hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核融合プラズマ燃料供給のための固体水素ペレット生成射出装置の高耐久化

平成13年度に行った基本設計に基づいた定常的な連続水素固化を行う部分の要素開発試験が成功し、これをまとめた方法について4月に特許出願を行った。テストスタンドを製作し、要素開発を組み合わせての基本的な総合試験を進めた。冷凍は2台のGM冷凍機(4.2Kで3W)用いて行い、室温からの冷却開始後、4時間で10K以下の必要な語句低温を得ることができた。また、後述する水素の連続固化と射出成形による負荷にも対応が可能であった。固化した水素を棒状の射出成形する引き出し部分については実際のプラズマ実験への応用を展望して、対象を大型ヘリカル装置で得られる高温プラズマに対応するものとして、直径を25mmとした。この時、15mg/秒の連続固化に成功し、射出成形については35mm/sの引き出しを得ることができた。温度範囲は水素(軽水素)に対して10.2Kから11.3Kが最適であり、11.8Kを越えると固体ペレットの質が顕著に劣化することが観測された。最大引き出し速度で1000秒間の運転を試みたが、この間の温度上昇を1K以下に抑えることが可能であり、冷却能力と制御性が確認された。この引き出された棒状の固体水素を切断し、ペレットを作成する駆動機構を製作した。最大11Hzまでの繰り返しで良好なペレットを製作することができ、10Hzで1000秒間、すなわち1万個のペレット製作について信頼性は99%を超えることを実証した。これらのペレットは連続的に加速ガスによって射出される。現在までに得られた健全なペレットの速度は400m/sから550m/sである。今後、加速ガス圧および射出バルブの開度の調整により、この速度の制御範囲をより低速から高速まで広げることが課題である。また、連続運転の繰り返しの際に射出されずに残った固体水素が熱伝達や真空度に悪影響を及ぼしており、この解決を今後図っていく。核融合プラズマへの水素燃料供給を高効率で行うために、固体水素ペレツト入射の定常運転に向けた高耐久性をキーワードとした技術開発を進めている。平成14年度までに製作したテストスタンドを用いて高純度水素ガスの連続固化と直径2.5mmの棒状への射出成形を行い、1分あたり10ccの棒状固体水素を1時間にわたり生成することに成功した。この棒状固体水素を2.5mmの長さで切り出しペレットに成形し、ガスで射出を行う動作を最大11Hzまで行うことができている。平成15年度はこれらの実験で問題となった点の解決を図り、性能と信頼性の向上を目指した。ペレット成形中での固体水素の昇華によって真空度が悪化し、温度の制御性が劣化することが一つの問題となっていたので、テストスタンドの真空排気能力の向上と熱侵入の抑制を図った。また、ペレットの射出に関してはこれまで射出弁が加速ガスの圧力によって開度が制限を受けていたが、射出弁を駆動するソレノイド部を強化し、弁の開度と加速ガスの独立制御性を改善させた結果、500m/s以上での速度での健全性が大きく向上した。ペレット生成射出装置を実機応用テストするため、大型ヘリカル装置の高温プラズマへの入射を試みた。これらの実験を通じて20万発以上の射出を実施したが、今のところ不具合は生じておらず、このプロトタイプ機の耐久性が高いことを示した。
ソフトウェアサイバネティクスに基づいた自律的信頼性評価技術の開発

通常,ソフトウェアのコーディングが完了した時点で,当該製品の仕様書と詳細設計書に基づいて作成されたテストケースを投入し,ソフトウェアのデバッグ作業が実施される.テストの進捗状況を逐次監視しながらソフトウェア信頼度を高い精度で予測し,「当たり前品質としての信頼性」を定量的に評価することが行われる.本研究では,ソフトウェアサイバネティクスと呼ばれる新しい概念を導入することにより,自律的に信頼性評価を行うためのスキームを提案し,テストの進捗状況を学習しながら信頼度を推定する適応オンライン評価システムのプロトタイプを世界に先駆けて開発した.具体的には,(a)フォールト検出数に関するデータや各種メトリクスデータに基づいて,フィールド情報を過不足なく信頼性評価に活用するための統計的推論機構の開発,(b)自律的かつ適応的にソフトウェア信頼性を評価するオンラインアルゴリズムの開発,(c)フィードバック原理と自己組織化原理に基づくテスト工程の制御,などを行うための方法論を展開した通常,ソフトウェアのコーディングが完了した時点で,当該製品の仕様書と詳細設計書に基づいて作成されたテストケースを投入し,ソフトウェアのデバッグ作業が実施される.テストの進捗状況を逐次監視しながらソフトウェア信頼度を高い精度で予測し,「当たり前品質としての信頼性」を定量的に評価することが行われる.本研究では,ソフトウェアサイバネティクスと呼ばれる新しい概念を導入することにより,自律的に信頼性評価を行うためのスキームを提案し,テストの進捗状況を学習しながら信頼度を推定する適応オンライン評価システムのプロトタイプを世界に先駆けて開発した.具体的には,(a)フォールト検出数に関するデータや各種メトリクスデータに基づいて,フィールド情報を過不足なく信頼性評価に活用するための統計的推論機構の開発,(b)自律的かつ適応的にソフトウェア信頼性を評価するオンラインアルゴリズムの開発,(c)フィードバック原理と自己組織化原理に基づくテスト工程の制御,などを行うための方法論を展開したソフトウェアメトリクスデータの活用技術を精査し、ソフトウェアテスト工程において観測される各種メトリクスデータとフォールト検出頻度データを融合した、新しい信頼性モデルを定式化した。自律的ソフトウェア信頼性評価ツールにおけるデータ処理機能の開発を目標に掲げ、モジュールテスト、結合テスト、システムテストを実施する過程で観測される各種メトリクスデータをデータベース上に記録し、さらに各々のテストにおいて観測されたフォールト検出頻度データを時系列情報として格納するためのファイルシステムを開発した。ソフトウェア信頼性モデルにおけるパラメータ推定においては、EMアルゴリズムに基づいたパラメータ推定法をベイズ推定の枠組みで改良し、残存フォールト数の推定問題に適用した。モデルに含まれる超パラメータの自動チューニングのために、ABICに基づいて逐次更新を行う方式を開発した。また、分散開発環境をシミュレートするために、システムテスト環境を仮想的に模擬するための実機システムを整備した。改良したパラメータ推定アルゴリズムに基づいて、既存の信頼性評価ツールSRATSを拡張し、さらに階層ベイズ構造に発見的自己組織化(GMDH)アルゴリズムを適用することで、環境(採集されたデータ)に応じて信頼性モデルを学習させるための自律計算技術を開発した。最終的に、今年度得られた理論的成果を統合し、システムテスト環境に対して自律的に適合しながら進化する信頼性評価アルゴリズムを開発し、整備した実機システム上にこれを実装した。前年度の成果に基づいて,モジュールテストと結合テストに対する信頼性評価技術の開発を行った.具体的には次のように要素技術を列挙することができる。(1)ソフトウェア・アーキテクチャモデルの開発:多数のモジュール(コンポーネント)から構成されるソフトウェア・アーキテクチャ上で、モジュールテストの実行プロファイルを記述するための信頼性モデルを定式化した。実行プロファイルの推移率や結合テストの失敗確率はすべて可観測ではないため、パラメータの推定にはEMアルゴリズムもしくは変分ベイズアルゴリズムを用いた。(2)実験システムの追加整備:分散開発環境下でのモジュールテスト環境を仮想的に模擬するために実機システムを整備した。これにより、モジュールテスト、結合テスト、システムテストという一連のテスト環境を連続してシミュレート出来る実験環境が整った。(3)適応オンライン推定に基づくテスト進捗過程の再構成:前年度に開発されたシステムにモジュールテストに対する信頼度推定機能を付加し、テスト工程全般を通じて信頼度を推定するためのスキームを確立すした。(4)テスト環境の変化への対応:テスト工程において発生する「フォールトの検出傾向の変化」時点を統計的に検出する機能を追加し、テスト環境の変化(モデルの構造変化)に対応することの出来るロバストな推定スキームに変更した。(5)ウェッブアプリケーションの開発と実証研究:得られた理論的成果を基に、自律的ソフトウェア信頼性評価を実施するためのウェッブアプリケーションの開発と、実工程で観測されたデータに基づいて実証研究を行った。
長期記憶獲得におけるシナプス伝達の関与

