hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コンフォメーション固定化抗体を用いた哺乳類の胆汁酸輸送体の結晶構造解析

NTCPは細胞膜の内外でのナトリウムイオン濃度勾配を利用して胆汁酸の腸肝循環を駆動する膜タンパク質であり、高脂血症治療薬の標的として重要である。本研究ではNTCPの結晶構造を解明し、構造に基づく医薬品の分子設計に欠かせない立体構造情報を得ることをめざした。熱安定性と分子サイズの単分散性が良好なNTCP変異体、ならびにNTCPに対する立体構造認識抗体を作製し、結晶化に適したNTCP精製標品の調製条件を確立することに成功した。現在、このNTCP変異体と立体構造認識抗体の複合体の結晶化条件を探索中である。本研究は、高脂血症治療薬の新たな分子標的であると有望視されている哺乳類のナトリウム依存性胆汁酸輸送体NTCP、ASBTの結晶構造解析を行うことを目的とする。一般に膜輸送体の結晶化が困難である主な原因は、精製試料中で複数の過渡的中間状態のコンフォメーション(基質輸送過程で生じる外向きー内向きのコンフォメーション間での動的平衡)が存在することである。本研究では、野生型と比べてコンフォメーション平衡に顕著な偏りを生じさせた変異型輸送体(コンフォメーション遷移状態アナログ)とコンフォメーション固定化抗体を用いて、胆汁酸輸送体ー抗体複合体の結晶化・構造解析を行う。最終的に異なる複数のコンフォメーションの結晶構造を3Å以上の分解能で決定し、阻害剤分子設計に資する動的構造情報の再構成をめざす。ナトリウム依存性胆汁酸輸送体では、2個のNa+および1分子の基質(タウロコール酸)の結合によりコンフォメーション変化が惹起され、交互アクセス機構による輸送サイクルが作動することが知られている。平成27年度には、すでに構造が解かれているASBT細菌ホモログ(PDB: 3ZUY)からの外挿により、ヒト・哺乳類のNTCPおよびASBTのNa+結合部位、胆汁酸結合部位のアミノ酸残基に対して種々の組み合わせでアラニン置換を導入した多数の変異体をSaccharomyces GFP融合発現系を用いて作製し、発現レベルと単分散性を蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー(FSEC)を用いて評価した。また、これらの変異体蛋白質の熱安定性もFSEC-TS (Hattori et al., 2012)の方法により解析した。その結果、コンフォメーション平衡に偏りが生じていると考えられる複数の変異体を得た。本研究全体の成否を握る鍵は、胆汁酸輸送体を特定のコンフォメーションに固定化し結晶性を向上させる抗体の取得である。目的に適った抗体クローンをできるだけ数多く作製して結晶化の成功確率を高めるためには、良好な胆汁酸輸送体の発現コンストラクトを入手することが必須である。平成27年度の当初目標には、結晶化実験に使用可能な安定性の高い変異体候補を得ることを挙げていたが、それがほぼ達せられたため、おおむね順調に進展していると判断した。高脂血症治療薬の新たな分子標的であると有望視されている哺乳類のナトリウム依存性胆汁酸輸送体NTCP、ASBTの結晶構造解析を行うことを目的とする。本研究では、野生型と比べてコンフォメーション平衡に顕著な偏りを生じさせた変異型輸送体(コンフォメーション遷移状態アナログ)とコンフォメーション固定化抗体を用いて、胆汁酸輸送体-抗体複合体の結晶化・構造解析を行う。ナトリウム依存性胆汁酸輸送体では、2個のNa+および1分子の基質(タウロコール酸)の結合によりコンフォメーション変化が惹起され、交互アクセス機構による輸送サイクルが作動する。すでに構造が解かれているASBT細菌ホモログ(PDB: 3ZUY)からの外挿により、ヒト・哺乳類のNTCPおよびASBTのNa+結合部位、胆汁酸結合部位のアミノ酸残基(計12-15残基)が予測できる。これらの残基に対して種々の組み合わせでアラニン置換を導入した24個の変異体を作製し、発現試験をSaccharomyces GFP融合系を用いて行った。その結果、発現量・安定性・単分散性の点で優れていると見なされた5個のコンフォメーション遷移状態アナログconformationaltransition-stateanalog:CTSA)を選抜した。各々のCTSAについて昆虫細胞Sf9における大規模発現条件・精製方法を最適化し、結晶化に必要な高品質の精製試料を大量に供給できる体制を整備した。ヒト・哺乳類の膜蛋白質の結晶化では、発現量・安定性・単分散性が良好な発現コンストラクトを作製することが最大の難関のひとつである。平成28年度末までにこの困難が克服されてたため、「おおむね順調に進展している」と自己点検評価をした。研究代表者らはすでに膜蛋白質の結晶化を促進する抗体の作製法に関して独自の技術を有している。平成29年度の初頭に結晶化シャペロンとして機能する抗体を取得して、すみやかにCTSA-抗体複合体の結晶化・構造解析に進める目処が立った。胆汁酸トランスポーターNTCPはNa+濃度勾配を利用して胆汁酸の腸肝循環を駆動する膜タンパク質である。B型肝炎ウイルスは侵入経路としてNTCPを用いることが知られている。またNTCPはプロドラッグキャリアとして機能することもわかっており、NTCPの創薬標的としての重要性は高い。本研究では、NTCPの結晶構造を解明し、構造に基づく薬剤設計に欠かせない立体構造情報を得ることを目指した。

一般に膜タンパク質は、発現・精製が困難で、親水性ドメインが小さいため結晶化が難しく、たとえ結晶が得られても結晶性が悪い、という理由から結晶構造解析の難度が高い。こうした課題を克服するために本研究では、(1)熱安定性とゲル濾過分析での単分散性が良好な変異体コンストラクトを作製、(2)融合蛋白質を付加したNTCPを作製、(3)立体構造認識抗体との複合体で結晶化する、という三つの方策を試みた。野生型NTCPは精製途中に凝集を起こすほど不安定であったが、点変異を導入することで、野生型より熱安定性が高く単分散性も良好な安定化変異体の取得に成功した。また当該変異体タンパク質の精製法も確立した。FLAGタグを用いた精製工程やPNGaseF処理という手順を加えることで、結晶化を行うのに十分な純度の最終精製サンプルが得られるようになった。さらに当該変異体タンパク質に対する立体構造認識抗体6クローンの取得にも成功した。抗体の結合により、NTCP結晶化サンプルの親水性ドメインを拡大するだけでなく構造のゆらぎを固定できたと考えられる。現在、ことNTCP安定化変異体精製標品と立体構造認識抗体Fabフラグメントを用いて、結晶化条件を探索中である。NTCPは細胞膜の内外でのナトリウムイオン濃度勾配を利用して胆汁酸の腸肝循環を駆動する膜タンパク質であり、高脂血症治療薬の標的として重要である。本研究ではNTCPの結晶構造を解明し、構造に基づく医薬品の分子設計に欠かせない立体構造情報を得ることをめざした。熱安定性と分子サイズの単分散性が良好なNTCP変異体、ならびにNTCPに対する立体構造認識抗体を作製し、結晶化に適したNTCP精製標品の調製条件を確立することに成功した。現在、このNTCP変異体と立体構造認識抗体の複合体の結晶化条件を探索中である。胆汁酸輸送体変異体をPichia酵母またはSf9昆虫細胞発現系で大規模発現させる系を構築し、精製方法を最適化し、結晶化に必要な高品質の精製試料を大量に供給できる体制を整備する。その上で、リポソーム再構成した胆汁酸輸送体変異体を抗原として、マウス免疫・ハイブリドーマ法ならびにラクダ免疫・ナノボディ(重鎖単一ドメイン抗体)ファージディスプレイ法の併用により、胆汁酸輸送体の細胞外親水性領域の立体構造を特異的に認識して結合するコンフォメーション固定化抗体を作製する予定である。目的に適った抗体クローンが得られた後には、胆汁酸輸送体ー抗体複合体を界面活性剤可溶化状態での蒸気拡散法または脂質キュービック相法により結晶化し、放射光回折データに基づき構造解析を行う。リポソーム再構成したCTSAを抗原として、マウス免疫・ハイブリドーマ法ならびにファージディスプレイ法の併用により、各々のCTSA細胞外親水性領域の立体構造を特異的に認識して結合するコンフォメーション固定化抗体を作製する。各々のCTSAと抗体(Fab、Fv)を一種類ずつ混合し、あるいは、より親水性領域を拡張する効果を期待して一種類のCTSAに対して複数の抗体を同時に混合することによって複合体を形成させ、ゲル濾過により単分散性を確認するとともにCTSA-抗体複合体を精製する。
未利用海藻の三次機能の解析-海藻茶としての利用と抗酸化作用-

