hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子シャペロンを介した食品成分の生体調節機構

ファイトケミカルは種々の生理機能性を示すが、その作用機構については不明な点が多い。以前に我々は、zerumboneの標的分子の1つをKeap1と同定した。しかし同時に、無数のoff-targetタンパク質群も存在することが判明した。そこで本研究ではこの非特異的なタンパク質への結合に着目し、その意義についての解析を進めた。その結果、zerumboneは細胞タンパク質を変性させるが、それが適度である場合は、結果として分子シャペロンを誘導し、オートファジーなどの異常タンパク質分解系を活性化することを見出した。適度なタンパク質ストレスが機能性に寄与することを示したのは本研究が初めてである。発がん抑制活性を有するテルペノイドzerumbone (ZER、東南アジア産ハナショウガ由来)に着目し、その生体内標的分子の同定を試みた。Hepa1c1c7マウス肝臓がん細胞をZERで処理したところ、細胞内タンパク質の非特異的修飾が認められた。これに伴い、変性タンパク質を基質とするユビキチンリガーゼであるCHIP依存的に、細胞内タンパク質のユビキチン化が促進された。また、分子ローター色素を用いて、細胞内凝集タンパク質の検出を試みた結果、ZERを処理した細胞において顕著な陽性染色を認めた。続いて、ZERがユビキチン-プロテアソーム系及びオートファジーを活性化する可能性について検証した。Hepa1c1c7細胞をZERで処理することにより、プロテアソームのキモトリプシン様活性が有意に増強し、また、オートファジーのマーカー分子であるLC3-IIの発現が増加した。さらに、ZERのオートファジー誘導機構の一部として、オートファジー促進遺伝子p62の誘導活性を見出した。p62は、異常タンパク質に対する選択的オートファジーの誘導に重要な分子であることから、ZERがその発現を誘導することで、タンパク質品質管理機構を活性化させる可能性を想定した。内因性の過酸化脂質分解物4-hydroxy-2-nonenal (HNE)で細胞を処理すると、HNE修飾タンパク質が増加し、細胞死が誘導された。これらHNEによるタンパク質修飾及び細胞毒性は、細胞をZERで前処理することにより、有意に緩和された。さらに、このようなZERによる細胞保護作用は、p62のノックダウンによりほぼ完全に消失した。以上の結果から、ZERはタンパク質修復系だけでなく、分解系を含むタンパク質品質管理機構を包括的に活性化させることが明らかとなった。ファイトケミカルは種々の生理機能性を示すが、薬剤と異なりその詳細な作用機構は不明な部分が多々残されている。以前に我々は、zerumbone(東南アジア産ショウガ科植物ハナショウガ根茎の主成分)の標的分子の1つをKeap1(解毒酵素誘導の鍵分子)と同定したが、同時に無数のoff-targetタンパク質群も存在することが判明した。本研究ではこの非特異的なタンパク質への結合に着目し、その意義についての解析を進めた。その結果、zerumboneは細胞タンパク質を変性させるが、それが適度である場合は、結果としてHSPなど分子シャペロン、ubiquitin-proteasome (UPS)やautophagy (AP)などの異常タンパク質分解系を顕著に活性化することを見出した。また、興味深いことに、zerumboneは、タンパク毒性物質であるHNEによるタンパク付加や細胞死を抑制し、さらに同様な作用はcurcuminやresveratrolなどにも観察された。これまでに、sulforaphaneなどが抗酸化・解毒酵素を誘導することが報告されているが、この現象も本質的にはchemical stressに対する適応応答だと捉えられる。上記の研究結果は、ある種のファイトケミカルがproteo-stressを誘導することでタンパク質品質管理機構を増強する可能性を示唆する。タンパク質品質管理機構は、神経変性疾患を始めとする種々の疾病の予防にも寄与していることから、ファイトケミカルの機能性発現機構の一部がタンパク質品質管理機構を介している可能性が提示できた。ゼルンボン(東南アジア産ショウガ科植物ハナショウガ成分)をHepa1c1c7マウス肝臓がん細胞に投与すると代表的な誘導型シャペロンであるHSP40やHSP70を含む、様々なHSPsが誘導されることをReal-time RT-PCR、PCRアレイ、およびWestern blotで確認した。次いで、作用メカニズムの解明を試み、次の知見を得た。1)ゼルンボン修飾タンパク質はHSP90に認識される(抗HSP90抗体による免疫沈降およびゼルンボン処理によるHSP90モノマーの減少)、2)ゼルンボンはHSPの転写因子HSF1をリン酸化し活性化する(ELISA)、2)HSP70の誘導にはHSF1が必須である(RNAi)。さらに、Hepa1c1c7細胞や線虫(C.elegans)をゼルンボンで前処理しておくと熱ショックによる細胞・個体死が抑制され、熱耐性を賦与することも明らかにした。

同時に、線虫においては、ゼルンボンに対してHSP16.41が特に顕著に感受性の高い分子シャペロンであることも見出した。これらの作用は、マイルドな熱処理によっても観察された。一方、3大栄養素、ビタミン、ミネラル、および種々のファイトケミカル(PC)についてHSP70誘導能をスクリーニングしたところ、栄養素についてはレチノールと亜鉛のみが活性を示した。またPCに関しては、クルクミン、ウルソール酸、αーフムレン、フェネチルイソチオシアネート、リコペンなどに顕著な誘導能が見られた。従って分子シャペロンの活性化はPCに特有な機能性であることが示唆され、また、特に分子疎水性が高い、あるいは求電子性である場合に誘導能が高いと推察された。以上から、ゼルンボンを含むPCはケミカルストレッサーとして作用し、その程度が適度な場合においては、分子シャペロンの活性化などの適応応答を活性化することが示唆された研究計画では、ZERの特異的な標的分子を究明する予定であった。しまし、予想外に数多くのタンパク質に結合する特性を示したことから、そのプロテオストレス作用に着目し、結果としてタンパク質品質管理(protein quality control, PQC)機能の増強という、ファイトケミカルに関して初めての機能性を発見することができた。しかも本作用がZERに止まらず、ファイトケミカルに広く認められることの研究意義は少なくない。PQCを高く維持することは、がん、メタボリックシンドローム、さらにはアルツハイマー病などの神経変性疾患の予防にも寄与する。従って、新規な生理活性発現機構であるPQC活性化作用がこうした生活習慣病の予防にも貢献していた可能性がある。今後、PQCの活性化がどの程度の生理活性を説明できるのかを検証することは非常に重要である。特にトラブルや予想外の実験結果が出たということはなく計画通りに進んでいる。ただ、ゼルンボンのHSP70誘導メカニズム解析において、HSF1の核内移行を免疫染色によって証明しようとしたが、HSF1がmultipleにリン酸化されるためか、明確なデータを得ることができなかった。そこで、これをELISA法によるHSF1のリン酸化というデータで補完することとした。まず、PQCが関与すると考えられるがん、メタボリックシンドローム、さらにはアルツハイマー病などの神経変性疾患の原因は慢性炎症である。さらに興味深いことに、炎症関連酵素である誘導型NO合成酵素(iNOS)はプロテオストレスでプロテアソーム依存的に分解することが知られている。従って、ZERを含むファイトケミカルがプロテオストレスを介してiNOSを分解することで抗炎症作用を示している可能性がある。また、熱ショック応答の鍵タンパク質であるHSP90は細胞増殖や炎症惹起に関与する種々のタンパク質をクライアントとして結合しているがHSRによってそれらが脱離し、結果としてプロテアソーム依存的に分解することも知られている。
先天停止性夜盲・不全型の視機能異常の機序に関する研究

