hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
古代ギリシア美術の私的領域に関する図像の研究

(3)研究例会を開催し、構成員のそれぞれの研究の進捗状況について報告し、課題について討論した。(4)本年度は三ヵ年の研究活動の最終年度にあたるため、2009年3月に報告書を作成した。冒頭に研究目的と計画について記し、さらに三年間の詳細な活動記録を記載した。本論として論文、研究報告等の研究成果を掲載した。執筆者は、研究代表の長田年弘、研究分担者の篠塚千恵子、研究協力者の遠藤祐輔、田中咲子、中村るい、名倉千絵、福本薫、計6名である。報告書は200部を作成し、国内外の専門研究者に配布する。
映画・映像メディアに関する地域ネットワーク型アーカイブ学の基盤形成

本研究は、現在様々な地域や大学で急務となっている映画・映像アーカイブの構築研究を、奄美群島を中心に数多くの離島を有し、本土最南端に位置する鹿児島県で実施したものである。南日本のヴァナキュラーな映像をデジタル・アーカイブし、そのメディア表象の批判的な分析を行った。鹿児島大学を拠点に、鹿児島コミュニティシネマやかごしまフィルムオフィスと連携し、また、様々な大学や研究機関と資料調査を恊働して行い、多地域間での研究者のネットワークの基盤形成を試みた。そして、アーカイブ学の構築のために、映画論やメディア論などの基礎研究を進めながら、映像技術や表象様式に関する歴史的分析と理論的考察を行った。研究初年度にあたる本年度は、まず鹿児島県の奄美群島で、記録映像の調査を開始した。残念ながら、高温多湿という環境のなか、フィルムがすぐに傷んでしまうため、個人所有の記録映像の多くがすでに失われている現状が明らかになり、個人映像資料の収集には至らなかった。しかしながら、奄美群島広域事務組合の視聴覚ライブラリーにおいて、奄美大島関連映像のデジタル化の現状を把握することができ、本土復帰に関する写真データ資料などを収集することができた。また、名瀬市政30周年記念映画の『奄美のこころ』や与論町役場の『与論島映像』をはじめ、再生不可能な状態にあるフィルムやベータカムを複数発掘することができ、そのデジタル・アーカイブ化へ向けた取り組みを開始することができた。そして、鹿児島市内においては、主に8mmフィルムの記録映像の調査を、かごしまフィルムオフィスと連携して開始した。このような実地調査と並行して、映像モニターやHDD、パソコンなどの設備・備品を整え、こうした記録映像だけでなく、戦後70周年に鹿児島で放送される番組映像の表象分析を行うための映像アーカイブの環境の構築を行った。「映像と戦争の記憶」に関しては、韓国ソウルの高麗大学校日本研究センターで開催された国際シンポジウムで研究発表を行うとともに、「デジタル時代の映画」をめぐる論文を、応用文化科学センターの紀要に寄稿した。また、京都市立芸術大学芸術資源研究センターのアーカイブ研究会をはじめ、映画・映像をめぐる研究会やシンポジウムに数多く参加しながら、研究者たちと打ち合わせを重ね、アーカイブ構築研究の進展に向けた様々な知見を深めることができた。さらに、鹿児島大学を拠点に、鹿児島コミュニティシネマと連携して、映画をめぐるトーク・イベントを2回開催し、映像を媒介にして、大学と地域を結びつける取り組みも始めることができた。研究最終年度にあたる本年度は、初年度に引き続き、鹿児島県の本土および島嶼地域において、記録映像の調査を進めた。だが、奄美群島をはじめ、高温多湿環境によるフィルム劣化や腐敗のため、記録映画やアマチュア映画はすでに失われており、本年度も収集することができなかった。しかしながら、名瀬市制30周年記念映画『奄美のこころ』を発掘し、また個人所有の本土復帰関連映像も複数本発見することができたので、そのデジタル・アーカイブ化を行った。修復・復元は完全にはできなかったものの、地域の生活の記録のために貴重な映像資料を得ることができた。そして、記録映画をめぐる研究書や撮影機材などの設備・備品を整えた。このような実地調査と並行して、東北地方の記録映画をめぐる対話型シンポジウム(上映会+トーク・ディスカッション)を、アーティストの藤井光氏、映画監督の濱口竜介氏とともに開催した。また、アーカイブをめぐるワークショップをアーティストの大久保美紀氏とともに実施した。そして、映像のデジタル化に関する研究論文と翻訳を共著『デジタル・スタディーズ』(東京大学出版会)にて発表するとともに、映像のアーカイブに関する研究論文を鹿児島大学法文学部紀要『人文学科論集』に投稿した。さらに、神戸映画資料館の公開研究会「映像アーカイブと地域連携」などに参加し、地域映像アーカイブ構築の進展に向けて、数多くの研究者たちと意見交換を重ねて様々な知見を得ることで、研究のネットワークを作ることができた。また、鹿児島大学を拠点に、鹿児島コミュニティシネマやかごしまフィルムオフィスと連携して、映画をめぐるトークセッションを開催し、映像を媒介にした地域連携を推進させることもできた。今年度は、鹿児島市や奄美群島で映像の実地調査を実行し、デジタル化して保存が必要となっている映像を見出すことができた。また、映像アーカイブ構築研究の基盤形成のために有益な知見を、数多くの研究者と交流することによって深めることができた。そして、国際シンポジウムおよび国際的な学術誌で研究の成果も発表することができた。8mmフィルムをはじめ、個人所有の記録映像の発掘の進捗状況は良くなく、今後さらなる調査を実施していく必要があるものの、鹿児島コミュニティシネマやかごしまフィルムオフィスとの連携体制の構築をはじめ、初年度としては研究をおおむね順調に進展させることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。映画論・メディア論今後も継続して、記録映像の実地調査を行っていく。そして、昨年度に見出したフィルム(『奄美のこころ』や『与論島映像』)のデジタル化保存を具体的に進めていく予定である。

地域と映像をめぐる映画上映会やトーク・ディスカッションを実施するとともに、地域映像をめぐる研究会を鹿児島で組織化して、本研究課題の成果を発表していく。それと並行して、記録映画やメディアをめぐるシンポジウムやワークショップに積極的に参加し、研究者との交流を続けることで、新たな知見を獲得していく。また、これまでの研究の成果として、映画・映像のデジタル化についての論文、戦争の記憶と映像の記録についての論文を執筆し、それぞれ共著(分筆担当)を出版する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。
液滴フロー法によるレーザー分光高感度環境計測装置の開発

