hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の物質循環に関する基礎研究

環境を回復するためには、物理・化学的手法には限界があり、もはや植物に頼らざるを得ないことは明白となってきている。そこで、本研究では植物個体が環境元素をどのように取り込みまたリサイクルを行っているかを調べ、環境回復を図るための手法開発の基礎データとすることを目的に実験を進めた。ダイズを水耕法で生育させ、種子形成後までの6ステージの植物体を510本採取した。この各生育段階の植物体を、根、茎、葉などのすべての組織に切り分け、各々、放射化分析法による元素の定量を行った。照射は日本原子力研究所研究用原子炉、JRR・3Mを用いた。照射した総熱中性子束は、1.5x10^<14>n・cm^2であった。照射後、γ線スペクトロメトリにより、Na、KおよびMg、Ca等の必須元素ならびにAlの定量を行った。その結果、各生育段階でこれらの元素がどのように吸収され、かつ植物体内に分布するかが示された。Naは全ての生育段階で根のみに蓄積されたが、他の元素は地上部へ以降され、特にKは葉よりも葉柄中の濃度が常に34倍高く維持されていた。そこで、植物の元素リサイクルシステムのモデルを構築し、得られたデータを用いて植物が吸収した元素がどのようにリサイクルされ次世代以降に使用されていくかをシミュレートした。その結果、リサイクル活動の最も律速となる元素はKであることが示された。また、水耕液中に環境ストレスとしてVを100μM添加して同様の実験を行い、植物体内における元素濃度の変化、ならびに元素がどのようにリサイクルされるかのシミュレーションを行った。Vが添加されたことにより、K、Mg、Caなどの吸収量は50%以下となり、特に生育後期における減少が顕著であった。また、我々が提示した本モデルおよびシミュレーション法は環境評価システムとして有用なことも示された。
非常に高い抗腫瘍性を持つエポチロンとその立体異性体の高効率エナンチオ選択合成

エポチロンの不斉全合成をキラルオキサザボロリジノン助触媒不斉アルドール反応を基盤とした戦略で達成させる課題に対して、研究が行われた。はじめに特に不斉炭素が集約されて存在するカルボキシル基末端からのC1-C9フラグメントの不斉合成を検討した。われわれの手法で最初の立体中心は高度に制御されて98%eeの不斉収率で導入された。しかしながらかさ高い4級の炭素をもつアルデヒドに関するわれわれの不斉アルドール反応はどのような条件を検討しても、期待する立体化学の構築に成功しなかった(Tetrahedron Lett.1999)。しかしながら、この研究からキラルオキサザボロリジノン助触媒不斉アルドール反応の適応限界を確定することができた。C6-C7の立体選択的な結合生成は、SchinzerらによるLDAを用いて達成することに変更し、そのために必要なキラルケトンの不斉合成に成功した。また、複素環側からの不斉合成を検討し、はじめて不斉アルドール反応で期待する立体中心の導入に成功している。現在、継続して鎖の延長を検討している。一方、3置換エポキシドの不斉アルドール戦略での合成も確立した(Tetrahedron Lett.1999)。期間内には、全合成に至らなかったが、近い将来それを完成の予定である。われわれの研究室ですでに開発したChiral Oxazaborolidinone-Promoted Asymmetric Aldol Reactionを有効に適用してAcydic Stereoselection under Promoter Controlのもとで,不斉反応を繰り返して必要な立体関係を構築する手法がいくつかの天然物の鎖式構造合成に効果的であることがわかってきた.エポチロンのCl-C9セグメントの不斉合成もその線にそって進行している.C4のジメチル基導入の不斉アルドール反応は>98%eeの不斉収率で進行した.しかしながら,つづく3級炭素をα位にもつアルデヒドの場合に非常な困難に直面した.詳細なモデル実験を繰り返して,その特殊な系での反応立体化学が明らかにされた(TetrahedronLett.1998,39.8287).このセグメントがわれわれの不斉アルドール反応にとってさらに困難である点は,プロピオネート単位を不斉導入しなければならない点である.キラルルイス酸を用いた不斉アルドール反応でそのシンおよびアンチ体のエナンチオ選択的作り分けはだれも成功していない非常に挑戦的な課題である.わたしはこの課題にたいして平成10年度の研究でひとつの解決を達成した.これらの研究結果は未発表である.すなはち,α位に除去し得る量換基を持つプロピオネートシリル求核剤を開発して,われわれの不斉アルドール反応に用い高エナンチオ選択的にα置換アルドールを合成した(>97%ee).つづいて,スズヒドリドによってラジカル還元することで,その条件をコントロールしてシンおよびアンチの作り分けに成功した.現在この新しい手法でセグメントの続く不斉点の導入を検討している.エポチロンの不斉全合成をキラルオキサザボロリジノン助触媒不斉アルドール反応を基盤とした戦略で達成させる課題に対して、平成10年度は、主に不斉炭素が集約された部分であるパートCのエナンチオ選択的鎖式立体制御のもとでの合成を行ないカルボキシル末端C1からC8までの不斉合成を検討した。この過程で、我々の不斉アルドール反応ではC6の立体制御が困難であることが判明した。平成11年度は、この問題の解決から着手し、Schinzerの方法を参考にLDAを用いる通常のアルドール反応でジアステレオ選択的にC6およびC7の構築を行った。基本的にパートCの不斉反応が完了した。続いて、11年度の計画に従って、パートAおよびパートBの不斉合成の研究を行った。パートAでは、複素環式部位を持つアルデヒドに対して、我々のアルドール反応が有効に働きC15の立体化学がほぼ完全に制御できることが判明した。さらに、パートBでは新しい方法として、エポキシドの立体化学を不斉アルドール反応を経て制御する試みに挑戦した。その結果、特にエポチロンBにとって重要なシス三置換エポキシドの不斉合成に成功した。
幾何的、組合せ的制約を有する三角形分割、静定グラフの生成手法の開発 建築への応用

