hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝的性状の異なる肺パスツレラの病原性

動物実験に用いられるマウスやラットの日和見病原体である肺パスツレラ菌の遺伝学的性質を詳しく調べた。日和見病原体とは健康な動物には病気を起こさないが、抵抗力のない動物には病気を起こす病原体のことである。その結果、本菌は3つのグループに大きく分けられた。その一つについて免疫不全マウスに対する病原性を調べたところ、全身感染を起こして死亡した。免疫不全マウスとは抵抗力の低下している動物のことで、病原性とは病気を起こす能力を意味する。P.pneumotropicaの標準株4株、野外分離株48株から16SrRNAをコードする領域(16SrDNA)の内、約1,500bpをPCRで増幅し、制限酵素HaeIIIを用いて断片解析をしたところ、4パターンの多型を示すことが分かった。さらに、16SrDNAの塩基配列を決定し、系統樹解析を行った結果、5つのクラスターを形成することが分かった。制限酵素解析と16SrDNAの塩基配列解析によって分類されたパターン(クラスター)は、マウスおよびラットなどの分離動物の違い、血液寒天上で示される溶血性による違いに相関があることが分かった。また、P.pneumotropicaの標準株と野外株のゲノミックDNAを分離し、制限酵素(NotIまたはApaI)を用いて完全消化した後に、パルスフィールド電気泳動(PFGE)により多型解析を行い、UPGM法を用いて系統樹解析した結果、910のクラスターを形成することが分かった。これらのクラスターは、分離動物の違いには相関を示さなかったが、明確な溶血性を示すすべての分離株は、PFGEのゲル上では特異的なパターンを示した。PFGEを用いて、環状ゲノミックDNAのサイズを測定したところ、2.3Mb3.2Mbを示し、マウス由来株よりもラット由来株のほうが大きいこと(P>0.05)が明らかになった。これらの遺伝性状解析から、P.pneumotropicaには少なくとも4タイプが存在し、その中でも複数のサブタイプに分類されることが示唆された。生化学性状については、アミノ酸や炭素源などの6項目について試験した結果、明確な溶血性を示すラット由来のべての株は、Hey1型と同一の性状を示すことが明らかになった。以上の結果から、P.pneumotropicaには生化学性状からも少なくとも2タイプが存在し、遺伝的にも生化学的にも不均一性を示すことが確認された。本年度はPasteurella pneumotropicaからの病原性に関与すると思われる毒素の同定を行った。とくに、Pasteurellaceaeに広く分布するRTX(Repeat in structural toxin)toxinに着目し、P.pneumotropica ATCC35149のgenomic DNAからクローンライブラリーを作製し、得られたクローンをE.coli 0157:H7.Actinobacilluspleuropneumoniae,Neisseria meningitidisなどのRTXをコードする遺伝子領域をプローブとしてハイブリダイゼーションによりスクリーニングを実施し、さらにスクリーニングされたクローンをDNAシークエンスベースで同定していった。その結果、RTXをコードする遺伝領域と類似した遺伝子配列があることがわかった。さらに、これにより得られた部分的な遺伝情報を基にinverse PCR、genome-walk法によってRTX toxinタンパク質と細胞外分泌に関連する全遺伝子配列を決定した。その結果、3種類のRTX toxinをコードする遺伝領域が同定された。そのうち、2種のRTX toxinをコードする領域(rtxlおよびrtxII)は、分泌されるRTX toxinとType I分泌機構をコードする領域から構成されているが、3番目のrtxIIIは分泌RTX toxinのみから構成されていた。これらのRTX toxinのDNAの保有状況をサザン解析によって行ったところ、野生株30株のほとんどの株がこれらの3種のRTX toxin遺伝子のいずれかを保有していることが明らかになった。Pasteurella pneumotropicaの遺伝的多様性を多角的に分析するため、生化学性状や遺伝子サイズや配列などの情報を、性質が異なる複数の要因を一元化する統計処理法(主成分分析)によって解析した。16Sribosomal RNA(rRNA)およびRNA polymeraseβサブユニットをコードするrpoBの塩基配列を用いた系統樹解析の結果、56のクラスターに分類されることがわかった。16S rRNAとrpoBの系統樹解析の結果は互いに近似しており、宿主や溶血性に依存したクラスターが形成された。また、同時に菌株間によって著しく利用性が異なる炭素源複数種を選択し、資化性の違いに基づく解析を行ったところ、6つのクラスターに分類された。さらに全供試菌株のゲノミックサイズを測定した結果、菌株間によって1.6Mbもの差があり、マウス分離株よりラット分離株のゲノミックサイズのほうが小さい傾向にあることがわかった。

これらの、それぞれの菌株のゲノミックサイズと炭素源の違いによるグループ、rpoB遺伝子の部分配列によるクラスターを要因として加味した主成分分析を行うと、3つのグループに大別されることがわかった。即ち、マウス、ラットの宿主に依存するそれぞれのグループと両者の由来宿主が混合された1グループに分類された。この結果を、当菌の外毒素の一つと考えられているRTX toxinの菌株間分布状況と比較すると、3グループのうち、マウス由来株が多く存在するグループの菌株が2つのRTX toxinタンパク質のうちserralysin motifが存在するPnxIIAを保有している傾向にあることが明らかになった。
肥育牛の産肉形質を反映する遺伝子の解明とこれらを活用した肉用牛肥育技術の開発

