hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
In vivoパッチクランプ法を用いた痒覚中枢機構の解析

中枢における痒みの情報伝達機構の詳細は未だ不明である。そのため、in vivo記録法を用いて皮膚への痒み刺激により誘起される興奮性応答を詳細に解析した。その結果、皮膚へのセロトニン(5-HT)投与によって、末梢で発生した活動電位が脊髄の表層及び大脳皮質の細胞にシナプス入力し興奮性応答を著明に増加させることが明らかとなった。時に痒みは痛み以上に耐え難い感覚であるにもかかわらず、痛みに比べ脊髄における痒み情報伝達機構の詳細は不明なことが多い。そこで、感覚情報の入り口である脊髄後角からのin vivoパッチクランプ法を用い、皮膚への痒み刺激により誘起されるシナプス応答の詳細な解析を行った。まず、痒み中枢への情報伝達系を解明するために、起掻物質であるセロトニンをラット下肢皮膚へ投与し脊髄後角におけるc-Fos発現部位の解析を行った。その結果、セロトニン投与により脊髄後角の表層にc-Fos陽性細胞が局在していることが明らかとなった。次いで、脊髄後角表層の痒み受容ニューロンのより詳細な特徴を解析するためにパッチクランプ法を用いて-70mVの電位固定下に記録を行い様々な検討を行った。その結果、痒み受容ニューロンの多くはある種のTRPチャネル発現線維の入力を受けていることを見出した。更に電流固定下で膜電位の変化の詳細を解析すると、セロトニン塗布により幾つかのニューロンでは長時間にわたる活動電位の発生が見られた。更に痒み受容ニューロンの発火パターンを解析すると、delayedタイプとtonicタイプを示す傾向が見られた。以上のことから、皮膚へのセロトニン投与によって痒み行動が誘発され、その情報は末梢で発生した活動電位がある種のTRPチャネルを発現した求心性線維により膠様質のニューロンにシナプス入力していることが明らかとなった。更に痒み情報を受け取る膠様質のニューロンはdelayedタイプとtonicタイプの発火パターンを示す傾向が見られた。これら脊髄におけるシナプス応答の詳細な報告は現在までになく、今後痒みのシナプス伝達機構の解明に非常に重要な結果であると思われる。尚これらの研究結果は、2013年に開催された国際痒みシンポジウム、アジア疼痛シンポジウム、日本生理学会などの学会で発表を行った。時に痒みは痛み以上に耐え難く非常に苦痛を伴う感覚であるにもかかわらず、痛みに比べ脊髄における痒み情報伝達機構の詳細は不明なことが多い。これまでの研究で、皮膚へのセロトニン(5-HT)投与によって痒み行動が誘発され、その情報は末梢で発生した活動電位がある種のTRPチャネルを発現した求心性線維により膠様質のニューロンにシナプス入力していることを明らかにした。本年度は、in vivoパッチクランプ法を用い脊髄後角から記録を行い、皮膚へのセロトニン投与によって活動電位が発生した細胞に対して痒み特異的な受容体の拮抗薬を脊髄に投与した際の効果を解析した。その結果、皮膚へのセロトニン投与により誘起された活動電位の発生頻度に若干抑制が見られたが大きな変化は見られなかった。その一方で、AMPA受容体拮抗薬では完全に活動電位の発生が抑制された。更に、脊髄から上位の中枢への痒み情報伝達を調べるために、セロトニン投与によりc-Fos陽性細胞が見られる脳領域を解析した。その結果視床、大脳皮質などでc-Fos陽性細胞が見られた。更に阻害薬を用いた実験結果から、痒み情報の主要な伝達物質はグルタミン酸であり、痒み特異的物質は修飾的な役割をしていることが示唆される。これらの結果は今後痒みのシナプス伝達機構の解明に非常に重要な結果であると思われる。尚これらの研究結果は、2014年に開催された国際痒みシンポジウム、日本神経科学会などの学会で発表を行った。神経生理学これまでの研究で、痒み中枢への情報伝達系を解明するために、起掻物質であるセロトニンをラット下肢皮膚へ投与し脊髄後角におけるc-Fos発現部位の解析を行い、セロトニン塗布により脊髄後角の表層にc-Fos陽性細胞が局在していることを示した。更に、in vivoパッチクランプ法を用いた実験で薬理学的な詳細なシナプス応答解析により、痒み受容ニューロンの多くはある種のTRPチャネル発現線維の入力を受けていることを見出した。次いで、記録した細胞の場所を調べると、セロトニンに応答した細胞は応答しなかった細胞に比べ有意に浅い層に分布しておりc-Fosの結果とも一致していた。更に痒み情報受容ニューロンの電気生理学的特性を解析すると、痒み情報受容ニューロンはdelayedタイプとtonicタイプの発火パターンを示す傾向が見られた。

以上の結果から、皮膚へのセロトニン投与によって痒み行動が誘発され、その情報は末梢で発生した活動電位がある種のTRPチャネルを発現した求心性線維により膠様質のニューロンにシナプス入力していることが明らかとなりその情報を受け取るニューロンはdelayedタイプとtonicタイプの発火パターンを示す傾向が見られる傾向にあることが分かった。これらの結果は、国際痒みシンポジウム、アジア疼痛シンポジウム、日本生理学会などで報告した。現在は、痒み受容ニューロンの形態学的解析や、さらに上位中枢への痒み情報伝達機構を調べるために脳におけるc-Fos陽性細胞の局在を調べる実験を行っている。以上のことから、おおむね研究計画通りに研究が出来ていることから順調に進展していると考えられる。現在行っている、セロトニンに応答した膠様質ニューロンの詳細を調べるために免疫組織学的手法を用いて形態染色を行う。更に、現在痒み特異的な受容体がいくつか報告されているがそれらの阻害剤を投与しセロトニン投与による応答がいかなる変化を起こすかを検討する。次いで、さらに上位中枢である脳における痒み情報伝達機構の実験を行う。セロトニン投与によりc-Fos陽性細胞が見られた脳部位からin vivo細胞外もしくはin vivoパッチクランプ記録法を用いて電気生理学的な解析を行い痒み情報伝達機構の解析を進める。電気生理学的解析や組織学的解析を行い、脊髄及び脳における掻痒シナプス伝達を担う基盤神経回路の同定と情報処理機構の全容を明らかにすることを目的とする。25年度は主に感覚情報の入り口である脊髄後角からのin vivoパッチクランプ法を用いた実験を行う為にパッチクランプ増幅器(Axopatch 200B)を購入予定であったが、円安などによる製品価格の急騰で当初申請単価では調達が非常に困難となってしまったが、所属研究室に代替品があり当初の計画をほぼ変更することなく実験が遂行できた為、26年度に助成金を繰り越しパッチクランプ増幅器の調達を行う事とした為。26年度はセロトニン投与によりc-Fos陽性細胞が見られた脳部位からin vivo細胞外もしくはin vivoパッチクランプ記録法を用いて電気生理学的な解析を行い痒み情報伝達機構の解析を進める予定である。26年度から申請者は富山大学へ異動の為、異動先での研究遂行の為にはパッチクランプ増幅器は必須であり購入予定である。また、研究立ち上げに際し消耗品として、細胞外液、細胞内液といった溶液や痒み誘発物質などの試薬品を購入する経費が必要である。更に本研究では動物を使用し行動薬理学的実験や電気生理学的実験を行う事からその購入経費も必要である。最終的には、本研究で得られた結果を国内外の学会で積極的に発表し、英文科学誌などに投稿することで社会に発信していく計画である。
関東、阪神・淡路、東日本の三大震災の復旧・復興過程に関する政治学的比較研究

