hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内視鏡外科手術の安全な普及を目指した支援ロボットシステムと遠隔指導システムの開発

1.支援ロボットシステムの開発構成が比較的簡単で小型である、触覚をある程度残すことが期待出来る、など遠隔型master-slave manipulatorの短所を改善した新しい概念に基づくmaster-slave-体型manipulatorを設計し、現行のトロッカーで使用可能な外径12mmのものを試作した。2.遠隔指導システムの開発臨床応用に最適なシステムを目指し、手技的な議論を行うのに必要な術野像の画質を保ちつつ、どの程度までの画像情報の圧縮が可能であるか、経済効率の面も含め様々な動画像圧縮伝送システムを比較検討した。現在最も性能の高いシステムを用いた場合、ISDN3回線の通信容量(384Kb)で、毎秒30フレームの高画質を実現し、臓器の色調変化や質感などの微妙な情報もリアルタイムで確認ができた。音声は、特殊な音響システムにより、術者も助手もマイクを意識せずに指導者と自然な会話をすることができた。さらにタブレットへの手書き入力で、遠隔地から動画像上に様々な色を用いて線や文字を双方向かつリアルタイムに書き入れることができるアノテーション機能機能の導入により、遠隔手術指導が大きく実効化した。本システムを用いて早期大腸癌に対する腹腔鏡下結腸切除術、胆嚢胆石症に対する腹腔鏡下胆嚢摘出術の手術指導を施行した。特に、手術医が経験が少ない部位の手術の場合や手術条件が悪く困難な症例において、遠隔手術指導を受けることにより手術医が順調に手術を行うことが可能となり、本システムの有用性が認識された。広域ネットワークの利用を目指し、ネットワーク上の情報を匿秘するための情報の記号化技術の画像伝送への応用を検討した。動画像を継続的に暗号化しながら伝送し、かつ通信速度を遅延させない新しいストリーミング・キーを遠隔手術指導へ導入して腹腔鏡下大腸切除術の遠隔手術指導が行われたが、動画像通信の安全性が高まり、また、画像伝送に特に遅延は認められず、十分な手術指導が可能であった。臨床応用に最適なシステムを目指し、手技的な議論を行うのに必要な術野像の画質を保ちつつ、どの程度までの画像情報の圧縮が可能であるか、経済効率の面も含め様々な動画像圧縮伝送システムを比較検討した。現在最も性能の高いの動画像・音声圧縮伝送システムを用いた場合、ISDN3回線の通信容量(384kb)で、毎秒30フレームで高画質を実現し、臓器の色調変化や質感などの微妙な情報もリアルタイムで確認ができる。高い音質の特殊な音響システムにより、術者も助手もマイクを意識せずに指導者と臨場感のある自然な会話をすることができる。画像情報圧縮伝送システムは高性能化とともに低価格化が進んでおり、また、通信回線料も、ATM技術を用いた光ファイバーによる高速・広帯域のマルチメディアサービスでは、従来の専用線よりも低いコストで大容量の通信を行うことがきる。手術指導においては、刻々と変化する手術状況に対応して適時に指示を相互に確認しながら指導することが重要でる。われわれは、タブレットへの手書き入力で、遠隔地から動画像上に様々な色を用いて線や文字を双方向かつリアルタイムに書き入れることができるアノテーション機能を共同開発した。この機能の導入により、遠隔手術指導が詳細かつ丁寧なものとなり、大きく実効化した。さらに、腹腔鏡把持ロボットを遠隔手術に導入し、指導医が遠隔地からロボットを操縦して術者に最適な手術視野を提供しつつ指導することを可能とするため、現在、音声情報を加工して、遠隔地においても全く同一の音声を再現可能なシステムを研究中である。

1.遠隔手術指導システムの臨床応用と暗号化通信装置の導入:遠隔手術支援システムを用いて早期大腸癌に対する腹腔鏡下結腸切除術、胆嚢胆石症に対する腹腔鏡下胆嚢摘出術の手術指導を施行した。特に、手術医が経験が少ない部位の手術の場合や手術条件が悪く困難な症例において、遠隔手術指導を受けることにより手術医が順調に手術を行うことが可能ととなり、本システムの有用性が認識された。広域ネットワークの利用を目指し、ネットワーク上の情報を匿秘するための情報の記号化技術の画像伝送への応用を検討した。動画像を継続的に暗号化しながら伝送し、かつ通信速度を遅延させない新しいストリーミング・キーを遠隔手術指導へ導入して腹腔鏡下大腸切除術の遠隔手術指導が行われたが、動画像通信の安全性が高まり、また、画像伝送に特に遅延は認められず、十分な手術指導が可能であった。2.master-slave manipulatorの臨床的検討:米国Intuitive Surgical社製master-slave manipulatorを試験的に導入し、腹腔鏡下食道外科手術、胆嚢摘出術、再発性鼠径ヘルニア根治術等を行い、際立った操作性を確認した。胆嚢摘出術では、胆嚢管・胆嚢動脈を吸収糸で結紮処理でき、また、胆嚢剥離後の肝床部の腹膜を縫合修復できるなど、従来の腹腔鏡下内視鏡手術では不可能であった操作が可能となった。3.master-slave一体型manipulatorの設計・試作;構成が比較的簡単で小型である、触覚をある程度残すことが期待出来る、など現行のmaster-slave manipulatorの短所を改善した新しい概念に基づくmaster-slave一体型manipulatorを設計し、現行のトロッカーで使用可能な外径12mmのものを試作した。
口腔内の多発癌および多発前癌病変発生機序の分子生物学的解析

頭頚部扁平上皮癌患者の予後を左右する因子として、多発癌を制御することが重要である。口腔の特徴として、飲酒、喫煙、さらに通常の食事によって口腔粘膜は常に発癌物質に曝されている。従って、多発癌を有する患者では、このような環境因子により口腔粘膜全体が癌化しやすい状態になっていると考えられる。今回、同時性、異時性を含めた口腔多重病変の分子生物学的解析として、このような患者の癌組織、前癌病変の組織を用いて染色体上の3p14、9p21、17p13領域における変異(microsatellite instability, loss of heterozygosity)を検討し、field cancerization theoryを証明することを試みた。その結果、1)大部分の口腔多発前癌病変はそれぞれ独立に発生しており、field cancerization theoryを裏付ける結果が得られた。2)口腔多発癌ではfield cancerization theoryを裏付ける発癌に加え、common clonal originのものも存在する可能性が示唆された。3)3p14、9p21、17p13領域でのmicrosatelliteの変化は病変の進展に伴い蓄積される傾向を示した(Oncogene,20 : 2235-2242,2001)。一方、Cytochrome P-450、Glutathione-S-transferaseの遺伝子多型を解析することによって、発癌物質に対する宿主の感受性について検討し、発癌物質に対して抵抗性であり、口腔癌になりにくい宿主の存在を突き止めた(Carcinogenesis, in-press)。この結果を踏まえ、多発病変を発症した患者についても遺伝子多型を検索していく予定である。口腔の特徴として、飲酒、喫煙さらに通常の食事によって口腔粘膜は常に発癌物質に曝されている。今回、同時性、異時性を含めた口腔多重病変の分子生物学的解析として、このような患者の癌組織、前癌病変の組織を用いて染色体上の3p14、9p21、17p13領域における変異(microsatellite instability, loss of heterozygosityを検討し、field cancerization theoryを証明することを試みた。3)3p14、9p21、17p13領域でのmicrosatelliteの変化は病変の進展に伴い蓄積される傾向を示した(Oncogene,20:2235-2242,2001)。一方、Cytochrome P-450、Glutathione-S-transferaseの遺伝子多型を解析することによって、発癌物質に対する宿主の感受性について検討し、発癌物質に対して抵抗性であり、口腔癌になりにくい宿主の存在を突き止めた(Carcinogenesis,23:595-598,2002)。さらに、癌抑制遺伝子であるp53のDNA結合表面領域における変異が口腔扁平上皮癌の従来の臨床病理学的因子とは異なる独立した予後因子であることが示唆された(Oral Oncology,39:163-169,2003)。
角運動センシング技術の研究

