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加齢性神経原線維変化のモデル動物としてのイエネコの有用性

イエネコを含む一部のネコ科動物の脳では、ヒトのアルツハイマー病でみられる神経原線維変化が形成されることを明らかにした。これらのネコ科動物では、アルツハイマー病の発病に関与するβアミロイドのアミノ酸配列が他の多くの哺乳動物(イヌ、サル)と異なっており、脳におけるβアミロイドの沈着パターンも異なっていた。また、神経原線維変化の程度が重度のイエネコでは、海馬の神経細胞が有意に減少していた。イエネコは、ヒトのアルツハイマー病の病態、特にAβとタウ蛋白質の関係と神経細胞変性に関する研究に有用な動物モデルと考えた。胎子から20歳までのイエネコ24頭の大脳を解析した。8歳未満の脳ではAβ沈着および高リン酸化タウ沈着は認められなかった。8歳以上の16頭のうち15頭で大脳にAβが沈着していた。また、Aβ沈着がみられた個体でのみ高リン酸化タウの沈着が観察された(15頭中9頭)。すなわち、老齢ネコの脳においてもヒトのアルツハイマー病と同じようにAβ沈着が先行し、続いてタウ蛋白質の過剰リン酸化がおこると考えられる。Aβ沈着は、ギ酸処理標本では大脳皮質の実質に、ギ酸処理をしていない標本では海馬錐体細胞の細胞質に顆粒状に観察された。これらの沈着物は渡銀染色で染色されない。また、ウェスタンブロッティングにより、海馬にAβオリゴマーが存在することを確認した。高リン酸化タウの沈着は、軽度の個体では嗅内野に限局し、重度の個体では海馬の錐体細胞に多数観察された。高リン酸化タウ沈着物はガリアスブラーク染色で黒色に染色され、主に神経細胞(神経原線維変化)に、一部で稀突起膠細胞の細胞質に観察された。脳凍結サンプルのサルコシル可溶分画では、胎子の脳において3リピートタウが多く発現されており、4リピートタウの発現はみられなかった。一方で、成体では3リピートタウと4リピートタウが両方発現されていた。さらに、組織学的に神経原線維変化が確認された脳ではサルコシル不溶分画にも3リピートタウと4リピートタウが検出された。年齢をマッチさせた老齢ネコについて、神経原線維変化陽性の脳と、神経原線維変化陰性の脳を比較すると、神経原線維変化陽性の脳ではNeuN陽性の錐体細胞が有意に減少していることがわかった。以上の結果から、イエネコは他の多くの哺乳動物とは異なり、脳に嗜銀性老人斑(Aβ凝集物)を形成しないが、低凝集性のAβ(Aβオリゴマー)が蓄積する。Aβの蓄積に伴って、ヒトのアルツハイマー病と同じ性質(分布、構成蛋白質、嗜銀性、神経細胞変性)の神経原線維変化を形成するイエネコを含む一部のネコ科動物の脳では、ヒトのアルツハイマー病でみられる神経原線維変化が形成されることを明らかにした。ネコ亜科(イエネコおよびツシマヤマネコ)の動物の脳では、βアミロイドと高リン酸化タウが加齢性に沈着することを明らかにした。平成24年度は、特にツシマヤマネコの脳について詳細に解析し、その内容を国際的な学術雑誌に報告した(Chambers JK et al. PLoS ONE. 2012)。高リン酸化タウが沈着する脳の領域、病変の広がり、細胞の種類および構成タウアイソフォームがヒトのアルツハイマー病と同じであった。タウ蛋白質の主要なリン酸化酵素であるGSK-3βが高リン酸化タウ陽性細胞で発現されていることを確認した。ガリアスブラーク染色では神経原線維変化やニューロピルスレッドが観察され、超微形態学的に線維性の凝集物であることを確認した。βアミロイドの沈着物は微細顆粒状を呈し、嗜銀性の老人斑を形成しなかった。ネコ亜科のβアミロイド沈着物は、ヒトβアミロイドのN末端に対する抗体では染色されなかった。ツシマヤマネコのβアミロイドのアミノ酸配列を解析したところ、N末端側7番目のアミノ酸がヒトを含む多くの哺乳動物と異なっていることが判明した。ツシマヤマネコは、進化の系統樹上でチーターとイエネコの間に位置しており、これらのネコ亜科の動物では共通した脳の老化病変が観察されることがわかった。すなわち、これらの動物では嗜銀性老人斑を形成しないにもかかわらず、神経原線維変化を形成する。ヒトのアルツハイマー病の病態を考える上でも意義のある成果が得られたと考えている。平成24年度の研究計画を概ね遂行することができた。すなわち、神経原線維変化の病理組織学的解析、タウ蛋白のアイソフォームパターン、リン酸化酵素の発現、神経原線維変化による神経細胞傷害性について検討し、神経原線維変化のモデル動物としてのイエネコの有用性を示す結果が得られた。この中で、神経原線維変化による細胞傷害性については、アポトーシスマーカーを中心に検討したものの、有意な結果が得られなかったため、他の評価方法を用いて次年度に検討する。また、次年度の研究計画の一部を既に終了している。

すなわち、ネコ亜科動物(ツシマヤマネコ)のβアミロイドアミノ酸配列の同定を行った。これらの研究成果は既に海外の学術誌に掲載され、新聞やインターネットなどのメディアを通して社会に公表した。神経原線維変化による細胞傷害性については、海馬領域の神経細胞の数を定量的に評価することで、神経細胞脱落の有無を確認する。リン酸化されているタウのアイソフォームについては、研究協力者(高島明彦、国立長寿医療センター)のアドバイスのもと、生化学的に評価し、可能であればリン酸化酵素の活性を測定する。ネコ科動物のβアミロイドアミノ酸配列については、さらに動物種を増やして解析することを目標とし、その目的で超微量分光光度計を平成25年度設備備品費に計上した。ネコ科動物のβアミロイド凝集性評価については、共同研究者とともに既に解析を始めており、今後データを蓄積する。特にオリゴマー化したβアミロイドに着目して研究を進める。少量のサンプルから核酸や蛋白質を抽出するため、超微量分光光度計を設備備品として計上した。消耗品費は、主に核酸や蛋白質の抽出キットおよび抗体試薬の購入にあてる。
バイオフィルムを破壊するイオン導入法の開発を目指して

