hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
擬1次元π電子系に於けるバンド幅と電子数変化による相制御

本研究は擬1次元電子系の形成する電子状態を、具体的には(DCNQI)_2Ag系の電子状態に注目し、1)バンド幅と2)バンド充填、を変化させることにより制御することを目的としている。以下、この2年間で得られた成果を列挙する。バンド幅制御:圧力下での(DI-DCNQI)_2Agの電子状態:常圧では室温以下絶縁体の(DI-DCNQI)_2Agに圧力を印可することによりその伝導性と磁性を測定した。5kbar以上の加圧により金属状態が出現することが明らかになった。温度を下げると金属絶縁体転移を示すが、その転移温度は圧力の増加とともに下がることを確認した。これは、圧力により分子間の重なり積分が増大し、電荷秩序の形成が抑えられているためと考えられる。また、5kbarの圧力下でのNMRの実験からは常圧で明瞭に観測された反強磁性転移が抑えられていることがわかった。これは電荷秩序の融解、または次元性の変化による磁気秩序の抑制との可能性があるが本年度の研究からは明らかにするには至らなかった。しかし、圧力で(DI-DCNQI)_2Agの電荷秩序相の制御に成功した。また、DCNQI分子を装飾するハロゲン原子を系統的に置換することにより様々な有効化学的圧力を系に印可することを試みた。(DCNQI)_2Agとしては新物質である(DCI-DCNQI)_2Agの合成に成功した。今年度の大きな成果としてはDCI-、DBr-、DI-の各DCNQI分子でそれぞれCl-/Br/I-NQRの観測に成功したことである。このことにより電子状態を電荷(が作る電場勾配)の揺らぎとして検出できる実験手法が確立した。バンド充填変化:(DI-DCNQI)_2AgのAgを部分的にCuで置換した試料を合成し、電気抵抗の測定を行った。この効果は1次元バンドの充填を1/4から1/3まで連続的に変化させることに相当する。Cuの濃度が32%以下では系は絶縁体のままであるが61%以上では金属的に振舞う。部分的置換により金属状態が出現したこと自体は不自然なことではないが、両者の間の中間濃度領域で3次元のアンダーソン局在を強く示唆する電気抵抗の温度依存の振舞いが観測された。未だ、データの収束性に若干の問題はあるがgap的でない振舞いであることは確かである。本研究の目的は(DCNQI)_2Ag錯体中のDCNQI分子の積層が形成する1次元π電子系を制御することである。(DI-DCNQI)_2Agのウィグナー結晶的電荷秩序相と(DBr-DCNQI)_2Agのスピンパイエルス相がどのように関係付けられているのかを明らかにするために、両者の中間の性質を持つと考えられる(BrI-DCNQI)_2Agで^1HNMRを測定し、その基底状態を調べた。この物質は室温から常磁性絶縁体として振舞う。磁化率の値はDI塩とDBr塩のほぼ中間の値を取り、輸送特性の見地からもこのBrI塩が両者の中間の電子状態を取りうることがわかった。NMR緩和率は100K以下でほぼ温度によらない一定値を取り、この温度域で局在モーメントの揺らぎが存在していることが明らかになった。低温、1.5Kまでは磁気秩序も非磁性転移も示さないことが確認された。このことは格子との結合より、電子同士の相互作用が強く電荷秩序相に近い電子状態であることを示唆している。(DCNQI)_2Agの1/4充填のバンドに電子を注入したとみなせる(DCNQI)_2Cu系についても研究を行った。(DI-DCNQI)_2Cuに約18kbarの圧力を印可し、金属-絶縁体転移を起し、その絶縁相内での磁性を明らかにすることに初めて成功した。^1HNMR線幅と緩和率の解析からCuのd電子が格子周期の3倍に対応する整列状態を作っていることが強く示唆される結果を得た。(DI-DCNQI)_2Agのπ電子の電荷秩序とは異なる、d電子の電荷秩序である可能性があることを強く印象付けた。

これは電荷秩序の融解、または次元性の変化による磁気秩序の抑制との可能性があるが本年度の研究からは明らかにするには至らなかった。しかし、圧力で(DI-DCNQI)_2Agの電荷秩序相の制御に成功した。また、DCNQI分子を装飾するハロゲン原子を系統的に置換することにより様々な有効化学的圧力を系に印可することを試みた。(DCNQI)_2Agとしては新物質である(DCI-DCNQI)_2Agの合成に成功した。今年度の大きな成果としてはDCI-、DBr-、DI-の各DCNQI分子でそれぞれCl-/Br/I-NQRの観測に成功したことである。このことにより電子状態を電荷(が作る電場勾配)の揺らぎとして検出できる実験手法が確立した。バンド充填変化:(DI-DCNQI)_2AgのAgを部分的にCuで置換した試料を合成し、電気抵抗の測定を行った。この効果は1次元バンドの充填を1/4から1/3まで連続的に変化させることに相当する。Cuの濃度が32%以下では系は絶縁体のままであるが61%以上では金属的に振舞う。部分的置換により金属状態が出現したこと自体は不自然なことではないが、両者の間の中間濃度領域で3次元のアンダーソン局在を強く示唆する電気抵抗の温度依存の振舞いが観測された。未だ、データの収束性に若干の問題はあるがgap的でない振舞いであることは確かである。
歯周炎の発症機構におけるフィブロネクチンの関与

歯周炎における上皮の深行増殖に,歯周組織由来の線維芽細胞が合成・分泌するフィプロネクチンが関与するのかどうかを,株化歯肉上皮細胞に対する走化活性を指標として検討した。その結果,線維芽細胞の無血清培養上清中には,フィプロネクチンおよびラミニン-8/9,-2/4が含まれており,これらの細胞外マトリックス分子が株化歯肉上皮細胞に対して走化活性を有していることを明らかにした。また,部分精製したラミニンに対する上皮細胞の走化活性は,インテグリンα3またはα6のブロッキング抗体によって部分的に阻害された。さらに,組織における遺伝子発現研究のための試料保存における至適条件を探るため,Biobank Projectに参加した。その結果,組織のままで試料を保存すると,RNAは室温でも24時間は安定であること,および組織中の遺伝子発現の変化は4°Cで保存すると最小に抑えられることが判明した。また,歯肉溝滲出液を用いた歯周病の病態把握をより正確に行うため,サイトカインアレイを用いてタンパクのプロファイリングを行った。その結果,これまでに報告されていなかった10種類のサイトカイン(GRO, Ang, IGFBP-3,GDNF, PARC, OSM, FGF-4,IL-16,LIGHT, P1GF)を新たに検出することができた。これらの結果から,歯周病の病態解明には炎症性サイトカインばかりでなく,成長因子も含めた解析が有効であることが示唆された。最後に,PDGF-Bを強制発現させたsis-NIH3T3細胞の自発的細胞移動が,フィプロネクチンおよびラミニンで阻害されることを見出した。また,その活性部位のひとつはRGD配列であることが判明した。歯周炎における上皮の深行増殖に,歯周組織由来の線維芽細胞が合成・分泌するフィブロネクチンが関与するのかどうかを,株化歯肉上皮細胞に対する走化活性を指標として検討した。抜去歯から得た歯根膜組織を用いてoutgrowth法により歯根膜線維芽細胞を初代培養し,56代継代培養した細胞を実験に使用した。T-75フラスコでコンフルエントに達した細胞を無血清のα-MEMで72時間培養し,上清を回収,アミコンで濃縮後,PBSに対して透析した。この試料をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで分離し,各画分の株化歯肉上皮細胞に対する走化活性を改良ボイデンチャンバー法で調べた。株化歯肉上皮細胞に対して走化活性を有する画分は、高分子領域に溶出した。フィブロネクチンおよびラミニン各鎖に対するモノクローナル抗体を用いてWestern Blottingで調べた結果,この画分にはフィブロネクチンとともに強力な走化性因子であるラミニン-8/9が含まれていることが判明した。このため,ゼラチンアガロースアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いてフィブロネクチンを担体に吸着させ,6M尿素で溶出させた。Western Blottingの結果,この吸着画分にはフィブロネクチンは含まれていたが,ラミニンは検出されなかった。この吸着画分をPBSに対して透析後,株化歯肉上皮細胞に対する走化活性を改良ボイデンチャンバー法で調べたところ,この部分精製フィブロネクチンは走化活性を有していた。しかしながら,部分精製ラミニンよりもその活性は低かった。また,非還元条件下でのWestern Blottingの結果から,このフィブロネクチンは分子量約45万の細胞性フィブロネクチンであることが確認できた。