本研究では肥育牛の様々な飼養環境における筋肉内遺伝子発現が牛肉生産と関係があることを明らかにした。筋肉内の遺伝子発現モニタリングは、肉用牛の肥育期間における筋肉内の蛋白質蓄積、脂肪蓄積等の生体反応を示唆することができ、肥育システムの改良のための有意義な情報となる。本研究では4グループの限られた遺伝子についての測定であったが、さらに多くのグループの遺伝子発現を測定することは、生体における多くの情報を得ることができる。遺伝子発現に基づく肥育システムの改良のためには、肥育・枝肉成績や筋肉内栄養成分等の牛肉生産と遺伝子発現との相関について、明らかにする研究が必要である。本研究では、肉用牛の肥育過程で、肥育・枝肉成績、肉質等を反映する遺伝子の探索と同定ならびにその発現プロファイルを解明することを目的する。本年度は、飼料イネWCSの給与ならびに放牧を取り入れた肥育試験を行い、その肥育・枝肉成績及び肉質の分析結果を得た。また、これらの試験において肥育過程の供試牛から遺伝子の発現解析のための筋肉試料をバイオプシーにより得た。いずれの肥育試験においても、肥育・枝肉成績及び肉質は濃厚飼料多給の慣行肥育(対照区)と比較して同等であった。肥育中期に放牧を行い、後期に飼料イネWCSを舎飼で多給した供試牛では、放牧後に対照区と比較して体重の減少が見られたが、その後のWCS給与により体重の回復が見られ、この時に代償性成長を示唆した。この試験区において放牧前、放牧前期・後期、放牧後のWCS多給時、肥育終了時の筋肉内遺伝子の発現解析を行った結果、放牧前期に骨格筋の成長を抑制的に調節するミオスタチンの発現が上昇し、その後、放牧後期からWCS多給時にその発現が減少することを明らかにした。また、骨格筋の主要タンパク質であるミオシン重鎖の遺伝子発現は放牧前期に発現が減少し、放牧後期あるいは肥育終了時にその発現が増加することを明らかにした。これら遺伝子の発現プロファイルは代償性成長を支持する結果となった。また、脂肪合成に関する遺伝子C/EBPα及びPPARγ2について発現を測定し、放牧前期から肥育終了時にかけて断続的に発現量の減少が認められた。筋肉内栄養成分について、対照区と比較して脂肪含量の減少が認められ、これは脂肪合成に関する遺伝子の発現変動と一致していた。また、肉用牛の骨格筋成長に係わる物質の探索では、放牧前、放牧中、放牧後の筋肉試料を対象にマイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的解析を行い、現在、解析を進めている。本年度は、飼料イネWCSの長期給与、肥育初期または肥育後期に放牧を取り入れた肥育試験を行い、その肥育・枝肉成績及び肉質の分析結果を得た。飼料イネの長期給与および肥育初期の放牧において、肥育・枝肉成績及び肉質は濃厚飼料多給の慣行肥育(対照区)と比較して同等であった。肥育初期に放牧を行い、中期以降に飼料イネWCSを舎飼で多給した供試牛では、放牧後に対照区と比較して若干の体重の減少が見られたが、その後のWCS給与により体重の回復が見られ、この時に代償性成長を示唆した。この試験区において筋肉内遺伝子の発現解析を行った結果、放牧前期のミオスタチンの発現上昇ならびにミオシン重鎖の発現減少および放牧後期からWCS多給時にミオスタチンの発現減少することを明らかにし、この結果は、前年度に実施した肥育中期の放牧試験の結果と一致し、これら遺伝子の発現プロファイルは代償性成長を支持する結果となった。肥育後期に放牧を行った供試牛では、枝肉重量の減少および肉質の低下が認められた。肥育後期の筋肉内遺伝子発現ではミオスタチンの発現減少ならびにミオシン重鎖およびフォリスタチンの発現増加が見られ、この時期に筋肉の成長が亢進状態にあることを示唆した。一方、脂肪合成に関する遺伝子C/EBPαおよびPPARγ2は発現減少が見られ、脂肪蓄積は抑制状態であることを示唆した。また、放牧肥育について、血中IgGの減少ならびにHSP27とHSP40の発現が放牧により減少していたことから、舎飼と比べて放牧はストレス負荷が少ないことが示唆された。本研究では、肉用牛の肥育過程で肥育・枝肉成績、肉質等を反映する遺伝子の探索と同定及びその発現プロファイルを解明することを目的する。本年度は、夏季及びその前後における飼料イネWCSの給与量の変化及び肥育前期の放牧後に飼料イネWCSの多給が肥育・枝肉成績及び肉質に与える影響を明らかにし、これらの供試牛から遺伝子の発現解析のための筋肉試料をバイオプシーにより得た。夏季の飼料イネ給与区は慣行肥育(対照区)と比較して枝肉成績は同等であったが、肉質はビタミン類の増加が認められた。この時、飼料イネ給与区では夏季の飼料摂取量の増加と増体重及び日増体重の増加傾向が認められた。一方で夏季前では増体重及び日増体重の減少傾向が認められたことから、夏季の代償性成長を示唆した。この時の血中IGF-1濃度は、夏季前から夏季にかけて飼料イネ給与で増加が認められた。

筋肉内の遺伝子発現は、飼料イネ給与区で夏季のミオスタチンの減少及びミオシン重鎖の増加が認められ、この時期に骨格筋の成長が亢進状態にあることを示唆した。これらの遺伝子の発現プロファイル及び血中IGF-1の増加はこの時期の代償性成長を支持するものであった。放牧後の飼料イネWCSの多給では、慣行肥育と比較して放牧区で枝肉重量の減少が認められたが、肉質は蛋白質含量の増加と脂肪含量の減少が認められ、ビタミン類の増加も認められた。さらに放牧でドリップロスの減少が認められたことから保水性の向上を示唆した。この時の筋肉内遺伝子発現は対照区と比較して放牧直後にミオスタチンの発現減少が認められたが、脂肪前駆細胞で発現し、脂肪細胞への分化を制御しているPref-1は放牧後に対照区と比較して増加が認められた。これらの遺伝子発現は放牧後に筋肉内の脂肪蓄積の減少及び筋肉の成長亢進を示唆しており、これらは筋肉内の栄養成分含量の結果を支持するものであった。27年度は、夏季の飼料イネ給与及び放牧後の飼料イネ給与が肥育・枝肉成績、肉質及び筋肉内遺伝子発現に及ぼす影響について明らかにした。これらの成果については、国際学会において発表を行い、短報に相当するプロシーディングの発刊および国内学会において発表を行った。また、次年度終了の新たな試験区の肥育試験を開始しており、これは当初の計画を上回る進捗となっている。一方で、今年度計画していたマイクロアレイまたは次世代シークエンサーによる解析から、生産形質と関連する候補遺伝子のスクリーニングについては、納期の関係から実施に至っていない。本研究では肉用牛の肥育過程で肥育・枝肉成績、肉質等を反映する遺伝子の探索及びその発現プロファイルを解明する。肉用牛の肥育は、飼料イネWCS等の自給粗飼料またはこれに放牧を組み合わせた飼養方法(試験区)で実施し、濃厚飼料多給舎飼いの慣行肥育(対照区)との間で肥育・枝肉成績、肉質ならびに筋肉内遺伝子発現について比較検討を行った。試験区の牛肉はビタミン含量の増加、ドリップロスの改善が対照区と比較して認められ、これ以外の栄養成分、テクスチャーでは有意な変化が認められなかったが、粗蛋白質の増加傾向、粗脂肪の減少傾向が認められた。また、肥育・枝肉成績について、放牧を取り入れた飼養方法では放牧直後に一時的に増体の遅延が認められたが、その後、代償性成長と考えられる増体の回復が認められ、枝肉重量等の生産性に有意な影響は認められなかった。肥育・枝肉形質、肉質等を反映する筋肉内遺伝子の発現解析において、ミオシン重鎖、Myostatin及びAtrogin-1の発現から放牧直後には、骨格筋の成長が抑制状態にあり、その後、放牧後期あるいは放牧後の舎飼い時には、骨格筋の成長が亢進状態にあることが明らかとなり、この時期の代償性成長の可能性を支持する結果となった。また、筋肉内の蛋白質蓄積及び脂肪蓄積では、前者はミオシン重鎖、Myostatin及びAtrogin-1について、後者はC/EBPa、Pref-1の筋肉内遺伝子発現から、生産性を反映する発現が認められた。肥育過程における筋肉内の一部の遺伝子発現は、生産形質を反映することが明らかとなり、この活用は肥育試験の短縮につながることが示唆された。また、テクスチャーと関係がある遺伝子については、物性変化との間で高い相関は見られなかったが、この遺伝子は試験区間で発現変動が認められ、物性等の肉質と遺伝子発現の相関については、研究の進展が期待されるところである。本研究では肥育牛の様々な飼養環境における筋肉内遺伝子発現が牛肉生産と関係があることを明らかにした。
安価ガラス基板上のIoTデバイスに向けた負性容量4端子低温poly-Si TFT

