hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
圧倒的な結合親和性を有する糖部架橋型人工核酸の創製と核酸医薬への応用

核酸医薬の劇的な活性向上を目指し、相補鎖核酸に対する圧倒的な結合親和性を有する人工核酸として、糖部架橋型核酸2',4'-BNA/LNAに三環性シトシン誘導体(フェノキサジン塩基)を導入したBNAP (2',4'-Bridged Nucleic Acid with Phenoxazine)シリーズを開発した。一方で新たに開発した9-アザフェノキサジン人工塩基核酸(9-TAP)は、オリゴ核酸中で様々な金属イオンと安定な金属錯体型塩基対を形成することを見出した。9-TAPはDNAナノテクノロジー等にこれまでにない動的変化を誘起させる新たな革新的分子としての応用が期待される。“圧倒的な二重鎖形成能"をコンセプトとして、糖部架橋型人工核酸2',4'-BNA/LNAと三環性シトシン型人工塩基(フェノキサジン塩基)を融合したBNAP (2',4'-Bridged Nucleic Acid with Phenoxazine base)を設計し開発してきた。圧倒的な二重鎖形成能の獲得は、オリゴ核酸への修飾数の抑制・遺伝子発現阻害の大幅な向上が期待され、核酸医薬として画期的な分子技術の創出につながるものと考えられる。初年度はBNAPヌクレオシドの合成とオリゴヌクレオチドへの導入、及び基礎的物性評価を主に実施した。BNAPの合成経路を種々検討した結果、最適条件の確立とBNAPヌクレオシドの合成に成功した。DNA自動合成機を用いてBNAPをオリゴヌクレオチドへ導入を試みたところ、首尾よく導入が可能であった。BNAPを組み込んだオリゴヌクレオチドの相補鎖核酸に対する二重鎖形成能を評価したところ、BNAPは適切な前後配列下で、2',4'-BNA/LNA、及びフェノキサジン人工塩基を上回る優れた二重鎖形成能を有することが明らかとなった。そこでBNAPの優れた二重鎖親和性を詳細に解明すべく、円二色性(CD)スペクトル測定、及び熱力学パラメータを算出したところ、BNAPは2',4'-BNA/LNAとフェノキサジン塩基の性質を併せ持つことが明らかとなった。またBNAPオリゴヌクレオチドの分解酵素に対する安定性を評価したところ、BNAPは天然型核酸や2',4'-BNA/LNA,フェノキサジン塩基よりも有意に耐性が向上することが分かった。以上、BNAPは核酸医薬に対して有望な基礎特性を有することを見出した。研究実施計画に基づき、平成27年度は以下の4点を重点的に検討した。(1) BNAPヌクレオシドの合成と反応工程の最適化:BNAPヌクレオシドの合成経路、反応条件、保護基の最適化を図ることで、安定に大量供給可能な合成法を確立した。(2) BNAPをオリゴヌクレオチドへ導入:DNA自動合成装置を用いてBNAPをオリゴヌクレオチドへ導入を試み、縮合時間を僅かに延長するのみで効率よく導入が可能であった。また複数・連続導入も問題なく対応可能であった。(3) BNAPオリゴヌクレオチドの二重鎖形成能評価:融解温度(Tm)測定によりBNAPオリゴヌクレオチドの相補鎖DNA、RNAに対する二重鎖形成能を評価したところ、適切な前後配列下でBNAPは2',4'-BNA/LNAやフェノキサジン塩基を上回る優れた二重鎖形成能を有することが分かった。(4) BNAPオリゴヌクレオチドのCDスペクトル・熱力学的パラメータによる解析:BNAPを組込んだ各種配列を有するオリゴヌクレオチド用いて評価したところ、BNAPは2',4'-BNA/LNAとフェノキサジン塩基の特徴を併せ持つことが見出された。以上、本年度は当初の実施計画をおおむね満足する成果が得られた。次年度では本年度の成果に基づき、更なる二重鎖形成能向上を目指した新たなBNAP誘導体の開発と、細胞を用いた遺伝子発現抑制効果を検討する。平成28年度は、BNAPで得られた知見に基いて更なる強化を図った人工核酸分子としてBNAPの9位にアミノエトキシ(AEO)基を導入したBNAP-AEOを設計し、合成と基礎的物性評価を実施した。合成はBNAPで確立した合成法を応用することで効率よく達成し、またDNA自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドへの導入にも成功した。