hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がんウイルスＥｐｓｔｅｉｎーＢａｒｒ　Ｖｉｒｕｓに対する新規分子標的薬の開発

EMSA assayの実験系を最適化した。その過程で、GST-EBNA1があまり高濃度に存在すると、それにより塩基配列特異的な結合よりも、GST-EBNA1の非特異的なDNA結合が生じてしまうことが判明した。そのためより選択的な実験条件を検討したところ、反応液に少量のデタージェントを加味することで、より塩基配列特異的なDNA結合が安定して見られるようになった。この実験条件で、ポリアミド化合物とoriP DNAの結合を検討した結果、マイクロモルオーダーでのポリアミド化合物とoriP DNAとの結合が確認された。さらにEMSAアッセイにより、その条件では一つのポリアミド化合物に、EBNA1-DNA結合の阻害活性が認められた。今後さらに解析していく予定である。申請書に記載のある通り進行しているが、さらに次のステップの予備実験として、合成したポリアミドの細胞毒性、EBV感染細胞における影響について、試験を進行中である。本年度は、ポリアミド化合物の合成が主要な目標であったが、実際に、数種類の合成に成功し、ある程度の精製度で使用出来るようになっている。その結果、平成24年度の計画にあったポリアミド化合物とEBNA1-oriP結合阻害実験に着手できている。これまでの実験で、EBNA1とDNAの結合を阻害するポリアミドが合成出来た。しかし、これらの実験はin vitroのチューブ内の話であるので、今後は、ポリアミド化合物による抗EBNA1活性、抗EBV活性の細胞レベルでの薬理評価実験を遂行する。本年度では、OriP上のEBNA1結合塩基配列に特異性高く結合するピロールイミダゾールポリアミド化合物のデザインと合成を行った。次は、合成されたポリアミド化合物によるEBNA1-OriP DNAの結合阻害確認の為のin vitro実験を行い、最適な化合物のスクリーニングをおこなう。その後、EBNA1のDNA結合に対する阻害活性が見いだされた化合物については、その標的となるDNA塩基配列を確定させるために、in vitroのFootprinting assayを行い、DNAのどの配列に化合物が結合しているか確認する。該当なし本年度同様、ほとんどをin vitroのスクリーニング実験用に試薬やチューブなどの実験消耗品の購入に計上するが、同時に、海外での学会発表用に旅費を計上する予定である。
アデニレートキナーゼ欠乏症の遺伝子解析

アデニレートキナーゼは、細胞内におけるアデニンヌクレオチド・プールの組成を規制する代謝調節上重要な酵素である。本酵素の欠乏症は極めて希であり、今までに世界で4家系が報告されているが、いずれも溶血性貧血を示す遺伝性赤血球酵素異常症として発見されている。本研究は、1982年東大三輪史朗教授によって発見された、本邦の1家系の患者から変異遺伝子を分離して、DNA塩基配列上の変化を解明しようとするものである。我々は既に、鶏の筋型アデニレートキナーゼのcDNAを分離し、DNA塩基配列を決定している。赤血球アデニレートキナーゼは筋型であることが知られているので、我々が分離したcDNAが赤血球の本酵素の遺伝子に対応していると考えられる。本年度は、異常遺伝子解析のための第一段階として、上記cDNAをプローブとして、正常人の本酵素遺伝子を分離して、その周辺の11キロ塩基対にわたる領域の全塩基配列を決定し、エキソンとイントロンの構成を明らかにした。それによると、本遺伝子は7個のエキソンから成り、それぞれのエキソン-イントロン接合部は、本酵素蛋白の立体構造上の、αヘリツクスやβシートなどの2次構造の末端部に一致していることがわかった。また、本酵素は筋組織内では、2個のmRNAが同一遺伝子から合成されていて、それらは3′末端側の長さが異っていた。以上の成績をもとにして、今後本症患者の異常遺伝子の分離と塩基配列の決定を行う予定である。
コヒーシンアセチル化制御ネットワークの解析

ヒトでは2つのコヒーシンアセチル化酵素、Esco1、Esco2の存在が知られているが、其々の役割については不明である。Esco1はコヒーシンサブユニットPds5と直接結合し、この結合が染色体上のコヒーシンへの局在とアセチル化に重要であることを示した。さらに、分裂期のEsco1のリン酸化がPds5との結合を阻害することを示した。また、Esco2は、Esco1とは別の経路を介し、DNA複製因子Mcmとの相互作用が活性化に必要であることを示した。一方で、複製後の分裂期やG1初期には、Esco2はCul4依存のユビキチン-プロテアソーム経路により積極的に分解され、活性が抑制されることを示した。コヒーシンアセチル化酵素Esco1は、コヒーシンの制御サブユニットであるPds5A及びPds5Bと直接的に相互作用した。この相互作用には、Esco1のN末側の特定の領域が必要であることを見つけ、さらにはそのドメイン内の3アミノ酸置換によるPds5と結合しないEsco1変異タンパク質の作製に成功した。このEsco1変異タンパクで置換した細胞では、コヒーシンのアセチル化と染色体上のコヒーシン結合領域への局在の減少、姉妹染色分体間接着の欠損を示し、この領域がPds5を介したEsco1の機能に重要であることを明らかにした。また、質量分析装置により、S期、分裂期にリン酸化されるEsco1の部位を同定した。その一つは、Pds5結合ドメイン内に存在し、AuroraBキナーゼによりリン酸化されることを明らかにした。この部位のリン酸化型変異Esco1は、Pds5との相互作用が弱くなることから、分裂期におけるEsco1の活性抑制に働く可能性が示唆された。一方で、Esco2は、Esco1のようにPds5との直接的な関係性についての結果は得られなかったが、Mcmとの相互作用やOrcやMcmとSmc3のアセチル化活性や姉妹染色体分体間の接着に対して遺伝的な相互作用を示した。コヒーシンの転写機能解析の手がかりとして、遺伝子発現における転写開始から伸長への移行にコヒーシンが機能することを示す結果が得られた。同時に、転写制御を解析する手法の一つとして、細胞の核抽出物とプロモーターやエンハンサーを含むDNAを用いたin vitroにおける転写開始及び制御複合体の再構成系の構築を行った。この系を用いた解析から、アクチベーターに依存したコヒーシンローダー及びコヒーシンのDNA上の転写複合体への会合が見られ、転写との直接的な関係を示唆するような結果を得ることが出来た。昆虫細胞を用いた強制発現系の実験から、ESCO1は、Pds5だけでなく、Rad21やSororinに直接、相互作用することを見いだした。しかし、この両因子との結合は、本研究で同定したPds5結合領域とは異なる領域、酵素ドメインを含むC末領域を介していた。また、これらの結合は、Esco2においても見られた。このことから、この結合は、Esco1とEsco2に共通する酵素活性に依存もしくは制御に寄与している可能性が考えられた。これまで、DNA複製がEsco2の活性の制御に寄与する可能性の結果を得ていたが、さらにヒトEsco2が、Mcmと直接的に結合する結果も得ることが出来た。Esco2によるコヒーシンのアセチル化は、Esco1とは異なりコヒーシン複合体へのSororinの安定的な結合に重要であった。また、反対にSororin自身が、Esco2によるコヒーシンの安定性に寄与する可能性を示す結果が得られ、Esco1とEsco2のコヒーシンに対する作用機序が異なることが示唆された。ChIP-seq解析の結果から、同定したEsco2の染色体局在は、Esco1に比べかなり結合領域数は少なかったが、同定できた一部は、コヒーシン、Esco1と共局在し、アセチル化を強調して行なうことが示唆される結果が得られた。その一方で、染色体全体で見ると、セントロメア周辺のようなヘテロクロマチン領域に局在するEsco2に特徴的な傾向を示す結果を得た。コヒーシンやコヒーシンローダーが転写伸長に関係する因子と直接作用し、転写活性を調節する結果を得ることが出来た。本年度、これまでの研究の一部を「Esco1は、Esco2とは異なり、Pds5に依存しコヒーシンをアセチル化し、コヒージョンを確立する」ことを示した論文にまとめた。Esco1とEsco2は、異なる経路でコヒーシンのアセチル化する。その中で、Esco2は、核抽出液中に含まれるMcmヘリカーゼ複合体と直接結合することを捉えた。さらに、この結果とこれまでの知見から、Mcmと結合に必要なドメインを決定し、そのドメインにアミノ酸置換変異を導入することでMcm非結合型Esco2の作製に成功した。この変異型Esco2を細胞に遺伝子導入し発現誘導すると、この変異型の発現は安定に維持できないこと、この不安定化は、プロテアソーム依存的に引き起こされていることが分かった。これまでの知見では、Esco2は、S期のみに安定に発現し機能すると考えられている。しかし、詳細な解析の結果、Esco2のクロマチンへの局在は、G1期後期から分裂期進行直前まで観察された。一方で、分裂期からG1期初期まで検出限界以下までそのタンパク量は減少していた。加えて、Mcmをノックダウンすると、細胞内のEsco2のタンパク量の減少が確認された。