<研究計画>ショウジョウバエの長期記憶獲得には時計遺伝子period(per)の発現が必要である。このことはper遺伝子の発現している神経細胞が長期記憶獲得に関与していることを示唆する結果である。そこで、per遺伝子発現部位のシナプス伝達を阻害することにより、長期記憶獲得にシナプス伝達が関与しているかどうかを明らかにする研究を行った。ショウジョウバエのshibire^<ts1>突然変異を正常な神経細胞に強制発現させると、その神経細胞でシナプス小胞のリサイクリングを温度依存的に抑制し、神経伝達物質の放出を阻害することができる。酵母由来の転写因子GAL4のターゲット配列であるUASにshibire^<ts1>をつないだ遺伝子を導入した系統(UAS- shibire^<ts1>)とper-GAL4系統(per発現部位でGAL4が発現している)を交配すれば、そのFl個体ではper発現部位のシナプス伝達を温度依存的に阻害することができる。これらのハエを用い、雄の求愛行動を利用したCourtship conditioningと呼ばれる長期記憶の測定法を利用した行動解析を行った。<研究経過>per発現部位のシナプス伝達を阻害しても長期記憶の獲得や維持はできるが、思い出すこと(長期記憶の呼び出し)ができなくなることが明らかとなった。また、per発現部位のシナプス伝達を阻害しても、雄の歩行活動や求愛行動は変化が見られず、短期記憶も正常に形成されることが明らかとなった。これらの結果は、per突然変異体の短期記憶は正常で長期記憶特異的な異常を示すことと一致する。ショウジョウバエ雄の求愛を利用した長期記憶の測定法(Courtship conditioning)を考案し、CREBおよびperが長期記憶獲得に関与していることを証明した。また、CREB以外のperの転写因子であるdCLOCKおよびCYCLEは長期記憶獲得に関わらないことを明らかとし、第24、25回日本神経科学大会において発表した。現在は、ショウジョウバエ脳内における長期記憶獲得に必須なper発現部位のシナプス伝達を阻害することにより、長期記憶獲得にシナプス伝達が関与しているかどうかを明らかにする実験を進行中である。ショウジョウバエのshibire^<ts1>突然変異は温度依存的にシナプス小胞のリサイクリングを完全に抑制する事が知られている。shibire^<ts1>を正常な神経細胞に強制発現させると、その神経細胞でシナプス小胞のリサイクリングを温度依存的に抑制し、神経伝達物質の放出を阻害することができる。酵母由来の転写因子GAL4のターゲット配列であるUASにshibire^<ts1>をつないだ遺伝子を導入した系統(UAS-shibire^<ts1>)とper発現部位でGAL4が発現しているper-GAL4系統を交配すれば、そのF1個体ではperが発現している部位にGAL4が発現し、GAL4発現部位でshibire^<ts1>が発現する。従ってper発現部位のシナプス伝達を温度依存的に阻害することができる。シナプス伝達を阻害した個体について長期記憶獲得が正常に行われるかどうかをCourtship conditioningにより今後解析する。
クローナル植物を用いた低線量放射線被曝の遺伝的評価

