hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
聴覚障害児の聴能開発プログラムの作成と実践評価

近年、人工内耳、振動感覚装置及びデジタル信号処理補聴器の開発によって、重度の聴覚障害児において残存する聴覚をさらに活用できる可能性が開かれている。しかしながら、ハードウェアの開発が進む-方で、それらの機器を使用して残存聴覚を活用する能力である「聴能」をどのように開発したらよいのかについてのソフトウェア面での研究が立ち遅れている。本研究は、乳幼児期に獲得したプロソデイ-を、幼児期から学童期においていかに音声言語コミュニケーションに発展させていくかを調べることを目的とし、聴覚障害児の残存聴覚の活用を促す「聴能開発プログラム」の作成の一資料を得るために実践的な研究を補聴器の主観的評価の観点から行った。本研究は、2つの側面から「聴能開発プログラム」開発のための資料を得た。1つは、補聴器装用効果を補聴器の調整などハードの面でみるのではなくて、補聴器装用児及びその保護者の主観的評価すなわちソフトの面で捉えるものであった。もう1つは、聴能開発プログラムの1つとして位置づけられる「聴覚を生かすための評価と指導チェックリスト」の提案であった。さらに、聴覚障害児の聴覚を活かす環境整備のために、補聴器のみならず、補聴器の周辺機器に関する検討を行い、補聴器の周辺機器の活用の手順に関する体制の構築が課題とされた。米国で1995年に発刊された人工内耳装用児や補聴器装用児を対象とした聴覚活用プログラムである"Speech Perception Instruction Curriculum and Evaluation"略して"SPICE"を参照して、日本語の音韻構造と談話の文法規則それに教育的背景を考慮して、「聴能開発プログラム」の骨子と内容を検討した。その結果、米国での聴能だけを取り出した指導プログラムを作成するとかえって誤解されること、聴能に対する子どもの準備性や意欲をかきたてる中で指導する重要性が討論された。聴能の評価と指導の観点として、次の5点が上げられた。(1)音声言語コミュニケーションの状況、子どもの発声発語をどう育てるか(意欲・意志、技法、楽しみ、発達段階への配慮:対象とする人・場所・内容、子どもの聞き取り・読話をどう育てるか、意欲・意志、技法、楽しみ、発達段階への配慮:対象とする人・場所・内容)(2)表出と受容の有機的な関係、聴覚フィードバック(フィードバックモデルの提示)(3)聴覚の自己管理を促す(発達段階への配慮、自分の張力を知る、オ-ジオグラムを知る、聞こえの状態を知る)(4)補聴器の自己管理を促す(発達段階への配慮、onとoffがわかる、ラウドネスに合わせてボリューム調整をする)(5)環境の調整現在、様々な聴能の発達段階にある聴覚障害児を対象に行われた聴能の個人指導場面をビデオ収録し、教師の指導意図と内容それに教材等と子どもの応答や活動レベルを整理している。それらを文字データとし、対応する指導場面の映像データを収録して、デジタル化するための準備をしている。来年度はこの作業を継続しつつ、デジタル化を行う。しかしながら、ハードウェアの開発が進む一方で、それらの機器を使用して残存聴覚を活用する能力である「聴能」をどのように開発したらよいのかについてのソフトウェア面での研究が立ち遅れている。本研究は、乳幼児期に獲得したプロソディーを、幼児期から学童期においていかに音声言語コミュニケーションに発展させていくかを調べることを目的とし、聴覚障害児の残存聴覚の活用を促す「聴能開発プログラム」の作成の一資料を得るために実践的な研究を補聴器の主観的評価の観点から行った。
介護老人保健施設看護管理者を対象とした日本版バリューズヒストリーの開発

本研究は、わが国の事情に即したバリューズヒストリーを開発することを目的とした。2018年度は介護老人保健施設看護管理者を対象とし、日本版バリューズヒストリーを構成する項目(国内における先行研究およびLambertらが示したValues Historyから抽出した57項目)に対する必須度の評価等を調査した。調査はデルファイ法によるもので、3回の調査のうち2回目まで終了した。1回目、2回目共に80%以上の人が日本版VHの構成項目として「必須である」と回答した項目は、57項目中19項目あり、終末期医療の意思決定や代理判断に関する項目が多く含まれていた。具体的には、「安心できる環境」、「自分の意思決定の方法」、「自分が望む生活」、「死に対する考え方、」、「末期疾患になった場合の延命処置に対する希望」、「意識の回復が困難になった場合の延命処置に対する希望」、「重篤な認知症になった場合の延命処置に対する希望」、「臨終場所の希望」、「臨終の際の家族の同席に対する希望」などであった。また1回目調査では「必須であると」回答した人が80%未満であったが、2回目の調査で80%以上の人が「必須である」と回答した項目は「人生に対する姿勢」、「生きる事に対する幸福感」、「共に過ごしたい人」、「日常生活動作で困難なこと」など17項目あり、生き方に関する項目複数含まれていた。※バリューズヒストリーとは終末期医療の意思決定をする際の根拠となる価値観歴である。※デルファイ法とは質問と回答を数回繰り返す方法であり、その都度集計結果をフィードバックして再考してもらうことで意見の集約を図る方法である。本研究は老人保健施設看護管理者を対象としたデルファイ法による質問紙調査であり、調査を3回実施する予定である。2018年度は2回目までの調査結果の集計と3回目調査の準備を行い、2019年4月現在、3回目調査の質問紙調査の回収中である。2019年度以降は、介護老人保健施設の入所者を対象として日本版VHについての質問紙調査を実施する予定だった。しかし、質問紙調査に協力できる入所者を得ることが困難なため、対象者をがん看護専門看護師、緩和ケア認定看護師に変更して調査を行う予定である。調査方法は2018年度に実施した老人保健施設看護管理者を対象とした調査と同様にデルファイ法で行う予定である。2018年度は、デルファイ法による3回の質問紙調査を実施する予定であった。しかし、3回目の調査が4月の実施となったため、3回目の調査分の費用が2019年度に持ち越された。2019年度は3回目の調査と2019年度分の調査を実施する。
最先端可視化技術による軸索内細胞骨格の動態解析

