hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光に応答しない膜機能分子の赤外分光測定

スペクトル測定系を最適化し、イオンチャネル、イオンポンプ、回転モーター、レセプターなど種々の膜機能分子に対する新しい構造機能相関の情報を得ることを計画した。これまでに全反射赤外分光測定系の最適化を行った結果、世界最高精度のスペクトルを得ることができた。これを用いて、我々が発見したナトリウムをポンプするロドプシンへのナトリウム結合を明らかにした(Nature Commun. 2013)。さらに、光駆動クロライドポンプであるハロロドプシンを用いて、タンパク質に結合した水分子1個を捉えることにも成功したが(BIOPHYSICS 2013)、この成果は世界最高峰の計測を実現した証明の1つである。またこれまでの解析はすべてイオンの結合による差スペクトル測定であり、リガンドなどそれ自身が振動を有する系の実験は困難であった。しかしながら測定系を最適化する中で、内部振動を有する系の測定も十分、可能であると判断し、ペプチド輸送体へのペプチドの結合に伴う構造変化の計測を試みたところ、その測定にも成功している(PNAS 2013)。これらの成果はそれぞれの分野において高く評価されている。振動分光法は一般に構造生物学のための解析ツールとして認識されていないが、機能発現のための構造変化をモニターする解析ツールとして高い可能性をもつことを、我々は光受容蛋白質の研究で明らかにしてきた。本研究では、この手法を光に応答しない膜機能分子に拡張し、原子レベルでの構造変化を解明するための解析ツールとして確立する。具体的には、エバネッセント波を利用して溶液中での計測が可能な全反射赤外分光法(Attenuated Total Reflection FTIR spectroscopy)を利用した差スペクトル測定系を最適化し、イオンチャネル、イオンポンプ、回転モーター、レセプターなど種々の膜機能分子に対する新しい構造機能相関の情報を得る。本年度は以下の成果を得ることができた。これまでに最適化した全反射赤外分光測定系を用いて、最初に結晶構造が解かれ2003年のノーベル賞につながった有名なイオンチャネルであるKcsAの測定を行った。このチャネルがカリウムを選択的に透過する機構や酸性でチャネルが開く機構を解析し、論文発表することができた。また分野の常識を覆す光駆動のナトリウムポンプを今年になって発見した。なぜ常識外であったかというと、光吸収を担う発色団が正電荷をもっているため、ナトリウムの結合や輸送は不可能であると考えられてきたからである。実際にこの新規ポンプはナトリウムの結合によっても色が変わらないため、全反射赤外分光法を用いて結合をとらえることができた。ナトリウムポンプの存在を証明したことは様々な発展性をもっており、今後が楽しみである。本研究では、この手法を光に応答しない膜機能分子に拡張し、原子レベルでの構造変化を解明するための解析ツールとして確立することを目指している。
励起芳香族分子の動的挙動と磁場効果・溶媒効果

二官能基性鎖状分子の光酸化還元反応について、外部磁場効果を研究した。用いた化合物は、O_2Nー1ーC_<10>H_8ー4ー0(CH_2)_<12>ーNHC_6H_5である。定常光照射を行うと、かご内過程においては、ニトロ基はニトロソ基に還元され、窒素原子と隣接するメチレン基は酸化されてアルデヒド基となる。このように、かご内過程は分子内光酸化還元反応である。一方、散逸過程は2分子反応であって、かご内過程と形式上同様の酸化還元が原料分子2個の間で起きる。今回、反応溶媒としてエタノ-ルを用い、原料の消失量に対する磁場効果を見出した。これまで、アセトニトリル・ベンゼンにおいて同様の実験を行っているが、有意の実験結果は得られていなかった。今回研究に用いた系では最低励起3重項から反応が起こり、超微細相互作用が重要な役割を果たしているので、生成した3重項ビラジカルが1重項ビラジカルになる項間交差速度が低下し、3重項ビラジカルの定常濃度が磁場の印加により上昇する。散逸生成物収量の低い反応初期では、原料分子が3重項ビラジカルの捕捉剤として働く。原料分子がラジカル捕捉剤として働き続けるならば、原料消失は、磁場存在下で大きくなるはずであるが、エタノ-ル中では消失量が低下している。これを説明するためには1次生成物の関与する2分子過程を考慮すればよい。ある程度以上反応が進行すると、ニトロソ体散逸生成物(ONー1ーC_<10>H_8ー4ー0ー(CH_2)_<12>ーNHーC_6H_5)がラジカル捕捉剤となる。ニトロソ体散逸生成物は原料分子に比べて、ラジカル捕捉能が著しく高いので、低濃度であっても有効な捕捉剤となりうる。このため、磁場存在下では、原料消費が抑制されることになる。今回の実験の特色は、原料消失量に対する新しい磁場効果を見出した点にある。複数の分子種が相互に関係しあっている生体系においては、複雑な磁場効果が現れる可能性が高いので、このような磁場効果を解析・検討しておくことは充分意義のあることと考えられる。
骨の健康寿命の延伸につながるフードケミカルエピジェネティクス研究

本研究では、運動器障害の主な要因となる骨粗鬆症に注目し、新規の予防手段の開発に取り組む。これまで骨粗鬆症に対する様々な候補治療薬が生み出されている一方で、申請者らも新薬の開発において先導的な役割を果たしてきた。このため、昨今では、骨粗鬆症治療薬の充足感は高まりつつある。一方、近年では、骨粗鬆症を未病の段階で食い止める予防法にも注目が集まっているが、効果的な方法が確立しているとは言い難い。そこで、本研究では、申請者が有効性を見出しつつあるエピゲノム創薬と食品科学を融合した学際的なアプローチを駆使することで、骨粗鬆症に対する新しい予防薬を開発することを目的とする。本年度は、破骨細胞のエピジェネティック制御にかかわる新規遺伝子Ochdの解析を行った。Ochdによる骨代謝制御の是非を明らかにするために、Ochd2ならびにOchd3遺伝子座にloxp配列をもつfloxマウスと破骨細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウスの系統を交配し、破骨細胞特異的な遺伝子欠損マウス(Ochd2KOおよびOchd3KO)を作出した。しかしながら、Ochd2、Ochd3と野生型コントロールの骨表現型に差は観察されなかった。そこで、次に、Ochd2とOchd3の機能代償性を検討するために、二重欠損マウスの作出を行ったところ、Ochd2KO;Ochd3HetおよびOchd2Het;Ochd3KOマウスでは有意な骨量増加ならびに破骨細胞数の減少が観察された。この結果から、Ochd2とOchd3は協調的に破骨細胞制御を担う重要な働きをもつことが示唆され、Ochdは破骨細胞の異常によって生じる骨粗鬆症の創薬標的になることが考えられる。そこで、続いて、Ochd2とOchd3の酵素活性を阻害する食品化合物を同定するために、Ochd2に対する食品化合物のin silicoドッキングシミュレーションを行った。本年度は、破骨細胞制御を担うOchdの機能解析が進展し骨粗鬆症の創薬標的となる候補遺伝子の同定に成功を収めることができ、おおむね順調に進展している。今後は、in silicoドッキングシミュレーションによって明らかとなるOchd2に対して結合能をもつ候補化合物を用いて、in vitroならびにin celluroのスクリーニング法によって候補化合物の絞り込みを行う。そして、最終的に同定された化合物に関しては、骨粗鬆症の病態モデルを用いた実験を行い、予防効果の是非を明らかにすることを計画している。in silicoドッキングシミュレーションによって同定された候補化合物を用いたin vitroならびにin celluroのスクリーニングが次年度に変更になったため、これに伴う費用の繰越が発生した。
気管支喘息の気道炎症に対するSialyl Lewis^xアナログによる治療の試み

