hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異性化反応-優先晶析同時プロセスによる高収率光学分割操作の開発

光学異性体を高純度、高収率で得る操作の確立が医薬品や食品工業の分野で求められている。これは光学活性な物質に固有な優れた生理活性や味覚などが、光学純度に大きく依存しているためである。本研究は、光学活性体の混合物の系の多くがラセミ化合物を形成することから、そのような系に対し優先晶析法が適用できるか否かを実験的に確認すること、および収率を高めるために異性化反応を同時に行った場合の優先晶析プロセスの原理を実験的に確認することを目的とした。これらの実験的研究を行う前に、ラセミ混合物を作るDL-Threonine系の優先晶析操作における製品純度低下について実験的な検証を行い、回分操作後半の不要成分(D-Thr)の析出挙動を解析してその原因をL-Thr結晶表面でのD-Thrの核化現象であることを確認した。続いてラセミ化合物を形成する物質(BOC-ピペラジン:BBP)に対して優先晶析法が適用できるか否かを実験的に小型装置を用いて検討した。その結果、ラセミ化合物と一つの鏡像異性体の析出速度(核化速度と成長速度)に差異が見られることから優先晶析法が適用可能であることを見いだした。最後に鏡像異性体間の異性化反応を伴う優先晶析プロセスの原理を考案し、医薬品として重要なDL-DOPAを用いて実験的に可能性を確認した。この結果、異性化反応速度と望まれる鏡像異性体の析出速度を実験的に決定するとともに、それらと溶媒の除去速度を等しくおける条件下では安定した連続操作が可能であることを示すことができた。医薬品製造などのファインケミカルで、「光学異性体(対掌体)の分離」は非常に重要な操作である。医薬品の場合、一方の対掌体のみが有効であることから、安全性や薬理特性を高めるために不要な対掌体を含まない製品が要求される。本研究は不要な対掌体を異性化反応により、有用な対掌体に変換しつつ、同時に有用な対掌体の優先晶析を行わせる操作を開発するものである。本研究は2年計画で進められるが、本年度はまず、回分式の装置で、連続化に向けての速度論的検討を行うための実験データを収集した。内容は次の通り。1.装置:晶析装置を設計作成した。これはジャケット式ガラス製の撹拌式晶析装置であり、この温度はEYELA製のプログラム式恒温循環システムを付帯させ、緻密な温度制御が行えるようにした。2.操作条件:晶析速度(核化速度・成長速度)の操作条件を決定するために対象とした物質の3成分相図(溶媒と2種類の対掌体)を各温度で決定した。このとき。組成は、光学分割用のカラムを用いた、高速液体クロマトグラフシステムLC-1500を用いて測定した。一連の実験の結果、優先晶析の際、所望の対掌体以外の結晶が析出することが知られているが、これは、所望の対掌体の析出により、不必要なもう一方の対掌体の見かけ過飽和度が増加し、この対掌対が核化することで発生している可能性があることが分かった。さらに、ラセミ化合物を形成する系の場合、ラセミ化合物が析出する条件下でも、対掌体結晶の析出速度を考慮すれば、優先晶析が行える可能性があることが実験的に分かってきた。医薬、食品などの分野において用いられる光学活性体には、鏡像異性体やジアステレオマーなどの光学異性体が存在し、目的に応じた生理活性体を分離することが必要となる。光学分割の代表的な手法として、ラセミ体の過飽和溶液中に一方の光学活性体を種結晶として添加することにより、選択的に析出させる優先晶析法がある。しかしながら、優先晶析法による光学分割における問題点として、回分操作で行われるために、操作後半で非目的成分(不要成分)が析出して製品純度の低下を招くことが拳げられる。

まず、優先晶析法による光学分割の適用性の検討を目的として、ラセミ混合物を形成するD-およびL-スレオニン、およびラセミ混合物を形成するS-およびR-BOC-ピペラジンを用いて検討を行った。その結果、ラセミ混合物を形成する系に対しては、競争析出(核化、成長)により望みの成分(L-スレオニン)が優先的に析出することが見出され、ラセミ化合物をつくるBOC-ピペラジン系に対しても優先晶析による光学分割が可能であることが示された(化学工学会第65年会(2000)で発表予定)。また、製品の純度低下機構の解明を目的として、D-およびL-スレオニンを用いて検討を行ったところ、純度の低下機構は結晶化している光学活性体と種結晶の表面形態の変化に関係していることがわかった(Colloids and Surfaces誌に掲載済)。さらに、異性化反応を伴う優先晶析による光学分割の適用性の検討として、D-およびL-DOPAを用い実験を行ったところ、通常の優先晶析法と比較して、分離効率が高いことが明らかになった。
低出力照射した光重合型コンポジットレジンからの未重合モノマーの溶出

照射光の出力の調整可能な光照射器を試作し、低出力照射によるコンポジットレジン修復の象牙質窩洞における窩壁適合性への影響を調べ、重合度を内部かたさおよび未重合モノマーの溶出量で、機械的強さをダイアメトラル引っ張り強さで評価し検討した結果、以下の結論がえられた。2.ヌープかたさにおいて低出力照射(9V・120秒)では通常照射(12V・60秒)に比べ一部で低値を示したがほぼ同程度の値であり、臨床的に許容されると思われた。3.ダイアメトラル引っ張り強さでは低出力照射(9V・120秒)と通常照射(12V・60秒)に差は認められなかった。4.Lite-fil IIAより溶出した未重合モノマーとしてHEMA,TEGDMAおよびBis-GMAを確認した。5.低出力照射(8V)では照射時間が増えると溶出モノマーが減少した。6.TEGDMA,Bis-GMAの溶出量は低出力照射(8V)と通常照射(12V)の間に差は認められず、HEMAの溶出量は照射時間が長い(40秒、60秒、90秒)と低出力照射(8V)の溶出量が少なかった。1.象牙質規格窩洞に光重合型コンポジットレジン(Palfique Estelite,Z-100,Lite-fil IIA)を充填し低出力照射(9V・120秒)によって重合させると良好な窩壁適合性がえられた。市販光重合型コンポジットレジンを用い、低出力長時間光照射による象牙質窩洞における窩壁適合性および重合体の内部硬さ、圧縮強さについて検索がなされた。光重合型コンポジットレジンとして、徳山社製Tokuso Light BondとPalfique Estelite(以下TP)、3M社製ワンオール(以下OA)、松風社製IMPERVA BONDとLITE-FIL IIA(以下IL)を用いた。シェ-ドはTPがA3、OAとILがA2、A3を用いた。光照射には長田社製キュアトロンを改造し、出力を6Vから12Vまで調整可能にした試作光照射器を使用した。照射条件はTPでは12V・60s、9V・60sおよび9V・120sの3条件を、OAとILでは12V・60s、10V・120sおよび9V・120sの3条件を設定した。1.窩壁適合試験:ヒト抜去歯象牙質内に規格円柱窩洞を形成し上記のレジンを充填、各種条件で光照射しHANSENの方法に準じ最大ギャップ幅(GP μm)、ギャップ発現頻度(GP %)を計測しさらにMarginal Index(MI=MG×GP/100)を算出した。2.内部硬さ:各種条件で光照射した半円柱形のレジン試料を照射側から0.2mm間隔でヌープ硬さを測定した。3.圧縮強さ:各種条件で光照射した円柱のレジン試料について圧縮強さを測定した。TPにおいては、低出力照射(9V)では通常の出力(12V)に比べ窩壁適合性が向上し、照射時間を120sに長くするとある程度の深さまで通常出力と同程度の内部硬さが得られた。OA、ILについても低出力照射(9V、10V)の方が窩壁適合性の向上が認められ、内部硬さもTPと同様の結果が得られ、シェ-ドによる差もなかったが、ILのA3、9V・120Sのみ表層から低い内部硬さであった。圧縮強さについては大きな差は認められなかった。また、歯質との接着力、溶解性について現在検討されており、未重合モノマーの検出、測定は予備実験が進めらている。平成6年度の研究から象牙質規格窩洞に光重合型コンポジットレジンを充填し低出力長時間照射によって重合させると良好な窩壁適合性が得られた。また硬化したレジンは臨床的に許容されると思われる機械的強度(ヌープ硬さ,圧縮強さ)であった。しかし,低出力照射では重合度の低下およびレジンからの未重合モノマーの溶出のため機械的強度が低下する可能性もある。本年度は,低出力照射されたレジンからの未重合モノマーの溶出量を測定し,通常出力の場合と比較検討した。

