hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SCC抗原作動型PD-1-Ig遺伝子を応用した新たな口腔癌免疫遺伝子療法の試み

SCC抗原作動型PD-1-Ig遺伝子を用いた口腔癌の免疫遺伝子療法の可能性を検討するため、マウスの舌に化学誘発性口腔癌モデルを作製するとともに、BALB/cマウスcDNAライブラリーを用いてPD-1およびSCC抗原遺伝子のクローニングを行い次のような結果を得た。1.マウス口腔癌モデルの作製前年度6-12週令のC57BLJマウスに発癌剤であるbebzo【a】pyreneを投与し、舌癌の作製を試み重度の上皮異形成を惹起することに成功したが、癌を形成するまでに至らなかった。そこで今年度は、BALB/cマウスに対しbenzo【a】pyreneとDMBAによるtow-stage chemical carcinogenesisを行ったところ舌癌を発症することに成功した。しかし、まだ癌の発生率がやや低いため、それを高めるべく検討を行っている。2.PD-1およびSCC抗原遺伝子のクローニングとSCC抗原作動型遺伝子の構築BALB/cマウスのcDNAライブラリーを用い、PD-1およびSCC抗原遺伝子をクローニングした。さらにSCC抗原遺伝子プロモーター作動型PD-1-Ig遺伝子を構築した。しかし、現在までのところアデノウイルスベクターにこれを組み込んだベクター(SCC/PD-1-IgAdeno)の作製には至っていない。以上のように、現在のところアデノウイルスベクターを作製中であり、今後早急にベクターの作製を終わらせ、vitroおよびvivoの実験を行う予定である。SCC抗原作動型PD-1-Ig遺伝子を用いた口腔癌の免疫遺伝子療法の可能性を検討するため、本年度はマウスに化学誘発性口腔癌モデルを作成するとともに、BALB/cマウスcDNAライブラリーを用いてPD-1およびSCC抗原遺伝子のクローニングを試み、次のような成果が得られた。1マウス口腔癌モデルの作成6-12週令のマウス(C57BLJ)に発癌剤である4-NQOあるいはbenzo[a]pyrene(B[a]P)を投与し、経時的に舌組織を採取して病理組織学的に癌化を検討した。その結果、いずれの発癌剤でも投与後6週間で上皮異形成が認められた。しかし、さらに投与を延長しても効率的に発癌させるのが困難であることが判明した。したがって、現在舌尖部を切除した後に発癌剤を投与し、癌化の早期発現につとめている。2マウス舌粘膜の癌化過程における細胞周期調節因子の発現変化この研究の目的である免疫療法の病理組織学的検討以外の評価マーカーとするため、癌化と密接に関連するとされるG1-S移行調節因子の発現変化を検索した。その結果、発癌剤投与6週間後では、BrdU陽性細胞の増加、cycline D1,CDK2,p21の発現増強、Rb燐酸化の亢進E2Fの結合低下が見られた。3 PD-1およびSCC抗原遺伝子のクローニング現在、マウスのDNAライブラリーを用いてPD-1およびSCC抗原遺伝子をクローニング中である。
患者中心のコミュニケーション教育プログラム(PEAC)の開発とその評価

予定していたCARE日本語版検証試験の遅れがあったこともあり、平成22年度に実施予定としていた「医学生・研修医のコミュニケーションへの認識および認識不足の要素の調査」を実施した。この調査では、7名の医学部5年生および6名の1・2年次初期研修医をそれぞれ対象とした2つのフォーカス・グループを実施し、その録画・録音記録の質的分析を行った。分析の主な結果としては、医学生は患者の感情を共有することで共感を示すことが可能になるのに対し、研修医は感情が共有できなくても病状などから必要と判断すれば共感を示す、という違いがあることが判明した。また、医学生の患者への共感を醸成する教育手段として、映画を用いた医学教育(Cinemeducation)も実施した。これは医学部1年生を対象にワークショップ形式で行った。実際には、患者の背景まで踏み込んで診療を行う、地域医療をテーマとした映画を学生に鑑賞してもらい、その後小グループで討議を行うという取り組みであった。この授業に対する評価は、無記名アンケートや小レポートで行った。前年度に進捗できなかったJ-CARE検証試験に関しては、研究協力者であるDr.Mercerと電子メールによる打ち合わせを行い、J-CAREの信頼性を検証する際に必要となる質問紙を作成することになった。質問紙は、患者個人の特性(年齢・性別・担当医への通院歴・社会背景等)を調査するものとなり、平成23年3月上旬にはほぼ完成した。21年度に発表した「医学生・研修医のコミュニケーションへの認識および認識不足の要素の調査」は、現在英文論文作成中であり、ほぼ完成しており、平成23年4月中を目処に国際誌に投稿する。また平成22年度は、PEAC実施の際に使用可能な医療面接用のシナリオを作成した。このシナリオと模擬患者養成に必要な情報をまとめ、書籍「よくわかる医療面接と模擬患者」を作成し、名古屋大学出版会より出版した。今年度は、患者による医師の共感的態度評価ツールであるConsultation and Relational Empathy (CARE) measure日本語版の、妥当性・信頼性検証試験を実施した。患者中心の医療コミュニケーション実現のためには、旧来行われてきた医療者によるコミュニケーション・スキルトレーニングだけでは不十分で、患者の視点を導入することが不可欠である。CARE measureは英国で開発された10項目からなる評価ツールで、現在香港やドイツでも翻訳版の信頼性や妥当性が検証された上で、活用されている。このため妥当性と信頼性の検証された日本語版CAREmeasureを作成することで、教育プログラムの質を国際的なレベルと比較した上で評価することが可能となる。今回行った検証試験では、314名の外来受診患者から日本語版CAREmeasureなどに対する回答を収集し解析を行った。その結果、構成概念妥当性検証に必要な、診療への満足度と日本語版CARE measure得点の相関は0.742(p<0.001)と高かった。また各項目への無効回答も0-2.7%と非常に少なかったため、表面妥当性も高いと思われた。また信頼性の一種である内的一貫性についても、0.984と他国での結果同様高い結果が得られた。今年度はこの試験の他に、医学生など模擬患者から受けるフィードバックをどのように受け止めているかを明らかにする質的研究も行った。2回のフォーカス・グループインタビューを行い合計10名の医学生が参加した。その結果、フィードバックに際しては、学生自身の自己評価を十分確認した上でフィードバックを行う必要があることが判明した。教育プログラム作成の際には、こうした点にも配慮する必要があると思われた。
外圏型ポリ酸イオン-遷移金属複合体の構造と物性

