct;40(19):9482-92)にて検出を試みたところ、Fibronectin, Mucinはタンパクバンドを検出することができなかった。さらに唾液試料濃度や抗体濃度、ケミルミネッセンス増感剤等を用いても同一ロットの抗体ではFibronectin, Mucinは検出不可能であった。これらのタンパク質については、次年度ロットの異なる抗体を用いて再度検討を行う予定である。本来、内部標準タンパク質としては、個体間の発現量の差があったとしても採取時間によって変動が少ないタンパクが候補となる。そこで採取時間による発現変動が一番小さいタンパクであるばかりでなく、性別や年齢に依存せず機能することも重要である。今年度の研究結果からはβ-Actinが上記条件を一番満足していたが、今年度検出できなかったFibronectin, Mucinを次年度再検討したうえで、最適の内部標準タンパク質マーカーを確定したい。今年度の研究目的は内部標準マーカータンパクの同定することである。前述のようにこれまでのところβ-Actinを候補とする結果を得ている。本年度当初予定していた候補タンパク質すべてを比較検討することができなかったが、現状では全唾液を用いて生体時刻を測定できることが判明しており、研究が当初計画通りうまく進行していると考えられる。ヒト唾液腺細胞にRev-erb alphaおよびBmal1を発現させた後、100 nM Dexamethasoneで2時間処理することにより当該細胞の概日時計をリセットした。次いで、ChIP (Chromatin immunoprecipitation)を行い、Rev-erb alphaおよびBmal1により転写調節されている遺伝子領域を回収、精製した。回収されたDNAをプローブとしてプロモーターDNAアレイ(NimbleGen社製)を用いて解析した結果、Bmal1により転写調節されうる遺伝子が797、Rev-erb alphaにより転写調節されうる遺伝子が2076あり、そのうち両方に調節されている遺伝子は500であった。これら遺伝子群は、唾液腺固有の時計システムで制御されうる遺伝子群である。この唾液腺固有の時計システムで制御されうる遺伝子群のうち、100 nM Dexamethasoneで2時間処理して時計遺伝子をリセットし、24時間後ならびに36時間後のRNAを用いてAgilent社製マイクロアレイ解析を行い、概日発現変動量の大きい遺伝子の選択を行った。両時刻において変動が0.5(底が2の対数)以上の遺伝子を選択したところ1368

遺伝子が選択され、このうち先のChIP on Chip解析と重複する遺伝子は22となった。選択された22遺伝子のうち、DNAマイクロアレイにおいて遺伝子発現が非常に弱い、シグナル強度が50以下の遺伝子を除いた16遺伝子について、ヒト正常唾液腺細胞においての遺伝子発現の有無を市販のヒト正常唾液腺RNA (TAKARA)を用いてRT-PCRにて検討し、8遺伝子を同定した。選択された8遺伝子の概日リズムについてRT-PCRにより検討した結果、概日リズム周期性が観察された遺伝子は3遺伝子に絞られ、これら遺伝子のうちで、ヒト唾液を用いてタンパク質の検出ができたのはARRB1のみであった。さらにActinを対象タンパク質としてウェスタンブロット解析を行ったところ、いずれの唾液試料においてもARRB1タンパクの概日リズム発現を確認することができた。生体リズムに基づく革新的歯科医療実現のために、非侵襲かつ簡便な生体時刻測定法の確立を目的に、遺伝子発現プロファイルを指標としてマーカータンパクのスクリーニングを行い、ARRB1を同定した。本タンパクは多様な唾液試料を用いた解析においても概日リズム発現パターンを示し、本生体時刻測定法の有用性が示唆された。また、採取した唾液試料の保存には、4M尿素を含む緩衝液が適していることを発見した。唾液試料を用いたウェスタンブロット解析時の内部標準タンパクとしてActinが適していることを見出した。今年度の研究目的は唾液試料の採取方法ならびに保存方法を確定することである。前述のように尿素存在緩衝液にて保存した全唾液を用いて生体時刻を測定できることが判明しており、研究が当初計画通りうまく進行していると考えられる。抗体ロット入手の関係で、今年度予定していた全ての候補タンパク質を比較検討することはできなかったが、これまでのところβ-Actinを候補とする結果を得ている。今年度検出できなかったFibronectin, Mucinを次年度再検討したうえで、最適の内部標準タンパク質マーカーを決定し、検出条件等の詳細を確定したい。次年度においては、経時的に採取した唾液試料を用いて計測し、実際の時刻変動結果を解析する。また性別、年齢別の唾液試料を用いて試料条件による結果変動を検証する。最終的には既存の他の分子マーカーを用いた時刻測定法と比較検討を行う予定である機能系基礎歯科学唾液の保存条件を確定し、唾液試料保存によるタンパク分解の影響について知見を得ることができた。4M尿素を含む保存液中に保存するとタンパク分解が抑えられるのみでなく、ウェスタンブロット解析等にもそのまま使用することができるため、本溶液に唾液試料を保存することにした。今後、尿素存在下保存唾液試料を用いて次年度以降の実験を進めていく予定である。ロットの異なるFibronectin, Mucin抗体の入手が当該年度中にできなかった。また成果発表のための学会にスケジュールの都合で1日しか参加できなかった。
解釈レベル理論による環境コミュニケーション方法に関する行動経済学的研究

