hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HTLV-1 Taxによるユビキチン修飾を介したIKK複合体活性化機構の解析

成人T細胞白血病の原因ウイルスHTLV-1にコードされるTaxタンパク質は、転写因子NF-κBの活性化を介して細胞不死化、がん化を誘導する。本研究では、Tax誘導性のNF-κB活性化機構の詳細な解析を行った。その結果、Taxは複数の結合様式が混在する混合型のポリユビキチン鎖を誘導すること、混合型ポリユビキチン鎖は高分子複合体形成を促進してIKK複合体活性化を誘導することを明らかにした。ヒトレトロウイルスHTLV-1にコードされるTaxタンパク質は恒常的なIKK複合体活性化を誘導することで細胞不死化・がん化を引き起こすため、その活性化機構の解析は重要である。これまでに、TaxはIKK複合体活性化にユビキチン修飾系を必要とすることが明らかとなっているが、その過程に関与するユビキチン修飾系の酵素、形成されたポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化を誘導するメカニズムの全容は明らかになっていない。はじめに、活性中心に変異を導入したユビキチン結合酵素(E2)のドミナントネガティブ変異体を用いて、Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なE2の同定を行った。その結果、作製した12個のE2変異体のうち、Ubc13の変異体によりTax誘導性のIKK複合体活性化が抑制された。次に、in vitroにおけるユビキチン化反応系を用いてTaxがユビキチンリガーゼ(E3)として機能しうるかどうか検討を行ったが、TaxはE3活性を有していなかった。そこで、Tax-IKK複合体に結合するタンパク質を質量分析により網羅的に解析し、その中からE3の候補を同定しようと試みた。その結果、一つのE3候補を得ることができた。さらに、Tax誘導性のIKK複合体活性化の際にポリユビキチン化される基質の同定を試みた。IsoT処理によってTax誘導性のIκBαのリン酸化が減弱したことから、unanchoredのポリユビキチン鎖がこの経路に必要であることが明らかとなった。また、ユビキチンのリシン残基をアルギニン残基に置換したユビキチン変異体を用いて、Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なユビキチンの型の同定を行った。K27RおよびK63Rユビキチン変異体を添加した際にTaxによるIκBαのリン酸化が減弱したことから、この経路には27型および63型のポリユビキチン鎖が必要であることが示唆された。Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なポリユビキチン鎖の型を決定するために、1)質量分析を用いたポリユビキチン鎖の絶対定量、2)鎖型特異的な脱ユビキチン化酵素を用いた解析、3)ユビキチンのリシン残基をアルギニン残基に置換した変異体を用いた解析を行った。その結果、Taxは複数の結合様式が混在する混合鎖のポリユビキチン鎖を誘導すること、また、混合鎖の形成に必要なリシン残基の変異体によりTax誘導性のIKK複合体活性化が抑制されることを明らかにした。Tax誘導性のIKK複合体に必要なユビキチン結合酵素(E2)を決定するために、哺乳細胞に存在する約30種類のE2ドミナントネガティブ変異体を作製した。そのうち、Ubc13変異体の強制発現によりTax誘導性のIKK複合体活性化が抑制された。また、Taxがユビキチンリガーゼ(E3)として機能する可能性を検討したが、Taxはリガーゼ活性を有しておらず、他のE3がIKK複合体活性化に必要であることが示唆された。5つのE3候補のうち1つの遺伝子欠損細胞において、TaxはIKK複合体活性化を誘導することができなかった。さらに、Tax発現細胞の細胞溶解液を用いた共免疫沈降実験やin vitro結合実験により、Taxと候補E3が結合することを明らかにした。以上の結果より、Taxは候補E3がIKK複合体に結合するためのアダプタータンパク質として機能し、候補E3によって誘導された混合型のポリユビキチン鎖依存的に巨大分子複合体が形成されてIKK複合体が活性化することを明らかにした。TaxによるIKK複合体活性化は細胞不死化に関与するため、Taxと候補E3の結合を阻害する化合物や、候補E3のリガーゼ活性を阻害する化合物はATL発症予防などに応用できる可能性が高いと考える。本年度はTax誘導性のIKK複合体活性化に必要なE2、E3、ポリユビキチン鎖の基質と型の同定を目的として研究を遂行した。その結果、E2に関してはUbc13がTax誘導性のIKK複合体活性化に必要であることを見いだした。さらに、この経路ではunanchoredのポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化に関与すること、IKK複合体活性化に必要なポリユビキチン鎖は27型と63型であることを明らかにした。

E3に関しては、当初TaxがE3として機能すると仮定していたが、TaxはE3活性を有していなかった。そのため、現在、質量分析により同定したE3候補について解析を行っている。また、E3候補以外にも新規Tax-IKK複合体結合タンパク質をいくつか同定しており、今後これら新規結合分子がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。上述のように、E3の解析に関しては少々遅れているものの当初の予定通りに計画を遂行しているため、おおむね順調に進展していると評価した。生物科学RNAi法を用いてE3候補の発現抑制を行い、同定したE3候補がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。その後、組換えTax、精製したIKK複合体、組換えIκBα、E1、Ubc13/Uev1aと同定したE3を用いてin vitroにおける再構築実験を行う。同定したE3の機能解析に関しては、in vitroのポリユビキチン化反応を行い、同定したE3が何型のポリユビキチン鎖を形成するのか検討する。また、実際にTax-IKK複合体に含まれるポリユビキチン鎖の型を質量分析により解析する。さらに、Tax依存的に誘導されたポリユビキチン鎖がIKK複合体活性化にどのように寄与するのか、IKK複合体の多量体化に注目をして実験を行う。質量分析で同定した新規Tax-IKK複合体結合タンパク質に関しては、RNAi法を用いて発現抑制を行い、これら分子がTax誘導性のIKK複合体活性化に関与するかどうか検討を行う予定である。Tax誘導性のIKK複合体活性化に必要なユビキチンリガーゼの同定に関して、当初はTaxがユビキチンリガーゼであると仮定していたが、他のユビキチンリガーゼが必要であることが明らかとなった。そのため、次年度にユビキチンリガーゼ同定を行うための試薬等を購入する必要ができたため、次年度使用額が生じた。次年度に再度質量分析を行って、Tax-IKK複合体結合タンパク質の同定を行う。また、E3候補の発現抑制のためのsiRNAなど発現抑制実験に必要な試薬類を購入する。
ICP用交換式再循環噴霧室の開発と実用化

