hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然海域における藻類感染性海洋ウイルスモニタリング法の開発

海産浮遊性珪藻類であるキリンドロテカ・クロステリウムに感染する新規ウイルス3種について,より高感度で安定的な自然海域におけるモニタリング法の開発を行った。主に,宿主リアルタイム定量PCR,3新種のウイルスの性状解析,各々のウイルスのリアルタイム定量RT-PCRの開発,ELISA法によるウイルス定量検出法の開発を行った。結果,リアルタイム定量RT-PR法およびELISA法による安定的であり,良好な定量・検出感度の手法を開発するに至った。海洋には,これまでに確認されていない多様なウイルスが存在することが示唆され,それらは宿主生態や海洋環境の恒常性の因子として,重要な存在であることが予測される。しかし,宿主およびウイルスの自然海域における動態の調査法として,現在は限界希釈法が行われているが,本手法ではウイルス検出限界値も低い上,一度に大量のサンプルを測定することが困難である。そこで,予備実験により得られた赤潮の因子として知られるキリンドロテカ・クロステリウム(真核単細胞藻類珪藻)を宿主とする3タイプの新種ウイルスをモデルとし,より高感度で安定的な自然海域におけるモニタリング法の開発を目的に,本年度は次の3つ実験を主に行った。1)宿主リアルタイム定量PCR2)3新種のウイルスの性状解析3)各々のウイルスのリアルタイム定量RT-PCRの開発宿主リアルタイム定量PCRについて,rDNA ITS1領域に特異性の高い領域を確認し,SyberGreen法による定量解析法を確立した。3種のウイルスの性状解析について,3k11kbの+センスssRNAであることが確認された。それらの塩基配列の相同異性は50%以上であり,中でもRNA依存RNAポリメラーゼ発現配列を用いた系統解析では,他の珪藻感染性RNAウイルスと同系統であることが確認された。これらのデータを用いてリアルタイム定量qPCR法の開発においては,各々のウイルスについてTaqManProbe法ではなく,より安価なSyberGreen法による検出・定量法が確立された。本定量法は,検出および定量において高感度であり,さらにDNAおよびRNA抽出法,サンプルの濃縮,溶媒の調整等,プロトコールを精査することにより,より高感度な自然海水における宿主およびウイルスの生態調査法が確立されることが期待される。昨年度は試料ウイルスのゲノム性状解析および塩基配列の解析、リアルタイムRT-PCR定量法の開発を行った。引き続き、より高感度な自然海水からのウイルス検出定量法を開発することを目的に、下記の2つの実験を主軸に研究を行った。1.リアルタイムRT-PCR法による検出定量法の精査2.ポリクローナル抗体によるELISA法による検出定量法の開発リアルタイムRT-PCR法の精査については、天然海水中に対象となるウイルスが確認されなかったため、自然海水に一定の濃度を培養ウイルス懸濁液を混合することによって試料とし、各段階の操作やプライマー濃度の調整等を行った。結果、昨年度より、2-3倍の検出定量の精度が得られるようになった。ELISA法の開発では、まず、昨年度に解析されたウイルス(+センス1本鎖RNA)全長塩基配列より、カプシドタンパク合成遺伝子配列約1,000アミノ塩基長を特定した。この配列より、本実験試料となるウイルスカプシドタンパクに特異性が高いと判断される配列を探索し、ポリクローナル抗体を作成した。本抗体を用い、ELISA法(直接吸着法)によるKT12RNAVの検出定量を試みた。わずかに、ネガティブ試料のバックが確認されたが、溶媒、抗体、ペプチド、各試薬濃度の精査を行ったことにより、昨年度に開発されたリアルタイムRT-PCR法よりも高いウイルス検出感度を示した。また、0.2μmフィルターによりろ過された自然海水と試料ウイルスとの混合液においても同様な結果が得られた。研究計画に基づいたウイルスの定量法の開発は概ね順調に行われた。定点採水を行っている海水からは、従来の限界希釈法による検出定量法も含め、1年を通して標的ウイルスの検出はされなかったため、本実験は、自然海水に実験室内で培養したウイルス株を混合することにより、各実験を行った。ウイルスリアルタイムRT-PCRについて、各試薬の濃度の他に、試料となるウイルスのろ過および懸濁法により定量値が異なることが確認された。使用するフィルター、サンプルプレートの特性を把握し、様々な精査を行った結果、昨年度より、疑似サンプルを用いた実験では、2-3倍の好感度の検出定量を行うことが可能となった。ELISA法については、予備実験を行った際に、最も安定的にウイルスが検出された直説法を用いて精査を行った。予備実験では、ネガティブコントロールの系でも定量反応が確認されたが、溶媒の種類、pHおよび抗体ペプチドの濃度を調整することにより、超高感度の検出定量が可能となった。これまでの海洋ウイルスの自然水域における動態の調査法ではウイルス検出限界値も低い上,一度に大量のサンプルを測定することが困難であった。そこで,予備実験により得られた赤潮の因子として知られるキリンドロテカ・クロステリウム(真核単細胞藻類珪藻)を宿主とする3タイプの新種ウイルスをモデルとし,より高感度で安定的な自然海域におけるモニタリング法の開発を目的に,研究計画に基づき,主に次の4項について実験を行った。1)宿主リアルタイム定量PCR,2)3新種のウイルスの性状解析,3)ウイルスのリアルタイム定量RT-PCRの開発,4) ELISA法によるウイルス定量法の開発。宿主リアルタイム定量PCRについて,rDNA ITS1領域に特異性の高い領域を確認し,Syber Green法による定量解析法を確立した。

