hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軸配位子によるアンチモンポルフィリン・層状粘土複合体の構造制御と光機能性

このことは、粘土層間での電子移動は進行しないことを示している。前年度、ピリジニウムカチオン部位を軸配位子として持つアンチモンポルフィリン錯体とカチオン交換性層状粘土(スメクトンSA ; SSA)との複合体形成過程を検討した結果、軸配位子としてカチオン部位をもつ場合には、複合体形成の過程おいて層構造が保持され、粘土のアニオン部位と軸配位子のカチオン部位との静電的相互作用が層構造制御に重要であることを明らかにした。今回の研究では、軸配位子部位と粘土アニオン部位との相互作用の関与をより明確にするために、軸配位子のカチオン部位周辺における立体環境の変化が層構造形成に与える影響について検討した。まず、ヨードアルキルとの4級化反応で得られる種々のアルキル基(メチル、エチル、イソプロピル、n-ブチル、n-ヘキシル、n-オクチル)を持つピリジニウムカチオンを軸配位子とするアンチモンポルフィリン錯体の合成に成功した。次にこれらの錯体とSSAとの複合体形成において、オクチル基以外の錯体では層構造形成が認められた。オクチル基ではアモルファス構造を取ることから、層構造形成を阻害するためには、軸配位子周辺での大きな立体障害が必要であることがわかった。また、前年度明らかにした粘土ナノシート上でのアンチモンポルフィリン錯体とピラニンとの光電子移動反応において、軸配位子の構造とピラニンとの電子移動の関係を検討した結果、ピラニンのスルホン酸アニオン部位と静電的あるいは水素結合相互作用が可能である軸配位子(ピリジニウムカチオンあるいは水酸基)を持つアンチモンポルフィリン錯体では、高効率な電子移動が粘土ナノシート上で進行することがわかった。さらにピラニンの代わりの色素として、ポルフィリン分子への有効な励起エネルギー供与分子として知られているボランージピリン錯体を用いて検討した結果、粘土ナノシート上でのアンチモンポルフィリンとの間でエネルギー移動が進行することも明らかにした。
癌に特異的なγGTP糖鎮に対するモノクローン抗体を用いたEIAの実用化

糖タンパク質の糖鎖に対する抗体を作製するのは非常に難解であり、23の例を除くと現在までほとんど報告がない。我々は、ヒト肝臓癌の組織よりγGTPを精製し、その糖鎖をヒドラジン分解によって分離した。次に、マウスの血清アルブミンとこの糖鎖とを科学的に結合させ、抗原としてマウスに免疫することにより、γGTPの癌化により変異した糖鎖を認識するモノクローナル抗体を作製することに成功した。得られた抗体をもとにエンザイムノアッセイ(EIA)法を用いて正常人、各種癌患者の血清中の変異γGTP量を測定した。その結果、1.γGTP-オリゴ糖に対するモノクローン抗体。2つのモノクローン抗体が得られた。そのうち、γS-54-29は、ヒト肝癌およびヒト腎臓γGTPと反応したがヒト正常肝γGTPとは低い反応性しか示さなかった。2.γS-54-29抗体の特異性の検討。本抗体をSDS-PAGEで泳動し、次でWestern blottingを行ったところ、γS-54-29抗体は肝癌およびヒト腎γGTPの大サブユニットとのみ反応し、小サブユニットとは反応せず、本抗体がγGTPの大サブユニットを認識するものであった。3.各種患者血清中のγS-54-29と反応するγGTPレベル。種々の悪性腫瘍患者などの血清のγGTPレベルをγS-54-29を用いたEIAで測定した。その結果、肝癌、転移性肝癌(原発は他臓器)、肝炎などで高値を示す例が多かった。肝硬変、肝癌、胆石などでは高値を示さなかった。正常人血清の平均値+2SDをカットオフ値として用いた。次に、マウスの血清アルブミンとこの糖鎖とを化学的に結合させ、抗原としてマウスに免疫することにより、γGTPの癌化により変異した糖鎖を認識するモノクローナル抗体を作製することに成功した。得られた抗体をもとにエンザイムイムノアッセイ(EIA)法を用いて正常人、各種癌患者の血清中の変異γGTP量を測定した。その結果1.γGTPーオリゴ糖に対するモノクローン抗体2つのモノクローン抗体が得られた。そのうち、γSー54ー29は、ヒト肝癌およびヒト腎γGTPと反応したがヒト正常肝γGTPとは低い反応性しか示さなかった。2.γSー54ー29抗体の特異性の検討本抗体をSDSーPAGEで泳動し、次でWestern blottingを行ったところ、γSー54ー29抗体は肝癌およびヒト腎γGTPの大サブユニットとのみ反応し、小サブユニットとは反応せず、本抗体がγGTPの大サブユニットを認識するものであった。3.各種患者血清中のγSー54ー29と反応するγGTPレベル種々の悪性腫瘍患者などの血清のγGTPレベルをγSー54ー29を用いたEIAで測定した。
血管内皮細胞由来microRNAによる糖尿病性血管障害機構の空間統合的解明

