hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミノ基キャリアタンパク質を介する生合成機構の解明と二次代謝産物構造多様性の拡張

1アザビシクロ環含有アミノ酸への生合成初期課程は、DADHの末端水酸基がまずVzb21によってスルホン化された後、αアミノ基がVzb12によってアセチル化され、その後、スルホン化によって活性化された末端水酸基とδアミノ基の間でアジリジン環構造を有するアミノ酸がVzb10/11により形成され、その後で保護基であるアセチル基が除去されると推測した。本年度は、DADHを基質として、Vzb21,12の連続反応、それにVzb10/11,さらにはVzb13を加えた系でin vitro反応を行った。その結果、予想される分子量を持つ化合物を生成することに成功した。2s56-p1のN-N結合生成に関わるSpb40の機能として、MetRSドメインによってグリシンを活性化し、CupinドメインでそれとN6-OHリジンと縮合させ、生じたエステル中間体の形成を経て、N-N結合を形成することが示唆された。各ドメインの活性中心を変異した変異酵素は、活性を示さなかったが、それらを同一細胞に入れた場合は活性が検出されたことから、MetRSドメインが他のサブユニットのCupinドメインと相互作用し活性を示すことが示唆された。3タイプIIAmCP遺伝子クラスターが、生合成機構未解明のマレイマイシンの生合成を担うことが明らかとなった。マレイマイシンは、AmCPに付加したグルタミン酸末端がセミアルデヒドになった後、未知の機構によりC3化合物の付加、アミノ化が進行し、最後に脱炭酸することにより生合成されるというその概略が明らかになった。4その他のAmCPクラスの解析これまで、不溶性タンパク質としてしか得られなかった2つのタンパク質を大腸菌で可溶性タンパク質として調製することに成功した。これまで未知である酵素が全く知られていない反応を行うことから、アザビシクロ環生合成におけるアジリジン環含有アミノ酸の合成機構の解明には少し手間取るのではないかと心配したが、タンパク質の調製、さらにはin vitroの反応での生成物の確認が出来るまでに持ってくることが出来た。アジリジン環のアザビシクロ環の変換には、NRPSであるVzb7が関わることが推測された。各種遺伝子破壊株から単離された化合物のMS解析から、機能未知タンパク質Vzb5/6がVzb7のPCP上でアジリジン環含有アミノ酸のαーβ不飽和化を行うことが示唆された。興味深いことにstand alone PCPであるVzb8の遺伝子破壊によっても、同αーβ不飽和アミノ酸が蓄積することから、これまで例を見ないVzb7のPCPからVzb8(PCP)へのアミノ酸の移し替え機構の存在が示唆される。Vzb5/6による不飽和化も含めて、未知の興味深い機構が山積しており、その機構解明により、新たな合成生物学の道が開けると期待している。Ficellomycinの環修飾および最終段階のジペプチド生成に関しては、in vitro再構成に成功している。生合成中間体を大量調製し、化学構造を決定を試みているところであり、近々学術誌に論文を投稿できると考えている。マレイマイシン(MM)生合成に関しては、ほぼ全ての遺伝子破壊株の作製に成功し、その代謝産物の解析から、C5からC7(MM)の炭素鎖伸張は、まずC3ユニットが付加し、それが脱炭酸するという全体像が見えてきた。幾つかの生合成中間体の単離が可能であり、未知の生合成経路の解明は近いと考えている。DADH生合成遺伝子に3つの遺伝子のみが付加された(転写因子と排出体を除く)遺伝子クラスターを見出し、それら全てのタンパク質の調製が可能となった。どのようなものが合成されるのか、in vitro、in vivoで解析していく。研究の推進方策の大きな変更はない。アジリジン環の生合成を担う酵素のin vitroの評価系自体は確立できた、今後は化合物の構造決定を行う必要がある。これは、有機合成化学的に基質を調製し、それを用いた反応、酵素の結晶構造解析を行う予定である。Vzb10/11、Vzb5/6、Spb40など全く新しい反応を触媒する酵素が研究対象となっており、その構造情報は反応機構の解明に不可欠である。これらのうち、Vzb10/11、Spb40については、タンパク質の調製に目処がついている。これらの結晶化を精力的に行うとともに、必要に応じて単粒子解析を用いた構造解析も行っていく。その他、新規化合物については、生合成経路だけでなく、その最終産物の生物活性も他機関への研究強力を仰いで検討していきたい。リジン生合成酵素とアミノ基キャリアタンパク質(AmCP)相互作用を解明する一環として、複合体構造が明らかでない、LysJとの共結晶の作製を試みているが、今までに良い反射を与える良好な結晶は得られていない。AmCPを介して生合成される二次代謝産物生合成は、1)アザビシクロ環生合成機構、2)a)グリオキシル酸ヒドラゾンユニットの生合成機構の解析、b)タイプIIAmCPが関わる二次代謝の生合成機構、3)その他の生物に見出されるAmCP遺伝子クラスターの解析に分けられる。

1)については、vzb10/11、vzb13、vzb7、vzb5/6の遺伝子破壊によりvazabitide Aの生産が消失すること、及びこれらの機能予測から、スルホン化によって活性化された末端水酸基とδアミノ基の間で三員環構造がVzb10/11により形成され、それが非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)であるVzb7にロードされ、Vzb5/6によってαーβに二重結合が導入され、アザビシクロ環が形成されると推測された。2)a)については、最初にリジンのεアミノ基をOrf38がに水酸化すること、ついでOrf40がグリシンを活性化し、水酸化リジンとの間でエステル中間体の形成を経て、N-N結合の形成に関わること、そしてOrf39がヒドラジノ酢酸を生成することが明らかになりつつある。2)b)については、タイプIIAmCPが担う二次代謝産物の生合成は、AmCPにグルタミン酸が付加した後に、修飾を受け、グルタミン酸末端がセミアルデヒドになった後、C3化合物の付加、アミノ化が進行することが明らかになりつつある。3)については、クラスターを構成する遺伝子のうち、2つが大腸菌では不溶性タンパク質として発現するため、まだ最終産物が何であるかは分からないが、宿主を変えたり、同遺伝子のホモログなどを用いることで打開していきたい。アザビシクロ環の生合成について進展が見られ、また新たなN-N形成反応が明らかになりつつある。さらにはタイプIIAmCPの中間体が検出されるなど、研究としては順調に進展している。若干遅れている結晶化、遺伝子発現において工夫をしていきたい。1アザビシクロ環含有アミノ酸への生合成初期課程は、DADHの末端水酸基がまずVzb21によってスルホン化された後、αアミノ基がVzb12によってアセチル化され、その後、スルホン化によって活性化された末端水酸基とδアミノ基の間でアジリジン環構造を有するアミノ酸がVzb10/11により形成され、その後で保護基であるアセチル基が除去されると推測した。本年度は、DADHを基質として、Vzb21,12の連続反応、それにVzb10/11,さらにはVzb13を加えた系でin vitro反応を行った。その結果、予想される分子量を持つ化合物を生成することに成功した。2s56-p1のN-N結合生成に関わるSpb40の機能として、MetRSドメインによってグリシンを活性化し、CupinドメインでそれとN6-OHリジンと縮合させ、生じたエステル中間体の形成を経て、N-N結合を形成することが示唆された。各ドメインの活性中心を変異した変異酵素は、活性を示さなかったが、それらを同一細胞に入れた場合は活性が検出されたことから、MetRSドメインが他のサブユニットのCupinドメインと相互作用し活性を示すことが示唆された。3タイプIIAmCP遺伝子クラスターが、生合成機構未解明のマレイマイシンの生合成を担うことが明らかとなった。マレイマイシンは、AmCPに付加したグルタミン酸末端がセミアルデヒドになった後、未知の機構によりC3化合物の付加、アミノ化が進行し、最後に脱炭酸することにより生合成されるというその概略が明らかになった。4その他のAmCPクラスの解析これまで、不溶性タンパク質としてしか得られなかった2つのタンパク質を大腸菌で可溶性タンパク質として調製することに成功した。これまで未知である酵素が全く知られていない反応を行うことから、アザビシクロ環生合成におけるアジリジン環含有アミノ酸の合成機構の解明には少し手間取るのではないかと心配したが、タンパク質の調製、さらにはin vitroの反応での生成物の確認が出来るまでに持ってくることが出来た。アジリジン環のアザビシクロ環の変換には、NRPSであるVzb7が関わることが推測された。
プロタサイクリン吸入治療法による片肺換気中肺酸素化能の改善の試み

