hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核小体型グルタチオンペルオキシダーゼ(PHGPx)による細胞増殖抑制機構の解明

リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ(PHGPx)は脂質ヒドロペルオキシドを直接還元できる細胞内唯一の酵素である。Thymidine同調培養時で核小体型PHGPx高発現株であるN63細胞、N120細胞では、G1期で停止した。核小体型PHGPxによる細胞増殖抑制のメカニズムについて詳細な解析を行った。G1期からS期への移行に必要なRbのSer780のリン酸化は核小体型PHGPx高発現株では、S1細胞と比較して、RbのSer780のリン酸化が抑制されていた。Rbのリン酸化に関わるサイクリンD1-CDK4の発現について検討したところ、CDK4の発現には変化はないが、サイクリンD1のmRNA、およびタンパク質の発現、活性がN63細胞、N120細胞で著しく抑制されていた。サイクリンD1の発現低下のメカニズムについて検討した。核小体型PHGPxが癌形成を抑制するのかどうかについて検討した。in vitroにおいて、癌細胞で特徴的な足場非依存性増殖能の解析を行ったところ、核小体型PHGPx高発現株のみでコロニー形成が抑制され。そこで次に、ヌードマウスに核小体型PHGPx高発現株を皮下注射し、腫瘍形成能について検討した。その結果、核小体型PHGPx高発現株ではS1細胞に比べて著しく腫瘍形成を抑制した。また、核小体型PHGPxの腫瘍形成抑制能は、癌細胞のThymidineの前処理の有無に関わらず観察された。1.サイクリンDの発現:コントロール細胞(S1)ではサイクリンD1はS期直前に増加が見られたが、サイクリンD2およびサイクリンD3では減少した。一方、核小体型PHGPx高発現した細胞(N63)はサイクリンD1の発現が非常に低くい。サイクリンD2、D3は発現が上昇した。2.CDK6:サイクリンDと複合体を形成しキナーゼ活性を示すCDK6については、S1およびN63細胞間で発現の変動に関する違いは見られなかった。3.pRbのリン酸化:S1細胞では、pRbのリン酸化体はS期より前にリン酸化が起きることが明らかとなった。N63細胞では、細胞周期の回転に伴いpRbのリン酸化体は減少し、G_1期で停止した9時間以降はリン酸化の亢進は見られなかった。このようにN63細胞では、Thymidine除去後細胞周期の2周目の際に、pRbのSer780のリン酸化を抑制させることが明らかとなった。このpRbのリン酸化の抑制により、N63細胞ではG_1期からS期への移行ができなくなったと考えられた。4.p16の発現の解析:CDK4/6によるpRbのリン酸化活性を低下させ増殖を抑制するp16^<INK4a>の発現はS1細胞およびN63細胞の間に発現の差はほとんど見られなかった。この結果は核小体型PHGPxによるpRbのリン酸化抑制機構にはp16^<INK4a>は関与していないことを示している。1.p53のリン酸化体の解析:細胞周期をG_1期に停止させるp21はp53の転写活性化により誘導される。活性化p53のリン酸化体(Ser15)について解析を行ったところ、PHGPx高発現による、p53のリン酸化体の変動は観察されなかった。2.p21、p19^<ARF>の発現の解析:p19^<ARF>は核小体に存在する蛋白質で、MDM2と結合することでp53のユビキチン化を阻害し、p53を安定化させることが知られているが、この発現も見られなかった。このことは核小体型PHGPxのG_1期抑制機構には、p53経路は関与していないことを示している。

3.核小体特異的蛋白質C23およびB23の解析:p19^<ARF>が結合して、細胞増殖を停止する核小体特異的蛋白質のC23およびB23の発現について検討したが、S1細胞とN63細胞では、発現量に違いはが見られなかった。4.がん細胞を用いたヌードマウスにおけるin vivoでの腫瘍形成能の解析:_Thymidine同調培養後の細胞を用いて、ヌードマウスによる腫瘍形成の解析を行なった。移植後、21日目には、核小体型PHGPx高発現株N63細胞、N120細胞では、コントロール細胞であるS1細胞に比較して腫瘍形成が抑制されているのが確認され。核小体型PHGPx高発現株であるN63細胞、N120細胞の腫瘍重量の増加の抑制がみられた。
Calyculin A生合成機構の解析

本研究では伊豆半島産チョコガタイシカイメンに含まれる細胞毒性物質カリクリンAの生合成経路の解明を目指した。カリクリンAはタンパク質脱リン酸化酵素1および2Aを特異的に阻害し、各種がん細胞に対してpMオーダーで増殖阻害活性を示す。我々はカリクリンAの生合成遺伝子クラスターの探索を進め、チョコガタイシカイメンよりメタゲノムライブラリーを作成、ポリケタイド合成酵素遺伝子に保存性の高い配列を足掛かりとしてスクリーニングを行った。その結果、全長150 kbpに及ぶ長大な生合成遺伝子クラスターの取得に至った。予想通り、本遺伝子クラスターはI型ポリケタイド合成酵素と非リボソーム型ペプチド合成酵素をコードしており、それらのモジュールやドメインの構成はカリクリンAの構造と良い一致を示した。さらに、いくつかの推定修飾酵素について機能解析を試みた。遺伝子クラスター上流には3つのリン酸基転移酵素がコードされており、それらを大腸菌において異種発現し、酵素反応を試みた。その結果、3つのうち1つ(CalQ)がカリクリンAを基質として受け入れ、二リン酸化体を生成することを明らかにした。このことには海綿メタゲノムより同定した遺伝子クラスターがカリクリンA生合成遺伝子であることを支持している。カリクリンAの二リン酸体の生物活性を調べたところ、細胞毒性は1,000倍、PP2A阻害活性は20倍と著しく減弱しており、カリクリンAのプロドラッグ体であることが示唆された。したがって、カリクリン生合成における最終産物はカリクリンAではなく、本研究で見出されたホスホカリクリンAであることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、伊豆半島、伊豆諸島近海に生息するチョコガタイシカイメン(Discodermia calyx)に含まれる、タンパク質脱リン酸化酵素阻害剤calyculin Aの生合成機構の解明を目指す。全長150 kbpに及ぶ推定calyculin A生合成遺伝子クラスターはI型ポリケタイド合成酵素と非リボソーム型ペプチド合成酵素をコードしており、そのmoduleの並びより推定される生合成産物の構造はcalyculin Aの構造と良い一致を示している。その上流にはリン酸基転移酵素に相同性を示すORFが3つ存在し、大腸菌をホストに用いてそれらの異種発現を試みた。海綿共生菌に由来するこれら酵素の異種発現は当初非常に困難であったが、シャペロンとの共発現系において可溶性タンパク質を得る事に成功した。次に推定される基質としてcalyculin A、calyculinamide A、dephosphonocalyculin A、dephosphonocalyculinamide Aを用いて酵素反応を試みた。その結果、3つのリン酸基転移酵素のうちの1つ、CalQがcalyculin Aとcalyculinamide Aを基質として認識し、新規生成物を与えた。その構造を解析したところ、calyculin Aのリン酸化体、phosphocalyculin Aであることが明らかになった。Phosphocalyculin Aは新規類縁体であったため、海綿抽出物を改めて精査したところ、intactな海綿の主要代謝産物であり、phosphocalyculin Aがcalyculin Aの生合成最終産物であることが明らかになった。推定calyculin A生合成遺伝子クラスターの上流にコードされる3つのリン酸基転移酵素に着目し、機能解析を進めた。その結果、1つのリン酸基転移酵素CalQが予想外の生成物を与えた。当初我々はcalyculin Aが生合成の最終産物であると信じて疑わなかったが、実はCalQによる生成物である二リン酸化体、phosphocalyculin Aが生合成の最終産物であることが明らかになった。この化合物がこれまで海綿抽出物から見出されてこなかった理由は、海綿中に存在する活性化酵素ホスファターゼが抽出過程においてphosphocalyculin Aからcalyculin Aへ変換していたためである。

