hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二重SOI構造による高温度用加速度センサ

膜上におけるシリコンの選択成長技術を確立した。これらにより、二重SOI構造を用いた加速度センサ製作のための基礎技術を確立した。2.加速度センサ設計、製作有限要素法を用いた構造解析プログラム(ANSYS)、CADソフト等を用いて加速度センサの設計を行った。また、昨年度経費で購入、整備した陽極接合装置やシリコンエッチング装置等と従来からの半導体製造装置を用いて、シリコン直接接合法によるSOI構造を用いた2種類の加速度センサを設計、試作した。SOI構造ならびにRIEプロセスを併用することで高い精度および再現性を達成した。3.加速度センサパッケージ、測定装置整備300度以上の高温でのセンサ特性を測定するため、高温度用センサに必要なパッケージング法を開発した。また、センサ特性測定装置の整備を行い、最大33Gの加速度をかけつつ400度まで温度を上げることのできる加速度測定システムを製作した。4.加速度センサ出力特性測定評価、高温特性加速度センサの出力特性ならびに高温での特性を測定した。その結果、常温から400度までの温度範囲で加速度センサとしての動作が確認できた。解析の結果、構造解析プログラムによる設計値と測定された特性は非常に似た結果が得られ設計法の妥当性が確認できた。
次亜塩素酸錯体の反応性と反応選択性の分子機構の解明及びそれに基づく制御法の開発

本研究では、酸化反応や生体防御過程の鍵となる次亜塩素酸錯体の生成機構や反応性に関する研究を行った。次亜塩素酸の生成過程を解明するため、酵素活性中間体モデル化合物を合成し、それと塩素イオンとの反応を研究した。その結果、次亜塩素酸を合成する酵素がもつ活性部位のシステイン配位やヘムとアミン酸の共有結合によるひずみが次亜塩素酸生成反応の鍵となっていることを明らかにした。次亜塩素酸錯体の反応性を解明するため、シス位とトランス位の配位子の電子供与性効果を研究した。その結果、シス位配位子とトランス位配位子の効果が反応性に対して逆の傾向を示すというたいへん興味深い結果を得ることができた。次亜塩素酸錯体や次亜塩素酸の生成過程おけるプロトンの機能を解明するため、さまざまな酢酸誘導体存在下、鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体と塩素イオンとの反応を行った。ジクロロ酢酸、クロロ酢酸、酢酸などをプロトン源として用いて実験を行った。メソテトラペンタフルオロフェニルポルフィリンから作成した鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体に、20等量の酢酸誘導体、2等量の塩化テトラブチルアンモニウムを順に添加し、その後の反応過程を吸収スペクトルで調べた。その結果、プロトンの酸性度が生成物の性質を変えることがEPR測定、2H NMR測定から明らかとなった。鉄3価ヘム次亜塩素酸錯体の生成や反応性に対するヘムの配位子効果を解明するため、電子供与性の異なる置換基をもつヘムを合成した。電子供与性が強い置換基をもつヘムから次亜塩素酸錯体の合成を行ったが、配位した次亜塩素酸イオンが直ぐにイオン的に分解し、高原子価ヘム錯体を生成することが明らかとなった。また、置換基の電子吸引性を強くするに従い、次亜塩素酸イオンはラジカル的解裂に変化することも明らかとなった。これらの一連の実験から、次亜塩素酸付加錯体を安定化するためには、非常に強い電子吸引性の置換基を導入する必要があることが明らかとなった。一方、軸配位子の効果を研究するため、様々なイミダゾール誘導体やピリジン誘導体の導入を検討した。電子供与性の弱い軸配位子では、配位力が弱くなるため過剰量のイミダゾールやピリジンを必要とすることがあきらかとなった。これら様々な軸配位子をもつ次亜塩素酸錯体のNMRやEPRを測定した結果、軸配位子による鉄イオンの電子状態には大きな変化がないことが明らかになった。昨年度のポルフィリン配位子の電子吸引生効果と鉄3価次亜塩素酸付加錯体の安定性の関係をさらに定量化するため、メソフェニル基やピロールβ位にフッ素原子を導入した4種類のポルフィリンを設計、合成した。これらのポルフィリン配位子から鉄3価次亜塩素酸付加錯体の合成を低温で行った。これらの鉄3価次亜塩素酸付加錯体は、NMRやEPRを用いて電子構造を明らかにした。反応性の変化を解明するため、シクロヘキセンのエポキシ化反応を行った。速度論的な手法により反応性を定量化するため、種々の反応条件を検討した結果、実験条件を最適化することができた。その結果、ポルフィリン環に導入したフッ素原子が増加し、ポルフィリン配位子の電子吸引性効果が大きくなるに伴い、次亜塩素酸イオンの反応性が低下するという結果を得た。この結果は、高原子価オキソ錯体のエポキシ化反応の反応性とは逆の関係であり、驚くべき結果であった。鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体と塩素イオンから次亜塩素酸錯体の生成についても検討した。昨年度までの研究により、高い反応性を持った鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体しか塩素イオンと反応しないことが明らかとなったので、上の実験で示したポルフィリン配位子を用いて鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体の合成を試みた。ピロール位にフッ素原子を導入したヘムから鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体は合成できなかったが、メソ位にフッ素原子を導入したヘムから非常に高い反応性を有する鉄4価オキソポルフィリンπカチオンラジカル錯体の合成に成功した。鉄3価ヘム次亜塩素酸の反応性をエポキシ化反応、塩素化反応を用いて評価した。これらの反応で、次亜塩素酸錯体と基質の反応が律速段階となるような触媒反応系を構築した。吸収スペクトルの吸収の時間変化から次亜塩素酸イオンの消費速度および反応活性種の同定を行い、また生成物の生成速度をガスクロマトグラフを使って測定を行い、それらの結果から反応性を評価した。その結果、エポキシ化反応、塩素化反応ともにヘムのポルフィリン配位子の電子密度が低下するほど、次亜塩素酸錯体の反応性が低下することが明らかとなった。不斉マンガン4価サレン錯体から次亜塩素酸錯体を合成した。この錯体は、エポキシ化反応を行うことがわかった。Jacobsen触媒による不斉エポキシ化反応の活性種との関わりを議論するため、生成物のエナンチオ選択性の測定を行った。その結果、次亜塩素酸錯体から生成するエポキシドはJacobsen触媒反応から生成するエポキシドのような高い不斉収率を与えなかった。これは、Jacobsen触媒反応において次亜塩素酸錯体が不斉エポキシ化反応の活性種でないことを示す結果であった。平成27年度に予定していた実験は、ほぼ順調に行うことができた。

