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ギリシャ政治哲学の総括的研究

初日はアリストテレス『ニコマコス倫理学』と『政治学』をテーマに、午前と午後に3名が発表、アリストテレスと後期プラトンの関係をテーマに、午後に1名が発表を行なった。二日目はギリシャ政治哲学の後世への影響関係について、数名が発表し、これを基に討論した。なお以上の活動に並行して、前年度に購入できなかった図書を購入し、研究資料の拡充に努めた。本研究は、プラトン『国家』篇(平成19年度)、『法律』篇(平成20年度)、アリストテレス『政治学』(平成21年度)という、古典期ギリシャにおいて成立した政治哲学に関する三大著作を研究主題とする。本年度は最終年度に当たることから、これまの成果を総括することを目指した。ギリシャ政治哲学における三大著作について、それぞれの固有性、それらの間の異同を多面的に考察し終えた今、そうした成果を、当時の政治的現実との関連(Aグループ)や、ヘレニズム、ローマ、中世初期におけるギリシャ政治哲学の受容と展開(Bグループ)などを視野に入れ、改めて総括し、ギリシャ政治哲学の全体像を展望した。グループ・リーダーの指揮のもと、各メンバーは随時連絡を取り合い、研究成果を報告し合うとともに、前年度に購入できなかった図書を選定、購入。12月に首都大学にて開催した研究集会(2日間)では、まず研究代表者がこれまでの研究を回顧し、今後の展望を語った後、ソクラテスの法理念、ヘレニズムのコスモポリタニズム、新プラトン主義の政治哲学、プラトンの哲人王思想など、本研究を締めくくるにふさわしい発表が続いた。集会ではこれに加え、本年度8月に東京で開催された国際プラトン学会(テーマ:プラトンの『国家』)との関連も視野に入れ、参加者による報告が行われた。なお、これまでの研究発表についての目録や書誌情報を作成し、研究成果の集成に努めた。
走査型トンネル顕微鏡(STM)からの発光

本研究の目的は走査型トンネル顕微鏡(STM)からの発光特性を調べ,その発光機構を実験的及び理論的に解析することにあった。STMの発光計測法に関して,STM試料を半球プリズムの上に置きプリズム側(試料裏側)から発光計測を行うプリズム結合法を考察し,それを表現したSTM装置を試作した。このSTM装置は超高真空中で動作させることができる。プリズム側への発光特性(発光スペクトルや発光強度の角度依存)のバイアス依存性とバイアス極性依存を計測した。発光の角度依存計測には光マルチチャンネル検出器(PCーIMD),スペクトル計測には低分散分光器(400nm/12.5mm)とPCーIMDを用いたので,発光強度の時間的変動が角度依存性やスペクトル中の構造として現れることはない。試料に金の蒸着膜,探針に白金を用い実験を行った。その結果,発光の角度依存は,探針側を負にバイアスした場合,43度にピ-クを持つことがわかった。この角度でプリズム中を進行する光の界面に平行な波数は表面プラズモンの波数と一致する。従って,この43度方向の発光は表面プラズモンからの発光であると言える。この実験事実とSTM発光現象に関する理論計算の結果から,発光機構は,トンネル電子により励起されたロ-カル・プラズモンが表面プラズモン"崩壊"した後,プリズム側に発光したものであることが明かになった。
分子複合体のX線解析による蛋白質の分子認識機構の研究

本研究では、分子認識の厳密性と助長性という生物物理学の観点から、転写因子によるDNA認識、ならびにシグナル伝達蛋白質の分子認識に関して分子複合体結晶のX線結晶解析を主力とした構造生物学的研究を行った。転写系では、酵母由来のリン酸代謝系の転写因子PHO4、マウス由来のインターフェロン関連遺伝子の転写因子IRF-2、及び分裂酵母由来のbZIP型転写因子PaplのDNA複合体の構造をそれぞれ決定して、塩基配列認識の詳細な機構を明らかにした。シグナル伝達系では、細胞骨格・細胞接着を制御する低分子量G蛋白質RhoAのRhoA/GTPγS複合体及びその標的蛋白質PKNとの複合体の構造を決定して、Rhoに特異的な機能領域の構造や標的蛋白質認識の機構を明らかにした。また、原核細胞に特徴的なHis-Aspリン酸リレーでは、嫌気性条件センサー蛋白質ArcBのリン酸転移ドメインやそれに働く蛋白質フォスファターゼSixAの構造を決定した。更に、酸化ストレスとシグナル伝達系との境界領域での研究としては、ヘム結合能を持つとともに、新規の酸化ストレスの応答のペルオキシダーゼ(ペルオキシレドキシン)であるHBP23の構造や、細胞外のシグナル制御系として、マウス海馬に高発現し記憶や学習に関与する新規セリンプロテアーゼであるニューロプシンの結晶構造を決定した。本年度は主に、タンパク質-DNA複合体の構造解析を重点的に行った。酵母由来のリン酸代謝系の転写因子PHO4のDNA結合ドメインとその認識配列DNA(PHO5遺伝子のUASp2)との複合体の結晶構造を分解能2.8Åで決定し、EMBO J.(1997)に発表した。従来のbHLHモチーフでは見られなかった第三のヘリックスがループ部分に存在すること、及び、E-boxと呼ばれるbHLHの認識する共通配列(CACGTG)に続く3'-側の2塩基対を余分に認識していることを発見した。ホモ二量体の非対称認識を示す最初の例である。また、分裂酵母由来のAP-1様転写因子Pap1のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの高分解能(2Å以上)複合体結晶を作成して、MIRより位相決定した。bZIPの認識する共通配列はAP-1及びATF/CREBサイトに大別されるが、Pap1(認識配列TAACGTTA)などの幾つかのbZIP転写因子はこれとは異なる種々の配列を認識することが知られており、その認識メカニズムは不明であった。本構造はこの非共通配列をもつ複合体の最初の解析例であり、塩基認識の多様性について新しいパラダイムを提出できる可能性がある。更に、マウス由来の転写因子IRF-2のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの複合体結晶を、MIR-MRより位相決定した。IRF-2は繰り返し配列にタンデムに結合しており、IRF-1/DNA結晶で報告されているような大きなDNAの湾曲が局所的には存在するもの、分子全体としては互いに打ち消し合っていることが明らかになった。これらのPap1/DNAとIRF-1/DNAの複合体は、現在、更に構造精密化中である。その他、真核細胞における細胞内情報伝達系での蛋白質間の分子認識機構を解明する目的で、低分子量G蛋白質RhoA-GTPγS複合体の結晶を得て構造決定した。更に、マウス海馬cDNAライブラリーからクローニングされた新規セリンプロテアーゼであるニューロプシンの結晶構造を決定した。本年度は主に、マウス由来の転写因子IRF-2のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの複合体結晶と低分子量Gタンパク質RhoAとその標的タンパク質キナーゼPKNの結合ドメインとの複合体結晶の構造決定を行った。また、分岐したDNAに特異的なヌクレアーゼヒトFEN-1の大量調整と結晶化を試みた。IRF-2/DNAの複合体は、既に重原子誘導体結晶を得ており、また、米国Mount Sinai医学校のAneelK.A ggarwalより供与されたIRF-1/DNA構造があるので、MIR-MRより位相決定し、構造を精密化する。予備的解析では、IRF-2は繰り返し配列にタンデムに結合しており、IRF-1/DNA構造とは種々の点で異なることがわかった。

