hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核多角体病ウイルスの殺虫時間決定機構の解明

本研究課題は、殺虫時間の大きく異なる2つの核多角体病ウイルス(AdhoNPVとAdorNPV)を比較することで、核多角体病ウイルスにおける殺虫時間決定機構を解明することを目的としている。採用初年度においては、研究計画における以下の3つの研究を遂行した。『ウイルスの増殖速度の測定』ウイルス粒子を包埋する包埋体タンパク質遺伝子(polh)においてAdhoNPVとAdorNPVに共通なDNA配列を増幅するための定量-PCR用primerを作製した。本primerを用いた定量-PCRにより、ウイルス感染虫より経時的にウイルスDNAを検出した。その結果、殺虫時間の差が大きい条件下では殺虫時間が短いAdorNPVが殺虫時間の長いAdhoNPVよりもウイルス増殖速度が大きく、殺虫時間の差が小さい条件下では両ウイルスの増殖速度に差が見られないことが明らかとなった。『エクダイソンの不活化活性酵素の調査』ウイルスによる宿主のエクダイソン不活化活性酵素(EGT)の遺伝子発現およびタンパク質分泌を調査した。まず、AdhoNPVとAdorNPVのEGTにおいて共通する領域をターゲットとしたPCR用primerおよびペプチド抗体を作製した。本primerを用いたRT-PCRおよび本ペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果、AdhoNPVとAdorNPVのEGTの遺伝子発現時期およびEGT分泌のタイミングには差が見られないことが明らかとなった。『トランスクリプトーム解析』次世代シーケンサーを用い、トランスクリプトーム解析(RNA-Seq)を行った。まず、AdhoNPVとAdorNPVに感染した宿主の遺伝子発現ライブラリを構築した。RNA-SeqによりAdhoNPVあるいはAdorNPVのORF発現を調査した結果、AdhoNPVとAdorNPVの全ORFの発現が確認された。さらに、Fisherの正確確率検定により、AdhoNPVあるいはAdorNPVにおいて特異的に発現量が高いORFが存在することが明らかとなった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
エピジェネティック理論を導入した口腔癌の化学療法感受性の増強

以下の研究成果を得た。HSC-3細胞では、CDDP単独処理に比較してZEBの前処理またはSAHAの同時処理でCDDPによる細胞毒性が有意に増強した。CDDP単独で30%、CDDP/ZEBまたはCDDP/SAHAで80%のアポトーシス誘導が確認された。一方、5-FUの処理では、5-FU/SAHAでアポトーシス誘導の増強が観察されたが、5-FU/ZEBは逆に5-FUの細胞毒性を減弱するという、興味深い知見が得られた。このことから、口腔癌の抗癌剤感受性にはエピジェネティクス制御が関与し、ZEBやSAHAと抗癌剤の併用は薬剤感受性増強に有効であることが示唆された。【結果】HSC-3細胞では、CDDP単独処理に比較してZEBの前処理またはSAHAの同時処理でCDDPによる細胞毒性が有意に増強した。この薬剤の減弱作用についてのメカニズムは現在解析中である。【研究成果の意義】19年度の研究実施結果により、口腔癌の抗癌剤感受性にはエピジェネティクス制御が関与し、ZEBやSAHAと抗癌剤の併用は薬剤感受性増強に有効であることが示唆された。しかし、その併用効果は、併用する抗癌剤の種類により異なり、抗癌剤の代謝や抗腫瘍効果の作用機序に依存していることが推察された。本研究成果は、薬剤併用による思いがけない副作用を回避するために非常に重要な意義をもつ。平成20年度は以下の内容に取り組み研究成果をあげた。【結果】本年度の研究より、以下の興味深い新知見が明らかとなった。ZEBやSAHAによる抗癌剤の増強作用は、併用する抗癌剤、細胞種により異なった。CDDP/SAHAの組み合わせは、HSC-3細胞のアポトーシスを有意に増強した。この増強には、SAHAが小胞体にストレスを与え、小胞体経由のアポトーシスが関与していることが示唆された。一方、5-FU/ZEBの組み合わせでは、逆に5-FUの細胞毒性を減弱し、そのメカニズムとしてZEBによるCREBのリン酸化が関与していることが示唆された。【研究成果の意義】20年度の研究実施結果により、口腔癌の抗癌剤感受性にはエピジェネティクス制御が関与し、ZEBやSAHAと抗癌剤の併用は薬剤感受性増強に有効であることが示唆された。しかし、その併用効果は、併用する抗癌剤の種類、細胞種により異なり、抗癌剤の代謝や抗腫瘍効果の作用機序に依存していることが推察された。
看護師と介護職の職場のソーシャルキャピタルを高める管理者向け教育プログラムの開発

