hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
麻酔関連薬剤のヒト胎盤通過性とそれに影響する因子の解析

蛍光検出器を装着したHPLCによる簡便なプロポフォール微量測定法を確立した。帝王切開時に娩出されたヒト胎盤により単一胎盤小葉の母体側・胎児側を各々潅流するモデルを作成し、母体側潅流液中のタンパク濃度を変化させてプロポフォールの胎盤移行を調べた。母体側潅流液のアルブミン濃度を22g/L、44g/Lと変化(胎児側は4.4g/Lに固定)させ潅流30分後の両薬剤のクリアランスを求めた所、プロポフォール・クリアランスは、2.47±0.37から0.72±0.26ml/hr/gに減少した。クーロアレイ3次元電気化学検出システムにおける4種類の局所麻酔薬〔Mepivacaine(M),Lidocaine(L),Bupivacaine(B),Ropivacaine(R)〕の検出法について、条件設定を行い検量線の作成も含め検出可能となった。その結果、(1)1mcg/ml濃度の各麻酔薬の新鮮凍結血漿と5%Albuminに対する結合率に大きな差はなかった。(2)pHの上昇に伴いタンパク結合率は上昇したが、BとRは、pH6でも高いタンパク結合能を示した。(3)臨床作用強度が強い局所麻酔薬ほどタンパク結合能が高い、ことが判明した。この測定システムを用いて、ヒト胎盤(帝王切開症例)の小葉を用いた灌流モデルにおいて、組織灌流液medium199を用いた灌流実験において母体側、胎児側の灌流液のpH変化における移行率を検討した。4種類の局所麻酔薬の移行率を(1)母体pH7.4,胎児pH7.4(2)母体pH7.4,胎児pH6.9(3)母体pH6.9,胎児pH6.9の3種類の条件下でそれぞれの血中濃度比をF(fetal)/M(maternal)比で検討した。10検体の十分胎児静脈サンプリングが可能なモデルを作成し、十分なHPLCのピークが認められた4サンプルにおいて結果を得た。その結果、以下が判明した。●pH7.4では非荷電型濃度の高い(pKaが7.4に近い)局麻薬ほどF/M比は高い。●胎児側のpHが低下するとF/M比は大きくなる。●pH6.9になるとpH7.4に比して母体側非荷電型濃度が低下し、その結果、F/M比も低下する。●局所麻酔薬の臨床強度が強いものほどF/M比は小さかった。クーロアレイ3次元電気化学(ECD)検出システム(4チャネル)を購入し、局所麻酔薬ropivacaine、bupivacaine、lidocaine、mepivacaineの微量定量法の確立に従事した。従来、これらの薬剤はHPLCの検出器としてUVを使用しておりECDによる検出の報告はなかった。検出条件の設定に時間を費やしたがようやく0.2ml試料での検出が可能となった。

ただし、bupivacaineラセミ体とlevobupivacaineの分離測定は出来ていないし、ECDでの分離測定は困難と考えている。現在、pH変化に伴うタンパク結合率の変化についての基礎データを取り始めたところである。すなわち、局所麻酔薬はそのpKaと溶液pHにより荷電型と非荷電型の比率が決定されるが、血漿タンパクに結合するのは非荷電型のみで、タンパクへの結合はそのブンゼン係数に従うと仮定してよいのか、また、タンパクへの結合飽和が臨床濃度の薬剤で生じうるのかを探索中である。なお、局所麻酔薬は血漿中のアルブミンよりはα1-acid glycoprotein(AAG)に結合するのとされているので、当初のタンパク液としてはヒト凍結血漿を用いる。次年度には、ヒト胎盤潅流モデルを用いた胎盤移行のデータについての研究に着手できる予定である。この場合、実施する条件は、(1)母体側潅流液のタンパク濃度変化・pH変化・潅流液流速の変化、(2)胎児側潅流液のタンパク濃度変化・pH変化・潅流液流速の変化であり、拡散移行の標準物質としてはアンチピリン、タンパク結合物質としてはインドシアニングリーンを用いる。クーロアレイ3次元電気化学(ECD)検出システム(4チャネル)を購入し、局所麻酔薬ropivacaine、bupivacaine、lidocaine、mepivacaineの微量定量法の確立に従事した。従来、これらの薬剤はHPLCの検出器としてUVを使用しておりECDによる検出の報告はなかった。検出条件の設定に1時間を費やしたがようやく0.2ml試料での検出が可能となった。この測定法については、現在、論文作成中である。pH変化に伴うタンパク結合率の変化についての基礎データでは、局所麻酔薬はそのpKaと溶液pHにより荷電型と非荷電型の比率が決定されるが、血漿タンパクに結合するのは非荷電型のみで、タンパクへの結合はそのブンゼン係数に従うと仮定してよいのか、また、タンパクヘの結合飽和が臨床濃度の薬剤で生じうるのかを探索した結果、4.4%人アルブミン液では、idocaine(pKa7.8)、mepivacaine(pKa7.6)、ropivacaine(pKa8.07)、bupivacaine(pKa8.2)のpH10,8,6,4での結合率は、各々、96、11、3、0%、86、6、0、0%、99、24、17、,0%、95、56、56、56%であった。なお、局所麻酔薬は血漿中のアルブミンよりはα1-acid glycoprotein(AAG)に結合するとされているので、ヒト凍結血漿でのデータを採取中である。検出条件の設定に時間を費やしたがようやく0.2ml試料での検出が可能となった。ただし、bupivacaineラセミ体とlevobupivacaineの分離測定は出来ていないし、ECDでの分離測定は困難であった。
極小変更の定式化に基づいた論理プログラミングにおけるソフトウェア発展モデルの研究

