hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトデ幼生のマクロファージ遊走阻止因子による炎症制御機構の解明

最も原始的なサイトカインの一つと考えられているマクロファージ遊走阻止因子(Macrophage m igration Inhibitory Factor: MIF)は、進化的に保存された炎症反応のキーレギュレーターである可能性が指摘されている。一方で、進化的に保存された受容体は同定されていない。代表者はこれまで、棘皮動物ヒトデの幼生の免疫細胞から2種のMIFを同定し、両者がそれぞれ走化性因子(ApMIF2)、走化性阻止因子(ApMIF1)として免疫細胞の移動を制御していることを明らかにした。本研究ではこの先行研究を基盤とし、進化的に保存されたMIF受容体とその下流シグナルの同定を目的としている。昨年度、ヒトデの幼生において、MIF刺激後の免疫細胞におけるトランスクリプトームの変化を解析し、MIFの下流にはERK/MAPK経路及びPI3K/Akt経路が存在する可能性を示唆した。そこで、これらの経路の阻害剤が、MIF刺激後の免疫細胞の行動にどのような影響が生じるかをin vitroで観察した。通常、ApMIF2刺激により免疫細胞の移動速度は上昇するが、ERK/MAPK経路阻害剤であるU0126存在下では、ApMIF2刺激による移動速度の上昇は全く認められなかった。さらにApMIF2刺激による移動速度の上昇を抑制するApMIF1の作用は、PI3K阻害剤であるLY294002存在下では認められなかった。これらの事実から、走化性因子であるApMIF2の下流にはERK/MAPK経路が、走化性阻止因子であるApMIF1の下流にはPI3K/Akt経路が存在していることが示唆された。受容体探索については、今の所有力な候補は得られていない。受容体の探索が当初の計画より難航している。当初の計画では、生理活性を有する融合タンパク質を細胞表面の受容体に架橋し、融合タンパク質のタグに対するアフィニティクロマトグラフィーで受容体を抽出する予定であったが、融合タンパク質が単独で多量体を形成することが明らかとなり、ウエスタンブロットによる複合体検出が困難だった。今年度はアプローチを変更し、ビオチンラベル転移化合物を用いた光反応架橋を試み、受容体を直接ビオチンラベルすることを目指したが、今の所有力なデータは得られていない。一方、下流シグナルの探索については順調に進んでいる。MIFの下流にERK/MAPK経路とPI3K/Akt経路が存在することが示唆されたため、今後はMIF刺激により、これらのキナーゼの活性化が実際に生じるかをウエスタンブロットで詳細に解析する予定である。受容体の探索については、これまで様々な方法を試したがうまくいっていない。この理由として、細胞表面の受容体の発現量がウエスタンブロットの検出限界を下回っている可能性を考えている。そこで、今後はアプローチを変更し、酵母Two-Hybrid(Y2H)法での探索に切り替える。Y2H法であれば、ライブラリー作製時にPCRでの増幅過程があるため、ある程度発現量が低い遺伝子であっても、MIFとの相互作用が検出される可能性は高い。【概要】最も原始的なサイトカインの一つと考えられているマクロファージ遊走阻止因子(Macrophage m igration Inhibitory Factor: MIF)は、進化的に保存された炎症反応のキーレギュレーターである可能性が指摘されている。受容体の探索は、還元剤で切断可能な細胞膜不透過性クロスリンカーを用いて、in vitroで2種のHisタグ融合MIFとヒトデ幼生の免疫細胞表面の受容体をそれぞれ架橋し、精製した膜画分をHisタグに対するアフィニティクロマトグラフィーに供することで行った。これまでのところ、抗Hisタグ抗体を用いたウエスタンブロットにより、ApMIF1と受容体候補の複合体が90 kDa程度のバンドとして得られている。一方、ApMIF2の受容体候補は検出できていない。下流シグナルの探索は、ApMIF2添加による免疫細胞の移動速度の上昇時と、その後のApMIF1添加による移動速度の低下時に経時的にサンプリングした免疫細胞のRNA-seq解析を通して行った。発現変動遺伝子として得られた約1400個の遺伝子を用いて共発現ネットワークを構築し、その中から2種のMIFが属するコミュニティを抽出した。抽出したコミュニティでエンリッチメント解析を行ったところ、MAPK経路とPI3K/Akt経路が有意に濃縮されていた。さらに、各コミュニティから2種ずつ、受容体候補になり得る遺伝子も見出した。受容体候補の検出は今年度中に完了する予定であったが、ApMIF1の受容体候補は検出できているものの、ApMIF2の受容体候補については検出できていない。一方で、RNA-seqの解析データから受容体候補として2種ずつ遺伝子を見いだせており、架橋剤を用いた生化学的アプローチと並行して受容体探索を進めているため、研究遂行において問題になるほどの遅れではないと考えている。

一方で、進化的に保存された受容体は同定されていない。代表者はこれまで、棘皮動物ヒトデの幼生の免疫細胞から2種のMIFを同定し、両者がそれぞれ走化性因子(ApMIF2)、走化性阻止因子(ApMIF1)として免疫細胞の移動を制御していることを明らかにした。本研究ではこの先行研究を基盤とし、進化的に保存されたMIF受容体とその下流シグナルの同定を目的としている。昨年度、ヒトデの幼生において、MIF刺激後の免疫細胞におけるトランスクリプトームの変化を解析し、MIFの下流にはERK/MAPK経路及びPI3K/Akt経路が存在する可能性を示唆した。そこで、これらの経路の阻害剤が、MIF刺激後の免疫細胞の行動にどのような影響が生じるかをin vitroで観察した。通常、ApMIF2刺激により免疫細胞の移動速度は上昇するが、ERK/MAPK経路阻害剤であるU0126存在下では、ApMIF2刺激による移動速度の上昇は全く認められなかった。さらにApMIF2刺激による移動速度の上昇を抑制するApMIF1の作用は、PI3K阻害剤であるLY294002存在下では認められなかった。これらの事実から、走化性因子であるApMIF2の下流にはERK/MAPK経路が、走化性阻止因子であるApMIF1の下流にはPI3K/Akt経路が存在していることが示唆された。受容体探索については、今の所有力な候補は得られていない。受容体の探索が当初の計画より難航している。当初の計画では、生理活性を有する融合タンパク質を細胞表面の受容体に架橋し、融合タンパク質のタグに対するアフィニティクロマトグラフィーで受容体を抽出する予定であったが、融合タンパク質が単独で多量体を形成することが明らかとなり、ウエスタンブロットによる複合体検出が困難だった。今年度はアプローチを変更し、ビオチンラベル転移化合物を用いた光反応架橋を試み、受容体を直接ビオチンラベルすることを目指したが、今の所有力なデータは得られていない。一方、下流シグナルの探索については順調に進んでいる。受容体探索が難航している理由の一つが、MIFが単独で二量体、三量体を形成してしまうことである。これがアフィニティ精製産物のウエスタンブロットにおける複合体検出を困難にしている。この課題を解決するため、今後はビオチンラベル転移化合物であるSulfo-SBEDによる光反応架橋を行い、Hisタグによる複合体検出ではなくビオチンで受容体を直接検出する方法で研究を進める。同時に、RNA-seq解析により得られた受容体候補のノックダウンも並行して進めることで受容体の同定を目指す。MIFの下流シグナルについては、候補として得られたMAPK経路及びPI3K/Akt経路の阻害剤が、それぞれのMIFで処理した免疫細胞の移動行動に及ぼす影響を検証し、実際にMIFの下流で機能しているかを明らかにする。MIFの下流にERK/MAPK経路とPI3K/Akt経路が存在することが示唆されたため、今後はMIF刺激により、これらのキナーゼの活性化が実際に生じるかをウエスタンブロットで詳細に解析する予定である。
閾下情報提示を用いた洞察における潜在的情報処理過程の解明

