hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳情報処理に基づくスポーツビジョンの確立とスポーツパフォーマンスの向上方略

本研究課題におけるこれまでの研究から、視覚的に物体の動きを感知する能力(運動視能)は、非スポーツ競技者に比べて卓球競技者などの球技系アスリートの方が優れていることがわかった。しかし、運動視能を含めた視覚刺激検出・弁別能は、目的とする視対象(視標)を取り巻く周辺の視覚情報によって大きく影響を受けることが知られており、視標の動きに対する感度という観点だけでなく、視野全体の不要な情報(ノイズ)の中から、いかに必要とする視対象の情報(シグナル)を分離できるか、という観点からの視機能評価が実際のスポーツ場面を想定した評価としてより重要になってくる。そこで今年度は、運動視能に対するノイズの影響を検討したところ、運動コヒーレンス感度(運動視能)は、ノイズが加わることで大きく低下し、その低下は非競技者で著しく、卓球競技者は耐性を示すことが明らかになった。このように、視覚的に物体の動きを検出・弁別し、身体的に反応する訓練を日常的に積んでいる卓球競技者では、単にシグナル検出感度が高く、弱いシグナルを検出できるだけでなく、運動シグナルの検出を妨げるノイズ情報に満ちた視覚条件下にあってもシグナル情報を確実に処理できるように視覚情報処理機構が改善されている、ということが明らかになった。脳の状態によって視機能は変化する。そこで、自由行動下のラットに視覚刺激検出課題を実施して、視機能評価としてのコントラスト感度計測を行い、大脳皮質の脱抑制効果を有するカフェイン投与の効果を検討した。その結果、カフェインはコントラスト感度を有意に改善することが明らかになった。この神経メカニズムを電気生理学的に明らかにするために、頭部固定条件下で視覚刺激検出課題を遂行中のラットの大脳視覚皮質から多点記録電極を用いて神経活動を記録する実験系を確立した。H30年度におけるヒトについての研究では、背側視覚経路の機能評価方法の妥当性や再現性を検討するとともに、計測プロトコルを工夫することで、スポーツ競技者の運動視能の特性を引き出すことを目的としていた。それら全てが予定通りに実行され、運動視能のノイズに対する耐性や脳状態依存的なゆらぎとその要因についての手掛かりを見出すことができた。動物実験については、脳状態の変化と視覚機能の関係性を直接的に調べることを本年度の目的としていたが、これについても脳の脱抑制を促すカフェインの投与によってコントラスト感度が改善されることをラットの行動実験により明らかにした。また、その神経機構を調べるために不可欠な、頭部固定下で視覚刺激検出課題遂行中のラットの大脳皮質視覚領野から神経活動を記録し、神経修飾物質などを投与することが可能な実験システムの開発も完了した。全てが予定通り順調に進んでいると言える。最終年度として、スポーツパフォーマンスに関わるアスリートの視機能について、視覚情報処理の解剖生理学的な知見に基づく実体としての神経基盤に即した評価法の確立とその体系化を行う。具体的には、既に確立した5次視覚野(運動視中枢)の機能評価法を軸として、眼(網膜)への視覚入力から5次視覚野に至るまでの各領域(外側膝状体・1次視覚野)における視機能評価法の確立し、アスリートの優れた運動視能が生み出される仕組み(どの領野のニューロンの、どのような性質が改善されているのか)を検討する。また、視覚入力から5次視覚野を経て最終的に運動出力に至るまでの情報処理機能評価を、頭部固定した心理物理実験だけでなく、実際に卓球ボールを打つスキル評価実験によって評価することで、運動視能が実際のスポーツパフォーマンスにどのように寄与しているのかを明らかにする。また、ラットを用いた視覚刺激検出課題遂行中の神経活動記録実験から、脳状態と視機能の直接的な関係を明らかにする。スポーツ場面における空間情報・運動情報の視覚的情報処理を担う背側視覚経路のニューロンの反応特性に基づいたヒトの視機能計測法として、ランダムに動くドット刺激の中から特定方向に動くドット刺激の運動方向を検出する運動方向検出課題と、高速で動くガボール刺激を把持力のコントロールでカーソルを動かしキャッチする視覚性高速連続運動課題を開発した。前者は視覚入力から運動視中枢に至るまでの情報処理機能を評価するために、後者は視覚入力から運動視中枢を経て、運動視情報処理の結果に基づいて運動出力を発現させるまでの情報処理機能を評価するために開発された課題であり、前者の課題成績は後者のそれと関連することが期待される。そこでこの点を明らかにするために、両課題をセットにして複数回の計測を実施したところ、同一被験者内において、両課題の成績に有意な相関関係が認められ、運動視の高低が視覚性運動のパフォーマンスを左右する事が明らかになった。スポーツ時、脳内に神経修飾物質が分泌されることで脳状態は変化する。その代表的な神経修飾物質の一つがノルアドレナリンであるが、どのような機能的変化を引き起こすのかについてはよくわかっていなかった。そこで、視覚機能に対する影響を調べるために、視覚刺激検出課題を学習させたラットのコントラスト感度を自由行動下で計測し、ノルアドレナリン受容体阻害薬の効果を検討した。その結果、課題中に脳内分泌されるノルアドレナリンはβ受容体を介してコントラスト感度を上昇させていることが明らかになった。これは、明暗差が小さい見難い物体をより見えるように視覚情報処理を亢進させていることを意味し、スポーツ場面においても同様な効果が発揮されていると考えられる。当該年度の計画では、1ヒトの背側経路機能計測システムの「背側経路の各ステージのニューロンの反応特性に基づいた基本的視機能計測法」を開発すること、2動物実験を用いて脳状態の最適化を促す運動プログラムついての包括的・系統的な検討を行うこと、であった。

