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ヒトips細胞を用いた脳内細胞移植における安全性の検討研究課題名

ヒトips細胞から効率よく安全な神経を分化させるためにBMP系, Activin系をそれぞれ低分子化合物で阻害する事、分化誘導期間を長くする事、移植前にNotchという因子を阻害する事が有効であることを発見した。これらの方法により分化誘導したips細胞由来の神経前駆細胞をサルパーキンソン病モデルに移植して生着を確認した。さらにゲノムへの外来遺伝子の挿入がなく、安全性の高いips細胞でも、既存のips細胞やES細胞と同等にドーパミン神経が誘導されることを示した。ヒトinduced pluripotent stem cells(iPS細胞)を利用した細胞移植治療の安全性についての検討を行っている。特にips細胞から神経細胞への分化を行い、それをパーキンソン病モデル脳内へ移植する系で実験を行っており、将来はパーキンソン病の新たな治療法の確立が目標である。inhibitorである低分子化合物の使用が有効であることを発見した。従来の多能性幹細胞からの神経誘導法に加え、これらの化合物を用いることにより未分化な幹細胞は著明に減少し、神経系へと分化していることが示された。未分化な幹細胞が移植細胞中に残存していると、移植後の腫瘍形成の原因となることが考えられるので、安全性という意味でもこの方法は非常に有効である。以上の成果は国内および国際学会で報告し、現在論文投稿中である。特にiPS細胞から神経細胞への分化を行い、それをパーキンソン病モデル脳内へ移植する系で実験を行っており、将来はパーキンソン病の新たな治療法の確立が目標である。初年度にはヒトiPS細胞から効率よく神経を分化させるためにBMP inhibitor, Activin/Nodal/TGFβinhibitorである2つの低分子化合物の使用が相補的に有効であることを発見した。従来の多能性幹細胞からの神経誘導の効率が格段に向上した。次年度には成果を国内および国際学会で報告し、論文発表も行った。さらに移植前の神経分化の度合いをより成熟させ、移植後の神経組織の過増大を抑制するためにNotch inhibitorが有効であることが示され、現在論文発表を準備しいている。Parkinson病に対する神経細胞移植では特にドーパミン産生神経の移植が必要となる。上記低分子化合物は神経のサブタイプであるドーパミン産生神経への分化方向は左右しない。細胞株による分化指向性が存在することがわかりつつある。神経に分化することは安定しているので、今後はドーパミン産生神経へと強力に分化を誘導する方法、物質などを模索していく。成果:平成21年度にはヒトiPS細胞から効率よく神経を分化させるためにBMP inhibitor, Activin/Nodal/TGFβinhibitorである2つの低分子化合物の使用が相補的に有効であることを発見した。分化細胞の純度が上がるため、安全性という意味でもこの方法は非常に有効である。平成22年度には成果を国内および国際学会で報告し、論文発表も行った。さらに2つの化合物を用いて分化誘導したiPS細胞由来の神経前駆細胞をサルパーキンソン病モデルに移植して生着を確認した。分化誘導期間を長くすることで、移植後のグラフトの増大が抑えられる事も判った。この業績を平成23年度に論文発表した。さらに移植前の神経分化の度合いをより成熟させるためにin vitroにおいてNotch inhibitorが有効であることがわかり、移植前のNotch inhibiroの処置が移植後の神経組織の過増大を抑制することが示され、現在論文発表を準備しいている。ドーパミン神経前駆細胞の表面マーカーCorinがドナー細胞の純化に有用であることがわかり、選別細胞は移植後の腫瘍形成の危険も少ない事が判った。この成果についても論文準備中である。遺伝子導入によるiPS細胞の腫瘍化の危険性については、ES細胞との明確な差異は現段階では認められていない。さらにゲノムへの外来遺伝子の挿入のないiPS細胞の樹立技術が確立され、そのような新しいiPS細胞からもドーパミン神経が誘導されることがわかり、平成23年度に論文報告した。
早産および低出生体重児出産と歯周病との関係

歯周病が早産・低体重児出産のリスクファクターとなるかについては、諸外国でさまざまな調査が行われているが、未だ定まった見解は得られていない。一方、日本では妊婦の歯周病に関する研究自体が少なく,妊婦の歯周病罹患状態には不明な点が多い。本研究の目的は,日本在住妊婦の歯周病罹患状態が早産のリスクファクターとなり得るか前向きコホート研究にて調査することである。本研究の結果より、歯周病は,日本在住妊婦に対して早産・低体重児出産の発症に関与する可能性が示唆された。妊婦の歯周病は早産発症のリスクファクターとなる可能性が指摘されている。しかしながら、早産には多様な因子が関与し、また、本邦においては妊婦の歯周病に関する研究自体が少なく、まだ一定の見解には至っていない。本研究では、日本における妊婦の歯周病の発症率ならびにその全身の炎症状態との関連、および歯周病罹患状態が早産のリスクファクターとなり得るかを前向きコホート研究にて調査した。昭和大学病院産婦人科で分娩を予定して健診を受けている妊婦のうち、本研究の協力に書面で同意した165名(初産婦92名、経産婦73名)を対象とし、妊娠初期に歯周病検査、血清サイトカイン(IL-6)の測定を行った。その後、歯周病検査結果と今回の妊娠経過との関連を前方視的に調査した。本研究は当院倫理委員会の承認の下で行われた。その結果、1)分娩終了した妊婦102名(初産婦58名、経産婦44名)の内、歯周病陽性例が77例(75.5%)であった。2)IL-6が測定可能であった78名の内、歯周病陽性例(54例)のIL-6は2.0±4.7pg/mlで、陰性例(24例)の1.2±0.4pg/mlと比較し高い傾向を示した。3)現在までに早産となった症例は7例で、そのすべてが歯周病陽性例であった。今回の結果より、日本での妊婦の歯周病有病率は75.5%であった。歯周病は局所の炎症のみならず、血清のIL-6を上昇させるなど全身の炎症反応と因果関係が存在し、それが早産発症に関与している可能性が示唆された。一方、日本では妊婦の歯周病に関する研究自体が少なく、妊婦の歯周病罹患状態には不明な点が多い。本研究の目的は、日本在住妊婦の歯周病罹患状態が早産のリスクファクターとなり得るか前向きコホート研究にて調査することである。当大学病院産婦人科で分娩を予定して健診を受けている日本在住妊婦(外国人2名含)のうち、本研究の協力に書面で同意して2009年6月から2011年12月までに分娩終了した187名(初産婦107名、経産婦80名)を対象とし、妊娠初期に歯周病検査、妊娠経過との関連を調査した。なお、本研究は所属機関の医の倫理委員会の承認の下で行われた。その結果、歯周病群は初産婦81名(75.7%)、経産婦58名(72.5%)だった。また、早産は初産婦3名、経産婦7名の10名(5%)であり、その全てが歯周病群であった。妊娠期間や出生時体重、年齢と各種歯周病マーカーとの関連を調べた結果、初産では平均Plaque Index (PlI) vs妊娠期間、総歯数vs IL-6、経産婦では年齢vs出生体重、プロービング深さ4mm以上の歯面の割合vs妊娠期間、IL-6 vs年齢、TNF-αvs妊娠期間、平均Gingival Index (GI) vs妊娠期間、Bleeding on probing(+)率vs妊娠期間において有意な相関がみられた。歯周病は,早産に寄与する可能性が示唆された。今後,被験者数を増やし,各因子の相対リスクの検討も行う必要がある。
A環アナログから探る活性型ビタミンDの作用メカニズム

