hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト神経芽腫の増殖、分化、生存とアポトーシスの制御機構

【目的】FRは、細胞にアポトーシスを誘導し、臨床応用が期待されている新規合成レチノイドであるが、その作用機序はまだ完全に解明されていない。最近、ストレス応答性シグナル伝達路であるJNKp38MAPKシグナル路の持続的活性化とアポトーシスとの関連が注目されている。そこで、NB細胞株において、FRによるストレスシグナルの活性化について検討した。【方法】当施設で樹立されたヒトNB細胞株のうち、FR感受性株としてKP-N-TKを、耐性株として、KP-N-TKをFR存在下で培養して樹立したKP-N-TK(FR-R)株とKPN-SIFAを用いた。これらを10μMのFR存在下で培養した際のアポトーシスをTUNEL法とwestern blot法(WB)によるcaspase活性化で評価した。細胞内活性酸素種(ROS)の経時的変化を、蛍光dyeであるCM-H2DCFDAを負荷したフロサイトメトリーで検討した。WBにて、JNK, P38MAPKの燐酸化を検討した。【考案・結論】FR感受性NB細胞株では、FRによるROS依存性のJNK, p38MAPK持続的活性化が、アポトーシスと関連していることが示唆された。一方、FR耐性NB細胞株では、FR存在下でもこのシグナル伝達が生じておらず、このことがFR耐性と関連していると考えられた。1.神経栄養因子、TRK family受容体と細胞シグナル伝達:TRK-AとTRK-B受容体の発現を認めたNB細胞株を神経栄養因子で処理し、TRK-AとTRK-B受容体を介する細胞シグナル伝達経路を解析し、(1)TRK受容体および細胞シグナル伝達蛋白のチロシン燐酸化、(2)神経栄養因子のTRK-AとTRK-B受容体を介するシグナル伝達が、細胞核内に伝達されるか否か、また(3)NB細胞株をretinoidまたはγ-interferon処理(TRK-A発現が増強または誘導される)を行ない、神経栄養因子の細胞シグナル伝達系を検討した。2.アポトーシス:レチノイドでアポトーシスを起こすNB細胞株が我々の研究室にある。この細胞株を用いて、アポトーシス関連蛋白・遺伝子(ICE、Akt、Bad、PI-3Kなど)の役割を検討した。最近、ストレス応答性シグナル伝達路であるJNK,p38 MAPKシグナル路の持続的活性化とアポトーシスとの関連が注目されている。【方法】当施設で樹立されたヒトNB細胞株のうち、FR感受性株としてKP-N-TKを、耐性株として、KP-N-TKをFR存在下で培養して樹立したKP-N-TK(FR-R)株とKP-N-SIFAを用いた。細胞内活性酸素種(ROS)の経時的変化を、蛍光dyeであるCM-H2DCFDAを負荷したフローサイトメトリーで検討した。WBにて、JNK,p38 MAPKの燐酸化を検討した。【考案・結論】FR感受性NB細胞株では、FRによるROS依存性のJNK,p38 MAPK持続的活性化が、アポトーシスと関連していることが示唆された。
非内分泌細胞における変異プロインスリンのプロセシング

インスリンは膵島β細胞で前駆体B鎖-Arg-Arg-Cペプチド-Lys-Arg-A鎖として産生され,転換酵素PC1,PC2によって塩基性アミノ酸対部分が限定切断をうけ,新たに露出したカルボキシル端塩基性アミノ酸がカルボキシペプチダーゼH(CPH)によって除去されて,A鎖とB鎖から成る生理活性型インスリンになる。我々はどの細胞にも存在する限定切断酵素Furinの切断をうけるようにcDNAをB鎖-Arg-Arg-Lys-Arg-Cペプチド-Arg-Arg-Lys-Arg-A鎖に変異させ,非内分泌細胞で生理活性型インスリンへの転換を試みた。モンキー腎上皮由来COS,ハムスター子宮由来CHO,マウス胎児由来NIH3T3,ヒト肝癌由来HepG2の各細胞から培養液中に放出されたインスリン免疫活性はセファデックスG-50によるゲル濾過でインスリン分画にCHO 50%,COS 60%,HepG2 70%,NIH3T3 80%溶出された。又各細胞のFurinはインスリンへの転換率が高い細胞程,発現していることが分かった。Furinで切断されたインスリンのB鎖カルボキシル端の塩基性アミノ酸が正しく除去されていることを調べるため,インスリン分画をイオン変換クロマトグラムとHPLCで分析した。各細胞におけるCPHの発現をノザンブロットで解析すると,NIH3T3は多量の,HepG2は中等量のCPHを含んでいたが,COSとCHOではCPHは発現していなかった。しかし各細胞からのインスリンはCPH発現の有無にかかわらずイオン交換クロマトグラムでもHPLCでも標準インスリンと同じ位置に流出し,余剰の塩基性アミノ酸が除去されていることを示した。このことは非内分泌細胞でもFurinと更にある種のカルボキシペプチダーゼによって変異プロインスリンを生理活性型インスリンに転換できることを示した。今後インスリン発現をグルコース等で調節することによって糖尿病遺伝子治療への基礎を作る予定である。インスリンは膵島β細胞で前駆体として産生され、分泌顆粒に入る過程で、Cペプチドに隣接する塩基性アミノ酸対が限定切断をうけ、A鎖とB鎖から成る生理活性型インスリンになる。この限定切断は内分泌細胞に特異的で、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞のような非内分泌細胞では、遺伝子を組込んでもインスリンは前駆体として産生され、生理活性型に変換されない。ところで血液凝固因子や成長因子のあるものは、非内分泌細胞中で前駆体として産生され、生理活性蛋白質に変換されるが、この変換は-Arg^<-4>-X-Lys/Arg^<-2>-Arg^<-1>配列が蛋白分解酵素Furinで切断されることによる。そこで我々はラットプロインスリンcDNAをB鎖-Arg-Arg-Eys-Arg-Cペプチド-Arg-Arg-Lys-Arg-A鎖となるようにした変異cDNAを作製し、モンキー腎上皮由来COS,ハムスター子宮由来CHO,マウス胎児由来NIH3T3,ヒト肝癌由来HepG2の各細胞に導入し、発現させた。正常プロインスリンcDNAを発現させた各細胞の培養液をSephadexG-50ゲル濾過で分離すると、プロインスリン分画に約9598%、インスリン分画に25%の免疫活性を得た。変異プロインスリンcDNA発現培養液ではインスリン分画にCHO50%、COS60%、HepG2 70%、NIH3T3 80%の免疫活性を得、NIH3T3でプロインスリンからインスリンへの移行が著しかった。そこで各細胞のFurinの発現を調べるために、RNAを電気泳動し、Northern blottingを行った。

