hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物細胞におけるリボゾームRNAのプロセシングとリボゾーム前駆体の形成

マウスГRNAは, RNAポリメラーゼエにより約14.000塩基長の45-47S前駆体RNAとして転写された後,数段階のプロセシングを受け, 18S, 5.8S,及び28SГRNAへと成熟することが知られているが,その分子レベルでの解析は未だ進んでいないのが現状である.このプロセシング機構を解明するため,先ずinvitroプロセシング系の開発を試みたところ, ГDNAの転写と共役及び脱共役化したプロセシング系として,18SГRNAの5′末端上流105塩基上流でプロセシングが生じる系が得られた.このプロセシングはinvivoГRNAにも見い出された.そこで,このプロセシングに関与する因子及び識別シグナルとなる塩基配列の検索を行った.その結果,転写に必要な因子とは別なプロセシングに関与する蛋白性因子の存在が見い出された.この因子は,熱処理により失活し,マイクロコッカルヌクレアーゼ処理に抵抗性を示した.また,このプロセシング活性は, Mg2+及びNTPの要求性がなく, 40-80mM塩化カリウムに至適塩濃度があった.一方,このプロセシングを規定するシグナル塩基配列を求めるため,プロセシング部位近傍の種々の欠失変異DNAをBAL31を用いて作成し,プロセシングが生じるか否かを検定した.その結果,プロセシング部位上流219塩基から下流26塩基の領域が必要なことが明らかとなった.この領域には,プロセシング部位をはさんで21塩基長から成るステム・ループの2次構造をとりうる配列があり,プロセシングシグナルとなる可能性を示唆した.又,このinvitro系で,スペーサー領域に生じるRNA切断部位近傍には, GGYUUGYの7塩基から成る共通塩基配列が見い出されたことから,プロセシングに何らかの役割を担っている可能性を示唆した.以上のように, 18SГRNAの5′末端上流105塩基のプロセシングを見い出し,それに関与する蛋白因子とプロセシングを規定する塩基配列を明らかにした.マウスГRNAは, RNAポリメラーゼエにより約14.000塩基長の45-47S前駆体RNAとして転写された後,数段階のプロセシングを受け, 18S, 5.8S,及び28SГRNAへと成熟することが知られているが,その分子レベルでの解析は未だ進んでいないのが現状である.このプロセシング機構を解明するため,先ずinvitroプロセシング系の開発を試みたところ, ГDNAの転写と共役及び脱共役化したプロセシング系として,18SГRNAの5′末端上流105塩基上流でプロセシングが生じる系が得られた.このプロセシングはinvivoГRNAにも見い出された.そこで,このプロセシングに関与する因子及び識別シグナルとなる塩基配列の検索を行った.その結果,転写に必要な因子とは別なプロセシングに関与する蛋白性因子の存在が見い出された.この因子は,熱処理により失活し,マイクロコッカルヌクレアーゼ処理に抵抗性を示した.また,このプロセシング活性は, Mg2+及びNTPの要求性がなく, 40-80mM塩化カリウムに至適塩濃度があった.一方,このプロセシングを規定するシグナル塩基配列を求めるため,プロセシング部位近傍の種々の欠失変異DNAをBAL31を用いて作成し,プロセシングが生じるか否かを検定した.その結果,プロセシング部位上流219塩基から下流26塩基の領域が必要なことが明らかとなった.この領域には,プロセシング部位をはさんで21塩基長から成るステム・ループの2次構造をとりうる配列があり,プロセシングシグナルとなる可能性を示唆した.又,このinvitro系で,スペーサー領域に生じるRNA切断部位近傍には, GGYUUGYの7塩基から成る共通塩基配列が見い出されたことから,プロセシングに何らかの役割を担っている可能性を示唆した.以上のように, 18SГRNAの5′末端上流105塩基のプロセシングを見い出し,それに関与する蛋白因子とプロセシングを規定する塩基配列を明らかにした.マウスrRNAは、約14,000塩基長の47S前駆体RNAとして合成された後、プロセシングを受け18S,5.8S及び28SrRNAへと成熟する。このプロセシング機構の分子レベルでの解析を行うため、マウスrRNAの合成開始点近傍のDNA断片(合成開始点から上流170塩基と下流291塩基)を含むプラスミドpMrSpと28SrRNAの5'末端を含む3.400塩基長のDNA断片(28SrRNAの5'末端から上流660塩基と下流約2.700塩基)を連結したミニジーンpMrSP/SSst(28A)を作成した。これを鋳型として用い、マウスFM3A細胞から調製したS100を酵素標品とし、in vitro転写系により20分間の反応で【^(32)P】-RNAを合成した。20分後、非放射化UTPを添加し、30分,60分とチェイスし、蓄積されるRNAの有無を検討した。その結果、28SrRNAの5'末端のプロセシングは検出されなかったが、28SrRNAの5'末端上流500塩基上流でプロセシングを受ける部位が在ることが見い出された。

即ち、pMrSP/SSst(28A)DNAをHae【III】で切断したものを鋳型として用いると、470塩基長のrun-off転写産物が得られ、チェイスにより415,340及び230塩基長のRNAへと移行した。このうち、230塩基長のRNAは、pMrSPDNAを鋳型として用いた時にも見い出された。パルスチェイス法により、これらRNAが蓄積することから、プロセシングに関与するものと考えられる。pMrSP及びpMrSP/SSst(28A)DNAから合成されたRNAのプロセシング部位を、SIヌクレアーゼ保護マッピング法により塩基レベルで調べた。その結果、即に報告した18SrRNAの5'末端上流のプロセシング部位を含め、in vitroプロセシング系で見い出された切断部位近傍には、【C!T】GG【C!T】TG【C!T】という共通塩基配列が存在することが示唆された。又、核小体に局在する低分子RNAU3に、この部分と相補性をもつAAGCCG配列が見い出され、低分子RNAがプロセシングに関与する可能性が考えられた。
生体材料-骨界面における3次元骨構造の解析と材料の表面構造の影響

