hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
UVBによる表皮細胞のアポトーシスの解析

さらに我々は表皮に出来る紫外線発癌の産物であると考えられている基底細胞癌(BCC)の発癌のメカニズムを検討した。そこで、β-cateninという細胞内情報伝達因子に着目した。β-cateninはWntシグナル系の下流に位置する情報伝達分子でその分子異常は、メラノーマや大腸癌の発生に関与することが以前報告されていた。そこで、BCC検体、有棘細胞癌検体、あるいはアトピー性皮膚炎や尋常性乾癬患者よりえた検体を用い検討したところ、β-cateninがBCCにおいてのみ情報伝達因子として機能し、その他の場合では細胞間接着に関与することを明らかにした(Yamazaki et al. Br J Dermatol2001;145:771-777)。1.紫外線(中波長UVB)によるメラノーマ細胞のアポトーシスに関与する分子の解析:ヒトメラノーマ由来細胞株G361に致死量を下回るUVBを4回くり返し照射すると、最終的に致死量のUVBを照射しても細胞はアポトーシスに陥らなくなった.この細胞はアポトーシス誘導因子であるCD95リガンド(CD95L)に対しても抵抗性であった為,次にCD95発現ベクターを,くり返しUVB照射を受けた細胞にトランスフェクションし蛋白を発現させたところ,同細胞はUVBに対してもCD95Lに対してもアポトーシス感受性を回復した.又,RT-PCR,FACS解析によりCD95分子のmRNA,タンパクが,くり返しUVB照射により著しく低下することが判明した.以上の結果はUVBによるメラノーマのアポトーシスにCD95が不可欠に役割を課していることを示すと考えられる.本研究はアポトーシスの臨床応用を目的とするが、計画2年目の本年以下のことが明らかになった。1)Fasリガンドを高発現するメラノーマMeWo細胞にFas(CD95/APO-1:アポトーシス誘導因子)の発現ベクターをin vitroで導入すると、高率に細胞のアポトーシスが誘導された。2)1)の生物学的意義はMeWo細胞をヌードマウスに移植し担癌マウスモデルを作成し、そのマウスにFas発現ベクターを投与することにより確認された。すなわち、担癌マウスのメラノーマはFasベクターの生体内投与により顕著に縮小した。3)2)の観察をさらに追及したところ、投与されたFasベクターが腫瘍内Fas蛋白の合成を引き起こし、Fas-Fasリガンドの結合により腫瘍細胞がアポトーシスに陥っていることが観察された。上記の研究においてUVBによる表皮細胞のアポトーシスに関する以前の知見(Aragane et al. J Cell Biol 1998;140:171-182)を用い、CD95蛋白の強制発現が有用であるというという点が明らかになった。さらに我々は表皮に出来る紫外線発癌の産物であると考えられているBCCの発癌のメカニズムを検討した。β-cateninはWntシグナル系の下流に位置する情報伝達分子でその分子異常はメラノーマや大腸癌の発生に関与することが以前報告されていた。そこで、BCC検体、SCC検体、あるいはアトピー性皮膚炎や尋常性乾癬患者よりえた検体を用い検討したところ、β-cateninがBCCにおいてのみ情報伝達因子として機能し、その他の場合では細胞間接着に関与することを明らかにした(Yamazaki et al. Br J Dermatol 2001;145:771-777)。今後さらに、治療応用に向け検討してゆきたいと考える。
分割GFPの再構成を利用した分子間相互作用可視化プローブの作成

本研究では、分割したYFPの断片の相補的再会合による蛍光回復(BiFC法,Bimolecular Fluorescence Complementation法)を利用して、蛋白質分子間の相互作用や活性状態を生細胞で可視化するプローブを開発することを目的とした。アクチン脱重合因子であるコフィリンとアクチンとの結合状態、活性化状態(リン酸化状態)を可視化できるプローブを開発するため、分割YFPの断片をアクチンとコフィリンに融合し、結合依存的にYFP断片が相補的に再結合し蛍光を回復する組合わせをスクリーニングし、単色でS/N比の高い蛋白質間相互作用検出プローブの作成に成功した。しかし、このプローブの蛍光発色は不可逆的であり、生細胞で蛋白質間の結合・解離の時空間的変化を計測するには不適当であった。そこで、私たちは、本法を用いてLIMキナーゼ阻害剤をスクリーニングすることとした。LIMキナーゼ存在下では、コフィリンがリン酸化されアクチン結合能を失うため蛍光発色しないが、阻害剤があればLIMキナーゼの活性が失われ、蛍光発色することとなる。本法により、約1000種の低分子化合物から、2種の阻害剤を見出した。さらにそれらをリード化合物として新たに類似化合物を合成し、LIMキナーゼに特異性の高い阻害剤を探索し、数種の新たな阻害剤を同定した。これらの阻害剤の細胞運動、癌細胞浸潤に対する効果を測定し、有効な結果を得た。また、BiFCプローブは蛋白質間相互作用を高感度で検出することが可能であり、RasとRafなどシグナル伝達経路における分子間相互作用を高感度に検出することができ、RasとRafの結合阻害剤のスクリーニング系を開発した。細胞内シグナル伝達研究において、シグナル分子間の相互作用や活性状態の時空間的変化を生細胞内で高感度で可視化するイメージング技術の開発が必須である。生細胞内で蛋白質間相互作用を検出する可視化プローブとしてFRETプローブが多く使われているが、検出感度、S/N比が低いという問題点があり、さらに革新的なプローブの開発が期待されている。特に、アクチン脱重合因子であるコフィリンのアクチンとの結合状態、活性化状態(リン酸化状態)の時空的変化を生細胞で可視化できるプローブを開発することを目的とした。分割YFPの断片をアクチンとコフィリンに融合し、結合依存的にYFP断片が相補的に再結合し蛍光を回復する条件を種々検討し、単色でS/N比の高い蛋白質間相互作用検出プローブの作成に成功した。YFP断片のアミノ酸配列にランダムに変異を導入することによって、融合蛋白質間の相互作用に依存して可逆的に発光・消光するプローブ(可逆的BiFCプローブ)を大規模スクリーニングし、数種の候補プローブを得た。また、BiFCプローブは蛋白質間相互作用を高感度で検出することが可能であり、シナル伝達経路における分子間相互作用を不可逆的に検出したり、キナーゼ阻害剤の高感度スクリーニング法として利用することが期待できる。私たちは、本法を用いてLIMキナーゼ阻害剤をスクリーニングし、数種の阻害剤を見出した。
Ｆｅｎｇｙｃｉｎ構造混乱の終結：生合成経路の矛盾解消

