hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Lyt-2ならびにLyt-3遺伝子の構造解析と機能発現

申請者らはCD8α鎖(Lyt-2)について研究を続けてきたが、今回の一連の仕事によってCD8のもう一つの構成蛋白であるLyt-3をコードする遺伝子を単離し、その全構造を明らかにすることができた。さらに遺伝子レベルのホモロジーからいままで存在しないと考えられていたヒトのCD8β鎖の存在を証明し、マウスとヒトのCD8の遺伝子のほぼ全容を明らかにすることができた。CD8β鎖に関してマウスとヒトで共通していることはともに免疫グロブリンあるいはT細胞レセプターのVあるいはJ領域様の構造をもち、免疫グロブリン多重遺伝子族のメンバーであること、しかしVとJ領域様の構造はともに同一のエクソンでコードされていて遺伝子の再構成は必要としないこと、トランスフェクションの実権からβ鎖の発現はα鎖の発現に依存していることである。一方、CD8α鎖とβ鎖のin vivoでの発現を比較するとマウスではα鎖とβ鎖は常に一緒に発現されているのに対し、ヒトでは一部の細胞でα鎖だけが発現されている。NK細胞のマーカーであるLeu-19抗体で多重染色を行うとNK細胞ではβ鎖は全く発現されていないが、一部のNK細胞はα鎖だけを弱く発現していることが明らかになった。またアミノ酸レベルのホモロジーを計算するとヒト・マウスとともにα鎖とβ鎖の間のホモロジーは低く約23%であるがα鎖どうし、あるいはβ鎖どうしではヒトとマウスで約50%のホモロジーがあることも明らかになった。CD8遺伝子の機能発現系として現在もっとも可能性のある方法は機能的T細胞のクローンをCD8α鎖あるいはCD8β鎖をトランスフェクションしたBW5147と細胞融合させて機能の変化をみるシステムである。今後さらに検討を続け、より優れた機能発現系を開発したい。昨年度クローラングしたマウスCD8(LYT-3)CDNAをプローブとしてマウス染色体遺伝子ライブラリー(B10.Aマウス由来, LYT-3.2のアレルを持つ)をスクリーニングし, LYT-3をコードするゲノム遺伝子を単離した.この遺伝子のDNA塩基配列を決定してCDNAの,塩基配列と比較することによりLYT-3をコードする遺伝子が, 1)リーダー部,2)免疫グロブリンV領域ならびにJ領域様の構造を持つ部分,3)ヒンジ様部,4)膜通過部, 5)二つの細胞実質内部をコードするエクソンの合計6個のエクソンより構成されていることを明らかにした. LYT-3はV領域ならびにJ領域様の構造を持つことから免疫グロブリン多重遺伝子族のメンバーであると考えられるが,ゲノム遺伝子上でVとJ領域様の部分が同一のエクソン上にあるという事実は免疫グロブリン祖先遺伝子にはVとJの間には介在配列は存在せず,その後に起こったトランスポゾン様DNA断片の挿入を回復するかたちで,免疫グロブリンやT細胞レセプターで見られるような遺伝子再構成が始まった可能性を示唆する重要な所見である.同様にAKRマウスよりゲノムセイブラリーを作成し, LYT-3,1遺伝子もクローニングcDNA塩基配列を決定してLYT-3, 2と比較し77番のArgがSerに置換されていることを明らかにした.またLYT-2, LYT-3,免疫グロブリンK軽鎖の遺伝子は6番染色体上で連鎖していることが知られている.スタンフォード大学のG.Chuより彼らが開発した最も新しいタイプのPulseField Gelの設計図を入手し作製した.現在この装置を使って三者の染色体上での距離を測定中である.また今までは存在しないと考えられていたヒトのLYT-3相同分子をコードするCDNAならびにCD8と同様にT細胞に特異的に発現されるCD2遺伝子をコードするcDNAも単離しその構造を明らかにした.

1)マウスCD8β鎖遺伝子の構造解析Lyt-3ゲノム遺伝子を単離し、そのDNA塩基配例を決定し、cDNAの塩基配列と比較することによって以下のことが明らかになった。a)Lyt-3遺伝子に約14kbで6個のエクソンと5個のイソトロンよりなっている。b)免疫グログリンV、J-領域様の構造は同一のエクソンよりコードされていて遺伝子の再構成を必要としない、c)Lyt-3、1とLyt-3、2のアロ抗原決定基は第2エクソンにある1塩基の違いによってもたらされるアルギニン(Lyt-3、2)とセリン(Lyt-3、1)の違いによるものであると考えられる、d)Lyt-3遺伝子の転写開始領域にはCATbox、TATAboxはなく、代わりにGCboxが存在していること、さらに上流にはT細胞レセプター遺伝子や免疫グロブリン遺伝子で報告されているエンハンサーモチーフが存在する、e)Lyt-3の発現はLyt-2に依存している。2)ヒトCD8β鎖の解析ヒトβ鎖をコードする遺伝子の解析からa)ヒトCD8β鎖もマウスと同様免疫グロブリンVならびにJ領域様の構造を持ち、同一のエクソンでコードされていること、b)alternative splicingにより少なくとも5種類の異なるタイプのcDNAが存在すること、c)末梢血中で一部の細胞はCD8α鎖だけを発現していること、d)NK細胞はCD8β鎖を発現していないこと、e)マウスLyt-3同様、ヒトCD8β鎖の発現もα鎖の発現に依存していることが明らかになった。
交感神経と局所RAASをターゲットとした脳心腎・糖代謝連関に対する治療法の開発

