hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光呼吸・光合成特性から見たF_1雑種イネの乾物生産におけるヘテロシス現象の発現機構

本年度は昨年度の成果を踏まえ,解析材料として栽培イネ2種(アジアイネ:Sとアフリカイネ:G)を両親系統にもつ正逆交雑の種間F1雑種の2系統(SxGおよびGxS)を用いて実験を行った.両親系統を比較対照とし,光呼吸反応と光合成反応のエネルギー消費バランスについてガス交換速度とクロロフィル蛍光消光の同時測定による解析を行った結果,以下の点が明らかとなった,1.総光合成速度については両F1系統が両親よりも高い値を示し,CO2固定から見た光利用効率の面でヘテロシス現象が確認された.2.光呼吸率(CO2固定に対するCO2放出の割合)においてはF1雑種間に違いが見られ,母親をアフリカイネとしたF1(GxS)の光呼吸率が低いことが明らかとなった.3.Vc/Vo相対比はGxSが他の系統の約1.5倍の値を示した.以上から,両F1間には光合成酵素Rubiscoにおけるカルボキシラーゼとオキシゲナーゼの相対反応比に違いが存在し,両F1雑種は同程度のエネルギー生産レベルを示すが,生産されたエネルギーの分配においてGxSの方が光合成によるCO2固定が効率良く行われていると推察された.F1雑種間の反応性の違いについては遺伝的な成り立ちとして核以外の遺伝情報の違いにあるのでないかと考えられ,Rubiscoの機能を決定し,その生成に深く関わるミトコンドリアDNA,およびそれと核DNAとの相互的な作用など複雑な要因が関与するものと推測された.F1雑種の光合成反応に関するヘテロシスが確認され,さらに正逆組み合わせ間でエネルギー消費バランスに違いがあることが明らかになったことは,今後のF1雑種育成での親の選定,その組み合わせを考慮する上での有用な知見となる.本年度は主たる解析材料の元となる両親系統の栽培イネ2種(アジアイネ:Oryza sativa L.とアフリカイネ:Oryza glaberrima Steud.)の光呼吸反応と光合成反応のエネルギー消費バランスについて葉内の炭酸ガス濃度環境を考慮に入れながら詳細な比較を行った.CO2ガス交換速度とクロロフィル蛍光反応の同時測定を行い,光化学系におけるエネルギー生産と光呼吸・光合成による消費のバランスを検討した結果,アフリカイネはアジアイネに比較してエネルギー生産レベルは同程度であるが,生産されたエネルギーの分配において光呼吸で消費する割合が小さく,光合成によるCO2固定に有利であることが明らかとなった.すなわち,真の光合成分(総CO2固定分)が大きく,光呼吸分(CO2放出分)が小さいことであり,みかけ上の光合成のエネルギー利用効率としてはかなり有利な状況であると判断された.この理由としては,蒸散が高く,気孔開度が高いことでガス拡散に優れるアフリカイネでは細胞間隙内のCO2濃度が常に高く,そのことによって光合成ならびに光呼吸の主要酵素のRubisco周辺のCO2濃度が高く,CO2/O2分圧が高く維持されているのではないかと推察された.また,光合成測定時に葉内の水分状態を急激に悪化させ,強制的に気孔を閉鎖させる実験を行ったところ,アフリカイネの気孔伝導度は常に高く保持され,気孔閉鎖がアジアイネに比較して緩慢であることが明らかとなった.そのときの光呼吸率はアフリカイネで低く推移し,葉内のCO2濃度環境と光呼吸率の関係が密接であることが確認された.以上のように栽培イネ2種の光呼吸・光合成特性が明らかとなり,来年度F_1雑種の特性を明らかにする上で有効な情報が得られた.また,今年度種間雑種交配を行い,材料となるF_1種子を得ることに成功している.本年度は昨年度の成果を踏まえ,解析材料として栽培イネ2種(アジアイネ:Sとアフリカイネ:G)を両親系統にもつ正逆交雑の種間F1雑種の2系統(SxGおよびGxS)を用いて実験を行った.両親系統を比較対照とし,光呼吸反応と光合成反応のエネルギー消費バランスについてガス交換速度とクロロフィル蛍光消光の同時測定による解析を行った結果,以下の点が明らかとなった,1.総光合成速度については両F1系統が両親よりも高い値を示し,CO2固定から見た光利用効率の面でヘテロシス現象が確認された.2.光呼吸率(CO2固定に対するCO2放出の割合)においてはF1雑種間に違いが見られ,母親をアフリカイネとしたF1(GxS)の光呼吸率が低いことが明らかとなった.3.Vc/Vo相対比はGxSが他の系統の約1.5倍の値を示した.以上から,両F1間には光合成酵素Rubiscoにおけるカルボキシラーゼとオキシゲナーゼの相対反応比に違いが存在し,両F1雑種は同程度のエネルギー生産レベルを示すが,生産されたエネルギーの分配においてGxSの方が光合成によるCO2固定が効率良く行われていると推察された.F1雑種間の反応性の違いについては遺伝的な成り立ちとして核以外の遺伝情報の違いにあるのでないかと考えられ,Rubiscoの機能を決定し,その生成に深く関わるミトコンドリアDNA,およびそれと核DNAとの相互的な作用など複雑な要因が関与するものと推測された.F1雑種の光合成反応に関するヘテロシスが確認され,さらに正逆組み合わせ間でエネルギー消費バランスに違いがあることが明らかになったことは,今後のF1雑種育成での親の選定,その組み合わせを考慮する上での有用な知見となる.
小腸粘膜増殖機序の遺伝子学的解析

