hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗原特異的調節性樹状細胞の樹立とこれによる原田病治療の可能性

最初にin vitroパルス樹状細胞に自己免疫疾患惹起能があるかを検討するため、マウス骨髄性樹状細胞を磁気分離システムで採取し、GM-CSF存在下で培養、Tyrosinase related protein 1(TRP1)peptides mixtureにてパルス、CD40,LPSの添加培養によって成熟樹状細胞へと分化させた。この細胞を直接あるいはこの細胞で同種T細胞をプライムし、同種C57BL/6マウスに注入した。それによりマウスに自己免疫性疾患を惹起させることができた。惹起された疾患は臨床的には皮膚の脱毛、白毛がみられたが、眼内に明らかな炎症所見は観察されなかった。組織学的には皮膚毛根、線組織周囲に大量の炎症性細胞の浸潤がみられ、上皮下、上皮中に細胞浸潤のみられる部位では皮膚潰瘍形成もみられた。脱毛、白毛部では色素を貧食したと考えられる大型の細胞が集積し、肉芽腫を形成していた。眼内では虹彩、脈絡膜に肉芽腫様の病変が散見された。これらの所見はVKHのそれに類似するものであった。次にGM-CSF, IL-10,TGF-β1を添加し、immatureな状態を保ったまま抗原をパルスした。これらの抗原特異的未熟樹状細胞の注入あるいは未熟樹状細胞によってプライミングされたT細胞をnaive miceに注射することにより、抗原パルス成熟樹状細胞やこれによってパルスされたT細胞の注入によって惹起される実験的VKHdisease類似疾患発症が抑制されると期待されたが、いずれの注入によっても疾患の発症は抑制されなかった。現在抑制されなかった機序について検索を行っているが、結論は得られていない。1.Mouse TRP1のC57BL/6j mouseにおけるmDCによるprimingによって抗原提示される抗原性部位の決定を行った。Mouse TRP1は20アミノ酸長のpeptideを9アミノ酸残基ずつ互いにオーバーラップするように合成し、タンパク質の全長をカバーした。それらのpeptideを用いてin vitro primingを行った。その結果mouse TRP1-10と29がin vitroでprimingされることがわかった。更にこれらのpeptideを11アミノ酸残基まで短縮して行った。mouse TRP1-10のin vitro primingではTRP1-10-3,7がin vitroでT cellをprimingすることができた。Mouse TRP1-29ではTRP1-29-6がin vitroでT cellをprimingすることができた。更にこれらのin vitro prepulsあるいはpreprimingされたDendritic cellやT cellの注射によって下記の病変を惹起することができた。2.上記によって惹起される自己免疫疾患の病理組織像上記in vitro primingされたT cellによって実験的Vogt-Koyanagi-Harada病類似の疾患をmouseに惹起することができた。臨床的にはT cell注射後、5-7日後に脱毛、白斑が生じた。皮膚の組織像では毛根、血管周囲、基底細胞周囲にリンパ球を中心とする細胞浸潤がみられ、所々類上皮細胞がgranulomaを形成していた。眼球では臨床的には軽微な炎症が注射後5-7後にみられたが、しかし著名な炎症は多発しなかった。組織学的には虹彩、脈絡膜に類上皮様細胞の集積がみられた。マウス骨髄性樹状細胞を磁気分離システムで採取し、GM-CSF存在下で培養、GM-CSF, IL-10, TGF-β1を添加し、immatureな状態を保ったまま抗原をパルスした。これらの抗原特異的未熟樹状細胞の注入あるいは未熟樹状細胞によってプライミングされたT細胞をnaive miceに注射することにより、抗原パルス成熟樹状細胞やこれによってパルスされたT細胞の注入によって惹起される実験的VKH

disease類似疾患発症が抑制されると期待されたが、いずれの注入によっても疾患の発症は抑制されなかった。現在抑制されなかった機序について検索を行っているが、結論は得られていない。HLADRB1*0405を持った人から末梢血単核球分画を分離しGM-CSFにて培養を行った。この培養により樹状細胞分画が多数を占めるようになることが磁気分離およびフローサイトメター解析により確認された。この分画を人GM-CSF, IL-10, TGF-β1存在下で培養し、未熟樹状細胞、制御性樹状細胞分画を安定的に得られるように試みたが、IL-10添加培地では長期間の培養は不可能であった。In vitroでの抗原提示能の検索ではGM-CSF, IFN-γ, LPS存在下では抗原をT cellにプライミングすることができた。しかし未熟樹状細胞と考えられる分画によって同一抗原をプライミングし、制御性T細胞と考えられる分画を作成し、これを成熟樹状細胞にて再度プライミングすると反応性のT細胞が生成された。現在この機序について検索中である。
サイトカイン受容体を介した細胞増殖および分化シグナルの分子機構の解析

我々はエリスロポエチン(EPO)受容体が赤芽球系の分化シグナルを発生できるのか調べるために、EPOに応答して分化する赤芽球系細胞ELM-1にキメラ分子(細胞外EGF受容体、細胞内EPO受容体)を導入した。この細胞はEPOに応答してヘモグロビンの合成が開始し赤味を帯びる。キメラ分子を導入しない細胞ではEGFはヘモグロビン合成に影響しないのに対し、導入した細胞ではEPOのみならずEGFに応答してヘモグロビン合成を促進した。この結果はEPO受容体の細胞内ドメインに分化誘導を行う機能が存在し2量体化によって分化のシグナルが発生することを示している。次にEPO受容体の細胞内ドメインに欠失やチロシン→フェニルアラニンの変異を導入した結果、Y343あるいはY401いずれか一方があれば十分分化しうることがわかった。この2つのチロシン残基はSTAT5の活性化に重要であり、確かにSTAT5の活性化と分化は強く関連していた。次にSTAT5の標的遺伝子であるCISについてEPO受容体との相互作用について調べた。CISは約260アミノ酸よりなる蛋白質で中央にSH2ドメイン、その両側に80個のアミノ酸からなる機能が未知のドメインを有する新規の遺伝子である。CISはSH2ドメインを介してチロシンりん酸化されたIL3受容体やEPO受容体と会合することを明かにした。C末端を削ったEPO受容体との結合を調べたところ結合は細胞膜付近のチロシン(Y)343およびY401を含む領域でおこることがわかった。この領域はSTAT5の会合する領域と一致する。したがってCISは受容体のりん酸化チロシンをマスクし、STAT5の会合を阻害する効果が考えられる。CISはSTAT5によって誘導されSTAT5の活性化を阻害することから一種の負のフィードバック調節因子と考えられた。現在アメリカとの共同研究によりCIS遺伝子ノックアウトマウスを作成、解析中である。次に酵母two-hybrid系を利用してJAK2のキナーゼドメインと直接結合しうる分化をスクリーニングした。その結果新規遺伝子JAB(JAK-binding protein)をクローニングした。JABは構造的にCIS(cytokine-inducible SH2 protein)に類似した分子であり、293T細胞を用いた実験ではJAK1,2,3およびTyk2どのJAK分子とも会合した。two-hybrid系ではCISはJAK2とは結合しなかった。またキナーゼドメインに変異を導入してキナーゼ活性をなくしたJAK2とは結合しなかったのでJABはSH2ドメインとJAK2の自己りん酸化部位を介して結合しているものと考えられた。次に293細胞においてJAK2を過剰発現させるとJAK2の自己りん酸化や基質であるSTATのりん酸化を検出できる。このときJABを共発現させるとJAK2の自己りん酸化やSTATのりん酸化が強力に抑えられることがわかった。ルシフェラーゼアッセイにおいてJABはSTAT3,STAT5の活性化を抑制した。またJABを安定に高発現させた繊維芽細胞はインターフェロンによる細胞増殖抑制効果にたいして耐性を示した。したがってJABはひろくJAK-STAT経路の負の調節因子と考えることができる。さらにデータベースの検索によってESTとして登録されているcDNAのなかにCIS,JABと構造的に類似する遺伝子が少なくとも3つ存在することが明かとなった(CIS2,3,4)。SH2ドメインは25-35%程度のアミノ酸が同一であり、他のSH2ドメインとは明かに異なったグループをつくる。現在このファミリーの機能をノックアウトマウスの作成も含めて検討中である。