先天停止性夜盲不全型の視機能を正常者、完全型停止性夜盲と比較し以下の結果を得た。1夜盲の責任病巣完全型ではERG(網膜電図)の杆体a波は正常で杆体b波は完全に消失しておりSTR(暗所閾値電位)も消失していたため夜盲の責任病巣は杆体双極細胞にあると考えられた。不全型ではERGの杆体a波は正常で中等度の刺激光で測定した杆体b波はsubnormalであった。しかしさらに刺激光強度を弱め杆体b波閾値近くで測定した杆体b波の振幅と頂点潜時は正常であった。さらに刺激光を弱めSTRを記録したところ、STRは記録されたが頂点潜時に有意な延長がみられ異常波形を示した。そのため不全型の夜盲の責任病巣は杆体双極細胞よりさらに中枢の杆体視路(STRの起源)にあると考えられた。2杆体・錐体干渉現象自覚的フリッカー閾値を用いて測定した杆体・錐体干渉現象は完全型も不全型もほぼ正常に観察された。この結果は両疾患の杆体、錐体機能障害が双極細胞あるいはそれより中枢に存在する事を示す。先天停止性夜盲(CSNB)の不全型の視機能異常のメカニズムを検討するため暗所閾値電位、錐体、杆体の干渉現象、錐体.色素のkineticsに関する研究を行った。1.暗所閾値電位(S・TR):4例の不全型CSNB,2例の完全型CSNBそれに4例の正常眼のSTRとrod b-woavを比較した。完全型CSNBでは、STR、rod b-waveともに消失していた。不全型CSNBでは全例にSTRは記録されその振幅は正常であったが、頂点時間の著しい遅延がみられた。閾値近くのrob b-waveの振幅、頂点時間はいずれも正常であった。以上より完全型CSNBではrod-b-waveを生ずるインパルスかon型双極細胞にまで届いておらずrod b-wave,STRともに消失しているのに対し不全型CSNBではon型双極細胞まではインパルスが届いているがそれより中枢の杆体視路に異常があり、STRの異常が示されたと考えられた。2.自覚的測定法で測定した網膜(後極部)の5ケ所の部位からは多くの不全型CSNBでは錐体、杆体の干渉現象がみられた。3.錐体色素のkineticsは中心穿錐体(10)をdensitometerを用いて測定した。不全型CSNBでは正常のkineticsが示された。昨年度は不全型停止性夜盲の網膜電図を正常者、完全型と比較して、その差を検討したが今年度は自覚的測定による杆体錐体干渉現象について検討した。暗順応した杆体は錐体系機能に対して抑制的に働きいわゆる杆体錐体干渉現象(SRC1)を示す。しかし先天停止性夜盲(CSNB)のSRC1に関してはその結果が諸家間で一致しない。12例の(SNBと完全型と不全型とに分類して赤色フリッカー光を用いて杆体刺激背景光がオフの状態とオンの状態で錐体フリッカー閾値を測定することでSRC1を視察した。対照群に例中10例では背景光でフリッカー閾値の低下(SRC1)が観察されたが、2例では観察されない部位があった。CSNBでは完全型、不全型ともに6例中5例では全測定部位でSRC1が観察されたが、それぞれ1例ではSRC1が観察される部位と観察されない部位があった。以上から完全型、不全型CSNBは正常なSRC1を示すが局所の網膜機能不全を伴いSRC1が観察されない部位が現われることがあると考えられた。
統計力学的密度汎関数理論に基づく液液界面構造の解明

本研究は液液界面におけるナノスケールの自己組織化現象を分子レベルで解明するための方法論を積分方程式理論に基づき構築することを目的としている。本年度は次ぎの問題に関する理論の定式化と数値計算を行った。(1)水-アルコール混合系の溶液構造(2)多孔性物質中での水およびアルコールの気液平衡これらの研究の成果はそれぞれ下記のとおりである。(1)我々(Kovalenko-Hirata)が最近提案した新しいクロージャーを含むRISM積分方程式(RISM/KH理論)に基づき、水-ブタノール混合系の溶液構造を解析した。その結果、ブタノールの濃度が希薄な領域では、水の水素結合ネットワークに組み込まれたブタノール同志がそのブチル基を接触するように溶け込んでいる、すなわち、一種の小さなミセルが出来たような状態であることが分かった。(J.Phys.Chem.B.,106,5042(2002).)(2)多孔性物質内の気液平衡に関してはこれまで多くの実験的研究が行われており、いくつかの興味深い結論が得られている。それらによると、細孔中では、まず、気液平衡の臨界温度が降下する。さらに、水は気液平衡に対応する1個のスピノーダルを示すのに対して、アルコールは密度が低い領域で2個のスピーノダルを示す。我々はスピングラス分野で開発されたREPLICA理論をRISM/KH理論と組み合わせることにより、多孔性物質中での水およびアルコールの気液平衡の解析を行った。その結果、上に述べた実験結果を定性的に再現すると同時に、アルコールにおける2個のスピノーダルのうちの一つがアルコールの炭素壁面への吸着に対応するものであることを解明した。(J.Theor.Comp.Chem.,1,381(2002).)本研究は液体統計力学の手法の一つである密度汎関数理論に基づき液液界面の構造およびそのダイナミックスを分子レベルで解明する理論的方法論を構築することを目的とする。本年度は液液界面の理論的取り扱いの第一歩として、下記の問題に取り組みその成果を2報の論文として発表した。1870年代に提案されたvan der Waals状態方程式は気体と液体の相転移を取り扱うことができる理論として100年以上もの間、化学、物理、工業化学の分野に君臨んしてきた。しかしながら、この理論は分子サイズと分子間引力に関する現象論的パラメタを含む経験的理論であり、その分子論すなわち統計力学的な基礎づけは、長年、理論物理における中心的課題のひとつであった。これまで、提案された多くの理論は相転移のuniversalityに着目しており、分子の化学的個性はむしろ排除されてきたと言ってよい。われわれは、今回、RISM理論に基づき分子性液体の化学的個性に着目した気液相転移の理論を提案した。この理論は従来のRISM理論がもっていた低密度領域における弱点を克服する新しい近似理論の提案によって初めて可能になったものである。この結果、相転移の物理的普遍性を保持しながら、水やアルコールなどの化学的個性を表現する新しい気-液転移の取り扱いが可能となった。(2)多孔質物質-溶液界面の構造と物性多孔性物質-溶液界面の構造と物性は古くからイオン交換樹脂や「分子ふるい」など工学的に重要な問題であるが、最近では、大気環境におけるアエロジェル中での光化学反応や燃料電池などの工業的的応用においてもその重要性が認識されつつある。一方、その理論化学的研究は十分になされていない。特に、細孔がランダムに分布した多孔質物質は分子シミュレーションの方法ではほとんど取り扱い不可能で、統計力学の助けを借りる必要がある。われわれはスピングラスの分野において開発されたレプリカ法とRISM理論を組み合わせることにより、この問題を解明する新しい理論を提案した。この理論は液相の水やアルコールなどの化学的個性のみならず多孔質内の官能基のそれも考慮できる点で、ナノサイエンスを含む化学における広範な応用が期待できる。