Bacillus subtilis H336Bの培養液は強い抗菌活性を示し、その培養抽出液から活性物質を単離したところ、報告されているfengycinと同一のスペクトルを示す環状デプシペプチドであることが判明した。しかし、その構造を詳細に調べたところ、その異性体として報告されているplipastatinと同一であることが判明した。plipastatinとfengycinはともに一対の鏡像体チロシンを含んでおり、その配列が異なるというものであった。調査したところ、両者の生合成クラスターはほとんど一致しており、論文上同一物質とみなしているもの、さらに異なった異性体と判断しているものなど多数あり、構造に混乱が見られた。本研究課題では、この構造混乱の終結を目指した。まず、fengycinとplipastatinのスペクトルは異なると報告されており、単離したサンプルはfengycinのそれとのみ一致したが、このサンプルを酢酸ナトリウムと処理後、ゲル濾過を行ったところ、報告されているplipastatinのスペクトルとほぼ一致した。したがって、両者は同一物質であることが明らかになった。次に、分解反応や、部分構造を合成するなど、可能な限り演繹的な方法で構造を解析したところ、この化合物は、報告されているplipastatinの構造が正しいということが判明した。この構造であれば、整合性クラスターにも矛盾がなく都合がよいといえる。今回の結論を完全に証明するにはFengycinとして報告されていた構造を合成し、そのスペクトルが天然物とは異なることを示す必要がある。そこで、旧fengycin構造の合成を検討した。2012年度で環状デプシペプチドの構築法を確立した。24年度が最終年度であるため、記入しない。.Bacillus subtilis H336Bより単離した強い抗菌性を示すデプシペプチドのプロトンNMRスペクトルは、1986年にBudzikiewiczらによって単離されたfengycinとよい一致を示した。純粋にした本化合物をカリウム塩に変換したところ、NMRスペクトルは大きく変化してplipastatinと一致した。両化合物はジアステレオマーとして報告されていたが、これらの実験から両者は同一物質であり、したがっていずれかの構造、あるいは両構造ともに間違いがあることを示唆した。そこで、本化合物の構造を独自に解析した。まず、温和な塩基性条件下でメタノリシスが進行し、その結果メタノール付加体を与えることからデプシペプチド構造を確認した。加水分解体およびメタノリシス体のMSMSスペクトルを比較してそのペプチド配列を確実に決定した。3-ヒドロキシ脂肪酸アミド部分は、酸加水分解後、還元、続く2-ナフトイル化により発色団を装着した。また同化合物を合成し、CDスペクトルを比較することによりR立体配置を決定した。本化合物はD-およびL-チロシンをそれぞれ1残基ずつ含んでいるが、そのうち一つのフェノール性水酸基はラクトン構造に含まれている。そこでダンシル化反応により遊離したフェノール性水酸基に選択的にラベル化し、引き続く加水分解、Marfey法によりキラル素子を装着、HPLCを用いて分析した。その結果、ラクトン環に関与したラベル化されないチロシンがL配置、ラベル化される、すなわち遊離のフェノール性水酸基を持つチロシンがD配置であることが明らかになった。以上の結果はplipastatinと同一構造である。このことより、200以上の科学論文に登場するfengycinの構造に誤りがあることを明らかにした。独自の構造解析による構造確定に成功、構造混乱にほぼ終止符を打つことができた。最終確定には訂正される以前の構造を化学合成し、スペクトルが一致しないことを示す必要があるが、これについては合成に着手した段階で、まだ進展が見えるとは言えないため。

24年度が最終年度であるため、記入しない。我々の構造解析から、fengycinの構造には間違いがあることが判明したが、その最終確定には、訂正される以前の構造を化学合成し、スペクトルが一致しないことを示す必要がある。現在その合成に着手した段階であるが、本年度中にその合成を完成すべく検討を進めたい。
音響信号記号変換に基づいたセマンティックインタラクション

(1)「音を聞き分ける」音の量的爆発促進技術:使用環境,設置条件に関する事前知識量を極力減らした実時間ロボット聴覚ソフトウエア「HARK」を5月から公開を始め, 11月に京都大学で, 12月には韓国KISTで無料講習会を開催した.今年度開発したHARKの新機能は,従来の2値マスクから連続値のソフトマスクによるミッシングフィーチャマスク自動生成法であり,音声認識率が10%程度向上した.また,ロボットの自己生成音を抑制するICAによるセミブラインド分離法も開発し,音楽ロボットに応用した.すなわち,ロボットが自分の出す歌声やハミングの影響を抑制し,音楽だけを聞いて実時間でビート認識する音楽ロボットを開発した. IEEE/RSJ IROS-2008発表の2本の論文が, Award for Entertainment Robots and Systems (NTF Award) Nomination Finalist 4件中の2件に選ばれた.(2)「音を見せる」音の質的複雑さ軽減技術:HARKと3D viewerを組み合わせた音環境可視化システムに,既開発の俯瞰モードでの機能拡充,及び,没入感モードでの「音アウエアネス」提示機能を開発した.前者は,音環境の早送り提示,音声認識結果のカラオケ風表示,及び,機能の洗練化である.後者に対しては,音の気付きという音アウエアネスを向上させるには,単なる高忠実音場再生ではなく,分離合成というプロセスが不可欠であるという観点から取り組んだ.人の動きは,ディスプレイ上に設置したステレオカメラで取得した画像データから色情報を用いた最近傍探索で認識している.音の没入モードでの提示に分離合成というアプローチは他に例がなく,今後の展開の可能性が示唆された.(1)「音を聞き分ける」音の量的爆発促進技術:使用環境,設置条件に制約がなく使えるように,環境に関する事前知識量を極力減らした実時間ロボット聴覚ソフトウエア「HARK」を開発した.HARKは,FlowDesignerというミドルウエアの上に,音源定位,音源分離,ミッシングフィーチャマスク自動生成,ミッシングフィーチヤ理論に基づく音声認識を組み込んだシステムである.体型が全く異なる3体のロボットで異なる配置のマイクロフォンアレイやサラウンドマイクロフォンを入力機器とし,ノートPC上で稼動する.3人同時の料理注文を受けるロボット,口によるジャンケンの審判をするロボットのデモを開発し,HARKの移植性の高さを実証した.IEEE/RSJ IROS-2006 Best Paper Finalistを受賞した.(2)「音を見せる」音の質的複雑さ軽減技術:(3)音楽を聞き分ける技術として,市販CD音楽を聞き分け,ビートを認識し,次のビートを予想してステップを踏むロボットの開発も行い,実時間で動くことが確認できた.自分の耳で音楽を聞き分けるロボットは世界初である.(1)「音を聞き分ける」音の量的爆発促進技術:使用環境,設置条件に関する事前知識量を極力減らした実時間ロボット聴覚ソフトウエア「HARK」を5月から公開を始め, 11月に京都大学で, 12月には韓国KISTで無料講習会を開催した.今年度開発したHARKの新機能は,従来の2値マスクから連続値のソフトマスクによるミッシングフィーチャマスク自動生成法であり,音声認識率が10%程度向上した.また,ロボットの自己生成音を抑制するICAによるセミブラインド分離法も開発し,音楽ロボットに応用した.すなわち,ロボットが自分の出す歌声やハミングの影響を抑制し,音楽だけを聞いて実時間でビート認識する音楽ロボットを開発した. IEEE/RSJ IROS-2008発表の2本の論文が, Award for Entertainment Robots and Systems (NTF Award) Nomination Finalist 4件中の2件に選ばれた.(2)「音を見せる」音の質的複雑さ軽減技術:HARKと3D viewerを組み合わせた音環境可視化システムに,既開発の俯瞰モードでの機能拡充,及び,没入感モードでの「音アウエアネス」提示機能を開発した.前者は,音環境の早送り提示,音声認識結果のカラオケ風表示,及び,機能の洗練化である.後者に対しては,音の気付きという音アウエアネスを向上させるには,単なる高忠実音場再生ではなく,分離合成というプロセスが不可欠であるという観点から取り組んだ.人の動きは,ディスプレイ上に設置したステレオカメラで取得した画像データから色情報を用いた最近傍探索で認識している.音の没入モードでの提示に分離合成というアプローチは他に例がなく,今後の展開の可能性が示唆された.
単一グルタミン酸受容体チャネルにおけるカルシウムイオン流入過程の画像化

