hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二重特異性抗体を迅速に作製するin vitro技術開発

iii)においてはi)で開発したモニタリング系を用いた遺伝子変換の確認は完了しているが、より直接的な方法(TSA処理後の細胞の抗体遺伝子配列を解析する方法)による確認は27年度初頭に実施することになった。その一方で、遺伝子変換活性のコントロール技術開発に関しては当初27年度中の開発を予定していたが、前倒して26年度中に作業を開始している。すでにコンストラクション作業の一部も実施しており、研究課題全体としての進捗は概ね予定通りと言え、全体的な開発計画のスケジュール修正はない。抗体工学27年度はまず、DT40細胞の抗体遺伝子座での遺伝子変換活性のオン、オフを適宜コントロールできる技術の開発を行う。これは、26年度に作製した株にさらなるゲノム改変を加える事で実現する。その際、所属研究室が開発した重鎖定常領域改変技術も活用していくことで、効率的な遺伝子改変を実施する予定である。次に、上記の株を用いて二重特異性抗体取得に使用可能なライブラリ調製を行うべく、ライブラリ調製方法の最適化を行う。様々なパラメターを最適化し、最も効率よく多様性のあるライブラリを作製できる条件を見いだす。さらに、二重特異性抗体のスクリーニング法の開発を行う。陽性クローンのスクリーニングは精製抗体を用いたELISAで実施する予定である。このためまずは得られた二重特異性抗体の精製法を確立する。96穴フォーマットのカラムを作製し、ハイスループットな精製法を開発することで、スピーディーな陽性クローンのスクリーニングを実現する。さらに得られた候補抗体が二重特異性を保有するかどうかは、二つの抗原に対するELISAを同時に実施する事で確認する。抗体遺伝子座に様々な改変を加えた事で抗体の発現量が不十分となり、ELISAのシグナルが弱く、陽性クローンのスクリーニングが困難になる事が懸念される。その場合、抗体遺伝子座により強力なプロモータをノックインすることで発現量を向上させる。最後に、上記のライブラリを用いてセレクションを実施する。当初のセレクション条件は従来の単一特異性抗体取得技術開発において得られた実験条件をベースに行う。得られた候補クローンは、上記のとおりに確立したスクリーニング手法により選別する。ここで得られた結果を参考に、最終的にはセレクション条件の最適化を行う。セレクションに関するパラメターの最適化を行い、効率的なセレクション条件を見いだす。
スケーラブルウェブサーバーのデザインと分析

このプロジェクトでは、私たちは、ウェブキャッシュとサービス模写でスケーラブルなウェブサーバを設計するために新しいメソッドとテクニックを研究しました。私たちは、異なったレベルでスケーラブルなプロトタイプウェブサーバを確立するためにこれらのテクニックを一緒に統合しました。私たちのプロジェクトは統合とプロトタイピングフェーズに2つの小川のあとに続かせています、既存の結果との大規模な性能比較で。(そこでは、すべてのタスクが、実装されて、テストされます)。1.キャッシュします:有効にキャッシュするのは移行します。ウェブクライアントの、より近くにウェブサーバからのポピュラーなドキュメントをコピーして、したがって、応答時間とネットワークトラフィックを短縮します。最初のプロジェクト年に私たちが大きいキャッシュがどうそれぞれクライアントサーバとプロキシサーバにインストールされるべきであるかを研究したので、費用対効果は最適化されています。プロジェクト2年目に、私たちは、それぞれのクライアントサーバにおけるネットワークtopologiesとアクセス頻度を発見するために様々なテクニックを適用しました。2.模写:模写は、システム性能を改良する別のフォームのデータ移行です。それは、専用サーバ(ミラーサーバ)にデータをコピーして、保存します、の代わりにする。地理的に最後のプロジェクト年が2番目のストリームのためにレプリカの中に一貫性を保つためにローカルなキャッシュが最初のストリームに完全で、展開している有効なモデルであるときに交換のためにコンテンツについて決めるタスクに集結したclient.Inの近くにキャッシュがあります。また、プロジェクトにおける、上の提案されたタスクの完成に加えて、私たちはプロジェクトテーマに関連する以下のタスクを完成しました:私たちは光学切り換えネットワークと新しい体系が垂直に積み重ねられた光学MINsで無漏話の順列がわかる性能を分析することへの目新しいアプローチを提案しました。私たちはバニヤンネットワークの水平な拡張と垂直な積み重ねの組み合わせのときに造られたフォトニック再配列可能ネットワークで無漏話の順列を研究しました。私たちはインターネットでのコミュニケーションパターン(トポロジー)発見のときに効果的なアルゴリズムを開発しました。前のメソッドと私たちの提案された新しいメソッドでの何らかの重要な分析と比較が完了しました。私たちは基づきました、また、提案されて、モバイルエージェントがネットワーク形態発見のためのモデルを基礎づけました。私たちは統合フレームワークで非常にスケーラブルなさざ波ベースのイメージ符号化器、S-SPECK、およびROI retrievabilityを首尾よく設計しました。(S-SPECKはひずみスケーラビリティ、解決スケーラビリティを達成します)。私たちは、透かしを幾何学上攻撃に傷つけられなくするように目新しい強健な盲目のさざ波ベースのイメージ透かしのアルゴリズムを提案しました。私たちがそれぞれ考えに基づくホストベースの侵入検出のためにオンラインSVMから従来のSVM、強健なSVM、および1クラスのSVMのテクニックを変更して、彼らの性能はオリジナルのもののものと比較されました。理論解析と実験の両方が、オンラインで私たちのメソッドを訓練することができるのを示して、減少している検出精度のない、より少ないSVsと、より少ないトレーニング・タイムがあるオリジナルのものより優れています。