本研究はポリ酸イオンと遷移金属イオンとの相互作用を利用して複合体を合成し、その構造を明らかにするとともに、実現された構造に特有の物性を発現させることを目的としている。代表者らが既に合成し構造を明らかにしたCu^<2+>が[V_<10>O_<28>]^<6->に配位して出来た新化合物[Cu_2(OH)_2(OH_2)_6][Cu_2(OH_2)_8][V_<10>O_<28>]・4(CH_3)_2COについて磁化率測定を行い、[V_<10>O_<28>]^<6->上に2.89Åおよび3.37Åの距離で並ぶCu^<2+>間には、磁気的相互作用がほとんど働いていないことが明らかとなった。また、[V_<10>O_<28>]^<6->のCu^<2+>とNH_4^+、K^+、Rb^+との複塩を新たに結晶化し、陽イオンに配位した水分子が[V_<10>O_<28>]^<6->上に付加したプロトンを水素結合でサポートする形で[HV_<10>O_<28>]^<5->が安定化されている構造が見出され、これまで不明であった[HV_<10>O_<28>]^<5->のプロトン位置を明らかにした。また、結果的に遷移金属でなくアルカリ金属イオンが系中に取り込まれていたが、[SiW_<11>O_<39>]^<8->をNa^+とグアニジニウムイオンで結晶化させた化合物において[SiW_<11>O_<39>]^<8->がNa^+で螺旋型に連結された構造が見出された。その構造から非線形光学効果の発現が期待されたため、波長800nmのレーザー光を試料に照射したところ、第二高調波発生が認められた。これらの研究と平行して、ポリアニオン結晶の高精度構造解析を行なうために、大型放射光施設および高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設にて単結晶構造解析装置の設置及び高度化を行なった。その成果として、上述の[SiW_<11>O_<39>]^<8->がNa^+で連結された構造や、一連の巨大リング型化合物{Mo_<154-x>}の分子間での縮合構造などを非常に高い精度で解析することが可能となった。外圏型ポリ酸イオン-遷移金属複合体の新規開拓を目指す過程で、混合原子価のポリオキソモリブデン酸イオンの合成を試みたところ、遷移金属イオンとの外圏型複合体は得られなかったものの、新たな結晶性の化合物が得られた。

その単結晶について、シンクロトロン放射光を利用してX線回折実験をおこなったところ、[Mo^<VI>_<72>Mo^V_<60>O_<372>(CH_3COO)_<42>(H_2O)_<32>]^<54->という新規巨大球状クラスターイオンが含まれることが明らかとなった。なお、このX線回折実験に用いた装置は、このような巨大無機分子や、微小結晶の構造解析のために今年度研究代表者らによって高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所放射光研究施設に設置されたものであるが、今回の解析により、その性能が実証された。このイオンは、既にMullerらによって報告されている[Mo^<VI>_<72>Mo^V_<60>O_<372>(CH_3COO)_<30>(H_2O)_<72>]^<54->と類似の構造を持つが、Mullerらの分子の対称性が正二十面体対群(Ih)であるのに対し、今回新たに合成された分子は内部に酢酸イオンがより多く取り込まれたために、対称性が正四面体群(Th)に低下している。さらに、Mullerらの分子では球状分子の内側は30個の酢酸イオンのメチル基とモリブデン原子に配位した水が混在する環境にあるが、今回見出された分子の内側は42個の酢酸イオンのメチル基にて埋め尽くされており、ナノメートルサイズの球状の疎水的環境が実現されていることが明らかとなった。そのことから、疎水分子の取り込みなどの機能が期待されるため、現在、Drug Delivery Systemなどへの応用を視野に入れ、さまざまな疎水分子の取り込みについて検討を加えている。外圏型ポリ酸イオン-遷移金属複合体の新規開拓を目指す過程で、モリブデン置換したデカバナジン酸イオン[Mo_xV_<10-x>O_<28>]^<(6-x)->とCu^<2+>イオンとの複合体の合成を試みたところ、現段階では遷移金属イオンとの複合体を得るには至っていないが、デカバナジン酸イオン[V_<10>O_<28>]^<6->の新規なナトリウム塩Na_<5.5>H_<0.5>V_<10>O_<28>・18H_2Oが得られ、その単結晶X線構造解析を行った。この化合物はデカバナジン酸イオン二分子当たり一つのプロトンが付加するという新しいタイプのデカバナジン酸の酸性塩であるとともに、{[Na_4(H_2O)_<15>]^<4+>}_∞という無限鎖状のポリカチオンが結晶内に見られるという点で類例のない化合物である。また、ポリ酸イオンと希土類金属イオンとの複合体の新規開拓を目指す過程で、Cs_<7.11>[(Cu^IW_<12>O_<40>)_<0.61>(H_2W_<12>O_<40>)_<0.39>]Cl_<0.5>・12H_2Oという新規化合物が得られ、単結晶X線構造解析を行った。この結晶中では[Cu^IW_<12>O_<40>]^<7->と[H_2W_<12>O_<40>]^<6->という二種類の電荷の異なるポリアニオンが同じ位置にディスオーダーして存在していた。また、結晶中には[Cs_<14.22>(H_2O)_6Cl]^<13.22+>という新規なLindqvist型のポリカチオンがみられ、このポリカチオンとKeggin型ポリアニオンとが蛍石型のパッキングにより立方晶の構造を形成していることが明らかとなった。外圏型ポリ酸イオン-遷移金属複合体の新規開拓を目指す過程で、Keggin型構造を持つシリコドデカタングステン酸イオン[SiW_<12>O_<40>]^<4->とLa^<3+>-edta錯体との複合体の合成を試みたところ、[SiW_<12>O_<40>]^<4->アニオン1分子に対し、ランタン原子2原子とedta配位子2分子からなる2核錯体[La_2H_3edta_2]^+4分子が電荷のバランスをとる外圏型の化合物[La_2H_3edta_2][SiW_<12>O_<40>]・nH_2Oが得られ、その構造を単結晶構造解析にて明らかにした。
プロテーオーム解析により発見された膀胱癌新規腫瘍マーカーの臨床的有用性の検討

