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コンフォメーション制御と分子認識を基盤とした架橋ペプチド触媒の創製

最終年度においてはこれまでに合成してきた触媒を用いて不斉触媒反応を行い、触媒の機能性を評価しつつ、得られた生成物の有用性を高めるため、新規骨格への変換反応を検討することを中心に研究をおこなった。ペプチド有機分子触媒のコンフォメーションの制御に関してはジ置換アミノ酸やかさ高いLーαーアミノ酸を用いたり、ペプチド側鎖上での架橋形成を利用することで達成した。反応に関しては、例えばマロン酸エステル類のα,β不飽和カルボニル化合物への不斉マイケル付加反応をおこなった。反応は非常にきれいに進行し、収率と不斉収率に関しても高い値が得られた。基質の適用範囲に関しても検討したが、α,β不飽和カルボニル化合物のβ位に関しては、各種アリール基のほか、アルキル基や、2ーフリル基、アルキニル基に関しても提供可能であり、一方、α,β不飽和カルボニル化合物のα位に関してはメチル基やノルマルプロピル基等、長さの違うものであっても同程度の立体選択性が得られた。さらに、得られたマイケル付加体の有用性を高めるため、新規骨格への変換反応を検討した。まず得られたマイケル付加体のカルボニル基をネオペンチルグリコールで保護したのち、エステル部位を水素化リチウムアルミニウムで還元し、環化前駆体であるジオールへと変換した。最後にジオールをトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートとトリエチルシランで処理し環化することで、2,4,5ー三置換テトラヒドロフラン環の構築に成功した。この反応では、ペプチド触媒反応で得られた不斉中心を利用し、一つの反応で一挙に2つの立体中心を得ることができた。初年度は下記に示す通り、架橋ペプチド触媒の最適化と構造解析及び反応機構の解明に関する研究を中心に行った。1. L-リンゴ酸から合成した5員環状ジ置換アミノ酸から立体反転や架橋部位の導入を行い、鍵となる4種の新規5員環ジ置換アミノ酸を合成した。これらと架橋を行うN末端部位のアミノ酸には、セリンの他にトレオニン、アスパラギン酸等を導入し架橋を試みた。その他アミノ酸の総残基数や架橋間の長さ(主鎖と側鎖それぞれ)に関しても検討した。2.二次元NMRとIRにより水素結合の相関関係を、CDとX線構造解析からペプチドの二次構造および巻き方を決定する事により、ペプチドの三次元立体構造を明らかにした。もう一方の試みとして、デプシペプチドを利用した反応機構の推定を行った。N末端の24番目のいずれかのアミドプロトンNHをOで置き換えたデプシペプチドを合成し、触媒反応に用いた結果、特に2及び3番目のアミドプロトンが求核剤の活性化に大きく寄与していることが判明した。これらの得られた情報をもとに、触媒の構造修飾にフィードバックすることで、触媒のチューニングを行うことができた。3.最適化の結果得られたペプチド触媒を用いて、幅広い基質への適用拡大を目指した不斉マイケル反応を試みた。求核剤はニトロメタン以外のニトロアルカン類やマロン酸エステル等が適用可能であった。求電子剤としては芳香環上の置換基や、芳香環部位を脂肪族鎖に置き換えたものに対しても、同等の触媒活性(収率・立体選択性)を示した。当初研究計画の3項目についてそれぞれ計画通り研究を行い、期待した一定の成果を上げることができている。本年度は、触媒構造に多様性を持たせるため、4-ヒドロキシプロリンをペプチドのN末に有するペプチドの合成と調査を行った。まず4-ヒドロキシプロリンにアリル基を導入し、これをペプチドに導入した。その後、ペプチド中の別のアミノ酸に導入してある内部のオレフィンとの間で架橋構造を形成させた。この際、側鎖の長さが架橋の効率に影響することがわかり、側鎖が短すぎるものでは架橋したペプチドが得られにくかった。これらの架橋前後のペプチドを有機分子触媒反応に用いたところ、架橋後のペプチドで大きく反応効率が向上することがわかり、架橋の効果を確認することができた。その他に4員環状ジ置換アミノ酸を入手容易な原料から新規に合成し、こちらも架橋の土台となる二重結合を環上に導入した。そして液相法によりロイシンとのヘテロオリゴペプチドを作成した。架橋形成反応において、第一および第二世代グラブス触媒のいずれにおいても架橋反応は良好に進行し目的の側鎖架橋ペプチドを得ることができた。合成した架橋前および架橋後のヘテロペプチドに関して、CDスペクトルによる構造解析を行ったところ、架橋前後でコットン効果の違いが見られ、架橋後の方が二次構造の安定化効果が強いことが示唆された。こちらでも側鎖架橋の効果を観測することができた。さらに架橋前後のペプチドに関してX線結晶構造に関する情報も手に入れることができ、多角的な面からペプチドの二次構造に関する知見が得られた。4-ヒドロキシプロリンを導入したペプチドなど当初の計画書に記載した内容に従い種々の研究を行った。

基質の適用範囲に関しても検討したが、α,β不飽和カルボニル化合物のβ位に関しては、各種アリール基のほか、アルキル基や、2ーフリル基、アルキニル基に関しても提供可能であり、一方、α,β不飽和カルボニル化合物のα位に関してはメチル基やノルマルプロピル基等、長さの違うものであっても同程度の立体選択性が得られた。さらに、得られたマイケル付加体の有用性を高めるため、新規骨格への変換反応を検討した。まず得られたマイケル付加体のカルボニル基をネオペンチルグリコールで保護したのち、エステル部位を水素化リチウムアルミニウムで還元し、環化前駆体であるジオールへと変換した。最後にジオールをトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートとトリエチルシランで処理し環化することで、2,4,5ー三置換テトラヒドロフラン環の構築に成功した。この反応では、ペプチド触媒反応で得られた不斉中心を利用し、一つの反応で一挙に2つの立体中心を得ることができた。当初の計画通り、触媒活性の向上を目指した人工アミノ酸の合成と、より高難度な分子変換反応に挑戦することで研究を推進していく。今後はより高い立体選択性を発現させるために、ペプチド触媒の構成アミノ酸を種々検討していく。高い触媒活性を示したものに関しては今後幅広い基質での応用を検討する。またX線結晶構造解析を始めとした機器解析も行い、ペプチドの3次元情報も収集することで、目的を達成するための一助とする。年度末に行う予定であった実験を次年度に行うことにしたため、若干の次年度使用額が生じた。研究の途中で派生した研究もあり、次年度にその詳細について検討する必要が生じたため。当初計画と合わせて、次年度にその成果をまとめる次年度に当該の実験を行うことで当初計画を達成するよう努める。
異常卵割から発生した胚は子牛になりうるか

