hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グローバル人材育成における国際共修：教授法の確立に向けて

日本の大学における国際共修のカリキュラム開発および教授法の確立に向け、先行研究による理論整理、国内外の国際共修における実施状況調査、グッドプラクティス事例研究、教育実践の検証を様々な研究アプローチを用いて重層的に行い、国際共修の意義と教育効果に対する考察を深め、国際共修カリキュラムおよび教授法の確立に向けて研究進捗を含む成果を継続的に国内外に発信することで国際共修の研究・教育両面の発展に寄与した。多彩なバックグラウンドを持つ研究者・教育実践者が協働し、国際共修の教育的価値を追求する中で、実践に役立つ国際共修事例集の発行や教本の出版等の大きな成果を得ることが出来た。国際共修のカリキュラム開発、教授法の確立に向け、理論整理およびグッドプラクティス事例研究を実施した。教育実践の検証を様々な研究アプローチを用いて重層的に行い、国際共修の意義と教育効果に対する考察を深め、カリキュラムおよび教授法の確立に向けて研究進捗を含む成果を継続的に国内外に発信した。実践者がそれぞれの知見や経験に基づき国際共修の意義や価値を検証し、グローバル人材育成のみならず、教育の国際化施策および政策提言につなげる実践への応用を主眼に据えた研究を以下のように実施した。1.国内の国際共修におけるグッドプラクティス事例研究:国内11大学37の国際共修事例研究調査を実施。授業実践者を対象とした半構造化インタビューをもとに、1テーマ設定、2教材、3クラスルーム・マネジメント(指導言語、教育介入、規律、倫理等)、4課題、5評価の方法、6直面した課題と解決策についてデータ収集し、項目別に整理し分析した。国内の国際共修の実践状況をある程度把握することが出来た。2.理論構築や海外の共修実践例をテーマとした研究会開催:「留学生と日本人学生が共に学ぶ国際共修:理論と実践」、メルボルン大学高等教育研究所副研究所長、リチャード:ジェームス教授を招き研究会を実施した。「留学生と日本人学生が共に学ぶ国際共修:ペダゴジーの確立に向けて」同研究所のソフィー・アーコーディス教授を招聘し、国際共修における理論構築、オーストラリアでの教育実践例に学ぶとともに同氏の提唱する「Finding Common Grounds」の日本の教育現場への応用を議論、事例研究成果報告を実施した。3.国際共修事例集作成グッドプラクティスや課題の共有を図るだけでなく、大学を越えた国際共修実践者のネットワーク構築にも寄与出来た。研究を進めるにあたって環境、施設、研究支援等の研究体制が整備されている。東北大学の将来像と指針を示す『グローバルビジョン』において、言語・文化背景の異なる人々との協調しながらも、自分の意見を的確に伝え問題解決につなげる高度なコミュニケーション能力を有するグローバル人材の育成、また、多様な価値観と文化を学ぶ国際共修・異文化理解プログラムの開発と推進が目標に据えられている。これらの大学としての教育目標に加え、文部科学省の国際化拠点整備事業(大学の国際化のためのネットワーク形成推進事業いわゆるグローバル30)、経済社会の発展を牽引するグローバル人材育成支援事業(全学型)、スーパーグローバル大学創成支援事業(全学型)採択の後押しもあり、これまで留学生と日本人学生の共修科目を積極的に開講してきた。留学生と日本人学生が正課内で相互研鑽しネットワークを構築する機会を創出するために全学をあげて体制整備を進めてきている。現時点で日本語、英語による国際共修を30科目以上も全学教育科目として開講している。また、研究分担者が務める大学においても同様に国際共修の取組が進んでいる。このような環境の中で国際共修を実践している研究者が集い本研究を進めているため、調査に必要なクリティカルな視点や分析力、また情報発信力等を自発的に発揮できる状況にある。また、事例研究を通して他大学の共修実践者とも幅広いネットワークが拡大できたことも、今後、調査をさらに発展させるためにプラスに働くと理解している。さらに、多文化教育の先進国であるオーストラリアの世界屈指のメルボルン大学高等教育研究所とも太いパイプ作りが出来、今後、共同研究等も実施する方向で協議が進んでいることもプッシュ要因と言える。カリキュラムの国際化を屋台骨とした国際共修授業の教授法開発を推進し以下の成果を生み出すことが出来た。1.国内外のグッドプラクティス事例研究:調査を海外の好事例研究に発展させ、オーストラリアのメルボルン大学、ラ・トルブ大学にて、多文化クラスや教員向け研修、教材開発についてインタビューを実施した。国内では立命館大学、名古屋大学等で引き続き事例研究を進めた。2.研究成果報告を兼ねた国際シンポジウム準備:これまでの成果を振り返り最終年度の取組に反映させるシンポジウム「国際共修:留学生と国内学生の学びあいをデザインする」を2017年6月18日(日)に東北大学で開催するための準備を実施した。趣旨)国際共修の効果検証・体系的考察、学習成果を最大化する教授法の開発等における課題の共有と、カリキュラムや授業設計、国際共修を含む「Internationalization at Home」の専門家を国内外から招聘し海外と日本の事例を通して大学教育における国際共修の現状と課題、展望につき議論し学習効果を意識した国際共修のあり方を検討。3.国際共修教本出版準備:本研究を進める中で国際共修授業の教授法に関心を持つ研究者のネットワークを構築できたのは大きな成果の一つと言える。これら研究者と教本出版に向け準備を開始した。構成は1国際共修の背景と理論、2事例に学ぶ国際共修(海外)、3事例に学ぶ国際共修(国内)、4国際共修の「デザイン」と「教授法」4.国際共修科目の開発:東北大学にて「国際共修ゼミ」の開講クラスを拡充し2017年度に向けてさらに新規科目の開発準備にあたった。

