hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本列島Geotraverse基礎調査の総合的研究

平成元年度の研究で、中部日本の飛騨帯の年代の整理が完了した。3.平成元年度の研究では、中部日本の飛騨帯のGeotraverseがある程度解明できた。飛騨帯は日本列島の基盤であると漠然と考えられてきたが、その形成年代については不確かな部分も多かった。片麻岩についてSm-Nd年代やRb-Sr年代を測定した結果、飛騨帯には古生代中期に生成した溶岩や火山砕屑岩を原岩とする変成岩が存在することを確認した。更に、これらの変成岩は二畳紀から三畳紀に主要な広域変成作用を受け、その後ジュラ紀に花崗岩の接触変成作用を被ったことも明らかになった。飛騨帯の中には先カンブリア時代(約20億年前)にその起源をもつ変成岩がある一方、明らかに古生代に起源をもつ変成岩の存在を確認できたことは、飛騨帯が様々な原岩生成年代をもつ地塊の集合体であることを示している。1.日本列島の地球科学的全体像を把握するために、9の“地域別Geotraverse"と10の“テ-マ別Geotraverse"を研究の主要テ-マとし、71の項目について調査研究を実施した。平成2年10月22日と23日に名古屋大学で研究集会を開催し、研究成果のまとめと討論を行った。この結果、71項目のうち29項目については、目的の成果が得られたことが明らかになった。今後、残りの42項目について、更に研究の精度を深めることにした。2.日本列島の地球科学的全体像を把握するためには、日本列島を構成する岩石の正しい年代を知ることが不可欠である。岩石の同位体年代は1960年代から大量に測定されている。これらの年代は、異なった年代測定法あるいは同じ測定法でも異なった壊変定数で計算されているため、最近改訂された万国共通の壊変定数で再計算して、Geotraverseと関連させる必要がある。平成2年度までに、824個のKーAr年代測定値と294個のRbーSr年代測定値の整理と再計算が完了し、71項目の地質調査結果と対照することができた。3.平成2年度の研究の主要な成果として、中部日本飛騨帯の変成史の解明・三重県鳥羽地域の黒瀬川帯の形成条件の解明・三重県伊勢地域の蛇紋岩中の青色片岩の形成過程の解析・三重県熊野市の熊野酸性岩類の形成機構・愛知県足助地域の伊奈川花崗岩の岩体解析・石川県手取川流域の手取層群の堆積環境と後背地解析・岐阜県万波地域の飛騨変成岩類と灰色花崗岩の副成分鉱物分析・岩手県陸前高田市の時代未詳壷の沢変成岩の副成分鉱物分析・九州秩父帯の砕屑岩の堆積環境と後背地解析・西南日本外帯の中新世花崗岩類の成因・中部日本美濃帯のラジオラリア生層序の確立・長野県駒ケ根地域の太田切花崗岩の固結過程の解析などがある。1.日本列島の地球科学的全体像を把握するために、北海道・東北・関東・中部・近畿・中国・四国・九州・琉球において9の"地域別Geotraverse"と、島弧-海溝系・火山地帯・鉱床地帯・自然災害・島弧全体・堆積岩・火成岩・Suture Zoneと変成帯・燃料地質・古生物についての10の"テ-マ別Geotraverse"を研究の主要テ-マとし、71の項目について調査研究を実施した。平成3年11月25日と26日に名古屋大学で研究集会を開催し、研究成果のまとめと討論を行った。また、平成3年12月から平成4年1月にかけて、研究分担者と個別に問題を討論し、日本列島全体の形成過程や地学的性状を組織的に総括した。
共鳴振動現象による動的格子変位効果を用いた窒化物複合薄膜触媒の反応選択性制御

化学反応を促進する固体表面の触媒作用を外部信号により`in-situ'で制御し、新規な触媒機能を発現させることは極めて興味深い課題である。これまでに、強誘電体結晶に高周波を印加することによって発生できる共鳴振動が、その結晶表裏に接合した金属および金属酸化物の触媒活性や反応選択性を顕著に変化させる効果を持つことを見出してき海。本研究ではさらにこの共鳴振動効果を発展させ、高度な機能を持つ固体触媒系の構築を目指し、(1)異種元素複合化触媒に及ぼす共鳴振動効果、および(2)窒化物触媒に及ぼす共鳴振動効果について検討した。(1)の検討において、単一触媒であるAg上のエタノール分解反応では、共鳴振動はアセトアルデヒド生成には影響を与えず、エチレン生成のみを増加させる効果を持つが、異種元素を複合化したAgAu合金(20%Ag-80%Au)上のエタノール分解では、逆にエチレン生成にはほとんど変化を与えず、アセトアルデヒド生成を増加させる効果を持つことを見出した。(2)の検討においては、発光材料として幅広く利用されている窒化ガリウム(GaN)に着目し、GaN薄膜の触媒作用に及ぼす共鳴振動効果を調べた。強誘電体基板上にトリコン波励起RFスパッタ法によりGaN薄膜を100nmの膜厚で接合し、窒化物触媒素子とした。GaN薄膜上のエタノール分解反応において、共鳴振動はエチレンの生成のみを顕著に増加させる効果を持つこと、さらに、触媒活性化効果はGaN薄膜の結晶性および表面構造と密接に関連することを明らかにした。化学反応を促進する固体触媒の触媒作用を外部信号によって"in-situ"で制御することは極めて興味深い課題である。これまでに、強誘電体単結晶に高周波電力を印加することにより発生できる共鳴振動が、その結晶表面に接合した金属薄膜の触媒活性や反応選択性を顕著に変化させる効果を持つことを報告してきた。本研究では、さらに共鳴振動効果を拡張し、高度な機能を持つ固体触媒の開発を目的として(1)印加電力による精緻な反応選択性の制御、および(2)窒化物薄膜に及ぼす共鳴振動効果について検討した。(1)の検討において、特定の印加電力の共鳴振動がPt薄膜上のメタノール酸化反応に対する部分酸化作用を顕著に促進する効果を持つことを明らかにし、共鳴振動を発生させる印加電力を変化させることにより、反応選択性を任意にコントロールできること、および新規な触媒機能を発現させることが可能であることを示した。(2)において、高いポテンシャルを持つ窒化ガリウム(GaN)を触媒自身あるいは触媒担持として用いるために、ヘリコン波励起RFスパッタ法によるGaN薄膜作製の条件について調べた。高周波印加電極としてMoを強誘電体結晶上に取り付け、さらにその上にGaNを種々の反応ガスおよび高周波電力条件下で取り付けた。GaN上のエチレン酸化反応やエタノール分解反応において、共鳴振動は触媒活性を増加させる効果を持つが、これまでの非窒化物触媒に比べて顕著な効果は得られなかった。このことは、作製したGaNの結晶性が悪いことに起因すると考えられ、さらにスパッタ条件(窒素導入圧力、高周波電力および基板温度)の検討が必要であることがわかった。高い結晶性のGaN薄膜の作製および、その上PtやPdなどの金属を分散させることにより、顕著な共鳴振動効果が期待できるものと考えられる。
モンテ・カルロ法による超臨界流体に対する高沸点化合物の溶解度の計算機実験