3次元角運動における角加速度を計測すること、および複合信号から角速度成分を分離定量することを目的とし、(1)2軸角運動に対し各軸の運動解析を行い、1モータで2軸角運動を実現する実験装置を開発した。それにより加速度センサの2軸角運動実験を行った。(2)3軸角加速度を計測するため、6個のモノリシックIC形センサを用いた。この場合問題点が2つ生じた。1つはノイズであるが、精度を勘案したロ-パスフィルタとハイパスフィルタを製作することにより解決した。2つ目はコリオリカによる他軸からの注目軸への現象論的な干渉である。これは手振りのような比較的ゆっくりした運動では、ほぼ無視できることを実験的に明らかにした。さらに各種シミュレーションを実施し、振動数2Hz以下(手振りなど)では、ほぼ角速度成分をなしとしてよいという結論を得た。3軸角加速度センサを用いて、手振り信号をロボットに入力しロボットが手振りに従って動作することを確かめた。(3)角速度を分離信号に使用することと、計測値そのもを使用する目的において、圧電ジャイロによる3軸角速度センサを構成し、3軸回転実験、手振り振動実験および1回振り実験を行った。3軸回転実験で3個のジャイロとも干渉なく3軸角速度を忠実にとらえていることが分かった。1回振りでは、圧電体の特性からサグ(パルス終了時の余計な跳ね返り信号)があるので、それをカットし、ヒューマンインターフェースの安全性を向上するため、しきい値を2個設け、手振り指令を機器制御に用いる場合の安全性を高めた。実際に多軸モータを回転させて有効性を確かめた。(4)ニューラル・ネットワークにより角加速度・角速度を分離するため、各種のシミュレーションを行った。BPアルゴリズムにより、3軸角加速度値から3軸角加速度と3軸角速度を良好に分離できる見通しを得た。学習回数は1024点ランダム入力として2000回以上であればよい。ただし、ノイズ成分が大きいと汎化能力が落ちる。そのため、角速度成分を近似的に除いて学習させる方がよいことが分かった。3次元角運動における角運動成分を分離定量する研究目的において,本年度は2軸角運動に対し,各軸の運動解析を行い,加速度計を4個用いた角運動センサを製作するとともに,2軸角運動を実現する実験装置を開発し,それらにより2軸角運動の実験を行った.また,汎用的なニューラル・ネットワークを構築した.次に,3次元回転実験装置を設計製作した.実験とシミュレーションの結果,一組(1軸2個)の加速度計を二組直交させた角運動センサから,それぞれの軸に対する角加速度が測定できることを確かめた.使用した加速度計はフルレンジが±50g用であり,加速度の計測値は2g程度であったので,ノイズの影響が大きく出た.その後フィルタを工夫することによって,角加速度の計測値をシミュレーション値と一致させることができた.次に,±2gの加速度計に交換し,適切な角加速度が得られることを確かめた.また,ニューラル・ネットワークによる角運動のシミュレーションでは,ノイズレベルが大きく(信号振幅の1/3程度)なると,角加速度,角速度の分離がうまくいかないことが分かったので,次年度では別のネットワーク・アルゴリズムを構築していく予定である.3次元角運動における角加速度を計測すること、および複合信号から角速度成分を分離定量することを目的とし、(1)2軸角運動に対し各軸の運動解析を行い、1モータで2軸角運動を実現する実験装置を開発した。

3次元角運動における角運動成分を分離定量する研究目的において,本年度は加速度計を4個用いた角運動センサによる2軸角運動の実験と,加速度計6個1組の角加速度センサによる3軸角運動の実験を行った.(1)2軸角運動実験1モータで斜旋回軸を駆動し,ジャイロ機構をもつテーブルを振らせる2軸角運動実験装置を開発した.ゴム被服ローラをかますことで機械ノイズを低減することができた.センサにはモノリシックIC加速度計を4個用いて2軸角加速度を得た.また,静電容量形3軸加速度計を2個用いて角加速度を得る実験も行った.両センサを比較すると,後者の静電容量形のものがはるかに良質の角加速度を計測し,手振りインタフェースに利用できることが分かった.(2)3軸角運動実験ところが上記静電容量形のセンサは3軸に拡張すると,構造的な干渉により3軸任意の角運動が計測できないことが分かり,再びモノリシックIC形センサを用いることとした.この場合問題点が2つ生じた.1つはノイズであるが,精度を勘案したロ-パスフィルタとハイパスフィルタを製作することにより解決した.2つ目はコリオリ力による他軸からの注目軸への現象論的な干渉である.これは手振りのような比較的ゆっくりした運動では,ほぼ無視できることを実験的に明らかにした.その3軸角加速度センサを用いて,手振り信号をロボットに入力しロボットが手振りに従って動作することを確かめた.ただし,自由に操ることはできず,安全性に対する制約条件は多い.安全性に対する新たな課題が生じたといえる.(3)ニューラル・ネットワークアルゴリズム各種のニューラル・ネットワークアルゴリズムを構築し、シミュレーションを重ねているところである.定常的なでノイズのない運動では各軸の角加速度を認識できるが,非定常(突発的な信号とノイズレベルが1/3と大きい)運動では各軸の角加速度を分離してくれない.したがって,この場合も精度の高いフィルタを併用しなければならないという中間結果を得た.3次元角運動における角運動成分を計測するため,本年度は角速度計を3個用いた角運動センサによる3軸角運動の実験と,ニューラル・ネットワークによる角加速度・角速度の分離シミュレーション行った.(1)3軸角速度実験圧電ジャイロによる3軸角速度センサを構成し,3軸回転実験,手振り振動実験および1回振り実験を行った.3軸回転実験では,3個のジャイロとも干渉なく3軸角速度を忠実にとらえていることが分かった.手振りの回内,回外繰返し振りでも振動数ほぼ1Hz,振幅0°90°の範囲で角速度を忠実にとらえていることが分かった.ところが,手の1回振りでは,圧電体の特性からくるサグ(パルス終了時の余計な跳ね返り信号)があることが分かった.そこで,ヒューマンインタフェースの安全性のため,余計な信号とかノイズをカットする方法を検討した.しきい値を2個設け,第1しきい値で信号が立上がる(立下がる)点を見つけ,第2のしきい値で信号の正負を判定し,信号が小さくなった時点で零信号に落とすという方法により,手振り指令を機器制御に用いる場合の安全性を高めた.実際に多軸モータを回転させて有効性を確かめた.(2)角加速度計測値の近似加速度計による角加速度計測では,3軸角加速度に3軸角速度が重畳するが,どの時点で角速度成分が省略できるかが問題となる.
刑事違法と民事違法の比較研究ー刑事違法判断における危険分配の特性の検討ー

