hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グライコーム異常によるグリア細胞の活性化機構

GM2ガングリオシドーシスは、リソソーム酵素であるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)の欠損に基づき、糖脂質であるGM2ガングリオシド(GM2)が過剰に蓄積して発症する常染色体劣性遺伝病であり、中枢神経症状を伴う代表的なリソソーム病である。本研究ではGM2ガングリオシドーシスの発症メカニズムの解明を目指し、SDマウス由来グリア細胞株(ミクログリア、アストロサイト)を用いて、蓄積している生体基質の解明と生体内基質蓄積による細胞内シグナル異常の解明、そしてサイトカイン・ケモカイン産生メカニズムの解明を明らかにすることを目的とした。その結果、SDマウス由来アストロサイトでは、ERKの活性化が起こり、細胞増殖が異常になっていることが明らかとなった。またミクログリアでは生体内基質蓄積により、Akt及びPKCの活性化が起こり、ケモカインであるMIP-1αが産生増大していることが明らかとなった。これらは、SDマウスの脳における病態を反映しており、生体内基質蓄積によるグリア細胞の活性化機構を解明することができた。本研究ではGM2ガングリオシドーシスの発症メカニズムの解明を目指し、以下の実験を行った。1)抗体による各グリア細胞株における細胞内蓄積糖脂質解析樹立しているSandhoff病モデルマウス(SD)由来グリア細胞株(ミクFグリア及びアろトロサイト)に対して、生体内基質に対するモノクローナル抗体を用いて間接蛍光抗体法により蕃積の程度及び局在性を検討し、Hex欠損に基づくGM2、GA2、末端GlcNAc含有糖鎖の蓄積が起こっており、その局在はリソソームであることが明らかになった。2)TLCによる各グリア細胞株における蓄積糖脂質解析SD由来グリア細胞株において総脂質を抽出し、TLCで展開後、糖脂質を検出して野生型由来細胞と比較を行い、アストロサイトではSD由来細胞においてβ-Hex欠損に基づくアシアロGM2(GA2)、GM2、グロボシドの蓄積が起こっており、さらに2次的な蓄積と考えられるGM3の蓄積が観察された。またミクログリアではアストロサイトと同様にHex欠損に基づくGA2、GM2、グロボシドの蓄積及び2次的な蓄積と考えられるGMI及びGDIaの増大が観察された。3)2次元電気泳動によるアストロサイト細胞株におけるタンパク変動解析SD由来アストロサイト細胞株において細胞抽出液を調製し、2次元電気泳動を行い、タンパクの変動を野生型由来細胞と比較した。その結果、幾つかのタンパクにおいてスポットの変動が観察された。4)ミクロクリア細胞株の細胞運動解析リアルタイム培養細胞観察装置を用いて、SD及び野生型由来ミクロクリアの細胞運動を比較した。その結果。野生型由来細胞では短い突起を延ばして周辺を動き回っていたのに対し、SD由来細胞では明らかに運動性が増大しており、長い突起を延ばして大きく動いていた。これはHexの欠損に基づく生体内基質の蓄積によりミクログリアが活性化して運動性が増大しているためと考えられる。以上より、SD由来クリア細胞株における蓄積基質及び活性化が明らかとなり、Sandhoff病でのクリア細胞の活性化メカニズムの解明において重要なツールとして役立つと考えられる。今後活性化に関わっている因子の同定を行っていく予定である。GM2ガングリオシドーシスはリソソーム酵素であるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)の欠損に基づき、糖脂質であるGM2ガングリオシド(GM2)が過剰に蓄積して発症する常染色体劣性遺伝病であり、中枢神経症状を伴う代表的なリソソーム病である。本研究ではGM2ガングリオシドーシスの発症メカニズムの解明を目指し、SDマウス由来グリア細胞株(ミクログリア、アストロサイト)を用いて、1)蓄積している生体基質の解明、2)生体内基質蓄積による細胞内シグナル異常の解明、3)サイトカイン・ケモカイン産生メカニズムの解明、4)グリア細胞活性化に関与するサイトカイン・ケモカインの探索を明らかにすることを目的としている。平成20年度は2)生体内基質蓄積による細胞内シグナル異常の解明、3)サイトカイン・ケモカイン産生メカニズムの解明を中心に研究を行い、SDマウス由来ミクログリア細胞株において、Aktの増大及びPKCの細胞内から膜への移行を明らかにし、さらに細胞内ERK、JNKそしてPLCが野生型と比較して上昇していることを明らかにした。同様にSDマウス由来アストロサイトにおいてERK及びAktのリン酸化に異常が起こっていることを明らかにした。

今後は、これらの細胞株においてSDマウスの脳で選択的に増大しているケモカインであるMIP-1αの発現上昇に関する詳細なメカニズムを解明する予定である。またSDマウス骨髄において細胞型解析を行ったところ、野生型とは異なっており、特に単球・マクロファージに異常が起こっていることを明らかにした。これらの細胞はSDマウスの脳に移行していることが既に明らかとなっており、MMIP-1αに対する応答性を解析した結果、野生型由来単球と比較してSDマウス由来単球では顕著にMIP-1αに誘引されることが明らかとなった。今後はSDマウスに標識した野生型及びSD由来単球を移植し、in vivoでの証明を試みる予定である。GM2ガングリオシドーシスはリソソーム酵素であるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)の欠損に基づき、糖脂質であるGM2ガングリオシド(GM2)が過剰に蓄積して発症する常染色体劣性遺伝病であり、中枢神経症状を伴う代表的なリソソーム病である。本研究ではGM2ガングリオシドーシスの発症メカニズムの解明を目指し、SDマウス由来グリア細胞株(ミクログリア、アストロサイト)を用いて、蓄積している生体基質の解明と生体内基質蓄積による細胞内シグナル異常の解明、そしてサイトカイン・ケモカイン産生メカニズムの解明を明らかにすることを目的としている。平成21年度は2)生体内基質蓄積による細胞内シグナル異常の解明及びサイトカイン・ケモカイン産生メカニズムの解明を中心に研究を行い、SDマウス由来ミクログリア及びアストロサイト細胞株において、様々なシグナル伝達機構が異常になっていることを明らかにし、これによりミクログリアではケモカインであるMIP-1αが顕著に分泌さら、アストロサイトでは異常な増殖を示すことが示唆された。またミクログリアの形態及び運動もSDマウスでは異常となっており、幾つかのシグナルが関わっていることが明らかとなり、論文投稿の準備をしている。まだSDマウスの脳に移行している血球系細胞が単球・マクロファージであることを明らかにし、さらにMIP-1αに対する応答性を解析した結果、顕著にMIP-1αに誘引されることが明らかとなった。以上から、SDマウス脳内では生体内基質の蓄積により、グリア細胞のシグナル伝達機構が異常となり、様々な応答が起こり、活性化マクロファージの浸潤などの病態を引き起こすことが明らかとなった。
レギュレータープロテオミクスによる新規の筋分化因子およびユビキチン装置の探索