我々は,以前,極小変化に基づく知識の更新について極小限定(Circumscription)に基づいて定式化する方法を検討し,その方法による更新の性質について研究を行った.その方法は,新しい情報が追加されたときに,知識の変化がその情報に矛盾している部分のみに限定されるというものである.上記更新の定式化は,プログラム更新の定式化とみなすこともできる.なぜなら,知識を表現する論理式がホーン節の連言であれば,それは論理プログラムとして見なすことができるため上記知識の更新は,論理プログラムの更新と考えられるからである.しかしながら,この定式化は第二階述語論理で記述されているため一般的には,計算可能ではなかった.以上の背景を踏まえ,本研究の目的を,以下の2点に設定した.1.上で述べた極小変更に基づく知識の更新の定式化を用いて論理プログラミングの発展モデルを構築する.2.本定式化において計算可能であるクラスを同定し,実現可能な論理プログラム発展機構を明らかにする.本研究の成果は以下である.1.論理プログラミングの適切な更新理論として,論理的モデルレベルの極小変更ではなく,論理式の成否レベルの極小変更を考案した.2.論理プログラミングにおいては,上記,極小変更は,変更可能なルールをデフォルトとし,変更不可能なルールを公理としたときの極小限定に対応することを明らかにした.3.本変更の計算を仮説論理プログラミングに対応させ,どのルールを消去すべきかを仮説として用いることで,極小変更すべきルールの同定を可能にした.この実現により,計算可能なクラスの同定に関する知見を得た.我々は,以前,極小変化に基づく知識の更新について極小限定(Circumscription)に基づいて定式化する方法を検討し,その方法による更新の性質について研究を行った.その方法は,新しい情報が追加されたときに,知識の変化がその情報に矛盾している部分のみに限定されるというものである.上記更新の定式化は,プログラム更新の定式化とみなすこともできる.なぜなら,知識を表現する論理式がホーン節の連言であれば,それは論理プログラムとして見なすことができるため上記知識の更新は,論理プログラムの更新と考えられるからである.しかしながら,この定式化は第二階述語論理で記述されているため一般的には,計算可能ではなかった.以上の背景を踏まえ,本研究の目的を,以下の2点に設定した.1.上で述べた極小変更に基づく知識の更新の定式化を用いて論理プログラミングの発展モデルを構築する.2.本定式化において計算可能であるクラスを同定し,実現可能な論理プログラム発展機構を明らかにする.本研究の成果は以下である.1.論理プログラミングの適切な更新理論として,論理的モデルレベルの極小変更ではなく,論理式の成否レベルの極小変更を考案した.2.論理プログラミングにおいては,上記,極小変更は,変更可能なルールをデフォルトとし,変更不可能なルールを公理としたときの極小限定に対応することを明らかにした.3.本変更の計算を仮説論理プログラミングに対応させ,どのルールを消去すべきかを仮説として用いることで,極小変更すべきルールの同定を可能にした.この実現により,計算可能なクラスの同定に関する知見を得た.
牧草への家畜育種法－BLUP法－の応用

家畜育種の分野で発展した最良線形不偏予測(BLUP)法および制限付き最尤推定(REML)法について、牧草育種への適用を検討した。BLUP/REML法は、遺伝資源のスクリーニング、従来は評価が困難であった形質の遺伝解析に利用できる。収量性の改良については、従来の後代検定を省略できるほどの育種価の予測精度ではなかった。その他、DNAマーカーを用いた父子検定により、選抜後の親の偏りの矯正や不良な父親の淘汰に利用できる可能性を示した。(1)材料の選定・交配試験育種事業で選抜された個体群から、選抜履歴の異なる2群60個体(40個体+20個体)を選定した。各個体を10株に株分けし、隔離条件下で無作為交配を行った。種子は、母株毎に採種し、試験実施に十分な種子量を得た。(2)DNAマーカーによる血縁関係情報の調査連鎖地図情報を利用し、SSRマーカー28ペアを選定した。交配試験へ供試した60個体の系譜情報を2世代程度遡及でき、母親、父親、祖母、祖父などを特定できた。(3)BLUP法による遺伝情報(育種価と遺伝率)の算出選定した材料群を中心として世代を遡り、16試験531材料1862データを収集した。これら試験データは、育種事業での後代検定試験、個体選抜試験、栄養系評価試験で得られたもので、欠測値などが含まれるが、年間合計乾物収量(Mg/ha)、出穂始(6月の日)などが調査されている。なお、個体選抜試験や1次スクリーニングを目的とした試験については、関連する材料のみを選定した。父系情報を利用しない場合の個体モデルにおけるREML法による解析結果では、試験、年次、播種後年数を母数効果とするモデルが適当であると考えられた。個体植条件下で調査した各形質の遺伝率は、0.000.71であり、既報の遺伝率の値よりも下回る場合があった。REML法で算出される遺伝率は、各試験での広義の遺伝率に影響すると考えられた。2形質モデルにおけるREML法により算出した個体植条件下での形質と条播条件下での年間合計乾物収量との遺伝相関からみた収量性との関連は、1番草草丈を除き、既知の情報と概ね一致する傾向がみられたが、遺伝相関が極めて高い形質はなかった。DNAマーカーにより推定した系譜情報を用いた解析結果では、母系情報のみの場合と比べ、いずれのモデルも当てはまりが高まり、推定された遺伝率が高くなった。従来法による遺伝情報の算出に向けた試験は、予定通り進捗している。DNAマーカーを用いた系譜情報の遡及は、一部、再確認が必要な材料を残しているが、概ね完了した。育種価の推定は、単形質・個体モデルおよび2形質・個体モデルで解析できた。Sireモデル、多形質モデルでの解析を残しており、さらなる精度向上が見込まれる。(1)同一環境下での交配後代と親の形質調査多交配後代60系統とその親60栄養系の評価試験を開始した。2回の刈払いと除草を行い、次年度の試験実施に十分なスタンドを確立した。(2)DNAマーカーによる血縁関係情報の調査145個体についてDNAマーカーによる親子鑑定を完了した。選抜個体の父親に偏りがあることが明らかとなった。その中には収量性に劣る親も含まれることから、DNAマーカーを用いた親子鑑定による父親の選抜により収量性改良の余地があることが示された。また、選抜個体の父親に偏りが生じた要因の一つとして、遺伝率の高い形質の表現型選抜や、選抜圧の高い表現型選抜自体が影響することが示された。(3)BLUP法による遺伝情報(育種価と遺伝率)の算出総当りの2形質モデルにより、収量性を予測する多形質モデルに用いる形質を抽出した。いずれの形質も収量性との関係(遺伝相関)は既知の情報と概ね一致した。推定された遺伝率は、既知の情報と概ね一致することから、チモシー育種での利用場面として、遺伝資源からの育種材料の選定や改良効果の検証に活用できると考えられた。栄養価関連形質を除く、収量性、越冬性、早春草勢、各番草の草勢、1番草茎数密度、2番草節間伸長茎割合、1番草草高を対象とした多形質モデルについて、マルコフ連鎖モンテカルロ法のひとつGibbs sampling法により育種価の推定を行った。検証については、従来法による算出結果が待たれる。最終年に従来法による結果が得られる見込みである。BLUP法による解析は、概ね完了した。従来法とBLUP法の比較・検証が残されている。本研究は、家畜育種の分野で発展した最良線形不偏予測(BLUP)法および制限付き最尤推定(REML)法について、チモシーを用いて牧草育種への適用を検討した。DNAマーカーにより血縁関係の調査をした結果、チモシー育種事業で選抜された個体の父親に偏りがあることが明らかになった。その中には収量性が劣る親も含まれることから、DNAマーカーを用いた父子検定による選抜により収量性改良の余地があること、DNAマーカーにより選抜後の親の偏りの矯正に利用できる可能性が示された。

