hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳用牛の暑熱適応に関する研究

この間、毎日11時の給餌をはさんで直腸温、呼吸数および心電図を8時間にわたり連続記録するとともに、給餌前と給餌3時間後の2回、血液と胃液を採取して分析に供した。また、心電図の記録から心拍変動解析を行い、非侵襲的に自立神経機能を評価することも試みた。得られた主な結果はつぎのようであった。(1)直腸温はH,F1ともに高温条件下で上昇し、その変化の度合いはHの方が大きかった。(2)心拍数はH,F1ともに給餌後増加し、その変化の度合いはF1では適温と高温条件でおおむね同程度であったのに対して、Hは高温条件のほうが小さかった。(3)呼吸数は高温条件下でH,F1ともに著しく増加した。しかし、高温2日目には、F1の増加は持続したのに対して、Hでは減少に転じた。(4)自律神経機能はH,F1ともに給餌後交感神経緊張状態に移行することが明らかとなったが,高温影響については方法論上の問題から今後の課題として残された。(5)血液性状面の代表的な変化として、高温条件下では血漿中3-メチルヒスチジン濃度の上昇が、Hでとくに著しいことが明らかとなった。以上のことから、HとF1では暑熱の影響の受け方が異なり、F1の方が耐暑性に優れていると推察された。今年度は本学付属農場で飼養されているホルスタイン種搾乳牛を対象に暑熱期と寒冷期における牛舎内の気温、気湿と乳量、乳質ならびに生理諸元との関係を明らかにするための調査研究を行った。調査期間は2000年8月21日から10月1日までの暑熱期と、12月8日から12月16日までの寒冷期であった。試験牛は7頭であったが、調査開始時の分娩後日数が29日から200日と、乳期にばらつきがあり、産次も25産にまたがっていた。その結果、(1)気温、気湿から求めた体感温度と乳量との間に有意な正の相関が、乳脂肪率、乳蛋白率、乳糖率、無脂固形分率との間には負の相関が認められた。(2)体感温度と呼吸数および体温との間にも有意な正の相関が認められた。(3)血漿中コルチゾール濃度およびT_3濃度は体感温度の上昇にともない有意に増加した。暑熱時に減少するといわれている乳量ならびに血漿中T_3濃度については、予想に反し、逆に正の相関が見られたことには、調査期間が8月から12月にまたがっていたので、この間の乳期の推移にともなう乳量減少が深く関係していると考えられた。現在、暑熱反応の良い指標とされている3-メチルヒスチジンの測定結果も含め、研究成果報告書を作成中である。
黒潮表層の流量および熱流量の測定

この研究では,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせて,四国沖に黒潮を横断する測線を設け,その測線上で,CTD/XBT観測と曳航式ADCP(音響ドプラー流速分布計)観測をなるべく頻繁に行い,それらの観測によって得たデータを,平行して実施された係留流速観測などのデータとともに総合的に解析し,以下の結果を得た.1.曳航ADCP観測による表層の流速データの解析から,黒潮の表層の最強流部が沿岸に接近している場合と沖合に存在する場合の二つのモードがあること,また,この最強流部の沖合に第二の強流部が存在する場合があることなどが分かった.2.黒潮強流域に係留した上向きADCPによって,深さ300m付近で100cm/secを超える速い流れが観測されたほか,10^<-2>sec^<-1>を超える大きな鉛直流速シアが観測された.3.これらの測流結果を,測線沿いに行われたCTD/XBT観測のデータから求めた地衡流の鉛直シアと比較した結果,上記の極めて大きな鉛直シアは,この時の測線観測データから求めた地衡流シアでは十分には表現できなかったが,それ以外の場合では黒潮域でも地衡流平衡がほぼ成立していることが分かった.4.沿岸の検潮所の潮位データが,黒潮の沿岸側の水位の時間変化をよく表現していることが分かり,沿岸近くが計測できない海面高度計のデータを補えることが分かった.5.これらの現場観測データと衛星海面高度計データを総合的に利用し,黒潮の流量の時間変化を3年間にわたって10日毎に推定した.その結果,黒潮の流量変化に季節変化がはっきりとは見られないことが分かり,今後の重要な研究課題を提供した.この研究では,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせて,四国沖に黒潮を横断する測線を設け,その測線上で,CTD/XBT観測と曳航式ADCP(音響ドプラー流速分布計)観測をなるべく頻繁に行い,それらの観測によって得たデータを,平行して実施された係留流速観測などのデータとともに総合的に解析し,以下の結果を得た.1.曳航ADCP観測による表層の流速データの解析から,黒潮の表層の最強流部が沿岸に接近している場合と沖合に存在する場合の二つのモードがあること,また,この最強流部の沖合に第二の強流部が存在する場合があることなどが分かった.2.黒潮強流域に係留した上向きADCPによって,深さ300m付近で100cm/secを超える速い流れが観測されたほか,10^<-2>sec^<-1>を超える大きな鉛直流速シアが観測された.3.これらの測流結果を,測線沿いに行われたCTD/XBT観測のデータから求めた地衡流の鉛直シアと比較した結果,上記の極めて大きな鉛直シアは,この時の測線観測データから求めた地衡流シアでは十分には表現できなかったが,それ以外の場合では黒潮域でも地衡流平衡がほぼ成立していることが分かった.4.沿岸の検潮所の潮位データが,黒潮の沿岸側の水位の時間変化をよく表現していることが分かり,沿岸近くが計測できない海面高度計のデータを補えることが分かった.5.これらの現場観測データと衛星海面高度計データを総合的に利用し,黒潮の流量の時間変化を3年間にわたって10日毎に推定した.その結果,黒潮の流量変化に季節変化がはっきりとは見られないことが分かり,今後の重要な研究課題を提供した.この研究では,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせて,四国沖に黒潮を横断する測線を設け,その測線上で,CTD/XBT観測と曳航式ADCP(音響ドプラー流速分布計)観測をなるべく頻繁に行い,それらの観測によって得た黒潮に関するデータを総合的に解析することにより,従来は相対的にしか求められなかった黒潮表層の流量と熱流量の大きさおよびその時間変化を,絶対値として求めることを目指している.平成7年度には,1993年秋に始まった黒潮の集中協同観測(ASUKA)の一環として,(1)5月に白鳳丸による,側線に沿った完全なCTD断面観測とXBT断面観測,および(2)5月に白鳳丸,6月豊潮丸,7月と9月に「しらふじ丸」,11月に天鷹丸による,曳航ADCPの流速断面観測を実施した.平成7年11月に終了した2年間のASUKA観測によって,合計41回のCTD/XBT横断観測データと,12回の曳航ADCP観測データを得た.曳航ADCP観測による表層の流速データを解析した結果,(a)黒潮の表層の最強流部の位置(流速を鉛直積分し表層の単位幅当りの流量が最も大きい所を選んだ)が,沿岸に接近している場合(足摺岬から約50km)と,沖合に存在する場合(同じく約150km)の二つのモードがあること,および(b)黒潮の表層の流量(上記の単位幅当りの流量のうち東向流の部分を測線沿いに積分したもの)が,45Sv(1Svは10^6m^3/s)程度と35Sv程度の二つのレベルに分かれること,などが明らかになった.平成8年度には,これらの観測データを係留流速観測データや衛星海面高度計データなどと組み合わせて,特に黒潮の表層の流量変動の特徴を探りたい.

