hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜熱帯地域に対応した自然環境学習プログラムと教師支援システムの開発

今年度の研究によって得られた情報から、植生の遷移や外来種の侵入に関する項目についても学習プログラムに加えることが可能になるなど、フィールドの植生情報の蓄積が進み、今後の研究における重要な基盤情報を整理することができた。教師が野外において身近な動植物を観察・調査した経験を持つことは、野外観察学習を行う際はもちろんのこと、教室内での理科授業を進める際にも重要な意味を持つと思われる。しかし、亜熱帯気候に属し他府県とは異なった自然環境にある沖縄県においては、他県での自然環境を想定した指導書や参考書等は参考にならないことが多く、児童・生徒が郷土の身近な自然環境について知るための効果的な学習プログラムや教師を支援するための取り組みは十分ではないのが現状である。そのため、野外観察学習に興味を持つ教員が効果的に利用できる学習プログラムと教師支援システムの開発を目的に研究を行った。今年度の研究では、これまでの研究によって得られた情報をもとにして、野外観察を実施する場合に好適なフィールドとして選定した末吉公園の植生の遷移や外来性植物の侵入に関する項目についての解析を行い、教材プログラムの内容の検討を進めた。その結果、本公園は相観と利用形態から自然林を中心にした「森林保持エリア」と、人工的な植栽が中心で遊具などが整備されている「整備利用エリア」の大きく2つのエリアに区分でき、野外観察学習の場として、それぞれのエリアの特性に基づいた取り組みが可能であることが明らかになった。自然植生が残っている「森林保持エリア」では、約30年前に大部分を占めていたアカギやオオバギなどの陽樹が優占する林から、陰樹性の高い樹木が優占する林に変化していく過程にあることが明らかになり、この地域の植生の遷移を確認できる学習フィールドとしての活用が可能である。また、人工的な植栽が中心の「整備利用エリア」では、外来性のタイトウウルシが植栽されており、本種の実生の一部が自然植生へ分散している可能性が示唆された。そのため、外来種が在来植生を脅かす存在となっていくプロセスを学習する場としての活用が可能である事が明らかになった。学習プログラムに必要な植生情報の集積が進んでおり、フィールド内のマッピング作業も順調に推移している。また、学習プログラムの検討を行う野外観察学習会等も複数回実施しており、研究における重要な基盤情報が順調に蓄積されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で得られたデータをもとに、学習プログラム内容について検討を進め、改善を行っていく。また、この数年で急速に普及してきたタブレット型情報機器への対応についても研究を進める。
大腸菌の蛋白質分泌における膜リン脂質の挙動と寄与の分子レベル解析

大腸菌における蛋白分泌に関連する諸反応と膜酸性リン脂質の関連を,主に酸性リン脂質含量を激減させる変異pgsA3を用いて解析し,以下の成果を得た。1.pgsA3が,酸性リン脂質合成開始過程を触媒する酵素ホスファチジルグリセロリン酸シンターゼの反応機作に係わる細胞質突出領域のミスセンス変異(Thr→Pro)であることを証明し,解析系の特性を明らかにした。2.pgsA3変異株で異常となる蛋白分泌系を検索し,前年度見出したTEMβ-ラクタマーゼのペリプラスムへの移行と成熟化の低下を,抗体を導入した分析系でより明確に示した。さらに,主要蛋白OmpC,OmpF及び未同定の52kDa蛋白の外膜含量が顕著に異なることを発見した。OmpCは増加,OmpFは減少,52kDa蛋白はほとんど消失した。この条件でompF及びsecA遺伝子の転写が昂進すること,52kDa蛋白はenvZ欠損株でも消失することなどを示し,蛋白質分泌過程における膜リン脂質組成の重要性を明らかにした。3.pgsA3変異株での蛋白質分泌異常の分子機序を明らかにするため,細胞機能の変化を解析し,NADHデヒドロゲナーゼ活性の低下,酸素吸収能の低下,Mn-スーパーオキシドディスムターゼの発現増大,RecA及びSulA蛋白に依存するSOS対応の部分発動などを見出した。酸性リン脂質欠損により,細胞には極めて広範な機能の異常が生じ,その一環として蛋白分泌能の低下が起こることが分かった。これらの因果関係を全て明らかにすることは容易ではないが,この方向の研究の重要性がさらに認識されたと考えられる。
肺移植後肺内リンパ組織新生に伴う局所抗体産生が重症型慢性拒絶ＲＡＳに及ぼす影響

Restrictive allograft syndrome (RAS)は研究代表者(佐藤)らが2010年に提唱した予後不良な肺移植後慢性拒絶だが、その発症機序について「外界に暴露された臓器である肺は移植後様々な刺激によってリンパ組織化する」との仮説に基づき研究を進めた。ラット肺移植を行い作成したRASモデルでは、肺内リンパ組織新生に伴う肺内局所での抗ドナー抗体産生を証明した。またRASの病態には上記の液性拒絶が重要であり、逆に従来型の気道中心の慢性拒絶に気道の感染等の炎症が重要であることを示した。さらにマウス気管移植モデルを用い、気道中心の炎症が直接線維芽細胞を活性化させる機序を見出した。平成26年度の目標は、第一に同所性ラット肺移植モデルの確立、第二に、異なる免疫抑制レベルでの同所性肺移植モデルにおける肺内リンパ組織新生と慢性拒絶の表現型の観察研究であった。同所性ラット肺移植モデルは、Brown-Norway ratをドナー、Lewis ratをレシピエントとして早期に確立することができた。異なる免疫抑制プロトコール(cyclosporineの投与期間の違い)によって、術後14週の時点で、早期の急性拒絶によるグラフト肺組織の破壊と荒廃から、ほぼまったく拒絶が起こっていない状態までのスペクトラムを再現することに成功した。とくに興味深いのは、術後5週の時点で拒絶反応が見られない投与プロトコールでもcyclosporineが比較的早期に中止されている場合には14週の時点で気道周囲にlymphoid neogenesisと考えられるリンパ球の集簇と気道の狭小化が見られることであり、これはヒトのbronchiolitis obliteransまたはその前駆病変とされるlymphocytic bronchiolitisの組織に類似していることから、比較的マイルドな慢性拒絶がBOSにつながるとの仮説を支持する結果である。一方、現時点で術後14週の結果がまだ得られていないが、もう少し免疫抑制を弱めたプロトコールでは、術後5週の時点で気道周囲に加えて胸膜直下や末梢肺にリンパ球の集簇を認める例がある。これらが長期的には気道周囲だけでなく末梢肺・胸膜の炎症と組織リモデリングをおこし、restrictive allograft syndromeに似た病変を作り出す可能性があり、最終結果が待たれる。本研究では、移植肺内に生ずるリンパ組織新生が肺移植後慢性拒絶に及ぼす影響をラット肺移植モデルを用いて調べた。これまでの研究成果の概要は以下にまとめられる。1)免疫抑制の程度が不十分であれば、移植肺内の新生リンパ組織においては局所での抗ドナーMHC class I抗体産生が認められる。2)抗ドナー抗体産生に比例して、慢性拒絶病変の進行が認められる。3)免疫抑制の程度に応じて、移植肺内ではBOSではなくRASパターンの変化(気道線維化に加えて、胸膜直下肺実質のfibroelastosis様変化)を生じる。今回我々は、科学研究費を用いたラット肺移植モデルの実験を通して,移植肺内の新生リンパ組織が抗ドナー特異抗体を局所産生することを見出した(Miyamoto E, Sato M, et al. Transplantation 2017).本研究はproof-of-conceptとして重要と考えられ、現在、トロント大学の協力を得て、ヒト肺移植臨床検体での検討が進んでいる。また京都大と東京大で基礎研究を行い下記の知見を得た.1)ラット肺移植モデルで免疫抑制を段階的に変化させ,免疫抑制が不十分な場合はRAS様の組織変化(胸膜末梢肺を中心とする線維化)を呈する(Miyamoto E, et al.投稿中)。2)ラット肺移植モデルで,免疫抑制下で細菌成分であるリポ多糖(LPS)を気道内に投与すると,気道中心の炎症と拒絶反応を生じBOS様病変となる(Takahagi A,投稿準備中).3)マウス同所気管移植モデルで,気道線維芽細胞がToll-like receptor (TLR) 4を発現し,LPS刺激で活性化・線維化を増悪させる(Kawashima M, et al.投稿準備中)。これらは肺移植後慢性拒絶の型を考えるうえでいずれも重要と考えられ、さらなる発展と臨床応用が期待される。ラット肺移植の手技を確立するとともに、動物実験としては比較的長期間にわたる観察研究において、有用な予備実験結果が得られた。これを基に抗体産生を介した慢性拒絶の実験・研究は予定通り27年度以降進める予定である。一方、比較的弱い免疫抑制をかけた個体では予想以上に炎症反応が遷延しており、組織は線維化に至っていない。つまり移植後2週間の急性期を免疫抑制で乗り越えれば、そのあとの拒絶反応は比較的マイルドで遷延性である。これは文字通りの「慢性拒絶」としてはよいモデルだが、実際の臨床像とは乖離しており、実際には患者に対し免疫抑制療法が強化されることがその理由として考えられる。

