hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経シナプス結合部位のChapsyn110の生理機能

・脳の新規ABCトランスポーターのクローニング脳RNAよりABCトランスポーターに保存されている配列より作成した縮重プライマーでRT-PCRを行い、新規ABCトランスポーター遺伝子断片をクローニングした。この配列をBLASTサーチした結果、3側の配列を得ることが出来た。5側については新たな縮重プライマーを用いたPT-PCRと5RACEにより、全長cDNAクローニングに成功した。この新規ABCトランスポーターは結果的に脳と血小板で発見が見られ、特に血小板での発現が強かったことからABCAPと命名した。・ABCAPに対するモノクローン抗体の作製ABCAPのC末側40kDa程の領域を大腸菌に発現させ、これを抗原としてマウスに免役したマウスの脾細胞よりハイブリドーマを作製し、モノクローン抗体産生株3クローンを得た。これらの抗体はいずれもマウス、ラットのABCAPと反応した。このモノクローン抗体を用いてマウス・ラット組織のウエスタンブロットの結果、予想分子量と一致する250kDaの蛋白質が検出された。神経シナプス結合部位の細胞膜裏打ち骨格関連蛋白質Chapsyn110の生理機能を追及するために、in vivoにおけるリン酸化状態について前年度まで追跡し、その結果からチロシンリン酸化部位の同定をこれまでに進めてきた。本年度はそのリン酸化部位について、細胞内での生理機能との関連を求めるために、リン酸化されない変異体遺伝子を構築し発現系を構築しつつある。またこの実験とは別に、神経細胞におけるChpasyn110の新たなリガンドとして、細胞膜蛋白質であるABC (ATP-Binding Cassette)transporterについてその可能性を検討してきた。ABC transporterは細胞膜を介して生体異物や生理活性物質などを輸送するATPaseであり、多様かつ多数の遺伝子群が存在し、重要な生理機能を持つことが次々と明らかになってきている。すでにABC transporterの一種、cMOATがPDZ蛋白質であるPDZK1と結合することが示されており、PDZ蛋白質の側からも、ABC transporterの側からもそれらの機能的連関がそれぞれの生理機能の追及において重要となることが考えられいる。そこで、脳で発現している新たなABC transporterを検索し、その結果幾つかの新しい遺伝子断片のクローニングに成功した。少なくともそのうちの一つにはPDZとの結合に必要なC末アミノ酸配列が保存されており、ここを介してChapsyn110と結合している可能性が考えられる。
核酸を分子組織化の場とする有機磁性体の開拓

分子の集団から磁性体を作るためには,構成分子の配列を分子レベルで制御する必要がある.本研究では,核酸に特有の相補的水素結合を利用して,磁性体の構成分子(ラジカル分子)の配列様式を制御する方法論を開拓した.化学的に安定なラジカル導入型核酸塩基を新たに合成し,それらから得られた共結晶についてX線結晶構造解析を行ない,Watson-Crick型ヘテロスピン対が形成されていることを明らかにした.また,オリゴヌクレオチド内で特定の塩基配列の中に,ラジカル分子を配列させるためのモデル系を構築した.分子の集団から磁性体を作るためには,構成分子の配列を分子レベルで制御する必要がある.本研究では,核酸に特有の相補的水素結合を利用して,磁性体の構成分子(ラジカル分子)の配列様式を制御する方法論を開拓した.化学的に安定なラジカル導入型核酸塩基を新たに合成し,それらから得られた共結晶についてX線結晶構造解析を行ない,Watson-Crick型ヘテロスピン対が形成されていることを明らかにした.また,オリゴヌクレオチド内で特定の塩基配列の中に,ラジカル分子を配列させるためのモデル系を構築した.天然型と非天然型の核酸塩基に安定なニトロキシド系ラジカルを置換した「安定ラジカル導入型核酸塩基」を合成し、核酸塩基間の相補的水素結合を活用した異種分子集積系-ヘテロ分子・ヘテロスピン集合系-を構築することを目標とする.基底三重項(スピン量子数S=1)のビラジカルと基底-重項(スピン量子数S=0)のビラジカルをそれぞれシトシンに導入した誘導体を合成した.基底三重項のビラジカルを用いて、閉殻のグアニン誘導体との1:1の水素結合錯体を得た.単結晶X線結晶構造解析により、分子配列は予想通りに水素結合で制御されていることを明らかにした.この錯体は、Watson-Crick型塩基対にS=1の安定な開殻分子種が導入され、結晶構造が確認された初めての例である.さらに、基底三重項のビラジカルからも、S=1/2のモノラジカルーグアニン誘導体との水素結合錯体が得られた.X線結晶構造解析から、ビラジカル-モノラジカル間でのWatson-Crick型ヘテロスピン対形成を明らかにしたる.このシトシン-グアニン錯体では、塩基対間のside-by-sideの水素結合により、塩基対の交替的な一次元水素結合ネットワークが形成されており、これによりビラジカル部位とモノラジカル部位の交互一次元配列が達成されたる.これらシトシン・グアニン系とともに、チミンのビラジカル誘導体とジアミノトリアジンのモノラジカル誘導体を合成し、X線結晶構造解析から分子構造を明らかにした.結晶固体中でのラジカル分子の配列を制御するための新しい方策として,核酸塩基に特有の選択的水素結合能を安定有機ラジカルに付与するbio-inspiredapproachを考案した.ウラシルとジアミノトリアジンを導入した核酸塩基置換モノラジカルとビラジカルを合成した.これらは,化学的に安定であり,なおかつ特有の相補的水素結合能を有するbuilding block分子になる.ジアミノトリアジン誘導体については,単結晶として単離し,X線結晶構造解析で分子構造を決定することに成功した.さらに,ESR/1H-ENDORスペクトルの測定により,分子内のスピン密度分布を決定し,水素結合錯体内で磁気的自由度を保持することが期待できるラジカル種であることを明らかにした.さらに,有限スピン系の分子配列制御法の開拓を目標に,分子スピン集積系の構造プログラミングとして,スピン導入型核酸塩基を用いて,オリゴヌクレオチド(ODN)を鋳型としたラジカル種の配列制御を試みた.最小構造のモデル系として,3本のODNからなる3鎖系2重鎖を分子会合場とする2分子(2スピン)配列系を設計した.3鎖系ODNの紫外可視吸収スペクトルの温度変化の測定より,2重鎖の融解温度が室温に較べて充分に高いことを明らかにした.さらに,ニトロニルニトロキシド置換のウラシル誘導体と3鎖系ODNの錯体についてESR禁制遷移を観測し,ウラシルニ量体による熱励起3重項に帰属した.この結果は,ウラシル誘導体がODN上で最近接で配列したことを示しており,非共有結合的な構造プログラミング(核酸の塩基配列特異的な分子集積化)が可能であることを意味している.DNAの塩基配列は,小分子を位置選択的に並べかつ集積するための場としてみなすことができ,構造制御のための分子設計可能なテンプレートとして活用できると考えられる.DNAに結合する機能性小分子として,不対電子持った安定ラジカルを用いることで,分子レベルで構造制御されたスピン集合系をDNA上で構築することができ,DNAを磁気機能化することが可能となる.本研究では,特定の塩基配列に位置選択的に結合する性質を安定ラジカルに付与したナフチリジン置換ニトロニルニトロキシドラジカル(NCDPhNN)を合成した.NCDPhNNの母体であるnaphthyridine carbamate dimer (NCD)は,5'-CGG-3'/5'-CGG-3' triadにおけるG-Gミスマッチ塩基対に対して特異的に結合する合成小分子として開発されたものであり,NCD:triad=2:1の量論比で結合することが知られている.NCDPhNNとDNAとの結合を評価するために,融解温度(Tm),CDスペクトル及びESRスペクトルの測定を行った,G-Gミスマッチ塩基対を含む

