hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MGMT発現悪性グリオーマに対するRNA干渉を用いた遺伝子治療

【研究目的】gliomaの化学療法には、ニトロソウレア剤が広く用いられているが、治療抵抗性を示す症例が多く認められる。その原因の一つとして、薬剤耐性遺伝子である06-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)の関与が注目されている。また、そのMGMTの発現は主にpromoter領域のメチル化によって制御されているといわれており、promoter領域のメチル化と予後との相関が認められている。今回、摘出腫瘍から培養したglioma細胞においてMGMTの発現とpromoter領域のメチル化を検索し、Temozolomideに対する薬剤感受性テストを施行し、それらの関連を検討した。【実施計画】2005年1月から2007年1月まで摘出術を施行した17例(grade□□3例、grade□5例、grade□9例)において、摘出腫瘍から培養したglioma細胞よりRNA、DNAを抽出し、MGMTの発現はRT-PCRにて、またpromoter領域のメチル化はMethylation-specific PCRにて検討した。【研究結果】2例は、培養段階で死滅し、RNA、DNAを抽出することができながった。他の15例は、腫瘍細胞を培養、継代することができた。MGMTの発現を認めたものは、15例中14例(93%)で、promoter領域のメチル化は、7例(47%)で陽性であった。この7例のうち1例のみがMGMTの発現なく、6例でMGMTが発現していた。Promoter領域のメチル化を認めない8例は、全例MGMTの発現を認めた。また、Temozolomideに対する薬剤感受性テストでは、promoter領域のメチル化を認めたものがより高い感受性を示した。【今後の計画】当初予定していたRNA干渉を用いた遺伝子導入実験は、今年度に実施する予定である。(1)摘出標本の一部をパラフィン切片とし、H&E染色ならびに免疫染色を実施した。抗体として、MGMT、GFAP、MIB-1等を実施し、WHO分類に従い悪性度を含めた組織診断を決定した。(2)摘出標本の一部はすぐに培養実験に使用した。患者の腫瘍組織からの初代培養株と細胞バンクより購入したグリオーマ株について実施した。(3)培養細胞からのDNA、RNA抽出は、それぞれ、DNA Extractor WB kit, ISOGENのキットを使用した。抽出したDNAは、MGMTのpromoter領域のMethylation specific PCRに使用し、抽出したRNAはMGMT発現を見るためにRT-PCRに使用した。研究協力者(大学院生)の大饗義仁が、第65回日本脳神経外科学会総会において途中結果を発表した。摘出腫瘍から培養したglioma株においてMGMTの発現とpromoter領域のメチル化を検索し、それらの関連を検討した。【対象・方法】2005年1月から12月までのgliomaに対して摘出術を施行した10例において、摘出腫瘍から培養したglioma株よりRNA、DNAを抽出し、MGMTの発現はRT-PCRにて、またpromoter領域のメチル化はMethylation-specific PCRにて検討した。【結果・考察】1例は、培養段階で死滅し、RNA、DNAを抽出することができなかった。他の9例は、腫瘍細胞を培養、継代することができた。MGMTの発現を認めたものは、9例中8例(88.9%)で、promoter領域のメチル化は、3例(33.3%)で陽性であった。この3例のうち1例のみがMGMTの発現なく、2例でMGMTが発現していた。Promoter領域のメチル化を認めない6例は、全例MGMTの発現を認めた。
アレルゲンによる非獲得免疫性アレルギー性炎症誘導機構

喘息の主な原因物質の一つであるダニ抗原Der f 1やpapainは、そのタンパク質分解活性のみによって、非常に早い段階から気道の炎症を誘導することを明らかにした。獲得免疫能を欠くRag-2遺伝子欠損マウスにプロテアーゼアレルゲンの一つであるpapainの短期間吸入を行うと、好酸球優位の気道炎症を呈することを見出している。アレルゲンが非獲得免疫性にアレルギー炎症を引き起こすメカニズムを明らかにすることで、新しいアレルギー病態形成機序の一端を示すことができると考える。本年度は、プロテアーゼアレルゲンによる非獲得免疫性気道炎症誘導メカニズムの解明のため、(1)主要なダニ抗原Der f1組換えタンパクの吸入後のマウス肺胞洗浄液の解析を行い、papainと同様の気道炎症が生じることを確認した。(2)エフェクター細胞成分の候補となる細胞として、本年度は好塩基球除去抗体を用いて、papain吸入後の炎症が減弱するかどうかを検討したところ、減弱が認められた。(3)抗IL-33抗体を使った免疫組織化学法により、マウスの肺でのIL-33産生細胞の同定を行ったところ、肺胞を構成する細胞核が特異的に染色され、この細胞は組織学的には肺胞上皮として矛盾しなかった。さらに、(4)理化学研究所との共同研究で開発したIL-33欠損マウスを用いて、パパイン短期間吸入による気道炎症モデルを作成・検討した。その結果、IL-33欠損マウスでは好酸球性の気道炎症が有意に減弱したことから、このタイプの気道炎症にIL-33が重要な因子であることを明らかにした。すでに、ヒトにおいて、独立した2つの大規模なゲノム関連解析から、IL-33とIL-33受容体が喘息関連遺伝子であることが報告されていることから、本研究成果により喘息におけるIL-33の役割についての理解を進めることが出来たと考える。喘息の主要なアレルゲンは、ダニ由来のDer pl/Der flであることがよく知られている。これらはプロテアーゼ活性を有している。獲得免疫能を欠くRag-2遺伝子欠損マウスにプロテアーゼアレルゲンの一つであるpapainの短期間吸入を行うと、好酸球優位の気道炎症を呈することを見出しており、アレルゲンが非獲得免疫性にアレルギー炎症を引き起こすメカニズムを明らかにすることで、新しいアレルギー病態形成機序の一端を示すことができると考える。本年度は、プロテアーゼアレルゲンによる非獲得免疫性気道炎症誘導メカニズムの解明のため、(1)papain吸入後の気道炎症評価を各種の遺伝子欠損マウスを使用し、複数の遺伝子が気道炎症細胞の増加に関与していることを見出した。(2)papain吸入の影響の理解を深めるために肺胞洗浄液中の気道炎症細胞数の経時変化を検討したところ、特徴的な変動が認められた。(3)papainを15分間熱処理することで熱変性したプロテアーゼ活性を失ったpapain吸入を行うと、気道炎症の誘導は起きないことから、papainのプロテアーゼ活性が一義的に重要である事が判明した。
マルチモーダルセンシングと機械学習による身体スキル検出手法に関する研究

