hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
真空中で作動する軸受部の磁化による耐摩耗性の改善に関する研究

近年の真空機器の発展は目覚ましいものがあり、真空中で作動する軸受部の潤滑法についての研究開発が急務とされているが、未だ完成されたとは言いがたい。本研究は、真空中で作動するすべり軸受けを磁化することによって、摩耗の低減をはかることの可能性を検討したものである。油回転ポンプならびに油拡散ポンプで排気されるアルミ鋳物製真空質の容積は、62×66×45mm^3で、回転主軸の先端部に取付けるアタッチメントによって、ピン・ロータ摩耗試験ならびに軸・軸受け摩耗試験を行うことが出来るように構成されている。また荷重はレバ-を介した重錘で与えられ、ピンの磁化は磁化コイルにより、軸受けはその外周にマグネットシートを巻き付けることで磁化される。1.ピン・ロータ摩耗試験における磁気効果S45CピンとS45Cロータとの組合せによる乾燥繰返し摩耗試験において、大気圧から5×10^2Pa程度の空気圧までの範囲では、ピンを20mTに磁化することによって摩耗面のフラクタル次元は小となり、その結果総摩耗量は3060%減少することがわかった。しかし10^0Paの真空中では、磁化によって摩耗量はわずかではあるが逆に増加する。2.軸・軸受摩耗試験における磁気効果外径φ8f7のS45C軸と内径φ8H7外径φ16長さ8mmのS45Cすべり軸受けとの組合せで、荷重1N摩擦速度11.3m/minで摺動させた場合、10^510^3Paの圧力範囲では、軸受けを20mTに磁化することによって、摩耗量は30%程度減少する。また5×10^2Paにおいて磁化しない場合には焼付きをおこすが、磁化によって微細な酸化摩耗粉を生じて摺動可能となる。しかし10^2Paでは、磁化した場合にも焼付きを生じる。SUS304軸とS4C5軸受けでは、大気中で磁気効果が認められるが、10^3Paにおいては焼付きを生じる。この磁気効果は、軸と軸受けとの嵌合公差によっても変化するので、さらに検討が必要である。
同種生体小腸移植における免疫抑制法の研究

新しい免疫抑制剤の開発により、移植成績が飛躍的に向上し、これまでむずかしいとされてきた小腸移植も可能性あるものとして見直されてきた。我々は今回、短腸症候群に対する生体からの小腸移植を想定し、実験を行った。まずレシーピエントのビーグル犬の小腸を亜全摘し、ドナーの雑種成犬より犠死させない長さとして回腸の60-70cmを採取して同所性に移植した。移植腸管の一部は腹壁に固定し、盲端の外瘻として移植後経時的に生検を行い、組織学的に拒絶反応について検討した。移植を全く行わなかった短腸犬は栄養障害のために平均37日で死亡した(n=3)。小腸移植後免疫抑制剤を全く使わないコントロール群は組織学的に強い拒絶反応の像を伴い、9日以内に死亡した(n=6)。移植後にCyclosporine(CsA)10mg/kgとFK506(FK)0.05mg/kgを併用投与した群の平均生着日数は28日であったが(n=5)、組織学的には中等度から高度の拒絶反応の像を示し、また著明な体重減少が見られた。T細胞、B細胞系ともに抑制するRS61443(RS)20mg/kg単独投与の生着日数は16日と軽度の生着延長のみであった。それに対し、CsA5mg/kg,FK 0.05mg/kg,RS 20mg/kg/dayの併用投与においては平均43日と生着の延長が得られ(n=4)、組織学的にも拒絶反応は軽度であった。また、移植後の体重も十分保たれていた。移植後3週目に、バリウム、バリウムシリコンによる経時的な小腸の運動機能、マルトース経口負荷試験、脂肪吸収試験をい、移植腸管の運動、吸収能が確認された。このモデルにおいては、組織学的に明らかなGVHDは見られなかった。以上の結果より、免疫抑制剤の投与方法の工夫により、機能を十分に保った小腸移植の生着延長が得られることが示され、小腸移植の臨床応用に向かい1知見が得られた。今後更に、接着因子に対するモノクローナル抗体のin vivo投与など、作用機序の異なる免疫抑制の併用により更に効果的な免疫抑制法が望まれる。[目的]短腸症候群の患者に対する根本的な治療として小腸移植が期待されるが、他の臓器移植と比較して免疫抑制が困難である。第一段階として経時的に移植小腸の生検が容易に施行できるイヌ同種小腸移植モデルを作成し、副作用を軽減しかつ強い免疫抑制を得る目的でcyclosporin(CYA).FK506(FK)併用による拒絶反応抑制効果を検討した。[方法]ビ-グル犬をレシピエント、雑種成犬をドナ-に用いた。小腸亜全摘群(I)の作製は、トライツ靭帯側15cm、回腸末端5cmを残して小腸亜全摘術を行なった。移植群[無治療群(II)、CYA+FK群(III)]は、レシピエントの小腸を亜全摘した後に、摘出したドナ-の小腸60cmを、それぞれの頭側腸間膜動・静脈とを端々吻合した後に腸管を端々吻合して間置した。

移植後の生検の目的で、間置した小腸とは別に有茎性に10cmのドナ-小腸を用いて小腸瘻を右下腹部に作製し、腹腔側は盲端とした。免疫抑制剤の投与量及び経路は、それぞれ単独では効果のみられない量、CYA5mg/kg/day im・FK0.05mg/kg imとした。移植後2日目迄は水分のみ、6日目迄は流動食を自由に摂取させ、7日目より通常食を摂取させた。[結果]I群:約50%の体重減少を伴い27、30,54日でそれぞれ死亡した。II群:移植腸管の腫脹が著しく、腹膜炎を併発しており、emdiansurvival time(MST)8日であった(n=6.517日)。組織学的にも強い細胞浸潤が見られた。III群:MST23日(n=5,2170日)と生着延長が認められたが、4050%の体重減少がみられ、組織学的には中高程度の拒絶反応の所見が見られた。[展望]新しい免疫抑制剤(RSーG1443)を加えた3剤伴用による効果をけんとうしたい。我々は、これまで経時的に移植小腸の生検が容易に施行できるイヌ同種小腸移植モデルを作製しcyclosporin (CYA), FK506 (FK)による拒絶反応抑制効果を検討してきた。今回は、作用機序の異なる新しい免疫抑制剤RS-61443 (RS)併用による拒絶反応抑制効果を検討した。[方法]ビーグル犬をレシピエント、雑種成犬をドナーに用いた。小腸亜全摘群(I)、移植群[無治療群(II),CYA+FK群(III),RS群(IV),CYA+FK+RS-約30日間投与群(V)]を作成した。免疫抑制剤の投与量及び経路は、併用あるいは単独投与に関係なくCYA 5mg/kg/day im., FK 0.05mg/kg im., RS 20mg/kg po.とした。[結果]I群;約50%の体重減少を伴い27,30,54日でそれぞれ死亡した。II群;移植腸管の腫脹が著しく、腹膜炎を併発しており、median survival time(MST)8日であった。(n=6,517日)。III群;MST 28日(n=5,2170日)と生着延長が認められたが、4050%の体重減少がみられた。組織学的には中高程度の拒絶反応の所見が見られた。IV群;2例に行なわれ、生存日数はそれぞれ8,20日であり、20日生存症例は約50%の体重減少が見られた。V群;MST 35日(n=4, 23,68日)であり、免疫抑制剤投与中は軟普通便を呈し体重減少も緩徐中程度であった。組織学的にも、細胞浸潤が抑えられており急性拒絶反応がコントロールされているものと考えられた。[結語]イヌ同種小腸移植モデルを用いてCYA,FK,RSによる拒絶反応抑制効果を検討した。副作用を軽減させる目的で、これら3剤を併用すると、RSによる相加性効果が得られ、移植小腸の機能発現も示唆された。新しい免疫抑制剤の開発により、移植成績が飛躍的に向上し、これまでむずかしいとされてきた小腸移植も可能性あるものとして見直されてきた。我々は今回、短腸症候群に対する生体からの小腸移植を想定し、実験を行った。まずレシーピエントのビーグル犬の小腸を亜全摘し、ドナーの雑種成犬より犠死させない長さとして回腸の60-70cmを採取して同所性に移植した。移植腸管の一部は腹壁に固定し、盲端の外瘻として移植後経時的に生検を行い、組織学的に拒絶反応について検討した。移植を全く行わなかった短腸犬は栄養障害のために平均37日で死亡した(n=3)。
前近代の歴史地震における都市域での被害要因の研究