本年度の研究実施計画の一つである「海藻茶」の作製に先立って,まず,輪島産素干しツルモおよびこれを水洗いの後に素干しにしたツルモの一般成分,無機質,フコイダンおよびアルギン酸を測定した。素干しツルモおよび水洗いツルモの一般成分は,それぞれ灰分58.4g(100g乾物あたり,以下同様),16.2g,タンパク質7.5g,7.4g,脂質1.4g,0.6g,炭水化物32.7g,75.8gであった。無機質はそれぞれナトリウム6,830mg,1,280mg,カリウム18,000mg,1,440mg,カルシウム2,310mg,3,160mg,マグネシウム2,220mg,1,255mgと,水洗いによる減少は見られるものの極めて豊富であった。一方,鉄,亜鉛,銅などの微量金属については,水洗いの影響は明瞭でなかった。食物繊維はそれぞれフコイダン10.1g,1.3g,アルギン酸27.0g,34.7g,不溶性食物繊維12.8g,13.8gとなった。水洗いすることによってフコイダンの量が著しく減少したが,アルギン酸は含量が高く,水洗による流出が少ないため,喫食による摂取も容易であると推察された。以上の結果から,ミネラルとアルギン酸の供給源としてのツルモの有用性が認められた。次に,荒木らの方法^<1)>に従い,ツルモの海藻茶を作成した。すなわち,海藻藻体を乾燥させて粉末化し,これを煎ったものを沸騰水に入れて1分間煮沸させるか,または煎った粉末に熱湯を注いだものを「海藻茶」とした。ツルモ茶浸出液中のミネラルを測定した結果,浸出率はカリウム57.0%,カルシウム56.8%,亜鉛76.2%,鉄17.1%となり,原藻に多く含まれるカリウム,カルシウムや微量金属の亜鉛の摂取にツルモ茶が有効であることがわかった。1)荒木葉子,森宏枝:アカモクの水溶性ビタミン類とお茶への利用,東京家政学院大学紀要,37,9-13(1997).本年度の研究実施計画の一つである「海藻茶」の作製に先立って,まず,輪島産素干しツルモおよびこれを水洗いの後に素干しにしたツルモの一般成分,無機質,フコイダンおよびアルギン酸を測定した。1)荒木葉子,森宏枝:アカモクの水溶性ビタミン類とお茶への利用,東京家政学院大学紀要,37,9-13(1997).
北米先住民の保留地保持を支える集合的記憶の検討:ノーザン・シャイアンの事例

本研究は、アメリカ合衆国モンタナ州に保留地をもつノーザン・シャイアンの集合的記憶の検討を通して、「合衆国史」という既存の文脈に即さない北米先住民の歴史認識を考察したものである。現地フィールド調査、インタビュー調査、史資料調査を通して、1)部族は共同体の「集合的記憶」を用いて、連邦政府信託地である保留地を「部族由来の土地」として積極的に解釈していること、2)集合的記憶に基づく言説が、1934年のインディアン再組織法以降、部族の土地政策の要として機能してきたこと、が明らかとなった。本研究は北米先住民の保留地を部族主権の基盤とみなし、その歴史認識の実際をノーザン・シャイアンの事例を通して検討するものである。平成21年度は、1850年代条約締結期から1900年部族保留地設立に至る経緯を明らかにすることを主眼に、米国モンタナ州ノーザン・シャイアン保留地等での現地調査、コロラド州デンバー国立公文書館での史料調査を行った。本年度調査研究からは、1)部族史は1884年大統領命をもって部族保留地設立と見なす見解を示すが、実際には保留地境界を明示した1900年大統領命をもって初めて部族独自の保留地が確保されたこと、2)送還先オクラホマ・テリトリーからの脱出(1878年)、フォート・ロビンソンからの脱出(18979年)は、保留地設立を可能にした「祖先の犠牲」として現在、部族員に認識されているが、実際には1877年に投降し、斥候として働いた一団の貢献によってタンリバー域での居住が認められ、これが後の部族保留地設立に繋がったこと、3)地域住民の激しい部族排斥運動によって保留地廃止の危機に晒された1884年から1900年の間に、他部族との合併案を一貫して退けることで、部族はタンリバー域を「故郷」と見なす部族側の見解を内務省側に浸透させていったこと、4)この時期、パインリッジ保留地等、他地域に散在していた集団のタンリバー域への移動の希求が、議会承認を経て叶ったことで部族再編が成されたことが明らかとなった。本年度研究の意義・重要性は、部族保留地設立過程を先住民部族がアメリカ合衆国という国家の内に部族主権の基盤を構築した時期と積極的に解釈し、そうした部族保留地設立の過程が現在どのように部族員に認識されているのかという部族の歴史認識の動態を、部族の「集合的記憶」の変容を通して明らかにした点にある。平成22年度は、インディアン再組織法(1934年)、連邦管理終結宣言(1953年)以降、ノーザン・シャイアンが保留地土地喪失の危機にどのように対応したのかを把握すること主眼に、米国モンタナ州ノーザン・シャイアン保留地地等で現地調査を行った。本年度調査研究からは次の3点が明らかとなった。1)インディアン再組織法に則った部族自治初期においては、「土地保全」は部族政策の最優先課題となっておらず、1940年代には経済的困窮から脱するため、内務省に「連邦政府認定部族」のステイタス末梢(部族終結)を申し入れ、エネルギー開発企業への土地譲渡が模索された。2)連邦政府管理終結政策下、インディアン局は1957年貴重な水源を有する保留地内土地60区画の売却を強硬に推し進め、部族政府の土地買い戻しのための資金調達を積極的に阻止した。部族はアメリカ・インディアン問題協会の助力を得て、土地買い戻しに当たった。3)以降、部族政府は1959年に土地分割譲渡禁止計画、1962年に部族土地再購入計画を導入し、非部族メンバーへの土地譲渡の防止、リース契約解除を推し進めた。また、土地統合計画を政策の柱とし、部族として牧畜事業に取り組むことで保留地内土地の保全と経済的自立の両立を目指した。本年度研究の成果は、20世紀における部族主権が、部族自治近代化を強要する再組織法と、同化を強要する連邦管理終結政策を経験するなかで確立されてきた、その詳細な過程を明らかにした点にある。この過程にあってノーザン・シャイアンが、保留地を「祖先の犠牲によって得られた故郷の土地」と見なす部族の集合的記憶による「保留地」解釈を、部族土地政策に反映させるとともに、外部支援団体、政府政策関係者に向けても発信した様が明らかとなった。本研究の目的は、北米先住民の部族主権の基盤である保留地に関わる歴史認識を検討することで、部族共同体の近代国民国家への集約を前提とする史観を再考することにある。平成23年度は、1960年代80年代のノーザン・シャイアン保留地での石炭採掘計画の詳細を把握し、部族政府とエネルギー企業、及び内務省インディアン局との交渉過程を精査した。ノーザン・シャイアンは石炭開発を通しての経済開発を一旦は目指したものの、インディアン局が企業に有利な安値で採掘権をリースしていたことを把握するとリース契約の破棄を訴え、法廷での係争を経て最終的に契約破棄に成功した。