生物が産生する低分子生物活性物質は最終産物が生合成されて終わりとのイメージがあるが、海綿動物由来の生物活性物質は共生系が起源であるため、共生微生物が作り、それをホストが利用、制御を行っている可能性が高く、静的な生産場ではない。むしろ共生者とホストの間で供給、制御機構が存在しており、ダイナミックで動的な物質のやりとりが行われていると考えている。このように予想外の結果でありながら、これまで見過ごされてきた天然物生合成の動的な機能制御機構を提示することができた。Calyculin Aの骨格構築や官能基変換に関わる生合成酵素の機能解析は未だ達成できていない。今後はリン酸基転移酵素以外の候補となるORFの異種発現、機能解析を進める。またニトリル形成機構に関しては、他の海綿類から単離報告のあるcalyculin類縁体の多くが末端官能基としてニトリルではなく、アミドを有していることから、アミドを前駆体としてニトリルが生じると予測している。そこで、calyculinamideを含む他種の海綿より生合成遺伝子クラスターの探索を行い、D. calyx由来のcalyculin A生合成遺伝子クラスターとの比較解析を行う。修飾酵素の構成に違いが認められれば、ニトリル形成に関わるORFとして解析候補に用いることができる。Calyculin Aは未培養微生物である海綿共生菌によって生合成されることから、中間体の補足などが不可能なため、その生合成機構解析は非常に困難であるが、多角的な手法を用いて解析を進めていく。
アンモニア酸化菌における新規分類指標の検討

アンモニア酸化菌(AOB)は、16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいた分子系統分類において、Nitrosomonas, NitrosococcusおよびNitrosospiraの3属に分類されている。しかし、従来は主に細胞形態の相違からNitrosospira(spiral)はさらにNitrosolobus(lobate)とNitrosovibrio(slender curved rods)を区別し5属に分類していたが、現在もなおこれら形態の相違に関する遺伝的側面については明らかにされていない。本研究では新たな分類指標の可能性について検討し以下の成果を得た。由来する1.新規株の分離:種々の自然環境(植物根面、酸性硫酸塩土壌等)より、AOBを多数新規分離した。特にタイの酸性硫酸塩土壌より分離したAOB4菌株は、高いウレアーゼ活性を示す菌株等、特殊環境での生息を反映した生理的特性を示した。2.新規分離指標の検討(1):PCRクローニングによって、gap、pgkの各遺伝子配列をAOB16菌株について決定し、比較した。これらの配列において、他の生物種由来酵素にも見られる機能的に重要ないくつかの保存領域が確認できた。gap及びpgkの配列より構築した各分子系統樹では形態的に異なるNitrosospira、Nitrosolobus、Nitrosovibrioを明確に個別のクラスターに区別することができた。(2):PCRクローニングによって、pykの遺伝子配列をAOB17菌株について決定し比較した。pykの配列より構築した分子系統樹では形態的に異なるNitrosospira、Nitrosolobus、Nitrosovibrioを前述のgap、pgkよりもさらに明確に個別のクラスターに区別することができた。アンモニア酸化菌(AOB)は、16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいた分子系統分類において、Nitrosomonas、NitrosococcusおよびNitrosospiraの3属に分類されている。しかし、従来は主に細胞形態の相違からNitrosospira (spiral)はさらにNitrosolobus (lobate)とNitrosovibrio (slender curved rods)を区別し5属に分類していたが、現在もなおこれら形態の相違に関する遺伝的側面については明らかにされていない。本研究では各種AOB由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)及びホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)の遺伝子塩基配列を明らかにし、新たな分類指標の可能性について検討した。【本年度の成果】(1)新規株の分離種々の自然環境(植物根面、酸性硫酸塩土壌等)より、AOBを多数新規分離した。(2)新規分離指標の検討PCRクローニングによって、gap、pgkの各遺伝子配列をAOB16菌株について決定し、比較した。アンモニア酸化菌(AOB)の16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいた分子系統分類においては、細胞形態の大きく異なるNitrosospira (spiral)、Nitrosolobus (lobate)、Nitrosovibrio (slender curved rods)が全てNitrosospiraに統合されている。しかし、現在もなおこれら形態の相違に関する遺伝的側面については明らかにされておらず、単一の分離菌株を対象としない非培養系の解析においては不都合が生じている。本研究では、ピルビン酸キナーゼ遺伝子(pyk)について塩基配列解析を行い、新規分子系統分類指標としての検討を加えた。また、新規分離株の株数は新規系統分類指標の評価のうえで多数獲得する必要がある。

したがって引き続き各種環境から多数の分離源について新規株分離を実施した。【本年度の成果】(1)新規分離指標の検討:PCRクローニングによって、pykの遺伝子配列をAOBI7菌株について決定し比較した。pykの配列より構築した分子系統樹では形態的に異なるNitrosospira、Nitrosolobus、Nitrosovibrioを前年度確立したgap、pgkよりもさらに明確に個別のクラスターに区別することができた。(2)新規株の分離:種々の自然環境(植物根面、酸性硫酸塩土壌等)より、AOBを多数新規分離した。特にタイの酸性硫酸塩土壌より分離したAOB4菌株は、高いウレアーゼ活性を示す菌株等、特殊環境での生息を反映した生理的特性を示した。
除神経嚥下筋におけるエネルギー代謝と筋病理学的解析