ニューロフィラメントは軸索内の細胞骨格を構成している重要なメンバーの一つで、安定重合型の比率が特に高い。今回我々は再生にともなう細胞骨格の再編成機構を知るために、ラットの坐骨神経を用いてニューロフィラメント蛋白の溶解性と軸索内輸送の変化を調べた。フォスファターゼ阻害剤の存在下にラットの正常坐骨神経を1%Triton入りの緩衝溶液で処理すると、ニューロフィラメントの高分子量サブユニット(NF-H)の15-25%が可溶性画分として回収される。一方、再生しつつある神経では、障害部位より遠位側にあるニューロフィラメント蛋白は1週間以内にすべて分解消失してしまうが、2週間後にこの部位まで伸長してきた再生軸索内では可溶性画分に回収されるNF-Hサブユニットの割合が50%以上に増加していると同時に、C-末端部分のリン酸化レベルも低下する。このようなNF-H可溶性の増加は障害部より近位側の軸索内を輸送されている標識蛋白でも認められる。これに対して低分子量サブユニット(NF-L)の場合には正常軸索でも、再生軸索でも可溶性画分に回収されることはない。これらの観察から、軸索が再生している時にはニューロフィラメント全体が脱重合するのではなく、NF-Hのみの選択的な離脱が起こるものと推定され、細胞骨格を組替えて再生に対処する早期のトリガーになっていることが示唆された。フォスファターゼ阻害剤の存在化に正常坐骨神経を1%Triton入りの緩衝溶液で処理すると、ニューロフィラメントの高分子量サブユニット(NF-H)の15-25%が可溶性画分として回収される。一方、再生しつつある神経では、障害部位より遠位側にあるニューロフィラメント蛋白は1週間以内にすべて分解消失してしまうが、2週間後にこの部位まで伸長してきた再生軸策内では可溶性画分に回収されるNF-Hサブユニットの割合が50%以上に増加していると同時に、C-末端部分のリン酸化レベルも低下する。これらの観察から、軸索が再生している時にはニューロフィラメント全体が脱重合するのではなく、NF-Hのみの選択的な離脱が起こるものと推定され、その分子機構についての検討を加えている。

これらの観察から、軸索が再生している時にはニューロフィラメント全体が脱重合するのではなく、NF-Hのみの選択的な離脱が起こるものと推定され、細胞骨格を組替えて再生に対処する早期のトリガーになっていることが示唆された。
天然資源からの中性脂質代謝を制御する低分子化合物の作用機序解析

真菌由来化合物ダイナピノンA (DPA)は、中性脂質であるトリアシルグリセロール(TG)およびコレステリルエステル(CE)の細胞内蓄積を阻害する。また、その機序は生合成経路の阻害ではなく分解経路の促進による可能性が示唆されている。そこで、脂肪滴分解経路の1つであるオートファジーへの影響を調べた。DPAの処理により、オートファジーマーカータンパク質であるLC3-II量の濃度依存的な増加が認められた。また、オートファジーの選択的な分解基質であるp62タンパク質の細胞内蓄積量がDPAの処理により濃度依存的に減少したことから、DPAはオートファジーを促進していることが示唆された。さらに、一般的に知られているオートファジー経路上の因子であるmTORやbeclin-1に対するDPA処理による影響を調べたが、これらに対する影響は確認されなかった。この結果から、DPAの作用点はこれら因子より下流、もしくは未知の経路を介している可能性が示唆された。さらに、蛍光緑色タンパク質(GFP)が融合したLC3を発現する細胞の構築を行った。プラスミドを細胞にトランスフェクトし、シングルセルクローニングを行うことで、GFP-LC3安定発現細胞を取得した。現在は脂肪滴マーカーやリソソームマーカーとGFPの細胞内局在の解析を行っている。さらにケミカルバイオロジー的アプローチとして、ビオチン化誘導体をはじめとしたDPAのケミカルプローブを合成した。これら誘導体と細胞ライセートを反応させ、DPAの結合タンパク質を取得した。今後、各タンパク質の機能解析を通して、DPAが示す表現系との関連をさらに精査する。DPAについては、国内・国外学会で発表を行い、現在論文投稿の準備中である。その他、真菌由来であるボーベリオライドIIIの作用機序についても研究を行い、学会発表だけでなく、論文発表に至った。28年度が最終年度であるため、記入しない。真菌由来の化合物dinapinone A (DPA)は、中性脂質であるtriacylglycerol (TG)の細胞内蓄積を阻害する。DPAには軸異性体の関係にあるdinapinone A1 (DPA1)とA2 (DPA2)が存在し、細胞内TG蓄積に対して、DPA1単独では活性を示さず、DPA2はIC50値0.65 μMでTG蓄積を阻害するが、2つの軸異性体を等量で混合した際(DPA1:1とする)にその活性がIC50値0.054 μMと非常に強い活性増強を示す。また、これまでの研究で、DPAはTGの生合成経路を阻害するのではなく、蓄積したTGの分解を促進している可能性が示唆されている。平成27年度は生化学的およびゲノミクス的手法からこの作用機序の解明を目指した。生化学的手法では、これまでに報告されている脂肪滴(TGを蓄積する細胞内小器官)の分解経路であるリポリシスとオートファジー(リポファジー)への影響を精査した。リポリシスへの関与は認められなかったが、オートファジーにおいて、DPA1:1の濃度依存的にオートファジーマーカーであるLC3-II量の増加が認められた。また、このLC3-II量の増加はDPA1:1によるオートファジーの促進効果によるものである可能性が示唆された。今後は、オートファジーと脂質蓄積阻害活性との関連性について精査していく。ゲノミクス的手法としては、マイクロアレイ解析による網羅的な細胞内遺伝子変動の解析を行い、幾つかの作用機序と関連がありそうな候補遺伝子を得た。またそのプロセス中のRNA解析で、DPA1:1処理細胞でのみ、濃度依存的な28S rRNAの消失(分解)を確認した(細胞毒性は認められない)。軸異性体の混合でのみ認められる表現型としては非常に興味深く、今後はこの切り口からも脂質蓄積阻害活性との関連性について精査していく。軸異性体の混合であるDPA1:1処理によってその細胞が示す表現型が大きく変わる現象として、オートファジーの促進活性およびrRNAの消失活性の2つを新たに見出した。中性脂質蓄積阻害活性との関連性については今後の検討課題である。しかし、平成28年度の研究計画であるケミカルバイオロジー的アプローチ(ケミカルプロテオミクスなど)の実施に伴い、標的候補分子の絞り込みを行う上で、これらの知見は非常に有益なものになると考えられる。本研究について発表を行った化学生物学研究会では、全20演題の中より奨励研究賞を受賞した。また、平成27年度は、細胞内の中性脂質代謝を制御するその他化合物として、新規化合物bafilomycin Lとclonoamide、既知化合物ではあったが2つのdiketopiperazine化合物についての発見から作用機序までをそれぞれまとめ、論文発表を行った。

