hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造成農地における計画排水量決定のための洪水流出モデルの総合化に関する研究

本研究では、この難点を解消するため、造成農地の出水特性を明らかにして、代表的な洪水流出モデルの総合化を試みるもので、今年度は、造成農地だけでなく、山地の流出特性も検討した。主な成果は以下の通りである。1.造成農地流域と山林地流域の直接流出特性を対比した結果、造成農地の直接流出率は山林地より大きく、数十mmの降雨で1020%、100mm程度の降雨で50%以上となった。また、浸透強度は山林地で1.3mm/h、造成農地で0.9mm/hとなり、この差が直接流出特性の相違に大きな影響を与えていることを明らかにした。2.開畑流域に表面流モデルを適用し、表面流としてマニング則が最もよく適合すること、その際の等価粗度は0.050.16の範囲にあること、洪水到達時間式の土地利用係数は80100にあることを明らかにした。3.タンクモデルの適応性を山地6流域で確かめるとともに、貯留関数法との相互関係を議論して、洪水流出タンクモデルの総合化を試みた。4.島根県西部の益田開拓農地造成域内の11団地流域、内田川流域および音無川流域で観測された過去の出水資料に基づき、従来の代表的な洪水流出モデルを改良・統合して、分布型にも利用でき、かつ物理的にも意味のある新たな流出モデルを開発した。5.加古川流域で洪水流出モデルの適応性と有効性を吟味した。また、流域水資源の有効利用や持続的開発の立場から、洪水流出モデルの重要性を考察した。造成農地などにおける合理的な排水計画の作成に際しては、流域の出水特性を明確にする必要があるが、そのための基礎資料はまだ不十分な状態にある。本研究では、この難点を解消するため、造成農地の出水特性を明らかにして、代表的な洪水流出モデルの総合化を試みるもので、今年度の主な成果は以下の通りである。1.農地造成流域で観測した出水資料で3種の貯留型流出モデルの最適定数を求め、モデル定数と土地利用形態等の流域特性等との関連を考察した。2.造成畑地流域の観測洪水に貯留関数法を適用し、Pは0.6に固定可能であり、Kは圃場の利用状況によって0.41.1の範囲にあることを明らかにした。また、降雨余剰を定めるための雨水保留特性を検討考察した。3.畑地流域と山林流域の雨水保留量曲線と初期土湿不足量の関係を明らかにした。また、保留量曲線の上下限値の包絡曲線を定式化して、そのパラメータを求めた。4.農地造成等の排水計画において単位図はなお実用的な手法として利用されている。この単位図を一般化するため、流域規模の異なる多くの山地流域に単位図を適用して、その結果に基づき、任意流域の単位図を作成する簡便な手法を提案した。5.表面流モデルを都市化が進む山地流域に適用し、斜面域の等価粗度はほぼ0.50.7であることを示した。6.ベキ乗型タンクモデルの適応性を新たに山地3流域で確かめた。7.昨年度提示した相互関係式から、対象流域のモデルの一覧表を作成した。また、雨水保留量曲線を式表示して、各流域の値の一覧表も作成した。
機械学習を実装した計量経済モデルの推定と検定

本研究では、機械学習理論を計量経済モデルに融合し、精度の高い推定方法を新たに提案する。分析対象となる集団のすべてからデータを得るには、多くの時間と費用を要する。このため、集団全体ではなく、一部からのみデータを抽出し分析を行うことが多い。しかしこの時、集団の一部のデータしか使わないことによる誤差が生じる。有限標本を用いた分析の制度を高めるには、この誤差から生じる影響が少ない分析手法を適用することが望ましい。本研究では近年発達している機械学習理論を計量経済モデルに融合することで、有限標本の下で精度の高い推定方法を新たに開発し、その性質を明らかにする。
癌原遺伝子産物Src型キナーゼの細胞内局在解析による機能解明へのアプローチ

細胞内蛋白質の多くは局在が厳密に制御され、特定の細胞内領域に存在している。Src型キナーゼはc-Src/Lyn/c-Yes/Fyn/Lck/Hck/c-Fgr/Blkの8種類から成り、細胞内小器官にも局在するが、Lynとc-Srcは異なる細胞内局在をしていることから、細胞内のリン酸化シグナルにも違いが生じ、細胞に及ぼす影響も異なってくると予想される。Src型チロシンキナーゼは、N末端脂肪酸付加によって細胞膜に係留し、細胞膜直下において、受容体からのシグナルを伝達し、増殖・分化・運動・生存・形態変化などに深く関与すると考えられている。Lynは免疫細胞に、c-Srcは破骨細胞に、Fynは神経細胞で互いに相補できない機能を有していることが既に報告されているが、細胞表面膜直下以外では、機能は殆ど明らかでない。本研究では、Src型キナーゼの細胞内小器官での機能解明のアプローチとして、Src型キナーゼの細胞内輸送経路と局在を研究した。貪食細胞や癌細胞などでは、外界から栄養などを取り込むためにマクロピノソームの機能が亢進していることが知られている。マクロピノソームにc-Srcが脂質アンカーで係留していることが明らかとなり、さらに、緑色蛍光蛋白質融合c-Srcを生細胞でモニターすると、細胞膜で生成したマクロピノソームが細胞内へと輸送されてゆくことがリアルタイムで可視化できた。また、マクロピノソームの生成とリソソームとの融合にc-Srcキナーゼ活性が必要であることも明らかとなった。さらに、c-Srcの仲間であるLynやc-Yes、Fynはマクロピノソームには殆ど係留されなかったので、Srcファミリーメンバー間での機能の差異が見い出された。さらに、細胞分裂の最後のフェーズはミッドボディー構造の切断を含む細胞質分裂期と呼ばれている。Src型チロシンキナーゼ酵素活性はそのミッドボディー切断に深く関わっていることが見い出された。Srcキナーゼのシグナル伝達下流でErkが活性化され、Rab11陽性の輸送小胞によって活性化型Erkがミッドボディーまで運ばれて、切断に関わることが示された。癌原遺伝子産物Src型チロシンキナーゼは、少なくとも8種類の分子から構成され、細胞活動の中枢的役割を果たしている。本研究はSrc型キナーゼの機能特異性の原因を探るため、Lynとc-Srcの二つのSrc型キナーゼを中心に、その時空間的な細胞内局在の解明を目指した。また、これまでSrc型キナーゼは主に細胞膜の受容体直下で機能することが報告されてきたが、細胞内小器官でのSrc型キナーゼ機能の探索を行った。1.Lynの局在と機能(1)Lynはゴルジ装置から細胞膜へ一方向性に輸送されていることを明らかにした。(2)Lynはゴルジ装置において、活性酸素刺激に応答してAnnexin IIタンパク質をチロシンリン酸化し、その細胞内局在を制御していることを明らかにした。(1)c-Srcは、Lynとは異なり、細胞膜と細胞内のエンドソーム(後期エンドソーム、リソソーム)を恒常的にリサイクリングしていることを明らかにした。C-Srcはクラスリン依存性にエンンドサイトーシスされる。(2)c-Srcはエンドソームの融合過程を促進することを明らかにした。ゴルジ装置に局在するLynはエンドソーム融合を促進しない。(3)c-Src特異的機能として、マクロピノサイトーシス(細胞外液の非選択的細胞内取込み)の誘導を発見した。3.局在選別メカニズム(1)Lynとc-Srcの局在の違いはパルミチン酸修飾の有無に依存することを見出した(有:Lyn、無:c-Src)。パルミチン酸修飾を受けないLyn変異体はc-Srcと同様の細胞内局在と機能(エンドソーム融合、マクロピノサイトーシス促進)を示す。(2)他のパルミチン酸修飾Src型キナーゼであるFynとYesもゴルジ装置に局在する。

