hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子育ての困難に直面する家族が形成する「承認とケアのネットワーク」に関する実証研究

Web版調査を補完するために、不登校児家族の自助グループを対象にした質問紙調査の実施可能性を関係者と協議しつつ模索したために、不登校に関する調査の実施時期を次年度に繰り越すことになった。2017年度には、第一に、これまで収集したデータを整理・分析し、不登校・ひきこもり当事者の親の会が参加者に与える影響を検討した。その結果、親の会で形成されるネットワークは2種類の社会関係資本を生み出していることが明らかにされた。(1)親の会では、困難をめぐる経験の共有を通じて、集合的なアイデンティティの形成を核にした結束型の社会関係資本を生み出していた。(2)他方で親の会は、会に参加するまでは接点のなかった人びとを結びつける架橋型の社会関係資本もあわせて産出していた。なお、架橋型の社会関係資本は、いま・この場を共有する人びとのみならず、今後、同様の困難に直面しうる想像上の他者にまで拡張しうる潜勢力を有していた。第二に、親の会の集合的なアイデンティティの特徴を探るために、会とは関わりのない保護者を対象にしたインターネットモニター調査を実施し、不登校に関する認識を、過去に親の会参加者を対象に実施した調査データと対比することで、会への参加者にみられる特徴について検討した。その結果次の3点が明らかになった。(a)親の会の参加者は、非参加者と比べると子どもの不登校をありのままに受けとめ、登校刺激を控える傾向が顕著であった。(b)親の会の参加者は、家族だけで問題を抱えこまずに専門家の力を借りると考える傾向が非参加者よりも強い一方で、専門家だけに任せきりにすれば良いとも考えない点に特徴がみられた。(c)親の会の参加者は、官民の支援機関をさらに充実させる必要があると考える傾向性が非参加者よりも顕著であった。これらの結果を踏まえると、子育て・教育上の困難に直面した家族が形成する社会的なネットワークは、閉じたコミュニティを形成するのでもなく、個々の家族がそれぞれに問題の解決を専門家・専門機関に委ねるのでもない、適度に開かれた「中庸なケアのネットワーク」を形成しているとみることが可能である。本研究は、様々な子育て・教育上の困難に直面した家族が形成するパーソナルなネットワーク、あるいは困難を乗り切る際に活用する支援のネットワークが有する特徴と、それが個々の家族を支える機能を明らかにすることを目的としたものである。この目的を達成するために、本研究では、1)不登校の子どもを持つ家族の自助グループを対象にした参与観察、2)子ども支援をミッションとするNPOとその利用者(子ども・保護者)を対象とした質問紙調査、3)インターネット・モニター調査を実施し、困難に直面する家族が形成する承認とケアのネットワークの特質を実証的に解明することを通じて、上記の目的に関わる一定の知見を得ることができた。当初の計画では、2014年度中に調査対象となる団体の選定と依頼の作業を行う予定であった。すでにこれまでの調査で関わりのある団体に対する依頼作業は予定通り進展した。他方で、本研究で実施する予定の質問
肺炎球菌感染症に対する間葉系幹細胞を用いた新たな治療法の開発

肺炎球菌肺炎におけるMSCsの抗炎症作用としての役割について検討した。骨髄由来マクロファージにおいては、MSC培養上清添加し、TLR2,9,4リガンドの刺激により、炎症性サイトカインの抑制、抗炎症性サイトカインの上昇がみられた。肺炎球菌感染モデルマウスにおいては、MSC投与により気管支肺胞洗浄液、肺において好中球数、炎症性サイトカイン、肺炎球菌の菌量等の抑制がみられた。以上によりMSCsは肺炎球菌肺炎において治療介入となる可能性が示唆された。18-10週齢の雄性C57BL/6マウスに臨床分離株である肺炎球菌を経鼻投与し、マウス肺炎球菌感染モデルを作成した。28-10週齢の雄性C57BL/6マウスにマウス馴化インフルエンザ(A/PR8; H1N1)の経鼻感染を行い、その7日後に肺炎球菌の経鼻投与による2次感染を行い、インフルエンザウイルス感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成した。3ヒト骨髄MSC(間葉系幹細胞)、マウス骨髄MSCも使用し、上記12のマウスに対し、MSCを経気道投与、経静脈投与を行い、生存率、体重推移、肺内菌量、肺及び脾臓での免疫細胞分画(CD8+T細胞、CD4+T細胞、NKT細胞、γδT細胞、NK細胞、マクロファージ、好中球など)をフローサイトメトリー法にて、血清・肺・気管支肺胞洗浄液におけるサイトカイン発現量をELISA法にて、肺病理組織像に関しても比較検討しMSCの投与効果を評価し検討した。肺炎球菌感染モデルマウスにおいては、MSC投与により、MSC非投与群に比較して気管支肺胞洗浄液中の細胞数、好中球数、TNF-α, IL-6などの炎症性サイトカインの発現、MPO活性は抑制された。平成27年度の計画は下記の通りであった。1.マウス肺炎球菌肺炎モデルとインフルエンザ・肺炎球菌重複感染モデルの作成・確立、2.肺炎球菌感染マウスに対するMSC投与のプロトコールの確立、3.肺炎球菌感染マウスに対するMSC投与の効果とその機序の検討、4.インフルエンザ・肺炎球菌重複感染マウスに対するMSC投与効果の検討。肺炎球菌肺炎モデル、インフルエンザ・肺炎球菌重複感染モデルを作成することができた。肺炎球菌感染マウスに対して、ヒト骨髄およびマウス骨髄MSCに関して、経気道、頸静脈投与を行う系で検討を行ない、評価を行った。機序を解明する点までは至っていないが、概ね予定していた内容を行えていると考える。肺炎は世界では死因4位であり、その中でも肺炎球菌は肺炎の原因として主要な起炎菌である。間葉系幹細胞(MSCs)は敗血症などの自然免疫において抗炎症採用が報告されているが、肺炎球菌肺炎に対する作用はほとんど報告されていない。;TLR)2,TLR9,あるいは4リガンドで刺激後、TNF-α、IL-6は有意に減少し、一方IL-10は有意に上昇した。さらに上記のBMDMsをTLR2,TLR9リガンド、および肺炎球菌加熱死菌で刺激後は好中球関連ケモカインであるCKCL1,CXCL2は有意に減少した。マウスにおいては、MSCs投与により肺炎球菌感染マウスは気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage fluid;BALF)における好中球数が有意に減少した。また、肺におけるミエロペルオキシダーゼ活性が有意に低下した。肺における炎症性サイトカインであるTNF-α, IL-6, GM-CSF、および肺炎球菌の菌量は有意に減少した。さらに組織学的な検討では炎症細胞浸潤の程度は軽減していたが、肺水腫の程度、BALFにおける蛋白濃度、細菌感染により上昇し菌の代謝や増殖に影響するとされるLipocalin2には差はみられなかった。以上の結果より、MSCsは肺炎球菌肺炎において治療介入となる可能性が示唆された。研究協力者の助言・協力を得ながら、予定の研究内容を推進する。感染症、呼吸器内科予定していた学会へ都合により参加できなかったため旅費、その他
多機能性抗菌ペプチドの統合的解明と疾病制御