誘導結合高周波アルゴンプラズマ発光分光分析装置では,励起源であるアルゴンプラズマに到着し測定に役立つ試料溶液の割合は,噴霧器により生成された霧滴の約3%であり,残り97%はドレインとして無駄に捨てられ,また一般に大容量の噴霧室が用いられてきた.このドレインを噴霧器に戻し,再び噴霧させる再循環方式の試料導入系は各種試みられていたが,どれも全く実用にはならなかった.本研究では同軸型噴霧器,エ-ロゾル出口と溶液再循環用の配管等を上部ユニットに一体化し,小さなネジ付丸底円筒管を噴霧室として用い,プラズマを消さずにこの小型噴霧室のみを簡便迅速に交換できる再循環噴霧室を新たに開発した.別に開発した並列試料導入系の一方にこの再循環噴霧室を,通常のワンウエ噴霧室を他方に接続し,測定信号の特性をA/Dコンバ-タとパソコンによる高速デジタル信号処理システムを用い,詳細に比較検討した.さらに日常分析に確実に適用できるよう上部ユニットの配置,下部噴霧室の形状等を改良した.その結果メモリ-効果0.01%以下と皆無であり,通常の噴霧室と同感度・同精度で従来一元素しか測定できない1ー2mlと少量の試料溶液を用いても20元素以上のシ-ケンシャル測定ができ,3分以内と迅速に噴霧室(試料)交換が可能となった.噴霧室毎の測定感度・精度の差はなく,再循環噴霧室では避けられない試料溶液の蒸発濃縮の影響も,噴霧室に入れる標準と試料の溶液量を同じにすることにより容易に回避できた.少量の標準試料を硝酸,過塩素酸等と共に二重テフロン製密閉容器と家庭用電子レンジにより分解・溶液化し,この中の9元素を交換式再循環噴霧室により定量したが,各元素とも保証値とよく一致した分析値が得られた.従って新開発の再循環噴霧室は日常分析にも何等支障なく用いることができる.誘導結合高周波アルゴンプラズマ発光分光分析装置では,励起源であるアルゴンプラズマに到着し測定に役立つ試料溶液の割合は,噴霧器により生成された霧滴の約3%であり,残り97%はドレインとして無駄に捨てられ,また一般に大容量の噴霧室が用いられてきた.このドレインを噴霧器に戻し,再び噴霧させる再循環方式の試料導入系は各種試みられていたが,どれも全く実用にはならなかった.本研究では同軸型噴霧器,エ-ロゾル出口と溶液再循環用の配管等を上部ユニットに一体化し,小さなネジ付丸底円筒管を噴霧室として用い,プラズマを消さずにこの小型噴霧室のみを簡便迅速に交換できる再循環噴霧室を新たに開発した.別に開発した並列試料導入系の一方にこの再循環噴霧室を,通常のワンウエ噴霧室を他方に接続し,測定信号の特性をA/Dコンバ-タとパソコンによる高速デジタル信号処理システムを用い,詳細に比較検討した.さらに日常分析に確実に適用できるよう上部ユニットの配置,下部噴霧室の形状等を改良した.その結果メモリ-効果0.01%以下と皆無であり,通常の噴霧室と同感度・同精度で従来一元素しか測定できない1ー2mlと少量の試料溶液を用いても20元素以上のシ-ケンシャル測定ができ,3分以内と迅速に噴霧室(試料)交換が可能となった.噴霧室毎の測定感度・精度の差はなく,再循環噴霧室では避けられない試料溶液の蒸発濃縮の影響も,噴霧室に入れる標準と試料の溶液量を同じにすることにより容易に回避できた.少量の標準試料を硝酸,過塩素酸等と共に二重テフロン製密閉容器と家庭用電子レンジにより分解・溶液化し,この中の9元素を交換式再循環噴霧室により定量したが,各元素とも保証値とよく一致した分析値が得られた.従って新開発の再循環噴霧室は日常分析にも何等支障なく用いることができる.
幾何学的に拘束された人間の自然な動作の解析とロボット制御への応用

本研究では人間らしいリーチング運動を表現する数学モデルを構築する。先ずは人間上肢動作の数学モデルを確率的な定式化により構築した。具体的には確率的要素を仮定したうえで動作生成のための数理モデルを作成し、これを変分問題として扱うことで一種の最適制御問題として動作軌道を求めた。次に、本研究の枠組みで、非ホロノミックシステムにおけるスムーズな動作生成の解析を行いました。非ホロノミック拘束の下での巧みな運動を理解するために、平面上に置かれた球の回転を利用した移動運動で、接触領域に制限がある場合についての運動計画に対して動力学的な解析を行った。提案した計画アルゴリズムは最適制御を用いた。本研究では、幾何学的に拘束された動作について考察している。この動作の最も重要な例題として、非ホロノミック拘束である転がり拘束によって生じるものがある。慣性ロータによって駆動される球型転がりロボットについて研究した。このようなロボットの駆動原理は非ホロノミック拘束を利用することによって転がり運動を生じさせる。ロボットの数学モデルを構築し、ロボットの動力学的に実現可能な運動の条件と可制御性について解析を行った。その結果として、動力学の範囲で考えた場合、球面上の測地線に沿う運動は、接触平面上では直線や円軌道を描かないことを明らかにした。この結果から、軌道計画アルゴリズムにおいて幾何学的な位相を利用したアプローチは困難となる。接触点の軌道を最短にする最適制御によるアプローチについてはシミュレーションによりその有効性を検証してきた。また、二ルポテント近次と反復性ステアリングを用いた軌道計画についても確認した。さらに運動解析に関しては、通常と異なった動的環境に対する人間の運動技能の形成を調べるため、高自由度柔軟物体の移動を伴うリーチング運動の解析を行った。柔軟物体を操る場合のヒトの腕の運動軌道を予測するために、手先加速度の運動時間区間にわたる二乗積分を最小化する一般的なモデルを考えた。柔軟物体操作におけるリーチング運動では、特に、高度に動的なタスクを実行するときに運動開始時に手先加速度のジャンプが観測されるが、これを従来から用いられている境界条件を課すことで再現することは困難であることを示した。この加速度のジャンプを説明するため、本研究では自然境界条件の概念を用いて問題を最定式化することにより、運動の予測精度を向上させることができることを明らかにした。現在までに得られた研究結果はロボティクス、ハプティックインターフェイス、最適制御の分野におけるいくつかの高水準な国内外の学会において発表されました。プレゼンテーションにおいては多くの前向きな意見とフィードバックが得られました。研究は滞りなく計画通りに進んでおります。現在の研究に対して、いくつかの課題をさらに加える予定である。第一に、軌道計画アルゴリズムはシミュレーション下で解析されるべきであり、より実践的なという観点で他と比較する必要がある。そこで、転がり摩擦を既存のモデルに含める必要がある。第二に、ロボットの姿勢と位置を推定するために用いる、ジャイロセンサーとカメラによるセンシングについてさらに改良を進める。第三に、転がりロボットの設計において、最適なアクチュエータの選定について考察する。最後に、転がりロボットのプロトタイプの設計製作を行い、実機実験により検証を行う。実験装置とソフトウエアの開発と並行して,拘束運動と最適制御の研究も同時に進める予定である。この段階では,以下に述べる問題について問題提起し,検討していく予定である。一つめの問題は、リーチング運動から周期的な運動までをカバーする最適化規範の一般化。これまでのところ、この問題について取り扱った研究の文献は見あたらず、未解決の問題であり、明らかにすべき重要な問題である.これらは共通の数理的な基礎に基づいていると考えられる。二つめの問題は、ロボティクスの文献において、機械システムにおける非拘束運動の自然な運動の定義はいくつか散見できるが、運動制御に用いられている最適規範との関係は明確でない。

