hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原始自己複製体の機能的再構成により生命の初期進化を追体験する

本年度では、昨年度までに作成したnucleotide diphosphate kinase (ndk)をコードしたRNAをもともとのRNA複製酵素をコードしたRNAと協力的に複製するシステムについて、どういう条件でなら継代可能かを理論的、実験的に調べた。その結果、重要なのは平均RNA濃度であることを見出した。RNA濃度が高すぎる場合には寄生体RNAが出現してしまい、協力的RNA複製が持続できない。一方でRNA濃度が低すぎると2つの協力的RNAが出合うことが難しくなり、やはり複製ができない。したがって、中間的な濃度でのみ協力的なRNA複製が持続することを見出した。さらに中間濃度で継代を続けていくと、RNA複製酵素をコードしたRNAではその大部分が協力性を失うのに対し、ndkをコードしたRNAの方は、半分以上のRNAが協力性を維持しており、さらにそのうち一部はよりndkの発現を上昇させていた。すなわち、この一部のRNAはより協力的になっていた。いままでの理論研究からは世代を重ねると協力性を失ったものが選択されることが多いと言われていたが、この結果は必ずしもそうではないことを示している。この原因のひとつは、ndkというのが相手の複製だけではなく、自身の複製にも貢献するためではないかと考えている。いままでは、協力性というと相手だけを助けて自分の複製は助けないというモデルが考えられていたが、分子の仕組みを考えるとそのような仮定は考えにくく、本研究のように相手も自分も同程度に助けるという方がむしろ自然である。このような“自然な"仮定の下では、協力性は今まで考えられていたよりも起こりやすいのかもしれない。以上の結果は、論文にまとめ無事に受理された。当初の予定では5年をかけて協力的な複製の進化実験をする予定であったが、4年目ですでに進化実験をある程度完了することができたため。さらに協力的なRNA複製を続けることにより、協力的複製が進化によりどう変わっていくかを調べる。より安定になっていくか、それともより不安定になっていくのか、どちらの可能性もありうると考えている。本研究ではこれまでに私達のグループで構築した人工RNAゲノム複製システムに、新しい遺伝子を加えて複雑化させることを試みる。そのための手段として本年度は導入すべき遺伝子の選択を行った。新しく加える遺伝子としての要件は、RNAゲノム複製に必須なタンパク質をコードする遺伝子である必要がある。また少ない翻訳量で十分な機能を持つタンパク質である必要がある。それらの要件にあてはまる遺伝子として、翻訳の開始因子であるIF1ー3,終結因子であるRF1,2、エネルギー再生系のNDKを選んだ。さらにこれらのタンパク質を反応系から除いて、代わりに遺伝子として系中に加えることで、遺伝子発現に依存したRNA複製が起こるかを検証した。その結果、最も効率良く複製が起きたRF1とNDKを候補遺伝子として採用した。本年度はRF1についてRNAにコードさせ、かつ複製酵素の認識部位を付けたRNAを構築した。これまでに分かっているように、このRNAはそのままでは2次構造がほとんどないため複製できない。そこで本年度はランダム変異を導入し、その後人為進化実験を行うことにより複製可能なRF1遺伝子を得ることを試みた。約20ラウンド継代した結果、予想に反してRF1としての活性が失われた配列が選択されてしまった。原因を検証した結果、RF1の場合は、その活性がなかったとしてもある程度選択される経路が存在することが判明した。本年度の計画である候補遺伝子を選ぶことは達成できたため。RF1遺伝子を複製可能にすることはうまくいっていないが、これはもともと時間がかかると予想していたため、予想の範囲内である。本研究で本研究ではこれまでに私達のグループで構築した人工RNAゲノム複製システムに、新しい遺伝子を加えて複雑化させることを試みる。新しい遺伝子として本年度はnucleotide diphosphate kinase (ndk)について検討した。この遺伝子は例えばCDPをCTPに変換する反応を触媒する。したがって翻訳には不要だが、RNA複製には必須という状況を作り出すことができる。この遺伝子の利点として全長が約400 bpと短いということがある。通常の遺伝子をコードしたRNAは我々のシステムではほとんど複製しない。それは私達の用いているRNA複製酵素により複製されるにはRNA全長に渡る強固な2次構造が必要だからである。本年度はこのndk遺伝子をコードしたRNAに同義変異を導入することで、ndk遺伝子の機能を変えずに2次構造を導入し複製しやすくすることを試みた。その結果、数十個の変異の導入により100倍以上複製しやすいRNAを得ることに成功した。ndk遺伝子を使うことにより、反応系中のNDKの混入が問題となった。私達は精製された翻訳系を用いているが、わずかに残存したNDK活性があり、それによってRNAからNDKが発現しなくてもRNA複製してしまうという問題が生じた。これを解決するために、翻訳系の成分を精製しなおして残存するNDK活性を無視できるほどに減らすことに成功した。本年度は第2ゲノムの候補遺伝子としてndkを検討したところ、十分に使えることが分かった。今後ndkを使って本研究課題で目指す複雑化したRNA複製システムを構築することが可能であることから順調に進んでいると判断した。本年度では、昨年度までに作成したnucleotide diphosphate kinase (ndk)をコードしたRNAをもともとのRNA複製酵素をコードしたRNAとさらにNDKの混入を極力減らした翻訳系を使うことで、2つのRNAの両方に依存した協力的な複製システムの構築を試みた。その結果、確かに2つのRNAが両方存在するときにのみ効率良く複製する反応系を構築することに成功した。

