hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スキットを活用したタスクに基づく授業の効果と検証

本研究の目的は、スキットを用いてタスクを作成し、言語形式への焦点化を考慮したタスクの開発を試みることである。ICTを利用してブラウザ上やモバイル端末で取り組めるタスクの開発につなげ、次世代型のタスクの作成を視野に入れる。平成30年度はあらためて文献調査をし直し、スキットの特徴やレベルを考慮しながらどのような理解型タスク(Ellis, 2003)を開発できるかを精査した。そして、Willis(1998)に基づいた自然な認知プロセスをベースとしたPrediction tasksやJumblesなどがスキット教材と親和性が高いと判断した。会話が行われている場面や状況を予測することや、どんな順序で対話が行われるかを考えることは、必然的に意味の理解が伴うことになる。これをMain-taskとし、Post-taskでは言語形式にも焦点を当て、さらに同様のタスクを繰り返すことでL2能力の発達につなげる。また、Post-taskにおいて理解型から発信型のタスクへの移行も行うことが可能である。スキット教材は豊富にあるので、学習者のレベルを考慮しながら徐々にタスクの難易度を上げることも十分可能である。LMSの開発は年度末にほぼ終了し、リスニングをベースとした理解型タスクを順次アップする準備が整った。開発したLMSの特徴は、ICT上でしかできないタスクを可能にしたことと、Post-taskでの自立型学習機能を搭載したことで、汎用性の高いLMSとなり今後のタスク開発に更なる可能性を見いだすことができた。学会や研究会などでタスク開発の考え方や方法を示したところ、今まではっきりわからなかった部分がわかったという反応が多かったことは収穫であった。理解型タスクの開発の遅れと、タスクをLMS上にどのようにデザインするかを考えるのに時間がかかり、LMSの開発が遅れてしまった。LMSの初期段階の開発が終了したので、タスクをアップしながら学習者に取り組ませ、フィードバックを基に調整して行く。学習者のログを取りながら、LMSを使った自立学習がどのような効果をもたらすかの検証を行う。本研究の目的は、会話の流れそのものである音声スキットを用いてタスクを作成し、日本人学習者が取り組みやすく、言語形式も考慮したタスクの開発を試みることである。日本の中学・高校の英語教育環境においてはタスクを取り入れた実践はまだ多くなく、作成も容易ではないことから本研究の意義は大きいと考えられる。またICTを利用してブラウザ上やタブレット端末で取り組めるタスクの開発につなげ、次世代型のタスク作成を視野に入れていく。二言語習得の認知プロセスとしてinput→noticing→intake→integration→output (Gass, 1997)が挙げられるが、inputの扱いが少ないと最終的に学習者の口から出てくる意味のある英語(output)ははるかに少なくなると考えられる。そこで本タスクの前にinputとしてスキットを聞かせたりスクリプトを使ったpre-taskを行ったりすることで、良質なoutputが期待できると考えた。またpost-taskでの言語形式に焦点を当てた活動にもスキットは有効活用できる。基礎英語LEADは一連の流れのあるスキットが多かったり登場人物を推理するのが難しかったりするので、タスク化するのが予想より難しいことが分かったため。本研究の目的は、スキットを用いてタスクを作成し、言語形式への焦点化も考慮したタスクの開発を試みることである。また、ICTを利用してブラウザ上やタブレット端末で取り組めるタスクの開発につなげ、次世代型のタスクの作成を視野に入れる。第二言語習得の認知プロセスとしてinput→noticing→intake→integration→output(Gass, 1997)が挙げられるが、inputの量が少ないと最終的に学習者の口から出てくる意味のある英語(output)は、必ずしも期待通りには出てこない可能性がある。日本の学校での英語教育に不足しているものの一つは、多様な音声インプットの量であり、中学生や高校生は教科書に関連するもの以外の英語音声に触れる機会は、学習者が自ら求めない限りほとんどなく、どのように増やすかが課題であると考えられる。本研究では、当初は音声のスキットを使った表出型のタスクを作成する予定であったが、音声を使ったタスクは表出型より理解型のタスクの方がより親和性が高いことから、Shintani(2016)の実践をヒントに、理解型タスク(Ellis, 2003)の開発を中心に試みることにした。平成29年度は、文献調査とWillis(1998)の自然な認知プロセスをベースとしたタスク作成を試み、LMS上で絵や写真を活用し画面上で自由に動かすことで、理解型タスクの一つであるListen-and-do tasksを可能にした。また、post-taskにおいてや自立学習支援として、語彙や言語形式への焦点化を促進するため、タスクで使われた音声のスクリプトをLMS上で有効活用できるようにした。スキットを用いた表出型タスクの作成が予想より遅れたため、文献調査をあらためて行い、理解型を中心としたタスク作成に方向を修正したため。また、LMSの選定にも当初の予定よりも時間がかかった。

そして、Willis(1998)に基づいた自然な認知プロセスをベースとしたPrediction tasksやJumblesなどがスキット教材と親和性が高いと判断した。会話が行われている場面や状況を予測することや、どんな順序で対話が行われるかを考えることは、必然的に意味の理解が伴うことになる。これをMain-taskとし、Post-taskでは言語形式にも焦点を当て、さらに同様のタスクを繰り返すことでL2能力の発達につなげる。また、Post-taskにおいて理解型から発信型のタスクへの移行も行うことが可能である。スキット教材は豊富にあるので、学習者のレベルを考慮しながら徐々にタスクの難易度を上げることも十分可能である。LMSの開発は年度末にほぼ終了し、リスニングをベースとした理解型タスクを順次アップする準備が整った。開発したLMSの特徴は、ICT上でしかできないタスクを可能にしたことと、Post-taskでの自立型学習機能を搭載したことで、汎用性の高いLMSとなり今後のタスク開発に更なる可能性を見いだすことができた。学会や研究会などでタスク開発の考え方や方法を示したところ、今まではっきりわからなかった部分がわかったという反応が多かったことは収穫であった。理解型タスクの開発の遅れと、タスクをLMS上にどのようにデザインするかを考えるのに時間がかかり、LMSの開発が遅れてしまった。音声スキットだけでなく動画も含めてデータベースを探しタスク化を試みる。ブラウザやタブレット・モバイル端末で取り組めるタスク開発の準備を行う。情報収集のための文献調査と学会参加も引き続き行う。音声のみのスキットや映像を含むスキットのデータベースを基に理解型タスクの作成を急ぎ、LMSを活用してブラウザやアプリ上で取り組めるタスク開発を引き続き行う。また、post-taskや自立学習で語彙や言語形式にフォーカスしリハーサルできるよう、LMS上での効果的な機能を開発する。LMSの初期段階の開発が終了したので、タスクをアップしながら学習者に取り組ませ、フィードバックを基に調整して行く。学習者のログを取りながら、LMSを使った自立学習がどのような効果をもたらすかの検証を行う。予定していた学会への参加が出来なくなった。当該年度中に参考図書とLMSのカスタマイズを申請したが、事務手続きの遅れ等で年度をまたいで納品されたため。タスク開発の計画段階で予想以上に時間を要し、ICTを利用したブラウザ上やタブレット端末上で取り組めるLMS・アプリケーションの構想とデザインが遅れたのと、開発したタスクの効果の検証と改善をする期間が必要なため。残りの助成金はLMS・アプリケーションの改良や、学会発表の旅費などに充てる計画である。タスクの材料になるスキットのデータベースの範囲を広げ、文献調査と学会への参加を増やす予定である。
新しい癌転移関連遺伝子mta1のヒト消化器癌における発現の検討と分子生物学的解析