また拘束多様体における運動においてどのように一般化されるかも未知である。三つめの問題は、人間のスキルの形成とロボットへの応用である。本研究で取り扱う規範は,人間のスキルの概念を数理的に表現している。そこで、これらの人間の拘束運動の基本原理を、いかにロボットに伝達することができるかを示すために、人間のような運動を生成するロボットの開発と、実験による評価検討を行う予定である。この目的のため、曲面拘束を用いたロボットシステムの最適な運動のシミュレーションと実験も行う予定である。本研究において最適規範によって計算される計算結果と実験装置の構成は重要となる。実験を行うためにコンピュータによって制御されるロボットを製作する予定である。ロボットを作るためには様々な部品(モーターとセンサーとコンピュータを含めて)購入するつもりである。次に、本研究の枠組みで、異なる最適規範のもとでの最適制御問題によって軌道が得られる。最適軌道の計算を行うためにソフトウエアの開発が必要である。このソフトウエアを作るために特別なツールボックスを購入するつもりである。なお、前年度の繰り越し分は、実験装置の製作(ハードウェア・ソフトウェア)に充てる。
事象関連電位を用いた統合失調症前駆期の縦断的検討

本研究は統合失調症の発病前後における脳機能の変化を事象関連電位によって検証するものである。統合失調症前駆期をふくむアットリスク精神状態の被験者、初発統合失調症患者、健常被験者を対象に、統合失調症の脳病態を反映すると言われている事象関連電位のひとつであるミスマッチマッチ陰性電位を測定した。平成24年度末の時点で、アットリスク精神状態の被験者21名、初発統合失調症患者20名、健常被験者22名に対しての測定が修了している。主たる目的は、これらの3つの群を比較する横断的検討を行い、統合失調症における進行性脳病態を反映する生物学的指標を得ることである。聴覚ミスマッチ課題に関しては、本研究では持続時間の逸脱によって得られる持続時間ミスマッチ陰性電位、周波数の逸脱によって得られる周波数ミスマッチ陰性電位の2種類のミスマッチ陰性電位を測定した。結果として、持続時間ミスマッチ陰性電位においては、アットリスク精神状態と健常被験者、初発統合失調症患者と健常被験者との間に有意な群間差がみられた。周波数ミスマッチ陰性電位においては、3群間で有意な群間差は得られなかった。これらより、持続時間ミスマッチ陰性電位の異常が、統合失調症発病前後の脳病態変化を反映している可能性が示唆される。さらにP3a成分についても検討を行ったところ、両課題において、初発統合失調症患者とアットリスク精神状態では、健常被験者よりも、有意に減衰が認められた。これまで、精神疾患において診断や予後予測などに使用できる生物学的マーカーはほとんど認められておらず、実際の臨床に応用できる段階にまで至っていない。ミスマッチ陰性電位は臨床応用の可能性もみられており、今後のさらなる検証が必要となる。統合失調症前駆期をふくむアットリスク精神状態の被験者、初発統合

失調症患者、健常被験者を対象に、統合失調症の脳病態を反映すると言われている事象関連電位のひとつであるミスマッチマッチ陰性電位を測定した。現在までに、アットリスク精神状態の被験者18名、初発統合失調症患者16名、健常被験者21名に対しての測定が修了している。平成23年度の目的は、これらの3つの群を比較する横断的検討を行うことによって、統合失調症における進行性脳病態を反映する生物学的指標を得ることが第一となっている。聴覚ミスマッチ課題に関しては、本研究では持続時間の逸脱によって得られる持続時間ミスマッチ陰性電位、周波数の逸脱によって得られる周波数ミスマッチ陰性電位の2種類のミスマッチ陰性電位を測定した。結果として、持続時間ミスマッチ陰性電位においては、アットリスク精神状態と健常被験者、初発統合失調症患者と健常被験者との間に有意な群間差がみられた。周波数ミスマッチ陰性電位においては、3群間で有意な群間差は得られなかった。これらより、持続時間ミスマッチ陰性電位の異常が、統合失調症発病前後の脳病態変化を反映している可能性が示唆される。これまで、精神疾患において診断や予後予測などに使用できる生物学的マーカーはほとんど認められておらず、実際の臨床に応用できる段階にまで至っていない。ミスマッチ陰性電位は臨床応用の可能性もみられており、今後のさらなる検証が必要となる。初年度の目的はほぼ達成している。予後予測などにミスマッチ陰性電位が使用できるかどうかについては未達成であり、次年度の縦断的研究の推進が必要となる。ひきつづきミスマッチ陰性電位の測定を行っていく。縦断的検討も行っていくために、一度測定をおこなった被験者の1年度のミスマッチ陰性電位の測定や病状の把握も重ねて行っていく。被験者謝金、成果発表のための学会参加費、出張費、論文発表のための英文校閲費、データ保存のためのハードディスクドライブ、データ解析のためのPCなどに使用予定。
交換スプリング磁性膜のナノ磁気構造のX線磁気散乱による解析