活性型ビタミンDは生体のカルシウムホメオスタシスを司るのみでなく,細胞の分化増殖に関わるホルモンである.その作用は特異的核レセプター(VDR)が担い,リガンドとの複合体形成が作用発現の引き金になると言われている.活性型ビタミンDは柔軟性が高く,多くの配座を取りうる.特に,6員環構造のA環は2つの椅子型配座間の速い平衡にあり,いずれの構造が受容体結合に関与するのか明らかでない.アナログは生体内のある挙動にスポットを当て,内在性リガンドを扱うだけでは見えない事実を明らかにする.既知の方法では合成困難であるA環アナログをツールとして,ビタミンDの作用メカニズムを探索するため実験に着手した.シンプル,かつ効果の高いアナログとして,A環上1位,2位,3位にメチル基を導入した化合物をデザインした.A環修飾を容易にするために,A環と別途合成したCD環部を後に連結する収束的合成法を用いた.受容体結合時リガンドは,水酸基のconfigurationではなくA環全体として認識されると考える.従って,独自に確立した合成法により,A環上の置換基について可能な立体異性体すべてを合成した.A環配座の固定は1位,又は3位メチル基導入により達成された.VDR親和性を指標に活性を評価したところ,水酸基の立体だけでなくメチル基の位置や立体によっても活性が変化することを見出した.特に,2α位メチル基導入が天然リガンドの活性を増強することが明らかとなった.その根拠は,VDRのX線結晶解析を用いたドッキングスタディによって示された.活性型ビタミンD(1α,25-dihydroxyvitamin D_3)は生体のリン・カルシウムのホメオスタシスを司るのみでなく,細胞分化や増殖に関わるホルモンである.その多様な作用は骨粗鬆症や癌治療への応用を期待させ,誘導体合成の推進力となっている.しかし,合成上の困難のために,活性型ビタミンDのA環修飾体は少なく,活性保持に必要な構造に未だ議論が残っている.そこで,A環構造と活性の関連を検討するため,A環にメチル基を導入した誘導体をデザインした.A環上の2つの水酸基は天然型である(1α,3β)が活性が強く,いずれのエピマーも活性が大きく低下することが知られている.しかし,ビタミンD作用発現の引き金となるビタミンDレセプター(VDR)との結合では,水酸基のconfigurationではなくA環全体として認識されると考え,天然型(1α,3β)に固定せず,A環上の置換基について可能なすべての立体異性体を合成した.その結果,A環部2α位へのメチル基導入がVDR結合能を天然型の4倍に増強することを見いだした.さらに,A環2位メチル置換に加え,側鎖部20位エピ化を組み合わせると,VDR結合能が加算的に上昇した.これらふたつの構造修飾が,それぞれビタミンD活性にどのような効果をもたらすのかを調べるため,側鎖部に種々の修飾を加えた2位メチル誘導体を合成し,その興味深い生理活性を見いだした.現在,その分子レベルでの作用を検討している.活性型ビタミンDは生体のカルシウムホメオスタシスを司るのみでなく,細胞の分化増殖に関わるホルモンである.その作用は特異的核レセプター(VDR)が担い,リガンドとの複合体形成が作用発現の引き金になると言われている.活性型ビタミンDは柔軟性が高く,多くの配座を取りうる.特に,6員環構造のA環は2つの椅子型配座間の速い平衡にあり,いずれの構造が受容体結合に関与するのか明らかでない.アナログは生体内のある挙動にスポットを当て,内在性リガンドを扱うだけでは見えない事実を明らかにする.既知の方法では合成困難であるA環アナログをツールとして,ビタミンDの作用メカニズムを探索するため実験に着手した.シンプル,かつ効果の高いアナログとして,A環上1位,2位,3位にメチル基を導入した化合物をデザインした.A環修飾を容易にするために,A環と別途合成したCD環部を後に連結する収束的合成法を用いた.受容体結合時リガンドは,水酸基のconfigurationではなくA環全体として認識されると考える.従って,独自に確立した合成法により,A環上の置換基について可能な立体異性体すべてを合成した.A環配座の固定は1位,又は3位メチル基導入により達成された.VDR親和性を指標に活性を評価したところ,水酸基の立体だけでなくメチル基の位置や立体によっても活性が変化することを見出した.特に,2α位メチル基導入が天然リガンドの活性を増強することが明らかとなった.その根拠は,VDRのX線結晶解析を用いたドッキングスタディによって示された.
転写開始過程におけるσ因子の動態

