hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮間葉相互作用を模倣した歯胚再生モデルに関する研究

マウスの歯の発生時に認められる遺伝子を検索し、従来報告のなかった28個の遺伝子を同定した。エナメル質形成細胞の成熟は、周囲に存在する細胞が制御していることを証明した。高脂血症治療薬(スタチン)は、象牙質の形成を促進し、歯科治療薬として応用しうることを示した。顎骨に存在する細胞は、手足の骨の細胞とは異なる性質を有していること、また、顎骨の再生促進に成長因子(結合組織成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子)が応用可能であることを確認した。本研究は,歯の発生が骨などの単一組織と異なり,外胚葉由来の上皮組織と神経堤由来の間葉組織の間で生じる上皮-間葉相互作用が重要であることから,上皮組織と間葉組織のどちらにも分化が可能であるES細胞を用いて,歯胚組織誘導を試みようとするものである.今年度は,gfp遺伝子を導入したマウスのES細胞株から作製した胚様体をプラスチックディッシュ上で接着刺激を加え,歯胚組織へ分化誘導できるかを検討した.すなわち,胚様体をプラスチックディッシュに接着させ20日培養し,経時的に歯胚関連遺伝子の発現パターンをRT-PCR法で解析した.その結果,歯胚発生に関連しているBMP4,Msx1,CTGFなどの発現が認められた.しかし,象牙芽細胞のマーカーであるDSPPやエナメル芽細胞のマーカーであるAmelogeninやAmeloblastinの発現は認められなかった.次にgfp遺伝子を導入したマウスのES細胞株から作製した胚様体を胎生12日のマウス下顎口腔上皮へ移植し,器官培養することで歯胚組織に分化誘導できるかどうかを検討した.すなわち,胚様体を移植したマウスの下顎をウシ胎児血清含有のBJGb培地下で器官培養し,経時的にtotal RNAを抽出し,歯胚関連遺伝子をRT-PCRで解析した.その結果,移植7日目で,BMP4やMsx1などの歯胚関連遺伝子の発現が認められた.しかし,プラスティックディッシュ上での系と同様に,象牙芽細胞のマーカーであるDSPPやエナメル芽細胞のマーカーであるAmelogeninやAmeloblastinの発現は認められなかった.今回器官培養の系では培養可能期間が7日間であった.歯胚組織の発生を考えるともう少し長期の器官培養が必要と考えられることから,今後はより長期の培養法の検討を行い,移植した胚様体に発現する遺伝子については,cDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析する予定である.歯の発生は歯胚上皮と歯胚間葉の相互作用により達成される.我々は,この相互作用の本態についてこれまでShh,BMP-4,CTGFを中心に基礎的なデータを蓄積してきたが,現在までのところ形態形成をも誘発しうる歯胚発生のマスターキー遺伝子は見つかっていない.そこで本研究の目的として,ES細胞や組織幹細胞から上皮間葉相互作用を用いて,歯胚の分化が信頼性高く生ずる方法を確立し,また歯胚の発生に関連する遺伝子やタンパクの網羅的解析を行うことによって,歯胚発生のマスターキー遺伝子を解明する.【歯胚誘導マスターキー遺伝子の検索】今年度は,歯胚発生が開始していると考えられる11.5日胚のデータに注目し,上顎隆起および下顎隆起に発現の見られる転写関連215因子をピックアップした.さらにこの中で,歯胚における発現の報告がないものを166因子抽出し,詳細な発現解析を行っている.新規同定因子については,その機能解析を進めていく予定にしている.具体的には,歯胚発生に関与する遺伝子のKOマウスを用いた発現解析,あるいは歯胚組織培養でビーズを用いた実験系による遺伝子間相互作用の解析などを進めている.【歯胚由来組織間細胞の樹立】抜去したヒト歯根未完成永久歯の歯乳頭由来組織に注目し,そこから間葉系幹細胞を単離・培養することに成功した.現在,三次元培養法を用いて,歯胚由来上皮系幹細胞の単離を目指している.皮系幹細胞の単離・培養に成功すれば,上皮間葉相互作用を再現し,詳細な解析が可能となり,さらに口腔組織の発生を再現させることが現実味を帯びてくる.来年度は,歯乳頭由来幹細胞の単離に成功した園山先生(岡山大学),上皮間葉相互作用のエキスパートである辻教授(東京理科大)にさらに研究協力を頂き,歯胚の再生を実現する予定である.本研究課題は,歯の発生の鍵となるマスターキー遺伝子を同定することを目的としている.平成19年度は,平成18年度に引き続き,胎生期マウス口腔領域における組織学的網羅的解析を行った.また,研究分担者として,あらたに東京理科大学辻教授と,岡山大学園山を迎え,歯の発生・再生に関連した細胞の分離とin vitroでの再構成技術を応用した歯の再生へ向けての基礎的検討を始めた.それぞれの具体的成果を以下に記す.1,歯胚誘導マスターキー遺伝子の検索

平成18年度はマウス11.5日胚の上顎隆起および下顎隆起に発現の見られる166個の因子を抽出した。平成19年度は13.5日胚と14.5日胚の組織切片を作製し,この166個の因子の発生期歯胚における発現をin situハイブリダイゼーション法で確認した.その結果,これまで歯胚において発現の報告のない32個の因子の発現を認めた.これら新規同定因子については,その機能解析を進めていく予定にしている.具体的には,歯胚発生に関与する遺伝子のKO動物を用いたフェノタイプの解析,あるいは歯胚の組織培養系でのビーズを用いたタンパクの添加(抑制)実験によるフェノタイプ解析を計画し,準備を進めている.2,ヒト歯胚細胞の分離と上皮間葉相互作用の再現歯胚の再生に応用しうる細胞の検索を行った.平成19年度は,倫理委員会の許可を得てヒト歯冠形成期歯小嚢組織の提供を受けた.本組織からはこれまでに詳細には検討されていない,歯小嚢間葉系細胞を分離するとともに,上皮細胞を分離し,その性格を解析した.この歯小嚢上皮細胞は,エナメル芽細胞マーカーであるアメロゲニンを発現する細胞であった.また,この上皮細胞と,間葉細胞を共培養することにより,それぞれの細胞の遺伝子発現が変化することを確認した.すなわち,部分的にではあるが,in vitroでヒト歯関連細胞の上皮間葉相互作用を再現できるモデルが確立できた.1.歯胚誘導マスターキー遺伝子の検索前年度までに新たに歯胚での発現が認められた28個の核内因子の詳細な解析を行った.その結果,28因子のうち,15因子がDNA結合ドメインを有する転写因子,13因子が転写コファクターなどその他の転写関連因子であることを明らかにした.これらの28因子については,胎生16.5および18.5日胚の歯胚での発現パターンも確認を行った.その結果,発現する発生ステージが限られているものや,発生ステージによってその発現パターンに変化の見られるものなどがあった.2.歯随幹細胞分化誘導因子の検討ヒト歯随幹細胞の分化を誘導する因子としてスタチンに着目し,その効果の検討を行った.その結果,スタチンはメバロン酸経路を介してヒト歯随幹細胞の増殖を制御すると同時に,分化関連遺伝子の発現を強力に誘導し,移植実験系で硬組織形成を促進することを明らかにした.3.ヒト歯小嚢上皮細胞の分化に与える歯関連間葉細胞の影響ヒト歯小嚢上皮細胞のアメロゲニン発現に与える歯関連間葉細胞の影響を検討した.その結果,歯胚間葉細胞との直接的な接触が,歯小嚢上皮細胞におけるアメロゲニン遺伝子発現を強力に促進することが明らかとなった.一方,分離共培養や歯小嚢間葉細胞との共培養ではこの発現促進は認められないことを明らかにした.4.歯に関連した周囲歯槽骨再生法の検討間葉系幹細胞に対する成長因子(CCN2/CTGF)の生物学的効果について検討した.その結果,CCN2/CTGFはヒト間葉系幹細胞の増殖と遊走を促進し,ハイドロキシアパタイトスカホードを用いての移植実験系で骨再生を促進することを明らかにした.また,ウサギの長管骨,顎骨からそれぞれ骨髄細胞を分離し,その特徴を比較・検討した.その結果,骨形成・骨吸収両方の観点から長管骨と顎骨は異なる性格を持っていること,特に骨芽細胞の破骨細胞形成支持能の観点からは大きな違いを有していることを明らかにした.
ナノ粒子を用いた高効率カルコパイライト系太陽電池の研究