抜去歯から得た歯根膜組織を用いてoutgrowth法により歯根膜線維芽細胞を初代培養し,56代継代培養した細胞を実験に使用した。T-75フラスコでコンフルエントに達した細胞を,無血清のα-MEMで72時間培養し,上清を回収,アミコンで濃縮後,PBSに対して透析した。この試料をゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分離し,各画分の株化歯肉上皮細胞に対する走化活性を改良ボイデンチャンバー法で調べた。株化歯肉上皮細胞に対して走化活性を有する画分は,高分子領域に溶出した。フィブロネクチンおよびラミニン各鎖に対するモノクローナル抗体を用いてWestern blottingで調べた結果,この画分にはフィブロネクチンとラミニンが含まれていた。ラミニン各鎖に対する特異抗体を用いて検索した結果,この線維芽細胞は主にラミニン-8/9を分泌していることが明らかとなった。ゼラチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて,フィブロネクチンを部分精製し,非還元条件下でWestern blottingを行ったところ,このフィブロネクチンの分子量は約45万であり,細胞性フィブロネクチンであることが確認できた。この部分精製したフィブロネクチンおよび市販の細胞性フィブロネクチンは,株化歯肉上皮細胞に対して走化活性を有していた。さらに,歯根膜由来線維芽細胞のフィブロネクチン遺伝子発現をReal time-PCRで定量的に調べた。その結果,この細胞のフィブロネクチンmRNA発現は他の細胞外マトリックス分子に比べて著しく高いことが判明した。昨年度までの成果により,無血清で培養した歯根膜および歯肉線維芽細胞が分泌する上皮細胞走化性困子はフィブロネクチンだけでなく,ラミニンも含まれていることが判明した。そこで本年度は,歯根膜線維芽細胞が分泌するラミニンに関する解析を行った。歯根膜線維芽細胞におけるラミニン各鎖の遺伝子発現を調べたところ,α1α5,β1β3,γ1γ3鎖すべての遺伝子を発現していた。続いてウェスタン・ブロッティングでタンパク発現を調べたところ,この細胞はおもにα4,α2,β1,β2,γ1各鎖を合成しており,これらの組み合わせによりラミニン-8/9および少量のラミニン-2/4を培養上清中に分泌していることが明らかとなった。部分精製したラミニンは,やはり上皮細胞に対する走化活性を有しており,その活性はインテグリンα3,α6,β1機能阻害抗体によって部分的に阻害された。さらに,抜去歯のヒト歯根膜組織におけるラミニンα2,α4鎖のタンパク発現を調べたところ,α2鎖は一部で,α4鎖はすべてにおいて発現が確認できた。また,Uppsala Biobank Projectに参加し,一般に不安定とされるRNAが,組織のままの状態では常温でも予想以上に安定であるが,遺伝子発現レベルではやはり4°Cでの組織の保存が最も安定であることを明らかにした。さらに,歯肉溝滲出液中に含まれるサイトカインをHuman cytokine antibody arrayを用いて分析した結果,10種類のサイトカインを新規に検出した。最後に,癌細胞の増殖を支える周囲の線維芽細胞のモデルとされる,PDGF-Bを強制発現させたsis-NIH3T3細胞が,走化性因子非存在下で自発的にmigrateすることを見出した。
光ファイバ加入者系ネットワークの診断のための光相関領域リフレクトメトリ

