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光機能性リン酸塩ガラス融体の粘度、密度、表面張力に関する研究

本最終年度ではアルカリ土類、亜鉛リン酸塩系ガラス融体(50RO-50P_2O_5, R=Mg,Ca,Sr,Ba,Zn)の密度,表面張力を精度よく測定し、組成依存性、温度依存性を明らかにすることを目的とした。密度はアルキメデス二球法を用いて測定した。表面張力はリング引き上げ法を用いて測定した。測定温度は状態図の液相線温度以上である800°Cから1200°Cの温度域において測定した。測定誤差はそれぞれ1%以内であった。全組成において密度は温度の上昇と共に減少した(2.33.4g/cm^3)。密度の大きさはBa>Sr>Zn>Ca>Mgの順に大きな値を示した。イオン充填率はBa,Sr,Ca系では4245%を示したのに対し、Mg,Zn系は3940%の値を示した。すなわちイオン半径の小さいイオンほど、充填率は小さく、Mg,Zn系の酸素配位状態がBa,Sr,Ca系と比較して異なるためであると推測された。表面張力はSr>Ca>Mg>Ba>Znの順に大きな値を示した(220258x10^<-3>N/m)。表面張力温度係数は全ての系において負の値を示し、Mg>Zn>Ca>Sr>Baの順に大きくなった。表面張力温度係数は陽イオン電場強度(Z/r^2,Z:電荷,r:イオン半径)が大きくなると共に大きくなる傾向を示した。その中でもBa,Sr,Ca系とMg,Zn系のカチオン場強度に対する表面張力温度係数が異なることから、それぞれガラス融体構造がそれぞれ異なるものと推察された。これらの相違は分光学的手法による構造解析結果より、Mg,Zn系の陽イオン酸素配位数が4と他の陽イオンと比較して小さく、リン酸塩ガラス構造の一部に網目として組み込まれている可能性があることを実験的に明らかにした。本研究成果を基に、鉛含有ホウケイ酸塩ガラスの粘度,密度、表面張力データとの比較を行い、これらの融体と同等の物性を有する鉛フリーリン酸塩ガラスの探索を行った。高温融体における物性として粘度、密度および表面張力は金属の製錬、板ガラス作製のためのフロートプロセスのみならず、光通信用ガラスファイバーや電子部品用封着材料の製造においても重要な実操業パラメータとなる。リン酸塩系ガラスは他のガラス系と比較して多種多様な光機能性ガラスとして期待される。平成14年度ではアルカリ土類,亜鉛リン酸塩系ガラス融体(50RO-50P_2O_5,R=Mg, Ca, Sr, Ba, Zn)の粘度を精度よく測定し、組成依存性、温度依存性を明らかにすることを目的とした。測定試料の調製は高純度メタリン酸塩試薬を用いて、秤量、混合し、現有の高温電気炉により、溶融法(溶融温度1100°C1300°C、溶融時間1時間)により調製した。低粘度域(10^<-22>Pa・s)におけるガラス融体の粘度測定はルツボ回転法にて行った。測定温度は状態図の液相線温度以上である800°Cから1200°Cの範囲内において50°C間隔で各温度に30min保持したのち測定を行った。その結果、メタリン酸塩ガラス融体の粘度はBaO, SrO, CaO, ZnO, MgOの順に大きくなり、その序例は陽イオンのイオン半径の大きさに依存していた。特に、ZnO, MgOメタリン酸塩ガラスが高い粘度を示した理由はこれら陽イオンの酸素配位数が4と他の陽イオンと比較して小さく、リン酸塩鎖状構造の一部に網目として組み込まれている可能性があることを実験的に示した。以上、本年度では高温ガラス融体における粘度を精度よく測定し、その組成依存性を明らかにすることができた。この成果は現在、学術雑誌Journal of Non-Crystalline Solidsに投稿中である。

表面張力温度係数は陽イオン電場強度(Z/r^2,Z:電荷,r:イオン半径)が大きくなると共に大きくなる傾向を示した。その中でもBa,Sr,Ca系とMg,Zn系のカチオン場強度に対する表面張力温度係数が異なることから、それぞれガラス融体構造がそれぞれ異なるものと推察された。これらの相違は分光学的手法による構造解析結果より、Mg,Zn系の陽イオン酸素配位数が4と他の陽イオンと比較して小さく、リン酸塩ガラス構造の一部に網目として組み込まれている可能性があることを実験的に明らかにした。本研究成果を基に、鉛含有ホウケイ酸塩ガラスの粘度,密度、表面張力データとの比較を行い、これらの融体と同等の物性を有する鉛フリーリン酸塩ガラスの探索を行った。
ゼブラフィッシュにおけるトランスポゾンテクノロジーの開発

本研究では、メダカゲノムから同定されたトランスポゾンTol2因子を用いて、モデル脊椎動物である小型魚類ゼブラフィッシュにおける新しい挿入変異生成法、遺伝子導入法の開発研究を行い、以下の成果を得た。(1)Tol2因子をもつプラスミドDNAを転移酵素をコードするmRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。これらゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代でトランスジェニックフィッシュを得た。これにより、Tol2因子を効率よくゼブラフィッシュ生殖細胞ゲノムへ転移させる方法の開発に成功した。(2)Tol2因子にゼブラフィッシュSix3.2遺伝子のプロモーターとGFP遺伝子を組み込んだ。このプラスミドDNAを転移酵素をコードするmRNAとともにゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入し、次世代においてトランスジェニックフィッシュを同定することに成功した。このトランスジェニックゼブラフィッシュは、前脳、目でGFPを特異的に発現していた。(3)Tol2因子を基に、スプライスアクセプター部位、リポーター遺伝子であるGFP遺伝子、SV40のポリAシグナルをもつ遺伝子トラップベクターを構築した。このトラップベクタープラスミドDNAを転移酵素をコードするmRNAとともに、ゼブラフィッシュ受精卵へ微量注入した。これらゼブラフィッシュを成魚に育て、かけあわせにより次世代のゼブラフィッシュを得た。それら次世代ゼブラフィッシュを解析することにより、遺伝子トラップ法の実施が可能であることを示した。本研究では、メダカトランスポゾンTol2因子を用いてゼブラフィツシユにおける効率のよい挿入変異生成法、遺伝子導入法の開発研究を行い、以下の成果を得た。また、哺乳動物細胞を用いた実験で期待以上の成果を得た。(1)Tol2因子のゼブラフィッシュ生殖細胞系譜における転移頻度を検討し、転移頻度を大幅に上昇させることに成功した。今後の研究を進める上での大きなブレークスルーとなった。(2)Tol2因子にGFP遺伝子を組み込み、GFP発現ベクター、遺伝子トラップベクターを構築した。実際にこれらが使用可能であることを示した。(3)Tol2因子が哺乳動物であるマウス細胞内で転移することを示した。
グリシンベタイン蓄積型イネ科植物の耐塩性発現機構

