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膜貫通型一酸化窒素還元酵素の一酸化窒素複合体の振動分光学的解析

一酸化窒素還元酵素(NOR)は脱窒過程の中で一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する。また、この反応は嫌気呼吸による生体エネルギーの合成に共役していることから、一酸化窒素還元酵素は嫌気呼吸を支える重要な酵素の一つとなっている。好気(酸素)呼吸系でこの酵素に対応するのがシトクロムc酸化酵素であり、両者は進化的に関連が深いことがアミノ酸配列などから明らかにされている。これら呼吸酵素の機能発現の仕組みを解明する鍵を握るのは短寿命な気体分子・呼吸酵素複合体である。本研究ではNORと一酸化窒素との複合体を安定に捕捉し、振動分光法によって解析することで活性部位の構造を明らかとし、その機能発現のメカニズムを解明することを目的としている。低温で凍結させた酵素を高圧ガスに曝露し、強制的に気体分子を試料内部に浸透させ短寿命な気体分子-蛋白質複合体を調製するクライオガスサイターを平成18年度に開発した。本年度は本装置を活用し、NORと一酸化窒素や分子状酸素との複合体を調製する条件検討を進めた。一酸化窒素ついては窒素ガス圧0.5気圧、-93度で20分間処理することでNORとの複合体と推定される化学種が吸収スペクトルにより観測された。また、酸素ガス圧10-20気圧、-53度で40分間処理することで酸素複合体の調製を試みた。調製した気体分子NOR複合体試料はナノリットルオーダーの微量であり、室温では不安定なため、その振動分光解析を行うため顕微低温共鳴ラマンスペクトル測定装置を兵庫県立大学の小倉教授らの協力の元整えた。本研究で確立した短寿命気体分子一酵素複合体の調製方法および測定装置をもちいて今後は複合体の詳細な振動分光解析を進めていく計画である。硝酸イオンを段階的に還元し窒素分子を生成する脱窒は自然界の窒素サイクルのプロセスのひとつであると共に、嫌気的なエネルギー代謝である硝酸呼吸として機能する重要な物質変換である。一酸化窒素還元酵素(NOR)は、この硝酸呼吸、脱窒の過程で一酸化窒素から亜酸化窒素を合成するヘム酵素である。また、本酵素は好気呼吸の末端酸化酵素であるシトクロムc酸化酵素(CcO)と相同性が見られることからNORはCcOの祖先分子であるとみなされており、分子進化の観点からも興味深い。このNORの作動機構を解明する上で最も重要な中間体は、活性部位に一酸化窒素が結合した複合体であるが、室温ではきわめて短寿命であるため反応機構には不明な点が多く残されている。本研究ではこの反応中間体の振動分光学的な解析を行い、NORが触媒するN-N結合生成機構を明かにし、嫌気呼吸、脱窒の原子レベルでの作用機構を解明することを目的とする。このためには短寿命な中間体を捕捉する新たな手法の開発が不可欠である。そこで低温下、凍結NORを高圧一酸化窒素ガスに暴露し、一酸化窒素複合体を調製するクライオガスサイターの開発を行った。この装置では-130°Cまで試料を冷却した状態で、20気圧の気体に曝露することが可能である。予備的な検討を行い、-80°Cの条件では塩化リチウム、グリセロール、エチレングリコールなどの抗凍結剤の存在下、気体分子が凍結試料に浸透できることを確認した。さらに、NORの一酸化窒素複合体解析のために顕微可視、顕微赤外分光装置を整えた。一酸化窒素は酸素に対する反応性が高いために、一酸化窒素複合体の調製は嫌気的条件下で行う必要がある。現在、酸素濃度を1ppm程度まで抑えたグローブボックス中でクライオガスサイターを用いる準備を進めているところである。
凍結耐性獲得に関与するタンパク質の細胞膜挙動に与える影響

温帯性植物の低温馴化過程で特異的な増加がみられる細胞膜タンパク質の機能について、凍結傷害発生の初発部位である細胞膜の凍結脱水過程の挙動に注目して解明することを目的とした。最初に、低温に応答して細胞膜に蓄積するシロイヌナズナLipocalin-like protein(AtLCN)を過剰発現させた植物体が野生型より高い凍結耐性を示すことを見出し、AtLCNが特定の凍結傷害機構(凍結過程で起こる凍結脱水により収縮した細胞が、融解過程に起こる吸水による膨張に耐えられずに破裂する機構)の発生を抑えていることを明らかにした。さらに、AtLCNは細胞膜のスフィンゴ脂質に富んだマイクロドメインの外側に局在すること、シロイヌナズナ細胞膜や細胞膜から抽出した脂質画分、さらには、細胞膜に微量に存在する酸性リン脂質(ホスファチジルセリンやホスファヂジルグリセロールなど)と相互作用することを明らかにした。また、これらのAtLCN反応性リン脂質を含む脂質小胞の凍結融解過程における膜融合を特異的に阻害することも判明したことから、AtLCNが細胞膜に存在する酸性リン脂質と電気的に相互作用し、その結果、細胞膜と他の細胞内膜系が凍結脱水過程で融合するのを防ぎ、凍結耐性の増加に貢献しているという仮説を提唱した。一方、細胞膜マイクロドメインに局在するタンパク質の網羅的同定と低温馴化の影響についても研究を進め、細胞の様々な機能に重要な働きをするタンパク質、具体的には、細胞膜-細胞壁の相互作用(細胞骨格)に関するもの、細胞内膜輸送系に関わるもの、膜輸送に関するものなどが局在することをプロテオーム解析によって明らかにした。その中でも、膜修復に関係するタンパク質(シナプトタグミン)に注目し、氷晶形成による機械的ストレスによる傷害修復に関係していることを見出した。最後に、細胞膜の凍結融解過程での挙動に影響を与える要因として、適合溶質の蓄積などの解析を細胞レベルや高等植物の祖先系である緑藻類を用いて行い、個体レベルや高等植物と異なる機構があることを提唱した。温帯性植物が低温に曝されて凍結耐性を獲得する過程(低温馴化過程)で特異的な増加がみられる細胞膜タンパク質の機能を凍結傷害発生の初発部位である細胞膜の凍結脱水下における挙動に注目して解明することを目的に研究を行った。平成17年度は、低温馴化過程で増加する細胞膜タンパク質(Arabidopsis lipocalin-like protein, AtLCN)に注目し、AtLCN遺伝子を恒常発現プロモーター(CaMV35S)に結合し、Agrobacteriumを用いてシロイヌナズナに形質転換した。得られた形質転換体の複数の系統を用いて凍結耐性を個体、葉、単離プロトプラストで評価したところ、野生型より高い耐性を示した。さらに、AtLCNタンパク質が示す凍結耐性増大メカニズムを明らかにするため低温顕微鏡を用いて単離プロトプラストの凍結融解過程を観察したところ、AtLCN過剰発現形質転換体では特定の凍結傷害機構(凍結過程で起こる凍結脱水により収縮した細胞が、融解過程に起こる吸水による膨張に耐えられずに破裂して傷害が発生する機構)が起こりにくくなっていることが示された。ついで、大腸菌で組換えAtLCNタンパク質を大量に生産する系を確立し、得られた組換えタンパク質を用いてAtLCN抗体を作製した。この抗体を用いて免疫電子顕微鏡観察によってAtLCNタンパク質の細胞内局在を調べたところ、多くが細胞膜近傍に存在することを確認した。野生型シロイヌナズナを低温馴化した場合も、AtLCNは細胞膜近傍に存在していることも明らかになった。

