hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレス蛋白質のTリンパ球抗原認識機構における分子機能

ストレス蛋白質(HSP)反応性γδ型T細胞のクローニングを行い、その抗原認識機構と機能について検討した。加齢(12ヶ月齢)マウスの自己リンパ球混合培養(MLR)のT細胞からγδ型T細胞ハイブリドーマを作製した。自己反応性を示す9個のγδ型T細胞ハイブリドーマのなかで5個のハイブリドーマの自己反応性を抗HSP抗体であるML-30が有意に阻害した。これらのハイブリドーマのγδ型T細胞レセプターのV領域の塩基配列を検索したところ、VδはVδ5-Jδ1からなり、そのN多様性は認められず、BALB/ccマウスに特異的にみられるBID(BALB/c invariant δ鎖)であることが分かった。刺激細胞をBALB/b、BALB/kにしても反応することから、この反応性には古典的なMHC以外分子が関与していることが明らかとなった。次に加齢マウスの自己MLRよりIL-2およびIL-7を用いてγδ型T細胞のクローン化を行い、Vγ1/Vδ5(BID)自己反応性γδ型T細胞クローン(KM1)を得た。KM-1のサイトカイン産生能をRT-PCRおよび培養上清のELISAで測定した。Th1型サイトカインであるIL-2、γIFNの産生がみられたが、Th2型サイトカイン(IL-4、IL-10)の産生は認められなかった。以上の結果より、特有なVδ5(BID)を発現するγδ型T細胞が自己脾細胞に反応してTh1タイプのサイトカインを産生することが分かった。抗HSP65抗体であるML-30で認識される抗原がそのリガンドと考えられる。HSPは系統発生的に非常に相同性高い蛋白質である。一方、このγδ型T細胞はBALB由来の抗原にしか反応しない。従って、このγδ型T細胞はHSPに結合したBALB由来のペプチドまたは抗HSP65抗体に交差反応するBALB由来の抗原を認識すると考えられよう。
感染・炎症応答に関与するガレクチンファミリーの機能及び情報伝達機構の解析

ガレクチンファミリーはβガラクトシドを特異的に認識する動物レクチンである。本研究では、感染や炎症応答におけるガレクチンファミリーの役割、中でもタンデムリピート型ガレクチン(galectin-8、-9など)を中心に、免疫系細胞の活性化と糖鎖認識を介した情報伝達の分子基盤の解析を行った。まず、ヒト末梢血好中球に対するgalectin-8の機能解析を行い、galectin-8の二つの糖認識ドメイン(CRD)のうち、N-末端側CRDはヒト好中球のproMMP-9と結合し、結合したproMMP-9の活性化が促進されることを見い出した。一方、C-末端側CRDは主にintegrinαMと結合して、培養プレートへの細胞接着誘導や活性酸素産生を亢進することを明らにした。さらに、顆粒球以外の免疫系細胞に対する作用を、各種培養細胞を使って調べ、galectin-9がJurkat、Molt-4などのT細胞のアポトーシスを、galectin-8はT細胞とともに、Namalwa、RPMI-8866などのB細胞やTHP-1(単球)、K562(前赤芽球系細胞)などの細胞接着を誘導することも見出した。さらにJurkat細胞をモデルにgalectin-8の細胞接着誘導に関与すると思われる候補分子の精製を試み、Integrin-α4が同定できた。また、galectin-8、-9について、2つのCRDを繋ぐリンカー領域(各種プロテアーゼに感受性を有する)を欠くリコンビナントガレクチン(null型ガレクチン)を作成し、それらの構造安定性と生理活性を詳細に検討した。その結果、null型ガレクチンはプロテアーゼに対する耐性と高い生理活性を保持する安定性を有していることが明らかとなった。このようにgalectin-8、-9は、顆粒球(好酸球、好中球、好塩基球)に限らず、様々な免疫系細胞に対して広範な作用を有し、今後の治療薬開発への有効利用も期待できる。ガレクチンファミリーは、βガラクトシドを特異的に認識する動物レクチンで、脊椎、無脊椎動物に広く分布している。しかし、ガレクチン分子種の詳しい組織分布や機能についてはほとんど分かっていない。本研究では、感染や炎症応答におけるガレクチンファミリーの役割、中でもタンデムリピート型ガレクチン(galectin-8、9など)を中心に、免疫系細胞の活性化と糖鎖認識を介した情報伝達の分子基盤の解析を行う。我々はこれまで、ヒト末梢血好中球に対するgalectin-8の機能解析を行い、galectin-8の二つの糖認識ドメイン(CRD)のうち、N-末端側CRDはヒト好中球のproMMP-9と結合し、結合したproMMP-9の活性化が促進されることを見い出した。以上の結果は、細菌や異物の感染に伴って、生体内のgalectin-8が好中球を活性化し得ることや、感染に伴って起こる炎症や好中球の組織への浸潤の調節にgalectin-8が関与している可能性を示唆している。今年度はさらに、顆粒球以外の免疫系細胞に対する作用を、各種培養細胞を使って調べ、galectin-9がJurkat、Molt-4などのT細胞のアポトーシスを、galectin-8はT細胞とともに、Namalwa、RPMI-8866などのB細胞やTHP-

1(単球)、K562(前赤芽球系細胞)などの細胞接着を誘導することも見出した。さらにJurkat細胞をモデルにgalectin-8の細胞接着誘導に関与すると思われる候補分子の精製を試みたところ、Integrin-α4が同定できた。このようにgalectin-8、-9は、顆粒球(好酸球、好中球、好塩基球)に限らず、様々な免疫系細胞に対して広範な作用を有する可能性がある。また、galectin-8の主な標的候補分子が免疫細胞で多く発現しているインテグリンファミリーであると考えられた。ガレクチンファミリーは、βガラクトシドを特異的に認識する動物レクチンである。本研究では、感染応答におけるガレクチンファミリーの役割、中でもタンデムリピート型ガレクチン(galectin-8、9など)を中心に、免疫系細胞の活性化と糖鎖認識を介した情報伝達の分子基盤の解析を行ってきた。まず、ヒト末梢血好中球に対するgalectin-8の機能解析を行い、galectin-8の二つの糖認識ドメイン(CRD)のうち、N-末端側CRDはヒト好中球のproMMP-9と結合し、結合したproMMP-9の活性化が促進されることを見い出した。一方、G末端側CRDは主にintegrinαMと結合して、培養プレートへの細胞接着誘導や活性酸素産生を亢進することを明らにした。さらに、顆粒球以外の免疫系細胞に対する作用を各種培養細胞を使って、galectin-9がJurkat、Molt-4などのT細胞のアポトーシスを、galectin-8はT細胞とともに、B細胞や単球、前赤芽球系細胞などの細胞接着を誘導することも見出した。また、Jurkatをモデルにgalectin-8の細胞接着誘導に関与すると思われる候補分子の精製を試み、Integrin-α4を同定した。このように、ガレクチンの主な標的候補分子は免疫細胞で多く発現しているインテグリンファミリーであると考えられた。今年度はガレクチン-8、-9の2つのCRDを繋ぐリンカー領域(各種プロテアーゼに感受性を有する)を欠くリコンビナントガレクチン(null型ガレクチン)を作成し、それらの構造安定性と生理活性を詳細に検討した。その結果、null型ガレクチンはプロテアーゼに対する耐性と高い生理活性を保持する安定性を有していることが分り、今後のガレクチンの機能解析や治療薬開発への有効利用が期待できることが明らかとなった。
遺伝子の相同組換えを利用したイネへの外来遺伝子の導入