(S-SPECKはひずみスケーラビリティ、解決スケーラビリティを達成します)。私たちは、透かしを幾何学上攻撃に傷つけられなくするように目新しい強健な盲目のさざ波ベースのイメージ透かしのアルゴリズムを提案しました。私たちがそれぞれ考えに基づくホストベースの侵入検出のためにオンラインSVMから従来のSVM、強健なSVM、および1クラスのSVMのテクニックを変更して、彼らの性能はオリジナルのもののものと比較されました。理論解析と実験の両方が、オンラインで私たちのメソッドを訓練することができるのを示して、減少している検出精度のない、より少ないSVsと、より少ないトレーニング・タイムがあるオリジナルのものより優れています。この研究課題において、我々は、ウェブキャッシングとウェブサービスの複製を通じてスケーラブルウェブサーバーをデザインする新しい手法と技術の分析を行い、これら技術全てを一つに統合し様々なレベルでのウェブサーバーの拡張縮小可能な機能の模範を確立する。研究活動我々は何度かの中国・オーストラリアへの出張で、主要研究機関を訪れ協力者とともに資料収集や研究打合せ、研究する上での意見交換を行った。また、研究補助として博士後期課程生徒1名の雇用、アメリカ合衆国、オーストラリアからそれぞれ1名の研究者を招聘した。研究成果我々はこれまでにスケーラブルウェブサーバーのデザインと分析関して研究を行いその成果を9部の研究論文として完成させ、4部を国際ジャーナルへ提出、うち5部を以下の国際会議で発表この研究課題に取り組み始めて以来、我々は期待通り納得のいく成果をあげている。我々が科学研究費補助金の支援のもと成し遂げた実績は以下のとおりである。今後について本研究課題により築かれた中国・オーストラリアとの協力関係、研究活動を通じて今後も進展させていく予定である。我々が行なった研究は、主にウェブサービスの拡張性を向上させるためのenルート統合キャッシングについてである。複数の特定されたオブジェクトに到達するようなenルートキャッシュ内において、オブジェクトのコピーを保存する為に、位置を計算するという問題に焦点をあてた。ツリーネットワークのこの課題に取り組み、また最大の課題として明らかにしていった。まず、制約されたケースとそうでないケースの両方において検討した。制約されたケースというのは、ノード当たりのコスト利益およびオブジェクト・コピー数における制約を含んでいる。
健康長寿の指標となる糖鎖構造とその生物学的意義の解明

申請者らは健康長寿マーカーの策定につなげるため、これまでに超百寿者(105歳以上)の血漿タンパク質のN-結合型糖鎖を解析し、超百寿者に特徴的な糖鎖構造を明らかにした。そこで本研究ではさらに深化させ、これらの糖鎖が結合しているキャリアタンパク質、シアル酸の結合様式、これらの糖鎖の健康長寿における生物学的意義について検討する。最終年度である本年度は、超百寿者に特徴的な糖鎖(高分岐高シアル酸含有糖鎖)の生物学的な役割を明らかにするため、高分岐高シアル酸含有糖鎖を多く持つモデル動物の作成に取り組んだ。まず、マウスにシアル酸を飲水投与して血漿タンパク質のN-結合型糖鎖の糖鎖解析を行い、高分岐高シアル酸含有糖鎖が増加するかどうかを調べた。糖鎖脱離酵素であるN-グリカナーゼF (PNGase F)を用いて血漿タンパク質より糖鎖を切り離し、Sialic Acid Likage Specific Alkylamidation (SALSA)法を用いてシアル酸の結合様式を区別するための前処理を行った後、MALDI-TOF MSを用いて測定した。その結果、糖鎖と推定できる58のピークを検出した。さらにそれぞれのピークについて全体に対する相対ピーク面積比を求め、シアル酸投与による影響について調べたところ、最もメジャーなピークである2つのalpha2,6-グリコリルノイラミン酸を含む2本鎖糖鎖が有意に増加した。また、シアル酸を含まない高マンノース型糖鎖などの減少が認められた。しかしながら、3分岐3シアル酸含有糖鎖については、シアル酸投与による有意な増加は認められなかった。そこで現在、高分岐糖鎖を合成する酵素であるN-アセチルグルコサミン転移酵素-V (GnT-V)のトランスジェニックマウスを用いて、超百寿者に特徴的な糖鎖(高分岐高シアル酸含有糖鎖)を多く持つモデル動物の作成に取り組んでいる。そこで本研究ではさらに深化させ、これらの糖鎖が結合しているキャリアタンパク質、同一人の加齢による糖鎖変化(縦断的変化)、シアル酸の結合様式、について検討する。本年度は、糖ペプチド解析を行い、超百寿者に特徴的な糖ペプチドを明らかにした。また、α2,3-結合シアル酸とα2,6-結合シアル酸を質量分析で区別して分析するための誘導体化法を構築した。1.超百寿者群(106-107歳)、高齢対照群(80歳代)、若齢対照群(20-30歳)の血漿中より、Erythrina cristagalli agglutinin (ECA)レクチンに結合する糖タンパク質を回収した。トリプシン消化後、LC-MS/MS (LTQ-FT)を用いてキャリアタンパク質の同定と糖鎖構造解析を行ったところ、47種類のタンパク質が同定され、35種類の糖ペプチドが同定された。これらの糖ペプチドのピーク面積を用いて多変量解析(OPLS-DA)を行ったところ、ハプトグロビンの2か所のアスパラギン残基(207Nと211N)に結合した高シアル酸含有3本鎖糖鎖が、超百寿者に特徴的であることを明らかにした。2.Sialic acid linkage specific alkylamidation (SALSA)法を開発した。この方法は、α2,3-結合とα2,6-結合の立体的な違いを利用して、それぞれ異なる分子量の誘導体にするものである。具体的には、イソプロピルアミド化とメチルアミド化を組み合わせることにより、α2,3-結合シアル酸とα2,6-結合シアル酸に28Daの分子量差をつけ、質量分析でこれらを区別することが可能であることを明らかにした。本年度の予定であった、超百寿者血漿タンパク質の糖ペプチド解析とシアル酸結合様式を区別する方法について、成果が得られたため、おおむね計画の通りに進行している。そこで本研究ではさらに深化させ、1.これらの糖鎖が結合しているキャリアタンパク質、2.同一人の加齢による糖鎖変化(縦断的変化)、3.シアル酸の結合様式、について検討する。本研究により、健康長寿に特徴的な糖鎖構造の詳細のみならず、キャリアタンパク質の機能変化を含めた生物学的意義や、加齢により亢進する慢性炎症への応答能との関連について新たな知見が得られる。本研究は、老化プロセスの理解を格段に深めるばかりでなく、健康長寿マーカーとして疾病の予防・診断・治療に役立てることを目指す。本年度は、昨年度報告したシアル酸誘導体化法(Sialic acid linkage specific alkylamidation (SALSA))を超百寿者血しょうの糖鎖解析に応用し、超百寿者と老齢コントロール(70歳代)の血しょう糖鎖解析を行った。その結果、超百寿者血しょうは老齢コントロールに比べて、高分岐でシアル酸を多く含む糖鎖が多いことが検証された。また、超百寿者で増加した糖鎖には、フコースを含む糖鎖が多いことが明らかになった。