血管機能障害は、糖尿病など生活習慣病に関わる様々な疾患の発症、病態増悪の基盤となる。我々は、血管機能の基軸である血管内皮細胞に発現するマイクロRNA(miRNA)による病態解明を行った。非翻訳短鎖RNAのmiRNAは生体内に数千種類の報告があり、標的蛋白質の転写・翻訳を抑制し、生体のあらゆる機能を制御する。血管内皮細胞に比較的発現するmiR-424/503についての検討で、(1)miR-424/503が血管弛緩物質の一酸化窒素の生成を抑制すること、(2)miR-424/503は血管の形質変化を制御すること、(3)分泌されたmiRNAが単核球系細胞の機能を変化させることなどを示した。平成26年度は、血管炎症の発症機序にマイクロRNA(miRNA)の関与があることを証明しようと試みた。特に、血管内皮細胞に注目して、その血管内皮細胞のmiRNAが炎症の厳しい環境下でどのように変化するのか、血管内皮細胞の機能との関係、そして、血中を循環しているmiRNAに血管内皮細胞由来のmiRNAは寄与しているのか、に焦点を当てて研究を進めた。(1)p53の活性化により発現が増強する血管内皮細胞のmiRNAを検索した。研究申請者は2010年発表の論文(PNAS)で大腸癌細胞のmiRNAのスクリーニングをし、p53で誘導されるmiRNAについての経験をもとに選定したmiR-34a、miR-107、miR-103、miR-503など数種類のmiRNAが血管内皮細胞での動態について検討した。これらのmiRNAにはp53プロモーターが存在する。次にこれらのmiRNAが、血管内皮細胞の一酸化窒素(NO)産生を制御するかを検討した。中でもmiR-34a、miR-503はNO合成酵素(eNOS)の発現を蛋白質レベルでコントロールしうることを見出した。これらは来年度もさらに研究を進めていく予定である。(2)miRNAは血管内皮細胞から分泌される。これは、小胞依存性のもの(エクソゾーム内在miRNA)と非依存性のもの(キャリア蛋白質結合miRNA)がある。血管内皮細胞特異的miRNAであるmiR-126はエクソゾーム内在性のmiRNAであり、TNFalphaなどサイトカイン刺激により培養上清中に検出できる。100,000Gの超遠心により単離したエクソゾーム中にmiR-126はそのほとんどが含有されることを証明した。次に、血管内皮細胞から放出されたmiR-126が、単球系細胞に取り込まれることを確認できた。共培養により、通常単球系細胞には発現がきわめて弱いmiR-126をqPCR法により検出できた。平成26年度にがん抑制遺伝子p53による制御を受けるmiRNAを探索し、miR-34aとmiR-503の2種類を導き出した。これらのmiRNAは血管内皮細胞に比較的高発現であることがその導入の理由である。平成27年度は、血管内皮細胞のmiRNAを中心に研究を遂行した。具体的には、血管内皮細胞の抗炎症作用について、miRNAが標的蛋白質を制御するメカニズムについての探索を行った。主として次の2つに焦点を当てて新たな知見を得ることができた。(1)平成26年度に発見したmiR-503とmiR-34aの血管内皮細胞への働きを一酸化窒素(NO)の制御という側面から研究した。特にmiR-503がNO産生に関与するメカニズムは、血管内皮細胞のNO産生酵素(eNOS)の発現を制御する機構と増殖シグナル伝達経路による機構の、少なくとも複数の経路の関与が考えられた。miR-503は低酸素刺激によりその発現が増強する。また、サイトカインの刺激によるmiR-503発現変化が観察できた。これらの刺激応答性miR-503の変化とNO産生の関連を模索中であり、これは来年度の課題でもある。miR-34aはアポトーシスを導く可能性があるが、血管内皮細胞では細胞増殖抑制に働く。このmiR-34aの炎症への役割を検討しているところである。(2)miRNAは血管内皮細胞から刺激により放出されるが、これがエクソゾームに含有されていること、単球系の細胞に取り込まれることを証明した。即ち、血管内皮細胞から放出されるmiR-126についてエクソゾーム分画で検出され、これがTHP-1など単球系培養細胞との共培養で取り込まれる。miR-126の標的遺伝子がTHP-1で抑制できるかを検討中である。特に、単球の炎症性接着分子などの発現制御などに関与するかを研究している。平成27年度は、研究内容を2つの課題に絞って施行し、おおむね期待通りの結果が得られた。初年度に注目したmiRNAが、その機能解析の過程で特に方向性の異なる結果を呈することなく、予想の範囲内での動態を示したことが順調な原因であると思われる。初年度は、研究体制、実験のセットアップなどに時間を費やしたが、平成27年度は、実施計画をスムーズに遂行することができた。(1)の課題は、対象とするmiRNAをmiR-503とmiR-34aの二つに絞って実験を行ったために、比較的仮説と相違なく研究を進めることができた。

miR-503がNOを制御することのみならずに、アルゴリズムによる標的遺伝子の検索により興味深いターゲットを見出し、現在検討を重ねている。そもそも血管内皮細胞に高発現であるが、刺激誘導性であるために、シグナル変化の検討はやや難しい印象がある。(2)エクソゾーム全体のmiRNAの分布により、そのmiRNAの働きを検討する手法ではなく、血管内皮細胞由来のmiRNAに絞り込んで実験をするため、平成26年度は極めて高発現のmiR-126を使って、細胞からの分泌、細胞への取り込みについて検討した。平成27年度も引き続きmiRー126を中心として、細胞間移動するmiRNAの機能的役割を検討した。エクソゾームの受け取り手の単球系細胞としてTHP-1を中心に研究を進め、予想通りの結果を得られている。以上のような平成28年度研究への橋渡しとしての研究結果を得ることができた。マイクロRNA(miRNA)による血管障害の制御という大きなプロジェクトを遂行するために、過去2年間で次の2点を明らかにした。(1)血管内皮細胞において、がん抑制遺伝子p53による制御を受けるmiRNAの探索から、miR-34aとmiR-424/503を導き出し、この作用機序の一つとして増殖シグナルの関連を推定した。(2)血管内皮細胞から一定の刺激によりmiRNAが放出されるが、これがエクソソームに含有されていること、単球系の細胞からもmiRNAが放出されることを証明した。平成28年度はこれらを基に次のことを明らかにした。(1)miR-424/503が血管弛緩物質の一酸化窒素の生成を抑制する。血管内皮細胞はinsulin刺激で一酸化窒素の産生が亢進するが、miR-424/503はこの内皮機能を抑制することを確認した。そのシグナル分子をさらに詳細に検討し、投稿する予定である。(2)miR-424/503は培養血管内皮細胞の形質変化を制御する。miR-424/503を導入した血管内皮細胞は、コラーゲン関連蛋白質や平滑筋関連蛋白質の発現を増強させる。結果として血管内皮としての機能を低下させることを見出した。この結果は現在投稿中である。(3)血管内皮細胞から様々なmiRNAが放出される。これは、エクソソームという分泌小胞に内包されており、この放出は種々の刺激により誘導されることが確認できた。血管内皮細胞に多く発現するmiR-126の分泌は単球系の細胞の機能を変化させることを確認し、さらに今後も単球の炎症性接着分子などの発現制御などに関与するかの研究が続行中である。科学研究費により、マイクロRNAの血管内皮機能の制御機構の一端を解明できた。今後の魅力的な血管研究へ礎とできたことに感謝いたします。血管機能障害は、糖尿病など生活習慣病に関わる様々な疾患の発症、病態増悪の基盤となる。我々は、血管機能の基軸である血管内皮細胞に発現するマイクロRNA(miRNA)による病態解明を行った。非翻訳短鎖RNAのmiRNAは生体内に数千種類の報告があり、標的蛋白質の転写・翻訳を抑制し、生体のあらゆる機能を制御する。血管内皮細胞に比較的発現するmiR-424/503についての検討で、(1)miR-424/503が血管弛緩物質の一酸化窒素の生成を抑制すること、(2)miR-424/503は血管の形質変化を制御すること、(3)分泌されたmiRNAが単核球系細胞の機能を変化させることなどを示した。平成26年度は、2つの課題についておおむね期待通りの結果が得られた。初年度なので、研究体制と試薬などのセットアップの時間のため、研究実施の計画自体をやや簡潔化して効率的に研究を進めた。
サリチル酸気孔閉鎖作用における硫化水素のシグナル伝達物質としての機能解明