民事責任は損害分配を志向して客観的基準に従うが、刑事責任は行為者非難を志向して主観的基準に従う......かつて有力だったこの命題を今日なお維持しうるかは疑わしい。民事の答責が、医療過誤や公害・薬害で無過失責任に接近したり、交通事故で(行政)交通規則に応じた画一処理の傾向を示すのは,医家・企業・国家という一方当事者の専門性に応じた特殊化(特権規制)や、道路交通という秩序枠に応じた特殊化(調整的規則)に由来する。各々の交渉の特性に見合った個別化、相手方にそれと信頼させる交渉をしたことこそが決定的であり、「交渉」の類型的把握という意味での客観化なら、普偏化を属性とする法一般の特徴である。刑法でも、心理状態の存否を問う主観的把握はもはや少数で、責任じたいは規範的に「客観化」されている。経済活動の拡大を背景にした動的安全のための「客観化」は時代的制約の中での論理でしかない。少なくとも民刑分化の原型では、私的自治=契約自由=意思主義から主観的事情に意味を見出すのが民法であり、国家刑罰権の発動を促す公的利害に着目する刑法で主観的事情の比重は低くてよいはずである。不法行為は契約と違うにせよ、当事者を見る民事責任が、より広く社会を考える刑事責任よりも「客観化」されるとは思えない。刑事答責の主観化傾向は、結果責任からの離脱を基礎づけた理性が「意思主義」を暗示した・違法論の客観化の裏面として責任論の主観化が強調された「時代」の現象と捉えられる。答責は要件たる責任の属性とは区別して分析すべきである。むしろ、民事答責の(個々の交渉過程への依存という)主観性・刑事答責の(公的諸原理への依存という)客観性を出発点として、交渉ルール担保の必要性を確認すべき刑事違法論であればこそ、当事者「交渉」関係(個別性)を直視しつつ社会規範レベルで・現実の損害(個別性)を直視しつつ社会的応報感情レベルでの「客観的」把握を追及すべきであろう。民事責任と刑事責任の相互関係という問題は古くて新しいテーマである。今日でも判例の大勢は民法と刑法の機能的分業を前提としている(例えば、慰謝料の本質をめぐる京都地判H5,11,25判タ853,249)が、学説には、損害賠償の「行為統制」機能を強調する主張もあるし、刑事法で「被害者の再発見」に基ついて「損害回復」を重視する主張もみられる。法秩序の中での刑事法の位置づけは、時代の変遷に応じた問い直しを迫られている。本研究が着目したのは、過失相殺をなす場合(最判S63,4,21民集42,4,243)に論じられる「公平」観を刑法学はどう受け止めるべきかという問題である。民事賠償が顧慮するのは加害者/被害者の「公平」であるのに対し、刑事法の問題は加害者/潜在的加害者のそれだといえるか?刑事法の判断はそこまで「行為者」の「責任」を志向すべきものであろうか?過失相殺の背景に「所有者危険負担の原則」や「領域原理」を顧慮するのなら、それが刑法にどんな意味をもつか、被害者の「自己答責性」との関係が検討課題になるであろう。現段階では、「被害者の過失」の前提たる「事理弁識能力」が「答責性」の前提たる「自己決定能力」に、相殺を否定させる「加害者の故意」が折衷的相当因果関係説のいう「特別知識」に、また、その思考方法は承諾論での「相互関係モデル」に近いと推察できる。これらの議論のより厳密な対比を継続して行いたい。半面、保険制度や求償関係の考慮が刑事法上の判断に影響するかは疑わしいし、いわば統一的正犯概念に近い不法行為理論と異なり、刑事責任の特性は「正犯」限定に関わる諸原理にも由来している。被害者態度の因果的考慮だけでは、行為者態度と結果の「結びつき」は示せても、「可罰的内実」を示したことになるかが問題である。刑事責任の限界づけは、「行為者」だけでなく、「当事者」の「相互交渉」の特質を考慮しうる枠組みで具体化すべきだと思われる。

不法行為は契約と違うにせよ、当事者を見る民事責任が、より広く社会を考える刑事責任よりも「客観化」されるとは思えない。刑事答責の主観化傾向は、結果責任からの離脱を基礎づけた理性が「意思主義」を暗示した・違法論の客観化の裏面として責任論の主観化が強調された「時代」の現象と捉えられる。答責は要件たる責任の属性とは区別して分析すべきである。むしろ、民事答責の(個々の交渉過程への依存という)主観性・刑事答責の(公的諸原理への依存という)客観性を出発点として、交渉ルール担保の必要性を確認すべき刑事違法論であればこそ、当事者「交渉」関係(個別性)を直視しつつ社会規範レベルで・現実の損害(個別性)を直視しつつ社会的応報感情レベルでの「客観的」把握を追及すべきであろう。
中国のモータリゼーションと排出ガス問題に関する総合的研究―地球温暖化問題への産業論的アプローチ―

