hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボローム解析を用いた腎疾患における新規診断法の開発

本研究では、腎生検で確定診断されたネフローゼ症候群上位7疾患(微小変化型ネフローゼ症候群、膜性腎症、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、アミロイド腎症、ループス腎炎、lgA腎症)274例の尿検体を用いてメタボローム解析を行い、診断を予測する代謝産物を得た。続いて、新規120例でvalidationを行い同様の結果を得た。また、イヌリンクリアランスを測定した症例173例の血漿と尿検体の代謝産物の中で、GFRと相関する物質を得た。オミクス解析法のひとつであるメタボローム解析は、生体試料中の全代謝物(メタボローム)の変化をバイアスをかけずに一斉測定する網羅的解析手法である。本研究分担者は、世界で初めてキャピラリー電気泳動装置+質量分析機(CE+MS)を用いて細胞内の全イオン性代謝物( 1k Da)を網羅的かつ高速に直接定量する手法を開発し(Soga et al., 2003)、薬剤性急性肝炎の新規バイオマーカーの発見(Soga et al., JBC, 2006)など良好な結果を得ている。腎疾患においてはメタボローム解析手法を用いた研究の報告はまだほとんどなく、本研究のような1,700例という大規模な臨床検体を用いた研究は世界でも初めての試みと思われる。現在、腎疾患の診断には腎生検が必要であるが、出血のリスクが高いため、全身状態の悪い患者や高齢者、出血性素因のある患者、片腎の患者などでは腎生検ができないことも多く、診断や病態の把握が困難となり、十分な治療ができないことも多い。腎生検を行わずに血液と尿から腎疾患の診断ができる新たな診断方法の開発は臨床的価値が非常に高いと思われる。予備研究としてすでに約200例の臨床検体(尿検体)のメタボローム解析を終了している。その結果、疾患により代謝の異なる物質が明らかとなっている。疾患特異的な代謝物を組み合わせることで、高い精度で各疾患の鑑別診断ができる可能性があることに着目し、検体数を大幅にふやし、更に精度の高い診断マーカーの開発を目指している。現時点では、約800例の臨床検体(尿検体)の収集が終了しており、メタボローム解析を順次行っている状況である。更に臨床検体の収集を続けつつ、メタボローム解析データの解析も行なっていく。多種類の腎疾患患者の尿検体が含まれており、解析が困難であることが予想されるため、まずはネフローゼに着目して解析していく予定である。オミクス解析法の一つであるメタボローム解析は生体試料中の全代謝物(メタボローム)の変化を一斉測定する網羅的解析手法である。本研究分担者は世界で初めてキャピラリー電気泳動装置+質量分析機(CE+MS)を用いて細胞内の全イオン性代謝物(1k Da)を網羅的かつ高速に直接定量する手法を開発し(Soga et al.,2003)、薬剤性急性肝炎の新規バイオマーカーの発見(Soga et al.JBC,2006)など良好な結果を得ている。現在、腎疾患の診断手法である腎生検は出血のリスクが高く、高齢者、片腎の患者などには施行ができないため診断や病態の把握が困難となり、十分な治療ができないことも多い。予備研究としてすでに約200例の臨床検体(尿検体)のメタボローム解析し、疾患により代謝の異なる物質が明らかとなっている。疾患特異的な代謝物を組み合わせることで識別診断ができる可能性があることに着目し、検体数を大幅に増やし、制度の高い診断マーカーの開発を目指している。現時点ではネフローゼ症候群、IgA腎症に着目して解析を進めている。また、尿中、血中の代謝物濃度はGFRによって変動することが予想される。これまでeGFRと尿中、血中代謝物濃度との関連の検討は報告されているが、GFR測定のgold standardであるイヌリンクリアランス(実測GFR)との関連の検討の報告は無く、これについても検体を収集し解析を行う予定である。腎疾患の診断手法として腎生検は有用である。しかし、出血のリスクが高く、高齢者、片腎の患者などには施行できないなど課題も多い。特に臨床的に問題となるネフローゼ症候群の原疾患を血液と尿から診断ができる新たなバイオマーカーが開発されれば臨床的価値は高い。また、現在腎機能マーカーとしては主として血清クレアチニンが用いられているが、軽度の腎機能の検出力は必ずしも高くない。臨床の現場では新たな早期腎機能マーカーの開発が求められている。オミクス解析法のひとつであるメタボローム解析は生体試料中の全代謝物(メタボローム)の変化を一斉測定する網羅的解析手法である。本研究では、1,000例といった大規模な症例の検体を用いたメタボローム解析を行ってきた。昨年度までに腎生検で確定診断されたネフローゼ症候群上位7疾患(微小変化型ネフローゼ症候群、膜性腎症、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、アミロイド腎症、ループス腎炎、lgA腎症)274例を用いた検討でそれぞれを予測する代謝産物を得た。

本年度は、あらたに120例のネフローゼ症候群の尿検体を用いてvalidationのための解析を行った。現在、確認された代謝産物の同定を進めている。腎機能マーカーの検討については、本年度はGFR測定のgold standardであるイヌリンクリアランス(実測GFR)を測定した症例173例の血漿と尿検体を用いた解析を行った。代謝産物の中で、実測GFRと相関する物質を解析したところ、腎機能が低下するに従い、血漿中、尿中でそれぞれ上昇、低下する物質が検出され、代謝産物は大きく4群に分類された。特に腎機能低下に伴い血中および尿中で低下する物質の存在は興味深く、現在各代謝物の同定を進めている。本研究では、腎生検で確定診断されたネフローゼ症候群上位7疾患(微小変化型ネフローゼ症候群、膜性腎症、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症、アミロイド腎症、ループス腎炎、lgA腎症)274例の尿検体を用いてメタボローム解析を行い、診断を予測する代謝産物を得た。続いて、新規120例でvalidationを行い同様の結果を得た。また、イヌリンクリアランスを測定した症例173例の血漿と尿検体の代謝産物の中で、GFRと相関する物質を得た。現在約1000例の検体が収集でき、解析を行った。解析の一例として、収集された症例の中からネフローゼ症候群のみを抽出し、かつ原因となった疾患上位7傑(微小変化型ネフローゼ症候群[MCNS]、膜性腎症{MN}、糖尿病性腎症{DN}、巣状分節性糸球体硬化症{FSGS}、アミロイド腎症{RA}、ループス腎炎{LN}、IgA腎症{IgA})233例において、他疾患と鑑別する代謝物の探索を行った。その結果、単一の代謝物で疾患を鑑別する代謝物として、MCNS:代謝物A・AUC=0.718、MN:代謝物B・AUC=0.712、DN:代謝物C・AUC0.954、FSGS:代謝物D・AUC=0.744、RA:代謝物E・AUC=0.715、SLE:代謝物F・AUC=0.897、IgA:代謝物G・AUC=0.755が候補となった。複数の代謝物を多重ロジスティック回帰モデルに投入してROC曲線を描くと、更にAUCが改善するモデルを作製することもできた。またIgA腎症の検体241例を用いて、Oxford分類による間質線維化スコア(T02)を予測する代謝物を同定することも試みている。スコアの上昇に伴い有意差をもって上昇/低下する代謝物が複数同定されたが、eGFRとの相関が強く、スコアの予測の予測能としてはeGFR以上には有用でない可能性が示唆された。本研究ではすでに非常に多数の検体を用いて大規模に解析することを目的としているので、検体の収集に予想以上に時間を要している。しかし、すでに約800例の検体は収集できており、大きな遅れではない。腎臓内科学ネフローゼ7疾患を鑑別する代謝物を探索する試みから得られた結果のvalidationのために、新たにネフローゼ症候群7疾患の検体185例を既に収集した。現在これらのメタボローム解析を行っている。IgA腎症に関しては、更に同一症例群の血漿中のメタボローム解析も追加し血液、尿の代謝物プロファイルの比較を行うことで、より生体内生理に基づいたバイオマーカーの探索を行う予定である。本研究では非常に多数の検体を用いて大規模に解析することを目的としているので、検体の収集に予想以上に時間を要している。しかし、すでに約800例の検体は収集できており、大きな遅れではないため、今後ややスピードアップを図っていく予定である。
メラニン生成関連遺伝子の色素細胞特異的発現に関わる転写因子の解析

