hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病原性菌の病原性因子に関する研究

歯周病局所からよく分離されるCapnocytophaga菌種の内毒素活性について検討した。免疫生物学的活性として、マウス脾臓細胞を用いてマイトジェン活性及び多クローン性B細胞活性可能を調べ、またヒト末梢血を用いてインターロイキン1産生誘導能について検討した。その結果C.sputigena LPSは比較的強い免疫生物学的活性を示したが、C.ochraceaおよびC.gingivalisのLPSの活性は弱かった。このことよりCapnocytophaga菌種のうち特にC.sputigenaが歯周病に関与している可能性が示唆された。Actionobacillus actinomycetemcomitansは、歯周病に深く係わっているグラム陰性通性嫌気性桿菌である。本菌種は、病原性因子として線毛、ロイコトキシン、内毒素などを保有していることが知られているが、近年本菌種が溶血活性を示すことが報告されている。そこで本研究ではA. actinomycetemcomitansから溶血活性に関わる遺伝子のクローニングを試みた。A. actinomycetemcomitans ATCC43718株からの染色体DNAをSau3AIで部分消化したDNA断片をpTZ18Rに組換えてE. coli JM109に形質転換し、ウマ血液寒天培地上で溶血を示すクローンを選択した。またそのクローンからの遺伝子産物についてその溶血活性などについて検討した。得られたクローンpTZAalは、A. actinomycetemcomitans由来の約1.7-kbpの挿入断片を有していた。その大腸菌クローン菌体の超音波破砕上清をSDS-PAGEで調べたところ分子量約1万にバンドが確認され、またこのタンパクは、ATCC43718株の全菌体に対するウサギ免疫血清と反応する事を確認した。このタンパクは、ウマおよびヒツジの赤血球は溶解したが、ウサギ赤血球は溶解しなかった。また本溶血活性は、Mg^<2+>、Mn^<2+>およびCa^<2+>によって促進され、EDTA、2-MEおよびDTTによって阻害をうけ、proteinase Kあるいは70°C30分間の処理で完全に失活した。A. actinomycetemcomitansは少なくとも2種類の溶血因子を保有していることを確認しており、今回クローニングに成功したのはそのうちの一つと考えている。今後この遺伝子の塩基配列を決定するなど更に解析を進めるとともに、今回クローニングされた以外の溶血因子のクローニングを試み、それらの歯周病との関わりについて検討する予定である。
質的インタビュー調査の新展開に関する研究

本研究では,質的インタビュー調査の概念と論理について,近年の欧米圏での達成をふまえた理論的方法的再検討に中心的に取り組んだ。その結果,第1に,従来の「採鉱モデル」に代えて,「交渉モデル」に基づくインタビューの再概念化が必要であることを確認した。その上で,第2に,質的インタビュー調査に含まれる,「質的」,「インタビュー」,「リサーチ」という3要素に着目して,質的インタビュー調査の再概念化をはかった。そして,質的インタビュー調査とは,当事者性と他者性を帯びた「意味」に焦点を合わせ,調査者と研究参加者とのシンボリックな相互行為を通して,両者の再帰的関係の中で,系統的な知識産出をめざす活動であるとした。第3に,質的インタビュー調査の「リサーチ」(一貫した論理と手続きに基づく系統的な知識産出活動)としての質をいかに確保するかという問題について,インタビュー調査の論理的階梯として,S・クヴェールらの議論を参考に,主題設定,調査デザイン,インタビュー実査,文字化,分析,確証,報告作成・公表という7段階を区分した上で,各段階での作業や分析の妥当性を確保するための貿意点を整理した。また,質的研究の評価規準をめぐって,従来の実証主義的規準に代わるものとして近年提案されている各種の代替案の検討も行なった。さらに,以上と並行して,農家インタビュー調査の実際に対して上記の概念や論理がどのような示唆や指針を与えるかについても再考と試行を行なった。一方、経験的研究としては、次年度以降の本格調査に向けた準備作業として、農業者ネットワーク(福井県内)などについて予備調査(参与観察および聴き取り調査)を行なうとともに、農業・農村・農政に関する諸資料の収集と分析を行なった(直近数年間の『農業白書』、『農業と経済』誌、『日本農業新聞』、2000年農業センサス福井県および山形県版、および農林水産統計年報の分析など)。また、農民インタビュー調査の結果分析や比較分析に活用すべく、現代日本の日常生活において流布・通用する農業・農村をめぐる言説状況を探るために、各種新聞(『朝日新聞』、『福井新聞』、『日本農業新聞』)の直近1年分の投稿記事を収集・分析し、並存・競合する意味(常識的、ロマン主義的、支配的/対抗的イデオロギー等の語彙と論理)の布置を確認した。本年度は,理論的研究としては,前年度に引き続き,質的インタビュー論の新展開について,文献研究を続行した。今年度は特に,「質的研究革命」を踏まえながら,バランスのとれた視点から,質的インタビュー調査論を展開しているS・クヴァルの研究(Inter-Views,1996)について検討を行なった。調査設計から報告書作成に至るインタビュー調査の7段階論,「構築的妥当性」という代替規準の提案など,今後の質的インタビューの前進に資する示唆を引き出すことができた。一方、経験的研究としては、前年度に引き続き,現代日本における「農」をめぐる日常言説の経験的資料の収集と分析を進めた。今年度は特に,農業当事者(農業者,農家成員など)において,「農」を意味づける種々の語藁や論理がどのように布置しているか,また,支配的意味への対抗的な意味形成がどのように行なわれているかに注目した。前者については,『日本農業新聞』の読者投稿(直近1年間,約500件)の詳しい分析を試みた。また,後者については,福井県内の農業者ネットワーク・メンバー対象の個人およびグループインタビューを実施して,インタビュー記録の分析を進めた。このインタビュー分析からは,例えば,前者の投稿に頻出する,「安全」,「環境」,「多面的機能」,「地産地消」などへの,アンビバレントな態度(共感と違和),自身の営農経験に即した「読み替え(誤読)」など,興味深い知見を引き出すことができた。最終年度にあたる今年度は,総括として,質的インタビュー調査の概念と論理について,近年の欧米圏での達成をふまえた再検討を行ない,その内容を中心に研究成果報告書のとりまとめを行なった。再検討の要点は3点。

第1に,従来の「採鉱モデル」に代えて,「交渉モデル」に基づくインタビューの再概念化が必要であることを確認した。その上で,第2に,質的インタビュー認査に含まれる,「質的」,「インタビュー」,「リサーチ」という3要素に着目して,質的インタビュー調査の再概念化をはかった。そして,質的インタビュー調査とは,当事者性と他者性を帯びた「意味」に焦点を合わせ,調査者と研究参加者との会話的相互行為を通して,両者の再帰的関係の中で,系統的な知識産出をめざす活動であると捉えた。第3に,質的インタビュー調査の「リサーチ」(一貫した論理と手続きに基づく系統的な知識産出活動)としての質をいかに確保するかという問題について,インタビュー調査の論理的階梯として,S・クヴェールらの議論を参考に,主題設定,調査デザイン,インタビュー実査,文字化,分析,確証,報告作成・公表という7段階を区分した上で,各段階での作業や分析の妥当性を確保するための留意点を整理した。合わせて,質的研究の評価規準をめぐって,従来の実証主義的規準に代わるものとして近年提案されている各種の代替案の検討も行なった。なお,本研究の成果の一部を,北陸社会学研究会(2005年9月,金沢)において発表した。
植物の免疫応答における移動性化学シグナルと輸送体の同定に関する生物有機化学