本研究プロジェクトは、関東大震災(1923年)、阪神・淡路大震災(1995年)、東日本大震災(2011年)という、三つの大震災の復旧・復興過程について、政治学的な分析視角をもって比較研究した。学術的な成果としては、三震災に係る豊富な資料をもとに、三震災からの復旧・復興の特徴および、三震災の比較から見られる共通点、相違点などを検証した上で、次なる震災への備えに関する新たな知見が得られた。これらの成果については共著本として、2016年度に出版される予定である。また、様々な分野にわたって実務的な政策提言も積極的に行った。東日本大震災は、次なる大震災の発生に対する備えの重要性を改めて再認識させる重要な契機となった。しかしながら、いずれ発生する次なる大災害の発生に対して、どのような「備え」をすればよいのか、とりわけ、復旧・復興を担当する政治や行政のあり方が問われている。そこで、本研究は、関東大震災、阪神・淡路大震災、東日本大震災の3つの震災の復旧・復興過程についての1政権運営、2リーダーシップ、3政府間関係、4官僚の役割、5行政と市民の関係5つの視角から比較研究を行う。これによって、大災害に対する応急救援対応や政府の危機管理のあり方といった現実政治への示唆を当たることが可能となろう。平成25年度は、研究代表者(五百籏頭真)の統括のもとで、関東大震災と阪神・淡路大震災に関する研究を進め、隔月の研究会を通じてその成果をまとめてきた。関東大震災に関しては、国立国会図書館、国立公文書館、東京都立図書館、横浜市立図書館等において、帝都復興院、復興局、帝都復興事業に関する資料収集を行った。阪神・淡路大震災に関しては、当時復旧・復興で中心的な役割を担った関係者に対するオーラル・ヒストリーおよび資料収集・分析を行った。さらに、海外の研究者やメディアが日本の大震災をどのように捉えているかについて文献や論文などを調査し、研究の知見を拡げた。2011年3月11日に発生した東日本大震災は、東北・関東地方を中心に、筆舌に尽くし難い甚大な被害をもたらした。それだけではなく、人々に次なる大災害の発生に対する備えの重要性を改めて認識させる重要な契機となった。しかしながら、いずれ発生するに違いない次なる大災害に対して、どのような「備え」をすればよいのかという点、とりわけ復旧・復興を担当することになる政治や行政のあり方についての明確な答えは存在していないのが実情である。本研究プロジェクトは、こうした状況を踏まえて関東大震災、阪神・淡路大震災、東日本大震災の3つの震災を、1災害における政治過程と政治リーダーシップ、2復旧・復興過程における政府の対応の実態、3震災をめぐる社会的認識及び災害の教訓について、政治学的な分析視角から比較検討する。これによって、次なる大災害の発生に対する、政治、政府、行政などの役割や行うべき対応に関する新しい知見を提供する。平成26年度には、研究代表者(五百籏頭真)の総括のもとで、6回の研究会と2回のシンポジウムを開催した。まず、6回にわたる研究会においては、研究委員各自の個別研究報告及び研究分担者間のディスカッションを行った。そして、3つの震災の復興・復旧過程における諸問題と問題の背景、これに対する政治レベル、行政レベル、民間べレルの対応の成果と限界を検討した上で、研究の新しい知見を導出した。また、2回のシンポジウム開催を通じて、災害研究に関する学問的成果を公表するとともに、次なる災害に対する備えの重要性と必要性に関する認識を拡げた。本研究は、関東大震災(1923年)、阪神・淡路大震災(1995年)、東日本大震災(2011年)という近現代の日本が体験した三つの大震災の復旧・復興過程について、5つの政治学的な分析視角(1.政権運営、2.リーダーシップ、3.政府間関係、4.官僚の役割、5.行政と市民の関係)をもって比較研究しようとした。これは、三つの大震災の復旧・復興の異なる実態を描き出す試みである。そして、復旧・復興過程を比較分析することを通して、各時期における政治社会の問題認識と対処能力を検証することを目指した。本研究では、大震災に係る豊富な関連資料群(オーラル・ヒストリー記録を含む)を検証した。そして、発災から復旧・復興へと至るプロセスを詳細に分析し、それらを踏まえた比較研究を進めていった。こうした作業を通じて研究代表者ならびに研究分担者は、たとえば発災時の政権運営や地方自治体の対応、国内外からの支援とそれへの対応、被災インフラの復旧・復興のあり方などの諸点で、約90年という時空を超えて顕著な共通点あるいは相違点が存在していたという知見を得ることができたのである。また、政府や地方自治体が過去の大震災で得られた教訓を「次なる大災害」向けて、どのように活用していたのかという実態を明らかにした。これらに加えて、様々な分野にわたって「次なる大災害」の襲来時に必要な政治・行政体制のあり方を提示することができた。これについて具体的には、被災地における住宅政策の見直し、復旧・復興プロセスでの女性参加の拡大の重要性、震災に関する記憶の記録の望ましい方向性などである。最後に、上述した成果を総括した図書として、五百籏頭真を監修者、御厨貴を編者とした『大震災復興過程の政策比較分析』がミネルヴァ書房から2016年夏に出版される予定となっている。