地球温暖化問題ならびに我が国のエネルギー問題の解決に資するため、Cu(InGa)Se2(CIGS)薄膜太陽電池に着目し、その技術開発を行った。通常CIGSは、真空蒸着を基本としたプロセスにより作製される。本研究では、低コストプロセスとして非真空プロセスを取り上げ、真空を用いないCIGS薄膜太陽電池の作製手法を開発した。CIGSを構成するCu-Se、In-Seの合成は、金属ヨウ化物とNaのSe化物を低温度においてコロイド合成することにより作製した。当初はCIGSナノ粒子の直接合成を行っていたが、Cu-Seが焼結助材となることから、Cu-Seナノ粒子をインク原料とする手法へと変えた。得られたナノ粒子インクは、Mo基板付きガラス基板へとスプレー印刷され、Se雰囲気下550°C程度でアニールすることによりCIS光吸収層とした。その結果、アニール時のチオウレア添加が変換効率向上に有効であることなどを新たに見いだした。CISはp型半導体であるため、作製した光吸収層上にn型CdSをCBD法により、透明導電膜であるZnOをMOCVD法により堆積し、太陽電池とした。最終的には、変換効率3.5%(Voc=0.38V,Jsc=23.5mA/cm2,FF=0.39)の太陽電池の作製に成功した。高効率Cu(InGa)Se_2薄膜太陽電池の低コスト化を図るために、非真空プロセスによるCIGS薄膜形成手法を研究・開発した。具体的には、溶液からのナノ粒子の合成、印刷、焼結プロセスを経て、CIGS薄膜の作製を試みた。当初は、ナノ粒子としてCuInSe_2(CIS)を合成し、薄膜を形成した。しかしこの場合には、膜の粒径等が小さく膜質も低かった。そこで、Cu-SeおよびIn-Seナノ粒子より薄膜を形成する手法を新たに開発した。これは、Cu-Seの融点が530°C付近に存在するため焼結時にこの溶融Cu-Se相を介して結晶の成長が期待されること、アモルファス状CISからの合成よりもCu-Se、In-Seからの合成の方が生成エンタルピーの差が大きく、焼結時に生成熱を利用できると考えられたからである。実験の結果、Cu-Se、In-Seナノ粒子からの膜形成の方が結晶粒が大きく、またX線の回折強度が強く、高品質膜が得られることが明らかとなった。さらに、焼結時にチオウレアを焼結助剤として添加することを新たに提案した。その結果、膜の緻密性、Mo基板との密着性が向上することが明らかとなった。また、実験過程より、In-Seナノ粒子から合成されるIn_2S_3がCIGS太陽電池のバッファ層に適用可能であることを発見、特許出願を行うことができた。以上の実験結果より、初年度、Mo基板上CIS膜の形成手法を確立することに成功した。次年度は、得られたCISをセル化し、太陽電池評価を通して本手法の有効性を実証して行く予定である。わが国のエネルギー問題の解決に資するため、高効率・低コストCu(InGa)Se_2薄膜太陽電池を作製するための技術開発を行なっている。ここでは太陽電池製造プロセスの画期的な低コスト化を図るため、従来、真空プロセスにより作製されていた太陽電池を真空プロセスを用いず、非真空プロセスにより作製する技術を開発している。昨年度は、Cu-Se、In-Seのナノ粒子から熱アニールによりCu(InGa)Se_2薄膜を作製する技術を開発した。本年度は、得られた薄膜のセル化プロセスに着手した。太陽電池構造は、ガラス/Cu(InGa)Se_2/CdS/ZnO/Alである。n形半導体であるCdSは溶液成長法により、透明導電膜であるZnOは有機金属気相成長法により作製した。最後にアルミニウム電極を設けた。この構造の太陽電池により、変換効率3%台の太陽電池作製に成功した。この成果は、本研究が提案している非真空プロセスによるCu(InGa)Se_2薄膜太陽電池実現に向けた大きな成果である。次に、さらなる変換効率向上を目指し、太陽電池のアニールを試みた。

アニールはナノ粒子を塗布後、N_2雰囲気下ならびにH_2を含むN2雰囲気下において行った。その結果、N_2雰囲気下のアニールにおいて変換効率2.3%(Voc=0.338V,Jsc=18.1mA/cm^2,FF=0,371)であったものが、H2を含むN2雰囲気下のアニールにおいて変換効率は3.2%(Voc=0.481V,Jsc=16.0mA/cm^2,FF=0.412)まで向上した。特に、開放電圧(Voc)の向上が顕著であり、H_2アニールの有効性が実証された。次年度は、さらなる変換効率向上を目指して実験を遂行する。地球温暖化問題ならびに我が国のエネルギー問題の解決に資するため、Cu(InGa)Se2(CIGS)薄膜太陽電池に着目し、その技術開発を行った。通常Cu(InGa)Se2は、真空蒸着を基本としたプロセスにより作製される。本研究では、低コストプロセスとして非真空プロセスを取り上げ、真空を用いないCIGS薄膜太陽電池の作製手法を開発した。CIGSを構成するCu-Se、In-Seの合成は、金属ヨウ化物とNaのSe化物を低温度においてコロイド合成することにより作製した。当初はCIGSナノ粒子の直接合成を行っていたが、Cu-Seが焼結助材となることから、Cu-Seナノ粒子をインク原料とする手法へと変えた。得られたナノ粒子インクは、Mo基板付きガラス基板へとスプレー印刷され、Se雰囲気下550°C程度でアニールすることによりCIGS光吸収層とした。昨年度、アニール時のH2添加が変換効率向上に有効であることを見いだした。Seは蒸発するとSe6, Se8などのポリタイプとなるが、高温下におけるH2添加によりポリSe分子がSe2などの低分子Seとなり、反応の活性化が増大、これにより焼結時に十分なSe原子が供給されることにより結晶性が向上したと考えている。CIGSはp型半導体であるため、作製した光吸収層上にn型CdSをCBD法により、透明導電膜であるZnOをMOCVD法により堆積し、太陽電池とした。最終的には、インク中にチオ尿素を添加することにより、変換効率3.5%(Voc=0.38V,Jsc=23.5mA/cm2,FF=0.39)を有する太陽電池の作製に成功した。非真空プロセスによるCu(InGa)Se_2薄膜太陽電池の開発は、当初の計画通り進展し、本年度は太陽電池を作製することに成功、変換効率として3.2%を得た。ナノ粒子の被覆によるバンドギャップ制御に関しては、太陽電池の作製に注力したため、当初計画より幾分遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。太陽電池の作製に関しては、真空プロセスによるCu(InGa)Se_2太陽電池より開放電圧が低いという問題点がある。これは、焼結時に発生するクラックが原因であることが明らかとなっている。今後は、このクラック低減を目指して研究を推進する。CIGSナノ粒子のバンドギャップ制御に関しては、ナノ粒子をCdSにより被覆、フォトルミネッセンス法などを用いてバンドギャップを評価、その可能性を検証していく予定である。
長寿制御因子Foxoの骨軟骨分化・代謝への関与の解析

