hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東アフリカ高学歴女性のライフコース戦略の研究：農村家族関係と新興中間層形成の動態

以下の年次計画にしたがって、研究目的を段階的に明らかにしていく。1年目ではおもに本研究のテーマに関わる対象者らの実態について明らかにし、2年目では、対象者らのより具体的な経験と意識について明らかにする。さらに3年目では、そうした対象者らの経験や意識がどの程度・どのように共有されているか明らかにしていく、という設計である。なお、各年度とも現地調査から帰国後に調査データの整理と分析をおこない、結果を英文論文として執筆し投稿する。
人工ウイルスによる安全・効率的遺伝子治療法の開発

人工ウイルスによる宿主染色体への遺伝子の組込みを効率化するため、プレインテグレーション複合体(PIC)の構成成分を検討したところ、PICの重要な構成成分であるインテグラーゼと転写因子YY1が、またインテグラーゼインターラクター(INI-1)と遺伝子抑制に働くポリコームタンパク複合体のサブユニットであるBmiが結合することがわかった。そこでまずGST pull down法によりモロニー白血病ウイルスインテグラーゼとマウスYY1の相互作用を解析したところ、YY1のN末端部位とインテグラーゼが結合していた。YY1のC末端はDNA結合部位、N末端は転写活性化部位であることから、PICにおいてcDNAはインテグラーゼとともにYY1とも結合し、インテグレーション反応になんらかの影響を与えていることが示唆された。さらにHIV-1由来インテグラーゼもYY1と結合した。一方、ウイルスベクター生産を効率化するため、一過性発現系であるQ-ベクターシステムについて検討した。従来法ではウイルス生産性のよいパッケージング細胞を用いて生産するが、手間が煩雑であり、時間がかかるという欠点があるのに対し、Q-ベクター法では23日でウイルスが生産できる。生産されたウイルスの力価はウイルスの長さに依存するが、トランスジーンが2Kb程度の場合Qベクター法でパッケージングセル法と同程度の力価が得られた。またトランスジーンに細胞毒性がある場合はパッケージング細胞法に較べはるかに高い力価が得られた。人工ウイルスのコンポーネントとして用いるプレインテグレーション複合体(PIC)を、モロニー白血病ウイルスを感染させたHeLa細胞より調製した。ショ糖密度勾配超遠心によりPICを分画し,サザンブロッティング及びφx174DNAを基質としたin vitroのDNA挿入活性測定によりPICフラクションを同定した。HIVではPICに宿主細胞由来のINI-1,PMLタンパク質が結合していると報告されているため、精製フラクションについて、INI-1,PML,さらに染色体リモデリング因子であるBRM, BRG1の結合を検討したが、これらはいずれも存在しなかった。そこでINI-1,PMLの遺伝子をクローン化し発現ベクターを作製し、すでにクローン化してあるBRG1とともに293FT, HeLa, c33Aなどでこれらを発現させ、モロニー白血病ウイルスの感染効率をFACSにより調べた。これらのタンパクの過剰発現により感染効率に大きな差はみられなかった。これらよりHIVと違いモロニー白血病ウイルスの感染にはINI-1が必要ないと考えられた。現在PICの同定を確実にするため抗モロニー白血病ウイルスインテグラーゼ抗体を取得している。一方、モロニー白血病ウイルスcDNAの核への取り込みにはPICの構成成分としても報告されているBAFが必要でないかと考え、この遺伝子をクローン化し、さらに細胞内局在性を調べやすくするためGFPとの融合タンパクとして発現させた。このタンパクを用いBAFが分裂中期に核に局在することを確認した。そこでまずGST pull down法によりモロニー白血病ウイルスインテグラーゼとマウスYY1の相互作用を解析したところところ、YY1のN末端部位とインテグラーゼが結合していた。
プロトオンコジンのクローニング

細胞増殖の調節に関与する遺伝子がオンコジンとしての潜在能力を持つことは従来のオンコジンの研究成果より明らかである。そこで私達は、細胞増殖の調節に働くヒト遺伝子をクローニングすることを行った。方法としては私達がこれまで分離したハムスターに由来する細胞増殖の温度感受性変異株にリン酸カルシュウム法でヒト高分子DNAを導入しこれによって野生型に復帰した株をまず分離した。ついでこれら復帰株のDNA中に含有されるヒト細胞由来のDNAをヒトのDNAに特異的な塩基配列を指標としてコスミッドベクターを用いてクローニングした。ヒトDNAを導入する温度感受性変異株としてはG1期の進行が制限温度では出来ないBN462株と、G2期における染色体凝縮開始の調節が温度感受性変異を起こしているBN2株を用いた。それぞれの変異株についての結果を以下に示す。(1)BN462株を用いたヒト遺伝子のクローニング。ヒト細胞のX染色体に由来する約70kbのヒトDNAを7個のコスミッドに分散する形で分離した。この分離されたヒトDNAの中心部(約50kb)は3回のDNAトランスフェクションを通じて安定に保持されていることが確認された。この遺伝子のコードするmRNAはまだ検出されていない。(2)BN2株を用いたヒト遺伝子のクローニング。私達は既にBN2変異を相補する生物活性を持つ約30kbのヒト遺伝子RCC1を約42kbのコスミッドにクローン化することに成功している。今回は、ヒトRCC1遺伝子のmRNAが約2.5kbのサイズであることを確認し、これに相当するCDNAを岡山氏のCDNAライブラリーより分離した。分離されたCDNAはBN2変異を相補する生物活性を持ち421個のアミノ酸をコードするORFが確認された。これは約45kbのタンパク質に相当する。この中に、約55個のアミノ酸が7回繰り返している構造が見つかった。
μオピオイド受容体を介する細胞内情報伝達の脱感作の分子機構に関する研究

1. NG108-15細胞に内因性に発現しているδオピオイド受容体を介するカルシウムチャネルの抑制が、δアゴニストの持続投与により分単位で減衰(脱感作)することが明らかとなった。さらに、この脱感作が可逆的であることを示し、βアドレナリン受容体キナーゼによるδ受容体のリン酸化が脱感作に関与することを示唆した。2.オピオイド受容体類似のノシセプチン受容体がNG108-15細胞に発現していることを示した。ノシセプチンの持続投与により、ノシセプチン受容体を介するカルシウムチャネル抑制は分単位で脱感作されたが、δオピオイド受容体を介するカルシウムチャネル抑制は影響を受けなかった。3.クローニングされたμオピオイド受容体を過剰発現させたNG108-15細胞において、μ受容体を介するカルシウムチャネル抑制が、2種類のμアゴニスト、モルヒネと[D-Ala^2,N-Me-Phe^4,Gly^5-ol]-enkephalin(DAMGO)の持続投与により、やはり分単位で脱感作されることがわかった。モルヒネの持続投与は、モルヒネによるカルシウムチャネル抑制のみを脱感作させ、DAMGOによるカルシウムチャネル抑制には影響を与えなかった。逆に、DAMGOの持続投与は、モルヒネによるカルシウムチャネル抑制をも脱感作させ、その脱感作の度合は、モルヒネの持続投与によるものよりも大きかった。このことは、μ受容体のパーシャルアゴニストであるモルヒネが、脱感作を引き起こすことにおいてもパーシャルアゴニストとして働くことで説明されることが示唆された。
亜鉛欠乏症診断マーカーの同定とそれを用いた検査法の確立