学術的な成果としては、三震災に係る豊富な資料をもとに、三震災からの復旧・復興の特徴および、三震災の比較から見られる共通点、相違点などを検証した上で、次なる震災への備えに関する新たな知見が得られた。これらの成果については共著本として、2016年度に出版される予定である。また、様々な分野にわたって実務的な政策提言も積極的に行った。平成26年度には、研究代表者(五百籏頭真)の総括のもとで、研究分担者各自の個別研究が充実に進展し、なお、当初の計画通りに開催された6回の研究会と2回のシンポジウムを通じて、研究成果も着実に公表してきた。27年度が最終年度であるため、記入しない。日本政治外交史本年(平成27年)度は、研究分担者各自の研究を完了するとともに、本研究会の全体の問題意識及び総論を大枠として、研究成果を整理・総括する。2015年11月には学会報告を行い、政治学的観点からした災害研究の知見を披露する。2016年春を目途に、こうした研究成果を一般向けの書籍としてまとめ発刊する。平成25年度は、研究代表者(五百籏頭真)の統括のもとで、研究分担者が各自の役割および研究を充実に行い、当初の計画通りに研究を進めることができた。現地調査が予想よりうまく行われ、出張回数が元の計画より下回ったため、次年度使用が生じた。本年(平成26年)度は、東日本大震災の復旧・復興過程の特徴を中心に研究を進める。復興庁をはじめとする中央政府や地方自治体がWebで公開している東日本大震災関連の復旧・復興の記録を調査・収集するとともに、関係者に対するオーラル・ヒストリーを実施し、これらのクロスチェックを通じて復旧・復興過程を分析検討する。引き続き隔月で総6回の研究会を開催し、資料状況の共有や研究分担者間でのディスカッションを行ない、東日本大震災と関東、阪神・淡路大震災と比較研究を本格化させる。後半には2回のシンポジウムを予定しており、学術的な側面(9月、於東京)と、実務家や市民にも開かれた内容(11月、於神戸)で開催を行う。平成27年度には、こうした研究成果を整理・総括し、学会報告および一般向けの書籍を発刊することを予定している。研究のさらなる発展のため、研究に必要な資料を引き続き収集、また現地取材の出張などに充てる。2014年3月11日の東日本大震災3周年に向けて関連文献が多く出版されるなどを予想し、3月中の調査研究費用として余裕を残して執行したためであり、また、当該期にはすでに手元に集めていた資料の精読に予想以上に時間が必要であった。さらに加えて現地出張への回数が予想より下回ったため、次年度使用が生じることとなった。単年度では未使用額が生じたが、研究の全体としては概ね予定通り進捗していると判断している。よって今後の使用計画としては、引き続き資料収集や研究の進展、現地取材の出張に充当する。
凍結耐性を付与する筋組織ビルドアップ法の確立と力学特性評価

本研究課題では、遺伝子操作を用いた筋細胞組織の凍結耐性付与法の確立を目標とし、本年度の研究成果は以下の3項目を実施した.1)筋芽細胞への目的遺伝子導入最適化2)筋組織形成後の目的タンパク質発現効率の評価3)標的遺伝子を保持した安定発現細胞株のクローニングとその評価4)トレハローストランスポーター発現筋組織の凍結耐性の評価1)では、マウス由来の筋芽細胞株C2C12へのTret1遺伝子の効率的な遺伝子導入方法を検討した.先ず、従来の遺伝子導入方法では、細胞全体の数%のみの遺伝子導入効率であったのに対して、培養基板に接着タンパク質コーティング(MatriGel^<TM>)を処理することによって、30-60%程度まで導入効率が高まることを見いだした.2)では、遺伝子導入後のC2C12細胞に筋組織形成の分化誘導を促し、目的タンパク質を強制発現し、その細胞集団から筋細胞組織を形成する実験を行った.その結果、筋組織形成に必要な10日間を経た後において、目的タンパク質を保持した細胞は数%程度に減少することが分かった.さらにこの発現細胞集団は筋組織への分化能を維持し、筋組織特有の筋管形状へ分化し、筋組織特有の電気刺激による収縮応答も確認することができた.3)では、目的遺伝子導入の処理後、薬剤選別による安定発現細胞株のクローニングを検討した.その結果、クローニング培養が3週間程度要する中で、目的タンパク質の発現量が減衰し、安定発現細胞株の発現効率は非常に低くなることが分かった.4)では、2)で作製した筋細胞組織をトレハロース含有培地の中で凍結の負荷を与えたところ、細胞膜が強固に保持されることが示され、トランスポータータンパク質の発現によって、筋組織の凍結耐性が向上することが明らかとなった.本研究課題では、遺伝子操作を用いた筋細胞組織の凍結耐性付与方法の確立を目標とし、本年度の研究成果は以下の3項目を実施した.i)生体から採取した筋形成細胞の効率的な分離法の開発.ii)哺乳類細胞への目的遺伝子の導入方法の最適化.iii)単一細胞レベルでの遺伝子発現に伴う凍結耐性獲得の相関解析.i)では、従来のラット筋組織から採取した細胞集団に対して、再生能力が優れた筋幹細胞を濃縮する流体デバイスプロセスを開発した.新規に提案した本プロセスは、筋幹細胞が他の細胞集団に対して、体積が小さいことに着目し、マイクロ流体デバイスの高精度粒子分離技術を適用したものである.筋細胞集団を安全にかつ、高速に分画でき、さらにその効果を筋細胞の成長過程の観察によって明らかとした。これにより、筋組織構築における細胞材料の純度が向上でき、形成される筋組織の筋品質が向上できると期待できる.ii)では、トランスポーター遺伝子(Tret1)を哺乳類細胞(筋芽細胞株C2C12)への導入方法を検討した.先ず、プラスミド試料を最適な容量に大量調製し、遺伝子導入方法の最適化実験の用意を整えた.次に遺伝子導入方法のリポフェクション法の2社の4つの試薬キット、また、エレクトロポレーション装置2機種の試行実験を行った.その結果、リポフェクション法では本遺伝子導入効率が著しく低く、約5%未満の発現効率の結果であった.一方、エレクトロポレーション法では、電圧印可に伴う細胞ダメージが80%程度にまで及んだが、生存した細胞では遺伝子導入効率が60%程度まで向上できることが分かった.iii)では、発現マーカーであるGFP蛍光を指標とし、凍結・融解操作後の細胞ダメージを観察した.その結果、未発現の細胞群に対して、遺伝子発現細胞では、著しい生存率の向上がみられ、遺伝子発現と凍結耐性の相関が強いことが示された.本研究課題では、遺伝子操作を用いた筋細胞組織の凍結耐性付与法の確立を目標とし、本年度の研究成果は以下の3項目を実施した.1)筋芽細胞への目的遺伝子導入最適化2)筋組織形成後の目的タンパク質発現効率の評価3)標的遺伝子を保持した安定発現細胞株のクローニングとその評価4)トレハローストランスポーター発現筋組織の凍結耐性の評価1)では、マウス由来の筋芽細胞株C2C12へのTret1遺伝子の効率的な遺伝子導入方法を検討した.先ず、従来の遺伝子導入方法では、細胞全体の数%のみの遺伝子導入効率であったのに対して、培養基板に接着タンパク質コーティング(MatriGel^<TM>)を処理することによって、30-60%程度まで導入効率が高まることを見いだした.2)では、遺伝子導入後のC2C12細胞に筋組織形成の分化誘導を促し、目的タンパク質を強制発現し、その細胞集団から筋細胞組織を形成する実験を行った.その結果、筋組織形成に必要な10日間を経た後において、目的タンパク質を保持した細胞は数%程度に減少することが分かった.さらにこの発現細胞集団は筋組織への分化能を維持し、筋組織特有の筋管形状へ分化し、筋組織特有の電気刺激による収縮応答も確認することができた.3)では、目的遺伝子導入の処理後、薬剤選別による安定発現細胞株のクローニングを検討した.その結果、クローニング培養が3週間程度要する中で、目的タンパク質の発現量が減衰し、安定発現細胞株の発現効率は非常に低くなることが分かった.4)では、2)で作製した筋細胞組織をトレハロース含有培地の中で凍結の負荷を与えたところ、細胞膜が強固に保持されることが示され、トランスポータータンパク質の発現によって、筋組織の凍結耐性が向上することが明らかとなった.遺伝子導入実験において、安価で細胞ダメージの低いリポフェクション法において、遺伝子導入効率が極めて低い結果であった.

