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中国語検定試験の信頼性と妥当性に関する研究

中国語検定は年間約6万人の受験生が利用する大型標準テストである。このテストはどれぐらい正確に且つ公正にその評価の役割を果たしているか、その受験者の最も多い3級を対象にして、古典的テスト理論の信頼性と妥当性の視点から、試験ペーパー・個々項目の検討、模擬テストによる独自の検証、ソフトによる語彙難易度の調査と統計、アンケート調査といった多角の手法で検討を加えた。3年間、6本の論文を学術研究誌に、口頭発表2回で、研究成果を発信した。中国語検定3級は安定しているとは言いかねる。より良質のテストを提供するために、テストそのものの質的向上はもとより、社会的責任の観点からテストの公平公正の重要性を示唆した。計画の通りに、今年度研究を進めた。具体的に下記の通りである。1今年度では、まず「中国語基本語彙使用頻度統計ソフト」を開発し、それにより中国語検定試験3級の使用語彙を調査し、試験内部の難易度、異なる試験間の難易度を把握したうえで、その安定性を考察した。2実証研究として、3級の模擬テストを複数回行い、その結果を今年度に購入した「自動採点読み取り機(OMR)」を使って、統計して、回答率、各選択肢の被選択率などのいろいろなデータを取得した。3中国語教師を対象にアンケートを実施した。4上述した1、2と3を踏まえて、研究論文をまとめ、査読付きの学会誌に投稿の上、採用された。論文のタイトル:試析日本漢語検定考試3級試題選項的編制(日本中国語検定試験3級の選択肢作成についての考察)『中国語教育』第12号P1361502014年3月。以下はその要旨である。中国語検定試験(3級)は、大型試験としてその信頼性の確保や採点の制限などで、多肢択一という客観問題の形式を取らなければならない。このような客観問題の作成は、一見易しそうだが、実際には非常に困難が多いとされている。試験の成否は出題の内容と形式(主に選択肢)の妥当性に左右されるところが大きい。そこで、多数の先行研究を踏まえ、多肢択一の客観問題の作問の基本要領及びそのテクニックを整理し、それに基づいて3級の選択肢の妥当性について分析を行った。その結果、適切な選択肢からなる良質な設問が多く、特に課題文は自然な中国語であり、設問ポイントもバランスよく配置されており、形式も安定していることが確認された。しかし、一方で、選択肢の作成において見逃された改善すべき点もいくつかあることが分かった。そこで、その原因と改善策を示唆して、より良い問題の開発につなげようというのが本論文の狙いである。このほか、国内と中国での口頭発表を2回行った。研究計画の通りに、言語テスト理論を把握し、中国語検定試験3級の問題をデータベース化して検討した。そのうえ実証研究を行った。成果として、研究論文を2本発表した。1本は査読付きの学会誌で、もう1本は本学の学部紀要である。論文1:試析日本漢語検定考試3級語音測試(日本中国語検定試験3級の発音測定についての考察)『中国語教育』第11号P88106 2013年3月。中国語検定試験3級は、筆記試験において41問のうち、発音を測定する問題が10問もあり、率にして24.3%占めているので、発音重視の意図が伺える。中国語の発音の言語構成の規則と日本人学習者の間違いやすい点を出題の基本として出された課題は、試験の妥当性が高く維持されていることが分かる。一方、試験の妥当性と信頼性を些か損ないそうなところに3点気づいた。1.漢字語から発音を無視して直接に声調を測る問題は初級者にとってふさわしい形式とは言いがたい。2.ピンイン表記の課題では、中国語にありそうもない音節を無理やり作り出して、言語構成の規則に反する例が多く見られる。3.選択肢に変量(要素)個数が多いので何を測ろうとするかが不明確になる。そのため、発音測定の妥当性が損なわれる可能性がある。論文2:テスト理論と実践から見る中国語検定試験ーその3級を中心に『県立広島大学人間文化学部紀要』第8号P115129 2013年3月。本論文は、「古典的テスト理論」の考え方及びその実践に基づき、具体的に1妥当性と信頼性、2基準参照テストと集団参照テスト、3客観テストと主観テスト、4間接テストと直接テスト、5分離テストと統合テスト、6記憶テストと識別テスト、7難易度と識別力といった視点から中国語検定試験について全面的に検討を行い、大型試験として何が大事か、どうすべきかなどを示唆した。

本年度は、研究課題について、査読付きの学術誌に論文を3本発表し、「中国語教育学会」全国大会で発表を1回、海外招待講演を1回行った。論文1:試析日本漢語検定考試3級的穏定性(日本中国語検定試験3級の安定性についての考察)(『中国語教育』第13号P1161302015年3月)という題で、3級の3年間計9回分の試験を研究対象にして、主に統計の手法で得たデータに基づいてその安定性を考察した結果、試験は安定しているとは言いかねる。それはランダム誤差というより、系統誤差によるものである。そこで、原因を検討したうえで、より良質のテストを提供するために、社会責任の視点からテストの公平公正の重要性を提示した。論文2:対日本漢語教学初級階段詞表的考察(日本の中国語教育初級段階用の語彙表についての考察)(『日中語彙研究』P3347第4号2014)という題で、『中国語初級段階学習指導ガイドライン』語彙表の妥当性を考察するために、『高校中国語教育のめやす』語彙表と、また、新HSK語彙表(14級)と対照比較を行って、その結果、『中国語初級段階学習指導ガイドライン』語彙表は、対照対象の二つの語彙表と相関性が非常に高く、最も基礎的な語彙を収録しており、しかも、品詞の規定も語形の選択も科学的であり、教えやすいという創意工夫がなされたことが分かった。日本の中国語教育現場では、特に初級の段階においてそれを最大限に反映すべきではないかと示唆した。中国語教育・言語テスト「研究の目的」の達成度が高い。理由としては、以下の通りである。一、1今年度では、まず「中国語基本語彙使用頻度統計ソフト」を開発し、それにより中国語教科書の語彙、中国語検定試験3級の使用語彙を調査して、試験と常用語彙表の相関性、試験と教科書の相関性を考察して、基本データを得た。2実証研究として、3級の模擬テストを複数回行い、その結果を今年度に購入した「自動採点読み取り機(OMR)」を使って、統計して、回答率、各選択肢の被選択率などのいろいろなデータを取得した。3中国語教師を対象にアンケートを実施した。4上述した1、2と3を踏まえて、研究論文をまとめ、査読付きの学会誌に投稿し、採用された。二、5さらに1のデータに基づいて、次年度で『試験と常用語彙表の語彙・教科書の相関性についての考察』という論文を準備する予定である。6また、次年度で1と2のデータを利用して、試験内部の難易度、異なる試験間の難易度を把握したうえで、その安定性を考察する論文を準備する予定である。理由としては、1言語テストの理論と関係論文などを把握した。2中国語検定試験3級の試験ペーパー計9回分を検討した。3実証研究の仮アウトラインを立てた。4その可能性を語学と言語テストの専門家に見解を求めた。5実証研究を行った。6成果として論文を2本まとめ発表した。と挙げられる。『中国語教育』11号に発表した「試析日本漢語検定考試3級語音測試(日本中国語検定試験3級の発音測定についての考察)」論文は、査読結果で「発音試験問題の作成において、多くの示唆を与えており、改善のヒントが得られる内容である、評価できる。」というコメントをもらったから、達成度が高いと言えよう。もう一本は、古典的テスト理論(Classical Test Theory)」の考え方及びその実践に基づき、中国語検定試験3級は大型試験だとう基本認識で、多角からその性格、課題などを分析することによって、今後の改善方向を示唆した。
骨・関節表現型におよぼすＭＭＰ２変異の影響の解明

