hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サンショウウオの生殖系の発達とホルモン調節機構

1.クロサンショウウオの雄の生殖器官の周年変化を組織学的に観察した。繁殖期に水に入ると排精が起り,ウォルフ管に束状の精子が充満し,管壁の上皮細胞の分泌物によって精子は活性化される。繁殖期のあと温度の上昇と共に精巣小葉で減数分裂が始まり,夏には精子が形成される。精子変態がみられる頃からクロアカ腺の発達が始まる。精子形成の進行はすべての精巣小葉で同調的に進行する。2.クロサンショウウオの雄は繁殖期に水に入ると著しい体型変化を起こす。これは皮下組織の膨潤によるもので,生殖活動が終ると陸生型に戻る。繁殖期に水に入る行動は従来プロラクチンの刺激によって起るといわれてきたが,これは支持できない。3.一匹の雌が産む卵の大きさと数の関係は生息地が北である程,また標高が高い程大卵少産であった。大きい卵は発生が早く,これは冬の長い環境への適応と考えられる。変態後の個体は高地では成長が遅く成熟に達するのが遅く,また寿命が長い。卵黄総量(卵サイズ×卵数)は雌の体の大きさと比例している。4.クロサンショウウオとエゾサンショウウオの幼生は低温で飼育すると成長をつづけるが変態は起らない。脳下垂体を免疫組織化学的に観察すると,生殖腺刺激ホルモン産生細胞の発達は変態しない個体ではほとんど起らず,従って,これらの種類では幼生を低温で飼育してもネオテニ-は起らないと考えられる。5.クロサンショウウオの雌では産卵池に入ると排卵が起る。この時期の雌に生殖腺刺激ホルモンを注射して8°Cにおくと,18時間で排卵が起り,その14時間後には卵は卵管に入っている。子宮で卵嚢が形成されるのはホルモン注射後約50時間であった。雌の体重は卵嚢形成中に著しく増加する。1.生殖腺性分化過程の電顕観察:クロサンショウウオの性分化様式は分化型で、卵巣よりも精巣が早く分化する。髄質は体腔上皮由来だ。2.産卵期の体型変化とそれに対応する体内変化:クロサンショウウオの雄は池に入ると排精を始め、体型が水生型になる前に完了する。水生型になると精管の腺分泌が起り、精子束は崩れる。雌は池に入って排卵し、卵嚢形成によって体重が著しく増加する。3.精巣の微細構造と雄生殖器官の周年変化:クロサンショウウオの精細管は精巣内輸出管の周囲に扇状に配列し、精原細胞は輸出管の近くにある。間質にはステロイド産生細胞が周年みられ、それらに接して無髄鞘神経軸索がみられる。輸出管は類筋細胞に囲まれ、それに無髄鞘神経線維が接している。精子形成は精巣全体に同調的に進行し、雄の二次性徴は精子形成後に発達する。4.卵サイズと卵数の変異:クロサンショウウオの卵数・卵サイズの集団内の変異は親のサイズと相関し、その度合は集団によって差がある。卵サイズと卵数、総卵黄量は集団によって違う。高地の集団は低地のものより成長・成熟がおそく、長寿である。5.越冬幼生の成因:クロサンショウウオでは一定サイズになる前に水温が低下すると越冬幼生となる。翌年の夏に池の水量が減ると変態する。変態開始の要因は水温上昇だけてはない。チロキシン(6×10^<-8>M)

水溶液飼育では10°C以上の外鰓消失、8°C以上で尾びれ消失、4°C以上で皮膚に変態的変化が起った。低温ではTSHは無効である。6.ネオテニ-の可能性:6°Cで飼育した幼生と室温飼育の幼若体の脳下垂体の免疫組織学的観察から、クロサンショウウオではネオテニ-が起る可能性は少いが、エゾサンショウウオにはその可能性があることを示唆する結果が得られた。1.クロサンショウウオの雄の生殖器官の周年変化:精子形成の進行は同調的に起る。二次性徴の発現は精子形成が終った直後に始まる。精巣からの精子の流出は産卵池に入ってから起り,精子は当初,束状をなしているが,精管分泌物と混じるとバラバラになる。2.クロサンショウウオの体型の周年変化:雄は産卵池に入ると,皮下の結合組織の膨潤と精管の水分貯溜により体重,頭幅が増し,尾高が高まる。雌の体型変化は雄に比べると小さいが,池に入ると卵嚢形成によって体重が増す。他の季節には雌雄ともに体型変化は認められぬ。3.日本産のサンショウウオで人為的にネオテニ-を誘導できるか:エゾサンショウウオとクロサンショウウオの幼生を低温で飼育すると,成長はつづくが変態は起らない。これらの個体では脳下垂体のTSH細胞は増えつづけるが,GTH細胞は,動物が変態しない限り,分化は進まない。従ってヒノビウス属サンショウウオでは,低温飼育によってネオテニ-を誘導することは因難である。4.トウホクサンショウウオの卵の大きさについての生殖戦略的考察:同一産卵集団内および異った性質の水域(流水,準止水,湿地)に産卵する集団間で卵の大きさを比較した。卵の大きさは流水産卵集団および一時的な湿地に産卵する集団で大であった。また各集団内での変異もかなり大きかった。卵の大きさは,その後の発育の速さ,幼生の大きさと強く関連性がある。従って、これらの変異は,本種の幼生が様々な水域で生息することを可能としている。5.クロサンショウウオの生殖腺原基形成における体細胞の動き:電顕とオ-トラジオグラフィによる研究で明らかになったことは:原基の髄質は体腔上皮由来,髄質形成に生殖腺原基以外からの細胞侵入はない,性分化は直接的に起る,その過程で皮質と髄質の抵抗はない。1.クロサンショウウオの発生段階図表の作成発生・生殖関係の研究の基礎となる発生段階図表を作成した。受精から変態完了までを73段階に区分し、それぞれのステ-ジを図示し、英文の解説をつけた。また温度と発生速度との関係をグラフで示した。一飼育例では17°Cで受精から変態完了まで80日、変態した個体の平均全長は53.4mmであった。2.クロサンショウウオの生殖腺の性分化過程の電顕的研究従来の研究では生殖腺原基の髄質の細胞は中腎域由来とされ、皮質と髄質は拮抗的に働らき,そのバランスが崩れることによって生殖腺の性分化がおこるといわれてきた。本研究では髓質の起源は皮質と同じく体腔上皮であり,性分化の過程で皮質と髓質の拮抗な認められなかった。これは我々が先に行った無尾両生類での観察結果と同じであり,従ってこの現象は両生類一般にみられると思われる。3.クロサンショウウオの幼若体における脳下垂体の甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生細胞の分化と発達TSH産生細胞の発達を免疫組織化学的に調べ,この細胞は低温飼育で変態しない動物でも同齢の変態した動物と同じく,齢と共に増加することが判った。前年度の実験結果と合せて,サンショウウオの幼生を低温で飼育すると成長はつづいても生殖腺の成熟は起らないであろうとの結論に達した。4.クロサンショウウオの産卵時の雄の行動本種の産卵時には雌がうんだ卵襄の周囲に雄が群れてメ-ティングボ-ルを形成するが,この察に卵襄を抱いて注精できるのは,水生型の雄であれば1匹だけである。
耐熱性ヘムタンパク質の構造安定化に寄与する疎水性コアの構造とダイナミクスの解析

