hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原子間力顕微鏡下その場観察とSSDA法画像処理によるナノスケールひずみ計測

原子間力顕微鏡(AFM)の観察ステージ上に設置が可能な,小型平面曲げ疲労試験機を用い、α黄銅の疲労き裂進展試験を行った.この時試験片には,収束イオンビーム装置によって微細な予き裂を導入している.予き裂から進展する疲労き裂先端近傍をAFMにより,連続的にその場観察した.その結果,α黄銅の結晶粒内には多くのすべり線が観察された.き裂はこれらのすべり線の影響を強く受けながら進展する.特に低進展速度域においては,結晶粒内で荷重軸に対して結晶方位学的に最も作動しやすいすべり系に沿ってき裂は進展する.しかし一方向のすべりが作動し続けることにより,そのすべり系上で繰返しひずみ硬化が生じるため,き裂進展は停留する.また繰返しひずみ硬化によって,最も作動しやすかったすべり系に比べて,他のすべり系が相対的に作動しやすくなり,停留したき裂はそのようなすべり変形によって分岐・屈曲することが判明した.また,一方向性3%ケイ素鋼板を用いて,比較的高進展速度域における疲労き裂進展試験を行った.この時疲労き裂先端近傍をAFM観察するとともに,SSDA法画像処理によりき裂先端近傍の変位場計測を行った.その結果,き裂先端近傍すべり変形の変形量をナノからマイクロメータ単位で定量的に解析することが可能となった.画像処理により測定される実際のすべり変形量と,観察されるすべり線間隔などの情報から,モードI型の疲労き裂進展およびき裂開閉口挙動のモデルを提案した.原子間力顕微鏡下での試験が可能な平面曲げ疲労試験機を用いて、微小切欠きを有するα黄銅の平面曲げ疲労き裂進展試験を実施し,疲労き裂の発生と進展挙動のナノスケール動的観察を行った.疲労き裂進展挙動として以下の知見が得られた。き裂進展駆動力の低い低K地レベルでは、き裂は結晶粒の優先すべり系に依存した進展挙動を示す。すなわち、粒内のに存在するシュミット因子の高いすべりのにみ優先的に作動することによって、そのすべり方向に沿って進展するが、同一すべり面を繰返し転位が移動することで繰返しひずみ硬化が生じ、き裂は停留する。その後、き裂先端もしくは極後方の二次すべり系の作動の影響が大きくなり、き裂は屈曲もしくは分岐して進展方向を変える.その後、この挙動を繰返し進展するため、巨視的にも傾いたき裂となる。これに対してき裂進展駆動力が高くなると、すべり面の違いによる作動しやすさの差の影響は比較的小さくなり、同時に2つのすべりがき裂上下面で作動することで微視的にも荷重軸直角方向に進展するようになる。疲労き裂進展挙動に及ぼす結晶粒界の影響も駆動力により違いが表れ、駆動力が小さい場合には結晶粒界によりすべりが抑制されるため粒界近傍でき裂進展速度の低下もしくは停留それに引き続くき裂の分岐・屈曲が顕著に生じる。原子間力顕微鏡(AFM)の観察ステージ上に設置が可能な,小型平面曲げ疲労試験機を用い、α黄銅の疲労き裂進展試験を行った.この時試験片には,収束イオンビーム装置によって微細な予き裂を導入している.予き裂から進展する疲労き裂先端近傍をAFMにより,連続的にその場観察した.その結果,α黄銅の結晶粒内には多くのすべり線が観察された.き裂はこれらのすべり線の影響を強く受けながら進展する.特に低進展速度域においては,結晶粒内で荷重軸に対して結晶方位学的に最も作動しやすいすべり系に沿ってき裂は進展する.しかし一方向のすべりが作動し続けることにより,そのすべり系上で繰返しひずみ硬化が生じるため,き裂進展は停留する.また繰返しひずみ硬化によって,最も作動しやすかったすべり系に比べて,他のすべり系が相対的に作動しやすくなり,停留したき裂はそのようなすべり変形によって分岐・屈曲することが判明した.また,一方向性3%ケイ素鋼板を用いて,比較的高進展速度域における疲労き裂進展試験を行った.この時疲労き裂先端近傍をAFM観察するとともに,SSDA法画像処理によりき裂先端近傍の変位場計測を行った.その結果,き裂先端近傍すべり変形の変形量をナノからマイクロメータ単位で定量的に解析することが可能となった.画像処理により測定される実際のすべり変形量と,観察されるすべり線間隔などの情報から,モードI型の疲労き裂進展およびき裂開閉口挙動のモデルを提案した.
糖尿病関連ヘパトカイン発現のマスターレギュレーターの同定とその機能解析

肥満・2型糖尿病状態の肝臓で過剰産生・分泌されるセレノプロテインP(SeP)およびLeukocyte cell-derived chemotaxin 2(LECT2)は、全身にインスリン抵抗性を含む多様な病態を惹起する“ヘパトカイン"である。SeP・LECT2の分泌異常は、2型糖尿病を代表する過栄養関連疾患の有力な治療標的と考えられるが、それらの分泌異常が起きる分子機序は不明であった。申請者は、その候補鍵分子として新規転写因子KLF16を同定した。本研究では、培養肝細胞・マウスを用いて、KLF16が肝細胞のSeP・LECT2両遺伝子発現を介して全身の代謝を制御することを明らかにする。
間葉系細胞の性格を持つcancer stem-like cells と血管性ニッチ

ヌードマウス皮下移植モデルにおいて、nestin陽性グリオーマ細胞が血管中心性に増生し、非nestin陽性グリオーマ細胞はnestin陽性グリオーマ細胞の周囲において増生することを示した。それら細胞をFACSにて採取することに成功した。遺伝子プロファイルを行うと、nestin陽性細胞には間葉系マーカーが強く発現されていた。そこで、TGFbeta存在下で培養すると、筋線維芽細胞や骨芽細胞へ分化した。さらに、nestin陽性グリオーマ細胞は抗がん剤に耐性であることが証明された。以上のことから、nestin陽性グリオーマ細胞はより未分化な細胞集団と考えられた。血管性ニッチを形成する細胞として毛細血管周皮細胞(pericyte)が挙げられるが、その実態が良く分かっていない。ヒトのpericyteの特異的マーカーが欠如することは、ヒトのpericyteの生物学的研究の進展を阻むものである。そこで、ヒトpericyte特異的マーカーを探索した。Pericyteと動脈壁平滑筋細胞特異的に発現するNG2(chondroitin sulfate proteoglycan)のpromotorによってDs-Redが発現するトランスジェニックマウスの肺からNG2 Ds-Red陽性/lineage marker陰性のpericyterich populationと、肺のfibroblast rich populationをFACSによって採取し、gene profileを比較した。Fibroblastと比較して、pericyteに強くと思われる遺伝子は187個であった。Human protein atlasによって、187遺伝子のタンパク質の免疫染色パターンを検討した。45個のタンパク質の情報は無く、残り142個のタンパク質の免疫染色パターンを検討した。すると8個のタンパク質が毛細血管のpericyteに比較的特異的に発現していると考えられた。7個のタンパク質に対する抗体を購入し、免疫染色を行った。Melanoma cell adhesion molecule、fatty acid desaturase 3、myosin、light polypeptide kinase、myosin 1B、synaptopodin 2およびPDGFRBはヒトの多くの臓器のpericyteに発現していた。特にmyosin 1Bの発現はpericyteに選択性が高く、ヒトpericyteマーカーとして適していると考えられた。血管性ニッチを形成していると考えられるpericyteをFACSによって、ほぼ純化することに成功した。しかし、pericyteの培養に成功していないので、至適な培養条件を見出すべく努力を重ねている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
転移経路の異なる犬乳癌と骨肉腫における転移関連因子の比較解析