人は意識的に把握できる情報以外の情報を積極的に活用して認知活動を行っている。しかしながらこの知見は主に知覚レベルの実験から得られたものであり、問題解決における潜在的情報の利用についての知見は少ない。本研究では、問題解決などの高次認知における無意識的な情報の利用についての検討を行った。2006年度は問題解決中にサブリミナル画像を提示し、それによる行為の変化を分析したが、実験群、統制群の間に有意な差が見られなかった。そこで2007年度はサブリミナル画像を視野のどの部分提示するかをコントロールした実験を行った。中心視野に収まる範囲、それを越える範囲、の2条件でサブリミナル画像を提示した。しかしながら双方の群ともに問題解決の促進は見られなかった。またサブリミナル画像の提示が被験者の意識しない眼球運動に現れる可能性を検討するため研究を行った。しかしながら実験群、統制群間に有意な差を検出することはできなかった。洞察問題とは異なる認知活動における潜在的な情報の利用を検討するために、ジェスチャーを用いた問題解決の分析も行った。その結果、問題解決者は問題解決の初期と後期に半ば無意識的にジェスチャーのタイプを変化させ、有用な情報を生み出していることがわかった。さらにスキル学習に無意識的な行為の変化を分析した。その結果、半ば自動的に生じる行為の熟達において、環境のセッティングの変化が重要な役割を果たすことが明らかにされた。洞察問題解決における潜在的情報処理の特性を明らかにするための研究を2つ行った。第1の研究では、従来から用いてきた空間的パズルを題材として、閾下刺激が問題解決過程にどのような影響を与えるかを検討した。この検討のため、被験者の問題解決過程をスクリーン上に投影し、ここにタキストスコープとプロジェクターを組み合わせたゴール状態の閾下刺激提示を行った。こうした刺激を提示された実験群と閾下刺激の提示を受けない統制群の比較を行った。その結果、問題解決時間に対して閾下刺激は何の効果ももたらさないことが示された。この結果は従来の結果とは大きく異なるのでその原因を分析した。分析の結果、実験群は制約の緩和が統制群に比べて少ないこと、またその原因は主に試行数の差に関係することが示唆された。今後は問題解決場面での自由な動きをより可能にする実験実施環境を作成し、同様の枠組みで検討を重ねる予定である。第2の研究では、身体的動作と問題解決のパフォーマンスの検討を行った。身体的運動は認知過程の様々な側面に対して影響を与えるが、その運動はすべてコントロールされたものではない。またその運動から問題解決者は潜在的な学習を行う可能性がある。そこで第1の研究とは異なる課題を用いて身体的運動(ジェスチャー)と問題解決との関係を探る研究を行った。その結果、優れた問題解決者はそうでないものに比べてより活発に身体的動作を行うこと、そのうちの多くは問題記述そのものを身体的になぞるものではなく、問題の断片的情報から解決者自身が生成した情報を含むものであることが示された。そこで本年度は、サブリミナル画像を視野のどの部分提示するかをコントロールした実験を行った。またサブリミナル画像の提示が被験者の意識しない眼球運動に現れる可能性を検討するために、事前にサブリミナル画像を提示したグループとそうでないグループが評価課題を遂行する際の眼球運動を分析した。しかしながら両グループの間に有意な差を検出することはできなかった。

洞察問題とは異なる認知活動における潜在的な情報の利用を検討するために、ジェスチャーを用いた問題解決の分析も行った。その結果、問題解決者は問題解決の初期と後期に半ば無意識的にジェスチャーのタイプを変化させ、有用な情報を生み出していることがわかった。さらにスキル学習に無意識的な行為の変化を分析した。その結果、半ば自動的に生じる行為の熟達において、環境のセッティングの変化が重要な役割を果たすことが明らかにされた。
精神薄弱者と痴呆性老人の歩行空間計画に関する研究

本研究は認知力に障害のある精神薄弱者と痴呆性老人が目的地を探索し、間違わずに到達出来るようにするには、どのような建築的配慮をすればよいかを、実験によって検討しようとするものである。実験には2種類の方法を用いており、一つは空間構成の異なる環境内での歩行行動観察であり、他は空間構成にかかわるシミュレ-ション図像等を提示して、アイマ-ク・レコ-ダを用いて種々の視覚情報(ランドマ-クや案内標識など)への注視傾向を分析しようとするものである。歩行行動観察では直線歩行、一回折れ歩行、階段昇降歩行、認識地図による空間把握状況などの基本的歩行行動を検討したのち、自室・便所・溶室・食堂などを探索歩行してもらうとともに階段やエレベ-タ-利用をともなう場合や分岐点の形態や数が異なる場合の探索状況を検討している。中度の障害者ではほぼ探索できるが、重度障害者では出発点で出発することさえもできない例があり、とくに分岐点での経路選択に困難がみられる。エレベ-タ-は操作困難であり、全員が単独利用が不能である。アイマ-ク法による視覚情報探索では、どのような図形が探索されやすいかを検討したのちに、探索経路の分岐点状況を想定した、直進性、貫性性、屈折性、無指向性、放射性、点動性を表象する図形を考案して実験している。さらにこれらの成果を踏まえてアイマ-クカメラを装着したままバリアのある経路を探索歩行してもらう実験も実施している。点滅したり規則的に移動したりする視覚情報は注視されやすく、静止したままや複雑な視覚情報は無視されやすい。精神薄弱者の注視は散漫に広がるが、痴呆性老人の注視は視野中央部に集中固定化する傾向がみられる。まとめとして施設内歩行空間の形成状況を15施設について調査したが、障害が重くなればなるほど、歩行空間に制限が加えられている実態が明らかとなっている。本研究は認知力の劣る精神薄弱者と痴呆性老人が目的地を探索し、間違わずに到達できるようにするには、どのような建築的配慮をすればよいかを、調査・実験によって検討しようとするものであり、とくに探索歩行行動の基本特性の把握に主眼が置かれている。調査・実験には二種の方法を用いており、一つは空間構成の異なる環境内での探索歩行行動観察調査であり、他は空間構成のシミュレーション図像を提示し、アイマークレコーダを用いて空間要素情報(ランドマークや案内標識など)への注視傾向を分析している。昭和63年度の探索歩行行動観察調査では、精神薄弱者施設1施設、痴呆性老人施設3施設における入所者計80名を被験者とし、自室・便所・浴室・食堂などを探索させている。軽度と中度の障害者ではほぼ探索が可能であるが、重度障害者では約3割が出発点で出発ができず、さらに途中の経路分岐点で約4割は間違った方向に進み、結局は23割しか到達できなかった。それも単調で同質のものが並ぶ居室群のなかから自室を探索することがもっとも困難であった。また同時に施行したシミュレーション実験では、屈折性、対比性、連続性、移動性、方向性、点滅性、信号性などを表象する図形や模擬交差点の図像を提示し、健常者を対象群として比較・分析している。これも重度障害者の場合には図形特質への注視が有意に減少している。しかし時間的には遅延するが移動物体への追随と点滅性には注視がみられ、これらを利用した誘導標識などが有効ではないかと考えられる。なお、精神薄弱者の注視は散漫化し、痴呆性老人の注視は視野中央部に固定化する傾向がみられている。これらの詳細については裏面に掲載している研究発表を参照して下さい。