受精後の細胞分裂(卵割)が異常な卵子の特徴の解明と異常卵割由来胚の子牛への発生能を検討した。異常卵割の発生は胚の生産方法により異なり、第1卵割異常卵子は正常卵割卵子に比べて胚盤胞期への発生能が低いがその半数は胚盤胞期へ発生することを見出した。個別割球は解析可能な遺伝子数が少ないことから個別割球のcDNA増幅法を開発し、2細胞期胚を分離した個別割球の遺伝子発現はその発生能と正の関係にあることを明らかにした。見出した卵割の正常性の4指標のうち、卵割の異常が1種類のみであっても正常卵割に比較して胚移植後の受胎率が低下し、2種類の異常ではさらに低率であるが受胎し、子牛への発生能を有することを解明した。異常卵割する卵子の卵割速度・パターンを解析した。食肉処理場由来卵巣から採取したウシ卵子(食肉処理場卵子区)および生体内経腟採卵ウシ卵子(OPU卵子区)について、事前に得た第1卵割終了時間の閾値までの早期に第1卵割を終了した卵子およびその正常性の割合を検証した。両区とも異常卵割の発生頻度は正常卵割に比べて低かった。OPU卵子区は、食肉処理場卵子区に比べて正常性の高いことが示された。異常卵割した卵子は、両区ともに、半数以上が胚盤胞期胚へ発生することが明らかとなった。食肉処理場卵子区では、卵割の正常性が胚盤胞期への発生能に影響していたが、OPU卵子区では第1卵割終了時の異常がその後の発生に影響していないことが判明した。供卵牛により卵割パターンに違いのあることが示唆された。胚の発育停止時期の解析において、個別に卵子の卵割過程を経時的に観察・スクリーニングした結果、胚盤胞に達する前に発生を停止して変性した胚は、第3卵割終了後が第3卵割終了前の時期に比べて死滅率に差のあることが判明した。細胞周期における個別胚・割球の遺伝子解析では、まず個別胚と個別割球で解析可能な遺伝子数を決定する必要があった。個別の胚盤胞期胚では全能性、細胞周期や分裂、エネルギー代謝や輸送、細胞運動等の候補遺伝子の解析を実施し、卵割の正常性において1種類の遺伝子発現に違いが認められた。一方、卵割スピードにおいては遺伝子発現に有意差が認められなかった。個別の割球では初期の実験で6種類の候補遺伝子の解析が可能であったが、卵割の正常性における影響は見出せなかった。解析遺伝子数の増加を試みるため、個別割球のcDNA増幅法を検討し、20個までの遺伝子発現解析が可能となったことから、現在これらの候補遺伝子の各割球における発現を解析中である。食肉処理場由来卵巣から採取したウシ卵子(食肉処理場卵子)および生体内経腟採卵ウシ卵子(OPU卵子)を用い、過去のデータから得た第1卵割終了時間の閾値までの早期に第1卵割を終了するかどうかおよびその正常性の基準(割球の正常性の基準)に基づいて胚および各割球を分類して以下を分析した。昨年度に成功した少数細胞からのcDNA増幅法を用い、食肉処理場卵子区の割球において、全能性、エネルギー代謝、細胞周期や細胞分裂、胎子成長等に関する19個の候補遺伝子の解析を実施した。すべての異常卵割指標を含まない、すなわち第1卵割が早期に終了してかつ卵割パターンに異常がなく正常卵割した個別胚の各割球と何らかの異常卵割指標を含む個別胚の各割球には、15個の遺伝子に異なる発現が認められた。一方、第2卵割以降の胚の割球においては、改良された本cDNA増幅法を用いても十分な増幅が得られない結果が多く、遺伝子解析を行える品質ではない割球が含まれることが示唆された。体外受精に用いた精液の種雄牛の違いにおける第1および第2卵割終了時の胚の正常性を検討した結果、第1卵割における卵割終了までの時間と卵割パターンの2つの指標が、胚盤胞期胚への発生能を予測可能な項目となることが明らかとなった。OPU卵子においては、割球の正常性の基準に従って分類した胚盤胞期胚を受胚牛へ移植し、各基準別の受胎率の調査を開始し、現在も継続中である。昨年度に成功したcDNA増幅法を用いることにより、今までの約3倍となる19種類の候補遺伝子の解析を可能とした。食肉処理場由来卵巣から採取したウシ卵子の第1卵割終了時の個別胚の各割球について、正常性の指標ごとにみると、閾値までに卵割が終了したかどうかでは12個、卵割割球の均等性の有無では14個、細胞断片等の存在の有無では13個の全能性、エネルギー代謝、細胞周期や分裂胎子成長等に関する遺伝子発現量の違いが見出された。第2卵割以降の胚の割球においては、十分な遺伝子解析を行える品質ではない割球が含まれることが示唆されたため、終了とする。体外受精に用いた種雄牛の精液において、第1卵割終了までの時間と卵割パターンの2項目を指標とすれば、胚の発生能を予測可能となることが明らかとなったこと、第1卵割の正常性に多くの遺伝子発現に違いが認められたことから、今後は第1卵割後の割球の一方を遺伝子解析し、残りを培養して胚盤胞期胚への発生能を検証する。