この研究では,海面高度計を搭載した人工衛星TOPEX/POSEIDONの軌道に合わせて,四国沖に黒潮を横断する測線を設け,その測線上で,CTD/XBT観測と曳航式ADCP(音響ドプラー流速分布計)観測をなるべく頻繁に行い,それらの観測によって得た黒潮に関するデータを,平行して実施された係留流速観測などのデータと一緒に総合的に解析することにより,従来は相対的にしか求められなかった黒潮表層の流量と熱流量の大きさおよびその時間変化を,絶対値として求めることを目指した.平成8年度には,前年度までの観測で得たデータの解析を行った.黒潮強流域に係留した上向きADCPによって,探さ300m付近で100cm/secを超える速い流れが観測されたほか10^<-2>sec^<-1>を超える大きな鉛直流速シア(深さ100mの間での100cm/secの流速変化に相当)が観測された.これらの測流結果を,測線沿いに行ったCTD/XBT観測のデータから求めた地衡流の鉛直シアと比較した.上記の極めて大きな鉛直シアは,この時の測線観測データから求めた地衡流シアでは十分には表現できなかったが,それ以外の場合では黒潮域でも地衡流平衡がほぼ成立していることが分かった.これらの現場観測データと衛星海面高度計データを総合的に利用し,黒潮の流量(1,000m深まで)の時間変化を3年間にわたって10日毎に推定した.その結果のうち特に興味深いのは,黒潮の流量変化に季節変化がはっきりとは見られないことである.黒潮の流量変化が,北太平洋の亜熱帯循環の強弱とどのように関係しているかを明らかにすることが今後の重要な課題である・これらの結果を報告書としてまとめ公表した.
内分泌撹乱様物質の作用機序に関する研究

リテラジンBはその分子の形が細長く長さが約30オングストロームと細胞膜に相当する長さではあるが膜透過性増大作用が活性の主たる作用機序ではなく、ある特定のタンパク質に相互作用し、その機能を阻害することにより、活性を示す。このためアイソトープトレーサー法によりラット脳腫瘍細胞C6より、標的分子の探索を進めた結果、膜画分に特異的結合を見いだした。更に陰イオン交換クロマトグラフィーで分画を進めたが活性画分はリポソームに再構成させないと活性を示さない。すなわち、リテラジンBの標的分子は膜蛋白質であるとの知見を得た。またマウスにおいて骨重量増大作用を有すノルゾアンタミンはヒト骨芽細胞Saos-2の突起伸長、増殖促進活性を有することを見出し、骨代謝にかかわる何らかの増殖因子に相互作用する実験事実を見出した。これについてもトリチウム標識体を合成し、骨芽細胞Saos-2の大量培養を行ってそれを材料に標的分子の探索を進めた。そのけっか核画分に特異的結合を見いだし、現在更なる精製を進めている。これまでの研究から活性型ビタミンDや17βエストラジオールとは違った作用機序を示しているので、それ以外の核内レセプターが標的であるとの可能性が強い。リテラジンBはその分子の形が細長く長さが約30オングストロームと細胞膜に相当する長さなので、ま細胞膜に何らかの作用をするかどうかを調べるために蛍光剤を封入したリポソームを調製し、リテラジンBの濃度をふって蛍光剤の流出実験を行った。この結果、細胞毒性の1万倍の濃度でコレステロールに依存しない膜透過性増大作用活性を示したが、溶血活性を示さないことからリテラジンBは膜透過性増大作用が活性の主たる作用機序ではなく、ある特定のタンパク質に相互作用し、その機能を阻害することにより、活性を示すものと結論した。このため標的タンパク質を同定するためにトリチウム標識体を合成し、アイソトープトレーサー法によりウシ脳より、標的分子の探索を進めた結果、ウシ脳のシナプトソームの膜画分に特異的結合を見出した。更に陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を行った結果SDS PAGE上で分子量約50kDa付近に蛋白質のバンドを確認した。以上の結果を総合するとリテラジンBはその強力な細胞毒性の作用機序は分子量50kDaを中心とするその前後付近に存在する膜蛋白質であるとの知見を得た。またマウスにおいて骨重量増大作用を有すゾアンタミンはヒト骨芽細胞Saos-2の突起伸長、増殖促進活性を有することを見出し、骨代謝にかかわる何らかの増殖因子に相互作用する実験事実を見出した。
メゾスコピック組織制御のための多層積層材作製プロセスの開発

メゾスコピックなスケールで組織制御して機能を最適化することが飛躍的な機能をもつ新素材開発に一つの方向性を与える。メゾ組織制御のため多くの作製方法が提案されるが、本研究ではメゾ材料に共通性の高い作製プロセスとしてジェリーロール法を中心とした多層積層材作製プロセスを開発した。すなわち異種金属箔を重ね巻き付け円筒にしたものをプレフォームとして、それを複数本束ねて塑性加工により複合線を作成する。本方法の特徴は(1)最初に素形材の段階で設計された構造を作り込むことができる、(2)ほとんど同一の加工設備の繰り返しにより大きな加工比が得られることである。すなわち本研究では多重積層メゾ材料を作製する方法を考案し、その過程で起こる塑性変形機構を解明し、併せてメゾ材料の機能を最適化するためのメゾ組織制御方法を明らかにすることを目的として次の成果を得た。(2)周期が数10nmのAg/Cu積層膜を作製し、その引張強度を測定したところ、この材料の強度は1300MPaを越えるものであり、Ag/Cuの複合材として考えたときの複合則より計算した強度よりはるかに大きく“koehler固体"に近い特性が見いだされた。(3)実用7000系Al合金における強化機構の素過程を考察し、それに基づきGPゾーンを含むメゾ組織の改良を行い900MPaを越える新しい合金を開発することができた。平成6年度は本研究課題の初年度でありジェリーロール法を開発するとともにメゾ材料の作製とその評価を行った。その研究実績は次ぎのようなものであった。(1)多重積層メゾ材料を作製するプロセスの開発を行った。すなわちジェリーロール法によるプレフオームの作製ため精密積層箔巻取機を作製しこれにより緻密で均一な異種材料の多層巻きプレフオームの作成が可能となった。高温押出、冷間加工、冷間押出は等の一連のプロセスを完成した。(2)Nb-Ti多芯超伝導複合体中の数10nmの微細な析出物によるフラクソイドのピンニングに関する実験結果の解析からピン力を最大にするメゾ組織の設計について理論計算を行い、それに従いNb-Ti/Nb人工超一常多相積層材を作製したところ非常に高い臨界電流密度が得られることが明らかとなった。(3)周期が数10nmのNi/Cu積層膜を作製し、その引張強度を測定したところ、この材料の強度は1300MPaを越えるものであり、Cu/Niの複合材として考えたときの複合則より計算した強度よりはるかに大きく"Koehler固体"に近い特性が見いだされた。(4)実用7000系AI合金における強化機構の素過程を考察し、それに基づきGPゾーンを含むメゾ組織の改良を行い900MPaを越える新しい合金を開発することができた。すなわち異種金属箔を重ね巻き付け円筒にしたものをプレフオームとして、それを複数本束ねて塑性加工により複合線を作成する。(1)Nb-Ti多芯超伝導複合体中の数10nmの微細な析出物によるフラクソイドのピンニングに関する実験結果の解析からピン力を最大にするメゾ組織の設計について理論計算を行い、それに従いNb-Ti/Nb人口超-常多用積層材を作製したところ非常に高い臨界電流密度が得られた。またAl/Nb_3Al/NbやNb/Cuおよび酸化物超伝導体を含むAg/Bi2223高磁場用材料を開発した。

