hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
共振周波数解析を用いた新しい尿流動態検査法の開発

この研究を始める動機は医師が患者に行っている診察の定量化である。たとえば泌尿器科医は診察により膀胱の状態を判断し検査により確認しているが、これを定量化できれば臨床応用は計り知れない。開発する過程によりソフト、ハード両方向よりアプローチした。人間が診察で感知しうる周波数帯域の装置、予算、材料の豊富さなどを考慮し市販されているオ-ディオ関連機器を利用した。解決すべき課題を以下のように分類した。1:効率よい振動伝達方法。2:効率よい振動検出方法。3:伝達、検出の切り替え。4:信号解析方法。5:実用レベルの検討。6:臨床的意味付け。『課題2』では一般的なマイクロフォン(空気振動を電気信号に変換する)よりコンデンサーマイクのほうが有効であるが得られる電気信号は極めて微弱であるためマイクに隣接したプリアンプが必要であった。『課題1』における装置では一般的なスピーカーを使用していたが外部に漏れる音に割に体内に伝わる振動が弱いため、現在は板などに効率よく振動を伝えるパイオニアのACT-1を利用している。『課題3』、『課題4』はソフト、ハードの統合が必要不可欠であり問題が山積みである。初期の実験より打診をそのまま応用することは極めて困難であると判断した。現在は特定の音を短時間に体内に伝え、その直後に振動を検出、フーリエ変換し同じ周波数の音の強さを解析している。最も大きな問題は信号の切り替え時に低周波雑音、およびそれに伴う高調波雑音、切り替え時の雑音などが強く必要な情報が得られないもので、現在ハードウエアを改良中である。風船、ボールなどではしっかりした信号が得られるが人体(自分自身)では試行錯誤している状態である。『課題5』、『課題6』については、ハードウエアの改良、スペクトラムアナライザーの導入、複数周波数の同時解析、動物実験、臨床検査に並行しての実験などを実施、検討中である。4:信号解析方法。6:臨床的意味付け。
ヒスタミンによる肥満細胞分化制御機構

1)HDCノックアウトマウスの肥満細胞の観察ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝子ノックアウトマウスの肥満細胞は,電子顕微鏡で観察すると,顆粒内容物が疎であり,プロテアーゼが減少している事が判明した.その後,ベルベリンという色素で顆粒を染色してみると,染色が弱く,陽性に染色された細胞も少なかった.現在,ヘパリン量の測定を開始しているところである.分化のどの段階で,顆粒に影響を受けたか検討している.2)肥満細胞のFACSによる解析まず,腹腔内の肥満細胞の表面抗体であるFcε受容体と,c-kit受容体を使い分けてみたが,ノックアウトもワイルドタイプも,腹腔細胞の中では,数がすくなくはっきりとした結果が得られなかった.現在,SV40LargeTantigenの遺伝子が入ったノックアウトおよびヘテロ由来の肥満細胞株を樹立できているため,この細胞をマウスの生体内で分化させ,顆粒と表面抗体の変化をみようと考えている.3)HDC遺伝子導入によるレスキュー実験食事中のヒスタミン量を増加させることによって,肥満細胞へのヒスタミンの取り込みが増大することがわかったものの,電顕で見た顆粒像はあまり変化がなかった.HDC遺伝子を再度導入するべく,HDC遺伝子のトランスジェニックマウスとノックアウトマウスとのstrainを合わせるようにバッククロスを行っている.現在6世代まで来ている.また,先ほどの樹立した肥満細胞にHDC遺伝子を再度発現させ,細胞を分化させるとどうなるか検討しているところである.3)野生型マウスからの骨髄移植実験ノックアウトマウスで観察された肥満細胞の表現型が野生型の骨髄をノックアウトマウスに移植することによって,もとの戻るかを確認しようと,骨髄移植実験を行ったが,もとに戻ることは確認できなかった.1)HDCノックアウトマウスの肥満細胞の観察ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝子ノックアウトマウスの肥満細胞は,電子顕微鏡で観察すると,顆粒内容物が疎であり,プロテアーゼが減少している事が判明した.その後,ベルベリンという色素で顆粒を染色してみると,染色が弱く,陽性に染色された細胞も少なかった.現在,ヘパリン量の測定を開始しているところである.分化のどの段階で,顆粒に影響を受けたか検討している.2)肥満細胞のFACSによる解析まず,腹腔内の肥満細胞の表面抗体であるFcε受容体と,c-kit受容体を使い分けてみたが,ノックアウトもワイルドタイプも,腹腔細胞の中では,数がすくなくはっきりとした結果が得られなかった.現在,SV40LargeTantigenの遺伝子が入ったノックアウトおよびヘテロ由来の肥満細胞株を樹立できているため,この細胞をマウスの生体内で分化させ,顆粒と表面抗体の変化をみようと考えている.3)HDC遺伝子導入によるレスキュー実験食事中のヒスタミン量を増加させることによって,肥満細胞へのヒスタミンの取り込みが増大することがわかったものの,電顕で見た顆粒像はあまり変化がなかった.HDC遺伝子を再度導入するべく,HDC遺伝子のトランスジェニックマウスとノックアウトマウスとのstrainを合わせるようにバッククロスを行っている.現在6世代まで来ている.また,先ほどの樹立した肥満細胞にHDC遺伝子を再度発現させ,細胞を分化させるとどうなるか検討しているところである.3)野生型マウスからの骨髄移植実験ノックアウトマウスで観察された肥満細胞の表現型が野生型の骨髄をノックアウトマウスに移植することによって,もとの戻るかを確認しようと,骨髄移植実験を行ったが,もとに戻ることは確認できなかった.
多文化共生社会日本の医療を考える：中国帰国者の医療受診に関する実証的研究