申請者は,植物の防御応答に深く関与する植物ホルモン「ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)」の輸送体JAT/GTR1/NPF2.10を見出した.興味深いことに,NPF2.10は植物の生長調節を担う植物ホルモン「ジベレリン酸」や食害に対する防御二次代謝産物として知られるグルコシノレートも輸送することが明らかになっている.この事実から,NPF2.10はJA-Ile,ジベレリン酸,グルコシノレートといった化学構造の全く異なる基質を輸送可能な多機能輸送体であることが示唆され,その活性調節および基質認識メカニズムに興味が持たれた.前年度の研究により,NPF2.10の単量体・二量体形成が,リン酸化・脱リン酸化によって制御される事を明らかにした.より詳細な知見を得るために,野生型GTR1タンパク質,NPF2.10-T135Aタンパク質(恒常的非リン酸化模倣NPF2.10),NPF2.10-T135D(恒常的リン酸化模倣NPF2.10)をアフリカツメガエル卵母細胞に発現し,各基質に対する反応速度や基質親和性を導出した.また,蛍光タンパク質を融合したNPF2.10-T135Dの細胞内局在を共焦点顕微鏡によって確認したところ,NPF2.10-T135Dは細胞膜にほとんど局在していなかった.このことからNPF2.10の二量体化が自身の細胞膜局在を制御し,各基質の輸送を制御することが示唆された.続いて申請者は,NPF2.10のヘテロ二量体形成による活性制御について検討した.シロイヌナズナにおいてNPFは53種類存在し,その組み合わせによって輸送体の性質や活性が変化することが考えられた.そこで酵母を用いたハイスループットスクリーニング系を確立し,ヘテロ二量体を形成することでNPF2.10の輸送活性を変化させ得るNPF輸送体の候補を探索した.その結果,候補輸送体を数種類見出した.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は,植物の傷害応答に深く関わる植物ホルモンである,ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)の輸送体JATを見出し,その生理学的意義の解明を目的として研究を行ってきた.そこではじめに,JATによるJA-Ileの輸送が実際の植物個体で生じているかを確かめた.傷害葉に重水素標識化JA-Ileを投与し,非傷害葉への化合物の移行量を測定した.その結果, jat変異株では,野生株と比べて移行量が減少していた.このことからJATは,傷害時に,JA-Ileの移行を制御することが示された.また,傷害を与えた際のJATの発現部位を調べると,傷害葉の葉脈とその周辺に発現していることを明らかにした.このことから,JATは,維管束系を介してJA-Ileの移行を制御することが示唆された.また,JATはJA-Ileだけでなく,植物ホルモンの1種であるジベレリン酸も輸送することが確かめられている.両者は構造的に全く異なっており,JATの基質認識メカニズムに興味が持たれた.申請者は,アフリカツメガエル卵母細胞を用いた系を用いて,より詳細な輸送活性の評価を行った.JA-Ileおよびジベレリン酸の構造類縁体のバリエーションを増やし,それぞれの基質に対するJATの輸送活性を評価した結果, JATはどの構造類縁体も輸送しなかった.このことから,JATは基質構造を非常に厳密に認識する事が示唆された.さらに,JATと各種基質のX線共結晶構造を得るために,昆虫細胞での発現系を検討した.これまでに,昆虫細胞において,緑色蛍光タンパク質融合JATの発現を確認している.重水素標識化ジャスモン酸イソロイシンを用いた,植物体における輸送活性評価により,JATは植物個体においてでもJA-Ileを輸送することが確かめられた.この結果は,JATを介したJA-Ileの移行が,傷害時に生じていることを示唆する,また,申請者は,アフリカツメガエル卵母細胞の異種発現系を用いたJATの輸送活性評価により,様々な構造類縁体に対するJATの輸送活性評価を行った.さらにSf9昆虫細胞を用いたJATタンパク質の発現検討も同時並行で行い,JATの基質認識機構解明に向けて確実に前進している.申請者は,植物の防御応答に関与する植物ホルモン「ジャスモン酸イソロイシ(JA-Ile)」の輸送体JAT/GTR1を見出した.当該年度は,植物体を用いた実験をより詳細に検討した.傷害処理を施した植物体の非傷害部位において,傷害応答の程度を野生型とgtr1変異植物体で比較した.その結果,非傷害部位における傷害応答関連遺伝子の発現量は,gtr1変異体の方が野生型よりも高くなっていた.GTR1はJA-Ileを移動生化学シグナルとして輸送し,傷害応答を伝達しているわけではないことを示唆する.ジャスモン酸類は,植物の防御応答を高める効果を有しているが,同時に成長阻害といった負の効果も有している.GTR1は,過剰な傷害応答の火消しに関与しているのではないかと考えている.申請者は,GTR1が植物ホルモン「ジベレリン」も輸送することを明らかにした.GTR1は防御応答に関わる二次代謝産物である「グルコシノレート」を輸送することも報告されている.

