hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
μ-フローシステム用化学発光検出器の開発

スパイラル形は流路長50と100cmの2種類を作製した。市販化学発光検出器をチップ装着可能に改良し、光電子増倍管の前面にチップのガラス面を密着させて、マイクロフローシステム用化学発光検出器として使用した。化学発光反応はペルオキシダーゼ(EC1.11.1.7)を触媒とする過酸化水素-ルミノール化学発光反応とアミノフェナンスレンを発光体とする過酸化水素-過シュウ酸エステル化学発光反応を検討した。発光強度は、流速が増加すると拡散による試料ゾーンの広がりのため低下した。流路長1cmのチップで、試料量200nLの10^<-8>M過酸化水素を流速10μL/minで、分析速度300/hで測定できるμ-フローシステム用化学発光検出器の試作に成功した。スパイラル形のフローセルは、流路長50cmと100cmでは発光強度に大きな差がなかったが、流路長100cmでは圧損出が大きく、液漏れのトラブルが頻発した。遅い化学発光反応のモニターには流路長の長いフローセルが必要なので、このようなフローセルを組み込んだ検出器の開発には50kg/cm^2程度の耐圧性の接続システムが必要であった。これらの検出器を用いて、過酸化水素を生成する酸化酵素反応を組み合わせて、微量な酸化酵素の基質のフローインジェクション分析法による迅速定量を開発した。グルタミン酸およびヒスタミンの定量に応用した。下記の10工程でマイクロチップを作製した。1)シリコンウエハーへ貫通穴形成。2)熱酸化膜形成工程。3)表面レジストパターニング工程。4)酸化膜エッチング工程。5)Siエッチング工程。6)レジスト除去工程。7)熱酸化膜エッチング工程。8)チャネルへの電極用白金の電着工程。9)ガラス板の静電陽極接合工程。10)流入用、流出用コネクターの接着工程。マイクロチャネルは幅150μm、深さ20μm、長さ50cmのスパイラル形を作製した。また、これの簡易型として、各種内径の透明フューズドシリカキャピラリーをスパイラル状にしてフローセルとして利用する方法も検討した。キャピラリーの脆弱さのため、内径50μmで流路長25cmまでのフローセルを作成出来た。市販化学発光検出器をμ-フローセル装着可能に改良し、光電子増倍管の前面にチップのガラス面を密着させて、μ-フローシステム用化学発光検出器として使用した。発光強度は、流速が増加すると拡散による試料ゾーンの広がりのため低下したが、全発光量(ピーク面積)は増加した。マイクロチップフローセルでは、試料量200nLの5x10^<-9>M過酸化水素を流速10μL/minで、分析速度315/hで測定できるμ-フローシステム用化学発光検出器の試作量成功した。また、キャピラリーフローセルでは、流路長が短く、滞留時間が少ないため、試料量200nLの10^<-8>Mの過酸化水素を流速25μL/minで、分析速度350/hで測定できるμ-フローシステム用化学発光検出器の試作に成功した。キャピラリーフローセルの場合、液漏れトラブルの発生の恐れが無いので、高流速での測定が可能であり、より迅速分析に適用できる検出器である。
自然免疫系細胞による慢性炎症性腸疾患の制御機構の解析

これまでにSTAT3をマクロファージで特異的に欠失させたマウスを作製し、STAT3がマクロファージでのIL-10シグナルに必須であり、マクロファージの機能抑制、さらには生体レベルで慢性炎症の抑制に必須であることを明らかにした。そして、病原体構成成分を認識するToll-like receptor(TLR)ファミリーが、STAT3非存在下でマクロファージの異常活性化による慢性腸炎の発症のトリガーとなることを、TLR4/STAT3二重変異マウスの解析により明らかにした。さらに、IL-10刺激によりマクロファージで誘導されるBcl-3が、TLR刺激依存性のTNF-α産生を特異的に抑制していることを明らかにした。今年度は、大腸粘膜固有層に存在するマクロファージの機能を解析した。その結果、正常マウスの大腸粘膜固有層マクロファージは、TLR刺激依存性の炎症性サイトカインの産生が認められないが、慢性腸炎を発症するIL-10ノックアウトマウスやSTAT3変異マウス由来の細胞はTLR刺激依存性に炎症性サイトカインを産生した。そこで正常マウスとIL-10ノックアウトマウスの大腸粘膜固有層マクロファージ間でTLR応答性が異なる分子機構を解析するため、両者間で遺伝子発現の差をDNAマイクロアレイで解析した。その結果、Bcl-3と同じIκBファミリーに属するIκBNSがBcl-3とともに正常大腸粘膜固有層マクロファージに特異的に発現していることを見出した。IκBNSをマクロファージに発現させると、LPS刺激依存性のIL-6産生が特異的に減少していた。さらにIκBNSを発現した細胞では、NF-κBのDNA結合能に障害が認められた。さらに、IκBNSはIL-6プロモーターにp50NF-κBサブユニットと共に恒常的に会合していることがクロマチン免疫沈降法の解析から明らかになった。さらに、RNAiによるIκBNSのノックダウンマクロファージでは、LPS刺激依存性のIL-6産生が特異的に増加していた。以上の結果から、正常大腸粘膜固有層マクロファージに恒常的に発現しているIκBNSがマクロファージ系細胞において、IL-6産生の抑制に特異的に関与していることが明らかになった。
中世の浄土信仰とその建築造形―密教の影響をめぐって―

