hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大気中常温接合の新手法

本研究は、我国が先行する常温接合を世界に先駆けて実用化・量産化に結びつけるための新しい視点として、大気中での常温接合を実現することを目的としている。そのため、従来の常温接合の基礎技術を体系化し、Arイオン衝撃とSiのナノ密着層の組み合わせ、原子拡散接合、大気圧プラズマ照射、水素ラジカル処理などの新しいプロセス、およびその複合プロセスを提案した。またこの過程で、当初予定していなかったSi-Feナノ密着層を適用することで、ポリマーとガラスや、SiCなどの接合が可能であることが判明した。これらの結果を応用し、光マイクロシステムの集積化やデバイス封止技術へ適用可能であることを示した。提案するフ〓ロセスのシーケンシャルの組み合わせに対し、対象材料を変化させ、大気中接合の可能性を検討した。1)Si、カ〓ラスを対象とした水フ〓ラス〓マ接合、およひ〓ナノ密着層接合を検証し、その有効性を確認した。2)上記に対するフッ素添加フ〓ラス〓マ接合の検証を行い、その有効性を確認した。3))Fe, Al、Cu、Siをナノ密着層(原子拡散接合)としてSiウエハの接合を行い,真空中ならびに超高純度Arガス中(0.11気圧)室温で接合が可能であった。4)GaN異種材料集積光デバイスを実現するために、常温オーミックコンタクト層(Cr/Au)を用いた低温接合技術を開発した。n-GaN表面をアルゴン高速原子ビームで前処理することにより、常温Cr/Auオーミックコンタクト層をn-GaN上に形成し、大気中、150°CでAu-Au表面活性化接合を行うことで、オーミック電極を有するGaNをSi基板上に集積することが可能となった。また、Au-Au表面化接合技術の気密封止プロセス(大気圧雰囲気)への適用可能性を調査した。300MPa、150°Cの接合条件では、MIL-STD-883の基準値以下のリークレートが可能であることを示した。ガラス基板、Siキャビティ基板を積層した低温気密封止パッケージングを提案した。小径対応常温大気中接合装置の試作し、本研究過程で提案されたSi-Feナノ密着層を適用することで、高分子フィルムの接合を実現した。界面の詳細な検討から、Siが接合部のポリマー内部に常温でも拡散し、接合強度の増加に寄与していることを明らかにした。さらに、SiC-SiCの常温接合が可能であり、接合が1000°Cの高温にまで安定であることを明らかにした。これらは、今後のSiCペパワーデバイスの製造に寄与するものと期待される。また大気中の常温接合を実現するため、接合雰囲気と接合メカニズムに関する結果を元に、酸化物生成能が低いAu膜をナノ密着層に用いて放熱用金属バルク材料とデバイスウエハを室温で強固に接合することに成功した。一方、安価で熱伝導性が高いものの室温で僅かに酸化物形成能を有するAg膜の室温接合では、接合時に加圧することでAu膜と同等の大きな接合強度が得られた。しかし,接合界面に空隙が散在し接合性能が低下することが明らかとなった。光素子の大気中常温接合については、大気圧プラズマを用いたAu-Au表面活性化接合技術を開発し、半導体レーザチップへ適用した。特に、水素ラジカル処理によるSnAgCuはんだの大気中での再酸化抑制効果を検証し、Au膜との低温固相接合を実現した。本技術を高い透過率を有するナノワイヤグリッド偏光子を集積した小型偏光センサに適用し、回転偏光面の計測が可能であることを実証した。以上の研究成果は、我が国が先行する常温接合を世界に先駆けて実用化・量産化に結びつけていくための新しい視点として、大気中常温接合を実現したものである。同時に、常温接合の基盤技術を体系化し、イオン衝撃を主体にした表面活性化+数原子層極薄膜形成プロセス、ないしは大気圧プラズマ、といった複合プロセスを提案し、これが、さまざまなデバイスの接合・封止技術等へ適用できることを明らかにした。前年度に、今後の著しい進展の見込みが得られるとの見通しが明確になったSi-Si系、SiC系、新たな展開が見込まれるPolymer-ガラス系を新たに対象材料として加え、常温大気中接合の可能性をナノ密着層の組み合わせにより検証した。また、小径対応常温大気中接合装置の試作を行い、シーケンシャルプロセスのパラメータ影響の検討、プロセスパラメータの最適化等を行った。基礎的な知見としては、酸化物生成自由エネルギーが正であるAu膜をナノ密着層(原子拡散接合)に用いて,水晶ウエハの大気中接合を行ない、接合に用いるAu膜厚と大気暴露時間等が接合に与える影響を検討した。その結果、大気にAu膜を取り出した後で168時間が経過した後に接合した場合でも、Au/Au界面では室温で再結晶が生じ、ウエハを強固に接合できることが明らかとなった。

この実験を通して、新しい接合プロセスの接合メカニズムと信頼性に関する基礎的な知見を得ことができた。フォトニクス関連の応用デバイスとしては、Si/Geヘテロ接合用いたフォトニクスデバイスを実現するために、p型Geウェハとn+型Siウェハに対し、Ar高速原子ビームによる表面活性化接合を行い、ダイシェア試験によりバルクから破断する程度の強い接合強度とI-V特性測定により低抵抗なオーミックコンタクトが得られることを明らかにした。また、半導体レーザなどの光素子の低温接合技術を実現するために、大気圧プラズマを用いたAu-Au表面化接合技術(大気雰囲気)を開発した。コイニングにより平滑(Ra: 3.0 nm以下)で厚い(10 μm以上)Auバンプを形成し、Ar+H2大気圧プラズマやN2大気圧プラズマにより活性化を行うことで、低温(常温150°C)で光応用に十分な接合強度(MIL-STD-883の基準値以上)が得られることを実証した。当初の実験を行い、おおむね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、我が国が先行する常温接合において、世界に先駆けて実用化・量産化に結びつけていくための新しい視点として、超高真空によらない大気中常温接合を実現することを目的としている。そのために、従来の常温接合の基盤技術を体系化し、Arイオン衝撃を主体にした表面活性化+金属やSiの数原子層極薄膜形成プロセス+水プラズマ照射というシーケンシャルな複合プロセスを提案し、MEMSパッケージ、次世代タイプCuバンプレス・インターコネクト、フォトニクスデイバス開発を通じてその可能性を検証することになっている。この目的に沿って、Ar-FABやSiナノ密着層(原子拡散接合)などが提案され、また、酸化、酸化物生成自由エネルギーの大小が接合に寄与しているという理論的な裏づけ、また膜厚と大気暴露時間との関係が明らかにされている。また、水プラズマ照射については装置の関係から直接の実施は見送ったが、これと同等の効果があると思われる大気圧プラズマの導入を行い、常温大気中接合の可能性が明らかにされ、また、MEMSパッケージフォトニクスデイバス開発を行っており、順調に進展しているといえる。なお、さらに、平成24年12月、当初予定していなかったSi-Feナノ密着層を適用することで、Polymer-ガラス・Polymer系の常温接合が可能となった。この新しい知見を有効に生かすために、新たに6カ月を要して新規に装置設計を行った。本研究で提案した手法が、Siやガラスのみならず、高分子フィルムの接合にも適用可能であることが明らかとなってきた。産業界へのインパクトが大きいと期待されるため、高分子フィルムへの適用を研究課題に含めることとする。平成24年12月、研究遂行の過程で、その成果として当初予定していなかったSi-Feナノ密着層を適用することで、Polymer-ガラス・Polymer系の常温接合が、新しいイオンソースを用いて可能となった。これは今後のデバイス開発にとって新しい発明であり、H24年度、試作予定であった小径対応
肺癌の免疫逃避の解明とその克服法の検討