照射条件は低出力照射として8V/40s,8V/60s通常出力照射として12V/40s,12V/60s低出力照射+通常出力追加照射として8V/20s+12V/40s,8V/30s+12V/30sを設定した。φ6mm×2mmのスプリット型ステンレスモ-ルドにLite-fil II A,shadeA2を充填し一方向より上記条件にて光照射し円柱試料を作製した。試料を75%エタノール2ml中に37°C1時間遮光下で浸漬後,5μlを採取し高速液体クロマトグラフィーにて未重合モノマーを測定した。測定にはカラム:Micro Bondapak C18,移動相:70%エタノール,流速1ml/minを用いた。モノマーの標準物質としてHEMA,TEGDMA,Bis-GMAを使用し観察された3つの主たるピークはそれらの標準物質と一致していた。各々3試料の測定を行いその中間値を各照射条件の代表値とした。検出されたモノマー溶出量は各照射条件での光エネルギーに負の対数相関を示した。低出力照射+通常出力追加照射では通常出力照射に近い溶出量であったが低出力照射では溶出量が多かった。本研究で検出された未重合モノマーはレジン重合体の網目構造内に存在していたため溶出試験前のレジンの機械的強度にあまり影響を与えなかったと考えられる。従って溶出試験後の試料の機械的強度について追加実験が必要であると思われる。
脳を育てるうつ病治療:中枢-末梢両面からの脳神経回路網修復促進機構の解明

うつ病治療の新たな試みとして、神経新生促進因子の中枢⇔末梢両面からの活用を目指し、神経幹細胞およびBDNFの末梢から脳内への移行を検討した。また、抗うつ薬によりヒト血小板からのBDNF遊離は促進されるが、その反応には個人差があり、抗うつ薬の種類でも異なることから、薬物治療反応性の予測に有用である可能性が示唆された。更に、治癒メカニズムに関与する遺伝子として、rhotekinおよびPrg1が神経幹細胞から神経細胞への分化過程や神経細胞の維持等に重要な役割を担っている可能性が示唆された。本研究においては、神経新生促進因子を中枢⇔末梢両面からに治療的に活用するという発想に基づいて、障害された脳神経回路網の修復・再構築に寄与する因子の抽出を試み、まず初めにBDNFの神経新生促進作用に関する検討を進めてきた。BDNFは脳内のみならず末梢血にも存在し、その多くが血小板で貯蔵、放出されることから、抗うつ薬を処置した際の血小板からの遊離能に関する検討を行った。成体健常ラットから採取した血小板にSSRI, SNRI等の抗うつ薬を添加することにより血小板からのBDNF遊離が促進されるが、モデル動物においては血小板からのBDNF遊離の低下が認められた。また、末梢血中のBDNFが脳内へ移行し作用している可能性が指摘されており、治療的応用も期待されるところから、末梢から中枢への影響に関する検索を進めた。昨年度の研究において末梢BDNF投与後の脳内移行に関する検討を行い、末梢BDNF-FITC投与24時間後にラット海馬歯状回にBDNF-FITCの集積を認めたが、今年度は更なる治療的試みに向けて、神経幹細胞の末梢からの脳内移行に関する検討を加えた。免疫原生が極めて低く成体適合性が高いバイオマテリアルであり、近年核酸医薬デリバリーシステム等においてその汎用性および安全性から担体としての臨床応用が期待されているアテロコラーゲンに着目し、神経幹細胞移植の際のより効率的な脳へのデリバリーシステムとして有用であることが示唆された。さらに、抗うつ薬の慢性投与後にマウス海馬で発現変化するPlasticity related gene 1(Prg1)について、海馬における発現分布を検討し、海馬歯状回の顆粒細胞での発現および神経細胞のマーカーであるNeuNと共局在を確認した。昨年度の検討で、成体健常ラットおよびうつ病モデルラットにおいて、抗うつ薬により血小板からのBDNF遊離が促進されて末梢血中のBDNFが増加することを明らかにしたが、同様の検討を健常者およびうつ病患者の血液サンプルを用いて行った。ヒト血小板を用いた検討では、血小板からのBDNF遊離反応は抗うつ薬の種類により異なり、その反応性には個体差が認められた。既に特定の抗うつ薬に対する治療反応性を認めた患者の血小板を用いた後方視的検討では、薬物反応性が血小板BDNF遊離反応と相関する可能性が示唆された。よって、うつ病患者に対する薬物療法の開始前に血小板BDNF遊離機能を測定することによって最も効果的な抗うつ薬が予測できるようになることも期待され、対象者を増やした前方視的な検討が有用と考えられた。さらに、これまでの検討で、抗うつ薬の慢性投与後にマウス海馬での発現変化を認め、神経細胞の生存維持に重要と考えられたPlasticity related gene 1 (Prg1)について、機能解析を進めた。神経細胞へのPrg1 siRNAトランスフェクションによりPrg1の発現を抑制すると神経細胞の生存率が有意に減少した。このsiRNAの標的にならないPrg1-4Sを共発現させるとこの減少は消失したが、siRNAの標的にならず、かつ235番目のアミノ酸をヒスチジンからアラニンに置換したPrg-4S-H253Aを共発現させると、消失はみられなかった。このヒスチジンは脂質の脱リン酸化に重要であるとの報告があり、Prg1の神経細胞生存維持作用に脱リン酸化活性が関与することが示唆された。これらの成果より、神経新生を促進する因子に活性化が抗うつ効果につながることが考えられ、また、抗うつ薬刺激による末梢因子評価の活用から治療反応性の予測・適切な治療法の選択等の臨床応用へ結びつける有望な手がかりが得られた。我々はこれまでに抗うつ薬が脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor:BDNF)を介して神経新生促進に働いている可能性を示し、内在性神経幹細胞の活性化を介した神経回路網の修復・再生を目指した治療に関する研究を進めてきた。BDNFは脳内のみならず末梢血にも存在し、その多くが血小板で貯蔵、放出される。抗うつ薬により血小板からのBDNF遊離が促進されて末梢血中のBDNFが増加することを既に報告しているが、BDNFは血液脳関門を通過し、その血中濃度は脳内濃度を反映することが推察されている。