試作したパッシブサンプリング装置を風洞内に設置し、装置胴体部へ気体試料を流し、胴体部中央を通るステンレスパイプは、吸収溶液を導き、先端に液滴を作る。吸収溶液はマイクロポンプによって送液する。形成された液滴によって周りを流れる気相中の物質を捕集する。液滴成長プロセスの再現性を高めるため、研究代表者らが開発したコンピューター制御のパルス吐出マイクロポンプ(現有設備)を使用して超精密流量で送液する。これにより、フローと液滴成形がより安定するので、大気中超微量成分検出に向けて高感度化が見込まれる装置構成が可能になる。本研究では、発光ダイオードと光ファイバーの組み合わせによる吸光検出を適用して液滴フロー法の装置化を研究してきたが、ある程度の研究経験を有する発光ダイオード分光検出法の適用により、新境地の高感度モニタリング装置開発へ移行した。現有発光ダイオード分光検出器を用いた高感度検出システムの適用は、液滴法と発光ダイオード分光検出法の接続について研究協力者(島津、ジーエルサイエンス)の支援を得た。標準ガス発光装置(設備備品として2台購入)を用いて、ホルムアルデヒド(HCHO)とNO_2をモデルにして液滴フロー計測装置の性能評価研究を行った。液滴界面を形成しガス吸収を行う際、それぞれの物質に最適な流動溶液を選択し、温度・湿度といった環境因子による測定条件や、検出時の操作条件について検討した。これによって得られた分析操作条件を適用することにより、高感度な測定法を確立し、さらにそれぞれの物質について実際の環境中でのモニタリングに適用を試みた。また、人間活動と地球環境の相互作用のリスクを評価するためのツールとしての用途開発を目標に、大気中微量化学物質によってヒトが受けるリスクを予測するため、室内環境に重点を置きながら室外環境と大気中微量化学物質の比較評価を行った。試作したパッシブサンプリング装置は、風洞内に設置した。装置胴体部へ気体試料を流し、胴体部中央を通るステンレスパイプは、吸収溶液を導き、先端に液滴を作る。吸収溶液は、ザルツマン試薬を用い、必要に応じてトリエタノールアミン(TEA)を加えて、マイクロポンプによって送液する。形成された液滴は周りを流れる気相中のNO_2を捕集し、発色する。この発色した液滴に赤色発光ダイオード(LED)の光を照射し、液滴を透過した光を光りファイバーでフォトダイオードまで導き、光電流に変換した。この電流を基に、見かけの吸光度及び吸光度を求めた。本研究では、発光ダイオードと光ファイバーの組み合わせによる急行検出を適用して液滴フロー法の装置化を研究してきたが、ある程度の研究経験を有する発光ダイオード分光検出法の適用により、新境地の高感度モニタリング装置開発へ移行した。現有発光ダイオード分光検出器を用いた高感度検出システムの適用に当たっては、室内環境で問題が顕在化しているNO_2をパッシブモニタリング・連続モニタリングするケーススタディの適用を目指すが、前例がないので、液滴法と発光ダイオード分光検出法の接続について研究協力者(島津、ジーエルサイエンス)の支援を得た。NO_2の標準ガス発生装置を用いて、液滴界面を形成しガス吸収を行う際、それぞれに最適な流動溶液を選定した上で、液滴フロー環境計測装置の性能評価研究を行っている。

前年度の研究により、液滴成長プロセスの再現性を高めるため研究者代表者が開発したコンピューター制御のパルス吐出マイクロポンプ(現有設備)を使用して超精密流量で送液し、これにより、送液精度と液滴形成がより安定するので大気中超微量成分の検出に向けて高感度化が見込まれた装置構成が可能になった。また、本研究グループでは、これまで発光ダイオードと光ファイバーの組み合わせによる吸光検出を適用して液滴フロー分析法の装置化を研究してきたが、ある程度の研究経験を有するレーザー光分光検出法の適用により、新境地の高感度モニタリング装置開発へ移行した。今年度は、標準ガス発生装置(設備備品として2台購入)を用いて、ホルムアルデヒド(HCHO)とNO_2をモデルにして液滴フロー環境計測装置の性能評価研究を行った。液滴界面を形成しガス吸収を行う際、それぞれの物質に最適な流動溶液を選択し、温度・湿度といった環境因子による測定条件や、検出時の操作条件について検討した。これによって得られた分析操作条件を適用することにより、高感度な測定法を確立し、さらにそれぞれの物質について実際の環境中でのモニタリングに適用を試みた。また、人間活動と地球環境の相互作用のリスクを評価するためのツールとしての用途開発を目標に、大気中微量化学物質によってヒトが受けるリスクを予測するため、室内環境に重点を置きながら室外環境と大気中微量化学物質の比較評価を行った。
ヒト体内時計の構造解析:睡眠覚醒リズムからの振動共役

ヒト血中メラトニンリズムが睡眠覚醒スケジュールに同調するか否かを、フリーラン条件下で検討した。それに先立ち、スケジュールに不可避的に伴なう明暗サイクルのリズム同調に対する影響を検討した。1リズム同調に対する光照度の下限値リズム同調に対する光照度の下限値をメラトニン光抑制反応から推測した。8名の健常成人男子を対象として、血中メラトニン濃度が上昇する夜間に20010、000ルックスまでの5段階の照度の光を3時間照射し、光によるメラトニン抑制反応を測定した。その結果、200ルックスの光照射では有為な抑制は見られなかったが、500ルックス以上の光では抑制がみられた。動物実験ではメラトニン光抑制反応の閾値がリズム同調の閾値より低いので、200ルックス以下の光には同調作用はないと考えられた。2睡眠覚醒スケジュールによるリズム同調8名の健康成人男子を200ルックス以下の照度に設定した時間隔離実験室で21日間生活させ、概日リズムをフリーランさせた。フリーランの8日目より24時間周期で就眠起床の時刻を指定し、睡眠覚醒リズムの位相を8日間固定した。その後5日間、再び睡眠覚醒の時刻を自由とした。血中メラトニンリズムを、第1日目の同調条件下、第1回フリーランの7日目、位相固定の8日目、そして第2回フリーランの5日目に測定した。メラトニンリズムの同調の有無を、リズム周期と睡眠覚醒リズムとの位相関係から判定したところ、8名中3名の被験者で同調が認められたが、4名ではフリーランした。1名は判定不能であった。以上の結果から、睡眠覚醒スケジュールは単独で血中メラトニンリズムを同調させることが可能であり、いわゆる非光因子による体内時計の同調がヒトでも確認された。
mRNA核外輸送トランスポーターTapの核膜孔通過機構