そのため、遺伝子導入法の最適化作業に多くの時間を要し、研究の進捗がやや遅れている.本年度では、細胞レベルでの遺伝子導入方法と作製された遺伝子導入細胞の特性を評価できた.今後は、遺伝子導入細胞を筋組織へ分化させ、筋組織の凍結ダメージの抑制効果について実験を行う計画である.当初の研究計画に変更はなく、実施項目の検討を進める.
減数分裂の連続的な分裂期を保証するAPC/C制御機構の解析

有性生殖はほぼ全ての真核生物が次世代ヘゲノム情報を受け渡す際に用いる普遍的なプロセスであり、減数分裂は、その過程の中で配偶子(卵や精子)を形成するためにおこなわれる特殊な核分裂様式である。減数分裂周期では核分裂が2度連続して起き、染色体数が半減した配偶子が形成される。この減数分裂に特有の細胞周期制御を達成するため後期促進複合体APC/Cは特殊な制御を受けるが、その仕組みの詳細は不明である。分裂酵母を用いた減数分裂におけるAPC/Cの制御機構の研究内容のうち、本年度に論文として発表した次の2点の研究項目ついて述べる。(1)fzr1およびsms5/cuf2,遺伝子の欠損株では3回目の分裂期が起きて配偶子形成に異常が生じるが、その理由は不明であった。昨年度から継続しておこなっている研究において、転写因子Sms5/Cuf2は減数分裂を終了させるためにAPC/C活性化因子fzr1遺伝子の転写を活性化することでサイクリンCdc13の分解を促進することがわかった。この仕組みにより核分裂の連続する回数は2回に限定されるというモデルを提唱した。(2)これまで減数分裂における紡錘体チェックポイント(SAC)の分子機構の多くは不明であった。そこでまず、薬剤超感受性の分裂酵母株とケミカルインヒビターを用いて、減数第一分裂期および第二分裂期に細胞を停止させながらSAC構成因子の細胞内挙動をライブイメージングする実験系を構築した。次に、Ark1キナーゼのインヒビターを用いた解析から、SACの活性化に必要なSAC構成因子Bub1タンパク質の動原体局在にはArk1キナーゼ活性が必要であることがわかった。まず、減数分裂の分裂する回数を2回に限定する仕組みについて計画通り論文に発表した。また当初の計画には含まれていなかった減数分裂における紡錘体チェックポイントの制御機構について、ケミカルバイオロジーとライブイメージングを用いた実験系を構築し、解析結果を論文発表した。当初の計画以上に大きな進展があったと判断する。(抄録なし)減数分裂において核分裂の回数は厳密に2回に限定される。これにより、2倍体の生殖細胞は倍数性が半減した1倍体の配偶子を生み出すことが可能となる。この特殊な細胞周期制御を達成するため、APC/C(後期促進複合体)は減数分裂特異的な制御を受けると考えられている。分裂酵母の減数分裂におけるAPC/Cの制御機構について、本年度大きな進展のあった点について述べる。(1)sms5破壊株とfzr7破壊株は減数第二分裂の後にふたたび分裂期を経験する。"減数第三分裂"と呼ぶこの異所的な分裂期では、多くの紡錘体微小管は単極性であり、微小管の極であるSPBの複製・分離や染色体の分離は部分的に起きた。(2)sms5遺伝子産物(Sms5タンパク質)は減数分裂特異的に発現する転写因子である。fzr1はSms5の重要なターゲット遺伝子であることが判明した。sms5破壊株ではfzr1の転写量が減少し、またSms5はafzr1遺伝子のプロモーター領域に結合した。(3)fzr1遺伝子産物(Fzr1タンパク質)は減数分裂特異的に発現するAPC/Cの活性化因子である。s〃is5破壊株ではFzr1の発現量が減少しており、上記(2)の転写量解析の結果に合致した。APC/Cの分解ターゲットであるサイクリンCdcl3の発現量は、sms5破壊株において減数第二分裂の後も蓄積することが判明した。Cdc13の分解は分裂期の終了に必須である。sms5破壊株およびfzr1破壊株では、減数第三分裂の時期にCdc13はSPBに局在した。これらを総合し、Sms5はfzr1遺伝子の転写を活性化してAPC/CによるCdc13の分解を誘導し、これにより減数第二分裂の後に細胞がふたたび分裂期に入ることを防ぎ、機能的な配偶子の形成を保証するというモデルを提唱した。

