hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト記憶を媒介する意識と情動の脳内機構の解明：大脳疾患による多角的検討

本研究の目的は、大脳疾患を有するさまざまな症例を対象とした本質的・相互作用的アプローチによる、エピソード記憶における意識と情動の脳内機構の解明であった。3年間の研究を通して以下の結果が得られた。第一に、健忘症例では、自伝的記憶の想起意識が健常者とは異なる(鮮明度が伴わない)可能性があること、第二に、パーキンソン病例では、記銘時の意味的、情動的処理による記憶の促進がみられないこと、第三に、健忘症例でみられた作話現象は、注意機能や時間見当識、長期記憶成績の低下と関連すること、であった。これらの結果から、エピソード記憶における意識や情動に関連する脳内機構とその障害機序が明らかにされた。本研究課題遂行2年目にあたる平成25年度には,引き続き,大脳疾患を有するさまざまな症例(健忘症例,自閉症例,依存症例,パーキンソン病例)を対象としたヒト記憶,特にはエピソード記憶機能への本質的,および相互作用的アプローチによる検討が行われた.本質的アプローチによる検討では,エピソード記憶を想起する際の想起特性を明らかにすることが,また相互作用的アプローチによる検討では,エピソード記憶の想起に促進的な影響を与える要因の解明が焦点であり,それらと関連する脳内機構を明らかにすることが研究の目的であった.本質的アプローチにおいては,前年度に得られた健忘症例におけるエピソード記憶想起時の特性を踏まえ,健忘を呈する多数例の検討のための準備が進められた.作話(意図なしに表出される記憶内容の変造)を伴う健忘症例を対象とした私たちの予備的検討では,作話を呈した記憶情報の文脈(いつ、どこで)や事象(何が)の想起の誤りが,注意機能および長期記憶成績の低下と関連していた.このことから,エピソード記憶において重要である文脈情報がどのように想起されるのか,中でも長期記憶における時間情報の想起に焦点を絞った検討をすることを目的とした,多数例による検討を行うこととした.現在そのための準備が進められている.相互作用的アプローチにおいては,前年度に続き,記憶に促進的影響を及ぼす要因とその脳内機構解明のため,パーキンソン病例、および健常被験者を対象としたデータを取得した.現在,症例22名,健常被験者24名のデータを取得しており,結果において,健常被験者では記銘時の情動処理や意味処理による,後の記憶の促進効果がみとめられた一方で,パーキンソン病例ではその効果がみとめられなかった.このことは,ドパミンの減少による前頭前野-線条体システムの不全によるものと考えられた.本研究の目的は、大脳疾患を有するさまざまな症例を対象とした本質的・相互作用的アプローチによる、エピソード記憶における意識と情動の脳内機構の解明であった。日常のあらゆる活動を支えるヒト記憶の脳内機構の解明は,私たちの生活の質的向上に重要である.本研究の目的は,大脳疾患を有する症例を対象とした,ヒトの記憶,特に,エピソード記憶(生活記憶とも言う)の1本質的,2相互作用的視点に立った脳内機構の解明にあった.1の本質的アプローチでは,エピソード記憶を想起する際の想起特性を,また2の相互作用的アプローチでは,エピソード記憶の想起に促進的な影響を及ぼす要因を解明し,1,2の脳内機構を明らかにすることが研究の内容であった.私たちが行った1の健忘症3例における自伝的記憶(エピソード記憶)の再生課題では,再生された自伝的出来事ごとに,15項目(7件法)で構成された質問紙を実施し,記憶がどのように想起されたのかを評定するものであった.結果,健常者と比較して健忘症例では,記憶再生における量的な低下がみられ,また同時に,質的違いも示された.健常者では,「記憶への信念」,「視覚イメージなどのさまざまな感覚処理」,および「出来事が持つ特性」(15項目はこの3つのグループ分けが可能)の3つの項目グループ間で高い相関を示したが,健忘症例では部分的にのみ相関を示した.健常者とのこのような違いが脳のどの領域と関連するのか,今後さらなる検討が必要となった.また,私たちが行った2の記憶に促進的な影響を及ぼす要因(従来,情動処理や意味処理)の予備的検討では,情動システムが障害されているパーキンソン病例を対象に実験を行った.結果,パーキンソン病例では,学習段階での情動判断(処理)がその後の記憶成績の促進にはつながらず,このことにおいて,情動システムを担う前頭ー扁桃体領域の重要性が示唆された.当該年度に得られた結果は,今後も引き続き,本研究目的に沿った研究を進めるにあたり,その礎になると考えられた.本研究課題の目的は、大脳疾患を有するさまざまな症例(健忘症例、自閉症例、依存症例、パーキンソン病例)を対象とした、1)本質的アプローチ(エピソード記憶の想起特性を中心とした検討)、2)相互作用的アプローチ(エピソード記憶想起に促進的な影響を与える要因の検討)による、エピソード記憶機能の脳内機構の解明にあった。本研究課題遂行

最終年にあたる平成26年度には、25年度の計画で遅れがでていた以下の内容が遂行された。1)本質的アプローチによる健忘症例を対象とした検討では、健常者における過去14年間の自伝的記憶再生時の特性が示唆された。「その出来事は何年前にあったのか」との記憶中の時間の想起には、その出来事の記憶情報への、確信度、鮮明度、情動的強さ、個人的重要度、および繰り返し度がそれぞれ関与していることが示された。出来事が生起した時間の記憶の想起と、このことに影響を及ぼす複数要因の詳細な検討は今日までほとんどなされていなことから、本研究の意義は大きい。1)本質的アプローチによる自閉症を対象とした検討では、時間や順序の記憶と、より短い時間の知覚(30,60、90秒)の関連性を調べた。データは患者群、健常群それぞれ10名程度取得済みであるが、現段階では、患者群特異的な傾向を見いだせていない。さらなるデータの取得によって患者群の特異性を解明する。3年間の研究を通して以下の内容を得ることができた。1健忘症例では、自伝的記憶の想起の特性が健常者とは異なる(鮮明度が伴わない)可能性、2パーキンソン病例では、記銘時の情動的処理や意味的処理による記憶の促進がみられないこと、3健忘症例でみられた作話現象は、注意機能や長期記憶成績の低下と関連すること、4健常者における自伝的記憶の時間の想起には、記憶情報そのものへの確信度や鮮明度などの要因が関連すること、などが示された。神経科学計画の遅れは,健忘症例およ自閉症例を対象とした検討で出ている.その理由として,健忘症例では,協力病院でのリクルートを継続して行ってはきたが,対象となる症例を確保することが困難であった.今現在,協力病院の枠を広げており,十分に検討を行える対象数を確保できている.また自閉症例でも同様に,症例確保が困難であったが,今現在,確保ができている.H26年度には,計画が遂行される予定である.本研究は,さまざまな脳領域に大脳疾患を有する症例を対象としている.対象症例は,健忘症例,依存症例,自閉症例,パーキンソン病例,意味性認知症例である.特に,健忘症例,自閉症例,意味性認知症例における患者選定が遅れている(症例が不足しているため).このことによって,計画遂行に遅れが出ている.最終年度であるH26年度には,本研究課題計画に沿って推進していく予定である.具体的には,1遅れの出ている健忘症例,および自閉症例を対象とした,エピソード記憶想起時の特性の検討のための準備を今年度8月までには終え,期間内にデータ収集および解析,成果発表を行う.次に2パーキンソン病例を対象とした検討における,データ収集を終え,解析および成果発表,論文作成に着手する.3データ取得中である,依存症例におけるエピソード記憶の特性の検討においては,現在,症例のデータ収集は終えている.残りの期間内に,症例における結果解析をすすめると同時に,性別,年齢をマッチングさせた健常被験者のデータ収集および解析,成果発表を行う.4同じくデータ取得中である,
小児運動器疾患に対する治療的電気刺激