本研究は、看護師及び介護職の高い離職率を改善することを目的に、離職の要因である職業性ストレスを緩和する職場のソーシャルキャピタル(職場における助け合いや、相互理解など)を高めるための管理者向けのメンタルヘルス教育プログラムを開発し、その効果を評価することである。初年度の2016年度に職業性ストレスに関わる質問紙調査票及び免疫指標のデータ解析及びフォーカス・グループ・インタビュー(FGI)により、職場のソーシャルキャピタルを高める要因を検討し、2年目の2017年度に職場のソーシャルキャピタルを高める管理者向け教育プログラムを開発し、介入群の管理職に実施した。最終年度の2018年度には、3回目の質問紙調査と免疫指標による調査を行い、教育プログラムの評価を行った。最終年度については質問紙調査では706人、免疫指標による調査は188人の協力を得ることができた。そのうち、管理職向け教育プログラム介入前の2016年度及び介入後の2018年度の2年間ともに質問紙調査に協力が得られた370人について分析を行った。その結果、対照群281人と比較して、介入群89人では職場のソーシャルキャピタルだけでなく、職務の裁量度、組織的公正、職場のソーシャルサポートなどが有意に上昇し、一方、努力ー報酬不均衡、ストレス反応、離職意思が有意に低下したため、一定の効果があったことが示唆された。免疫指標については、まだ一部の解析にとどまっているが、主観的健康観と炎症マーカーとの関連が認められた。本研究は、看護師及び介護職の高い離職率を改善することを目的に、離職の要因である職業性ストレスを緩和する職場のソーシャルキャピタル(職場における助け合いや、相互理解など)を高めるための管理者向けのメンタルヘルス教育プログラムを開発することである。計画は、初年度に調査票及び免疫指標のデータ解析及びフォーカス・グループ・インタビュー(FGI)により、職場のソーシャルキャピタルを高める要因を検討し、1年目の結果をもとに、2年目に経営学と医学・心理学の理論を統合した、職場のソーシャルキャピタルを高める管理者向け教育プログラムを開発し、2・3年目にプログラムを使った介入(ランダム化比較対象試験:RCT)を実施して、プログラムを評価する予定である。1年目である本年度は、予定どおり関西地方の医療法人に勤務する20歳以上の看護師約626名(師長45名を含む)、高齢者介護関連施設に勤務する20歳以上の介護職393名(管理職124名を含む)、合計1021名から調査票を回収した。免疫指標については研究費の財源が限られているため、高齢者介護施設の1事業所171名に実施した。フォーカス・グループ・インタビュー(FGI)については、中間管理職(課長・係長:医療法人18名、高齢者介護施設30名)を対象に、1グループ68人に分けて、「1.マネジメントでは、何を大切にしているか?」、「2.マネジメントで苦労していることは何か?」、「3.職場のソーシャルキャピタルを高めるために、どのような工夫(マネジメント)が考えられるか?」の3項目をテーマとして実施した。調査票の集計結果及びFGIのまとめについては、事業所の看護師及び介護職の責任者に報告し、個別の結果については研究協力者個人に返却した。平成28年度に予定していた、ベースライン調査に関する一連の計画(調査の準備・実施、データ登録・解析、結果の返却と報告)を遂行することができたので、おおむね順調に進展している。しかし、解析はまだ一部に留まっており、論文化が遅れている。計画は、初年度に調査票及び免疫指標のデータ解析及びフォーカス・グループ・インタビュー(FGI)により、職場のソーシャルキャピタルを高める要因を検討し、1年目の結果をもとに、2年目に経営学と医学・心理学の理論を統合した、職場のソーシャルキャピタルを高める管理者向け教育プログラムを開発し、2・3年目にプログラムを使った介入(ランダム化比較対象試験)を実施して、プログラムを評価する予定である。2年目である本年度は、1年目に続き関西地方の医療法人に勤務する20歳以上の看護師約571名(師長45名を含む)、高齢者介護関連施設に勤務する20歳以上の介護職275名(管理職124名を含む)、合計846名から調査票を回収した。免疫指標については研究費の財源が限られているため、高齢者介護施設の1事業所139名に実施した。また、2年目に予定していた職場のソーシャルキャピタルを高める教育の実施は、介入群の管理者84人に教育を実施した。研修の内容は、1年目に実施したFGIの内容にもとづき、職場の一体感を高めると同時に、自主的な業務改善意欲につなげる「参加型職場環境改善」を職場単位で管理職が進めるための手法を教育した。(平成30年度には対照群に研修を実施する了解はすでに取得している)。調査票の集計結果のまとめについては、事業所の看護師及び介護職の責任者に報告し、免疫指標については受診者個人に返却した。平成29年度に予定していた質問紙調査及び免疫指標の調査に関する一連の計画(調査の準備・実施、データ登録・解析、結果の返却と報告)と、介入群に対する管理職研修を遂行することができたので、おおむね順調に進展している。しかし、解析はまだ一部に留まっており、成果発表が遅れている。

本研究は、看護師及び介護職の高い離職率を改善することを目的に、離職の要因である職業性ストレスを緩和する職場のソーシャルキャピタル(職場における助け合いや、相互理解など)を高めるための管理者向けのメンタルヘルス教育プログラムを開発し、その効果を評価することである。初年度の2016年度に職業性ストレスに関わる質問紙調査票及び免疫指標のデータ解析及びフォーカス・グループ・インタビュー(FGI)により、職場のソーシャルキャピタルを高める要因を検討し、2年目の2017年度に職場のソーシャルキャピタルを高める管理者向け教育プログラムを開発し、介入群の管理職に実施した。最終年度の2018年度には、3回目の質問紙調査と免疫指標による調査を行い、教育プログラムの評価を行った。最終年度については質問紙調査では706人、免疫指標による調査は188人の協力を得ることができた。そのうち、管理職向け教育プログラム介入前の2016年度及び介入後の2018年度の2年間ともに質問紙調査に協力が得られた370人について分析を行った。その結果、対照群281人と比較して、介入群89人では職場のソーシャルキャピタルだけでなく、職務の裁量度、組織的公正、職場のソーシャルサポートなどが有意に上昇し、一方、努力ー報酬不均衡、ストレス反応、離職意思が有意に低下したため、一定の効果があったことが示唆された。免疫指標については、まだ一部の解析にとどまっているが、主観的健康観と炎症マーカーとの関連が認められた。基本的には、おおむね申請時の予定通り進める予定である。1.職場のソーシャルキャピタルを高める教育プログラムの調整と実施: FGIのデータを元に開発した教育プログラムを調査事業所の責任者等に提示し対象者に合わせて、プログラムを微調整し、RCTについても了解を得る。介入群の管理者84人に教育を実施(平成29年89月)し、平成30年度には対照群に教育を実施する。3.質問紙調査及び免疫指標の測定を実施(平成29・30年1112月):ベースライン調査と同時期(健康診断時)に質問紙調査及び免疫指標の測定を行い解析する。4.データ登録と結果評価:質問紙調査及び免疫指標の測定データを登録後、クリーニングおよび統計解析を行い、29年度については、職場のソーシャルキャピタルを高める教育プログラム実施後の短期的な介入効果について評価調を行う。30年度については1年後の介入効果を評価する。また、調査対象事業所及び協力者に結果を返却し、協力の継続を依頼する。5.データ解析と学会発表及び論文化(平成30年2月):ベースラインデータと介入後のデータを比較・解析して、職場のソーシャルキャピタルの状況の変化を観察し、短期的な効果については平成30年、長期的効果については平成31年に国内外の学会で成果発表するとともに、論文を投稿する。1.職場のソーシャルキャピタルを高める教育プログラムの実施(平成30年89月):平成29年には介入群に教育を実施したので、平成30年度については対照群の管理者84人に教育を実施する。2.質問紙調査及び免疫指標の測定を実施(平成29・30年1112月):ベースライン調査と同時期(健康診断時)に質問紙調査及び免疫指標の測定を行い解析する。
ルミネッセンス分光学の確立と高分子への応用

