hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自律位置情報を用いた柔構造ロボットアームの制御

新たに生ずる問題点につき考察を加えた.大学院学生姜兆慧,清水博文,学部学生福田望,近野敦の研究参加を得たことを付記する.昭和63年度は、前年度に引続き、自律位置センシングシステムの開発と、制振制御・弾性変形補償制御を含むフレキシブルロボットアームの制御方式の確立を目指して、(1)(6)の検討を行い、次の成果を得た。(1)FLEBOTIIの試作:既存の2リンクフレキシブルロボットアームの経験を生かして3次元フレキシブルロボットアームFLEBOTIIを設計試作し、同実験システムARS/Fを構築した。アーム姿勢による可変ゲイン制振制御アルゴリズムを提案し、良好な結果を得た。(2)慣性センサによる自律位置センシングシステムの性能評価:同システムの性能向上を図り、1)角速度と加速度および各軸間のクロスカップリングの低減、2)加速度、角速度の入力検出範囲の変更の2改造を行った上で試験を重ね、基本特性を、おおむね明らかにした。(3)レーザ光学式たわみセンサによる自律位置センシング:半導体レーザビームと2次元PSDを用いた3次元位置・姿勢を検出するセンサ方式を提案し、光学解析に基づき設計を行った。同センサは試作中である。(4)柔構造ロボットアームの操作性(II):前年度に引続き、可補償制について詳細な検討を行い、可補償制の判定法、補償の容易さの評価指標としての可補償性を提案し、さらにフレキシブルロボットアームの可操作性を論じた。また、階層制御についても、更に詳しく検討した。(5)2次元運動計測校正システムの校正:自律位置センシングならびにそれによる制御結果の検証のため、非接触電子光学式変位測定装置による固定フレームに対する運動計測システムを構成した。(6)軌道制御実験:FLEBOTIIの寄贈制御を、(5)のシステムによるエンドエフェクタの位置情報に基づくフィードバックたわみ補償により行い、良好な成果を得た。なお、大学院学生、姜兆慧、清水博文、近野敦、学部学生、榛澤文久、城島陽介の研究参加を得たことを付記する。
運動ニューロン栄養因子を発現する筋由来メッセンジャーRNAの分画

胎生期に運動ニューロンは自然に多数死滅する。この自然細胞死期の運動ニューロンの生存は、筋力から放出される栄養因子に依存すると仮定されている。しかし、この因子は未だ同定されていない。本研究は、筋のメッセンジャーRNA(mRNA)を抽出し、この翻訳蛋白がin vivo,及びin vitroの運動ニューロンの生存を促進するか、もしそうなら、どのサイズのmRNAが生存活性が高いかを検討することを目的とした。この目的のために、運動ニューロン自然細胞死期の鶏胚より下肢筋を摘出し、mRNAを抽出した。このmRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入飼育し、飼育液中に分泌される翻訳蛋白を鶏胚卵に投与したところ、運動ニューロンの自然細胞死が阻止された。次のこの細胞死阻止が、in vitroの運動ニューロンでも見られるかを検討した。この目的のために、自然細胞死期の運動ニューロンを鶏胚から単離し、翻訳蛋白を含む液で培養したところ、生存率が無投与群に比べ有意に増大した。次に、mRNAを蔗糖密度勾配遠心法により5分画し、それぞれの分画のmRNAの翻訳蛋白をこの培養運動ニューロンに投与した。その結果、18Sと28Sの間の分画のmRNAの翻訳蛋白投与群に生存率の上昇がみられた。この生存率と分画前のmRNAによる生存率との比較より、蔗糖勾配密度遠心分画で約10倍、生存活性を持つmRNAを濃縮したと推定できた。現在、この18Sと28Sの分画mRNAのcDNAライブラリーを京都大学医学部中西研究室との共同で作成中である。
高速中性子イメージング用輝尽性蛍光体の研究

高速中性子の検出・イメージングを行うため、輝尽性蛍光体とポリエチレンを用いる方法について研究を行った。その結果、高い感度で検出するためにはポリエチレンを全面に配置する方法が、高い位置分解能で検出するにはポリエチレンと輝尽性蛍光体を混合する方法が有効であることがわかった。また、これを基に実際に10cm×10cm程度の大きさの実用的なプレートを作成した。輝尽性蛍光体を用いて高速中性子イメージングを行うため、ガンマ線感度の低い輝尽性蛍光体の前面に有機高分子でできたラジエータを配置する方法を用いて行った。低ガンマ線輝尽性蛍光体としてはKBr:Euを新たに作成し、そのスペクトル特性やα線照射による輝尽性蛍光特性等の基礎特性を測定した。作成方法を工夫することにより、輝尽性蛍光強度はこれまでよりも一桁以上増大した。高速中性子から陽子変換用ラジエータとしてはポリエチレンを用いて高速中性子照射実験も行った。高速中性子源としては、原子力機構の核融合中性子工学用中性子源(中性子エネルギー14.8MeV)を用いた。実験の結果、輝尽性蛍光体の前面にラジエータを配置することにより、高速中性子が測定可能であることを確認した。また、ポリエチレンの厚さとしては、約3mmが最適であることを見出した。ラジエータから発生した陽子によるKBr:Eu蛍光体へのエネルギー付与が輝尽性出力を決定するので、これを評価するため、モンテカルロシミュレーションコード(PHITS)による計算を行った。この結果、計算においてもポリエチレンの厚さが約3mmであることが確認できた。3mmは高速中性子と水素原子との弾性散乱で発生する陽子の飛程がポリエチレン中では3mmであることに由来するものと考えられる。また、全輝尽性蛍光量に対するガンマ線の影響は無視できる程度であった。輝尽性蛍光体を用いて高速中性子イメージングを行うため、ガンマ線感度の低い輝尽性蛍光体とラジエータを混合する方法を用いて行った。本方法では、ラジエータを前面に配置する方法より感度は低くなるが、位置分解能が向上する可能性がある。低ガンマ線輝尽性蛍光体としてはKCl:Eu^<2+>を用い、ラジエータとしてはポリエチレンを用いてサンプルを作成し、そのスペクトル特性やα線照射による輝尽性蛍光特性等の基礎特性を測定した。また、輝尽性蛍光体とラジエータの混合比を変化させたサンプルを作成し、実際に高速中性子照射実験を行った。実験の結果、輝尽性蛍光体とラジエータを混合することにより、高速中性子が測定可能であることを確認した。また、輝尽性蛍光体とポリエチレンの混合比としては、重量比で4:1が最適であることを見出した。ラジエータから発生した陽子によるKCl:Eu^<2+>蛍光体へのエネルギー付与が輝尽性出力を決定するので、これを評価するための理論式を新たに導出すると共に、モンテカルロシミュレーションコード(PHITS)による付与エネルギー計算を行った。この結果、理論計算による最適な混合比も4:1であることが確認できた。輝尽性蛍光体を用いて高速中性子イメージングを行うため、昨年度行ったガンマ線感度の低い輝尽性蛍光体(KCl:Eu^<2+>)とラジエータを混合する方法についてモンテカルロシミュレーションコード(PHITS)を用いて詳細に検討を行った。蛍光体中に分散したポリエチレン中の水素原子核(陽子)と衝突した14MeV高速中性子は散乱されそのエネルギーの一部を陽子に与えるが、陽子のエネルギーは最大の14MeVからほぼゼロのエネルギーまで分布しており、約4MeV程度にピークがあることがわかった。また、高速中性子照射を蛍光体の半分の領域とした場合に、陽子による蛍光体へのエネルギー付与を計算し、この分布(Edge Spread Function)をフィッティングすることにより、Line Spread Functionを求め、分解能(Line Spread Functionの半値幅)を評価すると、0.034mmとなり、ラジエータを蛍光体全面に配置する方法に比べて数倍優れていることがわかった。また、これらの検討結果を基にプレートとすべき仕様を決定し実際にメーカーに依頼して実際的なプレートを製作した。製作したプレートはKCl:Eu^<2+>、KBr:Eu^<2+>、及びKCl:Eu^<2+>+PEの3種類である。これらは高速中性子線源を用いた実験において輝尽性蛍光出力を有することが確認でき、実際の高速中性子イメージング用プレートとして有用であることがわかった。また、本年度は研究期間の最終年度でもあることから、これまでの研究成果についてまとめた。
養護学校教員の研修形態のあり方に関する研究