二重鎖(11-mer)の融解温度(Tm)は,その他の塩基の組み合わせに較べて13□も高かった.CDスペクトルによるtitrationでは,誘起CDバンドの強度(ellipticity)がNCDPhNNの濃度とともに増大した.エキシトンバンドのヨブプロット解析から,NCDPhNNと,5'-CGG-3'/5'-CGG-3' triadは2:1の量論比で結合していることがわかった.ESRスペクトルでは,ラジカルの窒素核14Nに典型的な超微細分裂が観測されたが,磁気量子数mIに依存する線形の顕著な広幅化が見られた.スペクトルシミュレーションによる線形解析から,ラジカルの回転相関時間は,オリゴヌクレオチドが共存する溶液中ではラジカル単独の場合に較べ10倍以上増大することが明らかになった.これらの結果から,NCDPhNNはNCDと同様の結合モチーフでDNAに結合していると結論した.
膜電位イメージングによる胎生期の嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程の追跡と展開

我々は、膜電位感受性色素と用いた光学的測定法を鶏胚嗅覚系に適用し、嗅球におけるシナプス伝達機能が孵卵6-7日の段階で発現することを示した。嗅神経刺激により嗅球に誘発される後シナプス応答は、孵卵6-8では1相性応答であったが、孵卵9日には多相性となり、末梢側ではoscillationが見られることもあった。個体発生に伴いoscillationの出現頻度と持続時間は次第に増加し、シグナル波形が複雑になった。孵卵12日には、oscillationが1分位続く現象も観察された。Oscillationの周波数は個体発生と共に増加したが、孵卵9-12日の段階ではθoscillationの範囲内であった。地球上の生物は、嗅覚や味覚、視覚など様々な感覚機能を駆使し、食物になりうる物質の品質を評価している。このような能力は、何も成体に限られた能力ではなく、一般に生物は、生後まもない時期から口に入れたものが、自分にとって好ましいものであるか否かを識別する能力を未熟ながら備えている。これは、様々な感覚情報を処理する神経回路網が、出生時にはすでにある程度発達していることを示唆している。では、こうした食物の品質を評価する能力は、個体発生過程でどのようにして形成されるのだろうか?この命題に対する生理学的アプローチは、個体発生期の中枢神経系を構成するニューロンが小さく、また機械的にも脆弱であるため、従来の電気生理学的方法を適用することが困難であるという方法論的制約から、まだ十分に進んではいない。本研究は、個体発生過程、特に胎生期の嗅覚神経回路網に焦点をあて、1膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的イメージング法による機能的マッピングと、2カーボシアニン系蛍光色素やrhodamine dextranを用いた形態的マッピングとの比較から、(1)嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程のプロフィルを明らかにすることを目的とする。さらに、(2)嗅覚と味覚の感覚情報の統合処理機構が、個体発生の過程でどのようにして形成されていくのか、という命題について、その解析法の開発と展開を試みる。平成27年度は、「嗅神経の電気刺激により嗅覚系に誘発される光学応答の基本パターンの解析」を行った。神経活動の光学的イメージング法では、光学的シグナルの波形の解析から、シナプス後電位を時間経過の遅いシグナルとして同定することができる。そこで、孵卵9ー10日を中心に嗅神経ー嗅球ー終脳標本を作成し、これらを膜電位感受性色素NK2761で染色し、嗅神経を吸引電極で刺激することによって得られる光学応答を解析して、嗅球および終脳内で応答領域の同定に成功した。本研究は、個体発生過程、特に胎生期の嗅覚神経回路網に焦点をあて、1膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的イメージング法による機能的マッピングと、2カーボシアニン系蛍光色素やrhodamine dextranを用いた形態的マッピングとの比較から、嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程のプロフィルを明らかにすることを第一義の目的としているが、本年度はその基本データを取ることに成功した。実験計画は、ほぼ順調に進んでおり、今後の研究遂行の上での問題点は今のところ見当たらない。平成28年度は、「個体発生期の嗅覚系に誘発されるoscillatory activityの基本パターンの解析」を行った。孵卵9ー12日の鶏胚から嗅神経ー嗅球ー終脳標本を作成し、これらを膜電位感受性色素で染色し、嗅神経を吸引電極で刺激することによって嗅球に誘発されるoscillatoryactivityの光学的検出に成功した。さらに、oscillatory activityの発現時期と発生に伴うパターンの変化を解析した。本研究は、個体発生過程、特に胎生期の嗅覚神経回路網に焦点をあて、1膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的イメージング法による機能的マッピングと、2カーボシアニン系蛍光色素やrhodamine dextranを用いた形態的マッピングとの比較から、嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程のプロフィルを明らかにすることを第一義の目的としているが、平成28年度は、oscillatory activity基本データを取ることに成功した。