これらのことから,GTR1はJA-Ile,ジベレリン,グルコシノレートといった構造の全く異なる基質を厳密に認識し輸送できる多機能輸送体であることが示唆された.GTR1の活性調節および基質認識メカニズムを明らかにするために,実験を行った.GTR1と同じファミリーの一員であるNPF6.3は二量体を形成することで,基質親和性を変化させる.申請者は,GTR1にも類似したメカニズムが存在し,輸送活性の調節が行われていると予想した.まず,GTR1が二量体を形成し得るかどうか確かめるために,タンパク質間相互作用検出を試みた.その結果,GTR1は二量体を形成することを明らかにした.また,二量体形成に重要なアミノ酸に変異を加え,各基質に対する変異GTR1タンパク質の活性を検討した.その結果,単量体・二量体形成が基質認識に影響を与えることが明らかとなった.植物体におけるGTR1の生理学的役割を明らかにするため,gtr1変異植物体の傷害時の遺伝子発現応答を調べた.その結果,非傷害部位における傷害応答が野生型よりもgtr1変異体で高まっていることが明らかとなった.これは,当初の予想とは異なる結果ではあるが,GTR1が過剰な傷害応答の沈静化に働いている可能性が示唆された.ジャスモン酸イソロイシンの移行の制御に関して,全く新しい視点を提供した.また,アフリカツメガエル卵母細胞の異種発現実験系により,単量体・二量体の制御により,GTR1の活性が調節されることが示唆された.申請者は,植物の防御応答に深く関与する植物ホルモン「ジャスモン酸イソロイシン(JA-Ile)」の輸送体JAT/GTR1/NPF2.10を見出した.興味深いことに,NPF2.10は植物の生長調節を担う植物ホルモン「ジベレリン酸」や食害に対する防御二次代謝産物として知られるグルコシノレートも輸送することが明らかになっている.この事実から,NPF2.10はJA-Ile,ジベレリン酸,グルコシノレートといった化学構造の全く異なる基質を輸送可能な多機能輸送体であることが示唆され,その活性調節および基質認識メカニズムに興味が持たれた.前年度の研究により,NPF2.10の単量体・二量体形成が,リン酸化・脱リン酸化によって制御される事を明らかにした.より詳細な知見を得るために,野生型GTR1タンパク質,NPF2.10-T135Aタンパク質(恒常的非リン酸化模倣NPF2.10),NPF2.10-T135D(恒常的リン酸化模倣NPF2.10)をアフリカツメガエル卵母細胞に発現し,各基質に対する反応速度や基質親和性を導出した.また,蛍光タンパク質を融合したNPF2.10-T135Dの細胞内局在を共焦点顕微鏡によって確認したところ,NPF2.10-T135Dは細胞膜にほとんど局在していなかった.このことからNPF2.10の二量体化が自身の細胞膜局在を制御し,各基質の輸送を制御することが示唆された.続いて申請者は,NPF2.10のヘテロ二量体形成による活性制御について検討した.シロイヌナズナにおいてNPFは53種類存在し,その組み合わせによって輸送体の性質や活性が変化することが考えられた.そこで酵母を用いたハイスループットスクリーニング系を確立し,ヘテロ二量体を形成することでNPF2.10の輸送活性を変化させ得るNPF輸送体の候補を探索した.その結果,候補輸送体を数種類見出した.まず実際の植物体を用いた実験をより詳細におこなう.傷害時における,傷害応答関連遺伝子の部位別測定や,代謝物測定をより詳細に検討し,JATの生理学的意義を見極める.
リンパ管誘導因子の質量顕微鏡法を用いた網羅的探索

本研究の目的は、質量顕微鏡法を用いた網羅的な解析によりリンパ管内皮細胞の分化や維持を誘導する物質を同定することである。様々なマトリックスを用いることにより、MALDI質量分析イメージングで得られるデータの幅を広げ、データ精度を高めるとともに質量顕微鏡解析の方法を調整し、複数の結果を取得した。生体試料上でのマトリックス調整の最適化や検出限界の確認を行うことにより、質量顕微鏡を用いた網羅的解析の技術確立と向上を達成することができた。今後は見出したリンパ管内皮細胞の分化や維持を誘導する物質を実際に用いてリンパ管内皮細胞分化に作用するかどうかの検討を行う必要がある。リンパ管は毛細血管から漏出した組織液、タンパク質、脂質を、末梢の毛細リンパ管において吸収し、集合リンパ管および胸管を通した後、静脈角から血管系に戻すことにより、血液の量や組成を一定に保ち、末梢の環境を安定させる役割を担っている。また、免疫系細胞が血管系に戻る通路ともなっており、リンパ節とともに迅速な免疫応答に重要な役割を担っている。リンパ管内皮細胞の分化は頸部静脈の血管内皮細胞の一部が転写調節因子を発現し、リンパ管特異的分子の発現を促進することによって、血管内皮細胞であった細胞にリンパ管内皮細胞としての特異性を持たせる。このリンパ管初期発生の過程において、リンパ管の最初の分化は静脈の片側に偏って起こる。このことは解剖学的に分かっているが、この現象を誘導する転写調節因子が調節されるメカニズムはまだ不明な点が多い。本研究の第一の目的は、質量顕微鏡法を用いた網羅的な解析によりリンパ管内皮細胞の分化や維持を誘導する物質を同定することである。本研究では質量顕微鏡法を用いることにより、従来の方法では捉えにくかった誘導因子の血管内皮細胞上への沈着を捉え、リンパ管誘導因子の同定を行う。リンパ管内皮細胞分化領域は特徴的であり、無染色であっても顕微鏡下であればリンパ管分化の領域は予想でき、連続切片を蛍光免疫染色することによって領域の確定が可能となる。本年度は、マウス胎仔に対する質量顕微鏡解析の手法を確立した。そして、リンパ管内皮細胞分化領域とそれ以外の血管内皮細胞領域、それぞれから得られたスペクトルを統計的に比較することによりリンパ管内皮細胞の分化誘導因子を探索し、リンパ管内皮細胞分化領域特異的なスペクトルを見出した。本年度は、マウス胎仔に対する質量顕微鏡解析の方法を調整し、データ精度を高めた。また、質量顕微鏡解析で用いるマトリックスを変えることにより、複数のシグナルパターンのデータを得ることを試みた。それらのデータにおいて既報の血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルが取得できているかの確認も行った。しかしながら該当するシグナルを得られなかった。今後は、これまでに得られた候補分子について多段階質量分析を用いるなどして詳細に解析するとともに、標品を用いて既知のリンパ管誘導因子にとって最適な質量顕微鏡解析手法を検討することにより、質量顕微鏡を用いた網羅的解析の確からしさの検討も行う。本研究は、文部科学省先端研究基盤共用・プラットフォーム形成事業「先端的質量分析イメージング施設の学術・産業共用促進事業」を活用して遂行した。初年度に引き続き、計画に則って、リンパ管初期発生期のリンパ管内皮細胞分化領域を含む胎仔組織切片に対して質量顕微鏡法による網羅的な解析、位置情報から区別できる分化段階の異なるリンパ管内皮細胞領域と血管内皮細胞領域のスペクトル比較、その解析結果を用いたリンパ管内皮細胞に特徴的な生体物質の同定を行った。本研究の中心となる質量顕微鏡を用いた方法の最適化を初年度に引き続き行い、質量顕微鏡法で用いる質量分析法であるMALDI-TOF-MSで重要となるマトリックス化合物の選択と塗布方法、装置の測定条件に関して特に重点を置いた。マトリックス化合物は、DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid)、CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)、9-AA(9-aminoacridine)といったマトリックスを用いた。また、これらの得られた結果の確からしさを検討するために、既知の血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルが取得できているのかの確認を行った。しかしながら、この点においては該当するシグナルを得られなかった。リンパ管内皮細胞誘導因子の絞り込みにおいては複数回の測定で再現性の取れたものやデータベース検索によって同定可能な因子のリスト化を行った。質量顕微鏡解析の最適化と再現性の確認の結果、リンパ管内皮細胞領域由来の特徴的なシグナルからリンパ管誘導因子候補の絞り込みが行えており、総合的に考慮して計画通り進捗した。