保留地に本拠を構える環境保全NPOネイティブ・アクションのディレクター、部族歴史文化委員会委員長らへのインタビューからは、国家のエネルギー危機に端を発した保留地での石炭開発計画は部族を経済開発派と土地保全派に二分し、両者の間には激しい対立があったことが窺えた。部族内では地下資源の権利を巡っての係争もあったが、1976年最高裁で決着をみたホローブレスト・ケース判決により、居留地内地下資源の権利が部族政府に約束されたことで一応の決着をみている。ホローブレスト判決において、土地割当法に依って部族メンバー個人に割り当てられた土地権利は表層地のみに当てはまり、割当地の地下資源には及ばないこと、居留地地下資源は連邦政府から部族共同体に信託されたものであるという法解釈がなされたことは、「個人・市民」に還元され得ない「部族共同体」という特有の単位が近代国家の内に再認識されたとみてよいだろう。部族の側から見るならば、保留地土地散逸防止プログラム(1959年)や部族土地買戻しプログラム(1962年)を介しての、部族政府による保留地保持を部族主権の要とする方針は、ホローブレスト判決により堅固なものになった。長期に亘る係争を通して、部族政府は部族専任法務コンサルタント、外部団体等の助力を得つつ、内務省インディアン局を介さずにエネルギー企業と交渉する能力を獲得した。1934年にIRA部族となり、1935年に部族憲法を制定した部族は、20世紀末において近代国家の内に自らの部族主権のかたちを打ち立てたといえよう。
真空調理を用いた新規高齢者向け高タンパク質食品の開発

高齢者の低栄養予防を目的とし、高齢社に不足しがちなタンパク質、カルシウムを強化した真空調理を用いた高齢者用食品の開発を目指す。真空調理で調製した高タンパク質食品の物性、色度や遊離アミノ酸などの栄養学的側面について明らかにする。加えて、機能性成分の挙動と水分活性や微生物検査の結果から保存期間を明確にする。また、官能評価を実施し、食感、咀嚼、嚥下特性を明らかにした上で、最終的には商品化を目指す。
里山構成種の生理的可塑性と共存機構における林冠ギャップの機能評価

里山林構成種を対象として、光環境の変動に対する個々の樹種の生理的可塑性を明らかにし、種の共存に関わる林冠ギャップの役割を検証することを目的とて、異なる光環境で生育させた里山構成種の葉の形態的・構造的可塑性と成長との関係について解析した。その結果、陽葉と陰葉の比率(可塑性)が高いほど、成長量が高く、落葉広葉樹は常緑樹よりも、相対的に葉の形態的・構造的可塑性が高い傾向であった。異なる光条件に応じて、どれくらい構造的に性質の違う葉を作れるかどうかが、各樹種の適応能力を規制する要因となっていることが示唆された。本研究は、里山林構成種を対象として、異なる光環境に対する個々の樹種の生理的可塑性を明らかにし、林冠ギャップへの適応能力を明らかにすることを目的とする。関西周辺の暖温帯の里山林を構成する遷移初期から後期樹種、常緑、落葉樹、低木種、高木種を含む35樹種について、2年間異なる光環境下(H条件:相対照度100%皆伐地などopenな状態を想定、G条件:相対照度約30%平均的な林冠ギャップの明るさ、L条件:相対照度約4%閉鎖林内を想定)で生育させた苗木について、高さと地際の成長を測定した。また、それぞれの光環境で十分に展開した成熟葉をサンプリングし、葉面積、葉柄長、LMA、クロロフィル含量、クロロフィルab比、気孔密度を測定した。光環境の違いによる気孔密度の変化が最も著しかったのはイヌシデで、H条件での気孔密度はL条件の明るさの3.5倍を超える値であった。その次に高かったのはアカメガシワ、ウラジロノキ、アベマキの高木性樹種で高かった。一方、気孔密度の変化が少なかったのは、アセビ、ヤマツツジ、ソヨゴなどの低木類であった。多くの樹種が、光環境が明るくなるにつれて、気孔密度が増加する傾向であったが、アセビとマンリョウは、H条件よりもG条件の明るさにおいて最も高く、皆伐地などの強い光に対してこれらの樹種は形態的な適応能力が低いと考えられた。一方、異なる光環境での葉面積の変化は、遷移前期樹種であるアカメガシワが最も大きく、暗い環境になるほど、大きく薄い葉をつくる傾向があり、遷移後期樹種と常緑樹種では葉面積の変化の幅が小さく、形態的可塑性が低いことが示唆された。異なる光環境に対する生理生態的適応力の違いが、里山構成種の生育場所を制限する要因になっているかどうかを検証するために、低木種であるコショウノキを対象として、スギ人工林と隣接する落葉広葉樹林に生育する個体について、葉フェノロジー、開花結実率、葉の光合成特性、クロロフィル蛍光反応などの生理生態特性と生育場所の光環境との関係を調べた。コショウノキは、6月以降夏から秋にかけて一部落葉し、春4月から5月に新しい葉をだすという葉フェノロジーをもつ。1つのシュートにおける着葉数は、スギ人工林のほうが落葉広葉樹林内の個体のほうが多く、葉齢も人工林内の個体のほうが高かった。一方葉の回転率は、落葉広葉樹林のほうが高かった。結実率は、open個体、人工授粉個体とも人工林、落葉広葉樹林内で差は認められず、繁殖特性は光環境による影響を受けないことが考えられた。葉の最大光合成速度は、人工林と落葉広葉樹林の個体で差がなかったが、クロロフィル蛍光値(Fv/Fm)は人工林の個体のほうが高く、暗呼吸速度は人工林よりも落葉広葉樹林で高かった。このことから、落葉広葉樹林内の個体は光阻害によるストレスをうけ、暗呼吸速度が高いことによる光合成のロスが大きいことが示唆された。シュートの節間長は、人工林のほうが落葉広葉樹林の個体よりも長かった。光環境は、落葉広葉樹内では冬季は人工林内よりも明るいが、夏季は上層から下層まで樹木が繁茂することにより人工林内よりも暗かった。以上の結果から、落葉広葉樹林の個体は、葉が成熟する夏季には人工林よりも暗いため十分な光合成ができず、また冬季には低温と強光による光阻害でストレスをうけており、人工林の個体よりも成長が制限されていることが考えられる。葉の生理特性が冬季に光阻害を受けないですむ常緑樹林内の光環境に適応しているために、落葉広葉樹林へは分布を拡大することができないものと考えられた。里山林構成種を対象として、光環境の変動に対する個々の樹種の生理的可塑性を明らかにし、種の共存に関わる林冠ギャップの役割を検証することを目的とした。異なる光環境で生育させた里山構成種の苗木について、葉の形態的・構造的可塑性と成長との関係について解析をおこなった。