(2)周期が数10nmのAg/Cu積層膜を作製し、その引張強度を測定したところ、この材料の強度は1300MPaを越えるものであり、Ag/Cuの複合材として考えたときの複合則より計算した強度よりはるかに大きく"Koehler固体"に近い特性が見いだされた。(3)実用7000系Alを合金における強化機構の素過程を考察し、それに基づきGPゾーンを含むメゾ組織の改良を行い900MPaを越える新しい合金を開発することができた。
単球のインスリンシグナルの分子機構の解明と新規動脈硬化マーカーの探索

動脈硬化血管では血管内皮細胞のインスリン(Ins)抵抗性と、それに伴うフォークヘッド転写因子(FoxO)の活性化が起きることを報告した。土屋らは、マクロファージ特異的FoxO欠損マウスでは動脈硬化が促進することを報告した。即ち、動脈硬化の発症・進展においてFoxOは保護的に作用することが考えられた。本研究では、2型糖尿病患者の単球のInsシグナル/FoxO活性を定量評価し、マクロファージ特異的FoxO欠損マウスの血清蛋白の網羅的比較解析により、マクロファージのFoxOに調節される分泌蛋白を同定する。両方法より得た結果でヒトの血液検体によるFoxOの動脈硬化マーカーとしての臨床応用を目的とする。
制御性サイトカイン産生B細胞におけるカルシウム流入の生理的意義の解明

B細胞は抗体産生により液性免疫の中心的な役割を担っているが、近年、抗炎症性サイトカインであるIL-10を分泌することにより炎症を抑制する機能を有することも明らかになった。B細胞受容体が抗原により刺激されるとさまざまなシグナル伝達経路が活性化されるが、なかでも、Ca^<2+>濃度の上昇がB細胞の機能に重要であると考えられていたが、確たる証拠はなかった。そこで、B細胞におけるカルシウム流入の生理的意義を明らかにするために、B細胞特異的にSTIM1およびSTIM2を欠損したマウスを樹立した。STIM1、STIM2は小胞体カルシウムセンサーであり、カルシウム流入に必須の分子である。STIM1/2ダブルノックアウトマウスはB細胞の分化や抗体産生をはじめとする免疫応答は正常にみられたが、B細胞の分泌するIL-10が著しく減少していることが判明した。STIMの欠損により転写因子NFATの活性化が障害されることがIL-10の産生不全の原因と考えられた。B細胞におけるカルシウム流入の抑制機能への関与をin vivoで検証するために、多発性硬化症の実験モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発すると、STIM1/2ノックアウトマウスにおいて炎症反応の増悪化がみられた。さらに、人為的にIL-10の遺伝子を導入したSTIMI/2欠損B細胞でその抑制能の回復が認められ、STIM欠損によるIL-10産生不全に起因することが示唆された。実際、EAEマウス由来の対照B細胞は抗原によるin vitroでの刺激に対してIL-10を産生したが、STIM欠損B細胞ではこれが顕著に減少しており、抗原に特異的なIL-10産生がSTIMに依存していることを示していた。したがって、STIMの誘導するCa^<2+>流入は自己免疫性の炎症反応に対するB細胞の制御機能に重要な役割をはたしているものと考えられる。細胞内カルシウムの上昇が様々な生理的現象に関与することが知られている。B細胞における持続的なカルシウムシグナルは、B細胞機能における重要なイベントとして考えられていたが、その詳細は不明であった。持続的カルシウムシグナルは細胞内カルシウムストアである小胞体からのカルシウム放出が引き金となって引き起こされる細胞外からのカルシウム流入、つまり、ストア作動性カルシウム流入が主要なソースとなるが、小胞体内腔のカルシウム濃度の減少を感知して、細胞膜上のカルシウムチャネルを活性化する分子がSTIM1およびSTIM2である。当該年度は、STIMIおよびSTIM2のB細胞特異的ノックアウトマウスを用いて、以下のことを明らかにした。1)STIM1,STIM2はB細胞抗原レセプター刺激によるストア作動性カルシウム流入に必須である。2)STIMはin vivo B細胞分化、抗体産生免疫応答に必須でない。3)STIMはB細胞の抗炎症性サイトカインIL-10の産生に必須である。4)STIM1/2ダブルノックアウトマウスはB細胞のIL-10産生不全に起因する実験的自己免疫性脳脊髄炎の重症化がみられる。以上のことから、STIMはB細胞の自己免疫性炎症に対する抑制的機能に必須の分子であることが示唆される。本研究成果が自己免疫疾患の理解、さらには免疫系をコントロールするための新規薬剤の創製にもつながるものと期待して研究を進める。
分子シャペロンJemlpによる核膜融合の制御機構