その結果、上に述べた実験結果を定性的に再現すると同時に、アルコールにおける2個のスピノーダルのうちの一つがアルコールの炭素壁面への吸着に対応するものであることを解明した。(J.Theor.Comp.Chem.,1,381(2002).)
高度技術社会のパースペクティブ

本総合研究(B)は、同名の重点領域研究「高度技術社会のパースペクティブ」の計画、準備を進めるために企画されたものである。1989年度より発足する重点領域研究への申請は不採択となったが、当初の研究分担者間の討議の結果、引続き1990年度より発足予定の重点領域研究についても同趣旨の研究計画を提出することとし、今年度は、その計画をより精密なものとするための討議、および準備を行うこととした。その討議のため、7回の研究集会を行ったほか、随時討議を行い、またそれぞれの研究分担者において研究準備を進めた。討議の結果、21世紀高度技術社会を展望するに当って、各方面に亘る研究を統一的な視点から統合し、体系化するための中心的な課題を設定する必要性についての認識に到達し、その課題を「資源・環境問題の長期的解決をもたらすような新しい技術文明の構想」とすることとした。科学技術の生み出した近代技術文明は、人類の生活、文明、文化を飛躍的に向上させたが、他面、自然資源の浪費、環境の破壊をもたらし、「成長の限界」に近づきつつある。最近発展しつつある新しいタイプの技術、いわゆる先端科学技術は、このような「成長の限界」を打破して、人類全体の生活を向上させる可能性をふくんでいると期待される。しかし、21世紀において自然資源の枯渇や、地球環境の破壊をもたらすことなく、現在みられるような大きい格差を解消して、すべての人々が満足できる生活を営むことができるようになるためには、単なる生産力の向上だけでなく、社会組織、生活様式、そして人々の意識や価値観にも及ぶ、文明のあり方の転換がなされねばらない。勿論その具体的な形や方向づけについては、まだ明確にはされなかったし、また当然そこには多くの見解の相違があった。しかしその解明を基本課題として背景におきつつ、それぞれの研究分野、関心領域についての研究を進めることとした。
山岳森林景観で発生する山火事の要因と生態的役割の解明

現在,高標高域の生態系では,地球温暖化と人間による森林利用といった相互作用を受けて,大規模山火事が頻発し始めている可能性が指摘されている。たとえば,カナダ西部のクートニー国立公園では, 21世紀初頭に亜高山帯林の大部分が燃えた。本研究では,上記の国立公園を対象に,過去の気候変動や山火事体制の情報を明らかにすることで,最近の大規模な山火事が気候変動とリンクした自然撹乱現象として生態系に必須の現象であることを示した。北米においては,北部ロッキー山脈が,この20年程の間に山火事頻度が最も急増した地域である。たとえば,カナダ西部のクートニー国立公園では,21世紀初頭に亜高山帯林の大部分が燃えた。山岳森林景観を焼き尽くす山火事は,見た目には空前絶後の大規模な災害に思える。しかしながら,このような自然現象を単に災害と認識することは早計かもしれない。もしもこのような大規模なイベントが生態系に必要な自然現象ならば,災害と認識し排除することは,生物相や生態系のプロセスに対して,多大な負の影響を与えてしまう。必要な山火事を排除することは生態系サービスや生物多様性に負の影響を与えるが,自然に起こり得る以上の山火事も生態系を破壊し劣化させてしまう。そこで本研究では,上記の国立公園を対象として,樹木年輪から抽出される過去の気候変動や山火事体制の情報をもとに,1.過去数世紀間の中長期的な地域の気候条件の変動と山火事体制との関連性を明らかにし,同時に,2.火災抑制プログラムによる山火事体制の改変状況を評価した。以上をもとにして,最近の大規模な山火事が,自然撹乱現象としてどの程度許容され,どの程度人為災害として誘発されてしまったのかについて議論した。以上をもとにして,最近の大規模な山火事が,自然撹乱現象としてどの程度許容され,どの程度人為災害として誘発されてしまったのかについて、国際学会誌にて論文発表を行った。
腸内細菌によるネガティブセレクションへの関与