OPU卵子において、第1および第2卵割の正常性が胚移植後の受胎に及ぼす検討を開始した。第1卵割および第2卵割終了時に、卵割終了時間や卵割パターンの指標において、異常となる項目のどれか1つを有する異常卵割胚とその同じ1項目の異常がない胚と比較した場合、受胎率に有意な差は認められなかった。しかし、異常となる指標の全項目に該当しない正常卵割胚は、異常となる指標のうちどれか1項目のみを有する胚に比べて高い受胎率を示した。胚移植については進行中のため今後も受胎性の調査を継続する。培養液の違いによる異常卵割の発現と胚盤胞期への発生成績の検討については、異常卵割胚の受胎が得られることが初めて見出され始めていること、その理由を検証するために次項の計画を新たに開始することから中止する。以上のことから、平成27年度の研究成果は計画に従って順調に進展していると考えられる。牛の生産効率を阻害している受胎率低下の問題の一つに、受精後の細胞分裂(卵割)の異常が考えられることから、異常卵割卵子の特徴と発生原因の解明、異常卵割卵子由来胚盤胞期胚が子牛になりうるかについて検討した。第1卵割異常卵子は、正常卵割卵子に比べて胚盤胞期への発生能が低いが、その半数は胚盤胞期への発生能を有することを明らかするとともに胚盤胞期への発生能のない卵子の卵割停止時期を特定した。異常卵割の発生頻度は、胚盤胞の生産手法(経腟採卵由来卵子と食肉処理場由来卵巣から採取した卵子の間、ドナー間、媒精した種雄牛の間)で卵割パターンが異なることが明らかとなった。これらのことから異常卵割は、卵子の採取方法、ドナー、種雄牛により発生することを見出した。解析可能な遺伝子数に限りがあったことから、今までの約3倍となる19種類の遺伝子解析を可能とする個別割球のcDNA増幅法を開発した。異常卵割と正常卵割由来胚盤胞期胚の間、第1卵割における異常と正常卵割胚の個別割球の間の遺伝子発現が異なることを明らかとした。第1卵割終了後の2細胞期胚を分離した個別割球における胚盤胞期への発生能は卵割の正常性によって異なり、遺伝子発現はその発生能と正の関係にあることを明らかにした。見出した卵割の正常性の基準に従って分類した4種類の指標のうち、卵割の異常が1種類であっても異常な場合は同指標がすべて正常である場合と比較し、胚移植後の受胎率が有意に低下することが判明した。しかしながら、2種類の異常な卵割指標を経た胚盤胞期胚においては、通常の胚移植に比べて低率ではあるが受胎し、子牛への発生能を有することを解明した。受精後の細胞分裂(卵割)が異常な卵子の特徴の解明と異常卵割由来胚の子牛への発生能を検討した。異常卵割の発生は胚の生産方法により異なり、第1卵割異常卵子は正常卵割卵子に比べて胚盤胞期への発生能が低いがその半数は胚盤胞期へ発生することを見出した。個別割球は解析可能な遺伝子数が少ないことから個別割球のcDNA増幅法を開発し、2細胞期胚を分離した個別割球の遺伝子発現はその発生能と正の関係にあることを明らかにした。見出した卵割の正常性の4指標のうち、卵割の異常が1種類のみであっても正常卵割に比較して胚移植後の受胎率が低下し、2種類の異常ではさらに低率であるが受胎し、子牛への発生能を有することを解明した。前項で述べたとおり、研究はおおむね順調に進展しており、平成27年度の研究計画のとおり実験を進める。具体的には、まず、平成26年度の実験には計画していなかった体外受精に用いた精液の種雄牛の違いによる卵割の特徴が得られていることから、平成27年度にデータ数を増やして詳細な検証を進める。また、各割球の細胞周期別の遺伝子発現解析を予定どおり継続して実施する。さらに、異常卵割を経て胚盤胞期に達した胚を受卵牛に移植し、異常卵割が子牛への発生能へ及ぼす影響の検討を開始するとともに、培養液の違いによる異常卵割の発生頻度や胚盤胞期への胚発生成績の検討を開始する。
弾性表面波を利用した摩擦駆動型サブナノメートル位置決めスライダの開発

10MHz-100MHzの高周波,サブナノメートルの低振幅であり,高い振動エネルギーを有する弾性表面波に着目し,従来不可能であった超精密(0.5nm),高速(1.5m/s)かつ広範囲(理論上は無限平面)での位置決め可能なシステムを開発することを最終目的とする本研究において,2年目の本年は,1年目に新たに見出された「弾性表面波モータの推力低下」の原因の解明及びそれに基づく設計指針構築を行なった.得られた主要な結果は,以下の通りである.1.弾性表面波モータの推力は,駆動回数に伴い徐々に減少し駆動不可能な状態となるもののエタノールでステータを拭くことにより推力を回復させることが可能であることを明らかにした.2.エタノールで拭くことにより表面の電位を除去することが可能であることを明らかにした.3.除電を行ないながら弾性表面波モータを用いることにより,寿命の大幅な改善が可能であることを実験により明らかにした.4.ステータの表面電位が-12001200Vの範囲では,表面電位の変化に起因したステータの材料特性,振動特性の変化及びステータとスライダ間の静電引力の変化が,推力低下の直接的原因ではないことを明らかにした.5.弾性表面波モータの駆動に伴い発生する摩耗粒子が摩擦駆動面に付着することにより推力が大幅に低下することを明らかにした.6.発生した摩耗粒子の付着の主要因が摩擦に起因する帯電であることを示した.7.摩耗粒子発生の抑制及び発生した摩耗粒子の付着防止のための導電性を有する硬質材料の選択が弾性表面波を利用した摩擦駆動型サブナノメートル位置決めシステムの重要な鍵であることを示した.10MHz-100MHzの高周波,サブナノメートルの低振幅であり,高い振動エネルギーを有する弾性表面波に着目し,従来不可能であった超精密(0.5nm),高速(1.5m/s)かつ広範囲(理論上は無限平面)での位置決め可能なシステムを開発することを最終目的とする本研究において,1年目の本年は,弾性表面波の励振が可能な精密位置決めスライダを試作しその性能評価を行なった.得られた主要な結果は,以下の通りである.1.圧電基板上に配置した2組の電極により一軸に弾性表面波を励振させるスライダを試作し,表面に微小突起を有するスライダの駆動が可能であることを実証した.2.弾性表面波モータの推力は,駆動回数に伴い徐々に減少し,駆動不可能な状態となる.これが弾性表面波モータの寿命であることを明らかにした.3.弾性表面波モータの推力減少の主原因は,摩擦駆動時に発生する摩擦帯電により,ステータの摩擦駆動部の表面電位が上昇し,ステータの振動特性が劣化することである.4.弾性表面波モータの摩耗は,スライダ表面の微小突起によりステータが削られることにより発生する.また,これらの摩耗は,スライダが停止する減速時に発生する.5.3にて発生した摩耗粒子は,スライダの摩擦駆動面に付着し,発生しえる最大推力を下げる原因となる.6.除電を行ないながら弾性表面波モータを用いることにより,寿命の大幅な改善が可能であることを実験により明らかにした.10MHz-100MHzの高周波,サブナノメートルの低振幅であり,高い振動エネルギーを有する弾性表面波に着目し,従来不可能であった超精密(0.5nm),高速(1.5m/s)かつ広範囲(理論上は無限平面)での位置決め可能なシステムを開発することを最終目的とする本研究において,2年目の本年は,1年目に新たに見出された「弾性表面波モータの推力低下」の原因の解明及びそれに基づく設計指針構築を行なった.得られた主要な結果は,以下の通りである.1.弾性表面波モータの推力は,駆動回数に伴い徐々に減少し駆動不可能な状態となるもののエタノールでステータを拭くことにより推力を回復させることが可能であることを明らかにした.2.エタノールで拭くことにより表面の電位を除去することが可能であることを明らかにした.3.除電を行ないながら弾性表面波モータを用いることにより,寿命の大幅な改善が可能であることを実験により明らかにした.4.ステータの表面電位が-12001200Vの範囲では,表面電位の変化に起因したステータの材料特性,振動特性の変化及びステータとスライダ間の静電引力の変化が,推力低下の直接的原因ではないことを明らかにした.5.弾性表面波モータの駆動に伴い発生する摩耗粒子が摩擦駆動面に付着することにより推力が大幅に低下することを明らかにした.6.発生した摩耗粒子の付着の主要因が摩擦に起因する帯電であることを示した.7.摩耗粒子発生の抑制及び発生した摩耗粒子の付着防止のための導電性を有する硬質材料の選択が弾性表面波を利用した摩擦駆動型サブナノメートル位置決めシステムの重要な鍵であることを示した.
高密度単色原子ビームのナノマニピュレーション