古代・中世の浄土信仰にもとづく建築のなかでも、本年度は中尊寺金色堂を中心に空間構成理念の調査・研究をおこなった。また、阿弥陀堂など浄土信仰の建築の本尊となる阿弥陀如来像をはじめとする仏像の調査をおこない、そこにこめられた密教的意味を明らかにした。主たる成果は以下のとおりである。1.中尊寺金色堂における密教の影響:金色堂の四天柱には密教の尊像が描かれ、これまでこられの尊像は浄土教の阿弥陀四十八願にもとづくとする説と、密教の胎蔵界曼荼羅にもとづくとする説の二説があったが、五十二身像という密教の阿弥陀曼荼羅にもとづくとする新たな説を提示した。また、従来、金色堂の須弥壇に安置された奥州藤原氏三代の遺体は、東北地方のミイラ信仰と結びつけてとらえられてきたが、棺におさめられた曳覆曼荼羅などの副葬品を調査・検討し、同時代の京都の貴族と同じ密教による葬送であったとする説を提示した。この成果は冨島義幸「中尊寺金色堂再考」(入間田宣夫編『兵たちの時代III兵たちの極楽浄土』高志書院)として発表した。2.仏像と密教修法:仏教建築の本尊として安置された仏像は、その建築空間の宗教的な意味を決定づける、きわめて重要な要素である。阿弥陀如来像や観音菩薩像など、いわゆる浄土教にもとづく造像とされてきた仏像でも、その胎内にその像の種子を書いた月輪が納入されるなど、密教の要素が認められることが指摘されてきたが、その具体的な意味については明確にされていなかった。本年度は、仏像胎内の月輪や内部に直接書き付けられた本尊種子について、現存作品・記録・聖教を総合的に調査・検討し、こうした月輪種子が密教修法にもとづくものであること、すなわちこうした月輪種子を胎内におさめる仏像が、密教修法の本尊となっていたことを明らかにした。本研究の成果は冨島義幸「修法と仏像-胎内の月輪種子を手がかりとして-」として発表した。古代・中世の浄土信仰にもとづく建築のなかでも、本年度はとくに平等院鳳凰堂・三千院本堂という阿弥陀堂を中心に、空間構成理念について調査・研究をおこなった。成果は以下のとおりである。1.阿弥陀如来像の大日光背:平安後期になると、鳳凰堂をはじめ阿弥陀堂の本尊である阿弥陀如来像の光背に、密教の大日如来像を付ける事例が多く認められる。こうした大日光背の阿弥陀如来像を現存する作品と文献史料に求め、その成立過程と意味について検討した。阿弥陀如来像の大日光背は、阿弥陀法本尊が五智宝冠阿弥陀から螺髪阿弥陀に移行していくなか、院と真言密教の接点である勝光明院阿弥陀堂で、五智宝冠に代わるものとして、平安初期の密教像を参照しつつ成立したことを論じ、それが両界曼荼羅を基盤とする顕密仏教の阿弥陀信仰を体現するものと結論づけた。2.三千院本堂の天井画諸尊の構成:三千院本堂の天井画を赤外線カメラによって撮影し、そこに描かれた諸尊を分析した。結果、阿弥陀二十五菩薩と金剛界曼荼羅の諸菩薩からなる、天井画諸尊の具体的な配置構成が明らかになった。とくに後者については、左右で金剛界曼荼羅を南北にわけており、現在、南面している本堂は創建当初、来迎の本尊阿弥陀三尊像が西方から向かってくる造形にふさわしく、東面していたことを論じた。3.阿弥陀曼荼羅として阿弥陀堂:上記の三千院本堂の調査結果に、平等院鳳凰堂の空間について分析を加え、これらの阿弥陀堂の空間が九品曼荼羅という、密教の阿弥陀曼荼羅にもとついて構成されていることを明らかにした。さらに、これらの阿弥陀堂と密教修法である阿弥陀法の関係を明らかにし、その建築空間全体が密教の阿弥陀法の本尊たる阿弥陀曼荼羅であることを示した。古代・中世の浄土信仰にもとづく建築のなかでも、本年度はとくに平等院鳳凰堂を中心に、空間構成理念について調査・研究をおこなった。おもな成果は以下のとおりである。1.大日光背の広がりの検討:昨年度の阿弥陀如来像の大日光背の検討にひきつづき、大日光背の阿弥陀如来像以外への広がりを検討した。結果、大日光背は、阿弥陀をはじめ釈迦・薬師・弥勒など顕教像にも数多く存在したことが明らかになり、その意味は大日如来を中心とした顕密融合の両界曼茶羅という、中世のコスモロジーを表明するものと考えた。そのうえで阿弥陀如来像の大日光背は、顕密からなる平安時代の阿弥陀信仰の実態を示すものと結論づけた。その成果は「大日光背の展開と中世仏教的世界観」として発表した。2.鳳凰堂仏後壁背面画の調査・検討:鳳凰堂の仏後壁背面には、通説では『観無量寿経』に説かれる九品往生のうちの下品下生と中品下生がならべて描かれているとされてきた。今回、壁画の残存部分を赤外線カメラで撮影し、そこに描かれた図様の詳細を確認した。結果、ここに中品下生の存在を示すような図様は確認できず、鳳凰堂全体の空間構成からも下品下生のみが描かれていると考えるのが妥当と結論付けた。本研究の成果は『鳳飛学叢』6号に掲載予定である。3.鳳凰堂の空間構成の総括:昨年度、鳳凰堂は密教の阿弥陀法のための阿弥陀曼茶羅として構成されていたことを明らかにした。

この成果と本年度の上記2の成果を、『観無量寿経』にもとづく観想のための空間という通説とあわせ、鳳凰堂が顕密の諸行によって極楽往生を祈るための空間と総括した。そして、浄土教芸術の代表作とされる鳳凰堂に密教の本質的な影響がある以上、従来の建築史学や美術史学が採用してきた、浄土教を中心とする平安時代の造形論を見直す必要があると指摘した。その成果は『平等院鳳凰堂-現世と浄土のあいだ-』として出版した。古代・中世の浄土信仰にもとづく建築のなかでも、本年度は中尊寺金色堂を中心に空間構成理念の調査・研究をおこなった。また、阿弥陀堂など浄土信仰の建築の本尊となる阿弥陀如来像をはじめとする仏像の調査をおこない、そこにこめられた密教的意味を明らかにした。主たる成果は以下のとおりである。1.中尊寺金色堂における密教の影響:金色堂の四天柱には密教の尊像が描かれ、これまでこられの尊像は浄土教の阿弥陀四十八願にもとづくとする説と、密教の胎蔵界曼荼羅にもとづくとする説の二説があったが、五十二身像という密教の阿弥陀曼荼羅にもとづくとする新たな説を提示した。また、従来、金色堂の須弥壇に安置された奥州藤原氏三代の遺体は、東北地方のミイラ信仰と結びつけてとらえられてきたが、棺におさめられた曳覆曼荼羅などの副葬品を調査・検討し、同時代の京都の貴族と同じ密教による葬送であったとする説を提示した。この成果は冨島義幸「中尊寺金色堂再考」(入間田宣夫編『兵たちの時代III兵たちの極楽浄土』高志書院)として発表した。2.仏像と密教修法:仏教建築の本尊として安置された仏像は、その建築空間の宗教的な意味を決定づける、きわめて重要な要素である。阿弥陀如来像や観音菩薩像など、いわゆる浄土教にもとづく造像とされてきた仏像でも、その胎内にその像の種子を書いた月輪が納入されるなど、密教の要素が認められることが指摘されてきたが、その具体的な意味については明確にされていなかった。本年度は、仏像胎内の月輪や内部に直接書き付けられた本尊種子について、現存作品・記録・聖教を総合的に調査・検討し、こうした月輪種子が密教修法にもとづくものであること、すなわちこうした月輪種子を胎内におさめる仏像が、密教修法の本尊となっていたことを明らかにした。本研究の成果は冨島義幸「修法と仏像-胎内の月輪種子を手がかりとして-」として発表した。
酵素を模倣したdual activation触媒の開発と不斉合成への応用