本研究の第一の目的は、質量顕微鏡法を用いた網羅的な解析によりリンパ管内皮細胞の分化や維持を誘導する物質を同定することである。本年度も、マウス胎仔に対する質量顕微鏡解析の方法を調整し、データ精度を高めるとともに、質量顕微鏡解析で用いるマトリックスから、複数の結果を取得した。そして、得られたデータを質量分析データベースと比較することによってリスト化を進めた。一方で、既報の血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルの取得も目指し、標品に対して複数のマトリックスを試すことにより解析を行った。血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルと予測されるシグナルが得られた。今後は、これらシグナルの検出感度を上昇させることによりマウス胎仔切片上に含まれる微量な血管およびリンパ管誘導因子の検出を目指す。具体的な方法としては生体試料上でのマトリックス調整の最適化や検出限界の確認を引き続き行うことにより、質量顕微鏡を用いた網羅的解析の技術確立と向上を行う。これまでに引き続き、計画に則って、リンパ管初期発生期のリンパ管内皮細胞分化領域を含む胎仔組織切片に対して質量顕微鏡法による網羅的な解析、位置情報から区別できる分化段階の異なるリンパ管内皮細胞領域と血管内皮細胞領域のスペクトル比較、その解析結果を用いたリンパ管内皮細胞に特徴的な生体物質の同定を行った。本研究の中心となる質量顕微鏡を用いた方法の最適化として、大気圧質量顕微鏡法におけるマトリックス化合物の調製や塗布方法、装置の測定条件の検討を行った。本解析における確からしさを検討するために、標品を用いて既報の血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルの取得も目指した。複数のマトリックスを試すことにより、血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルと予測されるシグナルが得られた。これまでのデータからリンパ管内皮細胞誘導因子の絞り込みとデータベース検索によって同定可能な因子のリスト化を進めており、質量顕微鏡解析の確からしさを示せたことから、総合的に考慮して計画通り進捗した。リンパ管内皮細胞の分化は頸部静脈の血管内皮細胞の一部が転写調節因子を発現し、リンパ管特異的分子の発現を促進することによって、血管内皮細胞であった細胞にリンパ管内皮細胞としての特異性を持たせる。このリンパ管初期発生の過程において、リンパ管の最初の分化は静脈の片側に偏って起こる。このことは解剖学的に分かっているが、この現象を誘導する転写調節因子が調節されるメカニズムはまだ不明な点が多い。様々なマトリックスを用いることにより、MALDI質量分析イメージングで得られるデータの幅を広げ、データ精度を高めるとともに質量顕微鏡解析の方法を調整し、複数の結果を取得した。得られたデータは質量分析データベースと比較し、リスト化を行った。既報の血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルの取得では、標品に対して複数のマトリックスを試すことにより解析を行い、精度の高い血管内皮細胞誘導因子を示すシグナルと予測されるシグナルが得られた。
RNAiコレクションによるエストロゲン応答性G蛋白結合型受容体の網羅的解析

女性ホルモンであるエストロゲンは転写活性を有しているが、細胞内カルシウムの上昇など数分以内での活性も有している。この急性期の反応は細胞膜に作用しているが、そのメカニズムは不明であった。そこで急性期の作用を解明するため細胞膜受容体であるG蛋白結合型受容体(GPCR)に対するRNAiを合成した。しかし、エストロゲンの作用は予想外に弱く、内因性受容体では明確な細胞応答が観察されず、アッセイ系の再検討が必要であった。女性ホルモンであるエストロゲン(E2)は、細胞増殖やインスリン分泌、血管弛緩、転写因子として機能など多彩な生理作用を有している。その受容体は、核内受容体と細胞膜受容体に分類される。最近、E2の細胞膜受容体が同定されたが、生殖器では受容体が機能していないのではないかという論文が報告されている。そこで、受容体のすべて遺伝子をノックダウンさせることのできるRNAiコレクションを用いて、これまで解析が不可能だった細胞膜に発現している受容体に対して網羅的な同定解析技術を確立することを目的としている。この方法が確立すれば、生殖器に存在するE2細胞膜受容体の同定とその活性化経路を解明し、女性ホルモン応答性疾患のターゲットを解明することを2番目の目的として研究を行った。RNAi導入後の活性化を指標に受容体の同定を行うため、生理的条件下でE2刺激における活性化の指標を検討した。リガンド刺激における活性測定では、最も感度が高い細胞表面のインピーダンス測定をした。リガンド刺激後、5分以内では、子宮筋腫由来の培養細胞2種類、乳がん由来の培養細胞ではリガンド刺激の効果を検出することができなかった。このため、RNAiライブライリーの作成と並行して、内因性の受容体検出システムを検討している。E2刺激後の転写活性の変化を新たな指標として検出するシステムを構築しつつあり、このシステムを構築でき次第、受容体のスクリーニングを開始する予定である。(目的)女性ホルモンであるエストロゲン(E2)は、多彩な生理作用を有している。最近、E2の細胞膜受容体が同定されたが、生殖器では機能していない可能性が示唆されている。そこで、RNAiコレクションを用いて、これまで解析が不可能だった細胞膜受容体に対して網羅的な同定解析技術を確立する。この手法で生殖器に存在するE2細胞膜受容体の経路を解明し、女性ホルモン応答性疾患のターゲットを解明する。(方法)確立しているシステム(カルシウム応答、NO測定、ERK活性化)を96wellでハイスループットアッセイ(HTS)に対応出来る実験系を確立する。実験系の確立したアッセイから411種類の遺伝子を3カ所ノックダウンしたRNAiコレクションを使い、測定を開始する。(1アッセイ当たりトータル3700回(96well約40枚)4.細胞種を乳腺上皮細胞、子宮内皮細胞、子宮間質細胞、前立腺上皮細胞などエストロゲンに対してノンゲノミックな作用を有する細胞を全て順次測定する。(結果)RNAiコレクションの作成が終了し、411種類の遺伝子のノックダウン用遺伝子ライブリーが作成された。アッセイを行うため、カルシウム測定システムを立ち上げたが、感度が十分に得られず、測定できなかった。このため多くのGPCRに高感度で応答するzif配列を有するルシフェラーゼベクターのクローニングを行い、解析ベクターの作成が終了した。今後、この解析ベクターを用いてエストロゲンのGPCRを介する応答を検討する。(目的)RNAiコレクションを用いて、これまで解析が不可能だった細胞膜受容体に対して網羅的な同定解析技術を確立する。この研究は、抗がん剤やイオンチャンネルなど生命現象や疾患の根幹に関わる説明につながる。1.細胞培養RNAiコレクションをヒトの遺伝子で作成しているため、ヒト由来の培養細胞を使い、特にE2の応答が研究に観察されるHeLa, SiHa, Hep2細胞(子宮頸ガン), MCF7(乳がん), Ishikawa細胞(子宮体がん)の培養条件を確立した。これらの細胞の中で、E2の応答が最も強い細胞のアッセイシステムを優先して行う。2.ハイスループットアッセイによるRNAiコレクション導入条件の確立嗅覚の遺伝子を除き、ゲノム上、G蛋白結合型受容体であることが予想されるGPCR 411種類をアルゴニズムにかけたRNAiコレクションを培養細胞に導入する条件を確立した。均一に細胞に挿入するため細胞分散と同時に遺伝子を導入できる簡便法であるリバーストランスフェクション法を確立した。3.遺伝子導入が100毎以上のプレートになるため、自動分注ロボットによるプログラム作成を行い、テストランを繰り返し、安定して大量の遺伝子導入ができる手法を確立した。4.内因性受容でのアッセイを行うため、微量の検出システムが必要となる。本来予定していたあるカルシウムアッセイでは不安定であり、検出感度も不十分なため、安定したデータを出すことができなかった。

