hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表面磁性研究のためのナノメートルスケールスピン偏極走査電子顕微鏡の開発

安定して2次電子を取り込めるようになったら、モット検出器への2次電子の引き込みにチャレンジする。本年度は2次電子の検出実験と、モット検出器への引き込みのための探針部改造を行った。1.2次電子の検出実験昨年度、電界放射部の設計・製作、電界放射モードでの動作をおこなった。これを基に、本年度は2次電子の検出実験を行った。いきなりモット検出器で2次電子を引き込むことは困難が予想されたので、2次電子の総量を効率よく検出できる2次電子検出部を設計・製作した。これを用いて、電界放射モードにおける2次電子の検出を試みた。その結果、蛍光スクリーン付きのマルチチャンネルプレートを用いることにより、2次電子のパターンを観察することができた。2次電子パターンは探針-試料間の電界放射電流と同期して輝度が変化し、引き込み電極の電圧を加えなければ検出されず、レンズ電極の電位により形状が変化した。このことから、探針から電界放射した電子が試料表面で散乱したり、試料表面の電子を叩き出したりし、その2次電子が検出できたことを確認することができた。これにより、本研究手法の開発が可能であることを実証することができた。2.探針部の改造モット検出器への2次電子の引き込みのためには、試料表面垂直方向に探針制御部などが影を作らない構造に改造する必要がある。そこで、試料の横から探針をのばす構造に改良を行った。現在までに、この探針部を用いて、トンネル状態での表面観察と電界放射モードでの動作が可能であることを確認できた。さらに、2次電子検出部により、2次電子の検出実験を進めている。安定して2次電子の検出ができるようになったら、最後のステージであるモット検出器への2次電子引き込み実験へと進む予定である。昨年度までの研究により、探針先端から電界放出した電子による散乱電子を検出可能であることを示すことが出来た。しかし、試料表面平行方向へ散乱電子を引き出して検出していたため、対称性が悪化し、モット検出器による測定に不向きであった。そこで、本年度は試料表面垂直方向へ散乱電子を引きこむことができるように装置の改良を行った。改良の内容は以下の通りである。1.探針位置制御用のピエゾ素子を横に移動し、探針を横から延ばして直角に折り曲げて試料表面にアプローチする方式とした。この際、探針の表面平行方向の動作を確保するために8分割円筒ピエゾ素子を用いた。2.表面垂直方向に対称性良く、効率的に散乱電子を引き出すために、探針シールドを取り付けた。探針シールドは細い筒状の絶縁管でできており、外側に銀ペーストを被覆してある。この銀ペーストの被覆に配線を取り付け、電位を印加できるようにした。改良の結果、回折ビームによると思われる散乱パターンの検出に成功した。(0 0)回折ビームは探針シールド電圧の上昇と共に、真空側へと引き出されていく様子が観察できた。(1 0)回折ビームは探針シールド無しでは検出できなかったビームで、探針シールドにより散乱電子の検出効率が向上したことを示すことが出来た。これにより、試料表面垂直方向へ散乱電子を引きこみ、モット検出器でスピン偏極度を測定する目途が立った。
サケ科魚類スモルト化の生化学的研究

降海性サケ科魚類の多く孵化後一定期間河川生活を送った後、形態的には体型の変化に伴い体色が銀白色を呈し、スモルトになり降海する。この銀毛変態現象は形態学的、また生理学的には多くの変化を伴うことが知られている。銀白化は実際には甲状腺ホルモンの関与のもとに、表皮へのグアニン塩基の蓄積によるものであるが、このグアニンの由来、運搬経路については明らかではない。本研究ではグアニンが肝臓で生成され、血液を介して表紙へ運ばれると考え、スモルト化を物質レベルで定量化することを目的として行った。サクラマス1年魚を用い、銀毛前、銀毛時及び銀毛後の血清を採取した。2次元SDS-PAGE並びに家兎抗サクラマス銀毛血清を用いたWestern blotting法での結果、銀毛前後の血清のパターンに差異を見いだした。即ち、銀毛前の血清には全く観察されない蛋白が、銀毛時及び銀毛後の血清に見られた。この蛋白は等電点5.0-5.5、分子量43,000-50,000で銀毛魚に特異的な蛋白である可能性が示唆された。一方、肝臓におけるプリンヌクレオシドホスホオリラーゼ(PNPase)の活性に関しては、雌雄ともに同調的にスモルト化するスチールヘッドマス2才魚を用いて2-7月にわって15点のサンプリングを行った。PNPaseの活性測定法はイノシンを基質として、キサンチンオキシダーゼとのカップルアッセイにより、生ずる尿酸を定量化する方法を選定した。肝のPNPase活性は、2月下旬(パ-)から徐々に上昇し、4月下旬で最高となるが、外見的により銀白化があらわれる5月には、この活性は低下し、脱鱗が目立つ下旬には、再度上昇した後、徐々に定常状態に達した。今回、銀毛変態に伴う特異的な血清蛋白の出現を見いだし、また、肝のPNPaseの活性変化を観察したが、今後これらの蛋白及び酵素の関連、さらに皮膚のグアニン量との関連性を追求して行きたいと考えている。降海性サケ科魚類の多くは孵化後一定期間河川生活を送った後、形態的には体型の変化に伴い体色が銀白色を呈し、スモルトになり降海する。このスモルトは生理的には海水適応能の発達を含む複雑な現象であり、これまで多くの研究がある。しかし、体色の銀白化を起こした魚のみが海水適応能を獲得するのにかかわらず、これら両者の関係は全く不明である。グアニンが肝臓で生成され、血液を介して表皮へ運ばれると考え、スモルト化を物質レベルで定量化することを目的として研究を行った。サクラマス1年魚を用い、パ-およびスモルトの血清を採取し、それぞれの血清に対する家兎抗血清を作製した。これらの抗血清を用いた寒天内2次元電気泳動法の結果からα-グロブリン位に移動する血清淡白がスモルトに観察された。さらにラジオアイソト-プ標識したグアニンの結合性を指標として、グアニン結合蛋白の検索を上記抗血清を用い、免疫電気泳動のオ-トラジオグラフィ-を行ったところ、少なくとも4成分のグアニン結合蛋白が観察された。