TIP120Bで増えるタンパク質としてマイオジェニンとMyoDが同定され、マイオジェニンの分解関連酵素の成分としてMAFbxが同定された。筋芽細胞分化はTIP120BやMyoDで上昇し、一方、筋萎縮措置ではこれらのタンパク質が低下した。TIP120BプロモーターはE-boxをもち、MyoDにより活性化され、TIP120Bの発現はMyoDレベルと相関して変化した。MyoDはプロテアソームで分解されるが、それはTIP120Bによって阻害された。以上の結果から、MyoDとTIP120Bの間の相互活性化機構の存在が示唆された。近年、タンパク質分解による制御が筋分化に深くかかわることが知られるようになった。筋分化因子の代表的なものにMyoDやマイオジェニンがある。TIP120Bは筋特異的に発現することから、筋分化と関連があると考えられた。マイオジェニンはユビキチン化された後でプロテアソームによって分解されるといった制御を受けるが、その抑制にはTIP120Bが関与する。TIP120BはSCF複合体に結合することによってSCF複合体を不安定かし、結果、ユビキチン化が阻害される。以上のような事が明らかになったが、TIP120Bで分解が抑えられるタンパク質は、マイオジェニンだけではない可能性がある。本研究では、TIP120Bによって誘導的に発現上層する筋分化関連タンパク質の包括的に解析を通して筋分化のメカニズムを明らかにする。本研究課題では、筋肉におけるタンパク質分解の新たな制御機構、制御因子の発見を念頭に、特にエビキチン-プロテアソ-ム系に注目して研究を行った。筋肉はタンパク質分解の盛んな組織であり、骨格筋はある種の疾病や神経切断、筋肉の不使用などにより急速に委縮する。研究代表者らはこれまでの研究により、培養化された筋管細胞において、筋分化因子の一つマイオジェニンが急速に分解され、そこにユビキチンリガ-ゼであるSCF複合体が関与する事を明らかにしている。SCFはSkpl,Cull,F-boxタンパク質からなるが、Cullは触媒活性をもち、F-boxタンパク質は標的タンパク質結合という標的特異性に関る部分で、SkplはCullとF-boxタンパク質を連結している。さらにTIP120BはCullと結合し、それによってSCF複合体を解離させるというユビキチン化にとって負に働く因子である。以上のような背景を踏まえ、本年度は以下のような研究を行なった。まずSCF複合体のさらなる解析を行なった。その結果これまで未知であったF-boxタンパク質について、MAFbxがその候補として浮かび上がった。MAFbxは筋萎縮で発現が上昇する因子で、MyoDの分解に関与する。本研究ではMAFbxとマイオジェニンとの結合や、過剰発現によるマイオジェニンの減少、さらにはマイオジェニンのポリユビキチン化などが観察された。TIP120Bは筋分化を促進する。TIP120Bの遺伝子発現は筋分化にともなって発現するという現象を見出し、その発現制御機構を検討した。その結果MyoDが制御因子となる可能性が示され、遺伝子上流にMyoDコンセンサス配列の存在が明らかとなった。本研究課題では、筋肉におけるタンパク質分解の新たな制御機構、制御因子の発見を念頭に、特にユビキチン-プロテアソーム系に注目して研究を行った。研究代表者らはこれまでの研究により、培養化された筋管細胞において、筋分化因子の一つマイオジェニンが急速に分解され、そこにユビキチンリガーゼであるSCF複合体が関与する事を明らかにしている。SCFはSkp1,Cul1,F-boxタンパク質からなるが、Cul1は触媒活性をもち、F-boxタンパク質は標的タンパク質結合という標的特異性に関る部分で、Skp1はCul1とF-boxタンパク質を連結している。さらにTIP120BはCul1と結合し、それによってSCF複合体を解離させるというユビキチン化にとって負に働く因子である。以上のような背景を踏まえ、本年度の研究では以下のような成果が得られた。まずSCF複合体のさらなる解析を行ない、った。これまで未知であったF-boxタンパク質について、MAFbxがその候補として浮かび上がったが、今年度はMAFbxのcDNAおよび抗体を使用し、この因子がMAFbxであることを確定させた。細胞内ユビキチン化解析の結果、MAFbxを含むSCFがマイオジェニンのユビキチン化に関わる事を明らかにした。

昨年度はTIP120Bの遺伝子発現は筋分化にともなって発現するという現象を見出し、その発現制御機構を検討したが、本年度は複数存在するMyoD結合部位のうち、最も重要なものとして、一つの領域を同定した。これとは別にMAFbxの遺伝子発現がMyoDで活性化されるという現象を見出し、その制御領域が遺伝子上流約3kb以内に含まれることを明らかにした。本研究課題では、筋肉におけるタンパク質分解の新たな制御機構、制御因子の発見を念頭に、特にユビキチン-プロテアソーム系に注目して研究を行った。筋肉はタンパク質分解の盛んな組織であり、骨格筋はある種の疾病や神経切断、筋肉の不使用などにより急速に委縮する。研究代表者らはこれまでの研究により、培養化された筋管細胞において、筋分化因子の一つマイオジェニンが急速に分解され、そこにユビキチンリガーゼであるSCF複合体が関与する事を明らかにしている。SCFはSkp1,Cul1,F-boxタンパク質からなるが、Cul1は触媒活性をもち、F-boxタンパク質は標的タンパク質結合という標的特異性に関る部分で、Skp1はCul1とF-boxタンパク質を連結している。さらにTIP120BはCul1と結合し、それによってSCF複合体を解離させるというユビキチン化にとって負に働く因子である。以上のような背景を踏まえ、本年度の研究では以下のような成果が得られた。まずマイオジェニン分解にかかわるSCF複合体の1成分であるMAFbxについて、そのゲノムDNA(とりわけプロモーター部位)を取得し、転写制御解析を行った。その結果、MAFbxの発現にはMyoDとマイオジェニンの双方が関わることが示唆された。双方とも筋分化に正に効く転写因子であるが、それらが筋萎縮に働くMAFbxの発現にも関わる事が示唆された。この現象は、筋肉組織がタンパク質の分解と合成を並行させている組織である事を考えると、非常に興味深い。続いてTIP120B遺伝子の遺伝子発現についても検討した。その結果、ヒトやマウスのいずれのTOP120B遺伝子においても、上流部分のMyoD結合配列が転写に正にかかわり、MyoD因子が実際に転写の上昇に関わることが示唆された。TIP120B遺伝子の遺伝子発現についても検討した。
複合化による銅および銀一価強発光性錯体の高機能化

