hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
実解析的方法による非線形発展方程式の解の安定性の研究

また,圧縮性粘性流体に関する拡張も多少を行った.しかし圧縮性粘性流体についての研究の多くは今後の課題である.1.外部領域における無限遠方での流速が零でない定数ベクトルの場合,対応する線形化方程式であるOseen方程式の境界近傍での解のエネルギーの減衰度を詳しく調べた.またこれを応用し,Oseen半群のLp-Lq評価を求め,本来の問題であるNavier-Stokes方程式の無限遠方での流速が零でない場合の定常解の初期摂動に関する安定性を示した.(前者はすでに刊行済みであるが後者は発刊予定である).2.完全壁条件下でのラプラス方程式のレゾルベント問題の最良の評価をLp枠内で行った.この応用として超流動・超伝導を記述するひとるのモデル方程式である,Ginzburg-Landau-Maxwell方程式の定常解を磁場の外力が小さい場合に求め,さらに初期摂動に関するこの定常解の安定性を示した.3.半空間におけるストークス方程式のレゾルベント問題の解の原点付近での漸近展開を求めた.これを応用して摂動法により摂動半空間におけるストークス方程式の解の局所減衰定理を示した.さらにLp-Lq評価を求めた.摂動半空間での評価は外部領域より本質的に良いことがわかった.もって,摂動半空間でのNavier-Stokes方程式の解の漸近挙動に関して外部領域より本質的に良い評価を求めるにいたり,摂動半空間での流体の流れの解析の数理的側面に関し,最新の結果と得た.4.有界領域においてthermoelastic-plate方程式が解析半群を生成することを示した.また,最大正則性定理も成立することをしました.これより,板の運動に内部エネルギーの効果を考慮した現象を記述するnonlinear thermoelastic plate equationを初期値が小さい場合にLpの枠組みで解いた.1.有界領域におけるStokes方程式のNeumann問題に対する解の最大正則性原理の証明に成功した.先行研究としてはロシア科学アカデミー教授V.Solonnikov氏のものがあるが,それは時間局所的でありさらに指数に制限がついていたが,今年度の研究により時間大域的な性質と指数に関する制限なしの結果を得た.我々の証明方法はWeisのFourier multiplierに関する最新の結果を用いるところが他の研究グループとの違いであり,これにより世界に先駆けて上記の結果をえることが出来,この方面での研究を完成させたといってよい.さらにこの原理を応用して表面張力を考えなくて良い場合の自由境界をもつNavier-Stokes流の時間大域的一意存在定理を初期値が小さい場合に示した.2.無限遠方での流速が零の場合の回転する物体の外側を流れるNavier-Stokes流の数学的解析において,その線形化問題の解の時間大域的なLp-Lq評価を示した.先行研究としては解の存在とその時間局所的な評価は得られていた.
新しい動脈硬化性疾患発症の予知因子としての高感度CRPの意義に関する疫学研究-生活習慣改善の効果解明を含めて-

一般集団で、高感度法にて測定したCRP値と生活習慣、動脈硬化の程度との関連を、系統的文献レビューを行った結果、以下の点が明らかになった。高感度CRP値が動脈硬化性疾患発症もしくは死亡を予知するかについては、健康な男女の中高年で、他の因子と独立して動脈硬化性疾患発症と死亡のリスクの予知因子である。ただし、80歳以上の高齢者では、十分な根拠がなかった。CRP値は摂取する栄養素と関連し、身体活動はCRP値を低下させ、喫煙はCRP値を上昇させる。また、頚動脈硬化(Intima-medica thickness-IMTの肥厚)とCRP値と関連しており、また、中等量の飲酒がCRP値を減少させることについてはレヴェルIIのエビデンスがあることが明らかになった。職域集団のコホート集団で循環器疾患を予測する危険因子について検討するため、札幌市職員の13000人、北海道職員14000人、JR北海道職員1600人、千歳市職員の600人を対象に開始した。集団を追跡することにより動脈硬化性疾患発症の要因をストレスなどを含めて明らかにすることができる。また、札幌市職員については動脈の脈波測定をおこない、現時点の動脈硬化の評価と、その動脈硬化性疾患発症の予測因子としての役割を検討している。一部の集団で行った[日本人における高感度CRPと内臓脂肪の関連についての検討]を示す。【結論】健康な日本人では、CRPは内臓肥満に関連し、インスリン抵抗性の要素の一部に関連していたが、IL-6とTNF-αには関連しなかった。一般集団で、高感度法にて測定したC-reactive protein(CRP)値と生活習慣、動脈硬化の程度との関連を、系統的文献レビューを行い、動脈硬化性疾患発症の予知因子としての高感度CRP測定の意義を明らかにするものである。その結果,以下の点が明らかになった。高感度CRP値が動脈硬化性疾患発症もしくは死亡を予知するかについては、健康な男女の中高年で、他の因子と独立して動脈硬化性疾患発症と死亡のリスクの予知因子である(Level IVa)。ただし、80歳以上の高齢者では、十分な根拠がない。高感度CRP値と食習慣との関連では少なくとも1つのLevel IIのエビデンスがあったのは、CRP値が低い集団で、違いがみられた炭水化物、単不飽和中性脂肪、繊維、omega-6/omega-3脂肪酸比、エネルギー、飽和脂亡酸、コレステロール摂取量である。高感度CRP値と運動習慣と関連については、身体活動はCRP値を低下させる(Level IVb)。高感度CRP値と喫煙の関連については、喫煙者では、他の因子と独立してCRP値を上昇させる(Level IVa)。高感度CRP値と飲酒と関連については、中等量の飲酒は、CRP値を低下させる(Level II)。高感度CRP値と頚動脈硬化の関連については、男性では、CRP値上昇がIMT増加と関連する(Level IVc)。女性では、過去に喫煙歴があった者ではCRP値上昇が総頸動脈のIMT肥厚と関連する(Level IVa)。今回のレビューより、健康な男女の中高年での高感度CRP値スクリーニングが、動脈硬化性疾患発症と死亡のリスクの予知に有用であり、CRP値が栄養素、身体活動、喫煙、飲酒、頚動脈硬化(Intima-medica thickness-IMTの肥厚)と関連しており、また、中等量の飲酒がCRP値を減少させることについてはレヴェルIIのエビデンスがあることが明らかになった。
異物排出トランスポーターの構造・機能・制御と生理的役割