種々の小腸粘膜障害や小腸大量切除後の小腸機能の回復には,小腸粘膜の再生増殖が必要である。この再生増殖には粘膜上皮細胞内において前初期遺伝子群である核内転写因子c-fos, c-junの活性化が関与している。本研究では,種々の病態下における小腸粘膜の再生増殖機序を解明する目的でc-fos, c-jun遺伝子の発現に着目し,ラットを用いて検討した。絶食による小腸粘膜の萎縮から摂食によって起こる再生増殖の過程における加齢の影響を検討した結果,幼少ラツトでは摂食後早期にc-fos, c-junのmRNAが発現増強し増殖活性が増強するのに対し,成熟ラットではこれらの反応は弱く増殖能が低下していることを示された。小腸阻血再灌流障害モデルでは,再灌流後早期からc-fos, c-jun mRNAの発現増強がみられ,続いて増殖活性の増加がみられた。興味深いことはc-Fos, c-Jun蛋白の発現部位がアポトーシス細胞の部位と一致していたことで,c-fos, c-junの発現は再生増殖のみならずアポトーシス誘導にも関与している可能性がある。小腸大量切除後に起こる小腸粘膜の代償性増殖の過程においても,大量切除後早期からc-fos, c-jun mRNAが発現増強し,次いで増殖活性も増加していた。以上の結果から,いずれの病態下においても小腸粘膜の再生増殖にはc-fos, c-jun遺伝子の発現が重要な役割を演じていることが明らかとなった。現在,c-fos, c-jun遺伝子の発現と関連して細胞内シグナル伝達系のついて阻血再灌流モデルで解析中である。小腸粘膜上皮細胞の加齢に伴う増殖能の変化を解明するため,幼少(哺乳期を過ぎ固形食の摂取を始める5週齢の雄性ルイスラット)ならびに成熟ラット(生存率が下がり始める60週齢ラット)の小腸における,72時間絶食解除後の組織形態,前初期遺伝子群の一種である核内転写因子c-fosとc-junのmRNAと蛋白の発現,増殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)を用いた細胞増殖活性の時間的推移を検討した.組織形態的に,幼少群の絨毛伸長は絶食解除後48時間で非絶食群の絨毛高に回復したのに対し,成熟群の絨毛伸長は緩慢で,絨毛高の回復に96時間を要した.c-fos,c-jun mRNA発現量は,幼少群では絶食解除後2時間から72時間まで増加し,絶食解除後2時間で非絶食群に比較しc-fosは最高3.1倍,24時間でc-junは最高2.8倍に増加したのに対し,成熟群ではc-fos,c-junともに有意な増加を認めなかった.また,免疫組織化学染色では,幼少群の絶食解除後の粘膜増殖帯と吸収上皮でc-Fos,c-Jun蛋白が陽性に染色されたのに対し,成熟群では増殖帯のみに1腺管当たり27個の陽性細胞がみられるにすぎなかった.PCNA標識率でみた細胞増殖活性は,幼少群では絶食解除直後より上昇を認め,絶食解除後2時間をピークに48時間まで成熟群に比較して有意に高い増殖活性を認めたのに対し,成熟群では絶食解除後72時間まで有意の上昇を認めなかった.以上より,転写因子c-fosとc-junの活性化が,小腸粘膜絨毛の増殖活性に関与し,加齢によるc-fosとc-junの活性化の欠如が成熟群での増殖能の低下に関連していることが明らかにされた.次年度以降は同実験群における蛋白代謝率を測定の予定である。前年度(平成10年度)は,ラット小腸粘膜上皮細胞の加齢に伴う増殖能の変化について検討し,転写因子c-fosとc-junの活性化が小腸粘膜絨毛の増殖活性に関与していること,また,加齢によるc-fosとc-

junの活性化の欠如が増殖能の低下に関連していることを報告した.本年度は,小腸の阻血再灌流障害時における絨毛細胞の脱落と再増殖の機序を解明すめため,ラット小腸の阻血再灌流モデルにおいて核内転写因子c-fosとc-junのmRNAと蛋白の発現,増殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)を用いた細胞増殖活性[^<15>N]グリシンを用いた蛋白合性比速度,およびTUNEL法によるアポトーシス細胞の出現を経時的に検討した.上腸間膜静脈動静脈の20分血流遮断群(阻血再灌流群)と非阻血群(対照群)と比較し、以下のような結果を得た.(1)阻血再灌流群のc-fosとc-junのmRNAの発現は,再灌流後15分では対照群に比べそれぞれ6.3倍と4.4倍に増加した.(2)阻血再灌流群の細胞増殖活性は再灌流後5分から4時間までは対照群に比べ優位に増加し,再灌流後30分では対照群の4倍となった(3)阻血再灌流群の蛋白合性比速度は、対照群よりも高く,再灌流後2時間をピークに以後徐々に低下した.(4)対照群では絨毛の先端にわずかにアポトーシスを認めたが,阻血再灌流群では増殖帯を除く吸収上皮細胞に多数のアポトーシス細胞を認め阻血直後と再灌流後60分に2相性にピークを認めた.以上より,転写因子c-fosとc-junの過剰発現が,小腸の阻血再灌流後のアポトーシスの発現とその後の蛋白合性促進に関与していることが明らかにされた.これまで,ラット小腸粘膜上皮細胞の加齢に伴う増殖能の変化(平成10年度),および,ラット小腸阻血再潅流障害モデルにおける絨毛細胞の脱落と再増殖の機序(平成11年度)に関して,前初期遺伝子群c-fos,c-junに着目して検討し,その結果を報告してきた。本年度は,小腸大量切除後の残存小腸の代償的粘膜増殖における前初期遺伝子群c-fos,c-junの関与を明らかにすることを目的とした。実験にはラットを用い,空腸起始部より3cmの部位から回腸末端より3cmの部位までの小腸を切除した小腸大量切除群(約90%切除)と,空腸起始部より3cmおよび回腸末端より3cmの2カ所で小腸切離し吻合した対照群とを作製し,小腸大量切除群の残存小腸粘膜および対照群の相当部位の小腸粘膜において比較検討し,以下のような結果を得た。(1)小腸大量切除群の小腸粘膜でのc-fos,c-junのm-RNAの発現は術後2時間が最大で,対照群に比べそれぞれ5.09倍、3.47倍の過剰発現を示した。(2)c-Fos、c-Jun蛋白も小腸大量切除群の残存小腸で広範な発現が認められた。(3)増殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)標識率による細胞増殖活性は小腸大量切除群において有意に高値を示した。(4)[15N]グリシンを用いた蛋白合成比速度は小腸大量切除群において有意に高値を示した。(5)小腸粘膜ALP活性値は小腸大量切除群において有意に高値を示した。(6)小腸粘膜の組織像では,粘膜厚,絨毛高,陰窩深は小腸大量切除群において有意に高値を示した。以上より,小腸大量切除直後では,残存小腸での蛋白合成の亢進や粘膜増殖の前に,c-fos、c-jun遺伝子の過剰発現が認められることが明らかになった。これまで,1)ラット小腸粘膜上皮細胞の加齢に伴う増殖能の変化(平成10年度),2)ラット小腸阻血再潅流障害モデルにおける絨毛細胞の脱落と再増殖の機序(平成11年度),および3)小腸大量切除後の残存小腸の代償的粘膜増殖(平成12年度)に関して研究を行ってきた。
極低周波の正弦波交流磁場並びに誘導電流が培養細胞の増殖と分化に与える影響