レーザー光が有する力学的作用を用いると、原子の運動を精度良く制御できることが知られている。本研究では特に、レーザー光ビームによって数ナノメートル以下まで原子ビームが集束できるという理論的予測に着目し、その実現のための基礎的研究をおこなった。原子の集束は光の集光と現象的に極似しており、理想的な原子の集束のためには、速度分布をできるだけ狭くする必要がある。また、原子の平均速度は大きい方が、原子の単色性が向上する。そこで、本研究では単色な原子ビームの発生を容易に行う方法として、半導体レーザーを用いた白色冷却法の開発を行った。対象原子をセシウムとし、波長852nmの外部共振器型半導体レーザーの注入電流を直接変調することによって、周波数変調を行った。これにより、レーザー光の中心周波数を安定に保ちながら、そのスペクトル幅を自由に拡げることが可能になった。変調周波数をセシウム原子の自然幅の5MHzとすることによって、対象となる全ての原子を冷却できるようにした。冷却される原子の中心速度を精確に制御するため、波長の異なるふたつのレーザー光源を準備し、原子ビームの進行方向および逆方向からレーザー光を照射することによって、原子を挟み込むようにして原子速度を変化させた。すなわち、一方では減速、他方では加速することになる。実際にセシウムの原子ビームに対して実験を行って原子の速度分布を測定したところ、約20m/sの速度幅まで圧縮されていることが判明した。また、速度幅を保ったまま、原子の中心速度を100から300m/s程度まで自由に変化させることが出来た。原子に対する光圧力を計算することによって、速度分布のシミュレーションを行ったところ、実験結果と良く一致していることが見出された。本年度は、原子ビームの精密制御を行うための準備段階として、2台のFM変調した半導体レーザーを用いて、熱的に発生させたセシウム原子ビームの単色化(速度幅の狭帯化)を行った。当初、1台目のレーザーで予備的に減速させ、2台目のレーザーでさらに減速を行い、単色原子ビームを安定に発生させる2段階減速法を検討していたが、2台目の減速用レーザーを用いても、希望する速度幅での高密度単色原子ビームの安定発生は得られなかった。そこで、真空チャンバーの改造を行い、2台目のレーザーを1台目のレーザーに対向して照射できるようにした。過減速した原子を2台目のレーザーで加速させ、高密度単色原子ビームの安定発生を試みた。得られた原子ビームの速度幅は、現状の測定分解能(約15m/s)程度であり、希望する速度幅(数m/s程度)の原子ビームが得られた可能性は高い。正確な速度幅は、次年度にTOF測定法を用いて行う予定である。また、減速、加速用のレーザーをともにFM変調でスペクトル幅を広くしたため、広範囲の速度を持つ原子を加減速でき、得られた原子ビームは中心速度を速度純度の高いままでチューニングできる。理論上、中心速度が速く、速度の広がりが小さい原子ビームは、光の勾配力を用いた原子レンズを用いた場合、より小さなスポットに絞り込むことができる。そのため、本年度に得られた高密度単色原子ビームを用いれば、次年度に計画している原子ビームの集光をより高分解能に行うことが出来ると予想される。
ニホンライチョウ寄生原虫の寒冷地共生進化経路の解明と保全に向けた実践的病態解明

我々は、近年、ニホンライチョウの消化管で増殖し、下痢等、栄養吸収阻害を引き起こす可能性のあるコクシジウム原虫が広く存在していることを明らかにした。ライチョウに寄生する原虫は他種動物のものとは異なり、寒冷地でも生存でき、環境とライチョウ間で生活環を維持していると推定される。本研究では、極地寒冷地に生息するライチョウに寄生適応したこのコクシジウム原虫の特性を明らかにするため、環境中における生理生態、病態と関連付けた生存活性を評価する。また、本原虫の共生古代進化を明らかにするため、国内および海外におけるキジ目鳥類および他種ライチョウを対象に網羅的比較遺伝子疫学解析を実施する。
地震で変状した堤防の耐浸透・耐越流性能の評価と新しい性能指標の提案

地震によって堤防は変形し、天端の沈下だけでなく、ひずみやクラックなどの変状が生じる。このような変状が生じた堤防の耐浸透・耐越流性能は明らかになっておらず、従来は堤防天端の沈下量だけで性能評価がなされている。本研究では、堤防を構成する不飽和土の力学に立脚して模型実験や数値解析を用いて、地震による変状を受けた堤防の耐浸透・耐越流性能を明らかにする。遠心模型実験では、加振前後の変状の有無によって堤体の透水性が変化することを示し、変状した堤体は川裏側で浸透破壊の可能性が高くなる可能性を示した。また、浸透流解析では、堤体形状の変化では説明できない要因が変状後の堤体の透水性に影響している可能性を示した。地震・津波および地震・豪雨のような複合災害における様々な外力作用下において、先行の地震外力による堤防の変状を考慮し、後続の浸透・越流などの外力に対する堤防の性能を明らかにすることを目的とする。地震によって堤防は変形し、天端が沈下するだけでなく、ひずみやクラックなどの変状が生じる。本研究では、堤防を構成する不飽和土の力学に立脚して模型実験や数値解析を用いて、地震による変状を受けた堤防の耐浸透・耐越流性能を解明し、新たな性能評価の指標を提案する。具体的には、堤防の典型的な構成材料の浸水変形特性や震動後に変形した堤防の耐浸透・耐越流性能を定量的に明らかにする。最終的には、堤体の変形やクラックの開口幅・位置に着目し、耐浸透・耐越流性能の新たな指標を提案する。当該年度は上記の目的を達成するため、2011年東北地方太平洋沖震における堤防の複合災害の事例収集、不飽和土の浸水せん断試験、および震動後の浸透・越流を考慮した堤防の遠心模型実験を実施した。事例収集においては、降雨浸透と地震動の複合作用を受けた盛土を対象として地下水位観測などの現地調査を実施した。不飽和土の浸水せん断試験では、所有している不飽和三軸試験機の改良し、堤防土と同等の粒度を有する土を用いて不飽和三軸圧縮試験を実施し、試験装置の妥当性を確認した。遠心模型実験では、遠心場で使用する小型振動台を試作し、その性能を検証した。また、震動による堤防の被害形態を模擬した盛土模型を浸水させ、変状を受けた盛土の浸透性能を重力場および遠心場において検討した。その結果、盛土内のクラックにより一時的に浸透流速は低下するものの、その後の浸透では変状を受けた堤防の方が変状していない堤防よりも浸透流速が増加する傾向が確認できた。当該年度は上記の目的を達成するため、不飽和砂質土の浸水せん断試験、浸透による内部侵食を受けた砂質土のせん断試験および震動後の浸透・越流を考慮した堤防の遠心模型実験を実施した。不飽和土の浸水せん断試験では、改良した不飽和三軸試験機を用いて、堤防土と同等の粒度を有する土を用いてせん断後の浸水試験を実施し、せん断応力の大きさによって浸水時の挙動が異なることを示した。内部侵食を受けた砂質土のせん断試験では、種々の侵食特性を有する砂質土の内部侵食その後のせん断試験を実施し、内部侵食によりせん断特性が変化することを確認した。遠心模型実験では、遠心場で使用する小型振動台をさらに改良し、その性能を検証した。その結果、飽和砂質土の模型地盤を遠心場で振動することが可能となり、液状化の発生を確認できた。

