hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
維管束分化における転写制御ネットワークの解析

維管束分化における転写制御ネットワークを明らかにするために、シロイヌナズナの転写因子の過剰発現ベクターライブラリーを作成し、2つのクリーニング系を構築した。新規に作成した系を用い、道管細胞分化のマスター転写因子VND7を発現制御する因子の単離を行った。その結果、LBD/ASLファミリー遺伝子の単離に成功し、LBD15/ASL11がVND7プロモーターに直接結合することを明らかにした。維管束は水分や栄養分、シグナル分子を植物体全体に運搬する植物に必須な通道組織である。維管束のなかでも特に木部は、分化に関わる遺伝子群が多数明らかにされているものの、それらがどのような転写ネットワークにより発現制御されるのかということは未だ明らかになっていない。そこで、申請者は木部分化の分子機構を理解しそれを応用へと発展させていくために木部分化関連遺伝子群の遺伝子間の関係、発現制御ネットワークを明らかにすることを目的とした。平成20年度はまず、シロイヌナズナの転写因子のうち約1000個をGateway systemのENTRベクターとして収集・作成した。それらを薬剤誘導により過剰発現させることのできるDestination vectorへと組換えた。この転写因子の過剰発現ベクタープールを用いて、原生木部の分化に必須な転写因子VND7(Kubo et.al.2005)の制御因子の探索を個体レベルで行った。VND7を発現制御する転写因子を単離するために、VND7プロモーター::レポーターをもつ植物体に対して、転写因子を過剰発現させるベクタープールをアグロバクテリアを介して導入し、VND7レポーターを過剰にあるいは異所的に発現するものを選抜した。このスクリーニングにより複数の候補制御因子が得られた。そのうちのひとつLBD12/ASL5に着目し、LBD12/ASL5の過剰発現がVND7レポーターの異所的誘導を起こすことを確認した。LBD12/ASL5について現在詳細な解析を行っている。これらの結果は、今回採用した転写因子の過剰発現ベクタープールを用いたスクリーニングが有効であることを示している。維管束分化の転写制御ネットワークを明らかにするために、昨年度は各転写因子を過剰発現させることのできるベクタープールを作製した。今年度は、この転写因子ベクタープールを用いていくつかの転写因子の上流にある制御因子の単離を2つの方法で試みた。1つ目の方法として、Nicotiana benthamianaの葉にベクタープールとスクリーニング対象遺伝子のプロモーターレポーターを同時にインジェクションする方法でスクリーニングを行った。その結果、木部道管分化に関わるbHLH遺伝子の上流制御候補因子を単離することができた。2つ目の方法として道管分化のマスター因子であるVND7の制御因子の探索を、VND7プロモーターレポーターをもつシロイヌナズナ個体に転写因子過剰発現プールを形質転換する方法で行った。VND7レポーターを異所的に発現させる転写因子をスクリーニングした結果、LBD/ASLファミリー遺伝子を得た。8つのLBD/ASLファミリー遺伝子の詳細な発現解析を行った結果、一つのLBD/ASL遺伝子がVND7と発現領域が重なっており、VND7の制御因子であることがわかった。このLBD/ASLはVND7プロモーターのあるシス領域に直接結合することがわかった。また、VND7はこのLBD/ASLの転写を正に制御していることも明らかとなった。以上の結果から、このLBD/ASLはVND7と正のフィードバックループを形成しVND7の発現を増幅する機能を持つことが示唆された。また、今年度の結果より、今回作成した転写因子を過剰発現させるプールを用いたスクリーニング方法が転写ネットワークを明らかにするためのツールとして有効であることが明らかになった。
遺伝子DNAを基礎とした蛋白質の機能と構造

最終年度の本年は、公募研究で参加した7名を新たに班員に加え一層充実した研究が行なわれた。成果の主なものは以下のとうりである。多機能蛋白質のドメイン構造解析:遺伝子操作や遺伝子内抑制変異の位置の解析等から、RecA蛋白質のドメイン構造が明らかにされ、N末端とC末端が相互作用している可能性も示された(小川)。遺伝子がどのように編成され形成されて来たか、遺伝子中の機能の配列順序の共通性から理論が組みたてられたが、プリン生合成レギュロンの遺伝子群を解析した結果、その理論が更に裏付けられた(溝淵)。Artemia salinaのmRNAキャッピング酵素は、単一ポリペプチド鎖である。しかしトリプシン限定分解をすると酵母の様に、それぞれ独立の機能を持った二つの断片に分割され、ドメイン構造が明確になった(水本)。サブユニットの分担機能とその特異的相互作用部位:H^+ーATPaseの分子集合に重要な部位、βサブユニットのATP燐酸基との相互作用部位、H^+輸送に関与する部位等の同定がなされた(二井)。大腸菌のRNAポリメラーゼβのppGpp作用部位、プロモーターの認識特異性を持つ部位、αサブユニットと結合してホロ酵素を形成するのに必要な部位等が同定された(石浜)。コリシン生産菌はコリシン免疫蛋白質(Imm)を同時に生産してコリシンによる自殺を免れている。E3コリシンとImmE6の組み合わせで生存できる変異の解析から免疫特異性を決定する構造がつきとめられた(正木)。大きな分子集合体の形と大きさを決定する機構:λファージ尾部の「ものさし蛋白質」gpHは、その全長で長さを測っていることが明らかになった(桂)。蛋白質の耐熱性制御部位と活性部位:好熱菌B.Stearothermophilusの耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子をクローニングして一次構造を決定した。遺伝子操作でその蛋白の二つのドメインを結ぶαヘリックスが安定化する様に変えると耐熱性が上昇した(今中)。
アタッチメントを応用したジルコニアオールセラミックブリッジの設計と強度の関係

