hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
公共マイクロアレイデータを用いた家畜QTL候補遺伝子の探索システム

モデル生物においては、高品質な遺伝子アノテーション情報が利用でき、量的形質に関与する候補遺伝子の抽出が容易に実施される。しかしながら、家畜種においてはアノテーション情報は充実していない。近年では、マイクロアレイや次世代シーケンサー技術により網羅的な遺伝子発現データが得られ、これらのデータが複数の生物種に関して公共のデータベースに蓄積されている。本研究では、公共マイクロアレイデータを用いた家畜におけるQTL候補遺伝子の探索システムの開発を行った。ここでは、とくにマウスとウシの場合に焦点を絞り、本システムの表現型の予測および信頼性の高い遺伝子ネットワークの推定における有用性について検討を加えた。これらの情報の統合的な分析結果を用いてQTL候補遺伝子を選択し、選択遺伝子の発現情報を用いて約200個体のヘテロストックマウスの量的形質に関する表現型値予測を実施したところ、所与の正確度を達するために必要な遺伝子の数を大幅に減らすことが可能であったことから、構築した統合情報はマウスのQTL候補遺伝子の探索に有用な情報となり得る可能性が示された。一方、ウシについてもSequence Read Archive(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)のSRP002394から得たRNA-Seqデータに対して最新のゲノム情報(UMD3.1)を基にバイオインフォマティクス解析を実施し、15の組織における18,127遺伝子の発現に関する組織特異性スコアを算出した。ArrayExpress(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)におけるE-MTAB-88データセットから約200個体のヘテロストックマウスに関する肝臓と肺の遺伝子発現データを得た。ここで得られた約2万の遺伝子発現値に対してQTL解析を実施し、各組織における発現QTL情報を取得し、新たなQTL候補遺伝子探索のリソースを開発した。スケールフリー性については共通ネットワークで最も高いことが示された。また推定された3つのネットワークの何れにおいても、既知のネットワークとの類似性が認められた。とくに、スケールフリー性の高い共通ネットワークにおけるハブ遺伝子(接続している遺伝子の数が多い)には、飼料利用性と関連する機能をもつ遺伝子が多く含まれ、QTL候補遺伝子探索のための新たなリソースとなり得ると考えられた。平成26年度は、マウスの遺伝子発現データに対するQTL解析を実施して、候補遺伝子探索のための新たなリソースを追加する一方、ウシを対象として複数の情報を統合した候補遺伝子探索システムを構築した。また、この候補遺伝子探索システムに関する有用性を黒毛和種の実データにより検証したところ概して良好な結果が得られ、とくに正確性についても高いことが確認できた。マウスにおけるリソースの追加は計画外のものであるが、他の生物種では得られない非常に貴重な情報であるため優先的に取り組んだ。そのため、ブタにおける候補遺伝子探索システムの整備と描画に関わるインターフェースの構築が遅れる結果となった。動物遺伝育種ブタの様々な組織における発現データを利用して、マウスおよびウシと同様な候補遺伝子探索システムの開発を実施する。次に、異なる生物種のシステムを遺伝子間の相同性に基づく対応付けを通じて統合し、情報の網羅性を高める。また、生物種の組み合わせによって既報の形質関連遺伝子の順位付けの変化について検討することにより、候補遺伝子選択の頑健性の確認も行う。複数の生物種における情報を統合した候補遺伝子探索システムを、形質ー組織ー遺伝子機能ー遺伝子間の関連性についてHeat Map、ネットワーク図、ゲノムビューア等により概観しつつ利用するためのインターフェースを構築し、これをWeb上から実施可能にする。平成25年度は、マウスのマイクロアレイデータおよび関連のアノテーション情報を公共のデータベースより取得し、これらの情報を統合したQTL候補遺伝子探索システムを構築するとともに、その有用性を独立データにより検証することを目的とした。この点について、種々のデータの統合的な分析結果を利用したシステムを構築することに成功し、独立データによる検証では良好な結果を得ることができた。また、平成26年度で実施予定であったウシのデータマイニングの一部にもすでに着手している。「次年度使用額」の約40万円は、平成26年度に実施予定であったブタQTL候補遺伝子探索システムと描画に関わるインターフェースの構築が遅れたため、これに関わる人件費・謝金を平成27年度に充てる必要性が生じたことに依る。すでに着手しているウシのデータマイニングを進め、遺伝子の機能情報等も考慮に入れたQTL候補遺伝子探索システムを構築する。ブタにおいてもArray Express(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)のE-MTAB-1183における62種の細胞および組織における発現データを利用して同様なシステムの開発を実施する。次に、これらの家畜におけるシステムと先に構築したマウスのシステムとを、遺伝子間の相同性に基づく対応付けを通じて統合し情報の網羅性を高める。また、各情報の組み合わせによって既報の形質関連遺伝子の順位付けの変化について検討することにより、候補遺伝子選択の頑健性の確認も行う。

さらに、統合したシステムの性能を検証するために、黒毛和種のデータを対象とした検討を行う。ここではとくに、ゲノム育種価予測に用いるSNPを選択する際に、本システムに基づくQTL候補遺伝子の位置情報を考慮に入れ、予測の正確度の平均や標準誤差に対してどのように影響するのかを調べる。最終的に、形質ー組織ー遺伝子機能ー遺伝子間の関連性について、Heat Map、ネットワーク図、ゲノムビューア等で概観できるようなインターフェースを組み立てた上で、本システムをWeb上で公開する。平成27年度には、平成26年度に実施した各生物種の分析結果を統合したシステムの開発およびWeb上でのシステムの公開のために必要なインターフェースの構築の準備を予定しており、合計で130万円の研究費を使用する。平成26年度に分析予定であったブタデータのエディットおよび分析用の計算プログラム作成補助、さらにインターフェースの構築に関わる人件費・謝金に「次年度使用額」の40万円を含めた62万円を充てる。また、研究成果の学会発表等のための旅費として30万円、学術論文の印刷および投稿料等に関わる消耗品費・その他に合わせて38万円を充てる予定である。「次年度使用額」の約8万円は、当初の予定に比べ分析対象データの量が多量であったため、平成26年度に実施予定のデータ分析の補助等に関わる人件費・謝金を増額する必要性が生じたことに依る。平成26年度には、本課題における中心的な分析の実施およびその結果と平成25年度に実施した分析結果とを統合したシステムの開発およびWeb上でのシステムの公開のために必要なインターフェースの構築の準備を予定しており、合計で128万円の研究費を使用する。平成26年度の分析の対象となる素データは大容量であり単独ですべての作業を実施するのは困難であるため、計算用のパソコンの購入に33万円、データのエディットおよび分析用の計算プログラム作成補助に関わる人件費・謝金に38万円を充てる。また、研究成果の学会発表等のための旅費として28万円、学術論文の印刷および投稿料等に関わる消耗品費・その他に合わせて29万円を充てる予定である。
カ-ル湖堆積物によるネパ-ルヒマラヤの最終氷期以降の植生変遷の解析