DnaJファミリーのタンパク質はhsp70のパートナータンパク質として,hsp70の活性の制御を行っている.申請者らは酵母小胞体膜の内腔側に存在するDnaJファミリーのタンパク質としてJemlpを同定し,これが小胞体内腔のhsp70であるBiPのパートナータンパク質として,酵母接合時の核膜融合の過程に必須な役割をはたしていることを明らかにしてきた.Jemlpは表在性膜タンパク質であり,膜内在性タンパク質と相互作用することによって核膜融合を制御している可能性が考えられた.そこで昨年度に,Jemlpと相互作用するタンパク質を酵母two hybrid法を用いて検索し,新奇の核膜タンパク質をコードするNEP98遺伝子を分離した.NEP98遺伝子産物NEp98pは,膜貫通領域を1つ持つ,98kDaの核膜の膜内在性タンパク質である.Nep98pは,N末端がサイトゾル側に突出し,C末端部のJemlpとの相互作用領域が小胞体内腔側を向いた膜トポロジーを示す.また,酵母細胞内でNep98pがJemlpと相互作用していることが架橋実験によって示された.NEP98遺伝子の破壊を行ったところ酵母は致死となり,Nep98pは酵母の増殖に必須であることが明らかとなった.そこで,nep98温度感受性変異株の作製を行なったところ,得られた変異株は核の分裂に異常を示すことが明らかとなった.以上の結果はNep98pが核の融合・分裂に関与している可能性を示唆している.DnaJファミリーのタンパク質はhsp70のパートナータンパク質として,hsp70の活性の制御を行なっている.酵母小胞体膜に存在するDnaJファミリーのタンパク質Jemlpは,酵母接合時の核膜融合に必須な役割をはたしている.JemlpのC末端領域には,DnaJファミリー間で高度に保存され,hsp70との相互作用に必須なJドメインが存在する.JドメインはJemlpの機能に必須であること,小胞体のhsp70であるBiPが核膜融合に必須であることから,JemlpがBiPのパートナーとして機能していることが示唆されている.JemlpとBiPとの相互作用をin vitroで解析するため,JemlpのJドメインとグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質(GST-J)を遺伝子レベルで構築した.GST-Jは大腸菌を用いて発現し,大腸菌抽出液の可溶性画分からカラムクロマトグフフィーによって精製した,精製したGST-JはBiPのATPase活性を促進し,ATP存在下でBiPと複合体を形成した.GST-Jのこのような活性は,Jドメインに変異を導入すると消失した.以上の結果から,JemlpがJドメインを介してBiPと相互作用することを,直接示すことができた.DnaJファミリーのタンパク質の機能として,基質となるタンパク質と相互作用し,hsp70に引き渡すというモデルが提示されている.このことからJemlpは核膜の融合時に,分子シャペロンとして膜融合装置と相互作用していることが予想される.そこでJemlpと相互作用するタンパク質を酵母two hybrid法を用いて検索した.スクリーニングの結果,膜タンパク質をコードするORFがポジティブクローンとして得られた.現在,これが酵母内で実際にJemlpと相互作用しているか検討している.DnaJファミリーのタンパク質はhsp70のパートナータンパク質として,hsp70の活性の制御を行っている.申請者らは酵母小胞体膜の内腔側に存在するDnaJファミリーのタンパク質としてJemlpを同定し,これが小胞体内腔のhsp70であるBiPのパートナータンパク質として,酵母接合時の核膜融合の過程に必須な役割をはたしていることを明らかにしてきた.Jemlpは表在性膜タンパク質であり,膜内在性タンパク質と相互作用することによって核膜融合を制御している可能性が考えられた.そこで昨年度に,Jemlpと相互作用するタンパク質を酵母two hybrid法を用いて検索し,新奇の核膜タンパク質をコードするNEP98遺伝子を分離した.NEP98遺伝子産物NEp98pは,膜貫通領域を1つ持つ,98kDaの核膜の膜内在性タンパク質である.Nep98pは,N末端がサイトゾル側に突出し,C末端部のJemlpとの相互作用領域が小胞体内腔側を向いた膜トポロジーを示す.また,酵母細胞内でNep98pがJemlpと相互作用していることが架橋実験によって示された.NEP98遺伝子の破壊を行ったところ酵母は致死となり,Nep98pは酵母の増殖に必須であることが明らかとなった.そこで,nep98温度感受性変異株の作製を行なったところ,得られた変異株は核の分裂に異常を示すことが明らかとなった.以上の結果はNep98pが核の融合・分裂に関与している可能性を示唆している.
グラフ同型性判定問題の計算量の解析および効率的なアルゴリズムの提案

クリークサイズを定数に制限した弦グラフに対しては,グラフ同型性判定問題を拡張した制約付きグラフ同型性判定問題が多項式時間で解けることを示した.また,同様にグラフ同型性判定問題を拡張したPrefix Set of GIに対して多項式時間アルゴリズムを設計し,既知のアルゴリズムの時間量を改善した.グラフ同型性判定問題の応用として,静的文字画像から筆記運動を抽出するためのアルゴリズムの設計を行った.このアルゴリズムは,部分グラフ同型性判定を利用してダブルトレース等の構造を解析することで,組合せ的爆発を起こさずに筆順を復元できる.さらに,確率的タブーサーチを用いたより実用的なアルゴリズムの設計も行った.クリークサイズを定数に制限した弦グラフに対しては,グラフ同型性判定問題を拡張した制約付きグラフ同型性判定問題が多項式時間で解けることを示した.また,同様にグラフ同型性判定問題を拡張したPrefix Set of GIに対して多項式時間アルゴリズムを設計し,既知のアルゴリズムの時間量を改善した.グラフ同型性判定問題の応用として,静的文字画像から筆記運動を抽出するためのアルゴリズムの設計を行った.このアルゴリズムは,部分グラフ同型性判定を利用してダブルトレース等の構造を解析することで,組合せ的爆発を起こさずに筆順を復元できる.さらに,確率的タブーサーチを用いたより実用的なアルゴリズムの設計も行った.本研究では,グラフ同型性判定問題(GI)やグラフ自己同型性判定問題(GA)といったグラフの同型性を問う問題に対して,それらの部分解を計算する問題の計算量の解析,制限されたグラフに対する効率的なアルゴリズムの設計,および他の問題への応用を与えることを目的とする.本年度は,PrefixGIやPrefixGAを拡張した問題に対して,それらの計算量およびそれらの部分解を求める問題の計算量の解析を試みた.そのいくつかの問題について,NP-完全性,GI-完全性,GA-完全性が得られた.また,partial k-treesと呼ばれるグラフクラスについては,PrefixGIを解くためのアルゴリズムの計算量を改善した.GIやGAに関連した問題は他にも数多くあるため,次年度はそれらの部分問題を計算する問題の計算量の解明を目指す.他の問題への、GIの応用として,手書き文字画像データから筆順情報を復元するためのアルゴリズムの設計を試みた.本年度は,入力を制限した部分グラフ同型性判定問題を応用することで,多画文字の筆順を復元するためのアルゴリズムを設計した.このアルゴリズムは,ダブル・トレースを含むような複雑な文字画像にも対応し,さらにこれまでに知られていたものよりも高速である.次年度は,ダブル・トレースどうしの交叉などより複雑な構造を持つ文字画像に拡張する予定である.グラフ同型性判定問題は,2つのグラフの間の構造が等しいか否かを判定する問題である.グラフに関する問題としては基本的なものであることから,この問題が効率的に解けるか否かは応用上極めて重要である.またこの問題は他の判定問題にない特殊な性質を持っており,理論上も非常に興味深い問題である.本研究では,グラフ同型性判定問題およびグラフ自己同型性判定問題に対する応募者のこれまでの研究結果の拡張および他の関連する問題への応用を与えることを目的とした.制約付きグラフ同型性判定問題は,グラフ同型性判定問題を拡張した問題であり,NP完全であることが知られている.本研究では,入力グラフのクラスをk-treeに制限した場合の制約付きグラフ同型性判定問題が多項式時間で解けることを示した.また,同じくグラフ同型性判定問題を拡張した問題であるPrefixGIに対しても,入力グラフのクラスをk-treeに制限した場合にこの問題が多項式時間で解けることを示した.このアルゴリズムの計算量は,k-treeに対するPrefixGIを解くための既知のアルゴリズムの計算量を改善している.グラフ同型性判定問題の応用として,前年度に引き続き手書き文字画像から筆記運動を抽出するためのアルゴリズムの検討を行った.ダブル・トレースの交差を含むような複雑な文字画像に対して,その筆順を高速に復元するアルゴリズムを設計し,所望の結果を得ることができた.
角膜創傷治癒および発生過程における細胞性癌遺伝子の発現

