hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様なプール演算を持つ正規表現に対する検索アルゴリズムの高速化に関する研究

本研究は,平成18年度および平成19年度に行ったもので,以下の成果を挙げた.1.正規表現を非決定性有限オートマトンに変換するための高速アルゴリズムの開発正規表現から小さな非決定性有限オートマトンを得るための高速なアルゴリズムを開発した.2.多様なプール演算を導入したアルゴリズムの開発共通集合演算や補集合演算だけでなく多様なプール演算を持つ正規表現に対応できるようアルゴリズムを改良した.3.決定性有限オートマトン(DFA)を利用した高速検索アルゴリズムの開発従来のアルゴリズムに決定性有限オートマトンの概念を導入したアルゴリズムを開発するとともに,どのような性質を持つ拡張正規表現に対し,DFA型のアルゴリズムが高速に動作するかを示した.実際,共通集合演算および補集合演算について,DFAが有効に働くための性質を示した.4.正規表現からコンパクトな決定性有限オートマトンを作成する手法の開発双対位置オートマトンという新たなモデルを定義し,それを利用じたコンパクトなDFA表現を示すとともに,照合アルゴリズムへの応用を示した.本研究は,平成18年度および平成19年度に行ったもので,以下の成果を挙げた.1.正規表現を非決定性有限オートマトンに変換するための高速アルゴリズムの開発正規表現から小さな非決定性有限オートマトンを得るための高速なアルゴリズムを開発した.2.多様なプール演算を導入したアルゴリズムの開発共通集合演算や補集合演算だけでなく多様なプール演算を持つ正規表現に対応できるようアルゴリズムを改良した.3.決定性有限オートマトン(DFA)を利用した高速検索アルゴリズムの開発従来のアルゴリズムに決定性有限オートマトンの概念を導入したアルゴリズムを開発するとともに,どのような性質を持つ拡張正規表現に対し,DFA型のアルゴリズムが高速に動作するかを示した.実際,共通集合演算および補集合演算について,DFAが有効に働くための性質を示した.4.正規表現からコンパクトな決定性有限オートマトンを作成する手法の開発双対位置オートマトンという新たなモデルを定義し,それを利用じたコンパクトなDFA表現を示すとともに,照合アルゴリズムへの応用を示した.平成18年度は、多様なプール演算を持つ正規表現(プール演算付き拡張正規表現)に対する高速な検索アルゴリズムの開発に関する研究を行い、以下の成果を挙げた。1.決定性有限オートマトンを利用した高速検索アルゴリズムの開発我々が開発したモジュール分割法は、与えられたブール演算付き拡張正規表現を、正規表現を表す断片(モジュールと呼ばれる)に分割した後、各モジュールを有限オートマトンに変換し、得られた有限オートマトンを模倣することによって検索を実行するものである。本研究では、関係オートマトンという新たな概念を導入し、決定性有限オートマトンを利用したアルゴリズムを考案した。2.正規表現を非決定性有限オートマトンに変換するための高速アルゴリズムの開発正規表現からできるだけ小さな有限オートマトンを生成することはアルゴリズムの効率化にとって重要な要素である。本研究では、小さな非決定性有限オートマトンを得るための高速なアルゴリズムを開発した。3.ブール演算とアルゴリズムの効率さとの関係ブール演算とパターン照合アルゴリズムの効率さの関係について、作成した検索ソフトウエアを使って実験的に評価し、ブール演算の種類によるアルゴリズムの効率さの違いを示した。平成19年度は、拡張正規表現に対するDFA型の照合アルゴリズムの改善,DFA表現のコンパクト化と正規表現への応用について以下の成果を挙げるとともに,木パターンへの応用についても考察した.1.決定性有限オートマトン(DFA)を利用した高速検索アルゴリズムの改善開発したアルゴリズムを詳細に解析し,どのような性質を持つ拡張正規表現に対し,DFA型のアルゴリズムが有効に働くかを示した.実際,共通集合演算および補集合演算について,DFAが有効に働くための性質を示した.2.正規表現からコンパクトな決定性有限オートマトンを作成する手法の開発決定性有限オートマトンを利用するとき問題になるのがそのサイズである.ここでは,デュアル位置オートマトンというものを定義し,それを利用したコンパクトなDFA表現を示すとともに,照合アルゴリズムへの応用を示した.
スペクトル拡散通信方式による無線マルチメディア通信システムの研究

移動通信や無線LANなどの分野で、国内外の研究機関が行っているスペクトル拡散通信システムの構成法、制御法、解析法などに関する研究動向を調査した。次に、無線マルチメディア通信の実用化が期待される応用分野で解決すべき問題を調査し、理論的な問題整理、その対策技術を検討した。具体的には、(1)マルチメディア通信品質の評価基準の導出:伝送速度、信号相関特性、プライオリティなど異なる各種情報メディアに共通な通信品質の評価基準を導出した。(2)無線マルチメディア通信チャネルのモデル化:占有帯域、バケット長、発呼率などの異なるマルチメディア信号が混在する無線通信チャネルのモデル化を行った。(3)無線通信チャネルにおける干渉・妨害、雑音、フェージングなどの定式化:無線通信チャネルに共存する各種の干渉・妨害、雑音などのシステム外からの影響と、スペクトル拡散通信システム内の他局からの干渉の影響を理論的に定式化した。(4)アクセス制御や有線通信網との整合性を検討するためのトラヒック解析:CDMA無線系とTDMA有線系を組み合わせたアクセス制御の最適化を行うためのトラヒック解析を行った。(5)メディアに応じた処理利得や送信電力の制御法の考察:無線マルチメディア通信チャネルにおけるトラヒックの適応的な測定法と考案し、これを用いてマルチメディア通信品質基準を最適化する処理利得と送信電力の適応制御法を考案した。(6)干渉やフェージングを除去・抑圧するためのディジタルフィルタとアレーアンテナによる時間・空間領域の適応信号処理方式の考案と理論解析:メディアに応じて受ける影響が異なる干渉やフェージングに対して、ディジタルフィルタとアレーアンテナを統合的に利用して適応的に処理する方式を考案し、理論解析した。(7)CDMAシステム内で生じる他局間干渉を低減するための拡散符号の構成法と時間・空間領域における干渉除去方式の考案と性能解析:スペクトル拡散通信方式によるCDMAシステム内の他局からの干渉を低減し、周波数利用効率を向上するための拡散符号の構成法と、信号処理による適応的な干渉除去方式を検討した。(8)適応信号処理方式と誤り訂正符号により誤り制御方式との組合せの考案:(6)(7)の適応信号処理における更新アルゴリズムの高速化・高信頼化と、軟判定復号性能の向上のための誤り制御方式との組合せを検討した。(9)CDMAを組み合わせたアクセス制御方式の考案と性能解析:スペクトル拡散通信方式によるCDMAと、LANで一般に用いられるCSMA/CDなどを組合せたアクセス制御方式を考案し、マルチメディア環境下で性能解析を行なった。(10)有線通信網との整合性を実現するインターフェイスとプロトコルの体系化:無線通信網に固有な物理レイヤにおける処理遅延などの特性を考慮し、有線通信網とのトランスペアレンシを確保するネットワークアーキテクチャを検討した。(11)実験的解析:コンピュータ、スペクトル拡散無線LANのハードウェアシステムを用いて、等価的にスペクトル拡散無線マルチメディア通信システムを構成し、理論的に導出された各種の提案方式の性能を定量的に評価、解析した。(12)総合評価と研究発表:上記(1)(12)に基づき、各種提案方式の特長と問題点を明確にし、以後の研究課題として整理した。また、本研究を通じて得られた成果をまとめ、学会において報告した。

