hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
後期中等教育におけるコンピテンシー・ベースの職業教育の可能性に関する調査研究

本研究の目的は、後期中等教育での職業教育が学習者の学力形成および進路形成に対してもつ効果について、とくに特定の職業的スキルに限定されない教科横断的な能力の形成に焦点を当て、実証的に検討することにある。平成30年度の研究実績の概要は、以下のとおりである。第一に、職業教育における能力と知識の位置づけと特徴について、普通教育との関連性の視点から先行研究に基づき検討をした。これまで職業教育を通して伝達される知識は、文脈依存的で個々の知識の関連づけが希薄な水平的構造をもつものとして捉えられてきた。これは、普通教育がもつ垂直的な構造、すなわち知識が相互に関連づけられ、より上位の知識へと統合される特徴とは対照的な位置づけである。このことから、職業教育を通した能力形成の取り組みについて、1「身につけさせたい能力」として何が、どの程度明確に設定されているのか、2カリキュラムが目標に準拠した垂直的な構造となっているのか、あるいはより水平的な構造をなしているのか、に着目して分析をすることが有効である点が示唆された。第二に、職業教育を通した能力形成の先行事例として、スーパー・プロフェッショナル・ハイスクール(以下、SPH)指定校の取り組みを実績報告書をもとに分析した。その結果明らかになったのは以下の点である。(1)「身につけさせたい能力」として、各指定校は専門的なスキルだけでなく、課題解決能力や協働性といった一般的汎用的な能力を提示していた。また、各専門科目とこれらの能力との対応関係を示し、教育課程に位置づける試みがなされていた。(2)しかし、各専門科目間および普通科目との間で取り組みの関連づけが必ずしも明確におこなわれているわけではなかった。また、生徒の活動に対する評価について、ある取り組みのなかでどの程度個々の能力は示すことができたか、といった文脈依存的な評価が実施される傾向が見られた。現在までの進捗状況について、「やや遅れている」と自己評価する理由は、以下のとおりである。第一に、事例校における質問紙調査および聞き取り調査を実施できていない。「研究実績の概要」で述べたように、平成30年度は、今後の事例研究に向けての理論枠組の構築と、先進事例であるSPH指定校の取り組みの予備的分析を中心に研究を展開したが、枠組みの構築と資料の収集に多くの時間を費やし、事例研究の実施にまでは至らなかった。しかしながら、職業教育を通したコンピテンシーの形成過程を、学習者の認識まで視野に入れて解明するためには、事例校での時系列的なデータの収集が不可欠である。第二に、国内外の職業教育改革に関する理論的検討の不足である。「職業教育を通した能力(コンピテンシー:competency)の形成過程」に関するモデル構築の基盤として、「普通教育と職業教育の分化と接近」に関する諸研究、およびアカデミックな教育と職業教育との「評価の同等性」(parity of esteem)に関する諸研究の成果の整理が必要である。とりわけ、「評価の同等性」に関する研究の整理は、職業教育の効果の測定、後期中等教育における多様な学習成果の評価手法の開発に向けての基礎的研究として喫緊の課題である。しかし、資料の収集、読み込み等、十分な検討がおこなわれていない状態である。今後は、英米を中心に蓄積が見られる上記の諸研究に、本研究の知見を位置づける作業を進める必要がある。上記「現在までの進捗状況」の現状を踏まえ、今後は1事例校における量的および質的データの収集と分析、2調査の分析結果および理論的検討に基づく「職業教育を通したコンピテンシーの形成過程」に関する理論構築とその精緻化、の二つの研究を進めていく必要がある。その方策は以下のとおりである。第一に、事例校におけるデータの収集と分析についてである。現在、事例校である工業高校2校、商業高校2校での、生徒を対象とした質問紙調査の準備を進めている。この調査は、高校の職業教育が学習者の能力アイデンティティの形成にいかなる効果をもつのか検討するためのものであり、「職業教育の有意性の認識」「職業科目と普通科目との関連性の認識」「現在の学習内容と進路との関連性」の観点から実施される予定である。また、分析結果を調査対象校にフィードバックする過程で、当該高校における「身につけさせたい能力」の設定状況、生徒の学習活動に対する評価方法の現状、職業科目と普通科目との連携の現状と課題について、聞き取りと資料収集の場を設定する。ここで収集されるデータに基づいて、職業教育を通したコンピテンシー形成の現状と課題をより詳細に検討する。第二に、「職業教育を通したコンピテンシーの形成過程」に関する理論構築とその精緻化については、平成30年度に引き続き「職業教育と普通教育の分化と接近」に焦点を当てた理論的・実証的研究の文献収集および読み込みをおこなう。これに加えて2019年度は、とくに英国において蓄積が進展しているアカデミックな教育と職業教育との「評価の同等性」に関する研究、および職業教育改革に関する研究の知見を再検討する。これらの検討を通して、後期中等教育における職業教育の意義を能力形成の観点から捉え直すための理論的枠組の構築を図る。

これまで職業教育を通して伝達される知識は、文脈依存的で個々の知識の関連づけが希薄な水平的構造をもつものとして捉えられてきた。これは、普通教育がもつ垂直的な構造、すなわち知識が相互に関連づけられ、より上位の知識へと統合される特徴とは対照的な位置づけである。このことから、職業教育を通した能力形成の取り組みについて、1「身につけさせたい能力」として何が、どの程度明確に設定されているのか、2カリキュラムが目標に準拠した垂直的な構造となっているのか、あるいはより水平的な構造をなしているのか、に着目して分析をすることが有効である点が示唆された。第二に、職業教育を通した能力形成の先行事例として、スーパー・プロフェッショナル・ハイスクール(以下、SPH)指定校の取り組みを実績報告書をもとに分析した。その結果明らかになったのは以下の点である。(1)「身につけさせたい能力」として、各指定校は専門的なスキルだけでなく、課題解決能力や協働性といった一般的汎用的な能力を提示していた。また、各専門科目とこれらの能力との対応関係を示し、教育課程に位置づける試みがなされていた。(2)しかし、各専門科目間および普通科目との間で取り組みの関連づけが必ずしも明確におこなわれているわけではなかった。また、生徒の活動に対する評価について、ある取り組みのなかでどの程度個々の能力は示すことができたか、といった文脈依存的な評価が実施される傾向が見られた。現在までの進捗状況について、「やや遅れている」と自己評価する理由は、以下のとおりである。第一に、事例校における質問紙調査および聞き取り調査を実施できていない。「研究実績の概要」で述べたように、平成30年度は、今後の事例研究に向けての理論枠組の構築と、先進事例であるSPH指定校の取り組みの予備的分析を中心に研究を展開したが、枠組みの構築と資料の収集に多くの時間を費やし、事例研究の実施にまでは至らなかった。しかしながら、職業教育を通したコンピテンシーの形成過程を、学習者の認識まで視野に入れて解明するためには、事例校での時系列的なデータの収集が不可欠である。第二に、国内外の職業教育改革に関する理論的検討の不足である。「職業教育を通した能力(コンピテンシー:competency)の形成過程」に関するモデル構築の基盤として、「普通教育と職業教育の分化と接近」に関する諸研究、およびアカデミックな教育と職業教育との「評価の同等性」(parity of esteem)に関する諸研究の成果の整理が必要である。とりわけ、「評価の同等性」に関する研究の整理は、職業教育の効果の測定、後期中等教育における多様な学習成果の評価手法の開発に向けての基礎的研究として喫緊の課題である。しかし、資料の収集、読み込み等、十分な検討がおこなわれていない状態である。今後は、英米を中心に蓄積が見られる上記の諸研究に、本研究の知見を位置づける作業を進める必要がある。上記「現在までの進捗状況」の現状を踏まえ、今後は1事例校における量的および質的データの収集と分析、2調査の分析結果および理論的検討に基づく「職業教育を通したコンピテンシーの形成過程」に関する理論構築とその精緻化、の二つの研究を進めていく必要がある。その方策は以下のとおりである。
新規銀ナノ粒子触媒を用いた環境調和型酸化反応系の開発

