hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
変異酵母を利用するダイズタンパク質の分泌生産システムの構築と食品利用化

ダイズタンパク質を酵母で発現させると液胞へと運ばれると考えられている。そこで、植物及び酵母における液胞へのソーティング機構を解析するとともに、その機構に変異を持つ酵母を利用することによってダイズタンパク質の分泌生産システムを構築することを目的として研究をおこない、以下の成果を得た。1.種子におけるダイズタンパク質の液胞輸送シグナルの解析:コングリシンα'サブユニットに関して液胞輸送シグナルの存在領域の解析をアラビドプシス種子において行った。その結果、シグナルはα'サブユニットのコア領域のC末端部10残基までに存在することを見い出した。2.分裂酵母における液胞輸送機構:分裂酵母のカルボキシペプチダーゼYの出芽酵母における挙動を解析した結果、出芽酵母と同じ分裂経路により液胞へ輸送されることが判明した。3.酵母におけるダイズタンパク質の発現挙動:VPS10、VPS34などの液胞輸送機構に変異を持つ種々の出芽酵母および分裂酵母でのグリシニンA1aB1bサブユニットの発現挙動を調べたが、分泌されず菌体内に存在した。そこで、A1aB1bサブユニットのC末端に蛍光タンパク質であるGFPを融合させた分裂酵母で発現させたところ、その主な存在部位は液胞やゴルジ体ではなく、小胞体が肥大した領域であることを見い出した。また、グリシニン-GFPとコングリシニンRFPを共発現させると、両タンパク質がほぼ同じ部位に存在することが判明した。すなわち、両タンパク質の輸送機構は同一である。4.Pichia Pastorisにおける発現挙動:分泌効率が高いことが知られているPichia pastorisにおけるグリシニンの発現挙動を解析した。その結果、シグナルペプチドとしてαファクターのものを用いると効率よく分泌されることを見い出した。以上のように、ダイズタンパク質を酵母で分泌生産する基盤を確立できた。しかし、食品利用化に関しては検討できなかったので、今後行いたい。低温脱脂ダイズは、残油脂中の不飽和脂肪酸の酸化による品質劣化の問題がある。ところが、ダイズタンパク質はヒト血清コレステロール値低下機能を持っており、高齢化が深刻な問題となっている現在、品質劣化の心配のないダイズタンパク質を開発する技術の開発が望まれている。酵母でダイズタンパク質を発現させると液胞へと運ばれる。そこで、液胞へのソーティング機構に変異を持つ酵母を利用して、ダイズタンパク質〈グリシニン)の分泌生産システムの構築を計画した。1)構造解析:グリシニンは酵母液胞タンパク質と同じ機構で液胞へと運ばれると考えられる。そこで、代表的な液胞タンパク質であり、液胞へのターゲティングシグナル(TG)の同定されているCPYのプレ型(TGを持つ)のTG構造をグリシニンの高次構造と比較することによってグリシニンのTGを同定することを目的とした。プレCPYおよびプログリシニンA3B4の大腸菌生産、結晶化と構造解析を試みた。その結果、プログリシニンA3B4については高次構造を解明することに成功した(この時、購入したワークステーションを利用した)。プレCPYは可溶性の状態で発現させることができなかったが、可溶化に成功し、結晶化を試みている。2)酵母におけるグリシニンの発現挙動解析:代表者はPH05プロモーターを利用して、プログリシニンの酵母発現系を構築していた。より高い発現レベルを得るために、近年良く用いられているGallプロモーター、ADHプロモーターによる発現を、種々の液胞輸送変異株のとられている酵母SEY6210において試みた。しかし、非常に低い発現しか得られず、現在、変異酵母におけるPHO5による発現を試みている。

一方、酵母における局在性を容易に解析するために蛍光発光タンパク質であるGFPとの融合タンパク質を発現させたところ、構造形成の阻害のため本来の挙動とは異なることが判明した。低温脱脂ダイズは、残油脂中の不飽和脂肪酸の酸化による品質劣化の問題がある。ところがダイズタンパク質はヒト血清コレステロール値低下機能を持っており、高齢化が深刻な問題となっている現在、品質劣化の心配のないダイズタンパク質を開発する技術の開発が望まれている。酵母でダイズタンパク質を発現させると液胞へと運ばれる。そこで、液胞へのソーティング機構を解析するとともに、その機構に変異を持つ酵母を利用することによって、ダイズタンパク質の分泌生産システムの構築を進めている。1)ダイズタンパク質の液胞ソーティングシグナルの解析:ダイズグリシニンの全域(476残基)、N末端側330残基、N末端側170残基と緑色蛍光タンパク質(GFP)との融合タンパク質を作出し、これらの分裂酵母における局在性を解析した。その結果、N末端から170残基と330残基の間に液胞への局在が変更する領域があることが判明した。また、植物と酵母でシグナルに違いがあるのかどうかを解析するための遺伝子コンストラクトを構築し、アラビドプシスに導入した。現在、形質転換体が得られつつある。一方、グリシニンと同様の構造的特徴を持つコア領域に加えて、そのN末端側にプロ領域とエクステンション領域を持つコングリシニンのα'サブユニットに関して、ソーティングシグナルの存在領域をアラビドプシスを用いて免疫電子顕微鏡で解析した。その結果、ソーティングシグナルは、コア領域に存在することが判明した。したがって、グリシニンとコングリシニンのソーティングシグナルは類似している可能性がある。2)酵母におけるダイズタンパク質の分泌発現:液胞輸送機構に変異を持つ酵母におけるグリシニンの発現挙動を解析したが、これまでのところ分泌を行う変異酵母は見つかってはいない。さらに解析を進めていく。これを回避するために、酵母での分泌生産システムを構築することが望まれる。しかし、ダイズタンパク質を酵母で発現させると液胞へと運ばれると考えられている。そこで、液胞へのソーティング機構を解析するとともに、その機構に変異を持つ酵母を利用することによってダイズタンパク質の分泌生産システムを構築することを目的とした。1.種子におけるダイズタンパク質の液胞輸送機構の解析:コングリシニンα′サブユニットの液胞ソーティングシグナルの存在領域を形質転換アラビドプシスの種子で免疫電子顕微鏡によって解析した結果、ソーティングシグナルは、α′サブユニットのコア領域のうち、C末端6残基以外に存在することが解った。現在、さらに詳細に解析している。グリシニンに関しては、アラビドプシスに内在する同種タンパク質のために解析が不能であった。現在、グリシニンの解析システムの構築を進めている。
プラスチックの知能化リサイクルを目指したハイブリット分解システムの開発