主として腫瘍細胞株移植ヌードマウスモデルを用い、異なる移植部位による増殖/転移の差異について検討した。骨肉腫では、同所移植(骨内移植)と異所移植(皮下移植)により、ヌードマウスにおける増殖や転移に大きな差があり、特に転移にはezrinの発現が大きく関与した。一方、犬の乳癌に関しては、移植部位による差異は大きくなかったが、増殖、転移には、血管増殖因子や炎症関連因子NF-κBが大きく関与した。小動物腫瘍の転移経路を臨床的に大別すると、主として血行によるものとリンパ系を介して生じるものがある。前者の代表例は骨肉腫であり、乳癌は後者に分類される。これらはおそらく腫瘍細胞の生物学的特性ならびに発症部位の微小環境によって決定されるのではないかと推察されるが、詳細は全くわかっていない。そこで、既に教室で樹立した犬の骨肉腫細胞株ならびに乳癌細胞株をクローン化し、それらをヌードマウスの同所あるいは異所に移植し、その動態を観察するとともに、移植によって形成される原発巣と転移巣における遺伝子発現の差異を検討した。骨肉腫細胞株をクローン化したところ、ヌードマウス内で早期に発育転移を示すHMPOS株を得た。この細胞をヌードマウスの皮下(異所性)および頸骨内(同所性)に移植し、その動態を観察した。その結果、異所性移植による転移は同所性移植群に比較して有意に遅く、生存期間も延長した。またそれぞれの移植群における原発巣の組織に対するcDNASマイクロアレイの結果、多くの遺伝子変化が見られたが、中でもezrin関連の因子発現に差異が認められた。一方、乳癌に関しては、クローン化によって肺転移を生じるCHMp-5b株と生じないCHMp-13a株を得た。これらを用いて、その動態と転移関連因子を検討することとした。これらの細胞を皮下組織に移植し、それぞれの原発巣に関して転移関連と思われる因子の発現を同様にcDNSマイクロアレイで検討した。その結果、両者には、NF-κBや低酸素に係る因子に発現差異がみられた。現在、これらの国子の詳細な解析を実施している段階である。一方、本研究の計画に入れていなかったが、同様にきわめて悪性度が高く、転移の頻繁な犬のメラノーマに関してもいくつかの実験を行っており、特に悪性度と細胞周期に関する検討も実施した。本研究の背景は、たとえば骨肉腫については、原発巣の大きさに関わらず結構制に肺転移が多いのに対し、乳癌ではリンパ節浸潤を伴って肺転移が多い、という、腫瘍によって転移経路が異なる、という臨床的な印象である。それを踏まえて行った、ヌードマウスモデルにおける同所移植と異所移植によって、その増殖能、転移能が異なることから、転移経路の局所環境によって何らかの異なる因子が関わるのではないか、と推測される。前年度のマイクロアレーの結果から、本年度は犬の乳癌に関してはNF-κB,および血管新生、リンパ管新生に関わるヴェGFを主体に検討した。その結果、これらの発現とヌードマウス移植モデルにおける腫瘍増殖、肺転移には強い挿管が認められた。現在、実際の犬の乳癌組織におけるこれらの発現について検討しているところである。一方、骨肉腫に関しては、Ezrinに発現がその悪性度に関わっていることは確認された。ヌードマウスにおいて。同所である頸骨移植、異所移植である皮下移植におけるこの分子の発現比較を実施しているところである。昨年度の途中から実施した、犬のメラノーマの悪性度と細胞周期の関係については、現在最終的な解析を実施しているところである。本研究の目的は、腫瘍の悪性度と周囲組織との関連を検討する一助として、犬の乳癌と骨肉腫のヌードマウスモデルにおいて、原発巣と同じ部位(同所性)あるいは異なる部位(異所性)に移植した場合、その悪性度や転移能に差があるか否かを検討することにある。犬骨肉腫細胞に関しては悪性度の異なる3種の細胞株を、皮下(異所性)、脛骨(同所性)および静脈内(肺転移陽性コントロール)に移植した。もっとも悪性度の高い細胞株においても、皮下移植に比較し、脛骨移植の方が腫瘍の増殖は早く、また肺転移も数、大きさともに進展が早かった。一方、その際のezrinの発現では、原発巣での発現が高いほど、転移が多かったが、しかし、転移巣では、逆にezrinの発現は低下した。このことは、転移に関し手ezrinは何らかの役目を果たすが、転移巣における増殖には大きく関与しない可能性も示唆された。乳癌に関しては、転移経路ではなく、血管新生、あるいは炎症に関連するNF-kBと悪性度に関して検討した。その結果、VEGF-Aは乳腺腫瘍の増殖ならびに転移と関連し、またその際には組織の血管新生も増大した。また、NF-kBも同様に乳癌の悪性度に強く相関し、またその抑制によって、腫瘍増殖が抑制される可能性を示した。今後、これらは悪性度の指標となり、またその抑制が治療法のひとつとなりうることが示された。
妊娠,授乳期における母体の食生活及び生活習慣が骨組織へ及ぼす影響