本研究では、難治性根尖性歯周炎との関わりが示唆されている細菌由来バイオフィルムに対する各種抗菌剤を併用したイオン導入法の抗菌効果を検討することを目的とした。1)バイオフィルム形成法の確立:17年度に行った実験結果から、バイオフィルム形成能を有するとされ、最もバイオフィルム形成能の高かった、尿路感染症由来Enterococcus faecalis(E. F)(菌株740)を用い、培養シャーレに播種した。培地にはTryptic soybrothを用いた。好気条件下で培養後、シャーレを洗浄した後にシャーレ底面に付着した形成物をバイオフィルムとした。2)抗菌効果およびバイオフィルム除去効果:24時間培養後のバイオフィルム形成菌に対し、各種抗菌剤の添加および通電処置を行い、処置後のバイオフィルムをグラムハッカー染色し、吸光度計を用いてフィルムの残留量を定量した。また、シャーレ底面よりバイオフィルムを剥離して撹拝し、寒天培地上で培養してコロニー数を算出した。処置後のバイオフィルム内細菌をLiveのeadkitを用いて染色し供焦点レーザーにて生菌と死菌数を定量した。抗菌剤には、次亜塩素酸ナトリウム、クロルヘキシジン、オフロキサシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニダゾール、およびペニシリンを用いた。バイオフィルムに対する通電処置に使用する電極線として、金、ステンレス、ニッケルチタンおよびチタンを用いた。オフロキサシンおよびテトラサイクリンは強いバイオフィルム除去能力を示した。クロルヘキシジンは、バイオフィルム内の細菌を殺菌するが、フィルム膜の死菌は残存した。同様に細菌バイオフィルムに対して通電処置を行った。通電により、バイオフィルム内の細菌が殺菌されるとともに、シャーレ底面からバイオフィルム膜が剥離する傾向が認められた。供焦点レーザーによる観察から、陽極と陰極の電極周辺で抗菌効果が異なることが観察された。マクロライド系抗菌薬と通電の併用によりバイオフィルムの破壊効果および抗菌効果が最も高いことを明らかにした。本研究では、難治性根尖性歯周炎との関わりが示唆されている細菌が形成するバイオフィルムに対する各種抗菌剤の抗菌活性およびイオン導入法で使用する通電効果を検討することを目的とした。1)バイオフィルム形成能の評価:被験細菌として難治性根尖性歯周炎の病巣部から検出されており、バイオフィルム形成能を有するとされるEnterococcous faecalis(E.F)(菌株740,386および415)を用いた。各菌株を希釈調整し、培養シャーレに播種した。培地には、Tryptic soybroth, SDMおよびBHI培地を用いた。好気または嫌気条件下で培養後、シャーレを洗浄した後にシャーレ底面に付着した形成物をバイオフィルムと想定した。各菌群のバイオフィルム形成能を培地の種類、培養条件を変えて検討した。菌株の種類および培養条件によりバイオフィルム形成能は異なり、E.F.740のバイオフィルム形成能が最も強かった。培地の種類によるバイオフィルム形成の比較から、Tryptic soybrothを使用した際にもっとも強いバイオフィルム形成を示した。2)抗菌剤の殺菌効果:24時間培養後のバイオフィルム形成菌に対し、各種抗菌剤を数分間、単回から数回にわたって作用させ、処置後のバイオフィルムを寒天培地に移してコロニー数を算出した。また、バイオフィルムを染色し、共焦点レーザー顕微鏡と解析ソフトにより生菌と死菌数を定量した。抗菌剤には、フッ化ジアンミン銀溶液、ヨード・ヨード亜鉛溶液、ホルマリン製剤、次亜鉛素酸ナトリウムおよび抗生剤を用いた。次亜鉛素酸ナトリウムは最も強いバイオフィルム除去能力を示した。また、バイオフィルムは残存していても、バイオフィルム内の菌は殺菌されているものも認められた。3)通電による殺菌効果:上記同様に細菌バイオフィルムに対して通電処置を行った。通電に使用する電極線として、金、ステンレス、ニッケルチタンおよびチタンを用いた。金電極による通電時は、バイオフィルム内の菌を有意に効率的に殺菌した。

クロルヘキシジンは、バイオフィルム内の細菌を殺菌するが、フィルム膜の死菌は残存した。同様に細菌バイオフィルムに対して通電処置を行った。通電により、バイオフィルム内の細菌が殺菌されるとともに、シャーレ底面からバイオフィルム膜が剥離する傾向が認められた。供焦点レーザーによる観察から、陽極と陰極の電極周辺で抗菌効果が異なることが観察された。マクロライド系抗菌薬と通電の併用によりバイオフィルムの破壊効果および抗菌効果が最も高いことを明らかにした。
葉脈流観測を目的としたバイオスペックルセンサの開発

本研究は、農業生産管理における植物生理情報取得のため、葉脈流の流量・流速や揺らぎを観測可能な実用型バイオスペックルセンサの開発を目的とした。植物の葉を対象に、レーザ透過光を利用したレーザスペックル法を適用し、植物葉脈の解析を実施した。その結果、植物由来の特定のスペックル変動を分離・抽出するための解析手段の必要性と植物由来の特徴的なスペックル変動か確認された。今後は、スペックル変動の詳細な解析をもとに実用化に向けた計測装置の構築を目指す。精密農業では生産精度の更なる向上を目指し、現行の光合成活性や植生指標、収量予測情報に加え、より多くの植物生理・生育情報を多面的に評価することが必要である。葉の葉脈流は蒸散量や吸水量などの植物の水動態を表現するものと考えられており、間接的に葉の光合成速度、蒸散速度あるいはストレスなどの環境応答を反映する指標となる。しかし、農業現場においては、植物の水動態を非破壊かつ簡易に計測する方法はない。本研究は、農業生産管理における植物生理情報取得のため、葉脈流の流量・流速や揺らぎを観測可能な実用型バイオスペックルセンサの開発を目指した計測原理の構築を目的とした。平成26年度では,模擬葉脈を用いて流れ場における観測精度の確認を行った.模擬葉脈では,トレーサ粒子を水の中に流すことを試みたものの予定通りの流れが作れなかった.そのため,気泡を対象とした計測実験を行った.同時に,流れ場の可視化に利用される画像相関法のアルゴリズムを援用し,スペックル画像から流れのベクトルを算出する画像処理プログラムを作成した.以上の成果から,スペックル画像をもとにした流れの可視化が可能であり,レーザスペックルによる葉脈流の定量化が可能と考えられる.26年度の結果をもとに,屋外での計測システムを構築し,27年度のフィールドでの観測条件等を明らかにするための実験計画を策定する.合わせて,植物の蒸散量との相関を見るための実験についても,研究分担者と協議を始めている.精密農業では生産精度の更なる向上を目指し、現行の光合成活性や植生指標、収量予測情報に加え、より多くの植物生理・生育情報を多面的に評価することが必要である。前年度において構築した解析アルゴリズムの実証実験をダイズ葉を対象に実施した結果,葉脈流を明確にすることができなかった.本計測方法では,葉裏面よりレーザを照射し透過光による計測を実施している.そのため,葉の複雑な組織・器官での光の屈折散乱が解析画像に含まれ葉脈流由来のスペックル画像を得ることができなかった.そこで,まずは水ストレス由来のスペックル変動を探索するため,スペックル変動の大きな画素を対象に周波数解析及び周辺画素のスペックル変動との相互相関関数により,葉脈流計測を実施した.その結果,植物由来の特徴的な周波数成分抽出と変動の位相差による葉脈流の定量化の可能性が示唆され,今後のより詳細な解析の必要性が見いだされた.本研究は、農業生産管理における植物生理情報取得のため、葉脈流の流量・流速や揺らぎを観測可能な実用型バイオスペックルセンサの開発を目的とした。本研究は,フィールドにおける実用型のセンサ開発に向けた計測原理の構築を目的としている.そのため1年目においては計測アルゴリズムを構築し,2年目においては屋外計測による精度確認を計画している.26年度(1年目)については,前項のように計画通り計測アルゴリズムが作成され,次年度に向けた協議を始めている点で,順調に進展しているものと評価できる.農業情報葉脈流量の定量化に向けて,平成27年度では,以下の項目について研究を進める.葉脈観察のための光および画像取得条件の検討葉脈流計測では、葉への透過光を利用する予定である。レーザ波長によってはスペックル画像の取得精度が異なることが予想されるため、可視光および近赤外の範囲で複数の波長およびレーザ高出力でスペックル画像取得精度を確認する。ただし、レーザ光はクラス2以下の人体・植物への影響がない範囲で選定する。また、流量算出アルゴリズムとの兼ね合いからカメラ画像のフレームレートや解像度設定を検討する。実際の作物を用いた葉脈流観測ポット栽培したダイズを用い、チャンバー内で葉脈流のスペックル画像を取得し、光量や温度・湿度条件の影響が実際に葉脈流量の変化に現れるか確認し、前年度開発する流量算出アルゴリズムの妥当性を検証する。また、露地栽培ダイズでは、計測部位の遮光率がスペックル画像取得にどの程度まで許容できるか確認する。
T細胞因子による抗腫瘍免疫の調節機構に関する研究

