hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織切片からの疾患遺伝子シーケンスシステムの確立

本年度はこれらの方法を利用する疾患モデルとして、レニンノックアウトマウス、糖転移酵素トランスジェニックマウス、先天的白内障モデルマウス、精巣内減数分裂異常マウス、雄性不妊マウスなどの形態解析を主に行い、マイクロダイセクションの利用価値の高い組織の検索に努めた。特に、減数分裂M期特異的に細胞死の出現するMRLマウスについて興味ある所見が得られた。精子形成過程における減数分裂M期(MI,MII)のうち、アポトーシス像はMI期に集中していた。この変化は減数分裂の紡錘糸形成後に始まっていた。腹腔内停留精巣術を施しMRLマウスとC57BL/6マウスとを比較したところ、術後2週までにC57BL/6の精巣重量はほぼ半減したのに対し、MRLマウスのそれは術後3週においてもコントロールの70%前後で推移した。形態学的にはMRLマウスで多くの精祖細胞が残存していた。さらに、MRLマウス精巣では生後発達の一時期卵細胞が形成されていた。これらのことから、MRLマウス精祖細胞が熱耐性で、減数分裂中期チェックポイント完成前は卵細胞へと分化し、チェックポイント完成後は精母細胞のアポトーシス像として観察されるものと考えられた。この熱耐性精祖細胞に特異的に発現してくる遺伝子を同定するため、MRLマウスとC57BL/6マウス精巣cDNAを用いてdifferential display法を行ったところ、いくつかの既知ならびに未知遺伝子クローンを検出することに成功した。今後、MRLマウス精祖細胞の遺伝子分離にマイクロダイセクション法を利用したい。本研究は組織切片上から異常な細胞群を形態学的に観察し、その細胞内ゲノム遺伝子あるいはメッセージを直接採取しDNAシーケンスすることによって病態をより迅速に判定しうるシステムを確立することにある。最終年度に当たる本年度は、減数分裂M期特異的に細胞死の出現するMRLマウスを用い、連鎖解析によって責任遺伝子の染色体上の位置について検討した。精子形成過程の減数分裂MI期に集中してアポトーシスの見られるMRLマウスと正常マウスC57BL/6とのF1オスを解析したところ、アポトーシスはほとんど出現しなかった。次にこのF1とMRLとの戻し交配個体200例を作製し形態解析をおこなった結果、アポトーシスの陽性:陰性の比率はほぼ1:1となった。これらことから、責任遺伝子は単一劣性の遺伝様式をとることが明らかとなった。戻し交配個体200例のゲノムDNAを抽出し、マイクロサテライトマーカーを用いたPCRによる連鎖解析の結果から、責任遺伝子(MSApと略称)は第1染色体の100cMの位置に存在することが明らかとなった。第1染色体100cM近傍にはTlr5(98.0cM),Hlx(99.5cM),Tgfb2(101.5cM),Nek2(103.0cM)が位置しており、これらのうちの1つあるいは新規遺伝子としてMSApを同定できるものと考えられた。今後、マイクロダイセクション法を用いて当該部位より直接RNAを分離しdifferential display法やシーケンス解析を行うことのできるモデルとして、さらに検討していく予定である。
小児固形腫瘍におけるPー糖蛋白の発現と予後との関係に関する研究

さらに多数例の小児悪性固形腫瘍において,Pー糖蛋白の発現と予後との関係を検討した。東京大学小児外科と埼玉小児医療センタ-外科で経験した小児悪性固形腫瘍91例について,免疫染色法にてPー糖蛋白の発現と予後との関係を検討した。91例中43例にPー糖蛋白の発現が認められた。個々の腫瘍における陽性例は,神経芽腫31/64,ウイルス腫瘍5/11,卵黄嚢癌4/6,横紋筋肉腫2/3,末分化胚腫1/1で,肝芽腫,肺芽腫,脂肪肉種においては,陽性例は認められなかった。全症例中,腫瘍死した者は25例で,このうちPー糖蛋白陽性例は神経芽腫6例,横紋筋肉腫1例であった。神経芽腫においては,Pー糖蛋白陽性例はむしろ良好な予後を示すことを既に報告したが,その他の腫瘍においては予後との関係は明らかでなかった。しかし,少なくともPー糖蛋白の発現が,薬剤耐性の発現や不良な予後とは相関していないと考えられた。化学療法により,Pー糖蛋白の発現が誘発されるか否かの検討を目的として,ヌ-ドマウス移植系神経芽腫を用いて,実験的化学療法を行い,その前後でPー糖蛋白の発現に差が認められるか,検討を行った。実験的化学療法に用いた薬剤は,CDDP,THPーADR,CTX,VCRの4種である。この結果,化学療法前にはPー糖蛋白の発現は認められなかったが,CDDP,VCRの2種の薬剤については,化学療法後の腫瘍において,Pー糖蛋白の発現が認められた。これは小児悪性固形腫瘍においても,化学療法によってPー糖蛋白の発現による多剤耐性が誘発される可能性を示したものと考えられる。さらに他の薬剤,他の投与法によってもPー糖蛋白の発現が誘発されるか否かを検討する予定である。神経芽腫症例64例について、その腫瘍組織を、P-糖蛋白に対するモノクロ-ナル抗体で染色し、その発現を検討した。これを、患児の年齢、組織型、病期、術前化学療法の有無、予後と相関があるかを統計学的に検討を行った。この結果、P-糖蛋白陽性例は、31例で、このうち25例が生存している。一方、P-糖蛋白陰性例は33例で、このうち生存例は17例であった。これは統計学的に有意の差であり、P-糖蛋白は、予後良好な症例に多く発現していることが明らかとなった。また年齢との関係では、P-糖蛋白陽性例31例中1歳未満の症例は、22例であり、P-糖蛋白陰性例33例中1歳未満の症例は13例であった。これも統計学的に有意の差であり、P-糖蛋白はより年齢の低い例に、多く発現していることが明らかとなった。以上の結果は、多剤耐性蛋白としてのP-糖蛋白の性格とは矛盾するものであり、神経芽腫においては、白血病細胞などとは異なる意義を持っているものと考えられた。そこで、正常副腎髄質において、P-糖蛋白が発現しているかどうかを検討した。成人の剖検症例の副腎髄質を、全く同じ方法で染色し、P-糖蛋白が発現していることを確認した。またサル胎児の副腎髄質についても、同様な検討を行ったところ、やはりP-糖蛋白が発現していることが明かとなった。以上の点より、P-糖蛋白の腫瘍細胞における発現には、臓器特異性があり、必ずしも予後不良のサインとはいえないと思われる。従って、多くの腫瘍組織での検討を行い、それぞれの腫瘍における意義を見いだす必要があると考えられた。前年度までの研究により,神経芽腫においては,Pー糖蛋白の腫瘍細胞における発現は,薬剤耐性を示すものとは考えにくく,むしろより高い分化を示す指標となると考えられた.そこで今年度は,さらにそのほかの小児固形悪性腫瘍におけるPー糖蛋白の発現と予後,化学療法との関係を検討した.この結果,ウイルムス腫瘍,悪性奇形腫,横紋筋肉腫などの一部の小児固形悪性腫瘍において,Pー糖蛋白の発現が確認された.しかしこれらの腫瘍は,それぞれの症例数が少ないため,神経芽腫におけるような,予後,年齢との相関は認められなかった.しかし少なくとも,Pー糖蛋白の発現が,化学療法に対する耐性や不良な予後と関連しているという結果は得られず,神経芽腫におけるのと同様に,実際の薬剤耐性とは関連していないのではないかと考えられる.さらにヌ-ドマウスにおける化学療法剤の有効性の検討の基礎的実験として,臨床例と,化学療法剤の有効性の検定実験における,ヌ-ドマウスとの,化学療法剤の血中濃度の比較を行った.この結果,シスプラチンにおいては,臨床例における血中濃度と,ヌ-ドマウスにおける血中濃度は,大きな差がなく,妥当な投与量と考えられた.しかし,アドリアマイシンにおいては,最高血中濃度も,その減衰パタ-ンも全く異なっており,現在のヌ-ドマウスにおける投与量では,臨床例における有効性は検定できないのではないかと考えられる.そこで,さらに他の化学療法剤について,同様な検討を行うと共に,ヌ-ドマウスにおいて,臨床例と同様な血中濃度の得られる,アドリアマイシンの投与量・投与法を得るための実験を続けている.さらに多数例の小児悪性固形腫瘍において,Pー糖蛋白の発現と予後との関係を検討した。

