hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フレイルとAMRの課題に対応する食品由来機能ペプチドを素材とした歯周病医薬開発

口腔細菌の抗菌薬でのコントロールは,歯周病の予防・治療に有効なアプローチである。しかし,薬剤耐性菌の増加により,世界規模で抗菌薬の使用制限が課せられている。そこで本研究では,コメ及び大豆由来機能性ペプチドに着目し,特異的に口腔細菌のコントロールを行うペプチド群をスクリーニングする。その結果選出した食品機能ペプチドに対し,アミノ酸置換によりペプチド機能強化とナノカプセル化を行い,安全な次世代歯周病ペプチド医薬の開発を試みる。狭域スペクトルを特徴とする選択的バイオナノ医薬の開発による個別化医療を目指し,口腔領域におけるペプチド創薬研究を開拓する。
神経筋疾患の克服を目指す新規治療技術の開発

神経筋接合部(NMJ)は骨格筋収縮の運動神経支配に必須のシナプスである。NMJの形成不全は様々な神経筋疾患に認められ、NMJ形成を標的としたこれらの疾患の治療法の開発・検討が重要である。これまで、我々はDOK7発現ベクターの投与によりNMJの形成を増強する手法を作り、ある種の先天性筋無力症や筋ジストロフィーのモデルマウスに対する有効性を実証していた。この知見を基に、本研究では、神経筋疾患の克服を目指す新規治療技術の開発を更に進めた。中でも、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のモデルマウスに対する上記ベクターの有効性を示したことは根本的な治療法がまだ無い当該疾患の克服に向け意義があると言える。神経筋接合部(NMJ)は運動神経の軸索末端と骨格筋を結ぶ、運動機能に不可欠のシナプスであり、その異常は先天性筋無力症候群(CMS)や重症筋無力症に代表される筋無力症の原因となる。さらに、近年、筋ジストロフィーや筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症などの難治性の神経筋疾患や加齢性筋肉減少症においても、NMJ形成不全の重要性が注目されている。従って、多様な神経筋疾患に対し、NMJ形成を標的とした治療技術の有用性が期待されている。NMJの形成や維持は筋特異的な受容体型チロシンキナーゼMuSKによって制御されている。代表者の所属研究室では、MuSKの必須の活性化因子Dok-7をAAVベクターを用いて強制発現させることにより、マウスのNMJ形成を増強する手法を開発した。さらに、ある種のCMSや筋ジストロフィーのモデルマウスに対し、当該手法の効果(NMJ形成の増強、運動機能の改善、生存期間の延長)を実証してきた。本年度、代表者らは、ALSのモデルマウスに対しても、当該手法が有効であることを見出し、当該手法が筋原性疾患のみでなく、運動神経原性の神経筋疾患にも広く有効である可能性を示した。他方、NMJ形成・維持において、MuSKにはDok-7とは別に、運動神経由来のMuSK活性化因子Agrinが必須である。代表者らはAgrinがDok-7では代替できない、MuSK活性化以外の機能を持ち、その機能が生後のNMJ維持に必須であることを発見し、上述のDok-7強制発現によるNMJ形成増強法では賄えない原理でAgrinの発現増強はNMJ形成を増強できる可能性とその重要性に思い至った。そこで、本研究では、AAVベクターを用いたAgrin発現系の構築と、神経筋疾患モデルマウスに対する当該ベクターの投与実験を進めた。NMJ形成増強効果を示すAgrin発現系の構築が進んでいる。神経筋接合部(NMJ:neuromuscular junction)は骨格筋収縮の運動神経支配に必須のシナプスであり、その破綻は呼吸や運動機能の障害を引き起こす。NMJの形成不全は種々の神経筋疾患に認められており、NMJ形成を標的とした当該疾患の治療法の開発・検討は重要な課題である。NMJの形成には筋特異的な受容体型キナーゼMuSKとその細胞内活性化因子Dok-7が必須の役割を果たしている。これまでに、我々は骨格筋におけるDok-7の強制発現がNMJ形成を増強することを見出し、この発見を基に、DOK7発現アデノ随伴ウィルスベクターの投与によりNMJ形成を人為的に増強する技術を開発した。さらに、当該ウィルスベクターの投与によるNMJ形成増強がDOK7型筋無力症や常染色体優性Emery-Dreifuss型筋ジストロフィーのモデルマウスに対し、有効であることを実証していた。他方、筋萎縮性側索硬化症(ALS: amyotrophic lateral sclerosis)に代表される運動神経変性疾患においても、その初期病態として、NMJ形成不全が注目されていた。しかし、その治療標的としての可能性は未解明であった。そこで、我々はALSモデルマウスを用い、その発症後にDOK7発現ベクターを投与する実験を行ったところ、ベクター投与により、NMJ形成不全や筋萎縮の抑制に加え、運動機能の改善、生存期間の延長が認められた。この成果は、根本的な治療法のないALSに対するDOK7発現ベクターの有効性を実証し、さらに、NMJ形成増強がALSを含む運動神経変性疾患に対する治療概念となることを示した点に意義がある。種々の神経筋疾患モデルマウスを用いて、Agrin発現AAVベクターの有効性を検討する。分子生物学
観光地の歩行空間におけるSfMを用いたバリア情報抽出の可能性検証