中国では縦割り行政による自動車産業政策と環境政策の非整合性は環境保全の根本的な問題の一つである。自動車産業の監督省庁は国家計画発表委員会機械工業局であり、環境政策は環境保護総局によって管轄されている。問題は両省庁間の提携とコミュニケーションの不足にある。機械工業局の中には排ガス汚染の対応部署がなく、「汽車処」(自動車課)だけで産業政策の実施及び日常の行政指導を行っている。従って、環境への配慮が不足しがちである。機械工業局の下には「中国汽車技術センター」があり、ここでは排ガス規制基準を制定するが、行政監督機能を持っていない。こうした政府規制の不十分さにより、自動車企業は罰金を払ってでもエンジン技術の改良を行わず、政府・企業間の「イタチごっこ」が散見される。中央省庁よりもむしろ地方自治体のほうが大気汚染の深刻さから規制を始め、例えば、北京市では1999年から三元触媒の取付けを義務化し、欧州並の排ガス規制基準を課している。その姉妹都市の東京都のディーゼル車に対する規制策を彷彿させる。通常、先進国ではCO2の約2割が自動車運輸部門より排出されているといわれる。日本では昨年、2002年からディーゼル車のNOxを30%、2007年には60%削減するという数字目標を盛り込んだ中央環境審議会の答申が発表された。米国でも70年代のマスキー法以来、排ガス規制は厳しくなり、特にカリフォルニアは先端を走っている。だが、先進国企業がいざ海外進出となると、中国を含めた発展途上国の環境法制の不備を利用して、自国の進んだ環境対策車種を持っていかず、一方、途上国も技術水準の低い自国企業を保護するために、厳しい環境規制を回避しがちである。かくして、進出側と受入側両方の都合により途上国の大気汚染が益々深刻化して、地球温暖化の進展に拍車がかかる。中国の自動車産業はその典型例といえよう。環境技術が今日ほど世界の自動車産業を脅かしたことはない。中国は地球温暖化に直結する自動車の排ガス規制を放任すると、気候変動を加速させる危険性が高く、諸先進国の温暖化防止の努力を相殺してしまう恐れもある。米国ワールドウォッチ研究所によれば、1995年の世界のCO2総排出量は64億トン(炭素換算)の内、米国が23.0%で第1位、中国が13.9%で第2位となっている。現在のペースでいけば、2010には中国のCO2排出量は世界全体の37%を占め、世界最大の排出国になるとの予測もある。一方、中国国家計画発展委員会の予測によれば、20082010年の間に本格的なモータリゼーションが始まるといわれる。中国の自動車保有量を見ると、1998年には約1300万台であったが、85年から95年までの自動車の年平均増加率は12-14%であったことから、2010年には少なくとも2500万台を突破するだろうとの予測がある。このタイミングは中国のCO2排出量が世界一になる時期とは見事に一致している.排ガス汚染の実態については、90年代初めに四川省成都市では全国で初めて光化学スモッグの発生が観察され、95年には上海でも初めて観察された。96年に中国政府は新しい「大気環境質量基準」を制定し、窒素炭化物(NOx)の排出基準に基づいて、全国の主要都市を調査した結果、北方では17都市、南方では10都市が不合格となり、ワースト5は広州、北京、上海、鞍山、鄭州の順になっている。また、98年中国国家環境保護局はこれまで有鉛ガソリンの使用を認めていたのを改め、99年末までに有鉛ガソリンの生産を禁止する通達を発表した。北京市政府も2000年までに軽トラックを改造して作られたタクシー「面的」を全廃すると決定した。(自動車エンジン技術に関する分析は別の機会に譲ることにする。)中国では縦割り行政による自動車産業政策と環境政策の非整合性は環境保全の根本的な問題の一つである。

だが、先進国企業がいざ海外進出となると、中国を含めた発展途上国の環境法制の不備を利用して、自国の進んだ環境対策車種を持っていかず、一方、途上国も技術水準の低い自国企業を保護するために、厳しい環境規制を回避しがちである。かくして、進出側と受入側両方の都合により途上国の大気汚染が益々深刻化して、地球温暖化の進展に拍車がかかる。中国の自動車産業はその典型例といえよう。
ストレスタンパク質HSP90の構造と発現調節および自己免疫原性の解析

HSP90のストレス応答性を検討するために、骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞において、反復伸展刺激、熱ショック、亜ヒ酸処理した。どの場合でもHSP90αの発現上昇が認められたが、特に亜ヒ酸処理で顕著に上昇した。一方、HSP90βやGRP94(小胞体型HSP90)は変化しなかった。ラットでは歯槽骨の破骨細胞や骨芽細胞はじめほとんどの細胞や組織でHSP90βが優位に発現していた。しかし脳、精巣、赤血球においてHSP90αの発現が亢進していた。以上の結果から、HSP90αの組織特異的ストレス誘導性の発現とHSP90βの普遍的恒常的発現が明らかとなった。全身性エリトマトーデス患者はHSP90αよりもHSP90βにより選択的に結合する抗体を保持していた。HSP90ダイマーは直列に並んだ4構造からなっていたが(Maruya et al..,1999)、これは私たちが既に報告した一次構造上の3ドメイン構造(AC)のドメインBとCが連結してダイマーを形成する(Nemoto et al.,1995)というモデルと一致した。HSP90のダイマーの構造とドメインの機能をさらに検討するために大腸菌のHSP90であるHtpGを用いた。HtpGも同様に3ドメイン(A、1-336;B、337-552;C、553-624)からなっていた。そのうち、ドメインBとドメインCとの結合によってHtpGのダイマー構造が保たれていた。さらにドメインB同士にも相互作用がありダイマー構造を安定化しているようである。それらとは別に同一ポリペプチド内のドメインAとドメインBも結合することが見出された。ドメインBは同時にドメインAとドメインCと結合でき、そのN末側2/3、C末側1/3がそれぞれドメインA、ドメインCに結合した。HtpGのシャペロン機能に必須のペプチド結合活性はドメインAに局在していた。3種類のヒトHSP90ファミリータンパク質(HSP90α、βおよび小胞体型HSP90であるGRP94)と真核細胞HSP90の大腸菌ホモローグであるHtpGを大腸菌発現系にて発現精製した。細胞におけるHSP90ファミリータンパク質のストレス誘導性を検討するために、骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞において、反復伸展刺激、熱ショック、亜ヒ酸処理を行った。どの場合もHSP90αの発現上昇が認められたが、特に亜ヒ酸処理で顕著に発現が上昇した。一方、これらの条件ではHSP90βやGRP94は変化しなかった。また非ストレス条件ではHSP90βの発現のほうが量的に優位であった。ラット臓器のHSP90αとβの分布を比較すると、ほとんどの組織でHSP90βが普遍的にかつ優位に発現していた。しかし熱ショックによってダメージを受けやすい細胞(神経細胞と精子)を含む脳と精巣においてHSP90αの発現が亢進していた。以上の結果から、HSP90αの組織特異的、ストレス誘導性の発現と、HSP90βの普遍的、恒常的発現が明らかとなった。全身性エリトマトーデス患者のもつ抗HSP90抗体の性質について検討し、HSP90βアイソフォームに選択的に結合する抗体を保持することを示した。