本研究では、酸化剤として水や酸素(空気)を用いた液相酸化反応において、銀ナノ粒子の新しい触媒作用を見出し、クリーンかつ高効率な新規不均一系酸化触媒プロセスを開発することを目的としている。これまでにハイドロキシアパタイトやハイドロタルサイト上に、サイズ制御された銀ナノ粒子を調製することに成功し、液相でのアルコール脱酸素反応を応用したエポキシドの脱酸素化反応によるオレフィン生成に高活性な触媒系を見出した。本年度は、昨年度までに得られた知見をもとに新たな銀ナノ粒子触媒の調製を行った。これまで、無機担体上へのナノ粒子の固定化を行ったが、担体表面と銀ナノ粒子の接合界面を設計することでより高活性が得られると考えられる。そこで、銀ナノ粒子の表面を塩基性無機化合物超微粒子でおおわれた複合型銀ナノ粒子触媒を設計した。コアシェル型の構造をとる本触媒は、アルコール酸化を利用したエポキシドの脱酸素だけでなく、水素分子を用いたエポキシドの脱酸素化反応に従来の担持型銀ナノ粒子よりも高活性を示すことがわかった。触媒は反応後に容易に分離して回収再使用することができる。このような接合界面の設計は、これまでの不均一系触媒分野において新たな研究領域である。コアとなる金属ナノ粒子とシェルの組み合わせや、ナノ粒子の形状、細孔構造、酸塩基性など、触媒設計の自由度は極めて高く、今後さらに高活性な新規触媒系が開発できると期待される。特に、安全・安価な水を用いた反応系は、水が酸素源としても重要であるとともに、反応溶媒としても安全であり、有害な有機溶媒を代替することができる点が優れている。これまでにハイドロキシアパタイトやハイドロタルサイト上に、サイズ制御された銀ナノ粒子を調製することに成功している。液相でのアルコール脱酸素反応を応用することで、新たにエポキシドからの脱酸素化反応によるオレフィン生成に高活性を示すことを見出した。これまで、エポキシドの脱酸素化反応は、効率的な触媒系がなく未開拓の官能基変換法であったが、効率的かつ高選択的にオレフィンへの変換に成功した。本反応では、酸素アクセプターとなるアルコールの脱水素で生成する銀ヒドリド種を利用しており、副生成物は、2-プロパノールを用いた場合にはアセトンと水のみである。さらに、本触媒は、回収・再使用が可能な触媒であることがわかった。さらに、ヒドリド種を鍵とするニトロ基の選択的還元反応などに応用が可能である。これらの知見は、本研究で目的とする銀ナノ粒子の新規触媒機能の開拓と新規化学プロセスへの展開において、既存の反応系を一新する可能性が極めて高い。さらに、当初目標の一つであった、シクロヘキセンへの酸素官能基導入に展開している。
コンクリート細孔に存在する凝縮水の圧力変動と移動による構造物動的応答の変化

研究は載荷速度の異なる一軸圧縮試験及び四点曲げ試験およびRC梁の高速載荷実験を行った.その結果,低W/Cほどひずみ速度効果による圧縮強度,横弾性係数の増加が現れた.一方,RC供試体の四点曲げ試験では,準高速載荷において湿潤状態のRC供試体の引張強度の増加が示された.以上より,微小細孔内における正の水圧及び微細ひび割れ内の負の水圧が含水コンクリートのひずみ速度効果を発現させる要因の一つであることを示唆した.研究は載荷速度の異なる一軸圧縮試験及び四点曲げ試験およびRC梁の高速載荷実験を行った.その結果,低W/Cほどひずみ速度効果による圧縮強度,横弾性係数の増加が現れた.一方,RC供試体の四点曲げ試験では,準高速載荷において湿潤状態のRC供試体の引張強度の増加が示された.以上より,微小細孔内における正の水圧及び微細ひび割れ内の負の水圧が含水コンクリートのひずみ速度効果を発現させる要因の一つであることを示唆した.コンクリート細孔中の凝縮水の水圧変化が構造物の動的応答に及ぼす影響を定量的に明らかにすることが,本研究の目的である.粘弾性体である水の物理的性質に着目し,細孔内の凝縮水の動態という微小現象から,マクロなコンクリート構造物の動的応答を明らかにするところに,本研究の眼目がある.最終的には,道路橋設計荷重に衝撃を考慮するための割増係数と,水の存在による材料係数の低下という,個別に簡易な手法によって考慮されてきた損傷促進要因を,水の動態という機構に基づき一貫して評価する手法の構築を目指している.本研究では3つのステップを想定している.1.飽和コンクリートの細孔構造と短時間外力による変形特性の関係を定量的に調べる実験,2.含水状態の違いが短時間外力に対する構造物の動的応答に与える影響を調べる実験,3.細孔中の水の影響を考慮したコンクリート材料の構成則の提案と検証(H2426)である.そのうち,平成24年度は段階1の実験および3の構成則の大まかな提案を行うことができた.具体的には,1.では水セメント比および混和剤により硬化体中の細孔状態の異なるコンクリート円柱供試体を5水準作成し,ひずみ速度に換算するとおよそ100倍異なるふたつの載荷速度を用いて,強度試験を行い,動的計測システムを用いてサンプリング速度100Hzで応力-ひずみの性状を詳細に記録した.その結果,当初予測どおり高速載荷時は,含水によりコンクリートの見かけの剛性が増加すること,破壊が脆性的になることを確認した.また,これらの力学的特性の変化とセメント硬化体の細孔分布の関連が示唆された.この結果をもとに,力学特性に細孔量と細孔径の分布をとりいれた応力-ひずみモデル構築の方針を決定し,簡易なモデルを提案した.これらの成果をとりまとめ,査読付き論文集への投稿を行った(現在審査中).コンクリート細孔中の凝縮水の水圧変化が構造物の動的応答に及ぼす影響を定量的に明らかにすることが,本研究の目的である.全体計画の3つの項目,1.飽和コンクリートの細孔構造と短時間外力による変形特性の関係を定量的に調べる実験,2.含水状態の違いが短時間外力に対する構造物の動的応答に与える影響を調べる実験,3.細孔中の水の影響を考慮したコンクリート材料の構成則の提案と検証,のうち,本年は1と2を実施した.1.については,昨年度に引き続き,水セメント比のパラメータを増やし,縦ひずみに加え横ひずみについても測定を行った.また,水銀圧入試験を実施し,各試験体の細孔構造を調べ,構成則の提案と検証のためのデータを取得した.この結果,細孔中の水圧に起因すると思われるポアソン比の変化をとらえ,動的挙動に影響を及ぼす細孔径の絞り込みができた.圧縮強度増加倍率では一部の供試体で増加倍率が1以下の値を示したが,圧縮試験,曲げ試験共に増加率は1.11.4の範囲であり,既往の研究と同様な傾向を示した2.については,10cm-10cm-40cmの小型試験体(無筋およびRC)による高速曲げ試験を実施した.引張強度増加倍率ではRC,無筋供試体共に増加倍率は1以上を示し,増加傾向にあることが確認された.しかし,供試体の個体差が大きく,既往の回帰式とは異なる傾向となった.また,載荷速度が増加するとコンクリートと鉄筋の付着切れが生じにくい傾向が示された.さらに,イギリス,ヘリオットワット大学の高速移動荷重載荷装置GRAFTIIを用いた6.0m梁の高速載荷実験を行った.1体は静的載荷により基本的破壊性状を確認した.残り3体については,時速換算で3300km/hとなるように載荷速度を調整した疲労実験を実施中である.「研究の目的」本研究の目的は,含水コンクリートのひずみ速度効果発現メカニズムを検討し,コンクリート細孔内の自由水がひずみ速度効果に影響を及ぼすメカニズムを明らかにすることである.「研究実施計画」に基づく実績の概要・具体的内容・含水コンクリートのひずみ速度効果発現メカニズムを載荷速度の異なる一軸圧縮試験及び四点曲げ試験を用いて検討した.コンクリートの一軸圧縮試験では,載荷速度,W/C,含水状態をパラメータとし載荷試験を実施した.ひずみ速度効果を検討するため載荷速度は高速及び低速とした. W/Cはコンクリートの細孔構造の違いによる,自由水の量や存在スケールが及ぼす影響を検討するためとした.