平成14年度は局所レーザー光分解(FLIP)と全反射照明(TIRF)法の二目的を両立した正倒両立式蛍光顕微鏡法を用いて、1)神経細胞の細胞膜領域に限局したカルシウム応答をの検出、2)単一グルタミン酸イオンチャネルにおけるカルシウムイオン流入の同定を行なった。海馬神経細胞におけるグルタミン酸依存性Ca応答の領域を限局させるために、負荷するCa蛍光プローブの用量を低下させ、阻害剤を用いて他の(二次的な)Ca信号をできるだけ抑制することを試みた。3種の阻害剤、すなわちNMDA型受容体阻害剤であるMK-801(10μM)、膜電位依存性Caチャネル阻害剤であるニフェジピン(10μM)そして細胞膜透過型のCaキレート剤であるBAPTA-AM(20μM)を処置するとケージドグルタミン酸(1mM)のFLIPにより誘導されるCa依存性Rhod2蛍光は著しく阻害された。TIRF法で蛍光検出を細胞膜領域に限定するとグルタミン酸刺激直後において、グルタミン酸の投与領域(直径約3ミクロンの範囲)周辺に集中した蛍光強度の増大が検出された。蛍光強度はグルタミン酸投与後12msでピークに達し、この時平均直径約0.5ミクロンのスポットとして観察された。スポットは一度のグルタミン酸刺激で、9μm平方あたり平均で310個ほど出現し、出現から20ms後にはほとんどが消滅した。スポットの直径は消失まで大きく変化しなかった。グルタミン酸刺激依存性で出現するCa依存性Rhod2スポットの数は、グルタミン酸の投与範囲や投与用量に依存して変化した。以上の結果から、グルタミン酸刺激依存性で出現したスポットはCaイオンの結合により活性化した単一のRhod2蛍光分子であると結論された。スポットはTIRF法でのみ観察されたことから、Rhod2蛍光分子がガラス面(細胞接着面)に近づいたときに検出されたと考えられ、カルシウムチャネルが開いてカルシウムイオンが細胞内に入ってRhod2と結合した瞬間をとらえた可能性が高い。平成13年度は1)局所レーザー光分解(FLIP)法と全反射照明(TIRM)法の二目的を両立した蛍光顕微鏡装置を構築、および2)神経細胞の限定領域においてカルシウム蛍光プローブの高S/N検出を行った。1.FLIPとTIRM光学系の融合既製の顕微鏡装置を部品を組み合わせて、2つの対物レンズを正立および倒立式で使用可能にした。ケイジド神経伝達物質のFLIPは正立式、TIRM(蛍光信号の検出)は倒立式でそれぞれ独立動作が可能となった。FLIPの主な光学系はLD励起式パルスレーザー、光束径調節部そして集光位置調節部から構築した。レーザー光の集光位置を光軸に沿って移動するために凸レンズ位置をPCで制御して変位可能にした。レンズフォーカス面におけるFLIP領域を光活性化したフルオレセインの蛍光強度分布の解析より求めたところ、1ミクロン程度まで縮小化することができた。一方倒立側におけるTIRM用の光学系は固体レーザー、光軸調整部と高開口数レンズから構築した。緑色(532nm)連続波レーザーを選択し、対物レンズのフォーカス面における直径40ミクロンの範囲で全反射させることに成功した。全反射照明による微弱蛍光を高量子効率CCDカメラで検出したところ蛍光一分子が可視化できた。さらに毎フレーム5msで高速追跡可能なことが確認できた。2.神経細胞の限定領域におけるカルシウム応答の誘導および検出神経細胞は新生ラット海馬より初代分散培養した後、緑色励起用カルシウムプローブを導入して細胞内カルシウム濃度の測定に供した。カルシウム応答はケイジドグルタミン酸のFLIPにより誘導した。細胞膜近傍における染色性、蛍光信号の強度や信号速度を検討したところ、カルシウムプローブとしてRhod2AMを選択することが本研究目的に最適であると判断した。TIRMによる蛍光信号を落射式と比べたところ、少なくとも3倍以上のS/Nになることが確認できた。特にこれまで検出困難とされていた樹状突起におけるカルシウム応答を明瞭に検出することが可能になった。誘導するカルシウム信号の強度の調節を検討することにより、チャネルレベルの応答検出が期待できる。

スポットは一度のグルタミン酸刺激で、9μm平方あたり平均で310個ほど出現し、出現から20ms後にはほとんどが消滅した。スポットの直径は消失まで大きく変化しなかった。グルタミン酸刺激依存性で出現するCa依存性Rhod2スポットの数は、グルタミン酸の投与範囲や投与用量に依存して変化した。以上の結果から、グルタミン酸刺激依存性で出現したスポットはCaイオンの結合により活性化した単一のRhod2蛍光分子であると結論された。スポットはTIRF法でのみ観察されたことから、Rhod2蛍光分子がガラス面(細胞接着面)に近づいたときに検出されたと考えられ、カルシウムチャネルが開いてカルシウムイオンが細胞内に入ってRhod2と結合した瞬間をとらえた可能性が高い。
雲解像モデルと詳細な陸面パラメータを用いた広域大気陸面相互作用の 総合研究