本研究では,アパタイト焼結体および高純度チタン製インプラントをウサギ脛骨に埋入し,埋入後早期からバイオインテグレーションおよびオッセオインテグレーション獲得に至るまでのプロセスを,我々が独自に開発した3次元骨構造観察システムを用いて解析した.従来のインプラント周囲骨の観察は,研磨標本を作製することによって2次元的に行っており,インプラント周囲骨組織の全体像を把握することは困難であった.さらに,このような方法では骨接触率等の定量化が困難であり,また,定量化を行ったとしても全体の一部分に過ぎず,データが研究者によって大きく異なるという問題点を抱えていた.本観察システムでは、染色技法によりインプラント,骨,その他周囲組織に明瞭に分類できるためデジタル化が容易となった.このため,骨以外の周囲組織を取り除いた骨とインプラントの関係が3次元的に容易に観察できるだけではなく,インプラント-骨界面における接触率とインプラント周囲骨体積率についての定量化が可能となった.このシステムを用いてアパタイト,チタン,カルシウム注入チタンインプラントを比較したところ,アパタイトインプラントでは,埋入後2週から著明なロ-ト状の新生骨形成がみられ、埋入後4週でピークを迎えて骨接触率,骨体積率ともに最大値を示し,以後,減少していった.これに対し,チタンインプラントでは,経時的に増加する傾向を示し,本研究において最も長い観察期間である8週後に骨接触率60%と最も大きい値を示した.カルシウム注入チタンでは両者の中間的な傾向であった.このように各種材料間でインプラント埋入後の骨反応に大きな違いがあることが明らかとなった.本研究では,アパタイト焼結体および高純度チタン製インプラントをウサギ脛骨に埋入し,埋入後早期からバイオインテグレーションおよびオッセオインテグレーション獲得に至るまでのプロセスを,我々が独自に開発した3次元骨構造観察システムを用いて解析した.従来のインプラント周囲骨の観察は,研磨標本を作製することによって2次元的に行っており,インプラント周囲骨組織の全体像を把握することは困難であった.さらに,このような方法では骨接触率等の定量化が困難であり,また,定量化を行ったとしても全体の一部分に過ぎず,データが研究者によって大きく異なるという問題点を抱えていた.本観察システムでは、染色技法によりインプラント,骨,その他周囲組織に明瞭に分類できるためデジタル化が容易となった.このため,骨以外の周囲組織を取り除いた骨とインプラントの関係が3次元的に容易に観察できるだけではなく,インプラント-骨界面における接触率とインプラント周囲骨体積率についての定量化が可能となった.このシステムを用いてアパタイト,チタン,カルシウム注入チタンインプラントを比較したところ,アパタイトインプラントでは,埋入後2週から著明なロ-ト状の新生骨形成がみられ、埋入後4週でピークを迎えて骨接触率,骨体積率ともに最大値を示し,以後,減少していった.これに対し,チタンインプラントでは,経時的に増加する傾向を示し,本研究において最も長い観察期間である8週後に骨接触率60%と最も大きい値を示した.カルシウム注入チタンでは両者の中間的な傾向であった.このように各種材料間でインプラント埋入後の骨反応に大きな違いがあることが明らかとなった.近年,コンピュータグラフィック上で2次元像を重ね合わせて立体構築した後,任意の断面で画像を取り出すことのできる3次元構築システムが発表され興味を持たれている.本研究の目的は,我々の開発したインプラント周囲骨の3次元構築システムにより,各種インプラント材料と表面性状の異なるものを埋入したときの骨と生体材料との3次元的なインターフェイスを観察し,経時的な骨形成メカニズムを解明することにある.本年度は,いずれもスムーズな表面をもつアパタイトインプラントとチタンインプラントについて検討した.実験には,ニュージーランド白兎を用いた.脛骨を露出し,通法どおりインプラント窩を形成してそれぞれのインプラントを埋入した.2,4,8週後に屠殺して組織ブロックを作製し,我々の開発した方法に従ってインプラント周囲骨構造を3次元的に再現した.得られた3次元像をもとにインプラント周囲の骨体積率,インプラント-骨界面での接触率を算出したところ以下の結果が得られた.1)アパタイト、チタンのいずれのインプラントにおいても,骨体積率および骨接触率は埋入部位に依存する傾向にあった.2)アパタイトインプラントでは,2,4週後に著名な新生骨形成により,高い骨体積率および骨接触率を示したが,8週後には減少していた.3)チタンインプラントでは,2,4,8と時間の経過につれて骨体積率および骨接触率は増加する傾向にあった.以上の結果より,アパタイトとチタンはそれぞれ骨形成メカニズムに違いのあることが明らかとなった.来年度は,カルシウム注入チタンインプラントについても同様の検討を行う予定である.本研究では,アパタイト焼結体および高純度チタン製インプラントをウサギ脛骨に埋入し,埋入後早期からバイオインテグレーションおよびオッセオインデグレーション獲得に至るまでのプロセスを,我々が独自に開発した3次元骨構造観察システムを用いて解析した.従来のインプラント周囲骨の観察は,研磨標本を作製することによって2次元的に行っており,インプラント周囲骨組織の全体像を把握することは困難であった.さらに,このような方法では骨接触率等の定量化が困難であり,また,定量化を行ったとしても全体の一部分に過ぎず,データが研究者によって大きく異なるという問題点を抱えていた.本観察システムでは,染色技法によりインプラント,骨,その他周囲組織に明瞭に分類できるためデジタル化が容易となった.

このため,骨以外の周囲組織を取り除いた骨とインプラントの関係が3次元的に容易に観察できるだけではなく,インプラント-骨界面における接触率とインプラント周囲骨体積率についての定量化が可能となった.このシステムを用いてアパタイト,チタン,カルシウム注入チタンインプラントを比較したところ,アパタイトインプラントでは,埋入後2週から著明なロ-ト状の新生骨形成がみられ,埋入後4週でピークを迎えて骨接触率,骨体積率ともに最大値を示し,以後,減少していった.これに対し,チタンインプラントでは,経時的に増加する傾向を示し,本研究において最も長い観察期間である8週後に骨接触率60%と最も大きい値を示した.カルシウム注入チタンでは両者の中間的な傾向であった.このように各種材料間でインプラント埋入後の骨反応に大きな違いがあることが明らかとなった.
微小球光共振器を用いた光合成光捕集蛋白の超高感度単一分子分光