本研究では,光ファイバ加入者系ネットワークの診断を目指して,光周波数コム光源を活用し,高空間分解能・長測定レンジ・高精度,高感度・広ダイナミックレンジ,高安定・高速な高性能反射光分布測定法を創成している.さらに,本研究で確立する技術により,高機能な分布型・多点型光ファイバセンシング技術にも貢献している.本研究の研究成果と関連して,英文学会誌査読付論文18件,国内外学会論文62件を発表し,特許も5件出願した.本研究では,光ファイバ加入者系ネットワークの診断を目指して,光周波数コム光源を活用し,高空間分解能・長測定レンジ・高精度,高感度・広ダイナミックレンジ,高安定・高速な高性能反射光分布測定法を創成している.さらに,本研究で確立する技術により,高機能な分布型・多点型光ファイバセンシング技術にも貢献している.本研究の研究成果と関連して,英文学会誌査読付論文18件,国内外学会論文62件を発表し,特許も5件出願した.本研究では,研究代表者が属している研究グループにおいて成果を蓄積してきた独創技術である「光波コヒーレンス関数の合成法」による反射光分布測定法(光リフレクトメトリ)技術に,櫛形スペクトル光源や線形掃引光源も適用可能し,測定位置の掃引の高速化を実現する.その上で,精密なアポダイゼイションも実施し,新たな位相制御手法と光源に適応したデジタル信号処理手法も開発して,測定速度とダイナミックレンジの両立を実現する,これらの新たな提案の具体化によって,現存の光リフレクトメトリにおける様々な性能制限を打破し,高空間分解能・長測定レンジ,高感度・広ダイナミックレンジ,高精度・高安定かつ高速,といった高い機能を併せ持つ,光ファイバ加入者系ネットウークの診断に十分な光リフレクトメトリを創成する.さらに,本研究で確立する技術により,高機能な分布型光ファイバセンシング技術にも貢献する.本年度は,まず,光源に新たに櫛形スペクトル光源「光周波数コム」を用いることで,新たな光コヒーレンス領域リフレクトメトリを提案する.本手法に用いた光周波数コムは,コム間隔がkHz-MHzで,コム間隔を広帯域に変化させる必要があるため,コム間隔可変の光周波数コムを,ファイバリング型の共振器と位相変調器を用いて発生させた.コム間隔は、40MHzから80M地まで可変にすることに成功した.この光源を用いて光リクレクトメトリの原理確認実験を行い,空間分解能5cm,ダイナミックレンジ45dB,測定時間10sめ分布測定実験に成功し,本手法が空間分解能・ダイナミックレンジ・測定速度を併せ持つ反射率分布測定において有効であることを実証した.また,線形掃引光源を用いた光リフレクトメトリにおいて,反射率測定精度を向上するために,一回のフルレンジ光周波数掃引の間に採取した干渉信号を,複数のセッションに分け,それぞれのセッションから得られた反射分布を平均する,という新たな波長平均処理手法を提案した.これにより,複数回掃引・採取を要する従来技術における測定速度への制限や実際のレーザ光源の掃引速度からの制限などが解消した,加えて,本研究は,ブリルアン散乱を用いた分布型光ファイバセンシング技術の進展にも直接的に寄与している.本年度の研究成果として,英文学会誌論文6件が掲載され,国際会議発表7件および国内学会・研究会発表22件も行っている.本研究では,研究代表者が属している研究グループにおいて成果を蓄積してきた独創技術である「光波コヒーレンス関数の合成法」による反射光分布測定法(光リフレクトメトリ)技術に,櫛形スペクトル光源や線形掃引光源も適用可能にし,測定位置の掃引の高速化を実現する.その上で,精密なアポダイゼイションも実施し,新たな位相制御手法と光源に適応したデジタル信号処理手法も開発して,測定速度とダイナミックレンジの両立を実現する.これらの新たな提案の具体化によって,現存の光リフレクトメトリにおける様々な性能制限を打破し,高空間分解能・長測定レンジ,高感度・広ダイナミックレンジ,高精度・高安定かつ高速,といった高い機能を併せ持つ,光ファイバ加入者系ネットワークの診断に十分な光リフレクトメトリを創成する.さらに,本研究で確立する技術により,高機能な分布型光ファイバセンシング技術にも貢献する.本年度は,前年度に提案した光周波数コム光源を用いた光コヒーレンス領域リフレクトメトリの実証と性能向上を進めている.光周波数コムを用いた光コヒーレンス領域リフレクトメトリの空間分解能と測定レンジは,トレードオフの関係にあり,性能指標である両者の比は光周波数コムのサイドバンド数によって決まることを解明した.そこで,光周波数コムのサイドバンド数を増加する方法として,位相変調器の変調指数を変化させた光周波数コム発生を行い,空間分解能を従来手法の7cmから2cmに向上した.さらに光周波数コムのサイドバンド数を増加する方法として,多重位相変調を用いた光周波数コムの発生を行い,従来のOCDR-OFCの測定レンジを5倍拡大した.また,本手法の導入により,空間分解能向上と測定レンジ延伸の方向性を示し,今後,更なる多重数の増加により,OCDR-OFCの性能向上が見込める.また,光周波数領域リフレクトメトリにおいて,反射率測定精度を向上するために,光源として多波長光源である光周波数コムを利用した波長平均法を提案している.従来の波長平均法では複数回の測定で得たデータを平均する信号処理的手法であるが,本手法は広帯域に発生した光周波数コムをまとめてファイバ中に入射し,光学的な平均を狙ったものである.この手法の有効性を確かめるために、ファイバ中のレイリー散乱点を分割区間ごとからの反射としたモデルを考えシミュレーションを行った.

結果より光周波数コムを用いることによりフェイディングノイズ低減されることが示された.加えて,本研究は,ブリルアン散乱を用いた分布型光ファイバセンシング技術の進展にも直接的に寄与している.本年度の研究成果と関連して,英文学会誌論文5件が掲載され,国際会議発表および国内学会・研究会発表19件も行い,特許権も4件出願した.本研究では,研究代表者が属している研究グループにおいて成果を蓄積してきた独創技術である「光波コヒーレンス関数の合成法」による反射光分布測定法(光リフレクトメトリ)技術に,新たに光周波数コム光源を導入することにより,測定位置の掃引の高速化を実現し,現存の光リフレクトメトリにおける様々な性能制限を打破し,高空間分解能・長測定レンジ,高感度・広ダイナミックレンジ,高精度・高安定かつ高速,といった高い機能を併せ持つ,光ファイバ加入者系ネットワークの診断に十分な光リフレクトメトリを創成する.さらに,本研究で確立する技術により,高機能な分布型光ファイバセンシング技術にも貢献する.本年度は,本研究の最終年度として,前年度までに構築した基本系をベースにして,光周波数コム光源を用いた2つの実験系を実装し,検証実験を行った.光周波数コム光源を用いたコヒーレンス領域リフレクトメトリにおいては,共振器型の中の位相変調器の変調波形を多重化し,3重変調波形と5重変調波形のそれぞれの周波数成分の位相と振幅をシミュレーションと実験により最適化し,リフレクトメトリの測定距離を拡大することに成功した.光周波数領域リフレクトメトリにおいても,光周波数コム光源を導入し,複数の光周波数成分を一括で線形掃引し,光路差を調整しながら分布測定を行い,高速・低コストでフェイディングノイズを抑えて感度を向上させることに成功している.また,最適化したデジタル信号処理によって精密化したアポダイゼーションも施している.光加入者系ネットワーク診断の実証実験も行っている.加えて,本研究は,ブリルアン散乱を用いた分布型光ファイバセンシング技術の進展にも直接的に寄与している.本年度の研究成果と関連して,英文学会誌論文5件が掲載され,国際会議発表および国内学会・研究会発表18件も行い,特許権も1件出願した.
微生物間共生系による多糖分解能発現の機構と根圏定着における役割に関する研究