具体的には、堤防の典型的な構成材料の浸水変形特性や震動後に変形した堤防の耐浸透・耐越流性能を定量的に明らかにする。最終的には、堤体の変形やクラックの開口幅・位置に着目し、耐浸透・耐越流性能の新たな指標を提案する。当該年度は上記の目的を達成するため、繰返し履歴を受けた砂質土の透水試験、浸透による内部侵食を受けた砂質土のせん断試験、震動後の浸透・越流を考慮した堤防の遠心模型実験および変状した堤体を模擬した浸透流解析を実施した。繰返し履歴を受けた砂質土の透水試験では、改良した繰返し三軸試験機を用いて、堤防土と同等の粒度を有する土を用いて複数のせん断履歴を与えた後に透水試験を実施し、透水性がせん断履歴の影響を受けることを示した。内部侵食を受けた砂質土のせん断試験では、種々の侵食特性を有する砂質土の内部侵食その後のせん断試験を実施し、内部侵食によりせん断特性が変化することを確認した。遠心模型実験では、加振前後の変状の有無によって堤体の透水性が変化することを示した。変状した堤体を模擬した浸透流解析では、堤体形状の変化では説明できない要因が変状後の堤体の透水性に影響している可能性を示した。地震によって堤防は変形し、天端の沈下だけでなく、ひずみやクラックなどの変状が生じる。このような変状が生じた堤防の耐浸透・耐越流性能は明らかになっておらず、従来は堤防天端の沈下量だけで性能評価がなされている。本研究では、堤防を構成する不飽和土の力学に立脚して模型実験や数値解析を用いて、地震による変状を受けた堤防の耐浸透・耐越流性能を明らかにする。遠心模型実験では、加振前後の変状の有無によって堤体の透水性が変化することを示し、変状した堤体は川裏側で浸透破壊の可能性が高くなる可能性を示した。また、浸透流解析では、堤体形状の変化では説明できない要因が変状後の堤体の透水性に影響している可能性を示した。不飽和土の浸水せん断試験および内部侵食後のせん断試験は順調に進展している。平成25年度に遠心場での振動台を試作したが、その性能を向上させるため平成26年度も引き続き、振動台の改良を実施したため、遠心場において堤防の振動後の浸透特性を評価する実験がやや遅れている。積み残した実験は平成27年度に実施する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。地盤工学平成26年度に実施できなかった遠心模型実験は平成27年度に実施予定である。当初計画通り、2011年東北地方太平洋沖震における堤防の複合災害の事例収集、不飽和土の浸水せん断試験、震動後の浸透・越流を考慮した堤防の遠心模型実験を実施した。振動台の改良を行ったため、遠心模型実験で使用予定の消耗品の支出が少なくなったため。遠心模型実験で使用する小型振動台を試作したが、まだ調整が必要であり、今後この調整を加速する必要がある。遠心模型実験の消耗品として支出予定である。遠心場での小型振動台の製作コストを削減したため。遠心場での小型振動台の調整費として使用する。
肥大型心筋症の致死的不整脈に対する細胞内Ca2+制御による新しい治療法の開発

