hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
視体積交差法による植物体のオンライン三次元形状測定

デジタルカメラと複数の鏡による三次元形状測定装置を開発し,視体積交差法によりキャベツ苗の二次元画像から三次元形状を構成した。苗の葉は薄く,高い測定精度が要求される。このため立方体のガイドを用いるキャリブレーション法を提案し,その有効性を確認した。また視体積交差法における三次元形状測定においてRハードポイントの利用が有効であることを確認した。本研究の目的は苗や果実など植物体の三次元形状を迅速に測定するコンパクトな装置を開発することである。農業分野において,苗など対象物の三次元形状を迅速に測定できれば,個体別の葉面積や受光量が把握できメリットが大きい。また植物体を対象とするロボット,更には流通の分野においても,対象物の三次元形状を測定したいというニーズがある。測定方法としては,体積ベースの方法である視体積交差法を用いる。この方法では通常,対象物を複数の視点から撮影して得られたシルエットを,もとの三次元空間に逆投影して物体の形状を特定するが,本研究では複数のメラに代えて,一台のカメラと複数の鏡を用いる。測定対象物を特定することで,これが可能になる。対象物に合わせた効果的な装置の構成を明らかにし,モデル化と推定を取り入れた三次元形状復元のアルゴリズムを開発する。測定方法としては,一台のカメラと複数の鏡を用い,基本的には視体積交差法のアルゴリズムによって,測定対象物の三次元形状をデータとして再構築する。当初の予定では平成19年度に基礎実験を行って適切な仮想視点を決定した後,多視点撮影試験装置を製作し,キャリブレーション試験を行う予定であった。しかし基礎実験によって,キャリブレーションで同定すべきパラメータが予想以上に多く,基礎実験の段階でキャリブレーション手法を確立する方がよいことが分かった。また画像ひずみによる影響が大きく,予想以上に精密なキャリブレーションが必要であることが明らかになった。適切なキャリブレーション手法が確立されれば,仕様の異なる様々な撮影装置に対応できる。このため,研究の順序を変更し,19年度は基礎実験装置によるキャリブレーション手法の研究に力を注いだ。効率的な鏡の配置を探すために,回転ステージを用いて測定対象物および鏡の角度を変えて撮影できる装置を製作した。この装置により対象物をあらゆる方向から高精度で撮影し,視点の組み合わせと三次元形状復元精度の関係を調べることができる。キャリブレーションは平面に描かれた格子模様を複数の配置で撮影し,画像から再構築される線が元の模様を正確に再現するようにパラメータを決定する方法で行った。未知数を,カメラの内部パラメータ,外部パラメータ,鏡の位置と向きなど,計27個のパラメータに分解し,それらを撮影画像から逆算して決定した。19年度までの研究で,視体積交差法では原理的に植物の葉など薄い形状の物体を測定するのが難しく,正確な測定のためには,適切な鏡の配置とキャリブレーションの精度が重要であることが明らかとなった。このため,まずは複数のカメラを配置する代わりに,回転ステージを用いて測定対象物を回転させるとともに,一枚の鏡の向きを変更できるようにし,適切な鏡の配置を明らかにした。また平面の格子パターンを撮影してキャリブレーションを自動的に行えるようにした。この結果に基づいて,20年度には5枚の鏡を二段階に配置した,10枚の鏡による撮影装置を製作した。この装置ではカメラの内部パラメータと位置,向き,および10枚の鏡の位置と向きを知ることが必要で,キャリブレーションで同定すべきパラメータが非常に多くなる。本研究では,格子パターンを印刷した立方体を撮影することで,複雑なキャリブレーションを自動で行うアルゴリズムを開発した。これにより三次元形状の精度が向上した。更に,予め作成した植物体の形状モデルを測定結果に適用することで,視体積交差法の原理的な弱点を克服する方法を検討した。これに関連して,20年度はHard Pointの概念を導入した。これは視体積交差法によって得られた3次元データに含まれる点の内,測定対象物に必ず属すると言える点のことである。測定結果からHardPointを抽出した結果,葉の輪郭をよく再現しており,モデル適用の見通しを得た。

測定方法としては,一台のカメラと複数の鏡を用い,基本的には視体積交差法のアルゴリズムによって,測定対象物の三次元形状をデータとして再構築する。20年度までの研究で,回転ステージを用いて測定対象物を回転させるとともに,一枚の鏡の向きを変更できるようにし,適切な鏡の配置を明らかにした。また平面の格子パターンを撮影してキャリブレーションを自動的に行えるようにした。この結果に基づいて,5枚の鏡を二段階に配置した撮影装置を製作し,格子パターンを印刷した立方体を撮影することで,複雑なキャリブレーションを自動で行うアルゴリズムを開発した。21年度はHard Pointの検出によるモデルパターンの適用について検討した。Hard Pointとは視体積交差法によって得られた3次元形状に含まれる点のうち,測定対象物に必ず属するといえる点のことであり,通常,測定対象物のエッジ上の点である。実験の結果,鏡の配置を適切にすると,植物苗の葉のエッジが正確に検出された。しかし,対象物の形状により適切な鏡の配置を事前に予測し,設定するのが困難であった。モデルパターンとのマッチングについては,対象物の形状が単純で,Hard Pointが適切に検出されれば問題なく行える。やはりHard Pointの検出が重要課題であることが明らかとなった。本研究では視体積交差法のプロセスに加えて,対象物のシルエットの正確な抽出が重要課題である。このためカメラの設定やフィルタリング等の画像処理にも重点を置いている。本研究で検討した手法を適応することで,屋外での位置検出についての成果が得られた。本研究の目的は苗や果実など植物体の三次元形状を迅速に測定するコンパクトな装置を開発することである。農業分野において,苗など対象物の三次元形状を迅速に測定できれば,個体別の葉面積や受光量が把握できメリットが大きい。21年度までの研究で,回転ステージを用いて測定対象物を回転させるとともに,一枚の鏡の向きを変更できるようにし,適切な鏡の配置を明らかにした。この結果に基づいて,10枚の鏡を配置した撮影装置を製作し,キャリブレーションの自動化とキャベツの苗を測定する実験を行った。さらにR-Hard Pointから苗のモデルを構築する研究を行った。R-Hard Pointは視体積交差法によって得られた3次元形状に含まれる点のうち,測定対象物に必ず属するといえる点のことであり,通常は測定対象物のエッジ上に検出される。22年度は植物のように複雑な形状の対象物を測定する場合にR-Hard Pointを利用することの有効性を明らかにした。また実作業への応用としていちご収穫ロボットへの適用性を検討した。いちご収穫ロボットの開発研究では花柄を把持して収穫することが主流になってきており,細い花柄の位置と方向を性格に検出することが課題となっている。
地理情報システムを用いた地域計画立案支援システム