3種のウイルスの性状解析について,8k11kbの+センスssRNAであることが確認され,それらの塩基配列の相同性は50%以上であり,中でもRNA依存RNAポリメラーゼ発現配列を用いた系統解析では,他の珪藻感染性RNAウイルスと同系統であることが確認された。これらの塩基配列のデータを用いて行ったリアルタイム定量RT-PCR法の開発においては,TaqMan Probe法ではなく,より安価なSyber Green法による検出・定量法が確立された。さらに,ウイルスカプシドタンパクをコードする領域の配列より,ポリクローナル抗体を作製し,ELISA法(競合法)による,ウイルス検出定量法の開発も行った。結果,本研究機関2年度目に開発されたリアルタイム定量RT-PCR法を用いた手法よりも,さらに高感度にウイルスを検出することが可能となった。開発された検出定量手法を自然海水を用いて検証を行ったところ,宿主細胞が検出されない時期においても沿岸砂泥(水深30cm程度)からウイルス(KT12RNAV)がわずかに検出されることが明らかになった。海産浮遊性珪藻類であるキリンドロテカ・クロステリウムに感染する新規ウイルス3種について,より高感度で安定的な自然海域におけるモニタリング法の開発を行った。主に,宿主リアルタイム定量PCR,3新種のウイルスの性状解析,各々のウイルスのリアルタイム定量RT-PCRの開発,ELISA法によるウイルス定量検出法の開発を行った。結果,リアルタイム定量RT-PR法およびELISA法による安定的であり,良好な定量・検出感度の手法を開発するに至った。研究計画に基づいた宿主およびウイルスの定量法の開発は概ね順調に行われた。宿主リアルタイム定量PCRについて,rDNA ITS1領域に特異性の高い塩基配列を確認し,Syber Green法による検出定量法を確立した。本手法により,下限10 cells/mlの高感度により定量を行うことが可能となった。3種のウイルスについては,KT12RNAV,FTRNAV,そして,KURNVと仮称を付け,各々についてゲノム全解析および検出定量法としてReal Time qPCR法の開発を行った。全てのウイルスは3k11kbの+センス1本鎖RNAをゲノムとして所持することが確認された。また,解析された部分塩基配列より,特異性が得られる領域複数についてリアルタイム定量RT-PCR法を開発し,実験室系での安定的な検出定量法を確立した。3種ウイルスのゲノム塩基配列の相同性は各々50%以上であるが,3種を同時に検出定量可能な領域はなく,各々に特異的なプライマーを用いる必要性がある。本年度の成果について,新規ウイルスについては性状解析のデータを基に,学術論文の執筆を行っている。また,開発された定量検出法について,研究期間全年度において行われる月に1度の定点採水(東京-神奈川-千葉沿岸)により得られた自然海水からの検出定量への適用を検証している。平成28年度においても、研究計画通り実験を行う。
フランス通常学校における特殊教育施設による支援サービスSESSADの成立と評価

フランスでは,教育省管轄の小中学校への特別な支援体制において,厚生省系特殊教育施設,あるいは親の会の団体が大きな役割を演ずる場合のあることが確認されている。このシステムは,S.E.S.S.A.D.(地域の学校におけるケアと特殊教育サービス:Services d' education specialisee et de soin adomicile)と呼ばれ,厚生省系の治療教育施設が,教育省管轄である通常の学級において障害のある児童生徒への支援を提供するユニークな制度である。本研究では,UNAPEI(Union Nationale des Associations de Parents et Amis de Personnes Handicape'es Mentales)の協力を得て,SESSADと関連する特殊教育セクターの実地調査を行った。SESSADは,医師,特殊教育指導員(educateurs specialises),精神運動訓練士(psychomotricien),言語聴覚士などの多職種の専門家によるサービスを持つことに加えて,生活のさまざまな場所で介入をする運用の柔軟性のために,その数が拡大していること,実際に利用している一番多い年齢が6歳から10歳で4割程度を占めており,子供のニーズと教育者のニーズと両方に応えている現状が明らかになった。その一方で,安易な部分的統合教育の手段になっている現状などの問題点のあることが伺われた。「全ての障害のある子どもが,居住地に最も近い学校に登録されるべきこと」を規定した障害者の機会均等と社会への平等参加のための2005年2月法(Loi n^o 2005-102 du 11 fevrier 2005)施行後の実態,学校生活介助者(A.V.S.:Les auxiliares de vie scolaire)の導入による専門性の低下など,新たな課題も明らかになった。教育省管轄の小中学校への特別な支援体制において、厚生省系特殊教育施設、あるいは親の会の団体が大きな役割を演ずる場合のあることが確認されている(棟方,2002;2004など)。このシステムは、S.E.S.S.A.D.(地域の学校におけるケアと特殊教育サービス:Services d' education specialisee et de soin a domicile)と呼ばれ、厚生省系の治療教育施設が、教育省管轄である通常の学級において障害のある児童生徒への支援を提供するユニークな制度である。本研究では、このサービスの成立過程とその本質をオードセーヌ、バルドアーズ、イブリーヌ県における実地調査とデルファイ法とコンジョイント分析を組み合わせた独創的な手法で明らかにすることを目的としている。本年度は、教育省特殊教育研修研究センター(C.N.E.F.E.I.)、全国障害者親の会(U.N.A.P.E.I.)、治療教育院、地域支援機関等への実地調査を行った。とりわけ2006年1月から施行となった「全ての障害のある子どもが,居住地に最も近い学校に登録されるべきこと」を規定した障害者の機会均等と社会への平等参加のための2005年2月法(Loi n゚2005-102 du 11 fevrier 2005)を支えるシステムとしてのSESSADとAVSについて、さらに調査を進める必要が明らかになった。
脳血管攣縮の治療標的分子の同定

平成30年度は平成29年度確立した改良型の等尺性収縮張力測定法により、1性差や週齢が野生型マウス脳底動脈のSPC誘発収縮にどのような影響を与えるか検討した。2また新規分子Xのコンディショナルノックアウトマウスに供与会社推奨プロトコールのタモキシフェンを投与しその効果を検討した。3また野生型マウスでのくも膜下出血モデル作製に着手し始めた。平成30年度は平成29年度確立した改良型の等尺性収縮張力測定法により、これまでほとんど論文にも明かされていなかったマウス脳底動脈の性質を把握できたこと、週齢や性差がその収縮に及ぼす影響についても知見が得られたことから、今後2種類の遺伝子組み換えマウスで実験する際に適切な週齢で実験を行うことができると考えらえる。現在、野生型マウスの等尺性収縮張力についての解析がすみ、2種類の遺伝子組み換えマウスの繁殖も問題なくすすんでいることから、おおむね順調に進展しているとした。今後の方策としては以下があげられる。1)当研究室で検討してきたSPC/Fyn/新規分子X/Rhoキナーゼ経路について2種の遺伝子組み換えマウスを用いて検討する。1Fynノックアウトマウス:メスのノックアウトマウスが育児放棄する性質をもつことから繁殖が困難であったが、現在では安定的に繁殖できるようになったことから、令和元年度内にFynノックアウトマウスの脳底動脈におけるSPC誘発収縮を測定する。2新規分子Xのコンディショナルノックアウトマウス:確実に脳内でノックアウトが作製できるようにタモキシフェン投与量の更なる検討を行う。2)くも膜下出血モデルの作製にあたり技術の洗練を行う。平成29年度は血管組織レベルでの検証を行うために、野生型マウスの脳底動脈の等尺性収縮張力測定を行った。当初の実験方法でも等尺性収縮張力を測定する方法が確立できていたもののベースライン(基底状態でのトーン)の不安定性に問題が生じていた。その原因の一つとして、張力測定時の液交換により極微小な脳底動脈の動揺が生じておりそれがベースラインの状態に影響していることが示唆されたため、液交換方法を再検討しマウス脳底動脈の動揺をできるだけ少ない状態で測定することにより、当初よりも更に安定的にマウス脳底動脈の等尺性収縮張力測定することが可能となった。我々の研究室で検討してきた血管の異常収縮因子である、スフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)がマウス脳底動脈を収縮させるのかどうかについては、これまで検討されていなかった。しかし、上記の改良された等尺性収縮張力測定法により、SPCがマウス脳底動脈においても収縮を誘発すること、またその収縮の程度についても明らかにした。SPC誘発収縮を安定的に測定することができていることから、おおむね順調に進展していると区分づけた。しかしマウス脳底動脈が4ミリほどしかなく実験できる血管の本数が極端に限られていること、マウス脳底動脈を用いたSPC誘発収縮測定例が文献では全く見つからないことから、等尺性収縮張力測定実験については当初の予定より慎重に実験を重ねている。今後の研究の推進方策として、マウス脳底動脈の等尺性収縮張力が非常に安定して測定可能になったことから、1野生型マウス脳底動脈においてSPC誘発収縮が週齢や性差により程度の変化があるのかどうか検討するとともに、2当研究室で検討してきたSPC/Fyn/新規分子X/Rhoキナーゼ経路の分子をノックアウトした2種類の遺伝子組み換えマウスの脳底動脈を用いた等尺性収縮張力を測定することにより組織レベルで直接的にSPC誘発収縮張力が抑制されるかどうかについて、明らかにしたい。当該助成金が生じた状況:この当該助成金は高精度生体内圧力カテーテル計測システム購入に充てる予定であった。