肺癌の免疫逃避機構の解明を行い、その機序の克服をすることで、有効な癌免疫療法を確立することを目的に研究を行っている。免疫逃避機構として、HLA分子の発現異常と所属リンパ節の制御性T細胞について解析を行った。HLA分子の発現異常は肺癌において高頻度に認められ、低発現群の予後が不良である事が示された。また、所属リンパ節においてCD4リンパ球における制御性T細胞の頻度が高いことは、予後不良因子であった。これらのことより、癌抗原を標的とした免疫療法を行う場合、HLA発現異常例については、HLA遺伝子の導入などによるHLA分子の発現回復、さらに制御性T細胞を標的とした免疫治療などを考慮する必要がある。肺癌の免疫逃避機構の解明を行うため、肺癌患者における腫瘍内、所属リンパ節や、末梢血リンパ球の制御性T細胞(Treg)の発現を検出する系を確立することを目的に研究を行った。非小細胞肺癌患者における手術検体(176例)の所属リンパ節および末梢血リンパ球を用いて、細胞内FACSにてTregを検出した。Tregの比率は、リンパ節において、末梢血リンパ球よりも有意に高頻度であった。リンパ節リンパ球においてCD4陽性細胞の中のTregの割合が1%より低い群を低値群、1%以上を高値群とした場合、5年生存率は低値群で84.4%高値群63.5%であり、有意に高値群の予後が不良であった。病理病期I期においても、5年生存率は低値群で91.4%高値群84.8%であり、高値群の予後が有意に不良であることを明らかとした。また、非小細胞肺癌403例を対象とし,抗HLA class I抗体を用いてHLA class I分子の発現を疫組織化学染色にて、癌精巣抗原(KK-LC-1,MAGE-A3,MAGE-A4)の発現をRT-PCR法にて解析し、その相互の臨床病理学的関係を明らかにした。HLA class Iの発現における5年生存率は正常発現76.6%,低発現65.9%、重度低発現76.1%であり、正常発現に比べ,低発現では予後不良であった。一方、癌精巣抗原の発現率は、それぞれKK-LC-1、MAGE-A3、MAGE-A4において32.6%、23.8%、20.1%であった。癌精巣抗原の陽性例において、HLA class I正常発現例よりも低発現症例は予後不良であった。非小細胞肺癌におけるHLA class I分子の発現異常は、癌特異的免疫療法を行う上で重要な課題である。癌抗原を標的とした免疫療法を行う場合、HLA発現異常例については、HLA遺伝子の導入などによるHLA分子の発現回復などを考慮する必要がある。肺癌の免疫逃避機構の解明を行うため、肺癌患者における腫瘍内、所属リンパ節や、末梢血リンパ球また腫瘍組織内での制御性T細胞の発現を検出する系を確立することを目的に実験を行っている。非小細胞肺癌患者における、手術検体より凍結保存していた所属リンパ節リンパ球および末梢血リンパ球を解凍し、細胞内FACSにてFoxp3陽性T細胞を検出した。2003年1月より2006年までの手術症例で所属リンパ節リンパ球および末梢血リンパ球の保存が可能であった症例について細胞内FACSを進めている。現時点で84例については解析が終了しており、所属リンパ節リンパ球では4.4%の発現であるのに対して、末梢血リンパ球では2.8%と有意に所属リンパ節リンパ球にて、制御性T細胞が多いことが判明している。更に症例を増やして現在解析中で、今後予後との相関などを調べていく予定である。また腫瘍浸潤内および所属リンパ節の制御性T細胞を評価するため、腫瘍組織内および所属リンパ節のFoxp3の発現を検出するために、それぞれのmRNAを抽出し、定量的RT-PCRにてFoxp3を検出する系を確立することを行った。条件設定を行うために、細胞内FACSにて高い制御性T細胞の発現を認めた腫瘍浸潤リンパ球よりmRNAを抽出し、ポジティブコントロールとした。Foxp3の遺伝子配列を元にプライマーの作成を行い、定量的RT-PCRを施行した。希釈系列を用いて、定量的RT-PCRを行ったところ、1/1000の希釈系列まで、検出可能であった。また正常組織での発現を解析した。この条件設定を元に、肺癌組織および所属リンパ節のmRNAの抽出を行い、Foxp3の発現を定量的RT-PCRにて解析を進めている。HLA class Iの免疫染色については、染色は終了し現在評価を行い臨床因子との関連を解析している。Foxp 3を解析するため定量的PCRの条件設定に時間を要したが、安定して測定できるようになった。

腫瘍抗原の同定については、腫瘍抗原をコードする遺伝子と単離したが抗原エピトープを検索しているところである。腫瘍組織、所属リンパ節における制御性Tリンパ球をFoxp 3を指標とした定量的PCR及びフローサイトメトリーの2つの手法にて評価を続け、その臨床的意義を明らかにする。さらに免疫逃避機構の1つとしてHLAの発現異常について解析をすすめ肺癌切除例において腫瘍抗原の発現とHLA発現異常の関連及びその臨床的意義について検討する予定である。制御性T細胞を解析する定量的PCRの試薬・ディスポ製品および学会発表・論文投稿などに使用します。
海藻のアレロケミカルによる植食動物幼生と付着珪藻の排除機構に関する研究