さらにこの複製システムを長期継代することを試みた。その結果、多くの場合、元々は入れていない小さいRNA(寄生体RNAとよぶ)が増えてしまい、複製が継続できないという問題に直面した。この解決法を探るために理論モデルを構築したところ、RNAの濃度が高すぎず、かつ反応液が区画構造に封入されていれば、たとえ寄生体RNAが生じても協力的なRNA複製が継続できることを予想した。これは区画存在下では寄生体が出現しても、確率的に寄生体の存在しない区画が生じるからである。実際の実験でも予想に一致して、ある一定のRNA濃度以下を保つことにより50ラウンドまで協力的なRNA複製を継続することに成功している。高い濃度では寄生体が出現し、実際に複製が停止した。一方で低い濃度ではそもそも複製が開始できなかった。今後さらに複数の条件での継代実験を行うことで、どういう条件ならば継代ができるかを明らかにしていく。さらに継代中のRNAの配列を解析することで進化が起きているのかを調べる予定である。当初の予定では協力的な複製システムの構築を目的にしていたが、本年度はさらに継代実験まで行うことができたため、計画以上に進展していると判断した。本年度では、昨年度までに作成したnucleotide diphosphate kinase (ndk)をコードしたRNAをもともとのRNA複製酵素をコードしたRNAと協力的に複製するシステムについて、どういう条件でなら継代可能かを理論的、実験的に調べた。その結果、重要なのは平均RNA濃度であることを見出した。RNA濃度が高すぎる場合には寄生体RNAが出現してしまい、協力的RNA複製が持続できない。一方でRNA濃度が低すぎると2つの協力的RNAが出合うことが難しくなり、やはり複製ができない。したがって、中間的な濃度でのみ協力的なRNA複製が持続することを見出した。さらに中間濃度で継代を続けていくと、RNA複製酵素をコードしたRNAではその大部分が協力性を失うのに対し、ndkをコードしたRNAの方は、半分以上のRNAが協力性を維持しており、さらにそのうち一部はよりndkの発現を上昇させていた。すなわち、この一部のRNAはより協力的になっていた。いままでの理論研究からは世代を重ねると協力性を失ったものが選択されることが多いと言われていたが、この結果は必ずしもそうではないことを示している。この原因のひとつは、ndkというのが相手の複製だけではなく、自身の複製にも貢献するためではないかと考えている。いままでは、協力性というと相手だけを助けて自分の複製は助けないというモデルが考えられていたが、分子の仕組みを考えるとそのような仮定は考えにくく、本研究のように相手も自分も同程度に助けるという方がむしろ自然である。
舶用２ストロークディーゼル主機関の運転特性に及ぼす負荷変動の影響

今年度(平成30年度)は、供試機関である舶用2ストローク低速ディーゼル機関を運転して、定常負荷状態の舶用負荷特性(プロペラ負荷特性)における機関負荷率25、75 %において、主にNOx排出率、燃料消費率、排気弁動作タイミング、筒内圧力、燃料噴射圧力とともにフィルタスモークメータ、オパシメータを用いてスモーク濃度およびスート濃度の同時計測を実施した。負荷変動時の過給機回転速度の応答遅れ時状態の運転を模擬するため、上記の2負荷率において排気弁の閉鎖クランク角度を、機関の標準状態から変化させた計測を実施した。実験を実施した範囲のNOx排出率は、低負荷である負荷率25 %時において、排気弁閉鎖タイミング早めるほどNOx排出率は上昇し、燃料消費率は低下した。負荷率75 %時においては、排気弁閉鎖タイミングを遅くするほどNOx排出率とともに燃料消費率が低下する関係となった。排気弁閉鎖タイミングは、通常の値からクランク角度で負荷率25 %時に-10°0°、負荷率75 %時に0°+6°の範囲で変更したが、これらの運転時の空気過剰率(排ガスO2濃度から算出)は、低負荷率時で3 %程度、高負荷率時で8%程度の範囲で変化した。また、低負荷率時の着火遅れ時間に大きな変化は確認されなかった。このことから、着火遅れ時間に差が無い範囲で、機関出力が同じ場合には、掃気量が多いほどNOx排出率が高くなることがわかり、例えば負荷減少時において燃料噴射開始タイミングが変化しない出力、回転速度範囲においては、過給機回転速度の応答遅れ時にはNOx排出率が高くなることが考えられる。また、同時に計測したフィルタスモークメータによるスート濃度は今回の実験条件の範囲では大きな変化は見られず、負荷率25 %で0.8から1.0 mg/m3、負荷率75 %で0.4から0.5 mg/m3の値であった。初年度(平成27年度)は、計測システムとそれらのデータロギングシステムの構築、システムの試運転調整と機関低負荷率運転時の負荷単一変化の排ガス計測を中心に研究を行った。研究に使用する直挿式窒素酸化物センサ(ジルコニアセンサ)は、ガス接触部の耐熱性は高いが、センサ本体の計装線接続部およびハーネス部は耐熱性が劣る。排ガス中の窒素酸化物濃度の計測法が規定された国際海事機関(IMO)テクニカルコードでは煙道直径の1090 %まで挿入を行うことが規定されており、排気管内に突起する形の、取付アダプタを作成しその先端にセンサを装着する必要がある。また、舶用ディーゼル機関の排気管は自動車等の小型の機関と比較して排気管径が大きく、センサの取付アダプタが高温な排ガスにさらされる面積が大きいためセンサの耐熱が劣る部分の熱対策が必要であった。最初に直挿式の窒素酸化物センサの供試機関に適した取付アダプタの設計を行い試作を行った。その後、空冷、水冷を用いてセンサ計装線接続部とハーネス部の冷却機構作成して熱対策を行うことで連続的計測を行う事を可能とするとともに、データ解析の際に必要となる、機関回転数、トルク等を同時に記録できる計測システムの構築・整備を実施した。次に、構築した計測システムを使用して、機関低負荷時の直挿式窒素酸化物センサ(ジルコニアセンサ)と、ガスサンプリング式窒素酸化計(化学発光式)の同時計測を実施した。計測時には機関に単一の負荷変化を与えることで、2種類の窒素酸化物計測装置の応答性検討も実施した。計測の結果、2種類のセンサが示す窒素酸化物濃度は、ガスサンプリングに費やす時間を除き、濃度上昇時、濃度下降時もほぼ等しい応答性を示すことを確認した。初年度(平成27年度)研究実施計画と、進捗状況を比較すると予定していた実験・計測で実施できていないものがあり、やや遅れている。その理由として直挿式窒素酸化物センサ(ジルコニアセンサ)の熱対策等の問題点解決、アダプタ等の試作、試運転調整に時間を要したためである。計測に使用するセンサの一部は、価格面等の問題から自動車の排ガス計測用途に設計されている機器を転用した物が含まれいる。舶用ディーゼル機関の計測を行う場合には、それらの用途変更の対策を行う必要があることが判明(特に熱対策)し、その対策に予想以上の時間を費やす結果となった。なお、これらの予期しなかった問題は概ね初年度(平成27年度)で実施、解決済みである。今年度(平成28年度)は、計測システム(ジルコニアセンサ方式と化学発光法)の応答速度計測と、単一間隔負荷変動時の計測を中心に研究を実施した。窒素酸化物を計測する分析装置として、化学発光法による分析装置、ジルコニアセンサ方式による分析装置を準備し、それらの応答速度計測を実施した。分析装置のNOxおよびO2濃度はアナログシグナルによってリアルタイムデータロガーで記録し、そのデータを解析することで、計測しているガスの切替タイミングから、計測装置が示す計測値の遅れ時間を調べた。計測には、NOx標準ガス(1386 ppm, N2バランス)、O2標準ガス(20.63 %, N2バランス)およびN2ガス(純度:G3)を使用した。遅れ時間は、計測値が変化し始める応答開始遅れ時間、応答開始から使用しているガス濃度を示すまでの表示遅れ時間に区別して、分析装置の応答速度の特性を計測した。また、分析装置に流入させるガスをN2ガスとして、そこに一定間隔で標準ガスを流入させ、計測値が示す最高値、平均値等の計測を行った。

