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地球からの生命の分化-環境変動下での自己触媒系の安定性と進化-

生命の誕生に必要な遺伝系が確立されるには,前生命的な環境で十分な長さのポリマー分子が生成される必要がある.しかし,ポリマー合成反応の平衡定数は短分子側に偏っているため,平衡状態ではポリマーの濃度は長さの増加とともに指数関数的に減少する.よって非平衡状態において高分子ポリマーが選択的に高濃度に合成される相互触媒反応ネットワークが存在するかどうかが鍵となる.そこで系内の総モノマー数が一定という条件のもと,系外からの数種のモノマーが供給され,触媒・非触媒の合成分解反応により種種のポリマーがつくられ,各合成ポリマーが濃度に応じて流出するという数理モデルを構築した.触媒反応は,全ての可能な反応のうち一定の触媒確率で実現され,非触媒反応に比べ,触媒効率と触媒濃度の積のファクターだけ正逆の反応速度が増加するとした.一定のしきい値を越える濃度のポリマー間で触媒反応を実現させ定常状態を計算し,その結果新たにしきい値を越えるものを求める.これを繰り返し,新たに加わるポリマーが無くなる真の定常状態まで計算をした。その結果,反応定数が1を越えると非平衡状態で平衡状態の数十倍の濃度を持つポリマーが選択的に合成されることが明らかになった.また,反応定数が1より小さくても,分解生成ポリマーが合成触媒反応でつくられない触媒分解反応があれば,非平衡状態で平衡状態を上回る濃度のポリマーが選択的に合成された.こうした反応系は初期地球の熱水鉱床のまわりで実現される可能性が高く,外界環境によりモノマー供給率や反応定数が変動する場合について,この数理モデルを拡張することが重要であることがわかった.生命の誕生に必要な遺伝系が確立されるには,前生命的な環境で十分な長さのポリマー分子が生成される必要がある.しかし,ポリマー合成反応の平衡定数は短分子側に偏っているため,平衡状態ではポリマーの濃度は長さの増加とともに指数関数的に減少する.よって非平衡状態において高分子ポリマーが選択的に高濃度に合成される相互触媒反応ネットワークが存在するかどうかが鍵となる.そこで系内の総モノマー数が一定という条件のもと,系外からの数種のモノマーが供給され,触媒・非触媒の合成分解反応により種種のポリマーがつくられ,各合成ポリマーが濃度に応じて流出するという数理モデルを構築した.触媒反応は,全ての可能な反応のうち一定の触媒確率で実現され,非触媒反応に比べ,触媒効率と触媒濃度の積のファクターだけ正逆の反応速度が増加するとした.一定のしきい値を越える濃度のポリマー間で触媒反応を実現させ定常状態を計算し,その結果新たにしきい値を越えるものを求める.これを繰り返し,新たに加わるポリマーが無くなる真の定常状態まで計算をした。その結果,反応定数が1を越えると非平衡状態で平衡状態の数十倍の濃度を持つポリマーが選択的に合成されることが明らかになった.また,反応定数が1より小さくても,分解生成ポリマーが合成触媒反応でつくられない触媒分解反応があれば,非平衡状態で平衡状態を上回る濃度のポリマーが選択的に合成された.こうした反応系は初期地球の熱水鉱床のまわりで実現される可能性が高く,外界環境によりモノマー供給率や反応定数が変動する場合について,この数理モデルを拡張することが重要であることがわかった.
マスクレス真空蒸着による高分子表面への微細金属パターン形成

高分子膜表面への金属膜形成は、基礎研究から産業面で幅広く行われており、主に真空蒸着時にマスクを用いる手法が使用されている。ただし微細なパターン形成や大面積化が難しかった。本研究では、溶媒蒸発法とマスクレス蒸着を用いた新しい金属パターン作成法を開発した。高分子表面に有機溶媒を塗布すると、溶媒分子は表面を膨潤し蒸発する。この時に表面の高分子鎖間に隙間が出来、分子鎖の運動状態が活発になる。これに金属蒸気を堆積すると、金属原子は活発な分子運動の影響で表面から離脱し、堆積しない。この原理は数種類の高分子半導体材料や金属種に対して確認され、また10ミクロンレベルの微細パターンも可能であることが実証された。本研究は高分子表面にマスクレス真空蒸着によって、微細な金属パターンを形成する技術の開発を目的としている。従来はこのような金属パターン形成は、主にシャドウマスクを用いた真空蒸着が用いられてきたが、本研究ではガラス転移点(Tg)が異なる材料からなる有機膜表面での選択的金属蒸着現象を拡張し、比較的高いTgを有する単一の高分子半導体表面でも、所望の金属パターンをマスクレス蒸着で形成可能にするものである。今年度の研究では、単一の比較的高いTgを有する高分子半導体膜に有機溶剤を少量塗布・蒸発させた表面状態が、低Tg高分子膜と同様に金属Mg蒸気原子を堆積させないことを確認した。典型的高分子半導体材料であるMEH-PPV(Tg=70°C)及びP3HT(Tg=110°C)をそれぞれクロロホルムに溶解し、ガラス基板上にスピンコート法で塗布・乾燥することで高分子半導体膜を形成した。これにシクロヘキサノン溶媒を極少量滴下して1時間真空乾燥後Mgを真空蒸着したところ、溶媒が滴下されなかったところにはMg膜が形成され、滴下した箇所にはMg膜が形成されなかった。別途AFMフォースカーブ法で、この溶媒滴下・乾燥領域と非滴下領域の表面硬度を比較したところ、滴下領域表面が顕著に軟化していることが判明した。この原因としては残留溶媒の影響と、溶媒蒸発に基づく表面高分子鎖間隔の広がりによる移動度の向上(高分子鎖の運動の活発化)の二通りが考えられる。しかしながら、FTIR-ATR法によって表面残留溶媒は検出されず、原因は後者であると結論され本研究の原理的な確認に成功した。今年度は、さらにMg以外の金属種への可能性も検討し、MnやPbでも可能であることが判明し、また応用展開としてこの手法によるMEH-PPVを発光層とするポリマーELの陰極パターニングも実証した。従来はこのような金属パターンを形成するには、シャドウマスクを用いた真空蒸着が用いられていたが、本研究ではこれまで行ってきた低ガラス転移点(Tg)有機表面での金属原子離脱現象を拡張し、比較的高いTgを有する単一の高分子表面でも、所望の微細な金属パターンをマスクレス蒸着で形成可能にするものである。昨年度は代表的高分子材料であるポリスチレンや高分子半導体であるMEH-PPV膜に対して、溶媒印刷と蒸発により表面高分子鎖の運動を活発化させることで、Mg、Pb、Mnなどの金属蒸気の非堆積現象を確認することができた。この研究結果を基に、今年度はこの原理に基づくこれらの金属種のマスクレス蒸着におけるパターン形成の解像度限界を調べた。解像度限界を調べるには微細な溶媒印刷を行う必要がありインクジェット法が最適ではあるが、実験装置上の困難があるため代わりに溶媒ミスト法を用いた。これはスプレー法で微細な溶媒のミストを形成し、高分子表面に落下させて微細な溶媒塗布スポットを作る方法である。その後に、高分子膜上に金属のマスクレス蒸着を行い、金属の非堆積パターンを観察するのである。有機半導体高分子材料であるMEH-PPVとP3HTの膜に、クロロホルム、トルエン、シクロヘキサノンをそれぞれ溶媒ミスト法で噴霧し、Mgをマスクレス蒸着して得られた金属パターンを観察した。その結果、数ミクロンから数十ミクロンのMg非堆積領域が確認された。特に高分子に対する貧溶媒でもこの現象が生じた。これは、この溶媒印刷+マスクレス金属蒸着によって、数ミクロンレベルの金属パターンが形成可能であることを示している。以上の結果は、高分子エレクトロニクス分野における微細電極パターン形成への応用が期待できる。当初の計画では、高分子表面における金属原子の離脱(=非堆積)現象の原因解明手段として、AFMフォースカーブ法とFT-IR ATRによる残留溶媒の有無を調べることとしていた。今年度は計画に基づき、汎用のポリスチレンなどだけでなく高分子半導体膜においても上記評価を行い、この研究の原理的な実証が行えた。

