hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性炎症性疾患へのN-アセチルグルコサミン糖鎖高分子を用いた分子標的化技術の創製

本研究では、慢性炎症性疾患の疾患部位を標的とした分子標的化技術の開発を行った。これらの疾患部位では、筋線維芽細胞や星細胞が活性化しする。そして、これらの活性化した細胞はType3中間径フィラメント(ビメンチン及びデスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ペリフェリン)を高発現している。本研究では、これらの分子が細胞表面上に出現してN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)糖鎖に対して高い相互作用を示すことを発見した。さらにこれらの分子に対して高い結合力を有するGlcNAc糖鎖高分子AC-GlcNAcの開発を行い、慢性炎症性疾患に対する分子標的化技術の開発に成功した。本年度では、細胞骨格分子ビメンチンに強い結合力を有し、分子標的薬や生体イメージングのために利用できるプローブとしての分子量が均一に制御されたGlcNAc糖鎖高分子を設計および開発を行った。そこで、アクリル酸を主鎖とするGlcNAc糖鎖高分子の作製を検討した。カルボキシエチルアクリレートにアミノ基を一位に導入したGlcNAcを脱水縮合によって結合した。このアクリル酸エチルGlcNAcをRAFT(Reversible Addition/Fragmentation Chain Transfer)剤を用いることで重合して、分子量の異なるGlcNAc糖鎖高分子(AC-GlcNAc)の作製を行った。そして、これらのAC-GlcNAcに蛍光ラベルを施し、HeLa細胞との相互作用を検討した。その結果、分子量が20003000程度のものでもHeLa細胞にビメンチンを介して相互作用することが見出された。また、ビメンチン以外のType3中間径フィラメントであるデスミンやペリフェリン、グリア繊維製酸性タンパク質(GFAP)にも相互作用することが見出された。初年度に作製予定であった分子量の制御されたGlcNAc糖鎖高分子の設計に成功している。またビメンチンを介してHeLa細胞に相互作用していることも明らかにできた。以上のことことから概ね順調に進展していると考えている。ビメンチンを初めとするtype3型中間径フィラメントの細胞表面上の出現とN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)結合活性の検討を行った。これらの分子の細胞表面上の発現とGlcNAc結合活性を検討するためにCRISPR/CAS9システムを用いてビメンチンを欠損させたHeLa細胞を作製した。これらのビメンチンを欠損させたHeLa細胞は、GlcNAc糖鎖高分子に対する相互作用が喪失することが明らかにされた。そこで、これらのHeLa細胞にtype3型中間径フィラメントであるビメンチン及びデスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ペリフェリンを強制発現させ、これらの分子の細胞表面上の発現とGlcNAc結合活性をGlcNAc糖鎖高分子を用いて検討した。またこれらの分子のGlcNAc結合活性を表面プラズモン共鳴解析(Biacore)によって検討した。フローサイトメトリーや共焦点レーザー顕微鏡を用いて、これらの分子を強制発現させたHeLa細胞におけるGlcNAc糖鎖高分子の相互作用を検討したところ、細胞表面上でGlcNAc糖鎖高分子の結合が観察された。さらにBiacoreによるこれらの分子のGlcNAc糖鎖高分子へ結合の検討では、解離定数が10-7 Mから10-8 M程度であることが明らかにされた。さらにGFAPを発現するグリオーマやペリフェリンを発現するPC12におけるGlcNAc糖鎖高分子を検討したところ、相互作用が確認された。そして、これらの分子の細胞表面上の出現を検討したところ、GFAPやペリフェリンもビメンチンやデスミンと同様に細胞表面上に出現することが示された。以上のことから、type3型中間径フィラメントは細胞表面上に出現しGlcNAc結合活性を有することがはじめて証明された。ビメンチンに高い相互作用を有するGlcNAc糖鎖高分子の設計を実現し、さらにType3中間径フィラメントの細胞表面上の出現とGlcNAc結合活性を証明することができた。このことから、当初の予定どおり研究は進行している。申請者は、これまでに細胞骨格分子として知られているビメンチンが細胞表面に出現してN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)に対する結合活性を持つことを、GlcNAcが多価に結合したGlcNAc糖鎖高分子を用いて明らかにしてきた。本研究では、細胞表面に出現したビメンチンを効率よく結合できる新たなGlcNAc糖鎖高分子の設計を試みた。これまで検討してきたGlcNAc糖鎖高分子は分子量が一定でなく、ビメンチンに対する結合過程など不明であり、また安定な結合も困難であった。今回、ビメンチンとの安定な結合の実現とその過程を解明するために分子量の規定されたGlcNAc糖鎖高分子の設計し、その相互作用解析を行った。その結果、アクリル酸を主鎖とするGlcNAc糖鎖高分子を作製し、分子量がおよそ5000程度で、GlcNAcの数が、10個程度のものが、ビメンチンを高発現するHeLa細胞に高い相互作用を示すことを明らかにした。さらにビメンチンと相同性の高いType3中間径フィラメントであるデスミンやグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ペリフェリンについての細胞が出現とGlcNAc結合活性を検討した。その結果、これらの分子も細胞表面上に出現してGlcNAc糖鎖高分子と相互作用することを見出した。このことからType3中間径フィラメントが細胞表面に出現し、GlcNAc結合活性を有することを明らかにした。これらのType3中間

径フィラメントは、慢性炎症性疾患として知られる線維症や自己免疫性疾患、アルツハイマー病等の神経変性疾患の疾患部位で高発現することが知られている。従って、これらの疾患部位でこれらの分子の細胞表面出現も考えられる。以上のことから、新規のGlcNAc糖鎖高分子を用いたこれらの疾患に対する薬物送達システムの開発も期待できる。本研究では、慢性炎症性疾患の疾患部位を標的とした分子標的化技術の開発を行った。これらの疾患部位では、筋線維芽細胞や星細胞が活性化しする。そして、これらの活性化した細胞はType3中間径フィラメント(ビメンチン及びデスミン、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、ペリフェリン)を高発現している。本研究では、これらの分子が細胞表面上に出現してN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)糖鎖に対して高い相互作用を示すことを発見した。さらにこれらの分子に対して高い結合力を有するGlcNAc糖鎖高分子AC-GlcNAcの開発を行い、慢性炎症性疾患に対する分子標的化技術の開発に成功した。今後の予定は、作製されたGlcNAc糖鎖高分子(AC-GlcNAc)のガン細胞や線維芽細胞、間葉系幹細胞等への相互作用を詳細に検討していく。またビメンチン等の細胞骨格分子の細胞外への出現メカニズムについても検討していく。さらに慢性炎症性疾患の疾患部位への標的化が可能化について詳細に検討する予定である。Type3中間径フィラメントの細胞表面上の出現とGlcNAc結合活性の証明に成功した。そこで、これらの分子が細胞表面上に出現する機構について検討していく。またGlcNAc糖鎖高分子が細胞表面上でこれらの分子に結合したときの細胞の挙動を明らかにしていく。これらの結果を基にType3中間径フィラメントの細胞表面上の発現とGlcNAc結合活性の生理的意義の解明を検討していく。バイオマテリアル論文の投稿や次年度の研究を前倒しで実施するために予算の前倒しを実施したが、実験の進行が予定よりも遅くなり、金額が余ってしまい次年度使用金額が生じた。Type3中間径フィラメントを強制発現するHeLa細胞の作製およびBiacoreによる相互作用解析を実施するために、遺伝子工学用の試薬の購入を行った。しかしながら、遺伝子工学用の試薬の購入において前倒しした金額よりも少額での購入が可能であったため、差額が生じた。次年度使用金額では、引き続き論文投稿や平成28年度で実施する研究を行う予定である。Biacoreによる相互作用解析において、センサーチップの購入を行うため、差額が生じた金額を使用する予定である。また論文を投稿していることから、その投稿費用にも充てる予定である。
遺伝子改変マウス下丘で聴覚回路形成を見る