片肺換気法は開胸手術の術野条件を良好に保つ手段として有用である。しかし片肺換気中の肺酸素化能を適正に保つのは困難で、動脈血中酸素分圧が危険なレベルに低下することがしばしばある。これまでに様々な方法でこの時の肺酸素化能を適正に保つ工夫が提唱されたが、いずれも手技の困難さや効果の不確実性のため広く用いられていない。本研究ではプロスタサイクリン(PGI_2)の血管拡張作用の発現と持続時間、その吸入の容易さに着目し、PGI_2吸入が分離換気中の肺酸素化能を改善することを検証した。「方法」全身麻酔下の犬10頭に分離換気用ダブルルーメンチューブを経口的に挿管し、左肺のみを人工呼吸した。この状態でPGI_2を1ng/kg/minまたは20ng/kg/minの速度で、超音波ネブライザーで吸入させた。この間、動脈、肺動脈、中心静脈圧、心拍出量、動脈血酸素・二酸化炭素分圧を測定した。「結果」PGI_220ng/kg/min投与においてPaO_2は分離換気中⇒PGI_2投与中⇒PGI_2投与中止において122±60MmHg⇒145±83mmHgと変化した。すなわち、PGI_2投与中にPaO_2の有意な上昇が見られ、投与中止とともに低下した。1ng/kg/min投与では、107±72mmHg⇒106±81mmHg⇒113±87mmHgとPaO_2の有意の変化は見られなかった。血行動態およびPaO_2に有意の変化は見られなかった。「結論」PGI_220ng/kg/min吸入によって、分離換気中の肺酸素化能が有意に改善することが動物モデルによって示された。
転写因子MafAの安定性制御機構から膵島β細胞のグルコース応答メカニズムにせまる

グルコース応答性でβ細胞の諸機能の発揮に必須の転写因子MafAの制御機構の解明を通じて膵島β細胞がグルコース濃度を感知して応答する分子機構の解明を目指した. MafAタンパク質がリン酸化依存的に低グルコース条件下で分解が促進されること、MafAの分解はPA28γタンパク質によって促進されることを明らかにした.この分解促進はこれまでに知られていない新規の分解系であった.また、MafAのリン酸化依存的に結合する新規因子を同定した.グルコース応答性でβ細胞の諸機能の発揮に必須の転写因子MafAの制御機構の解明を通じて膵島β細胞がグルコース濃度を感知して応答する分子機構の解明を目指した. MafAタンパク質がリン酸化依存的に低グルコース条件下で分解が促進されること、MafAの分解はPA28γタンパク質によって促進されることを明らかにした.この分解促進はこれまでに知られていない新規の分解系であった.また、MafAのリン酸化依存的に結合する新規因子を同定した.われわれの血糖値はごく狭い範囲に保たれている必要があり、それを司るインスリン遺伝子の転写はグルコース(血糖値)に応答して上昇するが、膵島β細胞がグルコースの濃度を感知するメカニズムはあきらかになっていない。本研究課題においては、血中グルコース濃度に応じたインスリン遺伝子発現の制御の中心的役割を担うことがあきらかなった膵島β細胞特異的転写制御因子であるMafAのタンパク質分解の制御の分子メカニズムを解析することによって、膵島β細胞の血糖感知システムの実体が何であるのかをあきらかにすることが目的である。本年度は、MafAタンパク質を積極的に分解に導く因子の候補として同定したPA28γタンパク質との関連を探った。PA28γタンパク質は、7量体を形成して20Sプロテアソームに結合し、ペプチド基質に対するプロテアーゼ活性を上昇させることが知られているが、タンパク質の分解促進については、ユビキチン化を介さないとされているが、その機構は全く不明である。そこでまず、PA28γによるMafAの分解促進は、確かにプロテアソーム阻害剤によってキャンセルされることをあきらかにした。MafAは、N末端側の特定の5つのセリン・スレオニン残基がリン酸化されたときにのみ、特異的にPA28γによって分解が促進されることもわかった。この分解促進効果は、調べた限りにおいて他の転写因子に対しては見られず、MafAに特異的であることもあきらかにし、これまでに知られていない、まったく新しいタイプのタンパク質分解促進系である可能性を示した。一方で、通常のユビキチン化を介したMafAの分解経路についても検討を行い、E3リガーゼの同定を候補アプローチによって試みているが、未だに同定には至っておらず、今後も検討を続ける。血糖値はごく狭い範囲に保たれている必要があり、その恒常性を司るインスリン遺伝子の転写はグルコース(血糖値)に応答して上昇するが、膵島β細胞がグルコースの濃度を感知するメカニズムはあきらかになっていない。昨年度までに、MafAタンパク質を積極的に分解に導く因子の候補として同定したPA28γタンパク質との関連を探り、MafAに対する分解促進がきわめて特異的であり、これまでに知られていない、まったく新しいタイプのタンパク質分解促進系であることを示した。一方で本年度は、通常のユビキチン化を介したMafAの分解経路についても検討を行い、MafAのE3リガーゼの同定に成功した。このE3リガーゼはMafAタンパク質のGSK3によるリン酸化に依存して結合することから、PA28γと同様にグルコース感受システムの一部を構成している可能性が高い。以上の結果から、MafAのタンパク質分解はPA28γとこのE3リガーゼにより多重な制御を受けていることが判明した。これらの結果は、細胞のグルコース応答メカニズムの複雑さ巧妙さを示しており、また今後の展開への大きな手がかりである。
長期記憶形成におけるアストロサイト代謝の役割と麻酔薬作用の分子科学的機序の解明

