hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多様な運動・姿勢経験を元にした学齢期重度脳性麻痺児の脊柱変形予防

寝たきりレベルの重度脳性麻痺児は普段、どのような姿勢を取り、どれだけ運動の刺激を受けるかを定量的に調査するために、小型のセンサからなる非拘束姿勢・運動記録システムを構築した。このシステムを用いた調査よって、重度脳性麻痺児は日中の活動だけでなく、夜間、睡眠時の体動や姿勢変化も極度に少ないことを明らかにした。この成果によって、変形予防のための姿勢介入は、1回ごとではなく、1日単位でプログラムを考えることが重要であると示唆された寝たきりレベルの重度脳性麻痺児は普段、どのような姿勢を取り、どれだけ運動の刺激を受けるかを定量的に調査するために、小型のセンサからなる非拘束姿勢・運動記録システムを構築した。この成果によって、変形予防のための姿勢介入は、1回ごとではなく、1日単位でプログラムを考えることが重要であると示唆された学齢期脳性麻痺児に見られる側弯と日常生活における姿勢および体幹の運動性との関係を明らかにすべく、重度脳性麻痺児を対象に姿勢と体幹運動の調査を行い、以下の結論を得た。1.重度脳性麻痺児4名を対象に、姿勢モニターを装着し、30秒ごとの姿勢の変化を24時間に渡り計測した。その結果、重度脳性麻痺児は1日のほとんどの時間を臥位で過ごし、坐位などの抗重力姿勢を取る時間は対象児のうち3名が1時間以下で、1名のみ4時間であった。側弯の程度を表すCobb角の変化を見ると、坐位姿勢の時間が長かった1名が最も少なく、抗重力姿勢を取らない3名が大きかった。この結果から、抗重力姿勢を取ることだけが脊柱側弯の進行を助長するのではないことが示唆された。2.重度脳性麻痺児5名を対象に、体幹に加速度および角度センサーを取り付けることにより体幹運動を計測した。対象児のうち側弯を呈した4名は上肢に不随意な運動は時折見られるものの、体幹の動きはほとんど生じなかった。側弯のない1名は、四肢に不随意ながら大きい動きが見られ、体幹にも動きが波及していた。他動的に体幹を動かして回旋角度を計測すると、側弯の凸側への回旋に制限が見られた。以上から、重度脳性麻痺児では、(1)抗重力姿勢を長く取ることが必ずしも側弯を助長しないこと、(2)不随意であっても体幹運動がある方が側弯にならないこと、(3)一度側弯が生じると体幹の可動性に左右差が生じることが示され、体幹の運動性を引き出して姿勢を変えることが、脳性麻痺児に対する側弯対策になる可能性が示唆された。また、側弯の進行予防を目的とした坐位保持装置の設計、並びに試作機を製作した。本装置は胸郭を支えるハーネスと牽引装置を持ち、坐位時の脊柱の伸展を補助できるようになっている。今後、脳性麻痺児を対象とした適合試験や側弯に対する効果検証などを行う。学齢期脳性麻痺児に見られる側弯変形に対して、環境がどの程度影響するのかを見極めること目的に,今年度は在宅で暮らす重度脳性麻痺児(CP児)を対象に体幹運動機能と日常生活姿勢の調査を行い,以下の結論を得た.1.在宅で暮らすCP児11名を対象に姿勢を24時間計測した結果,1日のうちで坐位を取った時間の合計は平均5.7時間であった.在宅CP児で坐位が多く見られた時間帯は,通園施設や養護学校に在籍している時間帯と一致しており,通園施設や学校での活動が,坐位など抗重力姿勢を促していることが確認された.2.車いす坐位中に体幹を自ら動かせる6名(安定群)は,ほとんど動かせない5名(不安定群)よりも1日の坐位時間が長く(安定群平均7.5時間,不安定群平均3.6時間),1日に姿勢を変える回数が多く(安定群平均360回,不安定群平均165回),睡眠時に姿勢を変える時間の問隔が短かった(安定群平均2.7時間,不安定群平均7.2時問)。この結果よりCP児においては,体幹運動機能が抗重力姿勢の維持や姿勢変化の頻度を左右することが示唆された.3.不安定群の中に,睡眠中に姿勢の変化が全く見られず仰向けのままであった児が3名いた.いずれも日中は平均して30分に1回の割合で姿勢が変わっていたことから,自ら姿勢を変えることができず介助者への依存が大きいCP児では,介助者の関与が薄くなる時間帯で姿勢変化が極端に見られなくなることが明らかとなった.また,開発した牽引式坐位保持装置の適合試験も行った.側弯を有するCP児に適合させたところ,即時的こ脊柱が伸張され側方への彎曲が減少することが確認された.寝たきりレベルの重度脳性麻痺児(CP児)は,出生直後は筋骨格に異常がないにも拘わらず,成長につれ側湾に代表される変形が著明になる.本研究では日常過ごす姿勢が,変形と如何に関わるかを調べ,以下の成果を得た.

1.拘縮の要因である『動かず固定した肢位』がどの程度連続するか,また,その時間帯はいつかを明確に記述するウエラブル小型センサを使った24時間体位体動計測を確立した.これまで,24時間に渡る姿勢の記録はもっぱら観察に基づき行われてきた.観察は記録者に負担を強いるだけでなく,記録者間で判断が異なる場合もあり正確性に問題があった.われわれが構築した小型の傾斜角度センサと加速度センサを使用した記録システムは,体幹がどの方向に向いているか,そして,どれだけ動いているかを正確に把握できるもので,被験者,記録者双方とも負担を強いずに日常生活姿勢を計測することを可能にした.2.在宅で生活する寝たきりレベルのCP児13名(男性:7名,女性6名,平均年齢8.3±4.7歳)を対象に24時間体位体動計測を行い,これらの児では睡眠中の寝返り,体動が極端に少ないことを明らかにした.13名中6名では平均して約8時間の睡眠中に寝返りをまったく見せず,また,体動もわずか1回から4回見られるのみであった。3.文献調査から,変形予防として夜間にポジショニングを中心とした介入を行っている施設は国内・国外にいくつかあるが,その効果は明確に示されていないことが判明した.その理由として,長期に経過を追わなければ効果がはっきりしないこと,対象となるCP児の人数が1施設では限られてしまうなどが考えられた.
新規ヒアルロン酸分解酵素を分子標的にして顎顔面形成異常および口腔癌を制御する