東京大学小児外科と埼玉小児医療センタ-外科で経験した小児悪性固形腫瘍91例について,免疫染色法にてPー糖蛋白の発現と予後との関係を検討した。91例中43例にPー糖蛋白の発現が認められた。個々の腫瘍における陽性例は,神経芽腫31/64,ウイルス腫瘍5/11,卵黄嚢癌4/6,横紋筋肉腫2/3,末分化胚腫1/1で,肝芽腫,肺芽腫,脂肪肉種においては,陽性例は認められなかった。全症例中,腫瘍死した者は25例で,このうちPー糖蛋白陽性例は神経芽腫6例,横紋筋肉腫1例であった。神経芽腫においては,Pー糖蛋白陽性例はむしろ良好な予後を示すことを既に報告したが,その他の腫瘍においては予後との関係は明らかでなかった。しかし,少なくともPー糖蛋白の発現が,薬剤耐性の発現や不良な予後とは相関していないと考えられた。化学療法により,Pー糖蛋白の発現が誘発されるか否かの検討を目的として,ヌ-ドマウス移植系神経芽腫を用いて,実験的化学療法を行い,その前後でPー糖蛋白の発現に差が認められるか,検討を行った。実験的化学療法に用いた薬剤は,CDDP,THPーADR,CTX,VCRの4種である。この結果,化学療法前にはPー糖蛋白の発現は認められなかったが,CDDP,VCRの2種の薬剤については,化学療法後の腫瘍において,Pー糖蛋白の発現が認められた。これは小児悪性固形腫瘍においても,化学療法によってPー糖蛋白の発現による多剤耐性が誘発される可能性を示したものと考えられる。さらに他の薬剤,他の投与法によってもPー糖蛋白の発現が誘発されるか否かを検討する予定である。
変分原理により解き明かす、キラル液晶の回転駆動と動的散逸構造

液晶によって形成される滴(液晶滴)が液体溶媒中に分散した系において、温度勾配や電場を与えたときに生じる非平衡現象を対象とした研究を行っている。観測される現象に対して近年提案されたオンサーガーの変分原理を適用し、その機構を解明することを試みる。さらにこの過程を通して上記変分原理の妥当性、有用性を検証し、その効果的な運用法を模索することを目的としている。2018年度は主に、ネマチック液晶が形成する滴(N液晶滴)をサンドイッチセルに封入した系において、セル基板水平方向に温度勾配を印加したときに発現する散逸構造を解析した。偏光顕微鏡観察の結果、温度勾配下においては、N液晶滴内部の配向場(液晶分子が並んでいる方向の空間分布)が、平衡状態から変形した状態で安定化することが判明した。このときの系の流動場を蛍光退色法によって測定したところ、滴内部に対流が駆動されていることが判明し、さらにそのパターンから流動の駆動源は、温度勾配印加によって生じる表面張力の不均一性に起因するマランゴニ対流であることが示唆された。以上の実験結果から、系に対して単純化したモデルを設計し、オンサーガーの変分原理を適用して現象の機構を記述することを試みた。その結果、上記の配向変形が対流によって誘起されることが示され、変形の度合いは粘性力と配向弾性力の競合によって明確に決定されることが分かった。さらにこの理論に基づいた解析で、実験データは定量的に説明可能であることも示された。以上の結果は論文としてまとめられ、Physical Review E誌に掲載済みである。当初の計画では、コレステリック液晶によって形成される滴(Ch液晶滴)に、温度勾配や電場を印加した際に生じる回転運動を解析する予定であった。しかしながら、配向場が複雑であること、また内部流動の一切が不明であることから、これに取り掛かる前により構造が単純な液晶滴における非平衡現象を解析することで、液晶滴のダイナミクスに関する基本的な知見を収集する必要があると考えた。そこで2018年度はN液晶滴に着目し、これに温度勾配を印加したときに配向が変形する現象を解析し、その結果、実験結果はこの解析によってよく説明されることが示された(実績概要参照)。この成果は、少なくともこの現象に対する上記変分原理の妥当性、有用性を実証するものであり、本研究目的と合致するものである。これに加えて、上記の系を解析することで、温度勾配下の液晶滴にマランゴニ対流が誘起されていることが実験的に明確に実証されたことは大きな進歩である。これが温度勾配印加時のCh液晶滴における回転現象の駆動源になっていると予測され、今後は対流の存在を前提に実験解析やモデル化を展開していくことができる。以上より、当初の予定から変更はあったものの、研究は順調に進行していると言える。2019年度は、2018年度に解析したN液晶滴における非平衡現象に関する知見をもとに、温度勾配下のCh液晶滴のダイナミクスを解析する。先行研究において、セル基板垂直方向に温度勾配を印加するとCh液晶滴に回転運動が誘起されることが示されているが、2018年度の研究で得られた知見と組み合わせると、回転は温度勾配下で滴内部に発生するマランゴニ対流によって引き起こされているものと推測される。この推測に基づいて、現象のモデル化を行い、オンサーガーの変分原理を適用して回転の機構を解明することを目的とする。同時に、偏光、共焦点顕微鏡観察、および蛍光退色法を用いて内部配向場、流動場を実験的に解析し、理論と整合するかどうかを検証する。上記に加えて、2018年度の研究でCh液晶滴に対してセル基板水平方向に温度勾配を印加すると、配向場が周期的に変形する振動現象が発生することが判明した。この現象に対しても、上記と同様の手法で配向場、流動場の解析を行い、これらを実験的に明らかにする。加えて、オンサーガーの変分原理を用いて現象の機構を説明することを試みる。

