hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経伝達物質の生合成・分解機構におけるチトクロームP450 2Dの関与

このチラミンからのドパミン生成活性は、他のCYP分子種では見られず、CYP2D選択的な反応であった。我々の結果は、脳内に存在しているCYP2Dが、脳内微量アミンのチラミンを基質とし、ドパミン生成に関与している可能性を示峻するものであった。このCYP2Dによるチラミンからのドパミン生成経路は、従来知られているチロシンからL-ドーパを経てドパミンとなる経路とは別経路で、その意義は興味深いと考えられた。1.ラット、マウス、サルの脳及び肝臓ミクロゾーム画分の調製ラット、マウス、サルの脳及び肝臓からミクロゾーム画分の調製を行った。特に、CYP450含量の非常に少ない脳からのミクロゾーム画分の調製は難しく世界でも成功例は今までには少ないため、今回は、用いる緩衝液や遠心分離等の条件検討から行った。脳ミクロゾーム調製後は、CYP2D分子種酵素が存在し、かつ、活性を有していることを、CYP2D特異抗体を用いたウエスタンブロットおよびCYP2D特異的代謝活性(ブフラロールの水酸化活性)を測定することにより確認した。結果、調製した脳ミクロゾーム画分は、肝臓に比べると低いものの、CYP2Dが存在し、ブフラロール水酸化活性を検出することができた。2.ラット、マウス、サルの脳における、CYP2Dおよびカテコールアミン合成・分解酵素の発現量の検討ミクロゾーム画分の調製に用いたものと同じラット、マウス、サルの脳及び肝臓に含まれる、CYP2Dおよびカテコールアミン合成・分解酵素の発現量を調べた。3.ラット、マウス、サルの脳及び肝臓ミクロゾーム画分での活性測定ラット、マウス、サルの脳及び肝臓から調製されたミクロゾーム画分を用いて、チラミンからのドパミン生成反応を行った。組織に存在するモノアミン分解酵素がミクロゾーム画分にも混在していることが判明し、分解酵素の阻害剤の検討を追加する必要が生じた。結果として、脳ミクロゾームにおいて、P450活性に依存してドパミン生成が増加した。このことから、脳組織においても、P450によるチラミンからのドパミン生成経路が存在することが示された。我々の結果は、脳の神経伝達物質ドパミンの生合成機構に、脳存在チトクロームP4502Dが関与する事を示唆するものであった。
GーCSF及びGMーCSF受容体を介する刺激伝達機構の解折と臨床的意義

好中球機能に及ぼす顆粒球コロニ-刺激因子(GーCSF)と顆粒球・マクロファ-ジコロニ-刺激因子(GMーCSF)の作用を比較、解折した。GーCSF及びGMーCSFは、共にヒト好中球に作用して補体(C3bi)受容体の膜上への発現を増加させ、粘着能を亢進させた。また、遊走因子により誘導される好中球のス-パ-オキシド産生及び膜脱分極反応を亢進させた。GMーCSFはさらに直接好中球に作用してス-パ-オキシド産生を誘導し、この作用はサイクリックAMP及び微細線維を破壊するサイトカラシンBにより阻害された。GーCSFには直接好中球に作用してス-パ-オキシド産生を誘導する作用はなかった。糖鎖を有さないGMーCSFが糖鎖を有するGMーCSFより比活性が高かった。一方、GーCSFは糖鎖の影響を受けなかった。好中球に対する作用は、調べた全てのパラメ-タ-においてGMーCSFがGーCSFよりも強力であった。至適濃度のGーCSFと低濃度のGMーCSFを併用すると相加効果が得られたが、至適濃度のGーCSFと至適濃度のGMーCSFを併用するとGMーCSFのみの効果が発現した。これらの結果は、GーCSF受容体とGMーCSF受容体を介する刺激伝達機構が互に極めて類以しているとともに明らかに異なる機構も存在していることを示している。これらの基礎的実験結果をもとにして、再生不良性貧血及び骨髄異形成症候群患者の末梢血好中球に及ぼすGーCSF及びGMーCSFのin vitro作用を比較して、解折した。再生不良性貧血では13例中5例、骨髄異形成症候群では14例中5例においてGーCSFの作用が認められなかった。一方、GMーCSFによる好中球機能亢進作用は全例において認められ、個々の症例においてもGMーCSFの作用がGーCSFよりも強力であった。今後、臨床応用を通じて、個々の症例におけるより適切な投与計画の確立が必要と考えられる。
発光微生物蛍光タンパク質の細胞内時空分布と細胞周期との分子リンク

2.A. fischeri Y1由来の二種類の蛍光タンパク質(YFP及びBFP)及びL'aseコードをする遺伝子のクローニングを完了すると共に、大腸菌発現法を確立した。さらに時空分布解析への応用を目指して、種々のYFP-BFP融合タンパク質を構築した。特にYFPをN端とする融合蛍光タンパク質はYFP及びBFPの特徴を有するバイモード蛍光性であることがわかった。3.アミノ酸12残基をリンカーとする融合タンパク質をコードする遺伝子で形質転換した大腸菌のライブセルイメージングを詳しく実施した。それぞれ発現の過程でフォールディングすることが確認され、イメージングに好適であることが明らかになった。成長時間を変数として、イメージングを行った結果、対数期にある形質転換大腸菌の場合、細胞膜近傍で蛍光タンパク質が顕著に観測されること、またYFP及びBFPの両者に由来する複数の強い蛍光スポットとして、空間的に同サイトに観測されることがわかった。一方、静止期にある形質転換大腸菌では、BFPの蛍光がYFPに比して明るく観測された。一連の実験結果より、細胞内情報がバイモード蛍光挙動の変化として捉えられることが示唆された。4.さらに、Photobacterium phosphoreumが形成するコロニーの生物発光イメージングから、微生物コロニーが、規則的に変化する非線形パターンを示しながら成長することが明らかとなり、細胞分裂周期は、コロニーが形成する空間において同調していることが示唆された。1.微生物発光変調の時間過程に関する検討微生物細胞内の発光変調関連タンパク質の偏在性を蛍光イメージング法に基づいて調べた結果、蛍光タンパク質(YFP及び:Y1-BFP)及び過渡的蛍光性ルシフェラーゼ中間体は細胞膜近傍に存在すること、且つ呼吸活性と連動していることを明らかにした。二次元電気泳動法及びスペクトロスコピーに基づく実験から、微生物の成長過程において、YFP及びY1-BFPは同期して発現すること、発光変調の時間過程と対応すること、またYFP及びY1-BFPの発現はルシフェラーゼの発現と同期していないことを明らかにした。また発光変調が細胞分裂周期に依存する現象であることを示唆した。2.YFP及びY1-BFP遺伝子発現系の確立:YFPをコードする遺伝子(YFP遺伝子とよぶ)をインサートとして有するベクター(pETBlue-2)の調製法を構築した。YFPの発現はコンピテントセル(BL21)を用い、形質転換にはヒートショック法を採用した。発現誘導物質の添加条件を詳しく調べ、主にウエスタンブロッティング法により発現を検証した結果、最適発現条件を確立した。Y1-BFPをコードする遺伝子(Y1-BFP遺伝子とよぶ)については、インバースPCR法によって全塩基配列のシーケンスを達成し、塩基長が600bであることを明らかにした。さらに、Y1-BFP遺伝子をクローニングしたプラスミドベクタターの調製法を確立し、これを用いるBL21の形質転換と発現法を確立した。特に、YFPについては、形質転換大腸菌の蛍光イメージングから、in vivoにおいて機能発現が達成されることを確認した。3.今後、発光微生物ゲノム遺伝子における発光変調関連遺伝子の構造解析、及び発光変調に係わる全遺伝子を有する組換えDNA分子の構築と形質転換大腸菌による発光変調関連タンパク質の発現リズムを詳しく調べる。蛍光イメージングに基づいて、黄色発光微生物陽Vibrio fischeri Y1発光関連タンパク質(内在性蛍光タンパク質及びルシフェラーゼ(以下、L'ase))は細胞膜近傍に偏在していることを明らかにした。さらに、成長時間を変数とする発光の解析から、細胞成長過程において、発光色変化の主原因となる黄色蛍光タンパク質(YFP)の細胞内レベルが時間と共に増大し、成長末期において逆に低下すること、一方raseの細胞内濃度レベルはほぼ一定に保たれることを明らかにした。V.fischeri Y1の酸素依存型可逆的発光色変化の分子機構を調べ、発光色変化はYFPのレドックス変化によって支配されることを解明した。即ち、酸化型YFPにおいて黄色発光が惹起され、一方還元型YFPにおいて青色発光が主成分となる。

