hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近世松前地における水神信仰の定着と変遷について

平成10年度は調査最終年として、基本的には北海道西南部の神社祭紀の調査を中心に、水神がどのように配られているかについて調査した。また、道内との比較のため、東北・北陸・山陰・九州北部など、近世から北海道と関係の深い日本海沿岸の地域を含めて調査を実施した。その結果、調査研究項目は以下の通りに整理された。1.1872(明治5)年におこなわれた北海道西南部の社寺調査の報告である神社取調書を史料とし、516柱の祭神を抽出し、水神にかかわる祭神の分析を行った。これまで北海道における神社祭紀の研究が、地域的にも時代的にも分断して、統計的に大半を占める稲荷社、厳島社、恵比寿社、金比羅社、龍神社などの祭神や神社を検討し、錬など漁労にかかわる地域で数量的に多く配られることが特徴であるとの指摘に終始していた。しかし、今回、明治初期の神社取調の1事例をデーターベース化するとともに勧請年を中心に編年化し、それぞれの神社祭祀形態を比較検討した結果、祭神は単一ではなく複合的に祀られていること、しかもそれぞれの地域において重層的に積み重なって定着していたことを明らかにした。2.研究を進めるにあたり、従来までの研究状況、到達点、問題点、解明すべき点などを整理し、稲荷信仰など量的に多い信仰を取り除くことで、川下神社、龍神社、海神社など水神と認識される少数の祭神を肥る神社が、北海道西南部で特色のある構造で祀られていることが判明した。3.18世紀中頃には、北海道や北陸地方など北前船交易で関係の深い地域において、疫病などの穢れを祓うために、水月(水無月)祓いを行う神社を勧請している。この水月社は、後に川下、川裾、川濯神社と川にまつわる水神として祀られるようになったことが理解できた。
超音波刺激による筋損傷からの回復促進にマクロファージは必要か？

本研究の研究計画は,大きく分けて次の3つに分類される.まず,1超音波刺激によってマクロファージから分泌が促進される因子が筋衛星細胞の増殖を促進するかどうかを検証する.次に,2超音波刺激によってマクロファージからの分泌が促進される因子の同定とマクロファージの分化を検証する.最後に,12の結果を基に,3筋損傷モデルラットを用いた超音波刺激による筋損傷からの回復促進メカニズムの解析を行う.本研究の研究計画は,大きく分けて次の3つに分類される.まず,1超音波刺激によってマクロファージから分泌が促進される因子が筋衛星細胞の増殖を促進するかどうかを検証する.次に,2超音波刺激によってマクロファージからの分泌が促進される因子の同定とマクロファージの分化を検証する.最後に,12の結果を基に,3筋損傷モデルラットを用いた超音波刺激による筋損傷からの回復促進メカニズムの解析を行う.
デインターカレーション反応を利用したサイズ分布幅の狭い銀ナノロッドの精密合成

AgとIを包蔵したBi2Sr2Ca1Cu2O8(Ag-I-Bi2212)からのゲストのデインターカレーション反応を利用して、銀ナノロッドを創製することを終局目的とした本研究では、その終局目的の達成には至らなかったが、以下に示す幾つかの知見を得た。650700°C付近でAg-I-Bi2212を処理することによって、銀のワイヤーが形成され、その生成量は処理中にガスを流すことによって増加することを明らかにした。また、AgIをCu2OやFeOと接触させることにより、銀のワイヤーが生成することを見出した。その生成状態は、接触される酸化物の種類や処理中に流すガス種やガス流量に依存する結果を得た。本研究では、これまでに類似の取り組み例が無い試みとして、インターカレーション化合物Ag-I-Bi2212の不安定性とナノサイズの格子空間からの異方的な原子供給に基づく銀ナノ粒子合成を目的として検討を行った。以下に、平成25年度に得られた知見の概要を記す。・高温超伝導体として知られるBi2Sr2CaCu2O8(Bi2212)をヨウ素雰囲気中で加熱処理することによってヨウ素包蔵Bi2212を作製し、その試料とAgIを固相反応させることによって出発試料を得た。X線による相の同定から、得られた試料はAgとヨウ素を包蔵したインターカレーション化合物(Ag-I-Bi2212)と判断された。・インターカレーション化合物Ag-I-Bi2212を大気中適当な温度で処理すると、試料表面にワイヤー状粒子が生成することを見出した。X線による相の同定と電子線マイクロアナライザーを用いて組成分析を行ったところ、観測されたワイヤー状粒子は銀であることが明らかになった。また、ワイヤー状粒子が生成する温度よりも、より高い温度で熱処理をすると、生成物はワイヤー状粒子が融解したような形態を示した。・上記銀ワイヤーの生成は熱処理雰囲気に依存した。密閉空間で熱処理したところ、銀ワイヤーの生成は観測されなかった。また、熱処理空間内に空気を流したところ、生成ワイヤーの太さや長さが流量によって変化する傾向にあった。傾向的には、ガス流量が多い程、細くて長いワイヤーが生成する傾向にあった。その原因は現時点では明らかではないが、Ag-I-Bi2212からのヨウ素の脱離挙動が関係していると推察している。本研究では、他に類を見ない取り組みとして、インターカレーション化合物Ag-I-Bi2212の不安定性とナノサイズの格子空間からの異方的な原子供給に基づく銀ナノ粒子合成を目的として検討を行った。以下に、平成26年度に行った検討から得た知見の概要を記す。・前年度に引き続き、銀ワイヤーの生成と熱処理温度の関係をより詳細に検討したところ、熱処理温度の増加とともに銀ワイヤーは長くなり且つ多量に生成することが明らかになった。しかし、熱処理温度が700°Cを超えると、銀ワイヤーは融解することがわかった。・銀ワイヤーの分離を試みた結果、塩酸処理では当初に期待したような物質分離はできなかったが、エタノールを用いると分離が可能であることがわかった。・検討を進める中で、ある種の酸化物とヨウ化銀との反応から、銀ワイヤーが生成することを見出した。中でも、酸化鉄を用いて適当な温度で処理すると、直径約50ナノメートル、長さ12マイクロメートル程度の非常に細い銀ワイヤーが生成することを観察した。この銀ワイヤー生成は、流すガス種によって異なることを見出した。酸化鉄を用いた場合には、空気の導入では銀ワイヤーは生成しなかったが、窒素の導入では、ガス導入量の増加とともに銀ワイヤーの生成量が増える傾向にあることを見出した。セラミックス材料工学本研究実施者の発案に基づき、銀とヨウ素を包蔵させたBi2212を熱処理することにより、一次元的な銀ワイヤーが形成されるといった新規な現象を見出した。今後は上記の現象ついてより深く検討しながら、銀粒子のナノロッド化に挑戦する。ホスト試料の作製に多くの時間を費やしたことにより、デインターカレーション反応実験が限られた回数しか行えなかったことが影響している。デインターカレーション反応実験をより多く行い、微細構造観察により積極的に行う。繰越予算は微細構造観察用の消耗品購入に充てる。
定量位相顕微鏡を用いた新規CTC（血中循環腫瘍細胞）検出器の開発