これらの分析装置の応答速度を明らかにした後に、舶用2ストロークディーゼル機関を使用し、出力軸に接続されている水制動力計の制動力を周期的に変化させ、その排ガスを上記の2種類の分析装置で同時計測およびデータのリアルタイムロギングを実施した。これらの結果から、化学発光法ではNOx濃度の計測値を得られるまでに時間を要し、また、一定時間以上その状態が継続しないと計測される最高濃度が異なること、周期的に変動するNOx濃度の計測においては、化学発光法と、ジルコニアセンサでは計測時間軸が異なるとともに、平均濃度にも相違が生じる場合があることがわかった。初年度(平成27年度)及び今年度(平成28年度)の研究実施計画と進捗状況から、計画通りに実験・計測が実施できていない項目があり、やや遅れている。その理由として、前年度進捗状況で報告した、初年度における直送式窒素酸化物センサ(ジルコニアセンサ)の熱対策、アダプタ製作、試運転調整に時間を要したことが上げられる。なお、熱対策は初年度に概ね完了しており、前年度研究計画の順に研究を推進している。今年度(平成29年度)は,供試機関である舶用2ストローク低速ディーゼル機関において,機関負荷率を舶用負荷特性(プロペラ負荷特性)に従って定常負荷状態の25, 50, 75, 100 %に設定し,主にNOx排出率,燃料消費率,排気弁動作タイミングと筒内圧力,燃料噴射圧力を計測した.また,各負荷率の機関回転速度において負荷(トルク)が低下した状態の計測を実施し,機関出力,燃料消費率等とNOx排出率の関係を把握するNOx排出率マップを作成した.研究に使用した供試機関は,燃料噴射開始タイミングと噴射率,排気弁開閉動作が電子制御されている.同一の機関回転速度において,負荷が低下した場合に排気弁動作,燃料噴射状況は自動的に変化する.本計測では機関標準状態(メーカーから出荷されたセッティング)において計測を実施しているが,低回転速度(舶用特性の負荷率25 %の回転速度)においては低負荷であるほど,排気弁閉タイミングが早くなり圧縮圧力を高める制御となり,着火性を重視した制御であると考えられる.低負荷では着火遅れによる最高圧力の上昇や,排気弁タイミング制御によって,負荷が低下したにもかかわらず,NOx排出率が上昇する傾向が確認された.舶用特性の負荷率50 %の回転速度では,過給機が回転することで掃気圧力も高くなり,その結果圧縮圧力が上昇し,着火遅れが短くなる.そのため,低回転速度時のNOx排出率と比較して,排出率は大きく低下するが,低負荷であるほどNOx排出率が高くなる傾向がある.舶用特性の負荷率75 %以上の回転速度では,負荷の違いによって若干の差はあるものの,NOx排出率には大きな差がないことがわかった.燃料消費率とNOx排出率の関係は,同一回転速度において負荷が変化した場合には,燃料消費率が低いほどNOx排出率が高くなるトレードオフの関係が確認されたが,回転速度が異なる場合にはトレードオフの関係が成り立たないことがわかった.研究の実施計画と進捗状況から,やや遅れていると判断する.遅れている項目として,粒子状物質計測の一部が完了していないことと,負荷変動運転状態における検討の一部が未実施である.
ミツバチの分業におけるスペシャリストの出現とその機構