末梢血中のBDNFが脳内へ移行し作用している可能性が指摘されており、その治療的応用も期待されるが、末梢BDNF変化が脳に与える影響およびその具体的作用機序は未だ不明である。本研究では、BDNFが中枢ー末梢双方向で果たす役割を解明するため、蛍光標識したBDNF(BDNF-FITC)を用いて、末梢BDNF投与後の脳内移行に関する検討を行った。末梢BDNF-FITC投与24時間後にラット海馬歯状回にBDNF-FITCの集積が認められ、一部は神経細胞の形態を有していた。さらに、神経新生促進時の中枢における変化を分子レベルで把握する試みとして、抗うつ薬長期投与によりラット脳内で発現量が特異的に変化する遺伝子をスポットしたADRG(antidepressant related gene)microarrayを用いて、神経幹細胞分化時に選択的に発現変化する遺伝子の網羅的スクリーニングを行い、rhotekinの発現が変動していることを見出した。Rhotekinの産生は神経幹細胞と神経細胞で認められた。この産生量は神経分化に伴い有意に増加し、rhotekinが神経幹細胞から成熟神経細胞へ分化する過程の重要な調節因子であることが示唆された。神経新生促進因子の中枢ー末梢両面からの活用による神経回路網修復促進機構の解明を図るため、今年度はこれまでの研究により抗うつ薬による神経新生促進因子として抽出したBDNF等の因子について、抗うつ薬を処置した際の血小板からの遊離能に関する検討を開始した。成体健常ラットから採取した血小板にSSRI, SNRI等の抗うつ薬を添加することにより血小板からのBDNF遊離が促進されるが、同様の方法でモデル動物の血小板からのBDNF遊離が低下することに関して、各種抗うつ薬による比較検討を進めている。さらに、近年ドラッグデリバリーシステム等において担体としての臨床応用が期待されているアテロコラーゲンに着目し、神経幹細胞の末梢からのより効率的な脳へのデリバリーシステムとして、アテロコラーゲンが有用であることが示唆された。これは神経幹細胞を用いた再生医療的アプローチにおいて具体的な臨床応用に結びつくことが期待される有益な結果であると考えられ、この点においては当初の予定以上の進展といえる。また、神経新生促進時の中枢における変化を分子レベルで把握する試みを続け、神経細胞の生存維持に働く因子として新たにPlasticity related gene 1(Prg1)の重要性が示唆された。現在、その役割について、Wistarラット(E14)の終脳より単離しニューロスフェア法により増殖させた神経幹細胞をbFGF除去により分化させて作成した神経細胞を用いて、更なる検討を進めており、順調に進展している。本研究は、BDNFをはじめとする神経新生促進因子の中枢ー末梢両面からの活用による神経回路網修復促進機構の解明を図ることを目的としている。まず、BDNFが中枢ー末梢双方向で果たす役割を明らかにするため、末梢から蛍光標識したBDNF(BDNF-FITC)を経静脈的に投与し、その後の脳内移行を検索することを計画し、良い結果が得られている。すなわち、末梢BDNF投与24時間後にラット海馬歯状回にBDNF-FITCの集積が認められ、一部は神経細胞の形態を有していたことから、投与BDNF-FITCが脳内へ移行し、内在性神経幹細胞の活性化促進に影響を与えたことが示唆された。
高齢運転者の運転断念に向けての評価法と社会的受容性に関する研究

本研究では、高齢ドライバの運転断念に着目し、そのなかでも軽度認知障害と運転能力の関係を確立することを第1の目標とした。また、運転断念は、その人の生活や地域に大きな影響を持つため、断念後の生活のあり方について、自治体・地域と共同でケーススタディを行い、今後の日本各地で想定されることへのモデルケースを構築することを第2の目標とした。(1)福井と柏の自動車教習所で約2000件のドライブレコーダで記録した映像・会話データを分析し、高齢ドライバが不安全な運転行動を起こす要因が、加齢による身体・認知機能の低下と不安全行動の抑制力の低下であることを明らかにした。また、高齢者向け教育イベントを福井、柏にて実施し、高齢者の不安全行動に対する自覚を促す自己運転自覚教育システムの開発し、さらに通常の教育方法を比較した結果、開発した教育システムの有効性が示された。(2)高齢運転者の運転能力を簡単に計測可能なPCシミュレータ(運転能力評価システム)を約100名の高齢者へ適用し、運転能力を評価する指標を開発した。また、開発したシステムを用いて高齢運転者約20名で実験を行い、運転能力評価システムと運転能力の間には、個人差があるものの特徴的な操作があることを確認した。(3)福井と柏で実施したアンケート、グループインタビューの結果、運転断念に関する意識を分析し、運転断念後のモビリティ確保に向けた課題と超小型自動車の導入可能性についての提案を行った。高齢運転者の増加による事故多発の懸念があり、警察庁では高齢者講習や認知機能検査の導入などの対策を行なっている。しかし、車無しの生活が成り立たない地域もあり、運転断念の時期および断念後の生活設計をどうするかが重大な関心事である。本研究では、先行研究で得られたことをもとに、いくつかの対象地域で、長期間かつ多数のデータ収集及び解析を実施し、加齢や認知障害による運転能力の低下を検討し、運転断念の時期を明らかにし、断念後の生活をどうするかについて検討していく。平成20年度は、まず、既存システムの課題と改良と称して、運転シミュレータの改造を行い、またデータ収集・解析法の検討を行なった。前者の改造については、被験者の酔いを無くすためにヨー方向の運動を模擬するターンテーブルを運転シミュレータに付加した。また後者については、映像記録システムを後の解析がしやすくなるように新たに組みなおした。次に、データ解析手法および特性等の定量化手法の検討と称して、映像データの解析法および特性の簡易検査をPCで行なうシステムの改良を行なった。これにより、簡易PCシミュレータによる特性評価は、定量化がしやすくなった。次の項目としてはデータの収集と評価で、群馬県みどり市、福井県福井市、千葉県柏市の自治体や自動車教習所の協力により、教習車にドライブレコーダを取り付け、高齢者講習におけるデータ収集を継続的に行なっている。また、運転シミュレータを現地に持ち込んでの実験は、千葉県柏市で約20名の高齢者を集めて実施した。簡易PCシミュレータについては群馬県草津町の健康診断に持ち込み、約100名のデータを収集した。もう一つの項目としては、運転断念後の生活基盤の予備的検討と称して、福井県の複数の地域で、大規模アンケートを実施した。これは2年目に実施予定であったが、前記の運転シミュレータの改良の一部が遅れて21年度に繰り越してなされたため、前倒しで実施したものである。約1500名のデータを回収して、解析を行なっている。