そこでまず、薬剤超感受性の分裂酵母株とケミカルインヒビターを用いて、減数第一分裂期および第二分裂期に細胞を停止させながらSAC構成因子の細胞内挙動をライブイメージングする実験系を構築した。次に、Ark1キナーゼのインヒビターを用いた解析から、SACの活性化に必要なSAC構成因子Bub1タンパク質の動原体局在にはArk1キナーゼ活性が必要であることがわかった。本年度の研究結果により、Sms5タンパク質がfzr1遺伝子の転写を直接的に制御すること、この転写制御は減数第二分裂の終了に不可欠であることを示した。また当初の計画には含まれていなかった、減数第三分裂という異常の詳細な観察をおこなうことにより、この時期の染色体や紡錘体微小管は分裂期特有の構造をとることが明らかとなった。現在、以上の結果をまとめた論文を投稿中であり、当初の計画以上に大きな進展があったと判断する。まず、減数分裂の分裂する回数を2回に限定する仕組みについて計画通り論文に発表した。また当初の計画には含まれていなかった減数分裂における紡錘体チェックポイントの制御機構について、ケミカルバイオロジーとライブイメージングを用いた実験系を構築し、解析結果を論文発表した。当初の計画以上に大きな進展があったと判断する。今後は、減数分裂における連続した分裂期を引きおこす十分条件はなにか、という点に焦点をあてて研究を進める。APC/Cは減数分裂の進行にそって阻害と活性化をうけることが本研究より明らかになっている。APC/Cの活性を人工的に制御するための実験系を構築し、APC/Cの活性調節が分裂期を連続させるために必要十分であるか検証する。また、分裂期の終了に関与することが本研究の予備結果より示唆されているPP1の役割についてもあわせて検討をおこなう。以上の実験により、分裂期を2回連続させる特殊な細胞周期制御が、APC/CやPP1によっておこなわれるというモデルの実証を目指す。(抄録なし)
輝度ヒストグラムの分析による視環境デザイン手法の開発

照明環境の質を記述しデザインに活かせる可能性の高い,総体的な輝度分布と主観評価の関係について,屋外の夜景(イルミネーション,ライトアップ)を対象に画像データより作成した輝度ヒストグラムと主観評価実験結果の関連について分析を行った。主観評価実験は,現場実験および直視型高解像度(4K)ディスプレイによる実験である。複数の階級幅によるヒストグラムを作成して比較検討し,ディスプレイ上で輝度ヒストグラムの形状をほぼ再現できる階級幅が存在することが確認できた。屋外イルミネーションの評価と輝度ヒストグラムの関係については室内空間における知見とは異なり,単純な相関関係が得られないことも確認された。さまざまな環境(視環境)においてデジタルカメラを用いて広視野の画像撮影を行い,画像データより輝度ヒストグラムを作成し,これらをとりまとめたデータベース化のために,撮影機材の選定,購入,試行撮影を実施した。(1)対象環境対象環境選定のパラメーターとして,用途,空間の大きさについて取り扱う。対象環境の用途としては,本研究で取り扱う照明デザインが最も活用されると考えられる住宅,ホテルなどのエントランス,通路,居室等について,現実の環境での撮影を行った。また検討の結果,近年一般的となってきた屋外環境の照明演出も対象に含めることとし,樹木ライトアップおよびライトアップイベントについて撮影を実施した。(2)撮影方法本研究では,分析対象とする視野範囲の最適化についても検討を行うため,じゅうぶんに広視野のデータを撮影しておく必要がある。さまざまな環境で撮影を行うために小型カメラ+広角レンズ,またさらに広視野の撮影のために魚眼レンズを導入した。(3)輝度ヒストグラムの作成輝度分布測定システムを用いて撮影画像各ピクセルの輝度データを得るため輝度分析ソフトを最新版に更新した。通常のデータでは各ピクセルは中心からの距離により立体角範囲が異なるため,ピクセルデータの重み付けを行って立体角単位のデータに変換する手順を確認した。このデータを用いて,横軸が輝度値の対数,縦軸が立体角であるヒストグラムを作成する。このようなヒストグラムをいろいろな視野範囲に対して作成することができる。これらをとりまとめてデータベースを構築する。H25年度に引き続き、さまざまな環境(視環境)においてデジタルカメラを用いて広視野の画像撮影を行い、画像データより輝度ヒストグラムを作成する。H26年度は新たに魚眼レンズを用いた輝度ヒストグラム作成を開始した。ドイツにおいてデータを作成する機会があったため、対象環境として新たに屋外のイルミネーション、ライトアップを加えることとした。主観評価実験については当初計画の映像による実験は実験設備の構築中であるため、実環境での評価とした。実験設備は、当初予定していたスクリーンへの投影映像に代わり、低価格化によって導入が可能となった直視型高解像度ディスプレイを導入して提示環境を構築中である。これらをもとに輝度ヒストグラムと主観評価データの関係について、初期的な分析を行った。視野範囲については、標準的な広視野角と考えられる範囲についての分析を行い、ピーク形状の特徴による記述を行った。これまでのところ、屋外イルミネーションを対象としたヒストグラムによる記述を通して、基本的に室内照明で立てられた仮説を支持する結果が得られた。一部の仮説については異なる部分もあるため、今後の主観評価実験および他の評価対象等に関する検討を通して結果をまとめていく予定である。本研究は,照明環境の質を記述しデザインに活かすことのできる可能性の高い,総体的な輝度分布とその主観評価の関係を対象とし,予備的な分析で有効とみられる仮説を検証することを目的としている。このためにH27年度までに撮影した画像データより輝度ヒストグラムの作成・分析を継続して行った。対象環境は主としてドイツの屋外イルミネーション,ライトアップである。デジタル画像データのような階調値の細かいデータからヒストグラムを作成する場合の階級幅についてはまだ知見がないため,複数の階級幅によるヒストグラムを作成して比較検討した。主観評価実験については,現場実験のデータの分析,および直視型高解像度ディスプレイによる実験を行った。ディスプレイ実験においては,視野角が現場実験と同じになるよう設定するとともに,輝度ヒストグラムがどの程度再現されているかについてもデータを収集し整理した。これまでに得られた結果として,ディスプレイ上で輝度ヒストグラムの形状をほぼ再現できる階級幅が存在することが確認できた。屋外イルミネーションの評価と輝度ヒストグラムの関係については,室内照明で立てられた仮説を支持する結果も一部あるものの,今回の対象では他の要因(空間形状,照明光色など)の影響がやや大きく,これらを統制もしくは場合分けしての実験・分析が必要であると示唆された。このことは景観評価における固定要素・変動要素に関する知見と結びついていると考えられ,照明環境評価に変動要素モデルを導入することが必要であることが確認された。さまざまな環境(視環境)においてデジタルカメラを用いて広視野角の画像撮影を行う計画に対し,有効な撮影機材が稼働しており,ヒストグラムが得られている。海外の屋外ライトアップイベント,イルミネーションのデータも得られ,現場実験・映像評価実験も一通り完了している。このためにH27年度までに撮影した画像データより輝度ヒストグラムの作成・分析を継続して行っている。デジタル画像データのような階調値の細かいデータからヒストグラムを作成する場合の階級幅について知見がなかったため,複数の階級幅によるヒストグラムを作成して比較検討した。また主観評価実験については,現場実験のデータの分析および直視型高解像度ディスプレイによる実験を行った。