1:電子筋肉運動器ニューロテックによる治療的電気刺激(TES)訓練6例の痙直型脳性麻痺を対象としてTES訓練をおこなった。刺激は、上肢では肘屈筋群と筋群、下肢では大腿四頭筋と総腓骨神経をそれぞれ交互に刺激した(動筋と括抗筋の交互刺激)。治療効果の判定は、膝関節と足関節の関節可動域(ROM)の変化を徒手的に測定することに加えて、二次元動作解析装置(Quick Mag)による可動域の変化を計測した。膝振り子試験時の筋の同時収縮の状態を刺激前と刺激後に測定した。これらの結果を短期間のTES(治療開始1週間以内)と、長期間のTES(治療開始1ヶ月以上)に分けて比較検討した。3例の脳性麻痺を用いた短期TESの結果では、全例に痙性の減弱による足関節ROMの改善が、Quick Magによって示された。また膝振り子試験では、刺激前に認められた動筋と括抗筋の同時収縮が、刺激後では括抗筋の収縮が減弱しているという結果が得られた。他の3例の長期TESでは、全例に膝関節と足関節ROMの改善が、徒手的測定によって認められた。2:貫皮電極式機能的電気刺激(FES)によるTES訓練効果痙直型脳性麻痺1例、脳血管障害2例、脊髄損傷1例で貫皮電極を用いた麻痺肢へのTES訓練を1年以上の長期にわたり行った。刺激パターンでは平成7年度の本研究で作成したものを用いた。上下肢ともに痙性の軽減と随意性の改善がいずれの症例でもみられた。ことに下肢へのTESでは、歩行時の2次元動作解析の結果、体幹の安定性、歩容の改善、歩行速度の改善などがみられた。これらのことから、TESによる筋や神経の刺激によって求心性神経が刺激され、脊髄を介して括抗筋への抑制メカニズムが働いた結果、痙性の減弱によるROMの改善や随意運動の改善が認められたものと考えられた。1:健常人被験者における四肢の動作解析治療的電気刺激(TES)の刺激パターンを決定するため、四肢の動作筋電図解析及び二次元動作解析を行った。筋電図解析は、経皮的筋内電極を健常被験者の四肢の筋に留置して行った。今回解析した四肢動作は、肩の屈曲外転動作、肘屈伸動作、手の握り動作、下肢の起立・歩行動作である。その結果、各動作毎に、当該関節運動に関与する筋に関して、筋放電量の大小とその筋放電パターンより重要度を分類し、TESに用いる筋群を決定した。また、これらの筋群の特定動作における筋電図パターンより、TESの刺激パターンを作成し、我々の開発した機能的電気刺激(FES)装置に入力した。表面式電気刺激装置によるTES中等度痙直型脳性麻痺児2列に対し、下肢の痙性をとる目的で今回導入した電気刺激装置ニューロテックによりTESを行った。この際刺激を与えた筋は大腿四頭筋、大殿筋、総腓骨神経、脛骨神経である。その結果、下肢の痙性が、TES訓練2週間程度で軽減することが、二次元動作解析および筋電図学的解析で判明した。その結果、歩幅、歩行速度が増大し、歩行時バランスも改善するのが観察された。

刺激は、上肢では肘屈筋群と伸筋群、下肢では大腿四頭筋と総腓骨神経をそれぞれ交互に刺激した(動筋と括坑筋の交互刺激)。治療効果の判定は、膝関節と足関節の関節可能域(ROM)の変化を徒手的に測定することに加えて、二次元動作解析装置(Quick Mag)による可動域の変化を計測した。膝振り子試験時の筋の同時収縮の状態を刺激前と刺激後に測定した。これらの結果を短期間のTES(治療開始1週間以内)と、長期間のTES(治療開始1ケ月以上)に分けて比較検討した。3例の脳性麻痺を用いた短期TESの結果では、全例に痙性の減弱による足関節ROMの改善が、Quick Magによって示された。また膝振り子試験では、刺激前に認められた動筋と拮抗筋の同時収縮が、刺激後では拮抗筋の収縮が減弱しているという結果が得られた。他の3例の長期TESでは、全例に膝関節と足関節ROMの改善が、徒手的測定によって認められた。2:貫皮電極式機能的電気刺激(FES)によるTES訓練効果痙直型脳性麻痺1例、脳血管障害2例、脊髄損傷1例で貫皮電極を用いた麻痺肢へのTES訓練を1年以上の長期にわたり行った。刺激パターンでは平成7年度の本研究で作成したものを用いた。上下肢ともに痙性の軽減と随意性の改善がいずれの症例でもみられた。ことに下肢へのTESでは、歩行時の2次元動作解析の結果、体幹の安定性、歩容の改善、歩行速度の改善などがみられた。これらのことから、TESによる筋や神経の刺激によって求心性神経が刺激され、脊髄を介して拮抗筋への抑制メカニズムが働いた結果、痙性の減弱によるROMの改善や随意運動の改善が認められたものと考えられた。
低緯度MIZ向けの海氷熱力学モデル開発とオホーツク海海氷海洋結合シミュレーション