ミツバチのコロニーにおけるスペシャリストの成因として,遺伝的背景(血縁)および行動的背景(経歴)の両側面からの解析を試みた.遺伝的背景は,特定のスペシャリストが特定の血縁グループに帰属するかどうかという点に着目し,行動的背景は,スペシャリストとなる個体のそれ以前あるいは以降の行動パターンに特定の類型があるかどうかに着目した.スペシャリストとしては,死体捨て行動をとるものをサンプルとした.この個体数が充分に得られなかったこと,DNAマーカーを用いた血縁分析が必ずしも分離度の高いものとはならなかったことから,遺伝的背景のスペシャリスト化への寄与度は測定できなかった.一方で,死体捨て行動をとる個体の行動履歴には特異性が見られた.これらの個体は,スペシャリストとなる以前でも,あるいはスペシャリストのタスクからの解放後でも,他の個体に較べ,巣板上における行動量,行動の成分種数とも多く,外刺激に対して過敏な反応を示した.スペシャリストとして観察される個体がコロニーの働き蜂の1%内外であることから,ある血縁集団があるスペシャリストと密接に関係するとは考えにくく,ある(複数の)血縁集団のなかで特に反応閾値が低く設定されている個体がスペシャリスト化しやすい個体であると考えるのが妥当であろう.今後DNA分析においてより血縁グループの分離度の高い方法を導入し,血縁との関係をさらに詳細に調査することが必要である.平成10年にシーケンス電気泳動装置を導入したので,今後この点について知見が得られる予定である.また,観察巣箱に頼るスペシャリストの抽出は,もともとの個体が少なく充分なサンプルが得られない.今後は通常サイズのコロニーで観察できる行動系で実験を試みる.ミツバチのコロニーにおけるスペシャリストの成因として,遺伝的背景(血縁)および行動的背景(経歴)の両側面からの解析を試みた.遺伝的背景は,特定のスペシャリストが特定の血縁グループに帰属するかどうかという点に着目し,行動的背景は,スペシャリストとなる個体のそれ以前あるいは以降の行動パターンに特定の類型があるかどうかに着目した.スペシャリストとしては,死体捨て行動をとるものをサンプルとした.この個体数が充分に得られなかったこと,DNAマーカーを用いた血縁分析が必ずしも分離度の高いものとはならなかったことから,遺伝的背景のスペシャリスト化への寄与度は測定できなかった.一方で,死体捨て行動をとる個体の行動履歴には特異性が見られた.これらの個体は,スペシャリストとなる以前でも,あるいはスペシャリストのタスクからの解放後でも,他の個体に較べ,巣板上における行動量,行動の成分種数とも多く,外刺激に対して過敏な反応を示した.スペシャリストとして観察される個体がコロニーの働き蜂の1%内外であることから,ある血縁集団があるスペシャリストと密接に関係するとは考えにくく,ある(複数の)血縁集団のなかで特に反応閾値が低く設定されている個体がスペシャリスト化しやすい個体であると考えるのが妥当であろう.今後DNA分析においてより血縁グループの分離度の高い方法を導入し,血縁との関係をさらに詳細に調査することが必要である.平成10年にシーケンス電気泳動装置を導入したので,今後この点について知見が得られる予定である.また,観察巣箱に頼るスペシャリストの抽出は,もともとの個体が少なく充分なサンプルが得られない.今後は通常サイズのコロニーで観察できる行動系で実験を試みる.1.スペシャリストの抽出(行動学的側面)ミツバチの働き蜂の巣板上での分布は,中央から外側へ日齢の増加に伴って同心円上に拡大する.この性質を利用して,日齢の明らかな個体識別の可能な個体の休息場所の特定を経時的に行ったところ,15%程度の個体が,他個体よりも常に外側にいる傾向を示した.この成因と,それぞれの個体の遺伝的背景については現在調査中であるが,このような観察手法によっても特殊な個体の抽出が可能となると考えられた.2.個体の遺伝的背景の評価および評価方法の確立ミツバチの女王蜂が多回交尾をした結果,コロニー内には父親の異なる個体が共存することになるが,これを父親の系統ごとに分類する方法を確立した.各個体から抽出したDNAをミツバチで多型の明らかとなっているマイクロサテライトについて分析し,コロニーごとに多型解析を行った.この結果,試験蜂場内では,コロニー当たり39父系の存在が確認できた.本方法では特に電気泳動についてアガロースを用いた簡便方法の開発を試み,既報のマイクロサテライトの中から多型の出やすい4つについて分析を行った結果,今のところ2つについては本法での解析が可能となった.個体の背景としてのコロニー内の遺伝的多型とそれに依存するコロニー内現象変成王台への巣房の変形を血縁びいきとしての行動と見なし,それに関与する個体の遺伝的背景をコロニーレベルで評価し,行動の結果が父系構成に影響を受けるかどうかを評価した.その結果,多数個体を含む父系で多数の王台が形成され,その他の父系の幼虫は王台となる率が低かった.このことから,血縁びいきの存在が明らかになると同時に,スペシャリストにはよらないが,コロニー内で見られる非ルーチンの特定行動には遺伝的な背景が影響を及ぼすことが示唆された.1.遭伝的背景の評価アガロースを用いたマイクロサテライト多型検出は,父方多型の検出には限度があり,この点ではアクリルアミドゲルによるより高分解能を持つ検出方法が必要となった(現在も継続して開発中).ただし,観察巣箱によるスペシャリスト抽出は,比較的個体数を得やすいundertaking行動についても個体数に限界があり,より個体数の得られやすい条件を模索せざるを得ない.

2.行動学的背景の評価行動分析によってスペシャリストのタスク(今回はundertaking)を示した個体には,共通の性行があることが観察された.まず,スペシャリストのタスクを分担する間にも他のタスク(疑似タスク)を多く含み,またいずれのタスクについても多個体よりも頻度高く行うことが確認された.スペシャリストのタスクから開放されると外勤蜂となったが,その場合にも巣房に対する行動の成分が多種で,またそれぞれの頻度も高かった.さらに,異物反応が多個体よりも過剰であった.:3.スペシヤリスト化の要因遺伝的背景ついては,今後さらなる研究を進めるが,現状では,行動的な側面の方がより重要であるという結論を導いた.概して,働き蜂のうち,刺激に対する反応閾値の設定が低くなっているものが巣内の多様なタスクを検出しやすく,そのため,比較的需要の低いタスク(=スペシャリストのタスク)に就きやすいと考えられる.
細胞質型SODの臓器特異的ミトコンドリア局在を制御する機構の解明

家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)において、ミトコンドリア内のS-ニトロシル化をうけたタンパク質量の減少が報告され、ミトコンドリア内にも局在するCu,Zn-superoxide dismutase (SOD1)のCuが脱ニトロシル化を促進しているのではないかと推測されたが、根本的な点で矛盾があったので再検討した。生体内でのSOD1による脱ニトロシル化活性は期待できるものではなく、野生型とFALS変異型SOD1において、脱ニトロシル化活性の値に有意差は認められなかったことより、FALSとSOD1の脱ニトロシル化活性との関連は見出せなかった。生体内で消費される酸素の約95%はミトコンドリア内膜上の電子伝達系によるが、その12%がスーパーオキシドに変換されると推定されている。すなわち、活性酸素種の主な発生源はミトコンドリアである。ミトコンドリアのインターメンブレンスペース(IMS)に細胞質型スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)が局在することは、ミトコンドリア内膜からIMS側に放出されるスーパーオキシドを消去するのに重要であると考えられる。家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)において、ミトコンドリア内のS-ニトロシル化をうけたタンパク質量の減少が報告され、ミトコンドリア内のSOD1のCuが脱ニトロシル化を促進しているのではないかと推測された。そこで野生型とFALS変異型SOD1を精製し、脱ニトロシル化活性を測定したが、その活性値は非常に低く、生体内では他にも活性値の高い脱ニトロシル化酵素が報告されていることもあり、生体内でのSOD1における脱ニトロシル化活性は期待できるものではなかった。また、野生型とFALS変異型SOD1において、脱ニトロシル化活性の値に有意差は認められなかったことより、FALSとSOD1の脱ニトロシル化活性との関連は見いだせなかった。これらの研究結果は学術雑誌、Free RadicalBiology and Medicine 43(5),830-836,2007.に掲載されている。すなわち活性酸素種の主な発生源はミトコンドリアである。ミトコンドリアの膜間腔(Intemembrane space : IMS)に細胞質型スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)が局在することは、ミトコンドリア内膜からIMS側に放出されるスーパーオキシドを消去するのに重要であると考えられる。筋萎縮性側索硬化症の早期にミトコンドリア障害が見られるが、ミトコンドリアSOD1との関連性は未知な部分が多い。一方、タンパクのリジン残基とグルタミン残基の架橋反応を触媒するトランスグルタミナーゼのファミリーであるトランスグルタミナーゼ2(TG2)をノックアウトしたマウスでは、ミトコンドリア電子伝達系複合体の形成異常が報告されている。TG2は様々な臓器に発現しており、細胞質、ミトコンドリア、核、細胞表面、細胞外など広範囲に分布していることが知られている。今年度は家族性筋萎縮性側索硬化症の変異型SOD1がTG2の基質となり共有結合による架橋を形成し、それが筋萎縮性側索硬化症にみられる凝集体形成メカニズムのひとつであることを見いだした。筋萎縮性側索硬化症における凝集体形成機構は未知であったので、今年度の結果により、トランスグルタミナーゼの阻害剤が治療法の開発へと応用できる可能性が広がった。今後の新しい課題と発展させて検討する予定である。
糖鎖-糖鎖間の相互作用に基づく細胞間認識と情報伝達に関する研究