その結果、次亜塩素酸錯体の反応性を支配する要因が、配位した鉄イオンの電子密度の大きさであるという結論を得ることができた。この成果は、昨年度見いだした次亜塩素酸錯体の反応性の傾向がオキソ錯体の反応性と反対となるという結果を、明確に説明することを可能とした。さらに、マンガンサレン錯体を使った系で、次亜塩素酸錯体を固体に単離することに成功し、単結晶構造解析により次亜塩素酸錯体の構造を世界で初めて明らかにする機会を得た。マンガン4価サレン塩素錯体に次亜塩素酸イオンを2当量添加すると、マンガンイオンに2つ次亜塩素酸イオンが配位した錯体が生成すること見いだした。この錯体の構造を解析するため、単結晶の作成を試みた。結晶化溶媒として、ジクロロメタン、アセトニトリル、ヘキサン、ペンタンなどを用いた。アセトニトリル系から単結晶が得られたが、構造解析の結果、次亜塩素酸錯体が分解あるいは元の出発錯体に戻った錯体であることが明らかとなった。研究期間内では、次亜塩素酸錯体の単結晶を得ることができなかった。しかし、これらの研究を通して、サレン錯体の不斉選択性に関する重要な結果を得ることができた。これまでの研究では、アキシャル位の配位子の配位力が弱い場合は、大きな不斉構造をとらないことが明らかにしていたが、サレン配位子側に電子吸引性基を導入してマンガンへの配位力を弱くすると、アキシャル位の配位子の配位力が弱くても大きな不斉構造をとることがわかった。系統的にこの変化を調べた結果、不斉構造変化がアキシャル位とエクアトリアル位の配位力のバランスによって決定されているという結果をえることができた。次亜塩素酸錯体に構造研究は、ヘム錯体を用いても同様に行った。次亜塩素酸錯体を固体で単離することに成功したが、ヘムについても単結晶を得ることができなかった。単離した次亜塩素酸錯体を用いて、共鳴ラマン分光測定を行った。低温下で測定することにより、ヘム鉄に配位した次亜塩素酸イオンの振動ピークを観測することに成功した。次亜塩素酸イオンの酸素原子の同位体を用いることにより、これらのピークを同定することに成功した。本研究では、酸化反応や生体防御過程の鍵となる次亜塩素酸錯体の生成機構や反応性に関する研究を行った。次亜塩素酸の生成過程を解明するため、酵素活性中間体モデル化合物を合成し、それと塩素イオンとの反応を研究した。その結果、次亜塩素酸を合成する酵素がもつ活性部位のシステイン配位やヘムとアミン酸の共有結合によるひずみが次亜塩素酸生成反応の鍵となっていることを明らかにした。次亜塩素酸錯体の反応性を解明するため、シス位とトランス位の配位子の電子供与性効果を研究した。その結果、シス位配位子とトランス位配位子の効果が反応性に対して逆の傾向を示すというたいへん興味深い結果を得ることができた。平成26年度に予定していた実験は、ほぼ順調に行うことができた。その結果、高原子価オキソ錯体と次亜塩素酸錯体の反応性がまったく逆の傾向を示すという驚くべき結果を得ることができた。この成果は、論文投稿できるよう準備を進めている。昨年度、マンガンサレン錯体を使った系でマンガン4価次亜塩素酸サレン錯体を固体に単離する手法を見いだすことに成功した。固体を使った構造解析(単結晶構造解析やEXAFS)などを行い、次亜塩素酸イオンの金属への配位構造を解明したい。単結晶構造解析のための単結晶の作成を試みる。
インテリジェント機能付きPV-ECSシステムの開発

環境負荷の少ない自然エネルギーの有効利用促進において、天候に左右されずに出力制御可能な自律型太陽光発電(PV)の開発は有効なアプローチであると考えられるが、その実現には、PVと電力貯蔵装置とのハイブリッド化が不可欠である。本研究は、既に開発済みの、PVと電気二重層キャパシタからなる蓄電装置ECSを組み合わせたPV-ECSシステムを改良し、オンライン気象情報による日間のPV発電量推定値を用いて最適運用制御を可能とする、インテリジェント機能を持った系統連系型PV-ECSシステムの開発を目的としてきた。得られた研究成果を以下に要約することができる。(1)既存のPV-ECSシステムを対象に、双方向インバーターを採用し、PV最大出力点運転と定電力運転間の運転モード切替に伴う、インバーター出力波形のスパイク発生を抑制した。また、キャパシタのバンク切替モードが3段から2段に改められ、エネルギー効率の改善を図られた。(2)直達日射に関するHottelの式、散乱日射に関するLiuおよびJordanの式に基づき全天日射量の理論および実用推定式を開発し、これにより日間のPV総発電量の予測推定方式を確立した。(3)翌日のオンライン気象情報によるPV出力の理論値と実測値から、快晴時の理論出力を基準とする天候状態ごとのPV発電係数を統計的に推定し、PV発電係数、理論出力および3時間ごとの天気予報とから、翌日のPV総発電量を推定した。(4)日間のPV総発電量の予測値を用いて、PV-ECSシステムの負荷平準化機能の最大化に必要な、系統からの供給電力パターン決定アルゴリズムを開発し、システムに導入した。(5)実証試験により、その有効性を検証しシステムの実用化に向けての基盤を確立した。天候に左右されずに出力制御可能な自律型太陽光発電(PV)の開発において、PVと電力貯蔵装置とのハイブリッド化が不可欠であり、本研究では、電気二重層キャパシタと電子回路からなる蓄電装置ECSとPVを組合せたインテリジェント機能を持つハイブリッドシステム(PV-ECSシステム)の開発を目的としている。本年度は、以下の研究成果を得ている。(1)1.3kWのPVおよび1kWhのECS等、既存の装置に改良を加え、インテリジェント機能付きPV-ECSのハードシステムを構築した。ハード面での特徴として、PVの最大出力点追従運転と定電力運転モード切り替えに伴う、インバータ出力の脈動現象を抑制するよう双方向インバータを採用し、また、キャパシタバンク切り替えモードを3段から2段に改め、制御性能と信頼性の向上を図った。(2)構築したPV-ECSシステムを配電系統に接続すると同時に、ECSの日間運用法として、系統からの充電を用いた(満充電-放電-満充電)からなるサイクル運用法を開発した。これによりECSおよび負荷への供給電力(買電力)を一定とするような供給電力の平準化システムを確立した。様々な買電力値の設定量の下で、PV-ECSシステムの日間の運転を行い平準化機能(買電力の負荷率向上)、システムのエネルギー効率等を検証した。(3)翌日の気象予測を用いて運転当日のPV発電量の推定方式に関する基礎的考察を行った。以上の研究成果を電気関係学会北海道支部連合大会、電気学会全国大会で報告し、また、2003年7月にICEE2003(香港)での発表を予定している。天候に左右されずに出力制御可能な自律型太陽光発電(PV)の開発において、PVと電力貯蔵とのハイブリッド化が不可欠であり、本研究では、電気二重層キャパシタからなる蓄電装置ECSを組み合わせたインテリジェント機能を持つハイブリッドシステム(PV-ECSシステム)の開発を目的としている。昨年度開発したシステムにより、本年度はオンライン気象情報を用いる次世代型のPVシステムの開発を行った。研究成果を以下に要約する。