海洋の中規模渦(数百km)を解像する格子サイズでは初めてのオホーツク海における海氷-海洋結合数値シミュレーションを実施した。海洋モデルはPrinceton Ocean Modelベースの3次元、静水圧近似モデルを用いた。海氷モデルでは海氷域を連続体として扱い、弾粘塑性モデルに氷盤間衝突を考慮したモデルを使用した。外力となる気象データには気象庁領域スペクトルモデル客観解析値(1998-2000年)を使用した。昨年度に引き続き、今年度は海氷-海洋間抵抗係数の感度実験と海氷力学モデルの衝突レオロジーの検証実験を行った。成果を二件の論文にまとめ、一件はOcean Dyncamicsに受理され、一件はJournal of Geophysical Researchに投稿中である。今年度はモデル構築、シミュレーションの実施、及び結果の観測との整合、大気-海氷間抵抗係数C_Dの感度実験を目的とした。モデルにより得られた海氷分布は同時期の気象庁海氷解析図とよく対応し、また東サハリン海流の流量も観測とよく対応していた。さらに海氷生産に伴い生産される重く冷たい高密度陸棚水の再現に成功した。モデルで得られた高密度陸棚水の生産量は衛星データや水温塩分観測データによる見積りとよく対応していた。C_Dの感度実験において変動幅はオホーツク海南部沖合にて2002-2005年2月に行った直接計測結果(Fujisaki et al.2009,J.Oceanogr.,accepted.)を元に決定した。感度実験の結果、海氷移動速度及び東サハリン海流の流量はC_Dとともに増えるが、海氷分布はC_Dの影響をほとんど受けないことがわかった。これは比較的暖かい北太平洋海水の影響により南西部の氷縁付近で活発な融解が生じていたためである。このような融解は海氷-海洋間の接触面積に依存する。また接触面積は氷盤大きさが比較的小さい氷縁付近(Marginal Ice Zone,MIZ)で大きくなる。このようなMIZにおける融解をより正確に表現するには接触面積を考慮したMIZ向けの定式化が重要である。本モデル結果を元にMIZ向けの海氷-海洋相互作用の定式化について考察していく予定である。
多国籍企業における生産技術の水平移転の研究

平成30(2018)年度は研究課題「多国籍企業における生産技術の水平移転」に関する文献研究と探索的な事例研究を実施した。まず,文献研究を通じて,生産技術が「作用次元」と「原理次元」の2つの構成概念を使用して理解できるシステム概念であることをつきとめ,その2つの構成概念にそって生産技術システムの類型を導き出した。その生産技術システムとは,「定型生産技術システム」と「非定型生産技術システム」の2つである。本研究はそのうえで,知識移転の概念的枠組みを参考にして,「生産技術システムの要因→生産技術システムの移転過程→生産技術システムの移転の効果」という分析枠組みを構築した。まず,生産技術システムの国際移転(間接移転を含む)の要因としては,(1)生産不確実性の格差,(2)生産技術システムの移転コスト,(3)生産環境システムの類似性,(4)本社の国際経営戦略,(5)移転元における人材育成期待,(6)移転先における人材育成期待,の6つを想定した。ここでは,特に移転元における人材育成期待を生産技術システムの間接移転に特有の要因として認識するにいたった。次に,以上の分析枠組みに基づいて,日本の多国籍企業3社(A社,B社,C社とする)に対するインタビュー調査と探索的な事例研究を行った。A社とB社では本国親工場と海外子工場に対して,C社では本国親工場に対して,それぞれインタビュー調査を実施した。インタビュー調査の実施対象者は,述べ人数でA社では17人,B社では5人,C社では7人になった。その結果,多国籍企業における海外子工場から他の海外子工場への生産技術の「水平移転」は,本国親工場から海外子工場への生産技術の「直接移転」との関わりの中で生じるものであり,特にその「直接移転」を補完するための「間接移転」として生じる経営現象であることをつきとめた。平成30(2018)年度には文献研究と本国親工場へのインタビュー調査だけを実施する予定だった。しかし,研究協力企業のご厚意によって,幸運にも海外子工場に対してもインタビュー調査を実施することができた。文献研究では,「生産技術の間接移転と多国籍企業の古典理論」,「技術移転の理論と展開」,「知識移転の概念的枠組み」,「生産技術の間接移転の分析枠組み」に関する草稿を完成することができた。そのうち,「生産技術の間接移転と多国籍企業の古典理論」については『西南学院大学商学論集』第65巻第4号で公刊することができた。他方,インタビュー調査では,日本の多国籍企業3社(A社,B社,C社とする)に対して,インタビュー調査と探索的な事例研究を行った。そのうち,A社とB社に対しては,両者のご厚意によって本国親工場に加えて海外子工場に対してもインタビュー調査を実施することができた。令和元(2019)年度においては,日本の多国籍企業の海外子工場に対する質問票調査の実施を予定している。質問票調査は日本の多国籍企業における本国親工場と海外子工場の工場長に対して郵送法で実施しようと考えている。海外子工場の工場長に対しては,日本語の質問票に加えて,英語や現地語の質問票も準備して調査を実施したいと考えている。また,いずれの質問票調査に対しても,調査会社の協力を仰いで質問票の回答率を上げるように努めたいと考えている。調査結果が出たら,統計ソフトを使って,海外子工場視点の分析,海外子工場の従業員視点の分析をそれぞれ行い,研究論文にまとめたいと考えている。

しかし,研究協力企業のご厚意によって,幸運にも海外子工場に対してもインタビュー調査を実施することができた。文献研究では,「生産技術の間接移転と多国籍企業の古典理論」,「技術移転の理論と展開」,「知識移転の概念的枠組み」,「生産技術の間接移転の分析枠組み」に関する草稿を完成することができた。そのうち,「生産技術の間接移転と多国籍企業の古典理論」については『西南学院大学商学論集』第65巻第4号で公刊することができた。他方,インタビュー調査では,日本の多国籍企業3社(A社,B社,C社とする)に対して,インタビュー調査と探索的な事例研究を行った。そのうち,A社とB社に対しては,両者のご厚意によって本国親工場に加えて海外子工場に対してもインタビュー調査を実施することができた。令和元(2019)年度においては,日本の多国籍企業の海外子工場に対する質問票調査の実施を予定している。質問票調査は日本の多国籍企業における本国親工場と海外子工場の工場長に対して郵送法で実施しようと考えている。海外子工場の工場長に対しては,日本語の質問票に加えて,英語や現地語の質問票も準備して調査を実施したいと考えている。また,いずれの質問票調査に対しても,調査会社の協力を仰いで質問票の回答率を上げるように努めたいと考えている。調査結果が出たら,統計ソフトを使って,海外子工場視点の分析,海外子工場の従業員視点の分析をそれぞれ行い,研究論文にまとめたいと考えている。平成30(2018)年度においては,北米地域とヨーロッパ地域とアジア地域の海外子工場3工場に対して,海外インタビュー調査を実施する予定であった。しかし,研究協力企業の都合により,アジア地域の海外子工場2工場だけに海外インタビュー調査を実施することになったので,結果的に旅費に残額が生じてしまった。次年度の令和元(2019)年度においては,その旅費の残額と当初の助成金を合わせて使用し,大規模な質問票調査を実施したいと考えている。当初の研究計画では,経費上の制約から海外子工場のみを調査対象とする予定であったが,予算に余裕が生じることになったので,海外子工場で働く現地従業員も調査対象にすることにし,本研究課題である生産技術の間接移転をより多角的に分析するように努めたい。さらに,調査会社にも協力を仰いで,質問票調査の回収率を上げるように努めたい。
心疾患における海馬の活動性の意義の研究