大腸菌における主要σ因子であるσ70、終止期特異的に働くσ38、窒素代謝関連遺伝子の発現に働くσ54の3種のσ因子を対象に、分子上の様々な位置に1個のみシステイン残基を持つ変異体をそれぞれ12種類、9種類、5種類作成した。システィン特異的な修飾反応を使って、これらのσ変異体のそれぞれにペプチド鎖・ヌクレオチド鎖切断活性を持つ鉄・EDTA誘導体を導入した。ホロ酵素を再構成したのち、切断反応を行なって、RNAポリメラーゼのβ、β'サブユニット上の切断位置を同定した。また、DNAを加えて転写開始複合体を形成させたのちに切断反応を行ない、鋳型DNAの切断位置を調べた。その結果から、3種類のσ因子がコア酵素上のほぼ同一の領域と接触していること、転写開始複合体中でのσ因子の配向が互いによく似ていることが示された。β'サブユニットの種々の領域を含むフラグメントを調製し、in vitroでのσ70との結合を調べた結果、保存領域Bを含む201から345までの領域が、量も強い結合活性を示した。この結果は鉄・EDTA誘導体を用いた上の結果ともよく一致しており、この領域が主なσ因子結合部位であると結論された。σ70の保存領域のうち機能がわかっていない4.1領域に注目し、保存性の高いアミノ酸をAlaに置換した変異体11種を作成して、in vitro転写およびDNaseIフットプリンティングによる解析を行なった。その結果、4.1領域はプロモーターの認識に直接関わってはいないものの、4.1領域上のいくつかのアミノ酸残基が、恐らくはコア酵素との相互作用を介して、σの4.2領域とプロモーターの-35配列との正確な配向を決めるのに重要な役割を果たしていることが示唆された。大腸菌のそれぞれのσ因子の細胞内での存在量と増殖相による変動を測定した。またin vitroでそれぞれのσ因子のコア酵素への結合活性を測定した。これらのデータからそれぞれのホロ酵素の細胞内での存在量を推定するこくとができた。また、いくつかのσ因子の組み合わせについて、それぞれの濃度およびコア酵素への親和性を反映して実際にσ因子の交換が起こることをin vitroで示した。RNAポリメラーゼのσサブユニットは、RNAポリメラーゼによるプロモーターの認識と、転写開始点付近のDNA二重鎖の開裂に中心的な役割を果たすと考えられている。多くのバクテリアはプロモーター認識の特異性がそれぞれ異なる複数種のσを持つ。大腸菌における主要σであるσ^<70>、終止期特異的に働くσ^<38>、窒素代謝関連遺伝子の発現に働くσ^<54>の3種のσ因子を対象に、分子上の様々な位置に1個のみシステイン残基を持つ変異体をそれぞれ12種類、9種類、5種類作成した。システイン特異的な修飾反応を使って、これらのσ変異体のそれぞれにペプチド鎖・ヌクレオチド鎖切断活性を持つ鉄・EDTA誘導体を導入した。

その結果から、3種類のσ因子がコア酵素上のほぼ同一の領域と接触していること、転写開始複合体中でのσ因子の配向が互いによく似ていることが示された。特にσ^<54>は一次構造上は他のσ因子と全く似ていないにもかかわらず、高次構造およびコア酵素やプロモーターDNAとの結合様式が他のσと類似していることを示唆している点で興味深い。今後は閉鎖複合体や不全開始複合体についても同様の解析を行ない、転写開始過程におけるσ因子を含めた転写複合体全体の構造変化を追跡する予定である。RNAポリメラーゼのσサブユニットは、RNAポリメラーゼによるプロモーターの認識と、転写開始点付近のDNA二重鎖の開裂に中心的な役割を果たすと考えられている。大腸菌における主要σであるσ70、終止期特異的に働くσ38、窒素代謝関連遺伝子の発現に働くσ54の3種のσ因子を対象に、分子上の様々な位置に1個のみシステイン残基を持つ変異体をそれぞれ12種類、9種類、5種類作成した。システイン特異的な修飾反応を使って、これらのσ変異体のそれぞれにペプチド鎖・ヌクレオチド鎖切断活性を持つ鉄・EDTA誘導体を導入した。ホロ酵素を再構成したのち、切断反応を行なって、RNAポリメラーゼのβ、β'サブユニット上の切断位置を同定した。また、DNAを加えて転写開始複合体を形成させたのちに切断反応を行ない、鋳型DNAの切断位置を調べた。特にσ54は一次構造上は他のσ因子と全く似ていないにもかかわらず、高次構造およびコア酵素やプロモーターDNAとの結合様式が他のσと類似していることを示唆している点で興味深い。σ70の保存領域のうち機能がわかっていない4.1領域に注目し、保存性の高いアミノ酸をAlaに置換した変異体11種を作成して、in vitro転写およびDNaseIフットプリンティングによる解析を行なった。また、529番め以降のアミノ酸配列を持つC末端フラグメントに同じ11種類の変異を導入して、N末端フラグメントとの相補性に与える影響を調べた。それらの結果から、4.1領域はプロモーターの認識に直接関わってはいないものの、4.1領域上のいくつかのアミノ酸残基が、σの4.2領域とプロモーターの-35配列との正確な配向を決めるのに重要な役割を果たしていることが示唆された。昨年度に引き続き以下の研究を行なった。RNAポリメラーゼのσサブユニットはRNAポリメラーゼによるプロモーターの認識と、転写開始点付近のDNA二重鎖の開裂に中心的な役割を果たすと考えられている。システイン特異的な修飾反応を使って、これらのσ変異体のそれぞれにペプチド鎖・ヌクレオチド鎖切断活性を持つ鉄・EDTA誘導体を導入したホロ酵素を再構成したのち、切断反応を行なって、RNAポリメラーゼのβ、β'サブユニット上の切断位置を同定した。
シャペロニンGroELの標的タンパク質認識の分子機構

