hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高圧力下における分子のコンフォメーション

1.有効開口径0.30.5【mm^φ】のダイアモンドアンビルセルによる赤外吸収測定を良好なS/N比で行なうために、高感度のHgCdTe赤外線検出器を用いて、倍率が4の集光測定系を製作した。これは現有のディジラボFTS-14フーリエ変換赤外分光器の試料部空間に収まり、設置と取外しは極めて容易である。当初、非軸放物面鏡で集光する予定であったが、光学系の調整の難易とスペースの点から、KRS-5赤外レンズを2枚用いるように変更した。第1のレンズにより、干渉計からの光をアンビルセル試料部に集光し、試料透過光を第2のレンズにより検出器の検知素子に集光するものである。通常の走査条件において、口径0.4【mm^φ】のピンホールの透過光を充分なS/N比で測定できることを確認した。検出器のカットオフ波長は19.8μmで、500【cm^(-1)】以上の波数領域で使用できる。2.ドルッカー社(オランダ)製のタイプ【II】Aダイアモンドをアンビルセルに取付け、対抗面の平行度調整を行なった後、赤外吸収を測定したところ、ダイアモンドの固有吸収帯18002600【cm^(-1)】以外の領域では充分な透過率を持ち、特にタイプ【I】のダイアモンドに見られる11001300【cm^(-1)】の強い吸収帯が無く、分子のコンフォメーション研究に適していることが確認された。3.平均分子量400のポリエチレングリコールを、標準のガスケット(インコネル,厚さ0.3mm)を用いてアンビルセルに充填し、圧力1.6.22.40kbarに加圧して赤外スペクトルを測定した。OH変角振動吸収帯は0.3【cm^(-1)/kbar】の高波数シフトを示したが、これから、OH基は水素結合にあまり関与していないものと想像される。コンフォメーションに敏感な他の吸収帯に関しては、試料の吸収が強すぎて有意な結果を得るに到っていない。厚さ0.020.05mmのガスケット材料を入手して、測定する予定である。
人工衛星「ようこう」による太陽X線画像の三次元構造抽出

太陽観測衛生「ようこう」で得られたX線望遠鏡画像から三次元特徴を抽出するための前処理として特に輪郭抽出を取り上げ、画像の微分による輪郭強調手法を幾つか選び、太陽X線画像に適用してその有効性を比較検討した。その結果、一次微分フィルタであるPrewittオペレータによる輪郭強調が、注目しているフレアなどの輪郭を最もよく強調できることがわかった。さらに、三次元特徴の抽出について、まず現行の標準的なオプティカルフロー検出法が、「ようこう」での撮像のような著しく制限された条件の下でどこまで有効に働くかを見極め、またその際にどのような問題点が生じるかを見いだすために、この撮像条件をもとに以下に述べる方法で計算機シミュレーションを行った。太陽のモデルとして剛体球面を考え、平行投影によりモデル画像を得る。太陽の遅い自転を考慮して5度の自転前後の2枚のモデル画像の強度変化から、フローの滑らかさを考慮に入れた反復計算により拘束方程式を解くことでオプティカルフローを求め、フローの各成分よりモデルである球面の復元を試みた。結果として、滑らかさの度合いを大きく取ることにより、一部の箇所ではある程度正確なオプティカルフローが求まるが、画像強度変化が激しい領域の境界付近や、見かけの強度が変化しない部分において、正確なオプティカルフローが求まらず、三次元構造の復元には至らなかった。これらの問題点を克服する新しいフロー検出法、疑似フレアなどの非剛体モデルへの拡張などが今後の課題として残されている。また、太陽X線画像処理へ向けて、関係各研究機関で太陽画像データ入出力に使用されているデータ処理ソフトウェアIDLを購入・設置し、データ交換のための通信システムの整備を行った。
江戸時代の絵画における基底材に関する基礎的研究

呉春筆「白梅図屏風」の基底材は、国の重要文化財指定によると、「絹本墨画淡彩」として絹とみなされているが、基底材の組織や繊維を観察すると、明らかに絹とは異なる靭皮繊維を織った布が用いられている。それを科学的に確認するために、所属研究所の保存科学研究センターの協力を仰ぎ、FT-IR(赤外分光分析)の測定器で分析をおこなったところ、そのスペクトルが絹とは異なったため、絹ではない靭皮繊維が使われているのが確実であることが判明した。呉春筆「白梅図屏風」に用いられている基底材については、すでに葛布との指摘があることから、まずは、葛布に描かれた作例を広く探し出した。とりわけ、静岡の掛川は、江戸時代から葛布の産地であったため、同地ゆかりの画家の作例を中心に、葛布に描かれた作例の捜索を進めたところ、葛布と想定される作品を6点確認することができた。また、現在でも葛布を制作している静岡の大井川葛布という工房で、実際に葛布の制作工程を体験し、その制作工程や質感の確認作業をおこなった。その一方で、呉春筆「白梅図屏風」と同様に、現在は絹とみなされている作例の中にも、特殊な基底材を用いたものが含まれていると想定されるため、葛布に限らず、特殊な基底材が用いられた作例について広く情報収集を図り、麻布や芭蕉布などの可能性についても検討した。その際、絵画の基底材に限らず、染織資料も比較対象に含めた。その結果、葛布と芭蕉布が組織や繊維のうえでは、かなり類似しており、両者の同定に混乱がみられることが確認された。また、芭蕉布を基底材としたことが確実な4点の絵画や書跡の作例については、呉春筆「白梅図屏風」の基底材ときわめて類似することが判明した。呉春筆「白梅図屏風」に用いられている基底材については、すでに葛布ではないかとの指摘があったため、当初は葛布の可能性を視野に検討と調査を進めたが、葛布に類似する靭皮繊維を調査する過程で、芭蕉布とされる靭皮繊維にも類似していることが確認されたため、芭蕉布の可能性についても広く検討を加えることとなった。よって、芭蕉布に関する詳細な調査については、来年度以降の課題となった。また、所属する研究所の保存科学研究センターと逸翁美術館の協力を得て、呉春筆「白梅図屏風」をFT-IR(赤外分光分析)の測定器で分析をおこなったところ、そのスペクトルが絹とは異なったため、呉春筆「白梅図屏風」には、絹ではない靭皮繊維が使われていることは確実となったが、同測定器では、葛布でも芭蕉布でもセルロース系の靭皮繊維であれば類似したスペクトルを示すため、靭皮繊維の同定にまでは至っていない。今年度、葛布に類似した靭皮繊維を広く調査する過程で、芭蕉布とされる靭皮繊維にも類似したものがあることが確認されたため、今後は、芭蕉布の可能性についても検討を加える必要がある。ただし、葛布に類似した芭蕉布は、現在も織られているような一般的な芭蕉布ではなく、糸に撚りがなく、繊維の取り出しや仕上げの段階で灰汁炊きをおこなわない、生引きの芭蕉布であるとの指摘がある。歴史的な資料の中には、生引きの芭蕉布の事例が確認でき、それが呉春筆「白梅図屏風」の基底材と最も類似しているものの、現在もそうした芭蕉布が制作できるのかどうかは未詳である。今年度は葛布の制作工房において葛布の制作工程を確認したが、葛布と芭蕉布では、その制作工程も異なるため、今年度は、芭蕉布の制作工房などの調査を進め、芭蕉布制作の現状を把握する必要がある。そのうえで、さらに、現在作られている芭蕉布と歴史的な芭蕉布との共通点と相違点を確認していく作業をおこないたい。また、FT-IR(赤外分光分析)では、葛布でも芭蕉布でもセルロース系の靭皮繊維であれば類似したスペクトルを示すため、靭皮繊維の同定にまでは至らなかったが、今後は、類似したスペクトルの中から、葛布と芭蕉布のスペクトルの違いを検出できるような分析法を検討していく必要もある。

