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構造固定分子集合体の触媒作用に関する研究

末端に二重結合を有する脂肪酸ナトリウム類の、ミセル形成状態での、UV光照射による重合と、得られた重合体の諸特性を検討した。1.10-ウンデセン酸ナトリウム(UANa)の重合では、プリCMC以下の濃度では重合体はほとんど得られないが、それ以上の濃度では、重合体の収量は濃度の増加に従って増加し、CMC以上になるとレベルオフする傾向が認められた。これはミセル形成が重合を促進することを示唆している。得られた重合体の諸特性を調べ、この重合体の重合度が1018の範囲にあること、重合体がUANaに比べて著しく強い疎水場を有すること、などを認めた。2.UANaの同族体として、8-ノネン酸ナトリウム(NANa)および5-メチル-3、7-オクタジエン酸ナトリウム(MONa)を合成し、それらの重合挙動を調べた。これらの同族体はUANaによく似た重合挙動を示したが、脂肪族鎖長がより低いためにプリCMCおよびCMCがより高く、その結果重合体の得られる濃度領域よりも高くなることを認めた。得られた重合体の重合度はNANaでは約8、MONaでは約6であった。3.13-テトラデセン酸ナトリウム(TANa)を合成し、その重合挙動を調べた。このTANaもUANaに似た重合挙動を示したが、脂肪族鎖長がより長いためにプリCMCおよびCMCがより低く、その結果重合体の得られる濃度範囲もより低いことを認めた。得られた重合体の重合度は約20であり、この値はミセルの会合度と一致した。これは一つのミセル会合体が一つの重合体になることを示唆していると考えられる。4.UANaの重合体をスルホン化し、その酢酸P-ニトロフェニルの加水分解に対する触媒活性を調べ、それがスルホン化UANaより高い触媒活性を示すことを認めた。これはこの重合体がその単量体より強い疎水場を持ち、基質との相互作用がより大きいことによると考えられる。本研究では両親媒性化合物を分子集合体を形成している状態で重合し,その重合挙動と得られた重合体の諸特性を検討している.最初にウンデシレン酸ナトリウム(UANa)のUV光照射下における重合挙動を調べるた.まず, UANa水溶液の粘度や電導度の測定などから,この水溶液が約0.04mol/l付近に第一臨界ミセル濃度(CMC)を,また0.12mol/l付近に第二CMCを示すことを認めた.このUANA水溶液にUV光(>200nm)を照射すると,第一CMC以下の濃度では重合体は得られないが,それ以上の濃度になると,濃度と増加とともに得られる重合体の量が著しく増加し,さらに濃度が第二CMC以上になると重合体収量の増加がゆるやかになる傾向が認められた.得られた重合体の重合度は第一CMCから第二CMCまでの範囲では重合時のUANa濃度の増加とともに増加し,第二CMC付近で約15という極大値を示し,それ以上の濃度では濃度の増加にしたがって低下する傾向を示した.次に,得られた重合体の界面活性剤としての特性を検討した.水溶液の電導度測定および疎水性プローブを用いる蛍光発光スペクトルの解析によってこの重合体がUANaモノマーよりはるかに低い濃度2.0×10^<-4>mol/l付近に第一CMCを,また7.0×10^<-3>

mol/l付近に第二CMCを示すことを認め,これらは重合体セグメント間の分子内相互作用による分子内ミセル形成と,そのミセル間の分子間相互作用に由来するものと推定した.またこの重合体ミセルはUANaのミセルよりかなり強い疎水場を持つことを認めた.この重合体の各種エステル類の加水分解に対する触媒活性を検討し, pH一定の条件下では重合体が極く低い濃度で反応を加速することを見出した.これは一般のアニオン系界面活性剤ではみられない特異な現象であり,現在さらに検討を続けている.本研究ではミセルを形成している状態での、UV光照射による両親媒性化合物の重合と得られた重合体の諸特性を検討している。本年度は主として、末端に二重結合を持つ新しい長鎖脂肪酸ナトリウム類の合成とそれらの重合を試みた。まず、金属リチウムをテトラヒドロフラン中でアリルフェニルエーテルと反応させてアリルリチウムを合成し、これを6-ブロモヘキサン酸エチルと反応させ、ついでこれをアルカリ加水分解することによって8-1ネン酸ナトリウムを合成した。次にアリルリチウムをヨウ化第1銅と反応させてジアリル銅リチウムを合成し、これをソルビン酸エチルと反応させ、ついでアルカリ加水分解することにより5-メチル-3、7-オクタジェン酸ナトリウムを合成した。この2種の脂肪酸ナトリウムの水溶液の電導度を測定し、それらの濃度に対するプロットの折れ点から、それぞれの第1および第2CMCを8-1ネン酸ナトリウムについては0.08および0.22mol/l、5-メチル-3、7-オクタジェン酸ナトリウムについては0.10および0.26mol/lと推定した。この2種の脂肪酸ナトリウム水溶液にUV光を照射して重合を行い、重合体の収量およびその重合度を測定した。いずれの脂肪酸ナトリウムについても、低濃度では重合体がほとんど得られないが、それぞれの第1CMC以上の濃度では、濃度の増加に従って重合体収量が著しく増大する傾向が認められた。これらの収量は10-ウンデセン酸ナトリウムの重合の場合に比べるとはるかに少なかった。また、得られた重合体の重合度は8-1ネン酸ナトリウムについては約8、5-メチル-3、7-オクタジェン酸ナトリウムでは約6であった。これらの値は10-ウンデセン酸ナトリウムの重合体の重合度約12よりかなり小さい。このような低い収量および小さい重合度は今回合成した脂肪酸ナトリウムの脂肪族鎖が短かいことに由来すると推定される。本研究ではミセルを形成している状態での、UV光照射による両親媒性化合物の重合と、得られた重合体の諸特性を検討している。本年度は主として末端に二重結合を持つ13-テトラデセン酸ナトリウム(TANa)の合成とその重合特性、およびスルホン化ポリウンデセン酸(SP-UANa)の触媒活性を検討した。(1)アリルリチウムを10-ブロモウンデカン酸エチルと反応させて13-テトラデセン酸エチルを合成し、これをケン化することによりTANaを得た。TANa水溶液の電導度の濃度に対するプロットでは0.021および0.066mol/l付近に折れ点が認められ、これらの濃度をそれぞれプリCMCおよびCMCと推定した。UV光照射下のTANaの重合では、プリCMC以下の濃度では重合体が得られず、それ以上の濃度で得られる重合体の収量はTANa濃度の増加に従って徐々に増加し、さらにCMC以上の濃度では急速に増加することを認めた。これはミセルの形成によって重合が促進される結果と考えられる。得られた重合体の重合度は、重合系中のTANa濃度にほとんど関係なく、20±4であり、この値は浸透圧測定デ-タのコンピュ-タ解析により得られたTANaミセルの会合度の推定値とほぼ一致した。
新規頭頸部癌分子標的治療薬セツキシマブに対する耐性機構の解明と克服治療薬の開発