本研究では、「交感神経・腎内局所レニン・アンジオテンシン系(RAS)・SGLT2」に着目し、脳心腎・糖代謝連関における役割や関連を明らかにすることを目的とした。様々なモデル動物や培養細胞実験の遂行により、肥満や糖尿病の病態においては「脳心腎・糖代謝連関」が存在していること、交感神経・腎内局所RAS・SGLT2がこのような病態に密接に関与していること、それらが肥満や糖尿病で生じる合併症の進展に寄与していることなどを明らかにした。これらの研究結果より、交感神経・腎内局所RAS・SGLT2が、肥満・糖尿病で生じる合併症に対する新しい治療ターゲットとなることが示唆された。本研究期間の3年間では、「交感神経・腎内局所RAAS・腎尿細管SGLT-2」に着目し、「脳心腎・糖代謝連関」における役割や関連を明らかにすることを到達目標としている。まず初年度では、糖代謝異常が生じる初期段階において、SGLT-2がどのように「糖体内循環異常との関連」に関わっているのかについて検討した。実験は、食塩(1%NaCl飲水)を投与した肥満OLETFラットを使用して、SGLT2阻害薬の効果について検討した。その結果、高食塩摂取した肥満ラットでは、血糖値に異常は生じていないものの、腎尿細管でのSGLT2発現が増加し、インスリン抵抗性を伴った血圧の日内変動が欠損した高血圧(non-dipper型高血圧)を生じた。これに対してSGLT2阻害薬を投与すると、腎尿細管のSGLT2の発現減少を伴った著明な尿糖とインスリン抵抗性の改善が見られた。非常に興味深いことに、SGLT2阻害薬はナトリウム利尿を生じて、血圧の日内変動を正常化して高血圧の発症を抑制することが明らかとなった(dipper型正常血圧)。さらに、SGLT2阻害薬はナトリウム利尿を生じるにもかかわらず、レニン・アンジオテンシン系を活性化させなかった。最近、non-dipper型高血圧が脳心血管・腎イベントの大きなリスク因子であることが証明されていることから、糖代謝異常の病態では合併症として生じる「脳心腎・糖代謝連関」の病態に、SGLT2が深く関わっている可能性が示された。本研究結果の一部は、すでに国内外学会で発表され、現在、学術論文の投稿準備中である。一方で現在、肥満からメタボリックシンドロームの病態になったモデル動物であるSHR/NDmcr-cp(+/+)において、SGLT2阻害薬による効果の検討を開始している。本研究期間の3年間では、「交感神経・腎内局所RAS・腎尿細管SGLT2」に着目し、「脳心腎・糖代謝連関」における役割や関連を明らかにすることを到達目標としている。初年度では、糖代謝異常が生じる初期段階において、肥満で生じるインスリン抵抗性に伴って脳心腎の組織障害を生じるモデルラットにおいて、腎臓尿細管におけるSGLT2の発現が著名に増加していることを見いだした。さらに、その原因として、腎交感神経活性化が強く関与していることを明らかにした。次年度では、肥満でインスリン抵抗性を生じるOLETFラットに食塩を負荷したモデルを使用し、観察される血圧の日内変動の欠損をともなったnon-dipper patternの血圧上昇に対してSGLT2阻害薬を投与すると、血圧の日内変動の正常化を伴った血圧低下を生じることを証明した。一方、すでに血圧が上昇しているメタボリックシンドロームモデル動物であるSHR/NDmr-cp(+/+)においても、SGLT2阻害薬の投与が血圧の日内変動の正常化を伴った血圧低下を示した。さらに興味深いことに、このような血圧に対するSGLT2阻害薬の作用は、利尿薬と極めて類似しており、実際、尿中のナトリウム排泄の増加を伴っていた。そこで最終年度では、SGLT2阻害薬の尿細管に対する作用について、詳細なメカニズムを検討することを目的とした。平成26・27年度に予定していた研究は順調に推移し、複数の国内外の学会発表と、4報の英文学術誌への論文を投稿している(うち2報がin-press)。また、これが研究の中で予想を上回る新しい病態メカニズムの解明につながる成果も得ていることからも、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。培養細胞を使用した実験については、SGLT2が十分に発現しているヒト近位尿細管細胞が見つからず、マウスの近位尿細管細胞を入手して実験を進める。本研究では、「交感神経・腎内局所レニン・アンジオテンシン系(RAS)・SGLT2」に着目し、脳心腎・糖代謝連関における役割や関連を明らかにすることを到達目標としている。初年度では、肥満で生じるインスリン抵抗性に伴って脳腎腎の組織障害を生じるモデルラットにおいて、糖代謝異常が生じる初期段階に腎尿細管SGLT2の発現が著名に増加していることを見いだした。さらに、その原因として、腎臓の交感神経の活性化が強く関与していることを明らかにした。次年度では、肥満でインスリン抵抗性を生じるラットに食塩を負荷した動物モデルを使用して、観察される血圧の日内変動の欠如を伴ったnon-dipper patternの血圧の上昇が、SGLT2阻害薬の投与により、完全に抑制されることが明らかとなった。同様に、血圧の日内変動の欠如を伴ったnon-dipper patternの高血圧を呈するメタボリックシンドロームモデルSHR/ND-cp(++)ラットに対してSGLT2阻害薬を投与すると、血圧の日内変動の正常化を伴った血圧低下を示した。さらに興味深いことに、このようなSGLT2阻害薬の降圧作用は、利尿薬と極めて類似しており、実際、尿中ナトリウム排泄量の増加を伴っていた。

最終年度では、SGLT2阻害薬の尿細管に対する直接作用を検討したところ、SGLT2阻害薬は非糖尿病ラットに対して、腎血行動態の変化を介することなく、尿細管に直接作用してナトリウム利尿効果を示すことが明らかとなった。さらに、SGLT2阻害薬はナトリウム利尿効果を介して、交感神経の抑制作用を示すことも明らかとした。このように、肥満や糖尿病の病態において、「脳心腎・糖代謝連関」が存在しており、交感神経・腎内局所RAS・SGLT2がこのような病態に密接に関与していることにより、肥満や糖尿病で生じる合併症の進展に寄与しているものと考えられた。本研究では、「交感神経・腎内局所レニン・アンジオテンシン系(RAS)・SGLT2」に着目し、脳心腎・糖代謝連関における役割や関連を明らかにすることを目的とした。様々なモデル動物や培養細胞実験の遂行により、肥満や糖尿病の病態においては「脳心腎・糖代謝連関」が存在していること、交感神経・腎内局所RAS・SGLT2がこのような病態に密接に関与していること、それらが肥満や糖尿病で生じる合併症の進展に寄与していることなどを明らかにした。これらの研究結果より、交感神経・腎内局所RAS・SGLT2が、肥満・糖尿病で生じる合併症に対する新しい治療ターゲットとなることが示唆された。平成26年度に予定していた肥満OLETFラットにおけるSGLT2の動態に関する実験を完了し、予定を前倒しして、SGLT2阻害薬の実験を開始している。さらに、肥満からメタボリックシンドロームの病態になったモデル動物であるSHR/NDmcr-cp(+/+)におけるSGLT2阻害薬の効果についても、合わせて検討を開始した。このように、予定していた一部の測定項目は評価が完了していないものの、実験全体としては概ね順調に経過しているものと考える。尚、すでに実験結果の一部は国内外の学会にて報告され、現在、学術論文の投稿準備中であることからも、概ね順調に研究が進んでいると言えるのではないかと考える。最終年度ではSGLT2阻害薬の尿細管に対する作用について詳細なメカニズムを検討することを目的とし、前年度既に開始している麻酔したラットにおける腎クリアランス法を用いた研究を引き続き実行する。SGLT2阻害薬の急性静脈内投与によって生じる、腎血行動態と尿細管への影響を検討する。実験は正常ラットと5/6腎摘したラットの両方で行う。培養細胞を使用した実験については、SGLT2が十分に発現しているマウスの近位尿細管細胞を入手して実験を進める。SGLT2の発現を確認した後、高血糖やSGLT2阻害薬投与による細胞のフェノタイプの変化、各種パラメーターの変化について検討する。一方、臨床研究においてSGLT2阻害薬の腎保護作用が指摘されているので、動物実験モデルを用いて、これを検証する。使用する動物モデルは、腎虚血再還流モデルマウスと5/6腎摘したラットである。後者については、腎臓内レニン・アンジオテンシン系の変化についても併せて検討する。薬理学すでに検討を開始している肥満からメタボリックシンドロームの病態になったモデル動物であるSHR/NDmcr-cp(+/+)においての、SGLT2阻害薬による効果を検討する。
ジアルデヒドと有機ケイ素求核剤の反応による新規ポリエーテルの合成