聴覚路にβ-ガラクシトダーゼが特異的に発現する遺伝子改変マウス(Brn3b)を用いて聴覚回路形成過程を下丘でみた。この遺伝子改変マウスは、岡崎基礎生物学研究所の野田昌晴と渡辺栄治等が開発したものである。この遺伝子改変マウス系統をもらい受け滋賀医科大学動物生命科学研究センターの動物実験指針に従って実験をした。まずX-galによる組織染色によりβ-ガラクシトダーゼを可視化した。生後13日の新生児期の全脳標本でβ-ガラクシトダーゼが最もきれいに発現していた。下丘と上オリーブ核に強く、外側毛帯(核)と蝸牛神経核に中等度、内側膝状体に弱く発現が観察された。神経線維は成功裏に染まったが、幼弱脳の全脳標本ではニューロン群中では細胞体とニューロピルを識別することは困難であった。この遺伝子改変マウス(Brn3b)は聴覚路の他にも、視覚路の一部や小脳路の一部にβ-ガラクシトダーゼの特異的発現が見られた。このような特性は遺伝子改変マウスで一般にしばしば起こることである。さらに生後7日から発現が弱くなり生後2週以降はβ-ガラクシトダーゼ活性は検知できないレベルに低下した。一方、プレプロノシセプチン遺伝子のプロモーター領域にコレラトキシンBサブユニット(CTB)遺伝子を結合させ、プレプロノシセプチン遺伝子のプロモーター支配下にCTBが産生されるような人工遺伝子を作成した。これをラット下丘に注入し電気穿孔法で神経細胞内に導入することに成功した。これらの遺伝子操作技術は、免疫組織化学と組み合わせて用いることにより、今まで充分可視化できなかったためにその解析が遅れていた聴覚神経回路網を機能解剖学的に調べる強力なツールとなることがわかった。計画で申請した人工DNAの作成に成功した。ノシセプチン遺伝子を含むBACのクローンはEnsembl Genome Browserで検索され、該当するBACのクローンが複数存在することが確認された。そのうちRP23-101F9というクローンを入手し、ノシセプチンのプロモーター部位を制限酵素で切り出してサブクローニングした。さらにそのプロモーター部位をコレラトキシンBサブユニットの遺伝子の上流につなぎ合わせ、ノシセプチンのプロモーター支配下にコレラトキシンBサブユニットが発現するような機構にした。作成された人工DNAは以後の解析のため大量に精製した。この人工DNAは培養細胞系にカルシウムリポフェクション法で導入され、コレラトキシンBサブユニットの発現を蛍光抗体法で観察し、蛍光を示す細胞の存在を確認した。これにより人工DNAのノシセプチンプロモーターに充分なプロモーター活性があること、また免疫活性のあるレポータータンパクが確かに作られていることが確認された。さらにこの人工DNAをエレクトロポレーション法を用いて下丘の神経細胞に導入し発現させる事を試みた。主に成ラットの下丘実質内にDNA溶液を注入し、この用途のために新たに設計された電極を用いて下丘に電位をかけた。この操作の2日後にラットの脳を固定し得られた下丘組織の標本でレポータータンパクであるコレラトキシンBサブユニットの発現を免疫組織化学的に検索し、複数の神経細胞で陽性像を得ることができた。また、二重蛍光抗体法により、コレラトキシンBサブユニットの免疫活性を持つ細胞がノシセプチン及びGABAを含有している事を確認した。現時点ではプロモーター活性の特異性も確保されこの後の解析に進むことが可能であると期待できる。

この遺伝子改変マウスは、岡崎の基礎生物学研究所の野田昌晴氏と渡辺栄治氏等のグループが開発されたものである。我々はこの遺伝子改変マウス系統をもらい受け滋賀医科大学動物生命科学研究センターの動物実験指針に従って実験をした。まずX-galによる組織染色によりβ-ガラクシトダーゼを可視化した。生後13日の新生児期の全脳標本でβ-ガラクシトダーゼが最もきれいに発現していた。下丘と上オリーブ核に強く、外側毛帯(核)と蝸牛神経核に中等度、内側膝状体に弱く発現が観察された。神経線維はいつも成功裏に染まったが、幼弱脳の全脳標本ではニューロン群中では細胞体とニューロピルを識別することはできなかった。β-ガラクシトダーゼの染色法も変えてみたが改善はみられなかった。この遺伝子改変マウス(Brn3b)は聴覚路の他にも、視覚路の一部や小脳路の一部にβ-ガラクシトダーゼの特異的発現が起こる。このような特性は他の遺伝子改変マウスでもしばしば起こることである。さらに生後7日から発現が弱くなり生後2週以降はβ-ガラクシトダーゼ活性は検知できないレベルに低下した。一方、プレプロノシセプチン遺伝子のプロモーター領域にコレラトキシンBサブユニット(CTB)遺伝子を結合させ、プレプロノシセプチン遺伝子のプロモーター支配下にCTBが産生されるような人工遺伝子を作成した。これをラット下丘に注入し電気穿孔法で神経細胞内に導入することができた。これらの遺伝子操作技術を免疫組織化学と組み合わせて用いることにより、今まで充分可視化できなかったためにその解析が遅れていた聴覚神経回路網を機能解剖学的に調べる強力なツールとなりうることが大いに期待される。
マルチビームレーザーマニピュレーション法を用いたマイクロ反応制御