腫瘍免疫におけるエフェクター細胞、とくに、活性化マクロファージ(Mφ)、NK細胞、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、キラーT細胞や遅延型T細胞誘導におけるT細胞因子の役割について、次のようなことを明らかにした。すなわち、(1)MφやMφラインの活性化に働く、HTLV腫瘍化T細胞産生する液性因子(蛋白)を精製し、また、そのcDNAを分離しリンホトキシン(LT)と同定した。次いで、分離LTによるMφの活性化の概要を明らかにした。(2)マウスでヘルパーT細胞の産生するインターフェロンγ以外のMφ活性化因子の存在と、その働きを示した。(3)コロニー刺激因子などによる骨髄Mφの活性化機構を示し、その強い抗腫瘍性を明らかにした。(4)LAK細胞はNK細胞にも由来するが、LAKはこの活性化NKとMφの補助の下にT細胞からも誘導されること(T-LAK)を明らかにし、その誘導にかかわるNK、Mφ因子について追求した。(5)メチルコラントレン自家発癌細胞に対するエフェクター細胞(主として、LAK細胞)の誘導におけるインターロイキン2とサイクロホスホアミドの共同作用を明らかにした。(6)【Lyt^+】【2^-】エフェクターの抗腫瘍作用はその産生するマクロファージ活性化因子に由来することを明らかにし、その活性因子の部分精製に成功した。(7)キラーT細胞誘導における自己la反応性T細胞(autologous mixed lymphocyte reaction,AMLR)の役割と、それに介在する液性因子(インターロイキン3や4)の働きを明らかにした。これらの発見は、腫瘍免疫エフェクター細胞誘導に関与するT細胞因子の多様性を示すとともに、T細胞因子の実際的応用によって腫瘍免疫を誘導するために必要な多くの情報を提供するものである。
変異型可溶性接着分子(VCAM-1)を用いた自己免疫アネルギー誘導機序の解析

1.可溶性VCAM-1の細胞内シグナル伝達機構を検討し以下の結果を得た。1) IL-2プロモーター領域の主な転写因子の結合に可溶性VCAM-1がどのように作用するかゲルシフト法にて検討した結果、可溶性VCAM-1はAP-1,NF-AT,Oct 1の結合を抑制したがNF-kBの結合は抑制しなかった。2.可溶性VCAM-1の新たな機能に関して以下の知見を得た。1)リウマチ患者関節液では可溶性VCAM-1の抑制作用は主にCD45ROT細胞に作用した。2)可溶性VCAM-1はIL-2依存性T細胞株,リウマチ患者関節液T細胞,Jurkat細胞に対して遊走能を示した。3.変異型可溶性VCAM-1としてVLA-4結合部位を2つ有する従来型にIgGFcを融合させたdimer型を作成した。この変異型の作用については現在検討中である。本研究では、可溶性VCAM-1の細胞内シグナル伝達機構を検討し、自己免疫病態における、可溶性VCAM-1によるアネルギー誘導機序を解明することを主眼とした。[方法]1)変異性可溶性VCAM-1はVLA-4結合部位を2つ有する従来型とIgGFcを融合させたdimer型を作成した。2)アネルギー検出系としてIL-2プロモーター領域の主要な転写因子の結合をゲルシフト法にて測定し、またIL-2レポーター遺伝子活性のルシフェラーゼ測定系を確立した。3)VLA-4結合活性の高いJurkat細胞に変異型可溶性VCAM-1を作用させ、細胞を可溶化し、^<32>P標識ATP存在下に、CaMIIキナーゼ活性を測定した。4)リウマチ患者関節液T細胞をCD45抗体と磁気ビーズで分画し、ゲルシフト法を行った。[結果]19従来型可溶性VCAM-1に関してはさらに安定高発現株が樹立できた。2)ゲルシフト法にてAP-1、NF-AT、Oct-1等の各転写因子の結合が従来型可溶性VCAM-1により、抑制されたが、NF-kBは抑制されなかった。3)従来型可溶性VCAM-1により、CaMIIキナーゼ特異的基質のリン酸化が検出された。また可溶性VCAM-1によるこの反応は、CaMIIキナーゼ阻害剤KN62の添加によって疎外された。4)Western Blot法によるチロシンリン酸化蛋白の検討では、可溶性VCAM-1により、分子量6万の蛋白のチロシンリン酸化が検出さたが、固相化VCAM-1接着時にリン酸化されるFAK分子は検出されなかった。5)可溶性VCAM-1によるアネルギーは主としてリウマチ患者関節液中ではCD45RO記憶T細胞に対して働いていた。6)可溶性VCAM-1よるアネルギー誘導機序にapoptosisが関与している可能性があったのでさらに、抗TNF、TNFレセプター、FAS中和性抗体を作用させ、これらによる影響がIL-2産生にないことを確認した。さらにapotosis非誘導状態でも、FADD、TRADD等のdeath domainは存在することがWestern Blot法にて判明した。[考案]可溶性VCAM-1はCaMIIキナーゼを活性化させ、IL-2遺伝子n転写を抑制させることにより、アネルギーを誘導していることが判明した。さらに異なった変異型可溶性VCAM-1による、かかるシグナルを誘導するligandのvalencyの検討が、自己免疫病態におけるアネルギー機序解明に今後必要と考えられた。今年度は可溶性VCAM-1(以下sVCAM-1)を用いて以下の検討をおこなった。1) IL-2依存性,慢性関節リウマチ滑膜T細胞,Jurkat細胞への遊走能に関する検討。sVCAM-1はいずれの細胞に対してもケモタキシスチェンバー法にて有意の遊走能を示した。sVCAM-1による遊走はRho inhibitorであるH7,Protein kinase CのinhibitorであるH7,Calrnodulin dependent kinase IIのinhibitorであるKN62によって抑制され、Tyrosine kinaseのinhibitorであるgenisteinの抑制効果は軽度であったことより、sVCAM-1の遊走能はRho, Protein kinase C, Calmodulin dependent kinase IIの活性化を介したものであることが示された。
マグネシウム不足によるパラコート中毒促進の原因究明