この研究では、細胞内でのタンパク質構造形成とin vitroの巻き戻り反応との関連を調べる目的で、α-ラクトアルブミン(αLA)とスタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase)の巻き戻りの速度過程に及ぼすシャペロニンGroELの影響をストップフロー蛍光スペクトルを用いて調べた。その結果、SNaseとアポαLAとでは巻き戻り反応に対するGroELの影響が、見かけ上、大きく異なっていることがわかった。GroELの濃度を変えてタンパク質の巻き戻り反応を測定し見かけ上の巻き戻り速度を求めると、アポαLAで巻き戻りの速度定数が変化するのに対し、SNaseではフリーで巻き戻る時の主要な速度過程の変化量が小さくなり、GroELが過剰になるとGroELとの結合状態で巻き戻る遅い過程のみになった。この時、それぞれの過程の速度定数に大きな変化はなかった。GroEL存在下での巻き戻り反応のイオン強度依存性から、上の違いが二つの標的タンパク質の静電的性質の違いによりもたらされることが明らかとなった。αLAは酸性タンパク質であり中性pHで正味電荷-7を持つのに対し、SNaseは塩基性タンパク質で正味電荷は+12である。一方、GroELは強い酸性タンパク質でモノマー1分子当たり-20(14量体では-280)に帯電している。従って、αLAとGroELとの間には静電反発力が働くのに対し、SNaseとGroELとの間には静電引力が働く。本研究により、シャペロニンGroELの標的タンパク質認識には疎水性相互作用とともに長距離の静電相互作用も重要であることが明らかになった。次に我々は、GroELと標的タンパク質は可逆的に結合するが、GroELとの結合状態でも標的タンパク質が巻き戻る経路が存在すると言うスキームを立て、計算機上でGroELの影響を受けながらタンパク質が巻き戻る過程をシミュレートした。その結果、上の二つの標的タンパク質の巻き戻りにたいするGroELの影響は見かけ上大きく異なったが、いずれも、同一の反応スキームで説明されることがわかった。代表的な分子シャペロンである大腸菌GroELの標的タンパク質認識の分子機構を明らかとする目的で、ウシα-ラクトアルブミン(αLA)のMG状態からの巻き戻り反応に及ぼすGroELの影響をストップトフロー蛍光スペクトルにより調べた。GroELが共存するとアポαLAの巻き戻り速度が低下し、αLAのMG状態がGroELにより認識されることが明らかとなった。各タンパク質の濃度を巻き戻り速度低下率よりMG状態にあるαLAとGroELとの結合定数が求められた(pH7、イオン強度0.1Mで5×10^5M-1)。この結合は、1μM程度の濃度下でなされる分子篩いクロマトグラフィーでは観測することができなかったが、巻き戻りの速度過程に及ぼすGroELの影響を解析することにより定量的に評価できた。結合が室温ではエントロピー駆動であること、結合に伴って熱容量が大きく減少することより、この結合は疎水性相互作用によりもたらされると考えられる。GroELは強い酸性タンパク質であり、同じ酸性タンパク質であるαLAとの結合はイオン強度の増大とともに強くなることも観測された。従って、GroELの標的タンパク質認識には、静電相互作用も重要である。上の事実より、GroELは、塩基性タンパク質の中間体に対しては特に強い親和性を示すことが期待される。そこで、スタフィロコッカルヌクレアーゼのP117G+P47A変異体の巻き戻り速度に対するGroELの影響をストップトフロー蛍光スペクトルにより調べた。数マイクロモル過剰のGroELの存在下で、ヌクレアーゼの巻き戻りが停止し、GroELからの解離と巻き戻りの進行には過剰のATPが必要であることが明らかとなった。スタフィロコッカルヌクレアーゼP47A+P117

G変異体(SNaseAG)の酸変性状態からのpHジャンプによる巻き戻り速度過程に及ぼすGroELの影響を調べた。この条件下で遊離SNaseAGの巻き戻りは3相で表される。SNaseAGに対するGroELの影響は、前年度のαLAに対する場合よりもはるかに強力で、GroELの14量体濃度がSNaseAGに対し等モル以下でも、SNaseAGの巻き戻りの速い相の振幅が減少するのが観測された。これは、SNaseAGとGroELとの結合がほとんど不可逆的におき、GroELに結合したSNaseAGの巻き戻り速度が著しく低下することを示している。GroELがSNaseAGに比べ過剰に存在するとき、SNaseAGの巻き戻り過程は1相となり、速い相の巻き戻りの速度は2桁遅くなる。MgATPがあるときには、巻き戻りの速度は1桁しか遅くならないので、ATPによりGroELと標的タンパク質の結合が弱められると考えられる。イオン強度を0.15Mから0.01Mに下げると、GroEL存在下でのSNaseAGの巻き戻りの速度は更に10分の1になった。前年度標的タンパク質として用いたα-ラクトアルブミン(αLA)とは逆に中性pHでSNaseは正の電荷を持つので、イオン強度の減少によってSNaseAGとGroEL間の静電的な引力が強くなり両タンパク質の結合が更に強くなったものと思われる。このように、SNaseAGとαLAのGroELに対する親和性の違い、両標的タンパク質とGroELとの結合強度のイオン強度依存性のいずれも静電相互作用により合理的に解釈することができる。昨年度までの研究により、スタフィロコッカルヌクレアーゼ(SNase)の巻き戻り中間体はGroELにより強く認識され、大過剰のGroELが存在すると、SNaseはGroELとの結合状態のまま、ゆっくりと(速度定数0.01s^<-1>)巻き戻ることがわかっている。しかし、野生型SNaseとP47T+P117G変異体では、すべてのSNase分子がGroELとの結合状態で巻き戻るためには、SNaseに対して二倍モル以上のGroEL14量体を加えなくてはならない。SNase1分子に対して2分子のGroELが結合することは考えにくいので、これは、SNaseとGroELとの結合反応速度がフリーのSNaseの巻き戻り速度と拮抗しているためであると考えられる。そこで、巻き戻り速度の遅くなったSNase変異体、A90SとA69Tの巻き戻りに及ぼすGroELの影響を調べた。いずれの変異体に対しても、1/2モルGroELの添加により、巻き戻り反応の大部分がGroELとの結合状態で進行するのが観測され、SNaseとGroELとの結合のストイキオメトリーは2:1([SNase]:[GroEL])であることが分かった。SNaseとアポαラクトアルブミン(αLA)とでは巻き戻り反応に対するGroELの影響が、見かけ上、大きく異なっていることがわかった。
根管内破折したNiTiファイルを腐食により脆弱化させて除去を容易にする方法の確立