本研究は,ジルコニアセラミックを使用して製作した,リジッドタイプ及びアタッチメントを応用したノンリジッドタイプのブリッジにおいて,有限要素法を用いた応力状態を求め,破折を考慮した設計の検討を行い,適応症例の拡大に繋げることを目的としている.実験の結果,ブリッジのポンティック連結部の咬合面側と連結部下部に応力が集中する傾向があり,特に連結部下部の支台歯側で応力が上昇する傾向がみられた.本研究は,ジルコニアセラミックを使用して製作した,リジッドタイプ及びアタッチメントを応用したノンリジッドタイプのブリッジにおいて,有限要素法を用いた応力状態を求め,破折を考慮した設計の検討を行い,適応症例の拡大に繋げることを目的としている.実験の結果,ブリッジのポンティック連結部の咬合面側と連結部下部に応力が集中する傾向があり,特に連結部下部の支台歯側で応力が上昇する傾向がみられた.本研究は,ジルコニアセラミックを使用し,リジッドタイプ及びアタッチメントを応用したノンリジッドタイプの4ユニットブリッジと5ユニットブリッジを製作し,支台歯のパターン,アタッチメントの設置位置,荷重部位を変化させて破折強度試験を行い,臨床応用する際の基礎データを得,応用範囲の拡大に繋げることを目的としている.臼歯部リジットタイプの4ユニットブリッジの破折強度を検討した結果,平均2000N以上の非常に高い破折強度を示した.破折様相は,荷重点と連結部方向への破折と,荷重点から垂線方向への破折が見られ,ポンティックは複数の破折片となった.ブリッジの連結部は構造上最も狭窄する形状であり,応力が集中しやすく,連結部下部の粘膜側に高い引張り応力が限局的に発生し,破折の危険性がある.そのため,連結部下部に厚みを持たせた逆カテナリー形態にすることで,連結部下部に生じた応力を軽減することが可能であると示唆された.一方で,ノンリジッドタイプのブリッジでは,連結部を境として,ブリッジに加わる咬合圧を緩圧することが可能であると考えられる.さらに他の利点として,支台歯の予後が不確実な場合,支台歯に問題が生じてもブリッジの一部分を再製作するだけでよいことなどが挙げられ,アタッチメントを応用して固定性ブリッジを分割することは,リスクを最小限にとどめることができると考えられ,ジルコニアオールセラミックブリッジの応用範囲の拡大に繋がると期待できる.本研究は,ジルコニアセラミックを使用し,リジッドタイプ及びアタッチメントを応用したノンリジッドタイプのブリッジにおいて,有限要素法を用いたブリッジの応力状態を求め,破折を考慮した設計の検討を行い,適応症例の拡大に繋げることを目的としている.モデルは小臼歯2歯欠損および第2小臼歯と第1大臼歯欠損を想定した延長ブリッジ2種類とした.これらのモデルの3D-CADデータをもとにFEMデータを作成し,線形静解析にて応力解析を行った.この時の荷重値はポンティック咬合面に対し垂直方向に1Nとした.材料として,審美性を考慮した場合の選択肢となり得るジルコニアセラミックと陶材焼付け金合金のKIKを採用した.支台歯は単純な形態の真鍮製の金型とした.実験の結果,全てのモデルにおいて,ポンティック連結部の咬合面側と連結部下部に応力が集中する傾向があり,特に連結部下部の支台歯側で応力が上昇する傾向がみられた.また,ポンティック連結部の頬舌径を2mm拡幅した場合,連結部咬合面側の応力の発生は減少し,連結部下部の支台歯側に応力の集中がみられた.さらに,連結部の高さを0.5mm厚くした場合,応力集中範囲に大きな変化はみられなかった.本実験で使用したジルコニアセラミックとKIKにおいて,材質の違いによる応力傾向に大きな相違は認められなかった.特に連結部下部で発生する局所的に大きな応力値にも差異はみられず,材料による設計上の変更は必要ないであろうと考えられた.
乳歯を用いたＥＳＲ線量計測法の開発

人の歯のエナメルを用いて電子スピン共鳴(ESR)によって被曝線量を計測する方法において、乳歯を用いて100mGy以下の低い線量を求められるようにすることを目的とした。機械的手法と化学的手法を組み合わせることによって、測定に使用するエナメルを乳歯から適切に抽出できた。観測されたESR信号は永久歯と性質が多少異なるものの、永久歯とほぼ同様のプロトコルを用いて乳歯の線量計測を行うことができることがわかった。信号の感度の平均は永久歯とほぼ同様であるが、感度の個体差、したがってばらつきが永久歯よりも大きいことから、得られる線量の誤差は25%程度と大きくなる。人の歯の永久歯を用いた電子スピン共鳴(ESR)線量計測の手法が確立されているのに対し、乳歯はほとんど研究対象とされてこなかった。乳歯は一定の時期に必ず脱落するため、放射線事故時に線量計測のために提供される歯の多くが乳歯である。本研究では、乳歯のエナメルを用いたESR線量計測の手法を確立することを目的に研究を進めた。最初に、乳歯を処理して象牙質を除き、エナメル部分のみを抽出する方法について検討した。その結果、ドリルである程度機械的に象牙質を除いた後、水酸化カリウム溶液で処理する手法が適切であることがわかった。次に、永久歯と比較して、放射線によって生成するラジカルの線量応答を調べた。個体差についても検討するため、測定と照射を繰り返すことによって信号の線量応答を調べた。永久歯に比べて応答直線の傾きが10%程度大きく、また妨害となる有機物の信号も小さい、という結果が得られたが、照射による線量が正確でなかったことが判明し、実験をやり直す必要があることがわかった。一方、信号の処理に関しては、従来の永久歯の信号の解析に用いていたコンピュータプログラムがそのまま使用できることがわかった。照射による線量が正確でなかった可能性があることは予想外であったが、技術的な問題はすべてクリアできており、当初の計画に沿って実験を進めていくことで、研究目的を達成する結果が得られると予想される。人の歯のエナメル質を用いて電子スピン共鳴(ESR)によって被曝線量を計測する方法は、放射線事故時に線量計素子を所持していなかった作業者や住民の被曝線量を個々に求めるために有用である。永久歯を用いた電子スピン共鳴(ESR)線量計測の手法が確立されているのに対し、乳歯はほとんど研究対象とされてこなかった。乳歯について、永久歯と同様の信頼性の高い線量計測方法として用いられるための基礎実験を行い、線量計測方法(プロトコル)を確立することを目的とした。平成27年度の研究でエナメルを抽出する方法を確立し、平成28年度には被曝線量計測に用いるESR信号の線量応答、また妨害となる有機物の信号の個体差を調べた。提供された6本の乳歯と比較のための5本の永久歯を分析した。乳歯に見られる線量応答のある信号の感度(単位吸収線量に対する信号の生成量)は永久歯とほぼ同様であるが、個体によるばらつきが約20%と、永久歯の約10%よりも大きいことがわかった。妨害となる有機物の信号についてもその強度のばらつきが永久歯よりも大きく、またその線幅についてもばらつきが大きいことがわかった。従来、永久歯の分析に用いた信号分離プログラムは乳歯にたいしても使用できることがわかったため、線量計測は問題なく行うことができると考えられる。永久歯と同様に標準試料を用いたキャリブレーション法を適用した場合に、どれくらいの変動で線量計測が行われることになるかが今後の課題である。予定通り乳歯の個体差の研究を終了し、永久歯と同一でないにしても、同様の手法で線量計測が行えることがわかった。人の歯のエナメル質を用いて電子スピン共鳴(ESR)によって被曝線量を計測する方法は、放射線事故時に線量計素子を所持していない作業者や住民の被曝線量を個々に求めるために有用である。乳歯は一定の時期に必ず脱落するため、放射線事故時に提供される歯の多くが乳歯である。乳歯について、永久歯と同様の信頼性の高い線量計測方法として用いられるための基礎実験を行い、線量計測方法を確立することを目的とした。28年度までに乳歯に見られるESR信号の性質の特徴を調べ、線量応答の試料ごとの差異を求めることができた。29年度にはその結果について総合的に検討した結果、歯のエナメル抽出手順については機械的な抽出方法に加えて化学的な方法を併用することが勧められるが、その他の点については永久歯と同様の手法が適用できることがわかった。ただ、永久歯よりも試料の個体差が大きいため、通常用いられているキャリブレーション法を用いた場合には求められる線量に20%程度の誤差が含まれることになる。より正確な線量計測にあたっては個々にキャリブレーションのできる、付加線量法を用いることが推奨される。これらを踏まえて、福島第一原子力発電所事故による米沢への避難者から提供された乳歯についてキャリブレーション法により8個の歯について線量を求めた。一方、歯のエナメルではない物質を標準試料として用いられる可能性について検討した。