前年度において広瀬の二段階モデルの行動意図形成段階では、心理的距離が小さい場合に行動に伴う費用や行動結果がもたらす損失面の評価が高まることが環境配慮行動としての環境配慮米の購買行動で見られた。この結果を受けて、Fujita et al.(2006)の方法により心理的距離を小さくする(解釈レベルを低レベル解釈に)操作する実験群と、無操作の対照群に被験者を分けたWEBアンケート調査を実施した。環境配慮行動としては、エコカーなどの次世代自動車の購入行動を取り上げた。その結果、実験群の心理的距離を小さくする操作は有効に機能し、心理的距離の大きさを表す行動認識尺度(BIF)は実験群で有意に小さくなっていることが確認され、心理的距離を小さくする低レベル解釈操作が有効に機能した結果となった。調査結果では、低レベル解釈が環境に優しい自動車選択行動において価格と燃費というコスト面の重要度評価を増大させることとなり、行動の実行可能性評価において損失回避性が選択行動に強く作用することが検証された。一方、実験群ではCO2削減と最大走行距離という便益面の重要度は低下していることも確認された。このような損失と便益に対する評価の違いが最終的なエコカー選択行動に影響し、実験群では対照群よりもハイブリッド車や電気自動車などのエコカーの選択可能性がガソリン車よりも高くなることが明確となった。こうした選択肢の損失面と便益面に対する評価の差がエコカー購入行動では環境配慮を損なわずに意思決定されることが明らかとなった。エコカーの購入選択行動において心理的距離を小さくした低レベル解釈操作を施した実験群では、無操作の対照群よりも損失面を高く評価し、便益面を低く評価することが明らかとなった。この結果は、心理的距離が小さくなると損失評価のウエイトが増加することを裏付けるものとなった。また、自動車購入という選択行動は何年かに一度行うという頻度の意思決定であることと、その結果がもたらす損失の大きさも大きい。このため回答者は、慎重な判断を行ったと考えられ、その意味では現実的な選択行動としての結果が得られたと考えられる。しかしながら、食料品の購入のような日常的な選択では、環境配慮の態度は示すものの、小さな損失に対して過大な反応を示すというプロスペクト理論の感応度逓減性を裏付ける行動ととり、環境配慮行動の実行に躊躇する行動が見られることも事実であるため、こうした選択対象の違いによる解釈レベルの影響度の差を確認しなければならないことも課題となっている。エコカーの選択行動については二段階モデルは適用せずに低レベル解釈の選択行動への影響を確認した結果、エコカー選択行動では結果的に環境配慮行動を大きく阻害することは確認されなかった。一方、日常的な選択行動であるお米の購入行動では心理的距離が小さい低レベル解釈が環境配慮行動による損失評価のウエイトを増大させて行動意図の形成を阻害していることから、行動評価においても行動の望ましさ評価を低下させること無く行動選択させることが重要となる。そこで、チャルディーニの法則を援用した説得文を提示するコミュニケーションを行うことで、環境配慮行動の選択における解釈レベルが低レベルであっても行動の望ましさに対する評価を保持できることを検証する。

しかしながら、食料品の購入のような日常的な選択では、環境配慮の態度は示すものの、小さな損失に対して過大な反応を示すというプロスペクト理論の感応度逓減性を裏付ける行動ととり、環境配慮行動の実行に躊躇する行動が見られることも事実であるため、こうした選択対象の違いによる解釈レベルの影響度の差を確認しなければならないことも課題となっている。環境配慮行動の意思決定モデルの一つである広瀬(1994)の二段階モデルでは、目標意図の形成段階としての環境認知が環境リスク・責任帰属・対処有効性という3つの認知を規定因とし、これにより環境問題に対する態度を決定し、次いで行動意図の形成段階では行動の実行可能性・便益費用・社会規範二対する3つの評価を規定因としている。しかしながら、環境配慮の態度が目標意図として形成されても、実際の行動に必ずしも反映されないのは、態度と行動の意思決定段階が異なり、行動段階で一種の選好の逆転が生じることが原因と考えられる。そこで、この二段階モデルと意思決定時の心理的距離による解釈レベルを把握することで、心理的距離の違いが態度と行動の乖離を説明する一つの方法となる。そこで、環境配慮行動として環境配慮米の購買行動を対象に二段階モデルとBIF尺度により心理的距離を計測するWEB調査を実施した。その結果、二段階モデルで環境配慮の態度を形成し行動意図がある人は、形成していない人よりも心理的距離が大きいことが明らかとなった。一方、行動評価においては、行動の結果がもたらす損失面(費用面)に対する重要度が高い場合は、心理的距離が小さくなっており、損失回避性が強く作用していることが明らかとなった。これらより二段階モデルにおいて環境配慮に対する態度と行動の整合性が低い場合は、心理的距離が小さくなり低レベル解釈により行動を評価しているために、損失回避性が強くなり、環境配慮行動の実践を阻害しているものと考えられる。従って、行動評価時点でも態度形成時に考慮した行動の望ましさを意識させることが必要と考えられ、高レベル解釈の意識を保持したまま行動評価を行うことができるコミュニケーションが必要であると考えられる。二段階モデルの態度(目標意図)の形成と行動(行動意図形成)評価において、態度形成と行動評価の段階では心理的距離が異なることが明らかとなり、心理的距離の違いによる意思決定問題(環境認知と行動評価)に対する解釈レベルの違いが、態度と行動の不一致をもたらしていることが検証された。具体的には環境配慮に対する態度形成時では、心理的距離が大きく、対象を望ましさの観点で捉える高レベル解釈による意思決定を行っているが、態度と行動の不一致が見られる場合では行動評価時の心理的距離が小さく対象行動の実行可能性をより具体的な要因に着目した評価を行っていることが明らかとなった。さらには、環境配慮行動を実践する意思決定である行動評価においては、行動実行に対する心理的距離が近くなっていることから、行動の実行可能性評価ではより具体的な行動要因に着目する心理が働き、損失回避性が強く作用するため行動に伴うコストや行動の結果がもたらす損失面に対する評価(重要度)が高まることが明らかとなった。以上の結果は、目標意図形成段階では環境配慮に対する態度を望ましさのレベルで捉えて環境認知すること、行動意図形成段階では環境配慮行動の実行可能性の視点で捉えて行動実践に対する判断を行うとする二段階モデルの概念と一致するものであることが確認されたこととなる。
パラクリン機構による内分泌器官の機能制御機構の解明-特にPACAPとの関連-