現在、狙った分子量になるように高分子鎖を切断、含有している有害な添加剤のみ選択的分解するといった新規リサイクル(知能化リサイクル)技術の開発を行っている。また、知能化リサイクルを水中で行うことができるようにするために、ポリマー型光触媒の開発を行っている。具体的には、1)新規光・熱触媒システムを用いたポリウレタンのリサイクル化2)ヒンダードアミン系光安定剤(HALS)を用いたポリスチレン(PS)内部ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)難燃剤の選択的分解とPS部のリサイクル3)ナノTiO2粒子含有スチレン系ブロック共重合体の光触媒作用に関する研究を行った。1)に関しては、水性ポリウレタン(WBPU)を使い光触媒としてTiO2を劣化制御およびドーマント種化用にHALSを用い、ソフトセグメント部であるポリオキシテトラメチレングリコール(PTMG)鎖を選択的に切断および切断末端のドーマント種化に成功した。これによりWBPUの知能化リサイクル技術の開発に成功した。2)に関しては、同様にTiO2とHALSを組み合わせ、光および熱によってラジカルを制御することでPS内部のHBCDを選択的に分解させることでPS部の選択的なリサイクルに成功した。3)に関しては、リビングアニオン重合によって合成したポリスチレン-block-ポリアクリル酸tert-ブチル(PS-b-PtBA)を加水分解することで、ナノ鋳型であるPS-b-PAAを得た。このPS-b-PAAを用いてTiO2ゲルおよび銅フタロシアニン(CuPC)を加えることで、可視光応答性を持つポリマー型光触媒PS-b-PAA/TiO2/CuPcの合成に成功した。以上の成果について論文2報ならびに学会発表4件の形で研究実績として公表をおこなった。TiO2とHALSを組み合せた光・熱触媒システムを用いたWBPUの知能化リサイクル化を計画に従って行った。紫外光照射、その後の熱処理によりPTMG鎖の選択的に切断および切断末端のドーマント種化に成功した。この成果については、論文1報ならびに学会発表2件(内1件招待講演)の形で公表した。昨年度は知能化リサイクルのターゲットの1つであるPS中に添加されたHBCDの選択的分解を行い成功した。今年度は回収したPS部のリサイクル化を検討し、添加するHALSの種類の最適化を試みた。その結果、従来使っていたN-H型よりもN-OR型のHALSの方がPS部の変質を抑えるという点で優れていることが分かった。この成果については、論文1報(投稿中)ならびに学会発表1件の形で公表した。本年度はマイクロプラスチックの回収・知能化リサイクル化を目的として、可視光応答性を持つポリマー型光触媒PS-b-PAA/TiO2/CuPcの開発・合成を行った。その結果、水中・可視光照射下でも光触媒活性を発現させることに成功した。この成果については、論文1報ならびに学会発表1件の形で公表した。以上の理由により、おおむね順調に進展しているとした。平成31年度に計画していた水性ポリウレタン(WBPU)のオリゴマー体経由によるケミカルリサイクルの開発に関しては前述の通り、前倒しで平成30年度に行い成功した。そこで、平成31年度は計画にはないが、WBPUの知能化リサイクル化で得た末端にドーマント種(TEMPO)を持つPTMGがポリプロピレンのβ晶生成用の核剤になることを予備実験で見出したので、この核剤として作用機構の詳細を明らかにして新規アップグレードリサイクル法としての確立を検討する。また開発に成功したポリマー型光触媒PS-b-PAA/TiO2/CuPcに関して、水中下でのマイクロプラスチックの表面洗浄用触媒としての能力を検討する。これは現在問題になっているマイクロプラスチックに関して、リサイクルによる解決法の開発に必要な技術の一つである。この検討の成功は知能化リサイクル法のさらなる発展に寄与すると期待している。我々は現在、狙った分子量になるように高分子鎖切断の制御が可能、含有している有害な添加剤のみ選択的に分解するという今までにはない新規リサイクル(知能化リサイクル)技術の開発を行っている。今年度は知能化リサイクルのターゲットの1つであるポリスチレン(PS)中に添加されたヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)難燃剤の選択的分解を行った。HBCDは難分解性有機物の一種であるため、現存しているHBCD含有PSはそのままでは、リサイクルできない。我々は、光触媒である二酸化チタンとポリエチレンオキシド(PEO)ならびにヒンダードアミン系光安定剤(HALS)を組み合わせた新規な光・熱触媒システムを開発し、PS中に存在したままでのHBCDの選択的を試みた。HALSに光を照射させることでニトロキシラジカル(TEMPO)が生成する。このニトロキシラジカルがラジカル種(R・)をトラップしドーマント種になることで高分子材料の劣化を抑制する。しかしながら、熱を与えるとドーマント種からR・とTEMPOが再び生成する。このとき、与える熱の温度と時間を調整することで、これらラジカル量をコントロールすることが可能である。HALSを加えることでPSの架橋を抑えることはもちろん、ラジカル種の生成量を調整でき、PS中のHBCDだけを選択的に分解できると考えた。結果として、照射した可視光の時間ならびに熱処理温度の最適化を図ることで、PS中に重量比で10%添加したHBCDを約94%分解率で選択的に分解することに成功した。分解後のPSは分子量の低下はなかったが、動力学的測定からスチレンモノマーがグラフトしたPSがリサイクルされた事が明らかとなった。

今年度は知能化リサイクルのターゲットの1つであるポリスチレン(PS)中に添加されたヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)難燃剤の選択的分解を行った。HBCDに関してはほぼ完全に分解できる条件を見出すことができた。この成果を英文雑誌(査読付き)に1報投稿した。成果は査読を経て論文として掲載された。また全国規模の学会に5件発表することができた。さらには、1件の招待講演をする機会を得ることもできた。当初は本年度は、二酸化チタン(TiO2)とヒンダードアミン光安定剤(HALS)を組み合わせた精密高分子鎖切断プロセスの開発を中心に行うことを予定していた。TiO2系光触媒をPS-block-ポリアクリル酸(PS-b-PAA)のナノカプセルに包摂させ、これに市販のHALS化合物を組み合わせて光劣化を行うことでドーマント種(TEMPO-R)にして休止させる。そして120°C150°C程度の一定の温度下で空気を加えながらドーマント種からR・を制御して発生させる。熱劣化およびTiO2の存在により自動酸化劣化で効率良く分子鎖切断を起こさせる。架橋反応である高分子鎖ラジカル同士の反応は、その低い高分子鎖の分子運動性によりTEMPOと反応して再びTEMPO-Rにすることで抑制する。以上の機構の進行を確認するのが本年度の主な目的であった。実際には、確認は直ぐにでき、この過程で得た知見を基に一部計画を前倒し、変更してPS中のHBCDの選択的分解を行い、成功した。