また、マクロピノソームの生成とリソソームとの融合にc-Srcキナーゼ活性が必要であることも明らかとなった。さらに、c-Srcの仲間であるLynやc-Yes、Fynはマクロピノソームには殆ど係留されなかったので、Srcファミリーメンバー間での機能の差異が見い出された。さらに、細胞分裂の最後のフェーズはミッドボディー構造の切断を含む細胞質分裂期と呼ばれている。Src型チロシンキナーゼ酵素活性はそのミッドボディー切断に深く関わっていることが見い出された。Srcキナーゼのシグナル伝達下流でErkが活性化され、Rab11陽性の輸送小胞によって活性化型Erkがミッドボディーまで運ばれて、切断に関わることが示された。
終末期がん患者と家族が共に実施するライフレビューが死別前後の家族にもたらす影響

現時点で、研究協力者は4家族である。以下、逝去前の患者と家族が共に実施するライフレビュー・インタビューにおける留意点を示す。1.現在の家族関係について話すことを躊躇される状況:初回のライフレビューインタビューに参加していない家族がいる場合やすでに死別されている家族員との関係性については、話すことをためらうことがある。そのことを念頭に置き、積極的に聞くことは控え、話さなくても良いことを伝える。また、初回ライフレビューインタビューの際に、参加している家族との関係性についても同様の場合は、患者自身の生い立ちや自身の親との関わりなどがその後の人生の価値観や子育て、仕事のへの向き合い方にどう影響しているのかなどから、今の家族内で大事にしている価値とのつながりについて発問をする。2.患者の話に耳を傾けたいと家族が希望する場合:特に親子の場合、初回のライフレビューインタビューでは、家族は患者である親の語りに耳を傾けたいと希望されることがある。その場合、初回のライフレビューインタビュー後の家族のみのインタビューの際に追加したい内容や家族自身の思いが語られる。これらをもとに、2回目の確認のためのライフレビューインタビューにて、患者・家族間の円環的なコミュニケーションを促進する発問をする。また、本調査全体を通して、協力者の職業や家族構成など、研究結果に影響を与えない内容で個人が特定される可能性があるデータは匿名化する。研究者の所属が変わり、研究協力者を推薦してもらう施設との関係の構築に時間を要した。新しいフィールドにて研究協力者を募り、データ数を増加していく。また、臨床の看護師が、ライフレビューインタビューのインタビュアーになれるように、インタビューの手順だけでなく、留意点についても研究結果として示していく。1)本年度の実績本研究の目的の第1段階は終末期がん患者と家族とともにライフレビュー・インタビューを実施したことが、死別前の患者ー家族間のコミュニケーションを含む関係性や家族自身にどのような影響を及ぼしたのかを質的に明らかにすることである。ホスピス・緩和ケア病棟にて、療養中の終末期にあるがん患者と家族、1組を対象にライフレビュー・インタビューを実施した。家族への個別インタビューの結果、本介入の意義として、「時系列に家族の歴史を振り返ることで、どんな家族であったのか、大事にしてきた価値に気づく」、「患者の生きざまや言葉が力になる」、「患者と家族の互いを思い合う言葉を伝える場となる」、「患者の今の自分に対する思いを知ることができる」、「患者にとって自分の人生を振り返る機会になり、そのことを家族も満足する」、「その時々の家族が知らなかった患者の思いを知る」、「患者の曖昧な記憶や言葉が出てこない部分を家族が継ぎ足し、ストーリーになり、共有できる」、「ドキュメントを読むことで出来事の意味を深く考え、言語化する」などが明らかになった。2)今後の研究の展開ホスピス・緩和ケア病棟にて療養中の患者・家族への介入を継続するとともに、在宅にて療養中の参加者を募るため、当該施設に協力を依頼する。さらに、インタビューガイドの質問項目のほかに、患者と家族が何を、どのように語るのかその相互作用、研究者の質問に対する語られ方や内容から、実施準備やライフレビューを促進する質問方法、必要とされるコミュニケーションスキル、留意点についても、分析を同時に進めていく。終末期がん患者と家族とともにライフレビュー・インタビューの実施は平成27から29年度までの3年間で10名を超えることを目標に計画しているため。本年度の実績終末期がん患者と家族とともにライフレビュー・インタビューを行い、死別前後の家族への影響に関する半構造的インタビューを継続して実施している。現在3組の患者・家族にライフレビュー・インタビューを行い、家族へのインタビューの実施状況は、死別前の家族は3組、そのうち死別後の家族は1組である。ライフレビュー・インタビューを通して、初めは3組の患者・家族共に、「平凡な」・「普通の」家族と話しながらも、患者が大事にしてきた価値、患者の思い、他の家族員の支援などを再認識し、今を生きていることの実感する、互いに感謝の思いを伝え合う機会となっていた。また、2組の家族は、≪ドキュメントに追加したい・相手に伝えたい言葉が溢れる≫体験をしていた。ライフレビュー・インタビューが刺激となり、表出したい思いの増大や家族間コミュニケーションの促進、またドキュメントを共に作るという一体感が生じるといった効果が示唆された。死別後の家族インタビュー(1組)では、ライフレビュー・インタビューを実施したことの効果にについて、1.故人が大事にしてきた価値を今の生活に取り込みながら生きていく力(故人が肯定した自分の道をまっすぐ前を向いて生きていきたい、自分の居場所を大事に今、ここで生きることに誠実に笑顔で向き合いたい、故人を手本に人を愛し・愛される生き方をしたい)、2.生き方の道標でもあり、今の自分がどうであるかを見つめる機能(こうありたいと願う心のありようであるか見つめる、折に触れ読み返すことで、自分がどう生きていくのか変わっていく自分と変わらないものとの対話を可能にする)を語った。対象としている終末期がん患者の状態悪化が早く、家族の心情を考慮し、話し合いの結果、途中で中止したケースもあった。また、患者・家族にとって、話したいと思えるタイミングをつかむのが難しいこともあった。研究協力者は4家族であり、そのうち患者逝去後の遺族インタビューが実施できたのは3家族であった。以下、患者と家族が共に実施するライフレビュー・インタビューが死別前後の家族にどのような影響を与えたのかについて、インタビューデータからコード化し、コードから類似性にそって抽出したサブカテゴリーを<>、カテゴリー化したものを【】で示す。