これまでの科学研究費助成事業の研究において、近世の京都盆地に被害をもたらした1596年・1662年・1830年の歴史地震を対象として、地理情報システムの試作版を作成した。本研究では、これらの地理情報システムを統合して新たなシステムを作成した。また、近世京都における都市構造と地震による被害発生場所の分布との関係について検討するために、信頼性の高い史料記述にある被害発生場所について、当時の絵図や建築物の配置図などから現在の場所(現住所)及び緯度・経度を特定した。それに際して、都市構造や被害発生場所に関連する史資料の調査・収集を行った。以前の科学研究費助成事業の研究において、近世京都に被害を及ぼした歴史地震を対象として、史料記述にある被害発生場所に基づいた地理情報システムの試作版を作成した。今年度は、これらの地理情報システムの試作版を統合した新たなシステムを作成し、近世京都における都市構造と地震による被害発生場所の分布との関係について検討するための基盤を整備した。これまでの研究で作成してきた近世京都の歴史地震を対象とした地理情報システムの試作版を統合し、新たなシステムを作成した。このシステムを基盤として、新たに調査・検討した都市構造や被害発生場所に関する様々なデータを追加し、近世京都の都市域全体を対象とした地震被害の実態解明を目指していく。
食塩感受性高血圧における炎症性シグナルと高張性ナトリウム蓄積の意義

尿酸は、プリン体が肝臓で代謝される過程で合成される物質で、血清尿酸値は尿酸の産生と排泄のバランスにより決定されている。尿酸値は心血管病の発症や心血管病のリスクファクターと関連することが報告されている。内臓脂肪型肥満に高血圧・高血糖・脂質代謝異常が組み合わさった病態は、メタボリックシンドロームとして、国際的にも様々な診断基準が示されてきた。メタボリックシンドロームは、心血管病の発症と密接に関連していることが報告されている。尿酸値とメタボリックシンドロームはそれぞれ心血管病に関連しているにもかかわらず、尿酸値とメタボリックシンドロームの関連を直接評価した研究は少ない。本研究では、一般住民における尿酸値とメタボリックシンドローム新規発症の関連を、離散時間ハザードモデルを用いて検討した。2009年に定期健診を受診し、2011年または2012年に少なくとも1回のフォローアップ受診を行った24,112名のデータを使用した。各年度毎に年齢、性別、身長、体重、body mass index(BMI)、腹囲、収縮期血圧値、拡張期血圧値、空腹時の中性脂肪およびHDLコレステロール、LDLコレステロール値、血糖値、血清尿酸値のデータを収集した。さらに問診項目として、服薬の有無(降圧薬、糖尿病薬、脂質低下薬)、心血管病の既往を収集した。日本人一般住民において血清尿酸値は、他の因子と独立してメタボリックシンドローム新規発症との関連を認めた。この関連は、メタボリックシンドロームの要素を含む多変量による調整後も有意に認められた。食塩感受性高血圧の発症におけるメタボリック症候群や尿酸の関与について、さらなる前向き研究で検討されるべきであると考えられた。【目的】尿酸値は心血管病の発症や心血管病のリスクファクターと関連することが報告されている。本研究では、日本人正常血圧集団における尿酸値と高血圧新規発症の関連を検討した。【方法】定期健診受診者データを利用して、2009年度をベースラインとし、2012年度までの計3年間をフォローアップした。ベースライン時に血圧140/90mmHg未満、高血圧の既往歴なし、降圧薬使用なし、心血管病の既往なしの全てを満たす12,029名を対象とした。高血圧新規発症は血圧140/90mmHg以上、高血圧の既往あり、降圧薬使用ありのいずれかを満たすものと定義した。ベースラインの尿酸値と3年間の高血圧新規発症について、ベースライン時の年齢、性別、身長、体重、血圧、空腹時血糖、喫煙、eGFR、HDLおよびLDLコレステロールで調整した離散型比例ハザードモデルで検討した。また、JSH2014の血圧区分に従った至適血圧、正常血圧、正常高値血圧の3群において同様の検討をおこなった。【結果】対象集団は平均年齢49歳、女性31%で、尿酸の平均値は5.2 mg/dlだった。3年間のフォローアップの間に集団の12% (1457名)が高血圧を発症した。離散型比例ハザードモデルによる多変量解析の結果、尿酸は高血圧発症に有意に相関していた(HR、1.25; 95%CI, 1.12-1.39; p<0.001尿酸1mg/dl増加につき)。この関連は、至適血圧、正常血圧、正常高値血圧の各群でも同様に認められた。【結論】日本人の正常血圧集団において、尿酸の上昇は他の因子と独立して高血圧新規発症と関連を認めた。この関連はJSH2014で定められた血圧正常以下の各血圧群においても一貫して認められた。臨床データの蓄積に重点を置いたため、基礎的検討に十分な時間と労力がさけなかった。各年度毎に年齢、性別、身長、体重、body mass index (BMI)、腹囲、収縮期血圧値、拡張期血圧値、空腹時の中性脂肪およびHDLコレステロール、LDLコレステロール値、血糖値、血清尿酸値のデータを収集した。