さらに、一般的に知られているオートファジー経路上の因子であるmTORやbeclin-1に対するDPA処理による影響を調べたが、これらに対する影響は確認されなかった。この結果から、DPAの作用点はこれら因子より下流、もしくは未知の経路を介している可能性が示唆された。さらに、蛍光緑色タンパク質(GFP)が融合したLC3を発現する細胞の構築を行った。プラスミドを細胞にトランスフェクトし、シングルセルクローニングを行うことで、GFP-LC3安定発現細胞を取得した。現在は脂肪滴マーカーやリソソームマーカーとGFPの細胞内局在の解析を行っている。さらにケミカルバイオロジー的アプローチとして、ビオチン化誘導体をはじめとしたDPAのケミカルプローブを合成した。これら誘導体と細胞ライセートを反応させ、DPAの結合タンパク質を取得した。今後、各タンパク質の機能解析を通して、DPAが示す表現系との関連をさらに精査する。DPAについては、国内・国外学会で発表を行い、現在論文投稿の準備中である。その他、真菌由来であるボーベリオライドIIIの作用機序についても研究を行い、学会発表だけでなく、論文発表に至った。第一にオートファジーとの関連性を検討する。そのために、現在、GFPが融合したLC3を発現する細胞を構築中である。この細胞を用いて、脂肪滴マーカー、リソソームマーカーとの多重染色を蛍光顕微鏡で観察することで、DPA1:1が示すオートファジーの亢進作用により、脂肪滴が分解しているのかを確認する。第二に、ケミカルバイオロジー的アプローチを行う。現在、DPAにビオチンタグをつけた誘導体を合成している。本化合物と、細胞ライセートを反応させ、標的候補分子を網羅的に解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
微量有害物を考慮した河川水質の改善技術に関する研究

本研究により得られた成果は、以下の3点に集約することができる。1.河川水および底泥における毒性物質の存在河川底泥から有機溶媒で抽出した画分には、アルテミア(ブラインシェリンプ、あるいはシーモンキー)への致死作用が見られた。これは、農薬等が環境中に残留していることを強く示唆し、河川の自浄作用への影響が懸念された。2.河川水からのリン除去手法の確立湖沼の富栄養化における原因物質の一つであるリンを、廃陶土を原料とするセラミックを表面処理した吸着剤で長期にわたり効率的に除去することができた。3.微量有害物による河川水質変化への影響河川底泥に含まれる好気性微生物を馴養し、農薬を添加して酸素消費速度を測定したところ、共存する有機物が少ない場合に酸素消費の抑制が顕著で、自浄作用への微量有害物の悪影響が確認された。上記の結果は必ずしもお互いに結びついていないが、微量有害物が河川の自浄作用を抑制することが明らかになり、河川水からの直接除去が技術的に難しかったリン除去法の開発がなされたことで、河川浄化のための重視すべき点が明らかになったと考えられる。研究計画にある通りの検討を行い、以下の知見を得た。霞ヶ浦および涸沼へ流入する河川水質と底泥を調べ、底泥には毒性物質が存在すること、また、その毒性の強度は数週間程度では減少しないことがわかった。それらの検討の際には、アルテミア(別名ブラインシュリンプ、シーモンキー)を用いた簡易な生物検定法の開発を行った。底泥中の毒性物質の同定には至らなかったが、水田農薬の底泥への投入実験の結果その濃度変化が少なかったことより、農薬に類似した物質が原因であると考えられた。また、河川水の水質変化に関しても、従来の知見通りの炭酸同化作用による有機物指標の悪化が見られ、それが霞ヶ浦流入河川の場合にリン律速であることが確かめられた。水質改善技術に関しては、リン酸およびアンモニア性窒素を水から吸着除去する吸着材を土壌改良材等の安価な材料から選定し、金属の硫酸塩で前処理することによる性能の向上方法を開発、適用し、リン酸除去に関しては十分な吸着性能のある吸着材の開発ができた。実験室における実験で流水式の吸着モデルを開発し、完全混合吸着モデルでその効果の予測ができることが明らかになった。さらに、パイロットプラントによる実河川水を用いた連続実験で、その効果を実証することができた。また、オゾンによる底泥の無機化および毒性除去の実験を行い、それぞれ効果があることがわかった。河川流域の特性把握については十分な検討がなされていないが、農地を上流部に持つ河川底泥の毒性が顕著であったことから、底泥の毒性は農業起因のものであることが示唆された。
国際制度間の相互連関に関する研究 : クリーン開発メカニズムを事例に

昨年の文献レビューの結果、クリーン開発メカニズムの持続可能性に、国際制度間の相互連関の視点が取り入れられていないこと、また、国際制度間の相互連関の研究で定量的な研究が行われていないことが明らかになった。そのため、クリーン開発メカニズムのプロジェクトについて、国際制度間の相互連関の観点から持続可能性に関する評価を行うと同時に、国際制度間の相互連関の解明のために定量的なデータによる検証を行ってきた。本年度は、特に国際制度間の相互連関の視点から、前年に行ったクリーン開発メカニズムプロジェクトの評価を行ってきた。生物多様性条約が定めている生物多様性に悪影響及ぼす行動をクリーン開発メカニズムのプロジェクト設計書から抽出し、個々のプロジェクトの持続可能性評価を行ってきた。既存研究では、クリーン開発メカニズムは、生物多様性条約に配慮せず新規植林・再植林を行っており、京都議定書は生物多様性条約に悪影響を与えると考えられてきた。しかし、Oberthur & Gehring (2006)の概念枠組みを用いて、個々のCDMプロジェクトを評価した結果、京都議定書はクリーン開発メカニズムを通して生物多様性条約に悪影響と同時に相乗効果ももたらすことが明らかになった。この結果は、新規植林・再植林の際に特に影響の大きいとされる植林の際の種や場所の選定等から得られた。本研究の結果、国際制度間の相互連関をミクロなプロジェクトで見ることで、相互連関は相乗効果も悪影響も与えることが明らかとなり、今後、国際環境ガヴァナンスを理解し、より良い方向に制度設計する上で、非常に重要な知見が得られた。(抄録なし)クリーン開発メカニズムと持続可能な発展、国際制度間の相互連関、クリーン開発メカニズムをはじめとする市場型の地球環境ガヴァナンスを扱った研究に関する文献のレビューを行った。その結果、クリーン開発メカニズムと持続可能な発展に関する研究では、多数の事例を扱っている研究はあるものの、個々の事例の詳細な分析を行っていなかった。また、クリーン開発メカニズムを地球環境ガヴァナンスの一部として扱っていないため、持続可能性への分析に気候変動レジーム以外の視点を組み入れることができていなかった。一方で、国際制度間の相互連関に関する研究では、クリーン開発メカニズムを地球環境レジームとして扱い、詳細な分析を行っているものの、分析単位が個々のプロジェクトではないため、事例の数が少なく一般的な結論を導きだすことができていなかった。また、今後は国際制度間の相互連関に関する研究においても、アクター等を扱ったミクロな分析が求められていることが分かった。個々のクリーン開発メカニズムプロジェクトのプロジェクト設計書等から、事例を新規植林・再植林プロジェクトを選定し、国際制度間相互連関の視点を取り入れたクリーン開発メカニズムの持続可能性分析を行い始めた。この分析により、初期的な結果として、クリーン開発メカニズムの新規植林・再植林プロジェクトは生物多様性条約に相乗効果も悪影響も与えるという分析結果が得られた。昨年に引き続いて、クリーン開発メカニズムと持続可能な発展、国際制度間の相互連関、クリーン開発メカニズムをはじめとする市場型の地球環境ガヴァナンスを扱った研究に関する文献のレビューを行った。その結果、ミクロなアクターを分析した研究は少ないながらもあるが、定性的な分析に留まっており、定性的な分析と定量的な分析を組み合わせた研究が必要とされていることが明らかになった。前年に選定した、新規植林・再植林プロジェクトにおいて、NGOや企業等のアクターの違いやプロジェクト実施国の違い等を考慮した分析を行った。結果として、クリーン開発メカニズムの新規植林・再植林プロジェクトは生物多様性条約に相乗効果も悪影響も与えるという分析結果が得られた。また、クリーン開発メカニズムの新規植林・再植林プロジェクトにおけるアクターのやホスト国、投資国の違いが、相乗効果もしくは悪影響を説明するか否かに関する分析も行った。その結果、これまで重要だと思われていたアクターの違いは新規植林・再植林のクリーン開発メカニズムプロジェクトにおいては、生物多様性条約への相乗効果もしくは悪影響にはあまり関係のない要因であること等が明らかになった。今後は、これまでの研究結果をまとめ、今後のクリーン開発メカニズムをどのように制度設計すれば、国際制度間で相乗効果をもたらしやすいのかを明らかにする。また、国際制度間の相互連関一般に関係する仮説等を考える。