また他の金属種として、PbやMnに対する非堆積現象も実証することができた。さらにスタンプ法による溶媒印刷で、MEH-PPVを発光層とする高分子ELのMg陰極パターニングを行い、それに対応する発光パターンも確認できた。尚、計画調書に記載していたAuに対する非堆積は、現状のところ極めて困難であり、今後のさらなる研究が必要である。以上より、本研究は当初の計画通り進展していると判断できる。有機機能材料・デバイス前年度の研究成果を受けて、今年度は高分子半導体表面への溶媒印刷とマスクレス金属蒸着による微細金属パターニングの解像度限界を調べる。金属パターンの解像度を調べるには、微細な溶媒印刷が必要であるが、インクジェット法による直接的な微細溶媒液滴印刷を行う代わりに、溶媒ミスト噴霧法を利用する。有機溶媒ミストは数十ミクロンサイズなので、高分子膜にそれに相当する液滴塗布領域ができることになる。これに金属蒸着を行い、対応する金属非堆積領域が形成されるようする観察することで、金属パターニングの解像度を調べることができる。これが達成できれば、高分子エレクトロニクスの新しい微細な金属電極形成方法として有望であろう。年度末執行分の旅費・物品費に、若干の誤差が発生した。前年度の若干の残額は、今年度物品費として使用する。
選択的ニューロキニン１受容体拮抗型制吐剤が術後嘔気・嘔吐に及ぼす影響

硬膜外併用全身麻酔にて開腹手術を施行された患者に対し、「プロイメンド」群もしくは「オンダンセトロン」群に無作為に振り分け制吐作用を調査した。術中使用した麻酔薬および麻薬の量、麻酔時間、手術時間、出血量、輸液量にも両群に有意差はなかった。術後0-2時間、2-24時間後、24-48時間後、48-72時間後、の比較において、術後嘔気に対しては両群に有意差はなかったが、嘔吐に関しては「プロイメンド」群において有意に「オンダンセトロン」群と比較してその発生頻度が減少した。また、硬膜外併用全身麻酔にて人工関節置換術を施行された患者を対象とした場合も、同様の結果となった。硬膜外併用全身麻酔にて開腹手術を施行され、硬膜外より術後鎮痛の目的にて麻酔剤の持続注入を行われる予定の患者を対象とし、American Society of AnesthesiologistsのPhysical StatusにおいてがクラスIおよびクラスIIの20-70歳で本人の同意取得が得られた患者に対し、同意取得後に「プロイメンド」群もしくは「オンダンセトロン」群に無作為に振り分けた。手術室入室後に硬膜外カテーテルを留置、その後麻酔の導入・維持は通常の方法で行った。通常の麻酔同様に麻酔薬以外の鎮痛剤、筋弛緩薬などは便宜投与・調整し、麻酔深度モニターを用い十分な麻酔深度を保つと共に安定した麻酔管理を行った。術後疼痛対策に麻酔薬の持続硬膜外注入をおこなった。麻酔終了数時間後、1日後、2日後、3日後に術後の嘔気・嘔吐に関する術後回診を行いPONVの発生頻度の集計を行った。年齢、身長、体重、喫煙の有無、術後嘔気嘔吐の既往、乗り物酔いの既往などの患者基本データーに両群に有意差は認められなかった。硬膜外併用全身麻酔にて人工関節置換術を施行され、硬膜外より術後鎮痛の目的にて麻酔剤の持続注入を行われる予定の患者を対象とした。American Society of AnesthesiologistsのPhysical StatusにおいてがクラスIおよびクラスIIの20-70歳で本人の同意取得が得られた患者に対し、同意取得後に「プロイメンド」群もしくは「オンダンセトロン」群に無作為に振り分けた。術後疼痛対策に麻酔薬の持続硬膜外注入を行った。以下について各群に有意差があるかを調べる。年齢、身長、体重、喫煙の有無、基準血圧、PONVの既往、乗り物酔いの既往、病名、術式、術中使用した麻酔薬および麻薬の量、麻酔時間、手術時間、出血量、輸液量については両群間に有意差は認められなかった。術後0-2時間、2-24時間後、24-48時間後、48-72時間後、および急性期(0-24時間)、遅発期(24-72時間)、全期間(0-72時間)での各群の状況を評価した結果、嘔吐においてプロイメンド群が有意にオンダンセトロン群に比べ発生頻度が減少した。麻酔科学申請書に記載した研究目的に対し、平成25年度の進捗度合いは同じであり、おおむね順調と思われる。今後は申請書にあるとおり、人工関節置換術を施行される患者に対してのデーターを取る予定である。
衝突破片の速度分布とエネリギー分配に関する実験的研究

