hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コーティング層の機械的特性と劣化に関する研究

次世代の半導体素子は,プリント基板に実装された後に樹脂で上から基板ごとコーティングするタイプが増加すると考えられている.また,高温用タービンブレートは,耐熱性のセラミック材料を溶射によって金属基材にコーティングする.このような場合は,コーティング層の強度特性評価を充分に行わないと,材料の信頼性が得られない.そこで,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行なうことが重要である.本研究では,金属のベース材料にコーティングが施された場合の,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行った.本研究の成果を以下の通りである.(1)収集した情報に基づいて,コーティング素材の選定を行い,コーティング母材の試験片を製作した.(2)曲げ試験を行い,荷重-たわみ関係等を測定した.(3)x線応力測定装置で試験片表面のコーティング層の残留応力を測定した.(4)残留応力の測定結果を基に,破断荷重をワイブルプロットにより整理し,統計的な処理によって一般化破断荷重を決定できることを明らかにした.(5)ワークステーションを用い,材料中の各層ならびに層間に働く応力分布を弾性論にもとずく数値解析によって明らかにした.(6)各試験前後の試験片のコーティング層の界面を走査型電子顕微鏡で詳細に観察し,メカニズムを解明した.次世代の半導体素子は,プリント基板に実装された後に樹脂で上から基板ごとコーティングするタイプが増加すると考えられているが,このような素子を用いた場合は,コーティング層の強度特性評価を十分に行わないと,電子機器の信頼性が得られない.そこで,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行なうことが重要である.本研究では,金属などの剛性の高いベース材料に樹脂によるコーティングが施された場合の,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行った。.本年度は以下の計画にしたがって研究を行った.(1)収集した情報に基づいて,コーティング素材の選定を行い,コーティング母材樹脂の試験片を製作した。(2)引張試験を行い,剛性,ポアソン比ならびに応力--ひずみ関係等を測定した.また,3点曲げによって,破壊靱性を測定した.さらに,剛体パンチ押し込み試験によって,コーティング層を圧縮破壊し,積層界面の強度を測定した.(3)上記の力学試験において,負荷前後における樹脂の高分子鎖の分子量の変化等を赤外分光分析装置で測定した.(4)これら力学試験においてレーザ付き顕微システムでコーティング層の変形の様子を観察した.(5)ワークステーションを用い,材料中の各層ならびに層間に働く応力分布を弾性論にもとずく数値解析によって明らかにした.(8)各試験前後の試験片の界面をVTR顕微鏡ならびに走査型電子顕微鏡で詳細に観察した.次世代の半導体素子は,プリント基板に実装された後に樹脂で上から基板ごとコーティングするタイプが増加すると考えられている.また,高温用タービンブレートは,耐熱性のセラミック材料を溶射によって金属基材にコーティングする.このような場合は,コーティング層の強度特性評価を充分に行わないと,材料の信頼性が得られない.そこで,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行なうことが重要である.本研究では,金属のベース材料にコーティングが施された場合の,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行った.本研究の成果を以下の通りである.(1)収集した情報に基づいて,コーティング素材の選定を行い,コーティング母材の試験片を製作した.(2)曲げ試験を行い,荷重-たわみ関係等を測定した.(3)x線応力測定装置で試験片表面のコーティング層の残留応力を測定した.(4)残留応力の測定結果を基に,破断荷重をワイブルプロットにより整理し,統計的な処理によって一般化破断荷重を決定できることを明らかにした.(5)ワークステーションを用い,材料中の各層ならびに層間に働く応力分布を弾性論にもとずく数値解析によって明らかにした.(6)各試験前後の試験片のコーティング層の界面を走査型電子顕微鏡で詳細に観察し,メカニズムを解明した.次世代の半導体素子は,プリント基板に実装された後に樹脂で上から基板ごとコーティングするタイプが増加すると考えられている.また,高温用タービンブレ-ドは,耐熱性のセラミック材料を溶射によって金属基材にコーティングする.このような場合は,コーティング層の強度特性評価を十分に行わないと,材料の信頼性が得られない.そこで,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行なうことが重要である.本研究では,金属のベース材料にコーティングが施された場合の,コーティング層の機械的特性と湿度や応力による劣化の評価を行った.本年度は以下の計画にしたがって研究を行った.(1)収集した情報に基づいて,コーティング素材の選定を行い,コーティング母材の試験片を製作した.(2)曲げ試験を行い,荷重-たわみ関係等を測定した.(3)x線応力測定装置で試験片表面のコーテイング層の残留応力を測定した.(4)残留応力の測定結果を基に,破断荷重をワイブルプロットにより整理し,統計的な処理によって一般化破断荷重を決定した.(5)ワークステーションを用い,材料中の各層ならびに層間に働く応力分布を弾性論にもとずく数値解析によって明らかにした.(6)各試験前後の試験片のコーティング層の界面を走査型電子顕微鏡で詳細に観察した.
広帯域エネルギー対応高機能中性子モニタの開発