潜在的な亜鉛欠乏患者の診断に有効な高感度マーカー因子の同定を目的に、亜鉛結合領域として機能するヒスチジンに富む配列を持つ遺伝子配列をESTデータベースから複数個見出した。その中からマウスの食餌中への亜鉛添加により発現量の変化する遺伝子断片を同定し、この遺伝子の全長を取得した。その結果、この遺伝子は新規の亜鉛トランスポータータンパク質(ZnT-5と命名)をコードすることが判明した。ZnT-5遺伝子が目的とする亜鉛応答性のマーカー因子となる可能性について検討した結果、亜鉛含量に応じて発現量が変化する傾向は観察されたが、その変化は緩やかであり、マーカーに使用できるほどの感度も持ち合わせていなかった。故、この遺伝子は、亜鉛欠乏診断マーカーとしては適当なものではないと判断した。次に、今回同定したZnT-5は、これまでに見出されていた亜鉛トランスポーターに高い相同性を含む領域(C末側半分)とこれまでに見出されていない新規の構造を有する領域(N末側半分)からなるという特徴的な構造を有する。ZnT-5の発現組織を解析した結果、ユビキタスな発現パターンを認めたが、特に分泌組織に高い発現を示すことが判明した。さらに免疫染色により詳細に解析し、ZnT-5が膵臓ランゲルハンス島β細胞内のインスリシ分泌顆粒膜上に局在するタンパク質であることを明らかにした。インスリンは亜鉛と結合した形態で分泌顆粒内に貯蔵されるため、ZnT-5がインスリンに亜鉛を供給するというインスリン顆粒形成に重要な役割を担う可能性が考えられた。ESTデータベースを検索した結果、亜鉛結合領域と思われるヒスチジンに富む配列を有するタンパク質をコードする複数の遺伝子断片を見いだした。これらの遺伝子断片の中から食餌中に亜鉛含量により発現量の変化する遺伝子断片を絞り込み、この遺伝子断片の全長を取得した結果、亜鉛トランスポーターに高い相同性を示すタンパク質をコードする新規遺伝子であった。この遺伝子の発現組織を検索した結果、解析した全ての組織において発現していたが、血球系の細胞では比較的発現量が低く、一方で、膵臓や子宮・胎盤といった生殖器においては高い発現が確認された。培養細胞を用いて培地中亜鉛含量に応じた遺伝子発現量の変化を解析した結果、亜鉛含量依存的に発現が変化する傾向は視察されたが、その変化は鋭敏なものではなかったため、亜鉛欠乏診断マーカーとしては使用できないと結論づけた。現在、引き続きデータベースを用いて新たな候補遺伝子の探索・同定を行っている。一方、この遺伝子産物の諸性質を解析した結果、予想したように亜鉛輸送活性を有しており、新規亜鉛トランスポーター(Zinc Transporer 5; ZnT-5)であることが判明した。さらなる解析の結果、ZnT-5は膵臓ランゲルハンス島ベータ細胞内のインスリン分泌穎粒膜に局在するタンパク質であることが判明した。インスリンは亜鉛と結合した形態で分泌顆粒内に貯蔵されるため、ZnT-5のインスリン分泌への影響に興味が持たれる。
天文学計算機ネットワークの構築

現代の天文学は、宇宙における諸天体の形成・進化過程の解明を対象としている。このために、限られた資源である大望遠鏡からの膨大な観測データを多数の研究者が共同で解析したり、各地に分散した小口径望遠鏡の観測結果ならびに高速計算機等による理論シミュレーション計算との比較研究が重要である。従って大型観測施設と、各地に散らばる小口径観測施設、研究者、計算機施設等を結ぶ計算機ネットワーク構築が不可欠である。この様な観点から、本研究では天文学計算機ネットワークを以下の要素に分解し構築の企画調査を行った。1.各諸観測所から生み出される観測データを解析するためのデータ解析ネットワーク2.各観測所が連携して観測できる自動観測機能も含んだリモート観測システム(望遠鏡ネットワーク)3.各地に分散する多波長画像、理論シミュレーション結果等を検索する天体画像データベースネットワーク4.データ解析や観測装置制御などのためのソフトウェアの開発を組織だって行うための開発環境ネットワーク5.スーパーコンピュータ、専用計算機等を有効利用し、理論天文学計算を行うための理論計算ネットワーク6.研究情報の交換や研究活動の支援、資産の蓄積などを行う研究支援ネットワーク7.これらの各要素ネットワークについて、技術検討会をとうして必要なデータ転送量等をまとめ、既存ネットワークの定量的な評価を踏まえて、総合的なネットワークとしての概念設計を行った。この結果、上記1と3のネットワークに関連して、天文画像の転送が大きな問題点であることが明かとなり、技術的な解決を探る必要性が生じた。それ以外では、既存のネットワークによりある程度の成果が達成される見込みである。今後は、試験ネットワーク等により天文画像データの転送効率の実験・測定などを行ない、天文学ネットワークの構築を目指す。
過熱液滴型中性子線量計の基礎研究

1.過熱液滴型検出器の検出しきい値の研究には、組成の単純なブテン系液体を過熱液体に用いることが有利であると考え、従来から研究されてきたフレオン12と共にブテン系液体による検出器の試作を開始した。2.検出器はApfel-型とIng-型を試みた。フレオン12、イソブテン、1-ブテン等による両型の検出器にAm-Be線源からの中性子を照射、中性子に有感であることを確認した。Apfel-型は比重の小さいブテン系液体の場合は難点があることが明らかになったので、以後Ing-型についてのみ実験を行った。3.試作検出器のバブル生成をアコステックエミッシヨン(以下AEと書く)により検出した。バブルを目視するよりもAE検出の方が、液滴の分散の均一性等、検出媒体への要求が容易になる。4.試作検出器のAm-Be中性子に対する応答をAE計数により測定した。フレオンより高沸点のイソブテン、1-ブテン検出器でも常温で十分感度があることを確認した。しかし再使用時感度の再現性が未だ十分でない。5.温度依存性測定を、水を熱媒体とする試験槽中に検出器・防水型AEセンサーを設置して行う事とし、市販検出器で試験した。熱媒体の選択により検出機構研究に必要な、-20150°Cの温度範囲の測定が可能である。6.水をAE伝達媒体とすることにより、μsec領域の中性子によるバブル生成時の誘起AEを測定可能であることを確認した。バブル生成エネルギー効率決定のための実験的手法として有効と考えられる。7.本研究では実用検出器としての総合評価の試みには至らなかったが、ブテン系液体が過熱液滴型検出体として使用可能であること・AE法の有効性で明らかにした。ブテン系液体の使用により、理論と実験の比較が従来より明確になる。検出器感度の再現性の問題を克服すれば当初の目的を達成することができる。
スフィンゴシン1－リン酸の代謝経路を標的とする新しい脊髄損傷治療の開発

