hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遷延性意識障害患者の生活行動回復の看護介入の構築－覚醒低下時の端座位姿勢の解析－

本研究の今年度の課題1は、覚醒低下時の端座位姿勢の定位を測定する手法の検討であった。その手法として、複雑な装置や広範囲な測定環境を必要としない二次元動作分析を適用した。二次元動作分析のためのデータは、被験者の端座位姿勢の頭頂部から接地した足部までの矢状面を固定した家庭用ビデオカメラで撮影した動画とした。また、端座位姿勢の矢状面において、その変化を測定するために適切な身体部位および部位のマーキングについて検討を進めている状況である。さらに、覚醒低下に伴う端座位姿勢の変化の分析についても検討を進めている。また本研究の今年度の課題2は、覚醒低下時の端座位姿勢の安定性を測定する手法の検討であった。その手法として、頭頂部に小型無線加速度計を装着し、3軸方向の加速度を測定する手法を確立した。分析方法については検討を進めている状況である。これらのことから、本研究の平成27年度における研究計画の達成度は、おおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。リハビリテーション看護本研究は平成26年度および平成27年度の2年で、健康な成人の覚醒低下時における端座位姿勢の定位と安定性を明らかにすることを目的とする。このうち平成27年度は、平成26年度に構築した手法を用いて、健康な成人30名の端座位における覚醒の低下と姿勢の定位、および安定性の関係性を明らかにすることを目的とする。被験者は、研究者が所属する教育機関において公募し、書面と口頭によって研究の目的や意義、危険性とその対処方法、情報の保護について説明し、同意書を得る。平成26年度に構築した端座位姿勢の定位の測定手法は、被験者の端座位姿勢の頭頂部から接地した足部までの矢状面を、固定した家庭用ビデオカメラで撮影した動画から二次元動作分析を行うことであった。一般に矢状面の体幹の形状の計測は、脊椎の自然なS字カーブに従って、第7頸椎ー第7胸椎の胸部、第7胸椎ー第2仙椎の腰部がなす角度が指標とされる。本研究においては、胸部と腰部に加えて、覚醒が低下した時に動揺があることが報告されている頭頂ーC7の頭部、および座位の自立性に関与することが報告されている上前腸骨棘ー第2仙椎を計測の部位として設定する。これらの計測部位に複雑な生活環境でも抽出可能なマーカーを検討し、被験者に対して測定を行う。さらに、端座位姿勢の安定性は、頭頂部に小型無線加速度計を装着し、3軸方向の加速度を測定する手法を、平成26年度に構築した。平成27年度はその手法に則り、被験者に対して測定を行う。さらに、覚醒の低下について、開閉眼を指標とすることを計画した。しかし、覚醒が低下する時点の確認が困難であった。そのことから、簡易脳波形を用いたα波、β波を指標とした覚醒の低下の確認を行うことを検討中である。
ヒトホモログ蛋白質相互作用ネットワークを用いた癌化パスウェイの解析

本研究は、種を超えた蛋白質相互作用マップをシステマティックに構築し、構築したマップを用いて、癌化に関与するパスウェイの解析を行い、癌化の新たなメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、昨年度研究成果によって得られた生物種の相同性蛋白質、その蛋白質の相互作用をシステムに導入し、蛋白質相互作用マップを自動的に構築できるシステムを作成した。この際、足された相互作用の由来がどの生物かわかるようにエッジを色分けし、表示できるようにした。構築したマップが有効かどうか示すため、癌化に関与するパスウェイのうち、よく研究の進んでいる細胞周期を選択し、細胞周期に関わる蛋白質相互作用ネットワークを構築した。細胞周期に従って発現が振動する遺伝子群を用いて、ヒト蛋白質相互作用ネットワークを作成したところ、12の機能モチーフ(DNA複製、チェックポイント、フィラメント形成等)を含むネットワークが得られ、また、遺伝子の発現情報を重ねたところ、蛋白質相互作用が時期特異的に起こり、各モチーフが細胞周期の時期特異的に活性化することを示すネットワークが構築できた。さらに、このネットワークを構成している蛋白質の機能を調べたところ、38%が癌関連蛋白質であり、それらは、細胞増殖、アポトーシス、血管新生に関与するモチーフに存在していた。さらに、このデータに、他生物種で知られる相互作用を加えたところ、すでにヒトでも相互作用が知られている関係性とほとんどが一致し、他生物で相互作用のある蛋白質は、ヒトにおいても相互作用が見られ、今回作成したヒトホモログ蛋白質相互作用ネットワークが有効であることを示した。また、このほかに、ヒトではまだ同定されていない蛋白質相互作用も得られており、細胞周期に関与する新たな蛋白質を予測できる可能性を示唆した(国際学会にて発表、論文投稿準備中)。目的)本研究は、種を超えた蛋白質相互作用マップをシステマティックに構築し、構築したマップを用いて癌部・非癌部のマイクロアレイ解析の結果から、癌化に関与するパスウェイの解析を行い、癌化の新たなメカニズムを明らかにすることを目的とする本年度研究成果)1.他生物の蛋白質相互作用の抽出他生物で知られている蛋白質間相互作用を以下の3つの方法を用いて収集した。(1)我々がすでに開発しているヒト蛋白質相互作用検索システムを応用して、文献情報から、酵母・ショウジョウバエ・線虫の蛋白質相互作用を抽出した。(2)Y2H法を用いて網羅的に蛋白質間相互作用を決定した文献情報を重点的に収集し、蛋白質間相互作用を抽出した。(3)蛋白質間相互作用データベースであるBIND,DIP,MIPSなどから蛋白質間相互作用情報を収集した。以上のことから異なる5種の生物種の蛋白質間相互作用情報を得ることができたので、これらを用いて種を超えた蛋白質相互作用ネットワークのプロトタイプを作成した。2.蛋白質異種同意語を区別するための辞書作成得られた他生物の蛋白質はヒトホモログ蛋白質に置き換えた。しかし、蛋白質名は、正式名称の他に略語やシノニムが用いられ、同じ略語が別々の蛋白質を表すことがあり、蛋白質間相互作用を表示する際に支障をきたした。そこで、このような異種同意語を区別するための辞書の構築を行った。蛋白質は、名前でなく、遺伝子、蛋白質番号を基準に区別し、同じ名前でも異なった蛋白質として認識するよう工夫した。これによって、蛋白質名の混合をかなり軽減することができた。
糖尿病性腎症発症機転における Rho/ROCK 系シグナル制御機構の検討