本研究の段階には、組織レベルと生体レベルの2つの段階の実験があり、この高精度生体内圧力カテーテル計測システムは生体レベルの実験での使用を考えていた。しかしこのシステムは非常に高額であることから(一式:100万円。消耗品のカテーテル:53万円)、組織レベルの実験を十分に行う前に本機器を購入することにより、組織レベルの確固たる証拠の収集が困難になり、ひいては生体レベルの研究を進めるための根拠が乏しくなることを危惧したため、本システムの購入を保留にした。実験の進捗状況により組織レベルの実験結果が確実になり次第、本システムを購入する予定である。高精度生体内圧力カテーテル測定システム購入および旅費に充てる予定であったが、脳血管攣縮による血流障害を評価するために必須な、現有機器である2次元レーザー血流装置に不具合が見つかり、こちらの修理をする必要があると考えられたため、高精度生体内圧力カテーテル測定システムの購入を保留にした。この未使用額については、実験の進捗状況いに応じて平成31年度の研究費と合わせて2次元レーザー血流装置の修理、あるいは高精度生体内圧力カテーテル測定システム購入あるいは試薬の購入や旅費に充てる。
ペロブスカイト型構造を有する希土類複合酸化物の光触媒活性

申請者は,希土類であるテルビウムを含むペロブスカイト型酸化物BaTbO3が,可視光照射により光触媒活性を示すことを発見している。本研究では,新規可視光応答型光触媒である希土類含有ペロブスカイト型酸化物ATbO3(A =アルカリ土類)について,試料合成に固相法および液相法を駆使することで試料の結晶構造,化学組成,形態を制御し,未だ解明されていないATbO3の光触媒活性を明らかにし,希土類化合物群における可視光応答型光触媒探索の新たな指針を掲げることを目指している。平成30年度は,合成方法を再検討したSrTbO3の光触媒活性を調べた。平成29年度は得られたSrTbO3の光触媒活性が予想以上に低く,その合成方法の検討に時間を費やした。溶液法の一種である錯体重合法の合成条件を変化させることで,光触媒活性を向上させることに成功した。目的のペロブスカイト型複合酸化物SrTbO3を合成するために,錯体重合法の合成条件を検討した。いずれの合成条件を用いた場合でも,目的のSrTbO3試料を単相で得ることが出来た。SrTbO3試料の光吸収特性を調べたところ,波長530 nm以下の光を吸収することが分かった。BaTbO3では,波長550 nm以下の光を吸収することが分かっているので,SrTbO3はBaTbO3と同程度に青色LEDの光を吸収すると考えられる。合成した試料の光触媒活性を調べるために,1 wt%のPt助触媒を担持した試料による50%メタノール水溶液の還元反応により評価した。SrTbO3はBaTbO3と同程度に青色LEDの光を吸収するため,同程度の光触媒活性が期待された。前駆体の攪拌時間を長くして,加熱温度を下げて,加熱時間を短くすることで,粒子径の小さいSrTbO3試料を得ることができた。粒子径の小さいSrTbO3試料がBaTbO3試料と同程度の活性を示すことを明らかにした。当初の計画ではCa系の光触媒活性についても調べる予定であったが,Sr系の光触媒活性が予想以上に低く,その活性を高めるために,合成方法の検討に時間を費やした。その面では,当初の計画からは多少遅れているが,錯体重合法の合成条件を変化させることで,光触媒活性が向上させることが出来ているので,総合的にはおおむね順調に進展している。当初期待していたよりもSr系試料の光触媒活性が低いために,合成方法の検討を行い,試料の形態制御を試みたことで,触媒活性を向上させることが出来た。そこで,今後もCa系などの他の固溶体試料についても,合成方法を綿密に検討し,高い光触媒活性を示す条件を探る。さらに,光触媒の活性が低いために控えてきた論文発表についても,結果を検討して積極的に行っていく。平成29年度は,SrTbO3の合成とその光触媒活性を調べた。希土類含有ペロブスカイト型酸化物BaTbO3が可視光照射により光触媒活性を示すのは,[Xe](4f)7電子配置を有する+4価のテルビウムを含むためだと考えられる。そこで同じくTb4+を含む化合物に注目するために,BaTbO3中のBa2+を他のアルカリ土類に置き換えたSrTbO3を合成し,その光触媒活性を調べた。目的のペロブスカイト型複合酸化物SrTbO3を合成するために,固相反応法に加えて錯体重合法を用いた。いずれの合成方法を用いた場合でも,目的のSrTbO3試料を単相で得ることが出来た。SrTbO3はBaTbO3と同程度に青色LEDの光を吸収するため,同程度の光触媒活性が期待されたが,SrTbO3試料の光触媒活性を調べたところ,水素発生はBaTbO3よりも少ないことが分かった。その面では,当初の計画からはやや遅れている。しかしながら,錯体重合法の合成条件を変化させることで,光触媒活性が向上させることが出来ている。