1日本語を教授言語とする科目:実施:24科目(2015年度)→28科目(2016年度)2017年度は32科目開講予定2英語を教授言語とする科目:実施:18科目(2015年度)→21科目(2016年度)2017年度は22科目開講予定昨年度に集中的に行った国内のグッドプラクティス調査にて国際共修実践者とのネットワークが拡充され自主的に本プロジェクトへの協力を申し出てくれたこともあり本年度は予定していた以上の成果を達成することが出来た。異文化・自文化理解教育、ディスカッション、アクティブ・ラーニング、課題解決型学習等を効果的に取り入れた国際共修授業の改革を目的とした研究調査を進めるにあたり本事業を出発点として国内の研究者で国際共修研究チームを編成しそれぞれが専門や強みを生かしながら作業を分担し協力し合いながら研究を進めることが出来た。東北大学のみならず、岩手大学、一橋大学、名古屋大学、神戸大学、立命館大学の研究者も参画するプロジェクトに発展させることが出来た。また、比較的早い段階で来年度に向けて執筆する教本の校正を話し合う研究会を開催することが出来たため、課題や目標が明確になり、プロジェクトを大きく進展させることが出来た。さらに、海外調査を通じてオーストラリアを中心とした国際共修先進国の研究者、実践者と情報共有できたため、授業のテーマ設定,学習者の目標,教材,指導言語,課題、評価方法、教育介入などを中心に情報交換を行い、調査の焦点の明確化や課題の所在を早い段階で確認できたことも本プロジェクトの進展を後押ししたと言える。海外の研究者との交流により、本プロジェクトで予定していなかった海外での著書の出版についても議論する機会があり、本プロジェクトが既に終了している再来年度の共同研究・出版についても構想を練ることが出来た。日本の大学における国際共修のカリキュラム開発および教授法の確立に向け、先行研究による理論整理、国内外の国際共修における実施状況調査、グッドプラクティス事例研究、教育実践の検証を様々な研究アプローチを用いて重層的に行い、国際共修の意義と教育効果に対する考察を深めることが出来た。また、国際共修カリキュラムおよび教授法の確立に向けて研究進捗を含む成果を研究会、シンポジウム、セミナーの開催や専門誌への投稿および国内外の学会等で継続的に発信することで、国際共修の研究・教育両面の発展に寄与出来た。具体的には、異文化間教育、国際教育、日本語教育、グローバル・シティズン教育、教育評価を専門とする国際共修授業の実践者が協働し、それぞれの知見や経験に基づき、文献調査、アンケート及びヒアリング調査、フィールドワーク、教育評価検証等の様々なデータ収集ツールを用い、包括的な調査を行うことで国際共修の教育的価値を追求した。高等教育機関におけるグローバル人材育成のみならず、教育の国際化施策および政策提言の基礎資料の整備を通じて、実践に役立つ研究プロジェクトを行うことに注力した。
選択的な防除法の確立に資する寄生雑草に特有のプランテオース代謝経路の解明

寄生雑草は,世界中の乾燥地半乾燥地農業に大きな被害を与えており,グローバルな食糧安全保障を脅かしている.研究代表者らは寄生雑草に選択的な除草剤を開発するために,その特徴的な発芽に着目したメタボローム解析を行った.その結果,プランテオースの代謝経路が将来有望な標的となる可能性を示した.そこで,本研究では未だ報告例のないプランテオースの代謝経路明らかにすることを目的とした.その結果,プランテオースの生合成に関わる遺伝子のトマト変異体の取得とプランテオースの代謝の最初の加水分解を触媒すると考えられる酵素の取得に成功した.寄生雑草は世界の乾燥半乾燥地域の農業に甚大な被害を与えており,アフリカでの食料生産の不安定化を引き起こす最大の生物的要因といわれている.研究代表者は寄生雑草の特徴的な発芽過程に着目し,寄生雑草固有の代謝経路を見出すべくメタボロミクスを行った.その結果,プランテオースという特徴的な三糖の代謝が寄生雑草の発芽に重要であることを見出した.さらに,この代謝経路を阻害するノジリマイシンは寄生雑草の発芽を選択的に抑制することが明らかとなった.本研究では,プランテオース生合成酵素を同定するために,プランテオースが種子に含まれていることが既に報告されているトマトに注目した.種子一粒中のプランテオースの分析系を確立し,EMS処理による変異誘発系統についてプランテオースを分析した.これまでに約300系統を解析し,3系統で種子中のプランテオースが著しく減少していることを確認した.トマトの低プランテオース変異体の原因遺伝子を同定することで,プランテオースの生合成に関与する遺伝子を明らかに出来ると考えている.また,プランテオースの代謝酵素については,同時並行して進めていた次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析によってα-ガラクトシダーゼ様遺伝子のORFを取得した.この配列を大腸菌で発現させたところ,モデル基質である4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシドの加水分解活性が確認できた.今後この酵素がプランテオースを基質とするかなどについて解析を進める.さらに,ノジリマイシンの作用機構を解明することを目的として,次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行った.その結果,ノジリマイシンの処理によって,糖の輸送体遺伝子や,受容体樣キナーゼ,あるいは,フォスファターゼの遺伝子の発現に変化が見られた.これらは,寄生雑草の発芽に重要な役割を担っていると予想される.根寄生雑草は世界の乾燥地における農業に甚大な被害をもたらしている.その防除を目的とし,ハマウツボ科根寄生雑草であるヤセウツボの発芽についてメタボローム解析を行った結果,特徴的な三糖プランテオース代謝経路の同定に至った.さらに,ケミカルスクリーニングによって,ノジリマイシンがプラテオース代謝経路を阻害することで,根寄生雑草の発芽および幼根伸長を選択的に抑制することを発見した.そこで本研究では,ノジリマイシンの作用機構を解明するとともに,プランテオースの生合成および代謝に関わる酵素を同定することで,根寄生雑草選択的除草剤の標的設定に貢献することを目的とした.ノジリマイシンの作用機構に関して,その作用点はインベルターゼと予測されたが,粗酵素を用いたアッセイの結果から,ノジリマイシンがインベルターゼを直接阻害しているわけではないことを明らかにした.そこで,ウェスタン解析を行ったところ,ノジリマイシンがインベルターゼの活性化を調節している考えられているタンパク質のプロセシング(切断過程)を阻害していることを明らかにした.また,プランテオースの代謝については発芽時に発現している遺伝子配列の中に,α-ガラクトシダーゼ様の配列を認めたためこれをクローニングした.さらに,プランテオースの生合成については,トマト変異体ライブラリーのスクリーニングを行うことで,種子中のプランテオース量が減少している系統を複数取得した.ノジリマイシンの作用機構,プランテオースの生合成,プランテオースの代謝の3項目について,すべて解明のための有力な知見を得た.特にノジリマイシンの作用機構については,タンパク質のプロセシングの阻害というこれまでに知られていない活性が示唆された.本研究の対象である根寄生雑草は,世界中の乾燥地農業に甚大な被害を与えており,アフリカでの食料生産の不安定化を引き起こす最大の生物的要因と言われている.本課題では,この問題の克服のために根寄生雑草における特徴的な代謝経路を標的とする防除法の確立に向けた研究を行った.申請者らはこれまでに発芽過程のメタボローム解析によって,プランテオースという三糖が根寄生雑草の貯蔵糖として重要な役割を果たしていることを明らかにした.また,この代謝酵素を阻害することで,その発芽が特異的に抑制されることを明らかにした.そこで,本課題では,未だどの生物においても報告例のないプランテオースの分解酵素を明らかにすることを最初の目的とした.トランスクリプトームデータより,プランテオース中のα-ガラクトシル結合を加水分解すると考えられる酵素遺伝子の絞り込みを行い,これを大腸菌にて異種発現させ,その活性を調べたところプランテオースの加水分解活性を検出することに成功した.また,その活性は酸性で顕著であったことから,根寄生雑草の発芽種子中でプランテオースは液胞やアポプラストなどの酸性区画で加水分解されていることが示唆された.これは,その酵素タンパク質のN末端がシグナル配列と予測されることと一致した.また,これまでにプランテオースの二段階目の加水分解を触媒するインベルターゼがノジリマイシンによって間接的に阻害されていることを明らかとしていたため,その分子機構の解明を目指した.