1)Foxoファミリー分子の軟骨組織及び軟骨細胞での発現:凍結ヒト関節軟骨組織及び培養ヒト軟骨細胞から抽出したRNAを用いてRT-PCR法によりFoxo1,Foxo3,Foxo4遺伝子の発現を調べた。Foxo1,Foxo3は軟骨組織、軟骨細胞共に発現が見られたが、Foxo4はどちらにも発現が見られなかった。2)Foxo1遺伝子の発現分布:われわれが樹立したFoxo1遺伝子改変マウス(Foxo1遺伝子座にlacZ遺伝子を挿入している)より作出したヘテロ接合マウス(以下Foxo1lacZ/-マウス)は、成長及び骨格形成において野生型マウスと有意な差は認めない。このマウスの長管骨を摘出してXgal染色し、Foxo1遺伝子の空間的発現分布を調べた。ホールマウント組織染色では、関節軟骨が強く染色され骨組織はほとんど染色されなかった。また凍結切片組織の染色では、軟骨膜直下の未熟で増殖盛んな軟骨細胞が染色された。3)骨折治癒過程におけるFoxo1の関与:マウス大腿骨骨幹部を人為的に骨折させ、その治癒過程における差異を野生型とFoxo1lacZ/-マウスとで比較した。両者の骨折治癒過程に明らかな差異は見られなかった。今後Foxo3・Foxo4マウスでも同様に調べる予定である。4)Foxo1分子の新規キナーゼの同定:Foxo分子は種々のキナーゼによりリン酸化される。Foxo1アミノ酸配列を用いたキナーゼ蛋白データベースの検索から、未報告のFoxo1リン酸化蛋白の存在が推測された。この蛋白は予想通りin vitroでFoxo1を直接リン酸化した。この蛋白は過去の報告から神経老化・変性に関与するキナーゼとして知られている。今後この蛋白がFoxo1を介して骨軟骨においても老化変性へ関与するかどうかを調べる予定である。
アクチン細胞骨格系を制御するシグナル伝達蛋白質群の分子間相互作用機構

アクチン細胞骨格系の再編成は種々のアクチン結合蛋白質の分子間相互作用によって制御されている。私共はアクチン結合蛋白質のうち、生理機能が未解明である非筋型ミオシンに着目している。非筋型ミオシンのひとつである酵母I型ミオシンはWASP、WASP-interacting protein(WIP)、ARP2/3complexと相互作用することによりアクチン細胞骨格の再編成の制御に関与している。しかし、その詳しい分子メカニズムは明らかになっていない。そこで、私共はその分子メカニズムを明らかにすることを目的に新規のI型ミオシン結合蛋白質の探索を行った。その結果、Myosin Tail一Interacting protein 1(Mtilp)を同定した。Mtilpについて解析を行い、以下に示す結果を得た(投稿準備中)。(1)Mtilpはプロリンリッチドメインを有し、その部分を介してI型ミオシンのSH3ドメインと結合した。(2)MTI1の遺伝子破壊は、酵母のfimbrinであるSAC6およびヒトHuntingtin Interacting Protein 1(Hip1)のホモログであるSLA2の遺伝子破壊と合成致死になった。即ち、MtilpはSac6pやSla2pと遺伝学的に相互作用することが明らかとなった。(3)MTI1の遺伝子破壊は、酵母のWIPであるVRP1の遺伝子変異による異常を抑圧した。即ち、MtilpがVrplpとantagonisticに機能することを見出した。また、MtilpがVrplpと結合することも見出した。これらの結果から、MtilpはI型ミオシンやVrplpと蛋白質-蛋白質相互作用しながら、また、fimbrinやHip1と遺伝学的に相互作用をしながら、アクチン細胞骨格系の再編成に関与している可能性が高いと考えられた。以上により、平成12年度の研究計画はほぼ達成されたと考えられる。
中世鎌倉文化圏における絵画制作と外来文化受容に関する研究