本研究は認知力の劣る精神薄弱者と痴呆性老人が目的地を探索し、間違わずに到達できるようにするには、どのような建築的配慮をすればよいかを実験によって検討するものである。実験には2種の方法を用いており、一つは空間構成の異なる環境内での探索歩行観察であり、他は空間構成のシミュレ-ション図像を提示し、アイマ-クレコ-ダを用いて空間要素情報(分岐点や目的地の形状など)への注視傾向を分析しようとするものである。当該年度の探索歩行実験では、痴呆性老人施設2施設で被験者延べ147名を対象に経路が水平移動のみの場合と階段やエレベ-タ利用による階異同が含まれる場合のそれぞれについて分岐点数が07である条件のもとで目的地探索行動をさせている。水平移動のみの場合では障害程度が軽度と中度では9割が自力探索できるが、重度となると2割しか自力探索ができない。とくに分岐点数が4以上となると重度の全員が不可能であり、軽・中度でも4割に激減している。さらに階移動を伴う場合では軽・中度でも4割に激減している。さらに階移動を伴う場合では下・中度の2割が階段を自力利用できるだけで、エレベ-タ-利用は全員が不可能であった。またシュミレ-ション実験では、精神薄弱者施設と痴呆性老人施設の各1施設で、被験者10名を対象に、探索経路の分岐点状況を想定し、直進性、慣性性、屈折性、無指向性、放射性、点滅性を表象する図形を提示し、健常者を比較対照群として分析している。これについても重度障害者の場合には図形特質への注視が有意に減少している。とくに放射性と無指向性を表象する図形に対しては追随注視がほとんどできない。これらのことから、障害者では経路中に分岐点があっても、これを無視して直進し、あるいは目的地についても広がったところにあるよりは狭まったところにある方が到達しやすいのではないかと類推される。本年度計画は、(1)経路上にバリアがある場合の探索歩行行動の観察、(2)実験の歩行環境(直線通路と交差点)のスライドと8ミリ映画を提示した場合の注視点分布状況、(3)アイカメラ装着のまま探索経路歩行をした場合の注視点分布状況の検討、および(4)3年度にわたる研究の最終年度にあたるので、そのまとめをすることである。(1)バリアがある場合の探索歩行行動の観察については廊下内にロ-プ、スクリ-ン、通行止めサインなどのバリアを設置し、これらへの対処状況を観察している。被験者は精神薄弱者施設1施設と痴呆性老人施設1施設の入居者である。サインによるバリアはほとんどの被験者に無視されてしまって有効ではないが、その他のバリアでは約半数が規制条件に従った行動をしている。(2)直線通路スライド3場面と交差点付近の8ミリ映画3本を提示して、そのどの部分に注視が分布するかをみる実験を実施し、精神薄弱者7名、痴呆性老人7名、健常者10名について資料を得ている。前年度までの提示図に比べると情報量が増加しており、分析が困難となっているが、情報量が増加すると当然のことながら注視部分は広がり、障害者では歩行中に注視することが必要な信号や標識なども見落としがちとなっている。(3)アイマ-クカメラを装着したままバリアのある経路を歩行する実験は、精神薄弱者10名と痴呆薄弱者10名を対象に実施している。しかし、これの成果は研究デ-タの解析に困難な部分があり、未発表である。
非メバロン酸経路中間体を基質とするプレニル基転移酵素の探索と高分子合成への応用