従って、実験計画の修正が必要となっている。これまでの研究で、免疫抑制と局所抗体産生、移植肺の病変のパターンについての理解が大きく前進した。ここで生じた大きな疑問は、免疫抑制状態の程度によってBOSタイプとRASタイプの病変が生じるのではなく、免疫抑制の状態によってRASパターン内での程度の違いを生じるとのはなぜかである。新たな仮説は、「グラフトへの経気道的な刺激(例:感染、誤嚥)が気道を中心とした炎症、BOSパターンの慢性拒絶の誘導に関与する」である。これをさらに検証するため、これまで使用してきたモデルに経気道的刺激(LPSの少量反復投与など)を行い、BOSパターンの慢性拒絶が誘導されるか、またこれまでの研究で生じた局所での抗体産生が気道を中心に生じるのかを検証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。呼吸器外科平成27年度以降は、これらの結果をさらに確固たるものとするとともに、メカニズムの詳細に迫る研究、とくにlymphoid neogenesisの役割として局所の抗体産生の果たす役割をさらに追及していく。すでに確認された炎症(リンパ球の集簇)が実際にリンパ組織新生であることを免疫染色で確認し、また過去の研究で用いたのと同様、組織培養を4日間行い、その上清をflow cytometryで検証することで、抗ドナー抗体が肺内局所で産生されているかを検証する。一方、予想外なことに、比較的弱い免疫抑制をかけた個体では炎症反応が遷延しており、組織は線維化に至っていない。つまり移植後2週間の急性期を免疫抑制で乗り越えれば、そのあとの拒絶反応は比較的マイルドで遷延性である。これは文字通りの「慢性拒絶」としてはよいモデルだが、実際の臨床像とは乖離しており、実際には患者に対し免疫抑制療法が強化されることがその理由として考えられる。従って、実験計画の追加修正が必要となったため、以下の実験系を追加する。移植後0日14日または21日までの免疫抑制+移植後84日98日の免疫抑制(Cyclosporne A, 5 mg/kg)の投与をBrown-Norway ratをドナー、Lewisラットをレシピエントとして行う。98日目で犠牲死させた個体から移植肺を回収し、組織学的に検証を行う。とくに線維化が臨床検体でみられるBOSやRASに類似した局在を示すかどうかを、alpha-smooth muscle actin染色、trichrome染色などを用いて検証する。27年度の研究では、26年度に行った動物実験に対するまとめ作業を優先した。その分、英語論文校正等に対する費用が増えたが、動物実験そのものに対する予算を執行が予想を下回った。また計画していた国際学会での発表、共同研究を行っている海外施設との研究の打ち合わせが27年度内に実現しなかった。遅れていた分の動物実験を28年度に行う予定である。特に、新たな仮説である、BOSの発症には気道への刺激が気道中心の炎症を引き起こすために重要であるとの仮説を検討する。また28年度には、国際学会での発表、共同研究を行っている海外施設との研究の打ち合わせ等を行う予定であり、出張費にも使用する。
簡易傾斜計を用いた嚥下食塊特性測定法の開発