発光性遷移金属錯体は、配位子により発光性・分子サイズ・溶解度などを調整できる点、また、りん光を示す化合物が多い点から、光増感材ユニットのみならず、発光ダイオードの材料としても期待がもたれている。本研究では、これまで未開拓であったベンゼンチオール系配位子を持つ発光性の銅錯体の合成を系統的に行い、ハロゲノ配位子同様導入するピリジン系配位子により発光性制御が可能であることを示した。また、ハロゲノ銅錯体に関して、混合型配位子高分子を合成し、配位子の組合せによってはエネエルギー集約挙動がみられることを明らかにした。本研究では、強発光性の銅(I)ハロゲノ錯体、銀(I)ハロゲノ錯体に関するこれまでの研究を踏まえ、新たな銅(I)、銀(I)発光性錯体の開発に併せ、複合化による銅(I)、銀(I)錯体の高機能化を行う。具体的にはチオラト配位子を用いた新規発光性錯体の合成とこれまで得られた強発光性錯体の複合化を検討する。本年度は、昨年度の芳香族チオラト配位子を用いた新規発光性銅錯体を合成の結果を踏まえ、新たな錯体の合成を試みた。その結果、4-フルオロベンゼンチオール、4-クロロベンゼンチオール、4-ブロモベンゼンチオールを配位子とした際に、{Cu2(S-C6H4X)2(PPh3)}骨格をビスピリジルエチレンが架橋した配位高分子が合成できることを明らかにした。この化合物は、対応するハロゲノ錯体同様、室温固体状態で750nm付近を発光極大とする発光を示す。また、ブロモベンゼンチオールを用いると、二つの4,4'-ビピリジンが配位した錯体[Cu2(S-C6H4X)2(PPh3)(bpy)2]が生成することも明らかにした。これらの化合物の発光がピリジン系配位子への電荷移動遷移由来の発光であり、対応するハロゲノ錯体同様にピリジン系配位子の選択により発光色を制御できる可能性が示された。これらは、ホスフィン、チオール、およびピリジン系配位子を持つ銅錯体の最初の例である。複合化に関する研究としては、前年度の配位子混合型錯体の研究を踏まえ、配位子サイズの異なる混合配位子型銅(I)錯体[Cu2I2(PPh3)2(L)(1-x)(L')x]の合成を試みた。Lとしてビスピリジルエタン、L'としてピラジン、ピペラジンを用いた所、単一錯体と発光挙動の異なる化合物が生成することが明らかになった。単結晶構造解析により、ごく少量のピラジン、ピペラジンが構造中に取り込まれ発光物性が変化している可能性が示された。本年度は、芳香族チオラト配位子を用いた新規発光性銅錯体を合成した。その結果、ベンゼンチオール、p-トルエンチオール、4-フルオロチオール、4-ニトロベンゼンチオールを配位子とする発光性の複核および三核錯体をホスフィン誘導体を補助配位子として合成することができた。これらの錯体は可視領域に発光帯を示すが、その発光は第一次的には芳香族チオラト配位子の性質により制御され、青から赤までの発光が観測される。一方で、ホスフィン配位子の種類、核数はそれより小さい影響を与えることがわかった。複合化に関する研究としては、新規に混合配位子型銅(I)錯体[Cu2I2(PPh3)2(L)(1-x)(L')x]の合成を試みた。(L、L') : (ピラジン、アミノピラジン)および(ピラジン、ピペラジン)の組合せで複合型の錯体が合成できることを示した。単結晶構造解析によりこれらの錯体の構造を決定し、一次元鎖上にLおよびL'が混合して配列された錯体であることを確認した。複合型錯体を様々な反応比率で合成し、それぞれの比率で錯体の発光スペクトルの測定を行った。その結果、発光スペクトルは二つの発光サイトからの重ね合わせで説明でき、発光量子収率は親化合物の中間的な値をとることが明らかとなった。このことから、混合配位子型の錯体でも、発光励起状態は各サイトの配位子の種類により限定され、これらが連結された系として複合型錯体が捉えられることが示された。

本研究では、新たな銅(I)、銀(I)発光性錯体の開発に併せ、複合化による銅(I)、銀(I)錯体の高機能化を行う。具体的にはチオラト配位子を用いた新規発光性錯体の合成とこれまで得られた強発光性錯体の複合化を検討する。本年度は、強発光性錯体の複合化について主に検討した。前年度までに、大きさの近い配位子を用いると、同形混晶として複合型の発光性錯体を合成できることを示し、ピラジンーアミノピラジン混合錯体、ビスピリジルエタンービスピリジルエチレン混合錯体、ビピペリジンービピリジン混合錯体を合成した。まず、これらの錯体の発光挙動の検討を行った。また、架橋配位子の比率の決定についても詳しく検討した。これらの配位高分子が、ジメチルスルホキシド中で150度程度まで加熱すると分解することを見出し、この分解液のガスクロマトグラムを測定することにより、配位子の比率決定を行った。その結果、配位子の組合せにより、反応比とほぼ同じ比率で錯体中に取り込まれる場合と、反応当量比より大きく外れた比率で取り込まれる系があることを明らかとした。期間全体では、銅(I)チオラト錯体として最初の例であるホスフィン及びピリジン系配位子を持つ発光性錯体を合成し、その発光が対応するハロゲノ錯体と同じく銅チオラト骨格部分からピリジン系配位子への電荷移動遷移であることを示した。これにより、チオラト錯体の発光性もピリジン系配位子の選択により制御できることを明らかにした。複合系錯体に関しては、これまでの混合金属錯体、混合ハロゲノ錯体に加え、同形混晶形成を利用して架橋配位子混合型の錯体が合成できることを示した。また、サイズの異なる架橋配位子を用いると、異形混晶として混合配位子型の錯体が生成することも示した。混合比による影響も検討し、これらの混合配位子型の錯体でエネルギー集約挙動がみられることも明らかにした。錯体化学本研究では、チオラト配位子を用いた新規発光性錯体の合成とその発光メカニズムの解明による発光性の制御、および、発光性配位高分子の発光性に及ぼす複合化の影響の解明とそれによる高機能化を目指している。平成24年度は、チオラト錯体に関しては主に銅錯体について研究を行い、新規の複核および三核錯体を合成しこれらが発光性であることを示す事が出来た。平成25年度はこれに加えて、ホスフィン系配位子とピリジン系配位子を同時に持つ銅(I)チオラト錯体を合成することが出来た。これらの錯体に関しては、対応するハロゲノ錯体同様、ピリジン系配位子の性質が発光性に対して重要な働きをしている可能性が有ることを示せた。また、ホスフィン配位子を含まず、ピリジン系配位子のみで架橋された新規構造を持つ銅(I)チオラト配位高分子も得ることが出来た。複合化による配位高分子の機能化に関しては、24年度に同形結晶を与えるサイズの近い配位子の組合せでは混合錯体化が可能であることを示した。25年度は架橋配位子混合型の錯体の合成をさらに進め、ビスピリジルエタンとピラジン、ピペラジンなど二倍以上大きさの異なる配位子を混合した場合も、発光性に変化が出る例を見出し、サイズの異なる錯体でも混合配位子型錯体の合成の可能性が有ることを示すことが出来た。これらの知見は、混合系構築の可能性を広げるものである。これらのことから概ね順調に進展していると判断した。本研究では、チオラト配位子を用いた新規発光性錯体の合成とその発光メカニズムの解明による発光性の制御、および、発光性配位高分子の発光性に及ぼす複合化の影響の解明とそれによる高機能化を目指している。また、4位を置換したベンゼンチオラトを持つ錯体を補助配位子のホスフィンを選択することにより複数合成し、チオラト錯体でも系統的に錯体を合成できる可能性があることも明らかとした。
環境刺激に対する末梢性知覚応答の評価方法の確立と応用