(10)有線通信網との整合性を実現するインターフェイスとプロトコルの体系化:無線通信網に固有な物理レイヤにおける処理遅延などの特性を考慮し、有線通信網とのトランスペアレンシを確保するネットワークアーキテクチャを検討した。(11)実験的解析:コンピュータ、スペクトル拡散無線LANのハードウェアシステムを用いて、等価的にスペクトル拡散無線マルチメディア通信システムを構成し、理論的に導出された各種の提案方式の性能を定量的に評価、解析した。(12)総合評価と研究発表:上記(1)(12)に基づき、各種提案方式の特長と問題点を明確にし、以後の研究課題として整理した。また、本研究を通じて得られた成果をまとめ、学会において報告した。
高等植物の有性生殖過程における色素体の動態

ナスの受精前における卵細胞の色素体とミトコンドリアの数と分布および形態の変化を連続切片の電子顕微鏡観察によって明かにした。開花直前の胚珠の卵細胞には内部の構造が乏しい色素体が30個存在し、その半数は核を取り囲み、残りの半数は他の部位に散在していた。これらの色素体の核様体は切片の電子顕微鏡観察によっては明瞭な像として認めるのが困難であった。一方、ミトコンドリアは約140個存在し、細胞全体に散在していた。これらのミトコンドリアの内部には核様体が顕著に観察された。開花して既に受粉している花の、受精直前の状態に達したと見られる卵細胞では、色素体の内部構造の退化はさらに進み、ミトコンドリアとの識別が困難な色素体もあった。色素体は体積を増大し、数が約15個に減少していた。これらの変化はミトコンドリアでさらに著しかった。その数は約20個に減少し、そのうち7個は枝わかれした巨大で複雑な形態を採っていた。核様体は枝別れしたミトコンドリアの各所に顕著に認められた。これらの出来事は色素体とミトコンドリアそれぞれの融合による現象と考えられる。上の結果から、ナスの卵細胞の色素体とミトコンドリアは受精直前に、それぞれの融合によってその数が減少することが強く示唆される。卵細胞において色素体やミトコンドリアが実際に融合しているとすれば、その際にこれらのオルガネラのゲノムの再編が起こっている可能性も高い。以上の結果は、高等植物の有性生殖過程における色素体とミトコンドリア本体とそれらのゲノムの伝播機構に関して新しい問題を提示しており、今後の研究によって重要な知見がさらに得られるものと期待される。また今後の課題しとて、受精後の胚発生過程でのこれらのオルガネラとその核様体の動態を明らかにする必要がある。本研究の目的は高等植物の有性生殖過程における卵細胞の色素体とその核様体の動態を光学顕微鏡と電子顕微鏡を用いて明らかにすることである。研究材料は主にナスを用いた。ナスにおいては珠皮や胚嚢自体の細胞含有物が少なく、完成された胚嚢の時期には、ほとんど珠心の組織も消失しているので、生きた胚嚢を観察するのに適している(吉田、1970)。ナスの異なる発達段階の花蕾から胚珠を採取し、微分干渉顕微鏡によって内部の胚嚢を生きた状態で観察し、花蕾の発達段階と胚嚢形成の段階との対応関係を明らかにした。この方法は固定した胚珠を透明化して胚嚢を観察する方法に比べて、観察が格段に容易かつ能率的であり、さらに重要なことは、その同一の試料を電子顕微鏡観察の試料にできることである。このような方法で受精前の完成された胚嚢を電子顕微鏡で観察した結果、次ぎのような知見を得た。卵細胞では中央に大きな液胞があり、それを取り囲む細胞質は薄い層を成し、核は合点側に位置していた。色素体の形は扁平で、チラコイドは非常に乏しく、胚珠の他の組織の色素体とは大きさ、形態ともに明らかに異なっていた。一方、助細胞の合点側に顕著な顆粒が微分干渉顕微鏡で観察されたが、電子顕微鏡観察によって、これが大きな澱粉粒を含む色素体であることが明らかになった。助細胞の他の多くの色素体も澱粉粒を含むが、前述の色素体はそれ自体もその澱粉粒の大きさも著しく、助細胞に特有であると考えられる。卵細胞内での色素体の分布はほぼ均一であったが、この点については、現在連続切片法によってさらに詳しく検討しているところである。

また、酵素処理等の方法によって、胚嚢を分離またはプロトプラスト化する試みを現在行なっており、一定の進捗を見た。この方法によって、微分干渉顕微鏡による観察の精度も格段に上がる上に、蛍光顕微鏡による色素体核様体の観察も容易になることが期待される。本研究の目的はナスの有性生殖過程における色素体の動態を明らかにすることであり、本研究計画の最終年度である今年度は受精前の卵細胞における色素体の動態を定量的に扱うことに努めた。開花直前に胚珠を採り、、完成した胚嚢の受精前の卵細胞に含まれる色素体とミトコンドリアの数と分布を、卵細胞の連続切片像を再構成し調べた。その結果、色素体は卵細胞の中に30個存在し、その半数は核を取り囲み、残りの半数は他の場所に散在していた。これらの色素体の核様体は切片の電顕観察によっては明瞭な像として認めるのが困難であった。一方、ミトコンドリアは約140個存在し、細胞全体に散在していた。開花して既に受粉している花の、受精直前の状態に達したと見られる卵細胞では、色素体の内部構造の退化はさらに進み、ミトコンドリアとの識別が困難な色素体もあった。色素体は体積を増大し、数が約15個に減少していた。これらの変化はミトコンドリアでさらに著しかった。ミトコンドリアは枝別れした巨大な複雑な形態を採り、その数は約20個に減少していた。核様体は枝別れしたミトコンドリアの各所に顕著に認められた。これらの出来事は色素体とミトコンドリアそれぞれの融合による現象と推察される。上の結果から、ナスの卵細胞の色素体とミトコンドリアは受精直前に、それぞれの融合によってその数が減少することが強く示唆される。卵細胞において色素体やミトコンドリアが実際に融合しているとすれば、その際にこれらのオルガネラのゲノムの再編が起こっている可能性もある。以上の結果は、高等植物の有性生殖過程における色素体とミトコンドリア本体とそれらのゲノムの伝播機構に関して新しい問題を提示しており、今後の研究によって重要な知見がさらに得られるものと期待される。
実験グループへの技術移転を目指した新規複合アニオン物質の電子状態計算協働教育