IoTエッジデバイスをシリコン以外の基板上に形成する技術は、IoTエッジデバイスの多様化・多機能化とともに今後重要になる。本研究は、代表者が独自開発した高移動度を有する4T LT poly-Si TFTに対してNC技術を融合することで、高移動度(>300 cm2/Vs)・精密Vth制御・小さいs値(<100 mV/dec)の3要素全てを満足させ、Vdd=1.0 Vでgain>10を有するCMOSインバータを安価ガラス基板上で実現することを目指す。これにより、安価ガラス基板上に低価格・低消費電力IoTエッジデバイスを実現するためのデバイス・イノベーションを実現する。
水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の理解

1.陸域に沈着した放射性物質の内,森林渓流水における溶存態の137Cs濃度は二重指数関数的な低下傾向を示すこと,137Cs流出フラックスにおいて総流出量の97%以上を懸濁態が占めることを示した。2.阿武隈川における137Csの固液分配係数の経時変化が土地利用との関係が大きいことを解明した。3.懸濁態として河川領域に輸送された137Csは,9割以上が河川内に堆積することなく海域に輸送されることが示され,陸域からの流出量を海へのインプットとして沿岸域における海洋への懸濁物質の移行シミュレーション方法を確立した。水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の理解のために,汚染度の異なる3地域において,植生・土壌から地下水・河川・生態系へと,放射性核種の移行状況の継続的な観測調査を行った。また、水・土砂移動に関するモデル化を行った。具体的には、1)陸域環境中(森林、河川、水田・農地等)での放射性核種の移行状況の観測と、土壌侵食モデルによる土砂移動に起因する放射性セシウム移行の将来予測・2)地下水・湧水への放射性セシウムの移行調査・3)河川を通じた放射性核種の移行調査とモデル化4)事故発生時の地表面状態を把握すると共に,放射性物質の河川・湖沼・海への流出量の観測調査とモデル化・5)河川・湖沼において,水・有機物より藻類・バクテリア等に移行する状況を調査し,河川生物への放射性核種の移行調査及び将来予測・6)I-129, Cl-36等の微量核種について,環境トレーサーとしての可能性の調査汚染度が異なる3地域において、水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の観測を実施した。また、阿武隈川流域において,平水時及び出水時の浮遊砂及び濁水の採取,湖底の堆積物の採取を行った。得られた試料は,ゲルマニウム半導体ガンマ線検出器を用いて放射性セシウム濃度の測定を行った。様々な土地利用からの流出土砂、河川を流下する浮遊砂等の放射性セシウム濃度について、本年度の調査結果を加えることにより今後の時間変化傾向を予測し長期予測モデルへのインプットとした。I-129及びCl-36等の微量核種の測定環境として、筑波大学に6MVタンデム加速器質量分析装置の搬入が完了した。水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の理解のために,昨年度までに開始した観測、調査、解析を継続的に行った。具体的には、下記の項目である。1.放射性核種の環境への移行のモデル化2.地下水、湧水への移行状況調査3.河川における放射性核種の移行調査4.放射性核種の河川・海洋への流出モデル5.河川・湖沼調査6. 129I, 36Clの環境トレーサーとしての活用このうち、1)については昨年度まで観測結果を継続するとともに、土壌侵食モデルによる福島第一原発80km圏内における放射性セシウムの分布推定・予測を提示した。2)については、汚染度の異なる地域にある森林小流域での観測を継続し、地点間比較に供するデータ群を取得した。3)、4)について、新田川における放射性セシウムフラックス観測を開始し、同流域内のダムにおける放射性セシウム収支の観測およびモデル化に着手した。5)について、河川における観測を継続した。また、汚染度の異なる複数の湖沼(赤沼・霞ヶ浦など)での底泥採取・分析を行い、放射性物質の分布や水域内での収支の定量化を進めた。また河川・湖沼における魚類への放射性セシウムの蓄積量の調査を行った。6)について、微量核種の分布調査により、事故直後の放射性物質の拡散の推定に資する知見を得た。また3)に関連して、放射性ヨウ素の新田川流域内での分布、新田川河口における魚類への蓄積量に関する調査を行った。さらに土砂移動に伴う移行の物理的モデルの開発、都市域における移行調査、湖沼の堆積物等の化学的分析といった公募研究を設定し、放射性物質移行量およびプロセスの解明を促進した。1.放射性核種の環境への移行のモデル化2.地下水、湧水への移行状況調査3.河川における放射性核種の移行調査4.放射性核種の河川・海洋への流出モデル5.河川・湖沼調査6. 129I, 36Clの環境トレーサーとしての活用このうち、1)については昨年度まで観測結果を継続するとともに、土壌侵食モデルによる土地利用の影響を評価した。3)、4)について、新田川における放射性セシウムフラックス観測において、同流域内のダムにおける放射性セシウム収支の結果が得られてきた。