本研究は、若年成体マウスへのセボフルラン暴露が恐怖記憶を惹起するか、さらに海馬でのF-アクチンの構成が恐怖記憶形成と相関するかを明らかにすることを目的とした。マウスは生後2週でほぼ脳が完成するので、生後4週の雄若年成体マウスで実験を行った。さらに脳を摘出し、海馬の記憶の構成を示唆するF-アクチンの免疫染色を行った。若年成体マウスへの臨床使用濃度内のセボフルラン吸入は、恐怖記憶定着に加え海馬でのF-アクチン構成を増強した。本研究結果は、本研究で検討したマウス週齢に相当するヒト個体で、セボフルラン吸入が、恐怖記憶構築、すなわち、心的外傷後ストレス障害を引き起こす可能性を示唆するものと考えられる。本研究では、幼弱マウスへの麻酔薬暴露が成体に至るまでの長期記憶形成に影響を及ぼすか否かを、麻酔薬による長期記憶障害における海馬アストロサイトでの糖代謝とエネルギートランススポーターの役割を検証することを目的としている。平成25年度は、生後1ヶ月のマウスにセボフルラン2.5%を4時間吸入させ、セボフルラン吸入が驚愕反応を生後2ヶ月目にパッシブアボイダンスで評価した。その結果、この時期のマウスの場合、セボフルラン吸入により恐怖を伴う記憶は対照群に比べ増強するという、仮説と逆の結果が得られた。この記憶の増強は、海馬での記憶の形成とリンクしていると言われるFアクチンの構成(免疫組織学的に検証)を伴っていた。現在、平行して、生後6日のマウスに同様の検討を加えて比較と、生後1ヶ月の個体の実験個体数を増やす試みを行っている。ここまでの研究結果を、可能であれば本年度のアメリカ麻酔学会で報告する計画とし、抄録を投稿したところである。本研究では、幼弱マウスへの麻酔薬暴露が成体に至るまでの長期記憶形成に影響を及ぼすか否かを行動薬理で検討する。最終的には、長期記憶障害個体での脳エネルギートランスポーター追加発現が記憶障害を回復するかを明らかにし、麻酔薬が長期記憶に及ぼす作用とその分子科学的機序の新知見を構築することを目的とする。平成24年度は、今回申請のSMARTビデオ行動解析システム、明室と暗室が扉でつながったパッシブアボイダンスケージなど一式の購入と機器の調整を行ったのみにとどまった。撮影用に用いる携帯用ビデオ装置の固定、撮影の角度など、調整箇所が多く、前述の機器の納入が昨年末になった事もあり計画が大幅に遅れているが、6月には生後6日のマウスを用いた行動薬理実験を開始する見込みである。背景)記憶の機序の詳細は未だ明らかでない。その機序として、海馬での長期増強現象のほかF-アクチン構成の増強も、記憶形成を示唆することが近年明らかにされた。しかし、恐怖記憶と海馬でのF-アクチン構成との連関は明らかでない。生後4週の雄若年成体マウスに2.5%セボフルランを空気(2 L/min)をキャリアにし自発呼吸下に3時間吸入させた(セボフルラン群)。コントロール群では2 L/min空気のみ吸入させた。これらマウスに対し、生後8週で驚愕反応検査を行った。すなわち、仕切られた明室ー暗室付属の装置で、1日目に馴化させ、2日目に暗室侵入までの時間(獲得時間)測定と暗室侵入直後の電気刺激を施行した。ついで、3日目に暗室侵入までの時間(保続時間)を測定した。上記検査終了後、頸椎損傷でマウスを安楽死させた。灌流固定後に脳を摘出し、海馬を用いてF-アクチンの免疫染色を行った。(結果)獲得時間に両群の差はなかったが、セボフルラン投与群で保続時間は有意に延長した。海馬でのF-アクチン輝度はセボフルラン群で有意に高値を示した。(結論)若年成体マウスへの臨床使用濃度内のセボフルラン吸入は、恐怖記憶定着に加え海馬でのF-アクチン構成を増強する。麻酔・蘇生学当初予定していた機能的核磁気共鳴画像法による海馬領域の血流評価は、研究代表者の所属施設と施設が異なることから、エネルギートランスポーターの研究結果が出てからこれを施行する計画に変更した。そのため、本法による検討には遅れがある。

さらに、生後1ヶ月のマウスでの検討結果が当初の仮説と逆の結果となり、また、これについては他の研究ではほとんど検討されていないことから、先に生後一ヶ月の個体での影響から結論を出すことにした。平成24年度は、今回申請のSMARTビデオ行動解析システム、明室と暗室が扉でつながったパッシブアボイダンスケージなど一式の購入と機器の調整を行ったのみにとどまった。撮影用に用いる携帯用ビデオ装置の固定、撮影の角度など、調整箇所が多く、前述の機器の設置が昨年末になった事もあり計画が大幅に遅れてしまった。平成26年度は、空間認知機能について追加検討し、さらに、海馬での乳酸トランスポータの発現が増大しているか否かをまず検討することとした。ついで、生後6日のマウスの場合と比較検討する予定である。生後6日の雄C57BL6マウスに現有の気化器を使用して自発呼吸下にセボフルラン1 MAC(この時期のマウスでは2.9%)を吸入、あるいは、プロポフォール350 mg/kg、その2時間後にさらに200 mg/kg腹腔内投与しマウスを5時間鎮静する。コントロール群では等量のイントラリピッドのみを腹腔内投与する。これらマウスに対して、ひとまず行動薬理実験を行い、一部個体の海馬を摘出し、海馬内のDNAをマイクロアレイで評価して、実際に乳酸とランスポータ発現が麻酔薬により修飾されるかを検討して、以後の実験計画を早める計画にしている。幼弱マウス、各種試薬、抗体等の購入
スポーツ場面におけるイメージトレーニング・プログラム作成に関する基礎的研究