グリシンベタイン(以下ベタイン)は、乾燥や高塩条件下で植物が耐性を獲得するのに必要な浸透調節物質である。本研究では、ベタイン蓄積型植物を育成することおよび植物におけるベタインアルデヒド脱水素酵素(BADH)遺伝子の発現機構を明らかにすることを目標にした。まず、イネ科植物グリーンパニックと、我々によって得られたソルガムBADH1cDNA (pAW9, Plant Physiol.110, 1301, 1996)との相同性を確認した後、グリーンパニックにおけるBADH遺伝子の解析に用いた。グリーンパニックに100mMNaClで塩ストレス処理を行い、葉身と根におけるBADHmRNAの発現を解析した。その結果、葉身、根とも塩ストレスによりBADHmRNAの発現が認められた。葉身におけるBADH遺伝子の発現は、膨圧の変動と密接に関連していた。ソルガムを圃場栽培しソルガム蓄積型系統の育成を行った。ソルガム20品種を圃場で栽培し、葉身のベタイン濃度を測定し、ベタインを蓄積する品種の選抜を行った。ベタインを蓄積する品種としない品種を交配し、F1品種を育成し、さらにF1より純系を育成してF2個体を得た。現在これらの系統を圃場栽培し、葉身のベタイン濃度を測定することによってベタイン蓄積型品種の選抜を行っている。その結果、両親に比べてベタイン濃度が数10倍高い系統が得られつつあり、来年以降F3を育成すると共に、この品種を使って乾燥耐性や耐塩性を検討していくことにしている。
『車椅子エコノミークラス症候群』の実態調査とその予防対策

【目的】肺塞栓はParkinson病(PD)の重要な死因の一つである事から、その原因とされる下肢深部静脈血栓(DVT)の頻度と発症要因を検討した【対象】PD患者114例を対象に下肢静脈ドップラーエコーを行った。下腿浮腫、体重、身長、罹病期間、杖・車椅子使用、姿勢異常、抗パ剤服用状況などを検討した。【結果】DVT発症群23例とDVT非発症群91例に分けて比較検討した。DVTは女性に多い傾向があるも、BMI、罹病期間、重症度には関連性がなかったが、D-ダイマーは有意に高かった。合併症としては糖尿病症例でHbAlcと関連なくDVTが多かったが、慢性腎疾患(CKD stage3)、骨折歴は関連しなかった。下肢臨床徴候として浮腫、静脈怒張、周囲径左右差(>1cm)、restless legでは差がなかったが、こむら返りを有するPD患者ではむしろDVT頻度が低かった。PD患者特有の姿勢異常として腰曲がり・膝曲がり症例では有意にDVTは多かった。心臓エコーによる駆出率(EF)MIBGシンチグラフィーでは差がなかったが、CVR-RはDVT発症群で有意に低かった。抗パ剤についてはいずれの薬剤にも差が認められなかった。【結論】PD患者の約2割にDVTが認められ、その発症要因として車椅子使用、PDに特徴的姿勢異常、糖尿病が関与する事が示唆された。平成13年度厚生省(現厚生労働省)調査によると車椅子使用者は334、000人とされる。申請者は神経筋難病疾患の臨床経験の中で、車椅子ユーザーにおける肺塞栓の危険性を実感した。急性肺塞栓血栓症(PTE)は特徴的な症状に乏しく診断が困難で死亡率が高いことが知られているが、病態を的確に認識し治療することにより治療可能で、費用対効果に優れている。特に、寝たきり状態よりも車椅子使用者で深部静脈血栓が多いこと、下腿筋萎縮のため筋ポンプ作用が弱く静脈還流が悪いこと、などより高いリスクが存在すると考えられる。筋萎縮性側索硬化症経過中に長時間車椅子ユーザーに起こったPTE1例を報告した。その後、長時間車椅子使用患者の調査を行い、多発性硬化症による一過性の脊髄麻痺女性が車椅子使用中にPTEを発症した症例、2例のパーキンソン患者で104時間以上の車椅子ユーザーに深部静脈血栓が発見されPTEを未然に防止する事ができた。以上の点を踏まえ,車椅子ユーザーの肺塞栓の原因となる深部静脈血栓症の包括的科学的解析を行っている。そして『車椅子でも起こるエコノミークラス症候群』の概念をより多くの一般の方々に普及し、公共福祉および予防医学およびプライマリーケアーの立場から啓発運動を進めている。種々の患者会および平成20年第105回日本内科学会において発表を行った。2007年6月号Neurology誌に掲載された。運動障害をきたすパーキンソン病における下肢深部静脈血栓症(DVT)について検討した。Parkinson病(PD)患者の非運動症状の一つとして浮腫が高頻度に認められる。浮腫の原因として運動障害以外に多くの全身性因子(心、肝、腎、甲状腺、低蛋白など)が関与する。また、一部の抗パーキンソン病薬(アマンタジン、プラミペキソールカベルゴリンなど)が浮腫の発現に関わるとされる。一方、肺塞栓はPD患者の重要な死因の一つであることから、その原因となる下肢深部静脈血栓(DVT)の有無について検証する必要がある。本検討では、明らかな浮腫を引き起こす全身性疾患を有さない外来通院中PD患者における下腿浮腫と臨床症状、DVTおよび姿勢異常との関連性について検討した。外来通院中PD患者124例の中で心、肝、腎、甲状腺、低蛋白(<3g/1)および浮腫をきたす可能性がある薬剤投与(フロリネフ、プレドニゾロン、アクトスなど)等を省いた109名について検討した。

下肢深部静脈血栓(DVT)についてはALOKA社製超音波を使用した(Prosoundα-10;表在用probel-15メガヘルツ)。コントロールはその他神経疾患(other neurological disease=OND,脳梗塞後遺症、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、頭痛、めまいなど)82例である。PDにおける浮腫の頻度は56例(51.4%)とコントロール群(12.2%)に比し有意に多かった。浮腫陽性群は高齢者に多く重症になるほど多くBNPの上昇を認めた。PDの浮腫と抗パ剤服用状況との関連では麦角・非麦角系アゴニストを含めていずれの薬剤にも差は認めなかった。DVTは19.2%に認められたが浮腫の有無とは関連なかった。いずれもPOPLITEAL VEINより末梢側に認められたが、観察期間中肺塞栓はなかった。DVT陽性群と陰性群では重症度・年齢・罹病期間・BMI・BNPいずれにも差がなかった。補助具使用と姿勢異常について検討した結果、車椅子使用は下腿浮腫と、膝曲がりはDVTと有意に相関した。PDにおける膝曲がりはDVT発症のリスクファクターの一つである。神経難病であるParkinson病における深部静脈血栓(DVT)発症リスクファクター分析を通して『車椅子エコノミークラス症候群』の重要性について検討した。肺塞栓はParkinson病(PD)の重要な死因の一つである事から、その原因とされるDVTの頻度と背景因子を検討した。【対象】PD患者83例を対象に下腿静脈ドップラーエコーを行った。下腿浮腫、体重、身長、罹病期間、杖・車椅子使用、姿勢異常、抗パ剤服用状況などを検討した。【結果】DVTは16例(19%)に認められたが、下腿浮腫の有無による差はなかった。DVT陽性群ではD-dimer高値以外にはBMI、年齢・性差・罹病期間・ヤール分類等に差はなかった。一方、車椅子使用、膝曲がり、腰曲がりおよび糖尿病患者ではDVT陽性率が高かった。また、上記4因子が増えるほどDVT発症率が高かった(2因子36%、3因子72%)。【結論】PD患者の約2割にDVTが認められそのリスクファクターとしてPDに特徴的姿勢異常が関与する事が示唆された。
視覚意識の定量化と脳内ネットワークにおける情報表現の解明