1.地形発達および層序(1)1990年度に湿潤地域であるネパ-ル東部のシプトンパス周辺で地質,地形の調査を行ない,7ヶ所で合計約60kgの堆積物試料を採取した.少なくとも3回の氷堆石の発達が見られ,年代測定値とも合わせて考えると,これらはそれぞれ最終氷期前半,最終氷期後半,完新世の小氷期に発達したものであることが分かった.(2)1991年度にやや乾燥した地域であるネパ-ル西部のジュムラ南の山塊で地質,地形の調査を行ない,5ヶ所で合計約50kgの堆積物試料を採取した.東部ネパ-ルと同様に少なくとも3回の氷堆石の発達がみられた.年代測定値はまだ得られていないが,東部ネパ-ルと対応している可能性が高い.(3)ヒマラヤ地域における氷河の発達の時期の直接の証拠は,今回の研究により初めて得られたものである.(4)1991年度にカトマンズ盆地で地質調査を行なった.従来カトマンズ盆地の周辺の段丘堆積物はいずれも最終氷期のものと考えられていたが,実際には中期更新世までさかのぼるものが含まれていることが分かった.現在年代測定を実施おり,より説得的なデ-タが得られるものと考えている.2.植生調査(1)1990年度には17地点で,1991年度には14地点でコドラ-トを設けて植生調査を実施した.草本を含む全群集を記載しており,このような取り組みはネパ-ルでは初めてである.1990年度のものについては同定とデ-タ整理が終了しており,現在取りまとめ中である.(2)カトマンズ盆地近郊のシュワプリ山に永久コドラ-トを設置し,調査を開始した.成長肥大を測定するまでにはいたっていないが,マ-クなどは継年的に保存されており,将来の再調査が可能であることを確認した.3.表層花粉および植生変遷(1)植生調査を行なった全ての地点で比較検討のための表層花粉資料を採取した.予察的検討では,おおむね現在の周辺の植生と類似した組成を示すが,Shorea林でもその花粉がほとんど産出しないなど検討課題が残っている.(2)カトマンズ盆地周辺の堆積物からは,Quercus semecarpifolia(落葉のナラ)やTsugaに富む大型植物化石群と,Qurcus glauca(常緑カシ)に富む大型植物化石群が得られた.乾簡冷涼な氷期の植生と湿潤温暖な間氷期の植生を反映しているものと思われる.(3)1990年度と1991年度のカ-ル湖堆積物試料の花粉および大型植物化石の分析は終了していない.花粉の保存は良好であるが,草本で同定困難なものがあり,現生種も含めた基礎的な研究から取り組んでいる.大型植物化石も細片が多く,基礎的研究から取り組んでいる.4.その他(1)1990年度,1991年度ともに約10,000点の植物標本を採集した.(2)これらにはいくつかの新種・新変種・新分布が含まれており,順次報告する予定である.(3)標本は現生の植物ならびに化石共に1セットを王立森林植物研究所に寄贈する予定である.1990年度調査分で同定を終了したものについては,1991年に参加し,王立森林植物研究所に寄贈した.1.地形発達および層序(1)1990年度に湿潤地域であるネパ-ル東部のシプトンパス周辺で地質,地形の調査を行ない,7ヶ所で合計約60kgの堆積物試料を採取した.少なくとも3回の氷堆石の発達が見られ,年代測定値とも合わせて考えると,これらはそれぞれ最終氷期前半,最終氷期後半,完新世の小氷期に発達したものであることが分かった.(2)1991年度にやや乾燥した地域であるネパ-ル西部のジュムラ南の山塊で地質,地形の調査を行ない,5ヶ所で合計約50kgの堆積物試料を採取した.東部ネパ-ルと同様に少なくとも3回の氷堆石の発達がみられた.年代測定値はまだ得られていないが,東部ネパ-ルと対応している可能性が高い.(3)ヒマラヤ地域における氷河の発達の時期の直接の証拠は,今回の研究により初めて得られたものである.(4)1991年度にカトマンズ盆地で地質調査を行なった.従来カトマンズ盆地の周辺の段丘堆積物はいずれも最終氷期のものと考えられていたが,実際には中期更新世までさかのぼるものが含まれていることが分かった.現在年代測定を実施おり,より説得的なデ-タが得られるものと考えている.2.植生調査(1)1990年度には17地点で,1991年度には14地点でコドラ-トを設けて植生調査を実施した.草本を含む全群集を記載しており,このような取り組みはネパ-ルでは初めてである.1990年度のものについては同定とデ-タ整理が終了しており,現在取りまとめ中である.(2)カトマンズ盆地近郊のシュワプリ山に永久コドラ-トを設置し,調査を開始した.成長肥大を測定するまでにはいたっていないが,マ-クなどは継年的に保存されており,将来の再調査が可能であることを確認した.3.表層花粉および植生変遷(1)植生調査を行なった全ての地点で比較検討のための表層花粉資料を採取した.予察的検討では,おおむね現在の周辺の植生と類似した組成を示すが,Shorea林でもその花粉がほとんど産出しないなど検討課題が残っている.

(2)カトマンズ盆地周辺の堆積物からは,Quercus semecarpifolia(落葉のナラ)やTsugaに富む大型植物化石群と,Qurcus glauca(常緑カシ)に富む大型植物化石群が得られた.乾簡冷涼な氷期の植生と湿潤温暖な間氷期の植生を反映しているものと思われる.(3)1990年度と1991年度のカ-ル湖堆積物試料の花粉および大型植物化石の分析は終了していない.花粉の保存は良好であるが,草本で同定困難なものがあり,現生種も含めた基礎的な研究から取り組んでいる.大型植物化石も細片が多く,基礎的研究から取り組んでいる.4.その他(1)1990年度,1991年度ともに約10,000点の植物標本を採集した.(2)これらにはいくつかの新種・新変種・新分布が含まれており,順次報告する予定である.(3)標本は現生の植物ならびに化石共に1セットを王立森林植物研究所に寄贈する予定である.1990年度調査分で同定を終了したものについては,1991年に参加し,王立森林植物研究所に寄贈した.現地調査ならびにその後の検討による成果は次の15である.なお,標本は現生の植物ならびに化石共に1セットを王立森林植物研究所に寄贈する予定であり,すでに押し葉標本の一部は現地調査終了時に,王立植物調査局に寄贈された.1.ネパ-ル東部のシプトンパス周辺で地質,地形の調査を行ない,7ヶ所で合計60kgの堆積物試料を採取した.カ-ル地形と関連して数回の氷堆石の発達が見られた.現在年代測定中であるが、ヒマラヤ地域で初めての,具体的な年代試料に基づき氷河編年を行い得る試料になるものと思われる.2.カ-ル湖毎に,堆積物は違った時期の情報を保存していることが予測された.現在分析中であるが,おおむね1万年以降の植生変還が,地形の変還と関連して復元できる試料であることが分かった.3、シプトンパスにいたるル-ト沿いでは,比較対象のために押し葉標本約10,000点を初めとする植物標本を採集した.また,17地点で方形区を取り,比較のための植生調査を行なうとともに表層花粉を採取した.4.いくつかの新種・新変種・新分布が見いだされた.5.温室植物の経時的な温度変化が検討された.今年度は試料の分析を行なうとともに,6名を西部ネパ-ルに派遣して乾燥地域での現地調査を行なう.また,M.N.スベディ氏を研究取りまとめのため日本に招へいする.
複合発酵乳中に含まれる新規免疫活性促進物質の同定、および作用機構の解明