また土砂移動に伴う移行の物理的モデルの開発、都市域における移行調査、湖沼の堆積物等の化学的分析といった公募研究を設定し、放射性物質移行量およびプロセスの解明を促進した。「9.研究実績の概要」に示した6課題のうち、すべての項目について順調に観測が進展しており、新田川流域における総合的な移行調査プログラムにおいても観測結果が得られてきている。昨年度までに行われた水田、森林などさまざまな土地利用における観測結果に基づき、海外研究機関との連携を含めて、学術論文が出版に至っており、相当数出版されている。水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の理解のために,昨年度までに開始した観測、調査、解析を継続的に行った。具体的には、下記の項目である。1.放射性核種の環境への移行のモデル化2.地下水、湧水への移行状況調査3.河川における放射性核種の移行調査4.放射性核種の河川・海洋への流出モデル5.河川・湖沼調査このうち、1)については昨年度まで観測結果を継続するとともに、土壌侵食モデルによる土地利用の影響を評価した。2)については、汚染度の異なる地域にある森林小流域での観測を継続し、地点間比較に供するデータ群を取得した。3)、4)について、阿武隈川を中心とした河川における溶存態・懸濁態の観測を継続するとともに、新田川における放射性セシウムフラックス観測において、同流域内のダムにおける放射性セシウム収支の結果を得た。また懸濁態として輸送される放射性核種の環境動態を数値モデル化し,特に河川領域におけるセシウム137の移行過程について把握するとともに,海域へのセシウム137移行量,タイミング等について推定を行った。その上で河川からのインプットを考慮した沿岸域での放射性物質の堆積状況をモデルによって評価した。5)について、霞ヶ浦での底泥採取・分析を行い、放射性物質の分布や水域内での収支の定量化を行った。水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の理解のために,汚染度の異なる3地域において,植生・土壌から地下水・河川・生態系へと,放射性核種の観測,将来予測を行った。具体的には、1)放射性核種の環境への移行をモデル化2)地下水,湧水への移行状況調査3)河川における放射性核種の移行調査4)事故発生時の地表面状態を把握すると共に,放射性物質がどの程度,河川・湖沼・海へ流出していくか調査およびモデル化5)河川・湖沼において,水・有機物より藻類・バクテリア等に移行する状況を調査し,河川生物への放射性核種移行について調査するとともに,将来予測6)I-129, Cl-36等の微量核種について,環境トレーサーとしての可能性である。また、既存のプロジェクトでの調査地域に加え,新たに栃木県に中程度汚染地域の試験流域を設定した。そこにおいて,水・土砂移動に伴う放射性物質の移行過程の観測を行った。一方で,阿武隈川流域において,既存試料の収集,濁水の採取,湖底の堆積物の採取を行った。得られた試料は,ゲルマニウム検出器において測定を行った。1)放射性核種の環境への移行をモデル化2)地下水,湧水への移行状況調査3)河川における放射性核種の移行調査4)事故発生時の地表面状態を把握すると共に,放射性物質がどの程度,河川・湖沼・海へ流出していくか調査およびモデル化5)河川・湖沼において,水・有機物より藻類・バクテリア等に移行する状況を調査し、河川生物への放射性核種移行について調査するとともに、将来予測を行う。
生体膜における曲率形成と膜の形態変化を誘導・制御するペプチドツール

細胞の分裂や運動、分化、細胞内小胞輸送など、細胞の健全な営みには細胞膜のダイナミックな形態変化が必要である。細胞膜の曲がり具合(曲率、curvature)の誘導原理ならびに細胞に及ぼす影響の理解は、細胞の営みの本質の一端に迫れるのみならず、種々の細胞現象を制御・調節する新しい方法論の開発に結びつく。従来、曲率誘導は細胞膜の内層と外層の脂質組成の非対称性により生じると考えられてきたが、近年、種々のタンパク質・ペプチドに生体膜に曲率を誘導する機能が備わっていることが明らかとなってきた。本研究では、曲率誘導ペプチドに基盤をおく細胞現象の制御・調節ツールを得ることを目的とし、細胞内輸送小胞形成に関わるタンパク質エプシンのN末端由来の曲率誘導ペプチドEpN18を用いて検討を行った。生体膜にはリン脂質のパッキングの隙間(packing defect)が存在し、膜に曲率が誘導されるとパッキングの隙間が増大すると期待される。本研究では(i)EpN18により細胞膜のパッキングの隙間が増大することを環境感受性色素di-4-ANEPPDHQにより染色した生細胞のGP値解析から確認するとともに、(ii)細胞内薬物送達能を有するペプチドの一つであるオリゴアルギニンの膜透過が、パッキングの隙間が増大することで促進されることを見出した。また、小分子化合物であるpyrenebutyrateもにも同様の膜曲率誘導能、パッキング緩和能、さらにオリゴアルギニンの膜透過促進能があることが分かり、これらの三者に密接な関連があることを示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞膜の曲がり具合(曲率、curvature)の誘導原理の理解は、細胞の営みの本質の一端に迫れるのみならず、種々の細胞現象を制御・調節する新しい方法論の開発に結びつく。直接的な膜構造変化の誘導のみならず、膜曲率の変化は膜張力にも影響を与え、細胞内アクチンの構造変化を介した細胞の運動、増殖、分化等の生理的調節・メカノバイオロジー的な研究展開に結びつく可能性も示唆される。研究代表者は、人為的に設計したペプチドを用いての曲率・細胞機能の制御技術(曲率工学)の樹立を目指し研究を進めている。前回の公募研究において、膜構造変形作用が報告されている9種のタンパク質由来のペプチドの曲率誘導能の評価(人工膜・培養細胞系を併用)を行い、細胞内輸送小胞形成に関わるエプシンに加え、Sar1p由来のヘリックスペプチドが著明な曲率誘導能を有することを見出した。今回、これらのペプチドが膜のpacking状態や流動性に大きな影響を与えることを確認するとともに、曲率ペプチドの多量体化による局所相互作用の強化と曲率誘導活性増強、曲率誘導の細胞への作用(細胞膜の形状・張力変化と移動、分裂、細胞内小胞輸送等)等に検討を加えている。当初計画にあるように、エプシン、Sar1pペプチドが膜のpacking状態や流動性に大きな影響を与えることを確認するとともに、曲率ペプチドの多量体化による局所相互作用の強化と曲率誘導活性増強、曲率誘導の細胞への作用(細胞膜の形状・張力変化と移動、分裂、細胞内小胞輸送等)等に検討を加えている。継続してより効果的に曲率を生体膜に誘起する方法の開発に取り組みたい。
混晶半導体を用いた電界効果素子における量子効果に関する研究

1.有機金属気相成長法によるGaInAs混晶半導体の成長電界効果素子において量子効果を観測するためには、高純度の材料を用いることが望ましい。このことから、有機金属気相成長法により高純度GaInAsの成長を試み、また成長機構の解明を行った。用いた原料はトリメチルインジウム(TMIn)、トリメチルガリウム(TMGa)とアルシン(As【H_3】)である。TMInは多用されていないこともあり、基礎的なデータである蒸気圧などにもさまざまな報告がある。ここでは【◯!1】境界層を拡散する種がGaとInである、【◯!2】成長温度650°CにおいてInの再蒸発はない、【◯!3】TMInとAs【H_3】の間に中間反応はない、【◯!4】TMInの蒸気圧は20°Cにおいて1.361.73mmHgである、とすると得られている実験結果が統一的に説明されることを明らかにした。成長したGaInAsはInP基板にほぼ格子整合したもので移動度4700【cm^2】/V・S,キャリア濃度5×【10^(15)】【cm^(-3)】,を示した。2,GaAs/InAs超格子半導体の成長分子線エピタキシャル成長法(MBE)を用いて、【Ga_(0.5)】【In_(0.5)】Asと同じ組成をもつGaAs/InAs単原子層、および二原子層超格子を成長した。これは原子を規則正しく配列させて混晶半導体に特有の合金散乱を抑制するためである。GaAs/InAsの成長には反射電子線回折強度のモニタを一部用い、成長の最適化をはかった。構造の確認にはX線回折を用い、超格子からの回折を測定して構造を議論した。3.GaInAsMIS電界効果トランジスタの試作InPに適用して成功を収めた二重絶縁膜構造金属-絶縁体-半導体電界効果トランジスタをGaInAsを用いて試作した。絶縁膜形成は陽極酸化を用いた。絶縁膜は【Al_2】【O_3】(780Å)、GaInAs陽極酸化膜(180Å)の二重絶縁膜で、GaInAsの厚さ500Åのエンハーンスメントモードのものを試作したところ、実効移動度3100【cm^2】/V,Sのものを得た。またドレイン電流ドリフトは【10^(-6)】secから【10^4】secで30%減少する注入形であった。
iPS細胞と低結晶性炭酸アパタイトを用いたハイブリッド型人工骨による骨再生医療