以上の理由により、おおむね順調に進展しているとした。現在、狙った分子量になるように高分子鎖を切断、含有している有害な添加剤のみ選択的分解するといった新規リサイクル(知能化リサイクル)技術の開発を行っている。また、知能化リサイクルを水中で行うことができるようにするために、ポリマー型光触媒の開発を行っている。具体的には、1)新規光・熱触媒システムを用いたポリウレタンのリサイクル化2)ヒンダードアミン系光安定剤(HALS)を用いたポリスチレン(PS)内部ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)難燃剤の選択的分解とPS部のリサイクル3)ナノTiO2粒子含有スチレン系ブロック共重合体の光触媒作用に関する研究を行った。1)に関しては、水性ポリウレタン(WBPU)を使い光触媒としてTiO2を劣化制御およびドーマント種化用にHALSを用い、ソフトセグメント部であるポリオキシテトラメチレングリコール(PTMG)鎖を選択的に切断および切断末端のドーマント種化に成功した。これによりWBPUの知能化リサイクル技術の開発に成功した。2)に関しては、同様にTiO2とHALSを組み合わせ、光および熱によってラジカルを制御することでPS内部のHBCDを選択的に分解させることでPS部の選択的なリサイクルに成功した。3)に関しては、リビングアニオン重合によって合成したポリスチレン-block-ポリアクリル酸tert-ブチル(PS-b-PtBA)を加水分解することで、ナノ鋳型であるPS-b-PAAを得た。
新規がん遺伝子TRBファミリー分子による発癌作用の分子基盤の解明

新規キナーゼ様分子TRB1/TRB3はその発現や機能の異常が細胞のがん化に関与しており、がん遺伝子の特徴を有することが示されているが、その分子レベルでの詳細な機序は不明である。そこで、本研究ではこの点を検証した。TRB1は(一部はTRB3も)がん抑制遺伝子p53やFOXO1の転写活性を強く阻害し、がん細胞の増殖を促進すること、がん幹細胞形質を維持させるとともに、TGF-βによる上皮間葉転換(EMT)作用を強く促進することによりがん細胞の浸潤・転移を亢進し、各種抗がん剤に対する抵抗性を獲得することなどを明らかにし、がんの発生や悪性化に深く寄与していることが強く示唆された。TRB1は多くの腫瘍細胞で高発現していることが知られているが、我々はTRB1がTRB3同様、がん抑制遺伝子産物であるp53タンパクと結合し、p53の転写活性を阻害していることを見出した。p53が正常であるヒト乳がん細胞株MCF7細胞のTRB1をノックダウンすることにより、細胞増殖が低下するとともに、p53の標的遺伝子の発現がp53依存的に上昇した。これはTRB1が脱アセチル化酵素であるHDAC1と結合し、p53にリクルートすることにより、p53のアセチル化を阻害し、標的遺伝子のプロモーター領域への結合を抑制することにより引きおこされていることを明らかにした。また、MCF7細胞のTRB1をCRISPR/Cas9法により欠失させると、増殖が低下するとともに、そのスフェロイド形成能も強く抑制されることを見出した。野生型のMCF細胞では恒常的に活性化していたERK経路、AktがこのTRB1欠失MCF7細胞では強く抑制され、がん幹細胞のマーカーの一つであるCD44、及びそのvariant(CD44v8-10)の発現が低下していた。CD44v8-10は細胞内へのcystineの取り込みを促進し、ROSに対する抵抗性獲得に寄与していると考えられているが、TRB1欠失細胞では細胞内ROS濃度が上昇していることもわかった。この現象は正常細胞では見られず、複数の腫瘍細胞株(H1299, MDA-MB-231, A375等)で普遍的に見られた。さらに、細胞増殖を負に制御することが知られている転写因子Foxo1の活性もTRB1は強く阻害することを見出した。以上のことから、TRB1はp53の活性低下、Foxo1の阻害、ならびにがん幹細胞形質の維持に働き、がん細胞の増殖、進展に寄与していると推察された。平成27年度は主に、TRB1のがん発生・進展における役割に関する研究を進め、がん抑制遺伝子のp53やFoxo1の活性阻害作用、がん幹細胞の維持促進作用などを明らかにした。また、発癌のプロモーターであるPMAやがん細胞の転移能促進などに働くTGF-betaによってTRB1は発現誘導が見られ、そのメカニズムの解析を進めている。TGF-betaのシグナルは今まで阻害作用のみを示すと考えていたが、新しく腫瘍の悪性化には正に働くことを見出し、そのシグナルの使い分けについても解析を行っている。さらに、TRB1の示す様々な作用をエピジェネティック制御という観点で研究を進めており、既に複数の制御因子との結合、さらには活性阻害を明らかにしている。TRB1/TRB3は多くの腫瘍細胞で高発現していることが知られている。以前、TRB1はTRB3と同様に、がん抑制遺伝子であるp53タンパク質と結合し、p53の転写活性を阻害していることを見出している。今回、新たに、上皮間葉転換(EMT)を正に制御し、浸潤・転移を促進するSnailなどの転写因子群のTGF-betaによる発現上昇がTRB1のノックダウンによって、抑制することを見出し。また、TRB1のCRISPR/Cas9法により、MCF7細胞のTRB1を欠欠失させると、種々の機序の抗がん剤に対する感受性が上昇することを見出した。以上のことから、TRB1が上皮間葉転換(EMT)を正に制御するとともに、抗がん剤に対する抵抗性獲得に寄与していることが示唆された。また、インスリンやIGFなどの増殖因子によって、TRB1の発現が上昇することを明らかにし、増殖シグナルによってTRB1の発現が正に制御されていることも示唆された。さらに、細胞増殖を負に制御することが知られ、増殖シグナルでその活性が阻害される転写因子FoxO1の転写活性化能を抑制し、糖新生関連因子の発現誘導も低下させることがわかった。さらに、がんの多くでその発現が上昇しているTRB3の発現の低下を指標としたアッセイ系を確立し、様々な天然由来のライブラリー(外来薬用植物のエキスライブラリー)を用いてスクリーニングを行っており、複数の活性化合物を同定し、その作用メカニズムの解析を進めている。平成28年度は前年度に引き続き、TRB1のがん発生における役割に関する研究を進めると同時に、がんの悪性化におけるTRB1の関与について解析を進めた。また、がん抑制に作用するp53に加え、FoxO1のTRB1による転写活性化能の抑制メカニズムの解析を進めており、PGC-1alphaなどのco-activatorとの結合阻害など、エピジェネティック制御についても、新規の結果を見出している。また、現在、がんの多くでその発現が上昇しているTRB3の発現の低下を指標としたアッセイ系を確立し、様々な天然由来のライブラリーを用いてスクリーニングで見出された複数の活性化合物の作用メカニズムの解析を進めている。TRB1は多くの腫瘍細胞で高発現していることが知られているが、正常なp53を有するヒト