無脂肪牛乳を12種類の乳酸菌、酵母等の発酵微生物で発酵して得られた複合発酵乳を50,000rpm、30minの条件で遠心して得られた上清画分を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に対して透析したものをサンプルとし、ヒト培養細胞を用いて生理活性を評価した。その結果、ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞のIgM産生を3.3倍促進し、ヒト末梢血リンパ球のIgMとIgGの産生をそれぞれ2.8倍、5.4倍促進した。また、ヒト末梢血リンパ球のインターフェロンγ産生を6.0倍促進した。精製、および部分アミノ酸配列相同性検索の結果、活性因子はプロテオースペプトンコンポーネント3(PP3)の部分断片物であることが確認された。また、無脂肪乳に含まれるフルサイズのPP3にも促進活性があることが確認された。PP3の生理活性については未だ報告がなく、本研究によりPP3の生理機能が世界で初めて明らかとなった。PP3の抗体産生促進効果について、作用機構を検討した。HB4C5細胞のIgMをコードするmRNAの転写促進活性に対するPP3効果を検討した結果、転写活性には影響を及ぼさないことが確認された。また、タンパク質合成阻害剤であるアクチノマイシンDで処理することで転写活性を阻害したHB4C5細胞に対しても促進効果を示したことから、PP3は翻訳活性を促進することにより抗体産生を促進している可能性が示唆された。さらに、プロテオースペプトンのその他の生理効果を検討した。その結果、マウス大腸ガン細胞株Colon-26、ヒト乳ガン細胞株MCF-7の細胞増殖を濃度依存的に抑制した。また、ヒト骨髄腫細胞株U266細胞に対するIgE産生抑制効果を検討した結果、濃度依存的な産生抑制効果が確認された。このことから、プロテオースペプトンにはアレルギー抑制効果が期待できることが示唆された。12種類の乳酸菌、酵母等の発酵微生物で無脂肪牛乳を発酵して得られた複合発酵乳(pH4.6)を50,000rpm、30minの遠心により得られた上清画分を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に対して透析したものをサンプルとした。発酵乳の抗体産生促進効果を調べた結果、ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞のIgM産生を3.3倍促進した。ヒト末梢血リンパ球のIgMとIgG産生に対する効果を検討したところ、それぞれ2.8倍、および5.4倍促進された。本発酵乳をタンパク質分解酵素であるトリプシンで処理した後にHB4C5細胞に対する抗体産生促進活性を検討したところ、活性が消失した。このことから、発酵乳中の活性因子はタンパク質であることが明らかとなった。SDS-PAGEによる解析の結果、発酵乳中は分子量19.0kDaと15.0kDaのタンパク質を主要成分として含んでいた。ゲル濾過による液体クロマトグラフィーにより分画したところ、活性本体は19.0kDaタンパク質であることが確認された。発酵の原料乳である無脂肪牛乳のpHを4.6に調製し、同条件で遠心、透析処理したものに含まれるタンパク質性分と比較したところ、原料乳中には発酵乳中の活性因子である19.0kDaタンパク質は含まれてはいなかった。したがって、この19.0kDaタンパク質は発酵により生じた新規生理活性タンパク質であると考えられる。

本活性タンパク質の熱安定性を検討したところ、非常に熱安定性が高いばかりでなく、65°C、30分の加熱処理によってその抗体産生促進活性が2.5倍に促進された。12種類の乳酸菌、酵母等の発酵微生物で無脂肪牛乳を発酵して得られた複合発酵乳(pH4.6)を50,000rpm、30minの遠心により得られた上清画分を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)に対して透析したものをサンプルとした。発酵乳の抗体産生促進効果を調べた結果、ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞のIgM産生を3.3倍促進した。発酵乳をSuperdex200カラムによるゲルろ過にて分画した後、各フラクションの抗体産生促進活性の測定、およびSDS-PAGE分析を行った結果、分子量19kDaのタンパク質にIgM産生促進活性が確認された。さらにこのタンパク質のN末端アミノ酸配列を調べたところ、プロテオースペプトンコンポーネント3(PP3)であることが示唆された。PP3の分子量は28kDaであることが報告されているため、発酵乳中の活性因子はPP3の部分断片物であることが分かった。次に、原料乳である無脂肪乳に含まれる活性因子について検討した。まず、発酵乳の活性因子と推測されたPP3を構成成分とするプロテオースペプトン(PP)を調製するため、無脂肪乳の凍結乾燥標品を水に溶解後、90°C、30分間加熱し、pHを4.6に調製した後、超遠心して得られた上清画分をPP画分とした。このPP画分の抗体産生促進活性を測定したところ、高いIgM産生促進活性を示した。PP画分をゲルろ過により分画した結果、分子量28kDaのタンパク質にIgM産生促進活性が確認された。このタンパク質のN末端アミノ酸配列を調べたところ、この活性因子はPP3であることが分かった。以上の結果から発酵乳中の活性物質はPP3の断片物であり、原料乳中のインタクトなPP3にも活性が認められた。PP3の生理活性については未だ報告がなく、本研究によりPP3の生理機能が初めて明らかとなった。12種類の乳酸菌・酵母等の発酵微生物で無脂肪牛乳を発酵して得られた複合発酵乳(pH 4.6)を50,000rpm、30minの遠心により得られた上清画分を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)に対して透析したものをサンプルとした。発酵乳の抗体産生促進効果を調べた結果、ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞の、IgM産生を3.3倍促進した。精製の結果、活性因子はプロテオースペプトンコンポーネント3(PP3)の部分断片物であることが確認された。また、無脂肪乳に含まれるフルサイズのPP3にも抗体産生促進活性があることが確認された。そこで、無脂肪乳より調製したPP3を用いて産生促進活性の作用機構を検討した。ヒト型ハイブリドーマHB4C5細胞のIgMをコードするmRNAの転写促進活性に対するPP3効果を逆転写PCR法により検討した結果、転写活性には影響を及ぼさないことが確認された。また、タンパク質合成阻害剤であるアクチノマイシンDで処理することで転写活性を阻害したHB4C5細胞に対してもPP3は抗体産生促進効果を示したことから、PP3は翻訳活性を促進することにより抗体産生を促進している可能性が示唆された。さらにプロテオースペプトンの抗体産生促進活性以外の生理効果を検討した。
培養ヒト神経細胞の分化誘導に関する神経栄養因子と一酸化窒素の働きについて

