hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メラノーマを用いた腫瘍内抑制性T細胞と神経系細胞網とのシナプスに関する研究

がんを含めた種々の病態の形成過程を検討する上で重要だと考えらるTreg細胞や胸腺外分化型γδT細胞が、どのように神経組織とネットワークを形成しているかを検討した。以前から知られているTreg細胞またはγδT細胞マーカー分子の他に、3種(R1,R68,Y5)のヒトおよびマウス新規細胞表面分子を同定し、それらに対するポリクローン抗体または単クローン抗体を作製し、それら抗体と神経系細胞マーカー(GFAPやβIIItubulinなど)抗体を用いたメラノーマ組織やリンパ系組織の切片の染色による検討を行った。1)Treg細胞及び胸腺外分化型γδT細胞特異的ボリクローン抗体または単クローン抗体の作製CD4+CD25+T細胞(マウス、ヒト)と胸腺外分化型γδT細胞(マウス)のcDNAを用いたサブトラクション法で同定したR1,R68,Y5分子の抗原性の高い20アミノ酸程度の遺伝子領域を増幅させ、それをpDisplayベクターに挿入後BALB/c3T3(3T3)またはCOS細胞株へ導入し、それぞれの分子の一部のタンパク質を細胞表面に発現させた遺伝子導入細胞株を作製した(ヒト遺伝子導入細胞株を3T3hR1,3T3hR68,3T3hY5、マウス遺伝子導入細胞株をCOSmR1,COSmR68,COSmY5と命名した)。3T3hR1,3T3hR68,3T3hY5細胞株はBALB/cマウスに、COSmR1,COSmR68,COSmY5細胞株はラットに免疫することによって、それぞれの分子に特異的なポリクローン抗体を作製した。それぞれの細胞株で免疫された動物脾細胞をP3-X63ミエローマと融合することによりハイブリドーマを作製し、それぞれの分子特異的な単クローン抗体を現在作製中である(分子的に単クローン抗体作製が非常に困難を極め、あらゆる可能性の検討を行っている)。2)メラノー組織またはリンパ系組織切片のTreg細胞または胸腺外分化型γδT細胞特異的ポリクローン抗体と神経系細胞マーカの二重染色による検討B6マウスの皮下にB16細胞を移植した後、1,2,3,4週目の腫瘍、脾臓、腫瘍近傍リンパ節を採取し、それぞれの凍結切片を作製した。またヒトメラノーマ組織の凍結切片を作製した。それぞれの切片をR1,R68,Y5特異的抗体と抗神経細胞抗体(GFAPやβIIItubulin特異的抗体)との二重染色を行った結果、脾臓繊維膜近傍とリンパ関門付近で神経細胞とTreg細胞の接触が低頻度で観察されたが、メラノーマ組織内でそのような像は観察されなかった。今後は腫瘍ばかりでなく、アレルギーモデルマウスや自己免疫モデルマウスを用いても検討する予定である。

今後は腫瘍ばかりでなく、アレルギーモデルマウスや自己免疫モデルマウスを用いても検討する予定である。がんを含めた種々の疾患形成と関連し、疾患形成過程を検討する上で重要だと考えられているTreg細胞や胸腺外分化型γδT細胞が、どのように神経組織とのネットワークを形成するかを検討するためには、CD25,CTLA-4,GITR,foxp3など以前から知られているTreg細胞優位分子の他に、CD225やEDG1など、サブトラクション法にて我々が同定したヒトおよびマウスTreg細胞やγδT細胞に発現する新規細胞表面8分子に対するポリクローン抗体や単クローン抗体を作製し、それを用いた抑制性細胞の詳細な動態検出システムを構築する必要がある。そこで、今年度はそれら新規8分子の細胞外領域に特異的な抗体の作製を行った。1)ヒトTreg細胞およびマウス胸腺外分化型γδT細胞から目的遺伝子のクローニングB6ヌードマウスより、抗γδTCRmAbを用いて胸腺外分化型γδT細胞分離した。CD4陽性CD25強陽性のヒトTreg細胞をビーズを用いた分離法で分離した。それぞれの細胞からcDNAプールを作製し、目的遺伝子を特異的プライモーを用いたPCR法により増幅させ、増幅サンプルを精製後pRc/CMVベクターに組み込みDH5αを用いて大腸菌によるクローニングを行った。2)目的遺伝子導入動物細胞株の作製1)でクローニングしたそれぞれの目的遺伝子と発現確認用CD271遺伝子を含むpRc/CMVベクターを作製し、L929細胞にリポフェクション法で導入した。それぞれの目的遺伝子の発現は、CD271のフローサイトメトリーによる解析で確認し、CD271を用いたセレクション法により長期にわたり目的遺伝子を安定に発現させる細胞株を樹立した。3)ヒトTreg細胞およびマウス胸腺外分化型γδT細胞に発現する細胞表面分子に特異的なポリクローン抗体および単クローン抗体の作製ヒトTreg細胞表面分子であればBALB/cマウスを用いて、またマウスγδT細胞表面分子に関してはハムスターを用いてそれぞれの分子に特異的なポリクローン抗体及を作製し、その免疫動物脾細胞とミエローマの融合により単クローン抗体の作製を行った。免疫法は2週間おきに三回、1)で作製した目的遺伝子挿入プラスミドの腹部と尾の皮下への投与によるDNA免疫を行い、最終DNA免疫から2週間後に2)で作製した目的遺伝子導入L929細胞株の腹腔内投与する方法を用いた。最終の投与から3?5日後の血清を目的遺伝子特異的ポリクローン抗体精製に、脾臓を単クローン抗体作製に用いた。がんを含めた種々の病態の形成過程を検討する上で重要だと考えられるTreg細胞や胸腺外分化型γδT細胞が、どのように神経組織とネットワークを形成しているかを検討した。以前から知られているTreg細胞またはγδT細胞マーカー分子の他に、3種(R1,R68,Y5)のヒトおよびマウス新規細胞表面分子を同定し、それらに対するポリクローン抗体または単クローン抗体を作製し、それら抗体と神経系細胞マーカー(GFAPやβIII tubulinなど)抗体を用いたメラノーマ組織やリンパ系組織の切片の染色による検討を行った。1)Treg細胞及び胸腺外分化型γδT細胞特異的ポリクローン抗体または単クローン抗体の作製CD4+CD25+T細胞(マウス、ヒト)と胸腺外分化型γδT
自己免疫疾患におけるNF-κBを介したT細胞活性化機構の解析