1.ホスフィノイル置換ビスオキサゾリン誘導体の合成とアリル化に対する触媒機能の検討L-及びD-セリンを出発物質とし、ジフェニルホスフィノイル化した後、2,2-ジシアノプロパンあるいは2,6-ジシアノピリジンとの縮合により高収率でホスフィノイル置換ビスオキサゾリン(PM-Box)を合成することに成功した。そこで、PM-Box-ヨウ化亜鉛錯体10mol%存在下、アリルトリクロロシランによる各種アルデヒドのアリル化を行ったところ、化学収率4874%,エナンチオーマー過剰率最高86%でホモアリルアルコールを得た。更に、リン原子団を有しない4-ベンツヒドリルメチルビスオキサゾリンを用い同様の反応を行ったところ、ホモアリルアルコールの収率は4%、13%eeであったことから、本反応はルイス酸-ルイス塩基のdual activation機構により進行していることが示唆された。そこで、このことを明らかにするために、PM-Box-ZnI_2錯体とアリルトリクロロシランの等モル混合物の31P-nmrを測定したところ、大きく低磁場シフトしていることが明らかになった。これらの結果はTetrahedron誌で印刷中である。2.ヘテロ原子置換ビスオキサゾリン誘導体の不斉シアノシリル化、シモンズ-スミス反応の検討本触媒の有効性を検討するために、イミン類のシアノシリル化反応(Strecker reaction)に応用したところ、PM-Box/Cu(OTf)2錯体3mol%存在下N-ベンズヒドリル-ベンジリデンアミンの反応で收率91%、90%eeという良好な結果を得た。さらに、本反応を反応性が低く、また高選択的反応例が少ないケトイミンに応用したところ、高收率且つ高エナンチオ選択的に反応が進行する事を見いだした.例えば、アセトフェノン-N-ジフェニルフォスフィノイルイミンの場合收率87%、96%eeという結果を得た。これらの結果は現在学会誌に投稿すべく論文を執筆中である。上記のように、科学研究費補助金交付申請書に記載した研究を順調に進める事ができた。1.ボスフィノイル置換ビスオキサゾリン誘導体の合成とアリル化に対する触媒機能の検討L-及びD-セリンを出発物質とし、ジフェニルホスフィノイル化した後、2,2-ジシアノプロパンあるいは2,6-ジシアノピリジンとの縮合により高収率でホスフィノイル置換ビスオキサゾリン(PM-Box)を合成することに成功した。

2.ヘテロ原子置換ビスオキサゾリン誘導体の不斉シアノシリル化、シモンズ-スミス反応の検討上記PM-Box-Cu(OTf)_2錯体3mol%存在下、トルエン中0°Cで各種アルドイミンのシアノシリル化反応を行ったところ、化学収率8091%、エナンチオーマー過剰率6494%でシアン化物を得ることに成功した。本反応に関しては、現在反応機構を詳細検討している。また、ケトイミンへの拡張についても検討中である。以上のように、科学研究費補助金交付申請書に記載した研究は順調に進行している。1.ホスフィノイル置換ビスオキサゾリン誘導体の合成とアリル化に対する触媒機能の検討L-及びD-セリンを出発物質とし、ジフェニルボスフイノイル化した後、2,2-ジシアノプロパンあるいは2,6-ジシアノピリジンとの縮合により高収率でボスフィノイル置換ビスオキサゾリン(PM-Box)を合成することに成功した。そこで、PM-Box-ヨウ化亜鉛錯体10mol%存在下、アリルトリクロロシランによる各種アルデヒドのアリル化を行ったところ、化学収率4874%,エナンチオーマー過剰率最高86%でホモアリルアルコールを得た。更に、リン原子団を有しない4-ベンツヒドリルメチルビスオキサゾリンを用い同様の反応を行ったところ、ホモアリルアルコールの収率は4%、13%eeであったことから、本反応はルイス酸-ルイス塩基のdual activation,機構により進行していることが示唆された。そこで、このことを明らかにするために、PM-BQX-ZnI_2錯体とアリルトリクロロシランの等モル混合物の31P-nmrを測定したところ、大きく低磁場シフトしていることが明らかになった。これらの結果は現在学会誌に投稿すべく論文を執筆中である。2.ヘテロ原子置換ビスオキサゾリン誘導体の不斉シアノシリル化、シモンズ-スミス反応の検討本触媒の有効性を検討するために、イミン類のシアノシリル化反応(Strecker reaction)に応用したところ、PM-Box/Cu(OTf)2錯体3mol%存在下N-ベンズヒドリル-ベンジリデンアミンの反応で牧率91%、90%eeという良好な結果を得た。さらに、本反応を反応性が低く、また高選択的反応例が少ないケトイミンに応用したところ、高收率且つ高エナンチオ選択的に反応が進行する事を見いだした.例えば、アセトフェノン-N-ジフェニルフォスフィノイルイミンの場合收率87%、96%eeという結果を得た。上のように、科学研究費補助金交付申請書に記載した研究を順調に進める事ができた。
変質作用と高シリカ沸石の生成機構

1.沸石は電子線照射による損傷が大きく、電子顕微鏡による研究を有効に活用できなかったが、真空に排気しながら加熱する前処理をすることによって、電子線損傷に抵抗性をもたせることができる。その結果、分析電顕によって沸石の微小結晶の化学組成について一定の信頼性のあるデ-タを出すことが可能になった。2.前期の前処理により、高分解能電顕による電子線回折・格子像観察が可能となり、天然の状態のままで積層不整を解析した。ダッキャルダイトではa^*ーb^*面に並行な平板状逆格子ディスクを形成している。モルデナイト群だけでなく、積層不整が沸石に広く認められる。3.輝沸石ー斜プチロル沸石系では、続成作用の進行と共にR^<2+>+2Al【double half arrows】2Si置換によりSiが減少して2価陽イオンが増加するが、酸素72の構造式で2価陽イオンは4個が最大で、それ以上は束沸石に変化する。一方、輝沸石ー斜プチロル沸石の系では2価および1価陽イオンの合計が4以下になることはない。Ca斜プチロル沸石とアルカリ斜プチロル沸石との間に組成のギャップがあるか否かは今後の課題として残され4.ワイラカイト一方沸石系では、中間組成のものが方沸石よりも変質作用の進行したことろに産出する。ワイラカイトは深度の増大すなわち温度の上昇と持続時間の長さとともにAl/Siオ-ダリングが増大する。5.合成実験によりCaAlとNaKSi置換及び生成温度で結晶の形態が相違することが明らかとなった。AlとGaの置換によっても形態変化が生じる。6.平衡水蒸気圧の温度変化の測定から、沸石中の水の状態をエントロピ-値として表現し、水の状態のキャラクタリゼ-ションをおこなった。この過程で水の吸着・脱着のエンタルピ-も求められる。7.TEA(テトラメチルアンモニウム)を用いることによって広い組成範囲で沸石の固溶体単一相を合成することが可能である。高シリカ沸石の代表的なものについて從来の研究を総括し,問題点を整理した.とくに,産状・生成条件と固溶体における組成変化についてまとめ,新しいデータを加えて検討した.以下,新しい成果について記述する.1.輝沸石一斜プチロル沸石系では,火山ガラスから斜プチロル沸石もしくはアルカリの多い輝沸石タイプ2が生成するが,変質作用の進行と共にカルシウムが増加するようになり,さらに4面体Siを置換するAlが多くなり,それに伴って2価陽イオンも増加して,輝沸石タイプ1を生じるようになる変化が追跡された.2.ワイラケ沸石ー方沸石では低温において方沸石タイプIが生じ,濁沸石より高温部ではワイラケ沸石ー方沸石系の中間組成鉱物が生じている.これはCaに富んだ方沸石タイプIIで,ワイラケ沸石ではないことが明らかとなった.この事実が普遍的であるか否かについては今後検討すべき課題である.合成実験からは天然における産出状況を説明するのに重要な根拠が与えられる.3.積層不整について,モルデン沸石のグループには広く積層不整がみられる.とくに,ダッキャルド沸石は積層不整がきわめて頻繁に含まれる.ダッキャルド沸石はa^*ーc^*面に平行な平板状の逆格子ディスクを形成していることが解明された.