大腸菌へのカロテノイド生合成遺伝子の導入と阻害剤を用いた検証により、Corynebacterium glutamicum由来のプレニル基転移酵素がC40カロテノイド前駆体への4-ヒドロキシ3-メチルブテニル二リン酸(HMBPP)2分子の転移反応を触媒し、C50カロテノイドを生合成していることを示した。これはHMBPPをドナー基質とする酵素の2例目の発見である。また、各種プレニル基転移酵素の基質特異性を再検証することにより、同じくHMBPPをドナー基質とする酵素を複数見出した。さらに、通常はドナー基質となるジメチルアリル二リン酸をアクセプター基質として受け入れる酵素も発見した。Corynebacterium glutamicumにおいてC50カロテノイド生合成に関わるプレニルトランスフェラーゼの1つ、リコペン伸長酵素CrtEbが触媒する反応を明らかにするため、同菌のカロテノイド生合成系を大腸菌において再構成した。その結果、CrtEbの反応生成物であるフラブキサンチンの合成を確認できた。この大腸菌に酵母由来メバロン酸経路を導入した上で、各種濃度の阻害剤FR-900098を用いて大腸菌内在の非メバロン酸経路を段階的に阻害し、カロテノイド生産に与える影響を調べた。その結果、阻害の程度が進むにつれて大腸菌の生育が悪化し、メバロン酸経路による相補が十分でないことが明らかになった。しかし、部分的な阻害の結果として、生産される複数のカロテノイドの量比の変化も観察でき、CrtEbのプレニルドナー基質に関する情報が得られつつある。現在はより正確な情報を得るため、メバロン酸経路による相補の改善と非メバロン酸経路の遺伝子破壊実験を進めている。また、非メバロン酸経路の中間体がCrtEb以外のプレニルトランスフェラーゼのプレニルドナー基質となりうるか否かを確認し、一部の酵素で反応の進行を確認した。この知見をもとにすれば、既知の生合成経路を人工的な代替経路で置き換えることで、将来的にイリドイド化合物などの生産が可能となるかもしれない。今後は各酵素と同中間体の反応性を評価するため、速度論的な解析を進める予定である。Corynebacterium glutamicumのC50カロテノイド生合成経路を大腸菌に導入し、末端水酸基の起源が非メバロン酸経路(メチルエリスリトールリン酸経路)の中間体であるヒドロキシメチルブテニル二リン酸(HMBPP)にあるか否かを確認した。当初は計画に従い非メバロン酸経路の遺伝子破壊を試みたが、メバロン酸経路を導入した大腸菌においても破壊株を得ることができなかった。そこで阻害剤の利用、および大腸菌遺伝子の過剰発現によって、HMBPPが末端イソプレン単位の直接の前駆体であることを示唆する結果を得た。この結果は、HMBPPを基質とするプレニルトランスフェラーゼの2つ目の発見例である。一部のプレニルトランスフェラーゼはアリル性カルボカチオンを反応中間体とすると考えられており、そのカルボカチオンを不安定化することが予想される水酸基を持ったHMBPPがプレニルドナー基質となるとすれば驚きである。そこでカルボカチオンを反応中間体とすることが証明されている全E型プレニル二リン酸合成酵素を用いてHMBPPが基質となるか否かを確認した。その結果、一部酵素はHMBPPをドナー基質としてプレニル鎖延長反応を触媒し、同種酵素がHMBPPからカルボカチオンを生成できることが明らかになった。しかしながら、アクセプター基質としてHMBPPを受け入れる酵素はなく、期待したようなポリエーテル生成物は得られなかった。予定した研究を進めることができており、結果も出ている。遺伝子破壊のみ予定通りには進んでいないが、相補条件の検討を進めており、改善が期待される。農学CrtEbのプレニルドナー基質に関しては、よりはっきりした証拠を求めて大腸菌の遺伝子破壊実験を進めていきたい。また、それ以外の複数のプレニルトランスフェラーゼで、一般的なプレニル二リン酸以外の基質がドナーとなることが示せている。そのような反応の生成物は合成中間体として将来的な応用可能性があり、構造決定を行いたい。それと共に、同プレニルドナー基質の反応性を速度論解析によって調べ、生体内での反応が可能か否かを評価したい。結果次第では、遺伝子操作を施した大腸菌による合成中間体の生産を試みたい。また、これまでの調査では見つかっていないものの、非メバロン酸経路同士の縮合を触媒するプレニルトランスフェラーゼについても探索を続けたい。遺伝子破壊実験が進まなかったため、その後の実験が行えず、予定より支出額が少なかった。また、学会発表に至らなかったので旅費の支出もなかった。化合物の分析や構造決定のため昨年度未使用であった物品費を使用する。また、学会発表で旅費を、論文執筆に伴う英文校閲で謝金を、投稿料でその他の経費を支出する。
今までにない高時間レベルでイオンポンプ型ロドプシンのイオン輸送を測る

光駆動型イオンポンプであるロドプシン分子によるイオン輸送を、今までにないマイクロ秒オーダーの時間分解で測定する。バクテリオロドプシンなどのポンプ型ロドプシンは、光受容に伴う光反応サイクルにおいてイオンを能動輸送するが、その反応サイクルは数十ミリ秒程度である。過去のイオンポンプ活性測定では時間分解能がサブ秒分オーダーであり、かつ膜電位、イオン濃度勾配などの電気化学ポテンシャル差の正確な制御が困難であった。本研究では電気生理学的手法にナノ秒フラッシュレーザーを組み合わせる。これにより、電気化学ポテンシャル差を正確に制御しながら、ロドプシンの光反応を1回のみ誘起した際のイオン輸送を測定し、輸送速度、輸送量を定量的に解析することで、光反応サイクルにおけるエネルギー変換メカニズムの理解に迫る。現在までにフラッシュレーザーを用いた高時間分解での電気生理実験系の構築を完了した。この実験系を用いてロドプシン分子のシングルターンオーバーあたりのイオン輸送量を定量的にかつ高い時間分解能で測定することが可能となった。特に現在までにプロトンポンプ、ナトリウムポンプの輸送測定実験を行った。その結果プロトンポンプロドプシンにおいては数マイクロ秒と数ミリ秒の時定数でのイオン輸送が分子内で起こることが判明した、またその時定数は膜ポテンシャルや、pH勾配により変化することも判明した。一方ナトリウムポンプロドプシンでも同程度の時定数でのイオン輸送が観察され、時定数の膜電位依存性が観察されたが、ナトリウム勾配依存性は観察されなかった。研究計画の2年目前半(2019年9月)までに計画した実験を既に行い到達目標に順調に迫りつつある。本研究の目標は以下の問いに回答を出すことであった。(1)細胞膜内外の電気化学ポテンシャル差にどれだけ対抗してイオン能動輸送が可能か?(2)ポンプにとって膜電位差とイオン濃度差は等価か?(3)光エネルギー変換に最も重要な反応ステップはなにか?(1)については、プロトンポンプ型ロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンを試料とした計測によりおよそ200 mVから230 mVであることを証明した。(2)について、電気化学ポテンシャル差を構成する膜電位とイオン濃度差はロドプシン分子に必ずしも等価に作用しないことが判明した。熱力学的に等価であるはずの膜電位差とイオン濃度差が、ロドプシン分子に与える機構は同等でないということが示唆され、これはロドプシンタンパク質内部のプロトン化カルボン酸のpKaに対する効果が異なるということであろう。この点は今後のさらなる計測で明らかにしたい。以上のように実験系の立ち上げが予定したよりも早期に完了したことから順調に計測が行えていることから、計画以上に進展しているといえる。今年度は、変異体の測定によって、より詳細なイオン輸送と電気化学ポテンシャル差の関係を探る。プロトンポンプにおけるプロトン輸送においてはロドプシン分子中に機能に重要なプロトン化カルボン酸(グルタミン酸、アスパラギン酸)が同定されている。これらアミノ酸残基それぞれに変異導入を行い、変異体のイオン輸送の計測を行う。そして各反応ステップに対する膜電位やイオン濃度勾配の関与を検証することで、光エネルギー変換に最も重要となるステップを同定する。同様の実験をナトリウムポンプでも試みる。ナトリウムポンプロドプシンにおいてもイオン輸送に重要なアミノ酸残基は報告されている。それぞれの重要なアミノ酸残基の変異体の解析により、ナトリウムイオン輸送時の、光エネルギー変換ステップを決定する。(1)細胞膜内外の電気化学ポテンシャル差にどれだけ対抗してイオン能動輸送が可能か?(2)ポンプにとって膜電位差とイオン濃度差は等価か?(3)光エネルギー変換に最も重要な反応ステップはなにか?

