hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザー光を用いる遺伝子操作法の開発

5-ヨードデオキシウリジンより各種ビニルウラシル類縁体を良好な収率で合成することに成功した。それらをアミダイト化しDNA合成機を用いて5端末に修飾塩基を含む機能性オリゴ核酸を合成し、3端末にピリミジンを有するオリゴ核酸との光連結反応を行った。鋳型核酸存在下、光照射した後に、電気泳動を行い、連結された核酸を定量した結果、5位にカルボキシビニル基を含むピリミジンを用いると光連結に関する反応性が10倍向上することを見いだした。さらに、これら機能性核酸の合成の簡便化を行うべく、5位にホルミル基を有する核酸の合成を行った。DNA合成機後の固相担体からの切り出し及び脱保護条件において効率よくホルミル基を含むオリゴ核酸を合成し、その後、Wittig反応により効率よく目的とするビニル基の隣にカルボニル基をもつ光連結性核酸の合成に成功した。ビニル基の隣にカルボニル基を有するものだけでなくシアノ基を有するものも本手法により簡便に合成可能である。よって、本反応により共通の合成中間体から目的とする様々な光連結性核酸が容易に合成可能になった。この新しいポスト修飾法により酵素には調整できないようなユニークな構造を有する核酸(枝分かれ核酸・架橋型核酸・環状核酸)を合成することが可能となった。5-ビニルリジンのα-体を端末につけたDNAを用いて初めて3-端末側で連結できることを発見し、その応用を企った。可逆的な核酸連結反応に有用である5ビニルウラシルの反応性を向上させるために5位に置換基を有するピリミジン類縁体のライブラリーを作製し、スクリーニングを行った。それらをアミダイト化しDNA合成機を用いて5'末端に修飾塩基を含む機能性オリゴ核酸を合成し、3'末端にピリミジンを有するオリゴ核酸との光連結反応を行った。鋳型核酸存在下、光照射した後に、電気泳動を行い、連結された核酸を定量した結果、5位にカルボキシビニル基を有するピリミジンを用いると光連結に関する反応性が10倍向上することを見いだした。DNA合成機後の固相担体からの切りだし及び脱保護条件において効率よくホルミル基を含むオリゴ核酸を合成し、その後、Wittig反応により効率よく目的とするビニル基の隣りにカルボニル基をもつ光連結性核酸の合成に成功した。ビニル基の隣にカルボニル基を有するものだけでなくシアノ基を有するものも本手法により簡便に合成化膿である。

DNA合成機後の固相担体からの切り出し及び脱保護条件において効率よくホルミル基を含むオリゴ核酸を合成し、その後、Wittig反応により効率よく目的とするビニル基の隣にカルボニル基をもつ光連結性核酸の合成に成功した。ビニル基の隣にカルボニル基を有するものだけでなくシアノ基を有するものも本手法により簡便に合成可能である。よって、本反応により共通の合成中間体から目的とする様々な光連結性核酸が容易に合成可能になった。この新しいポスト修飾法により酵素には調整できないようなユニークな構造を有する核酸(枝分かれ核酸・架橋型核酸・環状核酸)を合成することが可能となった。5-ビニルリジンのα-体を端末につけたDNAを用いて初めて3-端末側で連結できることを発見し、その応用を企った。5-ヨードデオキシウリジンより各種ビニルウラシル類縁体を良好な収率で合成することに成功した。それらをアミダイト化しDNA合成機を用いて5端末に修飾塩基を含む機能性オリゴ核酸を合成し、3端末にピリミジンを有するオリゴ核酸との光連結反応を行った。鋳型核酸存在下、光照射した後に、電気泳動を行い、連結された核酸を定量した結果、5位にカルボキシビニル基を含むピリミジンを用いると光連結に関する反応性が10倍向上することを見いだした。さらに、これら機能性核酸の合成の簡便化を行うべく、5位にホルミル基を有する拡散の合成を行った。
DNA塩基配列情報に基づくヒノキ科およびスギ科の分類体系の再構築

葉緑体DNA上にコードされている4遺伝子(rbcL、atpA、petA、rps3)の塩基配列情報を基に、ヒノキ科・スギ科の系統関係を解明し、以下の点を明らかにした。1.スギ科植物の系統進化の解明およびヒノキ科との関係について検討し、スギ科はヒノキ科を含む5つのクレイドから成り立っていることが明らかとなった。2.ヒノキとその変種であるタイワンヒノキの間に塩基配列上の多型が存在するか検討した結果、petA遺伝子に塩基置換が認められた。これを利用してヒノキとタイワンヒノキの識別が可能となった。3.ヒノキ属植物の系統進化の解明について検討し、アラスカヒノキは系統的に大きく異なり、他の5種1変種は比較的短い間に3系統に分かれたことが明らかとなった。4.レイランドサイプレスの雑種性を検証し、分子レベルでモントレーヒノキとアラスカヒノキの雑種であることを明らかにし、その交配組合せを特定することができた。5.ヒノキ属植物のなかでも系統的に大きく異なったアラスカヒノキの分類学上の位置づけを試み、イトスギ属と系統的に近く、アラスカヒノキをイトスギ属の1種とすることを提唱した。6.ヒノキ科植物の系統進化解明について検討し、ヒノキ科は単系統で、北半球と南半球の属でそれぞれ単系統群を形成することが明らかとなった。ヒノキ科の中で最も早く分化したのは南半球の属で、北半球の属ではネズコ属・アスナロ属がまず分岐し、イトスギ属、ビャクシン属は比較的新しくできた属であることも明らかとなった。7.マオウヒバ属植物の系統進化解明について検討し、ヒノキ科の中で最も新しい属であり、短い間に種分化が行ったことを明らかにした。本年度は、葉緑体DNA上にコードされている4遺伝子(rbcL、atpA、petA、rps3)の塩基配列情報を基に、ヒノキ科ヒノキ属(一部イトスギ属を含む)を中心として以下の2点を明らかにした。1.ヒノキ属(Chamaecyparis)の系統進化:ヒノキ属全6種(1変種を含む)を対象として葉緑体DNA塩基配列情報を用いて、系統解明を行った。petA遺伝子でのみ塩基置換が認められたヒノキとその変種であるタイワンヒノキは、北米産のローソンヒノキと近縁であった。また、本邦産のサワラと台湾産のべニヒが近縁となった。アラスカヒノキは系統的に大きく異なっていた。この結果、ヒノキ属は、(1)ヒノキ・タイワンヒノキ・ローソンヒノキ、(2)サワラ・べニヒ、(3)ヌマヒノキ、(4)アラスカヒノキの4系統から成り、まずアラスカヒノキが分化し、残りの3系統は比較的短期間に分化したことが判明した。2.アラスカヒノキ(Chamaecyparis nootkatensis)の分類学的位置づけ:アラスカヒノキはイトスギ属の数種と属間雑種を形成する珍しい種である。これまでの形態や化学成分等の研究からイトスギ属(Cupressus)に近いという意見もあった。そこで、葉緑体DNA塩基配列情報を比較したところ、ヒノキ属の他種よりも多くの塩基置換が観察された。一方、イトスギ属3種との間に認められた塩基置換は少なかった。つまり、アラスカヒノキと他のヒノキ属との変異は属間に見られる変異であり、イトスギ属との変異は属内の変異であると考えられた。アラスカヒノキはモントレーヒノキやアリゾナイトスギと姉妹群を形成し、今回の分子データによって、アラスカヒノキはヒノキ属ではなく、イトスギ属の1種として分類すべきであることが示された。