光合成色素蛋白複合体の超高感度単一分子分光に向けて、微小球共振器やナノ光ファイバに代表されるナノ光デバイスを用いた超高感度蛍光検出技術の確立を行った。その結果、(1)単一光合成蛋白の共焦点顕微鏡観察に室温下で成功した。(2)ナノ光ファイバによる単一量子ドット蛍光観察に成功し、集光効率が全発光量の6.6%と非常に高い値である事を示した。これらはナノ光デバイスを用いて光合成蛋白の蛍光検出が4倍の感度で測定可能である事を示唆している。本年度は、光合成蛋白の超高感度単一分子分光向けた準備・調査を行った。具体的には、まず、光合成蛋白の取り扱いや本研究室における保管状況の調査を行った。その結果、当研究室でも、光合成蛋白を十分保管できる事が分った。次に、従来の方法である顕微鏡を用いた光合成蛋白の単一分子分光技術の確立を目指した。そのために、光合成蛋白のガラス基板上へのスピンコートとフッ化リチウム基板上へのコートを行い、基板表面からのラマン散乱の影響を評価した。その結果、本研究で使用する励起レーザーの波長790-800nmの周辺では、ラマン散乱の大きな影響は見られず、単一分子を分散させる基板としてはガラスで十分な事を明らかにした。さらに、790-800nmの領域でレーザーを使用可能なように、研究室所有の共焦点顕微鏡システムの改造を行った。顕微鏡の改造については、当初、790nmの励起光源用に改造した。しかし、この波長では十分な励起効率が得られないと判断し、800nmの励起光源として半導体レーザーの選定・購入を行った。現在、顕微鏡装置を800nmレーザーに最適化している。また、共焦点顕微鏡に使用している対物レンズが、光合成蛋白からの発光波長890nmでは透過率が20%程度しかないために、改善が必要である事も分った。来年度、最適な対物レンズの購入を検討している。微小球共振器を用いた実験に関しては、微小球材料として石英ロッドのフッ酸処理を行った。今後、この材料を用いて微小球を作製し、10^8のQ値を上回る共振器を目指す。また、当初の計画にもあったように、単一分子の発光を超高感度に検出するデバイスとして光ナノファイバにも着目し、ナノファイバを用いた単一発光体の検出にも取り組んだ。その中で、ナノファイバのほこりにする機械的脆弱性を明らかにした。これはナノファイバを用いた応用研究をする上で、重要な技術的知見である。現在、蛍光微小ビーズの蛍光検出には成功しており、光合成蛋白への応用を目指していく。本年度は、光合成色素蛋白複合体の超高感度単一分子分光の実現に向けて、(1)共焦点顕微鏡を用いた光合成蛋白の単一分子分光の実現、(2)高効率蛍光集光デバイスであるナノ光ファイバの集光効率の決定、(3)ナノ光ファイバ結合微小球を用いた蛍光体蛍光検出を行った。その結果、(1)光合成蛋白の共焦点顕微鏡観察に室温下で成功した。(2)ナノ光ファイバに単一量子ドットの蛍光観察に成功し、集光効率が全発光量の6.6%と非常に高い値である事を示した。(3)ナノ光ファイバ結合微小球上に配置した複数の色素ビーズからの蛍光検出に成功した。(1)に関しては、昨年度導入した半導体レーザーに共焦点顕微鏡を最適化し、試料保持も窒素雰囲気下で行うなどの工夫を行った。その結果、単一光合成蛋白からの発光を室温下で安定して検出する事に成功した。(2)については、ナノ光ファイバ上に単一量子ドットを配置し詳細な蛍光観察を行う事で、単一量子ドットの総発光量の6.6%を検出することに成功した。この蛍光集光効率は、開口数1.1の対物レンズに相当するものであり、極めて良好な値を示した。(3)に関しても、ナノ光ファイバ結合微小球上に配置した複数の色素ビーズからの蛍光検出に成功した。特に、ナノファイバが開口数1.1の対物レンズ相当の集光効率を有する事が明らかとなった事である。これまでクライオスタットなどでは作動距離などの要因により、開口数0.7程度のレンズしか実質的に使用できなかった。事実、光合成蛋白の従来の研究もNA0.55のレンズによって行われていた。ナノ光ファイバは極低温化でも使用可能であり、従来の4倍の蛍光検出を光合成蛋白に期待する事ができる。微小球共振器を用いるまでもなく、より簡便に利用可能なナノファイバを用いて光合成蛋白の高感度蛍光検出が可能である事を見出したことは、今後の大幅な研究展開につながるものである。
コピー数異常を示す自閉症関連遺伝子CNTN4の変異マウスによる機能解析

コンタクチン4(Cntn4)は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子であり軸索伸長やシナプス形成に関与しているものと考えられている。近年複数の研究により自閉症患者でCntn4遺伝子(CNTN4)のコピー数異常が認められた。本研究では個体レベルでCntn4の遺伝子量効果を調べるためCntn4ノックアウトマウスを作出した。変異型マウスの脳の構造には大きな異常は無いものの、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析の結果、変異型と野生型マウスの大脳と嗅球では数百の遺伝子に発現量の違いがあることを見出した。神経系の発生過程では様々な細胞接着分子が発現し、細胞間相互作用に重要な役割を果たしている。また、自閉症スペクトラム障害症例でコピー数多型・転座・欠失などのCntn4遺伝子(CNTN4)の構造異常が報告されており,この遺伝子の何らかの発現異常が高次脳機能に影響を及ぼす可能性が考えられた。本研究ではCntn4のノックアウトマウスの表現型と自閉症の病態との関連を調べ、Cntn4の機能解析を行い、自閉症の発症機序を解明する手掛かりを得ることを目的としている。すでにCntn4ノックアウトマウスの作出に成功し、ホモ接合変異体マウスの脳でCntn4欠失を蛋白質レベルで確認した。脳組織標本をHE染色およびKB染色を行ったが、野生型と変異型マウスの脳で大きな構造の違いは見られなかった。ホモ接合変異体は繁殖能力に異常なく、外見上の明らかな差異は見られない。また1年以上の生存を確認した。現在行動解析へ向けてC57BL/6Jへの戻し交配を継続している。さらにCntn4結合蛋白質の同定を目指し、膜分画を調製し免疫沈降法によりCntn4複合体構成成分を回収しマススペクトルで各蛋白質のアノテーションを行った。候補蛋白質についてその局在を免疫組織化学法で調べている。本研究ではCntn4のノックアウトマウスを作製してCntn4の機能解析を行い、自閉症との関連を調べることを目的としている。今年度はCntn4欠損により発現が変動する遺伝子群を抽出するためにマイクロアレイによる網羅的発現解析を施行した。まず、野生型および変異型マウス各3匹の大脳皮質と嗅球からRNAを調整し、Illumina社マイクロアレイ(Mouse WG-6 Beadchip)で解析を行った。その結果変異型マウスの大脳皮質で23遺伝子の発現増加、39遺伝子の発現減少、嗅球では164遺伝子の発現増加、52遺伝子の発現減少が観察された。これら発現変動遺伝子群の中には自閉症関係の3遺伝子を含む複数の精神神経疾患関係の遺伝子が含まれておりパスウェイ解析の重要性が示唆された。再現性についてはRT-PCRなど別の方法でさらなる確認が必要であり、その他の発現変化の大きい遺伝子も合わせて解析を進めている。自閉症スペクトラム障害症例ではCntn4遺伝子(CNTN4)のコピー数多型・転座・欠失などの構造異常が報告されている。また、最近になって神経性拒食症とCNTNV4との関連も報告されており、この遺伝子の何らかの発現量異常が高次脳機能に影響を及ぼす可能性が考えられた。そこで野生型および変異型マウスの大脳皮質や嗅球からRNAを調整しマイクロアレイにより網羅的遺伝子発現解析を行った。大脳皮質において2群間で統計的に有意な変動が認められたプローブ(P<0.05)のうち1.5倍以上発現変化があるプローブは85個、1.3倍以上の発現変化のあるプローブは223個見出された。そのうちのいくつかについてマウスの頭数を増やしRT-PCRによる発現定量を行った結果ある程度再現性の有る結果が得られた。そこでジーンオントロジー解析を行ったところ、転写に関わる遺伝子群が、野生型マウスに比較して変異型マウスで発現が上昇を示す遺伝子に特異的に集積している事がわかった。一方、嗅球では細胞接着、ストレス応答、摂食行動などに関わる遺伝子群が野生型マウスに比較して変異型マウスにおいて有意な発現低下を示す遺伝子に特異的に集積していた。さらに自閉症と一部のパスウェイを共有している可能性が示されている統合失調症の関連遺伝子Grm
太陽X線像の高分解能・高精度観測