嚥下機構はきわめて複雑で、嚥下筋の筋病理学的変化については不明な点が多い。本研究ではヒト咀嚼筋、嚥下筋の筋繊維構成を調べた。また幼弱ウサギを使用してSoft Diet実験、交感神経切除実験を行った。ヒトオトガイ舌筋ではタイプ2B線維は認められなかった。咀嚼筋は食性や顎運動様式に順応した組織化学的特徴を有している。Soft Dietにより筋線維タイプの転換が観察された。交感神経切除実験では、筋線維の分化、エネルギー代謝には交感神経が調節していることが示唆された。嚥下は、多上の筋か巧妙なタイミンクで収縮と弛緩を行う事で遂行される。この嚥下機構はきわめて複雑で、口腔期の咀嚼運動やその他の運動神経系、一咽頭期における知覚神経系、脳幹の嚥下中枢、嚥下関与筋がきわめて協調的に機能することで成り立っている。今回、1)嚥下関与筋の筋線維構成、2)31P MRスペクトロスコピー(MRS)によるエネルギー代謝解析を行い、嚥下機構の解明に迫る一助としたい。1.MRSは、非侵襲的に筋線維内の高エネルギーリン酸化合物の代謝を解析できる優れた方法である.MRSのクレアチンリン酸(Pcr)、無機リン酸(Pi)、ATPの吸収域を計算することにより解析可能で、咬筋肥大症や咬筋腱筋膜肥大症筋などの臨床に応用し、病変の評価に有用性が認められた。2.粉末飼料飼育(Soft Diet)実験:牛後4週齢(離乳期)から長期間粉末試料で飼育し咀噛筋に及ぼす影響を調べた。1)Soft Dietにより咬筋や内側翼突筋では、下記のような筋線維タイプの転換が観察された。タイプ2B→2A(強い力を必要としない)3.交感神経切除実験では、壊死、再生線維などヒト顎変形症や筋ジストロフィーと似たような異常所見がみられ、筋線維の分化、エネルギー代謝には交換神経が調節していることが示唆された。嚥下は、多くの筋が巧妙なタイミングで収縮と弛緩を行う事で遂行される。この嚥下機構はきわめて複雑で、口腔期の咀嚼運動やその他の運動神経系、咽頭期における知覚神経系、脳幹の嚥下中枢、嚥下関与筋がきわめて協調的に機能することで成り立っている。今回、1)嚥下関与筋の筋線維構成、2)嚥下造影検査VFを行い、嚥下機構の解明に迫る一助としたい。1.ヒト胸鎖乳突筋は四肢筋と似た構造でタイプ1、2A、2Bの3種類の筋線維がモザイク状に配列していた。オトガイ舌筋ではタイプ2B線維は認められなかった。ヒト咬筋には胎児型(type2C)、心筋型(α-cardiac MHC)ミオシンアイソフォームMHCが存在し、Type1(遅筋)が多く、Type2(速筋)が極端に小さい事を報告してきた。咀嚼筋は食性や高度に分化した顎運動様式に機能的に順応した組織化学的特徴を有している。2.粉末飼料飼育(Soft Diet)実験:生後4週齢(離乳期)から長期間粉末試料で飼育し咀嚼筋に及ぼす影響を調べた。タイプ2B→2A(強い力を必要としない)3.交感神経切除実験では、壊死、再生線維などヒト顎変形症や筋ジストロフィーと似たような異常所見がみられ、筋線維の分化、エネルギー代謝には交感神経が調節していることが示唆された。
クローン技術を用いた血管病治療モデルの確立

本研究では、血管細胞由来のクローン胚からES細胞を樹立し、この体細胞核由来ES細胞(ntES細胞)の未分化性や分化特性について検討した。また、ntES細胞確立の機序に関連し、初期胚におけるエピジェネティック制御に関して、DNA維持メチル化機構を中心に研究を行った。1.マウスES細胞から血管内皮細胞に分化する細胞系列の各段階をドナー細胞として用いることにより、分化の進行初期の段階で核移植後の桑実胚/胚盤胞発生率が低下すること、分化に伴う核移植後のリプログラミング感受性低下がOct4プロモーター領域のヒストン修飾と相関することを見いだした。しかし、血管内皮細胞核に由来するntES細胞においては、特に血管内皮細胞への分化嗜好性を示すという傾向は見られず、核移植前の細胞特性の記憶がntES細胞において維持されている証拠は得られなかった。2.血管病のクローン治療モデル確立の予備実験として、血管新生やリモデリングに異常をきたすアドレノメデュリン(AM)遺伝子欠損マウス胚からのES細胞樹立を行い、分化特性を検討した。その性質は正常胚由来のES細胞と大きな差はなく、内皮細胞分化や血管網様構造の形成などについても有意な差は見られなかった。3.初期胚におけるエピジェネティック制御に関し、これまでメカニズムが明らかにされていなかった胚盤胞形成に至るまでの着床前胚でのDNA維持メチル化が、従来考えられていた細胞質に存在する卵細胞型DNAメチル化転移酵素(DNMTlo)よりも、むしろ周期的に核に出現する体細胞型アイソフォーム(DNMTls)によって制御されていることを明らかにした。iPS細胞の出現により、核移植によるクローン治療の価値は下がり、新しい体細胞リプログラミング研究が重要となった。これにより、本研究の今後の方向はリプログラミングの機序などの基盤研究へと展開するのが妥当と考えられた。1.アドレノメデュリン(AM)遺伝子欠損マウスからのES細胞樹立と遺伝子導入による機能回復の試み:血管形成の異常を伴う胎生致死をきたすAM遺伝子欠損マウスホモ接合体の胚盤胞よりES細胞の樹立を試みた.このES細胞は正常のES細胞と同様のin vitroにおける血管内皮分化能を示した.しかし,キメラ作成実験ではキメラ率が悪く,生殖細胞系列に入るものは得られなかった.また,まだ複数のラインがとれておらず,細胞特性に関する研究には今後ESラインを増やす必要があると考えられた.一方,4倍体キメラ法によってAM遺伝子欠損マウスホモ接合体のレスキューを試みた.正常マウス由来の4倍体胚とAM遺伝子欠損マウスホモ接合体胚の融合により,正常マウス由来の胎盤組織から産生されるAMによりホモ接合体の致死性表現型がレスキューされるかどうかを検討したが,これにより表現型は変わらなかった.即ち,胎盤由来の側では致死性表現型をレスキューすることはできず,胚内におけるAMの産生と作用が重要であることが示された.2.核移植によるntES細胞の樹立と血管細胞への分化能の検討:ES細胞から血管内皮細胞に分化する細胞系列の各段階をドナー細胞として用いることにより、分化の進行初期の段階で核移植後の桑実胚/胚盤胞発生率が低下することを見いだした。桑実胚/胚盤胞発生率はES細胞の核移植に比べて分化した体細胞の核移植で大きく低下するため、リプログラミングの1つの指標と考えられる。すなわち、ES細胞は分化条件に置かれた早い段階でリプログラミング感受性を低下させる可能性が考えられた。一方、ES細胞から血管内皮細胞への分化の過程で、未分化性維持に重要なOct4遺伝子の制御状態は、ヒストン修飾の変化→DNAメチル化の順で変化することが示された。この結果と核移植後の発生率の結果を併せると、分化の過程で早期に起こるヒストン修飾変化の段階でリプログラミング感受性は低下し、DNAメチル化の変化に先行する可能性が考えられた。しかし、一旦形成された胚盤胞から樹立されたntES細胞は、特に血管内皮細胞への分化嗜好性を示すということはなかった。個体形成能や他の細胞系列への分化能については今後の検討が必要と思われる。