背景:うつ病や認知症といった脳疾患と心不全のような心疾患は相互に悪影響を与え、心脳連関と呼ばれる。うつ病や認知症患者では海馬と呼ばれる脳領域の機能が特異的に低下することが知られている。結果1:海馬の機能を脳血流量の測定によって評価し、心不全患者においても海馬の機能が低下し、うつ症状や認知機能と関連することを示した。結果2:心不全患者において、海馬の機能と相関のある血液マーカーである脳由来成長因子が心不全患者で低下し、うつ症状や認知機能と関連することを示した。結果3:精神的・身体的なストレスが原因とされるたこつぼ心筋症と呼ばれる心疾患が、急性脳幹病変によって引き起こされることを示した。本研究は、平成27年から28年の期間内に、研究1.心不全患者の脳活動に関する縦断研究、研究2.たこつぼ心筋症患者の脳活動に関する縦断研究、研究3.心疾患における海馬の異常の機序に関する研究、の三つの研究を行う予定で申請を行った。研究1については、2016年第80回日本循環器学会学術集会において研究成果について発表を行い、臨床研究部門Young Investigator's Award(優秀賞)を受賞した。研究2については、2015年度日本循環器学会学術集会で研究成果について評価され、循環器臨床研究奨励賞症例報告部門最優秀賞を受賞した。研究3については、まだ研究結果の発表は行っていない。また、平成27年度に、以下の論文を発表した(原著論文、全て査読あり、第一・第二著者のみ)。研究1.については、平成24-25年度に登録を行った80名の心不全患者のうち、71名において心エコー検査のフォローアップを行い、2016年第80回日本循環器学会学術集会において研究成果を発表した。平成28年度には、既にフォローアップを開始している脳・心臓MRI、採血検査についても検査を完了し、研究結果を報告する予定である。研究2.については、既に2015年度日本循環器学会学術集会に研究成果が評価され受賞している。平成28年度には、引き続き研究結果について解析を行い成果を発表していく予定である。研究3.については、心不全患者については平成24-25年度に採取した検体、たこつぼ心筋症については、発症0-7日目に採取した検体について、既に解析を完了した。平成28年度には、既に開始しているフォローアップの採血についても検査を完了し、研究結果を報告する予定である。以上より、研究1から3の全ての研究について研究結果が得られつつあり、既に一部の研究成果については学会で報告し受賞対象となっており、研究はおおむね順調に進展していると考えている。本研究は、研究1.心不全患者の脳活動に関する縦断研究、研究2.たこつぼ心筋症患者の脳活動に関する縦断研究、研究3.心疾患における海馬の異常の機序に関する研究、の三つの研究を行う予定で申請を行った。研究1については、2017年第81回日本循環器学会学術集会においてCirculation Journal Award 2016 Clinical Investigation部門優秀賞を受賞し、論文1,2として報告した。研究2については、脳幹病変とたこつぼ心筋症との関連について論文3として報告した。研究1から3ともおおむね順調に進展しており、引き続き当初の研究計画通り研究を進めていく予定である。循環器内科参加学会が近隣開催であったため、旅費を抑えることができた。平成28年度は、国内および海外学会への参加を計画しており、平成27年度分と併せて執行する。
運動由来の静脈血管伸展性増大が持つ生理的意義の検討ー呼吸・循環応答への関与ー

安静時および運動時の血圧応答や最大酸素摂取量に対する静脈血管伸展性の関与を明らかにすることを目的とした.健康な若年男女を対象とした.安静時のデータとして,下腿部静脈血管伸展性と動脈血管応答(脈波伝播速度:PWV)および循環応答(血圧と一回拍出量)を測定した.また,運動時のデータとして,最大酸素摂取量と最大酸素摂取量の40%強度に相当する自転車運動時の昇圧応答を評価した.最終的に,静脈血管伸展性およびPWVとその他のパラメータの関連性を男女別に検討した.本研究から得られた主な結果は次の通りである.1)下腿部静脈血管伸展性と安静時血圧の関連性については,男性において収縮期血圧(r = -0.359, p < 0.05)および平均血圧(r = -0.322, p < 0.05)との間に有意な負の相関が,女性において平均血圧(r = -0.232, p = 0.095)との間に負の相関の傾向が認められた.2)PWVと安静時血圧の関係については,男女とも収縮期血圧,拡張期血圧および平均血圧との間に有意な正の相関がみられた(p < 0.05).3)下腿部静脈血管伸展性およびPWVと運動時昇圧応答との間には相関関係がみられなかった.4)下腿部静脈血管伸展性およびPWVと安静時・運動時の一回拍出量との間には相関関係は認められなかった.5)下腿部静脈血管伸展性と最大酸素摂取量との間には女性でのみ有意な正の相関がみられたが(P < 0.05),PWVと最大酸素摂取量との間には男女とも有意な関連は認められなかった.以上の結果から,健康な若年者において,静脈および動脈とも,血管伸展性が低いほど安静時血圧は高いが,運動時昇圧応答との関連は見られないことが明らかとなった.また,女性でのみ静脈血管伸展性が高いほど最大酸素摂取量が高いものの,そこには一回拍出量はほとんど関与しないことが明らかとなった.予定していた実験は全て完了していることから,本研究はおおむね順調に進展していると判断できる.今後は,弾性ストッキングを用いて人為的に静脈血管伸展性を増大させたときの血圧応答を検討することで,循環調節に対して静脈血管伸展性増大が果たす役割を明らかにしていく.安静時および運動時の血圧応答や最大酸素摂取量に対する静脈血管伸展性の関与を明らかにすることを目的とした.健康な若年男女を対象とした.安静時のデータとして,下腿部静脈血管伸展性と動脈血管応答(脈波伝播速度:PWV)および循環応答(血圧と一回拍出量)を測定した.また,運動時のデータとして,最大酸素摂取量と最大酸素摂取量の40%強度に相当する自転車運動時の昇圧応答を評価した.最終的に,静脈血管伸展性およびPWVとその他のパラメータの関連性を男女別に検討した.本研究から得られた主な結果は次の通りである.1)下腿部静脈血管伸展性と安静時血圧の関連性については,男性において収縮期血圧(r = -0.359, p < 0.05)および平均血圧(r = -0.322, p < 0.05)との間に有意な負の相関が,女性において平均血圧(r = -0.232, p = 0.095)との間に負の相関の傾向が認められた.2)PWVと安静時血圧の関係については,男女とも収縮期血圧,拡張期血圧および平均血圧との間に有意な正の相関がみられた(p < 0.05).3)下腿部静脈血管伸展性およびPWVと運動時昇圧応答との間には相関関係がみられなかった.4)下腿部静脈血管伸展性およびPWVと安静時・運動時の一回拍出量との間には相関関係は認められなかった.5)下腿部静脈血管伸展性と最大酸素摂取量との間には女性でのみ有意な正の相関がみられたが(P < 0.05),PWVと最大酸素摂取量との間には男女とも有意な関連は認められなかった.以上の結果から,健康な若年者において,静脈および動脈とも,血管伸展性が低いほど安静時血圧は高いが,運動時昇圧応答との関連は見られないことが明らかとなった.また,女性でのみ静脈血管伸展性が高いほど最大酸素摂取量が高いものの,そこには一回拍出量はほとんど関与しないことが明らかとなった.予定していた実験は全て完了していることから,本研究はおおむね順調に進展していると判断できる.今後は,弾性ストッキングを用いて人為的に静脈血管伸展性を増大させたときの血圧応答を検討することで,循環調節に対して静脈血管伸展性増大が果たす役割を明らかにしていく.
脂肪蓄積を制御する膜蛋白同定とその可溶性分泌型のアディポサイトカインとしての意義