酸性インベルターゼの部分アミノ酸配列を抗原とする抗血清を用いたウェスタンブロットの結果,ノジリマイシンはインベルターゼのタンパク質発現にはほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなり,インベルターゼの翻訳後の活性化機構を阻害している可能性が示された.今後,このこれまでに知られていないインベルターゼの生理活性について詳細に検討する予定である.寄生雑草は,世界中の乾燥地半乾燥地農業に大きな被害を与えており,グローバルな食糧安全保障を脅かしている.研究代表者らは寄生雑草に選択的な除草剤を開発するために,その特徴的な発芽に着目したメタボローム解析を行った.その結果,プランテオースの代謝経路が将来有望な標的となる可能性を示した.そこで,本研究では未だ報告例のないプランテオースの代謝経路明らかにすることを目的とした.その結果,プランテオースの生合成に関わる遺伝子のトマト変異体の取得とプランテオースの代謝の最初の加水分解を触媒すると考えられる酵素の取得に成功した.これまでに植物中でプランテオースの生合成に関わる酵素の同定はなされていない.そこで,プランテオースが種子に含まれていることが既に報告されているトマトに注目した.種子一粒中のプランテオースの分析系を確立し,EMS処理による変異誘発系統についてプランテオースを分析した.これまでに約300系統を解析し,3系統で種子中のプランテオースが著しく減少していることを確認した.また,興味深いことに,1系統において,トマト種子に多く含まれるフルクトースがほとんど含まれていないことを発見した.プランテオースの代謝酵素については,同時並行して進めていた次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析によってα-ガラクトシダーゼ様遺伝子のORFを取得した.この配列を大腸菌で発現させたところ,モデル基質である4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシドの加水分解活性が確認できた.ノジリマイシンの作用機構を解明することを目的として,次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行った.その結果,ノジリマイシンの処理によって,糖の輸送体遺伝子や,受容体樣キナーゼ,あるいは,フォスファターゼの遺伝子の発現に変化が見られた.これらは,寄生雑草の発芽に重要な役割を担っていることが予想される.ノジリマイシンの作用機構については,インベルターゼのプロセシングに与える影響についてより詳細に解析する.ノジリマイシンのこれまでに知られていない生理機能およびプロセシングによるインベルターゼの活性調節機構が明らかになると期待される.プランテオースの生合成については,得られた変異体の変異を解析することによって,関連遺伝子を得る.また,代謝酵素については,異種発現系で調製するタンパク質について酵素活性を評価する.何の酵素もこれまでには報告のない新規なものである.生物有機化学トマトの低プランテオース変異体の原因
胸腺の存在をDll4でどこまで解くことができるのか

T細胞は、他の血液細胞が骨髄中にて分化・成熟するのと異なり、分化環境として胸腺を必要とする。これまで、我々を含む複数の研究グループにより、造血未分化細胞からT細胞への分化にはNotchシグナルが重要であることが示されてきた。我々は、哺乳動物での4つのNotchリガンドのうち、3つ(Dll1、Dll4、Jagged1)について誘導型遺伝子欠損マウスを作製・解析し、胸腺環境の成立には、胸腺上皮細胞に発現するDll4が唯一重要であることを明らかにした。すなわち、胸腺上皮細胞にてDll4遺伝子を欠失したマウスでは、胸腺内にT細胞はまったく存在せず、代わりに多数のB細胞が出現することを見出した。また、Notchシグナルは、胸腺内での未分化T細胞の分化・増殖にも重要とされており、Dll4の役割をさらに検討した。Dll4非存在下に胸腺未分化T細胞(DN1/2)を胸腺器官培養にて分化誘導を行うと、ほとんどT細胞は分化しなかった。これは、当該ステージにてNotchシグナルの標的分子と考えられてきたTCRβ鎖およびpTαの遺伝子導入を行っても改善しなかった。また、最近、Notch下流にて機能することが示唆されるc-mycおよび活性化Aktの共発現によっても正常T細胞分化は再現できず、異常増殖が観察された。これらのことから、T細胞分化および正常細胞増殖の担保には、制御されたNotchシグナルの発動が重要であることが明らかとなった。報告者はこれまで、T細胞の分化環境としての胸腺の役割を分子レベルで理解することを目的として、T細胞分化誘導におけるNotchシグナルの重要性と、シグナルを誘導するNotchリガンドについて研究してきた。すなわち、(1)活性化Notch1の強制発現により、胸腺環境に依存せず、単層培養系にてT細胞が誘導されること、(2)胸腺環境の特殊性は、胸腺上皮細胞に発現するNotchリガンド: D114にて説明されること、を報告してきた。本年度は、胸腺にてT細胞系列へ分化決定がなされた未分化T細胞(DN1/2期、DN3期)がさらに分化する過程でのD114の重要性を、D114-floxed/FoxN1-Creマウス胎仔胸腺を用いて調べた。まずDN1/2細胞では、D114欠失環境では、対照と比較し、著しく細胞数が減少(1/20)し、DP期への分化もほとんど認められなかった。この結果は、DN1/2細胞に遺伝子再構成したTCRb遺伝子を導入しても同様であった。よって、D114不在によるDN1/2細胞の分化異常は、同遺伝子の再構成不全によるものではないことが示唆された。現在、DN1/2期でのもう1つのNotchシグナル標的遺伝子であるpTa遺伝子の過剰発現による影響について検討している。一方、後者では、DP期への分化能はほとんど差異が認められないが、回収できる細胞数が少なく(1/4程度)、BrdUの取り込みにて検出される細胞周期の進展も低下傾向にあることが示された。以上のことから、胸腺上皮細胞にて発現するD114は、胸腺内T細胞分化(DN/DP期)にも重要であり、pTaを含むpre-TCR構築および細胞増殖に関与する可能性が考えられた。
網膜培養系を用いた血管新生のメカニズムとその制御