本年度は、養護学校教員の力量の伸長を促すための研修形態のあり方を検討するために,前年度に収集したデータの分析と、学校や研修機関の訪問調査を実施した.1.研究1では,全国の都道府県教育委員会及び(特殊)教育センター121機関から入手した研修計画についての資料の分析を継続して行った.その結果,各委員会やセンターで実施されている研究会の形態について、ある一定の共通点が認められた。しかし、細部については相違点も見られ,各機関が試行錯誤しながら,研修を実施しているという実態が明らかになった.2.研究2では,全国の精神薄弱養護学校94校,肢体不自由養護学校47校,病弱養護学校47校から入手した(1)研修計画についての資料と(2)校内研修に関するアンケート調査の分析を行った.その結果,実態形態には大きな違いは見られないものの,学校種別によって、研修テーマに関する違いが認められた.研究3では,全国の精神薄弱,肢体不自由,病弱養護学校の教員110名から得られた研修に関する意識調査をの分析を行った.その結果,教員の側からみた現在の研修内容や形態に対する問題点が抽出された.また、学校種別による相違も明らかにされた.研究4では、特徴的・独創的な研修を実施している教員センター、教育委員会、及び養護学校の訪問を行い、関係者の面接調査を実施し、一次資料を入手した.今後は、今回の研究成果を踏まえて、教員のライフステージに対応した研修形態を構築する作業を進めていく予定である.本年度は、養護学校教員の力量の伸長を促すための研修形態のあり方を検討するために,前年度に収集したデータの分析と、学校や研修機関の訪問調査を実施した.1.研究1では,全国の都道府県教育委員会及び(特殊)教育センター121機関から入手した研修計画についての資料の分析を継続して行った.その結果,各委員会やセンターで実施されている研究会の形態について、ある一定の共通点が認められた。しかし、細部については相違点も見られ,各機関が試行錯誤しながら,研修を実施しているという実態が明らかになった.2.研究2では,全国の精神薄弱養護学校94校,肢体不自由養護学校47校,病弱養護学校47校から入手した(1)研修計画についての資料と(2)校内研修に関するアンケート調査の分析を行った.その結果,実態形態には大きな違いは見られないものの,学校種別によって、研修テーマに関する違いが認められた.研究3では,全国の精神薄弱,肢体不自由,病弱養護学校の教員110名から得られた研修に関する意識調査をの分析を行った.その結果,教員の側からみた現在の研修内容や形態に対する問題点が抽出された.また、学校種別による相違も明らかにされた.研究4では、特徴的・独創的な研修を実施している教員センター、教育委員会、及び養護学校の訪問を行い、関係者の面接調査を実施し、一次資料を入手した.今後は、今回の研究成果を踏まえて、教員のライフステージに対応した研修形態を構築する作業を進めていく予定である.本年度は、養護学校教員の力量の伸長を促すための研修形態のあり方を検討するために,以下の3つの研究を実施した.1.研究1では,全国の都道府県教育委員会及び(特殊)教育センター121機関に対して,本年度の研修計画についての資料の送付を依頼した.その結果,各機関で実施されている研修会の目的,内容,方法についてはある一定の共通点が認められるものの,その様態は一様ではなく,各機関が試行錯誤しながら,研修を実施しているという実態が明らかになった.2.研究2では,全国の精神薄弱養護学校94校,肢体不自由養護学校47校,病弱養護学校47校に対して,本年度の研修計画についての資料の送付を依頼すると共に,校内研修に関するアンケート調査を実施した.分析の結果,実施形態には大きな違いはみられないものの,研修のテーマに関する違いが認められ,各学校種における児童生徒の実態が反映されている傾向が認められた.3.研究3では,全国の精神薄弱,肢体不自由,病弱養護学校の教員110名に対して,研修に関する意識調査を実施した.その結果,現在の研修内容や形態に対して,疑問や問題意識を少なからず持っている実態が明らかにされ,今後,改善,検討すべき点が抽出された.来年度は,本年度の研究成果を踏まえて,特徴的な研修を実施している学校や研修機関の訪問を行い,事例研究を実施する予定である.本年度は、養護学校教員の力量の伸長を促すための研修形態のあり方を検討するために,前年度に収集したデータの分析と、学校や研修機関の訪問調査を実施した.1.研究1では,全国の都道府県教育委員会及び(特殊)教育センター121機関から入手した研修計画についての資料の分析を継続して行った。その結果,各委員会やセンターで実施されている研修会の形態について、ある一定の共通点が認められた。しかし、細部については相違点も見られ、各機関が試行錯誤しながら,研修を実施しているという実態が明らかになった.2.研究2では,全国の精神薄弱養護学校94校,肢体不自由養護学校47校,病弱養護学校47校から入手した(1)研修計画についての資料と(2)校内研修に関するアンケート調査の分析を行った.その結果,実施形態には大きな違いはみられないものの,学校種別によって、研修テーマに関する違いが認められた.3.研究3では,全国の精神薄弱,肢体不自由,病弱養護学校の教員110名から得られた研修に関する意識調査をの分析を行った.その結果,教員の側からみた現在の研修内容や形態に対する問題点が抽出された.また、学校種別による相違も明らかにされた.