1,マイクロメートルサイズの液滴は、ピコリットルサイズの小さな容器と考えることができ、これらの液滴を接触、融合することにより、極微少量の反応・分析システムの構築が可能であると考えられる。研究代表者は、複数のレーザー光を走査するマルチビームレーザーマニピュレーションシステムを製作し、これを用いて2つの液滴あるいは、液滴と固体媒体を同時に且つ独立にレーザー捕捉・走査し、これらを顕微鏡下で融合させると同時に、融合の前後での吸収分光分析を行ないその変化を追跡した。その結果、マイクロメートルサイズ領域での反応、拡散、濃縮過程を直接的に解析することに成功した。2,水中の油滴に対してはそれらの屈折率の大小関係により、顕微鏡下でレーザー光を照射すればその焦点位置に油滴が捕捉されるが、逆の場合、即ち、油相中の水滴は、レーザー光に弾かれて捕捉することはできない。そこで、マルチビームレーザーマニピュレーション法を応用して、レーザー光を水滴の周りに円形に走査して「光のかご」を形成することにより、油相中の水滴の捕捉を行い、同時にその顕微吸収測定にはじめて成功した。更に、微小水滴中に於ける色素の分子会合挙動を研究したところ、マイクロメートルサイズの水滴の直径が小さくなるに従って、分子会合体の生成が促進される興味深い事実が見出された。これは、油水界面で会合体生成が促進されるという事を考慮することにより、定量的に解析された。
グローバリゼーション下の企業福祉の動向に関する国際比較研究

本研究では、標記のテーマについて究明するため、以下の研究を行った。第1に国内の企業福祉の現状を知るために「企業福利厚生の新たな展開に関する調査」を行った。第2には、国内企業の本社、経営者団体を訪問し、1990年代半ば以降の人事労務管理の動向と企業福祉の現状をヒアリングした。第3には、グローバル化の名の下に日本企業が海外進出している進出先における人事労務管理と企業福祉の実情をヒアリング調査した。主要対象国は中国、韓国、フランス、スウェーデン、フィンランドである。本研究の課題である企業福祉の国際比較という点については、アンケート調査、ヒアリング調査を通して以下の特徴が把握できた。第1に、日本国内では、90年代半ば以降、人事労務管理システムが能力主義・成果主義に急速に傾いたが、企業内福利厚生については、あまり急激なスリム化が行われていないことである。それは、企業福祉の目的として、「勤労意欲の維持・向上」、「従業員の生活安定」と幅広くその理念が捉えられ、また「労働力の維持・活性化」や「社会的責任を果たす」と、広く社会的機能の充実を企業は意識している。第2に、東アジアでは韓国が日本に近似した企業福祉体系をもつのに対して、中国では資本主義化が急速に進んだが、劣悪な労働条件から2002年以降漸く「4金、5金」と呼ばれる企業福利施策が、労働法制の強制の下に実施されている発展途上段階である。これに対して西欧、北欧では解雇権が厳しく制限されており、日本よりも長い終身雇用が存在し、一般的な企業福祉も充実している。国際比較の観点からは、日本企業の福利厚生は高く評価される一方で、人事労務管理システムの変化により雇用の流動化が進み、日本社会の「格差社会」化という新しい現象が生じてきている。この点をさらに全体的に人事労務管理システムと企業福祉との総合で究明することが本研究の最終目標である。この報告では、アンケート調査とヒアリング調査とで得られた実情を中心に報告する。本研究の平成17年度における目的は、わが国企業の1990年代以降における人事労務管理システムへの能力主義・成果主義の導入のもとで、企業福祉施策について、基本理念・プログラム・実施上の問題点の明確化、わが国企業のグローバル化・アジア化に伴う企業福祉施策の変化の把握、本国と進出先との比較、という点あった。この目的達成のため、関連する文献・資料の収集・整理、国内外における企業福祉に関するアンケート調査およびヒアリング調査を実施し、本国企業、アジア地域進出企業、欧米地域進出企業について調査を行った。まず日本企業本社の人事担当者にヒアリングし、企業福祉施策の重点の変化、問題点・課題について具体的に聞くことができた。また日本経団連、商工会議所、公益団体として日本貿易振興機構をヒアリングした。ついで、中国進出に注目し、上海・北京・青島・広州の4地域における進出先企業・工場の人事労務管理と企業福祉の実際を見聞した。さらに、欧米進出先企業の実情把握のため、伝統的な労使慣行のフランス、これと対照的に福祉国家モデルとされつつ、目覚しい企業発展を保持している北欧、スウェーデンおよびフィンランドについて、イエテボリ、ストックホルム、ヘルシンキの3地域への進出企業についてヒアリング調査を実施した。以上をつうじて達成できたことは、日本企業の本国と、進出先企業との企業福祉に関する明確な対照性であり、各国の社会保障・社会福祉施策をベースとした企業風土の特質が、きわめて対照的であることである。

次年度には、新しい調査票による新しい項目を中心としたアンケート調査およびヒアリング調査を実施することによって、これまでに見えてきた全体像と個別企業の実際とを比較検証し、今後の安定的な社会発展を支える企業の人事労務施策と企業福祉のあり方のベスト・プラクティスの選定にアプローチする。本研究の平成18年度の目的は、日本企業および海外進出企業を対象として人事労務管理と企業福祉に関して絞り込んだアンケート調査を行い、また前年度に行った中国・フランス・スウェーデン・フィンランドへの進出企業のヒアリング調査に加えて、18年度は韓国企業のヒアリング調査を行い、以って東アジア地域およびヨーロッパ地域における進出企業の企業福祉とわが国のそれとの国際比較を行うことにより、転換期にあると言える最近の人事労務管理と企業福祉の実態を明らかにし、グッド・プラクティス、さらにはベスト・プラクティスを絞り込むことに置かれた。この目的達成のため、平成18年度においては、人事労務管理と企業福祉の実際に関して新たな様式によるアンケート調査を行った。日本経済新聞による企業業績を中心とするプリズム調査の対象約600社に対してアンケート調査を行った。また、夏期休業中には、アジア地域に関するヒアリング調査で未実施であった韓国の企業および経営者団体についてヒアリング調査を実施した。これにおいては、韓国経営者総協会(経総)、ジェトロ・ソウルセンター、現代自動車株式会社本社および蔚山工場、現代重工業株式会社本社、SK株式会社本社、以上の2団体・3企業・工場について人事労務管理担当者などから直接ヒアリングすることができた。そこから韓国の特殊な社会環境の中で、伝統的な雇用・労使慣行から、急速に能力主義的な現代的人事労務管理体制に移行してきた企業の人事労務管理および企業福祉の取り組みの特徴を把握することができた。最終的な報告書を作成する中で、アンケート調査結果およびヒアリング調査結果から、現下の日本企業およびその海外現地法人、さらに欧州企業、アジア企業における人事労務管理の特質と企業福祉の取り組みの特徴を明らかにし、グッド・プラクティス、ベスト・プラクティスの析出を試みた。
近代日本の世帯経済と労働供給-小農・女性・副業に着目して-