サリチル酸(SA)の気孔閉鎖シグナル伝達への硫化水素の関与を確かめるため、孔辺細胞内の硫化水素量を蛍光イメージング法により調べた。硫化水素は無処理の孔辺細胞で検出されたが、その量はSA処理直後から減少し30分後には殆ど検出されなくなった。しかし、さらに時間が経つと硫化水素量は増加し処理1時間後には処理前の1.7倍に達していた。硫化水素量の上昇と気孔開閉が始まる時間は対応しており、SAによる硫化水素誘導と気孔閉鎖の関連性が示唆された。また、L-Cysteine desulfhydrase阻害剤アミノオキシ酢酸(AOA)は、SAによる硫化水素の上昇を抑制するとともに、SAの気孔閉鎖を完全に打ち消すことから、SAは孔辺細胞の硫化水素生合成を亢進していると考えられる。一方、AOAと同様にSAの気孔閉鎖を打ち消す一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤L-NAMEやNO消去剤PTIOは、SAによる硫化水素誘導を抑制しなかったので、SAの気孔閉鎖では発生する硫化水素は、NOの上流で働く重要なシグナル伝達物質であることが立証された。次に、孔辺細胞内の過酸化水素とNOのモニタリングを実施し、過酸化水素はSA処理5分までの短時間に処理前の2倍量以上まで誘導されるのに対し、NO量はSA処理30分後までは変化せず、60分後に処理前の2倍まで増加することを確認した。本年度、SA処理(10μM)により硫化水素、過酸化水素、NOが孔辺細胞内に一過性に発生誘導されることを明らかとし、各分子の発生量の最大時のタイミング、および増減パターンは異なることを見出した。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用い各分子が誘導局在化されている器官を調べた結果、硫化水素は孔辺細胞全体で一様に検出されるのに対し、過酸化水素は孔辺細胞の細胞膜とクロロプラスト、NOはクロロプラストのみに局在しており、各分子の発生器官が一致しないことを発見した。サリチル酸が直接的に硫化水素を発生誘導することは確認できたので、初めの計画では、硫化水素により生成が誘導される気孔閉鎖活性物質8-SHcGMPの定量を遂行する予定であった。サリチル酸を処理したソラマメ幼葉中の8-SHcGMPの測定は進めているが、現状では、同一サンプルであっても8-SHcGMPが検出される場合とされない場合があり、再度、抽出・精製法の見直しが必要であり、予定していた8-SHcGMPの定量が遅れている状態である。当初の計画通り、本年度に引き続きサリチル酸によって生じる硫化水素により生成誘導が予想される気孔閉鎖活性物質8-SHcGMPの定量を行い、サリチル酸が関与する気孔閉鎖での硫化水素のシグナル伝達物質としての機能を明らかとする。また、サリチル酸により硫化水素の他に、活性酸素、一酸化窒素が孔辺細胞内に発生誘導されるが、発生する器官および発生量の変動が各分子で異なること、さらにはサリリル酸が硫化水素生合成を亢進していることが明らか下ある。そこで今後は、硫化水素生合成阻害剤や過酸化水素生合成阻害物質の硫化水素、活性酸素、一酸化窒素誘導への影響を明らかとし、サリチル酸の気孔閉鎖シグナル伝達における各分子の関係性および役割を明らかとし、シグナル伝達機構を明らかとする。また、可能であればサリチル酸によるL-Cysteine desulfhydraseの発現誘導についても検討を加え、サリチル酸の作用点を検索する。サリチル酸(SA)は気孔閉鎖を引き起こし、孔辺細胞内に活性酸素(ROS)あるいは一酸化窒素(NO)を発生させることが明らかであったが、詳細な作用メカニズムは未解明であった。一方、アブシジン酸による気孔閉鎖では、硫化水素の発生がNOを生成誘導するシグナル伝達経路が提唱されていることから、SAの気孔閉鎖における硫化水素のシグナル伝達物質としての可能性の検証を試みた。まず、SAのソラマメ表皮切片の気孔開口への影響を調べ、1100μのSAが、明期条件下の気孔を処理1時間後から有意に閉鎖することを確認した。次に、硫化水素の消去剤ヒポタウリンのSAによる気孔閉鎖への影響を検討し、SA10μM処理時に100μMのヒポタウリンを添加すると気孔閉鎖は完全に打ち消されることを見出した。さらに、ソラマメ孔辺細胞内の硫化水素の発生を、蛍光プローブ(HSip-1 DA)を用いて検出を試みたが、細胞内の正確な硫化水素を検出するには至らなかった。これは、植物細胞内へのHSip-1 DAの浸透性の低さが一つの原因であると考えられるので、観察条件を検討し再度、孔辺細胞内の硫化水素の正確な定量を行う必要がある。一方、SAによる気孔閉鎖は、NO合成酵素阻害剤L-NAMEや,NO消去剤PTIO、カタラーゼやスーパーオキシドアニオンのスカベンジャーTiron処理により、完全に打ち消された。また、NOと過酸化水素を蛍光プローブにてモニターし、孔辺細胞内のNOと過酸化水素量はSA処理により明らかに増加することを確認した。また、SAにより発生したNOと過酸化水素はヒポタウリンを同時添加するとほとんど検出しなかった。以上の結果、SA処理により孔辺細胞内で硫化水素が発生し、発生した硫化水素がNO、さらにROSの生成を誘導しこれらが気孔閉鎖の二次メッセンジャーとして機能していることが明らかとなった。植物の孔辺細胞内の硫化水素の検出法は未だ確立されていなく、まず、近年開発された硫化水素検出用蛍光プローブ(SulfoBiotics- HSip-1 DA)を用いて試みた。

しかし、詳細な観察条件を検討できななかったために、硫化水素の定量な検出が出来ず、SAによる硫化水素の発生誘導を直接的に証明するには至っていない。サリチル酸(SA)の気孔閉鎖シグナル伝達への硫化水素の関与を確かめるため、孔辺細胞内の硫化水素量を蛍光イメージング法により調べた。硫化水素は無処理の孔辺細胞で検出されたが、その量はSA処理直後から減少し30分後には殆ど検出されなくなった。しかし、さらに時間が経つと硫化水素量は増加し処理1時間後には処理前の1.7倍に達していた。硫化水素量の上昇と気孔開閉が始まる時間は対応しており、SAによる硫化水素誘導と気孔閉鎖の関連性が示唆された。また、L-Cysteine desulfhydrase阻害剤アミノオキシ酢酸(AOA)は、SAによる硫化水素の上昇を抑制するとともに、SAの気孔閉鎖を完全に打ち消すことから、SAは孔辺細胞の硫化水素生合成を亢進していると考えられる。一方、AOAと同様にSAの気孔閉鎖を打ち消す一酸化窒素(NO)合成酵素阻害剤L-NAMEやNO消去剤PTIOは、SAによる硫化水素誘導を抑制しなかったので、SAの気孔閉鎖では発生する硫化水素は、NOの上流で働く重要なシグナル伝達物質であることが立証された。次に、孔辺細胞内の過酸化水素とNOのモニタリングを実施し、過酸化水素はSA処理5分までの短時間に処理前の2倍量以上まで誘導されるのに対し、NO量はSA処理30分後までは変化せず、60分後に処理前の2倍まで増加することを確認した。本年度、SA処理(10μM)により硫化水素、過酸化水素、NOが孔辺細胞内に一過性に発生誘導されることを明らかとし、各分子の発生量の最大時のタイミング、および増減パターンは異なることを見出した。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用い各分子が誘導局在化されている器官を調べた結果、硫化水素は孔辺細胞全体で一様に検出されるのに対し、過酸化水素は孔辺細胞の細胞膜とクロロプラスト、NOはクロロプラストのみに局在しており、各分子の発生器官が一致しないことを発見した。サリチル酸が直接的に硫化水素を発生誘導することは確認できたので、初めの計画では、硫化水素により生成が誘導される気孔閉鎖活性物質8-SHcGMPの定量を遂行する予定であった。サリチル酸を処理したソラマメ幼葉中の8-SHcGMPの測定は進めているが、現状では、同一サンプルであっても8-SHcGMPが検出される場合とされない場合があり、再度、抽出・精製法の見直しが必要であり、予定していた8-SHcGMPの定量が遅れている状態である。第一に、サリチル酸を処理した孔辺細胞内の硫化水素の検出法の確立を行う。具体的には、まず、HSip-1 DA蛍光試薬の観察条件の検討を行う。孔辺細胞にてHSip-1 DAを用いた蛍光観察法が上手く行かない場合には、モノブロモビマン法にて、LC-MSを用いて硫化水素の検出を行う。さらに、既に、サリチル酸処理により孔辺細胞内に硫化水素が発生し、それが一酸化窒素や過酸化水素などを誘導することを明らかとしているので、今後、1サリチル酸処理により硫化水素の生合成酵素であるL-Cysteine desulfhydrase(DES1)遺伝子が、発現誘導されているのかを検討すると共に、DES1欠損シロイヌナズナでの、サリチル酸処理による気孔閉鎖活性、硫化水素、一酸化窒素と活性酸素種の発生を検討し、DES1がサリチル酸シグナル伝達の構成因子であること明らかにする。
HRP法による食道自律神経支配の研究