親子同時検定試験で、年3回の刈取り調査を行い、年間合計乾物収量、出穂始、1番草WSC、1番草のOb/OCWの従来法での遺伝率と育種価を算出した。親子回帰により推定した狭義の遺伝率は、それぞれ、0.06、0.74、0.30、0.32であった。BLUP/REML法により出穂始と飼料成分の遺伝率を推定した結果、0.530.68と比較的高い値であり、従来法による広義の遺伝率と狭義の遺伝率の中間の値であった。反復率(多環境データの全分散中に占める遺伝分散の割合)に近い値であると考えられた。多形質モデルによる収量の遺伝率は、0.34であった。育種価の予測は、従来の後代検定試験を省略できるほどの予測精度ではなかったが、従来の母の一般組合せ能力(GCA)からの予測よりも精度は高く、母親と父親のGCAからの予測よりも精度が高い傾向がみられた。以上より、牧草(チモシー)の育種において、BLUP/REML法は、遺伝資源のスクリーング、従来は評価が困難であった形質の遺伝解析に利用できると考えられた。家畜育種の分野で発展した最良線形不偏予測(BLUP)法および制限付き最尤推定(REML)法について、牧草育種への適用を検討した。BLUP/REML法は、遺伝資源のスクリーニング、従来は評価が困難であった形質の遺伝解析に利用できる。収量性の改良については、従来の後代検定を省略できるほどの育種価の予測精度ではなかった。その他、DNAマーカーを用いた父子検定により、選抜後の親の偏りの矯正や不良な父親の淘汰に利用できる可能性を示した。(1)同一環境下での交配後代と親の形質調査交配試験に供試した60個体(栄養系)とその交配後代60系統の評価試験(親子同時検定試験)を開始する。試験圃場は、春に造成し、栄養系については個体植、乱塊法2反復、後代系統については、条播、乱塊法4反復とする。造成年の生育および収量調査を行い、次年度以降の試験実施に必要なスタンドを確立する。(2)DNAマーカーによる血縁関係情報の調査一部、再確認が必要な材料について解析を行う。(3)BLUP法による遺伝情報(育種価と遺伝率)の算出Sireモデルおよび多形質モデルでの解析を行う。制限付き最尤推定(REML)法に加えて、より複雑なモデルの分散成分の推定方法として、マルコフ連鎖モンテカルロ(MCMC)法の一つであるGibbs sampling法についても検討する。(1)同一環境下での交配後代と親の形質調査越冬後の形質について調査し、遺伝情報を算出する。(2)BLUP法のモデルの検証従来法とBLUP法の比較により、チモシー育種での利用に最適なモデルを明らかにする。(3)BLUP法による遺伝情報の算出従来法とBLUP法の比較・検証の結果、必要に応じて、再解析を行う。植物育種予備試験の結果から、2世代まで系譜情報を遡及できれば、安定した解析結果が得られる可能性が認められた。そのため、DNAマーカーを用いた解析の当初の計画では、可能な限り祖先を遡及する予定であったが、2世代までに止めた。加えて、一部、再確認が必要な材料を残しているため、DNA解析に係る費用分の未使用額が生じた。再確認のためのDNA解析点数は想定よりも少なく、残額が生じた。系譜情報を2世代以上遡及する必要があった場合や、再確認が必要な材料のDNA解析のため、消耗品および実験補助員の賃金として、未使用額を使用する予定である。異動により勤務地が変わったため、圃場試験での作業および調査の旅費として未使用額を使用する予定である。
プロドラッグ概念に基づいたネオニコチノイド系分子の創製

この二年間の研究により次のような知見および成果が得られた。(1)プロドラッグとして期待された1-クロロニコチニル-2-ニトロイミノ-1,3-ジアザシクロヘキサ-5-オンあるいは2-ニトロメチレン誘導体を合成する目的で、5位のアルコール体の酸化反応あるいはアセタールの加水分解を試みたが、これら出発物質の難溶性および生成物の不安定から、生成物を得ることができなかった。(2)ネオニコチノイド系殺虫剤イミダクロプリドの3N位をビニレンカルボネートメチル基で修飾した化合物は、加水分解速度の測定および殺虫試験や神経活性試験から典型的なプロドラッグの性質を示すことが明らかとなり、世界最大の殺虫剤の初めてのプロドラッグを合成した。(3)プロドラッグ用修飾基を結合する分子骨格の適当な位置を探索した。イミダクロプリドや類縁体のピリジンの5位に置換基を導入することにより、置換基の種類によってプロドラッグの可能性があるばかりではなく、母体活性分子とは異なった活性を示す可能性もあることが判明した。21種の置換基と殺虫活性および神経活性の定量的な相関関係式を求めた。(4)イミダクロプリドの3Nに3-フッ化プロピル基を導入したところ高い殺虫活性が見られた。プロドラッグとして、可能性を論じると共に、フッ素原子の水素結合能力を議論した。(5)効果的なプロドラッグの設計のためには、ネオニコチノイド分子のファーマコフォアを明らかにする必要がある。その観点から、基本構造を系統的に変化させ、各分子の脂溶性/水溶性の指標(分配係数Pow)の測定値と電荷密度の計算値を含めた構造と殺虫活性や神経活性の相関関係を求め、ニトロ基の酸素原子の電荷と分子の脂溶性が活性に大きく関わっていることが判明した。1.1-(6-クロロ-3-ピリジルメチル)-2-ニトロイミノ-1,3-テトラヒドロピリミジン-5-オンおよび2-ニトロメチレンと2-シアノイミン類縁体の合成の試み2.1-(置換-3-ピリジルメチル)-2-ニトロイミノイミダソリジンの合成と殺虫活性の関係の研究。イミダクロプリドは,1位の6-クロロ-3-ピリジルメチルが環境あるいは生体内で代謝を受けて,脱離し,活性体に変化することも考えられる。従ってピリジン環の置換基の種類によってプロドラッグとしての性質が異なることが予想される。本研究では,5位に10数種の置換基を導入して,殺虫活性を測定したところ,5位にハロゲン原子を導入した化合物に活性が見られ,特に5-フッ素6-塩素化合物は,イミダクロプリドに匹敵する昆虫に対する活性を示した。3.2-ニトロイミノイミダソリジンの1および/あるいは3位に,代謝を受けるあるいは受容体との結合が可能性のある置換基を導入したところ,いくつかは殺虫活性を示したので,特許出願の可能性を検討している。4.ネオニコチノイド系殺虫性分子の活性必須部位である,2-ニトロイミノイミダゾリジン,2-ニトロメチレンと2-シアノイミンを種々のヘテロ環と共役させた構造の化合物を合成し,それらの昆虫神経活性と構造の関係を,量子化学の手法も含めて,検討している。1.1-(6-クロロ-3-ピリジルメチル)-2-ニトロメチレン-1,3-テトラヒドロピリミジン-5-オンの合成の試み1)上記構造の5-ジメチルアセタールを合成し、その加水分解を試みたが、原料を回収するか複雑な混合物が得られるのみであった。