積層不整が生じる原因については今後の課題として残された.4.変質鉱物としての沸石はきわめて微細な結晶として産出するので,分離して化学組成を調べるのが困難である.從って,電子線を照射して発生する2次X線を捕捉して調べる方法がとられる.ところが,沸石類は多量の水を含有すると同時に,きわめて空隙が大きく,そこにアルカリ・アルカリ土類金属が存在することから,電子線照射によってアルカリ元素が散逸しやすく問題が多い.この点に関して実験を重ねたが,まだ検討中であり,引き続いて検討課題とする.各種の高シリカ沸石について天然・合成両面から新しい成果が得られているが、個々の鉱物については略し、まとめて記述する。1.科学組成と格子定数・屈折率の関係:沸石の格子定数は一般にSi/Al比と負の相関を示す。輝沸石-斜プチロル沸石系では格子定数bとAl含量間の負の相関、フェリル沸石では格子定数aとMg含有量間の正の相関を示す。方沸石-ワイラケ沸石系では屈折率はSi/Al比よりむしろCa/Na比との正の相関の方が強い。複屈折は秩序度の増大と関係する。2.化学組成と結晶形態:合成実験によりCaAlとNaKSi置換および生成温度で形態が相違することが明らかとなった。また、AlのGa置換によっても形態の変化が生じる。3.積層不整:モルデン沸石のグループに積層不整が広く観察されることは昨年度報告したが、フェリル沸石の一部にも観察されることが新たに見出された。5員環を主要構成要素とする針状-柱状の沸石に積層不整が生じる原因については引き続き検討課題である。4.電子線照射による損傷防止:変質鉱物としての沸石は極めて微細な結晶として産出するので、鉱物学的性質を調べるには電子顕微鏡による研究が有力な手段となる。しかし、沸石は含水量が高く結合しているため電子線照射によって結晶構造が破壊される。そこで、電子線による損傷を少なくする方法を検討したところ、真空に排気しながら加熱する前処理をすることが有効であると結論された。分析電顕による分析についても、アルカリ元素の散逸に対して脱水の前処理が有効な手段となる。鉱物種によって損傷のうけ方が相違するので、前処理の最適条件については鉱物種ごとに明らかにする必要があり、基礎実験を継続中である。5.合成実験:TEA (テトラメチルアンモニウム)を用いることにより広い組成範囲で固容体単一相を合成することが可能である。今年度の研究成果の主なものは次の通りである。1.電子線照射による損傷防止:昨年、加熱しながら真空に排気する前処理をすることによって、損傷を少なくすることが可能であることを開発したが、さらに改良を加え、この方法を有効に利用することによって次に述べる積層不整の直接観察と微小結晶の化学分析が可能となった。2,積層不整:天然に産する状態のままで積層不整を直接観察することは困難であったが、高分解能電顕による電子線回折と格子像の観察によってダッキャルダイトの積層不整の解析を可能にした。その結果、a^*およびb^*面に平行な板状の逆格子ディスクを形成していると考えられる。3.化学組成:火山ガラスを交代する微小な沸石の分析電顕による分析に際して、アルカリ元素の散逸について検討し、ある程度の目途をつけることに成功した。フェリエライトについては信頼できるデ-タが得られた。しかし、斜プチロル沸石については、なお一層の検討を要する。4.輝沸石-斜
シングルセルレベルの腫瘍内不均一性をターゲットとする革新的な創薬研究

同一腫瘍内における異なったトランスクリプトームをもつサブクローンの混在(腫瘍内不均一性)が、癌根治を妨げる治療耐性化の主因と考える。本研究で我々は、膀胱癌の臨床像・治療軸に沿った腫瘍内不均一性の変化を、シングルセルRNAシークエンスを通じて1細胞レベルで解明し、難治性である膀胱癌多様性の克服する新しい分子基盤を構築する。得られる腫瘍内不均一性の全容は、ライトシート顕微鏡により立体的に可視化し、治療耐性を促すサブクローンが生息するニッチ構造を3次元で明らかにする。実験材料として同種移植に基づくマウス担癌モデル(正所性)を使用し、間質内細胞(免疫細胞等)の多様性や免疫応答に付随する癌微小環境も、1細胞レベルで解析を予定する。2018年度は、マウス膀胱癌組織からの細胞単一化プロトコールの作成・最適化に取り掛かり、シークエンス時にバルク組織からの癌細胞同定を可能にする内因性マーカー発現マウス膀胱癌細胞を作成した。次にライトシート顕微鏡によるトランスクリプトーム情報の再現を視野に入れ、腫瘍塊を1細胞レベルの解像度で1免疫染色、2In situ hybridization、3免疫染色及びIn situ hybridizationで可視化する新規癌イメージング法を確立した。腫瘍塊がスライドフリーで透明化・可視化できる本プロトコール作成は、シングルセルRNAシークエンスの結果を立体的な腫瘍組織で再現する重要な研究基盤と考える。また血中循環腫瘍細胞がシングルセルRNAシークエンスに利用できれば、既に細胞が単一化されている点で興味深い。2018年度は転移性泌尿器がん(尿路上皮癌・腎癌)から得られる血中循環腫瘍細胞をシングルセルRNAシークエンスへ利用を前向き研究として倫理委員会で承認を得た。円滑なシングルセルRNAシークエンスには、1固形組織(癌)からの細胞単一化、2得られた細胞集団からの標的細胞単離が重要である。細胞単一化は酵素処理(トリプシン・コラゲナーゼ)を伴うため、Cell viability維持がプロトコールに求められ、標的細胞の単離にはマーカーが必要となる。2018年度はまず、マウス膀胱癌組織からの細胞単一化プロトコールの作成・最適化に加えて、バルク組織からの癌細胞同定を可能にするGFP発現マウス膀胱癌細胞の作製を行った(マウス膀胱癌組織からの細胞単一化は現在もプロトコール最適化の最中である)。得られたトランスクリプトーム情報を腫瘍組織へ3次元投射するライトシート顕微鏡の使用に関しては、我々は世界に先駆けて「腫瘍塊を1細胞レベルの解像度で1免疫染色、2In situ hybridization、3免疫染色及びIn situ hybridizationで可視化する」新規癌イメージング確立に成功した。透明化された腫瘍では、そのまま組織深部まで1細胞毎に可視化されるため、シングルセルRNAシークエンスで得られる表現型の再現が可能と考える。またシングルセルRNAシークエンス研究で血中循環腫瘍細胞を利用することは、既に細胞が単一化されている点で、研究に優位性があると考える。2018年度は転移性泌尿器がん(尿路上皮癌・腎癌)から得られる血中循環腫瘍細胞をシングルセルRNAシークエンスへ利用する前向き研究として、倫理委員会で研究承認を得た(承認番号:20180099課題名:腎細胞癌患者を対象とした血中バイオマーカーの検討、承認番号:20180354課題名:尿路上皮癌患者を対象とした血中バイオマーカーの検討)。同種移植に基づくマウス担癌モデルは、癌細胞のみならず、間質内細胞(免疫細胞等)の多様性や付随する癌微小環境も1細胞レベルで可視化できる。そのため宿主由来の間質内細胞(免疫細胞等)の多様性や免疫応答も網羅され、実際のヒト膀胱癌と一致した実験系が構築される。この試みにおいて、2018年度はIn vivoへのシングルセルRNAシークエンス適用に備え、マウス膀胱癌組織からの細胞単一化プロトコールの作成に着手し、現在は最適化に従事している。Cell viabilityを維持した細胞単一化は本研究手法の鍵を握る。我々は既にGFP発現マウス膀胱癌細胞の作製は終了しており、バルク組織からの癌細胞同定を可能にするマーカーとしてシングルセルRNAシークエンスに使用する予定である。我々のもう一つの独自性であるライトシート顕微鏡は、2018年度の成果で、固形癌を1細胞レベルの解像度を維持した状態で、1免疫染色、2In situ hybridization、3免疫染色及びIn situ hybridizationが何れもスライドフリーで可視化できる透明化プロトコール作成に成功した。即ちシングルセルRNAシークエンスの結果が立体的な腫瘍組織で再現するための研究基盤が整ったと考える。次年度はまず、マウス膀胱癌組織から確実性・再現性を有する細胞単一化プロトコールを早急に確立し、In vivoシングルセルRNAシークエンスを実装に移したいと考える。得られる結果は順次ライトシート顕微鏡でタンパク・RNAレベルで可視化を予定する。また血中循環腫瘍細胞は既に単一細胞化されている点で、シングルセルRNAシークエンスの実装がより現実的である。そのため倫理委員会で既に承認を受けている転移性泌尿器がん(尿路上皮癌・腎癌)から得られる血中循環腫瘍細胞も前向き研究として、シングルセルRNAシークエンスへの利用を予定する。