第一原理電子状態計算による基礎物性解析(状態密度解析、分散図解析、格子振動解析)は、物性解析における「枯れた解析技術」として定着が急速に進んでいる。申請者の此迄の研究により、スパコンなど大規模計算機上に手順が十分にルーチン化され整備されている。本研究では、申請者らが産学連携や外部協働を通じて培った遠隔サーバ利用促進と実験実務者向けの教程を活用し、領域内で合成に取組む若手研究者を対象に、解析ルーチンと遠隔利用技術を指導/普及させ、新規複合アニオン物質に対し、現場の合成実験家が、いち早く自らの手で電子状態計算解析も含めて世界で最初に発信できるよう技術移転を図ってきた。基盤研究との徹底した差別化を意識し、理論方法論としての独創性追求は別資金プロジェクトに押し込め、定形の基礎物性計算(全協働に共通するバンド分散/フェルミ面/フォノン分散/構造安定性といった評価)を「理論研究からスピンアウトすべきツール」とプラグマティックに捉え、「理論家の手を離れても自律的に廻る技術移転」を目標に据えた。別主務(実験)を持つ研究者が、副テーマとして計算に携わる際のモチベーション維持の重要性を考慮し、そのための仕掛けや、サーバ・ログ管理教育に一定の重点を置いて研究を遂行した。これまでに、電子状態計算チュートリアルワークショップを、国内2件(JAIST開催、領域内から9名の参加[東工大/京大/東大])、海外で2件(イタリア/インド開催、領域内から2名の参加[京大])開催し、実験グループ学生のシミュレーション実習機会を提供した。H29年度末の領域シンポジウムでは、若手スクールにて電子状態計算の利用法を中心とした講演を行った。申請時から大きく協働の幅が拡がり、すでに8報の共著原著論文が採録済となっている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。第一原理電子状態計算による基礎物性解析(状態密度解析、分散図解析、格子振動解析)は、物性解析における「枯れた解析技術」として定着が急速に進みつつある。代表者らの此迄の研究により、スパコンなど大規模計算機上に手順が十分にルーチン化され整備されている。本研究では、代表者らが産学連携や外部協働を通じて培った遠隔サーバ利用促進と実験実務者向けの教程を活用し、領域内で主に合成に取組む若手研究者を対象に、本解析ルーチンと遠隔利用技術を指導/普及させ、当該領域の研究期間中に期待される新規複合アニオン物質に対し、現場の合成実験家が、いち早く自らの手で電子状態計算解析も含めて世界で最初に発信できるよう技術移転を図ってきた。初年度は、電子状態計算チュートリアルワークショップを、国内で2件(JAIST開催、領域内から9名の参加[東工大/京大/東大])、海外で2件(イタリア/インド開催、領域内から2名の参加[京大])開催し、実験グループ学生のシミュレーション実習機会を提供した。合計8件の協働教育申入れを受け入れ、うち4件は、共著原著論文成果に繋がっている(うち2件が採録済/JACS/Inorg.Chem.)。技術移転と人材育成を主眼に置いた研究計画であったため、成果が実を結ぶまでに、少し時間が掛かるものと想定したが、原著論文成果が、予想以上に速く出揃ったものと評価している。4本の原著論文成果のうち、2本は協働先グループではなく、報告者グループ側大学院生による計算実務遂行であったが、これも間接的ではあるが、シミュレーション協働教育の機会増加により、研究グループ内での教程整備が急速に進んだ結果、グループ内所属の新しい大学院生も、より速くシミュレーション実務に到達出来るようになった点が一つの要因である。理論/方法論コミュニティでの研究取りまとめ速度に対して、より速報性を争う実験合成系の研究ペース、特に原著に取りまとめるペースが非常に速く、良い意味で、このペースに巻き込まれて研究を進める事が出来た。電子状態計算シミュレーションの根幹部分にある方法論は、本課題の根底にもあるように、十分よく「枯れて」きており、高速計算の普及と相俟って、今後、より材料開発の実験研究との協働という応用方面での展開を標榜する上においては、このような「速いペースに寄り添う」という信頼感を勝ち取る事は非常に重要である。この意味で、今後、この方面で活躍を期待される報告者グループ側の大学院生達にとって、本協働が非常によい研究環境を与えており、元来、「実験グループ側の学生を教育する」という趣旨の研究提案であったものが、図らずも、「シミュレーショングループ側の学生に対する、よい教育機会」となっている事を見出している。本領域でのシンポジウムやニュースレターなどの告知活動が活発になされている事も、別要因として挙げられる。