腸内細菌は腸管内の免疫系の維持に重要な役割を果たしているだけではなく、全身の免疫系に対しても重要な影響を与えている。本研究では腸内細菌が腸管とは遠隔の臓器である胸腺にも影響を及ぼしているかを、胸腺上皮細胞特異的に発現している転写因子autoimmune regulator (Aire)の発現量の解析を介して検討した。その結果、腸内細菌由来の免疫活性物質であるペプチドグリカンとStaphylococcal Enterotoxin BがAireを誘導することが明らかになった。この研究成果は腸管と胸腺という免疫系の重要な2つの臓器が腸内細菌由来の産物によってリンクしていることを示すものである。腸内細菌は腸管内の免疫系の維持に重要な役割を果たしているだけではなく、全身の免疫系に対しても重要な影響を与えることが近年明らかになりつつある。本研究では腸内細菌が腸管とは遠隔の臓器であり、1次リンパ組織である胸腺にも影響を及ぼしているかを、胸腺上皮細胞(TEC)特異的に発現している転写因子autoimmune regulator (Aire)の発現量の解析を介して検討した。まず、腸内細菌がいない無菌(GF)マウスとGFマウスのlittermateで生後直後にSPF環境下に移して飼育したSPF化マウスのTECのAireの発現量を比較したところ、GFマウスの方が有為にAireの発現が低かった。腸内細菌由来の免疫活性物質に着目したところ、ペプチドグリカン(PGN)は、腸管のリンパ組織の発達に重要であるという報告があるとともに、血中を循環し、骨髄の好中球を活性化するために重要であるという報告があった。そこで血中循環している腸内細菌由来のPGNがTECに作用してAireの発現に関与していると予測し、PGNのレセプターであるNod1の欠損マウスを使ってAireの発現を解析した。通常飼育下で5週齢のNod1欠損マウスでは野生型と比べてAireの発現と、Aire依存的な自己抗原の発現量が低下していた。次にPGNがNod1を介してAireの発現を上昇させているかを確認するために、Nod1リガンドであるC12-iE-DAP存在下で胎児胸腺培養(FTOC)を行ったところ、Aireの発現上昇を認めた。T細胞のRANKLによるAireの発現誘導の可能性を排除するため、dGuo処理により、T細胞を除去してからC12-iE-DAP刺激を加えたところ、やはりAireの発現上昇が確認された。以上の結果から、腸内細菌由来のPGNがTEC細胞でNod1を介してAireの発現誘導に関与している可能性が示唆された。本研究では腸内細菌が免疫の中枢である胸腺に対して何らかの影響を及ぼしているか検討した。昨年までの研究から、腸内細菌がいない無菌(GF)マウスとSPF化マウスで比較したところ、GFマウスの方が胸腺上皮細胞(TEC)に特異的に発現しているAutoimmune regulator (Aire)という免疫寛容とT細胞のネガティブセレクションに関与する分子が低下していることを見いだした。GFマウスでAireの発現が低下するメカニズムとして腸内細菌由来の免疫活性物質であるペプチドグリカン(PGN)とスーパー抗原であるStaphylococcalenterotoxin B (SEB)に着目し、遺伝子改変マウスと胎児胸腺臓器培養法(fetal thymus organ culture: FTOC)を用いて検討した。PGNのレセプターであるNod1の欠損マウスからTECを取り、Aireの発現を解析したところ、同腹仔の野生型マウスと比較してAireの発現と、Aire依存的な自己抗原の発現量が低下していた。次にPGNがNod1を介してAireの発現を上昇させているかを確認するため、Nod1リガンドであるC12-iE-DAP存在下でFTOCを行ったところ、TECでのAireの発現上昇を認めた。2d-Guo処理により、T細胞を除去してからC12-iE-DAP刺激を加えてもAireの発現上昇を認めたため、PGNによるTECのNod1を介したAireの発現誘導が示唆された。FTOCでSEB刺激を加えたところ、RANK-RANKLの経路が活性化されTECにAireが誘導されることが分かった。この研究成果から、腸内細菌が胸腺Aireの発現を誘導し免疫寛容に働きかけている可能性が示唆された。免疫学研究計画通り、腸内細菌と胸腺を結ぶ新しいネットワークを解明しつつあり、計画通りおおむね順調に研究は達成できている。腸内細菌由来のペプチドグリカンが胸腺Aireの発現に関与していることを、無菌マウスまたはNod1欠損マウスを使ったin vivoの実験と胎児胸腺培養や培養胸腺

上皮細胞の細胞を使ったin vitroの両面から実験することができた。当初はAireの発現解析に関して、real-time PCRと免疫染色のみの評価であったが、FACS解析が可能な抗Aire抗体を入手でき、さらには、数が少ない胸腺上皮細胞をソーティングやFACSで分離し細胞染色することができるようになったことから、Aireの発現レベルをFACSでも定量的に示すことができた。この結果は、以前得ていたreal-time PCRや免疫染色の結果と同じであり、主張をconfirmすることができた。また胸腺上皮細胞の培養細胞を入手できたことから、in vitroでの解析も進み、ペプチドグリカンがAireの発現を上昇させることをreal-time PCRやFACSによって示すことができた。さらには、ペプチドグリカンだけではなく、Staphylococcus aureus由来のStaphylococcal enterotoxin B (SEB)もAireの発現を上昇させることが分かった。SEBは胸腺内で胸腺上皮細胞のMHC class IIとTCR Vbを強く架橋してネガティブセレクションを起こすことが知られていたが、SEBによるネガティブセレクションを免れたT細胞にRANKLが発現し、胸腺上皮細胞にAireを誘導させることが分かった。ペプチドグリカンによるAireの誘導はNod1を介する新規のAire誘導経路であり、SEBによるAireの誘導はすでに報告のあるRANKL依存的な経路であると考えられた。腸内細菌由来のペプチドグリカンが胸腺上皮細胞のNod1を介してAireの発現上昇に影響していることを平成25年度の実験結果からおおむね示すことができた。今年度は計画通り、腸管と胸腺を結ぶ新たなネットワーク解明の2つ目の研究課題として掲げた、腸管由来の樹状細胞が胸腺のTreg産生に影響しているかについて取り組みたい。腸管DCが腸管から各臓器にmigrationするにあたっては、腸内細菌の影響を大きく受けていると考えている。DCの胸腺へのmigrationが減ると、Treg細胞の産生が低下し、自己免疫やアレルギー疾患の発症や増悪に関連するのではないかと予測している。非吸収性の抗生剤をマウスに投与することで腸内細菌を死滅させることができることが分かっている。抗生剤投与マウス(ABX)と通常の野生型マウス(cont)から調整したDCの動態と胸腺のTreg産生を比較することで、腸内細菌の関与を明らかにする。DCの動態を明らかにするために、腸管から調整したDCをCFSEラベル後、adoptive transferして、胸腺へのmigrationを観察する。DCの数を増やすために、Flt3L-B16メラノーマ細胞(入手済み)を前投与してDCを増やしておく。ABX郡、cont郡においてmigrationしたDCの数を比較する。DCが胸腺にmigrationするサブセットとしてplasmacytoid DC(pDC)が知られている。MigrationしたDCのうち、pDC(PDCA-1+CD11c+)の数を検討する。
微細加工技術を応用した単一細胞レベルでの力学刺激応答評価デバイスの開発