(1)各種消化器癌におけるmta1遺伝子の発現の検討と消化器癌の浸潤転移との関連;食道癌30例、胃癌34例、結腸直腸癌36例を対象とし、癌組織(T)と各々の正常粘膜(N)よりtotal RNAを抽出しRT-PCR法を用いてmta1 mRNAの発現を検討した。発現量の比が、T/N≧2の割合は、食道癌で40.0%、胃癌で38.2%、結腸直腸癌で38.9%であった。食道癌ではT/N≧2群で外膜浸潤陽性症例が有意に多かった。胃癌ではT/N≧2群で、漿膜浸潤陽性症例とリンパ節転移が有意に多く、さらに静脈侵襲が多い傾向にあった。結腸直腸癌ではT/N≧2群で、有意に壁深達度が高く、リンパ節転移が多く、またリンパ管侵襲が多くDukes′stageが進んでいる強い傾向があった。この結果はmta1遺伝子が癌浸潤と関与していることを強く示唆しており、mta1発現の検索は広く消化器癌一般の悪性度を評価する上で有用である可能性があると思われた。(2)mta1蛋白の分子生物学的機能解析;現在、senseおよびantisense mta1 cDNA遺伝子導入実験を行っており、stable cloneの単離が終了した。さらにmta1蛋白の全領域やSH3-binding domainなどをmyc-tagged蛋白として発現させ、細胞内局在の決定やリン酸化の有無、結合蛋白の同定などを行っている。これらにより、mta1蛋白の機能が明かになると思われる。また、mta1 antisense oligonucleotideはin vitroで細胞増殖抑制効果があることが分かり、癌遺伝子治療の標的に成りうる可能性がある。
保険事故招致免責の多角的分析

前年度に故意免責における故意の意義について、日本保険学会で報告したことを受けて今年度は、故意の意義についての論文をまとめあげた。故意免責の根拠は、違法行為に関わる事故招致の助長などの公序良俗に関わる部分と、公序良俗とは関係のない保険者の引受の問題という部分の2つのものがあり、商法641条が規定するのは後者の部分に関わる問題であるという視座から、故意の意義、故意の対象について考察した。特に、故意の対象に関しては、故意行為と損害との間の因果関係としてどの程度のものが必要かという視点が必要であることを明らかにしえたと考えている。これを受けて、今年度はさらに、法人による事故招致、公序良俗に関わる故意免責について検討した。法人による事故招致においては、法人におけるどのような地位にある者が事故招致をした場合に保険者免責とすべきかが問題であるが、これは商法641条の解釈としての問題と約款の解釈および効力の問題に分けられる。いずれも本質的には、保険者の引受という見地から、どの範囲の者の行為を予め免責の対象として考えるかという問題であるが、641条の解釈の問題としては、それが保険契約者または被保険者の行為と評価できなければならないという縛りがかかるため、保険事故の招致という事実行為について、法人組織における誰の行為を法人の行為と評価することができるかという視点も必要となる。これに対して約款の問題としてみれば、書き方さえきちんとしていれば、法人としての行為という問題とは関係なく、免責の範囲を広げることが可能になる.もちろん約款の有効性の問題は残るが消費者保護的要素を除けば基本的には有効と解してよいように思われる。また、公序良俗については、民法90条における公序概念の拡大の流れの中で、故意免責も位置づける必要があるものと思われる。イギリスでは、故意免責が認められているが、これは基本的には公序の問題ではなく、保険者の引受上の問題であるとの理解が一般的である。すなわち、故意の事故招致が起こるかどうかは被保険者の意思に完全に委ねられているから事故発生の予測が不可能であり、保険者は引き受けないということである。さらに、イギリスでは、認められているのは故意免責であり、重過失免責については一般的には特に認められていない。しかし、故意について客観的に理解するか、主観的に理解するかという議論があり、客観的に理解することが多数の認めるところである。故意を客観的に理解するということは、故意に該当するかどうかの限界線上にあるケースは、結果的には、日本では重過失免責の問題に該当することになる。次に、イギリスにおいて故意の内容と結果が食い違った場合の処理であるが、それほど多くの判例はないが、興味深い判例もある。そこでは、故意の行為と結果の因果関係の問題であることが示唆されるような表現がある。つまり、故意行為の結果と評価するだけの関係があるかどうかである。問題は、この因果関係をどのような内容のものとして位置づけることが適切かということではなかろうか。
概日リズム形成における時計タンパク質CRY2のリン酸化依存的な分解制御

