hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
隔年開花種コダチスズムシソウと毎年開花種オキナワスズムシソウの一方向交雑の解析

年度末の冬には、コダチが一斉開花したので、オキナワとともにフェノロジーを比較して、開花期に重なりがあることを確認した。<遺伝学的解析>前年度に選抜した核DNA複数遺伝子領域を解析し、野外集団から採取した個体の遺伝子型を決定して、雑種が両親種間でのどのような交配により生じているのかを調べた。<交配実験>一斉開花したコダチを含めて、自殖能力の検証のための袋がけ実験を行なった。また、戻し交配の検証のため人工交配実験を行なって種子を得る事が出来たので、今後の実験に使用する予定である。<花粉形態解析>採取した各サンプルについて高精度実体顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて花粉形態の観察を行なったところ、推定雑種の花粉は両親種の花粉形態の中間形となることが多いが、一定の形態にまとまってはいないことがわかった。奄美群島と沖縄島北部に分布し、毎年開花する多年草であるオキナワスズムシソウ(オキナワ)と、沖縄島に分布し6年周期で開花して枯れる1回繁殖型多年草コダチスズムシソウ(コダチ)を対象とし、それらの推定雑種の形成プロセスを詳細に検討し、雑種が独立種に向かう雑種種分化が生じているのかを明らかにすることを目的として研究を進めてきた。今年度は、2010年の冬に一斉開花したコダチ、およびオキナワと推定雑種について調査し、遺伝的解析のためのサンプルと、種子を採取した。また、台湾産でコダチの最近縁種であるS.flexicaulisについても追加現地調査を行ない、生活史の確認や資料収集を行なった。収集した資料について、葉緑体DNAのtrnSG遺伝子間領域および核DNAのPHOT2のexon、intron領域の塩基配列を決定した。また、コダチとオキナワで完全に分化している一塩基多型(SNP)をスクリーニングし、制限酵素部位に変異があるCAPSマーカー10遺伝子座を作成し、解析した。PHOT2遺伝子の塩基配列とCAPSマーカーのデータをもとに、Newhybrids (Anderson and Thompson,2002)解析を行なったところ、推定雑種には、F1雑種、F2雑種、コダチとバッククロスした個体、雑種後代が存在することが明らかとなったが、オキナワとバッククロスした個体は存在しないことが推定された。また、F1雑種やF2雑種は必ずオキナワの葉緑体DNAハプロタイプを持ち、他の雑種もほとんどの個体がオキナワのハプロタイプを持っていた。F1雑種やF2雑種が必ずオキナワのハプロタイプを持つことはコダチの花粉がオキナワの胚珠に運ばれて雑種が生じていることを示している。これは交雑の生じうるコダチの一斉開花年にはコダチが大量の花を咲かせるので、ポリネーターに付着した花粉のほとんどがコダチのものとなることが原因であると推定された。種子は、生育環境に対する適応度の違いがあるかどうか確かめるべく、異なる環境に播いて発芽および成長を観察しているが結果はまだ明らかでない。
小児の顎顔面形態や口腔機能が全身の健康に影響する因子に関するコホート研究

本研究は、子どもの健康と環境に関する全国調査(エコチル調査)と協力し、顎顔面形態や口腔機能が全身状態にどの様な影響を与えるかを解明する事を目的とする。更に、当科に通院している患者に同様の調査を行う事で、矯正治療等の歯科的介入により全身症状の改善が可能かについて明らかにする事を目的とする。これらにより臨床経験から推察されていたが詳細が明らかとなっていない全身状態に対するリスク候補因子を多数評価する事が可能である。
サンゴ礁における海水富栄養化の慢性毒性評価法の確立

本研究課題では、海水の富栄養化によってサンゴが受ける「慢性ストレス」の評価技術の確立を目的として、生化学的な新規定量法の開発を試みた。「活性酸素」と良く似た性質を持つ「活性窒素」の生成と消去のバランス崩壊が、ヒトの慢性ストレス障害に関与していることが指摘されている。そこで、富栄養化に伴う活性窒素障害(窒素毒性)の生化学的痕跡として生体成分のニトロ化に着目し、普及を念頭においた簡便技術の開発を検討した。ニトロ化合物を酸化分解処理し、遊離してくる硝酸イオンをイオンクロマトフラフィーによって検出することで、ニトロ化レベルが定量化できることが明らかとなった。富栄養化海水の共通特性として窒素過多が知られている。サンゴ礁生物は、貧栄養環境および低窒素環境下に適応進化した生物群である。窒素過多の急性毒性は知られておらず、主な影響は慢性毒性である。しかし、窒素過多の慢性毒性誘発のメカニズムは不明のままである。最近、無機窒素体から活性酸素と良く似た性質をもつ「活性窒素」が細胞内で生産され、様々な生理機能を発揮していることが明らかとなってきた。また、活性酸素と同様に、活性窒素が細胞死の誘導や様々な代謝障害の原因ともなっていることも指摘されている。本年は窒素過多による慢性毒性評価法確立を目指して、活性窒素生成のフィンガープリントであるニトロ化物質の定量技術の基礎反応の解析を行った。ニトロフェノールをモデル化合物として、亜硝酸遊離を伴う脱ニトロ化反応の検討を行った。土壌細菌による分解系では、ニトロフェノールの消失と亜硝酸の生成が連動して起こる事が確認されたが、光学異性体を分解しないなど、汎用目的に不向きな基質特異性の高さが明らかとなった。そこで、非酵素的にニトロフェノールから亜硝酸を遊離する反応を検討した。その結果、促進的酸化的分解が有効であることが明らかとなった。この手法を用いて、生体構成分子のニトロ化レベルアッセイ技術を検討している(山崎担当)。富栄養化耐性能は生物種によって異なっている。サンゴ礁海域の富栄養化にともなって、第一次生産者の生物相が変化することが知られている。そこで、上記の技術開発基礎研究に加えて、野外の自然環境下での藻類相を調査し、富栄養化環境に特徴的に出現する生物種の特定を試みた。サンゴ礁としての健全性が確認された南西諸島海域でのラン藻相に関する現地調査とサンプリングをおこなった。現在、形態観察、メタゲノム手法および、エンリッチ培養法による顕在化を試みている(須田担当)。造礁サンゴは、熱帯・亜熱帯の貧栄養環境に適応進化してきた生物群である。そのため、富栄養化によって無機窒素濃度が上昇すると、環境ストレスとして働き生体の機能障害を引き起こしてしまう。しかし、富栄養化による機能障害は急性反応を示すことは希で、多くは長期的な慢性ストレスとして作用する。急性反応に比べて慢性反応は、原因との因果関係特定が難しく、医学臨床分野でも課題となっている。また、生命科学全般において、長期ストレスの作用メカニズムも未だに明確にはなっていない。本研究課題では、富栄養化に伴う長期ストレスの評価法確立を目的として、ラジカル反応を用いた新規定量法の開発を試みた。特に、活性窒素による生体物質のニトロ化に着目し、実用化を視野に入れて簡便技術の開発をおこなった。その結果、ニトロ化物質をイオンクロマトグラフィー法によって定量化する手法が有効であることが明らかとなった。慢性ストレス障害の発生機序を明らかにするために、モデル生物としてAzollaを用いて検討をおこなった。その結果、酸素・窒素・硫黄の三つの活性分子種(ROS活性酸素、RNS活性窒素、RSS活性硫黄)の発生と制御が重要な働きをしていることが明らかとなった。研究結果を基に、様々なストレスによって同一の生理的応答が得られる新たな仕組みを仮説として提唱した。昨年度に引き続き、ニトロフェノールをモデル化合物として、亜硝酸遊離を伴う脱ニトロ化反応の検討を行った。酸化チタンを用いて、ニトロフェノールから亜硝酸を遊離する光触媒反応を検討した。その結果、ニトロフェノール分解と遊離亜硝酸生成に良い対応が見られ、光触媒法によって、ニトロ基が亜硝酸イオンへ転換されることが示唆された。この反応は、マンニトールで抑制されることから、光触媒で発生するヒドロキシラジカルによって、ニトロ基の置換反応が起きていることが考えられる。富栄養化の影響評価のモデル生物として、アカウキクサを採用した。アカウキクサは、富栄養条件等の環境ストレス負荷状態になると、根が急速に脱理する特徴的な性質を持っている。この現象を富栄養化解析の指標にして、ストレスに対するアカウキクサの応答を調べた。その結果、亜硝酸、高温、ポリアミンに対して感受性を示し、根の脱理を起こすことが確認された。