平成19年度は,前年度の成果を受け,デバイス本体の製作プロセス開発および試作機の製作を行った.シリコーンゴム製のマイクロチャンバーに引張りひずみを付与するための微小リンク機構の製作ではレフォトレジストSU-8の多重露光と表面層露光プロセスを応用することで,可動部を有する微小構造体を実現した.デバイス構造体の製作が可能となったことから,顕微鏡に取り付けた手動マイクロマニピュレータによって,試作したデバイスの作動試験を行った.その結果,マイクロチャンバーに単軸の引張り変形が付与可能であること.さらに引張り変形時にチャンバーの剛体変位が良好に抑制され,当初の目的であった引張り時における高時間・空間分解能観察が実現できる可能性が示された.これらの結果は現在,論文としてまとめられ日本機械学会論文集へと投稿・査読中である.また,論文投稿に先立ち,デバイス構造を特許として申請中である.マイクロデバイスの駆動に用いるマイクロアクチュエータの開発では,前年度の試作機から弾性電極の材質をカーボンブラック添加シリコーンへと変更し,さらなる性能向上を目指した.シリコーンゴム中へカーボンブラックを分散させ導電性を得るための条件検討を行い,良好な導電性を有した伸縮性導体の製作プロセスを開発した.この結果を受け,マイクロアクチュエータを試作し,動作試験を行ったところ,前年度のアルミニウム電極を用いたアクチュエータよりも低電圧で大きな出力変位を実現したアクチュエータが製作できた.しかしながら,伸縮性導体と伸縮性絶縁層を組み合わせた場合に,絶縁層の電流リークが顕著となり,複数回の作動でアクチュエータが破損に至る問題が生じた.この問題については研究期間内に解決に至らず今後の検討課題となった.平成18年度は,デバイス製作において基礎となる部分である,シリコーンゴムによる微小構造体の製作プロセスを開発した.その結果,モールディングを用いて,感光性厚膜レジストで製作した原型を転写し,1500μm程度の大きさを有する三次元的な構造体を製作するプロセスを開発することができた.さらに,製作したシリコーン微小構造体の表面上で細胞培養を行うための,洗浄工程,および滅菌行程についても開発を行った.その結果,製作したシリコーン微小構造体の剛性が高いため,70%エタノール水溶液を用いた超音波洗浄工程が適用可能であることが明らかとなった.また滅菌行程では12時間のUV照射が有効であることが明らかとなり,これらによって,作成したデバイスの洗浄・滅菌行程を確立することができた.加えて,デバイス表面への細胞接着を制御するための,表面修飾技術について検討した.フッ素樹脂液をスピンコートすることでデバイス表面に成膜し,デバイス表面全体を低細胞接着性にした後に,酸素プラズマ中へ暴露することで,表面を改質し細胞接着性を向上させる手法を開発した.ステンシルマスクを用いて,酸素プラズマへ暴露させる部分を局所的に限定することで,所定の部分のみを選択的に高細胞接着性へと変化させることができた.また,当初の研究計画を一部,前倒しして実施した.デバイスの駆動に用いるマイクロアクチュエーター製作の基礎研究を行った.今回試作したマイクロアクチュエーターは,弾性電極にアルミニウムを用い,シリコーンゴムの薄膜化プロセスとアクチュエーター動作の概念実証を行った.その結果,900Vの電圧印加で3%程度の伸びを発生させることが確認できた.しかしながら,当初の目標である,1020%の伸張量には達さず,また動作電圧も高いことから,弾性電極の材料とデバイスの構造について再検討が必要であることがわかった.平成19年度は,前年度の成果を受け,デバイス本体の製作プロセス開発および試作機の製作を行った.シリコーンゴム製のマイクロチャンバーに引張りひずみを付与するための微小リンク機構の製作ではレフォトレジストSU-8の多重露光と表面層露光プロセスを応用することで,可動部を有する微小構造体を実現した.デバイス構造体の製作が可能となったことから,顕微鏡に取り付けた手動マイクロマニピュレータによって,試作したデバイスの作動試験を行った.その結果,マイクロチャンバーに単軸の引張り変形が付与可能であること.さらに引張り変形時にチャンバーの剛体変位が良好に抑制され,当初の目的であった引張り時における高時間・空間分解能観察が実現できる可能性が示された.これらの結果は現在,論文としてまとめられ日本機械学会論文集へと投稿・査読中である.また,論文投稿に先立ち,デバイス構造を特許として申請中である.マイクロデバイスの駆動に用いるマイクロアクチュエータの開発では,前年度の試作機から弾性電極の材質をカーボンブラック添加シリコーンへと変更し,さらなる性能向上を目指した.シリコーンゴム中へカーボンブラックを分散させ導電性を得るための条件検討を行い,良好な導電性を有した伸縮性導体の製作プロセスを開発した.この結果を受け,マイクロアクチュエータを試作し,動作試験を行ったところ,前年度のアルミニウム電極を用いたアクチュエータよりも低電圧で大きな出力変位を実現したアクチュエータが製作できた.しかしながら,伸縮性導体と伸縮性絶縁層を組み合わせた場合に,絶縁層の電流リークが顕著となり,複数回の作動でアクチュエータが破損に至る問題が生じた.この問題については研究期間内に解決に至らず今後の検討課題となった.
心臓前駆細胞誘導因子による新しい心筋誘導法の確立と分子機序解明

本研究では新規心臓前駆細胞誘導因子を用いて、幹細胞からの簡便・効率的・低コストな全く新しい心筋誘導法を確立する。さらにこれまで不明であった心臓前駆細胞誘導の分子制御機構を解明する。マウス線維芽細胞を用いて同定した心臓前駆細胞誘導因子Xのマウスの心臓発生過程における発現パターンを明らかにし、さらにマウスES細胞からの心筋誘導にも成功した。この結果を踏まえ、ヒト細胞におけるX因子の関わりの解明に取り組んだ。1.ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化過程における心臓前駆細胞誘導因子Xの遺伝子発現解析(済)マウス同様に、ヒトiPS細胞からの心筋分化における心臓前駆細胞誘導因子Xの遺伝子発現パターンをQRT-PCRを用いて解析した。この結果、X因子はヒトiPS細胞からの心筋分化過程で、T, Mesp1など心臓前駆細胞の出現時期に一致して一過性に発現し、心筋細胞分化とともに減少していることが確認された。2.心臓前駆細胞誘導因子によるヒトiPS細胞からの心臓前駆細胞、心筋細胞分化誘導法の確立(一部実施済)次にドキシサイクリン(Dox)投与により心臓前駆細胞誘導因子Xの発現を制御できるヒトiPS細胞細胞株を樹立した。これまでの予備実験で、iPS細胞株においてサイトカインを使用せず、Doxを添加するだけで誘導開始後1日目に心臓前駆細胞特異的な遺伝子TやMesp1の発現をQRT-PCRや免疫染色で確認できた。またヒト誘導心臓前駆細胞はDoxをoffにして14日目に拍動を開始し、心筋細胞に分化することも確認している。別のX因子発現iPS細胞株でも心臓前駆細胞から心筋細胞の誘導が可能であることを確認するため、現在複数のiPS細胞株の樹立に着手している。当初の計画に沿ってヒトiPS細胞を用いた心筋細胞の誘導に取り組み、一部完了している。しかし、研究代表者の異動により研究機関の変更が生じ、他業務多忙のため当研究を行うことが困難な時期があり、研究計画に沿ったスケジュールで遂行できなかった。またこれまでの実験から得られた結果をより確かなものであることを証明するため、樹立するiPS細胞株数を増やし、より詳細に解析する。このため研究計画を見直し、期間を延長して実施する。研究代表者の異動により当初の実施計画から遅延した実験を実施する。また現在実施しているiPS細胞株の樹立を完了し、複数の細胞株で心筋細胞の誘導が可能であることを証明する。1.マウスES細胞から心筋細胞への分化過程における心臓前駆細胞誘導因子Xの遺伝子発現パターンの解析(済):心臓前駆細胞でGFPを発現するT-GFPマウスES細胞を用いて、BMP, ActivinA, VEGFなど複数のサイトカインで幹細胞から心筋分化誘導を行った。この結果、心臓前駆細胞誘導因子XはT-GFP陽性の心臓前駆細胞に出現しており、幹細胞が心筋細胞へ分化する過程で一過性に発現することが分かった。2.心臓前駆細胞誘導因子によるマウスES細胞からの心臓前駆細胞、心筋細胞分化誘導法の確立(済):T-GFPマウスES細胞を用いてドキシサイクリン(Dox)投与により心臓前駆細胞誘導因子Xの発現を制御できるES細胞株を新たに樹立し、サイトカインを使用せず、Doxを添加するだけでT-GFP陽性率86%と高効率な心臓前駆細胞誘導に成功した。さらにDoxを培養液から除いて心臓前駆細胞誘導因子の発現をoffにすることで、誘導心臓前駆細胞が効率的に拍動する心筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞の3系統の心臓構成細胞に分化することも確認した。3.マウスES細胞から心臓前駆細胞誘導の分子メカニズム解明(済):遺伝子XをshRNAでノックダウンしたところ、幹細胞からの心臓前駆細胞、心筋細胞の誘導が著明に抑制された。この結果より心臓前駆細胞誘導因子Xは、心臓前駆細胞分化に必須の遺伝子であることが示唆された。次に心臓前駆細胞誘導の分子メカニズムを解明するため、2.で作製したDoxシステムを用いて、マイクロアレイ、GO term解析などで網羅的に解析した。さらに心臓前駆細胞誘導因子Xが直接結合するターゲット遺伝子を免疫クロマチン沈降で同定した。これらの結果より、心臓前駆細胞誘導因子XはMesp1に直接結合して、中・内胚葉系の遺伝子を活性化させることで、心臓前駆細胞を誘導することが示唆された。研究は実施計画のごとく、心臓前駆細胞誘導因子の同定に成功し、この因子により従来の液性因子を使用した方法に遜色ない効率でマウスES細胞からの心臓前駆細胞を誘導した。また、この心臓前駆細胞より3種類の心臓構成細胞の誘導にも成功している。さらに分子生物学的機序の探索により心臓前駆細胞誘導因子XはMesp1に直接結合して、中・内胚葉系の遺伝子を活性化させることで、心臓前駆細胞を誘導することを明らかにした。現在、ヒトiPS細胞においても同一因子で心臓前駆細胞および心臓構成細胞が可能か検討している。