振動覚、温度覚、触圧覚といった末梢性知覚の客観的な測定法の確立に取り組み、種々の基礎的検討を行い、更にそれらを振動工具取扱い業務従事者の末梢性知覚障害の評価に応用した。本研究では、振動感覚閾値、温度覚閾値、二点弁別閾値の定量的評価を可能とした。本研究の成果は以下の通りである。1)指において小型加振器から発生する2400Hzの各種振動刺激に対する振動感覚閾値の加速度レベルが短時間に定量的に測定できる。2)指にあてたプロ-ベの温度を温度覚測定用アンプを用いて一定速度で上昇させることにより、被験者が知覚した温度上昇のレベルから温度覚閾値の定量的評価が可能である。3)試作した二点弁別閾値計を用いることにより、二点弁別閾値を210mmの段階で定量的に評価できる。4)健常人において加齢に伴って100Hz,200Hzといった高い周波数を中心に全周波数域で振動感覚閾値の上昇が示された。5)加齢に伴って温度覚閾値、二点弁別閾値の上昇も観察された。6)臨床的応用により、レイノ-現象やシビレや痛みなどの自覚症状を訴える者の末梢性知覚障害の重症度の評価に有用である。以上、末梢性知覚応答の評価方法の確立により、振動覚、触圧覚といった末梢性知覚が定量的に評価され、上記の末梢性知覚への加齢の影響などをより詳細に検討することができ、従来の定性的な評価法に比較して末梢性知覚障害の重症度の評価も容易である。今後はさらに、本研究において確立された測定法を温熱条件、振動、騒音といった環境刺激の単独および複合暴露下における末梢性知覚への影響の解明に応用していく予定である。温熱、振動など種々の環境刺激は何らかの形で末梢の知覚に影響することが知られているが、本研究は温度覚、圧触覚、振動覚といった末梢の知覚に関する客観的な測定法を確立し、末梢性知覚影響、障害の程度を総合的に評価することを目的として行なった。まず、振動覚の客観的評価にあたっては2400Hzの各種周波数の振動暴露を指や手掌に加えるため、正弦波発振器を用いて小型加振器から振動を発生させ、加速度パックアップからの信号を2チャンネル信号分析器にて測定できるように装置を製作した。これにより振動刺激に対する振動感覚閾値レベルの測定が可能となり、健常人を対象にした基礎的検討の結果、2400Hzの8種類の周波数における健常人での正常閾値レベルが決定され、今後の臨床的応用において振動刺激の影響や振動刺激による障害の程度の把握が可能となった。現在、加振器から発生される各種振動刺激の加速度レベルの上昇・下降、刺激のオン・オフおよび被検者が知覚した加速度レベルの記録などをコンピューターを用いて制御・管理するためにソフトウエアを開発中であり、ソフトウエアの利用が可能となれば測定時間も短縮され、臨床的応用が一段と容易となるものと期待される。次に、痛覚の定量的評価のため1g毎の段階的な加重が可能な痛覚計を試作し、振動感覚閾値レベルと同じ部位の痛覚レベルの評価を可能とした。また、210mmの9段階の2点弁別閾値計も試作し、触圧覚の定量的評価も可能とした。以上の結果から、振動覚、痛覚、圧触覚に関してはそれらの感覚閾値レベルの総合的評価が可能となった。

温度覚の定量的評価法の確立は現在進行中であるが、すでに温度覚測定用センサーを試作し、指尖の皮膚温と同レベルからほぼ一定の速度で指尖に当てたセンサーの温度を上昇・下降させることが可能となっており、装置の完成の後、臨床的応用が開始される予定である。振動覚、温度覚、触圧覚などの末梢性知覚の客観的な測定法を確立するため、まず2400Hzの各種周波数の振動暴露を指尖に加え、振動刺激の加速度の上昇・下降、刺激のオン・オフおよび被験者が知覚した加速度をコンピュ-タ-上で制御・管理するための振動感覚閾値測定プログラムを開発し、小型加振器から発生される各種振動刺激に対する振動感覚閾値のレベルを短時間で測定することができるように装置を改良した。次に、指尖にあてたプロ-ベを温度覚測定用アンプを用いて1秒に約1°C上昇させる温度覚閾値測定装置を試作した。被験者が温度差を知覚し指で押すことによりスイッチが切れ、その時の温度上昇がコントロ-ラ-によって計測され同時にパネルメ-タ-に表示されるようにし、被験者が知覚した温度上昇のレベルから温度覚閾値の定量的評価を可能とした。これらの測定装置とすでに試作されている二点弁別閾値計を用いて振動感覚閾値、温度覚閾値、二点弁別閾値の健常人における正常レベルを決定した。また加齢に伴って100Hz、200Hzといった高い周波数を中心に全周波数域で振動感覚閾値が上昇することを明らかにした。この加齢の影響は、温度覚閾値、二点弁別閾値においても観察された。次に、これらの測定装置を振動工具取扱い業務従事者の末梢性知覚の定量的評価に応用した。チェンソ-使用者のなかでレイノ-現象のある者は、ほとんどの周波数域の振動感覚閾値、温度覚閾値、二点弁別閾値のいずれにおいても健常対照群に対して有意な閾値の上昇を示した。一方レイノ-現象はないがしびれや痛みのある者は温度覚閾値において健常対照群に対して閾値の有意な上昇を示した。このように、本装置は手指に自覚症状を訴える者の末梢性知覚障害の重症度の総合的評価に有用であった。今後は、本研究において確立された測定法を種々の環境刺激の単独および複合暴露下における末梢性知覚への影響の解明に応用していく予定である。
DNAマイクロアレイによる胃癌化学療法感受性予測-超音波内視鏡下生検による検討-