日本人一般住民において血清尿酸値は、他の因子と独立してメタボリックシンドローム新規発症との関連を認めた。尿酸がメタボリックシンドロームの直接の原因となっているのか、また、スクリーニングや治療標的であるかについては、さらなる前向き研究や臨床試験が必要であると考える。基礎的検討には十分な進展がなかったが、臨床データの蓄積には十分な進展があった。尿酸は、プリン体が肝臓で代謝される過程で合成される物質で、血清尿酸値は尿酸の産生と排泄のバランスにより決定されている。尿酸値は心血管病の発症や心血管病のリスクファクターと関連することが報告されている。内臓脂肪型肥満に高血圧・高血糖・脂質代謝異常が組み合わさった病態は、メタボリックシンドロームとして、国際的にも様々な診断基準が示されてきた。メタボリックシンドロームは、心血管病の発症と密接に関連していることが報告されている。尿酸値とメタボリックシンドロームはそれぞれ心血管病に関連しているにもかかわらず、尿酸値とメタボリックシンドロームの関連を直接評価した研究は少ない。本研究では、一般住民における尿酸値とメタボリックシンドローム新規発症の関連を、離散時間ハザードモデルを用いて検討した。2009年に定期健診を受診し、2011年または2012年に少なくとも1回のフォローアップ受診を行った24,112名のデータを使用した。各年度毎に年齢、性別、身長、体重、body mass index(BMI)、腹囲、収縮期血圧値、拡張期血圧値、空腹時の中性脂肪およびHDLコレステロール、LDLコレステロール値、血糖値、血清尿酸値のデータを収集した。さらに問診項目として、服薬の有無(降圧薬、糖尿病薬、脂質低下薬)、心血管病の既往を収集した。この関連は、メタボリックシンドロームの要素を含む多変量による調整後も有意に認められた。食塩感受性高血圧の発症におけるメタボリック症候群や尿酸の関与について、さらなる前向き研究で検討されるべきであると考えられた。今後も、臨床データの蓄積と基礎データの掘り下げを進める。学会発表、論文発表は積極的に進めて行く。今後も臨床データの蓄積と基礎データの掘り下げを進める。
最先端形態学・シングルセル遺伝子発現解析による生後脳のニューロン移動機構の解明

生後の脳において神経幹細胞から生まれる新生ニューロンは、脳機能の維持および脳傷害後の神経再生・機能回復に関わっている。我々はこれまでに、様々なモデル動物を用いて、正常脳および傷害脳における新生ニューロンの移動メカニズムおよび周囲の細胞との相互作用を明らかにしてきた。本課題は、海外の研究室と共同で、移動する新生ニューロンと周囲の細胞の接着および細胞形態変化のメカニズムと、その意義を明らかにすることを目的としている。さらに、応募者の研究室に所属する若手研究者を参画させ、国際的に活躍できる研究者として養成する。本年度は、以下の研究を実施した。(1)新生ニューロンの構造の解析:脳内を移動するニューロンの微細構造や他の細胞との関係について、名古屋市立大学および海外の研究機関で解析を行った。(2)傷害脳における新生ニューロンと血管の接着の解析:我々はこれまでに、ニューロンが血管を足場にして移動することを明らかにしてきた。ニューロンと足場としての血管の相互作用の詳細を理解するため、その微細構造等について海外の研究機関と共同で解析した。(3)神経幹細胞の分化・移動調節因子の解析:新生ニューロンの移動・分化の分子メカニズムを明らかにするため、新生ニューロンの移動や分化調節に関わる遺伝子について、名古屋市立大学および海外の研究機関で解析を行った。本研究の成果は、脳可塑性の未知のメカニズムの解明と、新たな神経再生技術の提供につながる可能性がある。初年度に予定していた実験を名古屋市立大学および生理学研究所において実施するとともに、海外の研究機関を訪問して共同研究をスタートすることができたため。引き続き、名古屋市立大学及び生理学研究所において細胞生物学・分子生物学的な解析を行い、電子顕微鏡解析と遺伝子発現解析を中心に海外の共同研究者と連携して行う。研究代表者である澤本は研究全体の統括・論文作成等を担当し、研究分担者である金子及ひ澤田はマウスを用いた実験等を担当する。既存の試薬等を活用したため予定していた物品の購入を行わなかった。また、実験助手を採用予定であったが大学院生等が研究を行ったため雇用しなかった。次年度、主に物品費及び旅費に使用いたします。
遺伝子銃を用いたウイルス性肝炎に対する肝移植後再燃防止法の開発

近年、ウイルス性肝炎に起因する肝硬変の治療法の一つとして肝移植の適応が広がりつつある。本研究は移植後のウイルス性肝炎の再燃防止を目的に、安価で高い効果の期待できる肝臓への局所DNAワクチン療法の検討を行った。1)粒子媒体加速法(遺伝子銃)とハイドロダイナミクス法(大量のnaked plasmid DNAを高速静注する)におけるHBs抗体価の比較:前年度までに、抗原ペプチド遺伝子をアジュバント遺伝子(IL-12など)とともに肝臓に遺伝子銃で免疫すると、強力なワクチン効果が得られる事実から、肝臓は初回免疫の部位としてDNAワクチンの優れた標的となることを報告した。しかしながら、遺伝子銃法では肝表面への傷害は避けられず、今回はハイドロダイナミクス法によるDNAワクチン投与を検討した。同法はDNAを血管内投与するもので、キャリアーを用いない裸のプラスミドDNAをラットに静脈内に投与した結果、肝選択的に高いレベルの遺伝子発現が得られることを明らかにした。またハイドロダイナミクス法によるHBs cDNAワクチン療法での抗体価は、遺伝子銃法と比較しても遜色なく十分に高い価が得られた。さらに同法によって修飾された肝臓が移植可能であること、また同法をカテーテル法と組み合わせることにより、臓器選択的な遺伝子発現が可能であることをラットモデルで証明した。2)非特異的免疫抑制剤(FK506)の抗体産生への影響:初回免疫を30%切除肝に施行し、肝再生を誘導した場合、FK506存在下で顕著なHBs抗体の上昇が観察された。この結果は、単純に肝移植におけるDNAワクチン療法が有効であることに止まらず、肝再生を促した移植肝へのDNAワクチン療法と免疫抑制剤FK506の積極的な組み合わせがB型肝炎ウイルスの移植後再燃防止策として有効であることを示唆している。従って、臨床の生体部分肝移植での本法の有効性が期待される。研究初年度となる平成13年は、まず遺伝子銃を用いて筋組織または肝組織によく遺伝子を発現させる方法を検討した。まずラット大腿筋肉に0.5%塩酸ブビバカインを注入し、筋組織の再生を誘導した。そして、遺伝子銃を使用して発光クラゲの蛍光蛋白質であるgreenfluorescent protein(GFP)の遺伝子を導入し、24時間後に蛍光顕微鏡下に遺伝子発現を観察した。ブビバカイン処理を行っていない対象筋線維と比較しておびただしい数のGFP陽性筋線維が観察された。驚くことに、このGFP遺伝子の発現は肉眼的にしだいに減少するものの、数ヶ月間も持続していた。一方、遺伝子筋注法によってGFP遺伝子を導入した場合には、GFP発現は遺伝子銃法と比較して極端に少なかった。さらに最適な遺伝子導入のじきを調べるために、ブビバカイン処理の後、一定の時間において遺伝子銃によってルシフェラーゼ遺伝子を導入し、24時間後のルシフェラーゼ活性を定量化した。その結果、再生筋線維が出現し始める4日目に最も強い遺伝子発現がみられた。またその遺伝子発現もGFP結果と同様に少なくとも一ヶ月以上維持しており、直接ルシフェラーゼ遺伝子を筋肉注射した場合と比べても定量的に有意に高かった。さらにドンリュウラットの前胸部皮下に同系由来の悪性細胞である吉田肉腫細胞(1×105個)を移植し、転移性腫瘍モデルを作成した。肉腫細胞移植後4日目にIL-12cDNAとIL-18cDNA同等比のcDNAを混ぜ金粒子に付着させ、ブビバカイン前処理した大腿筋に遺伝子銃で射入した。このcombination治療の効果はIL-12、IL-18cDNA単独射入群より有意に強い抗腫瘍効果をもたらした。さらにこれらの結果はラットの生存率にも反映された。