定量位相顕微鏡は細胞を染色することなく、数nmの高い分解能で観察することができる。健常人白血球、4種類の消化器癌細胞株を定量位相顕微鏡で観察し、得られた画像から特徴量を抽出して画像認識システムへ学習させ、白血球を識別するためのアルゴリズムを作成した。これを用いて白血球を癌細胞株から選別できるか検討しROC曲線を作成すると、AUC=0.99と高い精度で選別することができた。定量位相顕微鏡での撮影は当初は静止状態で行っていたが、現在は細胞を流しながら撮影することが可能となった。CTC:Circulating Tumor Cells(血中循環腫瘍細胞)とは、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から遊離し血中へ浸潤した細胞と定義される。固形癌患者の末梢血中に微小量存在して他部位への転移能を有している細胞を含んでいると考えられ、近年注目を浴びている。従来の検出方法はいずれも上皮系細胞表面マーカーを指標に選別しているが、癌細胞は転移の過程において一部の細胞で上皮系表面マーカーが消失することが知られており、これらの手法ではCTCを漏れなく回収することは難しい。一方で末梢血液中の有核細胞はその殆どが白血球であることから、白血球を取り除くことでCTCを効率よく回収できると考えられる。そこで本研究では、定量位相顕微鏡と画像認識システムを組み合わせることで、表面マーカーに依存しない新たなCTCの選別方法を確立することを目的とする。定量位相顕微鏡は、細胞を染色せずに1nmの分解能で詳細に観察することができる。この顕微鏡を利用し、CTCの候補としてまず大腸癌細胞株DLD-1, HCT116、SW480、膵臓癌細胞株Panc1、肝細胞癌細胞株HepG2の位相像を定量位相顕微鏡で撮影し、得られた画像(位相像)から特徴量を抽出して機械へ学習させた。同時に健常人白血球の位相像も撮影し、特徴量を抽出して機械へ学習させた。これらの学習結果に基づいて、白血球を癌細胞株から高い精度で識別するアルゴリズムを確立することに成功した(AUC=0.98)。これらの学習結果に基づいて、白血球を癌細胞株から高い精度で識別するアルゴリズムを確立することに成功した(AUC=0.99)。更には細胞を流すためのフローセルを作成し、この流路に細胞を流しながら撮影し位相像を取得する手法を確立した。位相像によって細胞を選別する位相フローサイトメーターを構築するためには、流路系で撮影し、更にその結果に基づいて流路の下流で弁別する装置が必要となる。現時点では細胞を流路に流しながら位相像を得る手法は確立できたが、撮影効率にはまだ改善の余地がある。また、流路の下流で細胞を弁別する手法はまだ確立できていない。これらの問題の対応に時間を要し、位相フローサイトメーターを構築するのにやや遅れを生じている。

この顕微鏡を利用し、CTCの候補としてまず大腸癌細胞株DLD-1, HCT116、SW480、膵臓癌細胞株Panc1、肝細胞癌細胞株HepG2の位相像を定量位相顕微鏡で撮影し、得られた画像(位相像)から特徴量を抽出して機械へ学習させた。同時に健常人白血球の位相像も撮影し、特徴量を抽出して機械へ学習させた。これらの学習結果に基づいて、白血球を癌細胞株から高い精度で識別するアルゴリズムを確立することに成功した(AUC=0.99)。また、細胞を流すためのフローセルを作成し、この流路に細胞を流しながら撮影し位相像を取得する手法を確立した。更には、この流路系において位相像と蛍光顕微鏡画像を同時に撮影することに成功した。これを利用して、白血球を抗CD45抗体で蛍光標識した後に位相像と蛍光顕微鏡画像を同時することで、白血球の認識率を客観的に評価することが可能となった。定量位相顕微鏡は細胞を染色することなく、数nmの高い分解能で観察することができる。健常人白血球、4種類の消化器癌細胞株を定量位相顕微鏡で観察し、得られた画像から特徴量を抽出して画像認識システムへ学習させ、白血球を識別するためのアルゴリズムを作成した。これを用いて白血球を癌細胞株から選別できるか検討しROC曲線を作成すると、AUC=0.99と高い精度で選別することができた。定量位相顕微鏡での撮影は当初は静止状態で行っていたが、現在は細胞を流しながら撮影することが可能となった。白血球・癌細胞株の位相像を撮影する際はスライドグラス上に細胞を静置させた状態で撮影したが、位相像によって細胞を選別する位相フローサイトメーターを構築するためには流路系での撮影が必要となる。そのためには、細胞を流しながら撮影できるように定量位相顕微鏡の調節が必要となる。具体的には、撮影スピードに合わせて細胞を流すこと、その際に細胞が重ならないように流すこと、撮影する際に焦点を合わせることが必要となる。これらの問題の対応に時間を要し、位相フローサイトメーターを構築するのにやや遅れを生じている。撮影効率の改善に関しては、得られた画像を解析するプログラムを改良することで効率化を図る予定である。細胞を弁別する装置に関しては、作成したフローセルの下流に電磁弁を取り付け、画像の解析結果によって弁別する予定である。位相フローサイトメーターを構築した後、実際に白血球と癌細胞株を分離できるか検証する。その後、遠隔転移を有する癌患者の血液の有核細胞層を位相フローサイトメーターにかけて白血球を除去し、残った有核細胞をCTCの候補として詳細に検討する予定である。消化器外科前述の問題に対しては、細胞を流すガラス流路を再設計し対応する予定である。その後に、遠隔転移を有する癌患者の血液の有核細胞層を位相フローサイトメーターにかけて白血球を除去し、残った有核細胞をCTCの候補として詳細に検討する予定である。本年度の研究が主にデータ収集期間となり,予定必要物品や消耗品などが当該年度には必要でなく,次年度に必要と判断されたため,助成金を次年度へ繰り越した.解析プログラムの改良に機器の交換や改善が必要であり,また今後さらに膨大なデータを収集予定である.機器改良やデータ保存のための,機器・消耗品に繰り越した助成金を使用する計画である.
連合学習過程で摂食コマンドニューロンに生じる可塑的変化のリアルタイム解析