ヒトMMP2遺伝子変異は、多関節の関節破壊と骨粗鬆症を呈する多中心性骨溶解症を生じる。ムチランス型の関節リウマチに類似した病態が、プロテアーゼの不活性型変異で生じることは興味深いが、その分子機序については、全く明らかとなっていない。関節炎および骨吸収を生じる新たな病態機序の解明は、関節リウマチや骨粗鬆症の新たな治療法の開発へつながる可能性があり、臨床的にも極めて重要な課題である。骨溶解症の動物モデルの作成を行うべく、特殊な条件の下で変異型MMP2が発現する遺伝子改変マウスを作成し、安定的に繁殖させた。生体内のさまざまな組織に変異型MMP2を発現させ、その機能を解析することが可能となった。ヒトMMP2遺伝子変異は、多関節の関節破壊と骨粗鬆症を呈する多中心性骨溶解症(Winchester症候群)を生じる。MT1-MMP遺伝子欠損マウスの表現型が、ヒト多中心性骨溶解症ときわめて類似することから、変異型MMP2がMT1-MMPの機能を抑制する可能性が示唆される。骨溶解症の動物モデルの作成およびin vivoでの機能解析を行うべく、遺伝子改変マウスの作成を計画した。先行研究において、pCAGGSベクターを用いて変異型MMP2のトランスジェニック(Tg)マウスを作成したところ、生殖能力を持たない表現型を呈したため、本研究では組織特異的にトランスジーンを過剰発現させることを計画した。LoxP配列をもつpCALNL5ベクターに変異型MMP2を組み込むと、Cre非存在下ではネオマイシン遺伝子が発現するが、Cre存在下では変異型MMP2が発現する。この発現カセットを用いてTgマウスを作成した。現在、Col1-CreおよびCol2-Creマウスと交配するために繁殖を行っている。先行研究においてpCAGGSベクターを用い、全組織に変異型MMP2を過剰発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成したところ、生殖能力を持たない表現型を呈したため、本研究では組織特異的にトランスジーンを過剰発現させることを計画した。この発現カセットを用いて作成したTgマウスさせ、皮膚や骨といったI型コラーゲンが発現する組織に変異型MMP2を過剰発現させるため、Coll-Creマウスとの交配の準備を行っている。さらに、骨芽細胞や破骨細胞、軟骨細胞などで特異的に変異型MMP2を発現させるため、それぞれ特異的なプロモーターの下流に変異型MMP2を組み込んだ発現カセットを準備している。in vitroでの発現を確認の上、Tgマウスの作成を次年度に予定している。この発現カセットを用いて、Tgマウスを作成し、安定的に繁殖させた。

さらに、骨芽細胞や破骨細胞、軟骨細胞などで特異的に変異型MMP2を発現させるため、それぞれ特異的なプロモーターの下流に変異型MMP2を組み込んだ発現カセットの作成を行った。ヒトMMP2遺伝子変異は、多関節の関節破壊と骨粗鬆症を呈する多中心性骨溶解症(Winchester症候群)を生じる。ムチランス型の関節リウマチに類似した病態が、プロテアーゼの不活性型変異で生じることは興味深いが、その分子機序については、全く明らかとなっていない。関節炎および骨吸収を生じる新たな病態機序の解明は、関節リウマチや骨粗鬆症の新たな治療法の開発へつながる可能性があり、臨床的にも極めて重要な課題である。骨溶解症の動物モデルの作成およびin vivoでの機能解析を行うべく、遺伝子改変マウスの作成を計画した。先行研究においてpCAGGSベクターを用い、全組織に変異型MMP2を過剰発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作成したところ、生殖能力を持たない表現型を呈したため、本研究では組織特異的にトランスジーンを過剰発現させることを計画した。LoxP配列をもつpCALNL5ベクターに変異型MMP2を組み込むと、Cre非存在下ではネオマイシン遺伝子が発現するが、Cre存在下では変異型MMP2が発現する。この発現カセットを用いて、Tgマウスを作成し、安定的に繁殖させた。遺伝子改変動物の繁殖が、計画よりも遅い。また、発現ベクターの作成に遅れがある。25年度が最終年度であるため、記入しない。また、発現ベクターの作成に遅れがある引き続き、トランスジェニックマウスの作成、繁殖、交配を行う。進捗状況に応じては、発現カセットを新たに作成して、再度のマウス作成を試みる。引き続き、トランスジェニックマウスの作成、繁殖、交配を行う。
C.elegans神経系高次機能にかかわる遺伝子の系統的同定と解析

「記憶に関連する遺伝子と神経細胞の同定」という課題で、C.elegansを用い、広汎な学習欠損株の分離を行った。記憶は学習によって獲得されるという考えから、学習の基本要因の1つ慣れ(habituation)異常変異体分離を試みた。その結果、5変異株を分離することに成功した。慣れは個体差が大きい。そのためより正確を期すため複数の学習実験系を確立した。これらの手段によって、5変異株の学習能を調ベ、何れの規準によっても慣れ(habituation)の欠損株であることを確認した。現在これら変異株の遺伝子座決定を行っている。学習には特定の回路網が関与している。同定された遺伝子変異はこうした回路決定に役立つ。記憶はおそらく特定回路での神経統合によってなされる。神経回路網が働く最小単位はシナプスである。従って統合機構の解明には、シナプス伝達を明らかにする必要がある。そのため、学習異常変異体の解析と並行して神経ー筋肉系でのシナプス伝達をとる上げた。これに関与する複数の遺伝子を同定した。そのうち1つの遺伝子をクローニングし、その遺伝子産物の分子性状を明らかにした。その結果、この遺伝子がシナプスでのアセチルコリンの放出に関与していることを明らかにした。これらの成果は、次の論文として発表した。
高い異方性を有する有機－無機複合体の合成とその機能性触媒への変換