超音波骨密度測定装置(Achilles)を用いて測定されたStiffnessを骨密度指標として、妊娠初期から最長出産後2年まで、踵骨の骨密度および尿、血液中の骨代謝指標の変化を観察し、妊娠、授乳およびライフスタイルの影響を検討した。得られた主な所見は、1.妊娠中には、妊娠初期から骨吸収が亢進し、出産時に踵骨骨密度は、妊娠初期に較べ有意に低下し、低下の程度は第1子および2子の場合4-8%であった。第3子では、妊娠初期より低く、出産時の低下は小さかった。2.授乳期間が長い程骨密度は有意に低下し、回復までの期間も長かった。3.1年以内の授乳では、授乳後に骨代謝、骨密度の回復現象が見られた。4.授乳期間が1年以上の場合、骨密度はかなり低く、出産後2年でも快復傾向は見られなかった。長期間の授乳は母体の骨組織への影響が大きいと言える。5.種々の食品の中で、乳、乳製品の摂取量のみが骨密度変化率と有意な相関を示し、乳、乳製品摂取量が多い程骨密度低下率が低かった。妊娠、授乳期には乳、乳製品からのCa摂取が重要である。6.骨密度の低下率が高い程、尿中骨吸収指標値および血液中骨型アリカリフォスファターゼが高かったことから、骨代謝が高代謝回転型になっており、超音波法による骨密度測定が骨代謝の状況を反映する指標となり得ることが判明した。1.データ収集作業現在以下の3種の対象者グループを選定し、データ収集を行っている。(1)妊婦婦人平成7年8-9月の2カ月間に、奈良市内の1病院に来院した妊娠3-40週の健康な妊婦88名および対照者若干名について第1回目の調査、血液、尿、骨密度、体脂肪量、食生活調査終了。第2回目:12-1月に(1)の対象者について、妊娠中期の血液、尿採取、および食事調査実施、分析は未完了。第3回目:出産時に血液、尿採取、骨密度、食事調査、授乳状況調査、現在進行中。(2)授乳婦平成7年、11-12月に、乳、乳製品を殆ど摂取しない授乳婦で、授乳初期に当たる22人について、母乳、尿の採取、骨密度、食事調査などを行った。(3)妊娠前:若年女子女子学生(20-23歳)、約140名について、食事調査、骨密度測定、尿中代謝物質測定し、乳、乳製品摂取と骨密度との関連を検討した。分析完了。2.現在までに得られた知見(1)牛乳摂取量が少ない程、授乳期の骨吸収が亢進している。牛乳摂取量がかなり少ない場合、骨吸収程度と母乳中Ca濃度は相関関係がある。母体の骨密度がかなり低くなると、母乳中Ca濃度も低くなる。(2)妊娠中の牛乳摂取量と骨密度間では明確な関連性は確認されなかったが、妊娠前の牛乳摂取量多い程、妊娠前半期の骨密度が高かった。(3)女子学生145人について、成長期(小、中学生期)の牛乳摂取習慣、および現在の牛乳摂取量が骨密度に影響する。妊娠、授乳および食生活を含む生活習慣が骨密度に及ぼす影響について、前向き研究により縦断的に観察し、検討した。対象者は、妊娠初期(5-20週)と出産後の2回継続20人(G1群)、出産後と出産後6カ月の2回継続の46人(G2群)、妊娠初期より出産後、出産後6カ月の3回継続の13人(G3群)、出産後および6、12カ月の3回継続の13人(G4群)の4群に分けて分析を行った。その結果、(1)骨密度は出産後には妊娠初期に較べ有意(P<0.01)に低下した。(2)6カ月間母乳栄養を行った者(乳児栄養として母乳のみ)では、骨密度が有意に低下したが、混合栄養群では低下率は小さく、人口栄養群では逆に出産後より上昇した。

(3)乳、乳製品摂取量が多い程、全般的に骨密度低下率が小さく、授乳による影響も小さく、統計的に有意ではなかった。(4)乳、乳製品摂取量が少ない状態で授乳した場合、骨密度は出産後1年以上では6カ月前よりさらに低かった。(5)出産児数が多い場合、出産後の骨密度は小さいことから、骨密度が回復しないで次の出産をしたことになる。(6)尿中H.P/Creの平均値は、出産後は妊娠初期に較べかなり高値で、骨吸収が亢進して出産後に骨密度が低くなったと考えられる。(7)尿中H.P/Creが亢進している出産後6カ月の骨密度の低下率が大きかったことから、骨吸収の亢進の程度に伴い骨密度が低くなると考えられる。平成7年度よりの継続研究の3年度で、妊娠、授乳および食生活を含む生活習慣が骨密度に及ぼす影響について前向き研究により縦断的に観察し検討した。継続調査の対象者は、市内1病院を受診した妊娠初期(0-20週)の妊婦25人、出産後から対象者として加わった産褥婦12人および母乳栄養相談室に来院した出産後0-12週の26人で、妊娠初期と出産時の2回継続測定者20人、出産後と6カ月経過時の2回継続者46人、出産時およびその後6カ月間隔で5回継続者(現在も追跡継続中)について分析した。主要な結果は、1.骨密度は出産後には妊娠初期に較べ有意(P〈0.01)に低下した。2.6カ月間母乳栄養を行った者では骨密度が有意に低下したが、混合栄養群では低下率は小さく、人工栄養群では逆に出産後より上昇した。3.授乳婦において乳、乳製品摂取量と骨密度低下率とは有意の正相関が認められた。また、豆・豆製品、海草類、小魚などの摂取頻度が多く、乳製品摂取が少ない食生活では、骨密度の低下率は大きかった。授乳中の骨密度の保護には乳、乳製品の摂取が重要であることが判明した。4.乳、乳製品摂取量が少ない状態で1年間授乳した場合、骨密度の低下率は出産直後の値の10%にも上った。授乳後の骨密度の低下率も低かったことから、母性の保護が考えられる。5.尿中H.P/Creの平均値は、出産後は妊娠初期に較べかなり高値で、骨吸収が亢進して出産後に骨密度が低くなったと考えられる。6.尿中H.P/Creが亢進している者ほど出産後6カ月および12カ月の骨密度の低下率が大きかったことから、骨吸収の亢進に伴い骨密度が低くなったことの証拠と考えられる。
木造住宅の地震被害推定手法の開発

地震観測網などの充実に従って、地盤の揺れに関するデータは、より小さな単位で、かつ、応答スペクトルなどのより詳細なデータの入手が可能である。本研究は、そうした情報を前提にして、建築年、建築面積、壁量などの建物の属性から振動特性を推定し、予想される地震動の応答スペクトルとを付き合わせることによって、建物の被害確率を推定しようとするものである。本年度の研究では、以下のような研究を実施した。1.壁量や構法など、属性の分かっている建物約30棟について、その常時微動測定を実施して、固有振動数など、それらの振動特性を把握した。その結果、近年の住宅は、著しく剛性が向上しており、固有周期が0.20.3秒程度であることが分かった。2.既往の実験などから、地震時に問題となる変形領域における固有振動数と常時微動における固有振動数の関係を整理した。実大規模の振動実験におけるデータを約10ケースを収集し、常時微動と比較的大きな変形における固有周期の関係式を誘導した。3.常時微動測定を実施した建物について、耐震診断を実施した。その結果と、常時微動の関係を整理した。4.建築年、建築面積、壁の仕様、壁率などの建物の仕様と量から、常時微動がどのように、形成されて行くかを分析し、建物の仕様と間取り(特に壁量)から、建物の固有周期を推定する方法を提案した。
日本で発生しうる輸入感染症予見を目的としたスペインにおける下水中病原微生物の同定