4.研究4では,特徴的・独創的な研修を実施している教育センター、教育委員会、及び養護学校の訪問を行ない、関係者の面接調査を実施し、一次資料を入手した.今後は、今回の研究成果を踏まえて、教員のライフステージに対応した研修形態を構築する作業を進めていく予定である.
味覚受容体を指標とした霊長類の環境適応の分子機構の解明

苦味は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の1種であるT2Rを介した経路で伝わる。チンパンジーやニホンザルにおいて機能的なT2Rの多型解析をおこない、T2Rの高度な種内多様性をあきらかにした。本研究により、T2Rの種内多型の保持が多種多様な苦味物質を限られた数の受容体で認識する機構のひとつであることが示唆された。また、ヒト・チンパンジー・ニホンザルにみられるPTC感受性における個体差は、T2R38に独立に起こった変異が原因であることをあきらかにした。単細胞生物から脊椎動物までほぼすべての生物は、外界からの情報を受容する感覚システムを持ち、そこから得られた情報に基づいて行動する。感覚は生物の生存・繁殖に非常に重要であるため、それぞれの生物が生息環境に合わせた種特異的な感覚システムを保持していると考えられる。本年度は、霊長類の味覚受容体を対象にその多様化と環境適応との相互関係を明らかにするため以下の課題に取り組んだ。1)ニシチンパンジー約100個体を対象とした苦味受容体(T2R)の多様性解析を論文にまとめた2)ニホンザル・アカゲザル300個体を対象としたT2Rの多様性解析をおこなった3)苦味受容体機能解析のための実験系の構築をおこなった苦味は、七回膜貫通型構造を持つ典型的なGPCRの1種であるT2Rを介した経路で伝わる。ニシチンパンジーのT2Rの多型解析をおこなった結果、ヒトとニシチンパンジー間では遺伝子のレパートリーはほぼ同じであるが、ニシチンパンジーの方が機能的なT2Rを23遺伝子多くもつことが明らかとなった。また、ニシチンパンジーT2RにおいてヒトT2Rと同様に塩基多様度、アミノ酸置換の割合が非常に高いことがわかった。さらに、マカク類のT2Rにおいても種内多型が多く見られた。これらの結果から、T2Rの多様性を種内で保つことが、多種多様な苦味物質を限られた数の受容体で認識する機構のひとつであると考えた。また、本年度は甘味受容体・うま味受容体であるT1R1T1R3についても多様性解析を進めた。ゲノム配列の解析が大きく進んだため、さらに配列の多様性と蛋白質の機能との相関をあきらかにするための実験系を構築に取り組んだ。本年度は、霊長類の味覚受容体を対象にその遺伝子配列と蛋白質の機能との相互関係を明らかにするため以下の課題に取り組んだ。1)苦味受容体機能解析のための実験系の構築をおこなった2)ニシチンパンジーの苦味受容体機能解析をおこなった3)味覚機能評価における新たな実験系の構築を試みた苦味は、七回膜貫通型構造を持つ典型的なGPCRの1種であるT2Rを介した経路で伝わる。昨年度はニシチンパンジーやニホンザルのT2Rの多型解析をおこない、ヒトのT2Rと同様に種内多型が非常に大きいことをあきらかにした。本年度はそれらの多型が実際に受容体としての機能の違いや個体の苦み認識能力の差に影響を与えているか検討し、遺伝子配列と苦味受容能との相関をあきらかにした。霊長類の味覚機能解析は、ヒトの細胞で受容体を強制発現させ細胞に苦味物質を添加する方法や個体に実際に苦味物質を与えその行動をみる方法がとられている。本研究では、それぞれの生物で味細胞を作製し機能解析にもちいることができないかと考え、幹細胞から味細胞を分化誘導する新たな実験系の構築を試みた。本年度は、ヒトのiPS細胞を用いて味覚受容体を発現する細胞の誘導をおこなった。現在までのところ神経幹細胞への分化誘導に成功し今後さらに分化を誘導することで味覚受容体発現細胞の作製が期待される。
ヒトiPS細胞由来肝幹細胞の自己複製を制御する内在性および外来性miRNAの解析

ヒトiPS細胞は多能性と高増殖性を持ち再生医療の重要なソースである。我々はヒトiPS細胞から肝前駆細胞の誘導・培養系を構築している。そこで、ヒトiPS細胞由来肝前駆細胞の長期培養における性状解析を行った。その結果、この細胞に強く発現する細胞表面抗原を複数同定した。例えば、CD221(IGF1 receptor)はヒトiPS細胞由来肝前駆細胞に強く発現する一方で、そのリガンドであるIGFは肝前駆細胞の増殖を支持するフィーダー細胞に発現することを見出した。以上の結果から、フィーダー細胞とヒトiPS細胞由来肝前駆細胞との間にパラクライン的相互作用による増殖制御機構が存在することを明らかにした。本研究では、ヒト肝幹・前駆細胞の未分化性を維持する機構の解明のために、内在性・外来性それぞれのmiRNAに注目した以下の研究を遂行する。(1)ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の増殖・分化を制御する内在性miRNAの網羅的探索ヒトiPS細胞をサイトカインの連続投与により分化誘導し、肝前駆細胞マーカーCD13およびCD133陽性細胞を純化・培養することで、ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を得た。この細胞の長期培養にはEpidermal Growth Factor(EGF)およびフィーダー細胞が必要なことが分かった。そこで、EGF刺激により変化するmiRNA等の情報を今後収集する。(2)ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の増殖・分化を支持するフィーダー細胞特異的なmiRNA探索ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の増殖に必要なフィーダー細胞における遺伝子発現などを解析している。今後、フィーダー細胞に発現するmiRNAの発現をマイクロアレイ等を用いて網羅的に解析する。ヒトiPS細胞は多能性と高増殖性を持ち、再生医療の重要なソースと考えられている。我々はヒトiPS細胞をサイトカインの連続刺激および特異的表面抗原抗体を用いた分画法によって、継代培養可能で肝細胞系・胆管系への多分化能を保持した肝前駆細胞様細胞の誘導に成功している。このヒトiPS細胞由来肝前駆細胞のより詳細な性状について解析するために、細胞表面タンパク質発現の網羅的解析を行った。その結果、複数のシグナル伝達分子が発現していることを見出した。例えば、CD221(IGF1 receptor)はヒトiPS細胞由来肝前駆細胞に強く発現している一方で、そのリガンドであるIGFは肝前駆細胞の増殖を支持するフィーダー細胞に発現していることを見出した。以上の結果から、フィーダー細胞とヒトiPS細胞由来肝前駆細胞とのパラクライン的相互作用による増殖制御機構が存在することを見出した。そこで現在、肝前駆細胞およびフィーダー細胞に存在するノンコーディングRNAを解析することで、ヒト肝前駆細胞の増殖を制御する新規RNA分子の同定を目指した研究を進めている。既に我々はマウスをモデルとして、幼弱な肝前駆細胞および成熟肝細胞間でのmiRNAの網羅的発現比較を行い、DLK-Dio3クラスターなど複数のmiRNAの発が胎生肝臓由来の肝前駆細胞で特異的に発現することを見出している。そこで、これらのmiRNAがヒト肝前駆細胞の機能を制御するか検討する。細胞生物学ヒトiPS細胞の長期培養系を構築し、その増殖にフィーダー細胞やサイトカイン(EGF)が必要なことを見出した。今後、フィーダー細胞におけるmiRNA発現の網羅的解析や、EGFによって特異的に誘導されるmiRNAの同定を目指す。(1)ヒトiPS細胞由来肝前駆細胞の増殖制御におけるmiRNAの同定すでにEGFによってヒトiPS細胞由来肝前駆細胞の増殖が制御されることを見出している。そこで、EGFによって誘導されるmiRNAを同定するとともに、得られた候補miRNAが実際に細胞増殖等を制御するか、強制発現系などで検討する。(2)フィーダー細胞におけるmiRNAの発現フィーダー細胞に発現するmiRNAの網羅的解析をマイクロアレイ等を用いて行う。miRNAの発現解析を本年に行う予定であったが、発現解析を行う細胞の選別等に時間がかかったためヒトiPS細胞由来肝前駆細胞の発現を制御するmiRNAの発現解析などを行う。
西日本における考古地磁気編年の検討