あるグループとの協働成功事例が挙がると、この事が速やかに知れ渡り、次々と別グループからの協働が持ちかけられ、かつ、こうした協働が奨励される運営体制となっており、本公募班参画に対する、大きな有難味を感じている。第一原理電子状態計算による基礎物性解析(状態密度解析、分散図解析、格子振動解析)は、物性解析における「枯れた解析技術」として定着が急速に進んでいる。申請者の此迄の研究により、スパコンなど大規模計算機上に手順が十分にルーチン化され整備されている。本研究では、申請者らが産学連携や外部協働を通じて培った遠隔サーバ利用促進と実験実務者向けの教程を活用し、領域内で合成に取組む若手研究者を対象に、解析ルーチンと遠隔利用技術を指導/普及させ、新規複合アニオン物質に対し、現場の合成実験家が、いち早く自らの手で電子状態計算解析も含めて世界で最初に発信できるよう技術移転を図ってきた。基盤研究との徹底した差別化を意識し、理論方法論としての独創性追求は別資金プロジェクトに押し込め、定形の基礎物性計算(全協働に共通するバンド分散/フェルミ面/フォノン分散/構造安定性といった評価)を「理論研究からスピンアウトすべきツール」とプラグマティックに捉え、「理論家の手を離れても自律的に廻る技術移転」を目標に据えた。別主務(実験)を持つ研究者が、副テーマとして計算に携わる際のモチベーション維持の重要性を考慮し、そのための仕掛けや、サーバ・ログ管理教育に一定の重点を置いて研究を遂行した。これまでに、電子状態計算チュートリアルワークショップを、国内2件(JAIST開催、領域内から9名の参加[東工大/京大/東大])、海外で2件(イタリア/インド開催、領域内から2名の参加[京大])開催し、実験グループ学生のシミュレーション実習機会を提供した。H29年度末の領域シンポジウムでは、若手スクールにて電子状態計算の利用法を中心とした講演を行った。申請時から大きく協働の幅が拡がり、すでに8報の共著原著論文が採録済となっている。「基礎物性計算フェーズ/物質構造モデル(混晶モデル/界面の周期境界モデルなど)を立て、バンド図や格子定数などを算定、実験値との比較較正で正当性検証する基盤を確立する」、「応用物性計算フェーズ/上記基盤の上にプログラムパッケージ機能を駆使し、フォノンやスペクトルの計算を展開、もしくは、多体論的詳細スペックを調整し磁性などを議論など」の「2フェーズへの切分け」を意識し、後者に属する「各計画班個別での遂行事項」とは区別して、「本課題での遂行事項」には全プロジェクトでの共通基盤事項のみに傾注し、引き続き、技術移転普及を図る。「コンセプト教育(電子状態計算での基底関数/擬ポテンシャル/交換相関汎関数/分散図解析といったコンセプトの再確認」、「技術教育(スクリプト利用/UNIX/大型計算機や並列計算での概念とスペック)」、「協働体制教育(遠隔ツール利用/計算科学研究でのログ管理)」に関する技術移転を進める。「A/連携先(実験)学生が代表者グループに短期滞在し、電子状態計算のチュートリアルを受ける」、「B/代表者グループメンバーが連携先に滞在し、遠隔アクセスの情報環境を整える」、「C/代表者グループが開催する電子状態計算スクールに連携先学生が参加」といった内容で進める。多数の協働を確実に回すため、計算実務を「手法エキスパート側」が背負い込むのではなく、各「対象エキスパート」たる協働先大学院生に計算実務を技術移転し人材育成を図るという点に留意して進める。
Unified View of Entanglements in Polymer Liquids

高分子はお互いに絡みあう。高密度液体では、絡み合いは物性に大いに影響するが、その特性がすべて理解されているとは言えない。過去の研究から単体では剛直鎖は柔軟鎖より絡みやすいことが分かっているが、それらをブレンドするとどうなるか分かっていない。実験では、2つの高分子間の固さのみを変えることはほとんど不可能である。そこでシミュレーションを使用した。異なる固さの2つの鎖のブレンドにおいて、剛直鎖はブレンドすると絡み合いが減り、逆に柔軟鎖はブレンドすると、絡み合いが増えることが分かり、高分子管直径理論の拡張に繋がった。このことで、高分子の物性を分子の構造と力学に基づいて説明することが可能となった。物品の購入を検討していたが年度内に納品できなかったため、翌年度に繰り越した。当該助成金は実験データを保存するストレージの購入資金として予定している。
単一細胞の非線形ナノ光学

本研究では、細胞を構成する生体分子と光との非線形相互作用を利用した計測制御技術の開発を行った。近赤外超短パルスレーザーを生体試料内に入射させると第2高調波発生(SHG)やコヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)等の非線形な光散乱を生体内で誘起でき、その波長や強度から細胞内の分子種の判別やタンパク質の配列構造を得ることができる。実際に超短パルスレーザーを光源としたSHG顕微鏡およびCARS顕微鏡を試作し、生きた細胞の観察を行った。SHG顕微鏡では、ラット培養心筋細胞内のミオシンからの特異的な第2高調波の発生を確認し、染色等の前処理を行うことなくミオシンの分布を示す顕微画像を得ることに成功した。また、HeLa細胞(ヒト子宮頸癌細胞)のからは、細胞分裂時に限り微小管から強い第2高調波が得られることが分かった。これは、細胞分裂時に形成される高密度のチューブリンが強い異方性を示し、高い効率で第2高調波が発生するためだと考えられる。また、時間ゲート第2高調波イメージング法を開発し、第2高調波の発生が入射レーザーと同時に起こることを利用したS/N比の向上に成功した。さらに、CARS顕微鏡の試作を行い、HeLa細胞の分光観察を行った。試料に入射させるレーザー光の振動数の差を脂質分子の伸縮振動の振動数に一致させ、HeLa細胞内の脂質分子の分布を得た。ラット培養心筋細胞をSHGおよびCARSを用いて行い、ミオシンおよび脂質分子の分布を得た。これらの結果から、非線形光学効果を利用すれば、これまで行われてきた蛍光染色法を用いなくても、生体分子を直接検出し、生体試料の顕微観察に応用できることが示された。今年度は、細胞膜電位分布の高速マッピングを行うための第2高調波顕微鏡の試作、および興奮性細胞の光刺激装置の開発を行った。第2高調波顕微鏡の光学系にはマイクロレンズアレイディスクを利用したマルチビーム走査方式を採用し、測定系の高速・高感度化を行った。装置の開発は、観察範囲を一様に照明でき、かつ十分な効率で非線形光学効果を誘起できるマイクロレンズアレイディスクの設計を中心に行った。実際に試作した第2高調波顕微鏡では、光源にモードロックチタンサファイアレーザー(波長900nm、繰り返し周波数82MHz、パルス幅80fs)を用い、そこからのレーザー光線をマイクロレンズアレイを用いて約100本の光線に分割した。各レーザー光線は、マイクロレンズアレイを透過後、対物レンズアレイに入射し、同数(約100点、一点あたり約2mW)の焦点を試料内に形成した。マイクロレンズアレイを回転させることにより、約3msの走査速度で観察面を一様に照明した。.試作した顕微鏡を用いて、非線形感受率の大きな蛍光色素(RH237等)で染色した生きた細胞(ヒト癌細胞、ラット培養心筋細胞)を観察した。その結果、従来の蛍光観察法による像よりも格段にコントラストの高い像を得ることに成功した。また、光刺激光学系としては、従来の蛍光顕微鏡にモードロックチタンサファイアレーザーを導入したものを用いた。試作した光学系により、ヒト癌細胞およびラット培養心筋細胞内で光誘起によるカルシウムイオン濃度変化を確認した。【非線形光刺激下における細胞反応の理解と制御】前年度に開発した装置を用いて、光刺激下で誘起される細胞活動の理解およびその制御を行った。そのために、1)レーザー物理的、2)細胞光学的の二つの異なった観点を持ってアプローチし、その結果を踏まえ3)細胞機能の非線形光制御を試みた。1)レーザー物理的アプローチによる理解a)細胞-レーザー間相互作用の把握