本研究は、草津市を中心とする湖南地域のあらゆる社会・経済的データを地理情報システム(GIS)に取り込み、1990年代における対象地域の変容を明らかにする商業環境モニタリング・システムの構築と、地域将来計画にみられる様々なインパクト(大規模小売店舗の出店など)が当該地域の商業環境に与える影響を予測するシステムの構築を行った。1.現況の商業環境のモニタリング:1999年度に来街者調査、駐車場利用実態調査、消費者購買行動調査を実施し、2000年度は、詳細な買物日誌調査、事業所実態調査を実施した。なお、これら全て調査結果はGISで扱える形式で全てデーターベース化された。そして、それらのデータベースから、クロス集計やGISでの地図化を試みた。特に、草津駅周辺の駐車場利用の実態(山下、2001)や、来街者調査(中心調査法)と消費者購買行動調査(周辺調査法)のGISを用いた比較分析(香川等、2000)、消費者購買行動調査からの各店舗の3D商圏分析(矢野他、2000、NHK-BS2で放映)、消費者の1週間の買物行動に関わる時空間軌跡の3次元表示、草津市のジオデモグラフィクスの構築、などが行われた。2.インパクト予測モデル:本システムでは、欧米における消費者購買行動研究の展望とGISと空間分析の最近の動向を把握した上で(矢野、2000ab,2001)、現況の消費者購買行動のアンケート結果に基づいて、従来のハフ・モデルを拡張した空間的相互作用モデルを応用したインパクト予測モデルを構築した。3.商工会議所支援システム:本研究で行った調査・分析結果を、1992年に行われた草津商工会議所の商業近代化地域計画策定事業報告書と比較・分析した上で、湖南地域全体、そして草津市の商業環境を展望し、本システムの商工会議所での活用方法を提示した。本年度は、草津市を中心とする湖南地域のあらゆる社会・経済的データを地理情報システム(GIS)に取り込み、1990年代における対象地域の変容を明らかにするとともに、地域将来計画にみられる様々なインパクト(大規模小売店舗の出店など)が当該地域にどのような影響を与えるかを予測するための基礎となる地域活動モニタリング・システムの構築を行った。その内容は、以下のようである。1.地域活動のGIS化:対象地域に関するあらゆる地域情報をGISに取り込み、GIS上で表示するシステムを開発・整備した。具体的には、地図情報データとしては、対象地域全域の街区・町丁目・市町村、鉄道、道路などを、地域属性データとしては、1990年代の国勢調査をはじめとする小地域統計、地域メッシュ統計などを、GIS(ArcView)に取り込んだ。2.都市的土地利用変化のGIS化:対象地域のデジタル土地利用図を作成するための基図となる、最新のデジタル住宅地図『Zmap』(大津市1年次、草津市2年次)をArcView上で利用可能な形に整備し、さらにNTTのタウンページデータとのマッチングを試みた。3.商業活動のデータベース構築:対象地域の商業施設利用者や草津市住民を対象とするアンケート調査を実施し、当該地域の消費者購買行動を明らかにした。具体的には、来街者調査(平日と休日)、駐車場利用実態調査(休日)、消費者購買行動調査(草津市全戸郵送アンケート)などを実施した。なお、今年度の研究成果は、3月中旬に行われる地域連携先の草津商工会議所の月例会において、商業者会員に対して広く公表され、意見交換などが行われる予定である。

本研究は、草津市を中心とする湖南地域のあらゆる社会・経済的データを地理情報システム(GIS)に取り込み、1990年代における対象地域の変容を明らかにする商業環境モニタリング・システムの構築と、地域将来計画にみられる様々なインパクト(大規模小売店舗の出店など)が当該地域の商業環境に与える影響を予測するシステムの構築を行った。1)現況の商業環境のモニタリング:昨年度に行われたアンケート調査(来街者調査、駐車場利用実態調査、消費者購買行動調査)に加え、本年度は、詳細な買物日誌調査、事業所実態調査を実施し、それら全てをデーターベース化した。そして、それらのデータベースから、クロス集計やGISでの地図化を試みた。特に、草津駅周辺の駐車場利用の実態(山下、2001)や、来街者調査(中心調査法)と消費者購買行動調査(周辺調査法)のGISを用いた比較分析(香川等、2000)、消費者購買行動調査からの各店舗の3D商圏分析(矢野他、2000、NHK-BS2で放映)、消費者の1週間の買物行動に関わる時空間軌跡の3次元表示、草津市のジオデモグラフィクスの構築、などが行われた。2)インパクト予測モデル:本システムでは、欧米における消費者購買行動研究の展望とGISと空間分析の最近の動向を把握した上で(矢野、2000ab,2001)、従来のハフ・モデルを拡張した空間的相互作用モデルを応用したインパクト予測モデルを構築した。3)商工会議所支援システム:本研究で行った調査・分析結果を、1992年に行われた草津商工会議所の商業近代化地域計画策定事業報告書と比較・分析した上で、湖南地域全体、そして草津市の商業環境を展望し、本システムの商工会議所での活用方法を提示した。なお、最終的な研究成果は、3月22日に行われる地域連携先の草津商工会議所の月例会において、商業者会員に対して広く公表され、意見交換などが行われる予定である。
細胞外Cl^-を調節して神経回路の興奮性を制御するグリアのCl^-トランスポーター