本研究の結果、国際制度間の相互連関をミクロなプロジェクトで見ることで、相互連関は相乗効果も悪影響も与えることが明らかとなり、今後、国際環境ガヴァナンスを理解し、より良い方向に制度設計する上で、非常に重要な知見が得られた。交付申請書では、初年度の研究計画として、既存研究のレビューとその結果に基づいた事例の選定、そして予備的調査を行う予定であった。計画通り、文献のレビュー等から新規植林・再植林プロジェクトの選定し、分析を実施し始めた。従って、研究の目的の達成度は、おおむね順調に進展していると考えられる。クリーン開発メカニズムプロジェクトのプロジェクト設計書を用いた実証分析については順調に進展しているが、その検証ための調査についてはできていない。これまで行ってきた分析を進めてゆくとともに、統計的手法を使った方法論等も検討を行う予定である。追加のプロジェクト設計書を利用して、アクターの役割や国の役割を明らかにし、その研究成果を発表していきたい。(抄録なし)
低酸素微小環境における胃癌細胞の悪性形質獲得の機序解明と治療標的分子の探索

癌周囲低酸素環境が癌の悪性度に影響することが示唆されている。本研究は、低酸素環境が癌関連線維芽細胞(CAF)と胃癌細胞との相互作用におよぼす影響について検討した。胃癌細胞とCAFを低酸素状態にて共培養し、増殖能,遊走能、及び増殖因子受容体発現を検討した。その結果、低酸素はスキルス胃癌細胞のCXCR4発現やCAFのCXCL12産生を亢進させ、CAFースキルス胃癌細胞の相互作用を促進した。CXCR4阻害剤はこの相互作用を抑制した。以上のことから、低酸素環境はスキルス胃癌のCXCL12/CXCR4シグナルを増強し、CXCR4はスキルス胃癌の分子標的であることが示唆された。胃癌組織内には低酸素の部位が存在する。低酸素状態は、癌細胞の転移能や治療抵抗性を亢進させ、その悪性能を増強させる可能性が推測されているが、その検討は少ない。そこで今回我々は、低酸素状態で誘導されるCarbonic Anhydrase-9 (CA-9)を指標に、胃癌組織における低酸素状態とその臨床病理学的意義について検討した。当科で手術を行った胃癌265例を用いた。パラフィン包埋切片を作成し、抗CA-9抗体による免疫組織学的染色を行った。20%以上のがん細胞が染色される症例をCA-9陽性とした。胃癌265例中88例がCA-9陽性であった。CA-9発現は、4型で60%、未分化癌で41%、進行癌で43%、リンパ節転移陽性で45%、リンパ管侵襲陽性で43%と有意に高頻度であった。予後因子についての単変量解析ではCA-9の発現は予後に有意に相関していたが、多変量解析では有意な独立した予後因子ではなかった。CA-9の発現はoverall免疫染色の実験では、さまざまな因子とCA-9の発現が関わりを示し、腫瘍の悪性度との関係を示唆された。化学療法や放射線療法の抵抗性を示す低酸素の状態にCA-9が関わっている可能性があり、今後CA-9をコントロールすることで治療効果を向上させる可能性が示唆された。スキルス胃癌細胞(SGC)の増殖進展には周囲微小環境に存在する癌関連線維芽細胞(CAF)が関与することを明らかにしてきた。癌の増殖進展により増加した癌組織低酸素領域は、癌細胞の悪性度を促進することが報告されている。しかし、この悪性度亢進機序は明らかにされていない。そこで、低酸素がSGCとCAFとの相互作用におよぼす影響を検討した。SGC細胞株(OCUM-2M, OCUM-2MD3,OCUM-12)とCAF(CaF-53)を通常酸素環境と低酸素環境にて共培養し、増殖能,遊走能や、増殖因子産生、及び増殖因子受容体発現を、細胞数算定やRT-PCR,Western blotにて比較検討した。また、CAFの産生するCXCL12 (SDF-1α)をELISA法で測定し比較検討した。さらに低酸素環境において、c-Met阻害剤やCXCR4阻害剤が癌細胞の増殖能や遊走能におよぼす影響を検討した。SGCはCAFと共培養することで、通常酸素では増殖能は1.3倍、遊走能は1.4倍に増加したのに対し、低酸素環境ではさらに、増殖能が1.6倍、遊走能が2倍に増加した。低酸素環境は通常酸素に比し、SGC細胞のCXCR4発現が亢進し、CAFのCXCL12産生も2.5倍亢進した。低酸素環境はSGCの増殖浸潤を促進していた。線維芽細胞は胃癌の増殖・進展に関与していると考えられ、中でもα-SMA陽性の筋線維芽細胞の関与が示唆されている。しかしながら、癌微小環境における筋線維芽細胞の発現調節のメカニズムは明らかにされていない。本研究は、そのメカニズムを明らかにすることを目的とした。方法は、胃癌間質より樹立した2種類の線維芽細胞(CaF-29, CaF-33)と正常胃壁より樹立した線維芽細胞(NF-29)、および4種類のスキルス胃癌細胞株(OCUM-2MD3, OCUM-12)と非ヒトスキルス胃癌細胞株(MKN-45、MKN-74)を用い、共焦点蛍光顕微鏡にてα-SMA, Vimentin, DAPIで3重標識し線維芽細胞中の筋線維芽細胞の発現割合を継代別に調べ、ウェスタンブロット法にても同様に筋線維芽細胞の発現を検討した。またReal-time RT-PCR法にて胃癌細胞上清、TGF-βを添加しα-SMA mRNAの発現の変化を検討した。