試みた試薬:トリフルオロ酢酸,水,ナフィオン,硫酸ピリジン,PdCl_2(CH_3CN)_2,塩酸/メタノール,アリルアルコール/塩酸,トリフェニルホスフィン/塩化トリメチルシリル.試みた条件:種々の溶媒、種々の反応温度、開放フラスコや封管中、超音波照射等。2)上記構造の5-ヒドロキシ体を合成し、bis(cyclopentadienyl)diiridium dichlorideを触媒に用い、アセトンや2,2-ジメチルプロピオンアルデヒドと共存させてオッペンアウアー酸化によるケトンへの変化を試みたが、原料の回収か複雑な生成混合物を与えるのみであった。2.プロドラッグ1,3-ジオキソリル誘導体の創製。合成した5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソ-4-イルメチルイミダクロプリドは、生理食塩液中の半減期10-12時間でイミダクロプリドを再生し、プロドラッグの挙動を示した。また、イミダクロプリドの再生は、昆虫神経を用いた試験や殺虫試験においても確認された。この化合物は、イミダクロプリドの実質的に最初のプロドラッグであり、これらの結果を速報誌に投稿中である。3.イミダクロプリドに2-ニトロイミノイミダゾリジンの1位に3-フッ化プロピル基を導入したところ、高い殺虫活性を示した。プロドラッグの可能性を含めた活性発現の議論の論文が受理され印刷中である。4.イミダクロプリドのピリジン環に新たな置換基を導入したプロドラッグを創製するためには、ピリジン環上の置換基と活性との間の相関が必要になる。それに向けての合成をおこない、昆虫神経活性や殺虫活性との相関を求めた(論文発表済)。5.プロドラッグの創製には、活性体自身の活性機構の解明が不可欠である。ネオニコチノイド分子のファーマコフォアと思われる部位を系統的に変化させ、電荷密度や脂溶性と昆虫神経活性の相関を研究した(論文発表済)。
次世代HIV治療法開発を指向したHIV病原性タンパク質の新規翻訳機構の解明

本研究は、Nef mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)のNefの発現に重要な領域であるNERを介したNef発現の機構を解明することを目的としている。研究の結果、Nef mRNAの5'UTRの特定領域となるNER内の変異によりNefの発現が著しく低下し、Nefの機能低下を導くことが明らかになった。さらにNERの変異によるNef発現レベルの低下にはNef mRNAの効率的な核外輸送機構が関与していることが示唆された。研究代表者らは、Nef mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)にNefの翻訳に必須となる配列NERの存在を明らかにし、Nefが他に例を見ない独特な翻訳メカニズムで発現している可能性が考えられた。本研究では、NERを介したNef翻訳の機構を解明し、HIV感染症の機能的治癒の治療法開発に貢献しうる分子ターゲットを見いだすことを目的としている。平均的なmRNAはその5'UTRは平均200ヌクレオチド(nt)程度であり3'UTRは1000 ntを超える。それに対して、Nef mRNAは5'UTRが700 nt以上で3'UTRは200 nt程度である。一般的に3'UTRはmicroRNAによる翻訳制御の標的として配列を含むとして近年注目されている。一方、5'UTRは翻訳開始・促進等に関わる構造・領域の存在が知られている。例えば5'Cap構造、ウイルスにおいてはIRES等である。この非常に長いNef mRNAの5'UTRに着目し、未知のNef翻訳促進・増強配列の存在を仮定し、その探索を行った。その結果、Nef mRNAの5'UTR内のある種の変異体においてはNefの発現が著しく低下することを明らかになった。IRES (活性)とは関連せず5'cap依存的なNef翻訳効率の低下が起こっていることを明らかにし、これまでに例のないユニークな翻訳機構の存在が示唆された。また、そのNERの特徴的な2次構造がNef翻訳に重要であることを明らかにした。Nef mRNA発現ベクターを構築し、これを利用して、5'UTR内に存在するNERの絞り込みを行った。このとき、RNAfold及びCentroidFoldによるRNAの2次構造予測結果を参照しながら、欠損・塩基置換変異体を作製しNERの特定を試みた。その結果、Nef mRNAの5'UTRの各種変異体において、Nefの発現の低下を示すものと低下を示さないものとに分類され、得られた情報をもとにNefの効率的な発現に重要なNER領域の特定を進めている。このNERが関連する効率的なNef発現は、IRES (活性)とは関連せず5'cap依存的なNef翻訳が起こっていることを明らかにした。これまでに例のないユニークな翻訳機構の存在が示唆された。研究代表者らは、Nef mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)にNefの翻訳に必須となる配列NERの存在を明らかにし、種々の結果からNefが他に例を見ない独特な翻訳メカニズムで発現している可能性が考えられた。本研究では、NERを介したNef翻訳・発現の機構を解明し、HIV感染症の機能的治癒の治療法開発に貢献しうる分子ターゲットを見いだすことを目的としている。Nef mRNAの5'UTRの各種変異体において、Nefの発現の低下を示すものと低下を示さないものとに分類され、得られた情報をもとにNefの効率的な発現に重要なNER領域の特定を進めている。NERによるNef発現促進の機構の解明を促進するために、Nefの発現レベルを簡易に検出できるルシフェラーゼレポーター発現系を構築した。この系を利用し、必要十分なNERの特定を進めた。