立方体及び球形の葉蝋石を標的とした衝突破壊実験を、衝突速度400900m毎秒の範囲で行い、破片の飛散する様相を高速度カメラで撮影した。そのフィルムの解析から各々の破片の初期位置及び3次元速度を求めた。それらの解析から、以下の結果が得られた:1.他のグループが提唱していたような破片速度と破片質量の間の負の相関関係は見られず、破片速度は、破片質量にはよらず衝突条件によって決まるほぼ一定の値になる。2.各衝突で形成される全破片の平均速度(1で述べた一定値)は、その衝突の無次元衝突応力パラメターの1乗に比例する。無次元衝突応力パラメターとは、衝撃波が標的の背面に到達した時の圧力を標的強度で正規化したものである。3.一回の実験の各々の破片速度は、衝突地点から破片が標的内で最初にいた位置(初期位置)までの距離の-4/5乗に比例する。4.全ての実験の破片速度は、破片の初期位置における衝撃波の圧力の1/4乗に比例する式によりスケーリングできる。これらの関係式は、無次元衝突応力パラメターの定義式から直接求めることはできないけれども、このパラメターが破片のサイズ分布のみならず破片速度に関しても良いスケーリング・パラメターであることを示唆している。さらに、衝突破壊現象に関するスケーリング則を理解するためには、衝突により発生する圧力とその発生領域の大きさ、及びその衝撃波の減衰率の理解が重要であるという、従来からの我々のグループが主張してきた指導原理が正しい事を示している。葉蝋石を標的とした衝突破壊実験を、400900mの毎秒の衝突速度範囲で行った。その様相を高速度カメラで撮影し、その解析から破片の速度分布を求めた。破片の速度に関して、本研究が開始された時点における最も大きな論点は、破片速度の破片質量への依存性であった。すなわち、他のグル-プにより行なわれてきた従来の実験(衝突速度範囲は1000m毎秒以上)の結果は、破片速度と質量の間に-1/6乗の明瞭な負の相関があることを示していたのに対して、本研究の予備実験(秒速500m以下)は、破片速度が殆ど一定で質量依存性が無いことを示していた。この点に関しては、中間の速度領域で行なった本研究の結果は、わずかではあるが、負の相関が有ることを示した。しかし、それは従来の結果に示されていたもの程明瞭なものではなかった。本研究により新たに得ることができた結果の一つは、一回毎の実験の破片速度が、破片質量よりもむしろ、衝突点から破片の初期位置までの距離と負の相関を示すことである。この相関関係はどの実験においても顕著に示されており、その指数は約-4/5であった。この結果と、衝突点で発生する衝撃波の圧力とその減衰の計算から、破片速度が破片の初期位置における衝撃波の圧力の1/4乗に比例することを、全ての実験デ-タについて明らかにすることができた。この結果は、衝突破壊により形成された破片の大きさが、衝撃波の強度により記述できるという我々のグル-プのスケ-リング則と調和的である。しかし、1/4という係数の物理的意味などについての解明には、衝撃波の減衰率や継続時間などについての計算を含めたより詳細な検討が必要であり、平成4年度の研究課題である。

2.各衝突で形成される全破片の平均速度(1で述べた一定値)は、その衝突の無次元衝突応力パラメターの1乗に比例する。無次元衝突応力パラメターとは、衝撃波が標的の背面に到達した時の圧力を標的強度で正規化したものである。3.一回の実験の各々の破片速度は、衝突地点から破片が標的内で最初にいた位置(初期位置)までの距離の-4/5乗に比例する。4.全ての実験の破片速度は、破片の初期位置における衝撃波の圧力の1/4乗に比例する式によりスケーリングできる。これらの関係式は、無次元衝突応力パラメターの定義式から直接求めることはできないけれども、このパラメターが破片のサイズ分布のみならず破片速度に関しても良いスケーリング・パラメターであることを示唆している。さらに、衝突破壊現象に関するスケーリング則を理解するためには、衝突により発生する圧力とその発生領域の大きさ、及びその衝撃波の減衰率の理解が重要であるという、従来からの我々のグループが主張してきた指導原理が正しい事を示している。
難治性腫瘍の治療効果改善のためのマイクロ・マルチリ-フ装備集光照射装置の開発

集光照射(radio-surgery)は、頭蓋内の病変に、多方向から集束する細い放射線線束を集中して、病変のみを破壊する放射線治療の方法である。腫瘍にあわせて不整形標的容積の照射野を作成するのに、これまでは円筒形のコリメータを交換して照射を繰り返していた。しかし、複数shotを用いると、線良分布が悪くなり標的容積内で均一な線量分布を得られないのみならず、周囲の正常組織に線量が増加するなどの欠点がある。不整形照射容積の線量分布は小型のマルチリ-フ装置によって改善が期待されるが、実際にはリ-フの枚数、コリメータの取付位置などの問題は十分に検証されていない。本研究では、集光照射用に任意の不整形照射野を作成可能な着脱式不整形コリメータ装置を開発した。治療計画装置での出力結果から腫瘍の形状にあわせて、最大4cm径までの照射野形状の型を自動的に作成し、タングステン砂を型にいれることにて実際の照射野を作成するシステムを開発した。詳細設計に先立ち、必要な照射野の大きさ、厚み等を求めるシミュレーションをワークステーションにておこなった。CT装置よりの画像転送プログラムを開発し、CTで得られた腫瘍形状を3次元的に把握して、不整形照射野を決定した。また、コンピュータシミュレーションにより、マイクロ・マルチリ-フ装置を用いた場合のDose-Volume Histogram解析をおこない、最適の線量分布となるような照射野の形状、動きを求めた。今後、基礎的研究の結果をふまえて、線量分布、照射精度および安全性などが十分であることを確認した後、臨床的に応用する予定である。
赤痢菌の病原性研究を基礎にした分子遺伝子的手技による赤痢弱毒生菌ワクチンの試作

B群赤痢菌の病理発生に関する分子遺伝学的研究成果に基づき、経口弱毒生菌ワクチンを作成した。それはvirGとthyA遺伝子の重複変異株である。本株の安全性と有効性をカニクイザルとモルモットを用いて検討した。ワクチン株の湿菌100mgをサル胃内に投与後1日ではまだ消化管に生菌が検出されるが、その後漸次減少し、4日以上生存することはなかった。ワクチン株の湿菌100mgを1週間間隔で3回胃内投与した場合、20匹中8匹に軽い様下痢が起こった以外には副作用はなかった。ワクチン株3回投与後28日に強毒株湿菌量50mgの強毒株を胃内投与すると対照群では15匹中10匹(67%)、ワクチン群では15匹中7匹(47%)が発症し、粘血下痢を起こした。3日以内に死亡したのはそれぞれ15匹中6匹(40%)、2匹(13%)であり、発症ザルの致命率はそれぞれ60%、29%であった。強毒株菌量を湿菌20mgにすると対照群5匹中4匹(80%)が発症し、死亡したのに対し、ワクチン群では5匹中1匹(20%)が発症し、3日以内死亡例は0であった。ワクチン投与後強毒株に耐過したサルでは大腸粘膜の組織構造はよく保持され、杯細胞の著名な粘液貯溜と分泌のこう進、形質細胞の機能促進が認められた。ワクチン非投与で強毒株投与後死亡したサルでは粘膜上皮の著明な欠損や、組織全体の変性、融解が強く、出血性偽膜性大腸炎が認められた。免疫学的にはワクチンの抗原性は防御抗体産生を引き起こすに十分な能力を保持していた。しかし、ELISA用抗原として全菌体を用いたため、ワクチン投与群のうち、非発症例、発症後回復例、発症後死亡例は何れも強毒菌投与前にlgAとlgBを産生し、その抗体価に差を認めなかった。モルモットを用いた方法によれば対照群で全例陽性になる条件下で、ワクチン群は全例陰性(有効)であった。以上を総括し、本ワクチンは、まだ改良の余地は大であるが、ほぼ完全かつ有効であると結論した。吉川代表と笹川班員による赤痢菌の病原性に関する分子遺伝学的研究を基礎にして,弱毒生菌ワクチンの作出を試み,その有効性と安全性をサルを用いて検定し,病理学的,免疫学的に確認するため本研究を企図した。フレキシナ-赤痢菌親株の細胞侵入性プラスミド上にある細胞間拡散に関わるvirG遺伝子にトランスポソンTn10を挿入して不活化した後,テトラサイクリン感受性菌を選択することによりvirG遺伝子の欠失した薬剤感受性菌を分離した。更に染色体上のチミン合成遺伝子を同じ方法で不活化した二重欠失変異株をワクチン候補株としてえた。分子遺伝学的並びに細胞生物学的手技により本株は一次細胞侵入性は保持しているが二次細胞侵入性を欠く予想通りのワクチン候補株であることを確認した。他方,このワクチン株の有効試験に用いる親株のカニクイザルに対するビルレンスを胃内投与法で検討した。その結果,親株はサルに対してビルレンスが十分に強く,今後の有効試験におけるチャレンジ株として有用であることが判った。