雲解像モデルCReSSのバージョン3.4への更新に伴い、陸面過程モデルSiBUCについても畑地灌漑スキームや積雪融雪過程を更新し、最新版の結合モデルの開発と検証を進めた。2011年のモンスーンオンセット時を基準として、各年の衛星観測植生指標の空間相関係数が最も下がる2010年の地表面パラメータを用いた実験と実際の2011年の地表面パラメータを用いた実験を実施し、チャオプラヤ川の大洪水をもたらしたモンスーン変動と陸域植生の関係を検討した。AVHRRの後を埋める衛星データセットであるTerra/Aqua MODIS1km globallevel 1b(2000-現在)データを、インターネットを通じて取得した。2000年にTerra/MODISとNOAA/AVHRRの観測時期が重なることや、他のグローバル植生衛星データ(SPOT Vegetation)も合わせて、両者の系統的な差を考慮に補正した長期データセットを日単位、1km解像度で整備した。雲解像モデルによる様々な数値実験では、対象とする現象や領域の大きさに応じて1kmから数kmの格子サイズが設定されることになるが、ここではまず、衛星データのピクセルサイズにおいて葉面積指数、キャノピーカバー率、農事暦(播種日、収穫日、生育段階)等陸面過程モデルSiBUCで使用する様々なパラメータを整備した。次に、雲解像モデルの格子位置に合わせ、植生パラメータを植生タイル毎に集約するための処理ツールや土壌水分等の陸面状態量を初期値に取り込むツールを整備した。インドシナ半島およびインドチベットを対象として、水平解像度1kmから数kmで雲解像モデルCReSSを用いた予備実験を行った。これまでのGEWEX/GAME、CEOP、CREST等のプロジェクトを通じて整備されている、アジアモンスーン域のモデル検証用のデータを収集するとともに、各種実験結果との比較を容易にするためのツール整備を行った。全球モデルMIROCとCReSSの2-way nestingモデルにSiBUCを結合したMIROC-CReSiBUC 2-way nestingモデリングシステムの開発に着手した。1.各感度実験に対応した陸面過程モデルのパラメータ設定植生観測情報をもとに、陸面過程モデルSiBUCで使用する様々なパラメータを整備した。雲解像モデルによる様々な数値実験では、対象とする現象や領域の大きさに応じて1kmから数kmの格子サイズが設定されることになるが、ここではまず、衛星データのピクセルサイズにおいて植生パラメータを整備しておく。次に、雲解像モデルの格子位置に合わせ、植生パラメータを植生タイル毎に集約する。ここで、整備すべきパラメータセットは1通りではなく、衛星観測情報をそのまま活用した、いわば「真実」の場として、計算対象年の陸面状態をできるだけ正確に表現するためのパラメータセット、モンスーン変動に呼応した植生活動の年々変動の影響を除去し、平均的な季節変化を与える気候値的なパラメータセットなど、様々な数値実験の目的に合わせた陸面パラメータを複数セット整備した。2.モデルの更新雲解像モデルCReSSのバージョン3.4への更新に伴い、最新版の結合モデルの開発を進めた。陸面過程モデルSiBUCについてもここ数年の畑地灌?スキームや積雪融雪過程の更新を結合モデルに反映することにした。CReSS-SiBUCの結合部分の調整などのモデル本体の更新に加え、地表面パラメータ作成などのプリプロセッサ部分の更新が必要で、モデルの更新にはかなりの時間を要し起CReSSの最新版への更新により、長期積分を行う際にネックとなっていた大気放射過程が強化され、本研究で対象とするモンスーンの開始から終了にかけての連続計算が可能となった。全球モデルMIROCとCReSSの2-way nestingモデルにSiBUCを結合したMIROC-CReSiBUC 2-way nestingモデリングシステムの開発を進めた。4.陸面状態アノマリーの分析MODISデータの解析により、地表面温度の平年値からの偏差が大きな地域と時期を特定した。この情報は、最終年度に実施する数値実験をデザインする上で重要であり、またモデル出力値の検証情報としても活用される。雲解像モデルCReSSのバージョン3.4への更新に伴い、最新版の結合モデルの開発をさらに進めた。陸面過程モデルSiBUCについてもここ数年の畑地灌漑スキームや積雪融雪過程の更新を結合モデルに反映することにした。CReSS-SiBUCの結合部分の調整などのモデル本体の更新に加え、地表面パラメータ作成などのプリプロセッサ部分や地表面状態量の引き継ぎ部分更新が必要で、モデルの更新にはかなりの時間を要した。CReSSの最新版への更新により、長期積分を行う際にネックとなっていた大気放射過程が強化され、本研究で対象とするモンスーンの開始から終了にかけての連続計算が可能となった。しかしながら、本研究で当初掲げていた12kmの高解像度でアジア全域を対象とした長期計算を実施するには、本研究で導入した計算機の計算能力では限界があるため、計算対象領域をやや絞り、空間解像度もやや粗くした計算を実施することにした。

2011年のタイのチャオプラヤ川での大洪水を受け、2011年を重点解析対象年とした。過去の水文データの解析から、チャオプラヤ川で大洪水を引き起こす年の特徴として、特に雨期前半の降雨量が多いことが判明した。そこで、2011年のモンスーンオンセット時(5月6月)を基準として、各年の衛星観測植生指標の空間相関係数が最も下がる2010年のNDVIデータを用いた実験と実際の2011年のNDVIデータを用いた実験を実施し、このような大洪水をもたらしたモンスーン変動と陸域植生の関係を検討した。また、モデル検証用に静止気象星観測輝度温度情報から雲を抽出、判別する手法を開発した。モデルの更新に多くの時間を費やし、数値シミュレーションをあまり実行できていないが、本研究が対象とする時間スケールからすると、本質的に重要なステップであったと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。効果的に数値実験を設定、実行し、また結果を持ち寄り追加実験を設定、実行するために、定期的にメンバーが一堂に会する場を設ける。
母集団薬物動態および代謝酵素の遺伝子診断情報に基づく薬物個別投与設計法の開発

我々はこれまでに、フェニトインを対象薬剤として選択し、日本人てんかん患者における母集団薬物動態パラメータを推定すると共に、フェニトインの体内動態におよぼすチトクロームP450(CYP)2C9/19の遺伝子多型の影響を検討してきた。本研究では、患者個別のフェニトイン血中濃度の予測精度を検討することによって、薬物個別投与設計における代謝酵素の遺伝子診断情報および薬物血中濃度情報の有用性を評価した。CYP2C9およびCYP2C19の遺伝子変異の影響を考慮しないフェニトインの母集団動態パラメータに基づいて患者の血中濃度を予測したところ、CYP2C9の遺伝子変異(Leu^<359>)を有する患者では実測値が大きく高濃度側へ偏ることが明らかとなった。一方、CYP2C9/19の遺伝子変異の影響を考慮したフェニトイン母集団動態パラメータを用いた場合、CYP2C9の遺伝子変異(Leu^<359>)を有する患者においても血中濃度の予測に偏りは認められなかった。本研究では、さらにベイジアン推計理論に基づく個別投与設計の精密化について検討を加えた。すなわち、CYP2C9/19の遺伝子変異の影響を考慮した母集団動態パラメータを事前情報とし、患者に対する事後情報として12点の薬物血中濃度データを用いて速度論的解析を行ったところ、患者固有の動態パラメータに基づく血中濃度の予測精度は、母集団動態パラメータのみによる場合に比べ顕著に上昇することが認められた。従って、CYP2C9/19遺伝子診断情報はフェニトインの低代謝能患者の検出に極めて有用であること、また薬物血中濃度モニタリングに基づくベイジアン解析によって投与量の個別化と精密化が期待できることが明らかとなった。我々はこれまで薬物代謝を主とした薬物動態研究に加え、母集団薬物速度論に基づく薬物投与設計についての基礎・応用研究を展開してきた。一方、病態生理学的変動を考慮して薬用量を設定したにもかかわらず、一部の患者に血中濃度の顕著な上昇と重篤な副作用が発現することが以前から指摘されてきた。近年の薬物動態学の進歩によって、この主たる原因が薬物代謝能の遺伝子な欠損による薬物体内動態の変動であることが明らかになってきた。本研究では、抗痙攣薬フェニトインの体内動態に極めて大きな個体差が認められることに着目し、薬物代謝酵素P450分子種の一つCYP2Cサブファミリーの遺伝子診断を進めた。その結果、CYP2C9およびCYP2C19の遺伝的多型と日本人てんかん患者におけるフェニトインの代謝能との間に良好な相関があることを見い出すとともに、CYP2C9がフェニトインの主要な代謝酵素であり、本酵素の変異を有する患者では代謝能が大きく低下することを明らかにした。本研究では、さらに薬物代謝酵素の遺伝子診断情報を利用した個別投与設計法の開発を行った。すなわち、母集団動態解析の手法を用いて、フェニトインの代謝におよぼすCYP2C9およびCYP2C19変異の影響を定量化するとともに、得られた日本人てんかん患者の母集団薬物動態パラメータ、および個々の患者の遺伝子診断結果に基づく個別投与設計法の開発と評価を行った。病態生理学的変動を考慮して薬用量を設定したにもかかわらず、一部の患者に血中濃度の顕著な上昇と重篤な副作用が発現することが以前から指摘されてきた。これまでに我々は、抗痙攣薬フェニトインの体内動態に極めて大きな個体差が認められることに着目し、薬物代謝酵素P450分子種の一つCYP2Cサブファミリーの遺伝子診断を進めた。その結果、CYP2C9およびCYP2C19の遺伝的多型と日本人てんかん患者におけるフェニトインの代謝能との間に良好な相関があることを見い出すとともに、CYP2C9の変異を有する患者では代謝能が大きく低下することを明らかにした。

