hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
『新しい公共』とパブリック・セクターの役割に関する比較研究

3年目、最終年度として、これまでの研究成果を踏まえ、主として以下の3点を実施した。1)EUの政治的・経済的統合へのアジェンダが欧州各国およびそのサブナショナルな単位の政策に与える影響の分析。EUの政治的・経済的統合へのアジェンダが各国の政策に大きな影響を与えた経済・財政政策、市場における諸規制などについて、今年度は、国単位のみならず、サブナショナルな単位(広域自治体)における政策への影響を中心に調査した。2)国家以外の組職・機関が国民国家の政策に与える影響の分析。個別アクター分析を統括し、国民国家の変遷を考察する。超国家機構、多国籍企業、NGO、国家以外の組織・機関が個々の国民国家と社会、国家と国民との関係に与える影響を分析した。3)パブリック・セクターの機能の変化と国民国家との関係の分析行政経営改革の事例が国民国家に与えた影響を分析した。19年度は、イタリア、ドイツを中心として資料収集、関連機関ヒアリング等を実施した。イタリアについては中央省庁(内務省、内閣府、経済財政省)の他、行政高等学院、地方行政高等学院、中央=地方利害調整機関、地方出先機関、フリウリ・ヴェネツィア・ジュリア州、サルデーニャ州などの特別州においてヒアリング、実態調査を行った。日本については中央省庁(総務省、財務省)の他、宮崎県などの地方自治体でのヒアリング、実態調査を行った。ドイツについてはブランデンブルグ、ベルリン等へのヒアリング、資料収集を行った。これらの成果については、国際学会等にて6回の論文発表を行った。年度内に刊行されたものとしては、論文5本(邦文1、英文4を2書籍に章として分担執筆)、報告書2本にまとめた。現時点においては、海外学術誌で査読中の論文2本(英文)、書籍に分担執筆予定の論文1本(邦文)がある。
自己組織化セルラ-・ロボティクスにおける階層的知的制御方法に関する研究

現代のロボットは、一度設計製作されるとその形態を溶易に変更できないため、作業自体の多様化に対して、一つの形態すべての作業をこなすのに現界があると思われる。そこで、その解決のための一方策として、「セル」と呼ばれる単位機能素子からなり、動的再構成を行う事により形態を変化させる事ができる「自己組織化セルラ-ロボットシステム」を提案してきた。本研究では、セル自体はできるだけ単純な知識を有する事とし、これら多数のセルが統合・離散集合を繰り返す内に、自己組織化能力により情報通信及び学習を通して階層構造化可能な自己組織化セルラ-ロボットシステムについて研究を行う。特に「階層的知的制御方法」についてソフトウェアの面から研究する事を目的とした。本年度は自己組織化ロボットの個々の"セル"単体の構造と情報通信・制御ア-キテクチャについて具体的な実験用ロボットを想定し、情報量に基づく最適形態化と通信効率向上の研究を行った。具体的には、各種センシング・アクチュエ-タ,通信及び単純な知識保持機能を有する"セル"を想定し、複数のセルからなるネットワ-クシステムにある作業を行わせるときの最適通信形態の決定問題を考えた。その結果、各セル間の情報通信量(エントロピ-)を定義する事により、ある物理的制約条件下でエントロピ-を最小にする様な最適形態が存在し、階層構造により容易に準最適解が得られる事がわかった。また、ネットワ-ク内において、送信の必要性が高いセルにより多くの送信権を与える知的通信制御方式を提案し、これによりネットワ-クの通信効率が向上する事がわかった。以上は、階層的知的制御システムの有効性として、高速演算が可能なワ-クステ-ション上でシミュレ-ションを行う事により説明した。
一酸化窒素合成酵素のカルモジュリン、リン脂質、リン酸化による活性調節機構の解明

本研究では、nNOS,eNOS,iNOSの各アイソフォームのカルモジュリン結合ドメインに着目し、このドメインと酸性リン脂質、カルモジュリンなど各種エフェクターとの相互作用、リン酸化によるその調節機構を解明することを目的としている。また、NOSのリン酸化は、NO産生を調節する重要な機構の一つであるがその詳細は明らかでなく、各NOSアイソフォームのリン酸化解析が必要である。本年度は、各NOSアイソザイムのPKCによるリン酸化について明らかにした。血管内皮細胞型NOS(eNOS)では、大腸菌で発現させたeNOSはin vitroでPKCによりリン酸化された。部位特異的リン酸化抗体及び質量分析の結果からPKCによるリン酸化部位はカルモジュリン結合ドメインの中のThr497であることを同定した。ウシの血管内皮細胞から免疫沈降したeNOSは、リン酸化されたThr497を認識する部位特異的リン酸化抗体により反応し、さらにPKCのアクチベーターであるPMAによりその反応性が増加した。更に、eNOSの活性は、PKCによるリン酸化によりカルモジュリンと結合できなくなるため減少することが分かった。以上の結果から、eNOSの活性は細胞内でPKCによりnegativeに調節されていることが明らかとなった。同様に、神経型NOS(nNOS)についてもPKCによりリン酸化されることを示した。一方、誘導型NOS(iNOS)はPKCでリン酸化されず、別のキナーゼが関与していることが推測された。本研究では、nNOS、eNOS、iNOSの各アイソフォームのカルモジュリン結合ドメインに着目し、このドメインと酸性リン脂質、カルモジュリンなど各種エフェクターとの相互作用、リン酸化によるその調節機構を解明することを目的としている。本年度はその中で特にeNOSのCキナーゼによるリン酸化の活性調節機構について初めて明らかにできた。すなわち大腸菌で発現、精製したeNOSはCキナーゼで特異的にin vitroでリン酸化された。このリン酸化部位を明らかにするため、ある特定のリン酸化部位を認識できるような部位特異的抗リン酸化抗体を作製した。部位特異的抗リン酸化抗体を用いた実験よりカルモジュリン結合ドメイン内のThr497がリン酸化部位であることがわかった。また、このThr497のリン酸化はウシ大動脈血管内皮細胞を用いたin vivoの実験からも明らかとなり、細胞内においてCキナーゼによるこの部位のリン酸化が重要な役割を担っていることが示唆された。更に、このリン酸化の生理的な意義を調べるため、eNOSの活性に及ぼす影響を調べたところ、この部位のリン酸化によりeNOSの活性が減少することが分かった。そしてこの活性低下の原因として、Thr497のリン酸化によりカルモジュリンとの結合が阻害されたためカルモジュリンによる活性化ができなくなっていることが明らかとなった。このように、CキナーゼによるeNOSのカルモジュリン結合ドメイン内の特異的なリン酸化がその活性の負の調節に働いており、eNOSの活性調節機構の一つにリン酸化が大きく関与していることが明らかとなった。
気液界面近傍の液側乱流拡散におよぼす密度成層の影響-大気微量気体の海洋へのフラックス-