セツキシマブは上皮成長因子受容体(EGFR)を阻害することで腫瘍増殖・転移を抑制するが、実際の臨床において、その治療効果が明確ではない、または無効と考えられる症例にしばしば遭遇する。本研究では、セツキシマブの耐性機構を解明し、耐性克服薬剤を同定することを目的とした。我々が独自に樹立した3種のセツキシマブ耐性細胞株の遺伝子解析により、PLAURをセツキシマブ耐性の標的遺伝子として同定した。PLAURの発現亢進に続くインテグリンβ1シグナル伝達経路を介したセツキシマブの耐性獲得機構が示唆された。さらに、PLAURに対する阻害剤Resveratrolを同定し耐性克服薬剤としての効果を認めた。先行実験で、親株(Sa3, SAS, HSC-3)から誘導して既に独自に樹立したセツキシマブに対する3組の感受性細胞株と耐性細胞株を用いてその耐性メカニズムを検討し、耐性克服薬を開発することを目的としている。まず、3組(親株と耐性株)の各組み合わせにおける遺伝子発現状態をマイクロアレイにより網羅的に解析した。マイクロアレイ解析において、耐性細胞株中において感受性細胞株中よりも発現増強または減弱している遺伝子を耐性候補遺伝子として検索同定した。マイクロアレイにおいて検索同定した候補遺伝子について、real time PCR法を用いて各細胞株におけるmRNAレベルでの発現状態を調べ、マイクロアレイの結果との相同性を確認した。さらに、マイクロアレイ解析の結果とreal time PCR法の結果の両方において、発現傾向が一致している遺伝子に関して、絞り込みを行った。どちらの解析法においても3組全てにおいて共通に発現亢進している遺伝子として、発現が強いものから、LEPROT、PHF15、PLAUR、MORN4、DDRGK4、ARRDC4、CD44、HLA-A、LAMC2の9種類の遺伝子を選択した。また、マイクロアレイ解析において3組全てで発現亢進しているが、real time PCR法においては2組だけで発現亢進した遺伝子として、発現が強いものからTXNIP、NEDD9、OSMIR、NEAT1、MPRIPの4種類を選択した。さらに、これらの遺伝子群に関する絞り大身を機能の面から行った。具体的には、遺伝子パスウェイ解析を行い細胞増殖、アポトーシスに関与する4遺伝子(PLAUR、ARRDC4、TXNIP、OSMIR)について着目した。その中でも、EGFRとの関連性が報告されているPLAURを耐性第一候補遺伝子とした。今後、shRNAを導入し安定細胞株を樹立した後、セツキシマブに対する薬剤耐性がどのように変化しているかをin vitroでMTS assay等により評価していく。本年度に予定していた研究計画には十分到達することができた。またこれまでの研究成果は次年度以降の研究計画に大きく寄与できる内容であり、本年度の実績としては順調に進展しているものと考えている。本研究は、頭頸部癌で唯一保険収載された分子標的薬であるセツキシマブに対する耐性機構を解明し、その耐性メカニズムの阻害薬を同定してセツキシマブの耐性を克服することを目的とする。本年度、既に独自に樹立したセツキシマブに対する3種類の感受性細胞株と、それを親株として樹立した3種類の耐性細胞株を用いて比較検討を行い、耐性克服薬を同定する計画であり、以下のように実施した。まず、セツキシマブに対する3種類の感受性細胞株と耐性細胞株の組み合わせを用いてマイクロアレイ解析を行い、感受性株に対して耐性株において特徴的な発現状態を示す遺伝子を検索した。これらの耐性株で特異的発現を示す遺伝子のうち、遺伝子パスウェイ解析を用いて遺伝子ネットワークを構築する遺伝子を絞り込んだ。その結果からEGFRとの関連性が報告されているPLAUR遺伝子を耐性第一候補遺伝子として同定した。次に、同定したPLAUR遺伝子のshRNAを3種類の耐性細胞株に導入し、形質転換細胞株3種類を樹立した。それらの形質転換細部株における形質転換の程度の評価をreal time PCR法とWestern Blotting法で行い、形質転換細胞株の樹立を確認した。また、この形質転換細胞株におけるセツキシマブの薬剤耐性がどのように変化しているのかをMTS assayで評価を行ったところ、耐性株と比較して形質転換細胞株ではセツキシマブ感受性の優位な改善が認められた。さらに、文献検索、遺伝子パスウエイ解析ソフトなどを用いて詳細に検討し、耐性メカニズムの阻害薬を検索同定することができた。来年度は、本年度樹立させた形質転換細胞をマウスに移植して、セツキシマブに対する薬剤耐性の変化をin vivoにおいて評価を行う。さらに、マウス移植耐性癌細胞に対して、検索同定した候補薬剤が耐性を克服することができることをin vivoにおいて確認する。本年度に予定していた研究計画には概ね到達することができた。

本年度に同定した耐性候補遺伝子のshRNA導入を行い、耐性株において安定的な発現抑制株を樹立し、その性質(薬剤耐性の変化)を解析していく。上記に記載した候補遺伝子以外についても引き続き検索・解析を進めていく。いずれも当研究室において蓄積されたデータや、行われてきた実験手法を用いるものであり、スムーズに研究を進めていくことができると考える。初年度に同定した耐性候補遺伝子のshRNA導入を行い、安定的な発現抑制株を樹立することができた。また、この発現抑制株のセツキシマブに対する薬剤耐性の変化をin vitroでMTS assayで評価したところ、セツキシマブ耐性の改善が認められた。さらにセツキシマブ耐性メカニズムの阻害薬剤を同定することができたため、今後はこの候補薬剤を用いてマウス移植耐性癌細胞に対してin vivoで耐性を克服することができるのかを評価していく。医歯薬学
継続的な運動がストレス時の脳内神経活動に及ぼす影響