その結果、共焦点蛍光顕微鏡、ウェスタンブロット法にて筋線維芽細胞の発現率はNF-29よりCaF-29で有意に多く、継代ごとにその発現率は有意に低下した。TGF-βを添加することによってCaFのα-SMAの発現は有意に増加した。スキルス胃癌細胞より抽出した培養上清を添加することによりCaFのα-SMAの発現は有意に増加したが非スキルス胃癌からの培養上清では増加しなかった。またスキルス胃癌細胞の培養上清によるCaFのα-SMAの発現の増加はTGF-βの中和抗体およびSmad2 SiRNAにて有意に抑制された。以上の結果よりスキルス胃癌間質中には筋線維芽細胞の発現が多く、それにはスキルス胃癌細胞から産生されるTGF-βが深く関与することが示唆された。癌の増殖進展により増加した癌組織低酸素領域は、癌細胞の悪性度を促進することが報告されている。しかし、この悪性度亢進機序は明らかにされていない。そこで、低酸素がSGCとCAFとの相互作用におよぼす影響を検討し、周囲低酸素環境におけるc-Met阻害剤やCXCR4阻害剤の有用性を検討した。【方法】SGC細胞株(OCUM-2M, OCUM-2MD3,OCUM-12)とCAF(CaF-53)を通常酸素環境と低酸素環境にて共培養し、増殖能,遊走能や、増殖因子産生、及び増殖因子受容体発現を、細胞数算定やRT-PCR,Western blotにて比較検討した。また、CAFの産生するCXCL12 (SDF-1α)をELISA法で測定し比較検討した。さらに低酸素環境において、c-Met阻害剤やCXCR4阻害剤が癌細胞の増殖能や遊走能におよぼす影響を検討した。【結果】SGCはCAFと共培養することで、通常酸素では増殖能は1.3倍、遊走能は1.4倍に増加したのに対し、低酸素環境ではさらに、増殖能が1.6倍、遊走能が2倍に増加した。低酸素環境は通常酸素に比し、SGC細胞のCXCR4発現が亢進し、CAFのCXCL12産生も2.5倍亢進した。siRNAによりHIF-1αを抑制することで、CXCR4発現は低下した。低酸素環境におけるCAFのSGC増殖促進作用はCXCR4阻害剤投与により抑制された。またCAFのSGC浸潤促進作用はc-Met阻害剤により抑制された。【結論】低酸素環境においてCAFが産生するHGFやCXCL12が促進され、HIF1αを介してc-HGF/c-MetシグナルやCXCL12/CXCR4シグナルが増強されることが明らかになった。c-Met阻害剤やCXCR4阻害剤は癌周囲微小環境における新規分子標的治療剤であることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。胃癌組織内には低酸素の部位が存在し、低酸素状態は、癌細胞の悪性能を増強させることが明らかになった。今回の研究により、胃癌間質から癌関連線維芽細胞を新たに樹立することが出来た。さあらにこの癌関連線維芽細胞を用いて、低酸素における胃癌と癌間質の相互作用を明らかにすることが出来た。これらの研究結果は、予定した研究の成果であり、おおむね順調に進展していると言える。今回の研究により、胃癌間質においてスキルス胃癌細胞により筋線維芽細胞の発現が亢進し、それがスキルス胃癌細胞が産生するTGF-βの関与を深く示唆するものであり、この知見はスキルス胃癌と癌間質の相互作用における増殖進展機序解明に寄与するものと考えられる。癌組織内の低酸素の病態解明とその対策を検討する。今回の研究により、低酸素における胃癌と癌間質の相互作用が明らかになった。
ジーンターゲティングによるB細胞リセプターの機能の解析

1.ヒトIg-βのgenomic cloningを終了し、Ig-β遺伝子が約2kbの長さにわたり4つのエクソンに分かれて存在することを明らかにした。これにより,既にクローニングされているIg-α遺伝子とあわせ,Ig-α,Ig-βのジーンターゲッティングの準備が終了した.しかしながら、B細胞株を用いた遺伝子導入の予備実験の結果、B細胞株での遺伝子導入の効率がかなり低いことが明らかになり、この系でIg-α,Ig-β欠損B細胞株を樹立するのは困難であると考えられた。2.この結果を考慮し、目的を達成するための第2の方法としてIg-α、Ig-βを欠如したB細胞の突然変異株の誘導を試みた。B細胞株(Ramos,Daudi)に300-500radのγ線照射を行った後、培養液中に抗IgM抗体を加え表面IgM陽性のwild typeの増殖を抑制することで表面IgM陰性のクローンを選択的に増殖させ、最終的にpanning法で表面IgM陰性の変異B細胞株を得た。3.現在、これらのクローンの内Ig-αまたはIg-βの欠損が表面IgMの消失の原因となっているものを同定中であり、これに変異Ig-α,Ig-β遺伝子を遺伝子導入することで当初の目的を達成する計画である。4.1の解析中、ヒトIg-α,Ig-β遺伝子の転写産物に亜型の存在することが明らかとなった。この亜型は、B細胞活性化におけるB細胞リセプターの発現減少に何らかの関与をしているものと考えられる。これにより,既にクローニングされているIg-α遺伝子とあわせ、Ig-α,Ig-βのジーンターゲッティングの準備が終了した.2.B細胞株を用いた遺伝子導入の予備実験を行い、B細胞株での遺伝子導入の効率がかなり低いことを明らかにした。3.2の結果を考慮し、目的を達成するための第2の方法としてIg-α、Ig-βを欠如したB細胞の突然変異株の誘導を試みた。今後、これらのクローンの内、Ig-αまたはIg-βの欠損が表面IgMの消失の原因となっているものを同定し、遺伝子導入の実験に使用する。4.Ig-βのgenomic cloningを終えたことで、当初の目的に必要な材料がそろったことになりまず第1段階が終了したと考えられる。しかしながら、予備実験の結果、これらの材料を用いhomologous recombinationを誘導することは確率的に必ずしも容易でないことも明らかとなり、平行して前述の方法を試み、当初の目的をめざす。1.ヒトIg-βのgenomic cloningを終了し,Ig-β遺伝子が約2kbの長さにわたり4つのエクソンに分かれて存在することを明らかにした.これにより,既にクローニングされているIg-α遺伝子とあわせ,Ig-α,Ig-βのジーンターゲッティングの準備が終了した.しかしながら,B細胞株を用いた遺伝子導入の予備実験の結果,B細胞株での遺伝子導入の効率がかなり低いことが明らかになり,この系でIg-α,Ig-β欠損B細胞株を樹立するのは困難であると考えられた.2.この結果を考慮し,目的を達成するための第2の方法としてIg-α、Ig-βを欠如したB細胞の突然変異株の誘導を試みた.