3.初期胚におけるエピジェネティック制御に関し、これまでメカニズムが明らかにされていなかった胚盤胞形成に至るまでの着床前胚でのDNA維持メチル化が、従来考えられていた細胞質に存在する卵細胞型DNAメチル化転移酵素(DNMTlo)よりも、むしろ周期的に核に出現する体細胞型アイソフォーム(DNMTls)によって制御されていることを明らかにした。iPS細胞の出現により、核移植によるクローン治療の価値は下がり、新しい体細胞リプログラミング研究が重要となった。これにより、本研究の今後の方向はリプログラミングの機序などの基盤研究へと展開するのが妥当と考えられた。
遺伝子組み換え常在細菌を利用した動物に対する成長ホルモン供給法の確立

本研究では、昆虫の腸管に常在する細菌種の同定と遺伝子組み換え後の再定着能の検討を行った。クワガタムシの菌嚢とフタホシコオロギの腸管から、複数種の細菌を分離同定した。コオロギから分離した常在細菌について、プラスミド形質転換後の再定着が可能であった。また本研究は、昆虫の体サイズを増加させる生理活性物質の探索を行った。ロイヤルゼリーの経口投与により、カイコガとフタホシコオロギの体サイズの増加が認められた。以上の結果は、昆虫の腸管に常在する細菌の機能改変と再定着が可能であること、ならびに、昆虫の体サイズを増加させる物質がロイヤルゼリー中に存在していることを示唆している。本研究は、動物から分離した常在細菌に成長ホルモン遺伝子を組み込み、動物に再定着させて、成長ホルモンを持続的に動物体内に供給させる方法の確立を目指している。本方法においては、経口投与により動物の体サイズを増加させる生理活性物質が必要である。本年度は、経口投与により昆虫の体サイズを増加させる物質の探索を行った。ミツバチは幼虫時にロイヤルゼリーを経口摂取すると、体サイズが増加し、女王化することが知られている。ロイヤルゼリーが他の昆虫の体サイズを増加させるかについて検討を行った。完全変態昆虫の鱗翅目に属するカイコガの幼虫にロイヤルゼリーを経口投与すると、メスの蛹と成虫のサイズが増加した。一方、幼虫、並びに、オスの蛹と成虫のサイズ増加は観察されなかった。ロイヤルゼリーを投与したカイコガのメス成虫の腹部は通常のメス成虫に比べて肥大化していた。不完全変態昆虫の直翅目に属するフタホシコオロギにロイヤルゼリーを経口投与すると、オスとメスの両者において、幼虫と成虫のサイズが増加した。ロイヤルゼリーを投与してもコオロギのメスの腹部の肥大は観察されず、ロイヤルゼリーを投与したオスとメスの成虫の体サイズは全体的に増加した。ロイヤルゼリーに含まれる3大栄養素(タンパク質、脂質、炭水化物)量を含む餌を投与してもコオロギの体サイズは増加しなかった。以上の結果は、ロイヤルゼリーの体サイズ増加効果が完全変態昆虫と不完全変態昆虫の間で保存されていること、ロイヤルゼリーの体サイズ増加効果は3大栄養素の量の違いでは説明されないことを示唆している(投稿中)。長期にわたる薬の注射投与は患者の負担が大きい。さらに、成長ホルモンなどのタンパク質製剤の大量調製は工業的に困難であるため、医療費の増大にもつながっている。動物の体には、様々な常在細菌が存在し、動物と様々な物質のやりとりをしている。培養と遺伝子改変に適した常在細菌を分離同定し、成長ホルモンなどの遺伝子を組み込み、動物に再定着させてタンパク質を持続的に供給させることは、動物に特定のタンパク質を供給する新しい医療法となると考えられる。本研究では、昆虫の腸管に常在する細菌種の同定と機能評価を行った。また、昆虫の体サイズを増加させる生理活性物質がロイヤルゼリー中に含まれるかについて検討を行った。クワガタムシの菌嚢とフタホシコオロギの腸管から、細菌を分離同定した。クワガタムシ菌嚢から分離された細菌においては、抗菌物質を生産していることが判明した。また、コオロギ腸管から分離されたKlebsiella oxytocaについて、プラスミドで形質転換後、コオロギに再定着することが確認された。さらに、細菌のペプチドグリカンが昆虫の腸管から自然免疫経路を活性化し、感染防御に働いていることを見出した。ロイヤルゼリーの投与により、カイコガとフタホシコオロギの体サイズが増加するかについて検討を行った。その結果、両種において、体サイズの増加が認められた。フタホシコオロギでは体サイズの増加が幼虫期から観察されたが、カイコガでは幼虫期では体サイズの増加がおこらず、蛹期から体サイズの増加が観察された。本研究結果は、Klebsiella oxytocaが遺伝子組み換え後の腸管への再定着が可能な常在細菌であること、ならびに、昆虫の体サイズを増加させる物質がロイヤルゼリー中に存在していることを示唆している。おおむね順調に進展している概ね当初の計画通りの研究成果が得られていると判断している。1)経口投与により動物の体サイズを増加させる物質について:経口投与により動物の体サイズを大きくする生理活性物質は、国内外でほとんど報告されていない。本研究では、コオロギとカイコガに対して、ミツバチのロイヤルゼリーの経口投与が体サイズを増加させることを明らかにした。また、コオロギに対する体サイズの増加効果は、ロイヤルゼリーを添加した餌の3大栄養素量の増加では説明されないことが示唆された。以上の結果は、ロイヤルゼリー中の生理活性物質が昆虫に保存された体サイズを決定するシステムに対して働きかけ、体サイズを増加させることを示唆している。