研究の目的はメラニン生成関連酵素遺伝子の色素細胞特異的な転写の分子機構を解明することであり、当該年度に以下の研究を行い成果を報告している。1:メラニン生成関連酵素遺伝子の色素細胞特異的な転写機構の解析転写因子MITFの作用機構を調べる為に、大腸菌で発現させた組み換えMITFを用いて、メラニン合成系酵素遺伝子であるチロシナーゼ、TRP1、TRP2の各遺伝子上流領域に存在するCATGTGモチーフへの特異的な結合を明らかにした。更にこれらのCATGTGモチーフに変異を導入し、MITFによる転写活性化能の変化から、それぞれの配列の機能の違いを明らかにしている(投稿準備中)。また抗MITF抗体を作成しており、現在組織染色によって組織におけるMITFタンパク質の発現の状態を調べている。2:マウスメラニン生成関連遺伝子の発現におけるMITFの効果培養細胞にMITFを導入し発現させた後の転写活性化の比率を指標に、マウスチロシナーゼ遺伝子の色素細胞特異的な発現に必要な領域に存在する二つのCATGTGモチーフの機能の違いを明らかにした。さらにマウスTRP-1遺伝子の組織特異的な発現にも、プロモーターに存在するCATGTGモチーフが重要であることを明らかにし、報告した。3:MITF遺伝子の転写調節機構MITF遺伝子を単離し、色素細胞特異的な発現に働く転写開始点付近を中心とした領域の塩基配列を明らかにした。さらにMITF遺伝子の上流領域を用いてアッセイを行い、色素細胞特異的な発現に必要な調節領域をはじめて明らかにし、報告している。
北アメリカにおける伝統的建築物ーその保存・再生・活用に関する調査ー

本研究は,昭和61年度と昭和63年度に科学研究費補助金(海外学術研究)によって実施した「アメリカ合衆国における伝統的建築物の保存・再生・活用に関する調査」の発展的継承を意図するものであり,(a)伝統的民家などを移築・保存・公開する施設(野外博物館),伝統的民家などを中心に、それをとりまく歴史的環境を公園化した施設(歴史公園),伝統的民家などによって構成される町並みを修復・活用するために処置を施した地域の実情に注目し,(b)日・米・欧における具体的な事例を集積し,(c)それらを比較研究することによって,(d)伝統的建築物の保存・再生・活用をめぐる理論を提唱することを目的とする研究の一環をなしている。平成3年度には,計画調書作成時には,期間を3年とし,未調査全地域をカバ-する予定であったが、交付申請時には1年間と期間が縮少されたため,(1)ニュ-イングランドの一部とハドソン川流域(ニュ-ヨ-ク州),(2)北欧・中欧系移民の入植した中西部および中北部の大草原地帯(ミネソタ州およびノ-ス・ダコタ,サウス・ダコタ州東部),(3)太平洋岸地域(シアトル,ポ-トランドとその周辺地域)を重点地域とし,53の施設・地区を調査した。まず,今回の調査において収集した諸資料の整理を行なった。これらの地図,案内書,小冊子,研究紀要,写真などは,日本においては入手が困難なものが大半であり,研究代表者らが現地で行なった観察やヒアリングの内容とともに,本研究における貴重な資料となるものである。平成3年度の調査研究によって、我々は,ようやく対象となる施設・地区の分布やその傾向性を全米的な視野で概観できる段階に達したものと考える。すなわち,アメリカ合衆国における伝統的建築物の保存は,(a)各地域社会やエスニック・グル-プのアイデンティティの確立と深く関係していること,(b)したがって,きわめて多様にわたっていること,(c)生活状況の歴史的復元が重視され,そのためのコスチュ-ム・スタッフやプログラムの整備が充実していること。これは1960年末から1970年代にかけての社会状況ー公民権運動をはじめとするーを反映し,真の生活史の復元を求めるリビング・ヒストリ-・ム-ブメント(L・H・M)によって,各施設の内容が充実したことが指摘できる。さらに,(d)都市においては,その再開発にあたり,伝統的建築物の活用によって,その都市独自の景観を構成する試みが顕著であることなどに、きわだった特徴を指摘することができる。したがって,アメリカにおける伝統的建築物は,アメリカ社会の現代的な課題に答えるかたちでの活用がはかられているわけである。研究代表者らは,当初の計画から削減された地域について,当該課題にかかわる研究を今後も継続する計画であるが,これらの特徴は,将来の研究にあたり,重要な視点を示唆するものといえるのである。

研究代表者らは,当初の計画から削減された地域について,当該課題にかかわる研究を今後も継続する計画であるが,これらの特徴は,将来の研究にあたり,重要な視点を示唆するものといえるのである。
吹出しを伴う管内乱流の乱流構造に関する研究