この研究はEMBOJに投稿中である。RhoA/PKN複合体では、すでに我々が構造決定した活性型のRhoAの構造をもとに、分子置換法で構造決定した。PKNのRhoA結合ドメインは、反平行の2本のαヘリックスがcoiled-coil状に束になった構造をしており、我々はこの構造をACC-フィンガーと名付けた。ACC-フィンガーはRhoAのSwitch I、βストランドB2とB3、ならびにαヘリックスA5と主に水素結合により、認識されていた。また、結晶中では、もう一方のACC-フィンガーがSwitch II領域に結合していることも分かった。これはPKNが2つのドメインでと結合するという生化学的実験データと良く符合した。本年度は、主に、分裂酵母由来のbZIP型転写因子Pap1のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの複合体結晶の高分解能(2.0Å)の構造決定を行った。bZIP型転写因子は真核細胞において最も大きいファミリーの一つを形成しており、AP-1(TGACTCA)やATF/CREB(TGACGTCA)配列と異なる塩基配列を認識する幾つかのサブファミリーが存在することが知られるようになったが、それらの認識機構は不明であった。構造決定したPap1もその例であり、認識配列はTTACGTAAである。今回の複合体構造では、通常のbZIP型転写因子は塩基配列を認識する塩基性領域において、NxxAAxxCR配列を持つが、Pap1はNxxAQxxFRとなっており、置換しているグルタミンとフェニルアラニンがTT配列の認識に直接関与することがわかったが、興味深いことに、保存されている重要な残基の一つであるアスパラギンは本来、TG配列を認識しているが、本構造では側鎖のコンホメーションを変化させて、TT配列を認識していた。また、低分子量Gタンパク質RhoAとその標的タンパク質キナーゼPKNの結合ドメインの複合体結晶の構造の論文を出版した。
Ge/Si ヘテロ構造の歪開放機構の解明と刃状転位の新機能探索

本研究では、Si基板上のGe膜成長過程に生じる刃状転位の原子構造を提案し、第一原理量子計算を用いてエネルギー論を調べた。その結果、提案された5-7員環転位芯構造は安定に存在し、12層程度Ge層を積むことで刃状転位が生じることを明らかにした。また、刃状転位芯が存在するGe表面の走査型トンネル顕微鏡像(STM)を計算し、STM像には転位線が見られることが分かった。Si系デバイスでのスケーリング則に依存しない性能向上技術に注目が集まっている。その中で、Si基板上のGeを新機能電子・光デバイスへと応用する試みがある。本研究では、第一原理的量子シミュレーションを用いて、Si基板上のGe膜中に生じる刃状転位の生成機構と基礎電子物性に関する研究を行っている。本年度では、まず、Si基板上に作成されたGe膜の成長の初期過程おけるエネルギー状態を調べた。その結果、通常ダイマーのミッシング構造が観測されるが、表面が水素化された場合は、これとは異なって、ダイマーのミッシングがない表面構造の方がエネルギー的に安定であることが分かった。次にSi基板とGe膜の界面近傍に存在する刃状転位の転位芯の原子構造を提案し、この提案した転位芯構造において、Ge膜庫に関するエネルギー計算を行った。その結果、Ge膜の層数が十分大きい場合、刃状転位構造のエネルギーが転位の生じていない場合のそれよりも低くなり、刃状転位の生じる可能性があることが分かった。また、刃状転位の転位芯構造に関する電子状態を調べ、STM像を求めた。その結果、転位芯の上方に、ある程度のGe層が積まれた場合でも、STM像上では転位芯に沿った方向に、転位線が現れることが分かった。また、印加電圧の違いにより、STM像上の転位線は明るく見える場合と暗くなる場合があることが分かった。この結果、刃状転位の転位芯は、STMを用いることで原子分解能の検出が可能であると考えられる。本年度では、密度汎関数理論に基づいた第一原理電子状態計算により、昨年度に引き続き、Ge/Si界面近傍に生じた刃状転位の転位芯の構造特性と電子状態に関する研究を行った。ここでは、特にSi基板上のGe層数の変化に着目し、転位芯の幾何学的構造と電子状態との関連について調べた。すでに、Ge/Si界面近傍に存在する転位芯の原子構造として5-7員環からなる構造を提案している。この転位芯は、その上にGe層が積まれても壊れることなく安定に存在し、そのボンド長やボンド角はほとんど大きく変化しないことが分かった。また、転位芯よりも上に積まれたGe膜は、Geのレイヤー数の増加とともに、Ge膜中のボンド角の歪みが緩和されるが、Ge膜中で広範囲に広がっていることが分かった。電子構造に関しては、転位芯に関連する電子状態がバンドギャップ中に見られる。それらの状態は価電子帯トップで転位芯を避けるように電子密度分布が広がり、伝導帯ボトムでは転位芯上に電子密度が存在していることが分かった。このため、走査型トンネル顕微鏡の価電子帯での像では、転位芯に沿って暗い線として、伝導帯の像では明るい線として現れることが分かった。また、Geレイヤー数の増加とともに走査型トンネル顕微鏡像における転位線幅が広がることが分かった。これらの結果は、走査型トンネル顕微鏡を用いることで、転位芯の原子構造を観察できる可能性を示唆しているものと期待される。
海馬シータ波発現における中隔―海馬コリナージック・システムの役割