本研究では、雄ラットを用いて、自発走運動を継続的に行うことにより、拘束ストレスにより誘発される循環反応が減弱するか否かを検討すると伴に、脳内の神経活動の指標として用いられている免疫組織化学法によるFos蛋白の発現の程度を指標に、拘束ストレス時の視床下部室傍核の神経活動に、継続的な自発走運動がどのような影響を及ぼすかを検討した(実験1)。また、脳内オピオイド系が、継続的な自発走運動による拘束ストレス時の循環反応の軽減効果に関与しているのではないかという仮説をたて、この仮説についても、オピオイド受容体拮抗薬であるナロキソンを投与することにより検証を試みた(実験2)。その結果、実験1では、拘束ストレス負荷による血圧の上昇は、コントロール群に比べて自発走運動群で有意に少なく(p<0.05)、同様の傾向は、実験2においても認められた。実験1では、拘束ストレス負荷後に視床下部室傍核で認められたFos蛋白陽性細胞数も、コントロール群に比べて自発走運動群で少なかったが、この差は統計的に有意なものとはならなかった(p=0.069)。したがって、自発走運動を継続的に行うことにより、拘束ストレス負荷による昇圧反応は減弱することが示唆されたが、これに伴って視床下部室傍核の神経活動も低下するかどうかという点は必ずしも明かとはならなかった。実験2では、拘束ストレス負荷時、自発走運動群とコントロール群のいずれにおいても、生理食塩水投与時に比べて、ナロキソン投与時の方が循環反応はやや減弱する傾向を示し、両群の間でナロキソン投与による循環反応の変化に違いは認められなかった。したがって、少なくとも、自発走運動群において、拘束ストレス負荷による血圧の上昇が、ナロキソン投与により増強するという結果、すなわち、自発走運動群では、オピオイド系を介してストレス負荷中の循環反応が抑制されているという結果は得られなかった。本研究では、継続的な自発走運動が、運動とは異なるストレスを負荷した時の循環反応ならびに脳内神経活動にどのような影響を及ぼすかという点について検討した。脳内の神経細胞の活動性の程度は、各脳部位でのc-fosの発現の程度を指標に評価を試みた。実験には5週齢のラットを用い、自発走運動群(5匹)と対照群(5匹)の2群に分けた。自発走運動群のラットは回転車付きケージで、対照群のラットは通常のケージでそれぞれ11週間飼育し、両群の一部のラット(各群3匹)には、飼育6週目にそれぞれ血圧測定用の送信器を植え込む手術を行なった。自発走運動群の11週間の平均走行距離は、3246±1291m/日であり、飼育期間終了時の体重は、自発走運動群の方が対照群より少なかった(運動群:467±44g、対照群:514±44g)。飼育期間終了後に、金網でできた固定器の中に、両群のラットを1時間入れる拘束ストレスを負荷した。一部のラットについては、その際の血圧、心拍数の変化をテレメトリーシステムを用いて無麻酔、無拘束の状態で測定した。その結果、拘束ストレスを負荷した時の心拍数の増加反応は、自発走運動群の方が対照群より少ない傾向を示した(30分目:運動群412±64拍/分、対照群463±25拍/分、60分目:運動群376±84拍/分、対照群402±14拍/分)。ストレス負荷終了

60分後に、両群のラットの脳を潅流固定し、固定した脳を用いて脳切片を作成し、浮遊法によるc-fos抗体を用いた免疫組織化学的染色に供し、各脳部位でのc-fosの発現を同定した。視床下部室傍核では、c-fosの発現が認められたが、自発走運動群と対照群との間で発現の程度に差が認められるかどうかの詳細は、現在検討中である。また、他の脳部位(延髄の孤束核、腹外側核など)のc-fosの発現についても現在検討中である。本研究では、継続的な自発走運動が、運動とは異なるストレスを負荷した時の循環反応ならびに脳内神経活動に及ぼす影響について検討した。また、継続的な運動によるストレス負荷時の循環反応ならぴに脳内神経活動の変化に、脳内オピオイド系が関与するか否かについて検討を試みた。脳内の神経活動の程度は、各脳部位でのc-fosの発現を指標に評価を試みた。実験には5週齢のラットを用い、自発走運動群(3匹)と対照群(3匹)の2群に分けた。自発走運動群のラットは回転車付きケージで、対照群のラットは通常のケージでそれぞれ12週間飼育した。両群のラットには、飼育6週目に血圧測定用の送信器を、12週目に薬物注入用の静脈内カテーテルを植え込む手術を行なった。飼育期間終了後に、金網でできた固定器の中に、両群のラットを1時間入れる拘束ストレスを日を変えて2回負荷した。ストレス負荷直前および負荷中に生理食塩水あるいはオピオイド受容体拮抗薬であるナロキソン(負荷直前:10mg/kg投与、負荷中:20mg/kg/時間の持続注入)を投与し、ストレス負荷による血圧、心拍数の変化を無線式テレメトリーシステムを用いて測定した。その結果、生理食塩水を投与して拘束ストレスを負荷した時の血圧の上昇は、自発走運動群の方が対照群より少ない傾向を示した(5分目:運動群118±7、対照群127±15、30分目:運動群106±7拍/分、対照群119±11、60分目:運動群106±8、対照群115±10mmHg)。しかし、ストレス負荷時の昇圧反応が自発走運動群で少ない傾向は、ナロキソンを投与した場合でも認められ、両群ともナロキソン投与による影響は認められなかった。この点については、例数を増やしてさらに検討していく予定である。ストレス負荷終了60分後(ナロキソン投与時)における両群のラットの各脳部位でのc-fosの発現については、現在検討中である。
中国の慢性ヒ素中毒患者の生体内NO産生低下と酸化ストレスを改善するための介入研究

東アジア地域における井戸水を介した慢性ヒ素中毒は広範であり、その暴露人口は3,000万人を超える。我々は中国内モンゴル自治区の慢性ヒ素汚染地域における断面調査において、高濃度のヒ素を含む井戸水を10年以上飲水した住民の生体内一酸化窒素(NO)の産生量は対照群(平均値のヒ素濃度は0.02ppm)の約半分まで低下していることを明らかにした。そこで、中国の環境基準値(0.05ppm)以下の井戸水を1年間慢性ヒ素中毒患者に飲水させることで、低下した生体内NO産生畳は改善されるか否かを調べた。研究対象者は内モンゴル自治区包頭市の慢性ヒ素汚染地域に住む男性24名および女性30名。ヒ素の暴露期間はおよそ10年。このヒ素暴露群が使用した井戸水中平均ヒ素濃度は0.18ppmであった。環境基準値以下(0.038ppm)のヒ素を含む井戸水を1年間供給した結果、生体内ヒ素濃度は介入前に比べて顕著に減少し、尿中cGMP濃度で評価した生体内NO産生量は約2倍近くまで増加した。興味深いことに、慢性ヒ素暴露で生じた末梢血管障害も著しく改善された。(介入前男性、41.5mmHg;介入後男性、26.0mmHg;介入前女性、28.6mmHg;介入後女性、22.6mmHg)。以上より、慢性的なヒ素摂取で見られる中毒症状のひとつである生体内NO産生低下とそれに起因する末梢血管障害は、井戸水改水により改善されることを初めて明らかにした。2003年8月に中国沈陽の中国医科大にて当該公衆衛生院の研究グループと研究打ち合わせを行い、まず内モンゴル自治区包頭市の飲水型慢性ヒ素汚染地域の村で予備調査を実施した。しかし、調査した殆どの村では高濃度のヒ素を含んだ井戸は閉鎖されて改水されていた。つぎに、2003年11月に山西省飲水型慢性ヒ素汚染地域の村で予備調査した。当該衛生局との打ち合わせ、宿舎および機材運搬のための車の確保、調査に必要な液体窒素等の供給先の確認、調査対象者の母集団の確認、各家庭が飲水に使用している井戸水の採取、フィールド調査に必要な機材の確保等行った。井戸水中ヒ素濃度は簡便キットで半定量的に検討した。その結果、対象とする村の住民は高濃度のヒ素を含む井戸を使用していることが判明した。しかし、曝露期間は約5年程であり、内モンゴル自治区で観察されるような角化症は認められなかった。このことはヒ素の曝露時間と角化症発症との関連性を示唆している。つぎに、中国医科大学公衆衛生院長・孫貴範教授は対象住民に対して本介入研究の意義と予想される成果を説明した。ビタミン剤の服用に関しては、対照地域住民に対してビタミン剤の効果、使用目的、服用方法等を解説した。これらより、対象住民に本研究実施の了解を得た後、対象者150名程度に対して問診を行った。また、ビタミン剤を対象住民が摂取しているか否かのチェックを村の代表者に委ねることにした。本年度になって中国内モンゴル自治区包頭市の慢性ヒ素汚染地域の村では、井戸水の改水作業がなされたため、当初予定していた介入研究が出来ない状況に至った。そこで、2004年10月に井戸水改水が普及していない山西省山陰県でのフィールド調査を再度試みた。当該県には36村が存在するが35村で調査した。調査対象の人口は9,656人でそのうち1,561人において慢性ヒ素中毒症状が認められた。調査した井戸の数は3079個。採取した井戸水を中国医科大学・公衆衛生院において還元気化原子吸光法でヒ素濃度を測定した。