相対照度4%と100%で生育させた落葉広葉樹4種(アカメガシワ、イヌシデ、コナラ、エゴノキ)と常緑樹(サカキ、ソヨゴ、アセビ)の苗木の成熟葉をサンプリングし、葉面積、葉厚、気孔密度、LMA(g/cm2)を測定した。その後、葉を固定・樹脂包埋処理し、ミクロトームで切片を作成し、光学顕微鏡下で撮影した画像をもとに、細胞空隙率、LMA、空隙周囲長、葉肉細胞率を測定した。4%の葉(陰葉)と100%の葉(陽葉)の比率をplasticity indexと定義し、それぞれの葉の可塑性の指標とし、これらと成長との関係について解析した。その結果、陽葉と陰葉の比率(可塑性)が高いほど、成長量が高い傾向で、中でもアカメガシワは可塑性も大きく成長も高かったのに対して、アセビは可塑性が最も低く成長も低かった。常緑樹は落葉広葉樹に比べて、可塑性が低い傾向であった。常緑樹の中では、ソヨゴは葉の構造的可塑性が高く、光への適応幅が広い樹種であることが考えられた。本研究から、異なる光条件に対応して、いかに構造的に適応した葉を作れるかどうかが、各樹種の適応能力を規制する要因となっていることが示唆された。現在までに、苗畑で生育させた苗木の葉の生理特性および解剖特性の解析がほぼ終了しており、今年度は各樹種の光環境の変化に対する可塑性を馴化指数を用いて算出し、林冠ギャップ形成に対する反応性を評価する予定である。したがって、研究の遂行に特に問題はない。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、各樹種の生理生態的可塑性について、環境要因として光条件の変化を設定したが、今後は光以外の環境要因である水分条件、養分条件の変化に対する可塑性について同様の研究をおこなうことにより、各樹種の環境変動に対する生理生態的応答を評価したいと考えている。今回は、既に試験地が設定され利用可能なデータの蓄積がある暖温帯の里山林に限定して解析をおこなったが、将来的には、温帯、冷温帯を含む常緑広葉樹林帯から落葉広葉樹林帯まで幅広い気候帯を対象に同様の研究をおこない、汎用性の高い成果を得ることを目指したいと考えている。
電気防食効果を有する高機能塗装システムの最適設計手法の確立と新たな防食基準の提案

本研究では,犠牲陽極方式の電気防食工法を、腐食因子の浸透を抑制するための表面塗装材としての役割に防食効果を加えた「高機能塗装システム」ととらえ、その防食効果を環境条件、構造物の劣化レベル、犠牲陽極材の種類、施工方法等の各種要因から検討した結果、適用可能な範囲であれば既存構造物の長寿命化対策として十分な効果が期待できること確認した。さらに,対象構造物の立地環境や劣化レベルに応じて、必要とされる防食性能を確保するための設計手法ならびに防食基準の考え方を示した。電気防食工法には、「外部電源方式」と「犠牲陽極方式」の2種類がある。「犠牲陽極方式」は、陽極材金属の反応により防食電流を供給するため、電源装置が不要であり、施工が簡便などの利点がある。しかし、本方式では、防食電流の調節ができないため、長期間安定した防食効果を発揮するための陽極金属の種類や施工方法さらに施工方法について十分に検討する必要がある。平成24年度は、金属溶射型流電陽極方式電気防食工法において安定的に防食電流を供給する施工システムおよび溶射金属の種類を検討するため、海洋環境下に供試体を曝露することにより検討した結果、以下のことが確認できた。(1)コンクリート表面をブラストにより素地調整後、粗面形成材および封孔処理材を用いる施工システムによって通電初期の急激な防食電流の供給を抑制することができ、それによって安定した防食電流を長期的に供給することが可能となる。(2)流電陽極方式電気防食では,厳しい曝露環境では外部電源方式で用いられる防食基準を必ずしも達成しない可能性があるが、50mV以上のシフト量があれば、少なくとも無防食と比較して明確な防食効果が得られる。(3)亜鉛、アルミニウムおよびインジウム合金のように防食電流の供給能力の高い金属を使用した場合、その防食効果は十分に期待できるが、流電陽極方式電気防食における陽極材の腐食が短時間で生じる。(4)亜鉛、アルミニウムおよびインジウム合金とアルミニウムの擬合金は、亜鉛、インジウム合金およびアルミニウムとの擬合金よりも防食電流の供給能力が高い。しかし、本方式では、防食電流の調節ができないため、長期間安定した防食効果を発揮するための陽極金属の種類や環境条件さらに施工方法について十分に検討する必要がある。本年度は,昨年度までの実験の継続に加えて,「副次的効果を踏まえた塩分浸透抑制効果」について検討した。主な成果は下記の通りである。(1)物質移動抑制機構:通電中のコンクリート表面に配する金属溶射皮膜近傍には,樹脂塗膜程度の厚さの帯電領域が形成され,これがコンクリート中への炭酸イオン,塩化物イオン等のマイナスイオンに対する浸透抑制効果を発揮することが出来る。(2)中性化抑制効果:粗面形成材と金属被膜のみでは中性化抑止効果が得られないが,封孔処理材を加えることにより中性化深さは2030%程度まで抑制することが可能である。金属溶射被膜厚さの影響も若干認められた。なお,中性化が問題となる環境では,通常コンクリートの含水率が低く,そのため内部鋼材の腐食反応も自然に抑制される。したがって防食電流も自ずと減少することから,通電の有無が中性化抑制効果に及ぼす影響は小さい。この現象は検証実験でも確認された。(3)塩分浸透抑制効果中性化の場合と同様に,粗面形成材と金属被膜のみでは効果が得られないが,封孔処理材を加えることにより塩分浸透量が50%以下となった。さらに,流電陽極方式による防食電流によって遮塩性がさらに大きく向上した。したがって塩害環境においては,流電陽極方式によって,直接的な鋼材の防食効果だけでなく副次的な塩分浸透抑制効果も期待できることが確認された。本研究では、数種類の溶射金属を用いて、その防食効果に与える環境要因の影響を検討し、表面処理方法の違いが長期的な防食効果の安定性に与える影響を把握するための長期暴露試験を実施している。これまでの結果から得られた主な成果を以下に示す。(1)金属溶射を応用した犠牲陽極方式電気防食工法は、多湿環境、乾湿繰り返し環境、海洋環境、など様々な環境において有効な防食工法であり、特に20°C環境下、海洋環境下等において高い防食効果が期待できる。