本研究はソフト層の捩れ磁気構造をX線磁気散乱法で調べることを目的とし、実験とシミュレーション計算を行なった。シリコン基板に三層膜SmCo_5(16.5)/Ni_<80>Fe_<20>(60)/SmCo_5(16.5nm)を分子線エピタキシー法で成長させた。基板に面内一軸磁場をかけ、下側のSmCo_5層とNi_<80>Fe_<20>層を成長させた後、基板を面法線周りに90°回転し、上側のSmCo_5層を成長させた。この試料の磁化曲線は二段の変化を示し、上下のハード層の磁気モーメントが磁場配向していることが確認された。ゼロ磁場でソフト層の磁気モーメントは膜厚方向に捩れた構造を取っていると予想される。X線実験は高輝度光科学研究センター(SPring-8)で行なった。円偏光X線のエネルギーをNi K吸収端に同調し、試料の鏡面反射を測定した。電荷反射率曲線は明瞭なKiessigフリンジを示した。磁気反射曲線は非常にノイジーであるが、散乱角2θ【greater than or equal】1.1°の範囲に統計誤差を上回る変動が観察された。シミュレーション計算で予測された全反射臨界角付近(2θ0.7°)のピークと反射率振動は観察されなかった。X線分散面に対して印可面内磁場が0°、180°、90°、270°の方位で測定を行なったが、傾向は同様である。I(+)、I(-)の強度は強いが、磁気情報を含む差強度I(+)-I(-)は極端に小さくなる。第三世代放射光源での測定実験の結果,測定を制限しているのは十分な差強度を与えるだけの光源強度の問題ではなく,それより早く全計数率自体が検出器の性能限度に到達しているためであることが明らかになった.この問題は特徴的に強度変化の現れる散乱角領域が試料、及びその磁気構造に依存するために普遍的な問題ではないが,スプリング磁石構造においては本質的な問題であることがわかった。I(+)-I(-)を稼ぐためには長時間の計数が必要である。この点を改善すれば、磁気反射曲線が測定可能になる。交換スプリング磁性を示すパーマロイ/SmCo多層膜を試料としたX線共鳴磁気散乱実験に関し、計算機実験による散乱強度のシミュレーションと、第三世代放射光光源である、SPring8におけるNiK吸収端での共鳴磁気散乱測定の実験検討をおこなった。ニッケル吸収端におけるMXCDから得られる共鳴磁気散乱因子から推定される+/-ヘリシティーに対する散乱強度差は0.5%程度以下であると見積もられるため、測定のリニアリティーや精度について厳密に詰めていく必要があると予想された。これらのファクターの検討を進めながら第一回の測定をおこなった。3dのK吸収端での共鳴磁気散乱の断面積はこれまでに磁気散乱実験の実績のある4f(Gd)L端と比べて小さいため、まずSpring8のMCDにおける通常の測定方法である変調法と、磁気散乱実験で用いる+/-オフセット交互測定法でMCD信号が等しい事を確認した後、磁気散乱実験を試みた。

実験結果の検討より、3dのK吸収端での磁気散乱実験では、通常の電荷散乱測定実験では問題にならないレベルでの検出器のデッドタイム補正が非常に重要な問題になることが明らかとなった。磁場印加方向と直角成分の捩じれ方向を制御する目的で多層化した試料(設計構造・Si/SmCo(16.5)/NiFe(60)/SmCo(16.5)/Cu(2)単位nm)を京都大学化学研究所で作成し、磁場と散乱面のなす角度が0度の場合と90度の場合について、磁場反転により有意なX線磁気散乱強度成分を+/-ヘリシテイー差強度として取り出せることが分かった。今後データ点を増し、S/Nを向上させる事により捩じれ磁気構造の定量的な議論に結び付けることを目指す。抗磁力が大きい磁気的にハードな物質(例えばSmCo)の表面に磁気的にソフトな物質(例えばNiFe)の薄膜を成長させた交換スプリング磁性膜は特異な磁性を示し、大エネルギー積磁石などへの応用が期待される。本研究はソフト層の捩れ磁気構造をX線磁気散乱法で調べることを目的とし、実験とシミュレーション計算を行なった。シリコン基板に三層膜SmCo_5(16.5)/Ni_<80>Fe_<20>(60)/SmCo_5(16.5nm)を分子線エピタキシー法で成長させた。基板に面内一軸磁場をかけ、下側のSmCo_5層とNi_<80>Fe_<20>層を成長させた後、基板を面法線周りに90°回転し、上側のSmCo_5層を成長させた。この試料の磁化曲線は二段の変化を示し、上下のハード層の磁気モーメントが磁場配向していることが確認された。ゼロ磁場でソフト層の磁気モーメントは膜厚方向に振れた構造を取っていると予想される。X線実験は高輝度光科学研究センター(SPring-8)で行なった。円偏光シンクロトロンX線のエネルギーをNi K吸収端に同調し、試料の鏡面反射を測定した。非磁気反射率曲線はキージッヒ・フリンジを示し、各層の膜厚が設計値に近いことが分かった。磁気反射曲線は非常にノイジーであるが、散乱角2θ【greater than or equal】1.1°の範囲に光子統計を上回る変動が観察された。シミュレーション計算で予測された全反射臨界角付近(2θ0.7°)のピークと反射率振動は観察されなかった。X線分散面に対して印可面内磁場が0°、180°、90°、270°を成す方位で測定を行なったが、傾向は同様である。I(+)、I(-)の強度はかなり高いが、磁気情報を含む差強度I(+)-I(-)を計算すると、光子数が極端に小さくなる。現状のX線検出器は許容最高計数率が低く、I(+)-I(-)を稼ぐためには長時間の計数が必要である。この点を改善すれば、磁気反射曲線が測定可能になる。
ベンゼン環の触媒的不斉水素化