次に酵母two-hybrid系を利用してJAK2のキナーゼドメインと直接結合しうる分化をスクリーニングした。その結果新規遺伝子JAB(JAK-binding protein)をクローニングした。JABは構造的にCIS(cytokine-inducible SH2 protein)に類似した分子であり、293T細胞を用いた実験ではJAK1,2,3およびTyk2どのJAK分子とも会合した。two-hybrid系ではCISはJAK2とは結合しなかった。またキナーゼドメインに変異を導入してキナーゼ活性をなくしたJAK2とは結合しなかったのでJABはSH2ドメインとJAK2の自己りん酸化部位を介して結合しているものと考えられた。次に293細胞においてJAK2を過剰発現させるとJAK2の自己りん酸化や基質であるSTATのりん酸化を検出できる。このときJABを共発現させるとJAK2の自己りん酸化やSTATのりん酸化が強力に抑えられることがわかった。ルシフェラーゼアッセイにおいてJABはSTAT3,STAT5の活性化を抑制した。またJABを安定に高発現させた繊維芽細胞はインターフェロンによる細胞増殖抑制効果にたいして耐性を示した。したがってJABはひろくJAK-STAT経路の負の調節因子と考えることができる。さらにデータベースの検索によってESTとして登録されているcDNAのなかにCIS,JABと構造的に類似する遺伝子が少なくとも3つ存在することが明かとなった(CIS2,3,4)。SH2ドメインは25-35%程度のアミノ酸が同一であり、他のSH2ドメインとは明かに異なったグループをつくる。現在このファミリーの機能をノックアウトマウスの作成も含めて検討中である。我々はサイトカイン受容体からのシグナル伝達を解明するためエリスロポエチン(EPO)受容体を介する初期応答遺伝子を検索し、SH2ドメインを有する新規分子CISおよびマウス・オンコスタチンM(OSM)をクローニングした。CIおよびSOSMは未分化な骨髄系細胞においてIL2、IL3、GM-CSF、エリスロポエチンなど各種因子によって極く短時間に誘導された。誘導の分子機構を解析するためにプロモーター領域約1キロベースをクローニングしレポーター遺伝子に融合させた。このレポーター遺伝子はエリスロポエチンなどで強力に誘導された。CISおよびOSMのプロモーター領域には転写開始部位付近に複数のGAS(インターフェロンγ活性化部位)様配列が存在しサイトカインによる転写促進に必須であることがわかった。COS細胞ではこれらのプロモーターはSTAT5は多くのサイトカインで共通に活性化されることからCISおよびOSMの転写調節にSTAT5が関与することが強く示唆された。しかしCISとOSMの誘導の時間変化などは異なっており、STAT5以外の要素も関与するものと考えられる。次にCISのシグナル伝達における役割を解析するためCIS遺伝子をステロイドで誘導可能なプロモーターに融合し血液株細胞に導入した。
形式グラフ体系の機械学習とグラフマイニングに関する研究