また、遺伝子銃法と筋注法とで抗腫瘍効果を比較したところ、再生筋組に遺伝子銃でサイトカインを導入した群で優れた腫瘍抑制効果が認められた。これらの抗腫瘍効果はINF-γ濃度の有意な上昇で確認され、遺伝子銃によるIL-12とIL-18のcombmatlon治療で長時間(28日間)にわたり抗腫瘍効果を維持できることが示された。以上の結果は、再生筋組織における局所免疫療法が全身的な抗腫瘍効果を効率よく、かつ長時間持続的に誘導できることを示唆するものであり、筋組織の一つとなりうることを示している。同様の現象を肝部分切除後の再生肝組織において確認している。今後は筋組織の特異性を生かした長期発現型の非ウイルス性遺伝子治療として、代謝性疾患や悪性腫瘍の治療として、代謝性疾患や悪性腫瘍の治療、さらに臓器移植治療など幅広い分野での応用が期待される。昨年度(平成13年)に引き続き、遺伝子銃を用いて筋組織または肝組織によく遺伝子を発現させる方法を検討した。まずラット大腿筋肉に0.5%塩酸ブビバカインを注入し、筋組織の再生を誘導した。そして、遺伝子銃を使用して発光クラゲの蛍光蛋白質であるgreenfluorescent protein (GFP)の遺伝子を導入し、24時間後に蛍光顕微鏡下に遺伝子発現を観察した。さらにドンリュウラツトの前胸部皮下に同系由来の悪性細胞である吉田肉腫細胞(1×10^5個)を移植し、転移性腫瘍モデルを作成した。肉腫細胞移植後4日目にIL-12cDNAとIL-18cDNA同等比のcDNAを混ぜ金粒子に付着させ、プピバカイン前処理した大腿筋に遺伝子銃で射入した。このcombination治療の効果はIL-12、IL-18cDNA単独射入群より有意に強い抗腫瘍効果をもたらした。さらにこれらの結果はラットの生存率にも反映された。これらの抗腫瘍効果はINF-γ濃度の有意な上昇で確認され、遺伝子銃によるIL-12とIL-18のcombination治療で長時間(28日間)にわたり抗腫瘍効果を維持できることが示ざれた。以上の結果は、再生筋組織における局所免疫療法が全身的な抗腫瘍効果を効率よく、かつ長時間持続的に誘導できることを示唆するものであり、筋組織の一つとなりうることを示しているものであった。さらに本年度(平成14年度)は)ラット肝にHBs cDNAを用いてimmunizationの実験を行った。まず麻酔下で開腹し、肝表面に遺伝子銃を用いてHBs cDNAを射入し、その後皮膚から同様のcDNAでブーストを続けた。コントロールとして初回を皮膚で行ったものを用いた。経過を末梢血中の抗HBs抗体産能でフォローした。結果は初回免疫を肝に行ったものが極めて有効であった。その結果は肝切で増強する上にタクロリムスを加えても抗体産生が低下することはなかった。本結果は、移植肝への免疫の有効性を示すものである。次年度はラット肝移植モデルで検討を行う。
多能性幹細胞を用いた新時代移植医療における新しい免疫寛容誘導法の開発

1.マウスiPS細胞由来移植片および免疫抑制性細胞を用いたアロ臓器移植/移植制御系の確立マウスiPS細胞由来免疫抑制性細胞(iPS-SCs)の誘導に成功した。iPS-SCsはマクロファージ様の特徴を有しており、アロ刺激によるT細胞の増殖反応を抑制する効果を有していた。当効果は、NO依存的であることを明らかにした。iPS-SCs投与による免疫制御により、同iPS細胞から誘導した心筋様細胞のアロ移植系における生着期間を延長させることに成功した。さらに、アロ移植片移植を受けたマウス個体においてiPS-SCs治療を施した場合には、アロ移植片反応性の抗体産生が顕著に抑制されていた。これらの結果から、同一の多能性幹細胞から移植片と平行して有用細胞(免疫抑制性細胞)も誘導し、その投与により移植片に対する免疫制御を達成するというコンセプトの有用性が示された。2.コモンマーモセットES細胞を用いての検討前臨床研究を意識した検討としてコモンマーモセットES細胞から、免疫抑制性マクロファージ様細胞を誘導する方法を確立した。分化誘導にあたっては、マウスと同様の方法ではうまくいかなかったが、各種低分子化合物のスクリーニングを経て、エピゲノム制御因子を修飾する低分子化合物の添加により、最終的に免疫抑制性細胞を得ることができた。当該細胞はコモンマーモセットにおけるアロT細胞抑制能を有することをin vitroで確認しており、私たちの提唱するコンセプトを非ヒト霊長類動物モデルにて検証する基盤を整えた。3.ヒトiPS細胞由来免疫制御細胞の誘導および評価ヒトiPS細胞からの免疫抑制性細胞誘導に対して独自の分化プロトコールを開発し、マウスES/iPS細胞から誘導したのと類似の免疫抑制性細胞の誘導に成功した。リアルタイムPCR等で免疫抑制性の分子の発現を確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。近未来の医療として考えられていた多能性幹細胞(PSC)を用いた再生医療はもはや現実のものとなってきている。そこで私たちは、PSCを用いる新時代移植医療において効果を発揮する免疫制御法の開発を目指し研究を行っている。これまでに私たちは、マウスPSCからFoxp3陽性制御性T細胞やCD11c+でiNOSを高発現するマクロファージ様免疫抑制性細胞を含む様々な免疫系細胞の誘導が可能であることを示してきた。PSCを用いる新時代移植医療を想定し、ES細胞から拍動性心筋様細胞を誘導してアロにあたるマウスに移植するマウスモデルを確立した。このとき誘導心筋と同じES細胞から誘導しておいたマクロファージ様免疫抑制性細胞を並行投与することで、無治療対照群と比べて移植片の生着期間を有意に延長させることに成功した。PSCとしてiPS細胞を用いた移植医療を想定した研究も進めている。マウス線維芽細胞からiPS細胞を作製し、当iPS細胞から、マクロファージ様の表現型をもつ免疫抑制性細胞(iPS-SC)の誘導に成功した。iPS-SCはアロ刺激によるT細胞増殖を抑制する効果を有していた。また、ヒトへの応用を見据えた前臨床研究に適用する目的で、コモンマーモセットES細胞から免疫抑制性細胞の誘導も試みた。当初、マウスPSCからマクロファージ様免疫抑制性細胞を誘導するプロトコールにて分化誘導を試みたが、目的とするような細胞は得られなかった。分化誘導時に添加する因子を検討したところ、物質Aを培養系に添加することにより、免疫抑制性細胞(CMES-SC)の誘導に成功した。細胞表面マーカーとしては、CD11bをはじめとするマクロファージに特徴的な分子を発現していた。CMES-SCは、マウス系におけるアロ刺激によるT細胞増殖を抑制する効果を有していた。さらに、免疫寛容誘導を目的とし、胸腺上皮細胞の誘導についても検討中である。