スフィンゴシン1-リン酸(S1P)は中枢神経にも豊富に存在するスフィンゴミエリンの分解産物であるスフィンゴシンが特異的リン酸化酵素によってリン酸化されて生成されるが、S1Pリアーゼの作用を受けて不可逆的に分解される。S1Pリアーゼは脊髄に強く発現していることが報告されており、我々は脊髄損傷後急性期におけるS1Pリアーゼ活性の抑制が損傷部におけるS1P濃度の増加を促進し、S1Pが有する生のシグナルとしての作用が神経組織の保護と機能回復の促進につながるとの仮説を立てた。本研究の目的は、S1Pの主要な分解酵素であるS1P lyaseを阻害することが脊髄損傷後の機能回復を促進につながるか検討することである。脊髄損傷マウスに対して通常の飲料水投与群(Control)とDOP 50 mg/L投与群で損傷後の下肢機能の推移をBMSにより評価した。DOP投与群はControl群に比較して有意に機能回復が良好であった。脊髄損傷後の機能回復を促進する手段として、本研究ではスフィンゴシン1ーリン酸(S1P)の分解経路を調節することで神経組織を温存し、機能回復を促進できるとの仮説のもとに研究を行った。。まずS1Pの主要な分解酵素であるS1Pリアーゼ阻害剤を使用し、損傷局所のS1P濃度を増加させることが機能回復に与える影響を検討した。1.至適薬剤濃度の検討S1Pリアーゼ阻害剤で入手可能な薬剤としては、2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole (THI)と4'deoxypyridoxine (DOP)があり、これら2つの薬剤をそれぞれ1日1回胃ゾンデによる投与と飲料水を介した持続投与の2種類の方法で比較した。末梢血中のリンパ球数を指標とすると、胃ゾンデによる間欠投与の方が持続投与よりも効果が高く、THIでは30mg/kg、DOPでは50mg/kgでBリンパ球、Tリンパ球ともに有意に減少することが確認できた。2.脊髄損傷モデルへの薬剤投与マウス第10胸椎高位にIH impactorによる60kdynの定量的な圧挫損傷を加えて脊髄損傷モデルを作成し、これに薬剤の投与を行った。まずリンパ球が有意に減少する容量で薬剤胃ゾンデによる間欠投与を行ったところ、薬剤投与群でマウスの体重減少があり、後肢の機能の平均値は増加するものの、統計学的な有意差が見られなかった。その理由としては、リンパ球減少により尿路感染や硬膜外膿瘍が発生している可能性、S1Pの機能調節に伴う徐脈などの副作用が運動機能に負の影響を与える可能性を考えた。今後現在よりも低い容量で薬剤投与を行い、機能回復促進のための至適投与量と投与時期、投与期間を明らかにしたい。薬剤の投与法を確定することができたが、機能回復を有意に促進する投与量と投与時期、投与期間についてはまだ検討の必要があるため。1.至適薬剤投与法の検討:S1P lyase阻害剤で入手可能な薬剤としては、2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole (THI)と4'deoxypyridoxine (DOP)があり、これら2つの薬剤をそれぞれ1日1回胃ゾンデによる投与と飲料水を介した持続投与の2種類の方法で比較した。一定の濃度に達すると末梢血中のリンパ球数が減少するが、リンパ球減少の効果は持続投与よりも胃ゾンデによる間欠投与の効果が高いことがわかった。しかし、B細胞、T細胞がともに有意に減少する濃度では、好中球と総白血球数が増加し、特に脊髄損傷モデルではマウスが衰弱することが分かった。2.脊髄損傷の治療効果に関する検討:S1P lyase阻害剤を、有意なリンパ球減少を指標とした濃度設定で投与すると、脊髄損傷マウスが衰弱して有意な機能回復が得られなかった。様々な薬剤濃度で比較を行った結果、THI、DOPともに30-50mg/L程度の濃度で飲料水を経由して持続投与する方法が最も安定しており、DOP投与マウスでは脊髄損傷後の機能回復が有意に促進されることが確認できた。現在S1P lyase阻害剤が脊髄損傷後の機能回復に影響を与えるメカニズムを検討しており、損傷後24時間の組織における血管透過性とRNAの発現パターンの変化に関して検討を行っている。至適薬剤濃度の設定に時間がかかり、メカニズムの解明が予定よりもやや遅れているため。

薬剤投与量を現在よりも減らして機能改善を比較するとともに、S1Pリアーゼ阻害剤投与によって脊髄損傷部位で生じるS1P濃度の変化、炎症性サイトカインの発現、炎症細胞浸潤の程度などを調査し、作用のメカニズムを明らかにしたい。今後は機能回復促進のメカニズム解明を中心に研究を推進する予定である。具体的には、S1P lyase阻害が損傷脊髄におけるS1P濃度、血管透過性、炎症性サイトカインの発現パターン、炎症性細胞の浸潤、アポトーシスなどに与える影響を明らかにしたい。
食品における蛋白質分解機構解明に関する研究

チ-ズなどの食品における固液相での蛋白質分解反応を明らかにするために、カゼインがpH4.5あるいはCa^<2+>の存在によって会合沈澱する性質を利用し、この系における蛋白質分解反応について研究した。1.α_<SI->カゼイン(α_<SI->CN)溶液に10mHのCa^<2+>を添加し、α_<SI->CNを会合沈澱させた系(A系)とCa^<2+>無添加の溶液(B系)とにおけるα_<SI->CNのトリプシンによる分解について調べた。作用pHは7.1、作用時間は024時間で行った。その結果、反応後のα_<SI->CNの分解を電気泳動(PAGE)で調べるとA系での分解はB系に比し遅く、特に初期1時間までの分解は非常に弱かった。分解生成物を比較すると、その数はA系はB系にくらべ少なく、また生成する分解産物にも違いが認められた。同反応を高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)で調べた結果、A系で生成するペプチドはB系に比し多かった。以上の結果からA系ではトリプシンによって細かく切断されていると推定された。2.βーCNが等電沈澱するpH4.5での分解をβーCNが溶液状態のpH6.0とPAGEを用い比較した(酵素はペプシン)。その結果、pH6.0ではβーI、II、IIIに相当する分解産物が生じたがpH4.5では生成しなかった。2M尿素存在下で反応させたところpH4.5での分解はpH6.0と同じであった。従って両者の違いはpH4.5ではβーCNが会合沈澱していることに起因すると推定した。次いでβーCNのpH4.5での分解と4°C(βーCNは沈澱しない)および30°Cで試みた。その結果、4°Cの分解はpH6.0の場合と同じで、30°Cと異なっていた。更に同反応をHPLCでペプチドを分析した結果、4°Cより30°Cにおいてペプチドが多く生成し、これは1の結果と同じであった。すなわち、pH4.5やCa^<2+>によるカゼインの会合沈澱系は溶液系より多くの箇所が切断されていると考えられ、これはカゼインが会合沈澱を生成する蔡に生じる構造変化による結果と推定した。
ラン藻の麻痺性貝毒生産と生合成中間体に関する研究

