hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線脳障害に対する抗HMGB1抗体を用いた新規治療法の開発

近年、転移性脳腫瘍患者の生命予後が延長してきており、脳腫瘍治療などに対する放射線治療が引き起こす高次機能障害などの遅発性有害事象が問題となっている。これらが脳梗塞などの脳障害に関与しているとして近年注目されているHMGB1の核外放出を引き起こしていると仮定した。本研究の目的はラット脳を用いて放射線照射後に生じる正常脳組織での放射線脳障害と、HMGB1の核外放出との関連性を明らかにするものであり、また、抗HMGB1抗体を用いて放射線脳障害の予防につながる治療法を模索するものである。平成30年度ではラット脳に対する放射線照射実験を繰り返し、一定の放射線量を照射することでHMGB1の核外放出が見られることが判明した。これまでに10Gy, 15Gy, 30Gyと照射量を変更し、6時間後、24時間後、48時間後と照射後の異なる時期での脳組織の評価を行った。その結果、照射後24時間後では線条体、歯状回を中心にHMGB1の核外放出が認められ、また、48時間後ではさらに皮質下において同様の減少が観察できた。平成29年度は大脳の片側の照射を行い、非照射側とその組織変化の違い、また、組織のサンプリングでのサイトカイン誘導の変化を観察するべく実験を行っていたが、動物の体動などによる問題で十分な実験結果を得ることができなかった。平成30年度ではその問題を克服するため、実験装置に工夫を加えて計画にそった放射線照射モデルを作成するための実験を行ったが、期待していたような実験結果を得ることはできなかった。転移性脳腫瘍に対する治療の一つとして放射線の全脳照射が行われている。近年、転移性脳腫瘍患者の生命予後が延長してきており、脳に対する放射線治療が引き起こす高次機能障害などの遅発性有害事象が問題となっている。このような放射線脳障害に種々の炎症性サイトカインの発現が関与していることは既に報告されており、これらが脳梗塞などの脳障害に関与しているとして近年注目されているHMGB1の核外放出を引き起こしていると仮定した。平成28年度はラットを用いて放射線照射モデルの作成を行った。まず放射線照射後にHMGB1の核外放出が見られることを確認するため、全脳への放射線照射を行った。放射線照射の強度、核外放出が見られる時期の模索を行った。その結果、効率的にその変化を観察できる放射線照射線量、時期を確認することができた。これらの実験と並行し、放射線照射の有無による違いをより明確に示すため、片側に限定した放射線照射モデルの作成を行った。平成29年度以降は上記の結果を元に、放射線照射を行った大脳皮質、白質において組織のサンプリングを追加し、Real-time PCRを用いて炎症性サイトカインの誘導を観察する予定である。また、抗HMGB1抗体を用いることでその核外放出を抑制することができるかについて検証を行う予定である。本年度はラット脳に対する放射線照射により、HMGB1の核外放出が起こりうることを確認し、適切な放射線量、また、免疫染色の時期について結果をえることができた。平成29年度は上記の結果を元に、放射線照射モデルでの実験を継続し、HMGB1の核外放出がまず基底核に生じ、その後数日で皮質においても生じていることが観察された。放射線照射により脳組織においてHMBG1の核外放出が生じ、また、その変化は部位により異なることが明らかとなった。HMGB1が脳内での放射線への感受性の違いに関係していることが示唆された。本年度はラット脳に対する放射線照射実験を繰り返し、一定の放射線量を照射することでHMGB1の核外放出が見られることが明らかとなり、更に、その部位が照射後の時間により異なっている事が明らかとなった。平成29年度は片側の脳照射による組織変化の違い、また、組織のサンプリングでのサイトカイン誘導の変化を観察するべく実験を行っていたが、動物の体動などによる問題で十分な実験結果を得ることができなかった為、実験はやや遅れている。

これらが脳梗塞などの脳障害に関与しているとして近年注目されているHMGB1の核外放出を引き起こしていると仮定した。本研究の目的はラット脳を用いて放射線照射後に生じる正常脳組織での放射線脳障害と、HMGB1の核外放出との関連性を明らかにするものであり、また、抗HMGB1抗体を用いて放射線脳障害の予防につながる治療法を模索するものである。平成30年度ではラット脳に対する放射線照射実験を繰り返し、一定の放射線量を照射することでHMGB1の核外放出が見られることが判明した。これまでに10Gy, 15Gy, 30Gyと照射量を変更し、6時間後、24時間後、48時間後と照射後の異なる時期での脳組織の評価を行った。その結果、照射後24時間後では線条体、歯状回を中心にHMGB1の核外放出が認められ、また、48時間後ではさらに皮質下において同様の減少が観察できた。平成29年度は大脳の片側の照射を行い、非照射側とその組織変化の違い、また、組織のサンプリングでのサイトカイン誘導の変化を観察するべく実験を行っていたが、動物の体動などによる問題で十分な実験結果を得ることができなかった。平成30年度ではその問題を克服するため、実験装置に工夫を加えて計画にそった放射線照射モデルを作成するための実験を行ったが、期待していたような実験結果を得ることはできなかった。平成29年度以降は上記の結果を元に、放射線照射を行った大脳皮質、白質において組織のサンプリングを追加し、Real-time PCRを用いて炎症性サイトカインの誘導を観察する予定である。また、抗HMGB1抗体を用いることでその核外放出を抑制することができるかについて検証を行う予定である。次年度は昨年度の実験結果をふまえ、動物の照射装置に改良を加える。そこで片側の照射を行い、困難であれば全脳照射モデルでの実験を継続することも検討する。本年度は施行できなかった炎症性サイトカインの誘導をreal-time PCRを用いて評価し、その変化を観察する。また、抗HMGB1抗体を投与したマウスでの放射線照射モデルを作成し、HMGB1核外放出の有無を観察しその効果を評価する予定である。試薬の使用量が予想よりも少なく、次年度使用額が生じた。実験計画の遅れにより、予定していた抗体や動物の購入、画像検査に要する費用などが使用されなかった。翌年度にそれらの費用を用いた実験を追加で行う予定である。引き続き実験動物や染色試薬の購入、飼育代に使用する予定である。また、実験器具の更新、PCRに用いる試薬等への使用を予定している。
非侵襲血糖値計測の信頼性改善を目的とした励起光が水信号へ及ぼす作用機序の解明

