hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
養分制限を解除したウダイカンバにおけるマスティング資源の配備様式

可能性糖類の濃度は雄花で高く(10%、平均値、以下同)、幹や根の木部で低かった(< 3%)。デンプン濃度はいずれの部位も1%以下で、相対的に高いのは根木部(0.83%)、低いのは幹木部(0.21%)だった。施肥処理による差異は、雄花における可溶性糖類と根木部におけるデンプンに認められ、どちらも養分制限個体の方が高濃度であった。全窒素・炭素濃度については測定中である。種子成熟に用いる資源における貯蔵物質の寄与度を明らかにするため、豊作年であった当年度に安定同位体標識実験を行った。種子成熟期間である7月末に資源貯蔵量調査対象個体のうち一部個体(養分飽和個体と養分制限個体に対し各2個体)の根元に安定同位体窒素を散布し、約1ヶ月後に分析試料を採取した。採取部位は資源貯蔵量調査に準ずる。また繁殖量の経年変化を測定するため、林内にリタートラップを設置し、継続測定中である。豊凶現象の至近要因を説明する資源制限仮説に基づき、豊凶現象と連動する貯蔵資源の種類と貯蔵部位を明らかにするため、ウダイカンバ樹体内に貯蔵された資源量の経年変化を測定した。1974年に植栽され、植栽4年後より連年施肥(NPK)下で育成した施肥個体群と隣接林分において無施肥で育成した対照個体群の各10個体から2011年(大豊作)・2012年(大凶作)・2013年(凶作)・2014年(豊作)の展葉開始前に、また各5個体から2012-2014年の展葉終了後、盛夏、落葉直前の4回に樹体(根、幹、枝、葉、葉芽、繁殖器官)を採取し、各部位の非構造性炭水化物濃度(NSC)をフェノール硫酸法(可溶性糖類)および酵素を用いた加水分解法(デンプン)により、また全炭素窒素濃度(N)を乾式燃焼法により測定した(一部測定中)。施肥個体群はNが高くNSCが低い傾向が認められたが、豊凶や経年変化のパターンに違いは認められなかった。繁殖の有無と量は前年の盛夏以降落葉前に決まると推定され、豊凶と連動する年々変動を示した貯蔵資源は幹木部のNSCだった。幹木部のNSCは展葉終了後に低下して生育期間中に漸増する季節変動を示しつつ、大豊作年から時間が経過するにつれて濃度が高まる傾向が認められた。開花前年の落葉期までに作り終えられる雄花に対する投資資源は大きく、雄花のNSC量とN量は前年当年枝に対して大豊作時(2011年開花)には各々2.6倍と1.9倍、豊作時(2014年開花)には0.9倍と0.8倍に達した。展葉開始前の前年当年枝では開花年でNSC濃度が低い傾向も認められ、雄花が貯蔵NSCや当年NSCの強力なシンクとなっていると推察された。豊凶現象の至近要因を説明する資源制限仮説に基づき、豊凶現象と連動する貯蔵資源の種類と貯蔵部位を明らかにするため、ウダイカンバ樹体内に貯蔵された資源量の経年変化を大豊作(2011年)と豊作(2014年)を含む5年間に渡って測定した。1974年に植栽され、植栽4年後より連年施肥下で育成した施肥個体群と対照個体群(無施肥)を材料とし、樹体各部位の非構造性炭水化物濃度(NSC)と全炭素窒素濃度(N)を測定した。大豊作時のN投資量(雄機能15kgN/ha、雌機能3.6kgN/ha)は平年時葉窒素量の20%と5%に、NSC投資量(雄機能1.2tNSC/ha、雌機能0.4tNSC/ha、呼吸は含まない)は光合成産物量の10%と3%に相当した。施肥は各部位のN濃度を0.2%程度高めたが、豊凶周期と大豊作時の繁殖投資量には影響しなかった。また雄投資Nは開花年の葉量減少(3.2t/ha→2.6t/ha)で補償され、樹体内の貯留N資源(葉芽3.5kgN/ha、若年枝(ca.< 7年枝)30 kgN/ha、根<15kgN/ha)に相応する減少は認められなかった。豊凶と連動する年々の資源蓄積がNSCで認められた。樹体内NSC貯留(落葉期)の約50%を占める幹木部(e.g.,根30%、枝系20%)のNSC濃度は2%の季節変動を伴いながら、凶作年間に徐々に高まり、貯蔵資源量が豊作後の1.3倍(0.45tNSC/haの増加)を超えた時点で再び豊作となった。
ハイパーブランチポリシロキサンポリマーブラシの作製と環境材料への応用

固体表面上に機能性高分子を密なブラシ状に形成させるポリマーブラシが注目を集めている。本研究ではハイパーブランチポリシロキサン(ハイパーブランチポリシロキシシラン)(HBPS)を使って、無機固体表面上に新たな機能性ポリマーブラシを構築する方法を開発し、これを有機溶媒を使用しない「グリーンクロマトグラフィー」等に応用することを目的とする。本年度は昨年度に引き続き末端官能基化されたHBPSの合成を行った。HBPSはそれ自身ガラスやシリカ表面と強い相互作用を有するが、より強固にポリマーブラシが固体表面に結合することを目的に、HBPSの要部または周辺末端部にトリエトキシシリル基を導入した。これらをシリコンウェファー上に吸着して動的接触角を測定した結果、要部にトリエトキシシリル基を導入したときには、空気中で疎水的であった表面が水中で親水性になるという興味ある現象が観察された。これは、要部でHBPが固体表面に固定化されたときには、空気中では固体表面全体を被うために疎水性を示すが、水中に浸積すると、親水性の固体表面と水が接触して親水を示す。一方、周辺末端部で固体表面と固定したときには、固定点の数が多いので、水中でも水と固体表面との接触がなく、疎水性を維持するものと考えられる。また、ガラス表面にHBPSをポリマーブラシとしてコートし、その表面を使用してビオチンタンパクを固定したバイオチップの作製を行ったところ、効率よく固定されることを見出した。これはHBPSの新たな展開として注目できる。固体表面上に機能性高分子を密なブラシ状に形成させる方法が注目を集めている。これは広い意味でポリマーブラシと呼ばれている。本研究ではハイパーブランチポリシロキサンを使って、無機固体表面上に新たな機能性ポリマーブラシを構築する方法を開発し、これを環境ホルモン除去用のフィルターや有機溶媒を使用しない「グリーンクロマトグラフィー」に応用することを目的とする。本年度はまず、末端官能基化されたハイパーブランチポリシロキサンの合成を行った。以前より報告されているハイパーブランチポリシロキサンの合成法として、オレフィンとヒドロシランを持つAB_2モノマーの自己縮合による方法があるが、この場合には末端オレフィンのハイパーブランチポリシロキサンが合成できる。オレフィンはさらなる官能基変換が可能であり、アルキル基やパーフルオロアルキル基等の疎水性基、水酸基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基等、種々の末端官能基を有するハイパーブランチポリシロキサンを合成できる。本年度は水酸基、チオール基、カルノキシル基、エポキシ基、アルキル基、パーフルオロアルキル基、トリエトキシシリル基の導入に成功した。さらに、末端オレフィンを使用してポリマーをブロックとして導入することができるが、ATRP方によるリビングラジカル重合を使用して、N-イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合に成功した。次にシロキサンポリマーブラシの作製と評価を行った。以上のように合成した末端官能基化さされたハイパーブランチポリシロキサンを平滑なガラス表面に塗布する、あるいはハイパーブランチポリシロキサン溶液にガラス基板を浸積するだけでポリマーブラシを生成させることができる。浸積溶液の濃度や浸積時間等の詳細な検討を行った結果、効率よく吸着すること認めた。本年度は昨年度に引き続き末端官能基化されてHBPSの合成を行った。昨年度まではAB2形のモノマーを使用していたが、本年度はより官能基数が稼げるAB3形モノマーの合成と重合を行い。AB2同様にHBPSの合成が可能であること、また末端官能基化も同様に進行することを確かめた。