観光地におけるバリアフリー情報は、施設の機能やサービス内容を地図や一覧表で示す例が多く、移動に関するネットワークの情報に乏しい。特に歩行空間における段差や凹凸などは、移動に制約を生じさせる要因のひとつになる。そこで本研究では、観光地の歩行空間におけるバリア情報を効率的に取得するために、時間を要する測量や大規模な現地調査を必要としない画像処理技術を応用した簡易的な面的情報の取得法を検証した。その結果、測位や画像取得技術の向上に伴い、誰でも簡易的に歩行空間の面的情報が得られる可能性を示すことができた。本研究では、障がい者の旅行行動を支える一助として、現状では主に点でしか提供されていないバリアフリー情報の面的取得を試みた。障がい者や高齢者、外国人などの配慮が必要な方々の外出行動を支援する動きは、法整備の面において先行しているものの、実社会での取り組みは十分ではない。特に旅行という非日常空間での移動については、現地のバリアフリー情報が強く必要とされているが、現状では施設の情報が点として提供されているのみで、経路上の傾斜や段差といった面の情報がほとんど提供されていない。バリアフリー情報の現状把握としてバリアフリー・マップに注目し、作成・運用状況から課題点を抽出したところ、東京都区部においても情報の種類や表記方法は統一されておらず、面的情報が不足していることが明らかとなった。そこで、観光地の歩行空間におけるバリア情報を効率的に取得するために、時間を要する測量や大規模な現地調査を必要としない画像処理技術を応用した簡易的な面的情報の取得法を検証した。まず、現地で高精度画像を取得できるカメラを用いて複数枚の写真を撮影し、画像データを取得した。次に、取得した複数の画像から点群データを作成し、不要なノイズはバッチ制御を行い、分析から除外した。さらに簡易的に高精度位置情報を取得する手法としGNSS受信機を採用し、点群データに高精度位置情報を付与することにより、精度の向上を試みた。これらの結果から、精度の高い画像と位置情報が得られれば、誰でもローコストで簡易的に歩行空間の面的情報が得られるが、ノイズ除去等の知識も必要となることが明らかとなった。高精度位置情報をローコストで得るために、小型受信機、アンテナ、ケーブル等を海外などから取り寄せ、個別に組み合わせて簡易型の受信機を作成したが、使用する機材の選定と調達に時間を要した。しかし、機材としては秀逸なものに仕上がり、以降の実験では問題なく稼働している。また、調査対象が一般の歩行空間であるために、調査の時期や時間帯によって歩行者がノイズとなり、うまくデータを取得できないことがあった。さらに、調査実施日の天候に恵まれず、画像データは取得できたものの、位置情報が取得できなかった。機材も画像も降雨には対応できないので、調査日を調整する必要がある。観光地におけるバリアフリー情報は施設の機能やサービス内容を地図や一覧表で示す例が多く,移動に関するネットワークの情報に乏しい。特に,歩行空間における段差や凹凸などは移動に制約を生じさせる要因のひとつになるため,本来であれば観光情報やバリアフリー情報のひとつとして提供されることが望ましい。しかし,現在では公共交通での移動を車いす対応で示す乗換案内や,車いす利用者が利用状況を投稿し合うアプリなどが登場しつつあるものの,バリアの度合いは利用者によって様々であるため一律で可否を決めることは難しく,掲載エリアに偏りがある。そこで本研究では,観光地の歩行空間におけるバリア情報を効率的に取得し,移動に不便を感じる観光客に事前に現地の情報を提供するために,時間を要する測量や大規模な現地調査を必要としない画像処理技術を応用した簡易的な面的情報の取得法を検証した。本研究では現地で高精度画像を取得できるカメラを用いて複数枚の写真を撮影し,画像データを取得した。次に,取得した複数枚の画像から点群データを作成し,不要なノイズを除去し,DSMを作成した。特に歩行空間を撮影した画像データには街路の樹木等が映り込む例が多いため,それらを除去する必要がある。さらにローコストで簡易的に高精度位置情報を取得するGNSS受信機を作成し,現地の基準点と移動点の位置情報を点群データに付与し,歩行空間の情報を分析した。その結果,例えば車いす利用者が段差として困難を感じると言われる2cmの段差を検出することができた。また,傾斜のある歩行空間では傾斜角を具体的に示すことができた。このように,測位や画像取得技術の向上に伴い,誰でも簡易的に歩行空間の面的情報が得られる可能性を示すことができた。今後は得られたデータを利用者に伝えるための提供方法や表記方法を検討する必要がある。高精度データ取得に必要な要素を検証するため、追加で現地調査を行う予定である。特に前回調査で取得できなかった位置情報を追加取得する必要がある。使用する機材は防水仕様ではないので、天候の予報を考慮しながら日程調整を進める。

万が一、調整がつかない場合には、現在進めている調査地(愛知県犬山市)を首都圏近郊に変更し、方法論の検証が進められるように努める予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。観光学29年度が最終年度であるため、記入しない。
思春期過敏性腸症候群の発症因子と長期予後に関する前向き調査

全体の約4割で腹部症状は経時的に変化しており、思春期過敏性腸症候群(IBS)の有病率は約2割であった。3年間IBS症状が固定していた生徒では、自己効力感や生活の質の低下、睡眠障害、自覚ストレスやトラウマ的体験、失感情症傾向が腹部症状のない生徒より有意に多くみられたが、途中からIBS症状が出現した生徒ではこれらの変化は見られなかった。低年齢での発症やIBS症状の持続が失感情症傾向などと影響しあって自己効力感や健康関連QOLの低下につながると推測された。本研究では、中学三年生を追跡調査することにより、過敏性腸症候群の有病率とその症状変化を把握し、感染・ストレス・進学などの因子が及ぼす影響、有症状者が患者に変化する契機を検討する。また、同時に自己効力感(self-efficacy)およびQuality of Life(QOL)の変化も追跡する。さらにトラウマに関する調査を行うことにより、トラウマの種類や受けた時期と症状出現時期を検討し、自己効力感の低さやトラウマ的体験が過敏性腸症候群の発症率を増加させるという仮説を検証する。思春期過敏性腸症候群の病因を解明するための前向き調査を開始するにあたり、まず情報収集を行った。アメリカ消化器病学会に参加し過敏性腸症候群の疫学や病因に関する情報を得ると共に、思春期過敏性腸症候群に関する疫学的な先行研究のデータを発表し、当該分野の第一人者からそれに対する批評・意見を得、本調査で用いる質問紙や方法などに関する討議を行った。次にそれを元に調査に利用する質問票を作成した。質問票には通し番号を付し、プライバシー保護に配慮した。協力依頼文書・SIBSQおよびRIIMQ(過敏性腸症候群の診断用)・EAT-26(摂食障害の診断用)・GSES(自己効力感の評価用)・SF-36(QOLの評価用)・TAS20(失感情症の評価用)・病的行動質問紙(疾病罹患時の親の対応の評価用)(親用および子供用)・その他の質問(年齢・性別・受診歴など)・追跡調査同意書で構成される質問紙となった。東北大学医学部倫理委員会にて調査施行の承認を得た後、宮城県教育委員会の担当者に研究計画を説明、調査協力を要請した。学校側の意向で初回の質問紙配布は平成20年5月に二年生に施行することになった。各教育管轄区域の中学生数に比例させて区域ごとの配布数を決定し、無作為に配付する中学校を選別した。また、調査により不安が生じるなどの影響を受けて不調となった生徒の受け入れ先として、県内の対応可能な医療機関リストを作成し、ネットワークを作成した。本研究では、宮城県内の中学二年生を追跡調査することにより、過敏性腸症候群の有病率とその症状変化を把握し、失感情症や疾病罹患時の親の対応などの因子が及ぼす影響、有症状者が患者に変化する契機を検討する。また、同時に自己効力感(self-efficacy)およびQuality of Life (QOL)の変化も追跡する。宮城県教育委員会を通じ、県内の中学2年生約3000人に各地域の人口数に比例させて質問票・調査登録票を配布した。紙面にて本人および保護者に調査協力を求め、参加の同意が得られた調査協力者には、回答した質問票及び追跡調査登録票を期日までに研究代表者宛に返送してもらった。当初は配付数の約3割の返送を見込んでいたが、実際には341部にとどまった。追跡中に脱落することを考慮するとこれでは不足と思われたため、追加配布を行った。これにより262部の回答が得られ、計603人分の回答を得た。プライバシー保護に厳重な注意を払い、回収されたデータを研究分担者および専門業者が入力し、メモリーに保存した。このデータを研究代表者および分担者が解析を行った。さらに、追跡調査に同意した生徒のリストを作成し、次年度の調査の準備を行った。アメリカ消化器病学会に参加し、発表すると共に情報を収集した。本研究では、宮城県内の中学生を追跡調査することにより、過敏性腸症候群の有病率とその症状変化を把握し、失感情症や疾病罹患時の親の対応などの因子が及ぼす影響、有症状者が患者に変化する契機を検討する。昨年度アンケート用紙を返送してきた603人の生徒のうち、有効回答者は591人(男子256人、女子335人)であった。