好熱性水素細菌(Hydrogenobacter thermophilus)がもつ電子伝達タンパク質チトクロームc_<552>(HT)は分子量約8000、アミノ酸残基80からなる比較的小さな球状タンパク質である。活性部位にヘム(鉄-ポルフィリン錯体)をもち、ヘム鉄の酸化数の変化(還元型(Fe^<II>)、酸化型(Fe^<III>))により電子の授受を行う。HTは非常に熱安定性が高く、100°Cでも変性しない。一方、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のチトクロームc_<551>(PA)の一次構造はHTと高い相同性(56%)をもつにもかかわらず、熱変性温度はHTに比べて約40°Cも低い。また、PAの5個のアミノ酸残基をHTで対応するアミノ酸残基に置換した変異体(F7A/V13M/F34Y/E43Y/V781)は、HTに相当するほど熱安定性が高いことがわかっている。本研究ではNMRおよび可視吸収スペクトルの解析により得られる構造化学的因子や電気化学測定により求められるヘム鉄の酸化還元電位の温度依存性を幅広い温度範囲(5°C-95°C)で解析することにより、これらヘムタンパク質の活性部位の分子構造と機能を熱安定性の発現および機能調節の分子機構の解明という観点から詳細に比較した。その結果、ヘム鉄と軸配位子との配位結合の強度がタンパク質の疎水性コアの構造とダイナミクスに依存すること、ヘム錯体の安定性がヘムタンパク質の熱安定性と密接な関係があることなどを明らかにした。したがって、生体高分子の疎水性コアの構造を制御することにより分子の安定性と機能をそれぞれ独立的に調節することが可能であるということを発見したという点から、本研究は分子設計に利用可能な新規な原理を提唱したことになる。
高次脳機能構築における脂質シグナル分子産生酵素の機能とシグナル伝達機構の解析

我々は、細胞膜微量構成リン脂質のホスファチジルイノシトール4-リン酸のイノシトール環5位をリン酸化して多彩な機能を有するホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸を産生するホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIP5K)に関して、この脂質シグナル分子産生酵素の神経細胞における活性化機構と生理的役割についての解析を進めてきた。その結果、以下の知見が得られた。マウス海馬の内在性PIP5Kβは、スパインマーカー蛋白質であるPSD95と同一の画分に分画され、さらに、マウスの発生過程におけるPIP5Kβの発現パターンはPSD95と類似していた。これらの結果は、PIP5Kβがスパインにおいて機能している可能性を示唆している。さらに我々は、マウス海馬神経細胞に野生型PIP5Kβを過剰発現させると、スパイン数が顕著に減少し、活性欠失型PIP5Kβを過剰発現させるとスパイン数は増大することを見出した。これらの結果から、PIP5Kβはスパイン形成を負に制御していることが示唆された。2.PIP5Kγ661はAP-2複合体と相互作用して、海馬神経細胞におけるシナプス小胞のエンドサイトーシスに重要な役割を果たす我々は、三種のPIP5Kアイソザイム、α、β、γ、と二種類のPIP5Kγスプライシングバリアント、PIP5Kγ635とPIP5Kγ661、のうち、PIP5Kγ661がAP-2複合体と特異的に相互作用することを見出した。すなわち、PIP5Kγ661に特有のC末端26アミノ酸領域にAP-2複合体のβ2サブユニットのEarドメインが結合することが明らかとなった。さらに、このPIP5Kγ661のAP-2複合体との相互作用は、神経終末におけるシナプス小脳のリサイクリングに必要であることを明らかにした。本研究では、様々な細胞内シグナル伝達系や細胞機能に重要な役割を果たすことが示されている脂質シグナル分子産生酵素、ホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIP5K)とホスホリパーゼD(PLD)について、ジーンターゲッティング法により個体レベルでの生理機能、特に高次脳機能構築における重要性を明らかにし、個体レベルでの生理機能に直接連関するこれらの分子の機能とシグナル伝達機構を細胞レベルとin vitro実験系で解明することを目的して、研究を行った。現在までに、ほ乳類PIP5Kについては、それぞれα、β、γの三種類のアイソザイムが、PLDについてはPLD1とPLD2の二種類のアイソザイムが同定されている。これらのPIP5KとPLDアイソザイムのうち、今年度はPIP5Kα遺伝子ノックアウトマウスの作製とその解析が完了した。その結果、PIP5Kα欠損マウスは10ヶ月以上健常であり、脳における異常は認められなかった。しかしながら、PIP5Kα欠損マウスの骨髄由来肥満細胞においては抗原刺激依存的なヒスタミン放出反応が促進しており、PIP5Kα欠損マウスの全身性アナフィラキシーと受身皮膚アナフィラキシーが亢進していることが明らかとなった。以上の結果から、PIP5Kαの生理的機能は不適切な肥満細胞のヒスタミン放出反応とそれに伴うアナフィラキシーを抑制することが示唆された。現在は、PIP5KとPLDの個々のアイソザイムに特有の生理機能を個体レベルで明らかにするため、それらの遺伝子ノックアウトマウスを作製して解析を進めている。

