hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌抗原ペプチド、Ｔ細胞刺激と免疫抑制性細胞制御による癌特異的ＣＴＬ誘導と細胞療法

抗腫瘍免疫細胞療法の問題点は、誘導できる腫瘍特異的CTL数に限界があること、担癌生体内へ移入されたCTLは増殖できず、機能抑制やアポトーシスに陥る事である。マウスHER2陽性乳癌に対し移入したHER2特異的CTLが担癌宿主環境内で増殖し、抗腫瘍活性を維持できる方法を開発し、そのメカニズムの一端を解明する研究をおこなった。その結果、腫瘍特異的CTLを樹立する過程で、癌抗原ペプチド刺激とT細胞へのOX40補助刺激をうけたCTLは、in vitroでは増殖や分化が抑制され、担癌宿主へ移入後に分裂増殖し、抗腫瘍効果を発揮し、腫瘍特異的メモリーCTLとして宿主内に長期維持できることを初めて明らかにした。癌免疫治療の成功の鍵を握る免疫トレランスの打破には、制御性T細胞などの免疫抑制性細胞機能の抑制と、トレランスに打ち勝つ能力を有した強力な腫瘍特異的細胞傷害性T細胞(CTL)の樹立の両者が必要である。特徴ある免疫作用物質を用いて、細胞免疫治療で移入する癌抗原特異的CTLが、担癌生体内での免疫トレランスに打ち勝ち、抗腫瘍機能を維持することができる細胞治療法の開発を目的とし研究に着手した。〈癌抗原特異的CTLの樹立と移入された担癌生体内での機能維持〉ヒト細胞療法を念頭に置き、wild-typeマウス(FVB/N)モデルを用いた。&#61548;腫瘍抗原ペプチド(RNEU420-429)をT2Dq細胞(抗原提示細胞)にパルスし、NT腫瘍接種とHER2/neuワクチン接種を受けたマウス脾細胞より分離したT細胞と接触培養。RNEU420-429特異的CD8+T細胞を誘導し増殖させた。&#61548; CD8+ T細胞を分離。約3%のRNEU420-429特異的CD8+ T細胞を認めた。RNEU420-429特異的CD8+T細胞を含むCD8+ T細胞を、NT腫瘍接種を受け担癌状態になったマウスに、6x107個を養子移入した養子移入6日目に、レシピエント脾臓中のRNEU420-429特異的CD8+T細胞を細胞内IFN-γ染色(ICS)により検出した。免疫作用物質として抗OX40抗体やmutant B7-DC-Fcと共培養しそれぞれの補助刺激を受けたCTLを、レシピエント担癌マウスへ養子移入した。これら免疫介入した治療法により、腫瘍は有意に縮小した。養子移入6日目の、レシピエント脾臓中のRNEU420-429特異的CD8+T細胞は有意に多く維持されることがわかった。抗OX40抗体のもつ制御性T細胞の機能抑制作用とCTL機能増強作用、mB7-DC-FcのもつT細胞への補助刺激作用とCTLのPD-1発現抑制作用を利用し、癌抗原特異的CTLの樹立と移入された担癌生体内での機能維持をしらべた。融合タンパク、をそれぞれ共培養して癌特異的CTLを誘導し、担癌非寛容マウス(FVB/N)に、細胞移入して、抗腫瘍免疫効果を観察することができ、ほぼ予定通りの進捗状態といえる。〈癌抗原特異的CTLの樹立と移入された担癌生体内での機能維持〉1)マウスT細胞を腫瘍抗原ペプチドと抗OX40抗体と7日間共培養しOX40補助刺激を受けた腫瘍抗原特異的CTLは、OX40補助刺激受けなかった腫瘍抗原特異的CTLと比較すると、分裂回数は少なく、分化が早期のエフェクターT細胞であり、抗アポトーシス因子を多く発現していた。これらの腫瘍抗原特異的CTLを、レシピエント担癌マウスへ養子移入すると、OX40補助刺激を受けたCTLは、担癌生体内で、分裂能を有し、腫瘍抗原特異的CTL機能を長期間維持し、完全に腫瘍を退縮させ、メモリーエフェクターT細胞となった。しかし、OX40補助刺激を受けていないCTLは、担癌生体内では、分裂能を失い、腫瘍抗原特異的CTLも有意に少なく、担癌マウス腫瘍は増大した。以上から、腫瘍抗原特異的CTLを樹立する際にOX40補助刺激を行うことは、担癌生体内へ移入されてからも腫瘍抗原特異的CTLが長期間にわたり抗腫瘍免疫機能維持が可能で、腫瘍拒絶も得ることがことができる有用な方法であることがわかった。Wild typeマウスからの腫瘍抗原特異的CTLの樹立とCTL細胞治療であり、腫瘍抗原特異的CTLの数が予想以上に少なかったため、一度に多くのマウスへの細胞移入ができなかった。従って、実験を多数繰り返す必要が生じ、多くの時間が必要であった。このため、免疫寛容マウスを用いた研究にまで進むことができなかった。担癌マウス脾細胞由来のT細胞を、腫瘍抗原ペプチドとagonisticな作用のある抗OX40抗体と共培養して腫瘍抗原特異的CTLを培養樹立すると、OX40 co-stimulationをうけて樹立した腫瘍抗原特異的CTLは、分化が早期段階のエフェクター細胞であり、担癌マウスに細胞移入すると、分裂増殖し、腫瘍拒絶でき、担癌マウス内に長期間機能維持して存在できることがわかった。また、細胞移入直前の腫瘍抗原特異的CTL上には、OX40刺激の有無にかかわらずPD-1発現が認められた。