本研究では,低結晶性炭酸アパタイトとiPS細胞由来の骨芽細胞とを組み合わせたハイブリッド型人工骨を作製し,新しい骨再生医療を目指した.はじめに骨再生用scaffoldとして,低結晶性炭酸アパタイト顆粒とコラーゲンの複合体を作製した.この複合体をウサギ頭頂骨の欠損部に埋植したところ,良好な骨形成が確認でき,骨再生用scaffoldとしての有用性が示された.一方,iPS細胞から直接骨芽細胞へ分化誘導することが困難であったため,iPS細胞を一度間葉系幹細胞へ分化誘導させたが,分化効率が低かった.しかし,炭酸アパタイト上で培養した間葉系幹細胞が骨芽細胞へ分化することは確認できた.平成27年度は,低結晶性炭酸アパタイトとコラーゲンの複合化を行い,ウサギ頭頂骨への埋植実験を行った.また,骨再生医療の細胞ソースとして用いるiPS細胞のフィーダーレス培養法を確立するとともに,細胞ストックを作成した.1炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製:低結晶性炭酸アパタイト顆粒とコラーゲン溶液を混和した後,円柱状金型に炭酸アパタイト・コラーゲン混和溶液を充填した.凍結乾燥後,150°Cで熱架橋を行い,炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を作製した.コラーゲン濃度を1%,2%,3%として複合体を作製したが,1%と2%の場合は均一な複合体ができなかった.炭酸アパタイトとコラーゲンの重量比を50, 60, 70, 80%として複合体を作製したが,80%では均一な複合体が作製できなかった.熱架橋なしの複合体は生理食塩水中ですぐに溶解したが,熱架橋を行うことで,試料の溶解性が改善できた.2炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植:1の結果から,Col濃度を3%として炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を作製し,ウサギ頭頂骨に熱架橋なしの複合体を埋植して,8週後に組織学的評価を行った.骨形成は良好であったが,移植部から顆粒が分散してしまっている個体もあり,操作性と安定性に問題があった.そこで,150°Cで熱架橋を行った炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を埋植した.3iPS細胞の細胞ストック作製とフィーダーレス培養法の確立:理化学研究所から購入したヒトiPS細胞(HPS0002)を実験に用いた.まず,iPS細胞をマウス胎仔線維芽細胞をフィーダーとして培養を行い,十分な細胞ストックを作成した.また,フィーダーレス培養法の確立を行った.フィーダーレス培養法で継代培養,凍結保存を行ったiPS細胞について,多能性を維持していることを確認した.まず,顆粒径300ー600 μmの炭酸アパタイトを用いて,コラーゲンとの複合化条件の検討を行った.コラーゲン濃度が1%と2%の場合は均一な複合体ができなかったことから,コラーゲン濃度を3%とした.次に,炭酸アパタイト顆粒とコラーゲンの重量比を50-80%として複合体を作製したが,80%では均一な複合体が作製できなかった.さらに,顆粒径600ー1000 μmの炭酸アパタイトを用いて複合化を図ったが,同様の結果となった.最後に,熱架橋の影響を検討したが,熱架橋なしの複合体は生理食塩水中ですぐに溶解してしまったが,熱架橋を行うことで,試料の溶解性が改善できた.次に,炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植実験を行った.ウサギ頭頂骨に熱架橋なしの複合体を埋植して,8週後に組織学的評価を行ったが,骨形成は良好であった.移植部から顆粒が分散してしまっている個体もあり,操作性と安定性に問題があったため,現在,150°Cで熱架橋を行った炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を埋植して評価を行っている.骨再生医療の細胞ソースとして用いるiPS細胞の培養系(フィーダー細胞を用いた培養とフィーダーレス培養)を確立し,その特性を検討した.免疫染色とアルカリフォスファターゼ染色の結果では,維持培養,凍結,解凍を繰り返し行ったiPS細胞が多能性を維持していることを確認した.本研究を行うためには,均質で十分なiPS細胞のストックが必要であるが,ヒトiPS細胞の増殖が遅く,細胞ストックの作成に時間を費やした.1低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製:低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体は低結晶性炭酸アパタイト顆粒とコラーゲン溶液を混和した後,円柱状金型に炭酸アパタイト・コラーゲン混合液を充填し,凍結乾燥して作製した.複合体作製条件として,炭酸アパタイト顆粒の大きさ(顆粒径),混和するコラーゲン溶液の濃度,炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比について検討した.顆粒径は300ー600マイクロm(Sサイズ)と600ー1000マイクロm(Mサイズ)の2種類とし,コラーゲン溶液の濃度は3%,炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比は50%と65%という条件で複合体を作製することとした.2炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植:SサイズとMサイズの2種類の顆粒を用いて,埋植用の炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を4種類(50S, 65S, 50M, 65M)作製した.試料をウサギ頭頂骨に埋植し,8週後に摘出して組織学的評価を行った.