以上の結果は論文としてまとめられ、Physical Review E誌に掲載済みである。当初の計画では、コレステリック液晶によって形成される滴(Ch液晶滴)に、温度勾配や電場を印加した際に生じる回転運動を解析する予定であった。しかしながら、配向場が複雑であること、また内部流動の一切が不明であることから、これに取り掛かる前により構造が単純な液晶滴における非平衡現象を解析することで、液晶滴のダイナミクスに関する基本的な知見を収集する必要があると考えた。そこで2018年度はN液晶滴に着目し、これに温度勾配を印加したときに配向が変形する現象を解析し、その結果、実験結果はこの解析によってよく説明されることが示された(実績概要参照)。この成果は、少なくともこの現象に対する上記変分原理の妥当性、有用性を実証するものであり、本研究目的と合致するものである。これに加えて、上記の系を解析することで、温度勾配下の液晶滴にマランゴニ対流が誘起されていることが実験的に明確に実証されたことは大きな進歩である。これが温度勾配印加時のCh液晶滴における回転現象の駆動源になっていると予測され、今後は対流の存在を前提に実験解析やモデル化を展開していくことができる。以上より、当初の予定から変更はあったものの、研究は順調に進行していると言える。2019年度は、2018年度に解析したN液晶滴における非平衡現象に関する知見をもとに、温度勾配下のCh液晶滴のダイナミクスを解析する。先行研究において、セル基板垂直方向に温度勾配を印加するとCh液晶滴に回転運動が誘起されることが示されているが、2018年度の研究で得られた知見と組み合わせると、回転は温度勾配下で滴内部に発生するマランゴニ対流によって引き起こされているものと推測される。この推測に基づいて、現象のモデル化を行い、オンサーガーの変分原理を適用して回転の機構を解明することを目的とする。同時に、偏光、共焦点顕微鏡観察、および蛍光退色法を用いて内部配向場、流動場を実験的に解析し、理論と整合するかどうかを検証する。上記に加えて、2018年度の研究でCh液晶滴に対してセル基板水平方向に温度勾配を印加すると、配向場が周期的に変形する振動現象が発生することが判明した。この現象に対しても、上記と同様の手法で配向場、流動場の解析を行い、これらを実験的に明らかにする。加えて、オンサーガーの変分原理を用いて現象の機構を説明することを試みる。研究代表者の所属機関が申請時から変わり、旅費、会議参加費に関して機関から受けられる補助金が増えた。これらを用いたため、本助成から捻出する予定であった旅費等が大きく抑えられたことが、次年度使用額が生じた主要な理由である。これらの費用は、新たな試薬の購入や、実験装置改良のための部品購入に充てる予定である。
高機能性金属錯体を機能中心とする反応システムの構築

本研究では金属錯体の機能モデル化合物としての高機能性金属錯体を合成し、これを機能中心として用いて、ヘモシアニン機能モデル化合物としての二核銅錯体によるによる酸素分子の可逆的結合反応、メタンモノオキシゲナーゼ機能モデル化合物としての二核鉄錯体による酸素活性化による基質酸素化触媒反応、アルカリホスファターゼ機能モデル化合物としてのリン酸ジエステルの加水分解反応およびDNAと結合できるビスインターカレータ部位を持つ二核銅錯体によるDNAとの特異的結合などの様々な反応システムを開発した。(1)酸素活性化に関連する金属オキソ中間体の研究と高選択的基質酸素化システムの構築メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)の酸素活性化機構の解明を目指して、1)新規二核化配位子とその二核鉄(II)錯体の合成、2)二核鉄(II)錯体による酸素分子の活性化と効率的なエポキシ化反応、3)二核鉄(II)錯体にH_2O_2またはm-クロロ過安息香酸との反応による二核鉄(IV)(IV)オキソおよび二核鉄(III)(IV)オキソ錯体の生成、4)メタン資化細菌の発酵法による増殖とsMMOの単離の4つを実現した。(2)DNAの加水分解を触媒する多核金属錯体の合成と人工制限酵素の開発DNAを位置特異的に加水分解する制限酵素モデルとしての金属錯体の構築を目指して、新規配位子の合成を検討した。新規配位子として、1,2-dipyridylethaneの両側のピリジル基にアミノ酸およびペプチド基を導入した。さらに、1,2-bis(bipyridyl)ethaneを合成し、その両端にアミノ酸やペプチドを導入するために、ホルミル基を両側に置換した1,2-bis(bipyridyl)ethaneを合成した。(3)ヘモシアニンモデルを用いた可逆的O_2結合の機構解明と酸素検出運搬システムの構築ヘモシアニン(Hc)による酸素分子の可逆的結合機構を解明するためには、酸素親和性(P_<1/2>)および酸素錯体の生成速度の測定が必要である。Hcそのものを用いて測定を行う事は困難であるので、その機能を再現するヘモシアニン機能モデルが必要である。我々が開発した高機能性金属錯体は、oxyHcとほぼ同様の結合様式で酸素分子を結合し、室温付近で酸素分子を可逆的に吸脱着する。そこで、この高機能性ヘモシアニンモデルを用いて酸素親和性および酸素錯体生成速度を測定した。しかし、ヘモシアニンモデル化合物は、そのままでは酸素親和性が高過ぎてP_<1/2>の値を決定できなかった。今回、アセトニトリルを加えて測定可能な領域まで酸素親和性を低下させる事に成功した。酸素錯体生成速度はレーザーフラッシュホトリシス法によって測定し、酸素錯体の生成過程に中間体が存在する事を見いだした。本研究は、メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)などの二核鉄酵素のO_2活性化過程に生じる酸化活性種の構造と反応性の解明を目的としており、6-hpa配位子を用いたトリオキソニ核鉄(IV)錯体の生成、分光学的性質、反応性に関する研究を行った。sMMOはO_2と反応してパーオキソニ核鉄(III)中間体を生成し、O-O結合の切断を経てオキソニ核鉄(IV)活性種Qを生じると推定されている。しかし、この活性種Qは非常に不安定で、構造や分光学的性質には不明な点が多い。そこで、類似の構造を持つオキソニ核鉄(IV)錯体の開発が期待されている。最近、オキソ単核鉄(IV)錯体の結晶構造、分光学的性質、反応性などが報告されたが、オキソニ核鉄(IV)錯体の研究は遅れている。ドナー性の高いポリアミド配位子のμ-オキソニ核鉄(IV)錯体の結晶構造が報告されているが、この錯体は酸化力がなく、活性種Qの性質を再現する機能モデルとはいえない。我々は、6-hpaのμ-オキソ-ジアクアニ核鉄(III)錯体1を触媒として用いてH_2O_2によるアルケンの効率的エポキシ化に成功した。従来の研究で反応中間体としてパーオキソニ核鉄(III)錯体2が検出され、酸化活性種としてトリオキソニ核鉄(IV)錯体の存在が示唆された。しかし、酸化活性種は分光学的に検出されなかった。本研究では、錯体1とH_2O_2の反応条件を最適化して酸化活性種の検出を試みた。具体的には、MeCN中-40°Cにおいて錯体1にEt_3Nの存在下2当量のH_2O_2を加えたところ、定量的にパーオキソ錯体2が生じた。錯体2は、その後直ちに640nm(ε160M^<-1>cm^<-1>)に弱い吸収を持つ新たな錯体3へと変化した。