本研究では、薬物代謝酵素の遺伝子診断情報を利用した個別投与設計法の開発を行った。すなわち、得られた日本人てんかん患者の母集団薬物動態パラメータ、および個々の患者の遺伝子診断結果に基づく個別投与設計法の開発と評価を行った。その結果、CYP2C9およびCYP2C19の遺伝子変異の影響を考慮しないフェニトインの母集団動態パラメータに基づいて患者の血中濃度を予測したところ、CYP2C9の遺伝子変異(Leu@@S1359@@E1)を有する患者では実測値が大きく高濃度側へ偏ることが明らかとなった。一方、CYP2C9/19の遺伝子変異の影響を考慮したフェニトイン母集団動態パラメータを用いた場合、CYP2C9の遺伝子変異(Leu@@S1359@@E1)を有する患者においても血中濃度の予測に偏りは認められなかった。従って、CYP2C9/19遺伝子診断情報はフェニトインの低代謝能患者の検出に極めて有用であること、また薬物血中濃度モニタリングに基づくベイジアン解析によって投与量の個別化と精密化が期待できることが明らかとなった。
文科系大学生のための「総合的自然科学野外実習」プログラムの開発

赤城山での地球科学野外実習では、新しいプログラム・ユニットを加え、より教育効果の挙がる自然科学フィールードワーク講座に改良した。例えば、水の分析では、担当教員と同じ科学分析分野の群馬大学で微量分析を行なった。改良の効果は、学生による調査レポートの質の高さに現れている。私立文科系大学である武蔵大学の学生が、高等学校理科科目の基本的な概念や定義を理解しているかを「知識アンケート」によって調査した。教科書のなかでゴチックで記載されている基本概念を選び出してアンケートを作成した。また、理科系科目履修に対する「態度アンケート」も昨年とほぼ同じ内容で実施し比較を行った。これらのアンケート結果から、どの分野の知識が相対的に不足しているかが判明したので、来年度以降の講義内容の組み立て方を改良することができた。本研究では赤城山という自然が良く残されている地域でのプログラムを開発・改良してきた。一方人が自然を利用しながら形成されている里山の自然を材料としたプログラムも導入するため、千葉県において予備調査を行った。理科離れが問題となり,子ども時代の自然体験も希薄になっている。高校時代の理科科目履修状況と自然科学の基礎知識の理解度を知ることは,文科系大学で自然科学教育を行う前提である。入学時に提出された高校時代の理科履修記録と武蔵大学での履修記録とがともに存在する学生,3728人についての二つの情報を接続した。理科履修状況入力は手作業で行わざるを得ず時間がかなり掛かった。個人情報保護のガイドラインのため,当初予定していた入力作業補助員を依頼することはできなかった。文科系大学の全学生の高校時代の履修状況を調べた研究例は,ほとんどなく,大学での自然科学科目履修と科目の特性との関係を来年度は分析する。履修状況の初期分析からも,物理科目,地学科目の履修は非常に少数であった。在学生に講義時間を利用して,自然科学の基礎知識と科学への態度に関するアンケートも実施した。また,赤城山での調査活動のガイダンスVIDEOを編集し,DVDを作成した。赤城山での環境プログラムの開発を進めた。足尾銅山での産業公害と自然回復活動をサブメニューとして加える可能性を検討するため,現地踏査を行った。また,赤城山山麓に流れ山(山体崩壊で崩落した古火山の残骸)がありこれらも調査対象とできるか現地調査を行った。本年度は,班員で4回の研究集会を行い,結果の共有と今後の研究指針と分析視点について意見を交換した。また,このプログラムに直接関係する,同じく野外研究である「自然科学集中野外講座」や「国東半島の農業の歴史と現在を訪ねて」と本研究で対象としている赤城山でのプログラムを対比させて,より教育効果の高い方法を検討した。
Caチャンネル調節機構と多様性と調節機構間の相互作用