骨欠損部に試料が緊密に埋植されている個体では骨形成は良好であったが,顆粒が骨欠損部外へ分散してしまった個体では骨形成が不十分であったことから,作製した複合体の操作性と安定性に問題があることが明らかになった.そこで,熱架橋を行った4種類の複合体(50S, 65S, 50M, 65M)を埋植したところ,骨形成には影響はなく,操作性と安定性の改善が得られた.3iPS細胞の骨芽細胞への分化誘導:理化学研究所から購入したヒトiPS細胞(HPS0002)を実験に用いた.まず,iPS細胞をマウス胎仔線維芽細胞(MEF)をフィーダーとして培養を行い,十分な細胞ストックを作成した.次いで,レチノイン酸を添加してiPS細胞を培養した後,骨芽細胞分化培地で培養して,骨芽細胞への分化誘導を行った.今年度は,低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体の作製条件として,炭酸アパタイト顆粒の大きさ(顆粒径),混和するコラーゲン溶液の濃度,炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比について検討した.顆粒径は300ー600マイクロm(Sサイズ)と600ー1000マイクロm(Mサイズ)の2種類,コラーゲン溶液の濃度は3%,炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比は50%と65%という条件を見出した.さらに,炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植実験を行った.骨欠損部に試料が緊密に埋植されている個体では骨形成は良好であったが,顆粒が骨欠損部外へ分散してしまった個体では骨形成が十分ではなかったことから,作製した複合体の操作性と安定性に問題があることが明らかになった.そこで,埋植用炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を熱架橋処理して埋植したところ,骨形成には影響はなく,操作性と安定性の改善が得られた.iPS細胞の骨芽細胞への分化誘導については,分化誘導の効率が低く,予定通りには進んでいない.平成29年度は,これまでの結果をもとに埋植用の低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を作製し,その複合体をウサギ頭頂骨へ埋植して組織学的評価を行った.また,引き続き,骨再生医療の細胞ソースとして用いるiPS細胞の骨芽細胞への分化誘導を試みた.低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のウサギ頭頂骨への埋植:低結晶性炭酸アパタイト顆粒の顆粒径は300ー600マイクロm(Sサイズ)と600ー1000マイクロm(Mサイズ)の2種類を使用した.コラーゲン溶液の濃度を3%とし,炭酸アパタイトとコラーゲン溶液の重量比は50%と65%として複合体を4種類(50S, 65S, 50M, 65M)作製した.低結晶性炭酸アパタイト顆粒とコラーゲン溶液を混和した後,専用の金型に充填し,凍結乾燥して,円柱状の低結晶性炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を作製した.複合体をウサギ頭頂骨に埋植し,4,8週後に摘出して組織学的評価を行った.骨欠損部に試料が緊密に埋植されている個体では骨形成は良好であったが,顆粒が骨欠損部外へ分散してしまった個体では骨形成が不十分であったことから,作製した複合体の操作性と安定性に問題があることが明らかになった.そこで,炭酸アパタイト・コラーゲン複合体に150°Cで熱架橋を行った(h50S, h65S, h50M, h65M).熱架橋した炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を埋植したところ,骨形成には影響はなく,操作性と安定性の改善が得られた.iPS細胞の骨芽細胞への分化誘導:理化学研究所から購入したヒトiPS細胞(HPS0002)を実験に用いた.まず,iPS細胞をマウス胎仔線維芽細胞(MEF)をフィーダーとして培養を行い,十分な細胞ストックを作成した.次いで,レチノイン酸を添加してiPS細胞を培養した後,骨芽細胞分化培地で培養して,骨芽細胞への分化誘導を行った.
アミロイド前躯体蛋白質分泌酵素仮説の遺伝子変異マウスによる検証

アルツハイマー病の病変部に蓄積されるβA/4蛋白質は膜結合型レセプター様の前駆体蛋白質(βAPP)として合成された後、蛋白分解酵素により異常なプロセスを受けて生成される。横浜市立大学木原生物学研究所の宮崎香博士らは生化学的研究からGelatinase AがβAPPの強い分泌酵素活性を持つ可能性を示唆し、アルツハイマー病の発症機構に関与しうるとする重要な仮説を提唱している(Nature 362,839-841,1993)。Gelatinase AはβA/4蛋白質の内部に存在するアミノ酸配列を認識してβAPP切断・分泌するため、分泌されたβAPPはβA/4蛋白質生成の基質でなくなる。この点に関しては複数の研究グループにより、培養細胞を用いた生化学的手法で検討されてきたが相反する見解が示されている。この研究では、この仮説を直接的に検証することを第一義の目的として、Gelatinase A遺伝子欠損変異マウスを作製し、in vivoおよびin vitroにおけるβAPPの生合成を解析した。また、GelatinaseAは個体発生の過程で細胞の移動および組織構築、あるいは癌の増殖および転移にも関与すると考えられている。これらについても検討した。このマウスの脳組織および培養胎児線維芽細胞を用いたβAPP蛋白質の代謝過程の解析結果は、Gelatinase AがβAPPの主たる分泌酵素ではないことを明かとした。変異マウスは組織学的異常は示さないものの、野性型マウスに比して有為に体重増加が遅く、Gelatinase A発生上の役割を示唆している。また、腫瘍細胞の移植実験で腫瘍細胞の増殖は変異マウスで有為に遅いことが示された。これらの結果はGelatinase Aが細胞の増殖制御に関与することを示唆している。結果は、複数の論文として投稿中もしくは投稿準備中である。この研究では、Gelatinase A遺伝子欠損変異マウスを作成し、この仮説を直接的に検証することを目的としている。平成6年度(初年度)においてGelatinase AのゲノミックDNAをマウス129系統から単離し、これを元にターゲッティングベクターを構築し、相同性組換え機構によってGelatinase A遺伝子座に欠損変異を導入したマウス胚性幹細胞クローンを得た。このクローンをマウス初期胚に注入して得られた生殖系列キメラ個体を得て、変異体マウスの子孫を得た。研究は当初の予定どうり進展しており、100%の達成度といえる。この変異体の発生とAPPの代謝について解析する予定である。また併せて、マウスの行動学的性状についても解析する。また、平成6年度においては、アルツハイマー類似疾患であるプリオン病の病理発生機構におけるグリア酸性繊維性蛋白質(GFAP)の関与の仮説について、GFAP欠損変異マウスを用いて検証し、その仮説を明瞭に否定した。

宮崎香博士らは生化学的研究からGelatinase AがβAPPの強い分泌酵素活性を持つ可能性を示唆し、アルツハイマー病の発症機構に関与しうるとする重要な仮説を提唱している(Nature 362,839-841,1993)。この研究では、GelatinaseA遺伝子欠損変異マウスを作成し、この仮説を直接的に検証することを目的としている。GelatinaseAのゲノミックDNAをマウス129系統から単離し、これを元にターゲッテイングベクターを構築し、相同性組換えによってGelatinaseA遺伝子座に欠損変異を導入したマウス胚性幹細胞を得た。このクローンをマウス初期胚に注入して得られた生殖系列キメラ個体を得て、変異体マウスの子孫を得た。変異遺伝子ホモ接合体は正常に発育し、器官形成も正常であった。このことは、これまでGelatinaseAが器官形成時の細胞再配列に必須だろうとの仮説を否定すると同時に、この個体を用いたAPPの代謝についての解析を可能とした。この解析では、マウスAPPに対する有効な抗体が少ないなど、幾多の困難に遭遇したが、現在最終段階に達している。確認実験の結果を待って早急に公表する予定でいる。また、GelatinaseAは癌細胞の転移に関与する可能性が指摘されており、この点に関しての解析を計画している。アルツハイマー病の病変部に蓄積されるβA/4蛋白質は膜結合型レセプター様の前駆体蛋白質(βAPP)として合成された後、蛋白分解酵素により異常なプロセスを受けて生成される。横浜市立大学木原生物学研究所の宮崎香博士らは生化学的研究からGelatinase AがβAPPの強い分泌酵素活性を持つ可能性を示唆し、アルツハイマー病の発症機構に関与しうるとする重要な仮説を提唱している(Nature 362,839-841,1993)。Gelatinase AはβA/4蛋白質の内部に存在するアミノ酸配列を認識してβAPP切断・分泌するため、分泌されたβAPPはβA/4蛋白質生成の基質でなくなる。この点に関しては複数の研究グループにより、培養細胞を用いた生化学的手法で検討されてきたが相反する見解が示されている。この研究では、この仮説を直接的に検証することを第一義の目的として、Gelatinase A遺伝子欠損変異マウスを作製し、in vivoおよびin vitroにおけるβAPPの生合成を解析した。また、Gelatinase Aは個体発生の過程で細胞の移動および組織構築、あるいは癌の増殖および転移にも関与すると考えられている。これらについても検討した。このマウスの脳組織および培養胎児線維芽細胞を用いたβAPP蛋白質の代謝過程の解析結果は、Gelatinase AがβAPPの主たる分泌酵素ではないことを明かとした。変異マウスは組織学的異常は示さないものの、野性型マウスに比して有為に体重増加が遅く、Gelatinase Aの発生上の役割を示唆している。また、腫瘍細胞の移植実験で腫瘍細胞の増殖は変異マウスで有為に遅いことが示された。これらの結果はGelatinase Aが細胞の増殖制御に関与することを示唆している。結果は、複数の論文として投稿中もしくは投稿準備中である。
インターフェロンによる初期B細胞のアポトーシス誘導の分子機構と白血病治療への応用