植物根圏細菌の特性解析のために分離した,寒天分解細菌RB-5株は2種の細菌種(RB5-A,RB5-B)から構成されていた.そこで,この2菌株を単離した.16S rDNAの系統解析からRB5-Aはα-Proteobacteiaの根粒菌Mesorhizobium tianshanenseと近縁であった.また,RB5-Bは最も相同性の高い配列でも92%であったことからRB-5Bは新規細菌種であると推察された.RB5-Bの寒天分解能(アガラーゼ)発現は,RB5-A及び近縁の根粒菌との共存培養により誘導された.この際,RB5-A及び近縁の根粒菌からRB5-Bヘアガラーゼ発現を誘導する何らかの物質が存在することが推察された.そこで,この誘導物質の同定をするためにAgrobacterium rhizogenesの培養上清を(1)限外ろ過膜による分子量10,000以下,10,00050,000,50,000200,000及び200,000以上の4画分に分画,(2)有機溶媒(ヘキサン)による分画(3)100°C,30minで加熱処理,(4)プロテアーゼ(Trypsin)消化の4処理を行った.その結果,(1)アガラーゼ発現の誘導は分子量10,00050,000の画分のみに認められた.(2)有機溶媒による分画では水層に誘導が認められた.(3)加熱処理によりアガラーゼ発現誘導が失われた.(4)プロテアーゼ消化した培養上清もRB5-Bのアガラーゼ発現誘導が失われた.以上の結果から,アガラーゼ発現の誘導物質は分子量10,00050,000,熱感受性でプロテアーゼ消化により誘導能を失う物質であったことから,タンパク質と推察された.植物根圏細菌の特性解析のために分離した,寒天分解細菌RB-5株は2種の細菌種(RB5-A,RB5-B)から構成されていた.そこで,この2菌株を単離した.16S rDNAの系統解析からRB5-Aはα-Proteobacteiaの根粒菌Mesorhizobium tianshanenseと近縁であった.また,RB5-Bは最も相同性の高い配列でも92%であったことからRB-5Bは新規細菌種であると推察された.RB5-Bの寒天分解能(アガラーゼ)発現は,RB5-A及び近縁の根粒菌との共存培養により誘導された.この際,RB5-A及び近縁の根粒菌からRB5-Bヘアガラーゼ発現を誘導する何らかの物質が存在することが推察された.そこで,この誘導物質の同定をするためにAgrobacterium rhizogenesの培養上清を(1)限外ろ過膜による分子量10,000以下,10,00050,000,50,000200,000及び200,000以上の4画分に分画,(2)有機溶媒(ヘキサン)による分画(3)100°C,30minで加熱処理,(4)プロテアーゼ(Trypsin)消化の4処理を行った.その結果,(1)アガラーゼ発現の誘導は分子量10,00050,000の画分のみに認められた.(2)有機溶媒による分画では水層に誘導が認められた.(3)加熱処理によりアガラーゼ発現誘導が失われた.(4)プロテアーゼ消化した培養上清もRB5-Bのアガラーゼ発現誘導が失われた.以上の結果から,アガラーゼ発現の誘導物質は分子量10,00050,000,熱感受性でプロテアーゼ消化により誘導能を失う物質であったことから,タンパク質と推察された.
心筋イオンチャネル病の遺伝疫学と生殖に関する研究

日本と欧州3ケ国(フランス、ドイツ、オランダ)のQT延長症候群679家系3782例の家系調査を実施した。1892変異アレルのうち1155変異アレル(61%)が母系伝達であった。特にLQT1家系のKCNQ1変異アレルでは66%と、KCNH2とSCN5Aの変異アレルより有意に母系伝達が高率であった。またhaploinsufficiency、非dominant negativeタイプと比較して、dominant negativeタイプあるいはその他の変異で母系遺伝が優位に高率であった。KCNQ1変異アレルの伝達乖離は変異チャネルの機能変化の程度が関与していることが示唆された。心筋イオンチャネルの遺伝子異常は心臓不整脈の原因のみならず、心臓以外の臓器の変化をきたす場合がある。これは心筋イオンチャネルが多臓器に発現し機能していることの証拠である。心筋カリウムチャネル遺伝子変異によるQT延長症候群に女性が多いことが共同研究者のGuicheney教授らのグループから報告されており、生殖に関与するイオンチャネル群を明らかにし、そのメカニズムを解明することで、遺伝カウンセリングや生殖医療へ応用が期待されるものと考えている。本年は心筋ナトリウムチャネル遺伝子に変異を有するブルガダ症候群の家系調査を行った。ブルガダ症候群は男性患者が全体の9割を占めており、当施設とパリ第6大学の34家系120例のブルガダ症候群の男女差、変異アレルの伝達を検討した。発端者を除外した男性の割合は53%、父親から変異アレルの伝達は54%であり、大きな性差は認めなかった。心筋ナトリウム遺伝子の変異を有するQT延長症候群においても男女差、変異アレルの遺伝子伝達に関して乖離が認められなかった。ブルガダ症候群の原因となる遺伝子変異はloss of function(機能喪失型)タイプの機能変化をおこす一方、QT延長症候群の原因となる変異はgain of function(機能亢進型)タイプの機能変化をきたすが、これらの異なった機能変化を有する疾患群において有意な変異アレルの伝達変化を認めなかったことから、心筋ナトリウム電流は生殖への関与は薄いことが考えられた。日本、フランス、ドイツ、オランダの4ヶ国におけるQT延長症候群679家系3782症例の変異遺伝子の伝達を検討した論文を投稿中である。QT延長症候群に母方の変異アレルが多く、特にKCNQ1の変異アレルでは顕著である。QT延長症候群のサブタイプのうちKCNQ1遺伝子変異が原因となるものはLQT1と呼ばれるが、特にKCNQ1は刷り込み現象(imprinting)を認める遺伝子であり、父方の遺伝子は発現していない臓器もあるが、QT延長症候群に関しては母方あるいは父方から生まれた症例の臨床像に差はなく、心臓にはKCNQ1は両アレルともに発現していると考えられる。よって、母方の変異遺伝子が父方の約2倍存在する理由として、刷り込み現象によって母方から変異を伝達された症例の臨床像が重症であることから生じるものではないと考えられた。また、子に遺伝子を伝達する際にアレルの伝達は同等ではない可能性を指摘されており、3世代間の遺伝子伝達に関しては、フランスの遺伝子研究機関であるCEPHにあるサンプルを使用し祖父母の遺伝子の伝達を検討したが、KCNQ1、KCNH2、SCN5Aのアレル伝達はメンデルの法則に従っていた。一方、QT延長症候群の3世代間遺伝子伝達はKCNQ1、KCNH2でCEPHデータと乖離を認め、母方の祖母の変異アレルが多く特にKCNQ1は父方の祖父の変異アレルの約3倍であった。また、dominant negativeあるいはmissenseタイプの変異を有する家系のほうがhaploinsufficiencyタイプの家系より母方の変異アレルが多かった。チャネルの機能異常の程度が変異遺伝子の伝達乖離に相関があるため、発現したイオンチャネルの生殖細胞への直接の関与が推定される。日本と欧州3ケ国(フランス、ドイツ、オランダ)による679家系3782例の家系調査を実施した国際共同研究において、先天性QT延長症候群の遺伝子伝達がメンデル遺伝形式から乖離していること確認した。これらの遺伝子伝達は人種に関係なく、日本人、白人で同様に認められた。今回検討した遺伝子はKCNQ1、KCNH2、SCN5A変異遺伝子であるが、特にKCNQ1の変異遺伝子の伝達は母方からの伝達が多く、父方の2倍の頻度であった。機能異常つまり電流抑制が高度だと考えられる変異ほどその傾向は顕著であった。本研究結果は心筋細胞の再分極に関与するチャネル遺伝子の発現が生殖系細胞にも存在することを示唆するものである。実際KCNQ1とそのサブユニットが生殖系細胞に発現し、その妊娠過程に影響することも国外の施設から報告されている。正常コントロール家系とQT延長症候群家系の3世代における遺伝子伝達の解析から、本現象は受精時における遺伝子伝達の受け渡しではなく、その後の受精卵の発育に関与する可能性を示すものである。先天性QT延長症候群の遺伝子伝達情報の集計、調査、公表は終了した。基礎的研究は方針を検討中である。本研究は先天性QT延長症候群の遺伝形式がメンデル遺伝から乖離していることを示すものであり、心筋カリウムチャネル遺伝子のひとつでKCNQ1の遺伝子変異が原因となるQT延長症候群type1、いわゆるLQT1の家系調査を最終年度も引き続き実施した。2015年に本邦で頻度の高いAla341Val, Ala344splの臨床像を報告したが、本年度はS5膜貫通領域に位置するSer277LeuとGly269Ser、C末端領域に位置するArg591His変異症例の発症年齢を含めた臨床経過について検討した。