原発事故の被災地域における低線量放射線被ばくの蓄積が、そこに生育する植物の塩基配列の変異に与える影響についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、日本各地に遺伝的に同一な個体が生育するモウソウチクを対象として、様々な放射線量の地域からサンプルを収集し、次世代シーケンサーから得られる大量の塩基配列データによって、生育地の空間線量と塩基配列の突然変異数との関係を評価した。その結果、空間線量の増加に伴う変異量の増加は認められなかった。したがって、比較的空間線量が高い環境で生育しているモウソウチクであっても、事故後に塩基配列の突然変異を急激に蓄積しているということはないと考えられた。初年度は、福島県内において放射線量の高い地域と低い地域、および広島県など地質により自然放射線量が高い地域について、計5か所程度の現地調査、サンプルの採取を行うことを計画していたが、サンプルの採取許可の取得等が予想より順調に進んだため、現地調査やサンプルの採取地点を大幅に増やした。具体的には、福島県、宮城県、福井県、兵庫県、島根県、山口県の計18カ所において現地調査およびサンプルの採取を行った。福島県内においては、相馬市、南相馬市、福島市、川俣町、飯舘村、浪江町、大熊町、いわき市からサンプルを採取し、0.367.80μSv/hの様々な空間線量の環境下に生育するタケノコのサンプルおよび土壌を採取することができた。土壌サンプルの放射性物質の計測については、予想より、多数のサンプルが採取できたこと、遺伝解析に用いるサンプルを増やしたことから、作業効率を考慮し当初の計画を変更し、遺伝解析によってデータが得られたのちに計測することとした。モウソウチクのクローン解析については、申請者らによって開発されたマイクロサテライトマーカー(Kaneko et al.未発表)を用いて、日本国内のモウソウチクが同一クローンであることを順次確認している。ただ、新たに開発されたマーカーによってモウソウチクの原産地である中国のサンプルを解析した結果は、中国の一部の地域においては、複数クローンが存在することを示唆していた(Jiang et al. 2013)。今後、検証が必要である。次世代シーケンサーによる解析については、当初は、RADマーカー解析は、予備実験の結果、今回に解析においては必ずしも最善の手法ではないと考えられたことから、研究協力者の陶山佳久準教授(東北大)が開発中の手法で解析を行うこととし、現在、解析の準備を進めている。本研究では、有性生殖による遺伝子の組み換えが起こっていない個体(同一クローン)が広域に分布する植物を対象に、次世代シーケンサーから得られる大量の塩基配列情報を用いて、低線量の放射線が生物の塩基配列突然変異に与える影響の解析を行っている。本年度は、これまでに収集したモウソウチクのサンプルを対象に、マイクロサテライトマーカーによる解析および次世代シーケンサーを用いた解析行った。解析は、福島県内9カ所、福島県外5カ所から採取したモウソウチク計94サンプルを用いた。マイクロサテライトマーカーによる解析では、これらの94サンプルにおいて対立遺伝子の組み換え、すなわち有性生殖による繁殖は生じておらず、すべてのサンプルが無性的に繁殖したクローンであることが確認された。また、1集団においては、体細胞突然変異に由来すると考えられる対立遺伝子の多型も確認された。次世代シーケンサーによる解析の結果、上記の94サンプルについて19302527遺伝子座、約160bpについて塩基配列データを得ることができた。得られた塩基配列データは、約30万40万bpにのぼる。モウソウチクのゲノムサイズは、約20億bpであるので、全ゲノムの0.0150.020%の塩基配列情報を得たことになる。これまで同様のテーマにおける解析は、多くても300遺伝子座程度のPCR産物の長さのみを対象とした解析である。本研究のように94サンプルという多数のサンプルを対象とし、約2000遺伝子座について塩基配列情報を得た研究はこれまでになく、格段に信頼性の高い結果が得られたと言える。原発事故の被災地域における毎時数マイクロシーベルト以下の放射線被ばくの蓄積が、そこに生育する植物の塩基配列の変異に与える影響についてはほとんど明らかにされていない。しかし、ゲノム中の数数十遺伝子座、多くても数百座を対象とした従来の解析や対象とする集団内がもともと遺伝的な多様性を有する解析では、低頻度で生じた突然変異を正確に把握することは難く、低線量の放射線の影響を定量的に評価することは極めて難しかった。そこで本研究では、日本各地に遺伝的に同一な個体が生育するモウソウチクを対象として、様々な放射線量の地域からサンプルを収集し、次世代シーケンサーから得られる大量の塩基配列データによって、生育地の空間線量と塩基配列の突然変異数との関係を評価した。モウソウチクは、2013年に福島県のいわき市、大熊町、浪江町、南相馬市、相馬市、宮城県の白石市を含む全国14カ所から計94サンプルを採取した。これらのサンプルについて、マイクロサテライトマーカーを用いたクローン解析を行い、同一クローンであることを確認した上で、次世代シーケンサーを用いたMIG-seqによる塩基配列の比較を行った。データを得たこととなる。2,718カ所の配列のうち1,438カ所については、得られた配列は完全に一致していた。

サンプル間で多型の認められた1,280カ所のうち、1サンプルにおいてのみ認められた多型、つまり、比較的最近生じた可能性の高い多型が確認されたのは442カ所であった。これらの塩基配列についてのサンプルあたりの多型数は013カ所であり、空間線量の増加に伴う多型数の増加は認められなかった。したがって、比較的空間線量が高い環境で生育しているモウソウチクであっても、事故後に塩基配列の突然変異による多型を急激に蓄積しているということはないと考えられた。原発事故の被災地域における低線量放射線被ばくの蓄積が、そこに生育する植物の塩基配列の変異に与える影響についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、日本各地に遺伝的に同一な個体が生育するモウソウチクを対象として、様々な放射線量の地域からサンプルを収集し、次世代シーケンサーから得られる大量の塩基配列データによって、生育地の空間線量と塩基配列の突然変異数との関係を評価した。その結果、空間線量の増加に伴う変異量の増加は認められなかった。したがって、比較的空間線量が高い環境で生育しているモウソウチクであっても、事故後に塩基配列の突然変異を急激に蓄積しているということはないと考えられた。解析の正確性を重視したために、データ解析に含める遺伝子座数は若干少なくなったものの、解析手法の向上や研究協力者の協力により、当初想定していたよりも、多数のサンプルで解析ができており、おおむね順調に進展しているといえる。分子生態学得られたデータについて、詳細な解析を行い、低線量の放射線が生物の塩基配列突然変異に与える影響を解析する。状況に応じて追加の解析も行う。初年度は、サンプルの採取許可の取得等が予想より順調に進んだため、現地調査やサンプルの採取地点を大幅に増やすことができ、特に、福島県内においては、十分なサンプルを得ることができた。一方、次世代シーケンサーによる解析については、当初は、RADマーカー解析を行う予定であった。しかし、予備的な解析の結果、解析の最初のプロセスである制限酵素処理が安定しないため、モウソウチクにおいて多数のサンプルで解析を行うには、RADマーカー解析は必ずしも適さないと考えられた。そこで、研究協力者の陶山佳久準教授(東北大)が開発中の手法で解析を行うこととし、現在、解析の準備を進めている。本手法は、RADマーカーよりも、解析できる遺伝子座数は少なくなると考えられるものの、多数のサンプルが比較的低コストで解析できるメリットがあり、RADマーカーであれば集団毎にしか解析できなかったサンプルが、個体毎に解析することができ、より詳細なデータが得られることが期待できる。モウソウチクの現地調査およびサンプルの採取は、昨年度、当初計画していた以上のサンプルが採取できたため、本年度の調査は行わない。採取したモウソウチクのクローン解析については、申請者らによって開発されたマイクロサテライトマーカーによって引き続き解析を行うとともに、中国において複数のクローンを検出した新しいマイクロサテライトマーカーも使用して、日本国内に生育しているモウソウチクが同一クローンであることを確認する。次世代シーケンサーによる解析では、現在開発中の手法で解析を行い、得られた結果に応じて、次年度の解析やサンプリングを計画するとともに、論文の執筆等を進める。年度末に使用予定の旅費が、わずかに想定金額よりも低くなったため。旅費として使用する予定である。
未規制大気汚染物質ニトロアレーンの動態解析とその軽減に関する基礎研究