日本古代の近畿以西、西日本における考古地磁気の測定結果について再検討を行うのが本研究の課題であった。さらに考古学の手法によって行ってきた型式編年資料から得られた年代とのクロスチェックは、今回の研究で実施した重要な作業のひとつである。これらの前提に従って過去に測定され公表された地磁気測定が、どのような状況で行われたのかを検討した。すでに得られているデータを収集して現状でのデータベースを作成しフロッピデスクに入力した。さらに同時に出土した須恵器についても、考古学上の観察を行い、型式編年の基礎となっているものとの比較検討を容易とするため図をあわせて集成した。これらの作業で、現状での考古地磁気年代推定の成果の確認ができた。従来の地磁気の採集部位が必ずしも一定ではなく、対象となった焼土と一概にいっても、その部位が床面でない場合でも、かつては採集していた可能性が明らかとなった。その場合、一体どの時期の焼土が測定の結果に影響を与えているかが問題となってきた。この問題の解想された。比較的最近のデータである福岡県大野城市牛頸窯の成果を用いて検討を加えた。とくに九州と近畿の考古磁気の比較から、従来は差がないと見られていた両者の地磁気に幾分かの差があった可能性も指摘されるにいたった。近畿以西の西日本における考古地磁気の測定結果について再検討を行うのが本研究の課題である。さらに考古学の手法によって行ってきた型式偏年資料から得られた年代とのクロスチェックは、本年度実施した重要な作業のひとつである。これらの前提に従って過去に測定され公表された地磁気測定が、どのような状況で行われたのかを、まず検討することとした。最初にすでに得られているデータについて収集して現状でのデータベースを作成し、フロッピディスクに入力した。さらに同時に出土した須恵器についても考古学上の観察を行い、型式偏年の基礎となっているものとの比較検討を行った。これらの作業で、現状での考古地磁気年代推定の成果の確認ができたと思う。しかし、その過程で、従来の地磁気の採集部位が必ずしも一定ではなく、対象となった焼土と一概にいっても、その部位が床面でない場合でも、かっては採集していた可能性が明らかとなった。その場合、一体どの時期の焼土が測定の結果に影響を与えているのかが問題となってきた。この問題の解決には、サンプリング当時の採集部位の写真や図面が必要であるが、その収集には時間がかかるとともに、廃棄された可能性もあり、困難が予想された。したがって今年は、比較的最近のデータである福岡県大野城市牛頸の成果を用いて検討を加えてみた。また、九州と近畿の考古磁気の比較から、両者に幾分かの差があった可能性も指摘されるようになってきている。比較的最近のデータである福岡県大野城市牛頚窯の成果を用いて検討を加えた。
哺乳類の生殖を制御するGnRHの分泌リズム形成機構の解明

哺乳類の雌の性周期は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)のパルス状分泌およびサージ状分泌によって制御されることが知られているが、それらのリズム形成機構についてはよくわかっていない。本研究では、in vivo Ca2+イメージング法、トランスシナプストレーシング法、薬理遺伝学的手法を組み合わせることで、パルスおよびサージリズムがどのような神経回路で、どのようなメカニズムによって形成されるのかを明らかにする。
機能性成分及び環境耐性成分としてのソルビトールの遺伝子の解析と果樹器官への導入

ソルビトール-6ーリン酸脱水素酵素(S6PDH)遺伝子の導入により、ソルビトールを生産するカンキツの作出を目的とした。S6PDH遺伝子の発現:器官によるS6PDHの発現の特性を検討したところ、本活性は子葉及び本葉で強く、根や胚軸では余り検知されなかった。モモ新梢での発現の葉位別変動を調べたところ、未展開の葉ではS6PDH活性はほとんど検知されず、葉が生長するに伴って活性は増大した。この活性の増大はS6PDHタンパク質及びmRNAの変動とも一致した。季節によるS6PDHの発現の変動を調べたところ、活性の増減はS6PDHタンパク質及びmRNAの増減とも一致し、成熟前期での高い活性は果実への転流糖、収穫後での高い活性は樹体へのソルビトール供給のためと考えられた。S6PDHcDNAのキメラ遺伝子の作成:SAoriベクターのクローニングサイトにCaMV35Sプロモーター、S6PDHコーディング配列、Nosタ-ミネーターを挿入し、pSA-S6PDHを昨出した、一方市販のベクターからpBI121-S6PDHを昨出した。2種のキメラ遺伝子ベクターをトリペアレント法によってアグロバクテリウムに導入し、PCRによりS6PDHコーディング領域の挿入を確認した。キメラ遺伝子の導入と形質転換カンキツの昨出:カルスにアグロバクテリウムとの共存培養によりS6PDHキメラ遺伝子を導入し、カナマイシンで選抜したところ、スイ-トオレンジ系から胚形成するコロニーを得、再分化個体の葉よりDNAを抽出し、PCR検定によって、S6PDH遺伝子のカンキツへの導入が確認できた。形質転換体でのS6PDHの発現:葉より全RNAを抽出し、S6PDHの断片をプローブとしたノーザンブロットを行ったところ、形質転換体においてハイブリダイゼーションが認められ、mRNAが発現していることが確認できた。1.ソルビトール6リン酸脱水素酵素(S6PDH)の抗体及びcDNAのプローブを用いたウエスタンブロッティング、ノーザンブロッティングにより、S6PDH活性の器官特異的な発現を調べたところ、ソース器官である葉で強く、シンク器官である根や果実では殆ど活性を検知出来なかった。そしてこの発現はS6PDHのタンパク質及びmRNAの発現を伴うことを明らかにした。さらに葉におけるS6PDH活性は果実の肥大生長が最も盛んな時に高く、成熟期に一度低下し、果実を収穫した後に再び上昇した。この季節変動もS6PDHのタンパク質及びmRNAの発現を伴うことを明らかにした。2.カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターあるいはリブロース2リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットのプロモーターにS6PDHのcDNAを結合し、さらに選抜マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を結合したバイナリーベクターを構築し、それをアグロバクテリウムへ導入し、カンキツカルス細胞との共存培養によりS6PDHの形質転換体の獲得を試みたところ、数個体の形質転換体を得ることが出来た。これらの個体がS6PDHmRNA及びS6PDHタンパク質を発現するかについては現在のところ不明である。3.ソルビトールの蓄積と密接な関係を持っているソルビトール脱水素酵素(NAD-SDH)を、DEAE-セルロース、アフィニティークロマト、ゲル濾過、FPLCなどのステップにより精製することが出来た。そしてN末端のアミノ酸配列から本酵素の遺伝子のプローブを作成することが出来た。