その結果、インスリンへの変換率が高い細胞程、Furin-mRNAの発現が高いことが分かった。そこでFurinの発現が一番低いCHOにFurin cDNAを発現させたところ、インスリン分画への移行はほぼ100%となった。このことは非内分泌細胞で変異プロインスリンを生理活性型に変換させているのはFurinであり、Furin発現の高い細胞は代用インスリン産生細胞として用いることができる可能性を示している。インスリンは膵島β細胞で前駆体B鎖-Arg-Arg-Cペプチド-Lys-Arg-A鎖として産生される。この前駆体は分泌顆粒に入る過程で,Kex2型転換酵素PC1/PC3,PC2によって塩基性アミノ酸対部分が限定切断され,新たに露出したカルボキシル端塩基性アミノ酸がカルボキシペプチダーゼH(CPH)によって除去され,A鎖とB鎖から成る生理活性型インスリンになる。この限定切断と塩基性アミノ酸除去は内分泌細胞に特異的で,線維芽細胞,上皮細胞,肝細胞のような非内分泌細胞では,遺伝子を組み込んでもインスリンは前駆体として産生され,生理活性型に変換されない。ところで我々はほとんどの細胞に存在する蛋白分解酵素Furinの切断をうけるようにラットプロインスリンcDNAをB鎖-Arg-Arg-Lys-Arg-Cペプチド-Arg-Arg-Lys-Arg-A鎖にした変異cDNAを作製し,非内分泌細胞で生理活性型インスリンへの転換を試みた。この変異インスリンをモンキー腎上皮由来COS,ハムスター子宮由来CHO,マウス胎児由来NIH3T3,ヒト肝癌由来HepG2の各細胞で発現させると、各細胞から培養液中に放出されたインスリン免疫活性はセファデックスG-50によるゲル濾過でインスリン分画にCHO50%,COS60%,HepG2 70%,NIH3T3 80%溶出された。次に各細胞のFurinの発現を,Northern blotで調べた結果,インスリンへの転換率が高い細胞程,Furin-mRNAの発現が高いことが分かった。更にFurinで切断されたインスリンのB鎖カルボキシル端の塩基性アミノ酸が正しく除去されているかどうかを調べるため,ゲル濾過のインスリン分画をイオン変換クロマトグラム(Mono Sカラム)で分析した。各細胞におけるCPHの発現をノザンブロットで解析すると,NIH3T3は多量の,HepG2は中等量のCPHを含んでいたが,COSとCHOではCPHは発現していなかった。しかし各細胞からのインスリンはCPH発現の有無にかかわらずスタンダードインスリンと同じ位置に流出し,インスリンから余剰の塩基性アミノ酸が未同定のカルボキシペプチダーゼによって除去されていることが分かった。このことは非内分泌細胞でも,Furinとある種のカルボキシペプチダーゼによって変異プロインスリンを正しくプロセスされた生理活性型インスリンに転換できることを示した。
幹細胞分化異常がもたらす上皮系腫瘍形成におけるリン脂質代謝の関与

がんの85%以上は上皮系の組織より発生している。申請者らはリン脂質代謝の要の酵素であるホスホリパーゼC (PLC)の1つPLCδ1は極性のある上皮細胞に発現が非常に多いこと、PLCδ1遺伝子欠損(KO)マウスは皮膚上皮系幹細胞の分化異常により皮膚腫瘍を形成することを報告している。本申請では、イノシトールリン脂質代謝がどの様なメカニズムで皮膚上皮系幹細胞の増殖と分化制御、癌の形成に関わっているのかを明らかにすることを目的とした。PLCδ1KOマウスでは生後8日目(P8)での皮膚の肥厚が観察されるが、こうした肥厚と炎症やがんとの関連性が示唆されていることから、第一に、PLCδ1と炎症との関連性を検討した。まずPLCδ1KOマウス皮膚を免疫組織学的に調べた所、免疫性細胞であるマクロファージ、顆粒細胞、T細胞数がPLCδ1KOマウス皮膚では45倍多く存在していることが明らかになった。更に炎症性のサイトカインであるIL-1β,IL-6,MMP-9量をRT-PCRにより比較検討した所、PLCδ1KOマウス皮膚で、有為に増加していた。こうした事実はPLCδ1の欠損が炎症反応を誘導していることを示している。また肥厚の原因が増殖性の亢進であることを証明するため、上皮細胞であるHaCat細胞でPLCδ1を安定的にRNAiした細胞を作製し、増殖能を検討した所、約2倍増殖性が亢進していることが判明した。第二に、上皮細胞の極性形成におけるリン脂質の役割の解明を行った。上皮系がん細胞である乳癌細胞を用いて、浸潤突起形成におけるリン脂質の重要性を検討した所、PIP2が浸潤突起部位に非常に多く局在していることが判明した。また抗PIP2抗体を細胞に導入すると、浸潤突起の形成が抑制されることから、PIP2が突起形成に必須であることが判明した。さらにPI3キナーゼ阻害剤下においても浸潤突起形成が抑制されることから、PIP3も突起形成に関与することが判明した。がんの85%以上は上皮系の組織より発生し、上皮系のがんの多くが組織幹細胞に由来することが示唆されている。申請者らはイノシトールリン脂質代謝の要の酵素であるホスホリパーゼC(PLC)の中でも、PLCδ1は極性のある上皮細胞に発現が非常に多いこと、PLCδ1遺伝子欠損(KO)マウスは皮膚上皮系幹細胞の分化異常により皮膚腫瘍を形成することを報告している。本申請では、イノシトールリン脂質代謝が、どの様なメカニズムで皮膚上皮系幹細胞の増殖と分化の方向性の決定および分化異常と癌の形成に関わっているのかを明らかにすることを目的とした。PLCδ1KOマウスでは皮膚の肥厚が観察されるが、こうした皮膚の肥厚と炎症やがんとの関連性が示唆されていることから、第一に、PLCδ1と炎症との関連性を検討した。まずPLCδ1KOマウス皮膚の切片を作製し、免疫性細胞であるマクロファージ、顆粒細胞、T細胞数を免疫組織学的に調べた所、PLCδ1KOマウス皮膚では45倍のこうした免疫性細胞が存在していることが明らかになった。更に炎症性のサイトカインであるIL-1β,IL-6,MMP-9の量をRT-PCRにより比較検討した所、PLCδ1KOマウス皮膚で、有為に増加していることが判明した。こうした事実はPLCδ1の欠損が炎症反応を誘導していることを示すものである。

また肥厚の原因が増殖性の亢進であることを証明するため、上皮細胞であるHaCat細胞でPLCδ1を安定的にRNAiした細胞を作製し、増殖能を検討した所、約2倍増殖性が亢進していることが判明した。第二に、上皮細胞の極性形成におけるリン脂質の役割の解明を行った。上皮系がん細胞である乳癌細胞を用いて、浸潤突起形成におけるリン脂質の重要性を検討した所、PIP2が浸潤突起部位に非常に多く局在していることが判明した。また抗PIP2抗体を細胞に導入すると、浸潤突起の形成が抑制されることから、PIP2が突起形成に必須であることが判明した。さらにPI3キナーゼ阻害剤下においても浸潤突起形成が抑制されることから、PIP3も突起形成に関与することが判明した。
リーダーの倫理性の規定因とそのメカニズムの検討