オーストラリア産のラン藻Anabaenacircinalisを大量培養し、同種の麻痺性貝毒生産能と毒の組成をHPLCと機器分析により調査した。同種がN-sulfocarbamoyl基をもつC1,C2を主成分とする特異なサキシトキシン同族体群を生産することをはじめて分光学的に証明した。また、培養後期に毒の相当量が細胞崩壊に伴い環境中に放出されることを明らかにした。さらに、同種から側鎖および11位に硫酸基を導入するN-およびO-sulfotransferaseを検出し、基質特異性を調べて生合成経路の一部を明らかにした。アメリカ産の大型ラン藻Lyngbya wolleiが既知のdecarbamoyl毒群に加えて未知の数成分を生産することを発見し、これらを精製単離して機器分析による構造解析を行った。いずれも側鎖にアセチル基を有しており、12位が還元された2成分を含む5種の新規サキシトキシン同族体であることが明らかとなり、本種が渦鞭毛藻やラン藻とは全くことなる変換酵素系をもつことを推定した。国内外から単藻培養体および天然の“アオコ"試料を含む20種40サンプルのラン藻を集め、HPLCによるサキシトキシン同族体の検索を実施した。第一次スクリーニングでは多種から毒に相当するピークが検出されたが、新たに開発した精密分析法で調査することにより、すべてが疑似ピークであることが明らかになった。単純にHPLCの結果から麻痺性貝毒生産性を結論することの危険性を示すとともに、ラン藻によるサキシトキシン同族体生産はかなり限定された種によることが推定された。
炭素不飽和結合を含む系における炭素-炭素結合形成反応の開発と有用な変換反応の設計

第2級の光学活性アリルアルコールのピコリン酸エステルと有機銅試薬とのアリル化反応を検討した。まず,RMgBr(R=Bu,Ph)とCuBr・Me_2Sから1:1,2:1,あるいは3:1の比率で調製した有機銅試薬との反応を検討したところ,いずれの試薬もanti S_N2'形式で高選択的に反応した。その後,RLiから調製した銅試薬もMgBr_2存在下で高効率的に反応した。これにより,反応に使える有機銅試薬の範囲を広げる事ができた。例えば,立体的に混んでいるアリール基,求核性の劣るフランやチオフェン,シスオレフィンからなる有機銅試薬。同様にして,イミダゾールアニオンも反応した。ピコリン酸脱離基は強力であり,アセチレン銅試薬を反応させる事にも初めて成功した。キラルな4級炭素の構築にも有効であった。また,応用研究として,植物エストロゲンとして注目されているイソフラバンとLoxoprofenのヒト体内代謝産物の合成を行い,効率的な合成法を見いだした。当研究室では最近,鎖状のアリルアルコール誘導体(基質)のアリル化反応を位置選択的かつ立体選択的に行なわせる脱離基としてピコリル基(pyridy1-C(=0)0-)を見いだし,一方,R-C≡C-CH_2MgBrの調製では従来必要であったHg(II)を使わないクリーンな方法を見いだした(新たな活性触媒はZnX_2)。本研究申請時,これらの反応は未発表であったが,本研究をとおして,それぞれの反応の有用性を示し,論文発表した。具体的には,RMgBr/CuXから成る試薬のRとして,アルキル基,アリール基(芳香環),アルケニル基を使うことができた。反応はいずれも立体選択的かつ位置選択的に進行し,antiS_N2'生成物を与え,不斉転写は>95%以上であった。アリール基を選択的に導入できる点は本反応システムの大きな特長である。一方,ZnX_2触媒存在下,R-C≡C-CH_2BrとMgからR-C≡C-CH_2MgBrを調製する方法の一般性を調べたところ,RとしてH, SiMe_3(TMS),n-C_5H_11, n-C_8H_17を用いることができた。こうして調製したプロパルギルGrignard試薬はアルデヒドやケトンと良好に反応した。さらに,環状アリルエステルとのアリル化反応ではanti S_N2'生成物を位置選択的かつ立体選択的に生成した。さらに,この反応を応用して動脈硬化の原因物質と言われているエポキシイソプロスタンA_2ホスホコリンと核内レセプターに作用するΔ^<12>-プロスタグランジンJ_2類の合成に成功した。昨年度の基盤研究Cにて,鎖状のアリルアルコール誘導体(基質)のアリル化反応を位置選択的かつ立体選択的に行なわせる脱離基としてピコリン酸基(pyridyl-C(=O)O-)を見いだした。本年度はこの反応の拡張と応用研究を行った。まず,この反応系を拡張するため,有機リチウム(RLi)から調製した銅試薬が使えるかどうか検討した。当初,我々は銅試薬をGrignard試薬(RMgBr)とCuBr・Me_2Sから合成していたが,この時の条件下ではRLi由来の銅試薬は反応性も選択性も低く,副反応も進行した。ところが, MgBr_2共存下では反応が加速され,かつ高選択的に反応した。この発見により, RMgBr経由では合成できない試薬,例えば,シス・アルケニル試薬やヘテロ環から成る試薬を使ったアリル化反応が可能になった。また,オルソリチエーション等を経由する調製法もアリル化反応に使えることが判明した。これらのことにより,試薬の選択範囲,試薬の調製法に幅を持たせることができた。応用研究では,アリル化反応を2度活用して抗炎症剤として知られているロキソプロフェンの活性本体(服用し,体内で変換されて生ずる)の合成を行った。さらにこの合成研究の際,環状のアリルピコリン酸のアリル化反応を検討し,上述した鎖状の系とは異なる反応条件を見いだした。