(1)については、プロトンポンプ型ロドプシン、ナトリウムポンプ型ロドプシンを試料とした計測によりおよそ200 mVから230 mVであることを証明した。(2)について、電気化学ポテンシャル差を構成する膜電位とイオン濃度差はロドプシン分子に必ずしも等価に作用しないことが判明した。熱力学的に等価であるはずの膜電位差とイオン濃度差が、ロドプシン分子に与える機構は同等でないということが示唆され、これはロドプシンタンパク質内部のプロトン化カルボン酸のpKaに対する効果が異なるということであろう。この点は今後のさらなる計測で明らかにしたい。以上のように実験系の立ち上げが予定したよりも早期に完了したことから順調に計測が行えていることから、計画以上に進展しているといえる。今年度は、変異体の測定によって、より詳細なイオン輸送と電気化学ポテンシャル差の関係を探る。プロトンポンプにおけるプロトン輸送においてはロドプシン分子中に機能に重要なプロトン化カルボン酸(グルタミン酸、アスパラギン酸)が同定されている。これらアミノ酸残基それぞれに変異導入を行い、変異体のイオン輸送の計測を行う。そして各反応ステップに対する膜電位やイオン濃度勾配の関与を検証することで、光エネルギー変換に最も重要となるステップを同定する。同様の実験をナトリウムポンプでも試みる。ナトリウムポンプロドプシンにおいてもイオン輸送に重要なアミノ酸残基は報告されている。それぞれの重要なアミノ酸残基の変異体の解析により、ナトリウムイオン輸送時の、光エネルギー変換ステップを決定する。
大腸菌ゲノム解析の完成

全生物種の中で、大腸菌は生化学的、遺伝学的解析が最も進んでおり、これらのデータやゲノム解析から得られる情報は、他の生物種のゲノムを解読する上で、基準として役立つことが期待されてきた。平成6年度までにわが国では大腸菌ゲノム地図の013分に対応する約0.58Mbの配列決定を行ってきた。平成7年度より、13名が自主的に解析グループを組織し、新しく開発したプロトコールのもとで徹底した分業化と経済化を計りながら解析に取り組んできた。本研究はこのような背景と実績のもとに平成8年度1年間で2950分に対応する1Mbの配列を決定しようとした。その結果、目的とした1Mbばかりでなく、米国のグループが、平成7年までにすでに決定し登録していた10070分の領域に到達することができ、その結果大腸菌ゲノムの配列を一本にし、そのゲノムの全構造を完成することが出来た。日本としては合わせて070分の領域を連続した配列を決定したことになる。また、決定した配列を直ちに解析し、遺伝子の解析を進めるとともに、その結果をより早くより多くの研究者に理解され、利用されるよう、論文発表を行うとともに、配列とその解析結果を公的なデータバンク(DDBJ)を通して登録、公開した。さらに、DDBJの協力も得て、より使いやすいかたちにデータを変換しWWWでの公開も行っている。以上のような計画以上の成果が得られた原因は、いろいろあるが、グループ全員の-致した協力、配列決定の技術的改良、コンピューター関連のサポート(電子メール、インターネット、配列アッセンブルソフト)、米国との競争などが挙げられよう。また、決定した配列を直ちに解析し、遺伝子の解析を進めるとともに、その結果をよく早くより多くの研究者に理解され、利用されるよう、論文発表を行うとともに、配列とその解析結果を公的なデータバンク(DDBJ)を通して登録、公開した。以上のような計画以上の成果が得られた原因は、いろいろあるが、グループ全員の一致した協力、配列決定の技術的改良、コンピューター関連のサポート(電子メール、インターネット、配列アッセンブルソフト)、米国との競争などが挙げられよう。
豚肝移植におけるNO合成酵素阻害剤門脈内投与の再灌流障害抑制に関する研究

本研究ではNOが肝阻血再灌流においてどのように変動するのか、再灌流後のNO産生を抑制することで再灌流障害を軽減できるのかを肝温阻血再灌流・移植モデルにおいて検討した。【方法】実験1:20kgの雌豚を使用し門脈血を体外シャント下にバイパスした120分肝温阻血モデルを作成し、再灌流前後のNOの変動を検討した。NO合成酵素阻害剤の再灌流障害に対する効果を検討するために、構成型NO合成酵素を比較的阻害するL-NAME、誘導型NO合成酵素を比較的阻害するaminoguanedine(AG)を門脈内投与した。薬剤は虚血前に門脈内投与した。実験2:豚肝移植においてAGを再灌流直後に門脈内投与し、再灌流障害に対する影響を検討した。【結果】肝温阻血再灌流においてNOは再灌流後は虚血前値より数時間上昇し以後低下した。L-NAME投与は投与直後の血圧を上昇させたが阻血後の生存率20%で、虚血中もしくは再灌流後70分以内に80%が死亡した。AG投与は血圧を変動させず83.3%生存し、再灌流後のNO上昇を有意に抑制しており、肝組織血流は非投与群と比較すると有意に高くかった。肝逸脱酵素(AST)はAG非投与群に比較して低い傾向を認めた。肝移植においてAGを再灌流直後に門脈投与すると、NOは非投与群と比較して低値である傾向を示し、ASTは非投与群に比較して有意に低値であった。【考察】以上より肝阻血再灌流においてAG投与により再灌流後のNO産生が抑制されたことから、虚血再灌流によって誘導型NO合成酵素によるNOが産生されること、このNO産生を抑制することで再灌流後のASTが低値であったことから、誘導型NO合成酵素阻害剤は再灌流障害を軽減させ得ることが判明した。また、構成型NOを抑制することは肝虚血再灌流において障害的に働くことが判明した。本研究ではNO合成阻害剤を投与することで肝移植時の保存・再灌漑流障害を軽減できるかを検討する。また、全身への副作用を軽減させるため臓器特異的投与目的に門脈内に投与しその効果をみる。現在、肝移植モデルの投与前の予備実験として、適切なNO合成阻害剤の投与時期とNOの変動を確認するため、体外シャント使用下ブタ肝温阻血再潅流モデルにおいて経時的な動脈血中NO_2/NO_3(以下NOx)、エンドセリン-1(以下ET-1)、LDH、肝組織血流量の変動を検討した。【方法】20kg、メスブタにて体外シャント下に肝門部温阻血を60・90・180・240分施行後、再潅流し、動脈血中NOx、ET-1、LDH、肝組織血流量を経時的に測定した。【結果】60・90分阻血については全例生存し、180分阻血において25%、240分阻血において75%の死亡率であった。NOx、LDHは阻血時間依存性に上昇した。再潅流36時間後にNOxの上昇がみられ、iNOS由来のNO発生が示唆された。ET-1は再潅流90分3時間後に上昇し、死亡例で特に高値であった。【結語】ブタ肝温阻血限界時間は3時間前後であった。NO、エンドセリンと肝温阻血再潅流