ソルビトール-6ーリン酸脱水素酵素(S6PDH)のcDNAをバイナリーベクターpB1121に導入し、CaMV35Sプロモーター支配下においた組み換えバイナリーベクターpB1121-S6Pを作成し、アグロバクテリウムを介して5品種のカルスに感染させ、キメラ遺伝子による形質転換カンキツ細胞を得た。このカルス細胞を培養して植物体を得ることに成功した。そこで、形質転換体と思われる植物体の成葉を集め、PCR法により遺伝子へのS6PDHcDNAの取り込みを確認した。現在、S6PDHのmRNAとタンパク質の発現をノザンブロット及びS6PDH抗体によるウェスタンブロットにより確認中である。一方、モモ葉及びリンゴ葉を用いてS6PDH遺伝子の発現調節を検討した。その結果、S6PDHはスクロースーリン酸合成酵素のように遺伝子発現の日変動を示さなかった。S6PDHは幼葉では発現せず成葉になるにつれて発現量が増え、老化すると再び低下することが示され、葉のシンク器官からソース器官への切り換えと密接に関係することを示した。さらに、S6PDH遺伝子の発現は果実が肥大生長する時期に急激に増加し、成熟期は低下したが、収穫後より晩秋にかけて再び漸増した。最初の発現量の増大は果実に同化産物を供給するため、2回目の増大は枝、幹、根の充実及び耐寒性獲得のために必要なソルビトールを供給するためと考えられた。また、ソルビトール代謝に重要な役割を果たすソルビトール酸化酵素についてもその単離、精製を試みた。しかしながらリンゴ葉の細胞壁画分より可溶化して部分精製することは出来たが、精製までは至っておらず、現在実験中である。
極性制御因子の機能変化を基盤とした病態発生の分子機構の解析

癌や肝硬変、炎症性腸疾患では炎症反応による酸化ストレスに暴露されている。また、細胞極性の異常も確認されるが、酸化ストレスの細胞極性に対する具体的な作用は不明であった。本研究課題から、酸化ストレスによって極性制御因子であるaPKCの異常活性化がPar3, aPKC, Par6からなる三者複合体(aPKC-PAR複合体)形成を阻害し細胞極性の異常を惹起する要因となることを突き止めた。これら成果は、酸化ストレスが関与する病態に共通する分子基盤と考えられ新たな治療法の確立に貢献できることが期待される。炎症反応などによる酸化ストレスは、細胞・組織の傷害や癌の浸潤・転移に関与する可能性が示唆されている。しかし、酸化ストレスの細胞極性に対する作用についての詳細は不明であった。脂質は酸化ストレスに対する感受性が強く過酸化を受ける事から、脂溶性情報伝達物質であるイノシトールリン脂質(PIPs)の過酸化は、その作用(機能)が変化すると考えられる。申請者は、酸化ストレス刺激により、上皮細胞のPIPsの局在変化とその代謝に関わるPI3キナーゼシグナルの活性変化が誘導される可能性を見出した。また、aPKC-PAR複合体の形成阻害と局在変化を見出し酸化ストレスにより細胞極性の異常が誘導される事を発見した。これらの事から、「酸化ストレス→イノシトールリン脂質の過酸化→aPKC-PAR複合体の機能異常→細胞極性の異常」というカスケードが存在する可能性が浮上してきた。平成24年度では、酸化ストレス傷害モデルラットおよび、培養上皮細胞への酸化ストレス傷害によって誘導された極性変化は、抗酸化作用を有する化合物の投与により抑制され、aPKC-PAR複合体の形成阻害も抑えられた。さらに、ヒト毛細胆管構造の異常が観察される胆汁鬱滞モデルマウスにおいても極性異常が確認された。平成25年度は、胆汁鬱滞モデルマウスにおいて観察された極性異常の過程でaPKC-PAR複合体の形成やaPKCの過剰な活性化が生じているか検討する。また、aPKCの活性化阻害や発現抑制により酸化ストレスによって惹起される極性変化が抑えられるか検討する。本研究にから、酸化ストレスによる細胞極性制御の異常によりヒト病態の発生に関わる事が明らかとなれば、細胞極性の変化が観察される病態発生の分子基盤が明かとなり独創的な研究となる事が期待される。平成25年度では、新たに酸化ストレス傷害モデル動物としてマウスを作成し解析を行った。ANIT (alpha-naphthylisothiocyanate)による胆汁うっ滞モデルマウスを使った解析から、胆汁うっ滞による肝細胞障害の初期過程で管内胆管のタイトジャンクション(TJ)の消失やE-cadherinで観察される細胞間接着構造の異常が確認された。この時、aPKCやPar-3のTJの局在が失われていることが明らかとなった。本研究により、酸化ストレスによる細胞極性制御の異常によりヒト病態の発生に関わる可能性が示唆された。今後、更に、極性制御分子の機能変化について詳細に検討を行い検討により、細胞極性の変化が観察される種々の病態の分子基盤が明かとなり独創的な研究となる事が期待される。また、aPKC-Par複合体の形成阻害と局在変化を見出し酸化ストレスにより細胞極性の異常が誘導される事を発見した。