本研究は1314世紀の鎌倉文化圏においてどのような絵画が制作され、流通したか、また東国における宋・元代絵画の受容の諸相を明らかにしようとするものである。羅漢図、頂相、縁起絵という3つのテーマを中心に基礎的な情報を収集し、作品調査、研究を行った。とくに円覚寺所蔵の五百羅漢図(元時代・室町時代)は鎌倉における中国文化の受容を考える上で、重要な作品であり、他の羅漢図との比較、羅漢に紛れて描かれた人物像についても頂相などとの関連を考察した。本研究は鎌倉幕府が開かれてから古河に鎌倉府が移転するまでの1314世紀を中心に、鎌倉文化圏における絵画の制作および流通、宋・元時代絵画の受容の諸相を明らかにしようとするものである。本年度は次のような調査、研究を主に行った。1.嘉元三年(1305)の年記を有する鎌倉・光明寺所蔵の「浄土五祖絵伝」をはじめ、1300年前後に鎌倉地方で制作されたと考えられる鎌倉派絵巻を中心に、今後の作品調査の対象となる絵画について美術全集、報告書等の刊行物から基礎的データを収集した。2.鎌倉幕府が開かれてから、鎌倉府が古河に移転するまでの期間に鎌倉文化圏において制作され、流通し、受容された絵画の情報を収集。現存する絵画作例のほか、称名寺所蔵唐物関係史料などの文献史料についてもデータを採録した。3.宋・元時代の羅漢図や、舶載画などを中心に東京、大阪等において作品調査をおこなった。4.中国製の羅漢図の特徴としてあげられる「生身」的な表現や実在する人物像を羅漢図に描き込む慣習が日本においてどのように理解されていたのかを報告した。(梅沢恵「羅漢図における「生身」性とその受容」『アジア遊学』122号、2009)5.東国における密教図像の伝播を日蓮自筆の図像の典拠を例に論じた。(梅沢恵「日蓮筆『不動愛染感見記』について」『鎌倉の日蓮聖人』(展覧会図録)神奈川県立歴史博物館、2009)本研究は鎌倉幕府が開かれてから古河に鎌倉府が移転するまでの1314世紀を中心に、鎌倉文化圏における絵画の制作および流通、宋・元時代絵画の受容の諸相を明らかにしようとするものである。本年度は次の調査、研究を主に行った。(1)作品調査の成果を反映させ、ファイルメーカーで構築したデータベースを増補、拡充。(2)ひきつづき中世鎌倉文化圏での制作、流通がみとめられる諸作例について、美術全集、報告書や図録等の刊行物や所蔵先の写真資料などから採取できるデータ、画像をデータベースに入力した。(3)本研究に関連する諸作例について作品調査を行った。(4)中世の文献史料を中心に東国における絵画制作、流通に関する記事を収集した。(5)中世の鎌倉文化圏において制作された絵巻や掛幅縁起を主たるテーマとした展覧会の開催に向けた準備を進めた。(6)辟邪絵(国宝・平安鎌倉時代)[毘沙門天]幅に描かれる毘沙門天の図像を手がかりに、大陸の特殊な毘沙門天図像と中世における絵巻制作の関係について考察した。弓矢を執る毘沙門天像は特殊な図像で、元となる図像は西域の毘沙門天信仰に求められる。兜跋毘沙門天など中国西域由来の図像は日本では仏画そのものとしては定着しなかったものの、その特殊性、説話性ゆえに絵巻の制作のイメージソースとなった事例と考えられる。成果の一部は国際シンポジウムで口頭発表し、特別展「天狗推参!」(神奈川県立歴史博物館、9/2510/30)の展示および図録所収の論文でも一部報告した。鎌倉幕府が開かれてから古河に鎌倉府が移転するまでの1314世紀を中心に、鎌倉文化圏における絵画の制作および流通、宋・元時代絵画の受容の諸相を明らかにすることを目的として研究を行った。主な実績は次のとおりである。(1)作品調査の成果を反映させた関連作品のデータベースを作成。(2)本研究に関連する諸作例について作品調査を行った。(3)文献史料を中心に東国における絵画制作、流通に関する記事を収集した。(4)中世の鎌倉文化圏において制作された縁起絵巻や掛幅縁起を主たるテーマとした展覧会(2013年秋予定)の準備を進めた。(5)宝生寺(横浜市)所蔵絵画の調査、研究を行った。宝生寺所蔵の絵画には鎌倉から室町時代に制作された東国様式を示す仏画が多く伝存している。そのうち、涅槃図と羅漢図を中心に作品調査、研究を行った。成果の一部は所属機関の展覧会「涅槃図」の解説や論文(梅沢恵「宝生寺所蔵の二種の羅漢図について」『神奈川県立博物館研究報告』38)等で発表した。

(6)月1回、鎌倉・円覚寺所蔵の五百羅漢図についての研究会を行った。(継続中)本作品は三十三幅が中国・元時代、十六幅が室町時代、一幅が江戸時代の補作からなり、鎌倉における外来文化の受容、作品の移動の問題を考える上で重要な作例である。各幅の画題についての検討を行い、画面に描かれている器物や人物の表現について詳しい注記を施す作業を進めている。(7)光明寺(相模原市)所蔵の夢窓疎石像の調査研究を行った。画中には元時代の月江正印の賛があり、構図は妙智院本に倣う半身像であるが、金欄の袈裟を着す点などは円覚寺黄梅院本とも近い。成果の一部は特別陳列「夢窓疎石と鎌倉の禅宗文化」(2012年9月)の展示解説、図録等で報告予定である。
マイクロロボットの試作研究

本研究の目的とするところは,コンピュ-タを知能として内蔵したロボットの超小型化である。このために,IC製造プロセスを利用して,1mm以下(数百ミクロン)の寸法の機構部品をシリコンウエハの上に製作し,この部品の上に作り込んだIC回路をコントロ-ラとしてロボットシステムとして作り上げるのである。本研究がスタ-トしてから,既に,直径0.2ミリの歯車や,長さ0.1ミリのリンク機構などが,シリコンウエハに固定されたピンの回りに自由に回転できるように作り上げられ,機械システムの作成の可能性が確認された。更に,静電力を利用したマイクロアクチュエ-タの作成にも成功している。単純な片持梁の形式のアクチュエ-タは勿論のこと,静電力を有効に利用するくし(櫛)型の静電アクチュエ-タは,種々の形のものが開発され,静電力と弾性構造によって,1ミリ以下の寸法のアクチュエ-ションシステムの可能性が確かめられている。又,本研究の中心コンセプとして,昆虫規範型マイクロロボティクスを標傍している。昆虫は微小なサイズとしての有利な構造やアクチュエ-ションシステムを保有している。例えば,構造としては,外骨格であるということである。箱構造の中に筋肉が設定されており,筋肉の収縮が箱構造(外骨格)の弾性変形をひき越し,この変形によって昆虫の翼の羽ばたきが発生させられている。このようなシステムは,マイクロロボットの設計規範としては最良のもののひとつと考えられ,最終年は,このコンセプトの具現化に努力した。本研究の目的は半導体プロセスを利用してシリコンウェハ上にμmオ-ダの機構やアクチュエ-タを作成し、同時に制御回路も作成して、全体として自律的に可動なロボットシステムを試作することである。従来の機械加工法でなく、半導体プロセスを利用する理由は(1)集積回路の分野で十分に成熟した技術であること。(2)機械的な構造と制御用の電子回路を基板上に一体化できる可能性があること。などである。微小な機構では、個々の部品からの組み立て作業は困難であるため、(2)の特徴は大切である。本年度は、加工プロセスの基本操作を経験し、今後のためのノウハウを蓄積することを第1と考えた。そのために以下に述べるような機械要素を作成した。〔リンクの製作〕製作したリンクは長さ150μm、厚さ約1μmである。ピンは基板に固定されているが、リンクは基盤から完全に分離され、ピンを軸として自由に回転できる。リンクとピンはポリシリコンで構成され、SiO_2を犠牲層として利用した。〔カンチレバ-の製作〕異方性のエッチングを利用してカンチレバ-(片持ちはり)を作った。異方性エッチングは結晶方位によるエッチング速度の違いを利用して特定の方向に深くエッチングを行う技術である。カンチレバ-の長さは20μmであり、エッチング時間は2時間であった。〔ばねの製作〕犠牲層を利用する方法で、いろいろな形状のばねを作った。マイクロプロ-ブを用いて針によって弾性変形を与えたり、破壊してみたりして、ばねとしての働きを確かめた。本研究の究極のねらいは,コンピュ-タを内蔵したロボットの超小型化である。このため,IC製造プロセス,近年進歩の著しいロボットの機構,制御およびコンピュ-タのハ-ドウェア,ソフトウェアの研究の成果を用いて,頭脳としてのコンピュ-タと,歯車や軸に代表される機構部分をシリコン・ウエハ-上に一体構成し、小さな「人工の蟻」「人工の蝿」など、自律的なマイクロロボットを製作する。昨年度は,微小加工(マイクロファブリケ-ション)のできる必要最低限の装置の利用法のノウハウを蓄積し,歯車,直動スライダ,各種形状の弾性構造物(片持梁のようなもの),ピン支持されたリンク機構などを使えるのに成功した。そこで,今年度は,アクチュエ-ションの研究に精力をそそいだ。まず,単純弾性梁を静電力によって駆動することに成功した。