その結果、1612個の井戸が中国の環境基準値(0.05PPm)を上回るヒ素が検出された。調査した村の中で特に15A村と17A村に注目して詳しく調査を行った。15A村では人口1,233人中677人を対象とした。環境基準値を上回るヒ素濃度の井戸は181個中179個存在した。しかし、慢性ヒ素中毒症状は112名と全体の16.5%だった。また、0.1-0.5ppmのヒ素濃度を示す井戸は177個存在した。一方、17A村では人口1,684人中997人を対象とした。環境基準値を上回るヒ素濃度の井戸は327個中318個存在した。慢性ヒ素中毒症状は246名と全体の24.7%だった。また、0.1-0.5ppmのヒ素濃度を示す井戸は313個存在した。以上より、今回調査対象とした村では環境基準値を越えるヒ素濃度を示す井戸が全体の殆どであるのに対して、慢性ヒ素中毒症状は低頻度であることが示唆された。東アジア地域における井戸水を介した慢性ヒ素中毒は広範であり、その曝露人口は3,000万人を超える。我々は中国内モンゴル自治区の慢性ヒ素汚染地域における断面調査において、高濃度のヒ素を含む井戸水を10年以上飲水した住民の生体内一酸化窒素(NO)の産生量は対照群(平均値のヒ素濃度は0.02ppm)の約半分まで低下していることを明らかにした。そこで、中国の環境基準値(0.05ppm)以下の井戸水を1年間慢性ヒ素中毒患者に飲水させることで、低下した生体内NO産生量は改善されるか否かを調べた。研究対象者は内モンゴル自治区包頭市の慢性ヒ素汚染地域に住む男性24名および女性30名。ヒ素の曝露期間はおよそ10年。このヒ素曝露群が使用した井戸水中平均ヒ素濃度は0.18ppmであった。環境基準値以下(0.038ppm)のヒ素を含む井戸水を1年間供給した結果、生体内ヒ素濃度は介入前に比べて顕著に減少し、尿中cGMP濃度で評価した生体内NO産生量は約2倍近くまで増加した。興味深いことに、慢性ヒ素曝露で生じた末梢血管障害も著しく改善された(介入前男性、41.5mmHg;介入後男性、26.0mmHg;介入前女性、28.6mmHg;介入後女性、22.6mmHg)。以上より、慢性的なヒ素摂取で見られる中毒症状のひとつである生体内NO産生低下とそれに起因する末梢血管障害は、井戸水改水により改善されることを初めて明らかにした。
近傍活動銀河核の可視・赤外線同時モニター観測によるダストトーラスの構造の解明

当初の研究計画では活動銀河核のダストからの放射を観測する近赤外線カメラとして国立天文台で開発した広視野赤外線カメラPICNICを用いる予定であったが、同カメラが科研費申請後の1999年3月に故障し復旧の見込みが立たなくなったため、代わりに申請者が携わっている東京大学ビッグバン国際宇宙センターの口径2mの望遠鏡計画および同架する可視・赤外線多波長カメラを利用して本研究のための近傍活動銀河核の観測を遂行すべく研究計画を変更した。同望遠鏡およびカメラは今年度の夏にファーストライトを行い、その後望遠鏡の各種調整を経て今年度の冬ごろより試験的に数個の近傍活動銀河核について可視・赤外線同時モニター観測を開始した。観測天体は当初本計画で予定していたものではないが、変光のタイムスケールが非常に短いあるいは他の分野での研究が進んでいるなど特徴を持った近傍活動銀河核であり、比較的短い期間で一定の観測成果が得られるだけでなくダストトーラスと活動銀河核中心部の他の構造との関係も議論することができると期待している。観測データは現在解析中である。またCCDの読みだしノイズが大きいままで始まった試験観測であるが、その後の回路の改良により観測への影響が十分小さいレベルにまで落すことができた。そこで今後は当初予定していた天体も含めて観測天体を増やすとともに観測波長も広げ、数ヵ月の観測データを蓄積して反響探査法によりダストトーラス構造について調べる予定である。当初の研究計画では活動銀河核のダストからの放射を観測する近赤外線カメラとして国立天文台で開発した広視野赤外線カメラPICNICを用いる予定であったが、科研費申請後の1999年の3月にPICNICのADボードが故障し復旧の見込みが立たない状況になった。活動銀河核のモニターが可能なほど観測時間を利用できる近赤外線カメラが本研究には必要不可欠なため、代わる手段として申請者が携わっているMAGNUM計画の多波長カメラおよび望遠鏡を利用して本研究のための近傍活動銀河核の観測を遂行すべく研究計画を変更した。近傍活動銀河核の測光において同カメラの視野が狭いのが難点であるが逆にシーイングは当初計画していた国内での観測に比べてはるかに良いため、銀河本体の星の放射成分の差し引きには有利であり標準星を用いた測光によってモニター観測を行なう予定である。そこで本研究の観測目的に合わせるために同計画の多波長カメラの改良を行なった。とくに近傍活動銀河核の放射スペクトルのうち強力な広帯域/狭帯域輝線の影響を避けながら非熱的連続波成分の変光を観測するために、多波長カメラ付属のIバンドフィルタを新しいものに交換して効率を向上させた。試験観測は来年度から開始する予定であり、観測当初に低光度で変動のタイムスケールが短いと思われる近傍活動銀河核のモニター観測を重点的に行ないダストトーラスの構造の解明のためのデータを取得する予定である。
禁煙後に生じる体重増加メカニズムの解析-消化管機能、食欲関連ホルモンからのアプローチ