ポリエーテルは高分子化学、材料科学の分野において重要な高分子の1つである。その代表的な合成法は環状エーテルの開環重合、Williamsonエーテル合成、フェノール類の酸化重合等が知られているが、これらの重合に用いられる原料(モノマー)の種類はかなり限定されている。本研究では側鎖官能基を有するポリエーテルの新規合成法としてジアルデヒド、ジオールジシリルエーテルおよび有機ケイ素求核剤の3成分系による重合を検討した。1.アリルシランを用いた側鎖アリル基を有するポリエーテルの合成ジアルデヒド、ジオールジシリルエーテル、およびアリルシランを塩化メチレン中、触媒量の過塩素酸トリチル存在下反応させた結果、主鎖はジアルデヒドとジオールジシリルエーテル由来のポリエーテル構造および側鎖はアリルシラン由来のアリル基を有する高分子が得られた。電子求引基を有するジアルデヒドを用いたとき、最も分子量の高いポリエーテルが得られた(Mn=22000)。この高分子は反応性基であるアリル基を有するため架橋反応も検討した。その結果、80°Cbulk条件下でも一部架橋するが、AIBN存在下エタンジチオールとの反応では定量的に架橋ポリマーが生成した。2.トリメチルシアニドを用いた側鎖シアノ基を有するポリエーテルの合成アリルシランの代わりにトリメチルシアニドを用いて1.と同様に反応させた結果、主鎖はジアルデヒドとジオールジシリルエーテル由来のポリエーテル構造および側鎖はトリメチルシアニド由来のシアノ基を有する高分子が得られた。
小胞体膜トランスロコンにおけるタンパク質膜透過の動態

細胞には各種オルガネラ膜が存在し,それぞれ特定のタンパク質が局在化して,オルガネラ固有の機能を発揮している。小胞体は真核細胞内の分泌系オルガネラに存在するタンパク質の合成,膜透過および膜組み込みを担っている。これらの多彩な機能は,小胞体のトランスロコンとよばれるタンパク質膜透過装置によって実現されている。またこのトランスロコンを介した膜蛋白質の構造形成に正荷電アミノ酸残基が寄与することが報告されてきた。私はこれまでに正電荷が膜透過抑制作用を持つことを発見してきた。さらにこの作用は内腔側の糖鎖付加によって抑制され,正電荷部分も膜透過することを見出した。現在のところ,正電荷による透過抑制,ポリペプチド鎖の正逆両方向へのゆらぎ,及び糖鎖による方向性付与のバランスによって,ポリペプチド鎖の動きが決まると考えている。24年度はこれまでの研究成果をもとに,真核細胞小胞体膜におけるタンパク質膜透過機構について,正電荷の作用と順逆両方向への駆動機構に絞ってさらに展開した。真核細胞小胞体での膜透過は合成と共役したかたちで起こる。すなわち,合成によるポリペプチド鎖の伸長が駆動力となると考えられてきた。しかし,正電荷による膜透過抑制の研究において,合成完了後に起こる正逆両方向へのポリペプチド鎖の動きが見られ,そのトランスロコンを介した動きは様々な駆動様式が関わる事が示唆された。そこで正電荷の抵抗を克服して膜透過するモデルを構築し,それに基づいて系統的モデルタンパク質のふるまいを解析した。それにより膜透過が完了し内腔に存在する上流配列によって膜透過挙動が異なることを明らかにした。その順方向への駆動には二価イオンを必要とする細胞質側因子の存在も示唆された。さらに正電荷によりポリペプチド鎖が逆方向へも動きうることが確認できた。これは真核細胞小胞体の膜透過において新たな概念を提唱するものである。以上の内容は論文投稿直前の状態である.細胞には各種オルガネラ膜が存在し,それぞれ特定のタンパク質が局在化して,オルガネラ固有の機能を発揮している。23年度はこれまでの研究成果をもとに,真核細胞小胞体膜におけるタンパク質膜透過機構について,正電荷の作用と順逆両方向への駆動機構に絞ってさらに展開した。

その順方向への駆動には二価イオンを必要とする細胞質側因子の存在も示唆された。さらに正電荷によりポリペプチド鎖が逆方向へも動きうることが確認できた。これは真核細胞小胞体の膜透過において新たな概念を提唱するものである。以上の内容は論文投稿直前の状態である.正電荷単独による透過特性は論文発表することができ,また膜透過に対するコレステロール効果も2012年4月に論文発表できた。膜透過駆動に関する様々なデータが得られているが,リボソーム効果に関する明確なデータが得られていない。早急に実験を行う予定である。リボソーム効果を明らかにするために,直ちに大腸菌,小麦胚芽,昆虫,ウサギ等それぞれ異なる種のタンパク質合成系で膜透過を測定する。また、リボソームと膜(トランスロコン)間の作用を環境選択的化学反応により精査し、膜透過への関与を調べる。これらと膜透過駆動に関わるデータをまとめ,前方への一方向的な輸送に必要な条件を考察し,それに基づいてモデルタンパク質の膜透過駆動様式を発表する。このモデルにはブラウン運動,糖鎖ラチェット作用も関わっておるため,物理科学分野の「ゆらぎ」へのモデル提案も努力目標とする。これらを基盤として,それぞれの作用の分子レベルの機構について実験を進める。まずは一分子観察系の設定。蛍光アミノ酸導入や,膜透過実験条件を整備する。蛍光分光装置を用いてアンサンブル系での測定を試みる。同時に,全反射顕微鏡に関する実験技法の習得に努める。最終的に一分子観察を実行する。
生体ハイドロジェノミクスの理論解析

ヒドロゲナーゼは水素酸化とプロトン還元を可逆的に触媒する酵素であり、その反応メカニズムの学術的な興味もさることながら、水素分子の貯蔵・生産を可能にするバイオエネルギー源としても大変魅力的な研究対象である。実験で多くのことが解明されているものの、その詳細に関しては未知の部分も多く残されており、理論研究により相補的な情報を提供することが本研究の役割である。
切り欠きを導入した凍結魚肉の破断応力に及ぼす歪み速度の影響