本研究では、幕末から大正期にいたる織物業史の事例研究(埼玉県入間郡等)を行い、(1)織元の経営史料の分析から、賃織への発注と工賃支払いが、強い季節性をもち相互に逆相関の関係にあったことがあきらかとなり、次いで、(2)農家経済調査の検討から、それは、農家内の世帯構成員間の労働力配分の問題に依存していることが示された。これらの事実発見により、以下の点が世帯経済における小農、女性、副業の関連の特色として指摘される。すなわち、農家世帯は、その世帯の維持、存続のために、与えられた経営面積を短期的には所与の世帯構成人員との関係の下で処理することが求められている。しかし、必要農業労働量と世帯構成員との不整合は、世帯内に燃焼度の低い労働力を発生させるが、その度合いは、必ずしも放出可能な一人分の労働力に一致するとは限らない。また季節的な労働需要の変動も、恒常的な過剰労働力の発生には制約となるし、家事労働にみられるような非定型の世帯内労働需要の存在もそれを定型的、定量的な労働需要に振り向けることを、ロスの大きいものにしている。このような制約下にあって、世帯内にも労働需要を調整しているのが、特に女子による世帯内でも“多就業"であった。「副業」は、その就業形態の特色-労働力支出の空間的、時間的な拘束の弱さからくる可変性-から、この“多就業"が必然化せざるをえない労働力に適合的なものであったと考えられる。農家世帯は「副業」を、その固有の就業形態故にその就業構造の中に組込んでいたのであり、そのことによって、農家世帯は、より効率的な世帯内労働力の配分と動員を計っていた。農家世帯は自身の再生産「戦略」の一環として副業を就業構造に組み込んでいたと考えられるのである。
先天性高乳酸血症の新しい病因解明に関する研究

小児の難病の一つである先天性高乳酸血症の病因としてピルビン酸脱素酵素(PDH)複合体異常症の頻度が高い。PDH複合体異常症の中にはPDHホスファターゼ(PDPase)異常に基づくと推測される症例が存在するものの,これまでPDPase異常症と確定診断された症例は存在しない。先天性高乳酸血症の病因としてPDPaseの異常を分子遺伝学的に直接証明することにより,本症の早期病因診断と新しい治療法の開発とが期待される。そこで本研究ではPDPase異常症が疑われる先天性高乳酸血症患児においてPDPase異常を分子遺伝学的に明らかにするために,まずこれまでに報告されているラットPDPase cDNAの塩基配列を参考にしてPCR法により,2種類のヒトPDPaseに対するcDNA(PDPc1,PDPc2)をクローニングしし塩基配列を決定した。ヒト染色体上でのPDPc1およびPDPc2遺伝子の局在をクローニングしたcDNAをプローブとしたFISH法により検討し、PDPc1遺伝子が8q22-23上に,PDPc2遺伝子が3q27-28上に局在することを明らかにした。次いで,酵素活性測定によりPDPase欠損症が疑われる患者においてその病因を明らかにするために,患者におけるPDPc1およびPDPc2に対するcDNAでの塩基配列を解析し,遺伝子変異の解析を行い,PDPase活性が低下していた先天性高乳酸血症患者において,PDPc2遺伝子にアミノ酸置換を伴うA716T(D239V)の遺伝子変異を同定した。この変異によってアミノ酸置換がおこるD239はヒト,ラット,牛のPDPc1,PDPc2のすべてにおいて保存されおり,また機能ドメインを構成する重要なアミノ酸であり,このPDPc2遺伝子変異が本患者における先天性高乳酸血症の原因であることが明らかとなった。小児の難病の一つである先天性高乳酸血症の病因としてピルビン酸脱水素酵素(PDH)複合体異常症の頻度が高い。PDH複合体異常症の中にはPDHホスファターゼ(PDP)異常に基づくと推測される症例が存在するものの,これまでPDP異常症と確定診断された症例は損在位しない。先天性高乳酸血症の病因としてPDPの異常を分子遺伝学的に直接証明することにより,本症の早期病因診断と新しい治療法の開発とが期待される。しかしながらヒトPDPcDNAはいまだクローニングされてはいない。そこで本研究によりPDP異常症が疑われる先天性高乳酸血症患児においてPDP異常を分子遺伝学的に明らかにするために,本年度はまずこれまでに報告されているラットPDPcDNAの塩基配列を参考にしてPCR法により,2種類のヒトPDPcDNA(PDP1,PDP2)をクローニングした。ヒトPDP1のコーディング領域は,1611塩基からなり,ラットPDP1との相同性は塩基レベルにおいて91.6%,アミノ酸レベルで97.2%であった。ヒトPDP2のコーディング領域は,1587塩基からなり,ラットPDP2との相同性は塩基レベルにおいて83%,アミノ酸レベルで82.8%であった。次いで,ヒト染色体上でのPDP1およびPDP2遺伝子の局在をクローニングしたPDP1およびPDP2cDNAをプローブとしたFISH法により検討し,PDP1遺伝子が8q22-23上に,PDP2遺伝子が3q27-28上に局在することを明らかにした。さらに,現在クローニングしたPDP1およびPDP2cDNAをプローブとして,ヒト各臓器でのそれぞれの発現度をノーザンブロット法により検討している。

小児の難病の一つである先天性高乳酸血症の病因としてピルビン酸脱水素酵素(PDH)複合体異常症の頻度が高い。PDH複合体異常症の中にはPDHホスファターゼ(PDPase)異常に基づくと推測される症例が存在するものの,これまでPDPase異常症と確定診断された症例は存在しない。先天性高乳酸血症の病因としてPDPaseの異常を分子遺伝学的に直接証明することにより,本症の早期病因診断と新しい治療法の開発とが期待される。しかしながらヒトPDPaseに対するcDNAはいまだクローニングされてはいない。そこで本研究ではPDPase異常症が疑われる先天性高乳酸血症患児においてPDPase異常を分子遺伝学的に明らかにするために,昨年度までに2種類のヒトPDPaseのカタリティックサブユニットに対するcDNA(PDPc1,PDPc2)をクローニングし,その塩基配列および遺伝子座を決定した。本年度は,酵素活性測定によりPDPase欠損症が疑われる患者においてその病因を明らかにするために,患者由来の培養細胞から,mRNAを抽出し,患者におけるPDPc1およびPDPc2に対するcDNAでの塩基配列を解析し,遺伝子変異の検索を行った。PDPase活性が低下していた先天性高乳酸血症患者において,PDPc2遺伝子にアミノ酸置換を伴うA716T(D239V)の遺伝子変異を同定した。この変異によってアミノ酸置換がおこるD239はヒト,ラット,牛のPDPc1,PDPc2のすべてにおいて保存されおり,また機能ドメインを構成する重要なアミノ酸であり,このPDPc2遺伝子変異が本患者における先天性高乳酸血症の原因であることが明らかとなった。
実験的歯周炎が全身状態に及ぼす影響とそのメカニズムの解明