このうち19%に相当する111人(男子41人(16%)、女子70人(21%))が過敏性腸症候群の診断基準を満たした。これらの生徒は腹部症状の全くない生徒(男子194人、女子224人、計418人)に比べて有意に自己効力感やQOLが低下しており、失感情症傾向を認めた。睡眠障害、自覚ストレス、トラウマ的体験も有意に多かった。591人中追跡調査参加の同意を得られた371人の生徒に対し質問紙を郵送し、219部の回答が得られた。プライバシー保護に厳重な注意を払い、回収されたデータを研究分担者および専門業者が入力し、メモリーに保存した。このデータを研究代表者および分担者が解析を行った。さらに、次年度の調査の準備を行った。アメリカ消化器病学会および日本心療内科学会に参加し本研究で得た結果を発表した。過敏性腸症候群(IBS)を含む機能性消化管障害の症状を有する生徒(FBD群)は、腹部症状のない生徒(対照群)に比して疾病罹患時に親から気遣われていないと感じていた。一方、両群の親自身が感じる子供への気遣い度に差はなかった。また、FBD群は対照群よりアレキシサイミア(失感情症)傾向が高く、子供が感じる親の気遣い度はこのアレキシサイミア傾向と負の相関を示した。また、前回回答のあった197名に対し、2回目の追跡調査を施行した。158名(女子103人、男子55人)から回答があり、回収率は80.2%であった。各年度のIBS/FBD/腹部症状のない生徒の割合は、19.6/8.2/72.2%、13.9/7.0/79.1%、19.6/6.3/74.1%であった。このうち3年度ともIBS、FBD、腹部症状がなかった生徒はそれぞれ3.2/0.6/53.8%であり、それ以外の42.4%の生徒は腹部症状が変化していた。ずっと腹部症状がなかった85人を対照群とし、ずっとIBSだった19人(IBS群)と比較すると、IBS群では有意に睡眠障害やストレス・トラウマが多く、自己効力感・健康関連QOLが低下し、アレキシサイミア傾向が高かった。一方、初年度は腹部症状がなく次年度以降でIBSとなったもの19人をIBS進展群として初年度のデータを対照群と比較すると、腹部症状・トラウマやストレスの多さ・自己効力感・アレキシサイミア傾向・健康関連QOLのいずれも差がなかった。さらにIBS進展群で初年度とIBSとなった年度のデータを比較しても同様に差がなかった。思春期の腹部症状は変化しやすく、低年齢での発症やIBS症状が数年に亘って持続することがアレキシサイミア傾向などと影響しあって自己効力感や健康関連QOLの低下につながると推測された。
歯胚再生技術を用いたGFP陽性接合上皮細胞の単離による特異的遺伝子発現の解析

我々は、歯原性上皮を蛍光蛋白であるGFPで標識した再生歯胚を作製し、そのマウス顎骨内移植モデルを用いて、接合上皮が歯原性上皮由来であることを見いだしてきた。本研究では、当該モデルを用いて、GFPを指標に、これまで単離の難しかった接合上皮を採取し、酵素反応液にて分散化の後、回収した上皮細胞をフローサイトメトリーを用いて、接合上皮をGFP陽性分画として、口腔上皮をGFP陰性分画として採取し、microarrayを用いて発現遺伝子を網羅的に解析した。結果、接合上皮では、口腔上皮と比較してsecretory leukocyte protease inhibitor (Slpi)が高度に認められた。当該年度では、(1)GFPで標識された接合上皮の作製とその単離、(2)酵素処理を用いた接合上皮細胞の分散化を目的とした。実体顕微鏡を用い、胎生15日のGFPマウスと同齢の野生型マウスから歯胚を摘出し、それぞれの歯胚をディスパーゼ処理し、歯原性上皮組織と間葉組織に分離、GFPマウス歯胚の歯原性上皮組織と野生型マウスの間葉組織をコラーゲンゲル内で再構成し、37°C4日間器官培養して、再構成歯胚を作製した。移植3週前に、レシピエントとして、ソムノペンチル麻酔下で3週齢の野生型マウスの上顎第一第臼歯を抜歯した。抜歯窩の治癒を確認後、同様に麻酔下で歯胚を埋入した。具体的には、口蓋側に切開線を引き、歯肉を剥離翻転、直径、高さ1ミリの移植窩を形成、歯胚の上皮側をメチレンブルーにて染色し、移植の方向性を確認後、歯胚を埋入後、歯肉を元の位置に戻し、縫合した。接合上皮の回収時期は、萌出完了の移植後50日とした。頸椎脱臼にてマウスを屠殺後、上顎を分離し、頬粘膜をトリミングした。蛍光実体顕微鏡下で、上顎第一第臼歯相当部に萌出した再構成歯近傍の接合上皮と口腔上皮を回収した。回収した組織は1.25U/mLディスパーゼで処理後、結合組織と分離した。その後、0.25%トリプシン・50U/mLコラゲナーゼを用いた酵素反応液にて処理し、上皮細胞を分散化した。次年度では、フローサイトメトリーを用いたGFP陽性接合上皮細胞の採取、cDNA microarrayを用いた発現遺伝子の網羅的解析、免疫組織化学による接合上皮特異的発現因子の局在解析を行う予定である。本研究では、当該モデルを用いて、GFPを指標に、これまで単離の難しかった接合上皮を採取し、その発現遺伝子を網羅的に解析することとし、下記の5項目を2カ年に亘り解析した。詳細な実施内容は以下の通りである。実体顕微鏡を用い、胎生15日のGFPマウスと同齢の野生型マウスから歯胚を摘出した。摘出した歯胚はそれぞれをディスパーゼ処理し、歯原性上皮組織と間葉組織に分離した。GFPマウス歯胚の歯原性上皮組織と野生型マウスの間葉組織をコラーゲンゲル内で再構成し、37°C4日間器官培養した。レシピエントとして、ソムノペンチル麻酔下で3週齢の野生型マウスの上顎第一第臼歯を抜歯、その後、2週間治癒を待ち、治癒を確認後、同様に麻酔下で歯胚を埋入した。接合上皮の回収は、萌出完了の移植後50日とし、頸椎脱臼にてマウスを屠殺後、上顎を分離、GFPを指標に、蛍光実体顕微鏡下で、上顎第一第臼歯相当部に萌出した再構成歯近傍の接合上皮と口腔上皮を回収した。回収した組織を1.25U/mLディスパーゼで処理後、結合組織と分離、さらに、0.25%トリプシン・50U/mLコラゲナーゼを用いた酵素反応液にて処理することにより、上皮細胞を分散化した。回収した上皮細胞は、フローサイトメトリーを用いて、接合上皮をGFP陽性分画として採取し、同時に、GFP陰性分画として口腔上皮を採取した。cDNAmicroarrayを用いて,GFP陽性接合上皮細胞とGFP陰性の口腔粘膜上皮細胞の遺伝子発現を比較検討した結果、接合上皮細胞では、口腔上皮と比較して、過去に報告したSecreted Leukocyte Protease Inhibitor(SLPI)が高度に認められた。GFP陽性歯原性上皮・野生型C57BL/6マウスの間葉組織の再構成歯胚の作製、再構成歯胚の移植、GFPで置換されたマウス接合