その一方で、呉春筆「白梅図屏風」と同様に、現在は絹とみなされている作例の中にも、特殊な基底材を用いたものが含まれていると想定されるため、葛布に限らず、特殊な基底材が用いられた作例について広く情報収集を図り、麻布や芭蕉布などの可能性についても検討した。その際、絵画の基底材に限らず、染織資料も比較対象に含めた。その結果、葛布と芭蕉布が組織や繊維のうえでは、かなり類似しており、両者の同定に混乱がみられることが確認された。また、芭蕉布を基底材としたことが確実な4点の絵画や書跡の作例については、呉春筆「白梅図屏風」の基底材ときわめて類似することが判明した。呉春筆「白梅図屏風」に用いられている基底材については、すでに葛布ではないかとの指摘があったため、当初は葛布の可能性を視野に検討と調査を進めたが、葛布に類似する靭皮繊維を調査する過程で、芭蕉布とされる靭皮繊維にも類似していることが確認されたため、芭蕉布の可能性についても広く検討を加えることとなった。よって、芭蕉布に関する詳細な調査については、来年度以降の課題となった。また、所属する研究所の保存科学研究センターと逸翁美術館の協力を得て、呉春筆「白梅図屏風」をFT-IR(赤外分光分析)の測定器で分析をおこなったところ、そのスペクトルが絹とは異なったため、呉春筆「白梅図屏風」には、絹ではない靭皮繊維が使われていることは確実となったが、同測定器では、葛布でも芭蕉布でもセルロース系の靭皮繊維であれば類似したスペクトルを示すため、靭皮繊維の同定にまでは至っていない。今年度、葛布に類似した靭皮繊維を広く調査する過程で、芭蕉布とされる靭皮繊維にも類似したものがあることが確認されたため、今後は、芭蕉布の可能性についても検討を加える必要がある。ただし、葛布に類似した芭蕉布は、現在も織られているような一般的な芭蕉布ではなく、糸に撚りがなく、繊維の取り出しや仕上げの段階で灰汁炊きをおこなわない、生引きの芭蕉布であるとの指摘がある。歴史的な資料の中には、生引きの芭蕉布の事例が確認でき、それが呉春筆「白梅図屏風」の基底材と最も類似しているものの、現在もそうした芭蕉布が制作できるのかどうかは未詳である。今年度は葛布の制作工房において葛布の制作工程を確認したが、葛布と芭蕉布では、その制作工程も異なるため、今年度は、芭蕉布の制作工房などの調査を進め、芭蕉布制作の現状を把握する必要がある。そのうえで、さらに、現在作られている芭蕉布と歴史的な芭蕉布との共通点と相違点を確認していく作業をおこないたい。また、FT-IR(赤外分光分析)では、葛布でも芭蕉布でもセルロース系の靭皮繊維であれば類似したスペクトルを示すため、靭皮繊維の同定にまでは至らなかったが、今後は、類似したスペクトルの中から、葛布と芭蕉布のスペクトルの違いを検出できるような分析法を検討していく必要もある。購入しようとしていた機材の入手が難しく、また、新しい機能が付与された新型機が発売される予定のため、それらの機器と、機能を比較した上で、購入を検討したいから。繰り越した金額は、次年度以降に、機材の購入費に充てる予定である。
プログラム評価理論に基づく、介護予防プログラムの評価理論及び評価体制の構築

地域看護学領域において、成果をあげるための評価方法及び体制とはどのようなものか、また、支援を拒否する支援困難事例が「生活の再構築」を実現する支援プログラムとはどのようなものかという学術的「問い」を検討するため、本研究は閉じこもり高齢者など支援困難事例を対象に、支援に関するプログラム理論を用いた評価のためのロジックモデルや評価指標の開発、評価方法の検討及び評価体制の整備することを目的とする。具体的には、1全国調査によるプログラム理論の客観的検証、2優良活動事例への訪問調査による効果的援助要素の抽出を行う。これにより支援困難事例への効果的な支援プログラム理論を構築し、評価方法や評価体制を整備する。
ツバルとカーテレット諸島における環境悪化への対応に関する比較民族誌的研究

本研究は、共に南太平洋に位置し、低いサンゴ島からなるツバルとカーテレット諸島(パプアニューギニア)の人々の、地球温暖化に伴う海面上昇の脅威への対応を比較分析した。その結果、海面上昇の脅威に対する認識や行動が2つの場所で異なるのは、グローバル社会・経済に統合されていく過程での人々の移住の経験が異なることに起因するということが明らかになった。本研究は、地球温暖化に伴う海面上昇によって深刻な被害を受けることが懸念されているツバルとカーテレット諸島(パプアニューギニア)において、人々が自分の島で起きている環境の悪化にどのように対応しようとしているのかを比較対照しながら記述・分析することを目的としている。当該年度は、8月にツバルでの現地調査、2月にパプアニューギニアでの現地調査を計画していたが、所属大学における教育関連の職務が多忙を極め、そちらを優先したことから、前者は実行することができなかった。パプアニューギニアでの現地調査は2月中旬から3月中旬にかけて実施した。この現地調査では、まず同国首都ポートモレスビーに所在する国立公文書館で植民地時代の「パトロールレポート」を中心に閲覧し、カーテレット諸島に関する記録を洗い出した。その後、カーテレット諸島最大の島、ハン島を訪れ、幅広い年齢層の成人男女約20人に対してin-depth interviewsをおこない、同諸島の文化・社会・歴史および同諸島における環境悪化に対する人々の認識と行動に関する資料を収集した。この現地調査を通して、カーテレット諸島の人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況(特に海岸浸食と内陸浸水)をどのように認識し、それに対してどのように行動(特に移住をめぐる交渉)しようとしているのかが理解でき、また、それらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのかを見い出すことができた。当初の研究実施計画では、ツバルとパプアニューギニアにおいてそれぞれ2回ずつ調査を実施することにしていた。しかし、前年度(平成24年度)までにそれぞれの地で1回ずつ調査が完了した時点で、パプアニューギニアでの調査は完了したと見なしてよい状況にあったことから、当初の計画を変更して、最終年度である当該年度においては現地調査をツバルのみで実施することにしていた。しかしながら、実際にはツバルでの調査を実施することができなかった。ツバルでの調査はフナフチ島でのアーカイブ調査とバイツプ島でのフィールド調査からなるのだが、バイツプ島への船舶運航が不定期であるため、調査予定期間中の船舶チャーターの交渉をおこなってきた。ところが、船舶確保が予想に反して難航したため、現地調査を見送らざるを得なかった。その間、文献調査をおこなうことで、本研究に関連する文献資料を収集し分析することに努めた。本研究は、ツバルのバイツプ島とパプアニューギニアのカーテレット諸島という2つの環礁において、人々が地球温暖化の言説及び実際の影響をどのように認識し、それらに対してどのように行動しているかを、政治リーダーの役割を中心に比較対照しながら記述・分析することを目的としている。初年度である今年度は、ツバルでの1回目の現地調査を平成24年2月下旬から3月上旬にかけて実施した。今回は首都フナフチでアーカイブ調査とフィールド調査をおこなった。本来であれば、フィールド調査はバイツプ(フナフチから約120kmの離島)でおこなうべきだが、まばらな船舶運航(月に1回程度)によりスケジュール調整が難しかったため、今回はフナフチに留まってバイツプ出身者を対象にインタビュー等をおこなった。アーカイブ調査では、国立図書館・公文書館において植民地時代の公文書を中心に閲覧し、政治リーダーに関する記述を通時的に追った。今回は、時間の都合上、全体の半分ほどしか閲覧することができなかったが、ここで収集している資料は、後に今日の地球温暖化問題への対応におけるローカルレベルでのリーダーシップを歴史的に分析する際の重要な材料になってくると思われる。フィールド調査では、地球温暖化の言説及び実際の影響にまつわる人々の認識や行動についてよりも、後にこれらの認識・行動を解釈する際に必要となるツバル、特にバイツプの文化、社会、歴史についての情報を幅広く収集することに努めた。結果として、ローカルレベルでの政治プロセスにおいて島への帰属意識や島同士の競争意識が強く働いているという、既存の文献ではあまり触れられていない事実を発見し、本研究を進めていく上での新たな視点を得ることができた。本研究は、地球温暖化に伴う海面上昇によって深刻な被害を受けることが懸念されているツバルとカーテレット諸島(パプアニューギニア)において、人々が自分の島で起きている環境の悪化にどのように対応しようとしているのかを比較対照しながら記述・分析することを目的とし、以下の3つのことを明らかにすることを目指してきた。

1)ツバルの人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況をどのように認識し、それに対してどのように行動しているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。2)カーテレット諸島の人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況をどのように認識し、それに対してどのように行動しているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。3)環境悪化の状況に対するツバルとカーテレット諸島の人々の認識と行動がどの点で類似し、どの点で相違しているのか、またそれらの類似点・相違点が彼らの自然環境や文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。最終年度である平成26年度においては、ツバルでの2回目の現地調査の実施を模索したが、前年度同様、調査地の一つであるバイツプ島への船舶確保ができず、再度その実施を見送らざるを得なかった。したがって、ツバルに関連する補足資料については、引き続き国内での文献調査を通して収集・分析をおこなった。その一方で、これまでの研究期間において実施したツバルとカーテレット諸島での現地調査および史料・公文書調査、国内での文献調査に基づいて、上記の3つの点に焦点を当てて研究結果をまとめる作業をおこなった。その研究結果の一部は既に国際学会で発表しており、今後、その論文を国際査読雑誌に投稿すべく執筆作業をおこなう。文化人類学本研究では、以下の3つのことを明らかにすることを目指している。1)ツバルの人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況(特に海岸浸食と内陸浸水)をどのように認識し、それに対してどのように行動(特に移住をめぐる交渉)しようとしているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。2)カーテレット諸島の人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況(特に海岸浸食と内陸浸水)をどのように認識し、それに対してどのように行動(特に移住をめぐる交渉)しようとしているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。当該年度終了時点で、2)はほぼ達成できたと言ってよい。しかしながら、他の2つ、とりわけ1)に関する調査はあまり進んでいないと言ってよい。その理由としては、上述の通り、当該年度8月に計画していたツバルでの現地調査が実行できなかったことが大きい。本研究では、以下の3つのことを明らかにすることを目指している。(1)ツバルの人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況(特に海岸浸食と内陸浸水)をどのように認識し、それに対してどのように行動(特に移住をめぐる交渉)しようとしているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。(2)カーテレット諸島の人々が、自分の島で起きている環境悪化の状況(特に海岸浸食と内陸浸水)をどのように認識し、それに対してどのように行動(特に移住をめぐる交渉)しようとしているのか、またそれらの認識・行動が彼らの文化・社会・歴史とどのように関連しているのか。
OXA 型カルバペネマーゼのカルボキシ修飾リジンによるカルバペネム分解機構