1.ニトロアレーン分析法の改良:既報の化学発光検出HPLCによるトロアレーン分析システムにニトロアレーン分離用ODSカラム,亜鉛還元カラム,高圧流路切り替えバルブ等を導入することにより,極微量ニトロアレーンの分析システムを完成した.これにより,数mg以下の大気粉じん中の2-ニトロフルオランテン(2-NF),2-ニトロピレン(2-NP),4-NP,6-ニトロクリセン(6-NC)等を定量可能とした.2.ディーゼル粉塵抽出物の直接変異原性におけるニトロアレーンの寄与:ディーゼル粉塵のbenzen-ethanol(3:1)抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-hexane,dichloromethane,methanolの混合溶媒)で5分画した.Ames試験による直接変異原性(S.typhimuriumYG1024株)は高極性溶媒(dichloromethane-methanol及びmethanol)の2分画に集中し,ニトロアレーンはこのうちの前者に集中した.直接変異原性におけるニトロアレーン(8種)の寄与率はこの分画で50%余り,全分画合計の約1/3に達し,大きいことが明らかになった.3.札幌,東京,金沢の大気環境比較:金沢市,東京都,札幌市の大気中DNP及び1-NP濃度は札幌≧東京>金沢の純に低くなったが,都心は都市による差は小さかった.3都市の中では,札幌が1,3-,1,6-,1,8-ジニトロピレン(DNP)濃度に対する1-NP濃度の比が最も大きく,その理由の一つとして,ディーゼル車の保有台数の割合が高いことが考えられた.濃度推移は日内変動(昼高夜低)及び季節変動(夏低冬高)を呈したが,都市により程度に差があった.4.大気中のニトロアレーンの分解と二次生成:金沢市内の都心と郊外の大気中ニトロアレーンの比較により,DNP及び1-NPは大気輸送中に分解し,その主要因が太陽による光分解であることがわかった.また、2-NFと2-NPはディーゼル粉塵には検出されず郊外ほど存在比が大きくなることより,大気中で二次生成することが推定された.1.ニトロアレーン分析法の改良:既報の化学発光検出HPLCによるトロアレーン分析システムにニトロアレーン分離用ODSカラム,亜鉛還元カラム,高圧流路切り替えバルブ等を導入することにより,極微量ニトロアレーンの分析システムを完成した.これにより,数mg以下の大気粉じん中の2-ニトロフルオランテン(2-NF),2-ニトロピレン(2-NP),4-NP,6-ニトロクリセン(6-NC)等を定量可能とした.2.ディーゼル粉塵抽出物の直接変異原性におけるニトロアレーンの寄与:ディーゼル粉塵のbenzen-ethanol(3:1)抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-hexane,dichloromethane,methanolの混合溶媒)で5分画した.Ames試験による直接変異原性(S.typhimuriumYG1024株)は高極性溶媒(dichloromethane-methanol及びmethanol)の2分画に集中し,ニトロアレーンはこのうちの前者に集中した.直接変異原性におけるニトロアレーン(8種)の寄与率はこの分画で50%余り,全分画合計の約1/3に達し,大きいことが明らかになった.3.札幌,東京,金沢の大気環境比較:金沢市,東京都,札幌市の大気中DNP及び1-NP濃度は札幌≧東京>金沢の純に低くなったが,都心は都市による差は小さかった.3都市の中では,札幌が1,3-,1,6-,1,8-ジニトロピレン(DNP)濃度に対する1-NP濃度の比が最も大きく,その理由の一つとして,ディーゼル車の保有台数の割合が高いことが考えられた.濃度推移は日内変動(昼高夜低)及び季節変動(夏低冬高)を呈したが,都市により程度に差があった.4.大気中のニトロアレーンの分解と二次生成:金沢市内の都心と郊外の大気中ニトロアレーンの比較により,DNP及び1-NPは大気輸送中に分解し,その主要因が太陽による光分解であることがわかった.また、2-NFと2-NPはディーゼル粉塵には検出されず郊外ほど存在比が大きくなることより,大気中で二次生成することが推定された.広域的視点からニトロアレーン汚染の実態を明らかにするため、規模、気象条件の異なる札幌、東京、金沢の3都市で大気粉じんを同時に採取し、ニトロアレーン、重金属、直接変異原活性等の測定を行った。これにより以下の知見を得た。1.ベンゾ[a]ピレンに比較し、1-ニトロピレンは約1桁、各ジニトロピレンは3桁以上低濃度という知見は都市大気粉じんに広く該当した。また、交通量が飽和状態に近い道路端では、都市の規模(人口など)によらずニトロアレーンの濃度はほぼ同じレベルになった。しかし、小都市では郊外ほどそのレベルは急激に低下した。2.変異原性試験の結果から、いずれの都市においても大気中直接変異原物質におけるニトロアレーンの寄与が大きく、その重要性が示唆された。3.いずれの都市でも、大気中のニトロアレーンは概ね昼高く夜低い日内変動と、冬高く夏低い季節変動を示した。4.ニトロアレーン間の濃度比は各都市のディーゼル車保有率に依存することが推定された。一方、重金属類の濃度は捕集粉じん量との相関が強く、無機物質と有機物質では汚染の機構に差が見られた。

微生物によるニトロアレーンの吸収、分解特性を明らかにするため、サルモネラ菌をモデルとしたニトロアレーンの代謝実験を行った。これにより以下の結果が得られた。5.1,8-ジニトロピレンの代謝物として、モノアミノモノニトロ体、ジアミノ体が同定された。さらに、ニトロ基の一つがアセチルアミノ体に代謝されることが推定された。1.ニトロアレーン分析法の改良:既報の化学発光検出HPLCによるニトロアレーン分析システムにニトロアレーン分離用ODSカラム,亜鉛還元カラム,高圧流路切り替えバルブ等を導入することにより,極微量ニトロアレーンの分析システムを完成した.これにより,数mg以下の大気粉じん中の2-ニトロフルオランテン(2-NF), 2-ニトロピレン(2-NP),4-NP,6-ニトロクリセン(6-NC)等を定量可能とした.2.ディーゼル粉塵抽出物の直接変異原性におけるニトロアレーンの寄与:ディーゼル粉塵のbenzen-ethanol(3:1)抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-hexane,dichloromethane,methanolの混合溶媒)で5分画した. Ames試験による直接変異原性(S. typhimuriumYG1024株)は高極性溶媒(dichloromethane-methanol及びmethanol)の2分画に集中し、ニトロアレーンはこのうちの前者に集中した.直接変異原性におけるニトロアレーン(8種)の寄与率はこの分画で50%余り、全分画合計の約1/3に達し,大きいことが明らかになった.3.札幌,東京,金沢の大気環境比較:金沢市,東京都,札幌市の大気中DNP及び1-NP濃度は札幌≧東京>金沢の順に低くなったが都心は都市による差は小さかった.3都市の中では,札幌が1,3-,1,6-,1,8-ジニトロピレン(DNP)濃度に対する1-NP濃度の比が最も大きく,その理由の一つとして,ディーゼル車の保有台数の割合が高いことが考えられた.濃度推移は,日内変動(昼高夜低)及び季節変動(夏低冬高)を呈したが,都市により程度に差があった.4.大気中のニトロアレーンの分解と二次生成:金沢市内の都心と郊外の大気中ニトロアレーンの比較により,DNA及び1-NPは大気輸送中に分解し,その主要因が太陽による光分解であることがわかった.また,2-NFと2-NPはディーゼル粉塵には検出されず郊外ほど存在比が大きくなることより,大気中で二次生成することが推定された.
着床期子宮内膜機能:ヒト子宮内膜の腺細胞と間質細胞における糖代謝に関する研究