多機能性抗菌ペプチドの統合的解明のために、昨年度からの研究を進展させた。研究のポイントは2点-多剤耐性菌に対する効果とメカニズムおよび癌細胞に対する抗癌活性の検討である。世界的に蔓延している多剤耐性ブドウ球菌(MRSA, VISA,VRSA)など耐性菌問題に対してのアプローチに加えて、多剤耐性腸球菌をターゲットとして加えた。我々は哺乳類由来、細菌由来の抗菌ペプチドに比べて強い活性を示す節足動物由来の抗菌ペプチド(IP)を見出し、ブドウ球菌における膜破壊のプロセスを明らかにした。一方、腸球菌ではブドウ球菌とは異なり、膜破壊を伴わない。興味深いことに腸球菌はIPに対して殺菌活性を示さないが、増殖抑制を示す。この理由として、IPは直接細菌のDNAに結合し、その結果として増殖抑制を示すことが示唆された。また、細胞膜に対する作用を知るため、Backlight染色によるLive/Deadアッセイのモデル系を作成した。分子改変ペプチドを含むヒト由来ペプチドによる癌の制御メカニズムにおいてmiRNAによる制御機構を明らかにしてきた。抗菌ペプチドの癌細胞に対する作用は細菌への作用と異なり、膜破壊を伴わずに癌細胞の制御系を介してアポトーシスを誘導し、抗癌活性を示した。大腸癌細胞間では同様の応答が見られた。実際、蛍光標識した抗菌ペプチドは膜破壊を伴わずに細胞内にとりこまれた。その局在はミトコンドリアや核ではなく、細胞質であった。本抗菌ペプチド処理は癌細胞にストレス応答を誘導すると考えられる。そのプロセスとしてエクソソームに変化が見られた。エクソソーム量は抗菌ペプチド処理によって増加した。アレイ解析において癌細胞で発現するmiRNAと共通性が見られただけでなく、新たな癌細胞を制御するmiRNAの存在を示唆することができた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。抗菌ペプチドの機能の統合的解明を目指し、耐性菌問題を抱える感染症制御と新規抗癌剤創製のための分子基盤の2点について検討を行った。抗菌活性についてこれまで複数の膜破壊メカニズムの仮説が提唱されている。種々の抗菌ペプチド(アミノ酸置換体、ショートペプチドを含む)を用いて細菌に対する抗菌活性を調べるとともに、抵抗性・感受性決定因子の解析を行った。黄色ブドウ球菌のうち高度感受性株と低度感受性株の膜性状の違いをガスクロマトグラフィーにおける脂質分析で決定し、その組成の違いが感受性と関連することを明らかにしてきた。本年度においては腸球菌でも同様の結果が得ることができた。さらに異なる要請電荷をもつ分子置換体を作成し、種々の菌株で膜電荷に影響を与える抗菌ペプチド耐性遺伝子やValinomycin処理による膜電位の消失などについても検討を行った。しかし、これらについては有意な差は得られたかった。癌細胞は主に大腸癌細胞をターゲットして検討を行った。抗菌ペプチド処理後、複数の大腸癌細胞で同様のアポトーシスが見られた。抗菌ペプチドの処理によってmiRNAを介した制御系が動くと考え、miRNAマイクロアレイに解析を行った。アレイ解析によってもっともよく濃度依存性の動きを示したmi-663aについて検討したところ、miR-663aによってケモカインレセプターのひとつであるCXCR4が抑制され、最終的に細胞周期調節に重要なp21によって制御を受けていることが分かった。通常の大腸癌細胞を移植し抗菌ペプチドを投与した群およびmiR-663aを強制発現させた大腸癌細胞を移植したマウスでは、コントロール群に比べて腫瘍の形成が抑えられる事も明らかにした。抗菌ペプチドの合成は予定通りに行っている。分子シミュレーションモデルから合成したショートペプチドは薬剤耐性菌に対して期待したほどの活性を示さなかった。細菌の種類による感受性の違いを様々の観点から検討を行った。すなわち、電荷に与える影響を知るため抗菌ペプチド耐性遺伝子(mprF:細胞膜リン脂質リジン化酵素をコードする遺伝子など)の関与、膜の電荷、膜の脂質組成について、メチシリンおよびバンコマイシン耐性遺伝子を保有する腸球菌モデルおよびブドウ球菌モデルで検討した。抗菌ペプチド感受性決定には脂質組成が関連することを明らかにしてきた。癌細胞については特に大腸癌をターゲットにしたとき、いずれの細胞でも抗菌ペプチドによってアポトーシスが誘導された。大腸癌細胞に対する作用機序の解明を、アポトーシス誘導、細胞周期の抑制、細胞内シグナリングプロセスの制御などに焦点を当て、解析した。miRNAマイクロアレイに解析およびシグナル系の解析を通じて、癌細胞制御系の一端を明らかにすることができた。変化の認められたmiRNAを同定でき、そお機能を知るためにエレクトロポーションによる遺伝子導入を行い、mi-663a強発現大腸癌細胞の作製を試みた。しかし、非効率であるため、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入方法に切り替え、mi-663a強発現大腸癌細胞の作成に成功した。この細胞はマウスのXenograftモデルにおいて通常の癌細胞に比べて増殖が著しく抑制されていた。平成29-30年度に予定していた抗菌ペプチドによる癌抑制効果の分子メカニズムを示すことができた。