2018年度の一番の実績は、2019年1月に大阪大学出版会から、著書『多文化共生の医療社会学:中国帰国者の語りから考える日本のマイノリティ・ヘルス』を上梓できたことである。本著は、博士論文を再構成して書き上げたものであり、本若手研究の足掛かりというべき著書である。これによって、本若手研究の今後のフィールドワークの幅が格段に広がった。また、本若手研究の「戦後日本の保健医療政策を史実に則って明らかにする」という小目的の基盤部分を、本著の執筆過程において、成し遂げることができた。近隣の関西地域および東海地域において、これからのフィールドワークのための下地を固めた。2019年1月27日には、神戸市のNPO法人が主催する「中国帰国者地域交流会」において、勉強会の講師を務め、『中国帰国者の医療受診から、わたしたちの医療を考えよう』という題名で、中国帰国者家族が多く居住する集合住宅の地域住民に向けて講義を行った。また、2019年2月には、東海地域における「外国人高齢者と介護の橋渡しプロジェクト」発足会に招かれ、今後、運営委員として同プロジェクトに携わることになった。このプロジェクトは、中国帰国者2世の方が中心となって始めたプロジェクトで、日本語が不得手な高齢者を対象に、「介護通訳」を持続可能な形で事業化することを目的としている。今後このチャンネルを通じて、東海地域の中国帰国者たちの語りの収集が可能になる。当初の計画では、2018年度内に国内調査を3回(東海、北陸、九州)行う予定であったが、実施できたのは東海地域の1回と関西近隣のみであった。これは、本格的にフィールドワークを実施する前に、著書『多文化共生の医療社会学:中国帰国者の語りから考える日本のマイノリティヘルス』を上梓することが、調査のより良い進行の大いなる手助けになると考えたからである。また、研究計画書作成時には特任研究員(パートタイム)であったところ、2018年1月に助教のポストを得たことで、当初予定していた設備備品への投資が必要なくなった。フルタイムのポストに就いたことで、本研究の進行に若干の遅れは生じたが、2019年度で十分にキャッチアップできる範囲内である。国内における中国帰国者の語りの収集についても、8月ー9月を中心に精力的に実施する予定である。研究計画書提出時にはパートタイムの特任研究員であったが、2018年1月に助教のポストに就いた。そのことで、当初予定していた設備・物品費への投資が必要なくなった。同時に、フルタイムのポストに就いたことで、研究計画の進行に若干の遅れがでたことは否めない。具体的には、初年度に計画していたフィールド調査を次年度に持ち越すことにした。2019年度は、8月・9月を中心に精力的にフィールド調査を進め、助成金の適正使用に努める。
リスク及び危機対応態勢の連係的整備のための手法構築に向けた実証的研究

リスク・マネジメントと危機管理の連携に成功した事例として,北海道から関東に多数の店舗を展開するホームセンターのケースを分析した。この会社は,東日本大震災の被災地域に複数の店舗を持っているが,震災前からの綿密なリスク及び危機対応を行ってきた結果,勤務中の従業員に犠牲者をひとりも出さなかったことで,店舗を地域住民の避難場所として開放したり,いち早く営業を再開したりするなどして,地域の復興に大きく貢献することになった。このケースでは,リスクの認識及び危機発生時の行動について,定期的に実施される内部監査などの折りに従業員に繰り返し確認してきたことが,適切な危機対応につながっていたことが明らかになった。今年度は,昨年度実施した文献調査に基づくリスク,危機等の重要概念の整理を行った。また,来年度以降本格的に着手する予定の実地調査の準備として,これら概念の精緻化と操作性の向上を図ってきた。昨年度は,主として会計不正リスクを取り上げて検討したが,今年度は,災害時等に事業の継続を阻害するリスクや想定外といわれる事態を招くリスクなどに検討の範囲を拡張した。このため,リスクの発現形態としての危機についても,企業等の組織の経営(運営)業務全般に渡る検討に着手することになった。リスク対応の主たる手段としての内部統制について,デファクトスタンダードたるCOSOフレームワークが改訂されたため,その内容を分析するとともに,リスク・マネジメントに係る既存概念等への影響を検討した。根本的な思想に変更がないこと,ならびに内部統制とリスク・マネジメントの一層の連携が図られていることを確認した。これを受けて,本研究でも来年度以降,COSOフレームワークを十分に考慮してリスクと危機への統合的な対応策を構築して行くことになる。今年度は,来年度に実施する実地調査の準備として,企業情報におけるリスク情報の収集に着手した。有価証券報告書において開示されているリスク情報やBCP(事業継続計画)・BCM(事業継続マネジメント)などの危機対応情報を収集し,業界・業種別の整理を進めている。整理したデータは,業界・業種ごとの違いや特徴等を明らかにするための材料とするとともに,来年度実施予定の実地調査対象企業等を選定する際の資料としても活用する。今年度は,主として文献調査によって,過去に発生した事故,事件,不祥事などについてその原因や影響を分析し,リスク,失敗,危機といった本研究における重要概念の意義について検討した。リスクという概念は,組織等に不測の損失ないし思わぬ利益をもたらす要因,情報の質や将来事象の発生に関わる不確実性,あるいは漠然とした危険など多義的に用いられていることが確認された。また,リスク対応と危機対応とに共通して重要な役割を果たすと考えられるリスク・コミュニケーションという概念を詳細に検討した。リスク・コミュニケーションとは,リスクによって影響を受ける者に対して,具体的なリスクの内容やそれが現実化した場合に予想される影響などについて適切な情報を提供することによって,関係者のリスクに対する正しい理解と適切な対応を促す行為である。重大なリスクや危機に直面した際に,冷静かつ適切な対応が取られるように,日常的に有効なコミュニケーションが図られる必要がある。こうした概念的な分析・検討を背景に,具体的なリスクとして,金融市場に重大な影響を及ぼす会計不正リスクを取り上げ,監査における当該リスクへの対応について詳細な検討を行った。監査基準等の改訂によって不正リスクへの制度的な対応が明確化されたが,今年度の研究に即して,監査人の判断プロセスにおける不正リスクの考え方を概念的に整理したところである。これらの分析・検討は,次年度以降本研究を進めていく上で基礎をなす概念を明確化するために重要なプロセスである。こうした基本的な概念や具体的なリスクの分析に着手できたことで,今後の研究の進展にとって一定の成果を得られたと認識している。今年度は,昨年度までに実施した研究の結果を踏まえて,特にフランスにおけるリスク及び危機管理についての実態分析を行った。フランスにおけるリスク情報,リスク及び危機管理に関する開示情報を収集し,わが国におけるリスク及び危機管理ならびに情報開示の実態との比較研究を行った。情報開示については,両国間に決定的な違いは見られないが,フランスにおける情報開示が会社法の枠組みにしたがって実施されていることに伴う特徴も見られるため,今後さらに詳しく比較分析することを通じて,リスク・危機管理の基礎としてのリスク情報に対する考え方や対応について解明を試みる予定である。また,今年度は,リスク・マネジメントや危機管理に関して,組織のトップによる意思決定や行動を支援する内部監査の基本的な機能についても整理した。内部監査は,システムとしてのリスク・危機管理の整備状況をモニターすることにとどまらず,システムが所期の見込み通りに運営され,有効に機能しているかどうかという,リスク及び危機管理のプロセスの検証という役割を担っている。内部監査の実践的な基準などには,こうした基本的な機能について明確に示されているが,数人の内部監査人に聞き取りをしたところによれば,実態として,プロセスの監査にまで至っていないケースが大半であることが分かってきた。今後は,さらに聞き取り件数を増やすことによって,実態のより的確な把握に努める予定である。本研究は,東日本大震災におけるリスク及び危機対応の失敗を教訓として,リスクと危機への対応体制を連係的に整備するための手法を提示することを目標とする。本研究に着手した時点では,リスク管理やリスク情報の開示が定着しつつあったが,危機発生を想定した事後的な対応まで行っている企業は多くなかった。BCP(事業継続計画)の策定やBCM(事業継続マネジメント)への取り組みが徐々に始まったという状況であった。東日本大震災にともなう原発事故は,リスク・マネジメントおよび危機管理の1つの代表的失敗事例であるといってよい。