本年3月からワクチン株の安全試験と有効試験に着手する予定である。上述親株による胃内投与法に際して死亡したサルと生残後死亡させたサルのそれぞれについて細菌学的検査,臨床症状観察,病理学的検査,免疫学的検査を行った。その結果は目下集計中であるが赤痢に関する典型的な所見がえられた他,多くの興味ある知見がえられた。病理的には発症例で臨床的治癒後も剥離性腸炎が遷延し粘膜固有層にリンパ球や形質細胞の集合がみられ,非発症例でも免疫芽細胞様の細胞が出現したこと,顕著な感染巣を有する大腸では好酸球が目だち,マクロファ-ジの出現と血管内皮細胞の腫大を伴なっていたことである。これらの所見は今後ワクチン投与実験における有効性を形態学的並びに免疫病理学的に判定する上で重要な示唆を与えるものと考えられた。吉川代表者、笹川担者およびその共同研究者は病原細菌学的技術の他に組換えDNA技術などを援用して、赤痢菌の細胞侵入性に係わる大プラスミドおよび染色体上にあるビルレンス遺伝子の解析を行い、細胞侵入性、細胞内増殖と拡散、隣接細胞への伝播、これら遺伝子の発現調節機構、環境条件の変化に対する適応機構などに関与し、病原性発現に必須の数拾に及ぶ遺伝子が存在することを明らかにした。本プロジェクトの目的はこれらの知見にもとづき弱毒生菌ワクチン株としてふさわしいと考えられるVirG遺伝子とthyA遺伝子のダブル欠失変異株を作成し、サルを用いてその安全性と有効性を確認するとともに、病理学的および免疫学的検査により安全性と有効性をより確実にし、使用ワクチン株の分子遺伝学的解析によりワクチン株の信頼性をより高めることである。初年度に引つづき今年度はカニクイザルを用いた安全性と有効性の実験をおこなったが、初年度の実験においてワクチン投与のためにワクチン投与群のサルに予想以上のストレスを与えたため、ワクチンとは関係なく一般状態が悪化したため、データの信頼度が低下したことについて根本的な改善策を講じたので、結果の信頼度は著しく向上した。例えば最終実験(のべ4回目)では34X10^<10>のワクチン株投与3回で全身状態や便の性状がワクチン非投与群とほぼ同じであることが示され、強毒菌チャレンジの結果、ワクチン投与群にも発症することがあり、ワクチン非投与群にも健常なものがいたが、総合的に判定すれば安全かつ有効と推定される結果であった。これら実験例について病理学的、免疫学的検査を行った。最終データはまた出ていないが、免疫学的検査により、ワクチン投与群で非発症例に抗赤痢菌抗体の著明な上昇が観察されるなど興味ある結果が出てきている。研究代表者およびその共同研究者は過去約10年間にわたり,組換えDNA技術などを用いて赤痢菌の細胞侵入性に関与するプラスミドおよび染色体上の病原性遺伝子の解析を行ない,その病原性に必須の約50に及ぶ遺伝子を同定し,その夛くについて分子遺伝学的に解析した.これらの研究成果に基づき,本試験研究において,弱毒生菌ワクチンとしてふさわしいと考えられる菌株を作成し,サルを用いてその安全性と有効性を確認し,さらに病理学的ならびに免疫学的検査を行なうことを企図した.ワクチン株としてShigella flexneri 2a YSH6,000株を基礎にして,染色体上に存在する多剤耐性遺伝子とthyA遺伝子およびプラスミド上のvirG遺伝子を欠失した変異株を得,これが予想通りの性質をもつことを分子遺伝学的に証明した.このワクチン株の安全性と有効性を試験するためカニクイザルにおける感染実験系を確立し,前年度までにすでに二回実験を行い,本年度前半に第三回目を行ない,第四回目を目下行なっている.第三回目の実験結果は死亡率と臨床症状,細菌学的,病理学的検査結果から見る限り本ワクチン株は安全かつ有効とほゞ結論できた.しかしビルレント株(チャレンジ菌株)が多すぎたためもあって,ワクチン投与サルの中からも発症するものが出現した.
片麻痺膝屈伸への促進的電気刺激・筋力補助を用いた下肢装具装着型歩行訓練装置の開発