1.脳スライスのアストロサイトからの[Cl^-]_i測定とグリアによる神経回路機能調節の証明[窪田・福田]:まずアストロサイト親和性色素のsulforhodamine 101を用いて、海馬スライス中のastrocytesを同定した。次にパッチ電極内液にCl^-感受性蛍光色素のMEQを加えておき、同定した多数のastrocytesにsingle-cell electroporation法で次々とMEQを注入し、同時に5-6個のastrocytesでのCl^-イメージングを可能にした。シェーファー側枝をテタヌス刺激した時のastrocytesの[Cl^-]_i変化をこれら複数個のastrocytesで同時に観察した(astrocyte回路網のCl^-イメージング)。シェーファー側枝の高頻度刺激で記録したすべてのastrocyteでMEQ蛍光が低下、すなわち[Cl^-]_i上昇が見られた。これらの[Cl^-]_i上昇は刺激の頻度や強度に応じて変化した。しかしこの変化は、以前我々が報告した錐体細胞でのGABA作用を抑制性から興奮性に逆転させるCl^-蓄積(J.Neurophysiol. 2003)とは時間経過が異なり、静止電位におけるastrocyteのCl^-の電気化学勾配もニューロンと逆向きとの報告もあるので、このastrocyteでの[Cl^-]_i上昇はニューロンとは全く別のメカニズムであると考えられた。以上からastrocyte回路網による能動的なCl^- buffering機構が存在すると結論した。2.神経障害モデルを用いたアストロサイトの[Cl^-]_i調節による神経回路機能調節の検討[福田・窪田・井上]:神経障害モデル(皮質凍結損傷)の傷害部位ではastrocyteが増殖していた。GFAP、NSEとNKCC1,KCC2との二重免疫染色とin situ hybridizationを行った結果、ニューロンではNKCC1,KCC2とも発現していたのにたいし、astrocyteではNKCC1のみが発現しており、astrocyte回路網によるCl^- buffering機構存在の仮説と矛盾しない結果であった。1.アストロサイト親和性色素によるGAD67-GFP knock-inマウス脳スライスでのアストロサイト可視化[福田・窪田・山田・井上]:海馬スライスのCA1錐体細胞において、パッチクランプによる膜電位とCl^-感受性蛍光色素MEQによる[Cl^-]_iの同時記録を行い、シェーファー側枝テタヌス刺激中のGABA_A受容体過剰刺激による[Cl^-]_i上昇が、GABA作用の抑制から興奮(テタヌス後脱分極)への逆転を起こすことを明らかにした。この[Cl^-]_i上昇の持続中は、basket細胞のburst発火が錐体細胞に後発射を惹起した。そこでまず、この実験系においてアストロサイトの[Cl^-]_i変化を測定する方法を開発した。すなわち、GAD67-GFP knock-inマウスの海馬スライス標本を、アストロサイト親和性色素のsulforhodamine 101 (100nM)で20分間インキュベートすることにより、GABA細胞をGFP蛍光で、アストロサイトをrhodamine蛍光で識別することができた。同定したアストロサイトにパッチ電極からMEQを注入し、アストロサイトの[Cl^-]_i変化を測定することに世界で初めて成功した。2.グリア欠損モデルを用いた比較実験によるグリア型Cl^-トランスポーターによる神経細胞[Cl^-]_i調節の検討[福田・窪田]:海馬脳スライスを膜電位感受性蛍光色素JPW1114で染色し、双極タングステン電極で刺激した場合の興奮の空間的伝播を膜電位イメージングで可視化した。グリア選択性代謝阻害剤のfluorocitrate(100μM)でスライスを前処置し、急性的にアストロサイトの代謝を選択的に阻害した脳スライスの作成法を検討した。

GFAP、NSEとNKCC1,KCC2との二重免疫染色とin situ hybridizationを行った結果、ニューロンではNKCC1,KCC2とも発現していたのにたいし、astrocyteではNKCC1のみが発現しており、astrocyte回路網によるCl^- buffering機構存在の仮説と矛盾しない結果であった。
脳細胞の選択的死と機能分子

本年度は重点領域研究「脳細胞選択死と機能分子」のとりまとめとして、本班で挙げた主要な研究成果を中心として、一冊の報告書を作った。その内容は次ぎの通りである。第I章脳細胞死の分子細胞生物学1 Bcl-2による神経細胞死の制御辻本賀英班員2 NAIPの分子生物学池田穣衛班員3カスパーゼファミリーと神経細胞死三浦正幸班員4新規遺伝子DP5による神経細胞死の制御和中明生班員5受容体型チロシンキナーゼと脳細胞死田中英明班員6ミクログリアの活性化高坂新一班長7軸索切断にともなう遺伝子変動の解析北村忠久班友第II章神経変性疾患の分子機構1内因性神経毒とパーキンソン病太田茂班長2パーキンソン病に連鎖する遺伝子多型水野美邦班員3ハンチントン病の分子病態金澤一郎総括班長5脊髄小脳変性症の分子遺伝学辻省次班員6神経変性疾患の遺伝子治療小澤敬也班員(1)遺伝性神経疾患の遺伝子解析---ハンチントン病の原因遺伝子がIT15として同定されたので、CAGリピートの伸長および、CAGに続くCCGリピートの多型を検索した。その結果、我が国のハンチントン病は欧米のそれと起源は必ずしも同一ではないことがわかった。また、脊髄小脳変性症の一つであるDRPLAの遺伝子を世界に先駆けて同定した。また、マシャド・ジョセフ病の遺伝子が同定されたが、その本態はいずれもCAGリピートの異常伸長であった。リピート数と臨床症状とが対応していることも確認した。さらに、優性遺伝するジストニアとして我が国で発見された瀬川病の責任遺伝子が、チロシン水酸化酸素の補酵素であるテトラヒドロビオプテリンの合成酵素の一つ、GTPシクロヒドラーゼIであることを発見した。(2)パーキンソン病の病因解明に関する研究---MPTP類似の天然化合物を見出す研究は本班で昨年に引き続き行なっている。本年はそのような化合物として、イソキノリンの仲間であるサルソリノール、テトラヒドロイソキノリンの誘導体である1-ベンジル-TIQ、1-フェニル-N-メチル-TIQなどが取り上げられ、その黒質ドパミン細胞に対する毒性が検討された。現時点ではまだ確定的ではない。(3)神経細胞死とその修復・防御の研究---神経細胞の生存・維持因子に関連する研究として、脳由来の新規の因子を見出そうとする努力がいくつか実を結びつつある。さらに、実験的にプログラム細胞死、すなわちアポトーシスを制御するガン関連遺伝子が新たに同定された。本年度の重点領域研究では、(1)ハンチントン病や脊髄小脳変性症など遺伝性神経変性疾患の遺伝子解析に関する研究班、(2)パーキンソン病を中心とする非遺伝性で神経細胞死を示す変性疾患の病因解明のための動物モデルに関する研究班および(3)神経細胞死を神経栄養因子などの分子により修復・防御しようとする研究班の3つの班を構成した。さらにその上に総括班を作り、各班の研究を推進した。本年度の総括班としては以下の事業を行なった。1)研究が著しく進展している研究グループに総括班から、研究費を上乗せした。2)ニュースレター『脳細胞選択死ニュース』び第2巻(15号)を発行し、班員名簿、班員相互の研究の紹介、トクックスの紹介、誌上討論などを行い、班員相互の共同研究を推進した。3)平成7年8月28日、29日の2日間にわたって、恒例の『夏の浜名湖ワークショップ』を開催した。取り上げたトピックスは、(1)神経細胞の生存維持にかかわる機能分子、(2)遺伝子治療の最前線、(3)固体レベルにおける脳神経細胞死、の3つであった。4)平成7年12月14日には『公開シンポジウム』を行い、14、15日の2日間には本班班員による班会議を行った。5)本年は、研究計画委員会、研究連絡委員会および総括班会議をそれぞれ2回づつ開催し、研究の方向を合議により決定した。2)ニュースレター『脳細胞選択死ニュース』の第3巻(16号)を発行し、班員名簿、班員相互の研究の紹介、トピックスの紹介、誌上討論などを行い、班員相互の共同研究を推進した。3)平成8年7月8日、9日の2日間にわたって、恒例の『夏の浜名湖ワークショップ』を開催した。取り上げたトピックスは、(1)細胞の死に方:そのプロセスを形態からみる、(2)トリプレットリピートはどこまで理解できたか?(3)パーキンソン病をめぐる最近の話題、の3つであった。4)平成8年12月12日には『公開シンポジウム』を行い、12、13日の2日間には本班班員による班会議を行った。