これらの事から、「酸化ストレス→イノシトールリン脂質の過酸化→aPKC-Par複合体の機能異常→細胞極性の異常」というカスケードが存在する可能性が浮上してきた。平成23年度は、酸化ストレス傷害モデルラット肝組織を用いてin vivoにおいて酸化ストレス刺激によりaPKC-Par複合体の形成阻害の分子メカニズムについて詳細に検討した。その結果、イノシトールリン脂質シグナル(PI3キナーゼシグナル)の活性が確認された。この時、aPKCの過剰活性化が生じていることをin vitroリン酸化実験により明らかとした。さらに、電子顕微鏡を用いた超微細構造の観察を行ったところ、毛細胆管の異常が生じている事を突き止めた。平成24年度では、ヒト毛細胆管構造の異常が観察される胆汁鬱滞モデルマウスを用いてaPKC-Par複合体の形成およびaPKC活性変化について検討する。本研究にから、酸化ストレスによる細胞極性制御の異常によりヒト病態の発生に関わる事が明らかとなれば、細胞極性の変化が観察される病態発生の分子基盤が明かとなり独創的な研究となる事が期待される。本研究課題の目的は「酸化ストレスにより誘導される脂溶性情報伝達物質の過酸化物が、極性制御因子Par3, aPKC-PAR6からなる三者複合体(aPKC-PAR複合体)の機能を変化させ炎症性病態を誘導するか明らかとする」ことである。本研究課題、平成23年度本は、四塩化炭素による酸化ストレス肝傷害モデルラットで確認された極性異常が、培養上皮細胞への酸化剤添加や酸化ストレスによるマウス胆汁鬱滞モデルにおいて極性異常が生じている検討した。また、それら酸化ストレスモデルに抗酸化剤の処理による極性異常の抑制効果を生化学的手法および免疫組織化学を用いて精査した。その結果、培養細胞への酸化ストレス処理によりPar-3の細胞間接着の局在が失われ極性異常が生じている事が明かとなった。この時、aPKC-PAR複合体形成の阻害が確認された。さらに、これまで検討していなかった電子顕微鏡を使った解析結果によって、炎症を伴う原発性胆汁性肝硬変で確認されている形態異常が、本研究解析モデルラットにおいても同様の変化が生じていた。平成24年度では、胆汁鬱滞モデルマウスの胆管上皮細胞においてaPKC、Par-3の細胞間接着部位の局在が失われ極性異常が誘導される事を突き止めた。これら変化は、抗酸化作用をもつ化合物の投与により抑制された。この結果から、ヒト病態発生に酸化ストレスによるaPKC-PAR複合体の機能変化が関与する可能性が強く示唆された。以上のことから本研究はおおむね順調に進展していると判断するに至った。本研究課題の目的は「酸化ストレスにより誘導される脂溶性情報伝達物質の過酸化物が、極性制御因子Par3, aPKC-Par6からなる三者複合体(aPKC-Par複合体)の機能を変化させ炎症性病態を誘導するか明らかとする」ことである。本年度は、酸化ストレスによるaPKC-Par複合体の形成阻害の分子機構に着目し解析を行った。本年度は、イノシトールリン脂質シグナル伝達(PI3キナーゼシグナル)を介したaPKCの活性化が生じている可能性に着目し、酸化ストレスによる肝傷害モデルラットを使いaPKCの活性変化を詳細について生化学敵手法を用いて精査した。その結果、酸化ストレス刺激した肝組織では、aPKCの比活性が約2倍上昇している事を明かとなった。
沖縄におけるライフコースの出生コーホート間比較研究

1.研究の目的と方法沖縄県下の3カ町村を調査対象地とし、6070歳代の男女52人に対して、人生の出来事経験についての詳細な面接調査をおこない、出来事経験の種別、経験内容、年齢、時代背景などを、出生コーホート間およびコーホート内の下位集団で比較することを通じて、沖縄における人生の出来事経験の発達的・歴史的変化を把握し、そのメカニズムを探求するとともに、それの分析を通して、家族、職業、地域社会など個人がかかわる集団・社会的関係・制度的領域の動態についての洞察を得ることを目的とする。分析される人生上の出来事は、学卒、就職、結婚、子の出生、子の離家、退職といった、家族、教育、職業、地域社会において個人が取得する役割の重要な移行をもたらすと思われるものに限定した。2.研究知見(1)沖縄の人びとのライフコースの初期の段階には、戦前の沖縄農村の社会構造や文化的規範の影響が色濃く見られた。(2)その一方で、昭和前半期の社会変動の過程に、沖縄の対象者も否応なく巻き込まれていった。とりわけ、戦争の影響は甚大であった。男性の多くは兵役を経験した。また、男性も女性も沖縄が戦場となったとき、戦闘員でもない人たちも戦火にまかれて家族を失った。(3)戦後の復興期のなかで、人びとは、部分的には米軍統治下で新しい社会経済状況に適応しながら、またある部分は、沖縄の昔ながらの慣行を維持しながらライフコースを歩んできた。1研究経過平成9年7月に、沖縄県下の3ヵ町村(西原町、南風原町、豊見城村)を調査対象地とし、6070歳代の男女52人に対して、人生の出来事経験についての面接調査を行い、学卒、就職、結婚、子の出生、子の離家、退職といった、家族、職業、教育、地域社会において個人が取得する役割の重要な移行をもたらすと思われる人生上の出来事についての客観的および主観的情報を収集した。一部の対象者を除き、面接はテープに録音した。実査終了後テープ起こしを行い、その内容をコンピュータに入力し、平成10年3月までにデータベース化を完了した。2次年度の研究計画面接で得られたデータを用い、人生上の出来事経験の種別、経験内容、年齢、時代背景などを、出生コ-ホ-ト間およびコ-ホ-ト内の下位集団間で比較することを通じて、沖縄における人生の出来事経験の発達的・歴史的変化を把握し、そのメカニズムを探求するべく、分析を進める計画である。その結果は、年度末に報告書として刊行する。平成9年度は、7月に沖縄県下の3ヵ町村(西原町、南風原町、豊見城村)を調査対象地とし、6070歳代の男女52人に対して、人生の出来事経験についての面接調査を行い、学卒、就職、結婚、子の出生、子の離家退職といった、家族、職業、教育、地域社会において個人が取得する役割の重要な移行をもたらすと思われる人生上の出来事についての客観的および主観的情報を収集した。実査終了後、テープ起こし文をパソコンのファイルに起こした。その分量は、A4版で2000ページ以上にのぼった。平成10年度は、この面接データのデータベース化を行った。具体的には、人生上の出来事経験の種別、経験内容、年齢、時代背景などを、出生コーホート間およびコーホート内の下位集団間で比較するための、基礎的なデータベースをパソコン上に作成した。今後、これをもとに、沖縄における人生の出来事経験の発達的・歴史的変化について分析を進め、早急に報告書として刊行する予定である。
植込型補助人工心臓装着患者の生活習慣と運動耐容能評価から予測する合併症予防戦略