1と2の計画はいずれも達成され、1については予定通り二つの視機能計測システムを確立し、それらのシステムを用いた計測・評価実験を開始し、2についてもラットを用いた研究から、脳内ノルアドレナリンによりベータ受容体活性化状態により視機能が更新することを見出し、PLOS ONE誌に報告した。運動情報の視覚的情報処理を担う背側視覚経路のニューロンの反応特性に基づいたヒトの視機能計測法として、ランダムに動くドット刺激の中から特定方向に動くドット刺激の運動方向を検出する運動方向検出課題を昨年度に開発した。今年度は、これを用いて競技者と非競技者を比較したところ、スポーツ競技者の運動視能は非競技者よりも有意に高く日々の訓練効果は、感覚情報処理にも生じていることが明らかになった。身体運動時に脳内に分泌され、脳状態を変化させる神経修飾物質の一つにセロトニンがあるが、その機能的役割については不明な点が多い。特に、身体運動制御に関わる感覚情報処理から運動情報処理までのプロセスが、どのような修飾効果を受けるのかについてはよく分かっていない。そこで、視覚情報処理機能に及ぼす影響を調べるために、視覚刺激検出課題を学習させたラットのコントラスト感度を自由行動下で計測し、セロトニンの再取り込み阻害薬投与による脳内セロトニン濃度上昇の効果を検討したところ、コントラスト感度が上昇することが明らかになった。これは、明暗差が小さい見難い物体をより見えるように視覚情報処理を亢進させていることを意味し、スポーツ場面においても同様な効果が発揮されていると考えられる。麻酔下のラットの一次視覚野から単一ニューロン活動を記録し、セロトニンの再取り込み阻害薬の効果を検討したところ、自発発火や視覚応答に促通生あるいは抑制性の修飾作用を観察することができた。これらの修飾効果がコントラスト感度上昇に関わっていると考えられる。H29年度は、ヒトの視覚背側経路の機能評価方法の妥当性や再現性を検討するとともに、確立した評価方法を用いて、スポーツ競技者の機能評価を行うことが目的であった。それら全てを予定通りに実行し、スポーツ競技者が非競技者よりも視機能が高いことを見出すことができた。動物実験については視覚刺激検出課題を用いた行動実験により、脳内のセロトニンが視機能を向上させることを示すことが出来たものの、課題遂行中の神経活動記録については、十分なニューロン数の結果を得ることができなかった。本研究課題におけるこれまでの研究から、視覚的に物体の動きを感知する能力(運動視能)は、非スポーツ競技者に比べて卓球競技者などの球技系アスリートの方が優れていることがわかった。しかし、運動視能を含めた視覚刺激検出・弁別能は、目的とする視対象(視標)を取り巻く周辺の視覚情報によって大きく影響を受けることが知られており、視標の動きに対する感度という観点だけでなく、視野全体の不要な情報(ノイズ)の中から、いかに必要とする視対象の情報(シグナル)を分離できるか、という観点からの視機能評価が実際のスポーツ場面を想定した評価としてより重要になってくる。そこで今年度は、運動視能に対するノイズの影響を検討したところ、
チタン鉄鉱,及び磁鉄鉱とマグマ間のバナジウムの分配に関する実験的研究

本年度は今までの鉄-バナジウム-シリカにチタンを加えた系の実験を完成させた。昨年度の結果と本年度の結果を解析し、マグマ、磁鉄鉱、チタン鉄鉱三者が全て理想溶液であると仮定し、バナジウムの分配系数の温度、酸素分圧依存性を数式化した。それを天然の岩石に適用して妥当性を検討するために、磁鉄鉱、及び磁鉄鉱とチタン鉄鉱を斑晶として含む岩石試料を収集しそれ等の鉱物と石基を分離し、主化学組成とバナジウムの濃度を定量分析した。その結果、共存する磁鉄鉱とチタン鉱鉄から求めた温度及び酸素分圧とバナジウムの分配を利用して求めたものとの間に系統的な差が認められた。バナジウムの分配を利用する方法の結果は、温度が高く、酸素分圧は多少低くなった。但し酸素分圧の差は極めて小さい。ところが、他の地質温度計を用して求めた温度は、本実験で求めたバナジウムの分配を利用した結果にほぼ一致しており、この差異の原因の究明は次の計画の準備が必要である。本来バナジウムの分配に関与しているのは3価だけであるから、この分配を利用して、温度と酸素分圧を同時に求めるという方法にも問題はあるものの、磁鉄鉱とチタン鉱鉄のウルボスピネルと、ヘマタイトを利用する方法に比べて、溶岩の冷却過程で元素の再分配がおこらないため、より高温の状態を保っているので、本実験結果から得たバナジウムの分配を利用する方が、より実際に近い温度を示していると考えられる。しかしながら、実験では主化学組成が分配に大きな影響を与えることが明らかとなり、適用可能な岩石はソレアイトまたはカルクアルカリ岩系の石英安山岩、流紋岩等の限定された化学組成を持っている岩石に限られている。
メソスコピック凝固プロセッシング

材料は工業技術の基盤であり,鉄鋼を中心に材料を高度化し社会基盤を更なる安全生を有するようにと期待することは,今尚極めて大きい。地球環境の保全からCO_2対策・廃棄物対策・省エネルギー対策などが極めて深刻かつ焦眉の急として声高に叫ばれている。これを材料科学・材料工学の観点から見ると,耐熱合金の開発,高強度化,耐摩耗・耐酸化・耐熱材料などの多用途極限環境材料の開発など地道で着実な努力が要求されている。一方,合金開発は莫大な試行錯誤の結果生まれてきたものが大部分であり,「やってみなければわからない」状態であった。他方,材料の強度・靱性・信頼性に対する要求は,純度・組織粗さ・構造の完全さの内から1つ以上をメソスコピックに制御することを要望されるに至っている。核発生・結晶成長・析出などが順次あるいは同時に生じる凝固プロセスのメソスコピックな制御が新たな材料の創製ならびに材料の信頼性の格段の向上をもたらす可能性が拓けてきた。このような状況を踏まえて本総合研究では凝固・結晶成長のメソスコピックな物理現象をより深く理解し,その制御法を探索するとともに,新しい物性特に耐熱・高強度高靱性を有する新しい材料の可能性を提示し「メソスコピック凝固プロセッシング」と呼ぶことが出来る新しい研究分野を創出することを目的とし,日本金属学会・鉄鋼協会・鋳造工学会・学振19委員会の開催にあわせて会合を随時重ねてきた.最初に,基礎的なメソスコピックレベルでの凝固現象の理解を深め,それを制御して凝固プロセッシングの展開を図るために,現状の理解と今後取り組むべき対象を明確にすること,に努めた。主要な研究調査項目は,凝固アロイデザイングループ,凝固組織の形成をシミュレート,核発生制御凝固プロセッシングおよび極限環境利用プロセッシンググループとした.これにより新たなメソスコピックなプロセッシングを創出する研究分野への理解ならびに深化が図られた。
磁気共鳴による高圧力下分子性物質新機能の探索