この成果は、平成27年度の研究成果に基づきこれをさらに発展させた結果であり、実験計画は順調に進んでいる。今後の研究遂行の上での問題点は、今のところ見当たらない。地球上の生物は、嗅覚や味覚、視覚など様々な感覚機能を駆使し、食物になりうる物質の品質を評価している。このような能力は、何も成体に限られた能力ではなく、生物は生後まもない時期から口に入れたものが、自分にとって好ましいものであるか否かを識別する能力を未熟ながら備えている。これは、様々な感覚情報を処理する神経回路網が、出生時にはすでにある程度発達していることを示唆している。では、こうした食物の品質を評価する能力は、個体発生過程でどのようにして形成されるのだろうか?この命題に対する生理学的アプローチは、従来の電気生理学的方法の方法論的制約から、まだ十分に進んではいない。本研究は、個体発生過程、特に胎生期の嗅覚神経回路網に焦点をあて、1膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的イメージング法による機能的マッピングと、2カーボシアニン系蛍光色素やrhodamine dextranを用いた形態的マッピングとの比較から、嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程のプロフィルを明らかにすることを目的として行われた。平成27年度には、「嗅神経の電気刺激により嗅覚系に誘発される光学応答の基本パターンの解析」を行い、光学シグナルの波形解析から、嗅球および終脳内でのシナプス応答領域の同定に成功した。平成28年度には、「胎生期の嗅覚系に誘発されるoscillatory activityの基本パターンの解析」を行い、鶏胚嗅球からoscillatory activityの光学的検出に成功した。平成29年度には、「胎生期の嗅覚系に誘発されるoscillatory activityのダイナミズムの解析」を行い、oscillatory activityの発現時期と発生に伴うパターンの変化を解析した。全期間を通した本研究の遂行により、胎生期の中枢神経系における嗅覚神経回路網の機能発生・発達過程の一端が明らかとなった。我々は、膜電位感受性色素と用いた光学的測定法を鶏胚嗅覚系に適用し、嗅球におけるシナプス伝達機能が孵卵6-7日の段階で発現することを示した。嗅神経刺激により嗅球に誘発される後シナプス応答は、孵卵6-8では1相性応答であったが、孵卵9日には多相性となり、末梢側ではoscillationが見られることもあった。個体発生に伴いoscillationの出現頻度と持続時間は次第に増加し、シグナル波形が複雑になった。孵卵12日には、oscillationが1分位続く現象も観察された。Oscillationの周波数は個体発生と共に増加したが、孵卵9-12日の段階ではθoscillationの範囲内であった。引き続きまずは、「嗅神経の電気刺激により嗅覚系に誘発される光学応答の基本パターンの解析」を進める。ラット/マウス胎仔に比べて、鶏胚では嗅神経が長く、刺激が容易であるなど、実験上の利点があるため、さまざまな発生段階の鶏胚を用いて実験を行ない、基本データを得る。それを元にラット/マウス胎仔で解析を進める。具体的には以下の項目を遂行する。
フレキシブルグリッド用高精度波長安定化半導体レーザ光源の研究

フレキシブルグリッド光伝送用の高精度レーザ光源の実現に向けて、基準光からの波長誤差をマイクロ波帯バンドパスフィルタを用いて検出する波長安定化手法を考案し、制御系の構成とアルゴリズムの研究を行った。その結果、システム要求を満たす±0.01GHz以下の波長精度を実現した。また将来の光パケットネットワークへの展開を目指して波長切替高速化も研究し、レーザ出力波長が所望の変化をするように求めたフィードフォワード関数をコントローラに実装しレーザ駆動電流を制御することで60nsの波長切替時間を達成した。本研究に関する外部発表は、学術論文4件、会議発表29件であり、計画時の目標をはるかに上回る成果が得られた。今年度の研究では、フレキシブルグリッドから半周期ずらした基準光群と被測定光との差周波を波長誤差検出信号として検出することで高精度にレーザの波長を安定化する動作原理の確認実験、および光周波数制御のための波長可変レーザの波長変化メカニズムの解析と制御に用いる高速電流駆動回路の設計・製作を行った。高精度にレーザの波長を安定化する動作原理の確認では、電気フィルタが高い分解能を持つことに着目し基準光群との差周波を用いた光周波数のビート信号を検出する方法を検討した。被測定光がフレキシブルグリッドからΔfずれている場合、被測定光と基準光群の差周波3.125±Δfがフォトダイオード(PD)によりビート周波数として検出される。これを中心周波数3.125GHzのバンドパスフィルタ(BPF)に透過させることで、周波数のずれ量を透過電力として測定した。スペクトルアナライザで検出したビート信号のスペクトルでは、光周波数が目標波長からΔfずれた場合、周波数3.125GHzから±Δfずれた箇所に2つのピークが見られる一方、目標波長と一致した場合には3.125GHz付近に単一のピークが生じている。次にこれらの信号を中心周波数3.125GHz、バンド幅0.1GHzのBPFに通した後に透過電力を検出した。その結果、Δfが減少するに伴い透過電圧が下がることが確認され、本手法により波長ずれを±0.1GHz以下の精度で観測できることが確認された。波長可変レーザの波長変化メカニズムの解析と制御に用いる高速電流駆動回路の設計・製作では、求めたレーザの伝達関数をもとに導き出した制御電圧波形を用いて高速電流駆動回路でレーザを駆動し、50ns以下で波長を変化できることを実験により確認した。今後、フィルタ透過後の電力が最小となるようにレーザの光周波数を制御する制御系を実現し、波長安定化実験を行う。初年度であるH26年度に動作原理の確認を行った、基準光からの波長誤差をバンドパスフィルタ(BPF)を用いて検出する手法について、H27年度はフィルタ透過後の電力が最小となるように、すなわち波長誤差が最少となるようにレーザの光周波数を制御する制御系を構築した。この実験系は、光周波数間隔が6.25GHzの光コム状の基準光群との差周波のビート信号を用いるという新しい手法によるもので、被測定光がフレキシブルグリッドからΔfずれている場合、被測定光と基準光群の差周波3.125±Δfがフォトダイオード(PD)によりビート周波数として検出される。これを中心周波数3.125GHzのバンドパスフィルタ(BPF)に透過させることで、周波数のずれ量を透過電力として測定する。バンド幅0.1GHzのBPFを用いて波長ずれを±0.05GHz以下の精度で安定化制御できることを実験により示した。さらに、波長精度が高いほど波長キャプチャレンジ(波長安定化制御可能な初期波長ずれの範囲)が狭くなるというトレードオフが本手法の欠点であることを見出し、これを改善するために複数種類のBPFを併用した手法を発案、動作確認実験を行った。その結果、波長精度と波長キャプチャレンジを独立に設定可能であることが実証され、波長精度±0.05GHz以下と波長キャプチャレンジ6GHzを同時に実現することができた。H27年度の成果により、本提案手法でフレキシブルグリッド用としての要件を満たし、また波長切替時に目標波長にキャプチャ可能であるという実用性を併せ持ったレーザ波長が実現できることを明らかにした。当初計画では、H27年度は5nsの分解能で動作する高速電流制御系の実現と精度±0.1GHz以内の波長誤差検出を掲げていた。これに対し高速電流制御系は5nsの設定分解能の回路動作を確認し、また波長誤差検出は±0.05GHzを達成した。波長分割多重(WDM)においてさらなる大容量化実現のため、フレキシブルグリッドが注目されている。フレキシブルグリッドでは従来の50MHz間隔でのWDMに対して、最小で6.25GHz間隔で波長割り当てが行われる。そのため、従来よりも高精度な光周波数安定化が求められている。本研究では、光ビート法とマイクロ波信号処理技術を用いた新たな波長検出法を提案し、フレキシブルグリッドに求められる高精度のレーザ波長の安定化に取り組んだ。波長検出法として、基準光コムと対象光とのビート信号強度とマイクロ波帯バンドパスフィルタを用いて、フレキシブルグリッドからの波長誤差をマイクロ波電力へと変換することで、光波長ずれを10MHz以下の高確度で検出する技術を確立した。次にこの誤差信号をもとに、短時間でかつ高精度に目標波長へ移動、収束させる制御アルゴリズムの開発と、これを実現する高速制御ハードウエアの設計を行った。そしてこれら技術を統合して、半導体レーザの高精度波長安定化システムを構築した。実験の結果、当初目標に掲げていた±100MHzの精度を一桁上回る±10MHzの精度で波長を安定化することに成功した。