近赤外分光法に基づく非侵襲血糖値計測システムは、血中グルコース濃度が低く、かつ、グルコースと水の吸光スペクトルが重畳することに起因して両者を分離計測できないことから実用化に至っていない。これまでに、水の吸光ピークに対応した励起光(1450 nm)を計測光(1600 nm)に重畳することで、観測信号に占める水信号の割合を推定できる可能性を示してきた。本研究では、グルコース水溶液において、励起光強度に伴い計測光強度が上昇することを示した。この信号変化は、光による作用に加え、熱による作用であることを定量的に示し、これらを利用することで、観測信号からグルコース信号を正確に分離計測できる可能性を示した。近赤外分光法に基づく非侵襲血糖値計測システムの実用化は困難を極めている。これは、血中グルコース濃度が低く(溶媒となる生体水の濃度が高く)、かつ、グルコースと水の吸光スペクトルが重畳することに起因しており、両者を分離計測できないためである。本研究では、水の吸光ピークに対応した励起光(1450 nm)を観測光(1600 nm)に重畳しながら信号を検出することで、励起光照射が水信号の吸光度に及ぼす作用メカニズム(現象)を明らかにし、励起光照射により達成可能な水信号の分離効果を定量評価することで、1600 nmで観測された信号に占める水信号の割合を推定することを目的にしている。これまでの基礎実験では、励起光と観測光とを直交する方向からサンプルに試料に照射した場合の励起光照射の効果を評価してきたが、平成28年度は、励起光の照射効果を改善するために、励起光・観測光を光ファイバカプラで混合してサンプルに照射する光学系を構築し、励起光照射に伴う観測光(透過光)の変化を計測することを可能とした。また、励起光照射に伴う温度上昇等の物理現象がどの程度観測光の変化に寄与しているかを評価した。その結果、励起光強度に伴い観測光強度が変化し、数10%の変化が認められることが明らかになった。この作用メカニズムの一つとして、励起光による試料の温度上昇が考えられるが、水の吸光度の温度依存性、および、試料表面の温度上昇を評価した結果、その影響は観測光強度の変化に対して小さいことが示唆された。試料への励起光照射により、光の軌跡(ビームスポットの位置)の変化が認められているため、現在、軌跡が変化する要因について検討を続けている。また、励起光照射に伴う水の吸光スペクトル(1200 nm1700 nmの波長成分)の変化を把握する必要のあることが指摘されたため、観測システムの構築に着手した。平成28年度に予定していた、(1)光ファイバカプラによる励起光照射のための光学系を構築し、これを用いて観測光強度の変化を実験的に示したこと、(2)励起光照射に伴う温度上昇の影響を評価したことから、当初の目標をほぼ達成したと判断している。近赤外分光法に基づく非侵襲血糖値計測システムの実用化は、血中グルコース濃度が低く(溶媒となる生体水の濃度が高く)、かつ、グルコースと水の吸光スペクトルが重畳することから困難を極めている。本研究では、グルコースを検出するための観測光(1600 nm)と水の吸光ピークに対応した励起光(1450 nm)を同時照射することで引き起こされる吸光度変化のメカニズムを解明し、観測光として検出された信号から水信号成分の分離推定が可能かを明らかにすることを目的にしている。平成28年度までに実施した基礎実験から、励起光と観測光とを光ファイバカプラで混合して水溶液試料に照射した場合に数十パーセントの吸光度変化が示されたが、励起光照射に伴う観測光・励起光のビームスポット位置が変化する物理的な要因が明確にならなかったこと、また、励起光照射に伴う温度上昇に起因した吸光度変化をスペクトル変化として評価する必要のあることが示された。そこで平成29年度は、(1)励起光を観測光に対して平行、および、直交する方向から水溶液試料に照射した場合に、同一の光学検出系を用いて吸光度変化を計測可能なシステム、(2)近赤外分光装置に改良を加え、励起光照射に伴う吸光スペクトルの変化を観測可能なシステムを構築した。それぞれのシステムを用いた実験から、平行方向から励起光を照射した場合の方が、直交方向から水溶液試料に照射した場合に比べて吸光度変化がわずかに大きいこと、および、励起光エネルギーに起因した温度変化により、吸光スペクトルが数パーセント変化することを示した。さらに、平成28年度に認められた観測光・励起光のビームスポット位置の変化は、複合的な光学的要因に基づくことが明らかになり、個別要因の影響についてはより詳細な定量評価が必要であるものの、水信号分離に活用できるパラメータとなりうる可能性が示唆された。

この信号変化は、光による作用に加え、熱による作用であることを定量的に示し、これらを利用することで、観測信号からグルコース信号を正確に分離計測できる可能性を示した。平成28年度の実験により、励起光照射に伴う観測光の変化を観測するシステムを構築し、観測光強度が顕著に変化することを明らかにしたが、その作用メカニズムは明確になっていない。特に、励起光照射に伴う光の軌跡が変化する現象について、原因を究明する必要がある。この原因の一つとして励起光照射に伴う試料セル内の気泡状態の変化が疑われるため、寒天ファントム等を用いることで、気泡の影響が変化するかを評価するシステム、あるいは、励起光照射期間中の試料セル内の様子を可視化するシステムの構築を予定している。また、近赤外分光装置に改良を加え、励起光照射に伴う水の吸光スペクトル変化を観測可能とし、励起光エネルギーが吸光スペクトルに及ぼす影響を検討する。同時に、励起光照射による水の吸光スペクトルの変化を有効に利用し、水とグルコースとを高精度に分離するスペクトル処理手法を提案する。医用工学励起光照射に伴う吸光スペクトルを観測するための分光器オプション(光ファイバユニットFAP-754:日本分光、153,782円)に関して予算超過(残額20,195円)となったことから、該当品を学内予算で購入した。吸光スペクトルの観測には他の分光器オプションも必要となることから、残額を次年度へ繰越し購入費用に充当する。平成29年度予算は上記残額と合算して820,195円となるが、(1)分光器オプション(グルコース粉末計測用積分球)の購入費、(2)学会発表のための旅費等の支出を予定している。
高等教育を活性化する情報基礎教育の展開的研究

この研究ではXMLなどの最新技術を活用し「教材の融合」の実証的な研究を中心に行った。更に、XML自体を授業内容とする新しい情報教育について検討した。1.印刷教材やデジタル教材など多様な教材を、簡単な操作で参照や互いを関連付けた利用が可能な教材融合システムのプロトタイプ開発をおこなった。教材を識別する教材番号と参照する教材を指定する参照番号を入力して、印刷教材からホームページ教材を簡単に参照利用することができる。サーバがXMLファイルとして管理した情報をサーブレットで処理して実現している、この、管理情報は印刷教材をXMLて記述しXSLT変換し自動的に作成する。また、印刷教材はXSLて変換し作成する。このシステムの基本的機能を、テストプログラムを作成し技術的可能性を確認した。また、スタイルシートやDOMなど、XMLの関連技術を利用することで、比較的簡単にシステム化が可能なことが確かめられた。2.XMLマルチメディア技術を利用した教材の有効性とその作成について調べた。SVGを利用したサンプル教材を作成し、その可能性を確認した。今後、コンテンツの蓄積と再利用についての研究を進めることが必要と考え、その準備を進めている。3.リテラシー教育を中心とした基礎教育と発展的な教育との内容的なギャップは大きく、この間の橋渡しをする内容の教育が必要と考えられる。そこでリテラシー教育の展開を考えたXMLを題材とした教育の検討をおこなった。「インターネット社会を理解する1つの事例」,「プログラミング導入教育」の2つの観点から内容の検討をおこないモデル的な授業構成を考えた。今後、その詳細を検討し実際のコースウェア作成などへと研究を発展させることを考えている。
アポリポタンパク質による細胞内コレステロール搬出機構の解析