研究計画で掲げた列挙アルゴリズム設計に取り組み,一定の成果を得た.昨年度我々が提案した辺制約付き辞書付き順序最大三角形分割という概念を用いることで,列挙対象となるグラフクラスの性質に依存しない一般的な枠組みの構築に成功した.また組合せ剛性理論に関する研究でも大きな成果を得ることが出来た.特に重要な成果としてTayとWhiteleyによる剛板ヒンジ構造の組合せ論的剛性特徴付けの予想の解決が挙げられる.剛板ヒンジ構造物剛性の性質は共有結合で構成される分子構造の剛性と等価である事がCrapo and Whiteleyによって証明されており,剛板ヒンジ構造の剛性特徴付けを行うことによって,分子構造の剛性特徴付けが得られる.そのためTay-Whiteleyの予想は"Molecular Conjecture"と呼ばれており,応用の観点からも非常に重要であるにもかかわらず,25年余り未解決であった.我々はこの未解決問題を肯定的に解決した.またグラフの木分割定理の一般化として,一様点要求を満たす根付き森分割が可能であるための必要十分条件を導出する事に成功した.今後この根付き森分割定理が構造物の剛性特徴付けに利用される予定である.研究計画で掲げた三角形分割,静定グラフの生成問題の幾つかの内,主に無交差静定グラフの列挙問題に取り組み,一定の成果を得た.理論的には,無交差静定グラフのみに限らず無交差な幾何グラフを高速列挙行う為の一般的な枠組みの開発に成功し,応用面においては新たに開発したアルゴリズム実装を用い特殊な構造物の発見に寄与することが出来た.トラス構造物の棒部材を辺、ジョイント部材を頂点と捉えることで、数理的にモデル化を行い、静定トラスの設計問題は静定グラフの生成問題としてモデル化することができる.グラフの辺制約付き無交差静定グラフ(必要枝集合Sが与えられた際、Sを必ず部分集合として含むような静定グラフ)列挙問題を考え,その問題に対する高速なアルゴリズムの設計を行った.このアルゴリズムの実装を行い,コンプライアントメカニズムと呼ばれる特殊な構造物設計問題への応用を行った.辺制約付き列挙により出力される無交差静定グラフの個数を適切に減少させ,これまで得る事ができなかった大規模なコンプライアントメカニズムの発見に寄与することが出来た.さらに得られた知見を発展させ,高速な無交差幾何グラフ列挙の為の一般的枠組みの提案を行った.平面上の固定された点集合を頂点,それらを繋ぐ直線分を辺とするグラフを幾何グラフと呼ぶ.特に,各辺が無交差である幾何グラフを無交差幾何グラフと呼び,三角形分割や無交差静定グラフも無交差幾何グラフクラスの内の一つである.辺制約付き辞書式順序最大三角形分割の性質を用いる事で,様々な無交差幾何グラフクラスの高速列挙が可能である事を明らかにした。研究計画で掲げた三角形分割,静定グラフの生成問題の内,無交差静定グラフの列挙問題に取り組み,一定の成果を得た.また辺制約付き辞書付き順序最大三角形分割という概念を拡張させ,無交差静定グラフのみに限らず任意の無交差幾何グラフクラスに属するグラフを高速に列挙を行う手法を確立した.既存の無交差幾何グラフの列挙アルゴリズムは各グラフクラスの性質に大きく依存していたため,他の問題に同じ手法を適用することができなかった.しかし我々は辺制約付き三角形分割の組合せ的性質を巧く利用することで,列挙対象となるグラフクラスの性質に依存しない一般的なアルゴリズム設計の枠組みの確立に成功した.この成果を計算幾何学で一流の会議であるACM Symposium on Computational Geometryにおいて発表を行った.2次元空間内のトラス構造に対しては,その剛性と等価なグラフ理論的特徴付けがMaxwell-Lamanによってなされている.このグラフ理論的特徴付けを満たすグラフが静定グラフである.しかし,Maxwell-Lamanの定理は,2次元空間に限定されており,さらに外部拘束(構造物と外部環境間の接続数)が3つの場合のみに限定されている.我々はMaxwell-Lamanの定理を外部拘束数が任意の個数である場合に拡張し,より実践的な場合を含む形へ定理を一般化することに成功した.この成果と上述の列挙アルゴリズムの枠組みを組み合わせることで,外部拘束数が任意である場合においても高速に静定トラス構造や自由度を有するリンク機構のトポロジー生成が可能である事がわかった.また3次元静定グラフ生成への発展のため,トラス構造のみならず3次元剛板ヒンジ構造など剛性の組合せ的解析にも取り組み,一定の成果を得た.研究計画で掲げた列挙アルゴリズム設計に取り組み,一定の成果を得た.昨年度我々が提案した辺制約付き辞書付き順序最大三角形分割という概念を用いることで,列挙対象となるグラフクラスの性質に依存しない一般的な枠組みの構築に成功した.また組合せ剛性理論に関する研究でも大きな成果を得ることが出来た.特に重要な成果としてTayとWhiteleyによる剛板ヒンジ構造の組合せ論的剛性特徴付けの予想の解決が挙げられる.剛板ヒンジ構造物剛性の性質は共有結合で構成される分子構造の剛性と等価である事がCrapo and Whiteleyによって証明されており,剛板ヒンジ構造の剛性特徴付けを行うことによって,分子構造の剛性特徴付けが得られる.そのためTay-Whiteleyの予想は"Molecular Conjecture"と呼ばれており,応用の観点からも非常に重要であるにもかかわらず,25年余り未解決であった.我々はこの未解決問題を肯定的に解決した.またグラフの木分割定理の一般化として,一様点要求を満たす根付き森分割が可能であるための必要十分条件を導出する事に成功した.今後この根付き森分割定理が構造物の剛性特徴付けに利用される予定である.
後迷路性難聴モデル動物の神経障害パターンに関する検討―生理学的特質と異受傷性―