葉緑体DNA上にコードされている4遺伝子(rbcL、atpA、petA、rps3)の塩基配列情報を基に、ヒノキ科・スギ科全体について系統関係を解明し、以下の点を明らかにした。1.スギ科の系統進化およびヒノキ科との関係:コウヤマキ、カヤ、クロマツをアウトグループとして、得られた塩基配列情報を基に系統樹を作成した。スギ科は、(1)スイショウ属・ヌマスギ属・スギ属、(2)セコイア属・セコイアデンドロン属・メタセコイア属、(3)コウヨウザン属・タイワンスギ属、(4)タスマニアスギ属という4つのグループに分類された。スギ科の4グループとヒノキ科は同時期に相次いで分化した可能性が示された。2.ヒノキ科の系統進化:rps3遺伝子の塩基配列を決定したところ、各種間で長さに違いがあった。特に、南半球に分布するヒノキ科植物で違いが大きかった(628-664bps)。属単位で長さが同一であることが多く、この遺伝子における塩基配列長の違いは系統間の違いを反映していると考えられる。また、得られた塩基配列情報から分子系統樹を作成したところ、ヒノキ科は単系統となり、その下位で北半球と南半球の属はそれぞれ単系統群を形成した。ヒノキ科の中で最も早く分化したのは南半球の属であった。北半球の属ではネズコ属・アスナロ属がまず分岐し、次に、ヒノキ属・フッケンヒバ属、オニヒバ属・コノテガシワ属、さらに、イトスギ属、ビャクシン属が分岐したと考えられる。従来のヒノキ科の分類体系は24亜科と様々であり、その下位分類も異なっている。今回の結果からは、南北両半球の分布に対応する2亜科に分類できることが示された。
変動気候下での感染症媒介生物の生息域評価

マラリアを媒介するハマダラカの時空間分布を推定するため、一般気象要素を入力値とする、生理生態学ー気候学的結合モデルを開発した。次に、アジア地域でもっとも多くのマラリア罹患者を抱えるインドにおいて、モデルによる潜在的な媒介蚊の分布とマラリア罹患者の関係を調べた。(1)マラリア罹患者は媒介蚊の年間世代数が増加すればするほど指数関数的に増加していた。(2)報告されたマラリアの季節的なピークはシミュレーションされた媒介蚊の出現期間とよく対応していた。(3)しかしながら、集約的な農業が行なわれている地域では再現性が低かったため、灌漑水をモデルに組み込んだところ、媒介蚊の活動期を正確に表現できた。今年度は当初の研究目的である感染症媒介生物の気候学的・生態学的分布域評価モデル開発の一環として、個体群動態モデルの開発を中心に行った。このモデルが確立されると、日単位という高い時間解像度での媒介蚊各種の分布や発生密度の予測が可能となる。初年度の研究計画であった水・熱収支モデルに結合させる個体群動態モデルの基盤部分やマラリア媒介蚊各種のパラメータの設定はほぼ終了した。このモデルの開発状況と成果については、個体群生態学会第29回大会(2013年10月)や日本生態学会第61回大会(2014年3月)において発表した。開発中の個体群動態モデルがマクロスケールでの種の発生可能時期を予測するだけでなく、実際のマラリア媒介蚊各種の季節的な発生状況をミクロスケールでも再現可能であることを報告した。この結果より、二年目の実施計画であった本モデルのマルチスケールモデルとしての信頼をある程度確かめることはできたものの、とくにミクロなスケールにおいて複数種が同時に発生する地域を対象とした地理的分布や発生時期の検証が不十分であることから、本モデルの信頼性の確保は途上にある。ただし、気候値をもとに世代数を再現するモデルを発展させた複数種の潜在分布や優占種分布の研究は完成し、国際誌への投稿準備中である。一方、二年目のもう一つの目標である将来の気候変動に伴う媒介蚊の将来予測研究は、先の個体群動態モデルの修正のため、当初計画よりも34ヶ月程度の遅延が生じている。ただし、将来の気候データの整備や気候変動研究の分析手法確立の一環として、日本農業気象学会2014年全国大会(2014年3月)では気候変動と水稲の収量の関係性を分析する方法を発表したり、各種AOGCMのダウンスケールは完了している。将来を見据えた気候変動予測を行うための準備は終了している。従来型の感染症分布モデルではほとんど考慮されてこなかった媒介生物の生理生態に着目した生育評価モデルを構築し、感染症リスクモデルにたいして基礎的知見を与えることを目的としている。熱収支気候学的モデルとハマダラカの生活史にもとづく日単位の世代数推定モデルを結合させることを試みた(coupled model for Ecophysiological and Climatological Distribution of mosquitogeneration: ECD-mg)。その結果、ハマダラカの季節的な消長やモンスーンアジア域での空間的な生息域を表現することに成功した(Clim Res, 53, 77-88)。このモデルの主要な変数は気候データであり、将来変化すると予測される気候値に変化させると、ハマダラカの生息の将来予測を行うことが可能になる。本モデルの意義は将来の地球温暖化研究に応用可能な点である。加えて、構築したハマダラカの生息域評価モデルのうち、ハマダラカ各種ごとのパラメータ設定を行い、気候値をもとにした分布域評価に展開することを試みた。また、このモデルに農業のための灌漑水を水収支モデルの部位に組み込み、インド西部の乾燥地域で再現実験を行ったところ、単に気候値のみを入力するよりも灌漑を組み込んだほうがハマダラカの生育分布や生育時期を正確に表現することができた。以上のことから、人為的な水がハマダラカの生育に大きな影響を与えていること、人間の食料を得るための農業がかえって感染症を拡大することに働いてしまっていることが明らかになった(Int J Biometeorol, in press)。また、この研究は、30分グリッドといった大まかな気候値でしか評価してこなかったECD-mgモデルが比較的小さな地域でも高い精度でハマダラカの挙動を説明できることも同時に示している。当初の予定では、感染症媒介生物の将来気候下での分布域評価を行うことを最終年度の目標に、その源となる個体群動態モデルの開発を中心に行ってきた。このモデルの精度が十分に高いことが証明できれば、日単位という高い時間解像度での媒介生物の分布や発生頻度、密度の予測が可能となる。モデルの開発はほぼ終了し、将来気候データの準備も整っており、成果をとりまとめる段階であった。しかし、二年目の課題遂行中、モデルの推定精度に疑義が生じ、丁寧にその修正を行ったため、三年目の最終年度もすでに6ヶ月ほどの遅れでスタートした。科学的に信頼性の低いモデルでの将来気候時の予測を上塗りするよりも、原点に立ち返ってモデルの再構築することを選択した。(1)とくに、熱収支及び水収支に関わる項目に時間解像度の問題があることがわかり、この点を改めるため、媒介蚊の生息する森林を想定した植物の生長モデルを構築して実蒸発散量を正確に求めることを試み、熱収支的な計算のズレを解消することに成功した。この点に関しては、日本農業気象学会(2015年3月)で報告した。(2)現在、開発したモデルに関する論文の投稿準備中である。