(1)53症例から同意取得後に登録が得られた。ニコチネルTTSおよびカウンセリングによる禁煙支援を2ヶ月間行った。(2)禁煙支援により31例が2ヶ月間の禁煙治療を完遂し、うち22例が禁煙治療終了2ヶ月後も禁煙を継続し、解析に用いられた。(3)体重増加率は、禁煙開始時と比較し、禁煙治療終了時3.92±0.02%、禁煙治療終了2ヶ月後5.09±0.03%であり、禁煙後に有意に増加した。(n=22,いずれもp<0.001)(4)^<13>C測定による胃排出能は、Tmax値において禁煙前では1.05±0.32hであったが、禁煙治療終了時では0.72±0.64hと有意に禁煙後に短縮された(n=22,p<0.01)。しかし、禁煙治療終了2ヶ月後では1.28±1.69hと延長され、禁煙後の胃排出能亢進は、一過性であった。胃排出能の一時的な亢進が、禁煙後の一時的な体重増加に関与する可能性がある。(5)食欲に関連するホルモンの検討では、食欲抑制に働くレプチンの有意な増加が認められた(禁煙前3.96±3.78ng/ml、禁煙治療終了時5.13±3.78ng/ml、禁煙治療終了2ヶ月後5.90±4.68,n=22,2ヶ月後においてp<0.05)。食欲亢進に働くグレリンは有意な変化は認められなかった(禁煙前11.29±8.39ng/ml、禁煙治療終了時11.57±9.17ng/ml、禁煙治療終了2ヶ月後9.79±5.25,n=22)。レプチンの増加は体重増加に伴う二次的な増加の可能性がある。1.研究の目的喫煙者において禁煙前後の消化管機能、食欲関連ホルモンの各ホルモンの各パラメーターの変化を前向きに検討することで禁煙後の体重増加のメカニズムの理解に近づく。2.研究実績(1)平成17年7月11日付けの長崎大学医学部歯学部附属病院臨床研究倫理委員会にて承認され研究を開始した。(2)平成18年3月9日までに14症例(男性7例、女性7例)から同意取得後に登録が得られた。彼らに対して依存度テスト、呼気CO濃度測定により喫煙状況を把握後、ニコチネルTTSおよびカウンセリングによる禁煙支援を行った。(3)禁煙支援により3例が成功、5例が失敗、6例が治療継続中である。3例の禁煙成功者のうち2例で禁煙後に数Kgの体重増加が認められた。(4)喫煙者13例において胃排出能を呼気中の^<13>Cの測定により算出した。Tmax値は58.5±19.5分(n=13)であった。これは我々らの機能性ディスペプシアと健常人を比較した他の研究における健常人コントロール(喫煙者、非喫煙者を含む)57.9±3.6分(n=19)とほぼ同様の値であり、機能性ディスペプシア患者では75.6±4.7分(n=16)であり有意に短かった。(5)全例より今後の血漿グレリン、血清レプチン、各種サイトカイン測定のための検体を採取し、測定まで凍結保存した。3.今後の計画(1)症例の蓄積(2)各種食欲関連ホルモン値の測定

(3)禁煙前後での各種パラメーターの比較検討1.研究の目的喫煙者において禁煙前後の消化管機能、食欲関連ホルモンの各ホルモンの各パラメーターの変化を前向きに検討することで禁煙後の体重増加のメカニズムの理解に近づく。2.研究実績(1)平成19年3月5日までに42症例(男性31例、女性11例)から同意取得後に登録が得られた。彼らに対して依存度テスト、呼気CO濃度測定により喫煙状況を把握後、ニコチネルTTSおよびカウンセリングによる禁煙支援を行った。(2)禁煙支援により26例が成功、11例が失敗、5例が治療継続中である。26例の禁煙成功者について解析した。(3)禁煙前の平均体重は、67.7±14.9kg、後は69.4±14.8kgであり、禁煙2ヶ月間で有意に体重増加が認められた(n=26,P<0.01)。同様に腹囲も禁煙前86.6±10.7cm、禁煙2ヶ月後88.2±10.1cmと増加傾向が認められた(n=23,p=0.05)。(4)^<13>C測定による胃排出能は、禁煙前のTmax値は57.4±23.1分であり、禁煙2ヶ月後では49.1±17.0分と有意に禁煙後に短縮された(n=26,p<0.05)。禁煙により胃運動が亢進することが示され、禁煙後の体重増加への関与が示唆された。(5)食欲に関連するホルモンの検討では、食欲抑制に働くレプチンの有意な増加が認められた(禁煙前5.2±3.6ng/ml、禁煙後6.5±4.2ng/ml,n=26,p<0.05)。食欲亢進に働くグレリンも増加傾向が認められたが、有意差は認められなかった(禁煙前7.1±5.7ng/ml、禁煙後9.1±7.4ng/ml, n=14, p=0.21)。レプチンの増加は体重増加に伴う二次的な増加の可能性がある。3.今後の計画(1)症例の蓄積と長期経過例の追跡(2)学会発表及び論文作成研究実績(1)53症例から同意取得後に登録が得られた。ニコチネルTTSおよびカウンセリングによる禁煙支援を2ケ月間行った。(2)禁煙支援により31例が2ヶ月間の禁煙治療を完遂し、うち22例が禁煙治療終了2ヶ月後も禁煙を継続し、解析に用いられた。(3)体重増加率は、禁煙開始時と比較し、禁煙治療終了時3.92±0.02%、禁煙治療終了2ヶ月後5.09±0.03%であり、禁煙後に有意に増加した。(n=22、いずれもp<0.001)(4)^<13>C測定による胃排出能は、Tmax値において禁煙前では1.05±0.32hであったが、禁煙治療終了時では0.72±0.64hと有意に禁煙後に短縮された(n=22、p<0.01)。しかし、禁煙治療終了2ヶ月後では1.28±1.69hと延長され、禁煙後の胃排出能充進は、一過性であった。胃排出能の一時的な亢進が、禁煙後の一時的な体重増加に関与する可能性がある。(5)食欲に関連するホルモンの検討では、食欲抑制に働くレプチンの有意な増加が認められた(禁煙前3.96±3.78ng/ml、禁煙治療終了時5.13±3.78ng/ml、禁煙治療終了2ヶ月後5.90±4.68、n=22,2ヶ月後においてp<0.05)。食欲亢進に働くグレリンは有意な変化は認められなかった(禁煙前11.29±8.39ng/ml、禁煙治療終了時11.57±9.17ng/ml、禁煙治療終了2ヶ月後9.79±5.25、n=22)。
津波による大規模土砂移動の解析と評価方法の開発