ディスプレイ実験においては,視野角が現場実験と同じになるように設定するとともに,輝度ヒストグラムがどの程度再現されているかについてもデータを収集し整理した。これまでに得られた結果として,ディスプレイ上で輝度ヒストグラムの形状をほぼ再現できる階級幅が存在することを確認しているが,屋外のイルミネーションの評価と輝度ヒストグラムの関係については空間形状や照明光色などの影響が大きいことがわかっており,照明環境評価に変動要素モデルを導入する必要があることがわかった。そこで,本研究課題の中では視環境デザイン手法として,輝度分布を用いたその他の明るさに関する研究事例との間の関係の整理,イルミネーションの評価構造について先に検討することとし,H28年度には最新の研究事例を収集しつつ,あらためて概念整理を行うとともに,評価構造抽出のための調査に向けての準備を行った。さまざまな環境(視環境)においてデジタルカメラを用いて広視野角の画像撮影を行う計画については順調に進展しヒストグラムが得られた。海外の屋外ライトアップイベント,イルミネーションのデータも得られ,現場実験・映像評価実験も一通り完了している。これらの結果を分析したところ,当初の見込みとはやや異なる結果が得られたため,研究内容をやや変更し,他の明るさ研究との関係整理,評価構造抽出調査の準備を行ったため,これらの結果はまだ得られていないが,最終年度前半には評価構造データが得られる見込みである。光環境の質に関する研究分野では,その定義や測定・記述についてさまざまなアプローチがなされている。しかし未だ決定的な定義はなく,照明環境の質の記述についても糸口がつかめているとは言い難い。そこで本研究では,照明環境の質を記述しデザインに活かすことのできる可能性の高い,総体的な輝度分布とその主観評価の関係を対象とし,予備的な分析で有効と見られる仮説を検証することを目的とする。本研究における考察は最近の脳機能に関する知見や自然景観に関する考え方,さらには心理生理的反応に関する分析などを反映したものである。このために各所で撮影した画像データより輝度ヒストグラムの作成・分析を行った。対象環境は主として屋外の夜景(イルミネーション,ライトアップ)である。デジタル画像データのような階調値の細かいデータからヒストグラムを作成する場合の階級幅について知見がなかったため,複数の階級幅によるヒストグラムを作成して比較検討した。また主観評価実験については,現場実験のデータの分析および直視型高解像度(4K)ディスプレイによる実験を行った。
舌組織における組織増殖時のヒスタミン・ポリアミン変動と薬物の影響

本研究は、組織増殖におけるヒスタミン、ポリアミンの役割追求に重点を置き、増殖速度の早い組織として、舌に癌細胞移植あるいは発癌物質による発癌誘導を行い、人為的に作成した増殖組織におけるこれらアミン類、特にヒスタミンの役割を追求した。1.先天的肥満細胞欠損マウス(W/W^v)を用い、舌にエ-リッヒ腹水癌細胞を移植、congenic動物である+/+マウスおよび正常動物ddy系マウスと比較することにより、腫瘍増殖初期における肥満細胞およびヒスタミンの影響を検討、肥満細胞の存在が腫瘍組織増殖に促進的に作用すること、W/W^vにおいて、組織増殖とともに非肥満細胞由来ヒスタミンが増加することを認めた。現在、ヒスタミン生成酵素であるHDCの酵素活性阻害剤αFMHを使用、ヒスタミンの役割を更に追求中である。2.化学発癌分室であるDMBAをハムスタ-舌に塗布時におけるHDCおよびプトレシン生成酵素であるODCの活性変動を検討、DMBA塗布により、両者の活性は共に増加するが、抗蛋白生成作用を有するアクチノマイシンDを同時投与した場合、HDC活性のみが著しい増加を示し、非肥満細胞由来のいわゆるinducible HDCの活性増加によると推定された。3.DMBA誘発ハムスタ-舌癌におけるヒスタミンおよびポリアミンの変動を検討したところ、正常組織に比べ、腫瘍組織においてプトレシンなど一連のポリアミン量の増加、放射線照射によりそれら増加の抑制を認めたのに対し、ヒスタミンはなんらの変動も示さなかった。以上の結果より、腫瘍組織で代表される増殖組織において、増殖初期には非肥満細胞由来のヒスタミンが重要な役割を果たすことが示唆された。本研究は舌に癌細胞を移殖、人為的に組織増殖の実験モデルを作成し、組織増殖時におけるポリアミンおよびヒスタミン(殊に非肥満細胞由来)代謝変動と薬物の影響を検討することを計画としている。一方、ヒスタミン含有細胞である肥満細胞は腫瘍増殖時において、その数が増加することが知られるが、腫瘍増殖時における肥満細胞の役割もまた意見の分かれるところである。本年度は実施計画に基づき、マウス舌への腫瘍移植時のポリアミン・ヒスタミン量の変動と両者の生成酵素の活性変動を検討することにした。〔方法と材料〕先天的肥満細胞欠損マウスW/W^Vを使用、対照群としてコンジェニックマウス+/+およびddYを使用。エーリッヒ腹水癌細胞(5.5×10^5個)を舌筋層内に筋注、経時的に腫瘍増殖時のヒスタミン・ポリアミン及びそれら生成酵素の活性変動を定量した。方法としては遠藤の方法(Method in Enzym94,42ー47)を一部変更し、使用した。〔結果〕+/+およびddYにおける腫瘍容積の増加は略々等し、傾向を示したのに対し、W/W^Vにおいてはその増加が対照群に比べ小さな値を示した。また、癌細胞移植6日後において、舌ヒスタミン量は+/+、ddYともに減少を示したが、W/W^Vにおいては逆に有意の増加を示した。なお、癌細胞を腹腔内投与時における生存日数を比較検討したところ、500×10^4個投与時において、ddYおよび+/+群は9日において多くは死亡していたが、W/W^V群においては9日から12日において死亡した。〔結論〕本研究において、腫瘍増殖初期においては肥満細胞の存在が増殖を促対照群と異なり増加傾向を示したことは、ヒスタミンの存在が腫瘍増殖に重要な役割を有することを示唆している。今後、カルチノーマ細胞を用いて同様実験をすべく準備中である。生体内における主要なヒスタミン貯蔵細胞である肥満細胞は腫瘍増殖時においてその数が増加することが知られるが、その役割については意見の分れるところである。昨年度は先天的肥満細胞欠損マウス(w/w^v)の舌にエ-リッヒ腹水癌細胞を移植。腫瘍増殖初期における肥満細胞およびヒスタミンの役割を検討、両者が増殖に重要な役割を果す可能性を示唆した。