自己免疫疾患の発症機序の一つとしてT細胞の恒常性機能の逸脱による末梢のT細胞トレランスの破綻が病態を大きく左右することが知られている。T細胞の活性化に転写因子であるNF-_kBが中心的な役割を果たすことが知られているが、自己免疫疾患との関わりは不明である。本研究では各種自己免疫疾患モデル、NF-_kB各サブセットの遺伝子欠損マウスを中心にして末梢T細胞の活性化段階におけるNF-_kB各サブセットの機能的役割を明らかにし、さらにヒト患者検体を用いた詳細な検討により、自己免疫疾患発症におけるNF-_kBを介した分子機序を解明し、病因論に基づいた臨床応用の可能性を探ることを目的とする。18年度に自己免疫疾患モデル、NF-_kB遺伝子欠損マウスを用いNon-classical NF-_kB経路(NF-_kB2/Re1B)がT細胞の活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにし、NF-_kBk2分子直接NF-_kB1分子に結合することでT細胞の活性化を抑制することを見いだした(Nat Immuno1, 7 2006)。その結果を踏まえNF-_kB2分子がいかにclassical NF-kB_k経路を調節しているかを分子間の結合様式など詳細な機序を解明し、さらにNF-_kB2を調節する因子であるシグナル分子(PKC, PKB, RANKL, Bc1-10, Foxj1, NEMO, NIK, IKK, I_kBなど)を中心に細胞内での動態を検討した結果、NIKがナイーブT細胞の活性化に重要な役割を果たしていることが判明した。また、シェーグレン症候群や炎症性疾患のモデル動物を用いて、NF-_kBを介した病態形成メカニズムが明らかとなり、今後のNF-kBの活性化機構に基づいた臨床応用の可能性が示された。免疫調節の中心的役割を担っているT細胞はT細胞受容体(TCR)及び副刺激分子を介したシグナル伝達により活性化、増殖、細胞死が決定される。T細胞の活性化の中心となる分子であるNuclear Factor κB(NF-κB)のサブセットにはNF-κB1(p50/p105),NF-κB2(p52/p100),RelA,RelB,c-Relがありそれぞれのホモ及びヘテロダイマーが核内移行し、標的遺伝子のκB領域を介して転写調節が行われる。NF-κBの役割は炎症だけでなく発生、発癌など広い分野で多くの知見が見いだされているが、自己免疫とNF-κBの関係はよく知られていない。本研究の目的は末梢T細胞の活性化殺階におけるNF-κB各サブセットの機能的役割を明らかにし、自己免疫疾患の発症におけるNF-κBの役割を検討することである。平成17年度はNF-κB及び関連分子のノックアウト、ミュータントマウス(p50^<-/->、NIK^<-/->,RelB^<-/->,aly/alyマウス)を中心に末梢CD4陽性T細胞の活性化におけるNF-κBの動態を検討したところ、NF-κB1/RelAを介した古典的経路をNF-κB2/RelBを介した非古典的経路が調節していることが判明した。特に、p100(NF-κB2)がT細胞の細胞質にてNF-κB1/RelA複合体に直接結合することにより、NF-κB1/RelAの核内移行を抑制していることが明らかとなり、非古典的NF-κB経路に障害があるとナイーブT細胞はTCRを介した反応がより増強されることが示された(投稿準備中)。さらに、自己免疫疾患のモデルとしても知られているaly/alyマウスを用い、非古典的NF-κB経路の障害による自己免疫疾患の発症機序を詳細に検討した(投稿準備中)。また、各種自己免疫疾患モデルマウス(MRL/lpr,NOD,NFS/sld)を用い、NF-κBの動態を詳細に進めている。さらに、ヒト自己免疫疾患患者の末梢血及び組織検体を用いたNF-κBと病態発症との関係を解析する準備を行っている。T細胞の活性化の中心となる分子であるNuclear Factor κB(NF-κB)のサブセットにはNF-κB1(p50/p105),NF-κB2(p52/p100),RelA, RelB, c-Relがありそれぞれのホモ及びヘテロダイマーが核内移行し、標的遺伝子のκB領域を介して転写調節が行われる。本研究の目的は末梢T細胞の活性化段階におけるNFκB各サブセットの機能的役割を明らかにし、自己免疫疾患の発症におけるNF-κBの役割を検討することである。平成17、18年度はNF-κB及び関連分子のノックアウト、ミュータントマウスを中心に末梢CD4陽性T細胞の活性化におけるNF-κBの動態を検討したところ、NF-κB1/RelAを介した古典的経路をNF-κB2/RelBを介した非古典的経路が調節していることが判明した。

特に、p100(NF-κB2)がT細胞の細胞質にてNF-κB1/RelA複合体に直接結合することにより、NF-κB1/RelAの核内移行を抑制していることが明らかとなり、非古典的NF-κB経路に障害があるとナイーブT細胞はTCRを介した反応がより増強されることが示された。さらに、自己免疫疾患のモデルとしても知られているaly/alyマウスを用い、非古典的NF-κB経路の障害による自己免疫疾患の発症機序を詳細に検討した(Nat Immunol,7:763-772,2006)。また、関節リウマチのモデルマウスであるMRL/1prを用いRANKLシグナルからNF-κBを介し樹状細胞の過剰活性によるT紳胞の自己免疫反応への影響を明らかにした(Blood印刷中,2007)。今後、各種自己免疫疾患モデルを用い、ヒト自己免疫疾患患者の末梢血及び組織検体を用いたNF-κBと病態発症との関係を解析中である。自己免疫疾患の発症機序の一つとしてT細胞の恒常性機能の逸脱による末梢のT細胞トレランスの破綻が病態を大きく左右することが知られている。T細胞の活性化に転写因子であるNF-_kBが中心的な役割を果たすことが知られているが、自己免疫疾患との関わりは不明である。本研究では各種自己免疫疾患モデル、NF-_kB各サブセットの遺伝子欠損マウスを中心にして末梢T細胞の活性化段階におけるNF-_kB各サブセットの機能的役割を明らかにし、さらにヒト患者検体を用いた詳細な検討により、自己免疫疾患発症におけるNF-_kBを介した分子機序を解明し、病因論に基づいた臨床応用の可能性を探ることを目的とする。18年度に自己免疫疾患モデル、NF-_kB遺伝子欠損マウスを用いNon-classical NF-_kB経路(NF-_kB2/Re1B)がT細胞の活性化に重要な役割を果たしていることを明らかにし、NF-_kBk2分子直接NF-_kB1分子に結合することでT細胞の活性化を抑制することを見いだした(Nat Immuno1, 7 2006)。その結果を踏まえNF-_kB2分子がいかにclassical NF-kB_k経路を調節しているかを分子間の結合様式など詳細な機序を解明し、さらにNF-_kB2を調節する因子であるシグナル分子(PKC, PKB, RANKL, Bc1-10, Foxj1, NEMO, NIK, IKK, I_kBなど)を中心に細胞内での動態を検討した結果、NIKがナイーブT細胞の活性化に重要な役割を果たしていることが判明した。また、シェーグレン症候群や炎症性疾患のモデル動物を用いて、NF-_kBを介した病態形成メカニズムが明らかとなり、今後のNF-kBの活性化機構に基づいた臨床応用の可能性が示された。
条件付親告罪制度からみた刑事訴追に対する公益と犯罪被害者の権利の限界