この結果から、本研究で実現した技術は、将来の光通信技術の高度化に貢献することだけにとどまらず、高精度の波長安定化を必要とする光通信以外の分野へも適用できる汎用技術として普及できると考えている。本研究の結果得られた研究発表成果は以下の通りである。学術論文(査読有) 3件国際会議(査読有) 10件学会発表(査読無) 19件フレキシブルグリッド光伝送用の高精度レーザ光源の実現に向けて、基準光からの波長誤差をマイクロ波帯バンドパスフィルタを用いて検出する波長安定化手法を考案し、制御系の構成とアルゴリズムの研究を行った。その結果、システム要求を満たす±0.01GHz以下の波長精度を実現した。また将来の光パケットネットワークへの展開を目指して波長切替高速化も研究し、レーザ出力波長が所望の変化をするように求めたフィードフォワード関数をコントローラに実装しレーザ駆動電流を制御することで60nsの波長切替時間を達成した。本研究に関する外部発表は、学術論文4件、会議発表29件であり、計画時の目標をはるかに上回る成果が得られた。当初想定していた最大の課題である高精度光波長検出に成功し、すでに国際会議2件、国内学会1件を発表している。最終年度であるH28年度は、実際のフレキシブルグリッドWDMシステムで想定されるレーザ波高の切替動作である、1温度変化による目標グリッド領域への波長粗調整、2目標グリッド領域内での波長キャプチャ、3目標グリッドへの高精度波長安定化、の一連の動作を行うシステムを構築し、システムトータルとしての波長切替時間100ms以下を目指す。目標とする100msの切替時間は、通常のWDMシステムの切替時間よりも一桁以上短い。すなわち、現在技術のWDMシステム用レーザ波長切替技術よりも一桁以上は高精度が高くかつ一桁以上切替時間が短い波長切替を実現する。光通信用デバイス初年度に導出した各時間領域における波長変化の伝達関数をプログラム化し、5ns周期で信号入出力可能な高速デジタル回路に実装する。なおこの高速デジタル回路技術は研究活動スタート支援(H2425)の成果として確立済である。さらに初年度に製作した高速電流駆動回路を接続し、切替直後(50ns100ns)中期(100ns10μs)および長期(10μs以上)のすべての時間領域で任意の電流形状を5nsの時間分解能で生成する制御回路を実現する。確立した技術を統合した半導体レーザ光源を構築する。制御系では、切替直後(50ns100ns)に回路応答を加速するプレエンファシス制御、中期(100ns10μs)に熱平衡状態を加速するフィードフォワード制御、および長期(10μs以上)には高精度検出した波長誤差を修正するフィードバック制御をデジタル回路で時系列に切り替える。実験により50ns以内に精度±0.1GHzの波長安定化を実現する。さらに理論値との相違の解析から、さらなる高性能化の方策、本手法の理論限界値を明らかにし、将来の光通信方式研究の方向性策定に寄与する。回路に必要な電子部品の納期が年度内に間に合わなかった。4月中に納品するようすでに手配している。
大腸がんの発生・悪性化におけるAhレセプターの役割