この研究では、細胞膜の電位依存性Caチャンネルの調節機構を解明するために電気生理学的および生化学的実験を行った。1.心筋Caチャンネルにinsideーoutパッチで蛋白キナ-ゼを作用させその効果を調べた。Aキナ-ゼではチャネル活動の増大が認められたが、Cキナ-ゼではチャネル活動に著しい変化を認めなかった。2.心筋Caチャンネルを再構成したリポゾ-ムを用いて、蛋白キナ-ゼのCaチャンネルに及ぼす影響を調べた。ウシ心筋Caチャンネルを再構成したリポゾ-ムからK脱分極で誘発されるnifedipine感受性のCa流束は、Aキナ-ゼにより約2倍に増加した。これに対し、Cキナ-ゼは有意の効果を示さなかった。3.上記のリポゾ-ムにおいて、Aキナ-ゼは、200k,170k,150k等の膜蛋白質をリン酸化した。一方、Cキナ-ゼでは、150k,125k,108k等の膜蛋白質がリン酸化を受けた。200kDの蛋白質は、azidopineの結合からCaチャネルのα_1サブユニットと考えられた。4.心筋Caチャンネルに対するG蛋白質の直接作用を検討するため、cellーattachedパッチとinsideーoutパッチの実験を行ったが直接作用を支持する結果は得られなかった。5.蛋白キナ-ゼが平滑筋のCaチャンネルの調節に関与するかについて検討した。モルモット盲腸紐の平滑筋細胞からcellーattachedパッチ法でCaチャンネル電流を記録し、フォルスコリンおよびフォルボ-ルエステルを作用させたがチャンネル活動に一貫した変化は見られなかった。さらに、insideーoutパッチでAキナ-ゼや蛋白フォスファタ-ゼの抑制薬はチャンネル活動に有意の変化を示さなかった。本年度は、心筋および平滑筋のCaチャンネルのリン酸化による調節の可能性について検討した。1)心筋のCaチャンネル:CaチャンネルAキナ-ゼのリン酸化による調節はこれまでの研究でほぼ確立しているが、このことは今回のより単純な実験系であるinsideーoutパッチ(モルモット単離心室筋細胞を使用)においても確認された。しかし、リン酸化の基質となる膜蛋白が未同定であるので、同蛋白を電気泳動法、オ-トラジオグラフ法で同定するよう実験を進めた。その結果、チャンネル蛋白のα_1サブユニットに相当する分子量の膜蛋白がAキナ-ゼでリン酸化されることが判明した。一方、Cキナ-ゼの作用は、insideーoutパッチ法では確認されなかった。このことは、Cキナ-ゼの作用がチャンネルのリン酸化ではなく、他の間接的経路で発現している事を示唆する。2)平滑筋のCaチャンネル:平滑筋のCaチャンネルについては、蛋白キナ-ゼがチャンネルの調節に関与するのが議論の多いところである。モルモット盲腸紐から分離した単一平滑筋細胞からcellーattached法でCaチャンネルを記録し、フォルスコリンおよびフォルボ-ルエステル(TPA)を作用させたがチャンネル活動に一貫した変化は見られなかった。このことから、Aキナ-ゼおよびCキナ-ゼのチャンネルに対する直接的効果は否定的であると思われる。本年度も、心筋および平滑筋のCaチャンネルの調節機構について検討を加えた。1)心筋のCaチャンネル:Caチャンネルに対するG蛋白質の直接作用を検討するため、モルモットの単一心筋細胞にcellーattachedパッチを施しCaチャンネル電流を記録した。細胞外液にイソプロテレノ-ル(Iso)を投与しcAMPを介して作用するチャンネル活動の増大を解析した。Isoは10^<-7>Mの濃度でチャンネルの開口確率を2ー3倍に増大させた。また、10^<-8>でも開口確率の増大が認められた。

この結果は、cellーattachedパッチにおけるcAMPを介する効果がwholeーcell clampでのそれに匹敵することを示すと考えられ、G蛋白質が直接チャンネルに作用するという経路の効果が比較的弱いことを示唆している。さらに、insaideーoutパッチでのrundownに対するGTPγSの効果を検討したが、有意の効果は認められなかった。これらの結果は、G蛋白質のCaチャンネルに対する直接効果の生理的意義に疑問を投げかけるものである。2)平滑筋のCaチャンネル:モルモット結腸紐から単離した平滑筋細胞でCaチャンネルに対するAキナ-ゼの作用を検討した。Caチャンネルの活動がinsideーoutパッチで2分以上持続した例でAキナ-ゼの触媒サブユニットをATPと共に作用させたが、チャンネル活動に有意の変化は認められなかった。また、蛋白フォスファタ-ゼの抑制薬であるオカダ酸もCaチャンネルの活動に影響を与えなかった。これらの結果は、平滑筋のCaチャンネルではAキナ-ゼによる活動調節が弱いか存在しないという前年度に示された考えを支持するものである。
カイコ蛹に含有される新規アミノ化合物群の構造解明と血圧降下作用

節足動物カイコ(Bombyx mori)は,蚕糸生産の有用昆虫であり,その幼虫,成虫および糞は,漢方薬,民間薬として古来,糖尿病や痛風の治療などに用いられている.しかしながらこのような動物を基原とする薬用資源についての精緻な化学的,薬理学的研究は端緒についたばかりで,カイコについては韓国の研究機関において特に精力的に実施されつつあるものの未詳の部分が多い.申請者は,無脊椎動物由来の水溶性バイオアクティブファクターの探索研究の一環として,カイコ蛹に着目し,その水溶性成分の研究を開始した.本研究では,マウスに対する血圧,体温降下(直腸体温測定)作用および鎮痛作用(対照薬アミノピリン,酢酸writhing法)を成分探索の指標とした.前年度報告したとおり,カイコ蛹(群馬県大間々産)のメタノール抽出エキスをFolch分配(CH_3Cl-MeOH-H_2O=1:1:1 v/v)し,得られる上層可溶画分を0.15g/kg0.90g/kgのレンジでddY系雄性マウスに投与し,血圧,体温降下および鎮痛作用を検討したところ,いずれにおいても有為な結果が得られた.そこで引き続き,同画分について種々のカラムクロマトグラフィーによる分離,精製を行い,ニンヒドリン試薬陽性のフラクションより化合物1(白色粉末,【α】_D+1.5,MW291)を見いだし,このものの純粋単離に成功した.本化合物は,1とそのメチルエステル誘導体の恒数ならびにNMR,MS,IRスペクトルから構造解析がなされ,血圧降下作用を有する含窒素化合物,Laminineと類似の部分構造を有する新規物質と判明した*.1の絶対配置を含む立体化学については,X線結晶解析法により決定すべく誘導体あるいは重金属の塩として得られる各種結晶を調製中である.また同化合物は,ddY系雄性マウスに対し75mg/kg以上で鎮痛作用を示した**.現在,その吸収と動態実験の為,定量可能な1の誘導化体の調製法を確立しつつあり,さらに同化合物の血圧,体温降下についても,同上層可溶画分に存在する他の活性化合物群とともに検討中である.*日本農芸化学会1999年度大会で発表,99.3.31福岡**天然有機化合物2000年会議で発表,99.7.29アムステルダム節足動物カイコ(Bombys mori)は,白きょう蚕(白きょう病で硬直死した乾燥虫体),蚕沙(幼虫の乾燥糞便),蚕繭(まゆ)などの生薬として鎮静,降血圧作用などを目的に用いられている.しかしながらその蛹(さなぎ)については蚕糸の収穫後,鯉の餌や釣り餌として利用されるのみで,薬用に供されることはない.申請者は,無脊椎動物由来の水溶性バイオアクティブファクターの探索研究の一環として,また新たな医薬資源の発見を目指して,かいこ蛹に着目し,その水溶性成分の研究を開始した.本研究では,成分探索の指標として幾つかの薬理および生物活性実験を採用した.今回カイコ蛹(群馬県大間々産)のメタノール抽出エキスをFolch分配(CH3Cl-MeOH-H2O=1:1:1v/v)し,得られる上層可溶画分を0.15g/kg0.90g/kgのレンジでddY系雄性マウスに投与し,血圧,体温降した(直腸体温測定)作用および鎮痛作用(対照薬アミノピリン,酢酸writhing法)で評価したところ,いずれにおいても有意な結果が得られた.同画分について種々のカラムクロマトグラフィーによる分離,分画を行い,主要成分の一つであるニンヒドリン試薬陽性の水溶性化合物(1,白色粉末【α】D+1.5,MW291)を見いだし,このものの純粋単離に成功した.本化合物は,1とそのメチルエステルの誘導体の恒数ならびにNMR,MS-IRスペクトルから構造解析がなされ,血圧降下作用を有する含窒素化合物,Laminineと類似の部分構造を有する新規物質と判明した.現在,1の血圧降下作用をはじめとする各種薬理試験を実施中であり,薬効の本態解明への基礎データを蓄積している.さらに同上層可溶画分には数種のドラーゲンドルフ試薬陽性の化合物の存在も示唆されており,NMRスペクトル等から新規アシルコリンと推定されるそれら構造の詳細について解析中である.節足動物カイコ(Bombyx mori)は,蚕糸生産の有用昆虫であり,その幼虫,成虫および糞は,漢方薬,民間薬として古来,糖尿病や痛風の治療などに用いられている.しかしながらこのような動物を基原とする薬用資源についての精緻な化学的,薬理学的研究は端緒についたばかりで,カイコについては韓国の研究機関において特に精力的に実施されつつあるものの未詳の部分が多い.申請者は,無脊椎動物由来の水溶性バイオアクティブファクターの探索研究の一環として,カイコ蛹に着目し,その水溶性成分の研究を開始した.本研究では,マウスに対する血圧,体温降下(直腸体温測定)作用および鎮痛作用(対照薬アミノピリン,酢酸writhing法)を成分探索の指標とした.前年度報告したとおり,カイコ蛹(群馬県大間々産)のメタノール抽出エキスをFolch分配(CH_3Cl-MeOH-H_2O=1:1:1 v/v)し,得られる上層可溶画分を0.15g/kg0.90g/kgのレンジでddY系雄性マウスに投与し,血圧,体温降下および鎮痛作用を検討したところ,いずれにおいても有為な結果が得られた.