1.正常月経周期を有する婦人の子宮内膜を採取し,一部はwhole tissueとして,残りはKingらの方法に準じてcollagenase digestionにより腺細胞と間質細胞に分離し,増殖期ならびに分泌期子宮内膜における解糖系律速酵素(Hexokinase,PhosphofructkinaseおよびPyruvate kinase)を生化学的測定法により検討中である.現在また最終的な結論は得られていないが,三つの酵素活性はともに増殖期より分泌期に高く,また腺細胞と間質細胞とを比較すると腺細胞に高い傾向が認められるようである.2.アロキサン糖尿病の家兎を用い,子宮内膜における糖代謝について検討した.糖尿病群の子宮内膜ではglycogen phosphorylase活性低下が原因と思われるglyoogenの蓄積を認めた.さらに糖尿病群ではhexokinase,phosphofructkinase活性が有意の増加を示したにもかかわらず, pyruvate kinase活性には変化がなく,またズダンIII染色で糖尿病群の子宮内膜組織に脂質の沈着が認められたことより,糖尿病家兎子宮内膜ではglucoseが解糖系で十分に利用されず,途中から脂質代謝系に流出している可能性が示唆された.すなわち高血糖状態下では子宮内膜自体にも糖代謝異常によるエネルギー産生障害が生じるものと思われ,上位中枢障害に加え,着床の場である子宮内膜の機能障害も糖尿病における不妊の一因となっている可能性が示唆される.3.Anti-progesterone剤であるRU-486をラット着床期に投与し,子宮内膜glycogen代謝について検討した. RU-486はラット着床を阻害し,子宮内膜ではglycogen phosphorylase活性増加によると思われるglycogen量の低下が認められ, RU-486の着床阻害作用は子宮内膜における糖代謝調節への影響によって起こっている可能性が示唆された.またRU-486のこの作用は,血清progesterone,estadiol値より子宮内膜への直接作用のみならず黄体機能を介した作用による可能性も示唆された.1.正常月経周期を有する婦人の子宮内膜を採取し、一部はwhole tissueとして、残りはKingらの方法に準じてcollagenase digestionにより腺細胞と間質細胞に分離し、増殖期ならびに分泌期子宮内膜における解糖系律速酵素(He-xokinase,Phosphofruktokinase,およびPyruvate kinase)を生化学的測定法により検討中であるが、まだ現時点では例数が少なく明確な結論は下せない。2.アロキサン糖尿病の家兎を用い、子宮内膜における解糖系の律速酵素活性について検討した。Hexokinase,Phosphofructokinase活性は糖尿病群で有意の増加を示したが、Pyruvate kinase活性には変化を認めなかった。また糖尿病群の子宮内膜組織にズダン【III】染色により脂質の沈着を認めた。以上の結果より糖尿病家兎子宮内膜ではglucoseが解糖系で十分に利用されず、途中から脂質代謝系に流出し、そのためglucoseより生じるエネルギー産生に異常が生じている可能性が推察された。3.Anti-progesterone剤であるRU-486の着床阻害作用の機序を解明する目的で、RU-486をラット着床期に投与し、子宮内膜におけるglycogen代謝について検討した。RU-486の投与はラット着床を阻害し、子宮内膜におけるGlycogenphosphorylase活性の増加によると考えられるGlycogen量の低下が認められた。以上の結果、RU-486の着床阻害作用は子宮内膜における糖代謝調節への影響によって起こっている可能性が示唆された。またRU-486のこの作用は、同時に測定した血清ProgesteroneおよびEstradiol値より子宮内膜への直接作用のみならず黄体機能を介した作用による可能性も示唆された。1.正常月経周期を有する婦人の子宮内膜を採取し,一部はwhole tissueとして,残りはKingらの方法に準じてcollagenase digestionにより腺細胞と間質細胞に分離し,増殖期ならびに分泌期子宮内膜における解糖系律速酵素(Hexokinase,PhosphofructkinaseおよびPyruvate kinase)を生化学的測定法により検討中である.現在また最終的な結論は得られていないが,三つの酵素活性はともに増殖期より分泌期に高く,また腺細胞と間質細胞とを比較すると腺細胞に高い傾向が認められるようである.2.アロキサン糖尿病の家兎を用い,子宮内膜における糖代謝について検討した.糖尿病群の子宮内膜ではglycogen phosphorylase活性低下が原因と思われるglyoogenの蓄積を認めた.さらに糖尿病群ではhexokinase,phosphofructkinase活性が有意の増加を示したにもかかわらず, pyruvate kinase活性には変化がなく,またズダンIII染色で糖尿病群の子宮内膜組織に脂質の沈着が認められたことより,糖尿病家兎子宮内膜ではglucoseが解糖系で十分に利用されず,途中から脂質代謝系に流出している可能性が示唆された.すなわち高血糖状態下では子宮内膜自体にも糖代謝異常によるエネルギー産生障害が生じるものと思われ,上位中枢障害に加え,着床の場である子宮内膜の機能障害も糖尿病における不妊の一因となっている可能性が示唆される.3.Anti-progesterone剤であるRU-486をラット着床期に投与し,子宮内膜glycogen代謝について検討した. RU-486はラット着床を阻害し,

子宮内膜ではglycogen phosphorylase活性増加によると思われるglycogen量の低下が認められ, RU-486の着床阻害作用は子宮内膜における糖代謝調節への影響によって起こっている可能性が示唆された.またRU-486のこの作用は,血清progesterone,estadiol値より子宮内膜への直接作用のみならず黄体機能を介した作用による可能性も示唆された.
神経の栄養プログラミング機構の解明