岩礁生態系を構成する生物は、食物だけでなく、生産者である海藻が生産するアレロケミカルによっても結ばれている。本研究においては、海藻がアレロケミカルによって植食動物幼生や付着珪藻を排除するとの仮説を、新たな実験系を考案して実証した。海中林構成海藻が夏秋に大量死亡し、冬春に成長阻害と死亡によって海中林の再生が阻害されることによって起こる磯焼けは、高水温よりも栄養塩不足がもっとも主要な要因であることが初めて明らかになった。海中林を構成する褐藻アラメ・クロメが生産し、海水中に分泌するブロモフェノールは、ウニとアワビ幼生の変態を1ppmで阻害し、10ppmで死亡させることを、既知の変態誘起物質であるジブロモメタンを同時に作用させる実験系によって初めて明らかにした。またブロモフェノールは、藻体表面に着生する付着珪藻の増殖を15ppmの低濃度で阻害することも明らかにした。海藻のアレロケミカルの研究は、主にコンブ目褐藻を対象に進められてきた。今回、ヒバマタ目褐藻11種と潮間帯の褐藻マツモを培養し、得られた培養海水をガス質量分析器GC-MSで分析した結果、11種のヒバマタ目褐藻のうち5種とマツモがブロモフェノールを分泌すること、さらにヒバマタ目褐藻10種が植食動物幼生に高い毒性をもち、紅藻無節サンゴモが生産するトリブロモメタンを生産、分泌するという驚くべき事実も明らかになった。本研究によって得られた知見は、岩礁生態系の動的安定性の機構を解明し、高い生産力のもとに安定的に維持・管理できる生態系管理技術体系の確立に寄与する。海中林構成海藻アラメ・クロメが分泌する2種のブロモフェノールがキタムラサキウニとエゾバフンウニの幼生に対して110ppmで変態を阻害し、2050ppmで死亡させることを明らかにした。ウニ幼生は紅藻無節サンゴモ優占群落で変態して発生するが、海中林内では海底に無節サンゴモが生育していても変態個体は少なく、変態個体の死亡率も著しく高いことが知られている。この原因は海中林がウニ幼生の変態阻害物質を分泌しているためであると考え、ウニ幼生の変態誘起揮発物質ジブロモメタンに1時間被曝後、揮発物質ジブロモフェノールとトリブロモフェノールを2種の幼生に被曝させた。その結果、変態阻害濃度と死亡させる濃度を明確に明らかにできた。また2種のブロモフェノールに対する感受性は種によって異なることも明らかになり、受容体との構造相関が示唆された。海中林構成海藻カジメは、2630°Cの高水温と12.5μmol/m2/秒以下の低光強度では死亡すると考えられていた。本研究によって、高水温で10μmol/m2/秒の低光強度であっても、富栄養であれば光合成速度を維持し、炭素・窒素など物質を生産して成長できることを初めて明らかにした。海中林は、磯焼けと呼ばれて高水温・貧栄養の海況条件で深所から死亡個体が増加して衰退することが知られる。磯焼けの発生機構を明らかにするため、カジメの生理学的閾値を水温、光強度、栄養塩濃度、塩分濃度、流速の複合条件下で光合成速度の測定と培養実験を行った。培養実験の結果、貧栄養では高水温、低光強度、低流速では生育が阻害され、死亡するが、富栄養であれば、物質を生産・蓄積し、クロロフィル量を増加して生育を補償することが分かった。またカジメの光合成速度は、10μmol/m2/秒の低光強度、2psuの低塩分濃度であっても富栄養であれば維持され、貧栄養であれば阻害されることが示唆された。

高水温・貧栄養の海況条件下、夏から秋にかけて海中林が大量に枯死する磯焼け現象は、栄養塩欠乏がもっとも重大な発生要因であることが本研究によって始めて明らかになった。褐藻カジメを栄養塩強化PESI海水(富栄養)、男鹿半島産海水(貧栄養)、窒素・リン除去ASS_2人工海水(栄養塩欠乏)の3種の海水を用い、光量子束密度180、10、5μmol/m^2/秒、水温20、26、28、30°Cの各条件でそれぞれ培養した。富栄養条件では、濃度依存的に栄養塩を大量に吸収し、クロロフィル量を増加、光合成速度を高進させ、28°C以上の高水温にも適応して高い成長率を維持した。カジメは、26°Cが生育の上限水温と考えられていた。貧栄養条件では、富栄養条件と比べて栄養吸収速度が低下、成長率も著しく低下した。栄養塩欠乏条件では、早期に細胞の劣化をきたして死亡した。特に水温28、30°Cの高水温、180μmol/m^2/秒の高光量子束密度では代謝速度が高まるので、早期に細胞が劣化して、死亡した。また、水温20°Cであっても細胞が早期に劣化した。褐藻カジメの生育に最適な栄養塩濃度は、アンモニア態・硝酸態窒素がそれぞれ約200μg/l、リン酸態リンが50μ9/lであると考えられる。褐藻アラメ、カジメが分泌する揮発物質ジフロモフェノール(DBF)とトリフロモフェノール(TBF)が付着珪藻の増殖を阻害するか否かを、褐藻ヒジキから単離したNavicula britannicaとCylindroteca closterium、紅藻スサビノリから単離したMelosira nummuloidesの3種を対象に10日間生物試験を行った。DBF 1ppm添加区の場合3種とも対照区と同様の増殖を示したが、5ppm添加区の場合有意に増殖速度が低下した。25ppmの場合、まったく増殖せず、大部分死亡した。TBFの場合も、3種ともDBFの各濃度区と反応はほとんど等しかった。ヒバマタ目褐藻がDBFおよびTBFを分泌するか否かを明らかにするため、ヒジキ、エゾノネジモク、ヤツマタモク、ノコギリモク、フシスジモク、マメタワラ、ヨレモク、ジョロモク、スギモクの9種を密閉容器中、水温15°C、光量子束密度180μmol/秒で24時間(明暗周期12:12)培養し、培養液をGC-MSで分析した。その結果、実験に用いた9種のヒバマタ目褐藻は共通してDBFを分泌することが明らかになった。TBFは検出されなかった。したがって、海中林を構成する褐藻は、共通してブロモフェノールを常時多量に分泌してウニ・アワビ幼生の発生を阻害するとともに、付着珪藻の着生をも阻害することが本研究によって始めて明らかになった。
顔面非対称の評価における主観と客観の統合