ドイツ刑法典等に規定されている条件付親告罪制度は、原則は被害者等の告訴がなければ刑事訴追できないが、例外として検察庁が「刑事訴追に対する特別な公益」があると認めると告訴がなくても刑事訴追できる制度である。本研究では、この概念を素材に、刑事司法において「公益」概念の果たす役割および犯罪被害者の権利の本質と限界を探った。性犯罪は、親台罪よりも非親告罪の方が適切であるが、非親告罪よりも適切な選択肢として、条件付親告罪制度(または条件付異議申立制度)を検討すべきである。著作権等侵害罪は、ドイツの条件付親告罪制度とドイツ語圏各国で導入している「業として」行う場合の処罰規定等を参考にすべきである。ドイツ刑法典等に規定されている条件付親告罪制度は,原則は被害者等の告訴がなければ刑事訴追できないが,例外として検察庁が「刑事訴追に対する特別な公益(das besondere oeffentliche Interesse an der Strafverfolgung)」があると認めると告訴がなくても刑事訴追できる制度である。本研究では,この「刑事訴追に対する特別な公益」概念を素材に,刑事司法において「公益」概念の果たす役割および犯罪被害者の権利の本質と限界を探ることを目的としている。平成26年度は,平成27年3月末からドイツでの長期在外研究が内定していたため,文献の検討を中心として理論的基礎を固めるとともに,翌年度以降の現地実態調査に向けた予備調査を行った。まず,理論的基礎として,わが国のすべての親告罪を検討した拙著『告訴権・親告罪に関する研究』(平成19年)を基礎にして,わが国の親告罪制度をめぐる議論を再度整理した上で,拙稿「ドイツにおける条件付親告罪の構造と問題点」法律論叢77巻4・5合併号(平成17年)59頁以下を基軸に据えて,ドイツ刑法典に規定された主要な条件付親告罪について,立法理由・学説・判例を整理・分析した。また,予備調査として,平成26年9月に,ドイツにおいて検察官にインタビュー調査を実施した。さらに,「明治大学知的財産法政策研究所(IPLPI)シンポジウム」(平成27年3月)の「著作権・表現の自由・刑事罰」/「第二部著作権と刑事罰」のパネルディスカッションにおいて,著作権法における親告罪の非親告罪化の議論との関係で,本研究の成果の一部として,ドイツ著作権法の条件付親告罪制度について言及した。平成27年度は,明治大学長期在外研究員としてドイツに滞在していることを活用して,全般的な資料収集・分析および理論・実務の実態調査のほかに,主として下記のような研究活動に力点を置いた。1わが国で性犯罪の非親告罪化の議論が進行しているため,ドイツの性犯罪における条件付親告罪について,その立法理由・学説・判例の整理・分析を行い,法律論叢88巻6号(平成28年3月)で,論説として,拙稿「ドイツの性犯罪における条件付親告罪規定ーわが国の性犯罪は非親告罪化するしか道はないのかー」を公表した。2条件付親告罪の理論的基礎および運用実態について,実務家・研究者等に対して予備的聞取調査・意見交換を行った。また,検察官による「刑事訴追に対する特別な公益」の認定について,ドイツ各地の裁判所において条件付親告罪の裁判傍聴等を行い,その実態の比較調査・検討を行った。3 TPPとの関連で非親告罪化が議論されているわが国の著作権法における著作権侵害罪について,条件付親告罪が規定されているドイツの著作権法に検討対象を拡げ,論文執筆に着手した。明治大学長期在外研究員として滞在しているドイツにおいて実務家・研究者等に対して詳細なインタビュー調査を実施する予定であったが,やむを得ない事情により研究協力者(予定者)の協力を得ることができなかったため,調査を実施することができなかった。ドイツ刑法典等に規定されている条件付親告罪制度は,原則は被害者等の告訴がなければ刑事訴追できないが,例外として検察庁が「刑事訴追に対する特別な公益」があると認めると告訴がなくても刑事訴追できる制度である。平成28年度は,明治大学長期在外研究員としてドイツに滞在していることを活用して,全般的な資料収集・分析および理論・実務の実態調査のほかに,主として下記のような研究活動に力点を置いた。

1 TPP協定との関係でわが国で著作権等侵害罪の一部非親告罪化が進められていたため,ドイツの著作権法違反およびその他の知的財産法違反における条件付親告罪について,その立法理由・学説・実務等の分析を行い,法律論叢89巻6号(平成29年3月)で,論説として,拙稿「親告罪・私人訴追犯罪・職権訴追犯罪としての著作権法違反(1)ーTPPをめぐる著作権等侵害罪の一部非親告罪化の動きを踏まえたドイツ・スイス・オーストリア・リヒテンシュタインとの比較法制史的考察ー」を公表した。2条件付親告罪の理論的基礎および運用実態について,実務家・研究者等に対して聞取調査・意見交換を行った。また,検察官による「刑事訴追に対する特別な公益」の認定について,ドイツ各地の裁判所において条件付親告罪の裁判傍聴等を行い,その実態の比較調査・検討を行った。3スイス法の親告罪制度に調査対象を拡げ,法学新報123巻9・10号(平成29年3月)で,論説として,拙稿「スイス刑事訴訟法・少年刑事訴訟法における親告罪和解協議召喚制度ー損害回復協議勧奨制度及び少年刑事調停制度との比較も踏まえた修復的司法としての親告罪論ー」を公表した。明治大学長期在外研究員として滞在しているドイツにおいて実務家・研究者等に対して詳細なインタビュー調査を幅広く実施する予定であったが,やむを得ない事情により研究協力者(予定者)の協力を得ることができなかったため,調査を十分には実施することができなかった。他方で,研究対象をドイツ語圏の他の国々(スイス,オーストリア,リヒテンシュタイン)の親告罪制度に拡げたことで,ドイツの条件付親告罪制度における公益と犯罪被害者の権利・利益の問題が,他の国の法制度でこれまでどのように位置づけられ,処理されてきたのかという,比較法制史的研究へと大きく発展させることができた。ドイツ刑法典等に規定されている条件付親告罪制度は,原則は被害者等の告訴がなければ刑事訴追できないが,例外として検察庁が「刑事訴追に対する特別な公益」があると認めると告訴がなくても刑事訴追できる制度である。本研究では,この「刑事訴追に対する特別な公益」概念を素材に,刑事司法において「公益」概念の果たす役割および犯罪被害者の権利の本質と限界を探ることを目的としている。本研究課題の最終年度である平成29年度は,これまでに収集された資料等に基づいて全体的な理論・実務等を分析・整理し,論文等として公表することに力点を置いた。平成29年度中に執筆・公刊された研究成果の概要は下記とおりである。1オーストリア法の刑事訴追制度に調査対象を拡げ,同法における刑事訴追に対する公益の概念をドイツ法におけるそれとの比較を考慮して考察し,論説として,「オーストリアの刑事訴追制度についての予備的考察」を公表した。本論説では,著作権法における一部非親告罪化,条件付起訴猶予制度,オーストリアの親告罪制度を検討するための,オーストリアの刑事訴追制度についての予備的考察として,刑事訴追制度の大きな枠組み,職権主義・国家訴追主義とそれを修正する諸制度,起訴法定主義とそれを修正する諸制度を検討した。オーストリアに特徴的な制度として,検察官訴追と捜査が排除される「私人訴追犯罪」,裁判官の関与しない検察庁による「ダイヴァージョン」がある。2ドイツの条件付親告罪制度とドイツ語圏諸国における類似の制度を検討する中で,より広くそれぞれの国の刑事訴追制度における検察官の関与の在り方に関する検討を行う機会があり,本研究課題から見れば派生的な研究成果ではあるが,論説として,「検察官による訴追段階のダイバージョンにおける賦課・遵守事項と福祉的措置ードイツ語圏4ヶ国との比較法的観点から」を公表した。ドイツ刑法典等に規定されている条件付親告罪制度は、原則は被害者等の告訴がなければ刑事訴追できないが、例外として検察庁が「刑事訴追に対する特別な公益」があると認めると告訴がなくても刑事訴追できる制度である。
肝細胞癌の転移機構と転移促進分子の解析