疫学的な研究から、発生・発達期の環境が、成人の生命活動に強く影響することが示唆されてきた。しかしその分子機構については明らかになっていない。申請者らのこれまでの研究から発生期の食餌中チロシンやグルタミン酸が、成体の生理状態を変化させることが明らかになってきた。これらのアミノ酸は、神経伝達物質そのもの、あるいはその前駆体として、神経機能を不可逆的に変化させ、成体の生理状態を規定する可能性がある。本研究では、食餌中アミノ酸による神経発生・発達の栄養プログラミング仮説を検証し、その分子機構を解明する。
下肢運動の自動化にける下肢の各部位の運動の役割および準備脳活動

歩行様の周期的下肢運動(足踏み運動)の自動化における、腰部、股関節、膝関節、足関節の周期運動の役割と脳の準備状態を検討した。若年成人を対象に、周期的な腰部回旋運動、股関節屈曲運動、膝関節屈曲運動、および足関節背屈運動を個別に行わせ、一過性の上肢運動を周期運動の複数の時相で並行させた。その結果、腰部回旋運動のみの周期が上運動を並行するタイミングの違いによって有意に変化した。さらに、随伴陰性変動(CNV)の振幅も変化した。これらの結果から、周期的下肢運動の自動化おける腰部回旋運動の機能的役割の重要性と、腰部回旋運動の時相によって上肢の並行運動を遂行する際の注意の程度が異なることが推察される。本研究の目的は、健康な若年成人を対象に、周期的下肢運動における腰部、股関節、膝関節、足関節の各周期運動の機能的役割と脳の準備状態を検討することである。平成26年度は、腰部の周期的回旋運動の自動化の様相を検討した。自動化の様相は、左右側同時の一過性の上肢運動(掌屈運動)を並行した場合の腰部回旋運動の周期の乱れで評価した。脳の準備状態は、随伴陰性変動(CNV)を用いて評価した。被験者(13名)には、回転盤の上で立位を保持させ、左方向と右方向への交互の腰部回旋運動を行わせた。回旋方向の切換えの時間間隔は、1000msとした。左回旋と右回旋それぞれ角度は、回転盤のストッパーによって10度に規定した。一過性の掌屈運動は、警告刺激(S1)ー反応刺激(S2)ー反応課題パラダイムを用いて、腰部回旋運動中に実行させた。S1とS2には、それぞれ1KHzと2KHzの音刺激を用い、時間間隔を2秒とした。S2の提示は、腰部回旋角度が左回旋と右回旋それぞれ10度に達した時点から0msと500msの遅れ時間で行った。CNVは、Czから導出した。各S2提示タイミングでのCNV波形は、眼球電図とCNVの振幅変動が100μVを超える試行を除外し、17試行以上の加算平均を行った。S2を0msの遅れ時間で提示して掌屈運動を並行させた場合は、500msの遅れ時間で提示した場合に比べて、腰部回旋運動の周期の変化が小さかった。また、CNVの最大振幅は大きく、出現時点はS2提示時点よりも早かった。さらに、CNVの最大振幅からS2時点のCNVの振幅の減少が大きかった。腰部の回旋方向による差異は、認められなかった。こられの結果からは、腰部の回旋運動の方向を切換える時点では、一過性の上肢運動との干渉が小さいこと、また上肢運動の遂行に向けた脳の準備が早期に行え、その遂行に注意を向けることが容易であることが示唆された。本研究の目的は、周期的下肢運動の自動化における腰部、股関節、膝関節、足関節の各周期運動の機能的役割と脳の準備状態を検討することである。平成27年度は、左右側交互の周期的な股関節屈曲運動の自動化の様相を検討した。自動化の様相は、左右側同時の一過性の上肢運動(掌屈運動)を並行した場合の股関節屈曲運動の周期の乱れで評価した。若年健康成人(7名)を対象に、立位姿勢を保持させ、左右側交互の股関節屈曲運動を行わせた。膝は伸展位を保持させた。股関節の屈曲角度は、通常の足踏み運動時の股関節屈曲角度を参考に設定した。その平均は、30.7度(SD=6.2)であった。左右側の股関節屈曲運動の開始時間間隔は、1000 msとした。一過性の掌屈運動は、警告刺激(S1)ー反応刺激(S2)反応課題パラダイムを用いて、股関節屈曲運動中に実施させた。S1とS2には、それぞれ1KHzと2KHzの音刺激を用い、提示の時間間隔を2秒とした。S2は、左右側それぞれの脚について、離地いている踵が接地する時点を基準に、0 msと500 msの遅れで提示した。各S2提示タイミングでのCNVは、眼球電図とCNVの振幅変動が±100μVより大きい試行を除外し、17試行以上の加算平均波形を求めた。一過性の掌屈運動を並行することによる股関節屈曲運動の周期の乱れとCNVの最大振幅には、S2の提示タイミングの違いによる有意差が認められなかった。これらの結果からは、股関節屈曲の周期運動では、一過性の上肢運動を並行するタイミングの違いによる股関節屈曲の周期および脳の準備電位の変化に差異がないことが推察された。左右側交互の股関節の周期的屈曲運動に対する一過性の上肢運動の干渉の様相、および準備脳活動は、一過性上肢運動を行うタイミングによって変わらないことが示された。この結果は、腰部の周期的回旋運動を扱った研究(平成26年度)とは異なる知見である。下肢運動の自動化における腰部と股関節の運動の機能的役割の差異が示唆されたと考えられる。