本年度は、「書き方スキル」「演奏スキル」「体操スキル」の3つに対象領域を絞って研究を進めてきた。ペンデバイスのセンサー情報を利用した「書き方スキル」の取得については、タブレットPC(Surface ProとiPad Pro)を購入し、筆跡情報と描画情報をもとに、画像認識と特徴量抽出の手法とを組み合わせて、書き方スキルの検出手法の実装を進めた。また、本手法を応用して、書画カメラを利用した紙媒体への塗り絵行動の認識の研究も並行して行い、有益な結果を得ている。こららの研究の成果は、国内学会にて発表を行っており、学会誌への論文投稿の準備を進めている。楽器演奏スキルを対象とした教育・学習支援システムの試作として、ドラム演奏の支援を対象としたシステム開発を進め、ドラム演奏時の奏法の違いや左右の動きの識別などの検出精度を高める手法を実装した。本研究の経過は、国内会議ならびに国際会議で発表しており、学会誌への論文投稿の準備を進めている。リカレントニューラルネットワークによる動作識別に関する研究については、ラジオ体操を対象に実装を進めており、本研究の経過は、国内会議ならびに国際会議で発表している。これらの研究の成果は学内のイベントにておいても公開をしており、プロトタイプシステムを用いたデモや、一般参加者に対する試用を行っており、各システムの有用性が示唆された。また、ドイツのリューベック大学への研究調査出張では、同大の研究グループと情報交換を行い、以後関連プロジェクトについての情報交換を続けていくこととなった。また、昨年度に開発を進めたプレゼンテーション支援システムの研究の成果は、電子情報通信学会論文誌に掲載された。本年度は、センサー類を利用して学習・教育情報の検出方法を検討し、機械学習による学習・教育支援が適用可能な対象領域の選定と支援モデルの構築、システム実装をすすめてきた。対象領域の選定については、「書き方スキル」「演奏スキル」「体操スキル」の3つに対象領域を絞って研究を進めており、開発は順調に進んでいる。機械学習技術の適用としては、リカレントニューラルネットワークの導入がベターであるという知見を得ることができ、それをベースに学習支援のための診断フィードバックを考慮したモデルについて検討する必要があることが明らかになった。研究の土台となるベースシステムはほぼ完成しており、現在までに培ってきた画像認識による動作認識手法を組み合わせることで、成果が期待できる。以上の進捗に問題がおきる可能性は少なく、概ね順調であると判断した。昨年度までの成果を元にしながら、「書き方スキル」「演奏スキル」「体操スキル」の3つについては、装着型モーションセンサーの利活用も検討にいれながらスキル検出の精度を上げ、機械学習によるスキル診断のプロトタイプの実装を進めながら、その有用性を検証し研究成果をまとめていく。また、本研究課題の成果を一過性のものとせず、次段階へと研究成果を拡張していくことを視野に入れて、新たに装着型モーションセンサーを利用したハンググライダーの操作検出についても研究を進める。機械学習の実装についてはモジュール化を意識して行い、様々な領域やシステムへの適用が可能な形にすすめていく。なお機械学習技術については、まだ調査が必要なところもあるため、システム実装と並行してセミナーなどに参加する予定である。研究成果の公開については、国内学会、国際会議、学会誌への投稿を行なうだけでなく、センサーによる身体動作データも、個人情報保護を目的とした秘匿化を行った上で公開するプラットフォームを検討したい。また、開発したシステムのコードやモジュールの一部は、Githubなどのプラットフォームを利用して公開することを検討する。機械学習技術の導入についてのノウハウ取得を第一優先として、学会や技術セミナーに参加し、その技術調査を行いノウハウを得ることができた。その成果を踏まえて機械学習用の開発用コンピュータを購入し、機械学習技術の実装に向けた試作プログラムの実装を進めた。現在までに行なってきた画像処理によるカメラ制御の研究を応用し、プレゼンテーション支援の研究についてデプスカメラを利用するアプローチで実装した。本研究の成果は、電子情報通信学会の論文誌に掲載予定である。当初から予定していた楽器演奏スキルを対象とした教育・学習支援システムの試作として、ギター演奏とドラム演奏の支援を対象としたシステム開発を進めた。ギター演奏システムについては、デプスカメラを利用した画像解析のほかに深層学習の技術を取り入れ、畳み込みニューラルネットワークを利用した左手押弦指の認識に成功した。本研究の成果は、国内会議ならびに国際会議で発表しており、学会誌への論文投稿の準備を進めている。また、機械学習技術の適用については、動作識別にリカレントニューラルネットワークを利用することの有用性が示唆されたため、来年度も継続して研究を進める。スキル学習支援システムについて、ペンデバイスのセンサー情報を利用した「書き方スキル」の取得について新たな知見を得ることができ、次年度も研究を継続することとした。また、学内のイベントにて、研究対象となる基礎システムの公開デモと試用を行い、それらの有用性が示唆された。当初の計画では、小型無線多機能センサを初年度に購入予定であったが、機械学習に関する技術調査とその適用可能性を検討するために、先に機械学習用GPUコンピュータを購入することとした。その結果、機械学習技術の実装と適用するためのデータ分析手法の目処がたち、ギター演奏やドラム演奏だけでなく、ラジオ体操や書き方、松葉杖等、応用領域の範疇や適用可能な研究課題が明らかになってきた。これらの成果を元に、次年度は機械学習に適したデータを取得するためのセンサー類を購入することで、全体計画としては進捗に問題がおきる可能性は少なく、また様々な学習支援での成果が期待できるため、概ね順調であると判断した。

ペンデバイスのセンサー情報を利用した「書き方スキル」の取得については、タブレットPC(Surface ProとiPad Pro)を購入し、筆跡情報と描画情報をもとに、画像認識と特徴量抽出の手法とを組み合わせて、書き方スキルの検出手法の実装を進めた。また、本手法を応用して、書画カメラを利用した紙媒体への塗り絵行動の認識の研究も並行して行い、有益な結果を得ている。こららの研究の成果は、国内学会にて発表を行っており、学会誌への論文投稿の準備を進めている。楽器演奏スキルを対象とした教育・学習支援システムの試作として、ドラム演奏の支援を対象としたシステム開発を進め、ドラム演奏時の奏法の違いや左右の動きの識別などの検出精度を高める手法を実装した。本研究の経過は、国内会議ならびに国際会議で発表しており、学会誌への論文投稿の準備を進めている。リカレントニューラルネットワークによる動作識別に関する研究については、ラジオ体操を対象に実装を進めており、本研究の経過は、国内会議ならびに国際会議で発表している。これらの研究の成果は学内のイベントにておいても公開をしており、プロトタイプシステムを用いたデモや、一般参加者に対する試用を行っており、各システムの有用性が示唆された。また、ドイツのリューベック大学への研究調査出張では、同大の研究グループと情報交換を行い、以後関連プロジェクトについての情報交換を続けていくこととなった。また、昨年度に開発を進めたプレゼンテーション支援システムの研究の成果は、電子情報通信学会論文誌に掲載された。本年度は、センサー類を利用して学習・教育情報の検出方法を検討し、機械学習による学習・教育支援が適用可能な対象領域の選定と支援モデルの構築、システム実装をすすめてきた。対象領域の選定については、「書き方スキル」「演奏スキル」「体操スキル」の3つに対象領域を絞って研究を進めており、開発は順調に進んでいる。機械学習技術の適用としては、リカレントニューラルネットワークの導入がベターであるという知見を得ることができ、それをベースに学習支援のための診断フィードバックを考慮したモデルについて検討する必要があることが明らかになった。研究の土台となるベースシステムはほぼ完成しており、現在までに培ってきた画像認識による動作認識手法を組み合わせることで、成果が期待できる。以上の進捗に問題がおきる可能性は少なく、概ね順調であると判断した。昨年度までの成果を元にしながら、センサー類を利用して学習・教育情報の検出方法を検討し、機械学習による学習・教育支援が適用可能な対象領域の選定と支援モデルの構築、システム実装をすすめていく。機械学習の実装についてはモジュール化を意識して行い、様々な領域やシステムへの適用が可能な形にすすめていく。システムの実装対象については、様々なデバイスの利用も含めた応用を検討する。
ジャワ島におけるカニクイザル視物質遺伝子の多様性に関する研究