以上のことから、低温馴化過程で増加する細胞膜タンパク質AtLCNは、何らかの形で細胞膜との相互作用により、凍結融解過程における細胞膜の安定性を増し、凍結耐性を増加させているものと示唆された。温帯性植物が低温に曝されて凍結耐性を獲得する過程(低温馴化過程)で特異的な増加がみられる細胞膜タンパク質の機能を凍結傷害発生の初発部位である細胞膜の凍結脱水下における挙動に注目して解明することを目的に研究を行っている。平成18年度は、凍結耐性増大に関係することが既に知られている低温応答性細胞膜タンパク質の一つArabidopsis lipocalin-like protein (AtLCN)に注目し、その細胞膜上での局在性やLipid-Protein Overlay Assay法を用いた細胞膜との物理的相互作用の有無、さらには、リン脂質小胞の凍結融解過程における安定性への影響などを解析した。その結果、AtLCNは細胞膜のスフィンゴ脂質に富んだマイクロドメインの外側に局在することが判明した。また、AtLCNは、Arabidopsisから単離された細胞膜画分とそこから抽出した脂質画分、さらには、細胞膜に微量に存在するホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、そして、ホスファチジル酸と相互作用することが明らかになった。また、これらのAtLCN反応性リン脂質を含む小胞の凍結融解過程における融合を特異的に阻害することも判明した。以上の結果は、AtLCNが細胞膜に存在する酸性リン脂質とおそらく電気的に相互作用し、その結果、細胞膜と他の細胞内膜系が凍結脱水過程で融合するのを防ぎ、細胞が凍結耐性を増加することに貢献していることを示唆している。一方、解析を続けている低温応答性タンパク質Synaptotagmin-like proteinA (AtSytA)は、マイクロドメイン中に特異的に存在していることが明らかになり、低温応答性細胞膜タンパク質の局在や機能は、多様なものがあることが判明した。凍結傷害発生の初発部位である細胞膜の凍結脱水下における挙動に注目して、低温馴化過程で特異的な変動が見られる細胞膜タンパク質の機能を解明することを目的に研究を行った。平成19年度は、凍結耐性増大に関係することが既に知られている低温応答性細胞膜タンパク質の一つArabidopsis lipocalin-like protein(AtLCN)のリン脂質小胞の凍結融解過程における安定性への影響を引き続き解析した。その結果、AtLCNは脂質小胞の凍結誘導性融合現象を押さえるものの、凍結下で起こる小胞からの内容物の漏出には全く影響を及ぼさないことが判明した。つまり、懸濁液の凍結によって未凍結部分に濃縮し物理的に高い圧力を受けて起こる小胞間の相互作用には保護的に働くものの、小胞の膜二重層の安定性そのものには保護効果がないことを示している。さらに、細胞膜マイクロドメインに局在するタンパク質の網羅的同定と低温馴化の影響についても研究を進めた。マイクロドメインはステロールと糖脂質であるグルコセレブロシドに富んだ非陰性解明活性剤に不溶性の細胞膜画分で、低温馴化過程で細胞膜における割合が減少することがわかっている。
核酸コンフオメーションとその識別(総括班)

本特定研究は,遺伝情報の具現・制御にかヽわる生体機能を,これらの機能を指定する核酸コンフォメーションの構造とその識別の問題に集約して研究し,遺伝的生体制御についての理解を深めることを目的としている.この目的達成のため, 3ケ年の研究計画を立てヽ昭和60年度からスタートしており,したがって本年度はその最終年度となるので,研究の公募は行わず,初年度からの6計画研究班(計49名)と総括班により組織した.総括班はこの特定研究の実施に関する基本方針を定め,班員間の研究連絡や情報交換を促進することにより研究の円滑な実施をはかることを目的として,計画研究班の班長,関連領域の研究者,計17名で構成した.本年度実施した主な事業は次の通りである.a)班長会議を7月6日,総括班会議を8月27日に開催し,本年度の活動方針の立案と決定を行った.b)公開シンポジウムを12月7日,九州大学で開催し,本特定研究の主題である核酸コンフオメーション・シグナルの授受応答のメカニズムを中心に発表を行った.c)全班員が参加した合同班会議を8月25日から3日間にわたって開催した.全員が3年間の研究経過と成果を中心に発表を行い,今後の研究の方向についても十分な時間をかけて討論を行った.d)分子生物学データベース問題に関する研究会,染色体の構築に関するワークショップを開催し,研究の促進をはかった.e)サーキュラー,研究報告書の出版を行い,全班員と関連領域の研究者に配付した.g)合成DNA,酵素等の研究素材を班員に供与し,研究の捉進をはかった.本特定研究は,遺伝情報の具現・制御にかヽわる生体機能を,これらの機能を指定する核酸コンフォメーションの構造とその識別の問題に集約して研究し,遺伝的生体制御についての理解を深めることを目的としている.この目的達成のため, 3ケ年の研究計画を立てヽ昭和60年度からスタートしており,したがって本年度はその最終年度となるので,研究の公募は行わず,初年度からの6計画研究班(計49名)と総括班により組織した.総括班はこの特定研究の実施に関する基本方針を定め,班員間の研究連絡や情報交換を促進することにより研究の円滑な実施をはかることを目的として,計画研究班の班長,関連領域の研究者,計17名で構成した.本年度実施した主な事業は次の通りである.a)班長会議を7月6日,総括班会議を8月27日に開催し,本年度の活動方針の立案と決定を行った.b)公開シンポジウムを12月7日,九州大学で開催し,本特定研究の主題である核酸コンフオメーション・シグナルの授受応答のメカニズムを中心に発表を行った.c)全班員が参加した合同班会議を8月25日から3日間にわたって開催した.全員が3年間の研究経過と成果を中心に発表を行い,今後の研究の方向についても十分な時間をかけて討論を行った.d)分子生物学データベース問題に関する研究会,染色体の構築に関するワークショップを開催し,研究の促進をはかった.e)サーキュラー,研究報告書の出版を行い,全班員と関連領域の研究者に配付した.g)合成DNA,酵素等の研究素材を班員に供与し,研究の捉進をはかった.
APECED疾患モデルマウスを用いたカンジダ感染防御機構の解析