本研究においては、自由行動中のラットの海馬における電気活動を記録するとともに、脳内微小透析法によって海馬アセチルコリン(ACh)を定量し、海馬シータ波とACh遊離量の関係を解析することにより、海馬シータ波発現機構における中隔-海馬コリナージック・システムの役割について検討した。その結果、以下の諸知見を得た。(1)徐波睡眠時と比較して、シータ波が顕著なレム睡眠時には、海馬ACh遊離量が著しく増大した。(2)覚醒時においても、覚醒安静状態<グルーミング・摂食飲水行動<探索行動の順に、ACh遊離量が増大した。(3)これらの知見から、海馬ACh遊離量の増大は、シータ波の発現が顕著なステージ(探索行動、レム睡眠時)において認められることが確認された。(4)さらに、内側中隔野に種々のコリナージック作動薬(ネオスティグミン、カルバコール)、遮断薬(アトロピン)を投与すると、作動薬において海馬シータ波の増大、遮断薬でシータ波の抑制が生じた。以上の結果から、海馬シータ波には中隔-海馬コリナージツク・システムが関与していること、さらに中隔野のコリノセプティブなメカニズムを介していることが示唆された。これらの知見に基づき、シータ波が海馬の情報処理モードを反映している可能性等を論じた。動物が探索行動や定位反応を示したり、レム睡眠の状態にある時、海馬において特徴的な6-8Hzのシータ波が観察される。本研究においては、自由行動中のラットの海馬における電気活動を記録するとともに、脳内微小透析法(マイクロダイアリシス)によって海馬アセチルコリンを定量し、シータ波とアセチルコリン遊離量の関係を解析することにより、海馬シータ波発現機構における中隔-海馬コリナージック・システムの役割について検討する。初年度である平成11年度には、超高感度HPLCを導入し、同HPLCの性能試験を行った後に、ラット海馬におけるアセチルコリン遊離量をマイクロダイアリシス法を用いて測定した。従来、マイクロダイアリシス法を用いて微量の脳内アセチルコリン遊離量を定量するためには、エゼリンを灌流液中に含める必要があり、そのため生理的条件下でのアセチルコリン遊離量を決定できないという重大な問題があった。しかし、今回導入した超高感度HPLCを用いると、10フェムトモルのレベルまで感度を上げることが可能であった。次いで、実際にラット海馬からエゼリン・フリー下で採取したダイアリシスサンプルをHPLCで定量したところ、アセチルコリンを検出することができた。さらに、ラットにアセチルコリン・エステラーゼ阻害剤を腹腔投与すると、ダイアリシスサンプル中のアセチルコリンは500-600%増大した。これは、エゼリンを用いた場合(150-200%)と比較して著しく高い値であった。以上の結果から、超高感度HPLCとマイクロダイアリシス法を組み合わせることにより、生理的条件下での微量なアセチルコリン遊離量の変動を正確に定量できることが明かになった。以上の成果を踏まえて、次年度から海馬シータ波発現時の海馬アセチルコリンの測定を開始する予定である。これを、海馬シータ波あるいはRSA(rhythmic slow wave)といい、海馬が情報処理モードにあることを示している。昨年度は、超高感度HPLCを用いて、エゼリン・フリー下でラット海馬から遊離したアセチルコリンを定量できることが明らかになった。そこで、本年度は、自由行動中のラットの脳波を記録しながら、マイクロダイアリシス・サンプリングを行い、脳波とアセチルコリン遊離量との対応について解析した。その結果、次の知見を得た。

(1)徐波睡眠時と比較して、シータ波が顕著なレム睡眠時には、海馬アセチルコリン遊離量が著しく増大した(400-500%)。(2)速波が観察される覚醒時においても、アセチルコリン遊離量は増大した(300-500%)。(3)覚醒時の行動とアセチルコリン遊離量との関係を詳しく解析すると、覚醒安静状態<グルーミング・摂食飲水行動<探索行動の順に、アセチルコリン遊離量が増大した。これらの知見に基づき、今後、とくに覚醒時の脳波・行動と海馬アセチルコリン遊離量との関係について解析を進める予定である。動物が探索行動や定位反応を示したり、レム睡眼の状態にある時、海馬において特徴的な6-8Hzのシータ波が観察される。これを、海馬シータ波あるいはRSA(rhythmic slow wave)といい、海馬が情報処理モードにあることを示している。本研究においては、自由行動中のラットの海馬における電気活動を記録するとともに、脳内微小透析法によって海馬アセチルコリン(ACh)を定量し、シータ波とACh遊離量の関係を解析することにより、海馬シータ波発現機構における中隔-海馬コリナージック・システムの役割について検討した。その結果、以下の諸知見を得た。(1)徐波睡眠時と比較して、シータ波が顕著なレム睡眠時には、海馬ACh遊離量が著しく増大した。(2)覚醒時においても、覚醒安静状態<グルーミング・摂食飲水行動<探索行動の順に、ACh遊離が増大した。(3)これらの知見から、海馬ACh遊離量の増大は、シータ波の発現が顕著なステージ(探索行動、レム睡眠時)において認められることが確認された。(4)さらに、内側中隔野に種々のコリナージック作動薬(ネオスティグミン、カルバコール)、遮断薬(アトロピン)を投与すると、作動薬において海馬シータ波の増大、遮断薬でシータ波の抑制が生じた。海馬におけるAChは、内側中隔野のコリナージックニューロンに由来する。内側中隔野のコリナージックニューロンは海馬に投射するとともに、M3受容体を介して内側中隔野のGABAニューロンを活性化することが知られている。さらに、内側中隔野GABAニューロンは海馬の抑制性GABA介在ニューロンに投射し、介在ニューロンを抑制する。従って、覚醒時やレム唾眠時には、内側中隔野コリナージックニューロンは、M3受容体を介して同じ内側中隔野のGABAニューロンを活性化することにより、海馬を脱抑制し、シータ波を発現させると考えられる。
都市環境計画策定のための予測・評価方法と情報システムの確立

本研究班は川崎市を事例研究の対象都市として選んだが,その本質を浮き彫りにするため他の諸都市についても分析を開始した.国勢統計区単位に社会経済特性,小中学校区単位に住民特性や社会意識,地域リーダーによる地域の社会組織状況及び環境評価を把握しその関連分析を試みた.つぎに都市環境計画の策定に必要な効果測定方法の確立をはかったが,これには非貨幣的指標による方法と貨幣的指標による方法の二つがある.非貨幣的指標に関しては既存手法と指標例のサーベイを行い,これに基づき住民の満足度で示す指標開発のための環境観察調査を,川崎市において市との共同研究として行った.貨幣的指標についてはヘドニック・アプローチによる環境改善便益の評価法を用いた場合のバイアスについての研究を行った.以上の検討をふまえて,計画対象たる都市環境の変化を予測するため,土地利用と生物圏に着目して理論的整合性と実用性の二点から予測モデルの比較検討を行った.土地利用に関しては予測モデルの要件を整理し,関連データの利用可能性を検討し,予測モデルを一部完成させた.都市生態学的モデルに関しては対象地区に千葉市とその周辺を選び,基礎作業として環境変化と植生動態を空間的スケールによって3つのレベルに分けて調べた.最後に,以上に述べた都市環境の予測・評価に必要なデータを短期間に高精度で得る情報システムの構築をめざし,既存の関連システムの現状を調査した.都市環境の快適性をリモートセンシングや地図情報を基にして測定するために快適性ポテンシャルモデルの構築を試みた.また都市構造を把握するうえで必要となるリモートセンシングデータの最適分解能を検討し,川崎市を対象に昼及び夜のそれぞれ観測高度の異なる航空機MSSデータを収集した.さらに都市の快適性評価に必要となる都市構造に関連する項目を整理し,その軽量化手法について検討した.本研究班は川崎市を事例研究の対象都市として選んだが,その本質を浮き彫りにするため他の諸都市についても分析を開始した.国勢統計区単位に社会経済特性,小中学校区単位に住民特性や社会意識,地域リーダーによる地域の社会組織状況及び環境評価を把握しその関連分析を試みた.つぎに都市環境計画の策定に必要な効果測定方法の確立をはかったが,これには非貨幣的指標による方法と貨幣的指標による方法の二つがある.非貨幣的指標に関しては既存手法と指標例のサーベイを行い,これに基づき住民の満足度で示す指標開発のための環境観察調査を,川崎市において市との共同研究として行った.貨幣的指標についてはヘドニック・アプローチによる環境改善便益の評価法を用いた場合のバイアスについての研究を行った.以上の検討をふまえて,計画対象たる都市環境の変化を予測するため,土地利用と生物圏に着目して理論的整合性と実用性の二点から予測モデルの比較検討を行った.土地利用に関しては予測モデルの要件を整理し,関連データの利用可能性を検討し,予測モデルを一部完成させた.都市生態学的モデルに関しては対象地区に千葉市とその周辺を選び,基礎作業として環境変化と植生動態を空間的スケールによって3つのレベルに分けて調べた.最後に,以上に述べた都市環境の予測・評価に必要なデータを短期間に高精度で得る情報システムの構築をめざし,既存の関連システムの現状を調査した.都市環境の快適性をリモートセンシングや地図情報を基にして測定するために快適性ポテンシャルモデルの構築を試みた.また都市構造を把握するうえで必要となるリモートセンシングデータの最適分解能を検討し,川崎市を対象に昼及び夜のそれぞれ観測高度の異なる航空機MSSデータを収集した.さらに都市の快適性評価に必要となる都市構造に関連する項目を整理し,その軽量化手法について検討した.
河川、内湾水中マイクロプラスチック挙動解明と代替物質利用による将来濃度予測