上皮を外科的に単離、酵素処理を用いた接合上皮細胞の分散化といった各ステップは、順調に実施せ来ているが、移植数が不足しており、フローサイトメトリーに十分な細胞数が確保出来ていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯周病学再構成歯の移植を継続して行い、細胞数が十分に達した所で、フローサイトメトリーを用いたGFP陽性接合上皮細胞の採取、cDNA microarrayを用いた発現遺伝子の網羅的解析、免疫組織化学による接合上皮特異的発現因子の局在解析を行う予定である。
学習障害幼児に対する介入アプロ-チの有効性に関する実践的研究

1.診断-指導-評価態勢の確立学習障害という学際的な問題に対処するために、研究代表者は他の多くの専門家(県内小学校ことばの教室の教師や県教育センタ-の指導主事をはじめ、県立脳血管研究センタ-の医師など)と連携を図りながら、学習障害幼児に対する治療指導を展開する態勢を整えた。また、県内小学校ことばの教室の教師をコンサルティとする子ども中心の事例コンサルテ-ションを実施した。2.学習障害幼児の鑑別診断研究代表者は、学習障害の現時点で最も妥当だと思われる定義((1)中枢神経系の機能障害、(2)情報処理過程の障害、(3)読み書き算数能力やそれらの元となる基礎的技能の欠陥、除外条項、の4つの箇条から成る定義)を提示した。そして、これらの4つの箇条で表現される諸状態のすべてを保有していることを判別の基準にして、2名の研究分担者と協同で、コミュニケ-ションに問題をもつ約10名の学習障害幼児の鑑別診断を行つた。3.学習障害幼児に対する第1期治療指導の展開とその評価研究代表者は研究協力者と協同で、約5名の学習障害幼児に対して介入アプロ-チに基づく第1期治療指導を展開し、その評価を行つた。また、2名の研究分担者は研究協力者と協同で、約5名の学習障害幼児に対して情報処理アプロ-チに基づく第1期治療指導を展開し、その評価を行つた。
インターロイキン9による肺細胞における新たなケモカインの産生とその産生機序の解析

アレルギー疾患において炎症細胞の組織への浸潤は多くの活性化因子を放出し、このためさまざまな臨床症状が出現する。ヒト気道上皮により多くの生物活性が産生されることが最近報告されてきている。一方、インターロイキン9の遺伝子を導入したトランスジェニックにおいて気道上皮に多量の好酸球が浸潤することが報告された。そこで今回、ヒト上皮細胞と新たなTh2サイトカインであるinterleukine 9とのinteractionの有無をヒト気道上皮由来のBEAS-2B細胞を用いて検討した。まず、BEAS-2B細胞にIL-9receptorのmessageが存在するかにつきRT-PCRを用いて検討した。明らかにIL-9RαとIL-2Rγが認められた。そこでBEAS-2B細胞の表面上のIL-9RαとIL-2Rγの出現の有無につきFACSを用いて検討すると、明らかに両抗原が細胞上に存在していた。次に、BEAS-2B細胞をIL-9で刺激してその培養上清の炎症細胞に対するchemotaxisを検討すると、この培養上清は好中球に対して強力な走化性を有することが分かった。しかし、好酸球に対する走化性を認められなかった。そこで好中球に対する走化性の因子の検討をELISAにより検討すると、IL-8が高値であった。このように気道上皮はサイトカインの刺激により好中球を呼び寄せる因子を放出することが明らかとなり、アレルギー疾患を解析の新たな知見が得られた。インターロイキン9(IL-9)で気管支上皮細胞のcell lineであるBEAS 2Bを刺激して培養すると,培養上清中にヒト好中球に対して走化性を有し,好酸球に対しては走化性を有さない因子が誘導された。この因子の走化性はRANTES,インターロイキン8に対するモノクロナール抗体によっては抑制されず、抗G-CSF抗体によってその走化性は抑制された。IL-9によるBEAS 2B刺激への培養上清中のサイトカインをELISAにより測定するとG-CSFを検出した。ヒト好酸球上のインターロイキン9αおよびインターロイキン2γリセプターをflow cytometryによる検討により検出した。現在この-9のαおよびγ鎖であるIL9αおよびIL-2γのmRNAの検出をRT-PCRを用いて検討している。まず、BEAS-2B細胞にIL-9 receptorのmessageが存在するかにつきRT-PCRを用いて検討した。明らかにIL-9R αとIL-2R γが認められた。そこでBEAS-2B細胞の表面上のIL-9R αとIL-2R γの出現の有無につきFACSを用いて検討すると、明らかに両抗原が細胞上に存在していた。
超塑性・ナノクリスタルの疲労