mRNA核外輸送因子Tap/p15ヘテロダイマーの核膜孔通過機序を明らかにするために、本年度研究実施計画に従い、Tapと種々のヌクレオポリン由来のフェニルアラニン-グリシン反復配列(FG-リピート)の結合をプルダウン法および表面プラズモン共鳴法を用いて解析した.Tapモノマーと種々のFG-リピートとの解離定数を測定したところ、いずれのリピート配列とも数ナノモルのオーダーの非常に強固かつ安定な結合を示すことが明らかとなった.しかしながら、核膜孔通過の方向性を決定するような、核から細胞質、あるいは細胞質から核に向かっての親和性の勾配を見出すことはできなかった.一方、Tap/p15ヘテロダイマーとFG-リピートとの結合は、TapモノマーとFG-リピートとの結合と比べて、特に解離相が促進されることにより一過性となり、その結果、結合親和性が100倍程度減少することを見出した.しかしながら、この場合も核膜孔通過の方向性を決定するような、ヌクレオポリン間の結合親和性の勾配を見出すことはできなかった.一方、マイクロインジェクション、in vitro importアッセイにより、Tap単独あるいはTap/p15ヘテロダイマーのNPC通過能を比較すると、ヘテロダイマーのみが核-細胞質間を両方向性に移動しうることを見出した。これらのことから、p15はTapとヌクレオポリンのFG-リピート間の結合を制御し、TapがNPCを通過するのを促進する活性を有する因子であると結論付けた.また、Tapの核膜孔通過の方向性は、FG-リピートとの結合特異性のみでは制御されていないことが示唆された.mRNA核外輸送因子Tap/p15ヘテロダイマーの核膜孔通過機序を明らかにするために、本年度研究実施計画に従い、Tapと種々のヌクレオポリン由来のフェニルアラニン-グリシン反復配列(FG-リピート)の結合をプルダウン法および表面プラズモン共鳴法を用いて解析した.Tapモノマーと種々のFG-リピートとの解離定数を測定したところ、いずれのリピート配列とも数ナノモルのオーダーの非常に強固かつ安定な結合を示すことが明らかとなった.しかしながら、核膜孔通過の方向性を決定するような、核から細胞質、あるいは細胞質から核に向かっての親和性の勾配を見出すことはできなかった.一方、Tap/p15ヘテロダイマーとFG-リピートとの結合は、TapモノマーとFG-リピートとの結合と比べて、特に解離相が促進されることにより一過性となり、その結果、結合親和性が100倍程度減少することを見出した.しかしながら、この場合も核膜孔通過の方向性を決定するような、ヌクレオポリン間の結合親和性の勾配を見出すことはできなかった.一方、マイクロインジェクション、in vitro importアッセイにより、Tap単独あるいはTap/p15ヘテロダイマーのNPC通過能を比較すると、ヘテロダイマーのみが核-細胞質間を両方向性に移動しうることを見出した。これらのことから、p15はTapとヌクレオポリンのFG-リピート間の結合を制御し、TapがNPCを通過するのを促進する活性を有する因子であると結論付けた.また、Tapの核膜孔通過の方向性は、FG-リピートとの結合特異性のみでは制御されていないことが示唆された.
トロイダル巻線構造高トルク密度アキシャルギャップ誘導モータの開発

希土類磁石は価格の高騰や安定供給の面で懸念があるめ,レアアースフリーモータの開発が強く望まれている。そこで本研究では,高トルク化が可能なアキシャルギャップ構造に着目し,これに適した制作が可能な誘導モータの最適形状を明らかにするとともに,同体格のラジアルギャップ誘導モータの2倍のトルク特性が得られることを解析および実験の両面から明らかにする。
P2Y12受容体を介した突起進展によるミクログリア活性化シグナル複合体形成の解明

数種のATP受容体について、蛍光タンパク質との融合受容体タンパク質を発現するベクターを作成し、Iba1遺伝子上流配列をプロモータとして用いたレンチウイルスベクターによってこれら機能タンパク質を初代培養系・脳組織培養系のミクログリアに発現させる系を確立した。これによって生体組織内でミクログリア特異的に遺伝子導入するための基本的なツールを開発したことになる。また、P2Y12受容体の活性化とミクログリアの活性化様式との関連性について、初代培養ミクログリアのP2Y12受容体の活性化によってCCL2、CCL3の産生・放出が誘導されることを見出した。平成21年度は初代培養ミクログリアを用い、細胞突起進展時のミクログリア活性化因子の局在変化の可視化のためにGPIアンカー型蛍光タンパク質(GFP-GPI)、細胞膜に均一に配向する蛍光タンパク質(PM-GFP)をコードするプラスミドベクターを構築し、現在知られている唯一の初代培養ミクログリアへ高効率遺伝子導入系であるレンチウイルスベクターを作製した。また数種のATP受容体(P2X4, P2Y6, P2Y12)についても蛍光タンパク質との融合受容体タンパク質を発現するベクターを作成し、レンチウイルスベクターによってこれら機能タンパク質を初代培養ミクログリアに高発現させる系を確立した。これと同時にミクログリア特異的な外来遺伝子発現系を構築するためにIba1遺伝子上流配列をプロモータとして用いたところ、ラットグリア細胞の共培養系でミクログリア特異的に蛍光タンパク質を発現させることに成功した。平成22年度では、前年度の研究成果を踏まえ、より生体内環境に近い海馬組織培養切片を用いた実験系へと展開し、生体脳でのミクログリアの細胞外環境異常感知機構とそれに伴う活性化についての理解を広げたいと考えている。ミクログリア特異的発現を示すプローブ開発の手段としてIba1遺伝子上流配列をプロモータを利用し、ミクログリア特異的に蛍光タンパク質を発現させるためのウイルスベクターを構築した。このベクターを用いて脳組織細胞の混合初代培養系に遺伝子導入を試みたところ、ミクログリアの他のマーカー遺伝子であるCDllb陽性細胞優先的に蛍光タンパク質の発現が見られた。また、蛍光タンパク質以外にも、部位特異的に遺伝子発現制御する遺伝子改変動物で頻繁に用いられているcre-loxpシステムに注目し、Iba1遺伝子上流配列をプロモーターとしてcre組み換え酵素を発現するベクターを構築した。このベクターをEGFPレポーターマウスの脳から得られた培養組織切片に微量注入したところ、培養6日後からEGFP陽性細胞が観察されることを見出した。つまり、今回開発したベクターを使うことにより生体に極めて近い組織培養という条件においてもミクログリア特異的な遺伝子発現制御技術を得ることができる。一方で、P2Y12受容体の活性化とミクログリアの活性化様式との関連性について、炎症関連物質であるCCL2、CCL3、TNFαの産生・放出を解析したところ、初代培養ミクログリアにおいてCCL2、CCL3の産生・放出がP2Y12受容体の活性化によって誘導されることを見出した。また、新規合成に依存しないTNFαの細胞外放出がP2Y12受容体アゴニストで惹起されることを見出した。これまでにミクログリアからの炎症性物質の産生・放出には高濃度の細胞外ATPによるP2X7受容体の活性化が必要であるという認識が一般的であったが、ATPの分解産物であるADPをアゴニストとし、より低濃度で活性化されるP2Y12受容体によってもミクログリアの炎症性応答が見られることを明らかにした。この発見は激しいATP漏出・放出を伴わないような組織傷害時にも、P2Y12受容体を介したミクログリアの炎症性応答が引き起こされる可能性を示しており、P2Y12受容体を標的とした創薬の可能性を明確に示すものである。
ABC型トランスポーターによる細菌病原性制御機構の解明