イネのWaxy(澱粉合成酵素)遺伝子を標的として相同組換えを利用したターゲティング法を確立するために、ターゲティング用のベクターの構築を進めた。また同ベクターを高頻度でイネに導入するための遺伝子導入法と相同組換えの生じた細胞を効率良く選抜するための培養システムを開発した。ターゲティングベクターは複雑な上に長大となる可能性が高いため、この様な外来遺伝子を断片化することなくイネに導入するために、アグロバクテリウム法を適用することとした。種々のアグロバクテリア菌株やバイナリーベクターを検討した結果、アグロバクテリア菌株EHA101とPseudomonasのプラスミドの複製開始点を持つバイナリーベクターを用いることとした。また、相同組換えによる遺伝子導入の頻度はランダムな組換えに比べて極端に低いため、ポジティブ選抜マーカーとして高発現のハイグロマイシン耐性遺伝子に加えて、ネガティブ選抜マーカーを用いることとした。ネガティブ選抜マーカーは相同組換えが生じることで除去され無害となるが、通常生じるランダムな遺伝子の取込みでは除去されず有害に働き、形質転換細胞が致死となる仕組みを利用して、ランダムな遺伝子導入から相同組換えによる遺伝子導入を濃縮する。予備実験を行った結果、ポリペプチド鎖の延長因子EF-2を不活化するジフテリア毒素タンパクのAチェーン(DxL-A)遺伝子を用いることとした。次にこれらのマーカー遺伝子の選抜効果を調べた。まず選択したバイナリーベクターを用いて高発現のハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを作製し、同時にアグロバクテリウム法の効率化を目指して、アグロバクテリウムのイネ細胞への接種に関する種々の条件(アグロバクテリウムの接種濃度、共存培養の温度等)を比較検討し、極めて効率の高い形質転換法を確立した。さらに、ここで開発した高効率の形質転換法を基本として、ネガティブ選抜マーカーの効果、すなわちイネ遺伝子に導入されることによって引き起こされる致死率を調べた。その結果、ジフテリア毒素タンパク遺伝子によるネガティブ選抜の効果がイネで見られることが明らかとなった。一方、ターゲティング用のベクターの構築については、ポジティブ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーを持つ、基本ベクターを既に作製し、さらに相同組換えを引き起こすためのWaxy遺伝子及びその5'3'側の隣接領域を組み込むため、LA-PCR法を用いて同領域を増幅した。ベクターを完成させ、ターゲティングを試みる予定である。イネのWaxy(澱粉合成系酵素)遺伝子を標的とした、アグロバクテリウム法によるターゲッティング法の確立を目指して、Waxy遺伝子をハイグロマイシン耐性等のマーカー遺伝子と置き換えるためのターゲッティング用ベクターの構築、アグロバクテリウム法による遺伝子導入法の効率化を進めた。大腸菌及びアグロバクテリウムの両方で有効なプラスミッド選抜マーカーのスペクチノマイシン耐性遺伝子を持つベクターを用い、このベクターに、イネで高発現が期待されるアクチン遺伝子プロモーターを持つハイグロマイシン耐性遺伝子と、ネガティブ選抜マーカーであるジフテリア毒素タンパクのAチェーン(DxL-A)遺伝子をユビキチン及びカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子のプロモーターと接続したものを組込んだ。さらに相同配列での組換えを引き起こすためのイネのWaxy遺伝子の5'と3'隣接領域を同ベクターに組込む予定で、現在、隣接領域のクローニングを進めている。一方、イネのアグロバクテリウムによる遺伝子導入法の効率化を計るため、基本として用いる品種「日本晴れ」以外に世代交代の早い北海道の育成品種を用いてアグロバクテリウム法の培養、開花結実までの育成条件等を検討し、本実験に適したものを選抜した。上記のターゲッティング用ベクターのイネでの有効性とハイグロマイシンの選抜条件を決定するため、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみを持つ上記のベクターをEHA101及びRecA^-のUIA143のアグリバクテリアに導入し、選抜した品種を用いて遺伝子導入を行った。UIA143は長大なターゲッティング用ベクターをアグロバクテリウムの中で安定に保持するために有効と考えられる。さらにVirGおよびE遺伝子の発現を強化するためこれらの遺伝子を持つプラスミッドをアグロバクテリウムに加えて導入した。現在、ハイグロマイシンに耐性の再生植物が得られており、今後これらの植物の解析を行い選抜条件を決定する予定である。

予備実験を行った結果、ポリペプチド鎖の延長因子EF-2を不活化するジフテリア毒素タンパクのAチェーン(DxL-A)遺伝子を用いることとした。次にこれらのマーカー遺伝子の選抜効果を調べた。まず選択したバイナリーベクターを用いて高発現のハイグロマイシン耐性遺伝子を持つベクターを作製し、同時にアグロバクテリウム法の効率化を目指して、アグロバクテリウムのイネ細胞への接種に関する種々の条件(アグロバクテリウムの接種濃度、共存培養の温度等)を比較検討し、極めて効率の高い形質転換法を確立した。さらに、ここで開発した高効率の形質転換法を基本として、ネガティブ選抜マーカーの効果、すなわちイネ遺伝子に導入されることによって引き起こされる致死率を調べた。その結果、ジフテリア毒素タンパク遺伝子によるネガティブ選抜の効果がイネで見られることが明らかとなった。一方、ターゲティング用のベクターの構築については、ポジティブ選抜マーカーとネガティブ選抜マーカーを持つ、基本ベクターを既に作製し、さらに相同組換えを引き起こすためのWaxy遺伝子及びその5'3'側の隣接領域を組み込むため、LA-PCR法を用いて同領域を増幅した。ベクターを完成させ、ターゲティングを試みる予定である。
家庭科における生活資源とライフスタイル選択に関する実践的ライフキャリア教育の研究