3.ヒトiPS細胞由来免疫制御細胞の誘導および評価ヒトiPS細胞からの免疫抑制性細胞誘導に対して独自の分化プロトコールを開発し、マウスES/iPS細胞から誘導したのと類似の免疫抑制性細胞の誘導に成功した。リアルタイムPCR等で免疫抑制性の分子の発現を確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、多能性幹細胞を用いる新時代移植医療において効果を発揮する免疫制御法の開発を目指して行なっている。これまでに、マウスES細胞系にて免疫制御の可能性を有する免疫抑制性細胞の分化誘導法を確立してきたが、マウスiPS細胞からも類似の細胞を誘導可能であることが確認できた。また、前臨床研究を目的として、コモンマーモセットES細胞からの免疫抑制性細胞の分化誘導法も独自のプロトコールを確立するなど、研究はおおむね順調に進展している。これまでに、マウスiPS細胞にて免疫抑制性細胞の分化誘導を確立した。in vitroにて免疫抑制能を有することが既に確認できている。下記の研究を総合的に行なうことで、多能性幹細胞を用いる新時代移植医療において真に効果を発揮する免疫制御法の開発を目指したい。1.in vivoにおけるアロ移植モデルにおける免疫抑制能の解析、当該免疫抑制細胞を投与されたマウスにおける3rd party細胞に対する免疫反応性に関する検討を行なう。また、当該細胞の免疫抑制機序についても検討する。2.コモンマーモセットES細胞(CMES細胞)を用いた実験系においては、CMES-SC細胞がアロマーモセット抗原提示細胞により刺激されたT細胞増殖を抑止する効果があるかどうかをin vitroにて確認する。また、免疫抑制機序の詳細についても解析を行う。3.中枢性寛容の誘導を目指し、マウスES/iPS細胞、およびコモンマーモセットES細胞から胸腺上皮細胞の誘導を試みる。誘導できた細胞は、各種遺伝子発現をqPCRにて、またCytokeratin-5、Cytokeratin 8等のたんぱく質発現を免疫染色などにより確認する。生成した細胞をヌードマウス等に移植し、T細胞の分化誘導に寄与するかどうか、中枢性寛容に寄与するかどうかについても検討する。4.中枢性寛容の誘導において、T前駆細胞由来抗原提示細胞に着目している。そこで、T前駆細胞由来抗原提示細胞の役割について、in vitro、in vivoの両面から解析を進める。
DREADDシステムを用いた神経細胞GPCRシグナリング操作法の確立と応用

最近、G蛋白質共役受容体を変化させて、特定の神経細胞におけるシグナリングを操作できるシステム(DREADD : Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)が開発された。この方法は、受容体本来の内在性のリガンドは認識せず、人工的なリガンドのみを認識する変異体を作成し、使用する。その人工受容体を目的とする神経細胞に発現させると、人工リガンドを投与した時のみ、その下流のシグナリングを操作できるというものである。本研究では、このDREADDシステムをCre、FLPリコンビナーゼと組み合わせることにより時間・空間的に効率よく神経伝達物質のシグナリングを正へ負へと自在に制御できる系を確立することを目的とした。シグナリングを正に制御する人工受容体hM3D(ムスカリン受容体M3変異体)と負に制御する受容体hM4D(ムスカリン受容体M4変異体)もしくはKORD(κ-オピオイド受容体変異体)を用いた。初めに、CreあるいはFLPリコンビナーゼの下流で、これらと蛍光タンパク質を同時に発現させるベクターを構築した。さらにCreリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼで発現が誘導、そして抑制される系を一部に導入した。これらと該当するリコンビナーゼを株化細胞で発現すると、リコンビナーゼ特異的な発現の制御が行われていることを蛍光タンパク質で確認した。次に、これらをAAV(アデノ随伴ウイルス)ベクターに適用し、脳にインジェクションし、リコンビナーゼが特異的に発現するAAVや遺伝子改変マウスを用いて、同様の発現制御が確認された。また、このマウスに人工リガンドを投与し、神経細胞活性化の検討を進めた。
味覚修飾タンパク質ネオクリン・甘味受容体相互作用の解析とその感性工学的応用