5)本年は、研究計画委員会、研究連絡委員会および総括班会議をそれぞれ2回づつ開催し、研究の方向を合議により決定した。また、3年間の研究期間が終了した後に社会に対して成果を発信する事業について検討した。本年度は重点領域研究「脳細胞選択死と機能分子」のとりまとめとして、本班で挙げた主要な研究成果を中心として、一冊の報告書を作った。その内容は次ぎの通りである。第I章脳細胞死の分子細胞生物学1 Bcl-2による神経細胞死の制御辻本賀英班員2 NAIPの分子生物学池田穣衛班員3カスパーゼファミリーと神経細胞死三浦正幸班員4新規遺伝子DP5による神経細胞死の制御和中明生班員5受容体型チロシンキナーゼと脳細胞死田中英明班員6ミクログリアの活性化高坂新一班長7軸索切断にともなう遺伝子変動の解析北村忠久班友第II章神経変性疾患の分子機構1内因性神経毒とパーキンソン病太田茂班長2パーキンソン病に連鎖する遺伝子多型水野美邦班員3ハンチントン病の分子病態金澤一郎総括班長5脊髄小脳変性症の分子遺伝学辻省次班員6神経変性疾患の遺伝子治療小澤敬也班員
心筋細胞におけるアンジオテンシンIIタイプ2受容体の役割の解明

アンジオテンシンII受容体タイプ2(AT2)の機能はタイプ1受容体(AT1)に比し不明な点も多く,特に心筋細胞における機能はほとんど明らかでない。AT2ノックアウトマウスを用いた実験では,大動脈の結紮やアンジオテンシン負荷で心不全が惹起されず,AT2は心肥大形成に必須という報告がある一方,心筋梗塞後の心室リモデリングがAT2ノックアウトマウスで進行しやすくその予後は不良であることからAT2は心保護作用に働くという全く相反する報告もある。我々は心室におけるAT2の働きに着目し,心室筋特異的AT2過剰発現マウスを作成し、比較的低レベルの過剰発現を示すものと高レベル過剰発現を示すものとを比較することによりAT2が心筋細胞において発現量依存的に心不全を増悪させることを見いだした。本研究ではさらに、マウスの心筋を単離し、カルシウム感受性蛍光色素fluo3を細胞内に取り込ませることによって収縮に伴うカルシウム濃度の変化を細胞長の変化とともに計測した。結果、心室筋特異的AT2過剰発現マウスの心筋レベルにおいてカルシウム動態の異常を伴った収縮能の低下を観察した。しかもそれはAT2の発現量に依存していながら、AT2を介した直接作用でなく,AT1の作用を阻害するという間接的な反応であった。AT2はAT1とヘテロダイマーを形成して,AT2の薬理学的作用とは無関係にAT1の働きを阻害するという報告があり,我々の結果もこれに矛盾しない。実際、心筋細胞においてAT1,AT2の共染色を行い、AT1とAT2.との心筋細胞におけるco-localizationを観察した。さらに、収縮能に影響を与える因子としてpHがあるが、細胞における主たる寄与因子であるNa-H exchangerの働きも心室筋特異的AT2過剰発現マウスの心筋細胞において阻害されていた。従って、AT2はカルシウム動態およびpH調節のいずれにも働いて、心筋の収縮力それ自体を障害していることが、本研究により明らかになった。アンジオテンシンII受容体タイプ2(AT2)はタイプ1(AT1)に比し、その働きは十分に解明されていない。AT2の心筋細胞における機能を明らかにするため、心室筋特異的AT2過剰発現マウスを作成して検討した。同マウスは、心室筋におけるAT2の発現量依存的に増悪した心不全を呈するため、AT2が何らかの心筋障害を引き起こすことが示唆された。単離心筋細胞における検討では、心室筋特異的AT2過剰発現マウスにおいて、正常に比しカルシウム動態の異常を伴った収縮能の低下が観察され、やはり心室筋におけるAT2の発現量に相関していた。しかも心不全状態を示さない週齢マウスにおいても同様の傾向が確認され、これらの一連の異常は心不全の結果ではなく、AT2の心室筋における発現による直接的な作用が考えられた。さらに,正常心筋では収縮力を増強させるアンジオテンシンIIが、心室筋特異的AT2過剰発現マウスの心筋細胞においては収縮能を低下させ、拮抗剤を用いた検討からその作用はAT2を介した直接作用でなく,AT1を経た間接的な反応であることが示された。最近AT2はAT1とヘテロダイマーを形成して,AT2の薬理学的作用とは無関係にAT1の働きを阻害するという報告があり,我々の結果もこれに矛盾せず、実際心筋細胞においてAT1,AT2の共染色を行うとco-localizationが観察される。不全心においてAT2の発現はAT1に比し相対的に増加するため、心不全という病的な状態では心筋におけるAT2の意義が一層増すと考えられる。今後更なる検討を加えることにより心不全治療戦略におけるAT2の役割がさらに明確になるものと思われる。
自己組織化モデルによる地域ブロックの持続的発展可能性の指標化