窒素原子を3つもつアジ化ナトリウムで最も激しい脱理応答が見られ、その際に大量に一酸化窒素を放出することを見いだした。赤外線分光法を用いて脱理部分の細胞を調べたところ、ストレス負荷後では、細胞構成成分がニトロ化されていることが示唆された。研究開始初年度として、野外現地調査と実験環境の研究立ち上げが完了し、研究の進捗状況及び達成状況は概ね予定通りである。25年度が最終年度であるため、記入しない。富栄養化慢性ストレス指標として、生体物質のニトロ化に着目して研究を遂行していが、その基礎化学反応の解明に時間を要している。単年度の進捗状況としては、当初計画よりもやや遅れている感があるが、3年計画の研究進捗としては、想定の範囲であり、最終的な目標達成は可能であると考えている。最終目標である慢性毒性評価にあたっては、当初の予想よりも生化学的基礎知見が希薄で脆弱であることが判明した。そのため、今後はモデル系を用いた実験システムの構築と生化学的基盤確立に力点を置く。また、サンゴを材料として統計的な生物実験を行う事は、希少生物保護の観点から困難なことから、代替生物試験材料を用いたアッセイ系の確立も併せて行う。ニトロ化およびニトロソ化状態の検出法として、FTIR顕微分光測定法の適用を併せて検討する。実施にあたっては、米国ソノマ州立大学およびカリフォルニア大学の関連研究者と共同研究を実施し、生体ニトロ化のエビデンス取得を目指す。
MCI及び初期認知症の人とその家族の二者関係への並行的調査・介入：前向き研究

本研究の目的は、初期および若年性認知症の人とその家族がどのような困難を持つものか、その内容を調べ、認知症発症のごく初期からの並行的介入の効果を調べ、また、状況因性のBPSDの発症を抑えることができるかを前向きに研究することであった。すでに、2017年に初期及び若年性認知症の人(男性2名、女性1名)とその配偶者の数年間の聞き取り及び観察記録及び介入記録を検討し、介入を開始するときにはすでにBPSDとして様々にあった症状への改善効果を分析し、報告書にまとめた。2018年度は、BPSDの文献研究に加え、新たな参加者1名(A氏、若年性認知症の男性)とその妻に対して、初めて当初の目的通りに「前向き」に1年半にわたって研究することができた。最初の3人のケースとは異なり、認知症の発症の早い段階からの本人と家族からの聞き取りと観察に基づくもので、初期の段階における双方の困難と葛藤が明らかになった。並行的介入としてカフェでは、A氏とその妻の来店の度に、ボランティアスタッフと専門職が、個別の聞き取りを初めとし、双方の困難とニーズを探りながら、女子会、男子会など、ad hocにプログラムを実施した。そして聞き取りと相互作用の観察を記録し、共有した。介入1年半後の結果として、認知症の本人の適応は本人の自己評価、スタッフ評価ともに高く、妻についても、当初みられた本人のもの忘れや間違いへの指摘は収まり、本人の安定につながる態度の「優等生の介護者」に変化したと評価は高いが、妻から「自分自身の活気が失われた」と報告されたことは注目に値する。2018年のこの事例1件と最初の3名の継続的経過の結果を、代表及び2人の分担研究者で評価する予定である。また、カフェの複数のスタッフによる聴取と観察を共有する記録方法と評価方法の開発にも着手し、それを介入の評価会議に用いる計画である。この研究の目的は、MCIおよび初期認知症の人のBPSDの解消ないし軽減・予防のために、本人と家族介護者への心理社会的に並行的介入(parallel intervention)を個別に設計し、その効果を検証することである。特に状況因性のBPSDの軽減・予防に効果を持つ介入方法を確立し、効果を検証する。スケジュールとして1年目に10組の聞き取りをし、2年目でその記録を分析し,効果をもたらす介入方法を抽出し、ワーキンググループで介入プログラムを設計し、3年目でそのプログラム実施し、効果を測定するとしていた。1年目に研究代表者、研究分担者2名、研究協力者の4者で協議を行った結果、1)この研究の計画の元となったこれまでの研究の結果の見直しを質的分析で行い、認知症の人とその家族の双方の二者関係(dyad)の特質を測るアセスメント尺度を決めること、2)望ましい介入方法について、ワーキングチームでガイドラインを作成すること、3)並行して、この研究の趣旨であるBPSDの予防や削減の検証のために、ごく初期の認知症の人とその家族の研究参加を確実にすること、の3点を確認し、その後に実際の聞き取りを実施すべきだと判断、研究スケジュールを変更した。実績として、1)の分析は質的分析であり、多大の時間をかけて現在分析を進めている。2)はワーキングチームの研究者・実践者の選定を済ませ、1)の結果を待っているところである。3)のごく初期の認知症の人とその家族の研究参加を確実にすることへの模索は、当初、研究分担者のもの忘れ外来の患者のリクルートを計画したが、外来で初期患者の治験が実施され、この研究の心理社会的な介入の効果と治験の効果との混同が想定されたため外来患者ではなく、カフェ参加者から現在対象者を選定中である。研究実績の概要で記述したように、目的のより望ましい遂行のために、研究計画の順序を変えて、この研究の基盤となった介入記録の分析を先に行うようにしたことで、スタートそのものが遅れた。その変更は質的分析を必要とするが、介入記録が相当の分量であるために、多大の時間を必要とし、さらなる遅れを生じたとみている。加えて、この研究の目的である、状況因性のBPSDの軽減・予防について、その生成の機序への心理社会的な介入効果を検証するためには、認知症のごく初期またはMCIの人とその家族の参加を求めたいのだが、当初予定した分担研究者のもの忘れ外来では治験が行われており、薬物療法効果と社会心理的介入のような非薬物療法効果の混同を懸念して、外来からのリクルートを断念せざるを得なかった。そこで、認知症カフェの参加者からリクルートすることに方針を変えた。そのために代表研究者自身が認知症カフェの運営に加わり、週ごと開かれるカフェにスタッフとして貢献する必要があった。望ましい研究参加者を求めるために、代表研究者の研究にかける時間が削られ、分析が滞ることになってしまったと考える。スケジュールとして1年目に10組の聞き取り、2年目でその記録分析から効果的な介入方法を抽出し、介入プログラムを設計し、3年目でそのプログラム実施し、効果を測定するとしていたが、その計画は変更を余儀なくされたことは、昨年の実施状況報告書で明らかにした。

