hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低蛋白食の急性腎不全発症・進展への予防効果とその分子機構

低蛋白食は、慢性腎不全の治療手段として臨床応用されている。低蛋白食により、腎機能面及び組織面よりみた腎不全の遅延・蛋白尿の軽減などが観察されているが、その生化学的機能は明らかでない。最近、腎内内分泌環境の変化、特にレニン-アンジオテンシンシステムの増強及び腎内トロンボキサンの産生亢進が腎不全進展の一要因と考えられている。昨年度の研究で、我々は、低蛋白が、急性閉塞性腎症の糸球体において、シクロオキシゲナーゼ活性の上昇を抑制し、腎血行動態の変更に直接関与するエイコサノイド(PGE_2・6-keto PGF_<1α>・TxB_2)の産生亢進を阻害することを見い出した。本年度は、この生化学的機構をさらに明らかにするために、高(40%)・低(6%)蛋白食を摂取させたラットの腎糸球体でのホスホリパーゼ(PL)A_2・PLC活性、G-プロテイン(G_<αs>・G_<αi2>・G_<αi3>・G_β)量を測定した。低蛋白食に比し高蛋白食は、PLA_2活性を著明に上昇させたがPLC活性に影響を与えなかった。また、高蛋白食では、低蛋白食に比しG_<αi2>・G_<αi3>の低下及びG_βの上昇が観察されたが、、高蛋白食と低蛋白食の間でG_<αs>の変化は認められなかった。G-プロテインβγ-サブユニットは、PLA_2の活性化に関与することが知られている。故に、高蛋白食は、G_βの上昇を介してPLA_2を活性化することが示唆される。逆に、低蛋白食は、G_βの上昇を阻害することによりPLA_2の活性化を抑制するように思われる。過去2年間の研究をまとめると、食事中の蛋白制限により各種G-プロテインの変化(特にG_β)→PLA_2の活性化→シクロオキシゲナーゼの活性化→エイコサノイド(特にTx)産生の亢進が抑制され、腎不全の進展の遅延がもたらされると考えられる。他の血管作動性物質が蛋白制限に対してどの程度影響を受けるのか評価することは、今後の課題である。低蛋白食は、慢性腎不全進展予防の治療手段として臨床応用されている。低蛋白食により、腎機能面及び組織面よりみた腎不全進展の遅延・蛋白尿の軽減などが観察されているが、その生化学的機構は明らかでない。最近、腎内内分泌環境の変化、特にレニン-アンジオテンシンシステムの増強及び腎内トロンボキサンの産生亢進が腎不全進展の一要因と考えられ、また、我々も、高蛋白質がホルモン結合性G-プロテイン(βγ-サブユニット)・膜結合性ホスホリパーゼA_2を介して腎血行動態を直接的に調節するエイコサノイド(PGE_2・6-keto PGF_1α・TxB_2)の産生能を変化させることを見い出している。従来、低蛋白食における予防効果は、慢性腎不全で検討されているが、急性腎不全では、その効果はほとんど評価されていない。それ故にこの研究では、標準(23%)・低(6%)

蛋白食を摂取させたラットより、急性閉塞性腎症(BUO)・シャム手術(SOC)モデルを作製して、糸球体濾過率(GFR)・腎血しょう流量(RPF)から低蛋白食による腎機能温存効果を評価した。また、腎糸球体でのPGE_2・6-keto PGF_1α・TxB_2の産生量を決定すると共に、シクロオキシゲナーゼ(COX)活性・量を測定してその生化学的機構を明らかにした。標準食SOCでは、低蛋白食SOCに比しGFR・RPFが約50%まで上昇していた(Hyperfiltration)。BUOでは、それぞれのSOCに比し、標準食で約70%、低蛋白食で約30%のGFR・RPFの低下が認められた。低蛋白食は、BUOにおけるGFR・RPFの低下を軽減した。糸球体性エイコサノイド、特に血管拡張性PGE_2・6-keto PGF_1αは、標準食SOCで低蛋白SOCに比し、COX活性・量と共に有意に上昇していた。対照的に、標準食BUOに比し、低蛋白食BUOで、血管収縮性TxB_2は、COX活性・量と共に有意に低下していた。以上の結果より、低蛋白食は、COX活性を抑制することによりTxB_2の産生を阻害する結果、腎血行動態の悪化を軽減することが示唆される。低蛋白食は、慢性腎不全の治療手段として臨床応用されている。低蛋白食により、腎機能面及び組織面よりみた腎不全の遅延・蛋白尿の軽減などが観察されているが、その生化学的機能は明らかではない。最近、腎内内分泌環境の変化、特にレニン-アンジオテンシンシステムの増強及び腎内トロンボキサンの産生亢進が腎不全進展の一要因と考えられている。昨年度の研究で、我々は、低蛋白が、急性閉塞性腎症の糸球体において、シクロオキシゲナーゼ活性の上昇を抑制し、腎血行動態の変更に直接関与するエイコサノイド(PGE_2・6-keto PGF_<1α>・TxB_2)の産生亢進を阻害することを見い出した。本年度は、この生化学的機構をさらに明らかにするために、高(40%)・低(6%)蛋白食を摂取させたラットの腎糸球体でのホスホリパーゼ(PL)A_2・PLC活性、G-プロテイン(Gαs・Gαi_2・Gαi_3・Gβ)量を測定した。低蛋白食に比し高蛋白食は、PLA_2活性を著明に上昇させたがPLC活性に影響を与えなかった。また、高蛋白食では、低蛋白食に比しGαi_2・Gαi_3の低下及びGβの上昇が観察されたが、、高蛋白食と低蛋白食の間でGαsの変化は認められなかった。G-プロテインβγ-サブユニットは、PLA_2の活性化に関与することが知られている。故に、高蛋白食は、Gβの上昇を介してPLA_2を活性化することが示唆される。逆に、低蛋白食は、Gβの上昇を阻害することによりPLA_2の活性化を抑制するように思われる。
燃焼場で発生する微粒子前駆物質のレーザー計測法の開発