都臨床研の矢原らとの共同研究により、HSP90ダイマーは直列に並んだ4構造からなると判明した(Maruya et al.,in press)。私たちの以前の報告を考え合わせ、電顕観察でのHSP90ダイマーの4構造(以下の[ ]_<14>を示す)は、一次構造上の3ドメイン(A1C1、A2C2:ダイマーの各ペプチドを1、2で示す)が[A1]_1-[B1/C2]_2-[C1/B2]_3-[A2]_4と並んで形成されていると結論した。本年は以下のテーマを取り扱った。(i)二極類のHSP90アイソフォームの全身組織および口腔組織おける発現、(ii)HSP90の組織内での分子型の同定、(iii)HSP90ファミリー蛋白質〔HSP90、GRP94(小胞体型)、HtpG(大腸菌)]のドメイン構造の解析、(iv)HSP90sのターゲット分子結合領域の同定である。その結果、二つのHSP90アイソフォームのうち、HSP90βは恒常的、かつ優位に発現しおり、-方、HSP90は精巣や赤血球など組織特異的に、かつストレス誘導型の発現を示した。顎下腺、舌下腺、耳下腺、咬筋や、マウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1、ラット歯槽骨骨芽細胞や破骨細胞でもHSP90βがs優性であった。全身性エリテマトーデス患者の半数では抗HSP90抗体を産生するので、この抗体がHSP90α、βのどちらにより強く反応するかを検討した。その結果患者血清はHSP90βにより強く結合した。このことは多くの組織でHSP90βが優位であることと関連しているのかもしれない。しかし、反応性が弱く、かつサンプル数が少ないため有意差は得られなかったのでさらに検討する必要がある。HSP90α、βとも肝臓細胞質中では本来ダイマーがさらに重合したオリゴマー型が優位であるが、電気泳動中に(非変性条件はあっても)HSP90αはダイマーに、HSP90βはモノマーにまで解離してしまうことが判明した。HSP90ファミリー蛋白質は3ドメイン(N末側よりドメインA、B、C)からなり、そのうち、ドメインAとB、ドメインBとCが結合することが明らかとなっった。ドメインAには分子シャペロン活性に必須のターゲット蛋白質結合活性が局在していた。この活性は高温度条件での自己重合活性とカップルしていたので同じ活性を異なる方法でみているのだと結論した。
関心持続の脳内機構の解明とブレイン・エージェント・インタラクションの開発

エージェントやヒトとのインタラクションにおける関心持続の脳内機構を明らかにし,より「飽きのこない」インタラクション・エージェントの設計に活かす知見を売るための一連の脳イメージング研究を行なった.(1)脳の自発的活動の変動から状況への注意・関与状態のゆらぎが読み取れることを明らかにした.(2)HAIにおける内発的報酬,探索意図,文脈統制感などの,関心持続に重要な認知・情動的プロセスの神経基盤を解明した.(3)ヒト集団の自然なコミュニケーション/インタラクションへの関与が個人間の脳活動関係性から読み取れることを確立した.H24年度は,異なる適応性を持つ仮想エージェントとのヒューマン・エージェント・インタラクション(HAI)時の脳活動をfMRIで計測し,インタラクションとともに変化する内的状態の神経基盤を探る実験を行った.当初計画していたHAIと同時の主観的関心度サンプリングが困難であったことから,ログに基づき「思い通りの応答をさせた」時に高まる内発的報酬,「相手にとって予想外となりそうなアクションを選んだ」時に高い探索意図,「現在のやりとりが平均してどれだけ予想可能か」を表す文脈的統制感,などの内的状態を見積り,その変化に対応する活動を示す脳領域を探索するモデルベース解析を行った.その結果,内発的報酬には視床が正に,探索意図には左前頭眼野および両側の頭頂間溝が正に,それぞれ相関して賦活することが示された.一方,文脈統制感には両側の島皮質およびそれらを取り巻く下前頭回弁蓋部,上側頭回の活動が負の相関を示し,インタラクションが制御できない状況にある時ほどこれらの領域の活動が高まることが示された.これらの知見は,本研究の目的である,ユーザの脳活動からその内的状態をリアルタイムにモニタし,行動を選択する「飽きのこない」ブレイン・エージェント・インタラクションを実現するうえで重要である.また,ヒト同士がコミュニケーションを行っている際の前頭前野の脳活動を超小型NIRSで計測し,インタラクションの有無が脳活動間の関係性に与える影響を探る実験を行った.その結果,インタラクション条件では非インタラクション条件と比較して,Granger causality解析で定量化される脳活動間の同調的関係性強度が有意に高まることが示された.この結果は,脳活動からインタラクションの質や共感といった個々人に還元されないコミュニケーションにおける創発的な特性にアクセスできる可能性を示唆している.H25年度は,ヒト同士が自然な環境でコミュニケーションを行っている際の前頭前野の脳活動を超小型NIRSで計測し,インタラクションの有無が脳活動間の関係性に与える影響を探る実験を前年度に続けて行った.その結果,インタラクション条件では非インタラクション条件と比較して,脳活動間の同調的関係性強度が有意に高まることが明らかにされた.解析手法の工夫により,信号の同調性が外的なアーティファクトに依るものではなく確かに脳活動に由来するものであることも確立できた.この結果は,脳活動からインタラクションの質や共感といったインタラクションで生じる創発的な特性にアクセスできる可能性を示唆している.また,同じ対象に注意を向け続ける中での集中力の持続の変動に相関する神経基盤を探るためのfMRI実験を行った.その結果,集中が指定された対象から逸れている時にはデフォルトモードネットワーク(DMN)の活動が高まっているが,DMNの内側部と外側部,前部と後部の活動状態は違う意味合いを持つこと,また実行制御機能に関わるとされる背外側前頭前皮質なども集中が逸れている時に活動が高まっていることなどが観察された.これらの結果は,脳活動から集中の持続や逸脱をリアルタイムにモニタし振舞いに反映させることで「飽きのこない」ブレイン・エージェント・インタラクションを実現するための重要な知見である.本課題で得られた研究結果について,国際会議,国内学会にて成果発表を行った.また結果の論文化を進め,一部は国際学術誌に投稿済み,残りも投稿準備中である.エージェントやヒトとのインタラクションにおける関心持続の脳内機構を明らかにし,より「飽きのこない」インタラクション・エージェントの設計に活かす知見を売るための一連の脳イメージング研究を行なった.(1)脳の自発的活動の変動から状況への注意・関与状態のゆらぎが読み取れることを明らかにした.(2)HAIにおける内発的報酬,探索意図,文脈統制感などの,関心持続に重要な認知・情動的プロセスの神経基盤を解明した.(3)ヒト集団の自然なコミュニケーション/インタラクションへの関与が個人間の脳活動関係性から読み取れることを確立した.本研究の目的は,エージェントやヒトとのインタラクションにおける関心持続の脳内機構を明らかにし,より「飽きのこない」インタラクション・エージェントの設計に活かすことである.インタラクション時の注意,情動,共感,価値評価,意思決定に関わる脳領域の活動をfMRI/NIRSで計測し,主観的な関心度やそのリアルタイムな変化との対応を明らかにする.さらにヒト同士のインタラクションとヒューマン・エージェント・インタラクション(HAI)の結果を比較し,得られた知見を活かしてユーザの脳活動をリアルタイムにモニタするエージェントの開発を目指す.H23年度は,次項に述べる理由で,HAIの研究推進に充分なエフォートを割くことが困難であった.そのため,同時に推進している研究課題との共有部分を拡大し,上記目的達成の支えになる結果と方法の蓄積に努めた.