初心者のイメージトレーニングの第一歩は鮮明でビビッドなイメージをメンタルスクリーンに想起することから始まるといっても過言ではない.本研究では,最もポピュラーなカラー写真を素材にした9枚のイメージ想起カード(色:赤・黄・青,動物:サル・イヌ・トラ,花:サクラ・キク・ツバキ)を20秒間提示して,被験者のイメージ想起能力やイメージ想起過程(約二か月間に及ぶ十回前後の実験結果)を詳細に検索した結果,下記の知見を得たので報告する.1.イメージトレーニング経験者の実験結果1)イメージ想起カードの一点を凝視すると,イメージは想起されやすい.2)イメージ想起時のメンタルスクリーンは明るいか白っぽく,最初からカラーのイメージが想起された.2.イメージトレーニング未経験者の実験結果1)色の想起カードでは補色,動物や花の想起カードでは残像が見えるようになった.2)イメージ想起時のメンタルスクリーンは暗いか黒っぽく,イメージはカラーではなく白黒である.3)同じカードでも実験毎にイメージの見え方が異なり,さらに,イメージの想起持続も困難である.4)色の想起カードよりも,動物や花の想起カードの方がイメージの中でカラーを感じることが容易である.5)リラックスした状態や変性意識状態はイメージ想起によい影響を与える.6)イメージ想起は実験環境(照度,換気,騒音)に影響されやすい.初心者のイメージトレーニングの第一歩は鮮明でビビッドなイメージをメンタルスクリーンに想起することから始まるといっても過言ではない.本研究では,最もポピュラーなカラー写真を素材にした9枚のイメージ想起カード(色:赤・黄・青,動物:サル・イヌ・トラ,花:サクラ・キク・ツバキ)を20秒間提示して,被験者のイメージ想起能力やイメージ想起過程(約二か月間に及ぶ十回前後の実験結果)を詳細に検索した結果,下記の知見を得たので報告する.1.イメージトレーニング経験者の実験結果1)イメージ想起カードの一点を凝視すると,イメージは想起されやすい.2)イメージ想起時のメンタルスクリーンは明るいか白っぽく,最初からカラーのイメージが想起された.2.イメージトレーニング未経験者の実験結果1)色の想起カードでは補色,動物や花の想起カードでは残像が見えるようになった.2)イメージ想起時のメンタルスクリーンは暗いか黒っぽく,イメージはカラーではなく白黒である.3)同じカードでも実験毎にイメージの見え方が異なり,さらに,イメージの想起持続も困難である.4)色の想起カードよりも,動物や花の想起カードの方がイメージの中でカラーを感じることが容易である.5)リラックスした状態や変性意識状態はイメージ想起によい影響を与える.6)イメージ想起は実験環境(照度,換気,騒音)に影響されやすい.イメージ法を選手に定着されるためには,選手の「心の場」の整備と「心の要素」の活性化が肝要である.「心の場」を整備するには,シュルツの自律訓練法適用時の脳波をできるだけ長くコンスタントにアルファ波支配下(バイオフィードバック装置KLAUS 3000 PFで確認)に置くことである.「心の要素」を活性化するには,選手ひとり一人が鮮明なイメージ想起能力とパワフルなイメージ操作能力を獲得することである.1)自律訓練法のテープ(STEP 1 - STEP 6)の使用により,被験者は一日三十分の練習を一週間続けると,脳波を90%から95%アルファ波支配下に置くことができた.コンスタントに脳波をアルファ波支配下に置くことができるようになった被験者も,大きなプレッシャーを受けるとアルファ波の出現が二三割低下することが認められた.2)三原色,花(チューリップ,菊,桜),動物(犬,猫,猿)をメンタル・スクリーンに想起する場合,イメージ想起能力の12のチェックポイント(色彩,形態,大小,行動,躍動,並存,空間,調和,情緒,力量,巻き込み,展開)で被験者の想起能力を診断すると,個人間においても個人内においても12のチェックポイントに大きな差があることが明らかになった.アルファ波支配下でのイメージ想起能力は統計的検定を行っていないけれども,高まる傾向にあった.3)イメージ操作能力(拡大法,移動法,回転法,鏡像法,彩色法,採光法,増殖法,変容法,活性法,変質法,融合法,接続法)のうち拡大法と移動法は比較的簡単にマスターできるけれども,その他の操作能力を身に付けるにはかなりの時間を要し,さらに課題の関心の強弱によって大きく左右されることが明らかになった.初心者のイメージトレーニングの第一歩はあいまいで生気のないイメージではなく,鮮明でビビッドなイメージをメンタルスクリーン(脳裏)に想起することから始まるといっても過言ではない.本研究では,ポピュラーなカラーのイメージ想起カード(色,動物,花)を提示して,被験者のイメージ想起能力やイメージ想起過程を検索した結果,下記の知見を得たので報告する.イメージトレーニング経験者の実験結果から,1)20秒間,カードの一点を凝視している,2)20秒間どこを重点的に見るかによってイメージに違いが出ることがある,3)イメージ想起時の被験者のメンタルスクリーンは明るい,あるいは白っぽい.4)白黒のみの残像は見られず,最初からカラーの映像としてイメージが想起され,その状態を維持することができる.

イメージトレーニングの未経験者の実験結果から,1)色のカードでは補色,動物と花のカードでは残像が見えるようになった,2)イメージの見え方に統一はあまり見られず,同じカードでも実験毎にイメージの見え方が違うことが多く,また想起された状態が保たれにくい,3)イメージ想起時のメンタルスクリーンは暗いか黒っぽい,4)色のカードより,動物や花のカードの方がイメージの中で色を感じることが容易である,5)印象に残りやすいものはイメージとして想起されやすい,6)一点を凝視する方法を取り入れてからイメージ想起に変化があった,7)イメージはその時の気分や,その人のカードの好みに関わりがあり,リラックスした状態はイメージによい影響を与える,7)何度もカードの写真を見て記憶することがイメージの鮮明性や微視的な見方に影響を与える傾向がある,8)イメージは環境条件(一人または複数での実験,部屋の照度,換気,部屋の周囲の騒音など)に影響されやすい.
Ctf18-RFCによるDNA複製・染色体接着・損傷応答カップリングの解明