新たに開発した傾斜計による嚥下時の食品食塊特性評価が可能か否かについて検討した。数種の食品食塊を傾斜計(1度/秒で傾斜する傾斜板上の試料が動き出す角度(SA)と25 mm先のラインに到達する角度(AA)を測定する)で測定した結果、SAは試料の付着性を、またAAーSAの角度は食塊の凝集性を表すことが示された。また、傾斜計を用いると市販のトロミ剤の食塊特性に対する効果も測定可能であることが示された。嚥下時の食塊特性を明らかにすることは、ヒトの摂食・嚥下機能を解析する上で、特に摂食嚥下障害を抱えているヒトの摂食を考える上で極めて重要である。そこで本研究は、簡単な測定装置(傾斜計)を用いることで、嚥下食塊の特性を簡便に測定することが可能か否かを明らかにすることを目的としている。そこで初年度(平成27年度)は、試作した傾斜計を用いることで各種食品の食塊特性が即できるか否かについて検討した。傾斜計は、傾斜版、角度計および駆動系(傾斜版を1度/秒で傾斜させる)から成る。試験食品には、ケチャップ、トウフ、米飯、ビスケットを用いた。正常な食生活が営める12名の成人被験者にこれらの食品(各8g)を咀嚼させ、嚥下直前の食塊を回収し、食塊が滑り出す角度(SA)と25mm先のラインに到達する角度(AA)を求め、咀嚼前の各食品のSAおよびAAと比較した。その結果、ケチャップでは咀嚼前後で有意な変化は認められなかったが、トウフと米飯のSAとAAはともに嚥下時には有意に減少するのに対し、ビスケットでは逆に有意に増加した。この結果はトウフと米飯では咀嚼することによって食塊の付着性が増したことを示し、ビスケットでは逆に付着性が増したことを示している。以上の結果から、試作した傾斜計を用いることで、いろいろな食品咀嚼時の、咀嚼前後での各食品食塊特性の変化をかなり正確に測定することができる可能性が示された。初年度(平成27年度)の研究結果から、試作した傾斜計を用いて嚥下直前の食塊や咀嚼前の摂取食品試料が滑り出す角度、および到達ラインに達する角度を測定することにより、被験者の個人差、また、摂取する食品のタイプが異なっても、摂取した食品の特性が嚥下までの咀嚼過程でどのように変化したかを調べることが、可能であることが示された。したがって初年度は、当初の研究目的に向かって、おおむね順調に進展していると言える。嚥下時の食塊特性を明らかにすることは、ヒトの摂食・嚥下機能の解析、特に嚥下困難者や嚥下障害者の摂食を考える上で極めて重要である。しかしながら、嚥下食塊特性を測定するには高価な測定機器が必要となり、医療や介護の現場で簡単に用いることは不可能である。そこで本研究は、簡単な傾斜計による測定法を用いることによって嚥下食塊特性がどの程度正確に測定できるかについて調べることを目的として行っている。初年度(平成27年度)では、傾斜計を用いた方法(傾斜板が1秒当たり1度の角度で傾斜していく)がどの程度食塊特性を正確に測定できるかについて、数種の食品食塊を傾斜板上に載せ、嚥下直前の各食品食塊が滑り出す角度(SA)と25mm先のラインに到着した角度(AA)について調べた結果、傾斜計での角度測定は嚥下食塊特性をかなり正確に調べることが出来ることが示された。そこで平成28年度では、嚥下障害者の摂食で広く用いられているトロミ剤の効果について傾斜計を用いて調べた。実験には、米飯とビスケット(各8g)を咀嚼試料に用い、トロミ剤(濃度1%)を加えた試料と加えない試料を12名の成人被験者に嚥下まで咀嚼させ、嚥下直前の食塊を回収して傾斜板に載せ、各食塊のSAとAAを調べた。その結果、トロミ剤を加えると、嚥下までの咀嚼回数は有意に短縮するにも関わらず、嚥下に適する食塊特性は通常咀嚼時の食塊と変わらないことが示された。この結果は、トロミ剤は嚥下に適する食塊特性形成を少ない咀嚼回数で獲得させることを示しており、またこの結果は、傾斜計を用いた食塊特性測定法を用いることで、比較的簡単にトロミ剤の効果を調べることが可能であることを示唆している。しかしながら、トロミ剤の濃度は異なった場合などさらに調べていく必要がある。初年度(平成27年度)に引き続き、本年度では、トロミ剤を加えた食品試料咀嚼を行い、嚥下直前の食塊の滑り出す角度(SA)と到着ラインに達した角度(AA)を調べた結果、トロミ剤を加えると咀嚼回数が短縮するが嚥下食塊特性には有意差が無く、トロミ剤の効果を傾斜計で求めた角度の比較を通して示すことが出来たことは、傾斜計を用いた食塊特性測定法の正確性を実証したことになり、当初の目的に向かって、おおむね順調に進展していると言える。

嚥下時の食塊特性を知ることは、ヒトの摂食嚥下機能の解析、特に嚥下障害者の摂食を考える上で重要であるが、食塊特性の測定を行うには高額の機器が必要となるために、簡便な測定方法の開発が必要かつ急務である。そこで、“傾斜板による測定法"を開発した。この測定法は、傾斜板が1度/秒の速度で上昇し、その上に載せた食塊の動き出す角度と到達ラインに達する角度から食塊特性を測定する測定方法である。初年度(平成27年度)では、嚥下時の食塊が滑り出す角度(SA)と25mm先の到達ラインに達した角度(AA)を調べることにより、嚥下食塊特性を比較的正確に測定出来ることが示された。次年度(平成28年度)では嚥下障害者の摂食で広く用いられているトロミ剤の食塊特性に及ぼす効果について傾斜計を用いて調べた。その結果、トロミ剤を加えることにより嚥下可能な食塊特性が早期に形成される事実を角度測定から客観的に示すことが出来た。最終年度(平成29年度)では駆動系の無い一定の角度を保った傾斜板を用いた測定法(到達ラインに到るまでの時間測定)との比較を濃度の異なるトロミ剤を用いて行った。その結果、傾斜板による測定では試料の濃度が増す(粘性が増す)と到達ラインに達する時間が指数関数的に増大する(粘性が高くなると到達時間が指数関数的に増大する)のに対し傾斜計では直線的な関係が得られることから、傾斜計を用いると、低い粘性を持つ食塊から高い粘性を持つ食塊まで比較的短時間内に測定可能であることが示された。以上の得られた結果から、今回開発した傾斜計による食塊特性測定法は、比較的簡便かつ正確に嚥下食塊特性を調べることが可能であることが示された。新たに開発した傾斜計による嚥下時の食品食塊特性評価が可能か否かについて検討した。数種の食品食塊を傾斜計(1度/秒で傾斜する傾斜板上の試料が動き出す角度(SA)と25 mm先のラインに到達する角度(AA)を測定する)で測定した結果、SAは試料の付着性を、またAAーSAの角度は食塊の凝集性を表すことが示された。また、傾斜計を用いると市販のトロミ剤の食塊特性に対する効果も測定可能であることが示された。傾斜計を用いた食塊の角度計測が、従来の食塊物性測定で用いられてきたTPAで得られる一次パラメーター(硬さ、付着性、凝集性)とどのような関係にあるかを比較検討する。また、嚥下障害者などに広く用いられているトロミ剤を加えて咀嚼した場合には傾斜計で得られる角度がどのように変化するかを調べ、傾斜計を用いた食塊特性解析法が、介護や医療の現場で使用できる方法か否かについて検討する。更に、駆動系のない傾斜版での測定が可能か否かを検討する。これは、介護や医療の現場で実際に使用できる食塊計測法を提供するために必須で、この開発が本研究の最終目標となる。(今後の推進方策)傾斜計を用いた食塊の角度測定が、摂食嚥下障害者で広く用いられているトロミ剤の添加状況をどの程度正確に反映して測定できるかについて、濃度の異なるトロミ剤を用いて調べ、この傾斜計を用いた食塊特性測定法が、介護や医療現場でどの程度使用可能かについて検討する。また、駆動形のない傾斜板による食塊特性の測定が可能かどうかについても具体的に検討を加えていきたい。口腔生理学、生理学事前に試作した傾斜計を用いて実験を遂行したところ、特に手直し等の箇所もなく、今年度で予定した研究実績が得られ、傾斜計改良に予定していた経費がかからなかったため、211,167円の未使用額が出た。本研究で用いている傾斜板の素材はアクリル製の板であるが、擬似生体素材(人工皮膚)が存在するという情報を得て、この人工皮膚を傾斜板に貼り付けることでよりヒトの嚥下時の食塊移動に近い状況が得られると考え、人工皮膚を試験的に発注購入して実験を行ったが、人工皮膚を用いた場合に得られる結果はアクリル板で得られた結果と変わらなかったことから、人工皮膚製作の費用が不要となったため、120,50円の未使用額が出た。この金額を翌年度で計画しているトロミ剤の効果に関する実験等の費用に用いる。具体的には、初年度では、傾斜計に載せる傾斜板の試料到達ラインを25mmとして行ったが、トロミ剤を加えた場合、このラインを変更する必要があると考えられる。
C型肝炎にみられる補体のcold activationに関する研究