一方、腸球菌ではブドウ球菌とは異なり、膜破壊を伴わない。興味深いことに腸球菌はIPに対して殺菌活性を示さないが、増殖抑制を示す。この理由として、IPは直接細菌のDNAに結合し、その結果として増殖抑制を示すことが示唆された。また、細胞膜に対する作用を知るため、Backlight染色によるLive/Deadアッセイのモデル系を作成した。分子改変ペプチドを含むヒト由来ペプチドによる癌の制御メカニズムにおいてmiRNAによる制御機構を明らかにしてきた。抗菌ペプチドの癌細胞に対する作用は細菌への作用と異なり、膜破壊を伴わずに癌細胞の制御系を介してアポトーシスを誘導し、抗癌活性を示した。大腸癌細胞間では同様の応答が見られた。実際、蛍光標識した抗菌ペプチドは膜破壊を伴わずに細胞内にとりこまれた。その局在はミトコンドリアや核ではなく、細胞質であった。本抗菌ペプチド処理は癌細胞にストレス応答を誘導すると考えられる。そのプロセスとしてエクソソームに変化が見られた。エクソソーム量は抗菌ペプチド処理によって増加した。アレイ解析において癌細胞で発現するmiRNAと共通性が見られただけでなく、新たな癌細胞を制御するmiRNAの存在を示唆することができた。細菌に対する作用はとくに薬剤耐性菌を標的として、殺菌活性や増殖抑制作用だけでなく、バイオフィルム形成阻害およびバイオフィルムへの浸透性を検討する。さらに、新規活性として運動性制御試験を行う。自然免疫系機能分子として,我々は補体系レクチン経路のマンノース結合レクチン(MBL)が細菌の運動性制御に関わることを見出しているため、運動性阻害効果について抗菌ペプチドとMBLとの比較検討や相乗効果の有無などを検討する。抗菌ペプチドが癌細胞にどのように働くのかを調べるためFAM標識抗菌ペプチドを用いて細胞での局在を調べる。癌細胞に対する作用が細菌に対する作用とは異なり、単なる膜孔形成から生じるもの出ないことを明らかにする。また、イギリスとの共同研究の中で酸化ストレス(ROS)応答にも注目すべきではないかという考えに達した。そこで、ジヒドロエチジウムによる染色によってROSの発生を調べることとする。エクソソームは細胞間コミュニケーションに利用されることが知られている。そこで、内包されるmiRNAが抗菌ペプチド誘導によって自己制御に向かうかどうかを検討する。未処理および抗菌ペプチド処理癌細胞との比較の中でエクソソーム内のmiRNAの質的・量的違いに着目して検討する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
ナイル川全流域モデルの構築による持続的潅漑利水管理と洪水防御に関する研究

ナイル川流域の利水及び治水について問題を整理し、水資源の持続的利用のための現況ダム貯留水量の最大限活用のための潅漑水利用効率の向上、そして高水管理など、計画上重要な問題について検討した。乾燥地における貴重な水資源の有効利用のため、アフリカ最大88万haの面積をもつゲジラ潅漑地区において、潅漑水管理の合理化のための基礎となる試験を行った。降水量、流量等の限られた水文データという制約下で、ナイル川流域の水資源の評価と利用に関して、ナイル川総流量の大半を占める青ナイル川の流量把握に関するモデルの開発を行い、白ナイル川に関してはその流量特性に支配的影響をもつ広大なスッド湿地城の水域及び貯留水量の年間変動特性を明らかにした。さらに日本の河川流域管理を参照しながら今後のナイル川モデルについて考察した。ナイル川水需給関係で重要な作物用水量と直結する蒸発散量について、衛星データによる算定値を実測値と比較し、熱収支法の乾燥地域での実用性を確かめ、実蒸発散量の空間分布特性を明らかにした。また、水資源逼迫下での潅漑効率の向上を目指した実験的研究を行った。主要穀物ソルガムの潅漑効率はナイル川水資源利用に影響が大きいが、作付け時期や潅漑間断日数による用水量及び収量の変化を明らかにして、水資源の有効利用のための生育及び潅漑方法について実証的な検討を行った。大流域河川のモデル化について、一般に入手可能なデータとして既存データベースを用いて降水入力量を与え、関係気象データを基に蒸発散の空間分布をとらえ、GIS地形データによる流下経路に従って計算した応答関数を適用して目的地点の流出量変化のシミュレーションを行った。これによって年間を通した水資源変動を把握した。さらに洪水対策のための高水計面のあり方や農民参加型の潅漑水管理、防災面での農民の役割について考察した。ナイル全流域モデルを考えるために、ナイル川水資源の重要な課題を整理し、各地点流量の全般的評価を行った。今年度は関係資料の収集と部分モデルの作成を行った。分布型モデル作成の前に、統計的流域応答モデルについて検討し、一般に入手可能なデータとしてデラウエア大学のデータベースを用いて降水入力量を与え、関係気象データを基に蒸発散の空間分布をとらえ、GIS地形データによる流下経路に従って計算した応答関数を適用して目的地点の流出量変化のシミュレーションを行った。実用的な全流域的モデルの現状を把握するためエジプト水資源潅漑省のNile Forecast Centerを訪れ、モデルの実態と利用状況を調査したが、流量予測結果については一部のみ公表しているだけで、その実用性については疑問が持たれた。また、実測流量データについては限界があり、検証地点も多くはとれない状況であった。利水関係ではスーダン・ゲジラ潅漑地区の調査を行い、GPS測量による潅漑地区境界を明確にし、利水環境の基礎調査を行うとともに、農民団体から直接聞き取りによる潅漑水管理の実態と問題点について整理した。GPSによるground truthデータは各作物の蒸発散、水利用を定量する上で重要であった。これらのデータを基にLANDSATデータから算定したゲジラ潅漑地区での蒸発散量の推定値は実測データともよく一致し、広域にわたる潅漑地区全域の蒸発散量の空間分布が明らかになり、用水の合理的配分や利用上有用な情報が得られた。高水管理問題では洪水等の予測に関連して河道流量の時間予測法について検討し、Nearest-Neighbor法、Local-linear Approximation法等による予測精度を比較した。

ナイル上流エルダイム地点での高水及び低水流量の予測結果では、これらの方法での10日前、20日前予測は実用レベルの精度であった。利水及び治水についてナイル川流域の問題を解決するために、日本での状況を参照しつつ検討を進めた。水資源の持続的利用のため、潅漑水利用効率の向上、そして高水管理など、計画上重要な問題について検討した。乾燥地における貴重な水資源の有効利用のため、アフリカ最大88万haの面積をもつゲジラ潅漑地区において、潅漑水管理の合理化に関する基礎的な試験を行った。降水量、流最等の限られた水文データという制約下で、ナイル川流域の水資源の保全と利用に関して、ナイル川総流量の大半を占める青ナイル川の流量把握に関するモデルの開発を行い、白ナイル川に関してはその流量特性に支配的影響をもつ広大なスッド湿地域の水域及び貯留水量の年間変動特性を明らかにし、さらに今後のナイル川モデルについて考察した。ナイル川水資源利用に関し、作物用水量と密接な関係をもつ実蒸発散量の空間的分布について、衛星データを利用して乾燥地域の特性を明らかにした。また、ゲジラ潅漑地区をモデルに水資源逼迫下での潅漑効率の向上を目指した実験的研究を行った。ゲジラ潅漑地区だけで32万haの作付けが行われる主要穀物ソルガムの潅漑効率はナイル川水資源利用に影響が大きい。作付け時期をずらせた実験では、8月植え付けが潅漑効率上の限界であることを明らかにし、それ以降の植え付けで無駄になる用水を冬作や発電用水などに回すことで、効果的水利用が可能になることを示した。また、潅漑間隔を変えることによる用水量や収量への影響を明らかにした。飼料作物としての大麦の導入による持続・安定的な生産体系を検討した。水源である青ナイル川の流量モデルについて、既存水文気象データを基にして、流域内流動水のモデル化を行い、年間を通した水資源変動を把握した。洪水対策のための高水計画について論じ、計画のあり方や農民参加型の潅漑水管理に加えて防災面での農民の役割について考察した。
歯科用高分子モノマーが象牙質と口腔粘膜組織に及ぼす影響について