申請者は糖鎖-糖鎖間相互作用による細胞間認識機構を提唱している。最近、ある種の配糖体キノンといった低分子の物質が、糖鎖に特異的に結合し、抗菌作用や抗ウイルス作用を発揮することも明らかにされている。さらに糖脂質クラスターが細胞表面において情報伝達の場となっていること、糖鎖間相亙作用によって細胞に情報が伝達されることも示唆されている。しかし糖鎖間相互作用にっいては、実験系や再現性の間題が指摘されており、機器分析手法による糖鎖間の相互作用の直接的な証明が不十分であるとされている。また速度論的、化学量論的な検証も十分とは言えない。そこで最近生体分子の相互作用を測定するために用いられるようになってきた表面プラズモン共鳴を用いて糖鎖間の相互作用の速度論的な解析を試みている。本年度は配糖体型抗生物質で糖鎖に結合すると言われているPradimicinA及びその誘導体であるBMY-28864の糖鎖結合能を表面プラズモン共鳴を用いて解析した。BMY-28864はマンノースーBSAを固定化したセンサーチップにたいし強い親和性を見せたが、他の糖鎖をもつ人工糖タンパク質を固定化したセンサーチップには全く親和性を示さなかった。速度論的・化学量論的解析の縞果、BMY-28864はCa^<2+>存在下で複合体を形成してマンノースに結合していること、またBMY-28864のマンノースーBSAからの解離は2相性を示すことが明らかとなった。従って表面プラズモン共鳴は糖鎖と低分子認織物質の間の相互作用を解析するのに井常にすぐれた方法であることが判明した。
中等科学教育におけるポートフォリオを活用したオーダーメードカリキュラムの開発

平成14年度は,夏休み期間を中心とした「高校生と科学者の対話を通したカリキュラムの開発」し,その結果を高校現場でネットワークを利用しながら展開した。具体的な取り組みは以下のとおりである。1)第8回福岡湧源セミナー・・・九州地方の高校生の中から24名を選抜し,夏休み中に3日間(8月9日11日)の合宿形式でセミナーを行った。このセミナーの中で時計反応により化学反応の基本的な性質を理解し,その上で「BZ反応の不思議」について演示実験を交えて説明した。2)第23回数理の翼セミナー・・・全国の高校生・大学生・大学院生を全国から選抜(高校生35名,大学生8名,大学院生2名)し,夏休み中に5日間(8月16日20日)の合宿形式でセミナーを行った。このセミナーにはSSH校に指定された岡山一宮高校の生徒が参加し,「BZ反応」に関するテーマを参加者および若手研究者がともに実験をしながらその現象に潜む数理について解明を行った。3)広島大学附属高校SPPプロジェクト・・・広島大学附属高校(広島)のSPPプロジェクトの一環として,高校・大学連携遠隔授業実験『試験管の中の『ゆらぎ』の話-振動からパターンまで-』を企画・実施した。このプロジェクトは「3つのジョイント」(1)化学と数学の(学問的)ジョイント、(2)広島大学と大阪大学の(地理的)ジョイント、(3)高校生と教官と研究者のジョィントをコンセプトとして行った。4)広島大学附属福山高校SPPプロジェクト・・・広島大学附属福山高校のSPPプロジェクトの一環として,夏期科学技術・理科学習プログラム「科学シミュレーションに挑戦しよう」に参画した。5)福山明王台高校出張授業・・・高大連携の『出前授業』として,広島県立福山明王台高校において出張授業を行った。この授業では時計反応により化学反応の基本的な性質を時計反応の演示実験を交えて説明した。6)岡山一宮高校自然科学入門講義・・・SSH研究指定校である岡山一宮高校において,理数科クラス1年生を中心に「自然科学入門講義」を行った。この講義では,岡山一宮高校から「数理の翼セミナー」に参加した生徒が提案した「BZ反応」に関するテーマについて,実験およびシミュレーションの両面から講義した。講義の中で疑問に思ったことは,継続して「課題研究」等の時間に探求しており,その過程は「掲示板」等を通して生徒と研究者との間でDiscussionが継続している。以上の取り組みを通して,1)研究者が非常に多くのことを「教えること」によって「学んで」いること,2)学習者が「知り」,「理解」し,「納得」するプロセスにはかなりの時間が必要で,そのためには合宿形式のセミナーや事後のMAIL等を通したDiscussionが重要であることが明らかになった(右図)。このような視点から,高大連携プロジェクトには「サイエンスコーディネーター(あるいはディレクター)」の存在が不可欠であり,このような人材の育成が急務であることが示唆された。

以上の取り組みを通して,1)研究者が非常に多くのことを「教えること」によって「学んで」いること,2)学習者が「知り」,「理解」し,「納得」するプロセスにはかなりの時間が必要で,そのためには合宿形式のセミナーや事後のMAIL等を通したDiscussionが重要であることが明らかになった(右図)。このような視点から,高大連携プロジェクトには「サイエンスコーディネーター(あるいはディレクター)」の存在が不可欠であり,このような人材の育成が急務であることが示唆された。
限局型小細胞肺癌への放射線治療線量増加の有効性確認試験：生物、物理、人種の視点で