コンクリート細孔内に存在する自由水の有無がひずみ速度効果に及ぼす影響を把握するため,含水状態を設定した.その結果,ひずみ速度上昇に伴い圧縮強度及び縦弾性係数の増加は供試体条件に関わらず確認されたが,横弾性係数の増加は湿潤状態供試体のみ示した.また,低W/Cほどひずみ速度効果による圧縮強度,横弾性係数の増加が現れた.一方,RC供試体の四点曲げ試験では,載荷速度,引張鉄筋の有無,含水状態をパラメータとし載荷試験を行った.準高速載荷において湿潤状態のRC供試体の引張強度の増加が示された.さらに,乾燥後に水を再浸漬させた供試体でも,ひずみ速度効果による引張強度の増加が示された.以上の結果より,微小細孔内における正の水圧及び微細ひび割れ内の負の水圧が含水コンクリートのひずみ速度効果を発現させる要因の一つであることを示唆した.・意義・コンクリート内部の微小水圧がひずみ速度依存性に関与することを,実験および簡易数値モデルによって明らかにすることができた.・重要性・国内外で100年前から知られているひずみ速度依存性についてそのメカニズムの一端を示したことは重要な成果である.26年度が最終年度であるため、記入しない。コンクリート工学構造工学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定どおり3段階のうちに最初の材料実験を行った.結果は査読付き論文集へ投稿することができた(現在審査中).ただし実験はこれで完了ではなく,さらにパラメータを絞った確認実験を本年度継続する予定である.また,3段階のうちの最終段階と位置付けている力学モデルの構築について,方向性を得ることができた.簡易モデルを提案し,実験結果との比較検証を行った.順調に進展していると言える.予定していた実験を実施中で,データも蓄積されており,おおむね順調であると自己評価している.26年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,要素実験を継続するとともに,新たに水銀圧入試験によるコンクリート細孔構造の分析を追加実施する予定である.申請当初は計画していなかったが,昨年度の結果から最終目標であるモデルの構築には細孔構造の詳細な分析が不可欠であるとの判断に至った.引き続き実験を継続し,データの収集を行うため,現時点で認識している課題2点とその対応策について述べる.一つ目は,小型梁の実験において,既存の載荷装置では載荷速度を一定以上増加させることが困難という点である.これについて,新たな特注載荷装置を設計し,発注を行う予定である.もう一つは,研究協力者に依頼している大型梁の実験で,当初の載荷速度と載荷荷重の大きさでは,載荷中の振動により試験体の安定性が損なわれ,安全装置が働き実験がストップしてしまう点である.これについては,載荷フレームの補強を依頼するとともに,安全性に問題がない範囲で実現可能な載荷スピードと荷重の大きさを選定し,数値解析にて当初計画からの変更の影響を検討することで,対応をはじめている.26年度が最終年度であるため、記入しない。次年度以降は,当初計画に追加した上記の細孔構造の分析とともに,構造物実験を行う予定である.両試験の実施には他大学あるいは他の研究機関の施設を借用する予定である.また,構造物実験に用いる試験体は鉄筋や型枠の加工に特殊な技能が必要となるため,専門技術を有する機関に委託する予定である.研究協力者に依頼していた実験に関する諸費用は,相手方の通貨ポンドで計算された.為替の変動や送金手続き等の費用を日本円で確定した結果,次年度繰越分が発生した.次年度も引き続き実験を依頼する予定であり,その費用に充てるものとした.
各種薬剤溶出性ステント術後の傷害血管修復機転に関する研究