マルチチャンネルフーリエ変換型微弱発光分光分析装置で、高分子が加熱された際に発する微弱なルミネッセンスをスペクトルとして測定した。一般に、スペクトルは複数の発光種の発光バンドの重ね合わせとなるので、それぞれの発光種に分離する解析法を考案し、新たに「ルミネッセンス分光学」を確立した。実際に、炭化水素系高分子であるポリプロピレンの熱酸化劣化の機構、および炭化フッ素系高分子であるテトラフルオロエチレンのガンマ線照射劣化の機構などを分子レベルで解明した。本研究の目的は,これまでは微弱なために強度しか分析あるいは研究に利用されていなかったルミネッセンス(発光)を,電子吸収分光法や蛍光・りん光分光法,赤外分光法,電子スピン共鳴法などと同様にスペクトルとして観測し,様々な現象を分子レベルで解明する新しい「ルミネッセンス分光法」の構築を試みることである.これまでに,微弱な発光でも,検出する積算時間を延ばすことによってスペクトルとして観測できる「フーリエ変換型微弱発光分光分析装置」を用いて,アミノ酸,ジペプチド,ポリペプチド,ナイロン,ポリプロピレン,ゴムなどの熱ルミネッセンススペクトルを測定し,スペクトルの形状が加熱時間とともに複雑に変化することを見出した.この変化は複数の発光種のそれぞれの強度の時間変化が異なるために起こる現象であると考えられる.そこで,もしも,他の分光法と同様に,観測したルミネッセンススペクトルをそれぞれの発光種のスペクトルに分離して,それぞれの発光種の発光強度の時間変化などを解析することができれば,これまで複雑で解釈することが難しかった発光機構などを分子レベルで解明できる可能性がある.その目的のために,観測したスペクトルを複数の発光種の発光スペクトルに分離する様々な数学的な解析法を試みた.その結果,各発光種の発光スペクトルがガウス関数で近似できると仮定して,最小二乗法によって各発光種の発光スペクトルの中心波長,半値幅,強度を求めるバンド分離法が最も適した解析方法であることを見出した.また,加熱による酸化に伴う発光だけではなく,高分子にガンマ線を照射したときに起こる劣化の現象を,新たに構築したルミネッセンス分光法を用いて研究した.具体的には,ポリプロピレンの発光機構と放射線劣化機構を解明して論文に発表した.マルチチャンネルフーリエ変換型微弱発光分光分析装置で、高分子が加熱された際に発する微弱なルミネッセンスをスペクトルとして測定した。これまでは微弱なために強度しか分析あるいは研究に利用されていなかったルミネッセンスを,最近,開発した「フーリエ変換型微弱発光分光分析装置」を使って,紫外可視吸収スペクトル,蛍光・りん光スペクトル,赤外吸収スペクトルと同じようにスペクトルとして観測し,各発光種の発光バンドの分離ならびに発光バンドの帰属を試みる.すなわち,電子分光法,赤外分光法,ラマン分光法などと同様のルミネッセンス分光法を確立し,新たな分光学の構築を試みる.実際には,アミノ酸,ジペプチド,ポリペプチド,ナイロン,ポリプロピレン,ゴムなどの熱ルミネッセンスを測定し,複数の発光種のバンド分離法の検討,熱発光種の同定,発光機構の解明などを行う.さらに,ルミネッセンス分光法の確立および新たな分光学の構築のために,発光するための条件を検証する.とくに,発ルミネッセンススペクトルの加熱時間依存性,加熱温度依存性,試料雰囲気依存性(酸素および窒素)などを詳しく調べ,スペクトル変化を解析する.その結果,熱ルミネッセンスの原因の一つとして,アミノ基やアミド基の孤立電子対と酸素(あるいは酸素二量体)との相互作用の可能性を検討する.また,これまでに高分子の酸化劣化機構として知られているラッセル機構の理論に基づいて,高分子からの水素脱離によるラジカル生成,酸素付加による過酸化ラジカル生成,ラジカルから生成する励起カルボニルや一重項酸素からの熱ルミネッセンスの可能性を検討し,高分子の酸化劣化の機構を分子レベルで解明する.さらに,高分子に放射線を照射したときの劣化に伴う熱ルミネッセンススペクトルの変化を観測して,放射線の影響,劣化の機構,発光の機構などを解明する.本研究の目的は,これまでは微弱なために強度しか分析あるいは研究に利用されていなかったルミネッセンス(発光)をスペクトルとして観測し,様々な現象を分子レベルで解明する「ルミネッセンス分光法」の構築を試みることである.これまでに,「フーリエ変換型微弱発光分光分析装置」を用いて,平成24年度にはゴムの発光機構と放射線劣化機構を解明して論文に発表した.平成25年度にはポリプロピレンの発光機構と放射線劣化機構を解明して論文に発表した.平成26年度には,フッ素系高分子として最も基本的なポリテトラフルオロエチレンのガンマ線照射による劣化について詳しく研究をおこなった.試料を200°Cまで加熱しても酸化劣化は起こらず,ルミネッセンススペクトルを観測することはできなかったが,ガンマ線を照射した試料では,150°C以上の温度でルミネッセンススペクトルを観測することができた.窒素雰囲気下でも乾燥空気下でも同じようなスペクトルを観測できたことから,この発光は加熱したときの酸化劣化によるものではなく,ガンマ線を照射しているときの酸化劣化によって発光種が生成され,その発光種が加熱によって発光したと考えた.また,発光強度および発光時間は温度に強く依存することがわかった.

反応速度論的な解析から,発光種の前駆体は過酸化ラジカルであり,発光種は過酸化フッ素であるという劣化機構を分子レベルで解明した.以上の研究結果を二つの論文にまとめ,学術雑誌Chem. Phys. Lett.に発表した.また,韓国で開催された国際会議で研究成果を発表し,さらに,日本語による総説を日本分光学会の学会誌「分光研究」に発表した.また,スチレンブタジエンゴムとアクリロニトリルブタジエンゴムのルミネッセンススペクトルを測定し,スペクトルの発光強度がゴム中に残存する二重結合の割合に依存することを見出し,学術雑誌Polym. Test.に発表した.物理化学平成25年度には,150°C(固体)あるいは180°C(液体)の一定温度で測定したポリプロピレンの熱ルミネッセンススペクトルの解析を進めた.観測したそれぞれのルミネッセンススペクトルをガウス関数でバンド分離をした結果,すべてのスペクトルは加熱温度および加熱時間に関わらず,3種類の発光種のスペクトルで再現できることがわかった.それらの中心波長はそれぞれ490 nm,660 nm,740 nmであった.490 nmの発光はポリプロピレンが熱酸化したときにできる励起カルボニルからのエネルギー移動によって発光したものであると仮定した.この発光種は,加熱時間とともにまわりの領域の酸化が進む影響を受けて,中心ピークの波長は長波長側にシフトすることがわかった.一方,660 nmと740 nmの発光スペクトルのピーク波長は加熱時間に依存しなかった.また,これらの発光のエネルギー差が一重項酸素の二量体からの2種類の発光のエネルギー差に近いことから,ポリプロピレンのペレットの表面または内部に吸着した酸素からの発光の可能性があることを示唆した.また,ポリプロピレンのペレットに空気中で放射線を照射すると,加熱直後に490 nmの発光種が強く発光し,その後に強度は減少した.これは放射線照射によって炭化水素ラジカルが生成し,さらに,空気中の酸素と反応して過酸化ラジカルが生成し,その過酸化ラジカルが加熱直後に発光したためであると推定した.以上の研究成果をPolymer Degrad. and Stab.とChem. Phys. Lett.に投稿して受理され,印刷された.また,ポリプロピレン製の食品包装材に照射した放射線の検出に応用できることがわかり,その研究成果をRADIOISOTOPESに投稿して受理され,印刷された.よって,当初の研究計画以上に進展していると考えられる.平成24年度は,ゴムおよびポリプロピレンの熱ルミネッセンススペクトルの変化と,それらに放射線を照射したときの変化を中心に研究を推進した.具体的にはフーリエ変換型微弱発光分光分析装置を用いて,窒素中ならびに空気中で天然ゴム,クロロプレンゴム,エチレンプロピレンジエンゴムなどの熱ルミネッセンススペクトルを,室温から180°Cの温度で観測した.また,窒素中ならびに空気中でそれぞれのゴムに様々な線量の放射線を照射したときに,熱ルミネッセンススペクトルがどのように変化するかを検討した.天然ゴムでは,窒素中で放射線を照射しても熱ルミネッセンスは観測されなかったが,空気中で照射すると631 nmに強いルミネッセンスが観測された.
CCDカメラを用いた3次元プラズマ分光システムの開発とその材料プロセスへの応用