染色体接着因子Ctf18-RFCは第2のPCNAローダーとして機能し、複製DNAポリメラーゼε(Polε)と複合体を形成する。この複合体が複製、染色体接着、修復の3機能のカップリングに重要なはたらきを持つものと考え、複合体形成によって獲得する新規活性を解析した。これまでにヒトCtf18-RFCがPolεと複合体を形成することで、生理的塩濃度下のPCNAローディングにおいても高い活性を持つことを示した。そこで磁性ビーズに結合したオリゴDNAを使い、Ctf18-RFC、PolεのDNA結合特異性を解析した。その結果、いずれもがプライマーDNA 3'末端に特異的に結合した。さらにCtf18-RFCとPolεは、それぞれが単独であるより、複合体を形成した場合に、DNAにより安定な結合をすることを明らかにした。さらにこの条件下で実際に、Ctf18-RFCによるPCNAローディングが促進されることを示した。したがって、Ctf18-RFCはPolεと複合体を形成して、プライマーDNA 3'末端に安定な結合をする結果、PCNAローディングが促進されると考えられた。また出芽酵母Ctf18もそのC末を介してPolεと複合体を形成することを明らかにした。そこで出芽酵母のCtf18変異株を使い、その表現形質を解析したところ、細胞内のCtf18-RFCとPolε複合体形成能は、Ctf18がDNA損傷に対して抵抗性を導く機能、および染色体安定化を導く機能に必須であることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。単独の状態でのPCNAローディング活性に注目した結果、主要PCNAローダーRFCが多様なDNA構造を標的として生理的条件下で活性を持つのに対して、Ctf18-RFCは特定のDNA構造に対して、低塩濃度下でのみ活性を有する。これに対して、Polε存在下では、Ctf18-RFCも生理的条件下で高いPCNAローディング活性を持つ。このことからCtf18-RFCがPolεと一体となった複合体限定のPCNAローディングホロ酵素として機能することが予想される。これと平行して行った出芽酵母Ctf18のPolεとの複合体形成についての解析では、まずCtf18がヒト細胞と同様に、そのC末を介してPolεと複合体を形成することを明らかにした。さらにそのC末欠損持つ変異株の機能解析で、Polεと複合体を形成しないCtf18はPCNAローディング活性があるのにも関わらずCtf18ノックアウト株と同程度の高いDNA損傷感受性と染色体不安定性を示した。したがって細胞内でもCtf18-RFCとPolε複合体形成がCtf18の機能に必須であることが明らかとなった。再構築したCtf18-RFCとPolεを使った機能解析では、Ctf18-RFCのPCNAローディング活性がPolεによって促進されるという新規の結果を得た。また、出芽酵母でも、両者の複合体形成が保存されていることを明らかにし、その結合に必要な配列を欠くCtf18の機能解析を進めることができ、これらの主要な課題については、順調に解析が進んだ。しかし、本プロジェクトを次年度につなぐための研究であるPolε側の結合領域の同定については、予定した2hybrid系が機能せず、結果を得ることができなかった。またヒト細胞を使ったCtf18の機能解析は、まだCtf18の検出系が確立しておらず進めることができなかった。主要課題のCtf18-RFC/Polε

複合体の生化学的な機能解析については、PCNAのローディングがどのようなしくみで起き、どのようなはたらきを持つかを明らかにする必要がある。このために、DNA基質の構造を工夫してより複製DNAに近い状態にし、複合体の機能的な場面の再現が必要である。これに伴って、フットプリンディング、電顕等の単分子解析による複合体形成様式の解析に着手したい。技術的な問題で進めることができなかったPolε側の結合領域の同定については、Polε断片の発現を2hybrid系以外の方法で発現を試みる予定である。また抗体が有効に使えなかったヒト細胞での解析については、タグ付きCtf18の発現系を工夫して細胞内でのCtf18の挙動解析に着手したい。
虚血・過興奮毒性条件下における心臓・脳細胞の三次元イメージングとアニオンチャネルマッピィング

昨年度は、走査イオンコンダクタンス顕微鏡法(SICM)とパッチ・クランプ法を組合せたいわゆる"Smart patch"法を駆使して、容積感受性外向整流性(VSOR)アニオンチャネルの心筋細胞膜上の局在を調べるマッピング研究を行ったので、本年度は容積依存性ATP透過性マキシアニオンチャネルの心筋細胞膜上でのマッピングを主として行った。新生仔ラット心臓から初代培養した心筋細胞は、浸透圧性細胞膨張、虚血、低酸素条件などにおいて細胞外へのATP放出を発生するが、その放出は細胞の中央部やその周囲部からが著しく、細胞末端伸展部では殆ど見られなかった。ATP放出路を与えることの知られているマキシアニオンチャネルの形質膜上の発現分布をSmart patch法で調べたところ、本チャネルの分布も中央部とその周囲部での発現が著しく、伸展部では殆んど見られないことが判明した。成熟ラット心臓から単離した心筋細胞では、これまでマキシアニオンチャネルは存在しないと報告されていたが、極めて細いパッチピペットを用いてSmart patch法を行うと、T管開口部付近やZ帯にのみマキシアニオンチャネルが発現していることがはじめて確認された。更には、マウス脳グリア細胞における検討へと研究を進めた。大脳皮質から単離培養したアストロサイトにグルタミン酸を投与して過興奮刺激すると、細胞膨張が引き起こされることがSCIM法によって確認された。現在、VSORクロライドチャネルやマキシアニオンチャネルの発現分布についてSmart patch法によって検討しているところである。本年度は、初代培養新生仔ラット心筋細胞の容積感受性外向整流性(VSOR)アニオンチャネルの分布とその役割について、パッチクランプ法と走査イオンコンダクタンス顕微鏡(SICM)法を用いて検討した。低浸透圧刺激によってVSORアニオンチャネルの活性化が確認された。本チャネル活性はNPPBやphloretinやtamoxifenで抑制された。パッチクランプ法とSICM法を同時適用して、VSORアニオンチャネルの分布を調べたところ、細胞体中心部と辺縁部や突起部で差はなく、ほぼ均一に細胞全体に分布していることが判明した。浸透圧性膨張後に次第に容積が回復する容積調節能(即ちRegulatory Volume Decrease : RVD)が観察された。このRVDもNPPBやphloretinやtamoxifenで抑制された。解糖阻害剤(deoxyglucose)と酸化的燐酸化阻害剤(NaCN)の同時投与によって細胞を化学的に虚血状態にすると、細胞はやや膨張し、低浸透圧刺激後のRVDの達成スピードは減少することが判明した。今後、活性のあるVSORアニオンチャネルの分布が虚血によっていかなる影響を受けるか、ATP放出をもたらすマキシアニオンチャネルの場合はどうか、過興奮毒性条件下ではいかなる影響をうけるか、などについて調べて行きたい。
DNA塩基配列分析による霊長類と蟯虫類の共進化の研究ー原猿類からヒトまでー