最近、ガス吸収の問題は地球温暖化問題と関連して注目を集めている。特に、温室効果気体の大気海洋間の交換過程はオーシャンフラックス問題と呼ばれ、海洋への二酸化炭素の吸収量の評価の不確定性はミッシングシンク問題と呼ばれている。本研究ではガス吸収において気液界面近傍の密度成層(安定、不安定成層)が液側乱流拡散および乱流構造におよぼす影響を水槽実験により明らかにし、これに対する乱流輸送モデルを構築することを目的とする。また、これを用いて、二酸化炭素の全球的なオーシャンフラックスを高精度で見積ることを目的とする。気液界面を通しての移動過程(交換過程)を詳細に調べるために、熱伝達実験を行った。これは、物質移動の場合に比べて温度分布の形成される層(温度境界層)の厚さが大きくなるためであり((Pr/Sc)^<1/21/3>倍)、これが本研究の特色であり、独創的な点もある。実験には、温水回流式の開水路(測定部:0.6mWx0.6mHx10mL、既設)とその上部を覆う風洞とからなる、いわゆる「風洞水槽」を用いた。本年度は不安定成層実験を行った。一定流量、一定温度の温水をヘッドタンクから開水路に流し、気液界面からの蒸発冷却より大きな上向きの熱流束を得て気液界面直下に熱対流を発達させ、種々の成層状態に対して、乱流構造の変化、自由表面近傍での乱流から波状運動へのエネルギーの授受とそれらに及ぼす密度成層の影響を調べた。密度成層乱流理論については、これまでレ-ノルズ応力、乱流熱流束方程式を基にしたクロージャーモデルを構築してきた。本研究では、このモデルを発展させて、気液界面の効果(界面が存在することによる圧力変動場の変形と乱流から波状運動へのエネルギーの授受)を表現できるモデルを構築した。また、二酸化炭素の全球的なオーシャンフラックスの見積りにあたって、その算定の基礎になっている大気-海洋間の二酸化炭素濃度の測定にかなりの不確定性のあることが判明した。これは、二酸化炭素の液中濃度が測定方式によって大きな差を生じていることに起因する。そこで、本研究では、液中濃度の測定システム(4槽バブリング方式気-液平衡器)とその校正方法を新たに開発した。これを基準に、他の測定方式のデータのドリフト、測定誤差範囲の推定とこれらによって得られた大気-海洋間の二酸化炭素濃度差の全球分布の見直しに着手した。本研究では、ガス吸収において気液界面近傍の密度成層(安定、不安定成層)が液側乱流拡散および乱流構造におよぼす影響を水槽実験により明らかにし、これに対する乱流輸送モデルを構築することを目的とする。

また、これを用いて、熱帯洋上で放散過程が卓越し(このとき液側は安定成層状態にある)、極地方(液側:不安定成層)吸収が卓越するといわれる、二酸化炭素の全球的なオーシャンフラックスを高精度で見積ることを目的とする。気液界面を通しての移動過程(交換過程)を詳細に調べるために、熱伝達実験を行った。これは、物質移動の場合に比べて温度分布の形成される層(温度境界層)の厚さが大きくなるためであり((Pr/Sc)1/2-1/3倍)、これが本研究の特色であり、独創的な点もある。実験には、温水回流式の開水路(測定部:0.6mWx0.6mHx10mL、既設)とその上部を覆う風洞とからなる、いわゆる「風洞水槽」を用いた。本年度は不安定成層実験を行った。一定流量、一定温度の温水をヘッドタンクから開水路に流し、気液界面からの蒸発冷却より大きな上向きの熱流束を得て気液界面直下に熱対流を発達させた。開水路全域で一様な流束分布を達成するため、開水路入口に金網を設け、底面は水流と同じ速度で働くベルトコンベア-を設けた。流れ方向、鉛直方向の速度変動の測定にはレーザードップラー流速計を、温度変動測定には15μm直径の熱電対温度計を用いた。これらを同時に測定し、信号はAD変換して光磁気ディスクに集録する。データ処理として、乱流強度、確率密度関数、パワースペクトル、コスペクトルを求め、また、条件付きサンプリングによるアンサンブル平均法を用いて、乱流構造の変化、乱流から波状運動へのエネルギーの授受とそれらに及ぼす密度成層の影響を調べた。密度成層乱流理論については、これまでレ-ノルズ応力、乱流熱流束方程式を基にしたクロージャーモデルを構築してきた。これは、壁面剪断流や自由剪断流に対して高精度で密度成層効果を予測できる。本研究では、このモデルを発展させて、気液界面の効果(界面が存在することによる圧力変動場の変形と乱流から波状運動へのエネルギーの授受)を表現できるモデルを構築した。最近、ガス吸収の問題は地球温暖化問題と関連して注目を集めている。特に、温室効果気体の大気海洋間の交換過程はオーシャンフラックス問題と呼ばれ、海洋への二酸化炭素の吸収量の評価の不確定性はミッシングシンク問題と呼ばれている。本研究ではガス吸収において気液界面近傍の密度成層(安定、不安定成層)が液側乱流拡散および乱流構造におよぼす影響を水槽実験により明らかにし、これに対する乱流輸送モデルを構築することを目的とする。また、これを用いて、二酸化炭素の全球的なオーシャンフラックスを高精度で見積ることを目的とする。これは、物質移動の場合に比べて温度分布の形成される層(温度境界層)の厚さが大きくなるためであり((Pr/Sc)^<1/2-1/3>倍)、これが本研究の特色であり、独創的な点もある。一定流量、一定温度の温水をヘッドタンクから開水路に流し、気液界面からの蒸発冷却より大きな上向きの熱流束を得て気液界面直下に熱対流を発達させ、種々の成層状態に対して、乱流構造の変化、自由表面近傍での乱流から液状運動へのエネルギーの授受とそれらに及ぼす密度成層の影響を調べた。
緑膿菌感染症の制御に向けた新戦略-線毛を標的としたワクチン療法の開発-