本課題では高圧下での分子性物質の機能性を磁気共鳴法によって探索することを目的とした。課題遂行のため圧力の増減を任意の温度で加減できるガス圧力方式に加え、A01班の村田グループと共同研究を行い圧力媒体にダフニー7474オイルを使用し4Gpaまでの高圧、それ以上はダイヤモンドアンビル方式による圧力発生方式を導入し核磁気共鳴実験を行った。この結果以下のことを見出した。モット絶縁体κ-(BEDT-TTF)2Cu2(CN)3において三角格子に起因するフラストレーションによってスピン液体状態が実現していること、加えて加圧下NMR測定からスピン液体相に超伝導相が隣接していることを見出した。擬二次元モット絶縁体κ-(BEDTT-TTF)2Cu[N(CN)2]C1において圧力をパラメータとしたモット転移近傍の相図を完成させ、特異な臨界指数をもつことを見出した。有機伝導体θ-(BEDT-TTF)2I3は高圧下でゼロギャップ伝導体の可能性が指摘されているが、高圧下で13C NMR測定を行いスピン-格子緩和率、スピンシフトの振る舞いがゼロギャップ状態と矛盾しない結果を得た。中性-イオン性(N-I)転移を示すDMTTF-CAのNQR測定を行い、この物質のN-I転移が量子臨界性をもつ可能性について探索した。加えて同じくN-I転移を示すTTF-CAに関してNQR測定を高圧領域まで行うことにより、従来、見つかっていないイオン性常誘電相の存在の可能性を指摘した。本申請では高圧下における物性測定を行うため、圧力を印加し保持する高圧セルの使用が必要不可欠である。従来、使用されてきた高圧セルはBeCuを材料に用いたクランプ式のものであり耐圧が2GPa前後であった。これ以上の圧力下での電子相探索のため、当A01班、村田恵三氏の協力を得て、新構造材料を用いたセルのテストをまず行った。その結果、新型セルを用いることにより、旧来のBeCuセルの耐圧を越える3GPaに到達することができ、より広い領域での物性測定が可能となった。この圧力セルを用い、常圧下では電荷秩序形成によって絶縁化している1/4-filling系有機導体(DI-DCNQI)_2Ag塩の高圧力下での物性実験に取り掛かった。特に従来使用していたBeCuセルでは耐圧の関係で測定できなかった2GPaを越えるような圧力を中心に調べた。その結果、より高圧領域まで、この物質に関する温度-圧力相図を得ることができた。2.3GPaでは測定下限温度である1.5Kまで電荷秩序は形成されず電気抵抗が金属的になっていることがわかった。これは、高圧を用いることによって、電荷秩序を融解させ金属相を出現させることができたことを意味する。この圧力よりもわずかに低圧でおこる電荷秩序への転移は低圧側で観測された2次転移とはことなり1次転移であることが判明した。強く相互作用する^3Heや電子系などのフェルミ粒子系は、相関の強さに対して局在不安定性を持っている。この不安定性に関する磁場の効果は、興味ある問題である。理論研究によれば、磁場がフェルミ粒子の局在を引き起こすとされているが、それを実証した実験は無い。この問題の電子版は、強相関金属は磁場でモット転移するか、ということになる。本年度、我々は、圧力によって電子相関を容易に制御できる擬2次元有機伝導体κ-(ET)_2Cu[N(CN)_2]Clの電気抵抗を様々な温度、圧力、磁場のもとで測定し、問題となっている磁場誘起転移の有無を調べた。その結果、モット転移寸前の金属相は磁場によって絶縁体へと1次転移することが明らかになった。また、ヘリウム媒体圧力セルを用いたNMR実験装置の立ち上げを行った。種々のテストを行った結果、対応周波数領域20-90MHz、励起RF磁場振幅100ガウス以上を達成し、来年度からの13C NMR実験の体勢は整った。

DMTTF-QCl_4は、常圧下で温度変化により中性(N)相からイオン性(I)相に転移する物質で、量子相転移が議論されている一連の物質の一員でもある。我々は、この物質のN-I転移における電荷移動と格子2量体化の詳細を調べるためにQCl_4の塩素核のNQR実験をおこなった。まず、65Kでの転移にともなう電荷の移動と格子の2量体化によるNQR吸収線の分裂とシフトが観測された。スペクトルの温度依存性から、この転移が連続転移もしくは極めて弱い1次転移であることがわかった。緩和率1/T_1も転移温度近傍で臨界発散を見せることからも、これが裏付けられた。スペクトルの解析から、転移に伴う電荷移動と格子2量体化の起こり方を独立に特徴づけることができ、電荷移動が連続的なのに対し2量体化が急峻におこることも明らかになった。(1)三角格子における量子スピン液体から超伝導への転移ほぼ等方的な三角格子をもつ有機モット絶縁体κ-(ET)_2Cu_2(CN)_3の加圧下で現れる超伝導状態を探るべく単結晶^<13>C NMR実験を行った。その結果、(i)核スピン-格子緩和率1/T_1は超伝導転移直下でいわゆるコヒーレンスピークを示さずT^3で温度変化すること、(ii)ナイトシフトの変化が極めて小さいことがわかった。この結果は、電子対の軌道対称性がk-空間で線状のゼロギャップを与えるようなものである一方、スピン状態がトリプレットである可能性を残すものである。(2)中性-イオン性転移の揺らぎDMTTF-QBr_nCl_<4-n>(n=0-4)は,分子間の電荷移動(中性-イオン性(NI)転移)をともなった格子の変位により分極を示す物質群である.NI相転移点が絶対零度近傍にあり量子常誘電体と目されているDMTTF-2,6-QBr_2Cl_2の低温における揺らぎを明らかにするために,Br NQR測定を行った。その結果、DMTTF-QBr_nCl_<4-n>(n=0,2,4)のスピン-格子緩和率1/T_1は,約100K以下の低温でDMTTF-QBr_4の値より大きな値を示し,フォノンの熱揺らぎ(∝T^7)では説明できない揺らぎが1.7Kでも残存していることが明らかとなった。(3)単一成分分子性導体の磁気転移の加圧効果単一成分分子性導体として注目されている[Au(tmdt)_2]は、常圧下で110Kという高い温度で反強磁性転移が起こることが示唆されている。このメカニズムについては、第一原理バンド計算がなされていて、ネスティングしやすい平らなフェルミ面が予言されている。我々は、圧力依存性の実験からも磁気転移の機構を探るべく、加圧下で1H NMR実験を行った。その結果、8kbarでは小さいながら、明確な転移温度の降下が観測された。これは、転移のネスティング機構と矛盾しない。さらに高圧領域での実験を進めている。平成18年度はダイヤモンドアンビル法を用いた5GPa以上の超高圧下での実験環境の整備、ガス圧力を用いたモット転移の研究、一軸加圧下モット絶縁体の研究、中性-イオン性転移の研究、さらにゼロギャップ半導体状態の研究を行った。
最適ロバスト性を有する適応デッドビート制御

ある有限な時刻以降、被制御量(出力)を目標値に完全に一致させるというデッドビート制御は、離散時間制御における主要な研究である。しかし、制御対象の変動や外乱に対して、制御出力が極度に劣化してしまうという問題点が指摘されており、実用上の問題点とされてきた。この問題点をYoula et al.によって導出された安定化補償器の一般形表現と、2自由度補償法によって解決できるという着想を計測自動制御学会論文集に発表した。その理論では、デッドビートの時間を最短にすることと、ロバスト性を最適化することが同時に達成されるという注目すべき点を明確にした。この成果をうけて本研究では以下の諸結果を得た。1)従来のデッドビート制御は出力変数の有限時間整定のみに注目し、制御入力には注意が払われていなかった。本研究では、出力と入力の両方をデッドビートさせる制御系の構成法を考案した。そのような全てのコントローラのパラメトリゼーションを与えるとともに、出力変数をデッドビートさせれば制御入力もデッドビートする条件も明らかにした。2)ロバストな追従特性とデッドビート性の両特性をもつコントローラの構成法を明らかにした。ロバスト性の指標にはH∞のノルムを採用し最適ロバスト性と最短時間整定を達成するコントローラのクラスを求めた。3)あらかじめ将来の目標値が既知であるとき、その情報を有効に用いてデッドビートに近い制御を達成する手法を開発した。4)零位相差追従制御系は有限時間先の情報が既知であるときの有効な追従制御系として注目されている。本研究では、追従すべき周波数域を決めたときのゲインを最適化することにより最適零位相差制御系の構成法を与え、従来の手法よりもすぐれた性能を持たせることができた。
中世後期イタリア都市における司法と政治