【目的】前年度の結果から2-HEMAはGlyceryl mono methacrylate (GM)に比較して組織に対する浸透性、すなわち粘膜固有層を通過し筋層まで達していた事が明らかになった。そこで今回はこれらモノマーの粘膜組織から感作させ、皮膚の遅延型アレルギーを惹起する可能性を検討した。特にGMは市販品の場合純度が低くそのために不純物が感作成立の一要因になることも考えられるため純度をあげるための精製も行った。【材料および方法】動物はSD系雌ラットを約一週間予備飼育した後、合計14匹を使用した。Guinea pig maximization Testの変法を試みた。すなわち全身麻酔を施した後、左右頬粘膜に各々0.3mlを塗布し擦過した。その後、一週間後二次感作として再度同様に頬粘膜に塗布した。一週間飼育後ラット背部を剃毛しモノマーを塗布24、48時間後の皮膚反応を観察した。また、GMの精製方法は活性炭とセライトを用いアスピレーター中で吸引し、精製した。純度の分析はガスクロマトグラフィーを使用した。【結果および考察】2-HEMA純度の高いGMは従来より用いてきた者と比較して明らかに感差成立の可能性が低下した。不純物は皮膚タンパクと結合し、感作の大きな原因と考えられる。また従来のGMが約80%に対し精製することによって約93%まで上昇した。今後、ランゲルハンス細胞へのモノマーの集積を観察し、遅延型アレルギー反応の現象を検討する。【目的】今回我々はこれらモノマーの粘膜組織に対する浸透性を検討するために、ラット頬粘膜に2-HEMA及びGlyceryl mono methacrylate(GM)を直接塗布し、その経時的な粘膜浸透深度を病理組織学的に観察した。全身麻酔を施した後、左右頬粘膜に各々0.3mlを塗布し擦過した。塗布直後、10分、30分、1時間、6時間、24時間、1週間後に粘膜を採取し、凍結乾燥切片を作成し切片とした。HISTOFINE SAB-PO(R)キットを使用し特異染色を行い観察した。これら切片にはまず1次抗体(ポリクローナル抗体)を反応させ、次に2次抗体としてビオクチン標識抗ウサギIgG抗体(2-HEMA抗体)を反応させた。続いてペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを反応させることにより抗原部位(2-HEMA)を特異染色(茶褐色)し光学顕微鏡にて観察を行った。【結果および考察】2-HEMAはGMと比較して広範囲かつ深層まで浸透している像が観察された。また経時的変化については、時間が経過するにつれその浸透の度合いも強まり、2-HEMAをラットの頬粘膜に塗布して1時間後に採取した切片の特異染色像は筋層にまで浸透している像が観察された。この現象は硬組織すなわち象牙質に対しても同様なことが考えられるため、さらに詳細を検討中である。【目的】前年度の結果から2-HEMAはGlyceryl mono methacrylate(GM)に比較して組織に対する浸透性、すなわち粘膜固有層を通過し筋層まで達していた事が明らかになった。

一週間飼育後ラット背部を剃毛しモノマーを塗布24、48時間後の皮膚反応を観察した。また、GMの精製方法は活性炭とセライトを用いアスピレーター中で吸引し、精製した。純度の分析はガスクロマトグラフィーを使用した。【結果および考察】2-HEMA純度の高いGMは従来より用いてきた者と比較して明らかに感差成立の可能性が低下した。不純物は皮膚タンパクと結合し、感作の大きな原因と考えられる。また従来のGMが約80%に対し精製することによって約93%まで上昇した。今後、ランゲルハンス細胞へのモノマーの集積を観察し、遅延型アレルギー反応の現象を検討する。
一線維リアルタイム観察に基づくアミロイド線維形成機構の解明

いくつかのアミロイド蛋白質を材料として、全反射蛍光顕微鏡による一線維・リアルタイム解析を行い、アミロイド線維の形成機構を探った。また、重水素交換-溶液NMR解析によって、β2ミクログロブリンの線維形成中間体の解析を進めた。マイクロプレートリーダと超音波処理と組み合わせたアミロイドアッセイ法を開発して、アミロイド形成反応を解析した。以上より、アミロイドは、過飽和条件下でペプチドや蛋白質が析出することによって形成する固体構造であること、過飽和が全体の反応を支配する重要な因子であることを見出した。透析アミロイドーシスの原因となるβ2ミクログロブリン、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβ、II型糖尿病の原因となるIslet Amyloid Polypeptide (IAPP)を材料として、全反射蛍光顕微鏡による一線維・リアルタイム解析を行い、アミロイド超分子構造の形成機構を探った。これと並行して、溶液NMRと重水素交換反応を組み合わせた構造解析を行い、アミロイド中間体の立体構造を解析した。(1)全反射蛍光顕微鏡によるアミロイド線維形成反応の一線維・リアルタイム観察:全反射蛍光顕微鏡を用いて、アミロイド超分子構造形成の分子機構を研究した。特にアミロイドβを用いて、レーザー光によるアミロイドの損傷と爆発的増殖:線維形成の直接観察を進めた。レーザーエネルギーに対して、弱いときはアミロイドの増殖、強いときは崩壊が起き、全体でベル型の依存性を示すことを明らかにした。(2)溶液NMRによる線維中間体の解析:重水素交換-溶液NMR解析によって、β2ミクログロブリンの線維形成中間体を解析した。線維の側面に結合した初期中間体の蓄積すること、このような中間体ではまだ水素結合は形成されておらず、重水素交換からも保護されていないことを明らかにした。(3)マイクロプレートリーダの活用:マイクロプレートリーダを購入したことにより、アミロイドのアッセイが容易になった。超音波処理と組み合わせ、多検体に対して、超高速で簡便にアミロイド線維を作製する方法を開発した。透析アミロイドーシスの原因となるβ2ミクログロブリン、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβ、II型糖尿病の原因となるIslet Amyloid Polypeptide (IAPP)、角膜変性症の原因となるケラトエピセリンを材料として、全反射蛍光顕微鏡による一線維・リアルタイム解析を行い、アミロイド超分子構造の形成機構を探った。(1)全反射蛍光顕微鏡によるアミロイド線維形成反応の一線維・リアルタイム観察:全反射蛍光顕微鏡を用いて、アミロイド超分子構造形成の分子機構に関する研究を進めた。特にケラトエピセリンの部分ペプチドを用いて、レーザー光によるアミロイドの損傷の直接観察を進めた。レーザーによるアミロイドの破壊を利用することによって、アミロイドーシスの新たな治療方法を開発できることを示唆した。(2)溶液NMRによる線維中間体の解析:重水素交換-溶液NMR解析によって、β2ミクログロブリンの線維形成中間体の解析を更に進めた。線維の側面に結合した初期中間体が生じる原因を、蛋白質の溶解性の視点から考察した。(3)マイクロプレートリーダの活用:マイクロプレートリーダと超音波処理と組み合わせたアミロイドアッセイ法を開発して、さまざまな蛋白質やペプチドのアミロイド形成反応を解析した。そして、アミロイドは、過飽和条件下で比較的短いペプチドや蛋白質が析出することによって形成する固体構造であることを提唱した。いくつかのアミロイド原性蛋白質、ペプチドを材料として、全反射蛍光顕微鏡による一線維・リアルタイム解析を行い、アミロイド超分子構造の形成機構を探った。なお、本研究で用いた蛋白質は、透析アミロイドーシスの原因となるβ2ミクログロブリン、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβ、II型糖尿病の原因となるIslet Amyloid Polypeptide(IAPP)、角膜変性症の原因となるケラトエピセリンなどである。全反射蛍光顕微鏡によるアミロイド線維形成反応の一線維・リアルタイム観察:全反射蛍光顕微鏡を用いて、アミロイド超分子構造形成の分子機構に関する研究を進めた。また、2種類の蛍光試薬を用いることによって、アミロイド蛋白質が、既存のアミロイド線維の側面に結合した中間体を検出できることを示した。溶液NMRによる線維中間体の解析:重水素交換-溶液NMR解析によって、β2ミクログロブリンの線維形成中間体の解析を進めた。溶液状態では比較的コンパクトな前駆体が、より広がった変性構造を形成することによって、アミロイド線維の側面に結合することを示した。マイクロプレートリーダの活用:マイクロプレートリーダと超音波処理と組み合わせたアミロイドアッセイ法を開発して、さまざまな蛋白質やペプチドのアミロイド形成反応を解析した。