本研究では、加速器施設、その周辺環境等における線量をリアルタイムで測定できるモニタリングシステムDARWIN(Dose monitoring system Applicable to various Radiations with Wide energy ranges)を開発した。DARWINはBC501型液体シンチレータとLi-6含有ZnS(Ag)シートを組み合わせたホスウィッチ型検出器、デジタルオシロスコープを用いたデータ収集・解析システムで構成される。DARWINは、熱エネルギー領域からIGeVの中性子、150keVから100MeVの光子、1MeVから100GeVのミューオンによる線量を測定することが可能であり、従来の放射線モニタに比べて高感度及び高精度、また、簡便に操作できるシステムである。開発したDARWINの性能は、放射性同位元素、加速器を利用した高エネルギマ中性子源等の種々の線源を用いて評価した。その結果、DARWINは、加速器施設において想定される作業環境の中性子、光子、ミューオンに対し、広範な線量率にわたりそれらの線量を測定できることを確認した。DARWINは、高エネルギー加速器施設における線量測定はもとより、加速器施設と類似の放射線環境の高々度や宇宙空間における線量測定にも適用できるものである。熱エネルギー1GeVの中性子に対し,適切な線量応答特性を有する検出器を製作した。検出器の設計計算には,現在開発を進めている量子分子動力学法を用いた液体シンチレータ応答関数計算コードSCINFUL-QMD,重イオン輸送計算コードPHITSを用いた。エネルギー応答特性,検出効率を指標とした様々な解析に基づき,BC501型液体シンチレータと6^Li含有ZnS(Ag)シートを組み合わせたホスウィッチ型検出器を設計し製作した。製作した検出器に対し,数MeV1GeVの単色中性子入射に対する液体シンチレータの応答関数を計算した。液体シンチレータ外での粒子輸送はPHITSを用い,液体シンチレータ内での粒子輸送及びその発光量計算にはSCINFUL-QMDを用いた。また,熱エネルギー数MeVの中性子に対するZnS(Ag)シートにおける反応率を,PHITSを用いて計算した。これにより,検出器の出力から線量を導出するための線量変換関数を整備した。製作した検出器による速中性子,熱中性子,光子に対する信号弁別性能,線量変換関数を用いた中性子線量の評価性能を確認するために,日本原子力研究所イオン照射研究施設等において,熱エネルギー80MeV中性子に対する照射試験を行った。その結果,本検出器は,従来型モニタに比べて極めて高感度で,かつ広いエネルギー範囲の中性子線量測定に利用できることを明らかにした。さらに,デジタル波形処理技術を応用した検出器信号の解析により,従来のモジュール等を用いたアナログ解析手法よりも高精度で安定した線量導出システムを開発した。平成16年度までに,有機液体シンチレータと固体シンチレータを組み合わせて,熱エネルギーから100MeVまでの中性子に対する線量測定原理を開発し,その方法を採用した線量測定システムを製作した。平成17年度は,100MeV以上の高エネルギー中性子に対する製作した測定システムの特性試験を行うとともに,中性子線量を導出するためのソフトウェアの開発を行った。高エネルギー中性子に対する特性試験は,放射線医学総合研究所重粒子線がん治療装置HIMAC(最大中性子エネルギー800MeV)及び米国ロスアラモス国立研究所中性子科学センターLANSCE(最大中性子エネルギー800MeV)を利用して行った。100MeV以上の高エネルギー中性子入射による有機液体シンチレータの応答関数を測定し,既に開発した液体シンチレータの発光量計算コードSCINFUL-QMDとの比較を行った。また,基準光源を用いた光電子増倍管の校正実験を行った。これらの結果を用いて,100MeV以上の中性子入射にも適用可能な発光量-線量変換演算子(G関数)を計算した。さらに,中性子線量を導出するソフトウェアとして,GUI(Graphical User Interface)を用いて操作性に優れ,かつ線量をリアルタイムで表示できるソフトウェアを開発した。平成17年度の成果により,約1GeVまでの中性子線量を測定する方法を確立した。平成18年度は、3年計画の最終年度であり、平成16年度に開発した中性子検出器及び測定システム、平成17年度に開発した中性子線量を算出するソフトウェアの性能を総合的に評価した。これにより、放射線管理用機器としての利用に適したプロトタイプの仕様を提案し、本研究の成果をまとめた。

総合試験は、原子力機構の放射線標準施設棟、イオン照射研究施設、放射線医学総合研究所重粒子線がん治療装置等を用いて行った。自発核分裂中性子源、加速器を利用した高エネルギー中性子源を用いた照射試験により、開発した装置で測定した線量と中性子エネルギースペクトル等に基づき算出した参考線量とを比較し、測定値の信頼性を評価した。また、異なる中性子強度において線量率の直線性、中性子とガンマ線の弁別性能等を試験した。これらに基づき、加速器施設の作業環境において想定される熱エネルギー領域から1GeVまでのエネルギー範囲と広範な線量率に対する測定器の適応性を検討し、所期の剛票を満たす性能を確認した。以上の成果に基づき、本測定システムに基づく中性子モニタの基本デザインをとりまとめた。開発したモニタは、高エネルギー加速器施設における線量測定はもとより、加速器施設と類似した放射線環境の高々度や宇宙空間における線量測定にも適用できるものである。
マルチコアプロセッサでのRubyプログラムの高速実行方式の開発

本研究は、国産スクリプティング言語であるRubyを高速に実行する方式を提案し、評価するものである。具体的には、Rubyで書かれたプログラムを、マルチコアプロセッサ(1チップに複数のコアを搭載するプロセッサ)で実行可能なコードに変換するトランスレータを実装した。評価のため、ヤコビの反復法で連立一次方程式を解くプログラムを実行した結果、4個のコアを利用した場合に最大3.95倍、8コアで同6.67倍の性能向上が得られた。本研究では、逐次プログラムとして記述されたRubyプログラムを、並列実行するために、Rubyに付属する分散オブジェクトシステムであるdRubyを用いた。dRubyが提供する機能を利用して、複数のプロセスが同期し、変数を共有する方式を確立し、メソッドとして実装した。続いて、逐次プログラムを並列実行可能なプログラムに変換するトランスレータを実装した。このトランスレータはプロセス間通信が必要な箇所に上記のメソッドを生成する。上記の開発と並行して、ヤコビの反復法(問題サイズ2,048、反復回数1,000回)を手動変換し、8個のコアから構成されるマルチコアプロセッサ(3GHz Intel Xeonが2基搭載されたApple社Mac Pro)で実行した。その結果、コア数1個の実行時間に対して、4個で3.95倍、8個で6.67倍の台数効果が得られた。ただし、Cプログラムで記述したヤコビの反復法の実行時間と比較すると、Rubyの実行時間が2000倍以上大きい結果となった。一般に、コンパイル方式のCと比較してインタプリタ方式のRubyが実行時間が大きいため、この結果は想定内である。Rubyは、プログラムの開発に要する時間が短いという特長があるため、実行時間だけではなく、開発時間を含めた総合的な評価が必要であると考える。得られた結果と本研究の構想を、日本Ruby会議2007(2007年6月9、10日)で発表した。また、平成19年度において、JRuby、Ruby1.9といった次世代のRuby処理系が登場し、いずれも実行性能の改善を謳っている。今後の課題として、これらの処理系を用いて評価することが挙げられる。dRubyが提供する機能を利用して、複数のプロセスが同期し、変数を共有する。平成19年度の研究に実施した、ヤコビの反復法(問題サイズ2048、反復回数1000回)を8個のコアから構成されるマルチコアプロセッサ(3GHz Intel Xeonが2基搭載されたApple社Mac Pro)で実行する実験では、4個で3.95倍、8個で6.67倍の台数効果が得られていたが、Cで記述した同等のプログラムと比較して、実行時間が2000倍以上大きい結果となっていた。また、平成19年度には、実行性能の改善を謳ったJRubyやRuby1.9といった次世代のRuby処理系が登場した。平成20年度において、JRubyを用いた実験を行なった。その結果、上記と同じヤコビの反復法の実行時間がRuby1.8と比較して、2プロセッサ時に6.36%、8プロセッサ時に正7.7%短縮した。ただし、1プロセッサの実行時間が約4分の1になったことにより、台数効果自体は大幅に悪化することになった。本研究ではプロセス間通信としてdRubyを利用したが、JRubyではネイティブスレッドを実現しているため、今後は並列処理の単位としてスレッドを利用することによってマルチコアプロセッサの性能が引き出せる可能性がある。また、本研究で扱う共有メモリ型プログラムのオーバヘッド要因であるバリア同期に注目し、その同期処理に関する研究を進め、成果について論文誌で公表した。
遺伝子欠損マウスを用いての水銀毒性に対するメタロチオネインの生理的役割の解明