本研究の目的は、共和制からシニョリーア制、寡頭制への移行期のイタリア都市において、公権力としてのコムーネの性格がいかに変化したかを司法面から明らかにすることであった。各年1カ月程度、イタリアの文書館に赴き、裁判記録簿や議会議事録の調査、収集を行った。そこからは司法をめぐる政府や裁判官、市民らの実践によって、司法と政治とのバランスが後者に傾いていく様子が明らかになった。この成果は国内外の学術雑誌においてまもなく公表される予定である。本研究の目的は、中世後期イタリア都市の統治権力たるコムーネ(都市自治共同体)の特質とその変化を司法面から解明することであった。本年度は、14世紀後半から15世紀の民事司法の変化を跡付け、また刑事司法面から政治と司法との関係を考察した。特に、イタリア・ルッカ国立文書館やピサ国立文書館に赴き、裁判記録、公証人記録、議会議事録などを収集し分析を進めた。中世後期の民事司法の変化について、ルッカの裁判記録簿や公証人記録簿から検討したところ、14世紀から15世紀にかけて、法学者による法形式主義的な裁判から、裁判官の自由裁量にたよる裁判へ変化していたことが明らかになった。この成果は、「紛争解決制度化の比較史ー前近代における「裁判」と「裁判外」」研究会(秋田大学、2012年8月25日)において「中世イタリア都市の公証人と裁判」という題目で報告した。また「裁判からみた『新しい世界史』の試み」研究会(東京大学、2012年10月8日)においても「中世イタリア都市における契約と裁判」という題目で報告した。本年度は刑事司法に焦点を絞った。2週間にわたってルッカ国立文書館において刑事裁判記録を閲覧、収集、分析を行い、帰国後も写真データの形で検討を行った。裁判記録以外にも、政治の場で作成される議会議事録や決議録を閲覧、分析し、政治と司法との関係を検討した。これらの史料を基にした成果はブラッチェル教授の退官記念論集(Essays in Honour of Dr M.E. Bratchel, in press (2013))の"The gratia and the expansion of politics in fourteenth-century Lucca"という題目の論文において公表される予定である。ルッカの事例をイタリア都市の文脈で理解するためには、他都市との比較が不可欠である。中世後期のフィレンツェを対象に刑事司法と政治との関係を研究しているカリアリ大学のロレンツォ・タンツィーニ教授と個別にディスカッションを行った。その結果、ルッカとフィレンツェとの事例の共通性や差異が明確になり、さらなる比較検討の必要性を確認するに至った。コムーネの性格は司法以外の行政活動からも見ることができる。中世都市の衛生環境に関する研究をしているアムステルダム大学のギュイ・ゲルトナー教授とも、ルッカのコムーネの特性について議論した。そこでは都市行政の幅広い観点から司法とコムーネを検討する必要性を確認した。当初予定していたイタリアの文書館での史料調査を無事行うことができた。そしてそこで収集した史料の分析から想定していた以上の様々な情報を得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。初年度に収集した史料を読み込むとともに、さらに史料が必要となった場合にはイタリアに渡航し文書収集に当たる。
未分化胚性幹(ES)細胞で高発現する遺伝子sall4の機能解析

本研究は、多能性幹細胞におけるSall4の機能解析を目的としている。本年度は、人工多能性幹(iPS)細胞誘導過程におけるSall4の役割について解析した。マウス胎仔線維芽細胞から、初期化因子であるOct3/4,Sox2,Klf4を用いたiPS細胞誘導過程において、Sall4のLoss of functionおよびGain of functionによる遺伝子機能解析を行った。レトロウィルスによるSall4ノックダウンを行った結果、iPS細胞の樹立効率が低下した。一方で、レトロウィルスによるSall4の強制発現は誘導効率を高めた。また、数種類のヒト成人皮膚由来線維芽細胞(HDFs)株では、iPS細胞誘導過程におけるSALL4の強制発現は誘導効率を高めるが、効率の向上が認められないHDFs株も確認できた。効率の向上が認められたHDFs株は、誘導前および誘導中の内在性SALL4の発現量が低いことが分かった。以上の結果から、Sall4は線維芽細胞から多能性幹細胞を樹立する際に必要であり、かつ誘導効率の向上に寄与することを明らかにした。さらに、iPS細胞作成時に、他の因子のリプログラミング能力を検証する上で、各HDFs株が実質的に異なるという性質は考慮しなければならない事項であることを示した。以上の研究は、人工多能性幹細胞誘導の分子機構の解明に貢献し、幹細胞生物学および再生医療の発展に寄与するところが多い。ES細胞は多能性幹細胞であり、近年、再生医療への応用に期待が高まっている。近年、ES細胞から種々の有用な分化細胞を効率よく作出する多くの研究がなされているが、多能性を維持しつつ、大量に、かつ安全にES細胞を増殖させることは応用を目指す上での大前提となり、そのためにはES細胞の自己複製能の分子機構の解明が望まれている。その一端を明らかにするため、本研究ではヒトES細胞でも高発現することが示唆される遺伝子sall4の機能解析を行っている。sall4の変異マウスを作製し、解析した結果、これまでに、Sall4+/-マウスは外脳症、Curly tailといった神経管閉鎖異常や、肛門形成不全が原因で成獣となるまでに約半数が致死となることを明らかにした。現在、これらの表現型となる分子メカニズムを解析中である。また、sall4-/-マウスは受精後6.5日目以前に致死となった。この原因を明らかにするため、in virtoでsall4-/-胚盤胞を培養し、解析した結果、sall4-/-ICMでアポトーシスの誘導は認められなかった。一方sall4-/-ICMの増殖は極めて遅く、-/-ICMから-/-ES細胞は期待値の20%と、低頻度でしか樹立できなかった。これらのsall4-/-ESを詳細に解析したところ、細胞株間によって増殖能、分化能、腫瘍形成能などの性質が異なることや、Sall4の下流候補因子の発現に変化がなかった。このことから、sall4-/-ICMからのES細胞の樹立過程、また樹立されたES細胞でSall4下流因子がSal14の機能を補完していることが考えられる。現在、sall4+/+,-/-ESを用いてクロマチン免疫沈降を行い、Sa114標的因子を確定することで、Sall4のES細胞での機能を明らかにすることを試みている。前年度までにSall4-/-マウスが着床直後に致死となり、Sall4-/-ICMからSall4-/-ES細胞は低頻度でしか樹立できないことを明らかにし、また、樹立された-/-ES細胞株は何らかの因子によりSall4の機能が補償されている可能性を考えた.そこで-/-ES細胞でSall4の機能を補償する因子を同定するため、Sall4+/+,-/-ES細胞に,sall1,sall4に対する合成siRNAを導入し,Sall1,Sall4をノックダウンした時のNanogの発現量の変動を調べた.結果、-/-ES細胞でNanogの発現量は低下しなかったが,野生型ES細胞でSall4をノックダウンすると発現量の低下が認められ,さらに、-/-ES細胞でもSall1の発現量に応じてNanogの発現低下が認められた事から,これら低頻度で樹立されたSall4-/-ES細胞株では,Sall4の,少なくとも一部の機能をSall1が代償している事が示唆された.また、Sall4の直接の標的遺伝子を同定するため,マウスES細胞を用いて,ES細胞の多能性維持や分化を支持する遺伝子のプロモーター,エンハンサー領域でクロマチン免疫沈降法を行い,内在性Sall4が結合する領域を調べた.結果,ES細胞の未分化維持に必須である3つの転写因子,Sox2,0ct3/4,Nanogに共通する標的遺伝子のいくつかはSall4の標的遺伝子でもあり,未分化性を支持する遺伝子の転写活性化や,分化を支持する遺伝子の転写を抑制している事が示唆された.さらに,Sox2,0ct3/4,Nanog,またSall4自身の転写調節領域にSall4が結合する事を明らかにし,これら転写因子はSall4で発現制御されると考えられた.当研究で,Sall4はES細胞の特性を支持する転写因子ネットワークの主要因子である事を明らかにすることができた.本研究は、多能性幹細胞におけるSall4の機能解析を目的としている。