カルバペネム系抗菌薬を分解するβ-ラクタマーゼを産生する耐性菌が出現し、多剤耐性菌に有効な抗菌薬は開発途上にある。新規抗菌薬の開発に資するため、多剤耐性アシネトバクター由来のβ-ラクタマーゼOXA-58のX線結晶構造解析を行った。結晶構造中で活性残基のリジンはカルボキシ修飾され水素結合のネットワークによって安定化されていた。カルボキシ修飾によってOXA-58の活性・熱安定性は共に大きく向上し、カルバペネム耐性にとって重要な翻訳後修飾であることが示された。また、OXA-58の基質結合部位の可動性のループが様々な基質の構造に適合することが多剤耐性の構造基盤であると示唆された。細菌の薬剤耐性機序の一つであるβ-ラクタマーゼは、β-ラクタム系抗菌薬を加水分解して不活化することで薬剤耐性の原因となる。カルバペネム系抗菌薬は広い抗菌スペクトルと高い抗菌活性に加え、β-ラクタマーゼに分解されにくいことから薬剤耐性菌に対する切り札とされてきた。しかしカルバペネム分解活性を獲得したβ-ラクタマーゼ(カルバペネマーゼ)を産生するカルバペネム耐性菌が出現してから、カルバペネム耐性菌に有効な抗菌薬は開発途上にある。本研究では多剤耐性アシネトバクター由来のカルバペネマーゼOXA-58のX線結晶構造解析を行い、カルバペネム分解の構造基盤を解明することで新規抗菌薬の開発に資することを目的としている。OXA型カルバペネマーゼは触媒残基としてセリンとリジンの二つのアミノ酸を持ち、さらにリジンの側鎖のアミンが、炭酸イオン存在下でカルボキシ修飾されることでカルバペネマーゼ活性が上昇する。本研究では、OXA型酵素の特徴であるカルボキシ修飾リジンについて、構造と機能の両面からX線結晶構造解析と酵素学的解析によって研究を進めている。OXA-58を炭酸イオン存在下で結晶化し、X線結晶構造解析によって分解能1.8 Åの結晶構造を得た。結晶構造中で活性残基のリジンはカルボキシ修飾されており、活性部位内でカルボキシ基はもう一つの活性残基であるセリンに加え、OXA型酵素に保存されているトリプトファン残基とも水素結合しており、この水素結合のネットワークが水中で通常では不安定なカルバミン酸を安定化していることが示唆された。実際に、セリンとトリププトファンをアラニンに置換した変異体において活性と熱安定性が大きく低下し、カルボキシ修飾リジンを安定化する水素結合の形成は、OXA-58の機能と構造の両面で重要であることが示された。活性の炭酸濃度依存性を評価すると、野生型はサブミリモル濃度のEC50を示し、25 mM程度の生理的炭酸イオン濃度でOXA-58は十分にカルボキシ化され活性化状態にあると示唆された。さらに、OXA-58の基質結合部位の構造は、既報の結晶構造とは異なっており、基質結合部位に可動性があることが示唆された。特に基質結合部位を形成するループの構造が異なっており、この可動性のループが様々な基質の構造に適合することが、カルバペネムを含むβ-ラクタム薬に対する多剤耐性の構造基盤であると考えられる。OXA-58はアシネトバクター(Acinetobacter baumannii)が産生するβ-ラクタマーゼであり、カルバペネムを含む様々なβ-ラクタム系抗菌薬を加水分解する多剤耐性の原因酵素である。多剤耐性を獲得したアシネトバクターは特に抵抗力の低下した重病患者において呼吸器感染症や尿路感染症などを引き起こし、β-ラクタム系抗菌薬の最後の切り札と言われるカルバペネムに対しても耐性を示すことから近年強く警戒されている。OXA-58を含むカルバペネマーゼは、カルバペネムの酵素阻害機能を回避して加水分解反応を進行するが、その反応機構は未だ不明な点が多い。特にOXA-型のクラスD β-ラクタマーゼは、活性残基の一つであるリジン末端のアミノ基が、炭酸イオン存在下でカルボキシ化される。本研究ではカルボキシ化状態のOXA-58の結晶構造解析によってカルバペネム分解の構造基盤を研究した。分解能1.8 Åの結晶構造から、カルボキシ修飾リジンは水素結合ネットワークを形成することで安定化すると同時に、タンパク質構造の熱安定性も大きく向上させることが明らかとなり、このカルボキシ修飾による活性化/安定化がカルバペネム耐性を高めていることが示唆された。このカルボキシ基は加水分解において水分子の活性化を触媒すると考えられているが、水分子の結合サイトは未だ不明であり、今後は触媒水の取り込みと活性化機構の点からカルバペネム加水分解の機構解明を進めていく予定である。β-

ラクタマーゼうち触媒残基としてセリンを持つセリンβ-ラクタマーゼは、一般に反応中間体としてセリンと反応中間物が共有結合したアシル中間体を経て加水分解される。クラスA, C, Dに分類されるセリンβ-ラクタマーゼのうちクラスAの酵素は、結晶構造解析において加水分解反応の水分子が結合した構造研究が進んでいるが、OXA型酵素が属するクラスDでは、アシル中間体構造が数例報告されているもののいずれも加水分解反応の水分子は観察されておらず、加水分解の過程において特に触媒残基として働くと予想されるカルボキシ修飾リジンと水の結合は未だ不明である。今後はアシル中間体の結晶構造解析を含めて加水分解過程におけるカルボキシ修飾リジンの寄与を明らかにするべく研究を推進する。構造生物学研究が概ね順調に進み、実験条件の検討に必要な実験用試薬や器具などの消耗品や、分析機器のメンテナンスを含めた消耗品のコストが下がったため。翌年度分の助成金と合わせて、計画時には予算の都合上見合わせていた、より多角的・発展的な実験や分析を行うことで、研究目的の達成に役立てる。また論文発表時にオープンアクセスに必要な料金の支払いに充てるなど、研究成果の公知に役立てる。
オロソムコイドの遺伝子多様性と機能の解析およびその展開的研究

最近の集団遺伝学の大きな潮流のひとつは、未解明部分の塩基配列の決定はもちろんのこと、遺伝子重複などの精密な遺伝子の解明、自然淘汰の影響を受けている遺伝子領域の解明などである。さらに、もうひとつの潮流は、テーラーメイド医療と言われる個人の遺伝子型を反映した医療であり、薬物の代謝に関する遺伝子の研究もこのなかに包含されている。われわれがテーマとしているオロソムコイド(ORM)は、まさにこの潮流に一致したものである。ORMは少なくともゲノムの中に二つの遺伝子を有しており、塩基性薬物の運搬蛋白の機能を担っている。本研究では、アフリカ人やドイツ人のORM遺伝子構造を明らかにした。これらの集団は日本人のORM1重複遺伝子と異なり、ORM1*F1が重複したものが主要な重複遺伝子であり、その他に、ORM1*S1が重複したもの、ORM1*F2とORM1*S1が重複したものなどが観察された。ORM2遺伝子の重複は存在しているものの、高頻度に出現しているものではないことがあきらかにされた。ORM1やORM2遺伝子の単一塩基多型(SNP)をみると、集団特異的なSNPと集団で共通のSNPが認められた。全体的にはORM遺伝子の多様性はアフリカ人において高かった。これらの知見に基づいて、ORMのcDNAのクローニングをおこない、その遺伝子にsite-directed mutagenesisによって変異を導入し、市販ベクターのpcDNA3.1発現ベクターにligateし、オーバーラップエクステンション法により変異体を作った。大腸菌でサブクローニングしたのちCOS-7細胞にtransfectし、蛋白を得た。オロソムコイド遺伝子は日本人の約20%の染色体において三重複を起していることを報告してきたが、本年度はアフリカ出身の人々についてその構造を解析した。ドイツおよび日本在住のアフリカ人16名のDNAを用い、既報にしたがって遺伝子間のlong-PCRによる増幅、塩基配列の決定、制限酵素による確認などによってORMの遺伝子構造を分析した。遺伝子間のlong-PCRにより、ガーナ、ケニヤ、ジンバブウェ出身の3名においてORM1の重複を示すp11産物が観察され、2名はORM1A*F1(Ala)ORM1B*F1(Thr)-ORAM2*M、あるいは、ORM1A*S1(1)-ORM1B*S2(T)-RORM2*Mを有していた。もう1名はp11塩基配列がヘテロ型であり、重複ORM1をホモにもつのか、あるいは三重複したORM1を持つのか確定できなかった。アフリカ人と日本人でORM1重複遺伝子の微細構造は異なっていたが、ともにORM1B遺伝子のエクソン1の近辺の比較的狭い領域で組み換えが起こっており、この領域は組み換えのホットスポットと考えられた。一方、ORM2の重複を示唆するp22産物は観察されなかった。ORM1のイントロン5にORM2の配列もつORM1*S1(2)は、ORM1*S1を持つ6名のうち5名で観察され、日本人においては通常遺伝子であるORM1*S1(1より高頻度を示した。ORM2のエクソン内の4ヶ所の塩基置換を調べたところ、日本人は3ヶ所が単型的であるのに対してアフリカ人はいずれもの個所も多型性を示した。このように、アフリカ人においても日本人同様、ORMの遺伝子再構成がしばしば生じてきたと考えられた。なお、本研究は日本DNA多型学会第11回学術集会(14年10月、旭川)にて、優秀研究賞を得た。オロソムコイド(ORM)遺伝子はORM1とORM2の縦列した二つの遺伝子座からなるが、昨年度までに日本人やアフリカ人の構造を調べ、ORM1あるいはORM2がさらに重複して、少なくとも三つの遺伝子座からなる染色体が存在することを明らかにしてきた。本年度は、ドイツ人のDNAを用い、既報にしたがって、遺伝子間のlong-PCRによる増幅、塩基配列の決定、制限酵素による確認などによって、遺伝子構造を分析した。