その計画変更は、「1)この研究の計画の元となったこれまでの研究の結果の見直しを質的分析で行い、認知症の人とその家族の双方の二者関係(dyad)の特質を測るアセスメント尺度を決めること、2)望ましい介入方法について、ワーキングチームでガイドラインを作成すること、3)並行して、この研究の趣旨であるBPSDの予防や削減の検証のために、ごく初期の認知症の人とその家族の研究参加を確実にすること、の3点を確認し、その後に実際の聞き取りを実施する」ことであった。H28年度(2017)においては、1)のこれまでの研究の結果の見直しを質的分析で行ってきたが、研究者の体制および研究対象者のフィールドと研究体制に問題が生じた。当初の、研究分担者のもの忘れ外来患者リクルート計画は、治験の実施で、当研究の心理社会的介入と治験の効果の混同が予想されたため断念し、研究代表者が副理事長を務める認知症カフェの参加者に対象者を変更したが、カフェの運営資金確保と運営そのものに多大な時間を割く必要から、1)のデータの分析が遅れ、続く2)ガイドラインの作成、3)新たな研究参加者のリクルートも遅れている。さらに分担研究者2名の転任により、研究に支障が生じた。研究実績の概要で記述したように、目的自体に変更はないが、この研究の基盤となった介入記録の分析を先行したことで、スタートそのものが遅れた。その変更は質的分析を必要とするが、介入記録が相当の分量であるために、多大の時間を必要とし、さらなる遅れを生じた。とくに、この研究の目的である、状況因性のBPSDの軽減・予防について、その生成の機序への心理社会的な介入効果を検証するためには、認知症のごく初期またはMCIの人とその家族の参加を求めたいが、予定した外来患者が、治験が実施されたため、薬物療法効果と社会心理的介入のような非薬物療法効果の混同を懸念して断念せざるを得ず、認知症カフェの参加者からリクルートする方針に変えたが、そのために代表研究者自身が認知症カフェの運営に加わり、毎回カフェにスタッフとして貢献し、研究にかける時間が削られ、分析が滞ることになってしまった。加えて、過去2年の間に、研究分担者2名がいずれも、新規開設された職場に移動し、開設業務に多大な責任と時間が取られた上に、以前のように日常的に打ち合わせと共同作業会を行う事ができない距離となり、この研究の進行と協議にも支障をきたした。2017年度は前年度から引き続き、MCI及び初期認知症の人とその家族の二者関係についての並行的調査と介入を、認知症の人とその家族介護者6組に組に対して行った。具体的には、介入とは認知症カフェの参加者に対して、専門職、市民及び学生ボランティアによる治療的環境の提供である。このような治療的環境の中で、認知症の本人は、カフェの客として、自分の経験を語ることを好み、その語りの中で、認知症と診断された事へのとまどいや、やり切れなさなどと共に、主に介護家族である周囲の人たちへの不満、怒り、また感謝なども感情と共に表現する。さらには、生育環境における人間関係や、自身のライフヒストリーも好んで語る。ライフヒストリーは、学業や仕事の達成感や愉快さなども含み、カフェスタッフとの共感を伴う交流が生まれ、多くの場合笑いが起こるのを見る。一方、家族は、認知症の本人とは離れたところで、カフェスタッフや同じく家族介護者に対して、日常生活における、認知症の進行によるトラブル(モノの紛失、家事の能力を欠く、そしていわゆる「徘徊」などのBPSD)に拠り、驚いたり、困惑、狼狽する経験を、報告する。
半導体量子ドットネットワークにおけるスピン情報伝搬ダイナミクス

研究実施計画にしたがい、平成21年に引き続き本年度は以下の研究を実施した。(1)自己組織化量子ドットと希薄磁性半導体結合構造の微細加工自己組織化量子ドットと希薄磁性半導体の結合構造を利用して、希薄磁性半導体に光生成した電子・励起子スピンを量子ドット集合体の特定位置に注入するため、電子ビームリソグラフィーにより希薄磁性半導体層の微細加工を行った。その結果、直径200nm程度のメサ構造を作製することができた。さらに、このような自己組織化量子ドットと希薄磁性半導体の結合ナノ構造に対して、磁場中での円偏光顕微発光分光を行い、特定の量子ドット集合体における高い円偏光度を持つ発光スペクトルを観測し、そのスピン注入現象を確認することができた。(2)自己組織化量子ドットへのスピン注入と量子ドット間スピン伝搬ダイナミクスの分光計測希薄磁性半導体と結合した量子ドットに対して、円偏光を用いたピコ秒時間分解発光分光により、量子ドットへのスピン注入を示す発光とその円偏光度の時間変化、およびその詳細な励起子エネルギー依存性や励起密度依存性、さらに温度依存性などを測定した。このような測定結果に対して、スピン伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和時定数を取り込んだレート方程式解析を行い、注入されたスピンのドット間伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和ダイナミクスについて明らかにした。その結果、低温領域において主としてトンネル過程によりスピン偏極キャリアが伝搬する場合、スピン緩和は量子ドット内におけるスピン緩和過程に支配される。これに対して、温度が上がってくると、各量子ドット内に局在しているスピンが熱励起されるためドット間を拡散し、このような拡散過程におけるスピン緩和が顕著となる。高い面密度を持ち、各々が量子力学的にトンネル結合した半導体自己組織化量子ドット集合体を作製し、不特定多数の経路を伝搬する電子の量子情報であるスピンの伝搬ダイナミクスを実験的に明らかにすることを目的として、本年度は以下の研究を実施した。(1)高面密度半導体自己組織化量子ドットの作製分子線エピタキシーの成長条件を検討し高面密度量子ドットの作製を行った。特に、ドット層の堆積膜厚、ドット成長時の基板温度やアニール温度などを詳細に検討し、高い面密度を持つ量子ドット集合体を得ることが出来た。さらに、これらの高密度量子ドット集合体の一部に励起子スピンを注入するため、トンネルバリア層を介して光学特性に優れる希薄磁性半導体を積層した高品質磁性エピタキシャル半導体量子ドット構造を作製した。(2)自己組織化量子ドットへのスピン注入と量子ドット間スピン伝搬ダイナミクスの分光計測上述した希薄磁性半導体の結合構造を利用して、磁性半導体に光生成した励起子スピンを量子ドットへ注入した。そして(電子スピン情報を直接反映する)円偏光を用いたピコ秒時間分解発光分光により、量子ドットへのスピン注入とさらに注入後のドット間スピン伝搬ダイナミクスの実時間計測を行い、得られた発光の減衰特性とその円偏光度の詳細な励起子発光エネルギー依存性(ドットサイズを反映する)をもとに、スピン伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和時定数を取り込んだレート方程式解析を行った。このような実験手法により、注入されたスピンのドット間伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和ダイナミクスを実験的に明らかにした。研究実施計画にしたがい、平成20年に引き続き本年度は以下の研究を実施した。(1)高面密度半導体自己組織化量子ドットの作製平成20年度に引き続き、分子線エピタキシーの成長条件の検討により高面密度量子ドットの作製を行った。特に、ドット層の堆積膜厚とドット成長時の基板温度やアニール温度を変えることによるドット面密度の変化を調べた。その結果、ドット成長時の基板温度とアニール温度をともに下げた場合に比較的高い密度のドット構造が得られた。(2)自己組織化量子ドットと希薄磁性半導体結合構造の作製既に、希薄磁性半導体との結合構造を利用して、磁性半導体に光生成した電子・励起子スピンを量子ドット集合体の一部へと注入することに成功しているが、さらに、量子ドット集合体の特定位置にスピンを注入するため、電子ビームリソグラフィーにより磁性半導体層を微細加工し、特定のドット群にのみスピン注入を行う新規なナノ構造を作製した。(3)自己組織化量子ドットへのスピン注入と量子ドット間スピン伝搬ダイナミクスの分光計測エネルギー選択円偏光励起により、希薄磁性半導体と結合した特定の励起子エネルギーを持つドットへと光スピン注入を行った。さらに、円偏光を用いたピコ秒時間分解発光分光において発光エネルギーを弁別することにより、様々なエネルギーを持つ量子ドットへのスピン注入と注入後のドット間スピン伝搬ダイナミクスの実時間計測を行い、発光の減衰特性とその円偏光度の時間依存性よりスピン伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和時定数を取り込んだレート方程式解析を行い、注入されたスピンのドット間伝搬ダイナミクスを研究した。その結果、ドット間励起子移動時定数とドット内スピン緩和時定数を用いて実験結果を概ね再現することができた。