世界各地の野生および飼育霊長類およびヒトに寄生する様々な蟯虫類を集め、その形態学的な同定を行なうと共に、18SrDNAおよびmtDNA Cox1領域の塩基配列による系統樹によって、霊長類との共進化過程の検証を行なった。これらの2分子の解析では原猿類と新世界霊長類の分岐のような古い年代を正しく反映することはできなかったが、より新しい時代の分岐は霊長類進化の順序と一致し、分子的にも共進化を支持する結果が得られた。ヒト蟯虫にはCox1塩基配列に大きく3型がみられ、A型は日本、韓国などアジアのヒト、B型は東アフリカからヨーロッパのヒトにみられ、在日ブラジル人にも証明された他、飼育チンパンジーに見られた。C型はこれまで飼育チンパンジーのみに証明されているが、本来は西アフリカのヒトに寄生するものと考えられる。分子系統樹ではまずC型が分岐し、次にB型とA型が分岐しており、人類の分散に連動してこれら3型が形成されたものと考えられた。平成20年度の研究で,次のような成果をあげた.(1)ヒトから得たヒト嶢虫卵よりDNAを抽出してCox1塩基配列を解読し,系統解析を行った.その結果これまで飼育チンパンジー寄生ヒト嶢虫Enterobius vermicularisにしか見られなかったB型塩基配列の存在を証明した.このことは飼育チンパンジーに寄生するヒト嶢虫がヒト由来であるという仮説を支持する重要な所見であり,アフリカのヒトには残るC型も寄生していることを示唆している.(2)アフリカの野生チンパンジー(タンザニア産,ガボン産)53頭,ボノボ(コンゴ産)55頭,ゴリラ(ガボン産)241頭,ボルネオの野生オランウータン36頭の糞便を日本モンキーセンター,山口大学,京都大学の協力で採取して検査し,ガボンのチンパンジーからチンパンジー嶢虫E.anthropopitheci,オランウータンからPongobius属に入ると思われる嶢虫類を検出した.このPongobiusはスマトラ島のオランウータンから記載されているP.hugotiとは異なり,オランウータンの分散過程との関連が注目される.(3)日本モンキーセンターで飼育されている霊長類を調査し,ケナガクモザルとウーリーモンキーからクモザル嶢虫Try panoxyuris atelisを得て,Cox1塩基配列を比較し,これらの間,さらにジェフロイクモザル寄生との間にも差異を認めた.これは中南米でクモザル類と嶢虫類が共進化した結果と考えられる.(4)米国研究者からアルゼンチンホエザルの嶢虫提供を受け,ホエザル嶢虫Try panoxyurisminutusに近いものの卵が大きく,亜種レベルで異なると推定された.平成21年度の研究で,次のような成果をあげた.(1)南米原産のウーリーモンキー,ケナガクモザル,ジェフロイクモザルに寄生する蟯虫はTrypnaoxyuris atelisと同定していたが,昨年度のmtDNA Coxlに続いて18S rDNAも解読した結果,やはり一定の差があった.そこで形態を再精査したところ,交接刺に差異を認め,それぞれが別亜種を形成する可能性が示唆された.(2)霊長類の糞便からの蟯虫をはじめとした小型寄生虫の検出方法,形態観察法,およびDNA塩基配列から推定される霊長類寄生蟯虫類の系統樹をCambridge University Press刊行の単行本Primate Parasite Ecologyに発表し,併せて霊長類寄生虫卵図譜を同書のappendixに掲載した.(3)系統比較のためコウモリ寄生線虫RiouxgolvaniaのrDNA全域6530塩基の配列を解読した.(4)マレーシアのボルネオ島ダナムバレーの野生オランウータンから得られた蟯虫類を調べ, Pongobius属に2種が混在し,うち1種は新種であることを見出し,他の寄生虫と共にまとめて論文を投稿した.(5)インドネシア中部スラウェシに棲息するBunomys chrysocomusに寄生する蟯虫がSyphacia属の新種であることを発見し,命名記載した.(6)ヨーロッパの動物園で飼育された後,本来チンパンジーの分布しないビクトリア湖のルボンド島に導入され,定着したチンパンジー個体群の寄生虫感染状況を蟯虫類も含めてまとめて論文発表した.これらの寄生虫にはチンパンジー蟯虫Enterobius

anthropopitheciのようにチンパンジー固有でチンパンジーとともに導入されたものと, Protospirura muricolaのように現地で新たに獲得されたものが混在していた.(7)動物業者が飼育販売している霊長類(ワオキツネザル2頭,アカテタマリン2頭,コモンマーモセット2頭,スローロリス2頭,リスザル50頭,フサオマキザル18頭)を検査したが,蟯虫類を検出することはできなかった.平成22年度の研究で次のような成果をあげた.(1)ギリシャアテネ大学Dr.Piperakiの協力によって同国のヒト由来ヒト蟯虫Enterobius(Enterobius)vermicularisの虫卵を入手し,そのmtDNA Cox1塩基配列を解析したところ,全てB型に属することが証明され,東アフリカからヨーロッパにかけてはB型であることが示唆された.(2)約30年前に行なわれた海外在留邦人の健康調査の際の蟯虫検査セロファンの恵与を受け,付着する虫卵からDNAを抽出してmtDNACox1塩基配列を解読したところ,ほとんどでA型のヒト蟯虫が維持されていることを見出した.ただし1例は未知の型であった.(3)山口県と奈良県産ニホンザルからEnterobius(Enterobius)macaciを得て(本邦初記録),形態観察とDNA塩基配列分析を行なった.mtDNACox1塩基配列による系統解析では,ヒト蟯虫とチンパンジー蟯虫の分岐より古い時代での分岐を示し,霊長類の系統と矛盾しない結果となった(論文準備中).(4)ボルネオ産オランウータン寄生新種蟯虫Pongobius foitovaeを混合寄生しているP.hugotiや他の寄生蠕虫と併せて記載発表した.(5)スリランカ産ハイイロラングールの糞便からEterobius亜属と思われる蟯虫を検出した.(6)ベトナム産マカクの糞便20検体,南アフリカ産ヒヒの糞便約600検体の提供を受け,検査したが,蟯虫類は発見できなかった.
量子ホール系におけるランダウ準位間励起のテラヘルツ偏光分光