植物エストロゲンの一種として知られているエコールの光学活性体の合成では芳香環から成るGrignard試薬を調製し,これを銅試薬に変えてピコリン酸アリルと反応させた。芳香環から成る銅試薬は一般に選択性が低くなるが,我々の反応系では位置・立体選択的に反応した。また,アリル化反応を活用して動脈硬化の原因物質と言われているエポキシイソプロスタンA_2ホスホコリンと核内レセプターに作用するΔ^<12>-プロスタグランジンJ_2類の合成に成功した。新しく見いだしたアリル化反応系(アリルピコレート+RMgBr/CuBr)の適応範囲を拡張する研究とこの反応を使った生理活性化合物の合成研究を行ない以下の成果を挙げた。(1) RMgBrとしてアセチレン銅試薬を反応させることに初めて成功した。反応は,anti-SN2'で進行した。また,生成物のアセチレンに対するクリック反応は問題なく進行した。(2)ところが,基質として五員環状アルコールのピコレートを用いると,反応の効率は極度に低下した。幸いなことに,溶媒としてCH2Cl2を用いると効率的に反応した。現在,CH2Cl2の効果を他の系に応用し,成功しつつある。(3) 6員環上に4級炭素を構築する研究を行った。この場合,反応する炭素原子上での立体障害が大きく,そこでの反応は遅く,かつ位置選択でなかった。しかし,この系にZnX2を入れると,反応性も位置選択性も向上した。立体選択性は問題なく高水準を維持し,椅子型コンホメーションに対して立体的に空いている側で反応した。(4)この反応を活用して植物エストロゲンの一種である(S)-equolや関連するイソフラボノイドの合成に成功した。(5)基質としてアリルピコレートの代わりにプロパルギルピコレートを用いて同様の反応を検討した。キュープレート型試薬を用いるとプロパルギル位で反応し,反対に,カッパー型試薬を用いるとアセチレン側で反応してアレンを生じた。この反応は立体選択的に進行した。この反応を活用して,抗腫瘍活性化合物をいくつか合成した。
歯胚エナメル器における基底膜型ヘパラン硫酸プロテオグリカン・パールカンの役割

今年度は、前年度に作製したパールカン上皮細胞過剰発現系トランスジェニックマウス(Tg)の歯胚組織について、とくにエナメル器に着目して組織学的変化を検索した。まず、胎生期から生後の各歯胚発育段階の野生型マウスおよびTg頭部組織のPFA固定パラフィン連続切片を作製し、パールカンおよび各種細胞外基質と増殖因子の免疫組織化学的検索をおこなった。その結果、パールカン蛋白質はケラチン5に一致した局在をしめし、発現鐘状期(胎生18日)のTg臼歯歯胚エナメル器では、歯堤上皮索の肥大と星状網の細胞間隙の拡大が著明で、同部にはパールカンが高度に沈着していた。さらに歯乳頭細胞密度も減少していた。歯冠形成期(生後1日)では、エナメル器内への血管侵入が減少して星状網容積が保持されており、歯冠形態の鈍縁化をきたし、象牙芽細胞の不整列も確認された。したがって、パールカンは歯胚エナメル器細胞の分化と歯冠部形態の誘導に重要な役割をはたし、さらに象牙芽細胞の分化にも関与していることが示唆された。次に、胎生18日、生後1日および生後7日の下顎第一臼歯歯胚組織よりRNAを抽出し、RT-PCR法にて発現遺伝子の差異について検索した。その結果、生後1日齢歯胚において、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、トランスフォーミング成長因子β1(TGF-β1)などの各種増殖因子の軽度発現上昇が確認された。したがって、パールカンはこれら増殖因子を時期特異的に発現調節することによって、歯胚エナメル器の構築ならびに歯胚形成に重要な役割を果たしていることがあきらかとなった(裏面研究発表1,5)。以上、前年度および今年度の研究結果より、上皮細胞が産生する細胞外基質分子・パールカンが、歯胚ならびに各種上皮組織(毛、皮膚、唾液腺等)の形態形成や恒常性維持に果たす役割の一部が解明され、今後の再生医療の発展にも新たな研究展望がえられた。今年度はマウス上皮組織の発育過程およびヒト上皮性疾患におけるパールカンの局在を明らかにする目的で、胎生期から生後4週齢の正常マウス頭部組織および種々の上皮性疾患のヒト外科材料パラフィン連続切片を作製し、パールカンコア蛋白質の局在および遺伝子発現を、免疫組織化学的およびin situハイブリダイゼーション法にて検索した。その結果、マウス重層扁平上皮組織にはパールカン蛋白質の局在はみられなかったが、歯胚上皮組織であるエナメル器では星状網細胞の細胞間隙にきわめて豊富に存在し、星状網細胞にmRNAの発現が認められた。したがって、歯胚上皮組織の形態形成にパールカンが関与している可能性が示された。また、ヒト上皮性疾患では、口腔粘膜異型上皮および扁平上皮癌において、上皮細胞間隙が拡大し、上皮細胞間にパールカンが過剰に沈着し、上皮の癌化過程にパールカンが関与している可能性が示唆された(研究発表2)。次に、パールカン上皮細胞過剰発現系トランスジェニックマウスの作製をおこなった。上皮細胞に特異的に発現するケラチン5プロモーターにマウスパールカンcDNAを連結し、コンストラクトを作製した。コンストラクトの確認の目的で、ヒト扁平上皮癌細胞株ZK-1にリポフェクション法にて遺伝子導入をおこなった。トランスフェクション後24・48・72時間にRNAを抽出し、RT-PCR法にてパールカン遺伝子発現の変化を確認し、同時に培養細胞を4%PFAにて固定し、抗パールカン抗体をもちいた間接蛍光抗体法にて細胞染色をおこなった。遺伝子添加群において、24時間後にパールカン遺伝子発現が上昇し、細胞質内にはパールカン蛋白質が蓄積していることが確認された。その後、導入遺伝子を調整し、マイクロインジェクション法にてB6C3F1マウス受精卵に注入し、パールカントランスジェニックマウスを作製した。現在までの解析結果では、F1トランスジェニックマウスにおいて、口腔粘膜・皮膚の上皮組織の基底細胞にパールカン蛋白質の過剰発現が確認され、基底細胞の分化の乱れ、重層化等の上皮組織の形態学的変化が認められている。また、歯胚組織においても、エナメル質形成や象牙芽細胞分化に異常が確認されており、パールカンが上皮組織構築ならびに歯胚形成へ重要な役割を果たしていることがあきらかになりつつある。

次に、胎生18日、生後1日および生後7日の下顎第一臼歯歯胚組織よりRNAを抽出し、RT-PCR法にて発現遺伝子の差異について検索した。その結果、生後1日齢歯胚において、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、トランスフォーミング成長因子β1(TGF-β1)などの各種増殖因子の軽度発現上昇が確認された。したがって、パールカンはこれら増殖因子を時期特異的に発現調節することによって、歯胚エナメル器の構築ならびに歯胚形成に重要な役割を果たしていることがあきらかとなった(裏面研究発表1,5)。以上、前年度および今年度の研究結果より、上皮細胞が産生する細胞外基質分子・パールカンが、歯胚ならびに各種上皮組織(毛、皮膚、唾液腺等)の形態形成や恒常性維持に果たす役割の一部が解明され、今後の再生医療の発展にも新たな研究展望がえられた。
金属イオン認識能を持つ高分子イオン伝導体の合成と評価