pore sige13μmのケモタキスフィルターに再構築基底膜ゲル50mgを被覆し、上室に培養肝癌細胞(HuH-7,PLC/PRF/5)を播種してフィルター下面への癌細胞の通過能をIn vitroの転移能モデルとした。両培養肝癌細胞ともそれ自身ではフィルターの通過能力は認められなかった。一方、基底膜ゲル通過能が確認されているマウスメラノーマ株B_<16>を上室に播種したところ、細胞は基底膜ゲルを溶解しながら浸潤する像が認められた。そこで、上室の肝細胞培養上清にB_<16>メラノーマ培養上清を添加すると肝癌細胞に基底膜通過能力が発現され、細胞形態も突起様変化が生じることが確認された2)転移促進分子の解析B_<16>メラノーマと肝癌細胞培養上清中のIV型コラーゲン分解酵素活性を検討すると,B_<16>とPLC/PRF/5の上清中に酵素活性が認められたが、その大部分はAPMA添加により活性化される不活性型のものであった。B_<16>メラノーマ培養上清をSephacryl 200でゲル濾過して分子量を検討したところ、この転移促進分子は分子量約37KDであった。このことより、この分子はautocrine motility factor,IV型コラーゲン分解酵素やbasic FGFとは異なることが明らかになった。3)肝細胞癌の機能的診断本研究をIn vivoに還元する為には、生検材料を生細胞のまゝ診断することが必要となる。そこで肝癌細胞がIndocyanine green(ICG)を取り込まない点に着目して、ICG静注後肝生検法を考案した。この方法によると、ICGの取込みがない組織は95%以上が肝癌で、ICG取り込みの消失は細胞内リガンディンである(Glutathione S-transferase αの減少と有意な相関があることを明らかにした。pore sige 13μmのケモタキスフィルターに再構築基底膜ゲル50mgを被覆し、上室に培養肝癌細胞(HuH-7,PLC/PRF/5)を播種してフィルター下面への癌細胞の通過能をIn vitroの転移能モデルとした。1.メラノ-マ培養上清並びに上清添加後の肝細胞癌培養上清での各種蛋白分解酵素活性の測定とその阻害剤を用いた転移阻止実験:再構築基底膜をバリア-としたInvasion chamberを用いて培養肝細胞癌株(HuHー7,PLC/PRF/5)の転移能の検討したところ、それ自身では転移能は極めて低いが、In vivoで極めて強い転移能を示し、再構築基底膜を容易に通過するB16メラノ-マ培養上清の添加により肝細胞癌株の転移能が増強される事実を発見した。そこで、メラノ-マ培養上清中の転移と最も関連するIV型コラ-ゲン分解酵素活性を測定したところ、APMA添加により活性化される非活性型が分泌されていた。また、再構築基底膜を通過したメラノ-マ細胞を再回収培養した細胞の培養上清ではIV型コラ-ゲン分解酵素活性はさらに上昇し、活性型の比率も増加していた。2.メラノ-マ培養上清中に存在する肝細胞癌転移促進物質分子の精製:再構築基底膜を通過したメラノ-マ細胞を再回収し、培養操作を2回繰り返した細胞(B16(2))の培養上清を10倍濃縮後、細胞成分を除去し、セファクリルS200を用いてゲル濾過する。その各分画を透析し、凍結乾燥したものをmediumに溶解し、試料とした。各試料をInvasion chamber上室の肝細胞癌浮遊液中に添加し、培養24時間後、各Invasion chamber内のフィルタ-を取り出し、再構築基底膜を通過した細胞数を測定した。

此の結果、通過細胞数の最も多い分画は分子量約37kDに相当し、この分子は分子量よりAutocrine motility factor、IV型コラ-ゲン分解酵素、basic FGFとは異なると思われた。この分子は加熱処理(65°C、30分)により失活した。現在、電気泳動(SDSーPAGE)による検討を行なっている。pore sige 13μmのケモタキスフィルタ-に再構築基底膜ゲル50μgを被覆し、上室に培養肝癌細胞(HuHー7,PLC/PRF/5)を播種してフィルタ-下面への癌細胞の通進能をIn vitroの転移能モデルとした。両培養肝癌細胞ともそれ自身ではフィルタ-の通過能力は認められなかった。一方、基底膜ゲル通過能が確認されているマウスメラノ-マ株B_<16>を上室に播種したところ、細胞は基底膜ゲルを溶解しながら浸潤する像が認められた。そこで、上室の肝細胞培養上清にB_<16>メラノ-マ培養上清を添和すると肝癌細胞に基底膜通過能力が発現され、細胞形態も突起様変化が生じることが確認された。2転移促進分子の解析B_<16>メラノ-マと肝癌細胞培養上清中のIV型コラ-ゲン分解酵素活性を検討すると,B_<16>とPLC/PRF/5の上清中に酵素活性が認められたが、その大部分はAPMA添加により活性化される不活性型のものであった。B_<16>メラノ-マ培養上清をSephacryl200でゲル濾過して分子量を検討したところ、この転移促進分子は分子量約37kDであった。このことより、この分子はAutocrine motility factor,IV型コラ-ゲン分解酵素やbasic FGFとは異なることが明らかになった。3肝細胞癌の機能的診断本研究をIn vivoに還元する為には、生検材料を生細胞のまゝ診断することが必要となる。そこで肝癌細胞がIndocyanine green(ICG)を取り込まない点に着目して、ICG静注後肝生検法を考案した。この方法によると、ICGの取込みがない組織は95%以上が肝癌で、ICG取り込みの消失は細胞内リガンディンであるGlutathione Sーtransferaseαの減少と有意な相関があることを明らかにした。
対称空間上の球関数