ORM2の重複を示すp22産物は検出されず、ORM2の重複は現在のところ、ガーナ人で観察された一家系のみであった。一方、ORM1の重複を示唆するp11産物は20人中6名で、日本人やアフリカ人と同程度の出現頻度であった。表現型はF1型とF1-S型の2種類に認められ、塩基配列を決定すると、アフリカ人と同様に、ORM1*F1の重複が生じていた。組み換え部位はORM1B*F1のエクソン1の上流にあり、日本人やアフリカ人と同様、組み換えのホットスポットであった。その部位の塩基配列がヘテロ接合型のものもアフリカ人と同様に観察され、ORM1の三重複遺伝子の存在が示唆された。また、その6人中3人はORMlB*F1のイントロン5がORM2の配列を示した。このような配列はアフリカ人でもみられたが、異なる遺伝子に起きていた。このように、遺伝子変換や組み換えが頻繁に起きてきたことが明らかになった。アフリカ人に認められたORM2遺伝子内の6ヶ所の多型部位のうち、ドイツ人では5箇所で多型的であったが、エクソン部の3箇所はヘテロ接合度がアフリカ人にくらべてきわめて低く、日本人と同様の傾向を示した。アフリカ、ヨーロッパ、アジアの3集団で認められたORM1の重複の発生時期を解明するために、他の霊長類の遺伝子構造の研究が必要である。最近の集団遺伝学の大きな潮流のひとつは、未解明部分の塩基配列の決定はもちろんのこと、遺伝子重複などの精密な遺伝子の解明、自然淘汰の影響を受けている遺伝子領域の解明などである。さらに、もうひとつの潮流は、テーラーメイド医療と言われる個人の遺伝子型を反映した医療であり、薬物の代謝に関する遺伝子の研究もこのなかに包含されている。本研究では、アフリカ人やドイツ人のORM遺伝子構造を明らかにした。これらの集団は日本人のORM1重複遺伝子とことなり、ORM1*F1が重複したものが主要な重複遺伝子であり、その他に、ORM1*S1が重複したもの、ORM1*F2とORM1*S1が重複したものなどが観察された。ORM2遺伝子の重複は存在しているものの、高頻度に出現しているものではないことがあきらかにされた。ORM1やORM2遺伝子の単一塩基多型(SNP)をみると、集団特異的なSNPと集団で共通のSNPが認められた。全体的にはORM遺伝子の多様性はアフリカ人において高かった。これらの知見に基づいて、ORMのcDNAのクローニングをおこない、その遺伝子にsite-directed mutagenesisによって変異を導入し、市販ベクターのpcDNA3.1発現ベクターにligateし、オーバーラップエクステンション法により変異体を作った。大腸菌でサブクローニングしたのちCOS-7細胞にtransfectし、蛋白を得た。
都市鉄道の所要時間信頼性向上に起因する利用者便益の計測手法に関する研究