本研究では、南米からの輸入食品の流通が多いスペインにおいて、下水中に存在する病原体の同定を試みた。ウイルス及び細菌の同時検出手法を開発し、同時にスペイン国内でのサンプリング及びサンプル解析を行った。サンプルは日本に持ち帰り、病原体由来遺伝子の網羅的検出を行った。サンプル解析では、下水検体及び臨床検体中から得られたノロウイルス遺伝子の次世代シーケンス解析を行い、その塩基多様度を評価した。遺伝子型ごとのモニタリングを可能とするために、ノロウイルスGII.3、GII.4、GII.6及びGII.17に由来する遺伝子をそれぞれ定量することが可能なプライマー・プローブセットを設計した。本研究は、歴史上の繋がりから欧州連合における中南米の国々との窓口の立場にあり、魚介類等を大量に輸入しているスペインに着目し、スペイン国内の下水処理場で得られた下水中の病原微生物を網羅的にモニタリングし、将来の日本において発生しうる輸入感染症を予見するための知見を得ることを目的としている。研究初年度である平成26年度は、下水からのウイルス及びバクテリアの同時回収手法の開発、及びスペイン国内でのサンプリングを行った。下水からのウイルス及びバクテリアの同時回収手法の開発では、ポリエチレングリコール沈殿法を採用し、試験細菌及びウイルスであるPseudogulbenikania sp. NH8B_3960tnp及びマウスノロウイルスを同時に回収することが可能であることが確認された。さらに、同手法を日本国内で得られた下水サンプルに適用し、複数種細菌・ウイルス同時検出を行ったところ、アイチウイルス、アストロウイルス、エンテロウイルス、A型肝炎ウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、病原性大腸菌及びウェルシュ菌に由来する遺伝子が高頻度に検出されたことから、本研究で確立した細菌・ウイルス同時回収・検出技術が実用可能であることが確かめられた。スペインには計2回訪問し、研究協力者であるAlbert Bosch教授の協力を得て、サンプリングを行った。その結果、下水濃縮サンプル、食中毒患者由来サンプル、及び食中毒原因食品サンプルを得ることができた。次年度以降、得られたサンプル中に含まれる病原体の検出を行い、遺伝子配列解析を進める予定である。本研究は、歴史上の繋がりから欧州連合における中南米の国々との窓口の立場にあり、魚介類等を大量に輸入しているスペインに着目し、スペイン国内で得られた下水中の病原微生物を網羅的にモニタリングし、将来の日本において発生しうる輸入感染症を予見するための知見を得ることを目的としている。研究2年目である平成27年度は、研究初年度に得たサンプルに関する解析を進めた。スペイン・バルセロナ大学には2週間滞在し、研究協力者であるAlbert Bosch教授(バルセロナ大学)の研究室において、ウイルス遺伝子の抽出及び逆転写反応を行った。サンプルは日本に持ち帰り、Microfluidic PCRによるウイルス遺伝子の網羅的検出を行った。その結果、ノロウイルスGIIに由来する遺伝子を含むサンプルが複数得られた。これらのサンプルについて、ノロウイルスGII由来遺伝子を通常のPCRにより増幅し、次世代シーケンスによるアンプリンコン解析を現在進めている。また、2週間のバルセロナ大学滞在中には、「Special Workshop on Health-Related Environmental Virology」と題してワークショップを開催した。スピーカーは研究代表者と研究分担者2名(東北大学・大村達夫教授、東京大学・片山浩之准教授)、及びバルセロナ大学から2名(Anicet Blanch教授及びSusana Guix助教授)の計5名であり、約40名の参加者が聴講した。研究代表者はこのワークショップにおいて、本研究の意義と進捗状況を報告した。研究協力者であるAlbert Bosch教授(バルセロナ大学)の協力を得て採取したサンプルからノロウイルス遺伝子を検出したところ、複数のサンプルが陽性であった。これらのサンプルについて次世代シーケンスによるアンプリコン解析を進めているが、これにより各サンプルに含まれていたノロウイルスの遺伝子構成が明らかとなる。この情報はバルセロナ周辺における食中毒情報と比較され、輸入感染症の有無を判断する材料となる。また、情報交換のためにスペイン・バルセロナ大学でワークショップを開催し、約40名の参加者の前で、本研究の意義と進捗状況を報告した。これら一連の作業等は全て当初予定通りに進んでいることから、「おおむね順調に進展している」と言える。本研究は、歴史上の繋がりから欧州連合における中南米の国々との窓口の立場にあり、魚介類等を大量に輸入しているスペインに着目し、スペイン国内で得られた下水中の病原微生物をモニタリングし、将来の日本において発生しうる輸入感染症を予見するための知見を得ることを目的としている。研究最終年度である平成28年度は、これまでに得たサンプルの解析を進めた他、国際学会・国内学会での成果発表を行った。ノロウイルス遺伝子の調査領域は、ORF1とORF2の重複領域を含むNS領域である。その結果、下水検体由来ノロウイルス遺伝子は、臨床検体由来のそれよりも、塩基多様度が有意に高いことが確認された。また、同様の配列データに関し、多型サイト数をBrunner-Munzel検定により比較したところ、下水検体由来配列と臨床検体由来配列の間に統計的に有意な差が確認された。これらの結果は、下水検体中には複数のヒトから排出されたノロウイルス遺伝子が含まれており、1回のサンプリングで複数人分の疫学情報を取得することが可能であることを示すものである。このことは同時に、多様な遺伝子型が存在するノロウイルスに関しては、遺伝子型ごとに下水中濃度をモニタリングすることの必要性を示していると言える。

そこでノロウイルスGII.3、GII.4、GII.6及びGII.17に由来する遺伝子をそれぞれ定量することが可能なプライマー・プローブセットを設計した。これらの成果は、2016年9月に群馬県草津町で開催された国際食品・環境ウイルス学会において、研究協力者であるAlbert Bosch教授(バルセロナ大学)を招聘し、口頭発表された。本研究では、南米からの輸入食品の流通が多いスペインにおいて、下水中に存在する病原体の同定を試みた。ウイルス及び細菌の同時検出手法を開発し、同時にスペイン国内でのサンプリング及びサンプル解析を行った。サンプルは日本に持ち帰り、病原体由来遺伝子の網羅的検出を行った。サンプル解析では、下水検体及び臨床検体中から得られたノロウイルス遺伝子の次世代シーケンス解析を行い、その塩基多様度を評価した。遺伝子型ごとのモニタリングを可能とするために、ノロウイルスGII.3、GII.4、GII.6及びGII.17に由来する遺伝子をそれぞれ定量することが可能なプライマー・プローブセットを設計した。当初予定通りに手法開発及びサンプリングが進められており、今後の解析をスムーズに進めることが可能な態勢を構築することができた。スペイン国内で輸入感染症を引き起こした病原ウイルスの遺伝子型の同定を目指し、これまでに得られたPCR産物に対する次世代シーケンス解析を進める。本年度は研究最終年度であることから、研究成果報告も積極的に進める。平成28年9月には第5回国際食品・環境ウイルス学会が群馬県草津町で開催されるが、研究代表者はこの国際会議の幹事長を務めており、研究協力者であるバルセロナ大学・Albert Bosch教授及びRosa Pinto教授を招聘し、本研究の成果発表を行う予定である。また、この国際会議に付随する研究集会においても、本研究の成果を発表する。さらに、年度末には研究総括のために、スペイン・バルセロナにて第2回ワークショップを開催することを計画している。28年度が最終年度であるため、記入しない。土木環境システム平成27年5月にバルセロナ大学を訪問し、研究協力者であるAlbert Bosch教授の研究室で、サンプルからの遺伝子抽出作業を行う。抽出した遺伝子サンプルは日本へ郵送し、解析を進める予定である。これらは当初計画通りである。本研究の成果発表を行うために、共同研究者であるバルセロナ大学生物学部微生物学科のAlbert Bosch教授を2016年9月13ー16日に群馬県草津町で行われる第5回国際食品環境ウイルス学会に招聘する予定である。その招聘費用を確保するために、411,321円を次年度使用することとした。
多形性膠芽腫に多く発現する中間径フィラメント「ネスチン」のcDNAクローニング