そこで引き続き,同画分について種々のカラムクロマトグラフィーによる分離,精製を行い,ニンヒドリン試薬陽性のフラクションより化合物1(白色粉末,【α】_D+1.5,MW291)を見いだし,このものの純粋単離に成功した.本化合物は,1とそのメチルエステル誘導体の恒数ならびにNMR,MS,IRスペクトルから構造解析がなされ,血圧降下作用を有する含窒素化合物,Laminineと類似の部分構造を有する新規物質と判明した*.1の絶対配置を含む立体化学については,X線結晶解析法により決定すべく誘導体あるいは重金属の塩として得られる各種結晶を調製中である.また同化合物は,ddY系雄性マウスに対し75mg/kg以上で鎮痛作用を示した**.現在,その吸収と動態実験の為,定量可能な1の誘導化体の調製法を確立しつつあり,さらに同化合物の血圧,体温降下についても,同上層可溶画分に存在する他の活性化合物群とともに検討中である.*日本農芸化学会1999年度大会で発表,99.3.31福岡**天然有機化合物2000年会議で発表,99.7.29アムステルダム
生体異物相互作用の場としてのいわゆるニッチを介した造血幹細胞動態の制御と加齢影響

生体異物相互作用の場としても知られるいわゆるニッチを介した造血幹・前駆細胞の維持機構として、発達・成長途中で造血幹・前駆細胞の静止期分画が確立し、その後老年期に至る長期間その大きさが一定に維持される機構の存在を発見した。この機構の解析を目的として、1)これまで造血幹・前駆細胞の維持に関わることを示してきた種々の遺伝子改変動物による解析、2)電離放射線を含む生体異物の曝露による酸化的障害誘発条件下での造血幹・前駆細胞やその支持組織に対する細胞・分子生物学的解析、3)これらへの加齢影響、について検討し、造血幹・前駆細胞の分化段階に応じて機能的に異なる制御/防御システムの存在が示唆される結果を得た。本年度は、初年度における定常状態での各種遺伝子改変動物での解析に引き続き、電離放射線やベンゼンといった生体異物による酸化的障害下での、造血幹・前駆細胞とこれを支えるニッチの機能を、生命活動維持の生理と生体障害の両面から明らかにすることを計画し、主に放射線の影響に重点を置いて解析を進め、以下の成果を得た。即ち、2Gyのガンマ線の単回全身照射後、経時的に造血幹・前駆細胞数や、造血幹・前駆細胞における2',7'-dichlorofluorescein diacetateの蛍光強度を指標とした活性酸素種(ROS)量、細胞動態の解析の為のBromodeoxyuridine (BrdU)の取り込み分画、などの計測、及び、遺伝子発現解析を行った。分化型の血球数は照射直後に減少するものの、6週間程度で回復した。一方、造血幹・前駆細胞分画ではその分化階層の未熟な分画ほど回復の遅延が見られ、より未分化な造血幹細胞(lineage陰性, c-kit陽性, stem cell antigen 1 [Sca1]陽性[LKS])分画では、その回復は非照射群の40%に留まった。この時、LKS分画ではROS量を反映する蛍光強度の有意な増強が観察された。また、コロニー形成性の造血前駆細胞のBrdUの取り込み分画は、照射4週間後には有意な減少を示すが、照射10.5ヶ月後には有意な増加に転じた。LKS分画についても解析の為の検体を保存した。こうした未分化分画における数的回復の遅延の分子背景を検討する目的で、照射4週後ないしは加齢マウスの骨髄細胞における網羅的遺伝子発現解析で注目された細胞増殖やアポトーシスの関連遺伝子について、骨髄細胞及びLKS分画における遺伝子発現の定量PCR法による解析を進めた。照射4週後の骨髄細胞ではこれまでの結果がよく再現され、ATM/CHEK2/Trp53 pathwayの活性化やAKT/PI3K pathwayの抑制に符合する一連の遺伝子の発現変動が見られた。さらに、LKS分画でも同様の変化が観察され、骨髄細胞一般でもLKS分画でもアポトーシスの進行が示唆された。初年度は、これまで造血幹・前駆細胞の維持に関わることを示してきた種々の遺伝子改変動物による解析を中心に、造血幹・前駆細胞とこれを支えるニッチの機能を、生命活動維持の生理と生体障害の両面から明らかにすることを計画し、thioredoxin (Trx)過剰発現(Tg)マウス、アリールハイドロカーボン受容体(AhR)遺伝子欠失(KO)マウス、あるいはコネクシン(Cx)32-KOマウスを用いた個体レベルでの解析を行い、主に以下の成果を得た。1)造血幹細胞分画としての分化抗原陰性c-kit陽性Stem Cell Antigen1(Sca1)陽性(LKS)分画において2',7'-dichlorofluorescein diacetateの蛍光強度を指標とした活性酸素種(ROS)量を、定常状態の成体(1220週齢程度)で同腹の野生型由来と比較すると、AhR-KO由来では予想通り2.1倍であった。他方、Trx-Tg由来では予想に反して野生型と差異を認めなかった。但し、過酸化水素処理によって野生型ではROS量が定常状態の約3倍に増加したのに対し、Trx-TgではROS量増加の有意な抑制が観察されている。2)当申請者らが考案したin vivoでの造血幹・前駆細胞特異的細胞周期測定法、BUUV法によるコロニー形成性の造血前駆細胞の静止期分画は、特に未分化な13日目の脾コロニー形成性前駆細胞において、Trx-Tg由来では、BrdUrdの取り込み分画が野生型の0.57倍に留まり静止期分画が大きいのに対して、AhR-KO由来では、BrdUrdを取り込む分画が野生型の1.38倍に増加し静止期分画が小さくなることを明らかとした。