したがって、ロイヤルゼリー中の体サイズを増加させる生理活性物質を常在細菌に生産させれば、動物の体サイズを増加させることが可能だと期待される。2)昆虫の常在細菌について:本研究は、遺伝子組み換えをした常在細菌を昆虫に定着させることを目標としているため、昆虫に定着している常在細菌の数と質の変化が昆虫に対して及ぼす影響を理解する必要がある。昆虫の常在細菌の生理的役割を明らかにするため、クワガタの菌嚢に常在する細菌の分離同定を行った。その結果、多くの分離株が抗菌物質を生産していることが明らかになった(Drug Discov Therに発表)。常在細菌による抗菌物質生産は、宿主である昆虫の生体防御の一端を担う可能性が考えられ、興味深い。コオロギの常在細菌分離とその生理的役割の検討については、平成27年度に持ち越され、実施予定である。微生物学1)ロイヤルゼリー中の体サイズ増加物質について:平成26年度は、ロイヤルゼリー中の主要タンパク質がコオロギの体サイズ増加効果を担うと考え、リコンビナントタンパク質の活性を検討したところ、その活性は見出されなかった。この結果は、ロイヤルゼリー中の主要タンパク質の活性を保った状態で精製をできていない可能性と主要タンパク質以外のロイヤルゼリー中の成分がコオロギの体サイズを増加させる可能性の2つを示唆している。この結果をふまえ、本年度はコオロギの体サイズ増加を指標に、ロイヤルゼリー中の体サイズ増加活性を担う物質を同定する予定である。2)コオロギの常在細菌について:コオロギの腸管内に生息する培養可能な常在細菌について、分離同定を行い、コオロギの成長や生殖に及ぼす影響を検討する予定である。これらの分離同定された細菌の中から、遺伝子組み換えとタンパク質発現に適した細菌種を探索する予定である。当初、ロイヤルゼリー中の主要タンパク質が体サイズ増大効果があることを予想しており、このタンパク質の活性が確認された場合に、常在細菌の全ゲノム解析と遺伝子組み換えに対して助成金を利用する予定であった。予想に反し、主要タンパク質に活性が見出せていないため、これらの計画については、次年度に持ち越している。主要タンパク質以外に活性がある可能性も考慮し、ロイヤルゼリーから体サイズ増加活性を指標として精製を行う。精製された物質がタンパク質であった場合には、リコンビナントタンパク質を調製し、体サイズ増加活性を示すかを検討する。また、コオロギの常在細菌について、形質転換法を確立する。タンパク質を精製するための生化学試薬、形質転換のための遺伝子工学試薬、コオロギ常在細菌を全ゲノム解析について、研究費を使用する。
透過電子顕微鏡による高分解能電場その場観察システムの開発

申請者らの開発した、新たな透過電子顕微鏡内、電場・磁場観察測定法である"影像歪法"を、ナノスケールの試料に適用できるように分解能の大幅な向上を試みた。新しいタイプの測定用絞りを開発すると供に、測定データをCCDを用いてデジタル取得し、自動解析するシステムを開発した。最高分解能74nm、解析時間20秒を得た。幾何光学的な理論構築を進め、感度および、倍率を集束レンズおよび対物レンズを制御することにより、自由に決定できるようになった。さらに、超高圧電子顕微鏡でも適用でき、検出感度が中電圧の透過電子顕微鏡と同程度であることを明らかにした。申請者が独自に開発した透過電子顕微鏡内電場・磁場観察法の空間分解能向上を目的とした、測定方法改良を行った。測定に用いる影像絞りを、従来の2μmの等間隔に穴の空いたカーボン膜に換えて、数10nmサイズの点状の影がランダムに並んだランダムドット絞りを用いた。また、影像絞りの歪み検出を肉眼で行うのではなく、画像処理手法の一つであるパターンマッチング法を用いた。この結果、撮像メディアに写真filmを用いた場合740nmの空間分解能、CCDカメラを用いた場合74nmの空間分解能を得ることが出来た。また、画像処理のための専用ソフトウェアを開発したため、一画像の処理時間が20秒以下と、当初目的の1時間以内を遙かに上回る結果を得た。上記の改良を行った本手法を、半導体や、金属ナノギャップ素子など様々な電子素子に適用した。特に、電界放出電子銃の電子放出針先端部と、レーザー波長変換素子であるMg-LiNb_3周期反転ドメイン結晶表面の電場分布測定に重点的に適用した。電界放出電子銃の場合、測定結果と表面電荷法を用いた数値計算結果を比較したところ、誤差5%以内という高い精度が得られた。また、周期反転ドメイン結晶に関してはこれまで直接測定することの出来なかった誘電体の表面電荷を、試料作成方法を改良することにより帯電させることなく測定することに成功した。表面近傍の電場は面に平行な成分と垂直な成分が半周気ずれて繰り返していることが分かり、設計分極周期7μmにほぼ対応していた。この結果は、定性的な数値計算結果と良く一致していた。局所的な揺らぎと、結晶欠陥の存在を関連させる結果が得られた。さまざまな試料表面での帯電を状態ガス雰囲気下で観察するための、ガス導入システムの開発を行った。中電圧電子顕微鏡と超高圧電子顕微鏡に共通なガス導入ユニットの開発を行い、酸素、窒素、アルゴン及び一酸化炭素の導入試験を行った。また、試料表面を断面方向から観察しながら特定部位をガス雰囲気にさらすための試料作製方法及び試料ホルダーの開発を行い、鉄、銅、アルミニウムの表面酸化過程を断面方向で観察することに成功した。試料内部での電場分布のの高分解能像を得るために、超高圧電子顕微鏡中で本手法が適用可能かどうかの検証を行った。二機種の超高圧電子顕微鏡、日立H-1250ST及び日本電子JEM-1000K RSにおいて、電子光学定数の測定を行い、本手法に適切なレンズ電流設定の設計を行った。その結果、電場に関する感度係数は、超高圧電子顕微鏡においても中電圧電子顕微鏡とほぼ同じオーダーであることがわかり、電子線透過能の向上による、試料内部での電場測定能力の向上に有利であることがわかった。また、動電場分布の観察試験も行い、低周波ではあるが動電場の三次元的な分布測定の初期的な結果を得ることが出来た。申請者が独自に開発した透過電子顕微鏡内電場-磁場観察法の空間分解能向上や適用条件の拡大を目的とした、測定方法改良を行った。さらに、幾何光学的な解析をより進め、任意のレンズ条件で、任意の拡大倍理と及び検出感度を実現できる制御法を確立した。この結果、中電圧電子顕微鏡において、ガス雰囲気中において観察を行う設備の開発を完了した。これにより、さまざまなタイプの試料を10e-2Pa台のガス雰囲気で観察する二とが出来るようになり、化学反応により起きる電荷移動現象をその場観察することが出来る可能性が開けた。さらに、同一装置を用いてガス中表面反応を断面方向から観察する技術をく着想した。また、超高圧電子顕微鏡中でも、本手法が実現可能であることを示し、レンズ制御条件や得られる検出感度を幾何光学的に解析すると同時に、実機Hitachi H-1250STおよびJEOL JEM-1000K RSで実測した。実現できる検出感度は、中電圧300kVタイプの透過電子顕微鏡に対して80%から60%であり、レンズ条件を制御することにより同等に保つことが出来た。また、電子線の発散核を小さく押さえられることから、分解能の向上が望めることが示唆された。