河川や海洋、事業所排水等水中の10μm以上のマイクロプラスチックの調査方法を開発、成功した。さらに、調査法で得られた試料から、20μm以上のマイクロプラスチックを自動で同定定量する、顕微FTIRによる分析手法の開発に成功した。従来のマイクロプラスチック調査の問題点として、海洋では調査船を使用した大規模調査が必要なこと、河川や湖沼、事業所排水では大量のサンプルの収集方法が問題であった。さらに、従来の分析方法では、目視によりマイクロプラスチック用物質を判別し、ピンセットでつまんだうえ、FTIRで一つ一つプラスチックか否かを確認している。そのため、分析精度が担保できないこと、つまめないような200μm未満の粒子は対象としていなかった問題があった。開発した調査法、分析法はこれらの問題点をすべて解決するものである。可搬型のオンサイト濃縮器で河川や湖沼、下水処理場、海洋等でその場で水中のマイクロプラスチックを濃縮できる。さらに、メンブレン上の懸濁物質の赤外スペクトルを面的に測定し、PC上でメンブレン上のマイクロプラスチックの存在を一括にイメージングすることで同定が可能となった。さらに、イメージングで抽出したマイクロプラスチックの粒径、粒子数も自動で測定できる。この手法を用いて、沖縄のビーチの砂浜と海水、鶴見川河川水を調査した結果、従来の調査方法では検出できない、数十μmのマイクロプラスチックが数百1500個/m3検出された。また、海洋のマイクロプラスチックは河川水に比較して粒径分布が小さいことやビーチの砂浜中への微粒子マイクロプラスチックの選択的蓄積の傾向も観察された。顕微FTIRの納品が遅れたものの、より高精度な顕微FTIRの入手ができた。これにより、当初予想していた以上に精度の高い、マイクロプラスチックの自動同定定量分析手法が完成した。さらに、この手法の調査結果により、従来のマイクロプラスチック調査結果を大きく変えるほどの、新しい知見(マイクロプラスチックの粒径分布、ポリマー組成、マイクロプラスチック濃度)が得られた。この結果は世界的にも今後のマイクロプラスチック研究や社会的対策に大きなインパクトを与えるものと思われる。一方、海外の大学と共同研究が順調に進んでおり、来年度の結果が期待される。来年度は、今年度開発した調査分析手法を用いて、以下の点を明らかにする。・下水処理場へのマイクロプラスチック負荷量調査の実施と負荷量の統計学的推定・シミュレーションモデルを使用した国内河川水中マイクロプラスチック濃度及び挙動推定・台湾、オーストラリア及び中国における東シナ海を中心としたマイクロプラスチック共同調査・10μm未満のマイクロプラスチックの測定方法の開発河川や海洋、事業所排水等水中の10μm以上のマイクロプラスチックの調査方法を開発、成功した。・下水処理場へのマイクロプラスチック負荷量調査の実施と負荷量の統計学的推定・シミュレーションモデルを使用した国内河川水中マイクロプラスチック濃度及び挙動推定・台湾、オーストラリア及び中国における東シナ海を中心としたマイクロプラスチック共同調査・10μm未満のマイクロプラスチックの測定方法の開発物品について、予定していた金額よりも安く購入できたため、残金が発生した。少額のため特別な使用計画は立てないが、計画的に使用する予定である。
初期近代英国における演劇と印刷出版の相互交渉に関する考察

本年度は昨年度に引き続きWilliam Shakespeareを中心にその演劇作品と印刷出版との関係について考察を試みた。具体的には、以下のような研究成果を得た。3)Troilus and Cressidaに関して、George ChapmanによるThe Iliadの翻訳や同様の題材を扱ったThomas Heywoodの劇The Iron Age,2 partsとの比較・対照を試み、エリザベス朝最末期におけるナショナリズムの現れ方についての考察を進めた。本年度は特にWilliam Shakespeareに焦点を当て、その演劇作品と印刷出版との関係について考察をおこなった。具体的には、1)King Lear、特に、登場人物の一人Edgarが変装する狂人の乞食Poor Tomについて、この材源となったRogue Literatureとの関連において研究を進めた。特に、やはりこのジャンルに影響を受け、自らも一先行作品から剽窃することをも厭わず-The Belman of LondonやLanthorne and Candle-Lightなどのパンフレットを執筆、出版していたThomas Dekkerとの比較を試みた。この問題に関しては、来年度の研究計画の中心となる予定である、DekkerとThomas Middletonによる、The Roaring Girlの研究とも関係させながら研究を継続する予定である。2)歴史劇、特にKing Richard IIIに関して、その特異な主人公であるリチャード三世像の生成について、Shakespeareが直接、間接的に材源とした印刷出版物であるRaphael HolinshedやEdward Hallの年代記やThomas Moreによる『リチャード三世の歴史』における記述とShakespeare作品を比較・検討した。特にリチャードの身体上の欠陥が次第に強調され、不吉な意味合いを持つものへと変わってきた様子と、材源に既に見られる不信のShakespeare劇における表現について考察した。この考察に関しては2002年10月におこなわれた第41回日本シェイクスピア学会において「シェイクスピアの歴史劇における情報の信頼性」と題して研究発表を行った。本研究に関連するそのほかの研究成果は別欄に記したとおりである。2)リチャード三世像の生成について昨年に引き続き考察した。特に「情報の繰り返し」に着目し、Henry VI, Part 3 Richard IIIという互いに関連する2作品内におけるリチャードの出生時の異常に関する台詞と、Shakespeareが材源としたRaphael HolinshedとEdward Hallの『年代記』(さらにはこれらの財源であったThomas Moreによる一『リチャード三世の歴史』)において既に見ることが出来る情報の不確実性の指摘を比較・検討し、2004年4月におこなわれる第37回アメリカ・シェイクスピア学会におけるセミナー"Repetitio"に"Not Uncnt, Not Untoothed : Repetition, Uncertainty, and Historiography in Henry VI, Part 3 Richard III"と題する研究論文を提出した。
地域活性化モデルの開発と関西への適用