得られる腫瘍内不均一性の全容は、ライトシート顕微鏡により立体的に可視化し、治療耐性を促すサブクローンが生息するニッチ構造を3次元で明らかにする。実験材料として同種移植に基づくマウス担癌モデル(正所性)を使用し、間質内細胞(免疫細胞等)の多様性や免疫応答に付随する癌微小環境も、1細胞レベルで解析を予定する。2018年度は、マウス膀胱癌組織からの細胞単一化プロトコールの作成・最適化に取り掛かり、シークエンス時にバルク組織からの癌細胞同定を可能にする内因性マーカー発現マウス膀胱癌細胞を作成した。次にライトシート顕微鏡によるトランスクリプトーム情報の再現を視野に入れ、腫瘍塊を1細胞レベルの解像度で1免疫染色、2In situ hybridization、3免疫染色及びIn situ hybridizationで可視化する新規癌イメージング法を確立した。腫瘍塊がスライドフリーで透明化・可視化できる本プロトコール作成は、シングルセルRNAシークエンスの結果を立体的な腫瘍組織で再現する重要な研究基盤と考える。また血中循環腫瘍細胞がシングルセルRNAシークエンスに利用できれば、既に細胞が単一化されている点で興味深い。2018年度は転移性泌尿器がん(尿路上皮癌・腎癌)から得られる血中循環腫瘍細胞をシングルセルRNAシークエンスへ利用を前向き研究として倫理委員会で承認を得た。円滑なシングルセルRNAシークエンスには、1固形組織(癌)からの細胞単一化、2得られた細胞集団からの標的細胞単離が重要である。細胞単一化は酵素処理(トリプシン・コラゲナーゼ)を伴うため、Cell viability維持がプロトコールに求められ、標的細胞の単離にはマーカーが必要となる。2018年度はまず、マウス膀胱癌組織からの細胞単一化プロトコールの作成・最適化に加えて、バルク組織からの癌細胞同定を可能にするGFP発現マウス膀胱癌細胞の作製を行った(マウス膀胱癌組織からの細胞単一化は現在もプロトコール最適化の最中である)。得られたトランスクリプトーム情報を腫瘍組織へ3次元投射するライトシート顕微鏡の使用に関しては、我々は世界に先駆けて「腫瘍塊を1細胞レベルの解像度で1免疫染色、2In situ hybridization、3免疫染色及びIn situ hybridizationで可視化する」新規癌イメージング確立に成功した。透明化された腫瘍では、そのまま組織深部まで1細胞毎に可視化されるため、シングルセルRNAシークエンスで得られる表現型の再現が可能と考える。またシングルセルRNAシークエンス研究で血中循環腫瘍細胞を利用することは、既に細胞が単一化されている点で、研究に優位性があると考える。2018年度は転移性泌尿器がん(尿路上皮癌・腎癌)から得られる血中循環腫瘍細胞をシングルセルRNAシークエンスへ利用する前向き研究として、倫理委員会で研究承認を得た(承認番号:20180099課題名:腎細胞癌患者を対象とした血中バイオマーカーの検討、承認番号:20180354課題名:尿路上皮癌患者を対象とした血中バイオマーカーの検討)。
式亭三馬を中心とした江戸戯作者の広告戦略と作品世界の相関的研究