本研究では,火炎中で発生する粒子状物質の前駆物質である多環芳香族炭化水素を,測定するレーザー計測法を開発した.特に,従来からあるレーザー誘起蛍光法と分光分析法を結びつけて,多環芳香族炭化水素から得られる蛍光スペクトルに関するデータを収集し,実際の火炎場で観察されるスペクトルデータから,これら多環芳香族炭化水素の同定を行う方法の確立を目指した.レーザー誘起蛍光法はレーザー光を物質に照射して励起し,その後に発せられる励起光を検出することで,その物質の同定を行う方法である.この方法を多環芳香族炭化水素に応用する場合,多環芳香族炭化水素はベンゼン環の数や結合状態によって,基準振動状態が異なり,照射光に対する吸収感度や蛍光スペクトル構造が微妙に異なっている.そこでまず,さまざまな多環芳香族炭化水素の蒸気に対して,種々の波長のレーザー光を照射し,得られる蛍光のスペクトルに関する詳細なデータベースを作製した.次に,このデータベースを基に実際の燃焼場から得られる蛍光スペクトルの形状を解析して,燃焼場内での多環芳香族炭化水素の同定を行う方法を導入した.その結果,蛍光スペクトルのピーク波長から多環芳香族の構成炭素数を推定できることがわかった.特に,実際の火炎中での計測結果から,すす粒子が発生する領域の直前では,炭素数が1826程度の多環芳香族炭化水素が存在することが推定できた.また,このような推定法と同時に多環芳香族蛍光の緩和時間とすす粒子の赤熱発光時間の差を利用して,両者の像を分離する方法も開発した.さらに,実際の内燃機関における燃焼を想定して液体燃料の拡散火炎中の多環芳香族炭化水素についても蛍光スペクトルの観察を行った.その結果,ガス燃料の場合と同様にすす粒子が発生する直前の多環芳香族炭化水素の炭素数はおよそ1826程度であることが確認できた.本研究では,火炎中で発生する粒子状物質の前駆物質である多環芳香族炭化水素を,測定するレーザー計測法を開発した.特に,従来からあるレーザー誘起蛍光法と分光分析法を結びつけて,多環芳香族炭化水素から得られる蛍光スペクトルに関するデータを収集し,実際の火炎場で観察されるスペクトルデータから,これら多環芳香族炭化水素の同定を行う方法の確立を目指した.レーザー誘起蛍光法はレーザー光を物質に照射して励起し,その後に発せられる励起光を検出することで,その物質の同定を行う方法である.この方法を多環芳香族炭化水素に応用する場合,多環芳香族炭化水素はベンゼン環の数や結合状態によって,基準振動状態が異なり,照射光に対する吸収感度や蛍光スペクトル構造が微妙に異なっている.そこでまず,さまざまな多環芳香族炭化水素の蒸気に対して,種々の波長のレーザー光を照射し,得られる蛍光のスペクトルに関する詳細なデータベースを作製した.次に,このデータベースを基に実際の燃焼場から得られる蛍光スペクトルの形状を解析して,燃焼場内での多環芳香族炭化水素の同定を行う方法を導入した.その結果,蛍光スペクトルのピーク波長から多環芳香族の構成炭素数を推定できることがわかった.特に,実際の火炎中での計測結果から,すす粒子が発生する領域の直前では,炭素数が1826程度の多環芳香族炭化水素が存在することが推定できた.また,このような推定法と同時に多環芳香族蛍光の緩和時間とすす粒子の赤熱発光時間の差を利用して,両者の像を分離する方法も開発した.さらに,実際の内燃機関における燃焼を想定して液体燃料の拡散火炎中の多環芳香族炭化水素についても蛍光スペクトルの観察を行った.その結果,ガス燃料の場合と同様にすす粒子が発生する直前の多環芳香族炭化水素の炭素数はおよそ1826程度であることが確認できた.本研究で、火炎中で発生するすすあるいは粒子状物質の前駆物質である多環芳香族炭化水素を,測定するレーザー計測法を開発することを目的とした.特に,従来からあるレーザー誘起蛍光法と分光分析法を結びつけて,多環芳香族炭化水素から得られる蛍光スペクトルに関するデータを収集し,実際の火炎場で観察されるスペクトルデータから,これら多環芳香族炭化水素の同定を行う方法の確立を目指した.ここで用いるレーザー誘起蛍光法はレーザー光を物質に照射して励起し,その後に発せられる励起光を検出することで,その物質の同定を行う方法である.この方法を多環芳香族炭化水素に応用する場合,多環芳香族炭化水素はベンゼン環の数や結合状態によって,基準振動状態が異なり,照射光に対する吸収感度や蛍光スペクトル構造が微妙に異なっている.そこでまず,さまざまな多環芳香族炭化水素の蒸気に対して,種々の波長のレーザー光を照射し,得られる蛍光のスペクトルに関する詳細なデータベースを作製した.次に,このデータベースを基に実際の燃焼場から得られる蛍光スペクトルの形状を解析して,燃焼場内での多環芳香族炭化水素の同定を行う方法を導入した.その結果、蛍光スペクトルのピーク波長から多環芳香族の構成炭素数を推定できることがわかった.特に,実際の火炎中での計測結果から,すす粒子が発生する領域の直前では,炭素数が1826程度の多環芳香族炭化水素が存在することが推定できた.また,このような推定法と同時に多環芳香族蛍光の緩和時間とすす粒子の赤熱発光時間の差を利用して,両者の像を分離する方法も検討した.これによって,多環芳香族炭化水素のみの蛍光像を取得できることを確認することが出来た.本研究では,火炎中で発生する粒子状物質の前駆物質である多環芳香族炭化水素を,測定するレーザー計測法を開発した.

特に,従来からあるレーザー誘起蛍光法と分光分析法を結びつけて,多環芳香族炭化水素から得られる蛍光スペクトルに関するデータを収集し,実際の火炎場で観察されるスペクトルデータから,これら多環芳香族炭化水素の同定を行う方法の確立を目指したレーザー誘起蛍光法はレーザー光を物質に照射して励起し,その後に発せられる励起光を検出することで,その物質の同定を行う方法である.この方法を多環芳香族炭化水素に応用する場合,多環芳香族炭化水素はベンゼン環の数や結合状態によって,基準振動状態が異なり,照射光に対する吸収感度や蛍光スペクトル構造が微妙に異なっている.そこでまず,さまざまな多環芳香族炭化水素の蒸気に対して,種々の波長のレーザー光を照射し,得られる蛍光のスペクトルに関する詳細なデータベースを作製した.次に,このデータベースを基に実際の燃焼場から得られる蛍光スペクトルの形状を解析して,燃焼場内での多環芳香族炭化水素の同定を行う方法を導入した.その結果,蛍光スペクトルのピーク波長から多環芳香族の構成炭素数を推定できることがわかった.特に,実際の火炎中での計測結果から,すす粒子が発生する領域の直前では,炭素数が1826程度の多環芳香族炭化水素が存在することが推定できた.また,このような推定法と同時に多環芳香族蛍光の緩和時間とすす粒子の赤熱発光時間の差を利用して,両者の像を分離する方法も開発した.さらに,実際の内燃機関における燃焼を想定して液体燃料の拡散火炎中の多環芳香族炭化水素についても蛍光スペクトルの観察を行った.その結果,ガス燃料の場合と同様にすす粒子が発生する直前の多環芳香族炭化水素の炭素数はおよそ1826程度であることが確認できた.
無症候性脳梗塞・白質病変に関するガイドラインの検証研究