1)神経上皮性腫瘍におけるニューロフィラメント蛋白の発現神経上皮性腫瘍の手術標本ホルマリン固定切片をクエン酸バッファ内で95°C、25分間煮沸し抗原賦活し、ABC法によりニューロフィラメント(NF)の各サブタイプに対する単クローン性抗体を用いて免疫染色を行った。NFの発現はニューロン系腫瘍の分化度の指標となった。GlioblastomaにおいてNF陽性腫瘍細胞が存在し、この腫瘍が単にグリア系の細胞から構成されるだけでなく、より未熟な細胞を含んでいることを示唆した。2)ENU誘発ラット脳腫瘍におけるネスチンmRNAの発現ENUの経胎盤的投与によりラットに脳腫瘍を誘発させた。発生した腫瘍は形態学的にヒトの膠芽腫や未分化神経外胚葉性腫瘍に類似していた。摘出した腫瘍より凍結切片を作製し,、これにNFのcDNAおよびネスチンoligonucleotideをプローブとしてIn Situ Hybridizationを行い,NFとネスチンのmRNAを検出した。未分化神経外胚葉性腫瘍に類似した腫瘍だけでなくGFAPが陽性の膠芽腫にもネスチンとNFのmRNAが検出された。3)ヒト膠芽腫培養細胞由来cDNAライブラリーの作製Glioblastoma細胞株U251-MGよりmRNAを抽出し,これよりcDNAライブラリーを作製した。4)単クローン性抗ヒトネスチン抗体の作製の試みラットネスチンcDNAをexpressionvectorを用いて大腸菌に導入しラットネスチン蛋白を産生せしめた。これを電気溶出法により抽出し精製した。得られた蛋白をマウスに免疫し,細胞融合法を行った。産生された単クローン性抗体はELISA法又はウェスタンブロット法により,大腸菌由来ネスチンに反応するものが選択された。
間葉系幹細胞が支持する破骨細胞前駆細胞ニッチの解析

我々は、in vivoにおける破骨細胞は(1)細胞増殖が停止した破骨細胞前駆細胞(QOP)から分化すること(2) QOPは、M-CSF依存的に形成されることを明らかにした。以上は、M-CSFの発現を介して、QOPの形成を支持する微小環境(ニッチ)の存在が予想される。我々は間葉系幹細胞がニッチとして機能することを予想している。本年度は1QOPのFACS解析系の構築、2間葉系幹細胞に特異的に働くCreマウスの探索を行った。【QOPのFACS解析系の構築】QOPは静止状態でM-CSFの受容体(c-Fms)を発現することが予想される。また、これまでの研究結果より、Gr1が陰性であることが示唆された。そこでマウスの骨髄中におけるc-Fms陽性Gr1陰性Ki67陰性の細胞集団をFACSにより検出した。その結果、骨髄中の約1%の細胞がc-Fms陽性Gr1陰性Ki67陰性の細胞として認められた。この細胞集団における表面マーカーをさらに解析した。その結果、CD11bおよびF480が陽性であることが明らかになった。【間葉系幹細胞に特異的に働くCreマウスの探索】以前我々は、Leptin受容体プロモーターの下流でCreリコンビナーゼを発現する遺伝子(LepR-cre)と、Tomato蛍光色素をCre依存的に発現するレポーター遺伝子(flox-stop-flox-Tomato)を有するダブルトランスジェニックマウスの骨髄組織を観察した。その結果、3週齢では骨髄細胞のみが15週齢では骨髄細胞および骨形成細胞がTomato陽性細胞として認められた。平成26年度は、骨髄細胞と骨芽細胞をFACS解析にて区別するためにLepR-cre/Tomato/Col1-GFP(骨芽細胞特異的にGFPが発現)トリプルトランスジェニックマウスを作成した。以上より、M-CSFの発現を介して、QOPの形成を支持する微小環境(ニッチ)の存在が予想される。我々は骨髄間葉系幹細胞がQOPニッチとして機能することを予想している。平成27年度は、「QOPニッチのin vivo解析」を目的とした。「QOPニッチマーカーの探索」、「間葉系幹細胞の抑制によるQOPニッチへの影響の解析」および「破骨細胞形成促進モデルマウスにおけるQOPニッチの解析」を目標に研究計画を立てた。1「QOPニッチマーカーの探索」:骨芽細胞分化初期に発現する転写因子であるRunx2を、新たなQOPニッチのマーカーとして同定した。2「間葉系幹細胞の抑制によるQOPニッチへの影響の解析」: QOPニッチ特異的にジフテリアトキシン受容体を発現するマウスを作製し、QOPニッチの枯渇実験を行った。その結果、QOPニッチの枯渇によるQOPへの影響は認められなかった。3「破骨細胞形成促進モデルマウスにおけるQOPニッチの解析」:破骨細胞分化抑制因子である、Osteoprotegerin(OPG)を欠損したマウスでは、破骨細胞の分化亢進が認められる。野生型およびOPG欠損マウスのQOPニッチを回収し、RNAシークエンスによる比較を行う。現在、FACSにより細胞を回収している段階である。平成27年度は1QOPニッチマーカーの探索、2間葉系幹細胞の抑制によるQOPニッチへの影響の解析、2破骨細胞形成促進モデルマウスにおけるQOPニッチの解析を行った。【QOPニッチマーカーの探索】以前我々は、Leptin受容体プロモーターの下流でCreリコンビナーゼを発現する遺伝子(LepR-cre)と、Tomato蛍光色素をCre依存的に発現するレポーター遺伝子(flox-stop-flox-Tomato)を有するダブルトランスジェニックマウスを作製し、LepR陽性細胞が骨髄間葉系幹細胞であることを明らかにした。本年度は、Runx2-GFPマウスを用いて、骨髄間葉系幹細胞におけるRunx2の発現を調べた。その結果、Runx2を低発現する画分に、骨髄間葉系幹細胞能が高い細胞が含まれることを明らかにした。以上より、Runx2がQOPのニッチマーカーであることが明らかになった。【間葉系幹細胞の抑制によるQOPニッチへの影響の解析】ジフテリアトキシン受容体(flox-stop-flox-DTR)とLepR-creとのダブルトランスジェニックマウスを作成した。ジフテリアトキシンの投与により間葉系幹細胞の枯渇が確認されたが、QOP画分に変化は認められなかった。【破骨細胞形成促進モデルマウスにおけるQOPニッチの解析】Nestun(Nes)-GFPマウスは、骨髄間葉系幹細胞(QOPニッチ)をGFP陽性細胞として検出可能である。Nes-GFPマウスとOPG欠損マウスを掛け合わせた。野生型およびOPG欠損マウスにおけるNes-GFP陽性細胞を回収し、RNAシークエンスを行う。RNAシークエンス解析には、最低10 ngのmRNAが必要であるため、数回にわたりFACSによる細胞回収を行っている。

以上の所見から、M-CSFの発現を介してQOPの形成を支持する微小環境(ニッチ)の存在が予想される。我々は、骨髄間葉系幹細胞がQOPニッチとして機能することを予想している。以前我々は、レプチン受容体(LepR)を発現する細胞が骨髄間葉系幹細胞であることを明らかにしている(Dev Cell 29:340, 2014)。平成27年度に骨芽細胞分化初期に発現する転写因子であるRunx2を、新たな間葉系幹細胞(QOPニッチ)のマーカーとして同定した。そこで、平成28年度はLepR/Runx2共陽性細胞についての解析を進めた。1「LepR/Runx2陽性細胞における間葉系幹細胞マーカーの発現解析」: LepR/Runx2陽性細胞画分は、間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRaとCXCL12の発現が、全骨髄細胞中で著しく高いことを明らかにした。一方、LepR陽性細胞画分中のRunx2陽性および陰性細胞におけるLepRの発現を比較した結果、Runx2陽性細胞画分のLepR発現が有意に高いことが明らかになった。3「LepR/Runx2陽性細胞に対する副甲状腺ホルモン(PTH)の作用」:マウスへのPTHの間歇投与により、骨量が増加した。この時、LepR/Runx2陽性細胞が骨内膜近辺で増加することを明らかにした。また、PTH投与により、成熟骨芽細胞の増殖には影響を与えなかった。一方、Ki67陽性のLepR/Runx2陽性細胞が骨内膜近辺で多く認められた。平成26年度は「破骨細胞前駆細胞(QOP)ニッチのin vivo解析系の構築」を目的とした。「QOPのFACS解析系の構築」および「間葉系幹細胞得意的な分子の探索」を目標に研究計画を立てた。1「QOPのFACS解析系の構築」については、FACSによりQOPの細胞集団と予想される画分を検出することに成功しており、ほぼ予定通りに進行している。2「間葉系幹細胞得意的な分子の探索」については、解析に使用するLepR-cre/Tomato/Col1-GFPトリプルトランスジェニックマウスを作成したところである。当初の予定より遅れているが、今後の解析には時間は要さないと予想している。このマウスの解析を進め、間葉系幹細胞の特異的な分子を探索する。当初、間葉系幹細胞得意的にM-CSF発現を抑制し、QOPおよび破骨細胞に対する影響を調べる予定であった。しかし、M-CSF-flox/floxマウス供与の承諾が、Dr. Abbound Werner S. (デキサス大学)より得られなかったため、実験は中止した。今後は、平成27年度に引き続き、「破骨細胞形成促進モデルマウスにおけるQOPニッチの解析」を進める予定である。一方、副甲状腺ホルモン(PTH)は、骨形成促進作用を有することが知られている。最近我々は、PTHのマウスへの投与が、QOPニッチである骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進するという所見を得た。今後、PTH投与にともなうQOPニッチへの影響についても解析を進める予定である。骨代謝学平成26年度に引き続き、間葉系幹細胞に特異的に発現する分子を検索する。間葉系幹細胞を得意的に抑制し、破骨前駆細胞(QOP)および破骨細胞に対する影響を調べる。
執行のコストを想定した抵当制度の実体法的再検討

平成9年度において筆者は、担保制度を執行のコストまで含めた視点で分析するための一般枠組みとして、交渉ゲーム論によるモデル・ビルディングを採用してその一般理論としての彫啄に努めた。平成10年度は、抵当権制度に関して平成年間に下された最高裁の新判例を渉猟し、それらが如何なる法学的および実務的な利害の調整を図ろうとしたものであるのかを検討した。具体的には(1)抵当権に基づく賃料への物上代位(2)滌除・代価弁済(3)法廷地上権(4)短期賃貸借・売却のための保全処分に関するものである。その際に昭和金融恐慌下での金融実務の展開を意識して形成された旧通説の価値権論が大きく後退していく経緯が跡づけられた。他方で、この数年、判例のみならず個別立法のレヴェルでも幾つかの重要な進展が見られた。例えば民事執行法の平成改正が代表的なものである。またこれに公表された試案の類を合わせると、かなりの量の立法提案が既になされている。具体的には物上代位の配当手続に関する立法論、滌除制度改革に関する立法論、法廷借地権に関する立法論などがある。これらの収拾と分析を一定程度すすめ、かつ前期の判例分析と結合するための研究を進めた。研究成果としては、まず総論的なものとして、80年代後半にアメリカで展開された担保の効率性を巡る議論を手がかりとして、債務者、後順位抵当権者等の多数の利害関係者を視野に入れたモデルを作成した。次いで各論的なものとして短期賃貸借に関する395条についての立法諸提案をそのモデルによって分析して評価を加えた。当初本年度は実態調査にあて、モデル・ビルディングの為の検討と実際的な提言とは来年度に予定していたが、資料収集と研究進行の都合により本年度はむしろモデル・ビルディングに力を注ぐことになった。研究計画調書の中でも述べておいたとおり、本研究の究極的な目的である抵当不動産の任意売却の促進の為には、それに向けた交渉という訴訟外の事実を把握する枠組みと、それに対する法制度の作用を測定する社会工学的な枠組みが必要となる。筆者はその手がかりを交渉ゲーム論に求め、本年度の研究を通じてシェイキッド・サットン交渉ゲームによる法制度の分析・設計が可能であることを実証し得た。一般理論は論文「契約法とゲーム理論」の中に提示してある。またこの一般理論を、複雑な担保取引・執行制度に適用する前提作業として、折から論じられ始めた定期借家権を素材として実地に応用したものとして小論「定期借家権と交渉」がある。既に「売却のための保全処分」に関する判例研究を進めており、来年度は本格的に不動産担保実務の実態の分析に取組み、特に担保権の実行として競売に関する実用的な議論にまで具体化したい。具体的には(1)抵当権に基づく賃料への物上代位(2)滌除・代価弁済(3)法定地上権(4)短期賃貸借・売却のための保全処分に関するものである。