現在膀胱癌の診断法における尿細胞診は進行性癌や低分化癌に対する検出率は良好であるが、表在性癌や高分化癌での有効性は満足のいくのもではない。また診断や予後の判定可能な腫瘍マーカーがないため、治療効果半一」定、再発の予測が困難である。今回、我々が検討したSMC3尿細胞診は従来の尿細胞診を超える有効性をもつ可能性があり、血清から同定されたペプチドは早期診断や治療効果判定を行える可能性がある。(1)新規マーカー候補蛋白質の組織学的発現解析と機能解析1組織学的発現解析a免疫組織化学染色[馬場,松本,田畑,大草]候補蛋白質について、癌部と正常粘膜における発現の違いを検討した。そのなかで癌と正常粘膜で発現量に差が認められた蛋白質については多検体(膀胱全摘標本と正常尿路上皮組織)をもちいて免疫組織化学染色を行い臨床病理学的所見と比較検討。免疫組織学的検討は0から6までスコアリング(intensity, % positivity)し検討した。免疫組織化学染色において有意差が認められた蛋白質について、real time-PCRとIn situ-hybridyzationの手法を用いて癌と正常粘膜におけるmRNAの発現量を比較した。(2)尿細胞診への応用[馬場,松本,田畑,大草]今回検討している新規マーカー候補蛋白質は高分子蛋白質であり、細胞骨格を形成する構造蛋白尿が多い。このため尿中に分泌されている可能性は低く、尿細胞診での臨床応用が期待される。そこで今回、免疫組織化学染色で癌と正常粘膜における発現に有意差を認めた蛋白質について(現時点では2種類)尿細胞診に応用し臨床的有用性を検討。非膀胱癌患者尿50例、膀胱癌患者尿50例を用いて、感度・特異度を求める。従来の尿細胞診と比較し臨床的有用性を検討、単独または尿細胞診との併用により膀胱癌診断の改善が認められるかどうか検討した。(3)膀胱癌患者血清の比較[小寺,前田]根治的膀胱全摘出術を施行した患者5例について、手術前、手術後、健常者の血清をK法を用いてペプチド抽出し、HPLCで60フラクションに分画し,質量分析(MALDI-TOF MS)によって比較し、マーカー候補蛋白質を探索した。膀胱癌の初発症状は無症候性血尿で認められることが多く、診断方法として主に尿細胞診、膀胱鏡検査が行われている。膀胱鏡検査は確定診断に重要である反面、侵襲度が高く、身体負担を伴う検査であり改善が望まれている。本研究はプロテオーム解析技術を用いて膀胱癌に対する新規腫瘍マーカーを同定し、臨床応用することを目的としている。(1)機能解析[馬場,松本,田畑,大草]今回、組織で新規マーカー候補とした蛋白質は、その機能が解明されていないものも多く、癌との関連性を示した報告も少ない。このため上記過程で癌と正常粘膜で有意差が認められた蛋白質について特異的siRNAを用いてノックダウンした膀胱癌培養細胞を作成し、癌発育における蛋白質の機能を検討した。(2) ELISA法による定量[馬場,松本,田畑,大草]ウエスターンプロッティングで健常者尿と比較し、膀胱癌患者尿で発現量が増加した蛋白質(現時点では1種類確認)について、膀胱癌患者尿、健常者尿中での発現量をELISA法で定量し、臨床的有用性を検討した。膀胱癌患者については各病理学的ステージ(CIS : 10例、pTa : 10例、pT1 : 10例、pT2 : 10例、pT3以上: 10例)の患者尿と非膀胱癌患者尿(健常者:20例、膀胱炎や尿路結石患者などの炎症性疾患患者尿:10例)で検討を行なった。(3)膀胱癌患者血清マーカー候補蛋白質の同定、評価[小寺,大草]3ページ(2)に記載の通り、血清中のペプチド成分を比較し、患者と健常者血清でMSピークに違いの認められたものを探索。こうして得たマーカー候補ペプチドをMALDI-TOF/TOF MSを使ったタンデムMS (MS/MS)測定で同定した。このペプチドの安定同位体標識ペプチドを合成し、内部標準として用いて定量解析を行いマーカーとしての可能性を多検体で評価した(この方法は既に確立済み)。膀胱癌に対する尿中腫瘍マーカーとしてBTA(bladder tumor antigen)やNMP22(nuclear matrix protein 22)が用いられるようになったが、尿細胞診の診断率を超える有効性は認められておらず、膀胱癌に対する新規腫瘍マーカーの開発および本研究はこの問題に対してプロテオーム解析技術を用いて膀胱癌に対する新規腫瘍マーカーを同定し、臨床応用することを目的としており、(1)機能解析[馬場,松本,田畑,大草]組織で新規マーカー候補とした蛋白質は、その機能が解明されていないものも多く、癌との関連性を示した報告も少ない。

このため上記過程で癌と正常粘膜で有意差が認められた蛋白質について特異的siRNAを用いてノックダウンした膀胱癌培養細胞を作成し、癌発育における蛋白質の機能を検討した。(2)ELISA法による定量[馬場,松本,田畑,大草]ウエスターンブロッティングで健常者尿と比較し、膀胱癌患者尿で発現量が増加した蛋白質(現時点では1種類確認)について、膀胱癌患者尿、健常者尿中での発現量をELISA法で定量し、臨床的有用性を検討。膀胱癌患者については各病理学的ステージ(CIS:10例、pTa:10例、pT1:10例、pT2:10例、pT3以上:10例)の患者尿と非膀胱癌患者尿(健常者:20例、膀胱炎や尿路結石患者などの炎症性疾患患者尿:10例)で検討を行なった。(3)膀胱癌患者血清マーカー候補蛋白質の同定、評価[小寺,大草]血清中のペプチド成分を比較し、患者と健常者血清でMSピークに違いの認められたものを探索。こうして待たマーカー候補ペプチドをMALDI-TOF/TOF MSを使ったタンデムMS(MS/MS)測定で同定した後、ペプチドの安定同位体標識ペプチドを合成し、内部標準として用いて定量解析をした。これによってマーカーとしての可能性を多検体で評価した。
イオウ官能基が置換した新規ポリエン類の構築とその物性に関する研究

著者はまず新規なブタジエンを合成し、4炭素ホモロゲーションへ応用可能なジエン類を検索した。種々のジエン類を合成した結果、1および2位にイオウやセレン官能基を導入したブタジエン類で良い結果が得られることを見出した。原料のブタジエンの合成は著者のオリジナルな方法を開発した。フェニルプロパルギルスルフィドをエチルマグネシウムブロミドでアセチリドとした後、オルトギ酸トリエチルを加えて還流下反応を行なうと、4-フェニルスルフェニルあるいはセレネニルブト-2-イナールを良好な収率で与える。これを、ナトリウムエトキシドでアレニルスルフィドあるいはセレニドに異性化させた後、チオフェノールまたはメチルメルカプタンナトリウム水溶液を加えるとアレン中心炭素への求核攻撃が進行して3,4-ビススルフェニル-3-ブテナール類が定員的に得られる。これを、t-ブトキシカリウムで脱エタノール化反応を行いジエン類に変換する方法で目的の化合物を合成した。同じ手法でセレン誘導体も良好な収率で合成することができた。次に、これらブタジエン類を用いたアルデヒド類のペンタ-2,4-ジエナール化反応を検討した。1-フェニルスルフェニル-2-メタンスルフェニルブタ-1,3-ジエンをDABCO/n-BuLiを塩基としで-50°C下で反応させると比較的良好にリチオ化が進行し、アルデヒドとの反応の結果、付加したアルコール誘導体が得られることがわかった。1,2-ビスフェニルスルフェニルブタ-1,3-ジエンはLTMPを用いた場合が最もアルコールの収率が良かった。酸による加水分解は閉環反応が優先して進行することから、他の方法を検討したところ、SOCl_2/pyridineの試薬が最もよく、3,4-ビススルフェニルペンタ-2,4-ジエナール類が得られた。セレン誘導体もほぼ同じ合成法でアルデヒド類の3-スルフェニル-4-セレネニルペンタ-2,4-ジエナール化に成功した。著者は次に、2,4-ビスフェニルスルフェニル-2,4-ペンタジエナール化を繰り返し行なうことで、ノナ-2,4,6,8-テトラエナール誘導体の構築を検討した。ピバルアルデヒドから合成したペンタ-2,4-ジエナールに対してもう一度ブタジエニルリチウムを反応させると、付加したアルコールが異性体混合物として得られた。これを同じSOCl_2/pyridineで処理すると目的のテトラエナール類が満足のいく収率ではないが、得られた。これは2,4-ジニトロフェニルヒドラゾンへ変換することで、赤色結晶として単離することに成功した。今後、これらのテトラエナール類の物性について調べていく予定である。