本年度の研究目的は、周期的下肢運動の自動化における膝関節運動の機能的役割と脳の準備状態を検討することである。被験者は、健康な若年成人6名とした。下肢の周期運動は、立位にて、左右側交互の膝関節の屈曲運動とした。左右側の膝関節屈曲運動の開始時間間隔は、1000 msとした。膝の屈曲角度は45度とした。膝関節屈曲運動の自動化の様相は、左右側同時の一過性の上肢運動(掌屈運動)を並行した場合の膝関節屈曲運動の周期の乱れで評価した。一過性の掌屈運動は、肘を約90°に屈曲させた手掌の高さに設置したテーブルの上で行わせた。一過性の掌屈運動は、警告刺激(S1)-反応刺激(S2)反応課題パラダイムを用いて、周期的膝関節屈曲運動中に、実施させた。S1とS2には、それぞれ1000 Hzと2000 Hzの音刺激を用い、提示の時間間隔は、2秒とした。S2は、左右側それぞれの脚について、接地から離地する時点を基準に、0 msと500 msの遅れで提示した。脳の準備状態は、随伴陰性変動(CNV)を用いて評価した。CNVは、Czから導出した。各S2提示タイミングでのCNVは、眼球電図とCNVの振幅変動が±100μVより大きい試行を除外し、17試行以上の加算平均波形を求めた。一過性の掌屈運動を並行することによる膝関節屈曲運動の周期の乱れとCNVの最大振幅には、S2の提示タイミングの違いによる有意差が認められなかった。これらの結果からは、膝関節屈曲の周期運動では、一過性の上肢運動を並行するタイミングの違いによる膝関節屈曲の周期および脳の準備電位の変化に差異がないことが推察された。左右側交互の膝関節の周期的屈曲運動に対する一過性の上肢運動の干渉の様相、および準備脳活動は、一過性の上肢運動を行うタイミングによって変わらないことが示された。これらは、股関節の周期運動(平成27年度実施)と同様の結果である。腰部の周期的回旋運動(平成26年度実施)では、一過性の上肢運動を行うタイミングによる差異が認められていることから、下肢の周期運動の自動化における腰部運動の機能的役割の重要性が示唆されていると推察される。次年度は、足関節の周期運動を取り上げ、検討を行う。本年度の研究目的は、周期的下肢運動の自動化における足関節運動の機能的役割と脳の準備状態を検討することである。被験者は、健康な若年成人4名とした。下肢運動の周期運動は、立位にて、左右足交互の背屈運動とした。左右足の背屈運動の開始時間間隔は、1000 msとした。足の背屈角度は約5度とした。足の背屈運動の自動化の様相は、左右側同時の一過性の上肢運動(掌屈運動)を並行した場合の背屈運動の周期の乱れで評価した。一過性の掌屈運動は、肘を約90度に屈曲させた手掌の高さに設置したテーブルの上で行わせた。一過性の掌屈運動は、警告刺激(S1)ー反応刺激(S2)反応パラダイムを用いて、周期的な足の背屈運動を行っている最中に実施させた。S1とS2には、それぞれ1000 Hzと2000 Hzの音刺激を用い、提示の時間間隔は2秒とした。S2は、左右それぞれの足について、中足骨骨頭部の足底が離地する時点を基準に、0 msと500 msの遅れで提示した。脳の準備電位は、随伴陰性変動(CNV)を用いて評価した。CNVはCzから導出した。各S2提示タイミングでのCNVは、眼球運動とCNVの振幅変動が±100 μVよりも大きい試行を除外し、17試行以上の加算平均波形をもとめた。一過性の掌屈運動を並行することによる足の背屈運動の周期の乱れとCNVの最大振幅には、S2の提示タイミングの違いによる有意差が認められなかった。これらの結果かららは、足の背屈の周期運動では、一過性の上肢運動を並行するタイミングの違いによる足の背屈運動の周期および脳の準備電位の変化に差異のないことが推察された。
死体温度分布からの死後経過時間推定法に関する研究

死体温度分布から死後経過時間推定法を開発することが本研究の目的である。温度分布測定法として死体頭蓋内温度分布を測定するための多点温度プローブの開発を達成し,今後実務への活用が期待できる。MR温度画像を用いた死体内部の温度測定では,定量性に問題はあるものの,その温度変化を視覚化することが可能となった。また死体頭蓋内の死後冷却モデルのモデルも開発し,実務での死後経過時間推定に応用が期待できる。生物死体の死後冷却に関する空間勾配の把握を目的に、MRIの撮像により、死後の温度分布の可視化を実験的に行った。測定対象はブタ(18.5kg)であり,撮像範囲は頭蓋腔とした。MRI装置としてSigna EXCITE Twinspeed 1.5T、コイルとして送信側にはBody coilを、受信側にはBrain/8-channel phased array headcoilを用いた。撮像条件は、SPGR, TE=8.0ms, TR=100ms, FOV=18×18cm, matrix=256×128とし,麻酔抑制中に1回撮像し,安楽死させた後,1時間毎に,死後8時間まで撮像を実施した。また,ブタ外耳・皮膚・直腸内と室内の温度を連続的に測定した。これらの撮像画像は、DICOM形式で取得し、以降の計算過程は、MATLABにて処理した。撮像画像の計算処理により,内部温度の勾配と経時的な変化を把握することは成功したが,予想される実測温とのズレが認められていた。これらの要因は,撮像条件上の問題,位相計算上の問題,実験動物の姿勢固定の問題が挙げられるため,今後の実験として,これらの要因を解明した上で,新たな実験系の構築が必要となる。現在,死因究明を目的に各種画像検査を応用する研究がなされているが,本実験のように臨床用MRI装置にて相応の実験動物の温度画像が成功裏に取得できれば,ヒト死体への応用が可能となり,法医学的には,死後経過時間の推定等極めて応用性が高いものであり,今回は実験結果をより詳細に分析し,適切な撮像プロトコールのための基礎データとして活用ができる。平成21年度に実施したブタ頭部のMR温度画像の実験的な撮像結果に基づき,ヒト死体での脳内温度分布の実測を目的とした8対の多点温度センサーを作製・開発した。これにより,世界でも初めてのヒト死体頭蓋内温度分布の実測調査が可能となった。ただし,精度を追求したことにより,実験系は複雑になったため,利便性に欠けるところがあり,実務応用に向けて死後経過時間推定に重大な誤差を生じさせない程度に熱電対の数を減少させたより簡易な多点温度センサーの開発も今後は必要になるかと思われる。また,MR温度画像撮像にあわせて実施したブタ頭部の拡散強調画像(b値=600,800,1000,1200)の画像解析を進め,死後変化による死体内水分の就下や結合水の離開による自由水の増加,顔面筋肉の死後硬直による頭部内の身体部位の変動を明らかとし,これらは画像解析で無視できない誤差要因と認められた。また,拡散強調画像からADCマップを計算すると共に,拡散強調画像での各ボクセルでの拡散係数の平均,分散,ダイナミックレンジ,変化量を2次元分布として可視化させたADCマップ処理画像の作成も行った。これらの画像処理は,今後の温度画像処理に当たり重要な基礎知識になるばかりではなく,現在,社会的にも注目されている死亡時画像診断(Ai)の読影においても把握しておくべき死後変化による画像の修飾変化として,大変貴重な知見になるものと考えられる。平成21・22年度に作成したヒト頭蓋腔内用の多点温度プローブについて,冷点補正が不要な仕様に改良を重ね,操作性を格段に向上させることができた。これを元に,実測実験を重ね,頭蓋内温度勾配を観測することができた。冷点補正がないため,温度精度に若干問題があるが,実務への応用のためには,平成23年度作成の多点温度プローブ程度の操作性は必要と認められることから,本プローブで観測した頭蓋内温度勾配から得られた結果から死後経過時間を推定した場合の誤差について見積もる必要があると考察された。MR温度画像による死体内温度測定については,以前に実施した撮像実験の解析から,検証を要すべき項目が多く,再実験が必要と判断し,平成21年度と同様の実験を実施した。他のMR画像と同様,死後のMR温度画像については,今後,発展・実務応用が期待できるものの,更なる基盤的・基礎的研究を要するテーマとして,今後も研究が進められるべきと認められた。今後の研究課題については,本実験を通じて得られた知見について学術発表をすすめ,論点を整理して,技術開発につなげたいと考える。死体温度分布からの死後経過時間推定のプログラムについては,ヒト頭部形状の死後冷却シミュレーションモデルの結果を参照にしつつ,簡便かつ汎用性が保たれるように,Excelにて計算できるように,ファイルを作成した。計算精度などについては,今後詳細に検討を実施する。
皮膚のメラニン合成、分解系におけるオートファジーの役割の解明