さらに、このような自己組織化量子ドットと希薄磁性半導体の結合ナノ構造に対して、磁場中での円偏光顕微発光分光を行い、特定の量子ドット集合体における高い円偏光度を持つ発光スペクトルを観測し、そのスピン注入現象を確認することができた。(2)自己組織化量子ドットへのスピン注入と量子ドット間スピン伝搬ダイナミクスの分光計測希薄磁性半導体と結合した量子ドットに対して、円偏光を用いたピコ秒時間分解発光分光により、量子ドットへのスピン注入を示す発光とその円偏光度の時間変化、およびその詳細な励起子エネルギー依存性や励起密度依存性、さらに温度依存性などを測定した。このような測定結果に対して、スピン伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和時定数を取り込んだレート方程式解析を行い、注入されたスピンのドット間伝搬ダイナミクスとドット内スピン緩和ダイナミクスについて明らかにした。その結果、低温領域において主としてトンネル過程によりスピン偏極キャリアが伝搬する場合、スピン緩和は量子ドット内におけるスピン緩和過程に支配される。これに対して、温度が上がってくると、各量子ドット内に局在しているスピンが熱励起されるためドット間を拡散し、このような拡散過程におけるスピン緩和が顕著となる。
ウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナル抗体の調製とその応用

1.モノクローナル抗体(Mab)を用いた免疫組織学的研究-ウシ未萌出歯髄コラゲナーゼインヒビター(CI)に対するMabによる染色像は,歯髄細胞の細胞質内およびマトリックスのコラーゲン線維に沿って陽性反応を示した.ヒト歯髄でもウシの場合とほゞ同じ所見であった.電顕的には,ヒトの場合,歯髄細胞の細胞質にほゞ瀰漫性に,また細胞膜に沿って比較的強い反応が見られた.粗面小胞体の内腔は必ずしも強い反応を示さなかった.細胞間マトリックスの反応は,不定形,あるいは,小顆粒状を呈し,コラーゲン線維を囲むように存在していた.2.Mab-セファロース4Bアフィニティーカラムを用いて,ウシ歯髄培養液中のCIのみを特異的に吸着させた.その溶出画分はSDS-PAGE上で単一バンド(分子量32K)を示し,ワン・ステップでCIを単一な状態まで精製できることを明らかにした.3.CIのサンドイッチ酵素免疫測定法(SEIA)-前述したヒトと交又反応する4種のMabのうち,抗原上の異なったエピトープを認識する1組のMabを用い,一方を1次抗体として固相に,他方をFab-ペルオキシダーゼとして2次抗体に用いてSEIAを確立した.この方法は極めて高感度で,ウシCIでは1pg,ヒトCIでは1.5pgが定量限界である.この定量法を用いて種々ヒト正常体液についてCIを測定し,血清で183±30ng/ml(平均±SD),血漿62±12,脳脊髄液60±13,羊水1,780±969,尿7±8などの値を得ている.現在,さらに種々疾患時の血清について検索中である.1.モノクローナル抗体(Mab)を用いた免疫組織学的研究-ウシ未萌出歯髄コラゲナーゼインヒビター(CI)に対するMabによる染色像は,歯髄細胞の細胞質内およびマトリックスのコラーゲン線維に沿って陽性反応を示した.ヒト歯髄でもウシの場合とほゞ同じ所見であった.電顕的には,ヒトの場合,歯髄細胞の細胞質にほゞ瀰漫性に,また細胞膜に沿って比較的強い反応が見られた.粗面小胞体の内腔は必ずしも強い反応を示さなかった.細胞間マトリックスの反応は,不定形,あるいは,小顆粒状を呈し,コラーゲン線維を囲むように存在していた.2.Mab-セファロース4Bアフィニティーカラムを用いて,ウシ歯髄培養液中のCIのみを特異的に吸着させた.その溶出画分はSDS-PAGE上で単一バンド(分子量32K)を示し,ワン・ステップでCIを単一な状態まで精製できることを明らかにした.3.CIのサンドイッチ酵素免疫測定法(SEIA)-前述したヒトと交又反応する4種のMabのうち,抗原上の異なったエピトープを認識する1組のMabを用い,一方を1次抗体として固相に,他方をFab-ペルオキシダーゼとして2次抗体に用いてSEIAを確立した.この方法は極めて高感度で,ウシCIでは1pg,ヒトCIでは1.5pgが定量限界である.この定量法を用いて種々ヒト正常体液についてCIを測定し,血清で183±30ng/ml(平均±SD),血漿62±12,脳脊髄液60±13,羊水1,780±969,尿7±8などの値を得ている.現在,さらに種々疾患時の血清について検索中である.
消化管ペプチドから見た情動・社会行動の発露、こころのゆらぎと変容の神経内分泌機構