蝸牛神経は、その反応特性の特徴から、(1)高頻度自発放電(High-SR)神経と(2)中・低自発放電神経(Low・Med-SR)神経の2つの異なった生理学的特徴をもった神経群に分類されるが、High-SR神経とLow-, Med-SR神経の間での易受傷性が異なること、すなわち、High-SR神経に比してLow-, Med-SR神経の易受傷性が報告されている。Hidden Hearing Loss(隠れ難聴)は、このLow- Medium - SR群神経の選択的障害に起因する病態である。閾値の低いHigh-SR群が残存しているため、閾値は正常であるが、閾値は高いがダイナミックレンジが広く、音圧上昇に伴う蝸牛神経の興奮総和の増加やマスキング下での反応性に寄与するLow- Medium-SR群の神経脱落の為に、高レベル音に対するABR(聴性脳幹反能)波形の振幅低下やマスキング下の聴き取りなど閾値上の聴覚機能に障害が出現する。これまで、音響性聴覚障害、老人性難聴において、このHidden hearing lossのメカニズムの関与が報告されてきたが、本年度は、突発性難聴や急性音響性聴覚障害などの急性感音難聴回復症例を対象に、1)マスキング下の語音明瞭度、2)ABR(聴性脳幹反応検査)、3)ラウドネスの左右差を評価し、閾値が回復してもHidden hearing lossメカニズムに起因する閾値上の聴覚機能の不全が存在しえる所見を確認することができた。すなわち、従来報告されてきた、音響性聴性聴覚障害、加齢性難聴のみならず、それ以外のさまざまな難聴病理においても、本メカニズムが関与しえることを初めて示すことができた。内有毛細胞とシナプスを形成する蝸牛神経は、その神経の反応閾値、様式の特徴から、(a)閾値の低い高頻度自発放電(High-SR)神経と(b)比較的閾値の高い中・低自発放電(Low・Mid-SR)神経の2つの神経群に分類されるが、後者に比較して前者が有意に神経径が太いなど、形態学的にも異なる特徴的な性質を有することが知られている。これまで、High-SR神経とLow-, Med-SR神経の間での易受傷性の差異についての検討はないが、もし、神経の細いLow-,Med-SR神経の易受傷性があれば、「閾値に比較して、雑音下での聞き取りが不良」という、Auditory Neuropathyの臨床像の一因になることが推定される。(低レベルの雑音が提示されると、閾値の低いHigh-SR神経は雑音に反応するため、雑音下で提示される信号に反応しにくくなる(マスキング)。一方、Med-SR、Low-SR神経は、閾値が比較的高く、ダイナミックレンジも大きいので、High-SR神経がマスキングされた雑音下での聞き取りでは重要な役割を果たしているものと推察されている)。そこで、本年度は様々な内耳障害動物の蝸牛神経の障害パターンにHigh-SR神経とLow-, Med-SR神経の間での易受傷性に差があるか否かを神経径を指標に形態学的に検討を行ったが、骨ラセン板レベルにおいては、神経の脱落時の易受傷性に3者で明らかな違いは認めない結果であった。そこで、神経脱落をきたさない程度の軽度障害を対象に、内有毛細胞と蝸牛神経のシナプスレベルでの観察を開始し、易受傷性の差(中・低自発放電(Low・Mid-SR)神経の易受傷性)についての評価をすすめている。3年の全体計画で、1年目は形態学的検討、2年目から電気生理学的検討を行う予定になっており、概ね当初の計画通り進行している。蝸牛神経は、その反応特性の特徴から、(1)高頻度自発放電(High-SR)神経と(2)中・低自発放電神経(Low・Med-SR)神経の2つの異なった生理学的特徴をもった神経群に分類される。本研究では、1異なった神経群(High-SR vs Low・Med-SR)における、障害易受傷性の差異、2障害による聴覚特性(マスキングの影響)への影響検討と、易マスキング性の背景メカニズムの考察、を実施する。昨年度までの研究では、耳毒性による内耳障害においては異なった神経群(High-SR vs Low・Med-SR)での易受傷性の差異が示されなかったため、本年度は、Low・Med-SR群での易受傷性が示唆されている音響性聴覚障害動物を用いた易マスキング性の検討を行い、さらに、動物実験データから得られた知見をもとにした「Low・Med-SR群のみが障害されたときに生じるいわゆるHidden Hearing Loss検出に関する臨床検査法の開発に焦点をおき、研究をすすめた。その結果1)音響性聴覚障害によりLow・Med-SR群のみが障害された動物では、聴覚閾値の上昇をほとんど認めない場合においても、マスキング下の反応が著明低下すること(マスキングノイズによる聴性脳幹反応I波振幅低下所見の有意な増強)、2)ヒトの聴覚機能上は、マスキング下の語音明瞭の低下、閾値は不変でも音圧上昇にともなうラウドネスの低下が特徴的になる可能性があること、が明らかとなり、3)それらを検出するための正常データの確立も併せて実施した。蝸牛神経のLow・Med-SR群障害における易マスキング性が明らかとなり、さらには、実際の難聴症例における同病理検出の為の検査法開発にも着手できた。

蝸牛神経は、その反応特性の特徴から、(1)高頻度自発放電(High-SR)神経と(2)中・低自発放電神経(Low・Med-SR)神経の2つの異なった生理学的特徴をもった神経群に分類される。研究では、High-SR神経とLow-, Med-SR神経の間での易受傷性の差異、ならびにLow-, Med-SR神経の選択的障害の影響について、動物実験、並びに、ヒトを対象とした検討を行った。その結果、既報にあるように、Low-, Med-SR神経の選択的に障害される一過性音響障害動物では、聴力回復後、聴力閾値は正常に復するものの、マスキングノイズ下の反応が著明に低下することが示唆された。また、臨床での検討においても急性感音難聴回復後、聴力が正常に復した耳でも、Low-, Med-SR神経の選択的に障害されることに起因すると思われる、雑音下の聴き取り障害や、ラウドネス特性の変化が示唆される所見を得ることがあったが、一方で、症例間でのバラツキも大きい結果であった。ヒトでは、実際に神経の障害を評価することができないため、推論の域を出ないが、動物で観察されるような、Low-, Med-SR神経の選択的に障害が存在しえることが示唆される。このほか、動物でも観察されるABR振幅の低下についても検討を試みたが、現在までのところ、ABR波形の基線の変動の影響もあり、十分な評価ができていない。ABRを用いた、評価として、Low-, Med-SR神経とHigh-SR神経間の順応性の差を利用した検討も開始したが、現在までところ、十分な結論を得るに至っていない。症例によるデータのバラツキのため、結論が得られていない検討課題がある。蝸牛神経は、その反応特性の特徴から、(1)高頻度自発放電(High-SR)神経と(2)中・低自発放電神経(Low・Med-SR)神経の2つの異なった生理学的特徴をもった神経群に分類されるが、High-SR神経とLow-, Med-SR神経の間での易受傷性が異なること、すなわち、High-SR神経に比してLow-, Med-SR神経の易受傷性が報告されている。Hidden Hearing Loss(隠れ難聴)は、このLow- Medium - SR群神経の選択的障害に起因する病態である。閾値の低いHigh-SR群が残存しているため、閾値は正常であるが、閾値は高いがダイナミックレンジが広く、音圧上昇に伴う蝸牛神経の興奮総和の増加やマスキング下での反応性に寄与するLow- Medium-SR群の神経脱落の為に、高レベル音に対するABR(聴性脳幹反能)波形の振幅低下やマスキング下の聴き取りなど閾値上の聴覚機能に障害が出現する。これまで、音響性聴覚障害、老人性難聴において、このHidden hearing lossのメカニズムの関与が報告されてきたが、本年度は、突発性難聴や急性音響性聴覚障害などの急性感音難聴回復症例を対象に、1)マスキング下の語音明瞭度、2)ABR(聴性脳幹反応検査)、3)ラウドネスの左右差を評価し、閾値が回復してもHidden hearing lossメカニズムに起因する閾値上の聴覚機能の不全が存在しえる所見を確認することができた。すなわち、従来報告されてきた、音響性聴性聴覚障害、加齢性難聴のみならず、それ以外のさまざまな難聴病理においても、本メカニズムが関与しえることを初めて示すことができた。予定通り、平成27年度実施の形態学的検討の継続に加え、生理学的検討を始める予定である。具体的には1)雑音下の易マスキング性、2)蝸牛複合電位の入出力特性の変化を指標に、蝸牛神経の易受傷性の差と易マスキング性の関係について検討を進める。
自己免疫性肝炎におけるATPによる肝炎悪化のメカニズムの解明