意識とその脳内メカニズムを明らかにするために、意識を定量的に評価し、さらにその神経基盤をネットワークレベルで明らかにするという目標にもとづき行った、2016年4月から2017年3月までの間の研究活動の概要を報告する。意識がどのように脳内ネットワーク表現されているかについて研究する上で最も重要な問題が、意識というわかりにくいものをどのように測るかという点である。これを明らかにするための実験課題の開発を中心として、1年目の研究活動を行ってきた。まず、意識の中でも「主観」に着目し、反応時間を指標として自身の行動に関する主観的知覚と、そのメカニズムを明らかにするための実験パラダイムを開発し、実験データの取得を行った。特に、動物を用いた実験を行うための共同研究を開始したことで、主観的知覚における脳回路を詳細に明らかにすることを期待できる。これと並行して、2年目以降に主に取り組む脳活動データの解析の予備的検討を行った。意識・主観のような複雑な現象を支えているのは、脳の単一領域ではなく、複数領域間のコミュニケーションであるという仮説のもと、複数領域間の情報伝達の流れを明らかにすることを目標としている。まず、予備的検討として、脳活動データに関しては、ヒューマン・コネクトーム・プロジェクトの脳構造データを用いて、人と動物の脳内ネットワークの定量的な評価・解析を行った。さらに、アウトリーチ活動もかねて、「人々が、心理学の研究成果をどのように評価しているか」を予測する解析と心理実験を行い、この結果を国際学会で発表した。1年目の目標であった、行動実験パラダイムの開発を行うことができたということで、当初の計画通りに順調に進んでいる。今後は、1年目で開発した行動課題実験中の脳活動計測の実験を行っていく。脳活動計測の実験次第で、実験パラダイムの調整や一部変更を行っていきたい。
麻疹ウイルスの極性上皮細胞感染機構の解析

麻疹ウイルスは上皮細胞へ受容体特異的に感染する。受容体に結合するH蛋白質の抗原性の変化を解析した。H蛋白質上には複数の抗原部位があることが分かった。全ての株で保存されている抗原部位はH蛋白質の性質を保持するために重要であることが分かった。このため自然界ではこの部位の抗体からエスケープするウイルスが出現する可能性が低いと考えられた。一方、残りの抗原部位はウイルスの遺伝子型によって大きく変化していた。特に最近の流行株は糖鎖の付加によって特定の抗体から完全にエスケープしていた。よって麻疹ウイルスは、いつまでも単一血清型であり続けるであろうが、多少なりとも抗原性のズレは生じていることが分かった。上皮間葉転換や間葉上皮転換を制御する転写因子、転写抑制因子の検索と導入について、5種類の転写因子を、レトロウイルスベクターを用いて上皮細胞へ導入した。このうち2種類の転写因子について恒常発現細胞を樹立した。これらの細胞は、麻疹ウイルス感染能が消失していることから、上皮間葉転換を起こしていることを確かめた。上皮間葉転換を起こした細胞に上皮受容体候補遺伝子群を発現させて、受容体の同定を試みたが、麻疹ウイルス感染効率を復活させる遺伝子は同定できなかった。また、上皮受容体候補遺伝子のshRNA発現細胞やドミナントネガティブ発現細胞を樹立したが、受容体同定には至らなかった。また、極性上皮細胞を用いて、麻疹ウイルスHタンパク質のアミノ酸変化による抗原性の変化を解析した。Hタンパク質上には複数のantigenic siteがあるが、ウイルスの遺伝子型によって大きく変化しているantigenic siteと保存されているantigenic siteがあることが分かった。最も抗原性が高いantigenic site Iはよく保存されていたことから、麻疹ウイルスの単一血清型を決定する部分であると考えられた。一方、antigenic site I以外のエピトープは、一部の株で、すでに抗原性が大きく変化していると考えられた。これらの結果から、麻疹ウイルスは、今後も単一血清型でありつづけるであろうが、約半世紀前に分離された現在のワクチン株だけに依存していると、いずれ、ワクチン効果が低下する可能性があると考えられた。上皮細胞を用いて、麻疹ウイルスHタンパク質のアミノ酸変化による抗原性の変化を解析した。Hタンパク質上には6つのantigenic siteがあることが分かった。6つのうち3つのantigenic siteは全ての遺伝子型の株で保存されていた。これらの抗体からのエスケープミュータントを得ることに成功し、保存されているantigenic siteの場所を特定した。また、エスケープミュータントの解析から、保存されているantigenic siteは麻疹ウイルスの性質を保持するために重要であることが分かった。このため自然界ではこの部位の抗体からエスケープするウイルスが表れる可能性が低いと考えられた。一方、残る3つのantigenic siteはウイルスの遺伝子型によって大きく変化していた。特に最近の流行株は糖鎖の付加によってantigenic siteIIの抗体から完全にエスケープしていた。これらのことから、麻疹ウイルスは、いつまでも単一血清型でありつづけるであろうが、多少なりとも抗原性のズレは生じていることが分かった。保存されているantigenic siteは、受容体結合部位そのもの、受容体結合部位近傍、H-F相互作用部位であった。これらはHタンパク質の性質を保持するために重要であることが分かった。上皮細胞を用いて、麻疹ウイルスHタンパク質のエピトープとその保存性について解析した。麻疹ウイルスHタンパク質の主要な保存エピトープは3カ所であり、その他のエピトープは株によって異なる抗原性を示すことが明らかになった。

保存されているエピトープについての重要な知見は、(1)受容体結合に直接関与する多くのアミノ酸自身が、ひとつの保存エピトープを構成していること、(2)また、別の保存エピトープは、Hタンパク質二量体同士が相互作用して四量体を形成する接触面、ならびに、Fタンパク質との相互作用に関係する領域の双方に位置すること、すなわち、ともに機能的構造的にアミノ酸変化を許容し難いということである。ただし、ウイルスの増殖性の大幅な低下、ならびに受容体利用能の一部消失を伴うことにより、6つの全エピトープにアミノ酸変異を導入し、全エピトープの抗原性(モノクローナル抗体への反応性)を変化させることができた。しかし、このような(ウイルスの高度な弱毒化を伴う)自然界では起こり得ないと想定される大幅な改変によってもワクチン血清による中和の程度に変化はなかった。これらの結果から、Hタンパク質の抗原エピトープがアミノ酸変異を許容し難いことに加えて、ワクチンにより得られる抗体が、保存エピトープ3カ所を含む多くのエピトープに対して同時に、しかも強力に働いていると考えられ、今後も麻疹ウイルスの抗原性変化は生じ得ないであろうことを、科学的に立証した。麻疹ウイルスの感染機構について、レビュー論文を投稿した。またHタンパク質の構造上の複数のエピトープの役割について論文投稿予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。麻疹ウイルスの抗原性について論文を2報投稿した。上皮細胞への感染様式については明らかになりつつあるので、今までと同様の研究方針で、さらに神経細胞への感染についても加えて研究を進める。また、2報の投稿済みの論文で明らかにしたHタンパク質のすべてのエピトープの変異体についてさらに研究を進める。
幕末・明治期における国際海難事件と外交交渉についての基礎的研究