1.超臨界CO_2+芳香族化合物系固相は純芳香族化合物と仮定し、固相の芳香族化合物のフガシティーは飽和蒸気圧データより与えた。気相の芳香族化合物の残余化学ポテンシャルはWidomのテスト分子挿入法を改良した方法を用いて計算を行った。分子間ポテンシャルとしてCO_2は1サイト、芳香族化合物中のベンゼン環、メチル基および水酸基をサイトとするLennard-Jones(12-6)ポテンシャルを用いた。共通のサイト間ポテンシャルを使用することによりフェノール、キシレノール異性体、ナフタレン、ナフトール異性体およびジメチルナフタレン異性体など広い芳香族化合物群において超臨界CO_2に対する溶解度が良好に計算でき、異性体の区別も可能であることが示された。このことは、サイトモデルによるグループ寄与法で溶解度の推算が可能であることを示唆している。2.超臨界CO_2+高級アルコール系超臨界CO_2に対する高級アルコール(炭素数が16、18および20)系の溶解度の計算を行った。分子間ポテンシャルとしてはJorgensenらが提案したものを用いた。また、気相中の高級アルコールの残余化学ポテンシャルはKirkwood法を用いて計算した。CO_2とメチル基およびCO_2とメチレン基の相互作用パラメータk_<12>は昨年度の研究により0.12と決定した。そこで、CO_2と水酸基の相互作用パラメータk_<12>を超臨界CO_2に対する高級アルコールの溶解度を良好に表すよう決定したところ-1.5となった。このパラメータを用いて3種の高級アルコールの溶解度を計算したところ実測値との一致はほぼ良好であった。
組織的犯罪対策に関する刑事実体法・手続法的研究

本件研究の目的は、組織的犯罪対策に関する諸問題について、刑事実体法的観点、手続法的観点から包括的な考察を加えつつ、望ましい対策のありかたを提唱する点にあった。とりわけ平成一一年八月に、いわゆる組織犯罪対策関連三法が国会で成立したのを受けて、従来の法制度と改正法制度との比較分析、組織犯罪対策関連三法案の立法過程の調査・分析、ドイツ法・アメリカ法をはじめとする諸外国の法制度との比較法的研究など、多角的な視点のもと、分析作業を進めた。その具体的な内容としては、(1)「犯罪捜査のための通信傍受に関する法律」の規定と、憲法が要請している令状主義と適正手続保障との関連についての研究、(2)いわゆるロッキード事件に関する最高裁判例における刑事免責に関する判断の趣旨・射程範囲の分析、(3)刑事免責制度の導入の可能性に関する立法論・比較法的考察、(4)マネー・ロンダリング処罰を拡大することに関する理論的問題点の検討、(5)組織犯罪における刑の加重と違法要素・責任要素への関連づけの検討、(6)ドイツにおける最近の財産刑制度に関する議論の状況などの諸点である。さらに、刑事実体法的かつ刑事学的関心から、暴力団構成員を中心とする近時の執行妨害事犯の現況に関する調査を行いつつ、競売入札妨害罪をめぐる最近の最高裁判例の当否についても分析を加えることができた。結論として、組織犯罪対策関連三法は基本的に適切な方向にあることが確認されたが、対策として不十分な点や、理論的な正当化が不十分な点など、なお問題点が残されている。もっとも、これらの研究は基礎理論的な考察に多くを費やしたこともあり、その具体的な諸問題への適用については、その研究成果はなお不十分なものである。今後は、具体的な法運用までを視野に入れつつ、さらに継続的に研究を進める必要が残されている。本年度の研究においては、おりしも「組織的な犯罪に対処するための刑事法整備要綱骨子(案)」が法制審議会刑事法部会で可決されたのを受けて、同要綱骨子案の内容についての検討作業を進めた。具体的には、(1)組織的犯罪に関する刑の加重の根拠やその処罰範囲に関する問題点、(2)マネー・ロンダリング処罰に関する問題点、(3)没収、追徴に関する問題点、(4)通信傍受制度に関する問題点、(5)証人保護制度に関する問題点などの内容を中心として、分析・検討を行った。その結論については、現在なお検討過程であり、これらについては、なお来年度以降も継続して研究を行う必要がある。なお、その際にも、法改正作業の親展を可及的にフォロー・アップしていく予定である。また改正法が成立した場合には、その内容について綿密な分析を加える必要があろう。さらに、上記の検討を加える上での基本的視座とするべく、主としてドイツ、アメリカを中心として比較法的考察を加えた。その内容としては、実体法的側面としては、各国の没収・追徴制度、マネーロンダリング犯罪の実状についての分析を試みた。また訴訟法的側面では、主として通信傍受制度、証人保護制度についての比較研究を行った。もっとも本年度の作業は各国の基本的文献の収集活動に重点を置いたため、その内容の分析・解明はなお継続中であり、来年度以降に引き続き検討を加えなくてはならない。また来年度以降は、イギリス・フランス・スイスなど、それ以外の国・地域の組織犯罪対策の現状も視野に入れた研究を継続する必要がある。本年度の研究においては、昨年度に引き続き、主としてドイツ、アメリカを中心としで、組織的犯罪対策において問題となりうる論点にとつき、比較法的考察を加えた。ドイツ法の検討としては、没収・追徴に関する問題点とともに、1992年から導入された資産刑の制度やその運用について詳細な分析を加えた。