炎症の部位では、血管内皮細胞表面にはICAM-1,VCAM-1,E-およびP-selectinの発現が見られ、一方炎症細胞表面にはこれらの分子に対応して、Mac-1,VLA-4,sialyl Lewis^xが発現して、それぞれの分子が結合し合うことより、血管内から組織中への移行に関与している。我々は本研究において,E-およびP-selectinとsialyl Lewis^xとの結合をsialyl Lewis^xアナログで阻害し、炎症反応を抑制できるか否かを検討するため、真菌抗原感作マウスモデルに対してsialyl Lewis^xアナログの影響をBALF中細胞分画及び組織学的に解析した。真菌抗原Micropolyspora faeniを感作したマウスに抗原を暴露した後の肺組織では肺胞組織に著明なリンパ球を中心とした単核球浸潤がみられた。一方、経鼻的もしくは腹腔内にsialyl Lewis^xアナログを投与した群における肺組織では陽性コントロールに対して有意に炎症細胞浸潤を抑制された。肺組織の炎症と肉芽腫形成のスコア化による解析を行うと陽性コントロールの肺組織に対して経鼻的もしくは腹腔内にsialyl Lewis^xアナログを投与した群における肺組織では有意にスコアの低下が見られ、肺傷害スコアにおいてもsialyl Lewis^xアナログ投与群で有意の低下が見られた。BALF中細胞数に関して陽性コントロールとしての抗原暴露群では非抗原暴露群に比べて著明な細胞数の増加が見られた。一方、経鼻的もしくは腹腔内にsialyl Lewis^xアナログを投与した抗原暴露群においては陽性コントロールに比べ、有意の細胞数の低下がみられた。更に、抗原暴露マウス肺組織中の血管内皮細胞におけるP-及びE-セレクチンの発現が免疫染色にて明らかにされた。以上の結果は、炎症細胞浸潤の血管内から肺組織への移行において、E-およびP-selectinとsialyl Lewis^xとの結合は重要であり、sialyl Lewis^xアナログはこれら分子間の結合を阻害し、炎症反応を抑制しうることを示した。1)卵白アルブミン感作マウスの作成これまで報告されている方法に従い水酸化アルムと卵白アルブミンを混合して投与し、感作を行った。具体的にはBALB/Cマウスに一週間毎に2回抗原を腹注して感作を行い、2週間後卵白アルブミン溶液を吸入させてI型アレルギーを惹起して、その後48時間目まで経時的に末梢血、気管支肺胞洗浄液、肺組織を採取する。気管支肺胞洗浄液中の好酸球の変化を解析して、sialyl Lewisx糖鎖アナログの投与方法について検討した。2)抗原暴露後のマウス呼吸機能の解析これまでマウスのような小動物の呼吸機能のin vivoでの測定は難しかったが、本研究においてはBUXCO社製の小動物用Double Chamber Plethysmographsを用いることにより無麻酔下で呼吸インピーダンスの測定可能となり、抗原暴露後から24時間目まで経時的に観察できた。これまで抗原暴露後の即時型反応及び遅発型反応が観察され、薬剤効果の判定が十分可能と考えられた。本研究では喘息気道の好酸球浸潤におけるセレクチン分子のin vivoの役割を明らかにし、sialyl Lewis-x糖鎖アナログ吸入による喘息治療への可能性を検討する。1)アレルゲン暴露後の感作マウス呼吸機能の解析BUXCO社製の小動物用Double Chamber Plethysmographsにより無麻酔下で呼吸インピーダンスを測定して、アレルゲン暴露後から48時間目まで経時的に観察する。8週齢の雌BALB/Cマウスに卵白アルブミン(OVA)2回腹

注投与による感作後、2週間目にOVA吸入暴露し、呼吸インピーダンス(RI)を測定した。OVA吸入後、15分後にRIは有意に低下し、1時間後に正常のbaselineに戻り、4-6時間後に再びRIの低下即ち遅発型反応の発現が観察された。このOVA誘発マウス喘息モデルに対し、sialyl Lewlsx糖鎖アナログ投与し、その効果を解析した。sialyl Lewisx糖鎖アナログ投与群において対照群と比べ遅発型反応が減弱する傾向が認められたが有意な結果は得られなかった。2)アレルゲン暴露後の肺組織の解析a.抗原暴露前、1抗原暴露後6,24,48時間の時点での末梢血液中の白血球分画及び気管支肺胞洗浄液中細胞分画の測定し、sialyl Lewisx糖鎖アナログの効果を調べた。結果sialyl Lewisx糖鎖アナログ投与群において対照群と比べ、全ての時点で有意に好酸球の低下が見られた。b.接着分子発現の解析:即時型反応後P及びEセレクチン,ICAM-1,VCAM-1等接着分子群について、特異抗体を用いた免疫染色を施行し、抗原暴露6時間目のマウス気道組織においてP及びEセレクチンの強い発現が認められた。以上の結果より、OVA誘発マウス喘息モデルにおいてsialyl Lewisx糖鎖アナログは気道への好酸球浸潤を抑制し、気道反応を減弱させる可能性が示唆された。
海洋無脊椎動物由来天然医薬品資源の生合成遺伝子解析と利用