銅の高感度で簡便な定量法を開発し発表した(Clin Chem,2001,Jpn J ForensicToxicol,2001)。5μlの血漿、1.5mlの水道水で定量が可能である。この方法を用いて餌中にパラコート250ppmを投与して中毒をおこしたラットの組織中の銅を定量した。その他の金属は当補助金で入手した島津AA-6200原子吸光光度計にて定量した。中毒ラットでは、銅は肺、肝、血漿で2倍に、腎では半分に変動していた。鉄は肝、脾で2倍、血漿では半分に変動していた。マグネシウムは腎で2倍となり、肝ではマグネシウムと亜鉛が有意に上昇していた(J Toxicol Environ Health,2002)。マグネシウム半減食中にパラコート125ppmを投与したラットの上記金属レベルはパラコート中毒の場合と同様であった(Jpn J Legal Med,2001)。しかしながら、カルシウムは腎で10倍となっていた(法医学会総会,2002発表予定)。マグネシウム半減食のみでこのような高濃度のカルシウムの蓄積をおこすには通常35日以上を要する。マグネシウム半減食中に125ppmのパラコートを投与したラットではパラコート中毒とマグネシウム欠乏がともに促進されていた。カルシウムとマグネシウムの比を保つために全ミネラルを半減しパラコート125ppm投与ラットではカルシウムは腎で20倍となっていた(ISALM,2002発表予定)。除草剤パラコートの毒性発現には活性酸素が起因しており、活性酸素による組織の過酸化は、老化や虚血性心疾患の原因ともされている。ラットを用いてエサ成分の不足と、パラコート中毒との関連について調べた結果、抗酸化剤であるビタミンEやC、その他のビタミンの不足よりもミネラル不足の方がパラコート中毒を促進することを見出した(Jpn.J.Forensic Toxicol.1998発表)。さらにミネラル成分のうち、どのミネラルが最も重要であるかを知るために種々のミネラル不足のエサにパラコートを添加して中毒状況を調べた。アルミニウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、クロム、セレンの中で、マグネシウム不足が最も中毒を促進することを見出した(Arch.Toxicol.1998発表)。パラコート中毒により発生した活性酸素はビタミンCによっても無毒化されるが、その過程においてビタミンCはアスコルベートラジカルとなる。パラコート中毒ラットの肺、牌、肝において、アスコルベートラジカルが正常ラットよりも多量に生成し、かつより急激に減少することを見出した(The Proceedings of the 2nd International Conference on Bioradicals 1998発表)。パラコート類似のジクワットによる中毒の場合には、腎、牌、肝においてアスコルベートラジカルの生成系と消去系が共に活性化されることが示された(第6回インド・太平洋地域国際法医・法科学会1998発表)。平成10年度科研費で入手した原子吸光光度計を用いて、これらのラットの血清中のマグネシウム量を測定した。その結果、ミネラル不足を伴うパラコート中毒において血清中のマグネシウム量が最も上昇することを見出した。老化や虚血性心疾患は組織の過酸化に起因するとされている。除草剤パラコートの毒性発現には、活性酸素が関与しており、パラコートは毒物としてのみならず、過酸化機構解明のために用いたれている物質である。パラコート中毒により発生した活性酸素はビタミンCによって無毒化される過程で、アスコルベートラジカルを生成する。中毒ラットの肺、脾、肝、血清、及び中毒ヒト血清ではこのラジカルが多量に生成されることを見い出し報告した(Free Radical Research,2000:6th Indo Pacific Congress,1999)。パラコート類似のジクワットによる中毒では腎、脾、肝、血清でこのラジカルが多量に生成されることを見い出し報告した(Jpn.J.Forensic Toxicol.,1999)。

抗酸化ビタミンの不足よりも、ミネラル不足の方がパラコート中毒を促進し、生体内に過酸化物質を多量に生成することを見い出し報告した(静岡県立大学特別研究報告書,1999)。パラコート中毒とミネラルとの関係について今まで報告がなかった。平成10年度科研費で、ミネラルを測定するための原子吸光光度計を入手することができ、本年は研究を以下のように進展することができた。ミネラル不足のうちで、マグネシウム不足が中毒を最も促進すること、生体酸化には鉄と銅が関与していることから、ラットの組織中のマグネシウム、鉄、銅レベルとパラコート中毒との関連を調べた。これらレベルは各々の正常レベルを1とする中毒ラットではマグネシウム(血清1.0、肝1.2、腎2.1)、鉄(血清0.4、肝2.7、腎1.8)、銅(血清1.5、肝1.2、腎0.8)と顕著な変化を示し、ミネラルの重要性が示された(法医学会,2000年4月発表予定)。ミネラルのパラコート中毒への影響については我々が最初に見い出し、ミネラル特にマグネシウムの不足が中毒を促進することを報告した(Dietary Mg and/or K restriction enhances paraquat toxicity in rats.Arch Toxicol,1998)。パラコートの毒性は活性酸素による過酸化によるとされているが、老化や虚血性心疾患も過酸化に起因している。パーキンソン症の原因はまだ判明していないが、パーキンソン類似症状をひきおこすMPTPとパラコートの構造は酷似している。生体内の酸化還元反応にはミネラルが関与しているので、パラコートの毒性がミネラルの過不足に影響されることは当然ことであるのかもしれない。平成10年度科研費で、ミネラルを測定するための原子吸光光度計を入手することができたので、マグネシウム不足により中毒が促進したラットをコントロールラットと比較することにより、種々の知見をえることができた。ラットはヒトと同じようにビタミンCが合成できないODSラットを用いた。「パラコート中毒における血清中の金属レベルの変化」の演題で法医学会,2000年4月に発表した。「ミネラル半減食によりパラコート中毒の促進をきたしたラットの組織中アスコルベートラジカル」の演題で生体フリーラジカル研究会,2000年11月に発表した。「マグネシウムの不足によってパラコート中毒促進をきたしたラットの組織中マグネシウム、鉄、亜鉛レベル」の演題でJSoFF学術集会,2000年11月に発表した。また今までの銅の定量法の1/400の量で銅を定量する方法を開発したので、日本法中毒学会2001年7月、およびIndo-Pacific Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences,2001,Septemberで発表予定である。パラコー中毒へのマグネシウム不足の影響をみるために、ラットを種々の条件下で7日間飼育した。(1)正常食コントロール群(2)全ミネラル半減食群(3)正常食パラコート125ppm投与群(4)マグネシウム半減食パラコート125ppm投与群(5)全ミネラル半減
短パルスマイクロ波による大振幅イオン波の励起とその伝搬特性