手法の本質について考察した結果、単位吸収線量に対する生成スピン数を求めることに尽きることがわかり、tempolを標準物質として用いた結果、歯のエナメルに単位吸収線量あたりに生成するスピン数を求めることができた。手法の側面から言えば、tempolを線量計測の標準試料として用いられることがわかった。人の歯のエナメルを用いて電子スピン共鳴(ESR)によって被曝線量を計測する方法において、乳歯を用いて100mGy以下の低い線量を求められるようにすることを目的とした。機械的手法と化学的手法を組み合わせることによって、測定に使用するエナメルを乳歯から適切に抽出できた。観測されたESR信号は永久歯と性質が多少異なるものの、永久歯とほぼ同様のプロトコルを用いて乳歯の線量計測を行うことができることがわかった。信号の感度の平均は永久歯とほぼ同様であるが、感度の個体差、したがってばらつきが永久歯よりも大きいことから、得られる線量の誤差は25%程度と大きくなる。線量計測に用いるESR信号の生成効率の試料による個体差の検討には統計学的手法が必要であり、分担者と協力してこの点を検討していく。また、歯のエナメルではない物質を標準試料として用いる可能性についての検討が遅れており、この点について早急に取り組む。本研究課題の残りの課題である、どれくらいの変動で実際の線量計測が行われることになるか、また実際のパイロット線量計測が今後の課題である。歯のエナメルではない物質を標準試料としても用いる可能性についての検討が遅れており、この点に早急に取り組む予定である。放射線線量計測ドイツのミュンヘン放射線防護研究所を訪問して、標準試料の計測を行う予定であったが、2015年1月に別の所用でこの研究所を訪問した際に所用を済ませることができ、このための旅費を支出する必要がなくなったため。物品費が予定より少額で研究を進めることができた。今年度中途までの研究成果をまとめ、7月にドイツで開催される国際会議に出席する予定をしている。このための旅費として充当し、計画通りに研究を進める。パイロット試料測定、また歯ではない標準試料を用いた線量計測のためにより多くの物品が必要となるのにこれに充てて研究を遂行する。
生命の連続性に迫る―減数分裂の開始・進行の分子機構の解明―

生殖細胞は生命の連続性を担う。生殖細胞が減数分裂期へ移行し進行する際には、大規模な遺伝子発現変化が伴うが、その分子機構には不明な点が多い。本研究では、精子形成期の減数分裂期移行に生じるエピゲノム変化やクロマチン構造変化を明らかにすることによって、減数分裂の開始・進行の分子機構を解明する。主な手法として、減数分裂期の対象のステージの生殖細胞を単離し、エピゲノムやクロマチン構造変化を、次世代シーケンサーを用いてゲノムワイドに、さらに細胞イメージング解析によって視覚的に解析する。また、モデル動物としてマウス及びブタを用いて比較解析を行うことにより、生物種特異的な制御機構に迫る。生殖細胞は生命の連続性を担う唯一の細胞である。生殖細胞特有の現象である減数分裂は、種の多様性を生み出し、配偶子形成に不可欠なプロセスである。生殖細胞が分化し減数分裂期へ移行する際には、数千もの遺伝子発現が変化し、体細胞型の遺伝子発現プロファイルから生殖細胞特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。この変化は、生殖細胞特異的なエピゲノム変化及びクロマチン構造変化によってもたらされるが、詳細な機序は不明である。本研究では、減数分裂期への移行及び進行に伴うクロマチン構造及びエピゲノム変化を解析し、減数分裂開始機構の解明を目的とした。さらに、生殖細胞の分化制御を担う遺伝子の一部は生物種特異的な進化を遂げており、減数分裂期への移行に生物種特異的な制御が示唆されているため、モデル動物としてマウスに加え、以下の理由からブタを用いた。1)ゲノム情報が利用可能。2)雄性生殖細胞の単離法が確立済み。3)食肉処理場等から比較的容易にサンプルが得られる。4)成果を産業動物の繁殖法に利用可能。マウスとブタの雄性生殖細胞を用いて比較解析を行い、減数分裂期の移行及び進行に伴うクロマチン構造変化の生物種特異性の解明を目指した。本年度は、マウス及びブタ精巣から減数分裂期前後の生殖細胞を、フローサイトメーターを用いてステージ毎に単離した。それらの細胞からトータルRNAを抽出し、RNA-seqライブラリを調整した。一方、オープンクロマチン構造の変化を解析するために、ステージ毎に単離した細胞を用いてATAC-seqライブラリを調整した。次世代シーケンサーを用いて作製したライブラリの塩基配列情報を取得した。現在、それらのデータ解析を進めている段階である。さらに、核内オープンクロマチン領域を可視化する「ATAC-see法」を用いて、マウス生殖細胞の分化の進行に伴うオープンクロマチン動態を解析した。本年度は、第一に、本研究で焦点を当てている減数分裂期前後の分化ステージの生殖細胞の単離に成功した。マウスまたはブタ精巣をコラゲナーゼ及びトリプシンを用いて細胞懸濁液を調整した後、フローサイトメータを用いて、精原細胞、プレレプトテン期精母細胞、レプトテン・ザイゴテン期精母細胞、パキテン期精母細胞の4つのステージに分離し採取した。免疫染色法にて分離した細胞の精製度を評価した。第二に、分離した細胞から全RNAを抽出し、SMART-Seq v4キットを用いてRNA-seqライブラリを作製し、次世代シーケンサーを用いて大規模配列取得を行った。また、分離した細胞を用いて、Omni-ATAC-seq法(Corces et al, 2017, Nat. Method)に従ってATAC-seqライブラリを作製し、次世代シーケンサーを用いて配列取得を行った。現在、分化段階特異的に変化するクロマチン開閉状態と遺伝子発現変化の関連を明らかにするためにデータ解析を進めている。第三に、核内オープンクロマチン領域を可視化するATAC-see法(Chen et al, 2016, Nat Method)に従ってマウス精子形成期の生殖細胞に見られるオープンクロマチン動態を可視化した。その結果、分化段階特異的にオープンクロマチンの局在やクラスタリングなどの挙動が変化することが明らかになった。現在、免疫染色との二重染色や、ブタ精子形成期の生殖細胞を用いるための実験系の最適化を行っている。以上から、本研究は概ね順調に進展していると判断した。第一に、1年目に得たマウス及びブタ生殖細胞のRNA-seq及びATAC-seqデータを解析する。RNA-seqデータについては、減数分裂期の前後のステージ間比較を行い、発現変動遺伝子を抽出する。ATAC-seqデータについても、同様にステージ間比較を行うことによってクロマチン開閉状態の変化のある領域を同定する。同定した領域のゲノム上の分布(エンハンサーなどの制御領域や、プロモーター領域など)を解析し、転写因子の結合予測解析を行う。本研究で得られたRNA-seq及びATAC-seqデータに加え、既存の転写因子のChIP-seqデータ(A-MYBやRFX2など)と組み合わせて解析することにより、減数分裂期への移行と進行に伴うクロマチン構造変化と遺伝子発現変化への影響を明らかにする。さらに、ブターマウス間で、遺伝発現変化及びクロマチン構造変化を比較解析し、エンハンサー領域など制御領域の変化について種間特異性または共通性を明らかにする。第二に、1年目に立ち上げたATAC-see法と免疫染色法を組み合わせることによって、オープンクロマチン動態と転写因子の局在変化を解析する。特にATAC-seqデータを用いた転写因子結合予測解析によって得られた転写因子に焦点を当てて解析する。また、ブタ生殖細胞においても同様の解析を行い、生殖細胞分化におけるオープンクロマチン動態の共通性を明らかにする。