本年度においては抗ヒスタミン生成酵素剤αーフルオロメチルヒステジンの作用を同一実験において検討中である。一方、薬品入手に時間を要したため、ヒスタミンの役割について、DMBA誘発舌癌を中心に検討を加えた。〔実験概要と結果〕実験(1):DMBA誘発舌癌を使用、形成後の時間的経過をみた腫瘍組織中のヒスタミンおよびポリアミンの定量を行った。雄ハムスタ-舌左側に180日間、2日間隔で発癌物質DMBAの1%溶液を塗布、腫瘍形成を肉眼的に確認後、発癌操作を中止、2ケ月放置、腫瘍の充分な形成を計りその腫瘍組織(偏平上皮癌)中のヒスタミン、ポリアミン量の測定を行った。また、放射線3Gy一回照射10日後におけるアミン量変動を定量した。その結果、腫瘍組織におけるポリアミン量の増加を認め、放射線照射により減少するを認めたが、ヒスタミン量は何ら変化を示さなかった。実験(2):DMBAによる舌癌誘発開始時のヒスタミン生成酵素(HDC)およびプトレシン生成酵素(ODC)の活性変動を検討した。雄ハムスタ-舌左側にDMBA塗布後、4時間および6時間後におけるHDCとODC活生を測定した。また、蛋白生成阻害剤であるアクチノマイシンD同時投与の影響を検討した。その結果、HDCおよびODC活性はわずかな増加を示したが、アクチノマイシン同時投与によりHDC活性は著明な増加を示した。〔結論〕以上より、腫瘍組織増殖時において、ヒスタミンが重要な役割を果していることが示唆された。現在、更に検討中である。
金属ナノ粒子ペーストの常温焼結に関する研究

加熱処理を必要とせず,Agナノ粒子ペーストの低温焼結法として提案している,アルコール浸漬処理について得られた知見を以下にまとめる.SP(溶解パラメータ)値を基にしたパラメータを導入することで,Ag表面,分散剤,溶剤の相互作用の大小を議論することができ,分散剤除去のメカニズムを明らかにした.ペーストをガラス基板上に描画すると,溶剤であるトルエンは自然に揮発する.ここでアルコールによる浸漬処理を行うと,アルコールードデシルアミンおよびアルコール-Agナノ粒子それぞれの間における親和性の高さが,Ag-ドデシルアミンの親和性を上回る.これにより,ドデシルアミンはAgナノ粒子から効果的に剥離し,アルコール中に溶解する.エネルギーの高いAgナノ粒子は常温においても焼結し,ネック成長および粒子の粗大化に伴い低抵抗の配線を形成する.メタノール浸漬処理は,分散剤の除去能力が非常に高く,2h以内に分散剤を除去することができる.これにより,常温においても加熱処理と同程度の電気抵抗率を得ることが出来る.また,浸漬処理は低温処理にも関わらず,分散剤が深さ方向に均一に除去され,Ag粒子は一様に粗大化する.アルコール浸漬処理の促進方法について,処理液の温度を上げることにより,分散剤の除去および拡散が加速され,処理効果を促進させることができる.また,超音波の照射は,温度を上げることなく分散剤の溶解速度を速め,短時間で低抵抗を実現させることができる.分散剤除去のメカニズムから,浸漬処理に有効な処理剤は,金属ナノ粒子と分散剤の双方に適度な相互作用を有していなければならない.具体的には,分散剤と同程度のを持ち,高い親和性を有していること.また,排除体積,緩和時間を考慮した場合,分子鎖の短い処理剤が効果的である.新規Agナノ粒子ペーストの特性把握を行った。このペーストは従来のペーストと比較し、粒子に吸着している有機物を極力少なくしたものである。ペーストの大きな特徴は、溶剤の蒸発と共に焼結が起こり始め、またそれは粒子の粗大化や結晶粒の成長を伴うものであることが分かった。さらに、焼結したペーストは100nm程度の粒子がネック成長した多孔体になっていることを微細組織観察から確認した。また、このペーストは溶剤の蒸発を防ぐことによって保存することが可能であり、1ヵ月の保存後にも、溶剤の蒸発と共に焼結が起こることを確認した。このペーストを用いた接合に関して、Cu板を常温大気中で接合させることに成功した。研磨したCu板に新規ペーストを塗布し、1MPaの圧力を加えながら大気中に放置した。その結果、6時間以上放置した接合体で約8MPaのせん断強度があることが判明した。破断はAg焼結体内部から起きており、良好な接合が得られていると言える。また、接合強度は接合時間と共に増加し、これは常温焼結による粒子の粗大化、ネック成長に起因することを確認した。加熱処理を必要とせず,Agナノ粒子ペーストの低温焼結法として提案している,アルコール浸漬処理について得られた知見を以下にまとめる.SP(溶解パラメータ)値を基にしたパラメータを導入することで,Ag表面,分散剤,溶剤の相互作用の大小を議論することができ,分散剤除去のメカニズムを明らかにした.ペーストをガラス基板上に描画すると,溶剤であるトルエンは自然に揮発する.ここでアルコールによる浸漬処理を行うと,アルコールードデシルアミンおよびアルコール-Agナノ粒子それぞれの間における親和性の高さが,Ag-ドデシルアミンの親和性を上回る.これにより,ドデシルアミンはAgナノ粒子から効果的に剥離し,アルコール中に溶解する.エネルギーの高いAgナノ粒子は常温においても焼結し,ネック成長および粒子の粗大化に伴い低抵抗の配線を形成する.メタノール浸漬処理は,分散剤の除去能力が非常に高く,2h以内に分散剤を除去することができる.これにより,常温においても加熱処理と同程度の電気抵抗率を得ることが出来る.また,浸漬処理は低温処理にも関わらず,分散剤が深さ方向に均一に除去され,Ag粒子は一様に粗大化する.アルコール浸漬処理の促進方法について,処理液の温度を上げることにより,分散剤の除去および拡散が加速され,処理効果を促進させることができる.また,超音波の照射は,温度を上げることなく分散剤の溶解速度を速め,短時間で低抵抗を実現させることができる.分散剤除去のメカニズムから,浸漬処理に有効な処理剤は,金属ナノ粒子と分散剤の双方に適度な相互作用を有していなければならない.具体的には,分散剤と同程度のを持ち,高い親和性を有していること.また,排除体積,緩和時間を考慮した場合,分子鎖の短い処理剤が効果的である.
気分障害モデルマウス遺伝要因の解明