得られた成果は以下に示す通りである。1.培養骨芽細胞MC3T3-E1の増殖と分化に及ぼすELF磁界の長時間影響。60Hz,3mTの正弦波交流磁界(ELF)の発生装置を用いて曝磁の影響を植え継ぎ培養後25日間に亘って観察した。曝磁群のALP活性は分化期と考えられる培養13日目で対照と比ぺて有意な増加を示した。一方、細胞内蛋白質含量も培養13-17日間で同様の有意な増加を示した。特に、コラーゲンおよび非コラーゲン蛋白質は共に14日目で有意に増加した。2.培養骨芽細胞MC3T3-E1の増殖と分化に及ぼすELF電流の長時間影響。60Hz,0.3mAのELF電流が骨芽細胞に及ぼす影響について、白金電極間における通電実験を行なった。通電の有意の効果は認められなかった。3.培養骨芽細胞MC3T3-E1の増殖と分化に及ぼすELF磁界の短時間影響。1)プラディキニン(BK)作用による細胞内Ca2+濃度の変動に及ぼす交流磁界(60Hz,3mT)の24時間曝磁の影響を、植え継ぎ培養から3日目の増殖期にある細胞と11日目の分化期にある細胞について調ぺた。増殖期では、曝磁群の細胞のBK刺激による細胞内Ca2+濃度の一過性の上昇が有意に抑制され、特に細胞外液にCa2+が存在しない時では顕著に抑制された。分化期では細胞内Ca2+の上昇は、対照、曝磁の両群共に認められなかった。2)エンドセリン-1(ET)の作用下で、1)と同様に増殖期と分化期にある細胞で比較した。増殖期の細胞をETで刺激すると、曝磁群ではBK同様細胞内Ca2+の上昇が外液にCa2+がある無しに拘らず顕著に抑制された。一方、分化期にある細胞では増殖期の細胞と対称的に細胞内Ca2+濃度の一過性の上昇が両外液ともに対照群と比べ曝磁群では有意に促進された。今年度に行った研究によって得られた新たな知見等の成果は次の通りである。1.培養骨芽細胞(3T3-E1)の増殖と分化に及ぼすELF磁界の長時間影響細胞内アルカリフォスファターゼ(ALP)の活性およびコラーゲンなどのタンパク質含量は、骨芽細胞の骨細胞への分化に伴い変動し、分化の指標となる。そこで、60Hz、3mTの正弦波交流磁界(ELF)の影響を培養後25日間に亘って観察した。曝磁群のALP活性は培養13日後で有意な増加を示したが、培養10日までと17日以降では対照と比べて有意な増加は認められなかった。一方、細胞内タンパク質含量は培養13日-17日間で有意な増加を示し、特に14日でのコラーゲンおよび非コラーゲンタンパク質は共に対照群と比べて有意に増加していた。2.培養骨芽細胞(3T3-E1)の増殖と分化に及ぼすELF電流の長時間影響1.と同様の期間に亘って60Hz、0.3mAのELF電流の骨芽細胞に及ぼす影響を検討した。培養7日目と14日目の細胞共に白金電極間における通電による影響は認められなかった。3.培養骨芽細胞の小胞体貯蔵Ca^<2+>の放出に及ぼすELF磁界の影響

細胞内Ca2+濃度([Ca^<2+>]i)を一過性に上昇させる物質、例えばブラディキニンやエンドセリン-1などの作用機構に対するELF(3mT、60Hz)の影響について検討した。培養液にCa^<2+>(2.2mM)を含む時は、両物質ともにELFの3時間曝磁の影響は認められなかったが、外液のCa^<2+>を除去する条件では、曝磁群における[Ca^<2+>]iの一過性上昇は対照群と比べて有意な低下を示した。しかし、24時間曝磁を行った実験では、逆に曝磁群で有意な上昇が認められた。今後の課題としては、種々の磁場強度、周波数の磁界の作用下において、細胞内Ca^<2+>が骨芽細胞の骨化に与える影響について実験を進めたい。今年度に行なった研究によって得られた新たな知見等の実績は次の通りである。1.培養骨芽細胞(3T3-E1)における薬物による細胞内Ca2+濃度の一過性変動に及ぼすELF交流磁界及び誘導電流の影響1)ブラディキニン(BK)による細胞内Ca2+濃度の変動に及ぼす24時間曝磁(60Hz,3mT)の影響を、植え継ぎ培養から3日目にある増殖期と11日目の分化期の細胞について、調べた。増殖期にある細胞の対照群ではBKによる細胞内Ca^<2+>濃度の一過性急激な上昇が見られた。が、曝磁群の細胞ではこの上昇が有意に抑制され、特に細胞外液にCa^<2+>が存在しない時は顕著に抑制された。一方、分化期にある細胞ではBKによる細胞内Ca^<2+>濃度の変動は対照群、曝磁群共に見られなかった。2)エンドセリン-1(ET)による細胞内Ca^<2+>濃度の変動に及ぼす曝磁の効果を、1)と同様に増殖期と分化期にある細胞で比較した。ETで刺激された増殖期の細胞は、対照群ではBKと同じく細胞内Ca^<2+>濃度の一過性急激な上昇が見られたが、曝磁群の細胞ではこの上昇が外液にCa^<2+>がある無しにかかわらず顕著に抑制された。一方、分化期では増殖期と対称的に細胞内Ca^<2+>濃度の一過性の上昇が両外液とも対照群と比べ有意に促進された。今後の課題として、種々の磁界強度、各種の周波数が骨芽細胞のもつ増殖、分化誘導機能に及ぼす影響について検討を進める必要がある。
Halomonas属の新規PHA合成酵素の活性構造相関の研究