上記発光関連タンパク質をコードする遺伝子の解読を達成し、それぞれの大腸菌発現系を構築し、高い活性を有する発光関連組換えタンパク質の生産に成功した。時間を変数とする微生物発光イメージングにより、発光コロニー表面に酸素を供給することによって成長前線の環状発光帯の他、コロニー内部に新しく環状発光帯が出現すること、及び酸素の供給と停止に対応して、内部環状発光帯は規則的に明滅を繰り返すことを見出した。この環状発光帯に特徴付けられる発光挙動から、コロニーは規則性を有する動的な細胞集合体であることを明らかにした。最終年度において、発光変調と細胞分裂周期との分子リンクを詳しく説明する。2.YFPの他、A. fischeri Y1由来青色蛍光タンパク質(BFP)及びL'aseをコードする遺伝子ベクターを構築し、大腸菌発現系を確立した。さらに高度な時空分布解析への応用を目指して、YFP-BFP融合体をコードするキメラ遺伝子を構築した。YFP-BFP(逆方向のBFP-YFPを含む)間は最大12個のアミノ酸で連結した。YFP、BFP及び融合体は発現後、すべて菌体内で自発的にフォールディングすることが確認された。種々のYFP-BFPを生産し、単離精製して蛍光挙動を調べた結果、12アミノ酸残基をリンカーとする融合体(YFP-12-BFP)はYFP及びBFPの特性を併せ持つバイモード蛍光性であることがわかった。さらに遺伝子の構築と関連して発光に基づくDNAの特異的検出定量法を確立した。3.形質転換大腸菌の生細胞イメージングを実施した。YFP蛍光は細胞膜近傍で比較的明るいのに対してBFP蛍光は細胞空間全体で観測された。YFP-12-BFP融合体では、蛍光サイトの細胞内空間依存性がみられた。成長時間を変数とする観測から、融合体の発蛍光能がゆるやかに時間変化すること、特に静止期では融合体YFPからの蛍光が融合体BFPに比して明るくなることが示唆された。一連の実験結果より、時空変化を示す細胞内情報を、YFP及びBFPからの光シグナルとして捉えられることが示唆された。
単一生細胞成分の経時的ナノ分析:機能分子の採取・同定・注入法の開発

本研究課題では当該研究期間内につぎの事項の研究成果を挙げることができた。1)膜タンパク質の特異的引き抜き過程におけるフォースカーブの解析から、当該膜タンパク質と細胞骨格の連鎖機構に関する情報をえる方法を開発した。2)膜タンパク質の採取を行い、その同定法にけい光ラベルした抗体を用いた。赤血球膜タンパク質の採取は共有結合性架橋剤を用いる方法と、個々の膜タンパク質に特異的親和性を持つリガンドを用いる方法をとった。その結果を一般的な膜タンパク質採取法の指針とする方向を示した。3)細胞内に原子間力顕微鏡探針を挿入し、細胞内のmRNAその他機能分子が吸着するのを待って引き上げ、その後、RT-PCRおよびPCRによる増幅反応を経て採取されたmRNAの種別を5種類にわたって同定する方法を完成した。4)細胞膜を力学的および生化学的に穿孔し、細胞内構造の原子間力顕微鏡による影像を得る方法を開発した。5)探針先端にDNAを吸着した原子間力顕微鏡探針を細胞内に挿入することにより、細胞内にDNAを溶かし込むことができた。その結果、GFPタンパク質の遺伝子が探針挿入後の培養細胞で発現された。この結果から将来より効率のよい、またDNAの注入の有無を明瞭に区別しながら発現実験を行うことができることを示した。6)単一タンパク質分子の圧縮実験から、力学的操作の基本となるヤング率の値を精度よく求めることができた。この際、従来のHertzモデルの適用ではなく、試料の大変形を許すTataraによるモデルを適用することを始めて示した。個々の細胞を対象として細胞内機能分子の採取同定、膜タンパク質の採取同定、細胞内への外来機能分子導入などの操作を定量的、効率的に行う方法を開発する目的で細胞手術法の開発を行った。まず、培養生細胞を対象として細胞内に原子間力顕微鏡の探針を挿入し、一定時間後に引き抜くことにより探針先端に付着する分子の中からmRNAをRT-PCR法で増幅した後、電気泳動法によりその種類の同定を行う方法を開発した。この方法を用いて単一生細胞を生かしたままそのタンパク質発現状況を経時的にモニターする新しい方法が可能となり、細胞のいくつかの特定局所からのmRNA採取が可能となったので、例えば核からの距離に応じてその数が増減することをβアクチンのmRNAについて確証することができた。膜タンパク質の採取は、探針を細胞内に挿入せずに、軽く細胞表面に接触することにより行った。この場合は探針は共有結合架橋剤により修飾されているので、接触時間中に探針と膜タンパク質の間にアミノ基を介した結合が生じ、ついで探針と試料間距離を増すことにより膜タンパク質の部が探針に結合したまま脂質膜から引き抜かれてくることを確認した。この際に測定される引き抜きに要する力は0.45ナノニュートンと測定された。細胞手術の重要な基礎技術として細胞への穿孔法を行った。生細胞に対していろいろな先端半径を持つ原子間力顕微鏡の探針を強い力で押し付けることにより穿孔が可能であるが、あけられた穴の大きさによって細胞はこの穴を修復する場合と、穴がさらに広がって細胞が死に至る場合があることが判明し、生死の境界となる穴の大きさを測定することができたので今後の細胞手術法開発に重要な基盤を築くことができた。今後、穿孔法により生じた穴を通して医薬や遺伝子、酵素などの外来機能分子を細胞内に導入する方法を開発する。タンパク質、DNA、細胞を単一分子レベルの解像度で映像化し、さらに人工的に操作することができる原子間力顕微鏡を使用して単一生細胞を対象とした手術操作法を開発することが目的である。この目的を達成するためには、生体高分子や細胞を原子間力顕微鏡の探針で力学的に操作する際に印加する力と、試料の変形や破壊について調べ、その結果に基づいて生細胞からの機能分子採取と同定、細胞内への機能分子注入実験を行っている。