本研究は、(1)経済立地・生活関連施設配置パターンによる広域生活圏の役割に着目して、広域生活圏の空間規模を実証的に明らかにするとともに、(2)自己組織化モデルを応用して、広域生活圏の産業構造と生活関連施設の配置、さらには圏域間の近接性で構成される地域ブロックの階層原理をモデル化し、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性を指標化するものである。本研究の2年間の成果は次の3つである。なお、研究対象地域は北海道ブロックである。(1)個別産業・生活関連施設の集積データとNITASデータとの統合を行い、産業立地パターンと施設整備パターンから広域生活圏の成立過程を実証分析した。(2)自己組織化モデルの発展形である「A-LIFEモデル」を用いて、地域ブロックにおける広域生活圏の階層原理をモデル化した。(3)上記のモデルを用いて、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性の指標化を行なった。本研究で特筆すべきことは、自己組織化モデルの発展形である「A-LIFEモデル」を用いて、地域ブロックにおける広域生活圏の階層原理をモデル化したことである。特に、階層原理のモデルの改良は2つあった。1つは、北海道ブロックの実データを用いた分析を行ったこと。他の1つは、地域ブロックを構成する広域生活圏以外の圏域を分析に含めたことである。研究目的である「地域ブロック発展可能性の把握」は、この孤立地域の扱いが重要になり、これらは人口減少が続いて集落崩壊が起こっている地域でもある。さらに、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性の指標化を行なったことも、独自の試みである。ここでは、階層原理モデルの入力条件を変化させて人口(出力)への影響を把握することで、広域生活圏の階層性を考慮した地域ブロックごとの発展可能性に資する指標(入力条件)を明示した。本研究では、広域生活圏以外の圏域(非居住地域か、10万人以下の都市を核とする孤立地域)を分析に取り入れるところが特徴であり、「集落構造」を指標化することで対応できた。わが国の国土計画は、1998年3,月に策定された「21世紀の国土のグランドデザイン」で、大きな方向転換を遂げた。それは、1999年の第2次地方分権推進計画とも連動して、2002年11月の国土審議会基本政策部会報告の中で「二層の広域圏」として明示された。「二層の広域圏」とは、地域ブロックと人口20-30万人程度の広域生活圏である。ここでの問題は「広域生活圏」に求める生活質の向上であり、広域生活圏の多様性をいかに計測し、全国一律ではない生活質の向上策が必要になっている。本研究は2つの目的からなる。第1の目的は、広域生活圏の空間規模の実証的把握であり、総合交通分析システムを用いて、1Kmメッシュの単位で広域生活圏を把握するという、新しい分析の枠組みで行なう。第2の目的は、地域ブロックの持続的発展可能性を指標化であり、自己組織化モデルを構築して地域ブロック発展可能性の指標化する点が新しい。本年度の研究実績は次の3つである。

(3)上記のモデルを用いて、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性の指標化の試行を行った。本研究は、(1)経済立地・生活関連施設配置パターンによる広域生活圏の役割に着目して、広域生活圏の空間規模を実証的に明らかにするとともに、(2)自己組織化モデルを応用して、広域生活圏の産業構造と生活関連施設の配置、さらには圏域間の近接性で構成される地域ブロックの階層原理をモデル化し、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性を指標化するものである。研究の最終年度である平成17年度は、以下の研究を行った。(1)自己組織化モデルの発展形である「A-LIFEモデル」を用いて、地域ブロックにおける広域生活圏の階層原理をモデル化した。特に、階層原理のモデルの改良は2つあった。1つは、北海道ブロックの実データを用いた分析を行った。他の1つは、地域ブロックを構成する広域生活圏以外の圏域を分析に含めたことである。研究目的である「地域ブロック発展可能性の把握」は、この孤立地域の扱いが重要になり、これらは人口減少が続いて集落崩壊が起こっている地域でもある。(2)上記のモデルを用いて、複数の広域生活圏からなる地域ブロックの持続的発展可能性の指標化を行なった。ここでは、階層原理モデルの入力条件を変化させて人口(出力)への影響を把握することで、広域生活圏の階層性を考慮した地域ブロックごとの発展可能性に資する指標(入力条件)を明示した。ドイツの新空間整備計画にあって、重要な指標は「集落構造」であり、ドイツでは、この中に生態的保全指標が含まれている。本研究では、広域生活圏以外の圏域(非居住地域か、10万人以下の都市を核とする孤立地域)を分析に取り入れるところが特徴であり、「集落構造」を指標化することで対応できた。
細胞間伝播を導くタウの細胞外量調節機構の解明

タウの細胞間伝播は、細胞外腔に存在し、凝集核としての性質を有するseed tauによって進行すると考えられる。本研究では、正常に細胞外へ分泌されるモノマータウと、seed tauをbiosensor細胞によって区別することで、どのような分子メカニズムがseed tauの細胞外放出に関与するのかを明らかにすることを目的とした。特にタウの分泌がER-Golgiを介したconventional secretionの阻害剤brefeldin Aで抑制されないという実験結果に基づき、unconventional secretion pathwayとして知られる、Type I:細胞膜貫通型、Type II: Secretory autophagyの関与について検討した。近年Type I :細胞膜貫通型分泌にはHSPGが関与し、HSPGの硫酸化阻害剤sodium chlorateによって阻害されることが報告されている。しかしながらsodium chlorateの投与によりseed分泌はむしろ亢進することが明らかになった。次にTypeII: secretory autophagyの関与を調べるためにautophagy促進剤、阻害剤をドナー細胞へ添加する実験を行った。その結果autophgy促進剤によりseedタウ量を増加させ、secretory autophagyの関与と反する結果となった。Autophagy抑制剤として用いたchloroquineの短時間処理では、細胞内のタウ量は変動しなかったが、培地中のseed tau量は上昇した。またこの分泌上昇はexosome分泌阻害剤であるGW4869やBAPTA-AMの同時投与によって阻害されたことからchloroquine刺激によるseed tau分泌にはexosomeやcalcium依存性の分泌機構が関与することが考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。タウの異常凝集が細胞外腔を介し、神経細胞から神経細胞へ移行する現象は、「タウの細胞間伝播」と呼ばれ、アルツハイマー病における解剖学的規則性をもったタウ病理の進展の背景にあるメカニズムとして注目を集めている。タウの細胞間伝播は、細胞内に内在化し凝集の核(seed)として新規タウ凝集を促す特殊な活性をもった細胞外タウ分子によって進行すると考えられる。そこで本研究では、正常に細胞外へ分泌されるモノマータウ分子と区別するために、この活性をseeding活性と定義することとした。研究代表者はこれまでにP301S-tau-CFP/YFPを発現しseed依存的に凝集を生じるtau biosensor細胞を用いることで、FRETを指標にseeding活性を評価可能な実験系を構築している。平成29年度には、一過性にタウを発現・凝集する細胞に加えて、恒常的にタウ凝集体を保持する培養細胞を用いて、培養上清におけるseeding活性は細胞内のタウ凝集に依存することを確認するとともに、培養上清においてタウ多量体を検出することに成功した。またin vivoにおいてseedタウを検出する目的で、加齢依存的にタウを凝集・蓄積するP301S変異型タウトランスジェニックマウス(PS19)の海馬から1000kda cutoffのin vivo microdialysis probeを用いてISFを回収し、そのseeding活性を検出する実験を行った。コントロールである野生型マウスISFと異なり、PS19マウスのISF中にはseeding活性が認められた一方で、上述の培養上清と比較すると活性が極めて低く定量性に乏しいため、定量評価に向けて更なる改良が必要であることが判明した。平成29年度の研究実施計画では、1seeding活性を持つタウの分子的実体を明らかにすること、2exosomeなどの細胞外小胞を介した経路の他に、細胞外小胞を介さないようなunconventional secretionの寄与を検討すること、3in vivoにおいてもseedタウを検出する実験系の構築に着手することを挙げていた。1に関しては、二種類のタウ分子を発現し恒常的にタウ凝集体を有する細胞をあらたに導入することで、培養上清においてタウが二量体以上の高分子を形成することを明らかにした。その一方で2細胞外小胞を介さないようなunconventional secretionの寄与の関与を明らかにすることには至らなかった。また3に関しては、加齢依存的にタウを凝集・蓄積するPS19マウスから得たISFを用いてseeding活性を検出する実験系の構築に着手したものの、現存の手法はseeding活性を効率よく検出するには不十分であることが判明し、実験系の改良が必要となったため、やや遅れていると判断した。