PHAは石油化学ベースのプラスチックに替わる素材として注目されている。その優れた生体適合性、生分解性が理由である。我々は、海洋から分離した細菌のHalomonas sp. O-1がグリセロールをPHAに変換することに着眼した。まず、これまで報告されてきたPHA合成酵素の活性中心[GxC x G]のアミノ酸配列と異なる部分があった[SxC x G]。これを遺伝子組換え体で初めて解析した。次に、オペロン構造に着眼してPhasinタンパク質遺伝子を調べたところ、この遺伝子が細胞内PHA蓄積量に影響することを突き止めた。今後、海洋性細菌によるPHA合成の研究、海洋性資源の有効活用に期待できる。申請者は、Halomonas sp. O-1が、有機酸(吉草酸)に対する耐性があり、吉草酸を取り込んで、優れた物性を有する共重合体ポリマー、P(3HB-3HV)を合成することを明らかにした。申請者はHalomonas属のPHA合成酵素PhaCの活性中心に特異な配列を見出したので、この配列の相違(G→S)がPHAの物性にどのような変化を与えるのか、検討するために、本年度、活性中心のアミノ酸を部位特異的に変異させた変異株を作製することに成功した。独自分離株のHalomonas sp. O-1および登録標準株Halomonaselongata DSM2581の各々について、[S-Y-C-V-G]→[S-Y-A-V-G]および、[S-Y-C-V-G]→[G-Y-C-V-G]のアミノ酸置換を施した変異株2種の取得ができた。これらの変異PHA合成遺伝子を2種類の宿主(大腸菌E. coli JM109及びPHA非合成Ralstonia eutropha PHB-4)に導入して、計4種の変異株を取得できた。これらの変異株によって、Halomonas sp. O-1のPHA合成特性の基本的な性質を幾つか明らかにすることができた。まず、活性中心の必須アミノ酸であるシステインCをアラニンAに変異させた変異株では、大腸菌において完全にPHA合成能を失ったことから、本アミノ酸が活性発現に必須の活性中心であることが明らかにされた。次に、Halomonas属の特徴となっているセリンSを通常のグリシンGに戻したものは、ポリマーの分子量の増加が認められた。分離株O-1、保存株ともに、Mw:20(×105)→27(×105)の増加であった。これは、本セリン残基が合成されるポリマーの分子量に影響することを示唆する結果であったと考えられる。昨年度までに、申請者は、Halomonas属のPHA合成酵素PhaCの活性中心に特異な配列を見出したので、この配列の相違(G→S)がPHAの物性にどのような変化を与えるのか、検討するために、活性中心のアミノ酸を部位特異的に変異させた変異株を作製することに成功した。すでに、いくつかの物性に対しての影響があることを確認することができた。また、本年度の目標であったプラスミドの構築と形質転換の方法の確立に成功した。効率を今後高めていくことが必要だが、遺伝子導入は可能となったので、欠損や相補株などの作成が可能となった。また、目標として掲げていないものの、新たな発見として、本株が、中鎖脂肪酸を効率よく取り込む系を有している可能性があった。通常、中鎖脂肪酸は細胞膜を破壊することから、細胞毒性があり、PHA合成の基質として不向きであるとされてきたが、脂肪酸をモノマー単位として合成できれば、様々な修飾を施して機能化した脂肪酸をポリマーへ織り込むことが可能と考えられるので、脂肪酸の取り込み系は価値のある発見であったと考えられる。今後、別途、ゲノム解析が可能となれば、有用な取り込み系遺伝子をクローニングできる可能性がある。Halomonas属のPHA合成遺伝子、オペロン構造をHalomonas属として初めて解析して発表した。研究機関全体を通じて、従来のPHA合成酵素と異なる配列を有する活性中心について、部位特異的変異体を作成して、それぞれのアミノ酸の役割を特定することができた。これは4クラスに分類されるPHA合成酵素のうち、Halomonas属の属するクラス1の一般的性質の解析としても意義のあるものであったと思われる。また、次にオペロン構造について、PHA合成酵素遺伝子の上流にPHA顆粒の形成を介助するとされる「ファジン」タンパク質をコードする遺伝子があることを検討した。ファジンタンパク質の解析はほとんど行われていないが、他のHalomonas属のゲノムデータを見ても、PHA合成酵素遺伝子上流に普遍的に二つのファジンタンパク質遺伝子が存在することから、ファジンの役割の重要性が想定された。そこで、これらの遺伝子を欠損させて組み換え体により調べた結果、大腸菌内のPHA蓄積量が変化した。ファジンの存在によって細胞内蓄積量が増大することが認められた。最終年度である27年度の成果としては、上記の成果をHalomonas属の株で再現するための遺伝子組換え系の構築を行った。

通常、Halomonas属は接合伝達のみでしか外来遺伝子を受け付けないとされてきたが、我々は独自の系を確立して、エレクトロポーレーションによる導入を確立した。今後、これを用いて、さらに海洋性細菌の代謝、Halomonas属特有の代謝とリンクさせてPHA合成についての検討の幅が拡がると期待できる。PHAは石油化学ベースのプラスチックに替わる素材として注目されている。その優れた生体適合性、生分解性が理由である。我々は、海洋から分離した細菌のHalomonas sp. O-1がグリセロールをPHAに変換することに着眼した。まず、これまで報告されてきたPHA合成酵素の活性中心[GxC x G]のアミノ酸配列と異なる部分があった[SxC x G]。これを遺伝子組換え体で初めて解析した。次に、オペロン構造に着眼してPhasinタンパク質遺伝子を調べたところ、この遺伝子が細胞内PHA蓄積量に影響することを突き止めた。今後、海洋性細菌によるPHA合成の研究、海洋性資源の有効活用に期待できる。申請計画を達成できたと考えている。今年度は、Halomonas株の遺伝子導入についてプラスミドの構築とその形質転換を試行することが主な課題であったが、そこを達成できたことが大きいと考えている。その結果取得した細胞の性質については次年度の研究になるが、申請計画に沿って次年度の計画に進むことができている。応用微生物学今年度の計画は、予定通り遂行できたので、27年度は、形質転換株の培養系を組み上げて、ポリマー生産、精製したポリマーの物性解析(分子量、共重合)をHPLC、GC、NMRを用いて行っていく。また、PHA合成遺伝子群のオペロン内に存在する遺伝子(phaP)について、合成収率に与える影響を検討することも併せて実施していく。初年度である25年度の目標は、活性中心と予測されたアミノ酸配列の部位特異的置換変異株を作製することであった。これらはすでに作製が終了し、その基本的性質を培養系で検討するところまで結果を出したので、計画を遂行できたと言える。また、その結果、当該配列が活性中心であることを確認できたので予測通りの結果が得られており、順調に計画が進んでいると言える。研究計画のうち、遺伝子に関連する実験項目が当該年度の主たるテーマであり、支出を最も占めるものであったが、当該年度の進行が当初よりもスムーズにいったために、支出を抑えることができたためである。初年度の計画は、予定通り遂行できたので、26年度は、当初の計画通り変異株を用いた培養実験を実施していく。最終年度である27年度に計画されているHalomonas sp. O-1のPHA酵素遺伝子の欠損株の取得に向けての準備を今年度中に実施したい。分離株の欠損株取得は予測できない不適合性などの問題が発生しやすいので、できるだけ、予備実験を前倒しして26年度中に行っていく。最終年度の実験計画のうち、最も経費がかさむと予測される培養系実験、産物の物性解析実験に前年度の差額分を使用する。当初予定していた旅費20万円が、時価相場の旅行では、予定よりも安く済んだために差額が生じた。次年度、旅費、または学会費に追加してしようしていく。
将来の経済状況を考慮した企業の合併・イノベーション戦略と競争政策

