hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｘ線レーザー回折による生細胞ダイナミクス

本研究課題では、X線自由電子レーザー(XFEL)のフェムト秒オーダーのパルス幅を利用して、異なる状態の細胞を、独自開発したパルス状コヒーレントX線溶液散乱(PCXSS)法により放射線損傷なくイメージングすることにより、生細胞のナノレベルダイナミクスを観察することを目指している。異なる状態の細胞の調製方法として、同調培養による細胞周期の同期、温度制御、ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスなど複数の手法の研究を進めた。同調培養に関しては、Microbacterium属細菌に対するPCXSS測定データの解析を進めた。また、Thermus属細菌に対して同調培養を試みたほか、フローサイトメーターを用いた同調率の評価を行った。ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスに関しては、ポンプ・プローブ法に対応したコヒーレントX線イメージング用試料チャンバ(MAXIC-II)を用いて、がんのフォトサーマル治療用に近年開発されたpH応答性金ナノ粒子の凝集・分散過程を観察すべく、ケージドプロトンを用いたポンプ・プローブPCXSS測定を開始した。温度制御に関しては、MAXIC-II用に開発した試料温度制御装置を用いて、温度応答性金ナノ粒子やMicrobacterium属細菌のPCXSS測定を進めた。PCXSS測定では、従来、1マイクロメートルほどに集光したXFELを用いて、サブマイクロメートルサイズの細菌細胞等の試料を測定してきた。更に集光度を高めた100ナノメートルほどに集光したXFELを用いたPCXSS測定を新たに開始した。試料探索の過程で平成28年度に発見した、Thermus属細菌細胞が培養条件に依って短くなる新規現象に関して、細胞生物学的に興味深い予備的なイメージング結果が得られた。細胞の状態を同期させる方法として取り組んだ、同調培養、温度制御、ケージド化合物のフラッシュ・フォトリシスのいずれにおいても、おおむね順調に研究が進行した。同調培養に関しては、Microbacterium属細菌に対してデータ解析を進めたほか、同調率の測定を行った。ケージド化合物のフラッシュ・フォトリシス測定に関しては、ポンプ・プローブ法に対応したコヒーレントX線イメージング用試料チャンバ(MAXIC-II)を用いたポンプ・プローブPCXSS測定を開始した。温度制御に関しては、温度応答性金ナノ粒子やMicrobacterium属細菌のPCXSS測定を進めた。研究の新たな展開として、100ナノメートルほどに集光したXFELを用いたPCXSS測定を新たに開始した。さらに、新規微生物の探索では、生物学的により意義の大きいThermus属細菌に関する研究を進め、細胞生物学的に興味深い予備的なイメージング結果を得た。本研究課題では、いくつかのアプローチにより細胞の状態を同期させ、異なる状態の細胞を、X線自由電子レーザー(XFEL)を用いたパルス状コヒーレントX線溶液散乱(PCXSS)法でイメージングすることにより、生きた細胞のナノレベルダイナミクス観察を目指す。同調培養に関しては、Microbacterium属細菌に対するデータ解析を進める。温度制御に関しては、温度応答性金ナノ粒子やMicrobacterium属細菌のPCXSS測定およびデータ解析を進める。ケージド化合物のフラッシュ・フォトリシスに関しては、pH応答性金ナノ粒子の凝集・分散過程の観察に向けて、MAXIC-IIを用いたポンプ・プローブPCXSS測定を進める。さらに、MLEAチップやPCXSS測定技術や試料像再構成(位相回復)技術を高度化する研究を進める。特に、100ナノメートルほどに集光したXFELを用いたPCXSS測定に必要な技術開発を進める。細胞試料に関しては、Thermus属細菌細胞の大きさが変化する新規現象について、PCXSS測定によるイメージング研究を継続する。異なる状態の細胞の調製方法として、同調培養による細胞周期の同期、温度制御、ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスなど異なる手法の検討を進めた。同調培養に関しては、PCXSS測定に適するMicrobacterium菌の細胞周期を検討し、同調培養の条件を定めた。さらに、調製したMicrobacterium菌に対してXFEL施設SACLAを用いたPCXSS測定を行い、細胞の画像をナノレベルで得ることに成功した。温度制御に関しては、装置の仕様を検討・策定し開発を行った。ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスに関しては、ケージドプロトンによるpHの制御やMicrobacterium菌への適用などのスタディーに着手した。また、細胞のダイナミクスをXFELとは相補的に観察することを目的として、高速原子間力顕微鏡および蛍光顕微鏡のカメラシステムを導入した。さらに、PCXSS測定技術や試料像再構成(位相回復)技術を高度化する技術開発などを進めた。SACLAを用いたPCXSS測定に関して、ドラッグデリバリーにおける薬剤のキャリアなどへの応用に向けて開発された金ナノ粒子集合体や自動車排ガス浄化用触媒材料の溶液中の構造をナノレベルでイメージングすることに成功し、論文発表を行った。細胞の状態を同期させる方法として取り組んだ、同調培養、温度制御、フラッシュ・フォトリシスのいずれにおいても、当初の計画通りに技術開発が進行した。また、PCXSS測定技術、試料像再構成(位相回復)技術、高速原子間力顕微鏡、蛍光顕微鏡などに関しても、新たな技術開発や装置の導入が予定通りに進行した。さらに、SACLAを用いたPCXSS測定も順調に進み、論文発表や学会発表等を行うことができた。

本研究課題では、X線自由電子レーザー(XFEL)のフェムト秒オーダーのパルス幅を利用して、異なる状態の細胞を、独自開発したパルス状コヒーレントX線溶液散乱(PCXSS)法により放射線損傷なくイメージングすることにより、生細胞のナノレベルダイナミクスを観察することを目指している。異なる状態の細胞の調製方法として、同調培養による細胞周期の同期、温度制御、ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスなど異なる手法の検討を進めた。同調培養に関しては、PCXSS測定に適するMicrobacterium菌の細胞分裂周期の特定の段階にある細胞を調製し、XFEL施設SACLAを用いたPCXSS測定により細胞画像をナノレベルで得ることに成功した。温度制御に関しては、温度制御装置を開発・立ち上げ調整を行い、SACLAを用いたPCXSS測定において試用した。ケージド化合物を用いたフラッシュ・フォトリシスに関しては、PCXSS測定において細胞を封入するマイクロ液体封入アレイ(MLEA)チップ内に観察試料とケージドプロトンを導入し、紫外線を事前に照射した場合と、照射しない場合に対して、溶液中の試料画像を得ることに成功した。また、細胞のダイナミクスをXFELとは相補的に観察することを目的として、高速原子間力顕微鏡を用いてMicrobacterium菌の観察を行った。さらに、PCXSS測定技術や試料像再構成(位相回復)技術を高度化するため、4つのアダプティブ全反射鏡を用いたX線ズームレンズ光学系を構築し、新たに開発した非走査型のアポダイズ照明コヒーレント回折イメージング法により、X線集光スポットサイズよりも大きな試料の像再構成に成功し、論文発表を行った。また、細胞試料に関しては、Thermus属細菌細胞の大きさが変化する新規現象を発見した。細胞の状態を同期させる方法として取り組んだ、同調培養、温度制御、ケージド化合物のフラッシュ・フォトリシスのいずれにおいても、当初の計画通りに研究が進行した。同調培養に関しては、Microbacterium菌に対して順調にPCXSS測定を行った。温度制御に関しては、平成27年度に導入した試料加熱冷却機構をPCXSS測定において問題なく使用できることを示した。ケージド化合物のフラッシュ・フォトリシス測定に向けた事前準備も滞りなく進んだ。また、PCXSS測定技術の高度化に関しても、新たな技術開発や装置の導入が予定通りに進行した。さらに、新規微生物の探索では、生物学的により意義の大きいThermus属細菌に関して、PCXSS測定に繋がる新たな知見を得た。本研究課題では、X線自由電子レーザー(XFEL)のフェムト秒オーダーのパルス幅を利用して、異なる状態の細胞を、独自開発したパルス状コヒーレントX線溶液
胃マルトリンパ腫のAPI2-MALT1遺伝子転座と腫瘍化