緑黄色野菜に多く含まれる成分、indole-3-carbinol (I3C)は、aryl hydrocarbon receptor (AhR)のリガンドとして作用する。I3Cを含有する飼料をマウスに投与し、または大腸がん細胞の培地に添加する事によりAhRのがん抑制効果を検討した。前者では小腸の自然免疫関連遺伝子の発現低下が、後者では細胞増殖の低下が認められた。また腸上皮初代培養系で炎症性サイトカインの添加は、細胞増殖を促進した。I3Cは、その受容体を介して炎症反応を抑制することにより、細胞増殖を抑制していることが示唆される。飼料中の植物性分量の違いによるMinマウスの腫瘍形成の変化本年度は食餌成分によるがん予防効果を検討するため、indole-3-carbinol (I3C)処理による遺伝子発現の変化を解析した。正常C57BLマウスに0.1% I3Cを含む飼料を2週間与えたのち、小腸からRNAを抽出して自然免疫に関連する約180の遺伝子を調べた。I3C処理マウス(n=2)では、未処理(n=2)と比べて、サイトカインや免疫制御に関わる遺伝子に発現抑制がみられた。中でもケモカインであるCCL5は未処理の3割程度に抑えられた。一方STAT3の活性化を収束させることが知られるSOCS3の発現は増加した。RT-PCRで再検討すると、野生型マウス(n=4)では、I3C投与群のうち2匹にCCL5の発現が低下した一方、AhRKOマウス(n=4)では、低下しなかった。SOCS3の発現は、マウスの遺伝子型に関わらず、I3C投与による増加の傾向が見られた。腸におけるI3Cの免疫抑制的な効果が示唆され、腫瘍抑制効果との関連が考えられた。AhR発現細胞の同定と組織内分布ヒト大腸がん組織の免疫染色によりAhR発現分布を検討した。非腫瘍組織のAhR発現は上皮細胞では低く、間質の細胞に発現を認めた。特に腸の内腔に近い粘膜上皮の先端部に特徴的に分布した。このAhR陽性細胞は、マクロファージのマーカーであるCD68陽性細胞と類似の分布を示した。腫瘍組織のAhR染色性は、間質と腫瘍細胞に認められ、およそ50例調べたうち1/3の割合で腫瘍細胞の核に局在した。細胞増殖との関連を調べるため、ヒト大腸がん細胞株の培地にAhRのantagonistであるCH223191を添加したところ、細胞数の低下がみられた。これらより、大腸がん細胞でAhRの発現および活性化がみられること、また細胞増殖との関連が示唆された。AhR発現細胞の組織分布:タンパク質レベルでの解析のため、合成ペプチドをウサギ3匹に免疫して抗血清を得た。3匹中2匹の抗血清は、マウスHepa1細胞を使ったイムノブロットと培養細胞の免疫染色において、免疫前血清より強いシグナルが検出された。ヒト大腸ガン組織におけるAhRの役割:1)標的遺伝子の解析:細胞株HCT116にsiRNAをtransfectし、AhR発現を抑制させると、細胞増殖は促進された。AhRの下流のシグナルについて調べるため、この時に発現が変化する遺伝子をDNA micro arrayによって検討した結果、炎症関連因子が変化することが示された。さらに細胞内に生じるシグナルの変化を解析するため、免疫関連因子について検討したところ、リン酸化STAT3の増加が示された。2)細胞運動の解析:がんの悪性化に伴い、細胞増殖のみならず、細胞の運動性が上昇する。これについて検討するため、wound healing assayおよびリアルタイム細胞解析システムを用いた実験をおこなった。その結果、siRNAを導入することによりAhR発現を抑制した細胞の運動性は、有意に増加することが示さた。さらに、この細胞はfibronectinコートされたシャーレ上でcontrol細胞より短かい時間で進展すること、またfocal adhesion kinaseの自己リン酸化がcontrol細胞より上昇していることが示された。これらより、大腸がん細胞においてAhRが増殖と運動性の双方を抑制する働きがあることが示唆された。動物を使った実験が進んでいないため。*飼料中の植物成分量の違いによる腫瘍形成の変化緑黄色野菜に多く含まれる化学物質(I3C)はAhRリガンドとして働く。I3C含有飼料を摂取したマウス腸ではケモカインCCL5発現が低下し、AhRの炎症抑制作用が示唆された。今年度はAhRによるCCL5発現抑制の作用機序を検討した。マウス大腸がん細胞をサイトカイン処理するとCCL5 mRNAが誘導され、I3C前処理はこの応答を阻害した。AhRと炎症シグナルであるNFkB経路との相互作用に着目し、この経路の阻害剤BAYとI3C作用を比較した。BAY前処理は、I3C同様にCCL5誘導を阻害した。一方、BAYで観察されたIkBaタンパク分解の阻害は、I3Cではみられなかった。NFkB p65の核移行は、BAYで阻害されたが、I3Cは影響しなかった。さらにNFkBレポーター活性は、BAYで低下したが、I3C効果はなかった。マウスCCL5遺伝子の転写開始点の5'上流に存在するNFkBおよびAhR/ARNT結合配列を介したAhRとNFkB相互作用の可能性が示唆された。*ヒト大腸がん組織におけるAhRの役割

昨年度は、ヒト大腸がん細胞株に発現するAhRをsiRNAでノックダウンすると、細胞運動の亢進が見られることが示された。本年度はこの現象に関わる分子について解析した。用いた細胞株HCT116では、RhoファミリーのRacが多く検出され、AhRノックダウン細胞ではRacの活性化がみられた。次にintegrin分子種の発現を調べた。AhRノックダウン細胞ではintegrin b5タンパクの減少が見られたが、RNAレベルの変化は認められなかった。またARNTノックダウン細胞ではintegrinb5の変化はみられなかった。AhR発現抑制の結果、炎症に関連したシグナル経路の変化が細胞接着や細胞運動に影響を与える可能性がある。緑黄色野菜に多く含まれる成分、indole-3-carbinol (I3C)は、aryl hydrocarbon receptor (AhR)のリガンドとして作用する。I3Cを含有する飼料をマウスに投与し、または大腸がん細胞の培地に添加する事によりAhRのがん抑制効果を検討した。前者では小腸の自然免疫関連遺伝子の発現低下が、後者では細胞増殖の低下が認められた。また腸上皮初代培養系で炎症性サイトカインの添加は、細胞増殖を促進した。I3Cは、その受容体を介して炎症反応を抑制することにより、細胞増殖を抑制していることが示唆される。動物飼育施設の建設が遅れているためAhRリガンドを含む飼料を与えたマウスの腸にみられる遺伝子発現の変化を解析し、AhRのがん予防効果の仕組みを検討する。また今年度見出されたAhR発現抑制細胞の運動性の増加や基質への進展の変化について、AhRがどのようなシグナルにコミットしているのかを解析することにより、がん抑制効果のメカニズムを調べたい。分子細胞生物学AhRの腸管免疫に与える影響について:AhRリガンドによる免疫細胞分化のコントロールについて検討する。マウス個体また培養細胞等を用い、リガンド処理された細胞の分化マーカーの発現等を指標に解析する。またリガンド摂取による免疫関連遺伝子の発現変化とそのメカニズムについて、正常およびAhRKOマウスを用いて検討する。大腸ガンにおけるAhR発現と機能について: 1)ApcMin/+マウスならびにヒト大腸に生じた腫瘍では、AhR発現の亢進がみられた。複数の大腸がん細胞株を使ってAhR発現を変化させた場合の増殖等に及ぼす効果、またはAhRリガンドの効果等を調べることにより、AhRの役割を調べる。2)ApcMin/+マウスと組織特異的なAhRKOマウスを掛け合わせることにより、AhRの腫瘍形成における役割を検討する。3)腫瘍組織の初代培養系を確立し、AhRリガンド処理効果や、AhR発現を変化させた時の細胞増殖などを検討する。
触媒反応への展開を目指したゼオライト分離膜の設計