本研究では、凍結魚肉の切断(破断)に必要な荷重(応力)を減じる因子(切り欠きの導入、変形速度の変化)の効果を定量的に明らかにすることを目的とした。マグロの赤身肉から筋繊維の配向方向をコントロールした試験片を作成し、曲げおよび引っ張り試験を、-190,-130,-100,-80,-50,-20°Cにおいて行った。このとき、切り欠きの導入の有無、切り欠きの先端の鋭さ、試験片の変形速度をパラメータとして、試験片の破断応力を測定し、同時に、破断面の滑らかさ(粗さ)を評価した。さらに、切り欠き導入による破断応力の低減効果を定量的に明らかした。切り欠きの導入に伴なう破断応力の低減効果は、測定した全ての温度で認められたが、温度の低下とともにその効果は増加し、-100°C以下でほぼ一定となった。また、切り欠き先端の角度を鋭角にするほど、試験片の破断に必要な応力は減少した。この現象を材料力学における応力集中問題として解析したところ、解析的に得られた破断応力は、実測値と良好に一致した。破断面の滑らかさ(粗さ)を、破談面の最も高い凸部分と最も低い凹部分の高さの差(δ)として評価した。その結果、切り欠きが無い試験片では、試験片ごとのδの偏差が大きく(δ=3.8±1.7mm)、破談が不安定に起こっていることが明かとなった。一方、切り欠きを導入した試験片では、δはほぼ一定(δ=1.0±0.3mm)となり、切り欠き先端からクラックが安定して成長し、破断に至っていることが明かとなった。変形(歪み)速度の影響に関しては、本研究で行った条件(1.00.8mm/min)では、破断応力の低減効果は認められなかった。
肝炎発症機構の免疫学的解析と治療のための薬物運搬用高分子材料の開発

申請書はこれまでに、肝実質細胞上に発現し、肝炎の発症に重要な役割を果たしていると思われる接着因子を同定してきた。たとえば、これまで内皮細胞や上皮細胞に特異的に発現していると考えられてきたICAM-1やVCAM-1が肝実質細胞上にも発現すること、またこの発現が、炎症性リンホカインと呼ばれるIL-1、TNFa、IFN-gなどによって、正の制御を受けていることを明らかにした。さらにこれらの接着因子は標的細胞である肝細胞とエフェクター細胞であるリンパ球との接着に完全に機能的に働いていた。特に非活性化状態のリンパ球と肝細胞はICAM-1とVCAM-1の両方を利用して接着しているのに対し、活性化したリンパ球は主としてICAM-1を介して肝実質細胞と接着していた。また、ICAM-1の発現を誘導するIFN-gは同時に肝細胞に直接の障害性を持つという意外な事実も明らかになった。興味深いことにこの障害性は肝細胞増殖因子であるHGFによって、阻害される。これらの知見は肝臓において、巧妙なサイトカインのネットワークが機能していることを意味している。これらのネットワークが破綻した際に肝炎などの臓器障害が引き起こされるものと考えられる。
ゴンドワナ大陸の北進に伴う東南アジアの地質構造発達史と古生物地理的変遷

当該年度は前年度に得られた資料によって生じた問題点の探求と,新たな計画による地域での野外調査を重点的に行った。1.タイ国に関しては北西部,東北部,ならびに半島部南部の3地域の野外調査を計画通りに行った。(1)北東部は主としてチェンマイの北部地域が対象で,前年度に新たに見いだしたファング・チャート層中の放散虫化石による,ペルム系と三畳系の境界に関して,微化石研究のための詳細なサンプリングを行った。また境界付近に特徴的に介在する黒色頁岩中には,露頭でも異臭を放つ程度に硫化物が濃縮していることを突き止め,硫黄同位体比の検討など地球化学的研究の必要性から新たなサンプリングを行った。また三畳紀チャート中には特異な岩相を示す放散虫岩が介在していることが明らかになり,興味ある堆積学的な見解が得られる見通しがついた。これらの資料について室内研究が進展するとファング・チャート層の時代論の解析と共に,構造発達史,特にシブマス地塊とインドシナ地塊の衝突の時期について決着がつく解が得られるものと見られる。(2)東北部はロエイ南部やワンサプーン地域での石炭系・ペルム系境界付近の石灰岩層の詳細なサンプリングならびに層序の検討を行った。これに関しては新たな露出を数カ所で発見し,かなり精度の高いフズリナならびに小型有孔虫による化石層序が樹立される見通しが得られた。この地域で高い分解能のフズリナ化石帯で石炭系・ペルム系が連続的に石灰岩中に近い将来確認されるものと期待される。(3)半島南部はサムイ島やハジャイ周辺地域のペルム系ラトブリ石灰岩のサンプリングが主体であったが,石灰岩がかなり熱変質を受けており,化石の鑑定は極めて困難であるがウミユリ片に富む石灰岩など岩相上の特徴についての新知見を得ることができた。2.マレーシア国に関しては北西部,半島中央部ならびに東部地域の調査を行った。主要な研究対象はセマンゴール層中にペルム系・三畳系の境界を見いだすことや,シブマス地塊と東マラヤ地塊の衝突時期に関する資料があると見られるベントン-ラウブ構造線の珪質岩の時代論に関する資料の収集であった。(1)北西部はアロスター東方地域が主体で,三畳系とされていたセマンゴール層の時代に関する再検討が主体であった。今回は新たに数地点でチャート層の好露出を見いだして,詳細なサンプリングができた。このため室内研究が進展すると多くの新知見が得られるものとみられ,同層の時代論が詳細に判明するであろう。さらにマレーシア・タイ両国の国境付近で新たに建設されたダムの周辺部から,ペルム紀の特徴的なフズリナ化石を含む石灰質砂岩が見いだされ,古生物地理区を考察する上での新事実が得られた。(2)半島中央部はベントン-ラウブ構造線沿いの地域での珪質岩ならびに泥質岩のサンプリングを行ったが,この地域は深層風化作用がかなり進んだものが多いが,肉眼でも識別可能な放散虫化石が数地点で得られた。さらにカンポングアワ-など古くからペルム紀石灰岩体を含む地層に関しても,多くの資料を得ることが出来た。(4)半島中央部から東部にかけての地域では,クアンタン東北方のブキットチャラスなどの下部石炭系の石灰岩体から小型有孔虫やコノドント化石の採集を行い,新たに採石場も開発されていた関係から,良好な地質断面の計測とサンプリングができた。3.室内研究室内研究は現在鋭意続行中であるが,野外調査が11月から12月にかけてであり,採集品の到着後間もないこともあって,未だ十分な成果が得られているわけではないが,すでに開始したタイ国北西部のものに関しては,多くの三畳紀ならびにペルム紀の放散虫,コノドントなどの微化石の抽出に成功しており,時代論に関する新たな資料が蓄積されつつある。