本研究は、江戸戯作を社会的・文化的に位置づけるために、作品世界と、作品を取り巻く外的な要素との相関性について考察するものである。本年度は以下の成果を得た。1、京伝作の合巻と小枝繁の読本において『剪灯新話句解』が挿話として利用されていることを指摘し、繁読本では、先行する京伝合巻の挿絵をも併用していることを明らかにした。繁が京伝作品の典拠を読み解いていたことを示し、年間に多くの作品を執筆する必要のある彼らが、異なるジャンルであっても近い時期に刊行された作品によく目を配り、独自の工夫を施していることを指摘した。この成果は「小枝繁の先行作品利用」として『読本研究新集』に掲載予定である。2、京伝合巻における異国意匠の取材源が、同時代の戯作者・蘭学者である森島中良の貼込帖であることを指摘し、中良を含む知識人の間で異国に関する文物が共有され、そのネットワークに戯作者が含まれることを指摘した。この背景には、近世後期における考証学の隆盛が存する。この成果は「京伝作品における異国意匠の取材源ー京伝の交遊に注目してー」として『近世文藝』に掲載した。3、2の成果を踏まえ、戯作者が、どのような考証趣味のネットワークに属したのかについて、秋田藩お抱えの狩野派の絵師菅原洞斎が文化三年頃より主催した古書画展観会の成果の一部である『画師姓名冠字類鈔』に注目して考察した。本書は、洞斎が、様々な画師の落款・印章を集めたもので、展観会で披露された資料や知識等も書留められている。調査の結果、展観会の様相の一端を明らかにした上で、展観会の参加者ではないが、京伝が洞斎より借用した資料を用いて行った考証記事が収められていること、洞斎に考証の意見を求める京伝の書簡が存することを指摘し、両者が互いに考証の協力者であったと述べた。この成果は「京伝考証学の協力者ー菅原洞斎を中心にー」として日本近世文学会で口頭発表を行った。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、江戸戯作を社会的・文化的に位置づけることを目指し、作品世界と、作品を取り巻く外的な要素との相関性について考察するものである。本年度は、以下の成果を得た。1.山東京伝の黄表紙『唯心鬼打豆』(1792年刊)に、上田秋成の読本『雨月物語』(1776年刊)が利用されていることを指摘し、従来の説よりも7年早い時期に上方読本から江戸戯作への影響があることを明らかにした。この成果は「京伝黄表紙と「夢応の鯉魚」」として『上方文藝研究』12号に発表した。2.京伝合巻において、名所図会等が素材として頻繁に用いられることを指摘し、京伝が典拠について十分に理解した上で効果的に利用していることを明らかにした。この成果は日本文学協会第35回研究発表大会で口頭発表を行い、「京伝合巻と図会もの」が『日本文学』に掲載予定である。3.式亭三馬を中心に、江戸戯作者による広告活動について考察を行い、三馬の狂文が江戸以外の土地においても需要があり、依頼を受けて執筆した広告文においても、三馬の名前が全面に出されていることから、三馬の名前が一種の〈全国ブランド〉であったという結論を得た。この成果は「式亭三馬の広告文ー戯作者という〈ブランド〉ー」として、第6回大阪大学・チュラーロンコーン大学・日本文学国際研究交流集会で口頭発表を行った。4.京伝合巻における異国意匠の取材源が、同時代の戯作者・蘭学者森島中良の貼込帖であることを指摘し、戯作における異国趣味の背景について考察した。中良周辺には、長崎出役経験のある幕臣がおり、彼らがもたらした異国の物品や情報が同好の士の間で共有されている。この背景は近世後期の考証学の隆盛であり、戯作中の異国趣味は、当時の知識人達の異国に対する関心の高さの反映である。この成果は絵入本ワークショップVIII等で口頭発表を行い「京伝作品における異国意匠の取材源」として『近世文藝』に掲載予定である。本年度の研究は、インプットとアウトプットがバランスよく進み、複数の切り口で成果を挙げた点で、期待以上の進展があったと言える。研究課題の中心に据えた式亭三馬については、新資料を駆使して三馬という〈ブランド〉性を浮き彫りにした。しかし特筆すべきは、本研究が三馬にとどまらず、戯作研究の本山ともいえる山東京伝にも及び、成果を挙げたことである。研究実績の概要1は、京伝の黄表紙が『雨月物語』を踏まえていることを初めて明らかにし、2は京伝の合巻と〈図会もの〉の関係について、その利用方法にまで掘り下げた考察を行った。そして4では、京伝戯作に森島中良の貼り込み帖が利用されたことを実証するのみならず、京伝の人的交流にまで問題を広げることができた。そのことにより、文化文政期の戯作界と、同時期における考証学ネットワークとの関連性について具体的な様相を描くことができ、今後の、近世後期における人的交流についての研究への足掛かりとすることができた。

本研究は、江戸戯作を社会的・文化的に位置づけるために、作品世界と、作品を取り巻く外的な要素との相関性について考察するものである。本年度は以下の成果を得た。1、京伝作の合巻と小枝繁の読本において『剪灯新話句解』が挿話として利用されていることを指摘し、繁読本では、先行する京伝合巻の挿絵をも併用していることを明らかにした。繁が京伝作品の典拠を読み解いていたことを示し、年間に多くの作品を執筆する必要のある彼らが、異なるジャンルであっても近い時期に刊行された作品によく目を配り、独自の工夫を施していることを指摘した。この成果は「小枝繁の先行作品利用」として『読本研究新集』に掲載予定である。2、京伝合巻における異国意匠の取材源が、同時代の戯作者・蘭学者である森島中良の貼込帖であることを指摘し、中良を含む知識人の間で異国に関する文物が共有され、そのネットワークに戯作者が含まれることを指摘した。この背景には、近世後期における考証学の隆盛が存する。この成果は「京伝作品における異国意匠の取材源ー京伝の交遊に注目してー」として『近世文藝』に掲載した。3、2の成果を踏まえ、戯作者が、どのような考証趣味のネットワークに属したのかについて、秋田藩お抱えの狩野派の絵師菅原洞斎が文化三年頃より主催した古書画展観会の成果の一部である『画師姓名冠字類鈔』に注目して考察した。本書は、洞斎が、様々な画師の落款・印章を集めたもので、展観会で披露された資料や知識等も書留められている。調査の結果、展観会の様相の一端を明らかにした上で、展観会の参加者ではないが、京伝が洞斎より借用した資料を用いて行った考証記事が収められていること、洞斎に考証の意見を求める京伝の書簡が存することを指摘し、両者が互いに考証の協力者であったと述べた。この成果は「京伝考証学の協力者ー菅原洞斎を中心にー」として日本近世文学会で口頭発表を行った。平成27年度は、主に山東京伝の作品の特色について考察を深めたため、今後は、文化文政期の作品を網羅的に調査し、同時代の作品間の関係性について考察する必要がある。その際、本屋の企画による、人気先行作品の摂取のあり方に注目し、戯作の商業性をさらに浮彫にすることを目指す。また同時に、戯作者達の人的ネットワークについての考察を進める必要がある。その手がかりとなり得るのが、書簡や日記などの資料であるため、これらの調査を進め、当時の人的交流の様相を明らかにすることを目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
幼小接続期における確率概念の形成を意図したカリキュラムの開発