エチレングリコール中でニオブエトキシドをソルボサーマル反応させることにより,エチレングリコールが層間に配位した層状ニオブ化合物のナノ粒子が得られた.ナノサイズの板状形態を有している本生成物を適切な条件で焼成することで,その形態を維持したまま酸化ニオブに変換できることを見出した.ソルボサーマル法を利用して合成した酸化ニオブは含水ニオブ酸から合成したものより高い表面積を有しており,ベンジルアルコールの選択光酸化に高い活性を示した.また,通常,炭化水素類の光酸化は可視光照射下では進行しないが,酸化ニオブを真空下で加熱処理することでシクロヘキセンの光酸化が進行することも見出した.高効率な光触媒反応を実現しうる新規な触媒材料として,形態が制御された酸化物および(酸)窒化物ナノ結晶が期待されている.本研究では,金属への配位能力の高いビシナルグリコールを溶媒として用いる無機材料合成法(グリコサーマル法)を活用し,異方性の高い有機ー無機複合体の合成とその形態制御を行う.さらに,このようにして合成した有機ー無機複合体の形態を維持させたまま,それらを酸化物や(酸)窒化物ナノ結晶に物質変換する方法を確立させ,高性能光触媒などの創製に繋げることを目標としている.今年度は,主にニオブエトキシドのエチレングルコール中におけるソルボサーマル反応について検討した.その結果,NbOx層がエチレングリコールで架橋された層状ニオブ化合物が得られた.本化合物の形態は板状の形態を持つナノ粒子(幅,35 nm;長さ,200 nm)であり,本化合物を適切な条件で焼成することでその形態を維持したままNb2O5に変換することを見出した.さらに,こうして得られたNb2O5は100 m2/g以上の高い比表面積を持ち,アルコールの選択光酸化に対してNb2O5・nH2Oから合成したものより高い活性を示すことも明らかにした.また,Nb-Ti系のソルボサーマル反応についても検討を進めており,こちらの系でも層状化合物が得られることを見出した.さらに,Nb-Ti系の層状化合物を焼成して得られた生成物は,常法では合成困難なブロンズ構造を有していることも明らかにした.高効率な光触媒反応を実現しうる新規な触媒材料として,形態が制御された酸化物および(酸)窒化物ナノ結晶が期待されている.本研究では,金属への配位能力の高いビシナルグリコールを溶媒として用いる無機材料合成法(グリコサーマル法)を活用し,異方性の高い有機ー無機複合体の合成とその形態制御を行うことを目的にしている.前年度の検討から,エチレングリコール中でのグリコサーマル反応により,板状形態を有するグリコール含有の層状ニオブ化合物の合成に成功した.さらに,得られた層状ニオブ化合物を適切な条件で焼成することで,前駆体の形状を維持したまま酸化ニオブナノ結晶に変換できることを明らかにした.そこで,本年度では,グリコサーマル法を利用して合成した酸化ニオブによるベンジルアルコール選択光酸化を主に検討した.グリコサーマル合成した層状ニオブ化合物の焼成温度を調整することで,得られる酸化ニオブの表面積を60 m2/gから145 m2/gの範囲で制御できることを明らかにした.そこで,表面積の異なる酸化ニオブにおいて光酸化能を評価したところ,表面積と触媒活性に良い相関がみられた.なお,表面積が高い無定形生成物では高い触媒活性は得られなかった.これらの結果から,グリコサーマル合成した前駆体を利用することで良く結晶化した高表面積酸化ニオブが得られ,その結晶化度と表面積が光触媒能に寄与していることを明らかにした.さらに,酸化ニオブによる選択光酸化の基質適用範囲の拡張を目指し,研究を進めたところ,真空加熱処理を施した酸化ニオブは可視光照射にもかかわらずシクロヘキサンやトルエンの光酸化が進行することを新たに見出した.本前処理効果は,酸化ニオブに対して顕著であり,酸化チタン等の他の光触媒系では高い活性は得られなかった.エチレングリコール中でニオブエトキシドをソルボサーマル反応させることにより,エチレングリコールが層間に配位した層状ニオブ化合物のナノ粒子が得られた.ナノサイズの板状形態を有している本生成物を適切な条件で焼成することで,その形態を維持したまま酸化ニオブに変換できることを見出した.ソルボサーマル法を利用して合成した酸化ニオブは含水ニオブ酸から合成したものより高い表面積を有しており,ベンジルアルコールの選択光酸化に高い活性を示した.また,通常,炭化水素類の光酸化は可視光照射下では進行しないが,酸化ニオブを真空下で加熱処理することでシクロヘキセンの光酸化が進行することも見出した.今年度の検討により,ソルボサーマル合成した層状Nb化合物の形態を維持したままNb2O5に変化できることを実証した.そのため,本研究開始段階の目標は概ね達成しているものと思われる.また,Nb2O5の選択光酸化性能を評価する中で次のような実験事実を新たに見出した.未処理のNb2O5ではシクロヘキセンの選択光酸化はほとんど進行しないが,真空加熱処理を施したNb2O5は可視光照射にもかかわらずシクロヘキセンの選択光酸化を進行させることを見出した.このように,当初の計画以上に進展した成果も得ている.しかし,(酸)窒化物合成に関する系統的な結果は得られておらず,その改善に対する検討が少し遅れているものの概ね順調に進展していると判断される.

無機材料合成現段階では,ニオブ化合物に焦点を当て検討を進めているが,他の4族・5族元素(Ti, Zr, Hf, Ta)についても検討を行い,本処方の汎用性を広げる必要があると考えている.また,ソルボサーマル合成した層状Nb化合物を窒化処理することでは,(酸)窒化物は得られず,還元されたNb種が副生することを認めている.そこで,TaやZrのような還元されにくい金属種による(酸)窒化物合成を検討する必要がある.さらに,BaLa4Ti4O15やBaTaO2Nのような複数の金属種から成る複合酸化物や(酸)窒化物を目指して,複数の金属種から成る有機ー無機複合錯体の合成研究についても行う.また,得られた酸化物及び(酸)窒化物を可視光照射下でのアルコール等の選択光酸化や水分解反応に適用させ,高性能光触媒の創製に繋げる.
コンクリートの環境負荷評価手法の開発・実用化研究