本研究の申請者らは、平成9年にインドネシア、ジャワ島パンガンダランのカニクイザル(Macaca fascicularis)の血液から視物質遺伝子の異常を発見した。その後(平成10-13年度)、パンガンダラン地域で再調査を行い、異常な視物質遺伝子を持つサルがパンガンダランの特定の群に集中しており、以前の調査で集められた他地域のサンプルには見つからないことを明らかにした。平成1416年度の本研究では、ジャワ島内で、パンガンダランに隣接するワンゴン、パンガンダランから西に位置するソレアル、パンガンダランから東に位置するタワンマングーでカニクイザルの捕獲調査を行った。また、比較のために、タイ南部でも捕獲調査を行った。その結果、ソレアルで吸収波長には殆ど影響しない視物質遺伝子タイプを、タイ南部で中波長(M)視物質遺伝子を多コピーもつ個体を発見した。これらの変異はそれぞれの地域に限局しており、群内では高い頻度で見られた。カニクイザルの遺伝子レベルの研究と平行して、竹中の保有するチンパンジーのDNAサンプルなどを用いて色盲・色弱の検索を行った。その結果、三和化学研究所・熊本霊長類パークのオス・チンパンジー1頭が色弱の原因となるM/Lハイブリッド視物質遺伝子を持つことが判明した。そこで、網膜電図記録、行動実験を行い、この個体が赤欠損型の色覚を持つことを確認した。さらにボゴール農科大学で飼育繁殖した色盲個体、異常視物質遺伝子を持つキャリアのメス、正常個体を対象にカラー・カモフラージュ条件での図形弁別をテストした。その結果、色盲個体が有利であることが明らかになった。比較のために新世界ザルのオマキザル、チンパンジー、ヒトで同様の実験を行い、カラー・カモフラージュ条件では色盲・色弱が有利であることを示した。一連の研究結果は、ヒト以外の旧世界霊長類で色盲・色弱が少ない理由は、淘汰圧だけでは必ずしも説明できず、群れのサイズや移動度の要因が効いている可能性があることを示した。申請者らは、インドネシア、ジャワ島パンガンダランのカニクイザル血液から視物質遺伝子の異常を発見し、生理(網膜電図)レベル、行動レベルでもヒトの色覚異常と相同であることを確認した。一方、日本、タイ、インドネシアなど他地域のマカカ属サル約3000頭では同種の色覚異常は見つからなかつた。そこで本研究では、上記異常視物質遺伝子がパンガンダランに限局し、ヒトよりも遙かに低い確率である原因の解明を目指している。今年度は、「何らかの理由でマカカ属サルはヒトに比べて視物質遺伝子の多様性が低い」可能性を検討した。8月末に、ジャワ島西部ソレアルにおいてカニクイザルの捕獲調査を実施した。以前に実施したこの地区の予備調査により、色覚異常とはならない視物質遺伝子の多型(ヒトでは高頻度でみられるタイプ)の存在が確認されていたが、今回の調査でこの地区のカニクイザルにのみ、この多型が多数存在することを発見した。また、この調査と平行し、8月と2月の2回、現在ボゴール農科大学に飼育中の色盲カニクイザルを用いて色ゼリーを用いた色覚テストを実施した。赤で苦み、緑が甘みのゼリーであるごとを訓練したサルを用い、色彩色差計と標準蛍光灯を用いてゼリーの色を序々ヒトの混同色に近づけた。その結果、色盲ザルはヒトの混同色付近でゼリーの色の識別が困難になることを行動学的に確認した。

さらに、2月のインドネシア滞在中に来年度実施予定の色盲で有利となる可能性のある形の識別課題(色図案に入った図形弁別課題)の実験のためのセットアップをボゴール農科大学の研究室で行った。申請者らは、インドネシア、ジャワ島パンガンダランのカニクイザル血液サンプルから視物質遺伝子の異常を発見し、網膜応答、知覚レベルでもヒトの色覚異常と相同であることを確認した。約3000頭の検索の結果、色覚異常のマカカ属のサルの分布はパンガンダランに限局しており、日本、タイ、インドネシアの他地域では発見できなかった。本研究では、上記異常視物質遺伝子が狭い地域の少数の群れにのみ見られた要因を探るため、インドネシア内の他地域における異常視物質遺伝子と視物質遺伝子の多型を検索することを目的としてスタートした。平成14年度は、ジャワ島西部ソレアルの調査の結果、色覚異常を引き起こさない遺伝子の変異がソレアルの群れに限局して存在することが明らかになった。平成15年度は、視物質遺伝子の変異をさらにタイ南部とインドネシア、ジャワ島中央部の2ヶ所の捕獲調査で検索した。タイでは、約60%のヒトに見られるM(緑)視物質遺伝子を多コピー持つ個体が複数見つかった。このタイプの遺伝子型は日本やインドネシアのマカカ属のサルには見つかっておらず、タイ南部ヤラの群れに限局していた。インドネシア中央部ワンゴンでは、捕獲条件が悪く10頭の捕獲に留まった。この中には特記すべき視物質遺伝子の多型は見られなかった。これらと平行して、カラーカモフラージュの条件での図形識別は、正常色覚よりも色覚異常に有利であることを証明するための行動実験を実施した。その結果、カラーカモフラージュを施した視覚刺激を用いた図形弁別課題は正常色覚サル、異常遺伝子を1つだけ持つキャリアのメスでは、エラーが増加するのに反し、色覚異常のサルはカラーカモフラージュなしの条件と同じ正答率であることが分かった。平成16年度は、7月にインドネシア、ジャワ島中部のタワンマングーで捕獲調査を行った。捕獲用ネットを用いて16頭を捕獲し、血液サンプルを採取した。採取したサンプルはエーテル処理をして日本に持ち帰りDNAを抽出して遺伝子レベルの解析を行った。その結果、X染色体上にある赤・緑の視物質遺伝子は、すべての個体で正常と判断され、この群からは特記すべき視物質遺伝子の多型は見つからなかった。これらと平行して、6月と2月にボゴール農科大学において、行動実験を行った。カラーカモフラージュの条件での図形識別は、正常色覚よりも色覚異常に有利であることを証明するための行動実験を行った後、異常視物質遺伝子1つと正常遺伝子1つを持つキャリアのメスザルでの行動実験を行った。その結果、キャリアのサルは、カラーカモフラージュを施した視覚刺激を用いた図形弁別課題は正常色覚サルよりも正答率が良く、石原式色盲図形の識別は正常個体と同様にできることが分かった。さらに、ボゴール農科大学で飼育・繁殖した色盲ザル1頭とキャリア1頭を9月に日本に移送した。輸入業者のよる1ヶ月の検疫と霊長類研究所の2ヶ月の検疫を経た後、1月よりオスザルとの同居を開始した。
中心体キナーゼLats1/2を介した新たな染色体安定化チェックポイント機構の解析

中心体サイクルの制御異常は、多極紡錘体の形成や染色体の不均等分配を引き起こすため悪性癌の特徴の一つである「染色体不安定性」の原因となる。この制御には中心体キナーゼが重要な役割を担っていると考えられている。本研究では、中心体キナーゼLats1/2が多彩にリン酸化標的を換えることにより、細胞質分裂の制御、染色体分配の制御、DNA損傷後の核内制御を含む染色体安定化のための新たなチェックポイント機構に関与することを明らかにした。本研究の目的は、Lats1/2を介した新規のリン酸化シグナルカスケードの分子機序を明らかにすることにより中心体が染色体不安定性のチェックポイント機能を担うシグナル伝達(クロストーク)の場として機能することを明らかにすることである。実験はほぼ予定どおり順調に進み以下の研究成果を得た。(1)Lats1/2-CHO1-LIMK1経路の発見:中心体の制御異常がどのような分子メカニズムで染色体の不均等分配や細胞質分裂異常を誘導するのかを明らかにするために、分裂期制御因子の中からLats1/2キナーゼのリン酸化標的候補を探索した。その結果、Lats1/2が細胞質分裂に必要なキネシンモーター蛋白質Mklp1とそのバリアントCHO1の特定の部位をリン酸化することを見つけた。さらにLats1/2によるCHO1のリン酸化は細胞質分裂を制御するキナーゼLIMK1との結合および活性に関与していることを見出した。これらの結果は中心体という細胞内小器官がLats1/2を介して遠隔的に細胞質分裂の厳密な制御を行っているという新しいモデルを提唱している(論文印刷中)。(2)Lats1/2-INCENP経路:Lats1/2の新たなリン酸化標的としてINCENPを同定した。INCENPはAurora-Bの活性制御を行っているため、Lats1/2によるINCENPのリン酸化部位をアミノ酸置換した変異体をHeLa細胞に導入したところ、Aurora-Bの活性を阻害し細胞質分裂を抑制した(論文投稿準備中)。(3)Lats1による中心体複製制御機構:Lats1 nullノックアウトマウスおよびその培養細胞(MEF)を作製したところ、中心体の過剰複製が観察された。Lats1と相互作用する因子を探索したところ、中心体複製を制御する脱リン酸化酵素Cdc25Bを同定した。Lats1 null MEFにおいてCdc25Bタンパク質が安定化したことから、Lats1はCdc25Bと結合することによりそのタンパク質分解を誘導していることが示唆された(論文投稿中)。本研究は、Lats1/2を介した新規のリン酸化シグナルカスケードの分子機序を明らかにすることにより中心体が染色体不安定性のチェックポイント機能を担うシグナル伝達(クロストーク)の場として機能することを明らかにすることを目的とする。実験はほぼ予定どおり順調に進み本年度は以下の研究成果を得た。[1] Lats1による中心体複製制御機構:昨年度に引き続き、Lats1 nullノックアウトマウス由来の培養細胞(MEF)を解析し、中心体の過剰複製機構を詳細に調べたところ、Lats1欠損MEFでは中心体がクラスター化した状態で過剰複製することが高頻度に認められ、悪性癌細胞の特徴である微小核や巨大核、多極紡錘体の形成が観察された。また、この制御因子の一つとして同定した脱リン酸化酵素Cdc25Bとの結合を調べたところ、Lats1の非キナーゼドメインであるN末領域で結合することが明らかになった。Lats1の欠損はCdc25Bタンパク質の安定化を誘導することから、Lats1のN末領域はCdc25Bのタンパク質分解を誘導して中心体複製の恒常性を維持していることを明らかにした(Mukai et al., 2015)。[2] Lats1/2-INCENP経路:Lats1/2の新たなリン酸化標的として同定したINCENPについて、Lats1/2によるリン酸化部位を特異的にアミノ酸置換した変異体をドキシサイクリンで誘導できるHeLa/Tet-ON細胞株を樹立した。この細胞株をタイムラプス等で観察したところ、このリン酸化が、多極性に分裂する癌細胞の細胞質分裂(切断)とそれを制御するAurora-Bキナーゼの活性化に必要であることを見出した(論文リバイズ中)。[3] Lats2-NS経路:中心体と核内機能を繋ぐ経路におけるLats2の新しいリン酸化標的として、核スペックル(NS: Nuclear speckle)の構成因子であるPHF6を同定した。そのリン酸化部位も決定したので、今後は、核スペックルにおけるLats2の機能を解析していく。本研究計画の目標の一つである「Lats1による中心体複製制御の分子メカニズムの解明」として、Lats1-Cdc25B経路を見出し、本年度はその成果を学術論文として発表することができた(Mukai et al., 2015, Sci Rep)。また、もう一つの目標である「Lats1/2-INCENP経路の役割」についてもその分子メカニズムを解明し、その成果を論文としてまとめることができた(論文リバイズ中)。さらに、「中心体と核内機能を繋ぐ経路」としてLats2の新たなリン酸化標的を見出し、機能解析を進めている(投稿準備中)。これら以外に投稿間近で現在執筆中の論文が1報あり、実験は予定以上に順調に進んでいる。本研究の目的は、中心体が染色体不安定性のチェックポイント機能を担うシグナル伝達(クロストーク)の場として機能することを示すことである。