本研究では第二世代の薬剤溶出性ステント(DES)であるゾタロリムス溶出性ステント(ZES)、エベロリムス溶出性ステント(EES)における移植後の傷害血管修復機転を検討し、ベアメタルステント(BMS)および第一世代のDESと比較した。その結果ZES、EESともにBMSと比べ、移植後の血管内皮前駆細胞(EPC)の動員に伴う再内皮化が抑制され、そのため遠隔期に炎症反応が再燃する可能性が示唆され、第二世代のDESであってもこうした傷害血管の修復過程の問題は未解決であることが明らかとなった。当初は第一世代の薬剤溶出性ステント(DES)であるシロリムス(SES)、パクリタキセル溶出性ステント(PES)と第二世代のDESであるゾタロリムス溶出性ステント(ZES)とを比較する予定であったが、最近SESおよびPESは実臨床の場ではほとんど使用されなくなった。一方ZES植え込み10カ月後の剖検例の組織学的検討で再内皮化障害、潰瘍形成やマクロファージの集籏、ポリマー貪食像、新生血管などの炎症反応が観察されたことからZESであってもSES同様傷害血管の修復機転の遅延化、遠隔期の炎症機転の再燃が示唆された。こうした中新たに第二世代のDESとしてエベロリムス溶出性ステント(EES)が登場したことから、ZES、EESとベアメタルステント(BMS)の3者間で傷害血管の修復機転を比較することとした。植え込み1週間でピークとなる骨髄由来幹細胞(CD34+cell)および血管内皮前駆細胞(EPC : CD34+/CD133+/CD45^<low>cell)の末梢血への動員を評価するため、フローサイトメトリーでの基礎実験を繰り返し、安定した測定技術を確立した。その後少数例(8例)ではあるが実際のステント例で植え込み前、1週間後の末梢血のCD34+cell数およびEPC数の測定を行った。その結果、CD34+cell数およびEPC数とも植え込み前に比べ1週間後BMS例では増加、EESではやや増加、ZESでは減少した。特にEPC数の変化率はBMS : 48%, EES : 12%, ZES : -24%であった。ステント植え込み後の傷害血管の修復に必須の機転である再内皮化内皮細胞が一部骨髄由来EPCの分化によるものであることから、これらの結果はZESよりもEESのほうがより生理的に血管修復される可能性があることを示唆する。今後はさらに症例を加えて同様の検討を行うとともに、遠隔期のステント植え込み部位の血管修復状況を光干渉断層法(OCT)による画像診断で定量評価し、CD34+cell数やEPC数との関連を検討する。さらにはCD34+cellやEPCの動員に先立ち、植え込み後48時間後にピークを示す局所血管壁の炎症機転を各種炎症マーカーの測定により評価し検討を加える。またヒト末梢血単核細胞から血管内皮細胞への分化に対するゾタロロリムスおよびエベロリムスの影響を検討するin-vivoの実験に関しては、実験系を確立したので今後本実験を進めていく予定である。平成23年度は第二世代のDESであるゾタロリムス溶出性ステント(ZES)、エベロリムス溶出性ステント(EES)とベアメタルステント(BMS)の3者間で傷害血管の修復機転を比較した。植え込み1週間でピークとなる骨髄由来幹細胞(CD34+cell)および血管内皮前駆細胞(EPC:CD34+/CD133+/CD45^<low>cell)の末梢血への動員をフローサイトメトリーで評価した。ステント留置25症例(ZES:9例、EES:7例、BMS:9例)において留置前、1週間後の末梢血CD34+cell数およびEPC数の測定を行った。特にEPC数の変化率はBMS:74%,ZES:19%,EES:-10%であった。ステント植え込み後の傷害血管の修復に必須の機転である再内皮化内皮細胞が一部骨髄由来EPCの分化によるものであることから、これらの結果はZESよりもEESのほうがより生理的に血管修復される可能性があることが示唆された。また遠隔期のステント留置部位の血管修復状況を光干渉断層法(OCT)画像上ステント表面の新生内膜の被覆度で評価した。

現在9症例12病変で解析が終了しており、ステントごとの%非内膜被覆率(非被覆ストラット数/全ストラット数)がDES:0.55%、BMS:0.32%とDESで大であったことからDESにおける遠隔期の血管修復の遅延が示唆された。さらにステント留置遠隔期に再狭窄のなかったDES:53例およびBMS:50例で比較すると、DES群でIL-6(p=0.003)およびIL-8(p=0.015)が高値であった。これらの結果からDESの場合留置後急性期には炎症反応は抑制されるが、遠隔期になると血管修復の遅延のため炎症が再燃し遷延化する可能性が考えられた。平成24年度はさらに症例を重ねて検討を続けるとともに、一部の症例では遠隔期の再内皮化を血管内視鏡での評価も行う。さらにヒト末梢血単核細胞から血管内皮細胞への分化に対するゾタロリムスおよびエベロリムスの影響を検討するin-vitroの実験も進め、薬剤溶出性ステント術後の傷害血管修復機転に関する我々の仮説を基礎的・臨床的に検証していく。平成23年度に引き続き第二世代の薬剤溶出性ステント(DES)であるゾタロリムス溶出性ステント(ZES)とエベロリムス溶出性ステント(EES)における傷害血管修復機転を検討し、ベアメタルステント(BMS)との比較を行った。フローサイトメトリーによる末梢血血管内皮前駆細胞(EPC: CD34+/CD133+/CD45lowcell)数の評価では冠動脈ステント留置全38例(年齢70±9歳、BMS15例、ZES9例、EES14例)において留置前に比べ、7日目の変化率はBMS、ZES、EESの各群でそれぞれ74±59%、13±55% (P<0.05 vs BMS)、1±40% (P<0.001 vs BMS)であり、そのうち17例(BMS5例、ZES6例、EES6例)で光干渉断層法(OCT)による遠隔期(平均10か月)のステント表面の新生内膜被覆度の観察したところ、非被覆化率はそれぞれ2.4±4.0%、2.6±1.9%、41.6±25.6% (P<0.001 vs BMS)であった。そして7日目のEPC数の変化率と新生内膜非被覆化率との間には負の相関(R=0.42, P<0.05)が見られた。また本年度は新たにin-vitroの検討を行った。健常例5例から末梢血幹細胞を抽出し、VEGFを含む内皮環境下での培養を行ったところCD31陽性血管内皮様細胞へと分化した。次にこれらの培養時にシロリムス、ゾタロリムス、エベロリムスの3薬を添加すると(0.01, 0.1, 1 nM)、コントロール(100%として)に比べ内皮様細胞への分化はシロリムス(各容量でそれぞれ28%, 19%, 2%)、ゾタロリムス(34%, 23%, 7%)、エベロリムス(44%, 47%, 4%)の順に抑制された。以上の結果から第二世代といえどもDES留置後の傷害血管の修復過程には問題があることが明らかとなった。実験系の確立に時間を要したこと、臨床研究においては研究に適した症例が少ないことや患者の同意が得にくいこと、遠隔期までのフォローアップまでに脱落する症例があることなど、またin-vitroの実験においてはエベロリムス・ゾタロリムスの実験用原末の入手の遅延などがその原因と考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。対象症例数は着実に増えており、本年度で結果が出せるだけの数が集まる見込みである。患者同意を得るために、時間をかけて誠意ある説明を行うこととする。対象例に対し急性期EPCの経時的測定と遠隔期OCT、一部血管内視鏡を行う。急性期、遠隔期の保存血清で、炎症・酸化ストレスマーカーの測定を行う。データ収集に際してはこれを迅速に行い、すみやかに解析する。in-vitroの実験においてはヒト末梢血単核細胞から血管内皮細胞への分化と同時に培養血管内皮細胞(冠動脈内皮細胞)を用いた検討も行う。
赤血球前駆細胞を利用した転写翻訳に依存しない概日リズム発振機構の解明