このことから、Mcmのクロマチン局在が見られない時期は、Esco2は積極的に分解されることが明らかとなった。また、RNAi法によるノックダウン実験を用いてこの分解に必要なE3リガーゼを探索し、明らかにした。このように、DNA複製と協調して起こるEsco2の制御機構の新たな知見を得た。ヒトでは2つのコヒーシンアセチル化酵素、Esco1、Esco2の存在が知られているが、其々の役割については不明である。Esco1はコヒーシンサブユニットPds5と直接結合し、この結合が染色体上のコヒーシンへの局在とアセチル化に重要であることを示した。さらに、分裂期のEsco1のリン酸化がPds5との結合を阻害することを示した。また、Esco2は、Esco1とは別の経路を介し、DNA複製因子Mcmとの相互作用が活性化に必要であることを示した。一方で、複製後の分裂期やG1初期には、Esco2はCul4依存のユビキチン-プロテアソーム経路により積極的に分解され、活性が抑制されることを示した。in vitro及び細胞強制発現を利用したEscoと相互作用因子の探索系を構築することできた。また、ChIPseq解析により染色体局在を同定し、他の因子との比較解析を進めている。さらに、コヒーシンが直接転写に関係する因子との相互作用することを見いだし、この新たな経路にEscoが関与するか研究を展開していく。このように構築した実験系及び実験結果を利用してを新たに研究を展開していくことが出来る。27年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム構造Escoによる相互作用因子の同定及びアセチル化領域の決定、転写反応時のEscoの染色体局在の解析、結合ドメインの解析を行なう。ここまで得られた結果を元にコヒーシンのアセチル化制御のモデル化を行なう。Esco1、Esco2及びHDAC8の解析の材料を揃え、Esco1についてはリン酸化修飾の部位、染色体局在領域の決定及び細胞機能の解析に成功している。さらに、転写における機能を解析する上で重要な実験系(細胞及びin vitro系)を確立に成功しており、おおむね順調に進展している。様々な状況下における細胞応答に対して、Esco1、Esco2及びHdac8の修飾、染色体局在領域について解析を広げて行く。また、in vitro系を用いて、転写複合体や転写活性に対しての関係やコヒーシンのアセチル化に対する影響について解析を進める。
ＮＳＡＩＤｓ起因性消化管障害の制御に資する次世代型ナノ製剤の創製とその有用性評価