食道自律神経支配についてHRP法を用いて検討した。動物は雌雄成熟雑種ネコを用い、頚部食道筋群と胸部下部食道筋群に分けてHRP注入実験を行った。また、神経路を検討する目的で、種々の処置を加えた後にHRP注入を行い、各神経節のHRP陽性細胞を観察した。頚部注入群では、両側第1頚髄(C1)から第9胸髄(T9)に及ぶ脊髄後根神経節(DRG)にHRP陽性細胞を認め、C2-C5及びT2-T7に陽性細胞が多く、二峰性の分布を示した。神経切離処置により、前者は横隔神経を後者は大内臓神経を主たる経路としていた。胸部下部食道筋群では、両側第5頚髄-第13胸髄DRGより交感神経性求心性神経支配を受け、大内臓神経が主たる経路であった。他の経路として両部位とも星状神経節を介する交感神経心臓枝および交感神経幹よりの直接の神経枝が存在した。また、迷走神経節状神経節・頚静脈孔神経節にも陽性細胞を認め、副交感神経求心性神経支配が証明された。求心性神経支配についてみると、頚部食道筋群は副交感神経支配が優勢であり、胸部下部食道筋群では交感神経支配が優勢であった。交感神経遠心性神経支配についてみると、頚部食道筋は上頚-第8胸部椎傍神経節、胸部下部食道筋群は上頚-第12胸部椎傍神経節及び椎前神経節より交感神経節後神経の支配を受けていた。副交感神経遠心性神経支配に関しては、節前線維の細胞体は、頚部食道筋群では延髄の疑核に、胸部下部食道筋群では延髄の疑核および迷走神経背側核に存在することが判明した。神経細胞の大きさを測定すると、脊髄後根神経節・星状神経節・頚部節状神経節ではHRP陽性細胞は有意に小型であり、迷走神経背側核・疑核では陽性細胞が有意に大型であった。近年、癌手術症例の増加に伴い、胃切除後の逆流性食道炎などによる食道疼痛、及び食道切除後のQuality of lifeを考える上でも食道痛の神経学的発生機序を明らかにする必要があると考え、Horseradish Peroxidase(HRP)による逆行性軸索輸送を用いて、まず頸部食道、胸部食道の知覚神経支配を明らかにした。雌雄成熟ネコ12匹を用い、sodium pentobarbitalの腹腔内投与、もしくは静注による全身麻酔後、33%HRP生理食塩水溶液150μlを、頸部食道筋内(6匹)、胸部食道下部内(6匹)にそれぞれマイクロシリンジにて分注した。HRP注入後48時間の生存時間をおき、深麻酔下に、経左心的にヘパリン加生理食塩水にて脱血灌流し、1.25%glutaraldehydeー1%paraformaldehyde加燐酸緩衝液で灌流固定し、その後、10%サッカロ-ス加燐酸緩衝液にて灌流した。第1頸髄から第2腰髄に及ぶ脊髄後根神経節(DRG)を取り出し、クリオスタットにて40μm厚の凍結切片を作成し。顕微鏡下にHRP陽性細胞を観察した。

頸部注入群では、両側第1頸髄DRG(C1)から第9胸髄DRG(T9)の範囲に陽性細胞を認め、C2C5及びT2T6に陽性細胞数が多く、二峰性の分布を示した。胸部注入群では、両側C5T13の範囲に陽性細胞を認め、T3T7に陽性細胞数の多い分布を示した。よって、頸部食道はC1からT9の後根神経節から、また胸部食道はC5T13の後根神経節から支配されている考えられ、従来の報告よりも広範な神経支配を受けていることが明らかにされた。また、その神経経路には、横隔神経、大内臓神経、交感神経心臓枝などが関与していると推定されるが、今後明らかにして行く予定である。近年、癌手術症例の増加に伴い、胃切除後の逆流性食道炎などによる食道疼痛、及び食道切除後のQuality of lifeを考える上でも食道痛の神経学的発生機序を明らかにする必要があると考え、Horseradish Peroxidase(HRP)による逆行性軸索輸送を用いて、今回は、頸部食道は、胸部食道の知覚神経支配経路をめらかにした。雌雄成熟ネコを用い、sodium pentobarbitalによる全身麻酔後、(1)左側横隔神経切断、(2)左側大内臓神経内断、(3)左側星状神経節切除のいず感かの処置を加え、HRPを頸部食道筋内に注入した群、および脳部食道下部の注入した群を作成した。HRP注入後48時間の生存期間をおき、深麻酔下に、経左心的にヘパリン加生理食塩水にて脱血潅流し、1.25%glutaraldehydeー1%paraformaldenyde加燐酸緩衡液で潅流固定し、その後、10%サッカ-メ-ス加燐配緩衡液にて潅流した。第1頸官から第2腰随に及び脊髄後根神経節(DRG)を取り出し、クリオスタットにて40μm厚の凍結切片を作成し、顕微鏡下にHRP陽性細胞を観索した。頸部食道筋内注入群では、左側横隔神経喜断により左側の第2頸髄DRG(C2)第5頸髄DRG(C5)の陽性細胞が減少し、左側大内臓神経切断による左側の第2胸髄DRG(T2)第7胸髄DRG(T7)の陽性細胞が減少し、左側星状神経切除により左側頸髄の胸髄DRGともに陽性細胞が減少した。胸部食道下部注入群では、左側横隔神経切断により、頸髄・胸髄DRGともに陽性細胞の分布および数に変化を認めず、左側大内臓神経切断により、左側のT3T9の陽性細胞が減少し、左側星状神経節切除により、左側の胸髄DRG全域において陽性細胞は減少した。よって、横隔神経は頸部食道筋の主要知覚神経路であり、大内臓神経は頸部・胸部食道筋両者の知覚神経路であると考えられ、また、星状神経節を介する知覚神経路も存在することが示唆された。食道には、器質的疾患ばかりでなく、機能的疾患もある。疼痛などの知覚の解明には、求心性神経支配を、機能に関しては遠心性神経支配について知る必要がある。自律神経には交感神経と副交感神経があり、食道の交感性神経支配については前年度までの研究で、頸部食道と胸部食道では脊髄支配分節に差があること、大内臓神経を経由する経路や星状神経節を介する交感性求心性神経の存在することが解明された。本年度は、頸部食道および胸部下部食道の副交感神経性求心性および遠心性神経支配について検討した。雌雄成熟ネコを用い、HRP(Horseradish Peroxidase)注入部位を頸部食道筋群と胸部下部食道筋群に分け、HRP注入後48時間の生存期間をおいて灌流固定し、頚静脈孔神経節・頸部節状神経節・延髄を取り出し、40μm厚の切片を酵素反応させ、明視野顕微鏡下にHRP陽性細胞を観察した。頸部・胸部ともに頚静脈孔神経節・頸部節状神経節にHRP陽性細胞がみられ、副交感性求心性神経支配が証明された。また、求心性神経支配についてみると、頸部食道筋群は副交感神経支配が優勢であり、胸部下部食道筋群では交感神経支配が優勢であった。副交感神経遠心性神経支配に関しては、節前線維の細胞体は、頸部食道筋群では延髄の疑核に、胸部下部食道筋群では延髄の疑核および迷走神経背側核に存在することが判明した。
ヒトの記憶システムにおける前頭葉の役割:非侵襲的機能画像による検討および臨床応用