概日リズムの発振には、時計遺伝子の転写・翻訳が不可欠とされてきたが、近年これらの過程に不依存なリズムが報告されている。本研究ではこのようなリズムの発振機構と、概日リズムと細胞内レドックス制御の関連の解明を目指した。まず赤血球前駆細胞株を除核細胞に分化させ、抗酸化蛋白質ペルオキシレドキシンのウェスタン解析を行ったが、ヒト赤血球で報告された酸化リズムはまだ再現できていない。またレドックス制御関連化合物ライブラリーのスクリーニングを行ったところ、概日リズムの位相を制御する化合物が得られた。この化合物の作用機構の解明を通じて、概日時計機構におけるレドックス制御の意義が明らかになることが期待される。平成26年度は実験系の確立を目指した。赤血球は核をもたないため遺伝子の転写が起こらないことから、時計遺伝子の転写翻訳のフィードバックループに依存しない概日リズムの研究に適している。MEDEPBRC5はマウスES細胞由来の赤血球前駆細胞株であり、Stem cell factor存在下で未分化状態を維持しながら増殖し、Erythropoetin (EPO)存在下で赤血球様の細胞に分化する(Hiroyama et al. 2008, PLoS ONE e1544)。MEDEPBRC5をEPO存在下で培養したところ細胞が赤色を呈したことから、ヘモグロビンを合成できる赤血球様の細胞へ分化を進めることはできたと考えられる。次にライトギムザ染色により細胞の形態を観察したが、すべての細胞が脱核赤血球に分化するには至っていないようであった。また細胞培養の検討と並行して、細胞内の酸化還元状態をモニターする系の確立を試みた。26年度は培養が容易なヒトU2OS細胞を用いて、まず抗酸化蛋白質であるPeroxiredoxinの過酸化型の蓄積をイムノブロッティングにより検出した。細胞を様々な濃度の過酸化水素に短時間暴露した後経時的に細胞抽出液を調製し、抗体を用いて過酸化型ペルオキシレドキシンの検出を行ったところ、過酸化水素濃度に応じて異なる挙動を示したため、現在さらに実験を進めている。また、酸化還元状態感受性蛍光蛋白質Redoxfluor (Yano et al. 2010, MCB 30 3758)を利用して、酸化還元状態を無侵襲で長時間測定できる系の確立を試みた。Redoxfluorは環境の酸化還元状態によりFRET効率が変化する。まずU2OS細胞にRedoxfluor発現プラスミドを導入し、得られた複数の安定発現株に関して、蛍光プレートリーダーを用いて測定条件の検討を行っている。概日時計は細胞に内在する約24時間周期の振動体である。現在概日時計の発振機構として概日時計遺伝子の転写・翻訳のネガティブフィードバックループモデル広く受け入れられている。この反例として、2005年にシアノバクテリア概日時計蛋白質KaiCリン酸化リズムのin vitroで再構成が報告されたが、真核生物においてはこのようなリズムはまだ報告がない。本研究では細胞内の酸化還元状態に着目し、転写・翻訳のフィードバックループに依存しない概日リズムの解析を行う。平成27年度は、昨年度に引きつづきMEDEP BRC5の脱核赤血球への分化など細胞培養方法の確立、および蛍光蛋白質Redoxfluorを利用した細胞内の酸化還元状態のモニターを試みた。MEDEPBRC5については、培養条件の検討や塗抹標本の作成法の改善などに取り組んだが、今のところ完全に脱核された細胞集団を得るには至っていない。一方、ヒト骨肉腫由来のU2OS細胞株にCRISPR-Cas9法を適用することにより、時計遺伝子破壊株を樹立できた。またヒトU2OS細胞株より得られたRedoxfluorおよび酸化還元非感受性のコントロール蛋白質の安定発現株約50クローンについて、蛍光プレートリーダーを用いて、各ウェルからのFRETシグナルを経時的に測定した。しかしながらRedoxfluor発現株、コントロール蛋白質発現株ともにシグナルの日内変動は確認できなかった。さらにFRET測定が可能な蛍光顕微鏡を用いて1細胞レベルでの観察も行ったが、細胞内のいずれの部位においても日内変動は見いだされなかった。過酸化水素で細胞を刺激した場合にはわずかにシグナルの変動が観測されたものの、酸化還元状態の日内変動は過酸化水素刺激による変動に比べてさらに小さいことが予想されるため、この方法で検出するのは困難であると判断した。MEDEPBRC5の培養については、脱核赤血球に分化させた均一な細胞ポピュレーションを得るに至っていないが、代替法として、培養が容易なヒトU2OS細胞にCRISPR-Cas9法を適用して樹立した時計遺伝子破壊株が利用可能となった。Redoxfluorについては、蛍光プレートリーダーを用いてFRETによる測定を検討したが、今のところ酸化還元リズムの検出には成功していない。しかしながら、酸化還元電位の電気化学的手法による検出の有効性がシアノバクテリアにおいて確認されたことから、この方法を動物細胞に適用できる可能性が示唆された。以上より当初の予定とは異なるものの、これらの代替索を進めることによって目的が達成できる可能性がある。

またレドックス制御関連化合物ライブラリーのスクリーニングを行ったところ、概日リズムの位相を制御する化合物が得られた。この化合物の作用機構の解明を通じて、概日時計機構におけるレドックス制御の意義が明らかになることが期待される。平成26年度は実験系の確立に着手し、基礎的なデータを得ることによって27年度において改善すべき点が明確になった。まずMEDEPBRC5は比較的培養が困難なES細胞由来の細胞株であるが、Stem cell factor存在下での増殖能とEPO存在下での分化能は維持できていることが確認できた。しかしながらEPOの添加のみでは均一な脱核赤血球様細胞集団を得ることはやはり困難であることが判明したため、ギムザライト染色用のサンプル調製法の検討やセルソーターの利用を通じて分化状態を明らかにし、この点を解決していく必要がある。一方、培養が容易なヒト骨肉腫由来の細胞株U2OSを並行して用いることで、抗過酸化型ペルオキシレドキシン抗体を用いる方法、および酸化還元状態感受性蛍光蛋白質Redoxfluorを用いる方法の2種類の酸化還元状態のモニター系の確立に取り組むことができた。この細胞にCRISPR/Cas9法を適用し、時計遺伝子を破壊することでMEDEP BRC5を用いた実験系を補完する系の確立ができると考えられる。今年度は引き続きMEDEPBRC5から均一な脱核赤血球様細胞の調製法を検討した後、抗酸化型ペルオキシレドキシン抗体を用いてペルオキシレドキシンの酸化状態がフィードバックループによらず概日リズムを示していることを確認するとともに、レドックス制御関連化合物ライブラリー中の化合物を投与し、リズムへの影響を確かめることによって発振機構に関する手掛かりを得る。また、U2OS細胞にpBmal1::luc遺伝子を導入したレポーター株を用いて、上記のライブラリー中の化合物が転写・翻訳リズムに及ぼす影響も併せて調査し、蛋白質レベルのリズムと転写・翻訳リズムの関係について考察する。さらに、細胞内の酸化・還元状態を無侵襲で測定する方法として、電気化学的手法の検討も進め、U2OS細胞の元の株および時計遺伝子破壊株、およびMEDEP BRC5由来の脱核赤血球様細胞を用いて酸化還元電位の経時的な測定を試みる。時間生物学今後は、まずMEDEP BRC5から均一な脱核赤血球様細胞集団を調製し、抗過酸化型ペルオキシレドキシン抗体を用いて、蛋白質の酸化状態がフィードバックループによらず概日リズムを示していることを示す。次にケミカルバイオロジー的なアプローチによるリズム発振機構の解明を目指し、蛍光蛋白質Redoxfluorを用いたハイスループットなスクリーニング系を確立する。MEDEPBRC5細胞にRedoxfluorを導入することに挑戦すると同時に、Redoxfluorを導入したU2OS細胞においてCRISPR/Cas9法により時計遺伝子を破壊することも試みる。いずれかの系が確立すれば、転写翻訳フィードバックループに非依存的な、酸化還元リズムを調節する化合物のスクリーニングに利用できるものと考えられる。
狂飆社と山薬蛋派の比較研究