下垂体前葉は生体の成長、代謝、免疫、生殖に関わるホルモンを分泌する。これらのホルモンは各々異なった細胞から合成・分泌される。そしてこれらのホルモンの合成・分泌は視床下部因子によって制御されていることが明らかになっている。しかし、下垂体前葉のホルモン産生細胞は生体の種々の生理的変化に伴って、細胞の機能が亢進したり盛んに細胞増殖を行う。これらの前葉細胞のダイナミックな変化は視床下部因子のみでは説明できない。このことに関し、最近、下垂体前葉にはホルモン産生細胞の以外の細胞ではホルモン産生細胞を長い突起を伸ばして包み込む細胞、濾胞星状細胞が注目されてきた。この細胞からは繊維芽細胞増殖因子や血管内皮細胞増殖因子等が分泌される他、インターロイキン-6が分泌されることが明らかになった。そしてこれらの成長因子によるパラクリン機構で周囲のホルモン産生細胞の機能を制御することが考えられてきた。我々は、この濾胞星状細胞に注目して研究を行った結果、これまで知られていたい成長因子に加えインターロイキン-8およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が産生されていることが新たに明らかになった。またこれらの産生と視床下部因子として最近注目されてきたPACAPとの関係が明らかにされた。特にM-CSFに関しては下垂体前葉のホルモン分泌細胞と免疫との関連を探る上で注目している。下垂体のM-CSFは免疫系を非特異的に亢進するリポポリサッカライド(LPS)の刺激によって増加する。さらにLPSの刺激によってプロラクチンの分泌が促進することが明らかになった。これらの結果は下垂体におけるM-CSFの生物学的な意義と免疫との関連を考える上で重要な発見であると思われる。このことに関し、最近、下垂体前葉にはホルモン産生細胞の以外の細胞でホルモン産生細胞を長い突起を伸ばして包み込む細胞、濾胞星状細胞が注目されてきた。この細胞からは線維芽細胞増殖因子や血管内皮細胞増殖因子等が分泌される他、インターロイキン-6が分泌されることが明らかになった。我々は、この濾胞星状細胞に注目して研究を行った結果、これまで知られていた成長因子に加えインターロイキン-8およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が産生されていることが新たに明らかになった。
アルツハイマー型認知症の病態とABCA7遺伝子の役割

アルツハイマー型認知症患者に対して、遺伝子採血、認知機能検査などを行い、ABCA7遺伝子の遺伝子発現、メチル化、一塩基多型と症状等の関連を解析した。血液から、gDNA、cDNAを抽出し、cDNAから遺伝子発現量を測定し、gDNAからメチル化、一塩基多型の測定を行った。各々のデータでアルツハイマー型認知症50例と健常者50例を比較検討したところ、ABCA7遺伝子の発現量がアルツハイマー型認知症で有意に上昇していることが分かった。同様の症例で、遺伝子発現に与える影響を検討するため、エピジェネティックな観点からメチル化率を算出し、一塩基多型の頻度を測定した。その結果では有意差はみられず、解析したメチル化や一塩基多型が遺伝子発現に関与していることは否定的な結果であり、他の要因が関与していることが考えられた。一方、アルツハイマー型認知症において、罹病期間が長く、認知機能障害が重症になるほど遺伝子発現量は減少しており、ABCA7がアルツハイマー型認知症の病態や進行に関連するバイオマーカーとなりうる可能性を示唆する結果が得られた。今後も症例数を増やしていくとともに、他の要因の関与を検討するなど、遺伝子発現の変化に影響する因子を検討していことや、他のメチル化部位の変化が与える影響なども考慮して研究を進めていく必要があると考えている。また、アルツハイマー型認知症以外の疾患においても同様に検討し、ABCA7遺伝子の認知症やその他の精神疾患におけるバイオマーカーとしての有用性を検討していくこととしており、統合失調症においてABCA7遺伝子発現量が健常対照群に比較し有意に増加していたことを見出し、2018年統合失調症学会にて報告を行った。今後も症例数を増やしていくとともに、他の要因の関与を検討するなど、遺伝子発現の変化に影響する因子を検討していくことや、他のメチル化部位の変化が与える影響なども考慮して研究を進めていく必要があると考えている。また、アルツハイマー型認知症以外の疾患においても同様に検討し、ABCA7遺伝子の認知症やその他の精神疾患におけるバイオマーカーとしての有用性を検討していく方針である。サンプリングが順調にでき、遺伝子発現やメチル化、一塩基多型についてもこれまで我々が行ってきた手法にのっとって測定できているため、おおむね順調に進んでいる。遺伝子採血などのサンプリングを行い、統合失調症などの他の精神疾患でも同様の遺伝子採血を行い、測定し、疾患ごとにも研究をすすめていく。研究進度にあわせて、試薬等を当研究室でもともと使用していたものを共有することで不足分をまかなったため、本研究に費やす資金から次年度使用額が生じたが、今後もサンプルを増やしていくための費用や増やしたサンプルの遺伝子発現・メチル化率測定の際に使用する試薬等に次年度使用額をあてていく予定である。
ミトコンドリアタンパク質の輸送とミトコンドリア形態形成の解析

サイトソルからミトコンドリアに輸送される前駆体タンパク質はミトコンドリア外膜上の膜透過装置複合体により認識され、外膜および内膜を透過してミトコンドリア内部に取り込まれる。本研究においては、まず、ミトコンドリア外膜上の膜透過装置(Tom)の1つであるTom22のヒトオルソログの同定と機能解析を行った。その結果、ヒトTom22はTom20とコンプレックスを形成し、前駆体タンパク質を認識するレセプターとして機能することが示された(Yano et al., MCB(2000),20,7205-7213)。次に、Tom20、Tom22さらにはTom70などの外膜透過装置と相互作用するタンパク質をtwo-hybrid法で同定することを試みた。その結果、Tom70にはHsp90やHsc70が、Tom20にはAIPが特異的に結合することが示された。Hsc70はミトコンドリアに輸送される前駆体タンパク質を安定化する役割を持つことが既に報告されているが、Hsp90やAIpについてはミトコンドリア輸送への関与は現在のところ報告されていない。しかし、Hsp90、AIPはいずれも分子シャペロンであり、他のタンパク質の機能発現や高次構造の安定化に関与することが知られていることから、Hsp90とAIPもタンパク質のミトコンドリア移行において未知の機能を担っている可能性がある。現在、主にAIPについて機能解析を進めており、これまでに、1)AIPはin vitroでもTom20に結合する、2)AIPは前駆体タンパク質に結合する、3)AIPは前駆体タンパク質の安定化に寄与するなど、AIPが前駆体タンパク質のミトコンドリア輸送に関与することを示唆する結果が出つつある。ミトコンドリアタンパク質の多くはサイトソルにおいてプレ配列を持つ前駆体として合成される。これらの前駆体はミトコンドリア外膜上の膜透過装置複合体により認識され、外膜および内膜を透過した後にプレ配列が切断され成熟体となる。外膜上の膜透過装置複合体の解析は主に酵母の系で解析が進み、Tom40,Tom22,Tom20,Tom40および低分子量のTomなどが同定されていたが、これまで、高等生物においてはTom22のオルソログは同定されていなかった。本研究においては、Tom22のヒトオルソログの同定、および、機能解析を行った。その結果、ヒトTom22はアミナ末端領域をサイトソルに、カルボキシ末端領域を膜間スペースに露出し、中央部に膜貫通領域を持つミトコンドリア外膜タンパク質であることが示された。Tom22はTom20とコンプレックスを形成し、Tom22のサイトソル領域は前駆体タンパク質を認識するレセプターとして機能することが示された。以上の結果は酵母で見いだされていたTom22の特徴に合致する。さらに、前駆体タンパク質とヒトTom22の変異型を用いた解析から、ヒトTom22のサイトソル領域あカルボキシ末端側はプレ配列の結合に、アミノ末端側の領域は成熟体部分の結合に重要であることが示された。また、Tom20は前駆体タンパク質と主にプレ配列を介して結合するのに対して、Tom22はプレ配列と成熟体部分の両方を介して結合することが示された。
日本語学習者の母語と学習環境が言語能力と学習観にあたえる影響に関する研究