肥大型心筋症(HCM)では、著明な心肥大とともに致死性不整脈により突然死するハイリスク群が存在する。本研究では拡張期の心筋細胞内Ca^濃度上昇に着目し、リアノジン受容体(RyR2)からのCa^漏出による拡張期のCa^濃度上昇と致死性不整脈を来たす機序とが相互に深く関連性があること、Ca^漏出の抑制による心筋筋小胞体機能の改善により拡張期の心筋細胞内Ca^濃度上昇を防ぐことで、不整脈誘発抑制を起こしうる可能性が示唆された。肥大型心筋症(HCM)では、著明な心肥大とともに致死性不整脈により若年で突然死するハイリスク群が存在する。本研究では、HCMにおいて致死性不整脈を生じる機序として、拡張期の心筋細胞内Ca2+濃度上昇に着目し、ヒト肥大型心筋症でみられる点突然変異のトランスジェニックマウスを用いて研究を行った。単離心筋細胞を用いた実験により、イソプロテレノール負荷をおこなった際に、心筋細胞におけるCa2+貯蔵庫である心筋筋小胞体に存在する、Ca2+放出チャネルであるリアノジン受容体(RyR2)からの異常なCa2+漏出を原因とした拡張期のCa2+濃度上昇が、致死性不整脈誘発を来たす機序と相互に深く関連性があることが判明した。また、RyR2機能異常のメカニズムで大きな役割を果たすRyR2のドメイン連関障害を是正させる、ダントロレンによりCa2+漏出を抑制することで、心筋筋小胞体機能を改善し拡張期の心筋細胞内Ca2+濃度上昇を防ぐことで、致死性不整脈の誘発抑制を起こしうることが判明した。これらはわれわれが発見したリアノジン受容体を中心とした致死性不整脈誘発に関する新しい機序が、肥大型心筋症でみられる致死性不整脈誘発を抑制する治療法の可能性を示唆するものである。また、肥大型心筋症では、細胞内カルシウム濃度上昇が見られることは以前から報告されており、RyR2機能異常によるカルシウム動態異常と心肥大との関連も報告されていることから、心肥大の抑制にも関連しうる重要な所見であると思われる。本研究では、HCMにおいて致死性不整脈を生じる機序として、拡張期の心筋細胞内Ca2+濃度上昇に着目し、心筋筋小胞体(SR)Ca2+放出チャネルであるリアノジン受容体(RyR2)機能異常により生じるCa2+漏出の抑制による心筋筋小胞体機能の改善によって拡張期のCa2+濃度上昇を防ぐことで、致死性不整脈の誘発を抑制するという新しい治療戦略の開発を目指す。現有する、家族性肥大型心筋症でみられたトロポニンT点変異部位であるGlu160欠損のHCM型トランスジェニックマウス(TG)では、心エコーで加齢に伴い軽度の心肥大と拡張機能障害がみられた。TGの心筋細胞を用いてSRのCa2+放出能の評価のために、RyR2からの局所的なCa2+放出であるCa2+sparkを測定した。コントロール状態で既にコントロールマウスと比してCa2+sparkは増加しており、イソプロテレノール添加で著明に増加した。また、心筋のCa2+動態を反映するCa2+ transientではpeakからの下降脚が著明に延長していた。さらに、RyR2機能異常のメカニズムで大きな役割を果たすRyR2のドメイン連関障害を是正させる、ダントロレンを同マウスの心筋細胞に添加したところ、Ca2+sparkが抑制され、Ca2+ transientが改善した。以上の結果は、これまでカテコラミン誘発性心室頻拍モデル等で既に致死性不整脈を誘導する機序として報告されてきたRyR2機能異常により生じるCa2+漏出がHCMモデルマウスにおいても生じていること、RyR2機能異常の一因であるRyR2のドメイン連関障害を是正させることで、Ca2+漏出が抑制され、催不整脈性を是正しうる可能性を示唆している。研究計画に沿って実験計画、実行し、当初の計画通り、心臓の形態学的評価、心筋細胞におけるカルシウム放出能の評価を行い順調に進展している。また、RyR2機能を制御するドメイン連関の評価、RyR2機能を修飾するリン酸化などの評価、遅延型後脱分極の評価については現在進行中である。平成23年度に達成不十分であった項目について検討を行った上で、平成24年度の計画に基づいて研究を進展する。特に、HCM型マウスにおけるRyR2機能をはじめとしたカルシウム制御についてのメカニズムを詳細に評価する。また、HCM型マウスにRyR2安定化薬を投与し、催不整脈性の是正、肥大の抑制についてのメカニズムを含めた検討を行う予定である。実験設備は整っており、今後も遅滞なく研究が遂行可能である。上記の研究の推進方策にのっとって研究を進展、遂行させるために研究費を使用する。

平成23年度に購入予定であったが、バージョン等の兼ね合いで購入を見合わせた解析用コンピュータを購入予定である。これは、実験で得られるデータが大変膨大なデータ量であるために、データ保存、解析に必須である。また、RyR2機能を制御するドメイン連関の評価のための実験には、RyR2のアミノ酸配列の一部から新規に精製したペプチドの使用が不可欠であり、これはオーダーメイドであることから、非常に高価である。また、RyR2機能の修飾因子であるリン酸化などの評価のためのウェスタンブロティング、免疫染色等のための抗体、心筋細胞単離実験の試薬購入や、器具などの更新も必要であり、それらも高価であり、それらを中心に研究費を使用する。
低欠陥ドーピングと界面電荷移動プロセスを利用した新規可視光光触媒の開発

平成23年度は前年度に得られた高活性光触媒粉末材料の更なる高活性化を検討した。前年度の成果である酸化亜鉛光触媒に加え、酸化タングステンでも高度な可視光活性を発現する材料の開発に成功した。特に、酸化タングステンの表面に酸化チタンナノ粒子とアモルファス状酸化銅クラスターを担持することで高度な可視光活性が発現した。本研究で得られた光触媒は既往の研究で報告されている窒素ドープ型酸化チタンよりも高い可視光活性(量子効率)を示した。活性向上の機構として、様々な解析により酸化タングステンから酸化チタンへの正孔の移動に起因していることを明らかにした。また、平成23年度は、これらの高活性光触媒材料をベースに薄膜コーティングを検討した。特に、ガラス基材の上に白金助触媒、その上に酸化タングステン、更にその上に酸化チタン薄膜をコーティングした積層薄膜を開発し、白色蛍光灯の様な室内照明で自己浄化(セルフクリーニング機能)を発揮する画期的な部材を開発することができた。高度なセルフクリーニング機能を発現させるための因子として、積層薄膜の空孔率や酸素透過性が重要であることを見出した。この薄膜の全厚さは約100nm程度で、目視での透明性も高い。また、ゾルゲル法で成膜できるので、低コスト・大面積化が期待できる。開発した薄膜は高度なセルフクリーニング機能に加え、表面に酸化チタンをコーティングすることで、化学薬品への耐久性にも優れるといった副次的機能も発現した。セルフクリーニング機能以外にもVOC(揮発性有害化合物)の分解といった空気浄化機能も確認でき、光触媒の室内用途拡大が期待できる画期的な部材を開発することができた。異種半導体間での正孔の移動が重要であるという新しい知見をもとに、従来の材料では困難であった室内照明で自己浄化機能を発揮する光触媒部材を開発することができた。光触媒の室内応用への展開のため、国内の部材メーカーに対して営業活動をおこなう。平成22年度は不純物がドープされた酸化亜鉛(ZnO)を合成するための水熱反応条件の探索を始めることと同時に、評価方法として可視光(LED)照射による気相アセトアルデヒドの酸化分解活性を測定する方法も確立した。材料合成については、亜鉛イオンの出発原料の種類と濃度、ドーパントの種類と濃度、反応温度、反応時間、pH、界面活性剤の添加等、様々な水熱反応条件を検証した。ドーパントの種類として、マンガン(Mn)、ニッケル(Ni)、セリウム(Ce)、カドミウム(Cd)等を検討した。この結果、ZnOにカドミウム(Cd)をドープし種々の水熱反応条件を最適化することにより、伝導帯が狭窄し可視光を吸収できる粉末材料を合成することができた。更に、前記CdがドープされたZnOに対して多電子還元を誘起する助触媒を表面に固定化することを検討し、助触媒の種類、濃度、含浸時間、温度等の条件の最適化をおこなった。この結果、前記CdがドープされたZnOの表面に銅イオンを0.1%担持することで高度な可視光活性が発現した。本研究で得られた光触媒は既往の研究で報告されている窒素ドープ型酸化チタンや銅担持酸化チタンよりも高い可視光活性(量子効率)を示した。また、得られた光触媒粉末の光照射下での化学的安定性を評価した結果、中性の水中で1週間以上の光照射をしても性能が劣化しないことを確認した。更に、別のドーパントとしてセリウム(Ce)も有効であることを見出した。セリウムをドープしたZnOはカドミウムをドープしたZnOよりも光触媒性能は劣るものの、毒性はなく安全性も高い。今後、ドーパントとしてセリウムイオンに着目し、更に高い性能を発揮するための最適化を検討する。また、来年度以降、本年度の検討で得られた粉末材料をベースにコーティング化、薄膜化を検討する予定である。