本研究は,(1)フォロワーから「倫理的」と判断されるリーダーの特性や行動を解明すると共に,それらの特性や行動がELS得点を介してフォロワーの倫理性及び生産性に及ぼす影響を明らかにすること,(2)リーダーの倫理性(意思決定及び行動)を促進・抑制する要因を同定し,それらの要因がどのようなメカニズムでリーダー自身の行動を倫理的または破壊的にするのかを明らかにすること,を目的としている。平成30年度は,上記の目的1に関する研究として,倫理的リーダーシップ得点の高いリーダーの行動特徴や特性を探索するための調査を行った。様々な業種の企業に勤務する従業員400名を対象としてインターネット調査を行い,直属上司の倫理的リーダーシップへの評定を求め,上司の他の行動との関連を検討した。その結果,倫理的リーダーシップ(ELS)得点の高い上司は,尊敬される行動,他者との情報共有,部下の視野を広げる働きかけ,部下の個性を認めた上での育成への注力,根拠に基づく決断,信念に基づく決断などの行動や特徴を示すことが明らかになった。倫理的リーダーシップ得点の高い上司をもつ回答者は,組織コミットメントや上司への満足度が高く,組織市民行動を行う傾向にあることも確認された。また,目的2に関連する研究として,個人の中で優勢な道徳基盤や価値観が,道徳的意思決定にどのように反映されるかを探索的に検討した。大学生参加者に道徳的ジレンマ場面を提示し,その場面に対して自身の意思決定を求めると共に,決定の理由を自由に記述するよう求めた。その結果,理由の記述に表れた道徳基盤が意思決定の方向性に影響していることが示された。フォロワーから倫理的と称されるリーダーの行動や特徴の特定を行う段階で,リーダー自身の価値観とフォロワーからの評価との関連を検討するための集団単位の調査を行う必要があるが,その調査で測定する項目を絞り込む作業が難航している。欧米における先行研究の知見と必ずしも一致しない部分があり(勢力の機能など),倫理性・道徳性・価値観における文化差に関する研究知見を参照しながら進めているためである。しかし,この調査については次年度前半に実施できる見込みである。令和元年度は最終年度であるため,上述した集団単位の調査を実施するとともに,リーダーの倫理的意思決定のメカニズムを解明するための実験室実験を実施する。実験室実験については,平成29年度の研究においてリーダーの勢力の効果が予測と異なっていたため,勢力が熟考に及ぼす効果を検討できるデザインに変更する予定である。平成29年度は,目的1のための組織従業員へのインタビュー調査(現在,継続中)を行うと共に,目的2に関して,勢力,地位,及びモラルアイデンティティ等の非倫理性促進・抑制効果の検討を,インターネット調査によって実施した。欧米の先行研究では,勢力感が高く,地位感(他者から尊敬されているという感覚)が低いほど非倫理的行動が促進されることが指摘されていたが,本研究では欧米の知見とは反対に,勢力感が低いほど非倫理的行動が促進されること,地位感は非倫理的行動に影響を及ぼさないことが示された。また,モラルアイデンティティは非倫理的行動と関連しなかったが,勢力感や職位の高さとは正の関連を示した。さらに,回答者の職位が高い場合は勢力感が低いほど非倫理的行動を行うが,職位が低い場合は勢力が非倫理的行動に関連しないという結果が示された。全体的に,リーダーの勢力はむしろ非倫理性を抑制する効果があることが示唆された。今後は,リーダーの勢力の機能に関する仮説を修正しつつ今後の研究を進める必要がある。平成29年度中に組織従業員に対するインタビュー調査を終え,倫理性の高いリーダーの行動リストを作成する予定であったが,当初予定していたインタビュー対象者の一部の都合が変わったため,インタビュー対象の業種の多様性を確保することができず,インタビュー調査を終えることができなかった。そのため,その行動リストを用いる調査も遅れることとなったが,その代わりに平成31年度に行う予定であったインターネット調査の一部を前倒しで実施した。結果的には遅れは最小限に留まっている。

倫理的リーダーシップ得点の高い上司をもつ回答者は,組織コミットメントや上司への満足度が高く,組織市民行動を行う傾向にあることも確認された。また,目的2に関連する研究として,個人の中で優勢な道徳基盤や価値観が,道徳的意思決定にどのように反映されるかを探索的に検討した。大学生参加者に道徳的ジレンマ場面を提示し,その場面に対して自身の意思決定を求めると共に,決定の理由を自由に記述するよう求めた。その結果,理由の記述に表れた道徳基盤が意思決定の方向性に影響していることが示された。フォロワーから倫理的と称されるリーダーの行動や特徴の特定を行う段階で,リーダー自身の価値観とフォロワーからの評価との関連を検討するための集団単位の調査を行う必要があるが,その調査で測定する項目を絞り込む作業が難航している。欧米における先行研究の知見と必ずしも一致しない部分があり(勢力の機能など),倫理性・道徳性・価値観における文化差に関する研究知見を参照しながら進めているためである。しかし,この調査については次年度前半に実施できる見込みである。インタビュー対象者は現在も獲得を続けており,平成30年度中にはインタビューを終えて平成29年度に実施予定であった調査を実施できる見込みである。当初予定していた平成30年度実施予定の実験室実験は,インタビュー調査の内容に依存しない部分から予定通り実施する。令和元年度は最終年度であるため,上述した集団単位の調査を実施するとともに,リーダーの倫理的意思決定のメカニズムを解明するための実験室実験を実施する。実験室実験については,平成29年度の研究においてリーダーの勢力の効果が予測と異なっていたため,勢力が熟考に及ぼす効果を検討できるデザインに変更する予定である。平成29年度に予定していた部署単位のインターネット調査が平成30年度にずれ込んだため,その調査費用分が平成30年度分に加えられている。平成30年度中に,そのインターネット調査を行う予定である。平成30年度に予定していた部署単位の調査項目の絞り込みが難航したため,その調査費用分が令和元年度分に加えられている。令和元年度中に,その調査を行う予定である。また,実験室実験にかかる人件費も使用する予定である。
核ーミトコンドリアゲノム間の機能的不和合性を導入したモデル生物の作出

ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の突然変異が様々な疾患の遺伝的原因になる可能性が示唆されていることを受け、変異型mtDNA分子種を起点とした多様な病態の理解や治療法の探索には、変異型mtDNA分子種を導入したモデル動物の作製と活用が効果的な研究戦略となる。しかし、個体のmtDNA分子を人工改変できないという技術的な限界から、モデル動物の作製は停滞し、当該研究領域の展開が遅延する原因となっている。そこで本研究では、共生関係の成立過程で「したたかに築かれた機能的・遺伝的連携」に不和合性を誘導し、ミトコンドリア機能異常を発症する新奇モデル細胞及びモデルマウスの作出を行う。さらにこれらのモデルを活用し、mtDNA分子種を起点とした多様な病態発症機構の理解を目指している。前年度に引き続き、今年度は下記のような成果を得ている。1前年度に、Mus caroliのmtDNAを一般的な実験用マウスの核と共存させると呼吸活性の低下が誘導されることを示していた。今年度は、このMus caroliのmtDNAをマウスES細胞に導入し、キメラマウスを得ることに成功した。2また、C3H系統のマウス由来のmtDNAを有する細胞では低酸素に対する感受性が増加し、腫瘍形成力が低下していることを明らかにし、核とmtDNAの由来が異なることで細胞の性質に影響が出ることを突き止めた。3さらに、tRNA Lysの遺伝子上に位置するG7731A変異を見出し、この変異を有するモデルマウスの作製に成功した。この変異を高い割合で有するマウスには呼吸活性の低下がみられ、病態モデルマウスとして有用であることが証明された。25年度が最終年度であるため、記入しない。ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の突然変異が様々な疾患の遺伝的原因になる可能性が示唆されていることをうけ、変異型mtDNA分子種を起点とした多様な病態発症機構の存在が注目を集めている。このような多様な病態の理解や治療法の探索には、変異型mtDNA分子種を導入したモデル動物の作製と活用が効果的な研究戦略となる。そこで本研究では、共生関係の成立過程で「したたかに築かれた機能的・遺伝的連携」に不和合性を誘導し、ミトコンドリア機能異常を発症する新奇モデル細胞およびモデルマウスの作出を行う。今年度の成果として以下の3つをあげる。1)培養細胞レベルにおいて、Mus caroliのmtDNAを実験動物マウスの核と共存させると、ミトコンドリア呼吸機能不全が誘導されることを突き止めた。これにより、Mus caroliのmtDNAを含有するモデルマウスが病態モデルになり得ると結論した。2)新たに作製した活性酸素種を漏出する変異型mtDNAを導入したマウスではリンパ腫と高血糖が誘発されることが分かった。3)mtDNA複製の校正機能を破壊したモデルマウスから得たランダムな突然変異が生じた多様な変異型mtDNA分子集団が培養細胞レベルにおいてミトコンドリア呼吸機能を低下させることを突き止めた。mtDNAは人為改変できないことから、変異型mtDNA分子種を含有するマウスの作製は天然に存在する病原性mtDNA分子種(体細胞突然変異で生じた微量の病原性mtDNA分子種)を検出/単離し、それらを濃縮後、マウス初期胚またはマウスES細胞にミトコンドリアごと移植するという方法を取らざるを得ない。本研究の実施により、核とミトコンドリアの共生成立過程で「したたかに築かれた機能的・遺伝的連携」に不和合性を誘導できるmtDNA分子種を見出すことに成功している。

この発見によって、変異型mtDNA分子種を含有するマウスの作製が加速するとともに、最終目的である変異型mtDNA分子種による多様な病理の解明により近づいたことになる。Mus caroli由来のmtDNA分子をマウスES細胞に導入し、全身性にこのmtDNA分子を保有するモデルマウスの作製を行う。得られたマウスの包括的な病理解析(組織病理・糖代謝/インスリン感受性・行動解析など)を実施し、mtDNAに起因する病態のモデルとしての評価を行う。さらに、既に作製した複数の変異型mtDNA分子導入マウスとの比較解析により、変異型mtDNA分子種による多様な病理の解明を達成できる研究環境を築きたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ダム下流等に見られる河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系の解明

現地観測による河床低攪乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出、そこでの素過程を模した室内実験を踏まえ、河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系を考察した。その実施に際しては、流域特性とダムの影響に着目し、(1)河床材料のサイズ構成変化とその生態的影響、(2)水生生物による河床固化、(3)各プロセスを統合したモデル化による河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系の解明といったサブテーマにより構成した。本研究は,洪水による自然攪乱を内包する河川という環境に成立する生態系を適切に理解するため,付着藻類による1次生産,水生昆虫などによる2次生産が極めて大きく,魚類等の再生産の場としても機能する礫床河川の河床環境に着目し,ダム建設等のインパクトが下流河道の河床の低攪乱化を介して生態系をどう変えるのかを明らかにすることを目的とする.研究計画の全容としては,現地観測による河床低攪乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出を踏まえ,河床の低攪乱化における物理ー生物相互作用系をモデリングする.現地観測による河床低攪乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出、そこでの素過程を模した室内実験を踏まえ、河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系を考察した。本研究は,洪水による自然攪乱を内包する河川という環境に成立する生態系を適切に理解するために,付着藻類による1次生産,水生昆虫による2次生産・消費が極めて大きく,魚類等の再生産の場として機能する礫床河川の河床環境に着目し,ダム建設等の影郷響が河川の攪乱レジームをどう変えるのか,その因果関係を記述することを目的とする.河川環境の劣化が顕著となりながら,その修復方法については試行的に実施されているに過ぎない今日にあって,本課題は今後の河川生態系の管理に資する研究であると考えられる.研究計画の全容は,現地観測による河床低攪乱化の現況把握と影響因子の抽出,これに基づいた室内実験を踏まえて,河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系をモデリングする予定であるが,以下では,本年度実施した現地観測とその分析について解説する.河床の低攪乱化は,河床が動きにくくなって移動頻度が減少した状態を指し,河川流とそれにより運搬される材料の連続性が分断されることにより引き起こされる.実際の現象としては,河床材料のサイズ変更(粗粒化)を伴う場合と水生生物が環境を改変して材料同士を接着させる「河床固化」に分けて考えられる.この前者については,流域の表層地質に着目した小河川の材料構成比較により,地形的特性に関わらず,地質によって生産材料の質(サイズ,形状など)が異なることを実証した.一方,後者については,様々な礫床河川区間における河床固化の実態把握を行い,ダム下流における固化は明確であり,底質の構成により変化するが,人為的なフラッシュ放流による影響は観察されなかったことを明らかにした.ここで得られた知見は,次年度以降,追加の現地観測および室内実験により検証が加えられる予定であり,河床の低攪乱化の実態とその機構解明の端緒に位置づけられる.本研究は,洪水による自然攪乱を内包する河川という環境に成立する生態系を適切に理解するために,付着藻類による1次生産,水生昆虫による2次生産が極めて大きく,魚類等の再生産の場としても機能する礫床河川の河床環境に着目し,ダム建設等のインパクトが下流河道の河床の低攪乱化を介して生態系をどう変えるのかを明らかにすることを目的とする.河の低攪乱化は河床が動きにくくなって移動頻度が減少した状態を指し,実現象としては, (1)河床材料のサイズ構成変化(粗粒化)を伴う場合と(2)水生生物が環境を改変して材料同士を接着させる「河床固化」に分けて考えるものとした.研究計画の全容としては,現地観測による河床低攪乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出,そこでの素過程を模した室内実験を踏まえ,河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系をモデリングする.本年度は,三重県松阪市に位置し中央構造線に沿って広がる櫛田川流域において,構成する表層地質に着目した小河川の材料構成を調査したところ,地形的特性に関わらず,地質によって生産材料のサイズ,形状が異なることが明らかになった.さらに,流下に伴う細粒化現象について磨耗・破砕作用に着目した室内実験を行ったところ,火成岩(領家帯) ,堆積岩(秩父帯)は壊れにくいのに対し,変成岩(三波川帯)は破砕することが多かったほか,堆積岩(秩父帯)では細粒分が派生しにくいといった傾向が確認され,岩種(地質区分)によって異なる細粒化特性が記述できた.これらは,前記(1)を対象とした検討であるが,同一フィールドにおいて水生生物に関する調査にも着手しており, (2)の分析材料とすべく水生生物の群集組成を把握している最中である.