中国のウイグル族、モンゴル族、チベット族、マレーシアのマレー系の日本語学習者に対してキーボード入力調査と面接調査をおこなった結果、以下のことがわかった。(1)ウイグル族は正確さよりもなめらかさを重視する傾向がある。(2)モンゴル族は対立する存在として漢族をつよく意識するが、日本語の学習過程でみられる特徴は漢族とよくにている。(3)チベット族は日本語の音の学習は得意だが、文法の学習に漢字が障害になっていると感じている。(4)マレー系の学習者は漢字の影響を過大視していて自己評価がひくい。4月から7月にかけて、中国赴日留学生予備学校で渡日前の予備教育をうけている漢族の日本語学習者約80名の文法テストの項目別分析をおこなった。分析の結果を3月に東京外国語大学留学生日本語教育センター論集に発表した。従来経験的に認識されていた中国人日本語学習者の特徴をある程度数値化することに成功した。5月、中国赴日留学生予備学校で渡日前の予備教育をうけているウイグル人日本語学習者18名に対して学習観に関する面接調査を実施した。そのうち1名について、追跡面接調査とキーボード入力過程調査を2月に東京で実施した。そのほかに2名のウイグル人日本語学習者について、東京で面接調査とキーボード入力調査を実施した。9月から3月にかけて、来日後の留学生を対象として、日本語作文のキーボード入力過程調査と、学習環境と学習観に関する出張面接調査をおこなった。調査を実施した機関は、室蘭工業大学、岩手大学、山形大学、新潟大学、東京外国語大学、山梨大学、名古屋工業大学、静岡大学、和歌山大学、徳島大学、JASSO大阪日本語教育センターである。資料を提供した留学生は93名で、そのうち重点的にターゲットにしたマレー系マレーシア人留学生は58名である。DVDに録画されたキーボード入力調査の結果の分析を現在すすめているところである。面接調査の録音は、すべて文字おこしがおわり、分析をすすめている。キーボード入力過程の分析の結果、「作文のかきかえ」という観点から、マレー系マレーシア人留学生の日本語学習の特徴があきらかになった。成果の一部を5月に異文化間教育学会で発表する予定である。4月に電気通信大学でマレー語話者2名、6月に大阪でウイグル語話者2名、9月に名古屋工業大学でウイグル語話者5名、岩手大学でウイグル語話者5名、11月に東京でチベット語話者2名、北海道大学でチベット語話者1名に対するキーボード入力調査と面接調査をおこなった。そのほか所属機関でも調査をおこない、合計24名のデータをえた。9月に中国青海省西寧市に出張して、チベット語話日本語学習者33名に対して、学習環境と学習観に関する面接調査をおこない、漢族とのちがいをつよく意識していることがあきらかになった。昨年度重点的にターゲットにしたマレー語話者のデータの分析をすすめ、5月に異文化間教育学会で研究結果を発表した。マレーシア現地でマレー語話者だけで編成したクラスで日本語教育をおこなっていることのマイナスの影響が、キーボード入力調査の結果にもあらわれていることをあきらかにした。今年度重点的にターゲットにしたウイグル語話者のデータの分析をすすめた。ウイグル語とモンゴル語は文法的にも音韻的にもよくにているが、漢語の影響をあまりうけないウイグル族とつよく影響をうけるモンゴル族の日本語音韻の習得のスタイルがかなりちがうことがあきらかになった。この結果を、2010年7月に台湾で開催される世界日本語教育大会で「中国のウイグル族とモンゴル族の学習者による日本語誌の習得の比較」というタイトルで発表する予定である。先行研究から蓄積してきたキーボード入力調査のデータは690件に達した。文法的にも音韻的にもよくにているウイグル語とモンゴル語を母語とするが、漢語の影響がよわいウイグル族と影響がつよいモンゴル族による日本語音韻の習得のちがいについて、7月に台湾で開催された世界日語教育大会で発表した。ウイグル族の学習者は、漢語の影響がよわいだけでなく、正確さよりなめらかさを重視する学習観がみられた。前年の9月に中国青海省西寧市に出張してチベット語話者を対象としておこなった面接調査の結果を8月にチェコ、ブルノ市で開催された日本語教育連絡会議で発表した。チベット族の日本語学習者は、漢語以外のコミュニケーションツールを獲得しようとして日本語を学習しているのにもかかわらず、漢語の能力がひくいことが日本語学習の障害になっていると自覚している。おなじモンゴル語を母語としているが漢語をしらないモンゴル国出身の日本語学習者としっている内蒙古自治区出身の日本語学習者の日本語音韻の習得を比較し、漢語の知識が日本語音韻の習得にマイナスにはたらいていることを、11月に京都、龍谷大学で開催された日本モンゴル学会で発表した。また11月に新潟大学と名古屋工業大学でウイグル語話者3名に対するキーボード入力調査と面接調査をおこなった。そのほか所属機関でも調査をおこない、合計18名のデータをえた。先行研究から蓄積してきたキーボード入力調査のデータは708件に達した。
反応の計測,診断