さらに、ヒトの血しょう糖鎖においては、alpha 2,3-結合シアル酸に比べてalpha 2,6-結合シアル酸をもつ糖鎖が多く、老齢コントロールと超百寿者においてシアル酸結合様式が変化する糖鎖があることを発見した。申請者らは健康長寿マーカーの策定につなげるため、これまでに超百寿者(105歳以上)の血漿タンパク質のN-結合型糖鎖を解析し、超百寿者に特徴的な糖鎖構造を明らかにした。そこで本研究ではさらに深化させ、これらの糖鎖が結合しているキャリアタンパク質、シアル酸の結合様式、これらの糖鎖の健康長寿における生物学的意義について検討する。最終年度である本年度は、超百寿者に特徴的な糖鎖(高分岐高シアル酸含有糖鎖)の生物学的な役割を明らかにするため、高分岐高シアル酸含有糖鎖を多く持つモデル動物の作成に取り組んだ。まず、マウスにシアル酸を飲水投与して血漿タンパク質のN-結合型糖鎖の糖鎖解析を行い、高分岐高シアル酸含有糖鎖が増加するかどうかを調べた。糖鎖脱離酵素であるN-グリカナーゼF (PNGase F)を用いて血漿タンパク質より糖鎖を切り離し、Sialic Acid Likage Specific Alkylamidation (SALSA)法を用いてシアル酸の結合様式を区別するための前処理を行った後、MALDI-TOF MSを用いて測定した。その結果、糖鎖と推定できる58のピークを検出した。さらにそれぞれのピークについて全体に対する相対ピーク面積比を求め、シアル酸投与による影響について調べたところ、最もメジャーなピークである2つのalpha2,6-グリコリルノイラミン酸を含む2本鎖糖鎖が有意に増加した。また、シアル酸を含まない高マンノース型糖鎖などの減少が認められた。しかしながら、3分岐3シアル酸含有糖鎖については、シアル酸投与による有意な増加は認められなかった。そこで現在、高分岐糖鎖を合成する酵素であるN-アセチルグルコサミン転移酵素-V (GnT-V)のトランスジェニックマウスを用いて、超百寿者に特徴的な糖鎖(高分岐高シアル酸含有糖鎖)を多く持つモデル動物の作成に取り組んでいる。来年度は、次の2点に焦点を絞って検討する。1.加齢による糖鎖構造変化の縦断研究SONICは、70歳、80歳、90歳、100歳を対象とした大規模な縦断調査コホート(約3,000名)であり、採血などの医学検査の他、運動機能、認知機能、心理・社会的要因、歯学的要因について、3年ごとに継続調査を行っている。そこで、初回調査と継続調査の両方に参加した健康な70歳、80歳、90歳からそれぞれ無作為にサンプルを抽出してN-結合型糖鎖の糖鎖解析を行い、同一人において加齢により高分岐かつ高シアル酸含有糖鎖が増加するかどうか明らかにする。併せて、炎症マーカー(CRP、IL-6、TNF-alphaなど)との比較も行い、加齢により亢進する慢性炎症と高分岐かつ高シアル酸含有糖鎖の増加との関連について考察する。2.超百寿者におけるシアル酸結合様式の解析今年度に構築したシアル酸結合様式の分別誘導体化システムを用いて、超百寿者群及び対照群の血漿タンパク質におけるN-結合型シアル酸含有糖鎖を誘導体化する。MALDI-TOF/MSを用いて解析を行い、超百寿に特徴的なシアル酸の結合様式について明らかにし、免疫応答、感染、炎症などにおける高分岐かつ高シアル酸含有糖鎖増加の生物学的意義について考察する。来年度は次の項目について行う。1.加齢による糖鎖構造変化の縦断研究2.超百寿者特徴的糖鎖の生物学的意義の解明
コラーゲン被覆シリコンチューブを用いた人工食道形成の基礎的研究

食道癌手術では再建臓器に制約があり、その手術侵襲の大きさと臓器犠牲の面より人工食道の開発が待たれている。しかし、現在までに開発された人工食道は吻合不全と狭窄により臨床応用には難しい状況にある。今回、シリコンチューブ(内径3cm、長さ3cm)の外側をEGFを添加したコラーゲンで被覆し人工食道とし、雑種成犬4頭に対して頸部食道の部分置換実験を施行した。全麻下に犬の頸部食道を露出後切断し、人工食道を吸収糸Vicry13-0を用いて端々吻合した。術後は経口摂取を中止し、IVH(60Cal/kg/day、80ml/kg/day)で管理をした。最長生存期間は3週間で、最短生存期間は1週間であった。それぞれ死亡時に解剖し、人工食道部分を含んだ頸部食道を摘出し病理学的に検索した。頸部食道のHE染色にて、術後1週目(7POD)より結合織の増生を認め、術後3週目(21POD)には食道上皮の人工食道外側への進入をみとめた。同検体をKeratin染色したところ食道重層偏平上皮基底層の存在が認められた。以上の結果より本人工食道の臨床応用への可能性が示唆された。しかし、術後の管理に問題が残り長期生存例を得ていないため、術後の狭窄に対しては依然解決されておらず、今後術後管理の改善が必要と思われた。また、上皮再生の改善を目的にEGFを添加しているが、EGFの上皮再生過程における役割を検索するために現在、人工食道コラーゲン層へのEGF添加、非添加の2群による吻合実験を考慮している。
ベントDNAによる転写促進の機構ならびにその応用に関する研究