本研究では、意志力に掛かる脳機能の発現を、内臓環境、特に消化器系を巡る環境が制御する分子・神経基盤を探究することをねらいとしており、30年度では、以下の研究項目を軸に、消化器系が意志力の発現に与る脳内環境のホメオスタシスを調節する腸・脳間情報伝達系の分子的基礎の解明に当たった。(1)鹿児島大の乾、浅川らは、グレリンなどの消化管ペプチドとその自己抗体の動態をヒト、マウスの血液で解析し、ホルモンの生理活性が意志力の発現に連関すること、グレリンがSIRT1を活性化し、脳内ミクログリアの毒性転化を抑制することを確認した。また、マウスにおいてpalatable foodを用い、側坐核のCX3CR1、ΔFosBの発現が減少することから、fractalkine-CX3CR1シグナルが意志力に関与している可能性を見い出した。さらに、緑葉タンパク由来ペプチドやhelicobacter pyloriが産生するVacAが情動に影響することを見い出した。(2)九大の須藤らは、前年度に引き続き、腸内細菌叢による意志力制御の分子的基礎の解明に当たった。即ち、神経性やせ症患者の腸内細菌叢を移植した人工菌叢マウスが、体重増加不良を来すとともに、ストレス耐性が脆弱であることを見出した。また、同マウス菌叢の遺伝子解析により、病態を呈する菌種を特定するとともに、メタボローム解析により、トリプトファン代謝物質が増加していることを見い出し、内臓環境が意志力の発現を制御する可能性を指摘した。(3)名古屋市大の井上、植木らは、グレリン、レプチンなどの消化管ペプチドがミクログリアの毒性転化を伴う脳内炎症反応を抑制する一方で成体脳神経新生を増幅することを、老化促進マウス及びミクログリア-神経幹細胞培養系で確認した。これらの知見は、消化管ペプチドが神経免疫活性を調節することにより意志力の発現・維持に影響を及ぼすことを示唆する。本研究者らは、30年度までに、意志力の制御に作動する消化管ペプチドや腸内細菌叢などの内臓環境因子の抽出をほぼ完了し、それらが意志力の発現・維持に影響を及ぼす海馬を始めとする脳領野や神経回路などの作用点の同定も順調に進展している。また、意志力の問題を抱える患者からの資料、データの収集、患者菌叢を移植した人工菌叢マウスなどの意志力の障害に連関した内臓環境病態モデル動物の創出などの成果も上げられている。今後は、特定の内臓環境因子が、意志力に掛かる脳領野、神経回路の病変を来す分子・神経病理の精解が見込まれることから、本研究は、おおむね順調に進展していると判断した。31年度(令和元年度)では、30年度までに見出された内臓・脳相関の分子的基礎を同定することをねらいとし、以下の取り組みを行う。(1)鹿児島大の乾、浅川らは、マウスを用いてグレリン、グレリン自己抗体の血中動態を観察しつつ、社会性、運動性に関する行動学的解析を行い、意志力発現に及ぼす影響を検討する。また、摂食障害、肥満症、ひきこもり患者で血液中のグレリンや炎症性サイトカインなどの動態と意志力に掛かる社会的行動、運動などとの連関を解析し、グレリンの意志力マーカーとしての有用性を検討する。さらに、palatable foodを用いたマウスによる報酬系-意志力の解析、家族内の人間関係に焦点を当てた意志力障害因子の解析、運動・睡眠習慣と意志力との関係に焦点を当てた近赤外線分光法を用いた脳画像解析を行う。(2)九大の須藤らは、意志力の障害に連関する代謝物質の解析、腸内細菌種の増殖を抑制する薬剤の探索や機能性食品の開発などを行い、意志力の障害の快復と増進を図ることを目標とする。(3)名古屋市大の佐久間、植木らは、成育社会環境が腸管ペプチド産生に影響を及ぼし、脳内免疫系の機能を調節することによって意志力を制御する生理を、腸管粘膜バリア、腸管神経叢などの動態に着目しつつ解析する。鹿児島大学、九州大学、名古屋市立大学の3施設においては進行状況を共有し、緊密に連携しながら共同研究を進めていく。こころの発達・意欲を阻む原因を解明するため、社会-脳内-体内環境相関の全人的ループのバランス破綻のメカニズムの検討を行った。鹿児島大学においては、マウスにおいて、two-bottle sucrose preference testを施行し、sucrose濃度を増加させてから中断し、再開するとsucroseに対する感受性が上昇した。また、高脂肪食による飼育は、絶食した後の絶食解除後の摂食量が普通食に比べ増加した。さらに、高脂肪食における絶食解除後の摂食量の増加は、ニコチン受容体のsubtypeであるα7のアゴニストによって抑制された。肥満症の血液サンプルを用い、食欲促進ホルモンであるグレリンの自己抗体の探索を行い、グレリンの自己抗体が存在することを確認した。九州大学においては、神経性やせ症(AN)女性患者と女性健常者における糞便中腸内細菌を、次世代シークエンサーによって比較した。その結果、門レベルにおいて、AN患者群は健常群と比較し、バクテロイデスの比率が有意に少なかった。また動物実験では、AN患者の腸内細菌を無菌マウスに移植し、AN型人工菌叢マウス(ANマウス)を作製した。ドナー側(ヒト)とレシピエント側(ANマウス)の腸内細菌叢を主成分分析にて統計解析し、ANマウスの腸内細菌叢はドナー側の腸内細菌叢をよく反映した構成となっていることを確認した。