セルフクリーニング機能以外にもVOC(揮発性有害化合物)の分解といった空気浄化機能も確認でき、光触媒の室内用途拡大が期待できる画期的な部材を開発することができた。異種半導体間での正孔の移動が重要であるという新しい知見をもとに、従来の材料では困難であった室内照明で自己浄化機能を発揮する光触媒部材を開発することができた。光触媒の室内応用への展開のため、国内の部材メーカーに対して営業活動をおこなう。
糖鎖の結合とその修飾

生体中での糖タンパク質中の糖鎖の役割を解明するため、糖鎖の結合とそのプロセシングについて、研究計画に基づき研究を行い、下記の成果を得た。1.高速液体クロマトグラフィーを用いた糖鎖蛍光微量分析法、およびNMRを応用し、ヒト補体【C_3】および、オオゴチョウトリプシンインヒビターの糖鎖構造を解明した。2.マウス由来のK46細胞の培養上清よりIa抗原を精製し、その性質を調べ、膜のIa抗原との比較研究を行った。3.網膜の光受容体細胞のレチノール結合蛋白質中に新しい型の、フコースを含む混成型糖鎖を見い出した。4,ラット肝細胞の細胞膜に存在するシアリダーゼについて検討した結果、基質特異性を異にする少なくとも2種類のシアリダーゼが存在することを明らかにした。一方は、おもにリソソーム膜に、他方は、おもに形質膜に局在していた。5.マウス初期胚とテラトカルシノーマ幹細胞のフコース含有糖タンパク質の二つの糖鎖構造(H構造,X構造)の発生過程における消長を、フコース結合レクチンを用いて消長を明らかにした。また、X構造と反応するモノクロナル抗体を作成した。6,ムコリピドーシス【II】と正常細胞のリソゾーム酵素の糖鎖構造を、レクチンカラムを利用して調べ、正常では大部分が高マンノース型糖鎖を有していたが、ムコリピドーシス【II】では、複合型であることを見つけた。7.ラット肝粗面小胞体および培養肝細胞より、マンナン結合タンパク質の内在性リガンドを同定し、マンナン結合タンパク質が、糖タンパク質の生合成中間体の細胞内輸送に関与していることを支持するデータを得た。
超短時間麻酔薬曝露モデルにおける幼若ラットの認知記憶障害の検討

7日齢のSprague-Dawleyラットを用いて、超短時間吸入麻酔薬曝露モデルを作成した。臨床に則した形にするため、実際に小児の麻酔導入(吸入麻酔薬による緩徐導入)で使用されている,笑気、酸素、セボフルラン(GOS)もしくは空気、酸素、セボフルラン(AOS)の5分曝露、および比較対照群として笑気、酸素(GO)さらに空気、酸素(AO)の5分曝露,の計4群のモデルを作成した。ラットは無作為にいづれかの群に振り分けられ,麻酔後3,4,5,6,7週の各週、各群ラットにおいて,海馬CA1における細胞外シナプス電位の測定を行い,長期増強を検証した.残念ながら期間内に明らかな結果を得ることはできなかった.まず、7日齢のSprague-Dawleyラットを用いて、超短時間吸入麻酔薬曝露モデルの作成を開始した。研究実施計画では1.3MAC相当のイソフルラン、セボフルラン、デスフルランを用いて行う予定であったが、より臨床に則した形にするため、実際に小児の麻酔導入で使用されている笑気、酸素、セボフルラン(GOS)もしくは空気、酸素、セボフルラン(AOS)の5分曝露、および比較対照群として笑気、酸素(GO)さらに空気、酸素(AO)の5分曝露の計4群のモデルを作成した。いずれも臨床に合わせ、笑気および空気は4L/分、酸素は2 L/分で使用した。セボフルランに関しては、様々な濃度で麻酔後に血液ガス分析を施行し、ラットの呼吸抑制を認めず、二酸化炭素が貯留することのない上限濃度を調べた。その結果セボフルラン濃度はそれぞれGOS群で2.5%、AOS群で5.0%に決定した。麻酔は自作プラスチック製麻酔チャンバーを用いた半閉鎖式低麻酔・酸素回路・気化器で行い、カプノグラムで排気中の酸素、二酸化炭素、および吸入麻酔薬濃度を測定した。当初、平成26年度に行動学的検討を行う予定であったが、ラットの犠牲数を考慮し、先に平成27年度に実施予定であった電気生理学的検討から開始した。麻酔後3,4,5,6,7週の各週、各群ラットにおいて多点皿電極を用いた海馬における細胞外シナプス電位の測定を、研究実施計画通りに実施中である。平成26年度に確立した、7日齢のSprague-Dawleyラットによる、(1)笑気、酸素、セボフルラン(GOS)および(2)空気、酸素、セボフルラン(AOS)の5分曝露、および比較対照群としての(3)笑気、酸素(GO)さらに(4)空気、酸素(AO)の5分曝露の計4群のモデルをまず作成した。(1)から(4)群の判別がつかなくなる事態を防ぐため、麻酔後に耳に小穴を開けて区別することとした。3週齢で母ラットより離し、(1)から(4)群に、かつそれぞれの群を雌雄に分け、麻酔後3, 4, 5, 6, 7週の各週、各群のラットで、電気生理学的検討を施行した。具体的には、イソフルランで鎮静後に断頭し、海馬を含む厚さ300μmの脳スライスを作成した。そのスライスを多点皿電極の上に静置し、人工脊髄液を灌流しながら電気刺激を与え、海馬CA1領域でもっとも刺激が得られる場所を探索し、記録を開始。Paired pulse刺激による興奮性シナプス集合電位(fEPSP)が安定していることを確認した後、テタヌス刺激によりシナプス電位の長期増強を誘発し、fEPSPのamplitudeおよびslopeを40分間記録した。平成27年度各週、各群のラットおよそ3匹、計60匹施行した。安定したデータを収集するためには各群8-10匹ずつ必要であるため、引き続き施行予定である。麻酔後3, 4, 5, 6, 7週の各週、各群のラットで、電気生理学的検討を施行しているが、安定したデータを収集するためには各群8-10匹ずつ、多く見積もって計200匹行う必要がある。7日齢で麻酔後に亡くなってしまうラットが各群数匹ずついることに加え、1日行う数として3匹が限度のため、地道に進めていくほかないため、達成度は遅くなってしまう。平成26年度に確立した、7日齢のSprague-Dawleyラットに(1)笑気、酸素、セボフルラン(GOS)を5分曝露する群、(2)空気、酸素、セボフルラン(AOS)を5分曝露する群、および比較対照群として(3)笑気、酸素(GO)を5分曝露する群、そして(4)空気、酸素(AO)を5分曝露する群の計4群のモデルを、引き続き作成し、麻酔後3、4、5、6、7週の各週、各群のラットで、検証実験を施行した。平成27年度までは、3週齢で母ラットと分離する際にそれぞれの群で雌雄に分けていたが、雌雄では麻酔の影響が異なることが想定される(ヒトでは男女で麻酔からの回復の質が異なることが臨床研究で示されている)。このため雌雄で分けて解析するとなると、必要なラット数も、行わなくてはならない実験も倍以上に増えてしまう可能性が高いため、ひとまず仔ラットを雄に指定して購入するというように変更した。電気生理学的検証は昨年度に引き続き施行中である。