シナプスの可塑的変化によって記憶はつくられると考えられているが、両者の因果関係の解明については、「現在、我々の前に立ちはだかっている最大の問題は、ミクロな研究と、マクロな脳機能の研究との間に横たわっている深い溝を、繋げていく方法が必ずしも明確でないことである(塚原仲晃、脳の可塑性と記憶)」と指摘されている。そこで本研究では、神経活動の人為的操作や二光子顕微鏡を用いて、同定された中枢単一ニューロンと行動の同時リアルタイム観察によって、連合学習による行動変化を担うシナプスを同定し、シナプスのミクロな変化がマクロな脳機能の変化としての記憶へとつながる過程を明らかにすることを目指す。
株式会社における投下資本回収の法理

少数株主の保護は、株式会社法の中心的な課題の一つであるが、多数派株主の不当な行為そのものを防止・除去することと並んで、少数株主が投下資本を回収して会社から離脱できるかどうかが、少数株主保護にとって重要な意味を持つ。少数株主が自分の望むときに(時期)、満足のいく経済的代償を得て(対価)、投下資本を回収できる十分な機会を持つかどうかである。アメリカにおいても日本においても、投下資本回収制度を全体としてみれば、主要な方法として、株式譲渡、株式買取請求、会社の解散請求という三つの手段が会社法上用意されている。これらは有機的に関連し合っており、このうちの一つが十分に機能していれば、他の二つの手段が働くべき必要性は減少するといってよいが、三つがそれぞれともに十分に働かないのであれば、三つが相互に補完しあい、全体として十分な投下資本回収手段となっていなければならない。三つの手段のうち、株式譲渡が投下資本回収方法の中核をなすが、株式に市場性のない閉鎖会社においては事実上利用できない。また会社の解散請求は、会社を消滅させる最後的・例外的手段である。株式買取請求権制度が、とりわけ株式に市場性のない閉鎖的な会社において、株主間の利害調整手段として重要である。アメリカでは、同制度についてその存在自体を疑問視する見解をはじめ、種々の批判があるが、その欠陥を是正する立法論上・解釈論上の努力がなされてきた。アメリカ法を導入したわが国の株式買取請求権制度も、いろいろな問題を抱え、批判も多い。買取請求権を認めるべき場合を再検討するとともに、手続上の改善が必要であろう。母法アメリカにおける議論は、わが国における株式買取請求権のあり方を考える上で、きわめて有益である。
第一原理熱力学積分法の開発と高圧含水マグマへの適用

本研究は、第一原理電子分子動力学計算法と熱力学積分法を組み合わせたより効率的かつ高精度な計算手法(第一原理熱力学積分法)を開発し、これまで見積もることが難しかった地球深部条件下における水の自由エネルギーを決定することを目標として研究を行った。結果、定量的な結果を得るためには大規模かつ長時間の計算を必要とすることが判明したため、スーパーコンピューターを用いて計算を行う必要があり、新たにポスト「京」萌芽的課題プロジェクトに参加した。本研究で開発したプログラムを京コンピューター上でコンパイルし動作環境を整えた。本研究は第一原理電子状態計算法と熱力学積分法を組み合わせた新たな手法を用いてマグネシウムケイ酸塩-水系の相図を明らかにすることを目的としている。熱力学積分法は参照系と現実系の二つの異なる系の間の結合パラメーターを定義し、そのパラメーターを変化させ、参照系と現実系の間でポテンシャルエネルギーを積分することにより、参照系と現実系の間の自由エネルギー差を求めることができる手法である。ここで現実系のエネルギーを第一原理分子動力学計算により求め、参照系を理想気体やアインシュタイン結晶など解析的にエネルギーが求められる系とすることにより、対象とする系の自由エネルギーを求めることができる。本研究ではまず、手法の確立のため、水と氷の自由エネルギーを求めることをマイルストーンとする。これにより、高圧下における氷の融解曲線や、これまで正確に決定することが困難であった含水鉱物の融解曲線を決定することができる。固相の自由エネルギーについては密度汎関数摂動論と調和近似を組み合わせた方法やアインシュタイン結晶を参照系とする熱力学積分法のプログラムを作成し、これまでのところ、MgOやSiO2の無水鉱物については融解曲線が実験と非常に調和的な結果を得ることに成功している。今後、課題となるのは高圧下で存在が強く示唆されている超臨界氷の自由エネルギー計算である。超臨界氷は酸素格子が体心立方格子をとり、水素が流体のようにふるまう状態である。現在、酸素格子の参照系をアインシュタイン結晶にとり、水素の参照系を理想気体にとったプログラムの開発に取り組んでいる。地球内部の水の存在量とその状態を明らかにすることは、地球のダイナミクスを理解するために非常に重要である。さらに、地球内部の含水物質の安定性を見積もり、相図を明らかにするためにはそれらの自由エネルギーの情報が不可欠である。本研究は第一原理電子状態計算法と熱力学積分法を組み合わせた新たな手法を用いてマグネシウムケイ酸塩-水系の相図を明らかにし、地球深部へと水を運搬するメカニズムについて新たな知見を得ることを目的としている。本研究ではこれまで、含水物質の安定性を見積もるうえでかぎとなる水と氷の自由エネルギー計算を行ってきた。本年度は新たに計算機を追加し、大規模な第一原理分動力学シミュレーションを行うことにより、計算条件の決定や精度の検証を行ってきた。高圧高温条件下では氷は超イオン状態をとるため、第一原理熱力学積分法を行ううえで、通常の固体や液体とは異なる参照状態を考慮する必要があり、新たな手法の開発を行った。また、本理論計算の比較対照のための実験データが限られているため、相補的な計算として第一原理2相分子動力学計算により氷の融点の計算も追加して行った。付け加えて、今年度は地球内部へ水を運搬する役割を担うと考えられる新たな高密度含水マグネシウムケイ酸塩鉱物(H相)の結晶構造や弾性特性に関し理論計算を行い、国際学術雑誌に報告を行った。これらの第一原理計算の結果と地球深部を伝播する地震波速度の特徴を比較し、地球内部への水の運搬メカニズムについて包括的に議論を展開した。熱力学積分を行う際、参照系と現実系の中間状態を離散的にサンプリングし第一原理分子動力学計算を行い、得られたエネルギーの内挿を行う必要がある。また、サンプリングする点の数と第一原理分子動力学計算の精度が誤差の原因になるため、双方の精度をあげることが必要である。すなわち第一原理分子動力学計算から信頼できるエネルギーの値を得るためには十分なシミュレーション時間が必要である。本研究がやや遅れている原因は、この精度を上げるための計算時間が必要なためである。本研究では、第一原理分子動力学シミュレーションを行うことにより、計算条件の決定や精度の検証を行ってきた。高温高圧下において氷は超イオン状態をとる。すなわち酸素は結晶状態を維持するが、水素は液体のような振る舞いをみせる。そのため、第一原理熱力学積分法を行う上で酸素は固体の、また水素は液体の参照状態をとる必要があるため、そのアルゴリズムを開発した。本年度は、定量的な結果を得るために大規模な計算を必要とすることが判明したため、スーパーコンピューターを用いて研究を行う必要があり、新たにポスト「京」萌芽的課題プロジェクトに参加した。本研究で開発したプログラムを京コンピューター上でコンパイルし動作環境を整え、チューニングを行った。また、実際に第一原理分子動力学シミュレーションを行った。さらに本理論計算の比較対照のための実験データが限られているため、相補的な計算として第一原理2相分子動力学計算も追加して行った。また、氷VIII相とX相の弾性定数の決定を第一原理計算法を用いて行った。本研究の結果、これら氷VIII相とX相の弾性定数の値とその圧力依存性は顕著な違いを見せることが判明した。この結果は、相境界を決定する上で有用な情報となる。また氷VII相のブリルアン散乱実験データと比較することにより、氷VII相の水素結合対称化が30万気圧から110万気圧までの広い圧力範囲において徐々に起きている可能性を指摘し、国際誌に発表を行った。