幕末から明治20年代までの時期に発生した国際海難事件と外交交渉について、前年度に引き続いて調査、研究を進めた。その実績は以下のようである日本政府関係機関係文書の調査1.外務省外交史料館関係史料(1)明治4年、長崎港における英国人引受汽船と日本船夕顔丸の衝突事件(2)明治5年、大阪運上所における西京物産引立会社汽船元享丸へ英国汽船九所丸衝突事件(3)明治5年、周防海における仏国軍艦コスマオ号と鳥取県傭風帆船、泰徳丸の衝突事件(4)明治5年、横浜港における帝国軍艦雲揚号へ英国風帆船フランシスヘレデー号の衝突事件(5)明治10年、横浜港における英国軍艦ヲウダシウス号と三菱会社所有汽船千里丸の衝突事件2.高等海難審判庁関係史料(1)明治25年、英国汽船ラベンナ号による帝国軍艦千島沈没事件にかかる水先人、北野由兵衛審問関係文書(2)明治20年、英国汽船チベット号の海難にかかる水先人、小田善三郎審問関係文書各事件についての個別的な調査、研究ならびに総合的研究上記の各事件のうち、主要なものについては、別記のように論文を発表ないし発表予定である。残りの事件についても近く研究を集約し、総合的考察をまとめる予定である。
国立大学の保有する科学技術の事業化とベンチャーキャピタルの役割

ベンチャーキャピタル資金と国立大学の中にある技術シーズ(技術)、そして既存企業の経営能力(経営)を組み合わせ新しい企業を生み出す、その手法を探ること、これが研究の目的であった。まず技術については北海道の自然科学系研究者のシーズ集を作成に参加した、ベンチャーキャピタルについては平成9年1月に設立した北大アンビシャス投資事業組合を動かし既に三件の投資を実行した。既存企業には訪問活動を続け、大学に開発してもらいたい技術についての聞き取り調査を行った。平成9年度は15社、特に環境関連ビジネス、平成10年度には現時点で6社(主にリサイクル関連企業)の訪問調査を行った。さらに産学官連携をいかに進めるかの研究活動を北海道大学先端科学技術共同研究センターを中心に行った。センター内に研究室を設定し、必要な設備、資料等を配置し研究拠点とした。また学内を啓蒙するため、特許セミナー、共同研究セミナー、シンポジウム等を開催した。論文、学会発表については報告書のとおりである。現在より将来に向けての課題は、大学特許オフィス設立に関する研究である。情報公開法、大学等技術移転法に対応できる大学にするために大学の知的財産を特許化する機能は必要である。今回の研究は、こうした将来の課題の基礎的研究として充分な成果があったと思われる。研究の実績は次の二つの面であがりつつある。(技術シ-ズのデータベース化)北海道内の国立大学および公立の研究機関には6000人をこえる自然科学系の研究者がいる。北海道大学だけでも大学院博士課程在籍者、助手層を合わせると2500人という多数になる。彼らが現在、何を対象にして研究をしており、いかなる科学技術を保有しているかを調査する。そして、これをデータベース化し、外部からキーワード等をもって検索できるようにする。これが当面の作業である。実施初年度の平成9年度にはもっぱら情報を集めること。各部局ごとに情報を集めるためのキィーマンを探すことに費やした。(外部技術ニーズの調査)他面で学外の企業群がいかなる技術を欲しているか、いわば技術ニーズの調査・発掘を行った。この作業はもっぱら企業訪問という型で実施された。チームをつくり外部の組織とも協力して広域な北海道に散在する優良な企業を訪問し、面談記録を作成した。既に50社程の訪問を終え、それらについては情報の整理の段階に入っている。何件かについては北海道大学の研究者を紹介し既に協働作業が始まっているものもある。次年度(平成10年)には先端科学技術共同研究センターが完成するので、ここに入居し学内シ-ズのデータベース化、リエゾンオフィスの構築に着手する。
生体膜脂質のヘキサゴナル相形成と膜酵素活性調節機構の解明

細胞の生命維持には膜タンパク質の働きが必須であるが、その活性は生体膜脂質が構成する周囲の微小環境により調節されている。生体膜は生理的条件下では液晶(Lα)二重層構造を有しているが、刺激によりその一部が非二重層構造をとり膜構築の乱れを生じ、膜タンパク質の高次構造や機能に重要な影響を与えるものと思われる。本研究では細胞内情報伝達のセカンドメッセンジャーとして重要なジアシルグリセロール(DAG)が生理的に生じ得る濃度で生体膜液晶相(Lα)を逆ヘキサゴナル相(HII)に誘導すること、および相転移初期に膜内側方圧が上昇することを見出し、又それらと膜結合酵素の関係を明らかにした。
放射線治療施設におけるリニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システムの開発

2018年度にリニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システム開発用の機材と基本ソフトの作成を実施した。また、同年度に中国地区、四国地区、関東地区の3地区で放射線治療品質管理機構における地域連携支援活動のパイロットスタディを実施し、出力線量測定と遠隔支援システムの運用を開始した。このパイロットスタディでは、財団校正センターによる出力線量の相違が検出された施設に対して、地域の品質管理士が施設を訪問して調査や線量測定、および品質管理改善のためのアドバイスを行うなど支援活動の課題を整理し、リニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システムを用いた遠隔支援の構築と改善を図る。2018年度に実施したパイロットスタディを以下に記す。1.2018年10月27日(土)会場:広島がん高精度医療センター、参加者:施設責任者1名、都道府県代表者:8名、施設担当者・地域参加者7名、放射線治療品質管理機構委員5名合計21名2.2018年11月22日(木)11月23日(金)会場:愛媛大学医学部附属病院、参加者:施設責任者1名、都道府県代表者:8名、施設担当者・地域参加者4名、放射線治療品質管理機構委員5名合計19名3.2019年2月23日(土)会場:自治医科大学附属さいたま医療センター、参加者:施設責任者1名、都道府県代表者:8名、施設担当者・地域参加者5名、放射線治療品質管理機構委員12名合計26名上記3回のパイロットスタディを通じて、リニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システムにおいて、手順書やチェックリストの作成と電子データ登録、出力線量測定項目の追加や出力線量測定報告書の作成など改善を図った。参加者からの意見として、この地域連携支援活動の意義と遠隔支援システムの有用性が示唆された。2018年度は5の研究実績に記載したとおり、中国地区、四国地区、関東地区の3地区で地域連携支援のパイロットスタディを実施することができた。今回の報告書をまとめて、2019年度の活動につなげる予定である。本研究課題は、パイロットスタディにおいて改善が図られており、使用者からの意見も収集できている。2019年度は、東海地区、関西地区の2地区でのパイロットスタディを予定している。今後は、2019年度のパイロットスタディを2地区で実施し、リニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システムの改善を図る。2020年度に、北海道地区、東京地区、九州地区のパイロットスタディを実施する予定。最終的には、全国13地区におけるパイロットスタディを経て、リニアック出力線量測定データ収集・分析・管理システムを構築し、放射線治療品質管理機構における地域連携支援活動で運用できるようにする。今年度使用予定である物品費等の整備は終了した。研究実施に当たり付属品関係の購入等は次年度以降に実施する。研究成果発表等も次年度以降継続する。
アフリカツメガエル生殖細胞質でのミトコンドリアATP合成酵素の減少機構の解明