そのために中心体キナーゼであるLats1/2を介した新規のリン酸化シグナルカスケードの分子メカニズムを明らかにする。実験はほぼ予定どおり順調に進み以下の研究成果を得た。[1] Lats1/2-INCENP経路:前年度に引き続き、Lats1/2によるリン酸化部位を特異的にアミノ酸置換したINCENP変異体(SA, SD)のドキシサイクリン誘導系であるHeLa/Tet-ON細胞株を用いて、Lats1/2がINCENPのリン酸化を介してAurora-Bキナーゼの活性化を調節し、Aurora-Bと協調しながら多極分裂の細胞質分裂(切断)に機能することを明らかにした(Yabuta et al., 2016)。[2] Lats2-NS経路:中心体と核内機能を繋ぐ新しい経路としてLats2が核スペックル(NS: Nuclear speckle)の構成因子であるPHF6を特異的にリン酸化することを見出した。Lats2によるリン酸化部位を変異させた非リン酸化型PHF6はDNA損傷時に核小体から核質およびNSへの移動が阻害されたことからLats2によるリン酸化がPHF6の核小体からNSへの局在移動に必要であることが示唆された。[3]癌幹細胞におけるLATS1/2の役割:口腔扁平上皮癌細胞株であるSAS細胞は癌幹細胞の特性の一つである低接着プレート上でのスフェア(細胞塊)形成能を持つ。LATS1やLATS2をsiRNAでノックダウンするとスフェア形成が顕著に阻害された。この結果はLATS1/2が癌幹細胞の自己複製能に機能している可能性を示唆している。中心体サイクルの制御異常は、多極紡錘体の形成や染色体の不均等分配を引き起こすため悪性癌の特徴の一つである「染色体不安定性」の原因となる。この制御には中心体キナーゼが重要な役割を担っていると考えられている。本研究では、中心体キナーゼLats1/2が多彩にリン酸化標的を換えることにより、細胞質分裂の制御、染色体分配の制御、DNA損傷後の核内制御を含む染色体安定化のための新たなチェックポイント機構に関与することを明らかにした。本研究計画の目標の一つとして掲げていた「中心体と細胞質分裂を繋ぐ経路」としてLats1/2-CHO1-LIMK1経路を発見し、その分子メカニズムの解析について研究計画の1年目で既に論文発表に至ることができた(現在、印刷中)。また、この他にLats1による中心体複製制御の分子メカニズムの一端を明らかにし、その成果をまとめることができた(現在、学術論文を投稿中である)。さらに、これら以外に投稿間近で現在執筆中の論文が2報あり、実験は予定以上に順調に進んでいる。今後も研究計画どおり推進する。引き続き、中心体が染色体不安定性のチェックポイント機能を担うためのシグナル伝達(クロストーク)の場として機能し、細胞質分裂や染色体分配、核内の機能を連携する分岐点になっているという新しいモデルを実証するために中心体キナーゼLats1/2を介した新しいリン酸化シグナル経路の同定とその分子機序について機能解析を進めていく。さらに癌幹細胞におけるLats1/2の役割の一端も見出しているので、当初の計画どおりこれらの研究も進めて中心体の新しい機能に迫りたい。分子細胞生物学今後も研究計画どおり推進する。
頭頸部扁平上皮癌患者に対する癌抗原ワクチンに向けての基盤的研究

癌抗原MAGE-3は頭頸部扁平上皮癌の約半数の症例で癌細胞に特異的に発現するが、我々はMAGE-3由来のペプチドでHLA-A24分子に高親和性に結合するペプチドM3-p97(TFPDLESEF)はこのペプチドを負荷した樹状細胞を抗原提示細胞として用いることにより健常人末梢血リンパ球より癌細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導できることを証明した。MAGE-3抗原由来のHLA-A24分子結合性ペプチドによるCTL誘導に関しては我々の同定した上記のペプチドM3-p97とは別に、他の施設からも1つ報告されている。そこで、我々はこれら2種類のペプチドについてCTL誘導能を比較し、臨床応用を考えた場合どちらのペプチドを使うべきかについて検討した。その結果、両ペプチドはほぼ同等のCTL誘導能、CTL活性を有し、MAGE-3抗原とHLA-A24分子を共に発現する腫瘍においては、どちらのペプチドを用いても同等の有効性が期待できることが示唆された。また頭頸部癌の約50%で遺伝子変異が認められるp53癌抑制遺伝子についても、同様にHLA-A24分子結合性ペプチド(p53蛋白のN末端から125番目から134番目のアミノ酸からなるペプチドTYSPALNKMF)がペプチド特異的CTLを誘導できることを証明した。さらにこのCTLはp53遺伝子変異によりその遺伝子産物である変異p53蛋白が細胞内蓄積して過剰発現しているHLA-A24+頭頸部癌細胞を特異的に傷害することがわかった。これらの結果は頭頸部癌における癌抗原特異的免疫療法の可能性を裏付けるものである。我々は以前の研究で、癌特異抗原MAGE-3が頭頸部扁平上皮癌の約半数の症例で発現することを見いだしたが、今回はそのMAGE-3抗原由来のペプチドがワクチンなどの特異的免疫療法の手段となる可能性があるのかを調べた。日本人を対象とするので、日本人に最も多い抗原提示分子であるHLA-A24に結合する9merのペプチドをMAGE-3抗原上に5個同定し、それぞれについて細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導能をまず、健康人の末梢血単核細胞を用いて調べた。その結果、HLA-A24分子に高親和性に結合するペプチドM3-p97(TFPDLESEF)と低親和性に結合するペプチドM3-p120(EFLWGPRAL)でそれぞれペプチド特異的CTLが誘導できた。しかしながらMAGE-3抗原、HLA-A24分子を共に発現する頭頸部癌細胞を傷害したのはペプチドM3-p97特異的CTLのみであった。このようにペプチドM3-p97を刺激源とした場合に癌細胞を傷害するCTLが誘導できることが確認できたので、次にMAGE-3抗原とHLA-24分子を発現する頭頸部癌の担癌患者5名の末梢血単核細胞を用いて、ペプチドM3-p97特異的CTLの誘導を試みた。しかしながら、いずれの患者に於いても頭頸部癌細胞を傷害するCTLは誘導できず、癌患者にはこの抗原に対して免疫寛容が成立しているとが示唆された。現在、頭頸部癌細胞に発現される他の癌抗原ペプチド(SART-1,-2,-3抗原由来)についても、癌患者の末梢血単核細胞を用いて、これらのペプチド特異的CTLの誘導を試みている。癌特異抗原MAGE-3は-頭頸部扁平上皮癌の約半数の症例で発現するが、MAGE-3由来のペプチドでHLA-A24分子に高親和性に融合するペプチドM3-p97(TFPDLESEF)は癌細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導できることを1998年度の我々の実験にて証明した。MAGE-3抗原由来のHLA-A24分子結合性ペプチドに関しては我々の同定した上記のペプチドM3-p97とは別に、HLA-A24分子結合性ペプチドM3-p195(IMPKAGLLI)もまたCTLを誘導できると報告されている。