障害は相関性があり、NOは阻血時間依存性に上昇し、ET-1は死亡例において非常に上昇した。今後はNO合成酵素阻害剤門脈投与を施行する予定である。本研究ではNOが肝阻血再灌流においてどのように変動するのか、再灌流後のNO産生を抑制することで再灌流障害を軽減できるのかを肝温阻血再灌流・移植モデルにおいて検討した。【方法】実験1:20kgの雌豚を使用し門脈血を体外シャント下にバイパスした120分肝温阻血モデルを作成し、再灌流前後のNOの変動を検討した。NO合成酵素阻害剤の再灌流障害に対する効果を検討するため、構成型NO合成酵素を比較阻害するL-NAME、誘導型NO合成酵素を比較的阻害するaminoguanedine(AG)を投与した。薬剤は虚血前に門脈内に投与した。実験2:豚肝移植において誘導型NO合成酵素阻害剤(aminoguanidine)を再灌流直後に門脈内投与した。【結果】肝阻血再灌流においてNOは再灌流後は虚血前値より数時間上昇し以後低下した。L-NAME投与は投与直後の血圧を上昇させたが、75%が虚血中もしくは再灌流後に死亡した。AG投与は血圧を変動させず全例生存した。再灌流後のNO上昇を抑制されており、肝組織血流は非投与群と比較すると有意に高く、肝逸脱酵素は低かった。肝移植においてAGを再灌流直後に門脈内投与すると、肝逸脱酵素は非投与群に比較して低い傾向を認めた。【考察】以上より肝阻血再灌流においてAG投与により再灌流後のNO産生が抑制されたことから、虚血再潅流によって誘導型NO合成酵素によるNOが産生されること、このNO産生を抑制すると再灌流障害を抑制できたことから誘導型NO合成酵素阻害剤は再灌流障害を軽減させ得ることが判明した。また、構成型NOを抑制することは肝虚血再灌流において障害的に働くことが判明した。
新星・超新星における元素合成過程にかかわる軽い不安定核の天体核反応率測定

理化学研究所加速器研究施設において行われた高速RIビームを用いた実験結果の分析を行い、将来の研究へ向けた考察を行った。1)クーロン分解法によるrp過程陽子捕獲反応の研究不安定核^<23>Al,^<27>Pのクーロン分解反応の実験結果をもとに、爆発的水素燃焼過程の天体核反応率を決定した。両反応が陽電子崩壊より速くなる温度・密度条件を求め、新星やX線バーストの天体モデルと比較したところ、新星では大半の場合陽電子崩壊が勝り、X線バーストでは陽子捕獲が優勢であることがわかった。2)クーロン分解反応機構の研究^8B核のクーロン分解反応における磁気双極子(M1)、電気四重極子(E2)、および核力励起の寄与を求めるため、従来行った鉛標的に加えて、液体水素および液体ヘリウム標的による分解反応の実験を行った。これは、陽子捕獲反応に結果を焼き直すために必要な情報を得ることが目的である。弾性散乱の角度分布を導出し、光学ポテンシャルによる解析を行った。特に、鉛標的の場合は、従来用いていた光学ポテンシャルが結果を再現することを見いだし、従来の解析が正しいことを確認できた。理論研究者との議論から、微視的反応理論による解析から多階段過程の寄与が、従来言われていた直接反応の結果とクーロン分解反応の結果の違いを解消する可能性が高いことが明らかとなった。3)磁気双極子遷移を導出する方法の開発爆発的水素燃焼の核反応では基底状態とM1・E2混合遷移で結ばれている共鳴が重要なことが多い。M1、E2クーロン分解の散乱角度分布の違いを用いて両者の寄与を分離する方法を発案し、シミュレーションによる有効性の検証に基づき実験を提案し、理研の課題採択委員会によって承認された。理化学研究所加速器研究施設において、高速短寿命核ビームを用いた以下の実験き行うとともに、測定装置開発を行った。1.rp過程陽子捕獲反応のクーロン分解法による測定不安定核ビーム^<23>Al,^<27>Pを鉛標的に入射し、クーロン分解反応の測定を行った。天体核燃焼に寄与する共鳴状態を確認することにし、その生成断面積の理論解析より、^<22>Mg(p,γ)^<23>Al,^<26>Si(p,γ)^<27>P両反応の共鳴断面積を導くことに初めて成功した。2.クーロン分解法のテストクーロン分解法の信頼度を実験的に確かめるため、既に放射捕獲断面積が正確に知られている^<16>O(p,γ)^<17>F反応に対応する^<17>F核のクーロン分解の実験を行い、現在解析中である。3.クーロン分解法による2陽子捕獲反応の実験高温・高密度のrP過程に寄与すると考えられる陽子ドリップライン付近の原子核の2陽子吸収過程を調べるため、2つの陽子を放出するクーロン分解反応の実験を行う予定である。そのテストとして、^<20>Mgの鉛標的による2陽子放出分解の実験を行った。4.^<15>O核のクーロン励起CNOサイクルの反応^<14>N(p,γ)^<15>Oの低エネルギー断面積には、しきい値以下の双極子状態の電磁強度が影響する。これを^<15>Oビームによるクーロン励起法により調べ、この状態の寄与が予想より小さいことを見出した。5.ストリップ型シリコン検出器による粒子測定系の建設正確な角度情報と高い粒子識別能力を持つシリコン検出器によるカウンターテレスコープを建設し、クーロン分解反応の実験に用いた。