脳ドックガイドライン2003では無症候性脳梗塞と白質病変の鑑別については明記されていなかったため、白質病変を脳梗塞と診断する施設が多く、無症候性脳血管障害の画像診断基準の再検討が急務であった。今回、脳ドックの現状調査を行った結果、推奨されているT1,T2,FLAIRの3種を併用したMRI撮像法を実施していない施設が40%近くあり、FLAIR画像の撮像条件にもばらつきが見られた。以上の結果を踏まえて、画像診断精度向上のため複数の放射線専門医による画像診断実験を行い無症候性脳梗塞と白質病変を鑑別する上で最も有効な撮像法の組合せがT1,T2,FLAIRであることを科学的に証明し、Am J Neuroradiolに掲載された。これに基づいてMRI標準画像を含めて画像診断基準を作成し、脳ドックガイドライン2008に採用された。これにより初めて本邦での脳ドックにおける大規模追跡調査研究が可能になったといえる。また頸部エコーや認知機能検査の実施率も低かったので、頸部エコーの標準検査法、認知機能の標準検査法を現場での実用性、脳ドックでの有用性を考慮して具体的に示した脳ドックガイドライン2008に準拠した脳ドック標準データベースをファイルメーカーで作成し、さらにMRI画像のviewer、報告書作成を含めた安価な完全電子化脳ドック説明システムを試作した。最終的にこの脳ドック標準データベースを複数施設で無症候性脳梗塞例を合計247名実際に入力して貰い操作性を検証した。連結可能匿名化したこれらの無症候性脳梗塞例のMRIの3種画像を提出して貰い放射線専門医の判定と各施設担当医判定を比較検討し、今回作成した大脳白質病変の評価基準の検証研究も行いその有用性を確認した。1)ガイドライン検証研究脳ドック375施設への詳細なアンケート調査(回収率57%)を行った。その結果、ガイドラインに則ってT1、T2、FLAIR画像をすべて撮像している施設は216施設中99施設(1.5Tでは70施設)に過ぎないことが判明した。この状態では標準データベースを作成しても診断精度が担保できないため、今年度末に開始を予定していた登録は延期し、現状における撮像法の組み合わせでの診断精度を検討すべく、佐々木分担研究員を中心に「脳ドックにおける無症候性脳梗塞・白質病変の判定能に関する読影実験」を追加研究として実施した。対象は統一された基準を満たした無症候性脳梗塞または白質病変を認める35例と対象群15例で1.5ヵ月おきに4回の読影を行った。この結果、いずれの2つの画像の組み合わせもこれら3つによる診断よりも精度が劣ることが明らかとなった。診断精度のレベルアップを図るため次年度に標準画像も作成した上で診断基準の標準化を行うことにした。2)脳ドックデータベースの標準化に関する研究各施設における脳ドックデータベースの内容調査を実施した。すでに25施設のデータベースの内容を集積して現在解析を行っている。内容的にはばらつきが大きく、また無症候性脳血管障害の予後や危険因子の多施設共同研究目的には作られていない施設が大半を占めており、日本の脳ドックでエピデンスを作成して行くには標準データベースが不可欠であることが明らかとなった。標準データベースと各脳ドック施設のデータベースの橋渡しをするフィルターソフト開発を目指して脳ドック2施設の訪問調査を実施した。また、標準データベースを作成運用のためのサーバーを島根大学に設置した。38施設が研究協力者として標準データベース研究に参加してくれることになった。1)無症候性脳血管障害の画像診断基準作成昨年度の画像診断実験研究に基づいてMRI画像診断の標準化を行い、標準画像を含めて各施設に配布できる画像診断基準を作成した。この内容は平成20年6月に発表予定の「脳ドックガイドライン2008」に採用されることになっている。

2)画像診断基準に基づいた読影研究とその評価この研究についてアンケートと同時に依頼も行い、10施設以上から読影研究への参加承諾を取り付けた。最新の無症候性脳梗塞・白質病変診断基準に関するガイドラインの検証を行うことが重要な目的であるので今までの「脳ドックガイドライン2003」ではなく、新しい「脳ドックガイドライン2008」の公表を待って読影研究を行うことにした。3)標準データベース試作版作成標準データベース作成にむけて実績のある施設において各施設データベース等の内容調査を行った。36施設から回答を得て最低限必要な項目の洗い出しとオプション項目の検討を行い、標準項目の設定をほぼ終了した。画像診断の標準的記載法及び各施設で多様な形式のある結果報告書書式作成に予想以上の時間がかかり、標準データベース試作版作成が遅れている。しかし、基本項目については骨組みの設計は完成しており、来年度前半に完成予定である。施設毎のインターフェイスソフト開発については施設への訪問調査結果を踏まえて可能性を引き続き検討し、既往歴などの変換可能な項目の洗い出しを行った。4)脳ドック結果説明システム構築研究島根難病研究所脳ドックに、モデルとなる脳ドックデータ蓄積用サーバーとMRI機器をLANで結んだ電子化脳ドック結果説明システムを試作し設置した。画像を含めた各種検査結果取り込み、正常画像対比が容易に出来るところまで開発が進んでいる。標準データベースの検査結果説明内容を項目毎に抽出し、選択入力可能なソフトを開発する準備が整った。脳ドックガイドライン2003では無症候性脳梗塞と白質病変の鑑別については明記されていなかったため、白質病変を脳梗塞と診断する施設が多く、無症候性脳血管障害の画像診断基準の再検討が急務であった。今回、脳ドックの現状調査を行った結果、推奨されているT1,T2,FLAIRの3種を併用したMRI撮像法を実施していない施設が40%近くあり、FLAIR画像の撮像条件にもばらつきが見られた。以上の結果を踏まえて、画像診断精度向上のため複数の放射線専門医による画像診断実験を行い無症候性脳梗塞と白質病変を鑑別する上で最も有効な撮像法の組合せがT1,T2,FLAIRであることを科学的に証明し、Am J Neuroradiolに掲載された。これに基づいてMRI標準画像を含めて画像診断基準を作成し、脳ドックガイドライン2008に採用された。これにより初めて本邦での脳ドックにおける大規模追跡調査研究が可能になったといえる。また頸部エコーや認知機能検査の実施率も低かったので、頸部エコーの標準検査法、認知機能の標準検査法を現場での実用性、脳ドックでの有用性を考慮して具体的に示した脳ドックガイドライン2008に準拠した脳ドック標準データベースをファイルメーカーで作成し、さらにMRI画像のviewer、報告書作成を含めた安価な完全電子化脳ドック説明システムを試作した。最終的にこの脳ドック標準データベースを複数施設で無症候性脳梗塞例を合計247名実際に入力して貰い操作性を検証した。連結可能匿名化したこれらの無症候性脳梗塞例のMRIの3種画像を提出して貰い放射線専門医の判定と各施設担当医判定を比較検討し、今回作成した大脳白質病変の評価基準の検証研究も行いその有用性を確認した。
粘土単分子膜の製作とその不斉電極修飾膜への応用