ウェルシュ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流には3つのphased A-tracts(-66-40)が存在し、低温(25°C)で折れ曲がり(ベント)構造を形成する。するとplcプロモーターとRNAポリメラーゼ(RNAP)との接触領域の拡張がおこり転写が促進される。この分子機構を解明するために、phased A-tractsにウェルシュ菌RNAPαサブユニット(CpRNAPα)が結合するかどうか調べた。精製したCpRNAPα(315aa)、CpRNAPαのN末端ドメイン(αNTD,228aa)、C末端ドメイン(αCTD,79aa)を用いて、gel retardation assayとヒドロキシルラジカルフットプリンティングを行い、phased A-tractsにRNAPαCTDが結合することを明らかにした。さらにphased A-tractsとCpRNAPαの複合体の蛍光偏光をさまざまな温度で測定することにより、低温(25°C)ほどphased A-tractsとRNAPαの親和性が増加すること、またUPエレメントと大腸菌RNAPαでも弱いながら同じ傾向があるごとが確かめられた。UPエレメントのminor grooveに大腸菌RNAPαCTDが結合することが知られていることから、phased A-tractsのminor grooveにCpRNAPαのαCTDが結合していると考えられた。(Katayama, S. et al.2001.)次に、αCTDがphased A-tractsによる低温依存性の転写促進にどれほど貢献しているか明らかにするためにRNAポリメラーゼの再構成実験系を確立して、α2ββ'σとαNTD2ββ'σを作製しようと試みたが、活性をもったRNAポリメラーゼを再構成できなかった。ウェルシユ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流の3つのphasedA-tractsは折れ曲がり(ベント)構造を形成し、RNAポリメラーゼ(RNAP)との接触を強めることにより、低温依存的に転写活性を促進する。このphased A-tractsがRNAPのどの部位と結合するのかまたその分子間相互作用のメカニズムを明らかにするため平成13年度は以下のように研究を進め成果を得た。3つのphasedA-tractsとplcプロモーターを持つDNA断片(3Ap)と精製したウェルシュ菌RNAPαサブユニット(α,315aa)、αサブユニットのN末端ドメイン(αNTD,228aa)、C末端ドメイン(αCTD,79aa)を25°Cで15分間共存させ、gel retardation assayを行った。αとαCTDは3Apに結合したが、αNTDは結合できなかった。次にヒドロキシルラジカルフットプリンティングによりα、αCTDはphased A-tractsを含む領域(-64-37)に結合することが明らかになった。またこのパターンからRNAPαサブユニットがC末端ドメインを介してphased A-tracts DNAのminor groovesに結合することが示唆された。次にRNAPαサブユニットと蛍光ラベルしたphased A-tracts DNAとの見かけの結合定数(K_<app>)を蛍光偏光度測定により算出した。反応温度を45°Cから25°Cに下げると(K_<app>)値は約1/7に減少した。以上のことから、低温での転写促進の主な原因は、phased A-tractsとRNAPαサブユニットの親和力の増加によるものであることが明確になった。(Katayama, S. et al. 2001. FEBS Letters509(2):235-238.)ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流には3つのphased A-tracts(-66-40)が存在し、低温(25°C)で折れ曲がり(ベント)構造を形成する。

するとplcプロモーターとRNAポリメラーゼ(RNAP)との接触領域の拡張がおこり転写が促進される。この分子機構を解明するために、phased A-tractsにウェルシュ菌RNAPαサブユニット(CpRNAPα)が結合するかどうか調べたところ、phased A-tractsにRNAPのαCTDが結合することを明らかになった。UPエレメントのminor grooveに大腸菌RNAPαCTDが結合することが知られていることから、phased A-tractsのminor grooveにCpRNAPαのαCTDが結合していると考えられた。平成14年度は、αCTDがphascd A-tractsによる低温依存性の転写促進にどれほど貢献しているか明らかにするためにRNAポリメラーゼの再構成実験系を確立して、α2ββ'σとαNTD2ββ'σを作製しようと試みた。まずC.perfringensNCTC8237株からα、αNTD、β、β、σの各サブユニットをコードする遺伝子をそれぞれクローニングし、大腸菌の組換えタンパク質の大量発現系を用いて、各サブユニットを大量生産した。精製した各サブユニットを用いてRNAポリメラーゼを再構成してみたが、α2ββ'σ、αNTD2ββ'σともに十分な活性を得ることはできなかった。β'が不活化されていると考えられた。今後この点を注意して、再度試みる予定である。
可視化がん幹細胞による細胞競合の解析と根治的癌治療開発

本研究は癌幹細胞の細胞競合作用の分子的基盤解析とその臨床応用への展開という二つの視点を特徴とする。飢餓状態における癌幹細胞の細胞競合優位性が示唆されているが、分子機序には不明な点が多い。本研究ではアミノ酸欠乏状態における細胞競合について解析した。まずゲノム編集レンチウイルスを構築し、癌抑制遺伝子Xをノックアウト(KO)したヒト肝癌細胞を作成した。X-KOヒト肝癌細胞は、通常環境下では細胞増殖は変化しないが、分岐鎖アミノ酸ロイシン欠乏状態において優位性を示し細胞増殖が維持されることを見出した。アミノ酸欠乏によってオートファジーが誘導され、オートファジーの選択的分解基質であるp62が低下するが、X-KOヒト肝癌細胞ではオートファジーが阻害されておりp62蛋白の蓄積を認めた。p62は酸化ストレスを低下させ、細胞死を抑制する機能を持つことが報告されている。X-KOヒト肝癌細胞ではロイシン欠乏状態でもオートファジー誘導が遅延し、p62が保持されて酸化ストレス抵抗性が亢進することが示された。さらにTET-ONシステムを用いてX発現誘導ヒト肝癌細胞を作成した。ドキソルビシン投与によりX発現を誘導すると、p62が漸減しin vitro細胞増殖の阻害およびin vivo腫瘍形成の抑制を認めた。また肝癌臨床検体を用いた解析では、X発現低下を半数以上に認め、p62発現との負の相関を検出した。X低下症例は、全生存率および無再発生存率の何れにおいても予後不良を呈し、多変量解析の結果独立した予後不良規定因子であることを証明した。肝癌患者のほとんどは慢性肝障害を合併し、特に分岐鎖アミノ酸欠乏を認める。分岐鎖アミノ酸欠乏状態においてX低下肝癌は代謝競合を示すことが明らかとなり、競合的優位性による新たな癌進展メカニズムの存在を示した。アミノ酸代謝制御を用いた癌治療開発への応用が期待できる画期的成果である。28年度が最終年度であるため、記入しない。まずFACSソーティングによって単離した蛍光可視化癌幹細胞と、非対称性分裂によって生まれた非癌幹細胞に対して遺伝子プロファイリングを行なった結果、癌幹細胞に特異的に高発現する遺伝子DCLK1を同定した。癌幹細胞は生体内転移に対して高い優位性を認めるが、DCLK1ノックダウンによって転移巣は完全に喪失することが明らかとなった。実際の臨床検体における解析でも、転移巣におけるDCLK1高発現を検出した。さらにクロマチン免疫沈降法によるDCLK1プロモーター解析の結果、癌幹細胞では活性化マークH3K4me3が優位であるが、非癌幹細胞ではH3K4me3に加えて抑制マークH3K9me3およびH3K27me3も検出された。すなわち癌幹細胞ではopenクロマチン状態、非癌幹細胞ではbivalentクロマチン状態にあり、エピゲノム変化によってDCLK1遺伝子発現スイッチが制御されていることが示された。次にエピゲノム制御因子Xのノックアウト株を、ゲノム編集法(CRISPR/Cas9)によって作成した。Xノックアウト株において幹細胞性の亢進を認めたが、その制御にはヒストン抑制マークH3K9me3が関与する可能性が示唆された。網羅的遺伝子発現解析を用いてH3K9me3によって発現コントロールされている遺伝子候補Yを同定した。Xノックアウト株の幹細胞性亢進はYノックダウンによって抑制されることが明らかとなった。現在Xノックアウト株の生体内腫瘍解析・転移解析に加え、手術検体を用いて臨床病理学的検証を進めている。さらに、治療抵抗性獲得と幹細胞性エピゲノム制御について新たな解析を展開している。癌幹細胞の細胞競合がクロマチンの動的変動(open⇔bivalent)によって制御され、特に癌転移における生体内優位性の獲得に寄与することが明らかとなった。さらにエピゲノム制御因子とクロマチン変化による癌幹細胞の維持メカニズムを示唆する結果が得られ、新しい治療標的候補の可能性について研究展開を進めている。