本研究の目的は、高度に精密制御可能な熱プラズマプロセス技術を開発することである。ここでは、特に種々のプロセス条件に対して非常に安定なプロセス装置の開発を行うとともに、その装置の有効性を気体及び粉末材料を用いたプロセスで実証した。更に、プロセス進行中のプラズマ反応領域全体に亘るプラズマパラメータ及び注入材料粒子のパラメータが測定可能な診断装置の開発を行った。得られた結果を以下に示す。(1)高性能のプロセシング装置の開発強制伸張型プラズマジェット発生器を基礎としたプロセシング装置を開発した。特にこのプロセシング装置の基礎的な諸特性を調べ、広い圧力範囲で気体及び粉末材料注入に影響受けることなく安定で、また通常型に比較して20%以上も高い熱効率を保有することを明らかにした。(2)CCDカメラとCT法を用いた非軸対称プラズマジェット診断法の確立1波長透過光学干渉フィルターを付設したモノクロCCDカメラとCT法を用いることにより、非軸対称プラズマジェットの3次元温度分布の測定が可能となること、及び、1/30秒の時間分解能ではあるがジェット温度の時間変化を測定可能なことを示した。(3)3CCDカメラを用いたプラズマ温度および材料粒子の温度速度測定法の確立2波長透過光学干渉フィルターと3CCDカメラを用いることにより、目的とする2波長の2次元分布が短時間で計測可能であること、及びプラズマジェットの3次元温度が基準温度測定なしに計測可能であること、さらに注入された材料粒子の温度、速度が反応領域全体にわたって計測可能なことを明らかにした。(4)気体および粉末材料を用いた本プロセシング装置の有効性の立証混合粉末からの熱電材料(β"-アルミナ)の高速合成の実現、およびメタン、水素混合ガスからの大面積ダイヤモンド膜の高速合成が開発したプロセシング装置で可能なことを示し、装置の有効性を明らかにした。今年度は、プロセス進行中のプラズマジェットのパラメータ診断を行う分光システムの開発に重点を置き、研究を行った。1.光学干渉フィルタと3CCDカラービデオカメラを用いた計測装置の開発2波長透過型光学干渉フィルタ(透過中心波長404.6nm及び696.5nm)、3CCDカラービデオカメラ、画像取り込みボード、パーソナルコンピューターからなる計測装置を開発した。この装置を用いて、2線強度比法によるプラズマジェットの温度分布の測定を試みた。得られた温度は、従来の分光器を用いて測定した温度と比較して、やや低い値となる傾向にあるが、温度分布の形状等はほぼ一致しており、十分プラズマ診断に利用可能であることが分かった。また、1/30秒の時間分解能ではあるが、温度の時間変化も計測できることが分かった。計測精度の向上については来年度の課題である。2.CT法を用いた精密診断法の確立1波長透過型光学干渉フィルタ(透過中心波長960nm)を付設したモノクロCCDビデオカメラにより、プロセス中の非軸対称プラズマジェットの診断を行った。プラズマジェットジェット軸線に垂直で互いに対向する2方向から材料を注入した場合のジェットに対しては、投影像数4枚,空間分解能40×40分割の測定条件で実用上十分な断層像が得られることが分かった。プラズマジェットを用いた材料プロセスでその高品質化を図るためには、注入材料粒子のパラメータ(粒子の温度、速度)、およびプラズマパラメーターを精密に測定することが重要となる。昨年度は、光学干渉フィルターとCCDビデオカメラから成るプラズマ分光装置を試作し、プラズマジェットの温度測定が可能なことを明らかにした。今年度は、材料(搬送)ガス注入時のプラズマの温度分布および注入材料粒子の温度・速度の計測に重点を置き研究を遂行した。以下に得られた結果をまとめる。1.本装置とCT法を併用することにより、ジェット断面内の温度分布が詳細に測定可能である。

材料を搬送するフィードガスの進入状態が詳細に観測可能であり、ジェット温度の軸対称性を保つための流量範囲が明らかとなった。2.市販のビデオカメラで測定を行うので、1/30秒の時間分解能で温度変化が測定可能である。今回用いた我々が開発したプラズマジェット発生器から得られるプラズマ流を本装置により診断した結果、揺らぎも少なく、長時間安定であることがわかった。3.ビデオカメラで測定された画像から、プラズマ中に注入された低速の発光材料粒子の軌跡およびその速度測定が可能であることがわかった。4.さらに、2波長透過型光学干渉フィルターを用いることで発光材料粒子の速度だけでなく温度測定も可能なことがわかった。
インスリン分泌におけるCa^<++>シグナリングの分子生物学的研究-糖尿病発症との関係-