Spongistatinは、アリゾナ州立大学G. R. Pettitらがモルジブ近海の海綿Spongia sp.より見出した細胞毒性物質である。約400 kgもの海綿から10 mgの化合物の精製に成功し、1993年にその構造を報告している。興味深いことに全く同じ化合物が同年、別の研究グループから報告された。大阪大学薬学部の北川らは沖縄産海綿Hyrtios altum 11.2 kgから0.5 mgのaltohyrtin(= spongistatin)を精製し、構造決定した。また東京大学農学部の伏谷らは伊豆諸島産海綿Cinachyra sp. 6.6 kgよりcinachyrolide A (= altohyrtin = spongistatin) 1.1 mgを単離、構造決定した。これらは同時に報告されたために、3つの異なる名前が同じ化合物に対して付けられている。またそれぞれの海綿は系統的に異なる海綿であり、その生産者は異なる海綿動物に共生する共通の微生物である可能性を示唆している。しかしいずれの海綿においても含有量が低く、稀少な化合物であり、生産菌は共生微生物叢の主要種ではない可能性が高い。Spongistatinの細胞毒性活性は極めて強力であり、各種がん細胞に対して数十pMのIC50値を示す。微小管重合阻害作用を示すことから、抗がん剤として有望視されているが、複雑な構造を有するため、化学合成による供給は容易ではない。本研究では生産菌を同定することで、spongistatinの量産化へ向けた基礎的知見を得る。今年度は生合成遺伝子クラスターの取得に必須である遺伝子ライブラリーを作製した。さらに海綿メタゲノムを鋳型に用いたPCR分析によって、trans-AT KSの配列断片を複数得た。今後は特異的プライマーを設計し、スポンジスタチン生合成遺伝子クラスターの取得を目指す。我々は伊豆半島産、海綿D. calyxからcalyculin生合成遺伝子クラスターの取得に成功しているが、spongistatinの海綿中の含有量は極めて僅かである点が、これまでの我々の先行研究例とは大きく異なる点である。従って、spongistatin生合成遺伝子の探索はより困難なことが予想された。Spongistatinの構造にはβ-branch構造やピラン環が含まれることから、calyculin Aと同様にtrans-AT PKSによって生合成されることが予想できる。まず海綿に含まれる細胞を分画することを目的に、海綿破砕液を段階的に遠心分離に供し、得られたH. altumの微生物細胞画分を用いて、spongistatinの生産菌叢の絞り込みを行った。各画分をテンプレートにPCRスクリーニングを行った結果、β-branchの生合成に関わるKSドメイン特異的プライマーを用いた場合にのみ遺伝子断片の増幅が見られた。そのため、ライブラリーのスクリーニングにはβ-branchをターゲットとしたプライマーを用いることにした。また、20,000 x gの分離画分のみにて増幅断片が得られたことから、spongistatin生合成遺伝子は20,000 x gにて得られる比較的小さい微生物に由来すると考えられる。また、得られたDNA断片をシーケンス解析に供した結果、増幅断片には、難培養性バクテリアの産生するpsymberinの20,000 x gの分離画分より抽出したDNAを鋳型としたPCRにより、spongistatin 1に特徴的なβ-branch構造の生合成に関わる遺伝子の増幅が見られた。本画分は過去に海綿由来天然物の生産菌として報告されているEntotheonella sp.が含まれる200 x g画分とは異なるため、新たな有用化合物生産菌の発見につながることが期待される。昨年度遂行したメタゲノムライブラリーのPCRスクリーニングの結果、spongistatin生合成遺伝子を含んだコスミドDNAを得られた可能性が高いと考えられる。今後は、得られたコスミドクローンが含む挿入配列のサブクローニングと、周辺領域をコードするクローンの探索によってspongistatin生合成遺伝子クラスター全体の取得が可能になると考えられる。実際に取得したヒットクローンにはpsymberin生合成に関与するPsyA(GenBank accession number ADA82581.1)のKSドメインに相同性(identity 82%)を示すタンパク質がコードされていた。引き続きH. altumメタゲノムライブラリーの3D-gel法によりスクリーニングを行う。3D-gel法は、室温で半固体状態を維持できるアガロースを含んだLB培地(3D-ゲルLB培地)を用いることで、大量の候補の中から目的の遺伝子をもつクローンを効率的に選別できる方法である。50,000 cfus (colony forming units)のH. altumメタゲノムライブラリーを1,000 cfuとなるよう希釈・分割し、これらをテンプレートにPCRを行い、目的の遺伝子断片の増幅が見られる画分を選別する。それぞれの画分に対し、さらにPCRスクリーニングを行い、コロニーPCRの結果から増幅が見られた単一コロニーからフォスミドDNAを抽出し、現在挿入配列のシークエンス解析を行う。

また東京大学農学部の伏谷らは伊豆諸島産海綿Cinachyra sp. 6.6 kgよりcinachyrolide A (= altohyrtin = spongistatin) 1.1 mgを単離、構造決定した。これらは同時に報告されたために、3つの異なる名前が同じ化合物に対して付けられている。またそれぞれの海綿は系統的に異なる海綿であり、その生産者は異なる海綿動物に共生する共通の微生物である可能性を示唆している。しかしいずれの海綿においても含有量が低く、稀少な化合物であり、生産菌は共生微生物叢の主要種ではない可能性が高い。Spongistatinの細胞毒性活性は極めて強力であり、各種がん細胞に対して数十pMのIC50値を示す。微小管重合阻害作用を示すことから、抗がん剤として有望視されているが、複雑な構造を有するため、化学合成による供給は容易ではない。本研究では生産菌を同定することで、spongistatinの量産化へ向けた基礎的知見を得る。今年度は生合成遺伝子クラスターの取得に必須である遺伝子ライブラリーを作製した。さらに海綿メタゲノムを鋳型に用いたPCR分析によって、trans-AT KSの配列断片を複数得た。今後は特異的プライマーを設計し、スポンジスタチン生合成遺伝子クラスターの取得を目指す。我々は伊豆半島産、海綿D. calyxからcalyculin生合成遺伝子クラスターの取得に成功しているが、spongistatinの海綿中の含有量は極めて僅かである点が、これまでの我々の先行研究例とは大きく異なる点である。従って、spongistatin生合成遺伝子の探索はより困難なことが予想された。Spongistatinの構造にはβ-branch構造やピラン環が含まれることから、calyculin Aと同様にtrans-AT PKSによって生合成されることが予想できる。まず海綿に含まれる細胞を分画することを目的に、海綿破砕液を段階的に遠心分離に供し、得られたH. altumの微生物細胞画分を用いて、spongistatinの生産菌叢の絞り込みを行った。各画分をテンプレートにPCRスクリーニングを行った結果、β-branchの生合成に関わるKSドメイン特異的プライマーを用いた場合にのみ遺伝子断片の増幅が見られた。そのため、ライブラリーのスクリーニングにはβ-branchをターゲットとしたプライマーを用いることにした。また、20,000 x gの分離画分のみにて増幅断片が得られたことから、spongistatin生合成遺伝子は20,000 x gにて得られる比較的小さい微生物に由来すると考えられる。
速度選別した励起原子による固体表面の研究