(3)半島南部はサムイ島やハジャイ周辺地域のペルム系ラトブリ石灰岩のサンプリングが主体であったが,石灰岩がかなり熱変質を受けており,化石の鑑定は極めて困難であるがウミユリ片に富む石灰岩など岩相上の特徴についての新知見を得ることができた。2.マレーシア国に関しては北西部,半島中央部ならびに東部地域の調査を行った。主要な研究対象はセマンゴール層中にペルム系・三畳系の境界を見いだすことや,シブマス地塊と東マラヤ地塊の衝突時期に関する資料があると見られるベントン-ラウブ構造線の珪質岩の時代論に関する資料の収集であった。(1)北西部はアロスター東方地域が主体で,三畳系とされていたセマンゴール層の時代に関する再検討が主体であった。今回は新たに数地点でチャート層の好露出を見いだして,詳細なサンプリングができた。このため室内研究が進展すると多くの新知見が得られるものとみられ,同層の時代論が詳細に判明するであろう。さらにマレーシア・タイ両国の国境付近で新たに建設されたダムの周辺部から,ペルム紀の特徴的なフズリナ化石を含む石灰質砂岩が見いだされ,古生物地理区を考察する上での新事実が得られた。(2)半島中央部はベントン-ラウブ構造線沿いの地域での珪質岩ならびに泥質岩のサンプリングを行ったが,この地域は深層風化作用がかなり進んだものが多いが,肉眼でも識別可能な放散虫化石が数地点で得られた。さらにカンポングアワ-など古くからペルム紀石灰岩体を含む地層に関しても,多くの資料を得ることが出来た。(4)半島中央部から東部にかけての地域では,クアンタン東北方のブキットチャラスなどの下部石炭系の石灰岩体から小型有孔虫やコノドント化石の採集を行い,新たに採石場も開発されていた関係から,良好な地質断面の計測とサンプリングができた。3.室内研究室内研究は現在鋭意続行中であるが,野外調査が11月から12月にかけてであり,採集品の到着後間もないこともあって,未だ十分な成果が得られているわけではないが,すでに開始したタイ国北西部のものに関しては,多くの三畳紀ならびにペルム紀の放散虫,コノドントなどの微化石の抽出に成功しており,時代論に関する新たな資料が蓄積されつつある。当該年度は予定通りタイ国,マレーシア国,シンガポール国で野外調査を行い,多くの古生物学的資料を採集し層序等を検討した。採集品の室内研究は進行中であるが,現在までに判明した主な点は下記の通りである。タイ国北西部:Fang Chert層中に放散虫化石からペルム紀/三畳紀の境界が見いだされ,詳細な微古生物学的ならびに同位体地質学的な研究が鋭意行われている。これは東南アジア地域で始めて確認された遠洋性堆積岩中での境界である。また石炭紀中部・上部のフズリナ化石帯を含むセクションが新たに確認された。これはRaburi Limestoneの堆積年代についての新資料となる。タイ国中部ペッチャブン地域:保存良好なフズリナ化石や珊瑚化石が古カルスト堆積相を示す石灰岩層に見いだされ,上部石炭系と下部ペルム系に関する多くの古生物学的な情報が得られる見通しである。タイ国半島南部:三畳系の石灰岩層中の化石内容が明確になると共に,ペルム系との境界問題が解決できるとみられる多くの古生物学的資料が得られた。また三畳系上部にみられる礁性石灰岩の化石内容は古生物地理的に新資料で注目される。マレーシア国ランカイ島:中部古生界に関する多くの微化石資料が収集されている。また石炭系下部層からも新たに多くの微化石資料が追加された。
ピグー貿易論の経済学史的および現代的再検討

本研究の目的は、マーシャルからピグーへの貿易論の継承および現代貿易論への示唆の観点から、ピグー貿易論を再検討することである。研究成果を総括すると以下の通りである。第一に、ピグーはマーシャルの各種文献に言及するだけでなく、マーシャル流の弾力性概念に基づいて貿易を分析し、さらにはマーシャル貿易論の応用も試みた。こうして、ケンブリッジ学派における貿易論の継承関係が明らかになった。第二に、ピグーは国際関係や国内政治の観点からも、関税を分析した。つまり、経済理論だけでなく実践にも即して、貿易を研究する必要性をピグーが示したと言える。まず、本研究の基礎となる後期ピグーの貿易論を『財政の研究』の中から導出し、それを整理することに努めた。特に、初版・第2版と、第3版との間では論じられる内容に目に見える違いがあるので、その点に注意して、理論的な内容、政策の方向性に関する内容、ピグーに影響を与えたマーシャルの議論と関連する内容にそれぞれ分類して、ピグー貿易論を整理した。また、内外の先行研究の収集・整理を行った。ピグーの経済学がマーシャルの影響を受けていることは、周知の事実である。貿易論についても、同様に解釈するのが一般的である。とりわけ、両者が20世紀初頭の関税改革論争において共に自由貿易陣営に属したこと、その自由貿易擁護の立場がマーシャルがピグーに教授職を譲った理由の一つとして解釈されていることなどに、貿易論における両者の関係性が見出されてきた。他方で貿易論において、具体的にどの点にその影響を見出すことができるのか、についての研究は不十分だった。しかし本年度の研究によって、ピグーが種々の「弾力性」を用いた分析の方向性を示したこと、マーシャルの貿易論の主著である『貨幣信用貿易』をベースにした貿易論の構築を模索したこと、などが明らかになった。ここに、貿易論における両者の直接的影響関係を見出すことができる。併せて、マーシャルの経済学を現実に応用しようとするピグーの模索が垣間見える『マーシャルと現代思想』に基づいて、マーシャルに対するピグーの評価の一端を明らかにした。そして、マーシャルの「弾力性」概念をピグーが高く評価したことが分かった。これらから、ピグーがマーシャルの「弾力性」概念を継承して、それを貿易論に応用することを目指した点に後期ピグー貿易論の特徴がある、と考えられる。本研究によって、20世紀前半の自由貿易論の発展過程、およびケンブリッジ学派経済学の継承過程の一端を理解することが可能となる。本年度の主たる研究課題は、(1)後期ピグー貿易論の整理、および(2)貿易論におけるマーシャルからピグーへの直接的影響関係の有無の確認、であった。(1)については、全体としてはおおむね達成したと言える。特に、主な研究対象となる『財政の研究』各版の収集、ピグーの主著である『厚生経済学』各版の収集、それらにおける貿易に関する議論の有無の確認、その内容の把握などは、それぞれ比較的順調に行われた。他方で、主要著作以外に含まれるかもしれない、貿易に関する種々の研究についての収集・整理については、次年度以降も継続して行う必要がある。(2)についても、全体としておおむね達成したと言える。特に、平成28年度に行う予定であった『マーシャルと現代思想』の分析を、先行して進めることができた。しかし、『ピグー全集』を含めた、上記以外の文献の収集・整理は完了していない。それゆえに全体としては、現時点では、研究はおおむね順調に進展している、と結論付けられる。まず、本研究の基礎となる後期のピグー貿易論の特徴をさらに明らかにするために、『財政の研究』各版における議論の相違点の整理に努めた。また、『実践における経済学』および『所得』などの経済学入門的な著作における貿易に関する議論を整理し、貿易や関税と実際の経済政策との関連性が論じられていることを明らかとした。これらの研究を通して、20世紀初頭の関税改革論争において見られたピグーの貿易に対する関心が、『厚生経済学』以降も継続していたことが分かった。ピグー貿易論に対するマーシャル貿易論の影響を解明するためにまず、マーシャル貿易論の代表的文献である「国際貿易の財政政策に関する覚書」、『貨幣信用貿易』における自由貿易論を整理した。その上で、両者の貿易論の特徴を明確にした。とりわけ、マーシャル流の「弾力性」概念を用いたピグーの貿易分析に鑑みて、ピグーがマーシャル貿易論の妥当性を特に数式を用いて評価しようとした点が分かった。また、ピグーによる「代表的梱」や「弾力性」を用いた理論的分析および英国の現状認識の表明に鑑みて、マーシャルからピグーへの貿易論上の直接的影響が見出されることを明らかにした。そしてピグーによる関税の道徳的側面に対する言及にはマーシャル貿易論からの間接的影響が見出されることを明らかにした。さらに、ピグー経済学の特徴である「実践的な経済学」と貿易論との関係、厚生経済学と貿易論との関係を導出することに努めた。本年度の研究によって、経済政策への実践を意識したピグー経済学の様相、後期の貿易論における厚生経済学第1・第2命題の視点の存在、理論および実践に基づく英国の関税導入の不必要性の表明、などの特徴が分かった。本年度の主たる研究課題は、(1)後期のピグー貿易論の特徴の解明、および(2)貿易論におけるマーシャルからピグーへの直接的・間接的な影響関係の有無の確認、であった。