同様に、胎生12.518.5日、生後139日のマウス角膜を用い、c-Fos蛋白、c-Jun蛋白を、免疫組織化学法で検討した。c-Fos蛋白は、胎生14.5生後10日、c-Jun蛋白は、胎生14.5生後3日の角膜上皮に免疫反応陽性の細胞を認めた。以上の結果から、角膜の器官形成過程において、これら細胞性癌遺伝子が、何らかの関与をしていると考えられた。2.c-fos gene knockout mouseの角膜を、光学顕微鏡、透過電子顕微鏡で観察した。c-fos(-/-)のマウス角膜は、c-fos(-/+)(+/+)のマウス角膜にくらべ、低形成であった。特に、角膜上皮のデスモゾーム数は、有意に減少していた。このことから、c-fos遺伝子が、角膜上皮の分化に何らかの影響を与えていると考えられた。角膜上皮欠損、アルカリ外傷、穿孔等の角膜障害が周囲の上皮および実質細胞にどのようなシグナルを送り各種細胞性癌遺伝子が発現しているかを明らかにするため、ラット角膜を用い、創作製後のc-Fos,c-Jun蛋白の発現を、免疫組織化学法を用いて検討した結果、創作製後12時間後に上記蛋白の発現が創周辺部角膜上皮および実質のkeratocyteに一過性に認められた。このことから、上皮遊走がおこる前の角膜においても上皮遊走に備えた、何らかの転写活性の上昇が起こっていることが示唆された。また、マウスを用い、胎生期および発育過程における上記蛋白の発現についても免疫組織化学法を用いて検討した。その結果、胎生期から生後10日目までの角膜上皮に、c-Fos蛋白の発現を認め、胎生期から生後5日目までの角膜上皮に、c-Jun蛋白の発現を認めた。細胞分裂が活発な重層化していない角膜上皮に上記蛋白の発現が認められたことから、上記蛋白が角膜の発生、分化に何らかの影響をあなえていることが示唆された。糖尿病では、角膜創傷治癒が遅延することがしられでいるが、インスリン非衣存性糖尿病ラットを用い、角膜上皮欠損作成後のc-Fos,c-Jun蛋白の発現を、免疫組織化学法を用いて検討した結果、創作製後12時間後に上記蛋白の発現が創周辺部角膜上皮および実質のkeratocyteに一過性に認められ、コントロール群と差が見られなかった。このことから、糖尿病の角膜においても正常角膜と同様に、創傷治癒にそなえた何らかの転写活性の上昇が起こっていることが示唆された。現在、インスリン依存性ラットについても検討している。
制御性T細胞の系列安定性を規定する細胞内代謝メカニズムの解明

転写因子Foxp3を発現した制御性T細胞(Treg)は広範な免疫抑制機能を示し、自己免疫寛容と免疫恒常性の維持に必須の役割を担っている。これまでにTregへの運命決定はFoxp3発現の有無ではなく、Foxp3遺伝子のTreg-specific demethylation region[TSDR]と呼ばれる発現制御領域のDNA脱メチル化に基づく転写制御により補完されることがわかってきたが、現時点ではこのエピゲノム変化の分子基盤はほとんど明らかにされていない。本研究はTCR刺激依存的な細胞内代謝リプログラミングがTregエピゲノム形成に及ぼす重要性について検証する。
細胞周期チェックポイントで機能する薬物代謝酵素発現制御因子とその制御機構の解明

サイクリン依存性キナーゼ(cdk)阻害薬roscovitineが薬物代謝酵素(UGT1A1など)の発現を亢進することを認め、PXRに焦点を当て薬物代謝酵素発現調節機序を解析した。リガンド結合部位に変異を導入したPXRを用いて解析したところ、roscovitineはPXRの350番目セリンをリン酸化するCDK2の作用を抑制することによりUGT1A1、CYP3A4遺伝子転写を亢進させることが示された。S350D PXRは野生型と同様に核内移行するが、roscovitine刺激後も活性の低下したアセチル化体であることを初めて明らかにし、CDK2によるS350のリン酸化はPXRの核内での活性化シグナル伝達を阻害していることが推察された。HepG2細胞、SW480細胞などのがん細胞を用いて、細胞分化・増殖時の細胞周期制御メカニズムの解析を進める過程で、サイクリン依存性キナーゼcdkの種々の阻害剤の影響を解析することにより、cdk2阻害剤roscovitineが強力な薬物代謝酵素誘導作用を有していることを見いだした。Cdk2 siRNAをトランスフェクトし、ノックダウンした肝がん細胞HepG2細胞や大腸がん細胞SW480細胞ではCYP2B6,UGT1A1などの薬物代謝酵素発現量が増大し、S期にcdk2がCYP2B6、UGT1A1などの薬物代謝酵素の転写を負に制御していること、細胞周期チェックポイントG2/M期にCYP2B6,UGT1A1などの薬物代謝酵素の発現が始まり、G1期まで薬物代謝酵素の発現が認められることを明らかにすることが出来た。CYP2B6やUGT1A1遺伝子の転写調節で中心的役割を演じているのは核内受容体CARであるが、CARの発現亢進はG1期のcdk4の活性化後であり、CARがこれら薬物代謝酵素の転写を調節しているとすれば標的遺伝子の発現が先に起こり時間のずれの説明がつかない。本研究では、G2/M期にCYP2B6、UGT1A1などの薬物代謝酵素の発現を調節する転写因子が別にあると想定し、M期初期、終期に作用する種々の細胞周期調節因子の発現プラスミドDNAを作製し、核内受容体の発現に及ぼす作用を解析し、薬物代謝酵素発現制御機構の解明を進めている。HepG2細胞などのがん細胞を用いて、細胞分化・増殖時の細胞周期制御メカニズムの解析過程で、サイクリン依存性キナーゼ(cdk)阻害薬roscovitineが薬物代謝酵素(UGTIAIなど)の発現を亢進することを認め、cdkによる薬物代謝酵素発現制御機構の解明を目指した。CDKI、2、5を阻害するroscovitineの標的を同定するために、CDKI、CDK5をノックダウンしたところ酵素発現レベルに有意な変動は認められなかったが、CDK2をノックダウンするとUGT1A1の発現が亢進したことから、CDK2がこれら酵素の発現を負に制御していることが示された。さらに、cdkが多くの薬物代謝酵素遺伝子転写を調節する核内受容体CARあるいはPXRの発現を制御している可能性について解析を進めた。Roscovitineを作用させてもCARの核内レベルに有意な影響は認められなかったが、PXRの核内レベルが増大したことから、PXRに焦点を当て、UGT1A1発現調節機序を解析した。リガンド結合部位に変異を導入したPXRを用いてUGT1A1遺伝子発現に及ぼすroscovitineの作用を解析したところ、T350A PXRによりUGT1A1 mRNAの発現が亢進し、S350D PXRによりUGT1A1の発現が抑制され、CDK2によるリン酸化が抑制されたことから、roscovitineはPXRの350番目セリンをリン酸化するCDK2の作用を抑制することによりUGT1A1遺伝子転写を亢進させること、言い換えると、CDK2はPXRの活性化を負に制御していることが示された。S350DPXRはrosukovitineを作用させると野生型と同様に核内移行するが、roscovitineで活性化後も活性の低下したアセチル化された状態にあることを初めて明らかにした。また、S350DPXRはheterodimerを形成するRXRとの結合能が低下しており、コファクターSRC2過剰発現により部分的に活性が回復することから、CDK2によるS350のリン酸化はPXRの核内での活性化シグナル伝達を阻害していることが推察された。これらの知見をもとに現在、細胞周期等シグナル伝達系と密接に結び付いた、PXRの翻訳後修飾を介した活性制御機序の解析を進めている。