世界的に先端レベルにある研究実績として、1)単一タンパク質分子の機械的強度をナノレベルでの圧入試験により精密に測定し、その結果をTataraモデルにより解析し、従来の報告より1桁以上小さい、約100メガパスカルというヤング率を得た。2)細胞膜からのタンパク質採取および同定法を確立し、膜貫通型のタンパク質を引き抜くには200ないし500ピコニュートンという力を要することを示し、その同定法を開発した。3)人工膜および細胞膜を対象として原子間力顕微鏡の探針により膜を破壊するに要する力を測定し、脂質膜はおよそ5-10ナノニュートンの力を印加することにより穿孔されることを示した。4)上記の大きさの圧力を生細胞に加えることによって原子間力顕微鏡探針を細胞内に挿入後、探針を改修して付着している分子の中で増幅が可能なRNAについてRT-PCR法によって増幅したDNAとして同定する方法を確立した。この方法により、単一細胞の1平方μm程度の局所から経時的にmRNAを採取して同定する方法を開発した。毎回の探針挿入において、常時発現されているベータアクチンmRNAを基準として5-10種類のmRNAを同時に同定する方法を開発している。5)リポソームおよび生細胞に原子間力顕微鏡の探針を使用して穴を開ける方法を開発している。この際に使用する探針はいろいろな試薬および酵素によって修飾したものを用いている。タンパク質、DNA、細胞を単一分子レベルの解像度で映像化し、さらに人工的に操作することができる原子間力顕微鏡を使用して単一生細胞を対象とした手術操作法を開発することが目的である。この目的を達成するためには、生体高分子や細胞を原子間力顕微鏡の探針で力学的に操作する際に印加する力と、試料の変形や破壊について調べ、その結果に基づいて生細胞からの機能分子採取と同定、細胞内への機能分子注入実験を行っている。世界的に先端レベルにある研究実績として、1)膜タンパク質と脂質膜の相互作用を測定するプロジェクトでは、赤血球から膜タンパク質であるグリコフォリンAを引き抜く力の測定を行った結果、脂質膜からテザーが70pNで引き伸ばされてきた後にグリコフォリンがAFM探針に転移されることがわかった。この結果、膜タンパク質の採集と同定に共有結合架橋剤だけでなく、比較的強い結合力を持つリガンドあるいはレクチン分子が使えることになった。2)個々の生細胞に遺伝子DNAを確実に注入する方法として原子間力顕微鏡を使用するプロジェクトでは、いくつかの試行の結果、探針の性質によってDNAの吸着および細胞内への注入効率に大きな差があることがわかった。この結果から、来年度は成功率の高い方法の確率を目指すこととした。3)昨年度すでに原子間力顕微鏡探針を細胞内に挿入後、探針を改修して付着している分子の中で増幅が可能なRNAについてRT-PCR法によって増幅したDNAとして同定する方法を確立しているが、本年度は同一探針から10種類の異なるmRNAを同定することに成功した。4)リポソームおよび生細胞に原子間力顕微鏡の探針を使用して穴を開ける方法を開発している。この際に使用する探針は種々の試薬および酵素によって修飾したものを用いている。
de novo大腸発がんの分子機構解明と解析モデルの構築