平成21年度は、前年に引き続き、群馬県みどり市(途中で教習所の廃業により中止)、福井県福井市、千葉県柏市の自治体や自動車教習所の協力により、高齢者講習における実車運転時のデータ収集を継続的に行った。それを用いて、高齢者の運転特性の分類を行い、また適性試験や反応速度などの出データと運転特性の関連を考察した。次の項目としては、これまで改良を加えてきた簡易PCシミュレータを、福井県敦賀市の敦賀温泉病院のご協力で、物忘れ外来患者を対象にデータの収集を行った。それの分析から、認知症による能力低下が全般的に見られるものの、個々のケースごとに低下する内容が異なることが示され、認知症の問題の難しさがあらためて理解された。もう一つの項目としては、前年度実施した福井県福井市・坂井市での大規模アンケートの分析を行いつつ、さらに詳細の情報を得るため、5つの地区で10名程度ずつのグループインタビューを実施し、日々の生活の状況や運転に関する不安等についての意見徴集を行った。地方地域での車依存の姿があらためて確認できた。さらに、福井県と対比をする意味で、千葉県柏市においても同様な大規模アンケートを実施した。住民基本台帳による無作為サンプリングをする関係から、市との調整が必要となり、実施が年度を越えて繰り越し対応となってしまったが、7月までに実施し、約1300名のデータを回収して解析を行っている。本申請では、高齢ドライバの運転断念に着目し、そのなかでも軽度認知障害と運転能力の関係を確立することを第1の目標とした。また、運転断念は、その人の生活や地域に大きな影響を持つため、断念後の生活のあり方について、自治体・地域と共同でケーススタディを行い、今後の日本各地で想定されることへのモデルケースを構築することを第2の目標とした。(1)各地域における高齢運転者のデータ収集と解析福井と柏の自動車教習所で約2000件のドライビングレコーダで記録した映像・会話データを分析し、高齢ドライバが不安全な運転行動を起こす要因が、加齢による身体・認知機能の低下と不安全行動の抑制力の低下であることを明らかにした。また、注意バランスに関連する認知機能の低下は、意図せずに起こした不安全行動である「信号や標識の見落とし」の要因の一つであることを明らかにした。さらに、高齢者向け教育イベントを福井、柏にて実施し、高齢者の不安全行動に対する自覚を促す自己運転自覚教育システムの開発と通常の教育方法とを比較した結果、開発した教育システムの有効性が示された。さらに、道交法の改正により導入された高齢者講習の認知機能検査の数件の結果の分析を行った。(2)高齢運転者の特性や能力を評価できる手法の適用運転能力を簡単に計測可能なPCシミュレータを約100名の高齢者へ適用し、運転能力を評価する指標を開発した。また、認知症高齢者や認知障害のある高齢者約20名へ適用し、認知症の症状と運転能力の間には個人差があるものの、運転能力の一部が著しく低下する可能性があることを明らかにした。(3)アンケート調査等により、地域の移動手段についての検討福井と柏で実施したアンケート・グループインタビューの結果、運転断念に関する意識を分析し、また、運転断念後のモビリティ確保に向けた課題と超小型自動車の導入可能性についての提案を行った。
3次元マルチスケール・モデリングに基づく粒状材料のマクロ構成関係の推定

平成17年度は,平成16年度に開発した解析プログラムを用いて数値実験を多数行い,粒状材料のマクロ構成関係の推定を行った.本研究の主たる目的は,粒状材料のマクロ構成関係をマルチスケール解析に基づき評価・推定することである.マルチスケール法に基づく3次元ミクロ解析を用いて,塑性論をベースとする構成モデルの主要な要素である,流動則・負荷面(降伏面)・破壊基準などについて数値実験を行い考察した.さらに,現時点での構成モデルでは表現することの難しい主応力軸回転を受ける粒状材料の変形挙動について考察した.流動則については,p-q面内においては古典的塑性論で仮定されている非関連流動則がほぼ成立するが,π平面においては塑性ひずみ増分方向が一定では無く古典的な流動則の仮定が成り立たないことがわかった.π平面内においては塑性ひずみ増分の増分非線形性が非常に強く表れる.また,負荷面・降伏面に関してはp-q面内において角点が存在する可能性が高いことが数値実験の結果から確認された.破壊基準面については,従来の塑性理論で仮定されている形状にかなり近い形状になった.さらに,応力主軸回転時の粒状材料の変形特性については,粒状材料内部の微視的な構造異方性に大きく依存することなどがわかった。平成16年度は,主に,解析プログラムの開発を行った.均質化理論に基づく粒状体マルチスケール解析法のミクロ問題を3次元に拡張した.マクロ解析は平面ひずみ問題を仮定した有限要素法を用い,ミクロ解析には3次元粒状要素法を用いている.まず,解析手法の定式化を行い,プログラムを開発した.開発したプログラムの性能を評価するための数値解析を行い,実験結果などとの比較によりその有用性を検討した.その結果,十分に実現象を再現でき,粒状材料の巨視的な力学応答を評価するのに有効な手法であることがわかった.本研究の主たる目的は,粒状材料のマクロ構成関係をマルチスケール解析により評価・推定することである.本年度は,マルチスケール解析の3次元ミクロ解析を用いて,流動則・降伏面・破壊基準について数値実験を行い若干の考察を行った.流動則については,p-q面内においては古典的塑性論で仮定されている非関連流動則がほぼ成立するが,π平面においては塑性ひずみ増分方向が一定では無く流動則の仮定が成り立たないことがわかった.π平面内においては塑性ひずみ増分の増分非線形性が非常に強く表れる.また,降伏面に関してはp-q面内において角点が存在する可能性が高いことが数値実験の結果からわかった.破壊基準面については,従来の塑性理論で仮定されている形状にかなり近い形状になった.さらに,応力主軸回転時の粒状材料の変形特性についても検討した.平成17年度は,平成16年度に開発した解析プログラムを用いて数値実験を多数行い,粒状材料のマクロ構成関係の推定を行った.本研究の主たる目的は,粒状材料のマクロ構成関係をマルチスケール解析に基づき評価・推定することである.マルチスケール法に基づく3次元ミクロ解析を用いて,塑性論をベースとする構成モデルの主要な要素である,流動則・負荷面(降伏面)・破壊基準などについて数値実験を行い考察した.さらに,現時点での構成モデルでは表現することの難しい主応力軸回転を受ける粒状材料の変形挙動について考察した.流動則については,p-q面内においては古典的塑性論で仮定されている非関連流動則がほぼ成立するが,π平面においては塑性ひずみ増分方向が一定では無く古典的な流動則の仮定が成り立たないことがわかった.π平面内においては塑性ひずみ増分の増分非線形性が非常に強く表れる.また,負荷面・降伏面に関してはp-q面内において角点が存在する可能性が高いことが数値実験の結果から確認された.破壊基準面については,従来の塑性理論で仮定されている形状にかなり近い形状になった.さらに,応力主軸回転時の粒状材料の変形特性については,粒状材料内部の微視的な構造異方性に大きく依存することなどがわかった。
フォトフォレーシスによる制御性Ｔ細胞の誘導