我々は前頭葉損傷による記憶障害を中心に研究を進めてきた.本年度はこれまでの研究の成果をふまえ,以下のような検討を行った.1)作業記憶の加齢による影響の検討,2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図による検討である.研究結果1)作業記憶の加齢による影響の検討正常高齢者を年齢分別にわけ,作業記憶課題を施行した.その結果,作業記憶は健常人においても加齢とともに低下し,その要因は年齢群によって異なることを明らかになった.2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,言語性作業記憶課題を施行中の脳血流変化をfMRIを用いて測定した.その結果,作業記憶には両側前頭前野が関連することがわかった.さらに,作業記憶のなかでも,保持の過程と,保持した内容を操作する過程には異なった神経ネットワークが関与することが示唆された.3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図を用いた検討健常人において,エピソード記憶および意味記憶の不整合性に関連する事象関連磁界を記録した.意味的不整合条件では,前年度に示したとおり,いわゆるN400mと考えられる事象関連磁界が誘発された,さらに,意味的には整合でも,エピソード記憶に不整合である条件でも,同様の事象関連磁界が観察された.これらの不整合性に関連する事象関連磁界の等価電流双極子は,主として左側頭葉外側上部および左前頭葉外側に推定された.前年度までの結果をあわせて考察すると,記憶における前頭葉の役割は前脳基底部と前頭葉外側で異なり,記憶の各サブシステムがある程度独立して機能しうることが推測された.我々は前頭葉損傷による記憶障害を中心に研究を進めてきた.本年度はこれまでの研究の成果をふまえ,以下のような検討を行った.1)作業記憶の加齢による影響の検討,2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図による検討である.研究結果1)作業記憶の加齢による影響の検討正常高齢者を年齢分別にわけ,作業記憶課題を施行した.その結果,作業記憶は健常人においても加齢とともに低下し,その要因は年齢群によって異なることを明らかになった.2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,言語性作業記憶課題を施行中の脳血流変化をfMRIを用いて測定した.その結果,作業記憶には両側前頭前野が関連することがわかった.さらに,作業記憶のなかでも,保持の過程と,保持した内容を操作する過程には異なった神経ネットワークが関与することが示唆された.3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図を用いた検討健常人において,エピソード記憶および意味記憶の不整合性に関連する事象関連磁界を記録した.意味的不整合条件では,前年度に示したとおり,いわゆるN400mと考えられる事象関連磁界が誘発された,さらに,意味的には整合でも,エピソード記憶に不整合である条件でも,同様の事象関連磁界が観察された.これらの不整合性に関連する事象関連磁界の等価電流双極子は,主として左側頭葉外側上部および左前頭葉外側に推定された.前年度までの結果をあわせて考察すると,記憶における前頭葉の役割は前脳基底部と前頭葉外側で異なり,記憶の各サブシステムがある程度独立して機能しうることが推測された.本研究では,記憶の脳内機構のうち前頭葉の役割に焦点を絞り,検討を進めた.本年度はます前脳基底部健忘の患者を対象に,健忘の臨床的特徴を詳細に検討した.対象は前交通動脈動脈瘤術後の6名(女性2名,男性4名,年齢は45-61歳)である.全例,全般性注意および全般性認知は保たれていた.前向性健忘の特徴として,1)干渉効果を受けやすい2)再認が想起に比べて良好,どういう点が確認された.またエピソード記憶の主要な内容の想起に比べ,文脈情報である人や場所の記憶が低下していると考えられる症例が2例観察された.逆行性健忘について経時的に観察し得た1例では,過去の出来事の内容の想起はほとんど改善が見られなかったのに対し,その時間的順序の想起が時間と共に回復してきた.さらに作業記憶検査では,顕著な低下を示す例は認められなかった.また,新たに考案した予定記憶検査では,1例を除き良好な成績であった.従って,前脳基底部は作業記憶や予定記憶のシステムに直接は関与しないと考えられた.一方,正常人を対象にした記憶に関する脳内システムの検討を,脳磁図を用いておこなった.対象は健常成人5名(女性3名,男性2名,年齢は24-39歳,いずれも右利き)である.単語の対連合学習をした後に再認課題を施行し,その時の事象関連磁界を記録した.その結果,対連合学習による事象関連磁界の振幅および潜時の変化が主として左前頭側頭葉外側を中心に認められた.前脳基底部および前頭葉外側は記憶の異なったサブシステムに関与していることが推測された.今後,これらの連関につき損傷脳・正常脳の両面から検討進める予定である.本年度はまず前頭葉病変を有する失語症患者を対象に、意味記憶からの単語の想起について検討した。対象は前頭葉を含む左一側性病変により軽度の失語症を呈した患者10名(女性2名、男性8名、年齢は39-79歳)である。対照群として前頭葉を含まない左一側