前年度に引き続き、味覚修飾タンパク質ミラクリンについて、甘味受容体TIR2-TIR3との相互作用の解析を進めた。ミラクリンはそれ自体無味であるが、酸味を甘味に変換する味覚修飾活性を有するタンパク質である。本研究では、ミラクリンの味覚修飾活性のメカニズムを分子レベルで解明することを目指している。官能試験により、ミラクリンの感受性には個人差があることが経験的に知られているが、これを前年度に構築した、培養細胞を用いたミラクリンの味覚修飾活性の評価系を用いて、ミラクリンの酸により誘導される甘味の感受性と甘味受容体の一塩基多型(SNPs)に相関があることを見出した。相関が見られたSNPは、ミラクリンの活性化に必要な受容体ドメインに存在することから、今後の解析によりミラクリンとヒトT1R2-T1R3の相互作用の解明につながる知見であると考えられる。また酵母でミラクリンを発現生産し、その活性を培養細胞評価系により評価したところ、天然のミラクリンに比べて比活性は低いものの、味覚修飾活性が見出された。また中性において、ミラクリンは他の甘味物質によるヒトT1R2-T1R3の活性化を抑制するが、組換えミラクリンにおいても抑制活性が見出された。培養細胞評価系では、官能試験に比べて少量で定量的かつ客観的に活性を評価できることから、今後作製するミラクリン変異体を用いて、味覚修飾活性に関与する残基のスクリーニングを迅速に行うことが可能となる。また、もう一つの味覚修飾タンパク質ネオクリンについて、ヒトTI1R2-T1R3における結合部位の詳細な解析を行った。味覚修飾物質ネオクリンは、それ自身が甘いうえ、酸が存在すると強い甘味を誘導するタンパク質であり、他の甘味物質同様、Gタンパク質共役型受容体である甘味受容体で受容される。本研究では、この受容機の解明の一端として、ヒト甘味受容体のどの領域にネオクリンが作用するのかを明らかにした。ヒトはネオクリンの甘味を感じるが、げっ歯類では嗜好が見られないことからこれを受容しないと考えられる。我々はこのことに注目し、ヒトとマウスの甘味受容体のキメラを作製し、これらを培養細胞に一過的にGタンパク質とともに発現させ、ネオクリンへの応答をカルシウムイメージング法により測定することで、ネオクリンの受容に必要な領域を明らかにした。具体的には、ヒト甘味受容体(T1R2-T1R3)の細胞外領域のうちT1R3のN末端領域がネオクリンの受容に必要であること、また細胞外領域のうち、Cys残基を多く含むシステインリッチ領域は、ネオクリンの結合には関与しないが、リガンド結合によるN末端領域の動きを膜貫通領域に伝えるのに重要な役割を果たしていることを示唆する結果を得た。さらにN末端領域において必要な領域を探索したところ、T1R3のLys494がネオクリンの受容に重要な役割を占める残基の一つであること、201-300残基に必要な領域を含むことが明らかとなった。これらの領域は、これまでに報告のある甘味物質作用部位とは異なる部位であり、味覚修飾タンパク質であるネオクリンに特異的な結合様式があるものと推察される。また酸によって誘導される甘味の強さを定量的に評価できる培養細胞評価系を構築し、pHの低下に伴い甘味が強くなるのは、ネオクリンが酸性pHではヒト甘味受容体にアゴニストとして、中性pHではアンタゴニストとして作用し、機能的に平衡状態にあることによるという、味覚修飾活性の分子機構モデルを提唱した。味覚修飾タンパク質ミラクリンについて、甘味受容体T1R2-T1R3との解析を進めた。ミラクリンは、それ自体は無味であるが、酸味を甘味に変換する味覚修飾活性を有するタンパク質である。本研究では、ミラクリンの味覚修飾活性のメカニズムを分子レベルで解明することを目指し、まずは培養細胞を用いて、pHの低下に伴い、細胞応答が増加するという官能試験の結果を反映するような、味覚修飾活性の客観的評価系の構築に成功した。この際、通常の方法とは異なる方法をとっており、ミラクリンを細胞にあらかじめ負荷するという新たな方法(プレインキュベーション法)を確立した。ヒトT1R2-T1R3は、構造や分子量の異なるほぼ全ての甘味物質を受容することが知られており、複数の甘味物質結合部位を持つ。構築した評価系を用いて、ヒトとマウスのT1R2-T1R3のキメラレセプターを作製し、実験に用いることで、ヒトT1R2の細胞外領域、特にN末端ドメインがミラクリンの受容に必要であることを見出した。これは、他の味覚修飾タンパク質ネオクリンと異なる結果であり、味覚修飾タンパク質の受容に異なる部位が必要であることが示唆された。また中性において、ミラクリンは他の甘味タンパク質によるヒトT1R2-T1R3の活性化を濃度依存的に抑制したことから、甘味を呈さない中性においても、ミラクリンがT1R2-T1R3に結合していることが示唆された。これらの結果から、ミラクリンの味覚修飾活性のメカニズムについて、ミラクリンは受容体に結合した後、pHの変化に依存して受容体上で活性型⇔不活性型の変化をし、pHが低くなると活性型になり甘味を生じ、その変化は可逆的に起こりうるものであるという仮説を導き出した。

官能試験により、ミラクリンの感受性には個人差があることが経験的に知られているが、これを前年度に構築した、培養細胞を用いたミラクリンの味覚修飾活性の評価系を用いて、ミラクリンの酸により誘導される甘味の感受性と甘味受容体の一塩基多型(SNPs)に相関があることを見出した。相関が見られたSNPは、ミラクリンの活性化に必要な受容体ドメインに存在することから、今後の解析によりミラクリンとヒトT1R2-T1R3の相互作用の解明につながる知見であると考えられる。また酵母でミラクリンを発現生産し、その活性を培養細胞評価系により評価したところ、天然のミラクリンに比べて比活性は低いものの、味覚修飾活性が見出された。また中性において、ミラクリンは他の甘味物質によるヒトT1R2-T1R3の活性化を抑制するが、組換えミラクリンにおいても抑制活性が見出された。培養細胞評価系では、官能試験に比べて少量で定量的かつ客観的に活性を評価できることから、今後作製するミラクリン変異体を用いて、味覚修飾活性に関与する残基のスクリーニングを迅速に行うことが可能となる。また、もう一つの味覚修飾タンパク質ネオクリンについて、ヒトTI1R2-T1R3における結合部位の詳細な解析を行った。
突発性難聴における血液迷路関門の破綻と血管障害関連遺伝子

突発性難聴において血液迷路関門破綻の指標である内耳造影度を数値化した。突発性難聴耳の造影度は健側と変わらない症例と有意に増大している症例の両者があった。血液迷路関門の破綻には、血管障害、炎症、酸化ストレスが関連している。突発性難聴患者と一般住民の間で関連する遺伝子多型に違いがあるか検討した。Interleukin-1A (rs1800587), Interleukin-6 (rs1800796), Complement factor H (rs1061170), Aquaporin5 (rs3736309), NO synthase 3 (rs1799983)において突発性難聴とコントロールの間に差を認めた。突発性難聴とメニエール病の遺伝子多型検査につき倫理委員会で承認のあと、突発性難聴51人、メニエール病47人で24の遺伝子多型の検査を行った。コントロールは、国立長寿医療センター約2000人である。結果は、現在、集計中であるが、突発性難聴発症リスク遺伝子としてNOS3遺伝子多型が浮かび上がった。G894T (Glu298Asp)のヘテロ型が突発性難聴では、コントロールより有意に多かった。このNOS3の遺伝子多型は、突発性難聴発症のリスクになるとすでにヨーロッパから報告されており、日本人でも突発性難聴発症に関連することがわかった。この遺伝子多型は、NO産生に関連し、リスクとなる疾患として高血圧、心筋梗塞、脳梗塞、男性の勃起障害など報告されているが、いずれも血管拡張障害、血流障害に関与するものと考えられている。コントロールの中で、突発性難聴の既往が33人にあったが、これと残りの大勢とmethylenetetrahydropholatereductase (MTHFR)の多型C677Tを比べたところ突発性難聴ではC677Tのヘテロ型、ホモ型の比率が高かった(Laryngoscope in press)。MTHFRC677Tも突発性難聴発症と関連するとヨーロッパから報告されているが、血流障害との関連が述べられている。しかしながら、MTHFRの遺伝子多型と突発性難聴の関連について有意でなかったとする報告もあり、本研究では、今後症例を追加して検討していく予定である。突発性難聴における血液迷路関門の破綻を調べるには、血中に入れたガドリニウム造影剤が内耳にどれくらい漏れてくるかをMRIでみることにより可能になる。10人の突発性難聴患者(1側性9人、両側性1人)においてガドリニウム造影剤を静注し最も内耳に造影剤が集まると考えられている4時間後に3テスラMRIにて内耳を評価した。内耳信号強度比は、患耳11耳で0.452.17、健耳9耳で0.431.48であった。1側性突発性難聴9人において明らかに患側の内耳造影度が健側と比し高いのは9人中5人であった。突発性難聴では、血液迷路関門が破綻あるいは障害される例と血液迷路関門に異常が認められない両者がある。(Tagaya et al, Acta Otolaryngol, 2010)遺伝子多型が突発性難聴発症の危険因子となるか倫理委員会の承認を得て突発性難聴72人、コントロール2202人において比較検討した。またメニエール病68人においても同様な遺伝子検索をおこなった。その結果、インターロイキン1A(-889C/T ; rs1800587)でTアレルは、突発性難聴発症リスクを高めていることが判明した。TTの場合、コントロールに比し発症リスクは25.9倍(CI 12.2-55.0)と極めて高いものであった。メニエール病でも同様な傾向が認められた。インターロイキンは、炎症・血管透過性の亢進と関連している。メニエール病でも内耳の血管透過性は亢進している例が多くインターロイキン1Aが突発性難聴やメニエール病の内耳疾患発症と関連している。(Furuta etal, Int J Immunogenet, in press)内耳血管透過性の元進は、静注したガドリニウム造影剤が内耳液に漏れ、MRIにて造影所見陽性となることで知ることができる。突発性難聴やメニエール病では内耳血管の透過性が元進していた(Acta Otolaryngol,2010年6月号、2011年5月号)