交付者は研究実施計画に従って、4-alkoxy-1-(phenylsulfenyl)-1,3-butadieneを強塩基でリチオ化することを検討したが、アルデヒドとの付加生成物であるアルコールの収率は低く、さらにこれを酸で処理すると2,4-pentadienal誘導体ではなく、分子内の閉環反応が進行するすることが分かった。その結果、交付者はこのジエン類を用いてアルデヒドやケトン類の2,4-ペンタジエナール化を行なうことは困難であると判断した。そこで、置換基をさらに増やした1,2-bis(sulfenyl)-1,3-butadiene類を合成し、そのリチオ化およびアルデヒドやケトン類との付加反応を検討することにした。このアルコールを酸で処理すればアルデヒドやケトンの3,4-bis(sulfenyl)penta-2,4-dienyl化が達成できる。そこで、原料となるブタジエン誘導体の合成を検討し、数種の新規なブタジエンを合成することに成功した。そこで、交付者はまず、4-alkoxy-2-(methanesulfenyl)-1-(benzenesulfenyl)buta-1,3-dieneのリチオ化を検討した。種々の強塩基を検討したところ、n-BuLi/DABCO/-30°Cで良好に反応が進行することが分かった。すばやく、アルデヒドを加えると付加した5-alkoxy-3-(methanesulfenyl)-2-(benzenesulfenyl)penta-2,4-dien-1-ol誘導体が得られた。そこで、このアルコールの加水分解を検討すると、SOCl_2/pyridienの条件のみ目的の2,4-ペンタジエナール化が進行することを見出した。この反応は数種のアルデヒドにおいても進行し、立体選択的にジエナール類を与えた。さらに交付者は4-alkoxy-1,2-bis(benzenesulfenyl)buta-1,3-dieneにおいても同様の付加-加水分解反応が進行し、3,4-bis(benzenesulfenyl)-penta-2,4-dienal類を与えることも見出した。次に、このタンデム反応を検討した。まず、2-メタンスルフェニル誘導体を用いた2,4-ペンタジエナール化生成物に対してもう一度同じ反応を行なった。まだ、収率等の改善の余地はあるが、目的の3,7-bis(methanesulfenyl)-4,8-bis-(benzenesulfenyl)nona-2,4,6,8-tetraenal誘導体を立体選択的得ることに成功した。今後、交付者はこのテトラエナール誘導体の物性、特に光に対する反応性について調べていく予定である。著者はまず新規なブタジエンを合成し、4炭素ホモロゲーションへ応用可能なジエン類を検索した。種々のジエン類を合成した結果、1および2位にイオウやセレン官能基を導入したブタジエン類で良い結果が得られることを見出した。原料のブタジエンの合成は著者のオリジナルな方法を開発した。フェニルプロパルギルスルフィドをエチルマグネシウムブロミドでアセチリドとした後、オルトギ酸トリエチルを加えて還流下反応を行なうと、4-フェニルスルフェニルあるいはセレネニルブト-2-イナールを良好な収率で与える。
抜歯窩壁の骨吸収抑制はオッセオインテグレーションを促進するか?

本研究は、インプラント埋入時の骨吸収抑制とオッセオインテグレーションの獲得との関連を検討することを目的としている。骨吸収抑制因子のInterleukin-1 Receptor抗体(IL-1RA)は、In vitroでは、濃度依存性に破骨細胞様細胞の形成を抑制した。動物実験では、ラット脛骨にインプラントを埋入したところ、IL-1RAの投与により骨形成の促進、皮質骨の肥厚などの効果が確認された。本研究は、インプラント埋入時に起こりうる周囲骨の吸収に対して、生体活性物質を投与することにより、骨吸収を抑制することができれば、オッセオインテグレーションの獲得が可能になるかどうかを検討することを目的としている。本年度では、骨吸収抑制のできるタンパクの評価をin vitroで行うことを中心に行ってきた。破骨細胞形成抑制因子として、osteoprotegerin(OPG)とInterleukin-1 Receptor抗体(IL-1RA)を選択した。In vitroの実験系においてこれら2つのタンパクをラット骨髄細胞を用いた破骨細胞分化系(活性型Vitamin D3添加)に添加し、その効果を確認することとした。本法であるが、ラット骨髄細胞を採取後、3日間培養後にメディウムを交換し、2日後(培養期間計: 5日間)に破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)で染色した。その結果、OPG、IL-1RAともに濃度依存性に破骨細胞様細胞(TRAP陽性多核細胞: TRAP染色陽性で、かつ3核以上を有する細胞)の形成を抑制した。次に、動物実験では、ラットを用いて、予備実験を開始した。ラット脛骨に埋入窩を形成し、ここにIL-1を投与し、インプラントを埋入した。予備実験においては、1)投与タンパクの濃度、あるいは量の検討、2)タンパクの投与方法を検討した。しかし、脛骨における、治癒においては、インプラントと骨との間に吸収を起こすようなギャップを形成することは困難であり、これにより、本研究の目的であるインプラント周囲の骨吸収を誘導することは困難であるように思われた。よって、1)、2)の検討は、今後も行う予定であるが、タンパク投与の効果の検討に加え、実験モデルにおいてもさらなる改良が必要と思われた。さらに、in vitroの実験においても、両タンパクの添加時期を変え、添加したタンパクの生物学的作用機構の解明も追加の実験として行う予定である。破骨細胞形成抑制因子として、Interleukin-1 Receptor抗体(IL-1RA)を選択した。本法であるが、ラット骨髄細胞を採取後、3日間培養後にメディウムを交換し、2日後(培養期間計:5日間)に破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)で染色した。その結果、IL-1RAともに濃度依存性に破骨細胞様細胞(TRAP陽性多核細胞:TRAP染色陽性で、かつ3核以上を有する細胞)の形成を抑制した。脛骨へのインプラントの埋入に際し、インプラント周囲に2mmの骨欠損を作り、2週間後に肉眼と組織標本による観察を行つた。本モデルにおいては、IL-1RA投与群においてインプラント周囲の骨欠損はコントロール群と比較して、骨の欠損は小さくなっており、また皮質骨も厚い傾向が認められた。さらにイヌにおける同様の実験を行つたところ、ラットの場合と異なり、インプラントのサイズがイヌの顎骨に対してやや大きかったためか、オッセオインテグレーションの獲得が困難なものも認められた。また、欠損がラットよりも広範囲にわたるため、キャリアやIL-1RAの量に関しても十分な検討ができず、今後の検討課題も残った。
事例推論と仮説推論とを用いた機械の組立設計学習システム