この事例からは,想定しにくいことあるいは企業経営の負担となるため想定したくないことをいかに想定できるかが,危機管理の成否の鍵を握るということが教訓として導かれた。今年度は,リスク・マネジメントと危機管理の連携に成功した事例として,北海道から関東に多数の店舗を展開するホームセンターのケースを分析した。この会社は,東日本大震災の被災地域に複数の店舗を持っているが,震災前から綿密にリスク及び危機対応への意識づけを行ってきた結果,勤務中の従業員に犠牲者をひとりも出さなかったことで,店舗を地域住民の避難場所とて開放したり,いち早く営業を再開したりするなどして,地域の復興に大きく貢献することになった。このケースでは,リスクの認識及び危機発生時の行動について,定期的に実施される内部監査などの折りに従業員に繰り返し確認してきたことが,適切な危機対応につながっていたことが明らかになった。研究全般を通じて,リスク・マネジメントでは,従来から指摘されているリスク・コントロールとリスク・ファイナンスに加えてリスク・コミュニケーションが重要であること,また,危機管理については,広報部門の役割が重要であり,ガバナンス機関と連携して危機状態の早期収束を図ることの重要性も明らかにした。リスク・マネジメントと危機管理の連携に成功した事例として,北海道から関東に多数の店舗を展開するホームセンターのケースを分析した。この会社は,東日本大震災の被災地域に複数の店舗を持っているが,震災前からの綿密なリスク及び危機対応を行ってきた結果,勤務中の従業員に犠牲者をひとりも出さなかったことで,店舗を地域住民の避難場所として開放したり,いち早く営業を再開したりするなどして,地域の復興に大きく貢献することになった。企業の膨大な開示情報の中からリスク・マネジメントや危機管理に関する適切な情報を選別する作業にやや時間を要している。また,実態についての聞き取りに際して,先方の事情を考慮する必要があることから,実地調査の進展が予定よりやや遅れ気味になっている。監査論今後は,収集したリスク・マネジメントならびに危機管理に関連する情報の分析・検討と,それらを考慮に入れながら,内部監査部門の関わり方をも含めて,リスク及び危機への対応の実態に関する聞き取り調査件数を増やし,これらの結果に基づいて最終的な研究成果にまとめていく予定である。概念の整理や精緻化作業はおおむね順調に進んでいる。一方,過去30年間程度にわたるリスク・マネジメントやBCP・BCMに関わる情報収集を進めているが,これら情報が膨大な量となるため収集作業に時間がかかっている状況である。
液晶を用いた金属ナノ微粒子の自己組織化と規則構造の光マニピュレーション

本研究は,液晶の自己組織性を利用して金ナノ微粒子の凝集構造を制御することおよび,液晶分子の外場応答性を利用してナノ微粒子の凝集構造を外部刺激(光)により制御することを検討した。グラファイト基板上で金ナノ微粒子の凝集構造を観察した結果,直鎖状配列構造を示すことが分かった。また,配向処理を施した基板を用いて特定の方向にナノ微粒子を一次元配列させることに成功した。光応答性液晶を導入した金ナノ微粒子は,光照射により露光部から非露光部へ微粒子が移動することを見いだした。本研究では光応答性液晶を表面に結合させた無機ナノ微粒子を合成し,1)液晶分子の配向により無機ナノ微粒子集合体の規則構造が発現するメカニズムを解明し,2)液晶の光応答を利用して微粒子集合体の規則構造を光で操作することを目的とする。2009年度に行った研究の結果,光応答性液晶分子を金ナノ微粒子に結合すると,ナノ微粒子が規則的に凝集し,種々のナノ規則構造を発現することが分かった。この構造は試料調整に使用する溶媒の種類により1次元構造から2次元構造へと大きく変化することが分かった。溶媒を適切に選択することで,直鎖状1次元構造,環状1次元構造あるいは2次元構造を形成させることができた。これまでも,溶媒により自己組織体の規則構造を変えることが可能であることは報告されてはいるが,このような大きな構造変化が起こる材料は本研究で初めて見いだされた。また,光化学反応により液晶分子の構造を変化させ,液晶性を消失させるとこの自己組織体の規則構造がランダムな凝集構造に変化した。さらに,金ナノ微粒子の自己組織化が表面に結合された有機分子の液晶性によって誘起されたことをより明確にするために,非液晶性有機分子を結合したナノ微粒子を合成し凝集構造を観察した。その結果,非液晶分子が結合したナノ微粒子はランダムな凝集構造を示した。以上の結果より,ナノ微粒子表面の有機分子の液晶性に基づいてナノ微粒子の自己組織化が起こり,種々のナノ規則構造を形成することを明らかにした。2010年度は,液晶性アゾベンゼンを結合したナノ微粒子を合成し,透過型電子顕微鏡(TEM)用のグリッド上で凝集構造の観察を行った。その結果,金ナノ微粒子の自己組織化が起こり鎖状1次元配列,環状1次元配列および2次元規則構造を自発的に形成することが分かった。それぞれの自己組織構造は試料調製に用いる溶媒の極性により制御できることを見いだした。また,非液晶分子を結合した微粒子を用いて同様の観察を行った結果このような構造を示さないことから,このような自発的な規則構造の形成には,微粒子に結合する有機分子の液晶性が本質的に重要な役割を果たすことを明らかにした。次に,このナノ微粒子の凝集構造をいろいろな固体基板の表面で観察した結果,液晶性アゾベンゼンを結合したものは基盤表面で単微粒子層を形成し,基盤表面の規則構造に依存する凝集構造を示した。一方,非液晶分子を結合したのもは基板表面でランダムな3次元凝集構造のみを形成した。液晶を結合した微粒子のみが単微粒子層を形成することおよびこのときの自己組織構造が基板の表面構造に依存することから,液晶分子と基板表面との間に作用する界面配向規制力がナノ微粒子の規則構造形成にも大きな影響を及ぼすことが推察される。本研究では,液晶分子を結合した金ナノ微粒子を合成し,液晶の自己組織性を利用して金ナノ微粒子の凝集構造を制御することを目的とした。また,液晶分子の外場応答性を利用することで,ナノ微粒子の凝集構造を外部刺激により制御することも検討した。いろいろな液晶性化合物を金ナノ微粒子に結合して液晶挙動を観察した結果,特定の構造をもつ液晶分子を結合した場合にのみ微粒子も液晶性を発現した。高配向焼結グラファイト(HOPG)基板上で液晶分子を結合した金ナノ微粒子の凝集構造をAFMにより観察した結果,直鎖状の一次元的な配列構造を示すことが分かった。一方,非液晶分子で被覆した金ナノ微粒子はランダムな凝集構造しか示さなかった。この結果は,基板表面上における金ナノ微粒子の配列構造が微粒子に導入した分子の液晶性に強く依存することを示している。また,ポリイミド配向膜を塗布しラビング処理を施した基板表面では,ラビング方向にナノ微粒子を-次元配列させることに成功した。ポリイミド配向膜を塗布した基板表面で,as-cast試料を用いると各微粒子が比較的ランダムに分散した構造が観察されたが,この試料を液晶温度範囲でアニーリングすると,金ナノ微粒子がラビング方向に一次元配列した。