QTc間隔はSer277LeuとArg591Hisで486±76ms、485±41msとGly269Serの447±30msより有意に延長していた。Ser277Leu保因者のうち有症候者は64%と、Gly269Serの15%あるいはArg591Hisの17%と比較して高率であった。S277L変異保因者は他のLQT1と異なり、思春期以降も致死性不整脈イベントの発症率が高く、β遮断薬の投与の判断を含め慎重に経過を診ていく必要があると考えられた。Ser277Leuの予後が悪い理由として、女性の占める率が高率であることが原因の一つと考えられた。Ser277Leuの保因者のうち女性は86%で、Gly269Serの65%、Arg591Hisの50%と比して女性の占める比率が高率であった。重症変異であるほど女性優位となることを裏付ける結果であり、昨年度までの報告内容と一致する見解であった。日本と欧州3ケ国(フランス、ドイツ、オランダ)のQT延長症候群679家系3782例の家系調査を実施した。1892変異アレルのうち1155変異アレル(61%)が母系伝達であった。特にLQT1家系のKCNQ1変異アレルでは66%と、KCNH2とSCN5Aの変異アレルより有意に母系伝達が高率であった。またhaploinsufficiency、非dominant negativeタイプと比較して、dominant negativeタイプあるいはその他の変異で母系遺伝が優位に高率であった。KCNQ1変異アレルの伝達乖離は変異チャネルの機能変化の程度が関与していることが示唆された。QT延長症候群の家族解析において母方からの変異遺伝子の伝達が多いことは明らかとなったが、基礎病態の解明がまだ出来ていない。我々は本研究の他に、先天性QT延長症候群タイプ1のKCNQ1遺伝子変異にはhot spotsがあり、国によって特徴があることを報告した(Itoh H, Circ J 2015)。Hot spots別の遺伝子伝達を調査し、哺乳類培養細胞で解析された機能変化との相関を検討する予定である。KCNQ1遺伝子の生殖系細胞への発現状態を確認することは臨床情報から得られた新たな知見を裏付ける重要な検討課題であり、他施設との共同研究を検討していく予定である。循環器内科心筋カリウムチャネルが生殖細胞に発現し、受精時に何らかの影響を与えていることが明らかになってきている(Life Sci 2007; 80: 2195-2198., Hypertension 2011; 58: 497-504.,Mol Endocrinol 2013; 27: 940-952).特にKCNQ1遺伝子はさまざまなβサブユニットと関与して消化管、内耳などにも発現しており、チャネルの機能変化がもたらす心臓以外の臓器への影響を基礎的側面から検討する体制を整える。臨床遺伝学的検討に関しては概ね良好である。心筋カリウムチャネルの関与が大きいことが予想されるため、本年度はアンダーセン症候群の家族調査を行う予定である。
鎖状分子の固化に伴う温度履歴とコンホメーション多形との相関の研究

フレキシブルな鎖状ブロック化合物は,ブロック鎖長や固化過程における温度履歴などにより,固体状態において多様なコンホメーションをとることが多い.本研究ではアルキル-オキシエチレン-アルキル系トリブロックオリゴマー(C_nE_mC_n)同族体について,種々の結晶化条件によって得られる分子形態を赤外・ラマン分光法を用いて解析し,分子コンホメーションの鎖長依存性および温度履歴との関係を調べた.また,示差走査熱量分析(DSC)により固相転移のエンタルピー差とコンホメーション転移との相関を調べた.固体状態の赤外・ラマンスペクトルは融点液体窒素温度で測定した.アルキル鎖長が長くオキシエチレン鎖が短い同族体では分子全体が完全に伸びた伸延コンホメーションが優勢であることがわかった.外力を加えない非ホスト・ゲスト系においてオキシエチレンユニット数m=6におよぶ平面ジグザグ変態が見出されたのは今回が始めてである.それに対し,短いアルキル鎖長および長いオキチエチレン鎖長の同族体では基本的にはアルキル部分は平面ジグザグ,オキシエチレン部分はヘリックスのトリブロックコンホメーションであるが,鎖長や温度履歴の違いにより多様なコンホメーション状態をとることが明らかになった.DSCによると,伸延コンホメーションをとる同族体では温度履歴によらず1個の吸熱ピークを示して融解するが,トリブロックコンホメーションをとる同族体では複数の吸熱ピークを示し,複雑な相挙動を示す.エンタルピー測定により,高温側の吸熱ピークは中央ヘリカルオキシエチレンブロックの融解に対応することがわかった.いっぽう低温側の吸熱は鎖長・温度履歴依存性が大きい.アルキル鎖の炭素数n=6の同族体では低温側の吸熱量はアルキル鎖の結晶相と無定形相間の転移に対応することがわかった.これは振動スペクトルの解析結果と一致した.フレキシブルな鎖状ブロック化合物は,ブロック鎖長や固化過程における温度履歴などにより,固体状態において多様なコンホメーションをとることが多い.本研究ではアルキル-オキシエチレン-アルキル系トリブロックオリゴマー(C_nE_mC_n)同族体について,種々の結晶化条件によって得られる分子形態を赤外・ラマン分光法を用いて解析し,分子コンホメーションの鎖長依存性および温度履歴との関係を調べた.また,示差走査熱量分析(DSC)により固相転移のエンタルピー差とコンホメーション転移との相関を調べた.固体状態の赤外・ラマンスペクトルは融点液体窒素温度で測定した.アルキル鎖長が長くオキシエチレン鎖が短い同族体では分子全体が完全に伸びた伸延コンホメーションが優勢であることがわかった.外力を加えない非ホスト・ゲスト系においてオキシエチレンユニット数m=6におよぶ平面ジグザグ変態が見出されたのは今回が始めてである.それに対し,短いアルキル鎖長および長いオキチエチレン鎖長の同族体では基本的にはアルキル部分は平面ジグザグ,オキシエチレン部分はヘリックスのトリブロックコンホメーションであるが,鎖長や温度履歴の違いにより多様なコンホメーション状態をとることが明らかになった.DSCによると,伸延コンホメーションをとる同族体では温度履歴によらず1個の吸熱ピークを示して融解するが,トリブロックコンホメーションをとる同族体では複数の吸熱ピークを示し,複雑な相挙動を示す.エンタルピー測定により,高温側の吸熱ピークは中央ヘリカルオキシエチレンブロックの融解に対応することがわかった.いっぽう低温側の吸熱は鎖長・温度履歴依存性が大きい.アルキル鎖の炭素数n=6の同族体では低温側の吸熱量はアルキル鎖の結晶相と無定形相間の転移に対応することがわかった.これは振動スペクトルの解析結果と一致した.
南アジアおよび東南アジアにおけるデーヴァラージャ信仰とその造形に関する基礎的研究