Autophagy抑制剤として用いたchloroquineの短時間処理では、細胞内のタウ量は変動しなかったが、培地中のseed tau量は上昇した。またこの分泌上昇はexosome分泌阻害剤であるGW4869やBAPTA-AMの同時投与によって阻害されたことからchloroquine刺激によるseed tau分泌にはexosomeやcalcium依存性の分泌機構が関与することが考えられた。培養上清において伝播を生じるタウのseeding活性が評価可能になったことで、細胞内に内在化し凝集の核となるタウ分子の細胞外量に影響を与える因子を探索できるようになった。特にシグナルペプチド配列を有さないタウが、どのような分子メカニズムで細胞外へ分泌されるのかを明らかにしていくことが今後重要であると考えられる。また将来的にはin vivoにおいてもseedタウを検出する実験系が必要になってくるが、これまでの検討により既存の1,000kda cutoffのプローブを用いたin vivo microdialysis法では、ISFにおいてseeding活性を高効率かつ定量性をもって検出することが困難であることが判明した。そこで今後はより径の大きなmicrodialysisプローブを導入することで、in vivoにおけるseedタウ検出系の構築を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
覚せい剤依存症の治療薬に関する基礎的研究

本研究では比較的選択的NR2Bサブユニット構築型N-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体拮抗薬であるイフェンプロジルおよび新規κオピオイド受容体作動薬であるTRK-820の覚せい剤依存症治療薬としての可能性を検討した。覚せい剤であるメタンフェタミンを慢性処置し、その後休薬期間を設けると、通常では精神依存を示さない用量のメタンフェタミンにより有意な精神依存の増強、すなわちヒトにおけるフラッシュバック現象を一部反映した逆耐性現象が認められる。そこで、こうした現象に対するイフェンプロジルならびにTRK-820の影響について検討したところ、それぞれの皮下あるいは脳室内へ慢性併用処置することにより、メタンフェタミン慢性処置による精神依存の逆耐性形成は著明かつ有意に抑制された。また、TRK-820の前処置においてはメタンフェタミン慢性投与による側坐核でのドパミン遊離に対する逆耐性形成を有意に抑制した。これらのことから、NMDA受容体拮抗薬イフェンプロジルと新規κオピオイド受容体作動薬TRK-820は、覚せい剤依存症の治療薬として有用である可能性が示唆された。一方本研究では、メタンフェタミン慢性処置による逆耐性形成の分子機構として、側坐核におけるドパミン神経終末のプレシナプス側において、PKCによる促進的なドパミン放出機構の修飾とポストシナプス側におけるNR2Bサブユニット構築型NMDA受容体の増加に伴う細胞内情報伝達機構の変化によって引き起こされている可能性を明らかにした。さらに本研究では、メタンフェタミンが単に神経だけでなく、グリア細胞の中でも特にアストロサイトに対しても作用していることが明らかとなり、これに伴い、メタンフェタミンの逆耐性形成時には、側坐核および帯状回のアストロサイトの形態変化を伴う活性化が顕著であり、アストロサイトの活性化はPKC依存的に引き起こされ、長期に持続することも明らかとなった。以上の結果は、今後、薬物依存患者の治療や乱用の撲滅に繋がる治療薬の開発と治療法の確立に貢献できるものと考えられる。本研究では、覚せい剤依存症に対する治療薬を基礎的に検討することを目的とした。覚せい剤であるメタンフェタミンを慢性処置し、その後休薬期間を設けると、通常では精神依存を示さない用量のメタンフェタミンにより有意な精神依存の増強が認められた。このモデルはヒトにおけるフラッシュバック現象を一部反映しているものと考えられる。そこで、このメタンフェタミン慢性処置によるメタンフェタミンの精神依存増強効果に対する各種NMDA受容体拮抗薬の影響を検討したところ、非競合的にNMDA受容体を拮抗するジゾシルピンならびにケタミンの処置により有意な抑制が認められた。さらには、NMDA受容体拮抗作用を有し、現在臨床において脳梗塞や脳出血後遺症に伴うめまいに使用されているイフェンプロジル処置によっても有意な抑制が認められた。また、グルタミン酸遊離阻害薬であるリルゾールも、メタンフェタミン慢性処置による精神依存の増強を有意に抑制した。一方、メタンフェタミンの慢性処置により、薬物の精神依存に重要な役割を担う前脳辺縁部において、NMDA受容体NR2Bサブユニットタンパク質量の増加が観察されたが、ドパミントランスポーターのタンパク質量には何ら変化は認められなかった。これらのことから、メタンフェタミン慢性処置によるメタンフェタミン誘発精神依存の増強効果には、グルタミン酸神経系の活性化が関与しており、特に前脳辺縁部におけるNMDA受容体NR2Bサブユニットの増加が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