吹出しは境界層を制御するための手段として多くの分野で用いられ、流体機械や翼などの性能向上に大きな貢献をしている。本研究は、吹出し速度比を種々変化させた条件のもとで、吹出しを伴う管内乱流の乱流構造を実験的に解明することを目的として行われたものである。実験に際しては、最初に吹出し開始前から吹出し開始点近傍、さらに十分発達した領域までの合計12個所の流れ方向位置において速度分布、乱流エネルギ-などの測定を行った。ついで、代表的な流れ方向位置においてエネルギ-スペクトル、自己相関、確率密度関数などの測定を行うことにより、乱れの統計的性質を調査した。さらに、2種類の条件付き抽出法を適用して乱流中の組織的構造であるバ-スト現象の解析を行った。本研究により得られた主要な成果は以下に要約して示す。1.吹出しにより壁面近傍での速度は減少し、壁面から離れた領域での速度は増加する。減速と増速とが逆転する位置は、吹出し比の相違によらず流路幅のおよそ0.15倍壁面から離れた位置である。2.乱流エネルギ-、レイノルズ応力は吹出し比が大きくなるにつれて増加する。吹出しを伴う管内乱流では吹出しによる加速効果も現れるが、その効果は管中心部に極めて近い領域を除いて観察されない。3.エネルギ-スペクトルに及ぼす吹出しの影響は壁面近傍に限定される。また、いずれの吹出し比に対しても局所等方性乱流の存在を示す波数領域が存在する。4.バ-スト現象を解析した結果より、レイノルズ応力や乱流エネルギ-が吹出しにより増加するのは、吹出しによりバ-ストの発生頻度が増し、かつその継続時間も長くなること、ならびにバ-ストのスイ-プ事象からの寄与が増大することが原因となっていることが明らかとなった。吹出しは境界層を制御するための手段として多くの分野で用いられ,流体機械や翼などの性能向上に大きな寄与をしている。本研究では,レイノルズ数を2種類,吹出し速度比を3種類変化させて,吹出しを伴う二次元チャネル内乱流の乱流構造を実験的に解明することを目的としている。実験にあたっては,吹出し開始前から吹出し開始点近傍,さらに十分発達した領域までの合計10個所の流れ方向位置において速度分布,静圧分布,乱流エネルギ-,レイノルズ応力などの測定を行った。それらの結果より,吹出し速度が小さく加速度パラメ-タの値が逆遷移が発生すると従来からいわれている約3×10^<-6>以下の場合には吹出しの影響はあまり観察されないが,吹出し速度が大きく加速度パラメ-タの値が臨界値を越えた場合には吹出しの影響が顕著に現れ,速度分布は壁面近くで減速するとともに壁面せん断応力も小さくなることが明らかとなった。また,乱流エネルギ-,レイノルズ応力は特に壁面近傍で急激に減少し,再層流化傾向が認められた。ついで,乱流の構造を明らかにするために代表的な数個所の位置において乱れのパワ-スペクトル,自己相関関数,確率密度関数などの測定を行った。パワ-スペクトルの測定結果からは吹出しにより低波数領域のエネルギ-の寄与が増大することが判明した。確率密度関数については,壁面から離れた領域では吹出しによる影響はほとんど認められないが,壁面近傍では分布の非対称性が増し,スキュ-ネスの値が大きくなる現象が観察された。これは,壁面近傍の組織的構造であるバ-スト現象が吹出しにより変化していることを示唆している。

今後,測定個所を増やして乱れの統計的性質を明確にするとともに,乱れやレイノルズ応力の生成に非常に重要な役割を果しているバ-スト現象を解析することにより,吹出しを伴う管内乱流の乱流構造を解明する予定である。吹出しは境界層を制御するための手段として多くの分野で用いられ,流体機械や翼などの性能向上に大きな貢献をしている。本研究は、吹出し速度比を種々変化させた条件のもとで、吹出しを伴う管内乱流の乱流構造を実験的に解明することを目的として行われたものである。実験に際しては、最初に吹出し開始前から吹出し開始点近傍、さらに十分発達した領域までの合計12個所の流れ方向位置において速度分布、乱流エネルギ-などの測定を行った。ついで、代表的な流れ方向位置においてエネルギ-スペクトル、自己相関、確率密度関数などの測定を行うことにより、乱れの統計的性質を調査した。さらに、2種類の条件付き抽出法を適用して乱流中の組織的構造であるバ-スト現象の解析を行った。本研究により得られた主要な成果を以下に要約して示す。1.吹出しにより壁面近傍での速度は減少し、壁面から離れた領域での速度は増加する。減速と増速とが逆転する位置は、吹出し比の相違によらず流路幅のおよそ0.15倍壁面から離れた位置である。2.乱流エネルギ-、レイノルズ応力は吹出し比が大きくなるにつれて増加する。吹出しを伴う管内乱流では吹出しによる加速効果も現れるが、その効果は管中心部に極めて近い領域を除いて観察されない。3.エネルギ-スペクトルに及ぼす吹出しの影響は壁面近傍に限定される。また、いずれの吹出し比に対しても局所等方性乱流の存在を示す波数領域が存在する。4.バ-スト現象を解析した結果より、レイノルズ応力や乱流エネルギ-が吹出しにより増加するのは、吹出しによりバ-ストの発生頻度が増し、かつその継続時間も長くなること、ならびにバ-ストのスイ-プ事象からの奇与が増大することが原因となっていることが明らかとなった。
表面分光測定による高分子ゲルの表面摩擦物性と表面分子構造の関係解明

本研究では高分子などの機能性材料の表面分子構造と材料の生体適合性や表面摩擦特性などの表面物性との相関を解明するために、高い感度と界面選択性を持つ和周波発生(SFG)分光法を応用し、種々の環境下において材料の表面分子構造の決定を試みた。また、材料表面にラッピング処理等を施し、その表面分子構造の変化を分子レベルで評価した。本研究においては、柔らかい高分子材料の特性に合わせた分光測定セルを設計・作製した。SFG分光計測は、内部反射型の光学配置で測定を行った。一連のポリアクリレート系高分子やその共重合体、ポリイミド系高分子などの薄膜をCaF_2プリズムの平面にスピンコーティングによって作製した。SFG分光法で測定した結果、各高分子のバルクはアモルファスであるにもかかわらず、その表面において、側鎖がある程度の配向秩序をもっていることが分かった。また、水溶液中ではポリアクリレート高分子の表面構造の変化が確認できた。水中に浸漬すると、PMEA表面にある側鎖エステル結合のカルボニル基(C=O)の伸縮振動は1740cm^<-1>から1720cm^<-1>へレッドシフトし、表面におけるC=O基の大多数が水分子と水素結合を形成したことがわかった。一方、ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート(PHEMA)の表面では、浸漬直後ではこの水素結合が観測されたが、浸漬時間とともに大きく減少したことが観測された。そこで、(MEA)_<m>-co-(HEMA)_n(m, n=01.0)共重合体を用い、純水中への浸漬に伴う表面分子配向および水素結合の状態についても詳細に検討した。また、ポリメチルメタクリレート(PMMA)及びポリ-n-ブチルメタクリレート(PBMA)などの高分子表面においては、このような水素結合があまり強く観測されなかった。このような表面水素結合は、PMEAに特有な生体適合性との関連性が示唆された。これらのポリアクリレート表面にラッピング処理を施したが、SFGスペクトル上では変化があまり見られず、等方性であることが分かった。その他、ポリイミド系高分子の薄膜については、ラッピング前後に表面構造の大きな変化が観測され、表面構造異方性の存在が確認できた。この表面異方性構造の発現はポリイミド分子の官能基の種類やπ-πスタッキング状態などに依存することが分かった。その構造解析により、ラッピングによる表面構造変化の詳細について明らかにし、機能性の発現と性能向上の可能性についても検討した。本研究では生体材料である高分子ゲルの表面摩擦特性とその表面分子構造の相関を解明することを目的とする。高分子ゲルの表面摩擦特性は、高分子ゲルに含まれる水、特にゲル表面にある水の構造と強く関係しているものと考えられる。本研究は高い感度と界面選択性を持つ和周波発生(SFG)や表面増強赤外分光法(SEIRAS)を、高分子ゲルの表面分子構造の解明に用いる。