次に、細胞移入直前のCTLに抗PD-1抗体を作用させて担癌マウスにCTL細胞移入したところ、抗PD-1抗体を作用させたOX40刺激後CTL細胞移入は、抗PD-1抗体を作用させていないOX40刺激後CTL細胞移入に比べ、腫瘍抗原特異的CTLがより多く維持され、腫瘍拒絶までの時間も短かった。OX40補助刺激を受けて誘導された腫瘍抗原特異的CTLは細胞移入直前に抗PD-1抗体を作用させることにより、担癌生体内でより強い抗腫瘍免疫作用を維持できると考えられた。CTLをin vitroで抗体に接触させてからの使用であり、宿主へ直接抗体を投与しない方法は、抗体による副作用減少や貴重で高額な抗体使用量の減少にも貢献できるであろう。抗腫瘍免疫細胞療法の問題点は、誘導できる腫瘍特異的CTL数に限界があること、担癌生体内へ移入されたCTLは増殖できず、機能抑制やアポトーシスに陥る事である。マウスHER2陽性乳癌に対し移入したHER2特異的CTLが担癌宿主環境内で増殖し、抗腫瘍活性を維持できる方法を開発し、そのメカニズムの一端を解明する研究をおこなった。その結果、腫瘍特異的CTLを樹立する過程で、癌抗原ペプチド刺激とT細胞へのOX40補助刺激をうけたCTLは、in vitroでは増殖や分化が抑制され、担癌宿主へ移入後に分裂増殖し、抗腫瘍効果を発揮し、腫瘍特異的メモリーCTLとして宿主内に長期維持できることを初めて明らかにした。癌抗原特異的CTLが免疫トレランス状態の担癌生体内で長期間機能を維持できる細胞治療法を樹立するために、抗OX40抗体のもつ制御性T細胞の機能抑制作用とCTL機能増強作用、mB7-DC-FcのもつT細胞への補助刺激作用とCTLのPD-1発現抑制作用、さらに、LAP吸着カラムによるTGF-β産生免疫抑制性細胞の除去作用を利用を進める。1非免疫寛容マウスモデル(FVB/N)にて、癌抗原ペプチドと、1)抗OX40抗体2)mB7-DC-Fc融合タンパク、の他、3)LAP陽性細胞吸着カラムとをそれぞれ共培養して癌特異的CTLを誘導し、担癌非寛容マウス(FVB/N)に、細胞移入して、抗腫瘍免疫効果を観察する。さらに、1)2)3)の組合せも施行し、最も優れたCTLの樹立方法を検討する。2免疫寛容マウスモデル(HER2/neu transgenic mouse)を用いて、上記の免疫作用物質で誘導したCTLが、免疫トレランス状態の担癌生体内で抗腫瘍免疫効果を示すことを調べる。〈養子移入するためのヒト癌特異的CTL細胞の樹立〉1ボランティア末梢血からHA特異的ヒトCTLが、マウス研究での最適な方法で効果的に誘導できることを確かめる。2大腸がん患者末梢血から大腸癌抗原特異的ヒトCTLが、大腸癌に特異性の高い癌抗原ペプチドと上記3つ免疫学的介入で効果的に誘導できることを確かめる。OX40補助刺激を受けたCTLの養子細胞治療が、免疫トレランス状態を打ち破ってその機能が維持され、腫瘍退縮などの抗腫瘍効果を発揮することを確かめるため、免疫寛容マウスモデル(HER2/neu transgenic mouse (neu-N))を用いて抗腫瘍免疫効果を実験する。その後、腫瘍抗原特異的な免疫トレランス状態に移入されたCTLの動向を、CSFEでマーキングしたCTLを用いて、脾臓と腫瘍局所で観察する。
新医療福祉機器を目指した大気圧室温プラズマ生成

プラズマは、電子、イオンの荷電粒子の他に、種々の反応性を有する多量のラジカルから構成される。イオンやラジカルは、ドライエッチングやプラズマCVD等のプラズマプロセスで周知の様に、様々な化合物と相互作用を行い、表面改質や未知の反応過程を経て新たな物質を創製できる。従って、これらの粒子は、様々な化合物で構成されている生体との反応により、生体に対して有機的な役割を果たす可能性が期待できる。生体とプラズマを相互作用させるためには、大気圧かつ室温のプラズマを生成しなければならない。本研究では、新医療福祉機器を目指した大気圧室温プラズマの生成を実現させることを目的とする。具体的には、比較的ガス温度が低いバリア放電方式を採用し、下部電極構造をメッシュ電極にすることで低温大気圧プラズマを実現した。更に、低融点材料(PET、PP)の表面処理を行った。平成16年度に構築したメッシュ電極を用いた大気圧室温プラズマを用いて、PETフィルム等へのプラズマ照射実験を行った。その照射後の表面状態評価として、撥水性や膜質の分析を水接触角計やFTIR分析計により評価を行った。プラズマ照射実験では、導入ガス、混合ガスの種類、ガス流量、照射時間などを変化させて、PP(手書きOHPシート)やPETフィルム(複写用OHPシート)の表面状態変化を調べた。その結果、PPフィルムに対しては、プラズマ照射後に、撥水性の向上が観測された。その撥水性は、照射時間のみに依存し、ガスの種類や流量には依存しないことがわかった。一方、PETフィルムでは、PPフィルムと同じ条件範囲では、撥水性はほとんど変化しなかった。PPの融点は、PETのそれに比べて低い。このことから、本研究で開発した大気圧室温プラズマは低融点材料の表面改質に適していることが明らかとなった。この成果により、今後、プラズマと生体との相互作用へ展開が期待できる。本研究では、新医療福祉機器を目指した大気圧室温プラズマの生成を実現させることを目的とした。具体的には、比較的ガス温度が低いバリア放電方式を採用し、電極構造を工夫することで生体に対して「ソフト」なプラズマの実現を目指した。従来のバリア放電は、金属電極の片方あるいは両方に誘電体を張り付けた構造である。その場合、電極間に生体を挿入すると、生体表面に電荷が蓄積し、プラズマ維持が困難となり、生体表面の損傷も大きくなる。そこで、プラズマを安定に維持しつつ、生体にプラズマを「ソフト」に照射させるために、金属電極の片方をメッシュ電極(又はキャピラリー電極)とした。メッシュ電極の下に、生体を模擬した誘電体を設置し、主放電プラズマを通り抜けたプラズマをその誘電体に照射させ、安定に主放電プラズマが維持できるように、主放電部の電極間距離やメッシュ電極の穴径の最適化を図った。電源には、商用周波数60Hzの交流電源(現有設備)を用いた。主放電プラズマでは、空気、アルゴンなどのガスを用いて、安定なバリア放電を実現することができた。主放電プラズマとメッシュ電極下部に挿入した熱電対により、ガス温度を計測した。下部領域では、30°C程度の温度に達することが明らかとなった。
教育設計基礎力養成環境の構築とデザイン原則の導出に関する統合的研究