NiTiファイル破折片の腐食溶解に要する時間は、ファイルをAPFへ浸漬した後にNCNへ浸漬することで、効果的に短縮することが明らかとなった。また、近年臨床応用されている金属格子の相の異なるNiTiファイル破折片においても、APF浸漬後にNCNへ浸漬することで、効果的な腐食溶解が可能であった。NiTiファイル破折片の除去法を確立し臨床応用するためには、破折片の短時間での腐食溶解や金属格子の相の異なるNiTiファイルの腐食溶解が必要であり、本研究の結果は極めて重要である。[目的]申請者はこれまでの研究で、2種類の溶液に324時間浸漬することでNiTiファイル破折片が腐食溶解し、溶液によってその腐食様相が異なることを明らかにした。また、溶液温度の上昇および通電によって腐食溶解にかかる時間が短縮すること、間欠的な浸漬においても連続的な浸漬と同様の効果があることを明らかにした。しかし、臨床応用するためにはより効果的・効率的な腐食溶解が求められる。そこで平成25年度の研究では、腐食溶解に要する時間をより短縮するために、腐食様相の異なる2種類の溶液を相互的に作用させるハイブリッドな条件がNiTiファイルの腐食に及ぼす影響を検討した。[方法]NiTiファイルはProTaper(Dentsply Maillefer)F2を使用した。NiTiファイルは先端より5mmの部位で回転して破断させたものを試料とした。浸漬薬液には、10%(w/v)次亜塩素酸ナトリウム溶液に19%(w/v)塩化ナトリウムを加えて調製した薬液(以下NCN)と、pH4.5に調整したリン酸酸性2%(w/v)フッ化ナトリウム溶液(以下APF)を、37°Cに設定し1試料当たり5ml用いた。NCNに浸漬し続ける群(N群)、APFに浸漬し続ける群(A群)、NCNに浸漬後APFに浸漬する群(NA群)そしてAPFに浸漬後NCNに浸漬する群(AN群)を準備して、浸漬前後の重量を測定した。[結果]すべての実験群でNiTiファイルの重量の減少が認められ、AN群、N群、NA群、A群の順に重量の減少が多かった。特にAN群では他の実験群と比較して重量減少が著しく、有意水準1%で有意差が認められた。[結論]NiTiファイル破折片をAPFへ浸漬した後にNCNへ浸漬することで、効果的な腐食溶解時間の短縮が可能であった。臨床における治療時間を考慮した場合には、NiTiファイル破折片の短時間での腐食溶解が必要であり、破折片の除去法を確立し臨床応用するために、本年度の結果は極めて重要である。[目的]申請者はこれまでの研究で、2種類の薬液に324時間浸漬するとNiTiファイル破折片が腐食溶解し、薬液によって腐食様相が異なること、種々の方法で効果的な腐食溶解時間の短縮が可能であることを明らかにした。しかし、熱処理工程を工夫し金属格子の相の異なったNiTiファイルが登場し、これらが同様に腐食溶解するのか明確にされていない。そこで平成26年度の研究では、これらに対して効果的な腐食溶解が可能であるかを検討した。[結果]UNIではすべての実験群でファイル重量の減少が認められ、AN群、N群、A群の順に減少量が多かった。NEXでは、N群で腐食溶解するものとしないものが認められた。しかし、AN群、A群はUNIと同様に腐食が認められ、この順で重量減少が多かった。特にAN群では有意水準1%で有意差が認められた。[結論]金属格子の相の異なるNiTiファイル破折片においても、APF浸漬後にNCNへ浸漬することで、効果的な腐食溶解が可能であった。臨床での治療時間を考えた場合に、様々の相のNiTiファイル破折片の短時間での腐食溶解が必要であり、破折片の除去法を確立し臨床応用するために、本年度の結果は極めて重要である。医歯薬学平成25年度の研究実施計画では、これまで明らかになっている溶液温度・間欠的な作用・通電条件に加えて、新たに明らかになったハイブリッドな作用を組み合わせることが、NiTiファイル破折片の腐食溶解に及ぼす影響を検討し、より臨床応用に適した条件の検索までを行う予定であった。2種類の溶液のハイブリッドな作用の検討に対して、条件設定のための予備的実験に思いのほか苦慮を重ねたため、より臨床応用に適した条件の検索に関しては現在実験中となっている。今年度の研究では、NiTiファイル破折片をAPFへ浸漬した後にNCNへ浸漬することで、効果的な腐食溶解時間の短縮が可能であることが明らかとなった。このことは破折ファイルの除去法を確立するために重要であり、おおむね順調に進展しているといえる。これまでの研究で明らかになっている条件を総合的に組み合わせた条件設定を検討し、より臨床応用に適した条件を検索する。

また、根管模型上でNiTiファイル破折片の腐食溶解実験を行うことで、破折ファイルの除去法の確立を目指していく。2種類の溶液のハイブリッドな作用の検討に対して、条件設定のための予備的実験に思いのほか苦慮を重ねたため、予定よりNiTiファイルの使用量が少なかったために、次年度使用額が生じた。これまでに明らかになっている条件を組み合わせて実験を行うため、NiTiファイルを多量に使用する予定である。模型を使用した除去実験では根管模型を多量に使用する予定である。また、研究成果を国内学会で発表予定であり、その旅費として使用予定である。
食事成分の腸管吸収におけるリンパ系輸送の役割の解明

本研究ではリンパ系輸送の脂溶性食事成分吸収に対する寄与を再評価するとともに、脂質以外の食事成分に対するリンパ系輸送の役割について検討した。ビタミンEやカロテノイドの場合、小腸管腔における水への溶解性を向上させることでリンパへの輸送量が増加したが、フラボノイド配糖体では脂肪酸が吸収を抑制することが示唆された。また、疎水性が比較的高いメトキシフラボノイドはリンパへ輸送されやすいことが示唆された。ケルセチン含有タマネギ摂食後のヒト血漿ケルセチン代謝物について分析を行ったところ、タマネギ調理時に食用油を添加することにより、ケルセチン代謝物の血漿濃度が有意に上昇したもののわずかであった。リンパカニュレーションラットにケルセチン配糖体の投与を行ったところ、ケルセチンアグリコンで示された油脂による吸収促進と異なり、吸収が抑制されるという結果が得られた。このことから、油脂によるヒトでの弱い吸収促進はケルセチン配糖体の吸収を高めるのではなく、タマネギ組織からのケルセチン配糖体の遊離と分散促進に関与している可能性がある。カロテノイドのリンパ吸収実験において、プロビタミンAカロテノイドの吸収を比較したところ、βクリプトキサンチンが最も吸収されやすかった。βカロテンのリンパ液への出現は非常に少なく、また代謝後のレチニルエステルについてもリンパ液中濃度が低かったことから、βカロテン投与後ラット門脈血を直接採取し分析を行ったところ、同量のレチノールを投与した場合に比べてレチニルエステル濃度ははるかに低かった。すなわち、本実験の条件においては、βカロテンの吸収はβクリプトキサンチンに比べてかなり低いことが示唆された。さらに、αカロテンはほとんど吸収されないことも示唆された。リンパ輸送に欠かせないカイロミクロン合成を細胞レベルで解析するためのヒト小腸由来Caco-2細胞CD36遺伝子導入モデルについて、その性質を解析した。RI標識脂肪酸を用いた細胞への取り込み実験を行ったところ、CD36導入による初期取り込み濃度上昇は見られなかったが24 hインキュベートにおいては細胞取り込みが増加することが示唆された。CD36の細胞内局在を調べたところ、細胞膜への移行が不十分で小胞体にCD36が留まっていることが示唆されたため、遺伝子導入株の再構築を検討している。今年度は、フラボノイドとして柑橘類に豊富に含まれるヘスペレチンについてリンパ輸送の可能性を検討した。その結果、十二指腸にヘスペレチン(アグリコン)を投与したリンパカニュレーションラットのリンパ液中からヘスペレチン抱合代謝物が検出されるとともに、同時に採取した末梢血漿からもヘスペレチン抱合代謝物が検出されたことから、ヘスペレチンは腸管細胞による代謝を受けた後、門脈と腸管リンパの両方に輸送されることが示唆された。これまでに報告したケルセチンの場合と比較し、ヘスペレチン投与時には末梢血漿濃度に対するリンパ液中濃度比が高くなる傾向が示された。ヘスペレチンは化学構造上ケルセチンよりも脂溶性が高く、抱合代謝物においてもおそらく脂溶性がやや高いことから、脂溶性成分の輸送経路となるリンパへの移行割合が高かったものと推定された。カロテノイドのリンパ吸収実験においては、昨年度に引き続きプロビタミンAカロテノイドの吸収を比較した。疎水性のカロテノイドを充分に溶解させた状態でリンパカニュレーションラットに投与したところ、βカロテンの吸収性には著しい向上がみられたが、αカロテンの吸収性は可溶化によってもほとんど向上せず、ラット小腸にはαカロテンとβカロテンを区別して吸収する機構が存在している可能性が示された。また、ナノ粒子加工により可溶化したビタミンEのリンパ輸送についても評価を行ったところ、ナノ化によりビタミンEの吸収性は向上することが示唆された。培養細胞実験ではこのような効果はみられておらず、今後促進機構についてさらに検討する必要がある。これらの成果に加えて、今年度は食品汚染物質である有機水銀の吸収性に対する油脂の影響を検討した。メチル水銀は一部がリンパ液へと輸送されるため、種々の食事性油脂との同時投与実験を行ったが、油脂によるメチル水銀の吸収を促進する作用はみられなかった。リンパカニュレーションラットの十二指腸に大豆油とともに投与したケルセチンの代謝物は、リンパ液中でカイロミクロンには局在していないことを示唆する結果を既に得ていた。今年度はn数を増やして検討し、ケルセチン代謝物はカイロミクロン画分およびカイロミクロン除去液のいずれにも均等に分配していることを明らかにした(論文投稿中)。そこでヒトがタマネギから摂取したケルセチンのヒト血中カイロミクロン画分局在を確認するためタマネギソテーのヒト摂食試験を行い、血漿ケルセチン代謝物濃度について現在解析中である。疎水性食事成分の代表としてビタミンEについても検討する計画であったが、これを変更し、疎水性強度の異なる類似分子が多数存在するカロテノイドを用いたラットリンパ輸送比較実験を行った。