クメール王国の刻文に頻出するdevarajaの語は、「神のような王」を意味し、王の没後にその墓廟として寺院が造営され、神仏と一体化した王像が安置されたと考えられてきた。また東部ジャワでも、同様な信仰があったとされてきた。しかしインドではこの語は「神々の王」の意味で用いられるのが一般的で、王を神格化する信仰が盛行した形跡はない。南インドでは王像が神像と並べて寺院に安置されることは珍しくないが、むしろ王権の神聖さの明示にあったと考えられる。同じ代表者による平成14年度16年度、次いで平成18年度20年度の基盤研究Aを継承発展させて4年間の予定で実施する研究の初年度にあたり、まず4月19日に補助事業者会議を開催し、各分担者の研究課題、研究会と現地調査を活動の中心とすること、本年度の研究実施計画を確認した。1.研究会学外の研究者や学生、社会人にも公開して実施する研究会は、大阪人間科学大学正雀学舎を会場として次の6回開催した。(1)平成21年6月20日松浦史明「アンコールにおける王権と寺院」榎本文雄「インド仏教における葬儀と墳墓に関する近年の研究動向」。(2)7月18日小野邦彦「ジャワ島の仏教、ヒンドゥー教遺跡の概要」肥塚隆「ジャワのいわゆるportrait statueについて」渡辺佳成・岩本小百合「ロンゴワルシト博物館の石彫について」。(3)9月26日渡辺佳成「パガンから見たジャワの遺跡、遺物」深見純生「チャンディ・キダル名称考」肥塚隆「ジャワ建築の連珠垂飾」(4)10月31日宮崎晶子「チャンディ・プランバナンとアンコール・ワット-周縁における『ラーマーヤナ』の解釈と図像表現-」松浦史明「アンコールとジャワの寺院の運営に関する一考察」淺漱毅「中部ジャワの砂岩製のリンガについて」(5)11月28日山崎美保「中部古代ジャワにおける寺院-9世紀から10世紀初期のジャワ語碑刻文からの考察-」上野邦一「インドネシア遺跡踏査で気づいたこと」(6)22年2月13日深見純生・丸井雅子・上野邦一・永田郁・肥塚隆「パッラヴァ・チョーラ両時代の彫刻と建築の諸問題」(年末年始の現地調査の報告会)。2.現地調査。次の2回実施した。(1)8月2日26日肥塚、上野、深見、橋本、渡辺、(以下は研究協力者)松浦史明、宮崎晶子、佐藤恵子、岡部政美、ジャワ島の遺跡博物館(主な訪問地Jakarta, Yogyakarta, Dieng, Semarang, Solo, Blitar, Malang, Mojokerto)。(2)12月18日22年1月16日肥塚、上野、深見、渡辺、丸井、小野、(以下は研究協力者)松浦史明、永田郁、タミル地方の遺跡博物館(主な訪問地Chennai, Thanjavur, Mamallapuram, Kancipuram)。同じ研究代表者による平成14年度16年度、平成18年度20年度の基盤研究Aを継承発展させて4年間の予定で実施する研究の2年度で、初年度と同様に以下の通り研究会と現地調査とを活動の中心とした。1.研究会一般に公開して実施する研究会は、7回開催し、大阪人間科学大学を通例の会場とするほか、上智大学でも開催した。研究成果欄に記した補助事業者以外の発表は、次の通り。(1)4月17日松浦史明「ラージャラージャ1世期の王権と寺院」和田一将「パッラヴァ朝寺院における「小祠堂装飾」に関する類型的考察」(2)5月29日Gethin Rees,"Buddhism and Trade : Rock Cut Caves of the Western Ghats,"(3)7月17日青山亨「古ジャワ語文献にみる「神=王」観念を表わす表現の用例と意味」(4)8月24日永田郁「スリランカの遺跡と博物館」(5)10月17日上智大学四谷キャンパス袋井由布子「南インド現存のパッリッパダイについて」松浦史明「アンコールにおける個人崇拝と肖像の作成について」(6)11月13日松浦史明「W.M.Sirisena, Sri Lanka and South-East Aslaについて」。以上の研究会と現地調査の結果、次の諸点が明らかにされた。(1)支配者の神格化は、北インドではクシャーナ朝以外では明確ではなく、南インドではパッラヴァ朝とチョーラ朝において顕著である。(2)スリランカでは従来上座仏教の遺品が注目されてきたが、ヒンドゥー教や大乗仏教のそれも無視できないことが確認された。(3)フランス極東学院によるクメール彫刻史の編年に対し、疑義が提出された。

(4)ポスト・バイヨン期の廃仏の再検討が問題となった。同じ研究代表者による平成14年度16年度、平成18年度20年度の基盤研究(A)を継承発展させて4年間の予定で実施する研究の第3年度で、過去2年間と同様に以下の通り研究会と現地調査とを活動の中心とした。1.研究会一般に公開して9回の研究会を実施し、(2)以外は大阪人間科学大学を会場とした。(1)4月9日下田一太「クメーガレ古代都市イーシャナプラの研究」、上野邦一「アンコールの未解明遺跡の考察」(2)5月21日九州国立博物館において、佐藤由似「ポスト・バイヨン期彫刻に関する基礎調査」、原田あゆみ「ドヴァーラヴァティーの彫刻」および同館で開催中の「日本とタイーふたつの国の巧と美」展見学(3)6月18日深見純生「暹の再検討」、Dorothy C.Wong"power of Compassion : paths of Transmission of Avalokitesvara cross Asia,"(4)7月23日岩本小百合「ウィスヌを載せたガノLダをめぐる諸問題」、肥塚隆「Portrait statueに関する最近の研究動向」(5)10月8日深見純生「ローマ金貨・リンリンゴ・瑪瑙」、上野邦一「建物の中心性その2」肥塚隆「ピマイ国立博物館とパノム・ルン」(6)11月12日原田あゆみ「シーテープ出土の彫刻」、小野邦彦「東北タイのクメール寺院建築」、久保真紀子「プレア・カーンの出入口の装飾」(7)12月10日渡辺佳成「ビューおよびモンの諸遺跡と出土品」、寺井淳一「パガン遺跡の概要」(8)平成24年2月4日塚、淺湫、上野、丸井によるミャンマー調査報告1(9)3月3日渡辺、寺井淳一、小野によるミャンマー調査報告2。同じ研究代表者による過去2度の基盤研究(A)を継承発展させるため組織した4年間の研究の最終年度で、研究会と現地調査とを活動の中心とした。2013年3月に4年間の研究成果を論文集として刊行し、関係機関と研究者とに配布した。1.研究会一般に公開して以下の6回開催した。(1)5月26日河上麻由子「古代・中世アジアにおける仏教の機能」、久野美樹「唐王朝の龍門石窟における大佛造営意図を考える」、(2)7月14日深見純生「ジャワの史跡バヤット」、上野邦一「日本の神社と神と天皇」、(3)8月18日原田あゆみ「バンコク国立博物館特別展Dharmarajadhiraja」、丸井雅子「エイヤワディー沿岸出土の軒丸瓦と滴水瓦」、(4)10月6日上野邦一「建物、建物群の中心性・求心性」、肥塚隆「オランダの博物館での調査報告」、丸井雅子「クメールの聖遺物」、(5)12月1日榎本文雄「devarajaについて」、深見純生「クロッケ教授の講演『南・東南アジアにおける文化の出会い』」、肥塚隆「パッラヴァ朝の王の<肖像>」、(6)2013年2月2日淺湫毅「愛知県美術館所蔵の東南アジア関連作品紹介」、深見純生「プレレット考古学博物館」、肥塚隆「公開されたバプーオン寺院」。2.現地調査次の2回実施した。(1)8月24日9月13日、参加者:肥塚隆、深見純生、渡辺佳成、丸井雅子、小野邦彦、訪問した主な博物館と研究機関:レイデン
初期化誘導ペプチドを用いた体細胞クローンマウスの作出