(2) Al-Zn(AZ)は湿度環境によらず、安定した防食効果が得られる。また、Al-Zn-In(I)は特に多湿環境において極めて有効な防食効果を発揮することが分かった。(3)解体調査の結果から、いずれの環境においても通電中の防食電流、復極量、および腐食抑制効果の3者には概ね良い相関が得られた。ただし、高温環境化などの苛酷環境下では塗膜の剥離や腐食進行に伴ってこれらの関係が変化する場合がある。(4)コンクリート表面と溶射被膜との付着性は、過酷な環境になるほど低下し、被膜の浮きとして観察された。この現象は防食効果にも影響を及ぼすため、今後、溶射金属の反応特性の把握や下地処理などを含む施工システムの検討や、より長期的な効果の確認等を実施することにより、更に効果的な防食工法となる可能性がある。前年度開始した「防食機構に基づく新しい防食基準の設定」および「副次的効果を踏まえた塩分浸透抑制効果」に関する試験を継続するとともに、得られた測定データを用いて、防食基準の設定の前提となる復極量と防食効果の理論的裏付けるための解析的検討を開始している。実環境を想定した室内および屋外暴露実験であるため、実験において腐食進行および防食効果を確認するためにはそれなりの期間を要するが、データの蓄積も進み、経時的変化が現れ始めていることから概ね順調に進展していると判断している。初年度に計画していた(1)金属溶射による高機能被膜システムに関する知見の整理、については当初の計画通りに実施した。(2)防食機構に基づく新しい防食基準の設定、および(3)副次的効果を踏まえた塩分浸透抑制効果の解明についても計画通り実施中であるが、初年度前半を試験体の準備に充て、年度後半に実験開始となったため、まだ十分なデータが得られていないが、次年度以降引き続き実施する予定である。実施中である。本研究課題で実施した実験および解析的結果を総合し、1効果的な防食効果が得られる適用範囲(溶射被膜、環境、劣化レベル、持続期間)の明確化、2適用期間中の管理のための防食基準の設定、3初期費用と被膜交換によるLCC算定、等の検討結果を踏まえ、高機能塗装システムをコンクリート構造物の予防保全として適用するための最適設計手法を構築する予定である。ただし、初年度に作製した試験体の一部で、被膜の付着強度が極端に低下する現象が認められたため、追加的検討として、溶射被膜の付着強度に着目した検討を開始することとした。初年度に開始した、分割鉄筋入りコンクリート試験体を用いた種々の環境条件下での長期通電試験を次年度以降も継続し、そのデータの収集蓄積を進め、最終的な防食効果を確認した上で、防食機構に基づく新しい防食基準の設定、ならびに各種環境条件や構造物条件に応じた犠牲陽極方式電気防食工法の設計手法の提案することを目指している。なお、初年度に得られた成果を取りまとめた2,3の論文を国内外の学会へ投稿しており、一部は既に掲載が決定している。該当なし次年度使用する研究費として411円の残額が生じたが、これは予算執行上の端数額であることから、次年度の計画変更等は不要であり、当初予定通り使用する計画である。
3次元光-電子相関顕微鏡法によるオートファゴソーム膜構造の形態学的解析

本研究課題では3次元光ー電子相関顕微鏡法(3D-CLEM)の手法を確立すること、その応用としてオートファジーに関連する構造体の解析を行うことを目的としている。FIB/SEMの解析技術を習得し論文に繋げることが出来た。またオートファジーに関する共同研究にも進展があり成果を出すことが出来た。3次元光-電子相関顕微鏡法では、装置のトラブルや技術的な難点がありしばらく研究が滞ったものの最終的には解決し、当初の目的としていた手法を確立することが出来た。すでにいくつかのオートファジー関連構造をこの手法で観察することに成功している。3次元光ー電子相関顕微鏡法の新法を確立することが出来たため、今後はこれを用いたオートファジーの解析を行う。すでに観察は行なっているが、異なる条件での解析、定量的な解析を行なっていく。課題としては撮影した電子顕微鏡写真の画像解析を現在は手作業で行っているが、膨大な時間がかかる。これを半自動化出来るようなプログラムやソフトウェアを利用できれば大幅に効率が改善するであろう。また本課題の最終年となるため成果をまとめて原著論文として発表していきたい。そのためには超微形態解析以外の手法も合わせて進めていく必要がある。またCLEMと3次元電子顕微鏡解析を組み合わせる方法の開発を進めており、共焦点レーザー蛍光顕微鏡による3次元像と収束イオンビーム搭載走査電子顕微鏡(FIB-SEM)の3次元像とを組み合わせる基本的な手法を確立した。これによりオートファジー関連膜構造の3次元CLEM解析を行った結果を2度の学術会議で報告した。この手法を用いてオートファジー関連因子p62の3次元蛍光像を取得、同じ試料でFIBSEMによる3次元電子顕微鏡観察を行い、蛍光標識したミトコンドリアを目印として両者を統合することでp62陽性の膜構造の3次元的な解析を行うことが出来た。現在の手法には空間的な制限や、3次元像取得に失敗することがあるなどの欠点があり、今後はこの点の改良を行っていく。方法を確立したのちに解析対象を広げてより様々な細胞種・実験条件で研究を行っていく予定である。今年度前半では、これまでの研究成果をまとめて論文として発表することができた。その後本研究課題の中心である3次元CLEM解析の方法確立を目指して研究をすすすめ、基本的な手法を開発することが出来た。関連タンパク質p62の蛍光観察を行い、またミトコンドリア蛍光タンパク質をCLEMの指標として用いて、p62陽性の構造がオートファジー欠損細胞においてどのような膜構造に局在しているのかを3次元電子顕微鏡解析により観察することが出来た。ここまでの成果を学術会議で発表したものの、本格的な研究推進にはまだ手法的に課題が残っているため、その後はより確実に早く解析を行うための改善を試みている。前半はかなり順調に進んだものの、後半は装置(電子顕微鏡)のトラブルが相次ぎ予定通りに進められなかったため、年間を通すとほぼ予定通りの進歩となった。装置のトラブルが解決したため、今後の解析は予定通り進展すると期待できる。3次元CLEMの手法の改善としては、新しい蛍光染色剤の使用やFIB-SEMによる切削方法の変更により、より正確にCLEMを行うことを目指す。確立した手法を用いてp62以外にLC3等のオートファジー関連タンパク質を用いた様々な細胞種で3次元CLEMを行い解析を進めていく。年度末に購入予定であった試薬の納品が間に合わなかったため。繰越分は翌年度初めに当該試薬の購入費として使用した。年度末に開催された学会参加費用として少し多めに確保していたため
骨代謝における新規分子PRIPの役割解明