本研究の概要は、DNAマイクロアレイによる胃癌化学療法奏効例の予測を試みることである。対象症例は切除不能・再発胃癌であり、化学療法のレジメンはweekly paclhaxel + 5' -DFURである。本療法の奏効率は約50%であるため、半数近くの症例は治療の恩恵を受けられない。オーダーメイド治療を行うには治療前に奏効例を判別する必要がある。現在、paclitaxel 70mg/m^2、5' -DFUR 600mg/bodyによりphase II studyを進行中である。これまでphase II studyに42例が登録された。このうち20例において化学療法前の癌組織を計24検体採取し、凍結保存した。20例、24検体のうち14例、16検体においてDNAマイクロアレイの測定が可能であった。また超音波内視鏡による針生検では8検体のうち6検体(75%)においてDNAマイクロアレイの測定が可能であった。従って、針生検においてもアレイ測定に十分な組織が採取されることが確認された。DNAマイクロアレイが測定された検体において有効例と無効例を比較検討した。DNAマイクロアレイの測定が可能であった14例のうち有効例が7例(CRO, PR7)、無効例が7例(PD2, SD5)であった。これら14例において54675個の遺伝子を解析した(U133 plus2 array, Affymetrix)。まず14症例のP-callが全てPである遺伝子を選択し958個の遺伝子をピックアップした。さらに958個の遺伝子から有効例と無効例の遺伝子発現の差が2倍以上の遺伝子を検索し、最終的に39個の遺伝子が選択された。39個の遺伝子のうち有効例でup-regulateしている遺伝子が37個、down-regulateしている遺伝子が2個であった。これらをFisher比でランキングした結果、34位までは全て有効例でup-regulateしている遺伝子であった。本研究の特徴は新たな手法を用いて、DNAマイクロアレイによる胃癌化学療法奏効例の予測を試みることである。本研究の新たな点は、1)超音波内視鏡下に腫瘍本質部(深部)の組織を針生検により採取すること、2)DNAマイクロアレイの解析をわれわれの開発したsupervised learning理論に基づいて行うことである。化学療法のレジメンはweekly paclitaxel + 5'-DFURであり、われわれは本レジメンによるphase I studyを行い、推奨投与量はpaclitaxel 70mg/m^2、5'-DFUR 600mg/bodyと決定した。本療法は外来で、QOLを損なうことなく安全に施行できるレジメンであり、今後標準的治療の一つになるものと期待される。しかし本療法の奏効率は50%であり、半数近くの症例が治療の恩恵を受けられないことになる。現在、推奨投与量によるphase II studyを施行中である。これまでphase II studyに10例が登録され、現在治療継続中である。全例化学療法前の胃癌組織が採取してあり、凍結保存している。phase I studyで採取保存した胃癌組織と合わせて、現在DNAマイクロアレイを実施している。今後phase II studyへの登録を増やし、さらに追加してDNAマイクロアレイを実施する。最終的には化学療法の効果をもとにマイクロアレイの結果を解析する予定である。

本研究の概要は、DNAマイクロアレイによる胃癌化学療法奏効例の予測を試みることである。対象症例は切除不能・再発胃癌であり、化学療法のレジメンはweekly paclitaxel + 5'-DFURである。本療法の奏効率は約50%であるため、半数近くの症例は治療の恩恵を受けられない。オーダーメイド治療を行うには治療前に奏効例を判別する必要がある。現在、paclitaxel 70mg/m^2、5'-DFUR 600mg/bodyによりphase II studyを進行中である。これまでphase II studyに35例が登録された。このうち20例において化学療法前の癌組織を計24検体採取し、凍結保存した。20例、24検体のうち13例、15検体においてDNAマイクロアレイの測定が可能であった。また超音波内視鏡による針生検では8検体のうち6検体においてDNAマイクロアレイの測定が可能であった。従って、針生検においてもアレイ測定に十分な組織が採取されることが確認された。DNAマイクロアレイが測定された検体において奏効例と無効例を比較検討した。現在奏効例と無効例においてトレーニングサンプルを設定し、化学療法感受性に関与する遺伝子の抽出を行っている。最終的にはブラインドサンプルによる抽出遺伝子に対する再確認作業を行う。
ダイナミック特性を考慮したハイブリッド型顕微作業システムに関する研究