対称空間のある種の作用素の同時固有関数族として得られる関数は球関数と呼ばれ、対称空間の表現論で重要な役割をになうものである。実または複素数での理論やp-進reductive群の球関数の理論はすでに研究されている。p-進体上の等質空間の球関数の理論を構成し、さらには、代数体上定義された対称空間、等質空間の調和解析の理論を構成することは、興味深い問題である。以下は標数0の非アルキメデス的局所体上定義された等質空間を考え、ヘッケ環の同時固有関数を球関数と呼ぶ。まず、球等質空間上の球関数についての表現論的な考察をし、一定の仮定の下で、球関数の公式を与えた。これを不分岐エルミート形式のなす空間について適用し、球関数の理論を構成した。具体的には、標準的な球関数をうまく定義し、その良い具体的表示式を与えること;球関数を核関数とするフーリエ変換の像、および逆変換の決定この空間上の急減少関数のなす空間のヘッケ環加群としての構造の決定すべての球関数をうまくパラメトライズすることまた、球関数は局所密度μ_p(B,A)達の母関数とみなすことができる。したがって、球関数の明示式を用いて、局所密度μ_pを引き出すことができる。実際、局所密度および原始的局所密度の、組合わせ論的量を用いた明示式を得た。
脳梗塞急性期における皮質拡延性抑制とHMGB1核外放出の"負の連鎖"に関する研究

我々は、脳梗塞周囲において炎症誘発物質(HMGB1)と皮質拡延性抑制(CSD)が互いに増幅し合い、脳梗塞を進行させると仮定したが、急性期脳梗塞モデルにおいてこれらの因子に明らかな相関は認めなかった。また、脳梗塞作成後にHMGB1抗体を投与したが、CSD発生数は減少しなかった。これらの結果から、脳梗塞発症後急性期(6時間以内)においては、HMGB1がCSD発生数を増加させ、梗塞巣を増大させるというメカニズムは存在しないと考えた。今後は、炎症反応が著明となる脳梗塞亜急性期(発症後数日程度)にターゲットを絞り、HMGB1とCSDの関連を解明すべく新たな実験系を検討する予定である。本研究は、脳梗塞増大の一因と考えられている免疫応答反応と、虚血や外傷などの局所脳損傷時に損傷部周囲に自然発生する皮質拡延性抑制(cortical spreading depression:以下CSD)の相互作用を明らかにし、新たな脳梗塞治療法の開発を模索するものである。本研究グループは、免疫応答反応の契機となりうる物質として、虚血や外傷などの損傷脳の周辺領域に放出されるHigh mobility group box 1(以下HMGB1)と呼ばれる核内DNA結合タンパク質に注目し、HMGB1とCSDが互いに核外放出もしくは発生伝播を誘発しあうことが、脳損傷の二次性増悪の一因になると仮説した。実際の研究は、まずマウスの脳表血流量をレーザースペックル血流計で定性的に可視化する実験系を作製するところから開始した。その後、塩化カリウムを脳表に塗布することで人為的にCSDを発生させ、CSD伝播がレーザースペックル血流計で観察できることを確認した。ちなみに、CSDは脱分極の波であり、厳密には膜電位変化の可視化が望ましいが、これは非常に難しい手法であるため、CSDに付随する組織血流変化の空間的モニタリングを行うことで代用した。本年度の作業を行うことで、マウス脳表におけるCSDの発生頻度や伝播部位をカウントできるため、以後は特定部位におけるCSD伝播回数とHMGB1核外放出量の関連を検討することができる。次年度以降は、HMGB1抗原投与によりCSD発生数が増加しうるか、HMGB1抗体投与によりCSD発生数や伝播範囲が抑制できるか、ついて検証する予定である。本年度は、安定したマウス局所脳梗塞モデル作成および最適なレーザースペックル脳表血流計の設置条件検索に時間を要した。塩化カリウムによるCSD誘発は実施し得たものの、HMGB1塗布によるCSD発生への影響を確認するステップが次年度に繰り越された。本研究グループは、免疫応答反応の契機となりうる物質として、虚血や外傷などの損傷脳の周辺領域に放出されるHigh mobility group box 1(以下HMGB1)と呼ばれる核内DNA結合タンパク質に注目し、HMGB1核外放出とCSD伝播が互いに誘発しあうことが、脳損傷の二次性増悪の一因になると仮説した。平成27年度は、マウスの脳表血流量をレーザースペックル血流計で可視化する実験系を作製するところから開始した。(CSDは脱分極の波であり、厳密には膜電位変化の可視化が望ましいが、これは技術的に困難であり、CSDに付随する局所的血流変化を可視化することで代用した。)平成28年度は、正常脳組織および虚血巣辺縁領域(ペナンブラ)に種々の濃度のHMGB1抗原を塗布することにより、CSD発生数にどのような変化が起こるかを観察した。残念ながらHMGB1抗原投与によるCSD発生数の変化は認められなかったが、これは観察時間が短いことが影響している可能性があり、観察時間を延長することとした。平成29年度は、抗HMGB1交代投与を行い、CSD発生への影響について検証する予定である。様々な濃度のHMGB1を投与したが、CSD発生数の増減を確認することはできなかった。この理由として、HMGB1投与後の観察時間(3時間)が短かった可能性があり、今後、この点を改善しつつ実験計画を進めていく予定である。本研究は、脳梗塞増大の一因と考えられている免疫応答反応と、虚血や外傷などの局所脳損傷時に損傷部周囲に自然発生する皮質拡延性抑制(cortical spreading depression;以下CSD)の相互作用を明らかにし、新たな脳梗塞治療法の開発を模索するものである。我々は、免疫応答反応の契機となりうる物質として、損傷脳の周辺領域に放出されるHigh mobility group box1(以下HMGB1)と呼ばれる核内DNA結合タンパク質に注目し、HMGB1核外放出とCSD伝播が互いに誘発しあうことが、脳損傷の二次性増悪の一因となると仮定し実験を計画した。平成27年度は、マウスの脳表血流量をレーザースペックル血流計(以下LSF)で可視化する実験系を作製し、CSD伝播に伴い発生する一過性の脳血流変化を検知することで、CSD発生を観察することとした。