B細胞株(Ramos,Daudi)に300-500radのγ線照射を行った後,培養液中に抗IgM抗体を加え表面IgM陽性のwild typeの増殖を抑制することで表面IgM陰性のクローンを選択的に増殖させ,最終的にpanning法で表面IgM陰性の変異B細胞株を得た.3.現在,これらのクローンの内Ig-αまたはIg-βの欠損が表面IgMの消失の原因となっているものを同定中であり,これに変異Ig-α,Ig-β遺伝子を遺伝子導入することで当初の目的を達成する計画である.4.1の解析中,ヒトIg-α,Ig-β遺伝子の転写産物に亜型の存在することが明らかとなった.この亜型は,B細胞活性化におけるB細胞リセプターの発現減少に何らかの関与をしているものと考えられる.
アデノウイルスベクターを用いた新しい血管新生抑制因子の同定

当該研究では、アデノウイルスベクター眼内投与で発現される未知の新生血管抑制因子を特定し、臨床応用への基礎をつくることがその目的である.そのため、E4の削除してあるものとないものとの2種類のコントロールベクターをマウスの眼内に直接注入し、その後眼内で何のmRNAの発現が亢進もしくは抑制されているかマイクロアレイ法で検索した。ウイルスベクターを注入したマウスは2種類で、ひとつは何もしていない正常のC57BL6マウスで、もうひとつは、未熟児網膜症モデルで眼内新生血管のあるC57BL6マウスである。未熟児網膜症モデルは生後7日から12日の間75%酸素下で飼育し、その後大気下に戻し生後13日に眼球摘出し、mRNAを抽出した。正常C57BL6マウスにウイルスを注入した場合、全部で12,422のprobe setとESTsのうち、非注入眼とGV10ウイルス(E4の削除していないもの)の比較では、580種類のgeneとESTsの発現が変動していた。非注入眼とGV11ウイルス(E4の削除してあるもの)の比較では、660種類のgeneとESTsの発現が変動していた。また、注目すべきは、GV10とGV11との比較であるが、UGのMm81873、Mm51368、Mm24547の三種類のみが変動していた。しかしながら、これらのシグナルは大きくなく、変動が有意かどうかの判定が難しい。また、正常眼での検討と、実際に新生血管の発生が見られるモデルでは発現が異なってくる可能性が考えられたため、未熟児網膜症モデルにGV11ウイルスを注入した場合と、そうでなかった場合を比較した。その結果ウイルス注入で、有意に発現が増強した遺伝子は48種類、抑制されたものが12種類であった。そのうち、特に血管新生の抑制に関連している可能性のあるもののひとつに、MHC class I antigenが挙げられる。それ以外にもいくつか候補があった。これに加え、付随的な知見として、アデノウイルスベクターには神経保護作用のあることも明らかとなった。これは、網膜変性モデルとして、網膜光障害を作成し、それにウイルスベクターを導入すると、網膜視細胞は保護されていた。いずれにしろ、アデノウイルスベクター投与で血管新生および神経保護に関与する遺伝子の発現が亢進していることが明らかとなった。当該研究で本年度実施した内容は、ほぼ計画通りで、マイクロアレイで発現遺伝子を同定した。以下にその詳細を記す。まず、遺伝子治療用のアデノウイルスを準備した。これは2種類あり、ひとつはE1/E3を削除したもの(第二世代アデノウイルスベクター:AdNull.10)であり、もうひとつはE1/E3/E4を削除したもの(第三世代アデノウイルスベクター:AdNull.11)である。それぞれをC57BL6マウスの硝子体腔に各眼1×10^9ウイルス粒子ずつ注入した。それぞれ合計50眼ずつ注入した。これに非注入眼(コントロール)を同数用意し、それぞれtotal RNAを抽出した。total RNAは各群ともおおよそ350から400ug程抽出できた。

そこからmRNAを抽出し、精製、その後cDNA合成し、ビオチンで標識する。その後、cRNAを精製・抽出し、MgOAcでfragment化する。これをAffymetrix社のGene Chip(マイクロアレイ)にhybridizationさせて、そのシグナルを解析した。現在、解析はまだ終了していないが、いくつかの候補遺伝子が同定されている。このうち特に有望なのが、AdNull.10とAdNull.11との比較の情報が重要であった。なぜならば、この二つのウイルスの間では、抗血管新生作用に大きな違いがあり、そのメカニズムとして、この二つのベクターによる遺伝子発現の差によるものと考えられるからである。当面この二つのベクター投与群の比較のデータを重点的に解析していく予定である。当該研究では、アデノウイルスベクター眼内投与で発現される未知の新生血管抑制因子を特定し、臨床応用への基礎をつくることがその目的である。そのため、E4の削除してあるものとないものとの2種類のコントロールベクターをマウスの眼内に直接注入し、その後眼内で何のmRNAの発現が亢進もしくは抑制されているかマイクロアレイ法で検索した。ウイルスベクターを注入したマウスは2種類で、ひとつは何もしていない正常のC57BL6マウスで、もうひとつは、未熟児網膜症モデルで眼内新生血管のあるC57BL6マウスである。未熟児網膜症モデルは生後7日から12日の間75%酸素下で飼育し、その後大気下に戻し生後13日に眼球摘出し、mRNAを抽出した。正常C57BL6マウスにウイルスを注入した場合、全部で12,422のprobe setとESTsのうち、非注入眼とGV10ウイルス(E4の削除していないもの)の比較では、580種類のgeneとESTsの発現が変動していた。非注入眼とGV11ウイルス(E4の削除してあるもの)の比較では、660種類のgeneとESTsの発現が変動していた。また、注目すべきは、GV10とGV11との比較であるが、UGのMm81873、Mm51368、Mm24547の三種類のみが変動していた。しかしながら、これらのシグナルは大きくなく、変動が有意かどうかの判定が難しい。また、正常眼での検討と、実際に新生血管の発生が見られるモデルでは発現が異なってくる可能性が考えられたため、未熟児網膜症モデルにGV11ウイルスを注入した場合と、そうでなかった場合を比較した。その結果ウイルス注入で、有意に発現が増強した遺伝子は48種類、抑制されたものが12種類であった。そのうち、特に血管新生の抑制に関連している可能性のあるもののひとつに、MHC class I antigenが挙げられる。それ以外にもいくつか候補があるが、いずれにしろ、アデノウイルスベクター投与で血管新生に関与する遺伝子の発現が亢進していることが明らかとなった。
咽頭蠕動波は咽頭期嚥下の絶対的な基準となり得るか？