またこのレポーターを利用してNERを介するNef発現促進機構解明のために、Nef発現レポーター細胞を構築した。このレポーター細胞および阻害剤ライブラリーを利用してNERを介したNef発現促進に係るメカニズムの解明を進めている。研究代表者らは、Nef mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)にNefの翻訳に必須となる配列NERの存在を明らかにし、種々の結果からNefが他に例を見ない独特な翻訳メカニズムで発現している可能性が考えられた。本研究では、NERを介したNef翻訳・発現の機構を解明し、HIV感染症の機能的治癒の治療法開発に貢献しうる分子ターゲットを見いだすことを目的としている。平均的なmRNAはその5'UTRは平均200ヌクレオチド(nt)程度であり3'UTRは1000 ntを超える。それに対して、Nef mRNAは5'UTRが700 nt以上で3'UTRは200 nt程度である。一般的に3'UTRはmicroRNAによる翻訳制御の標的として配列を含むとして近年注目されている。一方、5'UTRは翻訳開始・促進等に関わる構造・領域の存在が知られている。例えば5'Cap構造、ウイルスにおいてはIRES等である。この非常に長いNef mRNAの5'UTRに着目し、未知のNef発現の促進・増強メカニズムの存在を仮定し、その解明を試みた。その結果、Nef mRNAの5'UTRのNER内のある種の変異体においてはNefの発現が著しく低下し、Nefの機能低下を導くことが明らかになった。また、そのNERの特徴的な2次構造がNefに重要であることが示唆された。さらにNERの変異によるNef発現レベルの低下には、Nef mRNAの細胞質/核存在比の有意な低下を伴うことが明らかになり、Nef mRNAの効率的な核外輸送にNERが関与していることが示唆された。本研究は、Nef mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)のNefの発現に重要な領域であるNERを介したNef発現の機構を解明することを目的としている。研究の結果、Nef mRNAの5'UTRの特定領域となるNER内の変異によりNefの発現が著しく低下し、Nefの機能低下を導くことが明らかになった。さらにNERの変異によるNef発現レベルの低下にはNef mRNAの効率的な核外輸送機構が関与していることが示唆された。平成27年度において、NERの絞り込みを進めてきたが、まだ十分なNERの解明に至っていない。今後において、より効率的な研究遂行のために、構築しているNef mRNA発現ベクターに加え、Nef発現を簡便に検出できるルシフェラーゼレポーター発現系を構築する。これらを利用し、必要十分なNERの特定を継続する。さらに、NERを介した翻訳系の簡便な評価系の構築を目指す。NERを介したルシフェラーゼ等のレポータータンパク質発現細胞株を構築し、関連する特異的なtrans因子や阻害化合物の探索を試みる。以上の研究を通してNERを介したNef翻訳に関与するcis-trans因子の解明とNef発現特異的阻害剤の同定を試みる。これまで、NERの絞り込みを進めてきており、NERを介したNef発現促進機構の解明を多面的に進めている。
励起状態精密制御に基づいた光応答性有機半導体の分子設計

光エネルギーの有効利用は、環境やエネルギーと言った人類が今まさに直面している問題の解決に直接繋がる事柄です。本研究では、光照射励により生じる光キャリアの寿命を延ばすための試みとして、光励起状態を精密に制御した有機半導体の分子設計指針に関する知見を得ることを目的としています。今年度は、低分子有機ラジカルの部分的な混入によって伝導性を発現する複数の有機伝導体の光応答特性に関する基礎的な知見を得るべく検討しました。その結果、これらの伝導性物質では、いずれも1000nmを超える近赤外領域(NIR)に強い吸収帯を有することが明らかになりました。これらの近赤外線吸収は電荷移動錯体などで見られるフリーキャリアを由来とする電荷移動吸収帯と似た性質ものでありますが、完全に等価なものではなく、本系特有の水素結合のダイナミクスとフリーキャリアが結合した吸収帯と考えられます。有機伝導体において、水素結合中のプロトンダイナミクスが近赤外線領域の光の吸収を増大させる効果はこれまでにあまり知られておらず、長波長領域の光エネルギーの利用に関して新しい知見を与えるものと期待されます。これは、プロトンダイナミクスと励起状態が低い光エネルギーで協調することを示唆しており、その因果関係については、理論的な手法を用いてその電子状態を明確にする必要があります。そして、これらの有機伝導体に擬似的な太陽光を照射した場合には、10-50%程度の伝導性の向上が認められました。光伝導性の波長依存性などについて、今後詳細に検討することによって、近接励起状態を有する有機導体の光キャリア特性に関する知見が得られるものと考えられます。
視聴覚臨場感の多次元定量的評価に関する研究