構造に基づく異物排出輸送機構の解明においては画期的なパラダイムシフトをもたらす大きな成果が得られた。すなわち、複数のマルチサイト異物結合ポケットの発見とタンパク質の蠕動運動による異物排出のペリスタポンプ機構の解明である。また、異菌種間センシングによる発現制御では、インドールによるサルモネラ異物排出タンパクの誘導機構を詳細に解析し、RamA, RamRの役割を解明した。創薬スクリーニング系として、完便な耐性菌検出デバイスを作成した。(1)AcrAB-TolC複合体作動機構の残された問題解決。とくに、マルチサイト結合機構が多剤認識機構として普遍妥当性を持つかどうか、大分子量薬物分子で確認すること。(2)異菌種間、宿主・細菌間情報センシングによる異物排出遺伝子発現制御機構の解析。(3)異物排出遺伝子の本来の生理的役割の解明。とくに高等生物における排出輸送体介在型情報伝達の解明。大腸菌が分泌したインドールを、インドール非産生菌サルモネラがセンシングして主要異物排出タンパクAcrABを発現誘導する分子機構の解明に向かって大きく前進した。この発現誘導には、大腸菌にはなく、サルモネラに存在する調節タンパクRamAが関与することを発見した。RamAは、インドールを介した異菌種センシングのみならず、宿主由来の胆汁酸によるAcrAB発現にも必須であった。極めて興味深いことに、インドールと胆汁酸とではRamAを介した誘導の機構が大きく異なることがわかった。すなわち、インドールはまずRamAの発現量を増大させることによりAcrABを発現誘導する。他方、胆汁酸はRamAの発現量そのものには影響を与えずAcrABを発現誘導する。私たちはサルモネラのRamAを初めて精製し、AcrABのプロモーター部位よりやや上流、AcrR遺伝子配列の中に結合サイトを持っ転写活性化因子であることを突き止めた。以上の事実から、RamAの発現量が増加するとプロモーター上流域への結合量が増加し、AcrABの転写量が上昇する。一方、RamA発現量に変化が無くても、上流域への結合親和性の増加などのRamA活性化が起こればやはりAcrAB転写量は上昇するというalternative induction modelが導かれる。現在、そのモデルを証明すべく、胆汁酸とRamAの結合、胆汁酸によるRamAのDNAへの結合親和性変化などの実験を行っている。サルモネラ菌感染モデルの構築、排出輸送活性測定法の確立、サルモネラ菌排出タンパク結晶化などはいずれも順調に実験系の確立などに取り組んでいる。フェムトリッターチャンバーを用いた一細胞排出測定系は確立し、好感度に検出できることを確認した。サルモネラ菌が環境を感知して異物排出トランスポーター発現を上昇させる制御系について研究し、異菌種からのシグナルとしてのインドールと、宿主のシグナルとしての胆汁酸が、何れもRamAを介してAcrAB発現を誘導すること、そのメカニズムがインドールはRamA発現量の増大、胆汁酸はRamA活性化によるという違いのあることを明らかにし、JBCに発表した。AcrABとAcrEFは異物排出スペクトルは類似しているが、前者は構成的に発現しており、後者は発現していない。AcrEF上流の転写調節因子AcrSは、AcrEFの発現ではなくAcrABの発現をトランスに抑制する因子であり、AcrEF-AcrSが発現誘導する条件で、AcrABの発現をオフにする働きをしている興味深い事実をを発見し、J.Bac.に発表した。また、インドールが腸管出血性大腸菌のtypeIII分泌システムを誘導することで病原性を高める働きをすることをMicrobiologyに発表した。排出トランスポーターは細菌のみならず、動物でも重要な役割を持っている。脂溶性情報伝達物質の分泌輸送体は長らく不明であったが、初めて、その一つであるスフィンゴシン1リン酸分泌輸送体を発見し、Scienceに発表した。基盤Sでは、細菌の異物排出タンパクの構造に基づく異物認識機構の解明と、その発現制御機構ならびに生理的役割の解明を目指している。まず、発現制御機構については、様々な新しい知見が明らかになってきた。外膜のリポタンパク質NlpEは環境センサーの一つとされているが、その高発現によって二成分情報伝達系CpxARを介してAcrD, MdtABCという異物排出タンパクを誘導し多剤耐性化をもたらすという新しい機構を発見した(AAC, 2010)。同様の機構は大腸菌だけでなく病原細菌サルモネラでも発動しており、臨床的にも重要な発見と言える。近年注目されているRNAシャペロンHfqの多剤耐性への関与も解明した(JAC, 2010)。このほか、異物排出による多剤耐性調節機構に関して2009年度中に5編の論文を発表した。構造に基づく異物認識機構については大きな前進があった。これまで、ミノサイクリンとドキソルビシン2つの基質結合構造解析から、多剤認識の構造的基盤としてマルチサイト結合という考えを提唱してきた。しかし、もっと大きな基質についてもタンパクの構造変化無しに認識可能かどうか疑問が残されていた。

本年度、ミノサイクリンの1.5倍から2倍の分子量を持つエリスロマイシンとリファンピシンの結合構造決定にほぼ成功し、その結合位置を特定した。驚くべきことに、3つのモノマーのうち、結合モノマーに結合しているのではなく、待機モノマーに結合していた。一見、大きくかけ離れた位置のように見えるが、子細に検討すると、基質の入り口から、ミノサイクリンが結合しているフェニルクラスター領域に続く分子内チャネルのうち、クラスターへの入り口の外に結合していることがわかった。すなわち、大分子量故に、経路の途中に引っかかっていたのである。これらは最終的には排出されるので、そこで詰まっているわけではなく、そこが認識部位になっているものと考えられる。マルチサイト結合領域は当初の予想よりも広範囲にわたっていることが明らかとなった。サルモネラ菌が環境を感知して異物排出トランスポーターの発現を制御している制御系について研究し、インドールに応答するramA/acrABの発現誘導はRamRを介していることを解明した。また、これとは別にパラコートがramA非依存的にacrABの発現を誘導することを見出し、新たなacrAB発現誘導機構としてSoxSを介した経路を明らかとした。これらの成果をJBCに発表した。この他、異物排出による細菌の多剤耐性化に関する研究をまとめて5報の論文を発表した。構造に基づく異物認識機構については大きな前進があった。これまで、ミノサイクリンとドキソルビシン2つの基質結合構造解析から、多剤認識の構造的基盤としてマルチサイト結合という考えを提唱してきた。本年度は、より大きな分子量を持つエリスロマイシンとリファンピシンとの結合構造決定に成功して、その結合位置を特定した。その結晶構造からミノサイクリンが結合するディスタルポケット(フェニルクラスター領域)とは別にプロキシマルポケットが存在することが明らかとなった。この2つのポケットは分子内チャンネルに沿って並んており、F617ループによって区切られている。排出される薬剤はまず待機モノマーのプロキシマルポケットに結合し、次いで結合モノマーへの構造変化に伴ってディスタルポケットに送り込まる。そして最終的には排出モノマーから排出されるという「ペリスタルティック機構」を提唱した(論文審査中)。23年度には異物排出トランスポーターの新たな基質結合型結晶構造決定に成功し、異物認識排出機構における画期的なパラダイムシフトをもたらす成果が得られた。リファンピシン、エリスロマイシンという比較的大分子量の抗生物質の結合構造を決定したところ、これまでの基質結合ポケットの手前にもう一つのマルチサイト結合ポケットがあり、これまで「待機」とされていた段階で基質は手前のポケット(近位ポケット)に結合し、次の「結合」段階でこれまでのポケット(遠位ポケット)に送られることが明らかになった。基質はタンパク質の蠕動運動により近位ポケット→遠位ポケット→出口と送られるというペリスタポンプ機構が証明された。
文化的-歴史的視座に基づく算数科における心理的道具と数学的思考の発達の関係の研究