科学衛星「ようこう」は打ち上げ後2年が経過したが、観測機器は依然順調に飛翔し続けて居り、活動度が極小期に向かって低下しつつある太陽のコロナの観測を継続している。この間、平成3年9月から平成4年9月までの最初の1年間のデータが解析ソフトウエアとともに公開され、世界の研究者との共同研究を可能とする研究協力体制が進んだ。「ようこう」による大きな成果として挙げられることは、磁気シアーを原因とし磁気再結合を基調とする太陽のコロナ活動の描像が定着したことにある。太陽フレアにおいては、実際磁気再結合によりエネルギーの開放が起こり、彩層から加熱されたプラズマがフレア・ループに沿ってコロナ中に上昇してくる現象が実証された。リムに発生したフレアには、磁気再結合の結果により発生したと考えられるX型をしたプラズマからのX線放射やカスプ状のループの形成並びにその時間発展が発見され、モデルの描像と整合性が検証されつつある。硬X線像でもフレアのインパルシブ期に軟X線フレアループの上部にX線源が見られ、軟X線のカスプ構造との対応が注目されている。磁気中性面における再結合の現場が直接に観測できる状況により一歩近づいたと言える。感度の非常に向上した輝線スペクトル観測からはフレア初期において完全に青方変位した放射が見つかり、これにより彩層物質が急激な加熱によりコロナ中に上昇して行く様子を完全に捕らえることが可能となった。また太陽コロナが非常にダイナミックであり、例えば活動領域における小さなフレアのようなループの増光、ジェットのようなプラズマの噴出、いわゆるX線輝点の突然の増光、コロナの大規模構造の変化、など様々の種類の活動性が発見・検証され、いずれも磁気再結合と深い関わりがあることが明快になってきた。平成3年8月30日の「ようこう」の打ち上げは成功し、各観測機器の正常動作が確認された。これにより今極大期飛翔の唯一の太陽観測衛星の時代の幕が切って落とされた。この衛星からのデ-タ、特にデ-タ量の多いX線の画像デ-タやスペクトルのデ-タを処理するために、打ち上げと時を同じくして、ワ-クステ-ション(μVAX3100ーVAX station 3100)システムを購入し、デ-タ解析処理ソフトウエアの開発を始めた。軟X線の画像は、時間尺度が短かく変化する太陽コロナの構造を浮き彫りにし、硬X線画像は、フレア・ル-プ中を運動する加速された粒子からと思われる輻射を検出している。また軟X線の輝線スペクトルからは、これらのダイナミカルなコロナの変化に寄与しているプラズマの物理量やその速度場を知ることが可能となった。現在までに打ち上げ後半年が過ぎたが、全観測機器とも正常な動作を続けている。取得デ-タも正常的な流れが確立し、鹿児島で取得されたものに遅れることなく、NASA/DSNでのデ-タ取得が行われている。デ-タの配布方法、デ-タ解析ソフトウエアの開発もかなり完成に近づき、現システムの上で行なえる状況になりつつある。今後さらに複数の機上機器を用いた解析や地上観測デ-タとの共同研究などにフレキシブルに対応できる様なソフト開発が必要となろう。昨年度打ち上げに成功した太陽観測衛星「ようこう」は順調に飛翔を続け、新しい成果をもたらしている。衛星観測が2年目に突入し定常観測が定着したので、地上観測網とも有機的な連携プレーが実現しつつある。また世界各国の地上観測設備、ロケット・気球を中心とする飛翔体観測装置との共同研究も盛んに行なわれるようになってきた。取得データのテープによる配布も順調に整備が進み、データ解析人口が向上しつつある。

また、「ようこう」取得のデータは観測2年後から公開されることになっているためその準備も進んでいる。国立天文台における解析システムもアクセス可能なターミナルを増設し、ニーズに対応できるところとなった。ソフトウエアの体系整備が進んだので、効率の良データ解析が可能になりつつある。硬・軟X線望遠鏡とプラズマ診断軟X線分光器がもたらした大きな成果は磁気結合を基調とする太陽コロナ活動の描象を定着させたことである。太陽フレアにおいては、実際磁気再結合によりエネルギの解放が起こり、フレア・ループに沿って電子が加速され、彩層から加熱されたプラズマがコロナの中に上昇してくる現場が実証された。また太陽コロナが非常にダイナミックであり、例えば活動領域における小さなフレアのようなループの増光、ジェットのようなプラズマの噴出、いわゆるX線輝点の突然の増光、コロナの大規模構造の変化、など様々の種類の活動性が発見・検証され、いずれも磁気再結合と深い関わりがあることが明快になってきた。科学衛生「ようこう」は打ち上げ後2年が経過したが、観測機器は依然順調に飛翔し続けて居り、活動度が極小期に向かって低下しつつある太陽のコロナの観測を継続している。この間、平成3年9月から平成4年9月までの最初の1年間のデータが解析ソフトウエアとともに公開され、世界の研究者との共同研究を可能にする研究協力体制が進んだ。この様に背景をもとに全観測機器のデータ解析をより系統的に行える様に、ワークステーションのソフトウエア/ハードウエアの整備を行った。フレアの解析については硬X線、軟X線画像を軟X線スペクトル、軟X線輝線スペクトル更に地上望遠鏡による磁場の情報と合わせて行える様になった。地上観測、X線画像とX線スペクトルの総合解析を通じて、フレアにおける磁気エネルギの熱エネルギへの転化の様子が明確になり、コロナ中の磁気ループの相互作用、磁気再結合の現場を捕らえつつある。コロナ磁気ループの接続に関しても種々の試みがなされ、成果を挙げている。特に硬X線源が軟X線フレアループ上空においても存在したことは磁気再結合との関連において非常に重要な発見である。活動領域の温度構造に関しては軟X線の画像と軟X線輝線スペクトルとの対応を調べて、活動領域のコロナ加熱についての知見を得ることが出来た。活動領域に存在する熱的プラズマの高温成分は、マイクロフレアの重畳によると考えられる。
ガイダンス因子セマフォリンの新しい細胞機能の解明：細胞内膜輸送の制御機構