静電力は,幾何学的に相似であれば,電極の面積などとは関係なく同じ大きさのものが得られる。したがって,マイクロロボットのアクチュエ-ションには静電アクチュエ-タが有利である。又,弾性力は長さの2乗に比例するので,小さくなるほど弱くなり,外力に対する歪が大きいことになる。そこで,静電力,弾性力を利用したアクチェエ-タの研究を進めているのである。ロボットのアクチュエ-ションにおいては変位にかかわらず一定の駆動力が出ることが位置制御などの面からも望ましいので,対向平板に仂らく駆動ではなく,平行平邦の間に仂らく平行力(重なりを増そうとする方向に仂らく)を用いることとした。平行板の個数をふやせば駆動力も大きくなるわけで,本研究ではくし型の電極をかみ合わせたような形に配置したものを製作した。駆動力も計算値に近いものが得られ,共振特性なども理論と実験のよい一致を見た。本研究の目的とするところは,コンピュ-タを知能として内蔵したロボットの超小型化である。このために,IC製造プロセスを利用して,1mm以下(数百ミクロン)の寸法の機構部品をシリコンウエハの上に製作し,この部品の上に作り込んだIC回路をコントロ-ラとしてロボットシステムとして作り上げるのである。本研究がスタ-トしてから,既に,直径0.2ミリの歯車や,長さ0.1ミリのリンク機構などが,シリコンウエハに固定されたピンの回りに自由に回転できるように作り上げられ,機械システムの作成の可能性が確認された。更に,静電力を利用したマイクロアクチュエ-タの作成にも成功している。単純な片持梁の形式のアクチュエ-タは勿論のこと,静電力を有効に利用するくし(櫛)型の静電アクチュエ-タは,種々の形のものが開発され,静電力と弾性構造によって,1ミリ以下の寸法のアクチュエ-ションシステムの可能性が確かめられている。又,本研究の中心コンセプとして,昆虫規範型マイクロロボティクスを標傍している。昆虫は微小なサイズとしての有利な構造やアクチュエ-ションシステムを保有している。例えば,構造としては,外骨格であるということである。箱構造の中に筋肉が設定されており,筋肉の収縮が箱構造(外骨格)の弾性変形をひき越し,この変形によって昆虫の翼の羽ばたきが発生させられている。このようなシステムは,マイクロロボットの設計規範としては最良のもののひとつと考えられ,本年度は,このコンセプトの具現化に努力した。
大腸菌菌体を用いたサルモネラ組み換え不活化経口ワクチンの開発

Salmonella Enteritidis(SE)の不活化経口ワクチンの開発を目的として、サルモネラのV型分泌装置のタンパク質を利用したN末端融合発現プラスミドベクターを構築した。本発現系を用いることにより、アジュバント効果をもつコレラ毒素のBサブユニット(CTB)とSEワクチン候補抗原を大腸菌菌体表面に共発現させることが可能であった。不活化した発現誘導菌体を鶏に経口投与したところ小腸のCTB特異的IgA抗体価の増加が認められた。本研究成果は、簡便で、安全性の高いSEに対する経口ワクチンの開発に応用できる可能性が示唆された。大腸菌菌体を用いたSalmonella Enteritidis (SE)の不活化経口ワクチンの開発を目的として、大腸菌菌体表面に組換えタンパク質を効率的に発現する発現プラスミドベクターを構築した。菌体表面におけるアンカータンパク質として、C末端に組換えタンパク質を融合・発現する大腸菌リポタンパク質のリーダー配列と外膜タンパク質(Lpp-ompA)、およびN末端融合発現にはサルモネラのV型分泌装置のβドメインタンパク質(MisL)を選択し、それぞれコードする遺伝子を組み込んだ発現プラスミドベクターを作製した。発現プラスミドベクターを評価するため、立体構造により機能性に明らかな変化が生じるタンパク質として既知の抗原を認識するニワトリ型一本鎖抗体(scFV)をコードする遺伝子を用いた。C末端発現プラスミドベクターを組み込んだ大腸菌は低温下(25°C)での発現誘導により、scFVの発現は確認できたものの、その機能性、および菌の生存率の減少が認められた。一方、N末端発現プラスミドベクターでは37°Cの培養温度下でも良好な生存性を示し、高率なタグタンパク質(6His)の表面発現が確認されたが、高分子量のタンパク質については菌体外に表出されるまでに分解されている可能性が確認され、表出前の立体構造の形成が菌体外への発現を阻害している可能性が考えられた。いずれの発現プラスミドベクターにおいても培養条件、発現誘導時のジスルフィド結合の抑制・菌の生存下におけるリフォールディング条件など発現条件について詳細な検討が必要であると考えられた。大腸菌菌体を用いたSalmonella Enteritidis (SE)の不活化経口ワクチンの開発を目的として、平成21年度に構築したサルモネラのV型分泌装置のβドメインタンパク質(MisL)を大腸菌菌体表面に組換えタンパク質を発現するアンカータンパク質として利用したN末端融合発現プラスミドベクターに、経口ワクチンにおけるアジュバント効果が期待できるコレラ毒素のBサブユニット(CTB)を挿入し、その発現と、機能性について検討した。Vibrico choleraeゲノムDNAからCTBをコードする遺伝子を増幅し、N末端融合発現プラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入した後、大腸菌UT5600株(OmpT-)に形質転換した。CTB分子内に形成されるジスルフィド結合の発現動態への影響について検討するため、形質転換体を還元、非還元条件下で培養・誘導を行った。免疫蛍光染色では大腸菌表面へのCTBの発現が観察され、また、Western blottingでは菌体外膜画分へのCTBの偏在が認められ、特に還元条件下で顕著に増加していた。蛍光標識したganglioside GM1 (GM1)を反応させたところ、結合したGM1による蛍光強度の増加が認められた。還元条件下で得た菌体をリン酸緩衝液で透析した後同様の検討を行ったが、軽微な増加が認められたものの有意差は見られなかった。本研究で構築した大腸菌菌体表面への組換えタンパク質のN末端融合発現系は、立体構造を形成するタンパク質の表面発現が可能であり、また、CTBはGM1と結合するために五量体を形成する必要があることから、多量体を形成するタンパク質を機能性を有して発現させることが可能であることが明らかになった.今後はSE抗原タンパク質を共発現させ不活化菌体を作製、ニワトリに投与し、免疫学的手法を用いて詳細に検討する必要があると考えられた。大腸菌菌体を用いたSalmonella Enteritidis(SE)の不活化経口ワクチンの開発を目的として、平成22年度に構築した、アンカータンパク質としてサルモネラのV型分泌装置のβドメインタンパク質(MisL)利用し、そのN末端に経口ワクチンにおけるアジュバント効果が期待できるコレラ毒素のBサブユニット(CTB)を融合発現するプラスミドベクターを用いて、菌体表面に組換えタンパク質を発現した大腸菌の不活化法について検討した。不活化処理によるCTBの機能性の変化を定量化するため、GM1 gangliosideに対する結合活性を検出するGM1-ELISAについて検討した。