本研究は、ゲルが機能する水溶液中の環境下で、異なる固体基板の表面で外部荷重を加えながらゲル表面の摩擦係数の荷重依存性を測定し、その場SFG測定によるゲルの表面分子構造、特に界面での水分子の構造の解析を比較し、高分子ゲルの表面摩擦物性と表面の分子構造の関係を解明する。研究の初年度においては、高分子ゲルの特性に合わせた分光計測セルを最適化し、ゲルを用いるその場分光測定の準備を行った。分光計測は、内部反射型の配置で測定を行うので、溶融石英またはフッ化カルシウム(CaF_2)の半円筒型プリズムを用いた。そのような柔らかい高分子薄膜表面と圧力を均一かつ連続的に加えるように、マイクロメート制御で圧力調整可能なその場分光測定セルを設計・製作した。まず、ポリアクリレートまたはポリスチレンなどの高分子薄膜を、基板表面にスピンコーティング法またはキャスト法により作製を試みた。上記に設計された圧力が制御できる分光セルを用い、その場SFGとSEIRAS測定を行った。特にSFG測定は、各偏光条件下において、1200-4000cm^<-1>の波長領域で初めて実現されており、ゲルと水界面の構造を観察する必要となる波長領域がほぼ確保できた。本研究では生体高分子材料の表面摩擦特性とその表面分子構造の相関を解明することを目的とし、高い感度と界面選択性を持つ和周波発生(SFG)分光法を用い、高分子材料の表面分子構造の解明を試みた。特に高分子材料の表面をラッピングさせた前後、その表面分子構造の変化を分子レベルで評価した。生体材料の表面物性を分子構造の観点で検討し、新しい評価方法の樹立を目指す。本研究においては、柔らかい高分子材料の特性に合わせた分光測定セルを設計・作製した。SFG分光計測は、内部反射型の配置で測定を行った。ポリ-2-メトキシエチルアクリレート(PMEA)やポリメチルメタクリレート(PMMA)等のポリアクリレート系高分子やポリイミド系液晶分子の薄膜をCaF_2プリズムの平面にスピンコーティングによって作製した。SFGで評価した結果、各高分子のバルクはアモルファスであるにもかかわらず、その表面において、側鎖をある程度配向させている秩序をもつ分子構造であることが分かった。また、水溶液中ではポリアクリレート高分子の表面構造の変化が確認できた。水中に浸漬すると、PMEA表面にある側鎖エステル結合のカルボニル基(C=O)の伸縮振動は1740cm^<-1>から1720cm^<-1>へレッドシフトし、C=O基の大多数が水分子と水素結合を形成したことがわかった。このような水素結合はPMMAとPBMAなどの表面では、あまり観測されず、PMEAに特有な生体適合性との関連性が示唆された。これらのポリアクリレート表面をラッピングさせると、SFGスペクトルに変化があまり見られず、等方性であることが分かった。一方、ポリイミド系高分子の薄膜においては、ラッピング前後に表面構造の大きな変化が観測され、表面構造異方性の発現が確認できた。このような表面異方性構造の発現はポリイミド分子の官能基の種類やπ-πスタッキング状態などに依存することが分かった。その構造解析により、ラッピングによる表面構造変化の詳細について明らかにし、新しい機能性の発現と性能向上の可能性についても検討した。
ミトコンドリアに存在するATP依存性プロテアーゼLonの構造と機能の解析

Lonプロテアーゼはタンパク質の分解と共役してATPを加水分解するATP依存性プロテアーゼの一種で,大腸菌などの原核生物からヒトなどの高等哺乳動物に至るまで広くその存在が知られている.原核生物においては細胞質に,真核生物においてはミトコンドリアに存在し,変性タンパク質の除去や細胞分裂,細胞壁合成の制御(原核生物),ミトコンドリアの機能維持(真核生物)などに関わっていることが示唆されている.本研究では,哺乳動物のミトコンドリアにおけるLonプロテアーゼの機能解析を行うとともに,Lonプロテアーゼ自体のATP依存的ペプチド結合切断のメカニズムを立体構造レベルで解明することを主な目的とし,これまでに,マウスのLON cDNAのクローニングを行うとともに,GFPとの融合タンパク質を用いて,ミトコンドリア移行に要求されるシグナルの特定などを行ってきた.今年度はLON遺伝子の機能を個体レベルで調べる目的で,ドミナントネガティブ体のLONを発現するトランスジェニックマウスを作成することを試みた.マウスLonのSer834は各種生物のLonに高度に保存されており,大腸菌ではプロテアーゼ活性残基であることが報告されている.そこで,このセリン残基をアラニンに置換したLon変異体(S834A)発現ベクターを構築し,マウス受精卵への導入を試みた.現在,この変異体LON遺伝子が導入されたマウス一匹を得ることができ,その解析を行っている.また,LonプロテアーゼのATP依存的ペプチド結合切断メカニズムならびに細胞内変性タンパク質認識メカニズムの詳細な解析にはX線結晶構造解析によるLonプロテアーゼの立体構造の解明が不可欠となる.そこで,結晶化に有利と思われる高度好熱菌のlon遺伝子の発現系を作成し,それより精製した標品を用いて結晶化の条件検討を行っている.Lonプロテアーゼはタンパク質の分解と共役してATPを加水分解するATP依存性プロテアーゼの一種で,大腸菌などの原核生物からヒトなどの高等哺乳動物に至るまで広くその存在が知られている.原核生物においては細胞質内,真核生物においてはミトコンドリア内に存在し,変性タンパク質の除去の他に細胞分裂,細胞壁合成の制御(原核生物)やミトコンドリアの機能維持(真核生物)に関わっていることが示唆されている.本研究では,哺乳動物のミトコンドリアにおけるLonプロテアーゼの機能解析を行うとともに,Lonプロテアーゼ自体のATP依存的ペプチド結合切断メカニズムの立体構造レベルでの解明をめざした.本年度は以下の結果を得た.既に報告のあるヒトのLON遺伝子をプローブとして,マウスcDNAライブラリーよりマウスLON cDNAを得た.このマウスLonとGFPとの融合タンパク質を培養細胞COS7に導入し,ミトコンドリアへ移行することを確認した.次いでLonのN末端付近の部分欠失変異体とGFPとの融合タンパク質を数種,培養細胞内で発現させ,細胞内局在を調べることにより,これまで不明であったLonのミトコンドリア移行シグナルの同定に成功した.現在,Lonプロテアーゼおよびそのプロテアーゼ活性を欠失した変異体を培養細胞に導入し,その機能を解析している.LonプロテアーゼのATP依存的ペプチド結合切断メカニズムならびに細胞内変性タンパク質認識メカニズムの詳細な解析にはX線結晶構造解析によるLonプロテアーゼの立体構造の解明が不可欠である.そこで,結晶化に有利と思われる高度好熱菌のlon遺伝子のクローニングを行い,それの大腸菌内での大量発現とLonの精製に成功した.この高度好熱菌Lonは基質特異性,ペプチド結合切断反応のATP依存性など,生化学的特性については大腸菌や哺乳動物のものとほぼ同じで,耐熱性が上昇していた.この発現・精製系を用いて1リットルの培養液より約5mgの精製Lonプロテアーゼを得られることがわかったので,現在,この精製標品を用いてX線結晶解析に向けての結晶化の条件検討を行っている.Lonプロテアーゼはタンパク質の分解と共役してATPを加水分解するATP依存性プロテアーゼの一種で,大腸菌などの原核生物からヒトなどの高等哺乳動物に至るまで広くその存在が知られている.原核生物においては細胞質に,真核生物においてはミトコンドリアに存在し,変性タンパク質の除去や細胞分裂,細胞壁合成の制御(原核生物),ミトコンドリアの機能維持(真核生物)などに関わっていることが示唆されている.本研究では,哺乳動物のミトコンドリアにおけるLonプロテアーゼの機能解析を行うとともに,Lonプロテアーゼ自体のATP依存的ペプチド結合切断のメカニズムを立体構造レベルで解明することを主な目的とし,これまでに,マウスのLON cDNAのクローニングを行うとともに,GFPとの融合タンパク質を用いて,ミトコンドリア移行に要求されるシグナルの特定などを行ってきた.今年度はLON遺伝子の機能を個体レベルで調べる目的で,ドミナントネガティブ体のLONを発現するトランスジェニックマウスを作成することを試みた.マウスLonのSer834は各種生物のLonに高度に保存されており,大腸菌ではプロテアーゼ活性残基であることが報告されている.そこで,このセリン残基をアラニンに置換したLon変異体(S834A)発現ベクターを構築し,マウス受精卵への導入を試みた.現在,この変異体LON遺伝子が導入されたマウス一匹を得ることができ,その解析を行っている.また,LonプロテアーゼのATP依存的ペプチド結合切断メカニズムならびに細胞内変性タンパク質認識メカニズムの詳細な解析にはX線結晶構造解析によるLonプロテアーゼの立体構造の解明が不可欠となる.そこで,結晶化に有利と思われる高度好熱菌のlon遺伝子の発現系を作成し,それより精製した標品を用いて結晶化の条件検討を行っている.
ヘリウムの吸収スペクトルを利用した小型ヘリウム漏洩検出器の開発