本研究は,洪水による自然撹乱を内包する河川という環境に成立する生態系を適切に理解するため,付着藻類による1次生産,水生昆虫などによる2次生産が極めて大きく,魚類等の再生産の場としても機能する礫床河川の河床環境に着目し,ダム建設等のインパクトが下流河道の河床の低攪乱化を介して生態系をどう変えるのかを明らかにすることを目的とする.河床の低攪乱化は河床が動きにくくなって移動頻度が減少した状態を指し,実現象としては,(1)河床材料のサイズ構成変化(粗粒化)を伴う場合と(2)水生生物が環境を改変して材料同士を接着させる「河床固化」に分けて考えるものとした.研究計画の全容としては,現地観測による河床低攪乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出,そこでの素過程を模した室内実験を踏まえ,河床の低攪乱化における物理-生物相互作用系をモデリングする.本年度は,昨年度に引き続き,三重県松阪市に位置し中央構造線に沿って広がる櫛田川流域を対象とし,地理情報システムによって流域特性を整理したうえで,流域の土砂動態とその生態的影響を分析した.具体的には,以下の2つのサブテーマに集約される.(1)山地流域における土砂生産特性に表層地質構成が及ぼす影響地形特性が類似して地質構成が異なる小流域からの土砂生産特性について,小ダム(貯留ダム)における堆砂量を調査分析したところ,変成岩で構成される流域と堆積岩で構成される流域では降雨に対する土砂流出が異なることが明らかになり,降雨特性を説明変数とする重回帰式が得られた.(2)流域の表層地質が河床材料構成,底生動物組成に及ぼす影響表層地質構成に着目した小河川の河床底質を調査したところ,優占する地質によって材料構成が異なり,それに応じて特徴的な底生動物組成が成立し,群集の多様度にも大きな影響を与えていることが示唆される結果が得られた.本研究は,洪水による自然撹乱を内包する河川に成立する生態系を適切に理解するため,付着藻類による1次生産,水生昆虫などによる2次生産が極めて大きく,魚類等の再生産の場としても機能する礫床環境に着目し,ダム建設等のインパクトが下流河道の生態系に及ぼす影響明らかにすることを目的とした.河床の低撹乱化は河床が動きにくくなって移動頻度が減少した状態を指し,ここでは,(1)河床材料のサイズ構成変化(粗粒化)を伴う場合と(2)水生生物が環境を改変して材料同士を接着させる「河床固化」を対象とした.現地観測による河床低撹乱化の現況把握と物理・生物影響因子の抽出,そこでの素過程を模した室内実験を踏まえ,河床の低撹乱化における物理-生物相互作用系を記述した.三重県松阪市に位置し中央構造線に沿って広がる櫛田川流域を始めとする伊勢湾流域圏を対象とし,地理情報システムによって流域特性を整理したうえで,流域の土砂動態とその生態的影響を分析した.具体的には,以下の2つのサブテーマに集約される.(1)山地流域における土砂流出特性,河床材料構成に表層地質構成が及ぼす影響地形特性が類似して地質構成が異なる小流域からの土砂生産特性について,ダム貯水池内の堆砂データを表層地質を始めとする流域特性から系統的に整理し,水理モデルによる記述を行った.さらに,櫛田川流域を対象として,岩種に応じた磨耗・破砕特性を考慮した土砂水理モデルを構築し,表層地質構成が河床材料構成に及ぼす影響を分析した.(2)流域の表層地質が河床材料構成,底生動物組成に及ぼす影響表層地質構成に着目した小河川の河床底質を調査したところ,優占する地質によって材料構成が異なり,それに応じて特徴的な底生動物組成が成立し,群集の多様度にも大きな影響を与えていることが示唆される結果を得た.さらに,これらの因果関係について統計モデルによる記述を試みた.
ヒトＰ２Ｘ４受容体の３次元構造を基盤とした神経障害性疼痛抑制分子の探索