我々は、細胞膜微量構成リン脂質のホスファチジルイノシトール4-リン酸のイノシトール環5位をリン酸化して多彩な機能を有するホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸を産生するホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼ(PIP5K)に関して、この脂質シグナル分子産生酵素の神経細胞における活性化機構と生理的役割についての解析を進めてきた。その結果、以下の知見が得られた。マウス海馬の内在性PIP5Kβは、スパインマーカー蛋白質であるPSD95と同一の画分に分画され、さらに、マウスの発生過程におけるPIP5Kβの発現パターンはPSD95と類似していた。これらの結果は、PIP5Kβがスパインにおいて機能している可能性を示唆している。さらに我々は、マウス海馬神経細胞に野生型PIP5Kβを過剰発現させると、スパイン数が顕著に減少し、活性欠失型PIP5Kβを過剰発現させるとスパイン数は増大することを見出した。これらの結果から、PIP5Kβはスパイン形成を負に制御していることが示唆された。2.PIP5Kγ661はAP-2複合体と相互作用して、海馬神経細胞におけるシナプス小胞のエンドサイトーシスに重要な役割を果たす我々は、三種のPIP5Kアイソザイム、α、β、γ、と二種類のPIP5Kγスプライシングバリアント、PIP5Kγ635とPIP5Kγ661、のうち、PIP5Kγ661がAP-2複合体と特異的に相互作用することを見出した。すなわち、PIP5Kγ661に特有のC末端26アミノ酸領域にAP-2複合体のβ2サブユニットのEarドメインが結合することが明らかとなった。さらに、このPIP5Kγ661のAP-2複合体との相互作用は、神経終末におけるシナプス小脳のリサイクリングに必要であることを明らかにした。
非コード反復配列RNAの発現を主因とした多段階発癌の発癌機構の解明と制御

癌は癌遺伝子・癌抑制遺伝子の変異に伴う多段階発癌が主要な発癌経路であると推定されているが、なぜそれらの遺伝子変異が最終的に雑多な遺伝子異常を伴う細胞癌化に結びつくのかはいまだ明確になっていない。本申請では、多段階発癌の初期の遺伝子異常の段階から非コード反復配列RNAが発現し、DNA修復因子であるYB-1蛋白と結合し細胞質に局在させることを明らかにした。この反復配列がゲノムDNAやミトコンドリアDNAの変異修復を阻害することで、細胞内環境を攪乱しDNA損傷を惹起することをつきとめた。反復配列RNAのYB1への結合を阻害するなどの介入法によって発癌を抑制できる可能性が示唆された。当該年度においては、もともと想定されていた膵癌組織における反復配列RNAの異常高発現の有無について、マウス膵がん組織から抽出したRNAを用いて検討をおこなった。反復配列RNAは長さが多様なため20mer程度の基本配列をprobeとしたNorthern blottingにおいてスメアバンドとして検出されるが、想定通り、200から8000mer程度のスメアバンドとして検出された。さらにその発現の組織内分布を確定するために、RNA in situ hybridizationによる検討を行ったところ、膵癌組織周囲の腺房細胞で特に高発現が認められた。すなわち癌細胞そのものだけでなく、その背景組織においてもすでに反復配列RNAは発現しており、癌組織の存在による反応として異常発現が起きるのか、あるいは発癌の前段階から発現してきているのか、という二点が想定された。そこで、反復配列RNAの異常発現が、細胞にもたらす生物学的影響を検討するため、基本配列を2.5回繰り返す構造を持つRNAを発現するコンストラクトをk-ras変異を持ったマウスにできる膵癌の前段階であるPanINから単離した細胞に強制発現し、その表現型を観察した。その結果、反復配列RNAが存在すると細胞分裂時の染色体の分離が多極化しaneupolidityのもとになること、および細胞にDNAダメージが生じた時にその修復が不全であり、ゲノムの異常が蓄積する可能性があることが示唆された。今後さらに詳細な検討を続け、発癌の原因となるのかを明らかにし、予防策の開発に向けて進めていきたいと考えている。慢性炎症に続発する癌(炎症性発癌)の病態として「炎症性ストレスによる慢性的な『miRNA機能阻害』が原因の一端である」ことを明らかにし、miRNA機能を増強する薬剤によって炎症性発癌の予防が可能になることを同定した、いっぽうで、炎症性発癌ではなくもうひとつの主要な発癌経路であるsporadicな発癌については癌遺伝子・癌抑制遺伝子の変異に伴う多段階発癌が主要な発癌経路であると推定されているが、なぜそれらの遺伝子変異が最終的に雑多な遺伝子異常を伴う細胞癌化に結びつくのかはいまだ明確になっていない。ウス膵癌モデルでは前癌段階から非コード反復配列RNAが発現してくることを確認しているが、その発現は癌の前段階から認められ、かつ癌周囲組織で多かった。その結果に基づいて、in vivo解析用に非コードRNAあるいは非コードRNAノックダウンコンストラクトを発現するtransgenic mouseを作製した。並行して、in vitroでの強制発現系を用いて非コード反復配列RNAの生物学的意義とその分子機構を、染色体の形態観察や転写物発現状態の網羅的変化や結合蛋白の検索をおこなうことで突き止めることを目標とした。その結果、反復配列RNAにはYB-1と呼ばれるRNA結合タンパクが結合することが質量分析のを駆使して明らかにした。YB-1は細胞の遺伝子異常の修復や細胞分裂時の染色体の分裂に必須の因子であるが、この非コードRNAのYB-1への結合がYB-1の本来持つ機能を落とし、その結果癌化に傾くことが示唆された。慢性炎症から続発する癌(「炎症性発癌」)の病態として「炎症刺激による慢性的なmicroRNA機能阻害が原因の一端である」ことを明らかにし、microRNA機能を増強する薬剤が炎症性発癌の予防法になることをこれまで見出した。その一方で、炎症性発癌ではなくsporadicに起こる発癌については癌遺伝子・癌抑制遺伝子の変異の蓄積による多段階発がんが主要な経路と推定されている。しかしこのような遺伝子変異がなぜ最終的に種々の発癌に結び付くことになるのかは不明であった。本研究では多段階発がんの初期の段階から非コードRNA、特に反復配列RNAが発現してくることに着目し、その多段階発がんにおける寄与を解明することを目的とした。本年度は、それまでに確認していた、反復配列RNAをhTERTによって不死化した正常膵管細胞に発現させて系で、細胞分裂時における紡錘糸形成不全が起こることだけでなく、反復配列RNAが発現することによって宿主細胞のゲノムDNAに変異が蓄積することが、whole exon sequencingによって明らかとなった。それだけでなく、ミトコンドリアゲノムDNAにも変異が蓄積することが明らかとなった。これらの表現型は、反復配列RNAが宿主細胞のYBX-1タンパクと結合し、その細胞内局在を変化させることで惹起されることを解明した。反復配列RNAを発現させたトランスジェニックマウスでは、Ras変異との交配によって、膵臓に過形成と慢性的な炎症が惹起され、それによって癌化が促進されるのではないか、ということが示唆された。これらの研究成果から、いわゆるsporadicに起きる発癌については、反復配列RNAの発現が、細胞内環境の異常、とくにゲノムおよびミトコンドリアDNAの異常を惹起させて発生してくる可能性が示唆され、今後はこの機構に介入することで発癌予防につなげることが期待される。