CRYタンパク質は、E-boxを介した時計遺伝子の転写活性化を強力に阻害することにより、概日時計の発振において中枢的な役割を果たす。マウスのCRY2は、557番目のセリン残基(Ser557)のリン酸化に依存してプロテアソーム系を介した分解制御を受ける。本研究は、Ser557をAla置換した変異マウス(S557A-CRY2ノックインマウス)を用い、CRY2のSer557リン酸化の時計発振における役割を解明すると共に、CRYをユビキチン化する新規E3リガーゼの同定を目指した。本年度は、Fbxl3ノックアウトマウスとS557A-CRY2ノックインマウスを交配した二重変異マウスを作製してマウス行動リズムへの影響を調べたが、Fbxl3ノックアウトマウスと二重変異マウスとの間に有意な行動リズム周期の差は観察されなかった。一方、FBXL3の相同タンパク質で機能未知のFBXL21に着目し、FBXL21がCRYをユビキチン化してCRYの安定性を制御する可能性を検証した。Fbxl3/Fbxl21ダブルノックアウトマウスではFbxl3ノックアウトマウスが示す周期長の延長が大きく緩和された。重要なことに、一部のダブルノックァウトマウスは、恒暗条件に移してから数週間のうちに行動リズムが消失するという顕著なリズム異常を示した。マウスの行動実験と並行して生化学的な解析を進め、FBXL3はCRYの分解を促進するのに対して、FBXL21はCRYを安定化することを見出した。さらに、FBXL3がプロテアソーム系分解の標的となるユビキチン鎖をCRYに付加するのに対し、FBXL21は異なるユビキチン鎖を付加することを明らかにした。これらの結果から、FBXL3とFBXL21による拮抗的な作用は概日時計が安定な振動を維持するのに必須であると結論づけた。本研究成果を筆頭著者としてまとめ、Cell誌に受理された。Cryptochrome(CRY)タンパク質は、E-boxを介した時計遺伝子の転写活性化を強力に阻害することにより、概日時計の発振において中枢的な役割を果たす。マウスのCRY2タンパク質は、557番目のセリン残基(Ser557)のリン酸化に依存してプロテアソーム系を介した分解制御を受ける。私は、このSer557リン酸化の生理的意義に追るため、Ser557をAla置換した変異マウスを作製した。このS557A-CRY2ノックインマウスを用い、CRY2のSer557リン酸化が個体の行動リズムおよび分子リズムに及ぼす影響を調べた。まず、S557A-CRY2ノックインマウスの輪まわし行動リズムを連続測定し、恒暗条件下における行動リズム周期を解析したところ、変異ホモマウスは野生型マウスに比べて長周期の行動リズムを示した。主観的夜の前半または後半に30分の光パルスを与えたときの光位相シフトには、変異マウスと野生型マウスの間で違いは観察されなかった。次に、一日の様々な時刻でマウスから肝臓を単離し、ウェスタンブロッティング解析によりCRY2,PER2,CLOCK,BMAL1およびCRY1のタンパク質発現リズムを調べた。その結果、変異マウスにおいて、CRY2とその結合パートナーであるPER2のタンパク質量が増加していた。一方、肝臓における時計遺伝子の発現リズムをRT-PCR解析により調べたところ、変異マウスではCry2およびDec1遺伝子の発現量が有意に低下していた。さらに、E-hoxに制御されている時計遺伝子であるDbp・Per1、および時計の下流遺伝子であるCyp51も発現量が低下する傾向が見られた。これらの結果から、CRY2のS557A変異によるCRY2とPER2タンパク質の安定化は、E-boxに制御される遺伝子の転写を抑制し、概日リズムの長周期化をもたらすと考えられた。本研究は、Ser557をAla置換した変異マウス(S557A-CRY2ノックインマウス)を用い、CRY2のSer557リン酸化の時計発振における役割の解明を目的とする。本年度は、細胞時計のリアルタイム-モニタリング系を用いて肝臓時計の分子リズムを可視化し、CRY2のS557A変異による細胞時計への影響を調べた。その結果、変異ホモマウスの肝臓リズムは野生型マウスに比べて1時間以上長い概日リズム周期を示した。さらに、ノックインマウスの肝臓において、CRY2のみならず、その結合パートナーであるPER2タンパク質の核内量が顕著に増加していた。同様に、培養細胞を用いた過剰発現実験より、S557A-CRY2と共発現させたPER2タンパク質は核内量の割合が増加する一方、細胞質のタンパク質量の相対量は減少した。これらの結果より、S557A-CRY2ノックインマウスにおいてはCRY2の存在量が増加することにより、CRY2-PER2複合体の核移行が促進され、PER2タンパク質の局在が細胞質から核に偏ると考えられた。一方、cry1ノックアウトマウスとS557A-CRY2ノックインマウスを交配させ、CRY1の寄与を排除した変異個体の輪まわし行動リズム解析を行った。

この二重変異マウスは、cry1ノックアウトマウスに比べて長周期の輪まわし行動リズムを示したが、その差は野生型マウスとS557A-CRY2ノックインマウスの行動リズム周期の差とほぼ同程度であった。このことから、CRY1によるCRY2のS557A変異の相補はないと考えられた。CRYタンパク質は、E-boxを介した時計遺伝子の転写活性化を強力に阻害することにより、概日時計の発振において中枢的な役割を果たす。マウスのCRY2は、557番目のセリン残基(Ser557)のリン酸化に依存してプロテアソーム系を介した分解制御を受ける。本研究は、Ser557をAla置換した変異マウス(S557A-CRY2ノックインマウス)を用い、CRY2のSer557リン酸化の時計発振における役割を解明すると共に、CRYをユビキチン化する新規E3リガーゼの同定を目指した。本年度は、Fbxl3ノックアウトマウスとS557A-CRY2ノックインマウスを交配した二重変異マウスを作製してマウス行動リズムへの影響を調べたが、Fbxl3ノックアウトマウスと二重変異マウスとの間に有意な行動リズム周期の差は観察されなかった。一方、FBXL3の相同タンパク質で機能未知のFBXL21に着目し、FBXL21がCRYをユビキチン化してCRYの安定性を制御する可能性を検証した。Fbxl3/Fbxl21ダブルノックアウトマウスではFbxl3ノックアウトマウスが示す周期長の延長が大きく緩和された。重要なことに、一部のダブルノックァウトマウスは、恒暗条件に移してから数週間のうちに行動リズムが消失するという顕著なリズム異常を示した。マウスの行動実験と並行して生化学的な解析を進め、FBXL3はCRYの分解を促進するのに対して、FBXL21はCRYを安定化することを見出した。さらに、FBXL3がプロテアソーム系分解の標的となるユビキチン鎖をCRYに付加するのに対し、FBXL21は異なるユビキチン鎖を付加することを明らかにした。これらの結果から、FBXL3とFBXL21による拮抗的な作用は概日時計が安定な振動を維持するのに必須であると結論づけた。本研究成果を筆頭著者としてまとめ、Cell誌に受理された。交付申請書に記載したとおり、細胞時計のリアルタイム・モニタリング系を用いてS557A-CRY2ノックインマウスの肝臓時計を可視化し、末梢時計と中枢時計の比較解析を行った。cry1ノックアウトマウスとS557A-CRY2ノックインマウスの交配および二重変異マウスの行動リズム解析も終了した。申請書に記載のとおり、Fbxl3ノックアウトマウスを用いた解析を展開する。具体的にはS557A-CRY2ノックインマウスと交配させた二重変異マウスの行動リズム解析を行い、CRY2の2種類の分解系を阻害したときの行動リズムへの影響を明らかにする。また、これまでの研究でFbxl3のホモログであるFbxl21のノックアウトマウスの表現型解析を行い、FBXL21がCRYタンパク質の制御に関与することを示唆するデータを得ている。そのため、今後はFBXL3に加えてFXBL21の機能解析を行い、CRYの分解制御機構の全体像を明らかにする。
ドナー臓器保護作用に基づく大動物移植肺生着延長戦略－同種移植から異種移植への展開