1.地域活性化モデルの精密化と汎用性の検討廣田は、上場企業を対象に「サービス価値向上のための戦略・組織、システムに関する質問票調査」を実施し、サービス業が地域社会・経済システムの活性化に対して果たす役割について「経済的貢献・自社へのフィードバック・問題状況への対応・社会的貢献」の類型化を行った。2.経済活性化の日英比較伊東は英国訪問調査により、1990年代以降英国における都市活性化の成功例である、各都市における小売業の「タウン・シティセンター」の動向実態と成功要因を研究し、大阪における小売業活性化に向けて、(1)地域都市圏全体での検討(2)きめ細かい土地利用計画(3)意思決定の仕方の再検討(4)計画・戦略の連携・調整の重要性などを指摘した。3.事業所統計調査結果の時系列比較高瀬は、過去の事業所組織と雇用関係の統計分析をすすめて、組織からの個人への束縛作用が、官僚制的な束縛と終身雇用的関係からの束縛という両方の点から見て軽減の傾向にあり、組織活性化を促進する背景的状況が生まれていることを明らかにした。4.経済活性化のための社会的基盤の検討与謝野と林は、全国の20歳以上を対象にした「信頼感」に関する調査結果をもとに、「信頼の解き放ち理論」の前提となる事実認識が支持を得られないものであることを示した。このことは、個人間競争を通じた経済活性化という、よく見受けられる政策的提案の妥当性に疑問を抱かせるものである。5.経済活性化の事例研究大西は、東大阪市の工場組織に関する実態調査をもとに活性化に向けた方策として中小企業の独立化、企業グループの形成、企業間ならびに官民連携による設備活用を提案した。6.活性化につながる人的資源の形成に関する研究森田は日米欧におけるエンプロイヤビリティの展開を比較し、人事制度に組み込むための条件について考察した。1.文献サーヴェイを通じ、従来の「活性化」に関する議論の論点を整理した。個人レベルでは「やる気」の創出、キャリア開発への積棒的意欲、イノベーションの受容などが、組織レベルでは創造的企業風土、イノベーションの導入、新規創業・新産業の創出、そして全体社会レベルではネットワーク社会化、競争に対応したセーフティネットの整備、社会資本の形成が重要な問題として抽出された。次年度には、諸調査結果に基づき、個人・組織・全体社会レベルの媒介項としての地域社会活性化の政策的モデルの提示をめざす。2.また、事業所統計調査の分析を通じて、地域の中で事業所の設立・成長・消滅などの分布パターンを検討した。それによれば関西、とくに大阪地区は事業所組織の新陳代謝が激しいという意味ではけっして停滞していない。しかしそれが雇用の拡大や経済の成長に結びついていない点に問題があり、次年度はその原因について追究する。3.経済活性化めための社会的基盤としての社会関係資本について市民を対象とした社会調査「信頼と社会の活性化に関する調査」を実施して、関西地方における問題点の摘出を目指した。調査の実施が年度末にかかったため、詳細な分析結果は次年度にまとめる。4.各地の地域活性化策で注目される事例を訪問し、聞き取り資料をもとにそのモデル化を試みた。地方においては第1次・第2次・第3次などの産業の枠を超えて融合させる試みの重要性が高まっており、その方法論の一般化が待たれているが、次年度にはさらにそれらのモデル形成化を推進する予定である。5.活性化につながる人的資源の形成と大学の役割についての調査を計画した。実施は次年度早々におこなう予定である。1.地域活性化モデルの精密化と汎用性の検討

廣田は、上場企業を対象に「サービス価値向上のための戦略・組織、システムに関する質問票調査」を実施し、サービス業が地域社会・経済システムの活性化に対して果たす役割について「経済的貢献・自社へのフィードバック・問題状況への対応・社会的貢献」の類型化を行った。2.経済活性化の日英比較伊東は英国訪問調査により、1990年代以降英国における都市活性化の成功例である、各都市における小売業の「タウン・シティセンター」の動向実態と成功要因を研究し、大阪における小売業活性化に向けて、(1)地域都市圏全体での検討(2)きめ細かい土地利用計画(3)意思決定の仕方の再検討(4)計画・戦略の連携・調整の重要性などを指摘した。3.事業所統計調査結果の時系列比較高瀬は、過去の事業所組織と雇用関係の統計分析をすすめて、組織からの個人への束縛作用が、官僚制的な束縛と終身雇用的関係からの束縛という両方の点から見て軽減の傾向にあり、組織活性化を促進する背景的状況が生まれていることを明らかにした。4.経済活性化のための社会的基盤の検討与謝野と林は、全国の20歳以上を対象にした「信頼感」に関する調査結果をもとに、「信頼の解き放ち理論」の前提となる事実認識が支持を得られないものであることを示した。このことは、個人間競争を通じた経済活性化という、よく見受けられる政策的提案の妥当性に疑問を抱かせるものである。5.経済活性化の事例研究大西は、東大阪市の工場組織に関する実態調査をもとに活性化に向けた方策として中小企業の独立化、企業グループの形成、企業間ならびに官民連携による設備活用を提案した。6.活性化につながる人的資源の形成に関する研究森田は日米欧におけるエンプロイヤビリティの展開を比較し、人事制度に組み込むための条件について考察した。
脳神経機能に関与するTPRモチーフタンパク複合体の機能解明