本研究は、インストラクショナルデザイン(ID)の基礎力養成方法を実証的に確立することを目指して、養成環境をWeb上に設計・開発・提供した統合的研究である。IDの普及を意図した関連情報提供の枠組み「IDポータル」を発展させ、そこで提供する各種のツール類を整備した。「教材設計マニュアル」企画書作成支援ツールを開発・公開しその成果を学会発表した。「レイヤーモデル」Q&Aによる逆引きの検索を考案・試作した成果を学会発表するとともに、IDツールとして参照可能な理論やモデル合計101個の解説と事例からなる入門書を刊行した。「授業設計マニュアル」改訂版と人材育成に応用した「研修設計マニュアル」も発刊した。本研究は、代表者と1名の分担研究者に加え、4つの大学に所属する4名の連携研究者(市川尚・井ノ上憲司・寺嶋浩介・稲垣忠)を加え、3つの柱を立てて研究を進めている。今年度は、(1)「ID基礎力」養成Webサイトの準備と公開に向けて初期検討とコンセプト検討を行い、それぞれを国内学会で発表した。(2)「教材設計マニュアル」関連の研究については、ツールの洗い出しと「ID基礎力」養成Webサイトへの統合の検討にとどまった一方で、姉妹編のテキスト「授業設計マニュアル」(稲垣・鈴木編著、市川・寺嶋分担執筆)が完成し、それを用いた実践が開始された。その中で、複数大学の試みを統合的に検討する作業を進め、学会発表の準備をした(5月に発表予定)。(3)「レイヤーモデル」関連の研究では、既存のツール類を整理し、「ID基礎力」養成Webサイトでの公開の準備をした。一方で、実践事例の収集と研究成果の公表については、内外の文献検索や研究代表者と分担研究者の勤務校での教育実践での成果をまとめる形で研究を進めた。研究成果としては、学習者が学習経験を省察するためのツール「ラーニングスケッチ」や課題分析図を用いた学習内容選択支援ツールを開発し、その成果は、それぞれ査読付論文として発表した。これらの成果は、「ID基礎力」養成Webサイトに統合していくことになる。また、教育設計に関する動向をまとめた解説論文「教育設計についての三つの第一原理の誕生をめぐって」では、本研究の中核と位置づけている「eラーニング質保証のレイヤーモデル」と3つの第一原理(Merrillの「ID第一原理」、Kellerの「学習意欲の第一原理」、ならびにParrishの「ID美学の第一原理」)について解説した。本年度は、当初計画に従って、各チームごとに連携研究者の協力を得ながら以下の実績を収めた。(1)レイヤーモデルについての研究は、その最上レベル「学びたさ」についての実践的研究をストーリー中心型カリキュラムの構築を中心に進め(国際会議発表2件、査読付論文誌1件、国内学会発表6件)、その成果を書籍として出版した(著書1件)。また、レイヤーモデルを用いた学習設計支援方法についての検討を進め、5つのレベル単位にそれぞれ示された達成指標への到達を目指しどのような支援ができるかを考え,レベルごとに直面すると思われる課題を「質問」,その対策を「回答・アドバイス」としてまとめた支援ツールを設計し,プロトタイプを作成した(国内学会発表1件).(2)ID基礎力養成Webサイトについては現在の「IDポータルサイト」の拡張作業を進め、来年度初旬の公開を予定している。導入のイントロゲームに続いて1出入口(責任範囲)を明確にできる、2課題分析を行い指導方略を立案できる、3形成的評価を計画できるの3領域を取り上げ、実力診断ができるパフォーマンスチェックの実装を目指している。(3)教材設計マニュアルについては、企画書作成時の相互評価のプロセスを分析し(国内学会発表1件)、その実態を踏まえてJOB-AIDの設計を終えた(国内学会発表1件)。このツールを他の2つの課題にも拡張し、Web型のパフォーマンス支援ツールとしての公開を来年度初旬に予定している。また、姉妹編の「授業設計マニュアル」については、現存するツール類をWebからアクセス可能にするとともに、テキスト自体の改訂を視野に入れてその内容を再検討している。本研究は、インストラクショナルデザイン(ID)の基礎力を養成する方法を実証的に確立することを目指して、養成のための環境をWeb上に設計・開発・提供することを目指す統合的研究である。IDの知見が教育の質向上に役に立つ可能性は周知されてきた。これまでにIDの普及を意図した関連情報提供の枠組み「IDポータル」を構築し、各種の研究知見を整理する枠組みを確立し、そこで提供する各種のツール類の整備を目指した研究を進めてきた。しかし、ID基礎力を養成する方法はまだ確立されていない。本研究では、これまでに行われてきた研究成果を統合し、Web上の各種システムとして整理・提供することでID基礎力の普及を目指すとともに、IDを活用したWeb上での効果的な実践力向上支援学習環境のデザイン原則を導出することを目的としている。1.「ID基礎力」養成Webサイトの逐次更新では、「教材設計マニュアル」関連の研究と「レイヤーモデル」の研究を中核とし、更に関連研究の成果も合わせて、現在公開中のID情報提供サイト「IDポータル」の第二世代として位置づけて設計・開発を開始した。2.「教材設計マニュアル」関連の研究としては、初年度に取り組んだ「7つ道具チェックリストのWeb化」の改良を続けるとともに、他のツール群(指導方略表作成支援JobーAidの開発、教材企画書チェックリストのWeb化、教材企画書診断力育成システムの開発など)に順次着手した。「教材設計マニュアル」の方法論を対面授業のデザインに応用した「授業設計マニュアル」(出版済)に用いられるツール群にも研究を拡張した。

3.「レイヤーモデル」関連の研究では、文献研究や実践事例の調査で明らかになった研究知見などを追加して、「ID基礎力」養成のためのツール群を充実させた。今年度は既存のデータを整理するためにデータベース化を試みた。「ID基礎力」養成Webサイトの逐次更新は、「IDポータル」の第二世代のプロトタイプ作成までは至ったものの、公開は次年度に持ち越すことになり、進捗が遅れている。「教材設計マニュアル」関連の研究では、企画書作成支援ツールを開発・公開し、試用に耐えられるものであることが分かったので、その成果を学会にて発表した。「レイヤーモデル」の研究については、Q&Aによる逆引きの検索を考案し、プロトタイプを試作した成果を学会にて発表した。「教材設計マニュアル」関連の研究としては、ツール群(指導方略表作成支援JobーAidの開発、教材企画書チェックリストのWeb化、教材企画書診断力育成システムの開発など)を継続して進めた。昨年度までの成果として得られた開発プロセスについての知見を参照しながら、本年度は「教材設計マニュアル」の方法論を対面授業のデザインに応用した「授業設計マニュアル」の改訂版を発刊したとともに、研修を中核とした人材育成のデザインに応用した「研修設計マニュアル」も発刊する(2015年4月予定)。これらの新刊本に関連するツール群は来年度さらに整備していく。「レイヤーモデル」関連の研究としては、IDツールとして参照可能な理論やモデルを合計100個に絞り込み、解説と事例からなる書籍「インストラクショナルデザインの道具箱』としての出版準備を進めた。以上に加えて、関連実践事例の収集や文献の調査なども継続的に引き続き行い、変化が激しいID関連の実践・研究知見の整理と公開に努めた。また、「ID基礎力」育成Webサイトの更新に合わせてそれまでの研究成果を研究会や関連学会の全国大会などで報告した。本研究は、インストラクショナルデザイン(ID)の基礎力を養成する方法を実証的に確立することを目指して、養成のための環境をWeb上に設計・開発・提供することを目指したものであった。研究の成果を「IDポータル」上に集約し、大幅改訂を実施して公開した(http://idportal.gsis.kumamoto-u.ac.jp/)。「教材設計マニュアル」関連の研究として、教材企画書・指導方略表・教材作成報告書の作成支援Job-aidを開発し、Web上に公開した。また、教材企画書チェックリストをWeb化し「教材企画書相互点検ツール」としてWeb上に試用版を公開した。さらに、教材企画書診断力育成システムの開発に着手し、そのプロトタイプを「ID実力チェック(教材企画書編)」としてWeb上に公開した。あわせて、設計マニュアル姉妹編として、企業などの人材開発にIDの基礎を応用したシリーズ第3弾『研修設計マニュアル』(鈴木克明著、北大路書房)を書籍として出版し、関連ツール群のWeb公開に着手した。「レイヤーモデル」関連の研究として、各レイヤーの関連情報を教育実践上の悩みから逆引きできる仕組みを考案し、「お悩み相談」としてWeb上に公開する準備を進めた。
動脈壁と血管周囲脂肪組織に生じる無菌的慢性炎症の病態解明と新規制御法の開発