動物の行動発達の3段階のうち、最終的な知性(あるいは合理的行動)の段階に達するのは、「行動の移行」を実験中に示したチンパンジーのような類人猿と人間のみである(Vygotrsky and Luria, 1930/1993)。さらにヴィゴツキーは、そのような類人猿から区別される人間の行動の特徴として、人工的な記号の助けを借りた自らの行動の支配があることも指摘している。また、トマセロ(1999/2006)によれば、(他の動物種と対比して)ヒトの文化的学習には、道具使用や記号行動の目的・目標の理解が必要であり、ヒトだけが他者を「通じて」学習するーつまり「他者の心の中に自分を置いてその動きをたどる」ーことが可能であるという。このような心理的道具使用に伴う人間行動の特質を踏まえ、心理的道具については、その道具自身の構造がどのようなものなのか〔(1)構造〕、何のために用いられるものか〔(2)目的・目標〕を示す必要があり、目的・目標を明らかにすることにより、その心理的道具の機能の限界がどこにあるのかも明確になる。また、人工物が機能する環境〔(3)環境〕や心理的道具を通じた自己の行動の支配〔(4)他者認識・自己支配〕も考慮せねばならない。これらを踏まえた心理的道具のデザインがより良い数学学習のために必要となる。本研究では、心理的道具に「階層性」という視点を導入し、算数科の授業で扱われる図・表・記号等の心理的道具の数学的意義・子どもの発達との関係性・それの持つ文化的-歴史的背景・学年を超えた使用の継続性といった観点から考察を行った。本研究は、ヴィゴツキーの文化的-歴史的視座に基づき、小学校算数科における心理的道具と数学的思考の発達との関係を解明し、最終的には算数科授業における望ましい心理的道具のあり方を提案することを目的としている。なおここでは人工物である心理的道具を用いて授業をどのようにデザイン(cf.Simon(1970)やWittmann(1995)のデザイン科学)するかという視点に立っている。「心理的道具」(Vygotsky,1993など)の例としては、数、代数記号、文字、図式、表などが挙げられる(ヴィゴツキー,1930/1987)。またヴィゴツキー・ルリア(1930/1987)によれば、心理学的な面においては記号(心理的道具)の助けを借りた自らの行動の支配が人間行動の文化的発達の本質を示している。これらを踏まえ、本研究では心理的道具の階層性を仮定し、その視点から心理的道具の機能などについて考察する。階層性を考えるにあたり、次のような心理的道具の分類が考えられる:(1)数や文字に代表される言語、(2)図や表、(3)「紙のコップ」(吉田、2005)、わら算、(Wittmannらによる)「百シートとかけ算定規」などに代表される数学的構造具。これらの特徴としては、(1)数学的構造をもつこと、(2)(3)→(2)→(1)と進むにつれて抽象化・一般化が進む(逆に(3)が最も具体性が高い)ことなどが挙げられる。例えば沖縄で用いられていたわら算には、有限個の数表現、わら算(という心理的道具)のもつ機能に依存した思考(つまり仮説的、抽象的、条件的な思考を導く概念的思考には至らない)という特徴が見出される。新しい状況における「構造の発見」、そして「構造の個々の要素の変化からの構造の相対的な独立性」(ヴィゴツキー・ルリア,1930/1987)という人間に特有の行動発達や、具体性から抽象性へという文脈の一般化を踏まえれば、(3)→(2)→(1)という心理的道具の使用の発達が、子どもの思考の発達にもより良い影響を及ぼすであろう。動物の行動の発達の3段階のうち、最終的な知性(あるいは合理的行動)の段階に到達するのは、「構造の移行」を実験中に示したチンパンジーのような類人猿と人間のみである(Vygotsky and Luria, 1930/1993)。さらにヴィゴツキーはそのような類人猿から区別される人間の行動の特徴として、人工的な記号の助けを借りた自らの行動の支配があることも指摘している。またトマセロ(1999/2006)によれば、(他の動物種と対比して)ヒトの文化的学習には、道具使用や記号行動の目的・目標の理解が必要であり、ヒトだけが他者を「通して」学習する一つまり「他者の心の中に自分を置いてその動きをたどる」-ことが可能であるという。このような心理的道具使用に伴う人間行動の特質を踏まえ、心理的道具については、その道具自身の構造がどのようなものか〔(1)構造〕、何のために用いられるものか〔(2)目的・目標〕が示される必要がある(目的・目標が明らかになれば、その心理的道具の機能の限界はどこにあるかも明確になる〔(2)'限界〕)。さらにサイモン(1969/1999)は人工物(the artificial)を特徴づける構成要素として、上記2つに加えて「人工物が機能する環境」〔(3)環境〕も挙げている。また上記3つの心理的道具の構成要素と共に、心理的道具を通じた他者の心の動きの理解や自己の行動の支配〔(4)他者認識・自己支配〕をも考慮されねばならないであろう。

これらを踏まえた心理的道具のデザインがより良い数学学習のために必要となってくる。例)おはじきを用いた位取り表(佐々・山本,2010):〔構造〕(十進)位取り記数法、すなわち、おはじきの個数によって各位の数を表現、〔目的・目標〕数の表現、〔限界〕可能な数の表現はおはじきの個数(有限個)に依存、〔環境〕記数法の学習→〔他者認識・自己支配〕百のプレート5枚、十の棒7本、一のブロック4個で574を表すことなく、おはじきの個数と位置への配慮のみによって様々な数を表現可能動物の行動発達の3段階のうち、最終的な知性(あるいは合理的行動)の段階に達するのは、「行動の移行」を実験中に示したチンパンジーのような類人猿と人間のみである(Vygotrsky and Luria, 1930/1993)。さらにヴィゴツキーは、そのような類人猿から区別される人間の行動の特徴として、人工的な記号の助けを借りた自らの行動の支配があることも指摘している。また、トマセロ(1999/2006)によれば、(他の動物種と対比して)ヒトの文化的学習には、道具使用や記号行動の目的・目標の理解が必要であり、ヒトだけが他者を「通じて」学習するーつまり「他者の心の中に自分を置いてその動きをたどる」ーことが可能であるという。このような心理的道具使用に伴う人間行動の特質を踏まえ、心理的道具については、その道具自身の構造がどのようなものなのか〔(1)構造〕、何のために用いられるものか〔(2)目的・目標〕を示す必要があり、目的・目標を明らかにすることにより、その心理的道具の機能の限界がどこにあるのかも明確になる。また、人工物が機能する環境〔(3)環境〕や心理的道具を通じた自己の行動の支配〔(4)他者認識・自己支配〕も考慮せねばならない。これらを踏まえた心理的道具のデザインがより良い数学学習のために必要となる。本研究では、心理的道具に「階層性」という視点を導入し、算数科の授業で扱われる図・表・記号等の心理的道具の数学的意義・子どもの発達との関係性・それの持つ文化的-歴史的背景・学年を超えた使用の継続性といった観点から考察を行った。
血管新生抑制因子としてのPEDF受容体の単離およびその機能解析