網膜色素変性症患者でSema4Aのアミノ酸変異を示す家系がある。Sema4A欠損マウスが視細胞欠損をしめすことから、Sema4Aが原因遺伝子であることを確認した。網膜色素上皮細胞は視細胞の生存と機能を制御するが、この細胞に発現するSema4Aが色素上皮細胞内での膜輸送経路の制御を行い、光刺激により視細胞に生じる酸化ストレスによる細胞死を抑制し、光刺激により位相転化したレチノイドを再生する。人の網膜色素変性症患者で認めたSema4Aの変異を導入した遺伝子改変マウスも視細胞の異常をしめす。このマウスに正常Sema4Aを色素上皮細胞に直接遺伝子導入することにより、視細胞の細胞死は抑制できた。セマフォリンが神経発生以外に心血管発生及び免疫調節機能を有することが明らかとなっている。さらにSema4Aの遺伝子欠損マウスは視細胞層の欠落を示すことが明らかになった。本研究では、Sema4Aにより膜輸送される分子群のうち視細胞の生存を決定する分子を同定するとともに、Sema4Aによる細胞内分子群の輸送を可視化技術により時空間的に解明することを目的とする。結果Sema4Aのレチノイド代謝調節の分子群の同定:Sema4Aはレチノイド結合タンパク質と結合し、色素上皮細胞内でのレチノイド再生経路を維持していた。酸化ストレス下でのSema4A結合蛋白質の同定:Sema4Aは酸化ストレス下で、視細胞保護作用を有するプロサポシンの細胞内輸送と細胞外放出を制御していることを見出した。Sema4Aの膜輸送制御の時空間的解析:Sema4Aとレチノイド結合タンパク質が色素上皮細胞内での移動を3次元的に時間経過を追って撮影した。両者は結合した状態で同心円状に移動することが明らかとなった。意義・重要性これまでのセマフォリン研究は、神経ガイダンス因子としての機能解析が中心であり、低分子量G蛋白質の活性、細胞内骨格の再構築に焦点が当てられてきた。しかし、本研究で申請者は膜型セマフォリンSema4Aが細胞内膜輸送制御を介する細胞内代謝調節に関わることを実証した。このように本研究はガイダンス分子の機能と細胞内膜輸送の結びつけに挑戦し、ガイダンス因子の"細胞内ガイダンス"機能の時空間的な解明を試みる野心的な研究である。本研究の結果は、セマフォリン研究の新しい局面を示すとともに、有効な治療法のない網膜色素変性症などの難治性疾患に対する革新的治療の創造に道を開くものであると期待される。セマフォリンは神経発生におけるガイダンス因子として同定されたが、神経発生以外に心血管発生及び免疫調節機能を有することが近年明らかとなっている。このセマフォリン分子群の機能解析は遺伝子改変マウスを作製して行われてきた。網膜色素上皮細胞に発現するSema4Aの遺伝子欠損マウスは視細胞層の欠落を示した。本研究では、Sema4Aによる色素上皮細胞による視細胞維持作用を解明することを目的とした。結果1Sema4Aのレチノイド代謝調節の分子群の同定:視細胞が光刺激を受けるとレチノイドの位相転化をきっかけに視細胞の電気的興奮が起こる。この時生じた位相転化したレチノイドは色素上皮細胞によって再生され、再利用される。Sema4Aはレチノイド結合タンパク質と結合し、色素上皮細胞内でのレチノイド再生経路を維持していた。2酸化ストレス下でのSema4A結合蛋白質の同定:光刺激は視細胞の情報伝達に重要であるが、同時に強い酸化スツレスとして視細胞死を誘発する。Sema4Aは酸化ストレス下で、視細胞保護作用を有するプロサポシンの細胞内輸送と細胞外放出を制御し、視細胞を酸化ストレスより防御していた。このように本研究はガイダンス分子の機能と細胞内膜輸送の結びつけに挑戦し、ガイダンス因子の“細胞内ガイダンス"機能の時空間的な解明を試みる野心的な研究である。網膜色素編成症患者の家系分析においてSema4Aの3つのアミノ酸変異(2つは細胞外領域の345番目、350番目と細胞内領域の713番目)が報告されている(J. Med. Genetics, 2006)。しかしこれらのアミノ酸変異が視細胞の機能に及ぼす効果は不明である。

そこで、申請者らは、個々のアミノ酸変異を導入した遺伝子変異Sema4Aのノックイン・マウスを作製した。1)遺伝子変異Sema4Aの細胞内移送のメカニズム網膜のSema4Aが視細胞の外節に隣接する網膜色素上皮細胞の繊毛方向に局在する。以前の研究においてSema4Aがレチノイド結合タンパク質の細胞内移動を制御することを見出し報告した(Genes & Development, 2012)。すなわちSema4Aがキャリアーとなりレチノイドタンパク質を含む細胞内小胞が早期エンドソームから後期エンドソームおよびエクソソームを介して細胞外へ放出される。遺伝子変異Sema4AはGFP融合型として発現し、細胞内輸送のどの段階に関わるかを共焦点レーザー顕微鏡を使用して追跡した。350番目のアミノ酸の変異Sema4Aは酸化刺激後の細胞膜直下への移動が阻害され、それ以外のアミノ酸変異Sema4Aは異常を示さなかった。以上より細胞内でのエンドソーム輸送にSema4Aの350番目のフェニールアラニンが重要であることを明らかにした。2)遺伝子変異Sema4Aの構造解析Sema4Aの細胞外ドメインn構造は報告されている(Nature, 2011)。350番目のアミノ酸の位置を3次元的に同定し、受容体との結合部位との位置的関係を解析した。同アミノ酸は結合部位とは反対側の分子表面に位置することが明らかとなった。以上より、Sema4Aの細胞質内移動には受容体をかいするメカニズムは介在しないことを明らかにした。成果は分子生物学・発生学分野で世界的に評価の高いGenes & Development誌に出版予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。神経細胞間の複雑なネットワーク回路は神経線維の正確なターゲット細胞への誘導にセマフォリンに代表されるガイダンス因子が重要であるが、セマフォリンが神経発生以外に心血管発生及び免疫調節機能を有することが明らかとなっている。申請者らは網膜色素変性症の原因遺伝子の一つであるSema4Aの遺伝子欠損マウスは視細胞層の欠落を示すことを確認し、当初の研究計画において研究目標として設定した以下の実験を遂行した。成果2:Sema4Aによる細胞内分子群の輸送を可視化技術により時空間的に解析する技術を開発し、酸化ストレス下に網膜色素上皮細胞内でSema4Aと結合する蛋白質の細胞内輸送を解析することに成功した。成果3:網膜色素変性症の家系解析より明らかになったSema4Aにおけるアミノ酸変異を導入した変異Sema4Aを発現するノックイン・マウスを作製した。この変異導入マウスの一系統は視細胞の欠損をしめした。この変異Sema4Aの構造解析により、Sema4Aの細胞内膜輸送制御が受容体を介さないメカニズムによることをあきらかにした。以上のごとく、当初の実験計画にそって研究を行い重要な知見を得て論文のかたちで報告することができた。人の網膜色素変性症患者においてSema4Aの遺伝子異常が同定されている。この遺伝子異常を導入したノックイン・マウスの解析により人の病態とその治療法の開発を進める予定である。本研究の特色は、網膜色素変性症の病因と報告されてきた分子群からは一線を画する神経ガイダンス因子であるセマフォリンによる視細胞変性の制御機構を解明することである。
再灌流心筋におけるβ受容体細胞内情報伝達経路の役割