動脈硬化巣内の細胞がアポトーシスやピロトーシス、ネクローシスといった細胞死を起こしており、動脈硬化の進展に関与していることが示唆された。また、肥満で大型化した脂肪細胞に細胞死が生じており、cell free DNA (cfDNA)といった遊離核酸断片を放出して、マクロファージを脂肪組織へリクルートして活性化していた。そこで、刺激を受けたり、細胞死に至った脂肪細胞から放出されたcfDNAがマクロファージを活性化する機序を検討した。3T3L1脂肪細胞を低酸素、過酸化水素、TNFα、Angiotensin IIなどを用いて細胞死を誘導して、培養上清を採取した。また、培養上清を野生型もしくはTLR9欠損マウス由来マクロファージに添加して、活性化状態をNFκBやサイトカインの発現で検討した。3T3L1脂肪細胞培養上清中のDNAを濃縮して、野生型ならびにTLR9欠損マウス由来のマクロファージに添加した。野生型ではMCP-1の産生が亢進し、脂肪細胞をTNF-αで傷害しておくとその程度が増強した。脂肪細胞培養上清によるマクロファージ活性化作用は、TLR9欠損マウス由来のマクロファージでは減弱していた。また、TLR9に対してのinhibitoryオリゴヌクレオチドを投与すると野生型における活性化がブロックされた。今回、我々の研究によって、生活習慣病によって、脂肪細胞や血管細胞の細胞死を引き起こし、そこから放出されるDNAが自然免疫受容体TLR9を活性化し、慢性炎症を惹起することが明らかとなった。生活習慣病によって生じるインスリン抵抗性、動脈硬化を防ぐうえで、自己DNA/TLR9系がキーとなる経路であることが明らかとなった。今後、自己DNA/TLR9系を標的として、新たな生活習慣病の合併症治療法の開発が行われることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。生活習慣病によってどのようにして慢性炎症が惹起されるのかを検討した。肥満に伴って脂肪組織から自己由来の遊離核酸断片(cell free DNA, cfDNA)が放出され、本来、病原体由来のDNA断片を認識するToll様受容体-9 (TLR9)をcfDNAが活性化し、脂肪組織での慢性炎症ならびにインスリン抵抗性が引き起こされた。また、アポリポ蛋白E欠損(ApoE KO)マウスにAngiotensin II(Ang II)を投与することで、血漿中の1本鎖DNAなどのcfDNAが増加した。大動脈において、cfDNAの受容体となりうるTLR9の発現がAng II投与により有意に増加し、主たる発現細胞はマクロファージであった。TLR9/ApoE 2重欠損(dKO)マウスを確立し、AngII投与下で誘導される動脈硬化病変を解析した。両群間で体重、血圧、血漿脂質値に差を認めなかったが、TLR9/ApoE dKOマウスの動脈硬化病変およびプラーク内脂質量は、ApoE KOマウスに比べて有意に少なかった。また、TLR9/ApoE dKOマウスの腹部大動脈において、MCP-1などの炎症性物質の発現やマクロファージの浸潤が減少していた。さらに、骨髄移植実験により、血管壁より骨髄のTLR9が重要であることが明らかとなった。また、TLR9のアゴニストやAng IIなどで傷害を与えた血管内皮細胞を用いてマクロファージを刺激することで、NF-κBシグナルの活性化が認められ、TNF-αやMCP-1などの炎症関連分子の発現が有意に増加した。以上より、血管傷害により遊離したcfDNAが、マクロファージTLR9を活性化し血管の炎症を惹起し、動脈硬化の進展を促進することが示唆された。当初の計画どおり、TLR9とApoE欠損マウスの作成に成功して、興味深い結果をすでに得ている。予定どおり、順調に研究は進行している。生活習慣病によって生じる動脈硬化やメタボリックシンドロームが、慢性炎症を基盤にがしていることが解明されているが、無菌的な慢性炎症が生じる機序については不明な点が多く、その分子機序について検討を行った。1.肥満に伴って脂肪組織から、cfDNAが放出された。そして、TLR9がcfDNAによって活性化され、脂肪組織での慢性炎症ならびにインスリン抵抗性が引き起こした。TLR9欠損マウスでは、脂肪組織での炎症が減弱しており、肥満に伴うインスリン抵抗性が軽減していた。骨髄移植の実験から、骨髄細胞上のTLR9が重要であることが明らかになった。TLR9の阻害オリゴヌクレオチドは、肥満による脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性を改善した。2.動脈硬化発症するApoE欠損マウスでは動脈壁におけるTLR9の発現量が増加しており、主にマクロファージが発現していた。ApoE KOマウスにAng IIを投与したことで、血漿中の1本鎖DNAなどのcfDNAが増加した。ApoE KOとTLR9/ApoEdKO間で体重、血圧、血漿脂質値に差を認めなかったが、TLR9/ApoE dKOマウスの動脈硬化病変およびプラーク内脂質量は、ApoE KOマウスに比べて有意に少なかった。LR9の阻害オリゴヌクレオチドは、血管での慢性炎症と動脈硬化を抑制した。

メタボリックシンドロームや動脈硬化における慢性炎症において、cfDNA-TLR9経路は重要な役割を担っており、新たな生活習慣病治療の標的になると考えられた。肥満、動脈硬化モデルにおいて、自然免疫の果たす役割が順調に解明できている。骨髄移植や臓器特異的な遺伝子改変マウスの作製も順調に進んでいる。動脈硬化巣内の細胞がアポトーシスやピロトーシス、ネクローシスといった細胞死を起こしており、動脈硬化の進展に関与していることが示唆された。また、肥満で大型化した脂肪細胞に細胞死が生じており、cell free DNA (cfDNA)といった遊離核酸断片を放出して、マクロファージを脂肪組織へリクルートして活性化していた。そこで、刺激を受けたり、細胞死に至った脂肪細胞から放出されたcfDNAがマクロファージを活性化する機序を検討した。3T3L1脂肪細胞を低酸素、過酸化水素、TNFα、Angiotensin IIなどを用いて細胞死を誘導して、培養上清を採取した。また、培養上清を野生型もしくはTLR9欠損マウス由来マクロファージに添加して、活性化状態をNFκBやサイトカインの発現で検討した。3T3L1脂肪細胞培養上清中のDNAを濃縮して、野生型ならびにTLR9欠損マウス由来のマクロファージに添加した。野生型ではMCP-1の産生が亢進し、脂肪細胞をTNF-αで傷害しておくとその程度が増強した。脂肪細胞培養上清によるマクロファージ活性化作用は、TLR9欠損マウス由来のマクロファージでは減弱していた。また、TLR9に対してのinhibitoryオリゴヌクレオチドを投与すると野生型における活性化がブロックされた。今回、我々の研究によって、生活習慣病によって、脂肪細胞や血管細胞の細胞死を引き起こし、そこから放出されるDNAが自然免疫受容体TLR9を活性化し、慢性炎症を惹起することが明らかとなった。生活習慣病によって生じるインスリン抵抗性、動脈硬化を防ぐうえで、自己DNA/TLR9系がキーとなる経路であることが明らかとなった。今後、自己DNA/TLR9系を標的として、新たな生活習慣病の合併症治療法の開発が行われることが期待される。予定どおり、生活習慣病によっておこる血管細胞の死が、マクロファージなどの炎症細胞を活性化して、慢性炎症を惹起する分子機序について、in vitroならびにin vivoにおいて検討する。臓器特異的な遺伝子欠損マウスを用いて、生活習慣病によって、自己DNAをはじめとする内在性リガンドが自然免疫を活性化するメカニズムを明らかにして、治療法の開発へつなげていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
喫煙によって引き起こされる慢性炎症の発症メカニズムの解明