生菌体、およびその超音波破砕物を材料として、固相化抗原、抗体の種類・濃度、ブロッキング剤の検討を行ったところ、GM1を固相化抗原、BSAをブロッキング剤として、発現誘導後の菌体の超音波破砕物を反応させ、コレラトキシンに対する抗体を用いて検出する方法がもっともCTBの定量性が高く、非特異的結合が抑えられた。また、既報のSEワクチン候補抗原として、べん毛の構成タンパク質であるfliC、三型分泌装置から分泌されるエフェクターであるsipD、sipCをコードする遺伝子をSEゲノムDNAから増幅、CTB融合発現プラスミドベクターのマルチクローニングサイトに挿入して、CTBとサルモネラ抗原タンパク質を融合発現するプラスミドベクターを構築した。今後は、菌体表面に組換えタンパク質を発現した大腸菌の不活化法について最適化し、CTBとSE抗原タンパク質を表面に融合発現させた不活化菌体を作製、ニワトリに投与し、免疫学的手法を用いて詳細に検討する必要があると考えられた。大腸菌菌体を用いたSalmonella Enteritidis(SE)の不活化経口ワクチンの開発を目的として、平成22年度に構築した、経口ワクチンにおけるアジュバント効果が期待できるコレラ毒素のBサブユニット(CTB)を菌体表面に融合発現するプラスミドベクターを用いて、菌体表面に組換えタンパク質を発現した大腸菌の不活化法、および鶏に対する免疫誘導能について検討した。不活化処理によるCTBの機能性の変化は、平成23年度に構築したGM1-ELISA法を用いてGM1 gangliosideに対する結合活性として評価した。菌体表面にCTBを発現させた大腸菌に、ホルムアルデヒド、加熱、あるいはアセトンによる処理を行ったところ、未処理の菌体と比較して、アセトンを除くいずれの条件においてもGM1に対する結合活性の低下が認められた。平成23年度に構築した、SEワクチン候補抗原としてfliC、SipD、あるいはSipCをそれぞれCTBと融合発現するプラスミドベクターを導入した大腸菌について、アセトンを用いて不活化し、CTBの機能性の変化について検討したところ、未処理の菌体と比較してGM1に対する結合活性の低下は認められなかった。CTBとSE抗原タンパク質(fliC、SipC)を表面に融合発現させた不活化菌体を作製し、7日齢の鶏に14日毎に2回経口投与後、小腸粘液中のCTB特異的IgA抗体価を測定したところ、対照群に比較して軽微な増加が認められたものの非特異的な反応が強く有意な差は見られなかった。本研究年度に得られた知見から、アセトンを用いることにより発現タンパク質に対する影響を最小限に留めた生菌の不活化が可能であることが示唆された。また、今後、不活化菌体の鶏への投与菌数、投与頻度・期間について最適化する必要があると思われた。大腸菌菌体表面へのSE抗原の発現ライブラリーの作製を試みているが、得られるライブラリーはいずれも多様性に乏しく、未だスクリーニングに至っていない。研究年度を鑑み、既報のワクチン候補抗原のクローニングを優先して行っている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究年度に構築したコレラトキシンBサブユニット(CTB)とSEワクチン候補抗原(fliC、sipD、sipC)を大腸菌菌体表面に融合発現するプラスミドベクターについて、大腸菌菌体表面に発現したそれら抗原の機能性を減弱させない不活化法について検討する。
学校開放と教師の資質に関する国際共同研究

本研究は、中等教育段階の学校開放と教師に求められる資質の関係について、日本、中国、ドイツ、アメリカの研究者の国際共同研究のための企画調査を目的としている。1.学校開放は、1)学校施設め地域への開放、2)学校活動への地域住民の参加、3)スクール・ボランティアによる授業の指導と保持、4)2校以上の学校間の共同研究、5)異文化理解や環境教育などの授業プロジェクトによる地域の特色を生かした授業、6)職業教育や進路指導と関連した勤労体験学習など、多くの形態でなされている。このような学校開放によって、学校のあり方や教授・学習関係、および教室空間のあり方が大きく質的に変化してきている。2.学校開放に関する研容は、教師の資質と関連させ、学校のカリキュラム編成や授業改革のための具体的な方策と理論的基礎を研究するという行為研究の手法がとられている。3.ドレスデン大学のHans Wener Kuhnを日本に招へいし、共同研究の枠組みについて討議した。1つめ重要な視点は、現代社会の変化について専門家にアンケート調査をして、どのような変化が現在ドイツと日本で起こっているか、または起こりそうであるかを確定することである。第2は、学校における授業記録をとることと、教師へのインタビューである。4.最後に残る問題は、これらのインタビューをどのように評価するかという問題である。ケルン大学のWolfgang Beywl教授が以前におこなった調査と評価が有益である。5.ノルトライン・ヴェストファーレン邦の学校・継続教育研究所で大がかりな学校開放のプロジェクトが開始されて、蓄積がある。
プランクトンネット採集特性に関する研究