ATP(アデノシン三リン酸)は全ての細胞内で生産され、エネルギー産生に欠かせない細胞内成分である。本研究により、肝臓の炎症で細胞外に放出されたATPが白血球のマクロファージやT細胞に結合することにより活性化を誘導して、正常組織を破壊する更なる炎症悪化の経路が示唆された。さらに、この炎症の経路は肝炎だけでなく、肺や腎臓やその他のマクロファージやT細胞が関わっている炎症全般に起こりえる経路であり、多くの炎症制御研究に応用できると期待される。本研究は、自己免疫性肝炎のモデルあるマウスのCon A誘導性肝炎において、T/NKT細胞に傷害された肝細胞から放出されたATPがMφの活性や肝炎悪化に関与する経路を検討している。1)肝細胞内成分投与によるCon A肝炎の症状悪化と白血球分画の検討肝細胞内成分投与群の肝炎は、ALT値および組織学的所見から有意な炎症悪化が認められた。また、PEC内の白血球分画は、肝臓内成分投与マウスでMφの増加が確認され、Con Aを投与すると顆粒球の増加が確認された。このことにより、Mφが肝臓内成分投により活性され炎症が悪化したと考えられた。2)in vitroでATPとCon A刺激によるMφのサイトカイン産生in vitroでATPが、Mφを活性化する事が報告されている。そこで、in vitroでATPとCon A刺激によるMφのサイトカイン産生能を測定した。その結果、IL-1βとTNFαが、Con A単独刺激よりATPを加えると有意に産生が増強された。このことから、ATPは炎症性サイトカインの産生を増加させ、肝炎の悪化を助長していると考えられた。3)ATP投与によるCon A肝炎の症状悪化今までの結果から、ATPを直接投与してCon A肝炎の悪化を検討した。その結果、ATPの予備刺激による肝炎の悪化は認められなかったが、Con A投与後にATP投与するとALT値の有意な増加を認め、さらに4割近いマウスが死亡した。これらのことから、ATPは肝炎の誘発を助長するより、肝炎の悪化に関与している可能性が示唆された。本検討より、肝炎により放出されたATPは活性化したMφを更に刺激して、TNFαの産生増加がおこり肝炎の悪化につながると示唆された。今後は更に、肝炎後の活性化したMφとATPの相互作用を検討する予定である。本研究は、自己免疫性肝炎のモデルあるマウスのCon A誘導性肝炎において、T/NKT細胞に傷害された肝細胞から放出されたATPがMφの活性や肝炎悪化に関与する経路を検討した。Con Aを投与後、8時間から24時間の間に、肝炎の指標である血清ALT値の著しい上昇が認められた。同時に、16時間をピークとする血清ATP値の上昇が確認された。このことから、Con A投与によるリンパ球性の肝炎により、傷害された肝細胞からALTが放出されたことが示唆された。2) in vitroでATPとCon A刺激によるMφのサイトカイン産生とそのシグナル経路in vitroでATPとCon A刺激によるMφのサイトカイン産生能を測定した。その結果、IL-1βとTNFαが、Con A単独刺激よりATPを加えると有意に産生が増強され、Mφ上のP2X_7受容体とATPの結合による反応であると示唆された。また、IL-1βの産生はERK1/2のシグナル経路が重要であることが示された。3) NKT細胞およびT細胞へのATPの影響in vitroでATPとCon A刺激によるNKT細胞およびT細胞のサイトカイン産生能を測定した。その結果、IL-4が、Con A単独刺激よりATPを加えると有意に産生が増強された。これは、組織傷害でのATPがNKT細胞やT細胞にも更なる活性をもたらしていることが示された。本検討より、肝炎により肝細胞から放出されたATPは活性化したMφ、NKT細胞およびT細胞を更に刺激して、サイトカインの産生増加を誘導することにより肝炎の悪化につながると示唆された。
三相アルコキシド法によるメンブレンリアクタ用高機能分離膜の開発

ゼオライトおよび酸化チタンなどの複合酸化物分離膜を付加したメンブレンリアクタの開発を目標に(1)三相アルコキシド法による製膜手法の確立と(2)分離膜上に触媒層を析出させたメンブレンリアクタの評価を行った。本研究の目標の一つは(1)と(2)の複合であるが、(1)の制御条件の検討に時間がかかってしまい、1年間では(2)との複合まで進まず、それぞれを評価するにとどまった。(1)三相アルコキシド法による製膜に関して、従来までの膜厚の制御だけでなく、膜状析出物の構成粒子の形状制御について検討を行った。この結果液相の温度を30°Cから60°Cで温度制御を行うことで、繊維状粒子の集合からなる膜状析出物から0.5ミクロン程度の粒子の集合からなる膜状析出物に制御できることがわかった。更に両形状の膜をガラス基板上に製膜し、ヨウ化カリウムの分解反応による光触媒特性を検査したところ、既往の研究で用いられているゾルゲル法により製膜された酸化チタン膜に対して光触媒として70%程度の分解能力を持つことがわかった。(2)現在申請者の研究室で開発中の水蒸気選択透過性の分離膜上にゼオライトを触媒担体層として析出させ、Ruを担持させ触媒として使用した場合の二酸化炭素のメタン化反応についてのメンブレンリアクタの評価を行った。特定の成分比で調製したゼオライト製膜用ゾル分離膜上に5回程度ディップコートし焼成した後、水熱処理をすることで分離膜上に非常に多孔性に富んだ触媒担持用のゼオライト層を持ったメンブレンリアクタの作製に成功した。このゼオライト膜作製過程において、わずかながら分離性能が低下し、透過係数が大きくなる傾向が見られたが、触媒活性に関しては従来本研究室で作製してきたゼオライト膜と同程度の活性がみられ、400°C、0.1MPaの条件における操作でほぼ理論平衡転化率でガス処理できることが確認された。
脂肪由来多能性細胞と炭酸アパタイト多孔体による骨と軟骨の複合的再生医療の開発

骨と軟骨の複合体の再生法として、1脂肪から単離した幹細胞様の多分化能を持つ脱分化脂肪細胞(DFAT)を細胞のソースとして使用する。2DFATをスフェロイド化し骨と軟骨の分化誘導培地を含有したバイオリアクター内で培養する。3これらのスフェロイドを別々の炭酸アパタイト多孔体へ播種し培養する。42つの多孔体を結合させて皮下に移植して異所性の骨・軟骨複合体の同時再生を図る。5再生した複合体を関節の欠損部位に移植する。上記の方法により、骨と軟骨との複合的な再生医療の開発を目指す。
犬および猫の乳癌幹細胞の同定とその機能解析