本研究はアポリポタンパク質によるHDL新生メカニズムをシグナル伝達系の面から解析し、この機序の分子的基礎を築くことを目的としている。今年度の研究により以下の結果が得られた。1.ヒトの線維芽細胞株WI-38において、apoA-IはABCA1のタンパク質レベルを上昇させたが、ABCA1のmRNAレベルは上昇させなかった。タンパク質合成を阻害してもapoA-IはABCA1のタンパク質レベルを上昇させたほか、ABCA1をRI標識してその分解を観察した結果、apoA-Iはその分解を抑制した。したがって、apoA-IはABCA1の分解を抑制し、その安定化を引き起こすことが明らかとなった。2.apoA-Iと同様、カルパイン阻害剤はABCA1の分解を抑制した。3.Protein kinase C (PKC)阻害剤はapoA-IによるABCA1の安定化を抑制し、apoA-I依存的な脂質の放出も抑制した。一方、PKC活性化剤はABCA1のタンパク質レベルを上昇させた。4.PC-PLCの阻害剤は、apoA-IによるABCA1の安定化とapoA-I依存的な脂質の放出を抑制した。5.WI-38にGFPを結合したPKCαを発現させ、その活性化を顕微鏡下で観察した。その結果、apoA-I刺激によってGFP-PKCαは細胞質から細胞膜などへ移動し、この移動はPKC阻害剤によって完全に抑制された。したがって、apoA-IがGFP-PKCαを活性化することが明らかになった。6.WI-38においてPKC活性化剤はABCA1のリン酸化を促進した。また、apoA-I刺激によってもABCA1のリン酸化は促進された。以上の結果より以下の結論を得た。apoA-Iは細胞と相互作用することでPC-PLCを介してPKCαを活性化し、この活性化によってABCA1の安定化とABCA1のリン酸化が誘導され、HDL新生反応が促進されることが示唆された。
現代アメリカ文学におけるポスト・ディザスターの修辞学

30年度は前年度と同様にアメリカ文学サバイバル研究会月例会でティム・オブライエンのヴェトナム戦争小説群に関する研究報告を重ねながら、それと並行して核をめぐる文学ー特に核とともにある現代の生のかたちーについて、オブライエンの核小説『ニュークリア・エイジ』の研究に集中した。この作品を読解するにあたって、2018年秋に共著『揺れ動く〈保守〉ー現代アメリカ文学と社会』で発表した論文「戯れるアトムとイヴーボビー・アン・メイスンの南部原発小説『アトミック・ロマンス』」のなかに著した持続する冷戦ノスタルジアと核の問題が有益な視点をもたらすこととなった。これにより、『ニュークリア・エイジ』のディザスター表象において「冷戦」「ベトナム問題」「家族」という三つの軸が極めて重要であることが分かった。活字となった業績は少なかったが、30年度は翌年度に向けてのいわばインプットの一年間であったと理解している。この期間に得られた知識や視点は、31年度の研究活動としてすでに決定している日本英文学会全国大会特別シンポジアム「核の時代と文学研究」におけるティム・オブライエン『ニュークリア・エイジ』論の準備にあたって有益な発見を与えてくれるものとなった。現在のところ、オブライエンがこの小説において描いた銃後の60年代が、実はベトナムという戦場と地続きであることが理解できた段階である。その他、ポストモダン小説にみられるディザスター表象の分野については、これまでに得た知見の一部を『英文學研究』第95巻に掲載された書評(「渡邉克昭著『楽園に死すーアメリカ的想像力と〈死〉のアポリア』」において間接的に反映している。核文学について調査に時間を要したため、30年度はティム・オブライエンに関する活字となった業績が日本英文学会『第90回大会Proceedings』(2018年)に寄せた「ホームへの帰還ーTim O'Brienのヴェトナム」のみという結果となった。しかし、31年度は日本英文学会全国大会において、オブライエンの作品群のなかでも異質であると考えられてきた〈核の時代〉に焦点を合わせた小説『ニュークリア・エイジ』について発表することが確定している。これをもとに論文を発表できる見込みである。今後はアメリカ文学サバイバル研究会での研究報告の頻度を高めるとともに、冷戦読書会にも積極的に参加することで冷戦期/ポスト冷戦期の問題を広い視野から眺め、課題の円滑な遂行に尽力したい。「戦後」表象の一環として、29年度はアメリカ文学サバイバル研究会月例会での定期的な研究発表の他、日本英文学会第70回九州支部大会における招待発表「ホームへの帰還ーTim O'Brienのヴェトナム」で、オブライエンのヴェトナム戦争小説すべてに共通して認められる「ホーム」という概念の諸層についてまとめることができた。この発表原稿は今後著書として発表予定であるオブライエン論における「戦後」表象の一部となる見込みである。また、朝鮮戦争を主題とした小説における「戦後」の描かれ方をヴェトナム戦争小説と比較検討するためにトニ・モリスン作『ホーム』を精読し、その一部を第66回冷戦読書会で発表した。ポスト9.11分野に関しては、これまでの活動によって得られた知見の一部を『アメリカ文学研究』第54号に掲載した書評(上岡伸雄著『テロと文学ー9.11後のアメリカと世界』)の中に反映した。ポスト・ディザスター表象における災害ナラティヴの領域では、『アメリカ文化事典』(丸善出版)に寄せた項目「ロードナラティブ」のなかでコーマック・マッカーシー作『ザ・ロード』を取り上げ、21世紀というグローバリゼーションの時代における災害のアメリカ的文化表象について論じた。さらに、30年度秋に刊行予定の共著『現代アメリカ文学における「保守」の諸層』に論文「戯れるアトムとイヴー南部原発小説としての『アトミック・ロマンス』」が掲載されることが確定している。これまで戦争や自然環境破壊の面から描かれることが多かったポスト・アポカリプスの主題に「労働」の側面をプラスしたという点から、この論文は3.11以後の現在の日本が抱える問題と共通項をもった<原発と労働>という着眼点をその特徴としている。口頭発表および活字業績二点ということで、一定の成果を出すことは出来た。平成29年度中に脱稿予定だったティム・オブライエン論の準備が進まず30年秋に完成見通しとなるというスケジュール上の遅れがあるが、これに関しては定期的にアメリカ文学サバイバル研究会を開催して準備を行う体制を整えているため、遅れを取り戻すことは可能である。この期間に得られた知識や視点は、31年度の研究活動としてすでに決定している日本英文学会全国大会特別シンポジアム