本研究は、第一原理電子分子動力学計算法と熱力学積分法を組み合わせたより効率的かつ高精度な計算手法(第一原理熱力学積分法)を開発し、これまで見積もることが難しかった地球深部条件下における水の自由エネルギーを決定することを目標として研究を行った。結果、定量的な結果を得るためには大規模かつ長時間の計算を必要とすることが判明したため、スーパーコンピューターを用いて計算を行う必要があり、新たにポスト「京」萌芽的課題プロジェクトに参加した。本研究で開発したプログラムを京コンピューター上でコンパイルし動作環境を整えた。本研究は新たな手法開発も含む意欲的かつ挑戦的研究計画であるため、既知の系等においた手法の有効性の検証が不可欠である。本研究ではまず、手法の確立のため、水と氷の自由エネルギーを求めることを第一目標とする。現在のところ、固相の自由エネルギー計算を精度よく決定する手法開発に若干時間を要している。しかし、問題点については明確であるので、ひとつずつ解決していけば良いと考えている。一方で、液相の自由エネルギー計算については手法開発済みであるので、固相自由エネルギー計算方法開発と同時に、液相(水)の計算を実行し、問題解決と同時平行して成果発表に取り組みたい。来年度中には計算の実行と解析を行い、精度の検証を行う。技術的な問題はほぼ解決しているので、今後はより効率的に計算を行う方法を検討したい。今回の研究結果を踏まえ、どの程度のサンプリング数が必要であるかのある程度の目安が得られ、今後の研究の展開につなげることができると期待される。理論鉱物物理まず、高温高圧下における水の自由エネルギーを決定する。これにより含水鉱物の融解曲線を決定する。特に、研究代表者が発見に貢献した高密度含水マグネシウムケイ酸塩鉱物のphase H(MgSiO4H2)について、融解温度を決定する。水以外の固相(phase HとMgSiO3 Bridgmanite)の高温高圧下での自由エネルギーについては研究代表者がすでに論文発表しており、これと併せて含水マグネシウムケイ酸塩鉱物の相図決定が可能になる。その結果より、地球深部の含水鉱物の安定性について議論を展開する。水の自由エネルギーを決定した後は、高温高圧下におけるマグネシウムケイ酸塩-水系マグマの相図の決定に取り掛かる予定である。設備備品として購入したコンピューターの軽微な価格変動と、学会出張計画の変更のため次年度使用額が生じた。差額の生じた理由は、コンピューターの価格が当初予定していたものから変動があったためと、情報収集にかかる国内旅費が必要なかったためである。次年度の成果発表のための国内出張に充てる予定である。差額は数万円であり、基本的な使用計画は当初予定と変わりはない。国内研究発表と情報収集のために旅費を使用する予定である。
RNAi法等によるシイタケ・ラッカーゼの生理的機能及び遺伝子発現メカニズムの解明

本研究では、食用担子菌シイタケにおけるフェノール酸化酵素の1つであるラッカーゼ(Lcc)の遺伝子発現制御機構の解明とLccの機能解明を目的とする。そのために、RNA干渉(RNAi)法による各lcc遺伝子の発現抑制株の取得とその解析を行う。今年度は、シイタケゲノム中に存在する全16種類のラッカーゼ遺伝子の発現をリアルタイムPCRで解析した。はじめに、シイタケゲノムに存在する全16種類の遺伝子発現パターンの解析を行うために、コントロール遺伝子(リファレンス遺伝子)の解析を行い、比較的安定に発現していたchs、ras、rpl2遺伝子の3種類の遺伝子を選抜した。次に、発現抑制遺伝子を、逆方向反復配列として組込むタイプと、2種類のプロモータで発現抑制遺伝子を挟み込むタイプの2種類のRNA干渉(RNAi)ベクターによる、lcc1遺伝子の発現抑制に関して解析した。その結果、Lcc活性が高い時期の組換え体では、どちらのタイプのRNAiベクター導入株も、lcc1遺伝子の発現はあまり抑制されていないことが明らかになった。しかし、宿主株で発現していないlcc5遺伝子の発現が、すべての組換え体で、転写レベルでも再確認された。この結果から、lcc1とlcc5遺伝子のより特異性の高い配列を選択して、それぞれ単独に抑制するRNAiベクターと、lcc1と1cc5遺伝子を同時に抑制するためのRNAiベクターを新規に構築した。また、宿主株に関して16種類のlcc遺伝子の発現の比較をはじめて行ったところ、lcc1遺伝子の発現が最も高く、lcc3、lcc5、lcc6、lcc12は検出されていないことが明らかとなった今年度ははじめに、リアルタイムPCR用のコントロール遺伝子(リファレンス遺伝子)の解析を行った。昨年までの結果と、最近報告された論文を参考に、構成的に発現している遺伝子の中から候補遺伝子として、5種類に絞った。宿主株と組換え体3菌株の液体培養時のLcc活性の高い時期の合計7種類の菌体からRNAを抽出し、それぞれの遺伝子の発現を比較した。その結果、比較的安定して発現していたchs、ras、rpl2遺伝子の3種類をリファレンス遺伝子として用いることとした。次に、上記の7種類のRNAに対して、シイタケに存在する16種類のlcc遺伝子に関するリアルタイムPCRを行なった。その結果、宿主株では、lcc1の発現が最も高く、lcc3、lcc5、lcc6、lcc12は検出されなかった。これまで、液体培養時の宿主株における16種類のlcc遺伝子の発現は、報告されていないので、新規の知見が得られたことは研究の進展と考えている。一方、RNAiベクター導入株では、lcc1の発現は宿主株に比べるとその発現は低い傾向にあったが、その抑制は必ずしも強くなかった。しかし、宿主株では発現していないlcc5がすべてのRNAiベクター導入株で検出された。この結果を踏まえて、lcc1とlcc5遺伝子に関して、それぞれ特異的な配列を利用した新たなデュアルプロモータ型RNAiベクターによる発現抑制ベクターを構築し、さらにlcc1とlcc5の連結遺伝子を挿入した同発現抑制ベクターを構築した。しかし、lcc1とlcc5以外のlccに関する発現抑制ベクターは構築できなかった。また、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析に関しては、ほとんど進展がなかった。lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、lcc1遺伝子の発現抑制が弱かったことと宿主株で発現していないlcc5遺伝子の新規の発現が確認された。この結果を踏まえて、それぞれの遺伝子に特異的な別の配列を用いた新たに発現抑制ベクターと、両遺伝子を同時に発現抑制するベクターを新規に構築できたことから、今後はこれらのベクターを導入した組換え体を造成して解析する。また、lcc2lcc4、およびlcc6の発現抑制ベクターの構築を行ない、シイタケに導入して組換えシイタケを解析し、その機能を探る。一方、Lcc発現変異株に関しては、ベクター配列から周辺遺伝子まであと24bpまで達しているので、ゲノムウォーキング法によるベクター導入位置周辺の遺伝子解析を進め、変異株のベクター導入位置に存在するシイタケの遺伝子を解明する。本研究では、食用担子菌シイタケに確認されているラッカーゼ(Lcc)に関して、RNAi法による発現抑制実験を行うことと、プラスミドタギング法により得られたLcc発現変異株の解析を行うことによって、シイタケの各Lccの機能の解明とLcc遺伝子発現制御メカニズムの解明を目的とする。今年度は、プラスミドタギング法によって得られたLcc変異株(Lcc変異株)及びLcc1発現抑制RNAiベクター導入株(Lcc1発現抑制株)で発現しているLccに関して、RT-PCRとウエスタン解析による解析を行った。申請者らが単離したLcc1Lcc6、Wongらが単離したLcc7Lcc11、Sakamotoらが確認したLcc1214、及び森林総合研究所のシイタケゲノムデータベースで確認されているこれら以外の2種類の合計16種類のシイタケlcc遺伝子に関して、RT-PCR用のプライマーをデザインした。Lcc変異株を液体培養し、Lccが発現している時期の菌体を回収して、total RNAを抽出し、cDNA合成後、すべてのプライマーの組合せでRT-PCRを行い、どのLcc遺伝子が発現しているかを確認した。その結果、宿主株とLcc変異株ではLccの発現パターンが異なることが明らかとなった。Lcc変異株では、宿主株で発現しているLcc1遺伝子の発現が抑制傾向にあり、発現しているLcc遺伝子数が少なくなる傾向を示した。