すなわち,液晶分子と基板表面の間に働く界面配向規制力を利用してメソゲンを一軸配向させることで金ナノ微粒子の1次元的な配列方向も規制でき,凝集構造の自在な制組が可能で左ることを明らかにした。
量子ドットの輸送・光学特性における超放射現象

量子ドットは将来の量子計算機における量子ビットの候補として注目されているデバイスである。報告者は、共通のボソン場と結合した二準位系(量子ビット)の間に自発的にエンタングルメント(量子もつれ)が成長していく超放射現象に着目し、量子計算への応用を想定した研究を行っている。昨年度は半導体二重量子ドット(電荷量子ビット)の非弾性伝導によって、半導体基板の光学フォノンが増幅され、フォノンレーザーやアンチバンチングが実現することを理論的に予言した。今年度は微小機械振動子に埋め込まれた半導体二重量子ドットの電気伝導によって、やはり電気伝導によって増幅されたフォノンの量子状態を観測する方法を理論的に提案した。具体的な方法としては(1)フォノンの生成に用いる二重量子ドットの電流ゆらぎを用いる方法、(2)フォノンの生成に用いる二重量子ドットの近傍に他の二重量子ドットを作成し、フォノン吸収伝導を用いる方法が考えられる。(1)については、フォノンのレーザー発振が実現している場合、二重量子ドットのフォノン放出に対応する電流ピークのまわりで電流ゆらぎが著しく増大し、電流ファノ因子が大きな値をとることがわかった。フォノンのアンチバンチングが生じているとき、このようなふるまいは見られない。(2)については、フォノン吸収に用いる二重量子ドットの電流の値から、生成されているフォノン数の見積もりが得られることがわかった。これらの成果はフォノンを用いた量子情報処理や、量子情報の転送の基礎研究としてきわめて有益であり、今後の研究の進展が期待される。(抄録なし)量子ドットは将来の量子計算機における量子ビットの候補として注目されているデバイスである。報告者は、共通のボソン場と結合した二準位系(量子ビット)の間に自発的にエンタングルメント(量子もつれ)が成長していく超放射現象に着目し、量子計算のプロトコルとしての応用を想定した研究を行っている。今年度は半導体二重量子ドット(電荷量子ビット)と半導体基板の格子振動を司るボソン場である光学フォノンとの相互作用に着目し、バイアスを印可した量子ドットと光学フォノンの非平衡ダイナミクスを理論的に研究した。光学フォノンは量子ドットと結合するΓ点近傍の長波長領域において平坦な分散関係を持つため、量子ドットから放出される光学フォノンは定在波を形成する。その結果、光学フォノンはあたかも光共振器中のフォトンのように量子ドット近傍に定在波をつくることが明らかになった。その結果、二重量子ドットのエネルギー準位間隔を光学フォノンのエネルギーに調整すると、量子ドットを介した電流によってフォノンが増幅され、フォノンのレーザー発振およびアンチバンチングが実現することが明らかになった。これは極めて重要な量子光学効果であるレーザー発振が、半導体の格子振動というまったく異なる舞台で実現することを示した画期的な成果であり、格子振動を利用した量子情報処理という新たな可能性を切り開くものである。報告者はこの成果を国内外の学術会議で報告するとともに、日本物理学会の発行する欧文誌、J.Phys.Soc.JPn.(JPSJ)に論文を発表した。この論文は極めて高く評価され、日本物理学会のJPSJ papers of Editors' Choiceに採択された。今年度は交付申請時に想定していなかった非自明で興味深い物理現象を発見し、その解明に重点を置いて研究を行った。この成果は量子ドットおよびボソンを利用した量子情報処理に新たな可能性を切り開くものであり、その知見をふまえて、研究を進めて行きたい。光学フォノンなどのボソン場と複数の量子ビットが結合した状況を理論的に解析し、超放射現象によるエンタングルメントの生成機構を明らかにする。量子計算への応用を念頭に、環境による擾乱や、量子ビットの不均一性の影響等を検討する。また超放射現象を利用した光学フォノンレーザーやフォノンのアンチバンチングによって放出されるフォノンの観測方法を理論的に考察し、量子情報処理への応用を検討する。(抄録なし)
Fasを介するアポトーシスを応用した癌遺伝子治療へ向けての基礎的研究

本研究では、あまり解析の進んでいないFasを介するアポトーシスによる抗腫瘍作用を解明し臨床的に応用することを目的として、Fas非発現マウス肝癌株MH134にベクターを用いてFas cDNAを導入したFas発現MH134細胞株(F6b株)を実験材料として研究を行った。In vitro実験においてF6b株を単クローン抗Fas抗体Jo2抗体と反応させて、その抗腫瘍効果をMTT assayにて検討したところ、200ng/mlでほぼ100%の細胞死を誘導した。この細胞死が実際にアポトーシスにより誘導された細胞死であることを蛍光核染色で確認した。同様にアポトーシス誘導能が証明されている精製可溶性リコビナントFasLでも、アポトーシスが誘導された。In vivo実験では、宿主に対する抗Fas抗体とFasLの肝臓障害作用を回避するために、ダブルミュータントマウスC3H-gld/gld・lpr/lpr(C3H-gld/lpr)を用いて癌ターゲット治療実験を行った。マウス皮下にF6b株を移植してJo2抗体50μgを投与するを、一過性の腫瘍の縮小あるいは腫瘍発現の遅延がみられた。一方、マウス腹腔内にF6b株を移植してJo2抗体50μgを投与すると、有意な延命効果がみられた。しかし、いずれの場合も完全治癒は達成されず、Fas発現を失いJo2抗体に対し耐性の腫瘍細胞の増殖がみられた。可溶性リコビナントFasLを用いても、一過性の抗腫瘍効果はみられたものの、完全治癒は得られなかった。一方、近年、かなり多くの腫瘍がFasを発現しているとの報告があることから、Fasを弱く発現しているマウス乳癌株MM2にFas cDNAを導入し、Fas強発現MM2細胞株(C8h株)を樹立した。MM2はFasを発現しているにもかかわらず、Jo2抗体およびリコビナント可溶性FasLに対して全く反応を示さなかった。In vitro実験においてC8h株をJo2抗体と反応させて、その抗腫瘍効果をMMT assayにより検討したところ、最大限で約60%の細胞死しか誘導しなかったが、可溶性リコビナントFasLはほぼ100%のアポトーシスを誘導した。そこで、C8h株をJo2抗体または可溶性FasLで約2週間処理し、Jo2抗体および可溶性FasLに対する耐性獲得の有無を検討したところ、抗体-抗体では完全耐性、抗体-FasLでは不完全耐性となり、FasL-抗体およびFasL-FasLでは感受性を維持していた。また、細胞表面のFas抗原の発現をFACSで検討すると、抗体処理では減少していたが、FasL処理では減少はみられなかった。この結果から、Jo2抗体と可溶性FasLではFas抗原に対するエピトープおよび細胞内シグナル伝達の経路が異なっていることが示唆された。さらに、可溶性リコビナントFasLによる治療の方が耐性を生じ難く、高い抗腫瘍活性が得られることも示唆された。