ブタをドナーとする異種移植は、ドナー臓器不足に対する有力な解決策となる。腎臓や心臓では2か月超える異種臓器の生着が得られる一方、異種肺移植の生着は数時間から数日に留まる。本研究では、ブタ肺をヒト血液で灌流するex-vivoモデルやカニクイザルへ同所性左肺移植を行うモデルによって、GalT-KOブタ肺が超急性期の肺機能不全を回避しうること、ドナーへの一酸化炭素投与による血管内皮保護効果を介して、術後微小血管障害軽減が得られた。しかし異種移植肺は術後3日以内に血栓性微小血管障害による機能不全を呈したことから、長期効果を得るためには新たな遺伝子改変ブタを用いた治療方針の開発が望まれる結果となった。目的1:異種肺移植の急性期機能不全を克服するため、Ex-vivo異種肺移植による評価方法を確立し、他臓器で超急性拒絶反応の回避を可能とするGalT-KOブタの異種肺移植での効果評価実験に着手した。方法:摘出心肺ブロックを体外循環回路に接続し、ブタ/ヒト血液を用いて灌流を開始後、段階的に灌流量を増やし、1)Group1(n=3):通常のブタ肺を自己ブタ血液で灌流、2)Group2(n=2):通常のブタ肺をヒト血液で灌流、3)Group3(n=2):GalT-KO肺を異種ヒト血液で灌流する各群で、生理機能(肺動脈圧、酸素化能等)、血液学的(血算、凝固・線溶系因子等)、病理学的に灌流肺を評価した。なお使用回路の変更に伴い、共同研究者施設においてEx-vivo灌流再設定としてビーグル犬を用いた実験を行い、本実験の基礎データとして活用した。結果:Group1では軽度な肺血管抵抗上昇(灌流前25%上昇)のみで安定した灌流が可能であったが、Group2では、灌流量の増加に伴い肺血管抵抗上昇が進行し、開始60分以内に100%以上の上昇となった。Group3では、灌流開始30分で30%の肺血管抵抗上昇を認めたもののその後の上昇は緩徐であった。Group2での灌流60分での著名な血小板数減少に比べ(灌流前値の14%)、Group3では前値の50%減少に留まった。病理・免疫組織検査ではGroup2で生じた顕著な肺胞内出血、血栓形成、好中球浸潤がGroup3では著明に減少し、IgMや補体沈着も軽度であった。このように、GalT-KO肺が急性期肺機能不全を回避しうることを大動物Ex-vivo肺移植モデル実験により示した。並行して目的2、3となるカニクイザルを用いた左同所性肺移植モデルでの実験を開始し、Ex-vivo実験の有用性や異種移植肺の早期機能不全の原因因子と対策を明確にする実験に着手した。異種肺移植の最大の問題である、肺の特異性から生ずる血管内皮細胞障害を契機とする異種間の凝固・炎症反応異常亢進の制御に対し、平成23から24年度にかけて、GalT-KO肺が急性期肺機能不全を回避しうること、さらにGal-KOブタへの一酸化炭素CO投与によって、術後早期の移植肺障害抑制効果が得られることを示した。しかし、microangiopathyによる移植肺機能不全は抑制されず、急性期異種移植肺機能不全の克服には、COに加え更に治療を追加する必要性が示唆された。これらの結果をもとに、H26年度はドナーに対するCO投与に加え、1)ドナーおよびレシピエントに対するステロイド投与によって術後超急性期のサイトカインストームから生ずる血管内皮障害を制御すること、2)ドナーに対してデスモプレッシンを投与することによって、異種肺移植後に生ずるブタvWFを介する異常な血小板活性化を制御し、微小血栓障害の制御をはかること、の2つの手法によって、急性期機能不全制御法の確立を目的とする実験を進めた。これらの治療の結果、1)ステロイドの投与のみでは急性期の肺機能不全に対する更なる投与効果が得られなかったが、2)デスモプレッシンの投与によって、術後2日目までは移植肺は良好に機能し、かつ血栓形成は軽度であることが明らかとなった。しかしその後急速に血栓形成が進行し、術後3日にはびまん性に血栓形成から肺出血を呈し、移植肺機能不全を呈した。現時点では、一酸化炭素、あるいはデスモプレッシンなど、異種移植肺の急性期(移植後2日間)機能不全の抑制効果を有する治療法が見出されてきたが、今後これらの知見を基にして、長期効果が得られる治療戦略の確立と、新たな遺伝子改変ブタ(ノックアウトあるいは遺伝子導入ブタ)の開発が異種移植肺杞憂性機能不全の克服には必須である。

異種間超急性拒絶反応の標的抗原α-Galを発現しないGalT-KOブタの開発を契機にブタ・霊長類間異種移植研究は進んだものの、異種移植肺の生存は数時間であり、急性期移植肺機能不全におけるGalT-KOブタ役割を明確にすることに加え、肺の特異性から生ずる血管内皮細胞障害を契機とする異種間の凝固・炎症反応異常亢進の制御が必須である。平成23年度には、目的1として、GalT-KO肺が急性期肺機能不全を回避しうることを大動物Ex-vivo肺移植モデル実験により示した。平成24年度には、カニクイザルを用いた左同所性肺移植モデルでの実験を開始し、1Ex-vivo実験とin-vivo肺移植実験結果の相同性評価、2血管内皮障害を契機とする異種移植肺特有の異常凝固・炎症を制御するため、ミニブタ同種移植モデルにより強力な血管内皮保護作用を有することが示された一酸化炭素(CO)を中心とした治療効果を明らかにする目的2、3へ実験を進めた。その結果、1In-vivo移植モデル(ミニブタ・カニクイザル左同所性肺移植)から(n=2)、Ex-vivoモデルと同様に、移植後2時間で、GalT-KOブタを用いた肺移植では、術後2時間の時点で血小板減少は約40%前後に抑制され、Ex-vivo実験の再現性が得られたとともに、組織学的にも超急性拒絶反応は抑制されており、GalT-KOブタ肺を用いることによる超急性の移植肺機能不全制御に対する効果が明らかとなった。2Gal-KOブタへのCO投与による移植肺血管内皮細胞保護効果に基づく異種移植肺生着延長効果を検討したところ(n=4)、病理学的には術後2日までの時点で移植肺障害抑制効果が確認された一方、microangiopathyによる移植肺機能不全は抑制されず、急性期異種移植肺機能不全の克服には、COに加え更に治療を追加する必要性が示唆された。目的1となる、異種肺移植の急性期機能不全を克服するためのEx-vivo異種肺移植による評価方法を確立することによって、GalT-KO肺が急性期肺機能不全を回避しうることを示すことができ、次年度以降の目的である、「血管内皮障害を契機とする異種移植肺特有の異常凝固・炎症を制御する治療法の確立」というステップへ移行するための大きな基礎実験データを得ることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度は、異種肺移植の急性期機能不全を克服するための評価系として、H23年度に確立したEx-vivo異種肺移植による評価方法が、In-vivo左肺移植実験結果と相同性があることを示し、Ex-vivo、In-vivo移植実験系を適宜用いることにより、様々な治療指針の効果を示す実験評価系となりうること示した。同時に、Ex-vivoおよびIn-vivo肺移植モデルのいずれにおいても、GalT-KOブタの肺を用いることによって、超急性期肺機能不全および急激な血小板減少を回避しうることを示すことができた(目的1および目的2)。一方、これまでの自験例で、ミニブタ同種肺移植および虚血再灌流モデルによって、強力な血管内皮保護作用、抗炎症作用が示されている一酸化炭素の投与による血管保護作用の強化をはかった実験を行ったところ、病理学的には肺障害の軽減が得られたものの、microangiopathyによる異種移植肺の移植後急性期の機能不全を十分には制御することができなかった。今後、GalT-KO+一酸化炭素+αの治療薬を確立する実験を推進することによって、「血管内皮障害を契機とする異種移植肺特有の異常凝固・炎症を制御する治療法の確立」が得られるものと考えている。次年度以降は、このex-vivoモデルをもとにして、異種移植肺の急性期機能不全を防ぐ治療方法の確立にうつり、特に一酸化炭素、HMGB1、可溶性トロンボモデュリン等、これまでの実験で効果が期待される薬物を体外循環中に投与することによる治療効果の検討を行う(目的2)。
無限グラフのスペクトルの大域解析