緑膿菌は易感染宿主において重要な病原体であり、その感染症の治療や予防法の開発は喫緊な課題である。本研究では緑膿菌線毛蛋白ペプチドにおける樹状細胞を介したワクチン効果の検討を行った。断片化した緑膿菌線毛蛋白の合成ペプチドではアミノ残基101-120残基のペプチドが樹状細胞(Jaws-II)からのIFN-γやIL-12の産生を亢進させた。その他の12種類の合成ペプチドではサイトカインの産生亢進を認めなかった。さらにこのペプチドは樹状細胞の成熟化を促していた。しかしながら、同ペプチドで刺激した樹状細胞とナイーブTリンパ球の混合培養ではリンパ球の増殖やリンパ球からのサイトカイン産生は認めなかった。混合培養時の樹状細胞比をさらに大きくするなど、今後もさらに詳細な検討を進めていく必要がある。緑膿菌PAO1株の線毛蛋白143アミノ残基を断片化し、20アミノ残基よりなる合成ペプチド13種(P^<1-20>、P^<11-30>、P^<21-40>、P^<31-50>、P^<41-60>、P^<51-70>、P^<61-80>、P^<71-90>、P^<81-100>、P^<91-110>、P^<101-120>、P^<111-130>、P^<121-143>)を合成した。これらのペプチドは緑膿菌線毛蛋白の全アミノ酸配列を網羅し、各々が10残基づつ重なるように設計し、作成を行った。また、これまでに我々が報告している濃度勾配サッカロース超遠心およびSDSポリアクリルアミドゲルより蛋白を精製する方法により、精製線毛蛋白を緑膿菌PAO1株より抽出した。これらの精製線毛蛋白または合成断片化線毛ペプチドを用い、マウス樹状細胞への刺激を行う予定としている。樹状細胞樹立については、8週齢雌Balb/cマウス骨髄より骨髄細胞を採取し顆粒球マクロファージ刺激因子を添加して培養し、前述した精製線毛蛋白および合成ペプチドによる刺激を行っている。今後は得られた細胞が樹状細胞であるかどうかをフローサイトメトリー法を用いてCDllc陽性であるかどうかを確認する予定である。また以前の研究ではマウス肺内での線毛蛋白あるいは断片化ペプチドの炎症誘導能を検索し、ペプチドの一部に軽度ではあるものの炎症誘導能を認めていた。今回はヒトの気道上皮細胞(BEAS-2B)を用いてin vitroにおける炎症誘導について検討を行っている。こうした検討を行うことで、最終的な本研究の目標である線毛蛋白の断片化ワクチン候補の決定の参考になるものと思われる。昨年度作成した緑膿菌PAO1株の線毛蛋白143アミノ残基を断片化した合成ペプチド13種(P1-20、P11-30、P21-40、P31-50、P41-60、P51-70、P61-80、P71-90、P81-100、P91-110、P101-120、P111-130、P121-143)を用い、ヒトの気道上皮細胞(BEAS-2B)でのin vitroにおける炎症誘導能について検討を行った。いずれのペプチドにおいてもIL-8などのサイトカインの産生を認めなかった。また8週齢雌Balb/cマウス骨髄より骨髄細胞を採取し、顆粒球マクロファージ刺激因子を添加して培養した。この細胞がCD11c陽性であるかどうかをフローサイトメトリー法を用いて確認したところ、CD11cを発現した細胞は少なく十分な樹状細胞を得ることができなかった。そこでマウス骨髄由来の樹状細胞cell lineであるJaws II細胞を入手した。入手した細胞が樹状細胞としての機能を有しているかを検討するために、LPSで細胞を刺激し、TNF-α産生の有無について検討したところ、その産生を認めていた。さらにIL-12の産生能についても検討を行っている。また刺激後の各種細胞表面マーカー発現(MHC class I、MHC class II、CD80、CD86、CD40)について、フローサイトメトリー法を用いて現在検討を行っている。

本細胞が樹状細胞としての機能を有することが確認されれば、精製線毛蛋白による刺激や上記合成ペプチドによるJaws II細胞に対する刺激を行い、表面マーカの発現やサイトカインの産生について検討を行い、刺激した樹状細胞のマウスへの移入によるin vivoでのワクチン効果の検討を行う予定である。こうした検討を行うことで、当初予定した本研究の目標である線毛蛋白の断片化ワクチン候補の決定が可能であると思われる。これまでに作成した緑膿菌PA01株の線毛蛋白143アミノ残基を断片化した合成ペプチド13種(P1-20、P11-30、P21-40、P31-50、P41-60、P51-70、P61-80、P71-90、P81-100、P91-110、P101-120、P111-130、P121-143)を用い、マウス骨髄由来の樹状細胞cell lineであるJaws II細胞を刺激し、樹状細胞より産生されるTNF-αおよびIL-12を定量した。さらに刺激した樹状細胞の成熟化を検証するために各ペプチドで刺激後の細胞マーカー発現(MHC class II、CD40)をフローサイトメトリー法にて検討を行った。その結果、陽性コントロールであるLPSあるいは緑膿菌PA01株全菌体の破砕検体での刺激群ではサイトカインの産生亢進や樹状細胞におけるMHC class II、CD40の発現増加を認めていた。一方で緑膿菌線毛ペプチド抗原ではP101-120のみでTNF-αの産生量増加とMHC class II発現の増加を認め、その他の12種類のペプチドではこうした変化は認めなかった。これらの結果から緑膿菌線毛蛋白の抗原提示にはP101-120が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。さらに樹状細胞をP101-120で刺激後、細胞をホルマリン固定し、C57BL/6マウスの脾細胞から磁気ビーズ(CD4^+、CD62L^+)法でT細胞を分離後、共培養を行った。培養24、48、72、96時間後の培養上清中のIFN-γ、IL-10濃度を検討したが、その上昇は認めなかった。またBrdU法を用いて48時間後のT細胞の増殖を検討したが、T細胞の明らかな増殖は認めなかった。しかしながらこうした結果は陽性コントロールである緑膿菌PA01株全菌体の破砕検体においても認められておらず、さらなる検証が必要である。
赤外分光法による孤立気相状態における分子内水素結合の研究

本研究の目的は近年開発された孤立気相分子・クラスターに対する赤外分光法を分子内水素結合を持つ化合物に適用し、OH伸縮振動の観測により孤立条件下における分子内水素結合の様相を明らかにするとともに、クラスター形成によるその変化を溶媒和との関連において微視的に理解することである。研究対象には分子内水素結合をもつ代表的な分子であるトロポロンを選び、単体に加えてトロポロン-水、-メタノールクラスターのOH振動領域赤外スペクトルを超音速ジェット中の孤立気相状態で観測した。トロポロン単体の赤外スペクトルにはOH振動は観測されず、これは分子内水素結合の影響であると考えられる。水及びメタノールとのクラスターはともに溶媒分子による強いOH振動バンドを示すが、小サイズのクラスターでは依然としてトロポロンのOH振動はスペクトルに現れず、溶媒分子との水素結合形成にも関わらず、分子内水素結合が保持されているものと解釈された。水が3分子、メタノールでは2分子が付着すると、トロポロンのOH振動バンドが現れ始め、分子内水素結合が切れて分子間のそれへと変化していることが分かった。これは水溶液中におけるトロポロンの弱酸性がこのサイズの溶媒和で発現し始めていることを示している。
細胞質分裂を制御する新たなシグナル伝達経路の解明