本研究は,資源を有効活用し持続可能な発展を目指す行為が,経済性の面においても有効となるような環境負荷の評価手法を開発することを目的とし,材料評価システムの構築と環境負荷評価手法の提案を2本の柱として実施した.材料評価システムの構築に当たって,環境負荷の観点から検査を行う必要性があるのは,環境負荷要因の中でも重金属類を中心とした有害物質となる.そのため,産業廃棄物等から重金属類がコンクリートに含有する場合の溶出評価方法について検討を行った.その結果,現行の,試料を微粉砕するバッチ試験結果を準用してコンクリート構造物からの長期重金属溶出を予測することは困難であり,タンクリーチング試験における溶出傾向より硬化体内部における重金属の見掛けの拡散係数を推定し,解析的に長期溶出量を評価することが最も妥当性があるとの結論に至った.タンクリーチング試験を応用した長期溶出挙動の把握によって,有害物質の影響を材料評価システムに取り込むことは可能であると考えられる.環境負荷評価そのものはLCA手法にのっとり,インベントリデータの整備ならびに運用方法を考慮した上での環境負荷評価手法の提案を行った.インベントリデータに関しては,エネルギー消費量,鉱物資源〔非金属・鉄〕消費量,エネルギー資源〔石炭・石油・天然ガス起源〕消費量,CO_2排出量,NOx排出量,SOx排出量,ばいじん排出量,廃棄物利用・発生量について,コンクリート構造物の材料製造・施工・解体・廃棄・再利用に関連する91項目を整備することができた.さらに,コンクリート構造物の環境に対する負荷の程度を環境性能と定義した上で,性能照査型設計手法に即した2種類の環境負荷評価手法を提案した.これらでは,異なる環境負荷要因の統合化を考慮し,また,評価にあたっては工事コストの影響を勘案することも可能としており,十分に実用化が可能な方法であると思われる.本研究は,資源を有効活用し持続可能な発展を目指す行為が,経済性の面においても有効となるような環境負荷の評価手法を開発することを目的とし,材料評価システムの構築と環境負荷評価手法の提案を2本の柱として実施した.材料評価システムの構築に当たって,環境負荷の観点から検査を行う必要性があるのは,環境負荷要因の中でも重金属類を中心とした有害物質となる.そのため,産業廃棄物等から重金属類がコンクリートに含有する場合の溶出評価方法について検討を行った.その結果,現行の,試料を微粉砕するバッチ試験結果を準用してコンクリート構造物からの長期重金属溶出を予測することは困難であり,タンクリーチング試験における溶出傾向より硬化体内部における重金属の見掛けの拡散係数を推定し,解析的に長期溶出量を評価することが最も妥当性があるとの結論に至った.タンクリーチング試験を応用した長期溶出挙動の把握によって,有害物質の影響を材料評価システムに取り込むことは可能であると考えられる.環境負荷評価そのものはLCA手法にのっとり,インベントリデータの整備ならびに運用方法を考慮した上での環境負荷評価手法の提案を行った.インベントリデータに関しては,エネルギー消費量,鉱物資源〔非金属・鉄〕消費量,エネルギー資源〔石炭・石油・天然ガス起源〕消費量,CO_2排出量,NOx排出量,SOx排出量,ばいじん排出量,廃棄物利用・発生量について,コンクリート構造物の材料製造・施工・解体・廃棄・再利用に関連する91項目を整備することができた.さらに,コンクリート構造物の環境に対する負荷の程度を環境性能と定義した上で,性能照査型設計手法に即した2種類の環境負荷評価手法を提案した.これらでは,異なる環境負荷要因の統合化を考慮し,また,評価にあたっては工事コストの影響を勘案することも可能としており,十分に実用化が可能な方法であると思われる.研究は,材料評価システムの構築と環境負荷評価手法の検討の2つを柱として実施した.材料評価システムの構築にあたっては,環境負荷の観点から重金属類に関するコンクリートからの溶出挙動について検討を行った.銅または亜鉛を含有させ,コンクリートの水セメント比を変化させた寸法の異なる供試体を作製し,環告13号試験,DEV S4試験,シリアルバッチ試験,アベイラビリテイー試験,タンクリーチング試験(以下.TL試験)を実施した.その結果.TL試験より得られる溶出は,銅イオンまたは亜鉛イオンの拡散現象としてほぼ表現可能であることが明らかとなった.TL試験結果は,実構造物の挙動を比較的良好に再現する試験方法と考えられるが.時間を要するため必ずしも実用的ではない.そこでバッチ試験の活用が不可欠となるが.従来のバッチ試験を活用し試料の寸法等の試験条件を改良することにより,TL試験より得られる結果がある程度予測可能ではないかとの結論を得た.この結果より得られる数値を無次元化し,環境負荷の一指標として取り込む方法を今後検討する必要がある.環境負荷評価手法の検討においては.その内容を,(1)環境負荷評価手法の概念に関する検討,(2)環境負荷の計算手法に関する検討.(3)環境負荷評価方法の運用方法に関する検討に大別した.(1)では,いかなる項目を環境負荷要因として取り上げるか,あるいはデータ収集の点から取り上げることが可能かについて検討するとともに,環境負荷を評価する簡易な方法として環境負荷の程度を点数化した環境ポイントを提案した.(2)では,文献調査やヒアリングを通して.コンクリート用材料,コンクリートの製造・運搬,コンクリート構造物の施工,解体・廃棄に関するインベントリを取りまとめた.(3)の運用においては,コストとの関連が不可避なため,政策的なサポートなくしては困難でとの結論に至った.ただし,数年前から国土交通省が導入している総合評価落札方式は環境負荷を取り入れる手法として適していることを明らかとした.コンクリート構造物の建設・供用・維持管理

・解体・廃棄・再利用のライフサイクルにおいて,環境に及ぼす負荷ならびに負荷を低減する作用をエネルギー排出量,二酸化炭素排出量,廃棄物発生量ならびに廃棄物使用量の観点から評価する手法について開発を行った.上記の環境負荷要因または環境負荷低減要因に関しては,ヒアリングや文献調査を通じてインベントリの整理・提案もあわせて行った.なお,環境に負荷を及ぼす要因は上記以外にも多数ある.これらについては,コンクリートの環境性能としての概念の下,考え得る項目の抽出を行い地球環境・地域環境に対する影響を個々の要因の相互関係とともに取りまとめたが,インベントリを明らかとするまでには至らなかった.定量評価までには至っていないものの,コンクリート構造物の性能照査型設計において,性能として定性的に活用は可能と考える.一方,環境負荷要因の定量評価において,複数の環境負荷要因を統合化する手法についても検討を行った.この手法には,既往の手法を用いることとしたが,過去の統合化手法について比較検討を行い,本研究で取り上げた手法の優位性を明らかとするとともに,工法や材料の選定に有効に利用できることを示した.材料評価システムに関しては,周辺環境に及ぼす影響の観点から重金属の溶出について重点的に検討を行ったが,コンクリートからの長期的な重金属溶出挙動を予測可能とする溶出試験の提案を行うまでには至らなかった.これは,重金属の種類によってセメント硬化体への固定作用が相違すること,短期的な溶出試験では固定作用の相違を適切に評価することが困難であることが理由としてあげられる.
歯根膜細胞と腱細胞の相同性からみた歯周組織再生の可能性