具体的には物上代位の配当手続に関する立法論、滌除制度改革に関する立法論、法定借地権に関する立法論などがある。これらの収拾と分析を一定程度すすめ、かつ前記の判例分析と接合するための研究を進めた。平成9年度の研究との関連では、さしあたり、80年代後半にアメリカで展開された担保の効率性を巡る議論を手がかりとして、債務者、後順位抵当権者等の多数の利害関係者を視野に入れたモデルを作成中である。
ピペラミドおよびマラバリコン類の殺線虫作用に於ける構造活性相関

ピペラミド類{Ar (CH_2)_nCO-X : Ar=芳香環,X=アミン}については,芳香環部(Ar)としてphenyl,p-methoxyphenyl,m,p-dimethoxyphenyl,3,4methylenedioxyphenyl,p-hydroxyphenyl,m,p-dihydroxyphenylのいずれか,またアミン部(X)としては,pyrrolidine (C),またはN-methylpiperazine (M)を持ち,メチレン鎖の長さ(n)が6から14の同族体を合計76種合成し,各々の殺線虫活性を測定した.その結果,殺線虫活性は側鎖の長さとアミン部の種類にって大きく異なり,水酸基を持たない化合物では,log Pで代表される化合物の疎水性と親水性のバランスが一定の範囲内で最大活性を示すことがわかった.これに対し,フェノール性水酸基を持つ化合物は,前記化合物群よりlog Pが小さいところで最大活性を示しており,単なるアミド化合物とは異なる作用機序あるいは作用部位を持っていることが推察された.その結果,アミン部としてpyrrolidineを持つもの(ピペラミドC)の同族体では,芳香環部の種類に関係なくn=10のものが最も強い活性を示し,活性の強さはMD>>DI【greater than or equal】PH>MEの順であった。但し,MD,DIはn=1になれると急激に活性が減少したが,PH,MEでは活性の減少は小さかった。一方,アミン部としてN-methylpiperazineを持つもの(ピペラミドM)の同族体では,最大の活性を示す炭素鎖の長さがn=12とpyrrolidineアミドの場合よりも長くなっていたが,芳香環部による活性の強さの順番はMD>DI>PH>MEで,pyrrolidineアミドの場合ピペラミド類{Ar (CH_2)_nCO-X : Ar=芳香環,X=アミン}については,芳香環部(Ar)としてphenyl,p-methoxyphenyl,m,p-dimethoxyphenyl,3,4methylenedioxyphenyl,p-hydroxyphenyl,m,p-dihydroxyphenylのいずれか,またアミン部(X)としては,pyrrolidine (C),またはN-methylpiperazine (M)を持ち,メチレン鎖の長さ(n)が6から14の同族体を合計76種合成し,各々の殺線虫活性を測定した.その結果,殺線虫活性は側鎖の長さとアミン部の種類にって大きく異なり,水酸基を持たない化合物では,log Pで代表される化合物の疎水性と親水性のバランスが一定の範囲内で最大活性を示すことがわかった.これに対し,フェノール性水酸基を持つ化合物は,前記化合物群よりlog Pが小さいところで最大活性を示しており,単なるアミド化合物とは異なる作用機序あるいは作用部位を持っていることが推察された.一方,ピペラミド類{Ar(CH_2)_nCO-X:Ar=芳香環,X=アミン}については,芳香環部(Ar)としてp-hydroxyphenyl,m,p-dihydroxyphenylのいずれか,またアミン部(X)としては,pyrrolidine(C),またはN-methylpiperazine(M)を持つピペラミド類について,各々メチレン鎖の長さ(n)が6,8,10,12及び14の同族体を新たに合成し,各々の殺線虫活性を測定した.その結果,水酸基の導入により分子全体の極性(親水性)は増加しているにも関わらず,最大活性を示す側鎖の長さはphenyl,p-methoxyphenylなどをもつものに比べ,p-hydroxyphenylで炭素数2個,m,p-dihydroxyphenylで炭素数4個少なくなっていた.このことから,本活性にはフェノール性水酸基が重要な役割を果たしていることが推察された.
モデル植物シロイヌナズナにおける小胞体ストレス感和の分子機構

小胞体でのタンパク質の成熟過程に異常が起こるとシャペロン等の遺伝子が転写誘導される。この現象は小胞体ストレス応答と呼ばれ、酵母や動物でそのユニークな分子機構が詳しく解析されている。一方で植物においては、分子機構、生理的意義ともに不明な点が多い。私たちはモデル植物であるシロイヌナズナから小胞体ストレス応答で誘導される転写因子AtbZIP60を単離した。AtbZIP60は膜貫通領域を有し、膜貫通領域を除いた部分を一過的に発現させると、BiPなどの小胞体シャペロンのプロモーターを活性化した。またこの部分にGFPを連結したキメラタンパク質は核に局在した。これらのことからAtbZIP60タンパク質は不活性な膜結合型として存在し、小胞体ストレス依存的にプロテオリシスを受け核へ移行し、BiP等の小胞体シャペロン遺伝子の転写を誘導すると仮定した。平成18年度はこの仮説を証明するために抗AtbZIP60抗体を作製しタンパク質の挙動を調べた。その結果、全長のAtbZIP60は小胞体に局在し、ツニカマイシンやDTTなどの小胞体ストレス誘導剤に処理により、切断型AtbZIP60が検出された。また、この切断型AtbZIP60は核に局在した。以上の結果から、上記の仮説が証明された。続いてAtbZIP60タンパク質の切断機構について調べた。動物の小胞体ストレス応答の制御に関わる転写因子ATF6は、ゴルジ体に存在するS1P、S2Pという2つのプロテアーゼにより切断される。そこで、シロイヌナズナのゲノム情報から、S1P、S2Pのホモログと考えられる遺伝子の遺伝子欠損株をそれぞれ入手し、AtbZIP60の小胞体ストレス依存的な切断を調べたところ、AtbZIP60は野生型と同様に切断された。このことから、S1P、S2PはAtbZIP60の切断には関与していないことが強く示唆された。シロイヌナズナの小胞体ストレス応答で重要な働きをすると考えられる転写因子AtbZIP60の機能解析をおこなった。具体的には、1、AtbZIP60の遺伝子破壊株を単離と解析、2、AtbZIP60に対する特異抗体の作成と抗体を用いたAtbZIP60のタンパク質レベルでの挙動の解析をおこなった。1については、野生型と遺伝子破壊株の間でツニカマイシン処理により変動する遺伝子の比較をアジレント社製のマイクロアレイを用いておこなった。その結果、ツニカマイシンで3倍以上誘導される133の遺伝子うち34個の遺伝子の発現が破壊株では野生型の半分以下に低下していた。特にBiP3などの遺伝子は、破壊株では野生型の10分の1以下に誘導が減少しており、AtbZIP60が小胞ストレス応答遺伝子の制御に関わることが確認された。しかし、破壊株で全ての小胞体ストレス応答遺伝子の誘導が抑制されているわけではなく、破壊株は野生型と同様の生育を示した。従って、AtbZIP60が関与する以外の情報伝達経路が存在することが示唆された。一方、2に関しては、、AtbZIP60が膜貫通領域を有すること、膜貫通領域を除いたタンパク質の一過的発現によりBipなどのプロモーターが活性化されることからAtbZIP60はタンパク質レベルで切断されることが予想された。そこでAtbZIP60に対する特異抗体によりタンパク質の挙動を調べたところ、ツニカマイシン処理やDTT処理などの小胞体ストレス処理によりAtbZIP60がタンパク質レベルで切断されることが確認された。さらに切断されたbZIPドメインと転写活性化ドメインを含む領域が核に局在することも確認した。従って、AtbZIP60は哺乳類のATF6と同様にタンパク質レベルで切断を受け、小胞体ストレス応答関連遺伝子の転写に関わるという仮説を証明することができた。