これにアルケンを加えると3の分解は加速され、エポキシドが生成した。3のESRスペクトルはサイレントであり、CSIMSスペクトルは{[Fe_2(O)_3(6-hpa)](ClO_4)}^+に相当するm/z865に主ピークを示した。これらの結果から、3は酸化活性種であるトリオキソニ核鉄(IV)錯体であると推定された。様々な基質と3の反応の速度論的研究から、チオアニソールでは擬一次速度定数は基質濃度の一次に比例し、アルケンの酸化速度はミカエリスーメンテン型の濃度依存性を示す事がわかった。後者は[3/アルケン]錯合体の生成を示唆している。アルケンと3の反応のESR測定では、アルケン添加直後にFe(III)Fe(IV)錯体に特徴的なシグナルが現れ、これが反応の進行に伴って減少した。これらの結果は、初期反応として3によるアルケンの1電子酸化が起り、[Fe(III)Fe(IV)錯体/アルケンのcation radical]が生じる推定機構と一致した。3は固体として単離された。XPS測定から鉄の2p軌道のbond energyは3で710.6eV、1で708.8であった。3は、1より1,8eV高い値を示す事から、鉄IV価の錯体であるといえる。本研究により、トリオキソニ核鉄(IV)錯体の生成が確認され、分光学的性質と反応性が明らかにされた事は重要である。本研究では、APモデルとして二核亜鉛錯体[Zn_2(HL1)]^<2+>を用い、リン酸ジエステルの取り込みおよび加水分解反応を行なった。また、[Zn_2(HL1)]^<2+>によるリン酸モノエステルの取り込みも検討した。リン酸ジエステルHPNPとBDNPについて、[Zn_2(HL1)]^<2+>を触媒とした加水分解反応を速度論的に検討した。その結果、HPNPとBDNPそれぞれについて、pHを上げると反応速度が増加した。この事から、反応活性種はジアルコキソヒドロキソ種であることが示唆された。基質および錯体濃度を変化させて初速度を測定すると、いずれの基質でもMichaelis-Menten型の反応が進行しており、[Zn_2(HL1)]^<2+>が基質を取り込んだ複合体が形成している事がわかった。HPNPの反応では高いpHでも[Zn_2(HL1)]^<2+>は安定であり、二核亜鉛がHPNPのリン酸部分で架橋されてZn(OH)_2が沈殿しにくくなっている。[Zn_2(HL1)]^<2+>によるリン酸ジエステルの取り込みについては吸収スペクトル滴定から検討を行った。その結果、[Zn_2(HL1)]^<2+>はリン酸ジエステルを1:1で取り込み、ジメチルリン酸の結合定数は410M^<-1>であった。芳香族性のリン酸エステルは比較的大きな結合定数を示した。これは芳香族基と錯体内のビピリジン部位との疎水性相互作用かもしれない。次に、[Zn_2(HL1)]^<2+>によるリン酸モノエステルの取り込みについて検討した。その結果、APが高い活性を示すpH8-9の水溶液中において、[Zn_2(HL1)]^<2+>によるリン酸モノエステルの取り込みがCSI MSによって観測された。さらに、本研究では、2つの金属イオンを取込む事の出来る新たなビスインターカレーター配位子H_2L2を開発し、その金属錯体によるDNAの分子認識を試みた。H_2L2にはDNAインターカレーター部位として、単純な平面性芳香族phenanthreneを2箇所持たせた。
口唇口蓋裂の最新遺伝子解析研究

口唇口蓋裂は外表先天異常の中で最も高頻度で現れる多因子遺伝疾患であり、以前より数多くの原因遺伝子が報告されてきた。今回の研究によってBMP4遺伝子の変異が微小型の口唇裂(Microform Cleft lip)と口唇口蓋裂の原因であることを発見した。近年、口唇口蓋裂の原因の一つであるIRF6遺伝子の解析において、IRF6遺伝子発現の調節領域であるTFAP2遺伝子結合部位の遺伝子多型変化が口唇裂発生に深く関与していることが示唆された。またTFAP2遺伝子そのものも連鎖解析において疾患関連遺伝子として報告されている。8カ所のTFAP2遺伝子多型解析にはTDT解析であるFBATを使用した。解析結果において、TFAP2遺伝子内部の多型(rs1675414)が有意差(P値<0.001)ありと判定された。2010年の大規模な全ゲノム遺伝子解析において、MAFB、VAX1、PAX7等の幾つかの遺伝子座が新たに口唇口蓋裂の候補遺伝子領域として報告されており、特にVAX1,MAFBが口唇口蓋裂に関与していることが示唆された。口唇口蓋裂は先天異常の中でも最も高い発現頻度でみられる外表奇形であり、その発現頻度は0.015%である。また発生頻度において、地域または人種により発現頻度が異なることは古くから知られている。日本人と遺伝的に類似点の多いモンゴル人の口唇口蓋裂ならびにそれに関連する先天異常ついて病因を解析することである。初年度においては、米国アイオワ大学およびピッツバーグ大学で得られた口唇口蓋裂患者サンプルの連鎖解析の結果から、TGFb遺伝子スーパーファミリーのひとつであるBHP4遺伝子の解析を行った。解析方法はPCR-Direct Sequenceにて一塩基多型(SNP)を含む遺伝子変異を検出、確認した。また国際RapMapプロジェクトよりBMP4遺伝子を含む領域についてSNPマーカーを設定し、TDT解析を行った。解析に使用したサンプルはモンゴル人、グアテマラ人、ヨーロッパ系白色アメリカ人、ヨーロッパ系白人、コロンビア人、フィリピン人の口唇口蓋裂患者及び関連疾患(微小型口唇裂; Hicroform cleft)その家族とコントロールサンプルである。合計1614人の遺伝子を確認し、疾患群においてのみ7種類8個の新規のBMP4遺伝子変異を発見(S91C, T102A, R162Q, G168A, R198X, R287H, A346V)した。これらの結果についてFisher exact検定を行い、有意差p=0.006をもって有意であった。このことからBMP4遺伝子が原因遺伝子の一つであることが強く示唆された。口唇口蓋裂は遺伝因子と環境因子がお互いに作用し合って起こる、複雑で最も頻繁にみられる先天異常である。最近のIRF6遺伝子解析において、その遺伝子の5末端側に存在する多型部位の一つであるAP-2a(activating enhancer binding protein 2 alpha)蛋白結合部位の一塩基変異(SNP)が口唇裂発生に深く関与していることが示唆された。米国アイオワ大学Jeffrey C. Murray教授が以前報告した連鎖解析においてもこのAP-2a遺伝子を含む領域が連鎖している。またマウスモデル実験においてもこのAP-2a遺伝子は頭頸部領域に強く発現しており、遺伝子欠失マウスでは顔面を含む多発奇形を発生させることが確認されている。また近年このAP-2a遺伝子変異が原因である疾患、branchio-oculo-facial syndromeが報告されている。我々はこのAP-2a遺伝子の内部もしくは近傍に存在する7つのSNPをモンゴル人175家系、アメリカ人、フィリピン人の口唇口蓋裂患者および両親についてTaqMan法にてgenotypingし、得られたデータはすべてバーディ・ワインベルク平衡を検定した後に解析した。多型解析にはTDT解析であるFamily Based Asspciation Test (FBAT)を使用した。解析結果において、AP-2a遺伝子内部の多型(rs1675414)が有意差(P値<0.001)ありと判定された。これらの事により、AP-2a遺伝子多型の直接的な関与を示し、口唇口蓋裂発生におけるAP-2a遺伝子に関わる遺伝子多型が深く関与していることが疑われた。