さらに、超高圧電子顕微鏡の広いポールピースギャップを利用し、電場の三次元観察の可能性を検証する基礎実験を行った。本来ベクトル場である電場は、二つ以上の軸で回転させて得られた画像からしか三次元構成出来ないが、取り出すベクトル成分を回転軸方向に限定することで、一軸回転のみで、ベクトル場の三次元再構成が可能である事を示すことが出来た。
ポリグルタミン病における異常タンパク質の新規クリアランスシステムの研究

多くの神経変性疾患においては封入体タンパク質の分解機構に破綻がある可能性があることが示唆されている。本研究ではMJD1の分解機構が分子レベルで理解し、それを制御するような遺伝子治療法や低分子化合物の探索することによって、全く新しい作用機序に基づく治療法の閉発を期待したものである。またヒトの疾患に類似したモデル動物を作出できることが予想され、根本的治療法の確立に寄与することも目指し、本研究を行っている。異常MJD1タンパク質のクリアランス機構に関与する二つのタンパク質VCPとUFD2がどのようにMJD1をユビキチン・プロテアソーム系によって分解へ導くかという分子メカニズムを明らかにすると同時に、モデルマウスの作製を今年度は行った。VCPやUFD2はMJD1の分解に関与する分子であるので、細胞内におけるMJD1の過剰蓄積が予想される。そこでこれらノックアウトマウスを観察した。小脳性失調等の神経学的異常の発症を中心に長期観察を行うと共に、発生期から成体までの全身病理検索を行う。さらにノックアウトマウスから初代培養細胞を作製し、その細胞を用いてMJD1のユビキチン化と分解が実際に阻害されているかどうかを検討した。また、それらの細胞に凝集体形成を起こすような変異MJD1を発現したトランスジェニックマウスを作製し、小脳性失調等の神経学的異常の観察を行うと同時に、UFD2ノックアウトマウスとMJD1トランスジェニックマウスを交配することによって、その凝集体形成能や細胞傷害性を検討している。本研究においては異常MJD1タシパク質のクリアランス機構に関与する二つのタンパク質VCPとUFD2がどのようにMJD1をユビキチン・プロテアソーム系によって分解へ導くかという分子メカニズムを明らかにし、さらに細胞生物学及び発生工学的にこれらの分子が異常タンパク質の凝集体形成や細胞傷害にどのように関わっているかを解明することを目的とする。1.組換えVCP及びUFD2タンパク質と特異的抗体の作製マウスVCPとUFD2 cDNAを用いて蛋白質を発現させ、精製後ウサギに免疫して特異的抗体を作製した。2.MJD1-VCP-UFD2の結合と細胞内局在に関する検討組換えMJD1、VCP、UFD2タンパク質を用いて結合を確認した。特異的抗体を用いて内在性タンパク質の結合を確認した。3.VCPとUFD2がMJD1のユビキチン化に及ぼす影響の検討組換えMJD1タンパク質を用いて試験管内でユビキチン化を起こすことに成功し、その活性分画にVCPとUFD2を発見した。4.MJD1の分解時間に対するVCP/UFD2系の関与の検討MJD1の細胞内分解時間はVCP/UFD2系で促進した。5.MJD1め凝集体形成及び細胞傷害性に対するVCP/UFD2系の関与の検討ポリグルタミン鎖が異常伸長したMJD1のN末端を欠失した変異体とともにVCP/UFD2を過剰発現によって凝集体形成や細胞傷害性が抑制された。6.VCP及びUFD2ノックアウトマウスの作製分子機能に重要と思われる部分をネオマイシン耐性遺伝子によって置き換えたジーンターゲティング用ベクターを作製し、ES細胞に導入、さらに胚盤胞へインジェクションし、正常遺伝子を持たないマウス(VCPノックアウトマウス、UFD2ノックアウトマウス)を作製中である。本研究ではMJD1の分解機構が分子レベルで理解し、それを制御するような遺伝子治療法や低分子化合物の探索することによって、全く新しい作用機序に基づく治療法の開発を期待したものである。

VCPやUFD2はMJD1の分解に関与する分子であるので、細胞内におけるMJD1の過剰蓄積が予想される。そこでこれらノックアウトマウスを観察した。小脳性失調等の神経学的異常の発症を中心に長期観察を行うと共に、発生期から成体までの全身病理検索を行う。さらにノックアウトマウスから初代培養細胞を作製し、その細胞を用いてMJD1のユビキチン化と分解が実際に阻害されているかどうかを検討した。また、それらの細胞に凝集体形成を起こすような変異MJD1を発現したトランスジェニックマウスを作製し、小脳性失調等の神経学的異常の観察を行うと同時に、UFD2ノックアウトマウスとMJD1トランスジェニックマウスを交配することによって、その凝集体形成能や細胞傷害性を検討している。
魚群れる河川再生に向けた回遊魚生活史の新機軸モデル創成