雑種成犬の左冠動脈回旋枝を45分閉塞し、45分再潅流した後、心筋のサルコレンマを分離し、虚血領域と非虚血領域の心内膜側および心外膜側のβ受容体とアデニル酸シクラーゼを測定した。その結果、β受容体は虚血領域の心内膜側および心外膜側ともに有意に(p<0.05)低下していた(心内膜側:45±5vs70±7、心外膜側:50±5vs73±8fmol/mg)。一方、アデニル酸シクラーゼは虚血領域の心内膜側のみで有意に(p<0.05)低下していた(心内膜側:45±9vs73±15、心外膜側:74±16vs82±21pmol cAMP/mg/min)。このように再潅流心筋におけるβ受容体細胞内情報伝達経路の障害の程度は心内膜側と心外膜側で異なっていた。今後、これらの生化学的な変化が実際の生理学的変化と相関するかどうかを検討するため以下の実験を行う予定である。冠動脈回旋枝を45分閉塞し、45分再潅流した後、β受容体刺激薬であるIsoproterenolあるいはアデニル酸シクラーゼ刺激薬であるフォルスコリンを投与し、クリスタルを用いて局所心筋壁運動を測定する。
日本版メンタルヘルス・ファシリテーター（MHF）プログラムによる被災者支援の効果

東日本大震災の被災地では,メンタルヘルスの鋏状格差が問題となっている。震災後の時間の経過とともに,生活の再建を成し遂げる住民と,生活機能が損なわれる住民との二極化が広がりつつある。しかし,精神保健福祉のニーズが増大しつつある一方で,専門家のリソースは慢性的に不足している。本研究では,被災地に在住する比較的健康な住民を対象として,メンタルヘルス・ファシリテーター(MHF)プログラムを適用し,その効果と課題を検討する。一般の住民に対して,新たなコミュニティアプローチを試みることで,被災地住民の相互扶助とメンタルヘルス改善を促す。震災後の時間経過とともに,生活再建を成し遂げる住民と,生活機能を損ない,心身の不調を抱える住民との二極化が広がりつつある。精神保健福祉のニーズは,大変大きいものであるが,被災地における専門家のリソースは慢性的に不足している。本研究では,一般の地域住民に対して,メンタルヘルス・ファシリテーター(MHF)講座を実施し,その効果と課題を検証することを目的としている。被災三県における比較的健康な住民をMHFとして育成し,被災地住民の自発的な相互扶助とメンタルヘルスの改善を促すことがねらいである。研究初年度の平成26年度は,倫理的な手続きの確認と,MHFプログラムの開発,そして,研究実施地域の調整を行った。まず,本研究では,手続きの科学的・倫理的妥当性を保証し,参加者の人権保護に努めるため,福岡大学大学院人文科学研究科教育・臨床心理専攻人文学部教育・臨床心理学科研究倫理審査委員会に,研究計画の審査を依頼した。その結果,研究の遂行については,条件付きの承認を得た。また,MHFプログラムの翻訳と,ビデオ教材の作成を行った。これは,NBCC International(全米認定カウンセラー協会国際委員会)が作成したMHFプログラムの原版が改訂されたためであり,オンライン学習のパートを新設したためである。今後の効果研究では,更新されたMHFプログラムを実施する。さらに,被災地におけるMHF講座の実施場所について,選定を行った。被災地域の復興状況は,地域差があり,時間の経過とともに変化するため,現地の住民や復興支援関係者のご意見も伺いながら,望ましい実施環境の調整を図っている。研究初年度の準備を踏まえた上で,平成27年度以降は,MHF講座の実施と効果研究を進める予定である。研究2年目の平成27年度は,MHF講座で講師を務める指導者の養成講座(MHFトレーナー養成講座)を計画した。MHFトレーナー養成講座のプログラムを準備し,被災三県の在住者・関係者で,心身ともに健康な対人援助職(臨床心理士や精神保健福祉士,看護師等)の参加者を募った。次年度上半期の実施を目指して,計画を遂行しているところである。また,効果研究の対象となる次年度のMHF講座の計画も進めた。被災地のニーズやご要望を踏まえながら,岩手県盛岡市等での開催を準備している。被災地の外部からの支援となるため,慎重で地道な人脈づくりが求められている。対人援助職(精神保健福祉士や社会福祉士等)の関連団体と協力関係を深めながら,効果研究に参加する受講者が円滑に集まるような関係調整を行った。東日本大震災の発生後,4-5年が経過し,現地の状況が変化しつつある。研究支援者(予定者)が複数名,転出し,遠隔地からの新たな人脈づくりに若干の支障を来している。本研究では,被災地に在住する比較的健康な住民を対象として,メンタルヘルス・ファシリテーター(MHF)プログラムを適用し,その効果と課題を検証することを目的とした。一般の住民に対して,新たなコミュニティアプローチを試みることで,被災地住民の相互扶助とメンタルヘルスの改善を促すことをねらいとした。研究3年目の平成28年度は,岩手県盛岡市内でMHF講座を開催した。岩手県,宮城県,福島県の在住者を対象として,20歳以上の成人を募ったところ,採用基準に合致する参加者は6名であった。全4日,30時間のMHFプログラムとして,症状理解や傾聴,セルフケア,リファーのスキルについて講義・演習形式で指導を行った。講座の前後には,傾聴スキルや社会的スキル,精神症状を測る質問紙調査も行った。その結果,MHFプログラムを完了した5名のデータを収集することができた。実際の応募者,参加者の数が当初の想定を下回ったこともあり,ランダム化比較研究を実施することはできなかった。しかし,実際に被災された方や,支援ボランティアの方を対象として,心の健康教育を行うことができた。

MHFプログラムの効果や課題に関して,個々の参加者の各種スキルやメンタルヘルスについては,別途,研究成果報告書で考察を加える予定である。東日本大震災の被災地では,メンタルヘルスの鋏状格差が問題となっている。震災後の時間の経過とともに,生活の再建を成し遂げる住民と,生活機能が損なわれる住民との二極化が広がりつつある。しかし,精神保健福祉のニーズが増大しつつある一方で,専門家のリソースは慢性的に不足している。本研究では,被災地に在住する比較的健康な住民を対象として,メンタルヘルス・ファシリテーター(MHF)プログラムを適用し,その効果と課題を検討する。一般の住民に対して,新たなコミュニティアプローチを試みることで,被災地住民の相互扶助とメンタルヘルス改善を促す。研究費が申請額から減額されたため,研究計画の効率化を図った。初年度は予算の消費を抑えつつ,主に研究計画の基礎的部分に着手し,次年度以降に備えている。次年度が研究の最終年度となるため,研究計画をできる限り遂行するために,予定していた以上のエフォートを投入する。臨床心理学被災地は,冬から春にかけて雪に閉ざされ,人の往来も制限される。また,年度初めは,研究遂行のための大学内の環境が整わない。そのため,被災地で研究計画を実施できる時期は,初夏から秋までの半年間に限られる。年間のエフォートを適宜振り分けることで,研究計画の推進に尽力する。研究計画当初の予算よりも,交付決定額が約3割減額されたため,研究期間の前期は予算のかからない計画を優先的に実施した。残りの予算は,多くの支出を要する次年度に繰り越している。研究計画当初の予算よりも,交付決定額が約3割減額されたため,初年度は,予算のかからない研究計画に注力した。残りの予算は,支出額の多い次年度に繰り越している。繰越金は,研究計画に従い,東日本への国内旅費や研究協力者の人件費・謝金等に充てる予定である。繰越金は,被災地への国内旅費や研究協力者の人件費・謝金に充てる予定である。
階層的ドメイン構造をもつ酸化物誘電体の微細構造解析