本申請課題は、国際共同研究により糖鎖生物学という新しい視点から歯科疾患や口腔組織をより深く理解しようという取り組みである。特に、頭蓋顎顔面の形態異常や口腔癌といったヒアルロン酸の合成・分解異常と関連がある歯科疾患に着目し、ヒアルロン酸の生物学的機能やTmem2を介した細胞機能制御機構を明らかにし、Tmem2を分子標的にした全く新しい治療、診断法の開発を最終目標とする。
シアノ架橋金属錯体ホスト包接体の誘電特性と機能性開拓

極性分子をゲストとするシアノ架橋金属錯体ホスト包接体のゲストの動的挙動と低温での最終の配列状態を誘電率、固体NMR、熱分析、X線回折法などにより調べた。ゲストが包接体内で三次元配置された場合は最終的に秩序状態、一次元配置された場合は無秩序状態となった。また、極性ゲストを包接することにより、ベイポクロミズムとスピン転移を発現するシアノ架橋金属錯体ホストの開発に成功した。本年度においては、[N(CH_3)_4][CdCu(CN)_4]・HCCl_3(1)、Cd(1,6-diaminoalkane)Ni(CN)_4ピロール包接体(2)、同じくフルオロベンゼン包接体(3)およびこれらの関連包接体に対して、試料調製、DSC、^2H-NMR粉末パターン、誘電率、熱容量等の測定、単結晶・粉末X線回折による結晶構造情報の収集を行った。マシンタイムの関係で全測定が完了しているわけではないが、得られた知見を以下に記す。化合物1はダイヤモンド格子状ホストに極性のHCCl_3と非極性のN(CH_3)_4^+の二種のゲストが内包された包接体であり、これらゲストの動的挙動の相関が興味深い。HCCl_3の配向は188K以上で等方回転運動による無秩序状態(常誘電性)にあるが、2つの相転移を経て175K以下でホストの変形を伴い分子運動の凍結により秩序化する。この状態で包接体は極性結晶となるが、ホストの変形が激しく外部電場印加によるHCCl_3の配向の逆転による強誘電性の発現は期待できない。一方、N(CH_3)_4^+は一貫して等方回転状態にあった。化合物2、3では、極性ゲストが一次元トンネル内に一列に配置され、いわば一次元イジング的な状況が作り出されている。2、3でゲストは異なるがゲストの運動性は類似しており、固体NMRから120K付近では偏りを持った再配向運動が、室温以上でも数種類の明確に制限された再配向運動が示唆された。一般に、低温ではゲスト間相互作用のため偏りのある再配向運動が出現する可能性があるが、高温では熱的攪乱によりゲストは等方的運動状態へと移行すると考えられる。しかし、観測結果はこれとは異なっており、高温でもゲストの協同的な振る舞いが残っている可能性がある。今後この領域での誘電率測定を行い、その情報も加え検討を行う。極性による相互作用を持つゲストの動的挙動や集団状態について、ゲストが3次元および1次元配列した場合を次の1,2に、もう一つの目標、スピンが絡む物性開発は3に述べる。(1)Aにおいて175Kで相転移によるフェロ的な配向秩序化が観測された。(2)これがゲストの極性に起因するのか、Aよりも強い極性を持ち、より堅牢なホストを持つBで観測したところ、相転移はなくゲストは再配向運動を続けた。(1)の結果には、AのCd金属錯体ホストの構造柔軟性の寄与があると考えられたが、Bについてより低温での検討も必要である。2.Cd(1,6-da)Ni(CN)4・G系、G=ベンゼン(C)、ピロール(D)、フルオロベンゼン(E)の各包接体。(1)Cより、極性による相互作用のない場合のゲストの運動性と活性化エネルギーEaを見積もったところ、面内回転運動をしており、そのEaは約4.5kJmol-1と極めて低く、上記の目的には適した場であることが確認できた。(2)D,Eでのゲスト運動は、180度反転した2つのサイトに存在率の大きな面内回転運動で、イジング的な再配向運動と相互作用によるEaの増加を確認できた。(3)D,Eでデバイ型の誘電分散が観測された。これより、協同的なゲスト運動はないが、逆に10K程度まで配向秩序化が起こらないことが示唆された。マクロな系で、このような低温まで運動凍結が起こらないのはあまり例がない。今後熱容量測定を行う予定である。合成したホストが極性ゲスト吸着によりベイポクロミズムとスピンクロスオーバーを示すことを拡散反射スペクトル、磁化率、メスバウアより確認したが、試料の安定性に問題が残った。極性ゲストの動的挙動や集団状態について、ゲストが3、1次元配列した場合を次の1、2に、もう一つの目標、スピンが絡む物性開発を3に述べる。1.【N(CH3)4】【MCu(CN)4】・G系、M=Cd,G=HCCl3(A)、M=Zn,G=CH2CI2(B)の各包接体。Aでは、ゲストの運動性に応じた3つの相があるが、温度可変X線回折より高温相から低温相へ結晶構造の対称性が低下が示され、1次転移であることが確認できた。

8の誘電率測定より、130K付近でCH2(羽分子の再配向運動が急激に低下し秩序化が見られたが、熱容量測定より、Aと異なり、この相転移は2次転移であることが示唆された。これは、ホスト成分のCdとZnの配位構造柔軟性の差が要因と思われる。2.Cd(1,6-da)N量(CN)4フルオロベンゼン包接体。固体NMR、誘電率で示されたフルオロベンゼンの反転運動が低温でどのように落ち着くかを検証するため熱量容量測定を行った。60Kにガラス転移が観測されたことより、無秩序な配向を維持したまま反転運動が凍結することが判明した。これは一次元lsi皿gモデルの帰結と同じで、現実には三次元構造を持つ本包接体の包接場が一次元相互作用の楊として有効であることが示された。3.Fe(bpy)Ni(CM)4・2.5H20・G(G=エタノール、アセトン)包接体。各包接体においてスピンクロスオーバー(SCO)が確認されていたが、SCOサイト問を連結する相互作用の情報を得るため重水素化ゲスト包接体のSCOを磁化率から評価した。水よりもGの重水素化がSCOに大きな変化を与えたことから、Gが包接体内で一種の化学圧力の媒体となりSCOサイト問を連結し協同現象の要因となっていることが示唆された。また、アセトン包接体ではヒステリシス・ループの拡大という例のない現象を発見した。
モーショナルシュタルク効果分光による回転変換角度分布の計測

本研究の目的は、モーショナルシュタルク効果分光による回転変換角度分布の計測を大型ヘリカル装置を用いて行い、ヘリカルプラズマにおける磁気シアと輸送およびMHD不安定性との関連について研究を進めることであ。平成15年度:ヘリカルプラズマにおいては、局所的な磁力線のピッチ角は、トロイダル電流と有限ベータ効果によるフィッシュ・シュルータ電流によって決まるので、異なる圧力分布・電流分布のプラズマの平衡配位のデータベースの構築を行った。またモーショナルシュタルク効果分光に関しては、分光に必要なハードウエアとして電子冷却式検出器を購入し、検出器テスト、ソフトウエアの開発を行った。平成16年度ではモーショナルシュタルク効果を利用した偏光分光計測器(モーショナルシュタルク効果分光システム)を完成させ、大型ヘリカル装置において計測を開始して初歩的なデータを取得した。モーショナルシュタルクで計測した磁場のピッチ角度から、プラズマの性質を決めている回転変換分布を導くための計算コードを開発し、回転変換分布を得ることができた。また回転変換分布を変化させる実験的手法として、中性粒子ビームによる電流駆動が有効であるかを調べるために、LHD及びCHSにおいて中性粒子ビーム電流駆動実験を行った。平成17年度においては、中性粒子ビームによる電流駆動の実験を行い、回転変換分布を計測した。電流駆動により中心の回転変換を下げて、プラズマの閉じ込めがどのように変化するか、また逆に中心の回転変換を上げて磁気シアを小さくし、MHD不安定がどのように変化するかについても調べた。これらの実験研究を通じて、回転変換分布のプラズマ閉じ込め及びMHD不安定性への影響について研究を行った。本研究においては、局所的な磁力線のピッチ角をモーショナルシュタルク効果分光で計測すると同時に、プラズマの内部磁気面を軟X線CCDカメラでもって決定する。モーショナルシュタルク効果分光単独ではなく、軟X線CCDカメラの計測と組み合わせることにより、トロイダル対称性を持たないプラズマにおいて、精度よく回転変換角度分布を計測しようとする点にある。すなわち、ピッチ角半径分布と内部磁気面形状とが矛盾無く再現できるプラズマの平衡計算を行うことにより、回転変換角度分布を導く。15年は軟X線CCDカメラで得られた磁気面形状が回転変換角分布によりどの程度変化するかを実験と平衡計算の両面から調べる。磁気面形状の決定に必要なデーターベースの構築を行う。一方、モーショナルシュタルク効果分光に関しては、分光に必要なハードウエアーとして電子冷却式検出器を購入し、検出器テスト、ソフトウエアーの開発を行う。本研究ではプラズマの放電に同期して検出器から自動的にデーターを取り込むソフトウエアーが必事であるが、その開発には時間がかかる為15年度に検出器を購入した。16年度にはモーショナルシュタルク計測を開始して、初歩的なデーターをとる予定である。モーショナルシュタルクで計測した磁場のピッチ角度から、プラズマの性質を決める回転変換分布を導くための計算コードの開発も平行して行なう。すなわち、ピッチ角の半径分布と内部磁気面形状とが矛盾無く再現できるプラズマの平衡計算を行うことにより、回転変換角度分布を導く事を目指している。平成16年度には大型ヘリカル装置にモーショナルシュタルク効果を利用した偏光分光計測器(モーショナルシュタルク効果分光システム)を設置し計測を開始して初歩的なデーターを取得した。平成17年度には、中性粒子ビームによる電流駆動の実験を行い、回転変換分布を計測する予定である。

電流駆動により中心の回転変換を下げて、プラズマの閉じ込めがどのように変化するか、また逆に中心の回転変換を上げて磁気シアーを小さくし、MHD不安定がどのように変化するかについても調べる予定である。これらの実験研究を通じて、回転変換分布のプラズマ閉じ込めおよびMHD不安定性への影響について研究を行う。本研究においては、局所的な磁力線のピッチ角をモーショナルシュタルク効果分光で計測すると同時に、プラズマの内部磁気面を軟X線CCDカメラでもって決定する。モーショナルシュタルク効果分光単独ではなく、軟X線CCDカメラの計測と組み合わせることにより、トロイダル対称性を持たないプラズマにおいて、精度よく回転変換角度分布を計測しようとする点にある。すなわち、ピッチ角の半径分布と内部磁気面形状とが矛盾無く再現できるプラズの平衡計算を行うことにより、回転変換角度分布を導く事を目指している。平成17年度には、中性粒子ビームによる電流駆動の実験を行い、回転変換分布を計測した。電流駆動により回転変換を増加又は減少させて、磁気シアとプラズマの閉じ込めがどのように変化するか、またMHD不安定がどのように変化するかについても調べた。その結果、回転変換を増加させる方向に電流駆動した場合、全体の回転変換角度は確かに増加するが、中心の回転変換角度は逆に減少し、磁気シアが増加することが解った。これは予想と相反する結果であった。一方、回転変換を減少させる方向に電流駆動した場合には、全体の回転変換角度は減少し、中心の回転変換角度が増加して、磁気シアが減少し、MHD不安定が発生することが実験的に確かめられた。モーショナルシュタルク効果分光で回転変換角度を計測することにより、磁気シアとMHD不安定との関連を明らかにすることができた。
超好熱菌の低温適応機構

Thermococcus属はPyrococcus属の超好熱菌に比べて生育温度範囲が広く、特により低温での生育が可能である。Thermococcus kodakaraensisのゲノムアノテーションを行い、Pyrococcus属超好熱菌との比較解析を行うとともに、培養温度を変えて培養し、発現してくる遺伝子の網羅的な解析を試みた。T.kodakaraensisにはPyrococcus属にはない747個の遺伝子が存在した。これら限られた遺伝子のいくつかは、Thermococcusのより低い温度で生育に関与すると考えられる。マイクロアレイ解析とプロテオーム解析で低温誘導型遺伝子の特徴を調べたところ、低温誘導型の分子シャペロニンはそれが転写後レベルで制御されていることが明らかになった。70°C以下の培養で分子シャペロニンCpkAの発現は誘導されるが、今回この遺伝子の転写開始点を特定し、リーダー領域の構造特異性を検討した。cpkAのプロモーター構造を高温誘導型シャペロニンであるcpkBのプロモーターと比較したところ、数箇所の違い以外高度に保存されており、進化的に両遺伝子がパラロガスな関係にあることが示された。わずかな配列の違いにより誘導特性の生じているいると考えられるが、この点は今後明らかにして行きたい。なおcpkA遺伝子の破壊株を構築できなかったことから本遺伝子は低温に限らず生育に必須な遺伝子と考えられた。また低温ではRNAヘリカーゼが特異的に誘導されていることを見いだしたが、これは超好熱菌由来の酵素でありながら反応至適温度が50°Cというユニークな特徴が見られた。本研究では膜脂質合成系に関与するイソプレノイド合成系酵素の機能解析のほか、Thermococcus属に特有のキチン資化系酵素についても検討を行った。研究計画に従い、Thermococcus kodakaraensisを培養温度を変えて培養し、発現してくる遺伝子の網羅的な解析を試みた。T.kodakaraensisを60°C及び85°Cで培養し、生育曲線をモニターしつつ、対数増殖期、定常期で急冷し、生育を止めたのち集菌した。対数増殖期の細胞からmRNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。温度によって異なる蛍光標識を行い、マイクロアレイ(DNAチップ)を用いたハイブリダイゼーションにより、60°Cで特異的に転写されている遺伝子をリストアップした。また二次元電気泳動法を利用し、低温特異的に発現してくるタンパク質の動態を調べた。タンパク質の同定はアミノ酸配列分析、質量分析により行った。網羅的解析により絞り込みのなされた低温特異的遺伝子群の中から、RNAヘリカーゼ、分子シヤペロニン、膜脂質合成系酵素群に注目して、いくつかの遺伝子産物を組換え体として取得した。RNAヘリカーゼに関してはATPase活性が認められたが、その反応至適温度は50°Cであり、T.kodakaraensisの酵素の中で最も低い温度特性が見られた。また分光学的手法によりタンパク質の安定性を検討したところ、80°Cで変性が認められた。分子シャペロニンCpkAの誘導メカニズムについて検討するためmRNA転写量、タンパク質の発現を調べたところ、低温での高発現は転写後レベルでなされていることが確認された。特にリボソーム結合部位周辺に形成される二次構造が発現調節に関与していると予想される。なおcpkA遺伝子のノックアウト株が構築されないことから、CpkAは生育に必須の機能を有すると思われる。Thermococcus kodakaraensisのゲノム配列に関してはアノテーションが精査され、詳しい情報に関しては論文を通じて一般公開された。前年度に引き続いて超好熱菌Thermococcus kodakaraensisを培養温度を変えて培養し、発現してくる遺伝子の転写レベルとタンパク質レベルでの網羅的な動態解析を試みた。

いくつかの遺伝子で転写後調節が示されたため、平成18年度はRNAヘリカーゼ(TK0306)とシャペロニンcpkA遺伝子に特に注目し、集中的に研究を行った。RNAヘリカーゼ(TK0306)の遺伝子発現は60°C以下の培養で特異的に誘導され、それは転写レベルでなされていた。TK0306の遺伝子を破壊したノックアウト株を構築し、生育特性を調べたところ、60°Cでの生育が低下し、55°Cにおける生育はみられなくなった。このことから本遺伝子は低温での生育に必須と考えられる。本遺伝子を大腸菌で発現し、産物を精製して調べたところ、ATPase活性が認められたが、その反応至適温度は50°Cであり、T.kodakaraensisの酵素の中で最も低い温度特性が見られた。また分光学的手法によりタンパク質の安定性を検討したところ、50°Cで変性が始まることが認められた。また70°C以下の培養で分子シャペロニンCpkAの発現は誘導されるが、今回この遺伝子の転写開始点を特定し、リーダー領域の構造特異性を検討した。特に低温で特異的に形成される安定なステム様構造の存在を期待したが、顕著なものはみられなかった。次にcpkAのプロモーター構造を高温誘導型シャペロニンであるcpkBのプロモーターと比較したところ、数箇所の違い以外高度に保存されており、進化的に両遺伝子がパラロガスであることが示された。わずかな配列の違いにより誘導特性の違いが導かれていると考えられる。なおcpkA遺伝子の破壊株を構築できなかったことから本遺伝子は低温に限らず生育に必須な遺伝子と考えられた。
消化管正常型糖鎖Sd^aを認識するレクチンの探索

Sd^a合成酵素活性を導入することで作製したSd^a発現細胞を用い、既知の動物レクチンとの結合活性をスクリーニングしたが、Sd^a認識レクチンは見出されなかった。ヒト組織ないし初代培養細胞を用いて更に検索した結果、Sd^a認識レクチンを発現する正常臓器および細胞を同定した。本研究の目的は,正常消化管上皮に発現する糖鎖Sd^a抗原を認識するレクチン分子を同定し,その生理的機能を明らかにすることである。平成19年度は,Sd^a糖鎖の合成に関与する酵素活性をヒト胃癌および大腸癌細胞株に導入することで,Sd^a糖鎖発現細胞株を作製した。Sd^a糖鎖認識分子を発現する細胞を,作製したSd^a糖鎖発現細胞株を用いた接着実験により検索した。その結果,Sd^a糖鎖を発現していない親細胞株は,ヒト大網より単離・培養した正常初代培養中皮細胞に接着しないが,Sd^a発現細胞株はヒト正常初代培養中皮細胞に対して強い接着性を有することが明らかとなった。そこで,ヒト正常初代培養中皮細胞にhTERT遺伝子を導入することで不死化し,株化細胞として樹立したが,不死化ヒト中皮細胞においてはSd^a糖鎖との結合性は失われてしまった。Sd^a発現細胞株と接着性を有していたヒト大網初代培養中の細胞を,組織化学的に検討した結果,中皮細胞にだけではなく,混在しているマクロファージ様細胞にもSd^a糖鎖認識分子が発現している可能性が示唆された。Sd^a糖鎖構造末端にはシアル酸が含まれるため,マクロファージに発現していることが知られている,既知のシアル酸結合性レクチン・シグレックに対するSd^a抗原の結合性を調べた。シグレック3,シグレック5,シグレック7およびシグレック9に対するSd^a糖鎖の特異的結合性は見出されなかった。本研究の目的は、正常消化管上皮に発現する糖鎖Sd^a抗原の生理的機能を明らかにすることである。平成20年度は、Sd^a合成酵素活性を胃癌および大腸癌細胞株に導入することで作製したSd^a発現細胞株を用い、Sd^a糖鎖を介したシグナルが細胞増殖にどのような影響を及ぼすかを検討した。Sd^a発現細胞株とSd^a糖鎖を発現していない親細胞株との間でin vitroでの増殖性に差は認められなかったが、抗Sd^a抗体を添加した場合にはSd^a発現細胞株においてのみ濃度依存的な増殖抑制が認められた。また、抗Sd^a抗体添加時の増殖抑制はヒト大腸癌細胞株にSd^a糖鎖を発現させた場合には認められたが、ヒト胃癌細胞株にSd^a糖鎖を発現させた場合には認められなかった。Sd^a糖鎖はヒト大腸では主としてムチン型糖鎖として糖タンパク質上に発現が認められるのに対し、ヒト胃では主として糖脂質糖鎖として存在していることから、ヒト大腸においては、Sd^a糖鎖の結合しているムチン型タンパクを介して上皮細胞の増殖制御が行われている可能性が示唆された。正常消化管粘膜に限局して発現するSd^a糖鎖が、胃癌・大腸癌では消失していることは既に知られているが、今回の検討において癌以外の病態におけるSd^a糖鎮発現異常について調べた結果、消化管の慢性である潰瘍性大腸炎においてSd^a糖鎖の発現が著しく低下していることが明らかとなった。
フォトニック結晶レーザ等による微小光場の生成とその応用

集光点において極微小な領域へ局在する光場を形成すると期待されるレーザビーム(径偏光ドーナッツビーム)について、その集光点での光場分布の検証と応用技術への展開を目的に研究を行った。その結果、細い円環状の径偏光ビームが、半波長以下の幅で、焦点深度が数波長以上にもなる集光点を形成することを見出した。"Z偏光"と呼ばれる電界からなるこの光場は、光加工やセンシング、超解像観測などに役立つ光源と期待される。本研究では、集光点において極微小な光場を形成すると期待される径偏光ドーナッツビームをフォトニック結晶レーザにより生成し、その集光点での光強度分布の検証と応用技術への展開を目的とする。中心軸(光軸)に対し対称な放射状の偏光をもつ径偏光ドーナッツビームを、高開口数のレンズで集光した場合、ビーム径方向の電界成分は打ち消し合い、光軸方向へ振動する電界成分のみが残り、これが極微小な光場の形成につながるものと予測される。平成20年度は、集光点の大きさを評価するため、集光点での電界分布を、ナイフエッジ法を用いて測定する光学系の構築を行った。高開口数の対物レンズで強く集光された光を全て捉えるため、フォトダイオードの受光層から数百nmの距離に、金属のナイフエッジを形成したディテクタを作製した。これを、ナノメートル精度のステージで走査し、光電流強度を測定することで、集光点での光強度分布が測定可能となる。構築した系を用いて、径偏光ドーナッツビームの集光点での光強度分布を測定したところ、理論的予測と一致する単峰の分布を得ることに成功した。これは、光軸方向へ振動する電界成分が、確かに光軸上に強度を有することを示した結果でもある。さらに、集光点についての理論解析も進めたところ、ビーム外側に強度を集中したビームでは、光軸上の成分が主成分となり、より微小な集光点が得られることが明らかとなった。特に強度を、ビームの半径の外側50%に集中することで、ガウスビームより小さくなることが予測される。実験によってもビーム外側に強度を集中させることが、微小集光点を形成するのに有効であることが確認できた。今後は、得られた集光点での物質との相互作用を検討していく。本研究では、集光点において極微小な光場を形成すると期待される径偏光ビームを含め、ベクトルビームをフォトニック結晶レーザにより生成し、その集光点での光強度分布の検証と応用技術への展開を目的とする。光軸に対し対称で放射状の偏光分布を示す径偏光ビームを、高開口数のレンズで集光した場合、光軸方向へ振動する電界成分のみが中心に残り、これが極微小な光場の形成につながるものと予測される。平成21年度は、光軸方向へ振動する電界強度をより増加させるため、ビーム外側に強度を集中させて、集光点の光強度分布を評価した。その結果、集光点の幅は半波長以下となるのに加え、焦点深度が5波長10波長程度に伸長することを見出した。この成果は、深さ方向の調整が容易で、高分解能な測定を可能にする光源が実現できたことを示している。さらに、集光点と物質との相互作用を検討するため、FDTD法による数値解析を開始した。径偏光ビームの集光点の中心に、一辺が半波長程度の金属立方体を設置し、光場の様子を検討した。その結果、電界強度分布の最も大きな光軸上に金属を設置したのにもかかわらず、90%以上の光が、伝搬していくことが明らかとなった。さらに、金属立方体の光軸上表面には、電界の増強効果(最大6倍)が観測され、径偏光ビームの特長が確認された。これらに加え、ベクトルビームの体系的な理解も深めた。径偏光ビームの他にも興味深い性質を見せるビームが存在することが期待される。まず、数学的に理解が進められるよう表現式を導き、ビームモードの系統的な理解を進めた。理論的に予測されたビームについては、一部実験的にも実現することに成功し、ベクトルビーム分野の発展に大きな一歩を踏み出すことが出来た。
蛍光指紋イメージングによる米ゲル含有パン生地の物性と膨化機構の解明

5つの水分量で白米ゲルと玄米ゲルをそれぞれ作製した。米ゲルの動的粘弾性は、加水量に影響されることが確認できた。また、特に貯蔵弾性率G'と損失弾性率G"、複素弾性率G*において白米と玄米の違いによる差も確認することができた。貯蔵弾性率G'と損失弾性率G"について、初期値に着目すると玄米ゲル添加生地も白米ゲル添加生地においても全体の水分量ごとで違いがみられ、全体水分量が少ない80%が大きな値をとっていることが判明した。また、tanδは、白米ゲル添加生地と玄米ゲル添加生地を比較するとピークの値が後者でより大きい値であることが確認できた。ピーク時の米粉と米ゲルの配合割合、また加水量を増加させて製パン試験を行い、パンの特性について検討を行った。前者について、米ゲル:米粉を2:8で使用すると硬さが小さく、比容積が大きいパンを作製できることが明らかとなった。各評価項目において、白米ゲル添加パンと玄米ゲル添加パンでほとんど違いはみられなかった。米ゲル自体の水分量も2通りで作製したが、製パン試験においてほとんど有意な差はみられなかった。全体水分量はパンの出来上がりに最も大きな影響を与えていることが確認できた。本実験では、全体水分量を80%、90%、100%の3段階で配合を変化させたが、100%のパンで硬さが小さく、比容積が大きいパンを作製することができた。しかし、官能評価でパネルから好まれたパンは中間の加水量で配合した90%パンであった。米粉と米ゲルの配合割合、また加水量を増加させて製パン試験を行いパンの特性について検討を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。米の品種の違いによるパンの膨化特性を確認した。品種の違いによる比容積への影響は大きく、米ゲル物性が膨化特性に大きく影響していることは明らかであった。具体的には、北瑞穂は、特に弾性の高い米ゲルが得られ、パンや麺に向いている物性が確認できた。ゆきひかりは、従来のモミロマンと似たような物性で、パン、洋菓子のいずれも製造可能なことを確認した。一方で、水分も大きく影響することが確認され、特に米ゲル自体の水分量、製パン時に加水する水分量のいずれもが、影響することが明らかになった。すなわち、米ゲル中の水分が少なく、かつ加水量が多い生地は、焼成すると生地は軟らかく、比容積が大きい傾向がみられた。さらに、米ゲルの乳化特性と物性に関して、詳細な検討を行った。米ゲル、乳化米ゲルの食品素材としての保存性をそれぞれの物性の経時変化から検討した。米ゲル、乳化米ゲルを冷蔵(4°C)、冷凍(-20°C)条件下で保管し、ゲル作成後1日目、7日目、14日目での物性の経時的な変化を、動的粘弾性測定裝置により測定し、比較・検討した。その結果、低加水条件(1.5倍加水または1.5倍(油+水)配合)での冷蔵および冷凍区分、高加水条件(4倍加水配合または4倍(油+水)配合)の冷蔵区分でE*、tanδともに乳化米ゲルの方が米ゲルと比較して経時的な変化の割合が小さくなった。この結果から米ゲルを乳化させることによって経時的な物性変化を抑制する効果が示唆された。初年度は、膨化特性に関する様々な要因に関して、全体的な傾向を掴むことを念頭に実験を行った。まず、水分がひとつのキーポイントになるが、その場合、米ゲル中に含まれる水分と、後から加水する水分は、若干、作用が異なることが示された。一方で、原材料の米自体の特性も、大きくパンへの膨化特性に寄与しており、基本的に、品種そのものの特性に依存することが明らかとなった。また、それ以外にも、米ゲルに油を添加することで、乳化米ゲルが生成され、非常に親油性が高い素材であることが示され、このことは、経時変化を抑えたり、物性への影響を緩和させたりする作用が示され、製パン性にも大きく寄与することが示唆された。以上より、本年度は、米ゲル添加によるパンの膨化特性に関して、キーファクターを掴むことができ、さらにその変化の傾向も明らかにできたため、おおむね順調に進展していると評価した。最初に、メインターゲットとして用いるミズホチカラの米ゲルと、それ以外の品種(愛知125号、モミロマン、コシヒカリ)の米ゲルとの老化特性の違いを、動的粘弾性測定およびDSC、X線回折にて確認した。その結果、アミロース含量が高い愛知125号だけは、他の3品種と比べると明らかに老化が早い傾向がみられた。総じてみると、ミズホチカラが最も変化が少なく、安定した物性を示していた。また、米ゲルに含まれている加水量と米ゲル外から米粉に加える加水量の膨化性への影響を調べてみると、後者の加水が大きいほど、膨化性がよく、比容積が大きくなることがわかった。米ゲルに含まれている水は、しっかりとゲルに内包されてキサンタンガムのような増粘剤的な役割を果たし、一方、添加水として供された水は米粉と一緒になり気泡を包み込むベース生地となると推察された。

また、油を増やすとパン生地のキメが大きくなることが確認された。これは、油で生地が軟かくなるためと思われる。これらを踏まえて、実際に、米ゲルと米粉の配合を最適化することにより、グルテンフリーパンの試作を試みた。グルテンが全くないため、撹拌時間に関しては、小麦生地のようなオーバーミキシングを心配する必要は全くなく、生地は、小麦生地よりかなり軟かく、トロトロ状態であったが、小麦パンと同様に200°Cで焼成することにより、通常のパンのように膨らませることに成功した。今後は、日持ちを伸ばす工夫も合わせて進める予定である。小麦粉を使わずに、米主体でパンを膨化させるさせるためには、米ゲルによる適度な粘性と気泡をバルーンのように囲い込む米粉の集積により、グルテンが無くても膨れるのではないかという仮説の目処がたった。5つの水分量で白米ゲルと玄米ゲルをそれぞれ作製した。米ゲルの動的粘弾性は、加水量に影響されることが確認できた。また、特に貯蔵弾性率G'と損失弾性率G"、複素弾性率G*において白米と玄米の違いによる差も確認することができた。貯蔵弾性率G'と損失弾性率G"について、初期値に着目すると玄米ゲル添加生地も白米ゲル添加生地においても全体の水分量ごとで違いがみられ、全体水分量が少ない80%が大きな値をとっていることが判明した。また、tanδは、白米ゲル添加生地と玄米ゲル添加生地を比較するとピークの値が後者でより大きい値であることが確認できた。ピーク時の米粉と米ゲルの配合割合、また加水量を増加させて製パン試験を行い、パンの特性について検討を行った。前者について、米ゲル:米粉を2:8で使用すると硬さが小さく、比容積が大きいパンを作製できることが明らかとなった。各評価項目において、白米ゲル添加パンと玄米ゲル添加パンでほとんど違いはみられなかった。米ゲル自体の水分量も2通りで作製したが、製パン試験においてほとんど有意な差はみられなかった。全体水分量はパンの出来上がりに最も大きな影響を与えていることが確認できた。本実験では、全体水分量を80%、90%、100%の3段階で配合を変化させたが、100%のパンで硬さが小さく、比容積が大きいパンを作製することができた。しかし、官能評価でパネルから好まれたパンは中間の加水量で配合した90%パンであった。米粉と米ゲルの配合割合、また加水量を増加させて製パン試験を行いパンの特性について検討を行った。本年度は、定性的な傾向把握がメインであったが、今後は、物性をきちんと測定できるような環境を整え、定量的な評価ができるような方向に進める予定である。そのためには、物性を、多面的に捉える必要があり、特に、弾性と粘性という2つの側面から追及していこうと考えている。しかしながら、パン生地のようなゾル状の物性把握ができる装置は、現在、持ち合わせておらず、機器選定も含めて、検討を行っていきたい。今後、米ゲルの加水量と全体として加える加水量の関係をさらに詳しく調べて、精緻な最適化を図るとともに、玄米を使った米ゲルの利用に関しても、展開を図っていく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
昆虫脳において闘争による順位形成を調節する生体アミン系の解析

(1)コオロギにおける新規遺伝子導入法の確立:組替え酵素(φC31 integrase)を用いた遺伝子導入コオロギ作成法の確立を進めた。昨年度選抜した組替え標的配列をもつ遺伝子導入系統を用いて、遺伝子導入法の効率の評価を行った。本年度は組替え酵素を受精卵内で発現させる発現ベクターを用いた遺伝子導入実験を立ち上げる予定であった。しかし飼育しているコオロギにウイルス感染が蔓延し、遺伝子導入法の効率評価実験を遂行するために十分な個体を確保することが困難となった。ウイルス感染に対処したのちに効率評価実験を再開しているが、本研究課題の実施期間内に結果を得ることはできなかった。(2)神経遺伝学実験ツールの開発:コオロギ脳内生体アミン系神経回路網の機能操作のため、オクトパミン・チラミン・ドーパミン・セロトニンの合成酵素群の転写調節領域の配列を決定した。さらに、本年度は闘争行動遂行中に賦活化する神経細胞の同定のための神経遺伝学実験ツールを開発する目的で、コオロギ脳内において神経細胞の賦活化に伴い発現が誘導される初期応答遺伝子に着目した研究を遂行した。コオロギ脳内で発現する初期応答遺伝子を同定し、その転写調節領域の配列を決定した。さらに初期応答遺伝子の転写調節領域の下流でEYFPを発現する遺伝子導入系統の作成を進めた。(3)コオロギ脳生体アミン系神経回路の解剖学的解析:昨年度作成したチラミン合成酵素TDC2に対する特異的抗体を用いて、コオロギ脳内チラミン・オクトパミン作動性神経回路網のマッピングを行った。オクトパミンの前駆体であるチラミンは昆虫脳で神経伝達物質としても利用される。TDC2に対する特異的抗体と抗チラミン抗体・抗オクトパミン抗体との二重染色によって、コオロギ脳内のチラミン作動性神経細胞の全てでTDC2が検出されること、コオロギ脳内のオクトパミン作動性神経細胞はTDC2免疫要請細胞に含まれることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。コオロギを含む多くの昆虫では遺伝子導入系統を作出する際にトランスポゾンにより外来遺伝子を挿入する。この方法では遺伝子導入系統間で導入遺伝子の発現量・発現部位に大きなばらつきが生じ、遺伝子導入系統を実験に使用する前に大規模なスクリーニングや長期に渡る戻し交配が必要となる。本研究では上記の問題を解決するため、組替え酵素(phiC31 integrase)を用いた外来遺伝子のsite-direct挿入法を確立する。平成24年度は組替え酵素phiC31 integraseの組替え標的部位attPを組み込んだ遺伝子導入系統の作出をおこなった。piggyBacトランスポゾンによりattP1-3xP3-EYFP-attP2を遺伝子導入し,強いEYFP蛍光を発する遺伝子導入系統を約160系統作出した。この中から46系統のコンジェニック系統を樹立し、inverse PCR法により導入遺伝子周辺領域を単離した。上記の実験と平行して、コオロギ脳生体アミン系の機能操作実験に必要な遺伝学ツールの開発を行った。GAL4/UASsystemなどの遺伝学的ツールの確立に必要な遺伝子導入ベクターの作成や、神経細胞投射パターンの可視化に必要な蛍光タンパク質発現ベクターなどのコンストラクトを作成した。本研究で着目するオクトパミン・セロトニン系神経細胞群の標識・機能操作を行うために、これら生体アミンの合成系酵素のプロモーター配列を利用する。本年度はinverse PCR法による転写開始点上流配列を単離した。さらに平成25年度に計画している生体アミン受容体遺伝子の機能阻害実験の準備として、薬剤誘導型knock-down法の開発を進めている。本年度は上記実験系に必要なRNA pol III系プロモーターをコオロギより6種類単離し構造解析を行った。1コオロギにおける新規遺伝子導入法の確立組替え酵素(φC31 integrase)を用いた遺伝子導入コオロギ作成法の確立を進めた。昨年度作成した組替え標的部位をもつ遺伝子導入系統を累代飼育し、繁殖力に優れた6系統を選抜した。次に遺伝子導入法の効率の評価を行った。野生型φC31 integraseを用いて遺伝子導入を試みたが、遺伝子導入が成功したコオロギを得ることができなかった。コオロギに最適化したコドン使用頻度を持つφC31integrase遺伝子を人工合成し、遺伝子導入効率の再評価を行った(現在継続中)。2神経遺伝学実験ツールの開発・生体アミン関連遺伝子のプロモーターの単離神経遺伝学研究には特定の細胞集団や組織において任意の遺伝子を発現させるためのプロモーターが必要となる。今年度はユビキタスなプロモーターであるβ-actin遺伝子のプロモーターを、神経マーカーとしてfound in neurons (fne)遺伝子のプロモーターを単離した。コオロギβ-actin遺伝子がプロモーターを2つ持つことを明らかにし、転写調節領域(3 kbp)を単離した。fne遺伝子については、この遺伝子の発現を調節する2つのプロモーターに相当するゲノム断片(23 kbp)を単離した。コオロギ脳内生体アミン系神経回路網の機能操作のため、合成系酵素のプロモーターについて配列決定を進めている。3コオロギ脳生体アミン系神経回路網の神経解剖学的解析闘争行動を調節する生体アミン・オクトパミンの合成酵素に対する特異的抗体を作成し、免疫組織化学法により抗体の反応性を調査した。その結果、コオロギ脳内オクトパミン