SDF-1/CXCR4はtip cellやマイクログリアに作用し、網膜の血管新生に寄与していることが明らかになった。眼内における病的血管新生は加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、新生血管緑内障など難治性の疾患の発症に深く関わっている。当初、Stromal Cell-derived Factor-1 (SDF-1)は、Tリンパ球の化学遊走物質として発見されたが、微小血管の血管新生にも関与していることが明らかになってきた。器官培養を用いた成体網膜新生血管の評価系、生体下におけるSDF-1/CXCR4の関与を検証する。生後7-8週のC57BL6/Jマウスの摘出網膜をVEGFとともに培養すると、72時問後より網膜血管から新生血管の発生が観察され、25ng/mLの濃度のVEGFで最大効果がみられた。Tie2/GFPマウスの網膜を用いることにより、新生血管の発育を経時的に観察することができた。次に300,100,30,10,3,1オg/mLの抗SDF-1抗体を加えて96時間培養を行うと、10オg/mL以外の濃度で血管新生の有意な抑制が観察された。またSDF-1のレセプターとされるCXCR4の阻害薬であるAMD3100を加えて培養を行うと、0.3オM以上の濃度で用量依存的に血管新生の有意な抑制が見られた。一方で生後3日のマウスの眼内にAMD3100を投与すると、網膜血管の発育の遅延が認められた。以上よりSDF-1/CXCR4は網膜における血管新生に重要な働きをしていることが示唆された。近年、stromal cell-derived factor-1(SDF-1)が血管新生に重要な役割を果たしていることが明らかになったが、SDF-1とそのレセプターであるCXCR4受容体が新生血管の進展にどのように寄与しているかを調べた。7-8週令のC57BL6/Jマウスの網膜を96時間培養した。VEGFを加えることでSDF-1のmRNAの発現が増加した。SDF-1/CXCR4をそれぞれの抗体で阻害するとVEGFによる血管新生が抑制された。Time-lapseイメージングを行うことで、SDF-1/CXCR4によって新生血管の伸展や、tip cellから進展するフィロポディアの動きが制御されていることが判明した。さらにSDF-1/CXCR4を阻害するとマイクログリアの動きも抑制されることがこの系で明らかになった。一方で、網膜血管発生モデルを用いて検討を行った。生後2日目のC57BL6/Jマウスに抗SDF-1抗体または抗CXCR4抗体、またはCXCR4阻害剤であるAMD3100を投与し、生後4日目で網膜を採取、固定して評価を行った。血管の伸展はコントロールに比べて有意に遅れていた。これらの阻害剤はtip cellからのファロポディアの進展を抑制し、tip cellに発現しているKDR/Flk-1, UNC5B, PDGFBのmRNAの発現を抑制していた。また網膜内のマイクログリアの数はコントロールに比べて減少していた。以上のことからSDF-1/CXCR4は網膜における血管新生をtip cellやマイクログリアを通じて制御していることが明らかになった。
孔辺細胞におけるアブシジン酸シグナル伝達の分子機構

我々は、ソラマメ気孔孔辺細胞をアブシジン酸(ABA)処理すると、サイトソルCa^<2+>濃度([Ca^<2+>]_c)上昇に続いてプロテインキナーゼ(ABRキナーゼ)が特異的に活性化されることを見出している。ABAによる気孔閉孔の分子機構解明を目的として本研究は行われた。ABRキナーゼはK^+チャネルKAT1を特異的にリン酸化し不活性化させた。KAT1不活性化によるK^+流入抑制が気孔閉孔機構の一部であると推測される。ABRキナーゼと同一と考えられるAAPKがAssmannによってソラマメからクローン化されたので、その配列を利用してシロイヌナズナcDNAライブラリーからAAPKをクローン化し、His-tagを付加して大腸菌で発現させた。予想される質量42kDがSDS-PAGEで得られたが、この蛋白質はプロテインキナーゼ活性を持たなかった。抗-His-AAPK抗体によるWestern blotはAAPKが孔辺細胞特異的に存在することを示したが、その質量は48kDであった。この結果はAAPKが翻訳後修飾を受けていることを示唆しており、これ酵素活性の発現に必要である可能性がある。AAPKをABA処理した孔辺細胞抽出液とインキュベートするとリン酸化され、AAPKキナーゼ(AAPKK)の存在が示された。AAPKKはAAPKに先だって活性化された。これらのキナーゼはABAシグナル伝達経路で、カスケードを構成していると考えられる。この下流でKAT1がリン酸化される。キナーゼカスケードの上流で[Ca^<2+>]_c上昇を担うのはCa^<2+>チャネルである。シロイヌナズナゲノム情報を利用してAtTPC1のクローン化に成功した。AtTPC1は、動物の電圧依存性Ca^<2+>チャネルαサブユニットの一般的構造である4ドメイン構造の丁度半分に相当する新規な構造をもつチャネル蛋白質であった。AtTPC1は酵母の仮想的Ca^<2+>チャネル欠損変異体cch1のCa^2取り込み活性を回復させた。また、Ca^<2+>依存性発光蛋白質エクオリンを導入したシロイヌナズナのショ糖応答性発光を利用した解析によって、AtTPC1は電圧依存性Ca^<2+>透過チャネルであることが間接的に証明された。これまでにアブシジン酸によって活性化されるプロテインキナーゼ、ABR kinaseが孔辺細胞に存在し、K^+チャネル、KAT1のC末端をリン酸化することを明らかにしてきた。本年度、ABR kinaseのクローニングを目的として、KAT1のC末端との相互作用することを指標として酵母を用いたTwo-hybrid系によるcDNAのスクリーニングを試みた。まず、単離したソラマメの孔辺細胞プロトプラストより、mRNAを精製し、cDNAを合成した。これをプレイ(獲物)ベクターに挿入し、ライブラリーを作成した。次にスクリーニングの効率化を考慮し、KAT1におけるリン酸化部位の特定に取り組んだ。KAT1の部分リコンビナントペプチドを作出し、インゲルプロテインキナーゼアッセイを行った。C末端を徐々に小さく分割し、それぞれをリン酸化させたところ、複数の領域がリン酸化されることが明かとなった。