このため、細胞表面の電気抵抗を測定するCell keyを用いたが十分な感度を得ることができなかった。さらに転写活性を指標にした測定システムに変更しているが感度の面では十分とはいえなかった。現在は、測定システムを細胞全体のインピーダンスを測定するシステムに変更して測定をスタートした。
有理曲面を用いたK3曲面上の力学系の解析

本研究で遂行する研究計画は次の4点である: (a)これまでの研究で構成したK3曲面の族を用いて, K3格子上の写像に対応するK3曲面上の写像の実現可能性を調べる.(b)これまでの研究で構成したK3曲面の族の適用可能範囲を広げる.(c)複数個のSiegel円板を許容する写像を具体的に構成する.(d)写像に対する最大エントロピー測度を解析する.本研究で遂行する研究計画は次の4点である: (a)これまでの研究で構成したK3曲面の族を用いて, K3格子上の写像に対応するK3曲面上の写像の実現可能性を調べる.(b)これまでの研究で構成したK3曲面の族の適用可能範囲を広げる.(c)複数個のSiegel円板を許容する写像を具体的に構成する.(d)写像に対する最大エントロピー測度を解析する.
東南アジア諸国の建築生産システムの実態および現代化プロセスに関する研究

本研究は、東南アジア諸国の建築生産システムを主に技能の観点から正確に把握し、発展度合いの異なる国々の比較により、建物や生産システムが変化して現代化するプロセスを学術的に考察したものである。対象国は、シンガポール、インドネシア、タイ、ベトナム、ラオスである。得られたデータは、各国の建物の構工法、職種分類、技能と技術の水準、技能者の組織、技能者の賃金、雇用形態、設計と施工の関係、プロジェクトの契約方式、日本および韓国のゼネコンのプロジェクト運営の実態等々である。ラオスにおいては、日本でいえば江戸から高度成長期の100年以上に相当する技能・技術、職能等の現代化プロセスについて記述することができた。本研究は、まず、各国の建築生産システムの実態を主に技能の観点から正確に把握することが目的であるが、ベトナムにおいては、野丁場、町場双方において現場調査をおこない、契約形態に関しては、請負が中心であるが、BQも存在すること、専門工事の職種区分が制度上定まっておらず、また、元請となるゼネコンが技術的資源を有していない場合もあり、その場合、躯体工事一式を請負う施工業者(これもゼネコンといってよい)があること(大手の元請ゼネコンには国営の系譜が2つあり、その場合はこのパターンが該当する)、内装工事や設備工事、あるいは杭工事については徐々に専門分化が始まっていること等を明らかにした。技能レベルについては、RCの躯体工事や左官工事は十分なスキルを有しているが、その他は成熟途上であるり、現状では外国資本の専門工事会社(韓国が多い)がフォローしている。これが、韓国ゼネコンとの競争力の源にもなっている。シンガポールは、労働者、技術者共にプロジェクト単位でゼネコンが直雇するのが一般的であるが、プロジェクトで雇用できる労働者の人数は工事金額に応じて制限があり、それを超えると人頭税を支払う必要がある。このような政策と、スキルに応じて人頭税が削減されるルール、ビルダビリティやコンストラクタビリティスコアなどの発注における取り決めが相互に関連しシンガポールにおける建設生産システムのレベル向上が図られ、全体としては合理的な生産システムが構築されていることを解明しつつある。これらは、日本の今後の方策において参考にするべき点も多い。引き続き、分析と考察を進める予定である。ラオスは、上記に比して圧倒的に発展途上であるが、本研究のもう一つのテーマである「現代化プロセス」については、広範囲から収集した住宅建築のサンプルにより、従来にない見解を示すことが出来そうである(調査が3月であったため分析は本報告以降)。2015年度は、シンガポールタイ王国を主に調査し、予備調査としてインドネシアを訪問した。シンガポールは、建設技能者を100%外国人に依存しているが、その実態は従来ほとんど明らかでなかった。我々は、2015年度の調査で、日本のみならず、おそらくは、研究者としては初めて、ゲートによって監理されたドミトリーと呼ばれる外国人宿泊施設に立ち入って調査をするなどした。シンガポールの現行制度の多くは日本をベンチマークしたとされるが、現在までに、生産性向上や環境負荷低減のための具体的評価指標を導入し、そのスコアにより外国人受入数や賦課額、建築確認等においてインセンティブを設け、中長期的な視点で外国人受入数を削減していくなど制度が緻密に設計されていること、一方、現場の声としては、スコア向上が目的化して生産性向上を阻害している矛盾、外国人労働者に対する人権的配慮等の問題がありそうなことを明らかにし、複数件の学会発表を行う予定である。タイ王国は、東南アジアにおいては、シンガポールに次ぐ成長国であるが、これまで調査したベトナム、ラオスと比較して現場は確実に進化しており、合理化構法など次のステップに移行しつつあること、および、現場には外国人労働者が増え、技能の承継に問題が生じつつあることを明らかにし、学会発表等により公表する予定である。インドネシアは、予備調査段階であるが、少なくとも日本の元請の現場においては、世界で唯一日本式の型枠技術が用いられていることを掴んでいる。これは、技能の承継や東南アジア圏に於ける日本企業の展開に対する重要な知見である可能性があることを確信している。2016年度に詳しい調査を行い、実態把握の精度を高める予定である。本研究は、東南アジアの建築生産システムについて主に技能の観点から実態を明らかにすることを目的としたものであるが、之まで、ベトナム、シンガポール、タイ、ラオス、インドネシアについて調査を行った。ただし、インドネシアは予備調査段階であり今年度に本調査の予定である。当初、毎年2カ国ずつ実態解明を行う予定であったが、調査は実現場において行うこと、日本のみならず韓国企業や現地企業の現場も比較対象として調査すること等の条件を満たすには、予想以上に調査準備に手間暇を要し、また、調査を行う度に、予想以上に新たな発見があることから1国に要する時間が大きくなり、国数は予定を下回っている。ただし、得られた成果は十分であることから、進捗は概ね順調と考えている。2016年度は、インドネシアとラオスを主に、フォローアップとしてベトナムとシンガポールを調査した。インドネシアの建設技術は、超高層を単独で設計・施工するレベルにあるが、躯体はRC一辺倒で、技術レベルのバロメーターともいえる壁構法はレンガからブロックへ移行し、日系のプロジェクトではヘーベルと呼ばれる軽量発泡コンクリートも使用されている。乾式工法は一部に使われ始めたレベルで、タイやベトナムよりは進んでいると考えて良い。建設労働市場に関しては、シンガポールが100%、タイでも半数程度を外国人に依存している中で、市場をクローズしている同国は、全てを自国民で賄っている。