本研究課題では,室温において超塑性変形をしめす超微細結晶材料の疲労変形機構を明らかにすることを最終的な目標として,(1)単結晶材料,(2)Equal Channel Angular Extrusion(ECAE)加工された超微細結晶粒銅,および(3)EACE加工されたPb-62%SnとZn2-2%Al合金の繰返し応力-ひずみ応答を調査した.銅,Fe-Cr,Fe-Cr-Niなどの単結晶や三重結晶を用いて結晶性材料の繰返し応答の基礎的な特徴を調査した.単結晶材料では特定の塑性ひずみ振幅域において固執すべり帯(PSB)が形成され,その形成にともなってバウシンガ効果が大きく変化することが明らかになった.また三重結晶を用いた研究では,結晶間の残留応力がバウシンガ効果の原因の一つであることを実験的に示した.ナノクリスタルの繰返し変形の基礎的側面を調査するために行った超微細結晶粒銅の繰返し変形試験では以下のようなことが明らかになった.ECAE加工された銅の応力振幅は250MPaにも到達し,バウシンガ効果も非常に高かった.しかしながら,微細結晶粒銅のそれらの特性は200°C程度の熱処理で劇的に変化した.ECAE加工されたPb-SnおよびZn-Al合金では,室温においても大きな伸びと流動応力の大きなひずみ速度依存性が一方向変形において観察された.繰返し変形試験では,初期段階から応力振幅は飽和状態に達した.Zn-Al合金では飽和応力振幅およびバウシンガ効果はひずみ速度が増加するにつれて増加した.一方,一方向変形おいて流動応力のひずみ速度依存性が特に大きかったPb-Sn合金では逆に応力振幅およびバウシンガ効果にひずみ速度依存性はほとんど見られず,一方向変形とは異なる傾向を示した.応力振幅およびバウシンガ効果の繰返し変形でみられたひずみ速度依存性は,Pb-Snでは超塑性変形に必要な熱活性化過程が作用しないこと,Zn-Alでは転位密度が増加することからそれぞれ理解することは可能であった.本研究課題では,室温において超塑性変形をしめす超微細結晶材料の疲労変形機構を明らかにすることを最終的な目標として,(1)単結晶材料,(2)Equal Channel Angular Extrusion(ECAE)加工された超微細結晶粒銅,および(3)EACE加工されたPb-62%SnとZn2-2%Al合金の繰返し応力-ひずみ応答を調査した.銅,Fe-Cr,Fe-Cr-Niなどの単結晶や三重結晶を用いて結晶性材料の繰返し応答の基礎的な特徴を調査した.単結晶材料では特定の塑性ひずみ振幅域において固執すべり帯(PSB)が形成され,その形成にともなってバウシンガ効果が大きく変化することが明らかになった.また三重結晶を用いた研究では,結晶間の残留応力がバウシンガ効果の原因の一つであることを実験的に示した.ナノクリスタルの繰返し変形の基礎的側面を調査するために行った超微細結晶粒銅の繰返し変形試験では以下のようなことが明らかになった.ECAE加工された銅の応力振幅は250MPaにも到達し,バウシンガ効果も非常に高かった.しかしながら,微細結晶粒銅のそれらの特性は200°C程度の熱処理で劇的に変化した.ECAE加工されたPb-SnおよびZn-Al合金では,室温においても大きな伸びと流動応力の大きなひずみ速度依存性が一方向変形において観察された.繰返し変形試験では,初期段階から応力振幅は飽和状態に達した.Zn-Al合金では飽和応力振幅およびバウシンガ効果はひずみ速度が増加するにつれて増加した.一方,一方向変形おいて流動応力のひずみ速度依存性が特に大きかったPb-Sn合金では逆に応力振幅およびバウシンガ効果にひずみ速度依存性はほとんど見られず,一方向変形とは異なる傾向を示した.応力振幅およびバウシンガ効果の繰返し変形でみられたひずみ速度依存性は,Pb-Snでは超塑性変形に必要な熱活性化過程が作用しないこと,Zn-Alでは転位密度が増加することからそれぞれ理解することは可能であった.本年度はナノクリスタル材料の一方向変形および繰返し変形の機構を基礎的に研究するために,Severe Plastic Deformation法で作成された超微細結晶粒銅を用いて,ひずみ速度急変試験による変形の熱活性化過程の調査,および定塑性ひずみ振幅下,定荷重振幅下での疲労特性の調査をそれぞれ行った.変形の熱活性化過程の調査では,試験片に種々の熱処理を施し,それらの材料の変形中の活性化体積を測定した.結晶粒の比較的大きな773K-2hr熱処理材および473k-10min熱処理材ではひずみの増加にともなう活性化体積の減少が観察された.

これらのことは転位密度の増加によりセル構造が形成され,短範囲の障壁となることが原因であると考えられる.一方,結晶粒の比較的小さな非熱処理材では,ひずみの増加にともない活性化体積は逆に増加した.これらの結果は非平衡粒界の局所的な回復による林転位密度の減少から理解できる.定塑性ひずみ振幅下(7.5×10^<-4>≦ε_<pl>≦5×10^<-3>)での疲労試験では,超微細結晶粒銅の応力振幅は250450MPa,バウシンガエネルギパラメータは0.51.5であり,通常の銅に比べていずれの値も約2倍大きいことが判明した.定荷重振幅下(70MPa≦σ_a≦150MPa)での疲労試験では,金属材料に典型的な右下がりのS-N曲線が超微細結晶粒銅で得られた.材料の疲労限度を10^7サイクルとすると,疲労強度は約82MPaであった.超微細結晶粒銅は通常の銅多結晶と比べて同一荷重レベルでの疲労寿命が5倍以上長いことが判明した.疲労変形後の試料の透過型電子顕微鏡による観察では,室温での疲労変形による回復や再結晶が見られた.ECAE法により平均結晶粒径1μmのZn-22%Al合金と5μmのPb-62%Sn合金を作製した.これらのPb-62%Sn,Zn-22%Al合金および焼鈍した多結晶銅(平均粒径75μm)の試験片を用いて繰返し変形を室温,大気中で行った.繰返し変形試験はε_<pl>=5×10^<-4>の定塑性ひずみ制御で行った.ひずみ速度は1×10^<-4>3×10^<-3>_s^<-1>の4種類を選択した.一方向変形試験では,Pb-SnおよびZn-Al合金どちらとも100%を超える破断までの高い伸びを示した.流動応力のひずみ速度依存性も高く,Pb-Sn合金では10^<-4>s^<-1>付近のひずみ速度で超塑性領域であるひずみ速度感受性指数m=0.5が得られた.繰返し変形試験では,焼鈍した銅では実験開始後の急速な硬化段階の後に応力振幅が飽和しているのに対して,Al-ZnおよびPb-Sn合金では初期段階で応力振幅は飽和状態に達した.Zn-Al合金では飽和応力振幅およびバウシンガ効果はひずみ速度が増加するにつれて増加した.一方,一方向変形おいて流動応力のひずみ速度依存性が大きかったPb-Sn合金では逆に応力振幅およびバウシンガ効果にひずみ速度依存性はほとんど見られず,一方向変形とは異なる傾向を示した.応力振幅およびバウシンガ効果の繰返し変形でみられたひずみ速度依存性は,Pb-Snでは超塑性変形に必要な熱活性化過程が作用しないこと,Zn-Alでは転移密度が増加することからそれぞれ理解することは可能であった.
配置薬キットを活用したユビキタスネット時代の日常生活圏医療に関する研究