光勃起プロセスによる薄膜形成の初期過程のその場診断について研究を行った。表面反応と気相反応にわけて説明する。1.表面反応計測手段の開発としては,角度分解型X線電子分光(XPS)による基板表面への材料ガス(有機金属化合物など)の吸着や光分解を調べることの外に,偏光変調高感度反射赤外分光法を確立して同じ目的に利用した。この結果,シリコン等の表面で有機分属化合物ガスが吸着する探子(物理吸着とか化学吸着)が詳しく調べられた。さらに,エキシマレーザが重水素ランプからの紫外光を照射して,吸着種が光分解する探子も分ってきた。さらに,走査型トンネル顕微鏡によってはアルミ薄暎形成の初期で島が成長し,しかも基板表面状態により結晶柱があることが観測された。同様に高連反射電子回析(RHEED)によって,シリコン基板上でチゲルマの二次元および三次元成長の楳様が明らかにされた。以上で述べたように光勃起表面反応のその場観測が多角的に行われ大きな成果を挙げることができた。2気相反応気相やでの材料ガス(シラン系ガスを中心として)の光分解により発生したラジカルの検出に,従来から行われていたレーザー誘起学光法(LIF)に加えて,赤外ダイオードレーザー分光が利用された。シラン系ガスの光分解に伴って発生したラジカルSiHnがこれらの手法で検出された。さらにゲルマンの光分解も調べられた。レーザーアブレーションによって基板からとび出した原子および基板からはね返った原子がLIFによって調べられている。
高機能性フォトニック光ファイバーセンサーの開発

巨大構造物(石油コンビナート、トンネル、高層ビル等)の極僅かな歪み、及び自動車、航空機等を使用中に常時モニターして破壊を事前探知する研究(スマートセンシング技術)が進められている。現在、ファイバーブラックグレーティング(FBG)やマルチコアファイバー等の光ファイバーセンシング技術が研究されているが、我々は更に高機能なセンシング方式である、「フォトニック結晶ファイバーセンサー」、の特に作成技術を開発するために研究を行った。結果、FBGや長周期ファイバーグレーティング(LPG)を作製することに成功した。近年の地球温暖化などの影響で観測事例に無い集中豪雨などの被害が後を絶たない。巨大構造物、例えば、石油コンビナート、トンネル、高層ビル、等は老朽化や地震などで崩落する危険性がある。それ故、これらの巨大構造物の極僅かな歪みを常時モニターしておくことが望まれている。現在、FBG光ファイバーを用いたセンシング技術が研究されているが、一方で、更に高感度な光ファイバーに、更に高機能な特性を持たせようとする試みもある。本提案では、高性能フォトニック光ファイバーの開発及び、フォトニック光ファイバーを用いた高感度センサーの製作を目指して研究を行った。本年度は、まずフォトニック光ファイバー製作装置を設計製作した。従来のFBG光ファイバーの場合に比べて、除振動能力に優れた(固有振動数、垂直1.2Hz、水平1.0Hz)光学実験台の上に、製作装置を製作した。そしてコヒーレント長が通常よりも2桁長い固体レーザーを書き込み用レーザーとして採用した。書き込み実験を行ったところ、所定の能力を得る事ができた。フォトニック光ファイバー製作装置の設計製作と平行して、フォトニック光ファイバー内の光伝搬の様子をシュミレーションした。フォトニック光ファイバー中を伝搬する光は、そのフォトニック光ファイバーを構成している材料の屈折率や構造に大きく依存する。それ故、時間差領域差分近似(FDTD)法を用いて光の伝搬をシュミレーションした。最終目的は、超音波計測を行うために最適な構造を見つけることであり、今年度も引き続いて計算を行う予定である。更に、フォトニックファイバーを作製するための材料となる光ファイバー素線の探索も行った。現在、水素ドープした光ファイバーとボロンドープした光ファイバーの2つが有力であることがわかった。本年度は、まず水素ドープした光ファイバーを用いてFBGおよびフォトニック光ファイバーの製作を行った。次にフォトニック光ファイバー製作装置の改良を行った。具体的には、顕微鏡レンズを中心とした光学系の改、及び光ファイバー支持装置の自動ステージ化である。ステージの位置決め精度はxz方向ともに5μm以下であり、書き込み実験を行ったところ、所定の能力を得る事ができた。また光ファイバー同士の突合せ技術についても改良を行い、前年度に比べて光透過強度を1桁以上あげることに成功した。光ファイバー内にフォトニック構造を作製するのに必要な技術の1つにガラスの改質技術が上げられる。石英ガラスに軟X線を照光ファイバー内にフォトニック構造を作製することが可能である。今後、水素ドープした光ファイバーを用いて、実際にセンシング用の光ファイバーを製作する予定である。また近年、自動車や航空機などを使用中常時モニターして破壊を事前に探知する研究(スマートセンシング技術)が進められている。現在、ファイバーブラックグレーティング(FBG)やマルチコアファイバーなどの各種光ファイバーを用いたセンシング技術が研究されているが、一方で、更に高機能な特性を持たせようとする試みもある。本提案では、高性能フォトニック結晶ファイバーの開発を目指して研究を行った。本年度は、振動計測やアコースチィックエミッション(AE)検出に最適なフォトニック結晶ファイバーの構造を検討した。その結果、光ファイバーコアのまわりに数個のホールが配置されているフォトニック結晶ファイバーに、長周期構造(LPG)を作製する事が望ましいことを見出した。検討結果を考慮したうえで、水素ドープしたゲルマニウムーボロン(Ge-B)をドープした光ファイバーにLPGの製作を行った。

紫外線レーザーを180分間照射することにより、実際に1550nm近傍に半値幅10nmで10dB程度の吸収ピークを作製する事ができた。LPG及びFBGを用いて、振動計測を行った。空気中を伝搬する振動を計測したところ1から2nm程度のピークの変化が観測できた。今後、高層ビル等の材料であるコンクリートや航空機の材料である金属や強化プラスチックを用いて振動計測を行う予定である。
地磁気マップを用いた深海性生物の位置測位手法の開発と回遊生態研究への応用