生殖細胞は生命の連続性を担う。生殖細胞が減数分裂期へ移行し進行する際には、大規模な遺伝子発現変化が伴うが、その分子機構には不明な点が多い。本研究では、精子形成期の減数分裂期移行に生じるエピゲノム変化やクロマチン構造変化を明らかにすることによって、減数分裂の開始・進行の分子機構を解明する。主な手法として、減数分裂期の対象のステージの生殖細胞を単離し、エピゲノムやクロマチン構造変化を、次世代シーケンサーを用いてゲノムワイドに、さらに細胞イメージング解析によって視覚的に解析する。また、モデル動物としてマウス及びブタを用いて比較解析を行うことにより、生物種特異的な制御機構に迫る。生殖細胞は生命の連続性を担う唯一の細胞である。生殖細胞特有の現象である減数分裂は、種の多様性を生み出し、配偶子形成に不可欠なプロセスである。生殖細胞が分化し減数分裂期へ移行する際には、数千もの遺伝子発現が変化し、体細胞型の遺伝子発現プロファイルから生殖細胞特有の遺伝子発現プロファイルへと切り替わる。この変化は、生殖細胞特異的なエピゲノム変化及びクロマチン構造変化によってもたらされるが、詳細な機序は不明である。本研究では、減数分裂期への移行及び進行に伴うクロマチン構造及びエピゲノム変化を解析し、減数分裂開始機構の解明を目的とした。さらに、生殖細胞の分化制御を担う遺伝子の一部は生物種特異的な進化を遂げており、減数分裂期への移行に生物種特異的な制御が示唆されているため、モデル動物としてマウスに加え、以下の理由からブタを用いた。1)ゲノム情報が利用可能。2)雄性生殖細胞の単離法が確立済み。3)食肉処理場等から比較的容易にサンプルが得られる。4)成果を産業動物の繁殖法に利用可能。マウスとブタの雄性生殖細胞を用いて比較解析を行い、減数分裂期の移行及び進行に伴うクロマチン構造変化の生物種特異性の解明を目指した。本年度は、マウス及びブタ精巣から減数分裂期前後の生殖細胞を、フローサイトメーターを用いてステージ毎に単離した。それらの細胞からトータルRNAを抽出し、RNA-seqライブラリを調整した。一方、オープンクロマチン構造の変化を解析するために、ステージ毎に単離した細胞を用いてATAC-seqライブラリを調整した。次世代シーケンサーを用いて作製したライブラリの塩基配列情報を取得した。現在、それらのデータ解析を進めている段階である。さらに、核内オープンクロマチン領域を可視化する「ATAC-see法」を用いて、マウス生殖細胞の分化の進行に伴うオープンクロマチン動態を解析した。本年度は、第一に、本研究で焦点を当てている減数分裂期前後の分化ステージの生殖細胞の単離に成功した。マウスまたはブタ精巣をコラゲナーゼ及びトリプシンを用いて細胞懸濁液を調整した後、フローサイトメータを用いて、精原細胞、プレレプトテン期精母細胞、レプトテン・ザイゴテン期精母細胞、パキテン期精母細胞の4つのステージに分離し採取した。免疫染色法にて分離した細胞の精製度を評価した。
Generalized Gamma Stochastic Volatility Models

この研究プロジェクトでは、新しい確率的ボラティリティモデルと、これらのモデルを推定するための新たなアルゴリズムを提案した。マクロ経済学および財務データを用いた本研究プロジェクトは、この新たなモデルが一般的に使用されている従来のモデルよりも優れていることを示した。特に、ブラジルと米国間またはインドと米国間の為替レートなど、より大きな変動や外れ値を示すデータセットにおいてその傾向は顕著であった。また、本プロジェクトは、Rソフトウェアを用いた並列計算を可能にするC++コンピュータコードも提供し、計算速度を大幅に向上させた。
膵癌細胞におけるPD-L1発現と腫瘍幹細胞性・上皮間葉転換による悪性形質の解析