HepG2細胞などのがん細胞を用いて、細胞分化・増殖時の細胞周期制御メカニズムの解析過程で、サイクリン依存性キナーゼ(cdk)阻害薬roscovitineが薬物代謝酵素(UGT1A1など)の発現を亢進することを認め、細胞周期等シグナル伝達系と結び付いた薬物代謝酵素発現制御機構の解明を目指した。Roscovitineの標的を同定するために、CDK2をノックダウンするとUGT1A1、CYP3A4の発現が亢進したことから、CDK2がこれら酵素の発現を負に制御していることが示された。Roscovitineを作用させてもCARの核内レベルに有意な影響は認められなかったが、PXRの核内レベルが増大したことから、PXRに焦点を当て、薬物代謝酵素発現調節機序を解析した。リガンド結合部位に変異を導入したPXRを用いて解析したところT290D PXRによりUGT1A1、CYP3A4の発現が抑制されたが、PXRの核内移行の抑制によることが示された。またS350D PXRによりUGT1A1、CYP3A4の発現が抑制され、CDK2によるPXRのリン酸化が抑制されたことから、roscovitineはPXRの350番目セリンをリン酸化するCDK2の作用を抑制することによりUGT1A1、CYP3A4遺伝子転写を亢進させること、言い換えると、CDK2はPXRの活性化を負に制御していることが示された。S350D PXRは野生型と同様に核内移行するが、roscovitine刺激後も活性の低下したアセチル化体であることを初めて明らかにした。また、S350D PXRはheterodimerを形成するRXRとの結合能が低下しており、コファクターSRC2過剰発現により部分的に活性が回復することから、CDK2によるS350のリン酸化はPXRの核内での活性化シグナル伝達を阻害していることが推察された。種々の変異PXR発現ベクターやコファクター発現ベクターの調製が順調に進み、これらをトランスフェクトした細胞を用いて解析できたことが成果に結びついた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では細胞周期制御と密接に結び付いたシグナルにより活性化されたCDK2がPXRをリン酸化することによって活性が抑制され酵素発現が制御されていることを明らかにした。本研究の過程で、リン酸化だけでなくPXRが翻訳後修飾を受け活性が制御されていることを認めており、翻訳後修飾を介したダイナッミクナなPXR活性制御機構の解明が期待できる。
ＲＮＡ干渉法による血液内耳関門の薬物透過性の調節

RNA干渉法によって血液-内耳関門の構成蛋白質の転写を抑制し、マウスの血液-内耳関門バリア機構を調整する。血液-内耳関門バリア機構を調整したマウスに対し、経静脈的に薬剤を全身投与し、内耳に薬剤が到達していることを証明する。巨大音響外傷を与え音響外傷モデル作成し、血液-内耳関門の主要蛋白であるclaudin-5転写の抑制RNA干渉剤を経静脈的に投与する。その後、内耳障害細胞再生を目的に神経保護剤として脳由来神経栄養因子(BDNF)を経静脈的に投与する。そしてコントロールマウスとを形態学的、電気生理学的比較を行った。RNA干渉法によって血液-内耳関門の構成蛋白質の転写を抑制し、マウスの血液-内耳関門バリア機構を分子量選択的、一時的、可逆的に調整する。C57BL/6マウスを使用して、巨大音響外傷を与え音響外傷モデル作成する。その後、血液-内耳関門の主要蛋白であるclaudin-5転写の抑制RNA干渉剤を経静脈的に投与する。RNA干渉法はその48時間後に内耳障害細胞再生を目的に神経保護剤として脳由来神経栄養因子Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)を経静脈的に投与する。そしてclaudin-5転写抑制する干渉RNAの代わりに生食を経静脈的投与後、BDNFを経静脈的に投与したコントロールマウスとを内耳免疫蛍光染色、聴性脳幹反応を用いて、形態学的、電気生理学的評価を行っている。さらにclaudin-5転写の抑制RNA干渉の効果をより明確な形でとらえる目的で、音響外傷の治療効果ではなく、claudin-5転写抑制する干渉RNAとBDNFの投与を音響外傷前に行い、予防効果の検討を行っている。分子量の小さい薬剤が受動的に血液-脳関門を通過できるとされているため、分子量の違う神経保護薬剤を使用し検討している。そしてclaudin-5転写抑制する干渉RNAの代わりに生食を経静脈的投与後、BDNFを経静脈的に投与したコントロールマウスとを内耳免疫蛍光染色、聴性脳幹反応を用いて、形態学的、電気生理学的評価を行った。分子量の小さい薬剤が受動的に血液-脳関門を通過できるとされているため、分子量の違う神経保護薬剤を使用し検討した。