水産資源管理を行う上で、対象種の生息域や移動経路に関する情報は不可欠である。深海に生息する魚類の多くは重要な水産資源として利用されているものの、その移動・回遊に関する知見は不明な点が多い。これは、これまで水産資源の位置推定は水産資源が経験する日出・日入時刻、日長をもとに滞在位置を推定する方法が主たるものであり、光の届かない深海域における生物の位置を把握する手段が確立されていないことに起因する。本研究では地磁気と重力というこれまで用いられてこなかったセンサ情報を用いて、今まで成しえなかった「深海性生物の位置測位」を実現し、それを応用して深海性水産魚種の回遊生態解明に資することを目的とする。平成30年度では、地磁気・重力を長期間記録できる小型記録計を開発した。次いで、鹿児島県沖永良部島で産卵するアカウミガメをモデル生物として、開発した地磁気・重力記録計をGPS記録計とともに装着し、産卵期間中にアカウミガメが滞在した位置を推定する実験を行った。装着した記録計は約2週間後に供試個体が再び産卵上陸した際に回収した。記録された地磁気・重力データを分析したところ、地磁気のデータに不具合があり、アカウミガメの位置をうまく再現することはできなかった。このため、開発した記録計の改善を行い、次年度再実験を実施する予定である。野外実験と並行して、仮想空間上において地磁気データから位置を再現するシミュレーション実験を実施した。シミュレーション上では、地磁気データによって位置の再現は可能であったが、その位置によって再現精度にはばらつきが見られた。現在、生物の滞在位置によってどのように再現精度が異なるのかを分析している。平成30年度では、地磁気・重力センサを搭載し、長期間記録できる記録計を開発した。次いで、鹿児島県沖永良部島で産卵するアカウミガメをモデル生物として、開発した記録計をGPS記録計とともに装着し、産卵期間中の行動を記録した。このため、開発した記録計の改善を行っている。上記野外実験と並行して、仮想空間上において地磁気データから位置を再現するシミュレーション実験を実施した。シミュレーション上では、地磁気データによって位置の再現は可能であったが、その位置によって再現精度は異なった。令和元年度は、再び鹿児島県沖永良部島で産卵するアカウミガメを対象に、産卵期間中の滞在位置を地磁気・重力データによって推定する実験を行う。合わせてGPS記録計を装着し、その推定方法の精度評価を行う。また、地磁気・重力による推定位置と、GPSによる位置(真値)の偏差を時系列的に解析し、地磁気・重力による位置推定を改善するアルゴリズムを開発する。

令和元年度は、再び鹿児島県沖永良部島で産卵するアカウミガメを対象に、産卵期間中の滞在位置を地磁気・重力データによって推定する実験を行う。合わせてGPS記録計を装着し、その推定方法の精度評価を行う。また、地磁気・重力による推定位置と、GPSによる位置(真値)の偏差を時系列的に解析し、地磁気・重力による位置推定を改善するアルゴリズムを開発する。
腸管運動の“ペースメーカー細胞"とその神経支配についての形態学的研究

腸管運動の細胞機構を解明するために緩徐波(slow waves)の発生源をペースメーカー細胞と仮定して、その本体の同定を試みた。緩徐波には平滑筋の自発性収縮が伴う。緩徐波の発生源は「カハールの間質細胞(interstitial cells of Cajal)」とみなされている。しかし、文献的考察とプレパラート観察結果から、この定説の誤りが決定的となった。従来、「カハールの間質細胞」と誤解された構造にはシュワン細胞、および細網細胞も含まれる。これらは緩徐波を生ずるとしても、自発性収縮とは関係がない。イヌ近位結腸の筋層は「腸管運動のペースメーカー細胞」に関する生理学的研究が盛んな生体組織であり、1)粘膜下表面と2)筋層間神経叢領域にペースメーカーが存在する。今回の研究では、筋層の粘膜下表面に、小型で扁平な特殊平滑筋の存在を見いだした。これは一部の学者が「カハールの間質細胞」と誤称する細胞に一致する。目下、この特殊平滑筋が、緩徐波および自発性収縮の発生源であることを裏付ける実験を実施している。一方、筋層間神経叢領域にも新しい平滑筋組織があり、これを斜走筋(oblique muscle)と名付けた。斜走筋は縦走筋と輪走筋との間隙を橋わたしする。筋層間神経叢の周囲に集中する。斜走筋の意義は不明であるが、筋層間のペースメーカーである可能性は高い。ペースメーカー細胞は神経の影響を受ける。自発性収縮はカルバコールによって増強され、NOニューロンによって抑制される。腸運動の「ペ-スメ-カ-細胞」は、電気生理学的にslow wave(緩徐波)を生ずる。これはTTX,アトロピンなどで神経を遮断して記録され、近傍にある一般平滑筋細胞の弱い収縮を伴う。本研究の目的は、「ペ-スメ-カ-細胞」の形態を明らかにし、その細胞生物学的性質を顕微鏡を用いた手法で検討することにある。1.平成3年度は、まずイヌの空腸と近位結腸を走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡で研究した。イヌの近位結腸の内輪筋層の最深部で、線維芽細胞や一般平滑筋とは異なる細長い細胞を見出して、その外形と微細構造を検討した。免疫形態学的手法を使って、ビメンチン,アクチン,MAPsなどの細胞骨格およびその関連蛋白の存在を調べた。多数のギャップ結合や小窩(caveolae)の存在から、一種の平滑筋と予想されるが、なおこの細胞群を取り出して、収縮能や電気的性質を解明しなければならない。2.レ-ザ-微小外科法、細胞内電極法および組織培養法を用いた研究の成果は映画や日本語のエッセイとして公表したので、腸管運動のメカニズムに関する社会への啓蒙にはなったと信ずる。この方面は継続して、最終年度までには論文としてまとめたい。3.平成3年度中、熊本大学西川伸一教授に依頼されて、受容体型チロシンキナ-ゼ癌源遺伝子cーkitの産物に対するモロクロ-ナル抗体(ACK_2)を新生仔マウスの腹腔内に注射する実験を行なった。ACK_2投与によって腸管運動は止まる。神経系を調べた限りでは正常。ブラジキニンまたはアセチルコリン投与で腸管の収縮を起こすことができる。ACK_2の結合の場を調べたところ「ペ-スメ-カ-細胞」の存在部位とほぼ一致していた。1.名古屋大学付属病院での外科手術に際して摘出される人体材料を組織学的に研究して、腸管運動のペースメーカ細胞を見出す試み。第一外科と協力して小児の小腸と大腸をZIO法によって検討することができた(正常および巨大結腸症)。巨大結腸症の腸管にも神経叢は存在することがある。組織、細胞、膜、分子等、それぞれのレベルでの消化管運動機能障害の存在の可能性を考えた。