(1)については、全体としておおむね達成したと言える。特に、『財政の研究』各版における貿易論の特徴の解明は比較的順調に行われた。結果として、初版と第3版との間で弾力性を用いた分析手法に複数の差異が存在すること、そして分析手法の差異の背景にドイツの賠償問題などの国際関係の変化が存在することなどの特徴が明らかとなった。また、『実践における経済学』や『所得』における貿易に関する議論の把握も、順調に行われた。(2)についても、全体としておおむね達成したと言える。特に、『財政の研究』を基にして、ピグー貿易論におけるマーシャル理論の継承と応用を析出する論文を執筆・投稿した。しかし、上記以外の文献にも、貿易に関するピグーの研究が存在する可能性がある。そのため、ピグー貿易論に関連する文献の収集・整理が完了したとは必ずしも言えない。それゆえに全体としては、現時点では、研究はおおむね順調に進展していると結論付けられる。最終年度は、実践経済学と貿易論との関連を研究した。特に、1930年に設置された経済学者委員会におけるピグーの議論に着目した。研究を通して、委員会での関税の議論においてピグーがケインズらの多数派と意見を異にした状況、ならびに関税に対する批判的な態度が初期と同様に1930年代においても保持されていたことがそれぞれ明確になった。また、ピグーが関税導入に反対した背景には、一国の関税が他国の関税を喚起するような関税戦争への危惧、関税を管理する政府に対する懐疑的な見解、関税に頼らない自国産業の発展の重視、などの側面があった。こうした各種の特徴に鑑みて、実践経済学を目指したピグーによる貿易論を改めて考察する意義があると想起されると同時に、現代貿易論への示唆を得ることが可能であろう。さらには、対照的な関税論を提起したピグーとケインズが、公共事業の効果に関して類似の立場を採用したことがより明確になった。これによって、戦間期のケンブリッジ学派の様相を一層理解することが可能となる。本研究は研究期間全体を通して、初期の関税改革論争以降のピグー貿易論、とりわけ厚生経済学形成以降の貿易論の特徴を導出した。第一に、ピグー貿易論には、マーシャルの『貨幣信用貿易』の議論に依拠する箇所がいくつも存在した。第二に、両者の貿易論には、弾力性に基づく分析を重視するという類似性があった。さらに、ピグーはマーシャル流の弾力性概念を継承するだけでなく、発展的な応用も試みた。こうした点に、マーシャルからピグーへの貿易論上の影響関係が見られる。第三に、貿易や関税に対するピグーの初期の関心はその後も、『財政の研究』やその他の入門的な著作を通して継続していた。総じて、ピグー貿易論の研究を通じて、理論と実践の双方から経済事象を分析する彼の姿が改めて浮き彫りになった。本研究の目的は、マーシャルからピグーへの貿易論の継承および現代貿易論への示唆の観点から、ピグー貿易論を再検討することである。研究成果を総括すると以下の通りである。第一に、ピグーはマーシャルの各種文献に言及するだけでなく、マーシャル流の弾力性概念に基づいて貿易を分析し、さらにはマーシャル貿易論の応用も試みた。こうして、ケンブリッジ学派における貿易論の継承関係が明らかになった。
精密粒度分布測定による抗菌薬の短時間殺菌能評価法の開発