臨床において、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)による消化管障害は重篤な問題である。我々は、このNSAIDs起因性消化管障害の制御を目指し、湿式ビーズミル法を用い、メロキシカム(MLX)ナノ結晶経口製剤を作製した(粒子径48±138 nm,平均値±標準偏差)。本製剤は、従来の製剤と比較し、4.3倍バイオアベイラビリティが高まり、薬物投与量の減量を可能とした。さらに、これら製剤化に伴うNSAIDs投与量の減少が、薬剤の消化管粘膜直接刺激の低下を介し、障害誘発を軽減することを示した。本成果が安全なNSAIDs療法の確立に繋がることを期待する。食事の影響を受けず、安定した吸収性を有し、かつ投与量軽減により消化管障害の減弱を可能とする「次世代型NSAIDs口腔内崩壊型ナノ結晶製剤」の開発を目指すべく、平成27年度はNSAIDsであるインドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン及びメロキシカムナノ結晶の調製法の確立と口腔内崩壊錠の処方設計について検討した。1)NSAIDsのナノ結晶調製法を確立する:インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン及びメロキシカムの4種のNSAIDsにおいて、界面活性剤(ソディウムドキュセート)、ベンザルコニウム塩化物、セルロース及びシクロデキストリンを添加剤として用い、ビーズミル法により乾式及び水中破砕を行うことで、安定な分散性及び粒子状態を有するナノ結晶分散液の調製方法を確立した(平均粒子径70-200 nm)。さらにこれらNSAIDsナノ結晶分散液は、溶液の状態と比較し分解性が低いことを明らかとした。2)NSAIDsナノ結晶を含む口腔内崩壊錠を確立する:上記で作成したナノ結晶製剤とアラビアゴム、ポリビニルピロリジノン、D-マンニトールを組み合わせた分散液を調製し、冷凍庫(-80°C)にて一日静置後、凍結乾燥機(EYELA FD-1000REC使用)にて凍結乾燥を行うことで口腔内崩壊錠の作成が可能となった。本処方で作成した口腔内崩壊錠は、第16改正日本薬局方製剤総則一般試験法記載の質量偏差試験、含量均一性試験、崩壊試験いずれにおいても適合であった。また、再分散後も良質なナノ結晶状態を維持することを確認した。以上、NSAIDsを用いたナノ結晶口腔内崩壊錠の作成法を確立した。来年度は、今回作成したナノ結晶口腔内崩壊錠の小腸膜透過性や血中動態について評価する予定である。NSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠の調製法を確立した。これら口腔内崩壊錠は第16改正日本薬局方製剤総則一般試験法に適合して、口腔内崩壊錠を再分散させたときの粒子サイズもまたナノオーダーを維持していた。これにより来年度には、NSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠経口投与後の腸管膜吸収性やバイオアベイラビリティを把握することができると考える。また、NSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠経口投与による抗炎症効果の評価についても検討可能である。さらに、薬物投与量を変更させることによる副作用軽減効果の確認も容易に可能である。これら新規ナノ粒子含有経口投与製剤の確立及び評価結果は、これまでの経口製剤と比較し非常にユニークな特性を示すことが期待でき、本年度の研究が順調に進展していることを示している。食事の影響を受けず、安定した吸収性を有し、かつ投与量軽減により消化管障害の減弱を可能とする「次世代型NSAIDs口腔内崩壊型ナノ結晶製剤」の開発を目指すべく、平成27年度で確立したNSAIDsのナノ結晶の調製法と口腔内崩壊錠の処方設計についてさらに検討を進めた。1)口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤の添加物の決定:増粘剤の種類及び添加量の違いにより、平成27年度に確立した湿式ビーズミル法の破砕効率が変化することを明らかにした。また、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの代表的増粘剤を用い、破砕処理及び処方の違いによる最適な添加量を決定した。これにより、良質な口腔内崩壊錠の作成が可能となった。2)口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤の消化管障害性を明らかとする:上記で作成した口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤をアジュバント関節リュウマチモデルラットに投与したところ、これまでのマイクロオーダーの粒子からなる錠剤と比較し、バイオアベイラビリティが高く、消化管障害(胃粘膜および腸粘膜障害)の軽減に応用できることを見出した。また、マグネシウムイオンの存在が、NSAIDsの消化管障害を軽減することも見出した。さらに、これらマグネシウムイオンを添加物として加えた口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤は、マグネシウムイオン非含有のものに比べ、消化管障害性が低いことを明らかとした。以上、NSAIDsを用いたナノ結晶口腔内崩壊錠の消化管障害性について検討を行った。来年度は、今回作成した口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤の抗炎症効果について評価する予定である。また、NSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠は、マイクロオーダーの粒子からなる錠剤と比較し、バイオアベイラビリティが高く、消化管障害(胃粘膜および腸粘膜障害)の軽減に応用できることを見出した。さらに、マグネシウムイオンの存在が、NSAIDsの消化管障害を軽減し、本製剤の添加物として有用であることを見出した。これら結果から、次年度にはNSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠経口投与による抗炎症効果の評価について検討可能である。

これら新規ナノ粒子含有経口投与製剤の確立及び評価結果は、これまでの経口製剤と比較し非常にユニークな特性を示しており、本年度の研究が順調に進展していることを示している。食事の影響を受けず、安定した吸収性を有し、かつ投与量軽減により消化管障害の減弱を可能とする「次世代型NSAIDs口腔内崩壊型ナノ結晶製剤」の開発を目指すべく、前年度確立したインドメタシン口腔内崩壊型ナノ結晶製剤の消化管吸収機構とメロキシカム口腔内崩壊型ナノ結晶製剤の処方設計及びその有用性について検討を行った。1)インドメタシンナノ結晶からなる口腔内崩壊錠の製造と小腸粘膜透過機構の解明:インドメタシンを用いた口腔内崩壊型製剤を経口投与することで、高いバイオアベイラビリティを示すことを示した。また、この高い薬物小腸膜透過性(吸収性)にはエンドサイトーシスが関わっていることを見出した。2)メロキシカムナノ結晶の消化管障害性: NSAIDsの一つであるメロキシカムを用いて、口腔内崩壊型ナノ結晶製剤を作製し、アジュバント関節リュウマチモデルラットに投与したところ、これまでのマイクロオーダーの粒子からなる錠剤と比較し、バイオアベイラビリティが高く、消化管障害(胃粘膜および腸粘膜障害)の軽減に応用できることを見出した。また、昨年度作成したインドメタシンナノ結晶製剤よりも消化管障害性が低く、消化管障害の少ない治療薬として有用であることを示した。以上、NSAIDsであるインドメタシンとメロキシカムを用いたナノ結晶口腔内崩壊錠を作成し、その消化管障害性について検討を行った。今回作成した口腔内崩壊型NSAIDsナノ結晶製剤は消化管障害性の少ない安全な剤形であるものと考えられる。臨床において、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)による消化管障害は重篤な問題である。我々は、このNSAIDs起因性消化管障害の制御を目指し、湿式ビーズミル法を用い、メロキシカム(MLX)ナノ結晶経口製剤を作製した(粒子径48±138 nm,平均値±標準偏差)。本製剤は、従来の製剤と比較し、4.3倍バイオアベイラビリティが高まり、薬物投与量の減量を可能とした。さらに、これら製剤化に伴うNSAIDs投与量の減少が、薬剤の消化管粘膜直接刺激の低下を介し、障害誘発を軽減することを示した。本成果が安全なNSAIDs療法の確立に繋がることを期待する。Wistarラットをイソフルラン麻酔後、今回作成したナノ粒子含有口腔内崩壊錠をラット小腸に直接注入し、経時的に腸管静脈から血液を採取し、腸管膜透過後のNSAIDs濃度の測定を行う。また、Wistarラットへこれらナノ粒子含有口腔内崩壊錠を経口投与し、頸静脈から血液を経時的に採取し、血中濃度変化を明らかとするとともに、ファーマコキネティクス解析を行う。これにより本年度作成したナノ粒子含有口腔内崩壊錠の薬物動態を詳細に評価する予定である。Dark Agoutiラットを用いたアジュバント誘発関節炎モデルを作成し、足容積を測定することでその炎症度を把握する。また、これらラットにNSAIDsナノ結晶含有口腔内崩壊錠を経口投与し、本製剤の抗炎症効果を測定する。
J-PARC固定標的実験へのTOPカウンターの応用