平成28年度は、正常脳組織および虚血巣辺縁領域(ペナンブラ)に種々の濃度のHMGB1抗原を塗布し、CSD発生数がどのように変化するか観察した。3時間の観察時間ではCSD発生数に変化を認めなかったため、観察時間を延長することとした。観察時間延長後もHMGB1抗原投与によるCSD発生数の増加は認められず、少なくともHMGB1抗原脳表塗布がCSDを発生させることはないと結論付けた。平成29年度は、抗HMGB1抗体を尾静脈投与し、虚血巣辺縁領域におけるCSDを観察したが、我々の仮説に反してCSDは減少しなかった。これらの結果から、少なくとも脳梗塞発症後超急性期(数時間以内)においては、核外放出されたHMGB1がCSD発生数を増加させ、梗塞巣を増悪させるというメカニズムは存在しない可能性が示唆された。今後、脳梗塞亜急性期(発症後数日程度)にターゲットを絞り、HMGB1とCSDの関連を解明すべく新たな実験系を検討する予定である。我々は、脳梗塞周囲において炎症誘発物質(HMGB1)と皮質拡延性抑制(CSD)が互いに増幅し合い、脳梗塞を進行させると仮定したが、急性期脳梗塞モデルにおいてこれらの因子に明らかな相関は認めなかった。また、脳梗塞作成後にHMGB1抗体を投与したが、CSD発生数は減少しなかった。これらの結果から、脳梗塞発症後急性期(6時間以内)においては、HMGB1がCSD発生数を増加させ、梗塞巣を増大させるというメカニズムは存在しないと考えた。今後は、炎症反応が著明となる脳梗塞亜急性期(発症後数日程度)にターゲットを絞り、HMGB1とCSDの関連を解明すべく新たな実験系を検討する予定である。平成28年度は、正常脳および虚血モデルを用いたCSD誘発およびHMGB1塗布実験を行い、その組織変化の程度を評価していく予定である。また、平成29年度は、抗HMBG1抗体投与によるCSD発生抑制の有無、そして、CSD抑制が結果的に梗塞巣の二次性増大を防ぐかどうかを検証する予定である。HMGB1投与によりCSDの発生数が増加した場合は、抗HMGB1交代を投与(静脈投与もしくは脳表への塗布)を行い、CSD発生数が減少するかどうかを確認する。HMGB1投与がCSD発生に影響を与えなかった場合は。CSD発生部位とそれ以外の部位の組織を採取し、各部位でのHMGB1核外放出程度を検証する。これらによりHMGB1とCSD発生の関連の有無を検討する。医歯薬学HMGB1抗原およびHMGB1抗体、その他免疫染色に必要な試薬の購入が3月末に間に合わなかったため、次年度使用額が発生してしまいました。HMGB1抗原および抗HMGB1抗体などの試薬購入が3月末に間に合わなかったこと、平成29年度はじめに動物実験用ルーペ購入を計画していること、などから、次年度使用額が発生しています。次年度使用額を用いて、平成28年度に早急に上記物品を購入する予定です。上記物品を早急に購入し、平成29年度の実験を遂行する予定です。
炭素線治療における解剖学的変化に応じたリアルタイム照射ビーム生成法の研究

本研究はpassive照射法での炭素線治療中の患者の解剖学的な変化、特にすい臓がんなどの腹部臓器に照射する際の周辺の腸管内のガス量の変化を測定し、その変化に応じてリアルタイムに照射ビームを生成することを目的とする。この方法を実現するためには、体内(水中)に炭素線が通過した際に発生する制動放射を精度よく検出する技術と、その変化量に応じてpassive照射法でのビームを変化させるためのadaptive可変ボーラスを製作することが必要となる。平成30年度はadaptive可変ボーラスの組み合わせパターンについて検討した。また、臨床データ中より、肝臓がん・肺がん・膵臓がん患者の体内変動の大きさを測定し、実際起こりうる変形量について検討した。検出器については、量研で開発したビームイメージングシステムに着脱可能なピンホール型コリメータを製作した。材質は銀合金で、穴径1.5 mm、開口角は±30度とした。製作したコリメータをビームイメージングシステムに取り付け、点線源を用いてイメージング性能のチェックを実施し点線源の移動とともに像が正しい位置に移動することを確認できた。エネルギー分解能は59.5 keVにおいてΔE/E = 17 % (FWHM)程度であった。次年度は簡易的なファントム内でビーム飛程が変化した場合の測定を行うことでビームイメージングシステムの評価を行う。その後、adaptive可変ボーラスを用いることで実際の飛程が修正され、線量が改善されることを確認する。Adaptive可変ボーラスの製作及び試験がまだ出来ていない。次年度は、まずadaptive可変ボーラスの製作をし、その精度試験を行う。また、簡易的なファントム内でビーム飛程が変化した場合の測定を行うことでビームイメージングシステムの評価を行う。炭素線治療はシャープな線量分布を形成可能でああるため、正常組織を避けつつターゲットに線量を集中させることが可能である。しかし腹部臓器、特にすい臓がんなどはターゲットが腸管に囲まれており、その腸管内のガスが移動することなどで線量分布が大きく崩れる可能性がある。平成29年度は、adaptive可変ボーラス製作のための、基本的なブロックの組み合わせについて検討した。また、制動放射の検出効率を上げるための、ピンホールカメラ用コリメータを購入した。次年度では、adaptive可変ボーラスを実際に製作し、動作試験を行うことで変形可能な形状およびその精度の評価を行う。また、購入したコリメータを用いて、炭素線通過時に発生する制動放射の検出効率を測定する。平成29年度にadaptive可変ボーラスを製作する予定であったが、製作できなかった。平成30年度は、adaptive可変ボーラスを実際に製作し、動作試験を行うことで変形可能な形状およびその精度の評価を行う。精度評価後に、adaptive可変ボーラスの改修を行う。昨年度にadaptive可変ボーラスを設計できなかったため。

昨年度までの予定であったadaptive可変ボーラスの製作・評価及び実験が行えなかったため。次年度はadaptive可変ボーラスの製作・評価及び実験を行う予定である。
低血糖を繰り返す 1 型糖尿病児童生徒のための、個別の指導計画作成に 関する研究