異物排出トランスポーターは抗菌薬を排出することにより細菌多剤耐性化に関与する。しかし、これらが持つ生理的役割は、そのほとんどが未知のままである。本研究では、特に、ABC型輸送体MacABに着目し、生理機能解析を行った。トランスポーターが宿主細胞表面への付着に関すること、酸化ストレスへの抵抗性に関与すること、バイオフィルム形成維持に関与すること、腸内の細菌生存に一部関与すること等の発見があった。また、阻害候補化合物の選定を行った。多くのトランスポーターの生理機能が未知な状況において、本研究成果は、その生理機能を明らかにしたものであり、新薬開発においても重要な情報が提供できると考えられる。異物排出トランスポーターは複数の抗菌薬を細胞外へ排出することにより細菌に多剤耐性をもたらす。しかしながら、異物排出トランスポーターが本来持つ生理的役割は、そのほとんどが未知のままである。我々は、グラム陰性菌において世界初のABC型異物排出蛋白質MacABを発見した。MacABを発現させた菌はマクロライド系抗菌剤特異的に耐性を示した。さらに、サルモネラにおいては細菌病原性発現に関与する。そこで、本計画では、細菌のABC型異物排出蛋白質の宿主細胞感染における役割や薬剤耐性への関係を調べるとともに、構造解析を行う。数多くの排出トランスポーターの生理機能が未知な状況において、本研究は、その生理機能を明らかにするという点できわめて重要であり、新薬開発においてもターゲティング分子として重要な情報が提供できると考えられる。今年度は、サルモネラのABC型異物排出蛋白質遺伝子欠損株を作製し、宿主細胞表面への付着に関する検証を行った。野生株と遺伝子欠損株のフェノタイプを確認したところ、異物排出トランスポーターが、サルモネラの宿主細胞表面への付着に関与している事が判明した。精製した異物排出トランスポーターについて電子顕微鏡顕微鏡を用いて構造解析を行った。また、蜂蜜中に含まれる抗菌性成分が異物排出蛋白質によって認識されるのかどうか、臨床から分離された多剤耐性緑膿菌に対して抗菌性を示すのかについて、大腸菌、緑膿菌、サルモネラの複数の異物排出蛋白質遺伝子欠損株や、臨床分離株を用いて調査を行った。研究成果は、科学雑誌や学会等で発表を行った。異物排出トランスポーターは、抗菌薬を含む異物を細胞外へ排出することにより細菌に薬剤耐性をもたらす。近年の研究から、これら異物排出トランスポーターが、抗菌薬耐性以外にも重要な生理的役割を担っていることが分かりつつある。グラム陰性菌において世界で初めて同定されたABC(ATP共役)型異物排出蛋白質MacABは、マクロライド系抗菌剤を特異的に認識して耐性に関与していることが分かっている。また、サルモネラにおいてMacABはマウスに対する本菌の致死性に関係しており、この遺伝子欠損株のマウスに対する病原性は野生株に比べて弱くなっていることが知られている。本計画では、細菌のABC型異物排出蛋白質の宿主細胞感染における役割や薬剤耐性への関係を調べるとともに、構造解析を目的として研究を進めている。今年度は、MacABトランスポーターが、細菌宿主感染時においてどのような生理的役割を担っているのかを明らかにするために、サルモネラ野生株ならびにmacAB遺伝子欠損株を作製し、細胞感染実験を行った。その結果、遺伝子欠損株は宿主細胞中での増殖能力が低下しており、また、細胞内においてその発現が大きく誘導されることが明らかになった。遺伝子欠損株は野性株に比べて酸化ストレスに対する抵抗性が低下していることも分かりつつあり、この現象がマウスに対する致死性の低下と関係していることが考えられた。さらなる解析のため、MacAB発現株を用いた阻害剤のスクリーニングを行い、いくつかの候補化合物を得た。また、異物排出トランスポーターが細菌バイオフィルム形成維持に関与しているなどの新しい発見があった。今後は、阻害剤を用いて細菌宿主相互作用に与える影響等について解析を進める必要があると考えている。研究成果については、科学雑誌や学会等で発表を行った。異物排出蛋白質が細菌の宿主細胞内生存に関与しているという新たな生理的役割を発見し、さらにはバイオフィルム形成維持における役割解明など、新たな進展があった。数多くの排出トランスポーターの生理機能が不明な状況において、本研究は、その生理機能を明らかにするという点で重要であり、新薬開発においてもターゲティング分子として重要な情報が提供できると考えられる。これら異物排出トランスポーターをコードする遺伝子は、人類が抗菌薬を使用する前から、細菌ゲノムに存在していることが分かっており、このことから、これらトランスポーターは抗菌薬耐性以外にも何らかの重要な生理機能を担っているのではないかということが議論されている。しかし、異物排出トランスポーターが本来持つ生理機能については、そのほとんどが未知のままである。近年の研究から、これら異物排出トランスポーターが抗菌薬耐性以外にも重要な生理的活性を担っていることが示唆されている。グラム陰性菌において初めて同定されたABC型異物排出トランスポターMacABは、発現させると菌はマクロライド系抗菌剤特異的に耐性を示すのに加えて、サルモネラにおいては病原性発現に関与することが分かっている。これまでに排出トランスポーターの生理機能について調べた結果、異物排出トランスポーターが、サルモネラの宿主細胞表面への付着に関与していることが分かり、それに加えて、宿主細胞内での細菌増殖にこれらのトランスポーターが関与していること、また、酸化ストレスによって、トランスポーターの発現が誘導されていることが判明した。さらには、宿主の腸内においてトランスポーターが細菌の生存に必要であることが分かってきた。