本研究では、脳神経機能に関与する可能性のあるTPRモチーフタンパクとしてTPRBKタンパクについて、主に以下の研究を実施した。(1) TPRBKタンパクと相互作用するタンパク質の同定(2)相互作用タンパクの機能ドメイン探索(3)蛍光抗体染色法を用いた細胞内局在解析その結果、(A)TPRBKは細胞分裂に関連するタンパク質X,Yと相互作用するの3つの研究成果が得られた。TPRモチーフは、タンパク質複合体形成時のタンパク質間相互作用に関与し、細胞の恒常性維持に関わる多くのタンパク質内に存在する。平成20年度は、以下の計画に従って研究を実施した。1.脳神経機能に関与するTPRモチーフタンパクのスクリーニング2. TPRモチーフタンパクと相互作用するタンパク質の同定3.培養細胞を用いた蛍光抗体染色による細胞内局在解析計画1では、スクリーニングした機能未知TPRモチーフタンパクの中で、成人及び胎児脳で発現が見られたTPRBKに焦点を絞り、さらに研究を進めた。計画2については、TPRBKの発現量が多かったアフリカミドリザル腎臓由来COS7細胞から抽出したタンパク質に対し、抗TPRBK抗体を用いて免疫沈降を行ったところ、タンパク質Xが共沈降した。Xは細胞分裂機構において重要な役割を担っており、関連タンパク質がいくつか存在するため、それらとの相互作用についても検討中である。また計画3については、抗TPRBK抗体を用いて細胞内局在解析を行い、TPRBKが中心体に局在していることがわかった。中心体は、細胞分裂期に紡錘体の極として働き、染色体分配や細胞極性の制御に主動的な役割を果たしている。この機能へのTPRBKの関与を調べるため、COS7細胞をDouble-thymidine block法により同調させ局在変化を観察した。その結果、G1SG2期では中心体に局在するが、M期前中期に中心体や紡錘体、さらに後期ではMidzoneにも局在し、細胞質分裂期ではMidbodyに局在することが明らかとなった。平成21年度は、昨年度に引き続き、TPRBKについて以下の計画に従って研究を進めた。1.培養細胞を用いた蛍光抗体染色による細胞内局在解析2.TPRモチーフタンパクと相互作用するタンパク質の同定3.TPR欠失変異体を用いた相互作用部位の特定まず計画2について、COS7細胞を用いて抗TPRBK抗体により免疫沈降を行い、タンパク質Xの他にタンパク質Yも共沈降することがわかった。Xは細胞分裂期に重要な役割を果たすことが明らかにされているが、Yは機能未知のタンパク質である。この結果をもとに、計画1についてTPRBK,X,Yのそれぞれに対する抗体を用いて細胞染色を行ったところ、細胞周期M期終局の細胞質分裂過程においていずれも中央体と呼ばれる構造部分に局在することがわかった。中央体は核分裂後の細胞質分裂において実質的な細胞質切断に関わる構造体であり、これらのタンパク質は細胞質分裂機構に機能的な関連を持つ可能性が高いことが示唆された。また、収縮環形成に関わるタンパク質の機能阻害剤を加えた細胞ではTPRBK及びXともに異常な局在を示し、siRNAを用いたTPRBK発現抑制実験では核分裂は完了したがその後の細胞質分裂が遂行されない状態の細胞(二核細胞)が多く観察された。さらに計画3において、TPRBKとタンパク質X,Yとの具体的な相互作用部位を調べるため、5種類のTPR欠失変異体を作製した。これらを用いて、免疫沈降法による相互作用部位の特定を進めている。以上の結果から、TPRBKは細胞質分裂機構に機能的な関わりを持つタンパク質であると推察される。
情動的記憶の検索抑制に及ぼす二重課題の効果

リスト指示忘却パラダイムでは、第1リストの呈示終了後に、第1リストを忘却するようにという忘却教示を与えた忘却群と、引き続き第2リストを記銘する記銘教示を与える記銘群を設け、いずれもすべてのリストの再生と再認を求める。典型的な結果は、(1)第1リストは記銘群より忘却群の再生成績の方が悪い、(2)第2リストは忘却群よりも(第1リストからの順向干渉を受けた)記銘群の再生成績の方が悪い、(3)再認テストでは第1リスト、第2リストともに両群の間に再認成績の違いが認められない、というものである。本研究では、このパラダイムを用いて、言語材料と画像材料における情動性と二重課題のそれぞれが意識的な検索抑制に及ぼす効果について検討することを目的とした。実験1で、ニュートラル単語16語とネガティブ単語16語を使って、記憶負荷のない状態で検討した結果、(1)と(3)という通常の指示忘却現象が認められた。実験2では、実験1と同じ方法で、記憶負荷を与えた(第2リストの呈示前に全員に6桁の数字を記憶させた)ところ、指示忘却効果の消失を確認することができた。実験3では、画像材料(ネガティブ写真24枚)を用い、記銘群24名と忘却群24名を対象に、記憶負荷を与えない場合のリスト指示忘却の知見を検討した。その結果、ネガティブ画像でも(記憶負荷を与えない)単語材料とまったく同様の(1)と(3)のリスト指示忘却現象が認められた。実験4では、画像材料の記憶負荷の影響を調べたところ、単語とは異なり、指示忘却現象は消失しなかった。これらのことから、言語材料、画像材料のいずれの場合にも検索抑制が認められること、また、これらの検索抑制が成功するためには、抑制したい材料から注意をそらし、別の材料の記銘活動に十分に従事しなければならないことが示唆された。本研究課題では、リスト指示忘却と呼ばれるパラダイムを用いて、言語材料の情動性と二重課題のそれぞれが意識的な検索抑制に及ぼす効果について検討することを目的としている。そこで、本年度はまず、すでに確立されている(記憶負荷のない場合の)単語の抑制効果(すなわちリスト指示忘却効果)の知見を実験的に確認した。まず、ニュートラル単語32語(食事、訪問など)と、ネガティブ単語32語(戦争、手術など)を選定する作業を行った。次に、材料の情動性(ニュートラル材料、ネガティブ材料)を被験者内要因とし、群(記銘群、忘却群)を被験者間要因とした実験計画のもと、リスト指示忘却効果の知見を検討した。記銘群24名、忘却群24名には、最初に記銘教示を与え、1語ずつ視覚提示される第1リスト(16語)の記銘の終了直後に、記銘群には記銘続行教示を与え、忘却群には(第1リストの)忘却教示を与えた。こうして、引き続き第2リストを学習した後に、記銘群、忘却群ともに、第1リスト、第2リストすべての単語の再生を求める書記再生(5分間)と、再認テスト(5分間)を求めた。その結果、材料の情動性とは無関係に、従来の研究と同様のリスト指示忘却効果として、(1)第1リストは記銘群より忘却群の再生成績の方が悪い、(2)第2リストは忘却群よりも(第1リストからの順向干渉を受けた)記銘群の再生成績の方が悪い、

(3)再認テストでは第1リスト、第2リストともに両群の間に再認成績の違いが認められない、という結果が得られた。本研究課題では、リスト指示忘却と呼ばれるパラダイムを用いて、言語材料と画像材料における情動性と二重課題のそれぞれが意識的な検索抑制に及ぼす効果について検討することを目的とした。昨年度は、すでに他の多くの研究で確立されている(記憶負荷のない場合の)単語の抑制効果(すなわちリスト指示忘却効果)の知見を実験的に確認した。本年度は、まず、昨年度とまったく同じ単語材料(ニュートラル単語16語とネガティブ単語16語)と手続きを用い、記憶負荷を与えた(第2リストの呈示前に全員に6桁の数字を記憶させた)ところ、指示忘却効果の消失を確認することができた。次に、画像材料(ネガティブ写真24枚)を用い、記銘群24名と忘却群24名を対象に、記憶負荷を与えない場合のリスト指示忘却の知見を検討した。その結果、ネガティブ画像でも(記憶負荷を与えない)単語材料とまったく同様のリスト指示忘却現象が認められた。すなわち、(1)第1リストは記銘群より忘却群の再生成績の方が悪い、(2)第2リストは忘却群よりも(第1リストからの順向干渉を受けた)記銘群の再生成績の方が悪い、(3)再認テストでは第1リスト、第2リストともに両群の問に再認成績の違いが認められない、という結果が得られた。これらのことから、言語材料、画像材料のいずれの場合にも検索抑制が認められること、また、これらの検索抑制が成功するためには、抑制したい材料から注意をそらし、別の材料の記銘活動に十分に従事しなければならないことが示唆された。
Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞のアクチンリング形成制御機構の解明