具体的には,注意・実行機能を要する認知課題を繰り返して行うとき,その都度パフォーマンスが変動することを「認知的かまえ(readiness)」の変動によるものと捉え,これを表現している神経基盤を,その自発的活動が直後に提示される認知課題のパフォーマンスに影響するようなネットワークとして,fMRIおよびMEG/EEG実験により全脳で探索した.実験の結果,いわゆるdefault mode networkを構成する楔前部,下頭頂小葉,内側前頭前野などでは直前の活動が課題パフォーマンスと負に相関し,他方で前頭前皮質背外側部,前帯状皮質背側,島皮質などの直前活動は課題パフォーマンスと正に相関することを示した.これら領域の多くはインタラクションの関心持続に関わると予想された領域と重なっており,認知的かまえを読み取りエージェントのアクションに反映させれば関心持続に大きく寄与すると期待できる.新たに明らかとなった問題に対処しつつ,H24年度までの計画として予定していたHAI時およびヒト同士のインタラクション時の脳活動計測実験の両方について現在までに実施し,関心の持続するインタラクションを実現するうえで重要な知見を得ることができた.また成果発表については,H23年度に行った「認知的かまえ(readiness)」の変動を反映した自発的活動を示す脳内ネットワークのfMRI研究の成果をジャーナル投稿して査読中であり,適応的エージェントとのHAI時の関心持続の神経基盤に関するfMRI研究およびヒト同士のコミュニケーション時の脳活動同調に関するNIRS研究についても発表準備を進めている.以上より,東日本大震災による初年度の計画の乱れもほぼ収束し,順調に進展していると言える.東日本大震災による実験研究環境への被害により約三ヶ月間にわたり研究が中断したこと,それにともない生じた既存研究課題の遅れ回復や新たに発生した職務への対応などにエフォートが割かれ,とくに適応的インタラクションエージェントに関しては当初の計画どおり進めることが出来なかった.他方で,上記のように関心持続に関連する脳内機構については予定以上の成果が得られており,研究課題の目的をふまえた全体的な観点からは,大きな遅れは生じていない.これまでに行った実験(とくに仮想エージェントとのHAIに関するfMRI研究)より,認識の更新とその内発的動機付けへの促進効果が関心持続の重要な要素として新たに示唆されてきた.そこでH25年度は慣れの生じた状況への認識更新とその情動的な帰結の神経基盤についてのfMRI実験を行う.その知見をこれまで得られた,状況統制感に基づく正負の価値評価,飽きに伴う探索意図,認知的かまえのゆらぎなどの神経基盤についての知見と統合する.これらのより,関心持続に重要な内的状態のうちNIRS計測からデコーディング可能なターゲットを選択し,ブレイン・エージェント・インタラクションの枠組を構築,その有効性を実験で検証する.エージェント設計に関する計画の遅れから,条件間で関心の持続に大きな差を生じうるようなインタラクションのデザインにはまだ時間がかかると予想される.その一方で当初計画を越えて,ヒト同士でのインタラクションにおける脳活動のNIRS同時計測などにも着手し,予備的なデータがとれている.
末梢神経損傷に対する肝細胞増殖因子投与およびストレッチングの併用効果の検証

脱神経筋モデル動物を用いて、骨格筋の線維化および萎縮因子を指標に伸張運動の効果を検討した。線維化に関与するTGF-beta 1、α-SMA、collagen、筋量をコントロールするmyostatin、筋特異的ユビキチンキナーゼであるMuRF1、atrogin-1は脱神経によって早期に増加した。さらに脱神経筋に対してゆっくりとした他動的伸張運動を加えたところ、それら因子は伸張運動を加えない群よりも著しく増加した。ゆっくりとした伸張運動は骨格筋の線維化および萎縮を助長するのかもしれない。何らかの外傷や絞扼により末梢神経損傷を来たした場合、その支配筋は神経支配を失い変性・萎縮する。骨格筋の機能不全は日常生活に障害をもたらすため、特に再神経支配が望める場合は変性や萎縮を予防する必要がある。脱神経筋に対するリハビリテーションとして、電気刺激や伸張運動が行われているが、その詳細な方法は確立していない。そこで、実験動物を用いて、右坐骨神経を切断することによって右足底筋を脱神経筋として骨格筋の線維化および萎縮因子を指標に伸張運動の効果を検討した。脱神経7日後に足底筋筋湿重量は著しく減少した。また、線維化に関与するtransforming growthfactor-beta 1、α-smooth muscle actin、collagen、筋量をコントロールするmyostatin、筋特異的ユビキチンキナーゼであるMuscle RING-Finger Protein-1 (MuRF1)、atrogin-1 mRNA発現量は脱神経後早期に増加した。さらに脱神経筋に対して1分間に12回、3回、0.5回の他動的伸張運動を一日に20分間加えた。その結果、それら因子は伸張運動回数が減少するほど伸張運動を加えない群よりも増加した。これらの結果は、ゆっくりとした伸張運動は骨格筋の線維化および萎縮を助長することを示しているのかもしれない。しかし、伸張運動は運動速度、伸張時間、伸張トルク、時間など多く要因が関与するため、今後さらに詳細な検討が必要である。末梢神経損傷後の筋萎縮抑制はリハビリテーション医学分野において重要な課題の一つである。脱神経筋に対するストレッチの効果を検討した。本年度は、ラット脱神経筋に対するストレッチの効果を調査するため、脱神経モデルラットの脱神経筋に対して膝関節伸展位での足関節背屈運動(ストレッチ)を3週間実施した。筋萎縮抑制効果の指標として筋湿重量、筋線維横断面積、Atrogin-1 mRNA、MuRF1 mRNA、Myostatin mRNA発現量、アポトーシスの指標としてTUNEL陽性細胞数を検討した。その結果、腓腹筋筋湿重量はストレッチを加えたことで、加えなかった群に比べてやや高値を示した。これに対して、ヒラメ筋筋湿重量は、ストレッチを加えた群では、加えなかった群に比べて低値を示した。次に腓腹筋の筋線維横断面積、mRNA発現解析、免疫染色を実施した。筋線維横断面積はストレッチを加えることで加えない群に対して高い値を示したが、その差は有意ではなかった。また、Atrogin-1、MuRF1、Myostatin mRNA発現量は、ストレッチによって変化しなかった。TUNEL陽性細胞数についても検討したが、明らかな差は認められなかった。今回、ストレッチ群のヒラメ筋筋湿重量が減少していることから、ストレッチ群には介入時の麻酔や運動抑制等のストレスが加わることで、介入効果が減少した可能性が考えられた。また、今回、二関節筋である腓腹筋に対するストレッチを実施したが、先行研究による脱神経筋に対するストレッチの筋萎縮抑制効果については、ヒラメ筋の報告が多く、線線維タイプによる影響も考えられた。脱神経筋に対するストレッチの効果が十分ではなく、ストレッチの方法や時間等の実験方法や対照となるグループの運動量を調整する等の再検討が必要がある。脱神経後に介入を加える動物と加えない動物の運動量を調整するため、拘束時間、麻酔時間等を厳密に調整して実験を行う。まずは、脱神経後の筋萎縮、アポトーシス、線維化の経時的変化を検討し、次に脱神経筋に対するストレッチの短時間効果を検討する。結果によって、長期的な介入効果を検討し直す。効果が得られれば、さらに薬剤投与の効果を検討する。実験動物、遺伝子抽出試薬、遺伝子解析試薬、アポトーシス検出試薬、組織染色試薬とそれらに関連する消耗品を購入する。また、解析機器使用料や学会参加費が必要である。
ルーメン藻菌の増殖とアミノ酸要求に関する研究