土砂の移動量を浮遊砂と掃流砂に分けて求めて計算を一様勾配斜面において基礎検討を実施し,この中で使用されている重要なパラメータとして流体中(海水中)の最大土砂濃度(Cs)や巻き上げに関する鉛直拡散係数がある.鉛直拡散係数は浅井・高橋(1998)による実験結果を引用することもでき,また,応答解析の結果でも範囲(0.0010.2)では,海底の変化は小さいことがわかった.一方,最大土砂濃度(Cs)による堆積量の違いは大きいことが判明した.これは,海水中に存在し得る土砂濃度(Cs)が大きいほど浮遊砂量が増大し,一旦巻き上げられた土砂が流れにより移動し易くなり,特に陸上部への堆積に寄与することが判明した.このCs値は,土砂の沈降と土砂を浮遊させる能力(乱流)に大きく関係していると考えられ,これに関する研究があるが室内実験に留まっているために,本ケースのような実際の現場で,しかもシールズ数がかなり大きいと思われる状態に適用することはできない.次に実際に,固定床での入射波条件を用いて,入間での移動床計算を実施した.全体的に海域で侵食傾向,陸側で堆積傾向であることが分かった.これは,押し波で入射した津波が,湾口の狭いしかも両側が切り立った入間湾に入ると,急縮の効果により流速値を増加させ,そこでの巻き上げ量を大きくして,陸上に運んだものと思われる.入間湾の地形は,今回の大規模堆積の原因の1つである.一方,Cs値の変化により地形が大きく変化していることも事実である.ただし,陸上部での堆積状態はほぼ同じである.現地調査で得られた70万m^3付近の堆積量を再現できたのは,0.3の時であった.従って,この程度の最大土砂濃度を仮定すれば大規模土砂移動をある程度再現できることがわかった.土砂の移動量を浮遊砂と掃流砂に分けて求めて計算を一様勾配斜面において基礎検討を実施し,この中で使用されている重要なパラメータとして流体中(海水中)の最大土砂濃度(Cs)や巻き上げに関する鉛直拡散係数がある.鉛直拡散係数は浅井・高橋(1998)による実験結果を引用することもでき,また,応答解析の結果でも範囲(0.0010.2)では,海底の変化は小さいことがわかった.一方,最大土砂濃度(Cs)による堆積量の違いは大きいことが判明した.これは,海水中に存在し得る土砂濃度(Cs)が大きいほど浮遊砂量が増大し,一旦巻き上げられた土砂が流れにより移動し易くなり,特に陸上部への堆積に寄与することが判明した.このCs値は,土砂の沈降と土砂を浮遊させる能力(乱流)に大きく関係していると考えられ,これに関する研究があるが室内実験に留まっているために,本ケースのような実際の現場で,しかもシールズ数がかなり大きいと思われる状態に適用することはできない.次に実際に,固定床での入射波条件を用いて,入間での移動床計算を実施した.全体的に海域で侵食傾向,陸側で堆積傾向であることが分かった.これは,押し波で入射した津波が,湾口の狭いしかも両側が切り立った入間湾に入ると,急縮の効果により流速値を増加させ,そこでの巻き上げ量を大きくして,陸上に運んだものと思われる.入間湾の地形は,今回の大規模堆積の原因の1つである.一方,Cs値の変化により地形が大きく変化していることも事実である.ただし,陸上部での堆積状態はほぼ同じである.現地調査で得られた70万m^3付近の堆積量を再現できたのは,0.3の時であった.従って,この程度の最大土砂濃度を仮定すれば大規模土砂移動をある程度再現できることがわかった.本研究の目的である「津波による大規模土砂移動の推定方法の確立」のためには、実現象を把握することは不可欠である。したがって、本年度は、以下に示す2種類の水理実験と現地調査を行った。(1)津波による底面せん断力に関する水理実験(2)土砂移動開始条件に関する水理実験(3)伊豆入間における津波堆積物の現地調査(1)土砂移動に直接関係している現象として、津波境界層がある。従来、波動境界層は、水深に比較して極めて薄いと考えられ、定常的な扱いがなされてきた。しかし、津波が浅海域に来襲した場合に発生する波動境界層は、準定常的な流れ場になることが予想される。そこで、通常の波動境界層から準定常状態の境界層までを発生させることのできるU字管振動流装置を用いて水理実験を行った。これから、遷移過程が明瞭に示され、また、波動抵抗則と準定常抵抗則と使い分けるための判定基準が得られた。(2)従来、津波による土砂移動を算出する場合に用いられている流砂量公式は、河川流などを対象としたものであった。しかし、河川流に比較し、津波による流れでは、より大きな掃流力が生じる。そこで、津波を想定した大掃流力を発生させることのできる一次元水路を用いて水理実験を行った。これから、大掃流力下での土砂移動が定性的に観測され、また津波を対象とした流砂量公式が得られた。(3)1854年安政東海地震津波において、伊豆半島西海岸では平均的に46mの遡上高であるのに対し、入間では13m以上を記録している。この時、大量の土砂移動の生じたことが報告されている。そこで、地質学的に現地調査を行った。

これから、当時の砂層が確認でき、次年度の詳細調査のための場所が決定できた。津波による土砂移動を解析するためには、掃流力を発生させる底面境界層および掃流力による流砂現象の把握が不可欠である。本研究では、それぞれについて、以下の成果を得た。1.底面境界層従来は正弦振動流を仮定して境界層の研究を行ってきたが、津波来襲時には強い非線形性を示すため、クノイド波理論を用いた解析を行う必要がある。そこで、非線形波動による底面境界層を模擬する非対称振動流を発生させるための新しい手法を提案した。これにより、従来良く用いられているサーボモータによりピストンの運動を制御する手法に比べて、簡便かつ安価に装置を開発できるようになった。理論解析の結果、この手法による流速波形は広い範囲でクノイド波理論による厳密解に一致することを確認した。また、実際の装置の設計が簡単に行なえるように、波浪特性が与えられた時に装置の緒言を決定するための式を導出した。さらに、ここに示した手法が、浅水域での前傾化した波動下の底面境界層実験にも用いることが出来ることを示し、装置の緒言を決定するための図を得た。2.流砂現象津波を想定した大きな外力を発生させるための実験装置を開発した。実験では、掃流形態と浮遊形態で運搬される砂粒を独立に測定し、掃流砂量および浮遊層への巻き上げ砂量と掃流力の関係を求めた。実験結果を基に、津波を対象とした土砂移動モデルを構築した。モデルは、掃流層と浮遊層から構成され、両層の交換砂量が新たに導入されている。従来の局所フラックスおよび平衡浮遊砂濃度を仮定したモデルでは、津波来襲時の浮遊砂が卓越し、非定常性の強い土砂移動やそれに伴う海底変動を説明することができなかった。しかし、提案モデルでは、底面から巻き上げ砂を考慮し、浮遊砂濃度の平衡を前提としていないため、再現性が向上している。土砂の移動量を浮遊砂と掃流砂に分けて求めて計算を一様勾配斜面において基礎検討を実施し,この中で使用されている重要なパラメータとして流体中(海水中)の最大土砂濃度(Cs)や巻き上げに関する鉛直拡散係数がある.鉛直拡散係数は浅井・高橋(1998)による実験結果を引用することもでき,また,応答解析の結果でも範囲(0.0010.2)では,海底の変化は小さいことがわかった.一方,最大土砂濃度(Cs)による堆積量の違いは大きいことが判明した.これは,海水中に存在し得る土砂濃度(Cs)が大きいほど浮遊砂量が増大し,一旦巻き上げられた土砂が流れにより移動し易くなり,特に陸上部への堆積に寄与することが判明した.このCs値は,土砂の沈降と土砂を浮遊させる能力(乱流)に大きく関係していると考えられ,これに関する研究があるが室内実験に留まっているために,本ケースのような実際の現場で,しかもシールズ数がかなり大きいと思われる状態に適用することはできない.次に実際に,固定床での入射波条件を用いて,入間での移動床計算を実施した.全体的に海域で侵食傾向,陸側で堆積傾向であることが分かった.これは,押し波で入射した津波が,湾口の狭いしかも両側が切り立った入間湾に入ると,急縮の効果&はり流速値を増加させ,そこでの巻き上げ量を大きくして,陸上に運んだものと思われる.入間湾の地形は,今回の大規模堆積の屏因の1つである.一方,Cs値の変化により地形が大きく変化していることも事実である.ただし,陸上部での堆積状態はほぼ同じである.現地調査で得られた70万m^3付近の堆積量を再現できたのは,0.3の時であった.従って,この程度の最大土砂濃度を仮定すれば大規模土砂移動をある程度再現できることがわかった.
プロテアソーム・ユビキチン・システムの免疫遺伝学的研究