申請者は、プラズマ中に短パルスマイクロ波(パルス幅5080ns)を共鳴領域に入射することにより、大振幅イオン波(δn/n_o40%)の励起に成功している。この波の励起には、入射マイクロ波のパルス幅をイオンプラズマ特性時間_T_i=2π/ω_iより短くする必要があることが確認された。励起されたイオン波がイオン周波数で決まる特性時間に関係していることは、大振幅電子プラズマ波の励起法として近年注目を集めているレーザー航跡場(Laser Wake Field)と深い関係があると考えられ、物理的にも、大変興味深い。さらに今年度、この励起された波の性質を注意深く観察することにより、この大振幅イオン波は、線形理論で予測される分散関係ω=C_skを満たさないことが明らかとなった。この波は、伝搬するに従い振幅は成長し、その後減衰するが、減衰につれて、線形理論で予測された分散式に従うようになる。このことは、従来のプラズマ物理学の理論では、説明がつかず、この分野の更なる進展が期待される。今回、申請したプラズマ生成用電源を購入した。現在、実験装置に組み込み、所要の電流値が出力されることは確認した。これにより、プラズマ密度の微調整を行う予定である。
パラメトリックX線放射の理論

パラメトリックX線放射の基本的なメカニズムは、本研究者の量子力学によるミクロスコピックな理論により明確に理解されるようになった。しかしながら、実験結果の定量的説明には、成功していなかった。その主な理由として、今まで使われてきたFeranchuk-Ivashinによる、結晶内における入射電子の多重散乱理論が、誤りであるらしいことが、実験的に、最近、明らかにされた。そこで、チャネリング理論などで知られる拡散近似を用いて、パラメトリックX線放射における多重散乱の理論を築いた。この理論に基づき、数値計算を行ったところ、実験結果とよい一致が得られた。この結果は、来年度の、「第16回固体内原子衝突国際会議」(オーストリア)で、発表する予定である。また、吸収端付近でのパラメトリックX線放射の理論を、RPAに基づいて築いた。その結果、従来の理論より実験値に近い結果が得られたが、未だ定量的一致には至っていない。上述の新しい多重散乱理論を取り入れて、更に理論を発展させていく必要がある。さらに、動力学的効果を取り入れたパラメトリックX線の理論を新たに作り、運動学的な理論と明確に比べられる、解析的な表式を得た。その結果、動力学的効果は、定量的にも無視できるぐらいの影響(絶対値で数%以下)しかないことが明らかとなった。この結果は、1994年秋の日本物理学会(静岡大学)で発表した。なお、数値計算には、本年度の科研費で購入したパーソナル・コンピュータを用いた。
聴器の音響易傷性の予知に関する耳音響放射の調査研究

誘発耳音響放射(eーOAE)は外耳道において記録される音響現象であり、発生源は蝸牛内の能動的微小機械系振動にあると考えられている。私共の今迄の研究からeーOAEが音響曝露に対する聴器曝傷性の予知に役立つ可能性が示されている。今回はそれを実証する目的で、比較的強大な楽器音の曝露環境にある対象において、聴力損失とeーOAEの関係を調べた。埼玉県下の2中学校の女子吹奏学部員、H校62名,F校33名,さらにH校の対象のうち追跡調査が可能であった20名を対象として聴力検査およびeーOAEの測定を行った。自記聴力検査では鋭い谷型の損失が10dB以上のものを研究上のdipとして検討した。eーOAEの測定には音響プロ-ブK・3(井上ら,1990)を用い,立上がり1立下がり1ms,持続3msの短音に対する刺激開始後20msの音響応答を加等平均し解析した。eーOAEの持続が延長している場合に,刺激時間の倍すなわち6ms以上であるものを持続性音響放射(cーOAE)とした。1)H校の対象における調査では,dipのある耳(dip【symmetry】耳)発現頻度は59.4%であり、cーOAEのある耳(cーOAE【symmetry】耳)の頻度は42.4%であった。dip【symmetry】耳の頻度はcーOAEの耳で82.0%,cーOAE【.horizontally divided corcle.】で34.8%であった。2)F校の対象においては,dip【symmetry】耳の発現頻度は63.5%であり、cーOAE【symmetry】耳の頻度は56.3%であった。cーOAE【symmetry】耳におけるdip【symmetry】耳の頻度は80.6%,cーOAEー耳では42.9%であった。3)H校の対象のうち,2年後の今回追跡調査が可能であったもののcーOAEのある耳の発現頻度は50%(40耳中20耳),dip耳の頻度は45%(40耳中18耳)であった。前回の調査と較べdipの有無に変化のあったのは4耳であったがそれらの耳のcーOAEには変化はなかった。cーOAEは1耳のみ【.horizontally divided circle.】から【symmetry】に変化したがdipは【.horizontally divided circle.】のままであった。追跡調査の成績から、cーOAEとdipは互いに原因と結果の関係にはないと考えられ、cーOAEが素因として易傷性の予知に役立つであろうことが示唆された。
統合的多階層アプローチによるシアノバクテリア生物時計システムの新展開