光刺激に用いるレーザー強度とカルシウムイオン波発生の頻度との関係を、異なった波長、パルス幅(デジタルオシロスコープを新規購入)、照射パルス数(液晶空間光変調器を新規購入)において正確に求め、光刺激に必要なフォトン密度の見積もりを行った。b)細胞構造の変化のナノスケールでの把握細胞の物理的な構造変化の観察も、開発した2光子顕微鏡を用いて、3次元的に行った。2)細胞光学的アプローチによる理解a)カルシウムイオンによる蛍光発生に繋がる反応経路の同定これまでに知られている細胞内でのカルシウムイオン波発生の原理(細胞内カルシウムの放出、細胞膜外部からの流入、メカノ刺激に対する応答)に着目し、それらが光刺激下のカルシウム波発生のメカニズムのどのように影響しているか薬理学的手法を用いて理解した。本研究では、細胞を構成する生体分子と光との非線形相互作用を利用した計測制御技術の開発を行った。近赤外超短パルスレーザーを生体試料内に入射させると第2高調波発生(SHG)やコヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)等の非線形な光散乱を生体内で誘起でき、その波長や強度から細胞内の分子種の判別やタンパク質の配列構造を得ることができる。実際に超短パルスレーザーを光源としたSHG顕微鏡およびCARS顕微鏡を試作し、生きた細胞の観察を行った。SHG顕微鏡では、ラット培養心筋細胞内のミオシンからの特異的な第2高調波の発生を確認し、染色等の前処理を行うことなくミオシンの分布を示す顕微画像を得ることに成功した。また、HeLa細胞(ヒト子宮頸癌細胞)からは、細胞分裂時に限り微小管から強い第2高調波が得られることが分かった。これは、細胞分裂時に形成される高密度のチューブリンが強い異方性を示し、高い効率で第2高調波が発生するためだと考えられる。また、CARS顕微鏡の試作を行い、HeLa細胞の分光観察を行った。試料に入射させるレーザー光の振動数の差を脂質分子の伸縮振動の振動数に一致させ、HeLa細胞内の脂質分子の分布を得た。ラット培養心筋細胞をSHGおよびCARSを用いて行い、ミオシンおよび脂質分子の分布を得た。これらの結果から、非線形光学効果を利用すれば、これまで行われてきた蛍光染色法を用いなくても、生体分子を直接検出し、生体試料の顕微観察に応用できることが示された。
生体内における蝸牛内K^+循環機構の解明-内耳性難聴解明へのチャレンジ-

本研究において、我々はカリウムイオンチャネルを始めとする各種イオンチャネルの蝸牛内発現様式を免疫組織化学的手法を駆使して詳細に検討し、哺乳類内耳におけるカリウムイオン循環機能の解析を試みた。我々はモルモット、マウス、およびスナネズミにおけるKv3.1bおよびKv3.4を始めとする電位依存性カリウムチャンネルおよび内向き整流性カリウムチャネルKir4.1の詳細な蝸牛内の発現様式を解明することができた。これまで、音響刺激に伴って蝸牛有毛細胞から放出されたカリウムイオンが周囲の支持細胞に取り込まれるメカニズム、そしてroot cellからラセン靱帯にカリウムイオンが放出されるメカニズムが明らかにされていなかったが、本研究の成果により、この二つのメカニズムにおいて内向き整流性カリウムイオンチャネルKir4.1が極めて重要な役割を担っている可能性が示唆された。我々は更に、電位依存性ナトリウムチャネルの解析も進め、ある種の電位依存性ナトリウムチャネルがラセン靱帯線維細胞に強く発現していることを明らかにした。このようにイオンチャネルの観点から内耳におけるイオン環境の維持機構および内リンパ電位形成機構を理解する上で貴重な数多くのデータを得ることが出来た。更に、本研究の結果、これらのチャネルタンパクの発現様式にはかなりの種差があることが判明し、実験動物内耳におけるチャネルタンパクの発現様式をそのままヒト内耳に当てはめることが困難であることが想定され、動物を使った実験結果の解釈には慎重を期する必要があることが強く示唆された。これまで我々は音受容に関る内耳内のカリウムイオン循環についての研究を進め、その中で特にカリウムイオン輸送に重要な働きをもつ内向き整流性カリウムチャネル(Kir)に注目した研究を行った。これまで内耳内におけるKirチャネル局在の報告としては蝸牛側壁血管条、らせん神経節辺縁細胞におけるkir4.1と蝸牛側壁線維細胞におけるKir5.1の局在が報告されていたが、我々は免疫組織化学的手法により蝸牛側壁外らせん溝細胞、有毛細胞支持細胞内におけるKir4.1チャネルの局在を見つけ、更に蝸牛基底回転ほど外らせん溝細胞樹状突起と有毛細胞支持細胞に多くのKir4.1が局在することを確認した。すなわちKir4.1チャネルは蝸牛内カリウムイオン循環にとって非常に重要なイオンチャネルであることを証明し、蝸牛頂回転より基底回転でより活発にカリウムイオンが循環する可能性を考えた。また新たに内耳前庭の移行細胞におけるKir4.1チャネルの局在も判明し、Kir4.1が蝸牛のみならず、前庭におけるカリウムイオン循環に関与している可能性を示唆した。方法は砂ネズミ、白色モルモット、マウスを用い、それぞれエーテル吸入後にネンブタールを腹腔内投与して麻酔し、PBS、10%ホルマリンで全身潅流固定後に蝸牛を摘出した。1%酢酸加10%ホルマリンにて外リンパ潅流し、EDTAで脱灰した。エタノール系列にて脱水後パラフィン包埋し、その後厚さ6μmの切片を作成し、抗Kir4.1抗体を一次抗体として24時間反応させ、さらに二次抗体と反応後DABで発色させた。その結果、砂ネズミ、モルモット、マウスのいずれにおける前庭移行細胞内でのKir4.1の発現が認められた。この結果により我々は内耳前庭では前庭暗細胞から分泌されたカリウムイオンが暗細胞の隣接細胞である移行細胞内のKir4.1によって吸収されている可能性があると考えた。我々はモルモット、マウス、およびスナネズミにおけるKv3.1bおよびKv3.4を始めとする電位依存性カリウムチャンネルおよび内向き整流性カリウムチャネルKi14.1の詳細な蝸牛内の発現様式を解明することができた。