補体のcold activationは,被検血清を低温で放置すると試験管内で補体のclassical pathwayが活性化され,残存補体による溶血活性が著しく低下する現象である.この現象がC型肝炎ウイルス(HCV)の感染,特にHCV血症と極めて密接に関連することは,Itohらと我々の共同研究で詳細に証明され,前年度の実績報告書にその概要を記した.今年度はインターフェロン(IFN)治療を行ったC型慢性肝炎症例につき,各種HCV関連マーカーとともに補体のcold activationを経時的に測定し,その臨床的意義を検討した.1)まずC型慢性肝疾患10例と対照の供血者10例につき,採血後直ちに血清分離を行った血清と,同血清を4°Cにover night静置した後の血清につき,Itohらの開発したmicrotitration methodにより溶血活性を測定した.C型肝炎10例中9例は4°Cover night保存にて溶血活性は低下し,うち7例では溶血活性は消失し,補体のcold avtivationが証明された.対照群では溶血活性に変化はみられなかった.2)6ヶ月間のIFN治療を行いその後少なくとも6ヶ月以上経過を観察し得たC型慢性肝炎67例につき,IFN投与前,投与中,投与終了後にHCV関連マーカーとともに,補体のcold avtivationを検索した.(ii)IFN投与前cold activationを示した56例中,IFN投与中ないし治療後にcold activationが消失した16例中14例はIFNのresponderであった.一方cold avtivationが残存した40例中33例はIFNのnon-responderであった.残る7例はcold activationの軽快を認めたが,これらもIFNのresponderであった.(iii)また,補体のcold avtivationの消失は,IFNによるHCV RNAの減少,消失を反映するだけでなく,IFN投与後の長期の予後の予測にも有用であった.補体のcold activationは,被検血清を低温で放置すると試験管内で補体のclassical pathwayが活性化され,残存補体による溶血活性が著しく低下する現象である.この現象がC型肝炎ウイルス(HCV)の感染,特にHCV血症と極めて密接に関連することは,Itohらと我々の共同研究で詳細に証明され,前年度の実績報告書にその概要を記した.今年度はインターフェロン(IFN)治療を行ったC型慢性肝炎症例につき,各種HCV関連マーカーとともに補体のcold activationを経時的に測定し,その臨床的意義を検討した.1)まずC型慢性肝疾患10例と対照の供血者10例につき,採血後直ちに血清分離を行った血清と,同血清を4°Cにover night静置した後の血清につき,Itohらの開発したmicrotitration methodにより溶血活性を測定した.C型肝炎10例中9例は4°Cover night保存にて溶血活性は低下し,うち7例では溶血活性は消失し,補体のcold avtivationが証明された.対照群では溶血活性に変化はみられなかった.2)6ヶ月間のIFN治療を行いその後少なくとも6ヶ月以上経過を観察し得たC型慢性肝炎67例につき,IFN投与前,投与中,投与終了後にHCV関連マーカーとともに,補体のcold avtivationを検索した.(ii)IFN投与前cold activationを示した56例中,IFN投与中ないし治療後にcold activationが消失した16例中14例はIFNのresponderであった.一方cold avtivationが残存した40例中33例はIFNのnon-responderであった.残る7例はcold activationの軽快を認めたが,これらもIFNのresponderであった.(iii)また,補体のcold avtivationの消失は,IFNによるHCV RNAの減少,消失を反映するだけでなく,IFN投与後の長期の予後の予測にも有用であった.ある種の肝疾患患者血清は低温保存すると補体が消費され、残存補体による溶血活性が著しく低下する事実は、1970年代に我が国の研究者により発見され、補体のcold activationと呼ばれていた。近年のC型肝炎ウイルス(HCV)の検出系の開発により、この現象がC型肝炎と極めて密接に関連することが解明されたが、この現象の臨床的意義はほとんど明かにされておらず、その発症機序も不明のままである。そこで今回、HCV抗体陽性供血者、C型慢性肝疾患、インターフェロン(IFN)治療を行ったC型慢性肝炎につき、各種HCV関連マーカーとともに、補体のcold activationを検索し、その臨床的意義を検討した。1)49,088名の一般供血者中、HCV抗体は315名(0.64%)に検出され、うち181名(57%)がHCV RNA陽性であった。補体のcoldactivationは181名中140名(77%)に認められ、HCVウイルス血症と密接な関連がみられた。2)C型慢性肝疾患327例中292例(89%)に補体のcold avtivationを認めた。特に236例(72%)は溶血活性は完全に喪失し、著しく高度な活性化を示していた。対照としたB型慢性肝疾患94例中14例(15%)でもcold activationを認めたが、その活性は弱く、溶血活性の喪失を示したのは1例(1%)のみであった。

3)補体のcold activationを示すC型慢性肝炎56例にIFNを投与したところ、18例で同活性の消失がみられたが、うち15例はIFNのcomplete responderであった。以上より、C型肝炎患者にみられる補体のcold activationはHCVウイルス血症と密接に関連し、IFN治療の長期予後の予測に有用と考えられた。補体のcold activationは,被検血清を低温で放置すると試験管内で補体のclassical pathwayが活性化され,残存補体による溶血活性が著しく低下する現象である.この現象がC型肝炎ウイルス(HCV)の感染,特にHCV血症と極めて密接に関連することは,Itohらと我々の共同研究で詳細に証明され,前年度の実績報告書にその概要を記した.今年度はインターフェロン(IFN)治療を行ったC型慢性肝炎症例につき,各種HCV関連マーカーとともに補体のcold activationを経時的に測定し,その臨床的意義を検討した.1)まずC型慢性肝炎疾患10例と対照の供血者10例につき,採血後直ちに血清分離を行った血清と,同血清を4°Cにover night静置した後の血清につき,Itohらの開発したmicrotitration methodにより溶血活性を測定した.C型肝炎10例中9例は4°Cover night保存にて溶血活性は低下し,うち7例では溶血活性は消失し,補体のcold avtivationが証明された.対照群では溶血活性に変化はみられなかった.2)6ヶ月間のIFN治療を行いその後少なくとも6ヶ月以上経過を観察し得たC型慢性肝炎67例につき,IFN投与前,投与中,投与終了後にHCV関連マーカーとともに,補体のcold avtivationを検索した.(ii)IFN投与前cold activationを示した56例中,IFN投与中ないし治療後にcold activationが消失した16例中14例はIFNのresponderであった.一方cold avtivationが残存した40例中33例はIFNのnon-responderであった.残る7例はcold activationの軽快を認めたが,これらもIFNのresponderであった.(iii)また,補体のcold avtivationの消失は,IFNによるHCV RNAの減少,消失を反映するだけでなく,IFN投与後の長期の予後の予測にも有用であった.
嗅覚系の加令変化に関する組織化学的検討