「臨場感」という感覚の性質を明らかにすることを目的とし,平成11年度は聴覚臨場感について,平成12年度は視覚情報が聴覚臨場感に及ぼす影響という観点から視聴覚臨場感について研究を行った.1.23種の環境音を刺激音として,以下の3種の実験を行った.(1)音源の種類が臨場感に及ぼす影響を調べるために一対比較実験を行い,尺度構成した.受聴者に対して音源が相対的に動く音および音像に広がりのある音の臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.(2)音の再生方式が臨場感に及ぼす影響を調べるための一対比較実験を行い,尺度構成した.音像の定位情報が正確に再現される方式ほど臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.(3)刺激音の各々を33種類の評価語対により評価するSD法の実験を行った結果を因子分析し,5因子(量的因子,美的因子,柔らかさ因子,音情報因子,音像定位因子)を抽出した.次に,これらの因子得点を説明変数とし,臨場感評価値を目的変数とした重回帰分析を行った結果,臨場感はこれらの因子の線形結合として表現される多次元的な感覚であることを明らかにした(重相関係数:0.92).2.50インチディスプレイにより視覚情報を同時提示し,以下の2種の実験を行った.(1)映像を付加した状態で上記1と同様の実験を行った結果,映像が音源を含むなど録音場の状況を正確に伝えるものである場合,および付加された映像が動的な場合には臨場感が高くなる傾向が顕著であることを示した.(2)一つの映像に対して再生音圧を変化させて臨場感を調べ,原音場における音圧よりも5dB程度高い場合に最も臨場感が高くなることを示した.これは,臨場感のうちの情報因子(情報が自然に伝達されているか否か)と迫力因子が複合的に現れたものと考えた.以上を総じて,曖昧な感覚とされてきた臨場感について,定量的な解析を行った.「臨場感」という感覚の性質を明らかにすることを目的とし,平成11年度は聴覚臨場感について,平成12年度は視覚情報が聴覚臨場感に及ぼす影響という観点から視聴覚臨場感について研究を行った.1.23種の環境音を刺激音として,以下の3種の実験を行った.(1)音源の種類が臨場感に及ぼす影響を調べるために一対比較実験を行い,尺度構成した.受聴者に対して音源が相対的に動く音および音像に広がりのある音の臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.(2)音の再生方式が臨場感に及ぼす影響を調べるための一対比較実験を行い,尺度構成した.音像の定位情報が正確に再現される方式ほど臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.(3)刺激音の各々を33種類の評価語対により評価するSD法の実験を行った結果を因子分析し,5因子(量的因子,美的因子,柔らかさ因子,音情報因子,音像定位因子)を抽出した.次に,これらの因子得点を説明変数とし,臨場感評価値を目的変数とした重回帰分析を行った結果,臨場感はこれらの因子の線形結合として表現される多次元的な感覚であることを明らかにした(重相関係数:0.92).2.50インチディスプレイにより視覚情報を同時提示し,以下の2種の実験を行った.(1)映像を付加した状態で上記1と同様の実験を行った結果,映像が音源を含むなど録音場の状況を正確に伝えるものである場合,および付加された映像が動的な場合には臨場感が高くなる傾向が顕著であることを示した.(2)一つの映像に対して再生音圧を変化させて臨場感を調べ,原音場における音圧よりも5dB程度高い場合に最も臨場感が高くなることを示した.これは,臨場感のうちの情報因子(情報が自然に伝達されているか否か)と迫力因子が複合的に現れたものと考えた.以上を総じて,曖昧な感覚とされてきた臨場感について,定量的な解析を行った.本研究は,「臨場感」という感覚の性質を明らかにすることを目的とする.本年度は,聴覚を通じて知覚される臨場感に限定して研究を行った.ダミーヘッドを用いて録音した23種の環境音を刺激音として,以下の3種の実験を行った.1.音源の種類が臨場感に及ぼす影響を調べるための一対比較実験.被験者は,ランダムに選ばれた二つの刺激音を継時的に聴取し,臨場感の相違を5段階尺度を用いて比較した.その結果を尺度構成し,受聴者に対して音源が相対的に動く音および音像に広がりのある音の臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.2.音の再生方式が臨場感に及ぼす影響を調べるための一対比較実験.刺激音の再生系として,精密なバイノーラル再生系からモノラル再生系までの5種を準備し,再生された音について臨場感を一対比較した.その結果を尺度構成し,音像の定位情報が正確に再現されるほど臨場感が有意に高いと評価されることを明らかにした.3.臨場感を構成する聴覚要因を探る実験.音源および再生方式の異なる24種の刺激音の各々を,33種類の評価語対により評価するSD法の実験を行った.その結果を因子分析し,5因子(量的因子,美的因子,柔らかさ因子,音情報に関する因子,音像定位に関する因子)を抽出した.次に,これらの因子得点を説明変数とし,臨場感評価値を目的変数とした重回帰分析を行った.

重相関係数が0.92であったことから,臨場感はこれらの因子の線形結合として表現される複合的な感覚であることが示された.重回帰係数を比較したところ,情景が自然に捉えられるように音情報が与えられることと,音像が良好に定位することが,高臨場感を得るために重要であることが判った.以上の知見を踏まえ,来年度は視覚情報を与えた場合の臨場感の性質について検討する予定である.「臨場感」という感覚の性質を明らかにすることを目的とし,平成11年度は聴覚刺激のみを用いて,聴覚臨場感について検討を行い,その多次元性を明らかにした.平成12年度は視覚情報が聴覚臨場感に及ぼす影響という観点から視聴覚臨場感について検討を行うべく,聴覚情報はバイノーラル再生方式により提示し,また視覚情報は,50インチディスプレイにより提示し,以下の2種の実験を行った.1.内外で収録した17種類の刺激について,まず音だけを提示した場合の臨場感を一対比較法により測定した.続いて,視覚情報も同時提示した条件下で同様の実験を行った.両実験の結果を尺度構成して得た臨場感尺度値について比較検討を行った.その結果,映像が音源を含むなど録音場の状況を正確に伝えるものである場合,および付加された映像が動的な場合には臨場感が高くなる傾向が顕著であることを示した.2.屋外で収録した8種の刺激のそれぞれについて,再生音圧を5段階に変化させた場合の臨場感を一対比較法により測定し,その結果を尺度構成して臨場感尺度値を求めた.この測定を,映像を提示せずに行った場合には,音圧レベルの増加とともに単調に臨場感尺度値が上昇した.これは,臨場感を構成する複合要因のうちの量的因子が現れたものと考えた.一方,視覚情報を同時に提示した場合には,本来の音圧レベルよりも5dB程度高い場合に臨場感尺度値が最大値となった.これは,臨場感のうちの情報因子(情報が自然に伝達されているか否か)と迫力因子が複合的に現れたものと考えた.以上を総じて,曖昧な感覚とされてきた臨場感について,多次元的な性質を明らかにした上で定量的な解析を行った.
水レンズによる太陽光の集熱型熱電変換