固体としての分子が、接近してくる励起原子に対して及ぼす相互作用についての知見を得ることを目的としてペニングイオン化電子スペクトル(PIES)を用いた実験を行った。本研究では試料として固体を扱うため、気体用速度分解ペニングイオン化電子分光装置のサンプル導入部を改造し、固体表面に対する測定を可能とした。その後、ペリレン、クリセン、コロネン、トリフェニレン、アントラセン等の多環芳香族炭化水素やC_<60>、トリフェニルホスフィンを金属またはグラファイト基板上に蒸着したものを試料とし、速度選別した準安定励起原子を一定の入射角で衝突させ放出される電子のエネルギーを分光した。放出電子強度の励起原子入射速度に対する依存性を調べることにより、固体表面を構成する分子が励起原子に及ぼす相互作用に関する情報を得ることができる。典型的な測定結果はクリセンについての測定で得られ、分子が固体表面で結晶軸を揃えて配向しているため、結晶表面となるクリセンのab面から外部への張り出しの大きい分子軌道に対応するPIESバンド強度の増大が見られた。また励起原子He^*(2^3S)との衝突部位を反映し、クリセン分子の水素原子近傍では斥力的相互作用が、π電子が広がって分布する領域では引力的相互作用が観測され、気体について知られていた相互作用が固体結晶を構成する分子の表面にも結晶構造を反映しながら現れることが明らかとなり、以上の結果は分子構造総合討論会(1995)で報告した。またその他のサンプルについても、それぞれ分子の電子構造を反映した興味深い結果が得られており論文投稿を予定している。今後の研究の展開としては、サンプル分子が金属原子を含む系についての研究を進め、固体表面を含めた金属原子と励起原子との間の相互作用について現在未知となっている事柄の解明を行っていきたい。
分極改善に基づく高性能な微生物-酵素ハイブリッド型燃料電池の開発

グリセリン微生物電池の電池構成要素を変更し,出力電力の向上を目指した.アノード電極として使用しているカーボンペーパー上に塗布しているカーボンスラリーの組成を変更したところ,VULCAN XC72を炭素微粒子とし,PTFE量を従来の半分に減らした場合に,最大電力密度が約3倍に増大した.微生物燃料電池のプロトン交換膜には一般にPTFE骨格と末端にスルホン酸基を持つパーフルオロエーテルペンダント側鎖からなる長鎖型アイオノマーであるナフィオンが用いられるが,側鎖を短くした短鎖型アイオノマーであるアクイヴィオン膜の微生物電池への特性を評価した.試験した条件下では最大電力密度の向上は約1.2倍となり,低温動作時の固体高分子形燃料電池における結果と同様の傾向を示した.カソード反応を酵素触媒系を用いた還元反応とすることを検討し,フェリシアン化カリウム溶液,白金触媒カソードと比較した.白金触媒カソードはカーボンペーパーに白金微粒子とナフィオンを含む触媒スラリーをナフィオン膜と圧着したものを使用し空気槽として反応を行ったところ,フェリシアン化カリウム溶液と同等の最大電力密度を示した.固体高分子形燃料電池では一般に白金カソード極での反応が律速となるとされているが,本研究で使用しているグリセリン微生物電池では,アノード反応が律速段階となっているか,カソード電極面積がアノードと比較して小さすぎる可能性が示唆された.酵素触媒系では,電極をカーボンフェルトとし,ラッカーゼとメディエータABTSを使用した.酵素触媒系においてもフェリシアン化カリウム溶液と同等以上の電力を得ることができ,アノード反応に微生物,カソード反応に酵素を利用するハイブリッド型バイオ燃料電池が十分に機能しうることが明らかになった.酵母ーグルコース系微生物燃料電池において,微生物・電極間の電子の受け渡しを行うメディエータ,アノード槽とカソード槽を仕切るプロトン交換膜,電極形状といったMFCの構成要素をそれぞれ変更し,電流-電位測定,長時間使用した際の出力測定を行った.メディエータには2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンより2-メチル-1,4-ナフトキノンのほうが適していた.プロトン交換膜としてはNafion膜,一価陽イオン選択透過性膜,陽イオン交換膜の中では,Nafion膜のみが安定した出力が得られた.また電極へのカーボンフェルト接着は内部抵抗の増大のため有効ではなかった.長時間運転では,メディエータとして最大出力値が高かった2-メチル-1,4-ナフトキノンが途中から急激に出力が低下し,2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンのほうが比較的安定して長時間出力が得られた.グリセリン系微生物燃料電池において,土壌および水圏より採取したグリセリンを単一炭素源として微好気的な環境で生育可能な微生物を用いて,電流-電圧測定により比較することで出力がより大きな菌株を選抜した.5種類の分離株を試験したところ、3種類について出力が得られ、その中でも2種類の菌株が高い出力が見られた。最も高い出力を示した分離株についてメディエータの種類が出力に及ぼす影響について検討したところ、酵母ーグルコース系とは逆に2-メチル-1,4-ナフトキノンより2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンのほうが適していた。使用している炭素電極との反応性をサイクリックボルタンメトリー測定で調べたところ2-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノンより2-メチル-1,4-ナフトキノンのほうが反応性が高いことから、微生物燃料電池ではメディエータは電極よりも微生物との反応性が重要であることが示唆された。「分極に影響を与える電池構成要素の解析」については概ね予定していた内容を検討することができたが,「超微小繊維構造を有する導電性分子導入によるアノード電極性能の向上」では使用したカーボンナノチューブ(CNT)の分散性が想定したよりかなり悪く,カーボンペーパー上への担持が困難であった.種々の分散溶媒を検討するとともにCNTも性状の違うものを試験することを検討している.平成28年度までに使用したグリセリンを単一炭素源として微好気的な環境で生育可能な微生物に加えて、凍結保存時の安定性等を新たに考慮しグリセリン微生物燃料電池に適した微生物の分離を試みた。微生物分離の際に真菌用抗生物質を入れず酵母・糸状菌も対象として新たに10種類の菌株を分離した。2-メチル-1、4-ナフトキノンをメディエータとして微生物燃料電池の出力特性を検討したが、保有株を超えるものは見いだせなかった。次世代シーケンサーによる菌叢分析を行ったところ、Enterobacteriaceae科とEnterococcaceae科の微生物が共通して優性種であり、新規に分離したものではBurkholderiaceae科の微生物が多く含まれていた。アノード極に使用するカーボンペーパーとそれに塗布するカーボンスラリーの構成を変更することによる出力特性の変化を検討した。カーボンペーパーの嵩密度と気孔率は出力に影響しないが、厚さが薄いほど内部抵抗が小さくなり最大電流密度が上がることが分かった。また、カーボンスラリーの組成は、スラリーの厚さによる抵抗に関しては炭素微粒子が少ない方が、表面積に関しては炭素微粒子が多い方が最大電流密度及び最大電力密度が上がると考えられた。酵素のカソード極への担持方法としてゼラチンとグルタルアルデヒドを用いた。酸化還元酵素であるGODとPODを用いてグラッシーカーボン電極上に酵素を担持した。また酵素と同時にメディエータ分子も担持できるか検討した。サイクリックボルタンメトリー測定によりいずれの場合においてもバイオセンサーとして使用するには十分なシグナルが得られた。