一方、Lcc1発現抑制株を寒天培地で培養した場合には、宿主株に比べてLcc1発現抑制株のほとんどの株で、Lcc活性が早期に検出される傾向を示した。また、ウエスタン解析により、Lcc1発現抑制株では、Lcc1の発現が抑制される傾向が確認できた。さらに、これらの株の一部では、宿主株では発現していないLcc5の発現が確認された。Lcc変異株の解析に関しては、当初シイタケに存在することが報告されていた11種類のLcc遺伝子を想定していたが、その後に明らかになった情報から、シイタケに存在するLcc遺伝子が16種類であることが推定された。この情報を基に、解析する遺伝子数を増やして解析できたことから、新たな進展があった。Lcc1発現抑制株に関しては、RT-PCRによる解析まで行うことができなかった。また、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析や、Lcc1Lcc6に関するRNAiベクターの構築を行うことができなかった。本研究では、食用担子菌シイタケに確認されているラッカーゼ(Lcc)に関して、RNAi法による発現抑制実験を行うことと、プラスミドタギング法によって得られたLcc発現変異株の解析を行うことによって、シイタケの各Lccの機能の解明とLcc遺伝子発現制御メカニズムの解明を目的とする。今年度は、lcc1発現抑制RNAiベクター導入株の寒天培地培養時におけるラッカーゼ活性、及びLcc1とLcc5に関するウエスタン解析を行なった。また、シイタケゲノムに確認されている16種類のlcc遺伝子の発現に関しても、RT-PCRによる解析を行なった。ランダムに選抜した10株のlcc1発現抑制RNAiベクター導入株はすべて、ラッカーゼ活性が宿主株より7倍以上高いことが明らかとなった。また、これらのサンプルのウエスタン解析により、Lcc1の発現は、宿主株に比べると抑制される傾向を示し、強い抑制を示す株も確認できた。また、これらの株では、宿主株では発現していないLcc5の発現が、株により強弱はあるものの、ほとんどの株で確認された。一方、RT-PCRの結果では、lcc1の発現に関しては、全く検出されない株が10株の中で1株確認された。これに対して、lcc5の発現に関しては、宿主株ではほとんど検出されなかったのに対して、10株すべてで確認された。以上の結果から、転写レベル及び翻訳レベルで、lcc1遺伝子発現抑制RNAiベクターを導入した株では、lcc1の発現抑制が確認され、同ベクターの有効性が確認できた。また、興味深い現象として、lcc1遺伝子発現抑制RNAiベクターを導入した株では、宿主株では発現していないlcc5が新規に発現していることが確認された。lcc1遺伝子発現抑制株の解析に関しては、lcc1の抑制と新規にlcc5が発現してくるという興味深い現象が確認されるなど、研究の進展があった。しかしながら、Lcc変異株のゲノムウォーキング法によるベクター導入位置の遺伝子に関する解析に関しては、ベクター内の配列から外側の配列に到達することができなかった。また、Lcc2Lcc6に関するRNAiベクターの構築ができなかった。
温度感応性高分子を用いる金属キレートの濃縮と分光分析法の簡易高感度化への応用