これまで、音響刺激に伴って蝸牛有毛細胞から放出されたカリウムイオンが周囲の支持細胞に取り込まれるメカニズム、そしてroot cellからラセン靱帯にカリウムイオンが放出されるメカニズムが明らかにされていなかったが、本研究の成果により、この二つのメカニズムにおいて内向き整流性カリウムイオンチャネルKir4.1が極めて重要な役割を担っている可能性が示唆された。我々は更に、電位依存性ナトリウムチャネルの解析も進め、ある種の電位依存性ナトリウムチャネルがラセン靱帯線維細胞に強く発現していることを明らかにした。このようにイオンチャネルの観点から内耳におけるイオン環境の維持機構および内リンパ電位形成機構を理解する上で貴重な数多くのデータを得ることが出来た。更に、本研究の結果、これらのチャネルタンパクの発現様式にはかなりの種差があることが判明し、実験動物内耳におけるチャネルタンパクの発現様式をそのままヒト内耳に当てはめることが困難であることが想定され、動物を使った実験結果の解釈には慎重を期する必要があることが強く示唆された。
幼若期麻酔薬暴露が記憶に及ぼす影響

近年我々は幼若期における麻酔薬(セボフルラン・デスフルラン・イソフルラン)暴露が成長期の記憶障害を起こすことを行動学的・形態学的手法を用いて動物実験で示した。当該年度では幼若期麻酔薬暴露による記憶障害発生メカニズムについて電気生理学的に検証した。以前より我々はextracellular signal-regulated kinase(ERK)が記憶に及ぼす影響について研究してきた。このERKの阻害薬を幼若期マウスに投与したところ麻酔薬同様の行動学的・形態学的変化が認められた。そのため、幼若期麻酔薬暴露による記憶障害はERKが関与していることが示唆された。まず、ERKが記憶の素過程である海馬LTPに及ぼす影響について電気生理学的に研究した。その結果LTP導入にERKが関与していることが示された。次に幼若期にERK阻害薬に暴露されたマウスを成長させ海馬LTPを観察したところ、暴露マウスでは非暴露マウスに比べてLTPの導入が抑制されることが明らかとなった。形態学的・行動学的・電気生理学的結果から幼若期麻酔薬暴露による記憶障害のメカニズムの一つとして麻酔薬によるERKの抑制が示唆された。近年麻酔薬の記憶への直接作用のみならず、幼若期の麻酔薬暴露がその後の記憶障害を引き起こす可能性が行動学的・形態学的手法を用いて動物実験において示されている。我々は以前吸入麻酔薬セボフルランによる幼若マウスへの麻酔は形態学的にもアポトーシスを引き起こし、成長後の行動異常や記憶障害を引き起こすことを報告した。成長過程での麻酔薬の暴露と成熟期の記憶障害の関与は極めて重要な問題であり、小児期の麻酔が成長期の記憶障害に関与する可能性は詳細に検討されるべきである。海馬は記憶の中枢とされ、海馬における神経伝達は記憶と関連する。記憶はシナプス伝達の効率が長時間にわたって変化することによって作られる。シナプス伝達の効率の変化はシナプス可塑性と呼ばれ、記憶の中枢と考えられている。海馬でのシナプス伝達長期増強(long-term potensiation: LTP)は高頻度電気刺激を与えることによりシナプス伝達が長期間にわたり増強する現象で、記憶の素過程と考えられている。海馬スライスを用いた電気生理学的研究により、成長過程での麻酔薬の暴露と成熟期の記憶障害について検討することができる。当該年度は幼弱期麻酔暴露による成長後の海馬シナプス伝達の変化について電気生理学的手法を用いて測定した。特に海馬CA1錐体細胞への細胞内記録法による(脱分極誘発、自発性、微小)抑制性シナプス後電流、興奮性シナプス後電流の測定、細胞外記録法による興奮性シナプス高電位、シナプス可塑性(paired-pulse facilitation、LTP)について研究した。電気刺激装置の更新により、データが不安定となり調整を余儀なくされた。コンピューターの電源が故障して計測ができなくなり、修復に時間がかかった。当該年度に収集したデータがまだ不足しているため追加データが必要である。麻酔薬の種類を増やして、薬剤による作用の差異について検討する。神経毒性が起こるメカニズムについて、それを抑制する可能性がある薬剤について選定するために、候補薬剤について予備的な研究を実施し、次年度の研究に使用する薬剤を選定する。現在使用中のシステムは既存のもので老朽化している。実際当該年度に電気生理用アンプをコントロールするコンピューターの電源が故障して立ち上がらなくなった。次年度はコンピューターを更新し、それに伴い必要なソフトウエア、周辺機器の整備を行う予定である。
疼痛下におけるモルヒネ依存不形成に及ぼす脊髄・脳内プロテインキナーゼCの役割