金属イオンを認識し、それを移動速度に反映できる系としてイオン伝導性高分子に着目し、金属イオン認識能を持つ高分子溶媒の設計を目的として、主に高分子とイオンの相互認識を2つの系で評価した結果を報告する。まず、各種クラウンエーテル環を主鎖上に有する高分子を合成し、これにアルカリ金属塩を溶解させ、複素インピーダンス測定から交流イオン伝導度を算出した。金属イオンの認識を正確にイオン伝導度に反映させる目的で、クラウン環上下からヒドロキシルによる作用が期待できる単位構造を持つクラウンエーテル高分子を合成した。さらに、アニオン席を高分子鎖上に固定し、アニオンの移動を抑止し、カチオンのみを供出できる高分子イオン伝導体を合成し、クラウンエーテル高分子と混合した。この系で、クラウン環のキャビティサイズに対応するアルカリ金属イオンの移動抑制が明確に認められた。クラウン環のキャビティが対象とするカチオンよりも大きい場合は、協同的な捕捉能は働かず、むしろ極性環境として塩解離を促進する効果があることも見いだされた。次に、ポリエチレンオキシド(PEO)に代表されるポリエーテルオリゴマー(PO)に溶解させた無機塩は、加熱すると結晶として析出する特性を詳細に検討した。まず、昇温により析出する塩は比較的高い格子エネルギーを持っている一群であることを明らかにした。また、加熱により析出する塩の格子エネルギーの下限は、カチオン半径の関数であることを明らかにした。ポリプロピレンオキシド(PPO)を利用すれば、結晶が析出する塩の格子エネルギーの臨界値をシフトさせることも可能であった。この現象が溶媒の高分子性に起因するならば、塩の溶解度の温度依存性が負となるPOの臨界鎖長の下限が存在するはずである。一連のPOを用いて無機塩の溶解度を検討したところ、臨界鎖長の下限が認められ、しかもカチオン半径に伴い増大した。さらに、POの中で複数の塩を混合させた系では、カチオンとアニオンの考え得る組み合わせの中で、最も格子エネルギーの大きな塩が析出してくることも明らかになった。
炭酸イオンに依存する化学発光反応機構の解明とその分析化学への応用

化学発光(CL)とは化学反応の結果生じたエネルギー状態の高い(励起状態)の化学種が、より低いエネルギー状態(主に基底状態)へ遷移する際に光を放射する現象のことである。従って、光エネルギーを吸収して生じた励起状態の化学種が基底状態に遷移する際に光を放射する蛍光及びりん光とは励起過程が異なる。化学反応の結果生じるエネルギーの源としては、酸素による酸化、結合の開裂、電子移動などがあるが、全般的に見て広義の酸化反応に何らかの形で関与しているものが多い。本研究ではCL反応系自体に高い感度及び選択性を付与するため、活性酸素種を利用した新しいCL反応系を開発している。特に、炭酸イオンに依存する化学発光反応機構を解明するため、アセトニトリル/水混合溶媒中での炭酸水素ナトリウムと過酸化水素の反応で生成される活性種と蛍光性有機化合物によりCLが生じることが確認された。アルコール類のかわりにアセトニトリルを用いることによりCL強度が強くなることが確認されたが、CLプロファイルも異なることより生成する活性種がアルコールを用いた場合とは異なっているとも考えられる。CL試薬を用いた場合のCL結果やNBTを用いた吸光度測定結果より、炭酸水素ナトリウムと過酸化水素の反応によりスーパーオキシドが生成していると考えられる。しかしCL反応に関与する活性種についての断定はできない。この活性種の確認について今後さらなる検討が必要である。
バリ・ヒンドゥー教徒の共同体における慣習の再解釈に関する文化人類学的研究

「伝統的」知識人と「近代的」知識人の慣習村規則への取り組み方(変更の許容の範囲やその背景となる理念)に大きな違いがある。伝統に執着し重要視しつつも、伝統的規則を積極的に改変する用意があるのは、都市に移住した(慣習村と)二重の帰属を持つ知識人である。本研究は、村の「伝統的」知識人や識字能力によって社会的地位を上げた比較的若い近代的知識人など、さまざまな位置の人々による、ローカルな場面での「伝統」の語られ方やその操作のしかたを、慣習村の規則、とりわけ儀礼遂行に関わる規則の変容を対象として調べようとするものである。インドネシア社会や「伝統の創造」に関連する文献を検討の上、地方紙の収集と予備的な現地調査を行なった。まず、ウダヤナ大学の調査パートナーと連絡をとり調査許可申請の準備を始めた。また、現代的な知識人として村の出身の大学教員(国立ウダヤナ大学の一部が独立法人化した応用科学教育大学)に事前に連絡を取り、聞き取り調査を行った。調査対象の慣習村を含む地域でこの大学教員が始めた村興しのプロジェクト(土地の農産物を用いた菓子の生産販売)に参加した。その際、これまでも親交のあった慣習村役職者や、近年慣習村に関心を示しだした新興のアントレプレナーや、教員や役人などを対象にオープンエンドのインタヴューをした。さらに、慣習村の近代的な指導者層のかなり部分が参加する慣習村大会議に参加し、伝統的組織の成員構成の変化や儀礼遂行に関わる規則の変更が現在どのように行なわれつつあるのかを調べた。初年度の調査で、「伝統的」知識人と「近代的」知識人がどちらも「古来変わらぬ伝統」を志向しているにもかかわらず、伝統儀礼への参加のあり方やとらえ方に大きな差のあることが分かった。こうした具体的事例から得られた資料をもとに、平成22年度は村の指導者たちの位置付けや彼らの間の関係の把握を視野に入れ、指導者層(伝統的指導者や近代的知識人層)に対し、より踏み込んだインタヴューを行なう。本研究は、慣習村において、「伝統的」知識人や識字能力によって社会的地位を上げた比較的若い近代的知識人がローカルな場面で「伝統」をどのように語り、そして操作するかを、慣習村の儀礼遂行に関わる規則の変容を中心に調べようとするものである。初年度に引き続き、インドネシア社会や「伝統の創造」に関連する文献の検討、および地方紙の収集をおこなった。地方紙の出版は近年の現象で資料的にも収集の意義がある。また、地方紙はきわめて地方特殊的な特徴をもっているので、現代バリ社会の知識人層のあり方をとらえる上で重要である。現地調査では、調査期間中に調査対象の慣習村に属する一部落を中心として遂行されていた大規模な集合火葬儀礼を観察し、その詳細に関する資料を収集した。この種の儀礼は慣習村を主体とする儀礼ではないので、慣習村規則そのものにはあまり関係が無いが、大規模儀礼遂行のための動員の仕方や組織の構成から、慣習村に近年新たに関わりを深くしてきた近代的知識人層がここでも主導権をもつことが明らかであった。さらに、調査許可の受け入れ機関となっていたウダヤナ大学文学部の依頼を受け、本研究の中間報告をバリ文化研究セミナーで行い、本研究の基本的枠組みとして主張している文化/伝統概念について2時間の講演と質疑応答を行なった。「伝統的」知識人と「近代的」知識人がどちらも「古来変わらぬ」ものとして「伝統」を語るが、伝統儀礼への参加のあり方やとらえ方には大きな差があり、慣習村規則への取り組み方(変更の許容の範囲やその背景となる理念)の違いがあることが分かった。平成23年度は短期の補充調査を2度行ない、昨年度の調査結果の確認を調査対象慣習村の役職者や知的指導者と行なう。最終の補充調査の際には、ウダヤナ大学文学部のセミナーで村の指導者たちの位置付けや彼らの間の関係に関する資料にもとづいて、調査報告を行なう予定である。最終年度も、文献購読および地方紙資料の分析と現地調査を行った。インドネシア社会や「伝統の創造」に関連する文献を検討し、地方紙『バリ・ポスト』や『ヌサ・バリ』の記事を収集した。地方紙の発行は近年の現象で資料的にも収集の意義がある。また、地方紙の記事はきわめて地方特殊的な特徴をもっており、バリ地方の伝統や慣習とそれについての知識人層の関心や意識を知ることができた。現地調査では調査対象の慣習村の役職者にインタビューをし、彼らの学歴や職歴の詳細や家族関係を調べた。慣習村の儀礼についての考えを述べてもらい、地方の知識人層に見られる都市の近代的知識人と伝統的知識人とに共通する伝統や慣習への愛着と同時に異なる伝統の扱い方があることを確認した。