最近の全ゲノム遺伝子解析が米国アイオワ大学Jeffrey C.Murray教授および米国ジョンホプキンス大学Terri Beatyにより報告され、アメリカ人、フィリピン人等においてMAFB、VAX1、PAX7等の幾つかの遺伝子座が新たに口唇口蓋裂の候補遺伝子領域として発見された。この度、この結果が関連しているかどうかを確認する為に独立した症例を使用した。モンゴル人サンプルを使用したCase-Control Studyにおいて有意差が確認できたため、二次解析としてモンゴル人204家系、日本人98家系を使用した。遺伝子解析においては、MAFB、VAX1、PAX7遺伝子の近傍もしくは内部に存在する一塩基変異(SNP)についてタックマンアッセイを用いて行った。連鎖不平衡解析および多型解析にはTDT解析であるFBATとPLINKを使用した。モンゴル人家系において、いくつかの有意差がみられた(VAX1, rs7078160,p=5.32E-05, and MAFB, rs13041247, p=0.00108)日本人家系においても有意差が認められた(VAX1, rs7078160, p=0.00511)これらの事により、MAFB、VAX1遺伝子多型の直接的もしくは間接的な関与が口唇口蓋裂発生に深く関与していることが示唆された。
東南アジア島嶼部諸民族の近代化に対する<心身>の反応と文化の創出

政治的安定と順調な経済発展を遂げてきたかに見えた東南アジア島嶼部は現在、1997年に端を発した経済危機とそれに続く政治的社会的混乱の最中にある。こうした混乱の原因は単純ではないが、堅固な伝統が保持されつつある一方で、急速に推し進められてきた近代化との間の摩擦の結果と見ることができる。本研究は、東南アジア島嶼部に住む人々の<心身>が現在、どのような歪みを受け、どのような文化を創出することでその歪みを是正しようとしているか、について実地調査によって明らかにした。以下はその結果である。ジャワの伝統と近代思想を融合させたキ・アグンスリョ・ムンタラムの哲学を学ぶことで、貧しく、困難に満ちてはいるが、現実を直視しながら生き生きと生きている人物に焦点を合わせ、彼がどのような経緯をたどって「幸福」な人生に送れるようになったか、を明らかにした。伝統文化を駆使して犯罪を抑止、あるいは犯されたとしてもそれを公然としないなどで騒ぎの拡大を抑止しようとしているジャワの公設市場の売り子たちの考え方と行動を明らかにした。近代化から起こる人間関係の軌轢を伝統的災因論で解決しようとしているマレー農村の事例を明らかにした。伝統的な出産形式と近代的出産形式を適宜織り交ぜながら、伝統を保持しつつその重圧も避けるという選択を選んでいるジャワ農村の女性たちの意識と行動を明らかにした。伝統音楽(ガムラン)を演奏することで健常を保とうとしているジャワの都市社会の高齢者の実態を明らかにした。現金経済に適応しようとしている人々がいる反面、それに適応できず森に逃げる人々もいるトゥグティル人の例を明らかにした。森林伐採が進むなかで森林への伝統的観念を放棄しようとしているダヤック人の事例を明らかにした。市場で有利な柑橘類を栽培したり、シャーマンとして社会的威信を獲得するなどさかんに活動することで健常を維持しているカロ・バタック人の高齢者などが報告された。1.人々を取り巻く問題植民地支配と国家建設そして急速に推し進められた開発などに直面してインドネシアやマレーシアの人々は貧困、不平等、人間関係の不調和、伝統の喪失、祖先伝来の土地の喪失などさまざまな問題に直面し、<心身>に歪みを受けている。それらに対して人々はどのように対処しているのであろうか。2.伝統文化による対処法ジャワでは伝統的なアルース(寂静、洗練、優雅などの意)志向に基づく「心学」によって獲得した平常心で挫折を乗り切ろうとする試み、また、北スマトラでは高齢者が伝統儀礼の中で占める重要な役割を果たすことで困難を乗り越えようとしている事例を見出した。マレーシアのケダ州ではますます複雑化している人間関係に伝統的な病因論(人災病)で対処し、伝統と近代を妥協させようとしている事例を明らかにした。3.伝統に逃げ込む対処法ハルマヘラでは大規模な開拓に伴い、森の中に逃げ込み、伝統的な狩猟採集生活を続けている人々がいる。4.伝統と近代を習合した対処法ジャワでは伝統的に高い地位を与えられてきた「高齢者」が伝統音楽を近代化することで自らの力を発揮しようとしている事例に着目した。また、続発する犯罪に対して多元的法体制がどのように対処しようとしているかについて知見を得た。更に、伝統的な「産婆」が近代医学を身につけた「助産婦」と分業体制を組んでいる事例などを観察した。5.近代の受容による対処法北スマトラでは市場に迎えられる柑橘類の栽培に力を注ぎ始めている。