次のような研究成果を得た。(1)コンパクト対称空間上のラプラシアンの第1固有値と断面曲率の評価を示し、エルワーシー=ローゼンバーグ予想の反例を得た。(2)境界付き有限連結グラフ上のディリクレ境界固有値問題の第1固有値に関するファーベル=クラーン型の評価を得た。(3)ディリクレ境界固有値問題の第1固有値に関するバルタ型の評価式を得た。これにより無限グラフのスペクトルの下限に関してシャープな評価式を得た。(4)グラフの手術理論を提唱し、応用として、ファーベル=クラーン型の評価式の別証明を与えた。(5)等質空間が不変な射影的平坦アファイン接続を許容するための新しい特徴付けを与えた。この応用として、リーマン対称空間で、不変な射影的平坦なアファイン接続を許容するものを完全に分類した。(6)ワイル構造全体のなす空間上の自然なゲージ不変な汎関数を定義し、その第1変分公式を求め、その臨界点の構造を決定し、その例を与えた。(7)2つのリーマン多様体の間の調和射影の研究は、調和写像の研究において重要であるが、2つのグラフが与えられたとき、その間の調和射影の概念を導入と特徴付けの方法を提起、調和解析に応用を得た。(8)ヤング・ミルズ接続方程式の非同次型方程式について、その解の応用を得た。(9)グラフの間の調和射影の完全な特徴付けを与え、この理論を使い、グリーン核の評価を得た。(10)無限グラフのスペクトルについて、新しい評価の方法を考案し、多くのグラフのスペクトルのシャープな評価を得た。平成10年度においては、次のような成果を得た。(1)リーマン多様体内の有界領域のデリィクレ問題の第1固有値の最もシャープな評価を与える定理として、バルタの定理が知られている。この研究では、このバルタの定理がグラフの場合にどうなるかを調べ、やはり同様の定理がグラフでも成り立つことを示し、離散的バルタの定理を与えた。この応用として、グラフの離散ラプラシアンの距離球の第1固有値のベストな評価を与える公式を得た。さらにこの公式の応用として、無限グラフのスペクトルの下限の評価や任意の有限グラフの第i固有値の上限を評価する公式が得られることを示した。(2)ユークリッド空間内の有界領域の第1固有値については、ファーベル・クラーンの定理が知られている。これは同じ体積をもつ有界領域の中で、円の第1固有値がもっとも小さくなり、かつそのときに限る、というものである。この定理を離散化してグラフの場合に考察した。すなわち、境界付き有限グラフの第1固有値を考える。これについて、辺の個数がm個の境界付き有限グラフを考えると、これらのうちで、境界点が1点でただ1つの境界辺もつ線状グラフL_mの第1固有値が最も小さくなり、かつそのときに限ることを示した。(3)リーマン多様体の間の調和射影(harmonic morphism)は、調和写像の例を広範に与えるものとして、重要な概念であることが知られている。本研究では、調和射影のグラフ版を考え、同様の概念を提示した。さらに任意の二つのグラフの間の写像がいつ調和射影になるか、その必要十分条件を与え、この判定条件を使ってたくさんの調和射影の例を構成した。さらに、このような調和射影の位相とラプラシアンについて解析し、調和射影のドメイン・グラフとターゲット・グラフについて、それらの成り立つベッチ数の関係式、及びグリーン核の関係式を得た。この応用として、グリーン核のシャープな評価を得た。平成11年度においては、次のような成果を得た。(1)無限グラフの離散ラプラシアンのスペクトルの評価について、従来あるチーガー型の評価とは全く異なる新しいアイデアに基づき、シャープな評価を得る一般的な方法を得た。

これは各頂点における次数と、あらかじめ定めた頂点からの距離が大きくなる隣接頂点を数える次数との比率を考えるもので、この比率の上限と下限により、離散ラプラシアンのスペクトルがシャープに評価できることを示した。この結果、従来わからなかったいろいろな無限グラフのスペクトルの評価を具体的に得ることができた。(2)リーマン対称空間上の群不変な射影平坦なアファイン接続の完全な分離定理、リー群上の左不変な射影平坦なアファイン接続の完全な分類する定理を得た。(3)ワイル構造全体の上のゲージ不変な汎関数の第一変分公式の導出に成功した。これはワイル構造とヤング・ミルズ接続と関係する新しい結果であり、従来、全くわからなかったものであり注目される。(4)上記の仕事を更に発展させて、ヤング・ミルズ接続を、ベクトル束の計量の保存条件なしに定義することに成功し、ヤング・ミルズ接続とワイル構造、アファインはめ込みなどと関連させて、議論することができ、4次元閉多様体上のアインシュタイン・ワイル接続であることと、我々の意味で、自己双対接続であることとが同等であることを、示すことができた。平成12年度においては、次のような結果を得た。(1)無限グラフの離散ラプラシアンのスペクトルの一般的な評価公式を得た。これは、与えられた頂点からの距離関数に関する増加次数と減少次数の比率を用いて評価する新しい方法によるものである。(2)無限グラフに新しく、曲率の概念を導入し、これを用いて、チーガー定数や熱核、グリーン核を極めて一般的にかつベストな形で評価する結果を得た。これにより、従来の方法では得られなかった様々な無限グラフのチーガー定数、熱核の評価が得ることに成功した。(3)曲面を離散化する離散曲面について、非固有アファイン球面の離散化に成功した。これにより、広田の離散非線形可積分方程式が自然な形で得られることがわかる。また、離散非固有アファイン球面の構成、分類も出来ることがわかった。(4)調和射の概念は、調和写像に関する微分幾何学において重要な役割を演じる。この離散化について考察し、離散調和射の概念を得、その完全な特徴付けに成功した。
航空機乗務員の宇宙線に起因する被曝線量の評価