本研究の目的は高等学校家庭科におけるライフ・キャリア教育の枠組と指導教材を開発することである。家庭科担当教員を対象とした実態調査の結果、家庭科の授業では、キャリア教育政策で示される「基礎的・汎用的能力」のうち、「自己管理能力」の形成につながる衣食住の知識・技術に関する内容が多く扱われているにも関わらず、それらの習得は教員にはキャリア教育として自覚されていない実態が明らかとなった。調査結果をふまえ、家庭科で扱う衣食住の知識・技術を、キャリア形成過程において重要な役割を果たす「自己管理能力」として位置づけたキャリア教育の枠組を作成し、教育実践に向けた家庭科のガイダンス教材を開発した。平成25年度は、家庭科において男女共同参画の視点から授業を行う際の課題を提示することを目的として以下の2つの研究を行った。これらの研究の結果を学会誌に投稿し、現在、審査中である。(1)家庭科の授業とキャリア教育との関わり:茨城県の高等学校123校の家庭科担当教員を対象に、家庭科の授業で扱っている内容とキャリア教育を行っているという意識等についてアンケート調査を実施した(回収率48%)。その結果、家庭科の授業では、中央教育審議会答申「今後の学校におけるキャリア教育・職業教育の在り方について」(2011)(以下、「答申」)に示された「基礎的・汎用的能力」のうち「自己理解・自己管理能力」の形成に資する内容がとくに多く扱われており、教員の意識としても家庭科の授業のねらいとして、「自己管理能力」の育成に通ずる、生活者として自立するための知識・技術の習得を挙げる割合が高いことが示された。だが、そうした知識・技術を扱う授業においてキャリア教育を意識する割合は低く、生活自立のための知識・技術の習得は、教員にはキャリア教育の一貫としては自覚されていない実態も明らかとなった。(2)家庭科の学習を通じてキャリア教育を行うための枠組の検討:「答申」に示された「基礎的・汎用的能力」の枠組をもとに、平成21年版『高等学校学習指導要領』における共通教科「家庭」の「家庭総合」の学習内容を、ライフ・キャリア発達支援の視点から検討した。その結果、「基礎的・汎用的能力」の4つの能力は、家庭科の学習において男女共同参画の視点からすべて扱うことができることが確認された。特に他教科にはない独自性としては、公的領域における社会的・経済的な活動のキャリア形成に必要な力だけでなく、それと大きく関わる私的領域の諸活動を視野に入れて、男女双方の生涯に亘る全人格的なキャリア形成を実現する力を育成できる点が見出された。平成24年度は、茨城県における高等学校家庭科教員を対象に実施する実態調査に向けた準備を行った。まず、平成11年の中央教育審議会答申「今後の初等中等教育と高等教育の接続の改善について」以降のわが国のキャリア教育に関わる政策上の課題認識や家庭科教育との関わりについて整理するとともに、高等学校の家庭科の学習指導要領を用い、キャリア教育にもっとも近い内容をもつ家庭科の生活設計領域の内容について検討した。その結果、平成21年版の学習指導要領のもとでの家庭科の生活設計領域の学習は、従来よりも家庭科の学習内容全体の中で重要な位置を与えられるようになったこと、多様な生活資源を扱い、それらの活用を目標達成やライフステージごとの生活課題、リスクと関連づけて学習させるようになったこと、リスクマネジメントが明確に意識されるようになったことが確認され、今日のキャリア教育をめぐる政策上の課題に十分寄与する内容であるというだけでなく、今後求められる社会の担い手を育むうえでもきわめて大きな貢献をする内容を含むものであることが明らかとなった。しかし、こうした学習指導要領上の内容の充実と、学校教育現場での授業実態とは必ずしも連動しない。今日、高等学校の家庭科は、カリキュラム上、極めて限られた時間数しか与えられていない。こうした状況のなかで、学習指導要領に示された家庭科の内容が実際にはどの程度、学習されているのか、また担当教員の意識の態様はどうか、授業内容が十分でないとすればその要因は何か等について実態調査により明らかにし、問題解決に向けた提案をしていくことを次年度以降の課題として設定した。そこで次に、家庭科の授業と担当教員の意識に関する実態調査に向けた調査票の作成に取り組んだ。高等学校家庭科担当教員5名にヒアリングを行うとともに、調査票案の作成、プレ調査を行い、その結果をふまえて調査票の改良を行った。平成26年度は、平成24年度、平成25年度の研究結果をふまえ、現行の学習指導要領に沿った高等学校家庭科におけるライフ・キャリア教育の枠組を作成するとともに、その実践のための教材を開発し、実践・評価を行った。(1)高等学校家庭科におけるライフ・キャリア教育の枠組の作成:平成25年度に実施した家庭科におけるキャリア教育の検討結果をふまえ、高等学校家庭科の共通教科

「家庭」の「家庭総合」および「家庭基礎」の内容を、現在のキャリア教育政策において育成が求められている「基礎的・汎用的能力」の枠組に沿って編成し直し、家庭科におけるライフ・キャリア教育の枠組を作成した。(2)教材開発:(1)の枠組にもとづいたライフ・キャリア教育の実践のための提案として、家庭科のガイダンス教材を作成した。教材では特に、家庭科の主要な学習内容である衣食住の知識・技術は、ライフ・キャリアを形成する過程において「自己管理能力」として重要な役割を果たすことを強調した。(3)ライフ・キャリア教育の実践・評価:大学1年生を対象に開発教材を使用して授業を実践した。また、教材の効果について、1家庭科の学習内容である「家庭生活に関わる知識・技術」は、性別やライフ・コースに関わらずだれにとってもライフ・キャリアを形成するうえで必要であること、2家庭科で学習する「家庭生活に関わる知識・技術」は職業生活と家庭生活を両立するうえで必要不可欠であること、に対する授業前後の認識の変化を中心に評価を行った。その結果、上記1については認識が高まることが確認できたが、2については有意差は見られず、開発教材の改善の課題が確認された。生活経営学、生活科学高等学校の新しい学習指導要領(平成21年版)が平成25年度から年次進行で実施されたことから、実態調査の実施を当初予定の平成24年度から平成25年度に延ばしたためである。平成25年度は平成24年度に予定されていた調査を実施したことに加え、平成26年度に予定している家庭科における新しいライフキャリア教育の内容の検討を行い、学会誌に投稿した(日本家庭科教育学会『日本家庭科教育学会誌』)。当初計画では平成24年度に実態調査を実施する予定であった。しかし、高等学校の新しい学習指導要領(平成21年版)が平成25年度から年次進行で実施されることから、実態調査の実施を1年先に延ばし、初年度である平成24年度は調査の実施に向けた準備に十分な時間を確保した。研究の進捗は遅れたものの、新学習指導要領に沿った指導案や教科書がそろった25年度に実態調査を実施することで、より意義のある研究にすることができるものと考えられる。平成26年度は平成25年度の研究結果について、学会誌に公表する(現在、審査中)とともに、研究結果をふまえ、家庭科におけるライフ・キャリア教育の実践・評価を行う。当初の予定では生活設計領域のみでの実践を行う予定であったが、これまでの研究結果をふまえるならば家庭科のカリキュラム全体を通じたテーマ設定が必要となる。実践・評価の方法を充分検討することが課題である。平成25年度は前年度の結果をふまえ、茨城県における公立高等学校100校、私立高等学校30校の家庭科教員を対象にアンケート調査を実施する。調査結果を分析し、家庭科教育学会で発表するとともに、研究論文として学会誌に投稿する。調査の実施にあたっては、茨城県高等学校教育研究会家庭部会の協力が得られたため、5月23日に開催される茨城県高等学校教育研究会家庭部会の会合のなかで、調査の趣旨説明と調査票の配布を行い、欠席者には後日、調査票を送付する。
リン供給源の違いがリン体内代謝動態に及ぼす影響の検証－CKD患者への応用に向けて