本研究では、高輝度Bファクトリー実験・Belle II実験用に開発研究が行われている新型リングイメージングチェレンコフ検出器TOPカウンターの技術のJ-PARC固定標的実験への応用を目指した。Belle II実験用TOPカウンターでは高品質石英を輻射体として用いているが、非常に高価であり取り扱いが難しく、チェレンコフ検出器の輻射体として用いるには相応の技術を習熟する必要があるなどの難点もあった。そこで本研究では、近年活発に開発研究されている高透明度・高機能アクリル素材を材料にした新しい輻射体の開発を目的としており、これを用いてTOPカウンターの汎用化および大型化の可能性を模索した。アクリル輻射体試作機の製作においては、検出器関係の国際会議や国内学会等に参加し収集した情報をもとにアクリル輻射体の詳細な検討、設計を行った。高機能アクリル材料のうち、UV光透過型のものと非透過型のものの中から特に優れた光学特性を持つものの選定を行うとともに、実際の製作方法や加工方法について詳細な検討を行った。また、アクリル輻射体試作機の光学特性を精度よく測定するために、Belle II実験用TOPカウンター石英輻射体用の検査システムをもとにした光学測定系を準備し、各種の測定データからアクリル輻射体本体の形状や集光ミラーの設計の最適化をさらに進める為に、Geant4ベースのモンテカルロシミュレーションコードの開発および実装を行った。比較的大きな試作機製作の段階においては、製造方法や加工方法において技術的な困難が見つかったが、材料の再選定により解決の道筋をつけることができた。本研究では、高輝度Bファクトリー実験(Belle II実験)用に名古屋大学が中心となり開発されている新型粒子識別装置TOPカウンターの技術をJ-PARC固定標的実験へ応用する事を目指している。新しいタイプのリングイメージングチェレンコフ検出器であるBelle II実験用TOPカウンターでは高品質の石英ガラスがその輻射体として用いられているが、本研究では主に高透過率・高機能アクリルを主材料とした新しい輻射体の開発研究を行い、TOPカウンターのさらなる汎用化や他実験分野への応用を狙っている。初年度である平成25年度においては、主にアクリル輻射体の試作機の製作に向けて、検出器関係の国際会議や国内学会等に参加し収集した情報をもとにアクリル輻射体の詳細な検討、設計を行った。高機能アクリル材料のうち、UV光透過型のものと非透過型のものの中から優れた光学特性を持つものの選定を行うとともに、実際の製作方法や加工方法について詳細な検討を行った。また、アクリル輻射体試作機の光学特性を精度よく測定するために、Belle II実験用TOPカウンター石英輻射体用の検査システムをもとに、レーザー、フォトダイオード、CCDカメラを用いた光学測定系を準備する一方で、各種の測定データをもとに、アクリル輻射体本体の形状や集光ミラーの設計の最適化をさらに進める為に、Geant4ベースのモンテカルロシミュレーションコードの開発、実装も行った。当初予定していたアクリル材料を用いた輻射体試作機の製作は、加工の段階で技術的な困難が見つかり、問題解決と設計の見直しに時間がかかっている。現在は輻射体の設計とアクリル材料の変更を行う事によって試作機の製作を急いでいる。アクリル輻射体の光学測定系やソフトウェアの準備等は概ね順調に進んでおり、試作機の製作ができ次第測定を始める予定である。生産が比較的容易な小型なアクリル輻射体の試作機から製作を開始する。光学特性の測定を進めるとともに、TOPカウンターの性能に大きな影響を及ぼす輻射体の平面性、表面粗さ、平行度等加工に関する技術的な課題を解決する。各種測定からさらに材料を絞り込み、また現実的な加工方法技術を再選択し、輻射体のデザインをかためる。平成25年度に製作予定であったアクリル輻射試作機の開発が技術的な困難により遅れ、年度内の購入が困難であった為。

アクリル輻射体の製作・加工における技術的な困難を解決しできる限り早く試作品の製作、試験を行う。現在の生産技術の情報をもとに設計の見直しを行い、技術的な困難を解決する予定である。
ミストCVD法による有機無機ペロブスカイト太陽電池の形成技術に関する研究

溶液原料を用いながらも、気相反応を介して成膜が可能なミストCVD法は、液相法と気相法の両方の特徴を有する手法である。液体原料を用いて形成されることが多い有機無機ペロブスカイトにこのミストCVD法を適用する検討を行った。横型のミストCVD装置を用いることで、液体原料を利用しながらも気相反応で有機無機ペロブスカイトが形成できることを示した。またこのミストCVD法は液体原料に溶解することができれば、どのような材料も溶解できるといった特徴を有している。この特徴を活かして、混晶材料を同時に溶解させることで、有機無機ペロブスカイトの混晶膜の形成に成功した。有機無機ペロブスカイト太陽電池は、塗布法などの溶液を原料とする形成方法を用いながらも高い太陽電池効率を達成できる新規の材料として盛んに研究されている。本研究では、ミストCVD法という有機材料、無機材料のどちらも成膜可能であり、かつ溶液原料を用いながらも、気相法で形成することができるというユニークな手法を有機無機ペロブスカイト太陽電池に適用することで、その太陽電池効率の向上に向けた検討を進めている。当初の計画であったミストCVD法の装置の立ち上げを完了し、ミストCVD法での有機無機ペロブスカイト材料の形成に成功した。得られた有機無機ペロブスカイトは他者から報告されているXRDの結果とほぼ一致しており、結晶化した有機無機ペロブスカイト材料が得られていることが分かった。特徴的な結果として、本研究では成膜温度を40°Cとしているにも関わらず、液体の凝集などが発生せず、有機無機ペロブスカイトの結晶が得られた。これは、小さなミストの特徴である少量の熱エネルギーによって溶媒が容易に蒸発することによるものと考えている。40°Cといった低温での形成はPET基板の利用が可能となる温度であり、より安価で柔軟性かつ、可搬性のある太陽電池の形成に繋がる可能性を有している。新規に立ち上げる計画であったミストCVD法の装置の立ち上げを完了し、ミストCVD法による有機無機ペロブスカイト材料の形成を達成している。一方で当初の研究予定であった不純物添加によるpn制御技術については、検討が進んでいない。これについては、有機無機ペロブスカイトの特徴的技術である、複数のハロゲンの混晶化によるバンドギャップエンジニアリングの技術を優先的に進めたことによるものである。そのバンドギャップエンジニアリング技術については、臭素と塩素の混晶化を行うことにより、可視光領域で異なる波長で発光する材料の形成に成功した。これらの混晶化した有機無機ペロブスカイト材料はXRDやホトルミネスセンスの結果より、相分離がなく、光学的に良好な結晶が得られている。この混晶化技術はpn不純物添加技術と同様に、材料物性の観点から重要な技術である。本研究では、ミストCVD法という有機材料、無機材料のどちらも成膜可能であり、かつ溶液原料を用いながらも、気相法で形成することができるというユニークな手法を有機無機ペロブスカイト太陽電池に適用することを目標に研究を行った。本研究では、有機無機ペロブスカイト用のミストCVD装置の立ち上げから、pn制御/混晶化、太陽電池/発光素子に関する研究を目標とした。当初の計画であった有機無機ペロブスカイト成膜用のミストCVD法の装置を開発し、有機無機ペロブスカイトの形成に成功した。さらに、特徴的な結果として、本研究では成膜温度を40°Cとしているにも関わらず、液体の凝集などが発生せず、有機無機ペロブスカイトの結晶が得られた。また、最終的に太陽電池などのデバイス検討には至らなかったが、ミストCVD法の溶液にできればどのような材料も形成できるという特徴を活かし、原料溶液に混晶材料を同時に混ぜることで混晶化することに成功した。混晶化では、BrとCl原料を使用し、それぞれ混合したものをミストCVDの原料に利用することで、発光波長の異なる有機無機ペロブスカイト薄膜の形成に成功した。今後は3つのテーマを中心に研究を推進する。1.ミストCVD法による有機無機ペロブスカイト材料形成技術の深耕化2.pn制御技術/混晶化技術の検討3.太陽電池/発光素子構造に関する検討まずは、本研究の初年度に成功したミストCVD法による有機無機ペロブスカイト材料の形成技術に関する研究を推進する。ミストCVD法による有機無機ペロブスカイトの形成技術は新規の技術であることから、その技術の優位性や特徴を明確にすることを優先的に行っていく。