本研究では、歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の存在が、全身状態に及ぼす影響を検討するため、ラットに実験的歯周炎を作成し、さらに歯周ポケット内にPgを感染させた場合の血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子の変化を検討した。実験にはWistar系雄性ラット48匹を用い、Pg感染群および未処置群の2群に分けた(各24匹)。Pg感染群ではM1に実験的歯周炎を惹起した後、Pg感染群には歯周ポケット内にPg付着絹糸を挿入し、未処置群は麻酔のみを行って、同様に5週間飼育した。飼料はより高度な歯槽骨吸収を惹起させるため、実験1では糖含有量の高いもの、実験2では脂肪含有量の高いものを与えた。得られた結果は以下の通りである。1.歯槽骨吸収度はPg感染群が未処置群よりも有意に大きかった。飼料の違いによる吸収度に有意差は認められなかった。2.実験1および2において、Pg感染群と未処置群の間で、血糖値および中性脂肪濃度に有意差は認められなかった。3.末梢血中のTNF-α、IL-6、CRPおよびadiponectin濃度はいずれもPg感染群の方が未処置群よりも低い値を示したが、有意差は認められなかった。本実験系では歯周組織へのPg感染が中性脂肪や血糖値などの代謝系や、TNF-α、IL-6、CRPおよびadiponectin濃度に有意な変化を及ぼすことはなかった。しかし肥満誘発ラットにおいてサイトカインレベルおよびadiponec-tin濃度が低下する傾向を示したことから、今後は歯周組織へのPg感染による全身への影響に関して、飼料の種類が及ぼす影響を検討する必要があると思われる。本研究では歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の存在が、全身状態に及ぼす影響を検討するため、ラットに実験的歯周炎を作成し、さらに歯周ポケット内に歯周病原細菌の1つであるP.gingivalis(以下Pgと略す)を接種して、血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子に及ぼす影響を検討した。実験動物として8週齢のWistar系雌ラット36匹を用い、Pg感染群(下顎第一臼歯にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成後、歯周ポケット内にPg接種)、Pg非感染群(実験的歯周炎作成のみ)、および未処置群の3群に分け各測定項目を比較検討した。得られた結果は以下のとおりである。1.Pg感染群におけるPg定着率は100%であったが、採取したプラーク中に占めるPgの割合は平均6.9%であった。2.Pg感染群では他の2群よりも血糖値が上昇する傾向が認められたが、有意差は認められなかった。3.血液中の中性脂肪濃度およびTNF-α、CRP濃度には有意差が認められなかった。4.実験的歯周炎を惹起した局所から、菌血症によって血液中に細菌が侵入する可能性を考慮し、血液中の細菌やLPSを処理している肝組織中のTNF-αm-RNA濃度を測定したが、有意差は認められなかった。今後はPg感染群におけるプラーク中のPgの割合を増加させるとともに、高脂肪食は歯周病を増悪させる因子であると報告されていることから、飼料の影響なども検討したいと考えている。本研究では歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の1つであるP.gingivalis(以下Pgと略す)の感染が全身状態に及ぼす影響を、動物実験で検討している。実験動物として8週齢のWistar系雌ラットを用い、Pg感染群(下顎第一臼歯にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成後、歯周ポケット内にPgを接種)、Pg非感染群(実験的歯周炎作成のみ)、および未処置群の3群に分け、4週後に血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子の値を測定した。

17年度は飼料としてDiet 2050(sucrose 28%含有)を用いた。Pg感染群は他の2群よりも中性脂肪および血糖値がやや高い値を示したが、有意差は認められなかった。またPg感染群の肝組織中のTNF-αm-RNAは、Pg非感染群よりも低かったが有意差は認められなかった。18年度は歯周病を増悪させることが報告されている高脂肪食(High Fat Diet 32)に飼料を変えて検討した。得られた結果は以下のとおりである。1.血液中の中性脂肪、血糖値、TNF-α、IL-6、CRP濃度のいずれにも有意差が認められなかった。2.実験期間を9週間に延長したところPg感染群は非感染群よりも中性脂肪、血糖値およびTNF-α濃度が低い値を示したが、有意差は認められなかった。すなわち雌ラットの歯周組織へのPg感染によって血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子への影響は認められず、また飼料の影響も認められなかった。今後は接種する細菌種や性差などを検討する予定である。本研究では歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の1つであるP.gingivalis(以下Pgと略す)の感染が全身状態に及ぼす影響を、動物実験で検討してきた。実験動物として8週齢のWistar系ラットを用い、Pg感染群(下顎第一臼歯にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成後、歯周ポケット内にPgを接種)および未処置群の2群に分け、4週後に心採血して血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子の値を測定した。【実験1】まず飼料としてDiet 2050 (sucrose 28%含有)と普通飼料を50%ずつ混合したものを与えた場合、感染群においてオスでは中性脂肪、メスでは血糖値が高くなる傾向を示したが、有意差は認められなかった。【実験2】次に歯周病を増悪させることが報告されている高脂肪食を用いて、5週齢からDiet 2050とHigh Fat Diet(HFD)32を50%ずつ混合したもので4週間予備飼育を行った後に同様の実験を行った場合も、実験1と同様に感染群においてオスでは中性脂肪、メスでは血糖値が高くなる傾向を示したが、有意差は認められなかった。また実験1および2において、TNF-α、IL-6、CRP濃度、adiponectinのいずれにも有意差は認められなかった。すなわち本研究におけるラットの歯周組織へのPg感染によっては血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子への影響は認められず、また飼料の影響も認められなかった。
FISHを用いた遺伝子増幅細胞迅速選択法

細胞培養を用いて、有用物質生産を行う場合、通常、目的とする有用物質遺伝子を遺伝子組換え手法を用いて細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行わせ、目的物質を高度に生産する細胞株を取得している。遺伝子増幅現象を利用する場合には、まず、目的有用物質遺伝子と、増幅可能な遺伝子の両方を持つベクターを構築する。次に、これを細胞に組み込み、増幅可能な遺伝子の産物に対する阻害剤耐性を獲得した細胞を選択する。最終的に、増幅可能な遺伝子と、目的有用物質遺伝子の両方が増幅された細胞株(目的有用物質高生産株)を取得することができる。本研究では、染色体上の特定遺伝子の位置を明らかにできるFISH(fluorescence in situ hybridization)法を用いて、遺伝子増幅領域と、目的遺伝子の生産性、安定性との関係について検討した。FISH法に基づいた結果から生産性の違う細胞の遺伝子増幅領域が異なることが示された。さらに蛍光標識した増幅遺伝子dhfrに対する阻害剤F-MTX(Methotrexate)を細胞内にとりこませることにより、F-MTXの取り込み量の高い細胞は、遺伝子増幅がよくおこなわれている細胞と、膜変異によってF-MTX蓄積量が高くなっている細胞の2種類が存在することが判明した。細胞内蛍光標識量に基づいて、細胞を分画し、生産性の高いテロメア型の細胞を実際に取得することが可能となった。本手法をもちいることにより、遺伝子増幅させた細胞を蛍光標識に基づいて迅速に分離することが可能となった。これまで、FISH法を用いて、選択できた細胞株の遺伝子増幅位置に違いがあることは明らかにした。そこで、さらに、増幅位置による生産性、安定性の関係について明らかにすることを目的として検討を行った。増幅位置によって、生産性、安定性が異なれば、ある特定の位置に増幅された細胞株を取得することにより、長期間の安定性試験を経なくても、高生産かつ安定性の高い細胞株を取得することが可能となる。高生産で安定な細胞株を迅速かつ選択的に分取する方法について検討を行った結果、蛍光標識した増幅遺伝子dhfrに対する阻害剤F-MTXを細胞内にとりこませることにより、細胞内遺伝子増幅量の多い細胞を特異的にラベルすることに成功した。さらに、この方法とこれまでに行われたFISHの結果を組み合わせることにより、特異的に特定の領域において遺伝子増幅が起こっている細胞を取得する可能性が示唆された。