I型インターフェロン(IFNαβ)が、IL-7によって誘導される正常骨髄由来初期B細胞又は、IL-7依存性プロB細胞株の増殖を抑制し、さらにアポトーシスを引き起こすことを見出した。この抑制はIL-7に特異的なもので、IL-2、IL-3及びIL-4によって誘導される細胞増殖はIFNαβによって全く阻害されない。さらに、正常マウス骨髄由来のマクロファージが恒常的に機能的なIFNを分泌していることを示した。IL-7依存性マウスプロB細胞株Scid7は、IFNの存在下では、増殖抑制とアポトーシスが起こることが既に示されているが、アポトーシスに先立って、Bcl-2の発現が低下することが示された。一方、IL-3依存性細胞株FDC-1は、IFNの存在下でもBcl-2の発現レベルは変化しなかった。すなわち、IFNによって引き起こされるアポトーシスに、Bcl-2発現のdownregulationを伴っていることが分かった。さらにEμBcl-2トランスジェニックマウス由来のプロB細部株においてはIFNによって、増殖抑制は起こるが、アポトーシスはほとんど起こらないことが判明した。以上のことより、IFNによって誘導される増殖抑制とBcl-2の発現との間に相関は見られないが、アポトーシスの誘導にBcl-2のdown regulationが関与していることが判明した。以上の結果は、骨髄における初期B細胞の増殖はIL-7,SCFなどの正の因子と、IFNαβのような負の因子によって巧妙に制御されていることを示している。未熟B細胞と同様に、未熟胸腺細胞もその増殖がIL-7に強く依存していることが示された。IL-7によって誘導されるCD4^-CD8^-の胸腺細胞の増殖がIFNによって強く抑制され、さらにアポトーシスも引き起こされることを見出した。興味深いことに、骨髄の場合と同様に胸腺においてもIFNが恒常的に産生されていることもRT-PCRによって示された。
牛の早期妊娠因子(EPF)の抽出と,免疫学的測定法の開発に関する研究

牛の早期妊娠因子(EPF)は、妊娠2日目以降母牛の血液中に出現することから、早期妊娠診断への応用、移植した胚の生存の確認ならびに妊娠継続のモニタ-になると期待されている。そこで本研究は、牛EPFに抽出・精製を行い、得られたEPFの生化学的特性を検討するとともに、牛EPFの免疫学的測定法(ELISA)を開発する目的で実施した。材料は、人工授精8日目のホルスタイン種1頭から全採血し、血清10lを得た。この血清のRIT値は6を示し、卵管に受精卵が存在したことから妊娠と判定した。EPFの抽出・精製は、限外濾過で10100kdの分画を分離,CMーSepharose Fast Flowで50mM Naclを含む緩衝液によって溶出した分画をDEAEーSepharose Fast Flowに適用した。さらに、非吸着分画をFPLCゲル濾過カラムに適用し、EPF陽性分画を採取した。EPFの生化学的検討は、各精製工程で得られた分画をSDSーPAGEによって精製度を検討し、分子量をPAGEで求め、O'Farrellの方法による等電点を求めた。さらに、抗一非妊娠血清IgGを用いてイムノブロッテングを行った。現在、抗一EPFモノクロナル抗体を作製、ミエロ-マとの融合を実施している。その結果、EPFの分子量は21.5KDと推定された。しかし、非妊娠血清IgGと妊娠血清由来のDEAEー非吸着分画とのイムノブロッテングで22KDと21.5KDのバンドは観察されてなかった。これは、PVDF膜への転写が不充分なためと考えられ、現在再検討している。等電点は二次元電気泳動から、pH6.3と推定された。また、EPFの構造について、2ーメルカプトエタノ-ルで環元されてないことから、単量体と推測された。妊娠由来のDEAEー非吸着分画とSDSーPAGEから切り出した22KDならびに21.5KDのバンドをラットに免疫し、モノクロナル抗体のスクリ-ニング用ELISAの測定系確立を進めている。本研究は,牛の妊娠血清より早期妊娠因子(EPF)を抽出して,Ko^^ ̈hlerとMilstein(1975)の方法で,EPFーMoAb(EPFモノクロナル抗体)を作る。また、各種の免疫学的方法によりその特異性を検討して,応用としての酵素免疫測定法(ELISA)の測定系を開発することを目的とした。人工授精により妊娠させた1頭のホルスタイン種雌牛(これは後の直腸検査とロゼット抑制試験=RITによって妊娠が確認された)を,人工授精後8日目にと殺,血液24lを集めた。血漿に分離した後,非働化して,EPF抽出の材料とした。EPFの抽出は,WiLSONら(1983)とYAMAMOTOら(1989)に従って実施した。すなわち,最初,透析装置によって100KD以上を除去した。そこで870mlまで濃縮した後,イオン交換DEAEセファロ-ズ,CMーセファロ-ズ,MPLCなどを通して分画した。そこで,RIT値を測定してEPFの高い分画を集めた。EPF・MoAbの作製は,Ko^^ ̈HLERとMILSTEIN(1975)の方法によって作製した。すなわち,近交系BALB/cマウスにEPF分画を注射し,腹水からEPF・MoAbを得た。特異性の検討は,OUCNTERLONY,免疫電気泳動イムノブロッテングなどにより現在,行っている。さらに,ENGVAL(1971)の方法により酵素免疫測定(ELISA)に応用する予定で実験を進めている。現在までに次の結果が得られている。1)今回のEPF抽出法で,2022KDの4つのバンドが妊娠血清に検出され,その3本は非妊娠血清に検出されることから,21.5KDの分画がEPFと推定された。2)等電点電気泳動から,これら4つのバンドはいずれもpH5近くで検出された。3)EPF・MoAbについて,現在スクリ-ニングを実施中である。