そこで、シロイヌナズナのゲノム情報から、S1P、S2Pのホモログと考えられる遺伝子の遺伝子欠損株をそれぞれ入手し、AtbZIP60の小胞体ストレス依存的な切断を調べたところ、AtbZIP60は野生型と同様に切断された。このことから、S1P、S2PはAtbZIP60の切断には関与していないことが強く示唆された。
１分子吸収分光法の確立

近年、タンパク質構造が原子分解能で明らかにされ、構造を基にした機能解析が可能になってきた。一方で、生体内の生理環境は刻一刻と変化しており、構造は常に変動している。このようなタンパク質構造ダイナミクスを解析するため、1分子蛍光分光法が発展した。しかし蛍光検出では、非蛍光性の分子・状態・反応中間体は解析できない。そこで本研究では、1分子の吸収分光法を新たに開発し、光合成光反応の光電変換過程を1分子レベルで観測する。タンパク質構造ダイナミクスと反応経路・速度の相関解析から、『構造自由度の高い生体タンパク質のような巨大高分子で、どのように反応の経路・速度が安定化されているのか?』を明らかにする。
アニサキス抗原の経口摂取とそれによるIgE抗体の産生はアレルギーに関与するのか？

海産魚摂取に伴う蕁麻疹等のアレルギー症状は、アニサキス(海産魚に寄生する線虫)がその一因と考えられている。アニサキス感作動物にそのホモジネートを投与した場合に抗体反応を増強させる抗原分画のうち、熱処理に耐性な約35kDaと14kDa分画の同定を試みた。35kDa分画はアニサキスアレルゲンの一つであるヘモグロビンであり、他方は同アレルゲンのAni s 9またはミオフィリンと考えられた。国内アニサキス症の主原因Anisakis simplex sensu strictoのヘモグロビンmRNAの塩基配列およびアミノ酸配列を同定し、同胞種(A.pegreffii)間の変異を明らかにした。アニサキス感作個体に幼虫ホモジネートを経口投与すると、ELISA法によってアニサキス特異IgG、IgM、IgE抗体産生の再誘導がOD値の上昇により確認された。その再誘導は幼虫のExcretory-secretoryexctract(ES抗原)よりもCrude extract(CE抗原)を抗原とした場合に明瞭に認められた。ELISA法で認めた特異抗体がどのような幼虫の抗原分画に反応しているかをイムノブロット法で確認した。その結果、アニサキス初感染、再感染、ホモジネート投与後に各抗体アイソタイプが認識する抗原分画は、約130kDa、100kDa、50kDa、37kDa、25kDa、1015kDa付近の複数の分画であった。CE抗原では100kDa、50kDa、37kDa、1015kDa付近の分画が認識され、それらに対する反応は再感染とホモジネート投与後に強まる傾向があった。一方、ES抗原に対しては、130kDa、100kDa、50kDa、37kDa、25kDa、1015kDa付近の分画が認識され、再感染後はそれら抗原に対する反応が強くなったが、ホモジネート投与後のそれら分画への反応は抗体アイソタイプによっては変化を認めないか軽微であった。CE、ES抗原を加熱処理しても、その抗原性はELISA法で確認した場合、多少減退するが維持されていたことから、両抗原には熱耐性の抗原が含まれていると考えられた。CE、ES抗原の120°C4分の加熱処理後のSDS-PAGEから判断すると、抗原分画は加熱処理でかなり変性していた。しかし、そのイムノブロット反応から判断すると、抗原分画によっては抗原性が残っているものと考えられた。CE、ES抗原のpepsin処理後のSDS-PAGEから判断すると、抗原分画はペプシン・酸処理でかなり変性していた。しかし、そのイムノブロット反応から判断すると、抗原分画(約130kDa、100kDa、50kDa、65kDa、37kDa、27kDa、10kDa)によっては抗原性が残っているものと考えられた。アニサキス感作動物に同幼虫ホモジネートを経口投与した場合、抗体反応が増強される抗原分画の同定をイムノブロット法等で試みた。ホモジネート投与後に各抗体アイソタイプの反応性が増強した主要抗原分画のサイズは次の通りである:IgM抗体では約130kDa、5075kDa、IgGとIgEでは約15kDa、35kDaであった。IgGとIgEで認識された両抗原分画はサイズから同一と推測された。15kDa、35kDaの分画は、沸騰浴中30分、115°C90分、121°C20分の加熱処理でも抗原性が失われなかった。また、酸およびペプシン処理によっても抗原性が保持されており、その耐性能は15kDa分画でより強かった。約35kDa分画の質量分析の結果から、同分画はアニサキスヘモグロビンである可能性が示されたが、それ以外の複数のタンパク質の混在も予想された。このため、二次元電気泳動とイムノブロットで陽性を示したスポットについて質量分析を試みたところ、それはアニサキスヘモグロビンであることが明らかとなった。このタンパク質はアニサキス感作に関わる慢性アニサキスアレルギー患者の抗体が認識するアレルゲンとしても知られていた。同様に約15kDa分画について質量分析を試みたところ、分類学的にアニサキスと近縁な犬回虫や豚回虫のミオフィリンタンパク質、アニサキスの9番目のアレルゲンAni s 9等が候補として示されたが、その特定には至らなかった。同分画の二次元電気泳動とイムノブロット解析から、SDS-PAGEで切り出された同分画には少なくとも可視的に8つのタンパク質が混在していると考えられ、そのイムノブロット解析から2つのスポットが抗体陽性を示し、特に一方のスポットは抗体の反応性が著明に強いことから、このスポットに含まれるタンパク質が約15kDaでの反応性に関わるタンパク質であると考えられた。アニサキス感作動物に同幼虫のホモジネートを経口投与した場合に、イムノブロット法でホモジネート投与後に抗体反応が増強された分画の中の主要2分画について、二次元電気泳動等でその分画・スポットの特定を試み、さらにその質量分析とMascot解析から当該スポットのタンパク同定を試みた。結果として、2分画中1分画については同定することができたが、抗原量が少ない割に