胃切除が基本治療であった胃マルトリンパ腫の60-80%はH.pylori除菌により退縮し画期的治療である。しかし、20-40%は退縮せず本疾患の除菌治療有効性を予測する因子を明らかにすることは重要である。胃マルトリンパ腫はH.pylori感染胃リンパ濾胞のメモリーB細胞を起源として発生し、一部症例にAPI2遺伝子(アポトーシス抑制遺伝子)とMALT1遺伝子の相互転座がありリンパ腫発生に関連している。API2-MALT1キメラを検出する方法を確立しH.pylori除菌治療有効例ではAPI2-MALT1キメラ陰性、除菌治療無効または増悪例はAPI2-MALT1キメラが検出されAPI2-MALT1キメラの有無が除菌治療の有効性を予測する有用な因子であることを明らかにした。本研究ではH.pylori感染感作胃粘膜B細胞にマルトリンパ腫由来のAPI2-MALT1キメラ遺伝子を導入し、胃マルトリンパ腫の腫瘍化機序を明らかにする。API2-MALT1キメラmRNAを高感度に検出する方法を確立し除菌治療有効例では全例がAPI2-MALT1キメラ陰性であり、除菌治療無効または除菌後増悪例は6例中4例にキメラが検出され、API2-MALT1キメラの有無がH.pylori陽性低悪性度胃マルトリンパ腫の除菌治療の有効性を予測する極めて有用な因子であることを明らかにした。この事実は除菌治療有効性予測因子であるのみならずAPI2-MALT1キメラが腫瘍化にも関連していることを示唆する。胃マルトリンパ腫症例から分離したAPI2-MALT1全長キメラcDNAを発現ベクターを用いてCOS7細胞に遺伝子導入するとキメラ蛋白は細胞質に蓄積する。一方、API2遺伝子あるいはMALT1遺伝子を導入すると蛋白は速やかに分解され細胞内には長時間は蓄積しない。さらにAPI2-MALT1キメラ遺伝子導入細胞ではNF-kBの活性化が起こっていることが判明した。したがってAPI2-MALT1キメラ蛋白の蓄積によるNF-kBの持続活性が重要な腫瘍化機序と推測された。低悪性度胃マルトリンパ腫の60-80%はH.pyloriの除菌により退縮し、画期的治療となりつつある。組織学的に低悪性度と診断されても20-40%は退縮せず、H.pylori除菌治療の有効性を予測する因子を明らかにすることは臨床的に極めて重要である。H.pylori感染により胃粘膜にリンパ濾胞が形成され、胃マルトリンパ腫は濾胞メモリーB細胞を起源とする。胃マルトリンパ腫の一部にt(11、18)転座があることは知られていたが、転座責任遺伝子が明らかとなり、11番染色体短腕上のAPI2遺伝子と18番染色体短腕上のMALT1遺伝子の相互転座であり本転座がリンパ腫発生に関連していることが推測される.

愛知がんセンターとの共同研究で本キメラを高感度に検出する方法を確立し、H.pylori除菌治療有効例では全例がAPI2-MALT1キメラ陰性であり、除菌治療が無効または除菌後増悪例は6例中4例にAPI2-MALT1キメラが検出され、API2-MALT1キメラの有無がH.pylori陽性低悪性度胃マルトリンパ腫の除菌治療の有効性を予測する極めて有用な因子であることを明らかにした。H.pylori感染者胃粘膜リンパ球を分離し、分離、保存されている胃マルトリンパ腫症例のAPI2-MALT1の全長キメラcDNAをレトロウイルスベクターおよび誘導性発現ベクターを用いてH.pylori感染胃粘膜B細胞に遺伝子導入した。抗CD5モノクロナール抗体、CD10モノクローナル抗体、CD20モノクロナル抗体を用いフローサイトメトリーにより遺伝子導入された胃粘膜リンパ球からメモリーB細胞を選別し、一部のクローンは持続培養でき、ELISPOTアッセイによりH.pylori特異抗体産生クローンであることも確認している。現在、NF-kB活性、アポトーシスを確認している。低悪性度胃マルトリンパ腫の60-80%はH.pyloriの除菌により退縮し、画期的治療となりつつある。組織学的に低悪性度と診断されても20-40%は退縮せず、H.pylori除菌治療の有効性を予測する因子を明らかにすることは臨床的に極めて重要である。H.pylori感染により胃粘膜にリンパ濾胞が形成され、胃マルトリンパ腫は濾胞メモリーB細胞を起源とする。胃マルトリンパ腫の一部にt(11、18)転座があることは知られていたが、転座責任遺伝子が明らかとなり、11番染色体短腕上のAPI2遺伝子と18番染色体短腕上のMALT1遺伝子の相互転座であり本転座がリンパ腫発生に関連していることが推測される。本キメラを高感度に検出する方法を確立し、H.pylori除菌治療有効例では全例がAPI2-MALT1キメラ陰性であり、除菌治療が無効または除菌後増悪例は6例中4例にAPI2-MALT1キメラが検出され、API2-MALT1キメラの有無がH.pylori陽性低悪性度胃マルトリンパ腫の除菌治療の有効性を予測する極めて有用な因子であることを明らかにした。この事実は除菌治療の有効性の予測因子であるのみならずAPI2-MALT1キメラが腫瘍化にも密接に関連していることを示唆する。そこで胃マルトリンパ腫症例から分離し、保存されているAPI2-MALT1全長キメラcDNAを発ベクターを用いてCOS7細胞に遺伝子導入するとキメラ蛋白は細胞質に蓄積する。一方、API2遺伝子あるいはMALT1遺伝子を導入すると蛋白は速やかに分解され、細胞内には長時間は蓄積しない。さらにAPI2-MALT1キメラ遺伝子導入細胞ではNF-κBの活性化が起こっていることが判明した。したがってAPI2-MALT1キメラ蛋白の蓄積によるNF-κBの持続活性が重要な腫瘍化の一因と推測される。
ヒトヘルペスウイルス6型、7型感染と宿主免疫応答