透明シートに水を溜めただけで作成できる水レンズを太陽光の集光集熱に用いる新しい提案を行った。半円筒形のレンズについて計算と実験で集光を確認した。理論的に水レンズの形状を計算する方程式を提示し、これを解いてレンズ形状を示した後、垂直入射光と斜め入射光についてその屈折を正確にトレースする数値解を示した。シートに入れた水量に応じて最適な張力が存在し、そのときに集光が最大になることを予言した。たとえば水面幅を1mと固定したときに得られる最大集光率は75を越す。斜め入射光に対する集光が効果的になる条件を計算で示した。これらにより太陽光の日周運動に対応する可変レンズの動作条件の設定が可能となった。世界中どこでも簡便に建設できる水レンズを用いて太陽光を集熱し、太陽光の赤外線成分を用いて太陽熱発電を行うために、熱電変換素子を利用して発電する場合を想定した。水レンズが具備すべき要件を計算と実験の両面から明示することが研究の目的である。50倍に集光する条件探索を目標とし、1一点もしくは直線焦点上に集光する条件、2水レンズに対して斜め入射光を集光する条件、3焦点距離を可変として刻々変化する太陽位置に適合する方策、4焦点に置く受熱板と熱電変換素子の最適条件、を計算結果に基づいて設計し実証した。平成25年度は計算機を援用した水レンズの設計と計算機実験を行った。まず、設計のため昨年度作成した数学モデルにより数値解を導いた。すなわち、透明シートは張力ベクトルおよび水の自重の釣り合いから保持される。斜め入射光は左右非対称の水中を通過して焦点に集光する。水層の厚さは透明シートの外形によって定まる。よって、1力の釣り合いを調整して、入射光が強く集光する条件と位置と光の強度を定めた。水溜り径と水深の関数として焦点位置を数値解で示した。さらに水レンズが汎用性を具備するために、焦点距離を、透明シートの大きさと引っ張り角度、水量の関数で示した。昨年度の実験結果をより詳細に再現できるモデルが完成した。2斜め入射を計算したところ、ある条件ではあるが、意外に大きな集光が可能であった。市販のソフトでは十分対応ができず自作の数値解を用いた。3焦点距離と焦点位置を変えることで太陽の位置の変化に追随する条件を見いだした。南中時の効率が多少悪化するのを我慢すれば、日の出から日没までの間に平均して集光することが可能となった。従来このような対応の出来るレンズは存在しなかった。4集光位置にたとえば熱電素子を置いた場合にどの程度の発電が期待できるかについて、実際のモジュールの特性を組み込んで検討した。世界中どこでも簡便に建設できる水レンズを用いて太陽光を集熱し、太陽光の赤外線成分を用いて太陽熱発電を行うために熱電変換素子を利用して発電する場合を想定して、水レンズが具備すべき要件を計算と実験の両面から明示することを研究の目的とした。50倍に集光する条件探索を目標とし、1一点もしくは直線焦点上に集光する条件、2水レンズに対して斜めに入射する光を集光する条件、3焦点距離を可変とし異なる太陽位置に適合する対応策、4焦点に置く受熱板と熱電変換素子の最適条件、を計算結果に基づいて設計し実証する。平成24年度は計算機を援用した水レンズの基礎設計と実験装置試作を行った。まず、設計に関しては、数学モデルにより数値解を導いた。透明シートは張力ベクトルおよび水の自重の釣り合いから保持される。水層の厚さは透明シートの外形によって定まるから、力の釣り合いを調整すれば、多くの入射光が集光する条件と位置と光の強度を定めることが出来た。水溜りの口径と水深の関数として焦点距離を数値解で示した。水レンズの利用者が用いやすいように、焦点距離を、透明シートの大きさと引っ張り角度、水量の関数で示すよう工夫した。実験は次のような結果である。透明シートと太陽を用いた小型集光を行い、設計の妥当性を確認する実験を行った。塩化ビニールシートに巻き上げロールを通して左右方向に張力をかけた。焦点に照度計を設置して集光の具合を確かめた。受光素子への光量をXYZ方向で測定して3次元的に焦点の位置を調査した。線状集光の場合、完全なる焦点位置からわずかにずらせて集熱した方が発電には効果的であった。実験結果の解釈について、解析解でこれに迫るのは困難であったので、数値解を準備した。

市販の光学系ソフトも利用出来ることが分かったので、これを用いても検討を始めた。当初はすべて解析解で記述できるものと考えていたが、研究の進展により2階微分方程式のはじめの積分は可能であったが、次の積分は数値解によるしかなかった。この修正を加え、数値解の検討をして数編の論文を執筆することが出来た。同時に市販の光学系ソフトを試験したところ、十分利用できることが分かったので、この利用に方針を変えた。実験は快調にデータを出している。多くのデータの相関関係を調べているところである。光源が完全に平行光線でないため補正が必要で、この点はやや難渋している。来年度に解決したい。解析解に乗り換えて斜め入射に挑戦し始めている。また市販のソフトを購入して利用を始めたが、水レンズの特徴をそのままソフトに導入できないことから、今後は3Dのソフトを追加購入してデータの受け渡しを行うことにする。福島高専との実験の連携は思いの外うまく進んでいる。その結果は2013年6月の国際会議で3件の発表として公表予定である。24年度未使用額は会計処理期日が年度内の早い段階であったためである。最終の伝票が使用額に反映されていなかった。最終的には年度内にすべての研究費を使い切っている。よって25年度に持ち越す金額は事実上ゼロであり、次年度の研究費使用計画には該当しない。
ウイルスによる心筋細胞障害発症機序に関する分子生物学的研究

【背景】ウイルス性心筋炎における心筋細胞障害の発症機序としては、ウイルスによる直接的な心筋細胞障害とウイルス感染により惹き起こされた免疫学的な反応(細胞性、並びに液性因子)による障害の二つの樹序が考えられているが、その機序解明に関する分子生物学的方法を用いた研究は稀である。今回我々は、レオウイルスを用いてウイルスによる心筋細胞障害の分子生物学的機序、並びに液性因子の関与の可能性につき研究を行った。レオウイルスは、その変異株8Bがマウスへ感染すると心筋炎がみられること、遺伝子の組み替えが容易に行えること、その遺伝子産物の機能解析が進んでいることより今回の研究のモデルウイルスとしてふさわしいと考えられた。【実験1】胎、及び新生児NIH-Swissマウスより培養心筋細胞を作成し、心筋細胞内でのウイルス増殖能をプラークアッセイ法で調べたところ、1型レオウイルスは3型レオウイルスに比べて約100倍の増殖能を示した。レオウイルスのウイルスゲノムは10本の二重鎖RNAにより形成されているが、1型と3型のレオウイルスを交配することにより作成した遺伝子組み替えウイルスを用いた検討では、ウイルス内部に存在する蛋白をコードするM1遺伝子が心筋細胞内でのウイルス増殖能を規定していることが判明した。このM1遺伝子産物(μ2蛋白)の機能に関してはあまり解明されていないが、M1遺伝子の突然変異によりレオウイルスが心筋炎惹起性ウイルスに変異することが報告されている。【実験2】牛大動脈由来の血管内皮細胞を用いて、実験1と同様にウイルス増殖を調べたところ、1型レオウイルスが3型に比し内皮細胞内でも増殖能を示し、遺伝子組み替えウイルスによる検討ではM1遺伝子がその増殖能と関連していた。また、マウス培養心筋細胞と比べて、牛大動脈血管内皮細胞は継代培養により多量の細胞収集が可能であり、ウイルスの細胞内動態の解析が可能である。^<35>S-メチオニンで標識した1型、3型レオウイルスでは血管内皮細胞への結合能、細胞内酵素による脱蛋白過程に差はみられなかった。ウイルス感染後6、24時間後のmRNAは1型レオウイルスで増加しており、M1遺伝子産物は転写レベルで内皮細胞内でのウイルス増殖を調節していると考えられた。M1遺伝子産物であるμ2蛋白はウイルス内核部に存在することから考えても、細胞への感染の早期過程(結合能等)に関与しないことは妥当と思われる。また、同じ遺伝子が心筋細胞と血管内皮細胞内でのウイルス増殖能を規定していることより、ウイルス性心筋炎の際にウイルスによる心筋細胞障害と共に、同時に感染した内皮細胞でサイトカイン等の液性因子の産生が亢進し、心筋細胞障害に関与している可能性が示唆され、ウイルス性心筋炎の病態を考える上で非常に興味深い。【実験3】心筋炎、拡張型心筋症患者27例より得られた生検、剖検心筋標本を用いてPCR法によりレオウイルスゲノムの検出を試みたが、レオウイルスは検出されなかった。【考案・結語】心筋細胞内でのウイルス増殖能を規定する遺伝子(M1遺伝子)が突然変異することにより、心筋細胞障害能が加わり心筋炎惹起性ウイルスとなることが判明した。また、同じ遺伝子が心筋細胞と血管内皮細胞内でのウイルス増殖能を規定していることより、ウイルス性心筋炎の際にウイルスによる心筋細胞障害と共に、同時に感染した内皮細胞でサイトカイン等の液性因子の産生が亢進し、心筋細胞障害に関与している可能性が示唆された。レオウイルスはウイルス性心筋炎における心筋細胞障害の発症機序を分子生物学的に研究するのに有用であるが、その臨床的な意義については今後の検討を要する。