X低下症例は、全生存率および無再発生存率の何れにおいても予後不良を呈し、多変量解析の結果独立した予後不良規定因子であることを証明した。肝癌患者のほとんどは慢性肝障害を合併し、特に分岐鎖アミノ酸欠乏を認める。分岐鎖アミノ酸欠乏状態においてX低下肝癌は代謝競合を示すことが明らかとなり、競合的優位性による新たな癌進展メカニズムの存在を示した。アミノ酸代謝制御を用いた癌治療開発への応用が期待できる画期的成果である。細胞競合におけるクロマチン動的変動と意義を解析するとともに、癌幹細胞を特異的に標的とする治療開発へと研究をさらに発展させる。現在、癌幹細胞競合におけるスーパーエンハンサーの関与が示唆されるpreliminary dataも得ており、標的分子の同定も進めている。細胞競合研究のトランスレーショナルな展開へ寄与する重要な研究課題である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
代数曲線の巡回拡大の変形について

正標数pの体上定義された代数曲線Cとその位数p^nの自己同型写像σの組(C,σ)を標数零の体上に引き上げることが最終目的であり,本研究では,その為に,Witt群のト-ラスへの変形理論を構成することが差し当たりの目的であった.n次元Witt群W_nはW_<nー1>のG_aによる拡大であり自然な形でZ/p^<nー1>のZ/pによる拡大Z/p^nを含んでいる.このようなW_nのfiltestionを保つ形でのト-ラスへの変形理論が,我々の目的の為には必要であり,こうした形の変形はArtin局所環上の群スキ-ムの拡大のある種の消滅定理が基本であることを発見した.実際,こうした消滅定理を用いて,W_<nー1>のG_aによる拡大の変形の統御,特殊化写像の全射性,constant群スキ-ムZ/p^nを含んだ形でのW_nの変形の存在を示すことが出来た.この理論により,一般次元nに対して,ArtinーSchreierーWitt完全系列の,Kummer型完全系列への変形の構成に成功した.更に,こうした変形群スキ-ム上の1次コホモロジ-群を自然に低次元群スキ-ムのコホモロジ-群の計算に還元することが出来,望みうるげでコホモロジ-群を決定することが出来,上記統一された完全系列が実際に,ArtinーSchreierーWitt理論とKummer理論の統一を与えていることが示された。しかし乍ら,この理論は充分に一般的ではあるが,求めた変形群スキ-ムの定義環を特定することが難しく,別の方法を工夫しなければならない.その為に,isogenyの変形を具体的に見ることにより,求めるW_nのト-ラス(G_m)^nへの変形の定義環をZ_<(p)>[μ_<p^n>]に特定することに成功した.また,こうした群スキ-ムは,群環の単元群からも構成されるべきであり,この方面からは,3次元まで成功している。本年度の我々の主目的は,Witt群のト-ラスへの変形理論を完成し,これを用いて,ArtinーSchreierーWitt理論とKummer理論の統合を行うことであった。Witt群のト-ラスへの変形の構成については我々の今までの研究により,その方法論は確立されており,1)環スキ-ムを用いるもの,2)N'eron blowーupを用いる方法,3)低次元の変形の拡大を計算する方法,の3通りがあった。このうち最っとも有力な方法は3番目の方法であり,本年度の研究の大半は,拡大群の計算方法の確立に費やしたものである。本年度の研究成果は次の通りである。1,低次元のWitt群のト-ラスへの変形同志の拡大の構成に関する障碍は,Artin局所環上のコサイクルとして表現され,重要なことは,この障碍は基礎環の分岐拡大をとれば消滅することである。2,1の結果を用いて,求める拡大の計算を,エタ-ル群スキ-ム(有限)の拡大の計算,特殊ファィバ-の拡大の計算に結び付けることが出来,理論的に完全に,ArtinーSchreterーWitt完全系列の,Kummer型完全系列への変形を記述することが出来た。

3,上記の方法では,期礎環の分岐の度合を評価することは出来ないが,更に,障碍のコサイクルを具体的にArtinーHapse exponentialを用いて処理することにより,その分岐指数の評価が得られた。このようにして得られた成果は,理論的には充分ArtinーSchreierーWitt理論とKummer理論の統合を与えるものであることは分るのであるが,具体的に,群環の単数群との関係を記述することはこれからの仕事である。しかし,巡回群の位数がp^n(n≦3)については,既にその具体的記述が得られている。正標数Pの体上定義された代数曲線Cとその位数がの自己同型写像σの組(C,σ)を標数零の体上に引き上げることが最終目的であり,本研究では,その為に,Wiet群のト-ラスへの変形理論を構成することが差し当たりの目的であった。n次元Witt群WnはW_<mー1>のGaによる拡大であり,自然な形でZ/p^<nー1>のZPによる拡大Z/P^nを含んでいる。このようなWnのfiltationを保つ形でのト-ラスへの変形理論が,我々の目的の為には必要であり,こうした形の変形はArtin局所環上の群スキ-ムの拡大のある種の消滅定理が基本であることを発現した。実際,こうした消滅定理を用して,W_<nー1>のGaによる拡大の変形の統御,特殊化写像の全射性,Constant群スキ-ムZ/P^nを含んだ形でのWnの変形の存在を示すことが出来た。この理論により,一般次元nに対して,ArtinーSchrierーWitt完全系列の,Kawmer型完全系列への変形の構成に成功した。更に,こうした変形群スキ-ム上の1次コホモロジ-群を自然に低次元群スキ-ムのコホモロジ-群の計算に環元することが出来,望みうる形でコホモロジ-群を決定することが出来,上記統一された完全系列が実際に,ArtinーSchreinーWitt理論とKummer理論の統一を与えていることが示された。しかし乍ろ,この理論は充分に一般的であるが,求めた変形群スキ-ムの定義環を特定することが難しく,別の方法を工夫しなければならない。その為に,isogauyの変形を具体的に見ることにより,求めるWnのト-ラス(Gm)^nへの変形の定義環をZ/(p)〔Mp^n〕に特定することに成功した。また,こうした群スキ-ムは,群環の単元群からも構成されるベきであり,この方面から,3次元まで成功している。
In vivo脊髄抑制性シナプス入力の生理的役割とその可塑的変化の解析