マウス嗅上皮および嗅球における神経栄養因子受容体の発現を,発達期から老化時まで経時的に,免疫組織化学的に観察した.用いた抗体はtrkA,trkB,trkCに対する抗体で,それぞれ神経成長因子,脳由来神経栄養因子,ならびにニューロトロピン3の高親和性受容体に対する抗体として使用されているものである.その結果,trkA(高親和性神経栄養因子受容体)の発現は胎生14日から老化時まで嗅細胞,嗅球糸球体に認め,中でも胎生16日目が最も発現が強く,成熟するにつれ,また,老化にともない発現は減少した.その間,発現が強い時期においては,嗅細胞の細胞体および軸索に発現していたが,発現の弱い老化マウスでは,細胞体での発現はわずかで,神経軸索(嗅神経繊維束)にのみ発現を認めた.trkB(高親和性脳由来神経栄養因子受容体)は全期間を通して発現を認めなかった.trkC(ニュウロトロピン3受容体)は胎生18日から生後3日にかけて嗅球に発現を認めたが,嗅上皮には発現を認めなかった.以上の結果から,嗅覚伝導路の発達,成熟ならびに生存維持には神経成長因子が重要な役割を演じていることが推察された.また,抗神経成長因子抗体を用いた実験も同時に行ったが,意義ある結論は得られなかった.その他,カルノシン,神経接着因子,PCNA,セロトニンならびにドパミンに対する抗体を用いて同様の研究を現在行っているところである.マウス嗅上皮および嗅球における神経栄養因子受容体の発現を,発達期から老化時まで経時的に,免疫組織化学的に観察した.用いた抗体はtrkA,trkB,trkCに対する抗体で,それぞれ神経成長因子,脳由来神経栄養因子,ならびにニューロトロピン3の高親和性受容体に対する抗体として使用されているものである.その結果,trkA(高親和性神経栄養因子受容体)の発現は胎生14日から老化時まで嗅細胞,嗅球糸球体に認め,中でも胎生16日目が最も発現が強く,成熟するにつれ,また,老化にともない発現は減少した.その間,発現が強い時期においては,嗅細胞の細胞体および軸索に発現していたが,発現の弱い老化マウスでは,細胞体での発現はわずかで,神経軸索(嗅神経繊維束)にのみ発現を認めた.trkB(高親和性脳由来神経栄養因子受容体)は全期間を通して発現を認めなかった.trkC(ニュウロトロピン3受容体)は胎生18日から生後3日にかけて嗅球に発現を認めたが,嗅上皮には発現を認めなかった.以上の結果から,嗅覚伝導路の発達,成熟ならびに生存維持には神経成長因子が重要な役割を演じていることが推察された.また,抗神経成長因子抗体を用いた実験も同時に行ったが,意義ある結論は得られなかった.その他,カルノシン,神経接着因子,PCNA,セロトニンならびにドパミンに対する抗体を用いて同様の研究を現在行っているところである.
非営利組織の組織論および働き方に関する日米比較研究

本年度はまずワーカーズ・コレクティブを事例として取り上げ、日本においてオルタナティブ組織が体制の中で既存組織と競争する道を選択した場合に、どのような影響を受けるかという点について事例をもとに考察し、論文にまとめた(『年報社会学論集』16号参照)。考察の結果、オルタナティブ組織は外的圧力を受けて官僚制的側面が高まることが考察された。このことから、Weberの鉄檻の呪縛に現代社会は依然として囚われ続けていると結論づけざるをえない。しかしながらオルタナティブ組織の既存組織への挑戦は決して失敗ではなく、むしろその挑戦を高く評価すべきである。本研究で取り上げた二つのワーカーズは、外的圧力から運動体的側面が薄れたがどちらの組織も設立から10年間以上存在し続け、その間、共同体や平等のイデオロギーを色濃く保ちながら一定期間活動を続けた。運動面と事業面のジレンマについて、二つのワーカーズは運動面から事業面重視の組織体へと変容を遂げたが、組織運営において運動面と事業面は両立し得ないのであろうか。NPOやワーカーズを含めた社会運動組織において、この命題はとりわけ重要である。しかしながら、両立の仕方は組織の掲げる運動面の内容により異なる。ワーカーズのようにメンバー間の平等を運動理念とする組織に対する一つの答えとして、意志決定への直接参加を確保するために組織を小規模に押さえ、技術の専門化による分業化や差異化がおこらないように技術の高度化を防ぐことにより、事業面と運動面のジレンマを防いだり、また組織が拡大した場合には、スピン・オフ(分離独立)をすることにより、組織規模を小規模に保つことができるだけでなく、同様の組織を増やすことにより、運動全体の影響力を高めることにつながるであろう。また、本年度は日本における非営利組織研究の一例として、現在新たに創設されつつある法科大学院にも注目し、いくつかの大学へ聞き取り調査を行った。
インドネシアの金鉱山地域における水銀汚染リスクの低減に関する超学際的研究