古典的なadenoma-carcinomaシークエンス以外の大腸発がん経路について不明な点が多い。本研究では、表面型大腸腫瘍や側方進展型腫瘍、鋸歯状腺腫における分子異常に着目した。数百例の大腸早期病変の内視鏡所見・病理所見・分子異常を統合的に解析し、新規大腸がん関連遺伝子としてNTSR1、DGKG、SMOC1、ZNF582-AS1を同定した。NTSR1のメチル化は大腸腫瘍の側方進展に相関し、SMOC1は鋸歯状腺腫の新たな診断マーカーとなりうることを示した。大腸腫瘍の分子異常は内視鏡や病理所見と相関し、大腸腫瘍表面構造の不均一性は、分子異常および大腸がんリスクを反映することを明らかにした。内視鏡的に切除された大腸組織(非がん部大腸粘膜、表面型腫瘍、隆起型腫瘍、進行大腸がん)合計40検体から得た全エクソームシークエンスデータをAvadis NGSソフトウェアを用いて解析した。variantと判定された配列のうち、SNPおよび正常大腸に認められるvariantを除外し、30遺伝子(蛋白コード遺伝子26個、long noncoding RNA遺伝子6個)を抽出した。これら30遺伝子の全領域をカバーするプライマーを設計し、Ion Protonシークエンサーを用いて正常大腸組織15例、大腸腺腫15例、平坦型早期大腸がん6例、陥凹型早期大腸がん18例、隆起型早期大腸がん12例、進行大腸がん18例を解析した。計画していた全エクソンシークエンスデータからの、新規大腸がん関連遺伝子候補30個の抽出と、Ion Protonシークエンサーによる解析を予定通り行った。またビーズアレイによる大腸臨床検体の網羅的メチル化解析を行い、大腸腺腫においてメチル化する新規遺伝子を12個同定した。多数の大腸腺腫および大腸がん臨床検体を対象にバイサルファイトパイロシークエンスによるメチル化解析を行い、大腸発がんへの関与が推測される3遺伝子のメチル化を新規に同定した。またNTSR1と大腸表面型腫瘍との相関を明らかにした。NTSR1メチル化はLaterally spreading tumorなど側方進展形式を示す大腸腫瘍に高頻度であり、NTSR1の高メチル化は予後良好と相関した。機能解析の結果、NTSR1は大腸がん細胞の増殖・遊走・浸潤を促進することから、NTSR1がメチル化されることが大腸腫瘍の非浸潤性・側方進展性に関わると推測された。予定していた大腸臨床検体におけるゲノム・エピゲノム解析を終了し、新規大腸がん関連遺伝子を複数同定しえた。それらの中から、表面型大腸腫瘍に関連する遺伝子を同定した。またserrated lesionの新規鑑別診断マーカーとなりうる遺伝子を同定した。これらの遺伝子の機能解析を行い、細胞増殖、遊走・浸潤能に関わる事を明らかにした。これらのことより研究はおおむね順調に進展していると言える。我々は昨年度までの解析から、新規大腸がん関連遺伝子を複数同定した。その中から早期大腸腫瘍および大腸がんにおいて高頻度にメチル化するDGKG、SMOC1に着目し、解析を進めた。DGKGは大腸がん細胞株において高頻度にDNAメチル化により発現抑制され、その発現回復は大腸がん細胞の増殖・遊走・浸潤を抑制した。マイクロアレイ解析の結果、DGKGは大腸がん細胞において細胞周期やDNA複製に関連する遺伝子発現に大きな影響を与えることが分かった。またDGKGは大腸がん細胞においてRac1活性を抑制した。これらのメカニズムを介して、DGKGが大腸がん細胞の増殖や遊走能の制御に関わっていることが示唆された(Mol Carcinog, 2017)。また我々は、SMOC1が大腸鋸歯状腺腫(traditional serrated adenoma)において高頻度にメチル化していることを明らかにした。SMOC1メチル化はKRAS変異およびCIMP-lowと強く相関し、従来のadenoma-carcinomaシークエンスや、sessile serrated adenoma/polypに由来するMSIがんとは異なる発がんパスウェイに関与していると考えられた。さらに我々はSMOC1がSSA/PとTSAを鑑別するマーカーとなりうることを明らかにした(Oncotarget, 2017)。Ion Protonシークエンス解析結果を検証し、隆起型および表面型大腸発がんに関わる候補遺伝子を抽出する。またメチル化解析結果を検証し、同様に大腸発がんに関わる候補遺伝子を抽出する。それらの遺伝子の強制発現系およびノックダウン系を作成し、大腸がん細胞の増殖能、細胞周期、アポトーシス、遊走能、浸潤能に与える影響を解析する。がん遺伝子あるいはがん抑制遺伝子として機能すると考えられる遺伝子については、マウスxenograftモデルを用いたin vivo解析を行う。同定した遺伝子について、さらに多数の臨床検体での遺伝子変異、DNAメチル化、遺伝子発現の解析を推進する。

臨床病理学的所見、および拡大内視鏡所見との相関関係を明らかにし、大腸前がん病変および早期がんの診断に有用な所見を明らかにするとともに、大腸がんリスク診断や超早期診断マーカーとしての有用性を検証する。また同定した遺伝子のノックアウト細胞を作成し、機能解析モデルの構築を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学29年度が最終年度であるため、記入しない。
トランスジェニックブタを用いた冠動脈攣縮機構の解明と麻酔薬作用に関する研究

ケタミン投与による麻酔処置したブタの頸動脈を露出,切開,脱血死させる。開胸を行い,心臓および肺を一塊に摘出する。摘出心臓より,冠動脈(左冠動脈[前下降枝,回旋枝])を分離し,周辺の脂肪組織および結合組織を剥離,除去する。内皮細胞は器械的に除去した。1.等尺性張力変化冠動脈を約2mmの長さのリング状標本を作製し,酸素95%,二酸化炭素5%を通気した37°Cのクレブス液中で等尺性張力変化を測定した。内因性Rho kinase活性化物質であるsphingosylphosphorylcholine(SPC0.01-10μM)の累積適用で冠動脈の濃度依存性の血管収縮反応を確認した。SPCによる処置の15分前より揮発性麻酔薬(セボフルラン)または選択的Rho kinase阻害薬Y27632(2μM)を摘出冠動脈リング状標本に投与または適応した。セボフルラン,Y27632ともに,SPCによる血管収縮反応を濃度依存性に抑制した。他の吸入麻酔薬(イソフルラン,ハロタン)において同様の実験をおこなったが,SPCによる収縮反応有意に抑制しなかった。2.ウエスタンブロット摘出冠動脈標本を酸素95%,二酸化炭素5%を通気した37°Cのクレブス液中でSPCで処置し,このときに血管平滑筋内でのRho A,Rho kinaseの活性が増大するかをウエスタンブロット法を用いて検討した。セボフルラン(3.4%)およびY 27632(2μM)は,SPC処置により増強したRhoA,Rho kinase活性を抑制した。血管内皮を機械的に除去したブタ冠動脈のリング上標本(内径2mm)で以下の実験を行った。1)等尺性張力変化内因性Rhoキナーゼ活性薬Sphingosylphosphorylcholine(SPC 0.01-10μM)による等尺性張力変化を測定した。SPCは濃度依存性にツタ冠動脈を収縮させた。次にSPCによる収縮の15分前に揮発性麻酔薬セボフルラン(0.5-2MAC)または選択的Rhoキナーゼ拮抗薬Y27632(2μM)を血管標本に付加し、SPCによる収縮反応を検討した。セボフルランはSPCによるブタ冠動脈の収縮反応を濃度依存性に抑制した。選択的Rhoキナーゼ拮抗薬Y27632はSPCによるブタ冠動脈の収縮反応を完全に抑制した。2)細胞内カルシウム濃度と等尺性張力変化の同時測定ラットにおいてpreliminary studyとは実験の設定が異なるため、実験結果が不安定であり実験を継続中である。ブタ冠動脈標本を10μMSPCで20分処置し、この時の血管平滑筋内RhoA、Rhoキナーゼをウエスタンブロット法で測定を行っている。現在、実験を継続中である。血管内皮細胞を器械的に除去したブタ冠動脈のリング状標本(内径約2mm)で等尺性張力測定の実験を行った。この実験に置いて、内因性Rhoキナーゼ活性物質であるスフィンゴシルポスホリルコリン(SPC)によるRhoキナーゼを介したブタ冠動脈の収縮(収縮比較対象としてKCIによる最大収縮を用いた)に及ぼす麻酔薬の影響として、セボフルランが濃度依存性にSPCの収縮反応を抑制効果が認められた。静脈麻酔薬のひとつであるプロポフォールは、SPCによるブタ冠動脈収縮に対して、明らかな抑制効果を認めなかった。つぎに内皮除去ブタ冠動脈冊状標本(幅4mm)に対し、細胞内カルシウム濃度と等尺性張力測定変化の同時測定の実験を行った。(fura-2を用いた血管平滑筋内カルシウム濃度と等尺性張力変化の同時測定)この実験において、SPCはブタ冠動脈平滑筋に対して、細胞内カルシウム濃度を軽度の上昇を伴った血管平滑筋の収縮反応を惹起した。この収縮反応に及ぼす麻酔薬の影響として、セボフルランは、カルシウム濃度の変化に対し、有意な反応は不さなかったが、この収縮において濃度依存性にこの反応の抑制効果を認めた。つぎに、ブタ冠動脈摘出標本において、内因性Rhoキナーゼ活性物質SPCによるRho A, Rhoキナーゼ活性の測定をウエスタンブロッティング法の実験を行った。SPCは、ブタ冠動脈血管平滑筋において、Rhoキナーゼの活性化を認めた。このRhoキナーゼの活性化は、吸入麻酔薬セボフルランの前処置により、この反応を有意に抑制した。現在、吸入麻酔薬であるイソフルラン、ハロタンおよび静脈麻酔薬であるケタミンおよびチオペンタールにて同様の実験を行う予定である。