「核の時代と文学研究」におけるティム・オブライエン『ニュークリア・エイジ』論の準備にあたって有益な発見を与えてくれるものとなった。現在のところ、オブライエンがこの小説において描いた銃後の60年代が、実はベトナムという戦場と地続きであることが理解できた段階である。その他、ポストモダン小説にみられるディザスター表象の分野については、これまでに得た知見の一部を『英文學研究』第95巻に掲載された書評(「渡邉克昭著『楽園に死すーアメリカ的想像力と〈死〉のアポリア』」において間接的に反映している。核文学について調査に時間を要したため、30年度はティム・オブライエンに関する活字となった業績が日本英文学会『第90回大会Proceedings』(2018年)に寄せた「ホームへの帰還ーTim O'Brienのヴェトナム」のみという結果となった。しかし、31年度は日本英文学会全国大会において、オブライエンの作品群のなかでも異質であると考えられてきた〈核の時代〉に焦点を合わせた小説『ニュークリア・エイジ』について発表することが確定している。これをもとに論文を発表できる見込みである。本研究課題のための研究会(アメリカ文学サバイバル研究会)を定期的に開催し、同分野の研究者たちと意見交換を重ねることで、課題遂行に向けて努力するつもりである。今後はアメリカ文学サバイバル研究会での研究報告の頻度を高めるとともに、冷戦読書会にも積極的に参加することで冷戦期/ポスト冷戦期の問題を広い視野から眺め、課題の円滑な遂行に尽力したい。課題の進行状況からアメリカへの資料収集と書籍購入のための出張を延期したため。30年度以降に計画的に使用するつもりである。海外への資料収集を予定していたが実行できなかった。次年度はアメリカ出張を行うとともに、成果発表の場としてシンポジアム等を企画する予定である。
神経ペプチドの調節性分泌経路の素過程におけるＲａｂ３／２７の機能実体

RabファミリーGタンパク質は細胞の生存や機能維持に不可欠な膜輸送を制御している。中でもRab3とRab27は分泌型の調節性エキソサイトーシス制御の中心分子である。しかし、その分子機構については、Rab3やRab27の活性変化が膜融合のどのタイミングで起きるのかという決定的に重要な情報が欠けているために、その機能は不明の点が多い。本研究では新たにRab3とRab27のバイオセンサーを開発した。Rab3センサーとRab27センサーのダイナミックレンジはそれぞれ73.0%と106.3%であり、細胞イメージングに使用できる目安の数字を十分超えている。これらのセンサーを使用していくつかの新知見を得た。本研究の目的は、神経ペプチドなどの放出を司る調節性エキソサイト-シスの素過程の分子メカニズムの理解である。この経路で中心的な役割を果たす低分子量GTP結合蛋白質Rab3/27の機能実体の解明を目指し、その活性変化とエフェクター相互作用の時空間解析を試みる。平成25年度は、1. Rab3, Rab27のFRETバイオセンサーの高性能化, 2.開口放出時におけるRab3, Rab27の活性変化の解析を計画し、その通りに遂行した。Rab3, Rab27ともに、Ypet, SECFP,エフェクターの組み合わせをEVリンカーで繋いだことで、ライブイメージングにおいて十分にイメージング可能なFRETセンサーを構築することができた。また、両センサーともに不活性化因子GAP,活性化因子GEFに反応し、細胞内でRab活性を正確に反映すると考えられる。さらに、両センサーともに小胞局在を示し、内在性のRab3, Rab27の局在と一致していた。次に、調節性エキソサイトーシスを観察するために、細胞膜近傍のイベントを検出可能な全反射蛍光顕微鏡(TIRFM)のセットアップをおこなった。分泌細胞であるPC12細胞にYFPタグしたニューロペプチドY (NPY-YFP)を発現させ、TIRFMで観察したところ、脱分極に依存した放出を検出することができた。さらに、Rab3センサーも開口放出イベントへ動員されていることを確認し、活性変化のイメージングが可能であることが明らかとなった。今後は、Rab3に加え、Rab27のTIRFMを用いたFRETイメージングをおこない、活性変化のタイミングおよびエフェクターとの結合の変化を調べていく予定である。本研究の目的は、神経ペプチドの放出を司る“調節性エキソサイトーシス経路"の始点から終点までの素過程における分子機構の理解である。そのために、この経路で中心的な役割を果たす低分子量GTP結合蛋白質Rab3, Rab27の機能実体の解明を目指し、その活性変化とエフェクターとの相互作用の時空間解析を試みる。平成24年度は、「Rab3とRab27のFRETバイオセンサーの開発」,「神経ペプチドの有芯小胞へのローディングの分子機構」を計画し、その通りに遂行した。Rab3, Rab27のバイオセンサーは、Forster resonance energy transfer原理(FRET原理)に基づいてデザインし、ライブイメージング可能な高性能センサーの構築を目指した。まず、Rab3, Rab27のセンサーの候補を複数構築し、十分にイメージング可能な性能を持つセンサーを絞り込み、仕上げていった。構築したセンサーは、「1Rab分子の活性変化をモニターするのに十分なダイナミックレンジを持ち」,「2本来のRab3, Rab27の細胞内局在を反映し」,「3細胞内のRabの活性調節因子に反応する」といったRabのバイオセンサーの条件を満たす。これらセンサーを用いて、Rab3, Rab27の活性の時空間的解析が可能になると考えられる。次に、Rab3, Rab27のゴルジ体における神経ペプチドの有芯小胞へのローディングの分子機構の解明を試みた。Rab3, Rab27のセンサーは、活性化型のRab3, Rab27が核近傍ゴルジ領域で神経ペプチドであるニューロペプチドYと共局在しする可能性を示した。今後、このRab活性と、ニューロペプチドYの小胞へのローディングのタイミングを明らかにしていきたい。平成24年度は、最初に、Rab3, Rab27の活性をモニターするためのFRETバイオセンサーの構築を計画した。FRET原理に基づいたセンサーデザインをおこない、黄色蛍光蛋白質-ディテクタ-Rab分子-青色蛍光蛋白質から構成される一分子FRETセンサーを複数種類構築した。十分に生細胞観察可能なFRETセンサーの基準として、「1シグナルノイズ比が高いもの」,「2活性化に伴うFRET効率上昇が十分に高いもの」,「3細胞内局在が本来のRab3, Rab27と一致するもの」,「4活性化因子,不活性化因子により正確に活性調節されるもの」を設け、スクリーニングした。その結果、Rab3, Rab27のセンサーともに、14の条件を満たすセンサー候補を複数種類見出し、実際に細胞内でセンサーとして機能するように仕上げた。