BALB/cマウスにCandida albicansを3.0×105CFU尾静脈接種すると、Aire KOおよび各種免疫不全マウス(μMT、Rag-1、nu/nu)で感受性に差が認められた。そこでこの感受性の差が何に基づくものか解明するため、各種サイトカインの変動に着目し、Th1、Th2、Th17応答の代表的なサイトカインとしてC.albicans感染マウス血清中のIFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17Aの変動を測定した。その結果、Aire WTマウスではIFN-γ、IL-4、IL-17Aは変動せず、IL-6のみ上昇することが確認できた。IL-6が、C. albicans感染により血清での濃度の上昇が認められたことから、IL-6が関与する自然免疫における貪食細胞の動員や炎症の誘導、また、Th17細胞の分化がカンジダ感染防御に重要であると考えられた。1.カンジダ感染防御機構異常の検討について本年はCandida albicansの感染実験のうち、生存率の変化に関して予備実験を実施した。これまでにBALB/cマウスでC.albicans3.0×10^5CFUの尾静脈注射を実施すると、Aire KOとWild typeで感受性に差を認めた。そこでこの条件で、B細胞欠損(μMT)マウスのC.albicansに対する感受性の検討を行ったところWild typeとμMTマウスで変化は認められなかった。次に、TおよびB細胞欠損(Rag1)マウスのC.albicansに対する感受性の検討において、Aire KOと同程度の感受性亢進を認めた。以上のことより、今回B細胞の意義に焦点を当てて研究を進めているが、B細胞単独というよりむしろB-T細胞相互作用にAireは関与している可能性が高いと考えられる。今後は、予定通り各KOマウスのリンパ球を移入し、感染実験を行い末梢におけるC.albicans感染防御にかかわる重要な細胞分画を決定する予定である。2. Aireの機能解析のために、AIREタンパクが相互作用するタンパクもしくは転写因子としての標的遺伝子を探索、同定について本年は、マウス抗Aire抗体を用いた免疫染色の実験系の確立をおこなった。従来から所有していたマウスの抗Aireペプチド抗体と、新たに購入した市販の抗ヒトAIRE抗体(マウス交差性あり)を用いて免疫染色の比較検討を実施した。その際、新生仔マウスの胸腺を用いた。結果として抗Aireペプチド抗体の有用性が確認できたため、今後このペプチド抗体を用いてウエスタンブロッティングや免疫沈降法を実施する予定である。1.カンジダ感染防御機構異常の検討についてこれまでのCandida albicansの感染実験で、BALB/cマウスでは3.0×10^5CFUのC.albicansを尾静脈接種すると、Aire KOおよび各種免疫不全マウス(μMT、Rag-1、nu/nu)で感受性に差が認められた。そこでこの感受性の差が何に基づくものか解明するため、各種サイトカインの変動に着目し実験を行った。Th1、Th2、Th17応答の代表的なサイトカインとしてC.albicans感染マウス血清中のIFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17Aの変動を測定した。その結果、Aire WTマウスではIFN-γ、IL-4、IL-17Aは変動ぜず、IL-6のみ上昇することが確認できた。今回の研究により、C.albicansの感染モデルマウスとしてのAire KOマウスは、30×10^5CFUのC.albicans接種で感受性の亢進が認められ、血清中のサイトカインはIFN-γ、IL-4、IL-17Aが測定限界近辺のため変動が認めらなかったものの、IL-6の上昇を確認できた。IL-6は自然免疫における貪食細胞の動員や炎症の誘導、また、Th17細胞の分化に必須で、全身の様々な細胞から産生されるサイトカインであるため、C.albicans感染により血清での濃度の上昇が認められたと考えられる。2.Aireの機能解析のために、AIREタンパクが相互作用するタンパクもしくは転写因子としての標的遺伝子を探索、同定についてAIREtransfected OTC-4細胞を用いてSDS-PAGEを行い、ヒト抗AIREペプチド抗体でウエスタンブロッティングの条件を設定した。その後、AIRE transfected OTC-4細胞とヒト抗AIREペプチド抗体で免疫沈降を実施したところ、相互作用するタンパク質のバンドを検出することができた。今後の展望としては、相互作用するタンパク質の同定を行うことで、Aireの機能解析を詳細に行うことが可能である。
知的財産権の権利範囲調節の仕組みと無体財産取引の動態に関する研究