近年骨髄移植をはじめ各種の造血幹細胞移植が数多く施行されるようになり、移植後の骨髄生着不全あるいは遅延やその他の移植後合併症と、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)などベータヘルペスウイルス亜科の活動性との関連が注目されてきている。同じベータヘルペスウイルス亜科に属していながら、ヒトヘルペスウイルス7型(HHV-7)については、このような報告はほとんどなく、宿主との免疫応答という点で非常に異なっている。また近年、樹状細胞がウイルス感染初期の抗原提示能だけでなく、その後の免疫応答を支配することや、感作されたTヘルパー細胞は、Th1とTh2という異なる機能を有する細胞に分化することが報告されている。本研究の目的は、HHV-6とHHV-7という非常に高い相同性を有しながら、異なった免疫応答を示すウイルスについて、感染の初期過程における樹状細胞の役割を探ることである。リンパ球系樹状細胞(DC2)は、近年主要なIIFN-α産生細胞であることが報告されており、今回は、ヒト臍帯血(CB)から単離したDC2を用いて、HHV-6およびHHV-7感染の効果を、ウイルスの増殖、サイトカインの動態、樹状細胞の成熟、感染リンパ球系樹状細胞によるナイーブなT細胞に対する抗原提示能などについて解析した。HHV-6、HHV-7の感染により、程度の差はあるがリンパ球系DCの表面抗原(成熟マーカー)の増強を認めた(IL-3>HHV-6>HHV-7)。メイ・ギムザ染色によりHHV-6は形態的にも成熟傾向を示したが、HHV-7では細胞の大きさの変化を認めるものの、細胞質内及び表面構造がスムースで未熟な状態にとどまった。TEM観察で、両ウイルスともに核内および細胞質内に、各成熟段階の子孫ウイルスの産生を認めた。HHV-6はリンパ球系樹状細胞に感染し、大量のインターフェロンαを産生し、ナイーブなT細胞をIL-10産生優位な制御性T細胞(Tr)に分化させること、対照的に、HHV-7は、インターフェロンαをほとんど産生せず、ナイーブなT細胞をIL-4優位なTh2細胞へ分化させることが示唆された。同じベータヘルペスウイルス亜科に属していながら、ヒトヘルペスウイルス7型(HHV-7)については、このような骨髄生着不全やその他の移植後合併症を生じる報告は全くなく、宿主との免疫応答という点で非常に異なっている。本研究の目的は、HHY-6とHHV-7という非常に高い相同性を有しながら、異なった免疫応答を示すウイルスについて、感染の初期過程における樹状細胞の役割ならびに潜伏感染と再活性化における樹状細胞の役割を探ることである。

本年度は、特に、臍帯血から直接単離した樹状細胞を用いて、これら二種ウイルスの感染の効果と抗原提示能を、ウイルスの増殖、サイトカインの動態、CD4陽性Tリンパ球の分化能における偏向性の有無などに着目して解析を行った。現段階で、1)電子顕微鏡観察によって、HHV-6およびHHY-7ともにリンパ球系樹状細胞に感染するが、ミエロイド系の樹状細胞(CD1c)には感染しないこと、2)両ウイルス感染樹状細胞の表面抗原の解析から、不完全ではあるが未熟型から成熟型へ移行すること、3)HHV-6感染リンパ球系樹状細胞はI型IFNを多量に産生すること、などを見いだした。近年骨髄移植をはじめ各種の造血幹細胞移植が数多く施行されるようになり、移植後の骨髄生着不全あるいは遅延やその他の移植後合併症と、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6型(HHV-6)などベータヘルペスウイルス亜科の活動性との関連が注目されてきている。同じベータヘルペスウイルス亜科に属していながら、ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)については、このような骨髄生着不全やその他の移植後合併症を生じる報告はほとんどなく、宿主との免疫応答という点で非常に異なっている。また近年、樹状細胞がウイルス感染初期の抗原提示能だけでなく、その後の免疫応答を支配することや、感作されたTヘルパー細胞は、Th1とTh2という異なる機能を有する細胞に分化することが報告されている。本研究の目的は、HHV-6とHHV-7という非常に高い相同性を有しながら、異なった免疫応答を示すウイルスについて、感染の初期過程における樹状細胞の役割ならびに潜伏感染と再活性化における樹状細胞の役割を探ることである。リンパ球系樹状細胞(DC2)は、近年主要なIFN-α産生細胞であることが報告されており、昨年度は、ヒト臍帯血(CB)から単離したDC2を用いて、HHV-6およびHHV-7感染の効果を、ウイルスの増殖、サイトカインの動態、樹状細胞の成熟などについて解析し報告した。引き続き今年度は、感染リンパ球系樹状細胞によるナイーブなT細胞に対する抗原提示能を解析した結果、HHV-6はリンパ球系樹状細胞に感染し、大量のインターフェロンαを産生し、ナイーブなT細胞をIL-10産生優位な制御性T細胞(Tr)に分化させること、対照的に、HHV-7は、インターフェロンαをほとんど産生せず、ナイーブなT細胞をIL-4優位なTh2細胞へ分化させることが示唆された。これらの結果は、HHV-6感染およびHHV-7感染による宿主免疫応答における顕著な相違、つまりHHV-6感染では発症および増悪因子となっているが、HHV-7感染では、ほとんど不顕性に移行するという現象と関連するものと思われる。
小胞体の網状構造の形成機構