このため、この手法によるリン酸化部位の特定を断念した。そこで、KAT1のC末端全体をベイト(餌)としてスクリーニングを開始した。スクリーニングの結果、31クローンの候補が得られた。得られた遺伝子の塩基配列は決定途中である。一方、我々がクローニングしようとしているプロテインキナーぜと同一である可能性が非常に高いプロテインキナーゼのcDNAが、ごく最近になつて、ソラマメ孔辺細胞からAssmannのグループによってクローニングされた(2000,Science287:300-303)。今後はこのキナーゼとKAT1や他の信号伝達系の因子との相互作用も視野に入れて研究する予定である。Assmannらによってソラマメ孔辺細胞からクローン化されたAAPK(ABA-activated protein kinase)は、我々が報告したABRキナーゼ(ABA responsive protein kinase)と同一である可能性が高い。このcDNAにHis-tagを付加し大腸菌で発現させ、アフィニティー精製してHis-AAPK融合蛋白質を得た。この蛋白質はSDS-PAGEで遣伝子から推定される分子質量42kDaを与えたが、ミエリン塩基性蛋白質、カゼイン、ヒストンを基質とする活性測定ではプロテインキナーゼ活性を示さなかった。His-AAPKを免役したウサギ抗血清を用いて、ウェスタンブロッティングによりこの抗血清と免疫交叉する蛋白質のソラマメ組織ごとの分布を調べたところ、孔辺細胞特異的に検出された。しかしながら、この蛋白質の分子質量は48kDaであった。このことは、AAPKが翻訳後修飾を受けていることを示唆している。今後、免疫沈降によってソラマメ孔辺細胞で発現しているAAPKを単離し、グリコシル化やミリスチル化の可能性について検討する。ソラマメ孔辺細胞プロトプラスト抽出液にHis-AAPKと[^<32>P]ATPを加えEGTA存在下でインキュベートすると、アブシジン酸(ABA)処理を行ったプロトプラスト抽出液にのみHis-AAPKのリン酸化が検出され、His-AAPKをリン酸化するプロテインキナーゼ(AAPKキナーゼ)が孔辺細胞に存在し、プロトプラストをABA処理することにより活性化されることが示された。His-AAPKリン酸化(すなわちHis-AAPKキナーゼの活性化)はABA処理後12分で最大となり、その後低下した。この経時的変化は、既に報告したABA処理後510分で最大になるAAPKの活性化に先立つものであり、AAPKはAAPKキナーゼによるリン酸化によって活性化を受けることを強く示唆している。これらのキナーゼを構成員とするプロテインキナーゼカスケードによって、孔辺細胞のKチャネルKAT1活性が制御されるものと推定される。アブシジン酸(ABA)の受容から気孔閉孔に至るシグナル伝達の初発反応は[Ca^<2+>]_<cyt>の上昇であり、これを担うのはCa^<2+>チャネルである。シロイヌナズナゲノム情報を利用してAtTPC1のクローン化に成功した。
中規模ペプチドの構造的相互作用解析基盤技術の開発

中分子創薬において重要とされるペプチドの標的を効率良く探索し、かつ標的との結合性を予測できる手法の開発が目的である。立体構造情報に基づくタンパク質間相互作用予測の大規模利用のための高度化と並列実行を実施した。また、代表的なヒトタンパク質構造に対して総当たり予測計算を実施し、結果をウェブブラウザを介して閲覧できるようにインターフェースを構築した。さらに、ペプチド分子とタンパク質との結合性解析計算を行う手法、2部グラフ予測を主体とした機械学習による分子標的予測手法であるLIK法、およびランク学習を主体とした機械学習による分子標的予測手法であるPKRank法を開発した。低分子創薬からの脱却を目指して,中分子=数残基から十数残基のペプチドが創薬研究において注目されている.しかしながら,さらに大きい規模である50150残基程度のペプチド分子(中規模ペプチド)においては,バイオインフォマティクス分野は未だ構造的な解析技術を有しておらず,解析手法・予測手法の確立が求められている.本研究では,このような中規模ペプチドを扱うための情報学的な解析手法を確立するために,中規模ペプチドの構造モデリング,中規模ペプチドの機能部位予測,中規模ペプチドとタンパク質の複合体モデリング技術の3点について並行して開発を進める.特に機能未知であるペプチドに対して相互作用可能性のあるタンパク質の予測を可能にすることが本研究の目的である.本年度ではペプチド構造モデリングと複合体モデリングについて焦点を当てた.15残基程度の構造既知のペプチドを用い,アミノ酸配列情報から実際に既存のモデリングツールでどの程度相互作用時の構造が再現されるかを調べた.その結果,大半のペプチドにおいて相互作用時の構造がうまく再現できないことを確認した.一方,それらのペプチドモデル構造(decoy)を複数用いて対象のターゲットとなるタンパク質に対してMEGADOCKソフトウェアによって相互作用計算をしたところ,複数の相互作用計算の結果から正規化などを行うことによって,正解位置との距離基準を満たす位置へ相互作用するモデル(near native decoy)が得られることが確認された.また,そのようなモデルを抽出するための方法として,アミノ酸相互作用プロファイルを用いる方法を新たに提案した.これらの結果からペプチドモデル構造の生成段階にフィードバックを行う方法を考案し,次年度で検証を行う予定である.本研究の目的である,機能未知ペプチドに対して相互作用可能性のあるタンパク質の予測を可能にするため,本年度はペプチド構造モデルの計算手法開発を行い,当初の計画通りに進めることができた.また,モデル選択のためにアミノ酸相互作用プロファイルが有効に働くことが新たに分かり,実際にタンパク質間相互作用やタンパク質-ペプチド間相互作用において結果を解析するところまで進めることができたため,本研究はおおむね順調に進展しているものと判断する.低分子創薬からの脱却を目指し、中分子、特にペプチド分子に関する創薬研究が注目されている。本研究は、このようなペプチド分子を扱うための情報学的な解析手法を確立するために、ペプチドの構造モデリング、ペプチドの機能部位予測、中規模ペプチドとタンパク質の複合体モデリング技術の3点について並行して開発を進めているる。特に機能未知であるペプチドに対して相互作用可能性のあるタンパク質の予測を可能にすることが本研究の目的である。本年度は複合体モデリングとペプチド分子の物理化学的性質の予測に焦点を当てた。昨年度の結果から、既存のモデリングツールでは15残基程度のアミノ酸配列情報からペプチドの構造(配座)は正しく再現することは困難であることを確認しているが、一方でそれらのペプチドモデル構造(decoy)を複数用いて対象のターゲットとなるタンパク質に対し、MEGADOCKソフトウェアによる相互作用計算を実施したところ、正解配座との距離基準を満たす部位へ相互作用するモデル(near native decoy)が得られることを新たに確認した。また、そのようなモデルを抽出するための方法としてアミノ酸相互作用プロファイルを用いる方法を新たに提案し、現在までに8つの複合体ケースにおける検証を完了した。これらの結果から、一定の構造集団を用いることで、完全に正しい構造モデルが得られなくとも、相互作用親和性と相関するパラメータが得られる可能性があり、次年度以降により詳細に研究を実施する。モデル選択のためにアミノ酸相互作用プロファイルが有効に働くことを検証でき、実際にタンパク質間相互作用やタンパク質-ペプチド間相互作用において一定の結果を示すことができた。本研究はおおむね順調に進展しているものと判断する.本研究は、中分子創薬の効率化を目指して、特にペプチド分子に着目した創薬支援研究を実施することを課題とする。ペプチド分子を扱うための情報学的な解析手法を確立するために、ペプチドの構造モデリング、機能部位予測、ペプチドが標的とするタンパク質間相互作用の構造モデリング技術および予測技術について並行して開発を進めてきた。本年度は、昨年度に続いてペプチド分子とタンパク質の結合に係る物理化学的性質の予測に焦点を当てた。昨年度までの結果から、既存のモデリングツールでは15残基程度のアミノ酸配列情報からペプチドの構造(配座)は正しく再現することは困難であることを確認しているが、一方でそれらのペプチドモデル構造を複数用い、対象のターゲットとなるタンパク質に対してMEGADOCKソフトウェアによる相互作用計算を実施したところ、正解配座との距離基準を満たす部位へ相互作用するモデルが効率よく得られることを確認できた。そのようなモデルを抽出するための方法として相互作用プロファイルベクトルによる解析手法を提案し、現在までに複合体10例における検証を完了した。これらの結果から、一定の構造集団(構造サンプリング)を用いることで、完全に正しい構造モデルが得られなくとも、相互作用親和性と相関するパラメータが得られる可能性があることを示した。また、ペプチドが標的とするタンパク質間相互作用を列挙するためのツール整備として、新たに予測されたタンパク質間相互作用情報を蓄積したデータベースMEGADOCK-Webを構築した。