(3)ほかに、気候変動適応策研究の一環として、将来気候下の生物評価の手法の一般的な部分を抽出し、解説する一般書の編著を行い、年度末に刊行した。感染症媒介生物の将来気候下での分布域評価を行うことを目標に、そのコアとなる個体群動態モデルの開発を中心に行い、同時に、近年豊富に公開されている気候モデルによる将来気候の予測値を本個体群動態モデルで活用できるように整備してきた。本研究課題は、もともと3年間(20122014年)の予定であったが、熱収支及び水収支に関わる項目に時間解像度の扱いの問題、個体群動態モデルの推定精度の問題が明らかになったため、1年間の延長を行った。感染症媒介生物の時間的変動をより正確に表現するために、年間世代数から個体数による評価手法へとモデルの改良を行った。改良した個体群動態モデルを用いて、感染症媒介蚊の個体数をさまざまな地点で推定したところ、多くの地点でその消長を再現できることを確認した。さらに、感染症媒介生物の生息域の微気象観測による垂直方向の気象データの必要性に迫られたため、都市域の新しい気象観測手法を開発した。気候値の関数として表現する部分を含む個体群動態モデルの開発のコア部分は終了し、現在国際誌への投稿の準備中である。また、将来気候モデルによる出力値を用いた媒介生物の将来予測結果についても投稿準備中であり、この二つの論文の投稿は今夏を予定している。マラリアを媒介するハマダラカの時空間分布を推定するため、一般気象要素を入力値とする、生理生態学ー気候学的結合モデルを開発した。次に、アジア地域でもっとも多くのマラリア罹患者を抱えるインドにおいて、モデルによる潜在的な媒介蚊の分布とマラリア罹患者の関係を調べた。(1)マラリア罹患者は媒介蚊の年間世代数が増加すればするほど指数関数的に増加していた。(2)報告されたマラリアの季節的なピークはシミュレーションされた媒介蚊の出現期間とよく対応していた。(3)しかしながら、集約的な農業が行なわれている地域では再現性が低かったため、灌漑水をモデルに組み込んだところ、媒介蚊の活動期を正確に表現できた。研究実績の概要にも記したように、個体群動態モデルの出力精度に問題があることがわかり、その修正対応が遅延の最大の理由である。モデルの骨子は修正され、投稿論文を準備中である。また、提供を受けた将来気候モデルによるデータの解像度が研究計画申請時に想定したよりも低かったため、モデルの出力形態の調整を含め、計画を変更せざるを得なかった。加えて、平成26年度中に関東近郊を中心に発生したデング熱を媒介するイエカ、シマカへの本モデルの応用を試みる必要性を感じ、適応範囲の広いモデルへと発展させるためにさらに時間を要した。環境科学二年目から蓄積した遅れを三年間の課題期間中で取り戻すことは不可能であると判断したため、また提供データの不備も相まって、一年間の延長申請を行った。十分な精度をもったモデルであることを確認したのち、早急に査読付き国際誌への投稿を進めるとともに、結果的に四年間の計画となるので、デング熱の評価モデルへの応用できる準備研究として意味をもった研究へと発展させることも試みたい。二年目の前半でほぼ完了する予定であった感染症媒介
樹状細胞と養子免疫を用いたマウス脳腫瘍モデルに対する治療

マウス脳腫瘍モデルを用いた免疫治療の検討を行うことにより、臨床治験に役立つ基礎的データを集積することが本研究の目的である。マウス脳腫瘍モデル作成後、腫瘍内へ樹上細胞を投与し、翌日に養子免疫療法としてCD8T細胞を静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をT細胞に抗原提示し、かつ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインによりケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたT細胞が効率的に遊走、集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。方法としては、in vitroでovalbminを発現しているマウスmelanomacell lineを培養し腫瘍細胞を準備し、C57BL/6系マウスに定位的に脳内に注入しマウス脳腫瘍モデルを作成した。一方で養子免疫療法として腫瘍抗原特異的リンパ球を準備した。培養中に様々なサイトカインを加えてtype I T細胞(Tcl)に誘導し、上記脳腫瘍モデルに静脈投与した(養子免疫療法)。腫瘍内投与するための樹状細胞は、同系マウスの骨髄から採取培養した。脳腫瘍モデル作成後、5日目に腫瘍内へ樹上細胞を定位的に投与し、翌日に養子免疫療法としてTc1を静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をT細胞に抗原提示し、かつ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインにより腫瘍内から例えばinterferon inducible protein-10 (IP10)といったケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたT細胞が効率的に遊走、集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。またこれらの免疫治療により有意に脳腫瘍モデルマウスの生存期間が延長した。長期生存したマウスに再度腫瘍細胞を脳内へ投与し腫瘍再チャレンジを行ったところ、樹状細胞投与群では、さらに生存期間が延長した。Tclも腫瘍内へ長期にわたり作用していることがわかった。このことから脳腫瘍モデルマウスに対して、樹状細胞や腫瘍抗原特異的T細胞投与といった免疫治療を行うことは、将来的にも臨床の場で効果的な治療法となる可能性がある。また本研究の成果は、脳腫瘍患者のみならず、他の癌患者にも、応用できるものと考えられる。方法としては、in vitroでovalbminを発現しているマウスmelanomacell lineを培養し腫瘍細胞を準備し、C57BSS/6系マウスに定位的に脳内に注入しマウス脳腫瘍モデルを作成した。培養中に様々なサイトカインを加えてtype IT細胞(Tc1)に誘導し、上記脳腫瘍モデルに静脈投与した(養子免疫療法)。脳腫瘍モデル作成後、5日目に腫瘍内へ樹上細胞を定位的に投与し、翌日に養子免疫療法としてTclを静脈投与した。結果として、腫瘍内に樹状細胞を投与することにより、腫瘍抗原をT細胞に抗原提示し、かつ樹状細胞から分泌される様々なサイトカインにより腫瘍内から例えばinterferon inducible protein-10(IP10)といったケモカインがより多く分泌され、静脈投与されたT細胞が効率的に遊走、集積し腫瘍細胞を攻撃する結果が得られた。Tc1も腫瘍内へ長期にわたり作用していることがわかった。
新生児糖尿病の中枢神経症状およびＫＡＴＰチャネルの中枢機能の解明と新規治療基盤