我々が1997年に発見した細胞内膜融合機構p97/p47経路に加えて、この程新規膜融合機構p97/p37経路を発見することが出来た。試験管内ゴルジ体再構成系を用いてp37の機能を検討した結果、p37単独では膜融合能を呈しないが、p97/p37複合体を形成すると膜融合を引き起こすことが分かった。この新規膜融合経路の分子機構は、p97/p47経路とは幾つかの重要な点で異なっていた。例えば、受容体としてsyntaxin5ではなくてGS15を必要とし、同時に小胞繋留装置p115-GM130複合体を必要とする。さらに、VCIP135を必要とするものの、その脱ユビキチン化活性は新経路では必要ではなかった。p37の細胞での機能をsiRNAを用いて検討したところ、p37発現の抑制はゴルジ体の小胞化と小胞体の網状構造の断裂をもたらした。さらに、細胞周期の時期に分けてp37の機能を検討するために、間期と分裂期にある細胞それぞれに抗p37抗体の微量注入を行った。その結果、細胞分裂期でのゴルジ体・小胞体の再構成のみならず、間期でのそれらの維持にもp37が必須であることが示された。従って、P97/P47経路が細胞分裂期終期での娘細胞に於ける細胞内小器官の再構成に特化した細胞内膜融合機構であるのに対して、このp97/P37経路は細胞周期間期での細胞内小器官の維持に働いていることが分かった。同時に、小胞体の網状構造とその機能の関係を明らかにするために以下の実験を行っている。培養細胞においてp37siRNA処理をしてp37の発現を抑制すると小胞体の網目構造は断裂しゴルジ体は小胞化する。このような細胞を用いて、蛋白質輸送能を検討した。その結果、小胞化したゴルジ体では蛋白質の輸送が遅延し半分以上が輸送されないままゴルジ体に蓄積した。ところが意外なことに、断裂した網目構造の小胞体からゴルジ体への蛋白質の輸送には全く遅延が認められなかった。即ち、ゴルジ体の扁平膜積層構造は蛋白質の輸送に重要であるが、小胞体の網状構造自体は蛋白質の輸送には関係ないということである。小胞体は蛋白産生の場所であり、細胞の根幹をなす細胞内小器官である。その形態は大変に特徴的で、細胞質全体に広がる網状構造を示す。それらの構造は下等動物から哺乳類まで幅広く見られることから、その複雑な構造はその機能と密接に結びついていると考えられる。そこで本研究では、以下の点について明らかにすることを目的とする。I.小胞体の特徴的な網状構造がどの様に形成・維持されるのか。II.その構造が機能とどの様に関連しているのか。本年は、上記の内、特にIについて研究を進めた。以下、具体的に述べる。我々は先に細胞分裂期終期での小胞体・ゴルジ体の再構成に特化した膜融合機構p97/p47経路の発見していたが(Nature, 388,75-78,1997 ; J. Cell Biol, 159,855-866,2002)、この程さらに新規膜融合機構を発見することに成功し、p97/p37経路と命名した。この新規膜融合経路は、細胞間期での細胞内小器官の維持に働き、現在の所、小胞体・ゴルジ体の維持に働いているを明らかにしている。細胞間期の細胞に抗p37抗体をマイクロインジェクションすると、小胞体の網状構造は失われた。この経路の必須因子を探索したところ、我々が先に発見した小胞体形成因子VCIP135も必要とすることが分かった。興味深いことに、p97/p47経路がVCIP135の脱ユビキチン活性を必要とするのに対して、この新経路はその活性を必要としなかった。

従って、P97/P47経路が細胞分裂期終期での娘細胞に於ける細胞内小器官の再構成に特化した細胞内膜融合機構であるのに対して、このp97/P37経路は細胞周期間期での細胞内小器官の維持に働いていることが分かった。同時に、小胞体の網状構造とその機能の関係を明らかにするために以下の実験を行っている。培養細胞においてp37siRNA処理をしてp37の発現を抑制すると小胞体の網目構造は断裂しゴルジ体は小胞化する。このような細胞を用いて、蛋白質輸送能を検討した。その結果、小胞化したゴルジ体では蛋白質の輸送が遅延し半分以上が輸送されないままゴルジ体に蓄積した。ところが意外なことに、断裂した網目構造の小胞体からゴルジ体への蛋白質の輸送には全く遅延が認められなかった。即ち、ゴルジ体の扁平膜積層構造は蛋白質の輸送に重要であるが、小胞体の網状構造自体は蛋白質の輸送には関係ないということである。
難加工性金属材料のダイレスフォ-ミングに関する研究

本年度は、ダイレス引き抜き機の基本設計を行うとともにNCーサ-ボダイレス曲げ加工機の基本設計も行い、これらの工業化について検討を加えた。引抜き機および曲げ加工機の構造系はおもに中国側が担当し、駆動系は日本側が分担して、それぞれの設計に関する情報交換をおこなって相互に必要なデ-タを補完した。ダイレス引抜きにおいては、最高加工速度が10m/minの連続型引抜き機の基本設計を行った。加工精度は引抜き速度の制御精度に依存するので、速度制御系としてはDCサ-ボモ-タを用いたクロ-ズドル-プ方式を検討した。また、速度制御と同時に加熱および冷却装置の制御を行う必要があるため、有限要素解析手法を用いて引抜き時における温度分布を計算してそれらの制御系の設計で必要な基礎デ-タを得るとともに、マイクロコンピュ-タをによる制御システムについて検討を加えた。ダイレス曲げ加工の実用化にあたっては、装置の自動化が必要であり、従来の旋回ア-ム方式に代わってXーYテ-ブル方式の曲げ加工機を検討した。旋回ア-ム方式の場合、曲率半径が変化する曲げ加工や曲げ方向が変わる複雑な加工に対応できず、またFMSの観点からも問題があるため、ここではXーYテ-ブル方式を採用することにした。すなわち、XーYテ-ブルに管材のチャッキング部を搭載し、X軸およびY軸のそれぞれをNCサ-ボモ-タで駆動すれば複雑な加工にも対応できる。本研究では以上のようなNCサ-ボダイレス曲げ加工機の基本設計を行うとともに加工機の制御ソフトも開発した。ダイレス引抜きの加工限界の解析を行うともに中国側で収集された実験デ-タとの比較を行い,材料の変形抵抗の温度依存性が加工限界を支配することを明らかにした。すなわち,変形抵抗の温度依存性の高いTiー6Alー4V合金の場合の理論加工限界値が90%であるのに対し,温度依存性の低いSVS304ステンレス鋼では約70%であり,これらの計算結果は実験デ-タとよく一致している。また,角鋼管のテ-パ引抜においては20×20mm(肉厚2.3mm)のSTKMー11A角鋼管を用い,引張速度を段階的に変化させた場合の変形挙動の解析を行った。引張速度を段階的に変化させた場合,変化量が一定であれば成形されるテ-パ角も常に一定となることが明らかになった。また速度の変化量が過大である場合(2倍以上の変化)は,材料が破断しやすく大きなテ-パ角を与えることは難かしいことがわかった。しかし,テ-パ角の小さいロンギテ-パ角管の場合は連続加工によらなくても段階的な方法で高精度のテ-パ引抜きが可能(速度制御装置の簡略化)であることが確かめられた。中国側においては、各種炭素鋼やステンレス鋼のダイレス引抜き材の金属組織ならびに機械的性質の調査が行われ,製品品質面から見た最適な加工条件が明らかとされた。また,ダイレス曲げ加工においては,加熱・冷却に関する最適条件が検討された。すなわち,管の肉厚に対し加熱幅(変形幅)が10倍以下になるよう加熱出力および冷却速度を設定すれば曲げ加工限界値は2.0以下になることが明らかになった。局部熱間アプセット加工に関する研究では角鋼管についての実験が行われ,15%程度の増肉が容易に行えることがわかった。今後の研究の展開としては,以上の成果をもとにして実用可能なダイレスフォ-ミング機の基本設計を行う。
メッセンジャ-RNA形成と安定性、その翻訳に関係する核小体の機能