研究目的:ヘリウムは軽く不活性、沸点が最も低い、危険性少ない、など優れた特長を持つため、研究・医療・工業に広く活用されているが、近年は世界的供給不足で価格が高騰しており、貴重な資源である。ただ分子直径が小さく漏洩しやすい欠点を持つ。小型の漏洩検出器は熱伝導度比較で検知する方式で、水素・窒素・アルゴン・二酸化炭素も検知してしまう。高精度の漏洩検出器はとても大きい装置で可搬性に優れない。またどちらの漏洩検出器も高価である。このような背景からヘリウムの漏洩を安価に検知できる新しい仕組みを探る。研究方法:ヘリウムの吸収スペクトルが発光スペクトル(587.56nm)近傍に存在すると仮定し原子吸光法を用いた。特定波長だけ選択的に透過させるBPFを使い、受光部に到達した光の強度でヘリウムの有無を検出する。LDではこの波長帯のものは存在しないため入射光を発する発光部にはピーク発光波長590nmの高輝度LEDを採用。BPFで波長幅を10nmに狭くし、受光部で信号増幅、A/D変換して、ヘリウムの漏洩を検知する仕組みの開発を試みた。またランベルト・ベールの法則に倣い、入射光が通過する光路長を長くすることも試みた。吸収スペクトルが発見できなかった場合は、白色の高輝度LEDを使い、可視光の範囲内でヘリウムの吸収スペクトルを探す。研究成果:この手法ではヘリウムの有無を観測することはできなかった。実験は常温・大気圧の下で行われたが、光路長を100mm確保しても、ヘリウムの有無は全く観測できなかった。ヘリウムは希ガスでありイオン化エネルギーが大きいため、通常は吸光せず温度・圧力・光量・入射光波長等で特別な条件があると思われる。原子吸光分析における関係文献にもヘリウムの記述は見当たらず、白色光でも全く検知できなかったということは通常環境下ではヘリウムの吸収スペクトルは現れない可能性も高いと考える。
白亜紀スーパークロン(超磁極期)における地球磁場強度の変更

白亜紀スーパークロンを含む中生代の岩石試料を用いて、古地磁気強度測定の信頼性を高めるため、(1)マイクロウェーブ励起によるテリエ法をジュラ紀玄武岩に対して適用し、また、(2)低温磁気特性により花崗岩磁化のキャリアを同定した。(1)について、ジュラ紀玄武岩に対しすでに従来のテリエ法が適用されている(Andrei et al.,1996)。しかし、試料中の擬似単磁区粒子(PSD)の物理的性質が室内加熱によって変質し、見かけ上大きな古地磁気強度を与えかねないことがわかっている(Andrei et al.,1999)。最近、マイクロウェーブ加熱(約12GHz)によって、磁性粒子のみを励起して、消磁・着磁をおこなえることが可能になっている(Hill et al.,2001)。本研究においてこの新方法によるテリエ法で古地磁気強度測定をしたところ、実験結果の合格率がかなり高くなり、効果的な測定法であることがわかった。ただし、従来のテリエ法でおこなっていたPTRM(部分熱残留磁化)テストを実施することができないという問題が残った。(2)について、1億年間前の白亜紀スーパークロン中期の阿武隈花崗岩の極低温磁気特性を測定した。花崗岩から長石と黒雲母を分離し、10Kまでの磁気特性を測定したところ、長石フラクションにはフェルベー変態点(Tv120K)が見られた。一方、黒雲母フラクションにはTvは見えなかった。このことと顕微鏡観察から、この花崗岩の磁化キャリアは斜長石中のマグネタイトであると同定した。特に、累帯構造コアにもマグネタイトが多くあること、斜長石は通常700°C以上で生成されることから、この花崗岩試料の磁化は初生的と結論した。
臨床試験の効率化と迅速化に向けた試験デザインの開発