獣医診療で高頻度に遭遇する犬および猫の乳癌の発症機構の解明を目指し、乳癌幹細胞の同定および細胞生物学的特性を解析した。ヒト乳癌幹細胞は浮遊細胞塊、side population(SP)細胞あるいはCD44+CD24細胞集団に濃縮され、犬および猫の乳癌細胞株においてそれらの濃縮法を検討した結果、犬および猫においても乳癌幹細胞の存在が示唆された。また免疫不全マウスへの皮下移植によりそれらの腫瘍形成能が認められた。乳癌幹細胞研究が乳癌発症機構の解明に極めて有益な情報を提供するものと考えられる。ヒトやマウスの癌幹細胞は細胞表面マーカーや細胞学的性質を利用して同定されているが、犬や猫では癌幹細胞は同定されていない。本研究の目的は、犬や猫の乳腺腫瘍から乳癌幹細胞を同定し、それらの機能解析、すなわち乳癌幹細胞の幹細胞性維持および腫瘍形成能を解析することである。本年度得られた知見は以下のとおりである。1)臨床症例から採取された試料を用いて癌幹細胞に特有な増殖様式である浮遊細胞塊の形成を検証した。犬の乳癌試料から浮遊細胞塊の形成が認められ、犬の乳癌幹細胞の存在が示唆された。一方、対照群では観察されなかった。2)犬および猫の乳腺腫瘍細胞株の浮遊細胞塊形成能を検討し、いずれの動物種においても浮遊細胞塊が認められた。浮遊細胞塊のRT-PCRを実施し、幹細胞に高発現する遺伝子の発現解析を進めている。3)臨床症例から採取された試料、乳腺腫瘍細胞株、それらから形成される浮遊細胞塊を用いて抗CD55抗体、抗CD44抗体および抗CD24抗体によるフローサイトメトリー解析を行い、各細胞分画の分布を詳細に解析した。すべて試料においてCD55+細胞が数%認められ、その中にはCD44+CD24-細胞も多く見られた。4)上記で同定した各細胞分画をセルソーターにより分取し、免疫不全マウスに移植し、腫瘍形成能を解析している。各細胞集団における腫瘍形成能を比較検討する。またin vitro試験におけるそれらの細胞群の機能解析も進めている。ヒト乳癌では、自己複製能かつ高い腫瘍形成能を有する乳癌幹細胞が存在し、乳癌幹細胞とそれから生じる乳癌細胞の不均一な細胞集団から構成されている。また癌幹細胞は癌形成に加え、癌の進展、再発、転移においてもキープレーヤーとして機能している。獣医学領域では癌幹細胞研究は緒に就いたばかりであり、本研究では、獣医診療の中心となる犬および猫に自然発生する乳癌に着目し、乳癌発症機構の解明を目指し、それらの乳癌幹細胞の同定、細胞生物学的特性を解析した。犬乳癌細胞株および猫乳癌細胞株を用いたフローサイトメトリー解析および細胞培養により、乳癌幹細胞が濃縮されるside population(SP)細胞、浮遊細胞塊および乳癌幹細胞CD44(+)CD24(-)細胞集団を同定した。特に、犬乳癌細胞株CHMp由来の浮遊細胞塊を中心に、RT-PCR解析、ヌードマウスへの皮下移植による腫瘍形成能解析を行った。CHMp浮遊細胞塊は、対照群(CHMp親細胞株)と比較して、乳癌幹細胞マーカーCD44(+)CD24(-)細胞を高い割合で含有し、未分化関連遺伝子CD133、MDR、CD34、SOX2、NOTCHおよびGli-1を高発現していた。浮遊細胞塊の腫瘍形成能解析では、浮遊細胞塊は対照群と比較して腫瘍形成能が高い傾向が見られ、さらに高い増殖活性を示した。浮遊細胞塊から形成された腫瘍の再浮遊細胞塊形成能では、浮遊細胞塊を形成する細胞の存在が示された。さらに浮遊細胞塊の継代移植による再腫瘍形成能も認められた。いずれも形成された腫瘍は元の病理組織像とほぼ一致していた。これらの結果から、株化した犬乳癌細胞においても乳癌幹細胞およびそれらを頂点とする階層構造が存在する可能性が示唆された。
イオン液体で切り開く新たな構造生物学

本研究は、イオン液体の真空中でも安定で蒸発しない性質を利用した画期的なイメージング技術の開発とその生命科学への応用を目指して、以下、3つのプロジェクトを進めた。具体的には、1)走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡のレプリカ作製のための「乾かさない」試料作製法の確立、2)導電性を持つ金属コート基盤を利用した、無蒸着生体試料の極めて簡便な走査型電子顕微鏡法、3)収束イオンビーム装置を生物に応用し、レーザービーム加工により細胞を自在に整形し、その断面像から細胞内構造を明らかにする1細胞解剖学の研究を進めた。3)は研究遂行中に海外の研究室から、クライオFIB法が報告されたため、我々の研究の優位性が薄れたと判断し、実験を中断した。しかし、化学固定しオスミウム酸で後固定した植物プランクトンの断面図をFIBで観察することには成功した。1)、2)に関しては、当初の予定通り順調に成果が得られた。レプリカ作製のためには、生物試料を2%イオン液体で40°C、15分間処理することで、乾燥による試料の変形を防ぎ、電子顕微鏡の前処理応用できることを確かめた。2)については、当初目標にしていた細菌のべん毛観察に成功し、シルエット法が微生物の形態観察に有効であることが示せた。イオン液体の種類によらず、電子顕微鏡観察ができることも明らかになった。この結果、イオン液体を用いた電子顕微鏡前処理法の確立にめどが立ち、今後、この方法の活用が広まることが期待できる。平成28年度は、真空下で安定かつ蒸発しない、そして導電性を持つイオン液体の利点を活かし、希釈イオン液体を使用した、手軽で保存性の高い電子顕微鏡の前処理法の完成を目指した。電子顕微鏡技術の1つレプリカ法でイオン液体の応用を試みた。レプリカ法では試料を乾燥させ、表面に金属/炭素蒸着を行うことで、試料にコントラストを与える。海洋性の極べん毛性細菌のべん毛をモデル試料に、イオン液体法におけるイオン液体の種類、濃度の最適化を行い、さらに従来法と試料の保存性を比較した。その結果、試料の保存性はイオン液体の種類で大きな違いはなく、濃度0.1ー0.05%で処理したときに、べん毛の構造がきちんと露出した透過型電子顕微鏡が得られることが明らかになった。イオン液体濃度を0.1%以上にすると、乾燥時におけるイオン液体の残留が顕著になり、べん毛構造が隠れることがわかった。イオン液体法で処理したべん毛は、滑らかな正弦波の構造をとっている一方で、tーブタノール乾燥法で得られたべん毛には細かい歪が見られ、保存性の点で、イオン液体法が勝っていることも判明した。このべん毛の歪みは前処理で使う有機溶媒が原因だと考えられ、有機溶媒を使用しないイオン液体法でより自然な状態に近い構造が観察できたと考えられる。また平成28年度は、イオン液体を用いた無蒸着試料の観察条件の最適化も行なった。こちらでは、光合成細菌をモデルとして使用した結果、化学固定化した試料を2%のイオン液体で処理し観察することで、コントラストが良好な画像が得られることが分かった。平成28年度の目標の1つが、電子顕微鏡のレプリカ法にイオン液体を応用し、最適な条件を見つけることであった。その結果、細菌のべん毛をモデルに、0.05-0.1%イオン液体で処理した場合に良好なレプリカ像が得られることを確認できた。また、導電性基盤とイオン液体を用いて、試料をシルエット状に観察する実験にも取り組み始めている。申請書で予定した通りのペースで研究が進んでいる。本研究の目的は、イオン液体を利用した電子顕微鏡法、特に安全かつ簡便な試料作製法の構築である。イオン液体は、常温常圧で液体となる「塩」のことで、導電性を持つ。この特性のため、イオン液体を塗布した試料は、金属蒸着せずに走査型電子顕微鏡(SEM)で直接観察できる。また、イオン液体は真空中でも液体状態を保つために、生体試料の乾燥を防ぐ保護剤の役割も持つ。平成29年度は、金薄膜と無蒸着試料の2次電子コントラスト差を利用し、試料を影絵のように観察する走査型電子顕微鏡法(以下、シルエット法と略)の検証を行った。SEMでは電子線照射に伴い、試料表面から発生する2次電子を検出する。生体試料は元素番号が小さい原子からなるため、2次電子が発生しにくい。そのため、通常は試料表面を薄い重金属膜(Au, Ptなど)でコートし、2次電子発生を増強する。また金属蒸着により導電性が得られ、SEM観察の妨げとなる帯電が抑えられる。今回、我々は基盤のみを金属蒸着することでSEM観察の帯電を防げ、生体試料を影絵のように観察できることを確認した。具体的には、厚さ8 nm程度の金薄膜を蒸着したカバーガラスを作製し、その表面に生体試料を化学固定した。これをイオン液体で前処理し、金属蒸着をせずに直接SEM観察した。このとき、試料表面から生じる2次電子は背景よりも少ないため、明るい背景の中に黒い試料像を観察することができた。さらにイオン液体、溶媒の組み合わせを最適化することにより、シルエット法で枯草菌のべん毛像の観察が可能であることを示した。申請者が昨年度、体調不良により長期休職せざるを得なく、計画の進展に遅れが生じた。本研究の研究期間を延長し、当初に提案した目的の達成を目指す。

本研究は、イオン液体の真空中でも安定で蒸発しない性質を利用した画期的なイメージング技術の開発とその生命科学への応用を目指して、以下、3つのプロジェクトを進めた。具体的には、1)走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡のレプリカ作製のための「乾かさない」試料作製法の確立、2)導電性を持つ金属コート基盤を利用した、無蒸着生体試料の極めて簡便な走査型電子顕微鏡法、3)収束イオンビーム装置を生物に応用し、レーザービーム加工により細胞を自在に整形し、その断面像から細胞内構造を明らかにする1細胞解剖学の研究を進めた。3)は研究遂行中に海外の研究室から、クライオFIB法が報告されたため、我々の研究の優位性が薄れたと判断し、実験を中断した。しかし、化学固定しオスミウム酸で後固定した植物プランクトンの断面図をFIBで観察することには成功した。1)、2)に関しては、当初の予定通り順調に成果が得られた。レプリカ作製のためには、生物試料を2%イオン液体で40°C、15分間処理することで、乾燥による試料の変形を防ぎ、電子顕微鏡の前処理応用できることを確かめた。2)については、当初目標にしていた細菌のべん毛観察に成功し、シルエット法が微生物の形態観察に有効であることが示せた。イオン液体の種類によらず、電子顕微鏡観察ができることも明らかになった。この結果、イオン液体を用いた電子顕微鏡前処理法の確立にめどが立ち、今後、この方法の活用が広まることが期待できる。平成29年度は、予定通りに、導電性基盤とイオン液体を持ちいた生体試料のシルエット観察法に取り組む。特に、この方法で到達可能な分解能について検証する。一方で、当初申請書にあげていた1細胞解剖法の実験は中止する。これは、化学固定化した試料をイオン液体処理し、それをFIB(収束イオンビーム装置)で加工し、細胞内部構造を観察する技術であるが、海外の複数のグループがこの技術の発展版であるクライヨFIBを既に報告しており、我々の方法の優位性が失われたと判断したからである。イオン液体の真空中でも安定で蒸発しない性質を利用した、画期的なイメージング技術の開発とその生命科学への応用を引き続き行う。具体的には、1)走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡のレプリカ作製のための「乾かさない」試料作製法の確立、2)導電性を持つ金属コート基盤を利用した、無蒸着生体試料の極めて簡便な走査型電子顕微鏡法、3)イオン液体の導電性を利用した走査型顕微鏡による生物試料の直接観察法の確立を目指す。申請時に購入予定していたスパッター装置を購入せずに、既存の真空蒸着装置で代用できたため物品費を抑えることができたため使用額を抑えることができた。申請者が体調不良により、昨年度長期間休職しており、計画通りの予算消化ができなかった。残金は電子顕微鏡の消耗費、電子顕微鏡の使用料にあてる。差額は、電子顕微鏡関連の消耗品を購入する物品費、また電子顕微鏡の使用料に当てる予定である。
栄養シグナルと炎症を結ぶ新規シグナル伝達経路の解明

我々は高感度質量分析計による定量的リン酸化プロテオミクス技術を用いて、のべ20000を超えるリン酸化について定量解析を行った結果、mTORC1の下流分子として転写因子FOXK1を含む36分子を同定した。さらにFOXK1によって誘導される遺伝子として、単球の遊走因子である炎症性ケモカインのCCL2を同定した。腫瘍細胞の皮下移植実験の結果、ラパマイシン投与、FOXK1の抑制、CCL2の抑制によって、それぞれTAMの浸潤抑制が認められた。このことより、mTORC1-FOXK1-CCL2経路は栄養シグナルと炎症をつなぎ、がんの発生や進展に重要な役割を持つことが明らかとなった。本申請研究では、予備的解析から完成したFOXK1(flox)マウスを用いて脂肪細胞特異的FOXK1欠損マウスを作製し、高脂肪食投与における血糖値とインスリン抵抗性を調べ、mTORC1やCCL2と同様にFOXK1と糖尿病に関連があるかを解析した。マウスで脂肪特異的にFOXK1を欠損させると、高脂肪食を投与してもインスリン抵抗性があまり起こらないことが判明し、mTORC1経路によるFOXK1の活性化がCCL2の転写量増加を引き起こし、それによって炎症反応が惹起されてインスリン抵抗性が付与されることが考えられる。またこれと並行して糖尿病予防薬の創薬を目指し、FOXK1阻害剤のスクリーニング系を構築するため、ハイスループットスクリーニングに適した細胞株として、mTORC1活性化依存的なCCL2の発現上昇を高い再現性で明確に誘導できる細胞株を選定した。次にCCL2の発現上昇を蛍光強度によって検出可能となるように、ゲノム編集技術を用いてゲノム上のCCL2の部位をEGFP (Enhanced green fluorescence protein)に置き換えた。すなわちCCL2が発現上昇するシグナルが入ればEGFPの発現量が上昇し、蛍光強度が増強する仕組みを作った。またカウンタースクリーニングとしてCMVプロモーター下に赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoを発現するカセットを組み込み、EGFPとtdTomatoの蛍光強度比(Ratio)を測定する系とすることで偽陽性率を低下させる。また、CCL2発現はmTORC1-FOXK1経路だけでなく、古典的なNF-κB経路の影響を受けるため、これを抑制するためにゲノム編集技術を用いてNF-κB経路の必須分子RelAを欠損させた。これによってノイズを受けることなく安定的な結果を得ることができることが期待される。分子生物学
筋ジストロフィーの発症と一酸化窒素(NO)の関わり

我々はジストロフィン(dys)-ジストロフィン結合タンパク質(DAP)複合体内において膜貫通性のサルコグリカン(SG)小複合体と細胞骨格性のα-ジストロブレビン(DB)との直接的結合を見出したことから、DBを介したSG複合体による神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の活性制御を想定して当研究を始めた。DBが一方でnNOSのアンカータンパク質であるシントロフィン(Syn)と結合しているからである。骨格筋においてDBはN末側を共通とし分子量の異なる3つの分子種が発現しているが、一番小さなDB3はDB1やDB2と異なり構造上Synそしてdysと結合できない特徴を持つ。我々はこの特殊な構造を持つDB分子種に対する特異抗体を作成し、それを利用して免疫沈降法などの研究を行った。その結果dys-DAP複合体には、結合するDB分子種(DB1/DB2/DB3)によって区別される3種類が存在すること、そしてこれらの中ではDB3を擁した複合体だけが(dys自身にもDB1/2と同様Syn結合部位があるにもかかわらず)Synを結合していないこと明らかにした。即ちnNOSと結合できないdys-DAP複合体が自然界に存在することを示す結果を得た。nNOS、そしてこれと結合することが知られているカベオリン-3の発現や局在の異常が筋線維崩壊に関与することが考えられていることから、それらの局在とこのヘテロなdys-DAP複合体の存在がどう関係するかに関心を持ち、研究を進めた。一つはカベオリン-3を含むラフト分画との関係を明らかにする生化学的解析、他は筋細胞膜上のコスタメア構造における分布を解析する免疫組織化学的研究である。しかし技術的な問題もあり、この研究期間終了時点までに結論を出せないでいる。我々はサルコグリカン複合体がα-ジストロブレビン(DB)、そしてシントロフィンを経由して神経型一酸化窒素(NO)合成酵素(nNOS)と分子的に結合可能であることを示した。骨格筋においてDBはN末側を共通とし分子量の異なる3つの分子種が発現しているが、一番小さなDB3はDB1やDB2と異なり構造上nNOSと結合不可能である。この分子種の筋組織中における局在に関心を持ち、その特異抗体作成を試みた。DB3特異的C末端配列に相当する合成ペプチドを抗原とした時、抗体生成は認められなかった。次にC末端領域の融合タンパク質を調製して抗血清を作成し(各分子種に反応)、DB3とのみ反応する抗体を上述の合成ペプチドを使って回収調製した。しかし力価が弱く組織染色において明瞭な結果を得るに至らなかった。我々の仮説によればサルコグリカン欠損マウスだけがNOによる被害を受ける。NOの発生はチロシンのニトロ化を引き起こす。市販のニトロ化チロシン抗体を2種購入し、筋組織及び筋のホモジネートを染めた。しかし陽性の結果は得られなかった。一方NOの発生はチロシンのニトロ化等を経てアポトーシスを誘導する可能性がある。そこでアポトーシスのマーカーとして活性化キャスペース3特異抗体作成を試みるとともに、市販の抗体を購入し組織染色を行った。その結果サルコグリカン欠損マウス骨格筋において染色される線維がしばしば観察された。抗原部位に相当する合成ペプチドの共存の有無によって染色を比較したところ、その何割かで差が認められ、特異的な染色のあることがわかった。mdxマウスではこうした陽性線維は少なかった。ただしこれら線維は何れも壊死に近い線維であり、一般的なアポトーシスとは様子を異にすると思われ、慎重に検討したい。また骨格筋収縮に伴い発生するNOの定量を検討する。

初年度我々は特異的抗体を作成してα-ジストロブレビン(DB)-3がタンパク質として実際に発現していることを明らかにした。今年度我々は同じ抗体を使い、精製したジストロフィン(Dys)複合体の免疫沈降を試みた。DB-3は他のDBと同様SG複合体と結合するが、DB-1や-2のようにDysとは結合できない。従って原理的にはDB-3(SG複合体に結合)とDB-1または-2(Dysに結合)が同一複合体中に共存することも想定できたが、免沈物を解析した結果DB-3だけが検出され、そのような事実は認められなかった。免沈物中には他にDysやSG複合体、ジストログリカン複合体が検出される一方、シントロフィン(Syn)は検出されなかった。DB-3はSyn結合部位を持たないが他のDBそしてDysは持っており、従らてこの結果は意外であった。この点を追求するためDB-1およびSynに特異的な抗体を用いた免沈物を調製し、それぞれ解析した。その結果精製したDys複合体は3種のDBそれぞれを結合した複合体が独立した分子集団を形成する混合物であること、この内DB-3を結合した複合体だけがSynを結合していないという新しい事実を突き止めた。DBを欠損させたマウスの報告を見るとSynは筋細胞膜上で組織化学的に検出されている。一方でSynを結合のターゲットとしているNO合成酵素(nNOS)は消失しており、そのSynは決して正常な状態で存在していないようである。こうした報告を我々の結果と併せて考慮するならば、Synが安定に結合しかつ(nNOSの結合が許されるような)正しい配向をとるためにはDysとDBが結合しており、双方のSyn結合部位が共存することが必要であると考えられる。結合したDB分子種に依存してSynの結合が左右されることは、SynがnNOSの結合ターゲットであるだけに興味深い事実である。我々はα-ジストロブレビン(DB)を介したSG複合体による神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の活性制御を仮定し、その破綻が筋ジストロフィー発症の一因であると考えて研究を進めている。昨年我々はジストロフィン複合体にはDB分子種(DB1/DB2/DB3)によって区別される3種類が存在すること、その中でDB3を擁した複合体だけがnNOSアンカータンパク質であるシントロフィン(Syn)を結合していないことを明らかにした。今年度はこのヘテロなジストロフィン複合体の存在がnNOS、そしてnNOSに結合するカベオリン3(Cav3)とどう関連するかに興味を抱き解析を行った。1.nNOSはジストロフィン複合体を筋細胞膜から精製する過程でかなり失われ、我々の系そのままでnNOSついて議論するのは難しいことがわかった。そこでnNOSの遊離を抑えるため文献を参考に筋細胞膜を解裂可能な化学架橋剤(DSP)で処理してから抽出し免疫沈降を行った。変性還元下で電気泳動したところ、架橋により不溶化が生じていることがわかり解析できなかった。現在架橋及び抽出条件の検討を行っている。2.最近の文献でジストロフィン複合体の一部がCav3を含む膜ドメイン(ラフト)に局在することが報告された。我々はそこにDB1/DB2が含まれ、DB3は含まれないだろうと予測して解析を行った。しかしラフトが文献記載のように得られず、現在調製法の検討を続けている。
半群・形式言語および語の組合せ論

形式言語の研究については、Pumping Lemmaを利用した稠密な文脈自由言語および正規言語の構造が伊藤、勝良、Yuによる共同研究によりかなりの程度解明され、その成果が本年8月末にハンガリー・Szeged市で開催される国際会議FCT'93において伊藤による招待講演のかたちで発表される。伊藤、ThierrinおよびReisによる半群のAdherenceに関する研究は特に自由単位半群に適用した場合の理論の精密化が当初の予定どおりをはかられ、この結果は本年2月に米国フロリダ州Boca Raton市で開催された国際学会Combinatorics,Graph Theory and Computingで伊藤により発表された。伊藤、Thierrinによる言語のShuffle積の結果は、ハンガリー・サルゴタルジャン市で開催される国際会議Automata and Programming Languagesにおいて伊藤により招待講演のかたちで発表される。小林、勝良によるShuffle積の抽象代数的一般化についての結果は国際専門誌Theoretical ComputerScience(Elsevier社)に掲載される。語の書換え系およびω-語の共同研究は、昨夏の小林のカナダ滞在中にJurgensenとの共同研究が開始された。勝良は、カナダ滞在を契機にJurgensenと極大なSolid codesの代数的な構造の研究を開始した。以上が平成4年度中になされた共同研究の内容および経過であるが、それ以外の事業として両国のメンバーを組織委員として昨年8月25日-28日の期間に国際会議The Second Colloquium on Words,Languages and Combinatorics、および8月29日-31日にワークショップが開催された。その成果はWorld Scientific社よりProceedingsとして、またElsevier社よりTheoretical Computer Scienceの特別号として出版される。
特異抗体を用いたラテックス凝集法による歯周病の迅速診断法の開発

歯周病の発症にはBacteroides gingivalisが重要な病原因子として深くかかわっている。本研究は、同菌の菌体表層に位置する線毛タンパク抗原に着目し、同抗原を指標としてラテックス凝集法を用いて、歯周病原菌たるB,gingivalisを迅速かつ特異的に検出する方法の開発を試みた。1.381株の培養菌体より機械的剥離により線毛を遊離させ、クロマトグラフィ-により純化した。精製線毛抗体に対するウサギ抗体、およびマウス単クロ-ン抗体を調製した。ウサギ抗線毛IgGはB,gingivalisの被験菌株14株のすべと反応したが、他のBacteroides種とは反応しなかった。これに対してマウスの抗線毛単クロ-ン抗体はB,gingivalis株の中でも反応性を欠如するものがあった。2.ウサギ抗線毛IgG感作ラテックス粒子は線毛タンパク(>4ng)の存在下で強い凝集反応を生じた。同反応はph7.08.5の間で安定であり、反応に要する時間は室温で5分以内であった。3.B,gingivalis菌体を尿素、グアニジン塩酸塩や各種界面活性剤を用いてタンパク質の抽出操作を行うと、凝集感度も特異性も著しく上昇することが明らかになった。4.成人性歯周疾患者の病巣部プラ-ク検体を上述の方法で感作ラテックス凝集反応を行うと明確な陽性反応を示した。しかし、健康部プラ-ク検体では反応は陰性であった。これらの実験結果から、抗線毛IgG感作ラテックスの凝集反応の有無により、B,gingivalisの感染の存在を推測できることが示された。歯周病の活動度、あるいは近未来における罹患の危険度を予知する実際的な手段は現時点では乏しい。この目的を達成するためには、病因論に基づいた臨床検査方法の確立が必要である。本研究では、成人性歯周炎の主要菌種の1つとして注目されているBacteroides gingivalisの菌体最表層に位置する線維状構造体である線毛蛋白抗原に着目し、この抗原を指標としてラテックス凝集法によるB.gingivalisを迅速かつ特異的に検出する方法の開発を試みた。得られた結果を要約すると次のとおりである。1.B.gingivalis381株からYoshimuraらの方法を一部改変して線毛タンパクを分離し、高速液体クロマトグラフィーを用いて純化し精製線毛タンパクを得た。2.同菌株の大量培養菌体より、Westphalらのフェノール・水法でLPSを抽出し、超遠心、クロマトあるいは電気透析により精製LPSを得た。3.上記精製抗原に対するモノクロナール抗体を調製した。すなわち、BALB/cマウスを抗原で免疫後、脾細胞とマウスミエローマ細胞SP2/oを融合させ、特異抗体産生クローンより各種モノクロナール抗体を得た。4.また、精製抗原をウサギに免疫しモノスペシフィックな抗血清を作出した。5.抗血清、モノクロナール抗体、及び線毛タンパク抗原あるいはLPSの各種ラテックス粒子への吸着結合を至適条件下で行った。これらの因子の結合の有無ならび程度は、蛍光色素FITCあるいはRITCをラベルした抗原あるいは抗体と反応させ、蛍光顕微鏡で観察することにより確認した。6.これら抗体あるいは抗原結合ラテックスは、B.gingivalisあるいはその抗体と特異的な凝集反応を示した。次年度において、抗体あるいは抗原結合ラテックスを用いて、歯肉溝液、唾液および歯垢中のB.gingivalisの検出や抗体価の測定を行ない、培養法、蛍光抗体法ならびにELISA法などと比較検討していく計画である。歯周病、特に成人性歯周炎の発病にはBacteroides gingivalisが深くかかわっている。

本研究は同菌に特異的な抗原性物質として菌体表層から外界へ突出している線毛のタンパク質に注目し、同タンパクに対する抗体をまず調製し、ついでIgG画分をラテックス粒子に吸着(感作)させ、感作ラテックスの凝集活性の有無によりB、gingivalisの存否を知ることを目的とした。1)ウサギの抗線毛抗血清よりえたIgGは、B、gingivalisの被験株14株のすべてと反応するのに対し、他のBacteroides種の菌株とは反応せず、菌種特異的であることが示された。これに対してマウスの抗線毛モノクロ-ン抗体はB,gingivalisの中でも反応しない菌株が認められた。2)ウサギ抗体感作ラテックス粒子はB、gingivalisのリポ多糖(LPS)や莢膜多糖抗原とは反応しないが、線毛タンパク(>4ng)の存在下で強い凝集反応を生じた。同反応はpH7.08.5の間で最も安定、かつ高感度であった。反応に要する時間は5分以内(室温)であった。3)B、gingivalis菌体をカオトロピックなグアニジン塩酸塩や尿素、非イオン界面活性剤であるTriton X-100,n-オクチル-β-D-グルコシドn-ヘプチル-β-D-チオグルコシド、CHAPS,CHAPSOによる溶菌を伴うタンパク質の抽出操作を加えることにより、凝集の感度や特異性が共に著しく上昇した。4)血中抗線毛抗体価の高い成人歯周炎の病巣部より得たプラ-クを上昇の方法で感作ラテックス凝集反応を行うと明確な陽性反応を示した。しかし、同抗体価の上昇が認められない被験者のプラ-クは反応陰性であり、凝集反応の有無によりB.gingivalisの感染の有無を知ることができることが示唆された。今後の実用化のためにはさらに感度の向上と、特異性の維持をはかりつつ一層の工夫を試みたい。