いまだデータ不足であり論文にはできない。2.「モルモットの小腸と大腸の深筋層神経叢および筋層間神経叢のペースメーカー細胞を培養して、細胞内電極法で形態と機能を明らかにする。」研究は施設の移管手続きの関係で実行できなかった。3.「レーザー照射によるペースメーカー細胞の性質の変化を研究する。」実験は研究施設の関係で実行できなかった。4.モノクローナル抗体を用いた実験。ヌードマウス新生仔を用いて、受容体型チロシンキナーゼの癌原遺伝子の一種c-kit遺伝子の産物に対するモノクロナール抗体(ACK2)を使い、巨大結腸症に似た病態をつくり腸管運動のペースメーカー細胞の分化・発達と神経系との関係を探った(Maeda,H. et al.:Development 116:369-375,1992)。5.イヌの小腸と近位結腸の「ペースメーカー細胞」。電気生理学的に緩徐波が最も典型的に記録されているイヌの小腸と近位結腸で、電顕免疫組織化学的に平滑筋に固有の細胞骨格の存在を検討して、「ペースメーカー細胞」が平滑筋である可能性を確かめた(Torihashi,S. et al.: Amer.J.Physiol.発売予定)。平成3、4年度の研究を継続した。すなわち下記の実験を行った:1)人体材料の組織学的検討。名古屋大学附属病院等の手術材料を研究した。(しかし、データ不足であり今後の継続研究を要する。)2)イヌの小腸と近位結腸のペースメーカー細胞の検討。生理学的に緩徐波(slow waves)が記録されている部位に特殊平滑筋(大部分を占める一般平滑筋とは形態を異にする)を見いだした。さらに、これらの部位の自発性収縮能を検討した。3)イヌの近位結腸の筋層間神経叢領域に「斜走筋」を発見した。当初に予定した下記の実験は設備の関係で実行できなかった。4)細胞内電極法による実験。5)レーザー照射によるペースメーカー細胞の性質の変化。6)ペースメーカー細胞の培養。イヌの小腸と近位結腸の「ペースメーカー細胞」については、結果を英文原著論文としてまとめて発表することができた。将来的には、イヌの小腸と近位結腸の「ペースメーカー細胞」について、緩徐波および自発性収縮能の発生との関連を調べたい(目下、追加実験が進行中)。
好気的条件下における好塩細菌のテクネチウム蓄積機構

テクネチウムは過去の核実験や核燃料再処理施設から自然界に放出されてきた人工放射性核種で、一般に水溶性の高い化合物を形成する。そのためテクネチウムを水溶液から回収するためには嫌気的条件や特殊な樹脂が必要とされてきた。本研究では好気的な条件下でテクネチウムを菌体内に取り込む海洋細菌に着目し、遺伝子組み換え実験により、その蓄積に関わる遺伝子のいくつかを特定した。テクネチウム-99(^<99>Tc)を好気的条件下で菌体内に蓄積する好塩細菌(Halomonas sp.Tc-202株)の蓄積に関わる遺伝子を特定するために,発現クローニングおよびトランスポゾン導入変異体作製を行なった。Tc-202株のゲノムDNAを用いた発現クローニングでは,抗生物質と^<99>Tcを塗布した平板培地で形質転換体を培養後に菌体をろ紙に写し取り,ろ紙上の^<99>Tcの放射能をイメージングアナライザーで解析した。この結果,Tc-202株と同等の^<99>Tc蓄積能を示すコロニーを得ることができたが,形質転換体の単離には至らなかった。トランスポゾン導入による変異体作製では,Tc-202株のエレクトロコンピテントセルを作製することが困難であったためエレクトロポーレーション法で変異体を得ることはできなかった。そこで,トランスポゾンと薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌とTc-202株を共培養することによりTc-202株にトランスポゾンを導入することができた。当初,得られた変異Tc-202株の^<99>Tc蓄積能を平板培地上で行なっていたが,蓄積能の欠損株の特定ができなかった。そのため,得られた変異体を単離し,^<99>Tc添加液体培地で培養後の培地中の^<99>Tc量を液体シンチレーションカウンターで調べた。これまでのところ^<99>Tc蓄積能を欠損した変異体は得られていない。より多くの検体を処理するためには変異株の^<99>Tc蓄積能の有無を確かめるアッセイ方法に改良の余地がある。今回の実験で使用している^<99>Tcの化学形態が^<99>Tc0_4-であることから,Tc-202株の^<99>Tc菌体移行がSO_4^<2->イオンの輸送機構によるのではないかと,BROOKHEAVEN National LaboratoryのA.J.Francis博士から指摘を受けた。そこでTc-202株の^<99>Tc蓄積へのSO_4^<2->イオンの影響を調べたところ,終濃度50mMまでのSO_4^<2->イオンはTc-202株の^<99>Tc蓄積に影響を与えないことが分かった。このことから本菌の^<99>Tc蓄積機構はこれまでに推定されている経路とは異なることが示唆された。好気的条件下でテクネチウム-99(Tc-99)を菌体内に蓄積する好塩細菌(Halomonas sp. Tc-202株)の蓄積に関わる遺伝子を特定するため,発現クローニングおよびトランスポゾン導入による変異体の作製を行った.発現クローニングでは,Tc-99を塗布した平板培地上に形質転換体を単離培養し,37°Cで24時間培養後にコロニーの放射活性をイメージングアナライザーで解析した.Tc-202株と同様の蓄積能を示すコロニーについてインサート配列を解析するとともに,液体培養によるTc-99蓄積能を調べた.インサートには他種のバクテリア由来のレダクターゼや酸化還元酵素と類似性を示す塩基配列が確認されたが遺伝子の全長は得られなかった.平板培地でスクリーニングした変異体は,液体培養条件下でもTc-202株の約3割程度Tcの-99を培地中から回収した.トランスポゾン導入実験に供するTc-202株に抗生物質耐性能を持たせるべく,抗生物質リファマイシン濃度を除々に上昇させた培地を用いてTc-202株を継代培養し,終濃度20ug/mLのリファマイシン下でも良好に生育する変異株Tc-202Rif+株を得た.この変異株に対してトランスポゾンを導入させ,2種の抗生物質を含む培地を用いTc-202Rif+株の最適培養温度(15°C)で培養し,トランスポゾンが導入されたTc-202Rif+株のみを生育させた.この変異株を単離し液体培養条件下でTc-99蓄積能を調べたところ,複数の変異株においてTc-99蓄積能が低下していることが確認されたが,完全にTc-99蓄積能を失う変異株は得られなかった.以上の結果からTc-202株のTc-99蓄積には単独のタンパク質ではなく,複数の酵素やタンパク質が相互作用し,Tc-99を培地中から菌体内へ取り込み還元しているものと考えられた.
慢性膵炎における膵炎関連蛋白の発現とアポトーシスの意義に関する実験的・臨床的研究