またミストCVD方は溶液法の一つであり、不純物添加や混晶化を原料溶液に混ぜるだけで行うことができるといった特徴を有する。これらの特徴を活かして、ミストCVD法によるpn制御技術/混晶化技術の検討を進める。また最終年度の成果に向けてデバイス構造の作製に向けて、太陽電池/発光素子の構造形成に関する検討を進めていく。有機無機ペロブスカイト以外の太陽電池/発光素子を構成する層については、主に有機系材料の利用を考えている。これらの材料はミストを用いた形成技術を用いることができるため、ミストによる一貫したプロセスの形成を視野に検討を進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。結晶成長28年度が最終年度であるため、記入しない。
脊髄損傷者における激運動時のNatural Killer Cell活性の研究

障害者スポーツは、脊髄損傷対麻痺者(脊損者)の精神・身体的能力の強化などを助け、身体障害者の社会参加、社会復帰につながる。一方、脊損者では易感染性が指摘され、一般に免疫力低下も危惧されている。免疫系の中で、Natural killer(NK)細胞は免疫能の一つの指標として広く、その活性は運動の影響を受けやすい。そこで、脊損者において車いすスポーツが免疫系に与える影響の一端を調査する目的で、過酷な運動である車いすフルマラソン(フル)と比較的適度な運動であるハーフマラソン(ハーフ)におけるNK細胞活性を測定した。被験者は大分国際車いすマラソン大会フル部門参加の男性脊損者9名とハーフ部門参加の男性脊損7名、コントロールとして競技に参加しない脊損7名とした。フル・ハーフ競技者は競技前日、終了直後、翌目に血液を採取し、コントロール群も同一のプロトコールで採血を施した。フル競技者のNK細胞数(310±130/μl)およびNK細胞活性(42.6±3.0%)は、それぞれ133±61/μlと38.2±3.2%へ競技直後低下し(P<0.05)、翌日には前値に回復した。血中アドレナリン、コルチゾール濃度は競技直後に増加し(P<0.05)、翌日には前値に戻った。一方、ハーフ競技者では、NK細胞数は競技直後も翌日も変化を認めず、NK細胞活性が45.5±7.5%から56.1±5.1%へ上昇(P<0.01)し、翌朝も上昇が保たれた。血中アドレナリン濃度はレース直後上昇し(P<0.05)、翌朝には前値に回復した。コルチゾールは変化しなかった。コントロール群ではいずれの項目も変化を認めなかった。NK細胞活性がフルでは低下しハーフでは上昇する結果は、運動負荷量の違いによるものであると考えられる。機序としては、コルチゾール濃度がフルのみで上昇したため、これがNK細胞活性低下に寄与したと推察される。本研究の結果から、ハーフでは特に格段の配慮は必要ないようであるが、フル競技者はゴール後も少なくとも翌日までは感染に留意することが推奨される。以上のように、本研究は障害者スポーツおける免疫動向を実用的な側面で予想を上回る成果をあげることができた。本年は大分国際車いすマラソン大会におけるフルマラソン部門の出場者で、男性脊髄損傷対麻痺者32名を対象にレース前、レース直後、レース翌日に採血を行い、血算、アドレナリン、ノルアドレナリン、コルチゾール、及びナチュラルキラー細胞活性(NKCA)等を測定した。その結果、血中ヘモグロビン、ヘマトクリット等の値は変化せず、レース中は血液濃縮が起きていないことが確認された。NKCAを高めると考えられているアドレナリンとノルアドレナリンはレース直後に上昇傾向を認め、翌日には回復した。また、NKCAに抑制的に働くと考えられているコルチゾールもレース直後に上昇し、翌日には回復した。NKCAはレース直前に比べ、レース直後に低下したが、翌日にはレース直前の値に復す傾向が判明した。