アミロイドは、過飽和条件下で比較的短いペプチドや蛋白質が析出することによって形成する固体構造であること、過飽和が全体の反応を支配する重要な因子であることを見出した。
甲状腺特異的転写因子とヒト甲状腺の発生異常

今年度は、マウス、ヒトの甲状線特異的転写因子TTF1 cDNAのクローニングを行っている。マウスの肺よりRNAを抽出し、RT-PCR法でTTF1 cDNAのクローニングを行っている。具体的には、TTF1遺伝子は甲状腺と肺に特異的に発現しているので、肺よりAGPC法でtotal RNAを抽出し逆転写酵素を用いてcDNAプールを合成した。これまで報告されていたラットのTTF1 cDNAより作成した蛋白コード領域の5'端と3'端に位置する一組のプライマーを用いてこのcDNAプールよりTTF1 cDNAをPCR法で増幅し、プラスミドベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、TTF-1蛋白の5'端と3'端の各11と10アミノ酸を除く部分のcDNAの中間領域の塩基配列を同定した。この中間領域のアミノ酸配列ははラットと約99%一致していた。残る5'端と3'端の塩基配列については現在、RACE5'とRACE3'を用いてクローニング中である。甲状腺が低形成のマウスモデルであるhytマウスのcDNAも同様にRT-PCR法を利用して構造解析中である。ヒトのTTF1 cDNAは、ヒト甲状腺のファージcDNAライブラリーよりマウスTTF1 cDNAをプローブとしてクローニング中で、現在、ファージクローンが得られ、プラスミドベクターにサブクローニングし、構造解析中である。
光励起イオニクス現象を利用したナノスイッチの開発

ナノスケールの金属イオン伝導を利用した,抵抗スイッチング素子を開発した。酸化物薄膜を用いた素子のスイッチ動作機構は,不均一核形成による金属架橋の構築と,ジュール熱に伴う熱化学的反応による架橋の溶解から成ることを見出した。提案した動作モデルの妥当性は,スイッチ動作の温度変化が古典的な核形成理論によって説明できる事実によって実証された。同様のスイッチ素子が,高分子電解質膜中の金属イオンの伝導を利用して実現された。さらに,光照射によるスイッチング現象もカルコゲナイドガラス膜を用いた素子において観測された。本研究は,光照射の有無により高抵抗(オフ)状態と低抵抗(オン)状態を繰り返し遷移する光制御型抵抗変化スイッチの開発とそのナノスケール化を目的としている。具体的には,イオン伝導体薄膜の両側を金属および透明電極で挟み込んだ素子構造を作製し,透明電極側からレーザー光を照射して光誘起の固体電気化学反応により伝導体膜内に金属のフィラメント構造を形成しオン状態を作り出す。20年度はスイッチ材料の最有力候補であるイオン-電子混合伝導体の硫化銀(Ag_2S)を用いた素子化を試みた。レーザー堆積法を用いることにより,均一な膜を得ることに成功した。この膜を用いて,Ag/Ag_2S/ITO素子を作製したが,スイッチ動作を確認することはできなかった。Ag_2S膜上に上部電極(Ag,ITOどちらでも)を付ける時にAgが析出・溶解反応を起こしてしまうことがわかった。この結果はAg_2Sが本研究の素子作製方法には適しておらず,より安定な電解質材料を探す必要があることを意味している。現在,カルコゲナイドガラスのGeSと超イオン伝導体のRbAg_4I_5を用いた素子を作るために,それぞれの材料の薄膜作製方法を検討している。また,Ta_2O_5やSiO_2などの還元されにくい酸化物薄膜でも,電圧印加下でAgやCuの金属イオンが固体電気化学反応により内部に金属フィラメントを形成することを見出した。この結果は光スイッチ材料として酸化物も候補になり得ることを意味しており,現在その可能性も検討している。21年度はカルコゲナイド(GeS)を用いて素子化を試みた。Ag/GeS/ITO素子を作製したが,スイッチ動作を確認することはできなかった。これはGeS膜上にAg電極を堆積するとAgが溶解してしまうことに起因することがわかった。Ta_2O_5やSiO_2などの還元されにくい酸化物薄膜でも,AgやCuを用いたMIM構造において電圧印加下により抵抗変化が起こることを見出した。電流-電圧測定,初期状態からオン状態までの電流-時間測定,およびオン抵抗の温度依存性を測定した結果,電気化学反応により金属フィラメントが酸化膜中に形成されてオン状態になること,またオフ化は電流に伴うジュール熱にアシストされたフィラメントの熱酸化および拡散によるフィラメントの切断に対応することを明らかにした。固体電解質としてイオン伝導性ポリマーを用いた抵抗変化素子の開発に成功し,Ag塩濃度を制御することにより,安定なスイッチ動作を可能にすることを見出した。カルコゲナイドガラスの一種であるGeSを用いて,Si基板上にPt/GeS/Ag素子を作製した。素子はバイポーラ型の抵抗スイッチを示すことを見出した。温度変化に対するスイッチ動作の詳細な測定から,観測された抵抗変化はGeS中のAgイオン伝導による金属フィラメントの形成と溶解に起因すると結論した。この材料を用いて光誘起抵抗スイッチの実験を進めている。Cu/Ta_2O_5/Pt素子の抵抗スイッチの動作機構を解明した。提案した動作機構モデルの妥当性を検討するため,スイッチ特性の温度依存性を詳細に調べた。その結果,オン/オフ電圧の変化は核形成理論によって説明できること,また,熱伝導理論に基づいた計算から,オフ過程は熱的な効果が重要であることを見出した。固体電解質としてイオン伝導性ポリマーを用いた抵抗変化素子の開発に成功し,Ag塩濃度を制御することにより,安定なスイッチ動作が可能になることを見出した。
gem-ハロゲン化合物の新規合成法の開発と利用