本研究においては、脳内への細胞移植を目的とした三種類の細胞種につき、基礎的研究を行った。<神経幹細胞の長期三次元培養>胎生15-16日のWistar胎児脳より線条体を摘出、cell suspensionとした後EGF存在下にて培養し、1/週の間隔で4回のpassageの後、得られたsphereをさらに2か月間、培地のみを1/週交換することにより、長期培養神経幹細胞を得た。免疫組織学所見としては、GFAP及びNSE陽性細胞は認められなかった。抗BrdU免疫染色では、周辺部にBrdU陽性細胞が多く分布していた。光顕学上、核内に大きな核小体を持つ細胞がsphereの周辺部に密に分布していた電顕では、周辺部に分裂中の細胞が観察された。未分化型の暗調な細胞、顕著な粗面小胞体を持つ明調な細胞、両者の中間型の細胞が認められ、豊富な中間径フィラメントを含む細胞突起も小数ではあるが見い出された。さらに、apoptosis過程の細胞も多数見い出され、中心部では変性細胞や、apoptotic bodyを初め多量の細胞残渣が認められた。現在、より効率に神経細胞を分化誘導できる条件をNT3などの神経栄養因子を用いて検討中である。<ヒト正常アストロサイトの脳内移植>転移性脳腫瘍摘出時に得られた白質組織を、培養、10世代以上passageを繰り返した後、すべてヒト特異的抗GFAP抗体陽性であることを確認、またBrdU陽性率は5%以下であった。次に、この細胞浮遊液をラットの線条体に定位的に移植、免疫組織学的に検討した。結果は、宿主脳内の反応性アストロサイトとは、明らかに異なった長いprocessを有した、ヒトアストロサイトの生着が確認された。ヒト胎児脳組織から分化したアストロサイトとは異なり、移植細胞の宿主内遊走は認められなかった。また、移植片近傍では、ヒトアストロサイトが血管腔周囲にprocessを伸長していた。<ヒトteratocarcinomaの神経細胞への分化誘導>hNTn細胞にNMDA受容体、AMPA/kainate受容体が発見していることは既に報告されているが、GABA受容体発現の証明は本報告が初めてである。神経伝達機構において最も重要な興奮性、抑制性神経伝達物質受容体が当細胞に発現していることは興味深く、移植応用可能なヒト神経細胞として期待が持たれる。現在ラット脳内移植後の機能的評価の研究を継続中である。1ヒト胎児性癌細胞種(NT2)をretinoic acidで5週間処置することにより形態学的に神経細胞様に分化した細胞を得た。神経伝達物質受容体の発現を調べるため、whole-cell patch-clampで検索した。その結果、誘導以前ではプリン受容体アゴニストにのみしか反応が認められなかったのが、誘導後は、NMDA受容体、AMPA/kainate受容体さらにGABA_A受容体も発現していることが確認された。2選択的誘導を調べる目的で、NT2細胞をアセチルコリン(1mM)存在下で培養後、同様の電気生理学的検討を行ったが、特に新たな受容体発現は認められなかった。3 NOSによる神経分化へのスイッチングの可能性を調べる目的で、上記細胞をNADPH-dによりNOSの存在を組織学的に調べたが、これまでの培養条件ではNOSの発現は確認できなかった。4神経細胞へ分化後、成ラットの線条体へ脳内移植し、移植片としての成着を現在経過観察中である。

<ヒトteratocarcinomaの神経細胞への分化誘導>hNTn細胞にNMDA受容体、AMPA/kainate受容体が発見していることは既に報告されているが、GABA受容体発現の証明は本報告が初めてである。神経伝達機構において最も重要な興奮性、抑制性神経伝達物質受容体が当細胞に発現していることは興味深く、移植応用可能なヒト神経細胞として期待が持たれる。現在ラット脳内移植後の機能的評価の研究を継続中である。現在神経系の細胞移植の臨床応用では、新鮮な胎児神経組織を随時利用するのが唯一の方法であり、本邦では倫理的間題が多く、胎児組織に代る細胞種の確立が課題となっている。本年度はこれまでの研究を発展させ、新たなドナー細胞候補として、神経細胞へ分化誘導可能なヒトteratocarcinomaに注目し、その神経細胞としての機能を電気生理学的に解析した。NT2細胞おいてはプリン受容体(P_<2Y>)アゴニストにのみ反応が認められた。分化誘導された細胞(hNTn細胞)は形態学的に神経細胞に類似し、多数の軸索様突起が認められた。hNTn細胞は電位依存性Na^+電流が認められ、NMDA、カイニン酸投与により下向き電流が誘発され、NMDA受容体、AMPA/kainate受容体の発現が示唆された。また、GABAでも下向き電流が誘発され(Fig.2.a)、この電流は2つのコンダクタンスを有するsingle channel currentsから形成されていた。これらの反応はGABA_A受容体拮抗剤であるビククリンにて抑制され、hNTn細胞にはGABA_A受容体も発現していることが判明した。本年度の研究により、腫瘍細胞NT2細胞が分化とともに神経細胞としての特性が発現することが明らかとなった。hNTn細胞にNMDA受容体、AMPA/kainate受容体が発現していることは既に報告されているが、GABA_A受容体発現の証明は本報告が初めてである。神経伝達機構において最も重要な興奮性、抑制性神経伝達物質受容体が当細胞に発現していることは興昧深く、移植応用可能なヒト神経細胞として期待が持たれる。
視床皮質投射をモデル系とした軸索の標的認識・分枝形成の分子機構に関する研究