本年度(最終年度)は4つの課題のうち,課題(2)(4)を重点的にとり組んだ.課題(2)(4)の研究実績の概要は次のとおりである.課題(2)生存時間解析を主解析とする臨床試験における標本サイズ設計の感度解析:2年目までに得られた研究内容に,試験の実施途中の情報を使用して,試験期間の確率密度関数を更新する方法を追加して,得られた成果を学術雑誌に投稿した.2019年1月末に査読の結果を受け,投稿論文の内容を修正している.課題(3)臨床試験の既存データを新規試験データに組み込む方法の実用化:既存の臨床試験のデータ(既存データ)を新規の臨床試験データ(新規データ)に組み込んで,試験治療の有効性をBayes流に評価する方法が提案されている.ところが,既存データと新規データに不均一性があると,試験治療の効果が過大または過小に評価されてしまう.両データの不均一性に影響する患者背景を解析モデルに組み込む方法が提案されているが,不均一性に影響する患者背景を正しく特定できるとは限らない.そこで,解析モデルを正しく特定した場合と誤特定した場合のもとでの既存法の動作特性を評価した.得られた成果を研究会(2018年9月(口頭))と国際会議(2018年7月,2019年3月(ポスター))で発表した.課題(4) 3群比較臨床試験における優越性検定と非劣性検定の検出力を考慮した2段階試験デザインの構築:2つの試験治療と対照治療の有効性の比較(優越性検定)と,試験治療間の有効性の比較(非劣性検定)の検出力を考慮して,これらの検定を2段階試験の枠組みで実施する試験デザインを構築した.さらに,投稿論文の草稿を作成した.最後に,研究成果の整理と研究成果報告書の作成を行った.本研究では,臨床試験の効率化と迅速化を達成するために,3つの研究課題を設定している.本年度の各課題の研究実績の概要は次のとおりである.課題(1)複数の評価項目と部分集団解析を設定する臨床試験における標本サイズ設計:全体集団と標的部分集団における試験治療の有効性を同時に評価するための多重比較法として,Constant function法(以下,CF法)と4A function法(以下,4AF法)をとりあげた.2つの方法の第1種の過誤確率と検出力を計算し,CF法の検出力が4AF法の検出力を上回る状況を明らかにした.得られた成果を国内学会(2017年3月(ポスター))で発表した.課題(2)生存時間解析を主解析とする臨床試験における標本サイズ設計の感度解析:標本サイズ(試験の参加者数)と試験期間の組み合わせを視覚的に捉えるための方法(両者の数理的な関係の導出と図示)と,試験期間の不確実性を評価するための方法(試験期間の確率密度関数の導出と図示)を開発した.得られた成果を,国際学会(2016年8月(ポスター))と国内学会(2016年11月(口頭),2017年3月(口頭))で発表した.課題(3)臨床試験の累積データを新規試験データに組み込む方法の実用化:既に実施された臨床試験のデータ(累積データ)を新規試験データに併合して,試験治療の有効性をBayes流に評価する方法が提案されている.ところが,両データに不均一性が生じると,第一種の過誤確率が有意水準以下にならないことがある.この問題を解決するために,(1)両データの不均一性に応じて累積データを併合する割合を決める方法と,(2)両データの不均一性に応じて試験群と対照群の成功確率の差の事後分布を調整する方法を提案し,その性能を評価した.得られた成果を国内学会(2017年3月(ポスター))で発表した.本年度の目標をほぼ達成できた.初年度は情報収集と基礎的な検討を予定していたが,国内・国際学会での成果発表が4件と当初の予定を上回った.課題(1)については,計画の一部を変更したが,変更後の内容について研究を十分に進めることができた.課題(2)については,研究協力者の助言などにより,予定よりも早く研究を進めることができた.課題(3)については,問題の根本的な解決には至らなかったが,今後の研究の進め方について有意義な結果が得られた.本研究では,臨床試験の効率化と迅速化を達成するために,3つの研究課題を設定している.これらの課題に加えて,2年目から,2つ(以上)の試験治療と対照治療が設定される多群比較臨床試験に関する課題を設定した.本年度の各課題の研究実績の概要は次のとおりである.課題(1)複数の評価項目と部分集団解析を設定する臨床試験における標本サイズ設計:多集団テーラリング試験の試験デザインの妥当性を検討した.本研究の課題の意義を見直し,2年目から設定した課題(4)に重点を置くことにした.課題(2)生存時間解析を主解析とする臨床試験における標本サイズ設計の感度解析:初年度の研究成果を踏まえて,試験の実施途中の情報を使用して,試験期間の確率分布を更新する方法を構築した.初年度の研究成果と合わせて,投稿論文の草稿を作成した.課題

(3)臨床試験の累積データを新規試験データに組み込む方法の実用化:初年度は,Bayes流の解析法であるPower prior法のもとで,既に得られている試験データと新規試験データの不均一性に応じて,試験群と対照群の成功確率の差の事後分布を調整して,試験治療の有効性を評価する方法を構築した.本年度は,Bayes流階層モデルのもとで,同様の方法を構築した.得られた成果を国際会議(2018年7月(ポスター))で発表する予定である.課題(4)多群比較臨床試験の試験デザインと多重性調整法の現状の調査と新しい試験デザインの構築:乳がん領域の多群比較臨床試験で使用されている試験デザインと多重性調整法を文献調査よって明らかにした.得られた成果を国際会議(2018年3月(ポスター))で発表した.さらに,2つの試験治療と対照治療の有効性の比較(優越性試験)と,試験治療間の有効性の比較(非劣性試験)を段階的に行う試験デザインを提案した.得られた成果を国際会議(2018年3月(ポスター))で発表した.本年度の目標をほぼ達成できた.国際学会での成果発表は3件(1件は予定)であった.課題(1)については,研究課題の意義を見直したため,目標の達成度は低い.課題(2)については,論文を投稿する準備がほぼ整っている.課題(3)については,近年注目されている課題であり,今後の研究の発展が期待できる.課題(4)については,投稿論文の草稿が半分できたところである.本年度(最終年度)は4つの課題のうち,課題(2)(4)を重点的にとり組んだ.課題(2)(4)の研究実績の概要は次のとおりである.課題(2)生存時間解析を主解析とする臨床試験における標本サイズ設計の感度解析:2年目までに得られた研究内容に,試験の実施途中の情報を使用して,試験期間の確率密度関数を更新する方法を追加して,得られた成果を学術雑誌に投稿した.2019年1月末に査読の結果を受け,投稿論文の内容を修正している.課題(3)臨床試験の既存データを新規試験データに組み込む方法の実用化:既存の臨床試験のデータ(既存データ)を新規の臨床試験データ(新規データ)に組み込んで,試験治療の有効性をBayes流に評価する方法が提案されている.ところが,既存データと新規データに不均一性があると,試験治療の効果が過大または過小に評価されてしまう.両データの不均一性に影響する患者背景を解析モデルに組み込む方法が提案されているが,不均一性に影響する患者背景を正しく特定できるとは限らない.そこで,解析モデルを正しく特定した場合と誤特定した場合のもとでの既存法の動作特性を評価した.得られた成果を研究会(2018年9月(口頭))と国際会議(2018年7月,2019年3月(ポスター))で発表した.課題(4) 3群比較臨床試験における優越性検定と非劣性検定の検出力を考慮した2段階試験デザインの構築:2つの試験治療と対照治療の有効性の比較(優越性検定)と,試験治療間の有効性の比較(非劣性検定)の検出力を考慮して,これらの検定を2段階試験の枠組みで実施する試験デザインを構築した.さらに,投稿論文の草稿を作成した.最後に,研究成果の整理と研究成果報告書の作成を行った.これまでの研究成果を踏まえて,各課題について,次のように研究を進める予定である.課題(1)については,標的部分集団を2つ以上設定した場合でも同様な結果が得られるかどうかを確認する.さらに,複数の評価項目を設定する状況に対して,研究成果を発展させる.課題(2)については,これまでの研究成果を論文として学術雑誌に投稿する.
哺乳動物の黄体組織消滅機構の解明