破骨細胞が骨を吸収する際に、アクチン細胞骨格の再編成によりアクチンリングと呼ばれる構造が形成される。サイトカインWnt5aの受容体であるRor2を欠損した破骨細胞では、アクチンリングが形成されず、骨吸収活性も低下していることを見出した。さらに、Ror2の下流でアクチンリング形成に関与するシグナル伝達経路を探索し、Daam2による低分子量Gタンパク質Rhoの活性化が重要であることを明らかにした。破骨細胞は、骨を吸収する際、アクチン骨格の再編成と波状縁の形成により、極性化する。この過程の詳細なメカニズムは不明である。我々は、Wnt5a及びその受容体であるRor2を欠損した破骨細胞では、アクチンリングが形成されず、骨を吸収できないことを見出した。そこで、破骨細胞極性化におけるWnt5a-Ror2シグナルの役割を解明することを目的とし、以下の研究を行った。昨年度までに、Ror2を欠損した破骨細胞に恒常的活性型のRho (caRho)を過剰発現させるとアクチンリング形成と骨吸収活性が回復することを明らかにした。今年度は、Ror2の下流でRhoの活性化に関与する分子の同定を目的とした。WntシグナルによるRhoの活性化には、Formin homology (FH)ドメインを持つタンパク質である、Dishevelled-associated activated morphogenesis (Daam)が関与するという報告がある。RT-PCR法により、成熟破骨細胞におけるFHドメインを持つタンパク質の発現を調べたところ、成熟破骨細胞においてDaam2、Fmnl2、Fmnl3が高発現していた。これらのタンパク質に対するshRNA発現用アデノウイルスを作成した。破骨細胞のアクチンリング形成及び骨吸収活性は、Daam2に対するshRNA(shDaam2)を発現させることで、顕著に抑制された。Fmnl2、Fmnl3に対するshRNAは、アクチンリング形成に影響しなかった。shDaam2を発現した破骨細胞では、Wnt5a誘導性のRhoの活性化が認められなかった。また、shDaam2を発現した破骨細胞に、caRhoを発現させるとアクチンリング形成及び骨吸収活性が回復した。Daam2は、Rhoの活性化を介して、アクチンリング形成に関与することが明らかになった。Wnt非古典経路を活性化するWnt5a-Ror2シグナルが破骨細胞のアクチンリング形成にどのような役割を果たすか解明するため、下流の標的分子を同定することを目的としている。昨年度までの研究で、低分子量Gタンパク質であるRho及びRacがWnt5a刺激により活性化されることを明らかにしていた。そこで、今年度は当初予定していた網羅的な解析ではなく、Rho及びRacに絞った解析を行うことにし,以下のことを明らかにした。1.Ror2を欠損した破骨細胞をWnt5aで刺激してもRho及びRacの活性化は生じなかった。2.Ror2を欠損した破骨細胞に恒常的活性型のRhoまたはRacをアデノウイルスを用いて過剰発現したところ、恒常的活性型のRhoを発現させた場合のみ、アクチンリングが形成され、骨吸収も起こった。以上の結果より、破骨細胞においてWnt5a-Ror2シグナルはRhoの活性化を介してアクチンリング形成を制御していると考えられる。次に、Wnt5a-Ror2シグナルの下流でRhoの活性化に関わる分子を探索した。これまでに、Formin homology (FH)ドメインをもつタンパク質であるdishevelled associated activator of morphogenesis (Daam)1という分子が、Wnt非古典経路におけるRhoの活性化において重要であることが知られている。そこで、破骨細胞におけるFHドメインを含むタンパク質の発現を網羅的に解析し、Daam2, FMNL2, FMNL3を同定した。現在、これらの分子がアクチンリング形成において果たす役割を解析中である当初の計画では、網羅的解析によってWnt5a-Ror2シグナルの標的分子を探索、同定する予定であったが、予備的な実験により有力な候補を見出すことができたため、その分子に着目して研究を進めた。それにより、Wnt5a-Ror2シグナルの下流でアクチンリング形成に関与する分子を一つ、候補となる分子を複数同定することができたため、目的はおおむね達成できたと考えている。1.FHドメインをもつ分子のうち、Wnt5a-Ror2シグナルの下流でRhoの活性化に関与する分子を同定する。アデノウイルスを用いて各タンパク質の遺伝子に対するshRNAを発現させ、Rhoの活性化が抑制されるか、アクチンリング形成が阻害されるか、を明らかにする。2.1.で同定した分子の過剰発現により、Ror2を欠損した破骨細胞でアクチンリング形成が生じるかを調べる。3.Wnt5a及びRor2の成熟破骨細胞における役割を解明するため、破骨細胞特異的遺伝子欠損マウスを作製し、骨量を調べる。3.Rhoの下流で、アクチンリング形成に関与するタンパク質の同定を試みる。

Rhoの下流で働く分子としてRhoキナーゼ(ROCK)が知られているが、ROCK阻害剤を用いた予備的な研究では、アクチンリング形成は抑制されなかった。そのため、その他の分子が重要である可能性を考えている。shRNA発現用のアデノウイルスを構築するために、shRNAの配列をデザインし、オリゴDNA合成を業者に委託する。アデノウイルスベクター作成用のキットを購入する。また、過剰発現用のベクターを構築するためのキットを購入する。これらのベクター作成の過程で必要になる、大腸菌培養に必要な器具及び試薬、遺伝子組み換えに必要な制限酵素を購入する。shRNAにより目的タンパク質の発現が低下しているか、また、過剰発現により目的としているタンパク質の発現が増加しているかを調べるためにウエスタンブロットを行う。必要な抗体及び検出試薬を購入する。破骨細胞特異的遺伝子欠損マウスを維持するためにケージ、床敷き及び滅菌済み餌を購入する。Rhoの下流で働くタンパク質の候補を調べるためにRT-PCR法を用いる。それに必要なRNA精製キット及びPCR用のプライマー、酵素及びプレートを購入する。
P型カルシウムチャネル病の臨床スペクトラムと遺伝子変異によるチャネルタンパク構造変化

今年度,我々はCa_v2.1cDNAを作製し,これにEA-2,FHMの原因として知られる点変異,SCA6で認められるCAGリピートの延長を導入した.これをtsA201細胞に発現させ,変異Ca_v2.1の電気生理学的特性を検討する.また変異Ca_v2.1を発現させたPC12細胞を神経成長因子(NGF)で刺激し,その形態的特徴をwild type Ca_v2.1と比較検討する.今年度,我々はCa_v2.1cDNAを作製し,これにEA-2,FHMの原因として知られる点変異,SCA6で認められるCAGリピートの延長を導入した.これをtsA201細胞に発現させ,変異Ca_v2.1の電気生理学的特性を検討する.また変異Ca_v2.1を発現させたPC12細胞を神経成長因子(NGF)で刺激し,その形態的特徴をwild type Ca_v2.1と比較検討する.
骨格筋のプリン代謝に着目した糖脂質代謝制御機構の解明とその応用