1)IFN-γで発現が誘導される3個の20Sプロテアソーム・サブユニット遺伝子は、クラスI分子による抗原提示システムが誕生した際に、構成的に発現されるサブユニット遺伝子から遺伝子重複によって形成されたものであることを明らかにした。さらに、1)この重複は個々の遺伝子の重複ではなく、MHC領域を巻き込んだ少なくとも2回の染色体重複の一環として起きたものであること、2)上記の重複は脊椎動物進化の初期段階、具体的には有顎脊椎動物の共通祖先が出現するまでに起きたものであり、HMCの誕生に不可欠な役割を果たしたと考えられることを明らかにした。これら一連の研究に基づき、MHCのゲノム構造を理論的に説明する「HMCの染色体重複モデル」を提唱した。2)IFN-γによって制御されるプロテアソーム・サブユニット遺伝子群を129/SvJマウスから系統的にクローニングし、遺伝子構造と染色体局在を決定し、発現制御機構を解析した。具体的には、IFN-γによって発現が制御されることが知られている9個の遺伝子中、6個の遺伝子(20Sブロテアソーム・サブユニヅトMECL1、Z、XをコードするPsmb10、Psmb7、Psmb5遺伝子、およびプロテアソーム・アクチベータPA28α、PA28β、PA28γサブユニットをコードするPsme1、Psme2、Psme3遺伝子)の解析を行った。Psme1、Psme2、Psme3遺伝子については、共同研究としてknock outマウスを用いた機能解析を行ない、Psme1、Psme2遺伝子はある種の抗原の提示に不可欠であること、他方Psme3遺伝子は抗原提示に関与している可能性は低いことなどを明らかにした。IFN-γ誘導性のプロテアソーム・アクチベーターPA28複合体は20Sプロテアソームのペプチダーゼ活性を増強することにより,MHCクラスI分子による抗原提示を促進することが知られている.本研究では,IFN-γによって発現制御されるプロテアソーム・アクチベーター遺伝子群を129/SvJマウスからクローニングし,その構造・発現制御機構・染色体局在を決定した.その結果,IFN-γ誘導性のPA28複合体をコードするPA28α,βサブユニット遺伝子は第14染色体上に6kb離れて存在することを見い出した.さらに,PA28α,βサブユニット遺伝子間のスペーサー領域をシークエンスすることにより,PA28αサブユニット遺伝子とoverlapしてCGI-112と命名された高度に保存された遺伝子が存在することを見い出した.興味深いことに,CGI-112とPA28α遺伝子は3'-endを向き合うようにして,ヒトでは5塩基,マウスでは6塩基,その3'非翻訳領域が重なっている.また,東京都臨床医学総合研究所・田中啓二・部長との共同研究で,プロテアソーム・アクチベーターPA28γを欠損したマウスを作製した.PA28γ欠損マウスの免疫系には特別な異常は認められなかったが,発育遅延や細胞容積の増大が認められた.以上から,PA28γは抗原提示においてよりは,細胞の増殖を制御するうえで重要な役割を担っているものと推定された.IFN-γ誘導性のプロテアソーム・アクチベーターPA28複合体は20Sプロテアソームのペプチダーゼ活性を増強することにより,MHCクラスI分子による抗原提示を促進することが知られている.昨年度は,PA28α,βサブユニットをコードする遺伝子を129/SvJ

マウスからクローニングし,これらの遺伝子が第14染色体上に6kb離れて存在することを示した.本年度は,PA28α,βサブユニット遺伝子を含む35kbの領域をシークエンスすることにより,1)PA28α,βサブユニット遺伝子間には,PA28αサブユニット遺伝子とoverlapしてCgi112と命名された高度に保存された遺伝子が存在すること,2)本領域には,Cg10671-like-Psme1(PA28α)-Cg112-Psme2(PA28β)-Flj10111-Isgf3の順に合計6個の遺伝子が存在すること,3)PA28βサブユニット遺伝子はアミノ酸置換を伴うalternativesplicingをおこなうこと,などをみいだした.また,東京都臨床医学総合研究所・田中啓二・部長の協力を得て,IFN-γ誘導性PA28α,βサブユニットを欠損したマウスを作製した.PA28α,β欠損マウスでは,ATP依存性のタンパク質分解活性の減弱が認められたが,免疫プロテアソームの誘導能やインフルエンザウイルスに対する抵抗性には異常は認められなかった.以上から,IFN-γ誘導性PA28複合体は抗原提示において不可欠の分子ではないと結論された.1)IFN-γで発現が誘導される3個の20Sプロテアソーム・サブユニット遺伝子は、クラスI分子による抗原提示システムが誕生した際に、構成的に発現されるサブユニット遺伝子から遺伝子重複によって形成されたものであることを明らかにした。さらに、1)この重複は個々の遺伝子の重複ではなく、MHC領域を巻き込んだ少なくとも2回の染色体重複の一環として起きたものであること、2)上記の重複は脊椎動物進化の初期段階、具体的には有顎脊椎動物の共通祖先が出現するまでに起きたものであり、MHCの誕生に不可欠な役割を果たしたと考えられることを明らかにした。これら一連の研究に基づき、MHCのゲノム構造を理論的に説明する「MHCの染色体重複モデル」を提唱した。2)IFN-γによって制御されるプロテアソーム・サブユニット遺伝子群を129/SvJマウスから系統的にクローニングし、遺伝子構造と染色体局在を決定し、発現制御機構を解析した。具体的には、IFN-γによって発現が制御されることが知られている9個の遺伝子中、6個の遺伝子(20Sプロテアソーム・サブユニットMECL1、Z、XをコードするPsmb10、Psmb7、Psmb5遺伝子、およびプロテアソーム・アクチベータPA28α、PA28β、PA28γサブユニットをコードするPsme1、Psme2、Psme3遺伝子)の解析を行った。Psmel、Psme2、Psme3遺伝子については、共同研究としてknock outマウスを用いた機能解析を行ない、Psme1、Psme2遺伝子はある種の抗原の提示に不可欠であること、他方Psme3遺伝子は抗原提示に関与している可能性は低いことなどを明らかにした。
ミクログリア活性化制御機構におけるプログラニュリンの役割に関する研究