形式グラフ体系(Formal Graph System, FGS)は、Uchidaら(1994)によって導入されたグラフを対象とする一種の論理プログラムである。本研究課題では、3つの計算論的学習モデル、すなわち正例からの多項式時間帰納推論モデル、質問学習モデル、PAC学習モデルを用いて、グラフパターンと形式グラフ体系の多項式時間学習可能性を議論した。特に、形式グラフ体系がPAC学習可能であるための十分条件を、論理プログラムの各種パラメータを用いて明らかにした。また、部分グラフの分布情報を利用する分布学習アプローチにより形式グラフ体系の一部のクラスが多項式時間質問学習可能であることを示した。平成26年度の研究計画に従って、次の1と2に関する研究を行った。1.グラフ理論的グラフクラスによるグラフパターン学習理論の進展:GとHを無向グラフとし、Gを辺縮約によってHに変換できるかを考える。ただし、次のような条件を設定する。Hの頂点集合の部分集合Uを指定する。HのUに属さない頂点vは、vへ縮約されるGの頂点数がちょうど1個となる頂点とする。本研究課題では、グラフHの頂点のうち、独立かつ次数2の頂点をUの頂点と指定すると、Hが部分k-木である場合に、GからHへの変換が多項式時間計算可能であることを証明した。この定理を踏まえ、新たに部分k-木縮約パターンという新しいグラフパターンを導入した。特に、部分1-木縮約パターン、これを単に木縮約パターンと呼ぶ、に関して、順序木集合が与えられたとき、それらに共通する木縮約パターンを発見する問題を最適化問題として定式化し、その問題の計算量理論的下界を数学的に証明した。2.形式グラフ体系によるグラフパターンの計算量理論的階層構造の解明:形式グラフ体系とは、グラフを項として直接扱うことが出来る一種の論理プログラムである。本研究課題では、文脈決定正則形式グラフ体系を形式グラフ体系のサブクラスとして導入し、そのクラスにより生成されるグラフ言語の全体が、多項式時間で教師付き学習(MAT)可能であることを数学的に証明した。また、形式グラフ体系により設計されたグラフパターンクラスのPAC学習可能性についても論じた。PAC学習とは、学習アルゴリズムの出す仮説に誤差を許す学習モデルで、現実世界のでータを扱う際、でータの揺らぎを許容できるので都合がよい。本研究課題では、形式グラフ体系がPAC学習可能であるための十分条件を数学的に証明した。以上が本研究課題で平成26年度に行った研究結果である。平成27年度の研究計画に従い、グラフパターン言語に対する多項式時間学習アルゴリズムの設計と解析に関する研究を行った。正例からの帰納推論は計算論的学習理論において研究の中心となる学習モデルのひとつである。正例から多項式時間帰納推論可能であるためには、グラフパターン照合・発見のための多項式時間アルゴリズムが得られること、及び帰納推論可能であるためのいくつかの条件を示すことができれば十分である。順序項木パターンは、構造的変数を持つことが出来るラベル付き順序木構造パターンで、XML文書やRNAの二次構造のような順序木構造パターンを表現することが出来る。一方、文字列パターンの研究でよく知られているタンパク質データベースPROSITEでは、文字列で表されたタンパク質のクラスを表現するパターンとして、正規パターンの変数に代入可能な文字列の長さに制約を課すPROSITEパターンが定義されている。順序木構造パターンにはPROSITEパターンのような照合する木の数値的特徴を表現するパターンは知られていなかったが、本研究では、そのようなパターンとして高さ制約付き順序項木パターンを定義し、このパターンのクラスが、変数のラベルが全て異なり、かつ変数をチェーンとして持たないとき、正例から多項式時間帰納推論可能であることを証明した。実用的側面からの研究成果として、ネットワークトラヒックデータからインターネットのインシデントを学習する手法の提案を上げる。本手法は、トラヒックデータのパケット間距離とパケットクラス分類に基づいて作成した重み付き有向グラフに対して、グラフカット半教師あり学習を適用する手法である。このような事例では、計算量理論的な効率の良さにこだわらず、確率的・近似的・発見的手法を取り入れ、実社会で支える技術の構築を目指している。以上が本研究課題で平成27年度に行った研究結果である。平成27年度の研究計画では、(1)グラフ理論的グラフクラスによるグラフパターン学習理論の進展、(2)形式グラフ体系によるグラフパターンの計算量理論的階層構造の解明、及び(3)形式グラフ体系言語の学習アルゴリズムの設計と計算論的学習理論の評価を行うこととしていた。(1)の研究を行うにあたって、順序項木パターンの多項式時間機械学習可能性は本年度までで十分吟味したと考えている。順序項木パターンはほとんどの現実的な順序木構造データを表現できることで有望である。さらに、本研究では、主にバイオインフォマティックスにおける実用面を重視し、高さ制約付き順序項木パターンの多項式時間機械学習可能性を議論した。本研究の成果は、学術雑誌に投稿済みである。(2)では、本研究課題開始と同時に形式グラフ体系に現れる様々な論理プログラム的パラメータによって形式グラフ体系を階層化することから始めている。そして、形式グラフ体系のパラメータ化されたクラスに対する枚挙による学習アルゴリズムを提案し、PAC学習可能な形式グラフ体系を明らかにした。この点から研究計画は順調に推移していると考える。(3)では、PAC学習以外にMAT学習についても多項式時間機械学習可能なクラスを明らかにしており、その研究成果論文の国際会議への投稿を計画中である。以上のことより、研究成果の公表が研究計画と比較してやや遅れているが、研究計画自体は順調に推移していると考えている。

平成28年度の研究計画に従って、形式グラフ体系言語によるグラフマイニングアルゴリズムの開発とその実装及び視覚化に関する研究を行った。語句の分布情報を利用する分布学習を形式グラフ言語に一般化することで、形式グラフ体系言語の学習理論構築における理論的基盤とした。形式グラフ体系はグラフを項とする論理プログラムの一種で、アルゴリズム論的学習理論で良く研究されている基本形式体系のグラフ理論的拡張である。本課題では、形式グラフ体系が、1-有限文脈性を有すること、正規であること、次数と木幅が有界であるグラフだけを生成すること、以上の条件を満たすならば、所属性質問を用いて多項式更新時間で正例から帰納推論可能であることを証明した。ここで、1-有限文脈性とは、形式グラフ体系の各述語に対して、その述語が定義するグラフ言語が一変数グラフパターン言語であることをいう。また、形式グラフ体系が正規であるとは、その形式グラフ体系が超辺置換文法と等価であることをいう。本定理は、分布学習アプローチによる形式グラフ体系言語のグラフマイニングの理論的基盤となる結果である。グラフマイニングアルゴリズムの実装及び視覚化を行った。本年度は、木幅が有界であるグラフとして知られている外平面的グラフパターン発見アルゴリズムの実装とGUI開発を行い、高校生向け公開講座等で実演を行った。外平面的グラフ構造は、化学化合物データからのデータマイニングで研究がすすめられている。これは化学化合物データの多くは外平面的グラフ構造を持つという理由による。本課題ではさらに、全ての化学化合物データからのグラフマイニングを効率良く行うために、木幅有界なグラフパターンを定義し、与えられた木幅有界なグラフパターンが、与えられたグラフに照合するか否かを判定する多項式時間アルゴリズムを提案した。以上が本研究課題で平成28年度に行った研究結果である。形式グラフ体系(Formal Graph System, FGS)は、Uchidaら(1994)によって導入されたグラフを対象とする一種の論理プログラムである。本研究課題では、3つの計算論的学習モデル、すなわち正例からの多項式時間帰納推論モデル、質問学習モデル、PAC学習モデルを用いて、グラフパターンと形式グラフ体系の多項式時間学習可能性を議論した。特に、形式グラフ体系がPAC学習可能であるための十分条件を、論理プログラムの各種パラメータを用いて明らかにした。また、部分グラフの分布情報を利用する分布学習アプローチにより形式グラフ体系の一部のクラスが多項式時間質問学習可能であることを示した。平成26年度の研究計画では、1.グラフ理論的グラフクラスによるグラフパターン学習理論の進展、及び2.形式グラフ体系によるグラフパターンの計算量理論的階層構造の解明を行うこととしていた。
熱ショックタンパク質70(hsp70)遺伝子の発現制御とmyc

熱ショックタンパク質70(hsp70)遺伝子の転写、複製活性を研究し、以下の点を明らかにした。まず、hsp70遺伝子上のin vivoで機能しているDNA複製開始領域を決定したところ、転写プロモーターと重複する約500塩基対であった。更にこの領域は自律増殖活性を有し、詳細に検討したところ、以前にc-mycタンパク質複合体結合配列として同定したmyc-A,B配列が複製開始に必須であり、転写と複製の連動、及びc-mycタンパク質の両機能を明らかとした。転写に関してはmyc量が少ないG1期においいてはmyc-B配列に依存したmycによる転写増強がなされるが、c-myc量が増加するS期では逆に転写抑制が観察された。このことはc-mycによる転写からDNA複製へのスウィッチが行われることを意味していた。更に細胞周期におけるhsp70遺伝子の転写活性を同調した細胞系で検討したところ、G1/Sで顕著に転写活性の増強が観察され、上記の結果を裏付けた。また、myc-B配列に結合し、c-mycタンパク質と複合体形成するタンパク質としてHT-1を同定し、そのcDNAをクローニングし、現在解析している。
歯科医師一患者一歯科衛生士のリスクコミュニケーションに関する基礎的研究