多くの哺乳動物において排卵後の卵巣に形成される黄体は、形成と消失(退行)を繰り返す一過性の内分泌器官である。本研究はウシにおける黄体退行機構にリンパ管を介した黄体細胞の卵巣外への移動が含まれていることを明らかにした。また、黄体細胞流出には黄体細胞自身が分泌する細胞外基質分解酵素群(MMPs)が重要であり、黄体細胞におけるMMPs発現は黄体退行誘導因子であるPGF2αおよびIFNγによって制御されていることを示した。多くの哺乳類において排卵後の卵巣に形成される黄体は、黄体ホルモンを分泌することで雌の体を妊娠可能にする。妊娠に至らなかった場合、黄体は卵巣から消滅し(黄体退行)、妊娠可能な状態が解除され、次の排卵が起こる。このように妊娠していない哺乳動物の卵巣では、黄体の形成と消失が絶えず繰り返され排卵周期が保たれている。これまで黄体退行は、黄体を構成する黄体細胞のアポトーシス(プログラムされた細胞死)とアポトーシスを起こした細胞を免疫細胞が貪食することによると考えられてきた。本研究では、黄体組織内リンパ管における黄体細胞マーカー陽性細胞の存在ならびに卵巣から採取されたリンパ液中における黄体細胞マーカー陽性細胞の存在を確認した。また、リンパ液中に観察される黄体細胞数は黄体退行期に急激に増加することを明らかにした。以上のことから「黄体細胞がリンパ管を通じて卵巣から流出する」という新規の黄体退行メカニズムを見出した。さらにリンパ液中に観察された黄体細胞は生存しており、生きた黄体細胞による黄体退行機構の発見はこれまでの定説であった黄体細胞のアポトーシスに依存していた黄体退行概念に大きなインパクトを与えた。多くの哺乳類において、排卵後の卵巣には妊娠の成立と維持を担うプロジェステロンを分泌する黄体が形成される。非妊娠時の黄体の消失(黄体退行)は次の排卵を誘起するために必須であり、黄体を短時間で消失させることは哺乳類が効率的に繁殖の機会を得る上で重要な生殖戦略である。これまでに黄体退行機構に関する多くの研究が成されてきたが、“極めて短い時間''で一つの組織が消失する機構は未だ明らかでない。本研究は、黄体組織消失(構造的黄体退行)機構における「未知の経路」の存在を明らかにすることを目的に実施された。初年度(H25年度)は黄体細胞が黄体退行期にリンパ管へ流出すること、また流出した黄体細胞は生存していることを明らかにした。また、リンパ管を介した黄体細胞の流出が最も活発になる時期は、黄体組織が卵巣上から完全に消滅する時期と一致した。これらの結果から、リンパ管を介した黄体細胞の流出という新たな黄体退行経路が明らかとなった。黄体細胞が黄体から流出するためには、退行期に黄体細胞が黄体組織から脱接着する必要がある。生殖生理学黄体退行時に正常な黄体細胞がリンパ管を通じて卵巣外へ流出することによって黄体が卵巣から消失することを証明した成果は、これまでの「黄体の消失は、黄体細胞のアポトーシスとアポトーシスを起こした細胞を免疫細胞が貪食することによる」という説明(常識)を覆すものであり、国際学会においても多くの議論をよび、国際的ジャーナル(PLoS ONE)に掲載され高く評価されている。また、朝日新聞をはじめとする新聞にプレスリリースされた。今後は黄体細胞のリンパ管を介した流出機構の解明をテーマとし、細胞接着崩壊の観点から研究を進める予定である。リンパ管を介した組織からの細胞流出はガン細胞転移過程において観察される。この時ガン細胞は細胞を組織に接着・固定している細胞外基質に対する分解酵素であるmatrix metalloproteinases (MMPs)を自身が合成・分泌し、組織より遊離したガン細胞がリンパ管に流入することで転移する。昨年度の本研究によって明らかにされたリンパ管を介した黄体退行過程においても、黄体細胞が黄体組織から遊離することが必須である。申請者は「黄体退行時に黄体細胞がMMPsを合成・分泌し、黄体組織から黄体細胞が遊離することでリンパ管へ流入する」という仮説を立て研究を進めており、すでにウシ黄体より単離した黄体細胞におけるMMPs mRNA発現を確認した。ウシにおいて黄体退行を誘導する物質は幾つか知られており、本研究では子宮から分泌され黄体退行のトリガーとして知られるプロスタグランディン、退行時に黄体組織に流入したマクロファージが分泌する腫瘍壊死因子ならびにインターフェロンに着目し、黄体細胞におけるMMPs発現に及ぼすこれらの物質の影響を検討する。得られた結果は2014年度に開催される日本繁殖生物学会(帯広、8月)において発表する予定である。また同年度に論文にまとめ発表する計画である。

当初の計画にある組み替え体マウス用いた予備実験をスタートさせなかったため、それに必要であった消耗品類の購入は行わず、次年度使用額が生じた。平成26年度には組み替え体マウス用いた研究をスタートさせるため、25年度に未使用であった金額をすべて組み替え体マウス用いた研究に必要な消耗品などの購入に充てる予定である。
宿主自然免疫応答からの菌の回避に細菌リポ多糖の構造変化が果たす役割