顔面非対称の主観的評価と正面セファロ写真における計測指標との関係を解析した.矯正科を受診した100名の患者を連続的に抽出し,その正面写真を10名の歯科矯正科医が観察して,3つのカテゴリーに分類した.(1)顔面は対称である.(2)顔面は非対称であるが治療を必要とするほどではない.(3)治療が必要な非対称である.各カテゴリーの特徴を抽出するために8名以上の評価が一致した症例40例について,セファロ正面写真上で各指標の計測をおこなった.その結果,Me, Maxillo-mandibular midline angle, L1などの下顎の指標が主観的評価と関連していることがわかった.またpostural symmetryangleは主観的評価と一致せず,骨格の非対称と主観的評価が関連しない症例があることがわかった.これには咬筋などの軟組織が関連していると推測された.次に矯正科医が患者の顔面非対称の治療を必要とするか否かを主観的に識別するための,セファロ指標の閾値をもとめた.上記100名の患者を,グループA,顔面対称的あるいは臨床的に受け入れられる非対称であり治療を必要としない群,グループB,著明な非対称で治療を必要とする群の2グループに分類した.セファロ正面写真上で各指標を分析し,各々の矯正科医における判別分析をおこなった.指標の中では,Meの正中からの距離あるいはMaxillo-mandibular midline angleがすべての観察者において高い精度を示し,顔面非対称の主観的評価の最も適切な指標である可能性が示唆された.Meの距離の判別点は,最大で4.9mm,最小で3.4mmであった.また,Maxillo-mandibular midline angleの判別点は,最大で5.1°,最小で3.4°であった.本研究で決められた閾値は矯正治療計画や評価に寄与するものと考えられた.顔面非対称の主観的評価と正面セファロ写真における計測指標との関係を解析した.矯正科を受診した100名の患者を連続的に抽出し,その正面写真を10名の歯科矯正科医が観察して,3つのカテゴリーに分類した.(1)顔面は対称である.(2)顔面は非対称であるが治療を必要とするほどではない.(3)治療が必要な非対称である.各カテゴリーの特徴を抽出するために8名以上の評価が一致した症例40例について,セファロ正面写真上で各指標の計測をおこなった.その結果,Me, Maxillo-mandibular midline angle, L1などの下顎の指標が主観的評価と関連していることがわかった.またpostural symmetryangleは主観的評価と一致せず,骨格の非対称と主観的評価が関連しない症例があることがわかった.これには咬筋などの軟組織が関連していると推測された.次に矯正科医が患者の顔面非対称の治療を必要とするか否かを主観的に識別するための,セファロ指標の閾値をもとめた.上記100名の患者を,グループA,顔面対称的あるいは臨床的に受け入れられる非対称であり治療を必要としない群,グループB,著明な非対称で治療を必要とする群の2グループに分類した.セファロ正面写真上で各指標を分析し,各々の矯正科医における判別分析をおこなった.指標の中では,Meの正中からの距離あるいはMaxillo-mandibular midline angleがすべての観察者において高い精度を示し,顔面非対称の主観的評価の最も適切な指標である可能性が示唆された.Meの距離の判別点は,最大で4.9mm,最小で3.4mmであった.また,Maxillo-mandibular midline angleの判別点は,最大で5.1°,最小で3.4°であった.本研究で決められた閾値は矯正治療計画や評価に寄与するものと考えられた.顔面非対称の主観的評価と正面セファロ写真における計測指標との関係を解析した.矯正科を受診した100例の患者を連続的に抽出してその正面写真を10名の矯正科歯科医が観察して,3つめカテゴリー(1)顔面は対称である.(2)顔面は非対称であるが治療を必要とするほどではない.(3)治療が必要な非対称である.に分類した.各カテゴリーの特徴を抽出するために8人以上の評価が一致した症例40例について,セファロ写真上で各指標の計測を行った.その結果,Me, Maxilo-mandibular midline angle, L1などの下顎の指標が主観的評価と関連していることがわかった.また,postural symmetry angleは主観的評価と一致せず,骨格の非対称と主観的評価が関連しない症例があることがわかった.これには咬筋などの軟組織が関連していると推察された.次にセファロ上の計測指標で,良く主観的評価と一致したMeの正中からの距離を取り上げて,10名の評価者が判別点としている値を求めた.その結果,最も大きな判別点を示す評価者で4.9mm,最小で3.4mmであることがわかった.また,客観的評価法としてCT画像の3次元再構築画像をもちいて,骨格の左右対称性に対する評価方法を確立した.この方法による評価の再現性は臨床応用するに十分であることがわかった.さらにこの方法で下顎前突症患者の評価をおこなったっところ,多くの症例で左右非対称であることが判明した.

顔面非対称の主観的評価と正面セファロ写真における計測指標との関係を解析した.矯正科を受診した100名の患者を連続的に抽出し,その正面写真を10名の歯科矯正科医が観察して,3つのカテゴリーに分類した.(1)顔面は対称である.(2)顔面は非対称であるが治療を必要とするほどではない.(3)治療が必要な非対称である.各カテゴリーの特徴を抽出するために8名以上の評価が一致した症例40例について,セファロ正面写真上で各指標の計測をおこなった.その結果,Me, Maxillo-mandibular midline angle, L1などの下顎の指標が主観的評価と関連していることがわかった.またpostural symmetryangleは主観的評価と一致せず,骨格の非対称と主観的評価が関連しない症例があることがわかった.これには咬筋などの軟組織が関連していると推測された.次に矯正科医が患者の顔面非対称の治療を必要とするか否かを主観的に識別するための,セファロ指標の閾値をもとめた.上記100名の患者を,グループA,顔面対称的あるいは臨床的に受け入れられる非対称であり治療を必要としない群,グループB,著明な非対称で治療を必要とする群の2グループに分類した.セファロ正面写真上で各指標を分析し,各々の矯正科医における判別分析をおこなった.指標の中では,Meの正中からの距離あるいはMaxillo-mandibular midline angleがすべての観察者において高い精度を示し,顔面非対称の主観的評価の最も適切な指標である可能性が示唆された.Meの距離の判別点は,最大で4.9mm,最小で3.4mmであった.また,Maxillo-mandibular midline angleの判別点は,最大で5.1°,最小で3.4°であった.本研究で決められた閾値は矯正治療計画や評価に寄与するものと考えられた.
日本語教員養成における「日本事情」教育のシラバス構築のための調査研究