一方、肝臓におけるプリンヌクレオシドホスホオリラ-ゼの活性に関してはサクラマス1年魚に加えて、雌雄ともに、しかも、同調的にスモルト化するスチ-ルヘッドマス1年魚を2-7月にわたって15点のサンプリングを行った。また、プリンヌクレオシドホスホリラ-ゼの活性測定法3種の比較検討を行い、イノシンを基質として、キサンチンオキシダ-ゼとのカップルアッセイにより、生ずる尿酸を定量化する方法を選定した。また、アイソザイム検討において、従来行われてきたスタ-チゲル法を改め、ポリアクリルアミド電気泳動法を確立した。降海性サケ科魚類の多くは孵化後一定期間河川生活を送った後、形態的には体型の変化に伴い体色が銀白色を呈し、スモルトになり降海する。この銀毛変態現象は形態学的、また生理学的には多くの変化を伴うことが知られている。銀白化は実際には甲状腺ホルモンの関与のもとに、表皮へのグアニン塩基の蓄積によるものであるが、このグアニンの由来、運搬経路については明らかではない。本研究ではグアニンが肝臓で生成され、血液を介して表皮へ運ばれると考え、スモルト化を物質レベルで定量化することを目的として行った。サクラマス1年魚を用い、銀毛前、銀毛時及び銀毛後の血清を採取した。2次元SDSーPAGE並びに家兎抗サクラマス銀毛血清を用いたWestern blotting法での結果、銀毛前後の血清のパタ-ンに差異を見いだした。即ち、銀毛前の血清には全く観察されない蛋白が、銀毛時及び銀毛後の血清に見られた。この蛋白は等電点5.0ー5.5,分子量43,000ー50,000で銀毛魚に特異的な蛋白である可能性が示唆された。一方、肝臓におけるプリンヌクレオシドホスホオリラ-ゼ(PNPase)の活性に関しては、雌雄ともに同調的にスモルト化するスチ-ルヘッドマス2才魚を用いて2ー7月にわって15点のサンプリングを行った。PNPaseの活性測定法はイノシンを基質として、キサンチンオキシダ-ゼとのカップルアッセイにより、生ずる尿酸を定量化する方法を選定した。肝のPNPase活性は、2月下旬(パ-)から徐々に上昇し、4月下旬で最高となるが、外見的により銀白化があらわれる5月には、この活性は低下し、脱鱗が目立つ下旬には、再度上昇した後、徐々に定常状態に達した。今回、銀毛変態に伴う特異的な血清蛋白の出現を見いだし、また、肝のPNPaseの活性変化を観察したが、今後これらの蛋白及び酵素の関連、さらに皮膚のグアニン量との関連性を追求して行きたいと考えている。
核融合炉システム用トリチウム低吸着・低溶解材料の探索

トリチウムガスに曝されても吸着・吸収による汚染が起こり難い材料の探索を目途として、銅基合金材料表面への吸着及び内部への溶解挙動を調べた。表面層にトリチウム高濃度領域が存在したが、内部は表面層に比べ1/1000以下の濃度であり、ステンレス鋼に対する溶解度の約1/300であった。この際の溶解熱は17kJ/molとなり、純Cuに対する報告値の約1/3に低下した。即ち、本合金が有望な候補材になり得る事が知られた。核融合炉では大量のトリチウム及び重水素が燃料として使用されるが、これらは何れも常温で気体であり散逸性が高く、広い酸素濃度範囲で僅かな火源により爆発的燃焼を起こす。この様な性質に加えて、トリチウムはβ線を放出するという特異性があり、天然には殆ど存在しないため、安全閉じ込めと同時に燃料として有効利用するための技術的検討が必要不可欠である。核融合炉内への燃料供給はトリチウムプラントが担うが、プラントから炉内に供給されたトリチウムは回収-精製-分離-貯蔵過程を経て再び供給プロセスに戻される。即ち、核融合炉の運転と同時に炉内及びプラントの燃料配管内をトリチウムが循環する。従って、トリチウムは各種の金属及び非金属材料の表面と接触し、それぞれの材料表面の物理的・化学的性質に応じた吸着・溶解現象によって利用不可能な状態になる。従って、トリチウムの吸着量・溶解量を根本的に低減し、トリチウムプラント等で実際的に使用可能な材料の開発指針の構築を目途とし、本研究では試験材料表面の物理的・化学的状態及び組成分析と共にトリチウムの吸着量・溶解量の測定データの蓄積・評価を行った。試験材料としてはCu・Be合金を評価対象として選定し、購入材料を所定のサイズに切断したのち、0.1μm以下の表面粗さにまで研磨して所定条件の下でトリチウムガスに曝露した。この様に処理された材料内に溶解したトリチウム量及び分布状況を調べた。その結果、表面から0.2μmまでの表面層はトリチウム濃度が内部の約1000倍以上となっているにも拘らず、内部はほぼ均一な濃度となっていた。また、この際の濃度はステンレス系材料と比較すると約200倍以上低いことが知られ、本材料がトリチウムの低溶解材料として有望であることが知られた。本研究の目的は、トリチウムの吸着量・溶解量を根本的に低減し、トリチウムプラント等で実際的に使用可能な材料の開発指針を構築することを目途とし、試験材料表面の物理的・化学的状態及び組成の分析と共にトリチウムの吸着量・溶解量の測定データの蓄積・評価を行い、トリチウムの低吸着・低溶解材料の探索・開発である。この様な目的の下で、銅基合金試料にトリチウムガスを曝露し、材料表面への吸着及び内部への溶解挙動を調べた。この際、トリチウムガスの曝露条件として圧力及び温度をパラメーターとして変化させ、それぞれの依存性を評価した。573K以上の温度でCu-Be合金をトリチウムガスに曝露した場合、SS316L材と同程度のトリチウム濃縮が表面層に観測され、内部との濃度差は1000倍以上に達し、このトリチウム濃縮層の厚みは表面から1μm程度以下であると推定された。なお、この表面層に保持されたトリチウムは水分との接触によって20%程度まで除去できるが、完全な除去は困難であることが判明した。一方、Cu-Be合金内部のトリチウム濃度は深さに関係なくほぼ一定になっており、曝露温度が高くなると濃度も高くなり、トリチウムの溶解が吸熱的であることが知られた。なお、溶解量の温度依存性は純銅における水素の溶解度の温度依存性に良く一致した。即ち、トリチウムの溶解度はSS316L材に比べ約1/300程度であり、トリチウムインベントリーの大幅な低減を図り得ることが知られた。上記目的を達成するために、今後は表面層のトリチウム濃縮を低減するための対策を検討することが重要であると結論した。本研究の目的はトリチウムの吸着量・溶解量を根本的に低減し、トリチウムプラント等で実際的に使用可能な材料の開発指針を構築することを目途とし、試験材料表面の物理的・化学的状態及び組成の分析と共にトリチウムの吸着量・溶解量の測定データの蓄積・評価を行い、トリチウムの低吸着・低溶解材料の探索・開発である。合金内部のトリチウム濃度は、曝露条件に関係なく表面層に高濃度領域が存在し、内部は均一濃度分布であった。曝露温度や時間にも依存するが、内部は表面層に比べ1/1000以下の濃度であった。