生体内では重金属に対する共通の防御因子としてグルタチオンや栄養素セレンが知られているが、これらに加えてメタロチオネイン(金属結合蛋白質)もまた重金属解毒作用を示すことが動物実験などで証明されている。日本人にはメタロチオネインの合成能力の低い集団がいることを明らかにされている。このような集団が一般環境から長期にわたり水銀やカドミウムなどの曝露を受けた場合の生理的レベルでのメタロチオネイン(MT)-の生体防御機構としての役割については不明である。このことを解明することは、メタロチオネイン(MT)1およびIIの発現を抑えたMT遺伝子欠損マウスを用い、(1)水銀蒸気曝露による水銀の動態や毒性に対するMT役割、(2)妊娠マウスを用いて、水銀蒸気曝露後の水銀の胎盤透過と胎児について検討した。急性水銀蒸気曝露後のMT遺伝子欠損マウスと野生型マウスにおける肺に対する毒性は明らかな違いを示した。MT欠損マウスは肺における水銀濃度が野生型マウスに比べ低いにもかかわらず、著しい肺の損傷が認められた。これに対し、野生型マウスの肺の障害は軽度でであった。野生型マウスの肺では著しいMTの誘導合成が認められ、肺の中の水銀は主にMTと結合していた。この結果は高濃度の水銀蒸気曝露に対し、MTが肺における水銀の毒性に対し、防御作用を示すと共に、肺における水銀蓄積に対しても重要な役割を果たしていることを示唆するものであった。MTノックアウト妊娠マウスおよび野生型マウスへの水銀蒸気曝露後、母体臓器中の水銀濃度は野生型マウスに比べて、MTノックアウトマウスは脳を除いて有意に低く、臓器からの消失速度が速いが、胎盤では両マウス間の水銀濃度に有意な差は認められなかった。しかし、胎児中の水銀濃度は野生型マウスに比べて、MTノックアウトマウスが有意に高値であった。胎盤中では野生型マウスでは水銀はMT分画に水銀が検出された。これに対し、MTノックアウトマウスでは可溶性分画の水銀の大部分が高分子分画に溶出した。これらの結果は、胎盤中のMTは水銀の胎児への移行に対し、重要な役割を果たしていると示唆するものであった。近年、水銀は環境ホルモン様作用(内分泌撹乱作用)を有することが報告され、長期間の低濃度水銀蒸気曝露による生殖器や胎児への影響が懸念されている。生体内では重金属に対する共通の防御因子としてメタロチオネイン(金属結合蛋白質)が重金属解毒作用を示すことが動物実験などで証明されている。ヒトでは、メタロチオネイン(MT)の合成能力の低い集団がおり、この集団が一般環境から長期にわたり水銀の曝露を受けた場合の生理的レベルでのMTの生体防御機構としての役割については不明である。本年度は、ジーンターゲッティング法によりMT-Iおよび-IIの発現を抑えたMT遺伝子欠損マウスを用い、水銀蒸気(Hg^0)に対する生理的レベルのMTの役割について検討した。Hg^0曝露後の野生型とMT欠損マウスにおける体内水銀の動態は、水銀の取り込みに差異は見られないが、その後の水銀蓄積は、脳を除き、MT欠損マウスの臓器からの消失速度が速いことが明らかとなった。この相違は体内に取り込まれた水銀は、野生型では、Hg^0曝露によって誘導されたMTに結合するためと思われる。脳では野生型とMT欠損マウスとも曝露直後から水銀はMTに結合していた。

とくにMT欠損マウスでは水銀がMT(III型)と結合しているものと考えられ、これら事実はMTが組織中水銀の保持に深く関与していることを示唆する結果であった。高濃度のHg^0を大量に吸入した場合に生じる急性中毒症状の1つである呼吸系への影響については、MT欠損マウスの肺における水銀濃度が野生型マウスに比べ低いにもかかわらず、著しい肺の損傷が認められた。しかも、Hg^0曝露後のMT欠損マウスの死亡率は野生型に比べ、著しく高率であった。肺において水銀は、野生型マウスでは主にMTと結合していたが、MT欠損マウスでは高分子蛋白と結合していた。これらのことは、MTが肺における水銀の毒性に対し、防御作用を示すと共に、肺における水銀蓄積に対しても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。胎児における水銀曝露はその後の発育・発達に大きな影響を与えるこことが知られている。金属水銀蒸気(Hg^0)は胎盤関門と容易に通過し、胎児に蓄積する。胎児では水銀は主に肝臓中のメタロチオネイン(MT)と結合しているこが報告されている。MTは亜鉛、銅などの必須微量金属の保持や重金属毒性軽減作用などの役割をもつ。MT遺伝子欠損(MTノックアウト)マウスへの水銀水蒸気曝露は野生型マウスに比べ、水銀蓄積量は少ないが、水銀に対する感受性は高いことが昨年までの研究で明らかとなった。本年度はMTノックアウト妊娠マウスへの水銀曝露が胎児にどのような影響を与えるかを明らかにするために、今回は水銀の胎盤通過におけるMTの役割について検討した。実験はジーンターゲッティング法によりMT-Iおよび-IIの発現を抑えたMT遺伝子欠損妊娠マウスを用い、妊娠16日目にMT欠損マウスと野生型マウスを水銀曝露装置に入れ、水銀蒸気5.5-6.7mg/m^3の濃度で3時間曝露を行った。曝露24時間後にエーテル麻酔下で、脳、肺、肝、腎、胎児を摘出した。臓器中の水銀とMT濃度はそれぞれ湿式灰化-還元気化法で、RIA法で測定した。水銀蒸気曝露後24時間目における母体臓器中の水銀濃度は野生型マウスに比べて、MTノックアウトマウスは脳を除いて有意に低く、臓器からの消失速度が速いことを示した。しかしながら、胎盤では両マウス間の水銀濃度に有意な差は認められなかった。胎児中の水銀濃度は野生型マウスに比べて、MTノックアウトマウスが有意に高値を示した。水銀の胎盤から胎児への移行を胎盤/胎児中水銀濃度比で見た場合、MTノックアウトマウスにおいて水銀の胎盤透過性が高いことが明らかとなった。胎盤の可溶性分画のゲル濾過を行ったところ、野生型マウスでは水銀はMT分画に可溶性分画の60%以上水銀が検出された。MTノックアウトマウスでは可溶性分画の水銀の大部分が高分子分画に溶出した。以上の結果より、胎盤中のMTは水銀の胎児への移行に対し、重要な役割を果たしていることが示唆された。
ミクロ細孔場における光触媒活性種の分子設計