本研究では、筋電気刺激機能とパワーアシスト機能を備え軽量で下肢装具に装着できる装置を開発して、歩行訓練における膝屈伸の神経路強化的随意運動促通療法を確立し、片麻痺膝の麻痺自体と歩行機能を効果的に改善させることを行った。(1)筋電気刺激機能には、特定された筋への収縮閾値下の持続的電気刺激による膝の随意屈伸運動への促進機能の実現;(2)パワーアシスト機能には、能動的に膝の筋力や随意屈伸運動を補助する他動介助訓練、および膝の伸張反射を起して自動伸展を促進する周期的筋振動刺激機能の実現;(3)これらの機能を併合した下肢装具装着型歩行訓練装置とその随意運動促通療法および訓練効果評価方法の開発を行った。平成24年度では、次の成果が得られて、下記の新規機構に対して特許出願をしている。(1)片麻痺患者歩行訓練中に特有な横偏り・転倒防止機構の考案・設計と製作:片麻痺患者歩行訓練中に麻痺側の無力や行動困難の状態で、体の重心が麻痺側に偏りやすいので、歩行訓練中に麻痺側への横移動や横転倒が特有である。そこで、訓練中の横偏り・転倒防止機構を考案・設計し、歩行訓練装置機構と一体化して製作した。(2)下肢装具装着型歩行訓練装置の製作:前年度に確立された装着型歩行訓練装置機構と力覚センシング機構の設計に基づいて、設計した部品を外注で精密加工し、力覚センシング機構を含む装置全体を製作して組み立てた。その上、訓練装置の運動学・力学特性、力覚センシング機構の静力学・動力学特性をテストして、良好な特性を有することが分かった。(3)刺激による筋力増強と筋力・屈伸の能動補助に関する運動学・力学的定量評価ソフトの開発:装置の運動覚センサと力覚センサを用いて、特定筋への持続的電気刺激による筋力の増強効果と、装置による膝の筋力と随意屈伸への能動補助効果について、訓練装置の運動学・力学に関する定量評価ソフトを開発した。そして、訓練課題と検査・評価課題のソフトをそれぞれ開発し、関節屈伸運動機能回復の定量評価方法を確立してその評価ソフトを開発して、その効果を片麻痺指や前腕のリハビリ訓練装置で確認した。本研究は、筋電気刺激機能とパワーアシスト機能を備え軽量で下肢装具に装着できる装置を開発して、神経路強化的随意運動促通療法より、片麻痺膝の麻痺自体と歩行機能を効果的に改善させることを目指す。平成25年度では、(1)筋電気刺激機能に、特定された筋への収縮閾値レベルの持続的電気刺激による随意屈伸運動への促進などの機能を実現するために、個人差において電気刺激のときの筋電位周波数解析で筋への収縮閾値を装置で定める方法を確立した。その有効性を、片麻痺指や前腕の機能回復訓練装置を利用して臨床研究で確認している。(2)また、パワーアシスト機能に、筋の伸張反射を起して自動伸展を促進する振動刺激機能を周期的に加えて、伸張反射の感度をアップするために、筋に振動刺激を加える最善タイミングを検討し、その有効性を、片麻痺前腕の機能回復訓練装置を利用して臨床研究で確認した。(3)そして、これらの機能を併合した下肢装具装着型片麻痺股関節・膝関節を能動的にアシストしかつ促進的電気刺激・振動刺激を加えた片麻痺歩行機能回復訓練装置を開発して一部の機構部品を改良して、さらに非金属の材料で軽量化に改善した.まず、力学情報から動作意図を取得できる股関節・膝関節をパワーアシストする機構、次に人体の関節の運動を踏まえた股関節・膝関節運動への順応機構、さらに個人の体形に対応でき,一人で使え、横転倒防止機能を有する機構を考案した。その上、装置全体の機構原理を提案し、装置の設計・試作・改良した。提案したパワーアシスト制御方法で動作実験を行い、その有効性を確認できた.提案した訓練装置を「片麻痺患者用歩行訓練装置」で平成25年9月に特許出願した。また、訓練効果の評価法も開発して有効性を確認したので、「片麻痺運動機能回復訓練装置を用いた訓練効果評価方法、および訓練効果評価演算装置、ならびにプログラム」で平成25年6月に特許出願した。(1)片麻痺下肢の膝屈伸に関して、屈伸する筋の特定、電気刺激による筋収縮の閾値レベルの検討、持続的刺激からの運動促通効果と膝折れ防止などの筋力強化効果の確定を行い、それらの神経学的本質と実質の運動学・力学的効用を探りながら、筋収縮閾値レベル持続的電気刺激方法を確立した。(2)力覚

センシング情報から筋力・随意屈伸を補助する制御手法を確立するために、人の膝屈伸する意図を、個人差や服装の環境の違いでも、人に感じない微小な力覚センシングで高感度かつ瞬間的に取得する手法と,その情報に基づいて膝の筋力や随意屈伸を能動的に補助する知的制御方法を理論的に検討し、その制御手法を確立してアームロボットと6軸力覚センサで実証した。(3)歩行の運動学解析を行い、膝の筋力や随意屈伸の能動補助と促通訓練を実現できる装置の駆動機構のメカニズムを確立する。また力学解析を行い、人の動きによる力変化を高感度検知できる力覚センシング機構のメカニズムを確立した。(4)上に確立された駆動機構と力覚センシング機構のメカニズムに基づき、駆動機構の運動と力覚センサのセンシングが互いに干渉にならないように設計に工夫して、下肢装具装着型歩行訓練装置を設計した。(5)さらに、設計した装置の膝関節部分のユニットを試作して、考案した機構のメカニズムと制御方法について、健常者でそれらの有効性を実証した。その結果を平成23年9月の第29回日本ロボット学会学術講演会にて「シンプルかつ高感度なSensor-Motor Mechanismによる膝関節パワーアシストの実現」を題として発表した。また、「膝関節パワーアシスト装置」との発明で,平成23年5月18日に国際特許として出願した。人間医工学平成24年度の研究計画に設定した2つの目標:下肢装具装着型歩行訓練装置の製作と、刺激による筋力増強と筋力・屈伸の能動補助に関する運動学・力学的定量評価ソフトの開発をほぼ達成した。さらに、平成24年度では研究計画に未設定の、片麻痺患者歩行訓練中に特有な横偏り・転倒防止機構の考案・設計と製作、という目標を設定して達成した。平成23年度には、特定筋、電気刺激による筋収縮の閾値レベル、持続的電気刺激からの運動促通と筋力強化効果を確定し、装置の運動機構、膝屈伸による微小力変化を高感度検知できる力覚センサ構造、また膝の筋力や屈伸を能動的に補助する制御手法を理論的に検討し、装着便利な装置を設計する、と計画していたが、設計までの進度は予定より早くなったので、膝関節部分のユニットを試作して実証した。平成25年度では、次の研究計画に基づいて研究を推進していく。(1)下肢装具装着型歩行訓練装置の臨床試験による性能評価:開発した訓練装置の臨床応用を行いその成績を確認して、筋収縮閾値レベルの持続的電気刺激による随意屈伸への促進効果や、能動的に筋力と随意屈伸を補助する他動介助効果などの機能回復を促進する有効性をハードとソフトの両面で評価検証し、歩行訓練の実施可能性について実証する。(2)機構部品の軽量化・低慣性化の改良:開発した訓練装置の動特性をさらに良くするために、一部の部品材料をアルミ合金材料の代わりに樹脂やナイロン材料を用いて、部品の軽量化・低慣性化を行う。これで、モータの制御特性もアップできる。(3)機能回復訓練システムの改良:評価実証に明らかになった訓練装置の改善点を検討し、改善を実施し、訓練装置の完成度を高める。平成24年度には、設計により全ての装置機構の製作を行う。そして、訓練装置により筋力・随意運動を補助する促通手技の運動学・力学的な定量評価ソフトを開発し、その上、訓練課題と検査・評価課題に関するソフト、歩行訓練中の膝屈伸運動機能回復の定量的な評価ソフトも開発する。平成24年度は296,537円の未使用金があり、これは約半分の設計・試作した部品が加工精度の高い鹿児島大学大学院理工学研究科中央実験工場で加工したもので、その費用を別途で支払ったためである。平成25年度にはこの未使用金を機構部品の軽量化・低慣性化改良のための外部加工費として使用する。
和本及び和刻漢籍に於ける各種伝記資料の所在に関する調査研究