本研究は血管新生抑制因子としてのPEDF受容体の単離およびその機能解析を最終目標としている。1,(1)PEDFの血管新生抑制活性に重要な部位の特定PEDFのどの部分が血管新生抑制因子として重要かを調べる目的で、PEDFの細胞外マトリックス結合部位に変異を加えたPEDF変異体を恒常的に発現するHeLa細胞株を樹立した。ヘパリン結合部位変異株R148A、コラーゲン結合部位変異株(D299N)、糖鎖付加部位変異体株(N284Q)はそれらの細胞株自体の細胞増殖速度は野生型対照群と比較して変化は認められなかった。次に、ヌードマウスへ移植し、経時的にその大きさを測定した。ヘパリン結合部位変異株と糖鎖付加部位変異体株は野生型対照群と同様にガン組織の増殖抑制が認められたが、コラーゲン結合部位変異株はその作用を示さなかった。また、移植後3週目の組織標本の結果から、PEDFのがん抑制作用は血管新生と相関していることがわかった。この結果から、PEDFの血管新生抑制作用の1つにコラーゲン結合部位が大きな役割を果たしていることがわかった。(2)PEDFレセプター結合部位探索のためPEDFのC末欠損変異導入したPEDFのC末欠損変異体を作製したが、残念ながら細胞外に分泌されなくなり、PEDFレセプターの検索にはPEDF全長を蛍光ラベルしたものを用いることとした。PEDF-DsRed融合タンパクの精製を行っており、リガンドが得られ次第即座に発現クローニングを開始する。スクリーニングに用いるライブラリー発現細胞は既にBa/F3に前立腺由来cDNA含有レトロウイルスを用いて作成した。2,PEDFの発現調節について。翻訳開始コドンを含む12kbのPEDFプロモーター部位を単離し、様々な長さを持つプロモーター領域をルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に挿入した。PEDF発現にこれまで転写レベルでの調節がないと言われていたが、ルシフェラーゼ活性によるプロモーター活性の検索の結果、開始コドンより約1.7kb上流に細胞周期、加齢に依存するプロモーターが存在することを発見した。本研究は血管新生抑制因子としてのPEDF受容体の単離およびその機能解析を目的としている。PEDF受容体の発現クローニングを始めるにあたり、先ずPEDFがPEDFレセプターへ結合する際に必須となるアミノ酸配列を決定することを試みた。しかしながら、C末またはN末を欠損させるとシグナル配列を挿入しているにもかかわらずそれら変異タンパクは分泌されず小胞体およびゴルジ装置に留まっており、ミスフォールディングされた結果だと考えられた。従って、発現クローニングのスクリーニングに用いるPEDFは全長を用いることとした。次に、ラットPEDFの各種変異体を発現させたHEK293細胞をヌードマウスの背部に移植し、その後形成される腫瘍の大きさと腫瘍中の新生血管の定量化を行った結果、コラーゲン結合部位に変異を導入したPEDFを発現するHEK293細胞に腫瘍形成抑制作用が認められなくなった。この結果から、PEDFによる血管新生抑制作用はPEDFのコラーゲン結合部位が重要であることが判明した(論文投稿中)。PEDFのC末にHisタグを付加したヒトリコンビナントPEDFをHEK293細胞に恒常的に発現させ、その培養上清からニッケルカラム(AKTA Prime液体クロマトグラフィーシステム使用)を用いてPEDFの精製を行った。

次にPEDFをビオチン化し、発現クローニングのスクリーニングに用いることとした。発現クローニングにはそのスクリーニングの簡便さからBa/F3細胞にヒト前立腺由来cDNAライブラリー(レトロウイルスベクター)を感染させた細胞をもちいた。現在、autoMACS及びFACSを用いてビオチン化PEDFが結合する細胞をアビジンビーズ、抗ビオチン抗体ビーズ、アビジンAlexa488等を用いてスクリーニング中である。さらに、最近PEDFの血管新生抑制作用にPEDFのリン酸化が重要であるとの報告や我々のPEDFのコラーゲン結合部位が重要であるとの結果から発現クローニングのスクリーニングにそれらの変異体を用いることも視野に入れ、現在それら発現ベクターの構築、リコンビナントタンパクの精製も行っている。本研究は網膜色素上皮由来因子(PEDF)の受容体を単離し、その機能を解明することを目的とした。先ずPEDFのどの部分が血管新生制御因子として重要かを調べる目的で、PEDFの細胞外マトリックス結合部位に変異を加えたPEDF変異体を恒常的に発現するHeLa細胞株を樹立した。ヘパリン結合部位変異株R148A、コラーゲン結合部位変異株(D299N)、糖鎖付加部位変異体株(NM284Q)はそれらの細胞株自体の細胞増殖速度は野生型対照群と比較して変化は認められなかった。次に、ヌードマウスへ移植し、経時的にその大きさを測定した。ヘパリン結合部位変異株と糖鎖付加部位変異体株は野生型対照群と同様にガン組織の増殖抑制を認められたが、コラーゲン結合部位変異株はその作用を示さなかった。また、移植後3週目の組織標本の結果から、PEDFのがん抑制作用は血管新生と相関していることがわかった。この結果から、PEDFの血管新生抑制作用の1つにコラーゲン結合部位が大きな役割を果たしていることがわかった。次にPEDFレセプター結合部位探索のためPEDFのC末欠損変異導入したPEDFのC末欠損変異体を作製したが、残念ながら細胞外に分泌されなくなり、PEDFレセプターの検索にはPEDF全長を蛍光ラベルしたものを用いることとした。現在、リガンドとして用いる蛍光ラベルPEDFの精製を行っており、リガンドが得られ次第即座に発現クローニングを開始する。また、PEDFの発現調節についても検討した。翻訳開始コドンを含む12kbのPEDFプロモーター部位を単離し、様々な長さを持つプロモーター領域をルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に挿入した。PEDF発現にこれまで転写レベルでの調節がないと言われていたが、ルシフェラーゼ活性によるプロモーター活性の検索の結果、開始コドンより約1.7kb上流に細胞周期、加齢に依存するプロモーターが存在することを発見した。
生物間相互作用に関わるセスキテルペンの構造多様性を生み出す遺伝的メカニズムの解明