最適薬物治療でもコントロールが困難な重症心不全患者に対し、わが国でも補助人工心臓植込みが普及してきている。近年はよりポンプやコントローラが小型化され、携帯しやすいものが認可されている。しかしながら、補助人工心臓植込み患者の増加とともに移植待機期間は延長している。補助人工心臓植込み患者の合併症として、脳血管障害や感染などの合併が、再入院や長期入院、生活の質(QOL)や生命予後の悪化をもたらしている。生活習慣、生活環境、運動耐容能と合併症との関連を評価することで、患者自身の日常生活での自己管理のみならず、家族がサポートを適切に行う意識を高め、合併症を予防し医療に関わる負担削減目的として本研究を計画した。平成30年度は、心不全患者に対する心肺運動負荷試験から得た運動耐容能と嫌気性代謝閾値の関係が、骨格筋疲労と関わる可能性を検討した。心肺運動負荷試験における嫌気性代謝閾値(AT)の酸素摂取量と最大酸素摂取量(peakVO2)の比をパーセント(%)で表した値が大きいと、下肢筋力や乳酸産生に関与する可能性があることを示し、第24回日本心臓リハビリテーション学会で報告した。このことから、補助人工心臓植込み患者の心臓、呼吸器、骨格筋の要因を評価することで、個々に合わせた運動処方を提供し、安全に運動療法を行ってもらうことで、運動耐容能を改善するのみならず、QOLの改善に寄与する可能性があることを示した。2018年度夏より、疾病により外来および入院での加療が開始となり、植込み型補助人工心臓患者に対する種々の測定が困難となった。このため研究の進行が遅滞した。平成30年度に行う予定であった超音波画像診断装置による骨格筋量(筋厚)測定による骨格筋評価を行う。このため、近赤外線による非侵襲的組織酸素飽和度の測定を再開する。この結果から、補助人工心臓の植込み後の活動度や骨格筋評価を行う。最適薬物治療でもコントロールが困難な重症心不全患者に対し,補助人工心臓植込みが徐々に普及してきている。心臓移植までの待機期間としての使用ではあるが、移植ドナーの増加は補助人工心臓植込み患者の増加を上まわり、移植待機期間はさらに延長している。植込後にADL拡大が順調にすすんでも、脳血管障害や感染などの合併が、再入院や長期入院、QOLや生命予後の悪化をもたらしている。平成28年度は補助人工心臓植込み後の合併症状況を確認するために、1これまでに植え込み型補助人工心臓を装着された症例のADL拡大の経過、動脈硬化危険因子、退院後の生活環境・サポート体制を評価し、植込み後から退院後までの、生活習慣の問題点を明らかにする、2そこから、植え込み型補助人工心臓装着患者に対する生活習慣調査表を作成する、ことを予定した。患者情報の収集から、補助人工心臓植込み患者における合併症は、植込まれたポンプと体外にあるコントローラを繋ぐドライブラインというチューブと皮膚との貫通部位の感染が最も多かった。感染が悪化し体内のポンプにまで感染すると致死的になるため、状態によっては長期入院を余儀なくされQOLの低下が問題となる。幼少児の存在な生活環境より、6分間歩行距離が長い=運動耐容能の高いほうが、貫通部感染の合併・悪化率が高いことが確認され、第22回日本心臓リハビリテーション学会で報告した。また、予後やQOL低下に大きく関与する合併症に脳血管障害があり、補助人工心臓植込み後2か月の間に発症することが多く、発症の有無に年齢以外明らかな関連因子がないが、症状等でのADLやQOLの評価、入院期間調査を行っている。平成28年度内に、植え込み型補助人工心臓装着患者に対する生活習慣調査表を作成する計画であったが、調査表の作成が未完了である。これは、植込み型補助人工心臓装着患者の合併症の種類やその誘因を調べ、特に多い合併症であるドライブライン貫通部周囲の感染が活動量に影響することが示唆されたが、活動量を評価する調査内容および実際の活動量の評価について、検討する必要があったためである。検討した結果、活動量計の利用を行うこととした。活動量計の測定内容を反映する調査表内容を検討中である。また、合併症の一つで予後やQOLに大きく関わる脳血管障害について、これまでの発症患者17例について、画像、障害の程度、リハビリ内容、経過について情報収集し、総合的に判断するのに時間を要している。現在、情報は収集し終え、脳血管発症患者と未発症患者についての背景の違いや運動耐容能、障害の程度、日常生活動作の獲得や退院までの期間について、リハビリテーションの役割について検討している。補助人工心臓植込み患者の合併症として、脳血管障害や感染などの合併が、再入院や長期入院、QOLや生命予後の悪化をもたらしている。

平成29年度は平成28年度の結果から、補助人工心臓植込み後の植込まれたポンプと体外にあるコントローラを繋ぐドライブラインというチューブと皮膚との貫通部位の感染が最も多く、状態によっては長期入院を余儀なくされQOLの低下が問題となること、感染は6分間歩行距離が長い=運動耐容能の高いほうが、貫通部感染の合併・悪化率が高いことが確認されたことから、骨格筋の状態や運動耐容能を評価することを目的とした。筋ジストロフィー患者で拡張型心筋症を合併し、補助人工心臓植込み術を施行する前、もしくは前後でのリハビリテーションの介入方法を検討するとともに筋力、活動量などを測定した。その結果を『拡張型心筋症を合併した筋ジストロフィー患者に対する心臓リハビリテーションの経験』として、第23回日本心臓リハビリテーション学会で報告した。また、予後やQOL低下に大きく関与する合併症に脳血管障害があり、症状やADLを調査した結果から、複数回脳血管障害を発症した患者は生命予後が悪く、高次脳機能障害を合併した患者にはサポートを多く必要とすることが判明した。この結果について論文にて報告予定である。平成28年度に活動量計を購入し、日常生活での活動範囲を拡大しながら適宜、活動量の測定を開始した。また、非侵襲的組織酸素飽和度測定装置であるINVOSを購入し、下肢の骨格筋の組織酸素飽和度測定を行うも、パイロット研究報告で骨格筋の筋厚に個人差があり、また、どの筋肉での測定なのかが重要であることを指摘され、骨格筋の厚さや部位を確認することが必要とされた。このため、超音波画像診断装置による骨格筋厚測定および部位確認を行うことが望ましいと判断した。その超音波画像診断装置購入に時間を要した為、研究に遅延が生じた。最適薬物治療でもコントロールが困難な重症心不全患者に対し、わが国でも補助人工心臓植込みが普及してきている。近年はよりポンプやコントローラが小型化され、携帯しやすいものが認可されている。しかしながら、補助人工心臓植込み患者の増加とともに移植待機期間は延長している。補助人工心臓植込み患者の合併症として、脳血管障害や感染などの合併が、再入院や長期入院、生活の質(QOL)や生命予後の悪化をもたらしている。生活習慣、生活環境、運動耐容能と合併症との関連を評価することで、患者自身の日常生活での自己管理のみならず、家族がサポートを適切に行う意識を高め、合併症を予防し医療に関わる負担削減目的として本研究を計画した。平成30年度は、心不全患者に対する心肺運動負荷試験から得た運動耐容能と嫌気性代謝閾値の関係が、骨格筋疲労と関わる可能性を検討した。心肺運動負荷試験における嫌気性代謝閾値(AT)の酸素摂取量と最大酸素摂取量(peakVO2)の比をパーセント(%)で表した値が大きいと、下肢筋力や乳酸産生に関与する可能性があることを示し、第24回日本心臓リハビリテーション学会で報告した。このことから、補助人工心臓植込み患者の心臓、呼吸器、骨格筋の要因を評価することで、個々に合わせた運動処方を提供し、安全に運動療法を行ってもらうことで、運動耐容能を改善するのみならず、QOLの改善に寄与する可能性があることを示した。2018年度夏より、疾病により外来および入院での加療が開始となり、植込み型補助人工心臓患者に対する種々の測定が困難となった。このため研究の進行が遅滞した。
細胞内分子機能のナノイメージングと機能のモデル解析