セボフルラン,Y27632ともに,SPCによる血管収縮反応を濃度依存性に抑制した。他の吸入麻酔薬(イソフルラン,ハロタン)において同様の実験をおこなったが,SPCによる収縮反応有意に抑制しなかった。2.ウエスタンブロット摘出冠動脈標本を酸素95%,二酸化炭素5%を通気した37°Cのクレブス液中でSPCで処置し,このときに血管平滑筋内でのRho A,Rho kinaseの活性が増大するかをウエスタンブロット法を用いて検討した。セボフルラン(3.4%)およびY 27632(2μM)は,SPC処置により増強したRhoA,Rho kinase活性を抑制した。
メリライト中に於るイオンの拡散とその機構

造岩鉱物中でのイオンの拡散機構を実験的に明らかにし,あわせて炭素質隕石に含まれるCaーAlに富むインクル-ジョン(CAI)の熱史を拡散の観点から推定する目的で,CAI中に最も普遍的に存在しているメリライト中に於ける陽イオンの拡散係数を回転引き上げ法により合成した試料を用いて測定した。1.拡散係数(1)相互拡散:メリライト固溶体中での主成分元素の拡散は化学組成によって大きく変化していた。この結果から1200°Cで同固溶体中に於けるMgの拡散係数は,オケルマナイト組成中で10^<12>,ゲ-レナイト組成中で10^<ー15>cm^2sec^<ー1>と著しく変わる可能性が見いだされた。これはCAI中のMg同位体の不均一な分布を説明するうえで重要な手がかりと考えられる。(2)トレ-サ-拡散:オケルマナイト中での2価陽イオンの拡散はその活性化エネルギ-に大きな差はなく,また拡散係数も1200°Cに於いて10^<ー11>10^<ー12>cm^2sec^<ー1>の範囲におさまっていて元素間の拡散速度の差による樋位体分布の変化には大きな差はないことを示していた。2.拡散係数とイオン半径オケルマナイト中での陽イオンの拡散係数はCa,Sr,Baのような大きなイオンではオリビンの場合と異なりイオン半径の違いにともなう変化が少なく1200°Cで約10^<ー11>cm^2sec^<ー1>であった。これはオリビンとメリライトの結晶構造の違いを明らかに反映していて,メリライト中の比較的大きなイオンを受け入れるMサイトの拡散への寄与がこれらのイオンに対して非常に大きいことを示していると考えられる。
剛直棒状高分子のポリイオン化と流動・電解法による高性能・高機能薄膜の開発

剛直棒状分子としてパラ型アラミドであるポリ(p-フェニレンテレフタルアミド)(PPTA)を用い、水素化ナトリウムとジメチルスルホキシド(DMSO)との試薬により、アラミドポリアニオンを生成させ、DMSO中に溶解し透明な溶液を得た。このポリアニオンは流動・電解法で電解すると、回転陽極上に溶媒和した均一なゲルとして析出する。半屈曲性のアラミドでは電着しないことから、電解によるゲル生成が起こるのは剛直棒状分子に特有な現象であることが分かった。この場合、剪断速度、共存するポリマーを用い、アラミド膜に異方性を与え、水で再生熱処理して、10GPa以上の弾性率を示す325μmの丈夫な膜を調製した。機能性付与の方法として、析出アラミド膜を支持膜として支持電解質の共存下にピロールなどの電解重合を行うことにより、導電性高分子をアラミドと相互侵入型に複合化した複合膜を調整した。アラミド電析膜が溶媒和した状態で、粗い構造をしていることが電解重合による導電性高分子との複合化を可能としたことが分かった。精製した複合膜は、弾性率、強度においてアラミド膜に近く、ポリピロール含有率60%で60S・cm^-を示し、複合化により導電性高分子の電導度をほとんど損なわないという特性を認めた。電導度は導電性高分子単独の場合よりも高温の150°Cまで保った。さらに両成分の複合状態が特別な相互佐用のない2相構造であることを示した。導電性の向上因子としてのドパントの効果を検討し、ボリピロール自身の導電性の向上させる塩酸処理法を見出した。これらの特徴を活用して、アラミド/ポリアニリン複合膜を正極とした二次電池の特性も検討した。複合膜を正極、Znを陰極として、電解液にZnSO_4水溶液を用いた二次電池の諸特性は、正極にポリアニリン単独膜を用いた場合とほぼ同様であった。複合膜はポリアニリンの脆弱さを補強した二次正極材料として有望であることを示した。(1)ポリ(pーフェニレンテレフタルアミド)(PPTA)をポリアニオン化し、これを電析して得られたフィルムで被覆した電極上にピロールを電解重合することにより,強固な導電性複合膜を作成した。電子顕微鏡によるモルフォロジーの観察および動的粘弾性の温度依存性の解析から、この複合膜が二成分の分子間に特別な相互作用のない2相構造であり、相互侵入型で物理的に複合化していることを明らかにした。(2)PPTA電析膜が残存溶媒を含む状態で、粗い構造をしていることがポリピロールとの複合化を可能にした。PPTA電析ゲルを塩酸処理して得た膜は、これまでのアセトニトリル処理した膜に比べ結晶性が高く、またPPTAの電析の際に取り込まれていたナトリウムイオンが除去されたものとなる。この膜を用い、ポリピロール複合後に塩酸処理をすると、処理前より高導電性で、しかもその熱安定性および力学特性が改善された。これは、塩酸処理によってポリピロールのドパントであるpートルエンスルホン酸イオンが塩素イオンに変わることにより、ポリピロール自身の導電性、力学的性質が向上したことが原因であることを明らかにした。