癌は癌遺伝子・癌抑制遺伝子の変異に伴う多段階発癌が主要な発癌経路であると推定されているが、なぜそれらの遺伝子変異が最終的に雑多な遺伝子異常を伴う細胞癌化に結びつくのかはいまだ明確になっていない。本申請では、多段階発癌の初期の遺伝子異常の段階から非コード反復配列RNAが発現し、DNA修復因子であるYB-1蛋白と結合し細胞質に局在させることを明らかにした。この反復配列がゲノムDNAやミトコンドリアDNAの変異修復を阻害することで、細胞内環境を攪乱しDNA損傷を惹起することをつきとめた。反復配列RNAのYB1への結合を阻害するなどの介入法によって発癌を抑制できる可能性が示唆された。膵癌前段階からの反復配列RNAの発現様式の同定と、反復配列RNAと結合する細胞内タンパクの同定を行えた。また、この非コードRNAを発現するトランスジェニックマウスも作成した。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学当該年度においてはまず臨床検体での反復配列RNAの発現状況を確認すること、それに基づいてin vitroで過剰発現した時の細胞の表現型の変化を観察することを主眼に置いていたが、そのどちらもおおむね予定どおりの進捗が見られている。できれば分子機構の解析をもう少し進めたいところではあったが、過剰発現細胞も得られその表現型を解析し、結合タンパクの同定にまで進んでいるため、ほぼ遅滞なく進行中と考えている。引き続き、in vitroでの反復配列RNAの過剰発現に伴う細胞機能異常を解析するとともに、結合タンパクの同定から得られる分子機構を詰めていきたい。また、いっぽうで、反復配列RNAが発癌の原因となっているのか、発癌の結果として反応性に発現しているだけなのかを明らかにするために、反復配列RNAのtransgenic mouseを作製し、その表現型を解析していきたい。そのためのコンストラクトは既に準備されており、in vitroで得られた結果をin vivoで検証する予定である。
肝癌患者に対する肝移植を想定した肝細胞増殖因子作用下のドナー細髄移植併用の効果

肝癌患者に対する新しいstrategyとして、肝移植を想定した肝細胞増殖因子(HGF)作用下のドナー骨髄移植併用効果の検討を行った。まず骨髄移植によるGVHD効果が肝癌に対して抑制効果があり、HGFがGVHDを制御できるかを検討するためにマウス骨髄移植モデルを確立して検討を行った。(方法)1、マウス肝癌細胞Hep1A (C57BL/6N由来肝癌細胞)をターゲット癌細胞に選択し、これを移植するレシピエントマウスとしてB6C3F1、骨髄移植のドナーとしてC3H/HeNを用いた。B6C3F1にHep1Aを移植した群をコントロール群、これに9Gyの全身放射線照射(TBI)を行ったものをTBI群、骨髄移植を施した群をBMT群、さらにHGFを導入したものをBMT+HGF群とした。腫瘍を移植した日をDAY0としHGFはDAY4,11,18,25に各100μg導入、DAY7に全身放射線照射(TBI)9gyと骨髄移植を行った。2、骨髄移植:C3H/HeNの大腿骨より骨髄、脾臓よりリンパ球を採取。全身に9Gyの照射を行ったB6C3F1の尾静脈より注入した。3、HGFの導入:導入にはHVJリポゾーム法を用いて行った。導入量は1回100μgとした。大腿内側に筋肉注射にて行った。4、摘出した皮下腫瘍を組織学的に解析行った。(結果)1、骨髄が移植されたかフローサイトメトリーで確認した。BMT後4週間、4ヶ月のマウスを対象とし骨髄および末梢血リンパ球(脾細胞)について検定したところ、すべての個体においてほぼ100%のキメラを形成し、長期間にわたり継続していた。2、腫瘍移植後4週目において平均腫瘍体積(mm3)はコントロール群1263.6、BMT+HGF群80.6と骨髄移植により腫瘍発育は有意に抑制された。3、BMT群ではHE染色にて小腸縦毛、大腸杯細胞の部分的消失、肝臓中心静脈周囲へのリンパ球の浸潤を認め、GVHDの所見を認めたが、BMT+HGF群では軽度の所見を認めるのみであり、HGFによるGVHDの抑制を認めた。4、酵素抗体および蛍光抗体を用いた免疫染色で、腫瘍内にdonor由来のリンパ球が証明された。現在さらにCTL assayを行い、donorリンパ球の関与を証明するとともに肝移植モデルでの検討を行っている。まず骨髄移値によるGVHD効果が肝癌に対して抑制効果があり、HGFがGVHDを制御できるかを検討するためにマウス骨髄移植モデルを確立して検討を行った。(方法)(1)マウス肝癌細胞Hep1A (C57BL/6N由来肝癌細胞)をターゲット癌細胞に選択し、これを移植するレシピエントマウスとしてB6C3F1、骨髄移植のドナーとしてC3H/HeNを用いることとした。腫瘍を移植した日をDAY0としHGFはDAY4,11,18,25に各100μg導入、DAY7に全身放射線照射(TBI) 9gyと骨髄移植を行った。腫瘍径の測定はDAY7より1週間ごとに行った。(2)骨髄移植:C3H/HeNの大腿骨より骨髄、脾臓よりリンパ球を採取。全身に9Gyの照射を行ったB6C3F1の尾静脈より注入した(3)HGFの導入:導入にはHVJリポゾーム法を用いて行った。(結果)(1)骨髄が移植されたかフローサイトメトリーで確認した。BMT後4週間、4ヶ月のマウスを対象とし骨髄および末梢血リンパ球(脾細胞)について検定したとこち、すべての個体においてほぼ100%のキメラを形成し、長期間にわたり継続していた。(2)腫瘍移植後4週目において平均腫瘍体積(mm3)はコントロール群1263.6、TBI群980.4、BMT群24.3、BMT+HGF群80.6と骨髄移植により腫瘍の発育は有意に抑制された。(3)BMT群ではHE染色にて小腸縦毛、大腸杯細胞の部分的消失、肝臓中心静脈周囲へのリンパ球の浸潤を認め、GVHDの所見を認めたが、BMT+HGF群では軽度GVHD所見を認めるのみであり、HGFによるGVHDの抑制を認めた。現在これらの結果を発展させるべく肝移植モデルの確立を行っている。