透過型電子顕微鏡を用いて、10-6rad以下の角度分解能を有するとともに、ローレンツ像を取得できる電子光学系の構築を目指した。カメラ長3kmを実現する電子光学系を構築するとともに、10-6radの角度分解能を有し、3500倍の実空間倍率を実現できる電子光学系を構築した。これらの手法をマンガン酸化物の強磁性金属状態でのストライプ磁区構造に適用し、磁気的微細構造解析を行った。また、HAADF-STEM法を用いて、YMnO3における原子レベルでの強誘電分域構造の観察から、tail-to-tail(head-to-head)の180°強誘電分域構造の原子変位パターンを決定した。透過型電子顕微鏡を用いて、10-7[rad]の角度分解能を持つ小角電子線散乱法を実現するとともに、原子スケールでの実空間観察が可能な高角度環状暗視野法を用いることで、原子スケールからマクロスケールにわたる広範囲な空間領域での微細構造観察・評価手法を確立する。また、多重相境界領域(MPB領域)を持つ鉛系リラクサー誘電体における巨大圧電効果の起因とされる階層的ドメイン構造や分極回転機構について明らかにするとともに、新たな巨大圧電効果を示す非鉛系圧電材料の物質設計指針を得ることを目的とする。以下に平成25年度に得られた研究成果を示す。(1)透過型電子顕微鏡を用いて、対物レンズ、中間レンズおよび投影レンズ系のレンズ電流値を制御することで、LaB6型透過型電子顕微鏡を用いて、0.1mから3000mにわたってカメラ長を制御できるシステムを実現し、電子線散乱角の角度分解能を10-7[rad]程度まで向上することに成功した。(2)六方晶マンガン酸化物InMnO3において、原子スケールでの実空間観察が可能な高角度環状暗視野法を用いて、YMnO3の強誘電相で観察されるようなInイオンのフェリ強誘電的変位パターン(up-up-down)に加えて、反強誘電的変位パターン(up-no-down)が存在していることを見出した。(3) La0.825Sr0.175MnO3単結晶を用いて、(001)面、(110)面および(111)面についてローレンツ顕微鏡観察を行い、無磁場中では各結晶面において、数百nmの周期で規則的に配列したブロッホ磁壁を持つストライプ状の180°磁区構造が形成されていることを明らかにした。次に、それぞれの結晶面に垂直にH = 224 mTの磁場を印加したところ、H ⊥(001)ではストライプ状磁区がランダムに分断された後、楕円状の磁区構造(磁気渦構造)に変化することを見出した。透過型電子顕微鏡を用いて、10-7[rad]以下の角度分解能を持つ小角電子線散乱法を実現するとともに、原子スケールでの実空間観察が可能な高角度環状暗視野法(走査型透過電子顕微鏡法)を用いることで、原子スケールからマクロスケールにわたる広範囲な空間領域で、機能性酸化物の微細構造観察・評価を行う。特に、多重相境界領域(MPB領域)を持つ鉛系リラクサー誘電体における巨大圧電効果の起因とされる階層的ドメイン構造や分極回転機構について明らかにするとともに、新たな巨大圧電効果を示す非鉛系圧電材料の物質設計指針を得ることを目的として研究を遂行した。その結果以下に示す研究成果が得られた。(1)透過型電子顕微鏡の中間レンズおよび投影レンズの電流値を制御することによって、カメラ長3 kmを実現した。(2)小角電子回折パターンとフーコ像を同一領域から同時に得られる電子光学系を実現した。(3)本手法を用いてBaFe10.35Sc1.6Mg0.05O19におけるフェリ磁性相でストライプ磁区構造が形成されており、磁場印加により磁気渦構造が形成されることを見出した。また、磁場印加によりストライプ磁区内にカイラリテイの反転を伴う領域が形成され、そこを核として磁気渦構造が形成されることを明らかにした。(4)本手法を用いて、巨大磁気抵抗マンガン酸化物での磁気的微細構造を調べた。その結果、La1-xSrxMnO3(x=0.175)において、磁場印加によりストライプ磁区構造から磁気渦構造への形成過程を明らかにした。構造物性本年度は、LaB6型透過型電子顕微鏡を用いて、対物レンズ、中間レンズおよび投影レンズ系のレンズ電流値を制御することで、LaB6型透過型電子顕微鏡を用いて、0.1mから1000mにわたってカメラ長を制御できるシステムを実現し、電子線散乱角の角度分解能を10-6[rad]程度まで向上することに成功した。また、高角度

環状暗視野法(走査型透過電子顕微鏡法)により、六方晶マンガン酸化物InMnO3およびYMnO3の強誘電相において、InおよびY原子コラムの可視化に成功するとともに、強誘電変位パターンを明らかにした。本年度においてLaB6型透過型電子顕微鏡を用いた小角電子線散乱法で10-7[rad]の角度分解能を達成することに成功したことから、研究は順調に進んでいると判断できる。また、高角度環状暗視野法(走査型透過電子顕微鏡法)を用いて、InMnO3およびYMnO3における強誘電相でのYおよびIn原子コラムの可視化に成功するとともに、強誘電変位パターンの可視化にも成功したことから、原子スケールでの強誘電体の微細構造解析についても、研究は順調に進んでいると判断できる。リラクサー誘電体(1-x)Pb(Mg2/3Nb1/3)O3-xPbTiO3 ((1-x)PMN-xPT)やPb(Zr1-xTix)O3(PZT)のMPB領域で形成される階層的ドメイン構造での自発分極の起因となる原子の変位パターンについて、走査型透過電子顕微鏡法による原子分解能HAADF法を用いて調べていく。特に、マイクロサイズのドメイン構造とナノサイズのドメイン構造のドメイン境界での原子レベルでの変位パターンを明らかにする。(2)、(1-x)BiFeO3-xRTiO3(R=Ba, Sr,Ca)系について固相反応法で多結晶試料を作製すると同時に、FZ法による単結晶試料作製を行う。また、PMN-PTでのMPB領域での階層的ドメイン構造と圧電性と相関に関する知見をもとにして、BiFeO3-RTiO3(R=Ba, Sr, Ca)でのMPB領域の有無およびドメイン構造と圧電性の相関を明らかにする。特に、階層的ドメイン構造の有無を調べるとともに、ドメイン構造の特徴やドメイン境界での原子変位パターン等について、小角電子線散乱法および原子分解能HAADF法により明らかにする。
内在性心筋幹／前駆細胞の分化誘導因子とニッチ構造の探索