ムギ類に深刻な病害を起こす赤かび病菌Fusariumgraminearumは感染因子としてトリコテセンと総称されるセスキテルペン毒素を生産する。本毒素の側鎖多様性を生み出すメカニズムとして、C-4位のアセチル基の有無を決定するC-4デアセチラーゼ遺伝子Tri104を生合成遺伝子クラスター外から単離、同定した。Tri104は液体培地ではなく固体培地で発現しており、固体培地で培養した時のみC-4位のアセチル基がはずれる事実と一致していた。トリコテセンの生合成経路において、中間体isotrichodermolのC-3位をアセチル化してisotrichoderminに変換するステップは、それ以降の生合成酵素が機能、作用するためには必須である。しかし、この反応を行う酵素遺伝子Tri101は、トリコテセン生合成遺伝子クラスター内の生合成遺伝子とは物理的にも進化的にも離れて存在している。このようにクラスター外のTri101依存性で、水平伝搬による生き残りには進化的に不利と考えられる二次代謝遺伝子クラスターがトリコテセンを生産するフザリウムに存在することは謎である。そこでクラスター中に2つあるアセチラーゼ遺伝子のうち、Tri3がコードするC-15アセチラーゼがC-3位をアセチル化する活性を有するかどうかについて調べた。高濃度(50μM)の組換えTRI3を用いて反応を行うと、本来の基質15-deacetylcalonectrinのC-15位をアセチル化する本来の活性と比べて5桁以上非効率的ではあるが、isotrichodermolのC-3位をアセチル化する微弱な活性を見出すことができた。さらにニバレノールを基質として用いた実験において3,15-diacetylnivalenolを検出し、TRI3がC-3位もアセチル化することを示した。C-3をアセチル化する微量の活性は、祖先トリコテセン遺伝子クラスターにおいて、もともとは自立的なクラスターであったことを示唆するのかも知れない。ニバレノール(NIV)型トリコテセン生産菌は、液体米煮汁培地中では4,15-diacetylnivalenol(4,15-diANIV)と4-acetylnivalenol(4-ANIV)を生産し、固体米培地上では4-ANIVとNIVを生産する。NIV型トリコテセン生産菌の液体培養におけるトリコテセン関連物質の代謝物の経時的変化を調べたところ、3,4,15-triacetylnivalenol(3,4,15-triANIV)→4,15-diANIV→4-ANIVの順に脱アセチル化が進むことが示唆された。この結果は、固体培養で本菌がNIVを生産するためにはさらにもう一段階C-4位の脱アセチル化が起こり、液体培地での最終産物4-ANIVが固体培地での最終産物NIVへと変換することを示唆する。そこでトリコテセン生合成の初発の遺伝子を破壊したFgTri5^-株を固体培養し、4,15-diANIV、4-ANIVをフィーディングしてその代謝物産物を解析した。4,15-diANIVをフィーディングした菌糸では4-ANIV、15-acetylnivalenol(15-ANIV)、およびNIVが新たに検出され、4-ANIVをフィーディングした菌糸ではNIVが新たに検出された。そこで固体米培養における気中菌糸からタンパク抽出液を調整して4-ANIVと反応させたところ、NIVへの変換が認められた。タンパク抽出液を熱処理したものと反応させてもC-4位の脱アセチル化は認められなかったことから、固体米培地で誘導される酵素によってNIV生合成の最終ステップ、すなわち4-ANIVのC-4位脱アセチル化が進むことが証明された。ニバレノール(NIV)型トリコテセン生産菌は、液体米煮汁培地中では4, 15-diacetylnivalenol(4, 15-diANIV)と4-acetylnivalenol(4-ANIV)を生産し、固体米培地上では4-ANIVとNIVを生産する。C-4位の脱アセチル化に関与する酵素遺伝子の取得を目的として、Fusarium graminearumのゲノムデータベースにおいて膜に存在するエステラーゼをコードする遺伝子の標的破壊を行なった。その結果、2番染色体に存在し447アミノ酸からなるエステラーゼをコードするFG_03846遺伝子を破壊するとNIV量が劇的に減少することを見出した。さらにこの破壊体に対してFG_03846大量発現ベクターを導入したところ、固体米培地上でのNIV生産能が相補された。またFG_03846大量発現体の菌体抽出液から、破壊体や野生株の菌体抽出液からは決して検出されることのない4-ANIVや4, 15-diANIVのC-4位脱アセチル化が観察され、in vitroの実験からもFG_03846遺伝子がC-4位脱アセチル化酵素をコードすることが明らかとなった。

興味深いことにNIV生産菌をYG培地で培養してもC-4位脱アセチル化活性は検出されないが、トリコテセン非生産菌であるイネいもち病菌Magnaporthe oryzaeをYG培地で培養するとC-4位脱アセチル化活性が検出された。以上のことから、もともと生合成とは関係のない糸状菌の酵素が二次代謝に関与することでF. graminearumが4-ANIVではなくNIVを最終産物として生産するように進化してきた可能性が示唆された。
細胞がん化に伴なう細胞骨格異常の分子生物学的解析

1.マウス脳DNAライブラリーよりγアクチン遺伝子を単離したが、両側に反復列を持つ僞遺伝子であった。又培養細胞よりβおよびγアクチンcDNAを単離じた。それぞれの3UT領域をプローブとして両アクチンの発現を各種正常、がん細胞で調べた。2.マウスリンホーマL5178Y細胞に発現する3種類のアイソフォーム【β_(1b)】,【β_(1a)】,【β_2】のうち、β2は1電荷酸性で、重合能が低く、リンホーマ特異的である。βチューブリンcDNAの単離、3'UT特異プローブによるハイブリッド、トランスレイション、SP6によるCDNAから5mRNAの合成法などを組み合わせた結果、【β_2】は、【β_(1a)】遺伝子の突然変異によるものか、【β_(1a)】チューブリンの特異的翻訳後修飾物である可能性が示唆された。3.ミオシン軽鎖アイソフォームは、5種類の遺伝子に由来する11種類のmRNAから合成される。これらの発現に対する細胞がん化の影響を調べる実験系を確立した。特に遺伝子発現の変化が転写レベルだけでなく、オルタネイティヴ・スプライシングにも基くものなので、細胞がん化の影響も従来のものと異ることが期待できる。4.酵母において有系分裂異常をもたらすnuc2という新しい変異を見出した。nuc2産物は核内に存在する分子量67Kのタンパク質であった。現在、動物細胞において、これに相当するタンパク質を検索中である。5.脳のミクロチューブル結合タンパク質MAP-1に対する抗体と結合する350Kタンパク質が、正常細胞では細胞周期に依存して規則的にリン酸化されるが、がん細胞ではどの細胞周期でもリン酸化されて核内に存在することを明らかにした。6.マウス骨髄性白血病由来のMI細胞の分化にともない、膜結合性アクチンの変化を調べたところ、細胞が運動能や貧食能を確得するにしたがい、それらは310倍に増加することを見出した。
Ｃｄｃ３７の天然変性領域によるシグナル伝達キナーゼ群の曖昧認識の分子機構の解明