ツメガエルの生殖細胞質(GP)には多数のミトコンドリア(Mt)が存在する。GPとMtとの関係を明らかにするために、GPに特異的なMtの構成タンパク質のパターンを解析した。その結果、GPを含む植物半球表層のMtに少ないタンパク質としてATP合成酵素(ATPase)を同定した。ATPaseのサブユニットであるFo-bの抗体を作製して、免疫染色により細胞内の局在を調べると、st.VI卵母細胞では、GPを含む植物半球表層のMtでATPaseが減少するが、将来、体細胞へ分化する領域のMtではATPaseの発現があり、一つの細胞の中で、Mtの住み分けがあることがわかった。そして、卵成熟後、免疫染色によってGPを含む植物半球表層のMtで、ATPaseが発現上昇することが示唆された。(以下、平成20年度に実施した研究成果である。)in vitroでの卵成熟の実験系を用いてATPaseの発現上昇機構を解析しようと試みた。卵成熟にともなって、翻訳抑制の解除が生じたかどうか調べるために、真核または原核生物タイプの翻訳を阻害したが、卵成熟が阻害され、それ以上、詳細を調べることができなかった。卵成熟におけるGPを含む植物半球表層のMtの経時変化を観察すると、表層に存在していたMtは、集塊を形成していく。この集塊の形成ともに、ATPaseの発現上昇が見られ、その集塊の中でATPaseの上昇する部分とそうでない部分とがあることがわかった。ATPase上昇する場所が存在することを示唆する結果である。私は、卵成熟前において、GPより広域に存在していたMtは、成熟すると生殖細胞質に移動し、生殖細胞質と何らかの相互作用することによってATPaseの発現が上昇しているのではないかと予想している。現在、卵成熟過程でのMtの局在変化と生殖細胞質マーカーとの位置関係を解析中である。ツメガエルにおける、生殖細胞質(GP)とミトコンドリア(Mt)の関係を明らかにするために、GPに特異的なMtの構成タンパク質のパターンを解析した。その結果、GPのMtに少ないタンパク質としてATP合成酵素(ATPase)を同定した。ATPaseのサブユニットであるFo-bの抗体を作製して、免疫染色により細胞内の局在を調べると、st.VI卵母細胞では、GPのMtでATPaseが減少するが、将来、体細胞へ分化する領域のMtではATPaseの発現があり、一つの細胞の中で、Mtの住み分けがあることがわかった。以下、平成19年度に実施した研究成果である。St.I卵母細胞のMtでは、内膜がDABで染色され、COX活性が検出された。St.VI卵母細胞の動物極のMtでは内膜とクリステの部分で強くDABで染色されるのに対して、GPを含む植物極表層のMtでは、内膜、クリステともにDABで殆ど染色されず、COX活性が低かった。St.I卵母細胞のMtは短いものが多く、クリステが未発達であった。一方、st.VI卵母細胞の動物極、植物極のMtは、ともにクリステは発達したものであった。St.I卵母細胞の免疫染色において、Fo-bのシグナルが検出されなかったのは、ATPaseが存在するクリステが未発達なためであると考えられる。また、St.VI卵母細胞の植物極表層でFo-bのシグナルが低いのは、GPを含む植物極表層で、酸化的リン酸化の活性が減少しているためであることが示唆された。
二酸化炭素の地下挙動予測手法の開発:二酸化炭素地中処分の実現にむけて

本研究では,二酸化酸素の深部帯水層中への地下貯留を実現するための基礎研究をおこなった.地下深部の流体移動を定量的に解析するためには,まず地下浸透率構造を知る必要がある.また,貯留できる二酸化炭素の量を見積もるためには,地下水の量を知る必要があり,そのためには地下間隙率構造を見積もり,地下水の総量から溶存可能なガスの量を正確に見積もる必要がある.本研究では,地表で採取した試料のを水理学的性質を地下深部条件下で測定することによって地下浸透率・間隙率構造を推定し,長期的なセメンテーションの影響については,時代が異なる堆積物の水理学的性質を測定することで経験的に評価した.このような方法で,新潟平野,台湾北西部,宮崎平野および三浦半島の第三紀層と第四紀層などで地下浸透率・間隙率構造を求めることができた.我が国初の二酸化炭素地下貯留実験サイトである新潟平野で,実験サイトの地下浸透率・間隙率構造を決めることができ,注入深度(約1km)では間隙率も大きく(約50%),流体も通りやすい(浸透率10^<-15>m^2)ことがわかった.これらの成果は,数編の論文として現在査読,改訂または執筆中である.地下の流体挙動を解析する際には,断層破砕帯の影響を考慮する必要がある.本研究では,下記研究発表論文の通り,英国の研究者と共同で内陸最大の断層である中央構造線の内部構造を調べた.また韓国・イタリアの研究者と共同で,大地震発生時の断層運動を再現して内部構造の変化を調べた.さらに,新潟平野の第四紀層中に形成された片貝断層帯の浸透率構造を調べた.その結果,母岩よりも遙かに流体を通しやすい基盤岩中の断層破砕帯に比べると,多孔質堆積岩中の片貝断層帯はほぼ母岩と同じ浸透率をもち,断層帯が必ずしも流体の通路にならないことが明らかになった.堆積岩中の断層帯の露頭は限られており,今後ボーリングなどを活用してより詳しい研究が必要である.浸透率構造を水と二酸化炭素の二相流に拡張すること,断層帯も含めたより現実的な浸透率・間隙率構造を使って地下深部の流体移動を解析することが今後の課題である.二酸化炭素の大気への放出量を減らすことは,一刻の猶予も許さない緊急課題であり,二酸化酸素の深部帯水層中への注入処理は,1つの対策と考えられている.本研究では,注入された二酸化炭素の挙動を予測するために必要な地下浸透率構造を決める方法を開発する.地震発生の影響も評価するために,破断面および断層帯の影響をも含めた浸透率構造を見積もりたい.初年度の成果としては,台湾北西部,新潟平野,宮崎平野および三浦半島の第三紀層と第四紀層の地下浸透率・間隙率・比貯留率・Skempton常数を求めた.とくに,台湾北西部のガス田地域では実測された性質に基づいて堆積作用と流体移動の競合過程を解析して,ガス田で実測された異常間隙圧と見事に一致する結果をえた.また,長岡市の二酸化炭層注入テストサイトでは,注入深度の1kmの深さでは流体が非常に通りやすいことを実測で示した.さらに,破断面と断層帯が多孔質堆積岩中の流体移動に与える影響について調べた.緻密な基盤岩が変形を受けると断層帯内部及び亀裂沿いに極めて流体が通りやすくなるが、多孔質堆積岩の場合には、断層内部の物質が細粒化と圧密を受けるために、断層帯はむしろ周囲の堆積物よりも流体が通りにくくなることが多い。また、多孔質堆積岩は母岩が空隙をもっているために、亀裂が形成されても新たに大きな空隙が形成されるわけではない.堆積岩は圧密・セメンテーションの進行とともに固結して流体を通しにくくなるが、隙間が少なくなると、堆積岩でも断層帯・破断面沿いに流体は通りやすくなる。両者の中間、つまり圧密が十分に進行して流体が通りにくくなっているけれども、断層帯・亀裂面沿いに流体が容易には動けない状態で、堆積岩は「最大シール能力」をもつことを提唱した。この概念は,堆積岩中の流体移動を調べる上で基本的な概念になると期待される.本研究では,二酸化酸素の深部帯水層中への地下貯留を実現するための基礎研究をおこなった.地下深部の流体移動を定量的に解析するためには,まず地下浸透率構造を知る必要がある.また,貯留できる二酸化炭素の量を見積もるためには,地下水の量を知る必要があり,そのためには地下間隙率構造を見積もり,地下水の総量から溶存可能なガスの量を正確に見積もる必要がある.本研究では,地表で採取した試料のを水理学的性質を地下深部条件下で測定することによって地下浸透率・間隙率構造を推定し,長期的なセメンテーションの影響については,時代が異なる堆積物の水理学的性質を測定することで経験的に評価した.このような方法で,新潟平野,台湾北西部,宮崎平野および三浦半島の第三紀層と第四紀層などで地下浸透率・間隙率構造を求めることができた.我が国初の二酸化炭素地下貯留実験サイトである新潟平野で,実験サイトの地下浸透率・間隙率構造を決めることができ,注入深度(約1km)では間隙率も大きく(約50%),流体も通りやすい(浸透率10^<-15>m^2)ことがわかった.これらの成果は,数編の論文として現在査読,改訂または執筆中である.