前年度の膵臓癌細胞株に引き続き、大腸癌細胞株よりCD274を高発現する分画を分取し、浸潤遊走能、細胞分裂能を検討したところ、膵臓癌と同様に、大腸癌細胞株においてもCD274高発現分画が高い浸潤遊走能、細胞増殖活性を有することを見出した。同時に、CD274高発現/低発現分画における遺伝子発現を網羅的に比較解析し、各分画において特異的発現を示す遺伝子群を抽出した。これら、特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し膵臓癌、大腸癌細胞株における発現を消失させ、浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能などの、腫瘍生物学的特徴を検討することを予定しており、CRISPR/Cas9systemを用いた遺伝子発現消失細胞株の樹立を進めている。また、免疫系の関与を生体内で評価するため、膵臓癌、大腸癌のマウス同種移植モデルについても使用することを計画している。研究者の所属する愛知医科大学における大腸癌手術症例より270例を選別し、外科切除標本の残余検体から大腸癌腫瘍組織アレイを作成するとともに、臨床情報、予後情報を収集し、データベースを樹立した。CD274、CD70をはじめとする免疫組織学的解析を行い、各パラメーターの予後への影響を解析し、大腸癌間質線維芽細胞におけるCD70発現が患者の予後を規定することを見出し、報告した。(Inoue S., Inaguma S., et al., Virchows Arch, 2019)膵臓癌細胞株のみならず、大腸癌細胞株においても、CD274高発現、低発現分画の分取と浸潤遊走能や細胞増殖活性の比較、腫瘍生物学的特徴の解析をすすめており、これらの分画における網羅的遺伝子発現解析、各分画において特異的発現を示す遺伝子群の同定も順調に進んでいる。(Inoue S., Inaguma S., et al., Virchows Arch, 2019)膵臓癌、大腸癌CD274高発現分画において特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し、CRISPR/Cas9systemを用いてその発現を消失させ、膵臓癌、大腸癌細胞株の浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能など、腫瘍生物学的特徴の変化を検討する。また、マウスを用いた同種移植モデルにおける検討も計画している。本研究より同定された遺伝子群の発現をヒト腫瘍組織アレイを用いて解析し、臨床病理学的特徴の解析や、予後予測因子としての有用性を検討する。膵臓癌細胞株よりCD274を高発現する分画を分取し、浸潤遊走能、細胞分裂能を検討した結果、CD274高発現分画が高い浸潤遊走能、細胞増殖活性を有することを見出した。また、CD274高発現/低発現分画における遺伝子発現を網羅的に比較解析し、各分画において、特異的発現を示す遺伝子群を抽出した。これら、特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し膵臓癌細胞株における発現を消失させ、浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能などの、腫瘍生物学的特徴を検討することを予定しており、CRISPR/Cas9systemを用いた遺伝子発現消失細胞株の樹立を進めている。アメリカ国立衛生研究所、国立がん研究所との共同研究として、腫瘍組織アレイを用いたCD274発現解析を行い、大腸癌の原発巣では、BRAF遺伝子変異やミスマッチ修復欠損など、Serrated pathway経由で発生した癌腫がCD274高発現を呈する一方で、転移巣においては、CD274発現とこれらの特徴との関係性に乏しく、腫瘍間質由来の液性因子がCD274発現を制御している可能性を明らかにし報告した(Inaguma S, et al., J. Pathol. Clin. Res. 2017;3(4):268-278)。研究者の所属する愛知医科大学における手術材料より、腫瘍組織アレイを作成し、免疫組織学的解析、予後解析を行う準備を整えた。膵臓癌細胞株における、CD274高発現、低発現分画の分取と浸潤遊走能や細胞増殖活性の比較など、腫瘍生物学的特徴の解析は計画通りに進んでいる。また、これらの分画における網羅的遺伝子発現解析も順調に進んでおり、各分画において特異的発現を示す遺伝子群の同定が終了している。また、米国国立衛生研究所、国立がん研究所との共同研究として、腫瘍組織アレイを用いたCD274発現解析を行い、大腸癌の原発巣と転移巣において、同遺伝子を発現するメカニズムが異なっている可能性を明らかにし報告した(Inaguma S, et al., J. Pathol. Clin. Res. 2017;3(4):268-278)。研究者の所属する愛知医科大学における手術材料より、腫瘍組織アレイを作成し、免疫組織学的解析、予後解析を行う準備もすでに整っている。

前年度の膵臓癌細胞株に引き続き、大腸癌細胞株よりCD274を高発現する分画を分取し、浸潤遊走能、細胞分裂能を検討したところ、膵臓癌と同様に、大腸癌細胞株においてもCD274高発現分画が高い浸潤遊走能、細胞増殖活性を有することを見出した。同時に、CD274高発現/低発現分画における遺伝子発現を網羅的に比較解析し、各分画において特異的発現を示す遺伝子群を抽出した。これら、特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し膵臓癌、大腸癌細胞株における発現を消失させ、浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能などの、腫瘍生物学的特徴を検討することを予定しており、CRISPR/Cas9systemを用いた遺伝子発現消失細胞株の樹立を進めている。また、免疫系の関与を生体内で評価するため、膵臓癌、大腸癌のマウス同種移植モデルについても使用することを計画している。研究者の所属する愛知医科大学における大腸癌手術症例より270例を選別し、外科切除標本の残余検体から大腸癌腫瘍組織アレイを作成するとともに、臨床情報、予後情報を収集し、データベースを樹立した。CD274、CD70をはじめとする免疫組織学的解析を行い、各パラメーターの予後への影響を解析し、大腸癌間質線維芽細胞におけるCD70発現が患者の予後を規定することを見出し、報告した。(Inoue S., Inaguma S., et al., Virchows Arch, 2019)膵臓癌細胞株のみならず、大腸癌細胞株においても、CD274高発現、低発現分画の分取と浸潤遊走能や細胞増殖活性の比較、腫瘍生物学的特徴の解析をすすめており、これらの分画における網羅的遺伝子発現解析、各分画において特異的発現を示す遺伝子群の同定も順調に進んでいる。(Inoue S., Inaguma S., et al., Virchows Arch, 2019)膵臓癌CD274高発現分画において特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し、CRISPR/Cas9systemを用いてその発現を消失させ、膵臓癌細胞株の浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能など、腫瘍生物学的特徴の変化を検討する。また、これらの遺伝子の発現をヒト腫瘍組織アレイを用いて解析し、臨床病理学的特徴の解析や、予後予測因子としての有用性を検討する。今後は、膵臓癌のみならず、大腸癌など、他の癌腫におけるCD274発現と悪性形質との関連に関しても、解析を進めていく予定である。膵臓癌、大腸癌CD274高発現分画において特異的発現を示す遺伝子群より、いくつかの遺伝子を選択し、CRISPR/Cas9systemを用いてその発現を消失させ、膵臓癌、大腸癌細胞株の浸潤遊走能や細胞増殖活性、免疫不全マウスにおける造腫瘍能など、腫瘍生物学的特徴の変化を検討する。また、マウスを用いた同種移植モデルにおける検討も計画している。本研究より同定された遺伝子群の発現をヒト腫瘍組織アレイを用いて解析し、臨床病理学的特徴の解析や、予後予測因子としての有用性を検討する。研究計画申請時に予定していた分子生物学的実験が、予想よりも順調に進んだため、本年度の支出が低減された。
音響信号を利用した避難誘導システムに関する研究