しかし、これには4群×5週分×有効なデータを得るための匹数、少なくとも15匹が必要であるため、現実として300匹以上を行わなければならず、未だ施行中である。行動学的検証を同時に行う場合、4群×5週分×有効なデータを得るための匹数、およそ20匹、結果総400匹必要となってしまうため、やはり電気生理学的検討を先に進め、有意差を認めた群もしくは週数で行動学的さらには生化学的検討を行うことが最善と考え、緩徐ではあるが進行中である。各群のラットで、麻酔後3、4、5、6、7週の各週、電気生理学的検討を施行しているが、上述したように4群×5週分×有効なデータを得るための匹数、少なくとも15匹が必要であるため、現実として300匹以上を行う必要がある。7日齢で麻酔後、14日齢までの間に亡くなってしまうラットが数匹ずついることに加え、電気生理学的検討の1日行える数として3匹が限度のため、地道に進めていくほかないため、達成度は遅れている。2014年度に確率した、7日齢のSprague-Dawleyラットに(1)笑気、酸素、セボフルラン(GOS)を5分曝露する群、(2)空気、酸素、セボフルラン(AOS)を5分曝露する群、および比較対照群として(3)笑気、酸素(GO)を5分曝露する群、そして(4)空気、酸素(AO)を5分曝露する群の計4群のモデルを、引き続き作成し、麻酔後3、4、5、6、7週の各週、各群のラットで、電気生理学的検証実験を施行した。2016年度前半までは、3週齢で母ラットと分離する際にそれぞれの群で雌雄に分けていた。しかし、ヒトでは男女で麻酔からの回復の質が異なることが臨床研究で示されているため、雌雄では麻酔の影響が異なることが想定された。雌雄で分けて解析するとなると、必要なラット数も、行わなくてはならない実験も、倍以上に増えてしまうことが容易に予想され、2016年度後半より、仔ラットを雄に指定して購入するというように変更し,2017年度もこれを継続し実験を行った。電気生理学的検証実験は引き続き施行したが、上述した4群(GOS, AOS, GO, AO)×5週分(麻酔後3、4、5、6、7週)×有効なデータを得るための匹数少なくとも15匹、すなわち計300匹以上を行わなければならず、これを施行できる人員が限られていたため,残念ながら解析可能な数を施行することは困難であった。このため、この期間で明らかな研究結果を示すことは不可能となってしまった。7日齢のSprague-Dawleyラットを用いて、超短時間吸入麻酔薬曝露モデルを作成した。臨床に則した形にするため、実際に小児の麻酔導入(吸入麻酔薬による緩徐導入)で使用されている,笑気、酸素、セボフルラン(GOS)もしくは空気、酸素、セボフルラン(AOS)の5分曝露、および比較対照群として笑気、酸素(GO)さらに空気、酸素(AO)の5分曝露,の計4群のモデルを作成した。ラットは無作為にいづれかの群に振り分けられ,麻酔後3,4,5,6,7週の各週、各群ラットにおいて,海馬CA1における細胞外シナプス電位の測定を行い,長期増強を検証した.残念ながら期間内に明らかな結果を得ることはできなかった.電気生理学的検討は今年度中に終える予定であったが、一グループにつき最大8週の時間を要するため、当初効率良く計画、実験することが難しく、やや時間がかかった。なるべく速やかに電気生理学的検証を終え、麻酔から何週後にもっとも記憶学習能の影響が出るかということを評価した上で、そのもっとも影響が出る週において行動学的検討、さらには生化学的検討を行っていく。なるべく速やかに電気生理学的検証を終え、どの群で、麻酔から何週後にもっとも記憶学習能の影響が出るかということを評価した上で、行動学的検討、さらには生化学的検討を行っていく。麻酔科学麻酔から何週後にもっとも記憶学習能の影響が出るか、電気生理学的検証を行った後、そのもっとも影響が出る週において研究実施計画に記載した手順で行動学的検討、さらには生化学的検討を行っていく。
スフェロイド培養法を応用した口腔がんリンパ節転移機序の解明

平成23年度は、(1)使用する癌細胞の性状解析および(2)癌細胞における三次元培養(スフェロイド培養法)の確立を中心に行った。細胞下株はヒト口腔、肺、皮膚および子宮の扁平上皮癌細胞とハウス肺の扁平上皮癌細胞およびメラノーマ細胞のがん細胞グループと、非がん細胞のコントロール・グループとして、マウス3T3細胞を使用した。(1)がん細胞の性状解析:がん細胞性状解析には、各種抗体によるIF (immunofluorescence)法により検討を行った。全ての扁平上皮癌細胞は、cytokeratinを発現し、Ki-67発現性から高い増殖活性を有していることが分かった。また、細胞間の結合に関しては、E-cadherinが関与していることが明らかとなった。(2)スフェロイド培養法の確立:スフェロイド培養法は、Hanging-drop法とLow-binding plateを用いて癌細胞のスフェロイド化を検討した。両方法ともに、癌細胞では明瞭な球状体(スフェロイド)の形成を認めた。また、applyする細胞数に依存してスフェロイド体の容積が増大した。また、スフェロイド体のIF法の結果、E-cadherin発現を認めた。さらに、スフェロイド培養の培地内にE-cadherin抗体を添加すると、スフェロイド体の形成が抑制された。以上の結果から、平成23年度は、1)扁平上皮癌細胞はスフェロイド化が可能である、2)スフェロイド体は癌細胞の性状を維持している、3)スフェロイド体の形成には、細胞結合に関与するE-cadherin分子が関与する、ということが示唆された。