以上より、激運動といえる車いすマラソンでは血液濃縮などの体液への悪影響は観察されないものの、NKCAに相反する働きを持つカテコールアミンとコルチゾールの上昇の総和の結果として、レース直後にはNKCAの低下傾向が認められ、翌日には回復する事が判明した。一般的に、脊髄損傷者は尿路及び呼吸器感染に陥りやすいと言われているため、脊髄損傷者においては車いすマラソンレースの直後には十分に感染症に陥らないような配慮が必要であると考えられた。次年度は、この結果の充実のために、コントロール研究を行う予定である。また、NKCAの低下は、我々の予想に反する結果であった。競技人口が多く、比較的障害が重度でも参加と完走が可能な車いすハーフマラソンに同様なNKCAの低下があれば、選手の健康のための対策が必要なため、次年度では車いすハーフマラソンにおける測定を計画する予定とした。障害者スポーツは、脊髄損傷対麻痺者(脊損者)の精神・身体的能力の強化などを助け、身体障害者の社会参加、社会復帰につながる。一方、脊損者では易感染性が指摘され、一般に免疫力低下も危惧されている。免疫系の中で、Natural killer(NK)細胞は免疫能の一つの指標として広く、その活性は運動の影響を受けやすい。そこで、脊損者において車いすスポーツが免疫系に与える影響の一端を調査する目的で、過酷な運動である車いすフルマラソン(フル)と比較的適度な運動であるハーフマラソン(ハーフ)におけるNK細胞活性を測定した。被験者は大分国際車いすマラソン大会フル部門参加の男性脊損者9名とハーフ部門参加の男性脊損7名、コントロールとして競技に参加しない脊損7名とした。フル・ハーフ競技者は競技前日、終了直後、翌日に血液を採取し、コントロール群も同一のプロトコールで採血を施した。フル競技者のNK細胞数(310±130/μl)およびNK細胞活性(42.6±3.0%)は、それぞれ133±61/μlと38.2±3.2%へ競技直後低下し(P<0.05)、翌日には前値に回復した。血中アドレナリン、コルチゾール濃度は競技直後に増加し(P<0.05)、翌日には前値に戻った。一方、ハーフ競技者では、NK細胞数は競技直後も翌日も変化を認めず、NK細胞活性が45.5±7.5%から56.1±5.1%へ上昇(P<0.01)し、翌朝も上昇が保たれた。血中アドレナリン濃度はレース直後上昇し(P<0.05)、翌朝には前値に回復した。コルチゾールは変化しなかった。コントロール群ではいずれの項目も変化を認めなかった。NK細胞活性がフルでは低下しハーフでは上昇する結果は、運動負荷量の違いによるものであると考えられる。機序としては、コルチゾール濃度がフルのみで上昇したため、これがNK細胞活性低下に寄与したと推察される。本研究の結果から、ハーフでは特に格段の配慮は必要ないようであるが、フル競技者はゴール後も少なくとも翌日までは感染に留意することが推奨される。以上のように、本研究は障害者スポーツおける免疫動向を実用的な側面で予想を上回る成果をあげることができた。
無脊椎動物由来糖脂質の合成と生物機能

近年、植物、動物を問わず細胞の認識に係わる現象に様々な形で細胞表層の糖鎖が関与することが示唆されている。我々は、下等動物の複合糖脂質の系統的研究を行っており、前年度、扁形動物及び環形動物より見出されたGalβ(1→6)Galをコアとするneogala系列の中でフコース及びマンノース含有新規糖脂質のアナログ体の合成を完了した。今年度は引き続きneogara系列中、グルコース及びホスホコリン含有4種の新規糖脂質アナログ体の系統合成を行った。ホスホコリンがガラクトース残基の6位水酸基に結合している化合物が報告されたのは、本化合物が初めてであり、PAF活性やモノカイン誘導活性等の生物活性が報告されており、創薬の観点から興味深い。これらの合成については現在投稿準備中である。一方、寄生虫の一種で、扁形動物に属するマンソン裂頭条虫より新規な糖脂質が報告され、この化合物についても合成を行った。本化合物はどの系列にも属さない五糖からなる糖脂質であり、host-parasite interactionの観点から興味が持たれる。今後、さらにより複雑な糖鎖にホスフォコリン基が結合した両性イオン型糖脂質の合成を行いその生理活性について検討する。neogala系列終了後、さらに節足動物由来のarthro系列、腔腸動物由来のschisto系列など一連の糖脂質についても検討する。我々は、以前に下等動物の複合糖脂質の系統的研究を行い軟体動物由来の一連のオリゴ糖鎖(mollu系列)を合成してきた。今回、環形動物、袋形動物及び扁形動物より見いだされた糖脂質のうちneogala系列の系統合成を目標とし、中でもエキノコッカスの一種から単離された新規糖脂質Fucα1→3Galβ1→6Galβ1-ceramide及びGalβ1→6(Fucα1→3)Galβ1→6Galβ1-ceramideは、host-parasite interactionの観点から機能上興味があり、これらを含んだ4種のアナログ体の合成を完了した。次に動物生薬として用いられている「地龍」及び「水蛭」由来の一連の糖脂質を目標とし、今回はManα1→4Galβ1→6Galβ1-ceramide及びGalα1→6(Manα1→4)Galβ1→6Ga1β1-ceramideを手がけた。前者については学術雑誌に投稿し、受理され、後者については現在投稿準備中である。今後、さらに同生薬より見いだされたガラクトースの6位にホスフォコリン基が結合した両性イオン型糖脂質の合成を行いその生理活性について検討する。
骨格形成の基盤となる新たな細胞極性形成メカニズムの解明

私共はこれまでの研究成果から、微小管ーWnt/PCPネットワークの制御分子であるMap7/7D1がWnt/PCP分子群のひとつであるDvlの局在化を制御して軟骨細胞の細胞極性を決定している可能性を考えている。本研究ではゲノム編集技術・蛍光イメージング技術を活用して、上記の可能性について当該分子のノックアウトマウス由来・軟骨組織を用いた解析を実施する。さらに、ノックインマウス由来・軟骨組織の器官培養下での蛍光ライブイメージングを試み、生理的な条件下での軟骨細胞・細胞極性形成過程における内在性レベルでの分子ダイナミクスを解析する。
母子分離記憶の痕跡の可視化と成体での再活性化による想起