名古屋市立大学においては、環境ストレスの負荷が、脳内ニューロン・ミクログリア相関の破綻を来す結果、ミクログリアの過剰な活性化による炎症反応を惹起する神経基盤の解析を、統合失調症の病態モデルマウスにて、ミクログリアCX3CR1受容体リガンド様分子の脳内動態に着目し行った。その結果、CX3CR1の活性化と神経細胞毒性を呈するニューロン障害関連タンパク質を同定した。報酬系のメカニズムにニコチン受容体が関与している可能性や食欲促進ホルモンであるグレリンの自己抗体が存在することを確認した。神経性やせ症の糞便中腸内細菌において、バクテロイデスの比率が有意に少ないことを見いだすとともに、AN型人工菌叢マウスを作製し、腸内細菌叢がドナー側(ヒト)の腸内細菌叢と近似していることを確認した。また、ミクログリアCX3CR1受容体リガンド様分子の脳内動態に着目し、CX3CR1の活性化と神経細胞毒性を呈するニューロン障害関連タンパク質を同定した。これらの知見は、本研究課題において次年度以降に予定している研究の実施に有用であると考えられる。平成28年度に続き、こころの発達・意欲を阻む原因を解明するため、社会-脳内-体内環境相関の全人的ループのバランス破綻のメカニズムの検討を行った。鹿児島大学においては、認知機能の低下におけるfractalkine-CX3CR1シグナルの関与を明らかにする目的で、糖尿病モデルマウスの学習記憶障害について検討した。その結果、血中corticosteroneレベルの増加およびinsulin-like growthfactor-1(IGF-1)の減少、さらに海馬のfractalkineおよびCX3CR1 mRNA発現の減少が認められた。正常マウスへのCX3CR1アンタゴニストの投与にて学習記憶障害が誘発されるとともに、dexamethasoneの投与にて、血中IGF-1の減少、海馬のfractalkineおよびCX3CR1 mRNA発現の減少が認められた。九州大学においては、神経性やせ症患者の腸内細菌叢を無菌マウスへ移植して作製した人工菌叢マウス(ANマウス)の特徴について、健常女性の腸内細菌叢を無菌マウスへ移植したコントロール群(HCマウス)と比較、検討した。まずANマウスの腸内細菌叢は移植したドナー患者の腸内細菌叢を反映した構成となっていた。ANマウスではHCマウスと比較し、エサの摂取量に対する体重増加率(栄養効率)が不良であった。またANマウスでは不安と関連した行動に異常が認められた。名古屋市立大学においては、自閉症、ひきこもりなどの動機付けに掛かる心身発達の障害病態脳にて、神経免疫系の病的な活性化が惹起される神経病理を紐解くことをねらいとし、自閉症などの病態モデル動物で脳内ミクログリアの毒性転化を来すニューロン・グリア相関破綻の分子基盤を解析した。その結果、母仔分離による自閉症病態モデルラットで、自閉症様行動の発現期(およそ2ヶ月齢)に脳内ミクログリアが活性化すること、また、それに先んじ、ニューロン由来の可溶性fractalkineの産生が著増することが確認された。糖尿病モデルマウスの学習記憶障害に海馬のfractalkine-CX3CR1シグナルの低下、グルココルチコイドおよびIGF-1が関与していることを明らかにした。神経性やせ症においては、腸内細菌叢が体重・行動異常の病態に関与している可能性が示唆された。
地盤との動的相互作用を考慮した浮き上がり活用型建築構造の耐震設計に関する基礎研究

浮き上がり活用型建築構造は簡易かつ安価に地震時の負荷低減効果を得ようとするものである。本研究では地盤ー構造物連成系の動的相互作用効果、非構造部材や床応答に関する研究代表者・研究分担者の知見を融合して、既往の研究を発展させる形で上部構造及び地盤の変形・塑性化を考慮した浮き上がり活用型建築構造の耐震設計に関して基礎的な検討を行う。具体的には浮き上がりに伴う地盤の局所的な変形を考慮した場合の上部構造の応答の特徴を把握するとともに、地盤の極限支持力に対するバランスを考慮した上部構造の適切な耐力設定に関する知見を得る。平成30年度は、1昨年度に実施した模型試験体による振動台実験結果の分析、2実験結果の数値解析による再現、3試設計建物等に関する地震応答解析、4関連検討、を行った。1に関しては、振動台実験における模型底面での測定圧力の最大値は、数種の載荷板による平板載荷試験結果の範囲にあることを確認した。また振動台実験結果の周波数特性を分析し、入力地震動が大きくなるにつれて低振動数成分が優勢となることを把握した。2については、PΔ効果を近似的に取り入れた解析プログラムを新たに作成し、PΔ効果を無視した場合よりも実験の再現性がよくなることを確認した。3については試設計建物モデルを対象として地盤バネを変化させた地震応答解析を行い、負荷低減効果の変化等を明らかにした。また、均一せん断棒モデルを対象とした地震応答解析により、入力地震動が大きくなると高次モードの応答が相対的に大きくなる傾向を明らかにした。4については振動方向の質量分布の非対称性に着目した実験や解析を補足的に行った。研究期間全体では実験・解析を通じて、地盤の極限支持力に対するバランスを考慮した上部構造の適切な耐力設定に関する基礎的な知見を得た。平成28年度は、自作の解析プログラムを改良・発展させた上で地震時の浮き上がり挙動を検討し、パラメータに応じた負荷低減効果を把握するとともに、高次モードの発生要因を分析してその推定手法を検討した。また、土槽を用いた振動台実験のために現有の模型を改良する形で直接基礎建築物を想定した試験体を製作した。自作プログラムでは、初速度を与えた自由振動を解析するプログラムを改良して、地震応答解析を行えるようにした。理想化したモデルを対象として接地状態と浮き上がり状態とに分け、いわゆる区分線形系としての解法を採用した。1つの状態が続く間は古典的なモード解析の方法により漸化式を活用した計算が可能であり、状態の切り替えは条件式を設定して数値的な判断を自動的に行うものとした。試験体については土槽に入れた砂質地盤上に設置することを想定し、基礎部材底面の複数点に小型の圧力計を設置して、接地率なども算定できるような計画とした。自作の解析プログラムの改良、地震応答解析による検討、実験計画などはおおむね予定通りに進展している。平成29年度は、模型試験体を用いた振動台実験を実施し、地盤の変形による応答の特徴や上部構造の耐力と地盤の極限支持力とのバランスに応じた応答の差異を確認した。実験では地盤条件(砂質地盤と剛地盤(鋼製))、上部構造の耐力(線形、非線形)などをパラメータとした。実験結果として、(1)剛地盤上で浮き上がり中に観察される顕著な高次振動が、砂質地盤上ではあまり見られなかったこと、(2)砂質地盤の一部に地盤変状が生じ、最終的にはわずかな沈下を含めた残留変位が生じたものの、転倒には至らなかったこと、(3)上部構造を非線形にした場合には基礎固定の条件では上部構造に大きな塑性変形を生じて傾きが残留したことに対して、浮き上がりを許容することによって塑性変形が抑制されたこと、などを把握した。また、地震応答解析により、浮き上がりを許容した場合の上部構造の応答に関して分析を行った。計画していた振動台実験を実施し、一定の知見が得られたため。

具体的には浮き上がりに伴う地盤の局所的な変形を考慮した場合の上部構造の応答の特徴を把握するとともに、地盤の極限支持力に対するバランスを考慮した上部構造の適切な耐力設定に関する知見を得る。平成30年度は、1昨年度に実施した模型試験体による振動台実験結果の分析、2実験結果の数値解析による再現、3試設計建物等に関する地震応答解析、4関連検討、を行った。1に関しては、振動台実験における模型底面での測定圧力の最大値は、数種の載荷板による平板載荷試験結果の範囲にあることを確認した。また振動台実験結果の周波数特性を分析し、入力地震動が大きくなるにつれて低振動数成分が優勢となることを把握した。2については、PΔ効果を近似的に取り入れた解析プログラムを新たに作成し、PΔ効果を無視した場合よりも実験の再現性がよくなることを確認した。3については試設計建物モデルを対象として地盤バネを変化させた地震応答解析を行い、負荷低減効果の変化等を明らかにした。また、均一せん断棒モデルを対象とした地震応答解析により、入力地震動が大きくなると高次モードの応答が相対的に大きくなる傾向を明らかにした。4については振動方向の質量分布の非対称性に着目した実験や解析を補足的に行った。研究期間全体では実験・解析を通じて、地盤の極限支持力に対するバランスを考慮した上部構造の適切な耐力設定に関する基礎的な知見を得た。次年度は予定どおり振動台実験によって実証的な検討を行う。また、自作プログラムに関してもさらなる改良や実験結果を踏まえた妥当性検証を行う予定である。次年度は予定どおり、実験結果の分析を継続するとともに、地震応答解析等による補足的検討を行った上で、本研究のとりまとめを行う。現有の部材等を活用することで試験体製作経費等を抑制できたため。(理由)現有の設備や部材等を活用し、自ら積極的に実験を実施したことで試験体製作経費や実験実施補助経費を抑制できたため。(使用計画)予定した試設計のための経費や成果公表のための国際会議参加経費に使用する。翌年度に計画している実験のパラメータを拡張するために追加試験体等を製作するための経費として使用する予定である。
健康食品「アマメシバ」による閉塞性細気管支炎の発症機序に関する免疫学的検討