タバコおよびシリカへの暴露によって、慢性的な炎症と病態進行を特徴とする慢性閉塞性肺疾患および珪肺症をそれぞれ発症する。本研究課題の目的は、珪肺症モデルにおける慢性炎症の発症機構の解明である。我々は、1ヶ月間、異なるシリカ用量にマウスを曝露し、肺疾患の進行状況を1年間にわたって観察し、暴露後1、3および12ヶ月目の免疫細胞数と遺伝子発現を測定した。最初の1ヶ月間に高シリカ用量に曝露されたマウスは、1年後の炎症性ケモカインおよびT細胞動員のレベルが高いことが示された。トランスクリプトーム解析では、別々に発現し、抗原処理および提示経路における顕著な役割を担う82個の遺伝子が同定された。総合生物
多自由度一次元プラズマシート模型の非線形挙動と巨視的輸送現象

一様に分布する正電荷に対して運動する負電荷のシートからなる一次元プフズマシート模型は、一定間隔に分布した平衡点のまわりで調和振動する粒子が隣同士で完全弾性衝突をする系と等価である。したがって、個々のシートの運動を作用変数と角変数で記述すると、衝突するまでは作用変数は一定であり、規則的運動であって、起動不安定性はない。ところが、衝突によって、作用変数はジャンプする。ある初期条件から出発して最初に衝突する粒子対の速度を交換すると、これが次の衝突までの運動の新しい初期条件となる。このようにして、数値的には、解析解を接続してゆく方法で、精密な計算が可能となった。まず、勲伝導度については、非平衡の境界条件として、系の両端に温度の異なる熱源を置き、高温側から低温側へのエネルギーの流れを計算すると、熱伝導度は、熱源が低温である限り、正常である。すなわち、熱伝導度は系のサイズに依存しない。ところが、熱源の温度を高くすると、熱伝導度は系のサイズと共に大きくなる。この異常性の微視的機構を見るために、位置と速度からなる相空間の構造を見ると、高温では、捕捉された粒子と、バリスティックに運動する粒子が見られる。後者はほぼ自由粒子のように振舞う。一方、低温では、急速にマクスウェル分布、すなわち、局所平衡に収束する。また、孤立した条件で、escape rate formalismによって、熱拡散の二乗平均を取ると、低温では、時間に比例することが分かる。すなわち、熱伝導度が正常であれば、Green-Kubo公式は成り立つことが分かる。本年度は、巨視的輸送に関する現象論としての熱力学の多成分系への拡張を行った。まず、非平衡開放条件下における非線形反応拡散系において、反応が衝突による運動量緩和よりも遅いときには粒子輸送の拡散によって記述でかる。研究協力者若生潤一とともに、反応速度が運動量緩和と同程度の頻度で起こる場合について、拡散のフィックスの法則に到る過渡現象を含むように熱力学を拡張した。これにさらに揺らぎを加えて、ランジュヴァン方程式とし、定常状態における揺らぎを評価した。さらに、解析的に扱えて自明でない運動論的模型をたてた。これは、位置と速度からなる相空間の各点における粒子数の変動についてに対する確率解析し、定常解については良い一致を見た。次に、研究協力者佐野光貞氏とともに、一次元クーロン系についてのBBGKY階層方程式を解析して、一粒子分布関数に対してブラソフ方程式、ランダウ方程式、バレスクレナード方程式の導出を行った。また、研究協力者柳沢剛は、一次元クーロン系のダイナミクスを記号力学に置き換えたときの、文法生成則が有限個になることを発見し、相空間の構造と関連があることを示唆した。本年度は、京都大学佐野光真氏を研究協力者とし、また日本学術振興会外国人招聘究者として来日したvan Beijeren氏とともに、一次元シート模型の輸送について数値的に調べた。この系は、調和振動を行っている剛体球が隣同上で衝突する模型と等価である。熱伝導について、平衡状態における物理量の二乗変位(グリーン久保公式)および非平衡条件下における熱伝導の両方について数値的に調べたところ、シート数が300程度で、熱伝導係数がサイズ依存しなくなり、正常な輸送系であることが判明した。また、輸送係数の温度依存性が、温度の2/3乗であることも判明した。これらのことを説明する模型として、運動論的模型を検討した。まず、各平衡位置のまわりでのシートの変位に対する一体分布関数は、エネルギーの大きさによって異なる振る舞いをするものと考える。低エネルギーでは、間欠的に隣同士が衝突するので、熱はソリトン的に伝搬していくものと考えられる。逆に高エネルギーでは一回の衝突における速度変化の割合いは小さいので、フォッカープランク的に振る舞うであろう、と考えられる。衝突確率を隣り合うシートの二体相関関数で近似すると一応のオーダーを評価することができる。

一様に分布する正電荷に対して運動する負電荷のシートからなる一次元プラズマシート模型は、一定間隔に分布した平衡点のまわりで調和振動する粒子が隣同士で完全弾性衝突をする系と等価である。したがって、個々のシートの運動を作用変数と角変数で記述すると、衝突するまでは作用変数は一定であり、規則的運動であって、起動不安定性はない。ところが、衝突によって、作用変数はジャンプする。ある初期条件から出発して最初に衝突する粒子対の速度を交換すると、これが次の衝突までの運動の新しい初期条件となる。このようにして、数値的には、解析解を接続してゆく方法で、精密な計算が可能となった。まず、熱伝導度については、非平衡の境界条件として、系の両端に温度の異なる熱源を置き、高温側から低温側へのエネルギーの流れを計算すると、熱伝導度は、熱源が低温である限り、正常である。すなわち、熱伝導度は系のサイズに依存しない。ところが、熱源の温度を高くすると、熱伝導度は系のサイズと共に大きくなる。この異常性の微視的機構を見るために、位置と速度からなる相空間の構造を見ると、高温では、捕捉された粒子と、バリスティックに運動する粒子が見られる。後者はほぼ自由粒子のように振舞う。一方、低温では、急速にマクスウェル分布、すなわち、局所平衡に収束する。また、孤立した条件で、escape rate formalismによって、熱拡散の二乗平均を取ると、低温では、時間に比例することが分かる。すなわち、熱伝導度が正常であれば、Green-Kubo公式は成り立つことが分かる。
陽電子消滅の研究のためのアンガ-カメラの改変