「電子移動効率に秀でた微生物の分離」については安定性(維持や保存の容易性)を考慮した新規のグリセリン資化微生物を分離できたが出力の向上は達成できていない。「炭素微粒子修飾アノード電極におけるMFC発電効率向上」については微生物の生理状態、メディエータの種類や濃度などの反応溶液組成の関係が明らかになってきた。引き続き検討を行う。「酵素のカソード極への適用」については炭素電極上への酵素担持法についての検討を行い酵素の電気化学反応が得られている。一方、耐熱性の酸化還元酵素の取得は遅れており、カソード極への担持に必要な酵素量を確保する発現・精製条件が定まっていない。精製酵素を使用せずwhole cell catalysisとして用いることが可能であるかの検討を考えている。グリセリン微生物電池の電池構成要素を変更し,出力電力の向上を目指した.アノード電極として使用しているカーボンペーパー上に塗布しているカーボンスラリーの組成を変更したところ,VULCAN XC72を炭素微粒子とし,PTFE量を従来の半分に減らした場合に,最大電力密度が約3倍に増大した.微生物燃料電池のプロトン交換膜には一般にPTFE骨格と末端にスルホン酸基を持つパーフルオロエーテルペンダント側鎖からなる長鎖型アイオノマーであるナフィオンが用いられるが,側鎖を短くした短鎖型アイオノマーであるアクイヴィオン膜の微生物電池への特性を評価した.試験した条件下では最大電力密度の向上は約1.2倍となり,低温動作時の固体高分子形燃料電池における結果と同様の傾向を示した.カソード反応を酵素触媒系を用いた還元反応とすることを検討し,フェリシアン化カリウム溶液,白金触媒カソードと比較した.白金触媒カソードはカーボンペーパーに白金微粒子とナフィオンを含む触媒スラリーをナフィオン膜と圧着したものを使用し空気槽として反応を行ったところ,フェリシアン化カリウム溶液と同等の最大電力密度を示した.固体高分子形燃料電池では一般に白金カソード極での反応が律速となるとされているが,本研究で使用しているグリセリン微生物電池では,アノード反応が律速段階となっているか,カソード電極面積がアノードと比較して小さすぎる可能性が示唆された.酵素触媒系では,電極をカーボンフェルトとし,ラッカーゼとメディエータABTSを使用した.酵素触媒系においてもフェリシアン化カリウム溶液と同等以上の電力を得ることができ,アノード反応に微生物,カソード反応に酵素を利用するハイブリッド型バイオ燃料電池が十分に機能しうることが明らかになった.電子移動効率に秀でた微生物の分離MFCに適した微生物に求められる特性として,電子を細胞外に放出しやすいことが挙げられる.ここでは土壌や水圏から採取した各種試料の混合系を対象として,アノード極とカソード極を結ぶ外部回路とは別に,アノード極の電位を操作するための回路を設けて,ポテンショスタットにより電位を印加する電気培養の手法を用いて,MFCに適した微生物の分離を試みる.MFCの燃料源としてグリセリンおよび糖を用い,印加する電位に応じて生育してくる微生物群を,MFCでの出力特性と微生物の安定性(維持や保存の容易性)も考慮して選別する.・CNT修飾のアノード電極におけるMFC発電効率向上
抗体のクラススイッチに先行して誘導されるGermline転写産物の機能解析

Germline転写産物のクローニングについては、SμSαともに終了した。しかし、T7/T3RNApolymeraseを用いたIn vitro転写は転写されたRNA分子がDNAと会合した状態で存在するため、転写産物の特性の解析には使用できなかった。そこで、1)RNAのセルフスプライシング活性を評価する目的にてE.Coli内でこのgermline ranscriptを発現させ、そのプロダクトをNorthern blotにて解析した結果、センスストランド転写産物特異的に5'/3'エクソンプローブともに検出できるspliced product様のバンドを同定した。現在このプロダクトの構造解析を行っているところである。2)また、Hela細胞の核抽出液を用いたIn vitro転写を行うためのconstructの構築中である。クラススイッチを特異的に抑えるある種の阻害剤を見い出した。この阻害剤の基質をある種のDNA polymeraseと想定して解析を行っている。DNA polymerase:cell cycleの解析からDNA polymeraseαは除外した。Polα/δ/εの阻害剤、aphidicolinは細胞毒性が高くクラススイッチを特異的に抑える確証は得られなかった。DNA polymraseβに関しては、小山らの作成したpolβk.O.マウスを入手し、現在irradiated RAG2-/-マウス(Dr.F.Altら。VDJ組み換え酵素の欠失のためリンパ球ができない)にfetal liver transferを開始している。今後、Germline転写産物のクラススイッチへの関与については、過剰発現と発現抑制によって行う。1)過剰発現:脾臓B細胞へのレトロウィルスによる遺伝子導入の系をたちあげた。現在、SμとSαのgermline transcriptのレトロウィルスを調整中。2)発現抑制:germline転写産物をターゲットとしたハンマーヘッド型のリボザイムを構築中。Ku80破壊マウスについては、human IgM transgenicマウス、human light chain transgenicマウス(この二つの抗体遺伝子によりB細胞ができる。)と交配し、それぞれのヘテロの個体を得ている。
無血清培養系を用いた、鳥類胚細胞の中胚葉化・神経化に関与する成長因子の探索