この研究は、知的財産権の保護範囲が、知的財産の取引の動態との関係でどのように決定されるべきかと、また法制度がそれをどのような具体的仕組みで達成しているのかを明らかにすることを目的とするものである。特許法については、特許権の権利の範囲が明細書による発明の公開という仕組みを通じて決められていることを明らかにし、また、発明が累積的に行われるという実体に着目し、権利の範囲の決定についてどのような態度で臨むべきなのかを明らかにした。また、著作権法については、著作物の取引がどのように行われているのか、特に価格差別理論に着目して、権利制限規定の意義についての新たな理論を提示した。本年度は研究の2年目であり、前年度に確立した研究の方向を継続して実行し、いくつかの成果を公表することができた。定常的な情報収集の場として、昨年度に、東京で開催される主に特許法関連の研究会のメンバーとなり、また、著作権に関しては、コンテンツビジネスにかかわる法曹・企業実務家との勉強会という形のネットワークを確立したが、その場における情報収集は今年度の前半までも継続して実行している。今年度後半からは在外研究する機会を得たが、テレビ会議による参加等、後半もそのような情報収集は継続している。知的財産権をめぐる実務の問題状況についての正確な認識を得る作業は継続して行っている。特許法に関しては、特許権の保護範囲論と明細書による開示の関係について研究して助教論文の公開に向けた作業を継続し、本年度の中ごろに研究所の出版に至ることができた。その他この業績に関る小論稿も公開し、来年度にもこれに関する業績の公開を行うこととなる予定である。著作権法に関しては、侵害主体論に関する最高裁判決の判例評釈を昨年公開したが、それに引き続いて研究を行い、私的複製に関する問題点を指摘した論文を学術誌に公開することができた。情報財の取引に関する理論、主に価格差別理論などの成果を取り込んだ論稿である。また、同論文の公開後も、著作物の取引に関する研究は継続しており、今後は、私的利用に関する理論をさらに深めていくとともに、孤児著作物の問題等にも研究を広げていく予定である。本年度は研究の3年目であり、研究期間の延長を結果としてすることになったものの、最終年度であった。前年度からの研究の成果をとりまとめ、成果を公表することができた。また、来年度の成果公表に向けた準備を係属中である。前年度後半より、研究の場を在外研究先のスタンフォード大学に移したため、国内の情報収集よりアメリカにおける情報収集に重点を置いた形による研究へとシフトしたものに変更した。特許法に関しては、前年度に特許権の保護範囲論と明細書による開示の関係について研究して助教論文を公開したが、今年度においても引き続きこれに関する業績を公開することができた。これをもって保護範囲論と明細書の開示に係る一連の業績について、ひとまずの総括をすることができたと考えている。また、特許権の取引と特許権の制限の関係に向けた研究のために、文献の収集や調査を行った。著作権法に関しては、前年度に私的複製に関して取引理論を取り込んだ論稿を公表し、今年度においては、より著作権法全体にわたる考察へと領域を広げた研究の公表に向けた準備を行った。著作権の基本的構造と取引秩序にかかわる文献の収集と調査を行った。関連して、孤児著作物など著作権流通円滑化の基本にかかわる基礎的な文献収集と調査を行った。本年度は研究の初年度であり、主に研究の方向性を確立することに力を尽くした。まず、定常的な情報収集の場を整えるために、東京で開催される主に特許法関連の研究会のメンバーとなり、定期的に参加する体制を整えた。また、著作権に関しては、コンテンツビジネスにかかわる法曹・企業実務家との勉強会という形のネットワークを確立し、同じく情報集・意見交換の場を確立することに成功した。そして、それらの場を通じて、知的財産権をめぐる実務の問題状況についての正確な認識を得ることができた。これらの情報収集は、次年度以降も継続する予定である。特許法に関しては、特許権の保護範囲論と明細書による開示の関係について研究して助教論文の公開に向けた作業を継続した。概ね本年度中に完成に至り、次年度の早い段階で公開が可能な段階にある。さらに、これに関してその後新たに出された裁判例等の検討、及びそれらについての小論文を公表する作業も継続している。また、関連して、特許権の延長登録制度についての研究を行い、研究会にて報告を行った。その成果は、本年度3月に論文として公表された。著作権法に関しては、侵害主体論に関する裁判例の検討・研究を行い、問題状況の整理に努めた。また、問題の解決のために情報財の取引理論について研究する必要性を見出し、それらについての論説の整理及び研究を遂行した。

その成果は、同論点に関する最高裁判決の判例評釈という形で学術誌に公表した。この論文はあくまで中間報告という性質を帯びており、さらに発展をさせた論説を、次年度の早い段階で学会発表及び論文の形で公表するための準備も継続している。本年度は、研究計画を延長しての最終年度であり、研究の総まとめというべき年度であった。また、本年度より、本科研の成果をさらに発展する新たな科研の採択を受けており、それとの接合をすべき年度としての位置づけを有している。本科研においては、研究機関全体を通じて、主に特許法、著作権法において、知的財産の取引の動態が知的財産権の保護範囲の問題とどのように関連するかを明らかにしてきた。特許法においては、発明が累積的に行われていくという実体に着目し、特許要件のうち特に記載要件の判断をどのように行うべきか、それが特許発明の技術的範囲の決定においてどのような影響を有するのかについて明らかにしてきた。研究機関中に、単著を公表し関連する論文もいくつか公表している。著作権法においては、著作物の取引の理論、特に価格差別理論に着目をして、著作権の消尽や権利制限規定の意義について多面的な分析を加えてきた。その結果についてもすでに公表をしている。本年度は、それに加え、権利行使の場面における、知的財産権の制限にも着目した検討を行った。FRAND宣言された特許の権利行使に関する論稿を公表したのがその成果の一つである。単純な保護範囲についての議論からより多面的な知的財産法制の検討へとつなげる成果を公表できたことは、新たに採択された科研において、研究をより発展させていくうえで重要な一歩となると考えている。知的財産法研究計画は順調に進行し、多数の論文を公表することができた。昨年度は、立ち上げ期間ということもあり目立った成果を公表することができなかった部分もあった。本年度は昨年からの研究が目を結び始め、多数の論文を公表することができた。昨年度に多数の業績を公開し、今年度もそれに引き続いた成果の公表をすることができた。ただ、今年度に計画していた成果の公表には至らなかったため、研究期間の延長をすることとなった。若干の遅れが見られるものの、研究は順調に進行している。第一に、本研究の遂行のためには定期的な情報収集の場を立ち上げることが必要であったが、それらについては順調に確立することに成功した。その成果は公表された論文の中に有形・無形の形で貢献している。また、特許法に関しては、助教論文の公表を本年度中に終える予定であったが、それが次年度にずれこんでしまった。もっとも内容そのものについてはすでに完成しており、校正作業の遅れが原因であるため、重大な問題ではない。それ以外の短い論稿の発表も順調に行うことができたので、むしろ全体としてみれば予定よりはかどっている部分も多い。著作権法に関しては、研究の方向性を示す短い論文を発表するつもりでいたが、それに代わるものとして、最高裁に関する判例評釈を公表することができた。これは、当初の予定よりやや縮小された形の物ではある。これは、研究の遅れが原因というよりは、発表媒体の制約のためのという事務的な事情が大きい。公表されていない手稿の段階のものは予定通りの研究の進捗状況にある。
若手教員育成のための介入授業型メンタリングシステムの基礎研究