家庭配置薬のビジネスモデルは、広くASEAN諸国において成功を収めはじめている。他方、高齢化が進む我が国における保健医療分野では、医療サービスの需要増に対応するための課題が山積している。本研究は、家庭配置薬と情報通信機器とを活用して、効率的に日常の健康管理を実現し、医療サービス需要増を抑制するためのシステム機能とその実現方法を見つけ出すことを目的としている。研究成果として、データフォーマットの世界標準であるコンティニュア準拠の情報通信機器と家庭配置薬とを組み合わせた、コミュニティ中心のセルフ・メディケーション・システムの概念を提唱するとともに、その実現と普及に向けたシナリオと課題を提示した。当該研究の究極のゴールは、アルマアタ宣言が標榜するように、「すべての人が健康な日常生活を送ることができる仕組みの構築」である。しかしながら、途上国においても高齢化が加速する我が国のような先進国においても、健康・福祉・医療に関わる分野は、きわめて深刻な問題を抱えている本研究は、江戸時代から継承している富山売薬のビジネスモデルがモンゴル国に導入され成功を収めた事例に着目し、次の2つを明らかにすることで、問題解決に貢献することを目的としている具体的な2つの目的と21年度における研究成果は、次の通りである。目的1:配置薬ビジネスモデルが他の途上国でも成功するための要件の抽出と整理・WHOおよび富山大学和漢医薬学統合研究所が中心となり、ASEAN地域における伝統医薬国際会議および富山での国際シンポジウムを定例的に開催することとなった。これらの会議を情報源として、各国および我が国の医療における配置薬ビジネスモデルの位置づけ、成功要因を抽出し整理した。・モンゴル国およびタイ国において、配置薬およびそのビジネスモデルの有効性に関する調査が実施されている。各国におけるデータ収集様式に準拠し、我が国における医薬品の利用実態と満足度に関するアンケート調査を開始した。目的2:このビジネスモデルをさらに効率よく機能させるためのICT活用の仕組みや方法の立案・各家庭に配布した配置薬と医療ハンドブックおよび医療スタッフとの関わりに焦点を当て、救急救命時における知識と情報の関わりを情報伝達メカニズムとして整理した。本研究は、江戸時代から継承している富山売薬のビジネスモデルがモンゴル国に導入され成功を収めた事例に着目し、次の2つを明らかにすることで、問題解決に貢献することを目的としている。具体的な2つの目的とその22年度における研究成果は、次の通りである。目的1:配置薬ビジネスモデルが他の途上国でも成功するための要件の抽出と整理・日本財団からの経済的支援を得て、モンゴル、タイなど、ASEANの複数の国において、配置薬およびそのビジネスモデルの有効性に関する調査が実施されている。各国におけるデータ収集様式に準拠し、我が国における医薬品の利用実態と満足度に関するアンケート調査を富山県薬業連合会と協働で実施した。・年度内に配置薬業界の大手企業の協力でデータの収集は完了した。数量化可能なデータについては、多変量解析を施し、大きなバイアスはあるものの、使用した医薬品とその有効性や満足度についての好意的な結果を得た。自由回答については、テキストマイニングを用いた分析を実施している。・今後の課題として、富山県や富山県薬業連合会が過去に実施した包括的なアンケート調査結果と今回の調査結果を統合した、業界の総合的な分析と整理を考えている。・残念ながら、医療政策も要因となって急激に衰退している我が国配置薬ビジネスの現況からは、ASEAN諸国における当該ビジネスモデル活用への肯定的要因は見あたらない。目的2:このビジネスモデルをさらに効率よく機能させるためのICT活用の仕組みや方法の立案・医療機器や健康管理サービスのICT連携による健康管理を支援するNPO法人コンティニュア・ヘルス・アライアンス日本地域委員会との情報交換を開始した。コンティニュア・ヘルス・アライアンスは、個人が利用する血圧計、体重計といった機器、医療機関が利用する医療機器、これらの機器と連動したソフトウェアやサービスなどが連携することで、パーソナルヘルスケアの質的向上を目指すNPO法人である。日常生活における健康モニタリングと配置薬を活用するセルフメディケーションの統合システムイメージを共有すべく、調査活動を開始した。しかしながら、途上国においても、高齢化が加速する我が国のような先進国においても、健康・福祉・医療に関わる分野は、きわめて深刻な問題を抱えている。具体的な2つの目的と23年度における研究成果は、次の通りである。

これらの会議を情報源として、各国および我が国の医療における配置薬ビジネスモデルの位置づけ、成功要因を抽出し整理した内容を国際ジャーナルに発表した。・モンゴル国およびタイ国において、配置薬およびそのビジネスモデルの有効性に関する調査が実施されている。各国におけるデータ収集様式に準拠した、我が国における医薬品の利用実態と満足度に関するアンケート調査を統合し、これに多変量解析を加え、現状を分析し発表した。目的2:このビジネスモデルをさらに効率よく機能させるためのICT活用の仕組みや方法の立案・各家庭に配布した配置薬と医療ハンドブックおよび医療スタッフとの関わりに焦点を当て、救急救命時における知識と情報の関わりを情報伝達メカニズムとしての情報システム機能を検討した。当該研究のゴールは、「すべての人が健康な日常生活を送ることができる仕組みの構築」である。しかし、途上国においても、高齢化が加速する我が国のような先進国においても、健康・福祉・医療に関わる分野は、深刻な問題を抱えている。本研究は、江戸時代から継承している富山売薬のビジネスモデルがモンゴル国に導入され成功を収めた事例に着目し、次の2つを明らかにすることで、問題解決に貢献することを目的とする。目的1:配置薬ビジネスモデルが他の途上国でも成功するための要件の整理目的2:このビジネスモデルをより効率よく機能させるための情報通信機器活用の仕組みの立案当該年度は目的2に焦点を当て,下記の成果を得た。1家庭配置薬システムの使命を「セルフメディケーションの支援と普及」,顧客を「健康な生活を求めるすべての人々」とした上で,2医療検査機器のコンピュータへの接続性標準化を使命とするコンティニュア・ヘルスアライアンスとその認証機器の活用方法を紹介し,3配置薬を利用したコミュニティ・ベースのセルフメディケーション(CBSM)とコンティニュア認証機器とのシステム連携イメージを提示するとともに,4再定義されるべき顧客はこのCBSMを実践できるコミュニティであること,そして5その実現に向けたシナリオと課題を提示した。先用後利をベースにした配置薬システムは,途上国においては,日本財団の財政支援の元,その有効性と新奇性故に,地域の行政や大学,そして住民にスムーズに受け入れられた。しかしながら,発信元の我が国において,現在、配置薬システムをコンティニュア認証機器と組み合わせたセルフメディケーション・システムとして普及させるための推進組織は国内に存在しない。学術研究だけでは、推進・普及という点で限界がある.しかしながら、推進・普及を阻害する要因を洗い出し、その対応策を検討することはできたと考えている。当該研究の究極のゴールは、アルマアタ宣言が標榜するように、「すべての人が健康な日常生活を送ることができる仕組みの構築」である。
インスリン様増殖因子(IGF)-I受容体とがん分子標的治療法