研究の背景・目的:従来、主として視覚情報による避難誘導力法がとられているが、地震や火災などの災害時の的確かつ効果的な避難誘導システムの構築が急務となってきている現在、これらの方法だけでは、十分な機能を果たせない場合も起こり得る。その場合にも機能する代替の方法として、我々は、音響信号による避難誘導方法について基礎的な検討を行っている。ここでは、その一つとして音を避難方向に走査させる誘導方法の実現可能性を検討することを目的とし、主として実験的研究によって有効な音響信号の種類(周波数特性、時間特性、有意音・無意音など)と提示方法、暗騒音の影響など実用化に当たって解決すべき問題点について検討した。研究の方法:音走査による誘導方式について、国立公衆衛生院の無響室(4.3m×4.0m×2.4m)において被験者(15名)を用いた聴感実験を実施した。5個のスピ-カにより実音場における音走査のシミュレ-ションを行い、3種類の信号音による誘導効果、騒音の有無による誘導効果の違い、さらに、室隅に設置したビデオモニタ-に点滅光に走行する地下街の画像を再生する光シミュレ-ションの有無についても実験を行った。その結果、暗騒音の影響については、全く騒音のない場合の誘導効果が最も高かったが、騒音レベルが60dBAおよび70dBAの場合でも誘導効果の低下はほとんどみられなかった。信号音の種類については、スイ-プ信号を用いた場合に高い誘導効果が得られた。また、全ての場合に共通して光走査シミュレ-ション映像のある場合の方が誘導効果が高い結果となった。音による避難誘導システム実用化の可能性の検討結果として、視覚情報による避難誘導が不可能な場合の補充システムの構築、視覚情報と音響情報とを組合せた信頼性の高いシステムの構築が可能となった。
大気微量分子の光学的遠隔計測のデータ解析アルゴリズムに関する基礎的研究

レーザー長光路吸収法,レーザーヘテロダイン分光法,FTIR等は,水蒸気,二酸化炭素,メタン,オゾン等の大気中分子のスペクトルを測定し,これらの分子の大気中の濃度を遠隔計測することが可能である。この中でも,レーザー長光路吸収法は,光源としてレーザーを用いることにより,高スペクトル分解能,高精度の測定が可能である。しかし新しい測定システムの開発には多大の費用を要するため,実験装置の開発に先立ち,コンピューターシミュレーションを十分に行い,測定手法の最適化を行うことが重要である。本研究は,大気微量分子の光学的遠隔計測手法開発のための,測定のシミュレーションによる評価手法の確立を目的として,以下の手順で研究を行った。大気微量分子の光学的遠隔計測手法の調査を行った。吸収スペクトルから大気微量分子の高度分布またはカラム濃度測定する方法の調査を行った。測定システムのパラメーター(測定波長範囲,スペクトル分解能,雑音等)を入力すると,大気の吸収スペクトルの測定データを作成するプログラムを開発した。また,作成したデータを解析し濃度を導出するプログラムを開発した。開発したプログラムを用いて,地上衛生間レーザー長光路吸収測定を例に取り,大気微量分子測定システムを新たに開発する場合の最適化に関する評価を行った。本研究により,測定システムのパラメーターの自由度を与えると,対象分子の測定精度を最大にする測定システムの仕様を決定する手順を確立した。
低侵襲脊椎手術実現のための新しい電極付硬膜外内視鏡の開発

腰椎手術治療戦略において神経障害高位を正確に評価することは重要であるが、画像上多椎間に神経圧迫がある場合の責任高位を評価することは未だ完全ではない。長期にわたり解決不可能であった腰部脊柱管狭窄症の真の責任高位診断を実現することが必要である。本研究の最終目標は、これを解決するために、電気生理学的機能診断の経験と新しいレンズ開発技術を融合させることにより電極付硬膜外内視鏡を開発作成することである。今年度も引き続き1電極付硬膜外内視鏡の開発2脊椎手術大規模データベースの作成の2本柱を研究計画として打ち立てた。1に関して内視鏡の開発は遅れている。今回の開発には内視鏡径が細くかつ画像が鮮明である必要があり、スカラ社が開発したGIレンズ(ポリマー樹脂を細長く伸ばしてレンズ機能をもたせたもの)が不可欠と考えている。まず、このGIレンズを口腔内の吸引管に埋め込むことに成功し、ポータブル端末画面で口腔内を確認しながら吸引を正確に行うことが可能となった。現時点で製品化・販売が完成しておらず,本研究の電極付硬膜外内視鏡の商品開発に着手できておらず、進捗状況は遅れている。高位診断に関する方法ならびに新規診断方法の承認・製品化に関する情報を得るために各学会への参加を積極的に行った。2データベースの作成は進んでいる。問診調査、自覚症状(VAS)、腰痛治療判定基準(JOAスコア)、SF-36、QOL、身体計測値、手術高位・方法・成績などの入力を継続しており、このDATAベースから術後成績不良因子などが判明すれば最終目的である真の責任高位診断の一助になると考えている。同様に神経障害高位診断に必要と考えるあらゆる検査法や診断法を検証することが、本研究の成功につながると考えられることから、積極的に各種学術集会に参加し論文を入手して情報収集に努めた。現在このデータベースを使用して学会報告に着手しはじめている。本研究の目的は、腰椎手術治療戦略において最も重要である神経障害高位を正確に評価する新しい画像的・電気生理学的検査法の確立することであり、電気生理学的検査開発の経験と新しいレンズ開発技術を融合させることにより電極付硬膜外内視鏡を開発・作成することで長期にわたり解決不可能であった腰部脊柱管狭窄症の真の責任高位診断を実現することが本研究の最終目標である。平成28年度の研究として1電極付硬膜外内視鏡の開発2脊椎手術大規模データベースの作成を2本の柱を計画していた。1に関して、産学連携体制での開発を計画しているスカラ社と打ち合わせを行い、電極付硬膜外内視鏡の概要を伝えている。今後の研究の推進方策に記載しているように、今後話し合いを具体化させることを計画している。2データベースの具体的な調査項目の内、以下の内容に関してDATA入力を順次行ってきた:問診票調査(既往歴)、痛みなどの自覚症状、日本整形外科腰痛治療判定基準(JOAスコア)、SF-36、QOLなど、身体計測値(身長、体重など)、単純X線、CT、MRI、選択的神経根造影、電気生理学的診断、手術高位、手術方法、術後成績。また、腰部脊柱管狭窄症の責任高位診断の際に、画像検査では多椎間に加齢的変性所見が認められることが多く、すべての圧迫所見が症状と関連しているか判断に苦慮することがあり、腰椎手術治療戦略において最も重要である神経障害高位を正確に評価する新しい画像的・電気生理学的検査法の確立が本研究の目的である。そのために必要な情報を収集するために積極的に各種学術集会に参加した。今回の電極付内視鏡の開発には、光学機器開発のスカラ社が開発したこのGIレンズ(ポリマー樹脂を細長く伸ばしてレンズの機能をもたせている)が不可欠である。現在手始めに、このGIレンズを口腔内の吸引管に埋め込み、カメラで確認しながら吸引を行う吸引管の開発に成功し、製品化をすすめている。このため今回の電極付内視鏡の開発は予定より遅れているのが現状である。しかしながらこの技術および製品化へのプロセスが今回の硬膜外電極付内視鏡の開発に直結すると考えている。腰椎手術治療戦略において神経障害高位を正確に評価することは重要であるが、画像上多椎間に神経圧迫がある場合の責任高位を評価することは現代においてもまだ完全とは言えない。そのためどうしても画像的に神経の圧迫のある部位に手術操作を加えることが多く、不必要な手術が追加され、医療費がかさんでいる可能性は否定できない。よって長期にわたり解決不可能であった腰部脊柱管狭窄症の真の責任高位診断を実現することが必要である。平成29年度は引き続き1電極付硬膜外内視鏡の開発2脊椎手術大規模データベースの作成の2本柱を研究計画として打ち立てた。1に関して産業連携体制で開発を計画しているスカラ社と打ち合わせを行い、電極付硬膜外内視鏡の開発に着手することを計画していたが、残念ながら資金面においてまだ着手困難な状態が続いている。資金面の目処が立ち次第具体的な話合いをすすめる予定である。