申請者は,希土類であるテルビウムを含むペロブスカイト型酸化物BaTbO3が,可視光照射により光触媒活性を示すことを発見している。本研究では,新規可視光応答型光触媒である希土類含有ペロブスカイト型酸化物ATbO3(A =アルカリ土類)について,試料合成に固相法および液相法を駆使することで試料の結晶構造,化学組成,形態を制御し,未だ解明されていないATbO3の光触媒活性を明らかにし,希土類化合物群における可視光応答型光触媒探索の新たな指針を掲げることを目指している。平成30年度は,合成方法を再検討したSrTbO3の光触媒活性を調べた。平成29年度は得られたSrTbO3の光触媒活性が予想以上に低く,その合成方法の検討に時間を費やした。溶液法の一種である錯体重合法の合成条件を変化させることで,光触媒活性を向上させることに成功した。目的のペロブスカイト型複合酸化物SrTbO3を合成するために,錯体重合法の合成条件を検討した。いずれの合成条件を用いた場合でも,目的のSrTbO3試料を単相で得ることが出来た。SrTbO3試料の光吸収特性を調べたところ,波長530 nm以下の光を吸収することが分かった。BaTbO3では,波長550 nm以下の光を吸収することが分かっているので,SrTbO3はBaTbO3と同程度に青色LEDの光を吸収すると考えられる。合成した試料の光触媒活性を調べるために,1 wt%のPt助触媒を担持した試料による50%メタノール水溶液の還元反応により評価した。SrTbO3はBaTbO3と同程度に青色LEDの光を吸収するため,同程度の光触媒活性が期待された。前駆体の攪拌時間を長くして,加熱温度を下げて,加熱時間を短くすることで,粒子径の小さいSrTbO3試料を得ることができた。粒子径の小さいSrTbO3試料がBaTbO3試料と同程度の活性を示すことを明らかにした。当初の計画ではCa系の光触媒活性についても調べる予定であったが,Sr系の光触媒活性が予想以上に低く,その活性を高めるために,合成方法の検討に時間を費やした。その面では,当初の計画からは多少遅れているが,錯体重合法の合成条件を変化させることで,光触媒活性が向上させることが出来ているので,総合的にはおおむね順調に進展している。当初期待していたよりもSr系試料の光触媒活性が低いために,合成方法の検討を行い,試料の形態制御を試みたことで,触媒活性を向上させることが出来た。そこで,今後もCa系などの他の試料についても,合成方法を綿密に検討し,高い光触媒活性を示す条件を探る。そこで,今後もCa系などの他の固溶体試料についても,合成方法を綿密に検討し,高い光触媒活性を示す条件を探る。さらに,光触媒の活性が低いために控えてきた論文発表についても,結果を検討して積極的に行っていく。納入金額の微調整が出来ずに,少額の残が出てしまった。翌年度は計画的に使用予定である。合成に使用する試薬を当初予定していたよりも安価で購入できたため。
ヒト顎関節オルガノイド作製への挑戦

顎関節原基オルガノイドを作製するには,顎関節の発生における分子メカニズムの理解が必須である.しかし,その基礎となる顎関節の発生初期における各構成体の出現時期や部位にも,未だ不明な点は多い.本研究ではマウス胎仔の体重を基準として顎関節の発生の正確な開始時期と部位の同定が可能であることを明かにした.また顎関節形成予定領域にRunx2とSox9の発現が認められ,その3次元解析から,下顎頭原基は下顎体と連続して発生することが示唆された.一方,顎関節の母体外発生誘導法として各種器官培養法を検討したが,現行の改良法では正常な顎関節の発育が継続されず,新規培養法の開発が必要であることが示された.1.顎関節原基誘導部位とその発現分子の同定凝集細胞の判別法の確立:顎関節を構成する下顎頭および下顎窩への分化が予定される細胞が,その発生初期に細胞凝集となって誘導される部位には,iPS細胞を顎関節形成細胞へと分化させる遺伝子群が存在すると考えられる.この細胞凝集を誘導する分子の解析には,細胞凝集が出現する前後のマウス胎仔を組織切片観察に頼らずに,選別する必要がある.そこで,マウス胎仔の体重に着目し,顎関節形成段階との関連性を確認した.その結果,マウスの系統間では体重に差があるものの,同一系統ではマウス胎仔の体重によって凝集細胞出現直前のマウス胎仔を抽出することが可能となった.細胞凝集直前から細胞凝集までの非常に短いステージを検索するために,細胞凝集直前の顎関節予定領域の発生を,母体外で継続させる必要がある.そこで顎関節の母体外発生誘導法として,Trowell法による器官培養,回転ドラム方式による全胚培養,回転ドラム方式と頭部部分器官培養の併用法を検索した結果,回転ドラム方式と頭部部分器官培養の併用法により顎関節の発生が継続することが見出された.また,その培養後にkidney transplantation法をさらに併用させて,細胞凝集組織を石灰化まで誘導させることにも成功した.次に,凝集細胞誘導部位を同定するには,細胞凝集組織の形態を3次元的に把握する必要がある.2Dスライス画像の組み合わせと,領域区分け抽出法をベースにした3次元構築ソフトにより,細胞凝集組織の3次元構築に成功した.同様の方法により,凝集組織,外側翼突筋,メッケル軟骨間の詳細な3次元的位置関係の把握も行った.回転ドラム方式と頭部部分器官培養の併用法で,凝集細胞出現直前の組織の顎関節への誘導が可能になったものの,培養液浸透を促すための頭部の一部除去が,培養後の組織の方向性の決定を困難にし,その後の解析の精度を低下させることが明らかとなった.しかしながら事前の組織染色等で方向性の精度が向上することを見出したため,現在サンプル数を増やし確認中であり,解決する見込みである.顎関節領域のkidney transplantation法による石灰化の誘導にも成功したが,サンプルの大きさによってドナーへの負担が変化し,石灰化にばらつきが認められた.重さによって移植サンプルのサイズを一定化させることで,ばらつきを減少させることが可能と考えられ,現在サンプル数を増やして確認中である.顎関節の発生初期には,下顎頭や下顎窩など各々の構成体へ分化予定の細胞が凝集し,顎関節原基として誘導される.その細胞の凝集は極めて短期間に誘導され,正確な位置や時期については未だ定説がない.顎関節原基が誘導される部位にはiPS細胞を正確に顎関節構成体の細胞へと分化させる遺伝子群が存在すると考えられ,その分子メカニズムの把握が顎関節発生の詳細を解明するためには必須である.前年度の研究成果により,マウス胎仔の体重を利用した顎関節形成段階の正確な把握が可能となった.この結果を用いて今年度は遺伝子解析を行い,顎関節原基が誘導される以前の体重の胎仔において,顎関節形成予定領域にRunx2とSox9の発現が認められた.続いてそれら遺伝子発現の3次元構築を行った結果,下顎頭原基となる細胞が凝集する時期の前後を通してRunx2とSox9の発現ドメインに断裂が認められず,下顎頭原基は下顎体と連続して発生している可能性が示唆された.こうした誘導分子メカニズムの把握には,形態学のみならず,分子レベルにおいても正常な顎関節の発生を促す培養法の確立が必須となる.顎関節の発生および発育が母体外で継続できる培養法については,前年度に形態学的に成果を得ていたもの,その培養顎関節における遺伝子解析の結果,遺伝子発現は正常の顎関節と若干異なっていた.血清の量や培養液,酸素分圧など複数の条件を変えて培養を試みたものの,分子レベルまで完全に正常な顎関節は形成されなかった.現在使用されている様々な培養法では,正常な顎関節の誘導が困難なことが明らかとなり,iPS細胞の顎関節原器への誘導メカニズムの解明には,従来とは異なる発想による培養法が必要であることが示唆された.顎関節原基オルガノイドを作製するには,顎関節の発生における分子メカニズムの理解が必須である.しかし,その基礎となる顎関節の発生初期における各構成体の出現時期や部位にも,未だ不明な点は多い.本研究ではマウス胎仔の体重を基準として顎関節の発生の正確な開始時期と部位の同定が可能であることを明かにした.また顎関節形成予定領域にRunx2とSox9の発現が認められ,その3次元解析から,下顎頭原基は下顎体と連続して発生することが示唆された.