抗菌薬の短時間殺菌能の新しい評価法として精密粒度分布測定の有用性を検証した。MRSA臨床分離株に対し、新規開発中の抗菌薬WAP-8294A2(以下WAP)とバンコマイシンを用いて、抗菌薬後短時間での生菌数の変化、精密粒度分布測定による菌径の変化などを評価した。その結果、WAP投与後短時間での生菌数の減少に一致して精密粒度分布測定での菌径の変化が確認され、短時間殺菌能の評価方法として精密粒度分布測定の有用性が示唆された。前年度は、精密粒度分布測定を用いた抗菌薬の短時間殺菌能の評価対象としてメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus;以下MRSAと略)の臨床分離株を用いて、新規開発中の薬剤WAP-8294A2(以下WAP)を含めて複数の抗MRSA薬作用後の精密粒度分布測定による菌径変化と生菌数カウントの評価を行った。その結果、従来の抗MRSA薬と比べてWAPでは、抗菌薬作用後短時間で菌径の変化が認められ、また実際の生菌数の減少に有意な相関を認めた。今年度は、まず、WAPに認められた作用後短時間での抗菌活性が溶液の蛋白濃度の影響を受けていなかったかを確認した。その結果、溶液にウシ胎児血清を加えた群では、加えなかった場合と比べて、MRSAの最小発育阻止濃度が有意に低下し、抗菌活性が増すことが判明した。一方で、精密粒度分布測定においては、血清添加群も非添加群も作用後5分の時点で菌径の変化を認め、有意な差は認めなかった。おそらく新規開発中の抗菌薬の短時間殺菌性のため、作用後5分では有意な差を捉えることができなかったものと考えられたが、血清を添加することでWAPの抗菌活性が増すことは他の抗MRSA薬では認められない新しい知見であった。次に、粒度分布測定で認められた菌径の変化が、実際に電子顕微鏡での形態変化と一致するかどうかを検証した。しかし、電子顕微鏡の検体準備過程における乾燥操作そのものが菌の形態を変えてしまう可能性があることが判明した。これについては、補助事業期間延長し、別の方法で形態変化を検証できないか検討中である。精密粒度分布測定を用いた抗菌薬の短時間殺菌能の評価対象として、まずは院内感染の原因菌の1つとして重要視されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus;以下MRSAと略)を用いた。また、短時間殺菌能の評価をより明確化するために、短時間に作用を発揮することが確認されている現在開発中の抗菌薬WAP-8294A2(以下WAP)、および現在市販されている各種抗MRSA薬であるバンコマイシン(VCM)、テイコプラニン(TEIC)、リネゾリド(LZD)、アルベカシン(ABK)を用いた。まずは、東北大学病院のMRSA臨床分離株約100株を用いて、WAPおよび各種抗MRSA薬の最小発育阻止濃度(minimum inhibitory concentration;以下MIC)を測定した。その結果、WAP、VCM、TEIC、LZD、ABKそれぞれの平均MIC値は、0.5μg/ml、2μg/ml、2μg/ml、2μg/ml、1μg/mlと算出された。次に、WAPおよびVCMを用いて、各々のMIC値の濃度で、作用後5分120分までの各タイムポイントにおいて、精密粒度分布測定による菌径の変化およびTime-killing assay法を用いた生菌数カウントを行った。精密粒度分布測定では、WAPでは作用後5分の時点から菌径の減少が認められたのに対し、VCMでは作用後120分の時点で有意な菌径の変化は認められなかった。一方で、生菌数カウントでは、菌径変化に一致して、WAPでは5分の時点で菌量が1/10001/10万へ減少したのに対し、VCMでは120分の時点で有意な生菌数の減少が見られなかった。これらはWAPやVCMの作用発現の特徴と合致しており、精密粒度分布測定での菌径変化が殺菌能評価として有用であることを示唆した。近年では薬剤耐性菌の問題が深刻化しているが、今ある抗菌薬を適切かつ上手に使用していくことは喫緊の課題であり、より有効な投与法を目指した研究が必要である。本研究では抗菌薬の短時間殺菌能に焦点を絞り、その総合的な評価法として精密粒度分布測定法を用いた抗菌薬投与後の病原菌の形態変化のリアルタイム解析の有用性を研究した。初年度は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の臨床分離株を用いて、短時間殺菌性が期待されている新規開発中の薬剤WAP-8294A2(以下WAP)およびおよび現在市販されている抗MRSA薬であるバンコマイシン(VCM)について、抗菌薬投与後の精密粒度分布測定による菌径変化と生菌数カウントの評価を行った。

その結果、VCMと比べてWAPでは、抗菌薬作用後極めて短時間で菌径の変化が確認され、また実際の生菌数の短時間での変化とも有意に相関していた。このことから、精密粒度分布測定での菌径変化が殺菌能評価として有用であることが示唆された。次年度は、WAPで認められた短時間での抗菌薬活性が溶液の血清蛋白濃度の影響を受けていなかったかをまず検証した。その結果、意外なことに、溶液中に血清蛋白を加えた場合には加えていない場合と比べてMRSAの生菌数が減少し、短時間での抗菌活性が増しており、精密粒度分布測定による粒径変化も伴っていた。この血清蛋白添加による変化は従来の抗MRSA薬では認められない新しい知見であった。次年度から最終年度にかけて、粒度分布測定で認められた菌径の変化が、実際の電子顕微鏡での形態変化と一致するかどうかを検証した。しかし、電子顕微鏡の検体準備過程における乾燥操作そのものが菌の形態を変えてしまうため、菌の形態変化の実際の確認までは至らなかった。感染症当初目標としていた電子顕微鏡による菌形態の実際の変化を捉えるには至らなかった。現在当施設で利用できる電子顕微鏡は検体を乾燥させる必要があり、乾燥の操作そのものが菌の形態を変えてしまうためである。これについては、従来の電子顕微鏡以外の方法で形態変化を捉える方法を引き続き検討している。また、細菌よりも乾燥による菌の形態変化の影響が少ないと予想される大型の酵母様真菌であるカンジダを用いて、短時間殺菌能の評価において、粒度分布測定による菌径の変化と電子顕微鏡による菌形態の変化を検討する必要がある。MRSAを用いた検討により、精密粒度分布測定の結果とTime-killing assayによる実際の生菌数カウント結果は一致していたことは確認された。しかし、当初目標としていた電子顕微鏡による菌形態の実際の変化を捉える段階までには至らなかった。その理由としては、現在当施設で利用できる電子顕微鏡は検体を乾燥させる必要があり、乾燥の操作そのものが菌の形態を変えてしまい、抗菌薬の影響なのか乾燥工程の変化なのか判別がつかないためであった。これについては、乾燥工程を要しない電子顕微鏡撮影を利用して検討する必要がある。来年度は、従来の電子顕微鏡以外の方法で菌形態の変化を捉えることができないか、アラマーブルー染色による評価なども含めて多角的に検討する予定である。また、MRSA以外にも、大型の酵母様真菌であるカンジダを用いて、抗真菌薬の短時間殺菌能を評価する予定である。今後は、まずは電子顕微鏡による菌形態の変化の確認をまず行う予定である。電子顕微鏡以外にもアラマーブルー染色による生菌数の評価なども組み合わせて、精密粒度分布測定の結果を多面的に検証する方針である。また、MRSA以外にも多剤耐性緑膿菌やカンジダなどの病原体についても既存抗菌薬を中心に短時間殺菌能を評価する。今年度は主に電子顕微鏡の費用を大きく見込んでいたが、電子顕微鏡の検体準備段階での乾燥過程が菌形態に影響を及ぼすことが判明し、電子顕微鏡の使用を途中から見合わせていた。次年度使用額が生じたのは、今年度使用予定であった電子顕微鏡の使用回数が大きく減ったためである。次年度の研究費の主な使用内容としては、1.菌の培養などに用いる試薬・消耗品、2.精密粒度分布測定に用いる試薬・消耗品、3.精密粒度分布測定用の機器のメンテナンス、を予定している。また、研究進行具合に応じて、国内外の学会での成果発表に関連した交通費や論文化に必要な諸経費などにも用いる予定である。
ＴＯＲＣ１シグナル伝達経路を介したゼブラフィッシュ尾びれ再生メカニズムの解明