今後は、作出したセンサーを微調整しながら、Rab3, Rab27の活性の時空間的解析をおこなっていく。次に、構築したセンサーを用いて、神経ペプチドの有芯小胞への分子機構の解析を試みた。まず、神経ペプチドの動態を観察するために、ニューロペプチドと赤色蛍光蛋白質の融合蛋白質(NPY-RFP)を構築した。Rab3, Rab27のセンサーは、ラット副腎髄質由来PC12細胞の核近傍ゴルジ領域で、活性化したRab3, Rab27を示し、これは、NPY-RFPと共局在していた。すなわち、Rab3, Rab27は、ゴルジ領域でNPY-RFPの有芯小胞へのローディングにおいて、役割を果たす可能性が示唆された。今後は、Rab3, Rab27の活性とNPYの詳細なダイナミクスを生細胞観察によって捉え、詳細な分子機構の解明に繋げていきたい。平成25年度は、構築したRab3, Rab27のセンサーを用いて、引き続き、「神経ペプチドの有芯小胞への分子機構の解析」,「有芯小胞のトラフィックの分子機構」,「開口放出におけるRab3, Rab27の役割」の3課題に取り組んでいくことを計画している。「有芯小胞のトラフィックの分子機構の解析」では、構築したRab3, Rab27センサーとNPY-RFPを含む有芯小胞がPC12細胞の突起先端に輸送される過程をイメージングする。まず、有芯小胞の移動の方向が変化する時のRab3, Rab27の活性変化を調べ、有芯小胞の動態におけるRab3, Rab27の役割を明らかにしたい。また、近年、小胞の細胞膜方向への輸送を担うRab3結合分子DENNが報告されたことから、DENNとRab3の活性変化のイメージングをおこなうことを計画している。すなわち、DENN-RFPとRab3センサーの共発現系を構築し、両者の局在の一致と、Rab3の活性変化の関係を明らかにし、正確な小胞の輸送機構の分子機構の解明を目指す。「開口放出におけるRab3, Rab27の役割の解析」では、Rab3, Rab27のセンサーを発現させたPC12細胞を全反射型蛍光顕微鏡(TIRFM)を用いてイメージングする。細胞膜近傍100 nmを観察できるTIRFM, FRRTイメージング,発現させたNPY-RFPを組み合わせ、「FRET + Red」のイメージングに挑み、開口放出過程のRab3, Rab27の正確な活性変化を明らかにする。また、Rab3, Rab27のエフェクターとRFP融合蛋白質を組み合わせてイメージングし、開口放出過程の正確な分子機構を明らかにしたいと考えている。本研究におけるFRETイメージングに必要な機器は、多波長の蛍光を測定するためのフィルターチェンジャーと高感度CCDカメラを全視野型および全反射型照明蛍光顕微鏡に装着したシステムである。申請者の所属研究室では、既にこのシステムが正確に稼動しており、データが十分に蓄積されてきている。また、遺伝子組換え・生化学実験や細胞培養を行う上で必要な施設・設備はすでに揃っている。
蒸気爆発に於ける圧力波の発生・伝播と機械的エネルギーへの転換特性

原子力発電の安全確保のための深層防護の観点から、万一の蒸気爆発における圧力波とエネルギー転換率の評価に資する目的でその基礎研究を行った。研究方法としては、鉛直に長い衝撃波管型試験部に高温溶融物プールを作り、上部を真空にし、その上部から膜破断により長さ約1mの水柱を落下させて熱的相互作用を起こし、慣性拘束状態での発生圧力を測定するとともに、上昇する水柱の運動速度を測定し、機械的エネルギーへの転換率を評価した。溶融物として今のところ、錫(融点232°C)及びアルミニウム(融点660°C)を使用して、200800°Cの温度範囲で実験を行っている。試験部の管内径を従来の31mmから42mmへとスケールアップを図って、実験を進めている。これまでの研究結果の概要は次の通りである。1)発生圧力はパルスピークが数10MPaに達するが、持続時間は1ms以下と短く機械的衝撃は小さい。機器に与える損傷は問題外である。時間積分であるインパルス(力積)で整理すると機械的エネルギーに対して比例関係がある。2)溶融錫温度が増すと、蓄積熱エネルギーが大きくなるので、機械的エネルギーは増すが、ある温度領域ではやや減少することがある。これは安定な蒸気膜が形成され緩和効果が働くためではないかと推測される。3)エネルギー転換率の溶融金属温度に対する依存性は、変動幅が大きく明確な傾向を見いだすことは困難だが、概ね1%前後かそれ以下に留まっている。4)アルミニウムについては、衝突速度が小さい間は固化の影響による温度しきい現象が見られるが、衝突速度が大きく混合がよくなると曖昧になる。今後は、圧力依存性、圧力伝播、外部圧力誘発による蒸気爆発を調べる。
ハイブリッド観察システムを用いたセラミックスのき裂発生過程の解明