診療を行っている1型糖尿病児童生徒に対し、学校での低血糖の頻度、程度、無自覚低血糖の有無、新規インスリンの効果を調査し、また、持続血糖測定をすすめた。教員への電話、面談による調査も併せて行った。その結果、昼食前の低血糖や運動後の低血糖等の問題があり、また、それらに伴うQOLの低下も認められた。学校での教員によるグルカゴン注射についての可能性も調査した。自験の同胞発症1型糖尿病3家系について親の心理的負担、学校での問題点などを調査し、初期の十分な心理的支援が重要であることを明らかにした。1.診療を行っている1型糖尿病児童生徒に対して、学校での低血糖の頻度、程度を調査した。低血糖に伴うQOLの低下についても具体的に聴取した。診療録の記載方法について、PDCA形式(Plan-Do-Check-Act)によるサイクルを適用して、無自覚低血糖に関する情報が確実に反映できるような記載を行った。これにより無自覚低血糖への対処がより拡充された。2.問診により無自覚低血糖の存在を推測した。持続血糖測定装置による、確認の準備をすすめた。1型糖尿病児童生徒へのインタビューにより、無自覚低血糖の学校生活、学習への影響を調査した。3.低血糖の頻度の多いもの、無自覚低血糖に陥っているものについて、教員に面会し学校との連携を行った。4.インターネット、公表文書により、American Diabetes Associationをはじめとする欧米の糖尿病関連団体、病弱教育関連団体の方針を調べ、学校でのグルカゴン注射について、教員が関与できる可能性を調査した。5. SU剤受容体先天異常による新生児発症糖尿病の低血糖について、強化インスリン療法から経口血糖降下剤に変更し、血糖コントロールの状態、低血糖頻度の変化を調査した。変更後、2ヶ月の時点で血糖コントロールは改善し、低血糖頻度は減っている。6.てんかん発作による交通事故に関するマスコミ情報を収集して、無自覚低血糖との対比を行った。1.新規超速効型インスリン、グルリジンを使用し、これによって空腹時の低血糖が減少することを確認した。2.持効型インスリンとしてのデテミルとグラルギンの両者の特性を検討し、どちらがより低血糖をおこしにくいか検討した。3.診療を行っている1型糖尿病児童生徒に対し、学校での低血糖の頻度、程度を調査した。低血糖に伴うQOLの低下についても引き続き聴取を続けた。4.問診により無自覚低血糖の存在を推測した。CGMSGOLDは使用法に困難を伴うことがわかり、新たにiPro2が開発され、より携帯に便利で測定しやすいため、別予算でこれを購入し持続血糖測定を進めている。1型糖尿病児童生徒のインタビューにより無自覚低血糖の学校生活、学習への影響を調査した。5.低血糖の頻度の多いもの、無自覚低血糖に陥っているものについて、教員に面会し学校との連携を行った。6.インターネット、公表文書により、American Diabetes Associationをはじめとする欧米の糖尿病関連団体、病弱教育関連団体の方針を調べ、学校でのグルカゴン注射について、教員が関与できる可能性を調査した。7.診療録の記載方法について、PDCA形式(Plan-Do-Check-Act)によるサイクルを適用できる可能性を検討した。8.SU剤受容体先天異常による新生児発症糖尿病の低血糖について、強化インスリン療法から経口血糖降下剤に変更し、血糖コントロールの状態、低血糖頻度の変化を調査した。1新規自己血糖用測定器「アキュチェックモバイル」についてカートリッジ式で穿刺針内蔵である特徴がどのように受けとらえるか、学校現場での使用状況について調査した。2兄弟(9歳兄、7歳弟)が2ヵ月おいて発症した例を経験したので学校、家庭での安定した治療にむけて検討をおこなった。3新規持効型、インスリンデグリレクを用いて低血糖の発症の頻度が減るか、HbA1cの推移の検討を行った。4診療を行っている1型糖尿病児童生徒に対し、学校での低血糖の頻度、程度を調査した。持続血糖測定装置(新たに購入したiPro2(ミ二メド社))を携帯してもらい、測定を行った。低血糖時の循環動態について超音波診断装置で確認した。5問診により無自覚低血糖の存在を推測し、持続血糖測定装置iPro2によって確認した。1型糖尿病児童生徒のグループインタビューにより学校生活、学習への影響を調査した。6低血糖の頻度の多いもの、無自覚低血糖に陥っているものについて新たに入手したiPro2を利用してより詳細に、学校と連携し、IEP(個別の指導計画)作成した。7American Diabetes Associationをはじめとする欧米の糖尿病関連団体、病弱教育関連団体を通じ、インターネット、公表文書、直接接触により、学校でのグルカゴン注射について、教員が関与できる可能性を調査した。昨年度の目標にしたがって研究を進め、ほぼ当初の目的を達成したと評価したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。

1.診療を行っている1型糖尿病児童生徒に対し、学校での低血糖の頻度、程度を調査する。持続血糖測定装置(新たに購入したiPro2(ミニメド社))を携帯してもらい、測定を行う。低血糖時の循環動態について超音波診断装置で確認する。2.問診により無自覚低血糖の存在を推測し、持続血糖測定装置iPro2によって確認する。1型糖尿病児童生徒のグループインタビューにより学校生活、学習への影響を調査する。3低血糖の頻度の多いもの、無自覚低血糖に陥っているものについて新たに入手したiPro2を利用してより詳細に、学校と連携し、IEP(個別の指導計画)作成を働きかける。4.American Diabetes Associationをはじめとする欧米の糖尿病関連団体、病弱教育関連団体を通じ、インターネット、公表文書、直接接触により、学校でのグルカゴン注射について、教員が関与できる可能性を調査する。24年度が最終年度であるため、記入しない。
マウス生体における細胞競合の普遍性・特異性の解明