<アマメシバ摂取マウスモデルの作成>マウスを対象群、アマメシバ低用量(200mg/kg/日)、高用量投与群(2000mg/kg/日)に分け、その生存期間と剖検肺組織を検討した。高用量投与群において早期死亡例が発生したが、剖検肺組織では一部に気管支周囲への細胞浸潤・線維化やBALT過形成が認められたものの、明らかな気道閉塞像は得られず、残念ながらアマメシバ投与による閉塞性細気管支炎動物モデル作成には成功しなかった。ただし、気道病変発症例におけるサイトカイン・ケモカインの検討では、対象に比してIFN-_Y発現が少なくMCP-1発現が多いという結果が得られ、線維芽細胞・大食細胞増殖が関与する閉塞性細気管支炎発症との関連が示唆された。<アマメシバ関連閉塞性細気管支炎症例の摘出肺に関する病理組織学的検討>生体肺移植の際に摘出された患者肺において病理学的検討を行った。組織学的には典型的な閉塞性細気管支炎で、増殖性(proliferative BO)と収縮性(constrictive BO)の両方の所見が認められた。また、この肺組織を用いてMatrix metalloproteinases(MMPs)に関する免疫組織化学的検討も行った。MMP-9は、細気管支上皮細胞および上皮下の線維芽細胞様細胞や浸潤する小型炎症細胞に強く発現し、また、MMPの内因性阻害剤であるTIMP-2は、細気管支上皮細胞への発現が高いことが確認された。これまでの研究および今回の成果により、アマメシバは気道上皮細胞の抗原性を変化させるとともに、Tリンパ球からもMMPを産生して持続性の炎症を形成。また、それに伴うMMP、TIMPの発現が、気道上皮細胞及び上皮下組織の傷害や炎症に伴う気道上皮の不十分な再生と異常な組織修復による過剰な線維増殖を来たし、それが閉塞性細気管支炎の病態に関与していることが推察された。<アマメシバ摂取マウスモデルの作成>マウス(BALB/cAnNCrj及びC57BL/6NCrjの2系統6週令で38例ずつ)を対象群、アマメシバ低用量投与群(200mg/kg/日)、高用量投与群(2000mg/kg/日)に分け、その生存期間を観察、8週、16週、32週後に剖検し、肺組織を検討した。結果、対象群および低用量投与群においては、観察期間中変化は見られなかったが、高用量投与群において、16週までに途中死亡するマウスが5例発生した。剖検肺組織においては、一部、気管支周囲への細胞浸潤および線維化やBALT過形成が認められるものもあったが、明らかに閉塞性細気管支炎の像を呈する組織所見は得られなかった。それらの気道病変発症例(C57BL/6NCrj)の肺組織における免疫学的検討では、凍結肺標本よりmRNAを抽出しサイトカイン発現を対象群と比較したところ、気道病変例では、IFN-γの発現が少なく、MCP-1の発現が多いという結果が得られた。IFN-γは線維芽細胞の増殖を抑制し、MCP-1は大食細胞の増殖を促進するとされており、閉塞性細気管支炎の病態形成を支持する所見とも考えられた。その他種々のサイトカインやケモカインの関与も報告されており、今後検討する予定である。<アマメシバ関連閉塞性細気管支炎症例の摘出肺に関する病理組織学的検討>本邦におけるアマメシバ閉塞性細気管支炎の初発報告例は、その治療のため、生体肺移植を行った。その摘出肺における詳細な病理組織学的検討も進行中である。組織所見は増殖性閉塞性細気管支炎(proliferative BO)と収縮性閉塞性細気管支炎(constrictive BO)の所見が両方認めらた。現在、その免疫組織化学的研究なども進行中であり、本症の病態及び発症機序の解明するために、上記アマメシバ摂取マウスの研究結果とも比較検討していく。

これまでの研究および今回の成果により、アマメシバは気道上皮細胞の抗原性を変化させるとともに、Tリンパ球からもMMPを産生して持続性の炎症を形成。また、それに伴うMMP、TIMPの発現が、気道上皮細胞及び上皮下組織の傷害や炎症に伴う気道上皮の不十分な再生と異常な組織修復による過剰な線維増殖を来たし、それが閉塞性細気管支炎の病態に関与していることが推察された。
縦断的継続診療によるアルツハイマー病及び軽度認知機能障害病態バイオマーカーの確立