一方,顎関節の母体外発生誘導法として各種器官培養法を検討したが,現行の改良法では正常な顎関節の発育が継続されず,新規培養法の開発が必要であることが示された.1.(1)継続的に凝集細胞および,その下顎体との融合部位,下顎窩に発現する遺伝子を同定した後,凝集細胞のみに発現する分子をin situ hybridization法および免疫染色により選出して,その分子のレポーターマウスを作成する.(2)顎関節誘導部位の同定:凝集細胞は,その細胞自身が産生するシグナルか,もしくは周囲組織からのシグナルにより分化する可能性がある.そこで,作成した凝集細胞-レポーターマウスのレポーター分子発現領域の周囲を,近遠心軸と頬舌軸で6分割し,組織塊として取り出す.これに凝集細胞組織を加えた7つの組織塊を,マウス胎仔早期四肢芽由来細胞の凝集ペレットとrecombination法で再結合させ,培養する.培養後,顎関節の誘導を形態学的・分子学的に確認する.(3)凝集細胞誘導部位における発現遺伝子の同定:(2)で凝集細胞誘導能があると判定された部位に発現する遺伝子を同定する.2.同定分子の機能解析同定遺伝子の機能解析:(1)上記で同定した分子の分子生物学・薬理学的手法による補正により,正常マウスの顎関節に異常が生じるか,回転ドラム方式と頭部部分器官培養の併用法アッセイにより追求する.凝集細胞発現前の正常マウス顎関節予定領域を培養し,各分子を増幅,または減少させた場合の顎関節形成における変化を,免疫組織学,qPCR,in situ hybridization法,western blot法にて確認する.kidney transplantation法で石灰化を促した骨・軟骨形成の解析も併用する.(2)in uteroアッセイによる追求を行う.(1)で変化のあったagonistもしくはantagonistを母親マウスへ腹腔内投与し,仔マウスの顎関節に変化が生じるか,(1)の方法にて検索する.研究成果をGordon Conference(米国)にて発表する.口腔解剖学本年度,研究室の移転等の関係で,一時的に研究が停止したため,予定通りに使用することができなかった消耗品・旅費が生じた.研究室の最終移転が終了して研究環境はこれまで以上に整備され,実験は順調に進んでいる.本年度は昨年度分も合わせた実験の遂行・予算執行が可能なように,前述の推進方策を計画した.この推進方策に従って,必要な実験動物,試薬等の消耗品類を購入する.また国内学の学会における成果発表の旅費に充てる.
アルツハイマー病におけるＤＮＡ修復機構破綻の機序解明

アルツハイマー病において神経細胞が障害される原因の1つとして神経細胞DNAへの異常蓄積が注目されている。先行研究において,アルツハイマー病において早期から蓄積するアミロイドβにより神経細胞はDNA損傷にさらされるが,遺伝性乳がん・卵巣がん症候群の原因遺伝子の産物であるBRCA1はその修復に重要な役割を果たし,アルツハイマー病においてはタウと共に凝集していることが報告されている。しかし通常核内でDNA修復に関わるBRCA1がどのように細胞質に移行しタウと共凝集に至るか,またこの共凝集を阻害することで病態の改善が得られるか明らかでない。そこで本研究ではこれらを細胞・動物モデルを用いて検討する。
細胞がん化に伴なう細胞骨格異常の分子生物学的解析

1.完全長ママウスαアクチンCDNAをはじめて単離することに成功した.3′UT領域をプローダとしてβおよびγアクチンの発現を,正常則胞とがん細胞で比較した.2.マウスリンホーマL5178Y細胞に特異的に発現するβ2チューブリンはβlaチューブリン遺伝子1対のどちらかに変異が生じた結果であるという仮説を, βla関連CDNAの3クローンの全塩基配例決定によって証明しようとしたが,結果は否定的だった.3.筋細胞分化によるミオシン軽鎖の発現変化を支配するプロモーター領域の特異配例とそれに作用するタンパク質因子を解析した.4.新たにスピンドル運動と染色体分配が共役しない分裂酵母突然変異株(dis変異)を単離し,遺伝学的,分子生物学的解析を行った.5.これまでほとんど研究がなされていなかった中間フィラメントタンパク質を生理的条件下で可溶化することにより,ビメンチンなどのタンパク質の重合がプロテインキナーゼCおよびAによるリン酸化によって調節されていることを明らかにした.6.マウスM1白血病細胞がマクロファージに分化すると, 105Kアクチン結合タンパク質が増加することを明らかにした.7.培養細胞をフォールボールエステルTPAで処理すると,トランスフォーム細胞にみられるような接着班様のアクチンプラークとそれをとり囲む点状のカルスペクチンの分布を見出した.8.アクチン調節タンパク質アクチノゲリンのアクチン結合ドメインの構造を明ラかにした.9.M1細胞の分化にともない,ホスホリパーゼA_2阻害活性を示すカルパクチン様タンパク質abp38の量的質的変化を解析した.10.SV40感染において,レセプター結合粒子がエンドサイトーシスされて核に到る過程にミクロチューブルの機能が必要であることを明らかにした.1.完全長ママウスαアクチンCDNAをはじめて単離することに成功した.3′UT領域をプローダとしてβおよびγアクチンの発現を,正常則胞とがん細胞で比較した.2.マウスリンホーマL5178Y細胞に特異的に発現するβ2チューブリンはβlaチューブリン遺伝子1対のどちらかに変異が生じた結果であるという仮説を, βla関連CDNAの3クローンの全塩基配例決定によって証明しようとしたが,結果は否定的だった.3.筋細胞分化によるミオシン軽鎖の発現変化を支配するプロモーター領域の特異配例とそれに作用するタンパク質因子を解析した.4.新たにスピンドル運動と染色体分配が共役しない分裂酵母突然変異株(dis変異)を単離し,遺伝学的,分子生物学的解析を行った.5.これまでほとんど研究がなされていなかった中間フィラメントタンパク質を生理的条件下で可溶化することにより,ビメンチンなどのタンパク質の重合がプロテインキナーゼCおよびAによるリン酸化によって調節されていることを明らかにした.6.マウスM1白血病細胞がマクロファージに分化すると, 105Kアクチン結合タンパク質が増加することを明らかにした.7.培養細胞をフォールボールエステルTPAで処理すると,トランスフォーム細胞にみられるような接着班様のアクチンプラークとそれをとり囲む点状のカルスペクチンの分布を見出した.8.アクチン調節タンパク質アクチノゲリンのアクチン結合ドメインの構造を明ラかにした.9.M1細胞の分化にともない,ホスホリパーゼA_2阻害活性を示すカルパクチン様タンパク質abp38の量的質的変化を解析した.10.SV40感染において,レセプター結合粒子がエンドサイトーシスされて核に到る過程にミクロチューブルの機能が必要であることを明らかにした.
「環境の民営化」:市場メカニズムによる自然環境の保全