本研究はルーメン藻菌のアミノ酸要求性をあきらかにして、藻菌の培養技術の向上、保育酵素やその遺伝子ならびにルーメン微生物生態系に占める役割の解析などに貢献することを最終目的としている。優占種であるNeocallimastix属菌および稀少種Caecomyces属菌を使用して、以下のような知見を得た。従来の藻菌用培地を改変し、硫酸アンモニウムのみをN源とする基礎培地を開発した。これに18種のアミノ酸を種々の組合せで等モル混合したものを添加し、藻菌の増殖促進効果の有無をしらべた。この際、増殖の指標としキチンの代わりにタンパク質を用いることにしたが、両者に高い正の相関があることを確認した。18種のアミノ酸(18AA)、10種の必須アミノ酸(10EAA)、8種の可欠アミノ酸(8NEAA)の等モル混合物を添加した場合、硫酸アンモニウムのみの基礎培地(C)と比べ、有意な生育促進がみられ、特に18AAで最も効果大であった。18AAから含硫アミノ酸を除くと明確な生育低下がみられ、この低下は無機の硫黄源の添加では回復できなかった。同様な生育抑制は18AAから芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸などを除いた場合にもみられたので、これらのアミノ酸に対する要求が高いものと考えられる。またリジン、メチオニン、ヒスチジンの等モル混合液の添加は18AA添加と同等の生育促進効果があった。しかしOrpinらが効果を認めたグルタミン酸、メチオニン、セリン混合液の添加では、Cより有意な生育増がみられなかった。以上がNeocallimastix属菌にみられた反応である。Caecomyces属菌でも18AAおよび8NEAAの増殖促進効果がみとめらたが、10EAAによる効果はまったくなかった。このことから、ルーメン藻菌は種属によりアミノ酸要求がことなることが示唆された。羊から分離したNeocallimastix sp.N13について培地へのアミノ酸添加が生長に及ぼす効果を検討した。N13株はろ紙(東洋ろ紙No.1)を炭素源としたJoblin(1981)の培地で6日ごとに継代保存したものを用いた。Joblin培地からルーメン液、イ-ストエキストラクト、トリプチケース、システインを除き、ルーメン細菌用のビタミン溶液、VFA溶液、硫化ナトリウムを添加し、窒素源を硫酸アンモニウムとしたものを基礎培地とした。アミノ酸は1O種の必須アミノ酸(Arg,His,1le,Leu,Lys,Met,Phe,Thr,Trp,Val)(1OEA)、8種の非必須アミノ酸(A1a,Asp,Cys,GIu,GIy,Pro,Ser,Tyr)(8NEA)およびこれら全部合わした18種のアミノ酸の等モル混合物(18A)をつくり、それぞれ等N量となるように基礎培地に添加してアミノ酸添加塔地とした。18A,10EA,8NEAの添加(5mg/ml)は無添加に比べ有意に生育量を増加させ、とくに18Aは効果的だった。.18Aから合硫アミノ酸を除くと生育量は有意に低下した。18Aから芳香属アミノ酸や分枝鎖アミノ酸を除いても同様な傾向が認められたが、合流アミノ酸の場合ほどではなかった。18AからMet,Cysのどちらか一つを除いても生育抑制がみられ、両方とも除いてNa_2S0_4を加えても効果がみられなかったが、Na_2Sを加えると幾分回復かみられた。0rpin and Greenwoodが効果的としたGIu,Met,Serの添加では効果がみられなかった。

ルーメン細菌のinvitro増殖に効果的な組合せLeu,Met,Hisの添加は3日目までの生育量では18Aと変わらなかった。以上の結果からNeocallimastix sp.N13はアミノ酸無しでも生育できるが、多種類のアミノ酸の存在は生育を著しく促進し、とりわけ含硫アミノ酸への要求は高く、しかもそれは無機の硫化物では代替できないことが明かで、同じNeoca1limastix属でもアミノ酸要求は多様であることを示唆した。本研究はルーメン内嫌気性藻菌の培養法の改善のため、またルーメン微生物生態系でのニッチを推定する目的で、藻菌の栄養要求性、とくにアミノ酸要求性について検討するものである。本年度はルーメン内の稀少種で、しかも培養がむづかしく、単離藻菌を使った報告例のないCaecomyces属菌をもちいて昨年度のNeocallimastix属菌と同様な検討を行い、属間のアミノ酸要求性の違いを比較した。本Caecomyces sp.K1においてもタンパク質合成量とキチンのそれとは高い正の相関をみとめた(r=0.80,p<0.001,n=102)ので、増殖の指標として菌体タンパク質をもちいることにした。N源として硫酸アンモニウムのみを含む基礎培地に18種のアミノ酸(18AA)、10種の必須アミノ酸(10EAA)、8種の可欠アミノ酸(8NEAA)を添加したところ、8NEAA、18AAの順に増殖を有意に促進したが、Neocallimastix属菌で効果のあった10EAAの添加はまったく無効であった。一番効果のあった8NEAAから、Ser,Glu,Gly,Cysを各々除いたものを添加したところ、Ser,Cysを除去した時、有意に増殖量が低下したので、これらが本菌の生育を左右する因子のひとつであると考えられた。CysについてはNeocallimastix sp.N13の場合にも有効性が認められているが、Serは同菌にそのような効果をあたえなかった。しかし、Orpinの報告にあるようにNeocallimastix patriciarumではSerの増殖促進効果がある。このように、ルーメン藻菌のアミノ酸要求性は、属はもちろんのこと種や株によっても異なる可能性があることがわかった。
微小結晶評価用マイクロLFB超音波プローブの開発