わが国の歯科診療所における歯科医師、患者、歯科衛生士を対象に3者間でのコミュニケーションを評価し、各2当事者間(歯科医師一患者、歯科医師一歯科衛生士、患者一歯科衛生士)のコミュニケーションが患者満足度、医療者の印象、および患者コンプライアンスに及ぼす影響を評価した。2当事者のコミュニケーションは、分担研究者の萩原が提唱している方法である、医療者(歯科医師、粛科衛生士)の患者に対する説明の程度に関し、医療者自信と患者の認識のずれを測定し評価した。その結果、歯科医師一患者コミュニケーション、歯科衛生士一患者コミュニケーションといった、医療者が患者に直接かかわるコミュニケーションとは別に、歯科医師一歯科衛生士問のコミュニケーションが患者満足度に強く影響している可能性が示唆された。近年、歯科医療の現場では患者への情報提供の重要性が高まっており、患者が得た情報や医療者とのコミュニケーションは、患者の治療における意思決定や受診行動に影響を及ぼす可能性が高い。しかし、歯科領域での医療者-患者コミュニケーションに関する知見は殆ど見あたらない。そこで、本研究では、歯科医療機関の患者、歯科医師、歯科衛生士を対象に、自記式質問票を用いて、3者間のコミュニケーションを評価する。特に、3者をセットにした3者コミュニケーションとして把握し、各2当事者間のコミュニケーション(「歯科医師-患者」「患者-歯科衛生士」「歯科医師-歯科衛生士」)の齟齬(例、歯科医師と歯科衛生士が患者に異なった説明や指示をする)や質が患者のコンプライアンス、治療に対する患者の満足度、受診行動に及ぼす影響を評価する。コミュニケーションの質は、萩原が提唱している方法である、患者と医療者に同じ選択肢を有する同一の質問(例、副作用に対する説明は十分ですか?)を発して回答を求め、両者の認識のズレで評価する。平成21年度は、(1)関連する文献や先行研究をレビューし、その知見を基に、当事者間のコミュニケーション(「歯科医師-患者」「患者-歯科衛生士」「歯科医師-歯科衛生士」)に関する自記式質問票を作成した。更に、(2)全国の歯科医療機関を対象に、調査に参加する複数の歯科医療機関を募り、全体で約10施設を確保した。(3)年度の後半から、自記式質問票を用い、一部の参加医療機関を対象に、質問票を送付し、調査を開始した。現在、調査票を回収中であり、回収状況を見て、今後、更に参加医療機関を募るか否かを判断する予定である。歯科医療の現場では患者の自己決定権を尊重する傾向が強まっており、患者への情報提供の重要性が高まっている。患者が得た情報や医療者とのコミュニケーションは、患者の治療における意思決定や受診行動に影響を及ぼす可能性が高い。本研究は、歯科医療機関の患者、歯科医師、歯科衛生士を対象に、自記式質問票を用いて、3者間のコミュニケーションを評価するものである。特に、3者をセットにした3者コミュニケーションとして把握し、各2当事者間のコミュニケーション(「歯科医師-患者」「患者-歯科衛生士」「歯科医師-歯科衛生士」)の鯉語(例、歯科医師と歯科衛生士が患者に異なった説明や指示をする)や質が患者のコンプライアンス、治療に対する患者の満足度、受診行動に及ぼす影響を評価する。平成22年度は、前年度に作成した自記式質問票を用い、三当事者間のコミュニケーション(「歯科医師-患者」「患者-歯科衛生士」「歯科医師-歯科衛生士」)に関する調査を実施した。対象は、本研究の趣旨に賛同し協力を得られた全国の歯科医院の医師、患者、および歯科衛生である。約300組の歯科医師、患者および歯科衛生のペアから回答が得られた。更に、これらの調査の回答に関するデータ入力が修了した。現在、鋭意、データ解析を進めており、結果がまとまり次第、学会発表や論文の形で発表する。

平成23年度は、前年度までに終了した三当事者間のコミュニケーション(「歯科医師-患者」「患者-歯科衛生士」「歯科医師-歯科衛生士」)に関する調査をデータベース化し、データ解析を行った。歯科医師-患者-歯科衛生士のペアは413で、その内訳は179人に歯科医師に対し、15の患者と歯科衛生士のペアが割り振られている。3当事者の場合、歯科医師-患者、患者-歯科衛生士、歯科医師-歯科衛生士という3種類の2当事者間コミュニケーションが存する。歯科衛生士-患者および歯科医師-患者コミュニケーションは、歯科衛生士-歯科医師コミュニケーションとは直接的なかかわりを持たない。しかし、歯科医師-歯科衛生士コミュニケーションが他の2者間のコミュニケーションに影響する可能性が示唆された。これは本研究で最も特徴的な知見であり、今後のチーム医療のあり方を考えるうえで、理論的および実務的に重要な意味を持つと思われる。早急に知見を論文にまとめ発表する予定である。
ＳＨＧ顕微鏡による増殖性網膜疾患新規病因タンパクの効率的スクリーニング