B6C3F1にHep1Aを移植した群をコントロール群、これに9Gyの全身放射線照射(TBI)を行ったものをTBI群、骨髄移植を施した群をBMT群、さらにHGFを導入したものをBMT+HGF群とした。腫瘍を移植した日をDAY0としHGFはDAY4,11,18,25に各100μg導入、DAY7に全身放射線照射(TBI)9gyと骨髄移植を行った。2、骨髄移植:C3H/HeNの大腿骨より骨髄、脾臓よりリンパ球を採取。全身に9Gyの照射を行ったB6C3F1の尾静脈より注入した。3、HGFの導入:導入にはHVJリポゾーム法を用いて行った。導入量は1回100μgとした。大腿内側に筋肉注射にて行った。4、摘出した皮下腫瘍を組織学的に解析行った。(結果)1、骨髄が移植されたかフローサイトメトリーで確認した。BMT後4週間、4ヶ月のマウスを対象とし骨髄および末梢血リンパ球(脾細胞)について検定したところ、すべての個体においてほぼ100%のキメラを形成し、長期間にわたり継続していた。2、腫瘍移植後4週目において平均腫瘍体積(mm3)はコントロール群1263.6、BMT+HGF群80.6と骨髄移植により腫瘍発育は有意に抑制された。3、BMT群ではHE染色にて小腸縦毛、大腸杯細胞の部分的消失、肝臓中心静脈周囲へのリンパ球の浸潤を認め、GVHDの所見を認めたが、BMT+HGF群では軽度の所見を認めるのみであり、HGFによるGVHDの抑制を認めた。4、酵素抗体および蛍光抗体を用いた免疫染色で、腫瘍内にdonor由来のリンパ球が証明された。現在さらにCTL assayを行い、donorリンパ球の関与を証明するとともに肝移植モデルでの検討を行っている。
ヒト脂肪由来幹細胞シートを用いた糖尿病足潰瘍の新規治療法の開発

糖尿病足病変(足潰瘍、足壊疽)は神経障害や血管障害を合併した破壊的病変で、自覚症状に乏しく早期発見が困難であり、易感染性かつ難治性である。患者数は年々増加しており、糖尿病診療における大きな問題の一つとなっている。症状が進行すると下肢切断を余儀無くされ、その生命予後は不良であるため、早期に創傷治癒を促す新規治療法の開発が求められているが、有効な治療法は確立されていない。そこで、細胞シート工学を用いた再生医療と現在用いられている人工真皮を組み合わせ、有効な治療法の確立を目標とした。我々は、すでに作製に成功しているラット脂肪由来幹細胞シートと人工真皮を併用した創傷治癒促進について、肥満2型糖尿病モデルラットの他家移植で成果を示したが(KatoらDiabetes 2015)、実験における再現性、確実性を重視し、プロトコルの詳細な手順、注意点等を細かに記載した論文を発表し、手順の映像も示した(KatoらJournal of Visualized Expreriments 2017)。また、当研究チームの濱田を筆頭に、5名のヒト脂肪細胞から抽出した脂肪幹細胞において、染色体検査、自己複製能、多分化能、表面抗原マーカーの確認、培養上清における成長因子の定量解析、細胞増殖率、生存率、剥離試験を施行し、評価を行った。作製したヒト脂肪由来幹細胞シート(hASCシート)を肥満2型糖尿病モデルラットに移植を施行し、hASCシート作製のプロトコルを確立することに成功した(HamadaらRegenerative Therapy 2017)。肥満2型糖尿病モデルラットの創部において、hASCシートは異種移植で有意な治癒促進が観察された。今後は、hASCシートの長期的な安全性確認と、ヒト臨床治験を見据えた大動物実験への移行を検討している。我々は、すでに作製に成功しているラット脂肪由来幹細胞シートと人工真皮を併用した創傷治癒促進について、肥満2型糖尿病モデルラットの他家移植で成果を示したが(KatoらDiabetes 2015)、実験における再現性、確実性を重視し、プロトコルの詳細な手順、注意点等を細かに記載した論文を発表し、手順の映像も示すことが出来た(KatoらJournal of Visualized Expreriments 2017)。また、当研究チームの濱田を筆頭に、5名のヒト脂肪細胞から抽出した脂肪幹細胞において、in virtoにおける評価を行うことが出来た。作製したヒト脂肪由来幹細胞シート(hASCシート)を肥満2型糖尿病モデルラットに移植を施行し、hASCシート作製のプロトコルを確立することに成功した点においても、2017年度までは、経過としては順調と考えている(HamadaらRegenerative Therapy 2017)。肥満2型糖尿病モデルラットの創部において、hASCシートおよび人工真皮の併用は異種移植で有意な治癒促進が観察されたため、ヒト臨床治験への前進と考える。2018年度は、研究代表者の妊娠による体調不良、出産、育児などで研究を一時中断としたが、体調が回復した後は研究を再開する予定である。ヒト脂肪由来幹細胞シート(hASCシート)の移植に関しては、4週間までの評価しか行えていないため、12週間を目標とした長期的な評価を検討していく。また、同時に、移植細胞の分化運命をたどることの施行も検討する。糖尿病ラット由来の脂肪、正常ラット由来の脂肪について、各々で細胞シートの作製を試みたが、糖尿病ラットにおける細胞シートの作製は成功しなかった。この点において、今後、他家移植を推進していく上で重要な理由となり得ると考えるため、原因の解析を検討したい。そして、ヒト臨床治験を見据えた大動物実験への移行を検討している。