神経障害性疼痛の原因蛋白質P2X4受容体に結合して機能抑制する分子の探索を行った。既に確立済みのラットP2X4受容体結合モノクローナル抗体(mAb)と同様な手法により、抗ヒトP2X4受容体細胞外ドメインmAbを作成した。それらのmAbはヒト2X4受容体のいくつかの領域に結合したが、P2X4受容体発現細胞を用いた実験で疼痛抑制効果がなかった。この結果は、これらのmAbが生理的条件で取りうるヒトP2X4受容体の3量体構造に結合しない事が原因であることを示唆した。3次構造を持ったヒトP2X4受容体の細胞外ドメインを調製し、抗原としてラットに免疫した。経時的に眼窩採血を行い、抗体価を評価したところ、数週間で適当な抗体価が得られた。次に定法に従い、マウスの脾臓を摘出後、脾細胞を回収し、ミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを調製した。ELISA法を用いて、ハイブリドーマの中にラットP2X4受容体の細胞外ドメインに結合せず、ヒトP2X4受容体の細胞外ドメインと特異的に結合するものが18個の培養上清に見いだされた。次年度は、これらをクローニングして、エピトープの解析、イメージングに使える抗体または機能阻害抗体かどうかを評価する。一方、X線結晶解析により立体構造が解析されたゼブラフィッシュP2X4受容体の構造を基にモデル動物であるラットP2X4モデリングを行い、サイト5に結合する候補化合物を市販されている低命子化合物のライブラリーから計算科学(ソフトウエアーMOEを使用)的にスクリーニングした。候補化合物20種類を入手し、それらがラットP2X4受容体を発現する培養細胞を用いて、ATP存在下でカルシウムの取り込みを阻害するかどうかについて解析した。その結果、いずれの化合物も阻害効果を示さなかった。今後は別のP2X4受容体の領域に対して、計算科学的に結合する化合物をスクリーニングする。さらに、既に我々が調製している3次構造を持ったヒトP2X4受容体の細胞外ドメインはATP結合能を持っていなかったことから、調製されたヒト細胞外P2X4は適切な3量体構造を持っていないことが示唆された。平成24年度では、ヒトP2X4受容体の細胞外ドメインを試験管内で巻き戻したものを抗原として、自己免疫疾患マウス、P2X4ノックアウトマウスを用いて抗体を作成し、この抗原に結合するモノクローナル抗体18種を得たことを報告した。平成25年度では、ヒトP2X4細胞外ドメインのN末側、C末側からアミノ酸配列を欠損させた蛋白質10種類を調製して、これらのモノクローナル抗体との結合を調べた。ウエスタンプロットの結果、18種類のほとんどはヘッドドメインに結合したが、それ以外のヒトP2X4細胞外の領域に結合するものも見出された。一方、天然型ヒトP2X4受容体に結合する抗体を探すために以下のような系を構築した。すなわち、ヒトP2X4受容体のC末端側に蛍光蛋白質であるGFPを連結したリコンビナント蛋白質を構築し、培養細胞で発現した。その蛋白質を粗精製してゲルロ過に供した。溶出はGFPの蛍光発光の波長で追跡した。ヒトP2X4は3量体蛋白質で生理活性を持つが、ゲルロ過ではP2X4受容体が3量体を形成している位置に溶出していた。また、生理活性なP2X4は3量体を形成する分子間にATPが結合するが、熱安定性を評価からATP結合型のヒトP2X4受容体が生成していることがわかった。P2X4受容体の細胞内領域に結合する抗体(市販品)存在下で、高分子側にP2X4受容体由来のピークが溶出したことから、この系では、P2X4受容体に結合する抗体を選別できることがわかった。そこで、昨年度得た抗体存在下で実験を行ったが、いずれもP2X4受容体由来のピークの溶出位置は変化せず、これらの抗体は天然型P2X4受容体に結合しなかった。以上のことから、本実験で用いた抗原では、天然型ヒトP2X4受容体に結合する抗体を得ることができなかった。しかし、天然型ヒトP2X4受容体に強く結合する抗体をスクリーニングするアッセイ系を構築することができた。このアッセイ系は天然型ヒトP2X4受容体に強く結合する抗体の選別に有益である。H23年度3次元構造を持つヒトP2X4受容体の細胞外ドメインを抗原としてマウスに対して免疫し、定法によりハイブリドーマを作成した。それらの中から18個をクローニングしたので、今年度はヒトP2X4受容体の細胞外ドメインの欠損変異体を10種類作成し、18のモノクローナル抗体のエピトープを同定した。

その結果、18のモノクローナル抗体はヒトP2X4受容体の異なる5つの領域に結合するタイプに大別するできた。この結果は、3次元的な構造を持つP2X4受容体の細胞外ドメインに対して、マウス体内で異なる結合様式の抗体が産生していることを示唆していた。一方、同様の抗原を用いて、自己免疫疾患マウス、P2X4ノックアウトマウスを用いて抗体を作成し、定法によりハイブリドーマを作成した。既に我々が調製したラットP2X4受容体の細胞外ドメイン内でATP結合領域(P2X4受容体は3量体の膜結合蛋白質で、サブユニット間にATP結合部位が存在すること、ATPが結合することでその構造が変化しカルシウムの細胞内への取り込みが行われることが報告されている)に隣接するヘッドドメインに特異的に結合する抗体について特徴付けを詳細に行い、一連の結果を論文として発表した。H23年度我々はヘッドドメインの溶液構造がX線結晶解析の結果とほぼ同一の折れたたみ構造を持つ事を明らかとしている。そこでヘッドドメインに対する抗体を作成するため長期間にわたりマウスに免疫を行ったが、抗体価は上がらなかった。ヘッドドメイン領域に金属イオンが結合することにより、ヒトP2X4受容体の機能の向上や低下が報告されている。そこでNMRを用いて金属イオンがヘッドドメインのどのアミノ酸周辺に結合するのかを同定した。今後、滴定型熱量計での金属イオンとP2X4受容体との結合力等の評価により、P2X4受容体の生理機能に及ぼす金属イオンの影響を考察する。機能評価には至っていないが、ヒトP2X4受容体特異的な抗体が調製できていることが主な理由である。計算科学的に候補化合物をスクリーニングする方法では機能阻害化合物を得ることができなかったが、計算科学による化合物の絞り込み、機能評価という一連の研究を実施できたという点も加え、全体的に進捗状況としては順調と判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。3次元構造を持つP2X4受容体に対する抗体が産生することを明らかとし、その一部を今年度報告した。また、3次元構造を持つ抗原蛋白質の種々の部位にモノクローナル抗体が結合することを明らかとした。さらに、P2X4受容体の生理活性に関与する金属イオンの効果についてNMRを用いて解析した。このように順調に成果が出ている。しかし、疼痛抑制分子がまだ見いだされていない現状を踏まえて評価は(2)とした。ヒトP2X4受容体の細胞外ドメインに対する抗体のクローニングとそれらのモノクローナル抗体の機能評価を行う。並行してヒトP2X4受容体が適切に3量体を形成できるような調製法を検討し、効率的に機能阻害抗体を作製するとともに、3量体構造のヒトP2X4受容体のX線結晶解析を目指す。3次元構造持つ蛋白質対して多様な抗体が産生することが明らかとなったが、P2X4受容体の機能抑制分子の発見には至っていない。この結果は3次元構造を持つ蛋白質抗原をマウスに免疫することで、種々の抗体を作成することはできるが、抗原の構造が野生型と異なっているため、特定の部位(ATP結合部位など)を認識する抗体をスクリーニングできないことが原因ではないかと考察している。そこで、今後は、野生型構造を持つP2X4受容体を酵母などを用いて発現し、クローニングしたモノクローナル抗体のエピトープが変動するかどうかを解析する。変動した場合は、P2X4受容体のATP結合領域のアミノ酸変異体を調製して、ATPのP2X4受容体への結合を阻害するモノクローナル抗体の選別を行う。
質問の多様な形態と機能を明らかにし利用する「質問工学」の創成