本研究の目的は、より効果的なIGF-I受容体機能を阻害する抗体を新規に作製し、IGF-I受容体に対する分子標的治療法の確立を目指そうとすると同時に、乳がん細胞で抗体により誘起されるIGF-I受容体の分解過程の分子機構を明らかにしようとするものである。1.ファージディスプレイ法の活用により種々のIGF-I受容体に対する抗体をスクリーニングし、より親和性の高いヒト型抗体を調製する。スクリーニングして得られた20種の抗体ファージの特異性検討、エピトープ解析を行った結果、インスリン受容体及び他のタンパク質にも結合し目的物は得られなかった。IGF-I受容体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから作製した抗体の特異性が、IGF-I受容体特異的であったことと対照的であり、はからずも、ファージディスプレイ法による生体外とマウスによる抗体産生の違いが明らかになった。ハイブリドーマから作製した2種のIGF-I受容体特異的単鎖抗体の解析により、親和性・エピトープに関しての新知見が得られた。この成果は2報として論文発表した。2.既存及び新たなIGF-I受容体特異的抗体の抗がん効果とそのメカニズムを評価する。IGF-I受容体に対する抗体によるダウンレギュレーションのメカニズムの解明に関して、ヒト乳がんMCF-7細胞で、エピトープの異なる抗体でも用いた抗IGF-IR抗体の全てがIGF-I受容体のダウンレギュレーションを引き起こした。抗IGF-I受容体抗体によるIGF-I受容体のダウンレギュレーションはクラスリン被覆小胞を介して細胞内に侵入し、リソソームにて分解されるという事が明らかになった。これらの成果は2回の学会で報告した。さらに、共焦点顕微鏡での解析結果を加え、平成19年、5月にアメリカ生化学・分子生物学会で報告した。現在、投稿準備中である。本研究の目的は、より効果的なIGF-I受容体機能を阻害する単鎖抗体を新規に作製し、IGF-I受容体に対する分子標的治療法の確立を目指そうとすると同時に、単鎖抗体に誘起されるIGF-I受容体のdownregulationとその分解過程の分子機構を明らかにしようとするものである。1.Phage display法の活用により種々のIGF-I受容体に対する単鎖抗体をスクリーニングし、種類と質の充実を図るとともに、よりhigh affinityの改良型単鎖抗体を調製する。(1)ファージ提示型ヒト単鎖抗体ライブラリーの作製と改良:安定でレパートリー数の多いファージ提示型ヒト単鎖抗体ライブラリーの簡易システムを開発しているが、さらに単鎖抗体として精製を容易にするためにtagの改良をしつつある。(2)IGF-I受容体に対するヒト単鎖抗体のスクリーニング:現在までに23クローンを単離したが、3クローンが同一であったため20の異なる抗体ファージを得た。抗体ファージとしての特異性・親和性解析が終了し、融合タンパク質として単鎖抗体の発現・精製を進めている。得られた抗体はすべて異なる配列であったにもかかわらず、エピトープ特異性が同様である可能性が示唆されたので、さらに、エピトープ特異性が異なる様々な単鎖抗体を取り揃える必要がある。2.既存及び新たな単鎖抗体の抗がん効果とそのメカニズムを評価する:(1)新たな単鎖抗体の親和性、エピトープ特異性、agonist作用、抗がん効果などからの分類:1-(2)で単鎖抗体の精製が完了し次第、進める予定である。

(2)IGF-I受容体に対する単鎖抗体によるdownregulationのメカニズムの解明:すでに解析が進んでいる1H7由来単鎖抗体による解析、および1H7とはエピトープ特異性が異なるmAbである自家製3B7,2C8に加え、市販品数種のmAbによるdownregulationのメカニズムの比較・解析を進めた。さらに、新知見として、IGF-I受容体に対する(単鎖)抗体により、インスリン受容体のdownregulationが起こること、その機構解明が進んだ。これは、Dr.Yeeとの共同研究での成果であり、Cancer Res.2006年2月号に掲載された。本研究の目的は、より効果的なIGF-I受容体機能を阻害する単鎖抗体を新規に作製し、IGF-I受容体に対する分子標的治療法の確立を目指そうとすると同時に、単鎖抗体に誘起されるIGF-I受容体のdownregulationとその分解過程の分子機構を明らかにしようとするものである。1.Phage display法の活用により種々のIGF-I受容体に対する単鎖抗体をスクリーニングし、種類と質の充実を図るとともに、よりhigh affinityの改良型単鎖抗体を調製するスクリーニングした20種の抗体ファージの特異性検討、エピトープ解析を行った結果、抗IGF-I受容体に対するmAbを産生するhybridomaから調製した抗体ファージの特異性が、IGF-I受容体特異的なのに対し、インスリン受容体とcrossreactiveであった。はからずも、in vitroとin vivoでの抗体産生の違いが明らかになった。現在、投稿準備中である。2.既存及び新たな単鎖抗体の抗がん効果とそのメカニズムを評価する。現在、共焦点顕微鏡での解析が進行中である。これらの結果を5月のアメリカ生化学・分子生物学会で発表するとともに、現在、投稿準備中である。本研究の目的は、より効果的なIGF-I受容体機能を阻害する単鎖抗体を新規に作製し、IGF-I受容体に対する分子標的治療法の確立を目指そうとすると同時に、単鎖抗体に誘起されるIGF-I受:容体のdownregulationとその分解過程の分子機構を明らかにしようとするものである。1.Phae dislay法の活用により種々のIGF-I受容体に対する単鎖抗体をスクリーニングし、種類と質の充実を図るとともに、よりhigh affinitの改良型単鎖抗体を調製する。スクリーニングした20種の抗体ファージの特異性検討、エピトープ解析を行った結果、抗IGF-I受容体に対するmAbを産生するhybridomaから調製した抗体ファージの特異性が、IGF-I受容体特異的なのに対し、インスリン受容体及び他のタンパク質にも結合し目的物は得られなかった。Hybridomaからの2種のIGF-I受容体特異的単鎖抗体の解析により、新知見が得られた。IGF-1受容体に対する単鎖抗体によるdownregulationのメカニズムの解明に関して、ヒト乳がんMCF-7細胞で、用いた抗IGF-IR抗体、エピトープの異なる抗体でも全て、IGF-IRのダウンレギュレーションを引き起こした。抗IGF-IR抗体によるIGF-IRのダウン
新規阻害剤を用いた巨大ＡＴＰａｓｅミダシンによるリボソーム生合成の制御機構の解明