研究代表者らは、未受精卵細胞質中に、核の初期化誘導に関わる蛋白質(リン酸化TCTP)を同定し、リン酸化TCTPペプチドを導入した体細胞を核移植に用いると、クローンウシが高率に得られる事を明らかにした。そこで、マウス核移植実験系を用いてリン酸化TCTPの持つ初期化誘導能を確認する事を目的に実施した。これまでは、接着細胞であるウシ培養細胞へ不活化センダイウイルスを用いる方法(GenomeOne)でペプチドを導入し、核移植に用いてきた。しかしながら、マウス体細胞の核移植で確実に産子の得られる細胞は、浮遊細胞である卵丘細胞や短期間培養する卵胞上皮細胞に限られている。これらの細胞へGenomeOneを用いてペプチド導入を行うと、細胞融合が高率に生じた事から、前年度はペプチドの効率的導入法を検討してきた。本年度は、これらの手法を用いて、リン酸化TCTPペプチドの導入がマウス体細胞核移植卵の発生能に及ぼす影響を検討した。卵胞上皮細胞ヘリン酸化ペプチドを導入し、除核未受精卵細胞質に直接注入法を用いて核移植した。ついで、トリコスタチンA (TSA)添加培地で前培養し、TSA添加活性化培地で6時間培養して活性化後、体外で4日間培養して胚盤胞へ発生させた。つぎに、胚盤胞を受胚雌に移植して胎子への発生率を調べた。なお、対照区として、非リン酸化ペプチド導入体細胞を用いた。その結果、胚盤胞への発生率は、実験区49% (176/358)、対照区57% (104/183)と有意差が見られなかった。また、妊娠10.5日目における生存胎子の割合も両区で大差は見られなかった。リン酸化ペプチド導入を導入した体細胞におけるOct4蛋白質の発現の有無を調べたが、検出する事は出来なかった。本実験いた事による可能性が考えられた。本研究で用いる初期化誘導ペプチドは、ウシ未受精卵細胞質内で見いだしたTCTP蛋白質の配列のうち、46番目と64番目のセリンのリン酸化部位を含む19残基のペプチド(10mg/ml)である。本ペプチドを導入したウシ体細胞を核移植に用いると、導入しない体細胞を用いた場合と比べて、核移植卵の胚盤胞への発生率に大差はないが、受胚ウシへ移植後の妊娠率が向上し、流産率ならびに異常子ウシ率が低下したことを明らかにした。そこで、本研究ではリン酸化TCTPがマウス体細胞核移植卵の発生能に及ぼす影響を検討することを目的に実施した。核移植は、hCG投与後14時間目にF1雌より採取した未受精卵の周りに存在する卵丘細胞を、ドナー細胞として用いた。ドナー細胞は、染色体を除去した未受精卵細胞質にピエゾマイクロマニプレーターを用いて注入し、6時間のストロンチウム処置によって活性化すると同時に、ピストン脱アセチル化阻害剤TSAによる前培養を行った。マウス体細胞核移植卵の産子への発生率は、13%と極めて低いため、初期化誘導ペプチドの影響を調べることは困難である。そこで、核移植卵の受胚雌への移植時期と移植部位の影響を検討して、着床率ならびに胎子への発生率の高い条件を調べた。その結果、核移植卵を胚盤胞期で1.0日目の卵管(着床率74%、妊娠10.5日目の生存胎子への発生率18%)に移植した場合、他区に比べて着床率(360%)と生存胎子への発生率(011%)が高いことが判明した。そこで、核移植直後の卵細胞質に10plリン酸化TCTPあるいはバッファーを注入後、ストロンチウムとTSA処置を行い、胚盤胞へ培養後偽妊娠1.0日目マウスの卵管に移植して、着床率ならびに生存胎子への発生率の影響を検討中である。

その結果、胚盤胞への発生率は、実験区49% (176/358)、対照区57% (104/183)と有意差が見られなかった。また、妊娠10.5日目における生存胎子の割合も両区で大差は見られなかった。リン酸化ペプチド導入を導入した体細胞におけるOct4蛋白質の発現の有無を調べたが、検出する事は出来なかった。本実験いた事による可能性が考えられた。
化学発癌過程における細胞形質発現の推移とその安定化

伊東はラットBBN膀胱癌におけるras遺伝子産物であるp-21の免疫組織化学的追求を行い、6例中4例に陽性癌細胞を認めた。また、実験胃癌において前癌変化のマーカーとしてpepsinogen isozyme 1(Pg1)の選択的低下が重要である事実を明らかにした。さらに腎細胞癌の前癌変化では好塩基性酵素変異尿細管は主部尿細管由来でgulcose-6-phosphatase dehydrogenase(G6PDH)が陽性でsuccinate dehydrogenase(SDH)が陰性を示し、オンコサイト酵素変異尿細管では遠位尿細管由来でG6PDHは陰性、SDHは強陽性を示す形質発現の変化を見出した。佐藤はラット肝GST-PおよびGST-P陽性細胞巣の発現条件を検討し、DEN投与数日後から陽性細胞が発現増加し、12週後ピークに達し、さらに硝酸鉛投与によっても肝小葉全体に陽性細胞が発現するなどの新知見を得た。中村は幼若肝細胞の自律的増殖能はラット発育にともなって低下消失するが、この低下消失と平行して初代培養幼若肝細胞が分泌するオートクリン増殖因子ならびにその応答能も低下消失することを明らかにした。さらにこのオートクリン因子は、分子量12万程度のタンパク質性因子で新しい増殖因子である可能性を示した。北村はras遺伝子の変化について、BBN誘発ラット膀胱癌とヒト膀胱癌とを比較し、通常のヒト膀胱癌では、点突然変異によるras遺伝子の活性化頻度は10%であるが、エジプト住血吸虫症ヒト膀胱癌では7例のすべてに見出されず、BBN誘発ラット膀胱癌でも、低頻度(1/9)であった。野瀬はヒト白血球細胞937に発癌プロモーター処理をするとC-fos遺伝子の転写が上昇することを見出し、それはc-キナーゼ活性化により誘起されるに伴い細胞膜イオン輸送の変化が起こる事実を明らかにした。
双曲型及び分散型の非線形偏微分方程式の解の正則性に関する研究