痛みの伝達に対する抑制性シナプス応答の生理的役割を明らかにするために、以下に焦点を合わせて研究を遂行した。まず、形態学的特徴から脊髄膠様細胞を分類し、樹状突起を頭尾側方向に伸ばすislet細胞が主にGABAなどを含有し、抑制性シナプス伝達に重要な役割を果たしていることが示唆された。また、神経因性疼痛モデル動物を作製して、脊髄の触刺激による抑制機序の変化を解析した。行動実験により触刺激で逃避行動を示すアロディニアが観察されたモデル動物を用いて、抑制性シナプス応答を解析した。しかし、触刺激によって誘起される抑制性シナプス応答はその振幅・発生頻度ともに正常と有意な差は得られなかった。また、痛覚過敏を呈した炎症モデルにおけても抑制性シナプス伝達になんら変化は認められなかった。一方、炎症モデル脊髄膠様質への興奮性シナプス伝達に異常が生じることが明らかになった。即ち、振幅の大きな自発性EPSCの発生、および触刺激に対するEPSCの脱感作が消失するなど過剰な興奮性入力が増大する、さらに、炎症患部に受容野を持つ細胞に特異的にCa^<2+>透過性AMPA受容体を介するEPSCが発生することが見いだされた。この脊髄における炎症患部からの興奮性入力の可塑的変化は、特にC線維の感作によって惹起されることが示唆された。脊髄後角における抑制性シナプス応答の生理的役割を明らかにするために、in vivoパッチクランプ法を用いて皮膚への生理的感覚刺激に対する抑制性シナプス応答を記録・解析し、併せてスライス標本を用いた神経回路の同定および行動解析を行った。その結果、一側の後肢皮膚に侵害刺激を加える、あるいは炎症を起こすと逃避行動に加えて、患側の後肢を舐める、即ち患部に非侵害性の刺激を加える行動が観察された。In vivoパッチクランプ法を用い、ホールセルクランプ法による電流固定下で脊髄後角表層の膠様質細胞から膜電位を記録すると、-70mVの静止電位を有し、自発性の興奮性シナプス後電位(EPSP)が誘起された。皮膚へ機械的痛み刺激を加えると、EPSPの発生頻度と振幅が著明に増大し、活動電位が発生した。次に、機械的痛み刺激と同時に、その周囲に非侵害性の触刺激を加えると活動電位の発生頻度が著明に抑制された。電位固定下で興奮性シナプス後電流(EPSC)を記録すると、機械的痛み刺激によって振幅の大きなEPSCが誘起された。一方、同一細胞におけるGABAやグリシンを介する抑制性シナプス後電流(IPSC)は非侵害性の触刺激によって誘起された。触刺激によるIPSCの受容野は、機械的痛み刺激によるEPSCの受容野を中心とし、その周辺部まで及ぶ広い面積を有した。次に、脊髄スライス標本を用いて一次求心性線維の後根誘起のシナプス応答を解析すると、EPSC、IPSCともにAδ線維とC線維を介する応答である事が示された。以上より、脊髄膠様質における抑制性シナプス応答は主に、非侵害性の触刺激によって誘起され、機械的痛みの伝達を有効に抑制する事が明らかになった。
人工関節のaseptic looseningの病態及び治療に関する研究―生体内摩耗粉の生物学的活性・副甲状腺関連ペプチド(PTHrP)の病理的役割及びビスフォスネートの治療効果について―

初年度の本研究からasepticlooseningを生じた人工関節の置換時に採取された関節液中のPTHrPが通常の血中濃度の10から100倍の濃度で認められること、また、骨吸収に関与していると思われる偽滑膜様組織が抗PTHrP抗体で陽性に染まることが判明した。PTHrPが本来、骨吸収を促す作用があることを考慮すると、人工関節のlooseningとそれに伴った骨融解に関与していることが考えられる。これらの研究結果を踏まえて、2年度年はPTHrPを誘導する因子を検索する実験を予定した。人工関節のlooseningにともなった骨吸収に関与する因子は多数考えられるが、今日、最も大きな要因としてはポリエチレンの磨耗粉が指摘されており、この面から検索を行うこととした。しかし、人工関節磨耗粉中のポリエチレンは工学的に粉砕したものと性状が異なっていることが指摘されており、生体中で作られた磨耗粉を直接使った実験を計画し、まず、人工関節再置換時に取り出した、偽滑膜様組織から、ポリエチレン粉末の抽出を行った。様々な方法を試みたのち、ポリエチレンが化学的に安定なことを利用して、取り出した組織をまずキシレンに浸し、PMMAを溶かした後、硝酸と塩酸に順次溶解して、溶解液を中和後、フィルターをかけ、フィルター上にポリエチレンを集める方法がシンプルで効率よくポリエチレンを回収できた。集めたポリエチレンを走査電顕で観察すると線状のものや球状のものが観察され、長さのサイズは前者が平均5.3ミクロン、後者が平均0.2ミクロンであった。さらに、これらの抽出ポリエチレンを貧食したマクロファージが刺激されPTHrPを産生するかを検索する予定であったが、置換症例が少なく、十分な抽出サンプルが取れずに現在、ポリエチレンの収集を行っている。人工関節再置換手術標本の解析人工股関節再置換手術時に偽関節胞内の貯留液を採取し副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHrP)を測定した。測定にはアレクロPTHrPキットを用いた。全8例の測定値は全て、正常血漿中の正常値より高値であり、35pmol/L-1200pmol/L(平均103pmol/L)であった。組織学的検案ではPTHrPアミノ端特異抗体を用いた免疫組織染色を行い、骨吸収巣の偽滑膜様線維組織にPTHrP免疫活性を認めた。マクロファージのin vitrostudy.マウス腹腔マクロファージを生理食塩水腹腔洗浄にて採取した。プラスティックシャーレ上にて24時間培養し、培養上清中にポリエチレン粉体を添加してさらに24時間培養し、培養液中のPTHrPを測定した。偏光顕微鏡下に貧食細胞数を測定した。培養液中のPTHrPは検出されなかった。また、貧食細胞は全細胞の平均8%であった。これはポリエチレン粉体が浮遊してしまうためであると考えられた。そこで、プラスティックシャーレ上に播種し、付着した腹腔細胞を6時間後にEDTA/トリプシン処理にて、回収し、ポリエチレン粉体と混和して、コラーゲンゲル内で3次元培養を行い、48時間後に培養上清と細胞を遠心分離して回収し、培養上清のPTHrPと細胞の貧食率を測定した。貧食率は平均12%であった。培養上清中にはPTHrP免疫活性が認められた。これまでの本研究からasepticlooseningを生じた人工関節の置換時に採取された関節液中のPTHrPが通常の血中濃度の10から100倍の濃度で認められること、また、骨吸収に関与していると思われる偽滑膜様組織が抗PTHrP抗体で陽性に染まることが判明した。