鳥類胚の中胚葉誘導・神経誘導をin vitroで検証するための培養系の作出を手がけた。鳥類胚の胚性多分化能細胞層であるEpiblastの無血清培養条件の単純化について、主な成果が得られたので、それについて述べる。本研究の申請書に記した、筆者が'93に得たEpiblastの完全無血清培地は、Mito+というハイブリドーマの無血清培養用の培地添加剤のX1倍液を、RPMI1640高栄養培地に0.2%の割合で加えている。このMito+には、Insulin,Transferrin,亜セレン酸の他に8種類の成分が入っている。その中には、EGFや成体中にあるホルモンも含まれている。誘導の研究に用いる培地には、成長因子や成体の組織液中に含まれる分子が含まれない方が望ましいと考えられる。そこで上記の無血清培養に最も必要とされる3要素のみで、どの程度Epiblastの培養が可能であるかを調べた。Insulin,Transferrin,亜セレン酸をそれぞれ10μg,10μg,5ng/lの割合でRPMI1640培地に添加しtypeI collagenを塗布した基質上で培養した。前原条期のEpiblastの組織片は4日程度の活発な増殖を示し、最大1週間の生存をみた。初期中胚葉組織片は、3要素のみの添加ではMito+入りの培養液程は生育せず、2日後から急速に死滅した。鳥類初期胚のEpiblastからの各組織の誘導現象を調べるにあたって、「神経誘導の系には、3要素のみを添加した培地(に近いもの)でin vitroの実験系の構築が可能であるが、Epiblastからの予定細胞の中胚葉化には、現段階では、中胚葉化した細胞の生存の為にMito+添加の培養液で引き続き実験する必要がある」と思われた。胚体形成域の周囲を取り囲む周縁帯(marginal zone)と呼ばれるド-ナツ状の領域がある。初期原条期の周縁帯の頭方向の部分は、原条頭端部のHensen's node(鳥類胚のオルガナイザーに相当する)の移植により神経管が誘導され、脳胞に発現する分子がそこにも発現するとの報告がある。つまり周縁帯の頭部領域は、中枢神経系の形態形成の能力を十分に有しているらしい。片や申請書に記したように、岡本らは、カエルの動物極側組織由来の細胞が、数pM程度の微量のbFGFに反応して神経化することを報告している。そこで、頭方向の周縁帯組織の小片を切り出し、type I collagenの塗布面またはゲル上で培養しながら、培養液中に1-80ng/mlのbFGFを加えて神経組織化が起きるか否かを調べた。Hensen's nodeと共培養したpositive controlにおいては、数百-千μmもの長大なneurite様突起が5-7日目に形成されたが、bFGF添加のみの実験群では突起形成は生じなかった。今後、更に詳しく実験条件を検討していきたい。片や申請書に記したように、岡本らは、カエルの動物極側組織

由来の細胞が、数pM程度の微量のbFGFに反応して神経化することを報告している。そこで、頭方向の周縁帯組織の小片を切り出し、type I collagenの塗布面またはゲル上で培養しながら、培養液中に1-80ng/mlのbFGFを加えて神経組織化が起きるか否かを調べた。Hensen's nodeと共培養したpositive controlにおいては、数百-千μmもの長大なneurite様突起が5-7日目に形成されたが、bFGF添加のみの実験群では突起形成は生じなかった。今後、更に詳しく実験条件を検討していきたい。
民事司法制度改革における裁判外粉争処理方法(ADR)と提訴権制限に関する比較法的検討

本年度の重点は、ADRの利用を実効的にするための強制的装置として、提訴権及び上訴権の制限についてドイツ法との比較検討をすること、ドイツ民訴法の改正論議を追って、わが国の法改正や制度改革への示唆を得ることにあった。現時点で以下のような成果が得られた。1.わが国ではADRの国家法制度への組み入れは、ADR基本法という構想に結実している。そこでは個々の手続的規整が提案されているが、より重要なのは従来からの手続法上の基本原則がどこまでADRで実現可能か(すべきか)という問題である。この点について、手続法ドグマを直接の対象とする近時の研究(Eidenmueller, Stuerner, Hager)を手がかりにして研究することができた。2.ADRの実効性を担保し、またその利用を強制できる鍵の一つが、ADRによる消滅時効の中断の可能性である。この問題は、従来ADR基本法の枠内で言及されることが多かった。しかし、わが国の法体系において時効法は実体法(民法)に属する問題である。この点で、ドイツにおいて民法(債務法)の大改正の中で、ADRによる消滅時効の中断を認める明文規定が新設されたことが注目され、新しい時効法体系にも関連させて研究することができた。3.ADR活性化の目的の一つは国家司法の負担軽減である。その際の理想はADRによって紛争が終局的に解決されることである。そのためには紛争解決内容の正当性が問題になるが、ADRの場合には、(手続利用または手続結果についての)当事者の合意が正当化根拠である。しかし、当事者の合意に瑕疵が含まれる場合には後から、またはADRの利用を重くしないために初めから、ADRの結果に対する不服申立を認める必要もでてくる。この点で、不服申立制度の大改正を実現したドイツの新民事訴訟法・仲裁法をめぐる議論から示唆を得ることができた。本研究の目的は、民事司法改革の眼目の一つされる裁判外紛争処理方法(ADR)の活性化・拡充の方向において、国家の司法制度の存在意義やADRとの連係はどのように行われるべきかを検討することにある。本年度は、英米法圏に比べて従来ADRが低調だといわれてきたドイツ法においてもADRの積極的活用へと方針転換が行われた理由を探ることを課題としてきた。研究計画段階において、ドイツでADRが注目されるようになった理由として、第一に国家司法の負担軽減、第二に紛争解決概念の質的変化、第三に弁護士の新しい職域探求があるのではないかという推測をもって本研究に着手した。現時点で得られた成果は次の通りである。まず、司法の負担軽減に関しては、現在進行中の民事手続法の全体に渡る大改正の文脈でADRの問題を検討すべきことが明らかになった。特に、一般的なADR前置主義の導入と控訴権制限を内容とする改正草案をめぐって激しい論争があり、注目しているところである。第二、第三の理由として考えられた新しい紛争解決方法の探求及び弁護士の職域拡大については、米国のADRブームに影響を受けた新しい世代の法律家の存在が大きいことが確認された。米国流のADR会社も2000年に設立され、法曹界のみならず経済界を巻き込んでめざましい活動を行うようになった。膨張する弁護士人口との関係では、専門弁護士制度、弁護士責任論、弁護士広告の範囲、弁護士費用融資会社、さらには法曹教育(私立ロー・スクールの新設)をめぐって大きな変動が見られ、ADRと法律(法化社会)の関係を論じる際に不可避の課題になっている。他方で、市民・非法律家にとってはADRを紛争解決の選択肢と考えることはまだなじみがないようである。そのために、法律家・団体からの啓蒙活動の盛んなことが目に付いている。
心臓手術患者における塩酸ランジオロールの薬物動態研究