なおBrdUrdの取り込み分画の大きさが一定に達する時期には両者とも野生型との差異を認めないことから、静止期分画の成立時期には野生型との差異はないものと考えられた。本年度は、昨年度に引き続き、電離放射線やベンゼンといった生体異物による酸化的障害下での、造血幹・前駆細胞とこれを支えるニッチの機能を明らかにすることを計画し、主に放射線の造血幹細胞分画に対する影響に重点を置いて解析を進め、以下の成果を得た。即ち、2Gyのガンマ線の単回全身照射後、経時的に、造血幹・前駆細胞数、造血幹・前駆細胞における活性酸素種量や細胞動態の計測、及び遺伝子発現解析を行った。尚、照射は6週齢ないし6ヶ月齢で行い、照射時期による応答性の差異も検討した。まず照射直後の分化型の血球や造血幹・前駆細胞分画の数の減少は、6週齢照射群の方が、6ヶ月齢照射群より反応が大きいものの、分化型の血球数はいずれの群でも速やかに回復した。一方、造血幹・前駆細胞分画では、照射の時期によらず、分化階層が低いほど回復が遅延した。また、照射4週後の骨髄細胞における網羅的遺伝子発現解析で浮上した細胞増殖やアポトーシスの関連遺伝子に注目して、21ヶ月齢のマウスの骨髄細胞やLKS分画を定量PCR法で解析したところ、照射の時期によらず、細胞周期関連遺伝子であるCcnd1、Fyn及びPiK3r1の過剰発現がLKS分画でのみ認められた。照射による遷延効果は加齢変化を促進することが示唆されており、ここで得られた結果もこれに符合するものと考えられた。以上の成果をとりまとめて論文として発表した。更にBrdUを2ないし6週間飲水投与してLKS分画の細胞動態を解析したところ、BrdUの標識率は、照射4週目以降22.5ヶ月齢までの計測した全ての時点において照射群で高値だった。一方、倍加時間を反映すると考えられる2週間の標識率に対する6週間の標識率の増加率は、照射群で低値だった。以上、遷延効果には照射時期による差異は認められず、その実態として無効造血の亢進が示唆された。所謂ニッチの役割については同定には至らなかった。幹細胞病理(造血幹細胞機能調節異常)概要に記載した成果に併行して以下の解析を進め、得られた成果の一部は、研究発表の項にあげたとおり、雑誌や、招聘講演を含む、関連学会などで発表した。なお概要で触れた、照射後のLKS分画レベルでのBrdU取り込み分画の解析に多少の遅れが出ているものの、検体の採取は終えており、研究計画全体の達成度としては、概ね順調に進展している。即ち、まず初年度に静止期分画の成立に直接的な機能を有することが示唆されたCx32について、骨髄再建能を指標として、連続骨髄移植法を用いた造血幹細胞機能の解析を進めることとした。その結果、特にCx32欠失(KO)マウスでは、LKS分画のdonorとして用いるマウスの加齢と共に再建能の低下が顕在化することが示唆される結果を得た。また、新生児期の造血幹細胞動態についても解析を進め、Thioredoxin (Trx)-KOマウスのBrdU取り込み分画が、Trx過剰発現(Tg)マウスとは逆に野生型に比べて大きい傾向などを観察した。これは、造血前駆細胞の数が野生型よりも、Trx-Tgマウスでは有意に少なく、Trx-KOマウスでは有意に多いことと符合する結果として興味深い。尚、分化型の前駆細胞においては、野生型でも、Trx-Tgマウスの同腹マウスと、Trx-KOマウスのそれとで同様の数的差異が観察されており、胎児期の同腹マウスに起因する何らかの要因の造血組織の発生に与える影響を示唆するデータと考えている。
僧帽弁閉鎖不全症における心筋病変の発生機序の解明と治療に関する基礎的研究

犬の高齢化に伴い、心疾患の中でも後天性心疾患の発生は増加傾向にある。特に、僧帽弁膜症(僧帽弁閉鎖不全症)は、高齢化と共にその発生は増加している。弁膜症の心臓は形態学的に弁膜の結節性あるいは禰漫性肥厚を特徴とし、そのため弁閉鎖不全による僧帽弁逆流を惹き起こす。本症に罹患した犬の心臓の左心室には、二次的な各種の病変がしばしば観察される。特にその中でも心筋線維化は最終的に重大な鬱血性心不全を惹き起こすことになる。従来このような心筋線維化は壁内冠状動脈の狭小化、あるいは血栓形成等による心筋虚血の結果であると考えられてきた。しかし、その発生メカニズムについての詳細は不明である。本研究はその発生メカニズムを解明する目的で実験的、臨床的に以下の項目につき検討した。先ず本研究を進めるに当たり、弁膜症を中心とした心疾患犬において、血液凝固能がどの程度亢進しているかを検討した。その理由は、血栓形成には凝固能の活性化が示唆されているからである。しかし、本研究による結果はその他多くの報告とは逆であり、心臓病を有する犬の方が凝固能は低下していた。その結果は、次に実施した僧帽弁膜症犬に限っても全く同様であり、我々の予期せぬ結果となった。しかし、ヒトでも犬でも弁膜症においては冠状動脈内に血栓が確認されていることは事実であるため、我々は本症の経過中のある時期に凝固活性が起こっているのではないかどうかを確認するために、実験的に僧帽弁閉鎖不全症犬を作成して、それらを薬物(抗血小板薬)投与群と無処置群に分けて経時的かつ長期にわたり凝固能を観察した。その結果、その両者においても全経過中、凝固能に有意差は認められなかった。そこでされに発生原因を明確にするために、我々は僧帽弁膜症自然発症例の大の心臓を用いて詳細に組織学的検索を実施した。その結果、細胞外マトリックスによる心筋組織構築のリモデリングの主要な部分を担っているのは、これまで注目されてきた置換性の心筋線維化より、むしろ血管周囲性/間質性の心筋線維化であることが明らかとなった。平成7年度に購入の各種測定機器(ACT測定装置、血小板凝集能測定装置、多要素心電計)を用いて、先ず僧帽弁膜症自然発生犬において検査を実施し、その病態を解明した。その結果、僧帽弁膜症を伴う犬のすべてがACT測定装置による血液凝固時間の短縮や血小板凝集能の活性化を示すものではなく、かなり病態の程度によって大きな開きがあることが判明した。また心電図学的な評価と、心臓の形態的な評価はかなり一致することも判明した。そのため僧帽弁閉鎖不全症の各病期と血小板凝集能、血液凝集時間等との関連性をさらに例数を増やし調査検討を進めるとともに、抗血小板または血管拡張薬投与後には、どのようにそれらが変化するかを調査中である。またそれらの数値と剖検時の心筋線維との関連も検討する。