昨年は蛍光標識した増幅遺伝子dhfrに対する阻害剤F-MTX(Methotrexate)を細胞内にとりこませることにより、細胞内遺伝子増幅量の多い細胞を特異的にラベルすることに成功した。さらに、この方法とこれまでに行われたFISHの結果を組み合わせることにより、特異的に特定の領域において遺伝子増幅が起こっている細胞を取得する可能性が示唆された。そこで本年度は、この手法を用いた実際の細胞分取に際して、蛍光度の高細胞、すなわちF-MTXの取り込み量が高い細胞が実際に生産性の高い(遺伝子増幅がよく行われているか)について検証した。その結果、F-MTXの取り込み量の高い細胞は、遺伝子増幅がよくおこなわれている細胞と、膜変異によってF-MTX蓄積量が高くなっている細胞の2種類が存在することが判明した。細胞培養を用いて、有用物質生産を行う場合、通常、目的とする有用物質遺伝子を遺伝子組換え手法を用いて細胞に組み込んだ後、遺伝子増幅を行わせ、目的物質を高度に生産する細胞株を取得している。遺伝子増幅現象を利用する場合には、まず、目的有用物質遺伝子と、増幅可能な遺伝子の両方を持つベクターを構築する。次に、これを細胞に組み込み、増幅可能な遺伝子の産物に対する阻害剤耐性を獲得した細胞を選択する。最終的に、増幅可能な遺伝子と、目的有用物質遺伝子の両方が増幅された細胞株(目的有用物質高生産株)を取得することができる。本研究では、染色体上の特定遺伝子の位置を明らかにできるFISH(fluorescence in situ hybridization)法を用いて、遺伝子増幅領域と、目的遺伝子の生産性、安定性との関係について検討した。FISH法に基づいた結果から生産性の違う細胞の遺伝子増幅領域が異なることが示された。昨年は蛍光標識した増幅遺伝子dhfrに対する阻害剤F-MTX(Methotrexate)を細胞内にとりこませることにより、F-MTXの取り込み量の高い細胞は、遺伝子増幅がよくおこなわれている細胞と、膜変異によってF-MTX蓄積量が高くなっている細胞の2種類が存在することが判明した。そこで、本年度は、細胞内蛍光標識量に基づいて、細胞を分画し、生産性の高いテロメア型の細胞を実際に取得することが可能となった。本手法をもちいることにより、遺伝子増幅させた細胞を蛍光標識に基づいて迅速に分離することが可能となった。
絵画のリアリティ鑑賞に関与する動的ノイズの存在

絵画や風景画像に感じるリアリティの印象形成において,固視微動に由来する動的ノイズが重要であることを明らかにすることを目標にした.そのため,画像観察時の固視微動をモデル化し,画像へ動的ノイズとして付加する画像処理手法を開発した.また,画像に動的ノイズを付加した際に画像から受ける印象の変化を明らかにした.実験の結果,画像に適切な強度の動的ノイズを付加することによって,奥行き感の印象が強くなることがわかった.平成27年度は,研究実施計画に示した「テーマ1)絵画を観察している際の固視微動の測定とモデル化」に関する研究を行った.まず,アイマークレコーダ(Tobii,TX300)を用い,300Hzのサンプリング周波数で,白背景中の注視点,ならびに絵画を60cmの距離で観察している際の固視微動の様子を測定した.絵画として,油絵,水彩画,版画からそれぞれ2種類ずつ選択した.画像の提示には,4Kモニタを使用し,実物と同じ大きさとした.12名の観察者がそれぞれの実験刺激を30秒間観察した.そして,データ中から固視の安定している時間帯を抽出し,フーリエスペクトルを算出した.その結果,固視微動の特徴に個人差が存在すること,そしてその個人差がいくつかのグループに分けられる可能性が示された.一方で,絵画の種類による固視微動の違いは明確では無かった.次に,実験刺激として絵画の空間周波数特性を変化させた画像を用意して同様の実験を行い,実験刺激の空間周波数特性と固視微動の関係性について調べた.フーリエ変換による周波数解析の結果,固視微動の中でもドリフト成分やマイクロサッカード成分において,刺激の空間周波数の違いによる影響が出る可能性が示された.これにより,ぼやけた画像を観察した際に,固視微動の性質の変化が引き起こされる可能性と,絵画への集中度などの観察姿勢が固視微動に影響を与える可能性が指摘できた.以上の実験結果より,絵画観察時における固視微動をモデル化するにあたり,導入が必要なパラメータの候補をあげることができた.また,研究実施計画に示した「テーマ2)無地の支持体観察時における動的ノイズの性質およびノイズ強度の推定」のための予備実験として,動的ノイズによる錯視の見えの変化に関する実験を平行して行った.この結果より,動的ノイズの種類とノイズに影響を受ける見えの関連性に関する知見を得た.当初の計画では,研究実施計画に示した「テーマ2)無地の支持体観察時における動的ノイズの性質およびノイズ強度の推定」に取りかかる予定であったが,その予備実験をするにとどまった.これは,テーマ1で得られた実験結果より,固視微動モデルに関わるパラメータが当初の予定よりも複雑であることがわかり,モデル化作業が遅れたためによる.平成28年度は,平成27年度に引き続きアイマークレコーダを用いて300Hzのサンプリングレートで固視微動のデータを収集した.白背景中の注視点,ならびに絵画を60cmの距離で観察している様子を対象とした.まず,固視微動データを分析するにあたり,平成27年度の懸案事項であったサッカードと,マイクロサッカード成分の除去方法を改良した.その結果,平成27年度に実現できなかった固視微動のモデル化を達成した.具体的には,固視微動の種類に従って周波数領域を分割することによって,周波数の逆数の関数を用いて良好にモデル化ができる事を示した.次に,固視微動モデルを画像生成処理に適用するプログラム開発をおこなった.生成画像の効果を検証するために,まず固視微動が起因して観測される運動錯視画像に対して,固視微動モデルを適用した画像を生成し,生成画像と錯視との比較実験をおこなった.また,風景写真と風景画像に対し同様に固視微動モデルを適用し,生成画像の印象評定実験をおこなった.実験の結果,錯視画像では人が知覚する錯視と類似した画像が生成することができることがわかった.ただし,その錯視量は人が知覚する量よりも過剰であることもわかった.風景写真と風景画像を対象にした場合,固視微動モデルを適用することによって風景における奥行き感が増加する可能性が示せた.ただし,こちらにおいても過剰なノイズが違和感をもたらすことも示された.当初の計画では,絵画の種類を変えて様々なシミュレーション動画像を作成する予定であったが,平成27年度の結果を受けて,絵画の種類を増やすのではなく,風景写真と風景画像に限定して動画像を作成した.また,錯視現象とのかかわりを見出したため,錯視画像にも適用した点において計画とも異なっている.しかし,予定通り,視覚ノイズモデルを作成することには成功した.平成29年度は,まず固視微動モデルを画像にノイズとして付加する画像処理手法を提案した.これは,対象画像の観察距離を考慮して固視微動による画像の空間的な揺らぎを再現したものである.固視微動には,平成28年度までに得られた固視微動データと同じ周波数特性を持つ揺らぎ信号と,フラットな周波数特性をもつ揺らぎ信号の2種類を用意した.またノイズ強度を任意に設定できるよう設計した.次に,この画像処理を5種類の風景画像に適用した.使用した風景画像はそれぞれ異なる絵画的奥行き手掛かりを有する画像とした.それぞれの画像には,2種類の周波数特性の固視微動ノイズを,それぞれ3つの強度で付加した.続いて,風景画像毎に画像から受ける奥行き感を評定する心理実験をおこなった.ノイズの周波数特性とノイズ強度の違いによる奥行き感の強弱を,一対比較法を用いる事によって調べた.この実験の結果,原画像に比べて固視微動ノイズを付加した画像は,有意に奥行き感が上回っていると選択されることがわかった.