研究計画中には2つの課題があった。1つは一般の半線型双曲型方程式に対するジブレイおよび解析的特異性相互作用の問題であり、もう1つは一般次元の非線型シュレ-ディンガー方程式に対して初期データがジブレイ指数2の関数であって遠方で減小しているならば、解は時間が経つと空間方向に解析的になるかどうかという問題である。1つ目の問題に関しては、線形部分が波動作用素で非線形項は解と解の一回微分に関し解析的である場合に完全な結果を得た。非線形項がジブレイ級関数の場合は現在検討中であるが、ほぼ同様の方法で解決することができると見込まれる。今後の課題は、さらに一般の半線形双曲型方程式に対してはどうなるかというものである。別のアイデアが必要であろう。現在模索中である。2つ目の問題に関しては、解決のめどがほぼ立ったところである。非線形項が一般のジブレイ級関数の場合の計算がほぼ終わっている。現在結果を論文にまとめる作業をしている。4月中には完成すると思われる。その中で新たな問題がでてきた。解が解析接続できる領域を調べるという問題である。現在、それを解くのに有望なアイデアが見つかったところであり、今後その方向で研究を進めていきたい。現在模索中である。
疲労動物モデルにおける尿素回路の代謝変化と、オルニチン投与による抗疲労効果検証

ラット血漿を対象に網羅的代謝物解析を実施したところ、疲労負荷ラットでは、分岐鎖アミノ酸代謝、尿素回路やプロリン代謝が特徴的に変動していた。さらに、肝臓や筋肉におけるATPレベルも有意に減少しており、組織レベルでエネルギー産生の低下が引き起こされていることがわかった。尿素回路の代謝物であるオルニチンが、尿素回路の代謝やエネルギー代謝の動きを促進するかを生化学的に検証したところ、オルニチン投与によるエネルギー代謝への影響は限定的であった一方、他の代謝経路へオルニチンが流入する知見が得られた。慢性疲労症候群(Chronic Fatigue Syndrome: CFS)は、原因不明の強い全身疲労倦怠感などが長期間に渡り継続する病態である。先行研究により、CFS患者の血液では、ATP産生やクエン酸回路などのエネルギー代謝に異常が見られることが明らかとなった。さらに、代謝物の数理モデル解析を進めることにより、エネルギー代謝異常には尿素回路の代謝変化が深く関わることが分かりつつある。本研究では、CFS患者と同様の代謝パターンを示す疲労モデル動物を用い、オルニチンを中心とする尿素回路における代謝解析、および遺伝子発現解析を行った。疲労モデル動物は、ラットを水深2.2 cmの水を張ったケージ内で5日間飼育することにより作製した。疲労負荷後、ラット肝臓中の血液を灌流除去した後、肝臓を採取して網羅的代謝物解析や遺伝子発現解析を行った。疲労負荷群において、解糖系代謝物は減少し、さらにTCA回路前半のシスアコニット酸・イソクエン酸が減少する一方、回路後半のコハク酸およびリンゴ酸が増加していた。尿素回路に関連する代謝物についても、尿素やオルニチンは増加するものの、シトルリンは減少するなど、尿素回路動態も疲労負荷の影響を受けることが分かった。疲労負荷群において、尿素回路やグルタミン代謝に関わる酵素やトランスポータの遺伝子発現を半定量的PCR法により調べたところ、疲労負荷群では、尿素回路の酵素群、グルタミナーゼ、GABAアミノ基転移酵素、および各種トランスポータの発現が亢進していることが判明した。これらの結果から、特に、オルニチンやグルタミンからGABAを介してTCA回路内のコハク酸に流入する疲労特有の代謝経路「疲労代謝回路」の存在が示唆された。われわれは、ラットに水浸疲労負荷を与えることにより疲労状態を再現し、血漿や肝臓を対象に網羅的メタボローム解析を実施した。疲労負荷によってTCA回路内のクエン酸などが減少してエネルギー産生が障害される一方、シトルリン-アルギニンバランスの変化や総一酸化窒素量の増加などといった尿素回路動態も疲労負荷の影響を受けることを見出した(Kume et al, PLOS ONE, 2015)。また、疲労負荷を与えたラットの肝臓では、尿素回路やグルタミン酸代謝を介してTCA回路内のコハク酸に流入することでエネルギー代謝を回復させようとする疲労特有の代謝経路(疲労代謝回路)の存在が予測された。われわれは、同回路の酵素阻害実験や肝組織の免疫染色を行い、疲労時における疲労代謝経路の活性化を確認した。さらに、尿素回路の代謝物であるオルニチンが、尿素回路の代謝やエネルギー代謝の動きを促進するかを生化学的に検証した。疲労負荷時にオルニチンを5日間経口投与し、ラット肝臓中の血液を灌流除去した後、肝臓を採取して網羅的代謝物解析を行った。その結果、オルニチン投与によるエネルギー代謝への影響は限定的であった一方、他の代謝経路へオルニチンが流入する知見が得られた。現在、オルニチンが解糖系やクエン酸回路を含むエネルギー代謝に与える影響を確定させるために、13C-グルコースをトレーサーとする代謝フラックス実験にも取り組み、エネルギー代謝への影響を調査中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。疲労の生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。疲労負荷モデル動物を用いて生体代謝に重要な肝臓を対象にメタボローム解析を実施した。その結果、ATP産生の低下とともに、ヒトの慢性疲労病態と同様に、クエン酸回路、尿素回路、およびグルタミン代謝が連動して変化することを明らかにした。さらに、関連酵素群の遺伝子発現解析や代謝シミュレーション法を用いた数理解析を通じて、疲労病態時には、尿素回路内のオルニチンやグルタミンからγ-アミノ酪酸(GABA)経路を介してクエン酸回路内のコハク酸へ流入する代謝経路、すなわち「疲労代謝回路」が存在することが判明した。この研究結果は、当初の研究計画をさらに展開させて得られた成果である。疲労代謝回路によるエネルギー代謝への影響を明らかにするために、疲労負荷ラットに対して13C-オルニチン(シグマ社より購入予定)を経口投与し、尿素回路や他の代謝経路への変換パターンを評価する。本実験では、経時的に肝臓を摘出し、ホモジネートした後に、抽出液の代謝物を質量分析法などにより測定する。

また、疲労代謝回路の律速酵素であるGABAアミノ基転移酵素を阻害し、尿素回路の代謝パターンやATP産生に与える影響も調べる予定である。