機械の組立方法をシステムに学習させるためには,どの部品をどこに組付けるかを正確に教示できる部分システムが必要である。正しい組立手順の指示のためには指示者の意図が明確に表現できる言語の設定が不可欠である。本研究では図面と自然言語を用いることにした。この際問題となるのは,図面の取扱いである。そこで(1)図面に出現する部品の形状や機能のモデルが既知である時,(2)図面を解析することにより出現部品のモデルを推定させる,という2つの状況説足を考えた。(1)の場合,組立の対象,操作,その限界を言語表現から抽出し,与えられた部品を指定された状能に配置した結果を2次元平面に投影し,指示者の意図通りの組立状況の確認が行なえるようにした。特に内部構造を視認できるように,組付けた部品と接触関係をもつ部品を含む面での断面図の表示により,機構のチェックも可能とした。(2)の場合は,(1)の仮定がとり除かれているため,部品の詳細な形状の取出しが説明文の手伝けを受けて始めて可能となる場合が多く出現した。その一例として複数のネジを挿入するといった部位のみが変化する操作は図面ではその内の1つが例示されているに過ぎないが,説明文では複数名詞や副詞の使用が繰返しを明示しているため,相関の高い部分図形の探索域が限定され,結果的にすべての部位を発見することに成功した。(1)に比して(2)は機械部品モデルの精度が悪いため,組立てのシミュレーションが困難である。この点に関してはモデルと照合する実部品をみつけることにより,2.5次元モデルの3係元化を行なった後に組立てを模擬する予定である。学習及び設計学習については,事例ベース化する程に大量の組立例を取扱うことができなかったため,今後の問題として未解決である。機械の設計は(1)使用部品が既知の場合と,(2)部品集合は既知、(3)部品集合が未知にまず分けられる.(1)の場合は設計対象の機能が未知であっても使用部品を使い尽して何らかの機能が得られれば設計は成功したといえる.しかし(2)(3)では目標とする機能が与えられなくては設計不能となる.本年度は(1)の場合について研究を行った.ただ部品が既知であるとしても,部品の組合せ,組合せの程度(ネジを少し挿入するのか締結するのかといった挿作量),組立て操作の順序の自由度から,機能する機械の探索空間は非常に大きくなる.そこで組合せとその順序を与えることにより機能する機械を,操作量の空間内で探索する間題について考察を行った.具体的には組立方法をシステムに提示して,機能物体をシステムに組立てさせる実験を行なった.まず使用される部品の名称と3次元のソリッドモデル記述を準備し,英文の組立て指令文を解析した結果を,ソリッドモデルと組立操作の知識とを用いて,基本組立指令(組立対象物に対する被操作対象部品の平進・回転移動量の記述)の順序列に展開する.次に各指令を組立てシミュレ-タ(衡突検出プログラム)によって模擬し,操作後の部品間の関係(固定接続,円柱接続,接触接続など)をもとめる.一連の指令の実行後の部品間の接続関係をもとめ,機械要素間に期待すべき接続関係と反する部分があれば,その原因となる組立操作をもとめて知的バックトラックを行う.これにより指令の解釈誤りを認識することが可能となり,類似した状況での指令の解釈法の学習が可能となった。組立て手順や組立て部品の設計情報を事例ベ-スに格納するために従来より研究してきた組立てマニュアル理解に基づく事例ベ-ス生成に加えて,事例ベ-ス構築の効率を上げるため,コマンドによる組立指令システムの開発を行なった。

問題となる点は,組立終了条件の提示とその確認方法である。どの部品のどこに他の部品のある部位を接合するか,その限界はいくらかをどう指定するかが困難である。これをコンピュ-タシステムで実現する1つの方法として,対象となる2つの部品の3次元図形をグラフィカル端末に提示し,組立て部をマウスで指した後,操作コマンドを終了条件をアイコンで選択させることが考えられる。しかし終了条件のすべてをアイコンに準備できないこと,終了条件を指定できたとしても実現できなかったり,指定が誤っている可能性を調べることが容易でないという問題点の解決が必要となった。そこで部品の組立て状態,すなわちある2つの部品の接合部がどのような状態にあるかを表示する内面状態表示システムを作成した。また表示されている断面に出現している部品を回転並行移動させるコマンドを用いて,部品の接合状態を変更可能とした。ただしこのためには各部品の正確な3次元のモデルが必要となる。現在はCLOSを用いて描画させているが,正確なオブジェクト指向型のソリッドモデルを記述する必要がある。この問題を解決するため,図面より各部品の3次元記述を獲得する方法についても研究を行ない,図面より各部品の3次元記述を獲得する方法についても研究を行ない,簡単な部品について満足すべき結果を得た。その際部品のみえない面について仮説をたてる必要性からJTMSを改良した。機械の組立手順をシステムに与える時,部品間の接続条件が正しく理解されていなければ、組立てられた物体が正しく機能しないことは明らかである.この点に関して我々は機械の組立説明書から正しい組立指令を抽き出し,指令にそった組立シミュレーションを行うシステムを作成して来た.このシステムでは入力文は誤っていないことを前提としているが,実際に我々がシステムに与える指令の内には誤まった指令や本来与えておくべき条件設定が抜けた指令が存在すると考えられる.この点を考慮した対話的組立支援システムを作成した.一般に組立てを計算機に行なわせる際には組立目標の記述が与えられ,目標を達成するプランの作成が試みられる.しかし実際の部品の記述を誤りなくシステムに与えることは容易ではない,しかし組立を教示する者にとって,ある組立操作の実行後にどのような接合状態が得られるかは既知である.しかしその既知の状態を記述するのが困難なわけである.そこで本研究のシステムでは,ある組立操作後の状態の詳細をコンピュタグラフィクスを用いて表示させることとした.隠面消去による描画では内部の接合関係の目視ができないため,組立操作によって組み付けられた部品と接合面を共有する部品群の関係を隠面消去された描画へ描き加えることにより,視認性を向上させることができた.このようにして,本来正しい操作の記述に瞹眛性がある時にはシステムが自動バックトラックして妥当な解釈を,与えられた操作が誤っている場合は組立不能状態まで組立てを行ない,与えられた操作に条件漏れのある場にはその条件を加えることにより,組立を模擬し評価することが可能となった。
心血管内皮を標的とした食物由来成分による心房内血栓形成予防法の開発