本研究活動は,日本語教員養成として「日本事情」をどのように教えるかを考えるための教育的方法およびその理念的な背景について検討し,そのモデルクラスの設置の方法と具体化について考察するものである。とくに、「日本事情」をどのように教えるかを考えるための教育的方法としてのモデルクラスについては、研究代表者の担当する早稲田大学日本語研究教育センターにおける「日本語・総合」クラスでの実践を記録し、この分析を行うとともに,ここでの学習者の活動と「日本事情」教育としての位置づけの問題について研究会を開催し,討議を行った。以上のような検討から、昨年度策定した、日本語教員養成として「日本事情」とその教授に関しての3段階の内容をさらにくわしく検討することができた。(1)体験・観察-ここでは、実習クラスに参加することによって日本語学習者と同様のことを実習生も体験し、同時にそのありさまを観察する経験を持つ。学習者とともに体験的な作業を行う。(2)分析・解釈-この結果を分析することによって、教室で起こっている問題について一人一人が解釈を行い、分析的な視点から、問題発見解決型クラスの活動および教師の役割等について検討する。(3)仮説・展開-前記の分析・解釈にもとづき、実習生一人一人が仮説を定め、その仮説にしたがって、新しい固有の展開をめざす。この部分は、今後の課題として残された。上記の目的に沿いつつ、4年間の討議を踏まえ、日本語教員養成として「日本事情」に関する教育的方法およびその理念的な背景および具体的な教員養成の試案を示し、研究会等の議論の成果も報告書の形で示した(2003・3刊行)。私たちは、第2言語習得としての日本語教育の分野における「日本事情」教育について、その基本的な概念やシラバス構築に向けて、1992年度より共同研究を開始し、国内外の「日本事情」教育の現状と実態をめぐる基礎的な調査研究を行ってきた(「外国人留学生のための「日本事情」教育のあり方についての基礎的調査・研究ー「日本事情」教育の現状と課題」1992・3年度総合研究(A)課題番号04301098・研究代表者・長谷川恒雄、「諸外国における「日本事情」教育についての基礎的調査研究」19951997年度国際学術研究・課題番号07041023・研究代表者・長谷川恒雄)。今回は、上記の研究成果を踏まえ、日本語教員養成における「日本事情」教育の現状を調査し、そのシラバス構築のための基本概念および方法論とそのあり方等を提示することが主たる目的である。平成11年度(1999年度)は、全国大学の日本語教員養成課程設置部局およびそれに準じる教育研究機関200余について、「日本事情」カリキュラム責任者および科目担当者を対象にアンケート調査を行った。平成12年3月現在、約5分の1の回答率であるが、継続的に調査を進めている。また一方、「日本事情」教育それ自体の活性化を目指して、雑誌「21世紀の「日本事情」ー日本語教育から文化リテラシーへ」(年1回発行、くろしお出版)を刊行、「日本事情」教育の歴史や問題の考え方あるいは方法等について新しい議論の場を設定した。今年度の活動としては、日本語教員養成における「日本事情」シラバス構築のためのモデルクラスとその実施を検討した。その手順の概略として、受講者は、モデルケースとして、まず細川の担当する早稲田大学日本語研究教育センターにおける「日本語・総合」クラスを見学し、その後、「研究」クラスに出席し、このクラスのコンセプトについて説明を受け、そのクラスの目的やねらいについてディスカッションを行う。次に、「総合」では、実際に学習者とともにレポートを書き、クラス討論に参加する一方で、このクラスの活動をカセットテープやVTRに記録として収録する。さらに、この結果を分析・解釈し、「研究」クラスでフィードバックし、受講者間で忌憚のない議論を行う。この「研究」プログラムは、まず体験によって、学習者が味わうグローバルな日本語世界を身を持って体験することを目論むものである。

なぜなら、従来の日本語構造知識と教授法の習得が教員養成のすべてと考えるには、あまりにもその日本語世界は広くかつ深いということを知ってもらうためである。日本語を学ぶということは、日本という社会における日本語による自己実現であり、学習自身の思考と表現・理解によるコミュニケーション世界の総体を受容することだからである。この体験と同時に、受講者には観察が義務づけられる。教室活動をどのように記録するかは、受講者にとって重要な訓練であるため、この作業を果たしつつ、受講者は教室の中で学習者一人一人がどのような活動を行い、その間のインターアクションがどのような学習効果を生み出しているかを学ぶ。つまり、教室は、決して一方的に教師が学生に知識や情報を与えるところではなく、むしろ学習者同士がさまざまなかたちで支えあい、そのことによって教室という共同体での自己実現を図っていくプロセスを学ぶのである。同時にこの過程で、受講者は教室の組織化の意図と学習者への支援活動の重要性を知るのである。さらに、その結果の分析・解釈へと進むことで、受講者は自らの気づきを分析・解釈というかたちで明確化し、第三者に提示する義務を負う。このことは、日本語教員自身の日本語運用能力に確固とした自信を持たせることにつながろうし、なによりも論理的な明確化のための思考とその方法論を学ぶと同時に、言語学習とは、他者との関係をインターアクションによって見直す作業であることを受講者は確認するだろう。以上のように、「日本事情」教育を日本語教育の一環として組み込むことで、その教員養成の方向を明らかにすることが可能になると考える。この実践および理論については、「21世紀の日本事情」第3号に掲載予定である。今年度の活動としては,日本語教員養成として「日本事情」をどのように教えるかを考えるための教育的方法およびその理念的な背景について検討し,そのモデルクラスの設置の方法と具体化について研究会等を定期的に催しつつ議論を重ねた。モデルクラスについては、昨年度に引き続き、細川の担当する早稲田大学日本語研究教育センターにおける「日本語・総合」クラスでの実践を記録し、この分析を行うとともに,ここでの学習者の活動と「日本事情」教育としての位置づけの問題について研究会を開催し,討議を行った。以上のような検討から、昨年度策定した、日本語教員養成として「日本事情」とその教授に関しての3段階の内容をさらにくわしく検討することができた。(1)体験・観察-ここでは、実習クラスに参加することによって日本語学習者と同様のことを実習生も体験し、同時にそのありさまを観察する経験を持つ。学習者とともに体験的な作業を行う。(2)分析・解釈-この結果を分析することによって、教室で起こっている問題について一人一人が解釈を行い、分析的な視点から、問題発見解決型クラスの活動および教師の役割等について検討する。(3)仮説・展開-前記の分析・解釈にもとづき、実習生一人一人が仮説を定め、その仮説にしたがって、新しい固有の展開をめざす。この部分は、今後の課題として残された。
新規実験システムを用いた血小板インテグリン制御分子の多角的解析とその応用