さらに、それと、あわせて、昨年成立した第六次刑法改正法の内容も考察の対象とした。またアメリカ法の研究としては、証言免責による供述証拠の収集活動、捜査手段としての通信・会話の傍受など、主として刑事手続法に関する諸問題をその分析の対象とした。今後はざらに、アメリカの刑事実体法、ドイツの刑事手続法についても許細な検討を加える必要があろう.さらに今年度は検討が不十分であったが、イギリス・フランス・スイスなど、それ以外の地域の犯罪対策の現状についても視野に入れた研究を進める必要がある。また国内法についても、昨年度に引き続き、法制審議会刑事法部会で可決された「組織的な犯罪に対処するための刑事法整備要綱骨子(案)」の内容について、刑事実体法・刑事手続法の両側面からの検討作業を進めるとともに、これらの諸問題に関連する従来の裁判例・学説についての網羅的な分析を行った。これらの作業と平行して、立法過程に関する研究、それをめぐる法曹実務家や刑事法研究者の反応などについても広く調査を試みた。これらの研究については、法改正作業の進展を可及的にフォローアップしつつ、今後もさらに検討を継続する必要がある。また刑事政策的な観点からも検討を加えていく必要があろう。本年度は、本件研究の最終年度に当たることもあり、これまでの二年間の研究成果をふまえつつ、組織犯罪対策に関する諸問題について、刑事実体法的観点、手続法的観点から総合的・網羅的な考察を加えた。とりわけ平成一一年八月に、いわゆる組織犯罪対策関連三法が国会で成立したのを受けて、従来の法制度と改正法制度との比較分析、組織犯罪対策関連三法案の立法過程の調査・分析、ドイツ法・アメリカ法をはじめとする諸外国の法制度との比較法的研究など、多角的な視点のもと、検討作業が進められた。その具体的な内容としては、(1)「犯罪捜査のための通信傍受に関する法律」の規定と、憲法が要請している令状主義と適正手続保障との関連についての研究、(2)いわゆるロッキード事件に関する最高裁判例における刑事免責に関する判断の趣旨・射程範囲の分析、(3)刑事免責制度の導入の可能性に関する立法論・比較法的的考察、(4)マネー・ロンダリング処罰を拡大することに関する理論的問題点の検討、(5)組織犯罪における刑の加重と違法要素・責任要素への関連づけの検討、(6)ドイツにおける最近の財産刑制度に関する議論の状況などの諸点を中心として研究が進められた。さらに、刑事実体法的かつ刑事学的関心から、暴力団構成員を中心とする近時の執行妨害事犯の現況に関する調査を行いつつ、競売入札妨害罪をめぐる最近の最高裁判例の当否についても分析を加えた。これらの研究の過程においては、これまでのわが国の学説・裁判例についても網羅的に検討を加えることができた。もっとも、これらの研究は基礎理論的な考察に多くを費やしたこともあり、その具体的な諸問題への適用については、その研究成果はなお不十分なものである。今後は、具体的な法運用までを視野に入れつつ、さらに継続的に研究を進める必要が残されている。
コムギのフルクタン分解酵素遺伝子群による越冬エネルギーの効率的利用機構の解析

ハードニング中および越冬中のフルクタン蓄積量はコムギの耐凍性と雪腐病抵抗性に強く関わる。近年、異なった基質特異性をもつコムギのフルクタン分解酵素遺伝子(FEH)が幾つか単離された。自然環境下で生育したコムギ組織において、1-FEH, 6-KEH, 6&1-FEH, 6-FEH, Wfh-sm3遺伝子発現の季節変化を解析したところ、発現変化は遺伝子によって異なった。その中で、コムギのフルクタンの全ての組成を分解する酵素をコードするWfh-sm3遺伝子の発現量は、フルクタン含量の季節変化に関係していた。これらの遺伝子の発現制御が越冬中の環境ストレスに対する品種間差異に重要な役割を担うと考えられる。フルクタン(fructan)は麦類や寒地型牧草の越冬能力に深く関わる多糖であり、コムギにおいて秋のハードニング時に蓄積されるフルクタン量がコムギの品種間の耐凍性及び雪腐病抵抗性と相関する。本課題では、圃場越冬コムギのフルクタン分解酵素遺伝子発現の変化を解析し、フルクタン代謝によるコムギの越冬エネルギー蓄積・利用の調節機構を分子生物学的に明らかにする。1)昨年と同じ品種に関して、次年度越冬中の圃場コムギ品種のクラウンと葉茎組織のフルクタン分解酵素遺伝子の発現を解析したところ、クラウンと葉茎では傾向は昨年度解析と概ね同じであった。2)季節を通して、それぞれ6-ケストース(3糖)とビフルコース(4糖)に強い基質特異性をもつ6-KEH, 6&1-FEHの発現量が長鎖を分解する酵素をコードする他の遺伝子よりも高いレベルで発現していた。ハードニング、越冬期間を通してエネルギー源供給のために、常にこれらの酵素によってフルクトオリゴ糖分解されている可能性がある。6&1-FEH遺伝子は昨年度結果では恒常的な発現を示していたが、今年度解析ではやや低温誘導性を示した。3)コムギのフルクタンの骨格となるβ(2→6)結合を切る6-FEHは昨年解析と同様にハードニング中に増加し、積雪下で減少した。単・二糖類含量の増減と相関する変化を示した。4)昨年解析でフルクタンの季節変化と品種間差異のキー酵素遺伝子と推察されたフルクタンの全ての組成を分解できる酵素をコードするWfh-sm3の発現は、フルクタンが急激に増加する秋口後半に発現量が抑えられ、積雪下で発現が誘導された。フルクタンの蓄積量が高く、雪の下でのフルクタン消費速度が低いPI 173438では多品種より一貫して発現が低く推移した。フルクタンはデンプンに代わって植物細胞の液胞に蓄積されるショ糖から生産されるオリゴ及び多糖である。我々のグループは、すでにフルクタン合成酵素遺伝子を3種類単離しており、そのうちの(sucrose:sucrose1-fructosyltransferase, sucrose:fructan 6-fructosyltransferase)の発現が、コムギのフルクタン含量の季節変化や品種間差異と相関することを報告している(Kawakami and Yoshida 2002)。一方、近年、異なった基質特異性をもつコムギのフルクタン分解酵素遺伝子(FEH, fructan exohydrolase)が幾つか単離された。自然環境下で生育したコムギ組織において、1-FEH, 6-KEH, 6&1-FEH, 6-HEH, Wfh-sm3遺伝子発現の季節変化を解析したところ、秋のハードニング中及び越冬中の発現変化は遺伝子によって異なった。オリゴ糖の分解を主に行う酵素遺伝子は、季節変化に関係なく恒常的に発現するものと、成長が盛んな時期に発現が高くなるものに分かれた。コムギの分岐型フルクタン(グラミナン)構造の全てを分解可能なWfh-sm3は、雪腐病菌接種によって発現が増加し、フルクタン含量の季節変化に関係していた。近年、異なった基質特異性を持つコムギのフルクタン分解酵素遺伝子(FEH, fructan exohydrolase)が幾つか単離された。本課題では、圃場越冬コムギのフルクタン分解酵素遺伝子発現の変化を解析し、フルクタン代謝によるコムギの越冬エネルギー蓄積・利用の調節機構を分子生物学的に明らかにすることを目的とした。