本研究では、ラングミュア・ブロジェット(LB)法によって粘土鉱物の超薄膜を作製する方法を開発し、それを電極修飾膜として不斉電極反応に応用することを目指したものである。研究は3年間に渡って行った。第1年度は、気液界面上に展開した単一層からなる粘土の超薄膜を得る方法を探索した。そのために、粘土粒子を疎水化するための様々な方法を考案して試みた。その結果、長鎖のアルキルアンモニウムでイオン交換した合成サポナイトをクロロホルム等の有機溶媒中に分散させたものが、もっとも再現性良く気・液界面において単一層からなるLB膜を可逆的に形成することを見いだした。第2年度は、このような超薄膜をLB法によってグラッシカ-ポン等の電極基板上に一層ずつ積層ていく方法を開発した。得られた積層膜は、キャストした膜と比べて均一であり、しかも層の厚さをナノメーターの精度で制御できた。膜構造は,赤外分光法、X線回折法、原子間力顕微鏡による観察等によって調べた。第3年度は、この薄膜中に電気化学活性な金属錯体をインターカレ-とさせ、その電気化学的挙動をサイクリックボルタモグラム法によって詳しく調べた。その結果、単一層からなる膜の中の電荷移動速度は、キャスト膜の場合と比較してきわめて小さいが(10^4分の1以下)、積層する層を増していくと移動速度が指数関数的に増大することを見いだした。このことより、膜中で電荷移動は膜の中の欠陥を通して行われるいわゆるホッピングによって起こると結論した。この修飾膜を用いて、ナフトールの酸化によりビナフトールを生成した。しかし現在までには、キラルなビナフトールを効率よく得るまでには至っていない。本研究では、粘土の単分子膜を介して分子オーダーで制御した分子機能膜を人工的に製作することを目指している。7年度においては、以下の2つの方法によってクロロホルムなどの有機溶媒に分散するような粘土・有機複合体の合成を試みた(山岸、谷口)。(i)粘土を長鎖アルキルアンモニウムによってイオン交換して疎水化した。この方法では粘土のシリケート面が全面疎水基によって覆うことができた。(ii)長鎖アルキル基を有するシラノール化剤によって結晶端の水酸基を反応させ疎水化した。これによると粘土の陽イオン交換能は失われずに粘土の端が疎水化された。得られた粘土・有機複合体を有機溶媒に分散して、水面に展開し単分子膜を得た。得られた膜が真に均一な単分子膜であるかどうかあるいは粘土面の配向の方向などを、表面圧-面積曲線の測定、適当な基板上に積層した多層膜(LB膜)に対する反射赤外吸収スペクトル、X線回折の測定およびAFM観察を行った(山岸、谷口)。さらに原子間力顕微鏡(AFM)による観察によって粘土膜表面の均一性を調べた。その結果LB法による粘土膜は極めて平坦で、粘土単結晶の1層に相当する凹凸(約10A)の範囲で平坦であることがわかった。また微結晶がすきまなく並んでいた。これは通常のキャスト法による製膜に比較して極めて優れていることがわかった。現在この膜を修飾膜にした電極反応を試みている。今までに以下の2つの方法によってクロロホルムなどの有機溶媒に分散するような粘土・有機複合体の合成を試みた(山岸、谷口)。(i)粘土を長鎖アルキルアンモニウムによってイオン交換して疎水化する。(ii)長鎖アルキル基を有するシラノール化剤によって結晶端の水酸基を反応させ疎水化する。

これによると粘土の陽イオン交換能は失われずに粘土の端が疎水化された。得られた粘土・有機複合体を有機溶媒に分散して、水面に展開し単分子膜を得ることができた。得られた膜が真に均一な単分子膜であるかどうかあるいは粘土表面の配向の方向などを、表面圧-面積曲線の測定、適当な基板上に積層した多層膜(LB膜)に対する反射赤外吸収スペクトル、X線回折の測定およびAFM観察を行った(山岸、谷口)。さらに原子間力顕微鏡(AFM)による観察によって粘土膜表面の均一性を調べた。さらにこの膜を修飾膜にした電極反応を試みた。今回はじめてナノオーダーで厚さが制御された粘土膜の電極修飾剤としての機能を実現することができた。膜中のキャリアの移動速度を厚さの関数として求めることができた。得られた結果はキャリアの移動機構を明らかにするうえで極めて有用であった。さらに、各種スルフィドのスルホキシドへの不斉酸化を試みた。また、粘土面上での不斉識別機能の発現機構を解明するためSTM観察を行った(山岸、谷口)。以上の研究と平行して本年度における特筆すべき成果として、人工的な合成により金電極表面に自発的に吸着して単分子膜を形成する粘土を得た。(山岸、谷口)。すなわち我々は、従来知られていた無機・有機ハイブリド合成を応用してSH基を含む層状スメクタイト型無機化合物を得た。この層状化合物が金単結晶表面に自己集積して単分子層からなる膜を形成することをAFM観察によって確認した。得られた膜はマイクロキャパシター、単一電子トンネリング等にマイクロデバイスに応用されたことが期待されることが期待される。本研究では、粘土鉱物の薄膜を得るのに、気液界面上に展開した単一層からなる超薄膜をラングミュア・ブロジェット法によって一層づつ積層していく方法を開発した。このような薄膜は、キャストした膜と比べて極めて均一であり、しかも層の厚さをナノメーターの精度で制御できる。このことは、赤外分光法、X線回折法、原子間力顕微鏡にによる観察等によって確かめられた。さらに、この薄膜を種々の陽イオン性錯体を含む水溶液に浸積することによって、層の積層構造を乱さないで層間に錯体をインターカレートすることが出来た。このことは、偏光電子吸収スペクトル、X線回折法等によって明らかにされた。この方法により電気化学活性な金属錯体をインターカレートした粘土超薄膜は、電極修飾膜として働くことが明らかにされた。この電極における電極反応の機構を、サイクリックボルタモグラム法によって詳しく調べた。その結果、膜中の電荷移動の過程について、興味ある知見が得られた。すなわち単一層からなる膜の中の電荷移動速度は、キャスト膜の場合と比較して極めて小さいが(10^4分の1以下)、積層する層を増していくと移動速度が指数関数的に増大した。このことは、膜中の電荷移動は、膜の中の欠陥を通して行われるいわゆるホッピングモデルによって説明されることを示唆している。以上のように、粘土膜の超薄膜をつくる方法を開発して、その構造を明らかにして、電極修飾膜として特異な性質を示すことが判った。現在、この修飾膜を用いて、スルフィドのスルフォキシドへの酸化、ナフトールビナフトールへの酸化等の不斉電極反応を行っている。
II-VI族半導体の光誘起カルコゲン原子移動