本研究は1920年代中華民国期に活動した文学結社“狂飆社"同人の作品を主たる対象とする。その唯美的と評される文学思想の実態を探り、同時に作品群の物語構造の変遷の軌跡を明らかにしていく。さらに“狂飆社"解散後の同人によって準備された環境から生まれた中華人民共和国期の文学流派“山薬蛋派"との関連性を探り、従来注目されることが少なかった両者の関係性を明らかにする作業を通じて、中国近現代文学史の新たな1頁を拓くことを目指す。また、本研究の成果物として、国内初の総合的な“狂飆社"及び“山薬蛋派"研究となる『“狂飆社"事典』・『“山薬蛋派"事典』制作を目指す。
アメリカ合衆国におけるコモン・ロー的な生ける憲法論の研究

本研究において研究者(大江)は、コモン・ローの観点からアメリカ合衆国における生ける憲法の意義を研究した。そして、(a)生ける憲法の形成を理解するには、連邦最高裁の判例だけでなく、連邦議会の立法や大統領の先例を考慮する必要があること、(b)成文憲法と生ける憲法は相互補完的なものであること、(c)裁判官は司法審査によって生ける憲法を成文憲法と調和させるべきであることを明らかにした。アメリカ憲法史においては、合衆国憲法5条による正式な憲法修正が行われていないにもかかわらず、数多くの変革がなされてきた。そのため、近時のアメリカにおいては、生ける憲法(living Constitution)をめぐる問題が活発に議論されている。そこで、こうした議論との関連で、合衆国憲法のポピュリスト的解釈で知られるイェール大学のA・アマーの不文憲法論(AKHIL REED AMAR, AMERICA'S UNWRITTEN CONSTITUTION: THE PRECEDENT AND PRINCIPLE WE LIVE (2012))に主として注目して研究を行った。アマーは、不文憲法がアメリカの統治制度の根底をなすこと、不文憲法には、一人一票の原則のような不文のルールだけでなく、尊重に値する連邦最高裁の意見、画期的な議会制定法や大統領布告等が含まれること、そして、不文憲法と成文憲法が相互補完的な関係にあることを指摘する。他方、コモン・ロー的な生ける憲法論を主張するシカゴ大学のD・ストラウスは、成文憲法の役割を重視しつつも、その限界を指摘し、一定の場合に裁判官が自らの観点に基づいて判断することを率直に認める。それゆえ、ストラウスは、アマーの議論が成文憲法の役割を過大評価しており、個々の憲法条項の解釈も必ずしも説得的ではないと批判する(David A. Strauss, Not Unwritten, After All?, 126 HARV. L. REV. 1532 (2013))。アマーの議論に対するストラウスの批判には相応の理由がある。しかし、アマーが成文憲法の行間を読む形で不文憲法の解釈を行い、また、最高法規としての憲法を遵守する裁判官の司法審査によって成文憲法と不文憲法が矛盾しないように統制を試みる点が注目に値することを明らかにした。アメリカ憲法史においては、合衆国憲法第5条による正式な憲法修正が行われていないにもかかわらず、数多くの変革がなされてきた。そこで、研究者は、アメリカ合衆国においては、先例や伝統からなり、成文憲法と同様の役割を果たすコモン・ローに基づいて生ける憲法が形成されてきたとするコモン・ロー的な生ける憲法論の意義を考察した。これらの議論の考察を通じて、(a)コモン・ロー的な生ける憲法の形成に際しては、連邦最高裁に加えて、大統領や連邦議会の憲法解釈に注目する必要があること、(b)成文憲法と生ける憲法は相互補完的なものであること、そして、(c)成文憲法と生ける憲法が矛盾しないように裁判官の司法審査によって統制が図られるべきことを明らかにした。憲法学本研究の対象となるコモン・ロー的な生ける憲法は、裁判所と政治部門の相互作用によって形成される。そこで、(a)連邦最高裁だけでなく、連邦議会や大統領を含めた全憲法秩序を視野に入れて生ける憲法の形成過程を説明しようとするJ・バルキンの「生ける原意主義」(JACK M. BALKIN, LIVING ORIGINALISM (2011))や、(b)正式な憲法修正や連邦最高裁の憲法判例からなる大文字の憲法(Constitution)のみならず各種法令や行政実務からなる小文字の憲法(constitution)がアメリカ立憲主義において大きな役割を果たしていると主張するW・エスクリッジおよびJ・フェレジョンの議論(WILLIAM N. ESKRIDGE JR. AND JOHN FEREJOHN, A REPUBLIC OF STATUTES (2010))を検討することが不可欠である。しかし、現時点では、これら(a)(b)の議論の考察が必ずしも十分ではない。そこで、「(3)やや遅れている」と自己評価する。購入予定であった研究関連書籍が当該年度内に購入できなかったために、残額2,642円を次年度に繰り越した。当該年度の繰越金は次年度の研究関連書籍の購入に充てる予定である。
下位脳幹弧束核におけるドーパ-グルタミン酸神経伝達間相互作用の機能解析