本研究では、血小板機能の中核をなすインテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)の制御分子の同定、解析を目的としている。本年度はGPIIb-IIIaの機能阻害の病態として、後天性血小板無力症(aGT)に注目した。aGTではその大多数はGPIIb-IIIaは正常に発現しており、リガンド結合を阻害する自己抗体により発症する。申請者らは、GPIIb-IIIaが欠損しているユニークなaGTの病態解析を行った。解析症例は72歳、男性のITP患者で、50歳台ごろより血小板数は回復するも、出血症状が悪化してきた。各種アゴニストによる血小板凝集が欠如しており、フローサイトメトリー(FCM)による血小板表面のGPIIb-IIIa発現解析では、健常者の5%程度と著減していた。一方、血小板可溶液を用いたWestern blotでは正常サイズのGPIIbおよびIIIaの発現を認め、その発現量は健常者の50100%程度であり、血小板表面と血小板内のGPIIb-IIIa発現量に乖離を認めた。患者血小板解離液および血漿中に抗GPIIb-IIIa抗体を認めたが、この抗体は正常血小板のアゴニスト刺激下でのリガンド結合を阻害しなかった。抗体のエピトープ解析では、他のITPの抗体との相違は明らかではなかった。GPIIbおよびGPIIIa cDNAの全翻訳領域において遺伝子異常は認めなかった。培養実験において巨核球細胞株や培養巨核球に抗体を作用させると、GPIIb-IIIaの発現が低下する傾向が認められた。解析開始後より2年後に患者の出血症状が改善傾向となり、再度GPIIb-IIIa発現を検討したところ、FCMにて健常者の20%程度までGPIIb-IIIa発現の回復を認めた。以上の成績より、本aGTの病態としてGPIIb-IIIaの機能を障害せずその発現を減弱する抗体が、関与していることが示唆された。昨年度は、トロンビン受容体からのαIIbβ3活性化に関して、PAR4受容体120番目のアミノ酸多型rs773902(Ala120、Thr120)に着目して解析を行った。その結果、Thr120を有する血小板では、Ala120を有する血小板に比べ有意差を持って低濃度のPAR4活性化ペプチドにて不可逆的な血小板凝集が誘導された。この現象は発現実験でも確認された。以上より、PAR4受容体120番目のアミノ酸多型rs773902(Ala120、Thr120)によりPAR4活性化ペプチドによる血小板の反応性に差があることが明らかになった。さらに本年度において、αIIbβ3の発現を減弱する自己抗体による新たな病態としての後天性血小板無力症の病態を明らかにすることに成功している。以上のように、インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)の制御分子の同定、解析に関して着実に成果を挙げている。血小板機能の中核をなすインテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)の制御分子の同定、解析を目的とした本研究は、おおむね順調に進展しているが、申請者らの新たな知見を発展するために以下を計画している。1.インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)異常に起因する病態としてGPIIb-IIIaの異常に関連した先天性巨大血小板減少症の病態をすでに明らかにしている(Blood 2011, Mol Genet Genomic Med. 2013)。申請者らはGPIIb(R995W)変異(マウスではGPIIbR990W)に注目し、そのノックインマウスを作製しているが、機能への影響に加えその変異の造血機能への影響を検討する。

解析開始後より2年後に患者の出血症状が改善傾向となり、再度GPIIb-IIIa発現を検討したところ、FCMにて健常者の20%程度までGPIIb-IIIa発現の回復を認めた。以上の成績より、本aGTの病態としてGPIIb-IIIaの機能を障害せずその発現を減弱する抗体が、関与していることが示唆された。昨年度は、トロンビン受容体からのαIIbβ3活性化に関して、PAR4受容体120番目のアミノ酸多型rs773902(Ala120、Thr120)に着目して解析を行った。その結果、Thr120を有する血小板では、Ala120を有する血小板に比べ有意差を持って低濃度のPAR4活性化ペプチドにて不可逆的な血小板凝集が誘導された。この現象は発現実験でも確認された。以上より、PAR4受容体120番目のアミノ酸多型rs773902(Ala120、Thr120)によりPAR4活性化ペプチドによる血小板の反応性に差があることが明らかになった。さらに本年度において、αIIbβ3の発現を減弱する自己抗体による新たな病態としての後天性血小板無力症の病態を明らかにすることに成功している。以上のように、インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)の制御分子の同定、解析に関して着実に成果を挙げている。血小板機能の中核をなすインテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)の制御分子の同定、解析を目的とした本研究は、おおむね順調に進展しているが、申請者らの新たな知見を発展するために以下を計画している。1.インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)異常に起因する病態としてGPIIb-IIIaの異常に関連した先天性巨大血小板減少症の病態をすでに明らかにしている(Blood 2011, Mol Genet Genomic Med. 2013)。申請者らはGPIIb(R995W)変異(マウスではGPIIbR990W)に注目し、そのノックインマウスを作製しているが、機能への影響に加えその変異の造血機能への影響を検討する。
生体内一酸化窒素(NO)可視化のための探索分子の研究・開発

本研究では、生体内一酸化窒素(N○)の計測用蛍光プローブと、スピントラップ剤の開発を進めた。【蛍光プローブ】蛍光プローブの設計に当たってNOを直接捕捉して活性化するクアニル酸シクラーゼの活性中心をモデルとした。様々な蛍光性配位子を設計・合成した結果、側鎖としてキノリン環を有する化合物の鉄錯体がNOと直接反応して蛍光が変化することを見出した。種々の検討から、この分子はNOを直接捕捉して蛍光変化を起こすこと、また、NO派生物として重要な過酸化亜硝酸に対して選択性を有することがわかった。S-ニトロソチオールでは鉄により触媒的に分解し、発生したNOを捕捉した。本プローブはリポソームなどに封入することによって、生体内NOを計測できる可能性があることが示唆された。【スピントラップ剤】スピントラップ剤としては、既に幾つかのジチオカルバメート鉄錯体が使用されているが、真の選択性や構造の最適化は不明である。そこで、系統的に構造因子を変化した種々のプローブを設計・合成し、NO計測能を比較した。その結果、水溶性のプローブでは、導入された官能基の電子吸引性に依存して感度が下がり、その原因は中心鉄の酸化のされ易さにあった。一方、疎水性のプローブでは、ミセルでの検討から分子のかさばりに依存してシグナル安定性が良くなるが、感度は低下した。これは、ミセル内の錯体のパッキング効率によるものと考えられた。また、NOは鉄三価存在下でジチオカルバメートをニトロソ化し、測定に影響することも見出した。すなわち、従来の測定計では、かなりの錯体が酸化されていることと、ニトロソジチオカルバメートの存在が誤差となることが分かった。水溶性プローブをアスコルビン酸溶液としてリポソームに封入すれば、これらの影響を除外でき、理想的計測系が得られることが示唆された。
エピゲノム異常を標的とした子宮内膜癌の新たな診断・治療法の探索