上位中枢神経レベルにおいて神経因性疼痛発生機序を主にPKCの検討から解明し、併せて臨床的に応用可能な薬物による治療方法の確立を目的とした。1)慢性痛に見られるhyperalgesiaを惹起する脊髄におけるPKCの活性化が、モルヒネによる報酬効果の減弱に関与していることが推定された。2)Conventional PKCおよびPKCζが脊髄腔内に増加し、これらが座骨神経結節モデルのモルヒネによる報酬効果減弱作用に関与していることが推定された。3)脊髄におけるPKC活性化が、hyperalgesiaに関係する脳内PF, amygdara, CGの神経活動の活性化と関係することが推定された。4)脊髄のμオピオイドのリン酸化はモルヒネによる疼痛抑制効果の減弱に関与していることが考えられた。5)神経因性疼痛時には、オピオイド神経系、5-HT神経系の変化が生じ、特にδオピオイド受容体を介するシグナル伝達の低下によりアストロサイトが活性化し、不安感受性の亢進を引き起こしていることが示唆された。6)神経因性疼痛に対して、imipramine、milnacipran、paroxetine投与が鎮痛作用を持つことを動物実験において初めて明らかにした。臨床的に、神経因性疼痛時に抗うつ薬を投与する意義が見いだされた。同時に、その作用機序として前頭前野、扁桃体におけるセロトニン受容体機能低下の関与していることが示唆された。モルヒネによる報酬効果が神経因性疼痛の際に減弱し、この機序にprotein kinase C(PKC)が強く関与していることが推定されている。今回、この点に注目し、以下の様な検討を行い結果を得た。1)PKCの活性薬であるphorbol12,13-dibutyrate(PDBu)をマウス髄腔内に注入し、hyperalgesiaおよびconditioned place preference(CPP)がどうなるか検討した。その結果、PDBuはhyperalgesiaを増強した。またCPPはPDBuによって消失した。これらの作用は、PKCの阻害薬であるRO-32-0432の投与によって元のように回復した。これらのことより、慢性痛に見られるhyperalgesiaを惹起する脊髄におけるPKCの活性化が、モルヒネによる報酬効果の減弱に関与していることが推定された。2)マウス座骨神経結紮モデルを用い、免疫組織化学的な検討を行ったところ、conventional PKCおよびPKCζが脊髄腔内に増加し、これらが座骨神経結節モデルのモルヒネによる報酬効果減弱作用に関与していることが推定された。3)2)と同様のモデルで、髄腔内にPKCの阻害薬(RO-32-0432)を投与したところ、モルヒネによる報酬効果減弱作用が消失した。4)PDBuをマウス髄腔内に注入し、行動ならびに脳内c-fos様免疫組織反応を検討した。その結果、parafascicular nuclei(PF)、amygdala、cingulated cortex(CG)においてはc-fos様反応が増大したが、hippocampusでは認められなかった。これらより、脊髄におけるPKC活性化が、hyperalgesiaに関係する脳内PF,amygdara,CGの神経活動の活性化と関係することが推定された。昨年度はプロテインキナーゼC(PKC)のモルヒネ依存不形成に及ぼす影響について検討した。本年度は、さらに慢性疼痛に対する脊髄・脳内オピオイド受容体について検討した。1,マウス神経因性疼痛モデル作成後、PKCなどを介して生ずるリン酸化されたμオピオイド受容体の免疫活性について検討した。坐骨神経結紮後、モルヒネの鎮痛作用が抑制された状況下において、脊髄後角L5レベルでのlaminaeにおいてリン酸化されたμオピオイド受容体の免疫活性が増加した。この結果より、脊髄のμオピオイドのリン酸化はモルヒネによる疼痛抑制効果の減弱に関与していることが考えられた。2,慢性疼痛による不安感受性の亢進と脳内神経系の変化について検討した。

方法は、神経因性疼痛モデル作成後、熱痛覚過敏反応、機械的アロディニアの測定、明暗試験、高架式十字迷路試験、GTPγS bindingassay,免疫染色法によって行った。結果、(1)神経因性疼痛マウスにおいて不安感受性の亢進が認められた。(2)前頭前野においてδオピオイドおよび5-TH受容体機能の減弱が認められた。扁桃体ではμおよびδオピオイド受容体機能の減弱が認められた。(3)帯状回表層の免疫染色においてアストロサイトの活性が増強した。(4)δオピオイド拮抗薬であるNTIにより帯状回表層のアストロサイトの活性が増強した。(5)NTIを脳室内投与したマウスでは優位な不安感受性亢進が認められた。(6)培養アストロサイト上清を帯状回領域にmicroinjectionしたところ、不安感受性の亢進が認められた。以上より、神経因性疼痛時には、オピオイド神経系、5-HT神経系の変化が生じ、特にδオピオイド受容体を介するシグナル伝達の低下によりアストロサイトが活性化し、不安感受性の亢進を引き起こしていることが示唆された。これまでに、脳内でのPKCの活性化が神経因性疼痛の発生に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきたが、同時に、神経因性疼痛時には、オピオイド神経系に変化が生じ、アストロサイトの活性化を伴う不安感受性の亢進が生じていることも昨年度は明らかにした。本年度は、この神経因性疼痛による不安感受性の亢進と脳内神経系の変化について慢性疼痛モデルを用いて、より詳細に検討し、さらに慢性疼痛に対する各種抗うつ薬、抗不安薬投与による治療効果について検討した。2,坐骨神経半周結紮または非結紮後4週間後の前頭前野および扁桃体よりそれぞれ得られた膜標本を用いて、5-HT処置による[^<35>S]GTP_γS結合量(Gタンパク質活性)を測定した。結果、神経因性疼痛時には、前頭前野および扁桃体におけるセロトニン受容体機能が低下していることが判明した。以上から、臨床的に、神経因性疼痛時に抗うつ薬を投与する意義が見いだされた。同時に、その作用機序として前頭前野、扁桃体におけるセロトニン受容体機能低下の関与していることが示唆された。今後、慢性疼痛において痛みの認知や情動の変容を引き起こす上位中枢の生理学的変化を、神経ネットワークや細胞間相互作用、細胞の再生・分化などを検討することによって、明らかにするよう研究を進めたい。
経済時系列の逐次統計解析とその応用～金融バブルの検出

本研究は、経済時系列分析に逐次解析法を取り入れた統計解析法を構築することである。それにより、例えば金融バブルの発生を早期に検出する方法を確立することが可能になる。データ収集をやめる時点を停止時といい、本研究では自己回帰モデルについて、データの情報の量的指標であるフィッシャー情報量が一定水準Cに達した時点でサンプリングを止める停止時を考える。漸近論ではそのCを大きくする枠組みで、推定問題、単位根検定問題を取り扱い、それらの推定量や検定統計量と停止時の同時分布を導出する。検定問題では、帰無分布のみならず対立分布も導出する。応用例として、金融市場におけるバブルの早期検出が考えられる。
プロテオミクス的解析法を用いた心血管リモデリング機構の解明および治療法の開発

本研究の目的はプロテオミクス的解析法を用いた心血管リモデリング機構の解明および治療法の開発である。リサーチプロテオミクスを導入し、我々が過去に同定した心血管リモデリングに重要な役割を有す転写因子KLF5を中心に、心血管病の病態形成に関わる遺伝子およびこれらのコ・ファクターの包括的な単離、発現抑制系による機能解析を行う。最終的には、KLF5をモデルとした核内転写因子ネットワークによる転写調節機構を解明し、臓器リモデリングの予防及び治療法を開発することを目標とする。PDGF-Aは平滑筋細胞の遊走・増殖を促進し、動脈硬化症の発症に重要な役割を果たす増殖因子であるが、我々の過去の検討によりKLF5の標的遺伝子であり、-71-55bp領域が心血管リモデリングにおいて重要であることが判明した。本研究における具体的な計画として、まずPDGF-A遺伝子-71-55bp領域に結合するタンパクを同定する。基本的にはKLF5結合タンパクのスクリーニングに準ずる。具体的にはPDGF-AプロモータのKLF5結合サイトである-71-55bp領域の二本鎖DNAを合成し、その一端をビオチン化した。ストレプトアビジンとビオチンの強固な結合を利用し、メタルビーズ表面に固定した。これに細胞の核抽出液を反応させ、pull downした。その後、SDS-PAGE展開し、特異的バンドをゲル内トリプシン消化法にて同定した。いくつかの興味深い因子が同定された。KLF5結合因子の生化学的特徴をもとに、細胞から動物レベルにおける病態メカニズムを追求した。なかでも、酸化ストレスからの心血管組織の防御機構における新規メカニズムが明らかになった。最初にProteinchipシステムを用いたハイスループットのスクリーニングを行った。ストレプトアビジンとビオチンの強固な結合を利用し、チップ表面に固定した。すなわちDNA-pull down法を用いた。これにHeLa細胞の核抽出液を反応させ、pull downし、結合条件・溶出条件を決めた。得られた条件をもとにDNAをビーズに固定し、大規模にpull downした。