(1)直達日射に関するHottelの式、散乱日射に関するLiuおよびJordanの式に基づき北見市における全天日射の理論推定式を開発し、これにより年間にわたる特定日の日間PV総発電量算定式を求めた。(2)予想される日間のPV総発電量を用いて、PV-ECSシステムの負荷平準化機能の最大化を実現するため、時々刻々の系統からの最適買電力設定アルゴリズムを開発し、実証試験により、その有効性を検証した。(3)翌日の3時間ごとのオンライン気象情報(晴れ、曇り、雨(雪))と、PV出力の実測値および理論値とから、快晴時の理論出力を100とした場合の各気象情報状態での出力比(PV発電係数)を統計的に平均値で推定した。PV発電係数、理論出力および3時間ごとの天気予報とから、翌日のPV総発電量を推定し、(2)の最適買電力設定アルゴリズムを用いてPV-ECSシステムの負荷平準化機能向上向上を図り、実験による検証を行った。以上の研究成果を電気学会の電力技術・系統技術合同研究会、全国大会、北海道支部連合大会および、IASTED・PES2003(スペイン)、DRPT(香港)で報告し、また、ICEE2004(札幌)、POWERCON2004(シンガポール)での発表を予定している。
金属材料の機械的性質における寸法効果発現機構の統一モデリング

研究代表者らが開発してきた高次勾配塑結晶性理論は,金属材料の寸法効果を広範に表現できる可能性を持っていた.しかしながら,材料の内部界面の数理モデルが確立していなかったために,様々な寸法効果を統一的に表現するには至っていなかった.本研究では,まず内部界面の数理モデルついて検討し,粒界に堆積する転位密度が一定値に近づくと,粒界が降伏して塑性流れが発生するとの仮説に基づくモデルを提案した.続いて,界面モデルの妥当性確認とそこに含まれるパラメータ同定を目的に,微細結晶粒材(Al)を用いた実験研究を行った.実験結果は微細結晶粒材内の粒界は,必ずしも塑性変形の強い障壁にはなっていないことを示唆した.マイクロメートル領域における金属材料の機械的性質は著しい寸法依存性を示す.本研究では,代表的な次の3つのタイプの寸法効果を考える:(1)部材そのものが小さいことによる寸法効果,(2)多結晶金属における結晶粒サイズの効果,(3)分散強化機構における介在物のサイズの効果.H25年度は,主に(1)の寸法効果に関する研究を実施し,年度終了時点で次のような実績状況にある.(a)高性能計算環境の整備:本研究を進める上での基盤となる代表者が提案中のミクロンスケール塑性論を搭載した3次元非線形有限要素解析自主開発コードを,本研究課題で新たに導入した高性能ワークステーション上で稼動させた.(b)部材寸法減少に伴う単結晶のモードに関する検討:マイクロピラー(直径20μm程度以下)の圧縮実験を基本的な問題と位置づけ,様々な結晶方位に対する3次元有限要素解析を行い実験で観察される特異な変形モードが幾何学的必要転位の蓄積の帰結であるという知見を固めた.(c)サイズ減少に伴う流動応力の上昇に関する検討:直径が数十μmを下回るマイクロピラーの初期降伏応力は劇的に大きくなる.文献調査やトライアルの計算から,この現象の第一義的要因は,転位源寸法そのもののサイズが制限されることによるものである可能性が高いという見解を得た.(d)繰返し負荷に対するバウシンガー効果の発現機構:マイクロピラーに繰返し横荷重を加える解析を行った.表面から自由に転位が抜け出す微視的境界条件が特徴的な内部応力を生み出し,これがバウシンガー効果に繋がることを3次元問題において確認した.(e)当初計画では次年度の予定であった反転負荷時のバウシンガー実験の予備試験と微細結晶粒試験片の試作を前倒しで開始した.以上の一部は国際学会で発表した.確固たる総合的知見として公表することが求められる学術論文の発表は今後の課題である.平成26年度においては,次のような研究結果を得た.(a)粒界の役割を調査するための実験研究:実験研究は次の手順で行った.(i)繰返し重ね接合圧延(ARB)で微小結晶粒板材を作製.(ii)引張り予ひずみを与えた試験片に反転負荷(圧縮)を与えてバウシンガー効果を観察.数例の実験結果が得られたが,微小サイズの試験片で精度の良いバウシンガー曲線を得ることが容易ではないため,再現性の確認には更に慎重に実験を重ねる必要がある.試行実験では,予ひずみが大きくなる程,バウシンガー効果が小さくなるという傾向が認められている.(b)粒界モデルの構築:物理的な仮説に基づき,予測範囲が広いモデルをの枠組みを提案した.すなわち,粒界に堆積できる転位密度には限界があり,その密度に達すると粒界塑性流動が開始するという仮説を立てた(学会発表1件).(c)粒界モデルのシミュレーションコードへの導入:上記(b)の粒界モデルを,これまで開発してきた高次勾配結晶塑性論を搭載した解析コードに組み込んだ.多結晶体のモデル(9結晶粒)を作成して引張りにおける粒径効果のシミュレーションを行った.粒径が小さくなると塑性降伏後も転位による背応力の影響で見かけの加工硬化係数が上昇するが,ある応力レベルで転位堆積が限界に達して粒界塑性流動が開始し,硬化係数が一気に減少する現象を再現した(学会発表1件).これは(b)の仮説の正しさを証明するものではないが,既往の研究で報告されている降伏挙動の粒径依存性の巨視的観察結果を再現しうるものである.(d)上記(b)(c)は結晶塑性理論を基礎とする研究であるが,その数値シミュレーションには多くの計算資源が必要になる.そこで,多結晶金属の寸法効果をより巨視的な視点と熱力学の観点からモデリングし,工学的な計算に用いることが容易な塑性理論の定式化の基礎を提案した(学会発表2件).本年度においては,「多結晶金属における粒界の影響を含めた結晶粒サイズ効果に対して物理に立脚した理論モデルの構築」を継続して行った.(a)粒界の役割を定量化するための実験研究:多結晶金属の最大の特徴は粒界である.粒界が転位運動の障壁となるのであれば,粒界に堆積した転位群は背(内部)応力を発生させる.その大きさは反転負荷におけるバウシンガー効果の程度により評価でき,内部応力の大きさを間接的に見積もることができる.この発想の下,繰返し重ね接合圧延(ARB)で作成した微小結晶粒板材による小型試験片の引張り予ひずみ反転負荷(圧縮)試験法の開発を試みた.一応の試験の実施はできたが,座屈防止機構の摩擦力評価に疑義が残る状態を解決するまでには至らず,信頼性の高いデータを取得することができないと判断した(年度の前半).