核小体は、リボゾ-ム合成の場として知られているが、我々は核小体に局在するウイルスタンパクを発見し、これらのタンパクが特にメッセンジャ-RNA(mRNA)の形成、安定性、翻訳にいたる過程でどのような役割を果たすかと解明する研究を続けている。まずヒトのレトロウイルスHTLVーIの核小体タンパクRex(p27X)がどの様にウイルスmRNAのプロセッシング、安定性、核から細胞質への輸出、翻訳に働いているかを生化学的に研究した。具体的には完全長に転写されたウイルスのRNAが核質でスプライスゾ-ムを形成して重複したスプライスを受けるmRNAと、スプライスを受けることなくウイルスの構造タンパクを作るためのmRNAが、核小体とどの様な関係にあるかを細胞生物学的及び生化学的に検討した。その結果、核小体移行シグナルを持たないp27Xでは、完全長のウイルスRNAが形成されないことを確認した。このことは核小体移行シグナルが完全長のRNAを核から細胞質へ移行するのに必要なシグナルであることを示している。核小体シグナルには、核への移行シグナルも存在している。この核への移行シグナルだけではウイルスRNAが安定な形で細胞質へ移行できないことも明らかになった。更にエイズの病因ウイルスHIVーIの調節遺伝子tat、revが作り出すタンパク質にも核小体シグナルのあることを明らかにした。これらの核小体シグナルを変化させると機能も共に変化することが分った。核小体は、リボソーム合成の場として知られているが、我々は核小体に局在するウィルスタンパクを発見し、これらのタンパクが特にメッセンジャーRNA(mRNA)の形成、安定性、翻訳にいたる過程でどのような役割を果たすかを解明する研究を続けている。まずヒトのレトロウィルスHTLVーIの核小体タンパク(p27X)がどの様にウィルスmRNAのプロセッシング、安定性、核から細胞質への輸出、翻訳に働いているかを生化学的に研究した。具体的には完全長に転写されたウィルスのRNAが核質でスプライスゾームを形成して重複したスプライスを受けるmRNAと、スプライスを受けることなくウィルスの構造タンパクを作るためのmRNAが、核小体とどの様な関係にあるかを細胞生物学的及び生化学的に検討した。その結果、核小体移行シグナルを持たないp27Xでは、完全長のウィルスRNAが形成されないことを確認した。この核への移行シグナルだけではウィルスRNAが安定な形で細胞質へ移行できないことも明らかになった。種々の核小体シグナルの変異を作成し、mRNA形成と安定性、その翻訳に関係する核小体シグナル及び核小体の機能を現在検討している。核小体は、リボゾ-ム合成の場として知られているが、我々は核小体に局在するウイルスタンパクを発見し、これらのタンパクが特にメッセンジャ-RNA(mRNA)の形成、安定性、翻訳にいたる過程でどのような役割を果たすかを解明する研究を続けている。まずヒトのレトロウイルスHTLVーIの核小体タンパクRex(P27x)がどの様にウイルスmRNAのプロセッシング、安定性、核から細胞質への輸出、翻訳に働いているのかを生化学的に研究した。具体的には完全長に転写されたウイルスのRNAが核質でスプライスゾ-ムを形成して重復したスプライスを受けるmRNAと、スプライスを受けることなくウイルスの構造タンパクを作るためのmRNAが、核小体とどの様な関係にあるかを細胞生物学的及び生化学的に検討した。その結果、核小体移行シグナルを持たないp27xでは、完全長のウイルスRNAが形成されないことを確認した。更にエイズの病因ウイルスHIVーIの調節

遺伝子tat,revが作り出すタンパク質にも核小体シグナルのあることを明らかにした。これらの核小体シグナルを変化させると機能も共に変化することが分った。核小体は、リボゾ-ム合成の場として知られているが、我々は核小体に局在するウイルスタンパクを発見し、これらのタンパクが特にメッセンジャ-RNA(mRNA)の形成、安定性、翻訳にいたる過程でどのような役割を果たすかを解明する研究を続けている。まずヒトのレトロウイルスHTLVーIの核小体タンパクRex(p27X)がどの様にウイルスmRNAのプロセッシング、安定性、核から細胞質への輸出、翻訳に働いているかを生化学的に研究した。具体的には完全長に転写されたウイルスのRNAが核質でスプライスゾ-ムを形成して重復したスプライスを受けるmRNAと、スプライスを受けることなくウイルスの構造タンパクを作るためのmRNAが、核小体とどの様な関係にあるかを細胞生物学的及び生化学的に検討した。その結果、核小体移行シグナルを持たないp27Xでは、完全長のウイルスRNAが形成されないことを確認した。このことは核小体移行シグナルが完全長のRNAを核から細胞質へ移行するのに必要なシグナルであることを示している。核小体シグナルには、核への移行シグナルも存在している。この核への移行シグナルだけではウイルスRNAが安定な形で細胞質へ移行できないことも明らかになった。更にエイズの病因ウイルスHIVーIの調節遺伝子<tat>___ー、<rev>___ーが作り出すタンパク質にも核小体シグナルのあることを明らかにした。核小体は、リボゾ-ム合成の場として知られているが、我々は核小体に局在するウイルスタンパクを発見し、これらのタンパクが特にメッセンジャ-RNA(nRNA)の形成、安定性、翻訳にいたる過程でどのような役割をを果たすかを解明する研究を続けている。まずヒトのレトロウイルスHTLVーIの核小体タンパクReX(p27X)がどの様にウイルスmRNAのプロセッシング、安定性、核から細胞質への輸出、翻訳に働いているかを生化学的に研究した。異体的には完全長に転写されたウイルスのRNAが核質でスプライスゾ-ムを形成して重複したスプライスを受けるmRNAと、スプライスを受けることなくウイルスの構造タンパクを作るためのmRNAが、核小体とどの様な関係にあるかを細胞生物学的及び生化学的に検討した。更にエイズの病因ウイルスHIVーIの調節遺伝子tat、revが作り出すタンパク質にも核小体シグナルのあることを明らかにした。これらの核小体シグナルを変化させると機能も共に変代することが分った。
幹細胞の分化制御機構の解析

血液細胞系譜分化完全欠損Tal1遺伝子破壊胚性幹(ES)細胞からの血液細胞分化誘導:転写因子Tal-1は中胚葉系細胞から血液幹細胞への分化過程で重要であると考えられるが、その詳細は不明な点が多い。そこで、ES細胞からの破骨細胞分化過程を血液分化経路のひとつのモデルとして、Tal-1と他の転写因子との関連を検討するためTal1遺伝子破壊ES細胞株からテトラサイクリンでPU.1の発現が制御できる細胞株を作成した。人為的にPU.1の発現を誘導すると、効率は野生型に比べ1/10程度であるが、骨再吸収能をもつ成熟破骨細胞が出現し、マクロファージ様の貪食細胞も誘導できた。それ以外のB細胞、顆粒球、赤血球、巨核球などの細胞系譜は全く出現しなかった。またFlk-1陽性中胚葉系細胞がPU.1の人為的発現によって破骨細胞へと分化できる能力を有することを明らかにした。このことより転写因子Tal-1は血液細胞のマスター遺伝子と考えられていたが破骨細胞にとってはPU.1の発現を誘導するだけの機能でよいことを示唆した。[Stem Cells,2005,23(1):134-143]アスコルビン酸は骨を作る骨芽細胞の分化に重要であることは報告されているが、骨を溶かす破骨細胞の分化に与える影響は明らかでない。そこで、アスコルビン酸の破骨細胞の全分化過程に与える影響を検討するためES細胞のみから破骨細胞を誘導する培養法を確立し、その効果を検討した。アスコルビン酸非添加群に比べ添加群で破骨細胞が効率よく誘導され、その効果は破骨細胞前駆細胞数に及んでいた。さらに、ES細胞からFlk-1陽性の中胚葉系細胞誘導効率の上昇に原因を見出した。したがってアスコルビン酸は破骨細胞側へも影響を及ぼし、その影響は発生初期の段階にも及んでいることを示唆し、論文として発表した。[Biochem Biophys Res Commun,2005,335:1239-1246]血液細胞系譜分化完全欠損Tal1遺伝子破壊胚性幹(ES)細胞からの血液細胞分化誘導:転写因子Tal-1は中胚葉系細胞から血液幹細胞への分化過程で重要であると考えられるが、その詳細は不明な点が多い。人為的にPU.1の発現を誘導すると、効率は野生型に比べ1/10程度であるが、骨再吸収能をもつ成熟破骨細胞が出現し、マクロファージ様の貧食細胞も誘導できた。このことより転写因子Tal-1は血液細胞のマスター遺伝子と考えられていたが破骨細胞にとってはPU.1の発現を誘導するだけの機能でよいことが明らかになった。[Stem Cells,2005,23(1):134-143]以上、血液細胞分化に重要である転写因子に関する新たな知見を論文として投稿した。[Biochem Biophys Res Commun,2005,335:1239-1246]
未分化型胃癌に対する低酸素誘導エピジェネティック分子を標的とした治療モデルの確立

本研究では、スキルス胃癌の腹膜播種形成における低酸素誘導因子(HIF-1α)発現の意義について検討した。スキルス胃癌細胞のHIF-1α発現を完全欠失させたkonckdown(ND)株の同所性移植モデルにおいて、KD群の胃腫瘍形成は86.7%と高率であったが、腹水産生および腹膜播種は低率であった。胃腫瘍内のリンパ管の個数・外径および新生血管は少なく、腹腔内接種モデルでは播種結節個数が有意に多かった。これらの結果により、胃癌腹膜播種の形成機序が従来の腹腔内直接散布説ではなく、胃癌原発巣に誘導されるHIF-1α依存的な血管・リンパ管侵襲を介した遠隔転移である可能性が示された。これまでに胃癌細胞において低酸素誘導因子(HIF-1α)発現が癌浸潤能亢進に重要であること、5-FU系抗癌剤耐性に関与することを明らかにした。また代表者はメチル化DNA免疫沈降法(MeDIP法)とDNAマイクロアレイ技術を用いて、ゲノムワイドなDNAメチル化解析法を開発し、この解析法を用いてヒト正常・癌細胞におけるDNAメチル化情報と遺伝子発現情報を統合し発癌・進展に関与する新規分子を同定するパイプラインを報告した。本研究では、胃癌分化型別に低酸素環境下HIF-1α発現誘導に伴う変化をエピジェネティックな側面から解析した。HIF-1α発現欠失胃癌細胞株2種(MKN74-KD:分化型胃癌由来, MKN45-KD:低分化型胃癌由来)ならびに各コントロール株(MKN74-SC,MKN45-SC)を常酸素および低酸素環境化に培養し、メチル化DNA免疫沈降法(MeDIP法)によりゲノムワイドなDNAメチル化解析を行った。これらのDNAサンプルを用いてマイクロアレイ解析を行い、低酸素環境下における分化型、未分化型別HIF-1α発現欠失細胞のゲノムワイドなエピジェネティック変化を比較解析した。この比較解析により低酸素環境下における分化型、未分化型特異的なメチル化異常(高いメチル化あるいは低メチル化)領域を同定し、定量RT-PCRおよびbisulfite sequence法を用いて確認した。現在、これらの新規エピジェネティック分子に関する機能解析を行うとともに臨床サンプルを用いて臨床的意義について検討している。出願者らはこれまでに胃癌細胞において低酸素誘導因子(HIF-1α)発現が癌浸潤能亢進に重要であること、5-FU系抗癌剤耐性に関与することを明らかにした。HIF-1α発現欠失胃癌細胞株2種(MKN74-KD:分化型胃癌由来, MKN45-KD:低分化型胃癌由来)ならびに各コントロール株(MKN74-SC, MKN45-SC)を常酸素および低酸素環境化に培養し、メチル化DNA免疫沈降法(MeDIP法)によりゲノムワイドなDNAメチル化解析を行った。MeDIP法により凝集されたDNAにおいて、異なるCpG密度の領域が濃度依存的にまた同領域の発現に応じて凝集されていることを定量RT-PCRおよびbisulfite sequence法を用いて確認した。現在これらのDNAサンプルを用いてマイクロアレイ解析を行い、低酸素環境下における分化型、未分化型別HIF-1α発現欠失細胞のゲノムワイドなエピジェネティック変化を比較解析中である。スキルス胃癌細胞株58As9を用い、胃癌腹膜播種の形成機序が従来の腹腔内直接散布説ではなく、胃癌原発巣に誘導されるHIF-1α依存的な血管・リンパ管侵襲を介した遠隔転移である可能性をヌードマウス同所性移植モデルにて立証し報告した(Int J Oncol. 2013)。この研究成果を元に、腹膜播種形成がマウス移植胃癌周囲の血管・リンパ管新生に端を発する機序およびヒト胃癌細胞58A9より分泌される液性因子によりマウス胃壁内の脈管系幹細胞(VSC)がde novo分化する機序を想定した。まずマウスembryonic stem(ES)細胞EB3を中胚葉に分化させた後、胃癌細胞株58As9の培養上清およびコントロールを添加し、経時的に形態学的変化および血管・リンパ管内皮細胞マーカー遺伝子の発現変化につき解析した。その結果、58As9上清添加ではcontrolに比し、EB3とは形態が明らかに異なる扁平colonyが多数形成された。

遺伝子発現解析では、58As9上清はコントロールに比し血管分化初期マーカーPECAM1, CD34が有意に発現上昇した。また、リンパ管内皮分化初期マーカーVEGFR3, Prox1の有意な上昇を認めた。さらに驚くべきことには、マウスES細胞の未分化状態維持に必須なLIF因子が除去された状況にもかかわらず、ES細胞の未分化マーカーであるOCT3/4, Nanog発現が上清添加後再上昇することが明らかとなった。尚、常酸素と低酸素で調整した上清間に明らかな誘導能の違いは見られず、HIF-1αは脈管新生ではなく脈管侵襲ステップに関与することが推測された。以上より、58As9細胞はマウス中胚葉細胞を脈管系(血管・リンパ管)幹細胞にリプログラミングする何らかの液性因子を分泌している可能性が推測された。消化器外科代表者、分担者によって研究計画がたてられ、実際の研究を研究協力者とともに行っている。研究協力者のさらなる実験の支援とともに定期的なdiscussionが必要である。代表者、分担者によって研究計画がたてられ、実際の研究を研究協力者とともに行っている。HIF-1αにより未分化型胃癌特異的に誘導される新規エピジェネティック分子を抽出し、胃癌細胞株を用いてその癌増殖能・浸潤能に与える影響を明らかにする。胃癌切除組織を用いて新規エピジェネティック分子変化を解析し、臨床病理学的因子および患者予後への影響を明らかにする。核酸・タンパク抽出試薬、PCR関連試薬、Western blot用試薬、自動免染機試薬、MTT assay関連試薬、Invasion assay用プレート、細胞培養関連費用などに使用する予定である。
siRNAを用いた進行性腎障害に対する遺伝子治療の検討

RNAi(RNA interference)は、細胞に導入された二本鎖RNAが相補配列を持つ標的遺伝子の発現を抑制する現象である.インターフェロン応答のため、長らく哺乳動物の系にRNAiが応用されることはなかったが、short interfering RNA (siRNA)により哺乳動物細胞でもRNAiが観察されることが報告され、RNAiを用いた研究が飛躍的に波及した。RNAiを用いた進行性腎障害に対する治療を考慮した場合、作用期間が一つのポイントとなる.合成siRNAとsiRNA発現ベクターの発現量・作用期間を比較したところ、遺伝子発現抑制効果に差は見られなかったが、合成siRNAに比べて、発現ベクターの方がsiRNA量は微量であり、作用期間も短い傾向にあった.また、siRNA発現ベクターに比べて、siRNAのほうが、インターフェロン反応などの副次的な反応が少ないことも考えられ、むしろ、siRNAのほうが有用であることが示唆された.siRNAの分解抑制もまた慢性腎障害に対する効果持続につながる.EGFPトランスジェニックラットを用いて、EGFPに対するsiRNAの効果を検討したところ、siRNAの遺伝子抑制効果は、糸球体では2週間程度しかないが、筋肉では90日以上持続する.これは、siRNAの分解酵素と考えられているeri-1が、神経や腎糸球体では発現が強く、筋肉では弱いためであると考えられる.ヌクレアーゼに耐性を有するsiRNAも開発され、化学修飾を施したsiRNAでは、進行性腎障害モデル(片腎摘Thy-1モデル)でも効果的であり、蛋白尿や腎障害の進展を抑制することを確認した.RNAi(RNA interference)は、細胞に導入された二本鎖RNAが相補配列を持つ標的遺伝子の発現を抑制する現象である.インターフェロン応答のため、長らく哺乳動物の系にRNAiが応用されることはなかったが、short interfering RNA (siRNA)により哺乳動物細胞でもRNAiが観察されることが報告され、RNAiを用いた研究が飛躍的に波及した。RNAiを用いた進行性腎障害に対する治療を考慮した場合、作用期間が一つのポイントとなる.合成siRNAとsiRNA発現ベクターの発現量・作用期間を比較したところ、遺伝子発現抑制効果に差は見られなかったが、合成siRNAに比べて、発現ベクターの方がsiRNA量は微量であり、作用期間も短い傾向にあった.また、siRNA発現ベクターに比べて、siRNAのほうが、インターフェロン反応などの副次的な反応が少ないことも考えられ、むしろ、siRNAのほうが有用であることが示唆された.siRNAの分解抑制もまた慢性腎障害に対する効果持続につながる.EGFPトランスジェニックラットを用いて、EGFPに対するsiRNAの効果を検討したところ、siRNAの遺伝子抑制効果は、糸球体では2週間程度しかないが、筋肉では90日以上持続する.これは、siRNAの分解酵素と考えられているeri-1が、神経や腎糸球体では発現が強く、筋肉では弱いためであると考えられる.ヌクレアーゼに耐性を有するsiRNAも開発され、化学修飾を施したsiRNAでは、進行性腎障害モデル(片腎摘Thy-1モデル)でも効果的であり、蛋白尿や腎障害の進展を抑制することを確認した.合成siRNAを直接導入する方法は、遺伝子抑制効果が一過性であるため、慢性疾患を対象として考えた場合、長期の遺伝子抑制のためにはsiRNA発現ベクターを導入する必要がある。我々もPolymeraseIII系プロモーターであるU6プロモーターによりヘアピン型siRNAが転写される発現ベクターを用いて検討を行った。siRNA発現ベクターを用いても、合成siRNAと同等の効果は得られたものの、Northern blotにより転写されたsiRNA量を検討すると、その発現siRNA量は合成siRNA導入に比べて微量であり、発現量も漸減していくことが確認された。糸球体腎炎を対象疾患として臨床応用するためには、siRNAを長期間作用させることが必要となる。しかしながら、前述したようにsiRNA発現ベクターを用いても、糸球体での効果は短期間である。ところが、興味深いことに、EGFPトランスジェニックラットの筋肉にEGFPに対するsiRNAをエレクトロポレーション法を用いて導入すると、その遺伝子抑制効果は90日以上持続することが確認された。このことは、siRNAの持続期間を決定する因子が組織により異なっていることを示唆する。最近、ERI-1が神経でのsiRNAの分解酵素ではないかという興味深い報告がみられたことから、我々も組織でのERI-1の発現を検討したところ、神経や腎糸球体ではERI-1の発現が強く、筋肉では弱いことが確認され、siRNAの作用持続期間にERI-1が関与するのではないかと考えている。ヌクレアーゼに耐性を有するsiRNAも開発され、化学修飾を施したsiRNAでは、進行性腎障害モデルでも効果的であることを我々は確認している。RNAi(RNA interference)は、細胞に導入された二本鎖RNAが相補配列を持つ標的遺伝子の発現を抑制する現象である。インターフェロン応答のため、長らく哺乳動物の系にRNAiが応用されることはなかったが、short interfering RNA(siRNA)により哺乳動物細胞でもRNAiが観察されることが報告され、RNAiを用いた研究が飛躍的に波及した。RNAiを用いた進行性腎障害に対する治療を考慮した場合、作用期間が一つのポイントとなる。合成siRNAとsiRNA発現ベクターの発現量・作用期間を比較したところ、遺伝子発現抑制効果に差は見られなかったが、合成siRNAに比べて、発現ベクターの方がsiRNA量は微量であり、作用期間も短い傾向にあった。

また、siRNA発現ベクターに比べて、siRNAのほうが、インターフェロン反応などの副次的な反応が少ないことも考えられ、むしろ、siRNAのほうが有用であることが示唆された。siRNAの分解抑制もまた慢性腎障害に対する効果持続につながる。EGFPトランスジェニックラットを用いて、EGFPに対するsiRNAの効果を検討したところ、siRNAの遺伝子抑制効果は、糸球体では2週間程度しかないが、筋肉では90日以上持続する。これは、siRNAの分解酵素と考えられているeri-1が、神経や腎糸球体では発現が強く、筋肉では弱いためであると考えられる。ヌクレアーゼに耐性を有するsiRNAも開発され、化学修飾を施したsiRNAでは、進行性腎障害モデル(片腎摘Thy-1モデル)でも効果的であり、蛋白尿や腎障害の進展を抑制することを確認した。
近世における日本語表記の意識と実態に関する研究