慢性腎臓病(CKD)患者は、食事から摂取したリンを尿として排出できず、過剰なリンが体内に留まることで高リン血症を引き起こす。高リン血症は、心血管疾患などの重篤な合併症を招くことから、透析導入以降、積極的なリン管理が必要となる。一方で、CKD患者の透析導入より以前からのリン管理が、患者の生命予後改善につながる可能性も報告されている。現在CKDの食事療法では、タンパク質を制限すれば必然的にリンも制限されると考えられているが、過度のタンパク質の制限は患者の栄養状態の悪化を招くことから、適切なタンパク質量を確保し、尚且つリンを選択的に制限することが求められる。本研究計画の2018年度は、動物性食品と植物性食品に含まれるリンの存在様式並びに吸収率の違いに着目し、リンを選択的に制限できる食事の開発を試み、植物性食品由来のリンが70%の食事(植物性70%食)は動物性食品由来のリンが70%の食事(動物性70%食)に比べて、食後の血中リン濃度の上昇を穏やかにするとともに、尿中へのリン排泄量が少ないことを明らかにした。2019年度は、植物性70%食の献立を精査し、体内へのリンの吸収に関わる要素の抽出を行ったところ、植物性70%食は動物性70%食に比べ食物繊維量が約2倍多かった。そこで、体内へのリン吸収に食物繊維が関わっている可能性を調べるために、動物性70%食の食物繊維量を植物性70%食と同程度に調整した動物性70%食物繊維調整食を作成し、摂取後の血中リン濃度並びに尿中リン排泄量を比較した。その結果、食後の血中リン濃度に差は認められないものの、動物性70%食物繊維調整食の尿中リン排泄量は動物性70%食より少なく、植物性70%食より多かった。すなわち、動物性食品由来のリンが多い食事でも、食物繊維を多く摂取することで、植物性70%食と同程度にリンの体内への吸収を穏やかにする可能性が示唆された。当初の予定通り、健常者を対象とした臨床研究の実施並びに結果の蓄積を行っており、慢性腎臓病患者への応用に向けた基礎的なデータの収集が進行している。これまでの研究の成果より、植物性食品由来のリンが多い食事は、動物性食品由来のリンが多い食事に比べて、食後の尿中リン排泄量が少なく、血中リン濃度の上昇も穏やかであることが明らかとなった。また、植物性食品由来のリンが多い食事が体内へ吸収されにくい要因として、生物学的利用率が動物性食品由来のリンより低いこと、或いは食物繊維量が多いことが関わっている可能性がある。そこで今後は、慢性腎臓病患者への応用に向け、健常者を対象とした臨床研究のサンプル数を増やすとともに、慢性腎臓病の食事療法基準に準拠した献立の作成に取り掛かる予定である。腎機能の低下している慢性腎臓病(CKD)患者では、摂取したリンを尿として排泄できないことから、余剰なリンが体内に蓄積し高リン血症を招くことがある。この高リン血症は、心血管イベントなどの致命的な合併症を引き起こすことから、積極的なリン管理が必要であるが現在のところリン制限の実施は透析導入以降に留まっている。一方で、CKDのより早いステージからリンを制限することがCKD患者の生命予後改善につながる可能性も報告されている。しかしながら食品中のリンは、たんぱく質と結合して存在していることが多いため、リンのみを制限することは容易ではない。そこで本研究計画では、新たな食事性リン制限の方法として、食品中のリンの存在様式並びに吸収率の違いに着目し、ヒトを対象とした臨床研究を行うことで、その効果の検証を行った。一般的に、動物性食品に含まれるリンの生物学的利用率は4060%と高く、植物性食品に含まれるリンは2040%と低いことが知られていることから、総カロリーおよび炭水化物・脂質・タンパク質・リン・カルシウムを同程度に調整したうえで、リン供給源を動物性食品と植物性食品で極端に比率を変え、試験食(植物性食品由来のリンが70%(植物性70%)あるいは動物性食品由来のリンが70%の食事(動物性70%))を作成した。対象者は、腎機能の正常な健常者とし、無作為に2群に分け、試験食を提供し、摂取後の血中リン濃度並びに尿中リン濃度の測定を行った。その結果、植物性70%群の食後血中リン濃度の上昇が、動物性70%群に比べ穏やかであった。さらに、食後尿中リン排泄量は植物性70%群のほうが動物性70%群に比べて有意に少なかったことから、植物性食品に含まれるリンは体内に吸収されにくく、血中リン濃度の上昇を抑制できる可能性が示唆された。概ね当初の予定通りに計画は進展していると思われる。当初の予定通り、健常者を対象とした臨床研究が実施できており、CKD患者への応用に向けた基礎的データの収集が進行している。