マウス胎仔線維芽細胞から、初期化因子であるOct3/4,Sox2,Klf4を用いたiPS細胞誘導過程において、Sall4のLoss of functionおよびGain of functionによる遺伝子機能解析を行った。レトロウィルスによるSall4ノックダウンを行った結果、iPS細胞の樹立効率が低下した。一方で、レトロウィルスによるSall4の強制発現は誘導効率を高めた。また、数種類のヒト成人皮膚由来線維芽細胞(HDFs)株では、iPS細胞誘導過程におけるSALL4の強制発現は誘導効率を高めるが、効率の向上が認められないHDFs株も確認できた。効率の向上が認められたHDFs株は、誘導前および誘導中の内在性SALL4の発現量が低いことが分かった。以上の結果から、Sall4は線維芽細胞から多能性幹細胞を樹立する際に必要であり、かつ誘導効率の向上に寄与することを明らかにした。さらに、iPS細胞作成時に、他の因子のリプログラミング能力を検証する上で、各HDFs株が実質的に異なるという性質は考慮しなければならない事項であることを示した。以上の研究は、人工多能性幹細胞誘導の分子機構の解明に貢献し、幹細胞生物学および再生医療の発展に寄与するところが多い。
血小板減少症治療薬インターロイキン-11を用いた心不全発症予防戦略の確立

血小板減少症治療薬インターロイキン-11(IL-11)の傷害心筋に対する保護効果についてヒト心筋培養細胞および心筋梗塞モデル動物を用いて検討した結果、IL-11はSTAT3を介し、心筋梗塞後の傷害心筋組織に対し保護効果を示した。このことは、IL-11の心筋保護・修復・再生促進作用を有する可能性を示唆し、本研究により、心不全発症予防薬としてのIL-11の臨床応用に向けた基盤的研究成果を提示することができた。Interleukin(IL)-6関連サイトカインは心筋組織傷害後の修復・再生において重要な役割を演じているが、それらの多くは全身性に炎症反応を誘発することが知られており、臨床応用するのが難しいと考えられる。IL-6関連サイトカインの中のIL-11は、血小板減少症治療薬として米国で認可され、既に臨床応用されていることより、本研究では、IL-11の心不全発症予防薬としての臨床応用の可能性を検討するため、サイトカインによる心筋における内因性の保護・修復・再生機構を賦活化することによる新たな心不全発症予防戦略の確立を目的とし、i)IL-11のヒト心筋培養細胞に対する効果(細胞レベルでの確認)について検討を行った。以上、本研究により、IL-11がヒト培養心筋に対し保護効果を有することを確認することができた。また、本研究はIL-11の心筋への影響を培養ヒト心筋細胞を用いて検討した最初の実験系であり、今後、ヒト心筋保護評価系を確立するためにも本研究成果が有用になるものと思われる。IL-6関連サイトカインの中のIL-11は、血小板減少症治療薬として米国で認可され、既に臨床応用されていることより、本研究では、IL-11の心不全発症予防薬としての臨床応用の可能性を検討するため、サイトカインによる心筋における内因性の保護・修復・再生機構を賦活化することによる、新たな心不全発症予防戦略の確立を目的とし、i)心筋梗塞モデル動物に対するIL-11の効果(生体レベルでの確認)について検討を行った。その結果、心筋梗塞モデルマウスにIL-11を静脈投与したところ、細胞レベル同様、心筋においてSTAT3が活性化されることを確認した。心機能は、心筋梗塞後に起こる心機能の悪化をIL-11投与により抑制されること、組織学的変化において、IL-11投与群では心筋細胞の線維化(心不全の前段階で多く観られる現象)が無処置群に比べ抑制されていた。更に、分子生物学的評価方法により、IL-11が投与された心筋ではアポトーシスを起こしている細胞数が無処置群に比し、減少しており、この時、IL-11投与群では、Bcl-2(アポトーシス抑制蛋白)が心筋で発現上昇していることを確認できた。以上のことより、IL-11がヒト心筋組織の保護・修復・再生促進作用の可能性を示唆し、本研究が心不全発症予防薬としての臨床応用に向けた基礎研究成果を提示するものと考えている。
次世代農業支援のための高機能センシング技術の開発