がんなど医学の診断用としてアンガ-カメラが広く使われている。このカメラは医用としては大体の10年を経過すると廃棄されるのが普通である。病院で廃棄するアンガ-カメラは毎年多数ある。本研究ではこのような医用としては役に立たないアンガ-カメラを改変して,陽電子消滅用の研究に利用した。陽電子消滅法は物質中の電子の運動量分布,すなわち金属においてはフェルミ面を決定する有力な手段である。とくに合金などのランダム系においては他の方法で測定困難なため威力を発揮する。陽電子消滅法において,今まで伝統的な1次元スリット法が使われてきたが,本研究は中古の医用アンガ-カメラ2台を改造して陽電子消滅の時発生する2本のガンマ-線を面で受け,ガンマ-線の入射位置を2次元的に捕え,2台の間に同時計測を行ない,今までとは比較にならないほど(数千倍)の効率で電子の運動量分布測定を行うことができた。これは単に計測速度が速くなったのみでなく,今まで測定不可能であると思われていた実験が可能になった。また陽電子消滅は結晶欠陥に非常に敏感である。金属中の結晶欠陥測定の方法としてここ15年ほど非常に盛んになってきている。この方法が半導体中の結晶欠陥にも敏感なことが最近わかってきた。シリコン単結晶につき実験を行なった。静岡市立病院,東京大学医学部から中古のアンガ-カメラ1台づつ貰ってきて改変した。これらはがんの検出用として主に使われていたもので,ガンマ-線の位置検出機能はあるが,2台のカメラは製作会社も異なるし,回路も全然異なっていた。まず,この間に同時計測回路を組み込んだ。特に東京大学医学部からのアンガ-カメラはかなり古く,2台のカメラのメ-カ-も異なるため苦労した。しかし,改変は成功し,高効率のデ-タ-収集ができた。また陽電子消滅ガンマ-線のエネルギ-分散陽電子寿命測定も合わせて行った。がんなど医学の診断用としてアンガーカメラが広く使われている。このカメラは医用としては大体10年を経過すると廃棄されているが、本研究ではこのような医用としては古く役に立たないアンガーカメラを改変して、陽電子消滅用の研究に利用する。本年は静岡市民病院からもらってきたアンガーカメラの改変を行いつつある。アンガーカメラを横方向および上下方向に駆動できる架台を作製する。アンガーカメラはその動作原理から位置情報はアナログであり、位置精度を向上させるためのX-Y鉛コリメターを前方に置いた。アンガーカメラを改造し、二台の間に同時計測をする回路をつけつつある。これにより陽電子消滅による2本のガンマー線が各々のアンガーカメラのどの位置に入ったかを決めることが出来る。本年及び来年において2台のアンガーカメラの間にコインシデンス回路を組み込む。陽電子消滅法は物質中の電子の運動量分布、すなわち金属においてはフェルミ面を決定する有力な手段である。とくに合金などのランダム系においてはドファース・ファン・アルフェン効果などで測定困難なため威力を発揮する。陽電子消滅法において、今まで伝統的な一次元スリット法が使われてきたが本研究は中古の医用のアンガーカメラ2台を改造して陽電子消滅の時発生する2本のガンマー線を面で受け、ガンマー線の入射位置を2次元的に捕え、2台の間に同時計測を行い、今までとは比較にならないほど(数千倍)の効率で電子の運動量分布測定を行うことができる。これは単に計測速度が速くなるのみでなく、今まで、測定不可能であると思われていた実験が可能になる。

また陽電子消滅は結晶欠陥に非常に敏感である。金属中の結晶欠陥測定の方法としてここ15年程度非常に盛んになってきている。この方法が半導体中の結晶欠陥にも敏感なことが最近わかってきた。がんなど医学の診断用としてアンガ-カメラが広く使われている。このカメラは医用としては大体10年を経過すると廃棄されるが、本研究ではこのような医用としては古く役に立たないアンガ-カメラを改変して、陽電子消滅用の研究に利用する。静岡市立病院からと東京大学医科研からもらって来たアンガ-カメラを改変しつつある。アンガ-カメラの光電子増倍管の強度を比較することにより、ガンマ-線が入った場所を決定した。これを二つのアンガ-カメラについて行ない、陽電子消滅によるガンマ-線から放出される2本のガンマ-線の角度相関を測定し、物質、材料中の電子の運動量を測定するものである。本年は一つのアンガ-カメラ(静岡市民病院からの)の場所の決定が出来るようになった。現在二つのアンガ-カメラの間にコインシィデンス回路を組み込み中である。陽電子消滅法は物質中の電子の運動量分布、すなわち金属においてはフエルミ面を決定する有力な手段である。とくに合金などのランダム系においてはドファ-ス・ファン・アルフェン効果などでは測定困難なため、この方法は威力を発揮する。陽電子消滅法において、今まで伝統的には一次元スリット法が使われてきたが、本研究は中古の医用のアンガ-カメラ2台を改造して陽電子消滅の時発生する2本のガンマ-線を面で受け、ガンマ-線の入射位置を2次元的に捕え、2台の間に同時計測を行ない、今までとは比較にならないほどの効率で電子の運動量分布測定を行う。これは単に計測速度が速くなるのみでなく、今まで測定不可能であると思われていた実験が可能になる。金属中の結晶欠陥測定の方法として、ここ15年程度非常に盛んになってきている。このカメラは医用としては大体10年を経過すると廃棄されるのが普通である。病院で廃棄するアンガ-カメラは毎年多数ある。本研究ではこのような医用としては役に多々ないアンガ-カメラを改変して、陽電子消滅用の研究に利用した。陽電子消滅法は物質中の電子の運動量分布、すなわち金属においてはフェルミ面を決定する有力な手段である.とくに合金などのランダム系においては他の方法で測定困難なため威力を発揮する.陽電子消滅法において、今まで伝統的な一次元スリット法が使われてきたが本研究は中古の医用のアンガ-カメラ2台を改造して陽電子消滅の時発生する2本のガンマ-線を面で受け、ガンマ-線の入射位置を2次元的に捕え、2台の間に同時計測を行ない,今までとは比較にならないほど(数千倍)の効率で電子の運動量分布測定を行うことができた。これは単に計測速度が速くなるのみでなく、今まで、測定不可能であると思われていた実験が可能になった。シリコン単結晶につき実験を行った。
リボヌクレオプロテインにおけるRNAの役割