若手教員の教授技術の習得・向上を目的としたメンタリング・システムの開発を行った。本システムは、共同の授業設計、授業中の認知的介入、授業後の介入場面についての省察的対話、の3フェーズから構成されている。本システムを用いて小学校3名と中学校1名の若手教員を対象にメンタリングを合計5回行い、指導教師と若手教師の対話の分析を行った。その結果、指導教師による具体的な状況における教授技術の提示は、若手教師にとって効果あることが示されたとともに、事後の話し合いによって、なぜその教授技術が用いられたのかというメンターの個人的実践理論が明示され、教師教育における教授技術の教育可能性が示された。今年度は,小学校及び中学校で介入型メンタリングを各1事例実施した.小学校は体育,中学校は国語である.小学校は初任者研修の一部として実施した.中学校は若手教員を対象とした.その結果,介入型メンタリングシステム上の問題とメンターの役割の問題が浮き彫りになった.まず,システム上の問題は,業務用ワイヤレスマイクを使用したが,その範囲が狭くon-goingでの指示が体育のような場合,メンターとメンティ(新任・若手教師)との距離が近くならざるをえず,メンターによる授業認知が制約を受けることである.また,メンターからの指示を受信する受信機と授業記録用のワイヤレス送信機を教師は持たなければならず,授業運営上問題となることが明らかになった.中学校でも授業者が二つのマイクシステムを持つということがメカニカルな問題を生じすることが明らかになった.データ収集における改善がポイントである.これらの問題には,市販の音響機器を購入して改善を進めているところである.次に,メンターの役割である.授業観察からon-goingで指示を出すためには,メンターに高次の判断が求められることが明らかになった.授業の流れの中では,「○○しておけば××にはならない」といった授業後の省察ではなく,「○○したが,それにどのように対処するか」という視点から指示を出す必要がある.これは,授業者の意図や授業計画を十分に理解していることを前提に,即時の思考をメンターに求められることになる.その意味から,メンターの質が本メンタリングシステムではとりわけ重要である.これに関して,体育という教科特性,活動内容および初任者研修という状況に影響されていると思われるが,介入した新任教師に応じたメンタリングというよりも,体育という教科一般に関する授業運営や注意点の指示が多かった.このこともメンターの役割を検討する必要性を示していると考えられる.今年度は,昨年度と同様に小学校新任教師及び中学校若手教師を対象に,介入型メンタリングの実践を行った。小学校は3年生社会科,中学校は2年生国語科である。昨年度の実践を踏まえ,今年度は授業における介入型メンタリングに加え,指導案作成段階におけるメンタリグを行うことを明確に位置づけた。それは,メンターが授業実施中にその後の授業展開を予測しながら介入を行うことが求められるため,少なくとも授業展開を理解しておくことが必要だったからである。その結果,指導案作成時にメンターが焦点をあてたところは,「学習目標の設定は学習活動の展開を導く」「手立ての記入は学習活動と手立ては重複するから,評価の観点や学習活動のための留意点を書く」など,実際の授業の具体的なイメージ化と授業展開のストーリ化を促す,メンタリグで言えばキャリア機能の指導支援が主として行われていた。また,授業実施段階では,生徒の学習状況の把握,学習目標の確認,生徒に関する情報提供,教授行動の指示に加えて,授業中の教師行動を肯定的に評価する情緒的サポートであるコメントが行われていた。教授行動の指示は全体の47.1%を占めたが,メンターのコメント内容に理由まで述べられたものは26.5%であった。On-going(介入)によるメンタリングにおいては,メンティ(初任者もしくは若手教師)がメンターのコメントによりその教授場面で行う教授行動が適切であるかを判断するよりも実際に行った結果の生徒の反応によりその適切さを感じるということ,すなわちメンティが納得するということではないかということが考えられた。介入型メンタリングの有用性は本年度の結果を含めてある程度検証されたのではないかと思われるが,より有用性を高めるためにプログラムとしてどのような要件が求められるかは次年度の課題と考えられた。介入型メンタリングの有用性は,前年度の結果も加え,本年度の事例を通して,かなり検証されてきたと考え,おおむね計画通りに進行していると考えられる。しかし,介入型メンタリングを継続的に行うことの効果についてはまだ扱えていない。昨年度と本年度で中学校においては同一教師,指導者を対象にデータを収集しているので,その比較により継続的に行うことの有用性と問題点を明らかにすることが残されている。この点が十分に行えない理由として,指導案作成時から授業実施,さらに授業後の話し合いという3つのフェーズを繰り返し行うことは,新任もしくは若手教師と指導者ともに負担が大きいことから,さらなる簡便化も考える必要があると思われる。本年度は,データの追加を行うため,新任教師を対象に同様の研究を行った。対象は,小学校3年生道徳の授業である。メンターは,元校長であり,メンティの大学からの指導教員である。これまでの事例と同じく,授業設計段階の記録3回(ICレコーダーによる録音記録),オンゴーイングによるメンタリングのビデオ記録,ビデオクリップに基づく事後インタビュー(ICレコーダーによる録音記録)のデータを収集した。