また、マウス培養心筋細胞と比べて、牛大動脈血管内皮細胞は継代培養により多量の細胞収集が可能であり、ウイルスの細胞内動態の解析が可能である。^<35>S-メチオニンで標識した1型、3型レオウイルスでは血管内皮細胞への結合能、細胞内酵素による脱蛋白過程に差はみられなかった。ウイルス感染後6、24時間後のmRNAは1型レオウイルスで増加しており、M1遺伝子産物は転写レベルで内皮細胞内でのウイルス増殖を調節していると考えられた。M1遺伝子産物であるμ2蛋白はウイルス内核部に存在することから考えても、細胞への感染の早期過程(結合能等)に関与しないことは妥当と思われる。また、同じ遺伝子が心筋細胞と血管内皮細胞内でのウイルス増殖能を規定していることより、ウイルス性心筋炎の際にウイルスによる心筋細胞障害と共に、同時に感染した内皮細胞でサイトカイン等の液性因子の産生が亢進し、心筋細胞障害に関与している可能性が示唆され、ウイルス性心筋炎の病態を考える上で非常に興味深い。【実験3】心筋炎、拡張型心筋症患者27例より得られた生検、剖検心筋標本を用いてPCR法によりレオウイルスゲノムの検出を試みたが、レオウイルスは検出されなかった。【考案・結語】心筋細胞内でのウイルス増殖能を規定する遺伝子(M1遺伝子)が突然変異することにより、心筋細胞障害能が加わり心筋炎惹起性ウイルスとなることが判明した。また、同じ遺伝子が心筋細胞と血管内皮細胞内でのウイルス増殖能を規定していることより、ウイルス性心筋炎の際にウイルスによる心筋細胞障害と共に、同時に感染した内皮細胞でサイトカイン等の液性因子の産生が亢進し、心筋細胞障害に関与している可能性が示唆された。レオウイルスはウイルス性心筋炎における心筋細胞障害の発症機序を分子生物学的に研究するのに有用であるが、その臨床的な意義については今後の検討を要する。心筋炎・拡張型心筋症患者27名を対象として心内膜心筋生検、及び剖検心筋標本より抽出したRNAよりcDNAを作成し、エンテロウイルス一般、及びコクサッキーウイルスB3、レオウイルス遺伝子にそれぞれ特異的なプライマーを用いてPCR法による遺伝子増幅を試みたところ、拡張型心筋症患者1名よりエンテロウイルス、コクサッキーウイルスB3に対するシグナルを検出することができた。このことにより、ウイルスの持続感染による心筋細胞障害発症に関して臨床的に証明することができた。平成6年度はさらに多くの症例で検討し、ウイルス持続感染例の臨床的特徴につき解析する予定である。ウイルスによる心筋細胞障害発症機序に関しては、ウイルスによる直接的な心筋細胞障害、及びウイルス感染により惹起された免疫応答細胞による二つの機序が従来考えられていたが、我々は第三の機序として、ウイルスが心筋と同時に非心筋細胞にも感染することにより産生された液性因子が心筋細胞障害に関与している可能性につき検討するため、レオウイルスと内皮細胞の関係について分子生物学的な手法を用いて研究を進めた。レオウイルスのM1遺伝子が心筋細胞内でのウイルスの増殖を規定していることについて以前我々は報告したが、今回の研究により内皮細胞においてもこの同じM1遺伝子が細胞内でのウイルス増殖を規定していることが判明した(J Clin Invest.1993,92:2883)。
シグナル分子を用いた新規象牙質再生医療の開発

象牙質形成機構を解析する目的で、本年度は象牙芽細胞前駆体培養系の確立を試みた。そのため未分化な歯胚細胞が存在するマウス切歯根尖部の歯乳頭組織より象牙芽細胞前駆体(Mouse Dental papillacells : MDP)の採取を試みた。組織採取後、培養皿上に間葉系細胞の形態を示す細胞のoutgrowthが確認された。次に安定した細胞株を作製するためMDPの細胞不死化を試みた。MDPの不死化にはヒトパピローマウイルス16型E6遺伝子のPDZ結合モチーフ欠損変異体を遺伝子導入し、p53遺伝子の不活性化による寿命延長を試みた。遺伝子導入した結果、MDPの寿命は延長し集団倍加数100以上継代可能な不死化細胞であることが確認された。次にMDPの分化能力を調べるため石灰化誘導培地で長期間培養したところ、高いアルカリフォスファターゼ活性と石灰化物の沈着が観察された。次に象牙芽細胞の分化を確かめるためRT-PCR法で遺伝子発現を観察したところ、骨シアロプロテインおよびオステリックス等の骨芽細胞分化に関わる遺伝子群の発現は観察されたが、象牙質マーカーであるdentin sialoprotein(DSP)の発現は観察されなかった。そこで上皮-間葉系の相互作用を利用して象牙芽細胞への分化誘導を行う目的で、基底膜成分から構成されているマトリゲルを用いて実験を行った。その結果、MDPはマトリゲル上でMDPは象牙芽細胞と類似した紡錘状の形態を示し、さらにDSPを発現する象牙芽細胞に分化する事が確認された。以上の結果より、MDPには象牙芽細胞への分化能力を有する前駆体細胞手段が存在することが明らかにされた。次年度は、象牙芽細胞分化誘導能力を有するシグナル分子の探索をMDPを用いて行うことを予定している。