近年の神経生物学の研究により、発生過程において軸索伸長を誘引する分子や反発する分子の存在が示され、神経回路形成の原理的な理解は大いに深まった。しかしながら、これら発生プログラムに従った軸索誘導分子によるメカニズムだけで説明することは困難である。本研究では視床から大脳皮質への投射をモデル系として、枝分かれ形成を含む標的認識における軸索誘導分子や神経活動による制御機構を解明することを目指した。まず、発生期の大脳皮質において層特異的に発現する分子として、ephrin-A5、stem cell factorやSema7Aの働きを局所的塗布法用いて視床軸索に対する働きを調べた。その結果、これら表層タンパク質が共同的に軸索成長抑制に作用することが明らかになった。次に、視床大脳共培養系において、神経活動の及ぼす効果を研究した。多電極培養皿を用いて自発発火活動を調べたところ、培養下でも数Hzに及び活動が見出された。次にそれを薬理学的にブロックすると、枝分かれが著しく減少することが示され、発火活動やシナプスの標的層での枝分かれ形成に必要であることが明らかになった。さらに、内向き整流特性を持つカリウムチャネルKIR2.1の遺伝子導入法により、視床・大脳皮質細胞の両方の神経活動が枝分かれに必要であることを示唆する結果を得ている。これらの結果から、層特異的な視床軸索の枝分かれ形成は、標的層由来の分子機構によって制御され、さらにその分子発現は神経活動によっても制御されていることが示唆された。特に発生発達における発火活動やシナプス活動による修飾作用については不明な点が多い。以上を踏まえて、本研究では視床皮質投射をモデル系として、枝分かれ形成を含む標的認識における神経活動による修飾機構を明らかにすることを目指した。そのために、視床-大脳皮質共培養を発生期のげっ歯類の脳から作製し(生後1日ラットより大脳切片を、胎生期16日ラットから視床切片を取り出す)、皮質内の視床軸索の枝分かれをeyfp(enhanced yellow fluorescent protein)ベクターを少数の視床細胞に導入することによって調べた。また、培養下での神経活動を記録するためにはMED(multi-electrode dish)を用いた。まず、形態観察の結果、培養1週後から視床軸索は枝分かれを作り始め、培養2週後では平均十数本の枝分かれが標的層を中心に分布していることが判明した。一方、神経活動も培養1週後から活発になり、培養1-2週の間数Hzの活動が見出された。次に、培養1週後からナトリウムチャネルあるいはグルタミン酸受容体のプロッカーを培養液に加えると、これらの標的層での枝分かれが著しく減少した。以上より、層特異的な視床皮質投射が形成されための分子機構が働くためには神経活動が必要であることを示唆された。発生期の神経回路形成においては軸索誘導分子によるメカニズムが中心的な役割を果たすことが明らかになってきたが、ニューロンの発火やシナプス活動がそれを修飾する作用をもつことも古くから示唆されている。しかしながら、神経活動に依存的な修飾機構については不明な点が多々ある。本研究では視床皮質投射をモデル系として、枝分かれ形成を含む標的認識における神経活動による修飾機構を明らかにすることを目指した。私たちは視床-大脳皮質共培養を発生期のげっ歯類の脳から作製し(生後1日ラットより大脳切片を、胎生期16日ラットから視床切片を取り出す)、皮質内の視床軸索の枝分かれをeyfp (enhanced yellow fluorescent protein)ベクターを少数の視床細胞に導入することによって調べてきた。

これまでに、視床・皮質細胞の神経活動が弱まると、視床軸索の枝分かれ形成も減少することが明らかになっている。本研究では、特に視床、皮質細胞の電気的活動を別々に制御することにより、どちらの活動が必須であるかを検討した。そのために、内向き整流特性を持つカリウムチャネル(KIR2.1)を視床細胞または皮質細胞に過剰発現させ、視床軸索の枝分かれ形成を調べた。その結果、視床細胞にKIR2.1を導入した場合、皮質細胞に導入した場合、いずれの場合も視床軸索の枝分かれ形成は、コントロールによりも優位に減少することが判明した。以上より、層特異的な視床皮質投射が形成されための分子機構が働くためには視床、皮質の両者、言い換えると、シナプス前後の細胞の両方の活動度が高いことが必要であり、形態的結合性にヘッブ則が成り立つことが示唆された。
肺炎球菌性肺炎の重症化に関わる疾患感受性遺伝子の同定とその機能解析

肺炎球菌は、市中肺炎の原因菌として国・地域を問わず最も高頻度に分離される。本菌は口腔・鼻腔に存在する常在菌であり、誤嚥などにより肺胞腔に侵入した肺炎球菌は肺胞マクロファージ・好中球により貪食殺菌されるが、莢膜が存在すると貪食殺菌に対して抵抗性に働く。肺炎球菌自体の病原性については多くの報告があるが、肺炎の重症化に関わる宿主側の要因はほとんど解明されていないのが現状である。これまでに莢膜型19Fの肺炎球菌によるマウス肺炎モデルを構築しており、この臨床から高頻度に分離される莢膜型の肺炎球菌によって肺炎が重症化することを見出している。そこで本研究では、肺炎球菌性肺炎の重症化に関わる疾患感受性遺伝子を特定し、重症化と莢膜型との関連性を見出すことを目的としている。これまでに、臨床から高頻度に分離される莢膜型19Fの肺炎球菌をCBA/JNマウスに感染させることによって、肺炎が重症化することを見出している。また連鎖解析法により推定している責任遺伝領域に存在する遺伝子Xとその関連遺伝子に関して、肺炎球菌に対する疾患感受性マウス(CBA/JNマウス)と非感受性マウス(CBA/Nマウス)とで遺伝子発現量に差が見られることが分かっている。そこで本年度は、それらの遺伝子発現量の経時的変化を中心に検討を行い、肺炎球菌の感染初期に発現する各種遺伝子が肺炎球菌の排除に関わることを推定した。また、それらの遺伝子が関わると考えられるマクロファージに関して、疾患感受性マウスでは殺菌能が低下していることがわかった。1)各種遺伝子の経時的な発現量の解析これまでの連鎖解析法を用いた検討により、肺炎球菌性肺炎の疾患感受性に関して、推定遺伝領域内に存在する遺伝子Xが関わることを予想している。また疾患感受性マウスでは、マクロファージ数が有意に増加していることも明らかにしている。そこで遺伝子Xおよびマクロファージの活性化等に関わるCXCL1、CXCL2、CXCR2の遺伝子発現に関して、疾患感受性マウスと非感受性マウスとでの遺伝子発現量の変化を詳細に検討した。その結果、疾患非感受性マウスでは感染初期に各種遺伝子発現量が増加するのに対して、感受性マウスでは初期の発現量の増加は観察されなかった。一方、肺炎球菌性肺炎によりマウスが死亡する感染後期では、疾患感受性マウスでの遺伝子発現量が増加していることが分かった。2)肺炎球菌に対するマクロファージの貪食殺菌能の観察マクロファージの活性化を評価するために、2系統のマウスからマクロファージを回収し、肺炎球菌を接触させる事による貪食殺菌の比較を行った。両者共に貪食能の違いは見られなかったが、疾患感受性マウス由来のマクロファージの方が殺菌能が高いことが分かった。連鎖解析法により推定している疾患感受性遺伝子については、肺炎球菌感染により疾患感受性マウスと非感受性マウスとで遺伝子発現量に差が見られることが分かった。また、マクロファージの貪食殺菌能にも違いが見られることが分かった。一方、これらの現象は莢膜型19Fのみで見られる現象であるため、なぜ莢膜型19Fのみが肺炎の増悪に関わるのかは分かっていない。今後は上記の機能解析を進めると共に、莢膜型19Fの莢膜構造との関連性を検討する予定である。莢膜型19Fの遺伝子欠損株については、別施設の研究者が別目的で保有していることから、その菌株を分与いただき本実験に供する予定である。また、近年、無莢膜型の肺炎球菌感染症も散見されるため、本モデルマウスを用いて無莢膜型株による肺炎の重症化についても検討を行う予定である。これまでに肺炎球菌によるマウス肺炎モデルを構築しており、臨床から高頻度に分離される莢膜型の肺炎球菌によって肺炎が重症化することを見出している。これまでに臨床から高頻度に分離される莢膜型の肺炎球菌をCBA/JNマウスに感染させることによって肺炎が重症化することを見出している。そこで本年度は、CBA/JNマウス(比較対象としてCBA/Jマウスを使用)の全ゲノム配列を解析し、責任遺伝子領域を中心にC57BL/6およびCBA/Jマウス(CBA/JNマウスの近縁種)との配列比較解析を実施した。また、既に先行研究により肺炎球菌を感染させたCBA/JNマウスとCBA/Jマウスの肺を用いて網羅的遺伝子発現解析を実施し、抗原提示に関わるciita遺伝子が致死感受性の高いCBA/JNマウスで高値を示すことが分かっている。そこでciita遺伝子と肺炎との関連性について検討した。1)比較ゲノム解析の実施これまでに、250匹のF2マウスを用いて連鎖解析を実施し、肺炎球菌性肺炎の重症化に関わる責任遺伝領域を特定したが、領域内の塩基配列情報は未決定のままである。