また、病原性に関与するトランスポーター阻害剤のスクリーニングも行い、候補化合物を複数同定した。研究の結果から、抗菌薬耐性因子として同定されている異物排出トランスポーターが、病原細菌が宿主に感染する過程において重要な役割を果たしていることが明らかになった。異物排出トランスポーターが細菌の宿主細胞内で発現誘導され、さらは、宿主内での細菌の生存に関与している新たな生理的役割を発見した。病原性に関与するトランスポーターの阻害候補化合物を同定した。異物排出トランスポーターは抗菌薬を排出することにより細菌多剤耐性化に関与する。しかし、これらが持つ生理的役割は、そのほとんどが未知のままである。本研究では、特に、ABC型輸送体MacABに着目し、生理機能解析を行った。トランスポーターが宿主細胞表面への付着に関すること、酸化ストレスへの抵抗性に関与すること、バイオフィルム形成維持に関与すること、腸内の細菌生存に一部関与すること等の発見があった。また、阻害候補化合物の選定を行った。多くのトランスポーターの生理機能が未知な状況において、本研究成果は、その生理機能を明らかにしたものであり、新薬開発においても重要な情報が提供できると考えられる。異物排出蛋白質が細胞付着に関与しているという新たな生理機能を発見し、さらには電子顕微鏡での異物排出蛋白質の構造解析が進展するなど、当初の計画以上に研究が進展した。今後は、異物排出トランスポーターの詳細な機能を解明するため、トランスポーター阻害剤に関するスクリーニングを継続してすすめるとともに、阻害剤の持つ効果について既存抗菌薬との相乗作用や、病原性におよぼす影響などについて解析を進める予定である。また。排出トランスポーターの局在や宿主感染時における変化や構造についても研究を推進したいと考えている。今後は、異物排出トランスポーター阻害剤に関するスクリーニングを継続して進めるとともに、新たな感染症治療法開発につなげる。細胞生物学、細菌学今後は、異物排出トランスポーターの機能の詳細を明らかにするために、遺伝学的、構造学的、生化学的手法を駆使して研究を進める。まだ、異物排出トランスポーターの細菌内での局在や、複合体形成の機構も謎が多く残されているので、精製蛋白質のみならず細菌細胞内での異物排出トランスポーターを構成する各コンポーネントの局在や、宿主感染時におけるトランスポーターの発現や局在変化についても免疫電子顕微鏡法とトモグラフィー解析を組み合わせて研究を推進する。主に物品費と人件費が当初予定していたよりも支出が少なくなったため、次年度使用額が発生した。研究の推進に特に影響はなかった。計画していた人件費が当初より支出が少なかったため、次年度使用額が発生した。研究の推進上影響はない。
糖蛋白品質管理選別輸送におけるカルゴ動物レクチンVIP36機能の超微形態学的解明

動物レクチンVIP36は、高マンノース型糖鎖を特異的に認識する、一回膜貫通型レクチン蛋白である。今回の研究を通して、このVIP36は糖蛋白質だけではなく、特に、フォスファジールイノシトールの1種であるSD1a等の糖脂質の品質管理選別輸送におけるカルゴ動物レクチンVIP36機能の超微形態学的解明を可能にすることができた。今回得られた新しい所見の中には、細胞のゴルジ装置、並びに、ゴルジ装置以降の細胞膜周辺領域においては、このVIP36が3種の異なる立体構造を有し、そのうちの1種が、特にシスーゴルジ装置以降のルートにおいて、二量体を中心とする多量体を形成してくることを見い出した。一方、他のタイプのVIP36は、上記に示したタイプのVIP36とは異なり、一量体のままでゴルジ装置を通過した。この一量体のままゴルジ装置を通過するVIP36はゴルジ槽の両端に多く、主としてゴルジ槽の中心部を中心に分布している多量体を形成するタイプのVIP36とは異なった微細形態上の分布を示した。以上の結果から、細胞のゴルジ槽には、ゴルジ装置を順行するVIP36と逆行するVIP36の分子があり、抗体によって、特異的に選別できることがわかった。抗体は、VIP36の特定のエピトープとして特異的なアミノ酸配列のみを認識しており、VIP36分子を特異的に分離した。以上のことから、我々が主張するこれら3種のVIP36の違いは、VIP36分子の立体構造そのものの違いによるものであり、山下等の報告とは異なる見解であった。これらの抗体を用いた免疫沈降法により、この2量体を形成するタイプのVIP36はERにおいて分子シャペロンと結合していた。また、細胞膜周囲のカベオラ周囲にも、このタイプのVIP36が存在しており、細胞膜の周囲領域まで、VIP36が輸送体としての機能をしていることが観察された。VIP36は細胞外膜部にはまったく認められず、ER、ERGIC (ER-ゴルジ中間体)、ゴルジ装置、細胞膜周囲、カベオラの周囲、エンドソームに存在していた。これらの分布は、このレクチンが、カベオラ内に取り込まれた糖蛋白、糖脂質を細胞内に輸送する可能性を強く示唆した。総括すると、動物レクチンVIP36は、ER、ゴルジ装置、細胞膜周辺領域を含む細胞内移動とともに、三次元立体構造の異なる分子タイプを相互に変化させながら移動していることを示す結果となった。上記に記載した結果の一部は、第20回IUBMBおよび第11回FAOBMBの国際学会ならびに米国における第46回細胞生物学会にて報告し、国際的な評価を得た。
痛覚特異的ナトリウムチャネル欠損マウスを用いた神経因性疼痛の発症機序の解析