ゼオライトの耐熱性・耐薬品性ならびに最大の特徴の一つである分子ふるい作用び着目してゼオライトを分離膜素材に応用しようとする研究が盛んに行なわれている。著者らはシリカライト膜がアルコール/水系および酢酸/水素の浸透気化分離において高い有機物選択透過性を示すことを見い出し既に報告した。しかし、膜そのものが多結晶体であるため分離は主に結晶粒界を通して起こっていると考えている。そこで、本研究ではシリカライト膜中に存在する結晶粒界の制御ならびに結晶表面の改質の観点からシリカライト膜をシリル化し、膜の分離特性に及ぼす影響について検討した。はじめに、シリカライト粉末を用いてシリル化処理条件の検討を行なった。いずれのシリル化処理の場合においても末端シラノール基に基づく3740cm^<-1>付近のピーク強度は減少し、シリル化剤のメチル基に基づくピークが3000cm^<-1>付近に観測された。このことは本処理条件下でシリル化が進行していること示している。差スペクトルにおける末端シラノール基に基づくピーク強度の減少量の違いから、シリル化剤としては(CH_3)_2SiCl_2およびCH_3SiCl_3の方が(CH_3)_3SiClより有効であると思われる。次に、シリカライト膜の結晶粒界の制御の観点から、CH_3SiCl_3を用いてシリル化剤の多層担持の可能性について検討した。すなはち、シリカライト結晶外表面に担持されたシリル化剤の未反応のSi-Cl結合を加水分解することによりSi-OH基に変えた後、再びシリル化処理を行なった。シリル化処理後のシリカライト粉末のFT-IRスペクトルにおいてシリル化処理回数の増加とともにメチル基に帰属される3000cm^<-1>付近のピーク強度が増大したことから、シリル化剤は層状に担持されたものと思われる。以上のシリカライト粉末のシリル化処理で得られた結果をもとに、次にシリル化剤としてCH_3SiCl_3を用いてシリカライト膜のシリル化処理を行い、そのシリル化処理したシリカライト膜を用いて酢酸/水系の浸透気化分離を行なった。シリル化処理により膜透過流束は著しく減少したものの、透過液の酢酸濃度は増加した。この結果から、シリル化処理はシリカライト膜の分解性能を向上させる有効な方法であることが明らかとなった。
生物との共生を目指した農地整備に関する研究

本研究では、トキの野生復帰を念頭に、対象生物をドジョウに絞り込んで検討を行った。そこで、まず水田や水路におけるドジョウの生息状況や動態を明らかにした。対象地域の水路はかなり傾斜があり、滝や落差工がある中山間地の水路であるが、ドジョウが数多く生息していることが分かった。これらのドジョウの供給源は上流の常時湿田状態にある棚田であることを明らかにした。水路のドジョウは水路中にフトン篭があったり、丸太を連続的に横断方向に入れて流れに止水域を作った所では、そこを出水時の避難場として活用している事が判明した。フトン篭の効果については実験でも検証した。農地の整備手法については、佐渡でよく見られる承水路(佐渡では江と呼んでいる)がある水田で生物が多く生存していることが明らかにした。傾斜地の水田では上段側の法尻に幅50cm程度深さ30cm程度の江を設置することを提案した。生物にやさしい農法でもある深水栽培を実施する際に農地として備えなければならない条件を提示した。また栽培方法別の肥料成分などの物質収支を八郎潟の水田で調査した結果を示した。圃場整備をすると暗渠排水を排水路に自然排水する関係で、排水路敷高と田面の高低差は1m以上になるのが通例である。そのために魚が水路から水田に上って来なくなっている。そこで暗渠の集水管を別に設けることによって水路と田面の高低差を縮小できることを提案した。すでに圃場整備を実施したところでは、コルゲートパイプを用いた水田魚道を提案した。コルゲートパイプは可擁性に富むので、加工も不要でそのまま伏せれば良いだけなので、設置が極めて容易でコストもかからないという利点を持っている。室内実験と現地実験で極めて少ない流量でドジョウが遡上するという結果を得た。本研究はトキ野生復帰を前にして、かつてのようにトキが水田で餌を採ることができることを目指すもので、近年生物にやさしい農法として知られるようになった深水栽培の地帯力や水質の問題と佐渡の河川におけるドジョウの生息状況調査ならびに水田用魚道の試作について取り組んだ。水田の環境改善的な管理手法として近年関心が集まっている深水管理の特性について生産技術の側面から検討した。深水管理は冷害回避技術として開発・評価されているが、常時湛水型と中干し型に区分され、今日では中干し型が一般的である。本研究においては水稲生育の環境緩和機能や生物の生存環境としての安定性の観点から常時湛水型に注目し、これが中干し型に比べて、収量、分蘖抑制の面で劣ることはなく、用水量、地耐力確保の側面から見ても遜色の無いことを確認した。トキ野生化が予定されている近くの水田圃場となっている佐渡市新穂町田野沢地区の無農薬有機栽培圃場において、水田の水質浄化機能、水文環境、水管理特性など、エサ資源供給場となる水田圃場の営農と水環境について定量的評価を試み、作付け期間の現地実証試験を行った。小規模の傾斜地水田の水利特性は、少量の用水連続取水と上流水田からの水田排水の反復利用による、節水・湛水型管理と特徴付けられた。佐渡天王川流城において,ドジョウの保全に向けて検討するために,魚類(ドジョウ)の生息調査,環境調査および資料調査を6月,8月および12月の3回にわたって実施した.

その結果,天王川の水利施設系の特性と生息環境との関係が明らかになった.平野部における保全と異なる方法が中山間地には必要であることが示唆された.水田用魚道としてコルゲートパイプを用いた実験を行い、勾配10°以下ならドジョウは遡上することを確認し、天王川上流などの水田3箇所で試験設置した結果。2箇所で遡上を確認し、有効な魚道になりうることを確認した。トキの野生復帰が予定されている小佐渡東部地区の水田を対象に、水収支、水管理およびトキの餌になるドジョウの生息量調査を行った。また水路河川における魚の生息状況調査を行い次の知見を得た。不耕起移植栽培圃場と慣行栽培圃場における水田の水質浄化機能、水文環境、水管理特性に関する調査の結果では、渓流取水と田越し潅概が混在し、作付け期間には厳格な番水制の節水型水管理が行われていた。その結果流出負荷は少なく田面水温も維持されており、冬季湛水区では冬期も810cmの水深が維持されており、採餌場としての機能に優れている事が分かった。また深水栽培方式に対応する圃場システムについて検討した結果、常時湛水型の深水栽培方式が現況の用水システムには適合性が高いことを明らかにした。また様々な農法の水田を対象にコドラート調査とトラップ調査でドジョウの生息量を推定した結果、農法による差より、地形的な差が生息量に意味を持つことが分かった。すなわち平地部より棚田地域の生息量が多いこと、更には常時水分の多い調整水田で生息量が多いことなどを明らかにした。また江といわれる水田の山側に設けられた承水路がある水田では、落水時に、そこがドジョウの退避場になることから生息量が多いことが分かった。水路・河川の調査は小佐渡東部を水源にする天王川を中心に主な河川で生息量調査を行ったが、天王川でドジョウの生息量が圧倒的に多かった。これは天王川の上流域の棚田地帯のドジョウ生産力によるものと推察された。傾斜が急な割には生息量が多いのは、水路・河川にいくつかワンド部分があり、そこに多くの生息量が見られたからである。また、魚類の一時的水域とするには農業排水路と圃場の段差縮小が重要な意味をもつが、この対策を圃場形態の面から検討し、効果的方法として地表排水と地下排水の分離を提案した。またコルゲートパイプの水田魚道は設置数をふやしたが、効果が検証できた。農地の整備手法については、佐渡で山付きの水田でよく見られる承水路(佐渡では江と呼んでいる)付きの水田で生物が多くいることを明らかにした。これは中干し時にも江には水があるか、なくても土が湿った状態にあるため、ドジョウなどが生息し続けることができるからである。傾斜地の水田では上段側の法尻に幅50cm程度深さ30cm程度の江を設置することを提案した。深水栽培は異常な寒さや暑さに対する対策として有効な水管理手法であるが、それと同時に生物にやさしい農法である。その農法を実施するために農地として備えなければならない条件4点を提示した。(1)湛水深を維持する畦畔高の確保、(2)畦畔の漏水防止対策、(3)畦畔高の増大に対する用水路の改修、(4)地耐力確保のための排水機能強化水田がドジョウなどの生物が生息できる条件を備えていても、水路と水田の高低差が大きいと魚は水田に入って来ない。圃場整備には暗渠排水を排水路に自然排水する関係で、排水路敷高と田面の高低差は1m以上になるのが通例である。そのために魚が水路から水田に上って来ることができなくなっている。そこで暗渠の集水管を別に設け、小排水路は地表排水だけのためにする。このようにすれば、水路と田面の高低差を縮小できることを提案した。
顔面と陰部に色素斑が多発する遺伝性全身性メラニン色素異常症（仮称）の原因解明