1.全国の図書館・文庫の目録から、『国書総目録』『古典籍総合目録』に未載のものを中心に人物の伝記に関係する文献を抽出し、所蔵者別に整理した「伝記資料所在一覧」を作成した。これにより、従来未紹介であった伝記資料の書名・所在等について新たに多くの知見が得られた。2.『国書総目録』『古典籍総合目録』および上記「伝記資料所在一覧」を参考にして、各地の図書館等に蔵される伝記資料の原本を調査し、内容の確認や他資料との比較を行った。3.国文学研究資料館がこれまでに収集したマイクロフィルムから、伝記関係の資料を抽出し、人名・時代・地域・事績等について簡明な解題を加えた「国文学研究資料館収集伝記資料略解題稿」を作成した。ただし対象となる資料はかなり多量のため、時間的な制約から、交付期間内に解題作業を終えたのは全体の約半分である。4.上記2と3の作業を通して、伝記資料は単独で用いるのは危険であり、できるだけ他の資料と比較対照しながら使用しなければならないことを改めて認識した。これは当初から予想されたことであったが、本研究によって、複数の伝記資料間における記述の相違と各々の資料の信頼度が具体的に把握できたことは貴重な収穫であった。5.本研究による調査を踏まえ、研究代表者・研究分担者各自の関心に基づき、人物の伝記・伝記資料の性格などに関連する論文および著書を執筆し公表した。6.以上のほか、伝記資料として有用な写本の奥書を集成する作業も行ったが、最終年度のみに実施した関係もあり、現存する厖大な写本のうちごく一部を調査したに止まった。ただし今回収集したデータを基礎として、将来的に写本奥書データベースの構築へと繋げて行きたい。まず全国各地の公私立図書館・文庫等の各種蔵書目録類、及び国書総目録・古典籍総合目録などの既刊書籍目録類から、伝記資料たり得ると思われる文献を網羅的に抜き出し、コンピュータ入力による整理・分類を行って、「伝記資料所在一覧」という基本台帳を作成する作業を始めた。この基本台帳は次年度以降も継続的に追加・訂正・整備していく予定である。なおそのデータ管理には現有設備のみならず、新規購入したパソコン2台をも活用した。また本年度はその台帳に基づき、京都府立総合資料館・大阪市立大学学術情報総合センター・天理大学附属図書館・広島大学附属図書館・熊本大学附属図書館・浙江図書館・上海図書館などに蔵される伝記資料の原典調査を行った。その際、寸法・筆者・奥書・刊記・書き入れといった基本的な書誌情報ばかりでなく、収載人物の顔ぶれとそれに関する記述の内容・傾向・他本との異同の有無などの諸点を確認・検証することをも重視した。一方、伝記資料の中で特に重要とみられるものについては、紙焼写真・電子複写・マイクロフィルム撮影などの形で順次収集していった。そのほか、古書業界に流通している各種蔵書目録類未載の和古書のうち、伝記資料たり得る文献を発掘・収集することにも努めた。以上によって整理・分類・調査・収集された伝記資料に関しては、各自分担し、時に相互に情報・意見交換をし合いつつ、考察を進めているところである。本年度得られたこれらの成果を十二分に活用し得るよう、来年度も同様の調査・収集・整理・研究を実施し、情報の整備を進展させる所存である。本年度も昨年度に引き続き、まず全国各地の公私立図書館・文庫等の各種蔵書目録類、及び国書総目録・古典籍総合目録などの既刊書籍目録類などから、伝記資料たり得ると思われる文献を可能な限り網羅的に抜き出し、コンピュータ入力による整理・分類を行い、「伝記資料所在一覧」という基本台帳を作成する作業を実施した。この基本台帳は、次年度以降も継続的に追加・訂正・整備していく予定である。

同時に、山鹿積徳堂文庫・宝鏡寺・天理大学附属天理図書館・名古屋市蓬左文庫・陽明文庫・佐賀大学附属図書館・熊本大学附属図書館・エール大学・ニューヨーク・パブリック・ライブラリーなどに蔵される伝記資料及び関連資料の原典調査を行った。その際、寸法・筆者・奥書・刊記・書き入れといった基本的な書誌情報ばかりでなく、収載人物の顔ぶれと、それに関する記述の内容・傾向・他本との異同の有無などの諸点を確認・検証することを重視した。また、調査に際しては新規購入したノートパソコンも活用し、データ収集や整理を行った。一方、伝記資料の中で特に学術的価値が高く重要とみられるものについては紙焼写真・電子複写・マイクロフィルム撮影などの形で適宜収集していった。そのほか古書業界に流通している各種蔵書目録類未載の和古書のうち、伝記資料たり得る文献を発掘・収集することにも努め、検討した結果『信長記』『三十六歌仙絵巻』などを選定し、購入した。以上によって整理・分類・調査・収集された伝記資料に関しては、各自分担し、時に相互に情報・意見交換をし合いつつ、考察を進めているところである。本年度得られたこれらの成果を十二分に活用し得るよう、来年度も同様の調査・収集・整理・研究を実施し、情報の整備を進展させる所存である。本年度も昨年度に引き続き、全国各地の公私立図書館・文庫等の各種蔵書目録類、及び国書総目録・古典籍総合目録などの既刊書籍目録類から、伝記資料たり得ると思われる文献を可能な限り網羅的に抜き出し、コンピュータ入力による整理・分類を行い、「伝記資料所在一覧」という基本台帳を作成する作業を実施した。この基本台帳は、次年度も継続的にデータの追加・訂正・整備をしていく予定である。同時に、萩市立図書館・肥前松平文庫・輪王寺天海蔵・東寺・キオッソーネ東洋美術館などに蔵される伝記資料及び関連資料の原典調査を行い、データを採取した。一方、伝記資料の中で特に学術的価値が高く重要と見られる資料については、紙焼写真・電子複写などの形で適宜収集していった。また次年度における索引の作成に備えて、当館所蔵の『元亨釈書』と『先哲叢談』のデジタル撮影を行った。そのほか古書業界に流通している和古書のうち、当該研究資料として欠くことのできない主要な伝記資料たり得る文献の収集にも努め、『奈良絵(大橋の中将)』『北野藁草』『寛永年中御能組』などを選定し、購入した。また、新規に当館収蔵のマイクロフィルムから伝記資料を抜き出して人名・時代・地域・業績等を解題する作業、及び既刊の叢書類から人物の事跡の貴重な記録である写本の奥書を収集しデータ入力する作業を、アルバイト複数名により行った。これらのデータの収集整理には、新規に購入したノートパソコンを活用した。この作業は次年度も継続される。以上により調査・収集・整理・分類された伝記資料に関しては、研究分担者並びに研究協力者各自で分担し、時折相互に情報・意見交換をし合いながら、考察を進めているところである。本年度得られたこれらのデータや研究成果を十二分に活用し得るよう、来年度の研究の最終とりまとめへ向けて、同様の調査・収集・整理・研究を行うと同時に、データ全体の整備状況を進展させる所存である。今年度は、本研究の目的に沿って、以下の作業を行った。
生化学的結合を指標としたLRR型受容体キナーゼのリガンド探索