金属ポルフィリン錯体は光合成で知られる電荷移動など特殊な機能を持ち、光触媒、光合成の人工化などのあらゆる分野に応用が期待されている。また、最近では錯体の光触媒作用とゼオライトの分子ふるい機能を組み合せるような複合触媒にも注目が集まっている。そこで本研究では、分子動力学(MD)法と量子化学計算を用いてY型ゼオライト中での金属ポリフィリン錯体の配向および電子状態について検討を行った。昨年度、MD法を用いてNaY型ゼオライト中に内包されたCo-ポルフィリンは、Co原子がゼオライトの細孔中心側に露出した湾曲構造をとることを解明した。そこで本年度は、密度汎関数法を用いて酸素分子の活性化機構を均一系のCoポルフィリンとNaY型ゼオライト中に内包されたCoポルフィリンについて比較、検討した。均一系のポルフィリンについて、酸素分子の構造最適化計算を行った結果、Co原子に酸素原子1個が配位している状態が安定であること、Co原子と酸素分子のなす角が115°の時に最安定構造をとることなどが明らかにされた。また、この時の酸素分子の電荷は-0.215となっており、酸素分子の反結合軌道への電子の流入によって酸素分子が活性化されていることが明らかとなった。均一系のCo-ポルフィリンとNaY型ゼオライト中のCo-ポルフィリンについて酸素分子の吸着構造を調べた結果、均一系に比べNaY型ゼオライト中の方が、酸素分子の吸着エネルギーが大きいこと、酸素原子間距離が伸びていること、より酸素分子に電荷が流入しているなどが明らかとなった。つまり、ポルフィリンをNaY型ゼオライト中に内包することにより均一系に比べ、より吸着酸素分子の活性化が促進されることが明らかとなった。
DLK-JNKシグナル系による細胞内輸送制御機構

細胞の分化や機能発現を支える重要な要素の一つである細胞内輸送は、輸送そのものを担うモータータンパク質と、輸送の足場となる細胞骨格に依存する。我々は、JNKの活性化を誘導するタンパク質リン酸化酵素であるDLKが、これら二つに対して別々のルートから影響を及ぼし、細胞内輸送の制御に関わっている可能性を示した。即ち、DLKはJNKの活性化を通して微小管の安定性を制御していることを明らかにしたと共に、JIP1との結合を介してキネシンモーターとカーゴ分子との結合を制御している可能性を示すことができた。これらの研究成果は細胞内輸送制御の原理を理解する新たな糸口を与えるものと考える。細胞の増殖、分化や細胞が持つ独特の機能の発現は遺伝子発現制御の他に、合成したタンパク質(或いは脂質、糖、核酸)を適所に配置するための細胞内輸送制御に大きく依存しており、細胞内輸送の異常は様々な疾患の原因となる。我々はDLK-JNKシグナル系を切り口に、モータータンパク質或は細胞骨格を介した細胞内輸送制御の分子機構解明に向けた研究を進めている。モータータンパク質を介した制御に関しては、JIP1によるキネシンモーターの活性制御に焦点を当てた研究を展開している。JIP1はDLK-JNK経路の足場となると伴に、モーター分子であるキネシンとも結合するタンパク質で、これとJNK及びキネシンとの結合様式の詳細な解析を行った結果、JIP1分子上にキネシンとの結合を制御する領域のあることを見出した。さらにこの領域に結合するタンパク質を同定し、これが細胞内におけるキネシン活性化にどの程度寄与しているかを現在検討している。一方細胞骨格を介した制御に関しては、DLK-JNKシグナル系がキネシン、ダイニンといったモーター分子の足場となる微小管の安定性の制御に関わることを見出した。これは大脳皮質神経細胞初代培養を用いたRNAiベクター導入実験によりDLK、JIP1の軸索形成における機能を検定する実験システムを用いたもので、現在その分子基盤解明に向け微小管のダイナミクスを制御するタンパク質がMUK/DLK-JNK経路のターゲットとなる可能性について検討を進めている。モータータンパク質を介した制御に関しては、DLK-JNKシグナル系の足場として同定されたJIP1によるキネシンモーターの活性制御に焦点を当てた研究を展開している。22年度中に行ったJIP1とキネシンとの結合即ちキネシンの活性化を制御する分子機構についての解析の結果、JIP3のJIP1特定領域への結合がJIP1とキネシンとの結合を著しく高めることを見出すと伴に、JIP3とJIP1の結合を制御する分子の存在を示唆する結果を得た。一方細胞骨格を介した制御に関しては、DLK-JNKシグナル系がキネシン、ダイニンといったモーター分子の足場となる微小管の安定性の制御に関わり、このことが大脳皮質投射ニューロン分化の過程における軸索形成を支える重要な要素となっていることをH21年度中に見出している。H22年度には大脳皮質投射ニューロンの初代培養細胞を用いることにより、いくつかの段階を経て進行する軸索形成の各段階においてDLK-JNK経路の活性及び微小管の安定性が持つ意味が異なることを見出した。さらに、微小管制御タンパク質の中でJNKの基質となる3種類に関するRNAi実験の結果を解析することにより、軸索形成の段階特異的な微小管安定制御の分子機構について検討した。細胞の増殖/分化や細胞が持つ独特の機能の発現は遺伝子発現制御の他に、合成したタンパク質(或いは脂質、糖、核酸)を適所に配置するための細胞内輸送に大きく依存しており、細胞内輸送の異常は様々な疾患の原因となる。これまでにDLK-JNK経路は細胞内輸送経路となる微小管の制御に関わることを見出しているが、23年度中は主としてDLK-JNKシグナル系がJIP1とキネシンの結合に与える影響について検討してきた。前年度までの研究結果からJIP1の特定C末端領域に結合する因子がJIP1とキネシンの結合制御に関わっていることが予想されたので、これの同定を目的とし、神経芽細胞種由来のNeuro2a細胞を用いてJIP1結合タンパク質の同定を試みた。