造影剤投与10分後と4時間後と2回MRIを撮って検討したところ4時間後が有意に造影度が強かった(Acto Otolaryngol, 2012)名古屋大学耳鼻咽喉科に受診した突発性難聴、メニエール病の遺伝子多型検索血液サンプルは、現在までにそれぞれ87人、86人分が集まった。これらサンプルと国立長寿医療研究センターにおける2000人以上のコントロールで遺伝子多型に差がないか種々検討した。インターロイキン1Aの889T(rs 1800587)の頻度は突発性難聴、メニエール病ともに有意に高かった.(Int J Immunogenet. 2011)このように突発性難聴では、内耳血管の透過性が克進している例が多いこと、血管透過性と関連のある炎症系の遺伝子多型においてコントロールと有意差があることが明らかとなった。突発性難聴の診断基準が、日本でも世界的に広く用いられている診断基準に合うように改訂された。隣り合う3周波数において30dB以上の難聴という具体的な数字が入れられることになった。これにより急性低音障害型感音難聴と突発性難聴の両者に入る症例が明確に存在することになった。急性低音障害型感音難聴は、内リンパ水腫との関連が以前より指摘されてきたが、画像検査による検討はなされてこなかった。今回、我々は、急性低音障害型感音難聴25症例においてガドリニウム造影剤を鼓室内または静脈内に投与して3テスラMRIにより内リンパ水腫を評価した。鼓室内投与の場合は、投与24時間後、静脈内投与の場合は投与4時間後にMRIを撮った。平均年齢は48.9歳、男性8人、女性17人であった。蝸牛では、著明水腫が15耳、軽度水腫が8耳、あわせて23耳(92%)に水腫を認めた。前庭においては、著明水腫が17耳、軽度水腫が6耳、あわせて23耳(92%)に水腫を認めた。このように蝸牛だけでなく前庭にも水腫を認め、メニエール病における水腫の状態と特に有意な違いは認められなかった。また、今回の検討では、再発例と非再発例との間にも、水腫の状態に差は認められなかった。メニエール病における水腫の画像検査所見から、無症状内リンパ水腫の時期をへて症状が出現してくる例が多いことがわかってきた。急性低音障害型感音難聴もベースに内リンパ水腫があり、それになんらかの要因が加わることにより症状が出現する可能性が高い。突発性難聴でも内リンパ水腫を呈する症例が報告されるようになってきているが、今後、内リンパ水腫と症状の出方について、急性低音障害型感音難聴、メニエール病、突発性難聴など対象を広くとって検討していく必要がある。突発性難聴の血管透過性および発症リスクに関係する遺伝子多型について、文献目録や研究実績の概要(in press文献含)に示したように成果をあげることができた。しかしながら、血管透過性を示した症例とそうでない症例で遺伝子多型にどのように差があるのか明らかにすることは出来なかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。突発性難聴において内耳血管透過性を示した症例とそうでない症例で遺伝子多型にどのように差があるのか、あるいはないのかを明らかにすることは出来なかった。この理由として血管透過性の亢進があるかどうかを検査するMRIを撮影できる症例が限られていたこと、また撮影できても、発症から相当日時が経過してからであったことがあげられる。血管透過性の亢進の有無は副腎皮質ステロイドホルモンの効果と関連する可能性があり、重要な課題である。今後、突発性難聴治療前にMRIを撮り、その結果とステロイドホルモンの効果、遺伝子多型がどのように関係するのか検討したい。
磁束フロー型発振器を用いたサブミリ波分子分光

最近新しいタイプの超伝導サブミリ波発振器として注目されている磁束フロー型(FFO:Flux-Flow Oscillator)発振器をサブミリ波分子分光に応用して、その有用性を示す事が本研究の目的である。FFO素子は電子総合技術研究所の桐生・神代氏によって製作され、大きさは4×4mm(厚さ0.3mm)で、スパイラルアンテナ構造をしている。はじめに素子を直接液体ヘリウムに浸す事により素子の電圧・電流特性を測定した。数ガウスの外部磁場を変化させると、超電流が立上がる電圧がなめらかに変化している事が確かめられた。その電圧より発振周波数は500-1000GHz付近であった。出力は最大70μWと見積られた。この出力を外部に取出して光源として利用するために、取出し窓付の金属製ヘリウムデュワーに装着し、素子を間接的に熱伝導で冷却する事を試みた。液体ヘリウムをデュワーに注ぐと素子が超伝導になるが、その時外部の磁束がトラップされる現象が認められたので、素子とデュワーの底板の間にヒーターを挿入して、超伝導温度付近で昇温、冷却を繰返すようにした。しかしこのヒーターにより、素子自体の冷却効果が悪くなり、ヒーターを加熱しない状態でも素子が超伝導温度以下に冷えなかった。これは素子と基盤の間の熱伝導の効率がよくない為なので、さまざまな低温接着剤を始めいろいろ試しているが、未だ冷却が不十分である。この方式がうまくいかなければ、素子全体を液体ヘリウムに浸した直接窓から電磁波を取り出す方法を開発する予定である。本科件費の一部を用い、上記実験と並行して分子分光用の吸収セルの製作を行った。短寿命の星間分子を放電および高温セルと組合わせて効率よく生成できる装置で、新しい星間分子MgNCの検出に貢献した。この分子は、星間空間で最初に同定されたマグネシウム化合物である。
脳下垂体ホルモンの起源解明を目指して～MSH受容体からのアプローチ～