左心房血栓は全身性血栓症の重要な要因となる。本研究は新規に開発した「左心房血栓自然発症モデルラット」の血栓形成と心血管内皮傷害との関連性を明らかにした。本モデル動物には胸部大動脈の内膜肥厚や内皮依存性弛緩反応の減弱がみとめられ、また、一酸化窒素産生能は有意に低下していた。さらに、一酸化窒素の基質であるL-Arginineを投与すると、一酸化窒素産生量が上昇し、血栓サイズが有意に小さくなった。よって、心血管内皮傷害を抑制することは、心房血栓予防に働く可能性が示唆された。さらに、ブルーベリー由来ポリフェノールなどの食物由来成分が血管内皮の傷害予防に働くことをみいだした。本研究ではWistar系ラットの近交法により確立した「心房内血栓自然発症モデルラット」への食物由来成分の投与が、心房血栓形成の予防に有用であるかを検討することを目的とする。私たちは心房血栓形成と心血管の内皮機能との関連性に注目し、モデルラットの内皮機能と一酸化窒素(NO)産生量に着目した。血管張力測定により大動脈の内皮機能を測定すると、モデル動物は内皮依存性の弛緩反応が有意に減弱していることが確認された。さらに、モデル動物の生体内NO量が顕著に低値を示したことから、心血管内皮のNO産生能が低下している可能性が示唆された。さらに、内皮依存性NO合成酵素(eNOS)の発現量を確認すると、心房および大動脈での有意に低下していた。さらに、NOの基質であるL-arginineを投与すると、NO量の上昇とともに心房血栓のサイズが小さくなった。以上の結果より、本モデル動物では血管や心房内皮のNO産生能低下により心房内での血栓形成が助長されている可能性が考えられた。心血管の内皮細胞は血管の張力調節作用のほかに、抗凝固作用を有するNOを産生し、心血管の恒常性維持に働いている。心血管内皮の一酸化窒素産生能をコントロールすることが心房内血栓形成予防に重要であると考えられた。次に、心血管内皮に作用する食物由来成分の検索とその効果について検討した。まず、Blueberryポリフェノール(BBP)を野生型Wistarラットに投与し、血管内皮機能を評価すると改善効果がみとめられた。本研究では、申請者らがWistar系ラットの近交法により確立した「心房内血栓自然発症モデルラット」への食物由来成分の投与が、心房血栓形成の予防に有用であるかを検討する。平成24年度はモデル動物の病態を観察し、心房血栓形成予防の評価法を確立することを目的とした。本モデル動物の心組織の病理標本を作製し観察すると、20週齢より左心房に小さな血栓が観察され、40、60週と加齢とともに血栓が肥大していくことを確認した。心房血栓は心臓の拍動リズム調節の不良(心房細動)による「凝固性の増加」と「血液のうっ滞」の両要素が亢進することが主な要因と考えられている。しかし、本モデル動物の心電図をテレメトリシステムによりモニターすると、不整脈を確認できなかったことから、本モデル動物の心房血栓形成は心房細動によるものではない可能性が考えれらた。そこで、内皮細胞より産生される一酸化窒素(NO)に着目した。さらに、モデル動物の生体内NO量が顕著に低値を示したことから、血管内皮のNO産生能が低下している可能性が示唆された。本研究ではWistar系ラットの近交法により確立した「心房内血栓自然発症モデルラット」への食物由来成分の投与が、心房血栓形成の予防に有用であるかを検討することを目的とした。当モデル動物は心房血栓形成に重要であると考えられている心房細動はほとんどみとめられないことから、心房血栓形成には他の要因が関与していると考えた。

血栓形成にはウィルヒョウの3要素としても知られているように心血管の内皮機能障害も1つの要因である。そこで当モデルラットの内皮機能と一酸化窒素(NO)産生量に着目した。血管張力測定により大動脈の内皮機能を測定すると、モデル動物は内皮依存性の弛緩反応が有意に減弱していることが確認された。さらに、モデル動物の生体内NO量が顕著に低値を示したことから、心血管内皮のNO産生能が低下している可能性が示唆された。さらに、内皮依存性NO合成酵素(eNOS)の発現量を確認すると、心房および大動脈での有意に低下していた。さらに、NOの基質であるL-arginineを投与すると、NO量の上昇とともに心房血栓のサイズが小さくなった。以上の結果より、本モデル動物では血管や心房内皮のNO産生能低下により心房内での血栓形成が助長されている可能性が考えられた。心血管の内皮細胞は血管の張力調節作用のほかに、抗凝固作用を有するNOを産生し、心血管の恒常性維持に働いている。心血管内皮の一酸化窒素産生能をコントロールすることが心房内血栓形成予防に重要であると考えられた。次に、心血管内皮に作用する食物由来成分の検索とその効果について検討した。まず、Blueberryポリフェノール(BBP)を野生型Wistarラットに投与し、血管内皮機能を評価すると改善効果がみとめられた。さらにラット大動脈組織を用いたin vitro実験でも内皮依存性血管弛緩作用がみとめられた。これらの成分が心房血栓の抑制や予防に応用できる可能性が示された。栄養学本研究で用いる「心房内血栓自然発症モデルラット」の病態に関して詳細な解析により、心血管内皮機能及び一酸化窒素(NO)産生量が低下していることが明らかとなった。さらに、NOの基質であるL-arginineを投与によりNO量の上昇と心房血栓サイズの減少がみられたことから、心血管内皮機能と左心房血栓形成には関連がある可能性が示唆された。これらの研究結果をまとめた論文はCirculation Journalに受理された。さらに、心血管内皮に作用する食物由来成分の検索とその効果について検討した。これらの研究結果をまとめた論文はBritishjournal of nutrition(109: 1746-1754, 2013)に報告したことは評価できると考えた。本研究で用いる「心房内血栓自然発症モデルラット」の病態を確認し、心血管の内皮機能が低下していることが明らかとなった。心房血栓の観察および心血管の内皮機能、生体内一酸化窒素量の測定方法を確立し、本モデルの評価系を確立したことは一部の目標を達成したと評価できる。また、本研究課題の申請段階で用いる予定の2種類の食物由来成分に加えて、新たに他の食物由来成分について血管内皮細胞に作用することを確認し、British journal of nutritionに報告したことは評価できると考えた。平成25年度までの結果より、心血管内皮の一酸化窒素(NO)産生能をコントロールすることが心房内血栓形成予防に重要であると考えられた。そこで平成26年度以降は、心血管の内皮細胞に作用し、NO産生を亢進させる食物または食物由来の成分の検索と、またそれらの投与が心房内血栓形成の予防に作用するかを検討する。平成24年度までの結果より、心血管内皮の一酸化窒素(NO)産生能をコントロールすることが心房内血栓形成予防に重要であると考えられた。そこで平成25年度以降は、心血管の内皮細胞に作用し、NO産生を亢進させる食物または食物由来の成分を用いて、心房内血栓形成を予防できるかを検討する。
ノンコーディングRNAの新規機能分類「Architectural RNA」の確立