これまで、PRIP-遺伝子欠損(KO)マウスでは野生型に比べ、骨形成パラメーターの亢進、骨密度や海綿骨の骨量の増加から、骨形成が促進しており、この現象はホルモンの直接的な影響を受けていないことが示唆された。また、骨芽細胞の初代培養を用いた解析にて、PRIP-KOマウスでは骨芽細胞への分化能が高く、骨形成に関与する転写因子Smad1/5/8のリン酸化レベルの延長が認められた。更に、破骨細胞の初代培養を用いた解析にて、PRIP-KOマウスでは破骨細胞の分化能は差が見られなかったが、骨芽細胞の初代培養との共存培養において、骨吸収能の低下が認められた。そこで、骨芽細胞の初代培養を用いて破骨細胞の分化に関与するRANKLやOPGの遺伝子発現を比較したところ、PRIP-KOマウスでは野生型に比べRANKLの発現は高く、OPGの発現は低かった。また、破骨細胞の初代培養を用いて破骨細胞の分化に関与する因子の発現を比較したところ、差は認められなかった。更に、骨芽細胞と破骨細胞との共存培養において、分化した破骨細胞を詳細に解析したところ、PRIP-KOマウスの破骨細胞は野生型に比べ細胞のサイズが小さく、またアクチンリングを持つ破骨細胞数の減少が認められた。これらの結果から、PRIP-KOマウスは野生型に比べ、骨芽細胞は破骨細胞の分化を促進させ、破骨細胞ではアクチンリングの形成能が低いことが示唆された。骨代謝における新規分子、PIRPの機能をin vivoおよびin vitroで解明することを目的として本研究を行った。初めに、骨の状態を把握する為に、6,12ヶ月齢のメスの野生型およびPRIP-KOマウスより大腿骨を摘出し3次元計測したところ、PRIP-KOマウスでは海綿骨の骨量が増加していた。この増加がホルモンの影響によるものかを調べる為に、8週齢のメスのマウスを用いて卵巣摘出マウスを作製し、大腿骨の3次元計測を行った。その結果、PRIP-KOマウスにおける骨量増加はホルモンの影響によらないことが示めされた。次いで、8週齢のメスのマウスを用いて大腿骨の骨形態計測を行ったところ、PRIP-KOマウスでは骨形成パラメーターの亢進が見られた。更に、新生児のマウスの頭蓋骨より調製した骨芽細胞の初代培養を用いて解析を行なったところ、PRIP-KOマウスより調製した骨芽細胞の分化能が高く、また、骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現を比較したところ、PRIP-KOマウスにて早期に発現した。そこで、Smad1/5/8のリン酸化について比較したところ、PRIP-KOマウスにてリン酸化が延長した。これらより、PRIP-KOマウスでは野生型にくらべ、骨形成パラメーターの亢進、骨密度や海綿骨の骨量の増加から、骨形成が促進していると考えられた。また、この現象はホルモンの直接的な影響を受けていないことが示唆され、更に、初代培養において骨芽細胞への分化能が亢進していたことから、PRIPが骨形成の制御に関与していることが示唆された。
生殖系列における性特異的エピゲノム制御の解明

生殖系列細胞の性分化機構の理解を深めるために、マウスの始原生殖細胞(PGCs)の性差について網羅的遺伝子発現・エピゲノム解析を展開した。トランスクリプトーム解析により胎齢13日の雌雄PGCs特異的発現遺伝子群を特定した。雌雄PGCsおよび生後一日目の生殖細胞における包括的ヒストン修飾をChIP-seq解析で取得することに成功した。それらの結果は雌雄PGC間の性差を明らかにし、さらに遺伝子発現との関連を示した。さらに、Sry欠損性転換XY雌マウスをゲノム編集により作成し、XY卵母細胞の減数および機能不全の背景を明らかにした。この研究成果は、雌雄生殖細胞の分化とエピゲノムの新たな関係を示した。研究初年度は、以下の3項目について集中的に研究を進めた。1)雌雄の始原生殖細胞(PGC)におけるトランスクリプトームデータ取得:雌雄マウスPGC間の有為に発現が上昇した遺伝子および低下した遺伝子を、それぞれ遺伝子651および428特定した。それらの多くは転写因子であった。遺伝子オントロジーおよびネットワーク解析は、生殖細胞への分化に必要な性固有の機能を明らかにし、差次的発現を示した遺伝子がPGCの性分化を調節していることを明らかにした。また、DNAメチル化およびヒストン修飾のChIP-seq解析は、低メチル化遺伝子のプロモーター領域が、H3K4me3修飾を受けていることを明らかにした。さらに、単一細胞のトランスクリプトームデータの取得に成功し、PGC細胞の不均一性を明らかにした。2)ゲノム編集によるSry-KO XY雌マウスの作出:ゲノム編集によるSry-KO XY雌の性転換雌を効率的(10-20%)に作出することに成功した。性転換個体は正常な雌の形態を呈していたが、交配試験の結果不妊であることが判明した。成体の性転換マウスの病理組織解析の結果、卵巣内卵子の消失が確認された。3)少数細胞を用いたChIP-Seqによる包括的ヒストン修飾解析手法の確立:ヒストン修飾解析法は、出来る限り少数の細胞を対象とした手法の確立を目指し、10,000個のES細胞を用いたNative ChIP-Seqを実施し、再現性の高いH3K4me3およびH3K4me1の手法を確立した。これは従来の1/10の細胞数で、網羅的ヒストン修飾情報の取得ができることを明らかにした。本申請で挙げた研究内容は、いずれも次世代シークエンサーを活用した網羅的な遺伝子解析を実施する計画である。解析対象が始原生殖細胞(PGC)で取り扱いが容易ではなく、かつ使用できる細胞数が限定される。まずOCT4-EGFPマウスを自家繁殖させ、FACSソーターを用いて効率的に始原生殖細胞を純化するシステムを確立して問題を解決し、安定的に十分数の細胞の供給を可能とし、研究が当初目標を上回る進展に結びついた。特にトランスクリプトーム解析の成果は、雌雄生殖細胞の特性を明確に示す遺伝子発現プロファイリングを提示し、さらに、単一細胞のトランスクリプトームデータの取得に初めて成功し、PGC細胞の不均一性を明らかにした。この事実は、今後の雌雄生殖細胞の分化・選別に重要な視点を提供したものと理解している。また、ゲノム編集による性転換XYマウスの作出は、当初難題と捉えていたが、効率的に作出することに成功した。今後の生殖細胞の性分化機構の解明に重要な進展と理解している。一方、DNAメチル化では説明できないエピジェネティクス修飾による遺伝子発現制御を理解するため、ヒストン修飾解析法の確立を目指した。細胞数を従来の1/10である10,000個での解析を可能としたことは、PGCを対象とした本研究課題の推進に重要な成果であり、2年度以降の研究に大きく貢献することは間違いない。初年度の成果は、PLOS ONE誌に掲載され、また学会発表においても優秀発表賞(日本卵子学会、Epigenetics 2015)を授賞している。以上のことから当初計画を上回る成果を挙げたと判断した。生殖系列細胞の特性を明らかにするために、本年度は、以下の成果を得た。1)包括的ヒストン修飾解析:我々が構築した少数細胞を対象としたChIP-Seq解析によりE13.5雌雄始原生殖細胞(PGC)の包括的ヒストン修飾解析を実施した。ChIP-Seq解析は、1x10(-4)個の雌雄PGCを対象とし、Native ChIP-Seqを行い、H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3およびH3K27acの6ヒストン修飾のゲノムワイドな情報取得に成功した。現在詳細な比較解析を実施しているが、既にDNAメチル化が消去した時期のPGCにおいて雌雄間にヒストン修飾の差異が明らかになっている。2)Sry欠損性転換マウスを作出:CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により作出したSry欠損性転換マウスを作出した。XY雌PGCのトランスクリプトーム解析を実施し、XX雌PGCとの発現差を示す遺伝子群を明らかにした。さらに、不妊の原因を探り、PGCおよび卵母細胞数の顕著な消失の実態について明らかにした。3)トランスクリプトーム解析:現在Fluidigm社IFC chipおよびC1 Single-Cell Auto Prep System methodを用いたE7.5日胚PGC前駆細胞のシングルセルトランスクリプトーム解析を進行している。Mil1-EGFP-TGマウスからサンプリングし、mRNAseq解析に着手したところである。4)