歯根膜細胞と腱細胞の相同性に着目して歯周組織再生の可能性を探る目的で、骨組織形態計測法を歯槽骨の発生に応用し歯槽骨表面の解析を行った。ラットでは歯槽骨の発生は幼弱歯槽骨(線維骨)に直接歯根膜線維が埋入されるのではなく、15日齢頃、歯根膜線維と歯槽骨との連結の前に歯胚歯槽窩の上部に破骨細胞の出現が起こり、その吸収面に歯根膜線維が埋入された。この歯根膜線維面はその後、歯槽骨全体に拡大して、35日齢以降定常状態に入ることが示唆された。歯根膜線維の埋入には、破骨細胞の出現が必須である可能性が示唆された。歯は、歯根セメント質と歯槽骨が歯根膜によって歯周靭帯によって柔軟かつ強靱に結ばれることによって機能を発揮するが、この複合組織が構成される発生メカニズムと、機能的な歯牙-歯根膜-歯槽骨複合体の再建の研究は不明な点が多い。我々は基礎的な組織発生学的解析の結果、セメント質への歯根膜線維の埋入、および固有歯槽骨およびシャーピー線維埋入にアクアポリン陽性細胞が直接関与していることを明らかにし、AQP1陽性細胞が歯牙-歯周靭帯-固有歯槽骨複合体を形成する主要な細胞であることを明らかにしてきた。様々な臨床的実験モデルを確立し。ラット臼歯における咬合性外傷モデル、歯の矯正移動モデル、実験的アンキローシスにおけるアクアポリン陽性細胞の動態の解明を行い、咬合性外傷モデルからは咬合性外傷後3日後にアクアポリン陽性細胞が歯根膜全体に現れ、硝子様変性部の形成の後、アクアポリン陽性細胞による被包化が起こり、14日後に無細胞セメント質、および、歯根膜線維の再生が起こることを明らかにした。また、矯正移動モデルでは、カルセイン2重染色、および骨芽細胞分化マーカーOsxの発現、線維芽細胞マーカーとしてS100A4およびコラーゲンの形成マーカーprolyl4-hydroxylase-beta(P4HB)の発現解析により、密生結合組織中の歯根膜埋入およびその石灰化という固有歯槽骨の特殊性から、その形成機構は一般的な骨形成とは異なり、アクアポリン陽性歯根膜細胞が固有歯槽骨の形成に直接関与し、歯槽骨に埋入される歯根膜線維形成の後、骨芽細胞に分化する可能性があることを報告した。現在、更に、臨床実験モデルを増やし、対合歯の喪失による、歯根膜廃用性萎縮に伴う、歯根膜の組織学的変化について解析を行っている。歯は、歯根セメント質と歯槽骨が歯根膜および歯周靭帯によって、柔軟かつ強靱に結ばれることで機能を発揮するが、この複合組織が構成される発生メカニズムと、機能的な歯牙-歯根膜-歯槽骨複合体の再建の研究には不明な点が多い。ラット臼歯において、咬合性外傷モデル、歯の矯正移動モデル、実験的アンキローシスになどの、様々な臨床的実験モデルを確立し、歯周組織および歯槽骨におけるアクアポリン陽性細胞の動態解明を行った。咬合性外傷モデルからは咬合性外傷後3日後にアクアポリン陽性細胞が歯根膜全体に現れ、硝子様変性部の形成の後、アクアポリン陽性細胞による被包化が起こり、14日後に無細胞セメント質、および、歯根膜線維の再生が起こることを明らかにした。現在、更に、臨床実験モデルを増やし、対合歯の喪失による、歯根膜廃用性萎縮に伴う歯根膜の組織学的変化について解析を行っている。歯は、歯根セメント質と歯槽骨が歯根膜によって柔軟かつ強靱に結ばれることによって機能を発揮する。この複合組織が構成される発生メカニズムと、障害後の機能的な歯牙-歯根膜-歯槽骨複合体の再生については不明な点が多い。我々は免疫組織化学を用いた解析により、セメント質への歯根膜線維の埋入、および固有歯槽骨へのシャーピー線維の埋入にアクアポリン(AQP)陽性細胞が直接関与することを明らかにし、AQP陽性細胞が歯牙-歯周靭帯-固有歯槽骨複合体を形成するのに重要な役割を果たしていることを明らかにしつつある。臨床的な視点から、様々な病的状態における歯根膜でのAQP陽性細胞の動態を明らかにするため、臨床実験モデルを確立し形態学的に解析した。咬合性外傷モデルからは咬合性外傷後3日後にアクアポリン陽性細胞が歯根膜全体に現れ、硝子様変性の後、アクアポリン陽性細胞による変性部の被包化が起こり、14日後には歯周組織の再生は完了していた。また、

電子顕微鏡を用いた微細形態学的な解析では、外傷後の歯根膜線維芽細胞の偽足先端部にAQPの発現が観察された。これらの結果はAQPは歯根膜細胞の変形・移動に関与しておることが示唆された。対合歯を抜去した歯根膜廃用萎縮モデルでは、抜歯後、3週まで挺出が持続し、歯牙の挺出と共に歯根膜幅、歯槽骨表層AQP陽性細胞数も減少した。また、挺出と共に歯根セメント質表層のAQPの発現にも変化が見られた。これらの結果は、歯の挺出に伴い機械的ストレスの減少が予測されることから、AQPは歯根膜の機械的ストレスの変化に伴って発現が変化した可能性が示唆された。これらの形態学的データの客観的な解析のために、歯根膜特有のパラメーターを設定し、評価する方法を確立し、客観的、数値的、統計学的解析を試みようとしている。歯は歯根セメント質と歯槽骨が歯根膜によって柔軟にかつ強靭に結ばれることによって機能を発揮する。これらの複合組織が構成される発生メカニズムと、組織に障害が起こった際の歯牙ー歯根膜-歯槽骨複合体の機能的な再生については不明な点が多い。我々は免疫組織化学を用いた解析により、セメント質への歯根膜線維の埋入、および固有歯槽骨へのシャーピー線維の埋入に、アクアポリン(AQP)蛋白陽性細胞が直接関与することを明らかにし、AQP陽性細胞が歯牙-歯周靭帯-固有歯槽骨複合体を形成するのに重要な役割を果たしていることを明らかにしつつある。臨床的な視点から、様々な病的状態における歯根膜でのAQP陽性細胞の動態を明らかにするため、臨床実験モデルを確立し、形態学的に解析した。咬合性外傷モデルからは、咬合性外傷3日後にAQP陽性細胞が歯根膜全体に現れ、硝子様変性の後、AQP陽性細胞による変性部の被包化が起こり、14日後には歯周組織の再生は完了していた。また、電顕を用いた微細形態学的な解析では、外傷後の歯根膜線維芽細胞の偽足先端部にAQPの発現が観察された。これより、AQPは歯根膜細胞の変形・移動に関与していることが示唆される。対合歯を抜去した歯根膜廃用萎縮モデルでは、抜歯後3週まで挺出が持続し、歯牙の挺出と共に歯根膜幅、歯槽骨表層のAQP陽性細胞数が減少した。また、挺出と共に歯根セメント質表層のAQP陽性細胞の発現にも変化が見られた。これらの結果は、歯の挺出に伴い、対合歯からの持続的、機械的ストレスの減少が予測されることから、AQPは歯根膜の機械的ストレスの変化に伴って、発現が変化した可能性が示唆された。また形態学的データの客観的な解析のため、歯根膜特有のパラメーターを評価する方法を確立し、これらの客観的数値的、統計学的解析を行った結果、歯根膜線維の埋入には、破骨細胞が必須である可能性が示唆された。歯根膜細胞と腱細胞の相同性に着目して歯周組織再生の可能性を探る目的で、骨組織形態計測法を歯槽骨の発生に応用し歯槽骨表面の解析を行った。ラットでは歯槽骨の発生は幼弱歯槽骨(線維骨)に直接歯根膜線維が埋入されるのではなく、15日齢頃、歯根膜線維と歯槽骨との連結の前に歯胚歯槽窩の上部に破骨細胞の出現が起こり、その吸収面に歯根膜線維が埋入された。この歯根膜線維面はその後、歯槽骨全体に拡大して、35日齢以降定常状態に入ることが示唆された。歯根膜線維の埋入には、破骨細胞の出現が必須である可能性が示唆された。臨床実験モデルの客観的、数値的評価のために独自に歯根膜形態計測プログラムを作製した。これにより、細胞数、歯根膜幅、歯牙挺出量の客観的評価が可能となった。歯根膜廃用性萎縮モデルでは、歯牙の挺出、歯根膜厚の菲薄化が統計学的に明らかとなり、歯槽骨表層細胞でのアクアポリンの発現は廃用性萎縮に伴い低下していることが明らかになった。また、骨芽細胞数、および破骨細胞数にも著明な変化が見られることが明らかになった。
構造解析を基盤としたタイトジャンクションクローディンファミリーの分子生理学的解析