レボドパ(ドーパ)は現在においても最も使用されているパーキンソン病の治療薬である。我々は今まで活性がないと考えられて来たドーパが神経伝達物質として働くという仮説を提唱している。本研究では、中枢性の血圧調節を司る延髄弧束核という脳領域においてドーパがグルタミン酸の作用を増強することを証明した。我々は血管におけるドーパの役割についても解明した。ドーパがドーパ受容体GPR143を介してアドレナリンα1受容体の作用を増強することを証明した。このメカニズムが血圧の日内変動に関与する可能性があることを証明した。これらの知見はドーパが生理学的な血圧制御に重要な役割を果たすことを示す。本研究では、麻酔下ラットの延髄弧束核領域(NTS)において、単独では無作用量のドーパがグルタミン酸による降圧および徐脈応答を増強させる知見を基に、ドーパとグルタミン酸の神経伝達間相互作用を明らかにすることを目的としている。平成27年度は以下の成果を得た。(1)麻酔下ラットのNTSにグルタミン酸またはドーパを微量注入し、降圧および徐脈応答に関する用量反応相関曲線を求めた。単独では無作用量のドーパ存在下におけるグルタミン酸応答を検討したところ、同用量のドーパはグルタミン酸応答を増強させた。この増強効果はドーパ拮抗薬であるドーパシクロヘキシルエステルで拮抗された。一方で、無作用量のグルタミン酸はドーパ応答に影響を与えなかった。(2)ドーパがどのようなグルタミン酸受容体応答を増強させるかを(1)と同様に、降圧および徐脈応答に関して検討したところ、ドーパはNMDA受容体作動薬のNMDAに関する応答を増強させた。一方で、AMPA受容体作動薬のAMPA、代謝性グルタミン酸受容体作動薬のdihydroxyphenylglycineに関する応答には影響を与えなかった。また、NMDA受容体のうち、NR2Bの拮抗薬イフェンプロジルの存在下ではDOPAによるNMDA性の血圧下降応答の増強は認められなかった。このようなNMDA受容体応答の増強がOA1を介しているか否かについてOA1遺伝子欠損マウスを用いて検討したところ、OA1遺伝子欠損マウスでは、DOPAによるグルタミン酸およびNMDA応答の増強は抑制された。(1)心血管調節中枢である延髄弧束核領域においてグルタミン酸とドーパが神経伝達間相互作用を示すことが見つかったことは大きな成果である。27年度の計画通り、ドーパとグルタミン酸の心血管応答に関する用量反応曲線を示し、ドーパによるグルタミン酸応答の増強が確認できた。また、その効果が拮抗薬で阻害されることを確認した。(2)ドーパによって修飾されるグルタミン酸受容体がNMDA受容体であることを同定した。また、NR2Bサブタイプを介する応答がドーパによって機能修飾を受けることを見出した。29年度に行う予定であったOA1遺伝子欠損マウスにおける検討も行うことができた。したがって、おおむね順調に進展していると考える。本研究の目的は、ドーパとグルタミン酸の神経伝達間相互作用を明らかにすることにある。平成27年度までに得ている知見は、延髄弧束核領域(NTS)において無作用量のドーパがNMDA受容体を介するグルタミン酸応答を増強すること、ドーパがOA1を介してNMDA応答を増強することである。データの再現性確認を含め、平成28年度は以下の成果を得た。(1)NMDA受容体応答の増強がOA1を介しているか否かについてOA1遺伝子欠損マウスを用いて検討したところ、OA1遺伝子欠損マウスでは、ドーパによるグルタミン酸およびNMDA応答の増強は減弱した。(2)ドーパがOA1を介して生理学的にNTSの神経伝達を担う物質か否かを検討するために、α1アドレナリン受容体作動薬のフェニレフリンを処置した際の圧受容器反射を検討したところ、予想外に、OA1遺伝子欠損マウスにおいてフェニレフリンによる昇圧応答が減弱することを新たに発見した。この表現系を詳細に検討し、論文投稿中である。また、バソプレシンによる昇圧応答はOA1遺伝子欠損マウスにおいて野生型と比較し同程度であることが分かった。(3)平成27年度にドーパはNR2Bサブユニットを介したNMDA受容体応答を増強すると報告した。平成28年度はNR2Aサブユニットに関する検討を行ったところ、NR2Bと同様の結果が得られつつある。平成29年度に再現性を得る予定である。(1)29年度に予定していたOA1遺伝子欠損マウスにおける検討を行った。ドーパがOA1を介してNMDA受容体応答を増強することを見出したことは大きな成果である。(2)ドーパが生理学的な圧受容器反射に関与するか否かの検討を契機に、末梢臓器におけるOA1の機能を明らかにしつつある。こちらは論文投稿中である。生理学的解析はバソプレシンで検討しようと考えている。OA1とグルタミン酸神経の局在性に関する検討が滞っているが、心血管応答解析に関しては多くの知見を得ている。無用量のドーパはグルタミン酸応答を増強させた。

一方で、無作用量のグルタミン酸はドーパ応答に影響を与えなかった。(2)ドーパはNMDA受容体作動薬のNMDAに関する応答を増強させた。一方で、AMPA受容体作動薬のAMPA、代謝性グルタミン酸受容体作動薬のdihydroxyphenylglycineに関する応答には影響を与えなかった。(1)(2)の結果より、ドーパはNMDA受容体を介するグルタミン酸の作用を増強すると考えられる。このような作用が生理学的であるかどうか検討する必要がある。(3)GPR143が生理学的に心血管機能を調節するならば、GPR143遺伝子欠損マウスにおいて圧受容器反射が抑制されるはずである。アドレナリンα1受容体作動薬のフェニレフリン静脈内投与による圧受容器反射を検討したところ、予想外にフェニレフリンによる昇圧応答自体がGPR143遺伝子欠損マウスにおいて著減した。また、単独では無作用量のドーパ(1,10 nM)はフェニレフリンによる血管収縮作用および細胞内カルシウム応答を増強させた。GPR143が末梢自律神経系血圧制御機構を持つかどうかを検討した。GPR143遺伝子欠損マウスと血管平滑筋特異的GPR143遺伝子欠損マウスにおいて痛覚刺激時および夜間における血圧上昇の抑制が認められた。また、GPR143遺伝子欠損マウスにおける血漿中ドーパ、ノルアドレナリン、アドレナリン濃度は野生型と比較し、同程度だった。(3)はJCI Insightに掲載された。ドーパおよびGPR143は生理学的血圧調節に関与すると考えられる。レボドパ(ドーパ)は現在においても最も使用されているパーキンソン病の治療薬である。我々は今まで活性がないと考えられて来たドーパが神経伝達物質として働くという仮説を提唱している。本研究では、中枢性の血圧調節を司る延髄弧束核という脳領域においてドーパがグルタミン酸の作用を増強することを証明した。我々は血管におけるドーパの役割についても解明した。ドーパがドーパ受容体GPR143を介してアドレナリンα1受容体の作用を増強することを証明した。このメカニズムが血圧の日内変動に関与する可能性があることを証明した。これらの知見はドーパが生理学的な血圧制御に重要な役割を果たすことを示す。実施計画の通り、ドーパと機能連関が認められるサブタイプを中心に、NTSにおけるOA1とグルタミン酸受容体およびグルタミン酸神経マーカーがどのような局在関係を示すか免疫染色により検討する。グルタミン酸受容体とOA1を動物細胞に共発現させ、免疫沈降法やFRETを用いて物理的相互作用の有無を確認する。イメージングや電気生理学的手法を用いて、ドーパがグルタミン酸応答を増強させるか否かを検討する。(1)NTSにおけるOA1とグルタミン酸受容体応答の相互作用を深く理解するために、OA1とグルタミン酸神経やグルタミン酸受容体との局在性を免疫染色やin situ hibridization法を用いて明らかにする。(2)ドーパが生理学的に圧受容器反射に関与するか否かをバソプレシンを用いて検討する。これらの知見を基に論文作製をする。その他、脳部位におけるOA1とグルタミン酸受容体との局在性について検討する。また、電気生理学的検討についても行う予定である。
イネにおける光呼吸窒素代謝関連酵素遺伝子の窒素による発現調節