地下の流体挙動を解析する際には,断層破砕帯の影響を考慮する必要がある.本研究では,下記研究発表論文の通り,英国の研究者と共同で内陸最大の断層である中央構造線の内部構造を調べた.また韓国・イタリアの研究者と共同で,大地震発生時の断層運動を再現して内部構造の変化を調べた.さらに,新潟平野の第四紀層中に形成された片貝断層帯の浸透率構造を調べた.その結果,母岩よりも遙かに流体を通しやすい基盤岩中の断層破砕帯に比べると,多孔質堆積岩中の片貝断層帯はほぼ母岩と同じ浸透率をもち,断層帯が必ずしも流体の通路にならないことが明らかになった.堆積岩中の断層帯の露頭は限られており,今後ボーリングなどを活用してより詳しい研究が必要である.浸透率構造を水と二酸化炭素の二相流に拡張すること,断層帯も含めたより現実的な浸透率・間隙率構造を使って地下深部の流体移動を解析することが今後の課題である.
ショウジョウバエパターン形成に関わる新規ペプチド遺伝子の機能

これまでの研究により、pri遺伝子がショウジョウバエ幼虫腹部上皮にある歯状突起の形成に関与していることが明らかになっており、器官形成におけるパターン形成の機構を探る上で、pri遺伝子の機能を明らかにすることは意義深いと思われる。本研究ではpri遺伝子の詳細な解析を行い、pri遺伝子産物の生理機能を明らかにすることを目指した。pri遺伝子のORFは最も長いものでも49アミノ酸に過ぎず、ごく短い短鎖ペプチドが遺伝子産物であると考えられた。この可能性を検証するため、培養細胞系を用いたレポーターアッセイを行ったところ、少なくとも4個の非常に短いORF(それぞれ11,11,11,32aa)がポリシストロニックに翻訳されていることが明らかとなった。また、各ORFを過剰発現型するトランスジーンがそれぞれpri表現型を完全に回復することができること、フレームシフト変異を導入したトランスジーンでは活性が完全になくなることから、個々のORFが完全な遺伝子活性を持つペプチドをコードすることが示された。pri遺伝子の生理機能を詳細に調べるため、歯状突起の形成に重要であることが知られているアクチン細胞骨格の動態を解析したところ、pri変異体では表皮細胞に特異的に見られるアクチン束が観察されなかった。また、pri変異体において、歯状突起形成のマスター遺伝子であるshavenbaby(svb)およびその標的遺伝子であるアクチン制御因子群の発現解析を行ったところ、svbの標的遺伝子群の発現消失は観察されるものの、svbについては顕著な発現変化は見られないことから、svbによる下流遺伝子の転写制御にpriが必要であると考えられた。上記の実験結果により、ショウジョウバエpri遺伝子は複数の極めて短いペプチドをコードし、アクチンネットワークの制御を介して、幼虫表皮や気管といった上皮性組織の形成に重要な役割を果たすと結論づけられた。本研究ではpri変異体の詳細な解析を行い、pri遺伝子産物の生理機能を明らかにすることを目指した。pri遺伝子は、種間でよく保存されている非常に短いORFを5個含んでおり、短鎖ペプチドをコードしている可能性が考えられた。この可能性を検証するため、培養細胞系を用いたレポーターアッセイおよび各ORFの過剰発現によるpri表現型の回復を試みたところ、少なくとも5'側の4個のORFが独立に翻訳されており、それぞれがpri遺伝子の機能を担いうることが明らかとなった。次に、PRIペプチドがそのような生化学的活性を持つかを調べるため、歯状突起形成に関与すると思われる遺伝子群との相互作用を検証した。分節遺伝子、EGFRシグナル関連遺伝子、歯状突起の制御因子svb遺伝子との相互作用を調べたところ、pri遺伝子はいずれの遺伝子とも相互作用を示さず、これまでに知られていないユニークな遺伝子であることが明らかとなった。pri遺伝子の生理機能をさらに詳細に調べるため、歯状突起の形成に重要であることが知られているアクチン細胞骨格の動態をタイムラプス観察により解析したところ、pri変異体では表皮細胞に特異的に見られるアクチン束が形成されず、priが遺伝子が新たなタイプのアクチン制御因子であることが明らかとなった。これらの実験結果は、pri遺伝子が複数のアクチン制御ペプチドをコードする、非常にユニークな遺伝子であることを明確に示している。