圃場越冬中の耐凍性及び雪腐病抵抗性の異なるコムギ品種のクラウンと葉茎組織のフルクタン分解酵素遺伝子の発現を解析したところ、クラウンと葉茎では傾向は概ね同じであった。季節を通して、それぞれ6-ケストース(3糖)とビフルコース(4糖)に強い基質特異性をもつ6-KEH, 6&1-FEHの発現量が長鎖を分解する酵素をコードする他の遺伝子よりも高いレベルで発現していた。ハードニング、越冬期間を通してエネルギー源供給のために、常にこれらの酵素によってフルクトオリゴ糖が分解されている可能性がある。コムギのフルクタンの骨格となるβ(2→6)結合を切る6-FEHはハードニング中に増加し、積雪下で減少し、単・二糖類含量の増減と相関する変化を示した。フルクタンの全ての組成を分解できる酵素をコードするWfh-sm3の発現は、フルクタンが急激に増加する秋口後半に発現量が抑えられ、積雪下で発現が誘導された。フルクタンの蓄積量が高く、雪の下でのフルクタン消費速度が雪腐病抵抗性品種では他品種より一貫して発現が低く推移した。Wfh-sm3の発現変化はフルクタンの季節変化および品種間差異と相関することから、越冬に係わるフルクタン代謝制御のキー酵素遺伝子と推察された。植物生理学圃場の遺伝子発現解析については、2シーズン分のサンプルについての実験を終了し、目的とする越冬性中のフルクタンの蓄積量の制御およびその品種間差異に関わるフルクタン分解酵素のキー遺伝子の特定までに至った。種類の多いフルクタン分解酵素遺伝子群の発現様式を圃場サンプルで解析し、フルクタンの蓄積、消費に関わる酵素遺伝子を明らかにした。遺伝子発現の結果を裏付けるため、酵素活性の季節変化を解析する。また、越冬下のフルクタン分解とエネルギー消費の制御を考察するために、人工環境下で高いDPフルクタンと3糖フルクタン(1ーケストース)に対するFEH酵素活性の温度応答を調べる。今年度の解析と同じ実験を、別の年度の圃場越冬コムギ品種で行う。人工環境温度レスポンス実験と併せて結果の比較検証を行い、それぞれの遺伝子の生理的役割を解明する。研究担当者の健康上の理由(長期病休)により、3月に急遽3週間実験を中断せざるを得なくなり、その間計画していた実験の費用と人件費が使用されないままとなった。上記期間に計画していた酵素活性実験を26年度に実施するのための費用に充填する。今年度、圃場サンプルの解析の温度レスポンスを検証するために、人工環境下の実験も平行して行う予定であったが、夏季に北海道の節電要請により人工環境室が使用できなかったため、これらの解析のための費用が残額として生じた。これらの植物育成とサンプリングは秋以降に順次行ったので、この解析を次年度に行う。糖解析と分子生物学的解析に購入する試薬類を物品費として申請当初の計画の150万円を使用予定。それに加えて、25年度は人件費に約90万を使用予定している。
新規なPCNAアンロード機構による細胞周期制御とゲノム維持

PCNAはローダーとして機能するRFC複合体によりDNAにロードされ、ゲノム制御因子のDNA集合と反応の中心となる。したがって、RFC1-RFCやCtf18-RFCによるPCNAロードはゲノム維持に必須である。本研究では、機能未知のもう1つのRFC複合体、Elg1-RFCについて解析を行った。Elg1欠失細胞ではDNA結合PCNAが過剰になり、S期の進行は遅延した。また、クロマチン構成因子のDNA結合量は低下し、M期では壊れた染色体が多く観察された。以上より、Elg1-RFCはPCNAアンローダーとしてDNA結合PCNA量を制御し、周期進行とゲノム維持に寄与することが明らかとなった。新規なRFC複合体であるElg1-RFCの細胞内における基本機能を明らかにするため、RNAi法によるElg1ノックダウン細胞の解析を行い、以下の結果を得た。1)対照細胞と比較して、複製(S)期におけるクロマチン結合したPCNA量が過剰になることがウエスタン法、免疫染色法で明らかになった。DNA合成のマーカーとなるBrdUの取り込みとPCNAの共染色では、DNA合成が行われている部位以外でもPCNAがクロマチン結合していることが示された。2) S期の進行が遅延するがチェックポイント機構は応答しておらず、クロマチン結合した過剰なPCNAが細胞周期進行を阻害していることが示唆された。また、通常はS期後のG2期ではPCNAはクロマチンから除去されるが、ノックダウン細胞ではPCNAはクロマチンに結合したままであることが示された。3)過剰にクロマチン結合したPCNAが他のクロマチン結合因子に与える影響を解析した結果、ヒストンH3やセントロメアタンパク質CENPAなどクロマチンの基本構造形成に関わる因子には影響がなかったが、コヒーシンサブユニットSMC3、クロマチンリモデリング因子SNF2H、ヘテロクロマチン形成因子HP1αなど、高次の染色体構造形成に関わる因子のクロマチン集合が阻害されることが示された。4)間期におけるクロマチン構造を核Halo標本、分裂期での染色体構造をM期核標本を作製して解析した。その結果、ノックダウン細胞では間期核におけるクロマチン構造が緩んだ状態になっており、M期核標本では断裂や崩壊していることを示す染色体が多数見られた。以上より、Elg1-RFCはS期においてクロマチン結合したPCNAをDNA複製終了後に特異的にアンロードすることで、複製と連係した安定な細胞周期の進行や高次染色体構造の形成とゲノム維持に寄与していることが明らかになった。前年度には、RNAi法等によるヒト細胞内での解析で、Elg1-RFCがPCNAアンローダーとして機能していることを明らかにした。当該年度では、Elg1-RFCの細胞内における動態と、精製タンパク質を用いた生化学的解析によりその特性を明らかにすることを目的とした。細胞内動態については、Elg1-RFCと、PCNAローダーとして機能する他のRFC複合体(RFC1-RFC、Ctf18-RFC)との比較を行った。その結果、Elg1-RFCは他のRFC複合体が溶出する高塩濃度でもクロマチンに結合しており、これはアンローダーとして機能するための特性の1つと考えられた。また、RFC1-RFCやCtf18-RFCはS期細胞においてPCNAと共局在することが示されているが、Elg1-RFCについては、これらとは全く異なる挙動を示した。今後は、これら新しく見いだしたElg1-RFCの動態について、その意義を含めて検討したい。生化学解析については、組換え精製複合体を得るために当初の目的通りに昆虫細胞発現系での発現と精製を行った。しかし、Elg1は他のRFC複合体とは異なり、昆虫細胞内では非常に分解されやすいことが分かった。そこで、ヒト細胞発現系(Uno et al., Methods, 2012)からの精製に切り替え、発現コンストラクトの構築と、ヒト細胞内での発現チェックをおこなった。その結果、昆虫細胞に比べElg1の安定性が格段に改善された。そこで、パイロット実験としてスモールスケールで精製を行い、複合体を得ることができる精製条件を確立した。これまでに、Elg1-RFCの精製複合体を用いた解析例は報告されていない。そこで現在は、ラージスケールでの精製に取り組んでおり、精製が完了次第、PCNAロード、アンロード活性等の生化学的解析を行い、Elg1-RFCの特性を明らかにしていく予定である。当該年度には精製Elg1-RFCを用いたPCNAアンローディングの生化学的解析、および、DNA損傷修復後のPCNAアンロードの解析を計画していた。精製タンパク質の解析では、発現系を昆虫細胞からヒト細胞に切り替えることでElg1-RFCをはじめ、RFC複合体ファミリーを安定に得られるようになった。精製Elg1-RFCを用いてこれまでに、ヒト細胞から回収したクロマチン分画からATP加水分解依存的にPCNAをアンロードする、という生化学活性を直接的に示すことができた。また結合解析では、他のRFC複合体とは異なり、Elg1-RFCはPCNAとの結合が弱いという結果を得た。これから、アンローダーであるElg1-RFCはローダーである他のRFC複合体とは異なる特性を持っていることが示唆される。そこで、精製タンパク質による反応再構築系で詳細なPCNAアンローディング機構の解析を続けている。これまでは、細胞周期S期におけるElg1-RFCのアンロードを前提に解析していたが、PCNAはDNA損傷後の修復過程でもクロマチンにロードされ、修復の完了後にはアンロードされる。

この過程でのElg1-RFCの関与を明らかにするため、Elg1をRNAiしたヒト細胞に紫外線を照射し、経時的にクロマチン結合PCNAの変化量を解析していたが、実験的に照射可能な紫外線量が強すぎると考えられ、対象となる通常細胞でもPCNAがアンロードされるポイントを見出せなかったため、実験系の改良が課題となった。一方で、Elg1をRNAiするとヒストンタンパク質の修飾が全ゲノムレベルで大きく変化しているという新規な現象も見出した。当初の計画にはなかったが、この点について解析を進めるため、CRISPR/Cas9法によりElg1のノックアウト細胞を作成し、Elg1-RFCのヒストン修飾への寄与について解析を進めている。PCNAはローダーとして機能するRFC複合体によりDNAにロードされ、ゲノム制御因子のDNA集合と反応の中心となる。したがって、RFC1-RFCやCtf18-RFCによるPCNAロードはゲノム維持に必須である。本研究では、機能未知のもう1つのRFC複合体、Elg1-RFCについて解析を行った。Elg1欠失細胞ではDNA結合PCNAが過剰になり、S期の進行は遅延した。また、クロマチン構成因子のDNA結合量は低下し、M期では壊れた染色体が多く観察された。以上より、Elg1-RFCはPCNAアンローダーとしてDNA結合PCNA量を制御し、周期進行とゲノム維持に寄与することが明らかとなった。Elg1-RFCの精製が当初の予定より遅れたことによる。これは、Elg1が昆虫細胞発現系では非常に不安定であったためである。しかし、ヒト細胞発現系に切り替えることで、Elg1が安定に発現するように改善され、精製のパイロット実験までは実施することができた。一方、精製Elg1-RFCによる生化学解析に用いるための鋳型DNAとしては、ssDNAを調製し、ビオチンを付加したプライマーから合成によってdsDNAにし、ニッケースやライゲースによってニックの有無をコントロールできる環状DNAをすでに調製済みである。これを用いることで、PCNAロード、アンンロードがどのようなDNA構造特異的に行われるのかといった特性を解析していく準備は整っている。分子生物学当初の予定よりElg1-RFCの精製が遅れたものの、すでに改善は行うことができたので、Elg1-RFCの特性について生化学的な解析を行い、他の複合体との比較でRFC複合体ファミリー間の機能の普遍性や特異性を明らかにしていく。また現在は、Elg1-RFC複合体の細胞内動態の解析の一部として、当初の研究計画にはなかった細胞内での相互作用タンパク質の質量分析の準備も行っており、この計画も進めていくことでElg1-RFCのPCNAアンローダーとしての特異性を明らかにしていく予定である。Elg1ノックダウン細胞による解析で、Elg1-RFCが特異的に示すPCNAアンローディング活性と、その機能が欠損した場合の細胞周期進行、クロマチン結合因子、高次染色体構造形成への影響を明らかにすることができた。これらの成果は、当初の研究計画通りに得ることができた。
μ-ピコリル白金族クラスターの合成と触媒能の発現

2-(クロロメチル)ピリジンおよび2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンの酸化的付加に関するこの研究の結果は以下の通りである.1トルエン中,100°Cで2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンをPd(PPh_3)_4に酸化的付加させ,2-(6-クロロメチル)ピリジルメチル基がC,N-架橋した複核Pd(II)錯体1および2,6-ジメチルピリジン-α,α'-ジイル基がC,N,C'-架橋した横並び型4核Pd(II)錯体2を得た.2錯体2は単離された錯体1の2核錯体にPd(PPh_3)_4を反応させても得られるが,この合成法を適用してパラジウム-白金から成るヘテロ金属4核錯体3の合成に成功した.しかし,この錯体にはヘテロ原子の組合せによる3種の異性体が存在するが,その分離には成功していない.3 4核錯体2は,内側と外側のそれぞれ2つのPd中心で異なる配位環境にあり,配位子置換反応やその他の反応の様子が異なることを,トリフルオロ酢酸銀,ジホスフィン,Tl(acac)との反応等で明らかにした.4一方,2-(クロロメチル)ピリジンおよび2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンとウイルキンソン錯体RhCl(PPh_3)_3との反応の場合には,トルエン中,室温で2-ピリジルメチル基および2-(6-クロロメチル)ピリジルメチル基がC,N-キレート配位した単核シス(PP)-Rh(III)錯体4-cis,5-cisが,また還流下では4-trans,5-transが得られた.5単核錯体5-cisに更にウイルキンソン錯体を反応させる,あるいは,2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンに2当量のウイルキンソン錯体を反応させることにより,2,6-ジメチルピリジン-α,α'-ジイル基が一方のRh中心にC,N-キレート配位し,他方にη^3-1-azaallyl型配位しためずらしい複核Rh(III)錯体を得た.2-(クロロメチル)ピリジンおよび2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンの酸化的付加に関するこの研究の結果は以下の通りである.1トルエン中,100°Cで2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンをPd(PPh_3)_4に酸化的付加させ,2-(6-クロロメチル)ピリジルメチル基がC,N-架橋した複核Pd(II)錯体1および2,6-ジメチルピリジン-α,α'-ジイル基がC,N,C'-架橋した横並び型4核Pd(II)錯体2を得た.2錯体2は単離された錯体1の2核錯体にPd(PPh_3)_4を反応させても得られるが,この合成法を適用してパラジウム-白金から成るヘテロ金属4核錯体3の合成に成功した.しかし,この錯体にはヘテロ原子の組合せによる3種の異性体が存在するが,その分離には成功していない.3 4核錯体2は,内側と外側のそれぞれ2つのPd中心で異なる配位環境にあり,配位子置換反応やその他の反応の様子が異なることを,トリフルオロ酢酸銀,ジホスフィン,Tl(acac)との反応等で明らかにした.4一方,2-(クロロメチル)ピリジンおよび2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンとウイルキンソン錯体RhCl(PPh_3)_3との反応の場合には,トルエン中,室温で2-ピリジルメチル基および2-(6-クロロメチル)ピリジルメチル基がC,N-キレート配位した単核シス(PP)-Rh(III)錯体4-cis,5-cisが,また還流下では4-trans,5-transが得られた.5単核錯体5-cisに更にウイルキンソン錯体を反応させる,あるいは,2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンに2当量のウイルキンソン錯体を反応させることにより,2,6-ジメチルピリジン-α,α'-ジイル基が一方のRh中心にC,N-キレート配位し,他方にη^3-1-azaallyl型配位しためずらしい複核Rh(III)錯体を得た.μーピコリルPd(I)クラスタ-を中心に以下のような成果を収めた。1.まず、トランスー[PdCl_2(SET_2)_2]に2ーピコリルリチウムを反応させ、4員環のビス(ピコリル)錯体[Pd(picーN,C)_2](1)を反応中間体として単離する試みを行なった。しかし、ー78°Cの低温で(1)と思われる黄土色沈殿を得たものの,窒素雰囲気下でも極めて不安定で単離には至らなかった。2.そのため、反応容器中に(1)を生成させたのち、in situでPdo価錯体[Pd(PPh_3)_4]を反応させ、oneーpot反応として[Pd_4(pic)_4ー(PPh_3)_2]の組成をもつ黄色錯体(2)を得た。3.錯体(2)は、我々が先に得ている複核のピコリル架橋Pd(II)錯体[{Pdcl(picーN,C)(PPh_3)}_2]にピコリルリチウムを反応させても得られることが判った。4.錯体(2)は当初想定したPd(I)ーPd(I)複核錯体[Pd_2(picーN,C)_2ー(PPh_3)_2]の組成と異なっている。

本年度当研究費補助金で購入した核磁気共鳴装置を含め、^1H,^<13>C,^<31>P NMR、分子量測定そのほかによるキャラクタリゼ-ションの結果、Pd(I)ーPd(I)間に単結合と供与結合を交互にもつ4核Pd(I)クラスタ-であることが判った。5.錯体(2)の構造解析は望ましい単結晶が成長しないため行っていない。また、無機、有機基質との反応性についても、得られた錯体の予想に反した構造のため今のところ実行していない。6.しかし、錯体(2)はCDCl_3中、その金属ー金属結合にCDCl_3のCーCl結合が酸化的付加する興味ある反応を示すことが見いだされ、それについては目下、継続研究中である。2,6-ルチジンの関与したPd(II)多核錯体の合成と反応に関して、以下の結果を收めた。1、2,6-ビス(クロロメチル)ピリジン(L)をPd(PPh_3)_4(M)に対して、トルエン中、100°Cで1:1のモル比に反応させたところ、2,6-ルチジン-α,α′-ジイル基がC,N架橋した複核Pd(II)錯体1およびC,N,C′架橋した4核Pd(II)錯体2が低収率で得られた。2、複核錯体1および4核錯体2の收率を高めるべく種々の反応条件を検討した結果、錯体1はL:M=1.3:1のとき、また、錯体2はL:M=1:2のとき、それぞれ56,39%の最良收率で得られた。3錯体2はいったん単離した錯体1にMを1:2のモル比に反応さたせときにも得られ、收率は48%であった。同じく錯体1にPt(PPH_3)_4を反応させると、2,6-ルチジン-α,α′-ジイル基がC,N,C′架橋した混合金属4核錯体3が得られた。4分子量測定、NMRおよびマススペクトルにより、それぞれC,N架橋、C,N,C′架橋の構造が決定されたが、特に4核錯体は、4金属原子が縦並び型に配列した新しい型のものであることが判明した。また、3についてはPd-Ptの組み合せの異なる3種の異性体の混合物から成ることが明らかにされた。5縦並び型4核錯体2は、内側と外側のそれぞれ2つのPd中心で異なった配位環境にあり、配位子置換反応その他の反応で反応の様子が異なる。例えば、トリフルオロ酢酸銀との反応では外側の2つのPd原子に配位しているCl原子が置換され易く、同じような傾向はジホスフィンでのPPh_3の置換についても見られた。一方、塩素原子をTl(acac)で引き抜くと、4核構造が壌れ、Pd複核錯体になることが判明した。2-ピコリンおよび2、6-ルチジンの関与したRh(III)錯体の合成と反応について以下の結果を得た。1大過剰の2-(クロロメチル)ピリジンおよび2、6-ビス(クロロメチル)ピリジンをウイルキンソン錯体RhCl(PPh_3)_3にトルエン中、室温で反応させたところ、Pd(0)との反応で先に得たC,N-架橋の2核Pd(II)錯体とは異なり、C,N-キレートした単核Rh(III)錯体[RhCl_2(C-N)(PPh_3)_2](C-N=C_5H_4N-2-CH_2,1or (6-CH_2Cl)C_5H_3N-2-CH_2,2)が得られた。2上記1で得た錯体1,2はPPh_3に関してシス体であり、加温すると熱力学的に安定なトランス体に異性化する。それ故、環流トルエン中では専らトランス体が得られた。これらのシス、トランス構造は^<31>P NMRの測定により決定された。3 2-cisおよび2-trans錯体には更に酸化的付加を起こしうる炭素-塩素結合が存在している。トルエン中、110°Cで2-cisに上記ウイルソン錯体を1:1のモル比に反応させるか,2,6-ビス(クロロメチル)ピリジンに対しウイルキンソン錯体を2:1のモル比に反応させることにより,2,6-ジメチルピリジン-alpha,alpha′-ジイル基が架橋した複核Rh(III)錯体3を得た。
線条体の機能局在化を制御する分子機構の解明

本年度は、Cdh20陽性線条体ニューロンがホモフィリックな結合により特定の神経路形成に関わる可能性を検証するために、ラット成体において、他の脳領域におけるCdh20の発現様式を解析した。大脳皮質から線条体へ入力する投射ニューロンの大部分は皮質第5(V)層の投射ニューロン(IT-type及びPT-type)であることが知られている。そこで、各種レイヤーマーカーとサブタイプマーカーを用いて組織学的解析を行った。体性感覚野においてCdh20陽性細胞は、Plexnd1を発現するVa層には少なく、Vb層にその多くが存在していた。PT-typeのマーカーであるCTIP2とCdh20の二重染色を行うと、Cdh20発現細胞のほとんどがCTIP2陽性であった。線条体へ入力する中脳黒質緻密部のドーパミンニューロンではCdh20の発現が検出された。一方、線条体へ入力する視床のFR核のニューロンではCdh20の発現は検出されなかった。このことから、大脳皮質及び中脳黒質緻密部の興奮性ニューロンと線条体Cdh20発現ニューロンとの間には、ホモフィリックなカドヘリンサブタイプ結合が存在することが示唆された。また、線条体の出力回路について解析を進めたところ、中脳網様部ニューロンにはCdh20の発現は検出されず、D2Rを発現する線条体間接路ニューロンが投射する淡蒼球ニューロンはCdh20を発現していた。背側線条体腹側部のCdh20陽性ニューロンのごく少数はD2R陽性であったことから、線条体からの出力回路においては、淡蒼球ニューロンとの間にホモフィリックなカドヘリンサブタイプ結合が存在することが示唆された。本年度は、初年度計画していたラット線条体におけるCdh20タンパク質の発現部位および局在解析を行うために、新たにCdh20の細胞外ドメインを抗原とするモルモット抗体を作製した。まず、Cdh20を強制発現させたHEK293細胞およびラット脳の細胞抽出液を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、作製したポリクローナル抗体は、Cdh20を認識する抗体が含まれることが確認できた。今後、本抗体を用いて、生体でのCdh20の局在パターンを明確にすることが出来ると考えられる。また、Cdh20を発現する線条体領域のニューロンへは、どの脳領域のニューロンからの入力があるのかどうかを明らかにするために、逆行性神経トレーサーであるAlxea-CTBをCdh20発現部位である背側線条体腹外側領域に圧注入法により注入した。8週齢で導入後、2週間飼育した後に還流固定を行い、50マイクロメーターの凍結切片を作製した。スライドグラスにマウント後、スライドスキャナーにより全体を撮影した。その結果、大脳皮質や間脳、および中脳において細胞体が標識されていることが確認でき、それらの細胞体の分布は、過去の研究により報告されていた線条体へ投射するニューロンの分布パターンと類似していた。今後は逆行性に標識されたニューロンにおいて、Cdh20が発現しているのかどうかを二重染色により調べる。さらに、同様の注入法により、shRNAを発現するAAVウイルスを線条体のCdh20発現領域に注入し、神経路形成に変化があるかどうかを解析する予定である。初年度は、H29年度予定しているAAVウイルスベクターによるCdh20遺伝子のノックダウン実験のため予備実験を計画していた。トレーサーの脳内注入による神経路解析までは行うことが出来たが、脳内AAV投与実験の立ち上げに時間を要したため、計画していたGFP AAVウイルスの投与実験までは遂行することが出来なかった。1)本年度は、Cdh20遺伝子の生体内におけるノックダウンを行うために作製した2種類のCdh20shRNA組換えAAVウイルス(AAV9-U6-Cdh20shRNA-GFP #1, AAV9-U6-Cdh20shRNA-GFP #2)とランダムなshRNA配列を導入したコントロール組換えAAVウイルス(AAV9-U6-NCshRNA-GFP)の感染効率を検討した。HEK293細胞に希釈したウイルス液を感染させ、36時間後にGFP発現レベルを解析した。すべてのウイルスについて、高効率が確認できた。脳内注入に用いる濃度の参考データを得ることができた。2)昨年度までに、Cdh20の細胞内ドメイン-GST融合タンパク質およびCdh20の細胞外ドメイン(EC4)-GST融合タンパク質を抗原としてモルモットに免疫後、抗体を精製し、ウエスタンブロットによりラット脳内でのCdh20の発現を確認していた。本年度は、これらの抗体を用いて、還流固定した成体ラット脳およびマウス脳から凍結切片を作製し、浮遊法により免疫染色を行った。Cdh20の細胞内および細胞外ドメインに対する抗体について、大脳皮質4, 5層、梨状皮質等において、Cdh20mRNAの分布と同様にタンパク質局在が認められた。細胞内ドメインに対する抗体の方が、発現が強く観察された。しかしながら、ラット線条体でのCdh20陽性細胞は、Cdh20mRNA発現細胞の数と比較して、極めて少数であった。これらのことから、線条体でのCdh20タンパク質の局在について、染色条件等を検討する必要が考えられた。ウイルス実験のセットアップに時間を要しており、脳内投与実験を進められなかったため。