IQGAP3による細胞質分裂制御に関わる直接のエフェクターとしてAnillinを同定した。AnillinとIQGAP3は直接結合し、分裂期細胞の分裂溝で共局在した。そしてIQGAP3はAnillinの局在を制御することで細胞質分裂を制御していることを明らかにした。またIQGAP1はAnillinとは結合せず分裂溝への局在も認められなかったが、IQGAP3とは異なる分子メカニズムで細胞質分裂に関与することを明らかにした。IQGAP1,3のノックアウト細胞を新たに作成し表現型の検討中である。IQGAP3の新規結合因子を同定し、その機能解析を行なっている。現在のところ、本研究計画の前段階であるIQGAP3の細胞質分裂への関与を明らかにした論文がまだ受理に至っておらず、そのリバイス実験のために実験計画段階で予定していた実験の多くに未だ手が付けられないでいる。現在はまず論文の受理に向けて全力で取り組んでおり、受理され次第、速やかに本課題の研究に取り組んでいきたいと考えている。課題1のIQGAP3のエフェクターの同定に関しては、現在までに確からしい分子の同定に成功しており、そのIQGAP3との分子間相互作用の制御・機構などの詳細について解析中である。またその分子のRNAiによる表現型をIQGAP3のそれと比較検討し、両分子間の機能的関連性についても注意部深く検討している。課題2のIQGAP3のノックアウト細胞の作製に関しては現在までに全く手を付けられていない。課題3の組換え蛋白質の作製については、現在までに様々な工夫を重ねてきたが、哺乳類細胞を用いた発現方法では、発現量の少なさと精製純度低さの問題を改善することができていない。そこで現在は代替手段として比較的多くの発現量の得られる昆虫細胞の発現系を用い、使用するタグの変更などのコンストラクト面での改良や、結合分子との共発現によって発現分子の安定化を試みるなどの発現系の改良などを行うことで、これまで満足な成果の得られていなかった発現分子の質の問題に改善が見られないかを検討している。課題4の新規細胞質分裂制御因子の解析については、現在のところ全く手が付けられていない。IQGAP3による細胞質分裂制御に関わる直接のエフェクターとしてAnillinを同定することに成功した。この分子はまたIQGAP3の分裂溝への局在を規定していることも明らかになり、IQGAP3の上流因子としても下流因子としても機能する興味深い性質を持っていた。これらの結果を本年度論文に発表した(Adachi et al. (2014) GenesCells 19:803-820)。Anillin以外にも分裂期においてIQGAP3と結合する機能未知の分子を複数同定しており、昨年度までにそれらの中に細胞質分裂に機能的に関与する分子が複数存在することが明らかになっていた。現在までのところこれらとIQGAP3との間にどのような機能的な関連があるのかは明らかに出来ていないが、その作用機序について現在鋭意解析を進めている。IQGAP3の機能をより明確にするため、IQGAP3遺伝子ノックアウト細胞の作製を計画していたが、当初の相同組換えによる方法から変更してCRISPR/Cas9の系を用いることでその作製に成功した。現在この細胞について詳細に表現型の解析を進めている。組換え蛋白質の発現精製については、昆虫細胞を用いて一部のコンストラクトの発現精製に成功した。しかし一部必要な機能ドメインについて未だ適切な分子を得るには至らず、結合分子との融合蛋白質をデザインするなどの工夫を試みている。IQGAP3と癌との関連について、現在のところ十分な解析が進められていない。これに関連して、本年度他の研究グループより肺癌とIQGAP3の機能的関連を示唆する報告がなされたが、現在我々はまだその検証などを行なえていない。CRISPR/Cas9のシステムを用いてIQGAP3およびIQGAP1のノックアウトHeLa細胞を複数株樹立し、それらの細胞質分裂過程における異常を検討している。しかし細胞株ごとの表現型に非常に大きなばらつきがあり、各分子の機能を正確に記述できない状況である。現在あらためて各ノックアウト細胞における遺伝子の変異導入の性状を確認し直しているが、併せて異なる細胞種でのノックアウト細胞株の作製も並行して進めている。分子間相互作用の検討および機能解析に必要なIQGAP3の様々なドメインの組換え蛋白質の発現精製を行なっている。昆虫細胞発現系を用いた条件検討の結果、MBPなどの可溶性タグを付加することで十分な発現量を得ることができたドメインがあった一方、様々な改良を試したにもかかわらず全く発現の得られないドメインもあった。現在前者については生化学的解析を進めている。なお、哺乳類細胞発現系も検討していたが、遺伝子導入法の問題(発現量が不安定・高額の費用が必要・など)および低発現量の問題を克服できなかった。IQGAP3と結合し、かつ細胞質分裂への機能的関与が示唆されていた複数の因子について解析を行なったが、いずれもIQGAP3による細胞質分裂制御との機能的な関連性は明らかにできていない。ただ、うち一つの因子について、細胞質分裂とは異なる側面での機能的な関連が疑われたことから、現在その解析を行なっている。IQGAP3と癌との関連については、十分な解析を進めることができなかった。

そしてIQGAP3はAnillinの局在を制御することで細胞質分裂を制御していることを明らかにした。またIQGAP1はAnillinとは結合せず分裂溝への局在も認められなかったが、IQGAP3とは異なる分子メカニズムで細胞質分裂に関与することを明らかにした。IQGAP1,3のノックアウト細胞を新たに作成し表現型の検討中である。IQGAP3の新規結合因子を同定し、その機能解析を行なっている。IQGAP3のエフェクターの同定およびその作用機構の解析、ノックアウト細胞の作製などは行なえたが、新規因子群の機能解析が十分に進められていない点、またIQGAP3と癌との機能的関連性について殆ど全く解析に手が付けられていない点などから、研究計画全体としてはやや遅れ気味であると判断した。細胞生物学癌との関連については、共同研究者の協力を得るなどし、可能な限り速やかに研究の進捗度を上げていきたい。前述したように、現在のところ研究計画の前段階であるIQGAP3の細胞質分裂への関与を明らかにした論文の受理に至っておらず、計画していた実験の多くに未だ手が付けられていない状態である。また課題3については、克服すべき問題点が当初予想していたよりも困難なものであることがわかり、代替手段の検討をせざるを得ないという現状がある。当初の計画よりも研究の遂行に遅れが生じているため。まずは研究計画の前段階である論文の受理を速やかに実現するために全力を尽くす。その上で、現状全く手つかずの課題2と4については特に力を入れてその遂行に努める。また特に課題3については、計画当初の哺乳類細胞発現系について、他機関の研究者に協力を仰ぐなどし、その実現の可能性をさらに探る。本年度遅れた分の研究を、来年度には当初から予定の研究と併せて進めていく予定である。先に述べた理由で本年度の研究の進行が当初の計画よりも遅れたため、結果として本年度に使用した助成金が当初の予定よりも少なくなってしまった。来年度は本年度遂行することの出来なかった研究を、当初予定の本年度分の研究と併せて進めていく予定である。
脂質ラフト構成分子の探索と自己免疫疾患におけるその異常

脂質ラフトは細胞膜上の機能微小ドメインであり情報伝達の起点として注目されている。種々の受容体はリガンド結合時に脂質ラフトに会合するがその機構は不明である。申請者はFc受容体の脂質ラフトとの会合が、従来もっとも上流の情報伝達事象と考えられていたSrc family kinase動員のさらに上流事象である事を見いだし、脂質ラフトの空間的融合がSrcfamily kinaseの相互活性化をもたらす機構を提唱した。またマスト細胞の重要な活性化受容体であるc-Kitを介する細胞運動にSrc family kinaseが必須の役割をはたすことを見いだした。さらにSLEに連関する抑制型Fc受容体FcγRIIB膜貫通部多型の機能解析を行い、同受容体が脂質ラフト移行の障害を呈しその免疫細胞活性化抑制機能が弱く、自己免疫発症の原因となりうることを示した。脂質ラフト移行に異常がある疾患連関受容体の報告はこれまでに無く、SLE発症の分子基盤、ならびに受容体の脂質ラフト移行のメカニズム解明に重要な知見と考えられる。また、Src family tyrosine kinase (SFK)の新たな活性調節機構解明、運動および極性形成に重要なその細胞内再分布の機構解明を目的としてSFK SH2-SH3をbaitとする2-hybrid cloningを行いポリプロリン配列及びRING finger様を持つ新たな微小管会合分子(仮にPPRと呼ぶ)を単離した。同分子は細胞の遊走方向に配向する微小管上に存在し、しかも安定化アセチルチュブリンと今日局在することから、安定化微小管をマークする新規分子であること、あるいは微小管の方向性を持った安定化を促進する新規調節分子であることが強く示唆された。抗原受容体架橋に続く細胞内シグナル発生がSrcfamily kinase(SFK)によって媒介される事は知られているが、SFK動員の機構は不明である。近年、架橋抗原受容体α鎖が細胞膜微小ドメイン、脂質ラフトに移行する事が観察され、ラフトの受容体初期反応への関与が注目されている我々は受容体シグナルが受容体架橋-脂質ラフトの空間的融合-SFKの近接と相互活性化の順に生じると考え、この仮説を支持する証拠として、ラフトに常在するSFK分子種のみがFe受容体シグナルを伝達する事、受容体架橋によるラフトの空間的融合がSFK活性の上流事象である事を示した。SFK活性化の新規機構を探索するためにLyn-SH3ドメインに会合し、Lyn活性化を惹起する2つの新規分子を同定した。1つはポリプロリン配列及び微小管会合に働くRINGドメインを持ち、微小管から遊離するとNF-AT活性化を生じる。抗原受容体反応における同分子の関与を解析中である。SLEに連関する抑制性受容体FcgammaRIIb多型の解析を行い、同多型のラフトへの分配が低下しておりB細胞受容体反応抑制が減弱している可能性を見いだした。

また、Src family tyrosine kinase (SFK)の新たな活性調節機構解明、運動および極性形成に重要なその細胞内再分布の機構解明を目的としてSFK SH2-SH3をbaitとする2-hybrid cloningを行いポリプロリン配列及びRING finger様を持つ新たな微小管会合分子(仮にPPRと呼ぶ)を単離した。同分子は細胞の遊走方向に配向する微小管上に存在し、しかも安定化アセチルチュブリンと今日局在することから、安定化微小管をマークする新規分子であること、あるいは微小管の方向性を持った安定化を促進する新規調節分子であることが強く示唆された。
生体関連分子および新規合成物質の超高速過程の時間分解分光による研究

フェムト秒アップコンバージョン分光法を用いて以下の研究を行った。【1.緑蛍光タンパク発色団分子の高速光ダイナミクスの研究】緑蛍光タンパクGreen Fluorescenc Protein (GFP)は蛍光顕微鏡による細胞構造研究において最も重要な蛍光プローブタンパクである。よってその物理化学性質を知ることは大変重要であるが、GFPはもちろん、GFPの発色団分子の光化学すらよくわかっていない。そこで、化学合成されたGPF発色団分子の蛍光ダイナミクスをフェムト秒時間分解測定した。昨年度研究したアニオン型に加え、本年度は中性型発色団を取り上げ、その励起状態のフェムト秒ダイナミクスを明らかにした。【2.ミセル中の溶媒和ダイナミクスの研究】ナノ空間の溶媒和ダイナミクスはバルクの溶媒和ダイナミクスと大きく異なっていることが知られている。特にミセルにおいては数百ピコ秒の時定数をもつ遅い溶媒和ダイナミクスがあり、興味を集めている。そこで、フェムト秒領域の蛍光ダイナミックストークスシフトを観測し、フェムト秒ナノ秒にいたるミセル中の溶媒和ダイナミクスの全貌を明らかにした。【3.トランス型レチナールの二光子励起蛍光ダイナミクスの研究】視物質の発色団として有名なレチナール分子の励起状態ダイナミクスには三つの励起状態がかかわっており未だ不明な点が多い。そこで二光子励起を用いて、通常では効率的に光励起できないAg状態へと分子を励起し、その後のフェムト秒緩和ダイナミクスを観測することに成功した。これは二光子励起でフェムト秒蛍光時間分光測定を行ったはじめての例である。これらの研究についてすでに2報の原著論文を著し、またさらに2報の論文を現在準備中である。また国内・国際学会において研究発表を行った。
パラメタ値学習モデルの知見を活用した生得的な文法原理への接近

言語理論において、母語話者が身につけている文法原理には生まれながらにして学習者に備わっている部分があるという主張がある。「刺激の貧困」の手法は、その生得的知識を、その学習者が経験する言語データと成人母語話者の文法の差分から推定しようとする研究手法である。同手法は、誤った仮説で、学習者が経験するデータだけからは誤っていることが分からないような仮説を見出し、その仮説を原理的に排除できるような初期状態を提案することで、文法の生得的知識を解明しようとする。本研究は、パラメタ設定の分野で用いられる学習モデルの手法を活用して「刺激の貧困」の手法を洗練し、適用範囲を拡大することを目指す。
紫外レーザー光による有機非線形材料表面への光導波路の形成