そこで,急遽,繰り返しせん断変形加工(ECAP)法を採用することとし,微小結晶粒棒材を作成して引張圧縮,圧縮引張の反転負荷試験の実施に成功した.微細化が進むとバウシンガー効果が大きくなる傾向が観察され,粒界の役割を間接的に定量評価する道は開けた.(b)粒界モデルの精密化:前年度に,幾何学必要転位が一定値に達すると粒界が降伏するという仮説に立脚した「粒界降伏モデル」を立案したが,上記(a)の反転負荷試験の実施が難航し,そのパラメータ同定までは至らなかった.しかしながら,それとは別に,新しい粒界モデルとして,隣接粒の方位関係とそれらと粒界面との幾何学的関係の両者を考慮した粒界すべり抵抗モデルを立案し,既往の文献にあるマイクロ双結晶試験片による実験結果との比較を通してパラメータ同定を行った.また,最初の計画には無かったが,現在研究中の多結晶塑性理論を巨視的な視点から再モデル化し,それの熱力学との整合性についての検討を通して,熱力学整合型の寸法依存性弾塑性理論を提案した.研究代表者らが開発してきた高次勾配塑結晶性理論は,金属材料の寸法効果を広範に表現できる可能性を持っていた.しかしながら,材料の内部界面の数理モデルが確立していなかったために,様々な寸法効果を統一的に表現するには至っていなかった.本研究では,まず内部界面の数理モデルついて検討し,粒界に堆積する転位密度が一定値に近づくと,粒界が降伏して塑性流れが発生するとの仮説に基づくモデルを提案した.続いて,界面モデルの妥当性確認とそこに含まれるパラメータ同定を目的に,微細結晶粒材(Al)を用いた実験研究を行った.実験結果は微細結晶粒材内の粒界は,必ずしも塑性変形の強い障壁にはなっていないことを示唆した.微小結晶粒材料の予ひずみを変化させたバウシンガー試験を行うことによって,粒界モデル構築のための基礎的かつ定量的な知見を得る計画であったが,微小結晶粒材料の試験片はサイズが小さいため,当初の予想以上に圧縮試験における摩擦の影響を正しく除去する難しく,再現性の点で実験結果に多少の疑義が残っている.このため,当初の計画には無かったが,板を多層接着した直方体型の試験片を用いる第二の圧縮試験法にもトライしている.このような経緯から実験研究に遅れが出た.一方で,物理的仮説(粒界降伏仮説)に基づく粒界モデルを提案し,多結晶解析にまで適用してみたところ,既往の研究で繰り返し報告されている粒径依存の降伏現象は,同モデルによる定性的には表現可能であるという感触を得るに至っている.今後,バウシンガー試験の精度向上が達成できれば,粒界降伏の仮説によるモデルはより精密化することが期待できる.このような状況ではあるが,当初予定のバウシンガー試験の精度が仮説の定量的評価に資するまでに至っていないという点を考えて,「やや遅れている」という自己評価とした.27年度が最終年度であるため、記入しない。塑性力学,計算力学当初の研究計画調書においては,代表的な次の3つのタイプの金属材料の力学的性質の寸法効果について研究するとしていた:(1)部材そのものが小さいことによる寸法効果,(2)多結晶金属における結晶粒サイズの効果,(3)分散強化機構における介在物のサイズの効果
大脳基底核による睡眠調節の神経生物学的基盤

大脳基底核疾患であるパーキンソン病においては,レム睡眠の減少や睡眠時異常行動症候群などの睡眠障害が出現する.これらの知見は基底核が運動や認知・学習などの機能に加えて睡眠の制御にも関与しており,そのメカニズムの破綻が睡眠障害を誘発する可能性を示唆する.レム睡眠時の運動機能を実現する基本的な神経機構は脳幹と脊髄に存在する.そこで本研究課題では,大脳基底核から脳幹へのGABA作動性出力がどの様にレム睡眠時の運動抑制機構の活動を制御するのかについて解析を試みた.実験には上位脳を離断した除脳ネコ標本を用いた.中脳に存在する脚橋被蓋核(PPN)に微小電気刺激やGABAの拮抗物質を微量注入すると,急速眼球運動を伴う筋緊張消失(REM with atonia)を誘発できること,基底核の出力核である黒質網様部(SNr)にGABA作動薬を注入するとREM with atoniaが出現すること,そして,SNrに電気刺激を加えるとPPN刺激によるREM with atoniaは抑制されることなどを見出した.次に,SNrからPPNへのGABA作動性投射による脊髄α運動細胞の興奮性調節機構について解析した.PPNに微小電気刺激を加えると,後肢の伸筋・屈筋を支配する脊髄α運動細胞の膜電位は過分極側に移行し,運動細胞の発射活動は抑制された.これに随伴して運動細胞の膜抵抗は低下した.この運動細胞に対する抑制効果はSNrへの電気刺激により消失したが,このSNrへの作用はPPNへGABA拮抗物質を注入することによりブロックされた.これらの成績は,PPNからのコリン作動性投射系の賦活によるレム睡眠時の運動抑制は,主にα運動細胞に対するシナプス後抑制作用により誘発されること,そして,基底核からPPNへのGABA作動性投射がPPNのコリン作動性細胞の活動を調節することにより,レム睡眠の発現や維持に関与している可能性を推定させる.大脳基底核疾患であるパーキンソン病においては,レム睡眠の減少や睡眠時異常行動症候群などの睡眠障害が出現する.これらの知見は基底核が運動や認知・学習などの機能に加えて睡眠の制御にも関与しており,そのメカニズムの破綻が睡眠障害を誘発する可能性を示唆する.レム睡眠時の運動機能を実現する基本的な神経機構は脳幹と脊髄に存在する.そこで本研究課題では,大脳基底核から脳幹へのGABA作動性出力がどの様にレム睡眠時の運動抑制機構の活動を制御するのかについて解析を試みた.実験には上位脳を離断した除脳ネコ標本を用いた.中脳に存在する脚橋被蓋核(PPN)に微小電気刺激やGABAの拮抗物質を微量注入すると,急速眼球運動を伴う筋緊張消失(REM with atonia)を誘発できること,基底核の出力核である黒質網様部(SNr)にGABA作動薬を注入するとREM with atoniaが出現すること,そして,SNrに電気刺激を加えるとPPN刺激によるREM with atoniaは抑制されることなどを見出した.次に,SNrからPPNへのGABA作動性投射による脊髄α運動細胞の興奮性調節機構について解析した.PPNに微小電気刺激を加えると,後肢の伸筋・屈筋を支配する脊髄α運動細胞の膜電位は過分極側に移行し,運動細胞の発射活動は抑制された.これに随伴して運動細胞の膜抵抗は低下した.この運動細胞に対する抑制効果はSNrへの電気刺激により消失したが,このSNrへの作用はPPNへGABA拮抗物質を注入することによりブロックされた.これらの成績は,PPNからのコリン作動性投射系の賦活によるレム睡眠時の運動抑制は,主にα運動細胞に対するシナプス後抑制作用により誘発されること,そして,基底核からPPNへのGABA作動性投射がPPNのコリン作動性細胞の活動を調節することにより,レム睡眠の発現や維持に関与している可能性を推定させる.レム睡眠は急速眼球運動、筋緊張の消失、脱波覚醒で特徴付けられる。しかし、レム睡眠にも関わらず筋活動が消失せず異常な行動が誘発される病態が存在する。睡眠時異常行動症候群と呼ばれるこの病態は脳幹網様体の筋活動抑制機構の障害により誘発されると推定されている。一方、基底核疾患であるパーキンソン病においてもレム睡眠の減少や睡眠時異常行動症候群などの睡眠障害が出現することが報告されてきた。これらの知見は基底核が運動や認知・学習などの機能に加えて睡眠の制御にも関与しており、そのメカニズムの破綻が睡眠障害を誘発する可能性を示唆する。レム睡眠を誘発する基本的な神経機構は脳幹に存在する。そこで本研究では、基底核が脳幹への投射系を介してレム睡眠誘発神経機構の活動をどの様に修飾するのか?そして基底核疾患においてどの様な睡眠異常が出現すると考えられるのか?の2点を解明しようと試みた。実験には上位脳を離断した除脳ネコ標本を用いた。中脳に存在する脚橋被蓋核(PPN)に微小電気刺激やGABA拮抗物質を微量注入すると、急速眼球運動を伴う筋緊張消失(REM with atonia)を誘発できることが分つた。REM with atoniaはレム睡眠の運動機能を反映することが明らかとなっている。従つてPPNに投射するGABA作動性投射がレム睡眠の発現に関与すると考えられる。さらに、基底核の出力核である黒質網様部(SNr)にGABA作動薬を注入するとREM with atoniaが出現すること、SNrに電気刺激を加えるとPPN刺激によるREM with atoniaは抑制されることを見出した。