本研究期間内に、我々は新生心筋細胞を同定できるα-MHC MerCreMer/CAG-CAT-LacZマウスを用いて、心筋梗塞後の新生心筋細胞の一部は、細胞周期に入った内在性心筋幹/前駆細胞に由来する事を明らかした。また、自己組織化ナノペプチド内で心筋前駆細胞を培養したグラフトを作成し、心筋梗塞後にα-MHCMerCreMer/CAG-CAT-LacZマウスに移植した。その結果、移植群において、心筋新生効果が高かった。次に、心筋組織切片からレーザーマイクロダイセクションにより心筋組織を採取し、LC-MS/MSを行い、心筋前駆細胞グラフト移植群で特異的に発現するいくつかのタンパクを同定した。平成25年度は、RGD配列を含むペプチドにより修飾された自己組織化ナノペプチドを細胞足場として、心筋前駆細胞を約4週間培養して安定した細胞グラフトを作成し、心筋梗塞を作成したα-MHCCreLacZマウスの心膜腔に移植した。α-MHCCreLacZマウスは、心筋梗塞作成前にタモキシフェンを投与することにより、ほぼ100%の心筋細胞にβ-galactosidaseが発現するため、心筋梗塞後に存在するX-gal染色陰性の心筋細胞を非心筋細胞から新しく分化した細胞として、既存の心筋細胞と区別して同定できる遺伝子改変マウスである。心筋前駆細胞グラフトを移植した後、4週間後に心筋組織切片を作成してX-gal染色を行い、心筋前駆細胞グラフトを移植していない対照群とX-gal染色陰性の新生心筋細胞の数と分布について比較検討した。その結果、心筋前駆細胞グラフト移植群において、X -gal染色陰性の新生心筋細胞が高頻度に分布する心筋新生効果が高い部位を確認した。次に、心筋前駆細胞グラフト移植群と非移植群の心筋組織切片からレーザーマイクロダイセクションにより心筋組織を採取した。採取した心筋組織をサンプル調整し、LC-MS/MS(ショットガン分析)を行い、測定データを解析して心筋前駆細胞グラフト移植群と非移植群で同定した蛋白を比較検討した。心筋前駆細胞グラフト移植群でのみ同定された蛋白には、代謝関連酵素、膜表面蛋白、細胞骨格関連蛋白が含まれていた。1.内在性心筋幹/前駆細胞由来新生心筋の同定申請者等が作成したalphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスはタモキシフェン投与直後にはalphaMHC promoterを介して、心筋細胞のほぼ100%にbeta-galactosidaseが発現してX-gal染色陽性となり、タモキシフェン投与後に認められるX-gal染色陰性心筋細胞を新生心筋細胞として同定できる。妊娠中の親マウスに核酸類似体のBrdUを投与して仔のalphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスを標識し、さらに、12週齢でタモキシフェン投与後に心筋梗塞を作成し、心筋梗塞後にEdUを投与して細胞周期に入った細胞を標識した。その結果、心筋梗塞境界部の新生心筋細胞にBrdU陽性またはEdU陽性の心筋細胞が認められた。BrdUは細胞周期の遅い幹細胞由来の心筋細胞に相当し、心筋梗塞後には内在性心筋幹/前駆細胞が細胞周期に入り、心筋細胞に分化することを示唆した。2.細胞移植による内在性心筋幹/前駆細胞の分化誘導効果の検討自己組織化ナノペプチドを用いた心筋前駆細胞scaffoldを心筋梗塞モデルマウスの心膜腔内に移植すると、非移植群に比較して梗塞部位に多くの血管新生が認められた。また、心筋前駆細胞scaffoldは移植後4週間後までに生分解されるが、移植されたred fluorescent protein陽性心筋前駆細胞の生着が確認された。次にalphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスにタモキシフェン投与後に心筋梗塞を作成し、心筋前駆細胞scaffoldを移植した群と非移植群作成で新生心筋数を定量化したところ、細胞移植群では心筋新生が促進された。平成24年度はBrdUとEdUの二種類の核酸類似体を細胞に取り込ませて、幹細胞と細胞周期に入った細胞を同一の個体で鑑別できる方法を確立し、alphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスに応用することにより、心筋梗塞後の新生心筋細胞の系譜と増殖活性を解析する方法へ昇華させることに成功した。自己組織化ナノペプチドを用いた心膜腔内心筋前駆細胞scaffold移植方法の心筋梗塞モデルに対する有用性を、そのメカニズムと細胞の良好な生着の両面から確認することができた。また、心内膜腔内心筋前駆細胞scaffold移植方法をalphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスに応用し、細胞移植が心筋新生を促進することを確認することができた。

平成24年度に確立したBrdUとEduによる新生心筋の系譜と細胞周期活性を解析する系を自己組織化ナノペプチドを用いた心膜腔内心筋前駆細胞scaffold移植方法に応用する。具体的には、妊娠中の親マウスに核酸類似体のBrdUを投与して仔のalphaMHC-MerCreMer/CAG-LacZトランスジェニックマウスを標識し、さらに、12週齢でタモキシフェン投与後に心筋梗塞を作成しする。心筋梗塞作成後、心筋前駆細胞scaffoldを移植し、かつ、EdUを投与して梗塞後細胞周期に入る細胞を標識する。梗塞4週間後に新生心筋のBtdUおよびEdUの核内取り込みの有無について組織学的に評価する。本解析により、細胞移植による内在性幹細胞の活性化動態が明らかになる。次に、新生心筋細胞、既存の心筋組織、移植床領域をレーザーマイクロダイセクション方式により採取し、各組織の遺伝子発現についてDNAマイクロアレーにより網羅的に解析を行う。心筋前駆細胞scaffold移植後のXgal染色陰性新生心筋細胞が集簇せず散在するために、マイクロダイセクションによる選択的組織回収が困難な場合は、niche構造に集約して、種々の細胞外マトリックス抗体、インテグリン抗体を用いた免疫組織染色を行い、発現の有無、局在について新生心筋細胞と既存の心筋細胞について比較解析を行う。平成25年度の研究には、遺伝子改変マウスの飼育が必須であり、実験動物および動物飼料費を計上する。また、心筋前駆細胞移植床作成に使用する細胞培養液、血清、滅菌プラスチック製品、免疫組織染色に必要な抗体試薬、レーザーマイクロダイセクションおよびDNAアレー解析にともなう消耗品費として使用する。