タンパク質はRNAと協働し、リボヌクレオプロテイン複合体を形成し、高特異的な遺伝情報変換過程に働く。本研究では、遺伝暗号翻訳過程に注目し、まずtRNAのプロセシングおよび転写後化学修飾の過程において働くCCA付加酵素(RNAポリメラーゼ)およびMnmAチオ化ウリジン合成酵素とtRNA(前駆体)との複合体について、各反応ステップの複数の結晶構造(スナップショット)を決定することで、高精度・高特異的な化学反応を触媒する動的なメカニズムを分子動画として原子分解能で明らかにした(Nature 2006, Nature 2006)。これらの動的過程では、核酸とタンパク質が協同的に構造を変化させながら活性化して行き、正確な化学反応を可能にしていた。さらに、真核細胞やその祖先となる古細菌の翻訳系酵素は、複数のタンパク質が(超分子)複合体を形成し、統合された化学反応(チャネリング反応)を触媒すると考えられる。本研究では、第2に、tRNAの化学修飾や間接的なアミノアシル化に働くチャネリング複合体(TusE・tRNA・MnmA、TYW1-4、box C/D snoRNP)、アミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)分子複合体(MARS)の再構成と予備的な結晶化に成功し、構造研究を推進している。また、古細菌において3つの連続した化学反応を触媒してGln-tRNA^<Gln>を合成するGatDEアミド基転移酵素とtRNA^<Gln>との複合体のX線結晶構造解析を行い、統合された連鎖反応の触媒機構、さらにアンモニア分子を輸送する分子トンネルを明らかにした(Science 2006)。第3に、タンパク質が細胞内から膜を隔てた細胞外へ輸送される一般的なメカニズムを解明するために、細胞膜(真核細胞では小胞体膜)を介した新生ペプチドの輸送を行うトランスロコン(超分子複合体)を構成する膜タンパク質、SecYEとSecDFのX線結晶構造解析を行い、構造決定に成功した。本年度はtRNAのプロセシング,転写後修飾,アミノアシル化に働く酵素とtRNA(前駆体)の複合体のX線結晶構造解析を行い、遺伝暗号翻訳のメカニズムを原子分解能のレベルで解明することを目指した。tRNAのプロセシングに関しては、Archaeglobus flugidus由来のクラスIのCCA付加酵素とミニヘリックスtRNA前駆体(CCA,CA,Aそれぞれ欠けているもの)とNTPとの計7通りの複合体の構造解析に成功し、CCA付加酵素がポリメラーゼドメインをノッキングしながら基質を厳密に識別し、C、C、Aを正しい順序で重合して行く新規のメカニズムを解明し、論文準備中である。RNasePに関しては、T.thermophilusおよびB.subtilis由来のRNasePホロ酵素とtRNA前駆体の複合体の結晶化に成功し、現在結晶化条件を改良して、高分解能結晶の作成を目指している。また、tRNAの転写後修飾に関しては、A.aeolicus由来のリシジン合成酵素(TilS)の結晶構造を2.2Å分解能で決定し、変異体解析により触媒部位を同定し、触媒メカニズム・tRNA認識機構を解明した(Pro.Natl.Acad.Sci.USAに掲載)。また、L-cysteine由来のチオール基をtRNAへ転移するTusBCDの結晶構造を2.15Å分解能で決定し、新規のチオール基運搬機構を発見した(Structureに掲載)。

さらにこのチオール基を最終的にtRNAへ転移する酵素MnmAとtRNAの複合体に関して、3種類の結晶構造を決定し、これがtRNA初期認識ステージ、前反応ステージ、アデニル化中間体ステージに相当することを解明し、さらに変異体解析を行うことにより、MnmAによる硫黄転移機構の構造的基盤、tRNA識別機構を明らかにした(論文改訂中)。また、アミノアシルtRNA合成に関して、Aquifex aeolicus由来メチオニルtRNA合成酵素(MetRs)、tRNA、Met-AMP3者複合体の結晶構造を2.5Å分解能で決定し、tRNAのアンチコドン認識に関する新規の機構を見出した(Nature Struct.Mol.Biol.に掲載)。さらに、古細菌のtRNA依存性アミドトランスフェラーゼ(GatDE)とtRNA^<Gln>の複合体の結晶構造を3.15Å分解能で決定し、GatDEによるtRNA認識・識別機構、GatEサブユニットによるGlu-tRNA^<Gln>のリン酸化反応のメカニズム、GatDで産生されたアンモニアが分子トンネルを通ってGatEの活性中心まで運搬する機構を解明した(論文準備中)。尚、本課題において東京工業大学大学院生命理工学研究科・助手、沼田倫征(研究者番号10401564)にタンパク質のX線結晶解析用務で理化学研究所に、研究協力出張を依頼した。tRNAプロセシング酵素の構造解析に関しては、古細菌のCCA付加酵素と各反応ステップのプライマーtRNA(ミニヘリックス)とATPおよびCTPの複合体、計6種類の結晶構造を解明した。その結果、CCA付加酵素が、鋳型DNAなしでも決まったCCA配列を重合できるダイナミックなメカニズムを解明することに成功した(Nature,2006)。tRNA修飾酵素の構造解析に関しては、tRNAのアンチコドン1字目のウリジンに硫黄を導入するMnmAとtRNAの複合体に関して、3反応ステップの結晶構造を解明した。その結果、MnmAが反応生の高い硫黄原子を、水分子等と副反応させることなく、tRNAの決まった位置に正確に導入できる機構を解明した(Nature,2006)。アミノアシルtRNA合成に働く複合体の構造解析に関しては、古細菌において、新規にGln-tRNA^<Gln>を合成するアミド基転移酵素GatDEとtRNA^<Gln>の結晶構造を解明した。その結果、GatDEがグルタミンの加水分解によるアンモニアの産生、Glu-tRNA^<Gln>のグルタミル基のリン酸化、さらにアミド基転移反応の3反応をいかに連携して触媒しているかを明らかにした。特に、GatDとGatEの活性部位をつなぐ分子トンネルがアンモニアの運搬に働いていることをつきとめた(Science,2006)。また、古細菌において新規にCys-tRNA^<Cys>およびSec-tRNA^<Sec>を合成する、SepCysSおよびSepSecSの結晶解析を行っている。SepCysSとtRNACysの複合体の結晶に関しては、4Å分解能の回折データを収集した。一方、SepSecSに関しては、酵素単独の結晶構造を2.5Å分解能で決定し、反応機構を示唆することに成功した(論文準備中)。
ヘルペスウイルス細胞侵入時における特異的レセプターの局在変化メカニズムの解明