癌関連の核内顆粒として知られるSam68 nuclear body (SNB)は、RNA分解酵素感受性を示すことなどから、顆粒構築に必要なRNAが存在すると考えられる。私たちが難溶性RNAを同定したHeLa細胞においてもSNBは存在するが、難溶性RNAの中には、SNBを構成するRNAは無かった(Chujo et al. EMBO J. 2017)。また、核内顆粒の骨格として働く既知の長鎖ncRNAの中には、難溶性を示さない核内顆粒構築ncRNAも知られている。従って、難溶性を示さないRNAがSNBの構築に関わると考えられ、このように難溶性を示さない核内顆粒構築RNAを探索する方法を世界で初めて開発することを目的とした。一般に核内顆粒を構築するRNAは、必ずその核内顆粒の内部に存在することから、私は、SNBを構築するRNAの探索方法として、Fluorescence activated cell sorting (FACS)法の活用を試みることを考えた。すなわち、FACSによってSNBを単離し、内部のRNAを同定すれば、SNBを構築するRNAの有力候補を得られるはずであると考え、この方法をFluorescence activated body sorting (FABS)法と名付けた。研究材料としては、蛍光タンパク質Venusを融合したSam68 (Venus-Sam68)を安定的に発現するHeLa細胞を使用し、(1)セルソータにより直径200 nmの微細粒子の分離可能性の確認、(2)細胞の前処理方法の開発、(3)FACSによるSNBの単離を実施した。単離した顆粒においてSNBのマーカータンパク質である内在Sam68と内在HNRNPLは濃縮した一方で、核小体マーカータンパク質Nucleolinはほとんど含まれていなかったことから、FABS法によりSNBの濃縮が行えたことを確認した。FABS法により、Sam68 nuclear bodyを濃縮することができた。早稲田大学浜田研との共同研究で、難溶性RNAの結合タンパク質に関する共同研究も進んでいる。FABS法により濃縮されたSam68 nuclear bodyに含まれるRNAの次世代シーケンス解析を行うことで、Sam68 nuclear bodyを構築するarchitectural RNAを同定したい。また、もしFABS法において、Venus-Sam68を指標にした1段階の濃縮では濃縮が不十分な場合は、内在のボディマーカータンパク質の染色を行うといった工夫を行うことで、2段階のFABSを行うといった改善法も考えている。
疾患特異的iPS細胞を用いた症候群性頭蓋縫合早期癒合症に対する新規治療法の開発

症候群性頭蓋縫合早期癒合症患者由来の細胞より樹立した疾患特異的iPS細胞を用いて、症候群性頭蓋縫合早期癒合症の病態を解明し、骨・軟骨系統への分化障害を改善する薬剤を発見する。
新規生理活性物質レピジモイドの構造と機能

筆者らは、本研究において新規生理活性物質レピジモイドの構造と機能を明らかにすることを目的として、1)レピジモイドの植物界における普遍性、2)レピジモイドの活性発現に寄与している化学構造、3)レピジモイドの生合成機構、4)レピジモイドの作用機作について研究を行い、以下に示すような結果を得た。1)レピジモイドの植物界における分布を調べるため、本研究において新たに開発した機器分析を用いて定量を行ったところ、種によって分泌量の差はあるものの、今回用いた24種(12科22属)の植物種子培養液総てにおいてその存在が確認された。2)レピジモイドおよびその誘導体を用いた構造活性相関実験の結果から、レピジモイドの活性発現にはα-グリコシド結合を介してラムノースに結合しているα,β-不飽和ウロン酸誘導体部分およびウロン酸部分のC-4,5位部位の二重結合が重要な役割を果していることが明らかとなった。3)発芽種子および分泌液中のレピジモイドの消長を機器分析および生物検定法を用いて調べたところ、レピジモイドは給水後数時間目から分泌されはじめ、分泌されたレピジモイドは遅くとも4日目迄には分解あるいは代謝されることが明らかになった。またこの間に、新たなレピジモイドの生合成が起きていることも明らかとなった。4)レピジモイドの作用機作を明らかにするために、種々の生物検定法を用いて効果を調べたところ、レピジモイドる胚軸の伸長を促進する他、弱光下でのクロロフィルおよびその前駆物質である5-アミノレブリン酸の生合成促進や、セネッセンスおよび離層形成等の植物の老化に対して抑制作用を示すことが明らかとなり、その作用の多様性が新たに示された。また、これらの結果の一部は、論文2編および学会発表7件として公表を行った。1.種子の発芽時に他の植物の成長を促進する物質(アレロパシー物質)が分泌されるという生物機能の植物界における普遍性について、13科22属の植物種子を用いて、ヒモゲイトウ下胚軸伸長試験で調べた結果、全ての植物に共通した生物機能であることが判明した。2.クレス種子の分泌液から、アレロパシー物質として単離・同定した新規・二糖類のレピジモイドの植物界における分布について、機器分析と生物検定を用いて調べた結果、レピジモイドが全ての植物の種子分泌液中に検出できた。ヒマワリ、ソバで種子一粒当たり10μg以上、トウモロコシ、エンバク、ミツバ、パセリ、クレスなど10種類の植物の種子分泌液で110μg、チモシー、アスパラガスなど6種類で0.11μg、イネ、レタスなど5種類の植物で0.1μg以下のレピジモイドが検出された。3.レピジモイドのアナログを合成し、構造活性相関を調べた結果、クレスから単離したレピジモイドはNa塩であったが、カルボン酸でも同様な活性を有したことから、Naは活性発現に必須でないことがわかった。ウロン酸部分のC-4,5位の二重結合が活性発現に重要であることも明らかになった。また、ラムノースとウロン酸から成る二糖(αグルコシド結合)が活性を有し、ラムノース、ウロン酸は単独及び混合して与えた場合、活性を示さないこともわかった。4.レピジモイド活性発現のメカニズムに関する研究は現在、進行中である。