さらに、結晶チャネリング効果によって方向によるエネルギー損失のゆらぎを防ぎ、高い粒子識別能を持たせるため、結晶軸を傾けた検出器を設計し、その性能測定を開始した。理化学研究所加速器研究施設において、高速RIビームを用いた実験を行うとともに、測定装置開発を行った。1)rp過程陽子捕獲反応のクーロン分解法による決定前年度行われた不安定核^<23>Al,^<27>Pのクーロン分解反応の実験結果をもとに、爆発的水素燃焼過程の天体核反応率の決定を行った。^<22>Mg(p,γ)^<23>Al反応については、実験的な値を得ることに初めて成功し、この反応が新星での核燃焼に寄与する条件を明らかにした。^<26>Si(p,γ)^<27>P反応については、共鳴からのγ線放出にM1,E2の2成分あることから、反応率の上限と下限を与えた。2)クーロン分解反応機構の研究連続状態を経由するクーロン分解反応では、陽子捕獲の主成分である電気双極子(E1)遷移が強く起きるが、他の遷移多重度(M1,E2)および、核力励起の寄与も含まれ、しかも、その割合が陽子捕獲の場合と異なる。特に近年の太陽ニュートリノ問題のように、高精度(典型的には5%)の結果を要求される場合は、これらの小さな寄与の推定が必要である。^8B核のクーロン分解反応におけるM1,E2および核力励起の寄与を求めるため、従来行った鉛標的に加えて、水素およびヘリウム標的による分解反応の実験を行った。3つの標的による結果の比較と角度分布の詳細な分析から、各成分の寄与を引き出すことを目指している。現在データの解析を行っている。3)クーロン分解法による2陽子捕獲反応の実験昨年度行った^<20>Mgの鉛標的による2陽子放出分解の実験データの解析を行った。まず、^<20>Mg核そのものの性質を調べる目的で2^+状態からのγ崩壊を分析し、鏡核^<20>Oとの比較を試みた。5)ビームライン検出器系の開発RIビームの識別能を高めるため、結晶軸を傾けた検出器を設計し、期待される性能を発揮することを確認した。また、高強度のビームを計数するため、高速の増幅器系を整備した。理化学研究所加速器研究施設において行われた高速RIビームを用いた実験結果の分析を行った。1)rp過程陽子捕獲反応のクーロン分解法による決定不安定核^<23>Al,^<27>Pのクーロン分解反応の実験結果をもとに、爆発的水素燃焼過程の天体核反応率の決定を行った。両反応が陽電子崩壊より速くなる温度・密度条件を求め、新星やX線バーストの天体モデルと比較したところ、新星では大半の場合陽電子崩壊が勝り、X線バーストでは陽子捕獲が優勢であることがわかった。2)クーロン分解反応機構の研究連続状態を経由するクーロン分解反応では、陽子捕獲の主成分である電気双極子(E1)遷移以外に、他の遷移多重度(M1,E2)および、核力励起の寄与も含まれ、その割合が陽子捕獲の場合と異なる。昨年度^8B核のクーロン分解反応におけるM1,E2および核力励起の寄与を求めるため、従来行った鉛標的に加えて、液体水素および液体ヘリウム標的による分解反応の実験を行った。理論解析の基礎となる弾性散乱の角度分布の導出に成功し、光学ポテンシャルによる解析が可能となった。また、分解機構の理論的解析について議論するワークショップを開き、理論研究者との研究協力を行った。
生体分子クラスターの衝突反応に関する研究

孤立状態にある蛋白質の多電荷イオンと、種々のアミン等のH^+親和力(PA)の大きな気体分子との衝突反応に関して研究した。エレクトロスプレーイオン化法によって孤立状態にあるlysozyme, cytochromec, myoglobin, hemogiobin, albumin, ubiquitin, angiotensin I, bradykinin等の蛋白質・ペプチドの多電荷イオンを生成させた。生成したイオンを特定の電荷数で選別した後、衝突反応セルに導き、蛋白質イオンと気体分子とのH^+移動反応について検討した。PAの大きな気体分子を、標的分子として衝突反応セルへ導入した。標的分子として1-propylamine, 1-buthylamine, pyridine, tert-butylamine, diethylamine, dipropylamine, triethylamineを用いた。蛋白質イオンを衝突反応セル中に数10ms間トラップして、標的分子と多重衝突させた。H^+移動反応によって生成したイオン種を質量分析し、検出した。特に、プロトン移動の反応温度依存性を測定した。その結果、温度変化に伴って、蛋白質イオンの立体構造が複数の準安定な異性体に転移することが分かった。以上のことから、プロトン移動の反応過程が蛋白質イオンの内部温度と強い相関を持つことを解明した。すなわち、生体分子の協同的な挙動を、原子・分子1個1個のレベルで直接観測し、気相中の衝突反応による、H^+移動の反応速度をひとつの指標として、生体分子の集団的な挙動を素過程に分解した。そして、孤立状態にある蛋白質イオンの立体構造と反応に関して詳細に理解することができた。その結果、生体分子の協同的・組織的な相互作用に関する詳細な知見が得られた。エレクトロスプレーイオン化法によって孤立状態にあるlysozyme, cytochrome c, myoglobin, hemoglobin, albumin等の蛋白質の多電荷イオンを生成させた。特に、lysozymeについては、試料溶液にdithiothreitolを加えてS-S結合を切断した試料についても同様の実験を行い、気相中の蛋白質イオンの立体構造と反応性との関係について調べた。すなわち、生体分子の協同的な挙動を、原子・分子1個1個のレベルで直接観測した。その結果、気相中の衝突反応による、H^+移動の反応速度をひとつの指標として、生体分子の集団的な挙動を素過程に分解した。
赤外領域におけるシンクロトロン放射光の有効利用に関する研究

これまでの放射光の利用は波長の短いX線・軟X線領域を中心に行われ、赤外域での利用は極小数のグループに限られてきた。本研究の目的は、これまで申請者らが中心となって行ってきた遠赤外領域での放射光利用での実績を基に、放射光の更なる利用を図るため、放射光ならではの研究課題を遂行することにある。具体的には赤外-遠赤外域における放射光の高輝度性を利用することで容易に実行できるダイヤモンドアンビルセルを用いた高圧下遠赤外分光実験、放射光の短パルス性を利用するこることで従来の時間応答スケールを千分の一以下に縮めるという新境地を開くことが可能な時間分解赤外分光実験、表面赤外分光実験への利用等である。これらの目的の下に本研究では分子科学研究所(岡崎市)の放射光施設UVSORにおいて全ての実験を行い、10Paを越す高圧領域での遠赤外分光実験が容易に行えることの実証・我々のグループが開発した時間分解赤外分光装置に高速の赤外検出器を組み込んで、赤外パルス光源としてのUVSORの時間応答スペクトルの観測を試み、放射光が優れた赤外パルス光源であることを実証するなどの成果を挙げてきた。この様な成果が大きなきっかけとなって今や赤外放射光の利用は世界数カ所の放射光施設で行われつつある。本研究はこれまで申請者らが中心となって行ってきた遠赤外領域での放射光利用での実績を基に次の2つの目的を持つ。(1)放射光の短パルス性を利用することで従来の時間応答スケールを千分の一以下に縮めるという新境地を開くことが可能な時間分解赤外分光実験、(2)放射光に高輝度性を最大限に利用することで初めて先進的な成果が期待できる半導体表面に関する表面赤外分光実験(IRAS)の2つの実用化。この為に、我が国で唯一赤外放射光の利用が可能な分子科学研究所の放射光施設UVSORにおいて、UVSORとの共同研究の下に10^4-100cm^<-1>領域の赤外分光が可能な実験ステーションを建設した(時間分解赤外分光が可能な干渉分光計の設置及び試料チャンバーへの光の輸送系の設計と建設立ち上げ)。この装置は従来UVSORに設置されていた遠赤外-ミリ波領域の分光装置に加えて測定有効波長領域を近赤外領域まで拡張するもので、本研究目的の達成には不可欠のものであった。この完成により本研究の目指す時間分解赤外分光の基本的な実験環境の整備が終了した。今年度後半には高速赤外検出器を持ち込み放射光パルスの時間応答を計測するためそのパルスの立ち上がりを計測する予備的実験に着手している。赤外放射光のパルスは2ナノ秒(10^<-9>)であり、本実験での瞬間応答は高速検出器の時間応答の早さ(20ナノ秒程度)で決まるものと思われる。今年度の本研究の目的はこれまで申請者らが中心となって行ってきた赤外-遠赤外領域での放射光利用での実績を基に、放射光の短パルス性を利用するこることで従来の時間応答スケールを千分の一以下に縮めるという新境地を開くことが可能な赤外領域における時間分解分光を実施することである。放射光は本質的にナノ秒(10_<-9>秒)という短い時間内に光が発せられる短パルス光源であり、この高速パルス性をフルに利用すればこれまでの時間応答スケールを一挙にナノ秒領域(従来の千分の一以下)に縮めることが出来る筈である。本研究ではこれまで申請者らが実績を挙げてきた分子科学研究所(岡崎市)の放射光施設UVSORの赤外ビームラインBL6A1を利用して先ず赤外放射光の短パルス信号を観測することを試みた。検出器は現在最も応答速度が速い半導体検出器MCTを用いた。プリアンプまで入れた応答速度は20ナノ秒である。電子ビームの固まり(「バンチ」と呼ばれる)は唯一個周回するシングルバンチモードにおいてそのパルスの立ち上がりを測定したところ見事に信号を検出することが出来た。信号の時間変化は検出器の応答時間に対応する20ナノ秒の立ち上がりを持っていた。