リバタリアニズムとは、現代正義論を語る際に無視することのできない思想的立場であると同時に、民営化・規制緩和政策などを推進する「小さな政府」論の理論的基礎を提供する政治哲学でもある。これまで筆者は、個人の自由を非妥協的に擁護し、私有財産制度や自由競争市場を最大限尊重するリバタリアニズムの自由主義哲学を概観し、殊にリバタリアニズム陣営内の論争に着眼して、最小国家論と無政府資本主義との間の対立について論じてきた。今回の研究プロジェクトでは、近代国民国家の衰退と共に、戦争も含めて、かつて国家の正常な守備範囲内と目されてきた機能を果たすため、市場メカニズムをはじめ公共部門以外の部門が積極的に活用されるようになったことに着眼し、環境問題に取り組む市場メカニズムを分析することとした。市場原理の導入で公共財などの財やサーヴィス供給の改善や効率化、合理化がはかられている中で、環境問題や絶滅の危機に瀕している動植物の保護など、市場があたかも公共部門によって解決することのできない多種多様な問題を解決する万能薬と看做すことができるかどうかを検討してきた。そのためにも、従来注目されてきたエコ・ツーリズムなどといった事例ではなく、国立公園の民営化および絶滅の危機に瀕する植物の繁殖・販売を請け負う民間企業のような事例を取り上げることとした。研究の結果は、リバタリアニズム理論という理論枠組を更に展開する形で研究論文としてまとめられてきた。近刊のものを含めて、今年、来年に数本の学術論文が公になる予定である。本年度の研究の課題は、第一に環境の民営化、中でも民間の公園のケース・スタディーに関する文献の収集および研究プロジェグト全体の理論的枠組に深く関わるものの収集であった。これらの資料収集を通して、「環境の民営化」についての理論的理解を深めると同時に、それに対する批判的視点の確立を目指した。また、民営化の理論的可能性と現実への適用可能性とを検証してきた。本年度の研究の第二の課題は、この理論的考察の実践化に関するフィールド・ワークに着手することであった。フィールド・ワークは、「環境の民営化」が進んでいるオーストラリアにて行った。ウォレマイ・パイン(Wollemi Pine Pty.Ltd.)の調査は完成し、またアース・サンクチュアリー(Warrawong Wildlife Sanctuary(Earth Sanctuary))におけるフィールド・ワークはアデレイドにて行った。第三の課題とは、民営化の理論的可能性と現実への適用可能性とを検証しつつ、研究論文の完成に取り組むことであった。現段階では、「民営化される自然環境-市場による公共財の供給に関する理論的考察」(仮題)という研究論文の執筆をほぼ完成しており、これを完成した上で学術雑誌に投稿する予定である。これまでの研究成果、あるいは今後の課題を明らかにしていくことを目指して、「環境の民営化」の理論的再構成やその可能性と限界とを整理する一般理論の研究として発表したいと考えている。同時に、民営化の理論的可能性と現実への適用可能性とに関する申請者の結論を、従来のリバタリアニズム研究の枠組の中に位置づけて、その全般的解明を目指す。その際、リバタリアニズム理論を導入した上での考察を試みる予定だ。
レーザープラズマ光源を用いたゾーンプレートX線顕微鏡による生物試料観察

高繰り返し高出力、ムービングスラブレーザー(5J,3Hz)を用いて発生した炭素プラズマより発生する水素様X線(波長3.37nm)を光源とし、ゾーンプレートを結像素子、背面照射型CCDをX線画像検出器とするX線顕微鏡システムを用いて、試料観察を行った。試料として、金属メッシュの場合、倍率100の場合、X線パルス数5(レーザーエネルギー3J)で、明瞭なコントラストが得られた。試料としてゾーンプレートを用いた場合、倍率役100倍では、X線パルス数100で明瞭なコントラストが得られ、また分解能0.5μmが得られた。ゾーンプレートの場合に必要パルス数が多いのは、光軸調製の困難さのためで、うまく調製すればパルス数は減少可能と思われる。生物試料として、乾燥したHela細胞を観察した。倍率100倍で、パルス数20を要した。このとき、微絨毛(直径0.1-0.5μm)が観察され、生物試料においても十分良好なコントラストが得られること、また分解能が0.5μmよりよいことが確認された。今後、X線光学系の改良により分解能の向上によりより鮮明な生物試料観察が可能と期待される。新しく導入した高繰り返し高出力ムービングスラブガラスレーザー(5J,3Hz)を用いて、X線発生の特性を調べた。5Jにて、波長3.37nmの強度8x10^<13>photons/srが得られた。従来のNd:YAGレーザーに比べて5倍以上大きい。上記のX線を光源とし、X線多層膜回転楕円鏡をコンデンサー、背面照射型CCDを画像検出器とする光学系を用いて、単一X線パルスで、金属メッシュの倍率121のX線拡大像を得た。Nd:YAGを用いた場合(倍率287で450パルス必要)に比較して光源の強度は大幅に改善できた。多層膜回転楕円鏡の設計パラメータの最適化により、光源強度を更に改善できることを、レイトレーシングにより示した。乾燥生物試料(ヒトの染色体)の作製を行なった。生物試料の測定を準備中である。試料として、金属メッシュの場合、倍率100の場合,X線パルス数5(レーザーエネルギー3J)で、明瞭なコントラストが得られた。ゾーンプレートの場合に必要パルス数が多いのは、光軸調整の困難さのためで、うまく調整すればパルス数は減少可能と思われる。倍率100で、パルス数20を要した。
超低摩擦THAの開発