乳がん細胞株MCF7細胞のTRB1をノックダウン(KD)することにより、細胞増殖が低下し、p53の標的遺伝子の発現が上昇した。これはTRB1がHDAC1をp53にリクルート→p53のアセチル化阻害→標的遺伝子プロモーターへの結合抑制をおこしていることを明らかにした。MCF7細胞のTRB1をCRISPR/Cas9法により欠失(KO)させると、増殖速度が低下するとともに、そのスフェロイド形成能も強く抑制されることを見出した。野生型細胞では恒常的に活性化していたERK経路、AktもこのTRB1KO細胞では強く抑制され、がん幹細胞のマーカーの一つであるCD44、及びそのvariant (CD44v8-10)の発現が低下していた。これらの現象は正常細胞では見られず、複数の腫瘍細胞株で普遍的に見られた。また、上皮間葉転換(EMT)を正に制御し、浸潤・転移を促進するSnailなどの転写因子群のTGF-betaによる発現上昇がTRB1のKDによって低下するとともに、TRB1KO細胞では種々の機序の抗がん剤に対する感受性が一様に上昇することも見出したことから、TRB1がEMTを正に制御するとともに、抗がん剤に対する抵抗性獲得に寄与していることが示唆された。さらに、インスリンなどの増殖因子によってTRB1の発現が上昇し、細胞増殖を負に制御することが知られ、増殖シグナルでその活性が阻害される転写因子FoxO1の転写活性化能をTRB1は抑制し、糖新生関連因子の発現誘導も低下させることがわかった。一方、がんの多くで上昇しているTRB3の発現低下を指標としたアッセイ系を確立し、様々な外来植物のエキスライブラリーを用いたスクリーニングで、複数の活性化合物を同定し、その作用メカニズムの解析を進めている。新規キナーゼ様分子TRB1/TRB3はその発現や機能の異常が細胞のがん化に関与しており、がん遺伝子の特徴を有することが示されているが、その分子レベルでの詳細な機序は不明である。そこで、本研究ではこの点を検証した。TRB1は(一部はTRB3も)がん抑制遺伝子p53やFOXO1の転写活性を強く阻害し、がん細胞の増殖を促進すること、がん幹細胞形質を維持させるとともに、TGF-βによる上皮間葉転換(EMT)作用を強く促進することによりがん細胞の浸潤・転移を亢進し、各種抗がん剤に対する抵抗性を獲得することなどを明らかにし、がんの発生や悪性化に深く寄与していることが強く示唆された。1. p53が欠損、あるいは変異している腫瘍細胞におけるTRB1の働きを解明する。2. TRB1のがん幹細胞維持作用の可能性については、他のマーカーの調査するとともに、CD44をモデルにして、そのTRB1による転写活性化の機序の解明を進める。また、TRB1高発現によるによるERKやAktの活性化、p38の活性低下の機序についても明らかにする。3. TRB1によるFoxo1の転写活性化能の抑制メカニズムを主に、エピジェネティックな制御の観点から解析を進める。4. TGF-betaシグナルにおいて、TRB1は増殖阻害作用は抑制に、転移能促進作用は増強する傾向があることから、この点を検証するとともに、この二相性の作用の機序について明らかにする。1. TRB1のがん幹細胞維持作用のメカニズムを昨年度に続き、進める。
免疫学的介入による心筋梗塞後リモデリング予防法の開発

樹状細胞、γδT細胞、NK細胞について、心筋梗塞後の炎症、損傷治癒過程における役割について検討した。樹状細胞を除去したマウスでは梗塞後左室リモデリングが増悪し心不全を発症した。γδT細胞はIL-17の分泌を介して好中球の浸潤を遷延化させ、マクロファージを向炎症性>損傷治癒へ傾かせ、線維芽細胞の増殖、collagen産生を促進させ、炎症の慢性化、臓器の破壊を促進させた。心筋梗塞後に肺NK細胞は、IL-10を産生することによって、肺の血管内皮細胞のバリアー機能を維持し、血管内から肺組織への好中球の侵入を抑制していることを明らかにした。1.樹状細胞の役割樹状細胞を除去したマウスを用いて樹状細胞が心筋梗塞後リモデリングを抑制する方向に作用する事を明らかにしてCirculation誌に報告した。現在、樹状細胞による心筋梗塞後リモデリングを抑制効果の分子機序に関してさらに詳細に検討を続けている。2.γδ細胞の役割心筋梗塞後に最初に浸潤してくる好中球やマクロファージから産生されるIL-23によってγδ細胞の増殖とIL17の産生性が高まる。IL-17の産生性γδ細胞は梗塞後7-14日後をピークに梗塞部及び梗塞周辺部に浸潤してきて、好中球の浸潤、マクロファージの極性を炎症惹起性に維持させる、線維芽細胞の増殖と線維化の促進を介して心筋リモデリングを促進する方向に作用することを明らかにした。現在、γδ細胞のリクルートにかかわる分子機序の解明を進めている。3.NK細胞の役割NK細胞をノックアウトすると梗塞後比較的早期にマウスが死亡する。死亡する原因は、心破裂でも不整脈死でもない。また、梗塞サイズもかわらない。死亡するマウスを呼吸速拍状態が持続しており、現在、肺におけるNK細胞の抗肺水腫効果に関して検討を進めている。肺血管透過性に対するNK細胞の機能に着目して、研究を行いました。NK細胞を除去したマウスは、除去しなかったマウスに比べると、心筋梗塞後に著しい呼吸不全に伴う低酸素血症を呈しました。一方、心筋梗塞後の心臓の左心室から全身へ血液を送り出す力は、NK細胞除去の有無では違いを認めませんでした。NK細胞を除去したマウスにおける呼吸不全に伴う低酸素血症の悪化は、心筋梗塞後の心臓の傷の治りが悪かったことが原因ではなく、好中球による肺の血管内皮細胞傷害の程度が重症化した結果、肺血管透過性が亢進、つまり血液の液体成分がより多く肺の中へしみ出したことが原因と考えられました。心筋梗塞後は24時間以内に、肺の血管内皮細胞が傷害され、好中球が肺胞隔壁、さらには肺胞内に浸潤します。血管壁の通りがよくなってしまい、血液内の液体成分や赤血球も肺胞腔内にしみ出す結果、低酸素血症(呼吸困難)を引き起こします。本研究グループは、肺NK細胞は、肺の中の主たるIL-10産生細胞であり、心筋梗塞後に肺の毛細血管の壁に近づき、IL-10を生み出すことによって、肺の毛細血管の壁に好中球が浸潤するのを抑制し、血液の液体成分が血管の外へしみ出すのを防いでいることを世界で初めて明らかにしました。樹状細胞(Dendritic cell:DC)の心筋梗塞後左室リモデリングにおける役割を、ジフテリア毒素(DT)によってCD11c陽性細胞すなわちDCを選択的に除去できるCD11c-DTRマウスの骨髄を放射線照射後の野生型(WT)マウスに移植した骨髄移植モデルを用いて検討した。DTを投与したDC-ablationマウスでは梗塞後心筋にDCの浸潤を認めず、左室リモデリングが増悪した。DC-ablationマウスではday7の梗塞部位でLy6chigh monocyte/macrophageの浸潤が増加し、向炎症性サイトカインの発現亢進、MMP-2やMMP-9の活性化が観察され、反対にLy6clow monocyte/macrophageの浸潤が減少し、抗炎症性サイトカインIL-10の発現は低下していた。adoptive transferを行い、左室リモデリングの増悪がDCを除去したことによることを確認した。IL-17産生細胞は心筋梗塞巣では90%以上がγδT細胞から分泌される。IL-17-KOマウスやTCRγδ-KOマウスでは、梗塞後2日目でMMP1,3,9, MCP-1, TNFα, IL-1β, IL-6の発現は野生型マウスと差がない。この結果は、IL-17産生性γδT細胞は梗塞早期の炎症、損傷治癒機転には影響を及ぼさないことを意味する。