これにより、JIP3が少なくともNeuro2a細胞においては主たるJIP1結合タンパク質であることが判明するとともに、JIP1上の特定C末端領域へのJIP3の結合がJIP1とキネシンの結合を著しく増強する事が明らかとなった。さらに、DLKのJIP1への結合は、JIP3とJIP1の結合を抑制し得る事を新たに見出した。一方、JNKのJIP1への結合及びJNKの活性化は、JIP1とキネシンの結合に影響を与えなかった。キネシンモーターの活性に影響を与える結合分子はJIP1を始めとして複数知られているが、これらとキネシンとの結合を制御する分子機構についてはほとんど解っていなかった。以上の結果は、この問題の一部を解決するもので、細胞内輸送の制御機構の理解に寄与するものである。細胞内で合成されたタンパク質(或いは脂質、糖、核酸)はそれらを必要とする部位に配置されて初めてその機能を発揮することになる。このような細胞内での物質の移動は、ただ拡散に依存しているのではなく、モータータンパク質と細胞骨格を中心に構成される細胞内輸送システムに大きく依存している。特に神経細胞の軸索における様々な分子や細胞小器官の方向性を持った輸送にはこのシステムが不可欠で、細胞内輸送の異常が神経変性等様々な疾患の原因となることを示唆する研究報告も多い。本研究の期間中、我々はDLK-JNKシグナル系を切り口に、モータータンパク質或は細胞骨格を介した細胞内輸送制御の分子機構解明に向けた研究を進めて来た。24年度には、23年度までにDLK-JNKシグナル系がJIP1とKinesin-1の結合に与える影響について検討した結果を論文にまとめて発表した。JIP1はDLKをはじめとするJNK活性化酵素及びJNKと結合することから、JNK活性化シグナルの足場と位置付けられていたが、後にモータータンパク質Kinesin-1と結合すると共に、Kinesin-1モーターの活性化に寄与することが報告され、種々のカーゴとKinesin-1を繋ぐアダプター分子として細胞内輸送を支えている可能性が指摘されている。我々はJNKの活性化やJIP1への結合がKinesin-1との結合に影響を及ぼすことはないものの、JIP1のリン酸化チロシン結合ドメイン(PTB)に結合するDLKやJI3がJIP1とキネシンの結合制御に関わっている可能性を指摘した。この論文発表の他には、DLK-JNK経路が細胞内輸送の足場となる微小管の安定性を制御する分子機構に関する仮説の検証を行い、JNKが特定の微小管制御タンパク質の安定性をリン酸化により変化させることを示す結果を得ている。当初の目的であったDLK-JNKによるJIP1を介したキネシンモーター分子の活性制御の可能性の検証と分子機構の解明について一通りの決着を見たのに加え、DLK-JNKが細胞内輸送の足場となる微小管の制御に関わる事を明らかにする事が出来、新たな展開を見た。24年度が最終年度であるため、記入しない。1)JIP1とキネシンの結合が、キネシンの活性に与える影響を、GFP-JIP1を導入したNeuro2a細胞を用いたfluorescence recoveryafter photobleaching(FRAP)法により評価する。2)これまでのJIP1とキネシンの結合制御に関する研究成果を論文にまとめて発表する。
大脳新皮質形成過程におけるカハール・レチウス細胞と皮質板細胞のクロストーク

1.マウス胎仔脳への電気穿孔法を用いたEGFP遺伝子導入による移動細胞の可視化(井上、山田、福田):分化直後の神経細胞に特異的にEGFPを発現させて移動過程を可視化する為、子宮内胎仔へのin vivo電気穿孔法により遺伝子導入を行った。すなわち、胎齢13日のマウス胎仔の側脳室にCAGプロモーターにEGFPあるいはDsRed2遺伝子を繋いだプラスミドを注入し、パルス電圧を加え脳室帯で分化直後の神経細胞に遺伝子導入した。これらの細胞がEGFP/DsRed2の蛍光を発しながら脳室帯から皮質板へ移動してinside-outの細胞配置により皮質を形成することを経時的に確認できた。これにより、細胞の発生時期を蛍光で識別することが可能になった。2.皮質板細胞でのCl^-ホメオスタシス調節遺伝子群発現バランスと細胞移動の解析(山田、岡部、福田):子宮内胎仔へのin vivo電気穿孔法により、分化直後の細胞(EGFP蛍光)にKCC2遺伝子を強制発現させ、[Cl^-]_iを低下させた細胞で細胞移動に変化があるかを調べた。まだ例数が少ないため、結論を得るために今後例数を増やす。グラミシジン穿孔パッチクランプ法でCl^-平衡電位を測定し、実際に[Cl^-]_iが低下していることを確認して、移動や[Cl^-]_iとの関係を明らかにする。3.辺緑帯におけるCajal-Retzius細胞間のクロストークの解析(福田、岡部、Luhmann):Cajal-Retzius細胞のグリシン受容体サブユニット(α1-3,β)とKCC2,NKCC1のmRNAの発現パターンを皮質板細胞と比較した。グリシン受容体はいずれもα2/βのヘテロであり、密度はCajal-Retzius細胞>皮質板細胞であった。また、両者ともNKCC1>KCC2の発現パターンを示したが、この傾向はCajal-Retzius細胞でより顕著であった。辺縁帯のtangential sliceを作成し、Cajal-Retzius細胞間のクロストークを膜電位イメージングで可視化したところ、グルタミン酸ではなくGABAとタウリンが興奮の伝播をになっており、NKCC1作用による[Cl^-]_i高値が関与していた。マイクロダイアライシス法ではタウリンが刺激応答的に増加することを発見した。
酸素-18安定同位体リン酸の酵素合成法の開発