予め運行スケジュールが確定している都市鉄道の所要時間信頼性に係る便益の推計手法は未だ確立されていない.そこで本研究では,東京首都圏の鉄道利用者に対してアンケート調査を実施し,便益の推計に必要な,所要時間不確実性下における鉄道利用者の出発時刻決定行動モデルと,輸送障害に起因する損失時間の縮減に対する支払意志額関数の推定を行った予め運行スケジュールが確定している都市鉄道の所要時間信頼性に係る便益の推計手法は未だ確立されていない.そこで本研究では,東京首都圏の鉄道利用者に対してアンケート調査を実施し,便益の推計に必要な,所要時間不確実性下における鉄道利用者の出発時刻決定行動モデルと,輸送障害に起因する損失時間の縮減に対する支払意志額関数の推定を行った初年度にあたる平成22年度においては,1.関連研究のレビュー,2.所要時間信頼性評価に関するアンケート調査票の設計,3.アンケート調査の実施を重点的に行った.以下順に詳細を記す.1.関連研究のレビューについて研究課題である交通所要時間の信頼性評価については,現在,国内外の研究者が精力的に研究に取り組まれている.本課題では,予め出発時刻と到着時刻が決定している鉄道が研究対象であるが,所要時間が決定していない自動車交通にまで範囲を拡大して既往研究のレビューを行った.その結果,所要時間信頼性については,所要時間の平均値とばらつき具合を表す指標(標準偏差など)によって評価する手法(平均-分散・アプローチ)と,早着と遅着の不効用を考慮して出発時刻の意思決定構造から評価する手法(スケジューリング・アプローチ)があること,またこれらの手法を併せて分析する統合アプローチに発展していることが明らかとなった.一方,所要時間信頼性への影響要因と考えられるネットワークのリダンダンシー性などが,利用者の行動に及ぼす影響については未だ十分評価がなされていないことが明らかとなった.2.所要時間信頼性評価に関するアンケート調査票の設計調査方法,調査項目,調査形式については検討し,調査内容に応じた必要サンプル数を確定した.3.アンケート調査の実施本研究では,株式会社マクロミルの調査モニターを対象とするアンケート調査を実施した.被験対象者は,一都三県(東京都・千葉県・埼玉県・神奈川県)の居住者であり,かつ鉄道を利用して通勤している者とした.なお回答モニターの数は5000名となった.一方,調査実施中に,東日本大震災後の計画停電に伴う鉄道運行サービスの低減が生じたことを受け,新たに調査項目を用意して,計画停電に伴う利用者の行動変化と,サービス改善に対する利用者意識についても調査した.1.移動余裕時間に関する分析前年度に実施した調査データを用いて,移動余裕時間に影響を及ぼしている要因の抽出を行った、その結果,移動距離,乗り換え回数,鉄道利用頻度などが要因として抽出された.2.出発時刻決定行動のモデル分析前庫度のレビューの成果を踏まえ,Fosgerauが開発した統合アプローチを援用して,首都圏の鉄道通勤客の出発時刻決定モデルを定式化した.そして鉄道通勤客が設定する移動余裕時間を被説明変数,移動距離,乗り換え回数,鉄道利用頻度などを説明変数とする非線形回帰モデルを構築した.モデルパラメータの推定には,余裕時間設定の個人間の異質性を考慮可能な階層ベイズを適用した.パラメータ推定の結果,上記の説明変数が移動余裕時間の影響要因であることを明らかにした.3.鉄道ネットワークのリダンダンシー性能評価指標の開発経路代替性の状況が出発時刻に影響を及ぼすと考えられる.そこで起点と終点を移動する際の経路代替性を評価するための指標を作成した.4.損失時間削減に対する支払意志額の分析鉄道の運行遅延による損失時間削減に対する支払い意志額を推定するモデルを構築した。生存分析手法を用いて支払い意志額関数を推定した結果,損失時間,鉄道利用頻度,遅延遭遇率などが支払い意志額への影響要因であることを明らかにした.5.補足調査の実施本研究では所要時間の不確実性を2種に区分して評価する予定であった。一つは,出発時刻の決定に影響を及ぼすような日常的に生じている所要時間不確実性であり,他方は,出発時刻の決定に影響を及ぼさない頻度で発生する所要時間不確実性である.しかしながら,これら2種の不確実性に対する評価は,個々人によって異なると考えるに至った.そこで本研究では,所要時間の不確実性が出発時刻に及ぼす影響の個人差を評価するためのデータ整備が必要という考えに至り,補足調査を実施した.本年度の研究実績の概要は下記の通りである.前年度末に実施したアンケートで鉄道サービスの選好意識(SP)に関する選択実験を行った.選択実験では,平均所要時間,所要時間の変動,費用が異なる2つの鉄道サービスを設定し,どちらのサービスを利用したいかを問う2肢選択を採用した.所要時間の変動については等確率で生じるという条件の下で生じ得る5つの所要時間を提示した.これら5つの所要時間から,所要時間の変動を表す標準偏差を算出しモデルの説明変数に採用した.所要時間,所要時間の変動,運賃を説明変数とする選択モデルのパラメータを推定した結果,説明力を有するモデルが推定された.また,「所要時間」「所要時間の標準偏差」「費用」の推定パラメータを用いて,所要時間と所要時間変動(標準偏差)の時間価値を推計した結果,所要時間については36.25円/分,標準偏差もついては1.08円/分であった.標準偏差については,既往の研究結果と比べて極めて小さい値であった.本件については,データ収集の方法等を含めて今後の検討課題とした.つぎに,実行動(RP)データを用いて,出発時刻の決定行動に関するモデルを推定した.

その際,所要時間・所要時間変動・費用に対する抵抗の大きさを反映していると考えられる鉄道サービス選択モデルの推定パラメータ(個々人ごとに推定している)を説明変数に用いた.その他,個々人の鉄道の利用状況(移動距離,乗換回数,鉄道利用頻度)を説明変数に用いた.パラメータの推定結果「移動距離」「乗換回数」「所要時間の抵抗値」ついては統計的に有為なパラメータが推定された.一方「所要時間変動」「費用」については有為なパラメータは推定されなかった.なお出発時刻の現況再現については十分高い性能を持っていることを確認した.当初,所要時間の不確実性を2種に区分して評価する予定であった.一つは,出発時刻の決定に影響を及ぼすような日常的に生じている所要時間不確実性であり,他方は,出発時刻の決定に影響を及ぼさない頻度で発生する所要時間不確実性である.しかしながら,これら2種の不確実性に対する評価は,個々人によって異なると考えるに至った.そこで本研究では,所要時間の不確実性が出発時刻に及ぼす影響の個人差を評価するためのデータ整備が必要という考えに至った.そのため,新たに分析すべき内容が加わった.分析するためのデータは昨年度中に整備したが,やや遅れている感は否めない.24年度が最終年度であるため、記入しない。当初,所要時間の不確実性を2種に区分して評価する予定であった.一つは,出発時刻の決定に影響を及ぼすような日常的に生じている所要時間不確実性であり,他方は,出発時刻の決定に影響を及ぼさない頻度で発生する所要時間不確実性である.しかしながら,これら2種の不確実性に対する評価は,個々人によって異なると考えるに至った.そこで本研究では,所要時間の不確実性が出発時刻に及ぼす影響の欄人差を評価するためのデータ整備が必要という考えに至った.そのため,新たに分析すべき内容が加わった.分析するためのデータは昨年度中に整備した.実際の現象を忠実に解析するため,また所要時間信頼性の経済評価を適切に実施するためには,必要不可欠な項目であり,研究計画を修正して実施することにした.24年度が最終年度であるため、記入しない。
磁気共鳴画像法を用いた炊飯過程のリアルタイム測定と糊化過程の分子レベルでの解析