高品質な農作物を効率よく生産するために,主に3つの対象ー栽培されている農作物の生育状況,耕地等生育環境,農作業の実施状況ーをセンシングし,その結果を適切に統合することが必要である.従前より開発されてきた各種センシング技術に加えて,農作物栽培現場内の微気象環境,植物形質発現・生体,農作業履歴等を時間的・空間的に詳細・リアルタイムかつ簡便に計測できるセンシング技術,およびセンシングされた情報を統合し,農業生産に必要な情報の可視化技術等の研究・開発が極めて重要となる.本研究では,主に,植物生体計測,圃場環境計測,農作業者計測,センサ情報融合とヒューマンインターフェースの4つについて研究を進めた.平成27年度の主な研究実績は以下の通りである.・トマトハウスにおいて,農作業者が装着したスマートウォッチで計測した動き情報からから「いつ,誰が,収穫作業を行なった」という農作業内容を自動取得する研究を行った.また,電波を発信するビーコンをトマトハウス内に複数設置し,農作業者が持っているスマートフォンで受信される電波強度から「いつ,誰が,どこで作業を行なった」という農作業位置を自動取得する研究を行った.これらを組み合わせることにより、「いつ,誰が,どこで,収穫作業を行なった」という農作業情報を自動取得できるようになった.・圃場環境条件と植物の生育特性を評価するために,温湿度,照度等のセンサ,RGBカメラおよびワンボードマイコンを組み合わせた計測装置の製作を行った.本装置を用いてハウス内の環境情報とコマツナの草高を計測した結果,積算気温と草高には明瞭な正の相関関係が存在し,本結果からコマツナの生長を予測できる可能性があることを示した.遠隔操作方式の移動台車に上記計測装置を搭載することにより,ハウス内の環境と植物生育状態の空間計測を行った。・農業ICTでは情報として使われることがほとんど無い,植物からの揮発性有機物(biogenic VOC; BVOC)を測定するための蛍光性分子鋳型MIPマイクロビーズを合成した.テンプレート分子により形成した鋳型に適合する分子認識能力の確認と光学的な測定を行った.対象分子はトマト果実から成熟度により揮発量が変化するヘキサナールとメチルヘプテノンとし,対象分子によって蛍光特性が変化する蛍光色素を選び,ビーズ中に配置した.結果,対象物質への蛍光変化を得たが,分子選択性については十分でなく,鋳型の作成条件について検討が必要であった.以下のような進捗状況により,おおむね順調に進展していると判断した.・「いつ,誰が,どこで,どの作業を行なった」という農作業情報について,収穫作業に絞って自動取得を実現した.これにより、農作業者に負担をかけることなく安定して農作業情報を自動取得するには,どのような情報をどのような機器を利用して計測すれば良いかという根本的な課題に対して解決の方向性を見出すことができた.・既存のセンサと廉価なRGBカメラを組み合わせた計測システムにより実用レベルでハウス内の計測が行えることを示した.一方,本年度自律移動式のモニタリング装置の試作も行う予定であったが,本研究で開発・搭載予定であったセンサの仕様決定に一部遅れが生じたため,自律移動式モニタリング装置の設計のみを行い,試作に関しては次年度に行うこととした.・植物の生理的な状態を匂いで検知するための基礎実験として,植物BVOCを検知・可視化する方法の検討,および材料の選択やセンサ方式の検討と材料開発が進んでおり,予定通りの進捗となっている.平成28年度の主な研究実績は以下の通りである.・前年度に行った,農作業者に装着したスマートウォッチで計測した動き情報からから「いつ,誰が,収穫作業をしたのか」という農作業内容を自動取得する研究について,収穫以外の農作業や他の農作業者にも適用可能とするための改良を行なった.・サーボモータとワンボードマイコンからなる自律移動式モニタリング装置の試作を行った.本装置の大部分は3Dプリンタを用いて造形されており,移動部と計測部が独立しているので,種々のセンサやカメラを搭載できる仕様となっている.計測実験では装置に全天球カメラを搭載し栽培空間の360度画像の撮影が行えることを示した.・農場におけるカメラの3D位置姿勢推定のために,パノラマ画像をデータベースとして作成し,入力された画像がパノラマ画像上のどこに相当するかを算出する再同定問題の研究を行い,カメラの位置姿勢推定を行うための基盤技術を構築した.また,画像を用いたフェノタイプ・生育状況解析のために,植物を撮影した画像から葉領域の切り出し,葉の枚数の数え上げ,葉の面積などを自動的に行う研究を行った.特に,葉領域とそれ以外を分割するための基盤技術を構築した.・植物からの揮発性有機物(biogenic VOC; BVOC)を光学的に検知できる蛍光性分子鋳型マイクロビーズの開発研究を継続し,その分子認識特性の確認を行った.また,植物が病害虫に侵された際に揮発するテルペン類を対象とした分子認識材料の開発を新たに実施した.蛍光性マイクロビーズについては検知対象となるトマトから発生するヘキサナールとメチルヘプテノンについて、鋳型を合成する際のテンプレート分子に類似物質を選ぶことで、分子選択性を持つ蛍光変化、および対象ガスの可視化検知が可能であった.以下のような進捗状況により,おおむね順調に進展していると判断した.・

「いつ,誰が,どこで,どの作業を行なった」という農作業情報について,機械学習の導入によって収穫作業以外の農作業,および多数の農作業者に対しても,学習データを用意することで適用可能であることを示すことができた.・移動式モニタリング装置を試作したことにより,ハウス内の環境や植物の時空間情報を計測できるようになった.本装置を構成するパーツの多くは3Dプリンタで造形できると同時に,他のセンサを搭載する場合の装置の仕様変更にも柔軟に対応できる構造とした.以上により,本装置は本研究で開発されるセンサのプラットフォームとしての利用が可能である。・パノラマ画像から切り出された多数の画像とそのパノラマ上の座標をペアとして深層学習により学習させることで,新たな画像を入力とした際にそのパノラマ上での画像を出力させるNNを構築できた.また,深層学習に基づく分割手法を利用した場合の,葉領域切り出し精度の検証を行った.いくつかの画像に対して,葉領域の真値を作成し,画像と真値をペアとしてニューラルネットワークに学習させることで精度検証を行った結果,既存の機械学習手法であるSVMによりも高精度であることを確認した.・テルペン類については広く植物が揮発させることが知られているジャスモン酸類を検知対象として,金属ナノ粒子の島状基板を分子認識材料(分子鋳型ゾルゲル)でコーティングし,その局在プラズモン共鳴変化によって検知できることを確認した.BVOCとしてテルペン類を加えることで,農業ICTとしての匂い測定の応用範囲を広げることができ,新しい植物用匂いセンサ開発への道筋が得られた.植物から発生する匂いの計測については,植物が揮発させるpVOC(plant Volatile Organic Compound)を測定する事で,植物の生育状態,病害虫による損傷,病原菌への感染を早期に検知することができる.そのために代表的なpVOCであるテルペン類,特に虫による食害を受けた際に放出されるcis-jasmoneを選択的・高感度に検知できる分子鋳型技術とプラズモニックガスセンサを組み合わせたpVOCセンサの開発を行い,選択的なcis-jasmone検知に成功した。植物の生育状況については,以下の3つについて研究を進めた.(1)異なる波長を発光する複数のLED照明を高速にスイッチングすることで,高速にハイパースペクトルイメージをキャプチャするシステムを開発し,vegetation indexを簡単に計測できることを示した.(2)栽培中のトマト植物を赤外線カメラで撮影した一連の生育画像に対してOptical flowを適用することにより,水分ストレスによる植物体の形状変化や概日リズムと呼ばれる周期的な植物体固有の運動を低コストで計測できることを示した.(3)RGB-Dセンサをコマツナの生育評価に用いた結果,葉面積計測の精度向上や草高のリアルタイム計測が可能であることを示した.農作業情報を計測については,トマトハウスにおいて農作業者の両手首にモーションセンサを装着し,その計測データから農作業者の収穫動作を認識した.同時に、ハウス内に多数設置したビーコンの電波を農作業者が携帯しているスマートフォンで受信することで農作業者の位置を推定した。これらの情報をもとに、日々のハウス内の小区画ごとのトマト収穫数を表す収穫マップを生成し、それをハウスの地図に重畳表示するスマートフォンアプリを構築した.これによりハウス内の収穫数のばらつきを視覚的に把握できるようになった.高品質な農作物を効率よく生産するために,主に3つの対象ー栽培されている農作物の生育状況,耕地等生育環境,農作業の実施状況ーをセンシングし,その結果を適切に統合することが必要である.
核酸結合試薬を用いた食品関連細菌の生菌死菌判別法