本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することを試みた。さらに、母子分離を受けた雌マウスを通常通り飼育し、正常雄マウスと交配して妊娠・出産させる実験を行なった結果、母子分離を受けた雌マウスは正常雌マウスに比べて子育て行動が劣化し、生後2ー3日までに約85%の子マウスが死亡すること等を見出した。近年、幼児虐待の発生件数が急増し、深刻な社会問題となっている。虐待など幼少期養育環境の劣悪化によるストレスが、成長後の脳の機能・構造に重大かつ継続的な問題を引き起こすことが報告されている。しかし、幼少期のストレスが脳のどの部位に記憶の痕跡として残され、生涯にわたって行動に影響を及ぼすのかは未だ解明されていない。本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、幼少期の母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することが出来るかを検討する。そして「虐待は繰り返される」という概念の分子基盤を明らかにし、劣悪な幼少期養育環境が精神神経疾患等を引き起こすメカニズムの解明、さらに生育後の精神神経疾患の予防・治療法の開発を目指す。平成27年度はc-fos遺伝子プロモーターの下流でtetracycline transactivator (tTA)を発現するTgマウス(Jackson研究所:Stock Number:008344)を連携研究者・林から供与を受け、tetracycline response element (TRE)プロモータ制御下でCreリコンビネースを発現するTgマウス(RBRC05563)を理研バイオリソースセンターから購入し、交配させてc-fos promoter-tTA-TRE-Creマウスの作製を試みた。現在母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。上記研究実績の概要のところで示したマウスを用いて母子分離を行い、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めている。本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することが出来るかを検討し、「虐待は繰り返される」という概念の分子基盤を明らかにし、劣悪な幼少期養育環境が精神神経疾患等を引き起こすメカニズムの解明を目指す。平成27年度に引き続き、c-fospromoter-tTA-TRE-Creマウスの作製を試み、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めた。一方、虐待が繰り返されるかについて、母子分離を受けた雌マウスを通常通り飼育し、正常雄マウスと交配して妊娠・出産させる実験を行なった。生後23日までに約85%の子マウスが死亡することを見出した。その原因を調べるため、出産の前日からビデオ撮影によって母マウスの養育行動を撮影して解析した結果、母子分離を受けた雌の巣作り、仔運び、licking等の養育行動がコントロールの母マウスに比して有意に低下することを見出した。また、虐待が繰り返されるかについて、母子分離を受けた雌マウスを通常通り飼育し、正常雄マウスと交配して妊娠・出産させる実験を行なった。虐待など幼少期養育環境の劣悪化によるストレスが、視床下部-下垂体-副腎皮質系(HPA-axis)などのプログラミングに影響を及ぼし、成長後の脳の機能・構造に重大かつ継続的な問題を引き起こすことが報告されている。本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することが出来るかを検討し、「虐待は繰り返される」という概念の分子基盤を明らかにし、劣悪な幼少期養育環境が精神神経疾患等を引き起こすメカニズムの解明を目指した。c-fos promoter-tTA-TRE-Creマウスの作製を試み、c-Fosの免疫組織化学で見られたのと同じ領域でtTA、Creの発現が見られるかの検討を進めた。

一方、虐待が繰り返されるかについて、母子分離を受けた雌マウスを通常通り飼育し、正常雄マウスと交配して妊娠・出産させる実験を行なった。生後2-3日までに約85%の子マウスが死亡することを見出した。その原因を調べるため、出産の前日からビデオ撮影によって母マウスの養育行動を撮影して解析した結果、母子分離を受けた雌の巣作り、仔運び、licking等の養育行動がコントロールの母マウスに比して有意に低下することを見出した。本研究では、幼児虐待の動物モデルの一つである母子分離マウスを用い、母子分離ストレスによって活性化する神経細胞を非可逆的にラベルし、成体において母子分離記憶の痕跡をオプトジェネテイクスを用いて再活性化することにより、母子分離記憶を想起することを試みた。さらに、母子分離を受けた雌マウスを通常通り飼育し、正常雄マウスと交配して妊娠・出産させる実験を行なった結果、母子分離を受けた雌マウスは正常雌マウスに比べて子育て行動が劣化し、生後2ー3日までに約85%の子マウスが死亡すること等を見出した。CreリコンビネースによってloxPに挟まれたStopコドンがはずれ、ChR2-mCherryが発現するコンストラクトをRosa26遺伝子座にノックインしたTgマウス(RBRC05158)を理研バイオリソースセンターから入手し、上記のマウスと交配させる。テトラサイクリン類似化合物のドキシサイクリン(Dox)オフの状態においてc-fos遺伝子プロモーター制御下でChR2-mCherryを非可逆的に発現するTgマウスを作製する。予め、Doxオン/オフによってc-fos遺伝子の発現が調節されるかについて、マウスに急性拘束ストレスを負荷し、c-fosが顕著に増強することがわかっている視床下部の室傍核において、mCherryを指標にして検討する。また、このTgマウス作製と並行して、母子分離を経験した雌マウスを野生型の雄と交配させ、母子分離を経験したマウスが母親になった際の養育行動(仔運び、巣作り、licking等の行動)を解析し、「虐待は繰り返す」かについて検討する。また、このTgマウス作製と並行して、母子分離を経験した雌マウスを野生型の雄と交配させ、母子分離を経験したマウスが母親になった際の養育行動(仔運び、巣作り、licking等の行動)を詳細に解析する。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経内分泌学、神経解剖学29年度が最終年度であるため、記入しない。
微生物ループと微細藻類による細菌群の制御を活用した魚類の種苗生産

「水作り」という言葉がある。養殖魚類の受精卵を収容する飼育水の水質環境を微細藻類により整えることを指す。本研究では微細藻類による飼育水細菌群の制御機構の解明を目的とし、微細藻類の培養液に多く存在する善玉細菌(例: Roseobacter属細菌)の働きと微生物ループの生態学的機能に注目した。善玉細菌は常にビブリオ属魚病細菌の増殖を抑制したが、微細藻類が共存するとその抑制効果が飛躍的に向上した。また、飼育水温の高いクロマグロ仔魚はマダイ仔魚などと異なり、微生物ループを経由した栄養を積極的に利用していた。これは経験的に行われてきた「水作り」を、科学的に検証した初めてのケースといえる。種苗生産とは受精卵を陸上の飼育水槽に導入し、仔魚から稚魚へと育てるまでの段階を指す。この陸上飼育水槽では通常、天然海水をそのまま利用して飼育を行う、かけ流し方式が採られる。したがって、飼育水槽内では仔稚魚を頂点とした、独自の生態系・食物網(構成生物:ウイルス・細菌・微細藻類・動物プランクトン・仔稚魚)が出来上がっている。この飼育水の環境条件の変化、特に初期の仔魚の生残には飼育水中の細菌群が種苗生産の成否を左右する。本年度は仔魚飼育に効果的だとして従来から経験的に飼育水に添加されてきた微細藻類(Nannochloropsis oculata、以下ナノクロ)が飼育水中の細菌群集をコントロールする可能性を確認し、ナノクロの生理状態により細菌群集が仔稚魚にとって良くも悪くもなることを明らかにした。さらに、ナノクロ培養液には、特定の細菌群が優占的に存在し、このナノクロとの共存性の高い細菌群(α-プロテオバクテリアグループ、Cytopha-Flavobacteriumグループ)が飼育水中でも優占すると仔稚魚の生残が良くなることが明らかになった。飼育水を人間の腸管内に例えるならば、微細藻類は善玉菌の増殖をサポートするサプリメント、すなわち健康補助食品的な機能を果たしているのかもしれない。善玉菌を大量に投入することで、飼育水環境を直接的に整えるプロバイオティックスは、その用法という面からいうと、従来から行われている薬剤の投与と基本的に似ている。それに対して、植物プランクトンにより間接的に細菌群集を制御しようとする方法は、いわば飼育水生態系の地道な体質改善を志向する方法といえるかもしれない。消費者の食の安全への関心の高まりや法改正に伴う薬剤の使用の制限などから、より環境を配慮した飼育法が望まれており、微細藻類による飼育水環境の制御は有用な方法といえる。種苗生産現場では「水作り」という言葉がある。養殖魚類の受精卵を収容する飼育水の水質環境を微細藻類により整えるプロセスを指す。水作りの成否は種苗生産に直結する。種苗生産の飼育水槽内では仔稚魚を頂点とした、独自の生態系・食物網(構成生物:ウイルス・細菌・微細藻類・動物プランクトン・仔稚魚)が出来上がっている。この飼育水の環境条件の変化、特に初期の仔魚の生残には飼育水中の細菌群が影響し、飼育水に添加されてきた微細藻類(Nannochloropsis oculata、以下ナノクロ)が飼育水中の細菌群集をコントロールする。本年度は微細藻類による細菌群の制御メカニズムの解明を中心に研究を進め、特にナノクロ培養液に多く存在するRoseobacter属細菌の働きに注目した。Roseobacter属細菌は魚病細菌の代表格であるビブリオ属細菌の増殖を抑制する能力を持つことが報告されているが、ナノクロ培養液中ではその抑制効果が飛躍的に向上した。通常の従属栄養細菌用培地では共存可能だが、微細藻類培養液になるとRoseobacter属細菌が魚病細菌を積極的に殺滅するのである。これは経験的に行われてきた水作りのメカニズムを、科学的に検証した初めてのケースといえる。微細藻類により間接的に飼育水槽内の細菌群集を制御しようとする方法は、いわば飼育水生態系の地道な体質改善を志向する方法といえる。
転写因子による膵β細胞の分化と機能維持のメカニズムの解析