gem-ハロゲン化合物を有用な合成素子として捉え、そのハロゲン基を足がかりとした種々のC-C結合形成反応を行うことで有用有機分子への変換反応に利用することを目的に研究を行った。まずsp2炭素上のgem-ハロゲンユニットの利用として、その複数のハロゲン原子のC-C結合形成反応への応用を検討した。具体的なターゲットとして興味深い生理活性を有することが期待できる複素環を持つレチノイド誘導体を取り上げた。すなわち、gem-ハロゲンユニットを有するピリジン誘導体について、トルエン溶媒中、アルキルリチウムを反応させた後、クエンチすると高選択的にトランスの立体配置を有するブロモアルケン誘導体が得られることを明らかにした。さらにこの反応をメチル基の選択的導入に展開することで、立体選択的な3置換ブロモアルケン誘導体を合成することも可能となった。さらに、残存するハロゲン基を足がかりとしたポリエン系の合成にも成功し、すべての2重結合の立体配置がトランスであるピリジン環を有するレチノイド誘導体を合成することが出来た。他方、同様の方法論をキノリン環を有する誘導体に展開すべく検討を行った。まずキノリン環の7位にハロゲン基を有する誘導体を合成した後、ポリエン系の誘導体へと構造展開を行った。このポリエンの内、適切な位置に配置した3重結合の選択的な2重結合への部分還元反応を検討した。その結果、Cu/Znのアマルガムを用いた反応条件でその選択的な還元に成功したばかりでなく、シス型2重結合への立体選択的還元も可能であることを明らかにした。現在、合成に成功した誘導体を用いて、視覚の分子機構へのアプローチを行っている。gem-ハロゲン化合物を有用な合成素子として捉え、そのユニークな利用法の開発を目的に研究を行った。sp^2炭素上のgem-ハロゲンユニットの利用sp^2炭素上のgem-ハロゲンユニットとして、ジブロモアルケン誘導体の反応性について検討した。特に今回は、ピリジン環を部分構造として持つジブロモアルケンについて検討を行った。すなわち、gem-ジブロモアルケンユニットを有するピリジン誘導体について、トルエンあるいはTHF溶媒中、アルキルリチウムを反応させた後、水にてクエンチすると、高選択的にトランスの立体配置を有するプロモアルケン誘導体が得られることを明らかにした。さらにこの反応をアルキル基の選択的導入に展開することで、立体選択的な3置換プロモアルケン誘導体の合成にも成功した。この際得られたプロモアルケン誘導体については、ピリジン環を有するレチノイド誘導体の合成に展開した。その結果、典型的なG蛋白質共役型受容体である視物質ロドプシンの機能解明に有用な複素環含有レチノイド誘導体を合成することに成功した。sp^3炭素上のgem-ハロゲンユニットの利用一方、sp^3炭素を有するgem-ハロゲン化合物として四臭化炭素を取り上げ、その選択的なアルキル基の導入を検討した。sp^3-sp^3カップリングに有効であると報告されている鈴木-宮浦カップリング条件を本反応系に適用し、ホスフィン配位子をスクリーニングするなど種々検討を行った。その結果、溶媒をTHFとし、Pd(OAc)_2,P(2-furyl)_3の組み合わせを用いた条件において、最高12%の収率で選択的なモノアルキル化が進行することが判明した。また本反応は配位子なしでも進行することが明らかになっており、現在その反応機構の解明および収率の向上を目指し努力している。
新しい動物モデルを用いた眼型トキソカラ症の発症機序に関する研究

平成11年度から13年度の3年間にわたる科学研究費の交付期間中に達成された眼型トキソカラ症の発症機序に関する研究成果の概要は以下の通りである。(1)眼トキソカラ症の動物実験モデルとしてスナネズミスナネズミ(Meriones unguiculatus)がこれまで報告されたいかなる動物よりも眼病変の発症率が高いことを発見した。またその病変はイヌ回虫卵の単一回経口投与によっておき,これまでの眼内直接投与による病変と異なり,ヒトの発症病理を理解する上できわめて優れたモデル動物であることを明らかにすることができた。(2)スナネズミの眼底に出現した病変を病理組織学的に検討した結果,出血病変は網膜深層出血、表層出血に分類でき,一部の個体では網膜神経層の増殖病変や好酸球浸潤を伴った血管炎が観察された。このような病変の出現頻度と分布は小動物用眼底観察装置を用いて詳細に経過を観察し,スナネズミにおける眼トキソカラ症のnatural historyを明らかにし得たことは重要な成果であった。(3)このスナネズミをモデル動物として用いることによって,ネコ回虫によってもイヌ回虫幼虫と同じ出血病変が網膜内に出現することを証明することができた。(4)スナネズミに感染したイヌ回虫幼虫の眼内移行経路を追究するために生きた幼虫17匹の大脳に直接注入したところ17匹中1匹は24時間以内に死亡したが、生存した16匹中8匹(50%)の眼底に幼虫注入後6日目で出血病巣を認めることができた。また、1匹については出血病変は認められなかったが網膜上に幼虫を確認することができた。まったく病変を認めることができなかったのは7匹(43%)であった。病理組織学的に、視紳経と視交叉に幼虫の断端を認めた。また、視神経の周囲には好酸球浸潤を伴っていた。このことから,大脳内の幼虫は視交叉を通り視神経から網膜にはいることが実験的に確かめられた。一方,内伏在静脈から直接生きた幼虫を注入した実験では網膜に幼虫の出現を認めず,また出血性病変も認めなかった。(5)眼トキソカラ症を発症したスナネズミの眼内液中にイヌ回虫幼虫排泄物抗原特異的な抗体を証明することができた。本年度の研究において,スナネズミ(Meriones unguiculatus)が眼トキソカラ症の実験モデルとして極めて有用であることを実証できた。すなわち,イヌ回虫幼虫包蔵卵(17eggs/Kg)を経口投与した20匹のスナネズミの眼底を小動物用眼底観察撮影装置により経時的に観察したところ,19匹の個体(40眼中30眼)に出血性病変がみられた。その種類は硝子体出血,網脈絡膜出血,網膜出血であり,感染後3日目から出現した。また,滲出性病変は20匹中15匹(27眼)に,血管炎は16匹(26眼)にみられた。病変の出現に左右差は認められなかったが,耳側および鼻側周辺部に集中して出現する傾向が強かった。