植物に数多く存在するLRR型受容体キナーゼには機能的に興味深い分子群が見出されており注目を集めているが,大半がリガンド未知のまま残されている.我々はリガンド-受容体の直接的な結合を指標として,ペプチドシグナルを直接結合する受容体の同定を通じて,植物のかたちづくりに関わる細胞間情報伝達系の解明することを目的とし,以下の成果を挙げた.1生理活性を完全に維持したアラビノシル化CLV3ペプチド[Ara3]CLV3の化学合成を達成した.また糖鎖の長さがCLV3ペプチドの生理活性に重要であることを示した.加えて[Ara3] CLV3のコンフォメーション解析を行い,糖鎖が付加することでCLV3ペプチドのC末端領域の立体構造が変化することを見出し,立体構造の変化がCLV3のCLV1への結合を強めていることが推測された.この成果を論文として発表した(Shinohara and Matsubayashi (2013) Plant Cell Physiol. 54 369-374).2光反応性[Ara3]CLV3ペプチドを用いたフォトアフィニティーラベルを行い, CLV3ペプチドがCLV1に加えてBAM1にも直接結合することを見出した.競合実験の結果, CLV1の場合以上にCLV3のアラビノシル化修飾がBAM1への結合に重要であることを確認した, BAM1がもうひとつのCLV3受容体であることを確認するためbam1変異体の解析を行った.clv1 bam1二重変異株は茎頂が著しく肥大し, clv3変異株の茎頂と同程度の大きさを示した.またclvl bam1二重変異株はCLV3ペプチド非感受性であり, CLV3ペプチド投与により茎頂の肥大を回復できないこと, CLV3ペプチド投与によりMUSの発現量が減少しないことを確認した.これらの結果より,茎頂メリステムにおけるCLV3ペプチドの受容体としてBAM1がCLV1と重複して機能していることを示した.(抄録なし)(1)BY・・2株中でHaloTag融合受容体過剰発現株を作製し,リガンド結合能を維持しながら安定的に発現させる「受容体発現ライブラリー」の構築を進め,LRR型受容体を中心にライブラリーを拡大させた.このライブラリーを用いて,受容体未知なペプチドホルモンであるRGFペプチドを直接結合する受容体候補を見出している,(2)アラビノシル化CLV3ペプチドの化学合成を試み,アラビノース鎖がβ-1,2結合で3残基結合したアラビノシル化CLV3ペプチド,[Ara_3]CLV3ペプチドを作製した.ペプチド投与実験によりclv3変異体の茎頂の表現型を回復させることを確認し,合成ペプチド[Ara_3]CLV3が天然から得られた糖鎖付加CLV3ペプチドと同等の活性を有することを示した.(3)アイランドドメインを持たないLRR型受容体のひとつであるBAM1をモデルとして,フォトアフィニティーラベルを応用したリガンド結合部位の生化学的解析を行い,細胞外LRR6-LRR8の領域がリガンド結合部位であることを示した.BAM1の詳細な配列解析およびホモロジーモデリングから,結合領域として同定された部位はLRRのコンセンサス配列から若干逸脱しており,この乱れがリガンド結合の特異性を生み出していると推測された.またBAM1ホモログであるCLVIの変異体のひとつであるclv1-4は,今回同定したリガンド結合部位近傍にアミノ酸置換変異を持つが,BAM1においてclv1-4に対応する残基に部位特異的変異を導入したところ,リガンド結合能が完全に消失することが確かめられた,BAM1におけるリガンド結合部位は膜貫通領域から離れた部位にあるが,これはブラシノステロイド受容体BRIIの場合とは対照的であった.これらの結果は,LRR型受容体におけるリガンド認識機構が極めて多様性に富むことを示すものであると考えている.植物に数多く存在するLRR型受容体キナーゼには機能的に興味深い分子群が見出されており注目を集めているが,大半がリガンド未知のまま残されている.我々はリガンド-受容体の直接的な結合を指標として,ペプチドシグナルを直接結合する受容体の同定を通じて,植物のかたちづくりに関わる細胞間情報伝達系の解明することを目的とし,以下の成果を挙げた.1生理活性を完全に維持したアラビノシル化CLV3ペプチド[Ara3]CLV3の化学合成を達成した.また糖鎖の長さがCLV3ペプチドの生理活性に重要であることを示した.加えて[Ara3] CLV3のコンフォメーション解析を行い,糖鎖が付加することでCLV3ペプチドのC末端領域の立体構造が変化することを見出し,立体構造の変化がCLV3のCLV1への結合を強めていることが推測された.この成果を論文として発表した(Shinohara and Matsubayashi (2013) Plant Cell Physiol. 54 369-374).2光反応性[Ara3]CLV3ペプチドを用いたフォトアフィニティーラベルを行い, CLV3ペプチドがCLV1に加えてBAM1にも直接結合することを見出した.競合実験の結果, CLV1の場合以上にCLV3のアラビノシル化修飾がBAM1への結合に重要であることを確認した, BAM1がもうひとつのCLV3受容体であることを確認するためbam1変異体の解析を行った.

clv1 bam1二重変異株は茎頂が著しく肥大し, clv3変異株の茎頂と同程度の大きさを示した.またclvl bam1二重変異株はCLV3ペプチド非感受性であり, CLV3ペプチド投与により茎頂の肥大を回復できないこと, CLV3ペプチド投与によりMUSの発現量が減少しないことを確認した.これらの結果より,茎頂メリステムにおけるCLV3ペプチドの受容体としてBAM1がCLV1と重複して機能していることを示した.目的のひとつであった糖鎖修飾を受けたCLV3ペプチドの化学合成を達成した.また受容体発現ライブラリーも順次拡大が進行中であり,ライブラリーを用いた結合実験によって受容体未知ペプチドホルモンRGFペプチドの受容体候補を見出しつつあり,研究はおおむね順調に進行していると考えられる.(1)受容体発現ライブラリーの拡大を順次,進める.LRR型受容体に限らず,現在までにリガンド結合能が示されている受容体の特徴(細胞外領域が400アミノ酸以上である,細胞外領域イントロンの数が少ない等)を有している受容体キナーゼを優先してライブラリー化を進める.またRGFペプチド受容体候補として同定した受容体の変異株の解析を進める.(2)化学合成経路を確立したアラビノシル化CLV3ペプチドを用い,受容体との結合を詳細に解析していく.糖鎖付加の有無が,CLV1以外の受容体(CLV2,RPK2,BAMなど)への結合に影響するかどうかを調べる.(抄録なし)
シナプスの制御性分泌と細胞骨格