膵β細胞におけるCaシグナルはインスリン分泌の最も重要なシグナルである。研究代表者らはこのカルシウムシグナルの分子基盤を明らかにする目的で膵β細胞で発現し、カルシウムシグナルを調節する重要な因子のcDNAを単離し、その構造と機能の解析を行った。また、一部については糖代謝異常における遺伝子の発現についても検討を行った。1)膵β細胞型/電位依存性カルシウムチャネル。α1サブユニット及び3種類のβサブユニットのcDNAを単離し、その構造決定を行った。このcDNAを動物細胞の系で発現させ、電気生理学的解析を行ったところ、α1とβサブユニットを同時に発現させた時のみ典型的なL型カルシウムチャネル活性が認められ、このチャネルがインスリン分泌に重要な役割を演じていることが示唆された。さらにヒトのα1サブユニットの遺伝子構造を決定した。この遺伝子は第3染色体の短腕に位置していた。全長は120kb以上におよび50個のエクソンから構成されていた。グルコース注入により高血糖状態をきたすラットではα1サブユニットのmRNAの発現が著しく低下するのが認められた。2)イノシトール1,4,5三リン酸(IP3)受容体サブタイプのクローニング。膵β細胞におけるカルシウム動員の1つはIP_3受容体を介して発揮される。我々は膵β細胞で発現する新たなIP_3受容体サブタイプ(IP_3R-3)のcDNAを単離し、その構造及び機能解析を行った。現在まで同定されている3種類のIP_3受容体サブタイプのうちIP3R-3がβ細胞で発現する主要なサブタイプであることを明らかにした。3)G蛋白共役受容体のクローニング。ある種のG蛋白共役受容体はcAMPやphospholipaseを介してカルシウムシグナルを修飾することが知られている。代表者らは膵β細胞で発現するソマトスタチン受容体及びpituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)の新たなサブタイプのクローニングを行い、それらが共役するシグナル伝達についても明らかにした。そしてこれらの受容体が膵β細胞内カルシウムシグナルを修飾することを示唆した。ラットのインスリ産生細胞RINm5FからcDNAライブラリーを作成し、すでに報告したヒト膵β細胞型電位依存性カルシウムチャネル(VDCC)α1サブユニットcDNAをプローブに用いてスクリーニングを行い、ラット膵β細胞型VDCCα1サブユニットの全長cDNAを単離した。ラット膵β細胞型とヒト膵β細胞型VDCCα1サブユニットの間では90%以上のアミノ酸の同一性が認められた。ラット膵β細胞型VDCCα1サブユニットと同一のisoformをアメリカのグループが脳から単離したが、C端が膵β細胞型と異なっており、このisoformは組織特異的なalternative splicingを受けている可能性が示された。また、RINm5FcDNAライブラリーよりチャネル活性を制御するサブユニットである新たなβサブユニットの全長cDNAも単離した。膵β細胞型VDCCの電気生理学的特性、薬理学的特性を解析するために、α1サブユニット単独あるいはα1サブユニットとβサブユニットを同時に動物細胞で発現させ、カルシウム電流をパッチクランプ法、細胞内カルシウムの動態を蛍光指示薬を用いた画像(imaging)により解析中である。予備実験から、発現したCa^<2+>チャネルはL型であることが示唆されている。

また、糖代謝異常におけるカルシウムチャネルの遺伝子発現を検討するためにラットに意識下で48時間グルコース接続注入を行った後、膵ランゲルハンス島を単離し、膵β細胞型のVDCCα1サブユニットの遺伝子発現量を測定したところ、グルコース注入したラットでは膵β細胞型VDCCα1サブユニットの遺伝子発現が明らかに低下しており、グルコース長期投与によるインスリン反応性の低下、いわゆる膵β細胞の脱感作にはVDCC遺伝子発現の抑制が関与している可能性があるという極めて興味ある新知見が得られた。本年度の研究は糖尿病発症候補遺伝子として、インスリン分泌におけるCaシグナルの調節に重要な因子である、1)電位依存性Caチャネル(VDCC)、2)G蛋白共役受容体(GPCR)に焦点をあて、それらの構造、機能を遺伝子レベル、分子レベルで明らかにすることを目的とした。1)膵β細胞で発現するVDCCラットの膵β細胞型のVDCCα1サブユニットのクローニングを行ったところ、すでに報告したヒトのα1サブユニットは95%以上のアミノ酸の同一性が認められた。C端がtruncationされているものも単離され、C端にはvariationが存在することが示された。膵ランゲルハンス島におけるβサブユニットの発現を検討した。β1、β2、β3いずれも発現が認められたがβ3が最も強く発現していた。CHO細胞、アフリカツメガエル卵母細胞いずれの系においてもα1-サブユニット単独ではチャネル活性を示さずβ-サブユニットをcoexpressionさせた時のみL型のcalcium電流が認められた。ヒト膵β細胞型VDCCα1サブユニットの遺伝子は120Kb以上に及び、合計50個のエクソンにより構成されていた。エクソンの長さは27bpから500bp以上を示すものまで様々であった。1個の細胞膜ドメインは1つのエクソンによりコードされている傾向が認められた。2)膵β細胞で発現する新たなGPCR新たなGPCRは437個のアミノ酸から構成されていた。CHO細胞で発現させたところ、この受容体はpituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)と特異結合が認められ、しかも、COS細胞の系ではPACAP刺激によりcAMPの増加が認められたことより、この受容体はPACAP受容体の新たなサブタイプ(PACAPR-3)であることが示された。またPACAPR-3 cDNAからin vitroでcRNAを合成し、アフリカツメガエルの卵母細胞で発現させたところ、PACAPによるCl^-電流が惹起されたことより、PACAPR-3はphospholipaseCとも共役しCa^<2+>シグナルを調節することが示唆された。
回動ガイドを用いた機能性セラミックスのワイヤ放電ミーリング加工の実現