トランスジェニックマウスの作成は新生児糖尿病(DEND症候群)を引き起こすR50Pを組み込んだベクターが大腸菌増殖に毒性を有し困難であったが、改良型ベクターによりES細胞のスクリーニングが終了し受精胚にインジェクションする段階にいたった。薬理学的にDEND症候群の状態を再現すべくラット脳にKATPチャネル開口剤であるジアゾキサイドを注入した結果、患者の飲水障害を再現することに成功した。既存の脳中枢作用薬の中にDEND症候群患者に有効なKATPチャネル閉鎖作用を有するものがないかの解析を行った結果、抗鬱剤のブプロピオンと抗てんかん薬のバルプロ酸がKATPチャネル閉鎖作用を有することを発見した。重症新生児糖尿病であるDEND症候群を引き起こすKir6.2(KCNJ11)におけるR50P変異にもとづいてトランスジェニックマウス作成を開始した。マウス完成までの間は野生型のマウスを用い薬理学的にDEND症候群の状態を再現し(KATPチャネル開口剤のdiazoxideを用いた)、各種マウスの状態、変化などの予備的実験を行い、トランスジェニックマウス完成後に速やかに目的の研究が開始されるよう必要な予備的データを多数得た。(1)トランスジェニックマウス:Bacサブクローニング&Red/ETシステムを用いた組み換えを行った結果、DENDを引き起こす変異型遺伝子であるR50Pが大腸菌に対する毒性を有することが明らかとなり大腸菌の増殖が停止する事態に陥った。そこでPgkNeoカセットを用いてターゲティングベクターを構築した。ES細胞を用いたスクリーニングも終了しマウス受精胚へのインジェクションの段階にこぎつけた。(2)上記のトランスジェニックマウスの作成が遅延したため、通常のマウスを用いて薬理学的に脳KATPチャネルの開口を試みDEND症候群患者の状態の再現を試みKATPチャネル開口剤であるdiazoxideをラットの脳第三脳室に注入した。その結果、diazoxideが注入されたラットにおいて飲水量の有意な上昇が確認された。これは実際にR50Pを有するDEND症候群患者がSU剤の内服によって脳KATPチャネル閉鎖が促された場合に飲水量が極端に減少することに対応している。(3) DEND症候群においてはSU剤が治療に有効であることが判明しているが、脳への移行がよくないことが神経症状の治療に有効な効果を挙げられない一因であると考えられる。そこで脳神経系疾患に有効な薬剤にSU剤と同様にKATPチャネル閉鎖させる作用を有する薬剤がないかの検討を行った。その結果、抗鬱剤であり禁煙補助薬として欧米で使用されているブプロピオンにKATPチャネル閉鎖作用があることが確認された。さらに抗てんかん作用を有するバルプロ酸にもKATPチャネルに作用する可能性を発見した。ブプロピオンやバルプロ酸がDEND症候群の治療に有効か否かについては安全面等の問題から今後の検討課題となるが、治療のひとつの方向性として重要な知見であると考えられる。トランスジェニックマウスの作成にあたりcDNAの作成からknock inの具体的な計画立案はスムーズに進み、マウスの作成に着手することが出来た。また、マウス完成前に薬理学的にトランスジェニックマウスの発症するであろう表現型を再現して多くの知見を得る事ができた。これによりトランスジェニック完成後に速やかに成果をあげるための予備データが多数得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。トランスジェニックマウス完成とともにDEND症候群の各種症状の研究・解析を開始する。具体的にはCreloxP法に基づき脳神経特異的にR50P遺伝子を発現したマウスを用いる。このマウスをNesCre-ERマウスをかけ合わせることでKATPチャネルが脳において果たしている役割を明らかにし、さらにDEND症候群の治療方法についての研究を行う。この際に導入型ではない(ERのない)NesCreマウスとかけあわせた脳特異的R50P発現マウスも作成して脳の発生においてKATPチャネルが果たしている役割についての検討を行う。さらに電気生理学的手法を用いてKATPチャネルのATP感受性に関する検討をR50Pトランスジェニックマウスの脳を用いて行う。
スクロースの構造を基盤とした特殊２糖の酵素合成と生理機能特性の評価

スクロースのグルコース残基をグルクロン酸やグルコサミンに置き換えた構造を有するスクロン酸やスクロサミンを、グリコシダーゼの糖転移作用やイオン交換樹脂を利用して合成することに成功した。これで、N-アセチルスクロサミンやスクロン酸アミドを加え、4種類のスクロースアナログ二糖を酵素作用などを利用して合成することができるようになった。そこで、これらの二糖についてプレバイオティクス機能を評価する実験を行うことにした。その一環として、まずはヒト腸内由来の8種11株のビフィズス菌と3種の異なる乳酸菌に対するそれらの増殖効果を調べた。その結果、これらの二糖はBifidobacterium infantisやbifidobacterium catenulatumなど特定のビフィズス菌のみを選択的に良く増殖させることが明らかとなった。また、N-アセチルスクロサミンはBifidobacterium pseudocatenulatumのみを特異的に増殖させることが分かった。同様な実験を、1-ケストース、ラクトスクロース、ラフィノースといった実際に使用されている代表的なプレバイオティクスオリゴ糖で行ったが、これらのオリゴ糖にはスクロースアナログ二糖のようなビフィズス菌に対する種特異的増殖機能が見られなかった。このことは、我々の合成した二糖は新しいタイプのプレバイオティクスオリゴ糖になる可能性を示す。細菌がオリゴ糖を栄養源として代謝するためには、まずそれをグリコシダーゼを使って単糖に分解する必要がある。そこで、上記のような現象がなぜ起こるのか、グリコシダーゼの生産の有無といった観点から調べることにした。その結果、B. pseudocatenulatumを用いた実験から、本菌がN-アセチルスクロサミンを加水分解するβ-フルクトフラノシダーゼを生産する能力を有することを明らかにした。新規なスクロースアナログ二糖の酵素利用合成に関し、当初合成を計画していたもののうち「研究実績の概要」に記載した4種類のものについては成功したが、スクロースのグルコース残基をガラクトースやアロースに置換したものについては合成することができなかった。これらについては今後、用いる酵素の種類を変えてさらに検討して行くつもりである。合成ができた4種類のスクロースアナログ二糖の、各種のビフィズス菌および乳酸菌に対する増殖効果を調べた実験の結果から、これらはビフィズス菌の種特異的増殖特性を示すことが確認でき、従来のプレバイオティクスオリゴ糖には見られないタイプのオリゴ糖であることが明らかとなった。この特性がプレバイオティクスとして有効なものなのかどうか、純粋培養を行ったこのデータだけでは判断がつかない。そのため、今後はさらに様々な実験を行い、スクロースアナログ二糖のプレバイオティクス機能を評価して行く予定である。本研究では、スクロース構造を基盤として従来のものとは異なる新規なオリゴ糖を酵素反応を利用して合成し、それらのプレバイオティクス機能を評価するため、一連の実験を行っている。合成目標としていた6種類のスクロースアナログ二糖のうち、4種類については酵素反応を用いた効率的合成法を確立できたが、残りの2種類については未だ合成法を確立できていない。そこで、この2種類のものについて、合成反応を触媒できる酵素の探索を行ってゆくことを計画している。現在は、合成できた4種類のオリゴ糖について、各種のヒト腸内善玉菌に対する純粋培養系での増殖効果を調べ、これまでに興味深い結果が得られている。しかし、ヒト腸内にはその他にも日和見細菌や悪玉菌など、様々な種類の細菌が生息している。そこで、Clostridium属細菌を中心とした日和見菌について、善玉菌と同様な実験を行う予定である。また、純粋培養による実験だけではプレバイオティクス機能を評価することはできない。このことから、今後はよりヒト腸内環境に近づけるため、様々なヒト腸内善玉菌、日和見菌、悪玉菌を混合した混合培養系にてスクロースアナログ二糖の善玉菌特異的増殖特性を調べて行くつもりである。また、小動物を使った腸内フローラ変化の実験についても着手する予定である。