一方、キュービックポリセスキオキサン(POSS)をHBPSの末端に導入したところ、高い結晶性を有するHBPSが得られた。このものは約100°C低いPOSSの融点と約100°C高いHBPSのTgを示し、そのX線回折像は末端に導入したPOSSと同じであった。これは、結晶性のハイパーブランチポリマーの最初の例であると思われる。HBPSはガラスやシリコン基板等の無機酸化物表面によく吸着することを昨年報告したが、これは物理吸着であり、特に水に対しては容易に剥離が起こることを認めた。そこで、要部や末端にトリエトキシシリルを導入することで、無機酸化物表面との吸着が化学吸着となり、非常に強固となることを確かめた。導電性高分子形コンデンサーは高性能小型コンデンサーとして市販されているが、より高い容量とする目的で、HBPSをアルミ酸化物絶縁体表面に塗布したところ、容量の大きな改善が見出せた。これは、HBPSがアルミ酸化物方面の凹凸を埋めて、その表面に導電性高分子層が滑らかに接触するためであると考えられる。固体表面上に機能性高分子を密なブラシ状に形成させるポリマーブラシが注目を集めている。本研究ではハイパーブランチポリシロキサン(ハイパーブランチポリシロキシシラン)(HBPS)を使って、無機固体表面上に新たな機能性ポリマーブラシを構築する方法を開発し、これを有機溶媒を使用しない「グリーンクロマトグラフィー」等に応用することを目的とする。本年度は昨年度に引き続き末端官能基化されてHBPSの合成を行った。HBPSはそれ自身ガラスやシリカ表面と強い相互作用を有するが、より強固にポリマーブラシが固体表面に結合することを目的に、HBPSの要部または周辺末端部にトリエトキシシリル基を導入した。これらをシリコンウェファー上に吸着して動的接触角を測定した結果、要部にトリエトキシシリル基を導入したときには、空気中で疎水的であった表面が水中で親水性になるという興味ある現象が観察された。これは、要部でHBPが固体表面に固定化されたときには、空気中では固体表面全体を被うために疎水性を示すが、水中に浸積すると、親水性の固体表面と水が接触して親水を示す。一方、周辺末端部で固体表面と固定したときには、固定点の数が多いので、水中でも水と固体表面との接触がなく、疎水性を維持するものと考えられる。また、ガラス表面にHBPSをポリマーブラシとしてコートし、その表面を使用して日落ちんタンパクを固定したバイオチップの作製を行ったところ、効率よく固定されることを見出した。これはHBPSの新たな展開として注目できる。
VAMP7を介した膵β細胞のミトコンドリア品質管理と糖尿病発症機序の解明

VAMP7は膜融合を仲介する、いわゆるSNAREタンパク質である。膵β細胞においてVAMP7はオートファゴソーム形成に関与することにより、機能不全ミトコンドリアの除去に関わることが我々の研究により明らかになっている。VAMP7によるオートファゴソーム形成の制御機構について検討した昨年度までの研究により、1)VAMP7はオートファジー関連タンパク質であるAtg9aと同じ小胞上に局在し、オートファゴソーム形成に関与する、2)VAMP7はHrb、SNAP-47、Syntaxin16と相互作用することによりオートファゴソーム形成を制御することを明らかにした。そこで本年度はこれらの結果を論文にまとめて発表するために必要な研究を行った。Atg9aをノックダウンすると、VAMP7、Hrb、SNAP-47、Syntaxin16をノックダウンした時と同様、細胞内に機能不全ミトコンドリアが蓄積し、グルコース刺激依存的なインスリン分泌が減弱することを明らかにした。つぎに、オートファジーによって分解されるミトコンドリアを可視化する蛍光タンパク質プローブを構築し、可視化解析を行った。その結果、Atg9a、Hrb、SNAP-47、Syntaxin16をノックダウンすると、オートファジーによるミトコンドリアの分解が抑制されることを明らかにした。さらに、SNAP-47とSyntaxin16の一部がVAMP7およびAtg9aと同じ小胞膜上に局在することを免疫染色法により明らかにした。昨年度までに得られていた結果とあわせ、これらの結果をEndocrinology誌に論文として発表した。また、オートファジーを介したミトコンドリアの分解を可視化するプローブを膵β細胞に発現するマウスを開発し、機能不全ミトコンドリアの分解活性を可視化する実験系の構築に成功した。VAMP7がAtg9aと協同してオートファゴソーム形成にはたらくこと、またVAMP7がHrb、SNAP-47、Syntaxin16と相互作用することによりオートファゴソーム形成にはたらくことについて論文にまとめることができた。また、機能不全ミトコンドリアの分解活性をマウスにおいて可視化する実験系の構築に成功した。高脂肪食飼育したり、糖尿病モデルマウスと交配することにより、機能不全ミトコンドリアの分解活性を可視化できるマウスにおいて糖尿病を誘導し、機能不全ミトコンドリアの分解・蓄積のバランスと糖尿病発症の関連について解析を行う予定である。VAMP7は膜融合を仲介するいわゆるSNAREタンパク質である。膵β細胞においてVAMP7はオートファゴソーム形成に関与することにより、機能不全ミトコンドリアの除去に関わることが、我々の研究により明らかになっている。しかしながら、VAMP7がどのようにしてオートファゴソーム形成に関与するのかについては不明であった。そこで本年度はVAMP7によるオートファゴソーム形成の制御機構について解析を行った。昨年度までに行った解析から、VAMP7はリサイクリングエンドソームに局在することが明らかとなった。そこで、本年度はリサイクリングエンドソームに局在するオートファジー関連分子であるAtg9aに着目して生化学的、細胞生物学的解析を行った。その結果、VAMP7はAtg9aと同じ小胞膜上に局在することを見いだした。次に、VAMP7と相互作用する分子について解析を行った。その結果、VAMP7のLonginドメインに結合するHrb、VAMP7のSNAREモチーフに結合するSyntaxin16およびSNAP-47がVAMP7依存的なオートファゴソーム形成に関与することを見いだした。HrbはVAMP7がAtg9a小胞に局在するのに重要な役割を果たし、Syntaxin16とSNAP-47はVAMP7がAtg9a小胞に局在した後の膜融合に重要な役割を果たしていることを見いだした。膵β細胞由来の株化細胞であるMin6細胞においてHrb、Syntaxin16およびSNAP-47をノックダウンすると、機能不全ミトコンドリアが蓄積し、グルコース刺激依存的なインスリン分泌の減弱が観察された。これらの結果から、VAMP7はHrb、Syntaxin16およびSNAP-47と相互作用することによりオートファゴソーム形成を制御すると結論した。Atg9aに着目することにより、VAMP7によるオートファジーを介した機能不全ミトコンドリア除去機構の分子基盤を明らかにできた。