性病変により軽度の失語症を呈した患者10名(女性5名、男性5名、年齢は41-72歳)にも同様の検査を施行した。失語症の程度は呼称成績を中心に評価し、両群で差がなかった。全例、全般性注意は保たれていた。検査として、カテゴリー名を与えての語列挙課題、語頭音(音節)を与えての語列挙課題を施行し、両群間の差を検討した。その結果、前頭葉群では対照群に比べて、半数のカテゴリーで想起しうる単語の数が有意に少ないことがわかった。従って、刺激に依存せず、自発的に意味記憶から単語を想起する際には前頭葉が重要な働きをすることが示唆された。一方、正常人を対象に、記憶に関する脳内システムの検討を脳磁図を用いておこなった。対象は健常成人8名(23-29歳、1名を除き右利き)である。文の意味的整合性を、意味記憶から判断する課題を施行し、それに関わる事象関連磁界を記録した。その結果、意味的に不整合な場合に、潜時400ms前後に誘発磁界が認められた。この事象関連磁界は右利き者で左半球優位に出現し、電流双極子は左上側頭溝周辺に推定された。従って、文レベルの意味記憶からの判断には、前頭葉ではなく、左側頭葉が重要であることが示唆された。以上より、意味記憶からの想起や意味記憶に基づく判断には、エピソード記憶とは異なる神経基盤があり、意味記憶からの自発的な単語の想起には前頭葉が重要であると考えられた。我々は前頭葉損傷による記憶障害を中心に研究を進めてきた.本年度はこれまでの研究の成果をふまえ,以下のような検討を行った.1)作業記憶の加齢による影響の検討,2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図による検討である.研究結果1)作業記憶の加齢による影響の検討正常高齢者を年齢分別にわけ,作業記憶課題を施行した.その結果,作業記憶は健常人においても加齢とともに低下し,その要因は年齢群によって異なることを明らかになった.2)作業記憶に関連する神経ネットワークの検討,言語性作業記憶課題を施行中の脳血流変化をfMRIを用いて測定した.その結果,作業記憶には両側前頭前野が関連することがわかった.さらに,作業記憶のなかでも,保持の過程と,保持した内容を操作する過程には異なった神経ネットワークが関与することが示唆された.3)意味記憶とエピソード記憶の処理過程についての脳磁図を用いた検討健常人において,エピソード記憶および意味記憶の不整合性に関連する事象関連磁界を記録した.意味的不整合条件では,前年度に示したとおり,いわゆるN400mと考えられる事象関連磁界が誘発された.さらに,意味的には整合でも,エピソード記憶に不整合である条件でも,同様の事象関連磁界が観察された.これらの不整合性に関連する事象関連磁界の等価電流双極子は,主として左側頭葉外側上部および左前頭葉外側に推定された.前年度までの結果をあわせて考察すると,記憶における前頭葉の役割は前脳基底部と前頭葉外側で異なり,記憶の各サブシステムがある程度独立して機能しうることが推測された.
口腔顎顔面領域の組織発生における細胞増殖因子および転写因子の役割に関する研究

肝細胞増殖因子(HGF)は肝再生因子として働く以外に多くの組織の発生分化に関わることが知られている。発生初期の下顎においてもHGFおよびそのmRNAが存在することから、下顎の初期発生にも関わる可能性が示唆されたが、その役割については全く知られていなかった。胎齢10日のマウス胎仔の下顎を摘出して無血清培地で10日間、Slavkinらの方法に従って器官培養を行った。培養は5%二酸化炭素供給下で行い、培地にはGibco-BRL社のBGJb培地を用い、1日おきに培地を交換した。培養前の下顎は薄い上皮層に囲まれた粗な神経冠由来間葉組織から構成されていたが、培養後の組織をパラフィン包埋の連続切片でヘマトキシリンエオジン染色を施して観察してみると、舌、初期の歯胚、メッケル氏軟骨が認められた。HGF添加群ではエオジンに好染する骨様組織の発生を認めた。この骨様組織はメッケル氏軟骨の周囲に帯状に認められた。添加するHGFの濃度を変えてみたところ、高濃度添加群は低濃度添加群に比べてより多くの骨組織が形成されているようであった。HGFはその標的細胞内でその細胞内伝達機構を機能させるためには特異的受容体(HGF受容体)に結合することで知られている。骨形成がHGFの効果であることを確認する目的で、HGF受容体のmRNAのアンチセンスオリゴヌクレオチドをHGFと同時に添加して、HGF受容体のmRNAからの翻訳を阻害してHGFの効果を減弱させる実験を試みたところ、HGF添加群に比べ骨形成が抑制された。逆転写PCR法でHGF受容体の発現を培養組織で調べたところ、HGF受容体の遺伝子発現が認められた。以上のことから、下顎の初期発生においてHGFおよびその受容体が下顎骨の発生に関わっているとが示された。
触媒抗体の触媒機能発見メカニズムの解明と活性向上を目指した改変

エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10を研究対象とし、それらの安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.両抗体は反応速度解析の結果から、基質と遷移状態アナログ(TSA)に対する親和力の差が触媒活性を生み出す機構であることがわかっている.NMRより得られた構造情報を比較・解析することにより,触媒反応に必要な抗原結合部位の特性について考察した.1)6D9の触媒活性発現に重要な残基であるHis27d(L)の側鎖NHのNMRシグナルを解析したところ,His27d(L)とTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合が形成されていることが判明した.6D9と基質との結合,および9C10における基質・TSA結合の際は、水素結合の形成は観測されなかった.したがって、6D9では,基質とTSAのエステル部分の化学構造の識別にHiS27d(L)が、水素結合を通して主要な役割を果たしていると考えた.2)基質とTSAはともに2個の芳香環を有するもののエステル部分の原子軌道は,それぞれsp2およびsp3と異なる.したがって、抗体に結合した状態では,基質とTSAでは反応中心を挟んだ2個の芳香環の相対配置が異なる立体構造をとる.NMR解析の結果,9C10結合状態では、TSAの4-((trifluoroacetyl)amino)phenyl)環の回転運動が抑制されるのに対し,nitorophenyl環の回転運動は抑制されていなかった.一方6D9においては、TSAの2個の芳香環の回転運動がともに抑制され,抗原認識において両芳香環がともに重要な役割を果たすことが明らかになった.これらの知見より、両芳香環をともに認識する6D9では,基質とTSAの立体構造の差を鋭敏に識別することにより親和力の差を生み出し,その結果,高い酵素活性を発揮すると考えた.エステル加水分解活性の異なる2種類の触媒抗体6D9,および9C10を研究対象とし、それらの安定同位体標識Fabを調製しNMR解析を行った.両抗体は反応速度解析の結果から、基質と遷移状態アナログ(TSA)に対する親和力の差が触媒活性を生み出す機構であることがわかっている.NMRより得られた構造情報を比較・解析することにより,触媒反応に必要な抗原結合部位の特性について考察した.1)6D9の触媒活性発現に重要な残基であるHis27d(L)の側鎖NHのNMRシグナルを解析したところ,His27d(L)とTSAのリン酸エステルの酸素原子との間に水素結合が形成されていることが判明した.6D9と基質との結合,および9C10における基質・TSA結合の際は、水素結合の形成は観測されなかった.したがって、6D9では,基質とTSAのエステル部分の化学構造の識別にHiS27d(L)が、水素結合を通して主要な役割を果たしていると考えた.2)基質とTSAはともに2個の芳香環を有するもののエステル部分の原子軌道は,それぞれsp2およびsp3と異なる.したがって、抗体に結合した状態では,基質とTSAでは反応中心を挟んだ2個の芳香環の相対配置が異なる立体構造をとる.NMR解析の結果,9C10結合状態では、TSAの4-((trifluoroacetyl)amino)phenyl)環の回転運動が抑制されるのに対し,nitorophenyl環の回転運動は抑制されていなかった.一方6D9においては、TSAの2個の芳香環の回転運動がともに抑制され,抗原認識において両芳香環がともに重要な役割を果たすことが明らかになった.これらの知見より、両芳香環をともに認識する6D9では,基質とTSAの立体構造の差を鋭敏に識別することにより親和力の差を生み出し,その結果,高い酵素活性を発揮すると考えた.
生薬を含む他疾患治療薬の抗HIV作用の検索とスクリ-ニング法の半自動化の確立