一方で、梗塞後7日目以降では、IL-17はCXCL1を介して好中球の浸潤を遷延化させ、マクロファージに対しては、向炎症性(M1)>損傷治癒(M2)へ傾かせ、線維芽細胞に対しては増殖、collagen産生を促進させ、炎症の慢性化、臓器の破壊を促進させる方向に作用している。急性期の炎症反応(=損傷治癒機転)には影響を及ぼさず、炎症の遷延化過程に深く関与するIL-17産生性γδT細胞は心筋梗塞後心不全発症予防の治療標的として有望である。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究を通じて、心筋梗塞後の炎症過程を免疫学的に検討するための環境を整備できただけでなく、心筋梗塞後の心筋における免疫細胞浸潤のダイナミックスを網羅的に解析し、今後の研究の基盤となる基礎データの獲得が順調に進んでいる。加えて、当初の目標であった樹状細胞(Dendritic cell:DC)の心筋梗塞後左室リモデリングにおける役割を、ジフテリア毒素(DT)によってCD11c陽性細胞すなわちDCを選択的に除去できるCD11c-DTRマウスの骨髄を放射線照射後の野生型(WT)マウスに移植した骨髄移植モデルを用いて検討した結果、DCが過度な炎症を抑制して左室リモデリングを予防する方向に作用する事を見出し論文化して報告した(Circulation. 2012 Mar 13;125(10):1234-45.)。さらに、IL-17産生細胞は心筋梗塞巣では90%以上がγδT細胞から分泌されることを発見し、IL-17-KOマウスやTCRγδ-KOマウスを駆使して急性期の炎症反応(=損傷治癒機転)には影響を及ぼさず、炎症の遷延化過程に深く関与するIL-17産生性γδT細胞は心筋梗塞後心不全発症予防の治療標的として有望であることを示し、こちらも論文として報告した(J Am Heart Assoc. 2012Oct;1(5):e004408.)。免疫系に関する様々な遺伝子操作マウスを駆使して、樹状細胞、γδ細胞、NK細胞の心筋梗塞後リモデリングにおける役割を明らかにしていく。現在の心不全治療の根幹は神経体液性因子(レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系や交感神経系)の過剰な活性化を阻害することにあり、これによって慢性心不全患者の予後は改善されてきた。しかし、治療成績は十分満足のいくものではなく、心不全患者は増加の一途をたどり、免疫学的介入による新規心不全治療法の開発に期待がよせられている。免疫応答は各臓器を構成する実質細胞と間質に局在する免疫細胞との細胞間コミュニケーションによって惹起され、組織の障害と修復という二面性を併せ持つ。本研究では、心不全の原因として最も重要な心筋梗塞による心不全モデルを用いて、ストレスによる炎症の慢性化が心臓や肺のリモデリングを促進させて心不全を発症させていく分子機序を、自然免疫細胞の極性の制御に着目して解明していく。特に、心筋梗塞後の炎症過程を終焉に向かわせ心筋リモデリングを抑制する機序(樹状細胞やマクロファージ)、梗塞後亜急性期以降活性化されて炎症の遷延化、非梗塞部位の線維化を介して心筋リモデリングを増悪させる機序(IL-17産生γδT細胞)、を明らかにして心不全の予防や治療、創薬につながる新たな医療基盤の創出を目指す。平成25年度は、3年間の研究計画の最終年度にあたる。今年度は、創薬につながる新たな医療基盤の創出をめざして、実臨床で行われる心筋梗塞後の再灌流療法が心筋梗塞後の炎症過程にどのような影響を及ぼすのかを詳細に検討して、免疫学的介入のtherapeutic windowを同定することを目標とする。
増殖因子―細胞間結合分子クロストークによる歯原性上皮・間葉細胞の分化機構の解明

これまでギャップジャンクションを介した歯および唾液腺の器官形成に及ぼす役割解明を行なってきた。特に唾液腺においては、間葉組織から誘導されるFGF-10シグナルが、上皮細胞に十分伝達できないことを、上皮細胞のERK1/2のリン酸化レベルを指標に明らかにしてきた。しかしながら、ギャップジャンクションの機能阻害のために、ギャップジャンクションの機能抑制を行なう18alpha-GAやoleamideを用いて行なってきたが、これらの小分子化合物は全てのギャップ結合を阻害するため、個々のギャップジャンクション分子の機能同定には至っていなかった。そこでコネキシン43やパネキシン3の発現抑制siRNAや機能阻害ペプチドを用いて検討した結果、18alpha-GAやoleamideを用いた結果と同様の結果が得られたこと、さらに歯胚上皮にはコネキシン43が強く発現し、他のギャップジャンクション分子の発現は少ないことが、single cell解析で明らかとなった。また歯胚由来上皮細胞を用いた解析により、TGF-beta1刺激によるアメロブラスチン発現誘導に関して、ギャップ結合阻害剤やコネキシン43発現抑制細胞において、アメロブラスチンの転写に関わるRunx2のリン酸化が低下していること、またRunx2のリン酸化はERK1/2によって行なわれていることを確認した。さらにリン酸化レベルの低下したRunx2には、TGF-beta1によって誘導されたリン酸化Smad2/3と結合していないことがわかった。したがって、今後はどのようにしてギャップジャンクションの機能抑制によりERK1/2がリン酸化されないのかを明らかにする必要があると考えられた。歯胚上皮におけるコネキシン43の機能に関しては、ERK1/2のリン酸化がどのように制御されているかについては未だ不明であるが、このリン酸化抑制がアメロブラスチンなどのエナメル基質の発現抑制を引き起こしている分子機能について詳細に解析することができた。特にTGF-beta1シグナルにおけるSmad2/3のリン酸化には影響を及ぼさないが、硬い組織形成に関わる分子群の転写調節の段階で、Smad2/3が核内において複合体を形成できていないという新たな分子機能を証明することができた。