金属担持触媒であるロジウム-炭素と光学活性ルテニウム錯体を触媒として同時に使用することによって、サリチル酸類が高立体選択的に水素化されることを見出した。例えば、サリチル酸メチルを基質とした場合、トランス/シス比91/9、鏡像異性体過剰率91% eeで2-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸エチルが得られた。ここで得られた光学活性置換シクロヘキサンはWeinrebアミドと有機金属反応剤を利用したケトンへの変換、Pd/C触媒とルイス酸を使った水素化によるカルボニルからメチレンへの還元、アルキル化を経て幼若ホルモン活性をもつ化合物に変換できる。各種金属担持触媒と[RuCl(p-cymene)(binap)]Cl錯体を用いて、様々な反応条件下でサリチル酸エチルの水素化を試みた。その結果、金属担持触媒としてRh/Cを用いることによって、サリチル酸のベンゼン環が水素化された2-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸エチルがトランス/シス比93/7、不斉収率71% eeでほぼ定量的に得られた。さらに、BINAP以外の様々な不斉配位子を用いてサリチル酸エチルの不斉水素化を試みた、不斉配位子としてC3-TUNEPHOSを用いることによってトランス体の2-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸エチルが92% eeで得られた。ここで見出されたRh/C-[RuCl(p-cymene)(C3-tunephos)]Cl複合触媒系を用いて、各種サリチル酸類縁体の不斉水素化を試みた。その結果、この触媒系によって、サリチルアミドやo-ヒドロキシベンゼンホスホン酸エステルが比較的良好なエナンチオ選択性で水素化されることがわかったが、シス/トランスのジアステレオ選択性を制御することはできなかった。本不斉触媒系の詳細を解明するため、幾つかのコントロール実験を行った。本複合触媒系を用いて、本水素化の中間体と考えられる2-オキソシクロヘキサンカルボン酸エステルの水素化を試みたところ、サリチル酸エチルの水素化とほぼ同じ立体選択性で水素化生成物が得られた。さらに、[RuCl(p-cymene)(C3-tunephos)]Clのみを触媒としてサリチル酸エチルの水素化を試みたが、基質は全く消費されなかった。以上の結果より、本触媒的不斉水素化では、Rh/Cによってサリチル酸のベンゼン環が水素化されて生成する環状β-ケトエステルが、光学活性ルテニウム錯体によって動的速度論的分割を伴う不斉水素化によって光学活性シクロヘキサンに変換されていると考えられる。平成27年度に目標とした、サリチル酸エステルの触媒的不斉水素化に有効な金属担持触媒-光学活性遷移金属錯体触媒複合触媒系を開発し、92% eeの高い立体選択性を達成した。また、反応機構に関する研究を行い、サリチル酸エステルの触媒的不斉水素化が当初想定したとおりの反応経路で進行することを照明し、立体選択性発現のメカニズムを解明した。一方、当初の計画を超えて、平成27年度に開発したRh/C-[RuCl(p-cymene)(C3-tunephos)]Cl複合触媒系を利用してサリチル酸類縁体であるサリチルアミドやo-ヒドロキシベンゼンホスホン酸エステルの水素化を試みたが、良好なエナンチオ選択性を達成することはできたものの、ジアステレオ選択性の制御は上手くできず、本触媒系の汎用性を示すことができなかった。今後の検討課題である。前年度に見出されたロジウムー炭素触媒と光学活性触媒[RuCl(p-cymene)(C3-tunephos)]Cl複合触媒系によるサリチル酸類の触媒的不斉水素化について、生理活性化合物の触媒的不斉合成への応用について検討した。ethyl (2-{4-[(2-hydroxycyclohexyl)methyl]phenoxy}ethyl)carbamateは、殺虫剤や飼料添加剤として利用されているメトプレンに匹敵する幼若ホルモン活性を示す化合物である。そこで、Rh/Cと[RuCl(p-cymene)((S)-C3-tunephos)]Cl複合触媒系によって得られたサリチル酸メチルの水素化物(91% ee)をWeirebアミドに変換し、ヒドロキシ基をMOM基で保護した。p-ベンジロキシフェニルリチウムと反応させてWeinrebアミドをケトンに変換した後、Sc(OTf)2存在下、Pd/C触媒で脱ベンジル化とカルボニルからメチレンへの還元を同時に行い、4-[(2-hydroxycyclohexyl)methyl]phenolを得た。18-crown-6と炭酸カリウム共存下、フェノール部位をethyl (2-chloroethyl)carbamateで選択的にアルキル化することによって、目的の化合物が良好な収率で得られた。これによって、サリチル酸エステルの触媒的不斉水素化の合成化学的有用性を証明した。この合成研究と並行して、o-アミノ安息香酸類の触媒的不斉水素化を検討した。同様の不斉触媒系を用いることによって、収率良く反応を進行させることができ、生成物を高エナンチオ選択的に得ることに成功している。しかし、現時点ではジアステレオ選択性の制御には至っていない。

例えば、サリチル酸メチルを基質とした場合、トランス/シス比91/9、鏡像異性体過剰率91% eeで2-ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸エチルが得られた。ここで得られた光学活性置換シクロヘキサンはWeinrebアミドと有機金属反応剤を利用したケトンへの変換、Pd/C触媒とルイス酸を使った水素化によるカルボニルからメチレンへの還元、アルキル化を経て幼若ホルモン活性をもつ化合物に変換できる。平成27年度で開発されたサリチル酸エステルの触媒的不斉水素化の反応機構をさらに詳細に解明する。特に、Rh/C触媒と[RuCl(p-cymene)(C3-tunephos)]Cl触媒の役割を解明すると同時に、それぞれの触媒がもう片方の触媒に及ぼす影響をコントロール実験やNMRなどを用いて明らかにする。さらに、当初の計画どおり、アントラニル酸エステルの触媒的不斉水素化の開発に着手する。この反応の中間体として二つの可能性を想定し、それぞれの想定に基づいた触媒探索を試みる。基本的にはベンゼン環の水素化に高い活性を示すRh/Cを金属担持触媒とし、各種光学活性ルテニウム、イリジウム、ロジウム錯体の不斉誘起能を調査する。さらに、ここで見出される不斉触媒を用いて、金属担持触媒をスクリーニングする。以上の繰り返しによって、アントラニル酸エステルの不斉水素化に有効な金属担持触媒-光学活性遷移金属錯体触媒複合触媒系を開発する。有機合成化学
流体力学の基礎方程式の解の一意生と解の性質について

私は、調和解析学等を用い、非圧縮性粘性流体の運動を記述するNavier-Stokes方程式、非圧縮性非粘性流体の運動を記述するEuler方程式、および熱の影響を考慮にいれた非圧縮性粘性流体の方程式である熱対流方程式(Boussinesq方程式)の解の一意性と解の性質について研究した。非圧縮性Navier-Stokes方程式の研究が関数方程式分野においてきわめて重要な位置を占めていることは、この方程式の未解決問題の一つがクレイ研究所からミレニアム問題の一つに挙げられていることからも明らかである。私は昨年度に、非有界領域におけるNavier-Stokes方程式の時間周期解の一意性を、適当な関数空間上で証明したが、平成20年度においては、同様の結果がBoussinesq方程式にも成り立つかどうか研究をし、部分的な結果を得た。この研究のためにはBoussinesq方程式のある種の共役方程式の可解性を示す必要があるが、平成20年度の研究でこれを証明した。さらに、Euler方程式に関して、共同研究者とともに、空間遠方で減衰しない初期条件のもとでのEuler方程式の解の初期値に関する連続性を証明した。さらにこの結果を利用し、初期条件が概周期関数であるとき、Euler方程式の解も各時刻で概周期的になることを証明した。調和解析学などを用い、非圧縮性流体の運動を記述するNavier-Stokes方程式、Euler方程式および熱対流方程式の解の性質について研究した。非圧縮性Navier-Stokes方程式の研究が関数方程式分野においてきわめて重要な位置を占めていることは、この方程式に関する未解決問題がクレイ研究所からミレニアム問題の一つにあげられていることからも明らかである。私は、平成19年度において、Navier-Stokes方程式の時間周期解の一意性を適当な関数空間上で証明した。これまでは、粗っぽく言うと、時間周期解に関して、同じデータに対し二つの解が両方小さい場合には、この二つの解が一致することが知られていた。私は、smallnessの仮定が一つの解に対してのみ課されている場合でも一意性が成り立つことを示した。(Math.Z.に掲載予定。)また、平成19年度において、半空間上の粘性のある熱対流方程式を記述するBoussinesq方程式に対し、空間遠方で減衰も増大もしない初期速度場と境界条件(境界上の熱源)を与えた場合の時間局所可解性を負ベキのBesov空間を用いて証明した。(投稿中。)さらに、同様に遠方で減衰しない初期条件に対するEuler方程式の可解性に関して、2次元全空間上において、初期渦度がlog(1/x+e)程度の特異性を持つ場合の大域可解性は証明済みであるが、この解の一意性は未解決であった。私は、共同研究者とともに、log(log1/x+e)程度の特異性を持つ場合に対しては、一意性も成り立つことを証明した。(投稿中。)私は、調和解析学等を用い、非圧縮性粘性流体の運動を記述するNavier-Stokes方程式、非圧縮性非粘性流体の運動を記述するEuler方程式、および熱の影響を考慮にいれた非圧縮性粘性流体の方程式である熱対流方程式(Boussinesq方程式)の解の一意性と解の性質について研究した。
赤身魚によるアレルギー食中毒予防のための基礎的研究