「伝統的」知識人と「近代的」知識人がどちらも「古来変わらぬ」ものとして「伝統」を語るが、伝統儀礼への参加のあり方は異なり、慣習村規則への取り組み方(変更の許容の範囲やその背景となる理念)にも大きな違いがある。
難治性嗅覚障害に対する分子生物学的アプローチ:ニオイ分子輸送蛋白の同定と発現動態の検索

1)ラットにおいてOBPl,OBP2は異なった発現様式を示す.OBPlは鼻中隔、鼻腔側壁の特に鼻前庭に開口する分泌腺に発現するのに対し、OBP2は一部OBP1と共通した分泌腺でも発現がみられるものの、鋤骨器に関係した分泌腺に強く発現するという違いがみられた.この結果からOBP2はフェロモンの輸送に関与するのではないかという仮説が立てられた.2)視覚、聴寛の未発達な生直後のマウスにとって嗅覚は生命を支える重要な感覚である.我々のノザン解析の結果OBP1がこうした生直後の段階からその発現が認められたことは、OBP1が嗅覚受容の構成するメンバーとしての資格を裏付けるものと捉えられた.3) RT-PCRを用いた実験ではヒト鼻組織にはラットOBPと相同性の高い遺伝子の発現は認められなかった.この結果から種の違いによって機能しているOBP蛋白が違うのではないかと思われた.4)種の近いマウスとラットの間ではOBP1遺伝子が共通して鼻粘膜の分泌腺に発現していることを明らかにした.しかし、ラットOBP2遺伝子のホモログはRT-PCRを用いた検討でマウス鼻組織には検出できず、種の僅かな違いによっても機能するOBPの構成が違うことが推察された.5)マウス鼻組織にはその構造からOBPファミリーに属すると考えられる蛋白、Major urinary protein(MUP)遺伝子が発現していることを明らかにした.MUP遺伝子は鼻中隔、鼻腔側壁の分泌腺にOBP1と類似した発現パターンを示し、その発現様式からフエロモンの輸送のみならず一般の匂い分子の受容機構にも関与しているのではないかと考えられた.1)ラットにおいてOBPl,OBP2は異なった発現様式を示す.OBPlは鼻中隔、鼻腔側壁の特に鼻前庭に開口する分泌腺に発現するのに対し、OBP2は一部OBP1と共通した分泌腺でも発現がみられるものの、鋤骨器に関係した分泌腺に強く発現するという違いがみられた.この結果からOBP2はフェロモンの輸送に関与するのではないかという仮説が立てられた.2)視覚、聴寛の未発達な生直後のマウスにとって嗅覚は生命を支える重要な感覚である.我々のノザン解析の結果OBP1がこうした生直後の段階からその発現が認められたことは、OBP1が嗅覚受容の構成するメンバーとしての資格を裏付けるものと捉えられた.3) RT-PCRを用いた実験ではヒト鼻組織にはラットOBPと相同性の高い遺伝子の発現は認められなかった.この結果から種の違いによって機能しているOBP蛋白が違うのではないかと思われた.4)種の近いマウスとラットの間ではOBP1遺伝子が共通して鼻粘膜の分泌腺に発現していることを明らかにした.しかし、ラットOBP2遺伝子のホモログはRT-PCRを用いた検討でマウス鼻組織には検出できず、種の僅かな違いによっても機能するOBPの構成が違うことが推察された.5)マウス鼻組織にはその構造からOBPファミリーに属すると考えられる蛋白、Major urinary protein(MUP)遺伝子が発現していることを明らかにした.MUP遺伝子は鼻中隔、鼻腔側壁の分泌腺にOBP1と類似した発現パターンを示し、その発現様式からフエロモンの輸送のみならず一般の匂い分子の受容機構にも関与しているのではないかと考えられた.匂い分子輸送蛋白(odorant-binding protein : OBP)の動態を探るため、本遺伝子の鼻内での発現部位及び生後発育過程での発現量の変化を検討した。ラットでは2種の異なるOBPの存在が知られるが、このうちOBPI mRNAは鼻前庭に開口する分泌腺に発現がみられ、従来の予想通りこの蛋白が吸気と共に嗅上皮に運ばれている様子が推察された。さらに生直後のラットが生き延びるには嗅覚系が機能していることが不可欠であるが、我々はOBPI遺伝子が生直後から発現していることを明らかとし、OBPIが嗅覚受容機構に関与することの条件を満たしていることを示した。これに対しOBPII遺伝子の発現はOBPIと大きく異なり、その発現部位からvomeronasal organに分泌されていると考えられた。この結果はOBPIIが一般の嗅覚ではなく、フェロモンの受容に関与する蛋白ではないかという新たな視点を提示する。これらのデータに基づきヒトの匂い分子輸送蛋白をラットOBPI遺伝子をもとにプライマーを作製し、下甲介粘膜から抽出したtRNAよりRT-PCRにてその存在を検討しているが、残念ながら十分な報告すべき結果が得られていない。平成9年度はマウスの匂い輸送蛋白(odorant-binding protein : OBP)について検討した。昨年我々の検討からヒトとラットの間ではOBPの類似性が低いことが予想されたため、種の近いラットとマウスの間でまずOBPの相同性を調べる必要があると思ったわけである。そこでまずマウス鼻粘膜のtotal RNAを抽出し、ラットでクローニングされている2種類のOBP(OBP1,OBP2)の塩基配列からデザインしたオリゴブライマ-を用い、RT-PCR法によってマウス鼻組織におけるOBP1,OBP2の発現を検討した。この結果、マウスにはラットOBP1と部分的塩基配列が完全に一致する遺伝子が発現していることが明らかとなった。その発現パターンをin situハイブリダイゼーションによって調べてみると、ラットと同様に鼻中隔、鼻腔側壁の分泌腺に認められ匂いの輸送蛋白として機能していることが推察された。一方OBP2に関してはラットと類似した遺伝子をマウスに於いて見いだすことはできなかった。この結果からマウスとラットという近い種であってもOBP遺伝子の保存性は高くないと考えられた。

さらにこうした検討のなかでマウスの鼻組織にはラットでは知られていない脂溶性分子輸送蛋白の存在を世界に先駆け遺伝子レベルで明らかにするという成果も得られた。Major urinary protein(MUP)がそれであるが、MUPは肝臓で多量に産生される蛋白でフェロモンの輸送に関与するのではないかと考えられている。MUPで報告さているサブタイプの中で鼻組織にはMUP4,MUP5が発現し、それらはOBP1と非常に類似した発現パターンを示す。この結果からMUPはフェロモンの輸送に加え一般の匂い分子の受容機構に関与しているのではないかと想像された。
がん幹細胞化に関与するSphere形成メカニズムを標的とした革新的治療開発

がん幹細胞仮説とニッチがん細胞は部位に依存しない無制限増殖能、浸潤能、転移能をもつ細胞であるが、臨床で遭遇するがんを形成する全てのがん細胞がこれらの性質を持っているとは限らず、がん細胞の一部が自己複製能や多分化能という幹細胞と同様の性質を持ち、がん組織中で自己複製を繰り返しつつ、分化してがん細胞集団となっていると考えられている。この考えは「がん幹細胞仮説」とも呼ばれる。このがん幹細胞は化学療法や放射線などの治療へ抵抗性を示すために残存しやすく、再発・転移の原因となる可能性がある。従って、がん幹細胞を標的とした治療法を確立することで再発、転移のリスクが少ない新しいがん治療が構築できるものと期待されている。Sphere形成とがん幹細胞がん幹細胞の研究手法は再生医療の研究と相まって飛躍的に進んでいる。がん幹細胞研究の代表的なin vitro評価系である“sphereformation assay"により、sphere形成はがん幹細胞を濃縮すると考えられているがその詳細な分子生物学的機序については不明である。研究代表者らは、「Sphere Biology」という概念を立ち上げ、その独特な低栄養・低酸素環境に起因すると考えられる変化こそが腹膜播種などに見られる悪性化の一因であることを突き止めた。本研究における「Sphere Biology」という新しい概念の分子生物学的観点からの理解により、がん幹細胞研究分野や再生医療分野へ直接的、間接的に成果を還元できるという点で特徴がある。本研究において、Sphere形成とがん幹細胞の関係やがん幹細胞のニッチを同定し、これらの分子生物学的特性を解析することによって、がん幹細胞を狙い撃ちすることができる治療標的分子を同定する事が可能となる。さらに、既存の治療法と組み合わせることで、がん治療のブレークスルーになりうる可能性がある。がんの難治性に関わるメカニズムとして『Sphere形成』に着目し、「Sphere Biology」研究を推進することで、その発生機序の解明が嘱望されていた消化器がん並びに卵巣がんの最も進行した病態かつ極めて予後不良である腹膜播種の全容を解明するに至った(Kasagi Y, et al. Cancer Res, 76:347-357, 2016)。その全貌は驚くべきもので、腹腔内に播種された腫瘍細胞は腹腔内に存在するplasma fibronectin及びType IVcollagenを用いて速やかに(6時間程度以内に)凝集し、sphereを形成しつつそのプロセスで多様な腹腔内タンパクを利用し、さらにがん細胞内のシグナル伝達が変化して転移に都合の良いがん微小環境を形成するというものであった。このようにして形成された腹膜播種結節は、その背景にsphere形成とそれに起因する微小環境との相互作用が存在することで、各種化学療法剤に対する抵抗性が極めて高いため、現行の治療法は生命予後の改善に繋がっていないことが明らかとなった。Sphereをターゲットとして行われたスクリーニングで得られた腹膜播種モデルに著効する化合物、PD0325901について、臨床開発の検討を開始した。ところが、当該化合物は過去に行われた別疾患に対する治験において、霧視が発現することが明らかになったことで開発が中止された経緯がある。当時の開発元であるPfizer社によると、現在も米国において他疾患に対して医師主導治験が実施中であることもあり、国内での提供は不可能との判断であった。そこで、我々は当該有害事象がMEK inhibitorによるon-targetによるものなのか否かを調査した。その結果、複数のMEK inhibitorで同様の症状を呈しており、中には不可逆的なものも含まれ得ることが分かった。そこで、我々は自身のスクリーニング結果に立ち返り、MEK inhibitorではないもう一つのHit化合物にも着目し、MEK inhibitorの効果と合わせて"true target"の探索を開始することとした。即ち、詳細はH30年度以降の研究計画に記すが、同じくSphereに対して著効するTriptolideはHsp70を阻害するという報告が一部にあるものの、Sphere破壊に関するメカニズムは一切不明である。それにも関わらず、ミネソタ大学による基礎検討によれば、膵臓癌細胞株を用いたマウス腹膜播種モデルに劇的に奏功し、腹水の著明な現象と生存期間の大幅な改善が見られたという。そこで、両化合物(PD0325901, Triptolide)を作用させたSphereに起こる現象を詳細に解析することで、狙うべき創薬ターゲットを見出す方針とした。1)網羅的手法によるsphere形成に必須な分子の同定Sphere形成を促進する候補分子から絞り込みを行うため、トランスクリプトームやプロテオーム解析などを行い、sphere形成に寄与している分子を同定した。2)化合物ライブラリによるsphere形成阻害物質の網羅的探索単一の分子標的に対する2D培養法を用いた化合物スクリーニングでは進行がん組織の特性を反映しておらず、in vivo及び臨床フェーズにおいて期待される薬効が十分に発揮されない場合がある。ポイントは難治化のメカニズムの一つである三次元形態的特徴をin vitroで再現したspheroidそのものをターゲットとし、化合物がspheroidに与える影響を感度良く、効率的に検出することで、進行がんの病態を反映した“劇的な治療効果が望める化合物"の探索を推進するためのシステムを構築することである。すなわち、従来の標的分子に対する活性を評価する2D培養法ではなく、“次世代型"とも呼べる腫瘍組織に対する活性を評価する3D培養法でのスクリーニングを行う。1)網羅的手法によるsphere形成に必須な分子の同定Sphere形成を促進する分子として、腹腔内洗浄液に含まれるコラーゲンタイプIVや血漿フィブロネクチンを同定した。