アユは,我が国における主要な内水面水産資源であるとともに,水圏生態系において欠かせない役割を担う魚種です.また,アユの生活史を考えるうえでは,これを取り巻く河川環境を評価し,管理していく方法を検討していくことが重要です.いずれの課題も,これからの人間と環境の共生を考えていくうえで社会的に極めて高い重要性を有しています.本研究では,数理モデリングと現地調査の両観点からこれらの問題に取り組みました.モデリングや調査片方のみではなく両者を組み合わせれば,より深い検討ができると考えたためです.数理モデリングについては,アユの生活史について,内在する最適性の原理を追求しました.具体的には,アユの個体群動態を確率微分方程式系で記述したうえで,確率制御理論に依拠して,回遊の様子をあらわす最適性方程式(HJB方程式という)を導きました.とくに,粘性解(HJB方程式に対して適切な解の概念)の観点にもとづいて,HJB方程式の数学解析や数値計算を行うことができました.こりにより,数理生物学的な観点からアユの生活史に関する理解が深まりました.また,アユを取り巻く河川環境に関しても,同様に確率制御理論にもとづく数理モデリングや数学・数値解析を行いました.これにより,実際の水産資源管理や河川環境管理への様々な示唆を得ることができました.現地調査については,斐伊川を主要な研究対象地として,季節的なアユの成長や河川環境の水理的な変化を追跡しました.これにより,斐伊川におけるアユの季節的な成長や,成長の個体差を明らかにできたとともに,河川環境変化との関係性について検討することができました.本研究の成果をベースに,発展的課題,例えば普通のアユとは異なる,ダム湖での成長を生活史を持つ「陸封アユ」に関わる諸問題にもアプローチできると期待しています.島根県斐伊川を研究対象地として,アユに焦点を当て,生物の巨視的な回遊メカニズムを記述できる数理的な方法論の構築を試みた.その結果として,近年発展が著しい「確率論的最適化問題」や「微分ゲーム理論」の観点から回遊を記述する,新しい数理生物学的な理論に至った.本理論の枠組みでの回遊は,確率論的に揺らぐ環境下における生物個体群の意思決定過程の帰結として生じる.これに加えて,斐伊川におけるアユ放流実験,定点的な水理水文観測を行った.初年度の数理モデリングではとりわけ,アユ個体群が生息地間を移動するタイミングを決定する確率論的最適停止問題の定式化,数学解析,数値計算,アユ回遊への応用性の検討を行った.また,河川環境の不確実性をより具体的な形で取り入れた,微分ゲーム版のモデルも構築し,その数値計算を行った.本研究の数理モデリングでは,ある種の非線型偏微分方程式の解を求めることが,結果として生じる回遊の具現化に繋がる.そのため,微分方程式の数値計算にある程度の重点を置いた.また,現代的な(偏)微分方程式論における弱い解の概念「粘性解」の観点から回遊のメカニズムを検討できた.すなわち,回遊の生起とある微分方程式の解が有する特異点の構造を関連づけた.この微分方程式に対しては,安定した数値計算が可能であることを実証した.さらに,数理ファイナンスにおいて用いられているモデルと本理論におけるモデルの類似性は非常に興味深く,なおかつ数学解析や数値計算において大変役立つことが示唆された.研究成果の一般市民向けシンポジウムでの講演,漁協総代会での講演,漁協広報雑誌での公開も行った.数理モデリング,現地調査ともに,ある程度の成果が得られており,学外への研究成果発表にまで至っているためである.現地調査については,研究初年度の成果から,次年度で改善すべき点が明らかとなった.これについては,次年度の研究に反映する.アユは,我が国における主要な内水面水産資源であるとともに,水圏生態系において欠かせない役割を担う魚種です.また,アユの生活史を考えるうえでは,これを取り巻く河川環境を評価し,管理していく方法を検討していくことが重要です.いずれの課題も,これからの人間と環境の共生を考えていくうえで社会的に極めて高い重要性を有しています.本研究では,数理モデリングと現地調査の両観点からこれらの問題に取り組みました.モデリングや調査片方のみではなく両者を組み合わせれば,より深い検討ができると考えたためです.数理モデリングについては,アユの生活史について,内在する最適性の原理を追求しました.具体的には,アユの個体群動態を確率微分方程式系で記述したうえで,確率制御理論に依拠して,回遊の様子をあらわす最適性方程式(HJB方程式という)を導きました.とくに,粘性解(HJB方程式に対して適切な解の概念)の観点にもとづいて,HJB方程式の数学解析や数値計算を行うことができました.こりにより,数理生物学的な観点からアユの生活史に関する理解が深まりました.また,アユを取り巻く河川環境に関しても,同様に確率制御理論にもとづく数理モデリングや数学・数値解析を行いました.これにより,実際の水産資源管理や河川環境管理への様々な示唆を得ることができました.現地調査については,斐伊川を主要な研究対象地として,季節的なアユの成長や河川環境の水理的な変化を追跡しました.これにより,斐伊川におけるアユの季節的な成長や,成長の個体差を明らかにできたとともに,河川環境変化との関係性について検討することができました.

本研究の成果をベースに,発展的課題,例えば普通のアユとは異なる,ダム湖での成長を生活史を持つ「陸封アユ」に関わる諸問題にもアプローチできると期待しています.モデルパラメータの同定や,可能な限り簡素な構造を保つモデルの深化,斐伊川漁協と協力した現地調査の継続,地域社会への研究成果のフィードバックを引き続き行っていきたい.とくに,モデリングについてはアユの一生を記述しうる,複数生息地間の回遊現象の記述にひとつの重点を置く.また,斐伊川以外の河川におけるアユ個体群動態のデータも取得できたので,これも本研究に積極的に活用していく.初年度春期のアユ生態現地調査結果から,次年度は調査規模を大きくする必要性が確認されたため.
切削力の大幅な低減を可能とする放物線振動切削装置の開発