【目的】Gpnmbは膜蛋白でその可溶性分泌型が報告されているが肥満での役割は不明である。【方法】GpnmbのR150X変異を有するDBA/2JマウスからGpnmb欠損(KO)マウスを作成し、さらにaP2プロモーターを用いてTgマウスを作製した。またGpnmbのELISAを用いて血中濃度の検討を行った。【結果】高脂肪食飼育KOマウス、Tgマウスでは野生型と比較して体重・内臓脂肪重量に有意差はなかったが、Tgマウスで肝への脂肪沈着、線維化が著明に抑制された。またELISAにより血中の可溶性分泌型の存在を示され、野生型マウスでは肥満によって血中濃度が上昇し、Tgマウスではさらに血中濃度が上昇していた。【結論】Gpnmb過剰発現による脂肪肝改善の分子機構として可溶性分泌型の肝組織への抗炎症効果や抗酸化作用が示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。我々はメタボリック症候群の病態に深く関与する遺伝子群を同定するために、内臓脂肪蓄積を来し2型糖尿病・高血圧・脂質異常症を発症するOtsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)ラットを用いて内臓脂肪特異的な遺伝子群のスクリーニングを施行し新規アディポサイトカインvaspinを同定しその意義について研究している。その過程で膜蛋白質であるACAM (Adipocyte adhesion molecule)とGpnmb/OA(Osteoactivin)を同定した。脂肪細胞の膜蛋白であるACAMおよびGpnmb/OAが、(1)遺伝子改変動物(ノックアウト(KO)マウスとトランスジェニック(Tg)マウス)により脂肪蓄積に重要な役割を演じていること、(2)可溶性分泌型細胞外ドメイン蛋白が動物およびヒト患者の血中に存在し、アディポサイトカインとして作用していることを証明し、(3)これら膜蛋白の細胞内シグナル分子、あるいは可溶性細胞外蛋白の受容体を同定し創薬へと展開するという3点を本研究の目標とする。本年度は、それぞれの遺伝子のKOマウスとTgマウスを作出した。AP2プロモータを用いたACAMTgマウスでは通常食、高脂肪高蔗糖食ともに著明に脂肪重量が抑制され体重が減少することが判明した。ACAMおよびGpnmbそれぞれの遺伝子のKOマウスとTgマウスが順調に作出されている。今後は可溶性分泌型細胞外ドメイン蛋白が動物およびヒト患者の血中に存在し、アディポサイトカインとして作用していることを証明する。
骨髄間葉系および上皮系前駆細胞の高効率回収法開発と難治性皮膚疾患治療への応用

1)新生仔マウス皮膚抽出液をヘパリンアフィニティクロマトグラフィーにより分画し、培養骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を指標に選択した。得られた分画を直径5mmのシリコンチューブに充填した後、GFPトランスジェニック骨髄細胞を移植したマウスの背部皮下に移植した。1週間後に移植チューブを取り出し、チューブ内に集積したGFP陽性細胞の表面マーカーを検討した。その結果、骨髄間葉系幹細胞の表面マーカーであるLin^-/PDGFRα^+/CD44^+/c-kit^-を持ち、かつGFP陽性である骨髄由来細胞が、PBSを充填したコントロールに比較して有意に多く集積していることが明らかとなった。これら、シリコンチューブに集積した骨髄由来間葉系細胞を、tube-entrapped cells(TECs)と命名した。2)TECsを培養、増殖させた後、種々の分化誘導培地を添加して多分化能を検討した。その結果、TECsは間葉系幹細胞が分化し得る脂肪、骨、軟骨への分化能に加えて、ケラチン5陽性表皮細胞や神経細胞への分化能を有することが明らかとなった。すなわち、新生仔マウス皮膚抽出液中に含まれる遊走因子によりシリコンチューブ内に動員されたTECsは、多能性幹細胞であることが示された。3)マウス背部皮膚に皮膚欠損を作成した潰瘍モデルを作成し、その潰瘍周囲にTECsを1カ所あたり1x10^5個、全体で4カ所移植して、非移植群と潰瘍縮小効果を比較検討した。その結果、TECsを移植した群では、非移植群に比較して明らかに有意な潰瘍縮小効果が得られることが明らかとなった。
ゲノムアダプテーションのシステム的理解