その結果、B. pseudocatenulatumを用いた実験から、本菌がN-アセチルスクロサミンを加水分解するβ-フルクトフラノシダーゼを生産する能力を有することを明らかにした。新規なスクロースアナログ二糖の酵素利用合成に関し、当初合成を計画していたもののうち「研究実績の概要」に記載した4種類のものについては成功したが、スクロースのグルコース残基をガラクトースやアロースに置換したものについては合成することができなかった。これらについては今後、用いる酵素の種類を変えてさらに検討して行くつもりである。合成ができた4種類のスクロースアナログ二糖の、各種のビフィズス菌および乳酸菌に対する増殖効果を調べた実験の結果から、これらはビフィズス菌の種特異的増殖特性を示すことが確認でき、従来のプレバイオティクスオリゴ糖には見られないタイプのオリゴ糖であることが明らかとなった。この特性がプレバイオティクスとして有効なものなのかどうか、純粋培養を行ったこのデータだけでは判断がつかない。そのため、今後はさらに様々な実験を行い、スクロースアナログ二糖のプレバイオティクス機能を評価して行く予定である。本研究では、スクロース構造を基盤として従来のものとは異なる新規なオリゴ糖を酵素反応を利用して合成し、それらのプレバイオティクス機能を評価するため、一連の実験を行っている。合成目標としていた6種類のスクロースアナログ二糖のうち、4種類については酵素反応を用いた効率的合成法を確立できたが、残りの2種類については未だ合成法を確立できていない。そこで、この2種類のものについて、合成反応を触媒できる酵素の探索を行ってゆくことを計画している。現在は、合成できた4種類のオリゴ糖について、各種のヒト腸内善玉菌に対する純粋培養系での増殖効果を調べ、これまでに興味深い結果が得られている。しかし、ヒト腸内にはその他にも日和見細菌や悪玉菌など、様々な種類の細菌が生息している。そこで、Clostridium属細菌を中心とした日和見菌について、善玉菌と同様な実験を行う予定である。また、純粋培養による実験だけではプレバイオティクス機能を評価することはできない。このことから、今後はよりヒト腸内環境に近づけるため、様々なヒト腸内善玉菌、日和見菌、悪玉菌を混合した混合培養系にてスクロースアナログ二糖の善玉菌特異的増殖特性を調べて行くつもりである。また、小動物を使った腸内フローラ変化の実験についても着手する予定である。
頭頚部癌動注患者に対するプラチナイメージングへの挑戦

GE社製Dual energy CTを用いてプラチナ製剤の画像化を試みたところ、保険適応下の動注用シスプラチン濃度1.43mg/mLよりも高濃度に調整した5mg/mLで周囲組織より弁別できる可能性が見られたが、動注可能濃度および静注用濃度(0.5mg/mL)では弁別が困難と考えられた。核磁気共鳴画像における拡散強調像のバイオマーカーとしての役割について、脈絡叢腫瘍と脊索腫と予後の関係について評価した。脈絡叢腫瘍はWHO分類においてGrade1から3まで分類されており、拡散強調像から計算した見かけの拡散係数(ADC値)と有意な負の相関を示した。またADC値が低い方が予後が悪いことも示した(Sasaki T, et al. Neuroradiology 2018;60:479-86)。1)シスプラチンがDECTで描出されるかどうかについて;市販されている静注用シスプラチンは濃度50mg/100ml(=0.5mg/ml)であった。これを含んだバイアルと対照とする生理食塩水をDECTで撮像し、スペクトラルカーブ解析を行った。その結果、シスプラチンの吸収値は-387HUと分布し、生理食塩水は-102HUと分布していた。特に低keV再構成に分離が良くなる傾向が見られた。2)動注用の高濃度シスプラチンがDECTで描出されるかどうかについて;動注用シスプラチンは濃度を調整することが可能であるので、それをDECTで撮像し描出できるかどうかを検討した。通常はシスプラチン濃度を1.43mg/mlで使用する。今回は70°C以上に加温した生理食塩水を用いて濃度5mg/mlと調整したものを『高濃度液』とし、これを2倍希釈して濃度2.5mg/mlとしたものを『2倍希釈』、さらに希釈して濃度1.25mg/mlとしたものを『4倍希釈』、さらに希釈して濃度0.625mg/mlとしたものを『8倍希釈』として調整した。対照として生理食塩水も同時に評価した。その結果、シスプラチン含有溶液の吸収値は高濃度液(62.888.8HU)>2倍希釈(26.242.7HU)>4倍希釈(12.621HU)>8倍希釈(2.411HU)>生理食塩水(-9.7-4.8HU)の順であった。3)DECTにおける肝実質スペクトラルカーブとの比較;様々な目的で肝臓が撮像範囲内に入っている8症例のDECTデータにおいて肝実質の吸収値は43.966.1HUで最大値は78HUであった。これを1)と2)の結果と比較すると、2)の高濃度液(5mg/ml)時でのみ肝実質より吸収値が高く描出できた。高濃度のシスプラチン溶液(5mg/ml)がDECTで描出できる可能性については肝内で同様の密度で存在する必要がある。しかし、実際の薬剤投与(静注および動注療法)での検出は難しい可能性が高い。一つに2倍に希釈された段階で肝実質より吸収値が低くなるため、肝実質のノイズの中に埋もれてしまうことが予想される。2つ目に、今回の高濃度シスプラチン(5mg/ml)は実験上の濃度であり、通常動注時に用いるシスプラチン濃度1.43mg/ml(2倍希釈の濃度2.5mg/mlと4倍希釈の濃度1.25mg/mlの範囲内)と比較すると非常に高濃度である。そのため、動注療法で使用できる濃度ではDECTで試験管上は描出できるが、肝実質内において別の組織と区別できるかについて困難が予想されたが、ファントム実験にて腹部に留置したシスプラチンを評価したい。結果として、今回のDECTにおける精度では臨床で使用できる低濃度のシスプラチンを特異的に描出することが困難であることも予想されるので、今後についてはDECTの使い方および精度の見極めも含めて検討する必要が出てきた。昨年度までの結果により現状のDual Energy CTによる体内のプラチナ検出(生体に投与できる濃度において)が困難であると予想されたことと、研究期間途中からアメリカのアイオワ大学神経放射線科に留学を開始したため、拡散強調画像が脳・骨腫瘍において予後因子となりうるか評価した。脊索腫は低悪性度の骨腫瘍であり、頭蓋底、脊椎、仙尾骨に発生する。近年は重粒子線治療が良好な成績を示す報告がされることが増えたが、手術による全摘出による予後改善のエビデンスが多い。脊索腫はその発生部位からは全摘出が難しい場合が多く、残存病変に対して定期的な画像における経過観察がなされる。その中で拡散強調像が再発の予測および予後に有用かを後ろ向きコホートに検討した。16名の再発脊索腫患者を20%以上の腫瘍増大かつdoubling timeが1年未満をPDrapid、20%以上の腫瘍増大かつdoubling timeが1年以上をPDslow、20%未満の腫瘍増大をnonPDと定義し、分類した。PDrapidは5名、PDslowは4名、nonPDは7名であった。経過観察の中央値は48か月であった。拡散強調像から得られたADC値はPDrapid群で最も低く、有意差があった(p=0.002)。