血球分離および光増感剤を用いないフォトフェレーシスの開発とフォトフォレーシスによるアレルギー・免疫疾患治療を対象にした効率的な制御性T細胞(Treg)の誘導の基盤技術の開発を目的とする。フォトフェレーシスの普及を阻害している要因として、血球分離が必要なこと、光増感剤を使用することなどが挙げられる。深紫外LEDやフォトニック結晶ファイバーという最先端の光学技術を駆使し、血球分離および光感作物質を必要としないシステムの構築を進める。フォトニック結晶ファイバーの最適化、分光分布、放射照度、照射量などの照射方法の最適化、フォトフェレーシスのメカニズム、動物実験による効果の検証を行う。
溶射皮膜におけるセラミックスー金属界面の最適形態の研究

セラミックス溶射皮膜の応用進展を阻害している低密着性の解明、ならびにその改良指針を明かにした。溶射皮膜の密着機構の発現要因は、(1)機械的な噛み合い結合力、(2)化学的な反応による界面での新しい化合物の形成、(3)溶射物質の基材への拡散、(4)ファンデルワールス力、等が考えられるが、溶融液滴の凝固速度の速さ、及び界面をグリット・ブラステイングを用いた粗面化による強度の向上等から、殆どが(1)であると推察される。これまでは、皮膜の密着強度がセラミックスー金属界面の表面粗さのみによって議論されてきた。しかし、表面粗さがある程度以上に増加すると強度が低下する実験結果にたいする説明が困難であった。本研究において、ブラステイング処理を施した界面の異なるスケールのSEM観察から、界面の微視的形態が自己相似性を持つことを推察し、画像処理を用いて界面のフラクタル次元を測定した結果、ブラスト処理面は明瞭なフラクタル次元を有すること確認した。さらに、フラクタル次元と皮膜の密着強度は比例関係にあり、フラクタル次元は表面粗さとは独立な界面形態の物理量であること確認した。さらに、表面粗さが大きすぎる場合の密着強度の低下は、フラクタル次元の低下によって引き起こされたものである結果を得た。それゆえ、セラミックス溶射皮膜の密着強度は界面の表面粗さよりはフラクタル次元によって評価するのが適当であり、機械的な噛み合い結合力によって発現する密着性の向上には高いフラクタル次元の界面創成が有効である結果を得た。
ＴＤＰ－４３コンフォメーション特異的なＰＥＴプローブの探索研究

筋萎縮側索硬化症(ALS)・前頭側頭型変性症(FTLD)患者の脳内に沈着したTDP-43凝集体に結合する化合物を見出すことをことができれば、それらをポジトロン放出核種で標識し、TDP-43病変を非侵襲的に計測することができる。TDP-43病変の非侵襲的な計測法は、アルツハイマー病で活用されているアミロイドイメージングのように、ALS・FTLDの早期診断や薬効評価系に有効活用することができると考えられる。今年度は、前年度剖検脳をスクリーニングして選定したTDP-43病変を高度に含むFTLD患者の脳切片を用いて研究室が保有する化合物ライブラリーを用いた蛍光染色およびI-125、ポジトロン標識(F-18)化合物を用いたIn vitroオートラジオグラフィーを実施した。蛍光染色では、TDP-43病変を明瞭に染色される化合物は見いだせなかった。その一方で、I-125およびポジトロン標識(F-18)化合物を用いたIn vitroオートラジオグラフィーでは、TDP-43病変が高度に含まれているFTLD患者切片において集積を示す化合物を見いだすことができた。また、その化合物の体内動態評価を行ったところ高い脳移行性を有し、その後のクリアランスも良好であった。この化合物はアミロイド/タウを含むAD脳切片においても集積を示し、今後さらなる最適化が必要である。以上のことから、TDP-43病変に対して高い選択性は有してはいないが、オートラジオグラフィーで集積が認められるレベルの結合性を持つ化合物が見いだせた。今後は、この化合物をリード化合物としてさらなる最適化を進めることで、TDP-43病変の非侵襲的な計測系の開発を目指す。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。TDP-43病変の非侵襲的な計測法は、アルツハイマー病で活用されているアミロイドイメージングのように、ALS・FTDの早期診断や薬効評価系に有効活用することができると考えられる。今年度は、ALSおよびFTLD患者の脊髄/脳切片からTDP-43病変のスクリーニングを行い、サブタイプ分けしたTDP-43病変を含む標本に対して化合物ライブラリーの化合物のTDP-43病変の結合性を検討した。TDP-43病変を含む標本に対して、アミロイド構造に結合する染色剤であるチオフラビン-Sで陽性になるかを検討した。その結果、チオフラビン-S染色ではTDP-43病変は描出されなかった。さらに、アミロイドPETトレーサーであるPiB、タウトレーサーであるTHK化合物のオートラジオグラフィーを実施した。その結果、両トレーサーはTDP-43病変の沈着領域への集積は認めらなかった。今後、TDP-43に結合する化合物のスクリーニングを実施していく予定である。本年度は、TDP-43病変の探索により、TDP-43病変のサブタイプ分けおよびそれらを含む標本を得ることができ、それらを用いた結合評価系を構築することができた。さらに、その評価系を用いてアミロイドトレーサー、タウトレーサーなどいくつかの化合物に関して、TDP-43病変への結合性を評価することができた点から、研究はおおむね順調に進展していると考えている。今年度に構築したTDP-43病変への結合評価系を駆使して、研究室のライブラリーにある化合物を評価していく予定である。

TDP-43病変の結合性を有している化合物を同定することができれば、併せて化合物の脳内移行性を検討する。さらに、その化合物を元に化合物の構造最適化を進める予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
情報通信ネットワークに関する性能評価モデルの総合的研究