Universal inheritedmelanodyschromatosis (UIM) (仮称:遺伝性全身性メラニン色素異常症)は常染色体優性遺伝形式の極めて稀な遺伝性皮膚疾患である。本研究では本疾患と診断した本邦初の日本人大家系より全エクソームシークエンス法を用いてUIMの病因遺伝子Xを同定した。さらに、病因遺伝子Xのメラニン合成の役割について知るために、メラノサイト細胞株を用いて機能解析を実施した。Universal Inherited Melanodyschromatosis (UIM) (仮称:遺伝性全身性メラニン色素異常症)は常染色体優性遺伝形式の極めて稀な遺伝性皮膚疾患である。研究代表者は家族歴、臨床所見、病理所見、電顕所見より、本疾患と診断した本邦初の日本人大家系の患者6人の経過観察をしている。本研究の目的は、以下の4つ、1.UIMの原因遺伝子を同定する。2.疾患原因分子UIMSH3(仮名)のメラニン合成への関与と3.相互作用するタンパク質群を明らかにする。4.雀羅斑、肝斑、日光色素斑、Laugier-Hunziker症候群の病変部におけるUIMの原因遺伝子と結合タンパク質群の関与について明らかにすることである。UIMの原因遺伝子が同定され、その機能がわかれば本疾患の病因に即した治療法開発への道を開くことができ、かつ上記の一般的な色素異常症の病因究明の端緒となる成果が得られる可能性がある。本研究ではまず全エクソームシーケンス法などを用いてUIMの原因遺伝子を同定することを目的とした。既に解析を進め、候補遺伝子を絞り込んだ。候補遺伝子UIMSH3(仮名)はSrc homology 3(SH3)ドメインを持つリン酸化酵素(仮名UIMSH3)をコードしていることが判明した。健常人100人の遺伝子と比較して候補遺伝子に見出された変異が稀少であることを確認した。野生型UIMSH3 cDNAと変異型UIMSH3 cDNAをネオマイシン耐性のプラスミドに組み替える。cDNAはヒトメラノサイト培養細胞のcDNAライブラリーからPCRで増幅した。既にUIMSH3のプラスミドは構築した。1.遺伝性全身性メラニン色素異常症原因遺伝子を同定した。6人の患者を含む家族12人から末梢血を採取し、白血球のDNAを抽出した。患者3人と患者家族の健常人1人の全エクソームシーケンス法で解析し、候補原因遺伝子を絞り込んだ。全エクソームシーケンス法を行わなかった家族のDNAを用いて変異解析、ハプロタイプ解析などを実施して原因遺伝子UIMSH3(仮称)を同定した。。2.UIMSH3のメラニン合成への関与とその役割:無色素性のメラノーマ由来細胞株A375とSK-MEL28に野生型UIMSH3あるいは本家系で発見された病的変異型UIMSH3を遺伝子導入し、恒常的に発現する細胞株を作成した。メラニンの合成、c-kit kinaseの活性化について検討した。Universal inherited melanodyschromatosis (UIM) (仮称:遺伝性全身性メラニン色素異常症)は常染色体優性遺伝形式の極めて稀な遺伝性皮膚疾患である。遺伝性全身性メラニン色素異常症の候補遺伝子を絞り込んだ。皮膚科学疾患原因分子UIMSH3(仮名)のメラニン合成への関与と相互作用するタンパク質群を明らかにする。雀羅斑、肝斑、日光色素斑、Laugier-Hunziker症候群の病変部におけるUIMの原因遺伝子と結合タンパク質群の関与について明らかにする。細胞培養の研究を行っている研究協力者の大学院生が妊娠休暇、育児休暇を取ったため。さらに、連携研究者である越川直彦博士が東京大学医科学研究所から神奈川県がんセンターへ転勤したため、研究室の立ち上げのために時間を要し、プロテオーム解析を用いた研究を中断せざるを得なかったため。細胞培養とプロテオーム解析のために消耗品を購入し、研究を進めてUIMSH3タンパク質に結合するタンパク質を同定する。越川直彦博士との研究の打合せのためと成果発表のために、旅費を使用する。
CDC42遺伝子異常症の病態解明