膵β細胞の発生,分化,再生及び正常な機能の維持を規定する因子として転写因子の役割は重要である.我々はβ細胞の発生に必須と考えられる転写因子であるPAX4について,マウス及びヒオのcDNAの全長をクローニングし,その構造を明らかにした.また,最近MODY3遺伝子として同定されたHNF-1αのdominant negative変異体をアデノウイルススベクターを用いてマウスインスリノーマ由来のMIN6細胞に過剰発現し,内因性のHNF-1αを抑制しインスリン分泌能について検討した.その結果,β細胞ではHNF-1αの機能障害により,arginineによるインスリン分泌増強効果の選択的な障害をきたすことが明かとなった.他の側面からのアプローチとして,β細胞の"mass"の異常をきたす疾患について発症の分子メカニズムの解析を行った.Wolfram症候群は1型糖尿病に視神経萎縮,感音性難聴、尿崩症などを合併する常染色体劣性遺伝性疾患である.患者のラ氏島ではβ細胞が選択的に消失する.我々はWolfram症候群の原因遺伝子WFS1を同定した.WFS1遺伝子産物は890のアミノ酸よりなり,その構造より膜蛋白と考えられるが,機能は明かではない.その機能の解明のための第1段階として,中枢神経組織内及び細胞内での局在の解析を行った.WFS1蛋白は,マウスの脳では,嗅結節,扁桃体,梨状皮質及び海馬(CA1)に強い発現が認められた.その他,弓状核や大脳皮質第2層にも発現が認められた.細胞内では,WFS1蛋白は主としてmicrosome分画,特にERに局在することが示唆された.また,新生児期に高インスリン血症性低血糖症をきたすpersistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy(PHHI)患者ではβ細胞の過形成をきたすことが知られている.PHHI患者の一部ではATP感受性カリウムチャネルを構成するスルフォニル尿素剤受容体(SUR1)遺伝子やKir6.2遺伝子に変異が同定されている.我々は日本人のPHHI患者においてSUR-1遺伝子の解析を行い,3種類の変異を同定した.さらにこれらの変異SUR1により再構成されるATP感受性カリウムチャネルの機能解析を行い,そのうちの1つの変異(R1420C)では,アデニンヌクレオチドのSUR1への協調的結合が障害され,そのためにATP感受性カリウムチャネルの活性化(開放)障害をきたし,持続性のインスリン分泌を引き起こしていることが明かとなった.膵β細胞の発生,分化,再生及び正常な機能の維持を規定する因子として転写因子の役割は重要である.我々はβ細胞の発生に必須と考えられる転写因子であるPAX4について,マウス及びヒオのcDNAの全長をクローニングし,その構造を明らかにした.また,最近MODY3遺伝子として同定されたHNF-1αのdominant negative変異体をアデノウイルススベクターを用いてマウスインスリノーマ由来のMIN6細胞に過剰発現し,内因性のHNF-1αを抑制しインスリン分泌能について検討した.その結果,β細胞ではHNF-1αの機能障害により,arginineによるインスリン分泌増強効果の選択的な障害をきたすことが明かとなった.他の側面からのアプローチとして,β細胞の"mass"の異常をきたす疾患について発症の分子メカニズムの解析を行った.Wolfram症候群は1型糖尿病に視神経萎縮,感音性難聴、尿崩症などを合併する常染色体劣性遺伝性疾患である.患者のラ氏島ではβ細胞が選択的に消失する.我々はWolfram症候群の原因遺伝子WFS1を同定した.WFS1遺伝子産物は890のアミノ酸よりなり,その構造より膜蛋白と考えられるが,機能は明かではない.その機能の解明のための第1段階として,中枢神経組織内及び細胞内での局在の解析を行った.WFS1蛋白は,マウスの脳では,嗅結節,扁桃体,梨状皮質及び海馬(CA1)に強い発現が認められた.その他,弓状核や大脳皮質第2層にも発現が認められた.細胞内では,WFS1蛋白は主としてmicrosome分画,特にERに局在することが示唆された.また,新生児期に高インスリン血症性低血糖症をきたすpersistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy(PHHI)患者ではβ細胞の過形成をきたすことが知られている.PHHI患者の一部ではATP感受性カリウムチャネルを構成するスルフォニル尿素剤受容体(SUR1)遺伝子やKir6.2遺伝子に変異が同定されている.我々は日本人のPHHI患者においてSUR-1遺伝子の解析を行い,3種類の変異を同定した.さらにこれらの変異SUR1により再構成されるATP感受性カリウムチャネルの機能解析を行い,そのうちの1つの変異(R1420C)では,アデニンヌクレオチドのSUR1への協調的結合が障害され,そのためにATP感受性カリウムチャネルの活性化(開放)障害をきたし,持続性のインスリン分泌を引き起こしていることが明かとなった.HNF1_αの変異により発症するMODY3の患者ではインスリン分泌障害が認められる.