減数分裂では組換えにより、父親、母親由来のゲノム情報の混ぜ合せが起こるだけでなく、"新規のゲノム変動"が配偶子に生じ、それが次世代の表現型に影響を与えること(ゲノムアダプテーション)が近年知られつつある。このようなゲノムアダプテーションを介して、ゲノムの多様性が生物集団の中に生じ、長期的には新しいゲノムを生み出す言動力になっていると考えられている。本新学術領域はゲノムアダプテーションの分子レベルでの仕組みを明らかにすること、様々な生物で見られる特異的ゲノムアダプテーション現象を解析する、ゲノムアダプテーションを解析するツールを開発すること、を目的としていた。平成22年度に開始した本領域研究は26年度が最終年度にあたる。本新学術領域の研究の進展を図ると共に、研究成果をまとめることが大切になる。特に、異分野の研究者が十分な連携の元で研究を推進した成果をまとめため、総括班が非常に重要な役割を担っている。過去5年間のまとめは、26年度末に行った。さらに新学術のまとめを行うため、評価のための資料を作成し、ヒアリウングを受け、A-の評価を得た。また、最終国際シンポジウムとして、平成28年3月1日から3日まで、淡路島夢舞台国際会議場で、新しくできた新学術領域“染色体OS"(代表、東大白髭克彦)と合同で開催した。外国人招待講演者に加え、若手の10名の発表を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。同じ生物種内ではほぼ均一のゲノムを有しているのにも関わらず、ある程度の変化を許容する現象、すなわち、同一種であることを確保しながら生物機能発現に多様的変化を与える現象を“ゲノムアダプテーション"と定義する。本領域研究によりゲノムアダプテーションに関して新規の知見を得た。1)染色体構造が形成・維持され、ゲノム変動により変化し、次世代へ継承されるメカニズムを解明し、2)熱ショックなど外的、内的ストレスにより変化を受けた染色体構造が中長期的に伝播され,維持されることを見出した。また、3)次世代DNAシークエンサを用いたゲノムワイドな染色体タンパク質の分布など解析をするための新規の解析方法を確立した。本領域研究において、異分野の研究者が十分な連携の元で研究を推進するために、総括班の役割は非常に重要となる。総括班は、定期的に会議を開催することで、各計画研究と公募研究の統括、評価を行うばかりでなく、本研究領域の効率的かつ効果的推進に必要な環境整備、情報収集、広報活動を積極的に行なった。本領域研究の基盤技術となるのが、ChIP-Seq、生物個体の高速DNA塩基配列、SNP配列決定法である。このため、最新の性能を持つ次世代DNAシークエンサ、Solid HQ(ABI社)を総括班で購入した。すでに東工大で伊藤が運用しているシークエンサを含め,複数の次世代DNAシークエンサを平行運用することにより、それぞれの長所を生かし、迅速、かつ効率良く本領域の班員が必要とする解析、測定基盤が整備できた。さらに、次世代DNAシークエンサが生み出す大量の情報を効率良く,演算処理する必要がある。そのために高速、かつ高容量をもつ高性能コンピュータを初期に投入し、データの大量処理を可能とした。広報活動の一環として、国際シンポジウムを、班会議を2回開催した、領域の研究の方向性の確認とそれぞれの研究の進捗状況について議論した。また、新学術領域の広報のためのHP(ホームページ)の作成した。大型予算の社会還元を目指し、関連分野を含めライフサイエンスの普及を行うため、高等学校への出前講義を行う形態を模索し、4回の出前講義を行った。昨年に引き続き、本研究領域の効率的かつ効果的推進に必要な環境整備、情報収集、広報活動を積極的に行なった。本領域研究の基盤技術となるChIP-Seq、生物個体の高速DNA塩基配列、SNP配列決定法がある。この技術開発のため、最新の性能を持つ次世代DNAシークエンサ、Solid HQ(ABI社)を総括班で22年末にレンタルという形で、東大分生研に導入し、本年度に本格的に運用を始めた。すでに東工大で伊藤が運用しているシークエンサを含め,複数の次世代DNAシークエンサを平行運用することにより、それぞれの長所を生かし、迅速、かつ効率良く本領域の班員が必要とする解析、測定基盤が整備し、複数の共同研究が複数実施されている(計画班では石井、岡田、井澤、岩崎が伊藤、白髭と組んで共同研究を行っている)。さらに、公募班メンバーとの計画も進んでいる。各計画研究と公募研究の統括、評価を行うため、班会議を平成23年8月30、31日に札幌で開催した、領域の研究の方向性の確認とそれぞれの研究の進捗状況について議論し,4名の評価委員から現状についての評価を受けた。また、国内の3つの会議(染色体ワークショップ、DNA複製、組換えワークショップ、核、クロマチンワークショップ)を支援した。広報活動の一環として、大型予算の社会還元を目指し、関連分野を含めライフサイエンスの普及を行うため、高等学校への出前講義を行う形態を模索し、班員全体で10回の出前講義を行った。過去3年間に引き続き、本年度も本研究領域の効率的かつ効果的推進に必要な環境整備、情報収集、広報活動を積極的に行なった。

特に、新規の公募計画班員を迎えたことから、新しい共同研究の促進に努めた。本領域研究の基盤技術となるChIP-Seq、生物個体の高速DNA塩基配列、SNP配列決定法があり、最新の性能を持つ次世代DNAシークエンサ、Solid HQ(ABI社)を総括班で22年末にレンタルという形で、東大分生研に導入し、その後順調に共同研究などを通して運用されている。また、東工大で伊藤が運用しているシークエンサを含め,複数の次世代DNAシークエンサを平行運用することにより、それぞれの長所を生かし、迅速かつ効率良く本領域の班員が必要とする解析、測定基盤(特に解析ツールの開発)が整備し、複数の共同研究が複数実施されている(計画班では石井、岡田、井澤、岩崎が伊藤、白髭と組み共同研究を行っている)。最初の2年の公募班メンバーとの共同研究は成果を上げるまでは適宜継続することが確認されている。各計画研究と新しい公募研究の統括、評価を行うため、班会議を平成24年6月30、31日に東京大学で開催した、領域の研究の方向性の確認とそれぞれの研究の進捗状況について議論し,3名の評価委員から現状についての評価を受けた。特に、一昨年に口頭発表における改善、班会議への若手の参加などが課題として挙げられていて,後者は大幅に改善できた。また、国内の3つの会議(染色体ワークショップー核、クロマチンワークショップ合同、国内3R(DNA複製、組換え、修復)ワークショップ)を支援した。広報活動の一環として、ライフサイエンスの普及を行うため、高等学校への出前講義を行う形態を模索し、班員全体で15回の出前講義を行った。本領域研究において、異分野の研究者が十分な連携の元で研究を推進するために、総括班の役割は非常に重要となる。昨年に引き続き、本研究領域の効率的かつ効果的推進に必要な環境整備、情報収集、広報活動を積極的に行なった。本領域研究の基盤技術となるChIP-Seq、生物個体の高速DNA塩基配列、SNP配列決定法がある。この技術開発のため、最新の性能を持つ次世代DNAシークエンサ、Solid HQ(ABI社)を総括班で22年末にレンタルという形で、東大分生研に導入し、昨年年度から本格的に運用を始め、順調に業績が上がり始めている。すでに東工大で伊藤が運用しているシークエンサを含め,複数の次世代DNAシークエンサを平行運用することにより、それぞれの長所を生かし、迅速、かつ効率良く本領域の班員が必要とする解析、測定基盤が整備し、複数の共同研究が複数実施されている(計画班では石井、岡田、井澤、岩崎が伊藤、白髭と組んで共同研究を行っている)。さらに、公募班メンバーとの計画も進んでいる。各計画研究と公募研究の統括、評価を行うため、班会議を平成24年7月4、5日に東京大学で開催した、領域の研究の方向性の確認とそれぞれの研究の進捗状況について議論し,3名の評価委員から現状についての評価を受けた。また、国内の3つの会議(染色体ワークショップ、DNA複製、組換えワークショップ、核、クロマチンワークショップ)を支援した。広報活動の一環として、大型予算の社会還元を目指し、関連分野を含めライフサイエンスの普及を行うため、高等学校への出前講義を行う形態を模索し、班員全体で11回の出前講義を行った。
ハームリダクション時代の依存症ケア：日蘭の文化的差異をふまえた国際比較研究