ROC解析においてPDrapidを予想するArea under the curveは0.964(p=0.001)と有意に高く、カットオフADC値を1.38x10-3 mm2/s以下とした際の感度は1.00、特異度は0.901であった。Log-ranktestにおける生命予後評価もカットオフADC値1.38 x10-3 mm2/s以下は有意に予後不良であった(p=0.001)。術後再発脊索腫において低いADC値は腫瘍増大速度が速く、かつ予後不良因子とするバイオマーカーの一つである可能性が示唆された。昨年度の実験結果から計画予定の変更を余儀なくされたため。今年度の途中より海外留学(アイオワ大学放射線科)に来たため、CT装置のメーカーが異なり研究を続けることができなかった。Dual energyCTおける撮像方法側からのアプローチも重要であるが、脳・骨腫瘍などの病変側からのアプローチとして画像におけるバイオマーカーを探索することも重要と考えられた。海外留学のため、核磁気共鳴画像における拡散強調像のバイオマーカーとしての役割について、脈絡叢腫瘍と脊索腫と予後の関係について評価した。脈絡叢腫瘍はWHO分類においてグレード1から3まで分類されており、拡散強調像で撮像し、計算した見かけの拡散係数(ADC値)と有意な負の相関を示した。またADC値が低い方が予後が悪いことも示した(Sasaki T, et al. Neuroradiology 2018;60:479-86)。ADC値は脳、脊椎領域において予後を示すバイオマーカーの一つである可能性が示された。Dual energy CTにおける研究が滞っていたため。拡散強調像から得られる見かけの拡散係数と予後についての関係は、後ろ向き研究および一部の腫瘍で示されたが、もっと他の腫瘍でも評価する必要があるし、今後の前向き研究につなげたい。GE社製Dual energy CTを用いてプラチナ製剤の画像化を試みたところ、保険適応下の動注用シスプラチン濃度1.43mg/mLよりも高濃度に調整した5mg/mLで周囲組織より弁別できる可能性が見られたが、動注可能濃度および静注用濃度(0.5mg/mL)では弁別が困難と考えられた。核磁気共鳴画像における拡散強調像のバイオマーカーとしての役割について、脈絡叢腫瘍と脊索腫と予後の関係について評価した。脈絡叢腫瘍はWHO分類においてGrade1から3まで分類されており、拡散強調像から計算した見かけの拡散係数(ADC値)と有意な負の相関を示した。シスプラチンのDECT描出においてはシスプラチン濃度に比例してDECT吸収値が上昇する傾向はあったので、投与できる物理量が増やせる薬剤が出てくる。または病変でシスプラチンが凝集する薬物動態を示す場合ではシスプラチンをこのDECTで定量できる可能性はある。その前に、DECTの使い方と精度について見極める必要も出てきたので、プラチナだけではなく、生体内に広く存在するヨードを含めた物質まで対象を広げてDECT研究を行っていく。具体的には甲状腺腫瘍に対するヨードの定量を試みることを目標とする。分化型甲状腺癌に対して放射性ヨードによるRI内用療法が適応となる場合があるが、低分化型甲状腺癌ではその適応はない。これは分化型甲状腺癌はある程度ヨードを取り込む機能があるためと考えられている。そこで甲状腺内結節のヨード量が甲状腺結節の良悪、あるいは分化度を推定できる可能性がある。またRI内用療法の適応の有無についても有用な情報をもたらす可能性がある。
多様な骨格導入を可能とする交差共役高分子の合成と機能性高分子への変換