物忘れ外来受診者について、長期間(3年以上)にわたり継続診療し、診断が正常から軽度認知障害(MCI)に変動した例、および更にアルツハイマー病に至った例について臨床情報、画像情報及び血液(血漿)検体を継続的に採取した。同一被験者由来の異なる採取時期の検体を生化学的精製処理後、質量分析により比較解析した。研究機関内に解析できた他の被験者間も含め検討した結果、6例の正常からMCIへの変動例に共通して同定された血漿ペプチド分子を確認した。立体構造解析から当該分子は補体のエンドペプチダーゼによるC端側消化断片であることが解明され、立体構造を認識するモノクロナル抗体を作製し、診断アッセイ系確立中である。1.臨床情報と臨床検体のの管理・分析前年度に集積された臨床情報(健常高齢者、軽度認知機能障害高齢者、認知症高齢者)の分析から、バイオマーカーを用いた解析に適合する検体(血漿および髄液)を選択した。特に病態群については、その発症に及ぼす脳血管性異常の寄与度を画像診断所見、生活習慣病に関る検査所見等から予め想定した。また、ピック病、レヴィー小体病等他の脳変性疾患の可能性のある例は積極的に除外した。2.タウ分子内立体構造特異的モノクロナル抗体の作成と、臨床検体への応用基礎的解析からヒトタウ分子の生理的エンドプロテアーゼ(カルパイン類等)切断部位(TCー3)の立体構造を特異的に認識するラットモノクロナル抗体(脾骨細胞法による)を複数クローン精製した。これらを上記検体のうち選択された髄液検体(全て健常高齢者由来)について初期的検討を行ったところ、1クローン(TCー3c)のみが交差反応性を示した。この交差反応性は抗原に対する各クローンの反応程度から判断して、合理的ではあったが、希釈しない髄液原液を使用していることから、感度の点でこのままの実用化は困難と判断した。本年度の以降の解析は、抗体感度の向上および髄液検体の前処理の検討に費やしつつある。現行の基準で軽度認知障害(MCI)と判断される被験者から、アルツハイマー病(AD)に以降するグループ(MCI due to ADあるいはprodromal ADと表記される)に関連する血液バイマーカー候補を見い出した。候補物質は髄液(CSF)中ではその総濃度(total tau concentration)がADの病態診断マーカーとして確立しているタウ蛋白の一部の限定分解ペプチドで、成人で1日に500ml静脈血中に還流する髄液が血液と混合し、血中のエンドプロテアーゼ作用で比較的選択的に分解され、低分子化したペプチドから見い出された。当該ペプチドの構造は現時点では開示できないが、そのC端側断片の立体構造に対する特異的モノクロナル抗体の高い比活性と特異性から、ADと正常群の区別は元より、MCI du to ADと正常群との区別を可能にするクローンも得られている。1.研究分担者による研究対象症例の包含・除外基準の策定、臨床情報・検体の採取。当初の研究実施計画内容に原則的に則り行ったが、平成23年度中において既に臨床経過や病態に変容を確認できる例もあり、当初平成24年度以降の研究実施計画に予定していた以下の内容も今年度から適宜実施した。なお最終的に対象とした被験者の病態は、他覚的に認知機能が正常な高齢者(65歳以上)、Peterson基準により軽度認知機能障害(MCI)と判定される高齢者(同上)、および最新の臨床診断基準によりアルツハイマー病(AD)と診断された高齢者(同上)である。なお認知機能に関る臨床所見の変容を確認した例については特に留意し、検体採取の頻度を上げ、適切な検査所見(特に高度な画像診断法)の確保に努めた。2.研究代表者および研究分担者による本(臨床)研究の京都大学「医」の倫理委員会への承認申請と承認(平成23年5月)。付帯的にアポEリポタンパクの遺伝子型解析のため、本臨床試験被験者について、採血時にその血球DNAの当該遺伝子解析についての同意を得て、インフォームド・コンセントの確立を併せて行い、同時に承認された。3.研究代表者によるバイオマイカー候補の探索研究の進捗状況。血漿蛋白の網羅的解析手法として、血漿から含有量が多く解析の妨げとなるアルブミンと免疫グロブリンを除去し、精製した各群検体について、レクチンカラム分画により分離した糖蛋白について、2次元電気泳動により解析した。群間で変動が検出されたいくつかの候補蛋白(スポット)について質量分析による同定解析を行ったところ、ハプトグロビンの糖鎖構造に相違があることが示された。また、髄液解析は血漿と同様に精製した検体について、既に有力なバイオマーカーとして確立しているタウ蛋白とそのペプチドを対象とし、それらの群間の定性・定量的差異の確認を目指して解析を継続中である。前年度までの研究解析成果により、軽度認知障害(MCI)の状態にある人の血漿バイオマーカー候補として、タウ蛋白の一部のエンドペプチダーゼ消化ペプチドのC端側断片立体構造が、最も有力な候補物質として確認された。本年度はこの候補物質について詳細な構造解析とモノクロナル抗体特異性解析を行った。前者では受託解析によりコンピュータ上で作成した本候補物質の構造に対する反応性・結合性物質の探索・解析を行った。

具体的にはドッキングシュミレーション用ソフトウエアを駆使して、血液中の既知エンドペプチダーゼとの結合性、他物質との結合性を解析し、血液中で当該構造物のどの部分が実際に暴露されており、どの部分が遮蔽されているかを推定した。後者では上記結果を踏まえ、既に多く作成されている当該物質に対する立体構造認識モノクロナル抗体クローン群について、その認識抗原決定基の解析、MCI者血液中での結合物質の有無の検討を行った。以上解析の結果、(1)候補エンドペプチダーゼが当該立体構造に結合して各抗体との結合性に影響を及ぼしている確率は無視できる程度に低いこと、が明らかになり、更に(2)血液中物質で当該立体構造に結合し、確率的に有意に抗体結合性を修飾する生体成分としてC4d(主要な補体成分C4の断片)が同定された。本研究の目的は、(1)正常高齢者中から軽度認知障害に移行するリスクを持つ集団を弁別できる病態バイオマーカーを末梢血液中に見出し、その分子を同定し、(2)同定されたバイマーカー候補分子について、臨床検体に対する至適なアッセイ系を確立すること。更に、(3)確立されたアッセイ系について、正常例から軽度認知障害を弁別する特異性、感受性を明らかにするとともに、他病態(他の脳変性疾患及び糖尿病)の偽陽性検出の可能性についても検討することにある。初年度から第3年度の間の、診療施設物忘れ外来における縦断的継続診療の過程で、6例の正常高齢者から軽度認知障害への移行例、およびその後の継続診療においてアルツハイマー病にまで進展した例も含め、重点的に探索に利用する血漿検体とした。アルツハイマー病の診断は臨床所見、脳MRI,脳血流SPECT等を総合的に判断して行った。血漿を生化学的前処理の後、質量分析プロファイリングを行ったところ、6例の病態移行に共通して関連するペプチドが確認された。さらにMALDI質量分析器によるPSD解析、及び4重極質量分析機にる絶対同定により、候補ペプチドの構造を決定した。当該ペプチドは血清中の補体分子の特定のエンドペプチダーゼによる消化断片であることが配列決定により予測され、コンピュータ上の立体構造解析で確認された。本ペプチド検出を目的とする抗体の作成は、C端断端の立体構造を認識する抗体が不可欠と判断し、ラット脾臓細胞を用いたポリクロナル抗体作成系により、当該ペプチドのC端断端を認識するが、C端断端にアミノ酸を付加したペプチドは認識しない、ことを条件としてスクリーニングを行った。総計370クローンをスクリーニングし、出来るだけ高い比活性・特異性で全ての認定された血漿検体を合理的に認識する2クローンを選択しアッセイ系を構築した。現在他病態の偽陽性認識の有無を検討中である。物忘れ外来受診者について、長期間(3年以上)にわたり継続診療し、診断が正常から軽度認知障害(MCI)に変動した例、および更にアルツハイマー病に至った例について臨床情報、画像情報及び血液(血漿)検体を継続的に採取した。同一被験者由来の異なる採取時期の検体を生化学的精製処理後、質量分析により比較解析した。研究機関内に解析できた他の被験者間も含め検討した結果、6例の正常からMCIへの変動例に共通して同定された血漿ペプチド分子を確認した。立体構造解析から当該分子は補体のエンドペプチダーゼによるC端側消化断片であることが解明され、立体構造を認識するモノクロナル抗体を作製し、診断アッセイ系確立中である。MCIの血漿バイオマーカーとして、タウペプチドのうち特定のエンドペプチダーゼ断端(C端側)の立体構造が、最も有力な候補物質として同定されるまでは比較的順調に進捗した。