また、細胞表面のFas抗原の発現をFACSで検討すると、抗体処理では減少していたが、FasL処理では減少はみられなかった。この結果から、Jo2抗体と可溶性FasLではFas抗原に対するエピトープおよび細胞内シグナル伝達の経路が異なっていることが示唆された。さらに、可溶性リコビナントFasLによる治療の方が耐性を生じ難く、高い抗腫瘍活性が得られることも示唆された。本研究では、あまり解析の進んでいないFasを介するアポトーシスによる抗腫瘍作用について、Fasを発現していないマウス肝癌株MH134にベクターを用いてFas cDNAを導入したFas発現MH134細胞株(F6b株)を用いて研究を行ってきた。単クローン抗Fas抗体Jo2、及びアポトーシス誘導が証明されている精製可溶性リコビナントFasLを用いて、in vitro、in vivoで腫瘍のFasとFasLを介するターゲット治療の基礎研究を行った。In vitro実験においてF6b株をJo2抗体と反応させて、その抗腫瘍効果をMTT assayにて検討したところ、200ng/mlでほぼ100%の細胞死を誘導した。この細胞死が実際にアポトーシスにより誘導された細胞死であることを蛍光核染色で確認した。同様にリコビナントの可溶性FasLを用いても、アポトーシスが誘導された。In vivo実験では、宿主に対する抗Fas抗体とFasLの肝臓障害作用を回避するために、C3H-lpr/lprとC3H-gld/gldから、ダブルミュータントマウスC3H-gld/gld・lpr/lpr(C3H-gld/lpr)を作出し、これを用いて癌遺伝子治療実験を行った。マウス皮下にF6b株を移植してJo2抗体50μgを投与すると、一過性の腫瘍の縮小あるいは腫瘍発現の遅延がみられた。一方、マウス腹腔内にF6b株を移植してJo2抗体50μgを投与すると、有意の生存率延長がみられた。しかし、どちらも完全治癒はみられず、Fas発現のないJo2抗体に対し耐性の腫瘍細胞の増殖がみられた。可溶性リコビナントFasLを用いても、一過性の抗腫瘍効果はみられたものの、完全治癒は得られなかった。今後は、宿主細胞傷害がないといわれているcell-bound FasLを用いての、正常マウスにおける抗腫瘍活性を検討し、臨床への応用をめざす。また、正常ではFasの発現のみられないマウス乳癌MM2株にFas cDNAを導入したFas発現MM2細胞株(C8h株)を作成し同様の実験を行っている。さらに、最近、FasL発現腫瘍細胞が宿主に腫瘍特異的免疫を誘導するとの報告から、MH134及びMM2細胞にFasL cDNAを導入した細胞株を作成し、この抗腫瘍効果について検討を加える予定である。本研究では、Fasを介するアポトーシスによる抗腫瘍作用の臨床的応用を目的として、Fasを発現していないマウス肝癌株MH134細胞にベクターを用いてFas cDNAを導入したFas発現MH134細胞株(F6b株)を用いて、単クローン抗Fas抗体Jo2及びアポトーシス誘導能を持つ精製可溶性リコビナントFasLによるFas-FasL系を介する腫瘍のターゲット治療の基礎研究をin vitro、in vivoで進めてきた。近年、かなり多くの腫瘍がFasを発現していると報告されている。
カチオン性有機分子のヒドリド受容能を利用する水素分子の反応開発