本年度は、Cdh20陽性線条体ニューロンがホモフィリックな結合により特定の神経路形成に関わる可能性を検証するために、ラット成体において、他の脳領域におけるCdh20の発現様式を解析した。大脳皮質から線条体へ入力する投射ニューロンの大部分は皮質第5(V)層の投射ニューロン(IT-type及びPT-type)であることが知られている。そこで、各種レイヤーマーカーとサブタイプマーカーを用いて組織学的解析を行った。体性感覚野においてCdh20陽性細胞は、Plexnd1を発現するVa層には少なく、Vb層にその多くが存在していた。PT-typeのマーカーであるCTIP2とCdh20の二重染色を行うと、Cdh20発現細胞のほとんどがCTIP2陽性であった。線条体へ入力する中脳黒質緻密部のドーパミンニューロンではCdh20の発現が検出された。一方、線条体へ入力する視床のFR核のニューロンではCdh20の発現は検出されなかった。このことから、大脳皮質及び中脳黒質緻密部の興奮性ニューロンと線条体Cdh20発現ニューロンとの間には、ホモフィリックなカドヘリンサブタイプ結合が存在することが示唆された。また、線条体の出力回路について解析を進めたところ、中脳網様部ニューロンにはCdh20の発現は検出されず、D2Rを発現する線条体間接路ニューロンが投射する淡蒼球ニューロンはCdh20を発現していた。背側線条体腹側部のCdh20陽性ニューロンのごく少数はD2R陽性であったことから、線条体からの出力回路においては、淡蒼球ニューロンとの間にホモフィリックなカドヘリンサブタイプ結合が存在することが示唆された。H29年度は、速やかにAAV-shRNAによるCdh20遺伝子のノックダウン実験を開始し、トレーサーによる標識と組み合わせることで、神経路形成に変化が見られるかどうかを検証する。H30年度は、in utero injectionによる、ノックダウンAAVウイルスの感染実験、および成体ラット脳への局所的AAVウイルス投与によるノックダウン実験を効率的に進め、初年度に行った神経回路標識により、大脳基底核神経路形成への影響が出るかどうかを明らかにする。また運動異常が生じるかどうかを、food reseachingテスト等により明らかにする。ウイルス導入実験用ラットの購入費を物品費を計上していたが、初年度のウイルス導入実験計画が遅れていることから、次年度使用額が生じた。ウイルス導入実験用ラットの購入費を物品費に計上していたが、実験計画が遅れているため、次年度使用額が生じた。H30年度は、ウイルス導入実験および行動実験を計画しており、次年度使用額は、これらの実験のための物品費等に使用予定である。H29年度はAAVウイルスによるノックダウン実験を計画しており、次年度使用額は、その計画実験に使用する。
神経障害性疼痛モデルに対する持続的末梢神経ブロック注射の効果と作用機序について

神経障害性疼痛の病態には、1次感覚神経での炎症反応と脊髄後角におけるアデノシン三リン酸(ATP)が関わることが知られている。臨床では末梢神経ブロック注射が、本来の局所麻酔薬の作用時間よりも鎮痛効果が延長することが知られている。そこで、本研究では神経障害性疼痛モデル動物を用いて、持続末梢神経ブロック注射の延長効果を調べるとともに、1次感覚神経での炎症反応と、脊髄後角でのATPを中心とした反応を調べることによって、ブロック注射の効果が延長する機序を解明することを目的としている。これまでに、SNI(spared nerve injury)モデルラットを用いた実験で、持続末梢神経ブロック注射は、神経損傷後の疼痛閾値の低下に対して抑制的に働き、その効果は持続末梢神経ブロックの期間に依存していることがわかった。H30年度は神経損傷後1, 2, 3, 4週における脊髄後角での各種メディエーター(HMGB1, TLR, NMDA受容体, MMP-9)の発現をwestern blottingおよびリアルタイムPCRにより定量分析を行うことにより、神経損傷に対する中枢性感作の発現時期の検討を行う。また、実験1のようにSNIに加えて持続末梢神経ブロックを行った場合についても同様に行い、比較検討を行う計画であったが、研究代表者が育児休業のため、一年間研究を中断した。H30年度は研究代表者が育児休業のため、1年間研究を中断していたため。今年度は中断していた研究を再開する。神経損傷後1, 2, 3, 4週における脊髄後角での各種メディエーター(HMGB1, TLR, NMDA受容体, MMP-9)の発現をwestern blottingおよびリアルタイムPCRにより定量分析を行うことにより、神経損傷に対する中枢性感作の発現時期の検討を行う。またSNIに加えて持続末梢神経ブロックを行った場合についても同様の分析を行い、比較検討を行う。平成29年度は持続末梢神経ブロック注射の効果について検討した。実験動物には、7週齢SD系雄性ラットを使用し、神経障害性疼痛モデルとして、SNI(spared nerve injury)モデルを用いた。持続末梢神経ブロックは、神経切断直後に浸透圧ポンプを神経切断部に留置することで行った。実験1として、SNIモデルラットに対し、生理食塩水(control)またはリドカイン溶液(0.5%,1%,2%)を充填した浸透圧ポンプ留置し、フィラメントを用いたvon-Fray試験にて持続末梢神経ブロックの効果を検討した。ポンプは3日目に取り出し、14日目まで測定した。その結果、0.5%および0.1%リドカイン溶液群は12日目まで、2%リドカイン溶液群は10日目まで有意な疼痛閾値の上昇がみられた。また、2%リドカイン溶液でポンプを1日目で取り出した場合は、4日目までしか有意な疼痛閾値の上昇がみられなかった。つまり持続末梢神経ブロック注射は、神経損傷後の疼痛閾値の低下に対して抑制的に働き、その効果は持続末梢神経ブロックの期間に依存していることがわかった。研究実施計画書に記載した実験1の持続末梢神経ブロック注射の効果の検討において、当初の計画よりも多くの時間を要したため、今年度の研究実施計画に組み込んであった実験2については年度内には結果を得るに至らなかった。

H30年度は実験2として、神経損傷後1, 2, 3, 4週における脊髄後角での各種メディエーター(c-FOS, HMGB1, TLR, NMDA受容体, MMP-9など)の発現を免疫染色、western blotting、およびリアルタイムPCRにより評価することにより、神経損傷に対する持続末梢神経ブロックの中枢での抑制効果について、その機序について検討する。今年度は中断していた研究を再開する。神経損傷後1, 2, 3, 4週における脊髄後角での各種メディエーター(HMGB1, TLR, NMDA受容体, MMP-9)の発現をwestern blottingおよびリアルタイムPCRにより定量分析を行うことにより、神経損傷に対する中枢性感作の発現時期の検討を行う。またSNIに加えて持続末梢神経ブロックを行った場合についても同様の分析を行い、比較検討を行う。産休育休取得に伴う研究中断のため。