1.ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化過程における心臓前駆細胞誘導因子Xの遺伝子発現解析(済)マウス同様に、ヒトiPS細胞からの心筋分化における心臓前駆細胞誘導因子Xの遺伝子発現パターンをQRT-PCRを用いて解析した。この結果、X因子はヒトiPS細胞からの心筋分化過程で、T, Mesp1など心臓前駆細胞の出現時期に一致して一過性に発現し、心筋細胞分化とともに減少していることが確認された。2.心臓前駆細胞誘導因子によるヒトiPS細胞からの心臓前駆細胞、心筋細胞分化誘導法の確立(一部実施済)次にドキシサイクリン(Dox)投与により心臓前駆細胞誘導因子Xの発現を制御できるヒトiPS細胞細胞株を樹立した。これまでの予備実験で、iPS細胞株においてサイトカインを使用せず、Doxを添加するだけで誘導開始後1日目に心臓前駆細胞特異的な遺伝子TやMesp1の発現をQRT-PCRや免疫染色で確認できた。またヒト誘導心臓前駆細胞はDoxをoffにして14日目に拍動を開始し、心筋細胞に分化することも確認している。別のX因子発現iPS細胞株でも心臓前駆細胞から心筋細胞の誘導が可能であることを確認するため、現在複数のiPS細胞株の樹立に着手している。当初の計画に沿ってヒトiPS細胞を用いた心筋細胞の誘導に取り組み、一部完了している。しかし、研究代表者の異動により研究機関の変更が生じ、他業務多忙のため当研究を行うことが困難な時期があり、研究計画に沿ったスケジュールで遂行できなかった。またこれまでの実験から得られた結果をより確かなものであることを証明するため、樹立するiPS細胞株数を増やし、より詳細に解析する。このため研究計画を見直し、期間を延長して実施する。現在論文投稿に向けて準備中である。論文執筆と並行してヒトiPS細胞を用いた実験、およびX因子欠損マウスを作製してこれを用いての表現型の検討を行う予定である。研究代表者の異動により当初の実施計画から遅延した実験を実施する。また現在実施しているiPS細胞株の樹立を完了し、複数の細胞株で心筋細胞の誘導が可能であることを証明する。平成29年度は国内学会への参加のみであったこと、また効率的に物品を購入・使用したことから未使用額が発生した。新たにノックアウトマウスを作製する実験を実施するため、遺伝子操作、マウス搬入等に使用することを予定している。平成30年度中に研究代表者の異動により、研究実施機関の変更が生じた。そのため一部期間研究の実施が困難になったため当初の計画より遅延した。また、さらに信頼性のある結果を追求するため研究を延長して行うこととなった。
薬剤徐放システムを利用した内耳障害治療モデル動物の作成

音響負荷によってフリーラジカルが産生され蝸牛障害が生じ、抗酸化剤がその障害を軽減することは数多く報告されている。我々は脳梗塞の治療薬として国内ですでに臨床応用されている抗酸化剤であるエダラボンを、浸透圧ポンプを用いて内耳に直接投与し、音響障害に対して有効であることを報告してきた。今年度は実際の臨床応用をみすえた現実的な投与経路として、経正円窓膜的投与と全身投与での有効性について検討した。プライエル反射が正常なハートレイ型モルモット(オス、350800g)を用いた。音響負荷として4kHz中心のオクターブバンドノイズ130dB SPLを3時間加えた。投与方法としては、正円窓膜上に薬剤を浸したゼラチン留置する経正円窓膜的投与と、腹腔内投与する全身的投与とした。音響負荷の7日後にトーンバーストを刺激としてABR域値を測定し、聴覚機能を評価した。結果として、経正円窓膜的投与ではABR域値について、8kHz、4kHz、2kHzのいずれの周波数においてもエダラボン投与群と対照群との間で有意な差を認めなかった。全身的投与ではABR域値について、8kHzと4kHzの各周波数において、エダラボン投与群は対照群と比較し、域値上昇が有意に小さかった。2kHzにおいては両群に有意差を認めなかった。今回、経正円窓的投与法ではエダラボンの音響障害を軽減する効果を認めず、腹腔内投与ではエダラボンの音響障害を軽減する効果を認めたことから、音響障害においては血管条における虚血/再潅流障害の重要性が示唆された。また今回薬剤として臨床応用可能なエダラボンについて効果がある結果が得られたことは、エダラボンの経静脈的全身投与が音響障害の治療薬として期待ができることを示す成果である。近年、内耳に薬物を直接投与する各種方法がDrug Delivery Systemとして注目を集めている。薬物の効果を評価する上で、浸透圧ポンプを用いた内耳への直接薬物投与による動物モデルは、EBMに寄与する。今回、モルモットを用い音響障害に対する抗酸化剤edaravoneの内耳への局所投与による効果を検討した。edaravoneは脳梗塞の治療に用いられており、ヒトへの臨床応用が可能な薬剤である。edaravone(1.722×10^<-2>M)を浸透圧ポンプを用い、右耳に投与した。edaravoneを音響付加9時間前と、音響負荷9時間後、21時間後、33時間後に投与した群に分けた。音響負荷には130dBのノイズを用い、3時間負荷した。音響曝露7日後に、機能的評価として聴性脳幹反応(ABR)を行い、また組織学的な評価として有毛細胞の消失率を調べた。ABR域値の上昇と外有毛細胞の消失率において、音響負荷後9時間後にedaravoneを投与した群が最も、また対照群と比べて有意に小さかった。以上の結果から、edaravoneが蝸牛障害に対する治療薬として、有効であることが証明できた。この結果はEuropean Journal of Pharmacology(2005)で報告した。一方ヒトへの臨床応用を考えると、浸透圧ポンプはポンプ除去という処置とその侵襲が問題となる。そこでより侵襲が少ない方法として、ゼラチンを正円窓膜上に留置することで内耳への薬物浸透の効果があるかどうか、モルモットを用いて現在検討を行っている。効果が確認されればヒトへの臨床応用が現実的となることが期待できる。
イミダゾ[1,5-a]ピリジンカルベンの系統的合成と性状の解明