現在CKDの食事療法では、タンパク質を制限すれば必然的にリンも制限されると考えられているが、過度のタンパク質の制限は患者の栄養状態の悪化を招くことから、適切なタンパク質量を確保し、尚且つリンを選択的に制限することが求められる。本研究計画の2018年度は、動物性食品と植物性食品に含まれるリンの存在様式並びに吸収率の違いに着目し、リンを選択的に制限できる食事の開発を試み、植物性食品由来のリンが70%の食事(植物性70%食)は動物性食品由来のリンが70%の食事(動物性70%食)に比べて、食後の血中リン濃度の上昇を穏やかにするとともに、尿中へのリン排泄量が少ないことを明らかにした。2019年度は、植物性70%食の献立を精査し、体内へのリンの吸収に関わる要素の抽出を行ったところ、植物性70%食は動物性70%食に比べ食物繊維量が約2倍多かった。そこで、体内へのリン吸収に食物繊維が関わっている可能性を調べるために、動物性70%食の食物繊維量を植物性70%食と同程度に調整した動物性70%食物繊維調整食を作成し、摂取後の血中リン濃度並びに尿中リン排泄量を比較した。その結果、食後の血中リン濃度に差は認められないものの、動物性70%食物繊維調整食の尿中リン排泄量は動物性70%食より少なく、植物性70%食より多かった。すなわち、動物性食品由来のリンが多い食事でも、食物繊維を多く摂取することで、植物性70%食と同程度にリンの体内への吸収を穏やかにする可能性が示唆された。当初の予定通り、健常者を対象とした臨床研究の実施並びに結果の蓄積を行っており、慢性腎臓病患者への応用に向けた基礎的なデータの収集が進行している。現在までの研究により、健常者において植物性食品由来のリンを多く含む食事は、食後の尿中リン排泄が少なく、食後血中リン濃度の上昇を穏やかにすることが明らかとなった。そこで今年度は、植物性食品由来のリンの多い献立を精査し、ある特定の食材が得られた有効性に影響を及ぼしているかを検証するために、特定の食材の比率が極端に多い食事や特定の食材を単独で摂取した際のリン体内代謝動態への影響を検討する。また、CKD患者への応用に向けて、慢性腎臓病に対する食事療法基準2014年版に準拠した献立作成を開始する予定である。これまでの研究の成果より、植物性食品由来のリンが多い食事は、動物性食品由来のリンが多い食事に比べて、食後の尿中リン排泄量が少なく、血中リン濃度の上昇も穏やかであることが明らかとなった。また、植物性食品由来のリンが多い食事が体内へ吸収されにくい要因として、生物学的利用率が動物性食品由来のリンより低いこと、或いは食物繊維量が多いことが関わっている可能性がある。そこで今後は、慢性腎臓病患者への応用に向け、健常者を対象とした臨床研究のサンプル数を増やすとともに、慢性腎臓病の食事療法基準に準拠した献立の作成に取り掛かる予定である。
増殖因子によって活性化されるカルシウム透過性チャネルの制御機構

Bリンパ球の発現するカルシウム(Ca^<2+>)透過性チャネルCD20を線維芽細胞に発現させると,インスリン様成長因子(IGF-I)により惹起させる細胞周期のG1期のプログレッションが加速すること,IGF-IがCD20チャネルを活性化することなどをこれまで明らかにしてきた。今回,IGF-IがCD20チャネルを活性化する機構,とくにG蛋白の関与を検討した。その結果,IGF-I受容体によるCD20チャネル活性化には細胞質にGTPだけでなく,ATPが必要であることが明らかになった。またこのATPは非水解性のアナログAMP-PNPによって代替え可能であった。CD20チャネルは細胞内のGTP-γSによって活性化され,この作用にはATPは必要でなかった。したがってATPはGTP-γSによりG蛋白が直接活性化される際には不要であり,受容体によるG蛋白活性化の過程で必要であろうと思われた。excised modeのパッチクランプ法によるCD20チャネルの活性はG_<i2>蛋白のαサブユニットにより活性化されること,G_<i3>蛋白のαサブユニットは弱いながらも活性化作用をもつが,G_<i1>のαサブユニットやβγサブユニットには活性化作用がないことが明らかになった。さらにIGF-IによるCD20チャネル活性化は抗α_<i2>抗体を投与することにより抑制されたことから,IGF-I受容体が活性化されるとG_<i2>蛋白が活性化され,そのαサブユニットによりCD20チャネルが活性化されることが明らかとなった。
希土類酸化物-窒化ケイ素系化合物セラミックスの創製と材料科学的評価

本研究ではSi_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物の合成方法を確立し,高密度焼結体を作製してそれらの熱的・力学的性質を調べた。また,メリライト構造を有するLn_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)に着目し,これらの合成条件を確立するとともに,蛍光特性を調べた。Si_3N_4,SiO_2およびY_2O_3粉体をそれぞれのSi_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物の化学量論比となるように混合・成形したのち,14501650°Cで種々の時間,N_2気流中で加熱して目的の化合物を得た。同様に,各種Ln_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)の合成も上記の方法に準じて行い,目的の化合物を得た。Ln_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)について,これらの化合物に近紫外線を照射するとGd_2Si_3O_3N_4の場合だけが単独で発光した。このGd_2Si_3O_3N_4に対してSm^<3+>を付活剤として添加したところ,300nmの光で励起して601nmの赤色を発光した。この材料の相対発光強度は1.8であり,良好な値を示した(標準物質:CaWO_4)。以上の結果より,Si_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物の熱的・力学的性質を解明するとともに,Gd_2Si_3O_3N_4を蛍光材料として使用するための基礎を確立することができた。Si_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物にはY_2Si_3O_3N_4,YSiO_2N,Y_4Si_2O_2N_7およびY_5(SiO_4)_3Nなどがある。これらの化合物は窒化ケイ素(Si_3N_4)と同様に高温構造材料としての応用が期待できる。本研究ではまずY_2Si_3O_3N_4の合成方法を確立し,高密度セラミックス(焼結体)を作製して,その焼結体の相対密度,微細構造および熱的・力学的性質を調べた。Y_2Si_3O_3N_4を合成するため,Si_3N_4粉体とY_2O_3粉体とを化学量論比(Si/Y比=1.5)になるように混合,成形したのち,15001700°Cの種々の温度で14h,N_2気流中で加熱した。まず,加熱時間を2hに固定して結晶相に及ぼす加熱温度の影響をX線回折によって調べたところ,いずれの温度においてもY_2Si_3O_3N_4が検出されたが,1600°CにおいてはさらにY_4Si_2O_2N_7が,また1700°CにおいてはYSiO_2Nの回折線がそれぞれ認められた。つぎに,加熱温度を1650°Cに固定し,Y_2Si_3O_3N_4の結晶相に及ぼす加熱時間の影響を調べた結果,2h加熱したときにY_2Si_3O_3N_4の結晶性が最も良かった。Si/Y比(EDX法)およびN/O比(熱間ガス抽出法)を調べた結果,合成した化合物はほぼY_2Si_3O_3N_4の化学量論比と一致することが確認された。