我々は、すでに作製に成功しているラット脂肪由来幹細胞シートと人工真皮を併用した創傷治癒促進について、肥満2型糖尿病モデルラットの他家移植で成果を示したが(KatoらDiabetes 2015)、実験における再現性、確実性を重視し、プロトコルの詳細な手順、注意点等を細かに記載した論文を発表し、手順の映像も示すことが出来た(KatoらJournal of Visualized Expreriments 2017)。また、当研究チームの濱田を筆頭に、5名のヒト脂肪細胞から抽出した脂肪幹細胞において、in virtoにおける評価を行うことが出来た。作製したヒト脂肪由来幹細胞シート(hASCシート)を肥満2型糖尿病モデルラットに移植を施行し、hASCシート作製のプロトコルを確立することに成功した点においても経過としては順調と考える(HamadaらRegenerative Therapy 2017)。肥満2型糖尿病モデルラットの創部において、hASCシートおよび人工真皮の併用は異種移植で有意な治癒促進が観察されたため、ヒト臨床治験への前進と考える。糖尿病足病変(足潰瘍、足壊疽)は神経障害や血管障害を合併した破壊的病変で、自覚症状に乏しく早期発見が困難であり、易感染性かつ難治性である。患者数は年々増加しており、糖尿病診療における大きな問題の一つとなっている。症状が進行すると下肢切断を余儀無くされ、その生命予後は不良であるため、早期に創傷治癒を促す新規治療法の開発が求められているが、有効な治療法は確立されていない。そこで、細胞シート工学を用いた再生医療と現在用いられている人工真皮を組み合わせ、有効な治療法の確立を目標とした。我々は、すでに作製に成功しているラット脂肪由来幹細胞シートと人工真皮を併用した創傷治癒促進について、肥満2型糖尿病モデルラットの他家移植で成果を示したが(KatoらDiabetes 2015)、実験における再現性、確実性を重視し、プロトコルの詳細な手順、注意点等を細かに記載した論文を発表し、手順の映像も示した(KatoらJournal of Visualized Expreriments 2017)。また、当研究チームの濱田を筆頭に、5名のヒト脂肪細胞から抽出した脂肪幹細胞において、染色体検査、自己複製能、多分化能、表面抗原マーカーの確認、培養上清における成長因子の定量解析、細胞増殖率、生存率、剥離試験を施行し、評価を行った。作製したヒト脂肪由来幹細胞シート(hASCシート)を肥満2型糖尿病モデルラットに移植を施行し、hASCシート作製のプロトコルを確立することに成功した(HamadaらRegenerative Therapy 2017)。肥満2型糖尿病モデルラットの創部において、hASCシートは異種移植で有意な治癒促進が観察された。今後は、hASCシートの長期的な安全性確認と、ヒト臨床治験を見据えた大動物実験への移行を検討している。我々は、すでに作製に成功しているラット脂肪
日本軍政期のインドネシア華人社会研究

平成30年度は、前々年度までに入手していた『共栄報(Kung Yung Pao)』華語版・マレー(ムラユ)語版のデータ(インドネシア国立図書館所蔵の同資料簡易撮影データ、および同図書館で1985年に作成されたマイクロフィルムの複製データ)を基に、『共栄報』の紙面分析を進めた。56月には、朝日新聞東京本社所蔵のジャワ新聞会関連資料の精査を進めた。ジャワにおける新聞発行業務は、軍からの委託を受けた朝日新聞社が一手に握っており、ジャワの新聞各紙(『共栄報』を含む)を管理・監督するものとしてジャカルタに設置されたジャワ新聞会からは、東京の朝日新聞本社宛に定期的に報告が上げられていた。それら報告資料の精査の結果、『共栄報』の発行部数、社員数や会社資産等の情報を具体的に把握することができた。上記に加え、日本軍政を経験した華僑当事者の回想録や档案資料等を渉猟した結果、『共栄報』華語版の発刊の経緯やそれに関与した人物について、(資料の性質上断定するには至らないものの)いくつかの可能性を示すことができた。上述の一連の成果は、東南アジア学会2018年度第1回関東例会、および南山大学外国語学部アジア学科セミナー「『国民国家』インドネシア再考」において、報告を行った。平成30年度の成果として特筆すべきは、『共栄報』を復刻刊行したことである。冒頭で述べた前々年度までに入手済みであったデータ中には、歪みやピンぼけ等のため判読不能の状態のものが相当な割合で混在していたため、インドネシア国立図書館および出版社と調整を行い、8月に改めて高精細撮影を行った。こうして得られたデータに、詳細な解題(『共栄報』の発行の背景やその経緯、社内編集体制や紙面の内容の分析を含む。解題は日本語に加え中国語訳を収録)を付して、台湾(漢珍数位図書)と日本(ゆまに書房)から復刻刊行(全32巻+別冊1)するに至った。平成30年度は、『共栄報』の紙面分析を一層進めた。年度末時点で、華語版紙面に登場する華僑系の主要組織、学校、およびそこで要職を占めている者として言及される人名(約1800名)を網羅的に抽出し、一覧にまとめた。一般に1940年代というのは、ジャワに限らずインドネシア全般の華僑史研究を進めていく上で、資料等の欠如から「ミッシングリンク」とされてきたが、膨大な量にのぼる上述の紙面抽出情報は、これまで謎に包まれてきた軍政下ジャワの華僑社会内外の生活実態・政治過程を今後具体的に明らかにし、かつその前後の時代との連続性や断絶を検討していく際に、不可欠の資料となるだろう。また、朝日新聞東京本社所蔵のほぼ未整理状態の資料(段ボール4箱分)へのアクセスにより、これまでおぼろげながらにしか分からなかった『共栄報』の刊行経緯や社内編集体制の内実解明に一段と踏み込むことができた。これらの成果は、2度の研究会で仔細に報告し、インドネシア華人史や日本軍の南方軍政研究の文脈で新たな知見を提供できた。これまでの紙面分析および周辺資料の精査結果を踏まえ、『共栄報』の解題を上梓し、その中国語訳(山田清・訳)を付して、『復刻共栄報19421945』(漢珍数位図書/ゆまに書房, 2019年3月,全32巻+別冊1)として、台湾・日本から同時に刊行した。平成31年度は、『共栄報』マレー語版の精査を進め、紙面に登場する華僑系の主要組織、学校、およびそこで要職を占めている者として言及される人名のリストアップ(および華語版との照合)作業を進めるとともに、データ公開を行う。また、解題の英訳作業を進め、より幅広い読者に向け資料紹介に努める。最終年度の作業として、これまでの研究成果を統括する作業を行う。本研究は、日本軍政下のインドネシア(旧蘭領東インド)における中華系住民(以下、華人)社会の具体的動向を、当時ジャワで華人向けとして発刊されていたものとしては唯一の日刊紙である『共榮報(Kung Yung Pao)』(華語版・ムラユ語版)の分析をもとに明らかにすることを目的としている。平成28年度は、マラナタ・キリスト教大学(Universitas Kristen Maranatha)のSugiri Kustedja教授協力のもと、インドネシア国立図書館(Perpustakaan Nasional RI)所蔵の『共榮報』をすべて撮影し、データとして入手することができた。所蔵資料に一部欠落があったものの、次年度以降に同紙華語版およびムラユ語版を相互対照しつつ読み解くことで、これまで具体的動向がほとんど明らかではなかった同時期の華人社会の様子の一端を、再構築することが可能になるものと思われる。平成28年度の成果としては、まず、本研究課題が主要な対象とする時代(194245年)と(華人社会をめぐる動向という観点では)連続性をもって捉えるべきスカルノ時代の末期(1950年代末1960年代初頭)において、華人社会内で流通していた「帰国」(インドネシアから中国本土への移動)をめぐる言説のあり様を、スラバヤで刊行されていた週刊誌『リバティー(Liberty)』を読み込むことを通して具体的に整理・検討した。