ハルマヘラでは政府主導の開拓とそれに伴う異民族の移住が進む中で市場に栽培植物を出荷するなと積働的に対処している人々もいる。彼らの土地所有観には変化が見られた。6.伝統を失い、近代も受容できない対処法中部カリマンタンでは政府公認の大規模な森林開発が進められ、伝統的な焼畑耕作用地が縮小されるなど変化を余儀なくされている先住民の生活を観察した。昨年度に引き続き、近代化に伴う諸々の困難に対して人々がどのように対処しているかという問題について観察と聞き取りを更に深化させた。その結果、伝統文化と近代文化を適宜選択し折衷しながら事に対処している複雑な実態と課題が明白になった。要点を挙げれば以下の通りである。すなわち、(1)ジャワの「心学」は単に伝統の所産のみならず、西洋近代の所産も取り込んだ思想であり、インドネシアのみならず、広く現代世界の混迷に対して根源的な価値を持っていること、(2)ジャワの伝統音楽が高齢者の心を引きつけ、彼らの<心身>の健常に貢献している一方、現代音楽とミックスした新しい音楽が創出され、老若両世代を結び付けていること、(3)たくさんの人々が集散する市場は近代化しつつも、そこで起こる紛争に対しては伝統文化を駆使して予防していること、(4)近代化が進むリプロダクションの過程では伝統儀礼から逃れようとする志向性も見られたこと、(5)マレーシアのケダ州では複雑化する人間関係の紛争を伝統療法で処理してきたが、療法師の死去と代替者の不在が課題となっていること、(6)ハルマヘラでは狩猟採集民が食料生産者、家畜飼養者、テレビの聴取者となり、異民族と通婚するなど近代化に適応する一方で孤立化・周辺化する人々もいて二極化が見られたこと、(7)職を求めて子孫が転出する中で北スマトラ農村の高齢者たちは血縁者と地縁者の双方の存在によって適切に変化に対応していること、(8)中部カリマンタンでは開発に伴い、たとえば人間と一体的に捉えられていた森を現金を生む森として捉え返すなど人々は伝統文化を変容し世界的変化に適応しようとしていること、などである。最終年度は、当初の計画通り、平成12年9月にインドネシアのジョクジャカルタで開催した調査発表会議で、研究代表者、研究分担者、海外共同研究者らが平成10年度から進めてきた調査の結果をそれぞれ発表し、相互に検討を加えた。(1)ジャワの伝統と近代思想を融合させたキ・アグンスリョ・ムンタラムの哲学を学ぶことで、貧しく、困難に満ちてはいるが、現実を直視しながら生き生きと生きている人物に焦点を合わせ、彼がどのような経緯をたどって「幸福」な人生に送れるようになったか、を分析した研究の他に、(2)伝統音楽(ガムラン)を演奏することで健常を保とうとしているジャワの都市社会の高齢者、(3)伝統文化を駆使して犯罪を抑止、あるいは犯されたとしてもそれを公然としないなどで騒ぎの拡大を抑止しようとしているジャワの公設市場の売り子たちの考え方と行動、(4)伝統的な出産形式と近代的出産形式を適宜織り交ぜながら、伝統を保持しつつその重圧も避けるという選択を選んでいるジャワ農村の女性たちの意識と行動、(5)近代化から起こる人間関係の軋轢を伝統的災因論で解決しようとしているマレー農村、(6)森林伐採が進むなかで森林への伝統的観念を放棄しようとしているダヤック人、
上気道アレルギー性炎症の制御に関する免疫分子生物学的検討―IL-15を用いたサイトカインネットワークの修飾による治療戦略の構築―

気道アレルギー性炎症に及ぼすIL-15の影響として、誘導相については、IL-15遺伝子導入マウスを用いた検討から、IL-15が抗原特異的Tc1細胞を誘導し抑制的に関与することを報告した(Ishimitsu et al.J.Immunol 2001)が、実効相におけるIL-15の関与については不明である。これまでの検討により、気道上皮細胞においてはtoll-like receptor(TLR)2が有意に発現しており、TLR2のligandであるlipoprotein刺激によりNF-κB経路依存性にIL-15遺伝子の転写活性が誘導されることを明らかにした。本年度は、マウスアレルギー性鼻炎モデルを用いて、アレルギー性炎症の実効相に及ぼす気道上皮細胞由来のIL-15の関与について検討を行った。経鼻的に抗原をチャレンジする際にリコンビナントIL-15を添加したところ、鼻粘膜において好酸球の浸潤が有意に増加した。粘膜より採取したtotal-RNAを用いてRT-PCR法にてIL-5の発現を解析したところ、IL-15非添加群と比較して発現の亢進を認めた。マウス骨髄肥満細胞腫瘍細胞であるP815を用いたin vitroの検討により、IL-15刺激による肥満細胞によるIL-5産生の誘導が確認されたため、肥満細胞欠損マウスであるW/Wvマウスを用いて検討を行ったところ、肥満細胞欠損マウスにおいては、IL-15添加群と非添加群で好酸球性炎症および粘膜組織におけるIL-5遺伝子発現において有意差を認めなかった。以上の結果より、アレルギー性気道炎症の実効相において、IL-15は肥満細胞由来のIL-5産生を誘導し好酸球性炎症を増悪させる可能性が示唆された。気道上皮細胞からのIL-15産生機構について検討した。IL-15のプロモーター領域にはNF-κB結合モチーフが存在し、Interferon responseelement(IRE)とともに転写に関与していると報告されている(Azimi N, etal. Proc Natl Acad Sci USA. 1998)。NF-κBの活性化を誘導する受容体として、Toll-like receptor(TLR)が挙げられるが、気道における報告はみられない。そこで、TLRの発現およびTLR下流のシグナル伝達機構に注目した。TLRsの発現について、Northern blot法により、TLR2,3,4,5,6,9の発現を遺伝子レベルで解析したところ、上皮細胞においては、TLR2,3,6の発現はみとめたものの、TLR4,9は発現していなかった。細菌の菌体成分のlipidAをligandとするTLR4、lipoproteinをligandとするTLR2に特に注目し、フローサイトメトリーにより蛋白レベルの発現を解析したところ、TLR2の発現は単球と同程度であったが、TLR4の発現はみられなかった。次に、lipoprotein, lipid A刺激によるIL-15の誘導について、Northern blot法で解析したところlipoprotein刺激でのみIL-15RNAの発現増強を確認した。培養上清中の蛋白濃度も同様の結果であった。TLR2依存性を確認するため、抗TLR2抗体を用いて中和実験をおこなったところ、lipoprotein刺激によるIL-15産生が抑制された。Dual-luciferase assayにより、lipoprotein刺激によるNF-κBの活性化が確認された。NF-κB阻害剤であるcurcuminを添加することにより、定量的RT-PCR法にて、lipoprotein刺激によるIL-15特異的mRNAの発現が有意に抑制された。以上の結果から、気道上皮細胞においては、TLR2が優位に発現しており、NF-κB依存性にIL-15産生を誘導していることが明らかとなった。以上の結果より、アレルギー性気道炎症の実効相において、IL-15は肥満細胞由来のIL-
細胞接着に関与するフコース転移酵素の生理的及び病理的意義

1.癌細胞におけるフコース転移酵素(Fuc T)の抑制シアリル・ルイスXの生合成に関与する酵素としてFuc T III、IV、V、VI及びVIIの5種類が知られている。これらのcDNAの共通配列に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドや、それぞれに特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを作製し、各種の培養細胞に加え、抗シアリル・ルイスX抗体を用いたフローサイトメトリーによって解析したところ、シアリル・ルイスXの発現には有為な抑制は見られなかった。アンチセンスの添加条件等についてさらに検討中である。一方、Fuc T IIIを発現している癌細胞にポリシアル酸転移酵素(PST)cDNAを導入し安定変異株を得た。糖鎖構造解析により、この変異株では、シアリル・ルイスXき発現量が抑制されていることが明らかになった。その抑制機序については明らかではないが、ルイスX構造の先にポリシアル酸が形成された構造も存在していたことから、単純な基質の奪い合いによる結果とは言えない。今後はFuc T IIIとPSTのどちらが先にポリラクトサミンに作用するのかを明らかにする必要がある。2.細胞接着への影響E-セレクチンをコートしたディッシュに対する上記PST導入安定変異株の接着能を検討したところ、親株に比べて、有意に接着能が減少していた。この結果が、シアリル・ルイスXの発現量の抑制そのものによるのか、ポリシアル酸の発現による二次的効果であるのかについて、現在検討中である。
郷土派の政治思想-戦間期のリトアニアの政治文化