II-VI族半導体をラマン散乱で観測するとバルク・フォノン以外にラマン禁止配置の縦光学フォノンや光誘起原子移動により変化した構造によると考えられる様々な異常フォノンが観測される。それらが結晶表面の性質かバルクの性質かを調べるためにCdTe,Cd_<1-x>Zn_xTeで結晶試料の表面処理(劈開、機械研磨、化学エッチング)を変えて、レーザー光波長、強度、偏光方向依存性を25K350Kの温度範囲でHε雰囲気で測定した。バルクの性質としては、(1)入射光と散乱光の偏光方向が平行の時縦光学フォノンの高次ラマン散乱が観測される。その強度はルミネッセンスと重なると非常に増強されるが、昇温課程でルミネッセンスが消えると共に弱くなる。従って共鳴多重散乱はホットルミネッセンスであると考えられる。(2)入射光と散乱光の偏光方向が平行で結晶の<1,1,0>又は<0,0,1>方向に平行の時低温では観測されない72,108,187cm^<-1>のピークが温度の上昇と共に大きくなる。劈開面の時だけ現れる表面の性質として(1)入射光と散乱光の偏光方向が共に<1,1,0>に平行の時低温から高温まで30,56cm^<-1>に小さなピークが存在する。(2)劈開直後のみ入射光と散乱光の偏光方向が共に<0,0,1>に平行の時150K以上で147cm^<-1>にピークが出現し温度の上昇と共に大きくなる。以上の温度変化は可逆的で低温にすると最初の状態に戻る。(3)劈開直後のみ入射光と散乱光の偏光方向が共に<1,1,0>に平行の時250K以上で126cm^<-1>にピークが出現し温度の上昇と共に大きくなる。これは試料の表面に析出したTeによると考えられ、試料の温度を下げると高温で光照射を行った場合だけ新しいピークが残る。新鮮な劈開面は光誘起原子移動に活性で、Teの析出機構としてオフセンター・セルフトラップ・ポーラロンのような機構が考えられる。イオン結合性の強いII-VI族半導体では電子-格子相互作用が強いため、エネルギー・ギャップ以上の光の照射により電子励起に関係した構造不安定を引き起こすことがわかった。CdTeではエネルギー・ギャップ以上の光で励起したとき、低温では正常なラマン・スペクトルを示していたものが、250K以上になると全体のバックグラウンドが異常に大きくなり新しいピークが現れる。この時点ではピークは小さく幅が広いが、再び低温にすると新しいピークは鋭いピークになる。この新しいピークはテルル結晶のフォノンと同じエネルギーであるので、この現象は250K以上で起こる光誘起カルコゲン原子の析出現象であると考えられる。この現象を説明するために最近アルカリハライドで見つかったオフセンター・セルフトラップ・エキシトンと同様なものがII-VI族半導体でも光照射により作られているというモデルを提案する。すなわち光照射でテルル位置に作られた正孔が隣の原子位置のテルルを引き込んで、一つの原子位置に二つのテルル原子が入り、アルカリハライドのHセンターに対応するスモール・ポーラロンができる。

低温ではできた位置から動かないで再結合して消滅するが、250K以上ではフォノンの助けを借りて結晶中を移動してテルル・クラスターを作ると考える。II-VI族半導体ではギャップ以上のフォトンで励起すると室温で本来ラマン不活性な波数ゼロ以外のフォノン・ラマン線がラマン活性なフォノン線より強くなったり、共鳴散乱時には9-10次までの多重フォノン散乱が観測される。これを電子状態の局在化とフォノンの強い非線型性のため通常は働かないフランク・コンドン・ラマン課程が働いているためであると考えると、II-VI族半導体の光誘起不安定性を上のスモール・ポーラロン・モデルで統一的に説明できると考えて確認のための実験を行っている。II-VI族半導体をラマン散乱で観測するとバルク・フォノン以外にラマン禁止配置の縦光学フォノンや光誘起原子移動により変化した構造によると考えられる様々な異常フォノンが観測される。それらが結晶表面の性質かバルクの性質かを調べるためにCdTe,Cd_<1-X>Zn_XTeで結晶試料の表面処理(劈開、機械研磨、化学エッチング)を変えて、レーザー光波長、強度、偏光方向依存性を25K350Kの温度範囲でHε雰囲気で測定した。バルクの性質としては、(1)入射光と散乱光の偏光方向が平行の時縦光学フォノンの高次ラマン散乱が観測される。その強度はルミネッセンスと重なると非常に増強されるが、昇温課程でルミネッセンスが消えると共に弱くなる。従って共鳴多重散乱はホットルミネッセンスであると考えられる。(2)入射光と散乱光の偏光方向が平行で結晶の<1,1.0>又は<0,0,1>方向に平行の時低温では観測されない72,108,187cm^<-1>のピークが温度の上昇と共に大きくなる。劈開面の時だけ現れる表面の性質として(1)入射光と散乱光の偏光方向が共に<1,1,0>に平行の時低温から高温まで30,56cm^<-1>に小さなピークが存在する。(2)劈開直後のみ入射光と散乱光の偏光方向が共に<0,0,1>に平行の時150K以上で147cm^<-1>にピークが出現し温度の上昇と共に大きくなる。以上の温度変化は可逆的で低温にすると最初の状態に戻る。(3)劈開直後のみ入射光と散乱光の偏光方向が共に<1,1,0>に平行の時250K以上で126cm^<-1>にピークが出現し温度の上昇と共に大きくなる。これは試料の表面に析出したTeによると考えられ、試料の温度を下げると高温で光照射を行った場所だけ新しいピークが残る。新鮮な劈開面は光誘起原子移動に活性で、Teの析出機構としてオフセンター・セルフトラップ・ポーラロンのような機構が考えられる。
アンデス文明形成期の神殿の成立～衰退の背景を村落機能・地域間ルートに着目して解く