リンには安定同位体が複数ないため、野外でリンの動態モニタリング実験が難しい。しかし、酸素の安定同位体(18O)をリン酸に導入すれば、18O-リン酸として追跡できる。18O置換数が異なる18O-リン酸を作るために、いくつかの酵素合成法を検討した。例えば、亜リン酸デヒドロゲナーゼは、NADを補酵素として、亜リン酸を酸化してリン酸を生成する酵素である。18O-H2O中で反応を行えば、18O-リン酸が効率よく合成できた。また、ピロホスファターゼを用いれば、4カ所置換された18O-リン酸が生成した。質量数32のリンはリンの放射性同位体で、これまで様々な分子生物学実験の中で、DNA、RNA、タンパク質(リン酸化)を標識することに用いられてきた。しかし、高エネルギーのベータ線が放出されるため、放射線取り扱い区域のみでの使用が許可されている。残念ながらリンには安定同位体がないので、窒素等の様に安定同位体による野外でのトレース実験が難しい。一方、生体中の核酸やリン脂質などに含まれるリンのほとんどは酸化数+5のリン酸態(PO4)である。従って、酸素の安定同位体(18O)を利用すれば、酸素-18安定同位体リン酸(18O-リン酸)として標識できると考えられる。しかも4カ所の酸素の置換が原理的には可能であり、様々な質量数での置換が可能である。酸素-18安定同位体は自然界にも0.2%の存在比で含まれており、生体や環境への有害な影響は全く認められていないので、生体実験や環境での利用が可能となる。亜リン酸(H3PO3)は酸化数+3の還元型のリン酸で安価に手に入る。亜リン酸デヒドロゲナーゼによる亜リン酸の酸化には水の酸素が使われる。[18O]水中で亜リン酸デヒドロゲナーゼによる亜リン酸の酸化を行った結果、約75%が[18O]安定同位体であるリン酸が合成できた。さらに、加熱による亜リン酸からリン酸への酸化反応に際し、[18O]水による[18O]ラベリングが可能かどうか確認した。1 Mの亜リン酸を[18O]水で溶解してNaOHで中和後、121°Cで2時間加温した。超純水で適宜希釈したサンプルを質量分析計に供し、18Oが導入されたリン酸に該当するピークの強度からその存在比を算出した。その結果、加熱により約50%の亜リン酸が酸化されてリン酸が生成されていたものの、18Oでラベルされたリン酸の割合は2%程度にとどまった。主に溶存酸素(O2)によって亜リン酸が酸化されたことが原因であると考えられた。酵素反応で、酸素-18安定同位体リン酸を合成することが出来た。リンには安定同位体がないため、野外でのトレース実験が難しいとされている。しかし、酸素の安定同位体(18O)を利用すれば、酸素-18安定同位体リン酸(18O-リン酸)として標識できると考えられる。18O-リン酸の国内生産が実現できれば、肥料に限らず、畜産、食品・医薬品製造や環境分野などリン酸の生物学的利用能の評価や動態モニタリングが可能になり、広範な産業分野で活用される可能性がある。置換数が異なる18O-リン酸を作る酵素合成法を確立するために、いくつかの酵素合成法の比較検討を行なった。亜リン酸(H3PO3)は、酸化数+3のリン化合物である。18O-H2O中で酸化することで、18O-リン酸を作り出すことができる。酵素を添加しない(加熱による)亜リン酸からリン酸への酸化反応を行なった結果、生成した18O-リン酸の割合は2%程度にとどまった。主に溶存酸素によって亜リン酸が酸化されたことが原因であると考えられた。亜リン酸デヒドロゲナーゼは、NADを補酵素として、亜リン酸を酸化してリン酸を生成する酵素である。大腸菌由来アルカリホスファターゼは、亜リン酸を酸化することが知られている。しかし、亜リン酸の酸化効率自体が非常に悪いことがわかった。また、ピロホスファターゼによるピロリン酸の加水分解を18O-H2O中で行えば、一カ所18Oで置換される。この反応は可逆的に起こるため、最終的に平衡状態に達した場合には、4カ所置換された18O-リン酸が生成した。また、ポリリン酸分解酵素はポリリン酸を加水分解する酵素である。本酵素を利用することで1カ所置換された18O-リン酸を作り出すことができた。

酸素-18安定同位体リン酸の合成に際し亜リン酸デヒドロゲナーゼだけでなく、今後大腸菌由来アルカリホスファターゼ等も検討する。応用生物工学質量分析計による酸素-18安定同位体リン酸の測定系の構築に時間を要したため、測定回数が予定より少なかった。また、同位体リン酸の合成方法として、本年度行う予定であったアルカリホスファターゼの選定に時間を要したため、次年度に持ち越しが生じた。最終年度である次年度は、測定回数を増やして予定のデータ取りを行う。
旗人から満洲族へ－２０世紀中国理解への新たな視座

本研究では多角的、マクロ的視点から中国近代史における満洲族社会の実態と旗人から満洲族誕生の過程を解明することを目的とし、北京及び満洲地域の清朝末期から中華民国北京政府時期、南京国民政府時期、満洲国時期の旗人・満洲族に関する資料調査を行っている。28年度は採用期間の最終年度であるため、研究課題の総括に取り組んだ。すなわち、清末、中華民国北京政府時期、南京国民政府時期、満洲国時期の旗人・満洲族の各時代の政治的、社会的環境の変化やそれにともなう自己意識の変遷について総括をおこなった。本年度は、前年度から引き続き、1910年代、1920年代の旗人・満洲族に関する資料調査をおこないつつも、特に力を入れたのが、20世紀初頭の清末時期と1930年代ー1940年代の南京国民政府時期、満洲国時期である。北京政府時期の前段階である清末と、後段階である南京国民政府時期、満洲国時期の調査を重点的に行うことで、旗人・満洲族をめぐる通時的変化と空間的な相互関係を明確にした。調査した資料のうち主なものは、清末では、早稲田大学に留学していた旗人留学生恒鈞、烏澤声、穆都哩らが東京で創刊した雑誌『大同報』及び早稲田大学所蔵の清国留学生関連資料、そして北京で恒鈞らが創刊した日刊紙『大同白話報』、『中央大同報』等である。1930年ー1940年代の資料では北京の日刊紙『実報』、奉天の日刊紙『盛京時報』等である。また、北京で実施した調査では、『大同報』の創刊者恒鈞の子孫への聞き取り調査をすることができ、従来知られていなかった恒鈞の民国以降の足跡を知ることができた。これらの調査を通じて旗人・満洲族をめぐる北京と満洲地方の密接な関係性や人の移動・往来、経済的結びつきについて多くの資料を得ることができ、20世紀前半の北京を中心とする華北地方と満洲地方にまたがる広域的マクロ的な旗人・満洲族研究を総括することができた。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は中国近代史における旗人から満洲族誕生の過程を解明することを目的としている。これは清代の、ツングース系満洲人を核としながらも多くのエスニックグループによって構成された多民族社会組織である八旗に所属していた旗人が、清朝崩壊を経て満洲族としての自己意識を形成していく過程でもある。この目的を達成するために中華民国時期の旗人をとりまく政治的、社会的状況を明らかにしつつ、旗人社会の崩壊と自己意識形成について分析する。本研究では清朝政府と中華民国政府によって締結された清室優待条件(清皇族待遇条件と満蒙回蔵待遇条件を含む)により辛亥革命後の1912年以降も存続した八旗が、1924年の北京政変による優待条件修正と1928年の北京政府滅亡にともなう八旗廃止を契機として、清代と民国期の旗人社会の連続性が断絶したととらえ、同時期の新聞、雑誌、旗人の著作などを資料として満洲族誕生の過程を解明する。上記の目的達成のため、本研究では特に清朝及び中華民国北京政府の首都である北京と、清朝発祥の地である満洲という2つの満洲族集住地域を主なフィールドとして設定し調査を行う。平成26年度には北京で調査を行い、清末から民国時期の新聞、雑誌資料を収集した。調査の結果、同時期の北京の庶民(旗人を多く含む)を読者層とする白話報に掲載されていた旗人関連報道を多数収集することができた。また、若手研究者による研究会「順天時報の会」に参加して、北京で発行された日本資本新聞『順天時報』について調査し、北京のメディアを通じて当時の北京旗人社会の実態を解明すると同時に、当時の北京メディア界に関する知見を深めることができた。新聞資料から得られた成果を平成26年7月に中国蘭州市で開催された国際学会「第六届晩清史研究国際学術研討会」で「晩清北京的学堂総弁和白話報ー以宗室女教育家継識一和葆淑舫郡主為例」として発表した。本研究は、中国近代史における旗人から満洲族誕生の過程を解明することを目的としており、その目的のために20世紀における満洲族の社会構造の変化とアイデンティティの形成について分析している。資料としては、主に清朝末期から中華民国北京政府、南京国民政府、満洲国の各時期の新聞資料の旗人・満洲族に関する報道や彼ら自身の投稿などを使用している。なかでも北京の庶民が購読していた白話報『京話日報』、『群強報』、『愛国白話報』などには清室や旗人に関する記事が多い。また日本人経営の保守系漢語新聞『順天時報』にも清室、旗人の記事が豊富である。27年度は前年度に引き続きこれらの北京の新聞資料の分析を行い、さらに北京における資料調査で、『北京女報』や『大同白話報』など新たな資料を収集することができた。さらに、瀋陽地区の旗人・満洲族について分析するため、『盛京時報』の調査も行った。また、若手研究者を中心に組織された研究会「『順天時報』の会」に参加し、北京のメディアや言論空間に対する知見を広げることができた。