またパネキシン3の機能に関しては、もともと前象牙芽細胞に特異的に発現する分子として同定した結果から、歯原性間葉細胞や骨芽細胞等を用いて解析を進めてきた。その中で、コネキシン分子群に認められる細胞間でのギャップ結合を維持するという機能よりは、小胞体膜でのヘミチャンネルとしての機能が明らかとなり、チャンネル構造の開閉機能に関する新たな知見を得ることができた。これらの成果により、ギャップジャンクション分子の新たな機能解明につながる新らたな情報が得られたことから、おおむね順調に進展していると判断した。コネキシン43の分子機能に関しては、ギャップジャンクションが機能しない状況により、なぜ歯胚においてはTGF-beta1、唾液腺においてはFGF-10などの増殖因子刺激によるERK1/2のリン酸化が抑制されているのかが未だ不明である。ERK1/2のリン酸化には上流分子のMEKやRasファミリー分子群が関与していることから、これら分子の活性化によっても検討を進める予定である。一方で、ギャップジャンクションは、Ca2+イオンやIP3などの小分子の輸送に関与することから、これらCa2+イオンやIP3の細胞内濃度の変化や、これら分子の輸送異常がRas-MEK-ERK1/2の活性化に及ぼす影響について検討を進める。これら解析においては、新たに作製できたsiRNAや機能阻害ペプチドを用いて、分子特異的な発現や機能抑制を行なうことで、歯胚と唾液腺上皮におけるギャップジャンクション分子の使い分けについても明らかにしていきたいと考えている。口腔上皮から発生する歯や唾液腺をモデルとし、細胞間結合分子の1つであるギャップジャンクションに着目し、その分化や形態形成における役割を解明してきた。歯および唾液腺の発生段階における遺伝子発現について、マイクロアレー、SAGEライブラリー以外に、本年度においては新たにCAGEを用いた新しい包括的なスクリーニング法を用いて、候補分子群の発現パターンを明らかにした。遺伝子スクリーニングの結果、これまで分子としての存在が確認されているコネキシンおよびパネキシンファミリーの全てについて、その発現の有無を確認することができた。また以前我々の研究により明らかにしていた歯および唾液腺にて高い発現を示すコネキシン43については、唾液腺の器官培養系を用いた解析から、唾液腺上皮でのFGF10誘導性の細胞増殖の促進やERK1/2のリン酸化において、コネキシン43の有無が重要であることを見いだした。また同様の結果について歯の発生過程においても証明することができた。しかしながら、歯胚上皮でFGF10が存在する領域においては、コネキシン43の発現はそれほど強くないために、増殖因子シグナルの制御に関しては、FGF10に限り唾液腺よりも弱い反応であると考えられた。一方、BMPファミリー分子については、特にBMP2およびBMP4に関しては、コネキシン43依存的にERK1/2のリン酸化制御が行なわれていることが明らかとなり、硬組織特異的な細胞間結合と増殖因子シグナルのクロストークを見出すことができた。現在、各所ギャップジャンクション欠損マウスにおける器官形成の評価や、増殖因子の反応性について検討を行っている。これまで歯胚上皮細胞におけるコネキシン43とTGF-βシグナルおよび唾液腺上皮におけるFGF10シグナルに関しては、そのクロストークに関する現象を見出していたが、これらの現象に関して、細胞内カルシウムレベルとの関連性や、細胞内ATP濃度との関連性など、新たな分子機構を明らかにすることができた。

特に、各種遺伝子の転写活性を指標とした遺伝子発現評価としてCAGE法を用いた解析においては、それぞれの分子の時間的発現様式を網羅的に明らかにすることができ、予想よりも詳細な遺伝子発現解析を実施することができた。さらにコネキシン43欠損マウスの歯および唾液腺の表現系に加え、新規ギャップジャンクション分子パネキシン3の欠損マウス、さらには両分子のダブル欠損マウスの解析から、何れの分子もエナメル質形成や象牙質形成に大きな影響を与えることが判明し、これまで明らかであった細胞レベルでのギャップジャンクション分子と増殖因子のクロストークについて、in vivoレベルでの表現系解析に繋げることができ、この点は大きく研究が進展した部分である。以上の結果から、進捗状況は「計画以上に進んでいる」と判断できる。本研究では、歯や唾液腺形成機構の解明を目的とし、特に細胞間結合分子ギャップジャンクションに着目し研究を進めてきた。これら器官の発生段階における遺伝子発現を網羅的に解析する為に、これまで行ってきたマイクロアレー、SAGEライブラリースクリーニング、CAGE法に加え、単一細胞内の遺伝子発現解析としてsingle RNA sequenceによる解析を行った。これまでギャップ結合分子コネキシン43の歯胚および唾液腺の発現解析を行っていたが、発生の初期段階の上皮細胞および、象牙芽細胞等の間葉系細胞に強く発現することを見出していたが、今回の単一細胞を用いた包括的な遺伝子スクリーニングから、成熟過程のエナメル芽細胞には発現が認められず、外エナメル芽細胞、星状網、中間層細胞の融合によって形成される乳頭層細胞に強い発現が認められことを見出した。実際にマウス切歯を用いた免疫染色にて確認した結果、single RNA sequenceの結果と同様のコネキシン43の組織発現を確認することができた。また間葉系細胞に発現するコネキシン43は、未分化な象牙芽細胞には発現せずに、分化した細胞に特異的に発現していることを確認した。同様の結果は骨組織においても確認され、骨芽細胞から骨細胞に分化する際に強く発現していた。一方、ギャップ結合分子パネキシン3については、象牙芽細胞細胞には発現が認められず、未分化な前象牙芽細胞に発現が認められた。これら分子の細胞内での機能を明らかにする目的で、機能阻害ペプチドを作成した、この機能阻害ペプチドは、ギャップ結合分子の6量体形成を阻害し、外部からのカルシウム流入を阻害した。この機能阻害ペプチドを用いることで、BMP2等の増殖因子による象牙芽細胞分化の抑制が確認できた。今年度は、従来の包括的な遺伝子スクリーニングに加え、single RNA sequenceといった新しい手法での遺伝子スクリーニングを実施することができた。本解析により、これまでに発生段階のあるステージの断片的な遺伝子発現の解析であったものが、全てのギャップ結合分子群の連続的な発現様式を把握することができた。実際、構築したデータベース上でのスクリーニングが、組織内での分子発現と完全に一致することを見出し、当初の予定以上に研究を進めることができた。
腎特異的な形質変換規定因子のクローニングと機能解析