また、トリチウム取り扱い装置等に使用されているステンレス鋼に比べると溶解濃度は約1/300の低さであり、本合金が非常に有望な材料である事が知られた。なお、曝露条件として温度一定でトリチウムガスの圧力を変化させた場合、溶解濃度は圧力の1/2次に比例し、トリチウムガスが合金表面で分子状態から原子状態に解離して合金内部に溶解するSieverts則に従う事が明らかとなった。曝露温度依存性よりSieverts定数を温度の逆数に対してプロットすると両者の間に直線関係が得られ、この直線の傾きより溶解熱が求められた。求められた溶解熱は17kJ/molとなり、純Cuに対して報告されている溶解熱の約1/3となった。Beとの合金化に伴う溶解熱の低下は、Beとの合金化による結晶構造の変化は起こっておらず、格子定数が純Cuよりも1.1%減少していたことを考慮すると、トリチウム原子の溶解可能な体積が減少したことによる構造的な因子の影響と考えられる。
肝糖代謝の新規調節メカニズムに基づいた創薬基盤の開発

1.肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスにおける糖・脂質代謝の表現型解析高脂肪食給餌下LTgマウスおよび野生型マウスの体重、血糖値、血清脂質を経時的に測定し、耐糖能・糖新生の評価のためブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、ピルビン酸負荷試験を施行した結果、LTgマウスで耐糖能およびインスリン抵抗性の改善、脂肪肝の軽減、血清LDL-コレステロール値の低下していることを確認した。2.肝プロスタシンの新規標的蛋白の同定高脂肪食給餌下LTgマウスおよび野生型マウスの肝臓からそれぞれRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを行い、糖尿病発症抑制に関わる新たな標的因子を検索した。その結果、肝臓内で脂肪滴の形成に関わるCIDE-A(Cell death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector)と、脂肪酸の取り込みを担う膜蛋白であるCD36(cluster of differentiation 36)がLTgマウスの肝細胞において低下していることが明らかとなった。プロスタシンの分子特性より、肝臓において膜蛋白に直接関与している可能性が高いためCD36に着目した。LTgマウス、野生型マウスのそれぞれの肝細胞から膜分画を抽出し、Westen blottingでCD36のタンパク発現量を比較したところ、LTgマウスで有意に低下していることが確認できた。さらに、ヒト肝細胞モデルであるHepG2にプロスタシンとCD36を遺伝子導入により過剰発現し解析したところ、HepG2の膜分画でCD36の発現が低下しており、プロスタシンが直接あるいは間接的に標的蛋白を切断することによりCD36の発現を低下させることが示唆された。肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスを用いた検討1)高脂肪食負荷による耐糖能評価:7週齢の雄マウスに高脂肪食を与え、野生型マウスと耐糖能を比較した。マウスの個体数を増やし比較したところ、LTgマウスで明らかな耐糖能改善傾向を認めた。腹腔内ブドウ糖負荷試験、ピルビン酸負荷試験、インスリン負荷試験でもLTgマウスでの耐糖能の改善が確認できた。その結果からインスリン分泌能(HOMA-β)とインスリン抵抗性(HOMA-IR)を評価したところ、LTgマウスではインスリン抵抗性が低下していた。2)肝組織切片の検討:高脂肪食飼育をしたLTgマウスの肝臓から肝組織切片を作製し野生型マウスと比較した。その結果、LTgマウスの肝臓では脂肪肝の発症が抑制されていた。また、両群のマウスの肝臓内中性脂肪量を測定したところ、LTgマウスで肝臓内中性脂肪量が有意に減少していることが確認された。3)インスリンシグナル伝達の検討:絶食条件下で下大静脈から速効型インスリンを静注し、5分後に採取した肝臓を使用し、インスリンシグナル下流にあるpAktの増減をウエスタンブロットで確認したところ、LTgマウスでpAktの増加傾向を認めた。4) DNAマイクロアレイによる新規標的因子の検索:高脂肪食飼育をしたLTgマウス、野生型マウスの肝臓からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを行い、糖尿病発症抑制に関わる新たな標的因子を検索した。その結果、LTgマウスでは脂肪肝に関わる遺伝子群が有意に低下していた。このDNAマイクロアレイの結果は肝組織切片の観察結果と一致しており、脂肪肝発症抑制が耐糖能改善と関連している可能性が示唆された。当初予定していた肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスを用いた検討を順調に行えている。実験結果から脂肪肝の発症に差があることが新たにわかったため、その点について検討する時間を追加で要した。肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスを用いて高脂肪食負荷を行ったところ、LTgマウスでは野生型(WT)マウスに比べ糖尿病発症が抑制されることに加え、脂肪肝の発症も抑制されていた。DNAマイクロアレイでも脂質代謝に関わる遺伝子の発現がLTgマウスで有意に低下していた。血清プロファイルではLTgマウスでLDL-Cが低値であり、プロスタシンが肝臓へのLDL-C取込みを制御している可能性が疑われた。LTgマウスの肝臓の膜蛋白を抽出しWesternblottingでLDL受容体を定量したところ、WTマウスに比較し、LTgマウスで有意にLDL受容体の発現が低下していた。さらに、ヒト肝癌由来細胞株であるHepG2にプロスタシンを過剰発現させて脂質の取り込みを確認したところ、コントロール群に比べ、脂質の細胞内への取り込みが抑制されていた。また、新たに判明したこととしては、LTgマウスでは肝臓に過剰発現するプロスタシンに由来すると考えられる血中プロスタシン濃度が上昇しており、脂肪組織炎症が改善していた。これは肝細胞に発現するプロスタシンが血中に遊離して肝臓以外の臓器にも作用する可能性を示している。肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスの高脂肪食負荷の実験で、当初予想していなかった脂肪肝の発症の抑制が認められた。この脂肪肝の発症抑制が、糖代謝改善に寄与している可能性が疑われるため、プロスタシンによる脂肪肝の発症抑制の具体的な機序解明に研究時間を割いている。そのため、当初予定していた肝臓のプロスタシン活性化に関する検討がまだ行えていない状況である。1.肝臓特異的プロスタシン過剰発現(LTg)マウスにおける糖・脂質代謝の表現型解析高脂肪