(3)高分子導電体の中で最も有望な二次電池正極材料であるポリアニリンとPPTAを複合化することにより、ポリアニリンの脆弱さを補強した導電性複合膜が得られた。複合化はPPTAを被覆した電極上に過塩素酸水溶液中でアニリンを電解重合して行った。PPTA/ポリアニリン複合膜の弾性率は2.5GPa、強度は136GPaであった。ポリアニリン単独膜と複合膜を正極とし、Znを負極として、電解液にZnSO_4水溶液を用いた二次電池の諸特性を調べた結果、両者の特性がほぼ変わらないことが分かった。したがって、PPTA電析膜は導電性高分子の電気物性を損なうことなしに力学的性質を改善できる材料であることが分かった。
膀胱癌におけるＧＣ療法抵抗性に関わる分子機構の解明

本研究では膀胱癌におけるシスプラチン(CDDP)耐性化機構を検証する目的で、CDDP耐性膀胱癌細胞株を樹立し、耐性化獲得にマイクロRNA200bが関与していることに着目し、マイクロRNA200bをCDDP耐性株であるT24RCに過剰発現させることにより感受性が回復することを確認した。耐性株T24RCにおいてはマイクロRNA200b遺伝子のCpGメチル化が亢進しており、脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidineによりマイクロRNA200b発現が回復すること、また、同薬とCDDPの併用によりT24RCにおいて相乗的な増殖抑制効果が得られることを確認した。膀胱癌細胞株T24および同株より樹立したシスプラチン(CDDP)耐性株であるT24RCにおけるmicroRNA200b(以下miR200b)の発現をqRT-PCRを用いて検証した。CDDP耐性株ではmir200bの発現は低下しており、他株でも検証する目的で新規に膀胱癌細胞株EJ138を用いて同様にCDDP耐性株を樹立し検討した。EJ138においてもCDDP耐性株ではmirRNA200bが低下しており関与が示唆された。T24RCに対するmiR200bの強制発現ではCDDPに対して感受性化し、T24においてはノックダウンによりCDDP耐性化が生じた。T24およびEJ138のCDDP耐性株では親株に比してCpGアイランドのメチル化が高いことがバイサルファイトシークエンス法およびパイロシークエンス法により確認され、CDDP耐性株は脱メチル化剤である5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-CdR)処理によりmiR200bの発現が回復した。T24RCにおいて5-aza-CdRがCDDPと相乗的に細胞増殖を抑制することが確認された。また公共データベースであるThe Cancer Genome Atlasを用い、miR200b発現およびmiR200b遺伝子のCpGのメチル化が予後と相関するか検証した。筋層浸潤性膀胱癌症例においてmiR200bの発現が低い群では全生存率が有意に不良であり(p=0.0024, Log-rank test)、高メチル化群でも予後不良であった(p=0.0015, Log-rank test)。またmiR200b発現およびメチル化は逆相関関係にあることが確認できた(R:-0.702,p=1.87e-52)。シスプラチンに対する反応性に関わるマイクロRNAの同定、および解析は比較的順調に進捗している。ただし当初の予定であったゲムシタビンに対する反応性に関わるマイクロRNAではなく、現時点ではシスプラチンに対するマイクロRNAの意義および機能解析を進めている状況である。本研究では膀胱癌におけるシスプラチン(CDDP)耐性化機構を検証する目的で、CDDP耐性膀胱癌細胞株を樹立し、感受性株とマイクロRNA発現プロファイルを比較検討した。我々はマイクロRNA200bに着目し、膀胱癌のCDDP耐性化機構への寄与を更に検討した。マイクロRNA200bをCDDP耐性株であるT24RCに過剰発現させることによりCDDP感受性が回復することを確認し、さらに、T24における耐性化の過程でマイクロRNA200bがエピジェネティックに制御されていることを確認した。T24RCにマイクロRNA200bを導入し、さらにCDDP処理を施すことにより抗癌剤耐性化との関連が報告されている複数の遺伝子が変動することをマイクロアレイ解析にて確認した。TCGA公共データベースを用いstage2以上の膀胱癌症例における全生存率とマイクロRNA200b発現に関して検討した。マイクロRNA200b発現量は同遺伝子CpGメチル化と逆相関し、さらにマイクロRNA200b低値は有意に全生存率が不良であった。マイクロRNA200bは他癌において抗癌剤抵抗性との関連が報告されているものの、膀胱癌においては報告がない。またCDDPは現時点においても転移性膀胱癌治療におけるkey drugであり、本薬剤の抵抗性機構の解明は臨床的課題である。本研究を通して膀胱癌におけるCDDP抵抗性機構の解明に寄与している。今後はマイクロRNA200bを導入することにより変動する遺伝子、また更に抗がん剤を暴露させた際に変動(応答)する遺伝子をマイクロアレイ、パスウェイ解析を用いて検証する。文献的な報告と照らし合わせ耐性化の機序をより詳細に検証する。尿路上皮癌
血管内皮細胞におけるATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の局在性に関する研究

ラット尾動脈内皮細胞におけるATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の関連性について,画像解析装置および,ATP可視化技術を用いて,以下の3点について検討した。【1】ATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の機能的接点:血管組織標本において、ノルアドレナリン(NA)のα_1受容体刺激により遊離されるATPは内皮に由来するとともに,外液Ca^<2+>依存性であり電位依存性でもあった。さらにこのATP遊離はGap Junctionの機能を低下させると考えられている高浸透圧条件下及びGap Junction阻害薬(1-heptanol)の存在下で消失した。【2】ATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の空間的接点:血管組織標本において、NAは内皮及び平滑筋の細胞内Ca^<2+>レベル([Ca^<2+>]i)を共に著明に上昇させたが、培養内皮細胞においては、NAによる[Ca^<2+>]i上昇は観察されず,ATP遊離も極めて微量であった。【3】ATP遊離機構とNO産生放出機構との機能的空間的接点:血管組織標本において内皮依存性弛緩反応(L-NAME感受性)を惹起するブラジキニン(BK)は内皮の[Ca^<2+>]iを著明に上昇させたが、ATPの遊離を全く惹起しなかった。また,培養内皮細胞においても,同様に[Ca^<2+>]iを上昇させたが、ATPの遊離は惹起しなかった。以上の結果より、α_1受容体に連関したATP遊離機構には,内皮細胞のCa^<2+>動員機構に加え平滑筋細胞のCa^<2+>動員機構も関与していること、さらに両細胞間のGap Junctionが重要な役割を果たしているのではないかという新しい可能性が示唆された。従ってATP遊離機構とNOの遊離機構に連関する細胞内のCa^<2+>動員機構の違いは、Gap Junctionの関与の有無による可能性が推察され、この点は内皮と平滑筋細胞の相互作用を解明する上でも今後検討すべき重要な課題であると思われる。今年度はラット内皮細胞からNAにより惹起されるATPの遊離機構とカルシウム動員機構の関係について機能的側面から検討を行い、以下のような成果を得た。1)NAによるプリン物質遊離は主に、脂肪外Ca^<2+>の流入による細胞内Ca^<2+>濃度の上昇に関連した反応であることを明らかにし、細胞内貯蔵部位由来のCa^<2+>も一部関与していることを示唆した。2)NAによるプリン物質の遊離は脱分極により促進されることを明らかにし、電位依存性・非LタイプのCa^<2+>流入経路がプリン物質遊離機構に関連している可能性を示唆した。3)NAによるプリン物質の遊離は低浸透圧変化により影響を受けることを明らかにし、伸展受容器と連関したCa^<2+>流入経路がATP遊離機構に対し促進的に関連している可能性を示唆した。4)NAによるプリン物質の遊離は高浸透圧およびギャップジャンクションの阻害薬である1-heptanolにより消失することを明らかにし、ギャップジャンクション様チャネルがATP遊離機構に関連している可能性を示唆した。一般的に内皮細胞では脱分極によりブラジキニンやアセチルコリンなどによるCa^<2+>の流入は抑制される。