1.レピジモイドの分泌機構を明らかにするために、ヒマワリとソバ種子を用い、分泌液および種子中に含まれるレピジモイドの発芽に伴う変動を機器分析で定量した。いずれの種子を用いた場合でも、乾燥種子に既にレピジモイドが存在し、吸収後2日で殆どのレピジモイドが種子から外に分泌されることが分かった。また、分泌液から検出されたレピジモイド総量が種子中のレピジモイド総量より多かったことから、吸水に伴い、レピジモイドが種子中で生成・分泌されることが示唆された。2.レピジモイドの生成系を明らかにするために、レピジモイドの前駆物質と予想される細胞壁多糖類のラムノガラクツロナンに発芽種子からの粗酵素液を処理し、機器分析を用いて定量した結果、レピジモイドが検出され、吸水種子におけるレピジモイドの新たな生成はラムノガラクツロナンの加水分解によることが示唆された。3.レピジモイドの活性発現の機構を探る手始めとして、レピジモイドの生理作用を調べた。(1)予備実験で、レピジモイド処理によって葉の緑化が促進されたことから、クロロフィル合成に対するレピジモイドの効果を調べた結果、レピジモイドはクロロフィル量を増大することが分かった。その場合、レピジモイドは、クロロフィルの前駆物質であるアミノレブリン酸の生合成を促進することも明らかとなった。(2)葉の黄変や離層形成といった老化に対するレピジモイドの効果を調べた結果、レピジモイドはいずれの現象も阻害し、老化防止の効果があることが分かった。4.レピジモイドの活性発現に関する分子生物学的研究は現在、進行中である。
ユビキチン-プロテアソーム系の自己抗体生産における意義の検討

各種膠原病患者を対象とし、PA28γ(Ki)およびPA28αのリコンビナント蛋白、および精製20Sプロテアソームを抗原源とした免疫プロット法にてプロテアソームに対する免疫応答を解析した。その結果、一連のプロテアソーム構成蛋白間およびそれらの結合蛋白に対する免疫応答の間には有意な相関を認めるものの、非結合蛋白戸の間には有意な相関が認められないことを明らかにした。また、プロテアソーム複合体の定量系を確立し、各種プロテアソームおよびその結合蛋白に対する抗体価が流血中プロテアソーム抗原量と相関する事を示した。以上の結果より、プロテアソームはその細胞内機能と関連しながらユビキチンを介して結合する一連の蛋白に対する免疫応答を誘導していることが示唆された。SLE患者血清300例、RA患者血清200例、強皮症患者血清60例、SjS患者血清100例などを対象とし、我々がクローニンしたPA28γ(Ki)およびPA28αのcDNAを用いて作成したリコンビナント蛋白、および精製20Sプロテアソームを抗原源とした免疫プロット法にてプロテアソームに対する免疫応答を解析し、PA28γ(Ki)に対する抗体は主として全身性エリテマトーデス(SLE),PA28αに対する抗体は主としてシェーグレン症候群(SjS)に検出されることを明らかにした(Matsushita M, et al : Mod Rheumatol 19 : 622-628, 2009)。さらに、プロテアソームとの結合が確認されている自己抗原、60KDおよび52KDSS-A抗原、PCNAに対する抗体は免疫プロット法、一方、プロテアソームとの結合を認めないU1 RNP、Smなどの抗原に対する抗体を免疫沈降法およびELISA法で測定し、免疫応答の連鎖について解析した。その結果、一連のプロテアソーム構成蛋白問およびそれらの結合蛋白に対する免疫応答の間には有意な相関を認めるものの、非結合蛋白に対する免疫応答の間には有意な相関が認められなかった。上述の結果によりプロテアソームおよびその結合蛋白に対する免疫応答には抗原自体の免疫系への暴露が重要な役割を有していることが示唆された。そこで、流血中のプロテアソームと一連の結合蛋白に対する免疫応答を解析するために抗PA28γ(Ki)モノクローナル抗体とそれと異なるエピトープを認識する高い特異性を有するSLE患者歯来の抗Ki抗体を用いたサンドイッチ式ELISA法の確立を試み、現在その特異性を検討する段階にまで至っている。我々は、前年度SLE患者血清300例、RA患者血清200例、強皮症患者血清60例、SjS患者血清100例などを対象とし、我々がクローニンしたPA28γ(Ki)およびPA28αのcDNAを用いて作成したリコンビナント蛋白、および精製20Sプロテアソームを抗原源とした免疫プロット法にてプロテアソームに対する免疫応答を解析し、PA28γ(Ki)に対する抗体は主として全身性エリテマトーデス(SLE),PA28αに対する抗体は主としてシェーグレン症候群(SjS)に検出されることを明らかにした(Matsushita M, et al : Mod Rheumatol 19:622-628, 2009)。さらに、プロテアソームとの結合が確認されている自己抗原、60KDおよび52KDSS-A抗原、PCNAに対する抗体は免疫プロット法、一方、プロテアソームとの結合を認めないU1 RNP、Smなどの抗原に対する免疫応答の連鎖について解析した結果、一連のプロテアソーム構成蛋白間およびそれらの結合蛋白に対する免疫応答の間には有意な相関を認めるものの、非結合蛋白に対する免疫応答の間には有意な相関が認められないことも明らかにした。本年度は流血中のプロテアソームと一連の結合蛋白に対する免疫応答を解析するために抗PA28γ(Ki)モノクローナル抗体とそれと異なるエピトープを認識する高い特異性を有するSLE患者由来の抗Ki抗体を用いたサンドイッチ式ELISA法の開発を試み、Ki抗原と特異的に反応する抗PA28γ(Ki)抗体モノクローナルの確立に成功した。この抗体の特性を検討した結果、自己抗体の認識するエピトープと異なっていることが明らかにされ、上述の抗原測定系を確立した。我々の樹立した一つの抗PA28γ(Ki)モノクローナル抗体とそれと異なるエピトープを認識する高い特異性を有するSLE患者由来の抗Ki抗体を用いたサンドイッチ式ELISA法で患者血清中のプロテアソーム複合体を定量系を確立した。その系を用い、平成21年度の方法で各種プロテアソームおよびその結合蛋白に対する抗体を測定し、その抗体価の推移と血中プロテアソームの濃度との関係を検討した。その結果、抗Ki抗体の発現と相関する抗PCNA抗体と同様に、流血中の抗原量に相関して、PA28γおよびPA28αの抗体価と流血中プロテアソーム抗原量の間に相関が見られることが示された。

この過程でユビキチンを介してプロテアソームと結合しているPCNAに対する免疫応答の相関も認められたことから、プロテアソームはその細胞内機能と関連しながら自己抗原に対する免疫応答を伝播させる役割を担っていることが示唆された。上述の結果より、プロテアソームおよびその結合蛋白に対する免疫応答には細胞より流血中に放出されるユビキチンープロテアソーム系蛋白複合体による抗原提示が極めて重要な役割を演じていることが明らかにされたが、今回の検討ではプロテアソームとの結合が確認されている自己抗原、60KDおよび52KDSS-A抗原、PCNA、およびその他の個々の蛋白間の免疫応答の連鎖の実態と抗原提示の関係について明確に詰めることはできなかった。