Cdc37はHsp90のコシャペロンの一つで、Hsp90がさまざまなキナーゼと複合体を形成する際のキナーゼ認識を担う重要な構成要素である。これまでに、Cdc37のN末端に存在するキナーゼ認識領域のCK2によるリン酸化がキナーゼ認識に必須であることを明らかにした。アミノ酸配列の解析の結果等から、Cdc37のキナーゼ認識には認識部位の天然変性状態が重要な役割を果たすと考えられる。DYRKファミリータンパク質キナーゼはMAPキナーゼと類似のキナーゼドメインを持ち、ヒトを含む哺乳類ではDYRK1A, DYRK1B, DYRK2, DYRK3, DYRK4の5種類のメンバーから成る。今回、DYRKメンバーそれぞれの細胞内結合タンパク質の同定を行ない、DYRK1BおよびDYRK4がHsp90, Cdc37, Hsp70と特異的に結合することを新たに見出した。いずれの分子シャペロンも他のDYRKファミリーとは安定な複合体を形成しなかった。Hsp90阻害剤ゲルダナマイシンにより細胞を処理するとDYRK1BおよびDYRK4からHsp90・Cdc37が離脱した。この処理によりDYRK1B・DYRK4は細胞質にドット状のアグリゲートを形成し、最終的には細胞内レベルが低下したことから、Hsp90・Cdc37のシャペロン機能がこれらのキナーゼの細胞内凝集の阻害と安定性に必要であると示唆された。Cdc37と安定な複合体を形成しない野生型DYRK2の1アミノ酸置換によるキナーゼ不能変異体はCdc37・Hsp90と強く結合するようになった。以上の結果から、Cdc37の天然変性領域は互いに類似したキナーゼドメインのわずかな構造の違いを厳密に認識する事、また安定な複合体を形成せずにCdc37・Hsp90がクライアントキナーゼの構造形成に関与し得る事が明らかとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。Hsp90-Cdc37シャペロンの新規クライアントとして、DYRKファミリーキナーゼのうちのDYRK1B, DYRK4を同定した。同ファミリーに属し配列の相同性が高いにも関わらず、DYRK1A・DYRK2・DYRK3はHsp90-Cdc37とは結合せず、Cdc37によるクライアント認識は極めて特異的であった。また、Cdc37・Hsp90のいずれもがチロシンリン酸化され、そのリン酸化がシャペロンサイクルの効率良い進行に重要な役割を果たすことを明らかにした。特に、Cdc37の天然変性領域の近くに存在するTyr-4のリン酸化がクライアントとの結合を負に制御することから、Cdc37の天然変性領域のリン酸化による構造変化とクライアント結合能との密接なかかわりが示唆された。また、Cdc37によるクライアントキナーゼの認識に関し、DYRK2を用いた解析を行なった。Hsp90-Cdc37は野生型DYRK2と安定な複合体を形成しないが、点変異によるキナーゼ不能型DYRK2とは強く結合した。一方、Hsp90阻害剤は野生型DYRK2の構造変化を引き起こしたことから、Hsp90-Cdc37は安定な複合体を形成しないにもかかわらずDYRK2のフォルディング過程に必要であると判った。また、DYRK2の構造形成に必須なチロシン自己リン酸化がHsp90の阻害剤によって抑制された。

更に、Hsp90-Cdc37はDYRK2のフォルディング過程の非常に初期段階を認識し、DYRK2の自己リン酸化の際のATP結合にともない解離した。これらの結果から、安定な複合体を形成しないクライアントキナーゼの中にもその構造形成にHsp90-Cdc37シャペロンを必要とするものがあること、すなわち本来的な意味での「分子シャペロン」としてHsp90-Cdc37がクライアントの構造形成に関わる場合があることが初めて示された。Cdc37のクライアントキナーゼ認識機構及びその調節システムの理解につながる研究成果については、主にDYRKファミリーキナーゼをモデルシステムとして充分な成果をあげられたと判断している。Hsp90-Cdc37のチロシン残基リン酸化の重要性に関する国際共同研究の成果はすでに有力誌に論文発表を行なった。また、DYRKファミリーキナーゼとその結合タンパク質についての研究成果も国際・国内学会での発表を行ない、一部について既に論文発表を行ない、残りの部分について現在2編の論文を投稿中である。当初の研究計画とは異なるが、研究の過程でDYRKファミリーキナーゼの新たな結合タンパク質WDR68を同定して論文発表を行ない、更にWDR68の結合タンパク質の同定に関する新たなデータが得られたため現在解析・論文執筆中である。一方で、当初計画のうちのCdc37のクライアント認識領域の構造-機能相関の解明に関しては現在までの達成度は充分ではないと認識している。Cdc37のクライアントキナーゼ認識・結合部位は分子のN末端付近に存在し、これまでの研究でCK2によるSer-13のリン酸化やSrcファミリーキナーゼによるTyr-4のリン酸化がクライアントとの結合を制御する事を示した。従って、リン酸化による構造変化がクライアントの認識を密に制御すると考えられ、その構造の詳細な解明が重要である。しかし、これまで同領域を含むさまざまな変異体の大量精製を行なってX線結晶解析を試みたが、未だ成功していない。おそらく天然変性領域の特性として同領域は固定した構造を取らないために結晶化しにくいと考えられ、現在NMRによる解析を共同研究により進行中である。Hsp90-Cdc37-キナーゼ複合体形成の制御機構の解明のため、リン酸化以外の翻訳後修飾の役割の解明を進めたい。まず、Hsp90の機能の一部を制御することが知られているアセチル化について、さまざまなタンパク質アセチル化酵素の阻害剤を用いてHsp90-Cdc37-クライアントキナーゼの複合体形成にどのような影響があるかを調べる。その結果からクライアントキナーゼの構造形成における分子シャペロンのアセチル化の生理的意義を明らかにしたい。これまでに、CK2によるCdc37のSer-13のリン酸化が、Cdc37の天然変性領域によるクライアントキナーゼ認識に必須であることを示した。このリン酸化反応あるいはリン酸化天然変性領域によるクライアント認識過程を阻害することができれば、Hsp90-Cdc37のさまざまなシグナル伝達クライアントキナーゼ活性の包括的な抑制につながることが期待できる。従来ゲルダナマイシンやその誘導体によってHsp90を特異的に阻害することで広範なクライアントキナーゼを抑制し、抗がん効果が得られることが知られている。このことから類推すると、Cdc37によるクライアントキナーゼの認識を阻害することによって細胞増殖抑制効果が得られると期待できる。
半導体表面のドーパントの元素識別-放射光STMを用いて-