本年度の研究実施計画:本研究プロジェクトの最終年度として、以下の各研究グループの研究を遂行した。年度中に、研究成果を発表するための国際セミナーを実施した。また、各グループの研究成果を国際学術雑誌および国際会議紀要(査読付き)に発表した。各グループおよび全体の研究成果発表の研究実施計画は以下の通りである。1環境影響評価グループ:平成28・29年度にゴロンタロ州の各調査地域において採取したすべての試料(堆積物、土壌、水、植物、毛髪、血液、作物等)、および、今年度、補足的に採取した試料の重金属濃度(水銀、ヒ素、鉛等)を分析した。分析終了後、各データの総合的解析を実施した。2社会経済評価グループ:平成28・29年度調査で不十分な地域を再調査し,戸別インタビューおよびアンケート調査を実施した。それらのデータに基づいて社会経済的に解析した。3技術開発グループ:昨年度、水銀を高濃度に蓄積するモエジマシダを発見した。今年度は、モエジマシダの分布調査を行い、水銀・ヒ素濃度を測定した。以上のデータに基づいて、、研究メンバー全員が、8月までに、研究結果のデータを共有し、その後、各グループの総合解析結果・考察を議論した。その成果は、平成30年8月11-12日にインドネシア・ゴロンタロ州ゴロンタロ市において、研究代表者が主催するTREPSEA2018(Trans disciplinary Research of Environmental Problesm in Southeast Asia 2018)において発表した。TREPSEA2018のポスト国際学会紀要は、現在、全論文査読中であり、2019年度中に発行する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。4月にスタートミーティングを愛媛大学で開催し,プロジェクトメンバー20名が参加した。研究代表者の榊原が6月にインドネシアを訪問し、インドネシア人主要研究協力者と研究の意義・目標や各グループの役割・課題等を共有した。7月に、調査のための打合せを、10月には平成28年度のフィールド調査報告会を実施した。のべ22名の日本人研究者が参加した。環境影響評価グループは、89月にゴロンタロ州北部の北ゴロンタロ県KuandangおよびSumalataの違法金鉱山周辺の河川周辺の生態系調査および分析試料採取を実施した。北ゴロンタロ県およびボネボランゴ県の鉱山周辺地域において、土壌・河川堆積物・河川水・植物等の水銀地球化学図を作成するための試料(約500試料)を採取した。また,総水銀濃度測定のための毛髪・爪試料を鉱山労働者および周辺住民から採取した(約200試料)。さらに水銀中毒調査のための問診票を作成し、鉱山労働者や住民に対する疫学的問診を行った。採取した試料をICP-MS、ED-XRF、PIXE等を用いて水銀および他の重金属濃度を測定した。社会経済評価グループは、ゴロンタロ州ボネボランゴ県における小規模金採掘による環境汚染・健康被害を軽減し、持続的な地域経済を実現させるため、現地の状況を把握するとともに、代替的な職業への就業機会を創出する上での基礎的情報の収集を行った。より具体的な情報の把握に向けて、現地研究者と合同で大規模調査を実施する方向で調整を進める。環境影響評価グループは、現地周辺において、植生調査を行うとともにシダ類およびマンゴーを中心に草本・木本類を採取した(約200試料)。現地に自生するカヤツリグサ科の植物も探索した。技術開発グループでは、天然繊維を用いた水質浄化システムをプロトタイプのデバイスを開発し、室内実験によってその性能に関する定性的試験を実施した。予算削減によって研究計画の一部変更が余儀なくされたが、ほぼ当初の予定通りプロジェクト研究を実施することができた。社会経済評価グループは、2016年8月にブラワ郡(ゴロンタロ州ボネボランゴ県)を訪問し、現地の小規模金採掘の状況を視察するとともに、代替的な職業に就業する際に重視する属性について、現地の一部住民を対象とした試行的調査を実施した。まず、7月に中間総括ミーティングを愛媛大学で開催し、これまでの進捗状況と今後の予定について情報を共有した。研究計画に基づいて、研究代表者の榊原が6月、8月、10月、11月、12月、3月にインドネシアを訪問し、インドネシア人主要研究協力者と研究打合せ、調査、セミナーなど随時行ってきた。また、4名の研究分担者および現地連携研究者も8月および12月にインドネシアを訪問・調査を行った。その結果、スラウェシ島のゴロンタロ州の多数の零細小規模金採掘(ASGM)現場では,金抽出に主に水銀が使用され,周辺環境に投棄されていることが明らかになった。この調査における各グループの研究実績は以下の通りである。●環境影響評価グループ:調査地域の沿岸域および島嶼部において周辺の土壌,サンゴ礁の分布範囲および海洋生物の生態系調査を行った。水銀分析用の魚介類の試料(約100試料)を採取し、水銀濃度を測定した。森林地域では、木本類の樹皮の水銀濃度分析を実施し、ASGMサイトから放出された蒸気水銀の挙動を解析した。また、調査地域の鉱山周辺地域において,土壌・河川堆積物・河川水の水銀地球化学図を作成するための試料を採取した。総水銀濃度測定のための毛髪・爪試料を鉱山労働者および周辺住民約200名から採取した。

また,水銀中毒調査のための問診票を作成し,鉱山労働者や住民のべ約300人に対する疫学的問診を行った。●社会経済評価グループ:既存資料レビュー・社会経済状況の調査に加えて,地域住民や行政主体などのASGM周辺地域の住民約350人へのアンケート・聞き取り調査を実施した。所得水準・貧困・環境問題の認識などの基礎情報も把握した。●技術開発グループ:現地周辺において,植生調査を行うとともに自生する草本類約100試料を採取し、水銀濃度等を測定した。特に現地に自生するモエジマシダの分布調査を行い、重金属濃度を測定した。本研究プロジェクトの調査・分析は、当初の予定をはるかに上回って研究成果が得られている。特に、環境影響評価グループでは、世界で初めて木本類を用いた蒸気水銀による大気汚染の評価方法を開発した。この成果につては、インパクトファクターの高い国際学術誌に公開する予定である。技術開発グループでは、現地住民の地域知とメンバーの科学知を統合した「統合知」をステークホルダーと共創し、日本の民間企業と協働でその製品化を目指し、貧困削減への活用を目指している。また、理論的研究には、本研究プロジェクトのように、ステークホルダー間の利害関係が強く、対話が困難な場合に、それを劇的に促進するトランスフォーマティブ・バウンダリー・オブジェクトという概念を創出し、その理論化および実践的活用をすることを目指している。また、探索したキーステークホルダーと協働で、水銀汚染の無い地域社会への未来シナリオを共創し、それに沿って、現状調査を行うだけでなく、重要なアクターとしてのコミュニケーターを中心に重要かつ孤立しているステークホルダーに対する対話・信頼・合意を獲得しつつ、問題解決のアクターへの変容をもたらすプロセスを解明する。また、キーステークホルダーによって組織されるトランスディシプリナリー実践共同体が、水銀汚染問題解決へ向けて新たな統合知を、さらにはその活用・普及によって持続可能な地域イノベーションを共創する道筋を解明する。本年度の研究実施計画:本研究プロジェクトの最終年度として、以下の各研究グループの研究を遂行した。年度中に、研究成果を発表するための国際セミナーを実施した。また、各グループの研究成果を国際学術雑誌および国際会議紀要(査読付き)に発表した。各グループおよび全体の研究成果発表の研究実施計画は以下の通りである。1環境影響評価グループ:平成28・29年度にゴロンタロ州の各調査地域において採取したすべての試料(堆積物、土壌、水、植物、毛髪、血液、作物等)、および、今年度、補足的に採取した試料の重金属濃度(水銀、ヒ素、鉛等)を分析した。分析終了後、各データの総合的解析を実施した。2社会経済評価グループ:平成28・29年度調査で不十分な地域を再調査し,戸別インタビューおよびアンケート調査を実施した。それらのデータに基づいて社会経済的に解析した。3技術開発グループ:昨年度、水銀を高濃度に蓄積するモエジマシダを発見した。今年度は、モエジマシダの分布調査を行い、水銀・ヒ素濃度を測定した。
レックリングハウゼン病の機械刺激受容システム解明とケロイド治療への応用