【目的】子宮内膜症治療薬である第4世代プロゲスチン製剤のジエノゲストや2型糖尿病薬であるメトホルミンには、子宮内膜癌に対する抗腫瘍効果があると期待されており、新たな子宮内膜癌治療薬の候補である。今回我々は、この2剤の併用による子宮内膜癌細胞に対する抗腫瘍効果の増強やその機序について検討した。【方法】4種類のヒト子宮内膜癌細胞株に対し、ジエノゲストとメトホルミンをそれぞれ段階的に希釈し作用させ、その時の細胞生存率をMTTアッセイにより測定した。薬剤併用による抗腫瘍効果に寄与する遺伝子を同定するため、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、2剤併用時にのみ発現が2倍以上変化する遺伝子を同定した。また、子宮内膜癌細胞株におけるEndothelin-2(EDN2)の発現とプロモーター領域のメチル化を、それぞれRT-PCRおよびメチル化特異的PCR(MSP)にて解析した。さらに、皮下腫瘍を形成させたヌードマウスに対しジエノゲストおよびメトホルミンを連日経口投与し、腫瘍径を経時的に測定した。【結果】ジエノゲスト単剤では子宮内膜癌細胞株に対する細胞生存率の低下は引き起こさなかった。一方、メトホルミン単剤は濃度依存的に細胞生存率の低下を認めた。ともに単剤では効果の認められなかった濃度でも2剤を併用することで細胞生存率の低下を生じることを確認した。マイクロアレイ解析の結果、2剤併用時にのみ発現が変化する遺伝子としてEDN2を同定した。子宮内膜癌細胞株においてEDN2はメチル化により発現が低下しており、ジエノゲストとメトホルミン併用時にEDN2の発現上昇とDNA全体の脱メチル化が認められた。ヌードマウスを用いた検討では、薬剤投与後21日目でジエノゲストとメトホルミン併用群は、コントロール群に比し皮下腫瘍の増殖抑制傾向が認められた(P<0.1)。【目的】子宮内膜癌は近年、罹患数および罹患率ともに増加傾向を示している。子宮内膜癌の征圧には発癌機構の解明が重要であるが、その分子機構はgeneticな異常だけでは十分に説明できていない。今回我々は子宮内膜癌におけるエピゲノム異常に注目し、子宮内膜癌の発癌機構解明の解明を目的とする。【方法】慶應義塾大学病院産婦人科において子宮内膜癌と診断された患者のうち、書面による同意の得られた25人を対象とした。対象患者から末梢血および子宮内膜癌組織を得た。まず、腫瘍組織からDNAを抽出しMethylation Specific PCR (MSP)法にてMLH1、APCおよびE-cadherinのメチル化を解析した。3種のうち2種以上の遺伝子に異常メチル化が認められたものをMethyl-High (M-H)群、hMLH1にのみ異常メチル化が認められたものをMethyl-Low (M-L)群、1つも異常メチル化が認められなかったものをUnmethyl (U)群とした。次に、M-H群2例と年齢や病期を揃えた比較対象としてU群2例を選別し、各症例の末梢血からDNAを抽出した。次世代シークエンサーにて各群のメチル化をゲノムワイドに解析し比較することで、M-H群の発癌に寄与する異常DNAメチル化を同定した。研究計画の段階では各群5例程度を次世代シークエンサーにて解析予定であったが、末梢血と癌組織両方が研究用に利用可能な症例が少なく、M-H群2例、U群2例の解析となった。しかし、研究自体は当初の予定通りのステップまで進んでいる。【目的】これまでの国内外の研究から遺伝性の子宮内膜癌は、全子宮内膜癌の約5%を占めると言われている。遺伝性に子宮内膜癌が発症する最も有名な疾患はリンチ症候群であり、その原因はDNAミスマッチ修復遺伝子(hMLH1、hMSH2,hMSH6)の生殖細胞変異である。近年、生殖細胞におけるエピゲノム異常によるリンチ症候群の発症が報告され、注目されている。そこで今回、子宮内膜癌患者の末梢血DNA中のメチル化状態を解析し、子宮内膜癌高リスク群の抽出および化学予防への貢献を目指し研究を行った。【方法】当科において子宮内膜癌と診断された患者から、書面による同意を得た上で末梢血を得た。末梢血からDNAを抽出し、MMR遺伝子(hMLH1, hMSH2, hMSH6)のプロモーター領域の異常メチル化をMSP法にて解析した。末梢血でMMR遺伝子の異常メチル化を認めた患者をエピミューテーション保因者として抽出し、その臨床像および頻度を解明した。異常メチル化を認めなかった患者をエピミューテーション非保因者とし、この中から対照群を選別した。【結果・考察】子宮内膜癌患者106人より書面による同意を得た上で、末梢血を採取しDNAを抽出した。hMLH1, hMSH2, hMSH6のプロモーター領域の異常メチル化をMSP法にて解析した。106例全例で全ての遺伝子のメチル化解析は可能であったが、エピミューテーションは検出されなかった。そこで、この106例にリンチ症候群患者がいるかリンチ症候群のスクリーニングを行った結果、106例中2例がリンチ症候群と診断された。本研究ではエピミューテーションが原因の遺伝性子宮内膜癌患者が同定できず、頻度および発癌メカニズムの解明には至らなかったが、今後、症例数を増やし検討したい。