今年度の目標は,文献・資料収集,および研究会への参加等を通じて,基本的な理論モデルを構築することであった.具体的には,将来の経済環境を表すパラメータを組み入れた連続時間モデルを構築し,1.企業の合併戦略,2.投資行動に関する戦略を分析し,基礎的分析を行うことである.1.と関連して,2社のケースで,各企業の戦略を友好的合併・敵対的買収およびそのタイミングとし,利子率・ボラティリティ・市場の成長率・投資コストを外生パラメータとする連続時間モデルを構築した.そして,各企業がいつ,どのような合併や買収を実行するのかについて,均衡戦略を導出した.特に,敵対的買収をする際のコスト,市場の成長率,およびボラティリティが,友好的合併と敵対的買収のどちらを行うべきか,そしてそのタイミングをどの程度早めるかについて,大きな影響を与えることがわかった.現時点で,このような合併コストをモデルに導入することで,先行研究とかなり異なる結果を得られることがわかっている.現在,本論文を,2019年度秋の日本経済学会に報告申し込み済みである.2.と関連して,1.と同様の連続時間モデルを構築し,企業のイノベーション戦略の1つである製品差別化戦略に応用し,論文を執筆した.特に,複数タイプの均衡を分類し,投資コストと均衡のタイプに応じて,企業の差別化戦略が変化することを示した.また,製品差別化と逐次合併,および厚生に関する分析を行い,競争政策に対する論文を執筆した.さらに,競争政策に関する分析に行う際に用いた厚生関数を,企業のイノベーション戦略に当てはめ,論文を執筆した.これらの論文を含めた計4本を現在,国際学術雑誌に投稿している.おおむね順調に進展している.その主な理由として,将来の経済環境に関する外生パラメータ(利子率・市場の成長率・ボラティリティ)を組み入れた連続時間確率過程モデルを構築できた点,合併および買収に関する均衡戦略を導出できた点が挙げられる.また,具体的な成果として,学会申し込み1件,および4本の論文の国際学術雑誌投稿が挙げられる.2019年度の目標として,前年度に構築したモデルに対して,さらに解析的分析を行うこと,および,新たに数値的分析を行うこと,の2点が挙げられる.そのため,解析的分析に関しては,外生パラメータに関する比較静学分析をさらに進める.現状,先行研究と類似したパラメータについてのみ分析を行っているため,他のパラメータについても分析可能か否かを検討する.また,数値的分析については,最新の手法に関する情報収集を進める.特に,確率微分方程式の解を求める必要があるため,この手法に着目して,情報収集および研究を進める.これ以外の点として,2020年度に向け,イノベーション戦略,および競争政策に関する最新の研究動向をサーベイし,同時に,関連テーマへの研究を進める.情報収集に際しては,学会,研究会への参加,および専門家へのヒアリングを想定している.また,現状,イノベーション戦略として,機械学習,自動運転に関連した応用研究に対する着想を得ている.これらの着想を論文として発表できるよう,研究を進める.今年度の目標は,文献・資料収集,および研究会への参加等を通じて,基本的な理論モデルを構築することであった.具体的には,将来の経済環境を表すパラメータを組み入れた連続時間モデルを構築し,1.企業の合併戦略,2.投資行動に関する戦略を分析し,基礎的分析を行うことである.1.と関連して,2社のケースで,各企業の戦略を友好的合併・敵対的買収およびそのタイミングとし,利子率・ボラティリティ・市場の成長率・投資コストを外生パラメータとする連続時間モデルを構築した.そして,各企業がいつ,どのような合併や買収を実行するのかについて,均衡戦略を導出した.特に,敵対的買収をする際のコスト,市場の成長率,およびボラティリティが,友好的合併と敵対的買収のどちらを行うべきか,そしてそのタイミングをどの程度早めるかについて,大きな影響を与えることがわかった.現時点で,このような合併コストをモデルに導入することで,先行研究とかなり異なる結果を得られることがわかっている.現在,本論文を,2019年度秋の日本経済学会に報告申し込み済みである.2.と関連して,1.と同様の連続時間モデルを構築し,企業のイノベーション戦略の1つである製品差別化戦略に応用し,論文を執筆した.特に,複数タイプの均衡を分類し,投資コストと均衡のタイプに応じて,企業の差別化戦略が変化することを示した.また,製品差別化と逐次合併,および厚生に関する分析を行い,競争政策に対する論文を執筆した.さらに,競争政策に関する分析に行う際に用いた厚生関数を,企業のイノベーション戦略に当てはめ,論文を執筆した.これらの論文を含めた計4本を現在,国際学術雑誌に投稿している.おおむね順調に進展している.その主な理由として,将来の経済環境に関する外生パラメータ(利子率・市場の成長率・ボラティリティ)を組み入れた連続時間確率過程モデルを構築できた点,合併および買収に関する均衡戦略を導出できた点が挙げられる.また,具体的な成果として,学会申し込み1件,および4本の論文の国際学術雑誌投稿が挙げられる.2019年度の目標として,前年度に構築したモデルに対して,さらに解析的分析を行うこと,および,新たに数値的分析を行うこと,の2点が挙げられる.そのため,解析的分析に関しては,外生パラメータに関する比較静学分析をさらに進める.現状,先行研究と類似したパラメータについてのみ分析を行っているため,他のパラメータについても分析可能か否かを検討する.

また,数値的分析については,最新の手法に関する情報収集を進める.特に,確率微分方程式の解を求める必要があるため,この手法に着目して,情報収集および研究を進める.これ以外の点として,2020年度に向け,イノベーション戦略,および競争政策に関する最新の研究動向をサーベイし,同時に,関連テーマへの研究を進める.情報収集に際しては,学会,研究会への参加,および専門家へのヒアリングを想定している.また,現状,イノベーション戦略として,機械学習,自動運転に関連した応用研究に対する着想を得ている.これらの着想を論文として発表できるよう,研究を進める.当初,計画していたよりも良い研究結果が出そうな論文があった.そこで,引き続きより精緻な分析を行い,その後に英文校正に出すこととした.そのため,その論文の英文校正および投稿にかかる費用を繰り越して,次年度に使用することとした.当該論文については,次年度の前期に英文校正に出し,国際が記述雑誌へ投稿予定である.
南極環流の成立がもたらした海洋プランクトン珪藻の変遷