これまでのデータの中で中学校国語教師を対象とした事例に関して,「わざ」あるいは「わざ知識(craft knowledge)」の獲得支援という視点から分析を行い,メンター教師の授業場面でのコメントは,一貫してその教師自身の授業に関する実践的理論に基づいていること,そしてその実践的理論に対応した教師行動を示していることが明らかになった。その分析結果ついては,ヨーロッパ教育学会(ECER2016)で発表を行った。また,同じ教師によるもう1つの事例に関して,メンタリングが行われる場を区別するinsideとoutsideという視点から分析を行った。これまでの事例から,特に指導案作成段階でのメンタリングがない場合,insideメンタリングだけでは十分な支援はできないことが示されていたので,授業中のinsideメンタリングと授業前のoutsideメンタリングの関係を明らかにすることを目的とした。授業前のメンタリングと授業中のメンタリングの関係に焦点をあてて分析を行った結果,メンター教師も教材研究を十分に行うこと,また単元目標,授業目標を明確にし,それをメンティと共有するために,「問い」という形式を多く用いてメンタリングをすること,などが明らかになった。さらに,insideメンタリングでは,事前の目標に基づく一貫したメンタリングが行われていた。結果は,ECER2017において発表予定である。若手教員の教授技術の習得・向上を目的としたメンタリング・システムの開発を行った。本システムは、共同の授業設計、授業中の認知的介入、授業後の介入場面についての省察的対話、の3フェーズから構成されている。本システムを用いて小学校3名と中学校1名の若手教員を対象にメンタリングを合計5回行い、指導教師と若手教師の対話の分析を行った。その結果、指導教師による具体的な状況における教授技術の提示は、若手教師にとって効果あることが示されたとともに、事後の話し合いによって、なぜその教授技術が用いられたのかというメンターの個人的実践理論が明示され、教師教育における教授技術の教育可能性が示された。小学校及び中学校各一事例を実施し,本研究計画で考えたシステムの試行ができ,問題点を明らかにできた.したがって,当初の計画に沿って,初年度の計画はおおむね達成できたと考えられる.ただ,実施時期が予定よりずれ込んだため,データの分析等がやや遅れている.最終年度を迎え,これまでの対象者と同一の対象者で介入型メンタリングを行い,このプログラムを繰り返し行うことのメリットと問題点を探ることを1つの課題とする。本年度行う事例も加えて,介入型メンタリングを行う手続きを明確にし,初任者研修などでの実施可能なプログラムのプロトタイプを開発する。教育工学今年度は,システム上の問題を解決するために購入した機器を活用した実践を小学校で行う.昨年度は,授業者との関係性を考え,初任者研修担当者にメンターとして参加していただいたが,今年度は研究協力をお願いしている,元校長(現大学教員)にメンターとして参加いただき,メンターの役割を吟味し,実践を行い,初年度の問題へアプローチする.また,昨年度お願いした中学校において,年間3回,同一教師,同一メンターで介入型メンタリングを実施し,両者の変容を明らかにする予定である.
C型インフルエンザウイルスのレセプター認識と出芽機構に関する研究

C型インフルエンザウイルスのレセプター結合能はヘムアグルチニン・エステラーゼ(HE)糖蛋白質に担われている。我々はレセプター認識部位をHE分子上に位置づけることを目的として解析を進めているが,これまでに,赤血球凝集能に変化を示した抗HE単クローン抗体抵抗性変異株の解析から,10個のアミノ酸(178,186,190,206,212,226,245,266,283,187)がレセプター結合活性に寄与していることを明らかにした。しかしレセプター結合部位はポケットを形成しており,抗原性を欠くと予測されるので,上記のアミノ酸は結合部位そのものではなくその周辺に位置している可能性が強い。ポケットを構成するアミノ酸を同定するためには,“抗体の圧力"以外の手段を用いて変異株を分離する必要がある。そこで本年度は,培養細胞への馴化変異株の分離を試みた。以下にその成績を要約する。1.現在山形県では2つの系統(山形/81系統,愛知/81系統)のC型ウイルスが共存し,流行を引き起こしている。そこでまず,山形/81系統の6株についてHMV-II細胞への馴化を試みた結果,レセプター結合能の増強に伴って,同細胞での増殖能が亢進した3つの馴化変異株を手にすることができた。さらにこれらの変異株のHEcDNAの塩基配列を決定することにより,HE分子上にそれぞれD283→Y,D283→N,E212→Kの変化が生じていることが明らかになった。いずれも抗HE単クローン抗体抵抗性変異株に見られたもので,それに呼応して,どの馴化変異株にも抗原性の変化が認められた。2.愛知/81系統に属する2株についてもHMV-II細胞への馴化を試みた。その結果,いずれの株からもレセプター結合能が亢進した馴化変異株が得られたが,その中に抗原性の変化を伴っていないものが3株認められた。現在アミノ酸置換部位の同定を急いでいる。
量子アニーリングの数値的研究

今年度も引き続き、最適化問題に対し量子アニーリングを用いた際に現われうる困難性についてランダム系の統計物理学による視点から解析を行い、研究論文として発表、及び学会において口頭発表を行った。ランダムスピン系特有の低温相として知られるスピングラス相と、難しい最適化問題に対しアニーリング法を用いて探索した場合の問題点における関連性がこれまで指摘されてきた。これは、模型の同一性、すなわち難しい最適化問題の典型例は物理学におけるランダムスピン模型で書き下すことが出来る事から示唆される。本研究では、新たなアニーリング手法である量子アニーリング法を最適化問題(スピングラス問題)に適用し、さらに対象を量子系に拡張することで低温相(量子スピングラス相)がどの様な物理的性質を持ち、アニーリングを実行した際の問題が生じるかを明らかにした。研究の特徴である対象の量子化には次のような意義がある。1.温度軸および量子化軸に対する相図や、量子性の導入のスピングラス相への影響は解析的研究が殆ど成されていない2.相図が明らかとなれば、相図平面上でスピングラス相転移を回避するといった比較的自由度の高いアニーリングパスを実現できる。結果として、量子スピングラス模型に対する低温相の性質を明らかにする解析的手法を提案し、それにより数値計算を行うことで相図を精度良く決定することに成功した。また、相図には現れない非平衡状態としての動的性質についても明らかにした。後者は特に最適化問題に対しての量子アニーリング法にとって大変重要である。動的性質が明らかとなる事で、量子アニーリング法を用いた際に量子相転移の回避を狙う最適なアニーリングパスを具体的に提案することが可能となる。このことは量子アニーリング法の今後のさらなる発展に対し大きな貢献になると考えられる。今年度は、縮退のある系の量子アニーリングを数値的な検証を中心に研究し論文として発表・及び学会において口頭発表を行った。縮退のある系というのは、組み合わせ最適化問題において解が複数あるという意味である。本研究により量子アニーリングにおいてこのような問題を扱う上では問題が生じる事が明らかとなり、「全て」の最適解の探索は本質的に難しいことが示された。このとき特定の最適解のみが他と比較して非常に高い確率で求まり、最適解は等確率で現れるとは言い難い。特に論文においては、その偏りの分布と系のサイズや縮退数依存性、そして縮退の有無による量子アニーリングの性能評価について詳細に調べられている。これは従来までの古典的なシミュレーテッドアニーリングでは現れなかった問題であり、今後量子アニーリングを用いて計算困難性のある最適化問題を取り扱う上で目的によっては注意を払う必要があることを意味する。また、量子アニーリングによって最適化問題を解く上で、量子相転移現象とアニーリングの困難性の関係が示唆されている。量子性を減少させ、解きたい最適化問題の基底状態に到達する過程で相転移現象が起ると、量子アニーリングが失敗する可能性が高くなる。今年度は最適化問題の一例としてスピングラス模型を取り上げ、量子性を横磁場により取り入れた場合の量子相転移現象についても研究を進めた。今後量子アニーリングのメカニズムである量子ダイナミクスの立場から、量子スピングラス模型について詳細に研究を進めていきたいと考えている。今年度は、最適化問題に対し量子アニーリングを用いた際に現われうる困難性について詳細に調べ上げ、研究論文として発表、及び学会において口頭発表を行った。スピングラス模型に代表される統計物理におけるランダムネスを伴うスピンモデルの基底状態を探索する問題は、難しい最適化問題の一種と見なすことができるために、最適化問題におけるコスト関数と、統計物理学におけるスピングラス模型のエネルギー構造との関連がこれまでの研究により指摘されてきた。スピングラス模型においては、スピングラス相と呼ばれる乱れた凍結相が低温において存在し、これが従来の熱アニーリング手法において最適解を求める際の障害となる。量子アニーリングにおいても同様の問題が起こると考えられており、このスピングラス相の存在や性質は、統計物理学上の問題としても、量子アニーリングの実用化を目指す研究としても大変興味深い研究対象である。本研究ではスピングラス模型を最適化問題の例として取り上げ、次のような視点から研究を行った。1.温度軸および量子化軸に対するスピングラス相の存在範囲の決定、2.スピングラス相転移とその物理的性質。結果として、量子アニーリングを行う際、多くのモデルにおいて量子性の減少によってスピングラス相転移が起こることが明らかとなった。一般に、相転移・臨界現象が起ると量子アニーリングが失敗する可能性があり、これが量子アニーリングの困難性であると考えられてきた。そのうえ、スピングラス相転移においては相内部においても特異性を持つ可能性が本研究において示唆され、これは相転移現象が転移点だけでなく、相内部において常に起き続けていることを意味する。これらの事実は量子アニーリングを実用化する際の大きな障害になり得るため、今後の研究ではこの困難性を回避するような経路を用いたアニーリングを提案し、実用性を追究したい。