Neurofibrominの機能的異常を来しているNF-1においては、LIMKおよびその下流のCofilinが過剰にリン酸化された状態、その結果アクチン重合亢進状態にあるため、伸展刺激によるアクチン重合促進という反応が生じにくく、過剰な瘢痕が形成されにくい可能性が考えられた。このことから、機械的刺激によるアクチン重合・脱重合サイクルの亢進という反応をコントロールすることができれば、ケロイド・肥厚性瘢痕のような過剰な瘢痕形成を抑制できる可能性が示唆され、今後さらなる研究により臨床への応用が期待される。レックリングハウゼン病(neurofibromatosis type 1、以下NF-1と略す)では、手術後の傷跡が非常にきれいになることが知られていることから、NF-1の瘢痕形成メカニズムについて、機械的伸展刺激受容システムの観点から解析を進めている。正常の皮膚線維芽細胞に機械的伸展刺激が加わると筋線維芽細胞への分化が亢進するのに対し、NF-1患者由来の皮膚線維芽細胞ではそれが認められなかった。一方で、いずれの線維芽細胞においても機械的伸展刺激により細胞骨格制御因子の1つであるRhoAは活性化することがpull-downアッセイにて確認された。同様の結果が、NF-1の原因遺伝子産物であるNeurofibrominのsiRNAを用いた実験においても確認された。過去の文献によると、NeurofibrominはRhoAの下流にあたるLIMKのリン酸化(活性化)に対して抑制的に作用することが報告されている。すなわち、Neurofibrominの機能的異常を来しているNF-1においては、LIMKおよびその下流のCofilinが過剰にリン酸化状態にあると予想した。そこで、伸展刺激前後におけるそれらのリン酸化タンパク質発現の変化をウエスタンブロッティングにて解析したところ、正常線維芽細胞では伸展刺激によりLIMK2およびCofilinのリン酸化が亢進するのに対し、NF-1由来線維芽細胞では伸展刺激前からリン酸化タンパク質が多く、伸展刺激を加えてもその増加は見られなかった。以上の結果から、NF-1における機械的刺激に対する反応性の低下は、Neurofibrominの機能的異常によるLIMKおよびCofilinの過剰なリン酸化による可能性が考えられた。本研究において非常に重要なポイントであるLIMKおよびCofilinの活性化評価において、それらのリン酸化タンパク質の発現解析を、ウエスタンブロッティングを用いて行っているが、結果に大きなばらつきが見られた。そのため、アッセイの再現性を獲得するために様々な工夫を繰り返し試す必要があり、そこに時間を要した。レックリングハウゼン病(neurofibromatosis type 1、以下NF-1と略す)では、手術後の傷跡が非常にきれいになることが知られていることから、NF-1の瘢痕形成メカニズムについて、機械的伸展刺激受容システムの観点から研究を行った。一方で、いずれの線維芽細胞においても機械的伸展刺激により細胞骨格制御因子の1つであるRhoAは活性化することが確認された。また、NeurofibrominはRhoAの下流にあたるLIMKのリン酸化に対して抑制的に作用することが報告されている。そこで、伸展刺激前後におけるLIMKおよびその下流にあたるCofilinのリン酸化やアクチン重合の変化について検討を行った。その結果、正常線維芽細胞では伸展刺激によりLIMKおよびCofilinのリン酸化が亢進しアクチン重合が促進するのに対し、NF-1由来線維芽細胞では伸展刺激前からリン酸化タンパク質や重合体アクチンの割合が多く、伸展刺激を加えてもその増加は認められなかった。最後に、アクチン脱重合阻害剤であるJasplakinolideを正常線維芽細胞に投与し、アクチン重合が亢進した細胞(NF-1由来線維芽細胞の近似状態)について解析を行うと、伸展刺激前から筋線維芽細胞への分化が亢進しており、伸展刺激による変化は認められなかった。これらの結果より、Neurofibrominの機能的異常を来しているNF-1においては、LIMKおよびその下流のCofilinが過剰にリン酸化された状態にあるため、伸展刺激によるアクチン重合促進という反応が生じにくく、過剰な瘢痕が形成されにくい可能性が考えられた。今後は、機械的伸展刺激に対してCofilinのさらに下流にあるアクチン動態の違いや、アクチン脱重合阻害剤であるJasplakinolideを用いた解析などを進めていく予定である。形成外科学他に使用できる財源があったので、そちらを優先して使用した結果、次年度使用額を生じた。
可逆形状記憶合金アクチュエータを用いたミクロンサイズロボットの研究

本研究計画は形状記憶合金を薄膜化してミクロンサイズのアクチュエータを作り、標記のミクロンサイズロボットの試作、駆動制御を行うものである。得られた研究成果を以下にまとめる。(1)全長1000μmミクロンサイズのアームの設計を行い、それを制御する方法について計画を行った。(2)次にこの種のアームの制御の可能性を知るために可逆形状記憶合金の薄膜(5μm)をマグネトロンスパッタにより作成し、入の手による組立可能な1自由度のミリサイズアーム(全長6000μm)の試作を行った。(3)これに通電制御のためのリードワイヤをスポット溶接し、フォトダイオードを用いた角変位センサをとりつけ、さらに電流制御回路をとりつけてセンサフィールドバック制御を行った。その結果簡単なPI制御であるが容易に制御することができ、センサフィールドバック制御について目途を得た。(4)次にこれを1自由度のミクロンサイズアーム(全長100400μm)のものを試作するために、シリコンウエハ上にTiNi合金薄膜、Si_3N_4薄膜、Sio_2薄膜を作成して作るアームの製造プロセスの計画を行った。(5)この計画に基づき、TiNi合金薄膜をマグネトロンスパッタによりシリコンウエハに作成し、ウエットエッチングにより1自由度アームのパターン化を行った。(6)(4)の研究で判明した問題点である「(800°C真空中)溶体化熱処理によるTiNiと(SiO_2+Si)基板との剥離問題」の問題解決のために、800°C以下での低温溶体化を目指し、種々の温度(500°C、600°C、700°C)等で溶体化実験を行い、500°C程度でも可能であることを発見し、TiNi膜と(Si+SiO_2)基板との剥離問題解決の糸口を見出した。(7)又立体化するためのエッチング条件調査のためにKOH、EDP(エチレンジアミンピロカテコール)によるSi基板の異方性エッチング条件を種々のレジストとエッチング温度等を変え、200μmのシャープなエッチング条件を発見し、ミクロンサイズアームの立体化の為の目途を得た。以上の諸点を解決したことで、当初計画したミクロンサイズアームの試作の為の基礎技術を確立することができた。本研究計画は形状記憶合金を薄膜化してミクロンサイズのアクチュエ-タを作り、標記のミクロンサイズロボットの試作、駆動制御を行うものである。本年度は薄膜タイプの可逆形状記憶合金ロボットの試作を目指して以下のように研究を進めた。全長1000μmミクロンサイズのア-ムの設計を行い、それを制御する方法について計画を行った。次にこの種のア-ムの制御の可能性を知るために可逆形状記憶合金の薄膜(5μm)を用い、人の手による組立可能な1自由度のミリサイズア-ム(全長6000μm)の試作を行った。これに通電制御のためのリ-ドワイヤをスポット溶接し、フォトダイオ-ドを用いた角変位センサをとりつけ、さらに電流制御回路をとりつけてセンサフィ-ドバック制御を行った。