我々は,細胞内やマウス体内で起こる生命現象を1分子・1粒子・1細胞を高時空間分解能で観察し機能の解明を行った.マウス耳介に腫瘍化したがん細胞のイメージングや好中球の動く様子を,マウスを傷つけることなく高時空間分解能でイメージングした.観察像の結果,腫瘍からがん細胞が突起していることや好中球内の小胞は非常に活発に運動していることが明らかとなった.また,がん細胞の損傷度を定量化するために,細胞の位相差像を取得し各画素の光強度揺らぎから細胞内の運動を計測した.この計測結果は,これまでに行われた染色の結果とよく一致したことから,揺らぎ法を用いて細胞損傷を継時的に定量することが可能となった.これまでのin vivoイメージングでは、腫瘍部を切開して、癌腫瘍表面近くを観察できた。しかしながら、切開をすると出血や免疫細胞の活性化などが起こり、生きたままの姿を観察する事は困難である。そこで、非侵襲で観察できる装置システムの改良と観察法の工夫をおこなった。明るくするため、倍率を下げ、レーザーの集光度を上げた。血量が見えるように、青い光の透過像を得られるようにした。観察法として約200μmの厚さしかない耳をえらび、蛍光を発する毛の脱毛をした。がん細胞をラベルするためにHerceptin-量子ドット複合体を尾静脈注射し、細胞膜に結合した量子ドットの観察に成功した。また、白血球の中でも運動能が高い好中球やマクロファージに結合した多粒子化量子ドットを結合することで、血管中の好中球をより鮮明に量子ドットを観察する事ができた。また、耳に刺激剤を塗りクロファージを誘発したところ、貪食した量子ドットの詰まった小胞の運動を観察する事ができ、小胞の位置を50nm精度で追跡することができた。また、細胞運動を観察でき、仮足が急速に伸びたのち、細胞体が仮足の方法に動き出した。好中球が生体内を動くメカニズムが解ってきた。マウスの耳殻にがん腫瘍を形成し非侵襲下でがん細胞を観察を試みた。耳殻に乳がん組織を形成する実験モデル(マウス)の開発を試みたところ、耳殻での腫瘍形成に成功した。さらに、このがんモデルマウスを用い、乳がん細胞に特異的に付着するように処理した蛍光量子ドット(QD)と当研究室で開発した共焦点顕微鏡を用い、リアルタイムで、かつ非侵襲下で乳がん細胞膜上のQDを観察することに成功した。本技術はin vivoにおける腫瘍細胞特性を解明と、がん治療のための医療応用としての基盤技術につなげていけるものと考えている。非侵襲in vivoがん細胞・白血球のイメージング:これまでのin vivoイメージングでは,腫瘍部を切開して、癌腫瘍表面近くを観察できた。しかしながら、切開をすると、出血や免疫細胞の活性化などが起こり、生きたままの姿を観察する事は困難である。観察法として、約200μmの厚さしかない耳をえらび、蛍光を発する毛の脱毛をした。がん細胞をラベルするためにHerceptin-量子ドット複合体を尾静脈注射た。細胞膜に結合した量子ドットの観察に成功した。耳にがん腫瘍を形成し非侵襲下でがん細胞を観察を試みました。耳殻に乳がん組織を形成する実験モデル(マウス)の開発を試みたところ、耳殻での腫瘍形成に成功しました。さらに、このがんモデルマウスを用い、乳がん細胞に特異的に付着するように処理した蛍光量子ドット(QD)と当研究室で開発した共焦点顕微鏡を用い、リアルタイムで、かつ非侵襲下で乳がん細胞膜上のQDを観察することに成功しました。これまでに我々が開発した非侵襲invivo観察技術を用いることで,マウス耳介内において、活性化した好中球内部の小胞輸送速度は,しばしば4um/secにも達することが明らかとなった(Kikushima et al. Scientificreports (2013))。精製された単一のモータータンパク質(細胞質ダイニンやキネシン)の運動速度は1μm/secでしかないことから,これには,複数のモータータンパク質が協調して働くといった未知の機構によってなされていると予想される.この高速小胞輸送のより詳細な特徴を明らかにするために,我々は、QDを内包した明るい小胞を持つ、活性条件の良い好中球を精製する手法を編み出した.この精製した好中球内部における小胞の速度を解析したところ,マウス耳介内で観測された際と同様に2um/secを超える高速小胞輸送が頻繁に観測されることが確認された.このようにして精製された好中球に微小管重合阻害剤であるノコダゾールを作用させたところ,2um/sec以上での高速小胞輸送が観察されなくなった.

一方で,アクチンのモータータンパク質であるmyosin IIの阻害剤であるblebbistatinや,myosin IIの上流で活性制御を行っているROCKの阻害剤であるY-27632を作用させた際にも,2um/sec以上での高速小胞輸送の頻度は大きく減少することが観測された.これとは別に,マウス内がんのイメージングの準備としてKPL4-EB1-GFP, MDA-MB-231(WT,GFP-tub,EB1-GFP)計4株における接種細胞数と腫瘍形成能の検討を行った。その結果、一定以上の接種細胞数があれば高確率(100 %)で腫瘍ができることが確かめられた.がん組織・細胞の非侵襲in vivoイメージングに関する現在作成中の論文に追加するデータを得るために2つの実験を行った.1つは,MDA-MB-231細胞のGFP-tub.とWild Typeを9:1で混合し,がん組織の蛍光タンパクのバックグラウンドを抑えin vivoイメージング行い,これまで以上に鮮明ながん細胞像を得る研究を行った。2つ目はヌードマウスの耳介の腫瘍形成率が低いが,例数が少なくSKIDマウスとの間に有意差がみられないことから,例数を増やす実験を行った.MDA-MB-231細胞のGFP-tubとWild Typeを9:1で混合し,マウス耳介に接種した結果背景光の低くコントラストの高い細胞イメージングができた.また,ヌードマウスの耳介の腫瘍形成率についての実験では,これまで4×10^6cellsの接種細胞数では腫瘍の形成がみられなかったが,5.0×10^6cells以上の細胞を接種すると,腫瘍が形成することが新たに明らかとなった.脳の悪性腫瘍からライン化された細胞(Brain tumor stem cells,BTSCs)の紫外線に対する耐性を調べた.がん幹細胞と幹細胞ではない腫瘍細胞U87に紫外線(280nm)10分照射した後に,幹細胞に結合した量子ドット-EGFRの細胞膜上の運動のトラッキングを行た.その結果,がん幹細胞のEGFRの膜上の運動は,照射前とほとんど変化しなかった.それに対して,幹細胞ではないU87では,膜上の運動は大きく阻害された(遅くなった).これらのことから,がん幹細胞が,紫外線に対する耐性があること明らかとなった.Par1ー量子ドットを用いて細胞内エンドサイトーシスの3次元追跡を行った結果、細胞内に入ったり出たりする不思議な現象が得られた。がん細胞のマウス内非侵襲イメージングの実験結果がすべて出そろったので、27年度は論文執筆を重点的に行うことができる。今年度新たに始めた幹細胞を選択的に除去を行う研究も順調に進んでいる。また、がん細胞の発現に重要なPar1がどのように細胞内に取り込まれているのかを3次元的に観察する装置は完成し、いくつかの追跡データーを得ることができた。これは、ほぼ予想の進行速度である。ミオシン分子の機能がどのように拡張され,効率的な力発生を実現しているのかを明らかにすることを目的として,ミオシンフィラメントに相互作用するアクチンの端にビーズを結合させて光ピンセットでトラップし,ミオシンフィラメントの発生する力を計測した.さらにシミュレーションモデルを構築し実験データとの比較から,外部負荷に対する各ミオシン分子の力発生状態を調べた結果,高負荷・高ATP濃度においてミオシンの力発生のタイミングが同調する可能性が示唆された.