赤外放射光のパルスの立ち上がりを計測できたのは我が国ではこれが初めてであり、放射光が赤外領域全般で白色光源であることを考えることを実験により任意の波長を選ぶことの出来るパルス光源の開発に見通しが得られたことになる。この3年に及ぶ本研究の目的は、これまで申請者らが中心となって行ってきた遠赤外領域での放射光利用での実績を基に、これまでその利用が普及してこなかった赤外領域での有効利用を図ろうというものである。具体的には赤外ー遠赤外域における放射光の高輝度性を利用する実験(例えば圧力発生器としてダイヤモンドアンビルセルを用いた高圧下遠赤外分光実験がこれに相当)の遂行、放射光の短パルス性を利用するこることで従来の時間応答スケールを千分の一以下に縮めるという新境地を開くことが可能な時間分解赤外分光実験の確立、等である。本年度は分子科学研究所(岡崎市)の放射光施設UVSORにおいて我々のグループが開発した時間分解赤外分光装置に高速の赤外検出器を組み込んで、パルス光源としてのUVSORの時間応答スペクトルの観測を試みた。シングルバンチ運転時のUVSORはパルス幅160ナノ(10-9)秒、パルス幅約0.2ナノ秒のパルス光源である。本研究において、UVSORがナノ秒領域の優れた赤外パルス光源であることが立証され、その成果を日本物理学会、国際会議(SR197(姫路))で発表した。
読書施設における「日本的底流」の存在に着目した近世教育と近代教育の連続性の研究

本研究は、明治・大正期の日本において、図書館観をめぐる合意がいかにして民意の中に醸成されたかを解明することにより、近代図書館の制度と思想が日本社会の中に位置づけられていく過程を明らかにすることを目的とする。本研究の独自性は、近世教育と近代教育との連続性を、文庫や貸本屋の概念を継承した図書館における日本的底流の存在の中に見ようとするところにある。そのことを、実在したいくつかの原初期図書館やその前身の読書施設について、その創設の発意から計画、設立、運営、利用に至るまでの経緯を詳しく跡付けることにより実証する。
視点・ヴォイスに関する習得研究-学習環境とcontextual variabilityを中心に-

(1)(2)を調査カテゴリ別に分析した結果、複文、受益文はJFL、JSL両環境に於て習得状況はよいが、視点、間接受身はJSLに於ても習得の進みにくいことが明らかになった。受益文については英語話者の場合、能動文と同じ視点をとる「てくれる」の生成が「てもらう」に先行すること、間接受身については、その習得過程に直接受身の現れることが分かった。さらにデータを増やし、JFLとJSLの英語話者、JSLの中国語、韓国語、インドネシア・マレー語話者等のデータにimplicational scalingを用いてヴォイスの生成順序を検討したところ、環境、母語の如何に関わらず、[受益文>直接受身>間接受身]という順序がimlicational hierarchyを成していることか分かった。最後に、自然なヴォイスの生成との比較という点から、英語、韓国語、中国語話者各30名のOral Proficiency Interviewに現れたヴォイスの生成を調べた結果、[可能>受益文>直接受身>間接受身]のimplicational relationが認められた。したがって、筆記テストによるデータと自然な口頭データから同じ生成順序が認められ、日本語ヴォイスの習得順序をある程度検証できたと言える。1.視点・ヴォイスの習得状況を調べるための「文生成テスト」の1年後の追跡調査(海外と国内)帰国した学生約100名と日本で学習を続けている学生約50名に調査依頼を送った。国内は38名回収されたが、海外の回収率は低く、統計的分析は不可能となった。従って、学習環境による差を厳密に調べることは無理であり、分析方法を以下のように変更した。(1)(2)を調査カテゴリ別に分析した結果、「複文」「受益文」はJFL、JSL両環境に於て習得状況はよいが、「視点」「間接受身」はJSLに於ても習得が進みにくいこと、また、補助動詞「てしまう」はJFLでは殆ど生成されないが、インプットさえあれば(JSLでは)容易に習得の進むことが分かった。これらの全体的傾向は「視点、ヴォイス、複文の習得要因」として「日本語教育92号」に発表した。更に「受益文」に関しては「てくれる」の生成が「てもらう」に先行することを平成9年1月に国際大学のConference on Second Language Research in Japanにて発表、「間接受身」に関しては7月にオーストラリアで発表の予定である。2.上記「文生成テスト」に於けるデータと自然なプロダクションに於けるデータの比較(1)作文、ロールプレイのデータ収集は完了し、現在分析中(2)自然発話のデータは現在収集中平成9年度は上記2のデータを中心に視点・ヴォイスの分析を行う予定である。1.「文生成テスト」(日本語学習者を対象に視点・ヴォイスおよび複文の生成状況を絵を使用して調べる筆記テスト)及びその追跡調査の分析とまとめ(1)カテゴリ別及び学習環境別分析(2)視点・ヴォイスの習得順序2.テストにおけるデータと自然なプロダクションにおけるデータの比較(1)上記1の筆記による「文生成テスト」を口頭で実施し、筆記と口頭のデータを比較検討中(2)同時にインタビューを行い、実際の発話において「文生成テスト」の調査構文が生成されるかどうかを調査(3)自然データ(学習者のスピーチや発表時における学習者同士の質疑応答等)を録音した。今後、データを文字化し、CHILDES(発話分析ソフト)を用いて、視点・ヴォイスの関係のlinguistic context(contextual variability)について分析を進める予定3.語用論面からの「視点」の検討