量子ホール効果は電子の局在現象が寄与し、ホール抵抗に量子化されたプラトー構造を生じる現象である。一方高周波数、特にテラヘルツ周波数領域はランダウ準位間の遷移エネルギーに相当するため、このようなプラトー構造を示すか自明ではない。光周波数領域のホール伝導度は偏光測定により決定できる。しかしながら量子ホール効果に由来する構造を観測するためにはmrad程度の微小回転角の測定が不可欠である。このため0.5mrad以上の検出感度を持つ高感度テラヘルツ偏光分光測定系を開発し、GaAs/AlGaAs2次元電子系のテラヘルツホール伝導度の決定を行った。前年度は3Kにおいて偏光測定を行い、ホール伝導度にプラトー構造を観測した。本年度はこの構造が量子ホール効果によるものかを明らかにするために、20Kで同様の測定を行った。得られたホール伝導度はプラトー構造を示さず、自由電子的なDrudeモデルに従った。この振る舞いは直流領域と一致し、これにより観測されたプラトー構造が量子ホール効果を由来とするものであることを明らかにした。一方テラヘルツホール伝導度に観測されたプラトー構造は、その中心磁場がランダウ準位間の中心よりも弱磁場側にずれていた。このためこの原因について考察を行った。青木らによれば、局在現象を特徴づける局在長はそのエネルギー依存性がランダウ準位ごとに異なる[H. Aoki and T. Ando, Phys. Rev. Lett. 54, 831 (1985)]。故にランダウ準位間の中心に対し、局在長は非対称であり、プラトー構造はずれを生じうる。この効果は高周波数になり系を特徴づける長さが短くなるほど顕著になるため、観測された振る舞いを説明することが可能である。量子ホール効果の起源である局在現象は系を特徴づける長さと局在長との大小関係により表される。この関係がテラヘルツ周波数でも成立すると考えれば、本研究結果はこの周波数領域においても系を特徴づける長さが局在長より長いスケールを持っていることを示唆していると言える。量子ホール効果は低温、高磁場下の2次元電子系において生じる、電子の局在現象に起因する現象である。この局在現象がランダウ準位の励起を生じるテラヘルツ周波数領域において伝導にどのような寄与を示すのか明らかにするために、本年度では量子ホール系に対し詳細なテラヘルツ偏光分光測定を行った。偏光回転角はホール伝導度に対応し、局在効果を議論することを可能にする。試料にはGaAs/AlGaAs単一ヘテロ構造における2次元電子系(東京大学大学院理学系研究科岡本研究室提供)を用いた。本試料は高磁場において高いサイクロトロン共鳴周波数を持つ。このためまずは検出領域の広帯域化を測った。具体的には発生結晶、検出結晶としてそれぞれp型InAs、ZnTe[110]を用い、広い帯域で強度を確保した。また磁場印加用の超伝導マグネットにテラヘルツ電磁波を入れるための窓材を、石英からより高周波数での吸収が少ないポリマーに変えた。これにより0.3から2.5THzの広い周波数領域における高安定な測定を可能にした。実験で得られた偏光回転角スペクトルはランダウ準位の占有数2近傍において自由電子的なDrude Modelからのずれを示した。さらに偏光回転角から決定されたホール抵抗は量子ホール的なプラトー構造を示した。このことはランダウ準位間遷移を生じる高周波数領域においても局在・非局在状態が伝導に寄与することを示唆している。また観測された低周波数領域の偏光回転角は量子ホール効果に従い、微細構造定数で表される値に量子化されることを明らかにした。これらは森本らの理論計算による予測[Phys.Rev.Lett.103,116803(2009)]と一致する結果である。

この効果は高周波数になり系を特徴づける長さが短くなるほど顕著になるため、観測された振る舞いを説明することが可能である。量子ホール効果の起源である局在現象は系を特徴づける長さと局在長との大小関係により表される。この関係がテラヘルツ周波数でも成立すると考えれば、本研究結果はこの周波数領域においても系を特徴づける長さが局在長より長いスケールを持っていることを示唆していると言える。
全無線自律分散ネットワークに向けた超大容量無線伝送方式と高度適応信号処理の研究

複数アンテナを用いるMIMO (Multiple-Input Multiple-Output)多重技術の登場により、無線通信においても有線通信並の高速性・安全性を有する情報伝送の可能性が拓けてきた。一方で無線機の小型化・省電力化の需要が拡大し、中継伝送を行うマルチホップ通信網の研究が進んでいる。ここに来てMIMO伝送とマルチホップ通信の利点を活かす一つの手段として、近傍の端末が協力して情報伝送を行う協力通信が注目され始めた。協力中継の有力な手法として時空符号化の研究が盛んであるがタイミング同期の困難性や符号割り当ての低い自由度が問題となる。本研究では複雑な中継処理を要しない協力遅延ダイバーシチ方式の有効性を示し、周波数領域繰り返し等化により統一的に遅延波の合成が可能であることを明らかにした。また、協力通信の問題点である搬送波周波数のオフセットを繰り返し処理により補償できることを示した。このときあらゆる伝搬環境において期待通りの特性を示すようにするため、伝搬路の時空間相関を利用した最適重みを持つ適応最小二乗伝搬路推定法を理論的に導出し、高い伝搬路推定精度が得られることを示した。さらに演算処理量を軽減する逐次アルゴリズムを提案している。同時に、伝搬路推定アルゴリズムを並列に用いるアルゴリズムダイバーシチの有効性も評価した。さらに相互情報量の伝達過程解析を行い、繰り返し等化において余分な繰り返し処理を省く効能を示した。また、高速伝送を実現するMIMO多重伝送にしばしば用いられる順序付け順次復号方式に関して、並列ハードウェア実装に適したシストリックアレイ構成を有する低演算量アルゴリズムを提案している。全無線マルチホップネットワークにおいて,近傍の無線機が互いに協力し合い,ダイバーシチ送信を行う協調通信が注目されている.受信機の負担軽減をねらって,簡易な線形処理によりダイバーシチ合成が可能となるSTBC(Space-Time Block Code)を利用する研究が多数行われている.協調通信の利点は,複数の近傍無線機の協力により,低いブランチ間相関を実現し大きなダイバーシチ利得が達成できることである.しかしダイバーシチ次数を向上させるためには,多数の無線機に効果的に高次のSTBCを割り当て,同期させて中継する必要がある.そこで本研究では高いダイバーシチ次数を実現し,同期ずれに寛容である遅延ダイバーシチ送信を利用する方式を提案した.遅延波数の増加に対して演算量増大が生じない周波数等化(FDE : Frequency-Domain Equalizer)を導入することで比較的容易にダイバーシチ次数の向上が可能である.等化器に利用により,広帯域伝送時に生じる符号間干渉は自然に補償することができ,特性の改善に寄与することができる.FDEは中継機間の同期ずれに起因する遅延を吸収でき,同期に関する制御困難性を緩和できる.また,ダイバーシチブランチの割り当ては送信タイミングの設定のみであるため,自由度の高いシステム設計が可能である.しかし,一般に線形等化による遅延ダイバーシチ利得よりもSTBCダイバーシチ利得の方が高いことが知られている.本研究ではさらにFDE利用のための周波数時空符号を提案し,遅延とSTBCの両ダイバーシチ効果を同時に引き出す繰り返し等化器の提案を行った.見通し内環境下などでは,協力無線機数を余計に増大させても特性改善に寄与しない現象が生じる.そこで,協調通信に空間多重技術を併用することで,さらに高い伝送容量が実現可能であることを明らかにした.無線通信の需要拡大に伴い、より高速かつ安全・正確に情報を伝達することが望まれている。集中制御型の通信網に代わり、各端末が自律分散的に通信網を構築する柔軟性に富んだ通信形態への関心が高まりつつあるが、上位層からの研究が主流であり、無線伝送方式など物理層と融合させた研究例は少ない。本研究では、複雑な処理を必要としない時空符号化協力中継方式を検討し、車車間通信システムにおいて動的な経路選択を必要とせずに通信の安定性を向上させることができることを明らかにした。トラックなどの遮蔽物による無線信号の劣化を協力中継により回避できることを示し、システム容量を効果的に向上させることに成功した。また、複数の送受信アンテナを用いて大容量伝送を行うMIMO (Multiple-Input Multiple-Output)方式において優れた通信品質を有する最尤受信機の研究開発を行った。これまで知られているQR分解を用いる方法が実装に適していないことに着目し、新たに相関メトリック計算法を提案し、実際にFPGA (Field Programmable Gate Array)を用いてギガビットを超える実時間処理を達成するMIMO受信機のハードウェア実装を行った。そして、MIMO伝送の有効性を室内伝送実験系により実験的に解析した。さらに、MIMOや協力中継システムで問題となる周波数オフセットおよび時間選択性チャネルを補償する理論的最適伝搬路推定法の導出と遺伝的アルゴリズムを利用した伝搬路推定系列の非線形最適化法の提案を行った。また、これらの技術を統合した適応最尤系列時空等化の有効性と並列化ニューラル信号処理の適用有効性を解明している。