MEGADOCK-Webはおよそ3000万件のタンパク質間相互作用予測の結果が収録されており、Molmil分子ビューワによるインタラクティブな構造可視化、KEGGパスウェイとの関連付けなどによって標的候補分子を効率よく検索することができるようになった。中分子創薬において重要とされるペプチドの標的を効率良く探索し、かつ標的との結合性を予測できる手法の開発が目的である。立体構造情報に基づくタンパク質間相互作用予測の大規模利用のための高度化と並列実行を実施した。また、代表的なヒトタンパク質構造に対して総当たり予測計算を実施し、結果をウェブブラウザを介して閲覧できるようにインターフェースを構築した。さらに、ペプチド分子とタンパク質との結合性解析計算を行う手法、2部グラフ予測を主体とした機械学習による分子標的予測手法であるLIK法、およびランク学習を主体とした機械学習による分子標的予測手法であるPKRank法を開発した。中規模ペプチドを扱うための情報学的な解析手法を確立するために,中規模ペプチドの構造モデリング,中規模ペプチドの機能部位予測,中規模ペプチドとタンパク質の複合体モデリング技術の3点について並行して開発を進める.特に次年度ではさらに残基数が大きくなった場合のケースに対応するため,天然変性タンパク質の情報を用いたモデリング手法の開発を行う.天然変性領域の実験的な情報が蓄積されているDisProtデータベースの利用を想定しているが,データ数の蓄積が少なく充分なモデリングが行えない場合は,天然変性領域を計算によって予測するツールの利用を検討する.ペプチドを扱うための情報学的な解析手法を確立するために、ペプチドの構造モデリング、ペプチドの機能部位予測、ペプチドとタンパク質の複合体モデリング技術の3点について並行して開発を進める。特に次年度では天然変性タンパク質の情報を用いたモデリング手法の開発を検討する。天然変性領域の実験的な情報が蓄積されているDisProtデータベースの利用を想定しているが、データ数の蓄積が少なく充分なモデリングが行えない場合は、天然変性領域を計算によって予測するツールの利用を検討する。バイオインフォマティクス開発用PC,およびメモリやストレージなどの少額ハードウェアの価格が下がったことにより,同等性能品を安価に手に入れることができたため.大型並列計算機であるTSUBAMEスーパーコンピューターの利用頻度が学内全体で高まっており、当該年度中に目標とする計算時間の確保ができなかったため。
炎症性皮膚疾患モデルマウスにおける脂質代謝ネットワークの解析

表皮の脂質は皮膚バリア機能の形成および皮膚病態生理機能に重要な要素である。脂質代謝の破綻が皮膚病態と密接に関連していることが予想されるが、皮膚疾患における脂質ネットワークの役割については充分に理解されていない。本研究では、PLA2アイソザイムのひとつであるPLA2G2Dが樹状細胞に局在し、DHA由来の抗炎症性脂質メディエーターのひとつであるリゾルビンD1の産生に関わり、接触性皮膚炎応答の収束を制御することを明らかにした。すなわち、PLA2G2Dによる炎症の収束は多くの炎症性代謝疾患でも引き起こされていることが予想され、PLA2G2Dを標的としたバイオ医薬品の開発研究へと発展する可能性がある。本年度は、リンパ組織のPLA2G2Dが抗炎症性リピッドメディエーターの産生を促し、炎症免疫応答の収束を制御することを示した。脾臓とリンパ節での発現が極めて高いPLA2G2Dは、その中でも樹状細胞(DC: CD11c+細胞)に高発現している。DCにおけるPLA2G2Dの機能を調べる目的で、ハプテン誘導接触性皮膚炎モデルをPla2g2d-/-に適用してその表現型を精査した。Pla2g2d-/-では皮膚炎応答の開始と進行は野生型マウスと同様に起こるのに対し、皮膚炎後期の浮腫の収束が見られず炎症が持続した。この収束期の皮膚と所属リンパ節における各種炎症性マーカーの発現は、野生型マウスに比べてPla2g2d-/-では顕著に高い値を示した。Pla2g2d-/-より調整した骨髄由来DC(BMDC)は野生型マウス由来BMDCと比較して活性化が亢進しており、Pla2g2d-/-OのBMDCを移植した野生型マウスに抗原を単回塗布すると、野生型マウスのBMDCを移植したマウスに比べて浮腫が増悪した。さらに脂質メタボローム解析の結果、PLA2G2Dはリンパ節において高度不飽和脂肪酸を持つホスファチジルエタノールアミンを基質として抗炎症性脂質とされるドコサヘキサエン酸(DHA)の遊離に関わることが明らかとなった。以上の結果から、PLA2G2DはDC由来の“抑制性"sPLA2であり、抗炎症性脂質の産生を制御することで炎症を収束する役割をもつことが示唆された。また抗皮膚癌薬のスクリーニングを目的としてPLA2G2Fを指標とした知見について特許出願をおこなった。申請者の研究室では従来機能が不明であった分泌性ホスホリパーゼA2(PLA2)群の遺伝子改変マウスを作出し、これに脂質メタボローム解析を展開することで、この酵素群を起点とする新しい脂質ネットワークとその生命応答との関連を見出しつつある。そのうち、本研究助成による成果を下記に記す。1)リンパ組織に局在するPLA2G2Dは、抗炎症性リピッドメディエーターであるリゾルビンD1の産生を促し、接触性皮膚炎(IV型アレルギー)の収束を制御することを示した。2)表皮に局在するPLA2G2Fは、新規脂質メディエーターのリゾホスファチジルエタノールアミンを供給し、ケラチノサイトの分化を促進することで表皮の弱酸性化環境の維持およびバリア機能に寄与すること、さらにPLA2G2F欠損マウスに乾癬、接触性皮膚炎、皮膚癌の病態モデルを施すと各病態が改善されることを示した。3)アレルギー応答に関わるマスト細胞の成熟が、マスト細胞内に貯蔵されているPLA2G3と隣接する繊維芽細胞におけるプロスタグランジンD2産生の連携による新規脂質代謝経路によるものであることを示した。接触性皮膚炎やアトピー性皮膚炎に代表される炎症性皮膚疾患は、免疫系、表皮バリア機能、掻破などが複雑に絡み合った複合アレルギー疾患である。免疫学的恒常性の維持や免疫応答の制御に脂質メディエーターが関与する事が最近知られてきているが、皮膚における役割については十分理解されていない。10種類のアイソザイムからなる細胞外分泌性PLA2(sPLA2)は、リポ蛋白質や細胞の外側からリン脂質膜を加水分解しリゾリン脂質と遊離脂肪酸を産生するが、その生体内機能については不明な点が多く残されている。我々はこれまでに炎症性皮膚疾患と関わりのある細胞に特徴的に発現しているsPLA2アイソザイムを見出しており、本研究ではsPLA2遺伝子改変マウスをツールに炎症性皮膚疾患における時空間的な脂質ネットワークを解明し、これを理論基盤とした創薬および予防治療の可能性を検討することを目的としている。本年度は、Th1免疫応答のDNFB誘導接触性皮膚炎、Th2免疫応答のOVA反復塗布誘導アトピー性皮膚炎、DMBA-TPA皮膚癌を各種sPLA2-KOマウスに適用して解析をおこなった。その結果、接触性皮膚炎に関連するsPLA2としてsPLA2-V,-X,-IIF,-IID,-IIIを同定した。そのうちsPLA