限局型小細胞癌94例の初診時の転移個数別のリンパ節転移マップを作製した。転移リンパ節1個の32例と転移リンパ節2個の10例を詳しく報告する。リンパ節転移1個は32例であった。右上葉11例中、右肺門リンパ節転移が5個、右上部気管傍リンパ節転移が5例、右下部気管傍リンパ節転移が1例、右下葉6例中、右肺門リンパ節転移が4例、気管分岐下リンパ節転移が1例、左上葉6例中、左肺門リンパ節転移が3例、左上部気管傍リンパ節転移が1例、左下部気管傍リンパ節転移が1例、傍大動脈リンパ節(大動脈下リンパ節に同時)転移が1例、左下葉9例中、左肺門リンパ節転移が7例、傍大動脈リンパ節転移が1例、気管分岐下リンパ節転移が1例であった。リンパ節転移2個は10例であった。右上中葉4例中、右肺門リンパ節転移と右下部気管傍リンパ節転移が2例、気管分岐部リンパ節転移と右下部気管傍リンパ節転移が1例、右上部気管傍リンパ節転移と右下部リンパ節転移が1例であった。右下葉2例中、右肺門リンパ節転移と気管分岐下リンパ節転移が2例であった。左上葉2例中、左肺門リンパ節と傍大動脈リンパ節転移が1例、左肺門リンパ節転移と左下部気管傍リンパ節転移が1例であった。左下葉2例中、左下部気管傍リンパ節転移と食道傍リンパ節転移が1例、左肺門リンパ節転移と気管分岐下リンパ節転移が1例であった。3個から8個の転移リンパ節の分布の報告も別途予定する。以上より、右上中下葉原発の場合は右肺門と気管分岐部下と右上下部気管傍まで、左上葉は左肺門と傍大動脈リンパ節と大動脈下リンパ節と左上下気管傍リンパ節まで、左下葉は、左肺門と傍大動脈リンパ節と大動脈下リンパ節と左上下気管傍リンパ節と気管分岐下リンパ節までを標準として、患者因子と腫瘍因子を組み合わせ、鎖骨上リンパ節や対側縦隔リンパ節の予防的リンパ節照射(ENI)やをENIを省いた放射線治療を検討する。上記の予防的リンパ節照射の考え方がまとまってきているため。上記の予防照射の考え方がまとまってきたので、実際の症例に適応できるか、回転式強度変調放射線治療や息止め照射の検討を行いながら、最適な線量分布を検討していく。追尾照射システム導入について、院内で進みつつあるため、息止め照射システムの購入について再度、必要な物品を検討中のためである。使用計画は、息止め照射システムの購入や勉強会、学会発表、論文発表を検討中である。
新規ＡＬＫ阻害薬に対する耐性機序の解明

新規ALK阻害薬アレクチニブによる肺癌細胞株の耐性機序を解明した。ALK陽性H3122細胞株にアレクチニブを長期暴露し耐性株を作成し、1EGFRリン酸化の亢進、2METシグナルによるALK下流シグナルの代償を見出した。またこれらを克服する方法として、EGFR阻害薬、MET阻害薬との併用療法をマウス腫瘍皮下移植モデルで有効性を確認した。ALK阻害薬に対する初期耐性として、腫瘍周囲からのEGF刺激によりEGFRがリン酸化され、ALKの下流シグナル(AKT, ERK1/2)を介して生存シグナルを代償することが本研究で示された。また、肺がん手術症例の検体における免疫染色の結果、ALK陽性肺がん患者9例はすべてpanEGFRが発現していることが示された。(ALK陰性肺腺癌は231例、このうちpanEGFR陽性は150例、65%)また、獲得耐性機序についてはALK陽性肺癌細胞株H3122を長期間アレクチニブに暴露し耐性化させた細胞株H3122AFRを樹立し検討を行った。H3122AFRにおいてSNP arrayによる全遺伝子の網羅的copy number解析を行い、EML4-ALKのfocal amplificationのパターンを解析した。またレセプター型チロシンキナーゼのスクリーニングでは、EGFーEGFRシグナル系の関与も確認されたが、このほかMETの関与が強く示唆された。つまりMETのタンパク発現亢進により、リン酸化受容体がALKの下流シグナルを活性化することが示された。これらの耐性を克服する手段として、1EGFR阻害薬(Erlotinib)とアレクチニブの併用、2MET阻害薬(crizotinib)とアレクチニブの併用の効果についてマウス皮下腫瘍移植モデルで有効性が確認された。この研究は2014年アメリカ癌学会総会(San Diego)で発表され、現在論文投稿中である。平成24年度には、ALK融合遺伝子を有する細胞株(H3122)の薬剤耐性株の樹立を行い、耐性メカニズムを検討した。これまで報告されているEGFRの過剰発現によるALKシグナルのバイパスがみられた。これはウエスタンブロットやqPCR法で確認している。また、この耐性機序に対する治療戦略としてEGFR阻害薬であるErlotinibとの併用が有効であることが分かった。平成25年度にはマウス腫瘍皮下移植モデルでのCH5424802とErlotinibの併用療法の効果を確認する予定である。さらに、H3122細胞とH3122の耐性株(H3122AFR)においてDNAのSNP arrayを用い、LOH, copy number解析を行ったところ、これまでの報告と同様H3122AFRでEML4のexon 113とALKのexon2028を含む領域のamplificationがみられた。EML4, ALK以外にもamplificationを認め、現在耐性メカニズムとの関わりを解析中である。Ba/F3細胞にEML4-ALK融合遺伝子を導入し、IL-3を添加せず自動増殖がみられる細胞を樹立し、これらにこれまで報告されている耐性変異を導入した。現在臨床で使用されているcrizotinibとCH5424802の効果をin vitroで比較し、さらにマウスのBa/F3移植モデルに対して治療効果の差を観察し現在結果の解析中である。今後の動物実験の結果によるが、次年度中には学会発表ができる見込み。上記のとおり、動物実験を進行中。同時にALK耐性細胞株の遺伝子解析も行っている。該当なし
99mTcMIBIシンチグラフィでの心室頻拍のカテーテル治療ターゲット電位の予測