本研究は,幼児・児童の不確定な事象に関する生活経験の実態及び確率概念の実態を,横断的・縦断的に把握するとともに,幼児・児童の確率の認知過程の考察を踏まえて,幼小接続期における確率概念の形成を意図したカリキュラムを開発することを目的とするものである。研究2年次にあたる2018年度は、年齢の上昇に伴う幼児・児童の不確定な事象に関する生活経験及び確率概念の実態の変容について,縦断的考察を加えるとともに,幼児・児童の生活経験及び確率の認知過程に配慮した学習材及び学習指導過程を考案することを目的として研究を遂行している。年齢の上昇に伴う幼児・児童の不確定な事象に関する生活経験及び確率概念の実態の変容についての縦断的考察については、研究初年度(2017年度)に開発・実施した実態調査の被験者(2017年度の幼稚園・保育園の年長児で2018年度に小学校1年生になっている児童)を対象として,同一問題(不確定な要素を含む遊びの生活経験を問う問題、身近な素材を用いた事象の起こりやすさについての認識を問う問題、玉引き(分離量素材)のあたりやすさを判断する問題,スピナー(連続量素材)のあたりやすさを判断する問題)による調査(第2年次)を実施し,第1年次の横断的考察の結果との比較・検討を通して,幼小接続期の幼児・児童の実態の変容を考察した。また,学習材・学習指導過程のモデルの考案に際しては,幼児・児童の不確定な事象に関する生活経験(経験値)及び確率の認知過程(共通概念経路の検定結果)を考慮した学習材及び学習指導過程のモデルを考案した。当初の研究目的・研究計画(年次計画)に基づき,研究を推進することができている。今後は,研究の最終目的としての「幼小接続期における確率概念の形成を意図したカリキュラム案の作成・提案」に向けて,実態調査・縦断的考察を継続するとともに,開発した学習材・学習指導過程のモデルの有効性について,実践的検証を行う。本研究の目的は,幼児・児童の不確定な事象に関する生活経験の実態及び確率概念の実態を横断的・縦断的に把握するとともに,幼児・児童の確率の認知過程の考察を踏まえて,幼小接続期における確率概念の形成を意図したカリキュラムを開発することである。本研究目的を遂行するために,研究初年度である平成29年度は,先行研究・実践事例・諸外国におけるカリキュラムを考察を踏まえながら,幼児・児童の不確定事象に関する生活経験及び確率概念の実態を横断的に把握するための実態調査を,広島県下の幼稚園及び保育所の幼児(30名),小学校1年生の児童(34名)を対象として実施した。実態調査においては,児童の生活経験を踏まえた分離量素材(トランプ,サイコロ,コイン,玉)及び連続量素材(スピナー)を用いて,1:不確定な要素を含む遊び(トランプ,サイコロ,コイン,くじ)の生活経験及び具体的な問題場面における事象の起こりやすさの認識・判断を問う問題,2:玉ひき(分離量素材)の当たりやすさを判断する問題,3:スピナー(連続量素材)の当たりやすさを判断する問題を設定し,それぞれの問題場面における児童の確率判断の実態を捉えるとともに,Vinner, S,Hershkowitz, Rによる共通概念経路の検定の手法を確率に関する異質の問題間の認知経路の検定として適用し,問題間の認知経路を考察することを通して,先行研究において調査の対象とされていない幼小接続期における幼児・児童の不確定事象に関する生活経験及び確率概念の実態を把握した。今後は,研究の最終目的としての「幼小接続期における確率概念の形成を意図したカリキュラム案の作成・提案」に向けて,実態調査の継続,横断的・縦断的考察,学習材・学習指導過程のモデル開発及び実践的検討を行う。
前癌遺伝子リスク診断に向けた基礎的研究

肝臓癌は世界的に死因の上位を占め、現在の癌早期発見の概念よりもさらに早い前癌段階で診断できるマーカーの同定は急務である。ラットに肝臓癌を誘起させる物質を長期投与し飼育した。細胞死を誘導する蛋白質であるNADE(p75-NTR associated death executor)の発現上昇は、組織形態学的変化が見られる前に開始し、遅れて癌幹細胞マーカーの発現上昇が始まった。癌幹細胞マーカーの発現は死亡直前まで上昇し続けたのに対し、NADEの発現は減少した。NADEは前癌段階から顕著な発現を始め、発癌過程を通じて特徴的な発現パターンを示すことから、前癌マーカーとして有用性があることが示唆された。本研究の目的は、現在の癌早期発見の概念よりさらに早い前癌状態での診断を可能にすること、安全な薬剤を開発する上で早期に発癌性の有無を見極められるようにすることである。平成25年度は、前年度中に行った発癌性物質投与によるラットの肝発癌実験によって得られた組織等を用いて各種染色やmRNAの定量を行った。発癌との関連が疑われるNADE, DR6, Aβの3つの蛋白質の関わりや発現を明らかにするため、平成25年度の研究実施計画では、NADE, DR6共発現下Aβ蛋白質を添加して細胞増殖への影響やアポトーシス誘導の程度を検討し3者の機能的な相関をin vitroで検討すること、これらの蛋白質が発現することによってどのような運命決定がなされるかを検討する予定であった。1肝臓から抽出したmRNAにおける、NADE, DR6, AβmRNAの経時的発現変化について: NADE, DR6, Aβの3つのmRNAは肝障害、発癌の進行過程で顕著な発現上昇が見られた。これらのmRNAにコードされる蛋白質は、細胞がアポトーシスを起こす際に重要な役割を果たすとされているが、今回の結果では、3つの蛋白質が細胞をアポトーシス以外の運命へ決定している可能性が示唆され、全く新しい知見である。2NADEとDR6が定常共発現する細胞株にAβ蛋白質を作用させ、NADEとDR6の結合を蛍光免疫染色法等で示した。これは、DR6にAβが作用する際にNADEの介在が起きているという仮説を立証する手がかりとなる。この系は、平成26年度に予定しているAβ-NADE-DR6 complexが細胞の運命決定にどのような結果をもたらすのか、そのシグナル経路はどのようなものかを明らかにする系として利用でき、研究遂行の上で重要である。現在の癌早期発見の概念よりさらに早い前癌状態での診断を可能にすること、安全な薬剤を開発する上で早期に発癌性の有無を見極められるようにすることを目的として研究を開始した。これまでに発癌性物質を最長28日間投与されたラットの前癌状態の肝臓で発現が上昇している3つの遺伝子NADE, DR6, Aβを見いだした。発癌過程でのNADE, DR6, Aβの発現変化を追い、これらの発現と発癌との因果関係を明らかにするために、平成24年度は3項目の実験の実施を計画し、遂行した。1.発癌性物質であるジエチルニトロソアミンをラットに長期間投与し、経時的に肝臓組織や血液を採取する実験を開始した。肝臓組織はその後の実験の用途別にそれぞれにあった形状や状態で保存した。2.発癌性物質を28日間ラットに投与すると肝臓は前癌状態に到達することが分かっている。そこで28日間投与によって得られた組織を使い、immunohistochemistry (IHC)とin situ hybridisation (ISH)の実験条件を検討した。前癌状態のラット肝臓組織におけるNADEの発現を購入可能な抗体で免疫染色できた。続いてDR6の免疫染色を購入可能な抗体で行っているが現在までに十分な感度の抗体は得られておらず、ISH法による染色と平行して検討している。3. NADE, DR6のタンパク質の関わりを確認する為に、一過性強制発現させた培養細胞を用いて免疫沈降法にて簡便に確認する計画で、電気穿孔法で共発現を試みたが死細胞が多く難航した。このため、NADEを定常発現する細胞株を構築し、そこにDR6を一過性強制発現させることにした。これにより、NADE, DR6の両方が発現する細胞を多く作り出すことに成功した。これらの実験は、発癌過程におけるこれらのタンパク質の細胞内での役割を解明する上で重要である。本研究は、現在の癌早期の概念よりもさらに早い前癌状態での診断を可能にすること、安全な薬剤を開発する上で早期に発癌性の有無を見極められるようにすることを目的として行った。ラットに肝臓癌を誘起させる発癌性物質を長期投与し飼育した。