水溶性高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)はその下限臨界温度(約32°C)以上で水に不溶となり、ゴムのような高分子の沈澱(凝集相)を形成する。疎水性金属キレートであるトリス(8-ヒドロキシキノリノラト)金属キレートは高分子水溶液に安定に可溶化され、高分子の沈澱とともに小さな体積を占める凝集相へ取り込まれた。高濃度の金属キレートを含む凝集高分子相は少量の極性有機溶媒に再溶解させることができた。高い濃縮率の結果、原子吸光法による飲料水中のコバルトの定量が可能になった。非電荷キレートとは対照的に負の電荷を持つ金属キレートであるビス(バスクプロインスルホン酸)銅(I)キレートや5,10,15,20-テトラキス(4-カルボキシラエニル)ポルフィリン金属キレートは凝集相にほとんど抽出されなかった。しかし、適当な種類や濃度の第四級アンモニウムイオンが対イオンとして存在するとよく抽出されるようになった。これらの金属キレートを定量的に凝集相へ捕集ずるための対イオンとしては、n-ドデシルトリメチルアンモニウムイオンが最も優れていた。再溶解した凝集相はマイクロプレート上に載せたり、逆相高速液体クロマトグラフィーの水-極性溶媒からなる移動相に直接導入することが可能であった。非常に簡単で迅速な前濃縮操作によって、マイクロプレートリーダーを用いる吸光光度法でサブ-ppbレベルの、HPLCの可視検出でサブ-pptレベルの金属キレートの検出が可能となった。1.温度感応性高分子の合成と凝集条件の検討:種々の分子量の温度感応性高分子ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)を合成し、水溶液における凝集条件を調べたところ、凝集の始まる温度については分子量依存性がみられなかったものの、分子量が大きな高分子ほど小さな温度幅で凝集が完了した。本高分子は全pH領域で凝集するものの、pH<2においては、凝集性が低下した。また、コンパクトな凝集相を得るためには、塩の添加が必要不可欠であり、非荷電高分子であるPNIPAAm中の形式電荷の存在が示唆された。高分子水溶液中に微視的環境プローブを可溶化したところ、プローブの蛍光スペクトルから、水和した高分子が周囲の水に比べて疎水的な場を提供し、そこに疎水性化合物が取り込まれていることが示された。2.金属キレートの抽出と定量条件の検討:高分子凝集相には多くの疎水性金属キレートが効率的に捕集された。なかでも重量分析試薬として知られる8-キノリノールの金属キレートは錯形成および捕集ともに良好な結果を得た。この系を黒鉛炉原子吸光法の前濃縮に応用したところ、他元素の妨害がほとんどなしに、100倍程度のコバルト錯体の濃縮を達成した結果、飲料水中のコバルトイオン濃度を定量できるようになった。一方、水溶性の荷電金属キレートはそのままでは凝集相にほとんど捕集されないものの、適当な対イオン共存下で凝集相に効果的に捕集されることが明らかになった。対イオンの選択によって、バソクプロインスルホン酸や水溶性ポルフィリンなど、吸光分析法で用いられる多くの金属キレートを凝集相に抽出することができた。現在、捕集条件の最適化を検討しているが、金属イオンに関するサブppbレベルの吸光分析およびサブpptレベルの高速液体クロマトグラフ/吸光分析が可能になる見通しが得られた。
上皮ナトリウム吸収と好酸球性炎症の関連

鼻茸培養上皮細胞を用いてIL-4刺激で分泌されるサイトカインについて検討を行った。IL-4刺激で上皮培養細胞から分泌されるサイトカインはRANTESが最多でありエオタキシンは測定感度以下であった。RANTESはapical側単独刺激IL-4にて100ng/ml, 72時間投与で最も分泌量が増えた。手術時に得られた鼻茸からプロテアーゼを用いて上皮のみを単離し培養細胞として発育させる。当初はdish cultureで培養を行いコンフルエントになった時点でculture insert内に継代しair liquid interface法(ALI culture)にて培養を続ける。ALI cultureにて培養した細胞は杯細胞、繊毛細胞などへの分化を示しin vivoに近い形態をとる。こうして培養細胞を2週間発育させ、その時点で実験に供した。昨年度はIL-4100ng/mlを用いて細胞刺激を行なった。まず実験の第1段階としてIL-4の投与側について検討した。具体的にはapical side, basolateralside, both sideのいずれがより多くのケモカインを分泌するかを調べた。その結果からbasolat eral side投与よりapical side投与の方が有意にケモカイン分泌量が多く、both side投与でもapical side投与のみとケモカイン分泌量は変らないことが分かった。培養上澄み液では細胞表面側の方が細胞膜側より有意に分泌量が多いことがわかった。よって以下の実験はapical sideのみにサイトカインを投与して実験を継続した。次に上皮培養細胞はどのケモカインを分泌するかについて検討した。現時点では分泌されるケモカインはRANTESが最多でありエオタキシン-1は測定感度以下であることがわかった。現在はRANTES分泌の濃度依存性、時間依存性について検討を行なっているところである。まず実験の第1段階乏してIL-4の投与側について検討した。その結果からbasolateral side投与よりapical side投与の方が有意にケモカイン分泌量が多く、both side投与でもapical side投与のみとケモカイン分泌量は有意差がないことが分かった。現在はRANTES分泌の濃度依存性、時間依存性について検討を行ない72時間刺激、100ng/mlで有意にRANTES分泌量が亢進することがわかった。
Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

DUFは二重鎖DNAに結合して、二重鎖に負のひねりを加えることによって、二重鎖を局部的に開く活性を持つ因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から初めて精製された。DUFは、出芽酵母のCdc68の類似体とSSRP1(シスプラチンによって修飾されたDNAに結合する因子)とのヘテロ二両体である。精製DUFを、種々のニックを持たない弛緩した環状二重鎖DNA溶液に加えると、二重鎖DNAに負のひねりが導入された。また、ひねりの導入にはATPは必要なかった。pSV00CAT DNA(4.6kbp)を用いて、DUF量とひねり数との量的関係を調べたところ、0.9pmolのDUFが、0.07pmolのDNAに負のひねり1つを導入することがわかった。このことは、1分子のDNAを1回ひねりるためには、約13分子のDUFが必要であるということを意味する。Xenopus卵抽出液に環状一本鎖M13DNAを加えると、それを鋳型としてDNA合成が行われ、形成された二重鎖にヒストンが結合してクロマチン構造が作られることが知られている。DUF存在下(mock処理卵抽出液中)および非存在下(抗-DUF抗体でDUFを除いた卵抽出液中)で形成させたクロマチンに対するミクロコッカスヌクレアーゼ感受性を調べたところ、DUF存在下のクロマチンDNAは、非存在下のクロマチンDNAよりもヌクレアーゼ感受性が高いことがわかった。また、ヒストンを固定化したカラムを用いてDUFとヒストンとの相互作用を調べたところ、DUFはヒストンに対して強い親和性を持つことがわかった。DUFはDNAのみならず、コアヒストンとも相互作用して、DNA複製に必要なゆるんだクロマチン構造を作る作用を持つということが示唆される。
Riemann多様体のコンパクト化と無限遠