糖尿病性腎症や慢性糸球体腎炎におけるメサンギウム細胞の形質変換は病変形成における最も重要な問題であるにも関わらず、その誘導因子は同定されていなかったが、yeast two-hybrid screening法を用い、Id2およびE蛋白質をbaitとして、新たなbasic helix-loop-helix (bHLH)型転写因子を修飾する数種類の因子をクローニングした。その全長cDNAをRACE法にて取得した。得られた因子が、同細胞でタンパク質レベルで発現することを各因子特異的抗体を用いたImmunoblotで明らかとした後、Id2およびE蛋白質との結合を免疫沈降法などで確認した。各因子とEタンパク質との結合部位を確定するため、さまざまなtruncated proteinを発現するconstructを作成し、免疫沈降法を行った。また、bHLH型転写因子は細胞周期調節機能も有しているため、BrdU proliferation assay, WST assayなどにより、これら因子が同細胞の増殖を調節する機構を明らかにした。この作用は細胞周期関連タンパクであるP21を介した作用であることをpromoter assayにより見いだした。さらに、代表的な増殖性腎炎モデルである、Thy1腎炎ラットを作成し、これら因子の腎糸球体内での発現が形質変換のマーカーであるsmooth muscle αactin (SMA)に一致してみられることが明らかとなった。また、これら因子のうち少なくとも一つは、われわれが先に解明した糸球体硬化の責任因子であるSmad1に直接結合し、その活性化を調節することも示した。1.糖尿病性腎症や慢性腎炎におけるメサンギウム細胞の形質変換は病変形成における最も重要な問題であり、その誘導因子は同定されていなかったが、degenerate PCR法により、腎メサンギウム細胞での新規basic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子Screlaxisをクローニングした。メサンギウム細胞の正常分化との比較により、異常な形質変化の本態が解明されつつある。2.これまでにメサンギウム細胞にId2が発現していること、同細胞の形質変換の過程において、Smad1が中心的な役割を果たしていることを解明しており、Id2のScleraxisに対する阻害効果の発現が形質変換、ないしは糸球体硬化進行の過程にそって変化することを見いだしている。また、糖尿病条件下でScleraxisの発現はRNAレベルでもタンパク質レベルでも亢進しており、病変形成に寄与している可能性を見いだした。さらに、Id2ノックアウトマウスに糖尿病を惹起し、これら糸球体硬化形成に寄与する因子の発現の変化を組織学的に検討している。3.腎メサンギウム細胞の形質変換のマーカーであるsmooth muscle αactin(SMA)はそのプロモーターにEボックスを有し、Scleraxisが他のbHLH型転写因子と同様に、E2Aタンパクと二量体を形成し、転写因子として結合することを確認した。結合することで、転写活性が実際に変化し、SMAの発現量に変化をもたらしている。また、糖尿病条件下でchromatin immunoprecipitation (ChIP) assayを用いて、in vivoでScleraxisがE-boxに結合することで、SMAの発現レベルを直接調節してはどうかを検討している。
サイトカイニン応答シグナル伝達の可視化:二成分制御因子間の構造と親和性相関解析

平成15年度はレスポンスレギュレーター(RR)について、トウモロコシ由来(ZmRR)のアイソフォームZmRR1、ZmRR2の大量発現系の構築がうまくいかなかったため、平成16年度は、異なるアイソフォームの発現系の構築を目指した。その結果、アミノ末端にヒスチジンタグをつけたZmRR3について、大量のサンプルを確保することが可能となった。しかし、このアイソフォームは非常に不安定で、精製したその日から蛋白質が変性し始めていた。4°Cで結晶化条件を検索したが、微結晶すら得ることができなかったため、蛋白質の安定化剤であるグリセロールやエチレングリコールをサンプルに添加し、同じく4°Cで結晶化条件を検索してもうまくいかなかった。またアイソフォームのヒスチジンタグをプロテアーゼで除去することによって安定性の向上を目指したが、温度が低いとタグがうまく切れず、室温付近で酵素処理すると、アイソフォームがほとんど変性してしまうため、うまくいかなかった。酵母由来のhistidine phospho-transfer protein(HPt)とRRとの蛋白質-蛋白質複合体の立体構造の報告を元に、ドッキングシミュレーションプログラムを用いてトウモロコシ由来のHPt(ZmHP)とZmRRの複合体モデルの構築を試みた。ZmHPの立体構造は、結晶解析によって実験的に得られたものであるのに対して、ZmRRについては、ホモロジーモデリング法によってin silicoで得られたものであるため、得られたモデルについて、リン酸基を授受するヒスチジン(ZmHP)、アスパラギン酸(ZmRR)周辺を見ると、両蛋白質が接触するinterfaceに隙間が空いており、モデルとしての信頼性に疑問の余地がある。平成15年度の研究計画では、トウモロコシ由来レスポンスレギュレーター(RR)のアイソフォームであるZmRR1、ZmRR2の結晶構造解析を目指していた。しかし現在のところ、発現条件の詳細な検討にもかかわらず両方とも発現量が少ないのと、融合させて発現させているGST-tagをプロテアーゼで除去する条件が定まっていない。一方、昨年末に酵母由来のhistidine phospho-transfer protein (HPt)とRRとの蛋白質-蛋白質複合体の立体構造が報告された。トウモロコシ由来と酵母由来HPtでは、互いによく似たfour-helix bundle構造を持っており、さらに植物間で保存されている残基をトウモロコシのHPt分子上に表示すると、酵母のHPtにおいてRRと相互作用する領域と極めてよく一致する。従って、酵母と植物との間では、HPtとRRの相互作用様式は本質的に同一である可能性が示唆される。以上の結果に基づいて、現在トウモロコシ由来のHPtとRRの複合体モデルを構築している。具体的には、結晶構造解析によって得られたトウモロコシ由来HPtと、ホモロジーモデリング法によって立体構造を発生させたZmRRを、それぞれ酵母の複合体構造に重ね合わせ、さらにドッキングシミュレーションプログラムを用いて、両蛋白質分子の側鎖の位置等に修正を施すという手順によって作製している。来年度は、引き続き2種のZmRRの結晶構造解析を目指して、培養、精製、結晶化条件の検索を続けるのと、得られた複合体モデルの評価、証明をするために、two-hybrid法及び表面共鳴プラズモン法を用いて、HPtとRRの各々のwild-type及び変異体について、これら2種の蛋白質の相互作用を測定することによって、両蛋白質のアイソフォームの組み合わせによって親和性の違いをもたらす残基の同定を試みる予定である。
ヘムタンパク質の高機能変換をめざしたミオグロビン表面への精密分子認識部位の導入