代表的なプロビタミンAであるβーカロテンの場合、十二指腸投与後にβーカロテンはリンパ液、末梢血液いずれにおいても検出限界以下であったが、代謝物であるレチニルエステルが双方から検出された。一方、含酸素キサントフィルのプロビタミンAであるβークリプトキサンチンを投与すると、未代謝のカロテノイドおよびレチニルエステルがリンパ液から検出されたものの、末梢血からはいずれも検出されなかった。このことから、小腸上皮でのプロビタミンAの代謝後、生じるレチノイドのリンパあるいは門脈への輸送は親化合物によって異なっている可能性が示された。またカイロミクロンアセンブリをより詳細に解析する培養細胞モデルを確立するため、CD36遺伝子を導入したCaco-2細胞について脂質代謝に関する形質の変化を検討した。その結果、CD36発現細胞へのトリグリセリド蓄積量が顕著に増加したものの、基底膜側へのトリグリセリド分泌量の増加は非常に小さかった。CD36の発現増強が弱すぎた可能性もあり、より発現量が増加した細胞株の構築を行い、その性質を現在検討している。フラボノイドにおいては、実際の食品に含有している構造である配糖体についてのリンパ吸収実験を開始することができ、さらにリンパ輸送に大きく影響する共存油脂の効果がアグリコンの場合と異なることが示唆された。また、カロテノイドにおいても腸管における吸収代謝を比較しており、リンパ吸収促進条件を引き続き検討することができる段階に進んでいる。さらに、細胞モデルの構築においては、実験系が確立された。細胞株については再構築が必要であるが、問題点が明らかになったので、最終年度にはさらなる進展が望める。リンパカニュレーションラットを用いた実験においては、申請当初とは異なる食品成分を用いているものの、研究目的であるリンパ輸送および門脈輸送の比較を行うために必要な計画変更であった。その点を踏まえ、動物実験および細胞実験のいずれも計画通りの進行をしているといえる。また、3年目に行う予定であったヒト試験についても前倒しで開始することができた。リンパカニュレーションラット実験:ケルセチンの吸収実験においては、配糖体のリンパ輸送についてさらに明らかにしていくとともに、リンパ液に輸送される代謝物と血中代謝物の構造比較を行い、リンパへ輸送される条件を明らかにしていく。また、最終年度は柑橘に含まれる代表的なフラボノイドであり、メチル化構造を有するヘスペレチンとその配糖体であるヘスペリジンについても吸収評価を行う。カロテノイドについては、引き続き吸収性と構造の関連を明らかにしていく。Caco-2細胞実験:CD36の細胞膜局在を確認し、脂肪酸ならびにモノグリセリドの細胞取り込み、カイロミクロン合成と分泌に及ぼす影響を評価する。細胞が確立できれば、フラボノイドやカロテノイドを細胞に投与し、吸収促進がみられるかを検討する予定である。ヒト摂食試験:保存している血漿について、代謝物構造の解析を行うとともに、より感度の高い分析法での再分析を行う予定である。リンパカニュレーションラット実験:ケルセチンのリンパ液中ならびに末梢血中代謝物の構造を分析し、輸送経路と代謝物構造の関連を検討する。また、ケルセチンのアグリコンおよび配糖体についての比較やメチル化フラボノイドであるヘスペリチンの投与実験を行い、リンパ輸送と血液輸送の割合について比較する。
オルタナティブ・トレードの普及可能性と消費者責任に関する比較研究