銅を吸着させたGe(111)表面において放射光照射下での走査トンネル顕微鏡観察をおこない原子分解能を持つ像の取得に成功した。また銅とGeの領域から得られる信号強度およびその強度差と照射x線光強度との関係を調べ、それらがx線の強度に比例することが明らかとなった。一方、Ge(111)清浄表面部分では硬x線照射下で表面の原子が頻繁に移動し短時間でc(2x8)構造が壊れることが明らかとなった。本年度は放射光照射下のGe(111)表面を走査トンネル顕微鏡(STM)によって観察した。Ge(111)清浄表面は表面再構成を起こしc(2x8)構造をとることが知られている。この広いc(2x8)構造領域が形成された表面に放射光を照射しその影響をSTMによって直接観察した。放射光照射下の測定でも安定して原子分解能を持つ像が得られ,STM装置は本研究の測定に十分な性能をもつこと確認した。一方,放射光照射下で連続して表面を測定し続けると表面のGe原子が頻繁に移動し短時間でc(2x8)構造が壊れていくことが明らかとなった。通常のSTM観察においては原子の移動はほとんど起こらないことから,この表面原子の移動は放射光照射の影響により起こっていると考えられる。これまで放射光照射下での半導体表面の原子分解能を有した実空間観察はあまり例がなく,この結果は非常に興味深いものである。本研究の目的は半導体表面近傍にあるドーパント原子を放射光により励起しその変化を直接観察することである。しかし本年度の研究からGe(111)表面では放射光照射による表面原子の移動が起こってしまいドーパント原子の励起に起因した変化を検出するのは難しいことが明らかとなった。今後は表面を他原子で修飾するなどして放射光による表面原子の移動などを抑え,ドーパント原子の励起のみを観測する工夫が必要となると考えられる。そのため,他種の半導体表面や表面修飾などを施した表面など放射光照射下の測定に最適な表面を選定する必要であり,目下その分析をおこなっている。前年度までの研究でこの表面においては放射光照射下のSTM観察によって表面原子の移動が起こり,長時間の測定では表面の結晶性が崩れることがわかっている。この現象は安定した測定を行う上で大きな障害となる。本年度は放射光照射下でも安定してSTM測定ができる条件を探索した。さまざまな条件を検討・試行した結果,放射線の強度を減少させて測定することにより安定したSTM測定を数時間続けることが可能となった。しかし,放射光強度を減らすということは検出すべき信号強度にも影響することが考えられる。そこで銅を吸着させたGe(111)表面を用いて銅の部分とGeの部分から得られる信号強度およびそれらの強度差と放射光強度との関係を調べた。ここで銅吸着表面を用いた理由は金属-半導体という異なる原子種の表面を使った方が信号を検出しやすいためである。この測定により信号強度およびその強度差は放射光強度に比例することが明らかとなった。放射光の影響をSTMのような実空間測定によって検出することはあまり例がなく,特に信号強度に対する放射光強度の依存性を確かめたことは今後の研究の進展に対し意義がある。これらの実験結果からわかることは,安定した測定のために放射光強度を減少させると検出すべき信号強度も減少し,その結果,測定そのものが難しくなるということを示している。今後は安定した測定が可能な範囲内でかつ信号強度としては十分に大きい値が得られる放射光強度を見出す必要がある。現在そのような条件を探索中である。今年度はこの表面の原子移動に対しての放射光の影響を厳密に測定するために,リソグラフィーによって基板に300nm程度の段差をつくり表面に放射光が照射される部分と影になる部分を物理的に作りだし,その表面を放射光照射下でその場観察した。その結果は段差の上下で大きな変化は観測されず,放射光の影響を明確にすることはできなかった。一方,基板を液体窒素で冷やした状態での測定もおこなった。その結果,低温でも原子移動は起こることがわかった。室温での結果と比較すると移動の割合は大きく変わることはなく,このことから原子移動が放射光による熱励起以外の原因で起こっている可能性が考えられる。また,放射光を用いず,レーザー光による励起のSTMその場観察も試みた。レーザー光の場合,照射による試料表面への影響は少ないことがわかり,また原子種の違いによる強度変化が現れたSTM像を得た。しかし,以前に探針-試料間の距離を微小振動させることにより局所的な仕事関数の違いを検出したという報告がある。

今回のレーザー光照射によるSTM像の変化も,探針の熱膨張に起因する探針-試料間の距離の微小変化によって局所的な仕事関数の変化を検出した可能性がある。これに関しては今後のさらなる詳細な分析が必要になる。
イネ抵抗性遺伝子下流の防御応答シグナル伝達機構の解明

イネのいもち病'真性抵抗性'遺伝子(R遺伝子)の単離が進み、そのほとんどがCC-NBS-LRR構造をもっていた。しかしながら、いもち病菌感染認識後の、下流へのシグナル伝達についてはほとんどわかっていない。研究代表者らは、CC-NBS-LRR型であるにも関わらず安定な抵抗性を示す穂いもち病ほ場抵抗性遺伝子Pb1が、転写活性化因子のWRKY45と相互作用することを見出し、新規なシグナル伝達経路を示唆する結果を得た。Pb1による抵抗性の安定性の分子機構解明のため、真性抵抗性Rタンパク質PitaとPb1の間で3つの推定機能ドメインの間でドメイン・スワップしたキメラ遺伝子を導入した形質転換イネを昨年度作製した。今年度、T2世代ホモの形質転換体イネを用い、Pita保有イネに対して親和性および非親和性のいもち病菌レースを噴霧接種していもち病抵抗性検定を行った結果、各ドメインの由来に関係なく、すべてのキメラ遺伝子の過剰発現体がいもち病のレースに非特異的で同程度の強さのいもち病抵抗性を示した。これらの結果は、各キメラタンパク質が強制的に核に発現した結果、WRKY45との相互作用を介して抵抗性反応が誘導されたことを示唆しており、WRKY45を介した抵抗性誘導に関して、PitaとPb1との間に本質的な違いはないことを示唆している。真性抵抗性Rタンパク質がWRKY型転写因子とタンパク質間相互作用することが見出された。また、Pb1とのキメラタンパク質を過剰発現すると、いもち病のレースに非特異的な抵抗性が誘導されることがわかった。これらにより、当初計画した実験はほぼ実行し、一定の成果を得た。当初の予定通り、課題を終了する。感染認識はRタンパク質によるいもち病菌因子の直接・間接的分子認識に基づいているが、下流への病害応答シグナル伝達についてはほとんどわかっていない。近年、オオムギのうどんこ病菌に対するRタンパク質MLA10が、感染認識後に核移行し、転写抑制因子型のWRKY型転写因子とタンパク質間相互作用してシグナル伝達することが報告され、シグナル伝達機構解明への突破口が開かれた。一方、研究代表者らは、CC-NBS-LRR型穂いもち病ほ場抵抗性遺伝子産物Pb1が、誘導抵抗性に関わる転写活性化因子のWRKY45と相互作用することを見出した。以上の事実は、Rタンパク質からWRKY型転写因子へのシグナル伝達の一般性と同時に、Rタンパク質とWRKY型転写因子の組合せがシグナル伝達の特異性を決定していることを示唆している。この仮説の検証のため、本年度、病徴の形状や接種法による病徴の違いが顕著な4種の真性抵抗性系統の原因となるRタンパク質とイネの8種のWRKY型転写因子とのタンパク質間相互作用を酵母2ハイブリッド法を用いて調べた。その結果、4種のRタンパク質はいずれもWRKY45と酵母細胞内で相互作用し得ることがわかった。また、4種のRタンパク質のうち2種は、WRKY45以外にWRKY66と、別の2種はWRKY66,62,47とも相互作用することがわかった。GSTプルダウン実験の結果、4種のRタンパク質はいずれもWRKY45およびWRKY66と試験管内で相互作用することがわかった。Rタンパク質とWRKY66との相互作用は新規な事実であり、新たなシグナル伝達経路の存在が示唆された。そこで、CC-NBS-LRR型Rタンパク質からWRKY型転写因子へのシグナル伝達の一般性を検証するため、4種のRタンパク質についてWRKY型転写因子との相互作用実験を前年度行った結果、2種のRタンパク質がWRKY45やWRKY66と相互作用することがわかった。そこで今年度は、これらのRタンパク質によるいもち病抵抗性が上記のWRKY型転写因子に依存しているかどうかをWRKY遺伝子のノックダウン植物を用いたいもち病菌接種実験で検定したが、結果は否定的であった。一方、Pb1による抵抗性の安定性の分子機構解明のため、Rタンパク質PitaとPb1の間でドメイン・スワップしたキメラ遺伝子を導入した形質転換イネを作製した。