現在、抗一EPFモノクロナル抗体を作製、ミエロ-マとの融合を実施している。その結果、EPFの分子量は21.5KDと推定された。しかし、非妊娠血清IgGと妊娠血清由来のDEAEー非吸着分画とのイムノブロッテングで22KDと21.5KDのバンドは観察されてなかった。これは、PVDF膜への転写が不充分なためと考えられ、現在再検討している。等電点は二次元電気泳動から、pH6.3と推定された。また、EPFの構造について、2ーメルカプトエタノ-ルで環元されてないことから、単量体と推測された。妊娠由来のDEAEー非吸着分画とSDSーPAGEから切り出した22KDならびに21.5KDのバンドをラットに免疫し、モノクロナル抗体のスクリ-ニング用ELISAの測定系確立を進めている。
ラットにおける侵害受容モニターの開発

昨年度にはラットにおける脳波測定システムの確立を行い、本年度にはその確立されたシステムを用い、侵害受容に対するモニターとなりうるかの評価を上口唇と後肢のホルマリンテストを用いて行った。当初、周波数解析によるデータの解析を目標としていたが、自発呼吸下で測定する際においては、バーストアンドサプレッションの状態を維持することが必要であった。従って、解析方法としてはタイムドメイン解析を主体に行った。脳波をとり始めて波形が安定した頃にそれぞれホルマリンを局注し、それに伴う脳波の変化を観察したところ、第一相にあたる部分に一致して、バーストアンドサプレッション比の低下が確認された。第一相の変化が落ち着いていると思われる時期に注射部位の刺激試験を行った。すると、刺激後にバーストアンドサプレッション比の低下が認められた。この変化は上口唇でより強く観察され、顔面と四肢に痛みの経路の違いを示唆させる結果となった。この結果の要旨は、日本疼痛学会、北米神経科学会で発表し、現在投稿準備中である。今回の研究の目的は動物の疼痛モデルにおいてその評価に客観性を持たせるための侵害刺激モニターの開発を行うことにある。そのために、まず我々は、ラットにおいて頭部にマウンテンスクリューを設置し、脳波を測定する系の確立を行った。脳波を測定すること自体は容易であったが、そのスクリューが脱落しやすく、実験計画に記載したような疼痛モデルにおいて評価を行う術後2週から4週ではほぼ全例脱落してしまい、エリザベスカラーを使用すると、今度はストレスによる行動変化がみられるなど困難を極めた。スクリューを銅線に変更したり、スクリューより銅線を用いて耳道へ誘導したりと様々な工夫を凝らしているが4週間その電極を持たせるには至っていない。一方、侵害刺激と脳波変化の関係を捉えるためにホルマリンテストを行いその変化の解析を行った。セボフルレン麻酔によるスローインダクションで維持濃度を一定にし脳波の測定が安定したところでホルマリンを右後肢に局注し、その後の脳波変化が安定したところでvon Frey Filamentの15gで刺激を行った。すると、対側では見られなかった脳波変化がホルマリンを打った側での刺激でとらえられた。しかし、まだ個体数が少なく具体的な数値化に至っていない。さらに、個体数を増やし安定した結果を得られたところでの論文発表を予定している。これまでの結果は来春4月の神経麻酔・集中治療研究会で発表予定である。
小胞体関連分解に関わるジスルフィド結合還元酵素ERdj5の構造及び作用機序の解明

ERdj5はミスフォールドした糖タンパク質の誤ったジスルフィド結合を還元し、小胞体関連分解を促進する酵素である。本研究代表者は、X線結晶構造解析により決定したERdj5の構造情報を基に、幾つかの生化学実験及び細胞生物学実験を行い、ERdj5の主要な還元活性中心がC末端側に存在するクラスター(Cクラスター)であることを突き止めた。さらに、Cクラスターがミスフォールドタンパク質の糖鎖構造を認識する因子EDEMとの結合にも関与することを明らかにし、ERdj5とEDEM, BiPの協同作業によるミスフォールドタンパク質の認識、還元の分子機構を解明するに至った。分泌蛋白質や膜蛋白質の合成の場である小胞体には、蛋白質の正しいフォールディングを促すシステムが存在する一方、ミスフォールドした蛋白質を適正に処理するシステムも存在する。このシステムは蛋白質品質管理機構と呼ばれ、細胞の恒常性を維持する上で不可欠である。この機構の1つである小胞体関連分解(ERAD)を促進する因子ERdj5は、酸化的な環境である小胞体においてジスルフィド結合還元酵素として働き、ミスフォールド蛋白質の誤ったジスルフィド結合を還元する注目すべき酵素である。そこで我々は、ERdj5全長のX線結晶構造解析に取り組み、すでにそれを達成するに至った。ERdj5は小胞体シャペロンBiPと相互作用するJドメインと6つのチオレドキシン様ドメインから構成され、これら6つのチオレドキシン様ドメインは同一平面上に並び、酸化還元活性部位である四つのCys-X-X-Cysモチーフは全てこの平面のJドメイン側に位置していた。興味深いことに、ERdj5の全体構造は、N末端から4番目と5番目のチオレドキシン様ドメイン間のリンカー領域を境に2つのクラスター(Nクラスター、Cクラスター)に分断されることが明らかとなった。得られたERdj5全長の構造情報を基に幾つかの生化学実験及び細胞生物学実験を行ったところ、ミスフォールドタンパク質のジスルフィド結合を還元する主要な活性部位がCクラスターに存在することが判明した。さらに、Cクラスターがミスフォールドタンパク質の糖鎖構造を認識する因子EDEMとの結合にも関与することを明らかにし、ERdj5とEDEM, BiPの協同作業によるミスフォールドタンパク質の認識、還元の分子機構が解明された。この研究成果により、Erdj5-EDEM-BiP複合体結晶構造解析を達成するための多くの情報が得られた。本研究成果はMolecular Cell誌に掲載された。この機構の1つである小胞体関運分解(ERAD)を促進する因子ERdj5は、酸化的な環境である小胞体においてジスルフィド結合還元酵素として働き、ミスフォールド蛋白質の誤ったジスルフィド結合を還元する注目すべき酵素である。得られたERdj5全長の構造情報を基に幾つかの生化学実験及び細胞生物学実験を行ったところ、ミスフォールドタンパク質のジスルフィド結合を還元する主要な活性部位はC末端側に存在するクラスター(Cクラスター)であることが判明した。さらに、Cクラスターがミスフォールドタシパク質の糖鎖構造を認識する因子EDEMとの結合にも関与することを明らかにし、ERdj5とEDEM, BiPの協同作業によるミスフォールドタンパク質の認識、還元の分子機構が解明された。さらに詳しくERADの分子メカニズムを明らかにするために、ERdj5とそのパートナー蛋白質の複合体結晶構造解析を試みた。ERdj5とBipの複合体については結晶化を行ったが、結晶は得るには至っていない。サンプル調整や条件検討を見直し、今後も粘り強く取り組む予定である。EDEMについてはバキュロウイルス昆虫細胞遺伝子発現系を用いた大量発現に成功したものの、EDEM単独及びERdj5との共結晶化を行ったが、まだ結晶を得るには至っていない。今後も引き続き取り組む予定であり、達成されれば細胞内に蓄積するタンパク質に起因する神経変性疾患などの成因解明につながると考えられる。