Nav1.8-null mutantマウス後根神経節より単離培養した30μm以上のmedium/largeDRG細胞に対し、whole-cell patch clamp techniqueを用いて電流記録を行った。medium/large DRG細胞においてはTTX-sensitive/fast Na電流に加え、電流値としては小さいが、非常にゆっくりとした活性化および不活性化を示すpersistentNa電流が観察された。これにはtetrodotoxin (TTX)にsensitiveなものとresistantなものが存在した。両者とも活性化閾値は約-60mVで、TTX-sensitive/fast Na電流よりも約20mV過分極側にシフトしていた。これまでの報告からTTX-resistant/persistent Na電流はNaV1.9に由来すると考えられ、TTX-sensitive/persistent Na電流の由来は不明である。文献的考察からはNaV1.6の可能性が考えられ、電流記録を行った細胞からsingle cell RT-PCRによるmRNA発現を解析した。しかしTTX-sensitive/persistent Na電流が認められた細胞のうち、NaV1.6のmRNAの発現がみられたものは65%に留まり、有意なものとはいえず、TTX-sensitive/persistent Na電流の由来を断定するには至らなかった。この電流はNaV1.9と同様静止膜電位付近に活性化閾値を有しており、活動電位を主に担っていると考えられるTTX-sensitive/fast Na電流を調節することで、DR胞の興奮に強い影響をもたらしていると考えられた。知覚神経特異的Naチャネル(sensory neuron-specific Nachannel : SNS,便宜上,それによって引き起こされるNa電流も含めてSNSとよぶ)は,末梢知覚神経節の小型侵害受容ニューロンにのみ特異的に発現しているため,以前から痛覚情報の伝搬に重要な役割を担っているNaチャネルであると考えられてきた.私たちはSNS遺伝子をノックアウトしたマウスを作製し,その変異動物におけるNaチャネル機能や痛覚感受性の変化を検討した.末梢知覚神経節の神経細胞に発現するNaチャネルのうち,NaV1.8,NaV1.9は侵害刺激情報を伝搬すると考えられる小型細胞に特異的に分布している.NaV1.8により引き起こされる電流は遅いカイネティクスでTTX非感受性のSNSであるが,NaV1.9の機能発現は成功せず機能は不明のままであった.SNSノックアウトマウスでは,SNSが完全に欠如しており,加えて新たなTTX非感受性Na電流であるNaV1.9によるNaNが観察された.NaNの特徴をまとめると,1)SNSと同様,TTX非感受性であり,C線維を発する小型知覚神経節ニューロンに特異的に発現する,2)活性化閾値が他のNaチャネルより約20mV程度過分極側へシフトしており,SNSよりさらに遅いカイネティクスをもつ"持続型"Na電流であり,閾値下の興奮性を制御している,3)その発現レベルが何らかの栄養因子により影響を受けダイナミックに変化する"誘導型"Naチャネルである,4)チャネルの活性化が細胞内環境の変化により著しい影響を受ける,などが挙げられる.これらの性質は,SNSと同様にNaNが侵害刺激の伝搬に関与している可能性を示唆するとともに,神経線維における興奮性の異常亢進や神経損傷に伴うチャネルの発現異常などの神経因性疼痛の病態生理に関連しており,これらTTX非感受性Naチャネルが神経因性疼痛をはじめとする各種疼痛の発現において重要な役割を演じていることを裏づけるものである.NaV1.8-null mutantマウス後根神経節より単離培養した30μm以上のmedium/largeDRG細胞に対し、whole-cell patch clamp techniqueを用いて電流記録を行った。medium/largeDRG細胞においてはTTX-sensitive/fast Na電流に加え、電流値としては小さいが、非常にゆっくりとした活性化および不活性化を示すpersistentNa電流が観察された。これにはtetrodotoxin(TTX)にsensitiveなものとresistantなものが存在した。

両者とも活性化閾値は約-60mVで、TTX-sensitive/fast Na電流よりも約20mV過分極側にシフトしていた。これまでの報告からTTX-resistant/persistent Na電流はNaV1.9に由来すると考えられ、TTX-sensitive/persistent Na電流の由来は不明である。文献的考察からはNaV1.6の可能性が考えられ、電流記録を行った細胞からsingle cell RT-PCRによるmRNA発現を解析した。しかしTTX-sensitive/persistent Na電流が認められた細胞のうち、Nav1.6のmRNAの発現がみられたものは65%に留まり、有意なものとはいえず、TTX-sensitive/persistent Na電流の由来を断定するには至らなかった。この電流はNaV1.9と同様静止膜電位付近に活性化閾値を有しでおり、活動電位を主に担っていると考えられるTTX-sensitive/fast Na電流を調節することで、DR胞の興奮に強い影響をもたらしていると考えられた。
良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん原因遺伝子の同定とクローニング

良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん(Benign Adult Familial Myoclonic Epilepsy;以下BAFME)は、3040歳代で発症、常染色体優性遺伝型、高い浸透率、四肢のミオクロニー、痙攣発作、手の振戦などを特徴とする。BAFMEは日本人の症例しか報告されておらず、日本国内において解明しなければならない遺伝性疾患であると考えられる。BAFME患者およびその家族の強力により、ABI Linkage map setを用い、Linkage analysisを行い、病因遺伝子が8q23の約4.4cMに存在することを突き止めた。また、4.4cMと推定される病因領域のうち、1/3の相当する約1,200kbをカバーするBACクローンを取得、また、ほぼ全領域をカバーするYACクローンによるコンティーグも取得し、これらを用いて、エクソン・トラッピングを行い、これまで報告されていない2つの新規エクソン様配列を得た。この配列を含む最長cDNAを取得して解析したところ、配列内にORFを見つけることができなかった。このクローンはUTRのみを含むと考えられ、現在、この遺伝子の全長をクローニングすべく解析を行っている。また、我々が狭めた病因領域に存在する3つのカリウムチャンネルタンパク質を同定した。うち2つは既知のカリウムチャンネルタンパク質(Kv8.1,KCNQ3)であった。KCNQ3には変異を見つけることができなかったが、我々はKv8.1のエクソンの上流にさらに別のエクソンがあることを同定し、新しく同定された領域およびプロモーター領域の変異解析を行い、この遺伝子も病因遺伝子から除外された。3つめは、最近Kv9.2であることが判明し、CDS領域には変異が存在しないことが明らかになった。今後、他のBAFME家系も含め、より広範囲にわたる原因遺伝子の同定を行う。BAFME患者及びその家族のDNAを用い、ABI Mapping Panelによる10cMマーカー全ゲノムスキャンを行った。その結果、すでに報告されていた染色体8番のほか、2番、7番、10番、17番において有意なロッドスコアを得た。さらに細かなマイクロサテライトマーカーを用いて、ハプロタイプ解析を行った結果、患者のみでハプロタイプが保存されているのは、8番染色体であることが判明し、BAFMEの原因遺伝子は、8q23-24領域に存在することが強く示唆された。また、founder effectを仮定して解析したところ、8q23-24のごく狭い領域でジェノタイプの保存が確認されたが、これがfounder effectを示唆するものかは、さらに細かな検討を要する。8q23-24領域、及びその周辺領域に存在するてんかんの候補遺伝子として、3つのカリウムチャンネル遺伝子を同定し、BAFME患者における変異を解析したが、ORF、スプライシング・コンセンサス、さらにプロモーター等、どの領域にも変異は見つけられなかった。この領域には、他にカリウムチャンネルが存在しないことから、BAFMEの原因遺伝子は、従来のてんかんの原因遺伝子とはことなることが示唆された。すでに作成したBACコンティーグを用い、エクソン・トラッピングを行ったが、もっとも高いロッドスコアを示したマイクロサテライトマーカー(D8S1779)の近傍約2Mbにおいて、候補遺伝子を見つけることはできなかった。また、既存のESTマーカーをハイブリダイゼーション法によりBACコンティーグにマップした結果、D8S1779の周辺部は遺伝子が疎になっていることが示唆され、エクソン・トラッピングの結果を裏づけた。さらに、2001年1月に発表されたヒト・ドラフト・ゲノム配列を検索したところ、D8S1779周辺には遺伝子がみつからず、検索範囲を広げる必要があることが示唆された。