本研究の課題は,主流派の生産・貿易モデルとは異なるもうひとつの貿易(オルタナティブ・トレード、以下AT)の普及可能性とそこにおける消費者の役割と責任を検討することである。この課題を解明するために、第1にWTO体制下の貿易構造の変化とその途上国における影響を実証的に分析し、第2にATの諸形態とその効果を解明した。第3にATの1形態であるフェアトレード(以下、FT)について、日本、フランス、台湾で消費者によるその認知度と購買行動に関する意識調査を実施し、その結果から消費者責任の概念とその具体的な現れ方について比較検討した。なお、同種の国際調査としては本研究が世界最初のものである。第4に、FTの経済的な意味を理論的に考察した。解明できた主要なポイントを列挙すると次の通りである。(1)南北問題の質的転換が起こり,その構造的固定化が進んでいる。このため,従来の市揚メカニズムとは異なる農水産物貿易の論理を構築すべき時期に来ている。(2)その際に消費者の役割が大きいけれども、日本では消費者の社会的責任に対する認識をもっと深める必要がある。台湾でもFTが認知され始めており、世界的に見て立ち遅れていた東アジアのFT市揚に拡大の可能性が生じている。(3)経済の二重構造を抱える南アフリカでもFTが定着しつつあるが、その担い手は、農業労働者を受益者とする大規模農場である点に小生産者を対象とする一般的なATと異なる特徴がある。(4)ATの担い手として協同組合セクターの役割が大きい。その期待を実現するための条件を検討する必要がある。(5)ATは「内部組織の経済学」理論によって説明が可能であり、この観点から、脆弱な立場にある生産者のリスクを流通・消費に移転し、限界的生産者の効用を安定化させることにATの経済的意義を認めることができる。本年度は研究期間の初年度にあたり、オルタナティブ・トレードの理論的深化とフレームワークの構築に向けた研究会を3回開催した。そのうち、1回はモラル・エコノミー研究会との合同で行った。この研究会ではとくに、制度的な側面と人的な側面の両面からオルタナティブ・トレードを捉えていく必要があること、この点で制度派経済学やモラル・エコノミー論との切り結びが有効と考えられること、オルタナティブ・トレードの成功とは何を意味するのかについての考察が求められること、などの論点が明らかになった。他方、実態調査についてはオルタナティブ・トレード研究の遅れている南アフリカにおいて予備調査を行ったところ、西ケープ州でいわゆるフェアトレードが取り組まれていることが分かり、次年度以降の本格調査へのめどが立った。タイでは、従来の調査地である南部ラメー地方の有機バナナ産地の変化をおさえるとともに、北部山岳地域でフェアトレード・コーヒーを生産している農民と仲介組織の存在を把握できた。この地区では、日本のオルタナティブ・トレード組織を通じてスーパーへ出荷している。このことは、日本でもフェアトレードの認証ラベルに基づく市場流通の拡大を予想させるが、同時にそこに潜む危険性についても考察を深める必要性があることを示している。オルタナティブ・トレードの論理構造は何も、国際関係だけにとらわれるものではない。アメリカでもローカル化やCSA(Community Support Agriculture)という文脈でオルタナティブ・トレードが注目されている。日本では20年以上も前から有機農業で産消提携が取り組まれており、その成果と限界を評価することがオルタナティブ・トレード研究にとっても有益であることが分かった。以上のような諸点について日本農業経済学会、地域農林経済学会、中部農業経済学会や2004年度フェアトレード大会(オックスフォード大学ノース・ビジネススクール主催)などで報告した。

本年度は2年目にあたり、オルタナティブ・トレードに関する実態調査と消費者の消費行動に関する意識調査を意欲的に行った。実態調査については、グアテマラのフェアトレード・コーヒー組合連合、南アフリカのプランテーション労働者を受益対象とするフェアトレード、タイ北部の山岳少数民族が生産しているフェアトレード・コーヒーの調査を行ったほか、タイ南部のエビ養殖組合並びにフィリピンのエビ養殖の持続可能性についても調査を行った。消費者意識調査については、学生フェアトレード・ネットワークの協力を得て、東京、大阪、福岡、高松、鳥取で調査票を配布し、郵送法による回収を行った。他にも生協、中学校PTAなどの協力により調査を実施している。現在調査結果をインプット中である。これだけの規模にわたる調査は日本最初の試みであり、大きな成果が期待できる。さらにフランス(調査完了)と台湾(調査中)でも同じ調査票を用いて意識調査を実施したので、次年度において国際比較を行う予定である。このほか、研究会を2回開催したが、いずれも研究組織以外の研究者を招聘し、研究成果を報告してもらった。1回目は辻村・京都大学助教授から、とくにタンザニア・キリマンジャロ州のコーヒー価格の決定メカニズムと新しい免許制度の下で変化しているコーヒー企業の行動原理が新鮮であった。2回目は、アメリカのCSA(Community Supported Agriculture)を参照枠としたフェアトレードの可能性(西山・千葉大学助手)、及びフェアトレードの対極にあるマグロ養殖の実態(鳥居・近畿大学COE研究員)について報告を受けた。その結果改めて、フェアな取引の意味内容に関する経済学的概念規定の必要性やトレード概念の一般交換への拡張、商品特性についての検討が必要であることが分かった。本年度は、オルタナティブ・トレードに関する実態調査と消費者の消費行動に関する意識調査結果を分析し、その成果に基づいてタイ国・バンコク市カセサート大学において中間的な総括のための国際ワークショップを開催した。実態調査については、南アフリカのプランテーション労働者を受益対象とするフェアトレード、タイ北部の山岳少数民族及びグアテマラの先住民が生産しているフェアトレード・コーヒーの調査を行ったほか、タイと台湾の果実の輸出構造に関する調査を行った。消費者意識調査の分析数は計978人(うちフランス119)に及んだ。本調査は日本だけでなく、国際比較が可能な調査としても最初のものである。分析の結果、何よりも日本におけるフェアトレードの認知率の著しい低さ、社会的な消費責任意識の希薄さが浮き彫りになった。今後、調査国数を増やし、その要因をより明確に解明しなければならない。国際ワークショップは"Perspectives of Alternative Commodities Chain : Production, Trade and Consumption"をテーマとした。参加者数は21人、うち外国人研究者及び実務者9人(京都大学・池野科研チームからの1名を含む)、報告数は11本だった。
走査型アトムプローブによる高機能電子材料の原子レベルの解析