血管外科患者から得られたパラメータを用いた予測血中濃度と実測値の大きな解離を認めなかった。心臓手術患者における薬物動態パラメータは、健常人と比較して低値であったが、大きな違いは無かった。ハイリスク患者におけるランジオロールの感受性の高さは、薬物動態、薬力学の何れも関与しているが、後者に寄与するところが多いと考えられた。塩酸ランジオロールは周術期管理に有用な短時間作用性β遮断薬であり、ハイリスク患者における低用量投与の有効性の報告が漸増している。しかし、現在はハイリスク患者における薬物動態パラメータが不明であるため、血中濃度が増加しているのか、感受性が増加しているのか明らかになっていない。そこで今回は、健常人の薬物動態パラメータ(PKP)を用いて標的濃度調節持続静注(TCI)システムを利用して、実際の心臓外科患者への投与を行い、ハイリスク患者のPKPの算出を行うことを目的としている。健常人のPKを用いたTCIシステムのプログラム作成、動作確認は順調に進んでおり、安定して患者への投与が可能となっている。プレリミナリー試験によって、実際の投与を行った患者では、計画通り投与を行うことが可能で有り、血圧変動・徐脈などの合併症を来すことなく、投与が可能となっている。また、実際の採血を行い、薬物の血中濃度の実測を行い、比較的想定内の血漿濃度であることが確認できている。また、実測値が低下しないように、酵素活性を阻害した採血法を行っており、検体処理後凍結保存を行うことも可能となっている。現在までに得られた実測値を用いて、PKPを仮に算出してみると健常人のPKPと大きな解離は見られず、独立したPKP算出という最終結果のみならず、健常人との差違の少なさも結果から導き出される可能性が現在までの状況では、示されている。対象は、心臓外科患者であり、症例数が豊富で、研究対象と成る患者は定期的に手術室で手術を受けている状況である。ランジオロールTCI(target-controlled infusion)システムは、順調に稼動し、安全に患者に投与できる状況である。また、倫理委員会の承認も取得し、研究遂行に障害となるものは存在しない状況である。また、血中濃度の実測に関しては、安定した計測を行うことが可能である。実際の患者への予備投与では、血行動態は安定して推移し、安全な研究の施行が可能であることも確認されている。健常人のPKを用いたTCIシステムのプログラム作成、動作確認は完了し、安定して患者への投与が可能となった。また、実測値が低下しないように、酵素活性を阻害した採血法を行っており、検体処理後凍結保存を行えている。象は、心臓外科患者であり、症例数が豊富で、研究対象と成る患者は定期的に手術室で手術を受けている状況である。ランジオロールTCI(target-controlled infusion)システムは、順調に稼動し、安全に患者に投与し、血中濃度を測定する検体保存を行い、後日まとめて、実測が可能としている。倫理委員会の承認も取得し、研究遂行に障害となるものは存在しない状況であり、組み入れも順調である。健常人のPKを用いたTCIシステムを利用して、実際の患者への投与を行った。計画通りの投与を行うことが可能で有り、血圧変動・徐脈などの合併症を来すことなく、安全に実施が可能であった。また、実際の採血を行い、予定通りのタイミングで薬物の血中濃度の実測の血液採取が可能であり、比較的想定内の血漿濃度であることが確認できている。今回得られたデータから算出されたPKPは、分布容積・代謝速度が異なっていることが示唆され、効果の違いの一因としてPKPが一部関与していることが示唆されている。

血管外科患者から得られたパラメータを用いた予測血中濃度と実測値の大きな解離を認めなかった。心臓手術患者における薬物動態パラメータは、健常人と比較して低値であったが、大きな違いは無かった。ハイリスク患者におけるランジオロールの感受性の高さは、薬物動態、薬力学の何れも関与しているが、後者に寄与するところが多いと考えられた。実際のエントリーを開始し、投与・採血を行う。血液サンプルは、凍結保存を行い、検体数に応じて、実測を開始する。実際の測定値の整合性を判断し、実際の薬物動態(PK)パラメータ算出に向けて、研究を進めていく。基本的なPKパラメータ算出を行った後、PKパラメータに影響を及ぼす因子の解析などを行い、より精度の高いPKパラメータ算出の段階に進むことが可能と考えられている。患者への投与が終了した段階で、最終解析に進むことが可能となるため、それと平行して、薬物動態解析を行いつつ、過去のデータと比較しながら新たなるPKパラメータを算出するのみならず、過去のデータと含めたPKパラメータの算出も試み、多岐にわたる比較を行い研究の精度を上げていくことで、よりよい研究を遂行できるよう計画している。残りのエントリーを終了し、採血・保存した血液サンプルの実測を行う。その値から、基本的なPKパラメータ算出を行った後、PKパラメータに影響を及ぼす因子の解析などを行い、より精度の高いPKパラメータ算出を進める。全ての実測値を利用して、最終解析を行うが、それと平行して、薬物動態解析を行いつつ、過去のデータと比較しながら新たなるPKパラメータを算出するのみならず、過去のデータと含めたPKパラメータの算出も試み、多岐にわたる比較を行い研究の精度を上げていくことで、よりよい研究を遂行できるよう計画している。心臓麻酔、経食道心エコー検査、静脈麻酔今年度中に、投与システムの確立、プレリミナリー投与、実測の解析を行うための物品購入を行行うための物品購入を行った。ただ、実際の患者の組込み・実際の解析、知見獲得のための学会・講習会参加を行っていないため、消耗品購入、旅費使用が次年度に移動したため、差額としての費用増加となっている。今年度中に、投与システムの確立、プレリミナリー投与、実測の解析を行うための物品購入を行うための物品購入を行った。実際の患者の組込みが完了していないため、消耗品購入、旅費使用が次年度に一部繰り越したため、差額としての費用増加となっている。実際にランジオロール測定に必要な試験管や試薬などの消耗品の購入は、必要な経費と考えられる。それに加え、実際のPKパラメータの算出という作業があるため、知見獲得のための、学会・講習会参加、解析に必要なソフト購入などを計画している。また、研究成果発表のための旅費や投稿に必要な英文校正などの費用に研究費を使用する計画を検討している。それに加え、実際のPKパラメータの算出という作業があるため、知見獲得のための、学会・講習会参加、解析に必要なソフト購入、研究成果発表のための旅費や投稿に必要な英文校正などの費用に研究費を使用する計画を検討している。
血小板活性化因子合成酵素の活性化機構の解析

今年度の研究計画に沿った研究の結果、以下の結果を得た。1.血小板活性化因子(PAF)合成酵素の活性化機構の解析マウスマクロファージ系細胞株、RAW264.7を用いて、血小板活性化因子合成酵素(アセチル-CoA:リゾ血小板活性化因子アセチル転移酵素)の活性調整機構を検討した。この細胞株では、PAFそのもの、および、LPS(エンドトキシン)で、この酵素が活性化されたが、PAFによる活性化は、投与後1-2分をピークとして、5分後には、基底状態まで戻るのに対して、LPSによる活性化は15分程度をピークとし、その後も持続するようなパターンを示した。また、カルシウムイオノフォア(A23187)もほぼPAFと同様の時間経過で、この酵素活性を活性化すること、および細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、BAPTAにより、PAFによる活性化が阻害されたことより、PAFは細胞内カルシウム濃度の上昇により、この酵素を活性化していると考えられた。現在この結果は投稿準備中である。2.PAF合成酵素cDNAクローニング今年度は、準備段階として、PAF合成酵素活性をもたないホスト細胞の検索を行った。その結果、一過性発現によく使用されるCOS細胞は、強いPAF合成酵素活性をもつことがわかり、スクリーニングには不適であることがわかった。逆にCHO細胞は、ほとんどこの酵素活性を持たず、使用可能なことが示されたので、CHO細胞を用いた一過性発現の最適化を行い、リポフェクション法により、高い発現を得られる条件を見いだした。今後、ライブラリーのスクリーニングを開始する予定である。
酵素を利用した文化財の新規クリーニング方法の開発　-旧修理材料や微生物痕の除去-