3Dイメージング解析: XY雌、XX雌およびXY雌生殖巣におけるPGCおよび支持細胞の3Dイメージング解析を実施した。大変興味深いことに、E13.5のPGC数は約12,000と定説の半数であること、さらに、この時点で増殖を停止せず、雌ではE16.5まで、一方雄ではE18.5まで増殖が継続していることが判明した。トランスクリプトーム解析については、XX雌-PGC, XY雄-PGC, XY雌ーPGCの比較解析を完了することができ、差次的発現遺伝子群の検出に成功している。これにより、E13.5のPGCにおいて性分化の初動の全容が初めて明らかになったことから、当初目標を上回って進展している。一方、PGC分化初期のシングルセル-トランスクリプトーム解析では、Fluidigm社からのキットの供給が大幅に遅れ(1年)当初計画から、若干の遅れとなっている。ただし、現在精力的に実験を進めていることから、29年度には成果が得られると確信している。ヒストン修飾解析は、すこぶる順調に成果を挙げており、DNAメチル化消去後のPGCにおけるエピジェネテクス修飾による遺伝子発現制御の実態が明らかになるものと期待できる。当然、雌雄生殖系列細胞の分化におけるエピジェネテクス制御の実態が明らかになることが期待される。CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集による性転換XY雌の作出は非常に効率的で、当初目標を上回る成果に結びついた。XY雌PGCの特性については現在論文を取りまとめている。XY雌不妊の実態を、交配試験、トランスクリプトーム解析、免疫染色などの手法を用いた詳細な成果を報告する。3Dイメージング解析では、当初目標を上回る詳細な解析結果が得られ、従来の定説を覆す成果が得られたことは重要な意味を持つ。また、その波及効果も大きい。以上の全体として概ね順調に進行していると評価できる。性転換されたXY雌マウスの繁殖能力は、卵母細胞の大量喪失および減数分裂進行の障害によって、著しく損なわれてほぼ不妊となる。しかしながらマウスの遺伝的バックグラウンドの違いにより表現型が異なることが報告されている。そこで、近交系C57BL /6マウスにおいて、重要な性決定遺伝子であるSryの遺伝的切除を伴う性反転した雌を作出して、性転換XY雌卵母細胞機能不全の分子病因を決定しようとした。XY<sry->突然変異体と呼ばれるこれらの突然変異体マウスは、胎児発達中の生殖細胞の重度の傷害を示し、性成熟前の卵巣生殖細胞の枯渇をもたらした。始原生殖細胞の包括的トランスクリプトーム解析は、有糸分裂増殖の段階の間に、XY<sry->雌が正常な発生プロセスから明らかに逸脱していることを示した。XY<sry->始原生殖細胞の顕著な増殖障害が認められたが、これは異常なβ-カテニンシグナル伝達および転移因子の過剰発現と関連していた。減数期に入ると、XY<sry->卵子は、クロスオーバ形成の障害、原始卵胞維持の障害、および胚発生の能力を含めて、広範な機能障害を呈した。これらの結果は、性転換されたXY雌マウスにおける生殖細胞形成異常の分子基盤の一部が明らかになった(論文投稿中Human Molecular Genetics)。「Swyer症候群」のようなヒトの性分化障害に関する洞察を提供する。
p105新規タンパク質による細胞質mRNA複合体の形成と細胞骨格依存的輸送

神経細胞の樹状突起内へmRNAが輸送され、そのmRNAがシナプスにおいて長期増強刺激依存的に局所的にタンパク合成されることが知られている。この局所的翻訳システムは、ひとつの細胞内に多様なシナプスを形成させるためにたいへん重要で、シナプス可塑性に必須のシステムだと考えられている。このmRNA輸送体はおもにリボソームとRNAで構成される高次複合体であることが報告されているが、詳細な分子構築についてはほとんど何もわかっていないのが現状である。p105タンパク質は、当初は中心体に集積する新規タンパク質として我々が同定したものである。本研究によって、p105は、大脳樹状突起に特異的に発現していること、またリボソーム・mRNAとともに細胞質粒子を形成することがわかってきた。この結果から、p105は神経樹状突起mRNA輸送複合体の全く新しい構成要素であると考えられた。この複合体には、シナプス形成に関与する翻訳調節因子(FMRP)やmRNA輸送因子(Staufen)など興味深い因子も局在していた。また、微小管およびアクチンモータータンパク質も局在し、これら細胞骨格依存的に複合体が細胞膜の直下まで輸送されることがわかった。さらに、この複合体によって輸送されるmRNAには、シナプス可塑性に深く関与するもの、例えばCaMキナーゼIIαやBDNFのmRNAが含まれていることがわかった。以上の結果から、p105は、大脳のシナプス可塑性に関与するmRNA輸送・翻訳制御複合体の新規構成因子であることが明らかになった。
肝内胆管がんに対する複合型細径ファイバを用いた光線力学治療研究