炊飯過程については多くの研究があるが,米一粒の中でどのように澱粉の糊化が進行するかについての定量的な研究は行なわれていない.本研究では生体組織中の水の状態変化を非破壊で測定する強力な手段である磁気共鳴画像法(MRI)を用いて米粒内の糊化進行過程を測定することを試みた.まず,炊飯過程の任意の時間で米粒を急冷した試料について2次元MRI横緩和時間画像をとりそれを換算して水分画像とし,炊飯の進行と共に水分分布の変化する様子を捕えた.しかしながら,この方法では1つの水分画像をとるのに2時間余りを費やし,しかも,試料の急冷による変化が大きな疑問として残る.そこでリアルタイムでの測定の実現を目差した.更にし数学モデルによる検討と組合わせて糊化過程の分子レベルでの解析を目的とした。炊飯のリアルタイム測定のためには短時間に数個の横緩和時間画像を測定するため多数回シーケンスモードによる測定が必要である.また対象とする系の磁気緩和時間が短いため信号強度が低下しノイズが大きくなることに対応した測定法の開発および解析のためのデータ処理プログラムの開発が必要であった.次にリアルタイム測定で得られた炊飯中の米粒内水分変化から糊化過程の分子レベルにおける解明を目指した.米粒を構成する細胞壁の果たす吸水・糊化過程への役割を明確にすべく酵素処理した精白米と無処理の精白米を調整し,偏光顕微鏡観察および炊飯中の水分変化測定を行なった。その結果細胞壁による吸水抑制効果は大きくないことがわかった.このことから米粒を楕円円柱状に成型されたデンプンと見做して,炊飯過程における水分子の移動現象を計算した.計算結果による予測は実験結果よりずっと遅い水分上昇を示しており計算に使った仮定に誤りがあるか或いは拡散係数や糊化速度が実際と異なっていることを示唆しており,更なる研究が必要である.炊飯過程については多くの研究があるが,米一粒の中でどのように澱粉の糊化が進行するかについての定量的な研究は行なわれていない.本研究では生体組織中の水の状態変化を非破壊で測定する強力な手段である磁気共鳴画像法(MRI)を用いて米粒内の糊化進行過程を測定することを試みた.まず,炊飯過程の任意の時間で米粒を急冷した試料について2次元MRI横緩和時間画像をとりそれを換算して水分画像とし,炊飯の進行と共に水分分布の変化する様子を捕えた.しかしながら,この方法では1つの水分画像をとるのに2時間余りを費やし,しかも,試料の急冷による変化が大きな疑問として残る.そこでリアルタイムでの測定の実現を目差した.更にし数学モデルによる検討と組合わせて糊化過程の分子レベルでの解析を目的とした。その結果細胞壁による吸水抑制効果は大きくないことがわかった.このことから米粒を楕円円柱状に成型されたデンプンと見做して,炊飯過程における水分子の移動現象を計算した.計算結果による予測は実験結果よりずっと遅い水分上昇を示しており計算に使った仮定に誤りがあるか或いは拡散係数や糊化速度が実際と異なっていることを示唆しており,更なる研究が必要である.本研究の目的は生体組織中の水の状態変化を非破壊で測定する強力な手段である磁気共鳴画像法を用いて,米粒内の糊化進行過程をリアルタイムで測定し,糊化過程を分子レベルで解析することにある.本研究ではたんにMR画像を得るのではなく,緩和時間画像を測定するのでパラメータを変えた多数回シーケンスモードによる測定が必要である.そのために本年度の研究では、ハードウェアでは低ノイズ高性能磁場勾配システムの開発を,ソフトウェアでは高速2軸スライス1次元イメージング画像法の開発を目差した.ハードウェアではBRUKER社グラジエントアンプ30Aの導入により、アンプへの負荷が相対的に軽減されてグラジエントパルスの繰り返し特性が安定化し,そのためデータの積算効果が高まった.しかしながら,米粒の吸水・膨潤・糊化の過程をON LINEで追跡するためには相当断面の継続観察が必要でそのための試料側の形状保持あるいは変化を測定中に判別するための手段を開発する必要が改めて認識された.ソフトウェアでは高速測定法であるSNAP SHOT法の手法をBASEとし,パラメタを変化させて測定した多数組のデータを大きな1つのデータとしてディスクに書き込む方式を用いて高速で2軸スライス1次元イメージングを撮るパルスシーケンスを開発することができた.食品中の水の縦緩和時間の差異を利用して"自由水"あるいは"束縛水"を区別して画像化する手法を現在検討している.1.米粒はコメデンプン粒を貯留する胚乳細胞から構成されるが,胚乳細胞の細胞壁が吸水過程に及ぼす影響を調べるためにセルラーゼ処理した精白米と無処理の精白米を調製し,偏光顕微鏡観察および炊飯中の水分変化測定(NMR imaging)を行った.セルラーゼ処理米は偏光顕微鏡観察によって細胞壁が破壊されていることが確認されたが,炊飯中の水分変化はセルラーゼ処理米と大差はなく細胞壁による吸水抑制制効果は大きくないことが分かった.

2.細胞壁の吸水抑制効果が大きくないことが分かったので米粒を楕円柱形状に成型されたデンプンと見做して,炊飯過程における水分子の移動現象を計算した.水は外側から内部へ拡散するが,糊化反応が進行しないと拡散は抑制される.シミュレーションによる水分分布の計算結果は,水分分布の形状が,炊飯途中で米粒を急冷した試料の2次元NMR imagingによる水分分布の測定結果と良く似たが,水分の絶対値は測定結果の方が計算値より20%以上大きくなった。この不一致の原因は炊飯米が急冷後の保存中あるいはNMR imaging測定中に吸水するからではないかと疑われた.この疑問はreal time測定によって解明できる.3.炊飯のreal time測定のためにCPMG1次元T2imaging法を開発して用いた.35回程度の積算によりS/N比を高めて1つのimageとして1分程度毎のimageを採取できた.このようにして得た1次元プロファイルを隣接する7つのピクセル毎に平均することで平滑化して水分分布を得た.この方法によって観察した水分分布は炊飯途中で急冷した米粒中の水分分布よりも水分の上昇が急速であることが判明した.これは前項で疑った保存中の吸水を否定する結果であり,米は炊飯の途中で急冷すると逆に水分分布が低下するものとみられる.この原因は米粒の冷却による収縮という可能性がある.
ダウン症候群の核型正常化による合併症の予防および治療法確立に向けた研究