本研究で取上げる郷土派が登場したのは、ロシア第一次革命直後であり、帝政ロシアの国会開設の動きに触発されて往時のリトアニア大公国領の復活をめざす機運が高まったときであった。往時のリトアニア大公国は近代の国民国家とは異質な多民族国家であり、民族自決が叫ばれた時代の要請には不適であった。郷土派は解決策として連邦制を選んだ。連邦化を踏まえた郷土派の歴史観は、タデウシ・ヴルブレフスキやコンスタンツィア・スキルムントの主張からも明らかなように、東欧史に特徴的な民族解放史観とは一線を画している。郷土派は、出自をみると在地のポーランド系エリートであったが、エンデツィア(国民民主党)が唱導する排他的なポーランド至上主義を断固拒否し、多元民族社会の共存共栄を提唱した。ヴルブレフスキの政治論には、オーストリア・マルクス主義の"文化的自治論"を髣髴とさせるものさえ認められる。郷土派の歴史観は、民族解放論に彩られ、ステレオタイプ化された近代ポーランド史学の再考を促す道標でもある。この視角は、日本近代史との比較を強く要請するものであり、とりわけ19世紀末にヨーロッパで探求された"郷土"の発見が世界史的にみて同時代性と普遍性をもち、その根底に農民問題の解決が共通課題であったことを示唆している。具体的には、新渡戸稲造と柳田國男の民俗学、すなわち"地方"研究と郷土派の"郷土(krajowosc、tutejszosc)"の発見とが共通項で結ばれていたことを本研究では指摘できた。郷土派の流れを汲む人たちは、第二次世界大戦後、ソヴィエト政権に与せず、西側へ亡命を余儀なくされた。その多くは他界し、彼らの主張の痕跡は、回想録などの形で西欧各地の文書館に保存されている。忘れ去られたかにみえた郷土派の見解は冷戦崩壊を機に復活し、本研究では、郷土派の路線が今日のEU統合(拡大欧州)の布石をなしていること、その先駆性を確認することができた。本研究に関する平成13年度の研究実績は、以下の2点に要約できる。1)12月1日、法政大学で開催されたJSSEES2001年度の年次大会の共通論題『21世紀のロシア・東欧への新しい視座』のひとつのセッション、「スラヴ地域をめぐる教育と研究のストラテジー」の基調報告で、本研究の方向を、地域研究と情報の総合化として提案した。すなわち、現代社会を特徴付ける情報化が16世紀のグーテンベルクによる活版印刷の技術開発に遡る歴史的転換であることを明確化した上で、この地で印刷活動を開始したフランツィスク・スコリーナの事跡を紹介し、1588年の第三次リトアニア法がその印刷技術によって公刊され、政治行政言語として後世に至る法効力を発揮したことの歴史的意義を紹介した。この地域全体は1569年のルブリンの合同以降、政治的にはポーランド王国と連合関係を深めていくとはいえ、古層としてのキエフ・ルーシの遺産をなお色濃く残し、ロシア史あるいはソ連邦史の枠組みでは把握不可能であること、ポーランドの政治文化との重なり合い、そして現地、すなわち重層化した社会編成をもつ「郷土」の政治文化を把握する必要性を指摘しておいた。2)このセッションの各報告を基に、スラヴ東欧地域、とりわけベラルーシやバルト三国のような、歴史学や政治学の分野ではマイナーとみなされる地域にも照明を当てる必要性を強調し、諭集としてまとめた。スラヴ東欧地域をめぐる関連学会へ学術情報を提供できるように配慮した。

忘れ去られたかにみえた郷土派の見解は冷戦崩壊を機に復活し、本研究では、郷土派の路線が今日のEU統合(拡大欧州)の布石をなしていること、その先駆性を確認することができた。ウクライナ共和国クリミア自治共和国のバフチサライ国立歴史民俗学博物館館長であるセルヴェル・エブベキーロフ氏を招聘し、研究交流を実施した。金帳汗国の崩壊とその後裔であるクリミア・タタールの歴史的文化的遺産は、アジア対ヨーロッパという古典的な対比にとどまらず、本研究課題が対象とする往時のリトアニア大公国にその歴史的遺産が継承され、今日に至るこの地域の多民族社会の特徴を形成することになった。同氏の来日の世話は早坂が担当し、各研究機関で以下のテーマで報告および講演をしてもらった。1、10月30日(東京工業大学)「ガスプリンスキイ、民族文化復興運動のパイオニア」2、11月1日(大阪市立大学文化交流センター)、JSSEES(日本スラヴ東欧学会)第17回国際シシポジウム、講演「クリミア、東西文明の交叉点」3、11月5日(京都大学文学部)「多民族社会、クリミア」4、11月8日(東京大学東洋文化研究所)「クリミア汗国、ロシアとオスマン帝国の狭間」大阪市立大学での同氏の講演原稿は、早坂が校閲を済ませた。本年春、日本スラヴ東欧学会(JSSEES)第23号に掲載予定である。同氏との意見交換を踏まえて、往時のリトアニア大公国が金帳汗国の瓦解の結果成立したクリミア汗国との交流により多民族社会が形成された経緯、および現代に至るまでアジア的要素と西欧的要素とが共生する地理的空間であったことを確認した。19世紀末にリトアニアの郷土派が活躍した政治空間は、往時のリトアニア大公国領、すなわち現在のリトアニアとベラルーシをカバーするものである。1992年の旧ソ連体制の崩壊直後、この地域では「諸民族の共生」を掲げた郷土派の言説に一躍関心が高まった。しかし、勃興した各地域のナショナリズムの高揚により、理想主義的な郷土派の言説は民族の大義の裏切りとみなされるなど、必ずしもポジティヴな評価は得られていない。平成15年度の研究では、郷土派の論客のひとり、ミハウ・レメルの評論をたどり、とくにその子孫の回想録を分析対象とした。検討の結果、帝政ロシアが19世紀後半、この地域に広く居住していたロシア旧教徒を意図的に非ポーランド化、すなわちロシア化政策の尖兵として利用しようとした経緯を確認できた。同様の経緯を帝政ロシアによる同時期のウクライナ人政策、ユダヤ人政策にも確認でき、19世紀後半における帝政ロシアの民族政策の特質を検証することができた。これらを複合したものこそ「ポーランド問題」であり、それはまさに恣意的に作り出されたロシア化政策の産物であること、その裏返しであることが確認できた。この経緯と構造はその後のソヴィエト時代にも引き継がれ、現代の錯綜した、混迷を深める民族対立になお反映している。郷土派の路線は結果的に破綻したとはいえ、理念としてその後も生き続けていることに現代的意義があると考えられる。最終年度において研究を総括し、以下を確認できた。郷土派がその活動を開始したのは、第一次世界大戦とロシア革命の勃発という国際環境の激変の時代であり、往時のリトアニア大公国領の復活をめざす機運が高まったときであった。往時のリトアニア大公国は、近代の国民国家とは異質な多民族国家であり、民族自決が叫ばれた時代の要請に応えるには不適であった。郷土派は、その打開策として、連邦制国家としてリトアニア大公国を復興することをめざした。こうした連邦化を視野に入れる郷土派の歴史観からは、民族主義史観あるいは素朴な民族解放論とは無縁であることが窺える。
H/K-ATPaseの構造解析とイオン輸送の分子メカニズムの解析