今年度は、第2回シンポジウムを平成7年1月23日25日の間に幕張で開催し、大学の研究者52名、企業の研究者19名および学生36名が参加し、45件の論文が発表された。論文内容は、情報システム、通信ネットワーク、生産システムなど幅広い応用を含み、待ち行列理論による基礎的モデルからシミュレーションによる具体的なモデル分析までについて活発な討論が行なわれた。なお、第1回シンポジウムから6件の論文が、性能評価の学術雑誌として世界的権威のあるPerformance Evaluation誌の1995年8月号に掲載されることが決まった。月例研究会は9回開催され、ATM(非同期転送モード)ネットワークにおける制御、生産工程に於けるジョブショップ制御、集積法による超並列計算機、通信におけるトラヒック推定、ペトリネットによる性能評価、応答性能に対する最適化目標、などのモデルについて発表・討論が行なわれた。なお、情報ネットワークに関する性能評価モデルの論文のデータベース化は、入力データが不十分なため今後データを蓄積しながら整理・分析を継続していくこととする。補助金が交付されてきた約1年半の期間は、シンポジウム2回および月例研究会13回の開催に重点を置いて活動してきた。シンポジウムには延べ186名の参加があり、また月例研究会には1回当り平均20数名の参加があった。本研究は、計算機や通信ネットワークに関する性能評価研究に従事している大学や企業の研究者に、情報交換や研究討論のための学会横断的な機会と場を提供し、国外に対しても研究状況に関する情報を発信でき、所期の目的を達成できたと考える。今後は、情報通信ネットワークの複合化・大規模化の傾向に対応して新たな性能評価の研究が一層必要となるため、関連分野の研究者からなるこのような学際的研究グループでの総合研究を継続することが望まれる。補助金交付の内定があったのが11月初旬であったため,研究分担者の間の共同研究や本補助金による研究推進は殆ど不可能であった.したがって,本テーマのもとでのシンポジウムを開催することに重点を置いた.幸い補助金交付の有無に関わりなく,関係する有志が集まって研究討論を実施することを予定していたため,急遽それを本テーマのシンポジウムとすることにより参加者への周知や準備を円滑に行なうことが出来た.シンポジウムは,平成6年1月19日21日に箱根で開催され,大学の研究者41名,企業の研究者14名,学生24名が参加し,36件の研究発表が行なわれた.内容は,広帯域ISDNにおける新しい性能評価問題,LAN等での多重アクセス制御,情報ネットワークのリスクマネジメント,情報ネットワークの輻輳制御,情報ネットワークにおける拡散過程,性能評価に有効な新しい待ち行列モデル,などの研究成果が発表され熱心な討論が行なわれた.これらの研究成果の雑誌等への発表は,来年度以降に予定される.月例研究会としては,情報通信ネットワークの性能評価モデルの討論を11月から月1回のペースで実施した.内容としては,毎回20名30名の参加があり,交換機の輻輳制御,電話呼の再呼現象,JIT生産システム,複数サーバー待ち行列の近似,などが討論された.なお,今年度購入したパーソナル・コンピュータは,最近発表された情報ネットワークの性能評価モデルに関する論文をデータベース化するためのツールとしてデータ入力を開始したところであり,時間的制約からモデルや問題点の整理・分析は来年度に行なう予定である.今年度は、第2回シンポジウムを平成7年1月23日25日の間に幕張で開催し、大学の研究者52名、企業の研究者19名および学生36名が参加し、45件の論文が発表された。論文内容は、情報システム通信ネットワーク、生産システムなどに幅広い応用を含み、待ち行列理論による基礎的モデルからシミュレーションによる具体的なモデル分析までについて活発な討論が行なわれた。

なお、第1回シンポジウムから6件の論文が、性能評価の学術雑誌として世界的権威のあるPerformance Evaluation誌の1995年8月号に掲載されることが決まった。月例研究会は9回開催され、ATM(非同期転送モード)ネットワークにおける制御、生産工程に於けるジョブショップ制御、集積法による超並列計算機、通信におけるトラヒック推定、ペトリネットによる性能評価、応答性能に対する最適化目標、などのモデルについて発表・討論が行なわれた。なお、情報ネットワークに関する性能評価モデルの論文のデータベース化は、入力データが不十分なため今後データを蓄積しながら整理・分析を継続していくこととする。補助金が交付されてきた約1年半の期間は、シンポジウム2回および月例研究会13回の開催に重点を置いて活動してきた。シンポジウムには延べ186名の参加があり、また月例研究会には1回当り平均20数名の参加があった。本研究は、計算機や通信ネットワークに関する性能評価研究に従事している大学や企業の研究者に、情報交換や研究討論のための学会横断的な機会と場を提供し、国外に対しても研究状況に関する情報を発信でき、所期の目的を達成できたと考える。今後は、情報通信ネットワークの複合化・大規模化の傾向に対応して新たな性能評価の研究が一層必要となるため、関連分野の研究者からなるこのような学際的研究グループでの総合研究を継続することが望まれる。
RANKLとTNFの細胞膜からの遊離調節機構の解明