既往歴など問診調査項目、痛みやしびれの自覚症状(VAS)、日本整形外科腰痛治療判定基準(JOAスコア)、SF-36、QOL、身体計測値(身長、体重など)、手術高位、手術方法、術後成績などの入力を継続している。2のDATAベースから術後成績不良因子などが判明すれば最終目的である真の責任高位診断の一助になると考えている。神経障害高位診断に必要と考えるあらゆる検査法や診断法を検証することが、本研究の成功につながると考えられることから、積極的に各種学術集会に参加し論文を入手して情報収集に努めた。前述した1電極付硬膜外内視鏡の開発は遅れている。今回の開発には、光学機器開発としてスカラ社が開発したGIレンズ(ポリマー樹脂を細長く伸ばしてレンズ機能をもたせたもの)が不可欠と考えている。手始めとしてこのGIレンズを口腔内の吸引管に埋め込むことに成功した。この開発によって画面で口腔内を確認しながら痰などの吸引を正確に行うことが可能となった。本研究には電極付硬膜外内視鏡の開発費は計上しておらず、この吸引管の製品化で得た資金を用いて行う予定である。そのため今回の電極付硬膜外内視鏡の具体的な商品開発に着手できていないのが現状である。しかしながらこのレンズ付き吸引管の開発技術および製品化へのプロセスより、電極付硬膜外内視鏡も製品化可能であると実感している。腰椎手術治療戦略において神経障害高位を正確に評価することは重要であるが、画像上多椎間に神経圧迫がある場合の責任高位を評価することは未だ完全ではない。長期にわたり解決不可能であった腰部脊柱管狭窄症の真の責任高位診断を実現することが必要である。本研究の最終目標は、これを解決するために、電気生理学的機能診断の経験と新しいレンズ開発技術を融合させることにより電極付硬膜外内視鏡を開発作成することである。今年度も引き続き1電極付硬膜外内視鏡の開発2脊椎手術大規模データベースの作成の2本柱を研究計画として打ち立てた。1に関して内視鏡の開発は遅れている。今回の開発には内視鏡径が細くかつ画像が鮮明である必要があり、スカラ社が開発したGIレンズ(ポリマー樹脂を細長く伸ばしてレンズ機能をもたせたもの)が不可欠と考えている。まず、このGIレンズを口腔内の吸引管に埋め込むことに成功し、ポータブル端末画面で口腔内を確認しながら吸引を正確に行うことが可能となった。現時点で製品化・販売が完成しておらず,本研究の電極付硬膜外内視鏡の商品開発に着手できておらず、進捗状況は遅れている。高位診断に関する方法ならびに新規診断方法の承認・製品化に関する情報を得るために各学会への参加を積極的に行った。2データベースの作成は進んでいる。問診調査、自覚症状(VAS)、腰痛治療判定基準(JOAスコア)、SF-36、QOL、身体計測値、手術高位・方法・成績などの入力を継続しており、このDATAベースから術後成績不良因子などが判明すれば最終目的である真の責任高位診断の一助になると考えている。同様に神経障害高位診断に必要と考えるあらゆる検査法や診断法を検証することが、本研究の成功につながると考えられることから、積極的に各種学術集会に参加し論文を入手して情報収集に努めた。現在このデータベースを使用して学会報告に着手しはじめている。
ラット後根神経節ニューロンにおけるTTX非感受性ナトリウムチャネルの機能解析

ラット後根神経節より単離した神経細胞において、outside-out型膜電位固定法を用い、電位依存性ナトリウムチャネルの性質を調べたところ単位単一電流値(unit amplitude)の違いにより2つのタイプの単一電流が固定された。このどちらの単一電流も細胞膜外側のナトリウムイオンをテトラメチルアンモニウムイオンで置換した溶液では記録されなかった。また、2種類の単一電流はテトロドトキシンに対する感受性が異なっていた。すなわち、振幅の大きい方の電流は1mMのテトロドトキシンにて抑制されるのに対して(これを以下TTX-Sと略す)、小さい方の電流は1mMのテトロドトキシンでも影響を受けなかった(以下TTX-Iと略す)。細胞内ナトリウム濃度1.4mM、細胞外ナトリウム濃度250mMにおいて、-40mVに脱分極させたときの単一電流幅測定値はTTX-Sが1.16pA、TTX-Iが0.57pAであった。各々の電流のコンダクタンスを-30mVにおける傾斜により求めるとTTX-Sは16.3pS、TTX-Iは8.5pSであった。これら2種類の電流の活性化、不活性化レベルには差異がみられた。つまりTTX-Sは-60mV以上の脱分極パルスで活性化されるが、TTX-Iは-40mV以上で活性化された。またプレパルスにより両者の不活性化レベルを比較すると、-50mV以上のプレパルスでは、TTX-Sの方がTTX-Iより不活性化を受けやすいことが示された。単一電流記録より合成したそれぞれのアンサンブル電流は、ホールセル記録で得られた各々の電流の特徴を持っていた。これらのことから、ラット後根神経節細胞における2種類のナトリウムチャネルはテトロドトキシン感受性が異なるだけでなく、単一チャネルコンダクタンスの種類の異なる電流であることが結論された。
算数を協定的に創り上げていく段階における創造過程モデルに関する研究