本研究では、新たなアニーリング手法である量子アニーリング法を最適化問題(スピングラス問題)に適用し、さらに対象を量子系に拡張することで低温相(量子スピングラス相)がどの様な物理的性質を持ち、アニーリングを実行した際の問題が生じるかを明らかにした。研究の特徴である対象の量子化には次のような意義がある。1.温度軸および量子化軸に対する相図や、量子性の導入のスピングラス相への影響は解析的研究が殆ど成されていない2.相図が明らかとなれば、相図平面上でスピングラス相転移を回避するといった比較的自由度の高いアニーリングパスを実現できる。結果として、量子スピングラス模型に対する低温相の性質を明らかにする解析的手法を提案し、それにより数値計算を行うことで相図を精度良く決定することに成功した。また、相図には現れない非平衡状態としての動的性質についても明らかにした。後者は特に最適化問題に対しての量子アニーリング法にとって大変重要である。動的性質が明らかとなる事で、量子アニーリング法を用いた際に量子相転移の回避を狙う最適なアニーリングパスを具体的に提案することが可能となる。このことは量子アニーリング法の今後のさらなる発展に対し大きな貢献になると考えられる。
自己弁利用,弁なし補助心臓による補助循環の研究(幼小児に対する補助循環の試み)

(方法)体重6Kg前後のブタ4頭を用い、冠動脈結紮法にて左心不全を作成し、以下の7項目、1)大動脈流量、2)大動脈圧、3)左室圧、4)左房圧、5)一回心拍出量、6)肺動脈圧、7)中心静脈圧について、弁なし補助心臓の左心補助効果を見た。あらかじめ人工弁を取り除いた補助心臓(ゼオン社製40ml)を、送脱血管となる一本の導管を介して左室心尖に装着し、駆動装置(東洋紡社製VCTー20)で駆動した。(結果)中等度の心不全時には補助システムは良好に作動し、心不全時にひし弁なし補助心臓駆動により大動脈流量、一回心拍出量、大動脈圧は130%150%増加し、左房圧は15%40%減少した。しかし重症心不全時には大動脈流量、一回心拍出量、大動脈圧の増加は110%130%にとどまり、全身循環を維持するには不十分であった。また不整脈の多発した時には補助効果がさらに減じ、心室細動時には大動脈流量はほとんどなくなった。一方肺動脈圧、中心静脈圧は、弁なし補助心臓の駆動の有無による影響はほとんど見られなかった。(問題点)重症左心不全時有効な補助ができなかったのは、弁なし補助心臓の駆出時、左室の過伸展がおこり、補助心臓から大動脈への駆出が減少してしまうことによる。左室過伸展を防ぐために、心外部にバンドをまく方法や、補助心臓に連動して心臓を外部からマッサ-ジするような方法を併用すべきと考えられる。
金属栄養に応答する制御系の解明