1.死別前の家族への影響:下記の6つのカテゴリーに集約された。【家族としての生き方を認める】は、ライフレビュー・インタビューを通して、<自分たち家族の価値を再認識する><家族で幸せであったと思いを馳せる>を含み、家族としての人生を改めて肯定的に認識した。他に、【患者から尊重された自分の生き方を認める】【患者の人生の統合に参加する】【引き継がれてきた家族の思いや生き方を継承する】【患者らしく生きられるよう家族で支える】【互いに思いや感謝を伝え合う】が抽出された。2.死別後の家族への影響:下記の5つのカテゴリー【ドキュメントを活用し、故人について話すきっかけとなる】【死別体験を通して自分の生き方を考える】【故人とのつながりを自らの生き方に組み入れる】【患者は幸せな生であったと振り返る】【ライフレビュー・インタビュー内容を悲嘆の苦しみなく振り返ることができる】に集約された。特に【ライフレビュー・インタビュー内容を悲嘆の苦しみなく振り返ることができる】は、死別後、患者との思い出を語ることは辛いことであるが、<ライレフビュー・インタビューを実施した場面が充実した時間だったと振り返る><患者が望んだ語りができ満足に思っていたことで家族も良かったと思える>というように、ライフレビューの内容が患者や自分自身に対して、肯定的にとらえられた結果が影響していた。研究代表者の所属変更に伴い、継続した介入が困難になったため。現時点で、研究協力者は4家族である。以下、逝去前の患者と家族が共に実施するライフレビュー・インタビューにおける留意点を示す。1.現在の家族関係について話すことを躊躇される状況:初回のライフレビューインタビューに参加していない家族がいる場合やすでに死別されている家族員との関係性については、話すことをためらうことがある。そのことを念頭に置き、積極的に聞くことは控え、話さなくても良いことを伝える。また、初回ライフレビューインタビューの際に、参加している家族との関係性についても同様の場合は、患者自身の生い立ちや自身の親との関わりなどがその後の人生の価値観や子育て、仕事のへの向き合い方にどう影響しているのかなどから、今の家族内で大事にしている価値とのつながりについて発問をする。2.患者の話に耳を傾けたいと家族が希望する場合:特に親子の場合、初回のライフレビューインタビューでは、家族は患者である親の語りに耳を傾けたいと希望されることがある。その場合、初回のライフレビューインタビュー後の家族のみのインタビューの際に追加したい内容や家族自身の思いが語られる。これらをもとに、2回目の確認のためのライフレビューインタビューにて、患者・家族間の円環的なコミュニケーションを促進する発問をする。また、本調査全体を通して、協力者の職業や家族構成など、研究結果に影響を与えない内容で個人が特定される可能性があるデータは匿名化する。
鉄ニクタイド系超伝導体の超伝導機構の解明と新規高温超伝導物質の探索

本研究の目的の一つである鉄ニクタイド系超伝導体の超伝導機構の解明に向けて以下の二点を明らかにした。1LaFeAsO_<1-x>D_xの中性子非弾性散乱測定を行い、x=0.1, 0.4の時にスピン揺らぎの増大を確認した。従来まで電子をFe一つ当たり0.3個ほどドーピングすると反強磁性揺らぎは消失すると考えられてきたが、本実験によりLaFeAsO_<1-x>D_xの二つ目の超伝導相(0.2<x<0.45)下においてもスピン揺らぎが増大することが分かった。二つ目の超伝導相の方が、従来まで知られていた一つ目の超伝導相(0.05<x<0.2)よりも超伝導転移温度が高いため、今回発見した高ドープ域のスピン揺らぎの起源や超伝導との関係性を調べることにより、より高T_cをもつ超伝導体の設計が期待できる2LaFeAsO_<1-x>Hxの中性子回折、ミューオンスピン緩和、放射光X線回折測定を行い、x>0.4に斜方晶への構造相転移とそれに付随する反強磁性転移を発見した。従来まで鉄系は単一の反強磁性のみを持っと考えられてきたが、本研究により、二つの反強磁性相に挟まれた二つの超伝導相を示す相図が明らかになった。La系に外圧を3GPa以上印加するとこの二つの超伝導相は合体しT_cは50K近くにまで上昇する。これらの知見から、本研究によって見出された二つの反強磁性相から派生する二種のスピン揺らぎが協調し合うことで鉄系の最高T_cが実現している可能性がある。これは、複数軌道がFemi準位にかかる鉄系ならではの特長と考えられ、高温超伝導体の新規設計指針になる可能性がある。(抄録なし)本研究の目的の一つである鉄ニクタイド系超伝導体の超伝導機構の解明に向けて以下の二点を明らかにした。(抄録なし)
変異リボトキシンを用いたリボソーム暗号解読中心の研究