研究期間の研究成果は,以下の通りである.(1)窒化ケイ素を対象として,実測した欠陥(介在物・空孔)寸法のばらつきの統計的性質と,欠陥から発生する微視き裂の進展挙動の実測値を用いて,モンテカルロシミュレーションを行い,曲げ強度,疲労寿命などを推定した.その結果,セラミックスの強度のばらつきの主要因は欠陥寸法のばらつきであることを再確認するとともに,疲労寿命のばらつきの多くは,き裂発生寿命のばらつきで説明できることなどを示した.(2)窒化ケイ素を対象として,欠陥(介在物・空孔)から自然発生する微視き裂の進展特性を,単調曲げ荷重下と静疲労荷重下で測定し,すでに得られている繰返し荷重下の結果と比較し,微視き裂に対する荷重繰返しの影響を調べた.その結果,微視き裂では,長いき裂とは異なり,荷重繰返しによるき裂進展の加速は顕著ではないことを示した.この現象を,荷重繰返しによるブリッジング摩耗で説明した.また,原子間力顕微鏡を用いて荷重繰返し途中の微視き裂を直接観察し,微視き裂においてもわずかであるが,ブリッジング摩耗が生じていることを示した.(3)セラミックスのき裂発生挙動を捉える目的で,物体が破壊する時に放出される「フラクトエミッション」に注目し,「光電子増倍管」を用いたフォトン計測システムを整備した.本システムを用いて,単調曲げ試験における発光を測定した結果,窒化ケイ素,アルミナともに,破断時には非常に多くのフォトンが放出され,この放出現象は破断後しばらくの間持続することがわかった.また,窒化ケイ素においては,破断前にもフォトンが漸増する現象が観察された.予き裂材を用いた実験の結果,この漸増現象は,き裂の安定成長に起因する現象であることがわかった.(4)セラミックスなどのぜい性材料の二軸応力下における微小き裂の成長挙動を観察するための,「その場観察用二軸応力負荷試験機」を製作し,ガラスの混合モード(モードI+モードII)下におけるき裂進展試験を行った.その結果,モードIIではき裂進展下限界が消失することや,繰返し混合モード下では,き裂はみかけ上,最大せん断応力方向へ進展することなどを示した.本年度の研究実績は,以下の通りである.(1)次年度以降で,セラミックスの製造欠陥から成長するき裂の発生段階を検出できるよう,フラクトエミッション計測に必要な機器を購入し,整備した.(2)次年度以降で,セラミックスの製造欠陥から成長するき裂の発生までの段階で蓄積されているであろう微視的損傷を検出できるように,原子間力顕微鏡を購入し,測定システムを整備した.(3)常圧焼結窒化ケイ素を用いて,単調増加荷重下と静荷重下で,製造欠陥から自然発生する微視き裂の成長挙動を観察した.その結果,単調増加荷重下と静荷重下の場合も,微視き裂は長いき裂と異なる特徴的な進展挙動を示すことを明らかにした.また,微視き裂の揚合,荷重繰返しの影響は受けにくいことを見出し,き裂面内に存在する架橋粒子量の違いで説明付くことを示した.(4)破壊の起点となる製造欠陥の寸法の確率分布特性と微視き裂の進展挙動を用いて,モンテカルロシミュレーションを行い,き裂発生寿命を予測した.研究期間の研究成果は,以下の通りである.(1)窒化ケイ素を対象として,実測した欠陥(介在物・空孔)寸法のばらつきの統計的性質と,欠陥から発生する微視き裂の進展挙動の実測値を用いて,モンテカルロシミュレーションを行い,曲げ強度,疲労寿命などを推定した.その結果,セラミックスの強度のばらつきの主要因は欠陥寸法のばらつきであることを再確認するとともに,疲労寿命のばらつきの多くは,き裂発生寿命のばらつきで説明できることなどを示した.(2)窒化ケイ素を対象として,欠陥(介在物・空孔)から自然発生する微視き裂の進展特性を,単調曲げ荷重下と静疲労荷重下で測定し,すでに得られている繰返し荷重下の結果と比較し,微視き裂に対する荷重繰返しの影響を調べた.その結果,微視き裂では,長いき裂とは異なり,荷重繰返しによるき裂進展の加速は顕著ではないことを示した.この現象を,荷重繰返しによるブリッジング摩耗で説明した.また,原子間力顕微鏡を用いて荷重繰返し途中の微視き裂を直接観察し,微視き裂においてもわずかであるが,ブリッジング摩耗が生じていることを示した.(3)セラミックスのき裂発生挙動を捉える目的で,物体が破壊する時に放出される「フラクトエミッション」に注目し,「光電子増倍管」を用いたフォトン計測システムを整備した.本システムを用いて,単調曲げ試験における発光を測定した結果,窒化ケイ素,アルミナともに,破断時には非常に多くのフォトンが放出され,この放出現象は破断後しばらくの間持続することがわかった.また,窒化ケイ素においては,破断前にもフォトンが漸増する現象が観察された.予き裂材を用いた実験の結果,この漸増現象は,き裂の安定成長に起因する現象であることがわかった.(4)セラミックスなどのぜい性材料の二軸応力下における微小き裂の成長挙動を観察するための,「その場観察用二軸応力負荷試験機」を製作し,ガラスの混合モード(モードI+モードII)下におけるき裂進展試験を行った.

その結果,モードIIではき裂進展下限界が消失することや,繰返し混合モード下では,き裂はみかけ上,最大せん断応力方向へ進展することなどを示した.本年度の研究実績は,以下の通りである.(1)次年度以降で,セラミックスの製造欠陥から成長するき裂の発生段階を検出できるよう,フラクトエミッション計測系を整備し,予備実験を始めた.(2)セラミックスの製造欠陥から成長するき裂の発生までの段階で蓄積されているであろう微視的損傷を検出できるように,原子間力顕微鏡の下で静疲労試験を行いながら,試験片表面をその場観察するための実験システムを整備した.このシステムを用いて,最大1000時間までのき裂発生源(介在物)周辺の微視的表面損傷を計測した.その結果,静疲労下では,原子間力顕微鏡で検出可能な損傷の蓄積は無いことがわかった.(3)レーザー顕微鏡式その場観察システムを用いて,窒化ケイ素セラミックスの製造欠陥(介在物)から微視き裂(長さ20ミクロン程度以下)を発生させ,そのき裂に最大10000サイクルまでの繰返し応力を負荷し,繰返し応力負荷前後の微視き裂の様相の違いを,原子間力顕微鏡式その場観察システムで観察した.その結果,局所的ではあるが,応力繰返し数の増加とともに,摩耗粉のようなものが堆積していくのが観察された.本年度の研究実績は,以下の通りである.(1)光電子増倍を用いて,セラミックスの破断および破断に至る過程におけるフォトンエミッションを検出できるように,暗箱内で4点曲げを負荷できる装置を製作した.(2)(1)の装置を用いて,アルミナと窒化ケイ素を用いた4点曲げ試験を行い,破断時に,非常に大きなフォトンエミッションを検出した.このフォトンエミッションは,試験片破断後もしばらくの間放出されることもわかった.(3)窒化ケイ素の場合,破断に至るまでの負荷応力約300MPa以上の領域でも,フォトンエミッションの漸増が観察された.製造欠陥からの微視発生と何らかの関係があると思われるため,次年度では,レーザー顕微鏡および原子間力顕微鏡を用いたき裂発生の観察をすすめる.(4)繰返し混合モード下におけるセラミックスのき裂発生研究のための試験機の改造と,ガラスを用いた予備実験を行った.その結果,単調混合モードにおけるき裂は,最大主応力に対して垂直(モードI)方向に発生するが,繰返し混合モード下ではみかけ上,主せん断応力(モードII)方向に発生する場合のあることがわかった.本年度の研究実績は,以下の通りである.(1)光電子増倍を用いた,セラミックスの破断および破断に至る過程におけるフォトンエミッションをリアルタイムで計測し,パソコンへ取り込めるように,フォトンエミッション計測システムに改良を加えた.(2)(1)の装置を用いて,アルミナと窒化ケイ素を用いた4点曲げ試験を行い,破断の前駆現象である「き裂発生」に伴うフォトンエミッションの検出を試みた.(3)窒化ケイ素の場合,破断に至るまでの負荷応力約300MPa以上の領域でも,フォトンエミッションの漸増が観察された.製造欠陥周辺を原子間力顕微鏡で詳細に観察し,フォトンエミッション検出前後で何らかの差異生じていないかを検討したが,「き裂」の明確な痕跡は観察できなかった.なおアルミナでは,フォトンエミッションの漸増は観察されなかった.(4)き裂発生・成長とフォトンエミッションの関係を明確にするために,窒化ケイ素とアルミナ試験片にビッカース予き裂を導入し,このき裂を安定成長させたときのフォトン数を計測した.その結果,窒化ケイ素では,き裂が1ミクロン成長する時に平均して1個のフォトンが放出されることがわかった.一方,アルミナでは,予き裂材においてもフォトンエミッションは計測されなかった.
実験動物種の食品成分の応答性の違いを利用したトランスクリプトーム解析に関する研究