走査型アトムプローブ(SAP)の特性を生かして炭素材料やシリコンが個々の原子のレベルで分析され、人工ダイヤモンドやカーボンナノチューブ、更にシリコンには大量の水素が含まれている事を明らかにした。また、分析を高分子であるポリチオフェンの分析結果を理論解析を進めると共に、有機分子であるクリスタルヴァイオレット(CV)やテトラブチルアンモニウム(TBA)が酸化チタンの(TiO_2)光触媒作用によりどのように分解するのかを調べた。ポリチオフェンを電界蒸発させると複数原子からなる特定のクラスターイオンとして蒸発するが、検出されるクラスターイオンがポリチオフェン内部の原子間の結合状態と密接な関連がある事を理論的に解明するために、カナダのDalhousie大学のKreuzer教授の協力を得た。その結果、絶縁性のポリマー内部の電荷が印加電界により移動するが、移動電荷量の大きい結合、つまり結合力の弱い結合が切れて電界蒸発する事が明らかにされた。TiO_2の光触媒効果を調べるために、TiO_2のナノシートを作製した。試料は、タングステンの下地の上にTiO_2層を形成し、その上にCVを付着させた。TiO_2層が無く、CVを直接タングステンの上に付着させた場合は、分解したCVのフラグメントイオンが多数検出されたが、分解しないCV分子も認められた。しかし、TiO_2層の上のCVは全ての分子が分解した。タングステン下地の上でCVが分解したのは、分析に際してYAGレーザー光の2倍波を照射したが、この波長がCVの吸収波長に近いからと考えられる。何れにしても、TiO_2の光触媒効果は紫外線領域で認めれるのか通説であるが、可視光でも起こり得る事が実証された。TBAでは、特定は長野の光を吸収しないので、少数の分子がタングステン上で分解された。今ひとつ興味ある点は、解離に際して、二重結合は安定であり、単一の窒素原子が解離して検出されない事である。以上の結果は、SAPによる有機材料の分析が原子間の結合の解明に新たな視点をもたらす事を示しており、今後は、より多様な有機分子や生体分子を解析する事を計画している。走査型アトムプローブ(SAP)の特性を生かして以下の研究成果を挙げた。1.炭素材料やシリコンに含まれる水素量の計測:水素の定量測定は容易ではない。しかし、SAPでは、試料表面に含まれる全ての原子を陽イオンとして電界蒸発させ、それらを逐一検出同定しているので水素量を極めて高い確度で測定できる特性がある。CVD法や高温高圧法で作製されたダイヤモンド、高純度グラファイト、カーボンナノチューブ、シリコンウエーハー等を分析し、大量の水素が含まれている事を明らかにした。最も多く水素を含んでいるのはCVDダイヤモンドであって、水素原子と炭素原子の比H/Cは1.28であって、水素原子の方が炭素原子より多い。一番少ないのはガラス状炭素であって、0.25である。シリコンに含まれる水素量は深さとともに減少するが、表面処理法によっても変わる。HF処理したシリコンでは、清浄な領域では表面原子数の35%であり、NH_4Fでは28%である。しかし、表面処理により汚染された領域では、水素濃度は高く、それぞれ53%と60%であり、深い領域まで分布している。

また、炭素やシリコン原子に結合している水素の結合には強弱二つの結合状態がある事も明らかにした。2.ポリチオフェンの電子状態と原子間の結合状態:シリコンと電導性透明薄膜上に形成されたポリチオフェン薄膜の電子状態を電界放射電流の印加電圧による変化より評価した。温度による電流量の変化はポリチオフェンが半導体であり、仕事関数はシリコンとほぼ等しい事が明らかにした。また、ポリチオフェンを構成する硫黄原子は単体として電界蒸発せず、炭素とともに、特にSC_4H^<2+>として検出された。この事は、ポリチオフェンの基本構造であるSC_4Hが極めて安定である事を示している。しかし、膜内にはチオフェンの重合が不十分な領域があり、炭素のみが検出される事も明らかにした。3.酸化チタン内の酸素分布:タングステン下地上の酸化チタンを分析した。電界放射特性は酸化チタンの仕事関数はチタンとほぼ同等であり、タングステンより小さい事を明らかにした。しかし、酸化チタンの表面層を電界蒸発すると、仕事関数がタングステンより大きくなった。予想外の結果は、酸化チタン内の酸素濃度がTiO_2より低く、多くの酸素原子が下地のタングステンと結合している事である。酸素濃度と光触媒としての機能との関連性の解明は今後の課題である。走査型アトムプローブ(SAP)の特性を生かし、以下の研究成果を挙げた。1.企業から提供を受けてカーボンナノチューブを分析したところ、2004年に入手できた試料は電導性が良好なために、電圧パルスの印加でAP分析が可能であった。2004年の試料では、飛び飛びの炭素数を持った特定の質量のクラスタピークが検出され、ある一定の構造のグラファイトシートが規則正しく解裂して電界蒸発したことが示唆された。(2003年以前の試料では炭素数が一つずつ異なるクラスタイオンピークが、一連の系列として検出された。)2.導電性ポリマーであるポリチオフェン試料の電界蒸発について2003年の実験結果を理論計算の結果と比較検討した。その結果、分子鎖の解裂により、チオフェンモノマーに対応するクラスタが生成することを理論計算でも見出し、実験結果との良い一致をみた。また、実験では、違う条件下で、その他のクラスタの生成も見出され、試料の重合条件との関連を検討した。3.層状酸化チタンのAP分析にあたり、試料の調整方法を改良し、出発物質中の過剰分の電解質除去に成功した。酸化チタン上での有機分子の光触媒分解反応を調べるために、まず陽イオン性の有機分子について単独でのAP分析を行ったところ、分子イオンのピークを得ることができた。次に酸化チタンに同じ分子をイオン交換吸着させて分析すると、フラグメントイオンが検出された一方で、分子ピークは完全に消失した。これにより、酸化チタンの光触媒作用によって、違う過程で有機分子の解裂がおこっていることが明らかとなった。平成15年度と16年度では、炭素材料やシリコンの分析が主であったが、平成17年度では、高分子であるポリチオフェンの理論解析を進めると共に、有機分子であるクリスタルヴァイオレット(CV)やテトラブチルアンモニウム(TBA)が酸化チタンの(TiO_2)光触媒作用によりどのように分解するのかを走査型アトムプローブ(SAP)の特性を生かして調べ、他の手法では得られない興味ある結果を得た。
肺癌における微量癌細胞検出による術後再発,転移ハイリスクグループの選別

肺癌における微量癌細胞の検出を肺癌切除230例(平成9年度までは144例)を対象として,骨髄,リンパ節,肺静脈血,末梢血を用いて行った。肺癌における微量細胞の検出を肺癌切除144例を対象として,骨髄,リンパ節,肺静脈血,末梢血を用いて行った。(2)免疫組織化学染色を用いたリンパ節(pNO-LN)パラフィン包埋標本における微量癌細胞の検出:抗CK抗体CK_+細胞が検出され,28.6%(4/14)がN1,21.4%(3/14)がN2にstage upした。