本年度は、これまで検討してきたイミダゾ[1,5-a]ピリジンカルベン配位子の性質に注目した反応として、前年度に明らかになっていた、パラジウム錯体をもちいるアルキンの水素移動型半還元反応について、より詳細に検討を進め、イミダゾピリジンカルベン配位子の電子的な影響とともに、立体的な嵩高さも反応に大きく影響を与えることを明らかにした。そこで、この知見を踏まえた上で、Organらによって開発されたPEPPISI型パラジウム錯体を誘導し、それらの触媒反応への応用を検討した。この際、別の検討において、パラジウム触媒による3ーアリールー1,5ージブロモイミダゾ[1,5-a]ピリジンとスチレン誘導体の反応において、分子内炭素-水素結合直接アリール化による環化反応とHeck反応が順次進行した発光性化合物が生成することを見つけており、それらが、イミダゾピリジンカルベン配位子を持つパラジウム錯体が、反応機構上有効に働くことが期待されたため適用してみたところ、期待通りの顕著な反応加速効果が見られた。この場合、特にHeck反応の加速効果が顕著であり、これは、これまでNHCを配位子とするHeck反応があまり良好な系が見られなかったのと対照的な結果であった。以上のことから、本研究期間において最終的に、われわれが当初期待したとおり、イミダゾピリジンカルベン配位子は従来のNHCと同様に強いドナー性を保ちながら、一方でπアクセプター性も顕著に持つため、それらの性質が顕著に影響する、不飽和結合の配位、挿入およびβ脱離反応を含む反応で有効に働くことが示唆された。本年度は、イミダゾ[1,5-a]ピリジンから導かれる含窒素複素環カルベンについて、対応するロジウム錯体の赤外吸収、NMR、X線結晶構造解析、ならびにフリーカルベンの分子軌道計算による、配位性軌道およびカルベン炭素の空軌道のエネルギー準位から、配位子としての電子的な性質を精査した。結果として、このカルベンは通常のイミダゾールから導かれるカルベンと同等の電子供与能を持っているが、イミダゾールカルベンでは見られない、アクセプター性の軌道を持っていることが明らかになった。一方、金属錯体にした場合には、立体障害による配位平面とイミダゾピリジン環平面のねじれにより、結合距離によるアクセプター性の評価が難しかったため、カルベンに対してセレン原子を付加させた、セレノウレアを導き、カルベン炭素ーセレン原子の結合の様子をNMRにより比較したところ、明らかな2重結合性を示していることが示された。すなわち、このカルベンは実際にアクセプター性をもつことが示唆された。一方、これらの検討が予定以上に順調に進んだため、二年目以降に予定していた、これら配位子を用いる触媒反応も検討した。初期の検討として、配位子のアクセプター性が反応を加速することが示されていた、ロジウムーカルベン錯体によるアセトフェノンの水素移動型還元反応を取り上げ、その反応性について評価してみた。結果、イミダゾ[1,5-a]ピリジンから導かれるカルベンを配位子としたRh錯体は、従来のカルベンと比較し格段に高い触媒活性を示すことが明らかになった。イミダゾ[1,5-a]ピリジンから導かれるカルベンの分光学的物性評価が想定より早く終了し、論文投稿もすませた。さらに、すでにこれら配位子を用いる触媒反応の検討も始まっており、その端緒になる結果も公開することができているため。前年度の研究において、われわれの期待通り、イミダゾ[1.5-a]ピリジンから導かれる含窒素複素環カルベンは、従来型のカルベンと比較し、電子受容能が高いことが示された。また、前倒しで実施した、この性質を意識した触媒反応調査では、特にこのような配位子をもつ金属錯体が加速させると考えられるβー水素脱離および不飽和結合の挿入反応をともなう反応、ロジウム錯体をもちいるアルコールを水素源にするケトンの水素移動型還元反応で顕著な触媒活性向上が見られることが明らかになっていた。そこで、この知見を踏まえ、同じくロジウム錯体による、アルキンの重合反応を検討したところ、この場合も従来型のカルベン配位子をもつ錯体に比べ有意な加速効果が見られた。さらに、パラジウム錯体をもちいる、アルキンの水素移動型反応による半還元にも適用したところ、この場合も顕著な加速効果が見られた。一方、含窒素複素環カルベン型配位子は、複素環平面と受容性軌道の方向性が金属のもつ被占軌道との重なりに一定の制限を与える。そこで、新たに配位可能部位を導入した化合物を合成し、二座配位可能な構造をもたせた化合物を合成し、その配位の有無での物性の変化に注目した。結果として、新たに導入した配位子の配位の有無により、現状因果関係は明確にはなっていないが、例えば、辻ートロスト反応に適用した場合、二座配位構造をもたせた錯体での反応が、大きく加速されることが予備的に明らかになってきた。対象のカルベン型配位子の触媒反応への応用例が予定よりも多く展開できており、また、期待していた効果が予想以上に発揮されることが分かってきており、すでに当初目的を超えた新しい展開が見えてきているため。本年度は、これまで検討してきたイミダゾ[1,5-a]