アンデス文明形成期に神殿が成立・維持・放棄された背景を、生活の場としての村落機能と長距離交易網との関係から考察する。まずヘケテペケ川中流域の2遺跡で発掘を実施し、モスキート遺跡に流域最古の神殿群があること、レチューサス遺跡が中流域一帯で最後の神殿であることを確認した。次に、河谷中流域における神殿の登場の早さと継続の長さを地域間交流との関係から説明するため、隣接する他の河谷群にかけて踏査し、仮想ルート上で神殿を含む5つの形成期遺跡を発見して仮説の蓋然性を高めた。南米大陸アンデス地域の諸河谷に、神殿建築を中核とする定住村落が成立した時期をアンデス文明の形成期と呼ぶ(前300050年)。神殿の存在は文明形成に大きく寄与したとされるが、その発生の背景については議論が不十分である。本研究では定住村落としての機能に着目し、神殿の成立から衰退までの過程を経済・技術などの側面から考古学的に解明し、その背景に迫る。また「他の谷との間を結ぶ南北方向のルートと、東西方向のルートそのものである谷との交差点から定住が開始した」という仮説を立て、検証課題に含めた。この目的に即し、河谷の1つヘケテペケ川中流域におけるモスキート遺跡とレチューサス遺跡の発掘(平成23年度)、絶対年代測定(24年度)、さらに周辺地域を含めた北部ペルー広域踏査(24年度)を実施した。代表者はこれまでヘケテペケ川中流域にて形成期前期(前1500-1200年)・中期(前1200-800年)の神殿群の成立・衰退過程を解明してきたが、モスキート遺跡にてそれに先立つ形成期早期(前1500年以前)の神殿群を確認した。先行研究に照らすと、これが流域最古の神殿である蓋然性は高い。一方レチューサス遺跡が形成期後期(前800500年)に創設され、比較的短期間で放棄された、中流域最後の神殿であるとの見通しも得られた。広域踏査では、ヘケテペケ川中流域から南方の諸河谷に向かって想定されるルート上を訪れ、5地点にて神殿や岩絵などの形成期遺跡を発見し、南北方向ルートの実相を解明した。とくにモスキート遺跡同様の形成期早期、および続く形成期前期の遺跡群は、「ルート交差点における神殿の成立」という仮説を検証する上で重要な発見となった。本研究は計画通りのデータ収集を達成し、また定住村落の成立と山間部を貫く地域間関係を関連づけたことにより、山岳部で展開したアンデス文明の特色を人類史に位置づける上で重要な成果を挙げた。南米大陸アンデス地域の諸河谷に、壮麗な神殿建築を中核とする定住村落が成立した時期を、アンデス文明の形成期と呼ぶ(紀元前300050年)。代表者はこれまで、河谷の一つであるヘケテペケ川の中流域にて神殿遺跡群の調査を重ねてきたが、その過程で発見したモスキート遺跡とレチューサス遺跡はそれぞれ、地域で最古の神殿、および地域で最後の形成期神殿であるとの展望を得ていた。平成23年には以下のように両遺跡の編年の検証が進み、遺構の詳細が明らかになった。【具体的内容】911月にペルー共和国に渡航し、両遺跡にて発掘を実施した。モスキート遺跡では最深部に至るまで土器が出土しないことを確認し、また平成21年の試掘で採取した炭化物の放射性炭素絶対年代測定を実施した結果、先土器段階にさかのぼる流域最古の神殿であるとの仮説が検証され、さらに従来の想定より大規模であることが判明した。レチューサス遺跡においては土器資料が多量に採取され、隣接地域の土器との対照によってその編年上の位置を確かめるとともに、遺構の重なり合いを検討し、創設されたのち短期間で放棄されたとの見通しを得た。両遺跡から多様な人工・自然遺物および年代測定用の炭化物が十分に採取されたため、これらの成果は平成24年度にさらに精緻に検証される。【意義】神殿建築を中核として社会が大規模化・複雑化する過程がペルー各地で解明されつつあるが、そもそも神殿はどのように成立したのか、という議論は不十分であった。神殿の成立理由は、その後維持・放棄された理由とも関係する根源的な問題である。代表者は神殿が村落の中核として機能したという点に着目し、その成立から衰退までの過程を、経済・技術などの側面から考古学的に検証しようとしている。今年度の成果は、当該地域の最初と最後と目される神殿を突き止め、実相解明のための資料を獲得し、文明形成の研究に資する点で意義深い。代表者は文明形成の過程を、神殿の村落機能および地域間ルートとの関係から解明することを長期的目標とし、とくに本研究はその基礎となる考古学データの収集を目的としている。

モスキート遺跡とレチューサス遺跡の発掘調査は、社会動態を考察する上で基礎となる編年研究に関して、大きな成果を挙げた。これにより成果発表(ペルー文化省への報告書、口頭発表、および査読中の英語論文)は予定よりも速いペースで進行中であり、また十分な量の人工・自然遺物が得られたことにより、「神殿の村落機能」の研究は平成24年度に大きく進展することが見込まれる。いっぽう、本研究におけるもう一つの着眼点である「神殿と地域間ルートの関係」という課題に関しては、荷駄獣リャマをとどめる家畜囲いなど、遺構レベルの直接的なデータは発掘を通じて得られなかった。そのため平成24年度に、2つの方針に則して研究する必要がある。第1に人工物の中に含まれる搬入品や、出土獣骨全体におけるリャマ骨の比率など、遺物分析を通じた地域間交易活動の検証である。第2にヘケテペケ川中流域一帯を踏査して景観を観察し、ルートの指標として重要な岩絵(宗教的図像を刻んだ自然岩)の登録を進め、ルートの復元をはかることである。以上のように本研究は、平成23年度のうちに見込み以上に進んだ部分と、やむを得ず平成24年度に持ち越した部分があるため、現時点での達成度は「おおむね順調に進展している」と自己評価する。平成23年度にモスキート遺跡・レチューサス遺跡から採取した炭化物を日本に搬入済みであり、速やかに年代測定に着手する。6月にペルーに渡航し、人工遺物の分析、遺跡周辺踏査、ならびに国際会議での成果発表を行う。89月に再度渡航して、人工遺物の分析と遺跡周辺踏査を完了させるとともに、採取した土壌を水洗して自然遺物を抽出し、生物種の同定をペルー国立トルヒーヨ大学考古生物研究室に委託する。これらすべての分析結果を年度内にとりまとめ、論文および口頭にて発表する。次年度使用額180,156円は、平成23年度に完了した放射性炭素年代測定の経費(180,000円)の請求書が、年度をまたいで処理されることになったために生じた。平成24年度にはペルー渡航・滞在費に34万円、自然遺物分析経費に13万円、年代測定経費に43万円の支出を見込んでいる。
癌の超早期診断を目指した新規 PET/MRI一体型腫瘍診断システムの開発研究