しかし、NAによるATP遊離が脱分極により促進されたことと細胞内Ca^<2+>の流入は抑制される。しかし、NAによるATP遊離が脱分極により促進されたことと細胞内Ca^<2+>濃度の上昇がこの遊離に重要であることを考え合わせると、これまでに我々が報告してきたように、ATP遊離機構に連関するCa^<2+>動員機構はアセチルコリンなどによるそれとは異なっていることが予想される。このようなATP遊離機構に連関するCa^<2+>動員機構としてギャップジャンクション様チャネルが関与しているという、新しい可能性が本研究により示唆された。今後は細胞内伝達機構に影響する様々な薬物を利用してATP遊離に連関するカルシウム動員機構の詳細をさらに検討するとともに、画像解析装置や培養細胞等を用いて形態的側面からも前述した可能性について検討を加えていく予定である。ラット尾動脈内皮細胞におけるATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の関連性について,画像解析装置および,ATP可視化技術を用いて,以下の3点について検討した。【1】ATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の機能的接点:血管組織標本において、ノルアドレナリン(NA)のα_1受容体刺激により遊離されるATPは内皮に由来するとともに,外液Ca^<2+>依存性であり電位依存性でもあった。さらにこのATP遊離はGap Junctionの機能を低下させると考えられている高浸透圧条件下及びGap Junction阻害薬(1-heptanol)の存在下で消失した。【2】ATP遊離機構とCa^<2+>動員機構の空間的接点:血管組織標本において、NAは内皮及び平滑筋の細胞内Ca^<2+>レベル([Ca^<2+>]i)を共に著明に上昇させたが、培養内皮細胞においては、NAによる[Ca^<2+>]i上昇は観察されず,ATP遊離も極めて微量であった。【3】ATP遊離機構とNO産生放出機構との機能的空間的接点:血管組織標本において内皮依存性弛緩反応(L-NAME感受性)を惹起するブラジキニン(BK)は内皮の[Ca^<2+>]iを著明に上昇させたが、ATPの遊離を全く惹起しなかった。また,培養内皮細胞においても,同様に[Ca^<2+>]iを上昇させたが、ATPの遊離は惹起しなかった。以上の結果より、α_1受容体に連関したATP遊離機構には,内皮細胞のCa^<2+>動員機構に加え平滑筋細胞のCa^<2+>動員機構も関与していること、さらに両細胞間のGap Junctionが重要な役割を果たしているのではないかという新しい可能性が示唆された。従ってATP遊離機構とNOの遊離機構に連関する細胞内のCa^<2+>動員機構の違いは、Gap Junctionの関与の有無による可能性が推察され、この点は内皮と平滑筋細胞の相互作用を解明する上でも今後検討すべき重要な課題であると思われる。
湿式成膜法による高飽和磁束密度を有する軟磁性薄膜の作製

磁気記録の高密度化は,磁気記録装置の大容量化,小型化を実現するために,年率3060%で進んでいるおり,書き込みヘッドのコア材料には,高い飽和磁束密度Bsを有する軟磁性薄膜が求められている.今までに,全金属中最も高いBs(=24kG)を有するCo35Fe65合金の現行プロセスである電気めっき法による作製を試み,バルク合金と同等のBs=24kGを有する電析CoFe薄膜を実現した.本年度は,組成を変化させたときのCoFeめっき及びめっき浴中での鉄イオンの挙動解析について検討を行った.まず,めっき浴中でのFe2+イオンとCo2+イオン濃度を変化させ,金属組成の異なるめっき膜の作製を試みた.デュアルセルを用いてめっき浴のアノード酸化の影響について検討を行ったところ,Fe含有量10%薄膜では,デュアルセルの使用による差異は認められずバルク金属と同じ値を示した.しかしながら,Fe含有量が10%より高い薄膜をデュアルセルを用いずに作製したところ,どの薄膜もBsは21kG以下しか示さないの対し,デュアルセルを使用して作製した薄膜はバルク合金とほぼ同等の値を示した.このことは,めっき浴中のFeイオン濃度が増加すると,アノード極での酸化反応の影響がより顕著になったためにBsが減少したものと思われる.つぎに,めっき浴中の鉄イオンの挙動解析を行ったところ,めっき浴中での鉄イオンの酸化は,自然酸化とめっき中のアノード酸化の二種類の酸化が有ることがわかった.そこで,アノード酸化をデュアルセルで,自然酸化を比較的低濃度の還元剤の添加により抑制を試みたところ,添加剤のみ使用のときよりも高いBsが比較的に安定に作製可能なことがわかった.磁気記録装置の大容量化,小型化に対応するために,書き込みヘッドのコア材料には,高い飽和磁束密度Bsを有する軟磁性薄膜が求められている。そこで,全金属中最も高いBs(=24kG)を有するCo35Fe65合金に着目し,現行プロセスである電気めっき法による作製を試みた。しかし,今までにBs=24kGを有する電析CoFe薄膜は報告されておらず,アノード極でのめっき浴の酸化が原因の一つとされている。そこで,めっき浴中の鉄イオン状態について調べたところ,めっきを行うことでFe2+がFe3+に酸化されていることを確認した.Fe3+は水酸化物を形成しやすいため,その水酸化物が還元されきらずに膜中に取り込まれBsが減少していると思われる.そこでFe3+の生成を抑制し,高Bsを実現する検討を行った.まず,めっき浴を還元雰囲気としてFe2+の酸化の抑制を試みた.還元剤であるL-アスコルビン酸,ギ酸,トリメチルアミンボラン(TMAB)の添加したところ,全ての添加剤において無添加時と比べBsの上昇が認められ,特にTMABの添加により最大23kGが得られた.ヨウ素滴定の結果よりFe3+は認められず,還元剤添加によりFe3+の生成が抑制されBsが改善したものと思われる.次に,浴中でのFe3+の生成を根本的に抑制するためデュアルセルを用いてアノードをめっき浴から分離して成膜を試みたところ,最大24kGを有するCoFe薄膜が得られた.アノードを分離することで浴中でのFe3+の生成が生成せず,水酸化物と思われる不純物の取り込みがほとんど無くなったことが一因と思われる.また,本薄膜は保磁力Hcが150eと良好な軟磁気特性を示さなかったが,熱磁場中にてアニールを行うことでHcの減少が認められ,400°Cの熱処理において,約80eの軟磁気特性を得ることが出来た.磁気記録の高密度化は,磁気記録装置の大容量化,小型化を実現するために,年率3060%で進んでいるおり,書き込みヘッドのコア材料には,高い飽和磁束密度Bsを有する軟磁性薄膜が求められている.今までに,全金属中最も高いBs(=24kG)を有するCo35Fe65合金の現行プロセスである電気めっき法による作製を試み,バルク合金と同等のBs=24kGを有する電析CoFe薄膜を実現した.本年度は,組成を変化させたときのCoFeめっき及びめっき浴中での鉄イオンの挙動解析について検討を行った.まず,めっき浴中でのFe2+イオンとCo2+イオン濃度を変化させ,金属組成の異なるめっき膜の作製を試みた.デュアルセルを用いてめっき浴のアノード酸化の影響について検討を行ったところ,Fe含有量10%薄膜では,デュアルセルの使用による差異は認められずバルク金属と同じ値を示した.しかしながら,Fe含有量が10%より高い薄膜をデュアルセルを用いずに作製したところ,どの薄膜もBsは21kG以下しか示さないの対し,デュアルセルを使用して作製した薄膜はバルク合金とほぼ同等の値を示した.