ラット自然発症慢性膵炎モデル(WBN/Kob)では12週令から慢性膵炎の変化が起こり,週令とともに顕著になった.RT-PCR法による膵組織中pancreatitis-associated-protein(PAP)mRNAの発現動態の検討では,膵炎発症前の8週令から上昇し,12週令でピークに達し,24週令でほとんど消失した.PAPが膵腺房細胞に発現することをmRNAレベルではin situ hybridization法,蛋白レベルでは免疫染色法により確認した.膵炎治療薬(メシル酸カモスタット,柴胡桂枝湯)投与により,膵炎の発症と進展が抑制され,PAPmRNA発現も低下した.アポトーシスの検討では,膵内炎症細胞にアポトーシス陽性細胞が認められたが,膵腺房細胞にはほとんど検出されなかった.膵腺房培養細胞を用いたin vitroの系で,PAPのアポトーシス抑制作用を見い出し,現在さらに検討中である.臨床的には,196例の消化器疾患において血清PAP値をELISA法により測定したところ,その陽性率は急性膵炎で90%であり,膵炎の重症度と有意に関連し,その上昇は他の膵酵素に比し遷延し,急性膵炎の治癒に一致して正常化した.また,各種消化器癌での血清PAPの陽性率は,胃癌16%,大腸癌40%,肝細胞癌40%,胆道癌26%,膵癌40%であった.以上より,慢性膵炎の発症と進展にPAPの発現が関連し,その意義としてアポトーシス抑制作用が考えられた.また,血清PAP値が膵炎の重症度や治癒判定の指標になること,癌細胞での異所性発現を反映して消化器癌の一部でも血清PAP値が上昇することを明らかにした.ラット自然発症慢性膵炎モデル(WBN/Kob)では12週令から慢性膵炎の変化が起こり,週令とともに顕著になった.RT-PCR法による膵組織中pancreatitis-associated-protein(PAP)mRNAの発現動態の検討では,膵炎発症前の8週令から上昇し,12週令でピークに達し,24週令でほとんど消失した.PAPが膵腺房細胞に発現することをmRNAレベルではin situ hybridization法,蛋白レベルでは免疫染色法により確認した.膵炎治療薬(メシル酸カモスタット,柴胡桂枝湯)投与により,膵炎の発症と進展が抑制され,PAPmRNA発現も低下した.アポトーシスの検討では,膵内炎症細胞にアポトーシス陽性細胞が認められたが,膵腺房細胞にはほとんど検出されなかった.膵腺房培養細胞を用いたin vitroの系で,PAPのアポトーシス抑制作用を見い出し,現在さらに検討中である.臨床的には,196例の消化器疾患において血清PAP値をELISA法により測定したところ,その陽性率は急性膵炎で90%であり,膵炎の重症度と有意に関連し,その上昇は他の膵酵素に比し遷延し,急性膵炎の治癒に一致して正常化した.また,各種消化器癌での血清PAPの陽性率は,胃癌16%,大腸癌40%,肝細胞癌40%,胆道癌26%,膵癌40%であった.以上より,慢性膵炎の発症と進展にPAPの発現が関連し,その意義としてアポトーシス抑制作用が考えられた.また,血清PAP値が膵炎の重症度や治癒判定の指標になること,癌細胞での異所性発現を反映して消化器癌の一部でも血清PAP値が上昇することを明らかにした.自然発症慢性膵炎モデル(WBN/Kobラット)を特殊繁殖飼料MB-3で飼育すると,12週令で膵炎が発症し,以後線維化が進行した.Kobラットの膵組織におけるpancreatitis-associated protein(PAP)mRNAの発現をRT-PCR法で検討すると,PAPmRNAは膵組織がまだ正常である8週令で発現し,膵炎の発症時点である12週令においてピークに達した.以後漸減し,24週令ではほとんど消失した.これをin situ hybridization法にて細胞レベルで検討すると,12週令において最も強く膵腺房細胞の細胞質にPAPmRNAの発現が認められた.アポトーシスの検討では,TUNEL法によるアポトーシス陽性膵腺房細胞が膵炎組織にみられ,膵炎所見の最も高度な12週令にアポトーシスが強く見られる傾向があった.アポトーシス抑制因子であるbcl-2蛋白の発現はほとんどみられなかった.さらにDNAラダーの検出を試みたが,明らかなDNAラダーは認められなかった(DNA抽出法などに検討する余地あり,現在検討中である).以上のような実験的検討より,慢性膵炎の発症と進展にPAPが関与している可能性が示唆された.臨床的には,膵疾患を中心に血清PAP値を測定した.健常者の平均値+2標準偏差から求めた55ng/mlをカットオフ値とすると急性膵炎100%,慢性再発性膵炎(慢性膵炎の急性増悪)57.1%,膵癌37.8%の症例に血清PAP値の異常上昇がみられ,慢性膵炎の9.4%に比し有意に高率であった.急性膵炎における血清PAP値は急性膵炎の重症度やCT gradeと相関した.以上より,血清PAP値は急性膵障害の鋭敏なマーカーであり,膵炎の重症度を反映すると考えられた.ラット自然発症慢性膵炎モデル(WBN/Kob)では12週令から慢性膵炎の変化が起こり,週令とともに顕著になった.RT-PCR法による膵組織中pancreatitis-associated protein(PAP)mRNAの発現

動態の検討では,膵炎発症前の8週令から上昇し,12週令でピークに達し,24週令でほとんど消失した.PAPが膵線房細胞に発現することをmRNAレベルではin situ hybridization法,蛋白レベルでは免疫染色法により確認した.膵炎治療薬(メシル酸カモスタット,柴故桂枝湯)投与により,膵炎の発症と進展が抑制され,PAPmRNA発現も低下した.アポトーシスの検討では,膵内炎症細胞にアポトーシス陽性細胞が認められたが,膵線房細胞にはほとんど検出されなかった.膵線房培養細胞を用いたin vitroの系で,PAPのアポトーシス抑制作用を見い出し,現在さらに検討中である.臨床的には,196例の消化器疾患において血清PAP値をELISA法により測定したところ,その陽性率は急性膵炎で90%であり,膵炎の重症度を有意に関連し,その上昇は他の膵酵素に比し遷延し、急性膵炎の治癒に一致して正常化した.また,各種消化器癌での血清PAPの陽性率は,胃癌16%,大腸癌40%,肝細胞癌40%,胆道癌26%,膵癌40%であった.以上より,慢性膵炎の発症と進展にPAPの発現が関連し,その意義としてアポトーシス抑制作用が考えられた.また,血清PAP値が膵炎の重症度や治癒判定の指標になること,癌細胞での異所性発現を反映して消化器癌の一部でも血清PAP値が上昇することを明らかにした.