触媒を利用して水素分子をプロトンとヒドリドに分割し、ヒドリドをカチオン性含窒素複素環化合物で捕捉する反応を開発した。生成物は安定な有機化合物であるが、触媒存在下では有機ヒドリド試薬としてはたらき、プロトン化による水素ガス放出や、有機物の還元が可能であった。また、カチオン性複素環内において高度に求電子的となった炭素原子へヒドリドを付加することにより、温和な条件で一炭素ユニットの還元を進めた。この反応は、有機補酵素の補助の下で水素を使って二酸化炭素を還元する、生物的メタン生成の経路と関連するものである。1.イミダゾリニウムカチオンを金属錯体触媒存在下に水素で還元する反応を開発した。1,3-ジフェニルイミダゾリニウムと等モルのトリエチルアミンとの混合物は、溶液中で1気圧の水素雰囲気下において1,3-ジフェニルイミダゾリジンとトリエチルアンモニウムに変換された。この反応は水素分子をヒドリドとプロトンに分割して各基質分子に付加させているため、水素を不均一活性化する錯体触媒が有効であった。高い活性を示すロジウムおよびイリジウム錯体を見出し、これらが常温で反応を定量的に進行させることを明らかにした。このうちイリジウム錯体の方は、逆反応にあたる1,3-ジフェニルイミダゾリジンからの水素発生にも高い触媒活性を示し、等モルのN,N-ジメチルアニリニウムをプロトン源として添加した条件で水素と1,3-ジフェニルイミダゾリニウムを定量的に生成した。本反応の可逆性を反映して、プロトン源の酸性度を下げると反応の進行度合いは低下した。また、塩基存在下における水素貯蔵とプロトン添加による水素放出が、常温で連続的に実施可能であることが実証された。基質のフェニル基への置換基の導入効果や、反応中間体の検出も検討している。2.生物的メタン生成経路による炭素原子の還元では、メチン炭素が補酵素H4MPTと結合してイミダゾリニウム環を形成したのち、イミダゾリジンのメチレンへと還元される過程を経由する。これに倣って、H4MPTの活性サイト近傍と構造が類似した分子2-(アニリノメチル)ピペリジンを用い、ギ酸等価体と反応させてイミダゾリニウム環へと変換した。これを1気圧の水素下で、触媒量のロジウム錯体およびトリエチルアミンとともに処理したところ、開環を伴いながら2-位炭素の還元がメチルの段階まで進行した。この反応は、4段階の水素化を要する二酸化炭素からメタンへの変換過程における中間2段階に相当するものであり、温和な条件で行うことができた。1.金属錯体触媒の作用機構の検討:イミダゾリニウムカチオンへのヒドリド移行とその逆反応の双方において,ジアミド配位子を有するイリジウム錯体が有効であることが,平成25年度の研究で明らかになっていた。様々な条件下での反応や基質との量論反応から,この錯体触媒がヒドリド活性種を生成する経路は,アミド上にプロトン化されたものと基質分子(水素またはイミダゾリジン)との作用によるものと,溶媒(アルコール)から協奏的にプロトンとヒドリドが移行するものの二通りあることが確認された。2.水素貯蔵材料としての評価:1,3-ジフェニルイミダゾリニウムをヒドリド受容体として,プロトン受容体と組み合わせることにより可逆的に水素を吸蔵・放出できるが,これに適する触媒と溶媒の組み合わせが限定的である上,吸蔵率は理論量の50%程度であった。前述の反応機構の検討から,反応初期のヒドリドがかなりの割合で溶媒のアルコールに由来していることを考慮し,それによって生成したケトンへの水素付加の時間を確保することにより,吸蔵率は70%まで向上した。3.生物的CO2還元モデルの構築:イミダゾリニウムの二段階水素化で生成するN-メチル基の切断を検討した。既報のN-メチル切断反応に使われている錯体との反応では,標的とするエチレンジアミン誘導体のN-メチル基は切断されず,脱水素による再閉環(水素化の逆反応)が進行することが明らかとなった。4.カチオン性複素環部位を構造単位とするポリマーの合成:高分子水素吸蔵材料を創製するため,種々の環構造を持つビニルモノマーを合成した。ラジカル重合の条件下ではイミダゾリジン構造を持つもののオリゴマー化が見られるが,高分子量には至っていない。5.ヒドリド錯体の新規反応性の探索:タングステン,モリブデンのポリヒドリド錯体についてヒドリド配位子の性質をさぐるため,有機分子や他の金属錯体との反応性を検討した。1.生物的C1変換のモデル反応:補酵素H4MPTはメタン生成経路で利用されるC1キャリアの一つであるが,これと類似の構造を持つテトラヒドロ葉酸もまたC1ユニット供与体としてはたらいている。これらの間の構造的違いは主に,テトラヒドロ葉酸ではN-フェニル基のパラ位に電子求引性置換基があることであり,結果としてこの誘導体の方がより還元されやすいことが知られている。そこで,電子的効果の異なる置換基を導入したモデル化合物を合成し,それらから誘導されたイミダゾリニウム化合物を錯体触媒を用いて水素化したところ,電子求引性置換基では転化速度が上がることが確認された。また,上記2種の生体分子と類似する六員環と縮合したイミダゾリニウム化合物に対し,縮合環構造のないイミダゾリニウム基質は水素化が遅いことも見いだした。2.N,N'-ジフェニルイミダゾリニウムの二段階

水素化:本基質はプロトン受容体と組み合わせることによりヒドリド受容体として作用し,可逆的な水素の吸蔵・放出を可能とする。この反応ではIrジアミド錯体が有効な触媒であるが,水素吸蔵反応においてはるかに高活性なRhジチオラート錯体は放出反応の効率がきわめて劣っている。後者の触媒作用について詳細に検討したところ,イミダゾリニウムの1段還元体であるイミダゾリジンをさらに水素化して鎖状ジアミンに変換することが判明した。本反応はプロトン供与体存在下において加速されるため,イミダゾリジンから引き抜かれたヒドリドとプロトンから水素を生成するよりはむしろ,別のイミダゾリジンにヒドリドが移行して鎖状ジアミンを生成する不均化が進行したものと考えられる。3.新規ヒドリド移行触媒:これまでの研究では貴金属触媒を土台としてきたが,現実の生体系で用いられているような第一周期遷移金属の利用を目的として,多座配位子で保持された鉄,コバルト,ニッケルのヒドリド錯体を新規に合成した。本年度当初の計画では実施項目として,「水素貯蔵材料としての評価」,「生物的CO2還元モデルの構築」,「カチオン性複素環部位を構造単位とするポリマーの合成」,「新規水素化触媒」の4点を挙げていた。第一の項目については,特に水素発生条件での触媒の作用機構の違いについて解明し,水素生成量低下の原因となる副反応を抑制するという開発方針が明らかとなった。一方で,この副反応はイミダゾリジン環の水素化開環であるため,C1ユニットの還元という観点では,第二の項目における有用な素反応である。これまでN,N'-ジアリールイミダゾリジンの水素化は困難であったが,反応条件によっては比較的温和な条件で進行することが判明したため,最適化の検討を行ってきた。これらの結果は複数の論文として発表する予定であり,先行する論文のデータを確実にするため時間を要した。第三の項目については進展がなかったが,第四の項目については貴金属を用いない新規錯体を合成し,その触媒活性の検討が進行中である。以上のように当初の研究計画よりも時間がかかっているが,過半数の項目については成果があり,論文発表の目処がおおよそ付いたと言える。今後は延長期間内で,論文を完成させるためのデータ追加と検証を行う予定である。1.N,N'-ジフェニルイミダゾリジンの水素化:本基質は触媒(Rh錯体)存在下に常圧の水素と反応し,2-位のメチレンがメチルへと還元されながら開環してN,N'-ジフェニルエチレンジアミン誘導体に変換される。主生成物では片方のN上にメチル基がある(モノメチル体)が,両方のN上にメチル基があるもの(ジメチル体)とメチル基を持たないもの(無置換体)が副生した(ジメチル体:無置換体1:1)。メチルアニリン共存下で水素化するとジメチルアニリンが生成することや,モノメチル体のみを触媒反応条件下で処理してもメチル基の移動が見られないことから,メチレン基が還元される過程において分子間で別の窒素原子上に移動していると考えられる。この反応はアルコール溶媒やプロトン性添加物によって加速されるため,プロトンによる基質の活性化が示唆される。基質に0.5ー1当量のプロトン源を加え水素ガスのない条件で触媒を作用させると,ヒドリド移動を伴う不均化により鎖状ジアミンとN,N'-ジフェニルイミダゾリニウムがほぼ等モル生成した。2.複素六員環構造を有するカチオン性色素の水素還元:錯体触媒を利用して常圧水素下における還元を検討した。
東アジアにおける活断層と地震テクトニクスの比較研究