2-IIDは、接触性皮膚炎の炎症収束(寛解)に関わり、炎症収束期のリンパ節のホスファチジルエタノールアミンを基質とし選択的に高度不飽和脂肪酸を遊離し、抗炎症性脂質メディエーターの産生を制御していることが明らかになった。さらに、アトピー性皮膚炎に関連するsPLA2として、sPLA2-III, -Vがそれぞれ抑制的および促進的に機能すること、sPLA2-IIFが皮膚癌の成長に機能することを見出した。現在、表現型の詳細な機能解析および関連する脂質分子の同定を行っている。接触性皮膚炎においてPLA2G2Dが炎症の収束に関わる脂質メディエーターの産生に関わることを論文報告した。皮膚の恒常性維持および皮膚癌に関する脂質ネットワークの詳細については現在論文にまとめているところである。アトピー性皮膚炎および皮膚癌に関連する脂質ネットワークの解析については若干遅れているが、概ね研究実施計画通りに進んでいる。アトピー性皮膚炎および乾癬に関わる脂質ネットワークの詳細について検討を進める。また、リンパ球サブセットにおける脂質プロファイリングの検討もおこなう。さらに抗体および低分子阻害薬を用いた治療戦略を進めて行くために抗体作製および阻害剤スクリーニングのための組換え蛋白質の調製をおこなう。前年度に引き続きアトピー性皮膚炎および皮膚癌に関わるsPLA2について皮膚および所属リンパ節の微小環境下において、質量分析を用いた脂質プロファイリングおよびマイクロアレイによる遺伝子プロファイリングを展開し、各sPLA2サブタイプを起点とする脂質ネットワークの解明を進めて行く。さらに、ヒトへの応用を目指し、sPLA2サブタイプの活性を阻害する低分子化合物または抗体を炎症性皮膚疾患モデルに適用し、予防治療薬としての検証も進めていく。申請者の所属機関における遺伝子改変マウスの維持費は、現状規模では一ヶ月約50千円である。本研究においては年間600千円が見込まれるが、その一部を本申請分で支払い、不足分は所属機関の公費でまかなう。残りの経費を遺伝子解析および脂質解析などに必要な一般試薬消耗品に充て、不足分は所属機関の公費を使用する。研究成果を国内外の学会で発表することを考慮し、本年度は日本生化学会および5th International Conference on Phospholipase A2 Mediated Signaling in Translational Medicineを設定する。また、本年度の論文報告を見込み、論文発表の英文校正と論文投稿費を計上する。年次毎に一時的な研究補助員(動物管理)の謝金120千円(月10千円X12ヶ月)を設定する。申請者の所属機関における遺伝子改変マウスの維持費は、現状の規模では一ヶ月約50千円である。残りの経費を遺伝子解析および脂質解析などに必要な一般試薬消耗品に充てるが、不足分は所属機関の公費でまかなう。研究成果を、国内外の学会で発表することを考慮し、本年度は日本生化学会およびFASEB meetingを設定する。年次ごとに一時的な研究補助員(動物管理)の謝金120千円(月10千円x12ヶ月)を設定する。
C.エレガンスをモデルとした神経軸索再生制御