本年度の研究成果としては、1928年の北伐以降の北京の資料調査から1930年代の満洲族社会について新たな発見をすることができた。1928年の北伐以降は、満洲族の回想録などの資料によると、北京では排満の風潮が一段と強まり、満洲族であることを表明しづらい雰囲気が醸成されていたというが、1928年以降の新聞資料では確かに満洲族に対する否定的な表現が増加しており、回想資料を裏付けることができた。五族共和が謳われていた北京政府時期と、中華民族主義による同化主義をとる国民政府時期の違いや、それが満洲族のアイデンティティ形成や民族表象の変化に与えた影響を今後も調査していきたい。本研究では多角的、マクロ的視点から中国近代史における満洲族社会の実態と旗人から満洲族誕生の過程を解明することを目的とし、北京及び満洲地域の清朝末期から中華民国北京政府時期、南京国民政府時期、満洲国時期の旗人・満洲族に関する資料調査を行っている。27年度は日本及び中国での資料調査はおおむね順調に進んでおり、調査範囲も1928年以降、1930年代にまで拡大することができた。1928年以降は中華民国北京政府から南京国民政府へと政権が交代し、満洲族を取り巻く政治的、社会的環境も大きな変化に直面していた。八旗が完全に解体し、北京政府時期の五族の一つとしての地位も喪失した満洲族にとっては、国民政府時期は生存のための模索の時代でもあったが、この時代の資料調査から従来知られていなかった満洲族社会の実態を探ることができる資料を得ることができた。28年度も引き続きこれらの資料収集と分析を行っていきたい。28年度は採用期間の最終年度であるため、研究課題の総括に取り組んだ。すなわち、清末、中華民国北京政府時期、南京国民政府時期、満洲国時期の旗人・満洲族の各時代の政治的、社会的環境の変化やそれにともなう自己意識の変遷について総括をおこなった。本年度は、前年度から引き続き、1910年代、1920年代の旗人・満洲族に関する資料調査をおこないつつも、特に力を入れたのが、20世紀初頭の清末時期と1930年代ー1940年代の南京国民政府時期、満洲国時期である。北京政府時期の前段階である清末と、後段階である南京国民政府時期、満洲国時期の調査を重点的に行うことで、旗人・満洲族をめぐる通時的変化と空間的な相互関係を明確にした。調査した資料のうち主なものは、清末では、早稲田大学に留学していた旗人留学生恒鈞、烏澤声、穆都哩らが東京で創刊した雑誌『大同報』及び早稲田大学所蔵の清国留学生関連資料、そして北京で恒鈞らが創刊した日刊紙『大同白話報』、『中央大同報』等である。1930年ー1940年代の資料では北京の日刊紙『実報』、奉天の日刊紙『盛京時報』等である。また、北京で実施した調査では、『大同報』の創刊者恒鈞の子孫への聞き取り調査をすることができ、従来知られていなかった恒鈞の民国以降の足跡を知ることができた。これらの調査を通じて旗人・満洲族をめぐる北京と満洲地方の密接な関係性や人の移動・往来、経済的結びつきについて多くの資料を得ることができ、20世紀前半の北京を中心とする華北地方と満洲地方にまたがる広域的マクロ的な旗人・満洲族研究を総括することができた。本研究では前述のように満洲族の集住地域である北京及び満洲地域をフィールドとして設定して調査を行う予定である。平成26年度は北京の研究機関を訪問して清末から民国時期の新聞、雑誌資料の調査を行った。また、所属機関である東洋文庫所蔵の清末民国期の新聞、雑誌資料も調査することができ、同時期の資料収集は順調に進んでいる。
初期免疫応答におけるビタミンＣの賦活化促進効果と炎症抑制効果の機構解明