前年度までに、polished rice (pri)遺伝子が複数のペプチドをコードし、アクチンネットワーク制御を介してショウジョウバエ幼虫腹部上皮にある歯状突起の形成に関与していることを明らかにしているが、その分子機構は不明であった。今年度はpriペプチドの分子機能を明らかにするため、歯状突起形成のマスター遺伝子であるshavenbaby (svb)に着目して以下の研究を行った。pri変異体においてsvbの発現を調べたところ、歯状突起が完全に欠損するにもかかわらず、svbの発現に変化は見られず、pri表現型はsvb遺伝子の下流でおこる何らかの現象に関与していると考えられた。次にsvbの標的遺伝子であるminiature, shavenoidの発現を調べたところ、発現の消失あるいは顕著な減少が観察され、svbによる下流遺伝子の転写制御にpriが必要であることが明らかとなった。svbは転写因子をコードしており、SVB,OVOA,OVOBの3つのアイソフォームが知られているが、priが表皮細胞に発現するSVBと特異的に相互作用することから、priとSVB特異的なドメインとの相互作用が、svb遺伝子による歯状突起の形成に必須であると結論付けられた。
糖脂質メタボローム解析による細胞のフェノタイピングに関する研究

あらゆる細胞において普遍的に発現しているスフィンゴ糖脂質の網羅的かつ定量的な構造解析を行うことによって、細胞のプロファイリングを行った。糖脂質は代表的な二次代謝産物であり、その網羅的な解析は細胞の状態を端的に示すものである。定量構造解析は主に質量分析法を用いて行った。スフィンゴ糖脂質の分子量分布を単純化させるため(構造多様性の排除)、酵素的に脂質部分のセラミド鎖を効率よく切断する系を構築し、糖鎖のみの解析を行った。その結果、各細胞のスフィンゴ糖脂質の構造と発現量は細胞特異的であり、定量データの統計的解析は細胞を効率よく分類・表現することを可能にすることを示した。平成24年度は、細胞の脂溶性物質メタボローム解析の一環として、細胞内の糖脂質分子の一種であるドリコールリン酸結合型糖鎖(DLO)の定量解析方法を確立した。DLOは翻訳語修飾の1つであるN-結合型糖鎖の前駆体であり、小胞体内で逐次合成され、成熟した14糖(Glc)3(Man)9(GlcNAc)2からなるオリゴ糖がタンパク質のアスパラギン側鎖に転移することが知られている。前駆体であるDLO、タンパク質上のN-結合型糖鎖、さらにN-結合型糖鎖の細胞内分解物である遊離糖(FOS)を統合して定量解析することは、細胞のN-結合型糖鎖修飾の恒常性をモニタリングし、細胞の状態を定義することを可能にする。一般にDLOは極めて微量であり、従来その定量は放射性同位体ラベルを用いるか、非常に時間とコストがかかる蛍光ラベルと電気泳動法の組み合わせで行われてきた。本研究では、超遠心法を用いた簡便なサンプル調整方法と質量分析法による検出方法を確立した。さらに本研究では、糖尿病や神経変性疾患など様々な疾患の原因となることが知られている小胞体ストレス状態で細胞を培養し、そのストレスの違いによるDLO、N-結合型糖鎖、FOSの包括的な解析による細胞の状態評価の有用性を実証した。また、昨年度にセラミド鎖の構造多様性を排除したGSLの糖鎖構造解析方法を確立したが、脂質分子の代謝経路を考慮した際、セラミドの構造多様性に関する解析も行うべきだと判断したため、液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS)を用いたGSL分子全体(糖鎖+セラミド)の定量解析法の開発に着手した。ガングリオシドに代表されるシアル酸を含む酸性GSLに特化した方法は報告があるものの、中性GSLとの同時解析は質量分析法のイオンモードの制約から未だ実現していない。本研究ではシアル酸のカルボン酸を選択的に中性化する方法の条件検討を開始した。最終年度である平成25年度において、細胞の脂溶性物質メタボローム解析の一環として、細胞内の糖脂質分子の一種であるドリコールリン酸結合型糖鎖(DLO)の定量解析方法を確立した。前駆体であるDLO、タンパク質上のN-結合型糖鎖、さらにN-結合型糖鎖の細胞内分解物である遊離糖(FOS)を統合して定量解析することは、細胞のN-結合型糖鎖修飾の恒常性をモニタリングし、細胞の状態を把握することを可能にする。DLOは微量であるが故に、放射性同位体ラベルを用いて定量解析することが常法の1つであったが、放射性の継時的な減衰に伴い、その代謝過程を定量化する上で問題もあったため、本研究では、超遠心法を用いた簡便なサンプル調整方法と質量分析法による検出方法を確立し、定量解析にも堪えることを実証した。研究期間全体(平成23年度25年度)を通しては、先に述べたDLOの解析の他、10種類程度のライン化されたヒト由来ガン細胞のスフィンゴ糖脂質糖鎖の定量的な構造解析を実施し、細胞間の発現量や構造の違いを解析した。その結果、スフィンゴ糖脂質の発現の違いによって、細胞種が分類され得ることを明らかにし、他の複合糖質糖鎖の定量解析結果を加えることで、より詳細な分類が可能であることを明らかにした。脂質に代表される細胞内の不溶性分子は必ずしも質量分析法に適しているとは言えないため、核磁気共鳴(NMR)によって得られる情報を、既存のデータベースと照合して細胞のプロファイリングに用いる予定であったが、NMR解析に耐え得るサンプル量を確保するための細胞培養が、本研究で賄えるよりも膨大であると判断し、NMR解析を断念した。その分の予算は返却することとした。