咽頭期嚥下運動は延髄に支配される反射運動で、その開始の絶対的基準は提示されていない。咽頭蠕動波の発現機序は明らかではないが、恒常的に発現する運動であり、咽頭期嚥下運動の開始の絶対的基準になりうると考えられる。本研究では消化管の蠕動運動における外縦筋を咽頭挙筋、内輪筋を咽頭収縮筋とし、その協調運動によって咽頭蠕動運動が発現すると考え咽頭後壁の挙上と収縮の関連につき解析した。咽頭後壁は挙上し、その後下降するが、その下降と同時に咽頭蠕動波が出現し下方へ伝播した。この一連の運動は再現性の高い時間的関係にあり、消化管の蠕動運動に類似し、咽頭の挙上運動は咽頭蠕動波の発現に関与する可能性が示唆された。正常ボランティアおよび臨床例において、X線透視装置を用いて、造影剤嚥下時の咽頭期嚥下運動の観察を行い、咽頭蠕動波の発現と喉頭挙上や食道入口部の開大のタイミングの時間的関係について解析した。これまでの報告通り、咽頭蠕動波の発現と食道入口部の開大は正常ボランティアおよび臨床例ともにその時間は一定に保たれていることが確認でき、喉頭挙上と咽頭蠕動波の発現の順序が、誤嚥を認める例と認めない例とで異なることがあることが判明した(H24 11気管食道科学会で報告)。この結果は、咽頭期嚥下における嚥下障害を発症する許容範囲の破綻の基準に咽頭蠕動波の発現が関与している可能性を示唆しているものであった。今後は症例をさらに増やし、疾患ごとに特徴があるかの研究を継続する予定である。同時に、機能生理学的な解析による証明のため、前年度から引き続き、正常ボランティアを対象に、バリウム嚥下時の咽頭蠕動波の発現と食道入口部方向への進行の形態、下顎、舌、舌骨、喉頭の運動を観察すると共に、同時に咽頭筋を中心とした嚥下関連筋へのhooked wired electrodeによる多チャンネル筋電図を行い、嚥下時の咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構について観察を行っている。こういった機能生理学的手法を用いた解析と臨床例におけるデータから、嚥下障害を発症する許容範囲の破綻の基準と咽頭蠕動波の発現との関連性につき、解析を継続していく予定である。咽頭期嚥下運動は、延髄の嚥下中枢に反射性に制御される時間的にも空間的にも再現性が極めて強くパターン形成された運動である。咽頭期嚥下運動開始の基準の報告は様々あるが、嚥下運動の相対的な基準であったために、全ての嚥下障害に対して有用な評価法とはなり得なかった。そのため、咽頭期嚥下障害の治療指針が未だに一定になっていない原因の一因であると考えられる。これに対して、咽頭期嚥下運動のうち、最も恒常的に発現するものは咽頭蠕動波であり(棚橋, 1967)、咽頭蠕動波の発現が咽頭期嚥下の絶対的な基準点として最も相応しいものと考えられる。しかし、咽頭蠕動波の発現を咽頭期嚥下障害の基準として観察を行った報告は無く、本研究では、嚥下時のヒトの咽頭蠕動波の発現機構を機能生理学的研究により明らかにし、咽頭期嚥下運動の絶対的な基準としての立場を明確にすることを目標とした。以前より咽頭期嚥下運動の解析では、喉頭の挙上運動を指標として報告されていたため、前年度においては、喉頭挙上運動と咽頭蠕動波の時間的関係をX線透視画像から解析し、喉頭挙上運動は変動が大きく、咽頭蠕動波はほぼ一定していることが確認でき、咽頭蠕動波を基準にしたリハビリテーションの有用性の可能性が示唆された(H24日本気管食道科学会で口演)。最終年度では、咽頭蠕動運動を消化管の蠕動運動と比較して検討し、消化管の蠕動波が内輪筋と外縦筋との協調運動によっておこることに着目し、その内輪筋に相当する咽頭収縮筋と外縦筋に相当する咽頭挙筋との協調運動によって発現している可能性を考えた。そこで、咽頭の挙上運動と収縮運動の関係をX線透視画像から解析すると、その関係は相関を持って協調していることが判明し、咽頭蠕動運動と消化管蠕動運動は類似した運動であり、咽頭の挙上運動は咽頭蠕動波の発現に強く関与している可能性が示唆された(H26、嚥下医学会にて口演)。

咽頭後壁は挙上し、その後下降するが、その下降と同時に咽頭蠕動波が出現し下方へ伝播した。この一連の運動は再現性の高い時間的関係にあり、消化管の蠕動運動に類似し、咽頭の挙上運動は咽頭蠕動波の発現に関与する可能性が示唆された。正常ボランティアを対象に、嚥下時の咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構について観察を行っている。X線透視装置を用いて、バリウム嚥下時の咽頭蠕動波の発現と食道入口部方向への進行の形態を観察すると共に、同時に咽頭筋を中心とした嚥下関連筋へのhooked wired electrodeによる多チャンネル筋電図を行い、咽頭期嚥下運動の全体の運動様式と筋活動の様式と時間的配列の関係を明らかにすることを目的とし、また、同様に嚥下圧測定を行い、咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構の時間的・量的な関係を明らかにすることを目的とした。また、下顎、舌、舌骨、喉頭の運動との関連性について、正常人を用いて、機能生理学的に解析を行っている。現在、これらの結果を集めるとともに、解析を行っているところである。また、更に、臨床例からも検討を行い、延髄障害例における咽頭蠕動波の異常形態とその発現機構、経過についても検討を行っている。これらを併せて咽頭蠕動波の発現が咽頭期嚥下運動の基準となり得るかを統計学的手法を駆使して証明しようと考えている。今迄、咽頭期嚥下の絶対的な基準が示されていなかったことから、嚥下障害の評価や治療について、明確な指針が示されていなかったが、これにより咽頭期嚥下の新たな、またエビデンスレベルの高い治療指針が作製される可能性が高い。本研究は実際の嚥下障害評価の際に、疑問を感じていることであり、本研究により咽頭期嚥下の絶対的な基準が咽頭蠕動波であることが証明されれば、実臨床での嚥下障害評価、治療に大いに貢献するものと考えられる。正常ボランティアおよび臨床例において、X線透視装置を用いて、造影剤嚥下時の咽頭期嚥下運動の観察を行い、咽頭蠕動波の発現と喉頭挙上や食道入口部の開大のタイミングの時間的関係について解析し、誤嚥を発症する原因にその時間的関係が関与する可能性が示唆された。機能生理学的な証明のため、前年度に引き続き、正常ボランティアを対象として、嚥下時における咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構について、具体的にはX線透視装置による嚥下運動の観察と同時にhooked wired electrodeを用いた多チャンネル筋電図の記録を行っている。やや遅れている理由として、対象となる正常ボランティアと検査日を合わせることが比較的困難なことから、統計処理を行うほどの対象が集まっていないことからが挙げられる。正常ボランティアを対象として、嚥下時における咽頭蠕動波の発現と運動制御機構について、機能生理学的な手法を用いて観察・解析を行っており、具体的には、hooked wired electrodeを用いた多チャンネル筋電図の同時記録と、嚥下時のVTR-X線透視画像と重ね合わせて記録し、解析を行っている。対象となる正常ボランティアと検査日を合わせることが比較的困難であり、統計処理を行うほどの対象が集まらないことが理由として考えられる。今後も前年度に引き続き、正常ボランティアを対象に、嚥下時の咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構についての観察を、hooked wired electrodeを用いた多チャンネル筋電図の記録を併せて行い解析を行っていくと共に、臨床例においての咽頭蠕動波と喉頭挙上の時間的関係の解析を引き続き行っていく予定である。臨床例の解析には、延髄障害などの疾患ごとに解析を行い、結果にエビデンスを求めていく。今後も前年度同様、引き続き、正常ボランティアを対象に、嚥下時の咽頭蠕動波の発現形態と運動制御機構について観察を行う。また、得られた結果を臨床例について確かめ、更に、超高速同期MIR撮像法、超音波断層法を用いての観察も行うことで実験結果により客観性を持たせ、咽頭蠕動波の咽頭期嚥下の絶対的基準であることのエビデンスを求める。また、延髄障害例における咽頭蠕動波の異常とその経過についても同様に解析を行うこととする。消耗品である白金ウレタンコーティング絶縁筋電図ワイヤーを今年度も購入し、上記実験を継続して行うこととする。また、連続複数咽頭内圧測定装置の購入も検討しており、上記実験と合わせて解析に加えていくことも検討している。消耗品である白金ウレタンコーティング絶縁筋電図ワイヤーを購入し、上記実験を継続して行う。
RNAファージの鋳型認識機構の進化