Rho/ROCKシグナルは、アクチンストレスファイバーの形成や諸種の遺伝子発現など、重要な細胞機能の制御に関わることが判明している。本研究では、2型糖尿病モデルdb/dbマウスの腎皮質ではRho/ROCK活性が過剰に亢進しており、このことが糸球体硬化に関与すること、また、培養メサンギウム細胞にて本シグナルが炎症性サイトカインの発現を増強させることを見出し、Rho/ROCKシグナルが糖尿病腎症の発症進展に関与することを証明した。平成22年度は、研究実施計画書に則り、in vitroの研究を行った。不死化したマウスメサンギウム細胞ならびにラット由来株化尿細管細胞を用い、RhoならびにRho-kinase(ROCK)の活性化条件を検討した。まず、高血糖の影響を確認する目的で、両細胞を高ブドウ糖培地で培養し、Rho/ROCKシグナルを検討したが、どのような条件設定を行っても、両細胞ともにRho/ROCKシグナルの有意な活性化を認めることはできなかった。そこで、近年、糖尿病ならびにインスリン抵抗性状態における血管病変への関与が注目されているTNF-αならびsphingosine-1-phosphate(S-1-P)の影響を検討したところ、これらがRho/ROCKの著しい活性化をもたらすことを見出した。次にメサンギウム細胞において、TNF-αの刺激下に発現する遺伝子を検討し、MCP-1とTGF-βの発現が数倍の亢進をきたし、ROCK阻害薬でこれが抑制されることを確認した。併せて、chemotaxis chamberを用い、TNF-α刺激下のメサンギウム細胞培養液がマクロファージの遊走を促進し、ROCK阻害薬がこれを抑制することを確認した。さらに、ROCKによるMCP-1の発現誘導には、p38MAPKが関与することを立証した。この結果から、メサンギウム細胞におけるRho/ROCK系の活性化は、糸球体におけるマクロファージの浸潤を促すと結論した。一方、尿細管細胞にS-1-Pを添加すると、Rho/ROCK活性化とともにE-cadherinの発現が低下し、α-SMA陽性細胞が増加することを見出した。また、この作用はS-1-Pの2型受容体を介することを確認した。このことから、S-1-PによるRho/ROCK系の活性化は、尿細管における形質転換(epithelial to mesenchymal transition, EMT)をきたすことが示された。以上の結果から、Rho/ROCK系シグナルは、炎症機転とEMT促進を通して、腎症発症に関与すると考えられた。平成23年度は、研究実施計画書に則り、2型糖尿病モデルdb/dbマウスを用いて、腎皮質におけるRho/Rhoキナーゼシグナルの動態と腎病変との関係について検討を行った。本マウスでは、糖尿病の発症ともに、腎皮質のGTP結合型Rhoの有意の増加を認めた。また、Rhoキナーゼ活性も有意に増加しており、その特異的阻害薬ファスジルの投与によってこれは抑制された。糖尿病の発症とともに尿蛋白が増加するが、ファスジルの投与はこれを有意に抑制した。糖尿病マウスでは糸球体係蹄の肥大・基質の増加などの形態変化を示したが、ファスジルの投与によってこれらの変化は改善した。また、糖尿病の糸球体ではマクロファージの浸潤を認めたが、ファスジルはこれを減少させた。そこで、線維化を促進するサイトカインTGF-β、CTGFならびにマクロファージの浸潤をうながすMCP-1の発現を検討したところ、糖尿病ではこれらのmRNAが増加していた。また、細胞外基質である各種コラーゲンのmRNAも糖尿病で発現の亢進を認めたが、ファスジルの投与によって、これらのサイトカインやコラーゲンの発現は有意に抑制された、CTGFやMCP-1は、低酸素状態で活性化を受ける転写因子HIF-1によって転写制御されることが知られている。そこで、糖尿病マウスの腎皮質におけるHIF-1α蛋白の変動を検討した。糖尿病マウスでは、非糖尿病マウスに較べ、腎皮質HIF-1α蛋白量は有意の増加しており、核分画でも発現量の増加を認めた。ファスジルの投与によって、HIF-1αの核内蛋白量は、減少していた。以上の結果から、糖尿病では、腎皮質におけるHIF-1の産生増加とともに核内への移行促進を生じ、その下流遺伝子の発現亢進をきたすこと、Rhoキナーゼはその上流に位置し、HIF-1を介した糖尿病性腎症の発症機序に重要な役割を演じるものと考えられた。2型糖尿病のモデル、db/dbマウスの腎皮質でRhoならびにRho-kinaseの活性化を認め、Rho-kinaseの選択的阻害薬Fasudilによって、尿蛋白が減少し、形態学的にも糸球体硬化が抑制されていたことから、腎におけるRho/Rho-kinaseカスケードの亢進が糖尿病性腎症に進展に関与することを明らかにした。この際、TGF-βやCTGFなどの線維化促進性

サイトカインならびにTNF-αやMCP-1をはじめとする炎症惹起性サイトカインの発現が増強していたことから、そのメカニズムに関与する転写因子の探索を行った。その結果、糖尿病状態では腎皮質におけるHIF-1αの蛋白レベルの発現が、細胞質ならびに核内ともに増加しており、HIF1-α下流に位置する遺伝子群の発現亢進を生じているが、これらはRho-kinase阻害薬によって、ほぼ抑制されることを明らかにした。そこで、Rho-kinaseによるHIF1-αの制御機構を解明する目的で、培養メサンギウム細胞を用いて、低酸素刺激におけるHIF-1α誘導に対するRho-kinaseの関与を検討した。Rho-kinase1ならびに2のsiRNAは、いずれもHIF-1α蛋白の発現を抑制した。この際、HIF-1αのユビキチン化は、Rho-kinaseの活性化にともなって有意に抑制され、その結果、HIF-1αの核が亢進することが判明した。さらに、HIF-1αのユビキチン化の律速段階を担うPHD-2の発現は、Rho-kinaseの活性化によって抑制されることを証明した。以上の結果から、糖尿病状態では、腎皮質におけるRho/RHo-kinaseカスケードが過剰に活性化されており、HIF1-αのユビキチン化が抑制され、転写活性の亢進を招き、一連の線維化促進機構の増悪につながること、Rho-kinaseが新たな治療標的になることを証明した。細胞レベルで得られた知見について、糖尿病マウスの腎臓でほぼ想定通り確認することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの実験結果からみると、糖尿病性腎症の成因においてRho/Rhoキナーゼシグナルはかなり大きな役割を演じていると考えられる。その活性化機構ならびに制御する遺伝子は多岐におよぶ可能性かある。今後の研究成果を踏まえ、何らかの網羅的探索が必要になると想定される。また、研究の進捗によっては、遺伝子改変マウスによる実験が必要となると考えている。
河道侵食と流砂機構に関する研究