器質的心疾患に合併する心室頻拍(VT)に対して遅延電位(late potential:LP)をターゲットとするカテーテル心筋焼灼術が施行され、LPの術前の局在予測に造影MRIや造影CTといった画像診断が非常に重要な役割を担っているが、ICD等デバイス装着例、腎機能低下例、低左心機能例においては施行困難である場合も多い。本研究では、上記の制約を受けない核医学検査、安静時99mTcシンチグラフィでの心筋へのトレーサの取り込みの程度と領域が、カテーテル心筋焼灼術中にマッピングされたLPの局在領域との関連を比較し、99mTcシンチグラフィがLPの局在領域の予測について有効な手段かどうか解明することが目的である。平成30年度にVTに対するカテーテル心筋焼灼術施行前に99mTcシンチグラフィを施行した6症例において、カテーテル心筋焼灼術中に左室全体の電位波高、LPの有無を記録し、99mTcシンチグラフィでのMIBIのuptake率との相関を確認したところ、特に虚血性心筋症においてはuptake率35%をcutoff値とすることで、uptake率35%未満の心筋のviabilityが低下した領域において有意にLPが存在することが確認できた。ただし、マッピングを行う中でより拡大した左室においてカテーテルが到達困難な箇所も存在し、そちらでは正確なマッピングが行えていない可能性があり、今後本研究の精度の向上のためにマッピング方法を検討するという課題が明確となった。また、uptake率35%未満の領域でもLPが存在する領域、存在しない領域の組織学的な性状評価についても今後検討課題であると考える。申請の時点で虚血性心筋症5例、非虚血性心筋症5例を予定していたが、心室頻拍に対する心筋焼灼術自体は10例以上経験できたが、術前に血行動態や日程的にTc心筋シンチグラフィを施行できない症例もあり、虚血性心筋症5例、非虚血性心筋症1例の登録となった。一方で虚血性心筋症ではTc心筋シンチグラフィのトレーサのuptake率で35%をcut off値とすることで35%未満の領域において感度77%、特異度89%と良好な診断精度で遅延電位(LP)の局在を予測することが可能であった。H30年度以前の症例のデータも含めて解析を行っても同様にMIBI良好な関連性が得られており、引き続き平成31年度も症例登録を行い精度の確認を行う。引き続き症例の登録は継続するが、現時点の解析においても99mTc心筋シンチグラフィのトレーサのuptake率と遅延電位(LP)の局在の有意な相関性は認めているため、論文発表を行う予定である。課題として拡大左室においてカテーテルの到達困難箇所があり、それらの領域の評価が不十分であることが研究のリミテーションとなると考えられたため、到達困難な領域の特定やマッピング方法の考案のため、今後拡大左室モデルを作成し、前記を評価することも併せて検討している。

引き続き症例の登録は継続するが、現時点の解析においても99mTc心筋シンチグラフィのトレーサのuptake率と遅延電位(LP)の局在の有意な相関性は認めているため、論文発表を行う予定である。課題として拡大左室においてカテーテルの到達困難箇所があり、それらの領域の評価が不十分であることが研究のリミテーションとなると考えられたため、到達困難な領域の特定やマッピング方法の考案のため、今後拡大左室モデルを作成し、前記を評価することも併せて検討している。次年度使用額が生じた理由として、平成30年度に当初想定されていたマッピングのために必要なAgilisシースの購入額とマッピングで得られた心電図波形を解析するためのバードラボシステムのレンタル料が当院内での支払いが可能となり賄えたこと、また国外・国内の学会参加についても他参加予定であったが不参加であったことである。平成31年度は国外・国内含め学会参加を予定しており、論文発表準備を進める予定である。また、本研究内で新たに明確となった課題についての追加の検討事項につき、拡大左心室の心臓モデルの作成等も予定している。
霞ヶ浦に発生したMicrocystis属藍藻の毒素生産に関する研究

1.Microcystis属藍藻のための平板培養法の確立M.aeruginosa K3Aを用い平板培養法を検討した. 0.4%濃度のアガロースおよび抵融点アガロース平板培地で最も旺盛なコロニー形成が認められた.菌液の希釈には滅菌水を用いるのが良く,混釈法と塗沫法ではコロニー形成数に差は認められなかった.2.霞ヶ浦からのMicrocystis属藍藻の分離と純化前記平板培養法と液体培養を交互に繰り返すことにより, Microcystis属藍藻の分離と無菌化を図った.本方法の特徴的な点は, plate outの際に菌懸濁液を激しく撹拌し,群体の分散を図ることおよび平板上の小さなコロニーを選択することにある.3回の操作の後, 15株中5株は完全に無菌化された.3.分離株の毒性前記方法により単藻化あるいは無菌化した20株について,その毒性を調べたところ, M.aeruginosaに属するK-70とK-139株がマウスに対し毒性を示した.この両株について詳細に検討したところ, K-70株のLD50値は250mg-菌体重量/kg-マウス体重であった.一方, K-139株は,強い毒性を示し,対数増殖期初期の菌体は7.3mg/kgのLD50値を示した.本毒素を投与し死亡したマウスの病理学検査を行ったところ,肝臓にのみ,うっ血,出血,壊死の病変が認められた.4.毒素の赤血球への作用およびcuringによる毒性の消失マウス,ヒツジ,ウサギおよびウマの赤血球に対する溶血反応を調べたところ,いずれの赤血球に対しても溶菌は引き起さず, Grabowらにより報告された毒素と異なる作用を示した.また, novoviocinによるcuring処理により, K-139株からの毒素の消失を調べたが,毒素の消失は認められなかった.1.Microcystis属藍藻のための平板培養法の確立M.aeruginosa K3Aを用い平板培養法を検討した. 0.4%濃度のアガロースおよび抵融点アガロース平板培地で最も旺盛なコロニー形成が認められた.菌液の希釈には滅菌水を用いるのが良く,混釈法と塗沫法ではコロニー形成数に差は認められなかった.2.霞ヶ浦からのMicrocystis属藍藻の分離と純化前記平板培養法と液体培養を交互に繰り返すことにより, Microcystis属藍藻の分離と無菌化を図った.本方法の特徴的な点は, plate outの際に菌懸濁液を激しく撹拌し,群体の分散を図ることおよび平板上の小さなコロニーを選択することにある.3回の操作の後, 15株中5株は完全に無菌化された.3.分離株の毒性前記方法により単藻化あるいは無菌化した20株について,その毒性を調べたところ, M.aeruginosaに属するK-70とK-139株がマウスに対し毒性を示した.この両株について詳細に検討したところ, K-70株のLD50値は250mg-菌体重量/kg-マウス体重であった.一方, K-139株は,強い毒性を示し,対数増殖期初期の菌体は7.3mg/kgのLD50値を示した.本毒素を投与し死亡したマウスの病理学検査を行ったところ,肝臓にのみ,うっ血,出血,壊死の病変が認められた.4.毒素の赤血球への作用およびcuringによる毒性の消失マウス,ヒツジ,ウサギおよびウマの赤血球に対する溶血反応を調べたところ,いずれの赤血球に対しても溶菌は引き起さず, Grabowらにより報告された毒素と異なる作用を示した.また, novoviocinによるcuring処理により, K-139株からの毒素の消失を調べたが,毒素の消失は認められなかった.61年度の研究計画はほぼ達成された。以下に記載する結果に基づき、62年度は毒素生産の遺伝的検討を行う予定である。1.平板培養法の確立アガロースあるいはLow gel temperatureアガロースを低濃度(0.40.5%)に加えた固型培地に、混釈法あるいは平板塗沫法によりMicrocystisを接種し、シャーレをクリーンベンチで乾燥後、反転し30°C,2000luxの条件で培養することにより、旺盛なコロニー形成が認められた。2.霞ケ浦からのMicrocystis属藍藻の分離と純化霞ケ浦より採取したアオコを浮上法により滅菌水で洗浄後、タッチミキサーで強く撹拌しながら希釈し、アガロース培地に混釈した。形成したコロニーを液体培地に、次いでアガロース培地へと接種を繰り返す。1回のこの操作で単藻化し、1数回の操作で無菌株が分離された。21株の毒性をしらべたところ、1株(K-139)の毒性株が分離された。3.毒素生産条件の検討とその毒性K-139株は、対数増殖期初期に強い毒性(【LD_(50)】,7.34mg/kg-体重マウス)を示し、対数期後期では毒性は低下した(【LD_(50)】,約30mg/kg)。この毒性は22°Cおよび30°Cの培養で差は認められなかった。死亡したマウスを病理学的に検討したところ、肝臓にのみ病変が認められ、本毒素は肝臓毒と判断された。