PTHrPが本来、骨吸収を促す作用があることを考慮すると、人工関節のlooseningとそれに伴った骨融解に関与していることが考えられる。これらの研究結果を踏まえて、本年度はPTHrPを誘導する因子を検索する実験を予定した。人工関節のlooseningにともなった骨吸収に関与する因子は多数考えられるが、今日、最も大きな要因としてはポリエチレンの磨耗粉が指摘されており、この面から検索を行うこととした。しかし、人工関節磨耗粉中のポリエチレンは工学的に粉砕したものと性状が異なっていることが指摘されており、生体中で作られた磨耗粉を直接使った実験を計画し、まず、人工関節再置換時に取り出した、偽滑膜様組織から、ポリエチレン粉末の抽出を行った。様々な方法を試みたのち、ポリエチレンが化学的に安定なことを利用して、取り出した組織をまずキシレンに浸し、PMMAを溶かした後、硝酸と塩酸に順次溶解して、溶解液を中和後、フィルターをかけ、フィルター上にポリエチレンを集める方法がシンプルで効率よくポリエチレンを回収できた。集めたポリエチレンを走査電顕で観察すると線状のものや球状のものが観察され、長さのサイズは前者が平均5.3ミクロン、後者が平均0.2ミクロンであった。さらに、これらの抽出ポリエチレンを呑食したマクロファージが刺激されPTHrPを産生するかを検索する予定であったが、置換症例が少なく、十分な抽出サンプルが取れず現在、ポリエチレンの収集を行っている段階である。
骨吸収および神経細胞変性におけるリソゾ-ムシステインプロテア-ゼ群の関与

(1)骨吸収とリソゾ-ムプロテア-ゼの研究:数週間低Ca食でラットを飼育すると、骨粗鬆は進展し、大腿骨中のカテプシンB及びL活性は数倍に増加したが、コラ-ゲナ-ゼ活性の上昇はなかった。Eー64を低Ca食動物に投与すると、骨中のカテプシンBの低下と共に血中のCa濃度の上昇が著明に抑制された。しかし、カテプシンBの特異的なインヒビタ-の投与では、骨中のカテプシンBの低下にかかわらず血中Ca濃度の低下は起こらなかった。マウス頭頂骨の培養実験でも骨吸収を促進するPTHや活性型ビタミンDの添加により、カテプシンL(大部分はプロカテプシンL)がカテプシンBより多く培地中に放出されることがわかった。さらに、中のカテプシンL量はPTHにより増加しており、強いコラ-ゲン分解能をもつカテプシンLの重要な役割が示唆された。形態学的手法で、カテプシンLは破骨細胞に局在することを証明した。(2)神経細胞の変性とリソゾ-ムプロテア-ゼ:遅発性神経細胞死のモデルとしてスナネズミの虚血脳を用いて行なった。カテプシンL,B及びCは正常神経細胞ではリソゾ-ムに局在するが、神経細胞の変性と共に染色性が弱くなるもの、逆に強くなるものが混在した。一方、カテプシンHは正常神経細胞には局在しないが、かなり初期より変性神経細胞の周辺のグリア細胞に陽性となり、次第に強くなる。反応性アストログリアは7日目をピ-クとして脱落細胞の周辺に多数出現した。カテプシン群は神経組織の変性過程の動態を調べるための良いマ-カ-となった。アルツハイマ-脳では神経細胞の変性につれ、リソゾ-ムとその内容物が細胞から出てくる、つまり細胞外の老人班にもカテプシンの免疫反応が局在することを見いだした。カテプシン群は他の膜を破壊する酸水解酵素とともに前駆体蛋白を切断し、βー蛋白の形成を促進するかもしれない。以上の病態に関する研究と並んで関連の研究も進展した。本研究は2つの病態におけるリソゾ-ムプロテア-ゼ群の関与の機構と制御を明らかにし、治療への指針を得ることを目的としている。神経細胞の変性とリソゾ-ムプロテア-ゼに関する御究は遅発性神経細胞死のモデルとしてスナネズミの虚血脳を用いて行った。スナネズミの両側総頭動脈を5分間結さつ後、再開流させると海馬のCAI神経細胞が3日目から変性し、714日目には細胞が脱落する。カテプシンL、B及びCは正常神経細胞内に顆粒状(おそらくリソゾ-ム)に局在するが、神経細胞の変性脱落と共に減少傾向がみられた。しかし、海馬CAI領域ホモジネ-トの比活性は変性共にやや上昇していた。一方、カテプシンHは正常神経細胞には局在しないが、脱落と共に逆に上昇し、グリア細胞の一部と変性神経細胞が強く染色された。ミクログリアのマ-カ-として用いたC3dRは3日目ぐらいから出現し、7日目では脱落細胞の周辺に多数の濃染細胞がみられた。

この結果は、神経細胞の変性につれ、細胞内のカテプシンは他の成分と共に減少(細胞外への放出も含む)し、細胞死が顕性となる3日目以降ミクログリアを中心とするスカベンジャ-細胞(カテプシンHを含む)の出現が顕在化することを示唆する(木南、石堂)。骨吸収とリソゾ-ムプロテア-ゼの研究は低Ca食による実験的骨祖鬆症ラットを用いて、骨吸収におけるカテプシンの役割を調べた。数週間低Ca食で飼育すると、大腿骨中のカテプシンBおよびL活性は数倍に増加していたが、コラ-ゲナ-ゼ活性の上昇はなかった。Eー64を低Ca食動物に投与すると、骨中のカテプシン活性の低下と共に血中Ca濃度の上昇が著明に抑制された。しかし、カテプシンBの特異的なインヒビタ-の投与では骨中のカテプシンBおよびLの低下にかかわらず血中Ca濃度の低下は起こらなかった。以下骨吸収に関与するカテプシンLの重要性が示唆された(勝沼)。マウス頭頂骨を用いた骨器官培養実験系で、PTH、活性型ビタミンD添加によりCa^<2+>遊離、コラ-ゲン分解、リソゾ-ム酵素の分泌が進されることがわかった。カテプシンB、Lも分泌促進されているかをみるために、無血清培地を用い、培地中に遊離したカテプシン量を調べると、カテプシンL(大部分プロカテプシンL)がPTH,ビタミンD依存的に放出されていた。カテプシンBの分泌量はLよりもすっと少なかった。さらにこのカテプシンLの分泌量の増加の一部はPTHによる骨内カテプシンの増加によるという結果を得ており、mRNAのレベルの変化を現在追求中である。ラット大腿骨におけるカテプシンB,L,Hの分布を免疫組織学的に調べ、これらの酵素は殆んどが破骨細胞に局在することがわかった。また、骨組織はカテプシンLを他の酵素より多く含むことも確認された。スナネズミを用いた虚血に続く遅発性神経細胞死ではさらにマ-カ-を増やし、そのプロセスを追求した。ニュ-ロンの変性の過程で細胞内のカテプシンは正常細胞よりむしろ強く染まるものがあること、変性神経細胞の処理にミクログリア(カテプシンH陽性)が遊走してき、神経細胞が脱落する7ー14日頃になると、反応性アストログリアが著明に増殖してくるというプロセスを確認できた。アルツハイマ-脳ではニュ-ロンの変性につれ、リソゾ-ムとその内容物がニュ-ロンから出てくる、つまり細胞外の老人班にもカテプシンの免疫反応が局在することを見い出した。カテプシン群は他の膜攻撃性の酸水解酵素とともに前駆体蛋白を切断し、βー蛋白の形成を促進するかもしれない。本研究の遂行に関連した研究もおおいに進歩した。
新規ペプチドホルモン"グレリン"による生体機能調節機序の解明