本研究は、山地河道における流砂現象を土砂水理学的手法に基づいて明らかにしようとするものであって、次の三つの分担課題、すなわち、1.河道における掃流力分布の推定法、2.流路の侵食機構、3.侵食砂礫の輸送機構からなっている。以下、得られた成果を要約する。1.山地河道の典型的な例として階段状河床波を取り上げ、このような流路床における掃流力の縦断分布を実験的に調べた。その結果、掃流力は、クレストと再付着点の間で負になり、再付着点より下流では直線的に増加し、クレストにおいて最大値になることが判明した。ついで、直線流路における掃流力の横断分布について理論的考察を進め、2次流の効果を考慮した掃流力の推定法を提示した。2.流路の侵食機構については、とくに、アーマ・コートに被覆された河床の侵食現象を対象として、アーマ・コートの破壊条件、破壊時における流砂の挙動を理論、実験の両面より検討した。まず、階段状河床波上の掃流力分布と材料の粒度分布特性値を考慮したアーマ・コートの破壊条件を明らかにした。ついで、破壊時における掃流砂と浮遊砂の挙動を詳細に調べ、破壊時におけるこれらの運動モデルを提示した。3.浸食砂礫の輸送機構については、上述の研究を基礎として、掃流砂および浮遊砂の輸送モデルを提示した。これは、流れの連続式とエネルギー式、流砂の連続式と流砂量式、および河床表面とその下層の粒度分布式からなっており、アーマ・コートの形成過程や破壊過程における流砂の量的・質的変化ばかりでなく、河床材料の粒度分布の予測を可能にするものである。本モデルの妥当性を検討するため、粒度分布の広い材料(138mm)を用いて水路実験を行った。その結果、本モデルは、掃流砂や浮遊砂の縦断分布およびそれらの粒度分布、ならびに河床の粒度分布を的確に評価することが判明した。1.山地河道の典型的な例とし階段状河床波を取り上げ、このような流路床における掃流力の縦断分布を実験的に調べた。2.流路の侵食機構については。とくに、アーマ・コートに被覆された河床の侵食現象を対象として、アーマ・コートの破壊条件,破壊時ひおける流砂の挙動を理論,実験の両面より検討した。3.侵食砂礫の輸送機構については、上述の研究を基礎として、掃流砂および浮遊砂の輸送モデルを提示した。

これは、流れの連続式とエネルギー式,流砂の連続式と流砂量式,および河床表面とその下層の粒度分布式からなっており、アーマ・コートの形成過程や破壊過程における流砂の量的・質的変化ばかりでなく、河床材料の粒度分布の予測を可能にするものである。本モデルの妥当性を検討するため、粒度分布の広い材料(138mm)を用いて水路実験を行った。その結果、本モデルは、掃流砂や浮遊砂の縦断分布およびそれらの粒度分布、ならびに河床の粒度分布を的確に評価することが判明した。
グローバル時代におけるケニアのキリスト教と国家意識の形成に関する社会学的考察

本研究の目的は、ケニアの諸キリスト教が国家統合を助長する機能を果たしているという仮説をたて、現代ケニア社会では、民族中心主義が社会階層格差とどのように向き合っているのかを検討することにある。この目的を達成するために、当該年度は、(1)平成28年度までに収集したデータの整理、(2)現地調査の遂行、(3)海岸地方のキリスト教に関するデータの収集・整理、(4)総選挙に関する新聞資料の収集・整理、(5)研究会および学術誌における研究成果の発表、および今後の成果報告に向けた準備を中心に研究活動をおこなった。これまでのデータ整理後、平成28年7月9月、「国家と宗教の関係性」を強く示す事例である大統領選挙、並びにイスラム教が支配的な地域でのキリスト教のあり方に関する調査を遂行した。まず、2007年末から2008年初めにかけて起こった選挙後暴力(PEV)に関する国民の意識を調査するため、その被害者およびその暴力に関わった人びとへの聞き取り調査をおこなった。そして、第11回目の総選挙(2013年)の時期の国民意識を調査するため、教会における聞き取り調査をおこなった。これらの調査から、2007/8年の惨事を二度と繰り返さないように、過去を反省し、悔い改めることが、個人のみならず国家として求められていたことが明らかになった。平成28年度後半には、新聞調査をおこない、2007/8年の選挙後のメディアの反応、知識人らのオピニオンや一般市民からの投書などを重点的に収集した。市井の人びとが、2007/8年選挙後暴力の惨事をふまえ、今後の「国民」統合に向けた動向をキリスト教的価値観から見出そうとしているという調査結果を、Sociology Association(ケニア)にて口頭発表をおこない、ケニアにおけるキリスト教と文化の関係性にかんして展開した構想を、関西学院大学先端社会研究所発行『KG社会学批評』にて発表した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、ケニアの諸キリスト教が国家統合を助長する機能を果たしているという仮説をたて、現代ケニア社会が民族中心主義や社会階層格差とどのように向き合っているかを検討することにある。この目的を達成するために、平成27年度の5月から8月(繰越申請分)は現地での長期調査に充て、主調査対象のナイロビにおける教会での参与観察・聞き取り調査、学校などの教育機関、若者の意識調査、貧困地域の家庭調査を中心に行った。平成26年度の短期滞在中に事前調査をおこなったナイロビ東部カヨーレ(Kayole)、ソウェト(Soweto)に加え、隣接する二地区、ダンドーラ(Dandora)、ケーシーシー(KCC)を含む三つの地区において、小規模ペンテコステ系教会での参与観察、牧師・教会関係者および信者への聞き取り調査を行った。カヨーレ、ソウェト地区を調査するにつれて、調査対象者の多くが隣接する地域であるダンドーラやケーシーシーに滞在していたことが明らかになったため、その軌跡をたどるべく、カヨーレ、ソウェト地区に加えてその二地区も調査対象とした。ダンドーラは独立以前よりスラム化がはじまった古いタイプの貧困層居住地区であるのに対し、ケーシーシーは1990年代より一気にスラム化がすすんだ地区である。特にケーシーシーに関する文献資料はほとんどなかったが、聞き取り調査によってその歴史や現状を明らかにすることができた。この調査によって、ナイロビの貧困層居住区における教会の状況、そして人びとが教会や牧師らとのかかわりによって、民族意識から脱却しようとする動きを明らかにした。またいずれの地域においても、ケニアにおける民族間の分断より社会経済階層格差の方がより深刻な問題であることが語られ、経済的な分断が一層強まっていることが明らかになった。平成27年度は長期の現地調査を行い、最終年度の論文執筆および研究発表に必要なデータを収集することが第一の重要項目であった。平成26年度はアフリカ全土へエボラ出血熱の感染拡大の危惧があり、現地調査が遂行できなかったが、平成27年度は計画どおり5月からケニアに滞在し、綿密な計画のもと調査を進めることができた。この目的を達成するために、(1)主調査対象のナイロビおよび地方都市/村における教会・教育機関での参与観察・聞き取り調査、(2)ケニア公文書館・ケニア法務省での資料収集・文献調査、(3)現地の提携大学における研究者との意見交換・情報収集、(4)成果発表を中心に研究活動を行った。(1)ナイロビ東部の4地区において、小規模ペンテコステ系教会での参与観察、牧師・教会関係者・信者への聞き取り調査を行った。この調査によって、ナイロビの貧困層居住区における教会の状況、民族意識から脱却しようとする動きを明らかにした。さらに民族間の分断より社会経済階層格差の方がより深刻な問題であることが語られ、経済的な分断が一層強まっていることが明らかになった。さらに、ナイロビで行った調査と同様の手法で、地方都市・村のマチャコス、ニャンダルア、メルーの三地域での参与観察、聞き取り調査を行った。(2)ケニア法務省にて保管されている全ての宗教機関に関するデータを収集し、それによってケニア全土における教会の分布や概要を把握することが可能になった。

(3)ケニヤッタ大学社会学部との提携を行い、当該学部の研究者と、ケニアにおける宗教的状況、ペンテコステ系教会の社会学的研究動向、宗教と国家意識の関連性に関する意見交換や情報収集を行った。(4)アフリカにおけるペンテコステ派教会に関する言説を理論的に分析した結果を、2015年度第3回「ケニア社会学会」にて口頭発表を行い、ケニアにおけるキリスト教文化の関係性に関して展開した論文を、関西学院大学キリスト教と文化研究センター編『現代文化とキリスト教』にて発行した。昨年度はアフリカ全土へエボラ出血熱の感染拡大の危惧があり、現地調査が遂行できなかったが、今年度は綿密な計画のもと調査を進めた。5月からケニアに滞在し、2期(5月から8月、9月から3月)に分けて調査を遂行した。第1期では、昨年度の短期調査によって基盤を築いたナイロビの都市における教会の調査を引き続き行い、さらに学校などの教育機関、若者の意識調査、貧困地域の家庭調査なども行った。第2期では、(1)ナイロビ市内での調査を続けながら、同時に東部・中央ケニアの地方都市および村での調査、(2)ケニア公文書館・法務省での文献収集を行った。村社会における宗教実践および国家意識に関する聞き取り調査によって、都市との比較につながるデータを多く収集することができ、ケニア法務省では、通常は開示されていない貴重なデータを収集することが可能となった。2期に分けた調査は、どちらも充分なデータ収集を行うことができた。本研究の目的は、ケニアの諸キリスト教が国家統合を助長する機能を果たしているという仮説をたて、現代ケニア社会では、民族中心主義が社会階層格差とどのように向き合っているのかを検討することにある。この目的を達成するために、当該年度は、(1)平成28年度までに収集したデータの整理、(2)現地調査の遂行、(3)海岸地方のキリスト教に関するデータの収集・整理、(4)総選挙に関する新聞資料の収集・整理、(5)研究会および学術誌における研究成果の発表、および今後の成果報告に向けた準備を中心に研究活動をおこなった。これまでのデータ整理後、平成28年7月9月、「国家と宗教の関係性」を強く示す事例である大統領選挙、並びにイスラム教が支配的な地域でのキリスト教のあり方に関する調査を遂行した。まず、2007年末から2008年初めにかけて起こった選挙後暴力(PEV)に関する国民の意識を調査するため、その被害者およびその暴力に関わった人びとへの聞き取り調査をおこなった。そして、第11回目の総選挙(2013年)の時期の国民意識を調査するため、教会における聞き取り調査をおこなった。これらの調査から、2007/8年の惨事を二度と繰り返さないように、過去を反省し、悔い改めることが、個人のみならず国家として求められていたことが明らかになった。平成28年度後半には、新聞調査をおこない、2007/8年の選挙後のメディアの反応、知識人らのオピニオンや一般市民からの投書などを重点的に収集した。市井の人びとが、2007/8年選挙後暴力の惨事をふまえ、今後の「国民」統合に向けた動向をキリスト教的価値観から見出そうとしているという調査結果を、Sociology Association(ケニア)にて口頭発表をおこない、ケニアにおけるキリスト教と文化の関係性にかんして展開した構想を、関西学院大学先端社会研究所発行『KG社会学批評』にて発表した。長期調査の継続して行う。
コバイモ類の種分化：花形態と系統の不一致の要因・独特な分布パターンの成因を探る

コバイモ類(以下、コバイモ節:Fritillaria sect. Japonica)は、ユリ科バイモ属の多年生草本で日本固有種のみから構成される。本節の植物は、3タイプの花形が認識されており、これらは分類形質としてよく用いられてきた。私たちの事前の調査により、3タイプの花形(筒形、広鐘形、傘形)はそれぞれ地理的にまとまる一方で、必ずしも系統を反映していない事が示唆された。コバイモ節の種分化には、地域間の昆虫相の違いや訪花昆虫の行動の違いが寄与したのかもしれない。そこで、本研究では、コバイモ節植物の種間と集団間の系統関係を明らかにし、得られた系統樹を基にして花形を含む形質進化の方向を明らかにする。また、訪花昆虫を調査して花形と訪花昆虫との関連性の解明を試み、花形態と系統が不一致となった生態的な要因と、その多様化した植物群の独特の分布パターンを成立させた要因について考える。初年度は、コバイモ類の種間の系統関係を明らかにするため、日本全国から収集したコバイモ節10種68個体について、葉緑体11領域(atpB-rbcL, atpF-H, petA-psbJ, psbA-trnH, rpl16, rps16, rpoB, rpoc1, trnL-F, trnS-G, trnG)の塩基配列を解析した。その結果、初めてコバイモ節全種を用いた分子系統樹が構築され、全種の系統関係が明らかになった。また、コバイモ節に2つの系統(染色体基本数がX=11とX=12の系統)が存在し、それぞれの系統に分かれた後に3タイプの花形が分化したことが明確になった。さらに、今まで雑種の可能性が示唆されたことのない種の中に単系統とならない種が複数見つかった。本研究では材料植物の収集が研究精度を左右する鍵となるが、共同研究者・研究協力者らの協力によって今年度までに各種の分布域を広くカバーするような材料収集ができた。また、葉緑体の塩基配列解析では、当初の計画以上に詳細な系統樹が得られ、いくつもの新知見が得られた。一方で、今年度は野外での訪花昆虫調査を本格的に行うことができなかった。よって、全体の評価としては上記区分となる。収集した材料植物について、核の塩基配列による分子系統樹を構築する。そして、得られた系統樹に形態形質を重ね合わせて形態進化の方向性を明らかにする。次に、次世代シーケンサー(MIG-seq)を用いて集団間のDNAのネットワーク図を構築し、コバイモ節のより詳細な系統関係を明らかにする。これにより、集団間の遺伝的交流の程度や、種内変異だと考えられている形態形質の系統的まとまりの有無を明らかにする。開花時期には訪花昆虫の観察を行ってデータの蓄積を行い、最終年度には、コバイモ類の系統関係、形態、訪花昆虫(送粉者、盗蜜者)の各情報を総合し、コバイモ類の花形と系統の不一致の要因と、独特な分布パターンの成因について考察する。本節は絶滅が危惧される植物種を多く含むため、保全にむけた分類学的整理を早急に行う。また、葉緑体の塩基

配列解析では、当初の計画以上に詳細な系統樹が得られ、いくつもの新知見が得られた。一方で、今年度は野外での訪花昆虫調査を本格的に行うことができなかった。よって、全体の評価としては上記区分となる。収集した材料植物について、核の塩基配列による分子系統樹を構築する。そして、得られた系統樹に形態形質を重ね合わせて形態進化の方向性を明らかにする。次に、次世代シーケンサー(MIG-seq)を用いて集団間のDNAのネットワーク図を構築し、コバイモ節のより詳細な系統関係を明らかにする。これにより、集団間の遺伝的交流の程度や、種内変異だと考えられている形態形質の系統的まとまりの有無を明らかにする。開花時期には訪花昆虫の観察を行ってデータの蓄積を行い、最終年度には、コバイモ類の系統関係、形態、訪花昆虫(送粉者、盗蜜者)の各情報を総合し、コバイモ類の花形と系統の不一致の要因と、独特な分布パターンの成因について考察する。本節は絶滅が危惧される植物種を多く含むため、保全にむけた分類学的整理を早急に行う。本植物の開花時期は年度をまたぐため、本格的な野外調査を2019年4月からとした。よって、野外調査は翌年度分として請求した助成金と合わせて実施する。
動物由来の生細胞内におけるタンパク質間相互作用の定量的解析