PCRは様々な環境中に存在する微生物の検出や定量に広く利用されている。しかし、PCRは生菌と死菌を区別することができず、食品製造現場における微生物検査において偽陽性や菌数の過大評価を引き起こす。近年、Propidium monoazide (PMA)を死菌の細胞へ取り込ませ、DNAと結合させることによりPCRの標的から除外する方法が報告されている。しかしながらその処理条件は報告によりまちまちであり、必ずしも最適化されているとは言い難い。本研究では、LEDを用いて最適な照射波長を決定し、PMAの濃度、処理時間を検討し、PMAとDNAの結合には375nmの照射波長が最適であることを明らかにした。本研究では、遺伝子手法を用いた食品中の微生物迅速モニタリングの際に常に問題になっていた、生菌死菌の判別について、核酸結合試薬であるエチジウムブロミドモノアジド(EMA)、プロピディウムモノアジド(PMA)等を用いて解決を図り、より正確なモニタリング方法(NBR-PCR法)を確立することを目的としている。研究は大きく2つのフェーズに分け、純培養系での細胞損傷と核酸結合試薬の浸透性、結合性、その反応最適化についておこない、次に実際の食品製造を考慮し、食品中で加熱、冷凍、薬剤等で細菌を殺菌した際のNBR-PCR法の適用性について検討を加えることとしているが、うち初年度では基礎的研究として核酸結合試薬を作用させる際の最適化を中心に検討を行った。細菌より抽出したDNAに対しPMAを混合し、各種波長を照射できるLEDランプにより照射波長、照射時間の最適条件を探索した。また、細胞の生死とPMA-リアルタイムPCRがどの程度相関するか明らかとするため、細胞の損傷度とPMAが死細胞へ導入される効率についても検討を行った。本年度の研究成果に関しては、FoodMicro2014(Nantes, France)における発表および国際誌への投稿を予定している。食品工場では、生産される食品の安全性を確保するため、様々な食中毒菌に加え、衛生指標菌にいたるまで生産工程の各ポイントで検査が行われている。しかしながら、その検体数は膨大であり、食品という性格上、検査にかかる時間も限られている。そのため、これまでのような培養法では対応が困難であり、自主衛生管理として分子生物学的手法を用いたモニタリング法が広く行われつつある。しかしながら、遺伝子定量技術(リアルタイムPCR)を用いたモニタリング手法は、生菌と死菌の区別が困難であり、しばしば培養法に対し菌数の過大評価をすることが問題とされてきた。本研究では、核酸結合試薬であるプロピディウムモノアジド(PMA)等を用いて解決を図り、より正確なモニタリング方法(NBR-PCR法)を確立することを目的とした。これまでに、純培養系において、損傷した細胞への核酸結合試薬の浸透性、光照射によるDNAへの結合性について最適化を行い、LEDにより特定波長を照射した際に効果的にDNAへ結合することを見出した。この光照射条件を用い、死菌生菌が混合した条件で、正確に生菌のみを定量できるか検討を行い、少なくとも生菌に対し死菌が1万倍含まれている条件においても定量可能な条件を確定した。また、食品製造現場で実用可能なレベルに高めるため、実際の食品に生菌、死菌を比率を変えて接種し、確立した方法が適用可能か検討を行った。食品生産現場では、生産される食品の安全性を確保するため、様々な食中毒菌に加え、衛生指標となる細菌にいたるまで生産工程の各ポイントにおいて検査を実施している。そのため、検査しなければならない検体数は多くなりがちである。また、食品という性格上、検査結果を速やかに取得する必要性がある。これに対応するため、多くの食品会社において、多大な労力と時間がかかる従来の培養法に代わり、PCR法などの迅速簡便法が広く用いられている。しかしながら、PCR法を用いた細菌の検出、定量は、生菌と死菌を区別できないという問題を抱えており、この問題の解決が急務であった。本研究では、核酸結合試薬とPCR法を組み合わせることで、生菌のみをモニタリングする方法を確立し、食品の加工工程で変動する菌数を正確に把握することを可能にした。具体的には、核酸結合試薬を死菌の細胞内へ流入させ、効率よくDNAを結合させ、PCRの標的から除外することのできる前処理法と最適条件を決定し、その方法をウイルスにまで適応範囲を拡大させた。また、各種殺菌条件を設定し、菌を殺菌した際に本法を用いてモニタリングできることを示した。なお、実際の食品製造現場での利用を想定し、複数の食品の系においてもその有用性を示した。この研究における一部の成果については、国内外の学会、国際誌へ発表を行い、残りの成果についても発表を準備中である。純培養系において、生菌死菌の判別条件を確定し、食品を用いた系での評価まで行うことができたため。

食品微生物学今後も計画通り進捗の見込み。研究計画通り、核酸結合試薬を用いたリアルタイムPCRの基礎的検討を進め、最適条件の決定までを行うことができたため。今後も計画通り遂行予定である。
心筋梗塞におけるロイコトリエンB4受容体の役割解析