この結果をもとに,1650°C,2h加熱して得たY_2Si_3O_3N_4粉体を成形し(一軸加圧:50MPa,CIP成形:100MPa),さらに1800°Cで4h以上常圧焼成したところ,得られた焼結体の相対密度は約95%となった。この焼結体は柱状粒子から構成されており,それらの長軸径は310μmであった。一方,ビッカース硬度は相対密度と対応しており,最高14.9GPaとなった。このY_2Si_3O_3N_4焼結体は空気中約1200°Cまで熱分解せずに安定であった。以上の結果より,(i)合成条件を制御して得たY_2Si_3O_3N_4粉体は1800°C,4h,N_2気流中で焼成すると,相対密度が約95%までち密化すること,(iii)得られた焼結体のビッカース硬度は14.9GPaと高い値を示すこと,さらに(iv)この焼結体は空気中で約1200°Cまで安定であることが分かった。希土類酸化物-窒化ケイ素系酸窒化物の諸性質を解明するため,本年度は(i)昨年度合成に成功したY_2Si_3O_3N_4以外のY系酸窒化物の合成法を検討し,得られた知見を基にGdおよびYb系酸窒化物を合成した。また,これらの化合物の熱膨張係数を明らかにしたのち,常圧焼成法およびホットプレス法によってセラミックス(焼結体)を作製して力学的性質を調べた。概要を以下に示す。出発物質にSi_3N_4,SiO_2およびY_2O_3を用いて,これらの化合物を化学量論比になるように混合したのち,Y_4Si_2O_7N_2およびY_5(SiO_4)_3Nの合成条件を検討した。その結果,最適な加熱条件はY_4Si_2O_7N_2の場合が1600°C,5h,またY_5(SiO_4)_3の場合が1450°C,2hであることを明らかにした。(i)の知見を基に,Gd系酸窒化物としてGd_2Si_3O_3N_4およびGd_4Si_2O_7N_2の合成条件を,またYb系酸窒化物としてYb_2Si_3O_3N_4およびYb_4Si_2O_7N_2の合成条件をそれぞれ検討した。その結果,Gd系酸化物を合成するための最適な加熱条件は1600°C,5hであることが分かった。一方,Yb系酸窒化物の場合,Yb_4Si_2O_7N_2は1600°C,5h、加熱すると得られたが,Yb_2Si_3O_3N_4の場合には単一相の化合物が得られなかった。この化合物の合成条件は今後さらに検討を行う予定である。(iii)各種化合物の熱膨張係数の解明X線法により測定したY_4Si_2O_7N_2の熱膨張係数(300-1050K)は8.395×10^<-6>K^<-1>,またGd_2Si_3O_3N_4およびGd_4Si_2O_7N_2の熱膨張係数はそれぞれ8.119×10^<-6>K^<-1>および14.775×10^<-6>K^<-1>であった。これらの化合物の熱膨張係数はβ-Si_3N_4の熱膨張係数(3.6×10^<-6>K^<-1>)よりも2倍以上高いもであった。(iv)高密度焼結体の作製と力学的性質の評価常圧焼成法やホットプレス法によって相対密度が95%以上の高密度なY_4Si_2O_7N_2およびY_5(SiO_4)_3N焼結体が得られた。これらの焼結体のビッカース硬度は10-15GPaの範囲にあった。本研究ではSi_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物の合成方法を確立し,高密度焼結体を作製してそれらの熱的・力学的性質を調べた。また,メリライト構造を有する各種Ln_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)に着目し,これらの合成条件を確立するとともに,蛍光特性を調べた。Si_3N_4SiO_2およびY_2O_3粉体をそれぞれのSi_3N_4-SiO_2-Y_2O_3系化合物の化学量論比となるように混合・成形したのち,14501650°Cで種々の時間,N_2気流中で加熱して目的の化合物を得た。同様に,各種Ln_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)の合成も上記の方法に準じて行い,目的の化合物を得た。Ln_2Si_3O_3N_4(Ln=Nd,Sm,Gd,DyおよびEr)について,これらの化合物に近紫外線を照射するとGd_2Si_3O_3N_4の場合だけが単独で発光した。
IL-6シグナル制御による慢性関節リウマチの分子・遺伝子治療の研究

インターロイキン6(IL-6)はRAの病態においてT細胞活性化や自己抗体産生など自己免疫反応の成立や炎症反応、破骨細胞の活性化にかかわっている。IL-6の阻害によりRAの治療と骨破壊予防の可能性がある。ヒト型化抗IL-6レセプター(IL-6R)抗体によるIL-6シグナルの阻害がRAの症状を改善し、難治性RAの新しい治療法になり得ることを、大阪大学で行った先進医療を通して明らかにしたが、IL-6の標的組織(細胞)にどのように作用するか、また複数のサイトカインの相互作用は不明であった。滑膜増殖に関しては、IL-6はTNFαによって誘導されるが、滑膜細胞から産生されたIL-6はTNFαによる滑膜の増殖を抑制し、ネガティブフィードバック因子として働くことが確認された。血管新生に関しては、IL-6そのものは血管内皮細胞の増殖をわずかに抑制するが、強力な血管内皮細胞の増殖因子であるVEGFの産生を促し、総合的には血管新生を促進した。骨・軟骨破壊にかかわる細胞外マトリックスを分解するメタロプロテアーゼ(MMPs)産生に対するIL-6、TNFα、IL-1の単独ならびに相互作用を検討したところIL-6が単独では作用せずTNFα、IL-1による滑膜細胞からのMMP-1、MMP-3産生を増強することを明らかにした。また、RAの合併症として重要なアミロイドーシスの発症にかかわるSAA1の産生に関してはTNFα、IL-1は単独では影響しなかったがIL-6はSAA1産生を促し、TNFα、IL-1の存在下ではさらに数倍増加させた。しかも、これらの作用は抗IL-6R抗体で阻害された。このことから、IL-6の阻害が滑膜増殖や血管新生、骨破壊、あるいは、二次性アミロイドーシスの予防に有効であることが示唆された。また、滑膜細胞ではIL-6の刺激により、IL-6シグナルのネガティブフィードバック因子であるSTATs-inducedSTAT inhibitor-1(SSI-1)とSSI-3が誘導されることが確認された。
産業廃棄物質の有用フッ素化合物への変換：「真の触媒化」への挑戦

有機フッ素化合物は,医薬,農薬,液晶化合物,高分子材料など様々な産業分野において利用されている。芳香族化合物へのトリフロオロメチル基の導入反応が世界中で活発に研究されており,これまでに多様な反応例が報告されてきた。一方、有機フッ素化合物中の炭素ー水素結合の効率的活性化と、その触媒的変換反応の開発は制限が多く、実用性に乏しい現状である。私たちは,フッ素系産業廃棄物を有用化合物に変換する基幹反応を見いだした。特に、塩基による含フッ素化合物の脱プロトン化と求電子剤との反応、およびシリル化トリフルオロメチルヘミアミナールを用いるクロスカップリング反応の触媒活性の飛躍的向上を実現した。有機化学
慢性疾患患者を対象としたピアサポートの提供者の技術形成と支援に関する研究