1.コリシンE3,E4,E6のC末端ドメインE3C,E4C,E6Cと,E3Cの活性中心変異体(E517Q),およびそれぞれのインヒビターImmE3,ImmE4,ImmE6と,E3耐性を獲得したImmE6点変異体(W47C)を精製し,各Cドメインのリボソーム失活活性,リボソームの結合特性,Immとの結合特性といった分子レベルでの特異性を,各imm遺伝子の各コリシンに対する耐性度(免疫性)という生物学的特異性と対照させた.まず,E4CとE6Cはいずれもリボソームに対しE3Cと同一の作用様式を持つことを明らかにした.さらにC/Immの解離平衡定数Kdが10^<-8>M以上ではコリシン感受性となり,効果的な1アミノ酸置換でKdは1桁小さくなって辛うじて耐性を獲得すること,この閾値は,Immと結合が競争関係にあるリボソームとCドメインとのKdが規定していること,またKdは結合ではなく解離の速度定数だけで決定されていることが判明し,正しい複合体では大きな構造変化の起こっている可能性が考えられた.2.NMRによりE6CとImmE6の立体構造を決定した.E6Cは逆平行5本鎖βシートを骨格とし,β3-β4上に活性中心があり,シートに対して裏側のβ1-β2のループの付け根に特異性決定基がある.ImmE6は先に決定していたImmE3に似て,逆平行4本鎖βシートとループから成り,特異性決定基はシートの端に存在していた.chemical-shift perturbationでE6C,ImmE6両分子の結合面を同定した.さらに遺伝学的に推定していた特異性決定基,E6CのA496とImmE6のW47間に分子間NOEを観測し,これらが直接相互作用していることがわかった.また遊離のImmE6分子上では,二つの特異性決定基H5とW47間に側鎖間NOEを見出し,協同性が推定された.コリシンE3のC末端,E3CドメインはRNase活性は弱いが,70Sリボソーム中の16S-rRNAの3'末端から49番目の部位を効率よく切断してリボソームを失活させ,蛋白合成を止めて大腸菌を殺すので,E3Cはリボソームの特別な構造を認識していると思われる.E3生産大腸菌は,E3Cに対する特異的阻害蛋白ImmE3を合成して自殺を免れる.さてCドメインの相同性が高いコリシンE4とE6は,同じく蛋白合成を止めて菌を殺すが,E3,E4,E6生産菌は自分のコリシン以外には感受性で,Imm蛋白による耐性の特異性は高い.本研究では,(1)コリシンの活性中心の検索とリボソームに対する酵素学的解析,(2)コリシンとインヒビターのin vitroの結合特異性の定量化とin vivoの耐性市区異性の関係の解析,(3)コリシン/リボソーム間相互作用とコリシン/Imm間相互作用の関係を解析した.(2)非変性電気泳動のゲルシフトアッセイで,各CドメインとImmとの結合特異性を定性的に調べた.また各CとImmとの結合速度定数,解離速度定数,解離平衡定数を求め,in vivoの耐性特異性がC/T2A間の結合の平衡定数で説明できること,それは解離の速度で決定されていることを示した.(3)E3Cとリボソームとの結合を定量化し,in vivo耐性を与えるImmE3はリボソームより強く,耐性を与えないImmはリボソームより弱くE3Cに結合することを示し,生理現象を定量的に説明し得た.1.コリシンE3,E4,E6のC末端ドメインE3C,E4C,E6Cと,E3Cの活性中心変異体(E517Q),およびそれぞれのインヒビターImmE3,ImmE4,ImmE6と,E3耐性を獲得したImmE6点変異体(W47C)を精製し,各Cドメインのリボソーム失活活性,リボソームの結合特性,Immとの結合特性といった分子レベルでの特異性を,各imm遺伝子の各コリシンに対する耐性度(免疫性)という生物学的特異性と対照させた.まず,E4CとE6Cはいずれもリボソームに対しE3Cと同一の作用様式を持つことを明らかにした.さらにC/Immの解離平衡定数Kdが10^<-8>M以上ではコリシン感受性となり,効果的な1アミノ酸置換でKdは1桁小さくなって辛うじて耐性を獲得すること,この閾値は,Immと結合が競争関係にあるリボソームとCドメインとのKdが規定していること,またKdは結合ではなく解離の速度定数だけで決定されていることが判明し,正しい複合体では大きな構造変化の起こっている可能性が考えられた.2.NMRによりE6CとImmE6の立体構造を決定した.E6Cは逆平行5本鎖βシートを骨格とし,β3-β4上に活性中心があり,シートに対して裏側のβ1-β2のループの付け根に特異性決定基がある.ImmE6は先に決定していたImmE3に似て,逆平行4本鎖βシートとループから成り,特異性決定基はシートの端に存在していた.chemical-shift perturbationでE6C,ImmE6両分子の結合面を同定した.さらに遺伝学的に推定していた特異性決定基,E6CのA496とImmE6のW47間に分子間NOEを観測し,これらが直接相互作用していることがわかった.また遊離のImmE6分子上では,二つの特異性決定基H5とW47間に側鎖間NOEを見出し,協同性が推定された.
劇症型心筋炎に対する診断と治療の一体化開発

(2)Gdキレート脂質を含有するリポソーム(Gdリポソーム)のインライン製造法の確立:DPPC/DPPG/DOPC/DOPG (モル比1:1:1:1)にGdキレート脂質を全脂質量比約7%添加した脂質組成で、平均粒子径が約100nmとなるインラインリポソーム製造条件(脂質量、有機溶媒濃度、反応温度、流速等)を最適化した。(3) Gdリポソームの物性評価:物性評価:Gdリポソーム中のGdの定量法を、高周波誘導結合プラズマ発光分光分析法(ICP-AES)を用いて確立した。(4) nAChR選択的アゴニストAR-R17779内包リポソーム(アゴニストリポソーム)のインライン製造法の確立:DPPC/DPPG/DOPC/DOPG (モル比1:1:1:1)の脂質組成で、AR-R17779を脂質重量比で約5%内包し、平均粒子径が約100nmのアゴニストリポソームのインライン製造条件(脂質量、有機溶媒濃度、反応温度、流速等)を最適化した。(5)アゴニストリポソームの物性評価:リポソームに内包されたAR-R17779の定量法を、LC-MS/MS法により確立した。(1) Gdキレート脂質の開発:DOTA修飾PE(キレート脂質)の初期合成法を確立しており、順調に進展している。(2)Gdキレート脂質を含有するリポソーム(Gdリポソーム)のインライン製造法の確立:Gdキレート脂質を全脂質量比約7%添加した脂質組成で、平均粒子径が約100nmとなるインラインリポソーム製造条件を確立しており、順調に進展している。(3) Gdリポソームの物性評価:物性評価:Gdリポソーム中のGdの定量法の確立に時間を要したが、概ね順調に進展している。(4) nAChR選択的アゴニストリポソーム(アゴニストリポソーム)のインライン製造法の確立: nAChR選択的アゴニストAR-R17779を脂質重量比で約5%内包し、平均粒子径が約100nmのアゴニストリポソームのインライン製造条件を確立した。疎水性の高い7nAChR選択的アゴニストについてのリポソーム化の検討は次年度に持ち越しとなったが、おおむね順調に進展している。(5)アゴニストリポソームの物性評価:リポソームに内包されたAR-R17779の定量法の確立に時間を要したが、概ね順調に進展している。(1)市販Gdキレート修飾脂質を用いたGdリポソームの開発:Gdの標識効率を上げるため、市販Gdキレート修飾脂質を用いてGdリポソームのインライン製造法を確立する。(2)Gdリポソームの薬物動態評価:血中動態評価:正常マウス(ラット)へ静脈内投与後の血中動態を、GdのICP-AES測定により行う。薬物濃度パラメーター(C0、Cmax、T1/2、AUC等)を算出する。(3) Gdリポソームの造影能の評価:自己免疫性の劇症型心筋炎モデルを用い、心筋炎肖像をMRI画像検査によって検出可能か検討する。(4)疎水性の高い7nAChR選択的アゴニスト(A582941、DMBX-A、PNU282987、A844606、4BP-TQS等)についてもリポソーム化を検討する。(5)アゴニストリポソームの薬物動態評価:正常マウス(またはラット)へアゴニストリポソームを静脈内投与後の血中動態を、アゴニストのLC-MS/MS測定により行う。(6)アゴニストリポソームの薬効評価:自己免疫性の両劇症型心筋炎モデルに静脈内投与し、心機能評価(心エコー、心臓カテーテル)、組織学的評価(心臓への炎症細胞浸潤、繊維化等)、生化学的評価(心筋組織中の炎症性サイトカイン量)の測定により総合的な薬効評価を行う。