本研究は、近世を対象に、日本語表記に対する意識と表記実態との相関を考察することを目的としたものである。具体的には、近世の国学者に注目し、彼らの表記意識をその著述の読解を通じて明らかにするとともに、それが彼らの著述における表記実態にどう反映しているかを分析した。その結果、国学者たちの間には表記の規範を古代に求めようとする意識が存在したこと、その意識にもとづいて古代的な要素を含んだ表記を自らの著作で実践した事例の存在することが、あらためて確認された。そして、国学者相互の影響関係のもと、そのような事例は従来指摘されていたよりも広い範囲にわたって行われていたことが明らかとなった。本研究は、近世の日本語表記について、当時の人々の有していた表記意識と資料に現れた表記実態の両面から分析を行い、両者の相関の様相を考察しようとするものである。具体的なテーマとして掲げた、国学者の日本語表記に関する問題、近世出版文化と筆耕に関する問題という2点のうち、平成24年度は前者についての考察を主たる目的として、以下のとおりの活動を行った。1、草鹿砥宣隆自筆資料における使用仮名字体についての調査を行った。その結果、古代を志向する復古的な表記意識にもとづく仮名の用字がそこに認められること、特に上代特殊仮名遣にもとづく仮名字体の使い分けを実践していることを明らかにすることができた。上代特殊仮名遣にもとづく仮名字体の使い分けという点は、これまで調査を行ってきた他の国学者には見出されなかった特色であり、近世国学者の日本語表記に関する問題を考察する上での新たな視点が得られたと評価できる。また、上記の事実は、上代特殊仮名遣研究史上における草鹿砥宣隆の位置付けを考察する上でも有用な材料となることが期待される。2、草鹿砥宣隆の著述に関する資料調査を実施した。豊橋市中央図書館および豊橋市美術博物館(森田家文庫)に所蔵される草鹿砥宣隆関連資料について、自筆資料を中心に書誌調査ならびに撮影を行った。3、近世の日本語表記に関する先行研究を収集し、研究の現状を把握した。4、近世国学者の著述の影印・コピー・活字翻刻本等を収集し、その内容について検討を行った。平成25年度は、主に以下のような活動を行った。第1に、近世後期国学者の著述における表記の実態とその背景を考察することを目的として、国学者の著述に関する資料調査を実施した。具体的には、前年度までの調査において、古代を志向する復古的な表記を実践していた事例の存することが確認できた草鹿砥宣隆を主たる対象として設定し、石川武美記念図書館、西尾市岩瀬文庫、名古屋市鶴舞中央図書館において、自筆資料を中心に書誌調査を行った。これらの調査により、草鹿砥宣隆については、前年度までの調査分とあわせ、日本古典籍総合目録データベースで把握できる範囲内において自筆資料の全点を網羅的に調査することができた。その結果、草鹿砥宣隆自筆資料に見られる、上代特殊仮名遣にもとづく仮名字体の使い分けなどといった古代を志向する表記は、内容面で上代特殊仮名遣や古代歌謡に関する考察を主題とし、なおかつ体裁面で清書本と目される整った様相を有している資料に限って認められることが判明した。第2に、近世出版文化と筆耕の表記に関する問題を考察することを目的として、板下本の調査を行った。作者の原稿を浄書する専門職人である筆耕が薄紙にしたためた板下は、開板にあたっては裏返して板木に貼り付けられ、それにもとづいて文字が彫られるため、実際に書物が刊行された場合には消えてなくなってしまうものである。しかしながら、何らかの事情で刊行が実現しなかった場合など、まれに板下の形で残存することがあり、それは筆耕の表記の実態を考察する上で有効な資料となりうると考えられる。西尾市岩瀬文庫において板下本の資料調査を行い、筆耕による表記の修正箇所を中心に検討を行った。具体的なテーマとして掲げた、国学者の日本語表記に関する問題、近世出版文化と筆耕に関する問題という2点のうち、平成23年度は前者についての考察を主たる目的として、以下のとおりの活動を行った。1、鹿持雅澄『万葉集古義』稿本(高知県立図書館蔵本)における使用仮名字体についての調査を進め、古代を志向する復古的な表記意識にもとづく仮名の用字がそこに認められることを明らかにした。2、鹿持雅澄の著述の収集

・読解を進め、上記1のような表記実践の背後にある雅澄の文字観・表記意識や、先行する国学者からの影響関係について調査を行った。3、近世国学者の日本語表記に関する先行研究を収集し、研究の現状を把握した。4、近世国学者の著述の影印・コピー・活字翻刻本等を収集し、その内容について検討を行った。その結果、草鹿砥宣隆『古言別音抄』(名古屋市立鶴舞中央図書館蔵本)など、国学者が自らの著述において古代を志向する日本語表記を実践したと捉えられる新たな事例が見出され、復古的な表記意識にもとづく表記の実践が、当初把握できていたよりも広い範囲の国学者たちによってなされていたことが明らかになるとともに、国学者間でのこうした表記の広がり方や相互の影響関係を論ずるための手がかりを得ることができた。近世国学者による復古的な表記意識にもとづく表記の実践のありようを明らかにするための調査が着実に進んだ点、特に上代特殊仮名遣にもとづく仮名字体の使い分けの実践例が存在していたという新たな発見があったことは評価できる。また、所蔵機関へ赴いての資料調査も、研究発表へと直結する成果が得られたという点で有意義であったと言える。ただし、その一方で、資料調査が少ない回数にとどまったこと、近世出版文化と筆耕に関する問題の考察について明確な成果をまとめあげられていないこと、ならびに研究の成果が論文発表の段階にまで至らなかった点については、研究計画の遂行が不充分であったと言わざるをえない。近世国学者による復古的な表記意識にもとづく表記の実践のありようを明らかにするための調査が着実に進んだ点、古代を志向する日本語表記の実践例のさらなる発見があったことにより国学者相互間での影響関係の考察に向けて新たな展望を得られた点は評価できる。ただし、その一方で、平成23年度の調査資料が主に影印公刊やマイクロフィルム化されている資料に偏り、当初計画していた所蔵機関へ赴いての原資料調査が実行できなかった点、ならびに研究の成果が論文・学会発表という形で発表される段階にまで至らなかった点については、研究計画の遂行が不充分であったと言わざるをえない。国学者の日本語表記に関する問題については、平成24年度までの成果を踏まえた上で引き続き資料調査ならびに分析を行う。具体的には、草鹿砥宣隆・鹿持雅澄ら、本居宣長よりも後の時代に活躍した国学者を主たる対象とする。また、これと並行して、近世出版文化と筆耕に関する問題についても、当初の計画に従い、曲亭馬琴およびその周辺を主たる対象として設定した上で、資料の調査・収集を行う。活字翻刻本・影印本として公刊されているものも含めて馬琴の日記・書簡・草稿類を収集し、資料の読解・調査を進めるとともに、原資料の閲覧・調査もあわせて必要と判断されるものがあった場合は、資料調査に赴く。引き続き、国学者の日本語表記に関する問題について資料調査・収集を行う。近世国学者の著述の収集にあたっては、所蔵機関へ赴いての原資料調査を積極的に行い、より幅広い資料に目配りした上で考察が行えるようにする。具体的には、平成23年度の実績を踏まえ、鹿持雅澄・草鹿砥宣隆を中心に、本居宣長よりも後の時代に活躍した国学者を主に取り上げ、宣長からの影響関係という観点に注目しながら分析を行う。