一方,11匹のBALB/cマウスに同量の幼虫包蔵卵を投与したときには,8個体(72.7%)で出血病巣を認めたが,スナネズミでみられたような,硝子体出血,網脈絡膜出血はみられず,その程度も軽微であった。感染スナネズミでみられた血管炎は病理組織学的には好酸球とリンパ球を主体とする血管周囲炎であり,視神経束にも好酸球浸潤が認められた。網膜内を活発に動く幼虫は全観察期間を通してみられ,時に硝子体腔にも幼虫がみられた。感染後のスナネズミの抗体産生を,抗スナネズミIgG血清(宮崎医科大学名和教授より分与)を用いてELISA法により測定したところ,イヌ回虫幼虫排泄物抗原に対する眼内液中の抗体は血清中の抗体の上昇に遅れて検出された。また,その抗体価も血清中の抗体価と比較すると低いものであった。更に,眼内液中の抗体と眼内に移行した幼虫数との間には正の相関がみられた。補助金を交付された2年目の平成12年度は,前年度において確立された眼トキソカラ症の動物モデル(スナネズミMeriones ungiculatus)を用いて,ネコ回虫によっても眼病変が惹起できることを明らかにすることができた。しかしその病変の程度はイヌ回虫と較べ弱く,かつ頻度も低かった。またイヌ回虫で見られたような再燃は認められなかった。イヌ回虫感染スナネズミの網膜病変をさらに詳しく病理組織学的に観察したところ,リンパ球の浸潤を伴ったぶどう膜炎が感染後期のスナネズミで認められた。また,イヌ回虫を感染させたスナネズミの約半数で神経症状が見られることを確認し,その脳病変を組織学的に追究したところ,小脳の神経線維の脱落,グリア細胞の消失など,不可逆的な小脳変性がその病態発現に関与していることを明らかにした。これまで80匹余りのスナネズミに経口感染を行いその眼底を観察してきたが,ヒトで見られるような肉芽腫形成にまで至るスナネズミはl例もなかった。そのため,幼虫排泄物抗原をあらかじめ眼内に直接投与した後に経口感染する実験をおこない,既感作眼の網膜病変の程度を非感作眼と比較した。その結果,既感作眼,非感作眼の病変に差は認められなかった。また幼虫の眼内への移行経路を追究するために,幼虫を脳内に直接接種したところ,1週目に幼虫が眼内に出現し,大脳内に移行した幼虫が直接眼内に移行することが初めて証明された。補助金を交付された最終年度の平成13年度は,眼トキソカラ症の動物実験モデルとして今回の交付金申請中に新しく発見したスナネズミ(Meriones unguiculatus)を用いて,眼内移行経路を詳細に解析した。イヌ回虫の幼虫がどのような経路を通って網膜内に出現するかについてはこれまで眼球の解剖学的特徴から,血行性,神経行性の2通りがあると考えられて来たが,これを裏付ける実験成績はいままで報告されていなかった。これまで2年間にわたる観察から,網膜病変は感染後4日目頃に現れる出血病巣と,それよりも遅れて出現する出血病巣があり,遅れて出現する出血病変は2カ月後に突然現れることもあった。そこで,これらの遅れて出現する出血病巣は,いったん脳内に侵入した幼虫が神経経路を伝って網膜に繰り返し侵入するために起こるのではないかとの仮説のもとに,スナネズミの大脳に生きた幼虫を直接注入し,網膜病変が出現するか否かを観察した。注入方法は,頭皮を切皮後23ゲージの注射針を用いて頭蓋骨を穿刺し,生きた幼虫約300隻を17匹のスナネズミの大脳内に直接接種した。17匹中1匹は24時間以内に死亡したが,生存した16匹を対象に眼底を経時的に観察した。その結果,出血病変は幼虫注入後6日目に初めて出現し,16匹中8匹(50%)に出血病巣を認めることができた。
超伝導渦糸フローが生み出す新しいスピン流の理論的探求

電子のもつスピン自由度を利用する電子技術はスピントロニクスと呼ばれ、次世代エレクトロニクスを担う有力候補として世界中で研究が進んでいます。このスピントロニクス機能を超伝導体を用いる量子計算機に組み込む将来を考えると、超伝導とスピントロニクスを組み合わせた超伝導スピントロニクスの探求は大きな意義を持ちます。スピン1重項の超伝導体はスピン偏極を嫌いますが、超伝導の渦糸中心ではスピン偏極が生き残ります。本研究では、これまでの超伝導スピントロニクスで注目されて来なかったこの超伝導渦糸のダイナミクスに注目し、渦糸フローによって作り出される全く新しいスピン流の性質について明らかとします。
形状加工シュミレ-タに関する研究

形状加工シュミレ-タの開発は、生産システムの自動化を高めるための一手段である。すなわち、形状加工シュミレ-タは実際に加工現象を事前に予測することができ、CAMシステムにおける有力な検証手段と考えられるためである。しかし、形状加工シュミレ-タは幾何形状の高速干渉処理を可能とする処理アリゴリズムを必要としているめ、CADにおける幾何モデルを基にするシュミレ-タは干渉処理の高速化に有効な手法がなく、実用的形状加工シュミレ-タは未だ実現されていない。前年度研究では、物本形状の干渉処理の高速化を実現するため、Voxelデ-タ構造による加工シュミレ-タの開発を目的とし研究を行った。そこで本年度は、開発した加工シュミレ-タの具体的応用とその総合的評価を行うために以下の研究項目に関して研究を行った。1)工具干渉情報を利用したNCデ-タ自動修正処理機能の開発2)格子空間情報の高速・高精度画像表示アルゴリズムの開発また、加工シュミレ-タの基礎理論の研究を新たに平成元年度において研究を開始し、形状加工の数学的モデルの構築が可能であることを明らかにした。形状加工シュミュレータの開発は生産システムの自動化を高めるための一手段である。すなわち、形状加工シュイミレータは実際に加工現象を事前に予測することができ、CAMシステムにおける有力な検証手段と考えられるためである。しかし、形状加工シュミレータは幾何形状の高速干渉処理を可能とする処理アルゴリズムを必要としているため、CADにおける幾何モデルを基にするシュミレータは干渉処理の高速化に有効な手段が無く、実用的形状加工シュミレータはいまだ実現されていない。そこで本研究では、物体形状の干渉処理の高速化を実現するため、Voxelデータ構造による加工シュミレータの開発を目的とし、以下の項目について研究を行った。(1)スケーリングと逐次代入法による形状モデルVoxel空間への高速・高精度変換アルゴリズの開発(2)加工シュミレーションにおける工具移動包絡体のVoxel空間への表示のための微小移動積分法の開発(3)被加工物、切削工具、治具間の全ての干渉状況を独立に認識できるアルゴリズムを提案した。(4)これらのデータ構造、アルゴリズムに基づき、EWS上で形状加工シュミレータの基礎研究を行った。しか、形状加工シュミレ-タは幾何形状の高速干渉処理を可能とする処理アルゴリズムを必要としているため、CADにおける幾何モデルを基にするシュミレ-タは干渉処理の高速化に有効な手法がなく、実用的形状加工シュミレ-タは未だ実現されていない。前年度研究では、物体形状の干渉処理の高速化を実現するためVoxelデ-タ構造による加工シュミレ-タの開発を目的として研究を行った。
リグナンの生合成酵素と立体化学