本研究は「広義の質問」を対象とし,(1)質問を観測する状況の設定と記録方法の設定,(2)インタラクションのセンシングと記録,(3)現象の類型化と機能の整理,(4)質問を扱う情報メディアのプロトタイプの検討を行った.まず,複数人が行動する種々の会議,学習・見学の場,ワークショップを対象に,人間の振る舞いをできるだけ簡易かつ自然な行動を妨げずに記録するための環境設定を行い,データ収集を行った.並行して,テキストによる質問応答システムにおける質問の収集を行った.次に,質問の意図,恣意性,回答方法の類型化とそれらのパターン,様々な要求の識別について調査を行った.さらに,会議における質問の類型化とそれによる会議のまとまり(発話の結束性)の推定を行い,システムと人間の協調によって会議状況の可視化を行う手法を提案した.本研究は「広義の質問」を対象とし,(1)質問を観測する状況の設定と記録方法の設定,(2)インタラクションのセンシングと記録,(3)現象の類型化と機能の整理,(4)質問を扱う情報メディアのプロトタイプの検討を行った.まず,複数人が行動する種々の会議,学習・見学の場,ワークショップを対象に,人間の振る舞いをできるだけ簡易かつ自然な行動を妨げずに記録するための環境設定を行い,データ収集を行った.並行して,テキストによる質問応答システムにおける質問の収集を行った.次に,質問の意図,恣意性,回答方法の類型化とそれらのパターン,様々な要求の識別について調査を行った.さらに,会議における質問の類型化とそれによる会議のまとまり(発話の結束性)の推定を行い,システムと人間の協調によって会議状況の可視化を行う手法を提案した.本研究のためには,(1)対象とする状況の設定と環境の設計,(2)インタラクションのセンシングと記録,(3)現象の類型化と機能の整理,(4)情報メディアとしてのプロトタイプ実装と評価があげられる.平成22年度は,上記研究項目のうち,主に(1)-(3)を以下のように進めた様々な状況でのコミュニケーションを収集するために,大きく分けて二つの状況,(a)ノンバーバルコミュニケーションが重要な役割を果たす一般的な状況,(b)言語によるコミュニケーションが中心的な役割を果たしているWebでの質問応答,について集中的にデータ収集と調査を行った(a)としては,会議,学習・見学の場,ワークショップでの状況の収録と整理を行った.このような場では,明示的な行動に加えて,さりげない振る舞いによる質問の意図表明や情報要求の発現が行われる.会議では,参加者の発話の状況と共に,発話に至るまでの態度と共に,質問を核とした議事進行の可視化について検討を行った.学習・見学の場では,個人視点の映像記録(ライフログ)とその他のセンサによる補強を行いながら,場の記録を行った.例えば,博物館での見学では,説明者と見学者の振る舞い,質問のタイミングやしぐさ,個人的な見学をしているときの振る舞いなどから,質問に至るまでの様子や質問しやすさ,しにくさ等をモデル化するための記録が得られた.ワークショップでは,作業をしながらの対話・会話を対象に,データ収集とモデル化を行った.今後,これらのデータを基に,質問のモデル化とその認識方法の検討を進めていく予定である(b)では,明示的な質問では問い返しや問い直しが頻繁に行われており,双方向に情報要求がなされていることが顕著に現れていることを基に,それらのパターン,様々な要求の識別方法等について検討を行った.これらを基に,モデル化を進めていく予定である本研究の要素的な研究項目には,(1)対象とする状況の設定と環境の設計,(2)インタラクションのセンシングと記録,(3)現象の類型化と機能の整理,(4)情報メディアとしてのプロトタイプ実装があげられる.平成23年度は,以下のように研究を進めた.(1)としては,昨年度に引き続き,(a)複数人が行動する種々の会議,学習・見学の場,ワークショップを対象に,人間の振る舞いをできるだけ簡易かつ自然な行動を妨げずに記録するための環境設定を行い,データ収集を行った.並行して,(b)テキストによる質問応答システムにおける質問の収集を行った.(2)としては,(1)として設定した状況の収録と解析を行った.質問や疑問の表明には複数人の間の細かな相互作用が用いられている確認してきたが,それを閲覧したり解析するための映像処理にも重要なテーマがあることがわかった.各自が身につけたカメラで収録する映像の広視野化・安定化,複数視点の統合を援用して場を解析する手法を提案した.(3)としては,質問の意図,恣意性,回答方法の類型化とそれらのパターン,様々な要求の識別方法等について検討を行った.説明が不十分であることの指摘する回答のタイプとその指摘にもとづいて再投稿された質問のタイプ,そしてそれぞれのタイプが利用される割合についてYahoo!知恵袋を対象に調査を行った(4)として,(c)会議における質問の類型化とそれによる会議のまとまり(発話の結束性)の推定を行い,システムと人間の協調によって会議状況の可視化を行う手法を提案した.(d)意見、評価、議論などを操作しようとするユーザを昇常な投稿行動の検出,文体の類似判定によって検出する方法について検討を行ったまだ,これらの個々の知見やシステムが有機的に統合されおらず,新しい枠組みを展開するためのさらなる研究が必要である.今後,質問のモデル化と生成手法についてのその認識方法の検討を進めていく予定である.
インスリン抵抗性糖尿病のアルツハイマー病加速機序に関する行動薬理学的研究

アルツハイマー病の原因物質の1つと考えられているアミロイドβタンパク質(Aβ)を糖尿病モデル動物であるGKラットの脳室内に投与する学習障害が発現した。Aβ脳室内投与による学習障害は、糖尿病によるインスリン抵抗性、または高血糖により増悪することが分かった。さらに本研究により糖尿病は合併症としての環境障害によりアルツハイマー病を加速するのみならず、脳内でインスリン抵抗性を作り出す神経膜のマイクロドメインでのインスリンシグナル伝達機構の変調が病態の加速に深く関わることを示唆した。さらに今回作成した動物モデルは臨床像を反映した新たなアルツハイマー病モデル動物として有用であり、これまでにない新しいタイプのアルツハイマー病治療薬の探索に応用できる可能性も示した。糖尿病がアルツハイマー病の危険因子であることは周知であるが,その機序は不明である。本研究では2型糖尿病患者に多く見られるインスリン抵抗性に着目し,これによりアルツハイマー病の進行が加速されるのではないかという仮説をたて,新たな実験動物モデルを作製し検討を行った。インスリン抵抗性が確認された遺伝的糖尿病モデル動物であるGoto-Kakizaki(GK)ラットを用い,それらの脳室内にARを微量投与し学習行動に及ぼす影響を調べた。まず,脳室内に投与するARについて基礎検討を行った。その結果,Aβは23個のオリゴマー体を用いることにより学習記憶に対する行動毒性が強く現れることを見いだした。さらにこの場合は海馬にアポトーシスなどの細胞死を伴わず,AChの遊離減少が生じていることが分かり,本モデルはアルツハイマー病の早期の状態を反映するモデルであり,これかインスリン抵抗性糖尿病との関わりを追究する上でも臨床を反映したモデルであることが分かった。続いてGKラットを用いてインスリン抵抗性の発現を確認し,水迷路課題を用いたて実験を行った結果,Wistarラットではコントロール群とAb投与群の間に遊泳時間の違いはなかったが,糖尿病モデルラットであるGKラットではコントロール群と比較してAβ投与群の遊泳時間は有意に長く,学習障害が発現することが分かった。以上のことより,インスリン抵抗性を示すラットでは,Aβ脳室内投与により容易に学習障害を発現することが明らかとなった。本検討から糖尿病がアルツハイマー病の危険因子である背景にインスリン抵抗性の増大がその役割の一つを演じる可能性が示唆された。インスリン抵抗性を有する遺伝的糖尿病モデル動物であるGoto-Kakizaki(GK)ラットを用い、それらの脳室内にAβオリゴマーを微量投与し学習行動に及ぼす影響を調べた。遺伝的糖尿病モデル動物であるGKラットおよび対照として同週齢のWistarラットを用いた。Aβ(1-42):Aβ(1-40)を1:10の割合で混合し、37°Cで2.5時間インキュベートしたものを、Aβオリゴマーとした。このAβオリゴマーをラットの両側脳室内に微量投与し、Morris水迷路課題による学習評価を行った。また、組織学的検討として、ラット脳の海馬錐体細胞のHE染色およびTUNEL染色を行った。Aβオリゴマーを処置したWistarラットの遊泳時間は、溶媒処置したWistarラットと比較して変化はなかった。Aβオリゴマーを処置したGKラットの遊泳時間は、溶媒処置した群と比較して延長した。また、HE染色およびTUNEL染色の組織学的検討より、WistarラットとGKラットのAβオリゴマー処置群は溶媒投与群と比較して、変化は認められなかった。Aβオリゴマーを処置したGKラットは溶媒処置した群と比較して学習障害が発現していたことより、糖尿病ラットでは、Aβオリゴマー脳室内投与により学習障害を発現することが分かった。Aβ脳室内投与による学習行動は、糖尿病によるインスリン抵抗性、または高血糖により増悪することが考えられた。これは疫学的調査や臨床報告でなされているように、糖尿病がアルツハイマー病の加速因子となりうることが示唆された。このモデルは臨床像を反映した新たなアルツハイマー病モデル動物として有用であり、これまでにない新しいタイプのアルツハイマー病治療薬の探索に応用できる可能性が示唆される。
フローフォーカッシングにより高伸張速度を達成する平面伸張流動場発生技術の開発