アレルギー様食中毒はヒスタミン食中毒とも呼ばれ、主に赤身魚の内在菌が産生するヒスタミンを多量に摂取することが原因とされている。アレルギー様食中毒予防並びにヒスタミンの摂取を減らすうえで、赤身魚中のヒスタミン量を家庭や給食施設、飲食店で把握できることが望ましい。そこで平成19年度では、今後期待できる検査法の一つである、酵素反応によるヒスタミン定量法について、将来的に一般での利用が実現可能であるかどうかを検討した。その結果調理済みの赤身魚と酸化防止剤添加済みの赤身魚について、酵素反応法によって食中毒レベルのヒスタミンの定量が正確に行えることがわかった。また、調理後の成分には発色試薬に影響を及ぼす成分が存在することを確認し、ヒスタミン定量に影響を及ぼすアスコルビン酸とイソアスコルビン酸ナトリウムの濃度を確認した。これらの成果は日本家政学会誌に掲載された。平成20年度では、ヒスタミン合成酵素であるヒスチジンデカルボキシラーゼの阻害物質を天然物から探索した。生薬・ハーブとして用いられている薬用植物をスクリーニングしたところ、阻害活性を示す植物を確認した。それらの植物を科で分類すると、バラ科が多く、阻害活性を示した全植物の約7割がバラ科であった(日本家政学会誌に掲載)。また、香辛料として用いられているオールスパイスについても阻害活性がみられたことから、成分の同定を試み、ケルセチンの配糖体に強い阻害を示すものが認められた。この成果については学術雑誌Food Chemistryに掲載された。酵素反応によるヒスタミン定量の原理はヒスタミンと1-Methoxy PMSの存在下でヒスタミン脱水素酵素を作用させ、その生成物がテトラゾリウム塩WST-8を還元型にすることで発色し、その程度を470nm付近で定量するというものである。そのため、発色の際の酸化還元反応が他の因子によって阻害もしくは促進されることによって正確な定量ができなくなる。本研究では赤身魚の調理・加工が発色に影響を及ぼし、その結果食中毒レベルのヒスタミンの定量に影響を及ぼすかどうかを確認する実験を行った。加工済み赤身魚中のヒスタミンを酵素反応法で定量し、従来のHPLC法で定量した値と比較することで評価した。これらの成果は現在日本家政学会誌に投稿中である。アレルギー様食中毒予防並びにヒスタミンの摂取を減らすうえで、赤身魚中のヒスタミン産生を防ぐことが望ましい。そこで平成20年度では、ヒスタミン合成酵素であるヒスチジンデカルボキシラーゼの阻害物質を天然物から探索した。内在菌からヒスチジンデカルボキシラーゼを得ることが望ましいが、スクリーニングの段階であるため、所属研究室で既に大量の酵素を獲得する系を確立していたヒト由来の組み換えヒスチジンデカルボキシラーゼを用いた。

それらの植物を科で分類すると、バラ科が多く、阻害活性を示した全植物の約7割がバラ科であった(日本家政学会誌に掲載)。そこで更にハーブ等で用いられているバラ科植物について調べたところ、高い割合で阻害を示すことを確認した。その中で、シモツケ(セイヨウナツユキソウ)については阻害率も高かったことから、阻害成分の同定を試みており、現在1成分を同定し、その成分が阻害活性を示すことを確認した段階である。また、香辛料として用いられているオールスパイスについても阻害活性がみられたことから、成分の同定を試み、ケルセチンの配糖体に強い阻害を示すものが認められた。この成果については学術雑誌Food Chemistryに掲載された。
戦前・戦中の青島におけるドイツおよび日本の言語政策に関する基礎研究

本研究調査において2回、青島を訪問し、資料収集と青島海洋大学の専門家の研究成果について直接話を聴くことができた。1回目の調査は、2006年9月に実施した。2006年9月に、柴田、小島、松岡、足立の4名で中国青島に行き、青島海洋大学、青島档案館、青島市立図書館を訪れ、1900年から1935年前後の資料を入手した。档案館の資料収集が思うようにできず、かなり時間を費やすことになった。また、1回目の調査の際に、1日だけであるが、ドイツ研究の第一人者青島海洋大学の孫立新教授に1914年までの青島におけるドイツの状況について全員でレクチャーを受けた。さらに、青島海洋大学の研究者たちに我々の研究目的を説明し研究協力に関する理解を得ることができた。2回目の調査は、2007年3月におこなった。2007年3.月に孫教授が新しい資料を見つけたと連絡があったのを受けて、柴田、松岡、足立で中国青島を再訪問した。青島海洋大学の修教授のおかげで、档案館の専門職員に会うことができ、档案館の利用が円滑にできた。新しい資料収集とともに、孫教授と青島市におけるドイツおよび日本軍の言語教育政策について意見を交わすことができた。小島は1914年以降の青島における日本人学校の動向を、柴田も同時期の仏教の布教状況を、松岡は、1900年から1914年までの青島におけるドイツの教育活動、特に中国人に対するドイツ語教育について、足立は、1914年以降の日本の教育活動、特に日本人や中国人に対する日本語教育について中心に分析をおこなった。本研究は資料収集が中心であったが、今後青島海洋大学の専門家たちとの共同研究により分析をおこなっていく予定である。
親電子シグナル解除機構の解明