投与開始後早い時点からmRNAレベルでの発現が上昇するNADE、DR6について、前癌、発癌、死亡直前までの各段階で肝臓をサンプリングし、mRNAレベルでの発現を定量、さらにタンパク質レベルでの発現分布を検討した。NADEとDR6のmRNAの発現は同じ様に上昇したが、一方は発癌後に減少したのに対し他方は死亡直前まで上昇し続けた。また肝臓組織ではNADEとDR6の2つのタンパク質が共発現する細胞塊が散見された。NADEとDR6が定常共発現するHEK293培養細胞株を作製し、NADEとDR6の2つのタンパク質の間に相互作用関係があるのかを検討した。この検討には、DR6の内在性リガンドとして知られるAPPのN末端タンパク質N-APP存在下、NADEとDR6の間でDuoLink法を用いて行った。コントロールとしてPBSを添加した場合と、N-APPを添加した場合とで相互作用に顕著な差が見られ、NADE、DR6、N-APPの相互作用が見られた。これらの検討によりNADE、DR6、N-APPが発癌過程で相互作用し、発癌抑制・促進に影響を及ぼしている可能性が示唆された。NADEは発癌過程のかなり早い前癌段階から顕著な発現を始め、発癌過程を通じて特徴的な発現パターンを示すことから、薬物の発癌性を早期に検討する上で有用であり、前癌マーカーとしても有用性があることが示唆された。病態生理学現在の癌早期発見の概念よりさらに早い前癌状態での診断を可能にすること、安全な薬剤を開発する上で早期に発癌性の有無を見極められるようにすることを目的として研究を行っている。発癌性物質を投与したラットの前癌状態にある肝臓でNADE, DR6, Aβの3つの遺伝子の発現上昇が認められ、これらと発癌との関係を明らかにするため平成25年度は研究実施計画に基づき次の点について検討を行った。NADE, DR6を定常共発現させた細胞株を用い、Aβ蛋白質を作用させることでNADEとDR6の結合が見られており、Aβ-NADE-DR6 complexの仮説が立証されつつある。計画ではNADEやDR6の強制発現により、アポトーシスを起こす可能性が考えられたため、2種類の細胞株を用いることを計画していたが、現時点では顕著なアポトーシスが見られないため、現在使用しているNADE, DR6定常発現株のみで事足りている。また、診断への応用をふまえ、血液中のNADEのmRNAを定量する系の検討も進んでおり、研究はおおむね順調に進展していると言える。ラットに発癌性物質であるジエチルニトロソアミンを発癌まで長期投与を行っているが、経時的に採取しているサンプルからは徐々に病変を形成していることが確認できており、動物実験は順調にすすんでいる。これらのサンプルを使って行うアッセイの為の実験条件の検討は、NADEの発現の確認とその細胞種の同定は成功しているものの、DR6のIHCによる確認は十分な感度の抗体が入手できていない。そこでISH法での染色を進めている。NADEとDR6のタンパク質を培養細胞に電気穿孔法で一過性強制発現させる簡便な方法をもちいる予定であったが、これらを同時に強制発現させると多くの細胞が死んでしまう為、その後のアッセイに向かないことが分かった。そこで、翌年度以降に行う予定であったNADEを定常発現させた細胞に、DR6を一過性強制発現させるという方法を行うことにし、すでに成功している。以上のような状況により、おおむね順調に進展しているといえる。
水中マイクを使用した腸音図(新しい消化管運動機能検査法)の開発

OROS社製PC FFTアナライザOR24J-K450・Bruel&Kajae社製水中マイクロフォン8103、計測技研社製D/AコンバーターInterDAQを用いて腹壁より収集した腹腔内由来の雑音をPC上にサンプリングし周波数解析を行った。雑音の収集にあたっては、6時間以上の絶食の後、ガストログラム研究会の定めたホットケーキ試験食を用いて空腹時ならびに食後期の腸雑音の採取を行った。平成12年度に行った基礎実験の結果より、採取されたデータには、腸管運動由来の腸雑音の他に、呼吸由来、循環由来のデータが含まれている可能性もあり、本年度はデジタルフィルタにより分離した100-500Hzの音声成分と10Hz以下の低周波成分について、パワースペクトル・サロゲート解析・RSサロゲート解析・FTサロゲート解析を行った。これらの解析の結果、音声周波数帯域は主にノイズにより構成されており、低周波成分は0.1-1.0Hzにピークを持ち、相関係数によって特徴づけられる特性をもつ信号であると考えられ、またバースト部分は、ややランダムな特性を持っていることが考えられた。以上の結果からデータ量の軽減ということから、低周波成分について検討。最も良い再現性が得られた次数M=14で近似したAR解析を用いて、測定位置による差、空腹期・食後期によるP(f)の変化、個体差を検討した。その結果、被験者間で、そのパワースペクトルのピーク周波数(0.8-0.9Hz)にはほとんど差が無いことが判明した。このピーク成分は、心拍由来の成分(1Hz)とも近いため消化管由来の信号と断定することは難しいが消化管の状態によりその振幅や周波数が変化することから、消化管運動に関連した血流の変化に由来する可能性も考えられた。以上よりさらなる検討によりこの方法が新しい消化管運動機能検査法として応用可能であると考えられる。平成12年度予算にて購入した,OROS社製PCFFTアナライザOR24J-K450を用いて,Bruel&Kajae社製水中マイクロフォン8103にて腹壁より収集した腹腔内由来の雑音の解析を行った.併せてB&K製8103より計測技研社製D/AコンバーターInterDAQよりPC上にサンプリングした.音声の採取は,当初の予定通り,6時間の絶食の後,ガストログラム研究会の定めたホットケーキ試験食を用いて,健常成人の空腹時ならびに食後期の腸雑音の採取を試験食摂取後6時間まで行った.しかし,現在これらの長時間記録の解析に難渋しており,同時並行して,1サンプル2分間の短時間記録も行っている.これらの音声データを音声成分と低周波成分に分離し,これらについての時系列解析を行っている.短時間のサンプリングデータについては,空腹期・食直後・食後1時間について,フーリエ変換,窓を2秒毎にずらしたスペクトログラム,スペクトログラムの等高線プロットにて比較を行ったところ,50Hz付近の定常的なノイズが確認された.また音声周波数成分(250Hz付近)に値がでていることがわかった.この音声周波数がでるとき,周波数全体の強度が増強していることが判明.等高線プロットをみるとある程度の周波数シフトが見られる.しかし,この方法では周波数分解能が低いため周波数の構造は明確にならない.そのため,低周波の詳しい時間周波数変動を見るために,雑音に強く,クロス項,自己artifactを減少させる事で知られている柏木渡辺野口(KWN)分布を用いて時間周波数解析を行っている.OROS社製PC FFTアナライザOR24J-K450・Bruel&Kajae社製水中マイクロフォン8103、計測技研社製D/AコンバーターInterDAQを用いて腹壁より収集した腹腔内由来の雑音をPC上にサンプリングし周波数解析を行った。