そこで今回、我々はこられ2種類のペプチドについてCTL誘導能を比較し、臨床応用を考えた場合どちらのペプチドを使うべきかについて検討した。その結果、両ペプチドはほぼ同等のCTL誘導能、CTL活性を有し、MAGE-3抗原とHLA-A24分子を共に発現する腫瘍においては、どちらのペプチドを用いても同等の有効性が期待できることが示唆された(Jpn.J.Clin.Oncol.2000,in press)。また頭頸部癌の約60%で遺伝子変異が認められるp53癌抑制遺伝子についても、同様にHLA-A24分子結合性ペプチド(p53蛋白のN末端から125番目から134番目のアミノ酸からなるペプチド)がペプチド特異的CTLを誘導できることを証明した。さらにこのCTLはp53遺伝子変異により変異p53蛋白が細胞内蓄積しているHLA-A24^+頭頸部癌細胞を特異的に傷害することがわかった。(Clin.Cancer Res.2000,in press)。これらの結果は頭頸部癌における癌抗原特異的免疫療法の可能性を裏付けるものである。
縁辺地域における医療供給体制に関する地理学的研究

本研究は日本と台湾の縁辺地域における医療供給体制を実証的に明らかにした。地域包括ケアを推進してきた高知県梼原町では,人口減少の進展により,推進員にかかる負担に集落による地域差が生じるとともに,担い手の減少と高齢化によって,NPO法人による要介護高齢者の移送サービスの存続が危惧された。台湾の緑島では,出身医師による長年の献身的な努力がみられた一方,ナショナル・スケールの支援が有効に作用していないケースがみられた。島内では家族の支援や外国人労働力による在宅介護,休業や家族の分断を伴った島外への受療行動が確認できた。以上,多層的ガバナンスのあり方が医療供給体制の地理的多様性を生む要因となっている。高知県内の基幹病院を中心として,現在の医療供給体制がいかにして維持されているのか検討する。特に,高知県の僻地医療政策において,医療従事者の確保と在宅医療の推進に向けた多職種間の連携強化の2点に焦点を当てて検討した。高知県の過疎地域では,無医地区が多く,高齢化率が50%を超える自治体もある。県内では,出張診療所を含めた僻地診療所が29カ所設置され,僻地医療拠点病院が8カ所指定されており,僻地診療所への医師派遣や巡回診療といった医療活動が継続的に実施されている。僻地医療の支援態勢として,高知県へき地医療支援機構による代診医師の派遣や情報ネットワークの整備,高知県へき地医療協議会による医師の確保があるが,診療機能の継続および医師確保がきわめて困難な状況にある。国内の先進事例地域である高知県において,フィールド調査を実施したことによって,本研究が目指す理論化に欠かせない基礎的データを収集することができた。また,高知県梼原町において,予備的調査を行うことができた。国外では,台湾において,複数の先進事例地域を選定するにあたって,必要な基礎的データを収集するとともに,留学生を通じて現地の事情に詳しい医師とのコンタクトをとる目途がついた。以上の成果は次年度に向けた詳細なフィールド調査に向けて不可欠な作業過程であり,交付申請書に記載した「研究の目的」をおおむね達成したと評価できる。日本では長年にわたって地域包括ケアを推進してきた高知県梼原町を事例に,縁辺地域でありながら多様な地域包括ケアシステムが構築されてきた経緯から,ケアの地理的多様性の要因を考察した。梼原町では,住民同士が話し合って,3年任期の保健衛生推進員(現健康文化の里づくり推進員)が推薦され,講習会などに参加して病気の知識を蓄え,医療者と町民の間をつなぐ役割として、特定健診やがん検診への参加を住民に呼び掛ける活動などを行っている。しかし,人口減少の進展により,集落によって推進員を担当できる者が限定されるなど,推進員にかかる負担に地域差が生じている。また,NPO法人によって,周辺部(初瀬区,松原区)の要介護高齢者への移送,配送サービスが実施されているが,担い手の減少と高齢化によって,サービスの存続が危惧される。加えて,高知県本山町において地域包括ケアシステムや災害時の医療救護体制を調査した。後者に関して,高知県本山町では,公助の限界を自助や共助でカバーしようとしている。しかし,農村部においても田畑非所有世帯が多くなっており,広域流通に依存している状況がうかがえる。ヘリポートは中心部と周辺部に2カ所設置されている。ただし,道路が寸断されていればやはり孤立集落への陸送は困難である。民間企業5社と救援物資輸送の協定を結んでいるものの,輸送手段が確保できなければ画餅に終わる。主要道路(国道439号)の啓開は県主導で行われ,地元建設業者と協定も結んでいるが,沿岸部で甚大な被害があった場合,山間部への支援が後回しになるとの危機意識が役場にある。救援物資輸送計画の段階で,支援に地域格差の生ずるリスクが内在している。台湾では,複数地域の医療供給体制に関する予備調査によって,資料収集およびデータ分析を行った。また,事例地域を選定するとともに,現地調査の実施に向けた準備を進めた。国内の中山間地域である高知県の複数地域において,現地調査を実施したことによって,理論化に欠かせない基礎的データおよび定性的データを収集することができた。また,台湾では,事例地域の選定にあたって,事情に詳しい研究者と出身者の協力を得るとともに,現地調査を実施するめどがついた。以上の成果は次年度の現地調査に向けて不可欠な作業過程であり,交付申請書に記載した「研究の目的」をおおむね達成したと評価できる。島嶼によって自然条件と社会条件は大きく異なるため,多様な供給体制を示し,島嶼内のよりローカルなスケールにおいても需要と供給の様態は異なる。こうした地域による差異や格差は,国の社会保障政策(ナショナルスケール),島外の支援態勢(リージョナルスケール),島内の人口分布に規定されたサービスの地域差や,家族や地域住民によるインフォーマルサポートの入手可能性の地域差(ローカル・スケール)など多様なスケールにかかる要因が複雑に関係している。こうした要因をスケールの違いを意識しながら解釈するうえで,多層的ガバナンスの視点が有効であると考えらえる。そこで,本研究では,人口が小規模ながら,観光地化によって多くの観光客が訪れる台東県緑島郷に属する緑島を事例に,台湾島嶼部の医療・介護サービスがどのようにして展開してきたのか,多様な空間スケールにおいて島嶼部の地理的条件から検討するとともに,住民のサービス利用行動から現在のサービス供給体制の空間特性について考察した。