その際,付加するノイズ強度は中くらいの画像が最も奥行き感があるように感じられることがわかった.ただし,奥行き感の向上に最も有効な周波数特性は,適用する画像に依存することがわかった.用いた風景画像は,それぞれ主要な絵画的奥行き手掛かりが異なっていたので,奥行き感の向上に有効な周波数特性は絵画的奥行き手掛かりと関連性があることが予想された.以上の研究により,動的ノイズが風景画像の奥行き感の向上において寄与できることが明らかになった.絵画や風景画像に感じるリアリティの印象形成において,固視微動に由来する動的ノイズが重要であることを明らかにすることを目標にした.そのため,画像観察時の固視微動をモデル化し,画像へ動的ノイズとして付加する画像処理手法を開発した.また,画像に動的ノイズを付加した際に画像から受ける印象の変化を明らかにした.実験の結果,画像に適切な強度の動的ノイズを付加することによって,奥行き感の印象が強くなることがわかった.平成28年度は,平成27年度に得られた実権結果から,固視微動モデルを提案する.そして,そのモデルの検証をする実験を行う.その後,研究実施計画に示した「テーマ2)無地の支持体観察時における動的ノイズの性質およびノイズ強度の推定」並びに「テーマ3)絵画観察時における動的ノイズの性質およびノイズ強度の推定」を実行する.これにより,平成29年度には,計画通り「テーマ4)実物の絵画,絵画写真,動的ノイズを付加した絵画写真の3つに対する印象評定」を行う予定である.平成28年度の研究において,視覚ノイズモデルを適用した画像生成手法の効果について一部明らかにした.平成29年度は,視覚ノイズモデルに視覚の周波数特性を適用することをおこなう.また,適切なノイズ強度に関する知見を得る実験をおこなう.これにより,視覚ノイズが画像観察者が知覚する素材感,奥行き感,リアリティなどの印象への効果を明らかにする.視覚工学
自己免疫性末梢神経疾患における新たな抗糖脂質抗体の同定

Fisher症候群(FS)患者の9割で、急性期血中にIgG抗GQ1b抗体が検出される。一方、近年FSやGuillain-Barre症候群(GBS)で、複数のガングリオシドからなる「ガングリオシド複合体」に対するIgG抗体が検出されることが明らかにされてきた。さらに、FS患者より分離培養されたCampylobater jejuniのリポオリゴ糖(LOS)上にGD1c様構造とGalNAc-GM1b様構造が存在することが示されている。これらの知見から本研究では、IgG抗GQ1b抗体陰性のFS症例(GQ1b-seronegative FS)において、抗ガングリオシド複合体抗体、およびGDlc様LOSとGa1NAc-GM1b様LOSに対するIgG抗体が検出されるか検討した。抗GQlb抗体陰性FS 24例を対象に、ガングリオシド複合体、およびカンピロバクター・リポオリゴ糖(LOS)に対するIgG抗体を測定した。その結果、24例中4例(17%)でGM1/GT1a複合体抗体が、6例(25%)でGD1c様LOSないしGa1NAc-GM1b様LOSに対するIgG抗体が陽性であった(健常者37例では全例陰性)。これらの抗体が陽性の症例は、抗GQ1b抗体陽性例と臨床像が類似していた。つまり、先行感染症状や神経所見からこれらの抗体の有無の推測は困難と考えられる。FSでIgG抗GQ1b抗体に加え、ガングリオシド複合体(特にGM1/GT1a)に対する抗体を測定することで検査感度を上げることができることが示された。またGD1cとGa1NAc-GM1bがFSの標的分子である可能性が示唆され、今後は、GD1cとGa1NAc-GM1bとを用いて抗体測定を行う必要がある。ギラン・バレー症候群(GBS)は自己免疫性末梢神経疾患で、自己抗体(抗ガングリオシド抗体)が患者血中に検出される。本研究では、GBSの原因病原体であるCampylobacter jejuniの菌体成分(lipo-ologosaccharide : LOS)を分析することで、未知の抗ガングリオシド抗体を同定することを目的に研究を行った。まず、菌体成分を分析する菌株を選び出すために、C. jejuniが分離培養されたGBS 126症例におけるIgG抗ガングリオシド抗体(GM1、GM1b、GM2、GD1a、Ga1NAc-GD1a、GD1b、GT1a、GT1b、GQ1b)をBLISAにて測定し、10症例においていずれの抗体も陰性であった。この10例において、分離菌株のLOS成分と血中IgGとの反応性を、薄層クロマトグラフィー免疫染色において検討した結果、7例で反応性があることが分かった。この7例から分離されたC. jejuni菌株のうち3株のLOS構造を質量分析で解析した結果、1株は従来からGBSの標的分子として知られているGM1b様構造を有していたが、残り2株は標的分子としては知られていないGD1cおよびGD3/GT1a/GT3//GQ3様構造を有していることが明らかとなった。GBSにおける未知の標的分子を探索するために、GBS患者から分離されたC. jejuni菌138株においてGM1、GD1a、GQ1bエピトープを薄層クロマトグラフィー免疫染色で検討した。6株でいずれのエピトープも検出されず、そのうち1株は質量分析においてGa1NAc-GM1b様構造を有していることが分かった。
麻ひ性貝毒含有二枚貝の嗜好性を高める除毒調理法の確立