当初の研究計画に従って、CDC42遺伝子異常症に特徴的な巨大血小板の電子顕微鏡を用いた形態解析、患者遺伝子変異を導入した遺伝子改変モデル動物の機能解析、国内外の本患者の表現型スペクトラムの解析を行い、研究成果を国際学術誌Scientific Reportsに英文論文として発表した。国内外の5人の本疾患患者について、詳細な表現型の比較検討を行った。その結果、巨大血小板性血小板減少症、知的障害、屈指、脳構造異常と感音性難聴、甲状腺機能低下症、易感染性が本疾患の核となる症状であることを見出した。患者由来の血小板を高解像度の電子顕微鏡で解析し、α顆粒は減少し、空胞が増加していることを見出した。また、血小板の定量計測により、患者では、血小板の一部のみが巨大化することを定量的に示すことに成功した。CRISPR/Cas9による遺伝子編集技術を用いて、患者由来の遺伝子変異(p.Tyr64Cys)を導入したC.elegansの作出に成功した。変異を導入したC. elegansでは、生殖腺と卵細胞において死細胞数が変異アレルの数に比例して増加していた。本疾患は、「武内・小崎症候群」として、厚生労働省の小児慢性特定疾病に認定されることが決定した。本疾患に対する治療研究をさらに発展させるため、2018年度から日本医療研究開発機構難治性疾患実用化研究事業の一環として「CDC42阻害剤による武内・小崎症候群の治療法の開発」研究班(研究代表者:武内俊樹)を組織し、強力に研究を推進している。当初の研究計画に従って、知的障害および巨大血小板性血小板減少症、感音性難聴を特徴として、CDC42遺伝子に変異を有する患者を国内および海外の小児専門医療施設からリクルートすることができた。その結果、国内外合わせて、合計5人のCDC42遺伝子異常症(Takenouchi-Kosaki症候群)患者を同定することができた。これら全ての患者では、患者の末梢血から抽出したDNAで遺伝子変異が確認され、診断が確定している。さらに、本疾患の表現型スペクトラムを明確に定義するために、各々の患者がもつ表現型を国際標準であるHPO(Human Phenotype Ontology)形式で詳細かつ客観的に記載し、検討している。その結果、巨大血小板性血小板減少症、中等度以上の知的障害、感音性難聴は全ての患者に認められ、本疾患の中核となる症状であると考えられた。また、屈指、頻回の感染症罹患歴、リンパ浮腫が複数の患者で認められた。これらの症状が本疾患の特徴的かどうかについて今後さらに検討を進める予定である。また、国内の2患者について、患者の同意のもとに、血小板の電子顕微鏡解析を開始することができた。患者の血小板細胞内小器官の解剖学的構造を詳細に明らかにし、これまでに報告されているCdc42およびその関連遺伝子の改変動物モデルの表現型との詳細な比較を進める予定である。CDC42遺伝子異常症患者で同定された遺伝子変異(p.Tyr64Cys)を培養細胞に導入し発現解析についても分担研究者と協力し進めている。当初の研究計画どおり、知的障害および巨大血小板性血小板減少症を特徴とし、CDC42遺伝子異常症を有する患者を国内外の主要小児専門医療施設から複数リクルートすることができた。全ての患者で、末梢血から抽出したDNAで遺伝子変異が確認され、診断が確定した。さらに、各々の患者の症状を詳細にHPO形式で検討することで、本疾患の表現型スペクトラムの定義を進めている。また、患者の同意のもとに、血小板の電子顕微鏡解析に着手した。「CDC42遺伝子異常症」患者で同定された遺伝子変異(p.Tyr64Cys)を培養細胞に導入し発現解析についてもおおむね順調に進行している。当該年度では、すでに表現型と遺伝子解析により診断の確定している本疾患罹患患者2名の協力を得て、本疾患に特徴的と考えられる巨大血小板について、電子顕微鏡を用いて詳細な形態解析を行った。その結果、血小板内の空砲の著明な増多が認められた。この所見は、2名の患者において共通して確認することができた。これまでに、モデル動物での知見として、Cdc42遺伝子とRac1遺伝子のダブルノックアウトマウスで、巨大血小板と血小板内の空砲の増加が報告されている。これらのことから、本疾患患者で認められているCDC42遺伝子の特定のアミノ酸置換変異(p.Tyr64Cys)は、機能低下型変異である可能性が示唆された。2018年に新しく3例目の本疾患患者が報告された。この患者において、巨大血小板性血小板低下症、重度知的障害、特徴的顔貌、屈指といったこれまでの2患者に共通して見られた表現型が確認され、網羅的遺伝子解析でCDC42遺伝子にこれまでの2患者と同じ新生突然アミノ酸置換変異(p.Tyr64Cys)を認めた。この報告は、本疾患が、臨床的に診断可能な独立した疾患概念であることをさらに支持するものであると考えられた。一方で、これまでの3名の患者では、同一のアミノ酸置換変異を有していることから、機能獲得型変異である可能性も完全には否定できない。遺伝子変異がタンパクレベルで与える影響を明らかにするために、当初の研究計画どおり、Cdc-42遺伝子改変モデル動物を作出し、機能解析を進めている。2患者について、詳細な血小板表現型を電子顕微鏡を用いて解析することができた。

3例目の患者が報告され、本疾患の表現型スペクトラムの解析が進み、核となる臨床表現型と、随伴する症状についての検討を進めることができた。当初の研究計画に従って、CDC42遺伝子異常症に特徴的な巨大血小板の電子顕微鏡を用いた形態解析、患者遺伝子変異を導入した遺伝子改変モデル動物の機能解析、国内外の本患者の表現型スペクトラムの解析を行い、研究成果を国際学術誌Scientific Reportsに英文論文として発表した。国内外の5人の本疾患患者について、詳細な表現型の比較検討を行った。その結果、巨大血小板性血小板減少症、知的障害、屈指、脳構造異常と感音性難聴、甲状腺機能低下症、易感染性が本疾患の核となる症状であることを見出した。患者由来の血小板を高解像度の電子顕微鏡で解析し、α顆粒は減少し、空胞が増加していることを見出した。また、血小板の定量計測により、患者では、血小板の一部のみが巨大化することを定量的に示すことに成功した。CRISPR/Cas9による遺伝子編集技術を用いて、患者由来の遺伝子変異(p.Tyr64Cys)を導入したC.elegansの作出に成功した。変異を導入したC. elegansでは、生殖腺と卵細胞において死細胞数が変異アレルの数に比例して増加していた。本疾患は、「武内・小崎症候群」として、厚生労働省の小児慢性特定疾病に認定されることが決定した。本疾患に対する治療研究をさらに発展させるため、2018年度から日本医療研究開発機構難治性疾患実用化研究事業の一環として「CDC42阻害剤による武内・小崎症候群の治療法の開発」研究班(研究代表者:武内俊樹)を組織し、強力に研究を推進している。当初の研究計画にしたがって、海外の研究者グループと連携し、さらに大きな疾患コホートの作成し、本疾患の診断基準の作成を目指す。引き続き、本疾患の分子学的病態の解明も強力に推進する。当初の研究計画に従って、本疾患患者で確認された遺伝子変異が表現型に与える影響を、モデル動物としてC.elegans(線虫)を用いて個体レベルで明らかにし、本疾患の病態を明らかにする。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。当初今年度分として計上していた消耗品への支出が予定より少なく済んだため、次年度に繰り越し、消耗品購入や成果発表のための学会出張に支出する予定である。次年度の研究費に合算して使用する予定である。