本研究では、in vivo実験において共役リノール酸摂取に対して脂肪細胞が逆向き(分化亢進とアポトーシス誘導)の応答を示したZucker(fa/fa)ラットとdb/dbマウスについて、共役リノール酸という刺激に対して応答する遺伝子群について発現プロファイリングを行う。AIN76に順じたコントロール食(6%Cornoil)もしくは共役リノール酸食(5%Corn oil+1%10tc-CLA)を4週間摂食させ、飼育終了後に大動脈採血により屠殺を行い、血液・肝臓・脂肪組織を得た。その結果、腎臓周辺白色脂肪組織重量は共役リノール酸食により、db/dbマウスでは劇的に減少し、Zucker(fa/fa)ラットでは増加した。また、肝臓トリグリセリド濃度は共役リノール酸食により、db/dbマウスでは劇的に上昇し、Zucker(fa/fa)ラットでは低下した。さらにホルマリン固定した肝臓組織の薄切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色により病理組織評価を行ったところ、Zucker(fa/fa)ラットでは組織中の脂肪滴蓄積が抑制されていることが確認された。以上のことから、db/dbマウスでは脂肪細胞のアポトーシスが誘導されて肝臓のインスリン抵抗性誘発脂肪肝が発症し、Zucker(fa/fa)ラットでは脂肪細胞の分化亢進と肝臓のインスリン抵抗性誘発脂肪肝が改善した事が示唆された。現在、共役リノール酸摂取に対する応答が逆を向いている脂肪組織及び肝臓を用いて、RAP-PCR DDによる発現プロファイリングを行っており、変動遺伝子のクローニングと塩基配列の同定を行っている。本研究では、in vivo実験において共役リノール酸摂取に対して脂肪細胞が逆向き(分化亢進とアポトーシス誘導)の応答を示したZucker(fa/fa)ラットとC57BL/6Jマウスについて、共役リノール酸という刺激に対して応答する遺伝子群について発現プロファイリングを行う。そこでそれぞれから初代培養前駆白色脂肪細胞を調整し、アルブミンと結合させた共役リノール酸を培地に添加して培養した。C57BL/6Jマウス由来白色脂肪細胞は、共役リノール酸添加培地で培養することにより、アディポサイトカインである"レプチン"及び"アディポネクチン"の分泌が顕著に抑制され、共役リノール酸による脂肪細胞の分化抑制が誘導されていることが示唆された。一方、Zucker(fa/fa)ラット由来白色脂肪細胞は、成熟脂肪細胞になると培養セルへの定着が弱くなりin vitro実験に使用できないことが判明した。よって、培養細胞系での発現プロファイリングを断念し、in vivo実験系において共役リノール酸を摂取させ、脂肪細胞における応答の違いを評価することとした。対象には保有する遺伝子変異がほぼ同等(レプチンレセプター変異による2型糖尿病モデル)であるdb/dbマウスとZucker(fa/fa)ラットを用いた。AIN76に順じたコントロール食(6% Corn oil)もしくは共役リノール酸食(5% Corn oil+1% 10tc-CLA)を4週間摂食させ、飼育終了後に大動脈採血により屠殺を行い、血液・肝臓・脂肪組織を得た。このことは、db/dbマウスで脂肪細胞のアポトーシスが誘導され、Zucker(fa/fa)ラットでは脂肪細胞の分化亢進が起きた事を示唆した。このことは、db/dbマウスで肝臓のインスリン抵抗性誘発脂肪肝が発症し、Zucker(fa/fa)ラットでは肝臓のインスリン抵抗性誘発脂肪肝が改善した事を示唆した。以上のことから、共役リノール酸摂取に対する応答が逆を向いている組織サンプルをマウスとラットから得ることができ、今後これらを用いて、発現プロファイリングを行っていく予定である。

現在、共役リノール酸摂取に対する応答が逆を向いている脂肪組織及び肝臓を用いて、RAP-PCR DDによる発現プロファイリングを行っており、変動遺伝子のクローニングと塩基配列の同定を行っている。
骨組織・細胞の適応的メカニカルストレス応答の観察と力学構造形成手法への応用

骨組織の適応的な再構築過程における力学環境変化の影響を明らかにするため,その素過程である細胞の活動に着目し,力学環境の変化が細胞活動に与える影響について検討した.特に,骨芽細胞内の細胞骨格アクチンフィラメントや細胞内カルシウムイオン濃度の変化は,他の様々な細胞内シグナリングカスケードの上流に位置しており,骨形成過程において重要な働きをしている.細胞が力学的刺激を感知する機構の中でも,特に力学的刺激を細胞内部へと伝達する経路において重要な役割を果たしていると考えられているアクチンファイバーが,細胞内において配向した特徴的な構造を有していることに着目し,この構造的特徴が,力学的刺激の伝達機能に対して影響を与えているとの仮説の下で実験を行った.まず,サイトカラシンを用いて細胞内アクチンフィラメント構造を調整し,アクチン量の異なる細胞に対して,マイクロニードルを用いて変形を与えた結果,細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された.さらに,同じ刺激に対して,アクチンの量に応じてその応答確率が上昇することが示された.次に,カルシウム蛍光指示薬であるFluo4とFura Redを用いたレシオメトリー法により,力学刺激に対する細胞内カルシウム濃度変化の定量的測定方法について検討した.また,観察領域を限定することにより,細胞のカルシウム応答を0.3秒間隔で追従することが可能となった.マイクロピペットの押し込みに対して,本手法を用いて細胞内カルシウム応答を観察したところ,ピペットの押し込み方向に対して,上流からカルシウムイオンが上昇し,それが細胞内に伝播していく様子が観察された.これらの結果は,分子レベルの複雑な微細構造からなる細胞内力学システム系における力学刺激感知能力を規範とする,新しいメカノセンサーメカニズムの開発へ向けた基礎的な考え方を与えるものと考えられる.また,骨の再生やリモデリングによる骨の構造形成過程における,骨芽細胞の活動に及ぼす力学的刺激の影響を探る基礎となるものである.力学環境の変化に対する骨組織の適応的な再構築のメカニズムを明らかにするために,その素過程である細胞の活動に着目し,力学環境の変化が細胞の活動に与える影響について検討した.特に,力学的刺激に対する骨芽細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は,他の様々な細胞内シグナリングカスケードの上流に位置しているため,骨形成過程において重要な働きをしている.本研究では,細胞が力学的刺激を感知するための機構の中でも,特に力学的刺激を細胞内部へと伝達する経路において重要な役割を果たしていると考えられているアクチンファイバーが,細胞内において配向した特徴的な構造を有していることに着目し,この構造的特徴が,力学的刺激の伝達機能に対して影響を与えているとの仮説の下,実験を行った.単一の骨芽細胞に対して,マイクロニードルを用いて,その大きさと方向を制御した定量的な変形を与え,力学的刺激に対する細胞応答として細胞内カルシウムイオン濃度の変化を観察した.マイクロニードルを用いて,骨芽細胞に変形を与えた実験の結果,細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察され,力学的刺激に対して,骨芽細胞が応答を示すことを確認した.また,骨芽細胞が応答を示す変形の大きさに閾値が存在し,骨芽細胞は,比較的微小な変形に対して応答を示さず,ある値を超えた変形を与えた場合に応答を示す結果を得た.さらに,変形を与える方向を変化させた場合,変形を与える方向と,応答を示す細胞の割合との間に有意な正の相関が認められることを示した.このように,本研究の結果より,力学的刺激に対する骨芽細胞の応答特性において,刺激の閾値およびその方向依存性の存在を示しており,骨芽細胞の力学的刺激伝達メカニズムに対する重要な知見を得ている.さらにこれらの結果は,分子レベルの複雑な微細構造からなる細胞内力学システム系における力学刺激感知能力を規範とする,新しいメカノセンサーメカニズムの開発へ向けた基礎的な考え方を与えるものと考えられる.また,骨の再生やリモデリングによる骨の構造形成過程における,骨芽細胞の活動に及ぼす力学的刺激の影響を探る基礎となるものである.骨組織の適応的な再構築過程における力学環境変化の影響を明らかにするため,その素過程である細胞の活動に着目し,力学環境の変化が細胞活動に与える影響について検討した.特に,骨芽細胞内の細胞骨格アクチンフィラメントや細胞内カルシウムイオン濃度の変化は,他の様々な細胞内シグナリングカスケードの上流に位置しており,骨形成過程において重要な働きをしている.細胞が力学的刺激を感知する機構の中でも,特に力学的刺激を細胞内部へと伝達する経路において重要な役割を果たしていると考えられているアクチンファイバーが,細胞内において配向した特徴的な構造を有していることに着目し,この構造的特徴が,力学的刺激の伝達機能に対して影響を与えているとの仮説の下で実験を行った.まず,サイトカラシンを用いて細胞内アクチンフィラメント構造を調整し,アクチン量の異なる細胞に対して,マイクロニードルを用いて変形を与えた結果,細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が観察された.さらに,同じ刺激に対して,アクチンの量に応じてその応答確率が上昇することが示された.次に,カルシウム蛍光指示薬であるFluo4とFura Redを用いたレシオメトリー法により,力学刺激に対する細胞内カルシウム濃度変化の定量的測定方法について検討した.また,観察領域を限定することにより,細胞のカルシウム応答を0.3秒間隔で追従することが可能となった.マイクロピペットの押し込みに対して,本手法を用いて細胞内カルシウム応答を観察したところ,ピペットの押し込み方向に対して,上流からカルシウムイオンが上昇し,それが細胞内に伝播していく様子が観察された.