本研究では、腫瘍ターゲティング素子として腫瘍血管特異抗体を単離、精製し、RIでラベルすることで腫瘍イメージングプローブとして機能することを明らかにした。さらに本抗体を用いてimmuno-PET/MRIの為のイメージングプローブとして開発すべく、MRI造影剤としての金酸化鉄複合ナノ粒子をPEG修飾し、さらにそのPEG鎖先端に本抗体を修飾するための方法論を確立した。本研究では、薬学研究者(研究代表者)の腫瘍血管特異的なモノクローナル抗体開発を、工学研究者のイメージング素材、さらには、医学研究者の最先端分子イメージング装置と融合することにより始めて可能となる、医・工・薬連携のimmuno-PET/MRIによる、癌の超早期診断システムを開発しようとするものである。今年度は研究代表者がこれまでに同定してきた腫瘍血管マーカーに対する抗体(複数種類)について一本鎖抗体(scFv)および完全型抗体(IgG)のリコンビナント蛋白質を高純度かつ高収率で作製可能な系の確立に成功した。また、作製したリコンビナント蛋白質の基礎的特性を評価した結果、抗原リコンビナシト蛋白質に対し、特異的かつ極めて高い親和性で結合することを明らかにした。さらに、immun-PET(SPECT)/MRIへの応用を目指し、作製した抗体リコンビナント蛋白質に対するSPECT核種(^<123>I,半減期13時間)のラベル化条件の検討を試みた。その結果、抗体分子1分子に対し少なくとも1分子以上の^<123>Iをラベル化することに成功した。^<123>Iラベル化抗体蛋白質は腫瘍モデルマウスの腫瘍組織内へと速やかに分布し、24時間にわたってその分布を経時的に観察することが可能であった。PET核種の^<124>Iについても同様の手法が適用可能であることから、今後PETへの応用も容易に可能であると期待される。また、研究代表者は、既にMoldayIONといった微細なMRI用酸化鉄ナノ粒子表面に金を付与した複合ナノ粒子に対し、PEGなどで表面修飾することで、腫瘍検出用MRI造影剤の開発を行っている。そこで、本造影剤についてPEGを介して抗体蛋白質を修飾した造影剤粒子の作製を試みた。その結果、抗体:PEG:酸化鉄ナノ粒子=2:2000:1(分子数比)の分散性の高い造影剤粒子の開発に成功しており、本粒子が酸化鉄粒子本来のMRI造影能を保持し、抗原発現細胞に対し特異的に結合可能であることが示された。次年度は抗体及びMRI造影剤について、それぞれのin vivoでの有用性を更に詳細に評価するとともに、それらを融合し、PET/MRI同時計測用プローブとしての応用を目指す。今年度は、MRI造影剤開発の一環として、昨年度確立したAb-PEG-Au/MoldayIONの作製系に従じ、実際に腫瘍血管特異的抗体としてVEGVR2に対するIgG型抗体リコンビナント蛋白質(V2-05iIgG)を用いて、V2-05iIgG-PEG-Au/MoldayIONを作製した。その結果、0.1mgAb/1.5mg PEG/mg FeでV2-05i IgGを修飾することができた。このV2-05iIgG-PEG-Au/MoldayIONとコントロールとしてCOOH-PEG-Au/MoldayIONをB16BL6腫瘍モデルマウスに投与し、マウス固形腫瘍モデルの造影を試みた結果、両者はともに、500μg/マウスで投与8時間後、及び24時間後に腫瘍組織の中央部が黒く造影されている様子が確認された。しかし、残念ながら両者の造影能の強度には差が認められなかった。一方、昨年度確立した抗体のSPECT核種(1231,半減期13時間)でのラベル化方法を用い、腫瘍血管特異的抗体(V2-05i)を^<123>Iでラベル化し、Bl6BL6腫瘍モデルマウスにおいてSPECT画像を撮影した。その結果、投与24時間後において腫瘍集積性を確認することが出来、腫瘍のイメージングプローブとして使用出来る可能性が示された。今後、それぞれのin vivoでの有用性を更に詳細に評価するとともに、それらを融合し、PET/MRI同時計測用プローブとしての応用を目指す。本研究では、薬学研究者(研究代表者)の腫瘍血管特異的なモノクローナル抗体開発を、工学研究者のイメージング素材、さらには、医学研究者の最先端分子イメージング装置と融合することにより初めて可能となる、医・工・薬連携のimmuno-PET/MRIによる、癌の早期診断システムを開発しようとするものである。今年度は、昨年度の問題点を踏まえ、MoldayIONの表面に修飾できる抗体量を増やす為の条件検討を行った。

その結果、MoldayIONの修飾に用いるCOOH-PEG-SHや抗体の濃度、反応条件、精製条件等を精査することにより、添加した抗体の90%以上が修飾した粒子(0.15 mg抗体/15 mg PEG/mg Fe)を作製できる条件を見出した。そこで、既に臨床で抗体医薬として用いられている抗体(リツキサン;Ab)をモデル抗体として選択し、CD20を標的とするMRI造影剤の可能性について評価した。最適な条件下で作製したCOOH-PEG-Au/MoldayIONに対し、リツキサンのアミノ基を縮合反応させることで、分散性に優れたAb-PEG-Au/MoldayIONを作製することに成功した。作製したAb-PEG-Au/MoldayIONの細胞表面抗原に対する結合性をCD20発現細胞であるDaudi細胞に対して評価した結果、特異的に結合できることを確認した。また、抗体修飾後の粒子は、MoldayIONTMとほぼ同等の造影能力を有していることも確認した。そこでこのAb-PEG-Au/MoldayIONをCD20を発現した担癌マウスに投与し、その造影能を評価した。しかし残念ながらAb修飾していないPEG-Au/MoldayIONと比較して両者の間に造影能の強度に差は認められなかった。今後、癌種並びに造影剤の投与量や造影条件について詳細に検討していく予定である。MRI造影剤(Molday ION)に腫瘍血管内皮細胞特異的な抗体(V2-05i)を修飾することで、腫瘍造影能が向上すると考え実験を行ったが、予想以上の効果が得られなかった。この原因として、修飾した抗体がターゲティング素子としての機能を発揮するためには修飾量が少なかった可能性が考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。上記問題点を解決する方法として、MRI造影剤(CAU/Molday ION)の腫瘍造影能の向上を目指し、粒子表面に修飾可能な抗体量を増やし、腫瘍血管内皮細胞を標的としたMRI造影剤への応用を試みる。また、腫瘍血管内日細胞を標的とする抗体だけでなく、既に臨床で抗体医薬として用いられている抗体(リツキサン)を用い、CD20を標的とするMRI造影剤の可能性についても検討する。
胃内ピロリ菌フローラ（遺伝子多様性）形成と各種疾患・病態との関連性の解明