平成11年度はチトクロムcなど表面にカチオン電荷が集中して存在しているタンパク質にターゲットを絞り、アニオンドメインをヘム末端に有する再構成ミオグロビンのデザインと合成を行った。具体的には、2つのヘム末端プロピオン酸側鎖に多数のカルボン酸を導入し、得られた修飾ヘムをアポミオグロビンに挿入することにより、アニオンドメインをタンパク質表面に有した再構成ミオグロビンを調製した。得られた再構成ミオグロビンの構造と安定性は、UV,NMR,Mass等で検証し、表面電荷が変化したことを等電点の測定から明らかにした。さらに表面に形成されたアニオンドメインの生体分子認識能の評価のために再構成ミオグロビン-チトクロムcの相互作用系を検討した。その結果、再構成ミオグロビンに構築したアニオンドメインの認識部位がチトクロムcと強い相互作用を形成し、新規タンパク質間複合体を得た。相互作用の安定性は、フラッシュホトリシスから見積り、さらにミオグロビンからチトクロムcへの円滑な光駆動型電子移動反応が観測されることを明らかにした。また、アニオンドメインに相当する、ヘム末端カルボン酸の数や形状がチトクロムcとの相互作用及び電子移動反応に強く影響することを示した。この研究はヘムタンパク質に効率的な人工分子認識部位を合成化学的に構築した初めての例であり、今後様々な生体分子に対して認識部位をテーラーメード的にヘム末端へデザインする手法を提案し、ミオグロビンをプローブとする新しい機能(ターゲッティング素子)としての例として今後応用を図る予定である。
中生代における隕石衝突記録と環境変動の解明

本研究では,遠洋性堆積物である層状チャートを対象に研究を行い,中生代に複数回起こったと考えられる巨大隕石衝突の記録を解読することを目的としている.平成29年度は主に,(1)美濃帯犬山地域に分布する上部三畳系層状チャートのサンプリング,(2) ICP-MSによる主要元素ー微量元素の定量分析,(3) MC-ICP-MSおよびN-TIMSによるオスミウム同位体比分析,(4) ICP-MSによる白金族元素濃度の定量分析を行った.具体的には,愛知県犬山地域に分布する上部三畳系ノーリアン中期レーチアン前期の層状チャートについて,1層準ごとに高時間解像度で採取し,巨大隕石衝突の証拠となり得る親鉄性元素および白金族元素の濃集,オスミウム同位体比の急激な負へのシフトが堆積物中に記録されているかについて探索した.その結果,ノーリアン後期の層状チャートにおいて,オスミウム同位体比が低下する層準があることを発見した.岩相の観察からは,チャート単層中に厚さ約1 mmの砕屑岩が挟まれていることが明らかとなり,オスミウム同位体比は砕屑岩を境として急激に低下していることが明らかとなった.一方,砕屑岩は親鉄性元素および白金族元素の濃集は確認されず,隕石衝突などの宇宙物質付加の明確な証拠は得られなかった.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。1.野外調査および試料採取:岐阜県坂祝町および愛知県犬山市に分布する美濃帯の三畳紀後期三畳紀/ジュラ紀境界にかけての層状チャートについて,チャートおよびその間に挟まれる粘土岩層を1層準ごとに高分解能でサンプリングを行った.採取試料範囲においては,200分の1スケールでの露頭スケッチの作成,10分の1スケールでの柱状図作成を行った.また岩相層序の記載については,試料採取層準を明確にするためにmmスケールでの記載作業を行った.2.オスミウム同位体分析:1.で採取したサンプルについて,海洋研究開発機構のマルチコレクター誘導結合プラズマ質量分析装置(MC-ICP-MS)を用いてオスミウム同位体分析を行なった.落下隕石などの地球外起源物質中では,高いオスミウム濃度と低いオスミウム同位体比(187Os/188Os)をもつという特徴がある.現在,三畳紀後期ノーリアン中期後期にかけて約100層準の測定データを取得しているが,その範囲内にオスミウム同位体比が低下する層準があることが明らかとなった.オスミウム同位体比が低下する層準については,1枚のチャート層を岩相の特徴によってさらに細分化し測定するための準備を進めている.3.論文投稿:美濃帯および秩父帯に分布する三畳紀後期の遠洋性堆積物中から発見した厚さ数cmの粘土岩が,隕石衝突によって形成された堆積物(イジェクタ堆積物)であることをPalaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology誌に発表した.これまでにイジェクタ層を報告したセクションに加え(佐藤・尾上,2010;Sato et al., 2013),新たに同層準の3セクションから粘土岩を見出し,白金族元素の異常濃集からイジェクタ層であることを証明した.さらに,複数のセクションから発見されたイジェクタ層中のクロムおよびイリジウム濃度比(Cr/Ir)を用いて,三畳紀後期の隕石衝突はコンドライト隕石に起源をもつ可能性を示した.遠洋性堆積物である層状チャートを用いたオスミウム同位体分析の結果から,新たな層準において地球外起源物質の混入の可能性を見出しつつある.地球外起源物質の混入が期待される層準について,野外調査での岩相の詳細な記載,薄片作成などの地質データを取得済みであり,さらに白金族元素濃度の定量分析についても測定準備を進めている状態である.また,これまでに三畳紀後期の層状チャート中から発見した複数の隕石衝突層準についても,その研究成果を国際学術雑誌であるPalaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology誌の査読付き論文として発表した.このように,野外調査に基づく地道な地質学的データの取得に加え,化学分析および論文執筆を進めていることから,おおむね順調に進展しているといえる.1.野外調査および試料採取:岐阜県坂祝町に分布する美濃帯の上部三畳系下部ジュラ系層状チャートについて,チャートおよびその間に挟まれる粘土岩層を1層準ごとに高時間解像度でサンプリングした.また岩相層序の記載については,試料採取層準を明確にするためにmmスケールでの記載作業を行った.2.オスミウム同位体分析:1.で採取したサンプルについて,海洋研究開発機構のマルチコレクターICP-MSを用いてオスミウム同位体分析を行なった.オスミウムは複数の同位体をもち,宇宙塵や落下隕石などの地球外起源物質中では,高いオスミウム濃度と低いオスミウム同位体比(187Os/188Os)をもつという特徴がある.現在,三畳紀後期ノーリアン中期後期にかけて約100層準の測定データを取得しているが,その範囲内にオスミウム同位体比が低下する層準が認められた.薄片観察から,このチャートは単層中に厚さ約1 mmの砕屑岩層を挟むことが明らかとなり,岩相の特徴によってさらに細分化し測定を行った結果,オスミウム同位体比は砕屑岩を境として急激に低下していることが示された.3.白金族元素濃度の定量分析: