hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宿主ゲノム内に見つかったフィロウイルス遺伝子の機能解析

報告されているフィロウイルス由来と考えられるゲノム配列のうち、トビイロホオヒゲコウモリ(Myotis lucifugus)のゲノム上に見つかったエボラウイルスVP35遺伝子に相同性が高く、且つ、オープンリーディングフレームが保存されている領域(mlEFL35)を人工合成した。mlEFL35由来の蛋白質(mlEFL35p)を哺乳類由来培養細胞に強制発現させる系を確立し、発現した蛋白質の機能解析を行った。mlEFL35pはフィロウイルスのVP35同様にIFN応答阻害活性を有した。一方で、mlEFL35pは、ウイルスゲノムの複製に重要なウイルスポリメラーゼコファクターとしての機能は持たないことが分かった。また、VP35を共発現させた細胞を用いた免疫沈降法の結果から、mlEFL35pは多量体を形成すること及びエボラウイルスのVP35とも相互作用することが示唆された。トビイロホオヒゲコウモリに近縁なコウモリ(Myotis myotis)の培養細胞を用いて、EFL35の転写および発現等を調べた。Myotis myotisのゲノムにもEFL35が存在することを確認し全長の塩基配列を確定したが、残念ながら通常培養条件下でのEFL35の転写等は確認できなかった。しかし、EFL上流の配列を精査したところ、遺伝子の転写に関与するゲノム配列と類似性が高い領域を見つけたので、ある特定条件下でEFL35の転写等が起こると仮定した実験をおこなった。現在、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行っている最中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。FrESs遺伝子の人工合成および発現の確認:報告されているフィロウイルス由来と考えられる遺伝子配列(FrESs)の内、トビイロホオヒゲコウモリの遺伝子内に見つかっているエボラウイルスVP35遺伝子に相当性が高い領域(mlEEL35)を人工合成した。哺乳類由来培養細胞に強制発現させる系を確立し、発現した蛋白質の機能解析をルシフェラーゼレポーターアッセイおよびELISA法により行った。その結果、mlEEL35由来の蛋白質はVP35様の機能を部分的に有することが分かった。新規FrESs遺伝子の探索およびクローニング:所属研究室が保有するコウモリ由来培養細胞および海外学術研究で捕獲したコウモリの臓器より核酸を抽出した。それらに対し、既存のプライマーセットを用いて、既知および新規のFrESs遺伝子の検出を試みたが、新規FrESs遺伝子は検出されなかった。既存のプライマーセットは、トビイロホオヒゲコウモリやオオクビワコウモリに特異的に作製されているため、今回対象となったコウモリ種に対しては、新たなプライマー合成を検討する必要がある。FrESsの局在確認およびFrESsと相互作用する蛋白質の同定:蛋白質タグとの融合蛋白質となるようにmlEEL35発現ベクター構築し、抗タグ抗体を用いた蛍光抗体法により細胞内における局在を観察した。その結果、VP35同様に細胞質に局在することが分かった。現在、ウイルス蛋白質とmlEEL35が相互作用するかを免疫沈降法により解析中である。当初の予定通り、既知の内在性遺伝子(mlEEL35)を人工合成し強制発現させる系を確立した事ならびにmlEEL35の機能解析を行い、VP35の機能と比較できたこと。さらに、恒常発現細胞を作製にも着手しており、次のステップへの準備も始めていること。報告されているフィロウイルス由来と考えられるゲノム配列のうち、トビイロホオヒゲコウモリのゲノム上に見つかったエボラウイルスVP35遺伝子に相同性が高く、且つ、オープンリーディングフレームが保存されている領域(mlEFL35)を人工合成した。これらの結果をまとめ、科学雑誌に投稿し、2017年10月に受理された(Kondoh T. et al., PLoSONE 12(10): e0186450. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186450)。また、VP35およびmlEFL35pの恒常発現細胞をHEK293細胞、Vero E6細胞、Hela細胞でそれぞれ作製し、海外のBSL-4施設(アメリカ合衆国の国立感染症アレルギー研究所)にて感染性エボラウイルスを用いた実験を行った。しかし、mlEFL35pがエボラウイルスの生活環に与える影響を確認することはできなかった。これらの結果をまとめ、2018年1月に開催された7th Negative Strand Virus-Japanで口頭発表を行った。当初の予定通り、既知の内在性遺伝子(mlEFL35)を人工合成し強制発現させる系を確立した事ならびにmlEFL35pの機能解析を行い、VP35の機能と比較して得られた結果を論文として投稿できたこと。

さらに、トビイロホオヒゲコウモリに近縁なコウモリの培養細胞を入手し、次のステップへの準備も始めていること。報告されているフィロウイルス由来と考えられるゲノム配列のうち、トビイロホオヒゲコウモリ(Myotis lucifugus)のゲノム上に見つかったエボラウイルスVP35遺伝子に相同性が高く、且つ、オープンリーディングフレームが保存されている領域(mlEFL35)を人工合成した。mlEFL35由来の蛋白質(mlEFL35p)を哺乳類由来培養細胞に強制発現させる系を確立し、発現した蛋白質の機能解析を行った。mlEFL35pはフィロウイルスのVP35同様にIFN応答阻害活性を有した。一方で、mlEFL35pは、ウイルスゲノムの複製に重要なウイルスポリメラーゼコファクターとしての機能は持たないことが分かった。また、VP35を共発現させた細胞を用いた免疫沈降法の結果から、mlEFL35pは多量体を形成すること及びエボラウイルスのVP35とも相互作用することが示唆された。トビイロホオヒゲコウモリに近縁なコウモリ(Myotis myotis)の培養細胞を用いて、EFL35の転写および発現等を調べた。Myotis myotisのゲノムにもEFL35が存在することを確認し全長の塩基配列を確定したが、残念ながら通常培養条件下でのEFL35の転写等は確認できなかった。しかし、EFL上流の配列を精査したところ、遺伝子の転写に関与するゲノム配列と類似性が高い領域を見つけたので、ある特定条件下でEFL35の転写等が起こると仮定した実験をおこなった。現在、次世代シークエンサーを用いたトランスクリプトーム解析を行っている最中である。現在までの結果をまとめ、専門誌に投稿する準備を進めている。今後は、当初の予定通り、恒常発現細胞を作製し海外のBSL-4施設にてフィロウイルスを用いた実験を行う予定である。また、新たにプライマー合成を行いFrESs遺伝子は検出も継続して行う予定である。今後は、トビイロホオヒゲコウモリに近縁なコウモリの培養細胞を用いた実験を行う予定である。また、昨年度に引き続き新たにプライマー合成を行いFrESs遺伝子は検出も継続して行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
筋芽細胞から骨芽細胞への分化に伴うBMPレセプターの発現とシグナル伝達機構の解析

我々は、これまでの研究から、筋芽細胞(C2C12細胞)をBMP-2で処理すると、筋細胞への分化が完全に抑制され、骨芽細胞への分化が強力に誘導されることを見いだした。そこで本研究では、BMP-2のレセプターの発現とシグナル伝達機構を解析した。まず、C2C12細胞におけるBMP-2レセプターの発現をNothern blotにより解析した。その結果、C2C12細胞はBMPR-IA、BMPR-IIを発現していたが、BMPR-IBのmRNAは検出されなかった。次に、C2C12細胞に構成的活性化変異を導入したBMPR-IAとBMPR-IBを発現させたところ、どちらの場合でもBMP-2非存在下でアルカリホスファターゼ(ALP)を発現し、同時に筋細胞への分化が抑制された。また、細胞内キナーゼ領域を欠失させたBMPR-IA(ΔBMPR-IA)をC2C12細胞に発現させたところ、その細胞はBMP-2で処理してもALP陽性の細胞はほとんど出現せず、多核の筋細胞へと分化したが、同様な変異を導入したBMPR-IB(ΔBMPR-IB)ではこのような現象は観察されなかった。さらに、ΔBMPR-IAを安定して発現する細胞株に全長のBMPR-IA、BMPR-IBを高発現させると、BMPR-IAを導入したときのみBMP-2による骨芽細胞への分化誘導が回復した。以上の結果から、C2C12細胞ではBMP-2による筋細胞への分化の抑制と骨芽細胞への分化誘導シグナルはどちらもBMPR-IAを介して伝達されるが、構成的活性型変異を施したBMPR-IBもBMPR-IAの場合と同様にシグナルを伝達することが明らかとなった。
データ包絡分析と指数アプローチによる動学的全要素生産性の計測法の開発と応用

本研究は、伝統的な全要素生産性(TFP)の計測法を、二つの点で拡張することが目的であった。第一は、生産が完全に効率的に行われるという前提を取り除き、技術非効率が生産性に及ぼす影響を計測できるようにすることある。第二は、すべての生産要素が即時的に調整されるという仮定を排し、調整費用を伴う準固定要素を導入して動学的生産性および動学的効率性を計測することである。第一番目の点については、Hicks-Moorsteen指数によるTFPの計測とその要因分解分析を提案し、生産性変化率が技術進歩率と規模の経済性要因のみならず、効率性要因にも依存する形での分析を可能とした。このHicks-Moorsteen指数に基づくTFP変化率の要因分解分析は、OECD17カ国のマクロデータに適用してその実証的有用性を確認した。その際、要因分解分析に必要なインプットおよびアウトプット距離関数値を得るため、新たな工夫をパラメトリック・アブローチで行う場合について考案した。また、非パラメトリック・アプローチ(データ包絡分析を利用する場合)にも利用可能な、規模弾性値の合理的な推定方法を示した。第二に、データ包絡分析を動学化することにより、動学的生産性と動学的効率性の計測を可能にする方法を開発した。この方法は標準的な投資理論との親和性が高く、投資のオイラー方程式やトービンのqを計測できることが特徴である。応用として、わが国電気事業の送配電部門を対象にした実証研究を行い、従来の静学的な方法によりしばしば電気事業において見出される配分非効率は、その大部分が動学的非効率に由来することを明らかにした。平成14年度においては、データ包絡分析(Date Envelopment Analysis)を動学化して、わが国電気事業の全要素生産性指数の計測を行った。これは、生産要素のうち資本を準固定要素と考え、期首に存在する資本ストックを当期のインプット、期末に存在する資本ストックをアウトプットとして扱うことにより、資本の最適投入に関する動学的条件を導き、それを参照することで各種の生産性および効率性を計測するものである。こうした分析法の基本的なアイデアは、先行研究(研究代表者の既発表論文を含む)によりいくつか提案されていたが、実証研究での本格的な応用例はアメリカの農業分野での研究に次いで二例目である、この研究では、わが国電気事業9社について、1981年から1995年までの生産性の変動を、技術進歩と技術非効率,配分非効率(一時点における生産要素投入の歪みに起因する非効率)および動学的非効率(異時点間における資本投入の歪みに起因する非効率)に分解し、かつ生産要素ごとに実際の投入量の最適水準からの乖離を計測した。その結果、わが国電気事業の生産性を規程する最も重要な要因は、動学的効率性であることが明らかになった。同時に、動学的要因を考慮しない伝統的な生産性計測法では、動学的効率性が無視されるために本来効率的であるはずの配分非効率に大きな値が計測され、誤った分析結果を導くこともわかった。要素ごとの評価では、資本ストックの過大傾向が明らかになり、特に送電部門の設備が効率的な水準に比べ大きいことが特徴的である。以上のような生産性指標は、生産性変化率の中にインプリシットに技術進歩率を含んでいる。本年度は、これを分離した形の生産性指数(Malmquist指数)に拡張する方法の理論的研究も行い、計測法をほぼ確立している。第一は生産が完全に効率的に行われるという前提を取り除き、技術非効率が生産性に及ぼす影響を計測できるようにすることである。

第二は、すべての生産要素が即時的に調整されるという仮定を排し、調整費用を伴う準固定要素を導入して動学的生産性および動学的効率性を計測することである。第一番目の点については、Hicks-Moorsteen指数によるTFPの計測とその要因分解分析を提案し、生産性変化率が技術進歩率と規模の経済性要因のみならず、効率性要因にも依存する形での分折を可能とした。このHicks-Moorsteen指数に基づくTFP変化率の要因分解分析は、OECD17カ国のマクロデータに適用してその実証的有用性を確認した。その際、要因分解分析に必要なインブットおよびアウトプット距離関数値を得るため、新たな工夫をパラメトリック・アプローチで行う場合について考案した。また、非パラメトリック・アプローチ(データ包絡分析を利用する場合)にも利用可能な、規模弾性値の合理的な推定方法を示した。第二に、データ包絡分析を動学化することにより、動学的生産性と動学的効率性の計測を可能にする方法を開発した。この方法は標準的な投資理論との親和性が高く、投資のオイラー方程式やトービンのqを計測できることが特徴である。応用として、わが国電気事業の送配電部門を対象にした実証研究を行い、従来の静学的な方法によりしばしば電気事業において見出される配分非効率は、その大部分が動学的非効率に由来することを明らかにした。
薬物による尿細管間質性腎炎の発症機序解明

薬物による腎尿細管間質性腎炎は、尿細管間質における炎症を起点として、腎実質の障害とそれに続く腎機能の低下や貧血など全身性の症状を惹起し得る。しかし、その発症機序はほとんど明らかにされておらず、科学的根拠に基づいた予防法及び治療法は確立されていない。そこで本研究では、腎臓外の要因が尿細管間質性腎炎発症に関与しているという概念をもとに、薬物による尿細管間質性腎炎の発現機序解明を目標とした。抗菌薬と腸内細菌叢に注目した解析から、薬物による尿細管間質性腎炎の発症には、腎外の要因が関与することを実証する結果が得られた。また、腎外の要因として、腸内細菌叢の重要性が示唆された。1.薬剤による尿細管間質性腎炎の実態調査薬物による尿細管間質性腎炎に関して、研究課題としてこれまで顧みられることが乏しかった背景として、その発祥頻度が低いことに加えて、臨床における実態が不明であったことが一因として考えられた。そこで、医薬品副作用データベースを用いて、尿細管間質性腎炎の被疑薬の特徴を検索した。その結果、自己免疫疾患を背景に有する場合に発症頻度が高いことが示され、腎臓外の炎症が薬物による尿細管間質性腎炎に寄与することが示唆された。2.薬物による尿細管間質性腎炎を再現する実験モデル動物の確立申請者は初めに、薬物による尿細管間質性腎炎の発症には、腎毛細血管透過性の増大と活性化T細胞の腎への浸潤が関与することを想定した。そこで、ロキソプロフェンをモデル薬物として用い、活性化T細胞との同時処置により、マウスにおいて尿細管間質性腎炎を再現する動物モデル作製を目指した。しかし、本実験系ではロキソプロフェンによる尿細管間質性腎炎は成立せず、モデル動物作成方法の変更が必要となった。上述の実態調査から、自己免疫疾患と薬物による尿細管間質性腎炎の関連が疑われたため、自己免疫疾患様のモデル動物にロキソプロフェンを投与することとした。本年度は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)によって誘発した大腸炎モデルを用いて、ロキソプロフェンの腎への作用を検討した。その結果、ロキソプロフェンとDSSの共処置によって腎臓内におけるIL-6やCCL2といった炎症性サイトカインの発現量が上昇することを見出した。当初の研究計画では、本年度の目標として、薬物による尿細管間質性腎炎を再現する実験モデル動物の確立、尿細管間質性腎炎を引き起こす薬物が有する特徴の同定、及び薬剤による尿細管間質性腎炎に関する実態調査としていた。薬物による尿細管間質性腎炎に関する課題としては、その発症機序が未解明であるとともに、臨床における実態が不明であることがあった。そこで、実態調査については、その結果がすぐに有益となることも期待されたため、初めに医薬品副作用データベースを用いた調査を行なった。その結果、尿細管間質性腎炎を発症しやすいと考えられる医薬品を同定することができたとともに、尿細管間質性腎炎を発症した症例に共通した特徴を見いだすことができた。これらの結果は、当初想定していた以上であったと考える。一方、薬物による尿細管間質性腎炎を再現する実験モデルについては、初めに、ロキソプロフェンをモデル薬物として用い、活性化T細胞との同時処置により作製を目指した。そこで、腎外から腎臓へ浸潤するT細胞の由来を炎症が起こった遠隔臓器であることを想定し、大腸炎モデルマウスに着目した。すなわち、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)によって誘発した大腸炎モデルを用いて、ロキソプロフェンの腎への作用を検討した。本項目の進捗は、当初の目標から下回るものであるが、発症機序が全く不明であった尿細管間質性腎炎に関しては一定の新知見を得られたものと考える。薬物による腎尿細管間質性腎炎は、尿細管間質における炎症を起点として、腎実質の障害とそれに続く腎機能の低下や貧血など全身性の症状を惹起する。そこで本研究では、腎臓外における炎症の存在が尿細管間質性腎炎発症の主要因であるという仮説を立て、薬物による尿細管間質性腎炎の発現機序解明を目標とした。はじめに、NSAIDsが関連する腎障害の実験モデルとして、ロキソプロフェン及びインドメタシンをマウスに経口投与し、腎臓への影響を観察した。しかし、これらのNSAIDsを8週間投与しても腎機能への明らかな影響は認められなかった。そこで、腎臓外における環境変化と腎実質の障害の両方が組み合わさることで尿細管間質性腎炎が生じると考え、NSAIDsを経口投与したマウスに腎毒性物質であるアリストロキア酸を腹腔内投与し、腎機能の変化を観察した。また、腸内環境の変化として抗菌薬の経口投与による影響についても検討を行った。その結果、アリストロキア酸処置後においてもNSAIDsによる腎臓への有意な影響は認められなかった。一方で、抗菌薬であるバンコマイシンを経口投与したマウスでは、滅菌水のみを投与したマウスと比較して、アリストロキア酸処置後の腎臓における線維化マーカータンパク質alpha-

SMAの発現が抑制された。従って、腸内環境は尿細管間質性腎炎の重篤化に関与することが示唆された。薬物による腎尿細管間質性腎炎は、尿細管間質における炎症を起点として、腎実質の障害とそれに続く腎機能の低下や貧血など全身性の症状を惹起し得る。しかし、その発症機序はほとんど明らかにされておらず、科学的根拠に基づいた予防法及び治療法は確立されていない。そこで本研究では、腎臓外の要因が尿細管間質性腎炎発症に関与しているという概念をもとに、薬物による尿細管間質性腎炎の発現機序解明を目標とした。抗菌薬と腸内細菌叢に注目した解析から、薬物による尿細管間質性腎炎の発症には、腎外の要因が関与することを実証する結果が得られた。また、腎外の要因として、腸内細菌叢の重要性が示唆された。平成29年度は以下の項目について検討を進める。1.薬物による尿細管間質性腎炎を再現する実験モデル動物の確立(ロキソプロフェンが腎間質への白血球およびリンパ球の浸潤へ及ぼす影響の評価、腎臓から単離した尿細管上皮細胞及び線維芽細胞を用いた細胞生物学的解析、及び、症状の可逆性や薬物曝露量への依存性に関する解析)昨年度に新たに見出されたDSS誘発性腸炎モデルにおいて薬物による尿細管間質性腎炎を解析する。また、薬物による尿細管間質性腎炎は、早期に発見し原因となる薬物を中止することによって、回復可能と考えられている。そこで、薬物の処置によって尿細管間質性腎炎を引き起こした際に、症状の可逆性を実証する。また、種々曝露量のロキソプロフェンを用いることで、尿細管間質性腎炎発症の用量依存性を解析する。2.尿細管間質性腎炎を引き起こす薬物が有する特徴の同定平成29年度には、疾患モデルとして決定したマウスを用いて、種々薬物によって尿細管間質性腎炎の起こりやすさが異なるかを検証する。この際に、各薬物の腎への影響に関する陽性対照として、腎細胞のアポトーシスや血管透過性を調べ、疑陰性の結果を排除するように工夫する。3.薬剤による尿細管間質性腎炎に関する実態調査データベースを用いた研究では、異なるデータソースでの再現性も必要とされる。昨年度は本邦における副作用について調べたため、本年度は米国及び欧州における実態についても調査を継続する。医療薬学当初の計画では物品費として1000千円を計上していたが、モデル動物作成に関する検討において予期せぬ結果が得られたこともあり、腎障害の解析に用いることを予定していた費用について計画と実際の使用額に差が生じた。このことが、次年度使用額が生じた大きな理由と考える。しかしながら、新たな仮説からモデル構築を進めた結果、尿細管間質性腎炎のモデルを作製することができた。そのため、2年間での計画としては、当初想定していた通りの解析を必要とすることが見込まれ、本年度に必要な金額と考える。本年度は次年度使用額を合わせて約1950千円の使用を計画している。平成29年度には、当初計画どおりに、細胞生物学実験に係る消耗品費及び動物実験関連消耗品費(450千円)、実験用動物の購入経費(410千円)を計上するとともに、腎臓に浸潤したリンパ球及び腸管リンパ球のDNAマイクロアレイ解析に400千円を計上する。また、国内における学会発表及び海外における学会発表にかかる旅費(350千円)、及び、動物の飼育管理や病理標本の解析に対して費用(340千円)を計上する。
アルペンスキーができるロボットとコンピュータ・シミュレーションの開発

本研究の成果の概要は以下の通りである。1)ミニスキーによる有効サイドカットの検討腰部材に取り付けられた一対の脚部材が左右独立して上下に動き、かつそれぞれに回動することができるパラレルターン装置を用い、いろいろな種類のミニスキーをターンさせ、それぞれのシュプールを記録し、有効サイドカーブとシュプールの関係を検討した。すなわち、スキー板の曲げ変形を考慮した有効サイドカーブがスキー回転に重要な影響を及ぼしていることを明らかにした。2)アルペンスキーロボットの開発3種類の連続自動回転のモデルを開発した。それらは、(1)股関節の回旋モデル、(2)ストレート内傾モデル、(3)股関節の内転と外転モデルでありる。これらのモデルはサーボモータなどの動力を使わず、斜面に置かれたスキーモデル(スキーロボット)が連続自動回転できる機構である。すなわち四節回転連鎖の両てこ機構を利用した簡単な機構によりスキーが回転する原理を明らかにした。3)コンピュータ・シミュレーションの開発2本のスキーを装着した股関節回旋型アルペンスキーロボットに基づいて、スキー操作の機構を解析し、トップリフト姿勢による連続ターンの力学的定式化とコンピュータ・シミュレーションを行った。その結果、転倒しないでターンする条件や、その際の内部応力などを求めた。今年度の研究目的は、新型のアルペンスキーロボットの基本モデルを開発し、コンピュータ・シミュレーションを行うことであった。おおむね順調に計画が進み研究成果が以下のようにまとめられる。1)アルペンスキーロボットの基本モデルの開発雪上や絨毯の上を、従来のようにサーボモータを用いてスキーロボットを動かすのではなく、斜面上でスキー運動の特徴である重力により、自動的にスキーの角付けが切り換わり、さらに連続回転を継続することのできるスキーロボットの機構を開発する。そして、すでに開発した股関節の回旋モデルに四節回転機構のリンクをつけ加えることにより自動的に連続回転ができる(1)股関節の内旋・外旋によるプル-クボ-ゲン・モデルと(2)股関節の内旋・外旋によるパラレルターン・モデルを開発した。それらは日本スキー学会第7回大会において発表した。また股関節の内転・外転によるパラレルターン・モデルとストレート内傾によるパラレルターン・モデルについては継続して研究中である。2)コンピュータ・シミュレーションの開発股関節の回旋型アルペンスキーロボットにより開脚姿勢をとった連続パラレルターンのコンピュータ・シミュレーションを行った。今後ターンの後半でエッジ角が0になる状態に戻る点に注目して研究を進めたい。本年度は、アルペンスキーロボットにとって重要な、スキー板の特性をテストする装置を開発する。そしてスキー回転の特徴である「切れ込みターン」と「横ずれターン」が生じる条件やスキー板の形状と回転の特性を明らかにすることであった。さらに股関節の回旋と外転・内転の複合モデルを主としたアルペンスキーロボットの開発と、コンピュータ・シミュレーションの開発を行うことであった。計画は順調に進み、以下のように研究を行った。1)パラレルターン用テスト装置の開発腰部材に取り付けられた左右一対の脚部材が左右独立して上下に動き、かつそれぞれに回動することができる装置を開発した。2)プル-クボ-ゲン用テスト装置の開発左右の脚部を開脚することができ、かつ左右を独立して回旋することができる装置を開発した。3)最適なミニスキーの開発様々な特徴を備えたミニスキーを製作し、1)と2)の装置により実験を行った。そして、アルペンスキーロボットにとって最適なスキーを検討した。4)アルペンスキーロボットの開発主として股関節の回旋と外転・内転の複合モデルを開発した。5)コンピュータ・シミュレーションの開発昨年度に継続してコンピュータ・シミュレーションを行い、転倒しないでターンする条件と、その際の内部応力を求めた。それらの研究を別紙のように発表した。最終年度である本年度の研究実績の概要は以下の通りである。1)ミニスキーによる有効サイドカットの検討腰部材に取り付けられた一対の脚部材が左右独立して上下に動き、かつそれぞれに回動することができるパラレルターン装置を用い、いろいろなミニスキーをターン(切れ込みターン)させ、それぞれのシュプールを記録し、有効サイドカーブとシュプール(軌跡)の関係を検討した。すなわち、スキー板の曲げ変形を考慮した有効サイドカーブ(サイドカット、たわみ、エッジング角など)がスキー回転に及ぼす影響を検討した。

2)アルペンスキーロボットの開発股関節の内転と外転による連続自動回転モデルを開発した。その結果サーボモータなどを使わず、斜面に置かれたスキーモデル(スキーロボット)が連続自動回転できる機構を開発した。それらは四節回転連鎖の両てこ機構を利用した股関節の内転と外転モデルである。3)コンピュータ・シュミレーションの開発2本のスキーを装着した股関節回旋型アルペンスキーロボットに基づいてスキー操作の機構を解析し、トップリフト姿勢による連続ターンの力学的定式化とコンピュータ・シュミレーションを行い、転倒しないでターンする条件や、その際の内部応力などを求めた。
アルツハイマー病老人斑へのトロンビン沈着の機序とその病的意義の解明

前年度作製した抗トロンビン・レセプター(TR)抗体が、アルツハイマー病剖検脳組織標本において一部の老人斑を染色したため、本年度はさらに、同レセプター蛋白の細胞内部分や細胞外部分の、異なるいくつかの部位に相当する合成ペプチドを用いて抗体を作製した。最初の抗TR抗体が、活性化に際してトロンビンで切断される部位をまたがって作製した物であるために、活性化に伴うTR蛋白の切断によって生じたペプチドの老人斑への沈着の可能性を考え、そのペプチドおよび切断部位のC末端(膜結合部分)側に相当する合成ペプチドも、抗原として使用した。しかし、このようにして本年度作製した計5種類の抗体は、いずれも老人斑を染色せず、前年度に作製した抗体による染色結果の特異性を確認することはできなかった。さらに、すべての抗体で、病理剖検脳組織標本では神経細胞やグリア細胞は染色されず、脳におけるTR発現は、現状の剖検標本による免疫組織化学的検出の感度よりは低いものと考えられた。なお、本研究で作製した抗TR抗体の一部は神経系培養細胞のTR活性化を阻害し、また培養細胞を陽性に染色した(Southern Illinois大学Brewer博士との共同研究)。これらの実験結果は、現在、共著論文として投稿中である。この研究では、神経由来の培養細胞のTR発現自体が、トロンビンによる刺激で亢進することが明らかになり、剖検脳組織標本において検出がうまくいかないこととの関連が推察された。本年度はまた、組織におけるもうひとつのトロンビンの受容体である、トロンボモジュリン(TM)の脳における発現の検討も行った。市販されている3種類の抗TMモノクローナル抗体は、いずれも血管内皮を陽性に染色した。なお、反応性アストロサイトの一部が1つの抗体で染色されたが、他の抗体では染色されず、アストロサイトがTMを発現しているかどうかは、今後さらに検討を加える必要がある。血液凝固系の活性化には従来より、内因系と外因系が知られている。このうち内因系は以前は、Hagemann因子に始まる接触活性化系により開始されるとされていたが、近年、トロンビン自体による活性化が中心であると考えられるようになった。内因系・外因系どちらのカスケードにおいても、トロンビンは前駆体であるプロトロンビンから、プロトロンビナーゼ複合体と呼ばれる細胞膜上に形成される酵素複合体により形成される。そこでプロトロンビナーゼ複合体の活性中心である活性化凝固第X因子(FXa)に対するウサギ抗血清を作製し、免疫組織化学染色を行った。その結果、免疫化学的にはFXaはミクログリアに検出された。しかし、この染色性は抗血清をFX、FXaのどちらで吸収しても消失し、現時点では活性化されたFXaによるか活性化前のFXによるものかは明らかではない。通常、プロトンビナーゼ複合体では活性化凝固第V因子(FVa)がFXaのレセプターとして機能している。市販の抗FV抗体でもミクログリアが弱く染色され、かつ外因系カスケードの初期コンポーネントである組織因子が老人斑に特に多く局在している(McCombら,1991)ことから、Alzheimer病脳に沈着しているトロンビンは外因系凝固経路活性化により、最終的にはミクログリア膜上で形成されている可能性が高い。ただし、ミクログリアが発現しているbeta2インテグリンのひとつ、Mac-1(補体レセプターCR3)はFXへの結合性を有し、しかもFVの非存在下でFXを活性化しうることが報告されている。したがって、ミクログリアによるFX活性化経路は複数であることも考えられる。

したがって、どの経路が主体であるかを決定するには、まずミクログリアの一次培養系を確立し、その膜分画におけるFX活性化を測定、モノクローナル抗体による阻害試験を行う必要がある。アルツハイマー型痴呆症におけるトロビン生成の経路を明らかにするため、前年度に引き続き、剖検脳組織標本を用いて、凝固系組織因子(TF)、凝固第VII、V、X因子の局在を検討した。その結果、アルツハイマー病変における、外因系経路を介した凝固系活性化が示唆された。しかし、最近、神経系の培養細胞がトロンビンに対するのと同様の反応を、不活性の前駆体であるプロトロンビンに対しても示し、その細胞膜上に凝固第X因子とは異なるプロトロンビナーゼ分子を持つことが報告された。現時点では、その、凝固第X因子とは異なるプロトロンビナーゼ分子の精製・同定はなされておらず、勿論、特異抗体も作製されていない。したがって、実際の脳組織における発現の有無や各種病態における変化など、今後、検討を加える必要がある。さらに、脳ミクログリアはその膜分子であるMaclを介して外因系とは別に凝固第X因子を活性化する能力を持っており、脳におけるトロンビン生成経路は複数である可能性が高い。また、本年度、作製した抗トロンビンレセプター抗体は老人斑アミロイドを染色した。この抗体はトロンビンレセプター分子のうち、トロンビンで切断される部位に対して作製されており、in vitroにおいてトロンビンの培養細胞に対する作用をブロックすることが確認された。しかし、合成ペプチドに対する抗体であるので、さらに、異なる部位に対する抗体を作製するなどして、他の蛋白との交差性の有無等を検討する予定である。現在、レセプターの細胞内部分や、活性化で切断・分離されるペプチド等に対する抗体を作製中である。アルツハイマー病におけるトロンビンの局在は補体蛋白の沈着と一致しているが、凝固系と補体系はC4結合蛋白S蛋白C蛋白を介して相互作用を生じる。C蛋白はトロンボモジュリンの存在下でトロンビンにより活性化されて機能する。本年度はトロンビンの作用の一つとして、C蛋白活性化についても検討したい。前年度作製した抗トロンビン・レセプター(TR)抗体が、アルツハイマー病剖検脳組織標本において一部の老人斑を染色したため、本年度はさらに、同レセプター蛋白の細胞内部分や細胞外部分の、異なるいくつかの部位に相当する合成ペプチドを用いて抗体を作製した。最初の抗TR抗体が、活性化に際してトロンビンで切断される部位をまたがって作製した物であるために、活性化に伴うTR蛋白の切断によって生じたペプチドの老人斑への沈着の可能性を考え、そのペプチドおよび切断部位のC末端(膜結合部分)側に相当する合成ペプチドも、抗原として使用した。しかし、このようにして本年度作製した計5種類の抗体は、いずれも老人斑を染色せず、前年度に作製した抗体による染色結果の特異性を確認することはできなかった。さらに、すべての抗体で、病理剖検脳組織標本では神経細胞やグリア細胞に染色されず、脳におけるTR発現は、現状の剖検標本による免疫組織化学的検出の感度よりは低いものと考えられた。なお、本研究で作製した抗TR抗体の一部は神経系培養細胞のTR活性化を阻害し、また培養細胞を陽性に染色した(Southern Illinois大学Brewer博士との共同研究)。
プロテオミクス解析技術による冠水下のダイズの生物フォトン放射機能の解明

プロテオミクス解析技術による冠水下のダイズの生物フォトン放射機構の解明を目指し、ダイズにおける冠水ストレスの生物フォトン放射に対する影響を、細胞内小器官の精製およびゲルフリープロテオミクス解析技術を用いて明らかにした。精製効率の高いミトコンドリア精製技術を確立し、ゲルフリープロテオミクス解析技術を用いて、冠水下で変動するタンパク質群を解析し、生物フォトン放出に関与する鍵酵素を同定した。(1)冠水ストレス下のダイズ根において、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼ類、脂質過酸化反応、過酸化水素、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、スーパー・オキシド・ラジカル、ヒドロキシル・ラジカルなどの活性酸素種の効果を同定した。冠水ストレス下で、上記の活性酸素種を使用して放出される生物フォトンを同定した。(2)冠水ストレス下のダイズの根からミトコンドリア画分を精製する方法を確立した。免疫ブロット法と指標酵素分析評価法を使用することで精製ミトコンドリア画分の精製効率が高いことを証明した。ゲルフリープロテオミクスの技術を利用して、冠水下のダイズ根において変動するミトコンドリアのタンパク質群を解析した。(3)生物フォトン放出の酵素分析評価法を使用することで、冠水ストレス下のダイズにおいて、生物フォトン放出に関与する候補タンパク質(フマラーゼとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ)を同定した。(4)冠水ストレス下でジャスモン酸を添加することにより、生物フォトン量が変動することを明らかにし、プロテオミクス解析により、関与している酵素群を示唆した。27年度が最終年度であるため、記入しない。ダイズの湿害を生育初期に回避することは、水田転換畑でのダイズの栽培を可能にし、生産性の安定・向上に不可欠である。一方、生物フォトンは非破壊で継続的に観察できることから、分光分析によりタンパク質の発現状況がリアルタイムで観察可能であり、ダイズ湿害の植物体での早期検出に、生物フォトン放射を測定することにより、湿害を回避できる可能性がある。プロテオミクス解析技術を用いて冠水下のダイズの生物フォトン放射機構を解明することを目指した。本年度は、出芽期のダイズにおける冠水ストレスの影響を、形態学的・植物生理学的、光工学的(生物フォトン発生量測定)、酵素化学的に解析した。播種後2日目のダイズに対して2日間および4日間冠水処理し経時的に根を採取し、さらに水除去後の回復過程において地上部と根を採取し試料とした。1.形態学的・植物生理学的解析:冠水ストレスからの回復過程で、ダイズの各器官(根・胚軸・子葉)における重量を測定することにより損失の程度を解析した。結果、特に根において根端部分の欠失を観察したが、水除去により側根形成により回復した。2.光工学的解析:非破壊系および組織抽出物について、生物フォトンの発生量を測定し、形態学的・植物生理学的解析結果と比較した。結果、他の器官と比較して根において冠水処理により、顕著に生物フォトンが照射された。この傾向は非破壊系および組織抽出物について同じであった。3.酵素化学的解析:活性酸素発生に関与する酵素等(H202, CAT, SOD, POD, APX, GR, LOX, NADPH等)を測定し、量的変化と生物フォトンの発生量を比較した。結果、全ての酵素が冠水下で変動するが、特に、冠水下でアスコルビン酸ペルオキシダーゼを活性化した時に、生物フォトン放射が向上することが明らかになった。以上、ダイズ冠水ストレス下での生物フォトン放射にアスコルビン酸ペルオキシダーゼを介する機構の関与を示唆した。プロテオミクス解析技術による冠水下のダイズの生物フォトン放射機構の解明を目指す。25年度は、出芽期のダイズにおける冠水ストレスの影響を、植物生理学的、光工学的、酵素化学的に明らかにした。26年度は、冠水ストレスを部位特異的な細胞内への影響を、細胞内小器官の精製およびゲルフリープロテオミクス解析技術を用いて明らかにする。上記項目は、播種後2日目のダイズに対して2日間および4日間冠水処理し、さらに水除去後の回復過程で解析した。1.播種後2日目のダイズに対して、冠水処理後および水除去後の回復過程において、経時的に根および子葉を採取し総タンパク質を抽出し、質量分析計を用いて非標識系のゲルフリープロテオミクス解析した。変動するタンパク質群に対して、その細胞内小器官特異性を情報科学的解析により推定し、湿害による損失の顕著な部位を特定した。2.特に、ミトコンドリアを中心に精製し、タンパク質を抽出後、質量分析計を用いて非標識系のゲルフリープロテオミクス解析した。冠水下および水除去後の回復過程で、ミトコンドリアタンパク質群の言動を明らかにすることにより、前年度の結果(生物フォトンおよび活性酸素消去系酵素の変動傾向)と比較して、生物フォトン発生とミトコンドリア機能の関連を考察した。以上の解析により、冠水ストレスが及ぼすダイズ器官および時期、さらに細胞内小器官機能と生物フォトンとの関連を明らかにした。

精製効率の高いミトコンドリア精製技術を確立し、ゲルフリープロテオミクス解析技術を用いて、冠水下で変動するタンパク質群を解析し、生物フォトン放出に関与する鍵酵素を同定した。(1)冠水ストレス下のダイズ根において、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ペルオキシダーゼ類、脂質過酸化反応、過酸化水素、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、スーパー・オキシド・ラジカル、ヒドロキシル・ラジカルなどの活性酸素種の効果を同定した。冠水ストレス下で、上記の活性酸素種を使用して放出される生物フォトンを同定した。(2)冠水ストレス下のダイズの根からミトコンドリア画分を精製する方法を確立した。免疫ブロット法と指標酵素分析評価法を使用することで精製ミトコンドリア画分の精製効率が高いことを証明した。ゲルフリープロテオミクスの技術を利用して、冠水下のダイズ根において変動するミトコンドリアのタンパク質群を解析した。(3)生物フォトン放出の酵素分析評価法を使用することで、冠水ストレス下のダイズにおいて、生物フォトン放出に関与する候補タンパク質(フマラーゼとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ)を同定した。(4)冠水ストレス下でジャスモン酸を添加することにより、生物フォトン量が変動することを明らかにし、プロテオミクス解析により、関与している酵素群を示唆した。冠水ストレスが及ぼすダイズ器官および時期、さらに細胞内小器官機能と生物フォトンとの関連を明らかにした。本成果を国際学会および国内学会で報告すると同時に論文として執筆し掲載された。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通りに進捗しているので、今後予定通りに推進する。つまりダイズの冠水ストレス下での、生物フォトン放射解明に向けて、阻害剤等の利用を行う。当初の計画通りに、出芽期のダイズにおける冠水ストレスの影響を、形態学的・植物生理学的、光工学的・酵素科学的に解析し、その間での相関性を明らかにし、本成果を平成26年度に学会発表する計画である。当初計画通りに進捗しているので、今後予定通り推進する。つまり、ダイズの冠水ストレス下での、生物フォトン照射の機構解明に向けて、細胞内小器官プロテオミクス、特にミトコンドリアタンパク質群を解析することにより、冠水により損失するタンパク質と生物フォトン放射の関係を明らかにする。
マウスの生殖細胞の発生と性分化機構に関する研究

様々な妊娠時期のマウス胎仔から取り出した始原生殖細胞を用いて、体外培養下で減数分裂へ自律的に移行する性質をどの時期の始原生殖細胞が獲得しているかについて解析したところ、生殖巣へ到着前の移動期においても減数分裂へ移行する性質を既に保有することを明らかにした。また雄胎仔から取り出した雄性始原生殖細胞についても生殖巣へ到着直後の時期までは培養下において減数分裂へ移行する性質を示すが、12日齢以降に分離した場合は前精原細胞としての性質を示した。さらに研究を進める中で、対外培養下の生殖細胞が減数分裂へ移行して卵母細胞に分化するプロセスをLIFの添加またはそれのレセプターとして働くgp130の活性化が強く阻害することを発見した。そこで、gp130遺伝子を破壊したノックアウトマウスを用いて検討したが、これまでのところでは明確な影響は見い出せなかった。引き続き、始原生殖細胞が雌雄生殖細胞へと性分化を行う段階を制御する因子を解明するために、胎仔精巣の体細胞によってつくられることが想定されている雄化因子(減数分裂抑制因子)についての解析を行い、まずは雄体細胞の培養上清や共培養が生殖細胞の減数分裂への移行に与える効果を調べたが、これまでのところは明確な結果は得られなかった。また、胎仔生殖細胞では大規模な細胞死が起きるが、アポトーシス抑制機能を持つbcl-x遺伝子欠損ヘテロマウスにおいて、雄性特異的に生殖細胞の大規模なアポトーシスが起きていることを発見し解析を行った。さらに、ショウジョウバエにおいて生殖細胞の発生に重要な役割を果たしているtudor遺伝子に関連する遺伝子を哺乳類で始めて同定して解析を行った。様々な妊娠時期のマウス胎仔から取り出した始原生殖細胞を用いて、体外培養下で減数分裂へ自律的に移行する性質をどの時期の始原生殖細胞が獲得しているかについて解析を行なったところ、生殖巣へ到着前の移動期においても培養数日後に減数分裂へ移行する性質を既に保有することを明らかにした。一方、マウス胎仔生殖巣原基が性分化を開始する時期に精巣特異的発現を示す遺伝子を、差次的クローニング法を用いて単離同定し、それらについて発現パターンなどを解析した。まずbHLH型転写因子Nephgonadinについて生殖巣分化に伴う発現を詳細に解析したところ、生殖巣の発生に重要な役割を果たしているAd4BP/SF-1と密接に関連した発現パターンを示した。また培養細胞での共発現系においてはNephgonadinがAd4BP/SF-1を発現抑制する活性をもつことが見いだされた。さらに、蛋白質分解酵素阻害因子と相同性をもつ新規遺伝子crespの発現を解析したところ、精巣分化開始時である1112日齢以降は精巣でのみ発現しており、生殖細胞マーカーとの二重染色の結果は、精巣の体細胞と生殖細胞の両者で発現していることが明かになった。性分化開始以前の胎仔では雌雄両方で発現が見られたが、どの組織細胞で発現しているかの同定はできなかった。これまで様々な妊娠時期のマウス胎仔から取り出した始原生殖細胞を用いて、体外培養下で減数分裂へ自律的に移行する性質をどの時期の始原生殖細胞が獲得しているかについて解析したが、生殖巣へ到着前の移動期においても減数分裂へ移行する性質を既に保有することを明らかにした。

さらに研究を進める中で、体外培養下の生殖細胞が減数分裂へ移行して卵母細胞に分化するプロセスをLIFの添加またはそれのレセプターとして働くgp130の活性化が強く阻害することを発見したが、この効果は平面培養下だけでなく、生体内と似た状態である細胞凝集塊や生殖巣の器官培養の状態でも効果を示すことから、生体内でも働きうることが分かった。そこで、実際に生体内で機能しているかを調べるために、gp130遺伝子を破壊したノックアウトマウスを用いて検討した。すなわち、この細胞内シグナル系がなくなったマウスの胎仔生殖巣において、生殖細胞の減数分裂への移行が促進されているかを調べたが、これまでのところでは明確な影響は見い出せなかった。また始原生殖細胞が雌雄生殖細胞へと性分化を行う段階を制御する因子を解明するために、胎仔精巣の体細胞によって作られることが想定されている雄化因子(減数分裂抑制因子)についての解析を行い、まずは雄体細胞の培養上清や共培養が生殖細胞の減数分裂への移行に与える効果を調べたが、これまでのところは明確な結果は得られていない。卵母細胞への移行を阻害する精巣因子が液性因子であったとしても濃度が十分でないか、細胞外基質に取り込まれたの因子であるか、あるいは細胞間の直接的接触が必要かどうかなどの可能性が考えられる。今後はこれらの点を検討する必要がある。マウス生殖細胞の胎仔期における発生分化について研究を行った。哺乳類において生殖細胞の基になる始原生殖細胞は、多能性幹細胞から体細胞系列が分岐すると同時に出現し、細胞増殖を行いながら生殖巣へ移動するが、この時期までは多能性幹細胞と共通の性質を多く持ち、多能性幹細胞であるEG細胞への変換を起こすことが可能である。しかしながら生殖巣到着後は、最終的な生殖細胞への決定が起き、減数分裂への移行と卵母細胞の分化、またはG0/G1期への移行と精原細胞の分化が進行する。我々はこれまでに、始原生殖細胞の増殖制御とEG細胞の出現、および減数分裂への移行制御に関する研究を行ってきた。これを基盤にして、生殖細胞への最終決定が起きたのち雌雄生殖細胞の分化が進行する時期に焦点を当て、細胞と遺伝子解析の2方向からのアプローチを進め、哺乳類生殖細胞の分化制御機構の解明を目指した。まず、始原生殖細胞の滅数分裂への移行と卵母細胞への分化を培養下で進行させる実験系を確立し、LIFおよびgp130シグナル系が減数分裂移行を強く抑制することを発見した。また、胎仔生殖細胞では大規模な細胞死が起きるが、アポトーシス抑制機能をもつbcl-x遺伝子欠損ヘテロマウスにおいて、雄性特異的に生殖細胞の大規模なアポトーシスが起きていることを発見し解析を進めた。さらに、ショウジョウバエにおいて生殖細胞の発生に重要な役割を果たしているtudor遺伝子に関連する遺伝子を哺乳類で始めて同定して解析を行った。
音声の情動判断に及ぼす視覚情報の影響と文化間の比較

話者の情動を認知する場合、表情だけではなく音声情報や視覚と聴覚の相互作用も重要な役割を果たしていると考えられる。この点を調べるために、音声のみ条件、視覚のみ条件、視聴覚条件の3つの提示条件のもとで、日本人評定者が日本人話者とアメリカ人話者の情動をどのように認知するか(話者条件)、表情が音声の情動と一致する場合と矛盾する場合に音声の情動判断はどのような影響を受けるか(視覚情報の影響)について、実験を行った。実験結果から、特に情動が幸福、驚き、恐れの場合は聴覚に比べて視覚の情動の選択率が非常に高いことが認められた。これに対して、情動が怒り、嫌悪、悲しみの場合には、音声の情動の選択率は上がり、視覚の情動の選択率も他の情動に比べると低い傾向にある。この傾向は話者条件の間で比較するとアメリカ人話者よりも日本人話者の方に強く認められた。怒り、嫌悪、悲しみのいずれも日本においてはコミュニケーション行動の際に偽ったり隠そうとしたりすることの多い情動と考えられ、音声の情動が選択されやすくなるのではないかと考えられる。このように、情動認知に及ぼす視覚情報の影響についても聞き手の属する文化の影響少なからず関与することが示唆された。
糖尿病に伴う培養自律神経組織の突起再性能と神経ペプチド発現の変化

[目的]コラーゲンゲル培養法を用いて、迷走ならびに脊髄神経線維束切断端からの神経突起再生に及ぼす糖尿病の影響について検討した。[方法]ストレプトゾトシン投与10週後の糖尿病マウス(DM)とその対照マウス(Control)より、神経線維束を伴った迷走神経下神経節(Nodose ganglia(NG))及び脊髄後根神経節(Dorsal root ganglia(DRG))を摘出した。これらの神経節をコラーゲンゲル内に包埋後、通常(10mM)あるいは高グルコース(30mM)濃度下で培養し、3日後と7日後の軸索切断端からの再生突起数を計測・比較検討した。[結果及び考察]通常グルコース濃度下では、NG、DRGともDMの方がControlに比し再生突起数が有意に多かった。また高グルコース負荷により、ControlのNG、DRGでは再生突起数が有意に低下したが、DMのNG.DRGでは有意な低下はみられなかった。以上より、迷走ならびに脊髄神経求心性線維のin vitroでの再生は、in vivoでの高血糖暴露により亢進するが、in vitroでの高グルコース負荷によっては抑制されることが示された。また、糖尿病マウス由来の神経組織はin vitroでの高グルコース環境に順応して、生存能や突起再生能を維持している可能性が示唆された。高血糖暴露による神経再生能亢進、高グルコース負荷による神経再生能低下、ならびに糖尿病マウス神経組織の高グルコース環境への順応の機序を明らかにするため、分子生物学的及び免疫組織学的手法を用いて、更に詳しく解析をすすめている。以上の成果の一部は、第9回日本病態生理学会(岡山)にて発表し、またNeuro Report誌に印刷中である。[2]ストレプトゾトシン投与3週間後の糖尿病マウス(血糖値>300mg/dl)ならびにその対照マウスより、網膜,DRG,SCG,NGを摘出し、組織片もしくは神経節のままコラーゲンゲル中で組織培養した。位相差顕微鏡下に組織を経時的に観察し、軸索切断端からの再生突起の数、長さを計測し、糖尿病の神経再生能に及ぼす影響を検討中である。
ペプチド栄養の根幹－－生体吸収スペクトル－－の完全解明

プロトン共役型オリゴペプチド輸送体(POT)は8,400種類のジ・トリペプチドを輸送する“基質多選択性"を有し、生体内への窒素栄養源の高効率な吸収に重要な役割を担っている。本研究では、ヒトhPEPT2をはじめとする5種類の真核生物POTについて、ジペプチドの網羅的親和性解析によって基質多選択性の全貌を解明した。hPEPT2はヒト必須・準必須アミノ酸である芳香族・分岐鎖アミノ酸含有ペプチドを高効率に取り込むことが明らかとなった。ペプチド栄養の根幹は、どの部位で、どの種類のペプチドが、どの程度吸収されるか?という生体吸収スペクトルである。その分子基盤は8,400種類のジ・トリペプチドの吸収を担うペプチド輸送体の“基質多選択性"であるが、詳細は明らかではない。本研究では申請者らが開発した新規ペプチド輸送体解析システムを活用することで(*Ito et al. Nat. Commun. 2013)、ヒトペプチド輸送体の“基質多選択性"とその基質認識メカニズムを明らかとし、栄養ペプチドの生体吸収スペクトルを分子レベルで解明することを目的としている。平成26年度の研究では、出芽酵母を宿主としてhPEPT2のハイスループット解析システムを構築し、さらにジペプチドライブラリーの網羅的解析を通じ、基質多選択性を解明した。さらに、抗2型糖尿病効果が期待できる機能性ペプチドの生体吸収性についても解析した。これまでの研究では、ペプチド栄養の根幹となるPOTファミリーのペプチド輸送体について、8,400種類の基質を認識する基質多選択性を明らかとし、ヒトペプチド輸送体はヒトが生合成できない必須アミノ酸を含有するペプチドを高親和性で認識することを明らかとした。本年度の研究では、本特性の、ヒトだけでなく他の生物種のペプチド輸送体における共通性を検証するため、5種の生物種のペプチド輸送体についてジペプチドライブラリーの解析により基質多選択性を明らかとした。解析データを基にin silicoでの基質親和性予測モデルを構築した結果、真核生物のペプチド輸送体は共通して、ヒトでの必須アミノ酸(芳香族・分岐鎖アミノ酸)の物理化学的性質を指標として基質ペプチドを認識していることが示唆された。一方、原核生物ではそのような特性は保存されていなかった。本成果はペプチド栄養の根幹としての重要な知見であるのみならず、進化過程におけるヒト必須アミノ酸の起源に迫る手がかりともなり得る。本研究課題の最終的な目標は、ペプチド栄養の根幹として重要なペプチド輸送体の基質多選択性を明らかとすることである。これまでの研究により、既にヒトペプチド輸送体PEPT2の基質多選択性の解明に成功しており、目標達成は視野に入っている。そのため現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」とした。ヒトが摂取した食品たんぱく質は、消化管プロテアーゼによる加水分解の後、ペプチドもしくはアミノ酸形態として小腸上皮細胞より吸収される。特にペプチド形態での吸収はアミノ酸形態よりも高効率であり、窒素源の吸収実体として中心的な役割を果たしている。本研究では我々が開発した新規ペプチド輸送体解析システムを活用することで、ペプチド輸送体の“基質多選択性"とその基質認識メカニズムを明らかとし、栄養ペプチドの生体吸収スペクトルを分子レベルで解明することを目的とした。本年度の研究では、腸管ペプチド輸送体であるcePEPT1のハイスループット解析システムを構築し、ジペプチドライブラリーの網羅的解析により、基質多選択性の全体像を初めて明らかとした。cePEPT1への高親和性ジペプチドには芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸が多く含まれ、低親和性ジペプチドには酸性アミノ酸が多く含まれていたが、この基質多選択性は腎臓に発現するペプチド輸送体であるhPEPT2とも類似していた。さらに植物、微生物等に由来する6種類のペプチド輸送体についても世界に先駆けて同様の網羅的解析を行い、得られたデータを比較した結果、「ヒト必須アミノ酸含有ペプチドを高効率に輸送する」基質多選択性が、真核生物のペプチド輸送体間で保存されていることが示唆された。現在、進化過程におけるヒト必須アミノ酸の起源とペプチド輸送体との関連について解析を進めている。ペプチド輸送体の“基質多選択性"の全貌を解明するためには、可能な限り多くの基質について、ペプチド輸送体を介した吸収性を調べる必要がある。すなわち、本研究成功のカギとなるのはハイスループットな解析システムと、膨大な基質数を網羅するライブラリーである。予算上の問題から、基質ライブラリー整備に不可欠なペプチド合成装置の導入が予定より大幅に遅れたため、基質ライブラリーの整備は未だ達成されていない。一方、ハイスループットなhPEPT2解析システムの構築に成功し、既にジペプチド337種類の網羅的解析を達成した。解析系が構築されたことで後の研究の進展がほぼ確実となったことから、現在までの達成度は「(2)おおむね順調に進展している」とした。