本研究では,慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,ピアサポーターが活動の中で感じる困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,ピアサポート技術に関連する要因を明らかにすることを目的として,面接調査と質問紙調査を行った.その結果,ピアサポーターは活動組織内の人間関係や他の活動・生活との両立に困難を感じていることが明らかになった.また,活動期間の長さや活動頻度の多さ,ピアサポート活動に対する満足度の高さとピアサポート技術の高さが有意に関連していた.さらに,相談事例の共有・検討に参加している者でピアサポート技術が高い傾向が認められた.本研究では,保健医療領域,特に慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,(1)ピアサポーターがサポートを提供する上での困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,(2)ピアサポーターの技術の習熟プロセスおよび習熟に影響を与える訓練内容を明らかにすることを目的としている.平成24年度は国内のピアサポート提供団体の管理者1名およびピアサポーター10名に対する面接調査を行った.ピアサポート提供団体の管理者への面接調査においては,ピアサポーターの技術形成や活動支援のために行なっている活動として,定期的な研修やメーリングリストによるサポート,電話によるサポート,マニュアル作成による標準化等が挙げられた.また,ピアサポート提供活動の今後の課題としては,他団体のとの連携や活動資金の安定的な確保,人材の安定的な確保が挙げられていた.ピアサポーターに対する面接調査では,ピアサポート活動を続ける中での困難として,正規の活動時間以外でも相談に応じなければならなくなることや,一緒に活動をするメンバーが少なく,一人一人の負担が大きくなる傾向があること,仕事や家庭との時間配分が難しいこと等が挙げられた.こうした困難の解決のためには,一緒に活動をするメンバーを増やし負担を減らすこと,活動中に困ったことを相談できる人の存在やピアサポート従事者同士の交流会が必要であることが語られた.また,ピアサポート技術を身につける方法としては,一緒に活動をしている先輩ピアサポート従事者からの学びの影響が大きく,ピアサポート活動に慣れていない間は熟練した者とペアを組んで活動をしていくことの重要性が語られた.慢性疾患患者が自己管理を身につけ,疾患によってもたらされる問題に適切に対処し,病ある生活を管理するための取り組みとして,個別指導や集団指導による患者教育が行われてきた.こうした教育の担い手は,医師や看護師等の医療専門職であったが,適切な指導が行える人材の不足や日常の診療等の業務との両立が難しいことなどから,医療専門職のみで十分な教育を行うのが難しい状況となっている.こうした状況の中,慢性疾患患者に対するケアや教育の担い手として疾患を持つ患者本人を活用するピアサポートの取り組みがより重要性を増している.本研究では,保健医療領域,特に慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,(1)ピアサポーターがサポートを提供する上での困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,(2)ピアサポーターの技術の習熟プロセスおよび習熟に影響を与える訓練内容を明らかにすることを目的としている.本研究では,平成23年度から平成25年度の3カ年のうちに,ピアサポーター・サポート提供団体の管理者への面接調査および質問紙調査を計画している.平成25年度は平成24年度に実施した面接調査の結果を日本公衆衛生学会総会で報告した.また,首都圏のピアサポート提供団体3団体の協力を得て,質問紙調査を行い,21名のピアサポート提供者から回答を得た.平成26年度は引き続き質問紙調査を行うとともに,その成果を公表していく.本研究では,慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,ピアサポーターが活動の中で感じる困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,ピアサポート技術に関連する要因を明らかにすることを目的として,面接調査と質問紙調査を行った.その結果,ピアサポーターは活動組織内の人間関係や他の活動・生活との両立に困難を感じていることが明らかになった.また,活動期間の長さや活動頻度の多さ,ピアサポート活動に対する満足度の高さとピアサポート技術の高さが有意に関連していた.さらに,相談事例の共有・検討に参加している者でピアサポート技術が高い傾向が認められた.慢性疾患患者が自己管理を身につけ,疾患によってもたらされる問題に適切に対処し,病ある生活を管理するための取り組みとして,個別指導や集団指導による患者教育が行われてきた.こうした教育の担い手は,医師や看護師等の医療専門職であったが,適切な指導が行える人材の不足や日常の診療等の業務との両立が難しいことなどから,医療専門職のみで十分な教育を行うのが難しい状況となっている.こうした状況の中,慢性疾患患者に対するケアや教育の担い手として疾患を持つ患者本人を活用するピアサポートの取り組みがより重要性を増している.本研究では,保健医療領域,特に慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,(1)ピアサポーターがサポートを提供する上での困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,(2)ピアサポーターの技術の習熟プロセスおよび習熟に影響を与える訓練内容を明らかにすることを目的としている.本研究では,平成23年度から平成25年度の3カ年のうちに,ピアサポーター・サポート提供団体の管理者への面接調査および質問紙調査を計画している.平成23年度は面接調査に先立って国内外の先行研究のレビュー,関連分野の研究者への聞き取り,サポート提供団体の技術研修のための運営担当者への聞き取り,およびサポート提供団体の会合での情報収集を行い,調査内容の検討を行った.平成24年度はこれらの検討結果を元に面接調査および質問紙調査を実施する.

本研究では,保健医療領域,特に慢性疾患患者のケアのためのピアサポート活動において,(1)ピアサポーターがサポートを提供する上での困難およびその困難を解決するための支援ニーズを明らかにすること,(2)ピアサポーターの技術の習熟プロセスおよび習熟に影響を与える訓練内容を明らかにすることを目的としている.平成26年度は平成25年度に実施したピアサポート提供者を対象とした質問紙調査の結果を日本公衆衛生学会総会で報告した.また,質問紙調査を継続し,47名から回答が得られ,平成25年度の実施分とあわせて70名から回答を得た.データの集計の結果,「精神的に疲れる」「責任が重い」「家族に迷惑をかける」ことに負担を感じるピアサポート提供者が多いことが明らかになった.活動期間の長さや活動頻度の多さ,ピアサポート活動に対する満足度の高さ,精神健康の良好さとピアサポート技術の高さが有意に関連していた.また,収入を伴う仕事を有する者の方がピアサポート技術が高い傾向が認められた.さらに,相談事例の共有・検討に参加している者でピアサポート技術が高い傾向が認められた.ピアサポート活動に対する満足度は学歴が大卒以上,活動に対する報酬を受け取っている群で高く,満足度の高さは慢性疾患が発症してからの期間の長さや精神健康の良好さと関連していた.これらの結果からピアサポート提供者は概ね活動に満足感を感じており,ピアサポートの提供に必要な技術を十分に持っていると考えられた.今後は本研究で得られた知見を元に,ピアサポート提供者の技術や活動に対する満足度をより一層高めるための方策を実施することが期待される.活動に伴う負担に関しては,ピアサポート提供者はサポート提供者としての責任に負担感を感じておりこうした負担を軽減するための支援が必要な可能性があると考えられた.健康社会学当初の計画では平成24年度に質問紙調査を実施することとなっていた.しかしながら,フィールドとの調整が難航し,調査の対象者の確保ができず,調査を実施することができなかった.平成25年度にピアサポート提供者を対象とした質問紙調査を行い,そのデータの分析結果を学会発表する予定であったが,フィールドとの調整が難航し調査実施時期が遅れたこと,および想定より回収数が少なかったため.当初の計画では平成23年度に面接調査を実施することとなっていた.しかしながら,フィールドとのスケジュール調整が難航し,面接調査の対象者の確保ができず,調査を実施することができなかった.平成25年度は面接調査結果のまとめおよび公表をを行う.また,平成24年度に実施できなかった質問紙調査を速やかに実施する.調査の実施方法は当初の計画と同様である.
関節リウマチの滑膜病変で産生される自己抗体の解析：「酵素抗原法」を活用して