これらの成績は、基底核から脳幹へのGABA作動性投射がレム睡眠の調節に関与する可能性、そして、パーキンソン病における基底核出力の亢進や異常が上記睡眠障害の背景に存在する可能性を推定させる。大脳基底核疾患であるパーキンソン病においては,レム睡眠の減少や睡眠時異常行動症候群などの睡眠障害が出現することが報告されてきた。これらの知見は基底核が運動や認知・学習などの機能に加えて睡眠の制御にも関与しており、そのメカニズムの破綻が睡眠障害を誘発する可能性を示唆する。平成15年度は,基底核が脳幹のレム睡眠誘発神経機構を介してレム睡眠の発現や調節に寄与している可能性を提示した.そこで本年度(平成16年度)は,大脳基底核からのGABA作動性出力がどの様にレム睡眠時の運動抑制機構の活動を制御するのかについて解析を試みた.実験には上位脳を離断した除脳ネコ標本を用いた.(1)大脳基底核の出力核である黒質網様部(SNr)の神経細胞活動を抑制するため,この領域にムシモール(GABA作動性物質)を微量注入すると,脚橋被蓋核(PPN)のコリン作動性細胞の興奮と筋緊張の消失が誘発された.(2)PPNに微小電気刺激を加えると,後肢の伸筋や屈筋を支配する脊髄α運動細胞の膜電位は過分極側に移行し,運動細胞の発射活動は抑制された.これに随伴して運動細胞の膜抵抗は低下した.また,PPN刺激は,Ia EPSPの振幅を減少させたが,その程度は膜抵抗の減少よりも有意に大きかった.(3)PPNコリン作動性細胞の賦活による運動抑制作用は,橋網様体細胞と延髄網様体の網様体脊髄路細胞の活動を介して誘発されることが明らかとなった.(4)SNrに微小電気刺激を加えると,PPNの刺激で誘発される運動細胞への抑制効果が低減し,PPNにGABAの拮抗物質であるビククリンを微量注入すると,このSNr刺激の効果はブロックされた.これらの成績は,コリン作動性投射系の賦活によるレム睡眠時の運動抑制は,α運動細胞に対するシナプス後抑制作用とシナプス前抑制作用の双方により誘発されること,そして,基底核からPPNへのGABA作動性投射がPPNのコリン作動性細胞の活動を調節することにより,レム睡眠時の筋緊張制御に関与することを示唆する.
優れた骨結合能を有する高分子ポリマー脊椎インプラントの開発

PEEK素材に材料特性を変化させずに酸化チタンをコーティング技術を開発し、その有用性について、in vivoおよびin vitroで検証した。前処理として酸化チタンのブラスト処理、そしてSol-gel法による酸化チタンコーティングを用いて作成したインプラントは、擬似体液でのハイドロキシアパタイトの析出や、骨髄幹細胞の骨分化への促進に優れた表面構造を有していた。また兎をもちいた動物実験では、優れた骨組織との結合を認め、引張り試験にて有意にコントロール群と比較して強い引張り強度を有していた。ビーグル犬をもちいた頚椎前方固定モデルでも、優れた骨癒合率を認め、臨床応用可能な材料であると考えられた。PEEKにコントロールを含む5種類の表面処理(blast法, sol-gel法,酸処理の組み合わせ)を行った材料を作成し、アパタイト形成能や表面性状の電子顕微鏡での観察、表面粗さやコーティング層の引き剥がし試験を行った。これらの研究から、sol-gel法、blast法どちらによっても均一な約30nmのチタンコーティングが見られ、酸処理により良好なアパタイト形成能が獲得された。材料表面で日本白色家兎より抽出した骨髄間葉系細胞の培養を行ったところ、チタンコーティングの表面での細胞の活発なアクチンフィラメントの形成が見られ、細胞接着能が高いことが示された。また細胞増殖能もチタンコーティング材料で優れた結果を示した。アルカリフォスファターゼ活性についてはblast法またはblast+sol-gel法を用いた材料で高い傾向がみられblast法によるコーティングが細胞接着や骨分化に適している可能性が示唆された。さらにこれらの材料を用いた、日本白色家兎脛骨への埋入試験を行ったところ、埋入後8週ではblast+sol-gel法を用いた材料で有意に骨との結合力が高いことが引っ張り強度試験を用いて示された。組織切片を用いた解析を行ったところblast+sol-gel法でのコーティング群では有意に表面の新生骨量が高く、骨組織と直接結合している所見が示された。また引っ張り強度試験後の切片には骨組織が接着しており、PEEKのコーティングが剥がれている所見は認めなかった。以上の実験からわれわれの開発したblast+sol-gel法によりチタンコーティングは高い骨伝導能を有し、コーティング層の強度も十分であると考えられることから臨床応用が期待されると考えられる。動物実験における、動物の死亡例や結果のばらつきが少なかったことから進捗が速くなったと考えられる。昨年度に未解決であったコーティング層の厚みの計測のため、表面処理を行ったPEEK(blast法、sol-gel法、酸処理の組み合わせ)後のチタンレイヤーにたいしField Emission SEMを行い、酸処理前で30nm,酸処理後で20nmと非常に薄いレイヤーが得られていることを確認した。このことはこのコーティング方法がPEEKの材料特性を維持したまま骨誘導、伝導能を獲得できることを示している。日本白色家兎の骨髄系幹細胞を採取し、in vitoroの実験に用いた。骨髄系幹細胞の証明としてフローサイトメトリーを行い、得られた細胞が、CD105(+),CD34(-), CD45(-), CD73(-), CD90(-)であることを確認した。同細胞をそれぞれの材料上に蒔き、細胞増殖の、分化能を評価した。細胞増殖能は差が見られなかったが、分化能ではblast法を行った材料(blast + sol-gel or blastのみ)でALP活性の上昇、石灰化の上昇、骨関連誘導遺伝子(BMP2, Col1など)の上昇がみられた。昨年度に行った動物実験の成果と合わせ、blast, sol-gel法の組み合わせが、臨床応用に最適と判断された.得られた成果をActa Biomaterialiaに投稿し、acceptされた。得られた成果をもとに、ビーグル犬を用いた前方固定モデルの作成を行った。頚椎前方椎間板に挿入し、上下の椎体にスクリュー固定できるPEEKケージを3D-CADを用いて作成し、blast, sol-gel法を用いてチタンコーティング後酸処理を行った。実際にケージの試験埋入を行い、現在条件や使用スクリューの最適化をおこなている。最適化条件を得られたあと、処理なしケージと、処理済みケージを用いた埋入試験を行い、本表面処理法の優位性を確立したいと考えている。昨年研究が順調にすすみ、追加実験を含め、本年度中に終了したことで、論文の受理にまで至った。ビーグル犬を用いた頚椎前方固定モデルの予備実験を行い、手術方法や評価方法を確立した。その後、コーティングインプラント(Sol-gel法)と未処理インプラントをランダムにC3/4, C5/6に割付け、ビーグル犬に埋入した(n = 5)。手術後3ヶ月後に、評価を行った。まずmicro-CTを用いたインプラントと骨との癒合に関しては未処理群が癒合率0%であったのに対し、コーティング処理群では60%で骨癒合を認めた。実際に組織とインプラト間に応力を加えてその固定性を確認したところ、未処理群では癒合率0%であったが、コーティング処理群では40%で癒合と判定できた。続いて、組織学的評価をおこなった。未処理群ではPEEKと骨との結合率が3.2%であったのに対し、コーティング処理群では32.6%の骨結合率を示した。

これまでの実験から日本白色家兎で応力のかからない部位(脛骨)での骨結合能に関して、コーティング処理の優位性は示されていたが、本年度の研究から、応力がかかる部位でも優位性があり、さらにビーグル犬という比較的大きな哺乳類でもその効果があることが示されたことにより、本コーティング処理法がヒトでの臨床応用が十分実用化される可能性が示唆された。特に犬の椎体間固定は固定を得ることが困難であることが知られており、本研究で用いた処理方法の優位性が示された結果となった。PEEK素材に材料特性を変化させずに酸化チタンをコーティング技術を開発し、その有用性について、in vivoおよびin vitroで検証した。前処理として酸化チタンのブラスト処理、そしてSol-gel法による酸化チタンコーティングを用いて作成したインプラントは、擬似体液でのハイドロキシアパタイトの析出や、骨髄幹細胞の骨分化への促進に優れた表面構造を有していた。また兎をもちいた動物実験では、優れた骨組織との結合を認め、引張り試験にて有意にコントロール群と比較して強い引張り強度を有していた。ビーグル犬をもちいた頚椎前方固定モデルでも、優れた骨癒合率を認め、臨床応用可能な材料であると考えられた。blast+sol-gel法を用いたインプラントの臨床応用に向けて、より臨床応用に近い実験系が必要と考えられる。そこで、ビーグル犬を用いた頚椎前方固定モデルを作成し、作成した椎体間ケージの臨床成績に優位性が見られることを確認する。犬の椎体間固定は非常に癒合しにくいことがこれまでのわれわれの実験でも明らかとなっているため、早期に骨癒合が得られれば、材料の有用性が示されると考えている。また材料表面のコーティング層の厚みに関しては明確な測定ができていないことから引き続き測定を行っていく予定である。ビーグル犬を用いるin vivo研究が行えるための条件設定を確実にし、本実験を行う予定である。整形外科
カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連抗原の合成分泌調節機構の検討

甲状腺C細胞は、カルシウム代謝ホルモンカルシトニン(CT)を産生・分泌するが、その調節機序については不明な点が多い。本研究では、C細胞のCT分泌調節機序の解明の一助として、正常でのCTの細胞小器管レベルでの局在を検討し、CTとカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)がC細胞の分泌顆粒に局在することを明らかにした(ActaAnat.135:17-21、1989)。ヒトC細胞癌培養細胞(TT細胞)を用い、カルシウムチャンネルブロッカ-Nifedipineを培地に加えると、TT細胞のCT分泌を阻止するため、細胞小器管の発達を顆粒数の増加を認める等有意の変化を示した。実験動物ラットでは、合成サケカルシトニン(TZ-CT)急性投与により、血中カルシウムイオンの低下(7.29.0mg/dl)を来すだけでなく、甲状腺中のCTメッセンジャ-RNA(CT-mRNA)の減少(5080%)とCT含量の減少(60%)を来すことを見い出した(第64回日本内分泌学会)、さらにTZ-CT長期投与により、ラット甲状腺C細胞は、その数を減少させ加令によるC細胞の増生も抑制される等、形態学的方法を駆使して証明した(Acta Pathol Jpn 39:545-550、1989)。すなわち、TZ-CT投与により、甲状腺C細胞はCT合成の抑制が起こり、CT-mRNAへの転写の減少と最終産物CTの減少を来すことが証明された。この抑制状態が長期持続する時、C細胞は数を減じ(萎縮)、負のフィ-ドバック調節を受けると考えた。CTとC細胞の直接作用は、CT受容体を介すると考えられ、その証明が必要と考えられた。カルシトニン(CT)とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)は、CT/CGRP遺伝子にコードされており、プロセシングにより、神経組織ではCGRPが、甲状腺C細胞では主としてCT(95%)が産生されている。本研究計画では、本年度以下の点について明らかにすることができた。(A)人C細胞腫瘍を材料とし、免疫組織化学的にCTとCGRPの発現頻度について報告した。(論文(2)、(4))(B)電顕レベルでの免疫組織化学的局在について、正常人C細胞(論文(6))ラットC細胞(論文(2))ラット迷走神経(論文(3))を用い検討し、これらのペプチドが分泌顆粒に局在することを明らかにした。(C)人甲状腺C細胞より培養株(HMCa)を樹立し(論文(1))、この培養株を用い、種々の分化誘導刺激を加え、形態学的、内分泌学的に検討を加えた。(D)その中で、少量の紫外線照射が、カルシトニン産生能を指標とした分化に細胞分化誘導刺激として作用することが明らかとなった。(内分泌学会発表予定、ヒト甲状腺髄様癌細胞株HMCaにおける紫外線照射によるカルシトニン産生能の変化)。現在、カルシトニンcDNAプローブを精製し、最終産物ペプチドの検討だけでなく、遺伝子の活性化、増幅、mーRNA転写量の変化等についての検討を加えている。本研究では、C細胞のCT分泌調節機序の解明の一助として、正常でのCTの細胞小器管レベルでの局在を検討し、CTとカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)がC細胞の分泌顆粒に局在することを明らかにした(ActaAnat/135:17-21、1989)。