PDGF-Aは平滑筋細胞の遊走・増殖を促進し、動脈硬化症の発症に重要な役割を果たす増殖因子であるが、我々の過去の検討によりKLF5の標的遺伝子であり、-71-55bp領域が心血管リモデリングにおいて重要であることが判明した。本研究における具体的な計画として、まずPDGF-A遺伝子-71-55bp領域に結合するタンパクを同定する。基本的にはKLF5結合タンパクのスクリーニングに準ずる。具体的にはPDGF-AプロモータのKLF5結合サイトである-71-55bp領域の二本鎖DNAを合成し、その一端をビオチン化した。ストレプトアビジンとビオチンの強固な結合を利用し、メタルビーズ表面に固定した。これに細胞の核抽出液を反応させ、pull downした。その後、SDS-PAGE展開し、特異的バンドをゲル内トリプシン消化法にて同定した。いくつかの興味深い因子が同定された。KLF5結合因子の生化学的特徴をもとに、細胞から動物レベルにおける病態メカニズムを追求した。なかでも、酸化ストレスからの心血管組織の防御機構における新規メカニズムが明らかになった。
Gjb2コンディショナル・ノックアウトマウスの遺伝子導入による内耳の再生への挑戦

GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(CX26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。その動物モデルとしてgjb2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、その生理学的・形態学的解析を行った。Cre recombinase存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようにコンストラクトを作成した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、二重選別法を用いて相同組換えを行い、ES細胞に2つのloxPサイトを導入した。このES細胞をC57BL6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、C57BL6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジエニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。Cx26の免疫蛍光染色で、ヘテロ変異マウスではコルチ器の支持細胞、ラセン靭帯の線維細胞から血管条の基底細胞にかけて豊富に分布していたが、ホモ変異マウスで発現が全体的に低下していた。トーンバーストを用いたABRにての聴力検査ではヘテロ変異マウスはどの周波数(8,12,16,20kHz)でも聴力域値が30dB以下なのに対し、ホモ変異マウスは7080dBと高度の難聴を認めた。また、周波数ごとにホモ変異マウスとヘテロ変異マウスの差をとると、高周波数になるにつれ差が大きくなった。基底回転と第2回転においてホモ変異マウスのコルチ器は高度に変性していた。頂回転ではコルチ器の崩壊は認めたが、基底回転や第2回転ほど高度ではなかった。ABRにてホモ変異マウスはヘテロ変異マウスと比較して高周波数の聴力のほうが低下しており、HE染色の基底回転側が高度に崩壊している所見と一致した。ホモ変異マウスのコルチ器の透過電顕所見では、内有毛細胞は保たれているが、外有毛細胞は変形しており、1列に減少していた。また、コルチトンネルの崩壊を認めた。支持細胞にも著明な変形がみられた。血管条とらせん靭帯には明らかな異常は認めなかった。細胞死の原因としてアポトーシスの関与を考え、検討した。ホモ変異マウスのコルチ器にはTUNEL、Caspase-3ともに数個の陽性細胞を認め、アポトーシスの関与が示唆された。タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションについての免疫染色を検討した。ZO-1ではコルチ器、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現を認め、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな発現の差はみられなかった。また、血管条の基底細胞にも同様の発現を認めた。β-catenin、E-cadherinの染色で代表されるアドヘレンスジャンクションでは同様にコルチ器の内リンパ側、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現し、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな差は認めなかった。GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(Cx26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジェニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。血管条とらせん靱帯には明らかな異常は認めなかった。

ZO-1ではコルチ器、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現を認め、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな発現の差はみられなかった。また、血管条の基底細胞にも同様の発現を認めた。β-catenin、E-cadherinの染色で代表されるアドヘレンスジャンクションでは同様にコルチ器の内リンパ側、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現し、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな差は認めなかった。GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(CX26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。その動物モデルとしてgjb2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、その生理学的・形態学的解析を行った。Cre recombinase存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようにコンストラクトを作成した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、二重選別法を用いて相同組換えを行い、ES細胞に2つのloxPサイトを導入した。このES細胞をC57BL6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、C57BL6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジエニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。Cx26の免疫蛍光染色で、ヘテロ変異マウスではコルチ器の支持細胞、ラセン靭帯の線維細胞から血管条の基底細胞にかけて豊富に分布していたが、ホモ変異マウスで発現が全体的に低下していた。トーンバーストを用いたABRにての聴力検査ではヘテロ変異マウスはどの周波数(8,12,16,20kHz)でも聴力域値が30dB以下なのに対し、ホモ変異マウスは7080dBと高度の難聴を認めた。また、周波数ごとにホモ変異マウスとヘテロ変異マウスの差をとると、高周波数になるにつれ差が大きくなった。基底回転と第2回転においてホモ変異マウスのコルチ器は高度に変性していた。頂回転ではコルチ器の崩壊は認めたが、基底回転や第2回転ほど高度ではなかった。ABRにてホモ変異マウスはヘテロ変異マウスと比較して高周波数の聴力のほうが低下しており、HE染色の基底回転側が高度に崩壊している所見と一致した。ホモ変異マウスのコルチ器の透過電顕所見では、内有毛細胞は保たれているが、外有毛細胞は変形しており、1列に減少していた。また、コルチトンネルの崩壊を認めた。支持細胞にも著明な変形がみられた。血管条とらせん靭帯には明らかな異常は認めなかった。細胞死の原因としてアポトーシスの関与を考え、検討した。ホモ変異マウスのコルチ器にはTUNEL、Caspase-3ともに数個の陽性細胞を認め、アポトーシスの関与が示唆された。タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションについての免疫染色を検討した。