食給餌下LTgマウスおよび野生型マウスの体重、血糖値、血清脂質を経時的に測定し、耐糖能・糖新生の評価のためブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、ピルビン酸負荷試験を施行した結果、LTgマウスで耐糖能およびインスリン抵抗性の改善、脂肪肝の軽減、血清LDL-コレステロール値の低下していることを確認した。2.肝プロスタシンの新規標的蛋白の同定高脂肪食給餌下LTgマウスおよび野生型マウスの肝臓からそれぞれRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを行い、糖尿病発症抑制に関わる新たな標的因子を検索した。その結果、肝臓内で脂肪滴の形成に関わるCIDE-A(Cell death-inducing DNA fragmentation factor-α-like effector)と、脂肪酸の取り込みを担う膜蛋白であるCD36(cluster of differentiation 36)がLTgマウスの肝細胞において低下していることが明らかとなった。プロスタシンの分子特性より、肝臓において膜蛋白に直接関与している可能性が高いためCD36に着目した。LTgマウス、野生型マウスのそれぞれの肝細胞から膜分画を抽出し、Westen blottingでCD36のタンパク発現量を比較したところ、LTgマウスで有意に低下していることが確認できた。さらに、ヒト肝細胞モデルであるHepG2にプロスタシンとCD36を遺伝子導入により過剰発現し解析したところ、HepG2の膜分画でCD36の発現が低下しており、プロスタシンが直接あるいは間接的に標的蛋白を切断することによりCD36の発現を低下させることが示唆された。本年度の実験結果から脂肪肝の発症の差に焦点を当てて実験を進める予定である。具体的には肝臓培養細胞であるHepG2にプロスタシンを過剰発現させ、脂肪肝に関わる遺伝子群、蛋白レベルの変化を確認する。プロスタシンが細胞膜に存在する蛋白に直接作用しているかも検討する。また、ヒトの糖尿病患者、脂肪肝患者の血清を用いて血中プロスタシン濃度を測定する。測定用キットとしてHuman Prostasin ELISA Kit (RayBiotech)を使用する。糖尿病に関しては劇症1型糖尿病、急性発症1型糖尿病、緩徐進行1型糖尿病、2型糖尿病の各病型別の患者血清も用いて測定する。さらに、各患者のインスリン分泌能、インスリン抵抗性などのデータと血中プロスタシン濃度を比較し、プロスタシンが糖尿病の病態にどのように関連しているかも検討する。これまでの研究結果から、肝臓の脂質取り込みに関連する膜蛋白にプロスタシンが作用し、脂肪肝とインスリン抵抗性が改善している可能性を考えている。LTgマウス由来初代培養肝細胞における種々の脂質トランスポーターとその関連分子の蛋白発現を検討し、肝細胞におけるプロスタシンの新規標的蛋白を絞り込む。プロスタシンによる切断予測部位の変異体を作成し、組換えプロスタシンとのin vitroの反応系により作用部位の同定を試みる。また、候補的アプローチの進捗が思わしくない場合のため、SILAC法による網羅的探索を並行して実施する。さらに、血中プロスタシンの肝外臓器への作用機構の解明と糖・脂質代謝異常への治療的応用を考えている。
行動抑制の学習機機構の研究

対称性強化のゴー・ノーゴー課題(遅延0-10秒)を学習させた、3頭のアカゲのコザル(ゴロウ、ユースケとサクラ、0-2才)に、課題遂行中に、ブロードマンの8野にアルファー2アドレノセプターのアゴンタゴニストであるヨヒンビンの微量を直接注入した。すると、5-60分の間、ゴー・ノーゴー課題の成績が悪くなり、課題遂行の時間が延長した。それだけでなく、宙返り跳び、時計回りまたは逆時計回りの歩行等の多動(hyperactivity)が誘発された。課題の成績は、ゴー試行もノーゴー試行もどちらも間違えるようになった(オミッションエラーとコミッションエラーの増大)。多動は、サルが手掛かり刺激をみて、反応するしないを憶えて反応を起す直前(遅延時間)に特に多くなった。課題成績の低下と多動は、同時に見られ、注入するアヒンビンの量によって分離することが出来なかった。これらの効果は、ノルアドレナリンが8野ニューロンに起している持続的抑制作用がヨヒンビンによって脱抑制されたために起こったものと考えられる。従来、多動がサルの前頭葉の破壊で誘発されることが知られていたが、ヨヒンビンによって誘発されたことは、前頭葉の抑制機能の脱落によって多動が起こること示したことになる。誘発された行動は小児の注意欠陥性多動異常(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)に似ているので、ヨヒンビンによってサルのADHDが誘発されたと考える。
DNAヘリカーゼRECQL5の組換え抑制における分子機構の解明

DNA損傷を正確に修復する系が相同組換え(Homologous recombination ; HR)であり、HR関連遺伝子における変異は細胞のがん化を促進する原因となり得る。HR関連遺伝子の一種としてRecQヘリカーゼファミリーがあり、高等真核生物では5つのRecQが存在する。このうちの1つであるRECQL5/Recq15を欠損したノックアウトマウスが高発がん性を示すことから、がん抑制因子としてゲノムの安定性維持に寄与することが示唆されていた。また生化学的解析により、RecQL5が組換えの必須因子であるRad51と結合することが示されているものの、その詳細な分子機能は不明のままであった。本研究において、RecQL5のがん抑制因子としての機能とHR機構との関連を細胞レベルで検討し、組換えの制御や正確性にどのように寄与しているか解明することを目指した。平成24年度までに、RECQL5遺伝子破壊細胞はシスプラチンなどのDNA鎖間クロスリンク(interstrand crosslink ; ICL)損傷を誘導する薬剤に特異的な高感受性を示すこと、RecQL5が細胞内で機能するにはRad51との結合が重要であること、および遺伝学的解析によりRecQL5はHR因子BRCA2と同経路において機能する可能性を示すことができた。本年度は、「RecQL5が細胞内で組換えの正確性を制御するかどうか」を明らかにすることに焦点をおいた。実験系として用いたDT40細胞はニワトリBリンパ球由来細胞であり、抗体の多様性を生み出すために免疫グロブリンをコードする領域において恒常的な組換えが起こっている。この性質を利用してRECQL5遺伝子破壊細胞における組換えの正確性を評価したところ、薬剤無処理の条件下では野生株と比較して差は見られなかったものの、シスプラチン処理時には組換えで使用される鋳型の多様化が観察された。すなわち、組換え頻度の上昇だけでなく正確性の低下が引き起こされた。以上の結果は、RecQL5がICL損傷誘導性のHRにおいて、組換えの量と質を適切に制御し、効率の良いDNA修復を保証する機能を持つことを示している。この発見は、RecQL5が発がんを抑制するメカニズムを考察する上で重要な知見となり得る。研究成果は原著論文としてまとめ、学術雑誌にて発表した。(抄録なし)DNA損傷を正確に修復する系が相同組換え(Homologous recombination;HR)であり、HR関連遺伝子における変異は細胞のがん化を促進する原因となり得る。このうちの1つであるRECQL5を欠損したノックアウトマウスが高発がん性を示すことから、がん抑制因子としてゲノムの安定性維持に寄与することが示唆されていた。また生化学的解析により、RECQL5が組換えの必須因子であるRAD51と結合することが示されているものの、その詳細な分子機能は不明のままであった。本研究において、RECQL5のがん抑制因子としての機能とHR機構との関連を細胞レベルで検討し、組換えの制御や正確性にどのように寄与しているか解明することを目指した。本年度は、(1)RECQL5の組換えを抑制する機能と、各因子との相互作用に関連があるか解析する、(2)遺伝子破壊細胞を用いた遺伝学的解析により、DNA架橋傷害の修復経路におけるRECQL5の作用点を明らかにする、という2点に焦点をおいて研究を実施した。申請者のこれまでの研究により、RECQL5遺伝子破壊細胞はシスプラチンなどのDNA鎖間クロスリンク(interstrand crosslink;ICL)損傷を誘導する薬剤に高感受性を示すことが示されている。RAD51と結合できない変異型RECQL5、およびヘリカーゼ活性を持たない変異型RECQL5では薬剤感受性を相補できないことが判明し、RECQL5がICL修復において機能するにはRAD51との結合およびヘリカーゼ活性が必要であることが示唆された。次に、RECQL5がICL修復中の各反応経路においてどの段階に関わるか調べるために、RECQL5/RAD17、RECQL5/FANCCおよびRECQL5/BRCA2二重遺伝子破壊株を作製し薬剤感受性の遺伝学的解析をおこなった。その結果、RECQL5とBRCA2はICL修復においてepistaticな関係にあることが示された。さらに、RECQL5遺伝子破壊株ではRAD51-fociが滞留し、速やかに消失しないことも判明し、RECQL5はBRCA2に依存したICL誘導性HR修復の後期過程で機能し、修復を促進する可能性が初めて示唆された.DNA損傷を正確に修復する系が相同組換え(Homologous recombination ; HR)であり、HR関連遺伝子における変異は細胞のがん化を促進する原因となり得る。