相互作用に関与する2種のタンパク質の発現量を、ペプチド核酸導入ペプチドを用いることにより自在に変化させることで、動物由来の生細胞内でのタンパク質同士の相互作用を詳細かつ定量的に解析できる系の構築を目指した。具体的には、新規タンパク質発現制御システムの構築、自己相互作用をモデルにした細胞内外における相互作用検出系の構築、高効率解析を実現するための細胞アレイの構築の三点の基盤的事項の確立に成功した。細胞内でタンパク質の相互作用を定量に解析できる技術は、試験管内よりもより正確な細胞内でのタンパク質の実際の相互作用や作用機序の把握につながる。そして、この知見をもとに細胞内タンパク質間ネットワークの制御や、成長・分化・細胞死といった細胞の生理的活動の調節などへの展開が期待できる。本研究では、目的の相互作用に関与する2種のタンパク質の発現量を、ペプチド核酸(PNA)導入ペプチドなどを用いることにより自在に変化させることで、動物由来の生細胞内でのタンパク質同士の相互作用を詳細かつ定量的に解析できる系の構築を試みる。本年度は、まず細胞内で複数種のターゲットタンパク質発現量を別々に制御できる系の構築を試みた。発現制御には、核酸に高次構造を取らせてその立体障害によって転写や翻訳を制御する、ペプチド核酸導入ペプチドを用いる新規の方法を検討した。具体的には、グアニンに富む核酸配列を四重鎖構造へ誘起させ、さらに特定の酵素の発現などの細胞内環境変化でその核酸構造を変化させる、PNA含有ペプチドの創製を行った。本ペプチドはグアニンPNAに富んだ配列により核酸の四重鎖形成を誘起させる部位と、プロテアーゼ基質配列部位から構成される。これにより、プロテアーゼ非存在下では本ペプチドは核酸の四重鎖構造形成を誘起し、プロテアーゼ存在下では本ペプチドが切断されてその構造誘起能を失うという核酸構造制御系の基礎が構築できた。今後、本成果を利用して実際に生体疑似環境などでの四重鎖構造制御が可能かどうかの検討や、細胞内などで発現制御が可能かどうかの検討を行っていき、細胞内での複数種のタンパク質の発現を制御できるシステムの確立を行う予定である。以上のシステムを確立することで、細胞内でのタンパク質相互作用解析に向けた基礎的技術の確立を目指す。細胞内でタンパク質の相互作用を定量的に解析できる技術は、試験管内よりもより正確な、細胞内でのタンパク質の実際の相互作用や作用機序の把握につながる。本研究では、目的の相互作用に関与する2種のタンパク質の発現量を、ペプチド核酸(PNA)導入ペプチドなどを用いることにより自在に変化させることで、動物由来の生細胞内でのタンパク質同士の相互作用を詳細かつ定量的に解析できる系の構築を目指す。本年度は、相互作用解析の第一段階として、動物細胞内でのアミロイドβペプチド(Abeta)の凝集をモデルとし、自己相互作用(1種のタンパク質の相互作用)の分布や凝集の度合いを解析できる系の構築を試みた。Abetaの凝集を検出できる蛍光・発光タンパク質融合Abetaを設計・合成し、これを用いて、自己相互作用の詳細解析を試みた。実際に本検出タンパク質を細胞外から添加することによる細胞の膜、近傍でのAbetaの凝集の様子や、本タンパク質を細胞内で発現させて内側でのAbetaの凝集の様子を観察し、Abetaの有無、凝集具合で蛍光や発光強度が変化することを見出した。以上の他に、多数の定量的データを一度に迅速に取得できるよう細胞アレイの構築も行った。今後、昨年度に構築したDNA四重鎖構造制御が可能なPNAペプチドを用いて、細胞内でAbetaの発現などを調節できる発現制御システムを構築し、細胞内や近傍でのAbetaの凝集の詳細解析を行う。さらに、以上を応用して、細胞内での複数種のタンパク質の発現を制御できるシステムの確立、および多量かつ迅速な解析が可能なアレイシステムの構築も行い、細胞内でのタンパク質相互作用解析の早期実現を目指していく。
酸性雨発生源対策としての石炭生物脱硫プラントの設計手法の開発

平成5年度に開始された本重点領域公募研究において,次の結果が得られた。(1)通常チオバチラス属細菌を用いた,石炭中の硫黄酸化溶脱反応では約2週間という長時間を要す硫黄化合物の除去が,吸着細菌による界面特性変化に基づく浮遊選別によって,分単位の滞留時間での操作で可能となることが確認できた。(2)この界面特性を変化させることのできる分離微生物はThiobacillus ferrooxidansと同定できた。(3)この微生物に硫黄化合物表面への特異的吸着能を与える物質は,細胞表層に形成される糖衣類似の層にあることが,シュウ酸洗浄細胞を用いた吸着実験等で明らかとなった。(4)吸着機能を与える層は,第二鉄イオン存在下で増殖した細胞のみに認められることが判明した。(5)微粉砕石炭および細菌吸着後の浮遊選別石炭の粒度分布から,排除限界情報を得た。以上,当初に計画した研究目的,研究計画・方法に対し,生物的な硫黄酸化溶脱反応で要する硫黄化合物の除去が,細菌吸着によって界面特性を変化させた後,浮遊選別することで,分単位の滞留時間での操作で可能となることを実証でき,そして,その機能物質同定のための生化学的検討が進められたことは,研究目的と合致した成果が得られた。
細胞内銅イオン輸送に関する構成論的理解への挑戦