我々は、増殖組織マイクロアレイ解析を行い、約300の増殖組織特徴的遺伝子群の抽出をしている。今回、新しくコラーゲンの構造を染色することなく観察可能なSHG顕微鏡を用いて、コラーゲン上に網膜色素上皮細胞を培養し、多数の目的タンパクで刺激をすることでコラーゲン再構築へのの影響を同時にかつ、継時的に観察することができるモデルを開発し、それを用いてペリオスチン・テナシンC等のコラーゲン再構築への作用を評価した。一方で、それらのタンパクの機能について、眼内細胞(網膜血管内皮細胞・網膜色素上皮細胞)を用いて細胞遊走・増殖・管腔形成に促進的に働くことを明らかにした。本年度はSHG顕微鏡を用いた線維化アッセイを小型化する至適化を大阪大学荒木研究室と行った。これまで6cm Dishを用いてコラーゲンゲル上にヒト網膜色素上皮細胞を播種し、経時的変化をSHG顕微鏡を用いて定量化している。このアッセイを用いて、ペリオスチンがコラーゲンリモデリングを促進するという結果を得ている。今回、Dishを小型化することにより多数の病因候補タンパクの線維化への影響を同時に評価することを目指した。しかし、Dishを小型化することによりゲル表面が盛り上がり、観察深度でのSHG輝度が不安定になった。この弱点を克服するためにこれまで使用していた大きめのDishの比較的平坦となる中央部を特殊なスペーサーで区切る事で、一つのDish上で多数の評価ポイントを得るように試みた。現在TGFβ及びマトリセルラープロテインの一つであるテナシンCを用いてその影響を評価し、特にテナシンCに線維化を促進する可能性を認めている。また、増殖糖尿病網膜症患者から摘出した増殖膜についてSHG顕微鏡で得られた像とSMA陽性細胞及び新生血管について相関解析を行った。血管内皮細胞、細胞核、SMA陽性細胞をCD31,EthD-1,SMA抗体で同時に染色し観察した。SHG輝度は、比較的大きな血管周囲で最も輝度が高くなる事がわかった。この部位は血管を構成するコラーゲンが同軸方向に規則的に配列しているために輝度が高いことが予想された。血管成分の少ない部位では核染された細胞周囲のSHG輝度が高い傾向があり、今後SMA細胞周囲と、それ以外の細胞周囲でSHG輝度に変化がないか解析を行う予定である。また、ペリオスチン・テネシンC機能解析については九州大学眼科学教室とともに細胞増殖・遊走への影響やノックアウトマウスを用いた線維化モデルを用いて評価を行っている。本年度は、昨年度までに完成させたSHG顕微鏡を用いた線維化評価モデルを使って、ヒト増殖糖尿病網膜症及び増殖硝子体網膜症増殖膜で遺伝子発現亢進を認めていたペリオスチンについて機能解析を行った。福大筑紫病院及び九州大学附属病院で手術時に採取された硝子体を用いて眼内のペリオスチン濃度を測定したところ、黄斑円孔・黄斑前膜患者硝子体中のペリオスチン濃度は平均0.19ng/ml(n=28)に対して糖尿病黄斑症患者硝子体中では1.48ng/ml(n=20),増殖糖尿病網膜症患者硝子体中には12.16ng/ml(n=163)と糖尿病網膜症患者硝子体中では60倍を超えるペリオスチン濃度の発現亢進を認めた。増殖糖尿病網膜症患者硝子体中には最大で175ng/ml濃度で存在する。そのためin vitro系で用いるペリオスチン濃度を100ng/mlとして機能解析を行った。I型コラーゲンゲル上にヒト網膜色素上皮細胞(RPE)を播種しすぐにペリオスチンを添加して、SHG発現面積率及び発現輝度をリアルタイムに測定し,無刺激群と比較して有意なSHG発現面積率・平均輝度の増加を認めた。SHG光の亢進はコラーゲン線維リモデリングを表し、コラーゲン量及びコラーゲン線維配向・線維径にも影響される。RPE細胞をコラーゲンゲルに包埋したコントラクションアッセイ系では、ペリオスチンはゲル収縮能を持たず、このことからペリオスチンはRPE細胞を介したゲルの牽引にはあまり関与せずに、主に線維化を促す可能性が示唆された。現在生体内でのペリオスチン機能解析目的で、ペリオスチンKOマウスを用いたレーザー脈絡膜新生血管モデルでの線維化の評価を行っている。SHG顕微鏡及び走査電顕を用いて観察し、コラーゲン線維走行及び線維の太さに対する影響を評価中である。これまで難航していた評価系の縮小化につとめた。最終的にはマイクロスライドを用いた評価系に落ち着いた。RPE細胞を接着させたコラーゲンゲルの構造を観察するために, 15ウェルマイクロスライド(μ-Slide Angiogenesis, ibidi,)を用いてサンプルを作製した。

コラーゲンゲルを10.5 μl注入し,その上にRPE細胞を播種して50 μlの培養液で培養した。マイクロウェルスライドを用いて評価系を縮小した際に、ウェル内のゲルの表面の歪みが6cmDishと比較して大きくなるために、SHG輝度を評価する際に、SHG輝度のばらつきとして問題となった。そのため、コラーゲンゲル表面の解析を行い、比較的歪みの少ない範囲を撮像に適している領域及びコラーゲンゲル内の撮影面積の至適化を行た。その評価系を用いて、TGFβ、ペリオスチン、テナシンCについて検討を加えた結果、TGFβのみがSHG輝度を有意に促進した。また、網膜色素上皮細胞(RPE細胞)を用いて、ペリオスチンの機能解析を行い、ペリオスチンが細胞の遊走を促進することが明らかとなった。また、ペリオスチンの核酸医薬を九州大学吉田講師と共同で作製し、脈絡膜レーザー血管新生モデルの線維化抑制効果を持つことを明らかとした。テナシンCについては網膜血管内皮細胞を用いた検討で、細胞増殖、遊走、管腔形成を促進することが明らかとなっている。一方で、硝子体内のペリオスチン濃度と増殖糖尿病網膜症の病態との関連について検討を加え、増殖糖尿病網膜症でも、牽引性網膜剥離を伴う症例で、硝子体内のペリオスチン濃度が高いことが明らかとなった。眼科学当該研究では包括的遺伝子解析方法を用いて得られた増殖性網膜疾患に対する新規分子標的候補(約300)をSHG顕微鏡を用いたコラーゲン線維リモデリングモデルを用いてスクリーニングし、動物実験などで機能の評価を行う予定である。現在このコラーゲン線維リモデリングモデルを用いてペリオスチンの線維化への影響を明らかにし、その生体内への影響についてレーザー脈絡膜新生血管モデルを用いて、血管新生後に起こる線維化課程を走査電顕及びSHG顕微鏡を用いて評価を継続中である。この方法は、今後他の新規分子標的候補の機能解析にも直接応用することが可能であり、今後の研究速度を上げるプラットフォーム作りに当たる。今回、SHGコラーゲン線維リモデリングモデルの小型化に有効な方法を見いだし、これまでの方法と比較して遜色ないか評価中である。今回の実験で新たにテナシンCが、眼内線維化に関連がある可能性を見いだしている。一方で、増殖糖尿病網膜症患者から摘出された増殖膜についても、組織を構成する構成成分と、SHG輝度との関連について検討を行い、いくつかの新しい知見が得られている。我々は九州大学眼科額教室と共同で増殖糖尿病網膜症及び増殖硝子体網膜症患者より採取した増殖組織を用いて正常網膜をコントロールとした包括的遺伝子解析を行っている。この方法で得られた増殖性網膜疾患に対する新規分子標的候補は約300種類に及ぶ。また、昨年度までにSHG顕微鏡を用いて、ゲル内のコラーゲン線維をリアルタイムに直接観察、定量化できる新しいコラーゲン線維リモデリングモデルを開発している。当該研究では、このモデルを用いて、新規分子標的候補のうち、直接線維化をもたらす物質をスクリーニングし、その機能解析を動物モデルを用いて検討する予定である。今年度は、この新規コラーゲンリモデリングモデルを用いてペリオスチンの線維化への影響を明らかにした。加えて、その生体内での働きについて、レーザー脈絡膜新生血管モデルを用いて、血管新生後に起こる線維化課程を走査電顕及びSHG顕微鏡で評価している。この方法は、今後他の新規分子標的候補の機能解析に直接応用することが可能であり、今後の研究速度を上げる基板作製課程に当たると考える。
インターフェロン誘導性ケモカインが腎癌の浸潤、転移にはたす役割についての検討