そこで本研究項目では、CBA/JNマウスの全ゲノム配列を解析し、責任遺伝子領域を中心にC57BL/6およびCBA/Jマウス(CBA/JNマウスの近縁種)との配列比較解析を実施した。得られた配列データをもとに、参照配列(CBA/JおよびC57BL/6)に対し取得リードをマッピングすることにより、配列決定・変異の検出を行ったが、責任領域内には特異な変異等は見つからなかった。現在、責任遺伝領域外の配列も含めて、別の解析方法を用いて検討している。2)抗原提示に関わるciita遺伝子に関する検討これまでに肺炎球菌を感染させたCBA/JNマウスとCBA/Jマウスの肺での網羅的遺伝子発現解析を実施し、抗原提示に関わるciita遺伝子が致死感受性の高いCBA/JNマウスで高値を示すことが分かっている。ciita遺伝子はIFNγによりコントロールされることが知られている。そこで肺炎球菌を感染後に経時的にIFNγとciita遺伝子の発現を調べたところ、両者に相関が見られた。さらにIFNγの発現と肺内菌数との相関も見られた。肺炎球菌は、市中肺炎の原因菌として国・地域を問わず最も高頻度に分離される。本菌は口腔・鼻腔に存在する常在菌であり、誤嚥などにより肺胞腔に侵入した肺炎球菌は肺胞マクロファージ・好中球により貪食殺菌されるが、莢膜が存在すると貪食殺菌に対して抵抗性に働く。肺炎球菌自体の病原性については多くの報告があるが、肺炎の重症化に関わる宿主側の要因はほとんど解明されていないのが現状である。これまでに莢膜型19Fの肺炎球菌によるマウス肺炎モデルを構築しており、この臨床から高頻度に分離される莢膜型の肺炎球菌によって肺炎が重症化することを見出している。そこで本研究では、肺炎球菌性肺炎の重症化に関わる疾患感受性遺伝子を特定し、重症化と莢膜型との関連性を見出すことを目的としている。これまでに、臨床から高頻度に分離される莢膜型19Fの肺炎球菌をCBA/JNマウスに感染させることによって、肺炎が重症化することを見出している。また連鎖解析法により推定している責任遺伝領域に存在する遺伝子Xとその関連遺伝子に関して、肺炎球菌に対する疾患感受性マウス(CBA/JNマウス)と非感受性マウス(CBA/Nマウス)とで遺伝子発現量に差が見られることが分かっている。そこで本年度は、それらの遺伝子発現量の経時的変化を中心に検討を行い、肺炎球菌の感染初期に発現する各種遺伝子が肺炎球菌の排除に関わることを推定した。また、それらの遺伝子が関わると考えられるマクロファージに関して、疾患感受性マウスでは殺菌能が低下していることがわかった。1)各種遺伝子の経時的な発現量の解析これまでの連鎖解析法を用いた検討により、肺炎球菌性肺炎の疾患感受性に関して、推定遺伝領域内に存在する遺伝子Xが関わることを予想している。また疾患感受性マウスでは、マクロファージ数が有意に増加していることも明らかにしている。そこで遺伝子Xおよびマクロファージの活性化等に関わるCXCL1、CXCL2、CXCR2の遺伝子発現に関して、疾患感受性マウスと非感受性マウスとでの遺伝子発現量の変化を詳細に検討した。その結果、疾患非感受性マウスでは感染初期に各種遺伝子発現量が増加するのに対して、感受性マウスでは初期の発現量の増加は観察されなかった。
ヘムオキシゲナーゼ反応における酸素活性化と構造との関連