フィルムやペットボトルの成形加工に用いられる平面伸張流動場における高分子流体の挙動を調べるために,シース流を利用して試料を急速に加速しフィルム状に引き延ばすフローフォーカッシングを用いて安定した高伸張速度の流れ場を形成した.伸張速度をさらに増加させるために流体駆動と試験部を一体化した装置を作り効果を確認した.さらに,定常伸張流動中に180旋回する流路を用いて伸張応力の評価も行った.フィルムやペットボトルの成形加工に用いられる平面伸張流動場における高分子流体の挙動を調べるために,シース流を利用して試料を急速に加速しフィルム状に引き延ばすフローフォーカッシングを用いて安定した高伸張速度の流れ場を形成した.伸張速度をさらに増加させるために流体駆動と試験部を一体化した装置を作り効果を確認した.さらに,定常伸張流動中に180旋回する流路を用いて伸張応力の評価も行った.本研究では二次元縮小流路とフローフォーカッシングを組み合わせた手法により高伸張速度を達成する平面伸張流動発生技術の開発を目的とする.フローフォーカッシングとは伸張させたい流体の流れ場(サンプル流)に対してその外側に別の流体を用いた流れ場(シース流:Sheath flow)を作り,シース流を駆動力としてサンプル流をフィラメント状,あるいは最終的に引きちぎられるまで伸張させる流れ場である.流れ場を安定させる流路形状,シース流の制御方法を検討し,伸張速度およびひずみ量に及ぼす効果を定量的に明らかにする.本年度は流路の設計・製作と流動駆動システムの構築および予備実験を行うことを予定した.流路として安定した二次元流動場を形成するための形状を検討し,テストセクション上流部において乱れの少ない流れを形成する形状を検討し,試験部の手前に二次元縮小部をもつ構造を採用した.テストセクションはシース流とサンプル流の流動方法を様々な形態でテストできるよう,簡単に流路が交換できる構造とした.さらにシース流とサンブル流を流入させるための駆動系を検討し,製作した.シース流については流量を大きく変化させることを考慮して圧力駆動型とし,サンプル流はシリンジポンプにより定量的に駆動するようにした.流路部分はガラスの観察窓を通じて内部を顕微鏡観察できるよう設計した.顕微鏡および光学系を取り付けた観察システムの構築も完成した.これらの装置により流動試験を行ったが水漏れなどの支障が出たため補修および改造を行っている.本研究では二次元縮小流路とフローフォーカッシングを組み合わせた手法により高伸張速度を達成する平面伸張流動発生技術の開発を目的とする.フローフォーカッシングとは伸張させたい流体の流れ場(サンプル流)に対してその外側に別の流体を用いた流れ場(シース流:Sheath flow)を作り,シース流を駆動力としてサンプル流をフィラメント状,あるいは最終的に引きちぎられるまで伸張させる流れ場である.流れ場を安定させる流路形状,シース流の制御方法を検討し,伸張速度およびひずみ量に及ぼす効果を定量的に明らかにする.本年度は流れ場の観察と伸張速度の評価を実施し,また,新たな実験装置の試作を実施した.シリンジポンプにより定量的にサンプル流を形成し,これをシース流で加速するが,シース流は水をヘッドタンクからの圧力により駆動した.形成されたサンプル流の形状をCCDカメラにより形状を撮影し,伸張速度を実測により評価した.平面伸張流動が形成され所定の伸張速度が得られていることを確認した.しかし,高速伸張を達成するにはこのままでは難しいため新しい流路の設計と試作を行った.新型の流路はシリンジ部と流路が一体となった構造であり,シリンジを高速で駆動することにより高い伸張速度を得ることができると期待される.流動試験を実施し平面伸張流動が形成されることは確認したが,流体の漏れなど技術的な問題点が残り,次年度の課題となっている.本研究では二次元縮小流路とフローフォーカッシングを組み合わせた手法により高伸張速度を達成する平面伸張流動発生技術の開発を目的とする.フローフォーカッシングとは伸張させたい流体の流れ場(サンプル流)に対してその外側に別の流体を用いた流れ場(シース流:Sheath flow)を作り,シース流を駆動力としてサンプル流をフィラメント状に伸張させる流れ場である.流れ場を安定させる流路形状,シース流の制御方法を検討し,伸張速度およびひずみ量に及ぼす効果を定量的に明らかにする.昨年度までに製作した流路に加えて,本年度は二次元縮小流路部に一定の曲率を有する旋回部を設置した流路を新たに設計した.この流路では平面伸張流動に旋回流動を合わせた流れ場を形成することが可能で,昨年度までの平面伸張流動場形成に対して,旋回部での遠心力と伸張応力による締め付け力の釣り合いより伸張応力を推定することを目指した.伸張応力の大小によりシース流に包まれたサンプル流が流路内の中心面からのずれ量が決定できるため,旋回部でのサンプル流の軌道を正確に求めればサンプル流に作用する伸張応力を算定することができる.これにより,昨年までの可視化による伸張速度評価と合わせて平面伸張粘度を算出することができる.これまで平面伸張粘度を測定することが困難であった希薄高分子溶液に対して本手法を適用し,平面伸張粘度を求め本手法の有効性を示した.