本研究では、放電創成加工法とWEDG法の利点を併せ持つワイヤ放電ミーリング法を開発し、工具形状が変化しない形彫放電加工の実現を目指している。本研究で提案する加工手法では先端が半球状のワイヤガイドを用い、ガイドに走行ワイヤを沿わせながら、ガイドを回動させることにより、ボールエンドミルを使用した場合と同様の形状加工を放電加工で実現することが出来る。またこの際、通常の放電加工では、電極の消耗により、加工形状に崩れが生じるが、本加工手法では走行ワイヤを電極とするため、電極形状の崩れが直接加工形状に影響を与えることが無く、電極の消耗を考慮する必要がないという特徴を有している。本年度は絶縁性Si3N4セラミックスに対する補助電極処理法について検討を行なった.絶縁性セラミックスに対する放電加工を実現する為には,あらかじめセラミックス表面に導体化処理を施す必要がある.しかしながら,従来の処理方法では,セラミックスと導電性材料とが密着しない場合があった.このような場合には放電がセラミックス側に移行することが困難となり,加工が進展しない.そこで,導体化処理を施す再にあらかじめセラミックス表面に対してショットピーニング処理を施すことで,セラミックス表面と導電性材料とを密着させる手法を試みた.その結果,処理をしない場合と比較し,従来の手法において,表面に剥離部分が観察されていた場合においても剥離を生じさせることなく処理を行なうことが出来た.本研究では、放電創成加工法とWEDG法の利点を併せ持つワイヤ放電ミーリング法を開発し、工具形状が変化しない形彫放電加工の実現を目指している。本年度は絶縁性Si3N4セラミックスに対してワイヤ放電ミーリング加工を実施した。しかしながら、加工中にワイヤ電極が断線に至った。加工面には加工されずに残留したセラミックスが確認された。残留したセラミックスに対しては放電が発生しないため、導電性被膜が形成されずワイヤ電極とセラミックスとが接触し、ワイヤ電極が断線に至ったと考えられる。そのため、安定した加工を実現するためにはセラミックス表面に安定した導電性被膜を形成することができる放電波形の制御方式が必要であると考えられる。そこで、放電の発生を検出する放電検知電圧の設定を高くし、かつ放電持続時間を長パルス放電と同等レベルの値まで長く設定した状態で加工することで安定した導電性被膜の形成が実現できる加工方式を見出した。安定した加工状態を維持することができる波形制御方式を見出すことができた。この制御方式は他の高抵抗材料に対する加工にも応用することができると考えられる。昨年度見出した放電波形の制御方式を適用した加工特性について調べた。デューティファクタ(D.F)と設定放電時間を変化させたときの加工表面状態についての観察を行なった。従来の放電波形制御方式で加工を行なった場合には設定のパルス幅よりはるかに長い時間継続される長パルス放電が発生するため、設定上のD.Fや放電時間はほとんど影響が見られなかった。一方、新しい制御方式を使用した場合には、加工速度はD.Fの設定にリニアに対応した。また、放電持続時間の変更に伴い表面粗さにも影響を与えることが確認された。さらに、放電持続時間の増加とともに、表面に形成された導電性被膜の表面粗さは大きくなるが、ショットピーニング処理によって導電性被膜を除去した後のセラミックスの表面粗さはほとんど変化が見られないことが確認された。新しく見出した放電波形の制御方式を適用した加工を実施した。この制御方式により、加工結果の安定性が向上した。この制御方式は加工特性の向上のほか、加工メカニズムの解明にも大きく寄与すると考えられる。本年度は絶縁性Si3N4セラミックスに対する補助電極処理法について検討を行なった.

絶縁性セラミックスに対する放電加工を実現する為には,あらかじめセラミックス表面に導体化処理を施す必要がある.しかしながら,従来の処理方法では,セラミックスと導電性材料とが密着しない場合があった.このような場合には放電がセラミックス側に移行することが困難となり,加工が進展しない.そこで,導体化処理を施す再にあらかじめセラミックス表面に対してショットピーニング処理を施すことで,セラミックス表面と導電性材料とを密着させる手法を試みた.その結果,処理をしない場合と比較し,従来の手法において,表面に剥離部分が観察されていた場合においても剥離を生じさせることなく処理を行なうことが出来た.本放電波形制御の効果について検討を行なう。DF,放電時間を変化させたときの表面状態についての観察を行なう予定である。放電波形の制御方式を変更したことにより、安定した加工が実現するようになった。しかしながら、いまだセラミックスと補助電極間にダメージが確認された。そこで、補助電極処理法について改めて検討する。所属機関から研究費が配分された為。研究がおおむね順調に進展したことと、所属機関から配分された研究費のほか、大学院生を担当したことによる研究費などが追加配分された為、各種消耗品や旅費などを賄うことができた。翌年度分として請求した助成金は当初計画していた各種実験などに使用する予定である。
生体分子機械の構造揺らぎと機能発現のメカニズムの解明

タンパク質の天然構造は、数多くの準安定構造との平衡状態にあり、非常に揺らぎやすい性質をもっている。この「柔らかな」立体構造には、タンパク質が機能発現に際して引き起こす大きな構造変化と密接な関わりがあると考えられており、これまでから、高圧NMRなどを用いて、タンパク質構造が大きく揺らぐ部位の同定がなされてきている。研究代表者は、高圧下で生体高分子フィラメントの構造揺らぎを制御しながら、顕微観測を可能にする「高圧力蛍光顕微鏡」を開発した。小型の高圧光学容器(ステンレス製:5.2x5.2x3.4cm)には2つの観測窓が空けてあり、容器内に封入した0.17mlのサンプル溶液を観測できる。観測窓の窓材には、耐圧性と高解像度の顕微観測を両立させるため、厚さ0.5mmのダイヤモンドを採用し光軸方向の厚みをおさえた。この高圧容器を倒立型顕微鏡(IX71, Olympus)にとりつけ、長作動距離の対物レンズ(SLCPlanFl 40x, Olympus)を用いて顕微観測したところ、蛍光染色した微小管の落射蛍光像を観察することに成功した。100MPa(1000気圧)の圧力下で、キネシン-微小管系のin Vitro Motility Assayを行ったところ、滑り運動が20%低下することが明らかになった。今後は、多くのタンパク質が変性しはじめる400MPaの耐圧性をもつ高圧セルを開発すると共に、圧力添加による構造揺らぎと機能発現過程との相関を明らかにする研究を行っていく。生体分子モーターは、ATPの加水分解反応により得られた化学エネルギーを利用しながら、滑り運動や力発生を行い、生体組織の動力源として重要な役割を担っている。分子モーターは、周囲の熱雑音にさらされながらも、きわめて効率よく駆動しており、その動作メカニズムは未だに解明されていない。研究代表者は、周囲を取り巻く熱雑音を変化させることで、分子モーターの構造揺らぎに変調を加える観測システムを開発し、構造揺らぎと運動機能との関係を明らかにする研究に取り組んだ。(1)レーザー光による温度制御装置の開発。全反射型1分子蛍光観測顕微鏡に、近赤外レーザーを用いて局所的な温度変化システムを構築した。ガラス表面に固定した金微粒子の凝集体にレーザー光を照射したところ、ほぼ同心円上に1°C/mm程度の温度勾配が発生させることに成功した(凝集体近傍では、室温+30°C)。凝集体へのレーザー光の照射を止めるとすぐに温度勾配は消滅し、パルス的に温度を変化させることに成功した。(2)キネシンの滑り運動の1分子計測と温度依存性上記の温度可変型1分子イメージング顕微鏡を用いて、微小管にそって滑り運動を行うキネシン1分子の動きを観測した。レーザー光の照射により、温度を10°C上昇させる毎に、その滑り速度は2倍ずつ上昇した。来年度は、変性剤などを溶液中に添加し温度変化により、構造の揺らぎを変調させて、分子モーターの滑り運動と構造揺らぎの相関関係を明らかにする研究に取り組む。
非イオン界面活性剤の曇点を用いた電磁波エネルギ吸収パターンの可視化材料の固形化