1.アロカ(株)の電子ポケット線量計から得た指示値に、放射線影響協会の岡野眞治らのめた校正定数を乗じて、各路線を1往復した場合の乗務員の体外被曝線量を算出した。現在までに得られた結果を24に記す。2.代表的な北米路線である成田-ニューヨーク路線(往路21回、復路22回の測定の平均)、成田-ワシントン路線(往路7回、復路7回の測定の平均)、成田-シカゴ路線(往路10回、復路10回の測定の平均)および成田-ロサンゼルス路線(往路9回、復路10回の測定の平均)の体外被曝線量は、おのおの93.3μSv(往復飛行時間26時間8分)、76.7μSv(同25時間50分)、80.4μSv(同24時間11分)および57.3μSv(同20時間58分)であった。3.代表的なヨーロッパ路線である成田-ロンドン路線(往路15回、復路13回の測定の平均)、成田-パリ路線(往路7回、復路8回の測定の平均)、成田-アムステルダム路線(往路3回、復路3回の測定の平均)および成田-フランクフルト路線(往路7回、復路7回の測定の平均)の体外被曝線量はおのおの82.6μSv(往復飛行時間24時間6分)、80.6μSv(同24時間6分)、80.5μSv(同23時間41分)および75.9μSv(同23時間37分)であった。4.成田-シドニー路線等の南半球路線、成田-ジャカルタ路線等のアジア路線についても測定を実施したが、低緯度飛行路線であるため、岡野らの求めた校正定数をそのまま使用すると、南半球路線では約35%、アジア路線では約25%も体外被曝線量が過大評価になる傾向が認められた。(1)日本乗員組合連絡会議の全面的な協力を得て、半導体式電子ポケット線量計を使って、成田-ニューヨーク路線、成田-ワシントン路線、成田-シカゴ路線、成田-ロサンゼルス路線(以上、北米路線)、成田-ロンドン路線、成田-パリ路線、成田-アムステルダム路線、成田-フランクフルト路線(以上、欧州路線)、成田-シドニー路線、成田-ジャカルタ路線を中心に、平均往復宇宙線被曝線量を測定した。この結果をもとに、年間800900時間飛行したときの宇宙線被曝線量を算出すると、北米路線では成田-ニューヨーク路線が最大で2.93.2mSv、成田-ロサンゼルス路線が最小で2.22.5mSvとなる。欧州路線では成田-ロンドン路線が最大で2.73.1mSv、成田-フランクフルト路線が最小で2.62.9mSvであることが明らかになった。平均被曝線量で見る限り、わが国航空機乗務員が、わが国で最大最高の職業被曝者集団である原子力発電所の労働者を23倍も上回る被曝をしていることが判明した。(2)中性子サーベイメータを使って、成田-ニューヨーク路線、成田-シカゴ路線、成田-ロンドン路線、成田-パリ路線などについて、宇宙線中性子線量の測定を行った。その指示値は予想される中性子線量より少し低めの値であったが、その相違は中性子サーベイメータのエネルギー特性から矛盾なく説明できた。(1)アロカ(株)の電子ポケット線量計から得た指示値に、放射線影響協会の岡野眞治らの求めた校正定数を乗じて、各路線を1往復した場合の乗務員の体外被曝線量を算出した。現在までに得られた結果を(2)(4)に記す。

(2)代表的な北米路線である成田-ニューヨーク路線(往路21回、復路22回の測定の平均)、成田-ワシントン路線(往路7回、復路7回の測定の平均)、成田-シカゴ路線(往路10回、復路10回の測定の平均)および成田-ロサンゼルス路線(往路9回、復路10回の測定の平均)の体外被曝線量は、おのおの93.3μSv(往復飛行時間26時間8分)、76.7μSv(同25時間50分)、80.4μSv(同24時間11分)および57.3μSv(同20時間58分)であった。(3)代表的なヨーロッパ路線である成田-ロンドン路線(往路15回、復路13回の測定の平均)、成田-パリ路線(往路7回、復路8回の測定の平均)、成田-アムステルダム路線(往路3回、復路3回の測定の平均)および成田-フランクフルト路線(往路7回、復路7回の測定の平均)、の体外被曝線量はおのおの82.6μSv(往復飛行時間24時間6分)、80.6μSv(同24時間6分)、80.5μSv(同23時間41分)および75.9μSv(同23時間37分)であった。(4)成田-シドニー路線等の南半球路線、成田-ジャカルタ路線等のアジア路線についても測定を実施したが、低緯度飛行路線であるため、岡野らの求めた校正定数をそのまま使用すると、南半球路線では約35%、アジア路線では約25%も体外被曝線量が過大評価になる傾向が認められた。
天然植物色素類の安定化と抗酸化関連機能のさらなる有効利用のための酵素的分子設計

近年、自然環境の破壊や環境汚染、生活習慣の変化や食生活の多様化により、「人類を取り巻く地球環境に関わる諸問題」が注視されるに至っている。このような状況において、天然資源の大量消費による有用な植物資源の枯渇にも伴い、天然由来の生薬成分や生理機能性物質の価値が見直されてきた。これらの機能性物質の中で、広義の植物性(ポリ)フェノール関連化合物は、抗菌作用(防腐効果)、消臭作用、血圧降下作用、血糖量上昇抑制作用、抗酸化作用やラジカル消去能などを有し、さらには、免疫力の亢進効果、抗ウイルス作用や制癌作用などの様々な有用生理機能も示すことから、最近では、機能性食品素材、食品添加物、化粧品、医薬品などとして注目されている。本研究では、植物色素類を始めとした天然由来の(ポリ)フェノール化合物の「食品機能素材」等としての使用上の安全性と有効性を拡大させること、すなわち、酵素的安定化と高機能化を通して、これらの機能性物質の薬理・生理活性を向上させ、有効に活用できる新機能性素材へと「酵素的な分子設計」を行うことを主目的に、まず、天然植物色素を始めとしたポリフェノールグルコシド類の安定化と生理機能の高機能化を目的として、リパーゼのエステル交換反応やムラサキイモ培養細胞由来の酵素共役反応系を利用した、(ポリ)フェノールグルコシド類の「芳香族酸エステル化(アシル化)」を可能にするための新規な酵素的方法を確立した。さらに、抗酸化性(ポリ)フェノール化合物等の安定化を始めとした生理機能の改変と有効利用方法のさらなる拡大を主目的に、ユーカリ培養細胞由来のUDP-グルコシルトランスフェラーゼ反応等を用いて、各種の(ポリ)フェノール性化合物やフラボノイド類の酵素的「グルコシル化」による構造機能改変を可能にした。最後に、これらの(ポリ)フェノールグルコシド類の有用生理機能のさらなる応用・利用について検討した。これらの機能性物質の中で、広義の植物性(ポリ)フェノール関連化合物は、抗菌作用、抗酸化作用やラジカル消去能などを有し、さらには、免疫力の向上効果、抗ウイルス作用や制癌作用などの様々な有用生理機能を示すことから、最近では、食品添加物、化粧品、医薬品などとしても注目されている。本研究では、植物色素類を始めとした天然由来の(ポリ)フェノール化合物の、「食品機能素材」としての使用上の安全性と有効性を拡大させること、すなわち、酵素的安定化と高機能化を通して、これらの機能性物質の薬理・生理活性を向上させ、有効に活用できる新機能性素材へと「分子設計」を行うことを主目的に、「グルコシル化とアシル化を介した酵素的機能改変」の方法を検討した。その結果、天然植物色素を始めとしたポリフェノールグルコシド類の安定化と生理機能の高機能化を目的として、リパーゼのエステル交換反応やムラサキイモ培養細胞由来の酵素共役反応系を利用した、ポリフェノールグルコシド類の「芳香族酸エステル化(アシル化)」を可能にするための新規な酵素的方法を可能にした。さらに、抗酸化性(ポリ)フェノール化合物等の安定化を始めとした生理機能の改変とそれらの有効利用方法のさらなる拡大を主目的に、ユーカリ培養細胞由来のUDP-グルコシルトランスフェラーゼ反応等を用いて、各種のフェノール性化合物やフラボノイド類の酵素的「グルコシル化」による構造機能改変法を確立にした。