上皮細胞は、多細胞生物の体内外表面をおおい、皮膚・肝臓・腎臓などの主要な機能と構造を担う生体内最多の細胞群である。上皮細胞は、細胞間接着装置で互いに結合し、上皮細胞シート構造を構築する。上皮細胞は高度に分化しつつシート構造をつくることで、皮膚のように体内と体外のバリアとなったり、腸管上皮のように栄養を吸収しながらも、一度吸収された栄養分が腸管内に戻らない仕組みを形成している。上皮細胞シートの形成は、上皮細胞間に、クローディン(Cldn)ファミリータンパク質により構築されるタイトジャンクション(TJ:密着結合)が存在する。TJは、Cldn分子の重合により形成されるストランド構造により細胞間透過性を制御することで、生体機能のための組織微小環境を構築する。そのことは逆に、TJ機能が破綻すると、適切な生体微小環境が構築されず、その結果として、生体の機能不全とさまざまな病的状態が生じることを示す。申請者は、複数のCldnノックアウト(KO)マウスを解析することで、TJ機能がバリアばかりでなく栄養吸収や肝胆汁循環など生体の正常な機能に欠かせないことを示してきた。本申請では、これまでに確立したノックアウトマウスの解析をさらに進めることで、Cldnの生体機能の解明を進める。しかし、単一CldnのKO解析では、欠失したCldnそのものの機能を直接みているか、残ったCldnの機能を見ているか、明確に示すことは不可能な場合が多い。そこで同時に、ゲノム編集技術を用いてCldnのない細胞を確立し、1つ1つのCldnサブタイプの機能と構造の理解を目指す。(1)ゲノムの編集技術を用いて、Cldnの発現の少ないあるいは欠失した細胞の樹立を進め、単一Cldnの解析を進める。本系の進行を進めている。(2)Cldnのノックアウトマウス解析を進めた。本年度は特に、胃に発現の多いCldnと、肺に発現の多いCldnのノックアウトマウスの解析を進めた。胃のCldnでは、長期のTJ機能障害では、初期の胃上皮細胞のバリア障害により生じた、活動性炎症をともなうSPEMと呼ばれる化生性変化が、週齢を重ねるにつれ、特定のサイトカインの分泌をともないながら慢性炎症化すること、炎症の持続が次のサイトカインにより幹細胞性を獲得した上で、さらに他のサイトカインの誘導により腫瘍を形成する状態を詳細に検討した。肺に発現の多いCldnについては、その表現型解析を進め、肺胞を形成する特定の細胞の増殖亢進を見出している。また、肺胞内での特定物質の濃度上昇の有無の検討など進めている。本マウスは、特に、LPSなどを用いた感染模倣実験に対する感受性が高く、肺のバリア障害が原因の1つと考えられる。しかし、易感染性を示す原因として、複数の理由が示唆されるため、詳細な検討がさらに必要である。(3)上皮細胞間の水の透過性の定量的実験は、生体における細胞間バリア機能上欠かせず重要な実験である。そのためのシステムの構築を進めている。現状では、トリチウム水を用いた透過性実験の系を樹立、計測を行っている。平成30年度には、以下の計画を遂行予定である。(1)解析に適した細胞系統の樹立:Cldnの発現の少ないまたは欠失した上皮細胞系の樹立と解析を進める。(2)微小な電気信号や水分子出納を捉えられる生理学的装置の確立:Cldn15の結晶構造が解かれたことから、Cldn15がつくるTJ-ポアの構造予測が可能となった。選択性に関わる重要なアミノ酸の位置推定も可能であるが、実験的な検証が必要である。細胞間に異なるCldnを発現するヘテロの細胞間TJの機能を知りたい場合、2細胞の間にTJを構築し、その部分の生理学的な解析をすること等が必要である。また、TJ間の水の透過性は、上皮組織の浸透圧や、さまざまなサイトカインの濃度の変動などとも関連し、重要である。水の透過性を測定する系を樹立する。現在、アイソトープを用いて進めている系を、改良する。(3)生物学的な機能との相関をin vitroの系で再現するorgan on chipシステムの確立:CldnKO細胞を得て、クローディンサブタイプごとの特性が理解されたら、それぞれのサブタイプが、生体内の種々の恒常性を維持可能か、可及的純粋にTJ特性を取り出して、生体内を模倣したシステムで、検討できるorgan on chip法の導入を進める。(4)CldnKOマウスの解析を進める。上皮細胞は、多細胞生物の体内外表面をおおい、皮膚・肝臓・腎臓などの主要な臓器の機能と構造を担う生体内最多の細胞群である。上皮細胞間には、クローディンファミリー蛋白質により構築されるタイトジャンクションが存在し、細胞間バリアが構築されることで、組織の微小環境と生体機能が確立する。逆に、TJ機能が異常になるとさまざまな病的状態に直結する。最近報告されたCldnの高分解能での構造解析が報告された。これまでの理解を大きく超えて、TJの構造と機能の理解が進んだ。本申請では、さらに、安定した結晶の構造と、生体内でのダイナミックな分子運動により生じる機能との違いは、高精度な細胞実験を用いて、比較検証する必要がある。本申請は、精緻な実験を積み上げることで、TJの理解を推進するものである。