平成23年度は、細胞の糖脂質メタボローム解析の第一段階として、細胞由来スフィンゴ糖脂質糖鎖の解析を行った。質量分析法を用いたスフィンゴ糖脂質の定量解析においては、しばしばセラミド鎖長のばらつきが、広範な分子量を与えてしまい、正確な定量を難しいものにするが、本年度はスフィンゴ糖脂質のヘッドグループである糖鎖構造のみを選択的に定量解析することによって、セラミド鎖長のばらつきがもたらす定量性の不確定さを排除することとした。スフィンゴ糖脂質から糖鎖を選択的に切断するために、放線菌由来のエンドグリコセラミダーゼの大量発現を行い、充分量の酵素を獲得した後、細胞から抽出したスフィンゴ糖脂質の糖鎖を切断した。これに先立ち、オゾン酸化と酸加水分解を組み合わせた化学的手法による糖鎖切断も試みたが、充分な量の糖鎖を回収するに至らなかった。最適な酵素反応条件の検討の結果、基質特異性の異なるエンドグリコセラミダーゼ1と2の2種類のサブタイプを等量混合することによって、最大量の糖鎖を回収することが出来ることを発見した。この系を用いて、チャイニーズハムスター由来細胞3種、マウス由来細胞4種、ヒト由来細胞4種の計11種類の細胞のスフィンゴ糖脂質糖鎖の定量解析を行った。定量解析はMALDI-TOF MSを用い、濃度既知の非天然型糖鎖からなる内部標準との比較によって行った。その結果、細胞によってスフィンゴ糖脂質の発現パターンに大きな差異があることを明らかにした。これは、スフィンゴ糖脂質の定量的プロファイリングが細胞を特徴づけ得るものであることを示しており、これを誌上発表した。また、次年度以降に糖脂質の代謝経路の定量的な解析を行うため、糖脂質の効率的な同位体ラベル方法の開発に着手した。本年度当初は、メタボリックラベリング法を用いて、細胞内の脂質分子の効率的な安定同位体ラベル方法を確立し、核磁気共鳴(NMR)法と質量分析法を組み合わせた網羅的な脂溶性分子の定量的構造解析を目指したが、ラベル化効率が予定より低く、NMR解析に着手できていないことから、やや遅れていると判断する。研究初年度において、質量分析法を用いた糖脂質の定量的解析方法を確立し、それによって11種類の細胞由来の糖脂質の定量解析に成功した。また糖脂質の定量データにより細胞を区別・記述することに成功し、これを誌上発表した点においては順調に進展している。質量分析法と合わせて、核磁気共鳴(NMR)法による定量解析も質量分析と組み合わせて行う予定であり、次年度以降のNMRによる解析も順次行う。現在のところ効率的な安定同位体ラベル化サンプルの調整方法の確立を行っており、方法論が確立次第NMRによる定量解析を実施する。質量分析法に比べ、NMRによる網羅的なメタボローム解析は低感度であることから、効率的な安定同位体ラベル法が求められるが、現時点でそれを達成するには時間とコストの面で難しい。しかし、細胞内脂溶性分子の代謝スピードの比較解析には同位体ラベル化が必須であるため、質量分析法による高感度な解析を優先して進める。ラベル化は透析血清を用いるなど、無血清培地からの変更を検討する。糖脂質全体(糖鎖+脂肪鎖)の定量的構造解析方法を確立し、た糖鎖部分に加えて脂質部分の構造情報を用いた細胞の分類を達成する。NMR法による糖脂質代謝物の定量解析のため、糖脂質の効率的な同位体ラベル方法の開発を優先的に進める。効率的なラベル化方法として、予期できない栄養源をカットするために無血清培地を用いる必要があり、適切な培養条件を確立した後、NMRを用いた代謝物の定量解析を行う。
腫瘍発生・進展における非定型的メチル化シトシンの病態学的意義についての網羅的解析

種々の遺伝子の転写調節領域に存在するCpG-islandのメチル化は、遺伝子発現を抑制的に非CpG-islandの意義は不明であった。私どもは、病理組織学的観察ににおける遺伝子発現制御の解析を、遺伝子プロモータ領域の非定型的なメチル化シトシンの解析を中心に行い、非CpG-islandのシトシンメチル化による転写制御が、悪性腫瘍の進展に関わっていることを明らかにした。種々の遺伝子の転写調節領域に存在するCpG-islandのメチル化は、遺伝子発現を抑制的に制御するが、私どもは、非CpG-islandのシトシンメチル化による転写制御について病理組織学的観察、つまり、形態学に即したエピジェネティクスの病的意義につき検討することを目的として計画を行った。特に、顕微鏡的に認識される「特定の形態的変化を示す病変部分」における遺伝子発現制御の解析を、遺伝子プロモ-タ領域の非定型的なメチル化シトシンの解析を中心に行うことを目標として、病理組織標本上でmRNAや蛋白発現の評価をするとともに、形態学的特徴に基づいて特定部位から微小組織を選択的に採取して、対象遺伝子に関するメチル化シトシンの検出を行う。種々の遺伝子の転写調節領域に存在するCpG-islandのメチル化は、遺伝子発現を抑制的に制御するが、私どもは、非CpG-islandのシトシンメチル化による転写制御について検討した。神経成長因子(NGF)の高親和性受容体TrkA遺伝子プロモータ領域には、典型的なCpG-islandはなく、非CpG-islandに位置するAP-1類似配列(TGAGCGA)が存在する。種々の膵癌、大腸癌培養細胞の解析で、高度メチル化の細胞株では、メチル化のない細胞に比して、TrkA発現が高いことから、同部位のシトシンメチル化が、TrkA遺伝子の転写を促進する機構を解析した。培養細胞への遺伝子導入実験により、AP-1類似配列が転写を抑制することを示し、シトシンメチル化は抑制性AP-1へのc-Jun蛋白の結合を阻害することによって、負に制御するシグナルがブロックして転写を促進することを示した。Desmoid腫瘍症例で、β-catheninの点突然変異によるβ-cathenin蓄積を証明した。β-catheninは骨形成シグナルとして働くが、desmoid腫瘍では骨形成因子(BMP)の発現とともに、偽受容体BAMBIの高発現を認め、BAMBIがBMPシグナルを遮断することにより、骨形成を抑制することを示した。Desmoid腫瘍内の骨形成巣では限局的に、BMBI遺伝子プロモータのCpGメチル化によりBAMBI発現が低下することを、病理組織のmicrodissection検体を用いて、bisulfite mapping法にて明らかにした。さらに種々の癌において、CpGメチル化によるBAMBI抑制が、TGFβによる細胞増殖シグナルを抑制して、腫瘍の増殖・進展に関与する可能性について、膀胱癌、大腸癌、前立腺癌の病理組織検体を用いた解析を行った。膀胱癌に関しては、環境発癌因子や生活習慣の影響について、ミャンマーと本邦の検体を収集して、MSP、SSCP法での比較検討を開始した。以上の研究成果の一部は、第96回日本病理学会総会にて発表するともに、学術誌投稿予定である。膵癌・大腸癌培養細胞の解析で、高度メチル化の細胞株では低メチル化の細胞株よりもTrkA発現が高く、TrkA遺伝子プロモータのメチル化が転写を促進した。当該AP-1類似配列へのc-Jun蛋白結合は転写抑制機能を有し、メチル化による両者の結合抑制がTrkA遺伝子の転写を促進する機構を解析した。Desmoid腫瘍の検討から、β-catheninは骨形成シグナルとして働くが、偽受容体BAMBIが骨形成因子(BMP)シグナルを遮断して、骨形成を抑制することを示した。腫瘍内の限局的な骨形成巣では、BAMBI遺伝子プロモータのCpGメチル化によりBAMBI発現が低下していた。膀胱癌、大腸癌、前立腺癌において、CpGメチル化によるBAMBI抑制が、TGFβの細胞増殖作用を促進して腫瘍の増殖・進展に関与する可能性について、病理組織検体を用いた解析を行った。膀胱では環境発癌因子の影響について、ミャンマーと本邦の検体を収集して、MSP、SSCP法での比較検討を開始した。膀胱癌では、high gradeの組織型ではlow grade群よりもCpGメチル化が高度でBMBI発現が低い傾向を認め、ミャンマーの検体ではlow grade群でも本邦の症例よりもメチル化が高頻度であり、環境因子の影響が示唆された。以上の研究成果の一部は、第96回第97回日本病理学会総会、第66回日本癌学会総会にて発表するともに、学術誌投稿予定である。