我々の研究グループは,近年,顕微鏡下での微細作業を支援するシステムの研究をおこなっている.このシステムは,液架橋力を用いたマイクロマニピューレタと顕微作業の支援システムから構成される.本研究では,システムの構成要素の動特性を考慮することで,操作性を改善するための新しいメカニズムを提案する.具体的には,キャピラリの制御や入力インターフェースに関する動特性の新しいメカニズムについて設計開発をおこない,基礎実験によりそれらの有効性を確認した.近年,圧力センサや流量センサなどの製品の大部分は半導体とMEMS(Micro Electro Mechanical Systems)技術で製作されるようなマイクロパーツによって構成されている.また回路の集積化や,製品のコンパクト化の流れも大きい.加工技術の向上に伴い製作できる部品のサイズが縮小化し,数十[μm]から数百[μm]で,質量が1[mg]以下のいわゆるマイクロパーツの数も増えている.今後マイクロパーツはさらに種類,生産数ともに増加することが予想される.しかし,マイクロパーツの操作技術・環境の開発は十分とはいえないのが現状である.そこでマイクロパーツを1つずつ持ち上げ,任意の場所に正確に配置し,複数のパーツを3次元的に組み立てることの可能な操作技術・環境が必要となる.本研究では,操作者に力覚フィードバックを与えるハプティクス・デバイスを使用し,触感覚的な操作性の向上をおこなう.さらに,視覚的補助を加えることで,操作者の操作性がより向上されることから,仮想三次元モデル表示による視覚的支援もおこない,触覚と視覚,二種類の作業支援機能を実装した顕微鏡下微細作業用システムの開発とその操作性検証をおこなう.また,微小物体のハンドリングにおいて,動的な液架橋力の変化を利用して効果的なハンドリングツール及びその手法の提案をおこなった.提案したシステムを統合して,200μmサイズの微細部品の立体組み立て実験をおこない,提案手法の有効性を確認した結果,平均作業時間で約46%の作業時間短縮結果を確認した。また,作業者の作業経験を問わず一律に作業時間軽減の作業支援効果があることを示した.我々の研究グループは,近年,顕微鏡下での微細作業を支援するシステムの研究をおこなっている.このシステムは,液架橋力を用いたマイクロマニピューレタと顕微作業の支援システムから構成される.本研究では,システムの構成要素の動特性を考慮することで,操作性を改善するための新しいメカニズムを提案する.具体的には,キャピラリの制御や入力インターフェースに関する動特性の新しいメカニズムについて設計開発をおこない,基礎実験によりそれらの有効性を確認した.本研究では,顕微作業システムの作業効率を高めるために,液架橋力と入力インターフェースの動特性に着目したマニピュレーションの開発および基本特性の解析を目的とする.静的と動的の液架橋力から発生する引き上げ速度による液架橋力の差を用いた,対象物とする微小物への負荷が少ない,ハイブリッド型マニピュレータの開発と基本特性の解析をおこなう事を本研究の目的とする.以下に本年度の研究成果を列挙する.(1)液架橋力の動特性を利用したマイクロパーツハンドリング装置の設計・製作:液架橋力の動特性を測定するために,これまで利用してきた顕微作業システムのハンドリング部分の機構の改造をおこなった.また,圧電振動板をもちいたマイクロインジェクタを作成し,マニピュレーションに利用する液的の吐出,吸引速度を変更できるように改良した.(2)精密電子天秤による液架橋力の計測:精密はかりの上にシャーレと微小球を載せ,微小球とシャーレを両面テープで接着した上で,微小球とキャピラリの間に液架橋を生成し,そこからキャピラリを引き上げ液架橋が切れるまで精密はかりに作用した力を計測した.(3)マイクロパーツのパーツのマニピュレーション実験:提案した装置をもちいて100μmサイズのμパーツのマニピュレーションの実験を実施した.これまでのシステムでは,作業に時間を多く必要としていた,マイクロパーツのプレース作業に対して,本年度実施した装置の改良が有効に働き,顕微鏡下での組み立て作業の時間を大幅に軽減することができた.実験装置の作成および液架橋力の測定実験および評価実験など,おおむね計画通り実施することができた.マニピュレーションの動特性を検討するにあたって,計画では,VCMをもちいたマニピュレータの作成を考えていたが,基礎実験により提案手法のみでは,引き上げ速度や位置決め精度で,期待する結果を得ることができないことがわかった.そのために,マイクロインジェクタによる改良や,キャピラリの改良により目標とするマイクロパーツのピック&プレース作業の改良について実施をすることができた.現在は,さらにアクチュエータの変更や機構の変更などで顕微作業の効率を向上させることを考えている.平成23年度に得られた結果を基にして顕微作業システムのインターフェース部分の構築をおこなう.また,マニピュレータ駆動のアクチュエータの選定については,引き続き検討をおこない,十分な性能を得られるよう改良をおこなう.最終的には,提案した手法を,操作性および作業時間の視点から,微小パーツのアセンブリや生体組織の操作などについて実用的に利用できるか否かについて,現場の意見を参考に,検討をおこない改良を加える.次年度の研究費は主に下記の点を中心に使用する.・実験装置の改良:顕微作業システムのマニピュレーション部の改良をおこない,利用者がよりストレスなくマイクロパーツを作業できるような性能を目指して改良をおこなう.・顕微作業システムのインターフェースの開発:現在のシステムでは,操作にある一定の熟練が必要であるために,より簡単により正確に顕微作業を実行できるよう,インターフェース部分の改良をおこなう.・アクチュエータ関連の学会での発表および情報収集:Actuator2012および精密工学会で発表,討論,情報収集をおこなう.
パッチクランプ法にて記録される神経細胞電気信号自動解析用ソフトウェアの開発

われわれはこれまで電気生理学的手法を用いて、中枢モノアミン作動性及びアセチルコリン作動性神経の調節的役割について研究を行ってきた。これらの電気生理学的実験によって記録される電流及び電圧デ-タは莫大量になるため、ミニコンピュ-タ-・システムを導入して実験デ-タの解析を行っており、特にパッチクランプ法による単一チャンネル電流の解析用ソフトウェアを独自に開発し、デ-タの解析に使用している。今回、このコンピュ-タ-・システムを改良してデ-タ処理を高速化すると共に、電気生理実験装置から送られた電気信号の監視用ソフトウェア及び学習機能を備えた自動解析用ソフトウェアを作製し、このシステムを用いて副腎髓質クロマフィン細胞のムスカリン性及びニコチン性興奮に関する電圧及び電流クランプによる研究並びにムスカリン性興奮に関するパッチクランプによるカリウムチャンネル電流解析を行った。さらに大脳皮質刺激に反応する尾状核ニュ-ロンに対する黒質からのド-パミンDー2受容体を介する抑制を検討した。第一の研究では副腎髓質クロマフィン細胞のアセチルコリンによる興奮がニコチン性及びムスカリン性受容体によって仲介された二つの異なる機構を含むこと、ムスカリン性興奮は静止膜電位近くの電位で開くカリウムイオンチャンネルの抑制によって誘発されること、及びこのムスカリンによるカリウムイオン電流の抑制は静止膜電位で活性されるカリウムイオンチャンネル数の減少に起因していることを明らかにした。また第二の研究では、黒質から由来するド-パミンは大脳皮質運動領からの神経終末に存在するDー2受容体に作用し、それによって大脳皮質ー尾状核の間の神経伝達を抑制している可能性を示した。HITACコンピュ-タ-システムの演算処理速度を高速化するための電子回路を試作し、コンピュ-タ-のハ-ドウェアに追加して装備した。またこの処理に付属して高速演算用のソフトの開発を行った。これらの神経細胞電気信号自動解析用ソフトウェアを用いて、ラット副腎髄質クロマフィン細胞におけるムスカリン性およびニコチン性興奮に関係したイオン機構を解明するためのパッチクランプ法による研究を効率よく実施することができた。すなわち、アセチルコリンは単一チャネル電流を誘発し、この電流の振幅は膜電位依存性であり、逆転電位0mVであることを見出した。このアセチルコリンによって活性化される単一チャネル電流はヘキサメトニウムによって遮断されたがアトロピンでは抑制されなかった。ピペットに高K溶液を入れ、膜電位を静止膜電位レベルでクランプした場合には、短時間の開口をもった群発性単一チャネル電流をパッチクランプ法で記録した。チャネル開口の振幅および頻度は膜電位および外液のKイオン濃度に依存した。また、インサイドアウト法で記録した高Kによる単一チャネル電流はKイオンチャネル遮断薬であるテトラエチルアンモニウムを膜の内側に与えることによって抑制された。細胞アタッチパッチクランプ法においてムスカリンはチャネル開口頻度を用量依存性に減少した。これらの成績は副腎髄質細胞におけるムスカリン性興奮が静止膜電位レベルで開口するカリウムチャネルの抑制によっておこることを示すものであり、細胞電気信号自動解析における高速演算用ソフトウェアの開発によって、今回のパッチクランプ法を用いた研究を円滑に実施することができた。昨年度以来開発した電気生理実験装置から電気信号の監視用ソフトウエア及び学習機能を備えた自動解析ソフトウェアに、さらに生理的な信号とノイズの多い信号パタ-ンを区別するプログラムを作製することにより、これまでのコンピュ-タ-システムに取り込まれた自動解析システムに改良を加えた。このシステムを用いまずラット副腎髓質クロマクイン細胞においてムスカリン性興奮を惹起するイオン機構を明らかにするためパッチクランプによる研究を行った。高カリウム溶液を含む電極を用いて細胞アタッチによる記録にて短い開口を伴う連続した単一チャンネル電流が、静止膜電位近くの電位で記録された。チャンネル開口の振幅及び頻度は静止膜電位及び外液のカリウムイオン濃度に依存した。