上記目的のために、個々のCldnの検討に適した細胞の検討と樹立、微小な電気信号や水出納を捉えられる生理学的装置の構築、生理学的な機能をin vitroで再現するorgan on chipシステムの樹立、微小環境の重要性を系統的に検証する系の確立、KOマウス解析による生体での検討、などを進める。特に、初年度の本年は、細胞系統の樹立と、KOマウスを用いた生体解析も重点を置く。KOマウスの解析は、これまで、申請者が複数のクローディンの解析を進めてきたが、クローディン2、3を優位なクローディンとして持つ肝臓は、胆汁のフローを検討することで、クローディンの機能と定量解析に結びつけることができる点で、期待される。微小な電気信号/水出納/浸透圧を測定する系についても、樹立を進める。タイトジャンクションの微弱な異常の検討は、十分に進んでいないが、測定系が不十分なためである。こうした点を改善していきたい。本申請の大きな課題は、これまでの定性的なTJ-Cldnの解析を、定量的な解析まで進めることである。そのための実験課題として、Cldnノックアウト細胞の樹立が必要であり、この点については、順次進行している。また、CldnKOマウスの解析についても、順次進行しており、特に、Cldn3KOマウスの解析は、胆汁フローの亢進と、胆石の形成を見た。胆石は、リン酸カルシウム石であり、ヒトで通常見られるコレステロール石とは異なる性状であった。解析を進めると、類洞から毛細胆管へのカルシウムの透過性はほぼWTとKOマウスで差が認められなかったが、KOマウスでは、リンの透過性の亢進が示唆された。このことは、食事による門脈血中のリン濃度が一過性に上昇することで、KOでのみ、門脈から脆弱化したTJバリアを通って毛細胆管にリンの透過性を亢進することが、示唆された。リン酸カルシウム石のできる閾値を超えることで、胆石が生じると考えられた。微弱な組織微小環境変化と、生体機能という観点からは、やや進行が遅れているが、MDCK細胞などをフィルター上に播種したときに、ベーサル側のプロトン濃度の変化はTJ変化に大きく影響するのに対し、アピカル側のプロトン濃度変化はTJ変化に大きな影響を与えないことを見出している。こうした点は、炎症が生じたときなど、間質pH変化とタイトジャンクションの透過性変化を介して、次の炎症の特性を決める可能性があり、興味深いが、十分な定量的な解析にまで至っていない。in vitroでの解析に持ち込むことがこうした解析には良いと思われるので、organ on chipの解析など、クローディンTJが決める微小環境と生体反応を直接に観察できる系の確立を目指していく。上皮細胞は、多細胞生物の体内外表面をおおい、皮膚・肝臓・腎臓などの主要な機能と構造を担う生体内最多の細胞群である。上皮細胞は、細胞間接着装置で互いに結合し、上皮細胞シート構造を構築する。上皮細胞は高度に分化しつつシート構造をつくることで、皮膚のように体内と体外のバリアとなったり、腸管上皮のように栄養を吸収しながらも、一度吸収された栄養分が腸管内に戻らない仕組みを形成している。上皮細胞シートの形成は、上皮細胞間に、クローディン(Cldn)ファミリータンパク質により構築されるタイトジャンクション(TJ:密着結合)が存在する。TJは、Cldn分子の重合により形成されるストランド構造により細胞間透過性を制御することで、生体機能のための組織微小環境を構築する。
抗癌剤封入リポソームの腹腔内投与における抗腫瘍効果に関する研究

われわれは、固形腫瘍に対する化学療法の選択的抗腫瘍効果増強を目的として人工生体膜モデルのリポソームに抗癌剤を封入した治療の検討を行ってきた。今回は、リポソーム表面に腫瘍関連モノクロナール抗体を結合させ、腫瘍選択性の向上を目的とした。さらに投与経路を腹腔内とすることで、その抗腫瘍効果、特に腹膜播種腫瘍の抑制、また、腸管癒着の抑制効果などの検討を計画した。今年度の成果は、1.アドリアマイシン封入単層リポソームを作製した。2.1.で得られたリポソームの表面に抗AFPモノクロナール抗体を結合させた。4.ヌードマウスにてAFP産生ヒト肝癌株NUEの腹膜播種モデルを作製した。以上であるが、今後は治療実験としてヌードマウスの腹腔内に2.で得られたアドリアマイシン封入リポソームを5mg/kg投与しアドリアマイシンの体内動態、腹膜播種腫瘍への腫瘍効果の検討を行う。さらに腸管の癒着への影響も検討する。
活性化血小板膜を基盤とした血栓溶解活性発現の多様な調節機構の解析

我々はイメージング手法を用い血管内皮細胞上と同様に活性化血小板膜表面に組織型プラスミノゲンアクチベータ(tPA)と共にプラスミノゲンがリジン結合部位(LBS)依存性に集積し、血小板膜が線溶開始起点として機能することを見出した。本促進効果には膜表面タンパクやフィブリンのC末端リジンが関わることも示した。生体にはこれを標的とするカルボキシペプチダーゼであるトロンビン活性化線溶阻害因子(TAFI)が存在することから、TAFIの活性化に必須のTMを発現する血管内皮細胞および血小板上では逆に線溶阻害も起こり得る。本研究では線溶の時空間的制御機構を解析することを目的とした。蛍光標識プラスミノゲン、tPA、フィブリノゲンの存在下で多血小板血漿を組織因子とCaCl2で処理し、フィブリン網の形成とその溶解過程を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。活性化血小板膜表面へのtPAとプラスミノゲンの集積、及び同部位から開始する溶解縁へのプラスミノゲンの集積を伴うフィブリン溶解を確認した。可溶性TM存在下ではフィブリン形成と初期のプラスミノゲンの集積は同様であったが、以降の集積の増幅は認めず、溶解時間は血小板数依存性に著明に延長した。可溶性トロンボモジュリンの効果および血小板数依存性の溶解時間の延長は、TAFIa阻害薬及びTM・トロンビン結合拮抗抗体(中和抗体)により消去された。これより血小板発現TMあるいは可溶性TMに結合したトロンビンにより活性化されたTAFIが、線溶活性を抑制する機構が明らかになった。TMは同時にプロテインCを活性化し活性化凝固因子V & VIIIを限定分解することにより抗凝固活性も示す。種々濃度の可溶性TMの効果の検討により低濃度では抗凝固活性よりも抗線溶活性が強く発現することも明らかになった。本研究の概要は、血栓(線維素)溶解(線溶)過程における血小板の役割を解析することである。我々はイメージング手法を用い血管内皮細胞上と同様に活性化血小板膜表面に組織型プラスミノゲンアクチベータ(tPA)と共にプラスミノゲンがリジン結合部位(LBS)依存性に集積し、血小板膜が線溶系活性化を促進し溶解開始起点として機能することを見出した。本効果は本来血管内皮細胞上に発現しトロンビン活性化線溶阻害因子(TAFI)の活性化に関わるトロンボモジュリンにより消失することも証明した。血管内皮細胞上の線溶活性発現を、標識プラスミノゲンの集積とフィブリン網の溶解で解析した。血管内皮細胞の存在下及び非存在下で、蛍光標識プラスミノゲン、組織型PA、フィブリノゲンの存在下で多血小板血漿を組織因子とCaCl2で処理し、フィブリン網の形成とその溶解過程を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。活性化血小板膜表面からのフィブリン形成とともに、同部位へのtPAとプラスミノゲンの集積、さらには同部位から開始する溶解縁へのプラスミノゲンの集積を伴うフィブリン溶解を認めた。可溶性トロンボモジュリン存在下ではフィブリン形成と初期のプラスミノゲンの集積は同様であったが、以降の集積の増幅は認めず、溶解時間は著明に延長した。トロンボモジュリンの効果は、活性化TAFI(TAFIa)阻害薬及びトロンボモジュリン・トロンビン結合の拮抗抗体により消去された。今回血管内皮細胞存在下では、トロンボモジュリン添加の影響は小さかったが、活性化TAFI(TAFIa)阻害薬及びトロンボモジュリン・トロンビン結合の拮抗抗体により、プラスミノゲンの集積の改善、溶解時間の短縮ともに強く認められた。これにより血管内皮上のトロンボモジュリンがTAFIの活性化を促進し線溶活性を抑制している事実が確認できた。血管内皮細胞上でのフィブリン網の形成溶解過程のイメージング解析に成功しており、今後各機能分子の動態を解析することが可能となった。また、トロンボモジュリン・トロンビン複合体形成を阻害する中和抗体、及びTAFIa阻害薬の使用により、血管内皮上に発現するトロンボモジュリンの影響の解析にも成功した。今後、血小板に発現するトロンボモジュリンの影響との役割の分担の解析が可能となっている。またPAI-1欠損iPS細胞からの血管内皮細胞及び脂肪細胞への分化誘導には成功しており、PAI-1欠損血小板産生の条件設定も開始した。これらの進捗状況より「おおむね順調」と判断した。本促進効果には膜表面タンパクやフィブリンのC末端リジンが関わることも示し、生体にはこれを標的とするカルボキシペプチダーゼであるトロンビン活性化線溶阻害因子(TAFI)が存在することから、TAFIの活性化に必須のTMを発現する血管内皮細胞および血小板による線溶の時空間的制御機構を解析することを目的とした。