KaiCを中核とした概日時計システムの詳細を明らかにするため、KaiCのATPase活性(Ouyang et al. 2019 submitted)や生物発光リズムを指標としたKaiC変異体のスクリーニングを実施した。野生型およびスクリーニングされた各種KaiC変異体の構造解析を実施し、ATPase活性を担うCIドメインからリン酸化/脱リン酸化を担うCIIドメイン(及びその逆も)への作用機序を確認した。CI自体の構造変化、CII自体の構造変化、CIとCIIの連携による構造変化、これらを区別しつつ互いの因果関係を読み解くべく、構造解析と変異体解析を駆使して研究を進めた。他方、構造解析から見いだされた作用機序とKaiA/KaiB結合との関係についても注意深く考察を進めている。蛍光プローブを導入したKaiCを用いてKaiCとKaiBの相互作用を検証し、KaiCの遅いATPase活性がKaiBとの結合のタイムスケールを律速する重要な因子の一つであることを解明した(Mukaiyama et al. 2018)。KaiA/KaiB相互作用をKaiC6量体の構造不均一性の観点から検証するべく、μ流路型自動サンプリングシステムを用いた連続滴定測定系を構築した。リン酸化/非リン酸化混合KaiCに対して、KaiA/KaiBの連続滴定X線溶液散乱測定を行ったところ、結合モードの非線形的な応答が見出され、KaiC6量体内の不均一性に由来する可能性が強く示唆された。進化系統樹をもとにKaiCホモログを調製して固有振動数を評価し(これまでに21種類実施して10種類成功)、in vitro/in vivoスクリーニング系で同定された各種変異体や構造解析の結果と対比させつつ、進化的多様性について考察を進めた。予備的中性子準弾性散乱測定の解析から、KaiCの内部運動が変異により変化する可能性が示されたため、野生型及び温度補償性が大きく損なわれたKaiC変異体についての中性子準弾性散乱実験を実施し、その運動の温度依存性を詳細に調べた。【秋山グループ】KaiCのATPase活性を指標に、シアノバクテリア生物時計の変異体をin vitroで迅速にスクリーニングするシステムを構築した(投稿中)。進化系統樹をもとにKaiCホモログを調製して固有振動数を評価した(21種類実施して10種類成功)。概日周期に相当する振動数(1.0/日)を中央値とした分布が確認されたが、振動数が優位に低い/高いホモログが認められた。スクリーニングされた各種変異体や構造解析の結果と対比させつつ、進化的多様性について考察を進めている。以上、in vitro ATPaseスクリーニング系の構築、焦点を絞った徹底的な構造解析、進化的多様性の検証、いずれも順調に進展している。【近藤グループ】CIとCIIの境界面/リンカーに、アミノ酸点変異ライブラリを作製し、シアノバクテリアの発光測定システムによって温度補償性が異常な変異体をスクリーニングした(約10か所)。これらの変異は今後の構造解析が期待され、研究は概ね順調に進展している。【上久保グループ】μ流路型自動サンプリングシステムを用いた連続滴定測定により、KaiC6量体の構造不均一性を評価した。その結果、リン酸化/非リン酸化体の混合比率が異なるKaiCのKaiA結合モードが観測された。更に、混合比に対する結合モードの非線形的な応答が示唆されたことから、KaiC6量体内のリン酸化状態の不均一性の評価に本手法が有効であることが実証された。【藤原グループ】野生型及び温度補償性が大きく損なわれたKaiC変異体について中性子準弾性散乱実験を実施したところ、内部運動の温度依存性が変異によって変化することを見出しつつあり、研究はおおむね順調に進展している。本課題の中核をなす研究項目については、2019年度を目処に研究成果が論文発表できるよう必要となる実験を加速させる。変異体ライブラリ構築については、秋山グループ(in vitro ATPaseスクリーニング系)と近藤グループ(in vivo生物発光スクリーニング系)で協力して研究を進める。in vitroATPaseスクリーニング系はin vivo生物発光スクリーニング系と両輪をなすものであり、これによって周期や温度補償性に異常をきたしたKaiC変異体の同定が劇的に加速される。秋山グループでは、焦点を絞った徹底的な構造解析(野生型および新規KaiC変異体)、新規KaiCホモログの発現と解析(目標:新規5種)に取り組む。KaiCに内在する2種類のATPase活性の関係性については近藤グループが中心となって生化学的研究を実施する。KaiCとKaiA/KaiBの相互作用については、上久保グループを中心にμ流路型自動サンプリングシステムを用いた実験を本格的に実施する。藤原グループでは、in vitro/in vivoスクリーニング系で同定されたKaiC変異体の中性子準弾性散乱測定を実施する。KaiCを中核とした概日時計システムの詳細を明らかにするため、生物発光リズムを指標とした部位特異的KaiC変異体のスクリーニングを実施した。加えて、KaiCのATPase活性を指標にスクリーニングするためのin vitro実験系を整備し、同系を用いたスクリーニングを通じて多数の変異体を取得した。各種構造解析においても良好な成果が得られた。Kaiタンパク質群の結晶化条件を複数の晶系で見出すことに成功し、かつ各々について位相決定を完了させることができた。

求められる空間分解能がほぼ達成されており、構造と各種変異体の情報を相補的に絡めつつ、24時間周期と温度補償制御を両立させるメカニズムを読み解きつつある。なかでも、複合体の機能をアロステリック転移させる仕組みに一定の目処がついたことは大変意義深い。その他、電子顕微鏡を用いた単粒子解析、ダイナミクス計測、概日時計システムの解析に特化したμ流路型自動サンプリングシステムの開発を開始した。各種蛍光プローブを導入したKaiCを用いて、KaiCの状態(位相)と複合体形成の因果関係を詳細に調べた。その結果、KaiCのATPase活性がKaiBとの相互作用において極めて重要な役割を果たすことが見出され、その安定した遅さをマルチスケールに伝播させる仕組みを解明するに至った。進化系統樹をもとに十数種類の祖先型シアノバクテリアをリストアップし、それらのKaiCホモログを調製して固有振動数を評価した。概日周期を中央値とした分布の存在が示唆され、それらと進化系統樹の対応関係を調べることの科学的意義や研究計画の妥当性を確認することができた。Kaiタンパク質群の変異体ライブラリ構築と結晶構造解析の成功は大きな研究成果である。これらを車の両輪として、24時間周期と温度補償制御を両立させるメカニズムを読み解くための活動を飛躍的に加速させることができる。KaiCとKaiBの相互作用に関する研究成果はそれ自体が意義深いだけでなく、μ流路型自動サンプリングシステムを用いた次の研究展開が見込まれる。単粒子解析やダイナミクス計測についても予備実験の結果は良好であり、概日時計システムの研究に特化した技術開発を行うことで、着実に成果を出すことができると考える。KaiCホモログの研究については、現時点での限られたサンプル数にも関わらず予想を上回る発見があり、今後サンプル数を増やすことによる発展が十分に見込まれる。KaiCを中核とした概日時計システムの詳細を明らかにするため、KaiCのATPase活性(Ouyang et al. 2019 submitted)や生物発光リズムを指標としたKaiC変異体のスクリーニングを実施した。野生型およびスクリーニングされた各種KaiC変異体の構造解析を実施し、ATPase活性を担うCIドメインからリン酸化/脱リン酸化を担うCIIドメイン(及びその逆も)への作用機序を確認した。CI自体の構造変化、CII自体の構造変化、CIとCIIの連携による構造変化、これらを区別しつつ互いの因果関係を読み解くべく、構造解析と変異体解析を駆使して研究を進めた。他方、構造解析から見いだされた作用機序とKaiA/KaiB結合との関係についても注意深く考察を進めている。蛍光プローブを導入したKaiCを用いてKaiCとKaiBの相互作用を検証し、KaiCの遅いATPase活性がKaiBとの結合のタイムスケールを律速する重要な因子の一つであることを解明した(Mukaiyama et al. 2018)。KaiA/KaiB
小脳登上線維―プルキンエ細胞シナプス発達過程の神経活動依存性とそのメカニズム