インサイドアウト記録の間、膜の外側に高カリウムイオンを与えて観察された単一チャンネル電流は、膜の内側にカリウムチャンネル遮断薬であるテトラエチルアンモニウムを加えることによって抑制された。一方、細胞アタッチ記録において、細胞外に与えたムスカリンにより高力リウムイオンにより誘発されるカリウムチャンネルの開口が用量依存性に抑制された。これらの成績はムスカリンによるカリウムイオン電流の抑制が静止膜電位での活性カリウムイオンチャンネル数の減少に起因していることを示した。次に、大脳皮質運動領に対するテスト刺激に先行しして黒質に与えた条件刺激は51個の尾状核ニュ-ロンのうち39個においてスパイクを抑制した。ド-パミンと選択的Dー2作用薬は、イオン泳動的に与えたこのスパイク発生を抑制した。これらの抑制作用はDー2拮抗薬であるドンペリドン及びハロペリド-ルによって拮抗された。これらの結果は黒質から由来するド-パミンは大脳皮質運動領からの神経終末に存在するDー2受容体に作用し、それによって大脳皮質ー尾状核の間の神経伝達を抑制することを明らかにした。
自己骨髄細胞を用いた虚血臓器に対する血管新生治療法 ―より効果的な血管新生を目指して―

自己骨髄細胞を用いた血管新生治療は虚血臓器の血流回復と生理機能改善効果が得られる。しかし、どのような細胞をどのように投与するのは最適なのかについては明らかでない。本研究の目的はこれらの点を明らかにすることである。本治療法における骨髄幹細胞と成熟血液系細胞の役割を明らかにするため、我々は加齢(12-14ヶ月)のC56BL/10マウスから骨髄単核球細胞を採集し、抗幹細胞受容体(CD117)抗体を用いてMACSで、単核球から骨髄幹細胞と成熟血液系細胞に分離した。加齢マウス骨髄単核球中の約2%の細胞がCD117陽性であった。培養7日目後の幹細胞の培養上清中のVEGF濃度は成熟血液系細胞より十倍高値であった(P<0.001)。また、幹細胞は培養14日目まで生存増殖し、細胞のCD34, VE-Cadherin, Flk-1免疫染色陽性率はそれぞれ約80%, 65%, 70%であった。しかし、大半の成熟血細胞では培養後14日内に死滅し、CD34などの陽性細胞はなかった。さらに、骨髄幹細胞(2x10^5)、成熟血液系細胞(9.8x10^6)、全骨髄単核球(1x10^7)をマウス虚血下肢筋肉内にそれぞれ4ヶ所に注入したところ、治療後2週目に骨髄幹細胞を注射したマウス虚血下肢の血流量は成熟血液系細胞を注射した群より有意に高値であった(90.7±7.9 vs 69.3±10.1; P<0.01)が、全骨髄単核球を注射した群との間に差はなかった。以上の結果より骨髄中の幹細胞が虚血臓器に対する血管新生誘導の中心的役割を果たすことが判明した。本治療法における細胞の投与経路に及ぼす治療効果の影響を明らかにするため、我々はメスのDAラットの冠状動脈(LAD)を結紮し、オスのDAラットから採集した骨髄単核球細胞(細胞総数1x10^7)を梗塞領域心筋内に4箇所注射(局所投与群)、あるいは経静脈的に注入(全身投与群)した。SRY遺伝子の検出量による心筋梗塞領域の残存細胞量は3日と7日目に局所投与が全身投与と比べ明らかに多かった。治療後3日と7日目の心機能は両群間に有意差はなかったが、投与14日目のEFは局所投与群が全身投与群より有意に良好であった(61.3% vs 38.1%, P<0.001)。また、治療後14日目の心筋梗塞領域の血流回復は局所投与群が78.6%であったのに対し全身投与群が51.3%であった(P<0.001)。以上の結果より、同数の骨髄単核球細胞を用いる場合には、血管新生誘導と心機能改善効果においては局所投与が全身投与法より優れていた。

また、治療後14日目の心筋梗塞領域の血流回復は局所投与群が78.6%であったのに対し全身投与群が51.3%であった(P<0.001)。以上の結果より、同数の骨髄単核球細胞を用いる場合には、血管新生誘導と心機能改善効果においては局所投与が全身投与法より優れていた。血管新生療法は虚血臓器に対する新しい治療法の一つとして注目されている。我々は自己全骨髄細胞を虚血臓器に局所注入し、血流と生理機能の回復を得ている。しかし、骨髄細胞の成分は非常に複雑であり、各研究者は種々の骨髄細胞の分画を血管新生誘導に使用している。しかし、理論的には、内皮細胞への分化能を有している骨髄幹細胞成分のみを分離して投与する方法が最も効率的な血管新生を誘導できると思われる。我々は骨髄幹細胞中の成熟血液系細胞とやや未熟な幹細胞を分離採集し、それぞれの血管新生誘導能を調べた。実験方法としては加齢(12-14ヶ月)のC56BL/10マウスから骨髄を採集し、骨髄細胞中の単核球を分離した。その後、抗幹細胞受容体(c-Kit, CD117)抗体を用いてMACSで、単核球から骨髄幹細胞と成熟血液系細胞に分けて、それぞれ培養し、培養上清中のVEGFとIL-1betaの産生量をELISA法で測定した。また、培養14日目の細胞のCD34,VE-Cadherin, Tie-2,Flk-1陽性率を免疫染色法で調べた。さらに、骨髄幹細胞(2×10^5)と成熟血液系細胞(9.8×10^6)を加齢マウス虚血下肢筋肉内にそれぞれ4ケ所注入し、血管新生効果を治療二週間後の虚血下肢の血管密度、血流量で評価した。結果では加齢マウス骨髄単核球中に約2%の細胞がCD117陽性であった。培養7日目後の幹細胞の培養上清中のVEGF濃度は成熟血液系細胞より十倍高かった(P<0.001)。IL-1betaの濃度は培養3日目までは成熟血液系細胞が幹細胞より有意に高かった(P<0.05)が、その後は差を認めなかった。幹細胞は培養14日目まで生存増殖し、細胞のCD34,VE-Cadherin, Flk-1,Tie-2陽性率がそれぞれ約80%,65%,70%,55%であった。しかし、大半の成熟血細胞では培養後14日内に死亡し、CD34など陽性細胞はなかった。骨髄幹細胞を注射したマウス虚血下肢の血管密度と血流量は成熟血液系細胞を注射した群より有意に高かった(P<0.01)。以上の結果より骨髄中の幹細胞は成熟血液系細胞より虚血臓器に対する血管新生誘導の中心役割を果たすことが判明した。虚血性心疾患に対する骨髄細胞を用いた血管新生療法における至適投与経路についての検討した実験方法1)骨髄細胞の採集:オスのDAラットの大腿骨と脛骨から骨髄細胞を採取し、比重遠心法により骨髄単核球を分離採集する。2)急性心筋梗塞モデルを作成と骨髄細胞の投与:メスのDAラットの冠状動脈の前下行枝を結紮して、急性心筋梗塞モデルを作成する。新鮮採集した骨髄単核球細胞(2x10^7/匹)を梗塞心筋内に4カ所局所投与(局所投与群)、あるいは経静脈的に全身投与(全身投与群)する。3)治療効果の評価:(1)残存細胞の測定:投与3,7,14日後の梗塞心筋および非梗塞心筋から、DNAを抽出し、Y染色体上の遺伝子(SRY遺伝子)をPCRで測定し、残存細胞数を相対的に定量評価する。(2)心機能測定:投与3,7,14日後に経胸壁心エコーを行い、心機能を測定する。(3)梗塞領域の血流量測定:投与14日後に、Colored-Microsphere法により、梗塞部位心筋と健常心筋の血流比率を測定する。実験結果1)骨髄細胞投与後3,7,14日目の梗塞心筋および非梗塞心筋のDNAのPCRを行ったところ、局所投与3日と7日目の心筋梗塞領域SRY遺伝子検出量は全身投与と比べ明らかに多かった。
同位体分析および行動観察による野生チンパンジーの離乳時期の解明