インフォームドコンセントの得られた腎癌患者の摘出標本より採取した凍結組織を、非腫瘍部、腫瘍部ともに保存状態が良好で予後の追跡可能な67例、134検体用意した。それらのRNAを抽出し、その腫瘍部、非腫瘍部におけるインターフェロン誘導性ケモカイン、およびそのレセプターのmRNAの発現状況に付き解析を行うこととした。抽出したRNAについてRNA integrity numberを計測しRNAの質的評価を行い、計測に不適切と思われる例を除外した後、ケモカインの発現につきrealtime RT-PCRによる解析を行った。検討したケモカインは血管新生を調節するMig、IP-10、I-TACおよびそれらのレセプターであるCXCR3、また、これらケモカインの負の調節因子であるRGS5の発現ついても解析を行った。以前の研究でこれらのケモカイン、およびレセプターの発現量が腎癌腫瘍部で上昇していることを報告した(Cancer.2005;103:258-267)が、症例数が少なく、臨床上の諸データとの比較検討が困難であった。今回は組織型別にケモカインの発現量を調べ、組織型による血管新生調整ケモカインの発現について検討した。ケモカインの腫瘍部での上昇は淡明細胞型腎細胞癌において特徴的な現象であることが明らかになった。その後、組織型、腫瘍径、転移の有無など臨床学的諸因子と、ケモカインの発現量との検討、および、RGS5とケモカインの発現量、またRGS5と様々な臨床学的諸因子との関連について検討を行っている。解析の途中経過については2008年4月の第96回泌尿器科学会総会において報告を行った。まずはそのうち42検体について、そのRNAを抽出し、その腫瘍部、非腫瘍部におけるインターフェロン誘導性ケモカイン、およびそのレセプターのmRNAの発現状況に付き解析を行うこととした。抽出したRNAについてRNA integrity numberを計測しRNAの質的評価を行い、計測に不適切と思われる6例を除外した後、ケモカインの発現につきreal time RT-PCRによる解析を行った。検討したケモカインは血管新生を調節するMig、IP-10、I-TACおよびそれらのレセプターであるCXCR3である。今後は症例数を増やしケモカインの発現上昇と、臨床上のデータとの関係について解析を進める予定である。また、これらケモカインの負の調節因子であるRGS5の発現が腎癌腫瘍部において発現しており、非腫瘍部ではほとんど発現していないことを発表したが(J Pathol.2004;203(1):551-8)、RGS5とインターフェロン誘導性ケモカイン、およびそのレセプターの発現については全く解明されていないため、RGS5の発現量についても解析を行い、今後臨床上のデータ、およびケモカイン発現量との関係について検討する予定である。
医療用陽子線加速器施設の研究

本総合研究は、近年すすめられてきた陽子線による癌治療の成績が優れていることから、これをより効果的な療法に発展させるための適切な施設を開発することを目的とした。とくに米国においては、マサチューセッツ総合病院がハーバード大学サイクロトロンを利用して800例を超える癌症例について高い制御率をしめし、我国では筑波大学粒子線医科学センターおよび放射線医学総合研究所における陽子線治療成績が、多くの癌研究者からなる検討委員会によって高く評価されている。しかしながら、これらの施設は当初から陽子線治療を目的として建設されたものではないので、陽子ビームの性質は満足すべきものとはいえず、また時間的、空間的にも制御が多い。本研究では、十分な癌症例数を治療する規模の病院内に設置しうることを条件として、陽子線治療の特徴を発揮しうる医療施設とはどのようなものであるか、について答えることを意図した報告書を作成した。適切な加速器,照射装置,建屋の例を示し、これについてのコストベネフィットを試算した。この報告書で提案した医療用陽子加速器施設は、この意図に対して現段階では満足すべきものと考えられる。このような施設の早急な実現によって、良質の治療を期待する多くの癌患者の社会復帰への助けとなることが切望される。
食品由来硫化水素ドナー化合物を用いたアルツハイマー病予防法開発に関する研究

本研究は食品成分によるアルツハイマー病予防効果について研究を行った。ガーリック香気成分のDiallyl trisulfide (DATS)が硫化水素ドナー化合物であることを見出した。アミロイドβは神経成長因子で分化誘導されたPC12細胞や初代培養のラット神経細胞に神経細胞傷害を誘導した。DATSや他の硫化水素ドナーはアミロイドβによる神経細胞傷害に対して保護作用を示さなかった。一方、DATSに抗炎症作用があること、その作用メカニズムを明らかにした。硫化水素は有毒ガスとして知られる一方、生体内で一酸化窒素や一酸化炭素に次ぐ第3のガス性シグナル伝達物質として注目されている。硫化水素の作用には神経細胞保護作用、平滑筋弛緩作用、抗炎症作用などが報告されている。ガーリック由来の香気成分diallyl trisulfide (DATS)がタンパク質やペプチドのSH基と反応する際に副産物として硫化水素を生じること、すなわち硫化水素ドナーとなると考えられている。高齢化社会の到来に伴いアルツハイマー病の患者数の増加は深刻な社会問題である。本研究は、食品成分由来硫化水素ドナーを用いたアルツハイマー病予防法の確立を最終目標としている。本年度はDATS投与により脳内で硫化水素の生成が見られるかを中心に検討した。いくつかの濃度でDATSを経口投与、あるいは静脈投与したマウス脳内の硫化水素についてメチレンブルー吸光光度法を用いて測定した。しかしながら、生成された硫化水素の濃度が低く、メチレンブルー吸光光度法では検出できなかった。そこで、DATSと生体内SH基のモデルとしてグルタチオンを様々なpH条件で反応させ、実際に硫化水素の生成を確認した。その結果、中性領域において硫化水素の生成を確認することができた。また、細胞や脳のlysateとDATSを混合し、硫化水素の生成をメチレンブルー吸光光度法で分析したところ、硫化水素の生成が確認された。以上の結果から、DATS投与マウスの脳内で直接的に硫化水素を検出できなかったが、in vitroではDATSはSH基を持つグルタチオンやタンパク質のSH基と反応し、硫化水素が生成されることが明らかとなった。本年度は硫化水素のドナーとしてのガーリック由来香気成分diallyl trisulfide(DATS)による神経細胞保護作用について、in vitroの検討を中心に行った。これまでの研究の結果、DATSにがん細胞増殖抑制作用やアポトーシス誘導作用があることから、まず、神経細胞に対する細胞毒性評価から行った。ラット副腎髄質褐色腫から単離されたPC12細胞を神経成長因子で神経細胞に分化させたモデルを用いて実験を行った。分化させたPC12細胞にDATSを作用させ、細胞傷害の有無を確認したところ、DATSはPC12細胞に対して細胞毒性を示さないことを確認した。次にamyloid βによる細胞傷害実験条件について検討した。ヒトamyloid β1-42をPC12細胞に作用させ、24時間後の細胞生存率を検討した。現在、再現性の高い実験条件が決まり、DATSと硫化水素ドナーとして広く用いられている硫化水素ナトリウムによる神経細胞保護の有無について実験を行っている。DATSはタンパク質やペプチドのSH基と反応する際、副生成物として硫化水素を生じる。本研究では生成した硫化水素による神経細胞保護作用を想定しているが、DATSと反応するタンパク質のSH基の酸化修飾によって神経保護作用や細胞機能調節作用を示す可能性も考えられた。そこで、DATSによる酸化修飾タンパク質について検討した結果、タンパク質の酸化還元に関わるthioredoxinや分子シャペロンタンパク質であるHeat shock protein 27のシステイン残基とDATSが反応することが明らかとなった。DATSのタンパク質修飾が細胞機能に及ぼす影響についても、あわせて検討を行っていく予定である。アルツハイマー病の原因はまだ分かっていない。しかし、臨床的には脳内でアミロイドβタンパク質(アミロイドβ)が凝集してアミロイド斑として沈着し、やがて神経細胞が死滅することから、アミロイドβがアルツハイマー病の原因物質と考えるアミロイド・カスケード仮説が有力となっている。昨年度まで培養神経細胞にアミロイドβを処理し、神経細胞傷害活性を測定してきたものの、神経細胞障害活性値が実験ごとに大きく異なり、結果が安定しない問題があった。そこで本年度は、細胞傷害活性測定方法の変更、アミロイドβ調製方法の変更、実験に使用するアミロイドβの変更を行った。まず、細胞傷害活性の測定方法はミトコンドリア活性を指標にしたMTT法を使用していたが、細胞膜が傷付くことで細胞内の乳酸脱水素酵素が培養培地へ逸脱することを指標にしたLDH法に変更した。また、アミロイドβは単量体として調製したあと、細胞に添加することで重合させて細胞障害を誘導していたが、論文を参考にあらかじめアミロイドβオリゴマーを形成させた後に添加する方法に変更した。さらに、実験に使用するアミロイドβの種類を変更した。以上の変更により、アミロイドβによる細胞障害活性を安定的に測定できることに成功した。また、LDH法以外の方法でもアミロイドβによる神経細胞死について評価を行い、アポトーシス細胞に特徴的なcaspase-3の活性化やPARPの断片化などが観察され、アミロイドβが神経細胞にアポトーシスを誘導することを確認した。アミロイドβによる神経細胞障害活性測定の安定的な測定に予想以上の時間がかかった。そのため、硫化水素や硫化水素ドナーによる神経細胞保護効果があるかの検証をすることができていない。