ヒト表皮正常メラノサイト(NHEM)を用いて、オートファジー関連因子がメラノソーム合成への影響を観察した、オートファジー機構がメラノサイトのメラノソーム形成、成熟に関与していると考えられる。ヒト表皮正常ケラチノサイト(NHEK)を用いて、培養メラノサイトから抽出、精製したメラノソームを貪食したNHEKにオートファジー関連因子をRNA干渉法よりノックダウンし、ケラチノサイトでのオートファジーがメラノソームの分解に関与していると考えられる。NHEMとNHEKの共培養モデルを確立し、オートファジーが細胞間メラノソーム転送機構への影響を検討した結果、明らかな影響はみられませんでした。1)ヒト表皮正常メラノサイト(NHEM)を用いて、オートファジー関連因子をRNA干渉法よりノックダウンし、Atg8(LC-3)とp62などで細胞免疫蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡による発現の変動を確認した、ウエスタンブロット、更に電子顕微鏡によるオートファゴゾームの形成を観察して確認した。同時に、メラニン産生関連遺伝子の発現パターン、メラノソームの形成も同様に検討した。オートファジー関連因子をノックダウンした培養メラノサイトで、メラニン合成の低下が観察された、これらの結果より、オートファジー機構がメラノサイトのメラノソーム形成、成熟に関与していると考えられる。2)ヒト表皮正常ケラチノサイト(NHEK)を用いて、培養メラノサイトから抽出、精製したメラノソームを添加し、メラノソームを貪食したNHEKにオートファジー関連因子をsiRNAによりノックダウンし、同様にオートファジー関連遺伝子発現、オートファゴソーム形成の変動を検討した。更に、NHEK細胞内メラニン含有量の変化も定性的に測定した。in vitro実験系でケラチノサイト内で、リソソーム関連オートファゴソームがメラノソームの分解に寄与することが証明された、ケラチノサイトでのオートファジーがメラノソームの分解に関与していると考えられる。3)NHEMとNHEKの共培養モデルを確立した、オートファジー抑制剤、促進剤の投与で、メラニン産生量、細胞間メラノソーム転送機構への影響を解析した。細胞単培養、共培養を比べることによって、オートファジー機構の役割をさらに明らかになってきた。4)Atg5をメラノサイトで特異的にノックアウトマウス:MITF-Cre; Atg5 flox/floxマウスの作成、ケラチノサイト特異的オートファジー欠損マウス:K5-Cre; Atg5 flox/floxマウスの作成をスタートした。1)ヒト表皮正常メラノサイト(NHEM)を用いて、オートファジー関連因子をRNA干渉法よりノックダウンし、LC3IIとp62を細胞蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡による発現を確認する、ウエスタンブロット、更に電子顕微鏡によるオートファゴゾームの形成を観察して確認した。同時に、メラニン産生関連遺伝子の発現パターン、メラノソーム合成の低下が観察された、これらの結果より、オートファジー機構がメラノサイトのメラノソーム形成、成熟に関与していると考えられる。2)ヒト表皮正常ケラチノサイト(NHEK)を用いて、培養メラノサイトから抽出、精製したメラノソームを貪食したNHEKにオートファジー関連因子をRNA干渉法よりノックダウンし、同様にオートファジー関連遺伝子発現、オートファゴゾーム形成の変動を検討した。In vitro実験系でケラチノサイト内で、リソソーム関連オートファゴゾームがメラノソームの分解に寄与することが証明され、ケラチノサイトでのオートファジーがメラノソームの分解に関与していると考えられる。3)NHEMとNHEKの共培養モデルを確立した、オートファジー抑制剤、促進剤の投与で、メラニン産生量、細胞間メラノソーム転送機構への影響を検討した結果、明らかな影響はみられませんでした。皮膚科学作成できたMITF-Cre; Atg5 flox/floxマウス、K5-Cre; Atg5 flox/floxマウスについて:マウスの皮膚の表現型を検討するため、皮膚組織を単離し、メラノサイト、毛根メラノサイト、ケラチノサイトなどの異常を観察する。免疫組織化学法、電子顕微鏡や生化学的手法を用いてオートファゴソーム、メラノソームを検出し、その分布やメラニン産生量を比較する。マウスの皮膚組織を用いて、メラニン合成に関する重要な因子の発現を調べる、遺伝子発現パターンの変化について解析する。マウスの皮膚からマウス表皮メラノサイト、マウス表皮ケラチノサイトを樹立し、培養系でオートファジーとメラノソームの関係を検討する。マウスの背部を剃毛後、UVBを500 mJ/cm2照射、照射後24、48時間での皮膚生検を行う。野生型マウスと比べ、皮膚全体にメラノソームの数、分布、動態やメラニン産生能を形態学的に調べ、類似点および相違点を形態学的に明らかにする。

オートファジーの生理機構のみならず、皮膚色素異常疾患全般におけるオートファジーの機能を明らかにすることを新な目的として、各種皮膚色素異常疾患の臨床検体を用いて検討する。当研究室にメラノーマ、尋常性白斑、結節性硬化症白斑、伊藤白斑の凍結組織、凍結ブロック、パラフィンブロックが保存されている、患者皮膚由来の繊維芽細胞、メラノサイト、ケラチノサイトも樹立されている。組織切片を免疫染色で、樹立した細胞を培養系でオートファジー関連因子を検討し、オートファジーと色素異常疾患の関連性を明らかにする。平成26年度、マウス作成が遅れたため、マウス飼育、維持費とマウス関連実験消耗品などが予算より少なかったです。前年度に遅れたマウス実験に、マウス飼育、維持費とマウス関連実験消耗品などに予算を入れる予定です。