さらに、SNAP-47とSyntaxin16の一部がVAMP7およびAtg9aと同じ小胞膜上に局在することを免疫染色法により明らかにした。昨年度までに得られていた結果とあわせ、これらの結果をEndocrinology誌に論文として発表した。また、オートファジーを介したミトコンドリアの分解を可視化するプローブを膵β細胞に発現するマウスを開発し、機能不全ミトコンドリアの分解活性を可視化する実験系の構築に成功した。VAMP7がAtg9aと協同してオートファゴソーム形成にはたらくこと、またVAMP7がHrb、SNAP-47、Syntaxin16と相互作用することによりオートファゴソーム形成にはたらくことについて論文にまとめることができた。また、機能不全ミトコンドリアの分解活性をマウスにおいて可視化する実験系の構築に成功した。昨年度までの研究により、VAMP7によるオートファゴソーム形成制御の分子機構が明らかとなった。今後は、糖尿病モデルマウスを用いた実験を行い、機能不全ミトコンドリアの蓄積と糖尿病発症の関連について解析をする予定である。高脂肪食飼育したり、糖尿病モデルマウスと交配することにより、機能不全ミトコンドリアの分解活性を可視化できるマウスにおいて糖尿病を誘導し、機能不全ミトコンドリアの分解・蓄積のバランスと糖尿病発症の関連について解析を行う予定である。VAMP7がAtg9aと共にはたらくことでオートファゴソーム形成を制御することを論文にまとめる過程で、見込んでいた実験の一部を行わなくて良いと査読者から指摘されたため。今年度の実験に必要な消耗品の購入に使用する予定。
ノックアウトラット作製が可能なラットES(胚性幹)細胞の樹立

これまでに、ラットES細胞を樹立するのに適したステージの解析を行ってきた。また、複数のフィーダー細胞を検討し、初代培養と継代培養では異なる細胞種をもちいることが有効である事を見出した。これらの知見を基に改良したラット胚特有のES細胞樹立法により、ES細胞の性質を有した細胞を得ることが出来た。本研究において最終目標としているのは、マウス同様に生殖系列に寄与するES細胞である。そこで、これらの細胞をラットES様細胞と位置づけ、キメラ胚を作製した。キメラ胚のマーカーとして緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子を導入した。このGFP陽性ラットES様細胞は、ES細胞の未分化状態マーカーであるOct-4を発現しており、かつ継代により長期間の培養が可能であった。次にこれらの細胞を、マイクロマニピュレーターをもちいて胚盤胞腔に注入することでキメラ胚を作製した。この胚を偽妊娠状態のレシピエント雌ラットに胚移植を行ったところ、産子を得ることが出来た。しかしながら、産子にはGFPの蛍光が認められなかった。胎盤や卵黄嚢、羊膜といった胚体外の組織においてもGFPの蛍光を認めることが出来なかった。そこで、GFP陽性ラットES様細胞を胚盤胞腔に注入後、胚移植直前まで培養したキメラ胚におけるOct-4発現を解析したところ、ホスト胚の内部細胞塊では発現していたが、GFP陽性細胞ではOct-4発現が認められなかった。これらの結果は、培養に伴いホスト胚の胚盤胞腔内でOct-4陽性ラットES様細胞が多分化能力を消失し、結果として胚体のみならず、胚体外組織へもGFP陽性ラットES様細胞の寄与がなされていないことを示唆している。本研究では、ラットES細胞の樹立を目標とした。これまでのラットES細胞樹立の試みではマウスの方法がそのまま用いられてきた。しかしながら、マウスとラットでは、着床前初期胚発生が異なることから、ラット胚の特徴を考慮したES細胞の樹立系を確立していく必要がある。そこで本研究では、ラットES細胞樹立に必要な要素のうち、フィーダー細胞の組み合わせとラット胚におけるOct-4の発現動態の解析を行い、培養条件と胚のステージを決定し、ES細胞の樹立を試みた。初代培養において、ラット胚盤胞期胚の付着率および増殖率は、フィーダー細胞にラット胎子線維芽細胞(REF細胞)を用いた区でSTO細胞区よりも高かった。さらにREF細胞を用いた区でコロニーの高い増殖能が観察された。継代後はSTOを用いた区でコロニー形成率が高く、アルカリフォスファターゼ活性が検出された。しかしながら、継代数が増加するに従って、アルカリフォスファターゼ陽性細胞は減少し、継代数7以降は検出されなかった。胚におけるOct-4発現を解析した結果、桑実期胚ですべての細胞に強い発現が認められた。一方、胚盤胞期胚では内部細胞塊だけではなく、栄養膜細胞にも発現が観察された。次に、最適なフィーダー細胞の組み合わせとOct-4発現の高い桑実胚を用いてES細胞樹立を試みた結果、ES細胞の性質をいくつか有した細胞を得ることが出来た。本研究の結果、ラットにおいては胚盤胞期胚よりも桑実期胚の方がES細胞樹立に適していることが明らかになった。また、フィーダー細胞とOct-4発現の高い胚の組み合わせにより、ラットES細胞を樹立できる可能性が示唆された。生殖系列に寄与するES細胞はマウスのみで樹立されている。本研究では、疾患などの生理機能モデルとして重要であるラットのES細胞の樹立を目標としている。まず最適なフィーダー細胞と未分化マーカーの発現が高い胚ステージの組み合わせを検討した。その結果、初代培養においてはラット胎子線維芽細胞(REF細胞)を、継代培養にはSTO細胞を、それぞれ用いることが効果的であった。また、ES細胞の樹立に重要である、胚における未分化状態マーカー因子の発現動態を解析した。未分化状態マーカーとしてOct-4発現を解析したところ、桑実期胚ですべての細胞に強い発現が認められた。一方、胚盤胞期では内部細胞塊だけではなく、栄養膜細胞にも発現が観察された。そこで、前述のフィーダー細胞の組み合わせとOct-4発現の高い桑実期の胚を用いてES細胞樹立を試みたところ、ES細胞の性質をいくつか有した細胞を得ることが出来た。ラットのES様細胞は、継代培養を続ける過程で未分化能が失われることが報告されている。そこで、得られたラットES様細胞を出来るだけ早い時期で凍結保存した。得られたラットES様細胞が生殖系列に寄与するかを検討するにはキメラを作製する必要がある。しかしながら、ES様細胞と胚のキメラ個体を作出し、毛色などにより生殖系列への寄与を判定するには長い期間を要する。それに対し、マーカー遺伝子を導入後、着床後の始原生殖細胞への寄与を検討すれば大幅な期間短縮が出来る。そこで、ラットES様細胞への緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子の導入法を検討した。その結果、細胞増殖に影響せず、GFP陽性細胞の長期継代が可能な遺伝子導入法を作出することができた。

そこで、これらの細胞をラットES様細胞と位置づけ、キメラ胚を作製した。キメラ胚のマーカーとして緑色蛍光蛋白質(GFP)遺伝子を導入した。このGFP陽性ラットES様細胞は、ES細胞の未分化状態マーカーであるOct-4を発現しており、かつ継代により長期間の培養が可能であった。次にこれらの細胞を、マイクロマニピュレーターをもちいて胚盤胞腔に注入することでキメラ胚を作製した。この胚を偽妊娠状態のレシピエント雌ラットに胚移植を行ったところ、産子を得ることが出来た。しかしながら、産子にはGFPの蛍光が認められなかった。胎盤や卵黄嚢、羊膜といった胚体外の組織においてもGFPの蛍光を認めることが出来なかった。そこで、GFP陽性ラットES様細胞を胚盤胞腔に注入後、胚移植直前まで培養したキメラ胚におけるOct-4発現を解析したところ、ホスト胚の内部細胞塊では発現していたが、GFP陽性細胞ではOct-4発現が認められなかった。これらの結果は、培養に伴いホスト胚の胚盤胞腔内でOct-4陽性ラットES様細胞が多分化能力を消失し、結果として胚体のみならず、胚体外組織へもGFP陽性ラットES様細胞の寄与がなされていないことを示唆している。
14族典型元素と6族遷移金属間の結合形成反応に関する研究

モリブデンとケイ素の結合を持つ化合物を合成する目的で、[MoH_4(Ph_2PCH_2CH_2PPh_2)_2](1)とフェニルシランとの反応をトルエン中還流下で行った。その結果、単なるSi-H結合の開裂を伴う酸化的付加にとどまらず、C-H結合の活性化を伴う二環キレートの同時生成という珍奇な現象が見出され、P^P^Si^P^P骨核からなる新規5座配位子を有するトリヒドリド錯体2と、それにさらに1分子のフェニルシランが酸化的付加をしたジシリル型の錯体3が生成した。2のタイプの錯体は、フェニルシランの代わりにo-またはp-トリルシランを用いても同様に生成した。1とジフェニルシランまたはメチルフェニルシランとの反応では、一つのC-H結合のみの活性化を伴い、P^P^Si骨核からなる3座配位子をもつヒドリド錯体4の生成が認められた。これら一連の反応に見られる、Mo-Si結合とSi-C結合の同時生成反応の機構については、シリレン中間体を経由するルートと、ホスフィン配位子のフェニル基の中心金属へのオルソメタル化中間体を経由するルートの二通りが考えられるが、現時点ではそのいずれかは決められていない。ここで得られた新規トリヒドリド錯体2は、その特異な骨核を保ったまま種々の試薬と反応して新たなモリブデン(IV)錯体へと誘導されることが分かった。例えば、2は穏和な条件で酸素と速やかに反応してペルオキソ型の二酸素モリブデン(IV)錯体を生成し、また、カルボン酸との反応では、カルボキシラト配位子が単座で配位したモリブデン(IV)錯体の生成が認められた。また、ヨウ化メチル、二硫化炭素などとの反応でも新規錯体の生成が見出されており、Si原子を含む特異な5座配位子でブロックされた場の反対側に反応性に富む配位場を提供している点で、これら一連の錯体の反応性には興味がもたれる。
海洋混合層変動に着目した南北モード現象に関する研究

現象の本質を担う要素のみで構成された理論モデルの構築および解析により、熱帯大気海洋結合系に、従来認識されていたWind-Evaporation-SST (WES)フィードバックに加えて、Wind-induced turbulence-Mixed layer-SST (WIMS)フィードバックおよびWind-Evaporation-Mixed layer-SST (WEMS)フィードバックという似て非なる二種のフィードバック過程の存在を新たに示した。また、これらのフィードバックは、WES feedbackと同程度以上の強度を持つこと、すなわち瑣末なフィードバック過程はないことを明らかにした。そして観測データや気候モデルの解析から、大西洋南北モードの成長において、現実にもこれらのフィードバック過程が働いている可能性が極めて高いことを確認した。上記の結果をまとめた論文を専門誌Journal of Climateに投稿した。さらに、海面水温偏差に由来する降水偏差が、海洋成層構造の変化を通じて初期の海面水温偏差を一層強化するという新たな熱帯大気海洋結合フィードバックに関する理論モデルも構築した。また、より現実的な状況下において、この降水偏差を伴うフィードバック過程が大西洋南北モードの発達にどの程度寄与しているのかを調べるための、気候モデル実験のデザインを決定した。具体的には、大気海洋モデルにおいて、大気は海洋の変動を感じるが、その一方で海洋は大気の変動のうち、淡水フラックスの一部を感じることができない実験を行う。実験環境の開発も開始した。当初の予定通り、WIMSフィードバックおよびWEMSフィードバックに関する成果をJournal of Climateに投稿し、年度内は叶わなかったものの受理されるに至った。当初の計画に加え、さらに新たな熱帯大気海洋結合フィードバックの着想に至り、その理論モデルを構築した。さらに、この新たなフィードバック過程に関する数値モデル実験の仕様決定まで至った。まず、より現実的な状況下において、降水偏差を伴う新たなフィードバック過程が大西洋南北モードの発達にどの程度寄与しているのかを調べるための、気候モデル実験環境の開発を行う。具体的には、大気海洋モデルにおいて、大気は海洋の変動を感じるが、その一方で海洋は大気の変動のうち、淡水フラックスの一部を感じることができないような数値実験を行い、結合系の(海面水温)変動における、降水偏差を含む淡水フラックスの寄与を定量的に評価する。産業や社会生活に大きく影響する干ばつや豪雨等の極端現象の母胎となる気候変動現象のメカニズムを理解する事は、その予測に向けた重要な課題である。例えば、熱帯大西洋で最も卓越する大西洋南北モードは、ハリケーン発生数の変動を通じて周辺国に災害をもたらすことが知られている。この赤道(より正確には熱帯収束帯の平均的な位置)を対象軸として正と負の海面水温(SST)偏差を伴う大西洋南北モードの成長には、エルニーニョ/南方振動や北大西洋振動等の外部強制のほか、風-蒸発-海面水温(WES)フィードバックと呼ばれる、熱帯大西洋に内在する大気海洋結合過程が重要となることが指摘されている。本研究では、現象の本質を担う要素のみで構成された理論モデルを構築/解析することで、熱帯大西洋には「風-混合層-海面水温フィードバック」及び「風-蒸発-混合層-海面水温フィードバック」という、これまで全く認識されていなかった二つのフィードバックが存在しうることを示した。また、これらのフィードバックは、従来認識されていた「風-蒸発-海面水温フィードバック」と比べて同程度、あるいはそれ以上の強度を持つことが明らかになった。つまり、本研究でその存在を示した二つの大気海洋結合フィードバック過程は、従来のフィードバック過程よりも、より異常気象の誘発に寄与する。さらに、観測データおよび、気候モデルを用いたシミュレーション結果を解析することにより、本研究で発見したフィードバック過程が、実際に大西洋南北モードの生成に働いていることが明らかになった。本研究では大西洋をターゲットとしたが、南北モード現象は熱帯太平洋にもその存在が報告されており、今回明らかになった「風-混合層-海面水温フィードバック」及び「風-蒸発-混合層-海面水温フィードバック」は、他の海域への応用可能性も持つものである。理論モデルの構築および解析により、当初の予定通り、熱帯大気海洋結合系に二種の新たなフィードバック過程が存在することを示すことができた。また、これらのフィードバックは、従来認識されていたフィードバックと同程度以上の強度を持ち、すなわち瑣末なもではないこと、そして実際、観測データや気候モデルの解析から、現実にもこれらのフィードバック過程が働いていることが確認され、当初の想定通りの結果を得ることができた。

具体的には、大気海洋モデルにおいて、大気は海洋の変動を感じるが、その一方で海洋は大気の変動のうち、淡水フラックスの一部を感じることができない実験を行う。実験環境の開発も開始した。当初の予定通り、WIMSフィードバックおよびWEMSフィードバックに関する成果をJournal of Climateに投稿し、年度内は叶わなかったものの受理されるに至った。当初の計画に加え、さらに新たな熱帯大気海洋結合フィードバックの着想に至り、その理論モデルを構築した。さらに、この新たなフィードバック過程に関する数値モデル実験の仕様決定まで至った。まずは初年度で得られた成果を論文にまとめ、専門誌に投稿する。大気大循環モデルや、海洋混合層モデル、海洋大循環モデルを用いた各種数値実験から、より現実的な状況下におけるフィードバック過程の時空間的特性を調べる。具体的には、海洋力学の役割や季節変化の役割に加え、海域ごとの特性、大陸の地理的分布の役割等の詳細を調査する。海洋混合層モデルは必要に応じて自ら構築する。まず、より現実的な状況下において、降水偏差を伴う新たなフィードバック過程が大西洋南北モードの発達にどの程度寄与しているのかを調べるための、気候モデル実験環境の開発を行う。具体的には、大気海洋モデルにおいて、大気は海洋の変動を感じるが、その一方で海洋は大気の変動のうち、淡水フラックスの一部を感じることができないような数値実験を行い、結合系の(海面水温)変動における、降水偏差を含む淡水フラックスの寄与を定量的に評価する。論文投稿料として一定額を確保していたが、年度内の投稿・出版が間に合わなかったため次年度使用額が生じた。次年度中には論文出版が見込まれるので、その際に使用する予定である。論文出版料として一定額を確保していたが、当該年度内に出版されなかっため次年度使用額が生じた。現在印刷中であるため、出版時に使用する予定である。
分子生物学的手法を用いた齧歯類由来バルトネラ属菌の生態解明に関する研究

わが国の小型哺乳類685頭のうち176頭(25.7%)からBartonella属菌が分離された。陽性個体はいずれも郊外で捕獲した個体であった。2007-2008年に米国のホームレスから採取したコロモシラミならびにアタマジラミのそれぞれ33.3%(11/33人),および25%(3/12人)から,B.quintanaの遺伝子が検出された。また,タイの齧歯類から採取したダニとツツガムシ類の30検体(73.2%)からB.tamiae DNAが検出された。ペット用の輸入齧歯類28種546頭のうち,17種142頭(26%)からBartonella属菌が分離された。リス科動物は,B.washoensisを31.7%(45/142),B.grahamiiを8.5%(12/142)保菌していた。これらの動物から分離された6系統の12株は全て新種のBartonella属菌であった。わが国の小型哺乳類に分布する病原性Bartonella属菌の生態を明らかにすることを目的とし,北海道,青森,群馬,神奈川,静岡,石川,長野,島根,徳島,愛媛,鹿児島,沖縄で捕獲した合計685頭の小型哺乳類(アカネズミ224頭,ヒメネズミ35頭,エゾヤチネズミ17頭,オキナワハツカネズミ7頭,クマネズミ297頭,ドブネズミ105頭)のBartonella属菌の分布状況,保有菌種ならびに宿主特異性について細菌学的,分子生物学的手法を用いて検討した。176頭(25.7%)の小型哺乳類からBartonella属菌が分離された。郊外で捕獲した個体の51.8%(176/340)からBartonella属菌が分離されたのに対し,市街地で捕獲した個体からは同菌は分離されなかった。また,アカネズミの60.3%(135/224),ヒメネズミの54.3%(19/35),エゾヤチネズミの23.5%(4/17),クマネズミの6.1%(18/297),が陽性であったのに対し,オキナワハツカネズミ(7頭)とドブネズミ(105頭)からはBartonella属菌は分離されなかった。分離されたBartonella属菌は系統解析により7つのグループに分類され,5つのグループはそれぞれB. grahamii, B. taylorii, B. rattimassiliensis, B. phoceensisおよびB. tribocorumのクラスターに分類された。他の2つのグループは,新種のBartonella属菌であると思われた。2004年から2006年の間に,世界の計8地域から輸入されたペット用齧歯類27種516頭のBartonella属菌の保有状況について検討した。Bartonella属菌の分離は,各個体の血液を5%兎血液加ハートインフージョン培地で35°C,5% CO_2下で2週間培養した。Bartonella属菌を疑う分離株からDNAを抽出し,rpoBおよびgltA領域を標的としたPCRによりBartonella属菌であることを確認し,両領域のDNAシーケンス解析により種の同定を行った。また,分離株の塩基配列からNJ法で系統樹を作成し,クラスター解析を行った。今回調査した輸入齧歯類27種516頭のうち,17種142頭(27.5%)からBartonella属菌が分離された。7種のリス科動物からは,人に心内膜炎を起こすB.washoensisが,4種のリス科動物からは人に視神経網膜炎を起こすB.grahamiiがそれぞれ31.7%(45/142),8.5%(12/142)から分離された。また,6種のネズミ科動物からは,人に心内膜炎を起こすB.elizabethaeが18.3%(26/1421から分離された。さらに,陽性個体の41.5%(59/142)が新種と思われるBartonella属菌を保菌していることが明かとなった。以上から,輸入齧歯類には,人に病原性のあるBartonella属菌やわが国の野生齧歯類には分布していない菌種が分布していることが明らかとなった。

今後,分離されたBartonella属菌の病原性や伝播経路の解明,ならびに飼い主および関係者への啓発が必要と思われた。前年度までに,2004年から2006年の間に,世界の計8地域から輸入されたペット用齧歯類27種516頭についてBartonella属菌の保有状況について検討し,17種142頭(27.5%)からBartonella属菌が分離され,陽性個体の41.5%(59/142)が新種と思われるBartonella属菌を保菌していることを明かとした。本年度は,ペット用齧歯類から分離された新種と思われる6系統の株(各系統から2株,計12株)について細菌学的,分子生物学的に性状解析を行った。透過型電子顕微鏡解析では全株に線毛が観察され,野鼠を自然宿主とするB.alsatica,およびB.tribocorumと類似していた。生化学的性状および推定G+C含量(36.2-38.9mol%)は,全株が既存種と類似した性状を示した。gltA,rpoB領域における既存種との塩基配列の相同性は,全株でBartonella属菌の種を分ける基準値となる96.0%,95.4%よりも低く,16SrRNA,ftsZ,gltA,groEl,ribC,rpoB,16S-23S遺伝子間領域の連結配列による系統樹では,各分節が100%に近いブートストラップ値で支持される6つの系統に分岐された。以上から,ペット用齧歯類から分離された6系統の株は全て新種のBartonella属菌であると思われた。今後新種として登録する予定である。
「植物界」の新概念と新分類体系を構築する系統学的研究

一次共生植物が単系統であると示した既存のデータの再検討による再解析並びに自由性生活の無色ミドリムシ類PeranemaのESTデータの構築と利用を実施した結果、一次共生植物が単系統と解析されている原因が遺伝子進化速度が高い細胞内寄生虫や繊毛虫等の影響である可能性が示せた。また、色素体二次共生植物のクロララクニオン藻とミドリムシ藻で、それぞれ緑藻の二次共生以前の隠された紅藻の2または3次共生が核ゲノムの解析で明らかになり、二次共生植物の概念も刷新しつつある。色素体は太古のシアノバクテリアの一次共生に由来し、二次共生で様々な原生生物に伝搬した。緑色植物はシアノバクテリアと基本的に異なる色素組成をもつ点で同じ一次共生植物の紅色植物や灰色植物とは異なる。最近の研究では一次共生植物3群が単系統である場合と非単系統の場合があり、多くの議論がある。我々は真核植物の真の系統を推測するには進化速度が遅い遺伝子だけを用いて、ミトコンドリアを欠く寄生虫のような遺伝子進化の特異な生物を排除すべきであるという立場で系統解析を進めているが(Nozaki et al.2003, JME)、緑色植物の姉妹群と二次共生のハプト藻の系統的位置に関してはギャップの多い灰色植物(27%,全体8%)の有無で異なる結果であった(Nozaki et al.2007, MBE)。本年度はNozaki et al.(2007)の用いた進化速度の遅い19核遺伝子を用いて、ギャップを減少させて(灰色植物11.7%、全体6.9%)再解析した。また、灰色植物やハプト藻は系統樹の枝が短く寄生虫等の長枝の影響を受けていることが予想されたので(Nei 1996, Ann.Rev.Gennet.)、長枝OTUを排除した解析も実施した。その結果、紅色植物と灰色植物は"超"植物界の中で基部に位置し、緑色植物はハプト藻とストラメノパイル・アルベオラータからなる単系統群(クロムアルベオラータ)と姉妹群を形成し、この関係は色素体ターゲット遺伝子ispG、fabIそれぞれの共通の遺伝子置換からも推測された。Hackett et al.(2007, MBE)は核コード遺伝子を用いた大系統解析で、ミトコンドリアを欠くギアルディア等の寄生虫を含めた系統樹を構築しており、その結果は一次共生植物が単系統と解析している。本年度、彼らのデータからギャプが50%に近い灰色植物・クリプト植物や寄生虫等を排除し、EF-2を排除した再解析を実施した。その結果、紅色植物とエクスカバータがバイコンタの根元に位置するという上述の系統関係と基本的に一致した。2007年に我々が一次共生植物単系統説に反論を示して以来(Nozaki et al,2007,MBE)、真核植物と原生生物の多遺伝子系統解析の研究は高い支持率で一次共生植物を単系統とは解析しないのが一般的になって来た。これはハプト藻のゲノム-ESTデータの公開によることが多いと思われ、ハプト藻は一次共生植物と近縁であると解析される場合が多い(e.g.Hampl et al-2009,PNAS;Parfrey et al.2010,Syst.Biol.)。最近我々は進化速度の遅い核コード遺伝子だけを利用したギャップの少ないデータマトリックスを用いて系統解析した結果、ハプト藻は一次共生植物よりも不等毛植物・アルベオラータ(SA)に近縁であり、解析された統計的支持率はエクスカバータやアピコンプレクサの存在で低下した(Nozaki et al.2009,MPE)。しかし,この研究ではミドリムシ類は使用されていなかった。本年度は、新たに無色ミドリムシ類PelanemaのESTデータを新たに構築し、このデータと既存のEuglenaのESTデータ並びにゲノムデータが公開された不等毛植物EctcearpusとAurerococcusをNozaki et al.(2009)に加え,系統解析を実施した。その結果、ハプト藻の解析された系統的位置は細胞内寄生生物のアピコンプレクサの有無に左右され.アピコンプレクサと共に解析した場合は弱くSAに近縁、または緑色植物と姉妹群となり、アピコンプレクサを削除すると高い支持率でSAに近縁となった。一方Parfrey et al.(2010)のデータはミトコンドリアを欠くエクスカヴァータや微胞子虫を含むが、これらを代表とする細胞内寄生生物を削除して再解析した結果でも同様のハプト藻の系統的位置のゆらぎが得られた。

本年度は、ミドリムシ(学名Euglena gracilis)のゲノム情報を対象にして、東京大学医科学研究所のスーパーコンピュータを使った大規模分子系統解析プログラムを独自に構築し、祖先的原生生物、共生藻類、その他に由来すると考えられる遺伝子のグループに振り分ける解析を行うことで、この「その他」の遺伝子がどのような進化的由来を持つかを検証し、太古の遺伝子水平伝達の痕跡とも言うべき遺伝情報を抽出することを試みた。その結果、ミドリムシの核ゲノム(祖先的原生生物に由来する)には、他の藻類の持つ遺伝子と類似性を持つ遺伝子が多く保存されており、その中でも、紅藻に由来する葉緑体を持つ二次植物(ここでは紅色系二次植物と呼びます)と進化的に起源が近いと考えられる遺伝子が複数見つかってきた。これはミドリムシ藻の祖先で緑藻の二次共生以前の隠された紅色系二次植物の三共生の存在を示唆した。緑色系二次共生藻のもう一つの系統、クロララクニオン藻はミドリムシ藻とは独立した系統の宿主真核生物に緑藻が二次共生して誕生したと考えられるが、色素体共生由来の核コード遺伝子の中には緑色植物起源でないものがあることが最近のゲノム情報の解析から明らかになりつつある。Phosphoribulokinase(PRK)遺伝子は保存的でシアノバクテリアを祖先とする典型的な核コード光合成遺伝子であるが、先行研究では上記2系統から得られた遺伝子がともに緑藻起源でないことが示唆されている(Petersen et al.2006,JME)。しかし、解析されたサンプルがそれぞれで1種であったために、祖先段階の遺伝子水平伝達か最近の補食等による偶発的なものかが議論できなかった。本年度、我々は緑色系二次共生藻の2系統の種数を増大したPRK遺伝子の系統解析を実施した。その結果、系統的位置と挿入/欠損配列から、ミドリムシ藻綱の2属2種のPRKが黄色植物起源で、クロララクニオン藻綱の3属3種のPRKが紅藻起源であることが明らかになった。
末梢免疫寛容成立におけるカルシウムシグナルの役割の解明