脳下垂体は様々なホルモンを産生し、脊椎動物において内分泌の要となる重要な器官である。しかし、無脊椎動物において、脊椎動物の腺性下垂体に対応するホルモンの同定はなされておらず、腺性下垂体のシステムは脊椎動物の進化の過程で獲得されたと推測されてきた。申請者は、ゲノムデータベースを参考に腺性下垂体ホルモンの一種である黒色素胞刺激ホルモン(MSH)の受容体と相同な遺伝子を軟体動物であるカキからをクローン化し、魚類MSHに対する応答性を調べた。その結果、当該受容体は、脊椎動物MCRの相同遺伝子であり、その細胞内シグナルは独自である可能性を示唆する結果を得た。脳下垂体は様々なホルモンを産生し、内分泌の要となる重要な器官である。しかし、脊索動物および無脊椎動物において、脊椎動物の腺性下垂体に対応するホルモンの同定はなされておらず、腺性下垂体のシステムは脊椎動物の進化の過程で獲得されたと推測されてきた。申請者は、興味深いことに腺性下垂体ホルモンの一種である黒色素胞刺激ホルモン(MSH)受容体と相同な遺伝子の存在を軟体動物である“カキ"および脊索動物である“カタユウレイボヤ"のゲノムデータベースから見出した。本研究では、当該受容体遺伝子を同定し、機能解析を行うことでMSHシステムの進化的背景および、無脊椎動物から脊椎動物を通した統括的な理解の基盤を確立し、これまで不明であった腺性下垂体の進化およびそのホルモン研究のブレイクスルーを目指した。まず、無脊椎動物のあらゆる組織から全RNAおよびゲノムDNAを安定して抽出可能な条件を確立した。また、最新のゲノムデータベースを参考にMSH様受容体特異的プライマーをデザインした。これらをツールとして、クローニングを試みた結果、カキから4種類、カタユウレイボヤからは2種類のMSH様受容体の断片を得た。加えて、カキでは内臓神経節で3種類が強く、残る1つは外套膜で顕著に発現していることを明らかにした。また幸運にも脊椎動物と無脊椎動物の間に位置するナメクジウオをサンプリングすることが出来た。ナメクジウオもゲノムデータベースが充実しており、既に候補遺伝子のクローニングに着手済みである。予定していたMSH様受容体の全構造を明らかにする迄には至っていないが、ゲノムデータベースの更新により当初想定していたより多くの候補遺伝子の部分構造を明らかにした。さらに幸運にも、ゲノムデータベースが充実しており、モデル生物として注目されている脊椎動物と無脊椎動物の間に位置するナメクジウオを手に入れる機会があった。既に、ナメクジウオを用いてMSH様受容体のクローニングに着手している。以上より、一部遅れている項目はあるが、当初の予定より得られた収穫も多くおおむね順調に進展していると言える。申請者は、腺性下垂体ホルモンの一種である黒色素胞刺激ホルモン(MSH)受容体と相同な遺伝子の存在を軟体動物である“カキ"および脊索動物である“カタユウレイボヤ"のゲノムデータベースから見出した。また、MSHと生理的に相反する作用を持つメラニン凝集ホルモン受容体(MCHR)は鳥類および無脊椎動物において研究が進んでいない。そこで、ウズラおよびナメクジウオにおけるMCHRの機能解析も含めて研究を行った。無脊椎動物のあらゆる組織から全RNAおよびゲノムDNAを安定して抽出可能な条件を確立した。また、最新のゲノムデータベースを参考にMSH様およびMCH様受容体特異的プライマーをデザインした。その結果、カキから3種類、カタユウレイボヤからは1種類のMSH様受容体の断片を得た。加えて、MCH受容体に関しては、ウズラからは1種類の全長配列およびナメクジウオからは2種類の部分配列を増幅した。全長をクローン化したウズラMCHRを含む進化系統樹を作製したところ、予想に反してウズラのMCHRは哺乳類よりも魚類に特徴が近い可能性が示された。また、この特徴は、CHO細胞を用いた培養細胞発現系解析から明らかにしたGタンパク質共役能を含む受容体機能からも支持された。これまでに、無脊椎動物(カキ、カタユウレイボヤ、ナメクジウオ)からMSHRおよびMCHR様の遺伝子断片を、合わせて6種類クローン化している。この数は当初の候補分子よりも多い数であるが、真に目的とする分子の候補が増えたことを示している。さらに複合的な研究として、脊椎動物で唯一研究が進んでいない鳥類のMCHRに着目し研究を行った結果、ウズラから全長MCHR(哺乳類MCHR1に相当)のcDNAを増幅した。さらに、ウズラMCHRのアミノ酸配列比較および薬理学的手法を用いた研究により受容体機能も解析済みである。これにより、哺乳類から魚類を通して脊椎動物MCHRシステムを包括的に理解するための情報が出揃った。

無脊椎動物のゲノムデータベースから、脊椎動物のMCRに最も高い相同性を示す哺乳類型受容体をカキ(Oy-MCRLa, Oy-MCRLb, Oy-MCRLc, Oy-MCRLd)およびカタユウレイボヤ(Ci-MCRL)から見出した。そこで、複数の候補を見出したカキからMCRLのクローニングを試みた。黒色素が多く認められる外套膜由来cDNAから、Oy-MCRLb、Oy-MCRLcの部分配列およびOy-MCRLdの全翻訳領域を決定した。そこで、Oy-MCRLdが脊椎動物MCRの対応遺伝子であるかを明らかにするために、Oy-MCRLdにFlagタグを付加した発現ベクターをHEK293T細胞に強制発現させ、受容体の機能解析を行った。脊椎動物のMCRサブタイプは全てGs共役であり、cAMP濃度を上昇させる。その共通性を基に魚類MSHで刺激したが、cAMP濃度の上昇は認められなかった。次に、進化の過程で、Gタンパク質選択性が変化している可能性を考慮し、細胞内Ca2+動員能測定も行ったが同じく活性は見られなかった。そこで、Oy-MCRLdはMCRの一般的な細胞内シグナル以外の分子が活性化されている可能性を想定し、GPCRにリガンドが結合した後に細胞膜上のGPCRが細胞内に引き込まれる現象である、受容体インターナリゼーション解析を行った。その結果、魚類MSH刺激により、細胞膜上の受容体が減衰し、細胞内に顆粒状の受容体が認められた。加えて、MSHよりもMCRに対して親和性が低いとされるDes-AC-α-MSHでは、その顆粒状受容体が認められる傾向がさらに減少した。即ち、Oy-MCRLdは脊椎動物MCRの相同遺伝子であり、その細胞内シグナルは独自である可能性が示唆された。本成果は、脳下垂体の起源解明の足掛かりとなるものであり、無脊椎動物を含めたMSHシステムの包括的な理解に繋がることが期待される。脳下垂体は様々なホルモンを産生し、脊椎動物において内分泌の要となる重要な器官である。しかし、無脊椎動物において、脊椎動物の腺性下垂体に対応するホルモンの同定はなされておらず、腺性下垂体のシステムは脊椎動物の進化の過程で獲得されたと推測されてきた。申請者は、ゲノムデータベースを参考に腺性下垂体ホルモンの一種である黒色素胞刺激ホルモン(MSH)の受容体と相同な遺伝子を軟体動物であるカキからをクローン化し、魚類MSHに対する応答性を調べた。その結果、当該受容体は、脊椎動物MCRの相同遺伝子であり、その細胞内シグナルは独自である可能性を示唆する結果を得た。カキ、カタユウレイボヤに加えてナメクジウオからMSH様受容体のクローニングを引き続き行い、全構造を明らかにする。その後、発現ベクター系を構築し、培養細胞発現系を用いて真にMSH受容体であるかを精査する。具体的には、魚類型MSH類(N末端がアセチル化修飾された物とされていない物が存在するため、これら2種)を用いて、脊椎動物のMSH受容体のメインシグナルであるcAMP亢進能を解析する。この際、魚類型MSH類に対して応答を示さない場合には、脊椎動物MSHの最小活性単位であるHis-Phe-Arg-Trpの4連のペプチドを合成し、活性を測定する等、柔軟に対応する。