現在行われている人工股関節では骨頭、ソケットの平滑面同士がすべり、接触を行うため摩擦、摩耗が多く、臨床上で多くの問題が発生する。本研究は人工股関節totalhip arthroplasty(以下THA)の長寿命化を目的として、THAのすべり面形状を改良し、摩擦の減少と耐摩耗性の向上を試みたものである。ソケット側の人工軟骨は、摩擦、摩耗粉が多いテフロン、ポリエステルよりポリエチレンが有用とされている。我々は、THAの長期連用により、ポリエチレンは関節面に均一に分布し、摩擦を低下させる液体膜潤滑状態を作りだす事を基礎的実験により証明した。我々は骨頭側にこのポリエチレンを埋没させることにより液体膜潤滑状態を促し超低摩擦THAを作製し、犬を用いた動物実験を開始した。(1)本研究に絶えられた科学研究費補助金により犬に挿入する超低摩擦THAを作製し、成犬を購入した。実験に用いる人工股関節はHS-21のCo-Cr合金製人工骨頭とポリエチレン製人工ソケットによるセメントレスTHAである。THAの骨頭部のすべり面に、深さ1.0mm、直径1.6mmのへこみを中心より半径5mmの円周上に6個作成し、骨頭にはさらに中心に1個のへこみを加えポリエチレンを埋め込んだ。(2)体重10kg前後のヴィーグル成犬6匹にTHAを挿入した。実験では、A群:へこみを作成しない平滑な骨頭と平滑なソケットの組合わせ。B群:へこみ付き骨頭平滑なソケットの組合わせ、の2種の組合わせによる人工股関節を使用し各3匹の2実験群を作成した。この人工股関節置換術は雑種成犬の一側後肢に対し施行し、術後4週間のギプス固定ののち自由に歩行させている。12、18、24ヶ月後に剖検し、ポリエチレンソケットの内面と人工骨頭表面に関して、肉眼的観察、光学顕微鏡・電子顕微鏡を用いて病理組織学的検索により、各群における摩耗の状態を経時的に検索中である。現在使われている人工股関節では骨頭、ソケットの平滑面同志がすべり、接触を行うため摩擦、摩耗が大きく、臨床上で多くの問題が発生する。ソケット側の人工軟骨は、摩擦、摩耗粉が多いテフロン、ポリエステルよりhigh density polyethylene(以下HDP)が有用とされている。我々は、THAの長期連用により、HDPは関節面に均一に分布し、摩擦を低下させる潤滑状態(流体潤滑状態)を作りだす事を基礎的実験により証明した。本年度、我々は骨頭側にこのHDPを埋没させることにより流体潤滑状態を促し超低摩擦THAを作製し、犬を用いた動物実験を開始した。(1)本研究に与えられた科学研究費補助金により犬に挿入する超低摩擦THAを作製し、成犬を購入した。実験に用いる人工股関節はHS-21のCo-Cr合金製人工骨頭と高密度ポリエチレン(HDP)製人工ソケットによるセメントレスTHAである。骨頭側の埋め込まれたHDPがソケットに対し、面積大となる割合と、骨頭の荷重に対する支持性大の形態を算出した。つまり、THAの骨頭部のすべり面に、深さ1,0mm、直径1.6mmのへこみを中心より半径5mmの円周上に6個作成し、骨頭にはさらに中心に1個のへこみを加えHDPを埋め込んだ。

(2)体重10kg前後のヴィーグル成犬6匹にTHAを挿入した。実験では、A群:へこみを作成しない平滑な骨頭と平滑ソケットの組合わせ。B群:へこみ付き骨頭平滑なソケットの組合わせ、の2種の組合わせによる人工股関節を使用し各3匹の2実験群を作成した。この人工股関節置換術は雑種成犬の一側後肢に対し施行し、術後3週間のギプス固定ののち自由に歩行させている。今後は6、12、18ヶ月後に剖検し、THAの摩擦面の形態を解析、検討する。現在使われている人工股関節では骨頭、ソケットの平滑面同士がすべり、接触を行うため摩擦、摩耗が大きく、臨床上で多くの問題が発生する。本研究は人工股関節totalhip arthroplasty(以下THA)の長寿命化を目的として、THAのすべり面形状を改良し、摩擦の減少と耐摩耗性の向上を試みたものである。ソケット側の人工軟骨は、摩擦、磨耗粉が多いテフロン、ポリエステルよりhigh density polyethylene(以下HDP)が有用とされている。我々は、THAの長期連用により、HDPは関節面に均一に分布し、摩擦を低下させる潤滑状態(流体潤滑状態)を作りだす事を基礎的実験により証明した。本年度、我々は骨頭側にこのHDPを埋没させることにより流体潤滑状態を促し超低摩擦THAを作製し、犬を用いた動物実験を開始した。(1)本研究に与えられた科学研究費補助金により犬に挿入する超低摩擦THAを作製し、成犬を購入した。実験に用いる人工股関節はHS-21のCo-Cr合金製人工骨頭とHDP製人工ソケットによるセメントレスTHAである。骨頭側の埋め込まれたHDPがソケットに対し、面積大となる割合と、骨頭の荷重に対する支持性大の形態を算出した。つまり、THAの骨頭部のすべり面に、深さ1.0mm、直径1.6mmのへこみを中心より半径5mmの円周上に6個作成し、骨頭にはさらに中心に1個のへこみを加えHDPを埋め込んだ。実験では、A群:へこみを作成しない平滑な骨頭と平滑なソケットの組合わせ。6、12、18ヶ月後に剖検し、HDPソケットの内面と人工骨頭表面に関して、肉眼的観察、光学顕微鏡・電子顕微鏡を用いて病理組織学的検索により、各群における磨耗の状態を経時的に検索する予定である。ソケット側の人工軟骨は、摩擦、磨耗粉が多いテフロン、ポリエステルよりポリエチレンが有用とされている。我々は、THAの長期連用により、ポリエチレンは関節面に均一に分布し、摩擦を低下させる液体膜潤滑状態を作りだす事を基礎的実験により証明した。我々は骨頭側にこのポリエチレンを埋没させることにより液体膜潤滑状態を促し超低摩擦THAを作製し、犬を用いた動物実験を開始した。
ダブルトランスプラント療法による難治性小児白血病治療の開発