通常のLFB超音波プローブのトランスデューサ装着面を超音波ビームの非集束方向に緩やかに湾曲させることで、超音波ビーム照射領域を小さくした200MHz帯マイクロLFB超音波プローブを作製した。点集束ビーム超音波プローブを受波プローブとして非集束方向の音場分布を計測したところ、0.26mmの幅となり通常のLFB超音波プローブに比べて1/3以下となった。Y-cutおよびZ-cutのLiTaO_3や(110)面および(111)面のGeを用いて異方性検出能力を実験的に検討した結果、超音波ビームの集束方向にのみ漏洩弾性表面波(LSAW)が励振され、通常のLFB超音波プローブと同様に試料の異方性(LSAW速度の伝搬方向依存性)の検出ができた。また、LSAW速度の測定再現性も、通常のLFB超音波プローブと同程度で得られた。このため、基本的には従来の標準試料を用いたシステムの校正方法を適用できる。超音波ビームの非集束方向の測定領域幅が狭くなったことにより、試料面の傾きに対する感度が鈍感になったため、超音波ビームの焦点位置計測を利用した試料のアライメント方法を検討した。最後に、測定領域の空間分解能について、Z-cut ZnO単結晶試料に対するLSAW速度の2次元分布計測を通して検討した。通常のLFB超音波プローブでは測定領域内の特性の分布が平均化されて検出できなかった速度分布をマイクロLFB超音波プローブでは検出することに成功した。これにより、開発初期の微小結晶の評価だけでなく、結晶内の微小領域で特性が変化している試料に対する評価が可能なマイクロLFB超音波プローブの開発に成功した。本研究の目的は、材料開発の初期段階で適用でき、0.5mm角程度の微小結晶でも高精度に弾性特性と圧電特性を評価できる技術を開発することにある。そのために、研究代表者らが開発した直線集束ビーム超音波材料解析(LFB-UMC)システムの円筒レンズの両端を少し絞るようにして、LFBシステムが有する異方性を評価できる特長を維持したまま集束領域を狭めて、0.5mm角程度の微小結晶に適用可能にする。平成18年度の研究成果を要約すると以下の通りである。1.マイクロLFB超音波プローブの設計(1)音場計算プログラムの作成マイクロLFB超音波プローブの精度を確保するには、プローブの形状による音場制御がキーポイントとなる。その計算を行うための数値計算プログラムを作成した。(2)数値計算作成したプログラムにより、いくつかの候補となるレンズ形状を挙げた。2.マイクロLFB超音波プローブの作製(1)数値計算結果をもとにレンズを加工した。(2)超音波トランスデューサの作製超音波トランスデューサとして、ZnO圧電薄膜を形成した。また、サファイア(音響レンズ)と水では音響インピーダンスが大きく異なるため、カルコゲナイドガラス(As:S:Se=4:4:2)を真空蒸着することで音響整合層を形成した。3.音場、挿入損失の評価2で作製したマイクロLFBプローブの挿入損失および音場を計測し、(1)の数値計算結果と比較した。音場分布の計測は、マイクロLFB超音波プローブと点集束ビーム(PFB)超音波プローブを対向し、互いの焦点を一致させ、PFB超音波プローブを走査することにより行なった。
分裂酵母の胞子形成におけるオルガネラ再構成の解析

胞子形成は細胞質中に新たな細胞膜である前胞子膜が新生するという、ダイナミックなイベントである。これまでに、前胞子膜の伸展には、小胞体、ゴルジ体、細胞膜といったオルガネラからの膜小胞輸送が必須であり、胞子形成時にはオルガネラの大規模な再構成が起こることが明らかになっている。また、以前取得した245株や、過去の研究で取得された数多くの胞子形成欠損変異株の中には、オルガネラ再構成が異常なものがみられている。本研究はこのオルガネラ再構成が、胞子形成にどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的とする。前年度までの結果から、前胞子膜形成の開始欠損株において、Rab GTPaseであるYpt2がSPBに局在が変わることが分かっている。その局在がSPB構成因子であるSpo13依存的であったことから、Ypt2の局在時期を詳細に調べた。その結果、第一減数分裂の後期、Spo13にやや遅れてSPBに局在することが分かった。第一減数分裂時には未だ前胞子膜が形成されていないことが確認されている。これまでの結果と合わせて、Ypt2のSPB局在は前胞子膜には依存しておらず、Spo13に依存することが明らかとなった。Ypt2の上流のRabであるYpt3がこの局在を調節している可能性を検証するため、ypt3-変異株において、減数分裂時のSpo13およびYpt2の局在観察を行った。その結果、Spo13もYpt2もSPBへの局在が確認され、Spo13およびYpt2のSPB局在はYpt3依存的ではないことが示された。すなわち、出芽酵母等で知られているようなRab GEFカスケードとは異なる局在の依存性を持つ可能性が示唆された。Spo13はYpt2のGEFであるSec2と類似の配列をもつことから、Sec2がspo13欠失による胞子形成欠損を抑圧できるかどうかについて検討した。Sec2をSpo2と融合することでSPBに局在できるようにし、これを強制発現させたところ、Spo2単独で発現させた場合よりも胞子を多く形成した。このことから、Spo13はYpt2をSPB局在させることで、前胞子膜形成の開始に関わることが示唆された。平成25年度は、前年度に引き続き詳細な解析を行うとともに、結果をまとめてモデルを構築する予定であった。実際にエキソサイトーシス経路におけるRabとSPBの関係性の解析を行い、これらが共働して前胞子膜形成の開始に関わるモデルを構築した。加えて、栄養増殖から胞子形成における前胞子膜形成への切り替えがGEFで調節されている可能性を見出すことができ、研究は進展したと判断できる。しかしながら、平成25年度中の論文受理には至らなかった点から、やや遅れていると評価した。これまでに得られた実験結果から、分裂酵母の前胞子膜形成開始におけるエキソサイトーシス経路とSPBの協働と、GEFによるエキソサイトーシスから前胞子膜形成への切り替えのモデルを構築した。今後は本研究に関する論文の受理を目指す。胞子形成は細胞質中に新たな細胞膜である前胞子膜が、減数分裂と同調して新生するという、非常にダイナミックなイベントである。また、私が以前取得した245株も含め、過去の研究で取得された数多くの胞子形成欠損変異株の中には、オルガネラの再構成に異常なものがみられている。本研究はこのオルガネラの再構成が、胞子形成にどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的とする。まず、胞子形成時のオルガネラ動態に重要であると考えられるメンブレントラフィックに着目し生細胞観察の系を構築した。その中でも特に、様々なオルガネラ間のメンブレントラフィックの調節因子であるRab GTPaseに着目した。Rab GTPaseは酵母からヒトまで広く保存されている。これまでに取得した胞子形成欠損株を、前胞子膜形態から(1)前胞子膜形成の開始欠損、(2)前胞子膜の伸張欠損、(3)一細胞中にサイズの異なる胞子状構造が共存、の3つのカテゴリーに分類し、構築した観察系を用いてオルガネラ動態の観察を試みた。興味深いことに、複数の(1)前胞子膜形成の開始欠損株において、エキソサイトーシス経路に関わるRab GTPaseの局在の変化が観察された。この観察結果から、胞子形成時におけるエキソサイトーシス経路と前胞子膜形成の開始部位であるspindle pole body(SPB)との関連性が見出された。さらに、(1)前胞子膜形成の開始欠損株に分類されたspo26変異株の原因遺伝子が、エキソサイトーシス経路に関わるRab GTPaseであるYpt3をコードしていた。以上のことから、エキソサイトーシス経路とSPBの相互作用が前胞子膜形成の開始に重要な役割を担っていることが示唆された。