本研究では、これまで独自に開発したAMPDの骨格筋欠損マウスを利用して、AMPD1欠損マウスで、ヌクレオチドレベルの変化とAMP活性化キナーゼ(AMPK)を含め下流の標的因子のリン酸化状態の変化を明らかにし、アデニンヌクレオチド代謝と糖代謝脂質代謝の変化、とくにインスリン感受性との関係を明らかにし、また、AMPD欠損と腎糸球体機能との関連についても検討を進めた。骨格筋は脊椎動物で最大の臓器として、糖脂質代謝エネルギー代謝の制御機関の役割も果たす。近年、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)はエネルギーセンサーとして糖脂質代謝を制御することが注目されている。本研究は、これまで申請者らが遺伝子欠損モデル動物を樹立したAMP分解系酵素AMPDの骨格筋欠損マウスを利用し、アデニンヌクレオチド代謝の変化とAMPKの機能変化を介した糖脂質代謝調節二着目し、糖脂質代謝のあらたな制御ネットワーク解明と応用にむけた新知見を得ることを目的として研究を開始した。本年度は、申請者らが既に樹立したAMPD1欠損マウスとAMPD3欠損マウスを交配させ、速筋AMPD欠損マウスであるAMPD1欠損マウスとともに筋AMPD全欠損マウスを樹立し、速筋AMPD欠損マウスと筋AMPD全欠損マウスの比較を開始した。さらに、各種AMPD欠損マウスにつき、各種骨格筋のAMP活性化キナーゼ(AMPK)のタンパク量、リン酸化状態、活性についてAMPK抗体、リン酸化AMPK抗体などにより評価し、下流ターゲットタンパクのリン酸化状態、さらに遺伝子発現状態を比較検討を行った。さらに、各種AMPD欠損マウスにつき、全身のエネルギー代謝状態、とくに糖代謝脂質代謝の変化を検討し、評価系の確立をおこなった。今後、AMPD遺伝子群と糖脂質代謝制御調節の関係について詳細な解明が期待される。本研究は、これまで申請者らが遺伝子欠損モデル動物を樹立したAMP分解系酵素AMPDの骨格筋欠損マウスを利用し、アデニンヌクレオチド代謝の変化とAMPKの機能変化を介した糖脂質代謝調節に着目し、糖脂質代謝のあらたな制御ネットワーク解明と応用にむけた新知見を得ることを目的として研究を推進している。本年度は、申請者らが既に樹立したAMPD1欠損マウスとAMPD3/AMPD3複合欠損マウスを比較し、各種マウスの骨格筋のヌクレオチド、AMP活性化キナーゼ(AMPK)などの下流ターゲットタンパクのリン酸化状態、下流に位置する遺伝子発現状態の比較検討などを行った。さらに、これら各種AMPD欠損マウスにつき、筋機能の比較検討を行うとともに、糖代謝脂質代謝の変化、肥満誘導との関係を検討し、AMPD遺伝子群と糖脂質代謝制御調節の関係についての検討が進捗し、肥満誘導とインスリン感受性との関係が明らかになりつつある。また、AMPK以外に関係するシグナル伝達を探索する目的で、候補因子アプローチによる探索法、各種AMPD欠損マウス動物骨格筋のRNA発現アレイ解析による網羅的探索法を開始して、関係因子の検討を進めている。骨格筋は脊椎動物では運動機能のみならず糖脂質代謝エネルギー代謝の制御機能の役割も果たす。近年、エネルギーセンサーとしてAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)が糖脂質代謝を制御していることが注目され、これまで申請者らが遺伝子欠損モデル動物を樹立し、検討を進めてきたAMP分解系酵泰AMPDの骨格筋欠損マウスを利用して、アデニンヌクレオチド代謝の変化とAMPKの機能変化を介した糖脂質代謝調節の関係に着目し、糖脂質代謝の新たな制御ネットワーク解明と応用にむけて新知見を得るべく研究を推進している。本年度は、これまでに行ってきたAMPD1欠損マウスとAMPD3/AMPD3複合欠損マウスの比較を通して、ヌクレオチド代謝関連分子や、AMP活性化キナーゼ(AMPK)など下流の標的因子のリン酸化状態などの変化、さらに、下流の遺伝子の発現状態の比較検討などを行ってきた。さらに、アディポカインとAMPDとの関係も検討し、アデニンヌクレオチド代謝と糖代謝脂質代謝の変化、また、肥満誘導との関係の検討が進捗し、アデニンヌクレオチド代謝と肥満誘導とインスリン感受性との関係が明らかになりつつある。一方、遺伝子欠損マウス解析の過程で新規に明らかにしたAMPD欠損と腎糸球体機能との関連についても関連分子との関係が明らかになった。
病原性未確定大腸菌の病原性因子の解媒

臨床的感染性下痢性である乳幼児から分離されたE.coli株で、その病原因子が特定されていない大腸菌70株について、エンテロトキシン(易熱性、耐熱性)、組織侵入性、細胞付着性、志賀様毒素の検出・同定を試みたが、いずれの既知病原因子も検出されなかった。血清型については特定の型に偏ることもなかったが、型別不能の株が32株あった。培養細胞(HEpー2,HeLa)への付着性を、菌株の培養条件を変えて(菌の細胞付着性因子を誘導するような条件を工夫して)調べたが、2株においてのみ付着性が亢進したが、再現性に問題があった。これらの保存菌株は生化学的性状検査ではE.coliと確認されているが、遺伝学的にも確認する必要があり、リボソ-ムの塩基配列について調べた。PCR法により、種を越えて保存されている部分と種独特に保存されているリボソ-ムの塩基配列を指標にして、プライマ-を設定して同定する方法を開発して、近縁関係にある腸内細菌群のものと比較検討した。PCR法では制限酵素による切断パタ-ンを併用すれば、赤痢菌と大腸菌をも鑑別できることが判明し、これにより分離株を検定したところ全てがE.coliのパタ-ンを示した。グラム陽性菌である、ウェルシュ菌やセレウス菌の病原因子とも比較すべくそれぞれの菌種の病原因子について、毒素活性やその遺伝子のクロ-ニングを行っているが、ウェルシュ菌の溶血毒やその調節遺伝子と同じ遺伝子は持っていない。セレウス菌では、従来のエンテロトキシンとは異なる細胞毒性因子を発見しその同定をすすめているが、分離大腸菌にはこのような細胞毒は検出されなかった。乳幼児急性下痢症から分離されたE.coli株で、その病原因子が確定されていない大腸菌から新しい病原因子は発見出来なかったが、遺伝子解析とその発現調節機構の解析手技の開発により今後さらに検索することにより未確定因子の同定が可能になるあろう。