(5)アゴニストリポソームの物性評価:リポソームに内包されたAR-R17779の定量法を、LC-MS/MS法により確立した。(1) Gdキレート脂質の開発:DOTA修飾PE(キレート脂質)の初期合成法を確立しており、順調に進展している。(2)Gdキレート脂質を含有するリポソーム(Gdリポソーム)のインライン製造法の確立:Gdキレート脂質を全脂質量比約7%添加した脂質組成で、平均粒子径が約100nmとなるインラインリポソーム製造条件を確立しており、順調に進展している。(3) Gdリポソームの物性評価:物性評価:Gdリポソーム中のGdの定量法の確立に時間を要したが、概ね順調に進展している。(4) nAChR選択的アゴニストリポソーム(アゴニストリポソーム)のインライン製造法の確立: nAChR選択的アゴニストAR-R17779を脂質重量比で約5%内包し、平均粒子径が約100nmのアゴニストリポソームのインライン製造条件を確立した。疎水性の高い7nAChR選択的アゴニストについてのリポソーム化の検討は次年度に持ち越しとなったが、おおむね順調に進展している。(5)アゴニストリポソームの物性評価:リポソームに内包されたAR-R17779の定量法の確立に時間を要したが、概ね順調に進展している。(1)市販Gdキレート修飾脂質を用いたGdリポソームの開発:Gdの標識効率を上げるため、市販Gdキレート修飾脂質を用いてGdリポソームのインライン製造法を確立する。(2)Gdリポソームの薬物動態評価:血中動態評価:正常マウス(ラット)へ静脈内投与後の血中動態を、GdのICP-AES測定により行う。薬物濃度パラメーター(C0、Cmax、T1/2、AUC等)を算出する。(3) Gdリポソームの造影能の評価:自己免疫性の劇症型心筋炎モデルを用い、心筋炎肖像をMRI画像検査によって検出可能か検討する。(4)疎水性の高い7nAChR選択的アゴニスト(A582941、DMBX-A、PNU282987、A844606、4BP-TQS等)についてもリポソーム化を検討する。(5)アゴニストリポソームの薬物動態評価:正常マウス(またはラット)へアゴニストリポソームを静脈内投与後の血中動態を、アゴニストのLC-MS/MS測定により行う。(6)アゴニストリポソームの薬効評価:自己免疫性の両劇症型心筋炎モデルに静脈内投与し、心機能評価(心エコー、心臓カテーテル)、組織学的評価(心臓への炎症細胞浸潤、繊維化等)、生化学的評価(心筋組織中の炎症性サイトカイン量)の測定により総合的な薬効評価を行う。<次年度使用額が生じた理由>当該年度中に研究代表者が香川大学から大阪大学へ移動し、機材の移設等に時間を要したため、疎水性の高い7nAChR選択的アゴニストについてのリポソーム化の検討を次年度に実施することとなった。<使用計画>疎水性の高い7nAChR選択的アゴニストの購入費に充てる。
葛根湯の粘膜免疫系での制御性T細胞誘導による抗アレルギー効果

食物アレルギーの患者数は急増しているが、未だ有効な治療方法がない疾患である。申請者は、病態モデルマウスを用いた検討により、漢方薬の葛根湯が食物アレルギーの発症を抑制することを明らかにしている。近年、腸管粘膜免疫系が食物アレルギーの発症に関与することが明らかになってきた。そこで本研究では、葛根湯による腸管粘膜免疫系に対する効果の検討を行い、葛根湯が腸管に制御性T細胞を誘導し、腸管粘膜免疫系を制御することにより治療効果を示すことを明らかにした。食物アレルギーの治療を目指し、食物アレルギー病態モデルマウスを用いて腸管粘膜免疫系に着目した病態解析と治療薬の検討を行った。漢方薬である葛根湯は、食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜免疫系において、過剰に亢進したTh2型免疫応答を抑制することにより治療効果を示すことを明らかにした。腸管粘膜免疫系と腸管神経系は密接に相互作用していることが示唆されている。そこで、漢方薬による詳細な腸管粘膜免疫系の制御を明らかにすることに先立ち、まず始めに、食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜免疫系の制御に対する腸管神経系の関与を検討した。近年、コリン性抗炎症機構として、α7ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化が抗炎症性作用を示すことが報告されている。そこで、この受容体の活性化が、食物アレルギーの症状に対してどのような効果を示すか検討を行った。α7ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化は、葛根湯と同様に食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜免疫系のTh2型免疫応答の過剰亢進を抑制し、腸管の粘膜型マスト細胞の増加を抑制し、食物アレルギー症状を改善することを明らかにした。また、食物アレルギー病態モデルの腸管では、腸管神経のCGRP陽性神経が増加していることを明らかにした。CGRP神経は、食物アレルギーの発症に関与する粘膜型マスト細胞と近接して分布しており、CGRPの分泌増加が食物アレルギー症状の発症に関与することを明らかにした。近年、食物アレルギーの患者数は急増しているが、疾患を治癒もしくは予防する薬物療法はいまだ存在しない。そこで、食物アレルギーの治療を目指し、食物アレルギー病態モデルマウスを用いて腸管粘膜免疫系に着目し治療薬の検討を行った。漢方薬である葛根湯は、食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜固有層において、制御性T細胞を誘導することにより、過剰に亢進したTh2型免疫応答を抑制し、かつマスト細胞の浸潤を抑制し、消化器症状の発症を抑制することを明らかにした。また、葛根湯の構成生薬及び含有成分を用いた治療効果の検討を行い、葛根湯による治療効果は、主に葛根の主成分であるプエラリンによって示されることを明らかにした。アレルギー症状の発症には、症状を呈する組織や臓器へのマスト細胞の浸潤とその脱顆粒が深く関与することが知られている。これまでに、申請者は、食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜固有層において、マスト細胞が神経ペプチドCGRPを発現した神経と近接して増多することを明らかにしている。そこで、CGRPによる粘膜型マスト細胞の制御について検討を行い、CGRPがマスト細胞の脱顆粒を増強させることを明らかにした。さらに、食物アレルギー病態モデルマウスにおいて、CGRP受容体の阻害剤の投与によりアレルギー症状の発症が抑制されることから、マスト細胞の脱顆粒がCGRPによって制御され、その脱顆粒が食物アレルギーの発症に関与することを明らかにした。また、漢方薬の含有成分を用いて、マスト細胞の脱顆粒を指標としたスクリーニングを行い、シコニン、クルクミン、アルカニンが脱顆粒を抑制することを明らかにした。さらに、シコニンは、カルシニューリン阻害剤として作用し、オーファン核内受容体のNr4aファミリーの発現の増加を抑制し、マスト細胞の脱顆粒を抑制することを明らかにした。未だ治療薬治療方法が存在しない食物アレルギーの治療を目指し、食物アレルギー病態モデルマウスを用いて腸管粘膜免疫系に着目した病態解析と治療薬の検討を行った。これまでに申請者は、葛根湯が食物アレルギーの発症を予防的に抑制することを明らかにしている。そこでさらに、詳細な機序を検討するとともに、有効成分の検討を行った。葛根湯の投与は、食物アレルギー病態モデルマウスの腸管粘膜固有層に制御性T細胞を増多した。しかし、抗CD25抗体の投与は、葛根湯による治療効果や制御性T細胞の増多に影響しなかった。従って、葛根湯によって腸管に誘導され治療効果に関与する制御性T細胞は、CD25陰性であることが推察された。また、葛根湯による治療機序の詳細な検討のために、有効成分の検討を行い、葛根の主成分であるプエラリンが主要な効果を示すことを明らかにした。プエラリンは葛根湯と同様に腸管粘膜固有層の制御性T細胞を増多し治療効果を示した。さらに、プエラリンの投与は、腸管に免疫寛容を誘導するCD103陽性樹状細胞を増多することや、制御性T細胞とCD103陽性樹状細胞の誘導に関与するレチノイン酸の産生酵素の発現を増加することを明らかにした。従って、葛根湯やプエラリンは、腸管でのレチノイン酸産生を増加することにより制御性T細胞とCD103陽性樹状細胞を増多し、腸管粘膜免疫系の破綻を改善し食物アレルギー症状に対して治療効果を示すことが示唆された。さらに、プエラリンと構造が類似した物質による治療効果の検討を行い、イソフラボン類の中でもゲニスチンが強い治療効果を示すことを明らかにした。