前年度の研究により、TORC1シグナル経路は、再生過程の尾びれで活性化が生じること、TORC1シグナルの阻害は細胞増殖、細胞生存、細胞分化を抑制すること、またTORC1シグナルの活性化は尾びれ再生を中心的にコントロールする因子であるWntとIGFによって生じることを明らかにすることができた。これらの結果より、TORC1シグナル経路が尾びれの再生を中心的に制御する非常に重要なシグナル経路であることを明らかにすることができた。また、この成果は、BMC Developmental biology誌に発表した。そこで本年度は、この成果を基に、再生を「促進」させるメカニズムに着目し解析を行った。私は、TORC1シグナルが再生を中心的に制御する重要なシグナル経路であることから、このシグナル経路を強制的に活性化することができれば、再生の促進を引き起こすことができるのではないかと予測した。そこで、TORC1シグナルの活性化の目標となるp-S6Kのシグナルを指標に、ドラッグスクリーニングを行い、ゼブラフィッシュ尾びれにおいてTORC1シグナルを過剰に活性化する薬剤の同定を試みた。その結果、甲状腺ホルモンであるTriiodo-L-Thyronine (T3)で処理した際、TORC1シグナルの過剰な活性化が生じることが分かった。そこで、T3処理条件下で尾びれ再生実験を行ったところ、T3処理ゼブラフィッシュの尾びれは、通常の尾びれ再生の速度より早くかつ、拡大された尾びれを再生することが分かった(図)。そこで、私はこのT3による再生メカニズムに興味を持ち、さらなる解析を行ったところ、IGF-TORC1経路がT3による尾びれサイズの拡大に関与していることが分かった。今後は研究を継続し、詳細なメカニズムを明らかにする予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はゼブラフィッシュ尾びれ再生過程におけるTarget of rapamycin complex 1(TORC1)経路の機能を明らかにすることが目標である。申請者は採用期間前に、TORC1の活性化の指標であるp-S6Kのシグナルが尾びれ再生過程で観察されること、またTORC1の阻害剤であるrapamycinを尾びれ再生過程のゼブラフィッシュに暴露したところ明らかな再生の阻害が確認できていたことから、TORC1が尾びれ再生に必須であることまでは明らかにしていた。申請者は、昨年度の研究でさらなる解析を進めた結果、以下の成果を得た。(1)TORC1の活性を制御する外部シグナル受容体の特定インシュリン様成長因子1受容体(IGFR)及びホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K),WntがそれぞれTORC1の活性化に関与していることが予測できた。(2)TORC1が制御する再生芽の増殖や分化に必要な遺伝子の特定TORC1は再生初期過程においては細胞増殖、再生芽形成を制御し、再生中期過程においては細胞増殖・細胞生存・骨芽細胞の分化を制御していることを明らかにした。ここまでの研究成果をまとめ、2014年12月にBMC Developmental Biology誌に論文発表を行った。申請者は、採用期間の2年間で、下記の2つを解明することを目標として設定していた。(1)TORC1の活性を制御する外部シグナル受容体の特定(2)TORC1が制御する再生芽の増殖や分化に必要な遺伝子の特定(1)に関して、Wnt及びIGF-PI3K経路がTORC1を制御することを明らかにした為、目標の大部分をクリアした。

(2)に関して、この解析を進める為に必要な再生過程におけるTORC1の詳細な役割を明らかにした。この結果をもとに更なる解析を進めることで目標に達成することができるだろう。ここまでの結果は、申請書に記載した本年度の計画以上の成果を得ることができている。また、ここまでの研究成果をまとめ、2014年12月にBMC Developmental Biology誌に論文発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。以下が本研究で明らかにする目標である。(1)TORC1の活性を制御する外部シグナル受容体の特定(2)TORC1が制御する再生芽の増殖や分化に必要な遺伝子の特定上記のように(1)の解析は概ね終了しているため、今後は(2)の解析を中心に研究を行う予定である。手法としては、これまでに明らかにしたTORC1の尾びれにおける機能から予測し、TORC1が尾びれ再生過程に制御する因子を探索し、その因子の再生過程における機能を解析することで、(2)の目標を達成することができるはずである。
新生仔ラットの脳内エストロゲン受容体アイソフォームの生理的機能の解析

本研究では、脳内のエストロゲン受容体タンパク(ER)にいくつかの変異型が存在し、かつその機能が異なる可能性があるので、解析を行った。当該研究者は、これまで、発生成長に伴う正常型ERの発現調節の機構に注目し検討し、ERタンパクの出現の程度が雌雄で異なり、雄での発現は雌に比べて有意に低値を示すことを観察した。一方、ER mRNAの発現については、ERタンパクが減少するにもかかわらずER mRNAの発現は低下しない脳内領域が存在する事実を見出した。この現象は脳内領域における変異型遺伝子の発現の差に起因する可能性が考えられたので、変異型ERの解析を行った。その結果、ERの変異型であるDelta4(ER-D4)が新生仔ラットの脳に発現している事実を見出した。本年度は、これらの観察に基づいて解析を進め、次の結果を得た。(1)ER-D4の発現は、正常型の発現と比べると少なく、1/10程度であった。RNase protection assayによる定量解析の結果、雌雄間及び脳の領域間での発現の量はほぼ等しかった。これらの事実から、ERタンパクが減少しているにもかかわらずER mRNAの高い値が検出された現象はER-D4によるものではないことが示唆された。(2)次に、D4以外にER-D5及びER-D7の発現を新生仔ラット脳で検出した。これらの、変異型の発現量はER-D4と同様に低い値であった。(3)また、他の変異型ERの可能性を調べるために、PCR等の増幅条件を変え検索を進め、正常型の存在を示すバンドと、正常型よりも分子量の少ないバンドが検出された。PCR/Southern法により解析を進めた結果、低分子量のバンドは正常型と同様にER-cRNAプローブとhybridizeすることが明らかになった。現在、低分子量のERの塩基配列の検索を行い、新種のisoformであるか否かについて検討している。さらに、雌雄間及び脳の領域間で発現量の違いがあるかについて解析を進めている。
尿細管性アシドーシスの臨床および分子生物学的研究

腎尿細管性アシドーシスは酸素欠損を含む多くの原因が知られているが、最近メチルマロン酸血症で尿細管性アシドーシスや腎不全をの合併の見られることが知られている。われわれは腎障害をともなったビタミンB_<12>不応性メチルマロン酸血症患児で安定同位体でラベルしたメチルマロン酸を用いて安定同位体希釈法により血中メチルマロン酸を8ポイントにつき微量定量し、血中メチルマロン酸濃度が血中クレアチニンと相関することを証明した。つぎにハイブリッド型(ただし年長になれば1型になる)の腎尿細管性アシドーシスの原因となるcarbonic anhydraseII欠損症について遺伝子解析の研究を施行した。われわれのグループは今までに本症での本邦第1例を報告し、さらにその第1例が、いままでに報告されていない新しい変異nonsense mutation(TAT→TAG)at Tyr40 in exon 2(Y40X)であることを発見したが、引き続き同疾患の他の患者の遺伝子解析を行い、ベルギーや米国人の本症で認められたのと同じ遺伝子変異であるexon 3(His 107-Tyr)を有するが、ヨーロッパ起源の本症患者では見られない中枢神経障害を伴う、日本人独立2家系を報告した。carbonic anhydraseII欠損症は今までまれな疾患と考えられてきたが、われわれの発見以来、我が国でもつぎつぎに診断されてきており、今後これらの患者について遺伝子解析が進めば、例えばphenotypeとgenotypeの関係など本症についてより多くの知見が得られるものと期待される。