親電子物質はタンパク質の求核基と共有結合する性質を有している。親電子物質に修飾されるセンサータンパク質の中でも、活性部位に反応性の求核基を有するタンパク質は親電子物質によってその活性を制御される。これまでに、我々はプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)が、大気中に存在する親電子物質1,2-ナフトキノンのセンサータンパク質であることを明らかにした。PTP1Bは上皮成長因子受容体(EGFR)のリン酸化を負に制御することで、生体恒常性を制御しているタンパク質であり、活性部位には反応性の求核基(システイン残基)を有する。一方、生体内においても多種の親電子物質が産生されており、そのひとつがニトロ化を受けると親電子性を有する脂肪酸となるニトロ化オレイン酸(OA-NO_2)である。本研究では、このPTP1B/EGFRシグナルが生体内の親電子物質であるOA-NO_2に対してもセンサーとして働くか否かを明らかにすることを目的とした。OA-NO_2をA431細胞に曝露すると、濃度依存的に細胞内PTPsの活性が低下し、EGFRの自己リン酸化が亢進し、EGFRの下流のシグナル伝達因子であるERK1/2のリン酸化も増加した。PTP1Bの精製酵素にOA-NO_2を曝露すると、OA-NO_2の濃度依存的にPTP1Bへの結合及び活性阻害が促進された。MALDI-TOF/MS分析した結果、OA-NO_2のPTP1B結合部位がCys215およびHis54であることが明らかとなった。以上より、内在性親電子物質であるOA-NO_2はPTP1Bの活性部位Cys215に結合し、本酵素活性を阻害することで、EGFRの自己リン酸化に伴う親電子シグナル伝達経路の活性化を引き起こすことが示唆された。
クラスBスカベンジャー受容体による脂肪酸およびその関連物質の認識機構の解明

我々はこれまでにCD36 (Cluster of Differentiation 36)が長鎖脂肪酸と相互作用する、マウスなどの哺乳動物の味蕾および嗅細胞に発現する、マウスが長鎖脂肪酸等を摂取した際、それらの感知に寄与するという証拠を得ている。本研究では、食品等に含まれる脂肪酸およびその関連物質からCD36の新規リガンドの探索、長鎖脂肪酸等とCD36結合(特性)についてのさらなる解析、模擬CD36と脂質リガンド複合体の結晶化とX線結晶構造解析を目指す。また、CD36と同じクラスBスカベンジャー受容体ファミリーに属するSR-BI (Scavenger Receptor Class B Member I)の嗅組織、味細胞発現解析、SR-BIと長鎖脂肪酸等の結合解析、を行う。すなわちクラスBスカベンジャー受容体を介した長鎖脂肪酸およびその関連物質の感知識別機構に関する分子基盤を明らかにすることを目的とする。平成30年度は蛍光標識化酸化型低密度リポタンパク質(oxLDL)を基準リガンド、ヒトSR-B1のoxLDL/酸化型リン脂質(oxPL)結合部位と同一配列を包含する化学合成ペプチドを人工模擬受容体とするSR-B1リガンド結合評価系を用いて、不飽和型の長鎖脂肪酸がSR-B1のリガンドになるという証拠を提出した。一方、飽和型の長鎖脂肪酸にはSR-B1リガンド活性を見出すことはできなかった。グルタチオンSートランスフェラーゼ(GST)とCD36(CD36-150-168)の融合タンパク質のデザインを変更したものをいくつか作成した。これらに対して酸化型リン脂質が結合することを明らかにした。また新規GST融合タンパク質の結晶化を試みた。我々はこれまでにCD36 (Cluster of Differentiation 36)が長鎖脂肪酸と相互作用(結合)する、マウスなどの哺乳動物の味蕾および嗅細胞に発現する、マウスが長鎖脂肪酸等を摂取した際、それらの感知のために一翼を担うという証拠を得ている。本研究では、食品等に含まれる脂肪酸関連物質からCD36の新規リガンドの探索、長鎖脂肪酸等とCD36結合(特性)についてのさらなる解析、模擬CD36と脂質リガンド複合体の結晶化とX線結晶構造解析、CD36と同じクラスBスカベンジャー受容体ファミリーに属するSR-BI (Scavenger Receptor Class B Member I)の嗅組織発現解析、SR-BIと長鎖脂肪酸等の結合解析、を行う。平成28年度は以下の3点について明らかにした。(1)我々は蛍光標識化酸化型低密度リポタンパク質(oxLDL)を基準リガンド、CD36のoxLDL/酸化型リン脂質(oxPL)結合部位と同一配列を包含する20アミノ酸残基程度の化学合成ペプチド(b3S-CD36(150-168))を人工模擬受容体とするCD36リガンド結合評価系を確立している。本評価系により、鰹節の匂い成分、Z,Z-4,7-tridecadienalにCD36リガンド活性があることを明らかにした。(2)グルタチオンSートランスフェラーゼ(GST)との融合体としての模擬CD36(GSTーCD36)とoxPLが直接的に結合すること、すなわち両者が複合体を形成していることを明らかにした。(3)マウス嗅組織でSR-BIが発現していることを、逆転写ーポリメラーゼ鎖反応、ウエスタンブロッティング、免疫染色により明らかにした。申請時に記述した平成28年度の研究計画は全て実施した。しかしながら、GST-CD36と長鎖脂肪酸が直接的に結合していることを支持する結果は得られなかった。さらなる条件検討が必要であると考えている。また、GST-CD36とoxPL複合体の結晶化には至らなかった。これについてはGST-CD36の更新が必要であると考えている。一方、その他の研究計画については全て目的とする結果が得られている(研究実績の概要の項参照)。本研究では、食品等に含まれる脂肪酸およびその関連物質からCD36の新規リガンドの探索、長鎖脂肪酸等とCD36結合(特性)についてのさらなる解析、模擬CD36と脂質リガンド複合体の結晶化とX線結晶構造解析、CD36と同じクラスBスカベンジャー受容体ファミリーに属するSR-BI (Scavenger Receptor Class B Member I)の嗅組織、味細胞発現解析、SR-BIと長鎖脂肪酸等の結合解析、を行う。平成29年度は以下の3点について明らかにした。(1)蛍光標識化酸化型低密度リポタンパク質(oxLDL)を基準リガンド、ヒトCD36のoxLDL/酸化型リン脂質(oxPL)結合部位と同一配列を包含する化学合成ペプチドを人工模擬受容体とするCD36リガンド結合評価系を確立した。本評価系により、テトラデカナールなどの脂肪族アルデヒドにCD36リガンド活性があることを明らかにした。(2)ヒトSR-BIのoxLDL/oxPL結合部位と同一配列を包含する化学合成ペプチドを人工模擬受容体とするSR-B1のリガンド結合評価系を確立した。本評価系により、いくつかの脂肪族アルデヒドにSR-BIリガンド活性があることを明らかにした。