北西太平洋に48ヶ月間設置された65個のセジメント・トラップサンプルと7本のDSDP(Deep Sea Drilling Project)コア(Sites,577,578,579,579A,580,581,192)、南極大陸のLutzow-Holm湾から採取された20個の海氷、海水試料の解析から、"cosmopolitan"なプランクトン珪藻であるThalassionema nitzschioidesとその変種の時空分布が海洋大循環の変遷にともなって起こる表層水塊の分化やその時空分布と密接に関連して変動していることが明らかになった。DSDP-ODP(Ocean Drilling Program)コアにおいて、T.nitzschioidesは古第三紀後期から第四紀に産出する。しかし現在の極前線(Polar Front)以南の南極環流域にはほとんど出現しない。南極半島沖の太平洋側から採取されたODPコア(Site 1905)における570、520-470、440-370万年前のT.nitzschioidesの増加は、現在の南大洋における植物プランクトンの地理的分布(Plankton province)の主要な境界である南極収束線(Antarctic Convergence)あるいは極前線(Polar Front)の移動によるものであることが明らかになった。これらの成果から、T.nitzschioidesとその変種の時空分布は表層水塊の分化に起因する地質時代の"plankton province"変遷史を解明する新しい指標であると結論することができる。南極還流の成立は、新生代の海洋史上最大の事件である。今日のよう海洋表層循環、海洋構造、氷床の発達、さらにグローバルな気候システムがその時にはじめて成立したと考えられる。一方、南極還流の発達は、海洋循環を活発にし、プランクトン珪藻の生産量を増加させ、さらに珪藻の進化速度を早め、個々の種の出現、絶滅、増加、衰退、地理的分布を強く支配したであろうと推察される。時系列にそってこの推察を検証し、今日の海洋プランクトン珪藻群の成立過程を明らかにするため本研究を進めている。4年計画の初年度に当たる今年度は、DSDP-ODP(国際深海掘削計画)報告書及び、表層堆積物試料、DSDP-ODPコア試料、日本列島の陸上セクションにおける珪藻群集組成の概査から、解析に用いる試料の選択と、解析する時間面の決定を行なった。南極大陸周辺から採取された表層堆積物試料、DSDP-ODPコア試料、日本列島の陸上セクションにおいて、珪藻殻の保存の程度、ハイアタス(無堆積)の位置、群集組成のおおまかな変動を予察した。その結果、表層堆積物試料約300点、南極収束線以北の大西洋・太平洋・インド洋からDSDP-ODPコア試料6本、南極大陸周辺から同じく3本のコア試料、そして3本の陸上セクションをそれぞれ精査のため選択した。解析する時間面は、南極還流成立前、成立後、還流が本格的に機能しだした後として、それぞれ45-40Ma、35-30Ma、24-20Maを選んだ。なお、これらの時間面は、南極還流の成立と関連するハイアタス(無堆積)の時間面(40Ma、24Ma)に基づいて決定した。現在の海洋表層循環やグローバルな気候システムは、南極環流の発達によりはじめて成立したと考えられている。一方、南極環流の発達は、海洋循環を活発にし、プランクトン珪藻の生産量を増加させ、さらに珪藻の進化速度を早め、地理的分布を強く支配したであろうと推察される。時系列にそってこの推察を検証し、今日の海洋プランクトン珪藻群の成立過程を明らかにするため本研究を進められている。4年計画の2年目に当たる今年度は、南極大陸周辺から採取された表層堆積物試料中の珪藻群集や北西大平洋から採取されたピストン・コア、さらに陸上セクション試料の珪藻群集解析を行った。その過程で、生産量、地理的分布、進化過程を検討すべき珪藻種が、その分類学的検討を経て決定された。

1)南極大陸周辺(南大洋)Fragilariopsis curta,F.cylindrus,F.kerguelensisがこの海域を特徴づける種群として選択された。なお、EcurtaとF.cylindrusばIce Alpae"である。これらの種のDSDP-ODPコア上での時空分布の解析を通じて、この南大洋特有の珪藻群集の成立時期、成立過程が明らかにされつつある。2)大平洋・インド洋本年度、以下の成果が得られた.1.珪藻化石帯の修正国際深海掘削計画のSite1095において南大洋珪藻化石層序の再検討を行ない、2亜帯の新区分と、1示準種の提唱をした.従来の南大洋珪藻化石層序は主としてインド洋、大西洋より得られた試料の定性分析に基づいて構築されたものであった.この成果により、太平洋セクタではじめて珪藻化石層序と古地磁気層序との対比がなされ、絶対年代によりイベントの等時性・異時性が議論できるようになった.2.珪藻化石群集の示す西南極氷床発達史国際深海掘削計画のSite1095(0-9.5Ma),Site1096(2.0-4.8Ma)の珪藻化石群集に以下の特徴が見い出された.(1)7.8-6.2MaにParalia sulcataの増加が見られる.底生種の増加も同調している.(2)5.7,5.2-4.7,4.4-3.6MaにThalassionema属の顕著な増加が見られる.(3)2.8Ma以降、珪藻の沈積がほとんど認められなくなる.(1)は後背地(南極大陸及び周辺陸棚域)に低塩分の浅海域が広がっていたことを示し、現在のような500-1000mの陸だなに囲まれた環境はこれ以降に形成されたと考えられる.Thalassionema属は現在の海洋において,極前線より低緯度に分布する.(2)で示された期間、現在より数度(6-9度)高い水塊の影響下にさらされたと考えられる.2.8Ma以降珪藻の沈積が認められなくなるのはこの海域が通年氷におおわれ表層での生物生産が阻止された可能性が高い.こうした寒冷化は北半球の氷床発達開始に調和的なタイミングで生じている.本年度は、解析結果が整理され以下のように成果がまとめられた。1.DSDP,ODP(国際深海掘削計画)で採取されたコアの珪藻群集組成の比較から、その地理的分布が水塊の分化と並行して起こったと考えられる種群として、Thalassionema nitzschioidesとその変種が識別された。2.T.nitzschioidesとその変種は"cosmopolitan"であるが、極前線以南には全く産出しないことを、南極Lutzow-Holm湾における、海氷、海水、堆積物中の珪藻群集組成と、フリーマントルから昭和基地に至るの海水試料の解析から明らかになった。3.北西太平洋に設置されたセジメント・トラップの解析により、T.nitzschioidesとその変種の地理的分布が水塊(プランクトン・プロビンス、plankton province)の分布と密接に関連していることが明らかになった。4.北西太平洋のDSDPコアの珪藻群集解析により、T.nitzschioidesとその変種の地理的分布の変遷が、水塊の分化(プランクトン・プロビンスの分化)と密接に関連して起こった可能性の高いことが示唆された。
精神疾患における霊長類型シナプス再編成異常の構成的理解

ヒトの脳では、出生から子供の時期にかけてシナプスが急速に増えた後、大人になるにつれて減っていく。このような現象をシナプスの「刈り込み」と呼ぶ。自閉スペクトラム症(ASD)患者の脳では、シナプスの「刈り込み」がうまくいかず、余分な神経回路が残っているためにスムーズな情報伝達が妨げられていると考えられている。げっ歯類では明確なシナプス「刈り込み」が観察されない。私たちは、ヒトと同じ霊長類であるマーモセットを使って自閉症の原因に迫ろうと企図した。ヒト自閉症脳の特徴を反映したサルを使って研究することで、自閉症の新しい治療法の開発に貢献できると期待される。
腎臓のエイジングにおける内分泌系の関与