1.神経伝達物質トランスポーター蛋白のオリゴペプチド作製および抗-ペプチド抗体作製神経伝達物質トランスポーターはシナプス間隙に放出された伝達物質を神経終末内へ再取り込みすることによりシナプス伝達終息に働く重要なシナプス関連蛋白質である。cDNAクローニングにより多くの伝達物質トランスポーターのcDNA配列およびアミノ酸配列が決定されている。これを利用して本研究ではドーパミン・トランスポーター、セロトニン・トランスポーター、グルタミン酸トランスポーターなどの特異的オリゴペプチドを各々作製した。次いでこれらを抗原としてインビトロ法で各々のモノクローン抗体を作製し、その特異性をイムノブロット法、免疫組織化学法などで検討した。2.神経細胞分化時におけるドーパミン・トランスポーターの発現上記課題について検索するため、PC12細胞(h株)を培養し、NGF添加して分化せしめ、この際のドーパミン・トランスポーター(DAT)の発現と局在の変化を免疫組織化学法によって追跡した。NGF添加後5時間で細胞体ゴルジ野にDAT発現が強陽性に認められた。次いで陽性の小顆粒の存在および細胞膜表面に限局性の陽性スポットが認められた。反応陽性の細胞膜部分は次いで神経突起として伸長し、その先端の成長円錐表面には強い陽性反応が常に認められた。また伸長中の神経突起中には免疫反応陽性の小顆粒の存在が見出された。以上の成績より、DATは分化初期に急激にその産生が増強され、神経突起伸長の初期からその成長円錐表面膜に組み込まれていること、さらに突起伸長に伴って細胞体からのDAT蛋白の輸送が盛んに行われていることが明らかとなった。1.シナプス関連蛋白の同定と免疫抗体作製。神経伝達に関連するシナプス関連蛋白を同定し,その機能を探るため種々のシナプス下分画を抗原としてモノクローン抗体を作製,または入手し,これら蛋白の細胞下局在や,発生時における発現の様態を検索中である。次のものについては既に抗体を作製または入手している。a.シナプス小胞膜蛋白(シナプトファイシン,シナプトタグミン,シンタクシン),b.シナプス後部濃物質(82K蛋白),C.シナプス結合部蛋白,d.Na^+-K ATPase。この内,aについては小脳皮質における細胞内,在,発生に伴う発現の様態についてbについてはシナプトソーム分画における細胞下局在を検索,その結果を報告した(Kadota et al.,1992)。2.高頻度刺激後における哺乳類シナプの迅速な回復現象。in vivoの哺乳類Cholinergicシナプスにおいて,非常に高頻度(30-100Hz)の連続刺激を与えた場合,神経伝達は急速に減蓑,消失する。刺激終了後,これをin vivo(正常血行下)で休息させてやると,シナプスの形態(とくにシナプス小胞数),機能(神経伝達)とも,約1分で迅速に正常状態に回復することを見出した(Kadota et al.,in press)。回復の際の細胞骨格の関与やその分布の変化,Ca^<2+>の影響などについては現在検索中である。また刺激時における膜回収機構を微細形態的,免疫電顕的に検索し,シナプス小胞膜の再循環と終末からの膜の逆行性搬出を担う構造物やその経路についての成績をまとめた(Kadota et al.,投稿中)。3.PC-12細胞におけるシナプス関連蛋白の発現PC-12細胞の突起伸長時における各種シナプス関連蛋白の発現を検索中。1.神経伝達時におけるシナプス小胞膜の転送についてネコ上頚神経節の節前線維に高頻度連続刺激(10Hz)を与えた際の、節前線維終末におけるシナプス小胞の超微形態変化を電子顕微鏡を用いて観察した。電気刺激に応じてシナプス前膜に開口したシナプス小胞は、直ちに大型エンドサイトーシスによって終末内に取り込まれ終末エンドソームとなる。これらは次いで終末前部付近で多胞体となって軸索内へ逆行性に輸送される。

これらの膜成分を免疫細胞化学的に検索すると次のようなことが示唆された。終末エンドソーム膜にはシナプス小胞特異蛋白が多く取り込まれる。その一部は局所的にソーティングされ、出芽の形でシナプス小胞として終末内へリサイクルされる。2.シナプス形成期におけるシナプス小胞蛋白の発現と細胞内局在変化。ラット小胞皮質外顆粒層細胞は生後著しい発達をとげる。これを利用して、シナプス小胞特異蛋白、とくにシナプトファイシン(SY)がニューロン発生のどの時期に発現してくるか、その細胞内局在は発生に伴ってどのように変化するかを免疫組織細胞化学的に検索した。外顆粒層は増殖層と移動前層の2層から成るが、移動前層の発生初期の顆粒細胞には既にSYが発現しており、その局在はゴルジ体のトランス側シスターンと周辺の小胞構造にある。さらに外顆粒細胞から伸び出す軸索(平行線維)や、その先端や途中にみられる成長円錐、小膨隆にもSYが発現している。その局在はシナプス小胞様構造や小管状構造物にある。これらはしばしばプルキンエ細胞樹状突起と接触し、さらにそれはシナプス構造へと分化してくる。以上の成績からSYは発生初期のニューロンにシナプス形成に先行して発現し、ゴルジ体周辺のシナプス様小胞に組み込まれ、次いで軸索中へ運搬されるものと考えられる。1.神経伝達物質トランスポーター蛋白のオリゴペプチド作製および抗-ペプチド抗体作製神経伝達物質トランスポーターはシナプス間隙に放出された伝達物質を神経終末内へ再取り込みすることによりシナプス伝達終息に働く重要なシナプス関連蛋白質である。cDNAクローニングにより多くの伝達物質トランスポーターのcDNA配列およびアミノ酸配列が決定されている。これを利用して本研究ではドーパミン・トランスポーター、セロトニン・トランスポーター、グルタミン酸トランスポーターなどの特異的オリゴペプチドを各々作製した。次いでこれらを抗原としてインビトロ法で各々のモノクローン抗体を作製し、その特異性をイムノブロット法、免疫組織化学法などで検討した。2.神経細胞分化時におけるドーパミン・トランスポーターの発現上記課題について検索するため、PC12細胞(h株)を培養し、NGF添加して分化せしめ、この際のドーパミン・トランスポーター(DAT)の発現と局在の変化を免疫組織化学法によって追跡した。NGF添加後5時間で細胞体ゴルジ野にDAT発現が強陽性に認められた。次いで陽性の小顆粒の存在および細胞膜表面に限局性の陽性スポットが認められた。反応陽性の細胞膜部分は次いで神経突起として伸長し、その先端の成長円錐表面には強い陽性反応が常に認められた。また伸長中の神経突起中には免疫反応陽性の小顆粒の存在が見出された。以上の成績より、DATは分化初期に急激にその産生が増強され、神経突起伸長の初期からその成長円錐表面膜に組み込まれていること、さらに突起伸長に伴って細胞体からのDAT蛋白の輸送が盛んに行われていることが明らかとなった。