本申請では、心筋梗塞時に生じる炎症応答にロイコトリエンB4受容体がどのように関与しているのかについて検討した。810週齢の雄性C57BL/6J野生型(WT)マウスおよびBLT1ノックアウト(BLT1-KO)マウスに心筋梗塞(Myocardial infarction: MI)処置(左冠動脈前下行枝の結紮)を施した。MI処置後の生存率(処置後28日間)と心機能の評価(処置後28日目、心エコー検査による)を行ったところ、WTマウスに比べ、BLT1-KOマウスでは生存率と心機能に有意な改善が認められた。生存率の差は、MI処置後3日目以降であったことから、MI処置後3日の心臓を摘出し炎症関連因子のmRNA測定を行った。その結果、炎症関連因子の発現誘導がBLT1-KOマウスでは有意に減弱していた。続いて、ガンマ線照射したWTマウスにWTマウスまたはBLT1-KOマウスの骨髄液を移植した骨髄移植マウス(WT→WTマウスおよびKO→WTマウス)を作成した。これら骨髄移植マウスに対してMI処置を施し、MI処置後3日目の心臓における炎症の程度を比較したところ、BLT1-KOマウスの骨髄を移植したマウス(KO→WTマウス)では、炎症関連因子の発現誘導の有意な減弱が認められた。これらの結果から、BLT1を発現している骨髄由来の細胞が、炎症応答を増幅させることで心筋梗塞の病態を悪化させている可能性が考えられた。治療への応用を考え次の実験を行った。BLT1拮抗薬(ONO-4057)をMI処置後すぐに尾静脈内投与すると、MI処置後の心機能(MI処置及び拮抗薬投与後14日目)は、コントロール群と比較して有意に改善した。本研究によって、BLT1が心筋梗塞後の炎症応答を制御することが明らかとなり、さらにはBLT1が心筋梗塞における新たな治療標的になる可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。野生型マウスとロイコトリエンB4受容体ノックアウト(BLT1-KO)マウスに心筋梗塞処置を施し、処置後28日目までの生存率を比較した。その結果、野生型マウスと比較してBLT1-KOマウスでは心筋梗塞後の生存率が有意に上昇していた。BLT1-KOマウスにおける生存率の有意な改善は特に心筋梗塞処置後3日目から6日目において認められたことから、心筋梗塞処置後3日目の心臓切片を作成し病理学的な解析を行った。染色の結果、梗塞領域周辺においてCD68陽性マクロファージやGr-1陽性好中球の浸潤が、野生型マウスと比較してBLT1-KOマウスにおいて顕著に低下していた。この結果は、BLT1が心筋梗塞後のマクロファージや好中球といった白血球の遊走の促進に重要な役割を持つことを示している。さらに、炎症性サイトカインやケモカインの発現量は、野生型マウスと比較してBLT1-KOマウスで有意に低下していた。次に、梗塞部位に集積する好中球やマクロファージに発現しているBLT1の発現レベルを測定した。その結果、BLT1は好中球、好酸球、単球およびマクロファージに発現しており、その中でも特に梗塞部位へ早い時期から浸潤してくる好中球での発現が最も高かった。これらの結果は、BLT1が心筋梗塞後に心臓への白血球の浸潤を促進し、過剰な炎症応答を引き起こさせることで病態悪化の原因となっていることを示している。これまで、心筋梗塞における白血球(とくに好中球)の役割については、ほとんど解析されてこなかった。本研究より、BLT1が心筋梗塞時の炎症応答を制御していることが初めて明らかになった。

本研究によって、BLT1が心筋梗塞後の炎症応答を制御することが明らかとなり、さらにはBLT1が心筋梗塞における新たな治療標的になる可能性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。おおよそ予定していた実験を終わっており、残された期間の実験を行うことで結論を得ることができると考えている。研究室ホームページ今後、次の実験を行いロイコトリエンB4ーBLT1シグナリング系が心筋梗塞後の病態に与える影響について明らかにする。(1)臨床への適用(治療)を考えると、BLT1拮抗薬の投与がBLT1-KOマウスと同じような効果を示す必要がある。そこで、BLT1選択的拮抗薬(ONO-4057)を投与し、心筋梗塞処置後の病態がどのように影響されるか検討する。(2)Gr-1は好中球での発現が高い。そこで、抗Gr-1抗体を腹腔に投与し、マウス体内から好中球を除去する。このマウスに心筋梗塞処置を行うことで、心筋梗塞時における好中球の役割解明を検討する。BLT1-KOマウスに心筋梗塞処置を行うと保護的な効果が観察されたことから、拮抗薬も保護的な効果を示すと考えている。これにより、好中球に発現しているBLT1が心傷害の主なプレイヤーであることを示せる。(3)心筋梗塞後に心臓に浸潤してくる好中球が骨髄に由来することを骨髄移植の実験より検討する。野生型マウスまたはBLT1-KOマウスの骨髄を野生型マウスに移植したキメラマウスを作成した。野生型マウスの骨髄を移植されたマウス(野生型→野生型)とBLT1-KOマウスの骨髄を移植された野生型マウス(BLT1-KO→野生型:すなわち、BLT1-KOマウスの骨髄を移植されたマウスは、骨髄に由来する細胞のみがBLT1を欠損している)に心筋梗塞処置を行い、骨髄由来の細胞の役割を明らかにする。また、これら骨髄移植マウスに心筋梗塞処置を行い、心臓切片の免疫組織染色(心臓に浸潤してくるCD68陽性マクロファージやGr-1陽性好中球)や炎症性サイトカインやケモカインのmRNA発現量を測定する。これにより、骨髄由来の細胞の役割を明らかにできる。さらに、心臓に浸潤してくる白血球のサブセットをFACSにより解析し、どの白血球が重要な役割を果たしているのか検討する。
シグナル伝達におけるPHドメインと蛋白質リン酸化酵素活性制御領域の相互作用の解析

PHドメインは細胞内シグナル伝達に関与する多種類の蛋白質中に存在しその役割が注目を集めている。構造モデルから、PHドメインの結合物質の候補として本研究申請時にはセリン/トレオニンリン酸等の陰イオン化小分子が想定されていたが、その後の研究によりホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸等の脂質誘導体やG蛋白質βγサブユニット、プロテインキナーゼC(PKC)等の複数の物質と結合することが報告され、その結合の意義の解析が行なわれている。本研究ではその構造中にPHドメインを有するセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素、RACプロテインキナーゼを用いてPHドメインとPKCの相互作用の解析を実施した。まず、RACプロテインキナーゼについてサブタイプの検索を行ない、従来、存在の知られていた2種類以外に3番目の新規クローンを分離し、これら3種類のRACプロテインキナーゼを培養細胞に発現し単一蛋白質として精製し、これらのRACプロテインキナーゼがセリン/トレオニン蛋白質リン酸化酵素活性をもつことを確認した。ついで、3種類のRACプロテインキナーゼのそれぞれのPHドメインとGSTとの融合蛋白質を作製し、試験管内でPKC分子種および蛋白質βγサブユニットとの結合を検討した。その結果、cPKC、nPKC、aPKCグループの代表的なPKC分子種ならびにG蛋白質βγサブユニットがいずれもPHドメインと結合することが示された。また、RACプロテインキナーゼとPKCとの共発現細胞を用いて免疫沈降法により両者の結合を解析したところ、RACプロテインキナーゼとPKCとの結合には組み合わせがあることが明らかになった。そこで、今後はこれらの成果に基づきPHドメインとPKCの相互作用の分子機構の解析を実施する。