今年度、T2世代ホモの形質転換体イネを用い、Pita保有イネに対して親和性および非親和性のいもち病菌レースを噴霧接種していもち病抵抗性検定を行った結果、各ドメインの由来に関係なく、すべてのキメラ遺伝子の過剰発現体がいもち病のレースに非特異的で同程度の強さのいもち病抵抗性を示した。これらの結果は、各キメラタンパク質が強制的に核に発現した結果、WRKY45との相互作用を介して抵抗性反応が誘導されたことを示唆しており、WRKY45を介した抵抗性誘導に関して、PitaとPb1との間に本質的な違いはないことを示唆している。真性抵抗性Rタンパク質がWRKY型転写因子とタンパク質間相互作用することが見出された。また、Pb1とのキメラタンパク質を過剰発現すると、いもち病のレースに非特異的な抵抗性が誘導されることがわかった。これらにより、当初計画した実験はほぼ実行し、一定の成果を得た。当初の予定通り、課題を終了する。
脳虚血における低酸素誘導因子とヘムタンパク・ニューログロビンの動態解析

脳虚血モデルの確立総頸動脈結紮法によりマウス脳虚血モデル作成を試みたが、安定したモデル確立はできなかった。代替案として低濃度酸素への長期暴露を用いた実験系を構築した。低酸素誘導因子とニューログロビンの発現解析初年度より低酸素誘導因子とニューログロビンの発現をノザンハイブリダイゼーションで解析するためのプローブを作成してきた。RT-PCRで増幅するためにプライマーを合成委託した。これを用いてプローブとして用いるcDNAを増幅し、現在プラスミドにサブクローニングしており、シーケンスによるcDNAの配列を確認後、ノザンハイブリダイゼーションにより発現解析が可能となる(組換えDNA実験計画承認済み)。低酸素誘導因子の発現状態をタンパクのレベルで解析(ウエスタンブロット)するための抗体は複数の会社より市販されたため、一次抗体、二次抗体、ラベル方法に関して最適なものを検討し、試験的にウエスタンブロットを行った。また実験計画当初ニューログロビンの抗体は市販されていなかったが、昨年度テキサスサウスウエスタンメディカルセンターより作製配布されたため、これを使用する予定であった。しかし供給体制に不備があり、今後の配布の目処が立たないためニューログロビンのウエスタンブロットは中止し、mRNAの解析を優先した。今後ニューログロビンの抗体が入手できた場合に、迅速に虚血時のニューログロビンの発現実験が行えるよう予備実験を行った。脳虚血モデルの確立マウス脳虚血モデル作成に顕微鏡下での総頸動脈結紮法を行うための解剖学的考祭を行った。今後効率良いモデル作成に総頚動脈結紮法が適切であるかを試験的に手術を行い検証する。低酸素誘導因子とニューログロビンの発現解析低酸素誘導因子とニューログロビンの発現をノザンハイブリダイゼーションで解析するためのプローブ作成に関し、RT-PCRで増幅するためのプライマーの設計検討まで行った。今後プライマーの合成、増幅したcDNAのサブクローニングを行い、ノザンハイブリダイゼーションにより発現を解析する(組換えDNA実験申請中)。インシチュハイブリダイゼーションによる解析は標本の準備が困難であり、ノザンハイブリダイゼーシヨンによる解析を優先することとした。脳虚血モデルマウス確立後、虚血前後の発現変化を確認する。また低酸素誘導因子とニューログロビンの発現状態をタンパクのレベルで解析するための抗体に関して、実験計画当初は市販されていなかったため、抗体作製を外注する予定であったが、ニューログロビンはテキサスサウスウエスタンメディカルセンターのprogram for genomic applicationsにて作製配布された。また低酸素誘導因子も複数の会社より市販されたので、試験的に使用し良好な結果であればウエスタンブロットでの解析を行う(虚血前後の変化)。さらに総頸動脈結紮法だけでなく低濃度酸素への曝露による虚血モデルでも実験し、発現量の変化を解析したい。
結晶性キラル有機亜鉛化合物の立体相互認識と触媒機能

非共有結合性の比較的弱い相互作用に基づく特異的ないし選択的な分子会合は、近年「分子認識」の概念で捉えられている。多数の比較的単純な同一分子にわたって分子認識が繰り返されることにより、特異な構造の分子集合体が形成し、その結果、特徴ある機能や物性が生まれることがある。とくに集合体構成分子が規則的かつ濃密に配列する分子性有機結晶においては、その可能性は極めて高い。化学反応においては、固相・液相を問わず、分子認識は当然、その選択性や反応性を決定する根源的要素である。これらいずれの場合においても、分子間の相互作用にかかわる種々の電子的立体的要素のなかでキラリティーの認識は一般的に観測される事実であるが、最も単純にして基本的なケース、すなわち、同じ相対的原子配置をもつキラル分子の鏡像体の自己・非自己認識にかかわる系統的な研究はなされていない。これまでに、キラル有機亜鉛化合物を触媒に用いるアルデヒド類の不斉アルキル化反応における触媒の光学純度と反応性・選択性の間に観測される非線形性に着目し、「エナンチオマー間の相互認識」だけでなく「ジアステレオマ-間の相互認識」も可能な触媒系を構築し、触媒平衡混合系の固相・液相での反応動的過程を調査してきた。平成7年度では、多種多様な触媒誘導体の組み合わせによって生じる結晶性有機亜鉛分子集合体から系統的な結晶構造データを得、動的核磁気共鳴分光実験、磁気飽和移動実験、迅速混合実験の結果とあわせて、非線形性現象発現の根源となるホモキラル二量体とヘテロキラル二量体の構造的相違を徹底的に調査した。分子間の立体相互認識の程度と反応性・選択性との関連を分子レベルで理解することができた。