成熟動物の小脳プルキンエ細胞は一本の登上線維によってのみ支配を受けるが、発達初期には一時的に複数の登上線維による支配を受けている。シナプス形成直後の多重支配している登上線維は、それぞれ同じような強さのシナプスを形成しているが、生後一週目までに一つのプルキンエ細胞上で、一本の最大振幅をもつ興奮性シナプス後電流(EPSC)を発生する登上線維入力(CF-multi-S)と、それ以外の弱い登上線維入力(CF-multi-W)が混在して見られるようになる。これまでの我々の研究から、CF-multi-Wは、CF-multi-Sに比べて、シナプス伝達の際にシナプス間隙で発生するグルタミン酸濃度上昇が小さいことが明らかになっている。今回シナプス間隙のグルタミン酸濃度上昇の大きさと、入力線維間のばらつきの形成との関連について解析した。その結果、CF-multi-WのEPSCの振幅が、もっとも優位なCF-multi-Sの振幅の20%以下になると、シナプス間隙の伝達物質濃度が低くなり始めることが明らかになった。さらに、入力線維間の強さのばらつきの形成と、登上線維除去との関連について解析した。2日おきに全細胞中、CF-multi-Wの応答振幅が、CF-multi-Sの20%以下でなおかつ2もしくは3本の登上線維により投射されているプルキンエ細胞の割合を求めると、その値は、その後2日間の間に増加する一本支配のプルキンエ細胞の割合とほぼ平行であった。これらの結果は、CF-multi-Wの応答振幅が、CF-multi-Sの20%以下になると、シナプス小胞放出過程に変化が起こり始め、シナプスの除去にいたることを示唆している。
音楽表現力を育むための総合的アプローチに関する実践的研究 スイスの教育からの示唆

本研究は,スイスの6つの公立小学校において50時間を超える音楽およびリトミック授業の観察,スイスの公立小学校へ通う児童185名から得られたアンケート結果を基に考察している.他分野の芸術活動を取り入れた総合的アプローチによる音楽表現学習について,先駆的に行われているスイス・フランス語圏の音楽授業を観察することによって,その効果と日本の音楽教育適用への可能性を探った.他分野の芸術活動を取り入れた総合的アプローチによる音楽表現学習について、先駆的に行われているスイス・フランス語圏の音楽授業を観察することによって、その効果と日本の音楽教育適用への可能性を探った。(1)本研究は、スイスの6つの公立小学校において50時間を超える音楽およびリトミック授業の観察、スイスの公立小学校へ通う児童185名から得られたアンケート結果を基に考察している。本調査からフランス語圏の州都ジュネーヴに関しては身体の動きを導入した学習、一方第2の都市があるヴォー州では、とりわけ絵や線、図形など視覚芸術を取り入れた音楽学習が盛んに行われていることがわかった。すなわち、総合的なアプローチという視点の共通性はあるものの、各州でその性格は異なっていることが明確となった。この成果は『鹿児島大学教育学部教育実践研究紀要』22巻に掲載されている。フランス語圏の学校音楽教育では、単に「歌をうたう」「楽器を演奏する」というだけのものではなく、「リズムとモチーフを身体によって表現する」「音楽を伴ったパントマイム」「視覚映像記録の音響効果の想像」等、様々な角度から音楽表現学習が行われている。この多面的で総合的なアプローチ方法について、スイスの指導書からその内容について明らかにした。この成果は『関西楽理研究』vol.29に掲載された。(2)総合的なアプローチによる表現学習が、日本の学校音楽教育において適用可能であるかについて検討した。日本の公立小学校における試験的な授業実践から、総合的アプローチによる学習が、子どもたちに音楽を感じられる感性、音楽を楽しめる姿勢、何かを想像して創りだす創造性が養われるという結論にいたった。この成果については30th ISME World Conferenceにおいて発表し、『研究論文集ー教育系・文系の九州地区国立大学間連携論文集』に掲載された。本研究は,スイスの6つの公立小学校において50時間を超える音楽およびリトミック授業の観察,スイスの公立小学校へ通う児童185名から得られたアンケート結果を基に考察している.他分野の芸術活動を取り入れた総合的アプローチによる音楽表現学習について,先駆的に行われているスイス・フランス語圏の音楽授業を観察することによって,その効果と日本の音楽教育適用への可能性を探った.研究初年度にあたる本年度は、スイス・ジュネーヴ州の小学校における音楽科授業に関する現状の把握と教育実践資料の収集について、1)ジュネーヴ州の小学校音楽科専科教員からの資料収集と分析、2)ジュネーヴ州の公立小学校に通う子どもたちへのインタビュー調査、を中心に行った。本年度行った研究活動と研究成果は以下のとおりである。1点目に関しては、ジュネーヴ州の小学校音楽専科教員より得た教材や指導案などの資料を整理・分析を行った。スイスの学校教育は、学習の到達目標は定まっているものの、そこに到る方法や道筋は各教員に任されているのが現状である。ジュネーヴは、リトミックの創始者であるジャック・ダルクローズが教鞭を執った地であるため、伝統的にリトミック教育が盛んであり、リトミックを学んだ背景を持つ音楽教員が多い。そのことは、学校音楽教育にも反映されており、教員の多くが音楽の授業にリトミックの要素を含んだ身体の動きを取り入れていることがわかった。2点目に関しては、ジュネーヴ州の公立小学校に通う児童に、音楽科の授業の実態についてインタビュー調査を行い、その現状把握に努めた。インタビューから、音楽の授業は歌を歌ったり楽器を演奏したりするだけではなく、音楽にあわせてダンスする、映画音楽にあわせて身体を動かす、音楽にあわせて字を書く、パントマイムする、四角い布やロープを音楽の流れにあわせて揺らしたり形をつくったりするなど、多様な活動が展開されていることが明らかになり、総合的な視点から学習が行われていることが確認できた。なお、本年度の成果の発表として、日本音楽教育学会第42回大会において「スイス・フランス語圏の学校音楽教育その1 聴取能力と評論の精神の育成に着目してー」の口頭発表を行った。さらに次年度7月には、ギリシャで行われるISME世界大会で成果を発表する予定である。教育実践資料を収集するための現地調査は、当初の計画では初年度に行う予定であったが、本研究開始直前の2011年2月にスイス調査を行ったばかりであったため、本年度はこの2月に収集した資料を基に現状の把握・資料の分析を行った。より高い研究の成果を得るためにスイスでの現地調査を一年後に延長し、次年度に持ち越した。次年度は、6月にスイスでの現地調査を行い、さらに多くの実践例の収集に励む予定である。さらにその結果を踏まえて、総合的アプローチによる音楽表現学習に関する有効な指導法と指導プログラムを開発する。その予備的研究として、総合的アプローチによる音楽表現学習について、現職小学校教員及び大学生に試行的に実施し、音楽的・教育的効果についてアンケート調査を実施することから着手していく。次年度の研究費の大半は、スイスでの現地調査における旅費及び調査費に充当する予定である。前述しているとおり、当初の計画では本年度教育実践資料を収集するための現地調査を行う予定であったが、本研究開始直前の2011年2月にスイス調査を行ったばかりであったため、本年度はこの2月に収集した資料を基に現状の把握・資料の分析を行い、スイスでの現地調査を次年度に持ち越した。