本研究は難治性小児腫瘍疾患患児において純化造血幹細胞を用いた移植術を施行することにより、小児がん治療成績の飛躍的向上を目指している。従来、純化細胞としてCD34陽性細胞が用いられてきたが、本研究では新たに造血幹細胞のマーカーとして認識されてきたCD133陽性抗原を標的とし、純化CD133陽性細胞移植術の臨床応用を計画した。純化CD133陽性細胞移植施行症例は世界的にも少ない。特に小児においてはほとんど報告がないので、第一段階として自家移植で純化CD133陽性細胞を移植片として用いた。実際には、小児がんの中で最も頻度が高い急性リンパ芽球性白血病(ALL)で、体内の腫瘍細胞を減量するための自家移植を実施し、続いて同種移植の前処置を軽減する方法を考案して、同種移植術後の再発率の減少をはかるダブルトランスプラント療法を施行した。合計10例の小児がん患者を対象に、造血幹細胞の動員・採取・純化を行ったが、実際に自家-同種でダブルトランスプラントに至った症例は1例にとどまったが、自家移植だけでダブルトランスプラントを施行した3症例において、より未熟なCD133陽性細胞と、より成熟したCD34陽性細胞の違いが示されるような結果であった。ダブルトランスプラントの有効性を検証できるだけの症例数に達しなかったが、本研究を通して現在の大量化学療法ですべての悪性腫瘍を根絶することは難しいことが確認された。また同種免疫反応だけで難治性小児がん細胞の増殖を抑制することは困難である。CD133陽性細胞を同種移植術の分野でどのように利用するかについては今後の検討を待たねばならないが、白血病の自家移植術ではダブルトランスプラントの第一段階での利用が見込まれ、同種移植術では生着後にドナーキメリズムが変動した場合の「造血幹細胞追加輸注」が考慮される。小児に発症する急性白血病の中で、もっとも頻度が高いのは急性リンパ芽球性白血病(ALL)である。小児ALLは化学療法の進歩によって約70%の患児が治癒するようになったが、30%の患児では造血細胞移植術を含む種々の治療に抵抗して致死的な経過をたどる。本研究は、造血細胞移植術を繰り返し実施するダブルトランスプラント療法を確立することが目的である。従来の造血細胞移植術で寛解を維持できない治療抵抗性の小児白血病患児を対象に、移植前の単回大量化学療法で体内に残存する白血病細胞を根絶することは困難である。従来の考え方では難治性の場合は制癌剤が大量となりすぎ、重篤な臓器障害を発症するか、移植片宿主病(GVHD)を増悪させることが多かった。このようなリスクを回避しながら抗腫瘍効果を上げるため、まず安全な自家移植術を利用して大量化学療法を計画した。初年度である平成16年度は末梢血CD133陽性細胞純化手技を確立して自家移植を実践した。2例(17歳、8歳)の再発ALL患者において、再寛解導入療法終了後2-3か月の時期に、リンパ球に発現しない表面抗原であるCD133を利用し、末梢血CD133陽性細胞を採して免疫磁気ビーズ法で純化した。純度は90%以上、回収率も60%であり、臨床的に有用なレベルであった。このうち一例は母親からのHLA不適合移植術とのダブルで実施し、移植後10か月を経過して完全寛解を維持している。二例目は純化末梢血CD133陽性細胞を用いた自家移植術を安全に実施した段階で、完全寛解を保つている。以上のように、細胞の採取・純化および自家移植術の実施まで計画通り進行しており、平成17年度実施症例を増やして検討する。

特に同種移植術の移植前化学療法については、画一的な方法を採用しにくい状況が明らかになりつつあり、患者の既治療歴を考慮したレジメンの確立を検討する。ALLなど急性白血病の同種移植術後の原病再発は、造血細胞移植術の治療成績を左右する最も大きな問題である。本研究では、小児ALL治療における同種移植術の治療成績向上を目指し、1回の毒性が強い治療で根治を目指すのではなく、移植直前の体内腫瘍細胞量を可能な限り少なくするための手段として、小児ALL患児の腫瘍細胞に発現しないCD133抗原を利用した。CD133抗原はヒトに特有の血球分化抗原で、非常に幼弱な造血前駆細胞に発現することが知られている。CD34抗原のようにマウスに発現していないため、前臨床段階の動物試験ができないが、80%程度がCD34抗原とダブルポジティブである。したがって、CD34陽性細胞移植術の知見で十分対応できることが予測されたが、本研究によって実際に移植術に使用できることが証明された。小児に最も多い腫瘍である急性リンパ芽球性白血病では、腫瘍細胞にCD34抗原が高頻度に発現するため、CD34抗原を利用した自家移植は腫瘍細胞混入の観点から問題があり、CD133抗原を利用することの意義は大きい。本研究の結果から、CD133陽性細胞も従来の純化CD34陽性細胞と同様に安全に移植細胞として利用できることが判明した。移植細胞としての機能も問題なかった。自家移植だけでダブルトランスプラントを施行した症例において、二等分した保存細胞であるにもかかわらず、2回目の移植後の血小板数回復が遅れた。より未熟なCD133陽性細胞と、より成熟したCD34陽性細胞の違いが示されている可能性がある。免疫磁気ビーズを利用したCliniMACSシステムで、造血幹細胞としてCD34陽性あるいはCD133陽性細胞を純化し、小児がん治療の大量化学療法後の造血幹細胞救済療法として臨床応用した。これによって大量化学療法後でも迅速に造血機能を回復させることができた。小児がん患者で実施する大量化学療法は種々の問題を抱えていることが再確認された。移植細胞の処理技術の進歩は移植機会の拡大につながるものの、制がん剤の総投与量の増大は患児に与える傷害が大きく、治療関連死亡が増加する可能性も示唆され、移植細胞の洗練とともに大量化学療法レジメンの確立が重要だと思われる。小児患者では各種薬剤に対する認容性が高く、造血細胞移植術は比較的安全に施行できると考えられてきた。その結果として、ダブルトランスプラント療法や高用量の制がん剤投与が日常化してきた。しかし、移植術までに強力な化学療法が実施されている分、移植前大量化学療法による毒性はそのときの各種臨床検査でとらえきれないこともあった。本研究で検討したCD34・CD133抗原は、長期的に造血機能を維持できる造血幹細胞に発現していることは示せたが、腫瘍細胞の混入がない理想的な移植片を作成することについては、残存腫瘍が現在の検索手法ではとらえられないレベルであるため、臨床的に5年10年の観察期間を経て結果が得られる。本研究の成果は、今後臨床応用される可能性がある種々の抗体を組み合わせての細胞療法に発展に寄与する。