RANKLは骨芽細胞膜上で発現するTNFファミリーのサイトカインであり、破骨細胞の分化と機能の活性化を促進する作用を有する。OPG欠損マウスとヒトOPG欠損である若年性骨バジェット病では血中RANKL値が高い。これは、OPGが直接膜型RANKLの切断を調節する可能性を示す。また、活性化T細胞等が産生する可溶型RANKLが自己免疫疾患、癌、歯周病などの全身性および局所性の骨吸収に関与すると示唆される。そこで、平成18年度の科学研究補助金により、(1)可溶型RANKLの組織由来、(2)活性型ビタミンD_3投与による可溶型RANKL産生の調節、(3)OPG、可溶型RANKおよび近縁のTNF受容体ファミリーメンバーの可溶型RANKL産生に対する抑制作用、を解析した。そして以下の研究成果を得た。(1)OPG欠損マウスに活性型ビタミンD_3を投与すると血中RANKL値は著しく上昇した。活性型ビタミンD_3は骨芽細胞のRANKL発現を誘導したが、T細胞のそれを誘導しなかった。さらに、OPGとT細胞の二重欠損マウスを作製し解析したところ、OPG欠損マウスの血中RANKL値の亢進にT細胞が関与していないことが示された。これらの結果より可溶型RANKLはおもに骨芽細胞由来であることがわかった。(2)OPGおよび可溶型RANKは骨芽細胞および活性化T細胞の可溶型RANKL産生を抑制した。一方、OPG近縁のTNF受容体ファミリーメンバー(DR6,DcR3)は、可溶型RANKL産生を抑制しなかった。(3)活性化T細胞はOPG産生がないために可溶型RANKLを過剰に産生できると示唆された。本研究でOPGに、膜型RANKL切断の強力な抑制作用という新たな生理活性を見出した(Nakamichi Y et al.:J Immunol 178:192,2007)。RANKLはII型膜タンパクであるが、プロテアーゼにより切断され可溶型RANKL (sRANKL)として血中を循環する。TNFもまたII型膜タンパクであるが、TACEにより切断され可溶型として存在する。OPG欠損マウスとヒトOPG欠損の患者では血中sRANKL値が高い。この結果は、OPGが直接RANKL切断を調節する可能性を示す。また、活性化T細胞が産生するsRANKLが自己免疫疾患、癌、歯周病などの全身性および局所性の骨吸収に関与すると示唆される。そこで、1.OPG欠損マウスで高値を示すsRANKLの組織由来、2.OPG欠損マウスへの活性型ビタミンD_3投与によるsRANKL値の変化、3.OPG、可溶型RANKおよび近縁のTNF受容体ファミリーメンバーのsRANKL産生に対する抑制作用、を解析した。[結果]1.OPG欠損マウスに活性型ビタミンD_3を投与すると血中sRANKL値は著しく上昇した。活性型ビタミンD_3は骨芽細胞のRANKL mRNA発現を誘導したが、T細胞のそれを誘導しなかった。この結果よりOPG欠損マウスで高値を示すsRANKLは骨芽細胞由来であることがわかった。2.OPGおよびsRANKは骨芽細胞および活性化T細胞のsRANKL産生を抑制した。一方、OPG近縁のTNF受容体ファミリーメンバーは、sRANKL産生を抑制しなかった。3.活性化T細胞はRANKLを高発現したがOPGを発現しなかった。活性化T細胞はOPG産生がないためにsRANKLを過剰に産生できると示唆された。本研究でOPGに、膜型RANKL切断の強力な抑制作用という新たな生理活性を見出した。以上の結果はjournal of immunology誌とBone誌に投稿し、現在revise中である。

一方、OPG近縁のTNF受容体ファミリーメンバー(DR6,DcR3)は、可溶型RANKL産生を抑制しなかった。(3)活性化T細胞はOPG産生がないために可溶型RANKLを過剰に産生できると示唆された。本研究でOPGに、膜型RANKL切断の強力な抑制作用という新たな生理活性を見出した(Nakamichi Y et al.:J Immunol 178:192,2007)。
腸管内分泌K細胞GIP合成分泌における細胞内シグナル伝達機構の解明

これまでにSTC-1を用いたmTOR抑制および促進の実験系の報告はまだ少なく、実験条件の設定に時間を要している。また、GIPは42アミノ酸残基からなるポリペプチドであり、western blot法にての検出条件も検討が必要な状況である引き続きin vitroの実験系の確立を継続し、mTOR系によるGIP合成の調節が確認されなかった場合にもGIP合成分泌に関わる既往因子の解析を進める。初年度はマウス腸管内分泌腫瘍株STC-1を用いてmTOR系を抑制条件または促進条件にした際のGIP合成・分泌の評価を開始した。STC-1細胞を、既報を参考にmTOR阻害剤rapamycinを0.625-10nmol/lにて添加した培地で24時間の培養後に、細胞タンパクを回収しwestern blot法にてGIP合成を評価した。Rapamycin 0.625nmol/lの添加にて、24時間後のphospho-S6は抑制されていることからmTOR系の抑制を確認したが、GIP発現量に一定した結果を得られず実験条件や使用する抗体の選定を行っている。
トランスジェニックマウスを用いた癌転移の分子機構の解析

遺伝子再構成により活性化されたRETがん遺伝子導入トランスジェニックマウスに発生した色素性腫瘍の悪性化に伴って発現異常を示す遺伝子の解析を行った。まず良性段階の腫瘍と悪性化した腫瘍(悪性黒色腫)よりRNAを精製し、種々のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-9,MT1-MMP)およびそのインヒビター(TIMP-1,TIMP-2)の発現をノーザンブロット法にて検索した。これらの遺伝子のうち悪性化に伴って、MMP-9遺伝子の著しい発現増強とTIMP-2遺伝子の発現低下が生じることが判明した。この結果はin situ hybridization法および腫瘍の細胞抽出物を用いたウェスタンブロット法によっても確認できた。われわれは腫瘍の悪性化に伴って、RETがん遺伝子産物の発現増加とその下流因子であるMAPキナーゼの発現増加が生じることを証明したので、今回明らかにしたMMP-9とTIMP-2遺伝子の発現異常はRETの高発現に伴ったシグナル伝達異常によって誘導された可能性が考えられる。本研究ではさらに多発性内分泌腫瘍症(MEN)2A型変異を有するRET遺伝子導入トランスジェニックマウスを作製した。このマウスでは甲状腺髄様癌が必発するとともに、約半数に唾液腺癌、乳癌が発生し、甲状腺癌では転移を生じないが乳癌では高率に肺に転移を生じることが判明した。よってこのトランスジェニックマウスを用いて転移関連遺伝子の検索が可能になると考えられる。われわれは遺伝子再構成により活性化されたretがん遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製し、メラニン産生細胞の増殖を生じる3系統を確立している。興味あることにこのうち1系統のマウスでは加齢とともに増殖した細胞が徐々に悪性化し、最終的に悪性黒色腫となり他の臓器に転移するようになる。本研究ではこのトランスジェニックマウスに発生するメラノサイト腫瘍の悪性化に伴って、変化する蛋白の異常を検索した。まずトランスジェニックマウスに発生した良性腫瘍と悪性腫瘍の細胞抽出物を用いて、ret蛋白の発現とチロシン燐酸化レベルを比較した結果、ともに著しい上昇がみられた。ret蛋白の発現の上昇に伴いmitogen-activated proteinkinase (MAPK)やc-junの活性化が悪性腫瘍で検出された。同様にゼラチンザイモグラフィーを用いて良性腫瘍と悪性腫瘍におけるmatrix metalloproteinase (MMP)-9の活性を比較したところ、悪性腫瘍において著しくその活性が上昇していることが明かになった。MMP-2についてもMMP-9と比較するとかなり弱いものの活性の上昇が観察された。retがん遺伝子導入トランスジェニックマウスにおいて発生した腫瘍の悪性化に伴いret蛋白自身の発現の上昇が見られ、さらにMARKやc-junさらにMMP-9の活性化が生じていた。この結果はこれらの活性化がいずれもret蛋白によって制御されていることを示唆した。さらにMMP-9の活性化はトランスジェニックマウスに発生した悪性黒色腫の転移能と相関している可能性が考えられる。本年度はRETがん遺伝子導入トランスジェニックマウスに発生した色素性腫瘍の悪性化に伴って発現異常を示す遺伝子の解析を行った。まず良性段階の腫瘍と悪性化した腫瘍(悪性黒色腫)よりRNAを精製し、種々のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-1,MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-9,MTl-MMP)およびそのインヒビター(TIMP-1,TIMP-2)の発現をノーザンブロット法にて検索した。すでにわれわれは腫瘍の悪性化に伴って、RETがん遺伝子産物の発現増加とその下流因子であるMAPキナーゼの発現増加が生じることを報告したが、今回明らかにしたMMP-9とTIMP-