Helicobacter pylori(HP)は著しい遺伝子多様性を有していることが知られているが、実地臨床で薬剤感受性を調べる場合、1カ所の生検組織から分離・培養された一株の感受性検査しか行われていない現状がある。そこで、今回我々は同一患者から胃前庭部、体部より生検・培養を行い、発育したHPを各々6株ずつ釣菌し(計12株/患者)、除菌治療に使用される4剤について感受性を調べたところ、同一患者から採取した複数の臨床分離株でも株間で薬剤感受性に違いがみられており、多様性を呈するピロリ菌叢(フローラ形成)を意識した治療の必要性が示された。ヘリコバクター・ピロリ(以下ピロリ菌)は慢性持続感染を経て、消化管のみならず様々な疾患・病態に関与している。しかし菌株の解析結果と罹患率や有病率(地域や個人差間)のエニグマは解明されていない。ピロリ菌は感染後に個々の胃内(部位)にて著しい遺伝子変異(high genetic diversity)を繰り返し、種々の変異株を創出しながら集団として存在し全体の遺伝子プールを有効利用することで慢性持続感染を成立させ、薬剤耐性菌の出現をはじめ多彩な病態に関与すると考えられる。すなわち、本菌感染は単クローンではなく、silent majorityやnoisy minority株の存在と役割(細菌特性・生物多様性)で構成された細菌叢(ピロリ菌フローラ)と捉えて、宿主免疫応答を解析し関連疾患・病態の解明を目的に本研究を推進したが、今年度研究成果を発表するには至らなかった。1.胃内慢性持続感染におけるピロリ菌フローラ形成機序とその生物学的役割本菌の初感染時は単クローンと仮定しても、胃内環境の変化に応じて出現した変異株を含む細菌叢(ピロリ菌フローラ)として慢性持続性感染が成立し、細菌ー宿主間相互反応(免疫応答)を経て多彩な病態に関与すると考えられる。これらの形成には本菌のhigh genetic diversityや生物種固有の種の保存メカニズム(細菌プログラム死:PCD)が関与すると考えているが、ピロリ菌のフローラ形成過程(本菌の細胞増殖・分裂・形態維持機構(PCD機構含む)から変異株創出)を解析し、慢性持続感染におけるピロリ菌フローラの生物学的役割を解明した。2.遺伝子多様性(変異株出現)によるピロリ菌フローラ形成と疾患との関連研究分担者の竹内らは「ピロリ菌感染と病原性」に関し幾つもの知見を明らかにしているが、接着因子BabAやSabAの発現(遺伝子変異)の有無が慢性萎縮性胃炎や胃癌の発症に重要な役割を果たすこと,またピロリ菌の遺伝子多型が胃炎の重症度や薬剤感受性と関連性を示すことを証明し、野生株のみでなくそこに存在している他の変異株(フローラ)に注意を払った解析が病態解析には重要と考えられる。これらを踏まえ、多数の菌株を収集しピロリ菌フローラ形成を検証し、各種疾患との関連性をフローラ形成と遺伝子型クラスター分類にて解析する。特に、持続感染・病原性・薬剤耐性等に関わる各遺伝子を中心に遺伝子変異および活性等について病変との関わりについて比較解析を行った。ヘリコバクター・ピロリは感染後に個々の胃内(部位)にて著しい遺伝子変異(high genetic diversity)を繰り返し、種々の変異株を創出しながら集団として存在し全体の遺伝子プールを有効利用することで慢性持続感染を成立させ、薬剤耐性菌の出現をはじめ多彩な病態に関与すると考え本研究を推進してきた。昨年は一人のピロリ菌陽性患者の内視鏡検査にて、萎縮や胃潰瘍形成など背景粘膜の性質が異なる胃粘膜の2箇所から生検を施行し、培養後各々最低6個ずつを釣菌し(1患者あたり最低12コロニー)、同一患者の同一部位もしくは異なった部位の粘膜から採取・培養したピロリ菌が、様々な多様性を有する遺伝子変異の集団として存在しピロリ菌フローラとして存在しているかを証明してきた。この結果は、2016UEGWおよびJDDWで発表して来た。ピロリ菌陽性患者の内視鏡検査にて、萎縮や胃潰瘍形成など背景粘膜の性質が異なる胃粘膜の2箇所から生検を施行し、培養後各々最低6個ずつを釣菌し(1患者あたり最低12コロニー)、同一患者の同一部位もしくは異なった部位の粘膜から採取・培養したピロリ菌が、様々な多様性を有する遺伝子変異の集団として存在しピロリ菌フローラとして存在しているかを証明することは出来た。しかし得られた遺伝的背景の異なる株(一応、変異株)は、各変異株の細菌学的・生物学的特性を検証するため、各解析(増殖・分裂、ストレス応答、薬剤感受性、AGSとの共培養によるサイトカイン誘導能など)を実施し菌株相互間の干渉も検証しフローラ形成の特性を解析することや、遺伝子変異クラスター分類と胃内慢性持続感染の関連および病変との関連につき解析し評価するところまで至っていない。Helicobacter pylori(HP)は著しいgenetic diversityを有していることが知られているが、実地臨床で薬剤感受性を調べる場合、1カ所の生検組織から分離・培養された一株の感受性検査しか行われていない現状がある。そこで、我々は同一患者から分離された複数の臨床分離株を用いて薬剤感受性試験を行い、その多様性について検討した。二次除菌失敗もしくはペニシリンアレルギーとして三次除菌療法目的に紹介された患者50名のうち、当院で再度内視鏡を行いHP培養陽性となった患者30例について、薬剤感受性を検討した。

患者の胃前庭部、体部より生検・培養を行い、発育したHPを各々6株ずつ釣菌し(計12株/患者)、アモキシシリン(AMPC),クラリスロマイシン(CAM),メトロニダゾール(MNZ),シタフロキサシン(STFX)の4剤について感受性を調べた。薬剤感受性試験の結果からは、同一患者から分離された株中において、各種薬剤に対する感受性株と耐性株が混在していることが明らかとなった。さらには、同一患者内の耐性株間で最小発育阻止濃度にもかなりの差を認めた。同一患者から採取した複数の臨床分離株を用いて薬剤感受性を検討した結果、同一患者内でも株間で薬剤感受性に違いがみられており、一患者一株のみの検証で薬剤耐性を論じることは困難であると考えられる。つまり多様性を呈するピロリ菌叢(フローラ形成)を意識した治療の必要性が示されたHelicobacter pylori(HP)は著しい遺伝子多様性を有していることが知られているが、実地臨床で薬剤感受性を調べる場合、1カ所の生検組織から分離・培養された一株の感受性検査しか行われていない現状がある。そこで、今回我々は同一患者から胃前庭部、体部より生検・培養を行い、発育したHPを各々6株ずつ釣菌し(計12株/患者)、除菌治療に使用される4剤について感受性を調べたところ、同一患者から採取した複数の臨床分離株でも株間で薬剤感受性に違いがみられており、多様性を呈するピロリ菌叢(フローラ形成)を意識した治療の必要性が示された。27年度に実施した研究から得られた変異遺伝子のフローラ形成や生物学的役割(慢性持続感染や宿主免疫応答)を検証するため、必要に応じてそれら遺伝子を操作した株(正常化したりさらなる変異を付加した株)を作成し疾患・病態との関連性を確認・検証する。また、フローラ形成解析で得られた結果から、それらのフローラ形成(各菌株を混合)状態で動物感染実験を行い疾患・病態の再現性を確認しながら、遺伝子変異クラスター分類と胃内慢性持続感染の関連および病変との関連につき解析し評価する。27年度の研究を継続しつつ、動物モデルによる慢性持続感染成立(ピロリ菌フローラ形成)機序の解明を行う。研究分担者の竹内らが作成した蛍光発色ピロリ菌(GFP遺伝子導入)を用いた動物実験にて感染初期からの胃内動態や慢性持続感染への変化について経時的、部位別にスコープによる観察が可能と考える。この蛍光発色は異なる遺伝子変異株や臨床分離株でも作成が可能であるため、ピロリ菌の遺伝子変異と感染率、初期感染成立に必要な遺伝子変異および疾患・病態関連性の解析も可能となる。今後はフローラ形成解析で得られた結果から、それらのフローラ形成(各菌株を混合)状態で動物感染実験を行い疾患・病態の再現性を確認しながら、遺伝子変異クラスター分類と胃内慢性持続感染の関連および病変との関連につき解析し評価する。さらに再現性および安定的な感染実験が実施でき十分な成果が得られれば、ピロリ菌による急性胃炎発症のメカニズムについて検討を行う。具体的な感染方法は同様で、感染後1日後、3日後、1週間後、2週間後の胃粘膜の状態および感染部位の拡がりの確認をUV照射による実体顕微鏡観察および組織学的観察により経時的、部位別に評価する。急性胃炎発症におけるピロリ菌遺伝子変異の検討および慢性持続性感染でのピロリ菌遺伝子変異との比較検討を行い、ピロリ菌遺伝子型のクラスター分類と解析を行う。ヘリコバクターピロリ研究成果について、発表段階に至らなかったため国際学会への出張が実現しなかった。