本研究では、Yap発現細胞をモザイク状に誘導したマウス細胞競合モデルを利用して、マウス発生過程から成体の各組織に至るまで、いつ・どこで細胞競合が起こるのかを広く明らかにし、成体における細胞競合の普遍性・特異性の解明を目指していた。上記目的に沿って、初年度、各組織における細胞競合の有無を調べたが明確な違いは示せていなかった。一方、モザイク状に誘導したマウスのコントロールとして、全身でYap発現を誘導したマウスの解析も同時に進めていたところ、新たな表現型として、成体での肥満が観察されたため、初年度後期からはそちらの解析を積極的に進めた。肥満は、脂肪細胞を主とした白色脂肪組織の増大によって起こる。脂肪細胞の分化の過程で、鍵となる働きをするのが転写因子PPARγであり、それを抑制的に制御する因子としてTAZが知られている。これまでの知見から、脂肪細胞分化においてTAZが重要な働きをすることがin vitroの実験では示されていたが、in vivoにおける役割については明らかになっていなかった。この課題の解明に、上記のYap発現マウスを活用した。このマウスは、Yapを過剰発現しているが、YAPの活性化によりHippoシグナルのフィードバックが起こりYAPの相補的な減少を誘導することにより、結果的にYAP活性は平常状態に保たれている。しかし、このフィードバックはYapのパラログであるTAZの抑制・核からの排除も引き起こすため、Yap過剰発現マウスでは、脂肪幹細胞におけるTAZ活性の抑制によりPPARγが活性化され、成熟脂肪細胞への分化促進へとつながり、結果的に脂肪組織が増加していた。これらの結果により、in vivoにおいてTAZが脂肪細胞の分化に重要であることが明らかになると共に、肥満の治療への見識を得ることにもつながった。本研究では、Hippoシグナル経路を改変した細胞を発現させたマウス細胞競合モデルを利用して、マウス発生過程から成体の各組織に至るまで、いつ・どこで細胞競合が起こるのかを広く明らかにし、生体における細胞競合の普遍性・特異性の解明を目指す。今年度は、マウス胚に活性化型Yap発現細胞をモザイク状に誘導して、そのYap発現細胞の増加の有無を調べることで、胚や各組織における細胞競合の有無を判断する、ということに、取り組んできた。具体的には、内胚葉性上皮細胞特異的Cre-ER発現マウスとCre誘導性のYapおよびGFP発現マウス(R26R-Yap-IRES-GFP)、mCherry発現マウス(R26R-mCherry)をかけ合わせ、内胚葉性上皮細胞特異的に遺伝子組換え細胞を誘導できるマウス胚・個体を得る。Cre-ERは、薬剤(タモキシフェン)の投与量に応じて活性効率が変化するため、投与量を適度に調節することで、GFP発現細胞(Yap発現細胞)とmCherry発現細胞(野生型細胞)を同程度かつモザイク状に誘導できる。これらのマウスに対して、薬剤投与後1日目と4日目で胚・組織を回収し、FACSにかけてGFP細胞とmCherry細胞の数を比較した。また、切片を作製して同じくGFP細胞とmCherry細胞の数を比較し、各組織における細胞競合の有無を確認した。その結果、E7.5とE10.5の間で、細胞数の比(GFP/mCherry)が増加していた。しかし、細胞死の頻度や細胞増殖の頻度については、コントロールとの差は見られていない。また、E10.5で比較した限りは、組織間の細胞競合の有無について、明確な違いは示せていない。モザイク状に誘導したマウスのコントロールとして、全身でYapを発現するマウスの解析も同時に進めていたところ、そちらで新たな表現型が観察され、そちらの解析に時間がかかっているため。本研究では、Hippoシグナル経路を改変した細胞を発現させたマウス細胞競合モデルを利用して、マウス発生過程から成体の各組織に至るまで、いつ・どこで細胞競合が起こるのかを広く明らかにし、成体における細胞競合の普遍性・特異性の解明を目指していた。上記目的に沿って、昨年度、各組織における細胞競合の有無を調べたが明確な違いは示せていなかった。一方、モザイク状に誘導したマウスのコントロールとして、全身でYapを発現するマウス(Tgマウス)の解析も同時に進めていたところ、新たな表現型として、成体での肥満が観察されたため、本年度はそちらの解析を積極的に進めた。肥満は、一般的には正常よりも体重、体脂肪が多い状態のことを指すが、細胞レベルで見ると脂肪細胞の肥大と増殖としてとらえることができる。しかし、脂肪細胞の肥大の上限がどのように決まっており、肥大と増殖がどのように切り替っているのかということについて、その分子メカニズムはいまだによく分かっていない。上記Tgマウスでは、Yapを全身で弱く過剰発現しているが、主要な臓器に外見上の異常はなく、脂肪組織だけが異常に大きくなっていた。また、組織切片を切ってみると、脂肪細胞の肥大が観察された。現在、脂肪細胞特異的にYapを弱く過剰発現するトランスジェニックマウスを作製しており、予備的ではあるが、やはり脂肪細胞の肥大が観察されている。これらのことから、細胞の増殖制御に関わることが知られているHippoシグナル経路が、脂肪細胞では細胞の肥大の制御に関わっている可能性が示唆された。

当初計画と異なるTgマウスの新規の表現型として脂肪組織が増大するという結果を得たため、新たな脂肪組織の解析や新たなTgマウスの交配に想定以上に時間を要したものの、Hippoシグナルと脂肪細胞をつなぐ面白いメカニズムがわかりつつあるため。本研究では、Yap発現細胞をモザイク状に誘導したマウス細胞競合モデルを利用して、マウス発生過程から成体の各組織に至るまで、いつ・どこで細胞競合が起こるのかを広く明らかにし、成体における細胞競合の普遍性・特異性の解明を目指していた。上記目的に沿って、初年度、各組織における細胞競合の有無を調べたが明確な違いは示せていなかった。一方、モザイク状に誘導したマウスのコントロールとして、全身でYap発現を誘導したマウスの解析も同時に進めていたところ、新たな表現型として、成体での肥満が観察されたため、初年度後期からはそちらの解析を積極的に進めた。肥満は、脂肪細胞を主とした白色脂肪組織の増大によって起こる。脂肪細胞の分化の過程で、鍵となる働きをするのが転写因子PPARγであり、それを抑制的に制御する因子としてTAZが知られている。これまでの知見から、脂肪細胞分化においてTAZが重要な働きをすることがin vitroの実験では示されていたが、in vivoにおける役割については明らかになっていなかった。この課題の解明に、上記のYap発現マウスを活用した。このマウスは、Yapを過剰発現しているが、YAPの活性化によりHippoシグナルのフィードバックが起こりYAPの相補的な減少を誘導することにより、結果的にYAP活性は平常状態に保たれている。しかし、このフィードバックはYapのパラログであるTAZの抑制・核からの排除も引き起こすため、Yap過剰発現マウスでは、脂肪幹細胞におけるTAZ活性の抑制によりPPARγが活性化され、成熟脂肪細胞への分化促進へとつながり、結果的に脂肪組織が増加していた。これらの結果により、in vivoにおいてTAZが脂肪細胞の分化に重要であることが明らかになると共に、肥満の治療への見識を得ることにもつながった。今後は、全身でYapを発現するマウスを中心に、成体での解析を進めていく予定である。今後も、成体における肥満の表現型に焦点をあてて、Hippoシグナルが脂肪細胞の分化・成熟に果たす役割について解析を進めていく予定である。成果発表を予定していた2016年度の日本発生生物学会大会(熊本開催)が、震災のため中止となり、旅費が不要となったため。また、使用を予定していたマウス施設使用料を他の研究費でまかなうことになったため。当初計画とは異なるTgマウスの新規の表現型として脂肪組織が増大するという結果を得たため、新たな脂肪組織の解析や新たなTgマウスの交配に想定以上に時間を要し、引き続き実施する必要があるため。マウス施設使用料、および、一般試薬(切片作製関連製品、免疫染色試薬など)、プラスチック・ガラス器具(プラスチックシャーレ、スライドガラスなど)、実験用動物(野生型マウス、遺伝子改変マウス)の購入に充てる。