また、ダイオキシン類であるTCDDも、腸管に制御性T細胞を誘導し治療効果を示すことを明らかにした。食物アレルギーの患者数は急増しているが、未だ有効な治療方法がない疾患である。申請者は、病態モデルマウスを用いた検討により、漢方薬の葛根湯が食物アレルギーの発症を抑制することを明らかにしている。近年、腸管粘膜免疫系が食物アレルギーの発症に関与することが明らかになってきた。そこで本研究では、葛根湯による腸管粘膜免疫系に対する効果の検討を行い、葛根湯が腸管に制御性T細胞を誘導し、腸管粘膜免疫系を制御することにより治療効果を示すことを明らかにした。葛根湯による腸管粘膜への制御性T細胞の誘導機序を検討する目的で、当初の予定通り樹状細胞やナイーブT細胞への葛根湯の作用を検討したが、葛根湯による樹状細胞やT細胞への直接的な作用は検出されなかった。しかし、食物アレルギー病態モデルマウスを用いて葛根湯の構成生薬及び含有成分を用いた治療効果の検討を行い、葛根湯の構成生薬の葛根の主成分であるプエラリンが、レチノイン酸合成を介して制御性T細胞を誘導することより治療効果を示すことを見出した。現在、プエラリンのレチノイン酸合成を介した作用機序について詳細な検討を行っている。また、腸管粘膜免疫系は、食物アレルギーの発症に関与することが報告されているが、複雑かつ精妙に制御されており、その制御機構の詳細は未だ十分には明らかになっていない。そこで、食物アレルギー病態モデルでの腸管粘膜免疫系の制御機構の検討として、腸管神経系による制御機構の検討を行い、腸管粘膜免疫系と腸管神経系は相互作用し、マスト細胞の脱顆粒が腸管神経によって制御されることを明らかにしている。腸管粘膜免疫系の制御機構や葛根湯やその含有成分による効果を明らかにしており、ほぼ予定通り研究が進んでいると考える。消化管生理学、免疫学、薬理学葛根湯による食物アレルギーの改善効果には、主にプエラリンによる腸管粘膜層への制御性T細胞の誘導が関与することを明らかにした。また、このプエラリンによる制御性T細胞の誘導にはレチノイン酸合成が関与することを明らかにしている。腸管における制御性T細胞の誘導には、レチノイン酸合成酵素を発現したCD103陽性樹状細胞の関与が報告されている。そこで、この樹状細胞の分化増殖へのプエラリンの関与を明らかにするために、骨髄細胞を用いて樹状細胞を分化誘導する各種条件下におけるプエラリンとレチノイン酸の効果を検討する。また、プエラリンが直接作用する標的細胞の探索も行い、プエラリンによる治療効果の詳細な機序を検討する。制御性T細胞は免疫寛容を誘導しアレルギー疾患の治療に有効性が示唆されている。そこで、アレルギー症状を発症した食物アレルギー病態モデルを用いて、アレルギー発症後もプエラリンにより、制御性T細胞の誘導が可能かどうか、また、寛容誘導によりアレルギー症状の改善が可能かどうか検討を行う。さらに、アレルギー性鼻炎モデルやアレルギー性皮膚炎モデルなど他のアレルギー疾患モデルマウスを用いて、プエラリンによる制御性T細胞の誘導が、他のアレルギー疾患にも有効であるか検討を行う。以上により、葛根湯を含めた漢方薬によるアレルギー疾患の治療に繋がる研究を進める。漢方薬である葛根湯の治療標的である腸管粘膜免疫系は複雑かつ巧妙に制御されている。
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達系の活性を制御する化合物の探索とその応用

本研究ではHippo pathwayにより活性が制御されている転写コアクチベーターTAZの機能を促進する化合物の探索を行い、得られたTAZ活性化化合物の医療応用展開を目的として研究をすすめた。TAZ活性化化合物の1つ、IBS008738がヘビ毒で誘発されるマウスの骨格筋損傷モデル、ステロイド誘発性筋萎縮モデルにおいて筋線維の回復を促進する作用があることを見出した。また探索から得られたIBS008738以外のTAZ活性化化合物に関しても筋芽細胞の筋管への分化を促進する化合物が複数存在することを確認しており、本研究はTAZ活性化化合物が筋萎縮に有効な薬剤開発につながる可能性を示している。これまでに転写コアクチベーターであるTAZの機能を促進する化合物の探索を目的に、東京医科歯科大学が所有する約20,000化合物からなるライブラリーを用いてスクリーニングを行い、40化合物がTAZによる転写の活性化を増強することを見出している。TAZは腫瘍抑制シグナル伝達系として知られるHippo pathwayにより負に制御されているが、間葉系幹細胞では分化制御に関わることが明らかになっている。スクリーニングから得られたTAZの機能を正に制御する化合物を種々の分化誘導系で評価したところ、マウス間葉系幹細胞の骨分化の促進、脂肪細胞分化の抑制など、生理活性を有するものが含まれていることが認められた。このうち、筋芽細胞株であるC2C12細胞の筋管分化を強く促進する4つの化合物に着目し、解析を進めた。ヘビ毒であるcardiotoxinによる筋損傷モデルに局所投与を行ったところ、1つの化合物が個体でも筋線維の回復を促進する作用を有することが認められ、またその際に骨格筋の再生を担う幹細胞であるsatellite細胞の数が増加していることを見出した。また、TAZのパラログであるYAPの機能を抑制する化合物の探索を目的に、GFP付加したYAPの細胞内局在を核から細胞質への移行を指標として昨年度スクリーニングを行った。得られたヒット化合物に関して今年度は転写因子のTEAD応答性のレポーターアッセイを行い、YAP依存的なTEADの活性化を抑制する化合物を選択した。さらに腫瘍細胞の浸潤能や幹細胞性を抑制する化合物を峻別した。現在これらの化合物に関して腫瘍を移植したマウス個体において腫瘍抑制効果を検証している。本研究ではHippoシグナル伝達系により活性が負に制御されている転写コアクチベーターTAZに関してその機能を促進する化合物の探索を行い、得られたTAZ活性化化合物の医療応用展開を目的として研究を行った。昨年度までTAZ活性化化合物の1つ、IBS008738がヘビ毒で誘発されるマウスの骨格筋損傷モデルにおいて筋線維の回復を促進する作用があることを見出している。本年度はこのIBS008738の薬理作用の解析をさらにすすめ、骨格筋損傷後にIBS008738投与により筋線維再生を担うPax7陽性の筋衛星細胞の増加がcontrol投与に比べて早い段階でおきること、また骨格筋分化を制御する転写因子であるMyoD陽性細胞数が増加する様子を認めている。マウス筋芽細胞C2C12細胞において、IBS008738の添加により筋管分化誘導時に細胞核におけるTAZとMyoDの共局在が増強すること、免疫共沈実験においてTAZとMyoDの結合が促進すること、またクロマチン免疫沈降実験によりIBS008738がTAZによるMyoDの転写活性化を増強することが認められ、IBS008738の筋分化促進作用はTAZによるMyoDの活性化の増強によることが示唆された。IBS008738にはマウスにおけるステロイド誘導性の筋萎縮からの回復を促進する効果も認められ、筋萎縮に対する薬剤の開発につながることが期待される。また、TAZのパラログであり、同じくHippoシグナル伝達系により制御されるYAPの機能を抑制する化合物探索および開発を引き続き行い、本年度は得られているYAPの細胞内局在を核から細胞質へと変化させる化合物にはYAPの機能を負に制御する127番目のセリンのリン酸化誘導によりYAPの機能を抑制している化合物が含まれていることを見出した。同時に得られているYAP阻害化合物にはHippoシグナル伝達系によるリン酸化以外のメカニズムによりYAPの機能を阻害する化合物が含まれており、これらの化合物の作用点の解析はYAPの制御機構の解明につながると考えられる。Hippo pathwayは細胞密度、細胞接着状態に応じて活性化し細胞増殖を制御する細胞内シグナル伝達機構である。ヒト癌症例で高頻度に機能不全が認められ、悪性度と相関するので、腫瘍抑制機構として重視されている一方、その機能亢進が過剰な細胞死を招き臓器障害を起こす可能性が明らかになりつつある。