加齢に伴うPGRNに起因する障害とリソソームの関係を調べるために、10週齢と90週齢の野生型(WT)マウスとPGRN遺伝子欠損(KO)マウスを用いて検討を行った。WTマウス、KOマウス共に加齢に伴うミクログリアの形態的な変化(活性化)が観察された。大脳皮質においてミクログリアマーカーであるIbal陽性の細胞数は群間で差が認められなかったが、ミクログリアマーカーでリソソーム関連タンパク質であるCD68の免疫反応性は90週齢のKOマウスで亢進した。さらに、リソソームマーカーであるLamp1の免疫反応性やリソソーム関連タンパク質の遺伝子発現量も90週齢のKOマウスで亢進した。一方で、アストロサイトのマーカーであるGFAPの免疫反応性も90週齢のKOマウスで亢進した。以上の所見はリソソーム病である神経セロイドリポフスチン症(NCL)のモデルマウスで脆弱性を示す視床の後内/外側腹側核(VPM/VPL)で特に顕著であった。さらにVPM/VPLでは90週齢のKOマウスで生存神経細胞数が減少し、グリア細胞で主要に産生される細胞傷害性因子の発現が亢進していた。また、90週齢のKOマウスではオートファジー・リソソーム分解系で特異的に分解される基質であるp62が神経細胞、グリア細胞で蓄積していた。同時に、TAR-DNA binding protein (TDP)-43の細胞質内蓄積が神経細胞に認められ、p62と共局在していた。一方で、リポフスチンの顕著な蓄積もミクログリアにおいて確認された。その他、90週齢のKOマウスでは大脳皮質の外側部においてNCLの特徴の1つである髄鞘の欠損が認められた。以上のことから、PGRNはリソソームの機能を維持することで、加齢に伴う神経炎症、神経細胞におけるTDP-43の細胞質内蓄積、NCL様の病理に対して抑制的に作用することが示唆された。(抄録なし)(抄録なし)マウスを用いた実験的外傷性脳傷害モデルによりミクログリアの活性化におけるプログラニュリン(PGRN)の役割を大脳皮質において解析した。まず、野生型(WT)マウスを用いた解析により、PGRNは傷害後産生増加し、CD68陽性の活性化ミクログリアを主要な産生源とすることを明らかにした。次にWTマウスとプログラニュリン遺伝子欠損(KO)マウスを用いた解析から、KOマウスではCD68の発現量、酸化ストレスの指標となるカルボニル化タンパク質の蓄積や血管新生の指標となるラミニンの免疫反応性が亢進していた。さらに、KOマウスではCD68陽性のミクログリアを産生源とするTGFβ1の発現が亢進し、その細胞内情報伝達を仲介するSmad3のリン酸化がアストロサイトにおいて亢進していた。CD68はリソソーム関連タンパク質であることから、Lamplを始めとするリソソーム関連タンパク質の発現解析を行ったところ、これらの発現はKOマウスの活性化ミクログリアで上昇していた。加えて、リソソームの発現を調節する転写因子TFEBが核移行した活性化ミクログリアはKOマウスにおいて増加し、逆に、その抑制的な制御を担うmTORC1の活性はKOマウスにおいて低下していた。さらに、PGRNはプロモーター領域にTFEB結合領域をもつこと、Lamp1と共局在することを明らかにした。また、神経細胞の損傷はKOマウスにおいて増加し、その機序へのリソソーム関連タンパク質の関与が示唆された。本研究によって、PGRNはリソソーム生合成やTGFβ1シグナルの制御を介して炎症反応を抑制し、神経保護作用を発揮していることが明らかとなった。PGRNのもつこのような神経保護作用は神経変性疾患を抑制する1つの機序となっていることが考えられた。

一方で、リポフスチンの顕著な蓄積もミクログリアにおいて確認された。その他、90週齢のKOマウスでは大脳皮質の外側部においてNCLの特徴の1つである髄鞘の欠損が認められた。以上のことから、PGRNはリソソームの機能を維持することで、加齢に伴う神経炎症、神経細胞におけるTDP-43の細胞質内蓄積、NCL様の病理に対して抑制的に作用することが示唆された。本研究は活性化ミクログリアのマーカーであるCD68、TGFβ1がプログラニュリン(PGRN)の欠如によって脳傷害後に発現増加することに着目して開始した実験である。現在までの研究によって、ミクログリアにおけるCD68の産生増加は、PGRNの欠如がmTORC1の活性低下を誘起することで、傷害後のリソソーム生合成が増加した結果に起因することを明らかにしている。また、TGFβ1についてもアストロサイトにおいて細胞内情報伝達が促進し、アストログリオーシスの制御に関係していることを示しており、当初の計画以上に進展していると言える。(抄録なし)現在までの研究によって、プログラニュリン(PGRN)の欠如はmTORC1の活性低下を誘起し、TFEBの核移行を促進することで傷害後のミクログリアにおけるリソソーム関連タンパク質の生合成を促進することを示唆している。加えて、PGRNはプロモーター領域にTFEBの結合配列をもつこと、リソソームタンパク質であるLamp1と共局在することから、PGRNはリソソーム関連タンパク質産生時に産生された後、リソソームに局在するmTORC1を活性化を介して、リソソーム関連タンパク質の産生に抑制的に働く(リソソーム生合成における負のフィードバック)可能性がある。この仮説を証明するために、ミクログリアの初代培養系を確立し、ミクログリアの活性化時にPGRNを添加するなどして、PGRNのmTORC1の活性化への役割を明らかにしていく。また、老齢マウスを用いて、上記の機構と加齢との関係を解明する。(抄録なし)
関節リウマチにおけるIL-23/IL-17免疫経路の解析と治療への応用

関節リウマチ滑膜組織にはCD4陽性T細胞が多数存在し病態に関与すると考えられている。実際にT細胞信号伝達を抑制するFK506やT細胞副刺激を抑制するCTLA4Igが臨床の上でヒト関節リウマチに有効である。CD4陽性T細胞は主にIFN-γを産生するTH1およびIL-4を産生するTH2に分化することが知られていたが、近年IL-17を産生するTH17という新たな分画に分化することが明らかになってきた。動物モデルからの知見より、TH17は関節リウマチをはじめとする様々の自己免疫性疾患に関与すると考えられている。一方でヒト関節リウマチなどの自己免疫疾患にてTH17がどの程度関与しているのかは明らかでない。本研究では、関節リウマチ患者および非関節リウマチ患者の整形外科手術時に廃棄される関節液、滑膜組織、骨軟骨組織および血液を患者の同意のもと実験に用いた。患者への説明は、倫理委員会にて承認された説明書に基づいて行った。再生医科学研究所坂口志文教授との共同研究により、マウスTH17細胞がケモカイン受容体であるCCR6を発現することが明らかとなった。本研究ではヒト関節液の解析において、CCR6受容体の唯一のリガンドであるCCL20が関節リウマチの関節液に著明に認められることを明らかにした。また、関節液中のCCL20の発現はIL-17と相関した。これらの事から、関節リウマチにおいてCCL20により関節局所へCCR6陽性Th17細胞が遊走し病態に関与することが示唆された。今回得られた知見を追及することで新たな関節リウマチの治療に応用可能であると考える。CD4陽性T細胞は主にIFN-γを産生するTH1およびIL-4を産生するTH2に分化することが知られていたが、近年IL-17を産生するTH17という新たな分固に分化することが明らかになってきた。まずはじめに、関節リウマチ患者および変形性関節症の関節液および滑膜組織におけるTH17関連サイトカインの発現を測定した。その結果、TH17関連サイトカインの発現が関節リウマチ患者の関節液および滑膜組織にて有意に増加していた。次に、関節リウマチ滑膜組織をSCIDマウスに移植する系を作成した(SCID-HuRAg)。SCID-HuRAgに既存の抗リウマチ薬を投与したところ、非投与群に比較して有意に滑膜組織の炎症の抑制が認められた。現在in vitroやSCID-HuRAgの系にてTH17関連サイトカインの作用を、それらの中和薬等をもちいて機能的に解析している。