日本列島から中国大陸東部にかけては、太平洋プレートとユーラシアプレートの境界部に位置しており、地殻変動・地震活動・火山活動の活発な変動帯をなす。本研究では、日本列島から中国東部における変動地形と地質構造の比較研究により、東アジアにおける活断層と地震テクトニクスの地域的特性と新生代後半から現在にかけての地殻変動の時代的変化を解明し、さらに東アジアにおける現在の地殻変動と大地震発生に関するテクトニクスモデルを提唱することを目的とした。具体的には、中国の山西地溝帯北部および東北地方長白山地域における活断層・活構造・火山活動・地震テクトニクスについて現地調査を行なった。とくに山西地溝帯北部では大同盆地と六稜山北麓地域において野外調査により詳しい活断層図・地質構造図・火山地質図などを作成し、断層変位基準や断層活動に関する放射性炭素年代・TL年代およびK-Ar年代測定試料を採取し、年代測定を行った。その結果、大同盆地南縁に分布する六稜山北麓断層の第四紀後期における活動について新たな知見を得た。それによれば、断層活動の様式は正断層、活動度はB球で、山麓の断層のほかに盆地側に断層が張り出している場所では、盆地側の断層が山麓側に比べて活動的であることが判明した。また中国北部におけるテクトニクスを明らかにするために、中国東北地方における新生代後期の火山活動に関する調査を行い、この地域における広域応力場の復元を含め、山西地溝帯の形成と第四紀火山活動の関係について検討した。(1)中国山西地溝帯北部における活断層山西地溝帯は東西性走向の地溝が北西-南東方向に左雁行する構造系である。地溝帯北端でみられる顕著な構造のひとつ、六稜山北麓断層は大同-陽原盆地の南縁を画する境界断層であり、東は河北省陽原から西は山西省大同市の麻山谷口付近まで、平均走向は東北東-西南西で、総延長約150kmに及ぶ。西端部は六稜山西麓において、北北東走向の右横ずれ断層に移化する。この断層は、近傍の恒山北麓断層、五台山北麓断層や系舟山北麓断層などsともに、山西地溝帯北部(晋北地区)に位置する伸張テクトニクスの主幹断層とみなされる。とくに独立単成火山群の活動を伴っていることからリフトと読んでよい。近年になって六稜山北麓地帯西部で地震活動が活発化し、1989年10月18日と1991年3月26日には、それぞれMs6.1とMs5.8を最大規模とする地震群が大同県西册田付近で発生した。六稜山北麓では、2本の断層、盆地山地間の境界断層(F1)および盆地側で後期更新世完新世の洪積沖積層を切る新生断層(F2)により階段状台地が形成されている。中東部では長さ1022kmを単元とするセグメンテーションが明瞭で、ミ型の雁行配列を呈する。陽原付近の露頭で走向N5090°Eのピッチ7580°で東にプランジする擦痕が数多く観察され、変位センスは約10%の右横ずれ成分をともなう正断層である。約5万年前以降に形成された時代を異にする山麓扇状地群を変位させている活断層の変位量と平均変位速度を明らかにすることができた。この地域における山麓扇状地は現成扇状地、新期の開析扇状地(約2万年前以降に形成された)、旧期の開析扇状地(約45万年前以前に形成された)に区分される。新期の開析扇状地はさらに3面に大別され、新しいものから約78千年前(T1面)、約1万1万4千年前(T2面)、約1万4千2万年前(T3面)に区別される。独山堡地区は、断層変位をうけている時代を異にする山麓扇状地群が典型的に発達する地域の一つである。独山堡地区における活断層の平均変位速度は千年当たり0.40.7mとなる。なお歴史記録上では、本断層が地表で地震断層を生じるような大地震(M≧7)の発生は知られていない。(2)大同盆地の玄武岩火山活動大周盆地では第四紀になって玄武岩火山活動が活発化し、とくに前期中期更新世(0.3Ma以前)には鮮新更新世湖成層を被覆する洪水型の溶岩台地を形成し、一部は湖成層中に狭世している。秋林溝の出口付近ではF1断層に沿って更新世の玄武岩が噴出した。玄武岩溶岩による焼成層のTL年代や玄武岩のK-Ar年代の測定結果によれば、この断層沿いに新旧2回の玄武岩噴出活動期が認められる。F1断層沿いの古期玄武岩(K-Ar年代1.71±0.41Ma)は、山地で断層下盤側の谷を埋積し、柱状節理が発達している。一方、新期の玄武岩はF1およびF2断層の両側に分布し、山地側では傾斜不整合で古期玄武岩を覆い玄武岩台地を形成している。より新しいとみられるスコリアコーンや半球状小丘列も後期更新世馬蘭黄土に覆われる。新期玄武岩は、溶岩流の接触による焼土や焼成黄土層のTL年代が、約20万年前の間の年代値を示す。

秋林北東の東馬営では、低位段丘面上に、走向N70°E,高さ3m,全長1km,幅100mの緩やかな溶岩丘があり、頂部には幅30m前後で深さ1.5m程度の凹地列が認められ、新期玄武岩の割れ目噴火による火口列と考えられる。この火口配列は主要な正断層の走向と平行であり、晋北伸張テクトニクス区における主張力軸の直交し、中間軸(水平最大主応力)の方位を示している。日本列島から中国大陸東部にかけては、太平洋プレートとユーラシアプレートの境界部に位置しており、地殻変動・地震活動・火山活動の活発な変動帯をなす。本研究では、日本列島から中国東部における変動地形と地質構造の比較研究により、東アジアにおける活断層と地震テクトニクスの地域的特性と新生代後半から現在にかけての地殻変動の時代的変化を解明し、さらに東アジアにおける現在の地殻変動と大地震発生に関するテクトニクスモデルを提唱することを目的とした。具体的には、中国の山西地溝帯北部および東北地方長白山地域における活断層・活構造・火山活動・地震テクトニクスについて現地調査を行なった。とくに山西地溝帯北部では大同盆地と六稜山北麓地域において野外調査により詳しい活断層図・地質構造図・火山地質図などを作成し、断層変位基準や断層活動に関する放射性炭素年代・TL年代およびK-Ar年代測定試料を採取し、年代測定を行った。その結果、大同盆地南縁に分布する六稜山北麓断層の第四紀後期における活動について新たな知見を得た。それによれば、断層活動の様式は正断層、活動度はB球で、山麓の断層のほかに盆地側に断層が張り出している場所では、盆地側の断層が山麓側に比べて活動的であることが判明した。また中国北部におけるテクトニクスを明らかにするために、中国東北地方における新生代後期の火山活動に関する調査を行い、この地域における広域応力場の復元を含め、山西地溝帯の形成と第四紀火山活動の関係について検討した。(1)中国山西地溝帯北部における活断層山西地溝帯は東西性走向の地溝が北西-南東方向に左雁行する構造系である。地溝帯北端でみられる顕著な構造のひとつ、六稜山北麓断層は大同-陽原盆地の南縁を画する境界断層であり、東は河北省陽原から西は山西省大同市の麻山谷口付近まで、平均走向は東北東-西南西で、総延長約150kmに及ぶ。西端部は六稜山西麓において、北北東走向の右横ずれ断層に移化する。この断層は、近傍の恒山北麓断層、五台山北麓断層や系舟山北麓断層などsともに、山西地溝帯北部(晋北地区)に位置する伸張テクトニクスの主幹断層とみなされる。とくに独立単成火山群の活動を伴っていることからリフトと読んでよい。近年になって六稜山北麓地帯西部で地震活動が活発化し、1989年10月18日と1991年3月26日には、それぞれMs6.1とMs5.8を最大規模とする地震群が大同県西册田付近で発生した。六稜山北麓では、2本の断層、盆地山地間の境界断層(F1)および盆地側で後期更新世完新世の洪積沖積層を切る新生断層(F2)により階段状台地が形成されている。中東部では長さ1022kmを単元とするセグメンテーションが明瞭で、ミ型の雁行配列を呈する。陽原付近の露頭で走向N5090°Eのピッチ7580°で東にプランジする擦痕が数多く観察され、変位センスは約10%の右横ずれ成分をともなう正断層である。約5万年前以降に形成された時代を異にする山麓扇状地群を変位させている活断層の変位量と平均変位速度を明らかにすることができた。この地域における山麓扇状地は現成扇状地、新期の開析扇状地(約2万年前以降に形成された)、旧期の開析扇状地(約45万年前以前に形成された)に区分される。新期の開析扇状地はさらに3面に大別され、新しいものから約78千年前(T1面)、約1万1万4千年前(T2面)、約1万4千2万年前(T3面)に区別される。独山堡地区は、断層変位をうけている時代を異にする山麓扇状地群が典型的に発達する地域の一つである。独山堡地区における活断層の平均変位速度は千年当たり0.40.7mとなる。
マウスモデルを用いた水頭症発症機構の解明