アジドチミジンに代表される従来の抗エイズ剤に、その副作用による治療上の限界が見えてきた現在、これらの薬剤とは異るメカニズムで働く抗エイズ剤の開発が急務である。その第一歩として、以前より優れた抗エイズ剤のスクリ-ニング系として評価の高い、MT-4細胞を用いて、我々は高感度、じん速かつ安全なアツセイ系の開発とその発展に取り組んだ。MTTという色素を用いて、生細胞数を評価する方法は、従来から抗癌剤のスクリ-ニング系として用いられていたが、これをMT-4細胞に応用、コンピュ-タ化されたプレ-トリ-ダ-を導入することにより、従来のアッセイ効率を10倍以上に引き上げることに成功した。更に得たデ-タを、種々のコンピュ-タソフトウェアを用いて解析、デ-タの再現性、信憑性をチェックすることも可能となった。上記の成果をもとに、研究グル-プは当該年度に500を超える新しい薬剤について、その抗HIV作用をテストし、そのうちいくつかのものについて選択的な抗ウィルス効果を発見した。中でも核酸誘導体の一種であるHEPTという物質は、HIV1型のみに特異的に効果を示し、2型には全く無効であるという事実からアジドチミジン等とは異るカテゴリ-の薬剤として期待し、現在も継続研究中である。また我々が開発した方法は、結果をグロ-バルに観られるという長所を有しており、コンピュ-タ-解析法と相伴って、2種類以上の物質の相互作用を検討するのに適していると考えられる。実際、我々は、アジドチミジンの抗HIV作用に対する腫瘍壊死因子(TNF)の影響を検討、TNFがアジドチミジンの作用に括抗することを発見した。その他、本アッセイ法を用いて、デキストラン硫酸の欠点を補った硫酸多糖類の開発にも成功しており、いくつかの論文において発表した。
数学教育における「批判的思考」に関する教育方法学的視座からの研究

本研究の目的は、教師教育にも着目しながら、数学教育における「批判的思考」の重要性について明らかにすることにある。「批判的思考」は、対話(ダイアローグ)や志向性などに着目して、先入観に捉われることなく真実により近づいていく思考である。数学教育においては、特に「対話」の重要性から、数学的コミュニケーションの再検討が考えられた。ここでは、「矛盾を指摘する」、「認識対象を認める」、「観点を変更する」、「統合する」といった活動の繰り返しが重要であることが示唆された。また、数学教育における「批判的思考」の具体化では、反例を挙げる活動などを日常的に行うことが重要であると考えられる。本研究は、次世代を生きる子どもたちにとって必要な力として「批判的思考」を捉え、これを数学的リテラシーなどの先行研究を踏まえて、数学教育において具体化することにある。「批判的思考」の捉え方は多様であるが、「対話」と「志向性」が重要であり、また教科教育で具体化する上では、教育学における“批判的思考"と“批判的教育学"の両面から検討する必要があると考えた。前者は論理の組み立てなどに目が向けられるが、後者は社会の構造を理性的に検討することにまで視野に入れた概念である。本年度は特に後者に着目し、これらを踏まえて数学教育で「批判的思考」を具体化する上では、目標概念と方法概念の両面から検討する必要があることを明らかにした。前者では人間形成的、文化的、実用的の3つの側面から、また後者では「a.社会の問題の考察に数学を批判的に用いる」「b.算数・数学の問題解決過程を批判的にみる」「c.数学そのものを批判的に捉える」の3点から検討した。なお「c」についてはヤブロンカなどの批判的数学教育があり、ここにはアーネストの社会的構成主義の立場があることを明らかにした。また“批判的教育学"の検討では、教育方法学の論考からフレイレへの着目が重要であり、ここでは「対話」の重要性がより一層示唆された。フレイレの「対話」の概念には、筆者の「数学的コミュニケーション」研究と共通する部分があり、本年度は特に批判的思考における「対話」の概念と「コミュニケーション」との関係についての考察から、これまでの「数学的コミュニケーション」研究を捉えなおした。ここでは、これまでの数学的コミュニケーション研究では算数・数学指導における「共有」に着目されていたが、「批判的思考」から「数学的コミュニケーション」を捉えると、考え方の発散と収束がより一層重要であり、これはフレイレの「矛盾」と「統合」とに言い換えられることを明らかにした。本科研研究は,教育方法学からの示唆を得ながら,数学教育の中で「批判的思考」について,教師教育にも着目しながら検討するものである。研究1年目の平成24年度は,文献研究から,教育,学校教育,数学,数学教育において「批判的思考」を考える着眼点について考察し,これを具体的に示した。具体的には,「批判的思考」は,ユネスコやOECDなどで強調されているように,ブラジルの教育学者,フレイレなどの主張が重要な意味を持つ。これは,リテラシーにも関係する見解である。一方,数学では,数学を可謬的に見る態度が重要であり,その歴史は,古代ギリシアにおける演繹的思考に遡ると捉えることができる。これらを踏まえて学校教育における「批判的思考」について検討してみると,ある事象に対して一方向から考察するのではなく,異なる他者の考えを自分の考えと対比しながら,他者が主張する立場に立って検討し,公平,平等という概念を加えながら,先入観にとらわれることなく,真実により近づいていくものであると考えられる。そして,これらの考察から,数学教育では,算数・数学指導において「批判的思考」を検討する場合は,目標概念,方法概念の両面から考察する必要があり,特に方法概念に着目すると,「ア.社会的事象の問題の解決に,数学を批判的に用いる。」「イ.算数・数学の問題の解決過程を批判的に見る。」「ウ.数学そのものを批判的捉える。」の3つの視点からこの具体化を考えることが重要であるとの知見を得た。なお,「批判的思考」の類似概念としては,「反省的思考」や「論理的思考」などが挙げられるが,「批判的思考」は,これらの思考よりも,より社会に目を向けられ,究極的には,民主的な社会を創り上げるうえでより重要な思考であると捉えられる。「批判的思考」は,最近話題になっている「21世紀型スキル」などでも強調されており,数学教育においても,創造性との関連から批判的思考の重要性を述べた論考がある。しかしながら,数学教育における「批判的思考」のあり方について,その根本に立ち返り検討したものはあまり見られない。