本研究では複雑な中継処理を要しない協力遅延ダイバーシチ方式の有効性を示し、周波数領域繰り返し等化により統一的に遅延波の合成が可能であることを明らかにした。また、協力通信の問題点である搬送波周波数のオフセットを繰り返し処理により補償できることを示した。このときあらゆる伝搬環境において期待通りの特性を示すようにするため、伝搬路の時空間相関を利用した最適重みを持つ適応最小二乗伝搬路推定法を理論的に導出し、高い伝搬路推定精度が得られることを示した。さらに演算処理量を軽減する逐次アルゴリズムを提案している。同時に、伝搬路推定アルゴリズムを並列に用いるアルゴリズムダイバーシチの有効性も評価した。さらに相互情報量の伝達過程解析を行い、繰り返し等化において余分な繰り返し処理を省く効能を示した。また、高速伝送を実現するMIMO多重伝送にしばしば用いられる順序付け順次復号方式に関して、並列ハードウェア実装に適したシストリックアレイ構成を有する低演算量アルゴリズムを提案している。
咀嚼筋機能異常における低反応レベルレーザー照射の影響

昨年度、レーザーによるLLLTが実際の診療でどの様な効果をあげられているかの検証を行い、これまで出されたLLLTの疼痛抑制効果についての報告と同様の結果が得られた.また、周囲組織へのLLLTの影響を考慮しなければならないことも判明し、本年は硬組織へのレーザー照射(CO2)の影響を観察してきた。XY軸エナメル質への照射出力差による影響は焦点距離4ミリでCW、SP1、SP2を0.5W、1W、1.5W、2Wでの盛り上がり量、蒸散した穴の直径と深さ、白濁したエリアの直径を求めた。X軸は、0.5Wではエナメル質の蒸散はなく白濁したエリア(100μm以下)のみ観察されたが、他は盛り上がりと蒸散が認められた。これに対しY軸では、0.5WであってもCW以外ではわずかな蒸散が認められた。XY軸象牙質への照射出力差による影響は、X軸で0.5WであってもCW以外でははっきりとした蒸散が認められた。この結果はY軸でも同様であったが、エナメル質と象牙質では蒸散されずに残存した歯質に違いが見られた。これは、エナメル質と象牙質の組成や構造の違いだけでなく、吸収線量の違いがあるのようにも考えられる。次に照射距離の違いによる象牙質への影響はCW、2Wで011ミリの範囲で観察した。蒸散深さは照射距離4ミリ、穴の直径は照射距離7ミリ、炭化部位の直径は照射距離11ミリが最大であった。しかし、蒸散深さと穴の直径は最大となる照射距離を中心に前後は減少しているが、炭化部位の直径は照射距離5ミリを最低とし、前後で増大していた。これらのことから照射条件により歯牙組織に与える影響には差が大きく、照射出力や距離や組織によって変わることが明らかとなった。今後さらに詳しい検討を行い、LLLTの条件設定を行いたい。第一に、本研究を行なうための測定システムの構築を行なった。先ず、血流測定装置により測定された値をパーソナルコンピューターに取り込み、保存するシステムの構築を完了させた。これは、術者が任意に測定時間を設定でき、レーザー照射前、照射中、照射後も測定可能である。次に、上記のパーソナルコンピューターに二次元放射温度計により測定された値を取り込み、同時に保存するシステムの構築を完了させた。これはデータ収集ソフトを導入することにより、リアルタイムに測定可能となった。また、テスト段階ではあるが、レーザー照射前、照射中、照射後の微小血管血流の観察を行うために、メダカの尾ひれを用い、動画および静止画での記録を行なえることを確認した。これで、血流測定および温度測定中の微小血管血流の観察(動画と静止画)を可能にした。ここまでのことを10匹のメダカを用いてでテストを行なったが、すべて良好に観察が可能であった。しかし、大気中でのメダカの微小血管血流の観察(動画と静止画)は5分から8分程度であり、照射後の観察には困難な場合もあった。第二に、ラットまたはマウスの皮下に透明窓を埋め込み、微小血管血流の観察を行なう予定であったが、埋め込み手術後の微小血管血流の観察への影響を考え、検討を行なっている段階である。手術後、一定の治癒期間(約12ヶ月程度)経過後に全ての測定を行なうものと、手術を行なわずに観察できる方法を模索するかであるが、現段階では前者は実現可能であると思われる。しかし、後者での観察を可能にする機器も開発されており、本研究に応用可能か検討中である。本年度、レーザーによるLLLTが実際の診療でどの様な効果をあげられているかの検証を行った。患者の主訴である痛みに対しLLLTを行った結果,照射直後から筋の疼痛症状が緩和したと感じた患者は5名中3名であり即効性はあると考えられたが,その効果が23日と持続しなかった.しかし,ハードタイプスプリントやソフトタイプナイトガードおよびストレッチを併用することにより,痛みの軽減,発症頻度の減少を認めた.唯一,LLLTのみの上下顎総義歯患者も照射直後から筋の疼痛症状が緩和し,他の4名と比べて緩やかではあったが発症頻度の減少が認められた.このことは,これまで出されたLLLTの疼痛抑制効果についての報告と同様の結果が得られた.今回の患者の5名中4名はブラキシズムを自覚していなかった.そこで,スタディーモデルを用いて歯牙の咬耗状態の確認をさせたり,ハードタイプスプリントやソフトタイプナイトガードが咬耗していることで自覚を促したところ,全員がブラキシズムを自覚した.これにより,患者の治療への積極的な参加を促したことは事実で,痛みや苦痛を伴わず副作用も報告されていないLLLTはこれまでの処置と比べても患者に受け入れられ易く,処置を行なう我々にとっても安心できる治療の1つと考えた。最後に,筋症状は患者により痛みの大きさ,感じ方,表現方法,部位など異なる点が多く,また,LLLT処置に対しても未知なところが多いため,客観性に欠けるが患者各々が使用している表現に合わせ,会話中の聞き取りによる主観的な評価をせざるを得なかった.この点に関しては今後の課題である.また、昨年度のメダカによる血流への観察が可能であることが分かったが、周囲組織へのLLLTの影響を考慮しなければならないことも判明した。我々が皮膚および粘膜組織にのみ照射対象としていても、その周囲の硬組織に影響をおよぼしている可能性があり、これらの影響を確認する必要がある。