本研究は肝内胆管がんに対し、内視鏡的に肝内胆管の腔内からレーザー光を照射する光線力学的治療(photodynamic therapy以下、PDT)の確立を目指して行った。本研究では外径は1mm弱の極細の複合型ファイバ(以下、ファイバ)を作成した。成果:1)ファイバは脆弱であるため、既成の内視鏡用カニューレを改造して、専用のシース(鞘)を作成した。先端には屈曲形状をつけ、洗浄機能を付加させた。2)ブタの胆道粘膜の観察と同部へのPDTを施行した。ブタを1カ月間観察し、その後犠牲死させた。PDT照射部の胆道粘膜は正常に戻っていた。本研究で同ファイバによるPDTは生体内で使用可能なことを示し得た。複合型細径ファイバを用い、胆管がんの管腔内からの光線力学的治療(以下、PDT)の確立を目指している。本年度の研究目標は、1)脆弱な細径ファイバをいかに簡便に目的部位まで到達させるかということである。実績として、細径ファイバ用の洗浄機能付き専用シースを作ることが出来た。またそのシースの効果、すなわち十分な洗浄効果、視野の確保とレーザー照射を行えることをin vitro、および豚の胆嚢で確認した。もうひとつは、2)胆道粘膜へのPDTの影響を経時的に観察することである。豚の胆嚢ではあるが、胆道粘膜上皮にPDTを施行し得た。そして4週間の経過観察とPDT施行直後と4週間後の胆道粘膜を採取し得た。その結果、PDT直後の正常胆道粘膜は出血とうっ血は見られるが粘膜の脱落はなく、また4週後にはほぼ正常粘膜の状態であることが確認された。この結果は本研究の目指す胆道粘膜へのPDTは、少なくとも非腫瘍部には重大な変化を及ぼさないことを意味する。本研究は複合型細径ファイバを用い、胆管がんの管腔内からの光線力学的治療(以下、PDT)の確立を目指している。本年度の研究目標は引き続き、外力に対し脆弱な細径ファイバを生体内深部まで、いかに安全に簡便に到達させるかということである。初回の試作シースを用いて、生理的洗浄下に主種の条件で画像を撮影した。その結果、最適の滴下生理的食塩水の量を決定した。同法による撮影結果では、水分による画像のゆがみが認められることが分かった。さらに改良を加え、適切な洗浄法を検討した。安定した製剤形を保つため、シースを市販のSpy Glassシースに代えるため、細径ファイバの全長を長くしたものを作製中である(本研究期間の一年の延長を申請、承認済み)。これまでも行ったin vivoでの研究を継続し、使用した豚の匹数を増やした。そして胆汁の洗浄、および視野の確保とレーザー照射を行えることを生体外と豚の胆嚢で確認した。視野の確保は従来径を持つCCDカメラと比し、不十分であるが、複合型細径ファイバの径が細いことから、この点についての改良は進まなかった。PDTの実際については、胆道粘膜へのPDTを施行後、四週間の経過観察によりPDT施行直後と四週間後の胆道粘膜を採取し得たため、PDT直後の正常胆道粘膜は出血とうっ血は見られるが粘膜の脱落はなく、また四週後にはほぼ正常粘膜の状態であることが確認し、さらに症例数の蓄積を行い、国際学会にて報告した。1.複合型細径ファイバは外径が1mm以下であるため、極めて外力に弱いために胆管内に同ファイバを保護しながら運ぶシース(鞘)が必要である。シーズをいくつも試作し、最適な洗浄条件とファイバの可動性を確認した。2.胆管内でレーザーを照射するため、視界を明瞭にしなければならない。さらにレーザー出力をより効果的に標的に照射するために、シースから無色透明である生理的食塩水を噴出させる工夫が必要である。その意味でのシースを作成し、改良を加えた。同システムを用い、in vitroで水滴を行いながらレーザーを照射し、散乱光の発生具合をレーザー光の強度をパワーメーターで測定、評価した。3.クラウンミニブタを用い、第二世代光感受性物質を投与し、胆嚢粘膜にPDTを施行する動物数を増やした。その結果、PDTによる正常胆嚢粘膜の変性がおこらないことを再度、確認した。現在、実験は休止している。豚にファイバーを噛まれ、損傷。現在、新しいものを作製中。本研究は胆管がんの胆管腔内からの光線力学的治療(photodynamic therapy以下、PDT)の確立を目指したものである。胆管が肝内を樹状に走行しており、最終的には1本になって十二指腸へ開口する。本研究で開発している複合型細径ファイバの外径は1mm弱である。2017年度に大動物を用いた実験を行った際、同ファイバを損壊したため、予定より1年の延期を余儀なくされた。2018年度の研究目標は2017年度と同じく、『外力に対し脆弱な細径ファイバを生体内深部まで、いかに安全に簡便に到達させるか』ということである。1.内部にファイバを通す鞘(シース)の改良:内視鏡の鉗子口への容易な挿入のため、既成の内視鏡用カニューレを改造した。1)末端の胆管への選択的挿入のため、先端に屈曲形状をつけた。

2)胆管内腔を満たす胆汁を洗浄するため、術者側末端に生理的食塩の滴下口を取り付けた。3)適切な洗浄速度を決定した。2.大動物の胆道(胆嚢)を用い、本ファイバの画像の鮮明度を調べた。⇒現在の主流であるCCDカメラには遠く及ばなかった。しかしながら超細径という本ファイバの特性上、改良は出来なかった。3. PDTの実際:大動物(豚)での照射に留まり、人への施行には至らなかった。大動物の胆道への照射は施行可能であった。PDT施行直後、および四週間の経過観察後の胆道を採取し、病理学的検討を行った。結果、PDT直後の正常胆道粘膜には微小血管からの出血とうっ血、組織間隙の浮腫がみられたが、粘膜の脱落はなかった。同所見は四週間後には消失し、ほぼ正常粘膜の状態に戻っていたことを確認した。本研究は肝内胆管がんに対し、内視鏡的に肝内胆管の腔内からレーザー光を照射する光線力学的治療(photodynamic therapy以下、PDT)の確立を目指して行った。本研究では外径は1mm弱の極細の複合型ファイバ(以下、ファイバ)を作成した。成果:1)ファイバは脆弱であるため、既成の内視鏡用カニューレを改造して、専用のシース(鞘)を作成した。先端には屈曲形状をつけ、洗浄機能を付加させた。2)ブタの胆道粘膜の観察と同部へのPDTを施行した。ブタを1カ月間観察し、その後犠牲死させた。PDT照射部の胆道粘膜は正常に戻っていた。本研究で同ファイバによるPDTは生体内で使用可能なことを示し得た。1.現行のものより長い細径ファイバを作製し、市販のシースを用いて、引き続きIn vitroのPDTシステムの完成を目指す。2.豚への内視鏡を行い、上記システムの改良を行う。消化器病1.複合型細径ファイバは外径が1mm以下であるため、極めて外力に弱いために胆管内に同ファイバを保護しながら運ぶシース(鞘)が必要である。また胆管内でレーザーを照射するためには、視界を明瞭にしなければならない。さらにレーザー出力をより効果的に標的に照射するために、シースから無色透明である生理的食塩水を噴出させる工夫が必要である。シースを作成した。内径はファイバ外径よりも十分広く、ファイバの動きを妨げない。さらに末端にY字のコネクターを接続し、一方の孔からファイバを、もう一方の孔からファイバを挿入出来るように工夫した。同システムを用い、in vitroで水滴を行いながらレーザーを照射し、散乱光の発生具合をレーザー光の強度をパワーメーターで測定する系を作った。2.クラウンミニブタを用い、光感受性物質(レザフィリン)を投与した。6時間後、全身麻酔下に胆嚢内に上記シースを挿入し、水滴下に胆嚢粘膜を観察した。水滴はファイバ周囲の胆汁を排除し、視野を明瞭にした。同部にレーザーを照射し、PDTを行った。PDT直後に胆嚢粘膜を切除し、病理組織学的変化の検討を行った。さらにミニブタを4週間生存飼育し、再度開腹し、胆嚢を摘出。PDT施行部胆嚢粘膜の病理組織学的な検討を行った。昨年度、豚を使った実験を施行中に、傾眠状態の豚が覚醒し、本研究でも用いていた細径ファイバを噛むアクシデントがあった。そのため、予定の実験が行えず、次年度へ予算の使用を持ち越すことになった。現在、細径ファイバを作製中である。新規のファイバが完成次第、実験を再開する予定である。1.In vitroのPDTシステムの完成を目指す。レザフィリンを添加した胆汁中で、開発中の水滴型シース内にファイバを通し、レーザー照射を行う。