予備的な実験によりK-139株にプラスミドの存在の可能性が示された。そこでエチジウムブロミド(0.11mg/ml)およびノボビオシン(1100μg/ml)処理によるCuring条件を検討し、現在処理株のプラスミドと毒性について検討中であり、本実験は次年度に継続される。
DNAメチル化を指標としたアジア系の年齢推定法の開発と展開

平成30年度は、日本人を主な対象として唾液および歯牙検体の収集、トライアルサンプルを用いた実験ターゲットの決定、情報管理を含めたサンプル処理、リアルタイムPCRデータ解析を始めた。唾液については予定よりも早く特定の年齢層のアジア系検体も日本人検体と同程度(1315検体)に収集できたため、予備的な検討として年齢に関連するとの報告のあるEDAREDDおよびELOVL2について条件・年齢層・国籍を絞った唾液の解析結果とその比較を行った。その結果、20歳台の唾液のメチル化スコアは日本人とその他のアジア系(カンボジア、ベトナム、インドネシア等)で有意な差が認められなかった。また、検体の保存状態にリアルタイムPCRの高解像度融解曲線を用いたD NAメチル化スコアが大きく影響を受けることが判明した。この2点について、本研究の予備的なデータとして、日本法歯科医学会学術大会において中間報告を行った。しかしながら、20歳台以外の検体数はまだ少なく、平成30年度は検量線を作成しての検討には至らなかった。歯牙については、年齢や抜歯に至った歯の状態に偏りはあるものの日本人の試料は40検体程度収集できている。予備検討を行ったところ、セメント質、象牙質、歯髄、歯石、歯牙全体に分けてのDNA抽出は可能であった。しかし、プライマーの設計およびリアルタイムPCRの実験条件検討がまだ完了していない。特に、象牙質とセメント質はモーターを用いて削り出したトライアルサンプルでは今回のリアルタイムPCRによるDNAメチル化スコアの測定は困難であった。平成30年度は、唾液および歯牙検体の収集、情報管理を含めたサンプル処理、リアルタイムPCRデータ解析を開始し、トライアルサンプルを用いた実験ターゲットの決定を行う予定であった。唾液については、学内および短期国際プロブラムで来日する協定校学生の協力を得て予定よりも早く20歳台の検体が収集できたため、予備的な検討として年齢に関連するとの報告のあるEDAREDDおよびELOVL2について条件・年齢層・国籍を絞った唾液の解析結果とその比較を行うことができた。その一方で、病院でのむし歯リスク検査の唾液残余検体数は少なく、20歳台以外の年齢層の検体が不足している。また、検体の保存状態によってもリアルタイムPCRの結果が影響を受けることが判明し、今後保存条件を一定にした検体を用いての検討が必要となった。歯牙については、アジア人の検体を集めることがほとんどかなわないため、現在日本人の検体で条件検討を行っており、収集した検体についても各部分分けてのDNA抽出に時間を要している。歯牙の検体収集や条件検討が困難となることは、当初より想定しており、その分唾液を用いた検証を先に進めている。以上のことから、全体として概ね予定通り進捗していると考えている。次年度(2019年度)は、唾液検体については口腔検査センターに再度状況を説明して少量の残余検体も積極的に収集し、特に日本人については全年齢層(10歳台以下、10.20、30、40、50、60、70歳台以上)の唾液検体を50検体(男女各25個程度)ずつそろえ、保存状態をそろえた唾液検体での検量線と歯牙のリアルタイムPCR高解像度融解曲線分析条件の確立を目指す。また、歯牙検体については、各部分のDNAについて、リアルタイムPCRのプライマーの検証と条件確立を目指す。

その一方で、病院でのむし歯リスク検査の唾液残余検体数は少なく、20歳台以外の年齢層の検体が不足している。また、検体の保存状態によってもリアルタイムPCRの結果が影響を受けることが判明し、今後保存条件を一定にした検体を用いての検討が必要となった。歯牙については、アジア人の検体を集めることがほとんどかなわないため、現在日本人の検体で条件検討を行っており、収集した検体についても各部分分けてのDNA抽出に時間を要している。歯牙の検体収集や条件検討が困難となることは、当初より想定しており、その分唾液を用いた検証を先に進めている。以上のことから、全体として概ね予定通り進捗していると考えている。次年度(2019年度)は、唾液検体については口腔検査センターに再度状況を説明して少量の残余検体も積極的に収集し、特に日本人については全年齢層(10歳台以下、10.20、30、40、50、60、70歳台以上)の唾液検体を50検体(男女各25個程度)ずつそろえ、保存状態をそろえた唾液検体での検量線と歯牙のリアルタイムPCR高解像度融解曲線分析条件の確立を目指す。また、歯牙検体については、各部分のDNAについて、リアルタイムPCRのプライマーの検証と条件確立を目指す。唾液検体を用いた検討については実験条件を当初の予定よりも早く確立することができ、20歳台の日本およびアジア系の検体が現時点で順調に収集されていることから、平成31年度以降に計画していた多国籍検体を用いたメチル化と年齢推定の関連の検証を前倒して開始した。この検証に必要な消耗品を前倒して購入する必要が生じたため、平成30年度に次年度分から20万円の前倒し請求を行った。平成30年度使用額は当初の金額よりも多くなり、次年度使用分が生じた。これについては、次年度予算と合わせ、メチル化スコアを測定するための試薬購入に用いる。