良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん(Benign Adult Familial Myoclonic Epilepsy;以下BAFME)は、3040歳代で発症、常染色体優性遺伝型、高い浸透率、四肢のミオクロニー、痙攣発作、手の振戦などを特徴とする。BAFMEは日本人の症例しか報告されておらず、日本国内において解明しなければならない遺伝性疾患であると考えられる。BAFME患者およびその家族の強力により、ABI Linkage map setを用い、Linkage analysisを行い、病因遺伝子が8q23の約4.4cMに存在することを突き止めた。また、4.4cMと推定される病因領域のうち、1/3の相当する約1,200kbをカバーするBACクローンを取得、また、ほぼ全領域をカバーするYACクローンによるコンティーグも取得し、これらを用いて、エクソン・トラッピングを行い、これまで報告されていない2つの新規エクソン様配列を得た。この配列を含む最長cDNAを取得して解析したところ、配列内にORFを見つけることができなかった。このクローンはUTRのみを含むと考えられ、現在、この遺伝子の全長をクローニングすべく解析を行っている。また、我々が狭めた病因領域に存在する3つのカリウムチャンネルタンパク質を同定した。うち2つは既知のカリウムチャンネルタンパク質(Kv8.1,KCNQ3)であった。KCNQ3には変異を見つけることができなかったが、我々はKv8.1のエクソンの上流にさらに別のエクソンがあることを同定し、新しく同定された領域およびプロモーター領域の変異解析を行い、この遺伝子も病因遺伝子から除外された。3つめは、最近Kv9.2であることが判明し、CDS領域には変異が存在しないことが明らかになった。今後、他のBAFME家系も含め、より広範囲にわたる原因遺伝子の同定を行う。
学習理論における特異性と複素および実解析的考察

学習理論の目的は,真の分布から発生する多量のデータセットから,そのデータを発している情報源の真の分布を再生・推測することである. WAIC法はAIC法を一般化したもので,特異学習モデルにも適用可能である.ベイズ推測における学習係数は,特異学習モデルの学習効率をあたえるものでWAIC法の重要な役割を果たしている.学習係数は,代数幾何の分野では,相対エントロピーのlog canonical thresholdとして知られている.この研究では,学習係数に関する考察およびそれらを得るために必要な定理を求めた.Vandermonde matrix型特異点と、Restricted Boltzmann Machineなどに現れる対称式型特異点のlog canonical thresholdの研究を行った。これらの特異点は高次元の多様体に定義され、ニュートン図形退化,孤立していないなどの特徴がある。イデアルの包含関係、斉次多項式に有効なadding variables methodを利用して、以前得られた結果より、真値に近いバウンドを得た。平成24年6月アメリカ、ペンシルベニア州立大学で開かれた国際会議``AlgebraicStatistics in the Alleghenies(代数統計学)''にて、題目``Learning coefficient and singular fluctuation in statisticallearning theory''について招待講演をさせていただき、有益な多くの意見をいただいた。次のステップにつなげていきたい。Vandermonde matrix型特異点のlog canonical thresholdの研究を行った.これらの特異点は高次元の多様体に定義され,ニュートン図形退化,孤立していないなどの特徴がある.今日の実世界のデータに比較的頻繁に応用される,混合正規分布,三層ニューラルネットワークモデルの学習係数を与えるものである.混合二項分布などにも現れ,異なるモデルから共通の特異性が現れたことから,学習理論において本質的ではないかと考えられている.この研究では,帰納的に行う特異点解消の中心となる多様体の適当な選択によってバウンドを得た.以前得られた結果より,条件によっては,かなり改良され真値に近づいた.この結果は,論文"Learning coefficient of generalization error in Bayesian estimation and Vandermonde matrix type singularity, Neural Computation"に掲載されることになっている.また,平成23年12月アメリカPalo Alto市AIM Research Conference Centerで開かれた国際会議"Singular learning theory: connecting algebraic geometry and model selectionin statistics"にて,この結果について講演をさせていただき,有益な多くの意見をいただいた.次のステップにつなげていきたい.超関数を用いて特異学習モデルの尤度関数である確率的複雑さの挙動を分析する定理において、別証明を与えた。学習理論において、超関数のメリン変換はゼータ関数であり、ゼータ関数の極はベイズ推定における学習モデルの尤度関数である確率的複雑さの挙動を与える。挙動の最大の次数を求める定理において、ヘルダーの不等式を用いて評価を行った。この結果は、博士前期課程高橋との共同研究であり、“学習理論における特異性の超関数を使った解析について"と題して、日本大学理工学部学術講演会にて発表した。また、学習誤差と関連する経験カルバック距離(経験過程)の挙動を考察した。特異点解消および中心極限定理を適用し、法則収束関数を求めることにより、経験過程の共通の標準形式を得る。これらをまとめたものを博士前期課程高村とともに、“学習理論における特異性と特異点解消について"と題し、日本大学理工学部学術講演会にて発表した。また、学習理論において、実世界データに比較的頻繁に応用される,混合正規分布,三層ニューラルネットワーク,混合二項分布の学習係数を与える特異点集合Vandermonde matrix型特異点のlog canonical thresholdについて考察を行なった。特異点を決定しているイデアルについて高次の項の影響を精密に調べ、数値をある程度固定した条件のもとで、数個の結果を得たが、現在論文にまとめ中である。Vandermonde matrix型特異点の学習係数の真値を昨年度より少し条件を緩めて得られることが出来たが,一般の場合には,まだ上界を得るにとどまっている.特異点の複雑な構造をさらに詳しく研究する必要がありそうである.これらのことを考慮し,近年得られた、Log canonicalthresholdを得る最良の特異点を求めるための定理「Method forfindinga deepest singular point」や変数の追加により、ブローアッププロセス内で行われる変数変換を簡略化するのに有効な定理「Method to add variables」に加えて新たな方法を模索したい。学習理論の目的は,真の分布から発生する多量のデータセットから,そのデータを発している情報源の真の分布を再生・推測することである. WAIC法はAIC法を一般化したもので,特異学習モデルにも適用可能である.ベイズ推測における学習係数は,特異学習モデルの学習効率をあたえるものでWAIC法の重要な役割を果たしている.学習係数は,代数幾何の分野では,相対エントロピーのlog canonical thresholdとして知られている.この研究では,学習係数に関する考察およびそれらを得るために必要な定理を求めた.Vandermonde matrix型特異点のlog canonical thresholdの真値をある条件付きで得たが、一般の場合には、去年と同じくまだバウンドにとどまっている。近年得られた、Log canonicalthresholdを得る最良の特異点を求めるものための定理「Method for finding a deepest singular point」や変数の追加により、ブローアッププロセス内で行われる変数変換を簡略化するのに有効な定理「Method to add variables」だけでは、不十分であることがわかってきた。これらのことを考慮し新たな方法を模索したい。昨年度に引き続いて,Vandermonde matrix型特異点、対称式型特異点に対する学習係数の真値を得たい.