1,3-ブタジエン骨格をもつ交差共役系分子を不均一系Pd触媒から合成する検討過程でPd/Cが直接的アリール化重縮合に対して優れた触媒であることを見出した。また、1,3-ブタジエン骨格をもつ交差共役系高分子に対してDiels-Alder反応を行うことによって、常法では合成が困難なo-フェニレン骨格を有する共役系高分子への変換に成功した。2,3-ジアリール-1,3-ブタジエンの合成では、Pd/Cに加えてPdナノ粒子担持触媒膜が使用できることを明らかにした。2,3-ジアリール-1,3-ブタジエンは、極性溶媒中でs-cis配座に有利な反応が進行しやすいことを見出した。まず、特殊構造高分子の1つであるオルトフェニレン含有高分子への変換反応を検討した。フルオレンなどの芳香族ジボロン酸をモノマーとして均一系Pd触媒を用いて重合を行い、種々の2,3-ブタジエニレン骨格をもつ交差共役高分子を合成した。続いてアセチレンジエステルとのDiels-Alder反応を検討し、2,3-ブタジエニレン骨格は全てシクロヘキサジエン骨格へ変換できることを明らかにした。さらに、酸化反応によりシクロヘキサジエン骨格をベンゼン環に完全に変換することができた。また、UV-vis吸収スペクトル、蛍光スペクトル測定を実施し、骨格変換に伴って光学的性質が変化することを見出した。交差共役高分子のDiels-Alder反応は、検討に用いた全てのジエノフィルで効率良く進行した。反応部位を2つもつベンゾキノンとの反応では、架橋反応が進行してネットワーク高分子が生成したことから、この高分子反応は進行し易いことがわかった。グリーンケミストリを指向した不均一系Pd触媒を用いた重合条件の検討では、Pd/C及びPd/iO-brane(関東化学社製)を用いモデル反応を実施した。Pd/Cは有効な触媒であり、収率60%以上で交差共役化合物が得られた。しかしながら、重合に適用するにはさらに反応効率を向上させる必要があった。Pd/iO-braneはPdナノ粒子が分散した有機無機ハイブリッド膜である。この触媒は均一系Pd触媒と同程度に収率良く目的物を与えたので、重合を含めて27年度でさらに検討を加えていく予定である。その他、モデル反応の一環として分子内に2つのピレン骨格をもつ交差共役化合物の合成を行い、極性溶媒中ではピレン環同士がπスタックした配座が有利であるが、芳香族系溶媒中では、全くスタックしていない配座が有利であることが明らかとなり、交差共役高分子の溶液中での立体配座に関する有益な情報を得ることができた。2,3-ブタジエニレン骨格をもつ交差共役型高分子の高分子反応による共役型高分子への変換および特殊構造を有する高分子の合成が主たる目的であり、加えてグリーンケミストリーを指向した交差共役型高分子の合成方法の検討を行った。予備的な研究としてC-Hアリール化を利用した共役型高分子の合成検討を開始したところ、重要な成果が得られたため、これに関連する研究も実施した。27年度はまず、特殊構造高分子の1つであるオルトフェニレン含有高分子への変換反応を検討した。26年度の時点では、主鎖にカルバゾール骨格をもつ場合、オルトフェニレンへの変換ができなかった。主鎖骨格に左右されると適用できる高分子が制限されるため、この点を克服するために種々検討した。その結果、2,7-ジボロン酸カルバゾールを用いることでオルトフェニレンへの変換が可能であることがわかった。次に、2,3-ブタジエニレン骨格に加えて、新規交差共役高分子として累積二重結合をもつアレンを有する高分子の合成に挑戦した。ビス(プロパルギルカーボナート)とジボロン酸との重合を重合条件やモノマー構造を変えて種々検討した。その結果、プロパルギル位にメチル基を1つもつビスカーボナートを用いることによって収率よくアレン骨格をもつ交差共役高分子を合成することに成功した。これまでにない新しいタイプの特殊構造を有する高分子として位置づけることができる。申請時、グリーンケミストリーを指向した交差共役型高分子合成に不均一系Pd触媒の利用のみを想定していたが、C-Hアリール化を利用した重合が急速に注目され始めた。しかし、使用される触媒は均一系触媒に限られていた。そこで、不均一系Pd触媒を用いてC-Hアリール化による共役型高分子の合成をまず検討した。その結果、Pd/C触媒を用いることにより、副反応を抑えつつ効率良く目的の高分子が得られることがわかった。27年度の重要な課題の一つは、26年度に続き2,3-ブタジエニレン([2]デンドラレン)骨格をもつ交差共役高分子のオルトフェニレン骨格を有する共役高分子への変換であった。26年度の時点では、カルバゾール骨格をもつ交差共役高分子のオルトフェニレン骨格への変換に成功していなかった。そこで種々検討した結果、生成する高分子がより直線的となるカルバゾール-2,7-ジボロン酸誘導体を用いることでカルバゾール骨格をもつ交差共役高分子に対してもオルトフェニレン骨格を導入できることが明らかとなった。さらに、アレン骨格をユニット単位でもつ交差共役高分子の合成に初めて成功することができた。高分子にこれだけ多くのアレン骨格を導入できた例はこれまでになく、特殊構造をもつ新しい高分子と位置づけることができる。初めての高分子骨格であることから反応性に加えて物性にも興味がもたれる。鋭意検討中である。

これまでに得られた成果に基づいて論文を35報程度は投稿する予定である。27年度に引き続き常法では合成困難な主鎖骨格を含む高分子の合成を中心に検討を実施した。2,3-ブタジエニレン([2]デンドラレン)骨格の変換の検討が昨年度は十分ではなかったことから、Diels-Alder反応以外の反応について検討し、特に[2]デンドラレン骨格のチオール-エン反応を実施し、スチルベン骨格含有共役型高分子への変換を試みた。モデル反応として実施した2,3-ジアリール[2]デンドラレンとの反応では、生成物の実に約7割がcis-スチルベン型生成物であり、約3割がtrans-スチルベン型であった。一般的にtrans-スチルベン類はcis型に比べて熱力学的に安定であることから優先して生成する傾向にあるが、全く異なる結果が得られた。そこで、[2]デンドラレン骨格を含む交差共役型高分子に対してチオール-エン反応を行った。その結果、trans-スチルベン型ユニットの割合が増えたもののcis/trans比はほぼ1/1であり、trans体が多く生成することはなく、これは興味深い結果である。研究の過程でジアリール隣接置換デンドラレン類は、いわゆる凝集誘起発光(AIE)挙動を示すことを明らかにすることができた。[2]デンドラレン類に加えて[4]デンドラレン類もAIE挙動を示し、ジアリール隣接置換デンドラレン類が固体状態でAIEを示すことを初めて明らかにした。28年度で予定されていた交差共役型高分子をチオフェン含有共役型高分子への変換を実施することはできなかった。これは、上述した予想外の興味深い結果が得られたため、これらの研究を行ったためである。また、ベンザイン類との反応でナフタレン骨格をもつ共役型高分子への変換についても検討した。しかし、種々反応条件を変えて実験を実施したが、検討した範囲では目的の反応を進行させる条件を見出すことはできなかった。1,3-ブタジエン骨格をもつ交差共役系分子を不均一系Pd触媒から合成する検討過程でPd/Cが直接的アリール化重縮合に対して優れた触媒であることを見出した。また、1,3-ブタジエン骨格をもつ交差共役系高分子に対してDiels-Alder反応を行うことによって、常法では合成が困難なo-フェニレン骨格を有する共役系高分子への変換に成功した。2,3-ジアリール-1,3-ブタジエンの合成では、Pd/Cに加えてPdナノ粒子担持触媒膜が使用できることを明らかにした。2,3-ジアリール-1,3-ブタジエンは、極性溶媒中でs-cis配座に有利な反応が進行しやすいことを見出した。26年度の重要な課題の1つは、2,3-ブタジエニレン([2]デンドラレン)骨格をもつ交差共役高分子のオルトフェニレン骨格を有する共役高分子への変換であった。アセチレンジエステルとのDiels-Alder反応および生成したシクロヘキサジエン骨格の芳香族化反応は効率良く進行することを明らかにできた。また、不均一系触媒としてのPd/iO-braneの有効性、および2つのピレン骨格をもつ交差共役化合物の立体配座の溶媒依存性などの有益な結果を得ることができた。現在、これらの成果に基づいて数報の論文を執筆中である。27年度に引き続き、常法では合成困難な主鎖骨格を含む高分子の合成を検討していく予定である。
キュウリ奇形果発生機構の動的解析