近年、自然環境の破壊や環境溝染、生活習慣の変化や食生活の多様化により、「入類を取り巻く地球環境に関わる諸問題」が注視されるに至っている。このような状況において、天然資源の大量消費による有用な植物資源の枯渇にも伴い、天然由来の生薬成分や生理機能性物質の価値が見直されてきた。これらの機能性物質の中で、広義の植物性(ポリ)フェノール関連化合物は、抗菌作用、抗酸化作用やラジカル消去能などを有し、さらには、免疫力の向上効果、抗ウイルス作用や制癌作用などの様々な有用生理機能を示すことから、最近では、食品添加物、化粧品、医薬品などとしても注目されている。本研究では、植物色素類を始めとした天然由来の(ポリ)フェノール化合物の、「食品機能素材」としての使用上の安全性と有効性を拡大させること、すなわち、酵素的安定化と高機能化を通して、これらの機熊性物質の薬理・生理活性を向上させ、有効に活用できる新機能性素材へと「分子設計」を行うことを主目的に、「グルコシル化とアシル化を介した酵素的機能改変」の方法を検討した。その結果、天然植物色素を始めとしたポリフェノールグルコシド類の安定化と生理機能の高機能化を目的として、リパーゼのエステル交換反応やムラサキイモ培養細胞由来の酵素共役反応系を利用した、ポリフェノールグルコシド類の「芳香族酸エステル化(アシル化)」を可能にするための新規な酵素的方法を可能にした。さらに、抗酸化性(ポリ)フェノール化合物等の安定化を始めとした生理機能の改変とそれらの有効利用方法のさらなる拡大を主目的に、ユーカリ培養細胞由来のUDP-グルコシルトランスフェラーゼ反応等を用いて、各種のフェノール性化合物やフラボノイド類の酵素的「グルコシル化」による構造機能改変法を確立にした。近年、自然環境の破壊や環境汚染、生活習慣の変化や食生活の多様化により、「人類を取り巻く地球環境に関わる諸問題」が注視されるに至っている。これらの機能性物質の中で、広義の植物性(ポリ)フェノール関連化合物は、抗菌作用(防腐効果)、消臭作用、血圧降下作用、血糖量上昇抑制作用、抗酸化作用やラジカル消去能などを有し、さらには、免疫力の亢進効果、抗ウイルス作用や制癌作用などの様々な有用生理機能も示すことから、最近では、機能性食品素材、食品添加物、化粧品、医薬品などとして注目されている。本研究では、植物色素類を始めとした天然由来の(ポリ)フェノール化合物の「食品機能素材」等としての使用上の安全性と有効性を拡大させること、すなわち、酵素的安定化と高機能化を通して、これらの機能性物質の薬理・生理活性を向上させ、有効に活用できる新機能性素材へと「酵素的な分子設計」を行うことを主目的に、まず、天然植物色素を始めとしたポリフェノールグルコシド類の安定化と生理機能の高機能化を目的として、リパーゼのエステル交換反応やムラサキイモ培養細胞由来の酵素共役反応系を利用した、(ポリ)フェノールグルコシド類の「芳香族酸エステル化(アシル化)」を可能にするための新規な酵素的方法を確立した。さらに、抗酸化性(ポリ)フェノール化合物等の安定化を始めとした生理機能の改変と有効利用方法のさらなる拡大を主目的に、ユーカリ培養細胞由来のUDP-グルコシルトランスフェラーゼ反応等を用いて、各種の(ポリ)フェノール性化合物やフラボノイド類の酵素的「グルコシル化」による構造機能改変を可能にした。
ナルコレプシーの誘因としてのマイクロビオータを動物モデルで検証する