光呼吸窒素代謝関連酵素の中で、機能の解明が待たれていたNADH依存性グルタミン酸合成酵素(GOGAT)は、申請者らのこれまでの研究で、イネの窒素転流において、特に若い組織で輸送されてくるグルタミンの再利用の初期段階で重要な役割を担っていることが解明されつつある。今年度は、NADH-GOGAT遺伝子の発現解析を中心に研究を進め、以下のことを明らかにした。1。イネの若い根において、特に低濃度のNH_4^+の供給に伴って、短時間にNADH-GOGATタンパク質およびmRNAのレベルが誘導的に増加することを発見した。2。イネ幼植物からゲノムDNAを調製し、ゲノムライブラリーを作成した。NADH-GOGATcDNA断片をプローブとしてスクリーニングを行い、コード領域の全長とプロモーター領域を含むと考えられる遺伝子をクローン化し、制限酵素地図を作製した。現在、塩基配列の決定を行っている。3。Agrobacteriumによるイネ栽培品種(ササニシキ・日本晴)の形質転換系を確立した。今後プロモーター活性の検討や、アンチセンス遺伝子の導入など、NADH-GOGAT遺伝子発現の制御について形質転換イネを用いて解析することが可能となった。4。イネの老化葉身では、維管束組織に存在し窒素の送り出しに機能していることが予想されていた細胞質型グルタミン合成酵素が、伴細胞に多く存在していることを免疫組織学的手法で明らかにした。1。2。3。4。
オオヒメグモの尾葉形成を制御する遺伝子の網羅的探索

本研究は、節足動物の尾部領域の発生様式に多様性があることに注目し、その多様化の仕組みを理解することを目指した。実験材料として鋏角類のオオヒメグモを用い、胚染色よるスクリーニングとマイクロアレイによるスクリーニングを行うことで、尾部(クモでは尾葉と呼ぶ)の発生に関わる遺伝子を探索した。得られた候補遺伝子はRNA干渉による表現型スクリーニングによって絞り込み、尾葉形成に必要な遺伝子を同定した。同時に、頭部形成に関わる候補遺伝子も複数同定された。動物進化の過程ではボディープランがほとんど変化しないまま、そのボディープランを作るための遺伝的仕組みが大きく変化することがある。私は節足動物門の体節形成がそのような形態に表れない遺伝的な変化を理解するためのよいモデルになると考え、鋏角類のオオヒメグモを用いて、後方部分の体節形成に重要な尾部領域(尾葉と呼ぶ)の形成に関わる遺伝子の網羅的探索を行った。主に2つの方法で研究を進めた。1、これまでに蓄積したESTクローンをもとに作製したプローブを用いてホールマウントインシチュハイブリダイゼーションによる胚の染色をし、予定尾葉領域または尾葉に発現する遺伝子のスクリーニングを行った。これまでに1584種類のプローブによる染色を完了した。2、尾葉の形成と背腹軸の形成が不全になるptc,dpp RNAi胚を用いてマイクロアレイ解析を行い、ptc,dpp RNAi胚において発現が著しく減少している遺伝子クローンを特定した。さらに、ホールマウントインシチュハイブリダイゼーションによる二次スクリーニングにより、予定尾葉領域を含む領域に特異的に発現する28個の遺伝子クローンに絞り込んだ。現在、それらの遺伝子クローンをもとにdsRNAを作製し、RNAiを利用した遺伝子機能抑制実験による三次スクリーニングを行っている。これまでに1つの遺伝子クローンで、胚全体の体節形成が全く進行しなくなるような表現型を得ている。今後、すべての候補遺伝子について三次スクリーニングを完了し、絞り込まれた遺伝子クローンについて詳細な解析をしていく予定である。その結果、ptc, dpp RNAi胚を用いたマイクロアレイ解析で候補に挙がっていたESTクローンAt-eW-020-B15に対してRNA干渉による遺伝機能の抑制を行ったところ、尾葉の形成に顕著な異常が観察された。この異常が特異的なものかどうかを判定するために、複数の重複しない二本鎖RNAを使用してRNA干渉を行ったところ、同様の異常が見られたことから特異性が確認できた。さらに、発現解析により、At-eW-020-B15の初期胚における発現パターンはヘッジホッグ(Hh)シグナルに大きく依存することが明らかになった。また、ptc, dpp RNAi胚で行ったマイクロアレイ解析と同じようなマイクロアレイ解析をhh RNAi胚で行い、Hhシグナルによって発現が制御される遺伝子を多数同定した。これらの候補遺伝子についても、RNA干渉による表現型スクリーニングを始めている。今後、遺伝子機能の詳細な解析を行うことにより、オオヒメグモにおける尾葉形成及び体節形成の仕組みを明らかにしたい。私は節足動物門の体節形成が、そのような実質的には形態に表れない遺伝的変化を理解するためのよいモデルになると考え、実験材料として利点の多い、鋏角類のオオヒメグモを用いて研究を行った。詳細な遺伝子発現の解析から、胚の前端領域(予定頭部領域)でも、胚の後端領域(尾葉とよぶ)で起こるような逐次増加型の体節形成が起こっていることが明らかになったために、本年度は予定頭部領域における体節形成の解析に集中した。頭部領域のパターン形成はヘッジホッグシグナルに支配されており、昨年度のマイクロアレイ解析において、ヘッジホッグシグナルの標的遺伝子の候補として15個程度の遺伝子が見出された。その中には、ショウジョウバエのギャップ様遺伝子オルソデンティクルとペアールール遺伝子オッドペアードのホモログが含まれていた。ヘッジホッグシグナルの標的候補となったほぼすべての遺伝子について、RNA干渉による表現型スクリーニングを行い、数個の遺伝子で発生異常を伴う表現型が得られたが、それらの表現型が遺伝子特異的な影響によるものかどうかは一部で未確認である。それでも、オルソデンティクルホモログとオッドペアードホモログの機能については詳細な解析を進め、オオヒメグモの頭部領域の体節形成に重要な役割を果たしていることが明らかになった。今後、その他の候補遺伝子についても解析を進め、オオヒメグモの頭部及び尾部の体節形成の仕組みを遺伝子ネットワークの働きとして理解し、形態の保守的な進化と発生プログラムの多様化の関係を探究したい。