作動性神経回路網を標識する抗体を得ることが出来た。現在、細胞体の位置・数や神経投射パターンの解析を行なっている。(1)コオロギにおける新規遺伝子導入法の確立:組替え酵素(φC31 integrase)を用いた遺伝子導入コオロギ作成法の確立を進めた。昨年度選抜した組替え標的配列をもつ遺伝子導入系統を用いて、遺伝子導入法の効率の評価を行った。本年度は組替え酵素を受精卵内で発現させる発現ベクターを用いた遺伝子導入実験を立ち上げる予定であった。しかし飼育しているコオロギにウイルス感染が蔓延し、遺伝子導入法の効率評価実験を遂行するために十分な個体を確保することが困難となった。ウイルス感染に対処したのちに効率評価実験を再開しているが、本研究課題の実施期間内に結果を得ることはできなかった。(2)神経遺伝学実験ツールの開発:コオロギ脳内生体アミン系神経回路網の機能操作のため、オクトパミン・チラミン・ドーパミン・セロトニンの合成酵素群の転写調節領域の配列を決定した。さらに、本年度は闘争行動遂行中に賦活化する神経細胞の同定のための神経遺伝学実験ツールを開発する目的で、コオロギ脳内において神経細胞の賦活化に伴い発現が誘導される初期応答遺伝子に着目した研究を遂行した。コオロギ脳内で発現する初期応答遺伝子を同定し、その転写調節領域の配列を決定した。さらに初期応答遺伝子の転写調節領域の下流でEYFPを発現する遺伝子導入系統の作成を進めた。(3)コオロギ脳生体アミン系神経回路の解剖学的解析:昨年度作成したチラミン合成酵素TDC2に対する特異的抗体を用いて、コオロギ脳内チラミン・オクトパミン作動性神経回路網のマッピングを行った。オクトパミンの前駆体であるチラミンは昆虫脳で神経伝達物質としても利用される。TDC2に対する特異的抗体と抗チラミン抗体・抗オクトパミン抗体との二重染色によって、コオロギ脳内のチラミン作動性神経細胞の全てでTDC2が検出されること、コオロギ脳内のオクトパミン作動性神経細胞はTDC2免疫要請細胞に含まれることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。配列特異的組換え酵素を利用した新規遺伝子導入法の開発については、当初に遺伝子導入効率の評価まで進める予定であったが、戻し交配に予想以上に時間がかかり、目標を一部達成できなかった。それ以外の実験(発現コンストラクトの作成、プロモーター領域の単離など)については、計画以上に実験が進展しており、遺伝子導入法が確立出来次第、本研究に必要な遺伝子導入系統をすみやかに作成できる。そのため、当年度の実験は計画と一部ずれが生じたものの次年度の研究計画への大幅な変更なしに研究の研究の継続が可能であり、概ね順調に進んでいると言える。組替え酵素を利用した遺伝子導入法については今年度中に効率評価までを終わらせる予定であったが,野生型の組替え酵素遺伝子をもちいて遺伝子導入を試みたところ新規実験手法として十分な導入効率を達成することが出来なかった。
Raman光学活性に基づく生体内反応の立体構造ダイナミクスの観測

本研究は、ラマン光学活性(ROA)分光法を利用して光受容性タンパク質の反応中間体の立体構造を計測することを目的とした。オレンジカロテノイドタンパク質を対象として過渡的状態のROA測定に初めて成功し、その立体構造を解析した。種々の光受容性タンパク質の中間体に対してROA分光法を応用するために、低温ラマン測定による構造解析を進め、ROA分光法を適用できる良好な中間体のラマンスペクトルを得るに至った。タンパク質内の反応は「活性中心」と呼ばれるタンパク質内の特異な反応空間において実現され、その活性中心の構造情報を反応過程において取得することがタンパク質の反応機構を解明するうえで極めて重要となる。本研究では、溶液中の分子の3次元構造を取得可能なラマン光学活性分光法をタンパク質の活性中心に応用した。これまで観測が困難であった活性中心の3次元構造を反応過程において計測し、反応機構を明らかにすることが主眼である。初年度は、光受容性の微生物が持つカロテノイド結合型タンパク質およびレチナール結合型タンパク質を対象として、これらのタンパク質の始状態および反応中間体のラマン光学活性測定を行った。対象としたカロテノイド結合型タンパク質は、シアノバクテリアの光防護機構を担うオレンジカロテノイドタンパク質(OCP)である。OCPは光照射後に約10秒程度の寿命を持つ活性状態を生成し、この過渡的状態が光防護能を発現する。初年度において、OCPの活性状態のラマン光学活性測定に成功し、結晶構造と量子化学計算を利用した構造解析によって、X線結晶構造解析から提案されたOCPの活性化機構が溶液中においても拡張できることを実証した。この結果は、過渡的状態のラマン光学活性を測定した初の成功例となった。また微生物のレチナール結合型タンパク質を対象とした研究では、バクテリアの光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシン(BR)を用いた。このタンパク質の光反応中間体はマイクロ秒あるいはミリ秒程度の短い寿命を持つため、中間体を低温下で補足する必要がある。低温下での安定かつ高効率なラマン光学活性測定に適した散乱円偏光方式の実験装置を新たに作成し、BRを用いたテスト測定を行った。主眼であったタンパク質の反応中間体のラマン光学活性測定を、微生物のカロテノイド結合型タンパク質に対して実現し、反応機構に直結した研究成果を得た。現在、寿命が数秒程度の反応中間体についてはラマン光学活性測定が可能である。しかし、当初予定とした短寿命な中間体に対する低温測定については十分な信号強度でラマン光学活性スペクトルを得るに至っておらず、装置改良とテスト測定を行っている。本研究は、ラマン光学活性(ROA)分光法を用いて光受容タンパク質の活性部位を反応過程(始状態→中間体→生成物)において計測し、時々刻々と変化する反応分子の立体構造を観測することを目的とした。初年度は、オレンジカロテノイドタンパク質の過渡的な活性状態のROA測定に成功し、本年度の初めにこの研究成果をJournal of the American Chemical Societyに公表した。しかし、オレンジカロテノイドタンパク質だけでなく、より広範な光受容タンパク質に対してこのような反応の中間状態のROA測定を行うにはラマン光学活性装置の安定化と効率化が必要であった。そこで、本年度はラマン光学活性装置の改良から取り組み、測定方式を散乱円偏光(SCP)方式へ改良した。その結果、従来の装置では測定が困難であった複数の微生物型ロドプシンについてROAスペクトルを取得し、タンパク質環境を考慮した量子化学計算を利用して活性部位の構造解析を進めた。また本年度も継続して光受容タンパク質の低温ラマン測定を行った。低温下では種々の光受容タンパク質の反応中間体を安定に補足することができる。測定条件を見直すことで、昨年は得ることができなかった微生物型ロドプシンの初期反応中間体のラマンスペクトルが得られるようになり、これまで報告がない複数の微生物型ロドプシンの初期反応中間体について良好なラマンスペクトルを得た。なかにはラマン信号強度が強い中間体も見出したため、低温補足法を用いたROA測定が現実的な段階に至った。低温下におけるタンパク質反応中間体のラマン光学活性測定が課題である。試料を極低温にすることで、常温では寿命がミリ秒以下の中間体の測定も可能になり、測定対象となる反応中間体を大幅に広げることができる。しかし、低温測定のためにクライオスタットを用いた場合、試料周りの集光が悪くなるために十分な信号強度を得ることができていない。検出系の光の損失をいかに抑えるかが低温測定の実現には重要となるため、低温測定に特化したレンズ分光器(あるいはプリズム分光器)の導入を検討している。また、初年度にカロテノイド結合型タンパク質がラマン光学活性測定の恰好の対象となることを見出したため、他種のカロテノイド結合型タンパク質についても研究を推進する。物理化学本年度予定した消耗品を購入した結果、約5万円の余りを生じた。次年度に測定を予定する試料に関連した試薬等の消耗品の購入に充てる