本年度では、動的なリボソーム生合成の仕組みを高い時間分解能で解析するための化学遺伝学的な手法を学ぶため、米国ノースウェスタン大学のAli Shilatifard教授の研究室に客員研究員として約1年間参加した。高等動物において、RNAポリメラーゼII(Pol II)によるRNAの転写伸長はプロモーター近傍で一時停止する。この転写伸長の停止と解除は数分のオーダーで起きる動的な生命現象である。Pol IIに結合するPAF1タンパク質複合体は、この転写伸長の停止と解除の制御に関わる。しかしこれまでに、PAF1が転写伸長を停止させる、または転写伸長の停止を解除するという相反する結果が報告されている。これらの結論は、RNAiノックダウン法によるPAF1タンパク質の除去後の実験結果に基づく。ノックダウン法の欠点は、PAF1を細胞内から除去するのに数日を要し、その間に生じる二次的な影響を排除できない点にある。そこで、標的タンパク質を数時間のうちに細胞内から除去することが可能なオーキシンデグロン法を用いて、PAF1の機能を直接的に解析できるのかを検討した。ライスTIR1を恒常的に発現するヒトがん細胞DLD1において、Cas9を用いてPAF1遺伝子のC末端にAIDタグをホモに挿入した。このPAF1-AID細胞株を低分子化合物オーキシンで1時間処理したところ、90%以上のPAF1-AIDタンパク質が細胞内から除去された。この実験系を用いて、転写伸長の様子をPol II ChIP-seqにより観察したところ、オーキシンを添加して1時間後に、転写伸長の停止がゲノムワイドに解除されることがわかった。この結果は、PAF1複合体が直接的にプロモーター近傍での転写伸長を停止させることを示す。以上の結果を含む研究成果をScience誌に発表した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は、ゲノム情報をタンパク質に変換する翻訳装置リボソームが細胞内で生合成される仕組みを解き明かすことを目的とする。リボソームの成熟過程において、巨大なATP加水分解酵素ミダシン(Mdn1)がどのような機能をもつのかを調べるうえで、初年度では以下のような成果が得られた。(1)これまで分裂酵母を用いた内在性Mdn1タンパク質の発現量解析や、Mdn1を含むリボソーム前駆体pre-60Sの単離・精製が困難であったため、これらを実現させる実験系の構築を目指した。検討の結果、Mdn1のN末端にリンカー配列を挟んでGFPタンパク質を融合させたタンパク質を、内在性Mdn1プロモータの制御下でゲノムから発現させることにより、約570 kDaの巨大なGFP-Mdn1タンパク質をウェスタンブロッティングによって簡便に検出できるようになった。さらに、抗GFP抗体による免疫沈降により、細胞抽出液からGFP-Mdn1を含むpre-60S複合体を効率よく単離・精製することが可能となった。(2)米ロックフェラー大との共同研究の結果、in vitroで低分子化合物RBin-1がMdn1のATP加水分解活性を阻害することがわかり、RBin-1がMdn1の阻害剤であることが証明された。しかし、RBin-1はMdn1の活性を最大で約50%までしか阻害できなかった。申請者のこれまでの解析によりMdn1は活性のあるATP加水分解ドメインを4つ持つことがわかっている。したがってRBin-1は、4つのATP加水分解ドメインの全てを阻害することはできないが、ある特定のドメインを特異的に阻害することが示唆された。初年度での主な目標であった(1)分裂酵母細胞からのMdn1タンパク質の精製法の確立と、(2)低分子化合物RBin-1がMdn1の阻害剤であること可能性の追究、の2点をどちらも達成したため、研究は概ね順調に進展していると判断した。本研究課題は、ゲノム情報をタンパク質に変換する翻訳装置リボソームが細胞内で生み出される仕組みを解き明かすことを目的とする。核小体から核、細胞質へと時空間的に秩序立ったリボソームの成熟過程において、その制御を司る重要な因子であるミダシンタンパク質の機能を詳細に解析し、以下の成果を得た。川島茂裕博士(東京大)とTarun Kapoor博士(米ロックフェラー大)と共同で、60Sリボソーム前駆体が成熟する分子メカニズムを解析した。具体的には、分裂酵母ミダシンの新規阻害剤Rbin1を用いて細胞内のミダシンを分単位で阻害し、そのときの60Sリボソーム前駆体の成熟度合いを解析した。ミダシンが核内において60Sリボソーム前駆体からRsa4という制御因子を除去するという出芽酵母の知見と合致して、Rbin1で15分処理した分裂酵母細胞では、核内の60Sリボソーム前駆体と結合しているRsa4のタンパク量が増加した。しかし処理後1時間後には、そのRsa4の量が逆に減少することがわかった。この結果は、分裂酵母ミダシンが関与する成熟過程のステップがRsa4除去のステップのさらに上流にも存在することを示唆する。Rsa4の除去が起きる核内よりも上流の核小体における成熟過程について解析した結果、Rbin1を30分処理した細胞では、60Sリボソーム前駆体に結合しているRix7やPpp1という制御因子の量が減少することを見出した。この結果は、ミダシンが核小体においてRix7やPpp1と60Sリボソーム前駆体の結合を促進する可能性を示唆する。

以上の結果より、ミダシンは核小体と核内の少なくとも2つのステップにおいて、60Sリボソーム前駆体と制御因子の相互作用を調節するという分子モデルを構築した。当初の主な目標であった、阻害剤Rbin1を用いたミダシンの機能解析の研究が進展し、その成果を国際誌で報告できたため、研究は順調に進んだと判断した。本年度では、動的なリボソーム生合成の仕組みを高い時間分解能で解析するための化学遺伝学的な手法を学ぶため、米国ノースウェスタン大学のAli Shilatifard教授の研究室に客員研究員として約1年間参加した。高等動物において、RNAポリメラーゼII(Pol II)によるRNAの転写伸長はプロモーター近傍で一時停止する。この転写伸長の停止と解除は数分のオーダーで起きる動的な生命現象である。Pol IIに結合するPAF1タンパク質複合体は、この転写伸長の停止と解除の制御に関わる。しかしこれまでに、PAF1が転写伸長を停止させる、または転写伸長の停止を解除するという相反する結果が報告されている。これらの結論は、RNAiノックダウン法によるPAF1タンパク質の除去後の実験結果に基づく。ノックダウン法の欠点は、PAF1を細胞内から除去するのに数日を要し、その間に生じる二次的な影響を排除できない点にある。そこで、標的タンパク質を数時間のうちに細胞内から除去することが可能なオーキシンデグロン法を用いて、PAF1の機能を直接的に解析できるのかを検討した。ライスTIR1を恒常的に発現するヒトがん細胞DLD1において、Cas9を用いてPAF1遺伝子のC末端にAIDタグをホモに挿入した。このPAF1-AID細胞株を低分子化合物オーキシンで1時間処理したところ、90%以上のPAF1-AIDタンパク質が細胞内から除去された。この実験系を用いて、転写伸長の様子をPol II ChIP-seqにより観察したところ、オーキシンを添加して1時間後に、転写伸長の停止がゲノムワイドに解除されることがわかった。この結果は、PAF1複合体が直接的にプロモーター近傍での転写伸長を停止させることを示す。以上の結果を含む研究成果をScience誌に発表した。今後は主に以下の3点について研究を推進させる。(1)pre-60S複合体の構成因子のなかで、Mdn1の酵素活性によって複合体との相互作用が制御される因子を探索する。具体的には、RBin-1で処理した細胞からGFP-Mdn1を含むpre-60S複合体を単離し、未処理の細胞由来のpre-60S複合体と比較することにより、化学量論的に変化のあった因子をLC-MS/MS解析を用いて同定する。(2)申請者の過去の解析によりMdn1との関連が示唆されているシャペロンタンパク質HSP70が、pre-60Sの複合体形成に関わる可能性を検討する。HSP70のATP加水分解活性を薬剤で特異的に阻害した場合に、GFP-Mdn1を含むpre-60S複合体の構成因子のなかで複合体との相互作用に変化がみられるかを調べる。(3)減数分裂期におけるリボソーム生合成を調べるため、減数分裂をおこなう酵母細胞をRBin-1で処理し、ライブイメージングによる細胞生物学的な解析をおこなう。今後は以下の2点に着目した研究を展開する予定である。