銅イオンは必須微量金属の一つであり、タンパク質に結合することで各種の酵素活性の中心として機能している。一方で、遊離状態の銅イオンは活性酸素の発生を触媒することで毒性を発揮することがあるため、その細胞内動態は厳密に制御されねばならない。そこで本課題では、銅結合酵素であるSOD1への銅イオン輸送経路に着目し、細胞内での銅イオンの「流れ」を制御するメカニズムの解明を行った。特に、細胞内に銅イオンを取り込む輸送体であるCTR1と銅シャペロンCCSとの相互作用について解析を行い、SOD1への銅イオン供給を試験管内で再現することができるのかを検討することを最終的な目標として研究を進めた。本研究では、細胞内での銅イオン輸送について構成論的なアプローチによりその制御メカニズムの解明を試みるために、銅シャペロンのモデルとして出芽酵母由来のCCSタンパク質に着目した。CCSは銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ(SOD1)に銅イオンを輸送するタンパク質である。また、膜タンパク質であるCTR1は、C末端側に存在するドメイン(CTR1C)が細胞質側となるように膜上に配置されていることから、CTR1Cドメインが銅シャペロンとの相互作用を行う部位であると考え、出芽酵母由来のCTR1Cを作製・精製した。精製したCTR1CにCu+イオンを滴下したものの、銅結合型CTR1C(Cu-CTR1C)は得られなかった。CTR1Cは6つのシステイン残基を配位子として、4つのCu+イオンを結合することが示唆されている。しかし、電気泳動法による解析の結果、精製したCTR1Cのシステイン残基は酸化されてジスルフィド結合を形成し、多量体として存在していることが分かった。そこで、CTR1Cに形成したジスルフィド結合を効率よく還元する手法を確立し、得られた還元型CTR1CにCu+イオンを滴下すると、約4当量のCu+イオンを結合したCu-CTR1Cを作製できることが、分光学的手法により明らかとなった。Cu-CTR1CからCCSへの銅イオン移動は、既報に従い作製したアポ型のCCS(apo-CCS)とCu-CTR1Cを混合し、37 oCで1時間インキュベートすることで検討した。反応後、CCSとCTR1Cをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、CCSを含む分画について、タンパク質及び銅イオンの比色定量を行った結果、CCSは銅イオンを結合していることが分かった。Apo-CTR1Cとapo-CCSを混合した場合や、apo-CCSのみを用いた際には、銅イオンが検出されなかったことから、CTR1Cに結合したCu+イオンがCCSに移動したと考えられる。銅イオンは様々な酵素活性や電子伝達の中心として機能する必須微量金属であるが、毒性の高い活性酸素の発生源ともなりうることから、細胞内での銅イオン輸送は厳密に制御される必要がある。銅イオンは細胞膜に存在するトランスポーター(CTR1)によって細胞内へと運び込まれ、銅運搬タンパク質である銅シャペロンに渡されると考えられている。しかし、CTR1から銅シャペロンへと銅イオンが直接渡されることを示す実験的な証拠は未だに示されていない。そこで、CTR1および銅シャペロンを精製し、それら二つのタンパク質だけを用いることで銅イオンの移動を再現できるのか検討し、細胞内での銅イオン輸送について構成論的なアプローチによりその制御メカニズムの解明を試みた。そこで本研究では、銅シャペロンのモデルとして出芽酵母由来のCCSタンパク質に着目した。CCSはSOD1に銅イオンを輸送するタンパク質である。また、膜タンパク質であるCTR1は、C末端側に存在するドメイン(CTR1C)が細胞質側となるように膜上に配置されていることから、CTR1Cドメインが銅シャペロンとの相互作用を行う部位であると考え、CTR1Cを作製・精製した。精製したCTR1CにCu+イオンを滴下することで銅結合型CTR1C(Cu-CTR1C)を作製し、アポ型のCCS(apo-CCS)と混合した。その後、CCSとCTR1Cをサイズ排除クロマトグラフィーにより分離し、CCSを含む分画について、タンパク質及び銅イオンの比色定量を行った結果、CCSは銅イオンを結合していることが分かった。つまり、CTR1Cに結合したCu+イオンがCCSに移動したと考えられた。本研究の目的であるタンパク質間銅イオン輸送システムの試験管内再構築にあたり、CTR1C及びCCSタンパク質の作製・精製に成功し、両タンパク質を試験管内で混合するだけで銅イオンがCTR1CからCCSへと移動することが分かった。よって、本研究は概ね順調に遂行されたと言える。銅結合型CTR1Cとアポ型CCSを混合するだけで銅イオンがCCSに移動することが明らかとなったものの、両タンパク質間での銅イオン移動は、CTR1CとCCSが複合体を形成することで進行するのか明らかでない。

そこで、両タンパク質間での相互作用やリポソームを用いた再構成系の構築についてより詳細に検討を行う予定で、細胞質に存在する還元型グルタチオンなどのCu+イオンのキレーターの役割等についても解明を進めている。SOD1/CCS/CTR1タンパク質を、大腸菌を用いて作製し、各種のカラムクロマトグラフィーにより精製する予定である。よって、連携研究者・研究協力者を含め計5名がタンパク質作製・精製を行うために必要となる研究経費を、大腸菌培養関連試薬、及びタンパク質精製関連試薬として消耗品費に計上している。また、GFPとの融合タンパク質作製の際に行う遺伝子クローニングのための経費、リポソームを作製する際に使用するリン脂質の購入経費、及び油中水滴を利用したリポソーム作製に必要となるチャンバーの作製費用についても、消耗品費として計上している。また、本課題を通じて得られた成果を広く知らしめるために、国内外で開催されるできる限り多くの学会に積極的に参加し発表することを考えている。そのために、研究代表者・研究協力者ともに成果発表旅費が必要となる。
液体中の自由度間相関を記述する新しい粘性係数の測定とその分子論からのアプローチ

液体の一般的な物性値として熱伝導率、拡散係数、粘性などが知られている。これらは流体中の複数の分子が相互作用しながらミクロな運動量やエネルギーを輸送する過程を表す輸送係数である。本研究は、分子の回転と並進運動のカップリングを記述する新しい輸送係数「並進・配向結合粘性μ」を様々な種類の流体で測定する要素技術の開発を目的とする。さらに分子配向によって特徴付けられる液晶や生体膜構造について、並進・配向結合粘性を測定し、その形成にとって結合粘性が果たす役割を調べ,集団的な分子配向構造の形成メカニズムを探る。本年度は、新たに開発した表面波励起流動複屈折スペクトロスコピー法と高分解能光散乱法により、液晶系におけるずり・配向・結合の3つの独立な輸送係数を世界で始めて独立に決定することに成功した。それぞれの温度依存性から、各粘性機構の障壁エネルギーを算出することができた。さらにこれまでの我々の研究により明らかとなっているネマティック-等方相転移における結合パラメータの臨界異常について、その原因が回転-並進結合粘性にあることを明らかにした。また1MHz以上の高周波領域でずり運動モードと分子の回転の動的カプリングを計測する定在波超音波複屈折法を用いて、液晶系における配向緩和を自由度間結合の支店から直接観察することを試みた。付随する成果として、音波周波数帯域を数MHzにまで拡張し、液晶緩和の全スペクトルを観察することが可能になった。ミクロな配向秩序という新たな自由度を持った流体の運動を、配向と並進運動のカプリングまで考慮して記述する運動方程式には三つの輸送係数が現れる。ひとつは並進運動量の輸送係数であり、今ひとつは分子の回転のモーメントが周囲に拡散してゆく過程をあらわす回転粘性である。本年度の研究により、さらに回転・並進結合粘性の計測を可能にした。申請者らが考案した光スペクトロスコピー技術を偏光解消散乱測定という光学配置に置くことにより、熱的な分子運動が起源となって現れる試料中の自発的な分子配向ゆらぎの観察に成功した。得られるスペクトルは分子配向と並進運動が結合している場合の特徴を表しており、中央部の深さから規格化された結合パラメータ得られた。一方、上で述べた光散乱測定で得られるのは3つの粘性の比であり、すべての輸送係数の絶対値を決定するためには情報が不足している。そこで、申請者らが開発したもうひとつの回転・並進結合プロセスの観察手段を用いて、別の規格化パラメータを決定することにより、すべての輸送係数を定量的に決定することに成功した。
昆虫におけるオーキシン生合成酵素の分子進化とゴール形成能獲得の因果性の解明