一方、κオピオイド神経は中脳辺縁ドパミン神経を抑制性に調節していることが知られており、数種依存性薬物の精神依存を抑制することが報告されている。しかしながら、既存のκ受容体作動薬はそれ自身で嫌悪効果などの精神症状を発現するため、臨床応用が不可能とされてきた。こうした背景の中、最近、既存のκ受容体とは構造を異にする新規κ受容体作動薬であるTRK-820が開発された。そこで本研究ではさらに、メタンフェタミン慢性処置による精神依存の増強効果に対するTRK-820の影響を検討し、その臨床応用への可能性を探索した。その結果、TRK-820の処置によってもメタンフェタミン慢性処置による精神依存の増強は有意に抑制された。以上本研究の結果から、現在臨床において脳梗塞や脳出血後遺症に伴うめまいに使用され、それ自身依存性を示さないイフェンプロジルならびに新規κ受容体作動薬であるTRK-820が、覚せい剤依存症の治療薬として臨床応用できる可能性を見出した。一方、本年度購入した冷却型CCDカメラを用いて、メタンフェタミンを慢性処置した前脳辺縁部ではアストロサイトの著しい活性化が引き起こされることを免疫組織学的に明らかにした。来年度はこれらの知見を基にさらなる展開を行う予定である。本研究ではNMDA受容体拮抗薬であるイフェンプロジルおよび新規kオピオイド受容体作動薬であるTRK-820の覚せい剤依存症治療薬としての可能性を検討した。その結果、イフェンプロジルを脳室内投与することによりメタンフェタミン誘発報酬効果の形成は有意に抑制された。また、TRK-820の皮下または側坐核内投与によっても、メタンフェタミン誘発報酬効果の著明な抑制が認められた。さらに、形成されたメタンフェタミンの報酬効果に対するTRK-820の治療効果について検討したところ、TRK-820の後処置でもメタンフェタミンの報酬効果は消失した。メタンフェタミンは中脳辺縁ドパミン神経系の神経終末である側坐核に作用してドパミンの過剰遊離を引き起こし、強度の精神依存を形成させることが知られている。そこで、TRK-820の抑制効果を明確にするために、メタンフェタミン誘発ドパミン遊離促進作用に対するTRK-820の影響を検討した。その結果、メタンフェタミン投与後に認められるドパミンの過剰遊離はTRK-820を側坐核内に前処置することにより有意に抑制された。また、メタンフェタミンを慢性投与した後、低用量のメタンフェタミンを投与すると、低用量メタンフェタミンの単回投与時と比較して側坐核におけるドパミン遊離作用の増強、すなわち逆耐性現象が認められるが、このような逆耐性が形成された条件下においても、TRK-820を前処置することにより、ドパミンの過剰遊離は著明に抑制されることが明らかとなった。さらに、このような逆耐性を形成したラット側坐核では、kオピオイド受容体および内因性kオピオイド受容体リガンドであるpreprodynorphinのmRNA発現量が減少していた。以上、本研究の成果より、NMDA受容体拮抗薬イフェンプロジルおよび新規kオピオイド受容体作動薬TRK-820が覚せい剤依存症の治療薬となり得る可能性を見出した。
脊髄におけるNMDA受容体-NO-cGMP系を介する疼痛制御機構の解明

脊髄後角におけるNMDA受容体-NO-cGMP系を介する疼痛の伝達システムがいわゆる疼痛過敏状態において海馬におけるNMDA受容体-NO-cGMP系を介する記憶形成における長期増強現象と同様のメカニズムが脊髄後角細胞に働き、疼痛閾値に変化を与えるのではないかという仮設に基き、科学研究費の補助を受けた2年間の期間においてラット脊髄を用いてin vivoおよびin vitroにおいてNOおよびグルタミン酸の関係についての検討を行った。方法として、よりreal timeな情報を得るために電極を用いた同時測定を試みた。しかし、NO電極は良好な反応時間と感度が得られたのに対し、グルタミン酸電極は結果的にin vivoにおいては十分な感度が得られなかった。そのため、まずNOについてのみ検討をおこなった。in vivo脊髄後角においてのホルマリン刺激後のNO測定実験においては、NOの上昇は2相性に観察され、それぞれNO合成阻害剤である7-nitroindazoleによって抑制された。in vivo脊髄スライスを用いた実験においても同様の結果が得られた。次にNMDAレセプターの拮抗薬であるMK801をあらかじめ投与しておいた場合、in vivoおよびin vitroのいずれの実験においても2相目のNOの上昇を阻害したが1相目の上昇は阻害しなかった。これらのことから、1相目のNOの由来が後根神経節細胞由来のものであり、2相目のNOの上昇が脊髄後角細胞に由来するものであることが考えられた。今後の課題として残されたグルタミン酸との関係については電極以外の方法(マイクロダイアリシス等)を含めてさらに検討を加える予定である。近年、その疼痛のメカニズムとして、脊髄後角シナプスにおけるNMDA受容体-NO-cGMP系を介する疼痛の情報伝達システムの存在が解剖学的にも生化学的にも明らかとなり、その役割が注目されている。すなわち、いわゆる疼痛過敏状態では海馬におけるNMDA受容体-NO-cGMP系を介する記憶形成における長期増強現象と同様のメカニズムが脊髄後角細胞にはたらき、疼痛閾値に変化をあたえるのではないかという仮説が提唱されている。近年、NOの測定にはNO特異的電極が開発され、in situにおけるNOの測定が可能となり、本年度の研究において我々は外径30μmの微小NO電極を用いて世界で初めて、ラット腰部脊髄後角におけるNOの変化を測定することに成功した。その結果、カプサイシン足底皮下投与後に一過性のNOの上昇を認めた。また、通常の単発疼痛刺激ではNOの変化がみられないのに対し、ホルマリン足底皮下注刺激においては、いわゆる痛みの第2層以降にNOの上昇を認めた。また、NMDA受容体阻害剤によりカプサイシン投与後のNO上昇はブロックされず、ホルマリン投与後のNO上昇はブロックされたことから、脊髄におけるNOの上昇がそれぞれ後根神経節細胞由来と脊髄後角細胞由来のものであることが推定された。また、カプサイシン投与によるNOの上昇は、脊髄スライスを用いた実験においても同様にみることができた。今回の我々の研究において、疼痛刺激による脊髄におけるNOを直接測定する方法を確立しえたことは、非常に意義のあることと考える。また、我々は同様にグルタミン酸の微小電極を作成しているが、現在のところスライスを用いたIN VITROにおいては予備実験に成功している。