川崎病の治療ではアスピリンが使用されるが、日米ではアスピリン使用量が異なる。アスピリンの副作用で起こる感音難聴発生頻度がアスピリン使用量の少ない日本ではアメリカに比べて低いことを示唆した。(Sensorineural Hearing Loss Associated with Kawasaki Disease. Otolaryngology online journal.2014;4:119-125)耳鼻咽喉科一側聴神経腫瘍で手術を行った患者で、術前の温度刺激検査で反応のある患者では術前に比べて術後1週で有意に機能低下し、3カ月で回復した。また50、60歳代では術後6、9カ月まで機能低下が続き、高齢であるほど、術後平衡機能障害が強いことを明らかにした。(第114回日本耳鼻咽喉科学会)川崎病の治療ではアスピリンが使用されるが、日米ではアスピリン使用量が異なる。(Sensorineural Hearing Loss Associated with Kawasaki Disease. Otolaryngology onlinejournal. in press)RNA干渉法によって血液-内耳関門バリア機構を調整したマウスに対し、経静脈的に薬剤を全身投与し、内耳に薬剤が到達していること、薬剤が内耳で作用していることを証明する目的に研究をすすめている。巨大音響外傷を与え音響外傷モデル作成して、血液-内耳関門の主要蛋白であるclaudin-5転写の抑制RNA干渉剤を経静脈的に投与し、血液-内耳関門の薬剤通過を可能にする。RNA干渉法後内耳障害細胞再生を目的に神経保護剤として脳由来神経栄養因子BDNFを経静脈的に投与した。そして内耳免疫蛍光染色、聴性脳幹反応を用いて、形態学的、電気生理学的評価を行っている。RNA干渉法によって血液-内耳関門の構成蛋白質の転写を抑制し、血液-内耳関門バリア機構を調整する。血液-内耳関門バリア機構を調整したマウスに対し、経静脈的に薬剤を全身投与し、内耳に薬剤が到達していること、薬剤が内耳で作用していることを証明する目的に研究をすすめている。C57BL/6マウスを使用して、巨大音響外傷を与え音響外傷モデル作成している。その後、血液-内耳関門の主要蛋白であるclaudin-5転写の抑制RNA干渉剤を経静脈的に投与し、血液-内耳関門の薬剤通過を可能にする。RNA干渉法後内耳障害細胞再生を目的に神経保護剤として脳由来神経栄養因子Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)を経静脈的に投与した。そして内耳免疫蛍光染色、聴性脳幹反応を用いて、形態学的、電気生理学的評価を行っているが、形態学的にも電気生理学的にもBDNFの神経保護効果はみられていない。さらにclaudin-5転写の抑制
非分散型溶媒抽出法による廃蛍光管からの希土類金属の回収

蛍光体廃棄物の塩酸浸出液からイットリウムとユーロピウムを、それぞれ、分離回収するための基礎研究を行った。具体的には、従来から希土類金属の相互分離に用いられている溶媒抽出法の問題点である、多量の有機溶媒が必要であることを克服するために、中空糸モジュールを利用した含浸液膜法の適用を検討した。抽出試薬には、希土類の分離に最も一般的に使用される2-ethylhexyl phosphonic acid mono-2-ethylhexyl ester(EHPNA)を使用した。供給液中のEu(III)とY(III)の初期濃度は、共に0.001kmol m^<-3>とした。供給液の塩酸濃度、逆抽出液の塩酸濃度、含浸時のEHPNA濃度を体系的に変化させることにより、相互分離のための最適条件として、供給液塩酸濃度0.1kmol m^<-3>、逆抽出液塩酸濃度4kmol m^<-3>、EHPNA濃度0.050.1kmol m^<-3>を求めた。このとき、Yの初期流束は3.2×10^<-6>mol m^<-2> s^<-1>、分離係数(初期透過係数の比)は27程度であった。また、希土類金属イオンの透過機構も考察し、4kmol m^<-3>の塩酸を逆抽出剤として用いたときは、供給液のpHが低く、EHPNA濃度も低いときは、供給液側界面での反応が律速となり、pHおよびEHPNA濃度が高くなると液膜内での拡散が律速になることがわかった。さらに、液膜の耐久性も調べ、5回程度の繰り返し操作によって、含浸した抽出試薬が剥離され、透過速度が著しく低下することもわかった。本研究で得られた成果より、今後、各種の金属イオンの分離精製プロセスを提案していくにあたって、中空糸モジュールを利用した含浸液膜法は考慮するべき重要なオプションであることが認識された。
過活動膀胱の発生機序に関する研究-高脂血症と膀胱虚血の影響について

【目的】過活動膀胱(OAB)の発症には膀胱虚血の関与が示唆されている。Watanabe Heritable Hyper-Lipidemirabbit(WHHLウサギ)の下部尿路機能について検討した。【対象と方法】6月齢、12月齢および24月齢のWHHLウサギ(WHHL群)とそれぞれ同年齢の日本白色家兎(対照群)を用いた。FVC、麻酔下膀胱機能検査、摘出膀胱平滑筋条片を用いての機能実験、内腸骨動脈と膀胱の組織学的検査ならびに膀胱の神経性および非神経性AChとATPの放出量を測定した。【結果】各月齢のウサギにおいて、体重、腎機能、一日尿量、血液パラメーターのうちWHHL群で高コレステロール血症を認める以外差はなかった。WHHL群では12月齢のウサギより排尿回数の有意の増加と1回排尿量の有意の減少が見られ、膀胱機能検査でも、12月齢よりWHHL群で排尿間隔の短縮と1回排尿量の減少、およびnon-voiding contractionが認められた。膀胱平滑筋条片の機能実験では、6月齢および12月齢のWHHL群でcarbacholおよびEFS収縮による反応性の増強が、24月齢では逆に減弱が観察された。24月齢のWHHLウサギでは内腸骨動脈の内腔の狭小化が見られた。また、WHHT,ウサギ膀胱は加齢により膀胱上皮が薄く、平滑筋成分の減少と間質の増加が観察された。S-100蛋白陽性神経は主に平滑筋層内に見られ、6月齢のWHHL群では対照群に比較してすでに減少が観察された。またCGRP陽性神経は主に上皮下に認められ、12月齢のWHHL群では増加傾向が、24月齢では有意の増加が観察された。神経性AchおよびATP放出量はWHHLウサギでは有意に減少した、一方、膀胱伸展に伴う非神経性AchとATP放出量は対照群に比して有意に増加し、その増加率はAchに比較してATPで有意に高かった。【結論】WHHLウサギは6月齢から運動神経の部分的除神経とそれに伴う膀胱平滑筋の除神経後過敏反応が見られることが明らかとなった。また、12月齢以降には知覚C線維の活性化も示唆されるようになり、これが排尿筋過活動に関与している可能性が推察された。今回の結果は、虚血や加齢などに伴うOABの発症過程の一端を明らかにしたものと考えられる。我々はこれまでWatanabe Heritable Hyper-Lipidemic rabbit (WHHLウサギ)の下部尿路機能について検討し、24月齢のWHHLウサギでは内腸骨動脈の内腔の狭小化が見られ膀胱虚血の状態にあること、またこのウサギは排尿筋過活動状態にあり、OABの発症メカニズムの検討に有用である可能性を指摘した。本年度の検討ではWHHLウサギにおける排尿筋過活動の発症過程を観察するとともに、神経線維の免疫組織学的検討を行った【対象と方法】