植物は様々な遺伝子の発現を制御して、必須栄養素の鉄を土壌から吸収する。鉄吸収機構を効率的に働かせるために、植物は「シス配列」と「転写因子」と呼ばれる遺伝子スイッチを使って調節を行っている。既に、鉄欠乏を感知して発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に存在する鉄欠乏応答性シスエレメントを、世界で最初に同定することに成功しているが、さらにこのシス配列に結合して鉄吸収機構に関わる遺伝子群の転写を活性化する、転写因子の同定を目的とした。鉄欠乏応答性シスエレメントIDEに特異的に結合する転写因子の探索を行った結果、イネの新規転写因子IDEF1(IDE-binding factor 1)の同定に成功した。IDEF1は植物固有の転写因子ファミリーABI3/VP1の未だ解析されていないサブグループに属し、IDE1内のCATGC配列に特異的に結合するという新規の配列認識特性を持つことが明らかになった。鉄欠乏誘導性プロモーターの制御下でIDEF1を発現させた形質転換イネは、石灰質アルカリ土壌において良好な初期生育を示した。この形質転換イネは鉄欠乏条件下で二価鉄トランスポーター遺伝子OsIRT1と、鉄欠乏誘導性転写因子遺伝子OsIRO2の発現を促進させた。これらの結果から、IDEF1は鉄欠乏応答に関与する多段階の遺伝子制御ネットワークの初期段階を担うことによって鉄欠乏応答性と耐性を制御することが明らかになった。IDEF1は、鉄欠乏に応答する遺伝子発現のマスタースイッチとして働くと考えられる。この成果は、未解明だった植物の鉄欠乏応答メカニズムを分子レベルで理解する上で、最初の決定的な発見であり、植物の鉄ホメオスタシスの分野に飛躍的な展開をもたらすブレークスルーである。植物は土壌中から必須栄養素である鉄を根の細胞膜に存在するトランスポーターによって細胞内に取り込み、必要とされる部位に送り込む。植物は鉄欠乏条件下で鉄の吸収・利用機構に関与する遺伝子群の発現を誘導するが、この遺伝子制御の分子メカニズムはほとんど解明されていなかった。そこで我々は、これまでに同定した鉄欠乏応答性シスエレメントIDEに特異的に結合する転写因子の探索を行った結果、イネの新規転写因子IDEF1 (IDE-binding factor 1)の同定に成功した。35Sプロモーターの制御下でIDEF1を恒常的に高発現させた形質転換タバコでは、鉄欠乏根のみでIDE1を介した発現が活性化された。鉄欠乏誘導性プロモーターの制御下でIDEF1を発現させた形質転換イネは、鉄欠乏水耕液で鉄欠乏クロロシスの進行が遅く、石灰質アルカリ土壌で発芽させると良好な初期生育を示した。本研究は、鉄栄養に関わると想定される転写因子を同定、解析することにより、鉄栄養に応答する遺伝子の発現制御の分子構造を明らかにすることを目的とし、今年度は、鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1、IDE2に結合する転写因子のスクリーニング、およびイネマイクロアレイ法による鉄欠乏誘導性転写制御関連タンパク質の網羅的探索を中心に研究を進めた。鉄は生命活動に必須な金属元素であり、植物は様々な遺伝子の発現を制御して、鉄を効率的に吸収する。

既に、鉄欠乏を感知して発現が誘導される遺伝子のプロモーター領域に存在する鉄欠乏応答性シスエレメントを、世界で最初に同定することに成功している。さらに我々が解明しているシス配列IDE1に結合して鉄吸収機構に関わる遺伝子群の転写を活性化する新規転写因子IDEF1を発見した。IDEF1は、鉄欠乏に応答する遺伝子発現のマスタースイッチとして働くと考えられる。このことは、それまで未解明だった植物の鉄欠乏応答メカニズムを分子レベルで理解する上で、最初の決定的な発見であり、植物の鉄ホメオスタシスの分野に飛躍的な展開をもたらすブレークスルーとなった。IDEF1の発現を強化したイネは、石灰質アルカリ土壌における鉄欠乏に耐性であった。
設計誤り検出のためのモデル検査を用いたソフトウェア解析システムの開発

信頼性の高い情報システムを実現するためには,設計上の誤りを開発のできるだけ早期の段階で検出することが非常に重要となる.そのための手法として,システム上で起こりうる状態を網羅的に調べるモデル検査と呼ばれる方法がある.特に,状態集合や遷移関係を論理関数によって表現することで効率良く検査を行う方法は記号モデル検査と呼ばれ,ハードウェアシステムの検証に広く利用されている.しかしながら,現在の段階ではソフトウェアに対するモデル検査手法は十分に確立されていると言いがたい.そこで本研究では,ソフトウェアのための新しい記号モデル検査手法を考案し,その方法を実装した解析システムの開発を行った.より具体的には,限定モデル検査(Bounded Model Checking)と呼ばれる新しい記号モデル検査手法の利用を試みた.この手法は,探索する状態系列の長さを予め限定することで,少なくとも処理の早い段階で現れる誤りを検出するという方法である.これまでの研究で,時相論理の良く知られたクラスである線形時間論理に属する論理式を検証するアルゴリズムが示されていたが,実際に開発されている検証系はその中の極一部の論理式にしか対応していなかった.そこでこのアルゴリズムを完全な形で実装した検証系の開発を行った.この過程で,検証対象となる並行システムがinterleavingなセマンティクスを持つ場合,このアルゴリズムでは効率の良い検証が困難であることが分かった.そこで,論理関数の新たな構成法を開発し,ペトリネットや,通信電話サービス等の上記の性質を有するシステムの検証に適用した.その結果,特にシステムの状態数が大きくなった場合,提案法が記号的な手法を用いない従来のモデル検査手法に比較して,非常に効率の良い検証が可能であることを示すことができた.信頼性の高い情報システムを実現するためには,設計上の誤りを開発のできるだけ早期の段階で検出することが非常に重要となる.そのための手法として,システム上で起こりうる状態を網羅的に調べるモデル検査と呼ばれる方法がある.特に,状態集合や遷移関係を論理関数によって表現することで効率良く検査を行う方法は記号モデル検査と呼ばれ,ハードウェアシステムの検証に広く利用されている.しかしながら,現在の段階ではソフトウェアに対するモデル検査手法は十分に確立されていると言いがたい.そこで本研究では,ソフトウェアのための新しい記号モデル検査手法を考案し,その方法を実装した解析システムの開発を行った.より具体的には,限定モデル検査(Bounded Model Checking)と呼ばれる新しい記号モデル検査手法の利用を試みた.この手法は,探索する状態系列の長さを予め限定することで,少なくとも処理の早い段階で現れる誤りを検出するという方法である.これまでの研究で,時相論理の良く知られたクラスである線形時間論理に属する論理式を検証するアルゴリズムが示されていたが,実際に開発されている検証系はその中の極一部の論理式にしか対応していなかった.そこでこのアルゴリズムを完全な形で実装した検証系の開発を行った.この過程で,検証対象となる並行システムがinterleavingなセマンティクスを持つ場合,このアルゴリズムでは効率の良い検証が困難であることが分かった.そこで,論理関数の新たな構成法を開発し,ペトリネットや,通信電話サービス等の上記の性質を有するシステムの検証に適用した.その結果,特にシステムの状態数が大きくなった場合,提案法が記号的な手法を用いない従来のモデル検査手法に比較して,非常に効率の良い検証が可能であることを示すことができた.