医療・介護資源が不足する緑島では,出身医師による長年にわたる献身的な医療サービスの提供とともに,台湾本島の病院の支援を前提とした供給体制が構築された。ヘリ搬送の消極的姿勢や遠隔画像診断の低利用などナショナル・スケールの支援が必ずしも有効に作用しているとはいえない。島内では家族の支援や外国人労働力が在宅介護を支える一方,休業や家族の分断を伴った島外への受療行動が確認できた。本研究は日本と台湾の縁辺地域における医療供給体制を実証的に明らかにした。地域包括ケアを推進してきた高知県梼原町では,人口減少の進展により,推進員にかかる負担に集落による地域差が生じるとともに,担い手の減少と高齢化によって,NPO法人による要介護高齢者の移送サービスの存続が危惧された。台湾の緑島では,出身医師による長年の献身的な努力がみられた一方,ナショナル・スケールの支援が有効に作用していないケースがみられた。島内では家族の支援や外国人労働力による在宅介護,休業や家族の分断を伴った島外への受療行動が確認できた。以上,多層的ガバナンスのあり方が医療供給体制の地理的多様性を生む要因となっている。予備調査を踏まえて,事例の主体を対象とするヒアリング調査を通じて定性的,定量的データを収集する。自治体や医療法人,社会福祉協議会といった医療・福祉関係団体等関係者による,医療空白地域の解消に向けた行動を明らかにする。被調査者へのヒアリングを実施するため,地域ケア会議をはじめとする研究会や関係組織の交友関係に基づいて被調査者にアクセスする。一連の分析で得られた成果は,医療供給空白地域の解消に向けた取組みにおける行動が展開される要因とメカニズムとして,国内外の学会発表において発信する。東アジアという広域の空間スケールにおいて位置づけるため,具体的には以下の2点を軸とした研究を遂行する。1日本の縁辺地域(高知県梼原町)における医療供給空白地域の発生要因の解明と,その解消に向けた医療供給主体の行動に関する分析と展望2台湾の縁辺地域における医療供給空白地域の特定と発生要因の解明および事例地域の選定1では,前年度の予備調査において把握した各事例を詳細に分析するとともに,医療供給体制において地域差が生じるメカニズムを提示する。そうして得られた研究成果は学会発表に加えて,学術雑誌に投稿する。2では,台湾における先進的事例にかかわる各医療供給主体に対するヒアリングに向けて,既存の統計データとを収集するとともに,医療関係者へのヒアリングを通じた定性的データを収集する。そして今後,本格的な調査を実施するにあたって,適切な事例を選定するための基礎的資料とする。日本では,高知県本山町において調査を継続するとともに,高知県いの町吾北・本川地区において,在宅医療体制を中心に地域包括ケアシステムの実態調査を行う予定である。また,災害時の医療救護体制を構築するための課題も抽出していく。台湾では,緑島を対象に保健医療機関および現地住民に対する現地調査を通じて,情報技術を活用した医療供給体制の構築とそのプロセス,医療サービス利用の実態について明らかにする。社会経済地理学
細胞周期制御機構におけるGタンパクサイクルRCCI・Ran系の機能

S期の開始および、S期終了とM期開始の制御に関わっているRCCI遺伝子は、真核生物中で良く保存されており、出芽酵母においても相同遺伝子SRMI/PRP20/MTR1の存在が報告されている。これらの変異のうち、prp20-1、mtr1-1、mtr1-3は、核内低分子量GタンパクRan/TC4の相同遺伝子GSP1/CNR1またはGSP2/CNR2の大量供給で抑圧され、srm1-1、mtr1-2は抑圧されない。これは、それぞれの変異遺伝子で欠損した機能が異なる可能性を示唆している。申請者は、既にsrm1-1を抑圧する変異ssr1-1を分離解析した。さらに、出芽酵母を使ってRCC1-Ranシステムに関わる遺伝子を分離するために、mtr1-2変異から抑圧変異を分離した。現在、約10^7細胞から12の劣性変異株を選択し解析中である。分裂酵母においては、RCC1遺伝子の高発現が生育を阻害する。これに対する抵抗性温度感受性変異(ror)を分離し、その一つror1が第2番染色体のhis4遺伝子座から22.5cMの距離にあることが分かった。また、2-hybrid法によるRan/TC4結合因子の検索は出芽酵母由来のライブラリー、分裂酵母由来のライブラリーの両方とも試みており、分裂酵母の方からRanBP1と相同なアミノ酸配列が認められた。RanBP1は、Ranに結合しRCC1に対してネガティヴに働く因子で、核膜孔タンパクの一つRanBP2もRanBP1に相同な機能ドメインを持ち、Ran/TC4に結合する。このcDNA断片が、RanBP1相同体のものかRanBP2相同体のものかいずれか明らかにするために、現在、詳細に検討している。
界面活性剤の吸着・脱着機構を考慮したマイクロバブルの非線形力学解析

1.レーザトラップしたマイクロバブルおよびカバーガラス表面に付着させたマイクロバブルを観測した結果,界面活性剤の最大平衡表面濃度および最大動的平衡表面濃度に対応する2種類の平衡気泡半径が存在すること,レーザトラップしたマイクロバブルの場合,レーザによる熱対流がマイクロバブルの収縮を促進させることが示された2.LevovistとImavistの2種類のマイクロバブルを用いて,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動を観測した.その結果,両者とも気泡径が十分小さい場合は,加圧により気泡が収縮する際に界面に凹凸(変形)が生じ,減圧しても気泡半径は初期半径まで回復しないこと,Imavistの場合には,内部ガスの気泡外部への拡散が抑制され,また,気泡周囲の空気が気泡内部に拡散により流入することにより,気泡の膨張が促進されることが示された.収縮時の変形は,マイクロバブルの表面に界商活性剤の多重層が形成されたことを示唆するものであり,多重層により気体の拡散が抑制されマイクロバブルが安定化していることが示された.3.界面活性剤の吸着・脱着,動的表面張力,および界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルを構築した.4.本力学モデルを用いて解析した結果,気泡の収縮時間に比べて,界面活性剤の吸着速度は十分速いこと,レーザトラップされたマイクロバブルの場合,レーザトラップ開始時から,マイクロバブルの界面の界面活性剤濃度は最大平衡表面濃度に達していること,気泡収縮の際の時間履歴は,気泡表面積の減少に伴う表面張力の低下に支配されていることが示された.また,界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルは,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動をシミュレートする上で,有効であることが示された.1.レーザトラップしたマイクロバブルおよびカバーガラス表面に付着させたマイクロバブルを観測した結果,界面活性剤の最大平衡表面濃度および最大動的平衡表面濃度に対応する2種類の平衡気泡半径が存在すること,レーザトラップしたマイクロバブルの場合,レーザによる熱対流がマイクロバブルの収縮を促進させることが示された2.LevovistとImavistの2種類のマイクロバブルを用いて,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動を観測した.その結果,両者とも気泡径が十分小さい場合は,加圧により気泡が収縮する際に界面に凹凸(変形)が生じ,減圧しても気泡半径は初期半径まで回復しないこと,Imavistの場合には,内部ガスの気泡外部への拡散が抑制され,また,気泡周囲の空気が気泡内部に拡散により流入することにより,気泡の膨張が促進されることが示された.収縮時の変形は,マイクロバブルの表面に界商活性剤の多重層が形成されたことを示唆するものであり,多重層により気体の拡散が抑制されマイクロバブルが安定化していることが示された.3.界面活性剤の吸着・脱着,動的表面張力,および界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルを構築した.4.本力学モデルを用いて解析した結果,気泡の収縮時間に比べて,界面活性剤の吸着速度は十分速いこと,レーザトラップされたマイクロバブルの場合,レーザトラップ開始時から,マイクロバブルの界面の界面活性剤濃度は最大平衡表面濃度に達していること,気泡収縮の際の時間履歴は,気泡表面積の減少に伴う表面張力の低下に支配されていることが示された.また,界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルは,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動をシミュレートする上で,有効であることが示された.(1)レーザトラップしたマイクロバブルならびにカバーガラス表面に付着させたマイクロバブルを観測した結果,収縮時にマイクロバブルの半径が,ある半径以下に達するとマイクロバブルが非常に安定化されることが示された.(2)カバーガラス表面に付着させたマイクロバブル周囲の圧力を変動させた時の,マイクロバブルの挙動を観測した.その結果,半径が20ミクロン程度の大きなマイクロバブルは,球状に収縮膨張するが,半径が510ミクロン程度の小さなマイクロバブルは,その収縮時に界面に凹凸(変形)が生じ,減圧してもマイクロバブルの体積が回復しないことが示された.収縮時の変形は,マイクロバブルの表面に界面活性剤の多重層が形成されたことを示唆するものであり,多重層により気体の拡散が抑制されマイクロバブルが安定化していることが示された.(3)気体拡散や周囲液体の対流等を考慮したマイクロバブルの運動方程式に,界面活性剤の吸着・脱着モデルを取り入れ,動的表面張力を考慮した運動方程式を定式化した.(4)(3)の理論の特別な場合として,表面張力がマイクロバブル表面の界面活性剤濃度の対数に比例する仮定したマイクロバブルの力学モデルを構築した.本モデルによるレーザトラップされたマイクロバブルの収縮過程のシミュレーション結果は,実験結果と良く一致した.また,レーザトラップされたマイクロバブルの場合,レーザによる対流がマイクロバブル内の気体の拡散に影響していることが示された.(5)界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルを構築した.圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動を,本モデルを用いて解析した結果,マイクロバブルの変形が小さい場合は,本モデルは実験をシミュレートする上で有効であることが示された.(6)3次元境界要素法を用いた非球形気泡に関する解析手法を開発した.1.前年度構築した界面活性剤の吸着・脱着を考慮した動的表面張力理論を用いて,気泡の安定性を解析した.