Down症候群は、21番染色体の数的過剰により、精神発達遅滞をはじめ多彩な合併症を招来する症候群で、地域・時代・人種を問わず人口の0.1%弱の人が有する症候群である。本研究は、Down症候群由来細胞を用いて、トリソミックレスキュー、すなわち過剰な21番染色体を消去する方法の科学的探索および確立、ならびに知見を統合して最適な新規治療用ベクターの構築を志向するものである。本研究では、当該施設の倫理審査承認を経て、Down症候群の人由来の皮膚線維芽細胞株、およびこの細胞株よりiPS細胞株を樹立し、両親を含めた縦列型反復配列(STR)解析を通じて、各21番染色体の由来を把握した。ついで、Cre-loxpシステムを利用した染色体消去法により、3本の21番染色体間での塩基配列の相違のリスト化(phasing)に成功した。このphasing情報を用いて、単一の21番染色体のみを認識する複数のsgRNAおよびCas9蛋白質発現プラスミドを構築した。なお、3本の21番染色体の各1本を消去した誘導型ダイソミーiPS細胞株、およびトリソミーiPS細胞株は、遺伝学的背景が同質であり学術上の価値を有するため、国内外の研究者が広く利用できるよう、公的細胞バンクへの寄託手続きを開始した。当初は、核型正常化作用を有すると報告される蛋白質ZSCAN4を細胞質型ウイルスベクター(パラインフルエンザ2型)にて強制発現させる系を確立し、複数の異なる条件下で核型修正化(トリソミーからダイソミーへの変化)の有無を検討したが、使用した条件下では核型修正は確認されなかった。そこで、上記単一の21番染色体のみを認識するCRISPR/Cas9システムで、染色体の複数箇所切断を行うと、10%以下の比較的低頻度であるが、21番染色体特的プローブを用いたFISH法にて核型修正効果が確認された。本研究は、ダウン症候群由来細胞を用いて、トリソミックレスキュー、すなわち過剰な21番染色体を消去する方法の科学的探索および確立、ならびに知見を統合して最適な新規治療用遺伝子ベクターの構築を志向するものである。本研究に用いるダウン症候群由来細胞は、研究の方法・目的上、21番染色体の各々のアレルの由来、すなわち各々のアレルの父母由来情報が少なくとも必要である。この点、細胞バンクなどから提供を受けた細胞では、アレル情報が不明である。したがって、本研究では、新規に承認された臨床研究として、両親の部分的なゲノム情報とともに、新たにトリソミー21由来細胞を調達し、研究の基盤を構築した。さらに採取された培養細胞(皮膚由来線維芽細胞)から不死化線維芽細胞、および人工多能性幹細胞(iPS細胞)株を樹立した。一方、研究を行うための実験計画の機関内承認(臨床研究1、組換えDNA実験計画7)の取得、特定の遺伝子を発現するウイルスおよび非ウイルス性の複数の発現ベクターの構築、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)や染色体展開標本を用いたG-banding等の評価系の確立、およびiPS細胞、線維芽細胞のシングルセルクローニング法の確立がなされた。また、in vivo使用のベクターとして、エクソソームを細胞培養上清から超遠心法にて単離し、透過型電子顕微鏡にて確認した。単離したエクソソームにpCMV-EGFPモニタープラスミドを封入し、他大学との共同研究として、ヒト線維芽細胞への導入効率をin vitroで評価した。結果、予想外の高効率(70%以上)で遺伝子導入が確認され、ベクターとしての有用性が確認された。初年度は、1つの臨床研究、7つの組換えDNA実験計画の承認を得て、研究が開始された。核型正常化作用があるとされる遺伝子のクローニング、ウイルスないし非ウイルスの発現ベクターの構築、複数の染色体解析の評価法の確立を行った。具体的には、当大学病院にてダウン症候群の人より線維芽細胞を採取し、hTERT遺伝子導入にて不死化線維芽細胞株を樹立した。本株は、長期間の培養(>100PDL)にても、トリソミー21の核型が維持されることを確認した。また、実両親のSTR解析と併せ、当該細胞の21番染色体の各アレルの由来を同定した。本研究においては、ウイルスベクターによる特定蛋白質の発現細胞作成やゲノム編集が可能であったが、シングルセルクローニングが困難である事が判明した。増殖能を停止させたフィーダー細胞を用い、線維芽細胞に薬剤耐性遺伝子を挿入する事で、シングルセルクローニングを行える実験系の構築に成功した。しかしながら、十分量のクローニングされた線維芽細胞を得るまでに長時間(数ヶ月)が必要である事が判明した。この問題を克服するために、細胞周期の短いiPS細胞を用いる戦略を採った。非不死化線維芽細胞からエピソーマルベクターを用いて、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を誘導し、数株を樹立し、特異的マーカーを用いた免疫染色法にて未分化状態を確認した。また、これらiPS細胞が、培養器コーティングなしの条件で、かつ単一分散法で未分化状態を維持しながら増生すること、シングルセルクローニングが比較的短時間で可能である事を確認した。以上の次第であり、主としてこれら研究材料の変更により実験実施予定が順延し、研究進捗としてはやや遅れているものと判断される。

本研究では、新規に承認された臨床研究として、両親の部分的なゲノム情報とともに、新たにトリソミー21由来細胞を調達し、研究の基盤を構築した。取得した細胞はiPS細胞化し、クローニングや将来的に分化誘導研究を容易かつ可能とした。また、核型判定のため、各種遺伝学的評価法(FISH、染色体伸展像、digital PCR、MLPA法、G-banding等)を確立した。また、研究を行うための実験計画の機関内承認(臨床研究1、組換えDNA実験計画7、動物実験計画1)の取得、特定の遺伝子を発現するウイルスおよび非ウイルス性の複数の発現ベクターの構築がなされた。一方、in vivo使用のベクターとして本研究ではエクソソーム(細胞外小胞)に重点を置いている。エクソソームを細胞培養上清から超遠心法ないしホスファチジルセリンに結合するタンパク質と磁気ビーズを利用したアフィニティー法にて分離し、透過型電子顕微鏡にて確認した。本エクソソームを用いて、蛍光蛋白質をコードするプラスミドベクターの導入効率は比較的良好であった。トリソミー21のiPS細胞を用いた実験では、ダイソミー21のiPS細胞と比し検出可能な増殖速度の差異を指摘できないこと、ダイソミー21のiPS細胞と比して培養中の自然発生的な細胞分化の割合に差異を認めないこと、20継代以上の比較的長期培養においても核型が変化しないことが分明となった。また、人iPS細胞への一過性遺伝子発現の誘導法としては、ヒトパラインフルエンザ2型ウイルス(PIV2)ベクターが、細胞毒性が少なく有用である事が示された。初年度は、複数の実験計画の施設内承認、核型正常化作用があるとされる遺伝子のクローニング、複数の染色体解析の評価法の確立、トリソミー21由来線維芽細胞のiPS細胞化と発現遺伝子の解析を主として行った。第2年度では、トリソミー21-iPS細胞のhaplotype phasingを行った。具体的には、inverted loxP間に、ポジティブセレクションマーカーとネガティブセレクションマーカー(puroΔTK)を配置したトランスジーンを、特定の21番染色体にCRISPR/Cas9システムを用いて挿入し、Cre蛋白質を発現させて染色体の消去を行った。トリソミー21の各21番染色体を消去したダイソミーiPS細胞株を3株樹立し、SNPを中心とした塩基配列を解析し、phasingを行った。すなわち、父親由来の21番染色体をF、母親由来のそれをM1, M2とした場合(オリジナル細胞は、F-M1-M2)、M1-M2, F-M1, F-M2の21番染色体のみを保有するダイソミー細胞株を各々樹立し、シーケンスを行った。細胞培養上の挙動としては、少なくとも増殖曲線においては、トリソミーとダイソミー細胞間で、優位な差異を認めなかった。また、核型正常化作用があるとされる遺伝子を、各種遺伝子発現データベース上の情報を用いて絞り込みを行い、一部はcDNAから、一部は人工遺伝子合成によりクローニングした。当初、一過性発現を意図し、mRNAの細胞内導入を行った。しかしながらiPS細胞に対する一般的なリポフェクションを用いた核酸導入法では、mRNA専用試薬を用い、毒性を軽減するためmRNAの塩基修飾を試みたものの、導入効率が極端に悪いことが判明した。