本研究は、野生チンパンジーの行動観察および体毛の同位体分析から、野生チンパンジーの栄養的な離乳の時期を明らかにし、ヒトの生活史の特徴である「離乳の早期化」の進化的基盤について再検討することを目的とする。チンパンジーの離乳時期は、乳首接触の終了などを基準に45歳とされている。一方、第一大臼歯の萌出年齢や、孤児になっても生存可能な年齢からは、2.53歳で母乳への依存度を大きく減少させていることが示唆されている。そこで本研究では、離乳と関わるこれら2つの時期をカバーする06歳の幼少個体の採食行動にフォーカスを当て、タンザニア連合共和国・マハレ山塊国立公園に生息するM集団の野生チンパンジーを対象に行動データを収集した。得られたデータの分析として、幼少個体を取り巻く環境として重要だと考えられる母親の影響を調べるため、母親と同時に採食する場合とそうでない場合とで、幼少個体の採食行動にどのような違いがあるかを検討した。チンパンジーの幼少個体は、母親と同時に採食する際には果実など母親と共通の品目を、母親と異なるタイミングでは出会いやすい地上性草本植物および木本性つる植物の茎部をより高い割合で採食していることが明らかになった。また、母親と異なるタイミングで採食する場合でも、幼少個体は母親から離れていることはほとんどなく、母親の移動に追随することによって採食バウト長が短くなる傾向があった。これらの結果を解釈すると、チンパンジーの幼少個体は母親との同時採食によって主たる採食の機会を確保しつつ、消化器官が小さいという身体的条件に対応して、母親が食べないタイミングでも機会主義的に採食を行っている可能性が示唆された。以上の結果を国際学術誌『Journal of Human Evolution』誌に投稿し、査読コメントを踏まえて改稿途中である。06歳の幼少個体の採食行動について、母親の採食行動との同時性に着目して分析した。その結果、幼少個体は母親の採食と異なるタイミングで機会主義的に「間食」を行うことにより、消化器官がオトナと比較して小さいという身体的条件に対応している可能性が示唆された。この採食上の特徴は狩猟採集民の子どもの採食行動とも共通した部分が多く、本研究は人類学系の国際学術誌『Journal of Human Evolution』誌の査読途中である。一方、チンパンジーの体毛の同位体分析については、研究上の目立った進展がなかった。収集した先行研究の情報および観察データの分析結果を土台に、フィールドワークによる行動データ、および体毛の同位体分析の結果を総合して野生チンパンジーの離乳時期の解明を目指す。今年度は、ヒト、およびチンパンジーの生活史に関する文献を収集し、パソコンを用いて情報を整理した。また、予備観察時に得られた野生チンパンジーの子の行動データを分析した。観察対象はアフリカ・タンザニアのマハレ山塊国立公園に生息する野生チンパンジー(M集団)である。5歳までの子の採食行動の発達変化を分析した結果、これまでチンパンジーの離乳時期とされてきた4ー5歳よりも早く、3歳前後で採食行動の大きな質的変化が起こっていた。この成果は、本研究の目的である「野生チンパンジーの栄養的な離乳の時期の解明」について、乳首接触の終了としての離乳(従来の定義による離乳)の時期と、栄養的な離乳の時期がずれていることを示唆するものである。今後、体毛の同位体分析の結果と併せて考えることで、子が栄養的に離乳しているにもかかわらず母親が次子を出産しない、というチンパンジーの特徴を描き出せる可能性が示唆される。本研究成果を、龍谷セミナー(4月)、生理人類学若手の会(6月)日本霊長類学会(7月)、国際霊長類学会(8月)において発表した。霊長類学・生態学・人類学を専門とする様々な研究者と議論する中で、今後研究成果を学術論文にまとめるための方針を洗練させた。育児に係る採用中断を行ったため、進捗状況としては遅れている。本年度は予備観察において得られたチンパンジーの行動データを分析し、結果を学術大会等で発表した。また、主にヒト・チンパンジーの生活史に関する文献を収集し、情報を整理した。今後、本年度に収集した先行研究の情報を土台に、フィールドワークによる行動データ、および体毛の同位体分析の結果を解釈する。今年度は、野生チンパンジーの行動データを分析し、3歳前後でアカンボウの採食時間が大きく増加し、特にそれ以前では咀嚼消化が困難だと考えられる葉の採食が増加すること、その一方で、同じ時期、乳首接触時間が減少することを明らかにした。こうした結果に加え、先行研究からの傍証をもとに、チンパンジーの栄養的な離乳年齢が、従来言われていた45歳より早くおよそ3歳であるという結論を導くに至った。本研究では、霊長類学における先行研究を、「乳首をくわえなくなる時期は栄養的自立とは無関係である」という観点から調べ直し、考察した。