その結果,気泡の収縮時間に比べて,界面活性剤の吸着速度は十分速いことが示された.また,レーザトラップしたマイクロバブルの実験結果と本理論との比較を行った結果,レーザトラップされたマイクロバブルの場合,レーザトラップ開始時から,マイクロバブルの界面の界面活性剤濃度は最大平衡表面濃度に達していること,気泡収縮の際の時間履歴は,気泡表面積の減少に伴う表面張力の低下に支配されていることが示された.2.LevovistとImavistの2種類のマイクロバブルを用いて,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動を観測した.その結果,両者とも気泡径が十分小さい場合は,加圧により気泡が収縮する際に界面に凹凸が生じ,減圧しても気泡半径は初期半径まで回復しないことが示された.また,Imavistの場合,内部ガスの気泡外部への拡散が抑制され,また,気泡周囲の空気が気泡内部に拡散により流入することにより,気泡の膨張が促進されることが示された.3.界面活性剤の多重層による拡散抵抗を考慮したマイクロバブルの力学モデルを用いて,圧力変動下におけるカバーガラス表面に付着したマイクロバブルの挙動をシミュレートした.その結果,気泡収縮時にその表面に凹凸が生じない場合は,本モデルはLevovistの収縮・膨張をシミュレートする上で,有効であることが示された.また,気泡表面に凹凸が生じる場合,収縮時に空気の拡散抵抗が非常に大きくなり,気泡が安定化されていることが示された.
LYVE-1抗体によるリンパ管の同定と消化管癌におけるリンパ管侵襲の予後的意義

平成16年度中に、今回の研究に必要な量の同抗体は充分に作製された。抗体は凍結保存した。2.正常消化管のリンパ管分布剖検時に採取した正常食道・胃・結腸をLYVE-1抗体で免疫染色。食道及び結腸の粘膜内にはリンパ管を認めず、胃粘膜には少数の毛細リンパ管が検出できた。粘膜下固有層にはいずれの消化管組織においても、豊富なリンパ管が認められ、特に粘膜筋板直下には多く分布していた。固有筋層では動静脈に沿って分布する傾向をみた。3.胃早期癌におけるリンパ管分布と癌のリンパ管侵襲手術摘出された132例の胃早期癌を検討。リンパ節転移群(66例)には21例にLYVE-1陽性のリンパ管に癌侵襲が認められ、リンパ節転移の無い群(66例)に比較して有意に多かった。リンパ管侵襲は癌周囲に観察され、腫瘍組織内には観察されなかった。腫瘍辺縁に2個以上のリンパ管侵襲がみられる場合には80%の確率でリンパ節転移があった。4.結腸癌におけるリンパ管増生と癌のリンパ管侵襲結腸癌160例を検討。m癌及びsm癌は40例、mp癌は60例、ss癌は60例で、それぞれ半数はリンパ節転移群である。LYVE-1陽性のリンパ管は癌周囲に認められたが、正常結腸に比較して増加を認めなかった。癌のリンパ管侵襲は、腫瘍辺縁・周囲に観察され、リンパ節転移群に有意に多かった。腫瘍細胞のリンパ管増殖因子であるVEGF-C発現とリンパ管数・リンパ節転移との関連を検討したところ、いずれも有意な関連を認めなかった。癌の増殖はリンパ管新生よりも早いために上記結果が生じたと思われる。5.まとめLYVE-1抗体を使用した免疫組織化学は、消化管のリンパ管分布検索に有用であり、胃癌や結腸癌におけるリンパ管侵襲の機構や意義を検討する上で極めて重要な位置を占めると考えられた。抗体は凍結保存した。1.LYVE-1抗体作製抗LYVE-1ウサギ抗体の大量作製は終了。予定の研究計画を遂行するに足りる抗体量を確保した。2.消化管におけるリンパ管の分布正常胃・結腸におけるリンパ管分布には大きな相違点が観察された。胃粘膜固有層には豊富なリンパ管分布をみたが、結腸では粘膜固有層の筋板上に限局していた。粘膜下固有層では両臓器とも筋板下及び固有筋層上に豊富なリンパ管分布を認めた。固有筋層内のリンパ管は動静脈走行に関連していた。この両者の相違は、胃粘膜内癌はリンパ節転移を起こすことがあるが、結腸粘膜内癌はリンパ節転移を起こさないという事実に一致している。食道では粘膜上皮内にリンパ管を認めず、粘膜固有層の上皮直下に横行するリンパ管が豊富で、その程度は下部食道ほど多く、食道癌の部位別リンパ節転移の頻度に一致する結果であった。3.胃早期癌におけるリンパ管侵襲胃早期癌の手術摘出例120例につき、病変部組織切片を、HE及びビクトリア青染色、LYVE-1抗体及びvon Willebrand factor抗体による免疫染色を施行した。これらの染色により毛細リンパ管と毛細血管の鑑別が容易となり、癌のリンパ管侵襲も容易に観察できた。リンパ管侵襲は、癌先進部やその深部に多く、癌病巣内には認めなかった。