6月齢(3羽)、12月齢(3羽)および24月齢のWHHLウサギ5羽(WHHL群)とそれぞれ同年齢の日本白色家兎6羽(対照群)を用いた。FVC、麻酔下膀胱機能検査、摘出膀胱平滑筋条片を用いての機能実験を行った。また、神経染色として、S-100蛋白(運動神経)ならびにCGRP陽性神経(知覚C線維)の免疫組織学的検討をおこなった【結果】各月齢のウサギにおいて、体重、腎機能、一日尿量、血液パラメーターのうちWHHL群で高コレステロール血症を認める以外両群間で差はなかった。WHHL群は対照群に比して12月齢のウサギより排尿回数の有意の増加と1回排尿量の有意の減少が見られ、膀胱機能検査でも、12月齢よりWHHL群で排尿間隔の短縮と1回排尿量の減少、およびpremicturition contractionが認められた。膀胱平滑筋条片の機能実験では、6月齢および12月齢のWHHL群でcarbacholおよび経壁電気刺激収縮による反応性の増強が、24月齢では逆に減弱が観察された。S-100蛋白陽性神経は主に平滑筋層内に見られ、6月齢のWHHL群では対照群に比較してすでに減少が観察された。またCGRP陽性神経は主に上皮下に認められ、12月齢のWHHL群では増加傾向が、24月齢では有意の増加が観察された。【結論】今回の検討で、WHHLウサギは6月齢から運動神経の部分的除神経とそれに伴う膀胱平滑筋の除神経後過敏反応が見られることが明らかとなった。また、12月齢以降には知覚C線維の活性化も示唆されるようになり、これが排尿筋過活動に関与している可能性が推察された。今回の結果は、虚血や加齢などに伴うOABの発症過程の一端を明らかにしたものと考えられる。【目的】過活動膀胱(OAB)の発症には膀胱虚血の関与が示唆されている。我々はこれまでWatanabe Heritable Hyper-Lipidemic rabbit(WHHLウサギ)の下部尿路機能について検討し、24月齢のWHHLウサギでは内腸骨動脈の内腔の狭小化が見られ膀胱虚血の状態にあること、またこのウサギは排尿筋過活動状態にあり、OABの発症メカニズムの検討に有用である可能性を指摘した。本年度の検討ではWHHLウサギにおける排尿筋過活動の発症機序を明白にすることを明らかにするために、膀胱からの神経性および非神経性アセチルコリン(ACh)とATP放出量の変化を観察した。【対象と方法】16月-20月齢のWHHLウサギ(WHHL群)と同年齢の日本白色家兎(対照群)を用いた。ペントバルビタール麻酔後に賭殺し、膀胱を摘出して、平滑筋条片を作成して、臓器透析用プローブを刺入した後に、筋浴槽内に懸垂固定した。プローブ内をRinger液にて2μ1/minにて還流しつつ、張力変化を等尺性トランスデューサーを用いて記録した。経壁電気刺激時(神経性)および条片をテトロドトキシン存在下にて40mNで伸展した際(非神経性)の透析液をマイクロダイアリシス法にて回収し、AChはHPLC-ECD法にて、ATPはルシフェリン・ルシフェラーゼ法にて濃度を測定した。【結果】神経性AChおよびATP放出量はWHHL群および対照群ともに周波数依存性に増加した。各周波数においてACh、ATPともにWHHL群では対照群に比較して有意の減少が認められた。非神経性AChおよびATP放出量は伸展張力依存性に両群で増加した。その増加はWHHL群で対照群に比較して有意に高値であった。また、増加率はAChに比較してATPで有意に高かった。
核内長鎖ノンコーディングRNAによる転写サイクル制御

報告者は、ウイルス感染や病原性バクテリア感染に応答して発現増加する核内長鎖ノンコーディングRNAを同定し、病原体感染時のホスト細胞の応答(細胞レベルの自然免疫応答)、特に転写サイクルの制御おける核内長鎖ノンコーディングRNAの機能を分子レベルで解明することを目指した。今回、報告者は細胞内寄生細菌であるサルモネラに感染させたHeLa細胞から得たtotal RNAを次世代シーケンサー(RNA-seq)解析することで多数の長鎖ノンコーディングRNAが発現増加することを確認した。このうち、以前に申請者が報告していた短寿命の核内長鎖ノンコーディングRNAであるnuclear short-lived noncoding transcripts (nSLiTs)に焦点を当てて、解析を進めた。さらに、nSLiTsのうち、特にエンハンサー領域から発現する転写産物に注目したところ、サルモネラ感染で発現増加する145種類のnSLiTsのうち26種類がエンハンサー領域から発現していることが判明した。26種類のなかからnSLiT16217を選択してノックアウトしたところ、nSLiT16217ノックアウトHeLa細胞はサルモネラ高感受性となった。さらに、nSLiT16217に隣接する遺伝子である免疫関連遺伝子はサルモネラ感染で転写活性したいたが、nSLiT16217ノックアウト細胞ではサルモネラに感染しても隣接遺伝子の転写活性化は起きなくなっていた。この結果は、サルモネラ感染によるnSLiT16217隣接遺伝子の転写制御にnSLiT16217が重要な役割を持つことを示唆している。以上の研究により、病原性微生物の感染をモデル系として、核内長鎖ノンコーディングRNAがエンハンサー機能の制御において重要な役割を持つという貴重なデータを得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。転写サイクルの制御を理解するため、これまでに多種多様なタンパク質性因子に着目して多くの研究がなされてきた。これに対し、最近、タンパク質をコードしない機能性RNA分子(ノンコーディングRNAと総称される)が転写制御や転写と共役した様々な遺伝子発現制御において重要な役割を果たしていることが判明してきた。そこで本研究では、転写サイクルの制御における長鎖ノンコーディングRNAの機能を調べることを目的とした研究を遂行する。まず、転写制御を理解する上では、転写レベルでの誘導が起きる条件での遺伝子発現変動を調べることが重要な第一歩となる。この観点から外的ストレスに応答して誘導される長鎖ノンコーディングRNAの網羅的スクリーニングを実施した。スクリーニングに当たっては、報告者がこれまでに独自に構築したノンコーディングRNAデータベースを活用した。その結果、病原体感染によってエンハンサー領域からenhancer RNAが誘導されることを見いだした。enhancerRNAの存在は以前にも知られていたが、その具体的機能についてはほとんど分かっていなかった。さらに、このenhancerRNAをノックダウンした細胞は病原体感染に高感受性となることも見いだした。この結果は、enhancerRNAが病原体感染防御において重要な役割果たすことを示す結果である。enhancerRNAの機能解明は転写サイクルの研究にとっても極めて重要な意味を持つため、enhancerRNAがどのようにして病原体抵抗性遺伝子発現制御を担うかについて研究を進めた。その結果、enhancerRNAによって転写制御される候補遺伝子を同定した。当初予定していなかった、病原体感染防御に重要な新規のノンコーディングRNAとしてenhancerRNAを見いだすことができたため、予定以上の進展があったと判断した。enhancerRNAによって転写制御を受ける標的遺伝子を同定し、この転写制御の具体的メカニズムを解明する。

具体的には、enhancerRNAに直接結合する転写制御因子の同定、ならびに、転写制御因子による標的遺伝子(病原体抵抗性を付与する遺伝子)の転写制御機構を分子生物学的・生化学的手法を用いて調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。