そのほかの学習モデルの学習係数についても考察したい.また,近年重要性を指摘されるようになった学習係数から得られるsingular fluctuationの研究を行い,一般的な学習モデルについて体系的に考察したい.これらの結果を実際のデータ解析に応用し,最適なモデル選択法への応用,効率のよい機械学習の構成法について考察したい.結果を広く学会等で発表させていただきたい.学習理論さらに、昨年度と同じく、近年重要性を指摘されるようになったlog canonical thresholdから得られるsingular fluctuationの研究を行い、一般的な学習モデルについて体系的に考察したい。また、M. Mustataにより証明されたJet Schemeとlog canonical thresholdとの関係が、実数体(標数0)でどのように適用できるかについて考察し、新たな手段を開拓したい。同様にMustataにより、log canonical thresholdの下限がmultiplicityを用いて得られているが、あまりtightではないようである。このような不等式をさらに精密に表現できるような一般的な関係を求めたい。これらの結果を実際にデータ解析に応用したい。この方策をさらに色々なモデルに適用し、最適なモデル選択法への応用、効率のよい機械学習の構成法について考察したい。Vandermonde matrix型特異点のlog canonical thresholdの真値を得たかったが、去年と同じくまだバウンドにとどまっている。特異点を決定しているイデアルについて、さらに、高次の項の影響を精密に調べ、新たな方法を模索したい。代数幾何・代数解析では主に代数閉体上でのlog canonical thresholdの研究が行われている。また、低次元での研究が主である。
歯周疾患における骨の吸収・抑制に関連するサイトカイン産生比の年齢的変化

本研究は、骨吸収促進因子IL-6とIL-1βならびに骨吸収抑制囚子IL-4の産生における年齢的変化が辺縁性歯周炎による骨吸収の病態と進行にどのように影響を及ぼしているかを、RT-PCR法と免疫組織化学的染色法を用いて検討するものである。平成9年度は、予備実験を行った。平成10年度は、歯槽骨の吸収を伴う進行性の歯周炎が認められる成人患者と仮性ポケットを伴うような高度な歯周炎が認められる若年者から外科処置時に得られた歯肉組織を用いた。歯肉片よりAPGC法の変法により全RNAの抽出し、RT-PCRを行った。IL-1β、IL-4、IL-6の特異的プライマーとpositive controlとしてハウスキーピングジーンであるG3PDHを用いた。増幅されたDNAの検出は4%アガロースゲルで電気泳動し、UVにて観察した。今回の検索ではIL-1βが若年者においてその発現が高い傾向が認められたが、有為ではなかった。IL-4、IL-6に関しては有為な差は認められなかった。免疫組織学的染色については凍結歯肉片から連続切片を作成し、酵素抗体法(ABC法)を行った。IL-1β、IL-4、IL-6に関して有為な差が認められなかったため、他の抗体を使用して検討した。その結果、細胞周期関連タンパク質であるp21に関して若年者の歯肉増殖症でその発現が多い傾向が認められた。本研究は、骨吸収促進因子IL-6とIL-1βならびに骨吸収抑制因子IL-4の産生における年齢的変化が辺縁性歯周炎による骨吸収の病態と進行にどのように影響を及ぼしているかを、RT-PCR法と免疫組織化学的染色法を用いて検討するものである。歯槽骨の吸収を伴う進行性の歯周炎が認められる成人患者と、仮性ポケットを伴うような高度な歯周炎が認められる若年者から外科処置時に得られた歯肉組織を用いた。歯肉片よりAPGC法の変法により、既存の超遠心器を用いて全RNAの抽出を行う。全RNA抽出については、260/280D値=1.61.8程度の純度が得られた。これらの試料をもちいてPCR反応を行った。増幅されたDNAの検出は4%アガロースゲルを用いて通法にしたがって電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、310nmのUVトランスイルミネーターで観察した。現在、IL-4の条件を検索中である。免疫組織学的染色については凍結歯肉片から連続切片を作成し、酵素抗体法(ABC法)によって免疫組織染色を施す。陽性細胞の割合は観察視野を設定して検鏡し、染色された細胞数を求めて定量的分析を行う。現在、歯肉組織と抗体を用いてこの方法を行っている。