1.可視化材料の温度対光減衰量の自動化計測が可能な曇点測定システムをGPIB付ディジタルマルチ温度計,光パワーメータ,光検出器およびパソコン等を組合せて構成した。出力が2mWのHe-Neレーザを光源に用い,光減衰量の測定ダイナミックレンジが約45dBの測定システムを完成することができた。2.上記システムによる寒天ゲルの透明度測定の結果,寒天ゲルの透明度が温度依存性をもつことがわかった。寒天ゲルの透明度を寒天の濃度を変えて測定した結果,寒天の濃度が2%以下で透明度が大幅に改善されたが,ゲルの機械的強度は低くなった。寒天にグリセリンを添加したところ透明度を改善することができたが,グリセリンを添加した可視化ファントムの温度対光減衰特性は,曇点近傍において光減衰量の増加が広い温度域で生じ,白濁した部分と透明な部分との境界が不明瞭になることがわかった。3.試作した可視化寒天ゲルの電気定数を生体組織に近付けるため,01%の範囲で食塩を添加したところ,曇点が低下する以外には性状の変化がみられず,電気定数の調整が可能であった。4.寒天以外のゲルでは,ポリアクリルアミドゲル,κ-カラギーナン,ジェランガムの透明度が良好であることが光減衰量の測定により明らかになった。ポリアクリルアミドゲルは機械的強度が十分とはいえないが,κ-カラギーナンとジェランガムはイオンの添加によりゲルの強度を高くすることができる。ジェランガムはイオンの添加により著しく透明度が悪化するが,κ-カラギーナンでは300g程度の重量のファントムを作製できた。κ-カラギーナンゲルの電気的特性は,寒天ファントムなどとほぼ同じであった。1.可視化材料の温度と光減衰量の自動化計測が可能な曇点測定システムをGPIB付ディジタルマルチ温度計,光パワ-メ-タ,光検出器およびパソコン等を組合せて構成した。出力が2mWのHeーNeレ-ザを光源に用いた場合,測定可能な光減衰量のダイナミックレンジは約45dBであった。寒天ゲルの架橋密度の高さが不透明さの原因であれば,温度が上昇するにつれてゲルが透明さを増すことが理解できる。そこで,寒天ゲルの透明度を寒天の濃度を変えて測定した結果,寒天の濃度が2%以下で透明度が大幅に改善された。また,経験的に寒天に砂糖を溶かすと透明度が改善されることが知られているが,物理的性質が砂糖に近く,親水性の高いグリセリンを添加したところ透明度が改善できた。3.界面活性剤を寒天ゲルに溶かし込み可視化材料の光減衰量を測定したところ,活性剤の濃度を高くすることによって曇点以上における白濁度を増すことができた。4.試作した可視化寒天ゲルの電気定数を生体組織に近付けるため,01%の範囲で食塩を添加したところ,曇点が低下する以外には性状の変化がみられず,電気定数の調整が可能であった。5.寒天以外にも透明度の高い食品添加物は種々存在するが,これらについても可視化材料としての検討を行った。その他,物質探索の結果,電気泳動によく用いられ,透明度が水とほぼ同等なポリアクリルアミドゲルが可視化のための基本材料としてかなり有望である見通しを得た。さらに,非イオン界面活性剤以外にも曇点を有する物質が存在するので今後検討を行う予定である。1.寒天ゲルの透明度を昨年度よりもさらに改善するため,寒天の濃度を低くしたところ,ゲルの機械的強度が十分に得られなかった.

つぎに,グリセリンを添加した可視化ファントムの温度対光減衰特性を測定したところ,曇点近傍における減衰量増加の傾きが小さくなった.このようなファントムでは白濁した部分と透明な部分との境界が不明瞭になることが明かになった.2.寒天に代る可視化材料の探索を行った結果,ポリアクリルアミドゲルの他に,κ-カラギーナンやジェランガムの透明度が良好であることが光減衰量の測定により明らかになった.κ-カラギーナンとジェランガムは寒天と同じく多糖類であるが,イオンの添加によりエッグボックスジャンクションを形成し,ゲルの機械的強度が高くなるという特徴を有し,ポリアクリルアミドよりも実用的であることがわかった.ただし,ジェランガムは,エッグボックスジャンクションの形成により著しく透明度が悪化するために可視化材料には不向きである.そこで,イオンの添加による透明度の変化が最少なκ-カラギーナンを母材として用いた.κ-カラギーナンゲルの温度対光減衰特性は,界面活性剤の水溶液がもつ特性曲線とかなりよく一致し,減衰量増加特性の優れた可視化ファントムを得ることができた.3.κ-カラギーナンゲルの直流域における導電率は,寒天ファントムなどとほぼ同じ傾向を示した.κ-カラギーナンを用いて容積が300mlの可視化ファントムを試作したが,ファントムを成形するための容器から取り出してもファントムの形は崩れなかった.また,このファントムを電磁波によって加熱したところ,内部に明瞭な白濁パターンを観察することができ,研究目的が達成された.
口腔扁平上皮癌におけるFAK発現を中心としたシグナル伝達が浸潤・転移に及ぼす影響