そのために、本年度は未使用研究費が生じることとなった。なお、この未使用研究費は次年度の現地調査に充当し、より質の高い研究成果をあげていきたいと思う。研究最終年度にあたる次年度は、本研究の成果を還元するため、学会で発表を行い、論文にまとめていきたい。
アズレン環および関連するπ共役系を用いた新規拡張π共役系化合物の合成に関する研究

1.アズレン環の高い分極効果を利用した・ラジカル・アニオン種の安定化新たにチオフェンがアズレン環に縮環した安定なカチオンを合成し、その安定化の効果を明らかにした。さらに6-アズレンニル基と2個の1-アズレニル基を組み合わせたメチルカチオンを合成し、その酸化還元的挙動についての検討を行なった。その結果、ラジカルやアニオン種の安定性が増大したため+0.89Vに可逆な酸化波、-0.56とー0.74Vに可逆な還元波を示すことを明かにした。2.ジアズレニルジシアノキノジメタンの2量化アズレン環により拡張されたジシアノキノジメタンを合成し、そのUVやCVを用いて分極特性に関する研究を行ない、合成したジアズレニルジシアノキノジメタンは酸化によりニ量化が起こることを明かにした。3.スペーサーとしてジフェニルアセチレンを用いた安定なジカチオンの合成二つ以上のジアズレニルメチルカチオンの間に色々なスペーサーを導入したジカチオンを合成しその性質を明らかにした。4.新規拡張π共役系骨格の合成アズレンニルチオン類よりチオフェンを含む新しいπ電子系を与える条件を見いだした。これより硫黄を含んだ新しいπ共役カチオンへ変換しスペクトル的な性質から周辺12π電子系より式に示した七員環がカチオンになった構造の寄与が大きいことを明らかにした。5.アズレン誘導体鉄トリカルボニル錯体合成方法の開発シクロヘプタトリエン鉄錯体と8-オキソヘプタフルベンの[ 2+8 ]π付加体からアズレンを含むπ共役系化合物のトリカルボニル鉄錯体への変換法の検討を行なった。その結果二段階でアズレンを含むπ電子系が鉄に配位した錯体の新たな合成方法を開発することができた。
骨格形成担当細胞分化決定転写因子Runx2のDNA結合共役因子の網羅的解析

初年度は実験のプラットフォーム構築に手間取り、2年目に目的となるRunx2結合因子の同定に至った。同定した因子の中から、生理的に重要だと思われた因子2つについて、その生理的役割を解明するためにトランスジェニックマウスを作成し、表現型解析を行ってきた。培養細胞を用いた解析から推定された表現型は即座に生体での機能には反映されず、トランスジェニックマウスの表現型は極めてマイルドであったため、野生型マウスとの比較検討するポイントが長期間にわたった。LaminA/Cは同定因子の1つであるが、Runx2との結合に重要な530番目のアミノ酸ロイシンは、ヒト変異体が見つかっており、プロリンへの変異体(L530P)は早老症(Progeria syndrome)の発症の原因であると同定されている。この3年間で得た成績では、早老症の骨での表現型がRunx2とlamin A/Cの結合消失に因る可能性を見いだせたことである。培養細胞を用いた解析までであれば十分な成果をあげ、公表も可能であったが、生体内での働きを明示していくことがより生理作用を打ち出していけるため、公表を差し控えるに至った。1つについては既に生体を用いた解析も終了しつつあり、次年度中には公表可能であると考える。採用前年度にRunx2とPI3Kシグナルの共役解析から、リン酸化非依存的なmytAktによるRunx2のDNA結合活性機構の存在を示唆する結果を得ていたので、これを含めRunx2の共役因子を同定する実験を試みた。Runx2モノクローナル抗体がRunt domainとC端の転写制御ドメインを認識するため、より網羅的に解析するために、N端にFLAGエピトープを融合したFLAG-Runx2を作製し、これを強発現させるためのアデノウイルスを作製した。これを用いて、抗FLAG抗体による免疫沈降産物を評価するための条件検討を行った。この実験系維持には大量のウイルス作製を必要とし、FLAG-Runx2と共役するわずかな因子探索にはより多くの試料から調整することが望ましいと考えられた。従って条件を設定した後、FLAG-Runx2を強発現する安定発現細胞株を樹立し大量の試料調整を必要とする。十分な試料の回収のため株化細胞を用いることとし、Runx2が本来発現している軟骨細胞と骨芽細胞の株化細胞であるATDC5とMC3T3-E1を用いてスクリーニングする予定である。より効率的にスクリーニングするために、IRES-GFP配列を融合したレトロウイルスを用いてクローン選別を行う予定である。同時に、Runx2の分化誘導作用としてアルカリフォスファターゼ活性によりスクリーニングも行う。また、融合タンパクは本来のRunx2による転写活性及びDNA結合活性を保持していた。以上の成績はFLAG-Runx2を強制発現したトランスジェニックマウスを作成した場合も同様にin vivoから試料を調整できる可能性を強く示唆するものとなった。別途、GST融合Runx2を大腸菌で作製し、網羅的な解析手段として準備を行っている。FLAG-Runx2をレトロウイルスでATDC5軟骨細胞株に導入し、大量培養を行った。ここからFLAG抗体を使ってプルダウンした分画を電気泳動によって分離し、Runx2結合因子を35個単離した。Runx2結合因子として、1)核内に局在性を示すもの、2)生体内で軟骨に発現するものを基準として絞り込み、5個の因子を解析を進めることとした。1つはLamin A/Cであるが、この遺伝子のdeletionおよびRunx2のdeletionを行って、結合ドメインを同定した。人のLamin A/Cの点変異でおこるHGPS(早老病)に認められる変異L530Pの点変異を導入すると、Runx2への結合が失われた。また、RNAiを使ってLamin A/Cのノックダウンさせると、ATDC5の分化モデルではLamin A/Cは分化を抑制していることを示唆する成績を得た。しかし、本遺伝子ノックアウトマウスの表現型をあわせて考えると、軟骨細胞におけるLamin A/Cの機能は軟骨細胞分化に対して促進的に働くことが十分に考えられたため、総合的に判断してLamin A/Cの生体における機能を明確にした後論文化させたいので、トランスジェニックマウスを作製しているところである。もう1つ、Filamin Aを同定した。これはCbfbに結合する因子で、Runx2とは間接的に相互作用する因子であることがわかった。これについては、軟骨で極めて特異的に発現していること、また分布として肥大化軟骨細胞において強い発現を認めた。本分子についての公表もまた、トランスジェニックマウスを作成している段階である。