アルツハイマー病は記憶を司る海馬を中心とした神経細胞の細胞死により、記憶や思考能力が障害され、最終的には日常的に行われる簡単な作業さえもできなくなってしまう病気である。アルツハイマー病患者の脳内ではアミロイドβタンパク質(アミロイドβ)が凝集してアミロイド斑として沈着し、やがて神経細胞が死滅することから、アミロイドβがアルツハイマー病の原因物質と考えるアミロイド・カスケード仮説が有力となっている。本年度は、これまでのPC12細胞を用いたアミロイドβの細胞傷害評価に加えて、ラット神経細胞の初代培養を用いた実験を行った。これまではラット副腎褐色種PC12細胞を神経成長因子で分化誘導させた神経様細胞にアミロイドβを処理し、細胞傷害をMTT法やLDH法を用いて検討を行っていた。しかしながら、細胞分化の程度によりアミロイドβ刺激後の細胞生存率が異なること、アミロイドβ未処理の細胞においても培養時間が長くなることにより細胞生存率の低下が見られ、再現性の高い結果を得ることは困難だった。そこで、ラット大脳より神経細胞を単離し、初代培養実験を並行して行い、PC12細胞と比べると、アミロイドβにより比較的安定した結果が得られた。そこで、アミロイドβによる神経細胞傷害を硫化水素のドナー化合物であるNaHSやNa2S、ガーリック由来硫化水素ドナーのdiallyltrisulfide(DATS)をPC12神経細胞と、ラット神経細胞の初代培養に前処理した後、アミロイドβを処理することでアミロイドβによる細胞障害を抑制できるか検討した。神経細胞にアミロイドβを処理することで細胞障害が誘導されたが、硫化水素ドナーの前処理ではその細胞傷害を抑制することができなかった。以上の結果から、細胞レベルではアミロイドβによる神経細胞傷害を外因的な硫化水素ドナーは抑制できないことが明らかとなった。本研究は食品成分によるアルツハイマー病予防効果について研究を行った。ガーリック香気成分のDiallyl trisulfide (DATS)が硫化水素ドナー化合物であることを見出した。アミロイドβは神経成長因子で分化誘導されたPC12細胞や初代培養のラット神経細胞に神経細胞傷害を誘導した。DATSや他の硫化水素ドナーはアミロイドβによる神経細胞傷害に対して保護作用を示さなかった。一方、DATSに抗炎症作用があること、その作用メカニズムを明らかにした。Amyloid βによる神経細胞の細胞傷害実験結果の安定性に問題があり、DATSや硫化水素による神経細胞保護作用の評価に至っていないため、全体として実験は遅れている。その一方、DATSによる神経細胞保護作用のメカニズム解明に重要なDATS酸化修飾タンパク質を同定し、2つの論文として報告した。硫化水素や硫化水素ドナーによる神経細胞保護効果があるかの検証を行う。研究を遂行する過程で当初検討していた手法では安定的に細胞傷害活性を示すアミロイドβを調製することが困難であった。そのため、細胞に添加するアミロイドβの調製方法の最適化や細胞毒性評価方法の変更をおこなったため、年度内の研究完了ができなくなった。
薬物動態に起因した肝毒性発現要因の解析