単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)がホスト細胞に侵入する際、ウイルスエンベロープ上に存在する糖タンパク質が重要な働きをすることが知られている。当研究室では最近、主要ウイルス糖タンパク質であるglycoprotein B (gB)の機能的レセプターとして非筋細胞ミオシン重鎖IIA (NMHC-IIA)を同定し、そのユニークな動態を報告した。特に、ウイルスのホスト細胞への侵入に際し、レセプターが細胞表面ヘリクルートされるという現象は他に例のないものである。本研究では、NMHC-IIAのダイナミックな動態を制御するメカニズムの解明を目指している。HSV-1は一度感染すると宿主内に潜伏し、種々のストレスによって再活性化し、再発を繰り返す特徴がある。そのため、HSV-1の感染を予防する意義は大きく、本研究がもたらす知見が新規機構の感染予防に役立つことが期待できる。以下に進捗状況を記す。(i)既報のように、HSV細胞侵入時にNMHc-IIAが細胞表面にリクルートされるが、アクチン重合阻害剤を用いた解析により、HSV細胞侵入時にアクチンフィラメントの動態が変化することが示唆された。ミオシンはアクチンフィラメントに沿って運動することが知られているため、HSV感染時に細胞表面付近のアクチンフィラメントの構造が変化し、NMHC-IIAを細胞表面へ誘導するという仮説を立て、検証を進めている。(ii)HSVに対する感染阻害活性を有するモノクローナル抗体の作製を目的とし、マウスに抗原(NMHC-IIA/IIB)を投与し、スクリーニングを行った。これまでに、高い感染阻害活性を示す血清が得られたが、抗原投与から経時的に血清のHSVに対する感染阻害活性を解析した結果、感染阻害抗体が産生される期間が極めて限られていることが明らかになった。現在その原因の解析を進めている。NMHCを抗原としてマウスに投与することで、HSVに対する感染阻害抗体が産生されることが確認できたため。ただし、効率的に感染阻害抗体が産生される条件を特定できるまでは、モノクローナル抗体の作製は困難と考えられる。本研究は本年度が最終年度である。HSVに対する感染阻害活性を有する抗NMHCモノクローナル抗体の作製を進めることで、NMHC-IIAとgBの結合領域の決定など得られる情報は多いと考えられる。そのためには、上述したようにNMHCを抗原として投与したマウスにおいて、HSVに対する感染阻害抗体が産生される条件を特定する必要がある。感染阻害活性を示す血清に含まれる抗体のアイソタイプを解析することで何らかの情報が得られることが期待される。当研究室では最近、主要ウイルス糖タンパク質であるglycoprotein B(gB)の機能的レセプターとして非筋細胞ミオシン重鎖IIA(NMHC-IIA)を同定し、そのユニークな動態を報告した。特に、ウイルスのホスト細胞への侵入に際し、レセプターが細胞表面へリクルートされるという現象は他に例のないものである。(i)ウイルス糖タンパク質のいずれかが、NMHC-IIAを細胞表面へリクルートすると推測し、可溶性ウイルス糖タンパク質発現ベクターを作製し、各糖タンパク質で培養細胞を処理した際の影響を評価している。現在、一部の糖タンパク質について十分な発現量が得られていないため、条件検討を進めている。これと併せて、各ウイルス糖タンパク質のノックアウトウイルスの調製を進めている。可溶性糖タンパク質とノックアウトウイルスによるアプローチで、NMHC-IIAを細胞表面へリクルートするウイルス因子の特定を進める計画である。(ii)NMHC-IIAが細胞表面へリクルートされる際にアクチンフィラメントが関与することを予測し、ウイルスを感染させる前に細胞をアクチン重合阻害剤および脱重合阻害剤で処理した。その結果、重合阻害剤で処理したときのみウイルスの感染率が低下することが明らかとなった。アクチンフィラメントはウイルスの感染サイクルの様々な点で利用されるため、この結果が細胞侵入特異的なものであるか検証を進めている。当研究室では、主要ウイルス糖タンパク質であるglycoprotein B(gB)の機能的レセプターとして、非筋細胞ミオシン重鎖IIA(NMHC-IIA)を同定し、そのユニークな動態を報告した。(i)ウイルス糖タンパク質のいずれかが、NMHC-IIAを細胞表面へリクルートすると推測した。

そこで、可溶性ウイルス糖タンパク質発現ベクターを作製し、精製した各糖タンパク質で培養細胞を処理した際の影響を評価し、これまでに責任因子の候補を得ている。併せて、糖タンパク質のノックアウトウイルスを作製し、当該因子の作用機序を精査している。(ii)NMHC-IIAが細胞表面ヘリクルートされる際にアクチンフィラメントが関与することを予測し、アクチン重合阻害剤で処理することでウイルスの感染率が低下することを確認した。アクチンフィラメントはウイルスの感染サイクルの様々な点で利用されるため、ウイルスの細胞侵入時のエフェクトに限定した解析を進めている。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)がホスト細胞に侵入する際、ウイルスエンベロープ上に存在する糖タンパク質が重要な働きをすることが知られている。当研究室では最近、主要ウイルス糖タンパク質であるglycoprotein B (gB)の機能的レセプターとして非筋細胞ミオシン重鎖IIA (NMHC-IIA)を同定し、そのユニークな動態を報告した。特に、ウイルスのホスト細胞への侵入に際し、レセプターが細胞表面ヘリクルートされるという現象は他に例のないものである。本研究では、NMHC-IIAのダイナミックな動態を制御するメカニズムの解明を目指している。HSV-1は一度感染すると宿主内に潜伏し、種々のストレスによって再活性化し、再発を繰り返す特徴がある。そのため、HSV-1の感染を予防する意義は大きく、本研究がもたらす知見が新規機構の感染予防に役立つことが期待できる。以下に進捗状況を記す。(i)既報のように、HSV細胞侵入時にNMHc-IIAが細胞表面にリクルートされるが、アクチン重合阻害剤を用いた解析により、HSV細胞侵入時にアクチンフィラメントの動態が変化することが示唆された。ミオシンはアクチンフィラメントに沿って運動することが知られているため、HSV感染時に細胞表面付近のアクチンフィラメントの構造が変化し、NMHC-IIAを細胞表面へ誘導するという仮説を立て、検証を進めている。(ii)HSVに対する感染阻害活性を有するモノクローナル抗体の作製を目的とし、マウスに抗原(NMHC-IIA/IIB)を投与し、スクリーニングを行った。これまでに、高い感染阻害活性を示す血清が得られたが、抗原投与から経時的に血清のHSVに対する感染阻害活性を解析した結果、感染阻害抗体が産生される期間が極めて限られていることが明らかになった。現在その原因の解析を進めている。研究に使用するマテリアルの準備が整いつつあるため。アクチン重合阻害剤によってHSV-1の感染率が低下することを示せたが、ポストエントリーに作用している可能性の評価に時間を要するため。細胞におけるアクチンの動態は、ウイルスのライフサイクルと密接に関わるため、細胞侵入時に限定した解析法を検討する必要があるため。NMHCを抗原としてマウスに投与することで、HSVに対する感染阻害抗体が産生されることが確認できたため。
創薬のための有機合成

本研究の目的は,創薬に対する有機合成化学の責任がますます重くなっている今日,我国における第一線の研究者が,それぞれの研究成果を開陳し,批判,討論を重ねることにより,基礎有機合成化学を中心に長期的展望にたつて,いかにして独創的医薬を創り出り出すために寄与できるかを英知を集めて探り出すことにある。本研究は,1)創薬の基礎としての不斉合成を中心とする新しい合成方法論の確立,2)複雑な化学構造を有する生物活性物質の合成を通じての総合的合成方法論の確立,3)各種生体反応の合成化学的モデル化と機能分子の設計,合成,4)リ-ド化合物の天然からの分離,構造決定,評価,5)コンピュ-タ-化学など各種の新手法による生体反応の機構解析と創薬化学への助言,の5項目の研究グル-プに分かれ,各分担研究者間の連絡を密に研究が進められた。その研究成果は研究連絡会議,研究班会議で徹底的に討議され,21世紀の創薬の基礎として精密有機合成化学における新しい多様な方法論確立のための努力がなされた。さらに,全体の討議を重ねる中で,21世紀の創薬のための基礎研究として生体応答分子の不斉合成を志向した研究領域を強力に推進すべきとの結論に達し,平成4年度に新たに重点領域研究として申請することが決められた。