労働者は、マンドールと呼ばれる親方が、故郷の村や親戚等を単位に組織し、現場近くのレイバーキャンプに住み込んで働くのが一般的である。技能レベルは、左官(土間)については日本並みか場合によってはそれ以上、コンクリート工事についても、少なくとも日系ゼネコンの現場においては高いレベルの品質管理が浸透している。現場の技能・技術について、特筆すべきは、日本式の型枠が普及していることである。12mmの合板に端太角、ホームタイ、セパレーターについて現地製の材料が調達できる。これは、おそらくは世界唯一と思われる。ラオスにおいては、ルアンパバーン以北について、過去に訪問したことのあるNayangtai村、Poung Chong村においては経年変化を、その他については1日に約100km程度移動しながら、沿道の建物を写真撮影し、伝統的高床、コンクリートの現代型、および移行過程のバリエーションを考察すべくデータを収集した。PoungChong村においては、今後、目の当たりにすることは非常に困難であろう、結による木造高床住宅の建設風景を記録することができたことは、大きな成果であった。本研究は、東南アジア諸国の建築生産システムを主に技能の観点から正確に把握し、発展度合いの異なる国々の比較により、建物や生産システムが変化して現代化するプロセスを学術的に考察したものである。対象国は、シンガポール、インドネシア、タイ、ベトナム、ラオスである。得られたデータは、各国の建物の構工法、職種分類、技能と技術の水準、技能者の組織、技能者の賃金、雇用形態、設計と施工の関係、プロジェクトの契約方式、日本および韓国のゼネコンのプロジェクト運営の実態等々である。ラオスにおいては、日本でいえば江戸から高度成長期の100年以上に相当する技能・技術、職能等の現代化プロセスについて記述することができた。本研究は、まず、各国の建築生産システムの実態を主に技能の観点から正確に把握すること、であるが、2014年度は、ベトナム、シンガポール、ラオスについて調査した。各国とも、問題なく調査を完了することが出来た。次いで、海外市場での強さに定評のある韓国企業をベンチマークして強さの秘訣を探ること、にあるが、特に韓国企業が強いベトナムにおいては、その要因が韓国人を最小化するマネジメント方式と、それを埋め合わせる下請の韓国専門工事会社とのネットワークにあることを明らかにできつつある。また、発展度合いの異なる国々の比較により、技能・技術、建築生産システムの現代化の過程を記述し、各国の将来を時系列的に予測することについては、ラオス→ベトナム→シンガポールの順序になるが、各国の制度、技能と技術の水準、契約システム等々の現代化に関する分析はこれからの作業である。本年度は、ベトナムとシンガポールの間に位置するタイを主対象に調査をおこない、データの充実を図る予定である。最終年度の本年は、研究の目的を達成するためにインドネシア、ラオス、ミャンマーの調査を行う予定である。
細胞性粘菌における細胞骨格制御のポストゲノム解析

細胞性粘菌は生育、分化の各ステージで多様な細胞運動(広義の細胞運動:細胞質分裂、細胞移動、貪食作用、飲作用など細胞形態変化を伴う細胞機能やその前提となる細胞基質間接着、細胞間接着なども含めて考える)を示し、半数体で変異株が使える、タギング法や標的遺伝子破壊など正逆遺伝学的手法に優れるなどの利点から高等動物の細胞運動の最も有力なモデル真核微生物である。本研究は、完了間近のゲノムプロジェクト及び筑波大田中可昌先生らによるESTプロジェクトの配列情報を利用し、上述の広義細胞運動の制御に関わる細胞性粘菌の低分子量GTPase、特にRhoファミリーGTPaseとその制御分子(RhoGDI, RhoGAP, RhoGEF)、さらにエフェクター分子(IQGAPなど)を網羅的に同定し、どの分子が細胞質分裂、どれが貪食作用といった細胞内機能のカタログ化、さらに各機能のシグナルカスケードの解明を目指している。昨年度までにRhoファミリーGTPase自身、RhoGDI、エフェクターIQGAPについて、分子の同定とクローニング、細胞内局在の決定、遺伝子破壊株の解析、酵母two-hybrid法の網羅的相互作用解析によるシグナルカスケードの解明を行った。今年度は、それぞれ少なくとも30種はあるRhoGAPとRhoGEFの解析に着手した。GAPとしてRhoGAP1、GEFとしてミオシンMyoMの尾部にあるGEFドメインを選び、全15種のRhoファミリーGTPaseの野生型、CA型、DN型とのtwo-hybrid相互作用を検討したところ、唯一RhoGAP1とRacF2のCA型との間に特異的相互作用が検出された。これにより、変異型利用の有効性が確認され、網羅的相互作用解析の系が確立した。さらに、RacF2-RhoGAP1系が、生育に必須であり、ゴルジ体に局在して小胞輸送に関わる可能性のあることもわかった。今後、確立した上述の系を用い、すべてのGAPとGEFについて解析を行う。
共鳴X線散乱による磁性薄膜の界面磁気構造解析