主要な薬物毒性因子「酸化的ストレス」と「活性代謝物」を中心に、肝ミクロゾーム、遊離肝細胞、初代培養肝細胞、肝臓組織を用いて薬物による肝毒性を解析した。酸化的ストレスを解析するために、化学発光測定系を導入した。この測定系を利用してCL-HPLCシステムを確立し、薬物代謝過程で生成する過酸化脂質を直接的に検出することができた。この特異的な手法を用いることにより従来の指標(TBARS)で評価される脂質過酸化よりも早期の段階を評価することができた。さらに薬物代謝過程で上記試料から発生する極微弱化学発光を検出することができ、肝障害性評価との比較対応することにより薬物毒性との関連性を明確にすることができた。また極微弱化学発光を利用した臓器灌流測定システムを作製し、薬物灌流時に肝臓より発生する化学発光を直接検出することができ、臓器レベルでの酸化的ストレスを実証した。これらの測定系が検知した結果は細胞内グルタチオンの変動と密接に関連していることを明らかにした。以上、薬物代謝に起因する酸化的ストレスに関する高感度で特異性の高い解析システムを確立することができた。活性代謝物に関しては、ラットおよびヒト肝ミクロゾームおよび発現系を用いて抗高血圧薬ジヒドララジンの代謝によりCYP1A2だけでなくCYP3A4も標的タンパクとなることを明らかにし、アレルギー性肝炎のneoantigenとなる可能性を示唆した。また三環系および四環系抗うつ薬、イミプラミンおよびミアンセリンによる肝細胞障害性はシトクロムP450による代謝的活性化と密接に関連していることを示した。NSAIDの肝障害を検討し、ジフェニルアミン骨格が細胞障害を惹起すること、さらにジフェニルアミンおよびその骨格を持ったNSAIDは酸化的リン酸化脱共役作用を有し、それが肝細胞障害の主因であることを明らかにした。薬物による肝毒性発現要因として、本研究では薬物動態に起因した酸化的ストレスと薬物の活性代謝物のタンパク質との共有結合について検討する。実験動物としてラットを用い、肝ミクロゾームおよび遊離肝細胞にて以下のような研究成果を得た。I.薬物肝内動態と酸化ストレス:非ステロイド系抗炎症薬としてサリチル酸を取り上げ、サリチル酸の肝障害発現因子を調べた。サリチル酸を肝ミクロゾームと反応させると、NADPH存在下でサリチル酸濃度依存的、反応時間依存的にチオバルビツール酸反応物質(TBARS)が生成し、これは酸化代謝物生成の経時変化と類似した挙動を示し、さらに化学発光を測定するとこの系から極微弱化学発光が観測された。この脂質過酸化はシトクロムP450阻害剤であるSKF-525Aおよびシメチジンによって抑制された。またこの化学発光は1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンの添加により一過性の増加を示し、さらに発光スペクトルから一重項酸素の発生が示された。遊離肝細胞系でもサリチル酸はTBARS、化学発光を生成し、細胞内還元型グルタチオンの低下、LDHの漏出を引き起こした。これらは抗酸化剤により抑制された。以上の結果はサリチル酸に肝細胞障害には酸化代謝過程での酸化的ストレスが関与していることを示唆している。II.薬物肝内動態と活性代謝物:ジヒドララジンを用いて肝ミクロゾームにおける薬物代謝酵素の不活性化を調べた。この薬物はCYP1A2酵素により代謝的活性化を受け、同酵素に共有結合をすることが知られているが、同酵素を不活性化することを示し、さらにCYP2C酵素をも標的として共有結合し、CYP2C酵素を不活性化することを明らかにした。ジヒドララジンによる酵素の不活性化が肝細胞障害につながる可能性を示唆する。

酸化的ストレスおよび活性代謝物の細胞内蛋白への共有結合を中心に薬剤性肝障害について検討した。(1) CL-HPLCシステムを完成し、ループ利尿薬エタクリン酸およびNADPH存在下でラット肝ミクロゾームからホスファチジルコリンハイドロパーオキサイドを検出することができた。(2)三環系および四環系抗うつ薬、イミプラミンおよびミアンセリンによる肝細胞障害性について雌雄Wistar系ラットおよび雄性Dark Agouti系ラットから単離した肝細胞培養系で調べた。両薬物ともLDHの漏出に先立ち、細胞内グルタチオンおよび蛋白質チオール量の著明な低下を惹起した。イミプラミンでのそれらの低下はWistar系ラットに比べてDark Agouti系ラットでは有意に遅く、またミアンセリンでは雌性Wistar系ラットでのチオールの低下は雄性の両系ラットに比べて有意に遅く、さらにLDHの漏出はチオールの変動と対応していた。これらに結果は両抗うつ薬による肝細胞障害性はシトクロムP450による代謝的活性化と密接に関連していることを示唆している。非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)のジクロフェナックによる肝障害にアシルグルクロニドとキノン体の生体高分子への共有結合が関与すると示唆されてきたが、UDP-グルクロン酸抱合酵素およびシトクロムP450阻害下でも肝細胞障害性が認められたことから、活性代謝物よりもむしろジクロフェナック自体が毒性を発現することが判明した。(3) NSAIDの肝細胞障害性と化学構造との関連性をラット遊離肝細胞にて検討したところ、障害性を示すNSAIDは細胞内ATPを顕著に低下させること、さらに肝ミトコンドリアを単離し呼吸活性に及ぼすNSAIDの影響を調べ、それが脱共役作用によるものであり、その作用にジフェニルアミン骨格が重要であることを明かにした。薬物による酸化的ストレスおよび活性代謝物の細胞内蛋白への共有結合を中心に薬剤性肝障害についてオルガネラ(ミトコンドリア、ミクロゾーム)、遊離肝細胞、灌流肝を用いて検討した。1新たに臓器化学発光測定システムを完成し、CL-HPLCシステムと組み含わせて肝におけるループ利尿薬エタクリン酸による酸化的ストレスの発生について調べた。ラット遊離肝細胞懸濁液へのエタクリン酸添加によりホスファチジルコリンハイドロパーオキサイド(PCOOH)の生成をCL-HPLC法によって検出した。PCOOHはチオバルビツール酸反応物質(TBARS)の生成に先立って生成することがわかづた。また、これらの現象は肝細胞内およびミトコンドリア内グルタチオン量の低下に伴い発現することが明らかとなった。さらにエタクリン酸を灌流した肝臓から極微弱化学発光の発生をリアルタイムで検出することができ、肝臓での工タクリン酸による酸化的ストレスの発生を実証した。2ヒト肝ミクロゾームを用いて、高血圧治療薬ジヒドララジンによるシトクロムP450の不活性化を調べた。ジヒドララジンはこれまでに知られているP450 1A2に加えて、P450 3A4によっても代謝的活性化を受け、P450 3A4への結合、不活性化を引き起こすことが判明した。このことはジヒドララジンによる自己抗体の産生にはP450 1A2だけでなく、それ以外の要因の関与も示唆している。3ジフェニルアミン骨格を有する非
受容体型チロシンキナーゼを介する情報伝達機構

インスリン受容体を介する情報伝達系に関しては、PI3-キナーゼの活性化機構について検討を行った。まずPI3-キナーゼの85Kに対するモノクロナル抗体を作製した。この抗体を用いて、CHO-IR細胞について検討した。その結果、インスリン添加により、IRS-1と呼ばれている分子量185,000の蛋白にPI3-キナーゼ活性が結合すると考えられた。その機構としては、IRS-1のチロシン燐酸化部位と想定される燐酸化ペプチドによって、IRS-1と85Kサブユニットの結合が阻害されるが非燐酸化ペプチドによっては阻害されないこと、また85KサブユニットのSH-2ドメインのみを発現するとこの部分がIRS-1と結合することにより、インスリン受容体によってIRS-1がチロシン燐酸化するとその部位をPI3-キナーゼの85KサブユニットのSH-2ドメインが認識して両者が結合すると推定された。EGF受容体を介する情報伝達系に関しては、EGF受容体の各種の変異体を作製した。これらの変異体と細胞内蛋白との結合を検討した。この中で我々はSHCと呼ばれる蛋白がEGF依存性にEGF受容体と結合すること、ある種の変異体ではこの蛋白の結合が認められないことを見い出した。SHCの結合はRas蛋白の活性化、すなわちGTP結合型Ras蛋白の増加と関係していると想定されているが、現在この点について検討中である。またEGF受容体の各種変異体とその作用との関係では、EGF受容体のキナーゼ欠損の変異体でもMAPキナーゼの活性化やチミジンのDNAへの取り込みは高濃度のEGFでは生じることを認めた。従って、EGF受容体には、高濃度ではその内在するキナーゼ活性を介さない情報伝達系も存在すると考えられる。