1。ジフテリア菌のヘムオキシゲナーゼ(HmuO)とヘムとの結合にはHmuOのヒスチジン20残基の中性イミダゾール基が関与していることをEPR、共鳴ラマンスペクトルの実験から明らかにした。このことは還元型のH20A変異酵素の共鳴ラマンの結果からも証明された。第五配位子を欠き、酵素活性もないH20A変異酵素にイミダゾールを加えたところ、ヘム分解活性が回復した。従って、H20Aでヘム分解活性を欠くのは第五配位子が欠如しているためと結論された。2。ヘムオキシゲナーゼ(HO)反応ではαビリベルジンのみが選択的に生成する。しかし、ラットHO-1の183番のアルギニンをカルボキシル基を持つグルタミン酸やアスパラギン酸に変えるとα型の他に20%程度のδ型が生ずることが判明した。これはおそらく、変異酵素での183番目ののカルボキシル基とヘムのプロピオン酸基との相互作用によってα特異性が崩れたためと考えられた。3。ヘムポケットを構成するアスパラギン酸140(D140)をアラニンやアスパラギンに変えた変異酵素ではヘム分解反応が野生型に比べ低下していた。特に過酸化水素による反応では、野生型はベルドヘムまで分解されるのに対し、D140AではコンパウンドIIで停止した。1)140のカルボキシル基が酸素活性化のために必須の役割を持つと判断された。4。ラットのビリベルジン還元酵素の結晶化と構造解析に成功した。本酵素は二つのドメインから成り、N末端側のドメインはNADPHやNADHを認識するヌクレチオド結合モチーフを持っており、C末端側にはβシート構造が多く見られた。これらの構造を本にNADPHやビリベルジンの結合部位を推測できた。1。2。3。4。ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解機構とピリペルジン還元酵素について次ぎの点が明らかになった.2.Hmu OのHis20をAlaに換えたH20A変異酵素ではヘムを正常に配位はするものの,そのヘムの分解活性は消失していた.H20A・ヘム複合体の光吸収スペクトルやEPRなどの測定結果と野性型酵素・ヘム複合体の結果との比較からHis20がヘムの第五配位子として機能している事が知られた.3.H20A酵素はイミダゾールを加えることでヘム分解活性は復活した.更に,H20A・ヘム複合体でもpHを酸性からアルカリ側に変化させると,第六配位子が水から水酸イオンに変化した.従って,H20A酵素ではヘムポケットの構造は正常であり,野性型と変わりがないと推測された.4.ラットHO-1のArg183残基をGluやAspの酸性アミノ酸に換えた所,α型の他に一割程のδ型が生成した.酸性アミノ酸のカルポキシル基が生成物特異性を変化させたものと思われる.5.ラットピリペルジン還元酵素の大腸菌での大量発現系とその精製系を確立した.精製酵素はラットの肝臓の酵素とほぼ同程度の活性をもっていた.結晶化にも成功し,その解析結果から,NADPHやNADHの結合部位を含む立体構造の全体像が明きらかになった,この発見は新生児黄疸の治療薬の開発などに繋がるものと期待される.基質であるピリペルジンを結合した結晶を得る事はできなかったが,現在,構造を基にして種々の変異酵素を作成し基質結合部位の特定を行っている.

ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解機構とビリベルジン還元酵素について次ぎの点が明らかになった。1.ラットHO-1を用いてヘム分解反応の第一段階、即ちヘミンからヒドロキシヘムへの酸素活性化機構にどのアミノ酸が関与しているかを検討した。基質であるヘムのαメテン炭素に近接すると考えられるアミノ酸残基をAlaに変異させた変異酵素、T135A,R136A,D140A,S142Aを大腸菌で発現させ、その大腸菌から精製した酵素を用いて種々実験を行った。これらの四つの変異酵素の内、D140Aを除く三種ではヘム分解活性は野生型と変わりがなかったが、D140Aでは野生型の半分程度の活性しか認められなかった。更に、過酸化水素との反応ではヘム分解反応は全く進行せず、いわゆるcompound IIの状態で停止した。D140E酵素ではこのような現象は見られないことからAsp140のカルボキシル基が酸素活性化にとって極めて重要という結論に達した。おそらく、このカルボキシル基が酸素活性化のための水素結合ネットワークの形成に与っていると思われる。私共はこの段階での活性化酸素の分子種はハイドロパーオキシドと報告したが、今回、D140A酵素などを用いて更に明確にした。2.ラットビリベルジン還元酵素の大腸菌での大量発現系とその精製系を確立し、更に、結晶化にも成功した。その解析結果から,NADPHやNADHの結合部位を含む立体構造の全体像を明らかにした.実際、その情報を基にして各種変異酵素を作成し、酵素活性を比較検討することにより、構造と機能との関連を明確にした。更に、基質であるビリベルジンの結合に関与すると思われる塩基性アミノ酸および電子伝達に関与すると思われるアミノ酸の特定にも成功した。
有機物輸送サブモデルの構築に向けた詳細観測による一次河川リターの動態の解明

平成16年度においては、河川上流域を対象にリターの落下・流下・堆積の局所性を調べるための詳細な観測を実施し、データを収集した。フィールドは、埼玉県入間市周辺を流れる柳瀬川の上流で、2次流域に相当する270mを区間を設定した。河床勾配は1%以下、流量が0.04m3/sec程度であり、比較的他の河川よりも緩やかで流量も少ない。河岸の森林はケヤキが最も多く、次いでサクラ、ブナ、コナラ、スギが繁茂していた。調査項目:1)河川を10mごとにポイントを分け、流速と水深を調査毎に測定した。2)河川のリーフリターの供給状況調査は、河岸の上流から下流にかけて約10mごとに任意で計38ヶ所のかごの設置をしてリーフリターの落下量を測定した。3)河川内にネットを設置し、1時間毎に2回リーフリターの流下量をサンプリングしてそれぞれの乾燥重量を測定した。4)河床内のリーフリターの堆積量を算出するために、主に堆積しているポイントを数箇所選定し、写真撮影とサンプリングを行った。5)河床の砂礫については有機物の滞留ポイント別にサンプリングを行い、その後粒径分布を調べ各粒径の強熱減量の測定を行い有機物の割合を見積もった。6)また各々の粒径のC/N比をCHNコーダーで測定し、有機物の割合と比較することで有機物の分解に関する関係を求めた。7)滞留ポイントの間隙水を採取し、TOCを測定した。結果:落葉期におけるリターについて、その総供給量の78%が樹冠からの落葉であり、総供給量の66%が貯留されたことになった。堆積する位置の特徴として、浮石が多数ある瀬、淵、湾曲部の内側と外側、後流域がある。なお、浮石以外のポイントでは、リーフリターとともに細かい砂礫も集積していた。堆積地点にはFPOMも多く、粒径が小さくなるほどAFDMの割合が高くなった。DOMは瀬と淵で大きな違いが見られないが、湾曲部に堆積している間隙水のDOMは高かった。平成15年度は、2つのフィールド観測に着手した。まず、リーフリターの分解過程について、リーフリターの種類や場所による違いを調べるためにリターバック法によって評価を行った。主なリターの樹種はサクラとケヤキであり、それぞれ5mmと1mmのメッシュサイズのバックに詰め、平瀬、淵、礫、樹林下に設置した。分解は流れのある平瀬で早く、特にサクラのほうがその傾向が顕著であった。種による違いはセルロースやリグニンなど難分解性有機物の含有割合の違いが反映されたと思われる。次に、5mmと1mmのバックを比較すると、水生昆虫の侵入を防ぐ目的で設置した1mmのほうでリターが早く消滅し、予想に反した結果となった。ところが、メッシュの中には1mm以上のサイズの水生昆虫が多く存在し、糞であるFPOMが多量に付着していた。このことより、1mm以下だった水生昆虫がメッシュの中で成長し、生長後メッシュの外に出られないのと、魚の捕食にも逃れられるという好条件も影響していたことが考えられる。この結果より、メッシュバック法によるリターの分解を評価する際、これを捕食する水生昆虫の条件を制御してしまうことで定量的な評価を困難にする危険があることが示された(以上の結果を速報として関連セミナー、および学会にて発表済み)。次に、リターがどの場所にどのくらい集積するのかを調査した。200mの領域を対象とし、現地の詳細なマップを作成し、それに実際のリターの量をプロットして詳細分布を作成した。このことから、平瀬においては河床の礫のサイズや礫の配置、水深がリターの集積に深く関与していることが推察される。今後も同様な調査を繰り返し行い、集積度合いを定量化するための基礎データと集め、物理パラメターを用いてリターの集積規模を表現するモデルを構築し、有機物(特にCPOM)輸送量の定量化を目指す。