申請者らがヒトおよびラットの胃から発見したグレリンは、成長ホルモン分泌促進および摂食亢進作用をもつ新しい生理活性ペプチドである。グレリンは3番目のアミノ酸セリンが、脂肪酸であるオクタン酸によって修飾されており、しかもその修飾基の存在が活性発現に必要という、これまでに知られていない構造をしている。申請者らはグレリンに関して研究期間中に次のような研究を行った。(1)ヒトでは複雑なグレリン分子型が存在する。ヒトの胃抽出物中ではメイン分子型のオクタン酸で修飾されたグレリン(C8:0)以外に、i、C末端のアルギニン残基(Arg)が欠けたグレリン-(1-27)(C8:0)ii、オクタン酸ではなく炭素数10個のデカン酸(decanoic acid)によって修飾されたグレリン(C10:0)iii、オクタン酸ではなく、炭素数10個で不飽和結合が一つ含まれたdecenoyl基によって修飾されたグレリン(C10:1)iv、C末端のアルギニン残基(Arg)が欠けた、炭素数10個のデカン酸によって修飾されたグレリン-(1-27)(C10:0)の4つのマイナー分子型が存在した。以上の結果から、グレリンはプロセシングの過程で、複数の分子型が生成することがわかった。(2)グレリン産生における胃の寄与について調べた。胃全摘患者で手術前、手術後の血中グレリン濃度を測定した。その結果、胃全摘後に血中グレリン濃度は約半分くらいに減少するが、その後次第に元のレベルに近づくことがわかった。これは腸管や膵臓などの胃以外のグレリン産生分泌が代償性に増加するためと考えられた。(3)ほ乳類以外のグレリンわれわれは他の脊椎動物種におけるグレリンの構造解明を行った。その結果、ほ乳類胃組織には全てグレリンが存在した。このようにグレリンは脊椎動物全部に存在して、代謝・エネルギー調節に関与するホルモンであることが明らかになった。(4)グレリン・ノックアウト・マウスの作製を行い、ホモ欠損マウスを得た。現在その表現型を解析している。申請者らはグレリンに関して本年度中に次のような研究を行った。

これらのマイナー分子型のグレリンは活性的にはメインのグレリンの強さとほぼ同じである。以上の結果から、グレリンはプロセシングの過程で、複数の分子型が生成することがわかった。これらの分子型が、ある特定の生理作用を公担しているのか、特定の疾患でいずれかが特異的に増加・減少するのか、など今後の解析が必要である。(2)グレリン産生における胃の寄与について調べた。胃全摘患者で手術前、手術後の血中グレリン濃度を測定した。その結果、胃全摘後に血中グレリン濃度は約半分くらいに減少するが、その後次第に元のレベルに近づくことがわかった。これは腸管や膵臓などの胃以外のグレリン産生分泌が代償性に増加するためと考えられた。(3)ほ乳類以外のグレリングレリンのユニークな構造がラットとヒトにのみ見られる例外的なものなのか、あるいは他の動物種でも認められるグレリンの特徴なのかを調べるため、われわれは他の脊椎動物種におけるグレリンの構造解明を行った。本年度、Bullfrog(食用ガエル)、ニワトリ、ウナギのグレリンの構造を解明した。その結果、ほ乳類胃組織には全てグレリンが存在した。これらのグレリンは、カエルでは3番目のスレオニン残基、ニワトリとウナギでは3番目のセリン残基が脂肪酸のオクタン酸あるいはデカン酸で修飾されていた。このようにグレリンは脊椎動物全部に存在する、代謝・エネルギー調節に関与するホルモンであることが明らかになった。1)ヒト胃からのペプチド抽出画分には複数のグレリン分子フォームが存在した。これらはC末端部分のプロセシングサイトであるArgが欠けたペプチド長の違うものと、脂肪酸修飾基の違いによるものとに分類された。これらの違いによって少なくとも5種類以上のグレリン分子型が存在することが明らかとなり、そのうち5種類を精製・構造決定した。これらの分子型の活性はほとんど同じで、グレリンの活性部位がN末端部分であることを考えると、C末端部分の活性発現への寄与は少ないと考えた。2)胃の摘出手術によって血中グレリン濃度は約半分に減少することがわかった。術後、血中グレリン濃度は次第に増加していくが、術前の78割までしか回復しない。このことから胃のグレリン産生への寄与は約50%であり、胃摘出によって腸管や膵臓から代償的にグレリン産生分泌が増えるものと考えられた。3)遺伝子異常が原因のプラダーヴィリー症候群患者(PWS)は摂食亢進・肥満を示す。PWS患者での血中グレリン濃度の変化を調べた。PWSでは血中グレリン濃度の著しい増加が認められた。このグレリン濃度上昇はPWS患者が過食を示す前から増加していた。4)非哺乳類のグレリン精製と構造解析両生類、鳥類、魚類のグレリンの構造を明らかにした。その結果、グレリンはほ乳類にだけ存在するのではなく、脊椎動物一般に広く存在することがわかった。また脂肪酸による修飾基も、ほ乳類グレリンに特有のものではなく、両生類、鳥類、魚類のグレリンでも認められる。このことからグレリンは進化の過程においてもずっと保存され、生体にとって必須の生理活性ペプチドであると考えられた。5)グレリン・ノックアウト・マウスの作製を行い、ホモ欠損マウスを得た。現在その表現型を解析している。