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環境配慮型ライフスタイルを促進するコミュニケーションの検討：国際比較実験を用いて

今年度は、環境配慮行動を勧める立場の役割を演じることが本人の環境配慮行動に及ぼす影響を検討するため、説得納得ゲームを用いた実験を行った。説得納得ゲームでは、参加者が説得する側と説得される側の2群に分かれ、説得する側は説得される側の一人に対して、自分が考えて省エネ行動を実施するように説得を試みる。本研究では、説得する際に「自己利益」を重視した説得を行う群と、「環境保全」を重視した説得を行う群の2群を設けた。29年度に作成した説得納得ゲームのルール説明と質問紙の英語版をもとに、共同研究者のGundula Hubnerの協力を得て、5月にドイツ国内の2つの大学で説得納得ゲームを実施した。参加者は116名であった。10月には、Kim-Pong Tamの協力により、香港科技大学において説得納得ゲームを実施し、参加者は65名であった。日本では、410月に国内の3つの大学において説得納得ゲームを実施し、参加者は合計92名であった。分析の結果、ゲーム実施前よりも実施後の方が省エネ行動意図がすべての国において高くなっていた。また、国別の比較では、日本が最も説得への自信、環境コミュニケーションが低かった。しかし一方で、主観的規範のゲーム前後での変化量は日本が最も大きく、説得納得ゲーム実施後の方が他者からの環境配慮行動の期待を高く認識していた。環境保全か自己利益かという実験群による差は、いくつかの変数で国との交互作用が見られ、国によって説得内容の影響が異なることが示唆された。The 5th European Conference on Behaviour and Energy Efficiencyにおいて2017年度に実施したメッセージの効果の比較研究の結果を発表した。国内では日本シミュレーション&ゲーミング学会において説得納得ゲームの予備実験の結果を発表した。今年度は当初の予定通りに、説得納得ゲームの国際比較実験をドイツ、香港、日本の3カ国で実施することができた。次年度は、国際学会において2017,2018年度にそれぞれ実施したメッセージの効果比較実験、説得納得ゲームの国際比較実験の結果報告を行う。また、説得納得ゲームの国際比較実験結果の分析をもとに英語での論文執筆を行い、次年度中に国際誌への投稿を行うことを目標とする。そのため、国内外の共同研究者らと分析方法、論文執筆方針についての打ち合わせを行う。今年度前半には文献調査と実験に用いる省エネ製品の選定を行った。省エネ製品について検討の結果、持ち運び可能な小型の太陽光発電装置を用いることとした。その理由は、現在世界的にそれほど普及しておらず新規の製品であること、学生でも購入可能な低価格であること、複数の国で同様の製品が売られており、入手可能であることである。続いてそれを用いて製品を勧めるメッセージの作成を行った。メッセージの送り手は友人と同製品を製作した会社の2種類とし、メッセージの内容として個人的利益を重視したメッセージ、環境保全を重視したメッセージ、両方のメッセージを含む混合メッセージの3種類を用意し、2×3の2要因によるメッセージの効果を検討することとした。また個人差の影響を最小限にするため、製品の写真と基本的な情報のみを最初に提示して質問紙に回答してもらい、次にメッセージの内の1種類を提示して再度質問紙に回答するという、被験者内要因による比較を行うこととした。以上の刺激とメッセージ、質問紙を含む実験用刺激冊子を作成した。省エネ製品の選定、メッセージの作成においては国内外の共同研究者との打ち合わせを行った。国内の共同研究者である杉浦氏、大沼氏とは、IAPS、国際心理学会、社会心理学会などにおいて打ち合わせを行った。またドイツの共同研究者であるHubner氏は10月に日本を訪問し、その際に奈良女子大学において打ち合わせを行った。上記の刺激とメッセージを用いて、2016年12月2017年1月に国内の2大学において予備実験を実施した。有効回答者数は計151名であった。分析の結果、メッセージの種類による、購入意図の変化は有意ではなかった。しかし、相互協調的自己観の高い人ほど友人からのメッセージの効果が強いことなどが明らかになった。また、購入意図の規定因としては社会的利益よりも個人的利益が強かった。予定通り、本年度中に予備実験用の刺激、質問紙の作成、共同研究者との打ち合わせ、予備実験の実施を行うことができたため。今年度は、省エネ製品を勧めるメッセージの効果の比較研究の本実験を実施した。そのため、実験刺激及び質問紙の作成を行った。本実験では、海外でも実施がしやすいように、条件設定をメッセージの送り手の2条件(友人、製品を製造した会社)とした。作成した実験刺激及び質問紙について、日本語から英語、中国語、ドイツ語への翻訳を行った。今年度後半にこれらの刺激を用いた国際比較研究の本実験を日本、ドイツ、中国において実施した。ドイツ、中国に関しては、それぞれの国の共同研究者であるGundula Hubner,李東輝に依頼して、大学生を対象に実験を実施した。日本での回収数は226(有効回答数161)、ドイツでの回収数は130(有効回答数94)、中国での回収数は132(有効回答数55)であった。チェック項目としてメッセージの送り手が誰であったかを尋ね、その回答が正答のデータのみを分析対象としため、有効回答数が少なくなっている。

分析の結果、日本では友人条件と会社条件で差がなかったのに対し、ドイツでは会社条件の方が友人条件よりも省エネ製品購入意図の変化量が大きかった。また、他者に環境配慮行動を取るように働きかけることが、説得者自身の態度、行動に変化を及ぼすかを検討するため、説得納得ゲームを用いた国際比較実験の準備を行い、1月に予備実験を国内において実施した。実験条件として、他者を説得する際に環境保全のメリットを重視する群と、個人的利益を重視する群の2群を設けた。分析の結果、省エネ行動意図はどちらの群も事後で上昇しており、群間の差は見られなかった。環境問題の深刻性認知は、環境保全群において有意に事後に高くなっていた。説得納得ゲームの海外での実施準備のため、実験資料、質問紙の英語への翻訳を行い、3月に研究協力者であるKim-Pong Tamと香港科技大学で打ち合わせを行った。今年度は予定通りにメッセージの効果の国際比較実験を3か国において実施し、第2のテーマである説得納得ゲームを用いた国際比較実験の準備と予備実験を実施することができたため。今年度は、環境配慮行動を勧める立場の役割を演じることが本人の環境配慮行動に及ぼす影響を検討するため、説得納得ゲームを用いた実験を行った。説得納得ゲームでは、参加者が説得する側と説得される側の2群に分かれ、説得する側は説得される側の一人に対して、自分が考えて省エネ行動を実施するように説得を試みる。本研究では、説得する際に「自己利益」を重視した説得を行う群と、「環境保全」を重視した説得を行う群の2群を設けた。29年度に作成した説得納得ゲームのルール説明と質問紙の英語版をもとに、共同研究者のGundula Hubnerの協力を得て、5月にドイツ国内の2つの大学で説得納得ゲームを実施した。参加者は116名であった。10月には、Kim-Pong Tamの協力により、香港科技大学において説得納得ゲームを実施し、参加者は65名であった。日本では、410月に国内の3つの大学において説得納得ゲームを実施し、参加者は合計92名であった。分析の結果、ゲーム実施前よりも実施後の方が省エネ行動意図がすべての国において高くなっていた。また、国別の比較では、日本が最も説得への自信、環境コミュニケーションが低かった。しかし一方で、主観的規範のゲーム前後での変化量は日本が最も大きく、説得納得ゲーム実施後の方が他者からの環境配慮行動の期待を高く認識していた。環境保全か自己利益かという実験群による差は、いくつかの変数で国との交互作用が見られ、国によって説得内容の影響が異なることが示唆された。The 5th European Conference on Behaviour and Energy Efficiencyにおいて2017年度に実施したメッセージの効果の比較研究の結果を発表した。国内では日本シミュレーション&ゲーミング学会において説得納得ゲームの予備実験の結果を発表した。今年度は当初の予定通りに、説得納得ゲームの国際比較実験をドイツ、香港、日本の3カ国で実施することができた。次年度は、国際比較実験の本実験を行う。
超高速電子環状反応を基盤とするクリック生体高分子標識化法の開発とその展開

本研究は、申請者らが独自に開発した"高速アザ電子環状反応"による修飾法を用い、生体分子アミノ基選択的な標識化法を新たに開発する。次いでこれを用いて蛍光および放射線標識による生体内イメージングを実施し、新たな生体内現象を明らかにすることを目的としている。これまでに放射性金属配位子DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)を持つ共役エステルアルデヒドプローブを新たにデザインし、リジン残基との超高速電子環状反応に基づいて、微量生体高分子の放射線標識化の開発とPETイメージングへの応用を行った。Stilleカップリングにより効率的に合成したプローブを用いて、1)ペプチドとしてソマトスタチンを、2)タンパク質として、ヒト血清アルブミン(HSA)や糖タンパク質であるオロソムコイドを、さらには3)抗体としてanti-GFP抗体の標識化を行った結果、いずれの場合においても室温・低濃度(10-6M)の条件下、10分以内での標識化に成功した。さらに得られたソマトスタチン標識体に対して放射性金属である68Gaを導入し、ラットやラビットにおけるPETイメージングを達成した。一方、本プローブに対してさらに標的生体分子と相互作用する低分子リガンドをコンジュゲートさせ、標的分子の特定のリジン残基のみの蛍光修飾に成功した。すなわち、HSAとこれと相互作用するリガンドとしてクマリン誘導体を用いて検討したところ、HASに存在する59個のリジン残基のうち、リガンド認識部近傍に存在する1つのリジン残基のみを選択的に蛍光標識化することに成功した。さらに相互作用に用いたクマリン低分子リガンドは、リジン残基修飾の後、環化生成物のピリジニウムイオンへの自然酸化に伴って、中性条件下のもと自動的に修飾分子から加水分解されることを見出した。以上の結果は、生理的条件下のもと蛍光部位のみの標識化が迅速かつ簡便に実現できることを示しており、今後はこれらの結果を基に糖鎖のPETおよび蛍光イメージングを中心に検討する予定である。
新高温構造材料としての金属間化合物

平成4年度より,新しく重点領域研究“新高温構造材料としての金属間化合物"が発足する。本研究の目的は,新重点領域研究における主たる研究項目,金属間化合物の結晶構造の予測と制御,力学的物性,組織制御,耐環境性にかかわる研究方針と研究分担計画の策定,さらに重点領域研究の円滑な発足を目指した予備研究を行うことであった。以下に各研究項目について行った予備研究の内容をまとめる。[1]結晶構造の予測と制御[2]変形と破壊のメカニズム2.1脆性と脆性→延性遷移:PeierlsーNabarroの式にもとづく,脆性→延性遷移温度の推定を試み,いくつかの系について良好な結晶を育成し,脆性→延性遷移温度を実験的に求めた。2.2変形機構:高融点金属のアルミナイド,シリサイドの単結晶を作製し,塑性変形可能な条件のもとで,変形能,変形モ-ド,変形組織,変形応力が,いかに組成,結晶方位,温度,変形速度に依存するかを明らかにするための予備実験を行った。[3]組織設計と制御金属間化合物の場合にも,組織の微細化,多相化が,一般に力学的物性,特に延性・靭性の改善に効果的である。金属間化合物の組織制御の指導原理について検討した。[4]耐環境性4.1高温酸化・高温腐食挙動:高温酸化と高温腐食の機構を明らかにし,耐酸化性,耐腐食性向上のための指導原理について検討した。4.2環境効果:高温酸化性,高温腐食性雰囲気下での金属間化合物の力学的挙動に関していくつかの系について予備実験を行った。
可積分系理論と特異トロピカル曲線の研究

トロピカル曲線の理論と超離散可積分系数学の関係に関して研究を行った。トロピカル曲線とは、区分的に線型な関数を用いて定義される幾何学的対象で、具体的には距離グラフとして実現される。一方、超離散可積分系とは、偏微分方程式に「超離散化」と呼ばれる特殊な極限操作を施して得られる、「区分的に線型な」微分方程式のことである。本課題では、周期境界条件を課した種々の超離散可積分系に対して、トロピカル曲線を用いた初期値問題の解法を構成した。本年度の主な研究成果は以下の2つである。1、非周期的な超離散可積分系の初期値問題の解を、トロピカルKricheber constructionにより構成した。2、(2+1)次元の超離散可積分系を構成し、その初期値問題の解が1と同様の手法で得られることを証明した。1について:離散可積分系のある特殊な極限を取って得られる離散力学系のことを、超離散可積分系という。ある種の超離散可積分系に対しては、離散可積分系の強力な研究手段として知られるKrichever construction (または代数幾何的解法)に類似した方法(トロピカルKrichever construction)で初期値問題が解かれることが知られている。本研究では、非周期的超離散KdV方程式(箱玉系)のソリトン解をトロピカルKrichever constructionにより導いた。この際、「特異トロピカル曲線」の概念が自然に導出された。この特異トロピカル曲線は、いわゆる「トロピカル曲線のsmoothness」とは関係のない概念であるという意外な結果を得た。2について: (2+1)次元の離散KP方程式に対応する超離散系として、「2次元箱玉系」を構成した。過去にも箱玉系の2次元版はいくつかの異なる方法で導かれているが、この2次元箱玉系は、2次元空間を走る浅水波の偏微分方程式の、直接の超離散化となっている点に特徴がある。周期境界条件のもと、1と同様の方法でこの系の初期値問題の解を与えた。本課題では、トロピカル曲線の理論と可積分系数学との関係に関して研究を行った。これまでに知られていた周期格子上の超離散可積分系(周期箱玉系)の初期値問題の構成(Krichever Construction)を、半無限格子系、周期3次元系、のそれぞれに拡張した。半無限格子系の解法の過程において、特異点を持つトロピカル曲線の理論を研究した。周期境界条件を課さない超離散可積分系に対してKrichever Constructionが構成されたことは新しい結果であり、登場するトロピカル曲線は(平面曲線ではなく)空間曲線にまで拡大された。空間曲線上のトロピカル積分の理論が可積分系に応用されたのも、新しい結果である。この成果によって、トロピカル幾何学と可積分系理論の関係がより深く明らかにされると信じる。一方、本研究の範囲においてはユークリッド空間内の特異点つきトロピカル曲線の理論で十分有効であったが、今後はより一般的な特異トロピカル曲線の研究は今後も続ける必要があると考える。それに付随して、近年発展しているトロピカル幾何学の最新の結果を研究していきたい。また、微分体・差分体の拡大の理論とトロピカル数学の関係を、可積分系の理論を通じて考察したいと考えている。半無限格子系を解く際に空間トロピカル曲線が必要となったことは前述したが、それは半無限格子上の戸田方程式に付随する差分体の拡張理論と関係がある。今後は、微分体・差分体の理論の専門家と協力し、研究を進める予定である。特異トロピカル曲線の概念を適切に定義することによって、特異点を持つトロピカル曲線に対応する超離散可積分系を構成した。それは、周期的とは限らない超離散可積分系のソリトン解として実現された。また、同様の手法の高次元化にも成功した。以上の成果を踏まえると、当初研究目的にある「種々の超離散可積分系の初期値問題を解く」という方面の研究は、一定の進展をみたと考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究により、様々な超離散可積分系の解空間の解析は、トロピカルKrichever consatuctionによって成功することがわかってきた。この一連の結果をもって、「個々の超離散可積分系の初期値問題を解く」という方面の研究は一段落したと考える。これからは個々の方程式を研究するのではなく、「可積分性そのもの」とトロピカル幾何との関係の解明に取り掛かりたい。超離散可積分系にトロピカル幾何を応用できた最大の理由として、可積分系のtotal-positivityが挙げられる。これは量子群のstandard basisの理論(特に偏屈層を用いた量子群の幾何学的構成)、クラスター代数のcategorificationの理論などに密接に関係する概念で、同時に「可積分系とは何か」という問題にも深い洞察を与えるものである。一方トロピカル数学とは、考えている系のpositivenessそのものを扱う数学である。

可積分性とトロピカル数学には根源的な関係があると期待する。これらの関係の解明のための第一歩として、以下の2つの研究に取り掛かる:1、超離散可積分系の結晶基底を用いた定式化およびKKR理論と、トロピカルKrichever constructionの間の標準的な対応を見つける。2、Qiiverを用いた量子群、結晶基底の構成と、トロピカル曲線(上の何らかの構造)との間の標準的な対応を見つける。25年度が最終年度であるため、記入しない。
DNA損傷の感知機構と修復機構のリン酸化による切り換えメ力ニズムの解明

放射線や紫外線などにより私たちの細胞の遺伝情報がコードされているゲノムDNAを傷っけられる!傷ついたDNAは子孫細胞へと受け継がれる前に速やかに検出され-正確に修復される!その際にはDNA上の傷を検出するチェックポイント機構と傷を修復する修復機構が協調し合う必要が有ると考えられるが分子レベルでの理解は全くされていなかった!本研究では傷ついたDNAの上でチェックポイント機構が修復機構と入れ替わるための分子機構を明らかにした!放射線や紫外線などにより私たちの細胞の遺伝情報がコードされているゲノムDNAを傷っけられる!傷ついたDNAは子孫細胞へと受け継がれる前に速やかに検出され-正確に修復される!その際にはDNA上の傷を検出するチェックポイント機構と傷を修復する修復機構が協調し合う必要が有ると考えられるが分子レベルでの理解は全くされていなかった!本研究では傷ついたDNAの上でチェックポイント機構が修復機構と入れ替わるための分子機構を明らかにした!真核細胞の染色体DNAは紫外線や放射線、酸化ストレスにより常に損傷をうけている。その損傷は(1)DNAチェックポイント機構により感知して細胞分裂を止めたのちに(2)DNA修復機構により直される。これら二つのタンパク質群はDNA損傷部位において連携することでより効果的にDNA損傷を修復していると予想される。本研究では先にDNA損傷部位へとリクルートされるチェックポイントタンパク質が効率よくDNA損傷部位から取除かれる事が続く損傷修復を円滑に進める上で重要であるとの仮説を立てそれを分子生物学的に検証した。具体的にはチェックポイントタンパク質Rad9のリン酸化に注目し、リン酸化されない変異タンパク質はDNA損傷部位からRad9が解離しない事、また、その変異タンパク質を発現する細胞ではDNA損傷修復が開始するが完了しない事を見出した。これらの結果からRad9がタイミングよくリン酸化を受ける事でDNA損傷部位を検出したチェックポイントタンパク質を取除き、修復酵素が損傷部位の全領域にアクセス出来る様にしているとのモデルをたてた。チェックポイントタンパク質はこれまでDNA修復を円滑に進めることでヒト等ではがんの抑制に働いている事が示唆されていたが、本成果がその基盤機構となるものであり、発がんの機構に迫る事が出来たと考えられる。私達の細胞が持つ染色体DNAは紫外線や放射線、酸化ストレスによる損傷の危険に曝されている。その損傷は(1)DNAチェックポイント機構により感知したのちに(2)DNA修復機構により直される。すなわちDNA損傷の的確な修復には速やかに検出され、正確に修復される必要があり、検出・修復の二つの機構が連携する事が重要であると考えられた。本研究ではこれまでのDNA損傷修復研究の中でも未解明であった、この連携機構の分子基盤を明らかにする事を目的とした。申請者はなかでもチェックポイント機構がDNA損傷を検出した後速やかに解離する事でDNA損傷の修復機構が損傷部位へとアクセスしやすくなっているとの仮説を建てた。初年度はリン酸化修飾がチェックポイントタンパク質Rad9の損傷部位からの解離を促すとのモデルを建て、検証し、論文として報告した。リン酸化は段階的に起こっており、一種のフィードバック制御と考えられる。本年度はRad9のフィードバック制御がDNA損傷ストレスのあとだけではなく、通常の生育時にも重要な役割を持つのではと考え、更なる解析を進めた。クロマチン沈降法を用いる事で、フィードバック制御が起こらない変異Rad9タンパク質は染色体末端領域に強く結合したままである事を示す事が出来た。変異Rad9タンパク質を発現する細胞は生育が遅く染色体分配に異常を示したため、フィードバック制御によりDNA上の様々な活動が協調を受けていると予想された。さらに申請者はフィードバック制御の有無をヒト培養細胞へと発展させる事が重要であると考えた。ヒトRad9タンパク質にも同様のリン酸化部位があり、変異遺伝子を発現する細胞は顕著な生育遅延の表現型を示す事が出来た。これら一連の結果により、申請者が提唱した連携機構がDNA損傷応答時だけでなく常に働く必要のあるリン酸化フィードバック制御である事、また、酵母からヒトまで共通の普遍的制御である事を示唆する結果を得る事が出来、DNA損傷応答研究の重要な課題の一つの分子説明に近づけたと考えている。
半導体単結晶電極の光励起初期過程の解明

半導体による光電極反応や、粉末系の光触媒反応における界面電子移動の素過程はサブピコピコ秒の非常に速い時間領域で進行することが知られており、近年超短パルスレーザーを用いた光励起電子と正孔の反応・再結合初期過程の追跡が行われている。しかしこれまでレーザーシステムの都合上、単一波長励起での測定しか行われていない。本研究では光励起電子と正孔の再結合初期過程をより詳細に検討するため、広範囲で波長変換可能なフェムト秒レーザーシステムを導入し、過渡吸収の励起波長依存性について検討した。昨年度に引き続き試料として、アナタース型とルチル型の結晶構造をそれぞれもつさまざまな酸化チタン粉末および板状酸化チタン試料を用いた。フェムト秒過渡反射吸収分光法は、再生増幅されたモードロック型チタンサファイアレーザーからのパルス光(波長790nm、1kHz)をシードとする2台の波長可変レーザー(パルス幅100fs、波長300nm10μm、1kHz)をポンプ光、プローブ光発生用として用いた。プローブ光波長を620nm、ポンプ光(励起光)を310nmとすると、きわめて速い(ほぼ検出限界)吸収の立ち上がりとその減衰が観測された。いずれの粉末状試料を用いる場合には減衰速度の違いはあるものの挙動はほぼ同じであり、速い二次減衰成分と遅い減衰成分の和で表されることがわかった。多結晶酸化チタン板でも同様であることから、多結晶試料では粉末と同じように微粒子ひとつひとつで光吸収とその減衰が起こると思われる。一方、単結晶試料では素早い吸収の立ち上がりは観測されるものの、測定時間範囲(約200nm)内ではほとんど減衰は見られなかった。これは、全体に占める表面の割合が粉末や多結晶体とくらべて小さいため、結晶の欠陥部位が少なく、励起電子ー正孔の再結合が遅いためと考えられる。
ルーメンメタン発生の低減法開発に関する研究

本研究は,亜硝酸中毒を予防するメタン生成抑制剤、飼料組成物並びにこれを反鯛動物に供与する方法を提供することを目的としている。アルカリゲネス菌は,硝酸を窒素ガスに変換する能力を有することが知られている。そこで本研究では,アルカリゲネス菌単独のメタン抑制効果と,アルカリゲネス菌と硝酸塩の組み合わせによるメタン低減効果と,異化的硝酸塩還元促進による亜硝酸塩蓄積抑制効果を,ルーメンメタン連続発酵測定装置によるin vitro培養試験によって検討した。硝酸塩2mMと土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を同時に投与することによって,in vitroルーメンメタン産生量は,対照区51.0mL,硝酸塩単独投与37.8mLに比較して11.5mLと大きく減少した。このことによる,培養液中揮発性脂肪酸濃度への影響は小さかった。硝酸塩NO_3と土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を培養した後に遠心分離し,その上澄み液を投与することによって,in vitroルーメンメタン産生量は,遠心分離しない懸濁液の8.7mL,遠心分離沈殿物の菌細胞投与7.8mLに比較して35.4mLと多かった。このことによって,菌から何らかの分泌物が精製されてメタンを抑制するわけでは無く,菌体自身がメタン産生量に影響を及ぼしているものと考えられる。土壌菌Alcaligenes faecalisNo.4は,少なくとも9.4 log10cfu/ml以上の濃度で存在しないとメタンの産生量抑制効果がない。二酸化窒素NO_2と土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を投与した場合においても,メタンの産生量抑制効果が観察された。また,二酸化窒素NO_2単独投与よりも土壌菌Alcaligenes faecalis No.4との同時投与の方が抑制効果は高かった。1.安全な天然素材のルーメンメタン抑制剤の新規開発を目的として申請者(高橋)らの研究室で既に開発したルーメンメタン抑制剤のレビューを行い、Animal Science Journalへの投稿準備を進めている。2.プレバイオティクス及びプロビオティクスのIn vitroメタン抑制効果を検討するための培養実験計画書を作成した。新規開発プロバイオティクスとして東京工業大学正田誠名誉教授からアルカリゲネス菌の分与を受け、ルーメン発酵における硝酸塩の異化的還元を応用する新たなルーメンメタン発生低減法を目指す。3.リアルタイムPCR解析のための実験設備の準備畜産草地研究所分子栄養研究チーム三森研究室のアドバイスを参考にして、DNA抽出キット等の準備を開始した。4.試薬類、DGGE関連消耗品類、ガスクロ及び液クロ用カラム及びキャリアガス類の準備を行った(DGGE機器類及びシークエンサはGCOE共通備品として現有)。5.マイクロプレートリーダー用硝酸態窒素及び亜硝酸態窒素測定キットの準備本キットはアルカリゲネス菌による硝酸塩の異化的還元作用を証明する重要な試薬で、硝酸塩の還元によるメタン生成阻害とアルカリゲネス菌による亜硝酸塩蓄積阻害を目論むものである。6.抗菌性物質を生産する乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムの培養増殖を検討し、抗菌性物質が顕著なメタン低減効果を有することを確認した。7.独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所を訪問し、畜産草地研究所分子栄養研究チーム(三森真琴研究員)とルーメンメタン菌解析のためのリアルタイムPCRについて意見交換を行った。1.ルーメンメタン抑制剤の新規開発を目的としてアルカリゲネス菌単独のメタン抑制効果とアルカリゲネス菌と硝酸塩の組み合わせによるメタン低減効果と異化的硝酸塩還元促進による亜硝酸塩蓄積抑制効果をルーメンメタン連続発酵測定装置によるin vitro培養試験によって検討した。その結果、アルカリゲネス菌単独でメタン抑制効果は示されなかったが、アルカリゲネス菌と硝酸塩の組み合わせによって、硝酸塩単独によるメタン抑制効果を増強する効果が認められた。2.ルーメンメタン抑制剤の新規開発を目的として乳酸菌Lactobacillus plantarumの生産する抗菌性物質のメタン抑制効果とをルーメンメタン連続発酵測定装置を用いるin vitro培養試験によって検討した。その結果、Lactobacillus plantarumによる抗菌性物質を安定的に得るためにはシリコ栓を装着した坂口フラスコを用いる高い強度の通期培養が必要であることが判明し、抗菌性物質には過酸化水素のような低分子化合物が関与するものと推察された。3.課題1及び2の分子生物学的研究のために、ルーメンメタン生成菌のリアルタイムPCR解析を開始した。ターゲットはルーメンのメタン菌、一般嫌気性菌、真菌、プロトゾアで、メタン菌及び一般嫌気性菌については取得したプライマーが有効であることを認めた。他のプライマーについても有効性を検討中である。また課題1及び2のin vitro培養試験におけるルーメン発酵性状の解析をガスクロ及びHPLCにより解析し、異状発酵が発生していないことを確認した。4.畜産草地研究所分子栄養研究チーム(三森真琴研究員)と北海道大学農学研究院(小林泰男教授)とルーメンメタ菌解析のためのリアルタイムPCRについて意見交換を行なった。5.課題1及び2の培養試験の結果得られた成果をSAADC2011国際会議(ナコンラチャシマ、タイ)、第8回SKC(日-中-韓ルーメンシンポジウム、札幌)、第115回日本畜産学会(名古屋)で発表し、これらを論文に纏めて国際誌投稿の準備を進めている。

そこで本研究では,アルカリゲネス菌単独のメタン抑制効果と,アルカリゲネス菌と硝酸塩の組み合わせによるメタン低減効果と,異化的硝酸塩還元促進による亜硝酸塩蓄積抑制効果を,ルーメンメタン連続発酵測定装置によるin vitro培養試験によって検討した。硝酸塩2mMと土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を同時に投与することによって,in vitroルーメンメタン産生量は,対照区51.0mL,硝酸塩単独投与37.8mLに比較して11.5mLと大きく減少した。このことによる,培養液中揮発性脂肪酸濃度への影響は小さかった。硝酸塩NO_3と土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を培養した後に遠心分離し,その上澄み液を投与することによって,in vitroルーメンメタン産生量は,遠心分離しない懸濁液の8.7mL,遠心分離沈殿物の菌細胞投与7.8mLに比較して35.4mLと多かった。このことによって,菌から何らかの分泌物が精製されてメタンを抑制するわけでは無く,菌体自身がメタン産生量に影響を及ぼしているものと考えられる。土壌菌Alcaligenes faecalisNo.4は,少なくとも9.4 log10cfu/ml以上の濃度で存在しないとメタンの産生量抑制効果がない。二酸化窒素NO_2と土壌菌Alcaligenes faecalis No.4を投与した場合においても,メタンの産生量抑制効果が観察された。また,二酸化窒素NO_2単独投与よりも土壌菌Alcaligenes faecalis No.4との同時投与の方が抑制効果は高かった。当初の目的としたルーメンメタン抑制剤の開発について新規抑制剤の発見につながる研究成果が得られた。研究期間中にそのメカニズムについての分子生物学的研究アプローチとしてリアルタイムPCRによる解析を行う予定である。ルーメンメタン抑制剤及び方法について安全なプロバイオティクスを用いる開発を行い、乳酸菌Lactobacillusplantarum及びAlcaligenes faecalis+硝酸塩による効果的抑制法を開発した。これらの培養試験結果のメカニズム解明のため、メタン生成菌をはじめ、関連する真正細菌のエコシステムを明らかにする必要がある、このため、培養液についてのリアルタイムPCRによる解析は重要な要素と考えられ、現在、ターゲットとする微生物のプライマーの選定と有効性の検証が確定した。本プライマーはとくにメタン菌の挙動の解析に有力な手法と考えられる。
感作肥満細胞の抗原へ向かう遊走に関する研究

マウス肥満細胞株MC/9およびマウス骨髄由来培養肥満細胞BMMCを用いて肥満細胞の抗原へ向かう遊走能を検討した。細胞をAnti-DNP IgEで受動感作し、Boyden Chamberを用いて3ミクロンの孔を有するポリカーボネート膜を通過して、抗原(DNP-HSA)側に遊走した細胞数をカウントした。Anti-DNP IgEで感作されたマウス肥満細胞は抗原へ向かって遊走し、感作されていない肥満細胞は遊走しなかった。至適濃度の抗原(10ng/ml)へ向かう遊走の程度はマウス肥満細胞の最も強力な遊走因子であるStemcell factorによる遊走の程度よりもはるかに大きかった。IgEのクロスリンクによって刺激した細胞の培養上清には遊走を惹起する活性はなく、抗原が直接遊走を惹起しているものと予想された。次にMC/9を用いて細胞遊走に関与する細胞内シグナル伝達因子について検討したところRhoキナーゼ阻害薬Y-27632およびp38MAPキナーゼ阻害薬SB203580はMC/9の遊走を抑制した。PI3キナーゼ阻害薬WortmanninはMC/9の抗原刺激によるp38MAPキナーゼの活性化を部分的ではあるが、有意に抑制し、その下流のMAPKAPキナーゼ2の活性化も部分的に抑制したが、MC/9の遊走を抑制しなかった。一方、SB203580は遊走を抑制する濃度で、MAPKAPキナーゼ2の活性化を完全に遮断したことより、細胞遊走にはp38MAPキナーゼの活性化は必要であるが、ある程度活性化が惹起されれば、十分であると考えられた。また、Y-27632はMC/9のMAPKAPキナーゼ2の活性化に影響を及ぼさなかったことより、肥満細胞の抗原へ向かう遊走においては、Rho、Rhoキナーゼ活性化によるMyosin phosphatase抑制を介したミオシン軽鎖リン酸化の亢進とp38MAPキナーゼ、MAPKAPキナーゼ2の活性化によるHeat shock protein 25/27のリン酸化を介したアクチンの重合との2つの経路が重要であることが示唆された。また、MC/9において抗原やSCF刺激により、Protein kinaseD (PKD)が活性化され、PKD阻害作用を併せもつProtein kinase C (PKC)阻害薬は細胞遊走を阻害するが、他のPKC阻害薬は細胞遊走に影響しないことより、肥満細胞の遊走におけるPKDの関与が予想される。肥満細胞はIgE Fcレセプター(FcεRI)を有し,FcεRIに結合したIgEが多価抗原と結合することによって,FcεRIが凝集し,即時型アレルギー反応が惹起される.この際,組織に固着した肥満細胞表面のIgEと拡散で広がった抗原とが偶然出会い,結合するかのように理解されてきた.私達は細胞表面に抗原特異的IgEを有する感作肥満細胞は至適抗原濃度の部位へ向かって遊走する性質があるという結果を得た.マウス肥満細胞株MC/9を用いた検討では肥満細胞をFcεRIを介して抗原刺激した細胞上清には遊走活性はない.肥満細胞がFcεRIを介して刺激されると各種Small GTP結合蛋白の活性化とその標的蛋白の活性化が起きる.Rhoの標的蛋白であるRho-kinaseの阻害薬Y-27632は肥満細胞の遊走を抑制する.また,肥満細胞は抗原刺激を受けるとMAP kinase familyに属するERK,p38 MAP kinase,JNKのいずれもが活性化されるが,ERK活性化経路を抑制するMEK1阻害薬PD98059は肥満細胞の遊走を抑制しない.一方,p38 MAP kinase阻害薬SB203580は肥満細胞の抗原へ向かう遊走を有意に抑制する.PI3-kinase阻害薬WortmanninはFcεRIを介するp38 MAP kinase活性化を部分的ではあるが抑制し,JNKの活性化をほぼ完全に抑制するが,肥満細胞の遊走を抑制しない.WortmaninnとSB203580の遊走抑制効果の相違を検討するために,p38 MAP kinaseの活性化に続くMAPKAPkinase 2の活性化を測定すると,SB203580はMAPKAPkinase 2の活性化をほぼ完全に抑制するが,Wortmanninは部分的に抑制するのみであり,遊走を抑制するためにはMAPKAP kinase 2の活性化を完全に遮断する必要があると思われる.マウス肥満細胞株MC/9およびマウス骨髄由来培養肥満細胞BMMCを用いて肥満細胞の抗原へ向かう遊走能を検討した。

次にMC/9を用いて細胞遊走に関与する細胞内シグナル伝達因子について検討したところRhoキナーゼ阻害薬Y-27632およびp38MAPキナーゼ阻害薬SB203580はMC/9の遊走を抑制した。PI3キナーゼ阻害薬WortmanninはMC/9の抗原刺激によるp38MAPキナーゼの活性化を部分的ではあるが、有意に抑制し、その下流のMAPKAPキナーゼ2の活性化も部分的に抑制したが、MC/9の遊走を抑制しなかった。一方、SB203580は遊走を抑制する濃度で、MAPKAPキナーゼ2の活性化を完全に遮断したことより、細胞遊走にはp38MAPキナーゼの活性化は必要であるが、ある程度活性化が惹起されれば、十分であると考えられた。また、Y-27632はMC/9のMAPKAPキナーゼ2の活性化に影響を及ぼさなかったことより、肥満細胞の抗原へ向かう遊走においては、Rho、Rhoキナーゼ活性化によるMyosin phosphatase抑制を介したミオシン軽鎖リン酸化の亢進とp38MAPキナーゼ、MAPKAPキナーゼ2の活性化によるHeat shock protein 25/27のリン酸化を介したアクチンの重合との2つの経路が重要であることが示唆された。また、MC/9において抗原やSCF刺激により、Protein kinaseD (PKD)が活性化され、PKD阻害作用を併せもつProtein kinase C (PKC)阻害薬は細胞遊走を阻害するが、他のPKC阻害薬は細胞遊走に影響しないことより、肥満細胞の遊走におけるPKDの関与が予想される。マウス肥満一細胞株MC/9およびマウス骨髄由来培養肥満細胞BMMCを用いて肥満細胞の抗原へ向かう遊走能を検討した。細胞をAnti-DNP IgEで受動感作し、Boyden Chamberを用いて3ミクロンの孔を有するポリカーボネート膜を通過して、抗原(DNP-HSA)側に遊走した細胞数をカウントした。Anti-DNP IgEで感作されたマウス肥満細胞は抗原へ向かって遊走し、感作されていない肥満細胞は遊走しなかった。至適濃度の抗原(10ng/ml)へ向かう遊走の程度はマウス肥満細胞の最も強力な遊走因子であるStemcell factorによる遊走の程度よりもはるかに大きかった。この遊走がIgEとIgEレセプターを介していることを確認するために過剰なMonovalentハプテン(DNP-lysine)で細胞を前処理して、多価抗原によるIgEのクロスリンクを阻害しておくと、遊走も抑制された。さらに、IgEのクロスリンクによって刺激した細胞の培養上清には遊走を惹起する活性はなく、細胞をの高濃度のアクチノマイシンDで処理しても遊走は抑制されなかったことより、抗原が直接遊走を惹起しているものと予想された。
高温酸化物超伝導体と金属の常温接合

表面活性化による常温接合は,超高真空中で金属表面をイオン衝撃により清浄化し活性化することによって,低エネルギ-で金属ー異種材料の接合を実現する手法である。本研究ではこの手法を高温酸化物超伝導体,特にYBa_2Cu_3O_<7ーX>焼結体と多結晶Alの接合に適用した。焼結体の表面は焼結のままの状態でかなりラフであるにも関わらず,かなりの強固の接合が得られた。界面抵抗は77Kで39×10^<ー9>Ωm^2であった。77Kから92Kの間,抵抗の温度係数は正で金属的であるが,抵抗値は電流にも依存し接合は完全なオ-ミックではない。電流値が大きい場合ジュ-ル熱による界面抵抗の増加も予想されるが,今回そのような影響はないことを確かめた。また電圧特性は極性に依存しない。本手法による接合は従来の蒸着法によるAl,Inなどの活性金属とYBCOの接合よりも3桁以上抵抗値が小さく,またわずかながら非オ-ミック特性を示すものの,接合は金属的で,従来の手法で報告されている半導体的な界面特性ではないという点でユニ-クな結果となっている。Alなどの酸素との親和性の大きい活性金属は一般に酸化物系超伝導体と反応しやすいと言われているが,今回の結果は必ずしもそれに従わない。その理由は現在のところ定かではないが,接合前のイオン衝撃によってAl表面には酸素を固溶した数nm厚のダメ-ジ層が形成され,これを介して接合しているための影響とも考えられる。
培養細胞の放射線致死および潜在致死回復におよぼすプロスタグランジンの影響

正常ヒト繊維芽細胞(以下NHF)の放射線照射後の致死および潜在致死回復(Potentially Lethae Damage Repain;以下PLDR)に対する各種プロスタグランジン(以下PG)およびPG生合阻害剤の影響を調べた。また、中性子照射のマウス骨肉腫(OFSa)に対する腫瘍縮小効果にPG生合成阻害剤がどのような影響を与えているかについても調べた。1.NHF細胞の放射線致死およびPLDRに対するPGおよびPG生合成阻害剤の効果NHF細胞をプラト一期まで培養し、放射線照射後この培養液に一時保持しておくと細胞生存率が上昇する(PLDR)。NHF細胞の致死およびこのPLDRは各種PGにそれぞれ異なる反応を示すことがわかった。PGE_1は致死に対しては防護剤として働くが、PLDRに対しては致死に対して防護剤として働いた分を差し引くと、何ら効果を示さなかった。PGE_2は両者に対して効果がなかった。また、PGD_2はそれ自身殺細胞効果を示すが、許容できる濃度ではPLDRを約50%抑制した。しかし、PGD_2濃度を下げていくとそのPLDR抑制効果も減少し、10mug/wlでは抑制効果はほとんど観察されなかった。PGA_1およびPGA_2は同じような作用をました。すなわち、非照射細胞を50mug/wl PGA_1またはPGA_2で処理すると多くの細胞は死に致る。PG濃度を10mug/wlに下げると、致死作用はまだ残っているが、PLDRを大巾に抑制した。2.インドメタシンによる中性子腫瘍縮小効果の修飾シンドメタシンに(35umg/wl)を飲料水としてマウスに10日間与え、中性子照射を行うと、中性子単独照射と比較して腫瘍縮小効果が大きくなった。インドメタシン単独では腫瘍抑制効果を示さないのでPG生合成阻害による増感効果があったと考えられるが、これが真に腫瘍内またはその他の器官、組識でのPG合成が抑制されたためかは今後の課題である。〔はじめに〕プロスタグランジン(PG)は膜リン脂質の多価不飽和脂肪酸を前駆体とし,生体の各所で産生され,生理的,薬理的作用などを有している。PGは放射線などによるラジカルによっても,その産生が促進されることや,その処理により,細胞内cAMPやGSHの量が変化することなどから,細胞,組織,個体の放射線感受性に何らかの影響を与えている。今年度は,PGE_1,PGE_2,PGD_2のヒト繊維芽細胞のPLD回復に及ぼす影響を調べた。〔材料と方法」ヒト繊細芽細胞をプラトー期までαMEMで培養し,照射1時間前に50μg/mlのPGを培養液に加えた。対照はPGの溶媒であるエタノールである(最終濃度0.5%)。PLD回復の発現は"3-day-old medium"で,5Gy照射後8時間,37°Cのインキュベーションで行った。〔結果と考察〕PGE_1は放射線防護剤として働き,照射後0時間,8時間にプレートした細胞生存率は対照に比べ,共に約3倍上昇したが,PLDR比は対照で,11.0PGE_1添加で10.4と有意の差がなかった。従って,PGE_1はPLDRには何ら影響を与えていないことになる。PGE_2は放射線感受性にも,またPLDR比が12.2と対照と有意差がなかっことから,PLDRにも影響を与えていない。

PGD_2添加では,照射後0時間で細胞をプレートした生存率は,対照との差がなかったが,8時間後プレートした生存率は対照の約半分になり(PLDR比=5.6),PLDRが完全ではないが,抑制された。これらのPGは照射時のみに存在しても,対照との差が認められなかったので,PGがラジカルの除去や生成に関与している可能性は低い。PGD_2によるPLDR抑制に関しては,PGD_2は細胞内でDNAポリメラーゼαおよびβを阻害することが知られているので,PLDの回復過程を抑制している可能性がある。〔はじめに〕プロスタグランジン(PG)は膜リン脂質の多価不飽和脂肪酸を前駆体とし、生体の各所で産生され、生理的、薬理的作用などを有している。PGは放射線などによるラジカルによっても、その産生が促進されることや、その処理により、細胞内cAMPやGSHの量が変化することなどから、細胞、組織、個体の放射線感受性に何んらかの影響を与えている。昨年度まではPGE_1、PGD_2のヒト繊維芽細胞のPLD回復におよぼす影響を調べた。今年度はさらに、PGA_1、PGA_2についても調べると共に、PG合成阻害剤であるインドメタシンの腫瘍細胞に及ぼす影響も調べた。〔材料と方法〕ヒト繊維芽細胞をプラト-期までαMEMで培養し、照射1時間前に培養液に加えた。X線5Gy照射後、コロニ-法により、致死および潜在致死回復を求めた。インドメタシンの影響はマウス固形腫瘍(OFSa)を用いた。35Mg/mlインドメタシンを飲料水として、1012日間連続投与し、中性子812Gy照射して、TCD_<50>を求めた。〔結果と考察〕PGA_1、PGA_2の放射線致死および潜在致死回復におよぼす影響はPGD_2、PGE_1、PGE_2の様相とは異なっていた。すなわち、PGA_1、PGA_2、PGD_2と同様、放射線と併用しなくとも細胞致死効果はあるが、PGD_2のそれよりも、同一濃度では大きかった。PGのみでは影響のない濃度で放射線致死を比較すると、PGA_1、PGA_2共に併用効果を示した。しかし、この濃度での潜在致死回復への影響はいずれも抑制する傾向にあるが、有意差は見られなかった。次に、インドメタシンのマウス腫瘍に及ぼす影響を調べた。今回使用したインドメタシン濃度(35μg/ml)ではOFSaの増殖を遅延させた。またこの濃度におけるOFSaの中性子によるTCD_<50>からのDMFは約1.1であった。今後、X線によるDMFを求める必要がある。またいずれの場合も薬剤の投与量に改善の余地がある。正常ヒト繊維芽細胞(以下NHF)の放射線照射後の致死および潜在致死回復(Potentially Lethal Damage Repain;以下PLDR)に対する各種プロスタグランジン(以下PG)およびPG生合成阻害剤の影響を調べた。また、中性子照射のマウス骨肉腫(OFSa)に対する腫瘍縮小効果にPG生合成阻害剤がどのような影響を与えているかについても調べた。1.NHF細胞の放射線致死およびPLDRに対するPGおよびPG生合成阻害剤の効果NHF細胞をプラト-期まで培養し、放射線照射後この培養液に一時保持しておくと細胞生存率が上昇する(PLDR)。NHF細胞の致死およびこのPLDRは各種PGにそれぞれ異なる反応を示すことがわかった。
細胞死抑制強化蛋白質の細胞内導入による新たな内耳保護治療法の開発

プラチナ製剤であるシスプラチンは頭頚部癌治療に広く用いられている有効な抗癌剤である。一方で、内耳障害、骨髄抑制、腎機能障害などの副作用を来たす事も知られている。特に内耳障害は抗癌剤投与中止の一因となっている。われわれはシスプラチンによる内耳障害にフリーラジカルを産生する誘導型一酸化窒素合成酵素が関与していることを既に示した。さらに、この内耳障害は最終的に細胞死をもたらすことも明らかになって来た。今回の研究の目的は細胞死抑制による内耳障害軽減であり、以下の点が明らかになった。2.シスプラチン単独(17mg/kg)投与群では投与後7日で聴性脳幹反応検査において聴覚閾値の上昇を認めた。また、BUNおよびクレアチニンの上昇を認めた。3.シスプラチンおよびPTD-FNK投与群では聴覚閾値の変化を認めなった。生存率もシスプラチン単独投与群に比べ有意に改善した。また、BUNおよびクレアチニンの上昇も抑制された。4.担癌マウスを用いた実験ではシスプラチン投与により腫瘍の増大率が抑制された。シスプラチンおよびPTD-FNK投与群でも腫瘍の増大率は抑制され、PTD-FNK投与がシスプラチンの抗癌作用を抑制しなかった。これらの結果より、PTD-FNKはシスプラチンの抗癌作用を抑制することなく、内耳障害および腎機能障害を効果的に軽減することが示された。抗癌剤投与は癌治療において重要な役割を果たしており、今回の実験結果は臨床的にも広く応用ができ、化学療法に大きな貢献をするものと考えられる。【1.方法】C57/BL6オス、4週齢のマウスを用いて実験を行った。シスプラチン投与群、シスプラチン+細胞死抑制強化蛋白質(FNK)投与群、FNK単独投与群およびVehicle投与群に分けて実験を行った。シスプラチンは17mg/kgを1回投与、FNKは5mg/kgをシスプラチン投与3時間前、1日および2日後に投与した。聴力は聴性脳幹反応検査を用い、投与前および7日後に測定した。【2.結果】(1)生存率シスプラチン単独投与群では7日目20%であったのに対し、シスプラチン+FNK投与群では60%であった。(2)聴力閾値の変化シスプラチン単独投与群では28±2.5dBSPLが7日後には37±7.6dBSPLと有意な閾値上昇を認めた(paired-t,p<0.0099)。これに対し、シスプラチン+FNK投与群では25±0.0dBSPLから25±0.0dBSPLと変化を認めなかった。(3)FNKの抗癌作用に与える影響A549担癌マウスを用いてシスプラチン投与後の腫瘍体積増加率を測定した。対照群では腫瘍の増大を認めた。しかし、シスプラチン投与群およびシスプラチン+FNK投与群では腫瘍の増大が抑制され、シスプラチン投与群とシスプラチン+FNK投与群の間に差は認められなかった。【3.考察】以上の実験結果よりFNKはシスプラチンの内耳障害を軽減すると同時にシスプラチン自体の抗癌作用を低下させないと推測された。

今回の研究の目的は細胞死抑制による内耳障害軽減であり、以下の点が明らかになった。2.シスプラチン単独(17mg/kg)投与群では投与後7日で聴性脳幹反応検査において聴覚閾値の上昇を認めた。また、BUNおよびクレアチニンの上昇を認めた。3.シスプラチンおよびPTD-FNK投与群では聴覚閾値の変化を認めなった。生存率もシスプラチン単独投与群に比べ有意に改善した。また、BUNおよびクレアチニンの上昇も抑制された。4.担癌マウスを用いた実験ではシスプラチン投与により腫瘍の増大率が抑制された。シスプラチンおよびPTD-FNK投与群でも腫瘍の増大率は抑制され、PTD-FNK投与がシスプラチンの抗癌作用を抑制しなかった。これらの結果より、PTD-FNKはシスプラチンの抗癌作用を抑制することなく、内耳障害および腎機能障害を効果的に軽減することが示された。抗癌剤投与は癌治療において重要な役割を果たしており、今回の実験結果は臨床的にも広く応用ができ、化学療法に大きな貢献をするものと考えられる。
単純ヘルペスウイルスの増殖を制御する宿主因子の同定とその役割の解明

単純ヘルペスウイルス(HSV)感染後の宿主遺伝子発現の変動について、マイクロアレイ法を用いて網羅的に解析し、感染によって発現量が著しく増大する多数の宿主遺伝子を新たに同定した。その中の一つ、zincfinger transcription factor insulinoma-associated 1(NSM1)は早期胚の神経系発生に必須であることが知られており、そのmRNAレベルはHSV感染によって400倍以上増加した。そこでINSM1に着目し、HSV感染における動態、役割について検討した。その結果、INSM1はHSVの増殖制御に重要な役割を果たす前初期遺伝子産物ICP0のプロモーター領域に結合し、ウイルス増殖に対し促進的に作用していることが明らかになった。ICP0は潜伏感染からの再活性化に重要な役割を担っていることが明らかになっており、この過程における宿主因子INSM1の関与の有無は今後の検討すべき課題といえる。Tankyrase1は細胞質を中心にテロメアや中心体などにも広く分布する蛋白質で、poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)活性をもつ。本研究ではHSV感染におけるtankyrase1の動態と役割についても検討した。その結果、HSV感染によってtankyrase1がリン酸化修飾を受けること、その反応にextracellular signa-related kinase(ERK)が関与していること、感染によってtankyrase1の局在性が著しく変化し核内のreplication compartment内にリクルートされることが判明した。また、ICP0とtankyrase1は相互作用し、核内で共局在することが明らかになった。さらに、tankyrase1及びtankyrase2の発現を抑制した細胞や、PARP活性阻害剤XAV939を用いた実験から、効率的なHSV増殖にはtankyrase1が必要であることが示された。以上の観察は、HSV増殖において、宿主因子tankyrase1がICP0、ERK依存的に重要な役割を果たしていることを示唆するものである。宿主遺伝子発現におよぼすHSV感染の影響についてマイクロアレイを用いて網羅的解析を行った。その結果、発現量の増加する宿主遺伝子が予想以上に多数存在することがわかり、その一つとしてinsulinoma-associated 1(INSM1)に着目した。INSM1は5つのzincfinger motifをもつ転写因子で、早期胚の神経発生に重要な働きをしている。RT-PCRの結果、ヒトケラチノサイトなど様々な感染細胞においてmRNA量の顕著な増加が確認された。INSM1 promoterを用いたリポーターアッセイでは、感染後経時的に活性が著しく上昇した。INSM1発現系では、感染によりreplication compartment様に局在性が変化した。HSVゲノム内で検索したところ、ICP0プロモーター領域にINSM1結合配列が認められた。ICP0プロモーターを用いたレポーターアッセイではVP16の存在下でINSM1は促進的に作用した。さらにChIPアッセイでICP0 promoter領域へのINSM1の結合が確認された。HSV感染におけるTankyrase 1の動態と役割について検討した。内在性Tankyrase1は殆ど細胞質に存在するが、感染により核内にリクルートされることがわかった。感染初期にTankyrase 1はICP0蛋白質と共局在し、その後replication compartment内に認められた。ウイルスのDNA合成はTankyrase 1の修飾とHEp-2細胞内のrelocalizationに必要ではないことがわかった。XAV939を用いてTankyraseの活性を抑制すると、HSVの増殖も有意に抑えられた。