「酵素抗原法」は、酵素やビオチンなどで標識した抗原を用いて、組織内の特異抗体産生細胞を可視化する組織化学的手法である。本研究では、酵素抗原法によって関節リウマチ病変滑膜における自己抗体産生細胞の証明を試みた。ヒトIgGに対する自己抗体を産生する形質細胞の可視化に成功した。一部のヒト抗原(FKBP4およびMAP1 LC3B)を免疫したラットのリンパ節で酵素抗原法を行ったところ、特異抗体産生細胞を確認できたが、ヒトのリウマチ滑膜では陰性だった。対象となる抗体産生細胞が病変部に局在していない可能性が示唆された。その他の自己抗原については病変部における抗体産生の可能性があるため、今後検討が必要である。本研究は、関節リウマチの滑膜組織における自己抗体産生細胞を酵素抗原法により可視化することを目的とする。関節リウマチ病変滑膜に浸潤する形質細胞が産生する抗体の標的抗原は明らかではなく、これら抗体を解析することで、病態解明に貢献できる可能性がある。前年度までの検討により、滑膜組織切片上に標的となる自己抗体産生細胞が局在しない可能性が疑われた。そこで、対象抗原をラットに免疫し、そのリンパ節の組織切片を陽性コントロールとして、酵素抗原法による形質細胞の染色性を検証した。滑膜組織内に自己抗体産生細胞の存在が疑われる抗原のうち、MAP1LC3BおよびFKBP4を免疫抗原とした。抗原をラットの前肢足底部に免疫して、腋窩リンパ節を採取した。リンパ節の組織切片を対象に、酵素抗原法により特異抗体産生細胞を検索した。同時に血清を採取して、ELISAにより各抗原に対する血清抗体の有無を確認した。ELISAの結果、抗原を免疫したラットの血清に明らかな抗体上昇が認められた。一方、酵素抗原法においては、組織切片を蛋白分解酵素処理することで、各抗原に対する抗体産生細胞を検出できた。さらに未標識抗原と標識抗原による競合反応を利用した吸収試験において、シグナルの減弱がみられ、切片上の抗体の抗原特異性を認めた。ラット組織における酵素抗原法で特殊な賦活操作が不要であったことから、MAP1LC3BおよびFKBP4による酵素抗原法で滑膜組織が陰性となる原因として、それら抗原に対する抗体産生細胞が滑膜組織に局在していない可能性が高まった。しかし、滑膜組織内で抗体産生が疑われる抗原として、他にHIST1H1CやKIAA0409などがあり、これらに対する抗体産生細胞については滑膜組織における存在を否定できていない。今後、酵素抗原法について新たな増感法を導入予定であり、これらの抗原に適用を試みる予定である。今年度は、これまでの酵素抗原法による検討で陽性細胞が得られたTRIM21とFBXO2について、免疫吸収試験を実施した。未標識抗原と標識抗原をPBS中で混合し、これを用いて酵素抗原法を実施したところ、TRIM21では、標識抗原単独染色で認められた陽性像が、良好に吸収された。一方FBXO2では、吸収が認められなかった。そこで、抗原希釈液をAlpahScreen(AS)で使用する緩衝液(AS buffer: 0.05M Tris、1%BSA、0.05%Tween20)に変更し、吸収試験を実施したところ、良好な吸収が認められた。単独染色においても、PBS希釈よりも、良好な染色像が得られたことから、他の抗原においても、染色性改善の手段となり得ると期待された。このAS bufferを用いて、組織抽出液でASシグナルの高い抗原を希釈して、対応する滑膜組織切片に対する酵素抗原法を実施した。しかし、陽性形質細胞の検出には至らなかった。一部の抗原で背景染色の減弱が認められたことから、抗原溶液への界面活性剤の添加や、血清タンパク等によるブロッキング処理が、抗原の種類によって有効であることが示唆された。一方、染色の過程で、二次抗体であるHRP標識抗IgG抗体に反応する少数の形質細胞が滑膜組織中に認められた。二次抗体の交差反応の可能性が疑われるが、rheumatoid factorを検出した可能性もある。そこで、ビオチン標識ヒトγ-globulinをプローブとして酵素抗原法を実施したところ、陽性細胞が検出された。したがってこの陽性シグナルはrheumatoid factorを検出している可能性が高い。今後、ビオチン標識ヒトIgGを用いた検討をさらに加える予定である。本研究では、コムギ胚芽無細胞系で合成した自己抗原を用いた「酵素抗原法」の染色条件を検討することを目的としている。しかし、酵素抗原法の染色性改善を期待して、種々の工夫を検討したものの、良好な結果が得られておらず、目的は達成できていない。

その理由として、染色対象としている組織切片上に、標的となる抗体を産生する形質細胞が浸潤していない可能性が考えられる。今後、この点を補えるような対応が必要である。酵素抗原法で良好な染色像が得られない理由として、染色対象の組織に、対象の抗原に対する特異抗体を産生する形質細胞が浸潤していない可能性がある。組織抽出液のAlphaScreen(AS)のシグナルが高値であることから、組織内の抗体の産生が疑われる。しかし、ASに使用した組織と酵素抗原法に使用した組織は、連続性はあるものの、同一の組織ではない。そのため、ASで認められた抗体を産生する形質細胞が酵素抗原法を実施した組織に確実に存在するとは限らない。そこで、今年度はラットに抗原を免疫して、確実に抗体産生を誘導する。そして、免疫ラットのリンパ節を対象に種々の検討を加える予定である。そのうえで、リウマチ滑膜を対象に、酵素抗原法を実施する予定である。次年度の研究費は動物免疫実験に使用する。具体的には1.免疫実験用ラット、2.免疫用精製抗原の作製、3.免疫実験用試薬・消耗品に充てる。また、rheumatoid factorを対象とした酵素抗原法の実験にも充当する予定である。翌年度に請求する研究費は、酵素抗原法の条件検討用試薬類、染色用標識抗原蛋白の合成に使用するほか、愛媛大学での実験・研究打ち合わせおよび学会発表のための旅費として使用する予定である。