神経発生に重要なHES1の機能を修飾するLmo3 Hen2のダブルトランスジェニックマウス(Tg)では100%が水頭症を発症し、大脳皮質と神経幹細胞が存在す領域の厚みが減少し、神経細胞の前駆細胞(IPC)が胎生期の大脳皮質で増加していた。胎仔脳室へのエレクトロポレーション法によるLmo3 Hen2両遺伝子の高発現ではIPCは増加するが神経細胞は増加せず、各遺伝子の高発現ではIPCが減少し神経細胞が増加した。従って、各遺伝子の高発現は未成熟な分化によるIPCの減少と幹細胞の枯渇を、両遺伝子の高発現は過剰なIPCの誘導による幹細胞の枯渇を惹起し異常な神経発生を誘導する事が示唆された。中枢・末梢神経系の発生に重要な転写因子HES1の機能を修飾するLmo3とHen2を高発現させたトランスジェニック(Tg)マウスを作製し解析したところ、中枢神経系の発生異常と水頭症が引き起こされた。従って、本Tgマウスは水頭症モデルとして重要であり水頭症の発症機構の解明につながると考えられる。水頭症の発生頻度は、Lmo3とHen2の両Tgマウスのhemizygoteでは野生型マウスに比較して有意に高く、両Tgマウスのhemizygoteを掛け合わせたダブルTgマウスでは100%が水頭症を発症した。発症した3週令マウスの脳の形態を検討したところ、大脳皮質の厚みが減少し脳室が拡大していた。両Tgマウスのhemizygoteでは、水頭症の主要な原因である中脳水道の狭窄が観察されたが、ダブルTgマウスでは観察されなかった。従って本Tgマウスの水頭症の原因は中脳水道の狭窄だけではなく、大脳の発生異常の可能性が示唆された。ダブルTgマウスの胎生18.5日では、大脳皮質および神経幹細胞が存在する脳室周辺の領域の厚みが減少していた。この大脳の異常は胎生13.5日では観察されなかった。胎生13.5日は幹細胞の増殖と神経発生が進行している時期なので、本Tgマウスでは大脳皮質の発生異常が生じ、その後水頭症が起っていることが考えられた。脳室周辺領域の厚みの減少は、神経幹細胞の分裂様式が対称分裂から非対称分裂に変化することによっても起るので、胎生13.5日の大脳皮質を神経細胞特異的な抗体で免疫染色したところ、野生型と比較してTgマウスで異常は観察されなかた。従って本Tgマウスでは、Lmo3とHen2が協調的に作用して神経前駆細胞の発生に干渉し、大脳における神経発生の異常を引き起こしていることが示唆された。大脳の発生異常については、Tgマウス胎仔脳の免疫染色等による解析により、順調に進展している。次年度に計画していた子宮内エレクトロポレーション法による、胎仔脳室への遺伝子導入の技術の習得はすでに進行しており、結果も出始めている。さらに本研究室が所有している、他の水頭症発症マウスの子宮内エレクトロポレーション法による解析でも同様の発症機構が示唆され、水頭症と神経発生異常との関連性の解明につながる可能性がある。一方で本Tgマウスでは、抹消神経系の異常の発症の前に大脳の異常が起り致死的であるため抹消神経系の解析は進行しなかった。中枢・末梢神経系の発生に重要な転写因子Hes1の機能を修飾するLmo3とHen2を高発現させたトランスジェニック(Tg)マウスは、水頭症モデルとして重要であり、その解析は水頭症の発症機構の解明につながると考えられる。昨年度までに本Tgマウスの水頭症の原因は大脳の発生異常の可能性が示唆されている。100%が水頭症を発症するダブルTgマウスでは、大脳皮質および神経幹細胞が存在する脳室周辺の領域の厚みが減少していた。幹細胞の増殖と神経発生が進行している時期である胎生13.5日で、大脳皮質を神経細胞特異的な抗体で免疫染色したところ、野生型と比較してTgマウスで異常は観察されなかった。そこで、大脳の神経前駆細胞であるradial glia cellsが非対称分裂をして生じる、神経細胞の前段階の細胞であるintermediate progenitor cells (IPC)について、そのマーカー蛋白質Tbr2に対する抗体で免疫染色して検討した。胎生12.5日と13.5日の大脳皮質では、野生型と比較してダブルTgマウスでIPCの有意な増加が観察された。このことをさらに検証するために、胎生13.5日の胎仔脳室へのエレクトロポレーション法によりLmo3とHen2を幹細胞で高発現させ、胎生14.5日の大脳皮質のIPCについて検討した。コントロールの胎仔脳に比較して、Lmo3とHen2を高発現させた胎仔脳ではIPCの有意な増加が観察された。従って、本Tgマウスでは、Lmo3とHen2が協調的に作用して、神経前駆細胞から過剰なIPCを誘導し、神経幹細胞の枯渇と大脳における神経発生の異常を引き起こしていることが示唆された子宮内エレクトロポレーション法による、胎仔脳室への遺伝子導入の技術を習得し、脳の発生異常を示唆する有意な結果を出す事ができた。この子宮内エレクトロポレーション法により更に解析を進めている。