Riemann多様体の各種コンパクト化の比較検討を行った.その中でRiemann幾何の観点からもっとも自然なコンパクト化として,距離関数を利用したGromovのコンパクト化を主に分析した.Gromovはコンパクト化した際に付加される部分を理想境界と読んでいる.本研究では,以下の空間の理想境界の構造を決定した.1.楕円放物面のコンパクト化は2次元球面で,理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.3.回転放物面で囲まれた3次元領域のダブルとしてできるAlexandrov空間のコンパクト化は3次元球面で,その理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.上記の分析から,理想境界ではBusemann関数がその骨格をなすのではないかとの予想を得た.ところで,理想境界の点(無限遠点)は関数として実現されているので,2点間の距離として関数の差のノルムを考えることができる.このノルムの意味でBusemann関数が理想境界の最大直径を実現していることが認められた.また,有限の位置にある点からは,無限遠点に対応した関数の勾配ベクトル場から決まるrayが出ている.これが通常の最短測地線に相当するものと見なされる.この意味で理想境界上の点の最小跡を分析すると,上のrayとそのBusemann関数との対応付けにおいて連続性の崩れる部分を最小跡と見なすのが自然であるとの結論に至った.この定義の正当性の分析が今後に残された課題である.Riemann多様体の各種コンパクト化の比較検討を行った.その中でRiemann幾何の観点からもっとも自然なコンパクト化として,距離関数を利用したGromovのコンパクト化を主に分析した.Gromovはコンパクト化した際に付加される部分を理想境界と読んでいる.本研究では,以下の空間の理想境界の構造を決定した.1.楕円放物面のコンパクト化は2次元球面で,理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.3.回転放物面で囲まれた3次元領域のダブルとしてできるAlexandrov空間のコンパクト化は3次元球面で,その理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.上記の分析から,理想境界ではBusemann関数がその骨格をなすのではないかとの予想を得た.ところで,理想境界の点(無限遠点)は関数として実現されているので,2点間の距離として関数の差のノルムを考えることができる.このノルムの意味でBusemann関数が理想境界の最大直径を実現していることが認められた.また,有限の位置にある点からは,無限遠点に対応した関数の勾配ベクトル場から決まるrayが出ている.これが通常の最短測地線に相当するものと見なされる.この意味で理想境界上の点の最小跡を分析すると,上のrayとそのBusemann関数との対応付けにおいて連続性の崩れる部分を最小跡と見なすのが自然であるとの結論に至った.この定義の正当性の分析が今後に残された課題である.Gromovの定義した理想境界の構造を、前田の定数が有限の値を持つ、いくつかの具体的な空間に対して調べた。特に、Ma renich調べたある種のAlexand rov曲面の3次元版を考察して、この場合も理想境界は閉区間に同相になると言う結果を得た。この例の分析においては、測地線を求めるに際して数式処理ソフトMathem aticaの補助を得た。この種の空間では、さらに次元を上げても理想境界の構造は、次元に関わらず同一ということが予想される。この事から、2次元以上の理想境界を持つ例の構成が、当該研究課題における今後の重要な問題である。理想境界上に定義される距離に関して、その直径は、Busemann関数の間の距離で実現されるのではないかと予想していたが、ほぼこの予想が正しいことが証明された。すなわち、定理理想境界の直径は、Busemann関数の間の距離の上限以下である。これは、理想境界上の各点をBusemann関数で近似することによって証明される。この定理の系として、理想境界のサイズは前田の定数で上から評価されることが証明される。また、多様体のホモトピー群と調和写像に関して、次のような結果を得た。n-調和写像が含まれるホモトピー類の中でn-エネルギーが最小になるようないくつかのn-調和写像があって、すべてのホモトピー類はそれらが代表する類の和でかくことができる。これを使うと、以前にElwort yとRosenbergによって間接的に示されたところの確率論における定理が、直接的に示されることがわかった。Riemann多様体の各種コンパクト化の比較検討を行った.その中でRiemann幾何の観点からもっとも自然なコンパクト化として,距離関数を利用したGromovのコンパクト化を主に分析した.Gromovはコンパクト化した際に付加される部分を理想境界と読んでいる.本研究では,以下の空間の理想境界の構造を決定した.1.楕円放物面のコンパクト化は2次元球面で,理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.3.回転放物面で囲まれた3次元領域のダブルとしてできるAlexandrov空間のコンパクト化は3次元球面で,その理想境界は閉区間である.その両端はBusemann関数である.上記の分析から,理想境界ではBusemann関数がその骨格をなすのではないかとの予想を得た.ところで,理想境界の点(無限遠点)は関数として実現されているので,2点間の距離として関数の差のノルムを考えることができる.このノルムの意味でBusemann関数が理想境界の最大直径を実現していることが認められた.

また,有限の位置にある点からは,無限遠点に対応した関数の勾配ベクトル場から決まるrayが出ている.これが通常の最短測地線に相当するものと見なされる.この意味で理想境界上の点の最小跡を分析すると,上のrayとそのBusemann関数との対応付けにおいて連続性の崩れる部分を最小跡と見なすのが自然であるとの結論に至った.この定義の正当性の分析が今後に残された課題である.
腸管粘膜バリア機能に着目した硬膜外鎮痛と周術期免疫応答に関する研究

周術期における硬膜外鎮痛が免疫応答に与える影響について、腸管粘膜バリア機能に着目して研究を行った。Perfusion CTにより、硬膜外鎮痛は腹腔動脈は有意に拡大させ、十二指腸、膵臓の血流速度を有意に低下させた。また、術中の十二指腸および結腸組織におけるサイトカイン(IL-6、IL-12p35、IL-12p40)のmRNA発現量は、硬膜外鎮痛の有無による有意な違いは見られなかった。今回の研究から、周術期の腸管粘膜におけるサイトカインのmRNA発現は明らかな影響はみられなかったが、硬膜外鎮痛は腹腔動脈を拡張し、臓器血流速へ影響を与えたため、今後さらに長期間の影響を検討する必要があると考えられた。本研究では、周術期の侵害ストレスが腸管粘膜バリア機能に与える影響に着目し、周術期における硬膜外鎮痛が免疫応答に与える影響について明らかにすることを目的としている。そのために、(1)硬膜外鎮痛は消化管粘膜血流量を維持するのか、Computed tomographyを用いて評価をする。(2)硬膜外鎮痛は消化管粘膜におけるBacterial translocationを防ぐのか、消化管粘膜における炎症性および抗炎症性サイトカインのmRNA発現を評価する。以上2つの項目を研究することを予定している。当初の予定では実験(1)から実施する予定だったが、サイトカインのmRNA測定協力者(大阪府立大学・藤本由香准教授)との相談の上、順番を変更して実験(2)を開始し、また採材計画についても、腸管の全層採材のほうが適していた予備検討から、開腹下での腸管バイオプシーに変更した。2014年度までに、硬膜外鎮痛が消化管粘膜におけるBacterial translocationへの影響を評価するために、消化管粘膜における炎症性および抗炎症性サイトカインのmRNA発現を評価する検討を行い、腸粘膜の採材を終了した。今後サイトカインのmRNA測定を行う予定である。また、実験(2)については、本年度に予定通り実施する予定である。また、侵害刺激が加わる開腹下で採材した十二指腸および直腸組織におけるサイトカイン(IL-6、IL-12p35、IL-12p40)のmRNA発現量をリアルタイムPCRを用いて測定した。その結果、犬の第13胸椎にカテーテル先端を留置した硬膜外鎮痛の開始1時間後および術中ストレスを想定した低血圧(平均動脈血圧50mmHg程度)状態に30分間維持した場合のサイトカインの発現量は、硬膜外鎮痛の有無によって明らかな違いは見られなかった。今回の研究から、周術期の腸管粘膜におけるサイトカインのmRNA発現については、現段階では術中期間で明らかな影響は観察されなかった。しかしながら、硬膜外鎮痛は鎮痛領域である腹腔動脈を有意に拡張させ、臓器血流速へ影響を与えることが明らかとなったため、今後はさらに長期間の影響を検討する必要があることを示す研究結果となった。研究費支給が行われてから実験を開始したため、2014年度の実質的な実験期間は予定した期間よりも短く、実験(2)の組織採材まで実施した。2015年度は、引き続き実験(2)のサイトカイン測定、および実験(1)を実施する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。獣医麻酔学まずは実験(2)において、すでに採材した腸粘膜および血液中のサイトカインのmRNA測定を実施する予定である。その後、Perfusion CT実験の協力者である帯広畜産大学・山田一孝教授と相談の上、予定通りに実験(1)を行う予定である。
コフィリンが飽和結合したアクチン繊維の分子間相互作用を近原子分解能で解き明かす