水中に存在するプランクトン群集を採集する簡単な方法として、プランクトンネットによる曳網がある。データの互換性を保つために北太平洋標準ネット(ノルパックネット)が広く使用されている。本手法は,荒天時には,ワイヤ傾角が40度以上となり,過小,過剰曳網となる可能性があるが比較的容易に行えるため,多少の荒天にも関わらず観測船の大小に関わらず実施され,長期的なデータセットが多く存在する.そこで本研究では,ノルパックの採集特性とその長期的なセータセットの特性を検証した.加えて,多層を同時に曳網可能なMTDネットや,卵・稚仔調査で使用頻度の高いボンゴネット,リングネットなどの採集特性と検証した.具体的には年度内で(12-14年度3ヵ年)に,下記の項目について研究を実施した.・北大水産学部附属練習船おしょろ丸の北洋航海時において,経度180度線とべーリン海でのノルパックネットを用いたプランクトン採集を行った.さらに,両海域におけるノルパックネットによるプランクトン資料の長期的な解析を行った.・同アラスカ湾内において,MTDネットを用いて当該海域の鍵種である頭足類幼生を採集した.・函館海洋気象台"高風丸"の1978-1994年夏季三陸沖においてノルパックネットを用いて採集されたプランクトン資料の解析を行った.・人口ふ化によって得られたスルメイカの卵,ふ化幼生を用いて調査で使用頻度の高い調査網地に対する保持をしらべた.さらに,鳥取県水産試験場試験船第一鳥取丸を用いて,再生産海域の一つである隠岐諸島周辺海域でスルメイカ幼生の採集を行った.水中に存在するプランクトン群集を採集する簡単な方法として、プランクトンネットによる曳網がある。本手法は,荒天時には,ワイヤ傾角が40度以上となり,過小,過剰曳網となる可能性があるが比較的容易に行えるため,多少の荒天にも関わらず観測船の大小に関わらず実施され,長期的なデータセットが多く存在する.そこで本研究では,ノルパックの採集特性とその長期的なセータセットの特性を検証した.加えて,多層を同時に曳網可能なMTDネットや,卵・稚仔調査で使用頻度の高いボンゴネット,リングネットなどの採集特性と検証した.具体的には年度内で(12-14年度3ヵ年)に,下記の項目について研究を実施した.・北大水産学部附属練習船おしょろ丸の北洋航海時において,経度180度線とべーリン海でのノルパックネットを用いたプランクトン採集を行った.さらに,両海域におけるノルパックネットによるプランクトン資料の長期的な解析を行った.・同アラスカ湾内において,MTDネットを用いて当該海域の鍵種である頭足類幼生を採集した.・函館海洋気象台"高風丸"の1978-1994年夏季三陸沖においてノルパックネットを用いて採集されたプランクトン資料の解析を行った.・人口ふ化によって得られたスルメイカの卵,ふ化幼生を用いて調査で使用頻度の高い調査網地に対する保持をしらべた.さらに,鳥取県水産試験場試験船第一鳥取丸を用いて,再生産海域の一つである隠岐諸島周辺海域でスルメイカ幼生の採集を行った.水中に存在するプランクトン群集を採集する簡単な方法として、ネットによる曳網がある。ところが北太平洋高緯度海域では、海況が厳しくプランクトンの鉛直採集においてワイヤー傾角が40度以上となることも珍しくない。こうした場合ワイヤー傾角にてネット到達深度を補正するものの正確な到達深度は不明であった。またうねり等による船体の動揺が水中のネットに伝わり、ネットが大きく上下していることが報告されている。この動揺がプランクトン採集にどの程度影響するのか定量的に扱った研究は少ない。本研究では近年の技術進歩に伴い開発された小型水深データロガーを用いて従来不明であった水面下でのネットの挙動を正確に把握することである。本年度は、北海道大学水産学部練習船「おしょろ丸」(7月のベーリング海において)、鳥取県鳥取水産試験場「鳥取丸」(10月日本海において)、の2隻にてノルパックネットによるプランクトン採集の際、ネット枠に小型水深ロガーを取り付け、1秒毎にネットの、水深を記録、回収後データを読み出し、ネットの挙動を調べた。同時に採集時の海況および船位を記録し、得られたプランクトン資料は湿重量を測定した。この2隻の違いは、大きさもさることながら(おしょろ丸1383トン、鳥取丸499トン)海洋観測機器の配置にある。ノルパックネットによるプランクトン採集に用いる観測ウインチの位置がほぼ船体中央にあるおしょろ丸に対して、鳥取丸は船首部分に配置されている。10月の鳥取丸日本海航海においては海況に恵まれ荒天時のデータがないが、来年度は文部科学省はもとより他省庁、大学の調査船にて様々な海況でのデータを記録し、ネットの水中挙動を観測機器の配置をふまえて比較し明らかにしたい。水中に存在するプランクトン群集を採集する簡単な方法として、ネットによる曳網がある。

こうした場合ワイヤー傾角にてネット到達深度を補正するものの正確な到達深度は不明であった。またうねり等による船体の動揺が水中のネットに伝わり、ネットが大きく上下していることが報告されている。この動揺がプランクトン採集にどの程度影響するのか定量的に扱った研究は少ない。本研究では近年の技術進歩に伴い開発された小型水深データロガーを用いて従来不明であった水面下でのネットの挙動を正確に把握することである。本年度は、北海道大学水産学部練習船「おしょろ丸」(7月のアラスカ湾において)にてノルパックネットによるプランクトン採集の際、ネット枠に小型水深ロガーを取り付け、1秒毎にネットの、水深を記録、回収後データを読み出し、ネットの挙動を調べた。同時に採集時の海況および船位を記録し、得られたプランクトン資料は湿重量を測定した。本年度は文部科学省はもとより他省庁、大学の調査船にて様々な海況でのデータを記録し、ネットの水中挙動を観測機器の配置、船体表面積が漂流に与える影響ふまえて比較し明らかにしたい。水中に存在するプランクトン群集を採集する簡単な方法として、ネットによる曳網がある。データの互換性を保つために北太平洋標準ネット(ノルパックネット)が広く使用されている。ところが北太平洋高緯度海域では、海況が厳しくプランクトンの鉛直採集においてワイヤー傾角が40度以上となることも珍しくない。本年度は、得られたデータから、ネットの水中挙動を観測機器の配置、船体表面積が漂流に与える影響をふまえて比較し明らかにした。
もう一つのヒトう蝕原因菌で遅れている遺伝子機能解明への一つのアプローチ