臨床検体の採取と腸内細菌叢の分析:平成30年度は晴和病院にてPSG検査入院をしたナルコレプシー症例24例に広げ前年度のプロトコールに従い採便キットで便を採取。患者群および対照群からDNAを抽出し、遺伝子解析によってヒト腸内細菌の16S rRNAの網羅的解析を行った。(委託検査:テクノスルガラボ;T-RLFPフローラ解析)解析結果としてこれまでの解析で示唆されたビフィズス菌の保有率が対照群より高い傾向がナルコ群において再確認された。クラスター解析によるとナルコレプシー群は共通のクラスターに分類される事が多いが、そこから外れる症例も散見されたため、過眠症状の各パラメーターとの詳細な検討が必要である。さらに過眠症状との関連を探るために、過眠症一般との比較検討も進めている。一例として睡眠障害を高い頻度で併発する発達障害症例で検討したところ睡眠傾向と腸内細菌分布に関連が見られ過眠症のどのパラメータと強く相関するのかを検討中である。患者検体の分析:バイオマーカ検索のためにPSG/睡眠脳波検査を行った翌朝に約20mLの採血を行い、血清およびリンパ球を分離・凍結保存しメタボローム解析をおこなっているところである。動物モデルによる細菌叢検討:最終年度は過眠症改善の効果があると考えられる薬物をナルコレプシーモデルマウスに長期投与し腸内細菌叢の変化を調べた。長期の投与により腸内細菌叢の変化と睡眠パターン、オレキシン神経の活性度の変化について検討中である。臨床検体の採取と腸内細菌叢の分析:晴和病院にてPSG検査入院をした症例6例に関して腸内細菌叢解析を行った。PSG/睡眠脳波検査を行った翌朝に約20mLの採血を行い、血清およびリンパ球を分離・凍結保存する。またPSG検査/睡眠脳波の翌日、採便キットで便を採取。患者便および対照群からDNAを抽出し、遺伝子解析によってヒト腸内細菌の16S rRNAの網羅的解析を行った。(受託検査:テクノスルガラボ;T-RLFPフローラ解析)。過眠症症例の検体を症例別に解析したがナルコレプシー特異的変化が見られなかった。症例数を増やして検討する予定である。過眠症という分類で対照群と比べるとなぜかビフィズス菌の保有率が対照群より高い傾向がある。詳細検討中である。患者検体の分析:血清はメタボローム解析(HMT社のCE質量分析による解析を予定)に用い、またリンパ球からはmRNAを抽出して網羅的遺伝子発現解析とメチル化部位の検討をすすめている。動物モデルによる細菌叢検討:フローラ解析によりナルコレプシーとそれ以外の過眠症症例との間に便細菌叢の違いが見いだせなかったので、さらに症例を増やしている状況であるため無菌動物の導入を次年度に延期し、過眠症改善の効果があると考えられる薬物を長期投与した場合の腸内細菌叢の変化を先行して調べた。マーモセットに関してナルコレプシーの原因となるオレキシン細胞の確認を行った。さらに発達に伴う腸内細菌の変化を同腹動物を用いて比較検討している。ナルコレプシー特異的な腸内細菌叢の変化が確認できないため症例を増やして解析を進めている。一方、ナルコレプシーを含む過眠症と対照群を比較するとフローラ分布に違いがあり、過眠症の誘因としての腸内細菌叢の役割という観点からも検討を始めた。当初の予定のように無菌動物への導入が進められないため、過眠症改善薬の投与による睡眠と腸内細菌叢の関係を先行して調べている。マーモセットに関してもナルコレプシーの原因となるオレキシン細胞の確認と同腹動物を用いて発達期における腸内細菌変化に関して次年度予定に先行して着手している。臨床検体の採取と腸内細菌叢の分析:平成28年度、6例のパイロットケースに関して腸内細菌叢解析を行ったが、ナルコレプシー特異的変化を検出するに至らなかった。そこで対象を晴和病院にてPSG検査入院をした症例20例に広げ前年度のプロトコールに従い採便キットで便を採取。(委託検査:テクノスルガラボ;T-RLFPフローラ解析)。あわせて最終年度のバイオマーカ検索のためにPSG/睡眠脳波検査を行った翌朝に約20mLの採血を行い、血清およびリンパ球を分離・凍結保存した。解析結果としてパイロットケースで示唆されたビフィズス菌の保有率が対照群より高い傾向が過眠症群において再確認された。さらに睡眠障害を高い頻度で併発する発達障害症例でも睡眠傾向と腸内細菌分布に関連が見られ詳細を検討している。患者検体の分析:最終年度のメタボローム解析の準備として症例の基礎データベースを整備している。患者検体の血清は網羅的遺伝子発現解析に供する予定である。またリンパ球からはmRNAを抽出して、メチル化部位の検討をすすめており、関連研究としてCCR3の特異的メチル化に関しての知見も得ている。動物モデルによる細菌叢検討:前年度過眠症改善の効果があると考えられる薬物を長期投与した場合の腸内細菌叢の変化を先行して調べた。長期の投与により腸内細菌叢の分布に明らかな変化が見られ、投与実験に関しては手間、費用のかかる無菌動物を用いずとも簡易的に比較できる事が判明し、以降の実験系を簡便化する事にした。前年度ナルコレプシー特異的な腸内細菌叢の変化が確認できなかったため症例を増やして解析を進めている。

ナルコレプシーから過眠症に症例を広げる事で過眠傾向と腸内細菌叢(特にビフィズス菌群)に相関が見られ目標の変更も視野に入れ検討している。実験動物を用いた基礎確認を終え臨床例の解析と最終年に向けて患者データベースの整備を進めている。臨床検体の採取と腸内細菌叢の分析:平成30年度は晴和病院にてPSG検査入院をしたナルコレプシー症例24例に広げ前年度のプロトコールに従い採便キットで便を採取。患者群および対照群からDNAを抽出し、遺伝子解析によってヒト腸内細菌の16S rRNAの網羅的解析を行った。(委託検査:テクノスルガラボ;T-RLFPフローラ解析)解析結果としてこれまでの解析で示唆されたビフィズス菌の保有率が対照群より高い傾向がナルコ群において再確認された。クラスター解析によるとナルコレプシー群は共通のクラスターに分類される事が多いが、そこから外れる症例も散見されたため、過眠症状の各パラメーターとの詳細な検討が必要である。さらに過眠症状との関連を探るために、過眠症一般との比較検討も進めている。一例として睡眠障害を高い頻度で併発する発達障害症例で検討したところ睡眠傾向と腸内細菌分布に関連が見られ過眠症のどのパラメータと強く相関するのかを検討中である。患者検体の分析:バイオマーカ検索のためにPSG/睡眠脳波検査を行った翌朝に約20mLの採血を行い、血清およびリンパ球を分離・凍結保存しメタボローム解析をおこなっているところである。動物モデルによる細菌叢検討:最終年度は過眠症改善の効果があると考えられる薬物をナルコレプシーモデルマウスに長期投与し腸内細菌叢の変化を調べた。長期の投与により腸内細菌叢の変化と睡眠パターン、オレキシン神経の活性度の変化について検討中である。ナルコレプシー特異的な腸内細菌叢の変化を確認するため症例を増やして解析を進めていく。もし症例を増やしてもナルコレプシー特異的変化が見いだせない場合は、ナルコレプシーを含む過眠症と言うくくりで対照群と比較し、平成28年度に見いだされた過眠症の誘因としての腸内細菌叢の役割という研究目標にシフトする可能性も検討する。過眠症改善薬の投与による睡眠と腸内細菌叢の関係を先行して調べ、それなりの成果が上がってきているので、さらに詳細検討するとともに当初の予定のように無菌動物への導入の準備を進める。過眠症の誘因としての腸内細菌叢の役割という研究目標にシフトする方向に舵を切り、ナルコレプシーを含む過眠症症例に於いて特異的な腸内細菌叢の変化を確認するため症例を増やして解析を進めていく。過眠症改善薬の投与による睡眠と腸内細菌叢の関係を先行して調べたところ成果が見られたので、パイロットケースとして患者さんに同意を取り摂取後腸内細菌叢の変化などさらに詳細検討するとともに最終年度のバイオマーカー検索準備を進める予定である。動物実験の実施順序の変更により動物の経費に変更が生じたため。平成28年度に臨床症例が充分に集まらなかった事から解析が先送りになり支払いが平成30年度に延期された。症例をまとめての解析となったため平成30年度中に執行できるものと考えている。持ち越し研究費に関しては無菌マウスの導入を行う予定である。マーモセット研究に着手した場合は動物の購入費用に充てる予定である。