ヒトC細胞癌培養細胞(TT細胞)を用い、カルシウムチャンネルブロッカ-Nifedipineを培地に加えると、TT細胞のCT分泌を阻止するため、細胞小器管の発達を顆粒数の増加を認める等有意の変化を示した。実験動物ラットでは、合成サケカルシトニン(TZ-CT)急性投与により、血中カルシウムイオンの低下(7.29.0mg/dl)を来すだけでなく、甲状腺中のCTメッセンジャ-RNA(CT-mRNA)の減少(5080%)とCT含量の減少(60%)を来すことを見い出した(第64回日本内分泌学会)、さらにTZ-CT長期投与により、ラット甲状腺C細胞は、その数を減少させ加命によるC細胞の増生も抑制される等、形態学的方法を駆使して証明したActa Pathol Jpn39:545ー550、1989)。すなわち、TZ-CT投与により、甲状腺C細胞はCT合成の抑制が起こり、CT-mRNAへの転写の減少と最終産物CTの減少を来すことが証明された。この抑制状態が長期持続する時、C細胞は数を減じ(萎縮)、負のフィ-ドバック調節を受けると考えた。CTとC細胞の直接作用は、CT受容体を介すると考えられ、その証明が必要と考えられた。
大規模比較ゲノム解析からカシ林の生物間ネットワークの成立・変遷の歴史を復元する

日本の暖温帯に生育する照葉樹林の中で比較的耐寒性のあるカシ類について遺伝的分化のパターンを解析した。日本のカシ類8種(イチイガシ,アカガシ,ウラジロガシ,アラカシ,シラカシ,ツクバネガシ,ハナガガシ,オキナワウラジロガシ)の系統関係を解析した結果,日本のカシ類は種ごとに明確に遺伝的分化していた。ゲノムワイドな遺伝子配列データを得ることにより,これまで不明瞭だったカシ類の系統関係を明らかにすることができた。本研究の目的は,照葉樹林の中で比較的耐寒性のあるカシ類の歴史的変遷を追跡することである。植物で使えるDNA多型情報は分子進化速度が遅いため種内変異量が少なく,分布変動を追跡するマーカーとして十分ではなかった。本研究では,近年の遺伝子解析技術の発展によって低コストで使えるようになった次世代シーケンサーも活用し,最近の分布変遷や集団動態の変遷を読み取る。カシ林の優占樹種とそれに密接にかかわって生活している昆虫などについても遺伝解析を行い,遺伝的変異の地理的パターンや遺伝的多様性を種群間で比較・統合し,カシ林の生態系ネットワークの成立過程を解明する。今年度は,カシ類に潜葉する植食性昆虫ツヤコガ類のミトコンドリアDNAを解析し,シイ類に潜葉するツヤコガ類との遺伝的関係を明らかにした。カシ林に生活し,カシ類と種間関係をもつ生物種群において遺伝構造や遺伝的多様性を比較することによって生態系全体の歴史的成立過程を解明できる。本研究では,近年の遺伝子解析技術の発展によって低コストで使えるようになった次世代シーケンサーも活用し,これまで行われてきた少数遺伝子座を対象にしたDNA多型解析からは推定できなかったような過去数千年単位の分布変遷や集団動態の変遷を読み取る。また,カシ林の優占樹種とそれに密接にかかわって生活している昆虫などについても遺伝解析を行い,遺伝的変異の地理的パターンや遺伝的多様性を種群間で比較・統合し,カシ林の生態系ネットワークの成立過程を解明する。今年度は,カシ類に潜葉する植食性昆虫ツヤコガ類のミトコンドリアDNAを解析し,シイ類に潜葉するツヤコガ類との遺伝的関係を明らかにし,カシ類に潜葉する植食性昆虫ツヤコガ類の種内の遺伝的変異を解析した。葉および植食性昆虫類のサンプル採集・整理状況は概ね順調であり,遺伝子解析も順調に進んでいる。植物で使えるDNA多型情報は,分子進化速度が遅いため種内変異量が少なく,分布変動を追跡するマーカーとして十分ではなかった。本研究では,近年の遺伝子解析技術の発展によって低コストで使えるようになった次世代シーケンサーも活用し,これまで行われてきた少数遺伝子座を対象としたDNA多型解析からは推定できなかったような過去数千年単位の分布変遷や集団動態の変遷を読み取る。今年度は,次世代シーケンサーを活用し,Restriction Site Associated DNA Sequence(RADseq)法を用いてゲノムワイドなSNPデータを得ることにより,日本のカシ類の系統関係を明らかにした。その結果,日本のカシ類8種(イチイガシ,アカガシ,ウラジロガシ,アラカシ,シラカシ,ツクバネガシ,ハナガガシ,オキナワウラジロガシ)は,種ごとに明確に遺伝的分化していた。イチイガシは他のカシ類と遺伝的にかなり離れており,アカガシ,ツクバネガシ,ハナガガシ,オキナワウラジロガシのクレードとウラジロガシ,アラカシ,シラカシのクレードに大きく分かれた。また,アカガシ,ウラジロガシについては,種内の遺伝構造を解析し,集団サイズの変動を地域間で比較中である。カシ類(コナラ属アカガシ亜属)が属するコナラ属Quercusは,種の境界があいまいな分類群の一つであり,複数の種間において葉緑体ハプロタイプの共有や核ゲノムの混合が報告されている。