しかし、現時点ではHippo pathwayを特異的に刺激、阻害する試薬がないため、腫瘍抑制以外のHippo pathwayの生理的、病理的役割は解明が進んでいない。本研究ではHippo pathwayの抑制剤探索を行うと同時に、刺激剤の探索を行う。得られた候補分子を解析し、それらを用いてHippo pathwayの生理的、病理的役割を細胞レベル、個体レベルで解析する。本年度は1. Hippo pathwayによって機能が制御されている転写コアクチベーター、TAZを発現させたMCF10A細胞が、Hippo pathwayの抑制によりsphereとよばれる浮遊細胞塊を形成することを指標に、Hippo pathwayの機能を抑制する化合物の探索を行った。得られた化合物の中に、TAZの結合パートナーであるTEADによる転写を活性化するものが複数含まれていることを見出した。2.また、TAZと同様にHippo pathwayによって機能が抑制される転写コアクチベーターであるYAPにGFPを付加したGFP-YAPを恒常的に発現するU2OS細胞を樹立し、YAPの核外移行を利用したHippo pathwayを活性化する化合物の探索系を確立した。この細胞系を用い、ベータ1アドレナリン受容体のアゴニストであるドブタミンによってHippo pathwayが活性化することを報告した。化合物ライブラリーからYAPの細胞質への移行を促進する化合物のスクリーニングを行った。TAZの機能を促進する薬剤を複数見出すことができ、いくつかの化合物に関しては生理活性を有することを示している。特に筋分化に促進的に機能する化合物に関しては、筋分化過程で重要な機能を果たす転写因子MyoDとTAZの相互作用を増強する可能性を見出している。個体の骨格筋の再生を促進する作用を有することも明らかにしている。YAPの阻害剤に関しては腫瘍細胞の浸潤能や幹細胞性を抑制し培養細胞レベルでは抗腫瘍性を保持することを示している。現在は予定通りマウスモデルにおける抗腫瘍効果の検討に進んでおり、本研究は順調に進行していると考えられる。当初の研究計画において、初年度はHippoシグナルを制御する化合物の探索系の確立とスクリーニングの遂行を計画していた。このうち、探索系に関してはHippoシグナルのいわば出口であるYAP, TAZに関して、前者については局在の変化、後者についてはsphere形成能の獲得という細胞応答を指標とした評価系を確立した。またその評価系を用いたスクリーニング系で、複数のヒット化合物を得ることができ、本研究は順調に進行していると考えられる。(I)筋分化を促進するTAZの機能促進剤に関しては個体の筋萎縮に対する作用を検討するほか、現在誘導体に関して筋分化促進活性の検証を行っている。より強い薬理作用を有する化合物を作成すると共に、化合物を利用したアフィニティーカラムを作成し、薬剤の作用点、作用機序を明らかにしたいと考えている。TAZは複数の転写因子と相互作用し、筋分化過程においてもMyoDだけではなくPax3やTEADなどとも相互作用する。これらの転写因子をどのようにTAZは選別して分化の各段階で相互作用し転写コアクチベーターとして機能するのか、化合物の作用点からTAZによる転写制御の分子メカニズムを解明したいと考えている。(II)
アメリカ民謡の文化史的研究

本研究の目的は、アメリカ民謡(フォークソング)を通して大衆の暮らしの歴史(文化史)をまとめることであった。集めた資料は幅広い分野の民謡にわたっているが、今年度、特に分析を進めたのは浮浪者民謡である。19世紀末から20世紀初頭にかけて、不景気や大量の移民の流入と平行して、アメリカでは浮浪者が激増した。彼らの残した歌や彼らについて書かれた歌はアメリカ独特の民謡であり、文化史を研究する上で重要である。それらの歌は、浮浪者の厳しい生活の現実を映し出したり、彼らのセンチメンタリズムを表現したり、貧しくて定住しない(あるいは、できない)者の論理を反映していたりする。また、浮浪者と関係の深かった鉄道が、貧しい者を人扱いしなかった事の告発的歌詞を通して、野放しの資本主義の害をかいま見ることができる。こうしたことは皆、当時のアメリカの状況をよく伝えてくれるとともに、現在までも続くアメリカらしさを発見し検討する際に大いに参考になる。また、浮浪者民謡は、他のアメリカ民謡と同様に、アメリカ文学に特徴的なトールテ-ル(大げさなほら話)を含み、楽園へのあこがれを表現し、ユーモアにあふれている。よく見ていくと、一つ一つの民謡が他の分野のアメリカ文化と深くかかわり合いながら口承されていったことがわかる。従って、民謡研究はアメリカ文化全般を理解する糸口となりえる。今後は、他の種類のアメリカ民謡について同様に検討と分析を進め、研究成果を随時発表していきたい。また、日本の民謡も視野に入れて研究していくことにより、比較民謡研究へ発展させていきたいと考えている。
P-450依存性エイコサノイドの血管作用と臓器障害における役割の解明