研究代表者らはこれまでにゴール形成昆虫が植物ホルモンの1種であるオーキシンを自ら合成し,高濃度に体内に保有していることを明らかにしていた。また,昆虫における独自の生合成経路を提唱し,それに対する阻害剤の取得も行った。本研究では,阻害剤を用いたオーキシン生合成のゴール形成への関与の立証,生合成経路の再検討,生合成酵素の同定を行った。その結果,昆虫体液に阻害剤の作用をキャンセルする物質が含まれており,個体レベルでオーキシン生産を抑えることが困難なこと,生成速度と代謝速度の差から生合成中間体が蓄積しない理由,主要な変換を担う生合成酵素などを明らかにした。本研究は,昆虫における植物ホルモンであるオーキシン(活性本体:インドール酢酸,IAA)の生合成に関する理解を深め,ゴール形成昆虫が,ゴール形成にいかにIAA生合成能を活用したかを明らかにすることを目的としている。そのため,ゴール非形成昆虫であるカイコの絹糸腺におけるIAA生合成系の解明を基本とし,その知見をゴール形成昆虫であるハバチ等に活かすという研究アプローチを採っている。化合物ライブラリー探索したIAA生合成阻害剤IBI1を用いて,カイコやハバチの個体レベルでIAA内生量の低下を引き起こせるか,また,ハバチの生合成を阻害したときに,ゴール形成へ影響があるかについて調査した。その結果,カイコ体内への直接注入を含め,いずれの方法によっても内生量の有意な低下は認められなかった。また,ゴール内部への注入を通して,ハバチが摂食時にIBI1を取り込むことを期待し処理したが,ゴールのサイズ,内壁の厚みなど,いずれも有意な効果が得られ出来なかった。そこで,原因の究明を行ったところ,カイコの体液に検出されるIAA生合成はIBI1の阻害効果が弱いことが判明した。また,IBI1は酵素液と1晩反応後に殆ど検出されなくなること,さらにメタノール等に溶解しておくだけで,分解が進むことが判った。分解物は単一化合物ではなかったが,その中で比較的安定な分解物の構造を特定した。また,阻害剤非存在下では,1晩反応後にも酵素活性が残っている一方で,IBI1存在下では,IBI1は残存していないにもかかわらず,酵素活性は無くなっており,IBI1の分解物に阻害活性がある可能性や,IBI1の不安定性の故に酵素と不可逆的に反応して失活させている可能性等が考えられた。その他,生合成酵素の同定のための前段階として,トリプトファン(Trp)からの代謝経路をより詳しく調べた結果,Trpからインドールピルビン酸(IPA)を経てインドール乳酸(ILA)に至る変換経路を見いだした。阻害剤の利用によって,ゴール形成昆虫におけるIAA生合成の重要性を証明することが,本研究の1つの目的になっていたが,阻害剤の有効な活用法が見いだせなかった。一方で,阻害剤の安定性の低さが明らかとなったことで,軌道修正の可能性を見いだしている。また,IAA生合成酵素については,特にゴール形成昆虫における高いIAA生合成能に寄与していると思われるTrp→IAOxの変換を触媒する酵素活性の検出系が未だ確立できていない。すなわちTrpを投与した時に検出できるIAOx量がごく微量であり,IAOxの蓄積量を増やす条件を検討している。IBI1はIAOx→IAAの変換を阻害するが,IBI1によってIAOxが蓄積しないことから,TrpやIAOxから別の変換経路を想定して解析した結果,Trp→IPA→ILAが判明したが,酵素の同定のための条件が整った状況とは言えず,更に検討が必要である。本研究ではカイコをモデル系とした絹糸腺酵素液を用い,昆虫におけるオーキシン(活性本体はインドール酢酸,IAA)生合成系を解明し,生合成酵素の特定と,それに基づくゴール形成昆虫への分子進化の過程の解明や,生合成阻害剤の有効活用を目指している。既に昆虫におけるIAA生合成経路はトリプトファン(Trp)→インドールアセトアルドキシム(IAOx)→インドールアセトアルデヒド(IAAld)→IAAであることを示していたが,IAOxやIAAldが内生物質としても,あるいは上記経路の前駆体からの代謝物としても検出できないという問題点があった。それに対し,各前駆体からIAAを生成する見かけの酵素活性を測定することにより,各中間体の生成速度より代謝速度の方が早いと評価され,上記の説明を得るに至った。また,IAAld→IAAの変換の阻害剤IBI1の共存下で,TrpやIAOxを大量投与た場合にもIAAldが検出されなかったことから,IAAldからIAAに至らない別経路が存在すると推定し,IAAldの代謝物の同定を行った結果,インドールエタノール(IEtOH)が同定された。IAOxを投与した際,IBI1共存下で減少するIAAの生成量が,丁度IEtOHの増加分と一致し,IAAld→IAAの変換が,IBI1によってIAAld→IEtOHへ切り替わったことが判明した。また,この研究を通して,IAOxがIAA生合成における真のIAAld前駆体であることが証明された。一方,昨年度はIBI1が加水分解されて生じる分解物の1つを同定し,今年度はその対になる分解物を同定した。両者の活性を比較することによって,片方にIBI1とほぼ同等の阻害活性が検出され,阻害活性に必要な構造を単純化することが出来た。また,絹糸腺粗酵素で唯一生成物が確認できるIAAld→IAAの変換に関して,それを触媒する酵素を生化学的に精製,単離し,N末端配列の決定に成功した。