平成24年度までに、RECQL5遺伝子破壊細胞はシスプラチンなどのDNA鎖間クロスリンク(interstrand crosslink ; ICL)損傷を誘導する薬剤に特異的な高感受性を示すこと、RecQL5が細胞内で機能するにはRad51との結合が重要であること、および遺伝学的解析によりRecQL5はHR因子BRCA2と同経路において機能する可能性を示すことができた。本年度は、「RecQL5が細胞内で組換えの正確性を制御するかどうか」を明らかにすることに焦点をおいた。実験系として用いたDT40細胞はニワトリBリンパ球由来細胞であり、抗体の多様性を生み出すために免疫グロブリンをコードする領域において恒常的な組換えが起こっている。この性質を利用してRECQL5遺伝子破壊細胞における組換えの正確性を評価したところ、薬剤無処理の条件下では野生株と比較して差は見られなかったものの、シスプラチン処理時には組換えで使用される鋳型の多様化が観察された。すなわち、組換え頻度の上昇だけでなく正確性の低下が引き起こされた。以上の結果は、RecQL5がICL損傷誘導性のHRにおいて、組換えの量と質を適切に制御し、効率の良いDNA修復を保証する機能を持つことを示している。この発見は、RecQL5が発がんを抑制するメカニズムを考察する上で重要な知見となり得る。研究成果は原著論文としてまとめ、学術雑誌にて発表した。二重破壊株を用いた遺伝学的解析により、RECQL5の細胞内におけるICL修復中の作用点を推察できた。また、間接免疫染色によるRAD51-fbciの検出系を当研究室で確立し、RAD51フィラメントの細胞内動態を観察することが可能となった。RECQL5がICL修復において機能する上で、RAD51結合能の重要性も明らかにすることができ、平成24年度の研究実施計画は概ね実践できたと言える。平成25年度は、作製の完了したRECQL5/RAD54二重遺伝子破壊株を解析しICL修復後期におけるRECQL5の機能を探りたいと考えている。また、ICL誘導性HRの正確性を評価し、RECQL5の有無により組換えの質の変化が生じるか調査する予定である。さらに、「RECQL5欠損細胞において実質的にゲノムDNAを傷つけている物質は何か?」という課題の解明を目標に研究を進めたいと考えている。具体的には内因性のアルデヒドをその標的と考えており、アルデヒドを用いた薬剤感受性試験等をおこなう予定である。(抄録なし)
生検標本での局所mRNA発現の定量的RT-PCRによる診断法の開発と臨床的応用

病態の診断、病因の解明、治療評価のためには組織の生検標本などの微量標本での局所因子のmRNA発現の定量は重要である。本研究はこれらの目的ため、組織局所のRNAの定量法としてのreverse、transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)法の確立と応用を目指している。具体的研究項目での本年度の成果は以下の通りである。(1)定量的RT-PCR法(MRT-PCR)の改良:本年度はMRT-PCR法の方法論的進歩は、1)プロスタグランジン(PG)E受容体EP3サブタイプの非放射性の定量法を確立した(特許開示中)、2)ヒトvitamin D受容体に関して、染色体遺伝子の多型性(RFLP)とmRNA定量が同時に可能な方法を確立し現在腎不全患者の骨病変の程度の指標としての臨床応用を検討している(特許出願中)。(2)生検標本におけるmRNA定量性の確認:微量なマウス腎のmicridissection標本にてPGE受容体EP3サブタイプのネフロン内の定量的分布と個体発生での発現変化を発見した。また、血小板活性化因子(PAF)受容体mRNAトロンボキサン(TX)受容体mRNAについても検討中である。(3)病態モデル動物でのmRNAの動態と治療効果:腎障害モデルとして、シスプラチン腎症ラットにてアポトーシス関連因子であるclusterinのmRNAの近位尿細管での異常発現からこの因子の関与を示唆するデータを得た。(4)遺伝子導入細胞、臓器に於ける遺伝子発現の定量化の検討:遺伝子治療における治療評価の予備的実験として、PAF受容体cDNAクローンをin vitroで導入する方法は確立した。現在、これらのmRNA定量と細胞内Ca^<2+>上昇など細胞機能の比較検討を行っている。(5)C型慢性肝炎の肝組織ウイルスRNA量の活動性、治療効果との関連の検討:RNAを外部標準とするcommpetitive RT-PCR法は確立した。現在他の方法との優劣の検討中である。以上のように、我々はMRT-PCR法を非放射性定量化、染色体遺伝子の解析とmRNA発現を同時に解析可能とし、臨床的適用の拡大の検討段階となっている。また、この過程で2件の特許も申請している。病態の診断、病因の解明、治療評価のためには腎、肝組織の生検標本などの微量標本での局所因子のmRNA発現、感染ウィルスの定量などは重要である。本研究はこれらの目的ため、組織局所のRNAの定量法としてのreverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)法の確立と応用を目指している。(1)定量的RT-PCR法(MRT-PCR)の改良:本年度にはMRT-PCR法やRNAを外部標準とする定量的RT-PCRに関しての方法論的基礎は既に確立した。非放射性のキット化の目度もついた。(2)生検標本におけるmRNA定量性の確認:生検材料よりさらに微量なマウス腎のmicroidisscction標本にてプロタグランジン(PG)E受容体EP3サプタイプのネフロン内の定量的分布と個体発生での発現変化を発見した。