そこで今年度は,次世代シーケンサーを活用し,Restriction Site Associated DNA Sequence (RADseq)法を用いてゲノムワイドなSNPデータを得ることにより,日本のカシ類の系統関係を明らかにした。日本のカシ類8種(イチイガシ,アカガシ,ウラジロガシ,アラカシ,シラカシ,ツクバネガシ,ハナガガシ,オキナワウラジロガシ)および中国のカシ類3種を解析した結果,種ごとに明確に遺伝的分化していることがわかった。日本の暖温帯に生育する照葉樹林の中で比較的耐寒性のあるカシ類について遺伝的分化のパターンを解析した。日本のカシ類8種(イチイガシ,アカガシ,ウラジロガシ,アラカシ,シラカシ,ツクバネガシ,ハナガガシ,オキナワウラジロガシ)の系統関係を解析した結果,日本のカシ類は種ごとに明確に遺伝的分化していた。ゲノムワイドな遺伝子配列データを得ることにより,これまで不明瞭だったカシ類の系統関係を明らかにすることができた。葉および植食性昆虫類のサンプル採集・整理状況は概ね順調であり,遺伝子解析も順調に進んでいる。収集したサンプリングの解析を進める。次世代シークエンサーによる遺伝子解析によって,カシ類の系統解析および種内多型の地理的分布パターンを調べる。収集したサンプルの解析を進める。引き続き,次世代シーケンサーによる遺伝子解析によって,カシ類の系統解析および種内多型の地理的分布パターンを調べる。分子生物地理学収集したサンプリングの解析を進める。植食性昆虫についても解析を進め,樹木の地理的分布パターンとそれに寄生する植食性昆虫のパターンの共通性を見ることによって,カシ林の分布変遷をより詳しく推定する。解析内容変更のため今年度中に研究代表者が所属機関を変更したため,変更先の所属機関での実験室の立ち上げに時間を要したため,実験解析サンプルが当初の予定より少なくなった。解析内容変更のため次世代シーケンサーによる解析費用に用いる。引き続き,日本のカシ類を対象として次世代シーケンサーでの解析を行う。次世代シーケンサーによる解析費用に用いる。
海洋堆積物における嫌気性原生生物の生理・生態

本研究の対象とする福井県の三方五湖の一つである日向湖の底泥の表層を採取し、Percollを用いた密度勾配遠心法によって微生物を分画し、プリムリン染色法によって原生生物(鞭毛虫)を計数し、嫌気的な底泥中での鞭毛虫の動態を把握する実験を開始した。この時、前年度までに単離培養している形態的に特徴のある鞭毛虫を分けて計数し、ある特定の原生生物の動態を調べている。また、DAPI染色法による細菌の計数も行っている。この調査は2019年1月から開始し、2019年12月まで毎月一回実施する。また、同じ試料を凍結保存し、後にDNAを抽出する。これをPCRの鋳型として用いる定量PCRによって、標的としている鞭毛虫の計数を行い、プリムリン染色法による直接計数値と比較する。本研究の対象水域ではないが、日向湖に隣接する水月湖(汽水)、久々子湖(海水)および三方湖(淡水)から、それぞれ数株の鞭毛虫あるいは繊毛虫の単離に成功し、それらの18S rRNA遺伝子の塩基配列を決定したところ、数株については新種である可能性が示唆された。一方、昨年度までに日向湖の底泥および嫌気的な底層水から単離したラビリンチュラ類を顕微鏡で観察したところ、形態的に特徴のあるDiplophrys属であることがわかった。現在、この細胞からDNAを抽出し、PCRによって18S rRNA遺伝子を増幅し、その塩基配列を決定し、種の同定を試みようとしているところである。単離された鞭毛虫の遺伝子の決定が進んでおらず、遺伝子プローブの作成には至らなかった。日向湖の底泥堆積物を定期的に採取し、密度勾配遠心法によって微生物画分を回収して、直接計数法によって鞭毛虫と細菌の計数を1年間にわたって調べる。また、一部の試料からDNAを抽出してPCRの鋳型とする。このDNAを用いて定量PCRによって鞭毛虫の計数を行い、直接計数で得られる計数値と比較することによって、定量PCR法の妥当性を検証する。先ず、底泥からの鞭毛虫細胞の回収方法について検討した。グルタールアルデヒドで固定した底泥試料をMilli-Q水で30倍に希釈してPercollを用いた密度勾配遠心に供し、得られた鞭毛虫画分をプリムリンで染色することによって、底泥中の少なくとも75%以上の鞭毛虫が回収できた。この方法で、本研究の調査対象としている日向湖の底泥中の鞭毛虫を計数したところ、底泥直上水の鞭毛虫の現存量が100 cells/mlのレベルであるのに対し、底泥中は10,00010,000cells/mlと水中の数十倍から数百倍の現存量で、嫌気的な環境でも高密度で鞭毛虫が存在することが明らかとなった。日向湖の他、汽水の水月湖、淡水の琵琶湖でも鞭毛虫を計数したが、日向湖と同様に底泥中の鞭毛虫は高い現存量であった。日向湖、水月湖、琵琶湖の各湖から採取時期の異なる底泥2試料を採取し、泥試料から抽出したDNAを鋳型に、V4およびV5領域を含む18S rRNA遺伝子の一部をPCRで増幅した。このPCR産物をIllumina社のMiSeqによって塩基配列を決定した。QCおよびキメラチェックを行った後、動物や光合成(微)生物、カビなどの塩基配列を除いたところ、各試料から約10万40万配列が得られた。近縁配列をまとめ、最小共通祖先(LCA)法を用いて代表配列の分子系統学的位置を推定した。原生生物の多様性は、湖間で異なっていた。嫌気的な底泥中にも極めて多様な原生生物が存在することが本研究で明らかとなった。また、未同定の配列の他、既存のどの分類群にも当てはまらないものも多くみられ、未知の原生生物の存在も示唆された。また、日向湖の底泥から、形態の異なる少なくとも3種類の鞭毛虫の集積培養に成功し、現在この培養を維持している。このうち1種類の鞭毛虫については、単一種の培養が確立できた。本研究の平成28年度の計画は、日向湖底泥中の鞭毛虫の現存量と群集組成を明らかにすることであった。密度勾配遠心法による底泥中から鞭毛虫を回収する方法を検討し、底泥中の鞭毛虫を計数する方法を確立した。この方法を用いて本研究の対象である日向湖の他、水月湖と琵琶湖を対照として加え、底泥中の鞭毛虫を計数したところ、嫌気的な環境でも極めて高い現存量であることが明らかとなった。また、次世代シーケンサーを用いて、底泥中の原生生物の多様性を調べた。その結果、嫌気的な底泥中にも極めて多様な原生生物が存在することが本研究で明らかとなった。今年度のもう一つの計画は、底泥から鞭毛虫の培養株を取得することであった。これまでに我々が開発した嫌気性鞭毛虫を培養する技術を用いて、形態の異なる3種類の鞭毛虫の集積培養に成功した。このうち1種類については、単一種の培養に成功した。この株については、18S rRNA遺伝子の塩基配列を決定したが、偽遺伝子である可能性が高かったので、再度塩基配列の決定を行う必要がある。一方、ラビリンチュラ類については、日向湖底層の嫌気環境から数株の分離に成功したが、何れも好気性の株であった。