可溶性TM存在下ではフィブリン形成と初期のプラスミノゲンの集積は同様であったが、以降の集積の増幅は認めず、溶解時間は著明に延長した。また血小板数を増やすと溶解時間は延長した。可溶性トロンボモジュリンの効果および血小板数依存性の溶解時間の延長は、TAFIa阻害薬及びTM・トロンビン結合拮抗抗体(中和抗体)により消去された。これより血小板発現TMあるいは可溶性TMに結合したトロンビンにより活性化されたTAFIが、線溶活性を抑制する機構が明らかになった。血管内皮細胞存在下では添加TMの影響は小さかったが、活性化TAFI(TAFIa)阻害薬及び中和抗体により、プラスミノゲンの集積の改善、溶解時間の短縮ともに強く認められた。これにより血管内皮上のTMもTAFIの活性化を促進し線溶活性を抑制している事実が確認できた。血管内皮細胞上でのフィブリン網の形成溶解過程のイメージング解析に成功しており、各機能分子の動態の解析も進んでいる。また中和抗体、及びTAFIa阻害薬の使用により、血管内皮上や血小板上に発現するTMの影響の解析にも成功した。TAFIも凝固・線溶過程において特異な局在を示す事実も最近確認した。今後、TMとTAFIの局在の変化を解析し、線溶系の時空間的な制御機構の詳細を明らかにできると期待する。これらの進捗状況より「おおむね良好」と判断した。我々はイメージング手法を用い血管内皮細胞上と同様に活性化血小板膜表面に組織型プラスミノゲンアクチベータ(tPA)と共にプラスミノゲンがリジン結合部位(LBS)依存性に集積し、血小板膜が線溶開始起点として機能することを見出した。本促進効果には膜表面タンパクやフィブリンのC末端リジンが関わることも示した。生体にはこれを標的とするカルボキシペプチダーゼであるトロンビン活性化線溶阻害因子(TAFI)が存在することから、TAFIの活性化に必須のTMを発現する血管内皮細胞および血小板上では逆に線溶阻害も起こり得る。本研究では線溶の時空間的制御機構を解析することを目的とした。蛍光標識プラスミノゲン、tPA、フィブリノゲンの存在下で多血小板血漿を組織因子とCaCl2で処理し、フィブリン網の形成とその溶解過程を共焦点レーザー顕微鏡で解析した。活性化血小板膜表面へのtPAとプラスミノゲンの集積、及び同部位から開始する溶解縁へのプラスミノゲンの集積を伴うフィブリン溶解を確認した。可溶性TM存在下ではフィブリン形成と初期のプラスミノゲンの集積は同様であったが、以降の集積の増幅は認めず、溶解時間は血小板数依存性に著明に延長した。TMは同時にプロテインCを活性化し活性化凝固因子V & VIIIを限定分解することにより抗凝固活性も示す。種々濃度の可溶性TMの効果の検討により低濃度では抗凝固活性よりも抗線溶活性が強く発現することも明らかになった。今後は、TAFI活性化の時空間的制御を検討する。現時点では蛍光標識TAFIの経時的な局在の変化を追跡しており、今後その活性化とTAFIa活性発現部位の経時的な局在の変化を解析する。またTAFI欠損GFP発現マウスの作成に着手する。
細胞機能および細胞分化制御のための光技術の創製

Photodynamic Therapy(PDT)は、光感受性物質を取り込んだ癌細胞などに波長特異的なレーザーを照射し細胞死を誘導する治療法である。PDTによって細胞が死に至る場合、細胞内で炎症やアポトーシスに関するシグナル伝達が亢進する。一方、再生医療や創薬に利用が期待されている幹細胞の研究分野では、幹細胞の分化・増殖はその周囲の微小環境に反応して変化することが知られている。そこで本研究では、骨髄間葉系幹細胞や骨芽細胞前駆細胞の骨芽細胞分化を用いて、細胞死に至らない低レベルレーザーを用いたPDT(Low dose PDT)が細胞の分化促進におよぼす影響を調べた。細胞自身が有する生理機能や分化能を非侵襲的に制御することは、疾病の治療・予防にとどまらず、基礎生物医学実験などにも有用な制御ツールとなる。そこで、細胞機能や分化誘導を制御する方法として光技術を応用することが本研究の目的である。現在、幹細胞をはじめとした細胞の機能制御や分化誘導方法として、遺伝子工学技術や薬剤添加による方法などが行われている。本研究提案は遺伝子組み換えや毒性または副作用を発現する薬剤を利用しない革新的な方法である。本研究期間では、骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を促進させた研究成果を公表した(Scientific Reports, 5, 13114 (2015))。骨髄間葉系幹細胞は再生医療に用いる細胞源として有望であるが、患者さんから採取後、細胞の増殖と分化に時間を要し、患者さんの待機期間が長期化していることが課題となっている。本研究で使用した分化促進方法に用いた光感受性薬物は生体親和性が高く、細胞毒性はほとんど見られなかった。また、光技術とこの薬物を用いて骨髄間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化過程を詳細に研究した結果、Activator Protein-1(AP-1)という転写因子が骨芽細胞分化に必須であることを明らかにした。本研究成果は、幹細胞生物学に新しい方法論を提案できたと考えている。前年度から使用しているハイスループット光照射システムを改良し、レーザー光源を用いた細胞への光照射をさらに効率よく、かつ、光照射以外のストレスが細胞へ負荷しないシステムを活用できている。技術職員を雇用し、幅広い条件で網羅的解析を行い、研究進捗を図ることができた。これらの結果は、当初の予想以上の成果を生み出し、また新たな事象の発見につながっている。得られた成果を論文にまとめており、平成27年度中には投稿する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。光生物学新規ハイスループット光照射システムにより、レーザー光源を用いた細胞への光照射を効率よく、かつ、光照射以外のストレス(液体培地温度の上昇など)が細胞へ負荷しないシステムを活用できた。細胞へ光照射後に発現タンパク質の網羅的解析を行うことができ、種々のmRNA発現量の増減を確認できた。次年度開始直後から2か月間、技術補佐員を雇用し、研究の進展を図るため。技術補佐員雇用のための人件費として使用する計画である。平成25年度分の物品費、人件費及び役務費の支払予定額が85万円あるため、次年度使用額は15万円である。次年度開始すぐに購入したい消耗品を計画しているため、15万円を次年度使用分とした。次年度助成金請求額(30万円)とあわせて、年度開始当初に消耗品費として25万円、役務費用として20万円を使用する計画である。