結果:落葉期におけるリターについて、その総供給量の78%が樹冠からの落葉であり、総供給量の66%が貯留されたことになった。堆積する位置の特徴として、浮石が多数ある瀬、淵、湾曲部の内側と外側、後流域がある。なお、浮石以外のポイントでは、リーフリターとともに細かい砂礫も集積していた。堆積地点にはFPOMも多く、粒径が小さくなるほどAFDMの割合が高くなった。DOMは瀬と淵で大きな違いが見られないが、湾曲部に堆積している間隙水のDOMは高かった。
大豆イソフラボンおよび亜麻リグナンを用いた新規歯髄保存療法の開発

本研究では、エストロゲン様作用を有するgenisteinをラット歯髄細胞に添加し、石灰化誘導能を検討し、ラット直接覆髄実験を行った。genistein添加によってラット歯髄細胞はALPaseの活性上昇,アリザリンレッド染色陽性,硬組織形成関連遺伝子群の発現を誘導し、直接覆髄実験では良質な修復象牙質形成と軽微な歯髄反応が観察された。これらの結果から, genisteinは,ラット歯髄細胞の石灰化を誘導し,直接覆髄剤として有用である可能性が示唆された.前年度までにラット歯髄細胞(RDP)へゲニステイン添加することによって石灰化が誘導される(石灰化に関連する遺伝子群の発現、アルカリフォスファターゼ活性等)ことが明らかになったため、本年度は、1ラット直接覆髄実験モデルにゲニステインを直接覆髄剤として用いることで、修復象牙質形成が誘導されるかを調べ、2in vitroにおけるゲニステインが石灰化を起こすメカニズムの解析を行い、以下の結果を得た。1ラット直接覆髄実験モデルにおいて、小池らの方法に従って上顎第一大臼歯近心に人工的な露髄腔を形成し水酸化カルシウムをコントロールとして直接覆髄を行った。実験群としてゲニステインは、in vitroで優位に石灰化を誘導した濃度(0.1uM)を中心に実験に用いた。水酸化カルシウム製剤を直接覆髄剤と用いた結果は、粗造で空隙のある修復象牙質が観察されたが、ゲニステインで形成された修復象牙質は欠損がなく、象牙細管を有する良質な象牙質が認められた。また修復象牙質直下の歯髄の炎症も軽微であった。このことからゲニステインは有効な直接覆髄剤となりうる可能性が示唆された。2ゲニステインが誘導する歯髄細胞の石灰化メカニズムを解析するため、Aktのリン酸化阻害効果およびTGF-β系シグナル経路であるp38のリン酸化活性の測定を行った。ゲニステインをRDPに添加することで、ELISA法によって濃度依存的にp38のリン酸化活性が上昇することが確認された。また、細胞増殖を亢進させるPDGFを添加してもAktのリン酸化活性は増加せずゲニステインの濃度依存的に抑制された。このことからゲニステインは細胞増殖を抑制し、p38のリン酸化を介して石灰化に関与することが示唆された。これらの結果から, genisteinは,ラット歯髄細胞の石灰化を誘導し,直接覆髄剤として有用である可能性が示唆された.ラット歯髄細胞にフラボノイドに分類される大豆イソフラボンおよび亜麻リグナンの添加を行い、石灰化を誘導する条件を設定し、象牙質形成関連遺伝子群の発現の定量化およびシグナル伝達経路を調べることを本年度の研究目的とした。genistein存在下でのRDP培養し、細胞の石灰化に与える影響を解析するためにALPase活性の測定およびアリザリンレッド染色を行った。genistein添加群のALPase活性は、培養10日目ではControlとほぼ同等の活性であったが、培養17日目以降に活性の上昇が観察された。さらにアリザリンレッド染色では、培養30日目に石灰化結節の形成が認められ、これに対しControlでは石灰化結節は培養期間内ではほとんど認められなかったまた、osteocalsinのタンパク量の定量をELISA法によって調べた。genisteinを含む培地でRDPを培養後、Controlと比較してgenistein添加群でosteocalsinタンパク量は顕著に増加していた。これらの結果から、ラット歯髄細胞に大豆イソフラボンであるゲニステインを添加することで石灰化を誘導することが観察された。このことは天然成分由来である大豆イソフラボンが直接覆髄剤や間接覆髄剤へと応用が可能になると考えられる。本年度は、ゲニステインによって歯髄炎が軽減するメカニズムを解析するため、ラット歯髄細胞にリポタイコ酸を添加し、プロスタグランジン活性の定量化と炎症関連遺伝子群の発現を調べることとした。ラット歯髄細胞(RDP)を110ug/mlのリポタイコ酸(lipoteichoic acid;LTA)を含む培地で12時間培養を行った後、ゲニステインを1または10uM(以下G1、G10)添加し24時間後に上清を回収し実験群とした。また、陰性コントロールとしてゲニステインのアナログであるゲニスチンを添加し、サンプルを回収した。その後プロスタグランジンProstaglandin E2(PGE2)活性をELISA法で測定した。2また各サンプルのtotal RNAを抽出し、炎症に関連する遺伝子群(IL-1, IL-6, COX-2, TNF-α, CXCL10)のmRNA発現量をReal time PCR法により定量した。その結果、LTA刺激によってRDPのPGE2活性が約6倍上昇したが、ゲニステイン添加によってその活性はコントロールレベルまで減少した。またゲニスチン添加によってPGE2活性は維持した状態であった。一方、IL-1, IL-6などの炎症性サイトカインやアラキドン酸カスケードのCOX-2および炎症性ケモカインCXCL10の遺伝子発現が上昇するが、ゲニステイン添加によってそれらすべての遺伝子発現が抑制された。