Wistar/Tw系ラットは、雄では16月齢頃、雌では20月齢頃より多飲多尿となる。これまでの検討から本系統は生体のホメオスタシス維持に重要な水・電解質代謝及び腎機能に関し加齢促進動物と考えられた。本研究ではこの亜系統ラットを用い、エイジングにともなう腎臓及びそれと関連した内分泌系変化の解明を目的とした。1.腎臓生理機能の方化について検討し、雌ラットで血中リン脂質やトリグリセリドの加齢にともなう増加を見いだした。これらは腎機能の低下にともなう臨床変化像としてヒトで知られている変化と一致した。2.心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は本系統では加齢にともなう変化はなかった。なお糖尿病(NOD)マウスも発症の結果多尿となるのでANPを検討し、血中値の低下、心房での増加を見いだし報告した。3.加齢にともなう血中アルドステロン値の低下、血漿レニン活性の低下(約10分の1)を見いだした。これは腎臓の病理変化にともなうレニン合成分泌の低下が原因と考えられた。すでにエイジングにともなう血中バソプレッシンの上昇を報告しており、以上より水・電解質代謝関連ホルモンの変化の実態が明らかになった。さらに4.雌で加齢にともない尿中カルシウムが一日排泄量で約10倍と著しく増加することを見いだした。5.そこで骨の変化について検討した。ソフテックス写真における加齢にともなう明らかな骨の実質の減少、大腿骨の乾燥重量の低下やカルシウム含有量の有意な減少が見られた。また、尾椎骨の乾燥重量の低下や力学的骨強度の有意な低下も観察された。これらの変化は臨床的には老齢者や閉経後に見られる骨粗鬆症や骨軟化症に対応し、本系統が骨粗鬆症のモデル動物になりうることが考えられた。6.エイジングにともないカルシトニン濃度は変化しなかった。カルシウム代謝変化の機構に関して内分泌系や雌雄差の問題も含め、今後さらに詳細な検討が必要である。これまでの検討から本系統は生体のホメオスタシス維持に重要な水・電解質代謝及び腎機能に関して老化促進動物と考えられる。本研究ではこの亜系統ラット並びに比較のためWistar系ラットを用い、加齢にともなう腎臓及びそれと関連した内分泌系の変化を解明することを目的とした。1.形態的変化については腎臓傍糸球体装置のエイジングにともなう形態変化を電子顕微鏡レベルで追求した。また性ステロイドが腎臓の形態に影響することを見いだした。2.生理機能の変化については雌ラットで血中リン脂質やトリグリセリドが加齢にともない増加することが新たな知見として得られた。これらは腎機能の低下にともなう変化として臨床的に知られているものと一致した。3.心房性ナトリウム利尿ペプチドについては本系統では加齢にともなう変化はなかった。3年度は腎臓機能に関連するアルドステロン、血漿レニン活性の加齢変化について検討する。なお糖尿病マウス(NODマウス)も発症の結果多尿となるので心房性ナトリウム利尿ペプチドについて検討したところ、多尿にともなう血中値の低下、心房での増加を見いだし報告した。4.カルシウム代謝の加齢変化については尿中カルシウムが一日排泄量で約10倍と著しく増加することを見いだし、その結果の一部を報告した。

この変化は臨床的には老齢者に見られる骨粗鬆症や骨軟化症との関連で興味ある変化と考えられた。3年度にはカルシウム代謝に関与する内分泌系であるパラトルモン、カルシトニン濃度や骨の形態の加齢変化などカルシウム代謝変化の機構とその意義について検討していく予定である。5.前述したように性ホルモンが腎臓の形態に影響すること、さらに尿量など腎臓機能にも影響することを見いだしたので3年度に性ホルモンと腎臓の加齢との関連を検討する。Wistar/Tw系ラットは、雄では16月齢頃、雌では20月齢頃より多飲多尿となる。これまでの検討から本系統は生体のホメオスタシス維持に重要な水・電解質代謝及び腎機能に関して老化促進動物と考えられた。本研究ではこの亜系統ラットを用いて、エイジングにともなう腎臓及びそれと関連した内分泌系の変化を解明することを目的とした。本年度は1.賢臓機能に関連する血中アルドステロン値の加齢にともなう低下を見いだした。さらに、血漿レニン活性が約10分の1に低下していた。これは賢臓の病理変化にともなうレニン合成分泌の低下が原因で、その結果血漿レニン活性が低下し、さらにその結果アルドステロン値が低下したと考えられた。すでにエイジングにともなう血中バソプレッシンの上昇を、また昨年度にはこの多尿ラットでは血中心房性ナトリウム利尿ペプチドが変化しないことをみており、水・電解質代謝関連ホルモンの変化の実態が明らかになった。2.加齢雌ラットで尿中カルシウム一日排泄量が増加することを昨年度見いだしたのでその意義について検討した。ソフテックスで撮影したX線写真で加齢にともなう明らかなカルシウムの減少が観察され、実際大腿骨の乾燥重量の低下やカルシウム含有量の有意な減少が観察された。また尾椎骨の乾燥重量の低下や力学的骨強度の有意な低下が見られた。これらの変化は臨床的には老齢者に見られる骨粗鬆症や骨軟化症のモデル動物になりうる変化と考えられた。3.カルシウム代謝に関与する内分泌系であるカルシトニン濃度は多尿ラットで有意な変化は認められず、カルシウム代謝変化の機構については今後さらに検討が必要である。4.腎臓の機能と性ホルモンとの関連について検討し、腎臓の形態が性ステロイドにより変化することを見いだした。カルシウム代謝変化に関しても雌雄差見られ、さらに詳細な検討が必要である。
インターネット学習場における協調メモリの構成と学習支援のための知識管理の研究

平成14年度には,平成13年度に設計を行った協調メモリ(学習者・グループプロファイルDB)および学習情報の管理(知識処理)機構と学習情報管理サーバ/クライアント環境の実装,および知識管理機構の設計の妥当性を確かめるために学習活動用アプリケーション・ツールの試作,そしてこれまでに開発した学習支援環境との統合を行った。具体的には以下の事柄について研究を進めた。1.学習情報管理のための処理機構の実装:平成13年度での設計結果を踏まえ,学習情報の管理機構および協調メモリの実装を行い,学習情報管理サーバ/クライアント環境を整えた。2.学習活動用アプリケーション・ツールの試作と,学習情報管理機構の実証テスト:学習活動を支援するための知識管理機構,すなわち学習情報管理のための処理機構の信頼性を検証するために,学習活動用アプリケーション・ツールの試作を行った。そして,1.で実装された処理機構との統合,およびこれまでに開発した学習支援環境との統合を図り,学習情報管理機構の実証性を確かめた。3.研究成果の報告:平成13年度での成果および平成14年度に期待される研究成果に関する報告を行った。国内学会での報告は日本教育工学会全国大会,教育システム情報学会全国大会,電子情報通信学会全国大会,同ソサエティ大会,情報処理学会秋季春季全国大会,人工知能学会全国大会,および上記5学会の各種研究会において報告した。国際会議としては,10th International Conference on Computer in Education(Auckland, New Zealand),2002 AACE e-Learning(Montreal, CANADA)等での発表を行った。本研究の目的は,インターネット学習場において学習者および教授者の意思決定を支援することを主眼としつつ学習情報を整理・管理するために,学習情報の管理方法の提案と,学習場から旅出される各学習者(グループ)の情報が蓄積される協調メモリの構造定義とを行うものである.本研究の成果として,・協調メモリの構造・学習用アプリケーション・ツールから放出される学習ログのデタ構造・ログデータの学習情報の協調メモリヘの格納モデル・協調メモリからの学習情報の参照モデルを提案した.本研究では,格納モデルおよび参照モデルに基づく学習情報管理を,学習場面における知識管理(Knowledge Management)として捉えた.本研究で提案するモデルに基づく知識管理機構を具備した学習環境では,学習者および教授者に対して,学習過程の見なおしや問題解決過程のサマライズ,過去になされた問題解決の方法の参照等が,各自の使用している学習環境に依存しない形で実現される.特に,インターネット学習場における協調学習をとりあげ,上記モデルに基づく学習基盤を設計・実装した.本基盤においては,協調学習に際する学習情報の共有・再利用を促進させるという観点から,学習場における知識管理の機構のプロトタイプが実装されている.平成14年度には,平成13年度に設計を行った協調メモリ(学習者・グループプロファイルDB)および学習情報の管理(知識処理)機構と学習情報管理サーバ/クライアント環境の実装,および知識管理機構の設計の妥当性を確かめるために学習活動用アプリケーション・ツールの試作,そしてこれまでに開発した学習支援環境との統合を行った。
妊娠中毒症の発症における絨毛の増殖、分化異常の解析-細胞周期と酸化ストレスの関係