有機線形材料は、概して耐久性に乏しく、加工性が悪い。そこでこの材料の表面のみを選択的に改質すれば、材料内部の特性は保持したまま、表面だけに機能性を付与することができる。これら光化学的改質を、有機非線形材料に適用し、ホログラフィク露光法をに応用し、干渉によって強め合って部分のみで光分解を起こさせ、そこに所望の原子団を置換することによって、従来線刻によって構成されていた回折格子を、屈折率、吸収率あるいは反射率の異なる格子を構成させる事が出来る。これは導波路として用いれば、エバネセント波による波長変換SHGを作ることが可能である。そこで本年はエキシマレーザーやエキシマランプを用いて、光化学的にPMMAやポリイミドに官能基の微細パターンを置換させることに成功した。1.ArFエキシマレーザーを用いたPMMA表面へのNH2基の置換PMMAと合成石英ガラス窓の間には毛細管現象を利用してアンモニア水を密着させ、この石英ガラスから、エキシマレーザー光を入射する。またPMMA板と合成石英ガラス窓の間には約50μmのアンモニア水(濃度28%)の薄液層を形成させ、入射されるエキシマレーザー光でアンモニア水とPMMA表面を同時に光励起した。この光処理をKrFレーザーで行った場合はOHのみが置換され、ArFレーザーの場合はNH2とOHが置換される事が明らかに成った。一方アンモニア水はArFレーザー光ではNH3そよびH20の療法を光分解出来るが、KrFレーザー光ではNH3は分解できず、その結果としてArFレーザー照射のみNH2基が置換されるものと考える。2.Xe^★2エキシマランプを用いたポリイミド表面へのOH基の置換ポリイミドフィルム上にまたはメチルアルコールを滴下し、合成石英窓を被せ、試料と窓との間に毛細管現象により薄液層を形成する。この窓面にヘッドオン型エキシマランプを密着させ、172nmの真空紫外線光を照射すると、水を用いた場合12分の照射で、またメチルアルコールの場合は3分で、水との接触角が未処理の63°から20°に改質されることがわかる。またいずれの場合とも、処理面のATR-FTIR分光で3300cm-1にOHの吸収が確認されている。
神経分化を制御する転写因子HES-1の遺伝子欠失マウスの解析

哺乳動物の神経分化機構を明らかにする目的で、ヘリックス・ループ・ヘリックス(HLH)型転写因子HES-1を同定し、神経分化における役割を解析してきた。我々は、今までに、HES-1は正の神経分化因子Mash-1に対してドミナント・ネガティブな作用を示し、神経分化を抑制することを明らかにしてきた。今回、さらにHES-1ノックアウトマウスを作製し、loss-functionの解析を行ったので以下に報告する。HES-1ノックアウトマウスでは、胎生9.5日目頃から頭部神経管閉鎖不全がおこり、open brainになった。その後、神経細胞死がおこり、やがて無脳症に至った。免疫組織学的解析を行ったところ、HES-1ノックアウトマウスではニューロフィラメントおよびL1接着因子陽性のニューロンが正常よりも早く出現しており、神経分化が早く進行することが示された。HLH型神経分化因子Mash-1の発現をしらべたところ、正常よりも早く、しかも高レベルな発現が見られた。以上の結果から、HES-1欠損によりMash-1活性が強まり神経分化が正常よりも早く進行すること、おそらくそのために頭部神経管閉鎖不全がおこることが示唆された。同様に、網膜においても神経分化が早く進行しており、正常な層構造が維持できずに、異常なロゼット構造を形成した。以上の結果から、脳や網膜の形態形成には、HES-1のような神経分化抑制因子が非常に重要な役割を担っていることが明らかとなった。従って、正常な神経発生には、Mash-1のような正の神経分子因子とHES-1のような神経分化抑制因子がバランスよく機能することが重要であるといえる。
ヒト核内受容体すべてをスクリーニング可能な万能蛍光トレーサーの開発

遺伝子の転写因子である核内受容体はホルモン等のリガンドが結合することによって活性化され、標的遺伝子の転写を促進する。一方、内分泌撹乱物質はこれらの核内受容体に結合して受容体応答を無秩序に誘起、あるいは遮断する。このため、ヒト核内受容体48種全てに対する特異的な結合を評価するための「受容体結合試験」の実施が必要である。受容体結合試験には標準化合物として、放射標識化合物が一般的に適用されている。一方、近年では蛍光標識化合物を用いる受容体結合試験も確立された。核内受容体に関する研究が進展するなか、最近になって、複数の受容体に結合する「非選択的リガンド」が見られるようになった。そこで、こうした化合物を結合核として蛍光標識化合物が調製できれば、多くの受容体に適用可能な万能型の受容体結合試験のトレーサーとすることができるのでは?との可能性を着想するに至った。そして、複数の核内受容体に結合するビスフェノールC(BPC)を蛍光標識した万能型トレーサー候補化合物を合成し、ERをはじめとする核内受容体の競合結合試験系の確立を試みた。前年度にはBPCを蛍光標識した7種類の蛍光プローブの合成を実施した。合成した蛍光プローブの核内受容体への結合親和性を調べたところ、ERαとERβに強く結合したが、ERRγおよびCARに対する親和性は著しく低下していた。そこでERに対する結合試験の構築を試み、メチレン数n=6のリンカーを持つプローブをトレーサーとして試験の条件設定に成就した。この試験系は非常に高感度であり、かつ専用の設備・施設を必要としない簡便性に優れた試験法として確立することができた。これは核内受容体に対する新規な内分泌撹乱化学物質探索のための簡便かつ迅速な試験法として非常に有用である。また、ERRγおよびCARに対してもプローブの改良によりこの試験を適用できる可能性が示された。核内受容体は細胞核に存在し、リガンドが結合することで活性化されて遺伝子の転写を調節するタンパク質である。核内受容体は現在、創薬の重要なターゲットであり、核内受容体に対する種々の化合物の結合親和性の網羅的な調査は緊急に解決されるべき課題である。核内受容体と化合物の結合親和性を調べる方法としては放射標識トレーサーを用いる結合試験が汎用されているが、放射標識トレーサーの取り扱いに特殊な施設・設備を必要することや高額であることなどが問題となっている。こうした中、当研究室では内分泌撹乱物質・ビスフェノールAの類縁体であるビスフェノールCが複数の核内受容体に結合することを明らかにした。そこで、この化学物質を蛍光標識すれば多くの核内受容体の結合試験に適用可能な万能の標準物質・トレーサーとして使えると考え、その合成と試験系の確立のための研究に着手した。本年度はビスフェノールCを結合核とする蛍光トレーサー候補化合物の合成と核内受容体ERに対する結合親和性の評価を行った。ビスフェノールCの片方のヒドロキシル基に様々な長さのアミノアルキル基を導入し、末端のアミノ基を蛍光標識することで、長さの異なるリンカーを有する7種類のリガンドの合成に成功した。合成した蛍光トレーサー候補化合物の核内受容体ERαおよびERβに対する結合親和性を測定したところ、ほとんどのリガンドがIC_<50>値10nM以下の非常に強い結合親和性を示した。現在、これらのリガンドをトレーサーとする蛍光による結合試験系の確立を行っている。一方、他のトレーサー候補の探索の結果、核内受容体RXR、LXRのサブタイプ計5種類に強く結合するビスフェノールA類縁体を新たに発見した。そこで、その化合物をもとにした蛍光リガンドの合成も行った。合成したリガンドは核内受容体RXRに強く結合することが判明し、新たな蛍光トレーサーとなりうることが判明した。