EP3サブタイプや血小板活性化因子(PAF)受容体mRNAなどについて、腎の生検組織のMRT-PCRとNorthern分析やin situ hybridizationなど他の方法との比較検討を行いつつある。(3)病態モデル動物でのmRNAの動態と治療効果:腎障害モデルとして、抗Thy-1腎炎にてPAF受容体mRNAの定量と腎組織所見の経時的比較を施行中である。また、PAF分解酵素のcDNAクローニング(東大薬学部、新井博士)により、この酵素のmRNA及び蛋白レベルでの動態の検討も準備中である。(4)遺伝子導入細胞、臓器における遺伝子発現の定量化の検討:PAF受容体遺伝子治療における治療評価の予備的実験として、各種GTP結合蛋白、PAF受容体cDNAクローンをin vitroで導入する方法は確立した。現在、これらのmRNA定量と細胞内Ca^<2+>上昇など細胞機能の比較検討を行っている。(5)C型慢性肝炎の肝組織ウィルスRNA量の活動生、治療効果との関連の検討:RNAを外部標準とするcommpctitive RT-PCR法は確立した。しかし、新しいブローブ法によるIICV-RNA定量法も発表されているので、現在これとの優劣を検討中である。この様に、我々は、既にMRT-PCR法やRNAを外部標準とする定量的RT-PCRに関しての方法論的基礎は確立し、生検標本や臨床的生検標本での適応も可能な段階となっている。RT-PCR法の改良にもある程度の目度がついている。今後は、これらの方法を前述の病態モデルや臨床標本に応用して行くための基礎、応用実験を重ねることで当初の目的を達成したい。病態の診断、病因の解明、治療評価のためには組織の生検標本などの微量標本での局所因子のmRNA発現の定量は重要である。本研究はこれらの目的ため、組織局所のRNAの定量法としてのreverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)法の確立と応用を目指している。具体的研究項目での本年度の成果は以下の通りである。(1)定量的RT-PCR法(MRT-PCR)の改良:本年度はMRT-PCR法の方法論的進歩は、(1)プロスタグランジン(PG)E受容体EP3サブタイプの非放射性の定量法を確立した(特許開示中)、(2)ヒトvitamin D受容体に関して、染色体遺伝子の多型性(RFLP)とmRNA定量が同時に可能な方法を確立し現在腎不全患者の骨病変の程度の指標としての臨床応用を検討している(特許出願中)。(2)生検標本におけるmRNA定量性の確認:微量なマウス腎のmicridissection標本にてPGE受容体EP3サブタイプのネフロン内の定量的分布と個体発生での発現変化を発見した。また、血小板活性化因子(PAF)受容体mRNA、トロンボキサン(TX)受容体mRNAについても検討中である。(3)病態モデル動物でのmRNAの動態と治療効果:腎障害モデルとして、シスプラチン腎症ラットにてアポトーシス関連因子であるclusterinのmRNAの近位尿細管での異常発現からこの因子の関与を示唆するデータを得た。
両親媒性分子性導体を用いた超薄膜構造の作製

本研究では、Langmuir-Blodgett(LB)法やスピンコート法に代表されるウエット法から、分子性導体のナノスケール化に関する検討を行った。両親媒性マクロサイクリックbis-TTF誘導体の分子設計から、ナノドット・ナノワイヤ・ナノリング・ナノワイヤ-金ナノ粒子集積構造などの低次元ナノ構造を固体基板上に固定化する手法を開発した。両親媒性TTF誘導体1が有機半導体ナノ構造の実現に対して有効なソフトマテリアルである事を明らかとした。分子1は、水素結合サイトを有さないにも関わらずオルガノゲルを形成する事が可能であった。これはオルガノゲル化合物としては、極めて珍しい例であり、ゲル形成に必要な分子間相互作用として、硫黄原子間の相互作用が利用可能である事を証明した新規な例である。分子性導体のソフトマテリアル化に関する第一歩を実現すると同時に、ソフトマテリアルの形成が分子の自己組織化を利用したナノ材料の開発に対して極めて重要で有る事を実証した。次に、両親媒性bis-TTF誘導体が形成する分子集合体構造のナノスケールでの制御を目的とし、分子間力の制御を目的とした分子設計を試みた。2次元的な分子間相互作用を増加させた化合物1では、LB法からは安定な2次元超薄膜構造が形成した事から、スピンコート法による薄膜化に関する検討を試みた結果、化合物1とヨウ素が形成する電荷移動錯体にスピンコート法を適用する事で、マイカ基板上でnmからμmサイズの有機半導体ドット構造を固定化できる事を明らかとした。さらに、スピナーの回転速度を制御する事で、有機半導体ドットの直径をnmからμmサイズまで制御する事が可能であった。スピナーの回転数とマイカ基板上のドット構造のサイズの間には、良い相関が得られ、回転数を早くするほど、サイズの小さなドット構造の作成が可能であった。デバイス化に際して高い潜在能力を有している事が明らかとなった。本研究では、両親媒性の分子性導体が形成する分子集合状態に着目して、そのサイズ・形状・電子機能の設計を、超分子化学・界面化学のアプローチから研究を行った。本研究の目的は、1)分子性導体超薄膜の表面構造と膜厚の制御、2)分子性導体超薄膜の電子状態制御である。16年度は、申請者らが独自に開発したエチレンジチオ置換型の両親媒性マクロサイクリックbis-TTF誘導体(1)が形成する電荷移動錯体に着目した研究を行った。両親媒性電子ドナー1に2等量のヨウ素分子を溶解させた電荷移動錯体溶液から、スピンコート法を利用して簡便にサイズ制御が可能なナノドット構造を基板上に固定化する手法を開発した。その際、基板を固定したスピナーの回転数を500から6000rpmの範囲で制御することで、ナノドット構造の直径を200から1000nmの範囲で任意に制御する手法を見出した。さらに、両親媒性ドナー1とTCNQ誘導体が形成する電荷移動錯体溶液を用いた場合、スピンコート法により、簡便に超薄膜構造が形成可能であることを見出した。均一な有機半導体超薄膜構造を、石英・ガラス・シリコン・マイカ等の各種基板上に簡便に固定化することが可能となった。また、超薄膜構造の厚さは、スピナー上に固定化した基板の回転速度を500から6000rpmの範囲で制御することにより、任意の厚みに制御可能であった。さらに、電子スペクトル測定から、超薄膜構造は約1eVのエネルギーギャップを有する有機半導体であることが判明した。また、17年度以降に実施予定の、ナノ構造の電気伝導度測定を行うために、新規に導入した絶縁抵抗計を用いた伝導度測定装置の構築に取り組んだ。
サル細胞によるHIV-1初期複製機構の解析