1.円偏光X線の共鳴散乱により磁性多層膜の磁気構造を解析する新しい実験法を開発した。ダイアモンド移相子をブラッグ条件の近傍で回転振動させ、磁性原子の吸収端のエネルギーを持つシンクロトロンX線から右および左円偏光を作り出す。これを試料に当て、それぞれの散乱強度を散乱角の関数として測定する。両強度の和は電荷散乱、差は電荷磁気干渉散乱を与える。これらを解析すると、磁性薄膜の磁気構造が分かる。2.[Fe(3.5nm)/Gd(5.4nm)]_<15>のGd層の磁化構造を上記の方法で解析し、この多層膜のFe整列状態、捩れ磁化状態におけるGd層の磁化構造をサブナノメーターの分解能で決定した。その結果、(1)両状態においてGd層はFe層との界面で飽和磁化を持ち、内部の磁化は小さい、(2)Gd層のキュリー温度はバルクのそれより50K以上低い、(3)捩れ磁化状態における局所Gd磁化の面内回転角は膜厚方向に不均一で、その分布は温度によって変化する、ことが明らかになった。3.上記試料の共鳴磁気散漫散乱データを解析し、(1)この試料の磁気界面は電荷界面より滑らかな構造を持つ、(2)電荷界面はFe/Gd界面にのみ存在するが、磁気界面はGd層内にも存在し、これらの内部界面は磁気的にラフである、ことを明らかにした。(1)ヘリシティ切換え型X線円偏向制御装置の設計ダイアモンド単結晶位相遅延子の特性を種々の表面方位、反射面について検討した。(001)表面結晶の(111)反射面を用いる透過型遅延子では、結晶内のX線パスが短いので、現在広く使われている(111)表面、(111)反射面の遅延子より強度が数倍高く、円偏向度が同程度のビームが得られることが分かった。反射面を入射直線偏向X線に対して45°傾けるゴニオメータ、結晶をブラッグ条件の附近で1mrad程度回転させる角度調整機構(ピエゾ素子使用)を設計した。(2)クライスッタの設計スプリット型超伝導コイルを内蔵し、X線ゴニオメータに搭載できるクライオスッタを設計した。可変温度範囲は室温3K、最大磁場は2Tである。液体ヘリウムを使用し、試料は2つのコイルの間に設置する。060°の範囲に散乱されたX線の測定が可能である。クライオスタットは±45°の範囲で全体を傾けることができる。厚さ3.5nmのFe膜と厚さ5nmのGd膜を15対積層した多層膜を真空蒸着法で作成し、GdのL3吸収端でX線鏡面反射の共鳴磁気散乱を種々の温度で測定した。データを解析したところ、170K(補償温度)以上の温度では多層膜は整列状態にあり、Gd膜は外部磁場と反対方向に磁化していること、磁化は膜厚方向に不均一であり、Fe膜との界面近傍で大きく、膜厚の中央で小さいことが分かった。170K以下ではGd膜は捩れ状態にあるが、その磁気構造は温度に依存する。すなわち、補償温度に近い温度ではGdの磁気モーメントはFe層との界面附近でのみ捩れているが、補償温度より30K程度低い温度ではGd膜全体が捩れ、膜厚の中央附近では磁気モーメントが外部磁場に垂直な方向を向いている。円偏光X線を用いた共鳴磁気散乱法によりFe/Gd多層膜の磁化構造、および、界面磁気構造を解析した。前者は鏡面反射、後者は散漫散乱を用いた。

磁化構造に関しては、整列状態/捩れ状態の構造転移がGd層で起き、その温度は多層膜の面内磁化が最小となる温度と一致する、いずれの状態でもGd層は膜厚方向に非常に不均一な磁化をもち、界面附近の磁化はバルクGdの磁化に近いが、内部の磁化は小さい、捩れ状態ではGdモーメントが膜厚方向にやはり不均一に回転し、温度によって回転の様子が異なる、整列状態ではFeモーメントとGdモーメントは反平行である、5nm程度のGd膜のキュリー温度はバルクGdより50K以上低い、ことを明らかにした。これらは、Gd層の磁化分布を数オングストロームの分解能で解析して得られた結果であるが、この種の研究として世界初である。界面構造に関しては、多層膜の2次および3次ブラッグ点附近で共鳴磁気散漫散乱を測定し、これを解析するため、ボルン近似の電荷磁気干渉散漫散乱理論を展開し方。その結果、実験に用いた試料では、界面内の高さ-高さ相関距離が電荷磁気干渉では150nm、純電荷散乱では40nmであり、磁気界面は化学界面より顕著に滑らかであることが分かった。また、Fe/Gd界面の磁気ラフネスはGd層内に及んでおり、内部磁気界面の構造を現在解析中である。1.円偏光X線の共鳴散乱により磁性多層膜の磁気構造を解析する新しい実験法を開発した。ダイアモンド移相子をブラッグ条件の近傍で回転振動させ、磁性原子の吸収端のエネルギーを持つシンクロトロンX線から右および左円偏光を作り出す。これを試料に当て、それぞれの散乱強度を散乱角の関数として測定する。両強度の和は電荷散乱、差は電荷磁気干渉散乱を与える。これらを解析すると、磁性薄膜の磁気構造が分かる。2.[Fe(3.5nm)/Gd(5.4nm)]_<15>のGd層の磁化構造を上記の方法で解析し、この多層膜のFe整列状態、捩れ磁化状態におけるGd層の磁化構造をサブナノメーターの分解能で決定した。その結果、(1)両状態においてGd層はFe層との界面で飽和磁化を持ち、内部の磁化は小さい、(2)Gd層のキュリー温度はバルクのそれより50K以上低い、(3)捩れ磁化状態における局所Gd磁化の面内回転角は膜厚方向に不均一で、その分布は温度によって変化する、ことが明らかになった。3.上記試料の共鳴磁気散漫散乱データを解析し、(1)この試料の磁気界面は電荷界面より滑らかな構造を持つ、(2)電荷界面はFe/Gd界面にのみ存在するが、磁気界面はGd層内にも存在し、これらの内部界面は磁気的にラフである、ことを明らかにした。
クラゲコラーゲンを利用した人工硬膜の作成とその性能評価

1人工硬膜の作成:ミズクラゲ由来のコラーゲンを用いて、人工硬膜となるシートを作成した。コラーゲン溶液に短波長紫外線(UVC)を照射しながら乾燥させ、それを重層させて人工硬膜を作成した。2コラーゲンシートにおける髄膜細胞生着・増殖実験:ミズクラゲ由来コラーゲンシートと、ブタコラーゲンシート上で、ヒト髄膜細胞を培養した。クラゲコラーゲンシート上におけるヒト髄膜細胞の生着は、ブタコラーゲン上に比べ不安定だった。3ラット硬膜欠損モデルにおけるクラゲ人工硬膜生着実験:ラットを開頭して硬膜を一部切除した硬膜欠損モデルを作成した。硬膜欠損部に1で作成したクラゲコラーゲンシートとブタコラーゲンシートを置き、2週間後に再開創した。クラゲコラーゲンシート、ブタコラーゲンシートとも生着は不良であった。予想していたよりも、クラゲ由来コラーゲンシート上でのヒト髄膜細胞の生着・増殖や、動物実験におけるコラーゲンシートの生着が不良だった。・生体生着性に優れたクラゲ由来コラーゲンシートの作成。・クラゲ由来コラーゲンパウダーで、同様のin vitro実験。・クラゲ由来コラーゲンシートおよびクラゲ由来コラーゲンパウダーの、動物生着実験。・人工硬膜に適したコラーゲンシートの作成:ミズクラゲ由来のコラーゲンを用いて、シートを作製した。コラーゲンに短波長紫外線(UVC)と電子線を照射することにより、シートの強度を増加させた。風乾コラーゲンシートと凍結乾燥コラーゲンシートの2種類を作成した。・In vitro実験:クラゲコラーゲン膜トと対照のブタコラーゲン膜上で、ヒト髄膜細胞を培養した。対照のブタコラーゲン膜上では、ヒト髄膜細胞が膜表面に二次元的に付着した。電子線照射クラゲコラーゲン膜表面には、ヒト髄膜細胞はほとんど認められなかったが、UVC照射クラゲコラーゲン膜上ではヒト髄膜細胞が膜内に入り込むように三次元的に付着した。人工硬膜の作成:ミズクラゲ由来のコラーゲンを用いて、人工硬膜となるシートを作成した。コラーゲンパウダーにおけるin vitro実験:ミズクラゲ由来コラーゲンをパウダー状にして、その中でヒト髄膜細胞を培養した。コラーゲンシート上よりも、ヒト髄膜細胞は三次元的に付着・増殖した。動物実験:コラーゲンシートをラットの脳表に移植した。コラーゲンシートの生着が認められたラットはわずかだった。動物実験において、クラゲ由来コラーゲンシートの生着が進んでいない。・人工硬膜の作成:ミズクラゲ由来のコラーゲンを用いて、人工硬膜となるシートを作成した。・コラーゲンシートにおける髄膜細胞生着・増殖実験:ミズクラゲ由来コラーゲンシートと、ブタコラーゲンシート上で、ヒト髄膜細胞を培養した。ヒト髄膜細胞はコラーゲンシート上に一部生着したが、ややブタコラーゲン上の方が良好だった。予想していたよりも、クラゲ由来コラーゲンシート上での、ヒト髄膜細胞の生着・増殖が不良で、動物実験でもコラーゲンシートの生着が得られていない。