これは核内受容体に対する新規な内分泌撹乱化学物質探索のための簡便かつ迅速な試験法として非常に有用である。また、ERRγおよびCARに対してもプローブの改良によりこの試験を適用できる可能性が示された。本研究の前に合成していた蛍光りガンドを基盤としたトレーサーの改良に成功した。まず、複数の受容体に結合するビスフェノールCを基本骨格とするリガンドの合成法を確立し、トレーサー候補となる7種類のリカンドの合成を達成した。合成リガンドは予測通り核内受容体に非常に強く結合した。以上より、1年度目の目標であったリガンドの合成・核内受容体のERへの結合親和性測定を達成でき、予定通りの進捗状況であるといえる。これまでに合成した蛍光トレーサー候補化合物を用いて、核内受容体ERに対する蛍光による結合試験系を構築する。そして、構築した蛍光による試験系を用いて約500種類の化合物に対する結合親和性を測定し、放射標識化合物をトレーサーとした場合の結果と比較し同等の試験系であることを確かめる。さらに、トレーサーと受容体が結合することによる蛍光強度の増加を定量化し、ERαについて活性炭を用いたB/F分離操作の不要な「混ぜるだけ結合試験法」を確立する。その結果が問題なければ、随時他の受容体にも拡張・展開して核内受容体の蛍光による試験系を完成させる。
地表面排水の圃場外流出を抑制する赤土流出防止対策の開発

ウッドチップを充填した浸透トレンチによる赤土流出防止対策を開発した.実験期間中の降雨条件下において圃場外への赤土流出量は70%以上削減され,高い対策効果が認められた.試験地の土壌条件下において浸透トレンチの貯水は速やかに地下浸透するため,浸透トレンチの貯水は作物栽培に影響しないと考えられた.浸透トレンチの維持管理や営農作業を考慮すると,圃場の末端部のみに大容量で設置する方がよいと考えられた.ウッドチップを充填した浸透トレンチによる赤土流出防止対策を開発した.実験期間中の降雨条件下において圃場外への赤土流出量は70%以上削減され,高い対策効果が認められた.試験地の土壌条件下において浸透トレンチの貯水は速やかに地下浸透するため,浸透トレンチの貯水は作物栽培に影響しないと考えられた.浸透トレンチの維持管理や営農作業を考慮すると,圃場の末端部のみに大容量で設置する方がよいと考えられた.地表面排水の圃場外流出を抑制する赤土流出防止対策として,ウッドチップを充填した浸透トレンチを用いる土中排水法を考案した.本研究では,土中排水法の効果の実証および実用化のための最適な配置形態の検討を目的とする.本年度の主な研究実績は試験地の造成および試験地造成後に実施された土中排水法の効果の検証である.具体的な研究実績は以下のとおりである.1.琉球大学付属フィールド科学センターの農場内に試験地を造成した.試験地は斜面長30m,斜面幅1mおよび斜面傾斜4.5%の斜面6つから成る.試験区として,5つの斜面にウッドチップを充填した浸透トレンチを設置した.のこりひとつの斜面には浸透トレンチを設置せず,この斜面を対照区とした.試験区と対照区の末端にタンクを設置して,降雨時の表面懸濁排水を回収できるようにした.浸透トレンチとタンクに水位計を取り付けて,降雨時の水位変動を連続計測した.以上のように造成した試験地を自然降雨下での実験に供試した.なお,当初計画では斜面にサツマイモを栽培して実験に供試する予定であったが,試験地の造成に時間がかかったため,サツマイモの栽培を断念した.裸地状態での実験を実施して,初期条件的な実験データを得ることとした.2.試験地完成直後の2009年12月下旬以降から実験データを得ることができた.その結果,試験区の地表排水量や土砂流出量は対照区より小さく,ウッドチップを充填した浸透トレンチの効果を実証することができた.また,複数箇所に小容量ずつ配置した方が効果が高いことがわかった.3.実験データを用いて水分動態モデルを改良し,浸透トレンチ内の水位変動をモデルで再現した.試験地は地下水位が高いことが特徴で,水分動態モデルに地下水位の影響を取り入れることが今後の課題となった.ウッドチップを充填した浸透トレンチの赤土等流出防止対策効果を検証し,その対策効果を客観的に評価した.また,水分動態をより詳細に調べるため実験圃場の一部を再造成した.具体的な研究実績は以下のとおりである.1.前年度の実験結果はデータのばらつきが比較的大きいと考えられたため,実験結果の再現性を確かめる必要があると判断した.そこで,同じ実験条件のもとで2010年5月から7月にかけての6つの降雨を使って第2期の実験を行った.なお,同じ条件の実験を繰り返したため本年度もサツマイモの栽培を断念した.2.対策区の流出水量と流出土量は非対策区より少なく,ウッドチップを充填した浸透トレンチが効果的な発生源対策であることを再確認することができた.3.30cm区と90cm区の流出土量と流出水量を比較した結果,90cm区の方が流出量は少なかった.また降雨中の浸透トレンチ内部の空き容量を調べると,30cm区より90cm区の方が空き容量は大きかった.これらのことから,浸透トレンチの容量が大きいと対策効果も大きく,これは浸透トレンチの空き容量が大きいことによる貯留効果のためであると考えられた.4.45cm×2個区と30cm×3個区の流出水量と流出土量は90cm区より少なかった.また降雨中の空き容量は45cm×2個区と30cm×3個区のほうが90cm区より大きかった.浸透トレンチを分散配置すると斜面長が短くなるため侵食土量そのものを抑制できることと,分散することによる浸透効果の増大が空き容量を増大させることが,分散配置の対策効果増大に寄与したと考えられた.5.ウッドチップを充填した浸透トレンチのUSLE保全係数は0.10.3であり,従来の赤土流出防止対策と比較して小さかった.6.地下水位の影響が水分動態に大きな影響を与えていたため,地下水位の影響が比較的少ない場所にひとつの対策区を再造成した.地下水の影響をできるだけ含めないようにして浸透トレンチ周辺の水分動態を調べるため,地下水位が最も低い部分に再整備した対策区(90cm区)を使って,ウッドチップを充填した浸透トレンチの赤土等流出防止対策効果を検証した.研究実績は以下のとおりである.(1)対策区の流出水量と流出土量は非対策区より少なく,ウッドチップを充填した浸透トレンチが効果的な発生源対策であることを改めて確認することができた.(2)実験条件下では,幅1m x長さ30mの圃場に対して,幅1m x長さ1m x深さ1m程度の浸透トレンチが最適であると考えられた.