制御性T細胞と樹状細胞におけるカルシウムシグナルに焦点をあて、末梢免疫寛容の成立のメカニズムを解析した。遺伝子欠損マウスの解析により、ストア作動性カルシウム流入が欠損した場合、胸腺における制御性T細胞の分化が前駆細胞の段階で阻害され、その結果免疫寛容が破綻することを明らかにした。樹状細胞においてカルシウムシグナルを欠損させた場合は、免疫寛容には変化は認められなかった一方、抗原投与などに対する免疫応答を制御していることを明らかにした。本研究の目的は、制御性T細胞(Treg細胞)や樹状細胞(DC)におけるカルシウム流入ーカルシウムシグナルの生理的な役割を、各細胞内レベルと細胞間レベルで解析し、カルシウムシグナルによる末梢自己免疫寛容の成立・維持の制御機構を解明することである。本年度は以下の解析を行った。1.ストア作動性カルシウム流入によるTreg細胞の分化制御機構について解析した。本年度は、ストア作動性カルシウム流入が、胸腺内Treg細胞分化のどの段階に関与しているのかを調べた。その結果、Foxp3陰性CD25陽性のTreg前駆細胞は存在することから、Treg細胞としての選択は正常であること、Foxp3の発現は誘導されるが、その後のFoxp3とCD25の発現上昇が阻害されていた。さらに、IL-2を用いて、Foxp3陽性CD25陽性のSTIM欠損Treg細胞を作製したが、このSTIM欠損Treg細胞は抑制機能を有していなかった。したがって、ストア作動性カルシウム流入はTreg細胞の増殖や機能的な成熟過程に重要であることが明らかとなった。この成果は、論文としてImmunity誌に発表した(13.研究発表、Oh-hora et al.)。2. Treg細胞とDCにおいて高発現している分子であるTbc1d4遺伝子のノックアウトマウスを作製した。その結果、ノックアウトマウスは正常に出生した。3.昨年度に作製したDC特異的なSTIM1とSTIM2の2重欠損マウスを用いて、樹状細胞におけるストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルの生理的な役割の解析を進めた。カンジダ菌を用いて真菌感染に対する防御反応を調べたところ、STIM欠損マウスは真菌に対する抵抗性が減弱していた。また、骨髄由来のSTIM欠損DCをザイモザンで刺激したところ、抗炎症生サイトカインであるIL-10の産生が増強されることを見いだした。本研究の目的は、制御性T細胞や樹状細胞(DC)におけるカルシウム流入ーカルシウムシグナルの生理的な役割を解明することである。1. DC特異的なSTIM1とSTIM2の2重欠損マウスを用いて、樹状細胞におけるストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルの生理的な役割の解析を引き続き行った。千葉大学・真菌センターとの共同研究によるカンジダ菌に対する真菌感染防御反応を調べたが、個体数を増やした結果、STIM欠損マウスの真菌に対する抵抗性に変化は認められなかった。2.骨髄由来のSTIM欠損BMDCを様々なリガンド刺激し、サイトカイン産生に対する影響を解析した。その結果、ザイモザン刺激によるDectin-1を介した応答では、STIM欠損BMDCからのIL-2産生が著明に減少していた。さらに、IL-12 p40産生も半減していた。これはより精製されたリガンドであるカードランを用いても同様であった。LPS刺激では、IL-6産生が半減していた。シグナル伝達経路を解析したところ、NFAT経路以外に、NF-kB経路の活性化に影響を認めた。3. DCのT細胞に対する支持能を解析するために、BMDCを様々なリガンドで刺激し、さらにOVAペプチドをパルスし、OVA特異的なTCRを持つOT-II CD4陽性T細胞と共培養を行った。その結果、共刺激分子の発現に影響は無かったが、T細胞の増殖に影響が認められた。これは、上清中のIL-2濃度が低下していたので、このことが原因だと考えられた。さらに、BMDCを刺激するリガンド依存的に、各ヘルパー細胞への分化に影響が認められた。以上の解析から、DCにおいてストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルは、DCを介した感染防御ではなく、DCによるT細胞の活性化において機能している可能性が示唆された。本研究の目的は、制御性T細胞(Treg細胞)や樹状細胞(DC)におけるカルシウム流入ーカルシウムシグナルの制御機構とその生理的な役割を、各細胞内レベルと細胞間レベルで解析し、カルシウムシグナルによる末梢自己免疫寛容の成立・維持の制御機構を解明することである。1.ストア作動性カルシウム流入によるFoxp3の発現制御機構について解析した。BrdUラベルを用いて、個体レベルで細胞を標識後に、Mx1-CreマウスとポリICを用いて、時期特異的にSTIM1とSTIM2を欠損させた。その結果、胸腺において新規に生成されるTreg細胞の数が著しく減る一方、末梢におけるTreg細胞はわずかに減少しただけであった。さらに、Foxp3の発現レベルも同程度であった。