豚の胃より採取したH/K-ATPaseを用いて、これまでに確立した結晶化条件により二次元結晶を作製し、極低温電子顕微鏡による構造解析を行うことで、6.5Åの分解能で立体構造を明らかにすることができた。同じP-typeファミリーに属するCa-ATPaseにおいては、今回の結晶化の際に加えたAlFxとADPの組み合わせはE1P-ADPの構造を模倣する阻害剤として用いられていたが、我々の立体構造はE2Pの反応中間体であることがわかった。今回明らかになったH/K-ATPaseの構造ではbサブユニットのN末端がaサブユニットのPドメイン周辺と相互作用していることが示唆されたため、この相互作用によりE2Pの構造の安定化に寄与していることが予想された。そこで、βサブユニットのN末端を欠損させた変異体を作製し、HEK細胞において野生型のαサブユニットと共発現させることで、E1P-ADPとE2Pの平衡反応にどのような影響を与えているのか機能解析を行った。その結果、βサブユニットのN末端を8アミノ酸以上欠損させた変異体では、E2PからE1P-ADPの逆反応が生じやすくなっていることが明らかになった。これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや膜輸送に関わると考えられていたが、今回の研究により酵素機能を担うαサブユニットとの相互作用により実際の酵素反応にも影響を与えるという新しい機能が明らかになった。また、今回見られた相互作用はNa/K-ATPaseの構造では見られておらず、H/K-ATPaseに特異的な機構であると考えられる。H/K-ATPaseの発現している胃壁細胞によって形成されるプロトン濃度勾配は100万倍という驚異的な値であり、これは他のトランスポーターと比較しても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによる逆反応を防ぐ仕組みがこのような特殊な性質に寄与していることが考えられる。申請書作成時に報告した手法により豚の胃より精製したH/K-ATPaseをn-Octyl-β-D-glucosideの界面活性剤を用いて可溶化後、透析法により二次元結晶を作製し、負染色条件において電子顕微鏡解析を行った結果、リガンド非結合型(E1)とアルミニウムフロライド-ADP結合型(E1P-ADP)で異なるプロジェクションを与えた。さらにトリプシンの限定分解をおこなったところ、それぞれの条件において異なる分解パターンを示したことから、各結晶のプロジェクションの変化は構造変化を反映していることが支持され、Ca-ATPaseの構造解析から明らかになっているように阻害剤などのリガンド結合に伴いH/K-ATPaseは細胞質可溶性A、N、Pドメインが大きく構造変化をしていることが類推された。また、二次元結晶化条件の最適化を進める過程においては、n-Octyl-β-D-glucosideとは異なる界面活性剤により可溶化した標品を用いてスクリーニングを行った結果、DMPCなどの外来の脂質を適量添加することで、比較的安定で結晶性の優れた二次元結晶を作製することに成功した。また、この結晶化条件においては解析に有利な単層の結晶もこれまでより高頻度で得ることができたため、極低温電子顕微鏡によるデータ収集を進めている。極低温電子顕微鏡における観察試料作製の検討においてはトレハロースを用いた試料包埋剤が結晶の保護に効果があることがわかり、さらに細かい条件を検討中である。現在、トリプシンによる限定分解後のペプチド断片のN末配列解析を行うことで、トリプシンによる切断部位を特定すると同時に、極低温電子顕微鏡による解析結果を組み合わせることでリガンド結合による構造変化を議論することを目指している。これまでの研究経過において確立された二次元結晶化、および極低温電子顕微鏡による解析法を用いることで、AIFx-ADP結合型(E1P-ADP)、およびリガンド非結合型(E1)のそれぞれの結晶化条件において得られた二次元結晶を用いて、10枚程度の電子顕微鏡画像から得られた投影図を14Åの分解能でマージして比較した。Ca-ATPaseにおける三次元結晶構造解析では、いわゆるオープンステイトであるE1型と、リガンドの配位したE1-PADPではNドメインなどが大きく位置を変えている構造が報告されている。分解能があまり高くないために各ドメインをアサインすることはできなかったが、H/K-ATPaseにおいても同様な構造変化を伴っているのであればかなり異なった投影図を示すことが予想されたが、これら二つの投影図は非常に似通っていた。そこで、トリプシンを用いた限定分解を行うことで、H/K-ATPaseにおいて各反応サイクル中にどのような構造変化を伴っているのかを検証した。二次元結晶化に用いた2つの条件以外に、ATPアナログであるAMP-PCP結合型(E1-ATP)、リン酸アナログ結合型(E2P)なども同時に比較した結果、トリプシンによる切断性はCa-ATPaseの構造、及び過去に報告されたNa/K-ATPaseにおけるプロテアーゼ応答性などと非常によく一致していた。このことから、H/K-ATPaseにおいてもこれらと同様の構造変化を伴っていることが類推された。これら二つの結果を合わせると、H/K-ATPaseは他のP型ATPaseと同様な構造変化を伴っているが、E1型においてNドメインはCa-ATPaseの結晶構造ほど大きく開いていないことが予想された。同じP-typeファミリーに属するCa-

ATPaseにおいては、今回の結晶化の際に加えたAlFxとADPの組み合わせはE1P-ADPの構造を模倣する阻害剤として用いられていたが、我々の立体構造はE2Pの反応中間体であることがわかった。今回明らかになったH/K-ATPaseの構造ではbサブユニットのN末端がaサブユニットのPドメイン周辺と相互作用していることが示唆されたため、この相互作用によりE2Pの構造の安定化に寄与していることが予想された。そこで、βサブユニットのN末端を欠損させた変異体を作製し、HEK細胞において野生型のαサブユニットと共発現させることで、E1P-ADPとE2Pの平衡反応にどのような影響を与えているのか機能解析を行った。その結果、βサブユニットのN末端を8アミノ酸以上欠損させた変異体では、E2PからE1P-ADPの逆反応が生じやすくなっていることが明らかになった。これまで、βサブユニットはαサブユニットのフォールディングや膜輸送に関わると考えられていたが、今回の研究により酵素機能を担うαサブユニットとの相互作用により実際の酵素反応にも影響を与えるという新しい機能が明らかになった。また、今回見られた相互作用はNa/K-ATPaseの構造では見られておらず、H/K-ATPaseに特異的な機構であると考えられる。H/K-ATPaseの発現している胃壁細胞によって形成されるプロトン濃度勾配は100万倍という驚異的な値であり、これは他のトランスポーターと比較しても大きいことから、この研究によって明らかになったβサブユニットによる逆反応を防ぐ仕組みがこのような特殊な性質に寄与していることが考えられる。