2遺伝子の発現異常はRETの高発現に伴ったシグナル伝達異常によって誘導された可能性が考えられる。つぎにTIMP-2はMMP-2を活性化するMT1-MMPの機能を制御していると想定されているので、MMP-2とMT1-MMP遺伝子の発現をRT-PCR法にて解析したが、良性腫瘍と悪性腫瘍の間で両者の発現変化は特に認めなかった。さらにゼラチンザイモグラフィーにてMMP-2とMMP-9の活性化を調べた結果、悪性腫瘍ではMMP-9のみの活性化が生じていることが明らかになった。よってTIMP-2の発現低下はMMP-9の活性化に何らかの役割を果たしている可能性がある。多発性内分泌腫瘍症(MEN)2A型変異RET遺伝子導入トランスジェニックマウスの作製を行った。コドン634のシステインをアルギニンに変異させたRET遺伝子cDNAをモロニー白血病ウイルスLTRに結合し、マウス受精卵に注入した。その結果、約20コピーの遺伝子が組み込まれたトランスジェニックマウスが確立された。導入遺伝子の発現は脳、唾液腺、心臓、肝臓、精巣に認めた。病理組織学的な解析を行ったところ、このトランスジェニックマウスではすでに4週齢において甲状腺のC細胞過形成あるいは甲状腺髄様癌の発生がみられ、6ケ月齢ですべてに髄様癌の発生を認めた。腫瘍発生に伴って血清カルシトニン値も上昇し、髄様癌を発生したマウスでは3ないし8倍に上昇していた。その他の病理学的変化としては約半数例に唾液腺癌あるいは乳癌の発生を認め、乳癌を有するマウスでは高率に肺転移が存在していた。変異RET蛋白は予想されるように腫瘍細胞内で二畳体が形成され、ShcおよびGrb2アダプター蛋白と複合体を形成していた。一方、脳、心臓、肝臓では変異RET蛋白が高レベルで発現していたが、腫瘍発生は認めなかった。予想に反し、これらの組織では変異RET蛋白の二畳体形成はみられず、そのチロシンリン酸化も有意に上昇していなかった。現在その原因について解析中である。
多様な発想で研究可能なリソースとしての遺伝子改変マーモセット作製法の開発

ヒトの脳機能と疾患を理解する上で霊長類モデルの利点は言を待たないが、多くの研究者が多様な発想で遺伝子改変マーモセットを用いるには経済的・倫理的障壁があり、現実的に困難である。我々は、マーモセットでの遺伝子改変をそれぞれの研究者が利用できるよう開発を試みた。このために以下の3つの基盤的項目について研究開発を進めた。1)安価且つ動物福祉的にもかなった手法でマーモセット受精卵を取得する方法を検討した。廃用個体や死亡個体から取得した卵巣組織を他の施設から分与を受け、これら組織を卵巣除去したヌードマウスの皮下及び腎臓被膜下に移植し、移植片からの卵子の取得に成功した。さらに、これら卵子の成熟培養、体外授精及び顕微授精による受精卵作製の手法についても検討を加え、桑実胚まで発生させる手法を見いだした。2)マーモセットES/iPS細胞をマウス胚に移植する異種動物間キメラ法で、遺伝子改変マーモセット精子を取得する方法の開発を試みた。このためにまず、2種類のマウス(FTB-Tg(Ddx4-Cre)1Dcas/Jと129-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Mrc/J)の遺伝子背景をヌードマウスにした繁殖コロニーを整備した。その結果、異種動物間キメラが可能でかつ精巣形成不全になる受容胚を安定供給できる体制が整備できた。さらに、ラットES細胞をこの胚に導入して、マウス体内でラット精子ができることを確認した。3)生殖細胞に分化するマーモセットES/iPS細胞の樹立をおこなうために、ナイーブ化の培養条件を検討した。理研より入手したマーモセットES細胞をマウスフィーダー上に播種し、ベースになる培地、添加するサプリメント、各種の成長因子、代謝阻害剤等を加えて、その形態と発現する未分化遺伝子プロファイルを検討したが、ナイーブ化した齧歯類ES細胞に近い状態を保つ条件は見いだせなかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、マーモセットでの遺伝子改変を容易でかつ動物福祉的にも問題のない形でおこなう手法を開発することであり、そのために胚盤胞補完法を用いて異種動物の精子をマウスで作出する方法を確立する。また、マーモセット受精卵を安価かつ動物福祉にかなった形で取得するために、卵巣組織をヌードマウスへ移植して、成熟卵子を取得する方法の確立を目指す。本年度の研究により、FTB-Tg(Ddx4-Cre)1Dcas/Jと129-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Mrc/Jを交配して得た精巣形成不全マウス受容胚に、ラットES細胞を移入することで、胚盤胞補完法によりラット精子を取得する手技を確立した。キメラマウス精巣にはラット精子が産生されており、顕微授精によりラット受精卵が取得できた。さらに、マーモセットES/iPS細胞の導入をする細胞性免疫不全の遺伝子背景を持つ受容胚作出マウスコロニーの整備も進んでいるので、この確立した手法を用いてマーモセット精子作出の研究進展を図る。次にマーモセット成熟受精卵をマウスから取得する研究は、日本クレア及び京都大学霊長類研究所より分与を受けた死亡動物から採取した卵巣組織を冷蔵下で移送し、約1-2mm角に細切後卵巣除去したヌードマウスの皮下及び腎臓被膜下に移植した。ホルモン投与により卵子の成熟過程を検討した結果、腎臓被膜下の方が卵巣組織の維持及び卵胞の成熟に適していることが明らかになった。ホルモン投与により認められた移植組織卵胞から採取した卵子は極体を放出しており、顕微授精により受精卵の作出が可能な状態であった。現在、ホルモン投与の期間や量などの条件検討を進めている状態である。本研究の肝である、胚盤胞補完法を用いた異種動物の精子を作出する手法に関しては、精巣形成不全マウス胚にラットES細胞を導入することでラット精子を生産するキメラマウスの作出に成功しており、基本的なプロトコールは完成した。また、2種類のマウスFTB-Tg(Ddx4-Cre)1Dcas/Jと129-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Mrc/Jの遺伝子背景をヌードマウスのものにする繁殖コロニーの整備も進んでいる。さらに、死亡個体からの卵巣組織取得に関しては、日本クレア八百津飼育場以外に、京大霊長類研、実験動物中央研究所などからも組織分与の協力が得られ、マウスでの成熟卵子の連続的な作出が可能になってきた。