キュウリの奇形果の発生への光合成産物の欠乏の関与を分子レベルで調べるため、光合成産物欠乏に伴って発現が増加する遺伝子を全摘葉処理及び連続暗黒処理により探索したところ、糖欠乏のよいマーカーとして知られるアスパラギン合成酵素遺伝子、キュウリの体細胞胚発生に伴って誘導されることが知られていたCsSEF1、および新規のジンクフィンガー様遺伝子の3つの遺伝子が得られ、そのうち後者2つは機能未知のものだった。特にCsSEF1は処理により約100倍も発現量が増加した。その発現は果実の成長速度に比例する呼吸速度の低下と時間的に相関しており、活発に成長する組織における成長停止に関与している可能性が考えられた。CsSEF1は植物では機能がよく分かっていないタンデムCCCHジンクフィンガーファミリーに属し、植物特有のモチーフを有しており、今回の知見は有用なものである。キュウリ果実において光合成産物欠乏条件で特異的に発現する遺伝子を探索するために、果実長約9cmの時期に全摘葉処理を行い、翌日果実を収穫して、対照果と発現が異なる遺伝子をサブトラクション法によってクローニングしたところ、ウリ科ゲノムデータベースのキュウリユニジーンVer.2に全て対応するものが見出され、それらから興味深いと思われるもの6種を選んでプライマーを作成し、定量PCRを行ったところ、転写因子と思われるジンクフィンガー様タンパクをコードすると思われる機能未知のものが摘葉処理によって発現量が約1000倍に高まった。未知遺伝子であるので興味深いとともに、光合成産物欠乏ならびに奇形果発生のマーカー遺伝子として有用な可能性が考えられた。果実の呼吸速度の測定を行ったところ、既報と同様の体積成長量と呼吸量の比例関係が再現され、比例定数も類似していた。そこで呼吸速度によって果実の成長活性を連続的に追跡しうると思われた。植物体を暗黒条件に置くと、当初の予想では、果実温が30°C程度の高温の場合、初期の成長・呼吸活性が高く、ある時点でカタストロフ的に活性が低下すると予想していたが、暗黒条件では呼吸活性は当初から抑制されており、呼吸速度はほぼ一定の低い値を取ったので、水ストレス処理等更に詳細な検討が必要である。昨年度に見出されたキュウリの摘葉によって果実で劇的に発現が高まる遺伝子がキュウリの体細胞胚発生時に誘導される遺伝子CCCH Zinc finger遣伝子であるCsSEF1と相同性が高かったので、5'-RACEを行い、全長cDNAを得て塩基配列を解析したところ、完全に一致した。また、cucurbit genome databaseにおいてBLASTを行ったところ、相同性が高い遺伝子は1コピーのみだった。そこで、我々の遺伝子がみCSEF1であることが明らかになった。キュウリ植物体を暗黒条件に置くと、室温・果実温30°Cでは、果実の呼吸速度が直ちに低下した。一方、室温・果実温25°Cでは、朝暗黒条件に置いた場合、翌日の6時までは呼吸速度は低下せず、その後急速に呼吸速度が低下した。このとき、CsSEF1の発現は暗黒に置いた当日の夕方には高まっていなかったが、翌日の昼には顕著に高まっていた。このことは、CsSEF1の発現が、摘葉に伴う水ストレス等によるのではなく、光合成産物の欠乏に関係すること、CsSEEF1は光合成産物の欠乏と果実の成長の低下に至る信号伝達系のどこかで機能しており、光合成産物欠乏のマーカー遺伝子になりうると考えられた。尻細り果はNaC1 60mMを添加した水耕栽培において、通気頻度を下げた時にのみ生じた。これは、呼吸速度のカタストロフ的な低下を伴っていた。キュウリ植物体で全摘葉を行ったとき果実で発現が増加する遺伝子をサブトラクション法によってクローニングしたところ、糖欠乏のよい指標として知られるアスパラギン合成酵素遺伝子ともう1つの遺伝子の発現が増加していた。後者の発現促進は50100倍と極めて顕著で、5'-RACEによりcDNAの全長を決定したところ、キュウリの体細胞胚発生に伴って発現することが報告されているCsSEF1遺伝子であることが明らかになった。全摘葉処理では水ストレス等の関与も否定できないので、植物体を連続した暗黒下におく処理を行ったところ、同様に顕著な発現の促進が見られた。キュウリ果実の成長速度は今回の補助金で購入した主な備品である赤外線ガス分析計を用いた呼吸速度の測定によって、連続的に測定することができる。その結果、呼吸速度は暗期開始の翌朝の6時頃に急激に低下し始めるが、CsSEF1の発現はこれとよく相関していた。

連続暗黒条件において、側枝の茎頂部や根ではCsSEF1とアスパラギン合成酵素の発現が促進されたが、成熟葉ではアスパラギン合成酵素の発現が促進されたものの、CsSEF1の発現は促進されなかった。そこで、CsSEF1は急速に成長するsink組織における成長停止と関係していると考えられた。CsSEF1はtandem CCCH zincfinger(TZF)モチーフを持っている。TZFはヒトなど動物では比較的よく調べられており、RNAに作用することなどが知られているが、植物においてはその機能がほとんど知られておらず、本研究の結果は有用な知見と言える。以上の成果の一部はPlantaに掲載された。また、サブトラクション法で得られた別のクローンを調べたところ、zincfingerモチーフをもつ新規遺伝子が見いだされたので、現在その配列の決定と発現解析を行っている。有力なマーカー遺伝子を同定した。24年度が最終年度であるため、記入しない。塩ストレスや果実温を独立に制御する処理などによる呼吸速度の変化を調べ、その際のCsSEF1の発現について検討する。また、果実や葉の糖やデンプン含量の処理による変化を調べる。また、CsSEF1が葉などで発現するか検討する。