標題の「もう一つのヒトう蝕原因菌」とはレンサ球菌類のソブリヌス菌(Ss菌)である。ミュータンス菌(Sm菌)でこの30年間に明らかにされた病原遺伝子の多くは、Ss菌では分かっていない。そんな遺伝子の1つであったグルカン結合タンパク質C遺伝子(gbpC)とよく似た遺伝子をSs菌で同定した。gbpC遺伝子は、Sm菌のグルカン依存性凝集という現象に関与する唯一の遺伝子であり、この菌の病原性に関わるが、Ssでは同様な遺伝子が予想外にも4つ存在し、それらがそれぞれ異なった役割でSs菌のグルカン依存性凝集に関与していたことを明らかにした。最近我々が同定したS.macacaeのgbpC遺伝子ホモログをプローブとしたサザン分析では,予想外にも全てのミュータンスレンサ球菌がgbpC遺伝子ホモログを保有していることを示唆する結果であった.当初の計画では,S.cricetusはS.sobrinusの近縁種で同様な強いグルカン依存性凝集を示すことと遺伝子導入が出来る可能性があることから,S.cricetusを最初のターゲットとしようとしたが,S.sobrinusでgbpC遺伝子ホモログが確かに存在し,しかも2つ存在するらしいことがわかった.そこで,今年度は,S.cricetusよりむしろS.sobrinusをターゲットとしてgbpCホモログもしくはグルカン依存性凝集に関与する遺伝子を同定することとした.まずこの2つのホモログの全遺伝子領域をPCRを利用したゲノムウォーキングにより増幅後,それぞれの塩基配列を決定してアミノ酸コード領域を同定した.それぞれをgbpC, db1遺伝子と命名した.そして両遺伝子のコードするタンパクがグルカン結合活性を持つか否かを.両遺伝子をプラスミドpBAD/Hisにサブクローニングし,Hisタグ融合タンパクとして過剰発現させ,グルカン結合活性を調べた結果,GbpCタンパクにはなく,Db1タンパクにのみ同活性が認められた.またグルカン依存性を示さない,S.sobrinus OMZ176株では,gbpC遺伝子はインタクトだったのに対してdb1遺伝子には1塩基の挿入がみとめられ,フレームシフト変異を起こしDb1タンパクが発現しないため凝集性を欠失したと考えられた.またOMZ176株の培養上清にはグルカン依存性凝集に関与すると報告されたGBP2タンパクが,凝集を示す株と同程度存在することを確認した.以上の結果から,新規遺伝子であるdb1がS.sobrinusにおいてグルカン依存性凝集に関与している可能性が強く示唆された.ヒトう蝕に重要なS.sobrinusでgbpC遺伝子ホモログが予想外にも2つ存在するらしいことが昨年度わかり,その特徴付を一部行った.そして,この2つのホモログのうち,S.sobrinusの顕著な特徴であるグルカン依存性凝集に関与する遺伝子はgbpC遺伝子ではなく新規遺伝子dblであることを報告した.その根拠のひとつは,リコンビナントGbpCタンパクがα1,6グルカンに結合活性がないことであった.このことから,GbpCタンパクはS.sobrinusの不溶性グルカンを構成するα1,3グルカンへの結合性を持つことも考えられ,その結合活性を調べたが認められなかった.一方,GbpC, Dbl両タンパクそれぞれに対する抗血清を調製し,S.sobrinusの細胞壁と培養上清において上記タンパクの検出を行ったところ,S.sobrinusの標準菌株である6715株の派生株であるK1R株の培養上清から,セファデックスに結合し,抗GbpC血清に反応するタンパクが強く検出された.そしてリコンビナントGbpCタンパクがセファデックスに結合し精製することが出来ることを確認した.即ちGbpCタンパクはα1,6グルカン架橋レジンであるセファデックスに結合するが水溶性のα1,6グルカンには結合能がないという一見矛盾した結果ではあったが,このことは,GbpCタンパクは分枝を持ったα1,6グルカンにのみ結合するのかもしれないことを示唆している.また,上記K1R株は6715株と異なり凝集を示さない.そこでこの株のgbpCおよびdbl遺伝子の塩基配列を6715株と共に決定したが,両遺伝子の塩基配列は6715株のものと100%同一であった.K1R株は別の遺伝子の変異のためグルカン依存性凝集能を欠失したと考えられ,その最も有力な候補遺伝子であるソルターゼ遺伝子の塩基配列を解析したところその5'側1/3の部位にフレームシフト変異が検出された.K1R株はソルターゼ活性の欠失のためDblタンパクを細胞壁に繋ぎとめることが出来ずグルカン依存性凝集を示さなくなったと考えられた.ヒトう蝕に重要なS.

sobrinusでgbpC遺伝子ホモログが予想外にも2つ(gbpC1,db1A)存在することを昨年度報告したが、The Institute of Genomic Research (TIGR)において当時公開されていたS.sobrinusのゲノムデータベース検索で高いホモロジーを示す領域をもつ複数のContigが検出されることなどから、更に別のホモログの存在が推定され,両遺伝子の上下流をPCRベースのゲノムウォーキングしたところ、更に2つのgbpC遺伝子ホモログが検出され、それぞれをgbpC2,db1Bと名付けた。これら4つの大腸菌リコンビナントタンパク質はGbpC1以外は全てグルカン結合活性を有していた。また全く凝集を示さないOMZ176株はgbpC2,db1A,db1Bの全てでフレームシフト変異が検出された。又,他の研究室で以前にアルキル化剤による変異誘発を6715株について行いグルカン依存性凝集をおこさない株を分離しているが、この株において4つの遺伝子の塩基配列を解析したところ、db1B遺伝子にのみ変異が検出された。従って、S.sobrinus6715株ではdb1B遺伝子がグルカン依存性凝集関与していると結論づけた。しかし、S.sobrinusのいくつかの株では、Db1A,Db1Bタンパク質の発現量にかなりの差があることが分かり、グルカン依存性凝集関与するタンパク質は株によって異なるかもしれないと考えられた。昨年度までに, mutansレンサ球菌の病原因子の一つであるグルカン結合タンパクCについて, S. mutansでは一つだけ存在するそのコード遺伝子がS. sobrinusにおいてはそのホモログが結局4つ存在することがわかり、アルキル化剤による変異誘発によりそれらのうち第4の遺伝子であるdb1Bがこの菌のグルカン依存性凝集に最も深く関与していることが示唆された。しかしそのdb1B遺伝子変異の詳細が不明であったので、同遺伝子周辺の塩基配列を親株のそれと同時に比較しながら決定したところ、この株ではdb1B遺伝子を含めて10kbにもおよぶ欠失が生じていた。また、凝集に関与する遺伝子候補であった他の3つのグルカン結合タンパクC遺伝子ホモログ(gbpC1, gbpC2, db1A)とこれらのコードタンパク質を細胞壁の外側につなぎ止める酵素の遺伝子srtAのすべてがこの株ではintactであった。この株以外に我々はこの凝集をおこさない株を2株(K1R, B13)保有していたので、それらの株においてその親株と共に上記5つの遺伝子全ての塩基配列を解析した。その結果K1R株ではsrtA遺伝子に、B13株においてはdb1B遺伝子が変異していた。更に後者ではその変異はIS配列によるものであった。'70年代後半にS. sobrinusに特徴的なグルカン依存性凝集が報告されて以来、ずっと未知のままであったその責任遺伝子が明らかになった。以上の結果をまとめ報文とした
カナダにおける「証拠開示」をめぐる判例立法の研究:当事者モデルの神話と実像

本年度は、カナダ証拠開示をめぐる判例立法の調査をほぼ終えることが出来た。カナダでは、1991年、最高裁判所により、従来立法が勧告されながら実現することのなかった、検察官による公判前事前全面証拠開示が承認された。この画期的な判決は1991年11月7日、スティンクコンベ事件において示されている。本年度は、同事件判決に至るまでの、カナダ刑事手続における証拠開示問題の沿革を調査分析し、同事件判決に検討を加え、さらに同事件の問題点を総合的に考察した。また、同事件判決以後の今日に至るまでの下級審における事例判例を収集し、その分析をおこなった。これらの作業の結果、カナダでは法律上の根拠のないまま、無辜の不処罰という刑事手続の最大の目標から帰結された理由と、不意打ちの防止といった実際的観点を理由にして証拠の事前全面開示が実現したことが理解された。また、かかる事前開示について、不開示の裁量を承認しつつ、その司法審査という実践的、実際的な開示手続を創設し、以後の下級審でかかる手続が現実に機能していることが理解された。これらの研究成果は、現在わが国で閉塞状況にある証拠開示実務に大きな示唆を与えるものと思われ、カナダの実際的な開示手続の判例による創造は、おなじように立法の展望の乏しいわが国にたいへん貴重な比較法的資料となると思われた。以上の研究成果は、本年度中にまとめることができ、わが国の法律学界で最も評価の高い実務雑誌である『ジュリスト』誌に掲載を認められた。