マウスにおける尾懸垂試験(TST)及び強制水泳試験(FST)の無動時間はヒトの抗うつ薬スクリーニングに用いられる指標である。そのため、この表現型を制御する責任遺伝子の同定、候補遺伝子の絞り込み、機能解析は、ヒトの精神疾患のメカニズムの解明や創薬に貢献できる。(1)QTL解析により検出された4番染色体上のFST無動時間を制御する責任遺伝子の同定を目的とした。昨年度、4番染色体上の責任遺伝子は、約15Mbp(138.4-155Mbp)間に存在することを明らかとした。そこで、さらに責任遺伝子存在領域を絞り込むためにFST無動時間が短縮する既存のコンジェニックマウスとC57BL/6Jマウスとを交配させ、新たに11系統のサブコンジェニック系統を作出し、FST無動時間を計測した。その結果、いずれのサブコンジェニック系統においても無動時間の短縮は認められなかった。(2)行動的絶望を制御する遺伝子Usp46の解明を目的とした。TST及びFSTの無動時間を制御する遺伝子のひとつはUsp46である。Usp46は脱ユビキチン化酵素であるが、その基質や関与する神経系などは不明である。そこで、Usp46KOマウスを作出し、薬理学的解析を行った。その結果、Usp46はGABA系を介する事が明らかとなった。さらに、様々な行動試験によって、KOマウスの表現型を解析した。その結果、TST、FSTだけでなく、Ethanol嗜好性、Ethanol鎮静効果、sucroseへの反応性、新規物体認知試験、Novelty-suppressed feedingtestにおいて行動の変化が認められた。これらの結果は予想外のものであり、Usp46の機能を解明するうえで、重要な知見である。マウスの行動的絶望を制御する量的形質遺伝子のうち、QTL解析により検出された4番染色体上の原因遺伝子の同定を目標とした。C57BL/6Jマウスをバックグラウンドとし、4番染色体上の一部をCSマウスの染色体に置き換えた既存のコンジェニックマウスを使用した。コンジェニックマウスに強制水泳テスト(FST)を実施し、遺伝型と照らし合わせることで原因遺伝子の存在領域を絞り込んだ。FSTにおいて無動時間が短縮したコンジェニックマウスの遺伝型より、行動的絶望を制御する原因遺伝子は4番染色体上の約15Mbp(138.4-155Mbp)間に存在することが明らかとなった。さらに原因遺伝子存在領域を絞り込むため、FSTにおいて無動時間が短縮する既存のコンジェニックマウスとC57BL/6Jマウスを交配させ、組み換え個体を得た。現在、14系統のサブコンジェニック系統を育成している。そのうち、9系統はF1世代が得られた。さらにその中の3系統はF2世代が得られ、FSTを実施している。マウスの行動的絶望はヒトの抗うつ薬のスクリーニングに用いられてきた。このため、原因遺伝子の同定はヒトの精神疾患の原因解明に大きく貢献することができる。前述のQTL解析を基に同定された5番染色体上の原因遺伝子"Usp46"の機能解析を行った。Usp46の詳細な機能や働きは不明であるが、GABA系に影響を及ぼすことが分かっている。この事から、Usp46突然変異マウスにおける脳内のGABA関連タンパク質について免疫組織学的手法を用いて検討した。GABA陽性細胞のマーカーとして利用されているパルプアルブミン(PV)を染色したところ、Usp46突然変異マウスの脳内PV陽性細胞数に変化は認めらなかった。この結果から、GABA生産量自体が減少している可能性が示唆された。
MATベクター系を用いた耐病性マーカーフリートマト植物の作出

植物の遺伝子組換えにおいて、目的とする遺伝子以外に選抜マーカー遺伝子が導入されることが、組換え植物の社会的な受容を妨げる要因のひとつとなっている。本研究は、この選抜マーカー遺伝子除去が可能な形質転換法であるMATベクター法を用い、キチナーゼ遺伝子およびディフェンシン遺伝子を園芸作物として重要なトマトに導入し、選抜マーカーフリーの耐病性トマトを作出する目的で行ったものである。まずトマトおよびナス科の重要な園芸作物であるジャガイモ、ペチュニア、ニーレンベルギアを対象に、MATベクターを持つA.tumefaciens EHA101菌株を用いて、葉切片および実生組織片を用いて感染条件の検討を行った。菌を接種した切片は除菌用抗生物質を含み、選抜用抗生物質と植物ホルモンを含まないMS培地上で培養したところ、4種類の植物すべてで、iptタイプMATベクターにおいては特異的なシュート塊であるiptシュート、rolタイプのMATベクターにおいてはrol遺伝子によって毛状根が誘導された。さらにiptシュートおよび毛状根からは選抜遺伝子が自動的に除去された正常に伸長するシュートが出現した。こうして得られた植物体について導入遺伝子の有無を解析した結果、選抜マーカーを伴わない形質転換体であることが確認された。さらに、耐病性遺伝子であるキチナーゼおよびディフェンシン遺伝子を導入したiptタイプおよびrolタイプの2種類のMATベクターを構築し、トマトのモデル品種であるMicro Tomおよび市販の数品種を対象に、上記実験で得られた最適感染条件下で形質転換を行った。その結果、iptシュートから耐病性遺伝子を導入したマーカーフリーの形質転換植物を得ることが出来た。今後はこれらの形質転換体の耐病性検定を行い、その有用性を確認する予定である。植物の遺伝子組換えにおいて、選抜マーカーを形質転換体作出の初期段階で自動的に除去する方法として、MATベクターシステムが開発されている。本研究は、このMATベクター法を園芸作物として重要なトマトに適用し、耐病性を付与することが期待されているキチナーゼ遺伝子およびディフェンシン遺伝子の導入を行い、選抜マーカーフリーの耐病性トマト作出を目的に行ったものである。まず本年度は耐病性遺伝子であるキチナーゼおよびディフェンシン遺伝子をMATベクターを用いて導入するために、日本製紙から譲渡を受けたiptタイプおよびrolタイプの2種類のMATベクター上へ、両遺伝子を個々に導入した4種類のベクターを構築した。これと平行して、トマトおよびナス科の重要な園芸作物であるジャガイモ、ペチュニア、ニーレンベルギアを対象に、耐病性遺伝子導入前のベクターを持つA.tumefaciensEHA101菌株を用いて、葉切片および実生組織片を用いて感染条件の検討を行った。現在はそれらを継代中であり、これらの選抜遺伝子が自動的に除去された正常に伸長するシュートの出現を待っている段階である。さらに、耐病性遺伝子を導入したMATベクター構築後は、トマトのモデル品種であるMicro Tomおよび市販の数品種を対象に、上記実験で得られた最適感染条件下で形質転換を行い、iptシュートと毛状根の誘導に成功した。今後はこれらの組織からの正常な植物体分化を待って、形質転換の確認とマーカー遺伝子除去を確認する予定である。