予想していたよりも、クラゲ由来コラーゲンシート上でのヒト髄膜細胞の生着・増殖や、動物実験におけるコラーゲンシートの生着が不良だった。コラーゲンシートを作成したが、実際に人工硬膜として臨床で用いるには、形状、強度等の条件が満たされていない。・生体生着性に優れたクラゲ由来コラーゲンシートの作成。・細かく形成しやすいクラゲ由来コラーゲンパウダーの作成。・クラゲ由来コラーゲンシートおよびクラゲ由来コラーゲンパウダーの、動物生着実験。・クラゲ由来コラーゲンパウダーで、同様のin vitro実験。・引き続き、人工硬膜として相応しい形状、強度を持った、クラゲコラーゲンシートの作成。・クラゲコラーゲン膜上での、安定的なヒト髄膜細胞の培養。・作成したクラゲコラーゲンシートを用いた動物実験。クラゲコラーゲンとヒト髄膜細胞に余剰があった。教室が所有しているラットを使用することができた。(理由)クラゲコラーゲンとヒト髄膜細胞に余剰があった。ラットは、教室で他の目的で飼育しているものを使用した。(使用計画)新たなクラゲコラーゲン、ヒト髄膜細胞、ラットの購入。実験に必要な機材、免疫組織染色用抗体などの購入。クラゲコラーゲンに余剰があったため、支出を抑えることができた。新たなクラゲコラーゲン、ヒト髄膜細胞、ラットの購入。免疫組織染色のための抗体購入に充てる予定
核内受容体のノンゲノミックファンクションを介した血管新生・腫瘍形成抑制機構の解析

ERリガンドが、全く新しい核内受容体の経路であるERβのNon-genomic経路を介してアンドロゲン不応性前立腺癌の腫瘍血管新生を強力に抑制することによって腫瘍形成を阻害することを明らかにした。さらに、NFκBが新たなERβのNon-genomicの標的転写因子であることを明らかにし、その活性を抑制させる化合物を同定した。これらの結果は、新たなアンドロゲン不応性前立腺癌の治療薬開発に繋がると考えられる。・ERβとKLF5を介して血管新生を抑制するGS-1405最適化化合物の設計と評価1)in silicoによるGS-1405最適化化合物の設計:これまでにERβの結晶構造に基づいたin silicoシミュレーションによってERβとGS-1405の結合様式の予測を行った結果、GS-1405はERβのGlu 305とArg 346と水素結合を形成していることが予測された。この結合がGS-1405のKLF5活性抑制に関与しているのかどうかを確かめるために305番目のグルタミン酸をアラニンに置換した変異型ERβを用いたルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、GS-1405によるERβ依存的なKLF5の転写活性化能の抑制効果は変異体により軽減された。2)GS-1405最適化化合物の評価:in silico予測を含むGS-1405最適化化合物のKLF5の転写活性化能に対する作用を検討した。その結果、いくつかの最適化化合物はKLF5の転写活性化能に対して強い抑制能を示すことが明らかになった。さらに、KLF5の下流因子であり血管新生に関与するPDGFAの転写への影響を検討した結果、これらの化合物により、PDGFAの転写が抑制されることが明らかになった。・ERβのnon-genomic functionを抑制する化合物のスクリーニングこれまでの報告から、ERbはそのnon-genomic functionにより、HIF-1αによるVEGFの転写を制御している可能性が考えられる。そこで、HIF-1αの転写に対する作用を測定するためのHIF-1の応答配列を挿入したレポータープラスミドを構築し、低酸素により誘導されるHIF-1を介した転写の活性化が検出できることを確認した。さらに、この系を用いたスクリーニングを行った結果、8種類のHIF-1活性を抑制する化合物を単離することが出来た。・GS-1405によるERb/KLF5を介した血管新生・腫瘍形成抑制機構の解析1)免疫沈降法により、GS-1405のERbとKLF5の結合への影響を評価した。その結果、ERbとKLF5タンパク質との結合にはGS-1405は影響しないことが明らかになった。2)これまでに、GS-1405がERb依存的にKLF5の転写活性化能を抑制させることを明らかにしている。そこで、血管新生・腫瘍形成に関与するERb/KLF5の標的遺伝子の解析をGene Chipを用いて行い、PDGFsを同定した。PDGFAとPDGFBのmRNA量はGS-1405添加によりERb又はKLF5依存的に減少することを確認した。3)KLF5のPDGFAプロモーターへの結合におけるGS-1405の影響をクロマチン免疫沈降法により検討した。その結果、KLF5のPDGFAプロモーターへの結合はGS-1405の添加により阻害されることが明らかになった。・ERb/KLF5の標的遺伝子であるPDGFAのin vivo機能解析1)KLF5のノックダウンにより抑制された血管新生はPDGFAの添加により回復した。この結果からKLF5の血管新生効果はPDGFAを介していることが明らかになった。さらに、GS-1405はKLF5/ERbを介してPDGFAの発現を抑制することで血管新生抑制することが示された。2)これまでにGS-1405の効果はERb/KLF5を介していることを明らかにしていた。そこで前立腺癌細胞を移植した担癌モデルマウスを用いた抗腫瘍試験を行い、KLF5の腫瘍形成能がPDGFAを介しているかどうかの検討を行った。その結果、KLF5のノックダウンにより抑制された腫瘍形成はPDGFAの過剰発現により回復したことから、KLF5の腫瘍形成促進効果はPDGFAを介していることが明らかになった。交付申請書に記載した「研究の目的」、「研究実施計画」の項目通りに研究を進めることが出来たので、おおむね順調に進展していると判断した。・核内受容体のNon-genomic functionを介してKLF5の活性を制御する核内受容体のスクリーニングこれまでにKLF5は前立腺癌のみならず、乳癌、大腸癌、白血病などの増殖や進行に関与することが報告されている。また、核内受容体はそれぞれ構造的に相同性が高く、組織特異的に発現しているものも多い。そのため、ERb以外の核内受容体もまたKLF5の転写活性を制御する可能性が高い。