そこで本科研では,「批判的思考」を教育学や心理学などに着目して文献解釈を行い,これをリテラシーやコミュニケーションに着目して数学教育において理論化し,さらに教師教育にも視点をあてて「批判的思考」を数学教育で具体化することを目指した。「批判的思考」は単に事象を否定的に捉えることではないと考える。また,「批判的思考」は,西洋思考から受け継がれる論理の規則性や根拠の示し方に重点が置かれる一方で,これを社会にまで拡げた批判的教育学の考え方にも目を向けて検討する必要があると考えられる。このような点から,数学教育における「批判的思考」は,「対話により課題が明確になり,その解決に向けて情報を精査し,自他の考えを対比しながら他者の立場に立って検討し,公平,平等といった概念を加えながら先入観にとらわれることなく真実により近づいていくもので,そのすべての過程において民主的な社会の構築という目的に対する態度形成が求められるとともに,文脈に適切な背景となる知識やストラテジーが重要な意味を持つ」と捉えた。特に「批判的思考」は「対話」が重要であるが、この考察からこれまでの「数学的コミュニケーション」研究が再検討された。また、「批判的思考」の具体化では、反例を示す活動が重要な意味を持ち、これが日常的になされることが重要であると考えられる。社会科学本研究では、数学教育において「批判的思考」を具体化することを目的としているが、その上で、文献研究、調査研究、事例的研究を主な手法としている。文献研究では、本年度は、教育学や心理学の文献解釈に加え、数学および数学教育に関する哲学的解釈にも目を向けた(アーネストなど)。これにより「研究実績の概要」でも述べた「C.数学そのものを批判的に捉える」についての検討が進展するとともに、「批判的思考」を数学教育で具体化するためのさらなる観点を見いだすことができた。例えば、「可謬的に捉える態度」に焦点をあてて算数・数学の教材開発に取り組むこともその1つである。ここでは具体的に、「数学的表現を批判的にみる活動」、「命題の真偽の考察において反例を挙げる活動」などが考えられ、今年度はこのような視点から、研究協力者とともに教材開発についての検討がなされた。また、調査研究については「数学を批判的にみる」ことについての中学生を対象とした調査を実施し、研究協力者を中心に算数・数学教育研究の全国大会においてその成果を発表するにいたった。なお、教師調査の実施も検討していたが、予算の関係もあり、筆者が分担者として加わっている「数学的判断力」および「統計教育」の科研の調査の中に本科研で開発した質問紙の質問内容を含める形で実施した。事例的研究については、授業実践は次年度となるが、前述のように教材開発の段階までは進んでおり、特に「批判的思考」を「数学的コミュニケーション」研究と関連付けて考察したことは、理論と実践の往還という意味からも価値ある成果であったと捉えている。平成24年度の目標は,教育方法学と数学にも着目して,文献研究を中心に検討を加え,算数・数学指導において「批判的思考」について具体化することであった。「研究実績の概要」にも記したように,その具体的な着眼点として,方法概念からは3つの視点を明らかにしたが,目標概念については,これを具体的に明らかにするまでには至らなかった。区分において,(2)としたのは,この点からである。
有用微生物における遺伝子解析系の確立

1.サッカロミセス属酵母のガラクトース代謝系遺伝子のプロモーターを利用した発現ベクターを効率よく用いるためには,正の調節遺伝子GAL4の併用と正しいターミネーターの挿入が有効であることが明らかにされ,第二の正の調節遺伝子GAL11の全塩基配列が決定された.2.ジゴサッカロミセス属酵母から分離された3種のプラスミドの全塩基配列が明らかにされすでに知られていた2種の結果とを併せてプラスミド間の類縁関係が推定された.3.枯草菌の胞子形成過程の初期に関与する遺伝子SPO II Gを含む約10KbのDNA断片の全塩基配列が決定された.見いだされた3つのオープンリーディングフレーム(ORF), I, II, IIIのうちSPO II G(ORFII)はσ^<29>因子であることが確認され, ORFIIIも新たなσ因子であることが推定された.4.枯草菌染色体上の任意の領域を増幅させる一般法が確立された.すなわち, cat(または, turβ)遺伝子を持つコスミドカイブラリーを用いて枯草菌を形質転換し得られるCm(または, Tm)耐性株中ではクローン化領域そのものが増幅しているはずであり,また実際的40Kbの領域が増幅していた.5.ストレプトミセス属放射菌に広い宿主域を持つアクチノファージR4とプラスミドPIJ364を用いて作られたコスミドPR4C1およびその誘導体が多くの同放線菌に導入可能であることが確認された.6.StreptomycesKanamyceticusよりS.lividans1326, PIJ702をそれぞれ宿主,ベクターとして7.5KbのDNA断片としてカナマイシン耐性遺伝子をクローン化し,調節領域,コード領域,転写開始点等が明らかにされた.7.Pseudomnas属のクローニング宿主P.cepacia PCJ102およびE.coliとの間のシャトルベクターPTS1209が確立した.1.サッカロミセス属酵母のガラクトース代謝系遺伝子のプロモーターを利用した発現ベクターを効率よく用いるためには,正の調節遺伝子GAL4の併用と正しいターミネーターの挿入が有効であることが明らかにされ,第二の正の調節遺伝子GAL11の全塩基配列が決定された.2.ジゴサッカロミセス属酵母から分離された3種のプラスミドの全塩基配列が明らかにされすでに知られていた2種の結果とを併せてプラスミド間の類縁関係が推定された.3.枯草菌の胞子形成過程の初期に関与する遺伝子SPO II Gを含む約10KbのDNA断片の全塩基配列が決定された.見いだされた3つのオープンリーディングフレーム(ORF), I, II, IIIのうちSPO II G(ORFII)はσ^<29>因子であることが確認され, ORFIIIも新たなσ因子であることが推定された.4.枯草菌染色体上の任意の領域を増幅させる一般法が確立された.すなわち, cat(または, turβ)遺伝子を持つコスミドカイブラリーを用いて枯草菌を形質転換し得られるCm(または, Tm)耐性株中ではクローン化領域そのものが増幅しているはずであり,また実際的40Kbの領域が増幅していた.5.ストレプトミセス属放射菌に広い宿主域を持つアクチノファージR4とプラスミドPIJ364を用いて作られたコスミドPR4C1およびその誘導体が多くの同放線菌に導入可能であることが確認された.6.StreptomycesKanamyceticusよりS.lividans1326, PIJ702をそれぞれ宿主,ベクターとして7.5KbのDNA断片としてカナマイシン耐性遺伝子をクローン化し,調節領域,コード領域,転写開始点等が明らかにされた.7.Pseudomnas属のクローニング宿主P.cepacia PCJ102およびE.coliとの間のシャトルベクターPTS1209が確立した.