また、インドネシア・ナショナリズムの黎明期から日本軍政期を挟み、さらにはスカルノ期、スハルト期、そしてポスト・スハルト期の現在にかけて、「民族=国民(bangsa)」を代表するものとしての「英雄」概念がいかに構築され、かつ「国家英雄」としていかに制度化され今に至っているかを、時代・地域の特性に注意を払いつつ多角的に論じた共編著を刊行した。今年度は、本研究の基盤となる『共榮報』の写真データを(一部欠落はあるものの)入手することができ、今後読み込み分析するための体制が整ったといえる。また、過年度から進めてきた本研究課題に関連する研究の成果を複数点公開することができた。具体的には、特に以下の2つが大きな成果である。1【論文】「「帰国」をめぐる言説空間ー1960年前後の『リバティー(Liberty)』誌の解題」日本軍政期を経て独立した後のインドネシア社会に暮らす華人たちが直面した「帰国」をめぐる問題構成について、同時代の資料に依拠しつつ当時の言説空間の一端を再構成する作業に取り組んだ。この論文が扱う時代は、本研究課題が主要対象とする時代よりも10数年後のものではあるが、華人社会内部の政治的立場の分化を捉える上では両時代は連続性をもって考えるべきであり、その意味で本研究課題を肉付けする成果であるといえよう。また、本研究課題が今後主要に依拠する予定の研究手法の確立という面からも、本論文の試みは大いに資する成果であるといえる。2【共編著】『「国家英雄」が映すインドネシア』(木犀社, 2017年)本論集は、蘭領期、日本軍政期を経て独立を達成したインドネシアにおいて、その担い手とされる「民族=国民」を代表する者として顕彰される存在としての「国家英雄(Pahlawan Nasional)」にかかわる表象や制度が(当の「民族=国民」概念の形成と同時並行的に)いかに形成され、また今現在いかに運用されているかについて、幅広く論じたものである。この中で本報告者は、(i)全体を俯瞰する序論を共同執筆するとともに、(ii)華人系の人物を国家英雄の殿堂に仲間入りさせるべく努めたある歴史学者の試みを取り上げつつ、インドネシア史の記述法をめぐる問題系の中に位置づける章を執筆した。平成29年度は、前年度にすでに入手したインドネシア国立図書館所蔵の『共栄報(Kung Yung Pao)』(華語版・ムラユ語版)の現物撮影データに加え、同図書館で1985年に作成された同資料のマイクロフィルムの複製データを新たに入手することができた。これらデータを基に、記事の整理と読み込み作業を進め、主要記事一覧に関するExcel表を作成するとともに、内容分析を行った。また同時に、国内外に存する日本軍政期ジャワの情報統制・新聞発行に関する資料を可能な限り網羅的に収集した。特に、89月にはジャカルタおよび中ジャワ州において文献調査を実施するとともに、華人団体関係者や日本軍政期に関する研究者などと意見交換を行った。上述の文献調査等の過程で入手した資料群については随時読み込み作業を進め、発行形態や編集体制などに関し依然謎の多い『共栄報』について、その実態把握に努めた。これら一連の作業の結果を踏まえ、12月から『共栄報』の解題執筆に着手した。執筆作業は3月末の時点では未だ終わっていないが、その成果の一部については、平成30年度初頭には東南アジア学会関東例会において報告予定である。また平成29年度は、軍政期のジャワの華人の置かれた状況をより包括的な観点から把握・整理することに努めた。その成果の一部は、編集幹事として携わった『華僑華人の事典』(丸善出版, 2017年11月刊)の第1部第2章「華僑華人の経済」(編集担当:津田浩司・杉村美紀)、第1部第3章「華僑華人の政治」(編集担当:王雪萍・津田浩司)、および第2部第3章「東南アジア」(編集担当:
肝臓における周産期の糖・脂質代謝ダイナミズムの検討