(3)浸透トレンチの貯水位の経時変化を解析した結果,降雨後,貯水位は速やかに低下することがわかった.このことから,試験地の地下の土層が有する浸透能を条件とした場合,浸透トレンチの貯水は速やかに地下浸透しているといえ,浸透トレンチ周辺の作土は水分過多の状態になりにくいと考えられた.したがって,作物栽培試験を実施することなく,本試験地の条件下においては,浸透トレンチの貯水が作物栽培に与える影響はほとんどないと結論した.沖縄地方には不透水性土層が分布している地域もあることから,そのような地域における検証が今後の課題である.(4)分散配置した浸透トレンチは幅が狭いため,比較的短期間のうちに表面全体が侵食土で覆われて目詰まりしてしまうことが外観の経過観察より確認された.維持管理を容易にすることを考慮すると,対策効果は少し低下するが,圃場の末端にのみ設置する方がよいと考えられた.(5)浸透トレンチの直上流部に設置したフィルター(ススキ葉などの植物残渣)で砂礫分を除去することによって浸透トレンチの目詰まりを抑えることができた.このことから,グリーンベルトの直下に浸透トレンチを設置するといったような複合型にすると浸透トレンチの機能を長期に維持できると考えられた.
新規ヘテロクロマチン関連タンパクMeteorの同定とそれによる動原体の構築の研究

ショウジョウバエのmtr^2突然変異体では、動原体部分で染色体の切断が頻度高く観察されることから動原体部位の構造が脆弱になっていると考えられる。この突然変異はIn(1)w^<m4>における遺伝子発現の抑制を解除することからmtr^2突然変異体において変異をおこしている遺伝子がヘテロクロマチンの構成タンパクをコードしており、この遺伝子の変異により、ヘテロクロマチン量が減少して動原体部位の構築が影響を受けたと考えられた。mtr^2変異体の細胞は姉妹染色分体の接着がmetaphaseまで維持できない。anaphaseにおいても染色分体の移動が途中で停止し、染色分体が過剰に凝縮していた。このanaphaseの細胞ではサイクリンBが分解されずに残存していた。したがってこの突然変異体の細胞では微小管のキネトコアへの付着を認識するチェックポイント機構、さらにその後におこる染色分体の移動も阻害されていると考えられる。以上の観察結果からmtr^2変異体の細胞では動原体の構築ができず、動原体の種々の機能も損なわれていると考えられた。mtr^2は細胞分裂に関わる2つの遺伝子、すなわち減数分裂の開始に関わるmtr遺伝子とヘテロクロマチンの構築に関わる新規の遺伝子l(3)acc6487の2重突然変異体であることがわかった。mtr^2突然変異そのものは雌雄不妊突然変異であり、この変異だけをホモにもつ雄は、減数分裂の際に染色体およびミトコンドリアの分配が異常となる。またこの雄の減数分裂が早期に開始されることもみいだした。この早期開始が不等分配の原因となるM期微小管構造の異常と密接に関連している。mtr遺伝子のクローニングをおこない、この遺伝子産物は新規の疎水性タンパクであり、ヒトの自己免疫疾患の原因タンパクのひとつLupas抗原と相同性の高い領域を持つ疎水性タンパクであることをみいだした。我々が分離したmeteor (mtr)変異体では、雄の減数分裂時に染色体の分配が異常となるため精細胞の異数化が頻度高く観察される。このため雄は不妊となる。さらに体細胞でも同様な染色体の異数化が観察された。劣性致死となるmtr2変異体では、姉妹染色分体の早期分離が観察され、動原体構造が脆弱であることが示された。さらにヘテロクロマチン化による遺伝子のサイレンシングも一部解除されていることが見い出されていた。一方、この変異体をさらに詳しい解析した結果、染色体の異数化以外の表現型はmtr2染色体上のmtrとは別の新規遺伝子の変異によることがわかった。そこで染色体の異数化をおこす原因遺伝子mtrに焦点をあてた研究をおこなった完全長cDNAの単離を5'RACE法をおこない、cDNAがコードするタンパクの全一次構造(1173アミノ酸)を予想した。このタンパクはSS-B/LAファミリーに属し、LAドメインをもつ。ところがこのORFのN末には翻訳開始のメチオニン残基が見出せない。そこでORF全長のN末にメチオニン残基を付加したタンパクを発現させたところ、雄不妊の表現型が回復した。この結果から予想したORFがmtr遺伝子産物としての機能を有することが示された。さらにGSTとMTRとの融合タンパクを大腸菌内で発現、精製させ、これに対する抗体を作成した。抗体はSDS-PAGEで分子量210kDaのポリペプチドを認識した。この抗体を用いてMTRタンパクの細胞内局在を調べるとともに,mtr変異体において染色体の異数化が生じる原因を知るために微小管などの分裂装置に異常がないか調べている。

さきに分離したショウジョウバエのmeteor(mtr)変異体では、雄の減数分裂時に染色体およびミトコンドリアの分配が異常となり、精細胞の異数化が頻度高く観察された。このためホモ雄は完全不妊となる。染色体ならびにミトコンドリアの不等分配の原因を知るために、変異体の減数分裂細胞に細胞分裂装置の異常がないか調べた。その結果、変異体の減数分裂の際に彎曲したり、途中で枝別れしたM期微小管が作られていることがわかった。さらにこの変異体では、雄の減数分裂が早期に開始されることをみいだした。正常な雄の精子形成過程では、16個の細胞がひとつのシストを形成し、そのなかで細胞周期が同調して進行する。減数分裂を開始するG2期において減数分裂およびその後の精子形成に必要な遺伝子の発現をおこなう。この変異体では、G2期にあるシスト内ですでに一部の細胞が染色体の凝縮、核膜崩壊を開始していた。さらに微小管の束化も観察でき、M期の微小管構造が作られていることも確認された。この減数分裂の早期開始が染色体ならびにミトコンドリアの不等分配の原因となるM期微小管構造の異常と密接に関連していると考えられる。また変異体の解析から、mtr遺伝子が減数分裂の開始を負に制御し、遺伝子発現に必要なG2期の確保を保証している可能性が示唆された。昨年度作成したMTRタンパクに対する抗体を用いてMTRタンパクの変動を調べたところ,減数分裂直前の細胞質にもっとも多くの蓄積がみられ、減数分裂開始後に急速に消失することがわかった。