様々ながん関連タンパク質と浸潤様式との関連については不明な点が多い。その関連性を解明するために、FAKを中心としたターゲット分子のタンパク質を浸潤様式別に調べた。6つの細胞株を利用して、uPA, uPAR, Maspin, FAKの発現をWestern blotting法を用いて調べた。その結果、浸潤様式が高い細胞株においてはuPA, uPARが高かったが、浸潤様式が低い細胞株では反対にその発現量が低下し、Maspinの発現が高くなった。また、FAKの発現を調べると、病理組織切片の免疫染色結果において浸潤様式が高い細胞株で発現が亢進していた。uPA,uPAR,FAKが予後不良因子と考えられた。FAKは、インテグリンを介在するチロシンリン酸化シグナルを含むさまざまなシグナル伝達経路を活性化し、細胞周期の進行やアクチン骨格系の再編成を誘導することで、細胞の生存や増殖、移動に深く関係している。また、浸潤・転移能の高い悪性腫瘍で、FAKが過剰発現していることが報告されており、分子標的薬のターゲットとして注目されている。しかし、FAK発現と口腔癌に関する臨床病理学的な関係を述べた報告はほとんどない。そこで、口腔扁平上皮癌におけるFAKおよびその活性化に関わるリン酸化FAK発現の臨床病理学的意義について検討することを目的とした。方法は、免疫組織化学的染色法で、口腔扁平上皮癌一次症例70症例を用いて、それぞれの切片をFAKおよびFAK pY397(リン酸化)を染色し、発現強度で評価し、臨床病理学的因子との関係を評価した。その結果では、FAK陽性群では、FAK陰性群に比べて局所再発率が高く、予後不良であった。また、FAK pY397では、陰性群に比べて陽性群において局所再発率と浸潤様式が高くなり、予後不良であった。in vitroの実験系として、浸潤様式の由来が明確な口腔扁平上皮癌細胞株を3型, 4C型、4D型からそれぞれ用いたが、浸潤様式間で有意なFAK発現差は認めず、浸潤様式3型のHSC-2のFAKが発現が比較的高かった。また、口腔扁平上皮癌におけるFAK発現は、正常線維芽細胞株に比べて3倍ほど高かった。上記の実験研究を行ってきたが、食道癌などの他部位の癌においては、FAKの過剰発現と転移との相関があると報告されている。しかし、今回の免疫組織化学染色法における臨床病理学的検討においては、転移との相関はないものの、FAK発現は、浸潤様式や局所再発率と相関し、予後不良を示した。今後もFAK発現の臨床病理学的意義を検討すべく研究を進める。FAK(Facal adhesion kinase)は、細胞質ドメインと会合している非受容体型のチロシンキナーゼで主要なシグナル分子の一つであり、接着班の形成および細胞骨格の再構築を行い、運動能を持ち、とくにがん細胞に強く発現していることが分かっている。また、インテグリンを介在するチロシンリン酸化シグナルを含むさまざまなシグナル伝達経路を活性化していることが報告されており、がん細胞の浸潤、転移する能力にFAKが重要かつ密接に関わっていることは明らかであるが、口腔扁平上皮癌においてFAK機能発現がどのように浸潤・転移に関与しているかは未だ不明な点が多い。そこで今回は、口腔扁平上皮癌においてがん化の様態をよく示すがん浸潤様式山本・小浜分類を用いてFAK機能発現がどのようにがん細胞浸潤・転移に関わるかを調べ、そのメカニズムを解明することでがん浸潤・転移の抑制化を検討した。また同時に、治療抵抗性を示すインテグリン発現も検討し、細胞運動能と接着能にも着目して今年度は研究を進めた。方法は、免疫組織学的染色法で、口腔扁平上皮癌一次症例70症例を用いて、それぞれの切片をFAKおよびFAK pY397(リン酸化)を染色し、発現強度で評価し、臨床病理学的因子との関係を評価した。その結果ではFAK陽性群が、陰性群に比べて局所再発率と浸潤様式が高くなり予後不良因子となることが判明した。そこで、本年度はインテグリンが介在するシグナル伝達経路にも着目し、浸潤様式の由来別細胞株を用いて、浸潤能が高い細胞株では、インテグリンα3の発現が高いことを実証し、発現抑制等の実験を行い、その発現機能を検討しているところである。当初の実験計画通りに進行しており、おおむね順調に進展している。FAK(Facal adhesion kinase)は、細胞質ドメインと会合している非受容体型のチロシンキナーゼで腫瘍なシグナル分子の一つであり、接着斑の形成および細胞骨格の再構築を行い運動能を持ち、特にがん細胞に強く発現していることが分かっている。また、インテグリンを介在するチロシン化シグナルを含むさまざまなシグナル伝達経路を活性化していることが報告されており、がん細胞の浸潤・転移する能力にFAKが重要かつ密接に関わっていることは明らかであるが、口腔扁平上皮癌においてFAK機能発現がどのように浸潤・転移に関与しているかは未だ不明な点が多い。そこで今回は、口腔扁平上皮癌においてがん化の様態をよく示すがん浸潤様式である山本・小浜分類を用いてFAK機能発現が、がん細胞浸潤・転移に関わるかを調べ、そのメカニズムを解明することでがん浸潤・転移の抑制化を検討した。

方法は、免疫組織学的染色法で、口腔扁平上皮癌一次症例70症例を用いて、それぞれの切片をFAKおよびFAKpY397(リン酸化)を染色し、発現強度で評価し、臨床病理学的因子との関係を評価した。その結果では、FAK陽性群が、陰性群に比べて局所再発率と浸潤様式が高くなり予後不良因子となることが判明した。また、同時に、治療抵抗性を示すIntegrinが介在するFAKシグナル伝達経路にも着目して研究を進めた。とくに浸潤能が高い細胞株では、とくにIntegrinβ1の発現が高いことを確認できており、FAKシグナル伝達経路に関わるメカニズムを解明していく必要がある。当初の実験計画通りに進行しており、おおむね順調に進展している。FAK(Facal adhesion kinase)は、細胞質ドメインと会合している非受容体型のチロシンキナーゼで主要なシグナル分子の一つであり、接着班の形成および細胞骨格の再構築を行い、運動能を持ち、とくにがん細胞に強く発現していることが分かっている。がん細胞の浸潤、転移する能力にFAKが重要かつ密接に関わっていることは明らかであるが、口腔扁平上皮癌においてFAK機能発現がどのように浸潤・転移に関与しているかは未だ不明な点が多い。そこで今回は、口腔扁平上皮癌においてがん化の様態をよく示すがん浸潤様式山本・小浜分類を用いてFAK機能発現がどのようにがん細胞浸潤・転移に関わるかを調べ、そのメカニズムを解明することでがん浸潤・転移の抑制化を検討する。方法は免疫組織学的染色法で、口腔扁平上皮癌一次症例70例を用いて、それぞれの切片をFAKおよびFAK pY(リン酸化)を染色し、発現強度で評価し、臨床病理学的因子との関係を評価した。その結果ではFAK陽性群が、陰性群に比べて局所再発率と浸潤様式が高くなり予後不良因子となることが判明した。また、FAKに比べてFAK pYの方が、より予後不良因子として認められた。上記の結果を踏まえて接着斑の形成時にFAKとインテグリンが介在するシグナル伝達経路にも着目し、浸潤様式の由来別細胞株を用いて浸潤能が高い細胞株ではインテグリンβ1が高発現していることが分かった。さらにその上流の転写調節因子であるTGF-βにて添加刺激した場合と、その抑制物質であるSB431542試薬を作用させた場合では、前者でインテグリンβ1が過剰発現し、一方で抑制物質では発現低下はほとんど認められなった。接着斑の形成発現において転写調節因子のTGF-βの役割も示唆されたが、不明点な点も多く残されており今後さらなる研究により浸潤能に関わる機序を解明する必要がある。様々ながん関連タンパク質と浸潤様式との関連については不明な点が多い。その関連性を解明するために、FAKを中心としたターゲット分子のタンパク質を浸潤様式別に調べた。6つの細胞株を利用して、uPA, uPAR, Maspin, FAKの発現をWestern blotting法を用いて調べた。その結果、浸潤様式が高い細胞株においてはuPA, uPARが高かったが、浸潤様式が低い細胞株では反対にその発現量が低下し、Maspinの発現が高くなった。また、FAKの発現を調べると、病理組織切片の免疫染色結果において浸潤様式が高い細胞株で発現が亢進していた。uPA,uPAR,FAKが予後不良因子と考えられた。FAKが発現機能を有するにはインテグリンを介在する必要があり、今後の研究ではインテグリンの関わりも調べることとする。