異常妊娠における絨毛細胞の細胞周期の発現解析胞状奇胎の子宮内容除去時、人工妊娠中絶時、早産時、満期産時に絨毛細胞を採取し、蛋白を抽出し一部をパラフィン包埋した。妊娠各期の正常絨毛細胞と胞状奇胎で、細胞周期関連蛋白の発現をウェスタンブロットにて確認した。PCNA、CDK2及びCyclin Eタンパクの発現は、胞状奇胎と妊娠初期絨毛でほぼ同程度に強く発現した。妊娠後期胎盤では、その発現は減弱した。正常絨毛で、妊娠初期に高発現を示し後期には低下するp21は、胞状奇胎では妊娠初期絨毛よりさらに強い発現が認められた。正常胎盤に発現しているp57は、胞状奇胎には発現は認められなかった。正常絨毛で、妊娠初期に発現が弱く後期に増強するp27は、胞状奇胎では妊娠後期絨毛より強い発現が認められた。p21,p27,p57の胞状奇胎におけるlocationを免疫組織染色にて確認し正常絨毛と比較検討した。絨毛組織における酸化ストレスの影響の解析早産時、満期産時の絨毛組織を採取し、RNA、蛋白を抽出し、一部をパラフィン包埋した。酸化ストレスによって生じる過酸化脂質分解産物、4hydroxy-2nonenal(HNE)の蓄積を、免染組織染色、ウェスタセブロットで確認した。妊娠中毒症における絨毛組織は、合併症のない絨毛組織と比較し、HNEの蓄積が顕著であった。絨毛羊膜炎の胎盤においても、合併症のない絨毛組織と比較し有意にHNEの蓄積が顕著であった。絨毛培養組織にHNEを添加し、cyclooxygenase-2 (COX-2)の発現をRT-PCR、Westernblotting法にて検討した。COX-2の発現はmRNAレベル、タンパクレベルで、濃度、時間依存的に上昇した。PGの産生も時間依存的に上昇した。この研究結果は絨毛組織が酸化ストレスを受け過酸化脂質分解産物が上昇し、プロスタグランディン系を活性化させる可能性が示唆された。子宮内膜における残存絨毛細胞の同定と精製1.男児の出産歴を有し、月経周期のある非妊婦婦人の子宮摘出手術時に、患者の同意のもと、子宮内膜および子宮筋層浅層を採取し、一部から凍結標本を作成し、その残りより、RNAおよびDNAを抽出した。2.採取した細胞から、DNAを採取した後、Y染色体特異的なSRY遺伝子のprimerを用いてreal-timePCRを施行し、Y染色体の存在を示唆する結果を得た。絨毛細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)とそのインヒビター(CDKI)の発現解析1.患者の同意を得て、人工妊娠中絶時、早産時、満期産時に絨毛細胞を採取し、蛋白を抽出し一部をパラフィン包埋した。2.妊娠各期の絨毛細胞にCKIである、p21,p27,p57の発現をウェスタンブロットにて確認した。P21とp27の発現量は胎盤完成を境に逆転していた。3.p21,p27,p57の絨毛細胞におけるlocationを免疫組織染色にて確認した。4.絨毛細胞より抽出した蛋白に対し、抗CDK2抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿物を回収し、pRbを基質とし、[γ-32P]ATPを添加したCDK2のキナーゼ活性測定系を用い、CDK2のキナーゼ活性を測定した。

5.絨毛細胞より抽出した蛋白に対し、抗CDK2抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿物を回収し、抗p21およびp27抗体を用い、CDK2とp21およびp27の結合状態により、CDK2活性の抑制能を解析した。異常妊娠における絨毛細胞の細胞周期の発現解析胞状奇胎の子宮内容除去時、人工妊娠中絶時、早産時、満期産時に絨毛細胞を採取し、蛋白を抽出し一部をパラフィン包埋した。妊娠各期の正常絨毛細胞と胞状奇胎で、細胞周期関連蛋白の発現をウェスタンブロットにて確認した。PCNA、CDK2及びCyclin Eタンパクの発現は、胞状奇胎と妊娠初期絨毛でほぼ同程度に強く発現した。妊娠後期胎盤では、その発現は減弱した。正常絨毛で、妊娠初期に高発現を示し後期には低下するp21は、胞状奇胎では妊娠初期絨毛よりさらに強い発現が認められた。正常胎盤に発現しているp57は、胞状奇胎には発現は認められなかった。正常絨毛で、妊娠初期に発現が弱く後期に増強するp27は、胞状奇胎では妊娠後期絨毛より強い発現が認められた。p21,p27,p57の胞状奇胎におけるlocationを免疫組織染色にて確認し正常絨毛と比較検討した。絨毛組織における酸化ストレスの影響の解析早産時、満期産時の絨毛組織を採取し、RNA、蛋白を抽出し、一部をパラフィン包埋した。酸化ストレスによって生じる過酸化脂質分解産物、4hydroxy-2nonenal(HNE)の蓄積を、免疫組織染色、ウェスタンブロットで確認した。妊娠中毒症における絨毛組織は、合併症のない絨毛組織と比較し、HNEの蓄積が顕著であった。絨毛羊膜炎の胎盤においても、合併症のない絨毛組織と比較し有意にHNEの蓄積が顕著であった。絨毛培養組織にHNEを添加し、cyclooxygenase-2(COX-2)の発現をRT-PCR、Westernblotting法にて検討した。COX-2の発現はmRNAレベル、タンパクレベルで、濃度、時間依存的に上昇した。PGの産生も時間依存的に上昇した。この研究結果は絨毛組織が酸化ストレスを受け過酸化脂質分解産物が上昇し、プロスタグランディン系を活性化させる可能性が示唆された。