線虫C. elegansにおいて、損傷を受けた神経の再生開始はSVH-1がc-Met様受容体チロシンキナーゼSVH-2を介してJNK MAPキナーゼ経路を活性化することにより促進される。本研究では、コラーゲンにより活性化される受容体チロシンキナーゼSVH-4が、SVH-2-JNK経路の上流で機能することを示した。我々はまた、SVH-1が細胞外マトリックス構成因子FBL-1を制御することで幼虫の成長を調節することも見出した。さらに、HIF-1を介したセロトニンシグナルの活性化が、RhoAおよびcAMP経路の両方を活性化することによって軸索再生を促進することも示した。平成26年度は主にSVH-1の解析を行った。これまでの研究から、SVH-1は増殖因子HGFと類似した因子としてHGF受容体ホモログSVH-2を活性化することにより神経軸索再生を制御していることが明らかとなっていたが、SVH-1が活性のあるプロテアーゼドメインを持っている理由についてはわかっていなかった。そこでSVH-1のドメイン解析を行ったところ、SVH-1がHGFに類似した増殖因子として機能するだけでなく、プラスミンに類似したタンパク質分解酵素としても機能するという、2つの異なる機能を同時に持つ因子であることを見出した。また進化学的な系統解析から、SVH-1が無脊椎動物に広く存在すること、そして脊椎動物ではこれがHGFとプラスミンという2つの異なる機能を持つタンパク質に分かれたことを示唆する結果を得た。なお、SVH-1の神経軸索再生因子としての機能は増殖因子の機能部分が担っており、タンパク質分解酵素の活性は必要でないことも示唆された。さらにSVH-1が、細胞外マトリクスタンパク質の分解を介して、線虫の生育を制御することも見出した。これらの成果はCell Reports誌に論文として発表した。さらに、神経軸索再生を制御する他の因子についても解析を行い、その進捗状況についてそれぞれ分子生物学会等において発表した。本年度は、線虫において神経軸索再生を抑制する因子の候補として同定されたSVH-4およびSVH-6について解析を行った。SVH-4は受容体型チロシンキナーゼであるが、その哺乳動物ホモログにおけるこれまでの知見から、ある特定の種類のリガンドによって活性化される可能性が考えられた。そのリガンドのホモログをコードする遺伝子は線虫に複数存在していたので、それらについて神経軸索再生への関与について調べたところ、ある1つのリガンド遺伝子の変異によって神経軸索再生が低下することを見出した。またその変異は、svh-4欠損変異と二重変異にしても、その神経軸索再生低下の表現型をエンハンスしなかった。さらにリガンド遺伝子の変異による神経軸索再生率の低下は、SVH-4を多量発現させることで抑圧できた。これらのことから、SVH-4がこのリガンドと同一経路かつ下流で機能することが明らかとなった。また、SVH-4がどこで機能するか知る目的で、SVH-4::GFP融合遺伝子を作成して神経で発現させたところ、軸索に沿って特徴的なドット状の局在を示した。さらに神経切断後には神経軸索の先端に形成されるbulbに速やかに蓄積すること、また成長円錐が形成されるとその先端によく局在することが判明した。それとは別にSVH-6についても解析を行い、SVH-6の持つアクチン結合ドメインはその機能に対して必要ではなくむしろ抑制的な役割を持つこと、さらにSVH-6が以前同定した受容体型チロシンキナーゼSVH-2の遺伝学的上流で機能することも見出した。当初の研究計画の3つのサブテーマのうち、2つについては予定通りに進展している。本年度は、神経伝達物質の一種であるセロトニンが神経軸索再生を促進することを見出した。セロトニンの産生は、軸索切断による転写因子HIF-1依存的なセロトニン合成酵素TPH-1の発現誘導により、切断神経の本来の性質に関係なく起こる。産生されたセロトニンは、切断神経自身にあるセロトニン受容体SER-7を介して三量体Gタンパク質GPA-12を活性化する。活性化したGPA-12はRhoGEFであるRHGF-1を介して低分子量Gタンパク質Rhoを活性化し、これがさらにジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)を抑制することで、ジアシルグリセロール(DAG)量を増大させる。DAGはJNK MAPK経路を活性化することにより神経軸索再生を促進する。なお、SER-7は上記の経路とは別にcAMP合成経路も活性化しており、それら2つの経路の両方が軸索再生には必要であった。以上のことから、HIF-1によるセロトニンシグナルが、RhoとcAMPの両方の経路を活性化することで神経軸索再生を促進することが明らかとなった。本年度はさらに、昨年度から解析しているチロシンキナーゼSVH-4について、その下流因子の探索を行い、その結果SHC-1を同定した。これまでの研究から、SHC-1は線虫の別のチロシンキナーゼSVH-2のリン酸化チロシンに結合することが報告されていた。そこでsvh-4との遺伝学的関係を検討したところ、svh-4変異体の軸索再生率低下の表現型は、SHC-1の多量発現およびSVH-2の多量発現によりそれぞれ抑圧された。これらの結果から、SVH-4はSHC-1と結合してSVH-2の機能を補助することにより、神経軸索再生を制御することが示唆された。

線虫C. elegansにおいて、損傷を受けた神経の再生開始はSVH-1がc-Met様受容体チロシンキナーゼSVH-2を介してJNK MAPキナーゼ経路を活性化することにより促進される。本研究では、コラーゲンにより活性化される受容体チロシンキナーゼSVH-4が、SVH-2-JNK経路の上流で機能することを示した。我々はまた、SVH-1が細胞外マトリックス構成因子FBL-1を制御することで幼虫の成長を調節することも見出した。さらに、HIF-1を介したセロトニンシグナルの活性化が、RhoAおよびcAMP経路の両方を活性化することによって軸索再生を促進することも示した。SVH-1については論文として発表できた。また他の因子群についても順調に解析を進めており、学会等で発表している。今後、順調に推移しているテーマについてさらに進めることで、残りの1年の間に研究成果をまとめてゆく。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学今後はSVH-1以外の軸索再生因子の解析を進め、論文として発表する。
擬似細胞チップによる膜タンパク質の動的構造機能計測技術の開発

本研究では、疑似細胞アレイチップを作成し、細胞膜機能を人工的に再構築するとともに、膜タンパク質の構造や機能の高感度計測基盤の開発を行った。具体的には、細胞膜画分をマイクロチップ上の生体膜と融合させることで、膜タンパク質を機能を保持した状態で再構成することが可能となり、特に膜輸送体に関して様々な機能を定量的に計測する基盤技術を確立することに成功した。また、F型ATP合成酵素などの構造変化の可視化技術の開発にも成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。細胞の中には、タンパク質でできた多様な分子モーターが存在し、それらの“構造変化"により、エネルギー合成、物質輸送および細胞分裂などの生理的に重要な機能が実現している。これまで、分子モーターの“構造"と“機能"を理解するため、光学顕微鏡を用いたin vitro1分子計測技術が開発され、化学・力学特性などの基本的な性質が明らかにされてきた。現在、in vitro1分子計測技術は生きた細胞へ展開され、生理条件下での分子モーターの理解を促進している。しかし、従来の細胞内1分子計測は技術的な障壁が高く、特に、膜タンパク質で構成される分子モーター(膜分子モーター)への展開は非常に困難であった。すなわち、膜分子モーターの生理条件下での構造変化および機能に関しては未解明な部分が多く、構造と機能の相関解析に基づいた作動機構の解明は学術的意義が高いといえる。本研究では、自主開発した「生体膜マイクロチップに細胞を融合させた「擬似細胞チップ」を新規開発し、生理条件下でのFoF1のプロトン輸送と回転運動の1分子同時計測技術の確立を目指す。そして、FoF1の構造変化と機能の相関関係を解析から、生理条件下での作動機構の解明を目指す。本年度の成果としては以下の2点があげられる。1,生体膜チップを利用した膜分子モーター(FoF1)の構造変化(回転運動)と機能(プロトン輸送)の相関計測を実現した。具体的には、従来機能解析に利用してきた生体膜チップ上に、FoF1の回転運動を可視化するための機構を実装した。2,細胞膜断片の融合による擬似細胞膜チップの開発に成功した。具体的には、大腸菌および牛心筋のミトコンドリア由来の反転膜小胞を生体膜チップへ融合させ、反転膜小胞上に存在する膜分子モーターのプロトン輸送活性を計測することができた。昨年度の目標であった、擬似細胞チップの開発および膜分子モーターの構造変化と機能の同時計測の実現において見通しがついた。当該技術を機軸として来年度の研究を円滑にすすめることができると考えている。生理条件下では、膜分子モーター(FoF1)は他のタンパク質と共にエネルギー代謝に必須な呼吸鎖を形成する。疑似細胞チップでは、FoF1だけでなく、他の呼吸鎖タンパク質も丸ごと再構成される。来年度は、呼吸鎖を構成するFoF1以外の膜タンパク質(例えば、Complex I)に外部から薬剤などで刺激を与えたときのFoF1のプロトン輸送および回転運動を解析し、呼吸鎖を形成する生理条件下でのFoF1の運動・機能における制御機構の解明を目指す平成30年度が最終年度であるため、記入しない。