(3)マウス味細胞でSR-BIが発現していることを、逆転写ーポリメラーゼ鎖反応、免疫染色により明らかにした。平成29年度の研究計画のなかでSR-B1のin situ hybridization解析以外は全て実施した。実施したなかで、GST-CD36と長鎖脂肪酸が直接的に結合していることを支持する結果は得られなかった。さらなる条件検討が必要であると考えている。また、GST-CD36と酸化型リン脂質複合体の結晶化には至らなかった。GST-CD36の更新を行ったが、安定性の高い産物はまだ得られていない。コンストラクト作成方針の変更が必要であると考えている。当該年度は新規CD36リガンド発見およびSR-B1リガンドアッセイ系の構築と新規リガンドの発見に関して論文発表を行った。我々はこれまでにCD36 (Cluster of Differentiation 36)が長鎖脂肪酸と相互作用する、マウスなどの哺乳動物の味蕾および嗅細胞に発現する、マウスが長鎖脂肪酸等を摂取した際、それらの感知に寄与するという証拠を得ている。本研究では、食品等に含まれる脂肪酸およびその関連物質からCD36の新規リガンドの探索、長鎖脂肪酸等とCD36結合(特性)についてのさらなる解析、模擬CD36と脂質リガンド複合体の結晶化とX線結晶構造解析を目指す。また、CD36と同じクラスBスカベンジャー受容体ファミリーに属するSR-BI (Scavenger Receptor Class B Member I)の嗅組織、味細胞発現解析、SR-BIと長鎖脂肪酸等の結合解析、を行う。すなわちクラスBスカベンジャー受容体を介した長鎖脂肪酸およびその関連物質の感知識別機構に関する分子基盤を明らかにすることを目的とする。平成30年度は蛍光標識化酸化型低密度リポタンパク質(oxLDL)を基準リガンド、ヒトSR-B1のoxLDL/酸化型リン脂質(oxPL)結合部位と同一配列を包含する化学合成ペプチドを人工模擬受容体とするSR-B1リガンド結合評価系を用いて、不飽和型の長鎖脂肪酸がSR-B1のリガンドになるという証拠を提出した。一方、飽和型の長鎖脂肪酸にはSR-B1リガンド活性を見出すことはできなかった。グルタチオンSートランスフェラーゼ(GST)とCD36(CD36-150-168)の融合タンパク質のデザインを変更したものをいくつか作成した。これらに対して酸化型リン脂質が結合することを明らかにした。また新規GST融合タンパク質の結晶化を試みた。(1)化学合成された模擬受容体を用いたSR-BIと長鎖脂肪酸等の相互作用の解析。SR-BIと長鎖脂肪酸の相互作用の検証のためb3S-CD36(150-168)と同等の性能をもつ人工模擬SR-BIを作出する。
ＥＳＲ動的解析法による筋運動スイッチマシナリーと常磁性イオン流モーターの解明

電子スピン共鳴ESRによる蛋白質の動的構造の原子レベル解析を行った。1)トロポミオシン(Tm)全長にわたってアミノ酸をシステインに変異させてスピンラベルSL標識し、筋肉の細いフィラメント(超分子複合体)を再構成して測定したSL側鎖運動性はCaイオンによって全く変化しない。今年度は、アクチンとTm間のSLまたはMn-SL距離の精密測定し、その距離マップから、Tmとアクチンの結晶構造の相互位置を動かし、複合体の立体構造のモデル作成に成功した。2)イオン輸送P型ATPaseは、細菌鞭毛やF1F0のイオン流と回転・構造変化との間のエネルギー変換とは共通原理があると考えられる。そこで、銅イオン輸送ATPase TtCopBに結合したCu2+のみのESRスペクトルを、PH7.4で遊離のCu2+をESR-silentにすることにより取得することに成功した。2個Cu2+が強く結合したESRスペクトルのg値、超微細結合定数から、Type2のCu2+配位構造が明らかとなった。また、N原子が近傍に存在することによる7本の吸収線が見られた。さらに3-10個のCu2+を結合させたところ、配位構造がやや異なるType2の結合であることがわかった。N末端の30アミノ酸を除去したCopBでは約3個のCu2+結合が見られ、N末端領域に多数のCu2+結合するリザーバーがあることがわかった。intact CopBに結合させた2個のCu2+の低温スペクトルはATP加水分解中に凍結した場合も変化は小さかったことから、配位構造の変化した中間状態は過渡的に形成されている可能性が示唆された。そこで、ATP迅速混合凍結法やリン酸アナログにより中間状態をトラップして調べる計画である。また、CopBのアミノ酸をスピンラベルSL標識し、SLと常磁性Cu2+の距離をマッピングしATP分解中のイオンの位置を決定することを目指したい。26年度が最終年度であるため、記入しない。電子スピン共鳴を用いて蛋白質の水溶液中での動的構造を原子レベルで解析することを目指す。1)筋運動スイッチマシナリー:トロポミオシン(Tm)全長にわたってアミノ酸をシステインに変異させてスピンラベルSL標識し、筋肉の細いフィラメント(超分子複合体)を再構成して測定したSL側鎖運動性はCaイオンによって全く変化しない。一方、アクトミオシン硬直複合体ではCaによるSL変化がおこり、Tm周辺構造が締まる。「強く結合したアクトミオシン複合体のATP分解反応が、この構造変化を通してCa調節される」という新しい仮説を提案した(Ueda et al. 2013)。現在アクチンとTm間のSL(またはMn)-SL距離の精密測定を行っている。2)常磁性イオン流モーター:P型ATPaseは可逆的にイオン流出(流入)とATP分解(合成)を行い、大きいドメイン構造の変化をともなう。細菌鞭毛やF1のイオン流と回転・構造変化との間のエネルギー変換とは共通原理があると考えられる。そこで、銅イオン輸送ATPaseであるThermus thermophiles TTHA1733 (TtCopB)を発現精製し、結合したCu2+(II)のみのESRスペクトルを、PH7.4で遊離のCu2+(II)をESR-silentにすることにより取得できるようになった。来年度は、結合数測定を行うとともに、Cu2+が結合したESRスペクトルのg値、超微細結合定数から、Cu2+(II)配位構造が明らかにし、ATP分解中のCu2+(II)がトランスポートされる際におこる、Cu結合強度の変化にともなう配位構造の変化を調べる計画である。CopBのアミノ酸をスピンラベルSL標識し、SLと常磁性Cu2+(II)の距離をマッピングしイオンの位置を決定することが最終目標となる。

また、CopBのアミノ酸をスピンラベルSL標識し、SLと常磁性Cu2+の距離をマッピングしATP分解中のイオンの位置を決定することを目指したい。26年度が最終年度であるため、記入しない。ATPaseに結合したCuのESRスペクトルを測定するには、free Cuのスペクトルを消去する必要が生じ、さらにスペクトル強度が試料ごとに誤差が出ることがわかり、それらの条件検討が必要になった。研究協力した学部4年学生の技術が未熟であるため、解決に手間取った。研究協力した学部4年生がCu-ATPaseのESR測定に未熟であり、予想以上に時間を要したと考え、平成26年度は、経験のあるポスドクを雇用して、迅速に実験を遂行する計画である。