代表的なグラム陰性菌としてネズミチフス菌を用いて、菌のリポ多糖(LPS)のアシル基数減少変異株を作成した。野生株と変異株をマウスやヒト由来の培養細胞に感染させ、LPSのアシル基数を減少させるという構造変化を起こすことによって菌は宿主自然免疫応答から回避して感染性を増強できることを示した。サイトカイン産生活性を自然免疫応答の指標とすると変異株に対する活性低下はヒト細胞TLR4系による認識からの回避に起因するところが大きいが、貪食性を指標にすると活性低下はマウス細胞でもみられTLR4非依存的でもあり、幅広い宿主に対する普遍的な回避機構である可能性が示唆された。LPSのアシル基数が減少したサルモネラ変異株の生菌をヒトマクロファージ系U937細胞に感染させる実験で、(1)アシル基数が6個から5個に減少すると炎症性サイトカイン産生誘導活性が大きく低下すること、(2)野生株やアシル基6個の生菌による強い活性も、ヒト細胞のTLR4に対する抗体や拮抗剤で処理した場合は抑制を受けるが、(3)抗TLR2抗体によっては全く抑制を受けないことが分かり、生菌感染の場合にも、フォルマリン死菌体を用いた場合とほぼ同様の結果が得られることが分かった。これらのことから、サルモネラ菌の感染に対してヒトマクロファージ系細胞は菌が持つLPSを優先的に認識してTLR4シグナル伝達系で強く応答するが、TLR2による認識を始めとしてLPS以外の菌体成分に対する認識応答系はさほど働かせていないことが示唆された。従って、LPSのアシル基数を変化させてTLR4を介した宿主の自然免疫応答系を回避することは、感染菌に取って宿主体内における排菌ネットワーク機構をすり抜けて増殖を続けるために、極めて有効な戦略であると考えられることを示すことができた。ネズミチフス菌のLPS生合成系を変異させ、アシル基数を減少させる目的で作成した変異株を培養し、得られた菌体からLPSを抽出し、予定通りアシル基数が減少しているかどうか調べた。ガスクロマトグラフィーやMALDI-TOF質量分析によって解析した結果、ほぼ予想通りにアシル基数が減少していることが確認できた。ただ、アシル基数を4個だけのものにまで減少させるのは無理なようで、4個と5個のアシル基が混在する変異株までしか作成できなかった。この菌ではアシル基が4個だけでは細胞壁が弱くなりすぎて、安定した菌体の形成が難しくなる可能性が考えられる。作成した変異株から抽出したLPSでヒトマクロファージ系培養細胞を刺激し炎症性サイトカインの産生を調べた。アシル基数が67個の野生型から6個だけのものに変化しても、ヒト細胞刺激活性は強く保持されていたが、野生型からアシル基1個分が減少した65個のもの以下54個のものでは刺激活性が認められなくなり、反対に刺激作用を抑制するアンタゴニスト活性が認められた。菌体レベルでの反応を見るためにフォルマリン死菌を調整してヒト細胞を刺激すると、アシル基6個までのものは強い刺激活性を示しLPSの場合と同様であったが、65個以下のものでは弱いながら刺激活性が認められ、LPSの場合の様なアンタゴニスト活性は認められなかった。弱い刺激活性はLPS以外の菌体成分による作用ではないかと考えている。グラム陰性菌が宿主の自然免疫応答を回避するために、細菌リポ多糖LPSのアシル基数を減少させることが有効であることを、ヒト細胞による炎症性サイトカイン産生応答を指標として明らかにすることが前年度までにできた。最終年度である今年度は宿主細胞による菌の貪食を指標にして研究を進め、野生株に比べてアシル基数減少変異株に対する貪食効率が有意に低下することを見出した。しかもこの低下はサイトカイン応答の場合とは異なり、LPS受容体であるTLR4には非依存的であることや、マウス細胞でもヒト細胞と類似の応答が見られる事もわかった。更に、貪食の前段階である菌と細胞との接着に関して検討したところ、アシル基数減少変異株では細胞への接着菌数が野生株に比べて低下することも分かり、この段階で既に差が出る事を示す結果が得られた。これらのことから、この貪食回避効果は宿主細胞の貪食受容体を介する特異的応答の関与というよりむしろ菌の疎水性減少により宿主細胞表層の膜脂質との疎水性相互作用が減少するという非特異的な作用の関与が大きく反映されるのではないかと考えている。前年度までに検討して来たサイトカイン応答は、貪食された菌を宿主細胞が細胞内で殺菌、排除する段階で重要な役割を果たすと考えられるが、今年度の研究では宿主細胞が感染菌を捕える最初の段階ですでにアシル基減少変異株は捕獲され難くなっている事を指摘できた。

前年度までの結果と今年度の結果とを合わせると、これら両段階で相乗的な効果を生じさせることができると考えられ、宿主自然免疫応答からの回避にアシル基数減少が極めて効果的に機能できる仕組みであることを明らかにすることができた。感染免疫(細菌感染に対する宿主自然免疫応答)実際の感染時に起こる生体内での反応に迫るために予定していた、培養細胞系での生菌感染実験も順調に進み、フォルマリン死菌体を用いる実験で得られた結果が生菌感染に対する応答にもよく反映されることが明らかになった。期待していたような結果が得られ、生菌感染に対する宿主細胞応答に関する基本的な情報が蓄積しつつある。当初は、目的通りの変異株が作成できているかを確認し、それら変異株から抽出したLPSがヒト系細胞にどの様に作用するかを解析するあたりまでを達成目標にしていたが、LPSの反応だけでなく菌体を用いた反応の解析にまで進むことができた。しかも、アシル基数の減少した変異株では単離したLPSの反応と菌体レベルでの反応に違いが見られるという興味ある結果が得られている。サルモネラ変異株の生菌をヒトマクロファージ系培養細胞に感染させ、宿主細胞の貪食効果に対する菌の応答がアシル基数の変化によってどの様な影響を受けるのかを調べる。その際、抗TLR4抗体やTLR4アンタゴニストを作用させたりTLR4アゴニストを作用させたりして、この貪食効果にTLR4刺激伝達系が関与しているかどうかについて明らかにする。また、菌の貪食に関与する可能性が指摘されている宿主細胞の様々な因子についても、これら変異株の貪食に影響を及ぼすものがあるのかどうかを調べると共に宿主細胞による殺菌効果に対する変異株の応答についても検討を加える。更に、生体内での菌のクリアランスに結び付けて説明できる結果を示すことを目指して、そのための実験系の開発についても検討する。サルモネラ変異株の生きた菌をヒト系細胞に感染させた時の反応について調べる。LPS以外にも様々な菌体成分が宿主の自然免疫応答を誘導することが知られている。サルモネラの生菌感染による宿主免疫応答誘導にLPSが果たす役割は他の菌体成分と比べてどの程度の比重を占めるのか、LPSに対する宿主の受容体であるTLR4に対する抗体やアンタゴニストを作用させて調べる。また、LPS以外の菌体成分に対する受容体であるTLR2やTLR9などを抑制した場合にはどの様な影響が出るのかについても合わせて調べ、実際の感染に近い状況下での宿主免疫応答に各々の菌体成分が標的物質としてどの程度利用されているのかについての解析を行う。この時、LPSアシル基の減少した変異株ではどの様な反応が起こるのかについても調べ、この様な変異が宿主自然免疫応答からの菌の回避に実際に貢献している可能性について検討する。また、サルモネラ以外の菌でも、野生株として高活性型のLPSを持つグループと、低活性型のLPSを持つグループの生菌感染で、LPS活性の差が反映されるのかどうかについても検討を加える。次年度使用額(BーA)は4,192円となり次年度使用額が生じたことになるが、小額であり予算のほぼ全額を使い切ったと考えている。次年度使用額として残ったのは小額であり、使用計画に変更を加える必要が生じる程の額ではないと考えている。次年度使用額(BーA)が71,534円となっているが、年度末の試薬購入などが少しずれこんだことによるものである。基本的には予算のほぼ全額を使っており、十万円以下の額なので翌年度分として請求した助成金にに上乗せしても、使用計画に大きな影響を与える程の額ではないと考えている。