本研究では、工具に放物線状の超音波振動を付加して切削する(放物線振動切削加工法と呼ぶ)ための装置を開発することを目的とし、約20kHzのねじり振動と約40kHzの縦振動を合成することによって超音波放物線振動を発生する装置等を設計・試作した.そして開発した放物線振動切削装置を加工機に組み込んで超音波領域での放物線振動切削加工を実施し、従来法に比べて切削力の低減効果を有することを確認した.本研究では、工具に放物線状の超音波振動を付加して切削する(放物線振動切削加工法と呼ぶ)ための装置を開発することを目的とし、約20kHzのねじり振動と約40kHzの縦振動を合成することによって超音波放物線振動を発生する装置等を設計・試作した.そして開発した放物線振動切削装置を加工機に組み込んで超音波領域での放物線振動切削加工を実施し、従来法に比べて切削力の低減効果を有することを確認した.本研究では、工具に放物線状の超音波振動を付加して切削する(放物線振動切削加工法乏呼ぶ)ための装置を開発することを目的とし、本年度は主として以下の項目について試作開発研究を行った。1.ねじり振動と縦振動を利用した放物線振動切削装置の開発まず、ねじり振動と縦振動を利用して円筒面内での放物線振動を得る装置を開発した。ここでは、すでに振動設計と試作を終えた振動子に対して、実際に工具刃先を固定し、支持を行った上で放物線軌跡の超音波振動を行い得るように調整等を行った。2.放物線振動切削プロセスの解析モデルの構築プロセスを理解するため、また切削条件によってどの程度の効果が得られるのかを予測し、目的に合わせた最適条件を決定するため、簡便な解析モデルの構築を試みた。本切削プロセスは基本的に間欠的な引き切りを行う傾斜切削プロセスである。そこで、ここでは、簡便な最大せん断応力説と最小エネルギ説に基づくせん断面理論を適用し、傾斜角が変化するプロセスを平均的に取り扱う解析モデルの構築を試み、その定式化を終え、解析アルゴリズムを開発した。3.ねじり振動と縦振動を利用した放物線振動切削装置による加工実験上記1において開発した放物線振動切削装置を加工機に組み込み、超音波領域での放物線振動切削加工を実施した。本装置では、従来の切削方向または刃先稜線方向の超音波振動切削も可能であることから、これらの従来型の振動切削も同条件にて実施し、本手法の効果について比較検討を行った。その結果、従来法に比べて切削力の低減効果を有することを確認するに至っている。1.たわみ振動と縦振動を利用した放物線振動切削装置の開発約20kHzの縦振動と約40kHzのたわみ振動を合成することにより、放物線軌跡を有する超音波振動装置を設計・試作した。本装置は、極めて小さい切削力で切断を行い得る工業用カッターや医療用メスを目的とするものである。本装置では2つの異なる振動モードが正確に2倍の共振周波数を持つこと、および支持のためにそれらの節点が一致していることが必要であるため、これらの特性について有限要素法解析を駆使して設計を行い、その解析結果を基にして切断装置の試作を行った。2.たわみ振動と縦振動を利用した放物線振動切削装置の性能評価上記において開発した放物線振動切削装置の振動特性を評価した。具体的には、振動軌跡を確認し、振幅24ミクロン程度の良好な放物線振動を発生しえることを確認した。また、刃先部に外力を加えて振動軌跡の評価を行うことにより、負荷特性の評価も行った。その結果、0.4N程度の負荷まで振動軌跡の大きな変化を生じずに良好な放物線軌跡を発生しえることを確認した。3.たわみ振動と縦振動を利用した放物線振動切削加工実験上記の装置を加工機に組み込み、超音波領域での放物線振動切削による切断加工を試みた。その結果、今回行った実験の範囲では、本装置による効果を確認することができなかった。負荷容量の不足が考えられ、今後本装置に関しては改善が必要と考えられる。
神経回路修復医学の創成

脳血管障害、脳・脊髄の外傷などの局所中枢神経障害、高次脳機能障害、神経障害性疼痛などの神経疾患においては、神経系のみならず免疫系、脈管系、様々な臓器からなる生体システムに時空間的変化をきたし、病態が形成される。本研究では、中枢神経回路の障害、その後の修復過程を、生体システムの機能ネットワークの観点から解析し、生体システムの時空間ダイナミクスによる一連の過程の制御機構の統合的解明に取り組む。特に、「神経系と各臓器」の連関による制御機構を見いだすことを本研究の到達目標とする。中枢神経回路障害と機能回復の過程を、生体システム全体のダイナミクスとして捉え、神経系と各システムの連関を統合的に解析することで、中枢神経回路障害における生体の動作原理を明らかにする。当該年度には、神経回路障害と修復の制御に関わる生体システムの空間的・時間的解析を行った。また中枢神経回路の構築に、末梢の免疫系細胞がどのように関わるかについて検討を加えた。その結果、B-1a細胞は自然抗体を産生してオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することで脳の発達に寄与しているという知見を得て、論文発表した(Nat. Neurosci., 2018)。さらにNuropilin-1やHDACが脊髄損傷後の機能回復に関与していることを見いだした(Cell Death Dis., 2018; Cell Death Dis., 2019)。ミクログリア、マクロファージ(M1, M2)、helperT細胞(Th1, Th2, Th17, Tregなど)、B細胞、新生血管細胞(CD105陽性細胞)などの挙動、そして膵臓、肝臓、心臓など各種臓器での細胞の挙動を、FACSを用いて解析した。また中枢神経回路の構築に、末梢の免疫系細胞がどのように関わるかについて検討した。発達期の脳では、リンパ球であるB細胞が豊富に存在していることが確認された。このB細胞は、B-1a細胞と呼ばれるサブタイプであり、血中の未成熟なB細胞がCXCL13-CXCR5依存的に脳に移行していくことを示した。B細胞を除去させる抗体を発達期のマウスの脳に投与すると、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖が抑制され、成熟したオリゴデンドロサイトの数も減少した。B-1a細胞が産生する自然抗体の受容体であるFcα/μRの機能阻害抗体を発達期の脳に投与したところ、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖と成熟オリゴデンドロサイトの減少が観察された。さらに、発達期にFcα/μRの機能阻害抗体を投与したところ、生後21日目の幼若期では髄鞘を形成している軸索の数が減少していた。以上の結果から、B-1a細胞は自然抗体を産生してオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することで脳の発達に寄与していることが示された。本研究成果を、Nature Neuroscience (2018)に公表した。生体システムが中枢神経回路障害と修復の過程をどのように制御しているかについて明らかにし、中枢神経回路障害における生体の動作原理を解明することが、本研究の到達目標である。脊髄損傷、片側大脳皮質損傷、局所脳脊髄炎(EAE)、およびADHDのモデルマウスを用いる。これらの病態モデルを用いて、各種臓器細胞群の動態と遺伝子発現の時空間的変化を解析してきた(項目1)。得られた成果を基盤として、免疫系細胞(項目2)、脈管系細胞(項目3)、各臓器(項目4)がどのように神経回路の障害と修復を制御しているか、そのメカニズムの解析を進める。得られた知見とともに、各細胞群の活性化による神経回路修復機構を見いだし、生体の反応の動作原理を解明する(項目5:H32以降)。免疫系細胞による神経回路障害と修復の制御機構の解明(項目2)としては、中枢神経回路の修復の過程で、免疫系細胞がどのような役割を担っているかを明らかにする。免疫系細胞としては、helper T細胞、B細胞、ミクログリア、マクロファージの関与について検証する。具体的にはhelper T細胞およびB細胞による神経回路の修復機構、ミクログリアおよびマクロファージによる神経回路の障害と修復機構について明らかにする。脈管系細胞と神経細胞のクロストークによる神経回路の構築機構の解明(項目3)としては、神経回路と新生血管のクロストークを明らかにする。神経回路の修復を促す脈管系細胞由来の因子とメカニズムの解明、神経細胞から脈管系細胞へのシグナル伝達、そして双方向性シグナルによる神経細胞のスクラップ・アンド・ビルドについて研究を進める。各臓器による神経回路障害と修復の制御機構の解明(項目4)としては、項目1で得られた臓器由来の候補因子が、神経回路の修復に与える影響を明らかにする。