1.研究目的算数を協定的に創り上げていく段階での創造的思考力の育成方法の提案2.研究経過全国数学教育学会誌『数学教育学研究』第16巻第2号に,学級全体を対象とした「創造的思考過程モデル」を公表した。しかし,新たな課題が3点見つかった。1点目は,創造的思考の定義のあいまいさに関する問題である。数学的な考え方に関する中島(1981),C.S.Peirceのアブダクション等の千研究を基に,理論的再定義を試みた。しかし,定義が精緻化しすぎるという難点が生じたため,特性という形式で以下の5点を抽出した(松島2010a)。特性(1)創造的思考は,子どもが問いをもつことによって始まる,特性(2)創造の驚きや喜びが次なる創造的思考へつながる,特性(3)創造的思考は方向をもった思考であり,統合的な方向が重視される,特性(4)問題の構造を見抜くことによって創造的思考は進行する,特性(5)仮説を設定することで創造的思考は進行する,である。この5特性につながる経験を算数授業のどのような場面で設定すればよいかが2点目の課題である。この点に関して,島田(1977)の「数学的活動」と5つの特性を対比して考察した。また,フィンランド教育視察を行い,フィンランドでの小学校算数教育での応用志向の重要性を実感した。その結果,「抽象化・理想化・簡単化」,「新理論の開発」,「一般理論,アルゴリズムの開発」の3つの場面で,創造的思考を育成することの重要性が明らかとなった(松島2010b)。3点目が,これらの3つの場面で創造的思考を起こさせる学習指導の実際である。この課題に対して,認知科学の知見を援用し,ジグソー学習法を用いて,子どもに協調的な対話による創造的思考を活性化させた。それにより,子どもたちの理解やコミュニケーション能力が高まった(松島ほか,2011)。3.今後の課題創造的思考が高まったと考えられる授業の実際の提案と収集,それに基づいた新たな創造過程モデルの構築が課題として残された。
膜結合型チロシンホスファターゼ遺伝子のクローニング

本研究ではチロシンリン酸化を介する中枢神経系および免疫系細胞の活性化、分化制御の分子機構をチロシンホスファターゼ(PTP)の側から解明することを目指している。これまでにマウス脳cDNAライブラリーより単離し解析を進めてきたMPTPδは、細胞外に接着分子様の構造を有する膜結合型PTPである。MPTPδには、細胞外領域の構造が異なる4種類のアイソフォームが存在し、マウス脳においてはMPTPδアイソフォームが発達段階特異的に発現していることが明らかとなっていた。そこで、今年度は、神経系細胞分化における、MPTPδの役割について培養細胞系を用いて検索を行い、以下の結果を得た。(1)神経芽細胞腫由来の細胞株であるN1E115はDMSO添加により増殖を停止し神経系へ分化する。PTP阻害剤であるNa_3VO_4存在下では、この分化誘導が有意に抑制されたことより、N1E115の神経系への分化過程にPTPが関与していることが示唆された。(2)この分化誘導時におけるMPTPδおよびMTPδ近縁遺伝子の発現の変化を検討した。その結果、MTPδ遺伝子発現が減弱していたのに対し、近縁遺伝子であるLAR、PTPσの発現には、増加傾向が認められた。(3)そこで、N1E115細胞に遺伝子導入によりMPTPδ蛋白を強制発現させたところ、神経系への分化誘導が抑制され、aggregateをつくりながら増殖する形質を獲得した。現在、神経系へ分化することが報告されている他の細胞株を用いて同様の解析を進めている。以上の結果は、日本癌学会、日本分子生物学会および日本病理学会にて発表済である。
Brugada症候群の分子病理

マウス心筋Naチャンネル遺伝子Scn5a特異的siRNAベクター機能の検討平成17年度に作成した3種のマウス心筋Naチャンネルαサブユニット遺伝子Scn5a特異的siRNAベクター(ベクターA,B,C)をマウス新生児単離心筋初代培養細胞に導入しベクターの効果を更に検討した。最も抑制効果の高いベクターAをマウス新生児単離心筋初代培養細胞に導入し、Immunoblottingならびに免疫染色、ホールセルパッチクランプ電気生理特性の解析を行った。Immunoblottingによる判定量的心筋Naチャンネルαサブユニットの発現量を検討したところコントロールに比してベクターBでは約21%の蛋白発現が認められた。免疫染色では心筋Naチャンネルαサブユニットは細胞端の接合部位での発現低下も認められた。ホールセルパッチクランプによる電気生理学的解析ではNa電流の大幅な減少が認められ、膜電位の持続時間の短縮が認められた。上記のマウス心筋Naチャンネルαサブユニット遺伝子Scn5a特異的siRNAベクターのうち最も阻害効果の高いベクターBをマイクロインジェクションによりマウス受精卵に導入し、胚形成後に偽妊娠マウスに戻し、トランスジェニックマウスの作成を試みた。しかしながらこれら受精卵からは初代トランスジェニックマウスの出生は認められなかった。妊娠初期にて死産となっており胎児発育の障害が認められた。死亡胎児マウスの心臓は低形成であり、それが発育障害の原因のひとつと考えられた。この死亡胎児マウスの心臓のImmunoblottingからは心筋Naチャンネルαサブユニットの発現低下を認めた。免疫染色では房室結節以下の刺激伝導系細胞での心筋Naチャンネルαサブユニットの発現低下を認めた。マウス心筋Naチャンネル遺伝子Scna5a特異的siRNAベクターの作製マウス心筋Naチャンネル遺伝子Scna5acDNA塩基配列情報より、選択的抑制効果の高いシークエンスをTuschlらの方法を用いて推定し、3種のScna5a特異的siRNAベクター(ベクターA、B、C)ならびにネガティブコントロール用塩基配列をデザインした。DNAオリゴはAmbion社にて委託合成した。この合成オリゴをHasuwaらの方法に準じヒトRNA polymerase IIIプロモーターであるH1プロモーターを包含したAmbion社のpSilencer3.1-H1 neoベクターに導入した。ベクターはラージスケールにて増幅分離調整した。発現ベクターの単離培養心筋細胞での導入次いで発現ベクターの機能をマウス新生児単離培養心筋細胞に導入し検討した。出生直後のマウスより心臓を摘出し、培養液内でピンセットにて物理的に分離し、培養シャーレへの接触性の強さにて心筋細胞と間質細胞を分離後培養し、コントロールと三種のScna5a特異的siRNAベクターをリポフェクタミンにて調整し各々培養液中に添加した。培養液中にはネオマイシンを投与して、ベクターが導入された細胞のみ生存するように設定した。約2週間培養後生存細胞からmRNAを抽出しcDNAを合成してリアルタイムRT-PCRにてScna5a発現抑制レベルを確認した。ネガティブコントロールに比してベクターAでは約78%の、ベクターBでは85%の、ベクターCでは62%の発現抑制効果が認められた。次いでこれらの細胞での心筋Naチャンネルαサブユニット蛋白の発現レベルを検討した。ベクター導入2週間後の培養心筋細胞より蛋白を抽出し、Immunoblotting法にて半定量的に心筋Naチャンネルαサブユニット発現量を検討した。コントロールに比してベクターAでは約30%、ベクターBで約20%、ベクターCで約60%の蛋白発現が認められた。現在Scn5a特異的siRNAベクターを発現するトランスジェニックマウス作成の準備をしている。