当該活性を有していることが妥当と思われる配列情報が得られている。IAA生合成過程に関しては,Trp, IAOx, IAAldからIAAへの変換効率の差から,生合成経路を推定し,また,IBI1がいずれの前駆体からのIAA生成をも阻害することに基づき,推定生合成経路が正しいことの傍証としていた。しかし,本推定経路を確実にすることが今後の研究を不安なく遂行する上で極めて重要であると考え,上記,各段階の酵素活性の評価と,中間体から分岐する代謝経路を確定することにより,中間体が検出できないという問題点に対する原因を特定し,不安要素を排除することが出来ると共に,仮説としていたIAA生合成の律速段階を明らかにすることが出来。本成果はもともと想定していなかった成果である。また,阻害剤の分解物を同定し,それにも強い活性があることを示したことは,今後,阻害剤を使用した基礎,および応用の両研究を進める上で重要な知見であり,本成果も想定外のものである。さらに,IAAld→IAAを触媒する酵素も特定できており,ゴール形成昆虫が高効率なオーキシン生産能の獲得に至った分子進化を明らかにする上で重要な前進である。本研究ではゴール形成昆虫の高いIAA生合成能の進化的獲得機構解明の基礎情報として,カイコをモデル系とし,5齢幼虫の絹糸腺を持ちいて,昆虫におけるオーキシン(インドール酢酸,IAA)生合成の機構の解明を進めてきた。その過程で,トリプトファン(Trp)→インドールアセトアルドキシム(IAOx)→インドールアセトアルデヒド(IAAld)→IAAの生合成経路を示した。この経路のうちIAOxやIAAldが中間体として見出されないという問題点に関しては,各前駆体からIAAへの見かけの変換速度をUnit/mlとして求めることにより,生成速度より代謝速度が速いことが原因であることを明らかにした。また,IAAld→IAAの変換を阻害する阻害剤IBI1存在下でもIAAldが蓄積しない原因として,IAAldのもう一つの代謝物としてインドールエタノール(IEtOH)を見出し,IBI1存在下ではIAAld→IAAからIAAld→IEtOHへの代謝の切り替えが起こっていることを見出した。さらに本年度は,IAAld→IAAを触媒する酵素を単離,同定した。本酵素の温度依存性,pH依存性,Km,Vmax等の性状を決定した。また,本酵素が触媒するステップは,カイコにおけるIAA生合成の律速段階ではないものの,本酵素のコファクター等の非酵素的な働きも含めると,本酵素単独でTrpやIAOxからIAAを生成することが出来ることを明らかにした。それと共に,それとは別に,Trp→IAOxを非酵素的に触媒する画分,IAOx→IAAを酵素酵素的に触媒する画分なども見出した。これらの反応を総合的に解析することによって,カイコにおけるIAA生産能を明らかにする必要がある。また,これらの情報をゴール形成昆虫に適用する事によって,ゴール形成昆虫における高いIAA生産能の仕組みについても解明を行いたい。研究代表者らはこれまでにゴール形成昆虫が植物ホルモンの1種であるオーキシンを自ら合成し,高濃度に体内に保有していることを明らかにしていた。また,昆虫における独自の生合成経路を提唱し,それに対する阻害剤の取得も行った。本研究では,阻害剤を用いたオーキシン生合成のゴール形成への関与の立証,生合成経路の再検討,生合成酵素の同定を行った。
L-myc遺伝子および変異型p53遺伝子のアポトーシス誘導に関する研究

癌抑制遺伝子p53およびmyc遺伝子ファミリーのアポトーシス誘導の相互作用を解析するためそれぞれの遺伝子の異常と臨床データとの比較,遺伝子導入による抗癌剤の感受性の比較を行うこととした。1)原発性肺非小細胞癌47例につきPCR-SSCP法をもちいてp53遺伝子変異の検出を試みた。12例(25.5%)に遺伝子変異を認め,うち3例は喫煙との関係が示唆されているG→Ttransversionであった。p53遺伝子の変異の有無とTNM各因子,組織型,予後のあいだに有意な相関は認められなかった。また化学療法を追加した症例の生存率に有意差は認められなかった。2)またp53遺伝子変異の免疫組織学的検討も増殖細胞核に発現するKi-67抗原の分析との比較を交えて行った。肺非小細胞癌切除例162例を対象として,変異型p53遺伝子による異常蛋白に対するDO-7抗体および増殖細胞核に発現するKi-67抗原に対するモノクローナル抗体MIB-1を用いて,切除した腫瘍の免疫組織化学染色を施行した。MIB-1,DO-7ともに陽性率は術後病理病期とは関連がみられなかったが,生存率との関係ではDO-7陽性例は絶対的および相対的治癒切除症例全体では有意に予後不良であった。さらにp53異常蛋白発現およびKi67抗原発現の両者の間には有意な相関がみられた(P<0.05)。3)遺伝子導入細胞実験実験を簡素化するために,cell lineより変異型p53遺伝子を有し,myc遺伝子の過剰発現がみられないものを選び出し,これに発現ベクターに組み込んだmyc遺伝子を導入,発現ベクターのみを組み込んだ細胞とetoposideに対する感受性の比較を行うこととした。ヒト肺癌cell line計7株につきp53遺伝子の変異を分析し,5株に遺伝子欠失を認めた。これらについてmyc遺伝子の過剰発現の有無をノザンブロッティングをもちいて解析中である。p53遺伝子のアポトーシス誘導能の臨床像への反映を評価するため臨床検体をもちいてp53遺伝子の解析を行った。非小細胞癌46例につきPCR-SSCP法にてp53遺伝子の変異の検出を試みた。9例に遺伝子変異を検出し,うち5例は術後に化学療法を受けている症例であったが,p53遺伝子変異を持たない症例と生存率とのあいだに有意差を認めなかった。(95年日本癌学会にて報告)また原発腫瘍と転移リンパ節それぞれから得られたDNAについてp53遺伝子変異を検討したが両者に明らかな差を認めずp53の変異と悪性度,転移に明らかな相関は得られなかった。(95年日本肺癌学会にて報告)今回得られたデータではp53遺伝子変異によるアポトーシス誘導能の低下を反映した臨床像,すなはち抗癌剤および放射線治療における効果の減少,生存率の低下という結果は得られなかった。小細胞癌の臨床検体を用いた研究については症例数の集積が十分で無く現在集積中である。培養細胞をもちいた基礎的実験に関してはp53遺伝子を有さないcell lineとしてH-358,K-562の二つを入手し、これらのcell lineに関するmyc遺伝子の発現の検討を行っているが、併行してエレクトロポレーションをもちいた遺伝子導入による実験が進行中である。

12例(25.5%)に遺伝子変異を認め,うち3例は喫煙との関係が示唆されているG→T transversionであった。p53遺伝子の変異の有無とTNM各因子組織型,予後のあいだに有意な相関は認められなかった。また化学療法を追加した症例の生存率に有意差は認められなかった。2)またp53遺伝子変異の免疫組織学的検討も増殖細胞核に発現するKi-67抗原の分析との比較を交えて行った。肺非小細胞癌切除例162例を対象として,変異型p53遺伝子による異常蛋白に対するDO-7抗体および増殖細胞核に発現するKi-67抗原に対するモノクローナル抗体MIB-1を用いて,切除した腫瘍の免疫組織化学染色を施工した。MIB-1,DO-7ともに陽性率は術後病理病期とは関連がみられなかったが,生存率との関係ではDO-7陽性例は絶対的および相対的治癒切除症例全体では有意に予後不良であった。さらにp53異常蛋白発現およびKi67抗原発現の両者の間には有意な相関がみられた(P<0.05)。3)遺伝子導入細胞実験実験を簡素化するために,cell lineより変異型p53遺伝子を有し,myc遺伝子の過剰発現がみられないものを選びだし,これに発現ベクターに組み込んだmyc遺伝子を導入,発現ベクターのみを組み込んだ細胞とetoposideに対する感受性の比較を行うこととした。ヒト肺癌cell line計7株につきp53遺伝子の変異を分析し,5株に遺伝子欠失を認めた。これらについてmyc遺伝子の過剰発現の有無をノザンブロッティングをもちいて解析中である。