本研究は三つの調査研究から成り立つ。一つは材料化学的調査であり、除去対象とする汚れの化学構造の把握を目的とする。二つ目は微生物酵素学的調査であり、材料の分析をもとに酵素の選定やその機能の評価を行う。三点目は現場での適用である。1.材料化学的調査。本年度はアクリル樹脂の物性について化学分析を行った。文化財修復に多く使用されるアクリル樹脂のうちエマルション系の接着剤に関し強制劣化試験を行い、得られた試料をGC-MS等の分析手法を用いて分析した。2.微生物酵素学的調査。本年度は、比較的失活しやすいと想定されるαアミラーゼについて、失活する条件を探索した。澱粉糊は日本で古くから使用されている接着剤であり、文化財の修復で非常に多く使用されている。これらを安全に除去した上で、次の段階で修理する際に接着の阻害にならないような酵素の探索と各種条件下での活性評価を行った。さらに、大阪産業技術研究所の所有するポリビニルアルコール分解酵素に関して、より効率的な酵素産生方法についても多角的に検討を行った。これらは主に大阪産業技術研究所において行われた。3.現場での適用。海外の染織品に使用されたポリビニルアルコールの除去に、ポリビニルアルコール分解酵素を適用するために、種々の条件検討を行った。また、絵画(屏風)、ラベルなどに使用されたポリビニルアルコールの除去にも適用し、その効果を確認した。4.総括。文化財修理における酵素の適用について総括した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、酵素を利用した文化財上の汚れ除去に関する基礎的な研究を行い、実際の修復現場における適用を目指す。文化財上の汚れの除去は作品を汚損するリスクを避けるため、限定的な処置しかなされない側面もあり、十分な効果のあるクリーニングができずに終わる事例も多い。本研究では、酵素というきわめて選択的な化学反応をする生体触媒を用いることにより、喫緊の課題である安全で効果的な除去方法の開発を行う。酵素は反応選択性が高いため、汚れの種類を分析し、それぞれに効果のある酵素を探索した上、それらの文化財材料への影響まで含めて評価する必要がある。本研究ではこれらを包括的に研究し、文化財の保存修復への貢献を目的とする。1.材料化学的調査。本年度はポリビニルアルコールの劣化とそれと併用されたアクリル樹脂の劣化について化学分析を行った。過去および現在に使用されているアクリル樹脂の組成解析と強制劣化を使用した劣化サンプルの化学構造解析をした。成果は文化財科学会における口頭発表および「Polymer Degradation and Stability」にて論文発表した。本年度は、金属顔料および膠着剤存在下でのポリビニルアルコール分解酵素の活性について評価を行った。また、使用後に失活させやすく現場的に使用しやすいαアミラーゼについての探索を行い、来年度以降はこの評価を行う。3.現場での適用。建造物彩色に使用されたポリビニルアルコールの除去に酵素を用いた。この際、同一条件下でも樹脂の劣化状態により、効果が不均一であることが明らかになり、来年度以降の課題とした。1.材料化学的調査。文化財修復に多く使用されるアクリル樹脂、PralodB-72について、溶媒吸着に着目し、使用する有機溶媒が異なる場合、膜の物性も異なることをNMRとDSC、クラークこわさ試験等で評価した。本年度は、フノリや膠などの修復材料とポリビニルアルコール分解酵素の併用した場合の酵素の活性の阻害について評価した。その結果、酵素の活性阻害はほとんどなく、むしろ膠を使用した場合は活性が上昇することが確認された。3.現場での適用。この際、酢酸ビニルと併用されていたポリビニルアルコールでも、酵素が有効であることが明らかになった。文化財上の汚れの除去は保存修復において重要な作業の一つである。しかし作品本体を汚損するリスクを避けるため、安全に行える限定的な処置しかなされない側面もあり、十分な効果のあるクリーニングができずに終わる事例も多い。

2015年度までは、主にポリビニルアルコールの除去に関して、酵素を用いた際の適用方法の検討を行ってきた。金属酸化物である顔料の存在下で使用するため、顔料による活性阻害の影響確認や、現場での試験施工を行っている。一方で、経年劣化したPVA(実試料)上での酵素適用では、不溶部分が白色化することが明らかになり、その部分の溶解が今後の課題とされる。アクリル樹脂に関しては、エマルション状態で使用されたアクリル樹脂の除去方法についての課題が生じており、酵素のスクリーニングを検討しており、古墳壁画等でパラロイドB72に発生したカビなどについて培養を検討中である。溶菌酵素については、文化財構成材料についての影響評価は終了しており、古墳壁画の修復などに実用的に用いられ始めた。デンプンを分解後、容易に不活性化する酵素が、修復現場では求められているが、これらについても低温での耐性のある微生物種からの探索を遂行中である。本研究は三つの調査研究から成り立つ。一つは材料化学的調査であり、除去対象とする汚れの化学構造の把握を目的とする。二つ目は微生物酵素学的調査であり、材料の分析をもとに酵素の選定やその機能の評価を行う。三点目は現場での適用である。1.材料化学的調査。本年度はアクリル樹脂の物性について化学分析を行った。文化財修復に多く使用されるアクリル樹脂のうちエマルション液で使用されるものについて紫外線を用いた強制劣化試験を行い、得られた試料をGC-MSで分析した。アクリルエマルションに用いられる樹脂は劣化しにくいと言われているが、文化財現場では過酷な環境で使用されることもあるため、劣化した場合の状況を想定するためのデータとした。2.微生物酵素学的調査。本年度は、ポリビニルアルコール分解酵素による顔料の変色の有無、修復材料(主に接着剤)の接着力への影響評価を行った。これらの成果は前年度までの成果と合わせて論文投稿を行った。また、劣化して不溶化したポリビニルアルコールについて、エーテル化が進行しているとの推定を元に、このような物質の分解酵素の探索を行った。3.現場での適用。建造物彩色に使用されたポリビニルアルコールの除去に酵素を用いた事例について、実際に適用を行った。PVA単体を用いて処置されていた作品であったため、暗色化部分が除去され、新たに膠での処置も行うことが可能になり、酵素の有効性が現場においても確認された。ポリビニルアルコールの分解酵素による顔料の変色の有無、修復材料に用いる接着剤への影響評価など、文化財修復の現場に直接還元できる調査研究が遂行された。これによって、酵素使用における安全性が確認されたため、以後の使用に際して、安定した用途を確保することができる。この結果、ポリビニルアルコールの使用された文化財建造物など、実際の修理現場での適用も実施することができた。本研究では、酵素を利用した文化財上の汚れ除去に関する基礎的な研究を行い、実際の修復現場における適用を目指す。文化財上の汚れの除去は保存修復において重要な作業の一つである。