一般調理による麻痺性貝毒含有二枚貝の除毒を試みた。その結果、毒化二枚貝の毒性は、磨砕物をpH7.2に調整し、30分間煮ることで規制値(4MU/g)以下となった。調理過程での遊離アミノ酸とATPおよび核酸関連化合物量はわずかに減少したが、食味への影響は少ないと考えられた。一方、pH7.2に調整し、毒化ムラサキイガイと野菜ペーストの混合物を15分間煮た場合に除毒が認められ、大根ではきわめて高い効果を示した。以上の結果、毒化二枚貝はpH7.2に調整すること、除毒効果のある野菜と一緒に調理することで、嗜好性を損なうことなくPSPの除毒効果を発揮することが示唆された。本研究は麻痺性貝毒で毒化した二枚貝より安全に除毒できる調理法を検討するとともに、呈味成分の分析により嗜好性を高める調理加工法を確立するものである。今年度は、昨年度除毒効果のあった茹でる操作を行い、毒化カキの加熱時間が除毒状況に与える影響について検討した。試料は2013年に大阪湾で採取された毒化カキで、摩砕してpH未調整と、pH7.0およびpH7.2にpH調整したものをそれぞれ耐熱容器中で茹でる調理を行った。pH未調整とpH7.0での加熱調理では除毒効果はみられず、高毒性成分の割合が増加するなど、低毒性成分からの変換が認められた。一方、pH7.2での加熱調理では11.4nmol/gの毒量が加熱5分で1/3、加熱15分では1/10まで減少した。pH7.2下の処理では加熱時間経過とともに毒量が著しく減少し、15分の加熱調理で除毒が可能であることが確認された。また、毒化カキに含まれる呈味成分を調べたところ、核酸の主成分はイノシン酸で、70%以上を占めた。遊離アミノ酸はタウリンが約60%を占め、グルタミン酸、アラニン、グリシン、アスパラギン酸を多く含んでいた。pH7.2での加熱処理では15分以上加熱することで遊離アミノ酸は約20%減少したため、長時間の加熱により嗜好に影響を与える可能性が考えられた。次いで、一般調理への応用として、除毒処理したカキを使ってロールキャベツを調製し、一般調理が除毒に与える影響について検討した。その結果、pH7.2に調整した試料でのみ毒量の減少が認められた。しかし、均一に除毒するには一般調理では難しかい傾向にあったため、今後は均一な除毒が可能な加工食品について検討する必要があると思われる。近年、麻痺性貝毒(PSP)による二枚貝の毒化は広域化の傾向にあり、食料資源の確保の面からも問題となっている。これまで、PSPにより毒化した二枚貝の除毒法の検討が行われてきたが、食品の嗜好性に配慮した除毒加工・調理法の開発には至っていない。そこで、毒化マガキの除毒調理操作がPSPの除毒に与える影響について検討した。有毒渦鞭毛藻Alexandrium tamarenseにより毒化したマガキを試料とした。むき身にしたホール状のカキは、炭酸水素ナトリウム溶液に10分または30分浸漬した後に200°Cに設定したオーブンで焼成した。磨砕したペースト状カキはpH 7.2に調整し、ゆでるものとオーブンで焼くものに分けて調理した。調理後の試料は公定法に準じてマウス毒性試験に供するとともに、高速液体クロマトフラフィーにて麻痺性貝毒の成分分析を行った。生ガキのマウス毒性値は23.1 MU/gであった。一方、ホール状焼く試料では10分浸漬で19.3 MU/g、30分浸漬で20.6 MU/gとなり、ペースト状焼く試料でも20MU/gを越え、除毒効果は認められなかった。しかし、ペースト状ゆでる試料では、加熱5分で1/2程度まで毒性値が減少し、加熱30分では規制値(4MU/g)以下となった。生ガキの毒成分はPX1,PX2が全体の約50%を占め、その他GTX1,2,3,4およびdcGTX2,3から構成されていた。ホール状焼く試料は生ガキと同様な毒組成を示した。しかし、ペースト状の試料ではいずれの調理操作においてもdcGTX2,3の割合が増加し、ゆでる操作において高毒性のGTX1,4が減少したことで毒性値が低下したと考えられた。以上の結果より、PSPで毒化したカキは弱アルカリ処理後にゆでる操作を行うと除毒効果が高いことが示唆された。

麻痺性貝毒で毒化した二枚貝より安全に除毒できる調理法を検討し、弱アルカリ下で茹でることで除毒効果が認められた。また、毒化カキを用いてロールキャベツを調製したところ、同様の結果が得られた。そこで、本年度は、麻痺性貝毒を減毒させる食材のスクリーニングを行うと同時に、カキ以外の毒化二枚貝からの除毒効果をpH条件の面から検討した。2013年大阪湾で毒化したムラサキイガイ(230MU/g)を試料とした。剥き身にした貝を磨砕し、pH7.0およびpH7.2に調整した後、茹でる操作を行なった。加熱試料は限外ろ過にて得られた分子量10,000以下の画分をHPLC分析に供した。その結果、pH7.2に調整した試料で除毒効果が大きく、加熱5分で54%、10分では約86%、15分では92%の毒量の減少が認められた。除毒調理が貝の呈味成分含量に与える影響を調べるために核酸および遊離アミノ酸を測定した。核酸含量は加熱15分でpH調整の有無に関わらず24%減少した。また、ムラサキイガイにはグリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニンなどの遊離アミノ酸が多く、加熱調理により最大13%の減少がみられた。一方、ロールキャベツに使用した食材を中心に8種の食材と磨砕したムラサキイガイの磨砕物を1:1で混合し、除毒調理を行った結果、大根、れんこん、人参で減毒率が高く、とくに大根においては検出限界以下となり、除毒が認められた。しかし、pH未調整試料よりもpH調整試料で除毒効果は高く、食材のもつ有効成分の影響よりもpHの影響が強いことが示唆された。複合領域麻痺性貝毒の除毒が可能な一般調理条件を確認することができた。平成24年度は麻ひ性貝毒で毒化したマガキを用い、弱アルカリ処理した後にゆでる操作を行うことで除毒が可能であることが明らかとなった。今後は市販の二枚貝を使用して除毒処理を行った二枚貝の品質評価を行う予定である。平成26年度は麻痺性貝毒の除毒効果を持つ食品のスクリーニングとともに、加工食品への応用を試み、呈味成分の残存量と官能評価による嗜好性について評価する予定である。除毒処理した二枚貝をゆでるや焼く以外の調理法にて加熱調理を行い、調理条件が呈味有効成分の含有量に及ぼす影響を検討する。さらに、食材としての利用法を検索するために調理済み試料の食味試験も行う予定である。分担者の方では安全性の確認のために消耗品を購入する予定であったが、昨年購入した試薬で分析が可能であったため、予定額よりも使用金額が少なくなった。平成26年度は研究の進捗状況から分析試料数の増加が見込まれることから、次年度に繰り越し、必要な消耗品の購入に充てたいと考えている。平成26年度は除毒のスクリーニングも行う予定であり、分析試料が増加する予定である。この分を含めて麻痺性貝毒の安全性の確認を行うために残予算を使用する。平成24年度は試薬の発注が間に合わず、若干研究費に残額がでた。次年度は残額を試薬代に充当し、当年度の予定額に加えて執行する予定である。