このことは,めっき浴中のFeイオン濃度が増加すると,アノード極での酸化反応の影響がより顕著になったためにBsが減少したものと思われる.つぎに,めっき浴中の鉄イオンの挙動解析を行ったところ,めっき浴中での鉄イオンの酸化は,自然酸化とめっき中のアノード酸化の二種類の酸化が有ることがわかった.そこで,アノード酸化をデュアルセルで,自然酸化を比較的低濃度の還元剤の添加により抑制を試みたところ,添加剤のみ使用のときよりも高いBsが比較的に安定に作製可能なことがわかった.
抗体可変領域を用いた誘導物質を自由に設定できる新規遺伝子発現調節システムの創製

遺伝子発現制御システムは、特定の時期に目的の遺伝子の発現を可能にすることから、分子生物学の分野で広く利用されてきた。しかし、本システムは生物が本来持っている化学物質受容体などを利用していることから、その化学物質を自由に設定して遺伝子発現調節システムを構築することはできない。そこで我々はポリ塩化ビフェニルに対する抗体の可変領域とDNA結合ドメイン、転写活性化ドメインを組み合わせた人工転写因子「抗体転写因子」を構築し、抗体が作製できるならばどのような化合物に対しても構築可能な遺伝子発現調節システムを創製した。平成22年度は以下の4項目について研究を行った。1.モノクローナル抗体産生細胞からの抗体遺伝子のクローニングポリ塩化ビフェニルの一種(3,3',5,5'-テトラクロロビフェニル、PCB80)に対する抗体転写因子を構築するために、抗PCB80モノクローナル抗体Mab-4444の軽鎖可変領域(VH、H)と重鎖可変領域(VL、L)を用いた。2.抗体遺伝子を含む組換え型転写因子遺伝子の構築抗体転写因子を構築するために、DNA結合ドメイン(LexA、X)、転写活性化ドメイン(VP16、V)、核移行シグナル(NLS、N)をVH並びにVLと組み合わせた組換え型転写因子を8種構築した。3.組換え型転写因子の酵母発現プラスミドへの導入と酵母の形質転換構築した8種の抗体転写因子を組合せて組換え型転写因子を導入した7種の酵母を作製した(アルファベットはそれぞれの機能ドメインを示す、XL/HV、XHN/NLV、NXH/NLV、XNH/NVL、XL/NHV、XHN/NVL、XNH/NLV)。プラスミドの導入は、それぞれの機能ドメイン特異的プライマーを用いて確認した。4.PCB80を添加した組換え酵母におけるLacZ活性の測定7種の組換え酵母にPCB80を添加して、LacZ活性を測定したところ、XL/NHVが最も高い活性を示した。7種のPCB80組換え型転写因子のLacZ活性と同じ組合せをもつ、以前に構築したビスフェノールA組換え型転写因子のビスフェノールAに対するLacZ活性とを比較すると、正の相関が見られた。これは、特定の機能ドメインの組合せを用いるとどの様な抗体であっても高いLacZ活性を示す組換え型転写因子を構築できることを示している。平成23年度は以下の2項目について研究を行った。1.抗体転写因子を導入した組換え酵母によるポリ塩化ビフェニル(PCB)検出条件の最適化ポリ塩化ビフェニルを検出するための最適条件をPCBの一種であるPCB80(3,3',5,5'-テトラクロロビフェニル)を用いて行った。PCBは極めて脂溶性の高い化合物であることから水に溶解させるためにジメチルスルホキシド(DMSO)などの有機溶媒を溶液に添加する必要がある。組換え酵母XL/NHVにDMSO濃度を0.1%から8%まで変化させたて処理した結果、0.1%DMSOを添加したときに最も高いLacZ活性を示した。また、LacZの基質との反応時間は30分のときにその活性が最大となった。最適化した条件をもとに本システムによるPCB80の検出限界を調べたところ、0.1ppbであった。2.各種PCB同族体を処理した組換え酵母におけるLacZ活性の測定組換え酵母XL/NHVにPCB126(3,3',4,4',5-ペンタクロロビフェニル)、PCB169(3,3',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニル)並びにPCB180(2,2',3,4,4',5,5'-ヘプタクロロビフェニル)をそれぞれ処理し、LacZ活性を測定したところ、ほとんど差がなかった。本抗体転写因子を作製するもとになったモノクローナル抗体Mab-4444のこれらPCB同族体に対する交叉反応性はPCB169が最も高く、次いでPCB126であった。PCB180はモノクローナル抗体とは反応しなかった。組換え酵母の反応性はモノクローナル抗体のそれと異なっていた。これはPCB同族体の脂溶性がそれぞれ異なり、酵母細胞膜への透過性が異なったためと考えられる。