以上の結果から、ストア作動性カルシウム流入はTreg細胞の分化に必須であるが、末梢における生存やFoxp3発現の維持においてはそれほど重要ではないことが明らかとなった。2.Treg細胞とDCにおいて高発現しているTbc1d4分子の遺伝子改変キメラマウスを作製し、生殖系列移行を確認した。現在、T細胞あるいはDC細胞特異的なCreマウスと交配している。3.CD11c-Creマウスを用いて、DC特異的なSTIM1とSTIM2の2重欠損マウスを作製し、その解析を行った。その結果、生後4ヶ月から、2重欠損マウスの雄の7割において、皮膚炎が発症することを発見した。これらのマウスでは、IL-4、IL-17やIFNgammaなどのサイトカインを産生するエフェクターT細胞が多く認められ、脾腫やリンパ腫が認められた。制御性T細胞の分化におけるストア作動性カルシウム流入の役割を明らかにでき、論文として発表することができた。また、樹状細胞におけるストア作動性カルシウムが真菌感染の防御に関与するという予備データを得られたうえ、抗炎症性サイトカインであるIL-10の産生を抑制していることを示唆する予想外の結果が得られたため。Foxp3の発現制御におけるストア作動性カルシウム流入の役割を明らかにできた。また、新規遺伝子欠損マウスも生殖系列移行に成功し順調に交配が進んでいる。さらに、ストア作動性カルシウムが非免疫状態においても、樹状細胞の恒常性の維持に関与する結果が得られたため。樹状細胞におけるストア作動性カルシウム流入が、どのようにして真菌の感染防御を制御しているのかを明らかにする。さらに、ストア作動性カルシウム流入による樹状細胞におけるIL-10産生のメカニズムとその生理的な意義を明らかにする。また、自然発症するまで時間がかかることから、自然発症する皮膚炎と類似する実験モデル系を導入し、生体レベルでの解析を加速する。新規分子Tbc1d4については、ノックアウトマウスを用いて、Treg細胞や樹状細胞の分化、免疫応答などの解析を行う。樹状細胞において、ストア作動性カルシウム流入を惹起するリガンドー受容体を同定し、そのシグナル伝達の制御機構を明らかにする。新規分子については、ノックアウトマウスを用いて、Treg細胞や樹状細胞の分化、免疫応答などの解析を行う。マウスの個体維持に加え、サイトカインなどの細胞培養用の試薬の購入、シグナル伝達機構の解析用の試薬の購入にあてる。マウスの個体維持や細胞培養試薬などの購入にあてる。また、DNAマイクロアレイ解析も行いたいと考えている。
遺伝的素因と環境因子の相互作用による神経細胞死

常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病の原因蛋白であるParkinについて機能解析を推進し,これがユビキチンリガーゼの一種であることを明らかにした.Parkinの欠損により,これによりポリユビキチン化される蛋白が黒質に蓄積して黒質変性が進行すると推定できる.またParkinは,Golgi装置を経て軸索輸送小胞に結合し,シナプス小胞に運ばれ,その膜に存在することを明らかにした.今後alpha-synucleinとの関連や孤発型パーキンソン病におけるParkinの解析で,パーキンソン病の原因に関する研究の進展が期待できる.Parkin遺伝子については,その欠失変異の切断点が18タイプに分類されることを明らかにした.エキソン4欠失の切断点は日本人5家系,韓国人1家系に共通していた.更にFISHプローブを調製し,複合ヘテロ接合体の欠失変異のDNA診断を可能にした.孤発型パーキンソン病に関しては,PD患者リンパ球で内在性神経毒N-methyl(R)-salsolinol生成律速酵素である中性N-methyltransferase活性が著しく高い例が存在することを明らかにした.本神経毒はアポトーシスを誘導して黒質神経細胞死を起こす.更にpropargylamine誘導体はこの細胞死機構に介入しアポトーシスを抑制して神経細胞保護活性を示すことを見い出した.またドパミン系作用薬が核内移行し,転写因子に直接作用している可能性を明らかにした.パーキンソン病の遺伝子治療に関しては,チロシン水酸化酵素,芳香族アミノ酸脱炭酸酵素,テトラヒドロビオプテリン合成の律速酵素GTPシクロヒドロラーゼIの各遺伝子を全て搭載したアデノ随伴ウイルスベクターをMPTP投与により作製したラットモデルで1年以上改善が継続することを明らかにし,サルを用いた前臨床研究でも効果を確認した.遺伝的素因と環境因子の相互作用により発症する代表的疾患であるパーキンソン病の発症機序に関し,大きな進歩があった.遺伝的素因では,Mn SOD,αケトグルタル酸脱水素酵素複合体のE2component,ミトコンドリア電子伝達複合体lの24Kサブユニット,カテコールOメチル転移酵素各遺伝子の遺伝子型がパーキンソン病発症の危険因子となることを明らかにした.更に本邦に比較的多い常染色体性劣性遺伝を示し,レビー小体の出現しない若年性パーキンソニズムの大部分が6番染色体長腕に連鎖し,遺伝学的に同一の疾患であることを明らかにした.本症の原因遺伝子クローニングも間近にせまり,黒質の選択的変性機序解明に向かい前進ができた.環境因子あるいは内因性・外因性黒質毒性物質に関しては,ドーパミンから生成する内因性テトラハイドロイソキノリン化合物の一種であるN-methyl-(R)salsolinolが黒質に対して強力な毒性を有し,アポトーシスを誘導することを明らかにした.更にパーキンソン病患者には,本物質を合成する中性Nメチル転移酵素活性が高い一群があることを明らかにした.パーキンソン病の将来の遺伝子治療にむけ,adeno-associated virus vectorにチロシン水酸化酵素・芳香族アミノ酸脱炭酸酵素遺伝子を組み込み,ラットの実験的パーキンソニズムに対し,著明な症状の改善が得られることを明らかにした.また,GDNF遺伝子を培養黒質細胞にtransfectすることにより,細胞の寿命を延長できることを明らかにした.これらは,近い将来ヒトパーキンソン病の治療に応用可能であると考えられる.本邦に多い常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病の原因遺伝子のポジショナルクローニングに成功し,Parkinと命名した.Parkin遺伝子は約1Mbの巨大遺伝子で,エクソンは12,cDNAは2,960bp,翻訳領域は1,395bpよりなり,N端にはユビキチンとの部分的ホモロジー,C端にはRING-finger様モチーフを有する.mRNAは広範に発現している.本症患者についての変異分析で,エクソン3から5の間の欠失が多く,mutational hot spotが存在した.今後Parkin蛋白の機能及びその欠損による黒質の選択的変性機序を解明することにより,パーキンソン病の大部分を占める弧発型パーキンソン病の解明にも重要な手がかりが得られると期待できる.弧発型パーキンソン病の発症の遺伝的危険因子として,ミトコンドリア電子伝達系複合体lの24kDaサブユニット遺伝子多型が発症の危険因子になることを明らかにした.環境因子では内因性のN-methylsalsolinolが黒質毒性を有し,アポトーシスを誘発し,その合成酵素活性がパーキンソン病患者リンパ球で高いことを明らかにした.またパーキンソン病の黒質で8-HO-dGTPase及び8-HO-deoxyguanineが細胞質において上昇していることを明らかにした.パーキンソン病の遺伝子治療に関し,Adeno-associated virus vectorを利用し,パーキンソン病モデル動物の線条体に,チロシン水酸化酵素・芳香族アミノ酸脱炭酸酵素遺伝子を直接導入して症状を軽減することに成功した.昨年度原因遺伝子のポジショナルクローニングに成功した常染色体性劣性遺伝の家族性パーキンソン病の原因遺伝子(parkin)につき、変異解析及び遺伝子産物の機能解析を推進した。国内外から集積した200以上のサンプルについて変異解析を行い、家系により種類の異なる変異を多数発見した。多くは欠失変異であるが点突然変異の家系も存在することが判明した。一方臨床症候は一致していても、抹消血DNAのPCRにて変異が検出できない家系が相当数あることも判明し、これらの多くは異なる変異をそれぞれの相同染色体に持つcompound heterozygotesであるとの予測をたて、これを検出する方法を確立した。この方法により色々な種類のcompound heterozygotesがみつかりつつある。