これらの結果は,分子レベルの複雑な微細構造からなる細胞内力学システム系における力学刺激感知能力を規範とする,新しいメカノセンサーメカニズムの開発へ向けた基礎的な考え方を与えるものと考えられる.また,骨の再生やリモデリングによる骨の構造形成過程における,骨芽細胞の活動に及ぼす力学的刺激の影響を探る基礎となるものである.
環境感覚を支える植物液胞動態とその適応機構

温度、必須栄養素のリン酸、病虫害応答において、細胞膜、単膜系オルガネラ、構成タンパク質、代謝物質や無機イオン類が、これらの外部環境の変化に対して変動する分子機構を解析した。1.セントポーリアの葉で温度降下時に生じる柵状細胞の傷害が、機械感受性イオンチャンネルによるCa2+の流入と、それによる液胞膜の崩壊が原因であることを明らかにした。2.シロイヌナズナ根の異なるリン濃度での応答過程の解析を行った。ポプラが落葉時に枝にリン回収物質としてフィチン酸を貯めることを明らかにした。3.病虫害応答に働くミロシン細胞の分化過程と、光や重力応答にアクチン・ミオシン系が重要であることを明らかにした。細胞内環境の維持と変動は、細胞内で生じるあらゆる生理機能の基盤的要素であり、無機イオン・代謝物質やタンパク質の濃度・分布として捉えることができる。本研究では、温度、塩ストレス時の水・イオン環境、必須栄養素のリン酸への応答、さらに病原体や共生微生物に着目し、細胞膜、および小胞体から液胞につながる単膜系オルガネラの構成要素である膜構造、構成タンパク質、あるいは低分子量代謝物質や無機イオン類が、これらの外部環境の変化に対してどのように変動するかを明らかにし、その分子機構を解析することを目的とした。平成22年度の研究成果として、1.アフリカ原産のセントポーリアの葉で、柵状組織の細胞において急激な温度降下により、傷害の初期に柵状組織の細胞質pHが下降し、液胞内pHが上昇することと、その時間経過を明らかにした。また、細胞内pHが変化すると同時に、液胞が変形していることを示す結果も得た。2.低リン環境で生育したシロイヌナズナ根が高リン環境に遭遇した際のリン応答解析系の確立を進めた。3.アブラナ科植物は、葉のミロシン細胞の液胞に集積したミロシナーゼの働きにより、食害部位で病害虫の忌避物質を生産する。小胞体由来のERボディに大量のβグルコシダーゼ(PYK10)を蓄積し、PYK10が根に大量に蓄積されているindolyl glucosinolate(I3G)に対して分解活性をもち、ミロシナーゼとして機能していることが分かった。平成23年度の研究成果として、1.アフリカ原産のセントポーリアの葉で、急激な温度降下により生じる柵状細胞の傷害が液胞膜の破壊によることを明らかにし、さらにそれに関わるタンパク質組成の変動を調べた。また単離細胞系の確立を試みた。2.低リン環境で生育したシロイヌナズナ根が高リン環境に遭遇した際に短時間で発現する遺伝子を複数見出した。また、ポプラが落葉時にリンを回収する機構についても解析を進め、冬季に幹に有機リン酸化合物が貯蔵されることが明らかになった。ミロシン細胞は、維管束細胞に隣接して分布しているが、葉原基から両細胞はそれぞれ協調して分化することが分かった。この協調的分化は、液胞型SNARE依存的なエンドサイトーシスにより制御されていた。また、非病原性バクテリアの感染応答にもエンドサートーシスが関与していた。一方、光や重力などの環境刺激に対する屈性反応の調節を植物特異的なミオシンが行っていることも明らかとなった。平成24年度の研究成果として、1.アフリカ原産のセントポーリアの葉で、柵状組織の細胞において急激な温度降下により液胞膜が崩壊して酸性の液胞内容物が漏出し、細胞死に至るという傷害メカニズムを見出し、細胞外のCaイオンが温度傷害の引き金になることを明らかにした。また、大量の柵状細胞の単離が難しかったことから、葉組織を用いて馴化過程のプロテオーム解析を進めた。2.低リン環境で生育したシロイヌナズナ根が高リン環境に遭遇した際のリン応答遺伝子発現解析を行い、高リン処理後10分30分で発現する遺伝子を複数見出した。この遺伝子のプロモーター領域にレポーター遺伝子をつなぎ、リン酸応答過程の解析を始め、実際リン添加に伴い、レポーター遺伝子の発現を確認した。