そのため、まずNOについてのみ検討をおこなった。in vitro脊髄後角においてのホルマリン刺激後のNO測定実験においては、NOの上昇は2相性に観察され、それぞれNO合成阻害剤である7-nitroindazoleによって抑制された。in vivo脊髄スライスを用いた実験においても同様の結果が得られた。次にNMDAレセプターの拮抗薬であるMK801をあらかじめ投与しておいた場合、in vivoおよびin vitroのいずれの実験においても2相目のNOの上昇を阻害したが1相目の上昇は阻害しなかった。これらのことから、1相目のNOの由来が後根神経節細胞由来のものであり、2相目のNOの上昇が脊髄後角細胞に由来するものであることが考えられた。今後の課題として残されたグルタミン酸との関係については電極以外の方法(マイクロダイアリシス等)を含めてさらに検討を加える予定である。
細菌性スーパー抗原による活性化T細胞の細胞内シグナル伝達機構について

ブドウ球菌由来毒素性ショック症候群外毒素(TSST-1)やエンテロトキシンA-E(SEs)は、代表的細菌性スーパー抗原である。これらをマウスに投与し、サイトカインの変動およびその変動を修飾する要素について検討した。細菌性スーパー抗原を生体に前投与したマウスに同抗原の再刺激を行うと、CD4^+細胞はIL-2産生を次第に減じ免疫寛容状態となるが、生体へのIL-2補充により免疫寛容の誘導は抑制されることを見いだした。またマウスT細胞分化の過程におけるretinoic acidの関与に関しても新しい知見を得た。一方、新生児の発疹症であるneonatal TSS-likeexanthematous disease(NTED)は、細菌性スーパー抗原TSST-1が強く関与していることを見いだし報告した。TSSとは異なり、予後良好であることから、T細胞の成熟度によりT細胞の活性化が異なる可能性が考えられた。そこで、成熟度の異なる3種の細胞(ヒト成熟胸腺細胞、ヒト臍帯血、健康成人末梢血T細胞)を用いて検討したところ、前2者は末梢血由来のT細胞に比しスーパー抗原に対する免疫寛容が誘導されやすいことを見いだした。さらに細胞内シグナル伝達について検討したところ、細菌性スーパー抗原刺激によるCD3-ζchainのチロシンリン酸化の程度に差を認めた。CD3-ζchainはT細胞内シグナル伝達において最も上流に存在するので、このリン酸化の差がT細胞の反応性の差の原因の一つと考えられた。現在このCD3-ζchainのチロシンリン酸化にかかわるtyrosine kinaseについて検討中である。スーパー抗原により誘導されるT細胞の免疫寛容における細胞内シグナル伝達について次の諸実験を行った。1)マウスCD4^+、CD8^+T細胞をin vitroで芽球化し、SEAあるいは抗CD3抗体で再刺激後の細胞内チロシンリン酸化を、immunoprecipitationおよびwestern blot analysisにて検討した。複数のチロシンリン酸化蛋白が検出されたが、刺激後の経時的変化については確定的な所見がまだ得られていない。現在追加実験を施行中である。2)同様の系において、T細胞を^<32>Pで標識しリン酸化蛋白の同定を行った。いくつかのバンドが同定され刺激の違いによりリン酸化パターンも異るようであるが、再現性に乏しく、現在系をかえて再検討中である。3)同様の系でT細胞をfura-2色素にて染色、細胞内カルシウム変動を測定した。SEAによる刺激では、CD4^+芽球化T細胞においてのみ細胞内カルシウム濃度の変動を認め、シグナル伝達が行われていることが判明した。抗CD3抗体刺激ではCD4^+およびCD8^+芽球化T細胞の両者において細胞内カルシウム濃度の変動を認めた。また、刺激の違いにより細胞内カルシウム濃度変化としても異ることが判明した。4)ヒト臍帯血あるいは胸腺細胞は、ヒト末梢血にくらべてスーパー抗原刺激によりトレランスになりやすく未熟であることが判明している。臍帯血と末梢血リンパ球における細胞内チロシンリン酸化の差についても検討中である。スーパー抗原により誘導されるT細胞の免疫寛容における細胞内シグナル伝達の解析を行う目的で、以下の諸実験を行った。実験には、ヒト臍帯血、ヒト胸腺細胞(CD1a^-の成熟型胸腺細胞を分取)、ヒト末梢血より分離採取したCD4^+T細胞をスーパー抗原であるTSST-1で刺激し、得られた芽球化CD4^+T細胞を用いた。1)細胞表面抗原については、いずれの細胞についても、CD3およびCD4は90%以上を占め、そのうち7090%がTSST-1反応性のVβ2陽性細胞であった。IL-2産生能は、ヒト末梢血で著明であり、ヒト胸腺細胞では末梢血の10分の1以下に低下、ヒト臍帯血では、胸腺細胞と末梢血の中間レベルであった。

したがって、当教室の今西らが報告したとおり、成熟した胸腺細胞であっても、末梢血に比して免疫寛容状態にあることが再確認された。2)1)で述べたようなbiologyをもつ芽球化T細胞をTSST-1で再刺激し、細胞内蛋白のチロシンリン酸化反応を検討した。刺激にともなってチロシンリン酸化をうける細胞内蛋白のパターンを検討したところ、臍帯血、胸腺細胞と末梢血で量的差異のある蛋白を認めた。現在、これらの蛋白の同定を行っている。3)芽球化T細胞をTSST-1で再刺激し、テロメラーゼ活性およびテロメア長を検討した。テロメラーゼ活性はいずれの細胞においても著増し、有意差はみられなかった。また、テロメア長は無刺激状態の細胞ですでに差がみられ、刺激によるさらなる変化はみられなかった。本研究の目的は、スーパー抗原により誘導されるT細胞の免疫寛容が、いかなる細胞内シグナル伝達機構の改変によって誘導されるのかを明らかにすることである。現在までの研究で、ヒトの臍帯血や胸腺細胞はヒト末梢血に比べてスーパー抗原刺激により免疫寛容になりやすいことが明らかとなった。この系を用いて、スーパー抗原刺激時の細胞内チロシンリン酸化や、それらの制御機構を、各種抗体によるimmunoprecipitationおよびwestern blot analysisにて検討した。その結果、この3者の細胞で、TSST-1刺激に伴うCD3ζchainのチロシンリン酸化の程度に差を認めた。CD3ζchainは、T細胞内シグナル伝達において最も上流に存在し、本データのチロシシリン酸化の差は、T細胞の反応性の差を十分に説明しうるものと考えられる。このζchainのチロシンリン酸化に関るtyrosine kinaseの変動を検討中である。