ハームリダクションという薬物使用者支援アプローチがある。日本では、公式的な実践例はないが、近年、海外の実践例などに関心がもたれるようになった。本研究で、ハームリダクションに関する精度の高いモノグラフを作成した。そして、ハームリダクションの早期採用国であるオランダと、日本との間の比較調査を行い、ハームリダクションあるいはハームリダクション的実践についての言説の幅について検討した。本研究は、薬物・アルコール依存症におけるハーム・リダクション・アプローチの日本への移入可能性を検討するため、ハーム・リダクション実施国であるオランダと日本との比較を行うものである。初年度の研究課題として、ハーム・リダクションについての基礎情報収集【研究課題5】および、次年度以降に実施する予定の日蘭比較調査の準備調整【研究課題1】を計画した。【研究課題5】の基礎情報の収集については、2015年8月に、研究代表者・徐がオランダでの第1回目の現況調査を行い、比較研究を行うために必要な地域研究(社会・文化、医療制度等)と、ハーム・リダクションを含めた依存症対策プログラム等についての現地視察および情報収集を実施した。オランダ調査地での調査地調整を兼ねて行った。その成果の一部を、平成25年度日本アルコール・薬物依存関連学会合同学術集会にて発表した。徐と池田は、ハーム・リダクションの基本概念と日本の状況を報告する英文論文(Suh, S. & Ikeda, M. , 2015)をCommunication Design 13号に発表した。オランダの研究協力者との、日本の状況についての情報共有に資した。2015年度に実施した3回の研究会議にて、徐、池田、近藤の3者で、それぞれが収集した国内外の情報を共有した。【研究課題1】については、徐が、第2回のオランダ現況調査(2016年3月)を行い、異なる社会状況で意味のある比較研究を実施するための、調査計画の変更/調整、実施準備を行った。具体的には、Peters, H.I. (2015)が行った、ハーム・リダクション・スケールの研究を元に、本研究班で独自の調査紙を策定し、質的および量的調査に用いることとした。また、徐が、第25回国際ハーム・リダクション会議に参加し、Peters, H.I.氏ほか各国専門家より調査案についての助言を受けた。2015年度の研究活動により、1国外調査地(オランダ)の関係者とのリエゾン形成が進んだ。2日蘭研究者の依存症対策の現況についての情報共有を行った。3実証研究のための調査体制を明確化した。4調査内容および方法についての具体的な協議を行った。以上のことより、2016年度以降予定の研究課題の実施準備が円滑に進み、2015年度中に一部課題の前倒し着手の見通しが立ったため。薬物使用をめぐる状況は、日本とオランダの間で大きく異なる。本研究課題は、ハーム・リダクションとよばれる比較的新しいアプローチについての考え方の違いを日蘭で比較しつつ、日本におけるハーム・リダクションの受容、薬物問題にたいするアプローチの多様性について検討する。そして、日本における医療・ケア、予防のオプションをどのように展開していくかの議論に、貢献していく。研究初年度の2015年には、オランダ他におけるハーム・リダクション実践の動向を明らかにすべく、現況調査に力を入れ、それと同時に、オランダの研究協力者と調査の打ち合わせを重ねた。また、日本の状況についても、班員・近藤を中心に情報を収集し、整理した。その結果、研究期間2年目の2016年度には、初年度の研究成果発表として、徐・池田・近藤(2017)他4編の関連論文を刊行、また、徐他、班員それぞれが関連する内容で執筆・口頭発表を行った。研究計画の面では、2016年8月に日本側研究班より2名(徐、池田)がオランダの研究協力者(G-J Peters,G Kokら)をオランダ・マーストリヒト大学に訪問し、質/量的調査の概略、質的調査の調査項目、調査対象者、データ処理、研究倫理審査について打ち合わせた。一方、研究班員・近藤から、ハーム・リダクション先進国のオランダ等だけでなく、日本と近い薬物政策をとっている国や、政策的にみて日本(厳罰政策)とオランダ(寛容政策)の中間に位置づく国を参照事例にとっては、との提案があった。2016年度は、2015年の日蘭双方での現況調査の結果を検討し、日本の状況に近い事例として韓国、ハーム・リダクションを一部取り入れている中間的な事例として台湾の2カ所を現況調査した。これら情報は日蘭調査の結果と合わせ、最終成果に統合する。当初計画では、2016年度後半より日本およびオランダの両サイドで実証調査に着手する予定であった。ところが、以下の理由で進行が遅れた。1)日本およびオランダの研究者双方が合議し、当初の調査内容からの変更があったため、2)年度始まりや学年歴の違いより、日本側研究者とオランダの研究者で繁忙期が異なり、調査研究の進度擦り合わせに、当初計画以上の時間を必要としたため。この遅れに対応するため、当初、研究期間内に予定していた日蘭双方の研究ワークショップ開催を2018年3月以降に繰り延べすることも検討していく。逆に、研究成果の発表にかんしては順調で、現況調査の結果を学術論文および学術集会での口頭発表やポスター発表として、公表できた。

本研究課題では、ハームリダクションという、日本では近年知られるようになってきたアプローチについて調査研究を行うものである。2015年・2016年の2年間においては、ハームリダクションについての基礎情報を収集し、日蘭での比較を行うための調査を準備した。最終年度の2017年では、以下のような研究活動を行なった。まず、昨年より着手していたインタビュー・ガイドを日本およびオランダの研究者で整備した。日本語、オランダ語、英語版を作成した。また、日蘭でインタビューの条件がなるべく同等になるように、フィールド調整を行なった。その後、日本・オランダのそれぞれの所属機関で研究倫理審査を受け、調査を実施した。この調査による研究成果の発表(論文・学会発表)は、次年度(2018年度)以降に予定されている。また、昨年度(2017年度)の研究により着手した、アジア(韓国および台湾)の事例について、昨年度行った現地への現況調査の研究協力者の支援を得ながら、引き続き基礎情報を収集した。そして、次の研究サイクルへの準備を整えた。研究成果の公表では、徐が前年度までの研究成果を2本のモノグラフ論文を刊行し、徐・池田が、国内の専門学会で2回の学会報告を行った。その他、池田は、本研究課題遂行による経験にもとづき、社会調査論上の重要論点についての論文および学会報告を行った。3年間の研究成果公表としては、報告書執筆時点(2018年5月)で、2018年度に1本の論文公表(国内雑誌)、国際学会International Society of Addiction Medicine 2018年大会(於・韓国釜山市)での発表を予定している。ハームリダクションという薬物使用者支援アプローチがある。日本では、公式的な実践例はないが、近年、海外の実践例などに関心がもたれるようになった。本研究で、ハームリダクションに関する精度の高いモノグラフを作成した。そして、ハームリダクションの早期採用国であるオランダと、日本との間の比較調査を行い、ハームリダクションあるいはハームリダクション的実践についての言説の幅について検討した。2015年度の研究活動で、比較調査のための準備調整が整ったため、日蘭双方の調査地で、研究者がそれぞれ質的・量的調査を実施する。進捗状況の相互確認および情報共有のため、日蘭の調査実施者が双方の調査地を訪問しあう。2017年は、本研究課題の最終年度である。当初よりの研究計画修正点(見込み)は以下のとおりである。1)日本において「ハーム・リダクション」ということばの知悉度は高まってきていると予想されるが、現在、ハーム・リダクションについてのまとまった日本語情報がじゅうぶんでなく、ハーム・リダクションの実際についてよく知られていない。そのため、調査は、当初予定の日蘭薬物使用者の直接比較だけでなく、当事者に医療者やケア・ワーカーを含めた言説比較、態度比較を行う。ハーム・リダクション先発国のカナダでも、当事者・専門職のハーム・リダクション理解に幅があることが明らかにされている。ハーム・リダクション連続体(Kellog SH, 2003, Suh S and Ikeda M, 2015)、ハーム・リダクション・スケール(Peters H, 2016)の考えに立ち、日蘭を比較する。
神経細胞内の異常なリソソームとオートファゴソームの関わりについての遺伝学的研究