リグナンの生合成は不明である。カラスザンショウのフロフラン型リグナン類〔例えば(-)-ピノレジノール〕の絶対配置は(8S,8'S)であるが、これらの生合成研究例はない。また、その(-)-セコイソラリシレジノールの立体配置は逆に(8R,8'R)であり興味深い。これらのリグナンの生合成を解明するためにカラスザンショウ、イヌザンショウの若枝を用いて、取り込み実験と粗酵素実験を行い、以下の成果を得た。(1)リグナン類と〔8-^<14>C〕コニフェリルアルコール(CA)を合成して標品・基質として用いた。(2)種々のHPLC分析条件を確立した。(3)両植物の若枝の切断面に〔8-^<14>C〕CAを投与したところ、〔^<14>C〕は茎と葉のピノレジノールに取り込まれたが、エピピノレジノール、セサミン、アサリニンには取り込まれなかった。セコイソラリシレジノールとラリシレジノールについては検討中である。(4)無細胞推出液と〔8-^<14>C〕CAをNADPH/H_20_2の存在下で、また、それと(±)-ピノレジノールをNADPH存在下でインキュベートすると、いずれも(+)-ラリシレジノールが得られた。これはCAから生じた(±)-ピノレジノールの(+)体の一部が酵素的に(+)-ラリシレジノールに還元されたことを示す。この立体配置は(8R,8'R)であり、(-)-セコイソラリシレジノールのそれに対応するが、セコイソラリシレジノールを生成する酵素活性は得られていなく、この点は今後の課題である。残りのピノレジノールは天然の符号と同じ(-)体である。(5)可溶性の酵素を除いた不溶性残さを〔8-^4C〕CAと補因子なしでインキュベートすると、ほぼラセミ体のピノレジノールが生成した。NAD/リンゴ酸を添加して生じたピノレジノールは(-)/(+)=53.5:46.5でわずかに(-)体が多かった。不溶性残さ中に存在する細胞壁結合型ラッカーゼが、溶存酸素を用いて(±)-ピノレジノールを与えたと推定される。しかし、(-)-ピノレジノールが有意に多いとは断定できず、それを選択的に与える酵素については今後さらに検討する必要がある。リグナンは生物活性のある植物フェノール性成分であるが、この生合成は不明である。その酵素レベル及び光学異性体レベルの研究は緒に就いたところであり、集中的な検討を必要とする。リグナンの生合成経路と立体化学を解明するために、本研究では日本産のサンショウ属を対象とし、レンギョウ属と比較する。ピノレジノールの旋光度は前者では(-)であるが、後者では(+)である。一方、セコイソラリシレジノールは両属共に(-)と大変興味深い。

そこで、コニフェリルアルコールや(±)-ピノレジノールから上記リグナン類の生成を、取込み実験と粗酵素実験によって検討することを目的とする。本年度は植物を準備し、リグナンとその前駆体の合成と分析条件を確立し、粗酵素実験の開始を目指したところ、以下の実績を得た。(1)サンショウ及びイヌザンショウを移植して本学構内で栽培した。本学の樹林地と構内のカラスザンショウとシナレンギョウを確保した。(2)HPLCによるリグナンの分析条件を求めた。(3)上記のサンショウ樹皮とシナレンギョウ若枝のリグナンのHPLC分析を行い、イヌザンショウからセコイソラリシレジノールとシリンガレジノールを、シナレンギョウからラリシレジノールをそれぞれ初めて検出した。(4)前駆体コニフェリルアルコールの標識化合物として重水素化合物を合成し、[^<14>C]化合物を合成中である。(5)ピノレジノール、ラリシレジノール、セコイソラリシレジノール及びシリンガレジノールを合成した。(6)イヌザンショウから粗酵素を抽出し、ピノレジノールとNADPHの存在下でインキュベーションした。(7)生成物としてラリシレジノールをHPLCで検出し、さらにこれが(+)体であることをキラルHPLCで明らかにした。このものは本粗酵素による(+)-ピノレジノールの立体特異的還元によって生成したとみなされる。レンギョウ属以外から初めてリグナン生合成酵素活性を検出したが、この活性は両属リグナンの立体化学の差異に重要な示唆を与える。リグナンの生合成は明らかでない。特にカラスザンショウのフロフラン型リグナン類の絶対配置は(8S,8'S)で、この立体配置をもつリグナン生合成研究はない。また、同植物の(-)-セコイソラリシレジノールの絶対配置は逆に(8R,8'R)であり興味深い。これらの生合成を解明するためにカラスザンショウと近縁のイヌザンショウを用いて、取り込み実験と粗酵素実験を行い、以下の実績を得た。(1)[8-^<14>C]コニフェリルアルコール(C.A.)を合成して前駆体・基質として用いた。(2)両植物の若枝を用いて[8-C.A.の取り込みを行い、茎と葉からの抽出物中のピノレジノールに^<14>Cが取り込まれたが、エピピノレジノール、セサミン、アサリニンへの取り込みは検出されなかった。セコイソラリシレジノールとラリシレジノールについては他成分との分離を検討中である。(3)若枝の無細胞抽出液と[8-^<14>C]C.A.をNADPH/H_2O_2の存在下でインキュベートした。(+)と(-)-ピノレジノールの生成が認められ、前者の放射能が少なかったが、これと同程度(+)-ラリシレジノールも生じた。セコイソラリシレジノールのピークは放射能を示したが、コントロールと比較して検討している。(4)細胞壁不溶性残さを[8-^<14>C]または[9-D_2,OCD_3]C.A.と補因子なしでインキュベートした。両植物ともにピノレジノールが生成した。ピノレジノール画分を分取してキラルカラムで分離したところ、光学異性体の比率は(-)/(+)=53.5:46.5であった。(5)以上、in vivoでC.A.がピノレジノールを与え、in vitroで可溶性粗酵素がC.A.を(±)-ピノレジノールにして、このうちの(+)-ピノレジノールが一部(+)-ラリシレジノールとなることが明らかになった。この立体配置は(8R,8'R)であり、(-)-セコイソラリシレジノールに対応する。残余のピノレジノールが(-)を示すとすると立体化学が説明できる。