当院倫理委員会で承認され、同意を得られた慢性胆汁うっ滞患者9名、対照患者4名の血清および肝組織を用いてFGF19シグナル経路の解析を行った。その結果、慢性胆汁うっ滞患児の血清FGF21、FGF19濃度は増加していた。またFGF19の肝細胞での異常産生を明らかにした。高胆汁酸血症においてもCYP7A1の合成は抑制されておらず、SHPも有意に高かった。FGF19受容体であるFGFR4とKLBは発現が増加し、FGFR4のリン酸化も亢進していたが、ERKのリン酸化は抑制されていなかった。以上より、慢性胆汁うっ滞下では、高FGF19血症となるが、CYP7A1発現を抑制できていないことが示唆された。前年度に、乳児期より体重増加不良、成長障害、脂溶性ビタミン吸収障害をしばしば来す、胆汁うっ滞性肝障害罹患児における糖・脂質代謝のダイナミズムについて検討するべく当施設倫理委員会に臨床研究計画書を提出し承認を得た。対象は、当院にて胆汁うっ滞性肝障害のため肝移植を実施した胆道閉鎖症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症の患児とし、肝芽種やオルニチントランスカルバニラーゼ欠損症にて肝移植を行った児を対象とした。同意を得て得られた血清と肝移植時の摘出肝を用い、FGF21に加え同様にホルモン用の作用を示し体内の胆汁酸プールを制御するFGF19の測定をELISAにて行った。すると、生理的には肝臓では発現の少ないはずのFGF19が胆汁うっ滞肝では著明に高値を示しており、胆汁酸の律速酵素であるCYP7A1の発現も低下していた。生理的にはFGF19の産生は小腸上皮細胞で行われているが、慢性胆汁うっ滞肝で実際にFGF19の産生が行われているか組織insitu hybridization法および組織免疫染色法を用いて調べると、実際に、肝細胞において産生が行われていた。同様に、FGF21に関しても胆汁うっ滞群で明らかに高い傾向があった。さらに、その肝臓におけるシグナル伝達経路につき調べた所、FGFR4および共受容体KLBの発現がdown regulateしており、細胞内ERKのリン酸化も低下していた。現在、その詳細なメカニズムに付き検討を行っている。子宮内発育遅延マウスに関しては、生後8週齢のマウスを交配し膣栓を確認した後、8%蛋白制限食群と20%蛋白食(通常食)群の2群に分け、飼育を行った。現在、引き続きサンプリングを行い基礎データ収集中である。当院倫理委員会で承認され、以下の患者に対し研究内容を説明し同意を得た。胆汁うっ滞患者として胆道閉鎖症9名、対照として非胆汁うっ滞患者4名(肝芽腫2名、肝血管腫1名、OTC欠損症1名)の正常部位を使用した。血清、肝組織中のFGF21,19蛋白濃度をELISA法にて測定。レーザーマイクロダイセクション法を用いて肝小葉を切り出し抽出したRNAを用いてcDNAを合成し、定量PCRを行った。また、FGF19の肝組織における発現を証明するためin situ Hybridizationおよび免疫染色を行った。FGFシグナル伝達分子のリン酸化に関しては、免疫沈降ウエスタンブロット法を用いて行った。その結果、1肝移植時における慢性胆汁うっ滞患児の血清FGF21およびFGF19濃度はともに増加していた。2慢性胆汁うっ滞肝においてFGF19の少なくとも一部は肝細胞が異常に産生していることを初めて明らかにした。3高胆汁酸血症においても肝臓では胆汁酸合成律速酵素CYP7A1の合成は抑制されていなかった。4核内転写因子FXR/SHPは有意に増加し、その下流にあるSHPも有意に高かった。同様にCYP7A1の上流転写因子であるLRH-1、HNF4αも同様に発現増加を認めた。5高FGF19血症の状況下においてFGF19の受容体であるFGFR4およびKLBは発現が増加し、FGFR4のリン酸化も亢進していた。6その下流のERKのリン酸化は抑制されていなかった。以上より、慢性胆汁うっ滞の状況では、高FGF19血症となり肝細胞表面においてFGF19の受容体であるFGFR4およびKLBは発現が増加し、FGFR4のリン酸化も亢進するが、その下流のERKのリン酸化は抑制されておりこのことから、ERK経路より下流に位置するSHPがCYP7A1発現を抑制できていないことが示唆された。

以上より、慢性胆汁うっ滞下では、高FGF19血症となるが、CYP7A1発現を抑制できていないことが示唆された。最初に、子宮内発育遅延マウスの作製に着手した。基礎データを集めるため、生後8週齢のマウスを交配し膣栓を確認した後、8%蛋白制限食群と20%蛋白食(通常食)群の2群に分け、飼育を行った。新生仔の身長、体重を測定し、子宮内発育遅延のデータを確認後、各臓器のサンプリングを行う予定であった。しかし、妊娠中のストレスからくると思われる死産や母親マウスが新生仔を食べてしまうといった問題に見舞われ、サンプリングが遅延しているため、マイクロアレイ解析には至っていない。次に、子宮内発育遅延と同様に乳児期より体重増加不良、成長障害、脂溶性ビタミン吸収障害をしばしば来す、胆汁うっ滞性肝障害罹患児における糖・脂質代謝のダイナミズムについて検討するべく当施設倫理委員会に臨床研究計画書を提出し承認を得た。対象は、当院にて胆汁うっ滞性肝障害のため肝移植を実施した胆道閉鎖症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症の患児とし、肝芽種やオルニチントランスカルバニラーゼ欠損症にて肝移植を行った児を対象とした。同意を得て得られた血清と肝移植時の摘出肝を用い、FGF21に加え同様にホルモン用の作用を示し体内の胆汁酸プールを制御するFGF19の測定をELISAにて行った。すると生理的には肝臓では発現の少ないFGF19が胆汁うっ滞肝では著明に高値を示しており、新たな知見が得られた。FGF21に関しても胆汁うっ滞群で明らかに高い傾向があり、現在、さらに肝臓内における糖・脂質代謝に関わるシグナル伝達経路につき、どの経路が活性化され、また抑制されているかにつきmRNAレベルおよびタンパクレベルにて解析を行っている。血清および肝組織中のFGF21、FGF19濃度測定のためELISA法によるアッセイ系を確立し、さらにヒトFGF19およびFGF21をPCRにてクローニングした後、肝組織におけるin situ hybridization法と免疫染色の系も確立した。これらを用いて解析を行うと、生理的には肝臓では発現のないはずのFGF19が胆汁うっ滞肝では著明に高値を示しており、組織in situ hybridization法および組織免疫染色法を用いて調べると、実際に、肝細胞において産生が行われていることを初めて明らかに出来た。そのため、当面、こちらの成果発表を優先に研究を進めている。子宮内発育遅延マウスの作製に関しては、生後8週齢のマウスを交配し膣栓を確認した後、8%蛋白制限食群と20%蛋白食(通常食)群の2群に分け、飼育を行った。現在、引き続きサンプリングを行い基礎データ収集中である。まず、血清および肝組織中のFGF21、FGF19濃度測定のためELISA法によるアッセイ系を確立した。次に発現細胞の同定のために、in situ hybridizationを行う事とし、プローブ作成のためhuman FGF21およびFGF19のPCRクローニングを行った。これをもとにプローブ作成を行い、各組織においてin situ hybridizationを行い、発現細胞を確認する。子宮内発育遅延マウスの作製に関しては、妊娠中のストレスからくると思われる死産や母親マウスが新生仔を食べてしまうといった問題に見舞われ、サンプリングが遅延している。現在、実験系を安定化させるべく、トラブルシューティング中である。まず、ヒト胆汁うっ滞性疾患に関するFGF19の知見は、今年度中に実験結果をまとめ、論文作成を行うこととする。また、慢性胆汁うっ滞肝において、何故、FGF19およびFGF21の産生が上昇するのか、そのメカニズムについても検討を行っていく予定である。