HeLa細胞において、Lamp1陽性リソソームにおけるp18(LAMTOR1)の免疫陽性反応が分裂期で低下する傾向を見いだした。そこで、同調培養によりS・early G1・late G1・G2/M期の細胞を分取しウエスタンブロットを行い、G2/M期でp18、mTORC1の下流の標的タンパク質S6Kのリン酸化の減少を認めた。一方、WYE354投与や飢餓の誘導によるmTORC1の活性化の阻害はp18の量に影響を及ぼさなかった。以上は、分裂期のp18の減少がトリガーとなりmTORC1の活性化が抑制されることを示唆する。分裂期におけるepoxomicine投与によりp18の量が回複し、プルダウンアッセイによるユビキチン化タンパク質の検討により、G2/M期の細胞でp18抗体陽性のユビキチン化タンパク質の増加を認めたことから、分裂期のp18の減少へのユビキチン・プロテアソーム系の関与が示唆された。次に、p18/LAMTOR1の中枢神経系特異的遺伝子欠損マウスを解析した結果、新生仔は体重が対照群より軽く、生後14日前後で致死となることを見出した。生後14日目のマウス脳を用いた免疫組織化学的解析により、ニューロン、アストロサイト、ミクログリアでは顕著な変化が観察されなかったのに対して、p18/LAMTOR1の中枢神経系特異的遺伝子欠損マウスでは、成熟したオリゴデンドロサイトのマーカータンパク質の発現が全脳にわたって消失していた。さらに、透過型電子顕微鏡をもちいた形態学的解析により、脳梁及び小脳における軸索の髄鞘化をほとんど認めなかった。以上の結果は、mTORC1の活性がオリゴデンドロサイトの分化に重要な働きがあることを示唆するものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。ユトレヒト大学医学部細胞生物学/Cell MicroscopyCoreとの共同研究により、凍結超薄切片法を用いたオートファゴソームのマーカーLC3の免疫電顕に関する条件検討を行った。蛍光抗体法で内在性のLC3を認識することが知られている数種類の抗体を用いて、GFP-LC3を強制発現したHela細胞を用いて免疫電顕を行ったところ、コスモバイオ社のマウスモノクロナール抗体のみが使用可能であることが分かった。そこでこの抗体を用いて内在性のLC3の局在解析を試み、パラホルムアルデヒドのみの固定の細胞においてある程度標識が可能であることを確認した。さらに、凍結超薄切片のオートファゴソームの構造保持のため、切片回収の溶液に脂質を固定する作用を持つウランを加えたところ、より良好な像が得られることがわかった。しかし、この回収法では内在性のリソソーム膜タンパク質lamp1の抗原性が消失するため、酸性コンパートメントの標識はBSA-goldの取り込みなど他の方法を用いる必要があることが明らかとなった。リソソーム膜タンパク質p18/LAMTOR1の中枢神経系における役割の遺伝学的検討のため、p18コンディショナルノックアウト(p18F/F)マウスと小脳プルキンエ細胞特異的にCreを発現するGluD2-Creノックインマウスを交配したが、小脳プルキンエ細胞特異的p18欠損マウスは小脳症状を呈さず、長期生存することがわかった。一方、p18F/FマウスとNestin-Creマウスを交配して得た中枢神経系特異的p18欠損マウスは生後14日齢で死に至ることがわかった。組織化学的、超微形態解析により同マウスでは髄鞘がほとんど認められないことがわかった。このことはNestinプロモーターが発現する細胞のうちオリゴデンドロサイトの系列の細胞がp18の欠損の影響を最も受けやすいことを強く示唆している。

オートファジーの免疫電顕による詳細な解析においては、LC3の単染色ではなくLC3と他のオルガネラマーカーとの多重染色が必須であるが、従来LC3の免疫電顕に多用されていた包埋前染色法では多重染色が困難であった。一方、凍結超薄切片法では多重染色が可能であるが、これまでに容易に手に入るLC3抗体を用いた安定的な検出法に関する報告はほとんどなかった。しかし、本年度に行ったユトレヒト大学のグループとの共同研究の結果、多重染色の免疫電顕によるオートファゴソームと他のオルガネラとの関係を解析するための条件が整った。p18/LAMTOR1は培養細胞レベルではエンドソームないしオートファゴソームとリソソームとの融合に必須であるため、同分子の欠損は神経細胞に大きな影響を与えると予想し、GluD2-Cre、Nestin-Creマウスと交配した。しかし神経細胞における同分子の欠損の影響は大きなものではないと考えられた。しかし、中枢神経系特異的p18コンディショナルノックアウトマウスの解析結果から、当初の予想と異なり、p18の欠損は神経細胞よりもオリゴデンドロサイト系列に大きな影響を及ぼすことで、髄鞘形成不全という極めて重篤な症状を呈することが明らかになった。この結果はmTORC1のリソソーム膜表面での活性化に必須なp18/LAMTOR1がオリゴデンドロサイト系列の分化成熟に決定的な影響を及ぼすことを初めて示すものである。このような重要な所見を見い出すことが出来た点で、当初の予想とは異なるものの順調に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今回習得したLC3の凍結超薄切片法による免疫電顕を利用して、最近得られた内在性DFCP1に対する抗体との二重染色を行うとともに、光顕-電顕相関観察によるオートファゴソームとオートリソソームの免疫電顕と蛍光タグ標識像の同時観察を試みる。p18が神経幹細胞からオリゴデンドロサイト系列への分化に必須である可能性を考え、p18F/F;Nestin-Creマウスおよび対称群より神経幹細胞を採取し、in vitroの系で神経細胞・アストロサイト・オリゴデンドロサイト諸系列への分化効率の相違を検討するとともに、ラパマイシンなどmTORC1の系統に影響を与える各種薬剤投与実験を行う。さらに、p18が成熟オリゴデンドロサイトの維持に必須か否かを検討するため、成熟オリゴデンドロサイトにおいてCreを発現するMBP-Cre(入手済)との交配によりp18F/F;MBP-Creマウスを作製し、白質における髄鞘形成について対称群と比較するとともに、Curprizoneなどの薬剤投与による脱髄後の再髄鞘化の遅延の有無を比較する。カテプシンD欠損マウスにおける異常なリソソームの生化学的検討を行うため、同マウスより安定的にリソソームを採取する方法を確立しつつあるが、終末期の同マウスからは対称群と質的にほとんど変化のないリソソームしか回収できないことが明らかとなった。このことは、終末期の同マウスの異常なリソソームは既存の方法と全く異なる方法で採取する必要があることを示している。そこで、ユビキチン化や界面活性剤に対する不溶性などを利用した特異的な採取法の検討を進めるとともに、蓄積しているリソソームそのものに質的な異常が生じていない可能性のあるより早期の同マウスより同様の方法でリソソームを採取し生化学的に比較検討を行う。