ヒト臍帯由来の血管内皮細胞を培養細胞として用い、20-HETEによる血管内皮機能障害や血管内皮細胞の活性化におけるシグナル伝達機構を検討した。20-HETEは炎症性エイコサノイドであるPGE2やサイトカインであるIL-8の産生を刺激増大し、また酸化ストレスマーカーである8-isoprostane PGF2αを増大した。20-HETEは速やかに強力にMAPKやIkB-αのリン酸化を活性化し、NF-kBのnuclear translocationを刺激した。免疫蛍光染色法にて、そのnuclear translocationはNF-kB阻害薬であるPDTCやSN50で完全に抑制された。また20-HETEによるNF-kBのnuclear translocationはMAPK阻害薬であるPD98059やU126により抑制された。接着分子であるICAMの蛋白発現は20-HETE投与後2.5倍増大し、その増大した蛋白発現はNF-kB阻害薬やMAPK阻害薬により抑制された。結局、20-HETEによりNO利用能の減損や活性酸素の増加が起こり、血管内皮機能障害を来たす。また、20-HETEが引き金となり、まずMAPKがリン酸化され、その後NF-kBが活性化され、炎症性タンパク(IL-8, ICAMなど)を誘導し、血管内皮細胞の活性化を引き起こすと考えられた。メタボリックシンドローム患者において、尿中20-HETE排泄量と酸化ストレスが相関するという報告(Free Radic Biol Med. 2009 ; 46 : 263-70)、また日本人男性において、ヒトで20-HETE産生に関与するP-450 4A11遺伝子が本態性高血圧に関与する報告(J Hypertens. 2008 26 : 453-61)があり、それらの機序に本研究結果が関与している可能性が考えられた。
腫瘍ワクチンによる悪性腫瘍特異的免疫の誘導

(1)腫瘍ワクチンの作製:5.0×10^5のB16 melanomaあるいはSq1979(マウス扁平上皮癌)に対して、0.7KE(0.07mg)のOK-432を加え、pH7.38・室温の条件下で0.2%グルタールアルデヒドを用い1時間重合させ、OK-432重合腫瘍ワクチンを作製した。(2)抗原性の保持:作製したOK-432重合腫瘍ワクチンは、抗OK-432抗体にて染色されることから上記条件下での重合ではOK-432の抗原性は保たれることが示された。また腫瘍自体の抗原性も保持されることが示唆された。(3)安全性:80%以上の重合細胞がトリパンブルーに濃染し、培養しても増殖がみられなかった。300回以上マウスへ接種しても腫瘍は発生しなかった。以上から、OK-432重合腫瘍ワクチンは失活しており宿主に対して極めて安全であると考えられた。(4)有効性:2.0×10^5のB16メラノーマは接種後、21日目で100%の腫瘍発生率を示したが、腫瘍接種前に5.0×10^5のOK-432重合B16細胞(B16ワクチン)を3回免疫した群は42.9%の腫瘍発生率にとどまった(P<0.05)。またコントロール群では40日までには100%のマウスが死亡したが、B16ワクチンを3回免疫した群は42.9%の死亡にとどまった(P<0.05)。さらにこの群の28.5%のマウスが完全にB16メラノーマを拒絶することができた。次に、4.0×10^5のB16メラノーマを接種後にB16ワクチンを免疫してその効果を調べた。コントロール群では25日目までには100%のマウスが死亡したが、B16ワクチンを3回免疫した群は50%の死亡率にとどまった(P<0.05)。次いでOK-432重合Sq1979細胞(Sq1979ワクチン)の効果について調べた。8.0×10^6のSq1979を接種後、Sq1979ワクチンで3回免疫した群は、Sq1979の増殖をきわめて強く抑制した(P<0.01)が、B16ワクチンやOK-432単独では抑制が困難であったことから本方法により腫瘍特異的免疫の誘導が示唆された。腫瘍ワクチンの作製:B16-melanoma 4A5およびSq-1979それぞれ5.0×10^5,8.0×10^5に対して、OK-432 0.7KE(0.07mg)を加え、pH7.38・室温の条件下で0.2%グルタールアルデヒドを用い2時間反応させた。15分後には腫瘍細胞に対して、OK-432が重合した状態いわゆるstar formationが見られはじめた。重合後、800rpm・10分間遠心を2回行い、未反応のOK-432やグルタールアルデヒドを取り除き、腫瘍ワクチンを作製した。腫瘍接種後ワクチン投与(preliminary examination):C3Hマウスに8.0×10^6/150μlのSq-1979を接種後11・25日目に8.0×10^5/150μlの腫瘍ワクチン(V-Sq)を2回接種した。コントロール群には生理食塩水150μlを同様に2回接種した。腫瘍接種後42日経過した時点で、コントロール群の平均腫瘍容積は286mm^3であったのに対して、腫瘍ワクチン接種群では、腫瘍は徐々に小さくなり、平均腫瘍容積は29mm^3と統計学的に有為の差が認められた(P<0.01)。また、C57BL/6マウスに4×10^6/150μlのB16 melanomaを接種後7・14日目に5.0×10^5/150μlの腫瘍ワクチン(V-B16)を2回接種し、コントロール群には生理食塩水150μlを同様に2回接種した。Sq-1979に比べB16 melanomaは急速に増大傾向を示し、腫瘍接種後18日経過した時点で、コントロール群の平均腫瘍容積は9690mm^3,腫瘍ワクチン接種群では9367mm^3と有為の差を認めなかった。しかし生存率を調べると、腫瘍接種後21日経過した時点で,コントロール群は0%であったのに比べ腫瘍ワクチン接種群では、50%と明らかに予後の改善が見られた。

(4)有効性:2.0×10^5のB16メラノーマは接種後、21日目で100%の腫瘍発生率を示したが、腫瘍接種前に5.0×10^5のOK-432重合B16細胞(B16ワクチン)を3回免疫した群は42.9%の腫瘍発生率にとどまった(P<0.05)。またコントロール群では40日までには100%のマウスが死亡したが、B16ワクチンを3回免疫した群は42.9%の死亡にとどまった(P<0.05)。さらにこの群の28.5%のマウスが完全にB16メラノーマを拒絶することができた。次に、4.0×10^5のB16メラノーマを接種後にB16ワクチンを免疫してその効果を調べた。コントロール群では25日目までには100%のマウスが死亡したが、B16ワクチンを3回免疫した群は50%の死亡率にとどまった(P<0.05)。次いでOK-432重合Sq1979細胞(Sq1979ワクチン)の効果について調べた。8.0×10^6のSq1979を接種後、Sq1979ワクチンで3回免疫した群は、Sq1979の増殖をきわめて強く抑制した(P<0.01)が、B16ワクチンやOK-432単独では抑制が困難であったことから本方法により腫瘍特異的免疫の誘導が示唆された。