〔研究目的〕RNAファージ感染菌中のレプリカーゼ(RNA依存RNA合成酵素)は、高い鋳型特異性を有するRNA合成酵素である。この酵素蛋白とRNA分子との相互認識の機構の解明は単にRNAファージの発生と進化の理解に役立つのみでなく、普遍的な核酸と蛋白質との相互識別の機構の理解さらには生命体の持つ分子認識機構の理解のためにも極めて重要な問題である。〔研究成果〕(1)Qβレプリカーゼの分離、50gのRNAQβの感染菌に(-80°C凍結保存)と100gのアルミナを徐々に加えながら菌を破砕する。これに300mlの緩衝液を加えて懸濁液としてこれを10,000rpm10分間遠心する。沈査に50%polyethylen glycolと30%(w/w)Dextran 500を加えて30分間撹拌する。これを遠心してDextran層を集める。これをNaClを含む緩衝液に溶す。さらにPolyethylenglycolを加えて、のち遠心する。Polyethylenglycol層にレプリカーゼは分画されて来る。これを透析したのち55%飽和硫安を加える。遠心して沈査を集めこれをカラムクロマトの原材料とする。2.フォスフォ・セルロース・カラム(PC)フォスフォ・セルロース・カラムにphase分配によって得られた試料をのせ50mM-1M NaClの濃度勾配によって溶出する。酵素活性をAssayして活性分画を集める。3.QAESephadexクロマトグラフPCカラムよりの活性分画をQAE Sephadexカラムにのせ100mMAmS-300mMAmSの直線濃度勾配によって溶出する。4.アガロース・ゲル濾過Bio Gel A0.5mカラムによってゲル濾過することによってきわめて高い比活性のQβレプリカーゼ分離に成功した。(2)Mx-1レプリカーゼの分離、Mx-1レプリカーゼ分離の為の第一段階として目下各種の分離条件を検討中である。Qβに於いて成功した方法についてまず試みるべく目下その準備を進めている。
日米農業における生産性の差異とその要因に関する実証的研究

平成6年度から8年度にかけて、『日米農業における生産性の差異とその要因に関する実証的研究』という研究課題の下に日米農業の実証分析を行って来た。データベースの作成およびup-to-dateに以外に時間がかかり、米国農業のデータベースはまだ未完成である。これに関しては、さらに精緻なデータベースを作成すべくかなりのエネルギーと時間をつぎ込んでいる。他方、日本農業のデータベースはほぼ完成したので、それを用いての生産性の要因分解分析など、かなり多方面にわたっての研究が可能になった。これらの統計的推計に基づいて3本の論文を完成することが出来た。今後さらに、3、4本の論文作成を予定している。さらに、同時並行して行ってきた台湾農業のデータベースが稲作に関して完成したので、それを用いて、日本の場合と同様の実証的分析を行い、興味深い結果を得ることが出来た。この線に沿った実証研究をあと2、3年続けて、韓国農業をも研究対称に含めて、日韓台米農業の生産性の比較実証分析を行い、一冊の書籍としてまとめ上げたいと思っている。本年度の研究作業は専ら日米農業の生産性の推計に必要なデータベースの作成であった。日本農業のデータベースはほぼ完成の域に達したので、平成7年度には本格的な実証分析に着手する。同時に、アメリカのデータベースをも完成させ、これに対しても実証的分析を実施したい。日本農業のデータベースの概要は以下の様なものである。データの集計期間は1956-90である。総生産、総投入、および総生産性を推計するために、それぞれの指数はテルンクビスト近似法によって推計した。これらのデータがまたトランスログ生産関数、費用関数、および利潤関数の推計にも使用される。このデータベースの作成に用いられた主な資料は以下のとおりである。「農家経済調査報告」、「農村物価賃金調査報告」、「作物統計」、「農林水産省統計表」、「農業・食料関連産業の経済計算」、「ポケット農林水産統計」、「国民経済計算年報」、「日本統計年鑑」、「長期経済統計」、「日本長期統計総覧」などである。本年度の研究作業は専ら日本農業の生産性の推計であった。日本農業のデータベースはぼぼ完成の域に達したので、本年度には本格的な実証分析を行ってきた。目下、これらの結果を用いて論文を作成中である。同時に、アメリカのデータベースをもかなりの程度まで完成させた。平成8年度には、これに対しても実証的分析を実施する予定である。実証分析に用いられた日本農業のデータベースの概要は以下の様なものである。『農家経済調査報告』、『農村物価賃金調査報告』、『作物統計』、『農林水産省統計表』、『農業・食料関連産業の経済計算』、『ポケット農林水産統計』、『国民経済計算年報』、『日本統計年鑑』、『長期経済統計』、『日本長期統計総覧』などである。日本農業のデータベースはほぼ完成の域に達したので、本年度には本格的な実証分析を行ってきた。同時に、アメリカのデータベースをもかなりの程度まで収集を行った。しかしながら、いくらかの実証的分析を試みたところいろいろと不備な点が見つかったので、このデータベースの改善に時間とエネルギーを注いでいる。このマクロ的分析と並行して、日本と台湾の稲作における生産性の研究も進めてきた。今年度には、特に、農業におけるR&Dや普及活動が生産性に及ぼす影響について実証的研究を行った結果、興味深い結果を得た。それらは、別々の論文として書き上げた。

『農家経済調査報告』、『農村物価賃金調査報告』、『作物統計』、『農林水産省統計表』、『農業・食料関連産業の経済計算』、『ポケット農林水産統計』、『国民経済計算年報』、『日本統計年鑑』『長期経済統計』、『日本長期統計総覧』などである。