ピリジンカルベン配位子の性質に注目した反応として、前年度に明らかになっていた、パラジウム錯体をもちいるアルキンの水素移動型半還元反応について、より詳細に検討を進め、イミダゾピリジンカルベン配位子の電子的な影響とともに、立体的な嵩高さも反応に大きく影響を与えることを明らかにした。そこで、この知見を踏まえた上で、Organらによって開発されたPEPPISI型パラジウム錯体を誘導し、それらの触媒反応への応用を検討した。この際、別の検討において、パラジウム触媒による3ーアリールー1,5ージブロモイミダゾ[1,5-a]ピリジンとスチレン誘導体の反応において、分子内炭素-水素結合直接アリール化による環化反応とHeck反応が順次進行した発光性化合物が生成することを見つけており、それらが、イミダゾピリジンカルベン配位子を持つパラジウム錯体が、反応機構上有効に働くことが期待されたため適用してみたところ、期待通りの顕著な反応加速効果が見られた。この場合、特にHeck反応の加速効果が顕著であり、これは、これまでNHCを配位子とするHeck反応があまり良好な系が見られなかったのと対照的な結果であった。以上のことから、本研究期間において最終的に、われわれが当初期待したとおり、イミダゾピリジンカルベン配位子は従来のNHCと同様に強いドナー性を保ちながら、一方でπアクセプター性も顕著に持つため、それらの性質が顕著に影響する、不飽和結合の配位、挿入およびβ脱離反応を含む反応で有効に働くことが示唆された。イミダゾ[1,5-a]ピリジンから導かれるカルベンを含む錯体は、高いπ酸性を持つことが示されつつある。しかし、これらが配位した錯体は、イミダゾピリジン平面と金属の配位平面がほぼ直交した構造をとっており、金属からの電子の逆供与を受けにくい状態になっている。すなわち、イミダゾピリジンカルベンがもつ電子受容性能を活かしきれていないことになる。そこで、今後はイミダゾピリジンカルベンに対し、もう一つ配位子になる官能基を導入し、キレート構造を保たせることにより、それぞれの平面の二面角を小さくし、より理想的な逆供与の実現をめざす。また、金属のπ酸性が強く影響する既知の触媒反応を取り上げていき、これら配位子を用いる触媒反応の展開の方向性を探っていく。最終年度にあたり、現状、予備的な結果としてしか得られていないそれぞれの触媒反応の検討をまとめていく。また、次の展開の予備検討として、イミダゾピリジンカルベン配位子の立体効果の触媒活性への影響に鑑みた検討を進める。物品費で注文した輸入品の価格が不明確で、最終的に1200円の残高が生じたが、額が少額であったため、無理に使用せず次年度に合わせて使用することにした。
抗がん剤によるがん細胞の生物学的特性の変化とＬＰＡ受容体シグナルの役割

抗がん剤を用いた効果的ながん薬物療法を推進するために、がん細胞の抗がん剤抵抗性獲得機構とその制御にかかわる標的分子の探索は重要な研究課題である。これまでの我々の研究において、リゾフォスファチジン酸(lysophosphatidic acid, LPA)受容体を介する細胞内シグナルが、がん細胞の細胞機能の調節に深く関与することを報告してきた。本研究は、抗がん剤処理によって変化するがん細胞の生物学的特性にLPA受容体シグナルがどのような役割を担うかを明らかにし、LPA受容体シグナルを標的とする新しいがん薬物療法開発にむけた基礎的研究である。研究初年度は、膵がん・肺がん・大腸がん・骨肉腫・線維肉腫細胞などの種々のがん培養細胞に抗がん剤を長期処理することで抗がん剤抵抗性細胞を樹立し、これらの細胞を用いてLPA受容体および抗がん剤耐性関連遺伝子であるATP-bindingcassette(ABC)transporter遺伝子発現レベルをリアルタイムRT-PCR法にて網羅的に解析し、発現プロファイリングの作成を主体に研究を行った。また、抗がん剤処理におけるがん細胞と周囲間質細胞の相互作用を理解するために、大腸がん・乳がん・骨肉腫細胞と血管内皮・線維芽細胞をそれぞれ共培養下にて抗がん剤を処理し、抗がん剤に対する感受性の変化とLPA受容体シグナルの関連性についても検索をすすめている。さらに、がん細胞の増悪化過程におけるLPA受容体シグナルの機能を解明するために、高運動能肺がん・大腸がん・骨肉腫細胞に長期抗がん剤処理を行い細胞機能解析も行っている。研究計画に基づいて研究初年度は抗がん剤処理によるがん細胞の生物学的特性の変化を検索する目的で、がん臨床で実際に使用されている抗がん剤を各々のがん細胞にあわせて長期単独および併用処理し、種々の抗がん剤抵抗性細胞を作成した。これらの細胞におけるLPA受容体(LPA1-LPA6)遺伝子とABC transporter(ABCB1・ABCC1・ABCC10・ABCG2)遺伝子発現レベルをリアルタイムRT-PCR法により検索し、各種抗がん剤抵抗性細胞に対する一連の発現プロファイリングを行った。本結果をもとに抗がん剤の特異的に発現変化するLPA受容体ならびにABC transporter遺伝子の同定を行い、ノックダウン細胞の作成と細胞機能解析をすすめている。長期抗がん剤処理によって変動するLPA受容体ならびにABC transporter遺伝子発現プロファイリングをもとに、LPA受容体とABC transporter(ABCB1・ABCC1・ABCC10・ABCG2)に対するノックダウン細胞を作成し、細胞機能解析(細胞増殖、細胞運動・浸潤、細胞外基質分解酵素の活性化、造腫瘍性)を検索することで抗がん剤に特異的な細胞特性の変化をLPA受容体の関連性について明らかにする。またLPA受容体シグナル阻害剤およびLPA受容体ノックダウン細胞を用いて、抗がん剤に対するがん細胞の細胞生存率を計測することで、抗がん剤に対する感受性を制御するLPA受容体を見出しその分子生物学的役割を検索する。長期抗がん剤処理によって変動するLPA受容体

ならびにABC transporter遺伝子発現プロファイリングをもとに、LPA受容体とABC transporter(ABCB1・ABCC1・ABCC10・ABCG2)に対するノックダウン細胞を作成し、細胞機能解析(細胞増殖、細胞運動・浸潤、細胞外基質分解酵素の活性化、造腫瘍性)を検索することで抗がん剤に特異的な細胞特性の変化をLPA受容体の関連性について明らかにする。またLPA受容体シグナル阻害剤およびLPA受容体ノックダウン細胞を用いて、抗がん剤に対するがん細胞の細胞生存率を計測することで、抗がん剤に対する感受性を制御するLPA受容体を見出しその分子生物学的役割を検索する。材料用品費として購入した物品について割引価格で取得することができたので、その余剰分を次年度に持ち越した。あまり高額ではないものの貴重な研究費として有効に活用すべく、翌年度分に請求した助成金と合わせて細胞培養用の試薬・材料に用いる予定である。