その結果簡単なPI制御であるが容易に制御することができ、センサフィ-ドバック制御について目途を得た。次にこれを1自由度のミクロンサイズのア-ム(全長100400μm)のものについて確かめるために、シリコンウエハ上にTiNi合金薄膜、Si_3N_4、薄膜、SiO_2薄膜を作成して作るア-ムの製造プロセスの計画を行った。この計画に基ずき、TiNi合金薄膜をマグネントロスパッタによりシリコンウエハに作成し、ウェットエッチングにより1自由度ア-ムのパタ-ン化までは行った。来年度はこれをさらに進め、RTiNi薄膜の熱処理及び動作制御まで進める予定である。そこまで成功すれば当初のグリッパ付2自由度ミクロンサイズア-ムは比較的簡単に作成可能であろうと考えている。本研究計画は形状記憶合金を薄膜化してミクロンサイズのアクチュエータを作り、それを用いてミクロンサイズロボットの試作を行うものである。昨年度は6000μm長の可逆形状記憶合金薄膜について通電電流の制御を行うことにより制御の可能性を示し、さらにSi+SiO_2上にTiNi形状記憶合金薄膜の一自由度ミクロンサイズアームのパターン化を行った。本年度は昨年度の研究で判明した問題点である「(800°C真空中)溶体化熱処理によるTiNiと(SiO_2+Si)基板との剥離問題」の解決及び一自由度ミクロンサイズアームのパターン化されたものを立体化するためのエッチング条件調査の2点に絞って研究を行った。前者の問題解決のためには、800°C以下での低温溶体化を目指し、種々の温度(500°C、600°C、700°C)等で溶体化実験を行い、500°C程度でも可能であることを発見し、TiNi薄と(Si+SiO_2)基板との剥離問題解決の糸口を見出した。又後者のエッチング条件調査のためにはKOH、EDP(エチレンジアミンピロカテコール)によるSi基板の異方性エッチング条件を種々のレジストとエッチング温度等を変え、200μmのシャープなエッチング条件を発見し、ミクロンサイズアームの立体化の為の目途を得た。以上の2点を解決したことで、当初計画したミクロンサイズアームの試作の為の基礎技術を確立することができた。
白血球の分化、活性化および機能におけるCD45の役割に関する研究

本共同研究において、CD45エクソン6欠損マウス(以下、CD45-/-マウス)の白血球の発生・分化・機能を詳細に解析した。白血球の中でも、とくに、(1)T細胞、(2)B細胞、(3)NK細胞におけるCD45の役割を中心に研究を進めた。以下、各研究課題において得られた研究成果を報告する。(1)T細胞の発生・分化・機能におけるCD45の役割胸腺において、未熟胸腺細胞(CD4^-CD8^-)から成熟胸腺細胞(CD4^+CD8^-またはCD4^-CD8^+)への成熟段階が阻害され、胸腺および末梢リンパ系組織における成熟T細胞数の著明な減少が認められた。トランスジェニックマウス由来のT細胞レセプター(TCR)のトランスジーンを導入したCD45-/-マウスが解析された結果、胸腺におけるポジティブ/ネガティブセレクションのいずれもが機能していないことが明らかとなった。CD45欠損胸腺細胞および成熟T細胞では、TCRを介した刺激に対して応答できないことから、CD45はTCRを介したシグナル伝達に必須であることが証明された。さらに、CD45-/-マウス欠損マウスでは、抗原特異的免疫応答(細胞傷害活性:CTL活性、ヘルパーT細胞活性)がほとんど認められなかった。CD45-/-マウスにおける皮内樹状細胞(DEC)の発生・分化を解析した結果、DECの主要な細胞亜集団であるVγ3(Toengawaらの命名法ではVγ5)陽性γδT細胞の発生・分化がほとんど阻害されていた。DECは胎仔胸腺由来であることから、CD45-/-マウスの胎仔胸腺細胞が解析され、Vγ3陽性γδT細胞の分化が未熟な分化階段で抑制されていることが明らかとなった。(2) CD45-/-マウスの骨髄および脾臓におけるB細胞(sIgM^+)数が3週齢においてすでに増加しており、正常マウスの約2倍であった。この傾向は、20週齢においても認められた。また、CD45-/-マウスの骨髄および脾臓におけるB細胞は、sIgM(μ)^<high>IgD(δ)^<high>の表現型を有する細胞が大部分であり、正常マウスの場合の場合(μ^<low>δ^<high>が大部分)と異なることが明らかとなった。CD45^-B細胞では、リポ多糖(LPS)に対する増殖応答は正常であったが、抗μモノクローナル抗体に対する応答は消失していたが、抗μポリクローナル抗体に対する応答は低いながらも認められた。興味深いことには、CD45^-B細胞では正常B細胞と同様に、上記のいずれの刺激によっても、活性化マーカー(CD25,CD40 MHCクラスII)の発現上昇が認められた。したがって、増殖応答に必要な抗原レセプター(sIgM)を介したシグナルのレベルと活性化マーカーの発現上昇に必要なシグナルのレベルが異なる可能性が示唆される。また、CD45-/-マウスでは、T細胞非依存性抗原に対する抗体産生は正常であった。一方、T細胞依存性抗原であるオボアルブミン(OVA)で免疫した場合、OVA特異的抗体(IgG1,IgA,IgE)は認められなかった。しかしながら、CD4陽性T細胞(ヘルパーT細胞)をCD45-/-マウスに養子移入することによって、正常なOVA特異的抗体産生が誘導されるようになった。したがって、CD45の消失にもかかわらず、B細胞の抗体産生能には明らかな異常はないと考えられる。ただし、CD45-/-マウスでは、CD45の機能を補償する機構あるいは分子が働いている可能性があることは留意しておかなければならない。(3) CD45-/-マウスでは、NK細胞数の著明な増加が認められ、それに伴い脾細胞におけるNK活性が明らかに上昇していた。しかしながら、NK細胞当たりのキラー活性は正常NK細胞と有意な差はなかった。また、このNK細胞の発生亢進は、NK細胞におけるCD45の消失が原因であることが証明された。CD45^-NK細胞を高濃度のIL-2存在下で培養することによって誘導されたLAK細胞においても、キラー活性は正常LAK細胞と有意な差はなかった。また、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)にも差は認められなかった。以上のことから、T細胞、B細胞、NK細胞のそれぞれにおける発生・分化・機能おいて、CD45の要求性が異なることが明らかとなった。とくに、T細胞の発生・分化・機能おいて、CD45が不可欠の役割を果たしていることが明確となった。トランスジェニックマウス由来のT細胞レセプター(TCR)のトランスジーンを導入したCD45-/-