当初予定していた検体数は解析完了することができたが、予想よりエピミューテーション保因者の頻度が低く、今回の解析では保因者の同定に至らなかった。よって、エピミューテーション保因者と非保因者の比較解析ができなかった。【目的】子宮内膜症治療薬である第4世代プロゲスチン製剤のジエノゲストや2型糖尿病薬であるメトホルミンには、子宮内膜癌に対する抗腫瘍効果があると期待されており、新たな子宮内膜癌治療薬の候補である。今回我々は、この2剤の併用による子宮内膜癌細胞に対する抗腫瘍効果の増強やその機序について検討した。【方法】4種類のヒト子宮内膜癌細胞株に対し、ジエノゲストとメトホルミンをそれぞれ段階的に希釈し作用させ、その時の細胞生存率をMTTアッセイにより測定した。薬剤併用による抗腫瘍効果に寄与する遺伝子を同定するため、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、2剤併用時にのみ発現が2倍以上変化する遺伝子を同定した。また、子宮内膜癌細胞株におけるEndothelin-2(EDN2)の発現とプロモーター領域のメチル化を、それぞれRT-PCRおよびメチル化特異的PCR(MSP)にて解析した。さらに、皮下腫瘍を形成させたヌードマウスに対しジエノゲストおよびメトホルミンを連日経口投与し、腫瘍径を経時的に測定した。【結果】ジエノゲスト単剤では子宮内膜癌細胞株に対する細胞生存率の低下は引き起こさなかった。一方、メトホルミン単剤は濃度依存的に細胞生存率の低下を認めた。ともに単剤では効果の認められなかった濃度でも2剤を併用することで細胞生存率の低下を生じることを確認した。マイクロアレイ解析の結果、2剤併用時にのみ発現が変化する遺伝子としてEDN2を同定した。子宮内膜癌細胞株においてEDN2はメチル化により発現が低下しており、ジエノゲストとメトホルミン併用時にEDN2の発現上昇とDNA全体の脱メチル化が認められた。ヌードマウスを用いた検討では、薬剤投与後21日目でジエノゲストとメトホルミン併用群は、コントロール群に比し皮下腫瘍の増殖抑制傾向が認められた(P<0.1)。平成29年度は研究計画通りエピミューテーション解析を行う。次年度は申請通り、エピゲノム異常と治療効果との関連について検討する予定である。購入予定であった試薬が海外取り寄せとなり、本年度中の納入ができなかったため。一部の試薬をキャンペーン期間中に購入したため、当初の予定より支出額が減った。次年度使用額は、消耗品費(細胞培養試薬代)として速やかに使用予定である。納入次第、使用予定。
植物の環境ストレス種特異的な翻訳制御機構の解明

植物は環境ストレス(熱、塩等)に曝されると細胞内の翻訳状態が劇的に変化する。熱と塩ストレスによる翻訳状態変化をゲノムスケールで比較すると非常に類似しているが、熱では維持されるが塩では抑制されるなどストレス間で翻訳状態変化が異なるmRNAも存在する。本研究により、特異的な挙動を示すmRNAの5'UTRをレポーター遺伝子に連結した一過性発現実験および形質転換体を用いた解析から、5'UTR内のCU反復領域等が、熱抑制/塩維持というストレス種特異的な翻訳状態変化に寄与する制御配列である可能性と熱ストレスに応答した転写開始点の変化が、mRNAの熱ストレス下での翻訳活性を変化させることが示された。植物は環境ストレス(熱、塩等)に曝されると細胞内の翻訳状態が劇的に変化し、多くのmRNAからの翻訳が抑制される中で一部mRNAからの翻訳は維持される。先行研究において、熱と塩ストレスによる翻訳状態変化をゲノムスケールで比較することで、両ストレス下での全mRNAの翻訳挙動は非常に類似しているが、熱では維持されるが塩では抑制されるなどストレス間で翻訳状態変化が異なるmRNAの存在も認められた。本研究では、これらmRNAに着目し、特にストレスの種類に特異的な翻訳制御に関わる5'UTRの配列特徴を明らかにすることを目的とした。植物遺伝子には、場合によっては複数の転写開始点が存在していることが知られている。本研究では5'UTRの配列に着目することから、シロイヌナズナ培養細胞T-87の培養3日目コントロール(Control)、37°C熱ストレス条件下(37°C, 10 min)、NaCl 200 mM塩ストレス条件下(200 mM, 10 min)の細胞から抽出した全RNAからCAGEライブラリーを作製し、シークエンス解析を行うことで、全mRNAについて5'末端の配列情報(5'UTR配列情報)の取得を行った。その結果、熱抑制/塩維持、熱維持/塩抑制されるmRNAの中で、転写開始点が収束していて転写開始点が各条件で変化しない2種(At1g09970, At5g13180)と各条件で転写開始点が変化していた6種(At1g16030, At1g53540, At3g08970, At1g70300, At2g46240, At5g37340)をストレス種特異的な翻訳挙動を示すmRNAとして選び、それぞれの5'UTRを解析候補として選抜した。シロイヌナズナ培養細胞の通常条件、熱ストレス条件、塩ストレス条件から抽出したmRNAについて5'末端の配列情報(5'UTR配列情報)の取得が終了した。また、その結果に基づき、ストレス種特異的な翻訳挙動を示すmRNAの5'UTRについて解析候補として選抜を終え、当初の予定どおり研究が進展している。昨年度までに選抜した候補5'UTRの中で、熱ストレス下では翻訳が抑制され塩ストレス下では翻訳が維持されるAt1g09970やAt5g13180 mRNAの5'UTR(142および67塩基、転写開始点が条件間で一致)を35Sプロモーターの支配下でレポーターFLUC遺伝子と連結したバイナリーベクターを、それぞれシロイヌナズナ培養細胞T87に導入した形質転換培養細胞を作出し、ポリソーム/定量RT-PCR解析を行った。結果、それぞれの5'UTRを連結したFLUC mRNAは、内在性At1g09970およびAt5g13180 mRNAと同様に、熱ストレス下と比較して、塩ストレス下で翻訳が維持される挙動を示した。これら5'UTRは、熱抑制/塩維持のストレス種特異的な翻訳状態に寄与し、熱抑制/塩維持のストレス種特異的な翻訳状態を規定する要因としての5'UTRの重要性が示唆された。また、各条件で転写開始点が変化していた6種(At1g16030, At1g53540, At3g08970, At1g70300, At2g46240, At5g37340)の候補遺伝子の5'UTRについて、それぞれ変化前後の5'UTRを連結した、cap構造、ポリA配列を有する合成FLUC mRNAをin vitroで合成し、プロトプラストに導入した。その後、通常条件(22°C)および熱ストレス条件下(37°C)に20分間静置後、それぞれのFLUC活性値を測定した。結果として、FLUC活性値は、転写開始点変化前後の5'UTR間で異なり、ストレスに応答した転写開始点の変化は、mRNAの熱ストレス下での翻訳活性を変化させることが示された。シロイヌナズナ培養細胞の通常条件、熱ストレス条件、塩ストレス条件のいずれにおいても転写開始点が変化していなかった2遺伝子については、キメラ遺伝子を導入した安定形質転換体を用いた解析を、また、条件間で転写開始点が6変化していた遺伝子については、変化前後の5'UTRを連結したin vitroで合成したmRNAを用いた一過性発現実験により、それぞれの特性を評価し、当初の予定どおり研究が進展している。昨年度までに行った形質転換体を用いた解析より、ストレス種特異的な翻訳状態変化を規定する要因としての5'UTRの重要性が示され、5'UTR内に制御配列が存在すると考えられた。この中で、熱抑制/塩維持という翻訳の挙動を示す候補mRNAの5'UTRに限定すると、CU反復やCU richという共通性が認められた。