サルVero細胞へヒトCD4及びCCR5を発現させることにより、HIV-1の複製を調べることが可能になった。その結果、サル由来のHIV-1はヒト由来のHIV-1に比べ極端にVero細胞での複製が低下することが判明した。昨年度までの研究によりHIV-1の逆転写においてウイルスに取り込まれる宿主topoisomerase Iの特にライゲース活性が重要であることを見出しているが、上記のように、粒子中の宿主因子が複製に重要な働きを行っているため、さらに他の宿主因子の関与を調べた。Topoisomerase IとN末端で結合する因子のうちC23及びPSFのHIV-1複製における関与を調べた。COS1細胞にinfectious clone DNAとそれぞれの発現ベクターをコトランスフェクションしたところ、C23を発現させたときのみ、ウイルス蛋白の発現が上昇することが判明した。RNAの転写効率自体は不変であったため、アクチノマイシンDによって転写を阻害しRT-PCRによってRNAの安定性を調べたところ、C23の発現によりゲノムRNAの安定性が増すことが判明した。また上精中のウイルス粒子もC23の発現により4倍程度上昇することが判明した。以上より、C23は何らかの機構によりゲノムRNAの安定性を増し、ウイルス粒子を経た感染細胞での逆転写に影響を及ぼしていることが示唆された。C23が粒子へ取り込まれていくか、ウイルスの発芽へ影響を及ぼしているか、また粒子に取り込まれるtopoisomerase Iと共同してRNAに働きかけているか等さらに研究が必要であると考えられた。
クロロフィルを用いた自己集積型光応答ナノデバイスの構築

緑色光合成細菌の膜外アンテナ部=クロロゾーム中では、通常のクロロフィルとは分子構造の異なる特別なクロロフィル分子が、自己会合することによってアンテナ色素部を形成している。そこで、天然型のクロロゾームクロロフィルを模した様々なモデル色素分子を合成して、多様な条件下でその自己会合体を創製し、その物性を検討しつつ、光応答ナノデバイスの構築を固体界面上で行った。クロロゾームクロロフィルモデル分子に様々な官能基を導入する際には、これまでは有機合成化学的手法を駆使してきたが、選択的な官能基導入は困難を伴うことが多かった。そこで生合成に用いられている酵素を利用して、クロロフィルの位置・立体選択的変換を行った。活性化されていない20位の炭素上への直接メチル化に成功したのをはじめ、ピロールB環上のC7=C8二重結合の不斉還元にも世界で初めて成功した。さらに、17位上のエステルのゲラニルゲラニル鎖の位置選択的で段階的な不斉還元にも取り組んでいる。次に、光機能性界面デバイス構築のために、より安定な自己会合体の構築を行った。アクリレートやジアセチレンの熱・光重合やシラノールの縮重合の利用を試みて、後者によって生成するポリシロキサンが有効であることが判った。このようにして構築された自己会合体は、残存シラノールによって水中では表面負電荷を有するために、正電荷を帯びた界面上に固定化でき、さらに幾層でも積層出来ることが判った。同様の静電的相互作用を利用して、負電荷を有するカルボン酸型クロロフィルを半導体表面に修飾して、色素増感型太陽電池を構築できることも判明した。緑色光合成細菌の膜外アンテナ部=クロロゾーム中では、クロロゾーム型クロロフィル分子が自己会合することによって、アンテナ色素部を形成している。クロロゾーム型クロロフィルの自己集積体形成時には、中心金属でのアキシャル配位が必須であるが、その配位方向が上下のどちらからであるかは不明である。このような現象は、クロロフィル分子が光学活性であるために、配位によるジアステレオマー(α・β体)の形成をもたらし、その構造と機能の面からも、興味が持たれている。そこで、クロロフィルπ平面の片方をオリゴメチレン鎖で覆った化合物を合成し、その配位能について検討した。また、ガリウム(III)を中心金属としたクロロフィルを合成し、NMR法を利用して、溶液中でのα・β体を区別することにも初めて成功した。次に、光機能性界面デバイス構築のために、天然クロロゾームを基板上に物理的に分散させて吸着させることや、表面が負の電荷を帯びている天然(あるいは人工)クロロゾームを、正に電荷を帯びた界面上に固定化することにも成功した。静電相互作用を利用した基板上へのクロロゾームの固定化では、その基板上での可視吸収スペクトルが、溶液中の吸収スペクトルとほぼ同じであり、固定化したクロロゾームが、基板上で変性を受けていないことが判明した。さらに、収穫したエネルギーを電気エネルギーに変換するために、半導体表面をクロロフィル類で修飾した系を構築し、その変換効率も検討し、最高4%の値を得た。
自己免疫性膵炎関連遺伝子の全ゲノム関連解析