本研究では、培養液のビタミンC濃度を、血液中よりもはるかに高い濃度(5 mM)になるように設定し、細胞内外のビタミンCの濃度を高めることで、細胞内の炎症抑制因子の生成が促進される可能性が示唆された。しかし、ビタミンCの炎症抑制因子に対する直接的な作用経路や免疫応答の体系的な作用機序については不明な点を多く残していることから、今後は、免疫応答へのビタミンCによる直接的な影響と、生体内の種々の環境因子との相互作用からもたらされる間接的な影響とを分け、両面からの検討を進めることが重要であると考えている。平成25年度は、樹立細胞系であるヒト白血球細胞を用い、ビタミンCによる免疫応答活性化の評価を検討した。免疫応答のなかでもとくに中心的役割を果たす白血球細胞に着目し、ヒト白血球細胞に対してビタミンCを負荷させることにより、ヒト白血球細胞の増殖および分化程度を詳細に解析した。ヒト白血球細胞の増殖については、細胞内に取り込まれて色素を生じる〔3-(4, 5-ジメチル-チアゾール-2-イル)-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕(MTT)アッセイ法を用いて評価した。また、ヒト白血球細胞の分化程度については、免疫細胞の表面に存在する表面抗原を指標とし、フローサイトメーターにより検出して、評価した。その結果、ヒト白血球細胞へ負荷したビタミンCの濃度により(一部ではビタミンC濃度依存的に)、白血球細胞の増殖割合が変化することが示された。また、表面抗原を指標とした免疫細胞の存在割合についても、負荷したビタミンCの影響を受けることが明らかとなった。これらの過程は必ずしも負荷したビタミンC濃度依存的に認められず、今回行った実験において認められたヒト白血球細胞の増殖・分化における変化の要因は、ビタミンCのもつ様々な化学的特性、ビタミンCとその他の物質との相互作用といった、種々の要因による可能性が想定された。しかし、ここまでの段階では、どのようなメカニズムによって、ビタミンCがヒト白血病細胞の増殖および分化に変化をもたらすかについての明確な情報は得られていない。次年度では、このような研究経過を踏まえ、ビタミンCの濃度依存的に認められる変化とその範囲を明確にし、免疫応答におけるビタミンCのより詳細な分子メカニズムの解明を目指す。痛みや発熱、炎症などに重要な役割を果たすエイコサノイドは、アラキドン酸カスケードを経て合成される。一方、ビタミンCは強い抗酸化性をもっており、免疫系に関与する可能性があると考えられる。そこで、本研究ではビタミンCがアラキドン酸カスケードを介し、免疫応答系に関与するか、関与するのであればその経路、特定部位、特定物質との相互作用などを含めた具体的な作用機序を明らかにすることを目的とした。平成24年度は、ビタミンCおよびその誘導体を負荷し、細胞毒性および細胞内取り込み量の検証などを実施したほか、免疫モデル系としてヒトマクロファージ・好中球を使い、アラキドン酸カスケードの主要律速酵素活性などについて、ELIZA法を用いて検討した。その結果、ビタミンCはアラキドン酸カスケードに関与する可能性があるのではないかと考えられたが、具体的な作用機序については特定できなかった。現在は、特定の酵素のノックダウンを行った条件下でビタミンCの影響を検討するため、特定酵素のsiRNAによるノックダウン効率の検討中である。当初、実験計画で予定していた白血球細胞であるHL-60細胞の生育が不調であったため、平成26年度は、HL-60と同じくヒト白血病由来であり、急性単球性細胞であるTHP1を代用することにより、ビタミンCによる免疫促進効果を主に2つの方法で評価した。免疫反応の過程で、白血球内では抗原の酸化的な分解が誘導されることから、この酸化レベルを一つの指標として、ビタミンCの負荷時における酸化レべルの評価を行った。その結果、免疫活性剤により活性化されたTHP1細胞では、ビタミンCの負荷によって、酸化レベルに大きな差異は認められなかった。また、ビタミンCに対する濃度依存的な変化も確認されなかった。免疫反応の初期では、酸化的環境がごく局所的に発生している可能性も考えられ、より検出感度の高い評価法を検討する必要があると考えられた。一方、免疫応答において、酸化的環境を誘導する際のスイッチとなるタンパク質の発現レベルをウエスタンブロッティング法により解析した。その結果、ビタミンCの負荷により、酸化的な環境を誘導するタンパク質の発現が有意に増加していることが確認された。さらに、本タンパク質は情報伝達物質による活性化に伴い、細胞膜上へ移行することが報告されていることから、免疫活性剤で処理したTHP1の細胞膜を分画し、膜画分におけるタンパク質発現量を解析した。膜画分では、細胞の活性化状態にかかわらず、ビタミンCの負荷によるタンパク質の発現レベルの増加が認められた。添加したビタミンCの濃度依存的な変化は認められなかった。これらの結果より、ビタミンCを負荷することによって、一過性に免疫応答の一部が誘導、または活性化される可能性は否定できないものの、そのメカニズムや時間的経過等を含め、さらなる詳細な検証が必要であることが示された。平成27年度は、ヒト由来の単球様細胞であるTHP-1細胞を用い、免疫応答におけるビタミンCの影響を遺伝子レベルで評価した。単球様細胞であるTHP-1細胞は、phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)で刺激することにより、浮遊細胞から接着細胞変化し、免疫応答の初期過程で重要な役割を果たすマクロファージ様の性質を示す。

そこで、THP-1細胞をPMAで刺激してマクロファージ様に分化させ、これらに対するビタミンCの影響を解析した。その結果、免疫応答に関連するいくつかの遺伝子において、ビタミンCの負荷による発現変化が認められた。また、細胞内レドクッス環境に関連する遺伝子についても検討したところ、いくつかの遺伝子発現がビタミンCの負荷によって変動した。これらの遺伝子発現の変化は、ビタミンCによる細胞内のレドックス環境の変化に応じて変動している可能性も高いため、ビタミンC以外の酸化剤や還元剤による遺伝子発現変化を測定した。その結果、レドックス環境に影響を受ける因子と受けない因子が認められ、その変化の程度やパターンについては、酸化剤や還元剤の付加した濃度によってさまざまな影響を受けている可能性が示された。これらの結果は、必ずしも細胞へ負荷したビタミンCや酸化剤、還元剤の濃度依存的に認められず、さまざまな細胞内環境の影響を受けている可能性が示唆された。本研究で認められたマクロファージ様細胞における遺伝子発現変動のメカニズムについて明らかにできていないが、ビタミンCによる直接的な影響だけでなく、ビタミンCとその他の因子との相互作用による細胞内環境の変化による影響も関与している可能性が示唆された。本研究では、培養液のビタミンC濃度を、血液中よりもはるかに高い濃度(5 mM)になるように設定し、細胞内外のビタミンCの濃度を高めることで、細胞内の炎症抑制因子の生成が促進される可能性が示唆された。しかし、ビタミンCの炎症抑制因子に対する直接的な作用経路や免疫応答の体系的な作用機序については不明な点を多く残していることから、今後は、免疫応答へのビタミンCによる直接的な影響と、生体内の種々の環境因子との相互作用からもたらされる間接的な影響とを分け、両面からの検討を進めることが重要であると考えている。平成26年度に所属機関を異動したことにより、異動先の所属機関において、実験台の設置工事、および実験機器の据え付け工事などの研究環境の整備に時間を要し、当初、計画していた研究が予定よりも進まなかったため。分子栄養学当初、計画していた最終年度の研究計画の通り、ビタミンCの免疫応答変化を細胞レベルで検証するため、免疫化学染色法やELIZA法を使った解析を実施する。また、細胞内の酸化状態を評価するための高感度な測定系を検討し、ビタミンCの負荷時における細胞内の酸化レベルの評価を行う予定である。本年度は、樹立細胞系を用いて、ヒト白血球細胞に対するビタミンCの影響を詳細に検討してきた。しかし、実験に使用している樹立細胞系であるヒト白血球細胞の増殖程度が一定でなく、増殖に時間を要する場合がある。また、サイトカインの分泌レベルなどは継時的に変化することから、実験結果の再現性が十分に取れないものも多かった。そのため、実験試料の収集や解析結果の検証に時間を要したことが大きい。交付申請書に記載されている研究計画に従って研究を実施したところ、アラキドン酸カスケード主要律速因子のsiRNAノックアウトモデルの設計に時間を要したため、現在も引き続きsiRNAのノックダウン効率についての検証を行っている。