電子顕微鏡画像処理プログラムEos (安永、若林、1996)を用いて、らせん対称線維の単粒子解析プログラムを構築した。そのプログラムを用いて、コフィリンが飽和結合したアクチン線維(以下、cofilactin)の3次元構造を、クライオ電子顕微鏡像の単粒子解析により7.4 &#197;分解能で明らかにした。分子動力学計算によるモデル構築プログラムMDFF (Trabuco et al., 2008)を用いて、密度マップに基づくcofilactin原子構造モデルを構築した。D-loopはアクチン分子単量体において最もフレキシブルな部位であるが、アクチン線維形成時にはループ構造を取り、線維の上下のアクチン分子間を強固につなぐ重要な接着点として働くことがわかっている。また、コフィリンがアクチン線維に結合して線維の分子間相互作用を変えるためには、このD-loopによる接着点を弱体化する必要があると考えられていた。しかし本研究によるモデリングの結果、D-loopはαヘリックス構造としてモデル化した方が密度マップをよく説明するとわかった。αヘリックス構造をとると、D-loopの側鎖は隣接アクチン分子から離れる方向を向くため、コフィリンが分子間結合を破壊する文脈でこれは効率の良いシステムである。また、cofilactin原子構造モデルの静電ポテンシャルを計算して可視化したところ、ヘリックス構造へとフォールドしたD-loopが存在する空間は、アクチンの負電荷表面とコフィリンの正電荷表面に挟まれており、αヘリックスの電気双極子を安定化する方向の電場が生じているとわかった。この電場がD-loopのヘリックス構造転移を促進・安定化し、コフィリンの作用を助けている可能性がある。現在、コフィリンの正電荷表面の正電荷残基の電荷反転変異体・電荷消失変異体の発現系を構築し、電場の役割を実験的に確かめている。27年度が最終年度であるため、記入しない。コフィリンが飽和結合したアクチン繊維(以下、アクチン・コフィリン繊維)の極低温透過電子顕微鏡像の単粒子解析により、現在までに8.9Å分解能の3次元密度マップを得た。また、その密度マップを用いて分子動力学計算による原子モデル構築を行った。今回の構造で新たにわかった注目すべき点としで、アクチンサブユニットのD-loop部分が、αヘリックス構造をとる可能性が強く示唆された事が挙げられる。これまでの研究では、アクチン単量体・繊維状態の両方において、D-loopはループ構造をとるとされている。またアクチン繊維においては、D-loopを介したサブユニット間相互作用が、繊維構造の維持に必要だとわかっている。私が今回、アクチンのD-loop領域がループ構造をとっている構造(PDBID 2ZWH, Oda et al., 2009)と、D-loop領域の一部がαヘリックス構造をとっている構造(PDBID 1J6Z, Otterbein et al., 2001)を初期構造としてモデル構築したところ、D-loop領域がαヘリックス構造をとる方が、密度マップを良く説明する事がわかった。また、D-loop領域は、繊維軸方向のアクチンサブユニット間結合に寄与しなくなる事もわかった。このことから、コフィリンの結合によって、アクチン繊維の繊維軸方向のアクチンサブユニット同士をつなぐD-loopを介した結合が破壊され、D-loopはループ構造からαヘリックス構造へと構造相転移する事が強く示唆された。コフィリンの作用機構において、D-loopがαヘリックス構造をとる事に重要な意義がある可能性がある。また、少なくともコフィリンが結合した場合にはD-loopはαヘリックス構造をとりそうだとわかった事は、アクチン研究における進展である。コフィリンが飽和結合したアクチン線維(以下、cofilactin線維)の極低温電子顕微鏡像の単粒子解析により、現在までに7.3オングストローム分解能(Fourier shell correlation値0.143)の3次元密度マップを得ることに成功した。次に、密度マップに対する蛋白質構造のフィッティングを行い、構造・相互作用の議論が可能な原子構造モデルを構築した。フィッティングには全原子分子動力学法による計算を利用した。原子構造モデルから考察できた事を以下に述べる。まず、cofilactin線維において、アクチンのD-loop領域は、ループからヘリックスへの構造転移を起こすことを発見した。しかしヘリックス化するものの分子間の相互作用には全く関わらないため、分子間相互作用に都合の良いようにフォールドするわけではない。仮にループ構造をとったものと比較をしてみると、ヘリックス構造の方が分子内での原子間相互作用が増えるため、エンタルピー的により安定であると示唆された。また、D-loopは疎水的領域であり、ヘリックス化することで疎水性溶媒接触表面積が大きく減少するため、疎水効果の観点からエネルギー的に有利である。このことから、D-loopのヘリックス構造転移は、コフィリンの結合によって相互作用の相手を失ったD-loopが、エネルギー的に有利な方向へ変化した結果ヘリックス化したものと解釈している。また、裸のアクチン線維では分子間相互作用に参加しない荷電残基が、cofilactinでは塩橋に参加していることを確かめた(サブユニット間相互作用のリモデリング)。アクチン結合蛋白質が存在する下でのアクチン線維構造多形機構の仕組みの一つと理解できる。このように、本研究の結果から、cofilactin線維構造を安定化する構造基盤を理解できた。