自己免疫性膵炎(autoimmune pancreatitis: AIP)発症に関連する感受性遺伝子の検索を、全ゲノム関連解析(genome-wide association study: GWAS)により行った。AIPとコントロールとの相関解析で有意差を示すSNPより13種類の候補遺伝子を確認し、fine mappingを行ったところCLNK, PAX5遺伝子と疾患との相関を確認した。さらに、疾患活動性が高い涙腺・唾液腺病変合併に関連する候補遺伝子を10種類認め、KLF遺伝子と有意な相関を認めた。自己免疫性膵炎と涙腺・唾液腺炎は代表的なIgG4関連疾患であり、両者の臨床像の特徴を合併例で検討した。対象は涙腺・唾液腺病変を合併しない自己免疫性膵炎47例(A群)と合併60例(B群)である。血液検査ではA群と比較してB群で活動性マーカーIgG、IgG4、可溶性IL2受容体、β2ミクログロブリンが有意に高値であり、後腹膜線維症、腎病変の合併も多く認めた。従って、自己免疫性膵炎において涙腺・唾液腺病変を合併例は活動性が高い状態であると推察された。涙腺・唾液腺病変合併に関連する遺伝子を検索する目的でgenome-wide association study: GWASを行い、自己免疫性膵炎例で涙腺・唾液腺病変非合併と合併の患者群間において、アリル頻度にp<0.0001で有意差を示すSNPsから、涙腺・唾液腺病変誘発に関わると思われる遺伝子KLF7, ABI3BP, SNCAIP, COL12A1, MATN2, SH3GL2, FLJ45537, MPPED2, NTRK3を選出した。これら遺伝子のうち、MANT2とMPPED2遺伝子について、GWASで使用されていない新たなSNPsを設定し、TaqManプローブを用いたタイピングを行った。両遺伝子内に設けたSNPsには、GWASで示されたようにp<0.01で相関を示すSNPが認められた。これらの遺伝子は合併に関与するつ考えられる。その他の遺伝子についても今後詳細な検討を行う予定である。自己免疫性膵炎において、涙腺・唾液腺病変合併例は非合併例と比較して活動性の高い病態を示す。この合併症を誘発する遺伝的要因を検討するためにAffymetrix社のHuman Mapping 500K SNPsセットを用いて遺伝子タイピング(genome-wide association study:GWAS)を行った自己免疫性膵炎症例を対象に、涙腺・唾液腺病変合併例群と非合併例群間からアリル頻度が有意に異なるSNPsを抽出し、合併症に関連する候補遺伝子を推定した。さらに、候補遺伝子内に新たにSNPsを設けてTaqManによるSNPタイピングを行いGWASで得られた結果を評価した。GWASにおいてP<0.0001以下で有意なSNPを示す候補遺伝子は10種類検出された。その中で、染色体2q33.3位にあるKLF7遺伝子、6p25.3位にあるLOC101928923遺伝子、11p14.1位にあるMPPED2遺伝子について、合併症発症との関連性を確認したところ、各遺伝子内に設定したSNPsのアリル頻度は両群間で有意な相違を示し、涙腺・唾液腺病変合併症に関わる遺伝子であることが示唆された。転写因子であるKruppel-like factor family (KLF1KLF17)は、本来細胞の分化や成長に重要な役割を果たしている。KLF7遺伝子は広範囲なヒト組織中に発現しており、特に神経新生制御に重要な機能を果たしているとの報告があるが、タイプ2糖尿病発症に関わるとの報告もある。また、この遺伝子の発現は脂肪細胞生成に抑制的に機能し、脂肪細胞機能と関わりをもつタイプ2糖尿病の感受性に影響していることが示唆された。涙腺・唾液腺合併に負の相関を示したLOC101928923遺伝子は、いまだ機能不明であるが、non-coding RNA遺伝子として多くの生体内作用に影響を及ぼしている。自己免疫性疾患(AIP)は遺伝的要因と環境要因が背景に存在する多因子疾患である。本疾患の病態に関連する遺伝的要因解明の目的で、Affimetrix社製SNPチップ、GeneChip Human Mapping 500k Array Setを用いて自己免疫性膵炎115検体の全ゲノム網羅的な相関解析(genome-wide association study: GWAS)を行った。コントロールのタイピングデータは健常人315例分をもちいた。本検討、解析1はAIPとコントロールとの相関を、解析2ではAIPにおけるIgG4高値群とコントロールとの相関を評価した。P値が0.0001未満を示すSNPを抽出したところ、解析1で38SNP、解析2で37SNP、で強い相関を認め、それらに共通するSNPとして17SNPを認めた。これらの関連遺伝子から機能的に興味深い3種類の遺伝子CLNK、PAX5、FCER2に注目した。

CLNKは、T細胞およびB細胞抗原レセプターの下流で免疫シグナルを調節し、IgEレセプターを介したMAST細胞の脱顆粒反応や,サイトカイン刺激に伴う多様なシグナル伝達に関与している。PAX5は、CD19遺伝子プロモーター、B細胞に特異的なtyrosine kinase遺伝子BLK、heavy chain locusの調節領域に結合するBSAPをコードしている。CD23とも呼ばれるFCER2は、低親和性IgE受容体として、主に成熟B細胞、単球、濾胞樹状細胞に発現し、B細胞の活性化とIgEの下方制御に関与しており、細胞接着、抗原提示、B・T細胞の増殖と分化、アポトーシスからの救済、細胞毒性物質の放出、IgE産生の調節にも関与している。これら3種類の遺伝子内のSNPで確認試験を行ったところ、CLNKとPAX5では相関を示したが、FCER2では有意な相関を認めなかった。本疾患の病態に関連する遺伝的要因解明の目的で、2年間のGWAS検討で明らかとなった自己免疫性膵炎発症に関連する候補遺伝子、涙腺・唾液腺炎合併に関連する候補遺伝子について、fine mappingが未確認の遺伝子について、遺伝子内に新たなSNPsを設定し相関解析を行い、GWASで得た結果を検証する予定である。また、これらの遺伝子が疾患発症に関わる意義を検討する予定である。更に、Illumina社製SNPチップのシステムを用いて、従来のAffimetrix社製SNPチップのデータと比較し、相関に関わる遺伝子の絞り込みを行う予定である。症例をさらに追加してGWAS検討例を増やし、より客観的なデータとする。候補遺伝子についてfine mappingが未確認の遺伝子について、遺伝子内に新たなSNPsを設定し相関解析を行い、GWASで得た結果を検証する予定である。今回明らかになった、自己免疫性膵炎の病態に関連していると考えられる候補遺伝子の臨床的意義について検討を進める。また、GWASを推し進め、さらに涙腺・唾液腺炎に関連した遺伝子の検索を行う。涙腺・唾液腺炎合併例と非合併例の間で、有意な相関を認めるSNPsを検索し、関連する遺伝子を見つけ出す。GWASの検討には充分な症例数をそろえることが望まれるが、臨床検体のさらなる集積に努める。GWAS検討に関しては、自己免疫性膵炎ならびに涙腺・唾液腺合併症例の症例数をさらに追加して、より客観的なデータを作成することが肝要である。本疾患は発生頻度が少なく、なかなか充分な症例を集積することには困難を伴うが、信州大学は世界的にも患者数が多く、さらに努力して症例数を追加する予定である。追加した症例について、GWASを行う為の予算措置が必要となる。また、候補遺伝子については全て解析したわけではないので,未確認のものについてはfine mappingの為の、SNPs作成や解析用の費用が必要となり、次年度の研究費を使用予定である。また、当初計画で見込んだよりも安価に平成24年度の研究が完了したため、次年度使用額が生じた。当初計画で見込んだよりも安価に研究が完了したため、次年度使用額が生じた。