BNAP-AEOを組み込んだオリゴヌクレオチドは、相補鎖DNAやRNAに対してBNAPを遥かに上回る優れた二重鎖形成能とグアニン塩基に対する高い塩基識別能を有することを見出した。一方で新たなコンセプトとして、核酸医薬に相応しい核酸塩基部の高機能化を図るべく、フェノキサジン塩基の9位に窒素原子を導入した9-アザフェノキサジン人工塩基核酸を設計し、合成・評価を実施した。その結果、既存のフェノキサジン塩基と同様の優れた二重鎖形成能を獲得するとともに、三重鎖核酸においてチミン様構造体として機能し、A:T二重鎖において優れた結合親和性を示した。さらに酸性条件下でその安定性が有意に向上した。9-アザフェノキサジン人工塩基核酸は従来のmRNAを標的としたアンチセンス法のみならず、DNA二重鎖を標的としたアンチジーン法への応用も期待される。研究実施計画に基づき、平成28年度は以下の4点を重点的に検討した。(1) BNAP-

AEOの合成:BNAPの合成で確立された実用的合成法を応用することで、効率よくオリゴ導入前駆体となるアミダイト体の合成を達成し、DNA自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドへの導入に成功した。(2) BNAP-AEOの物性評価:BNAP-AEOを組み込んだオリゴヌクレオチドの二重鎖形成能を評価したところ、BNAPを圧倒する優れた二重鎖形成能を有していた。特にBNAP-AEOの隣接塩基がピリミジン塩基の場合にその効果が高いことが分かった。更に対面塩基に対する塩基識別能を評価したところ、マッチ塩基であるグアニンに対して極めて高い識別能を有することが見出された。また、CDスペクトル測定や熱力学的パラメータ解析を実施し、BNAP-AEOは二重鎖構造に大きな構造変化を誘起することなく安定な二重鎖形成能を獲得していることが見出された。(3) 9-アザフェノキサジン人工塩基核酸の合成:オリジナルのフェノキサジン塩基核酸の合成法を踏襲しつつ本分子に最適化した反応条件を確立し合成を達成した。(4) 9-アザフェノキサジン人工塩基核酸の物性評価:フェノキサジン人工塩基核酸と同様な優れた二重鎖形成能を保持しつつ、一方で異なる興味深い蛍光特性や塩基識別能を有することを見出した。特に三重鎖核酸中においてチミン様アナログとして、A:T二重鎖に対して優れた認識能を有し、その効果は酸性条件下で向上することを見出した。以上、本年度は当初の実施計画を概ね満足する成果が得られた。9-アザフェノキサジン人工塩基核酸は計画書の段階で当初想定していなかった新たな分子であり、本研究をより推進可能にするものと期待される。最終年度は本年度の成果に基づき、細胞を用いた遺伝子発現抑制効果を中心に検討する予定である。核酸医薬の劇的な活性向上を目指し、相補鎖核酸に対する圧倒的な結合親和性付与を期待した人工核酸として、糖部架橋型核酸2',4'-BNA/LNAに三環性シトシン誘導体(フェノキサジン塩基)を導入したBNAP (2',4'-Bridged Nucleic Acid with Phenoxazine)シリーズを開発してきた。前年度までにBNAP及び9位にアミノエトキシ(AEO)基を導入したBNAP-AEOの合成を達成し、基礎的な物性評価を実施した。今年度はBNAP-AEOを組込んだオリゴ核酸の相補鎖核酸に対する二重鎖形成能を詳細に評価したところ、相当する天然のシチジン体よりも約1万倍、2',4'-BNA/LNA-mCよりも約150倍高い圧倒的な親和性を有することを見出した。更にBNAP-AEOの核酸医薬への実用化を目指すべく、合成法を最適化し大量合成を実施した。現在、細胞を用いた遺伝子発現抑制評価に向けて、BNAP-AEOを組込んだホスホロチオエート型オリゴ核酸の合成準備を進めている。一方で新たな着想により、フェノキサジンの9位に窒素原子を導入した9-アザフェノキサジン人工塩基核酸(9-TAP)も開発している。9-TAPを組込んだオリゴ核酸は、シトシン誘導体であるにも関わらず、チミン誘導体としての特性も有することを見出した。今年度は9-TAPを組込んだオリゴ核酸を、各種金属イオン存在下で、その二重鎖形成能の評価を実施したところ、9-TAPは様々な金属イオンと特異的な金属錯体型塩基対を形成することを見出した。特に9-TAP同士での金属錯体型塩基対は、天然型核酸で形成される金属錯体型塩基対よりも圧倒的に安定な親和性を有することが分かった。
薬理活性を持つ高度不飽和脂肪酸の固定キャリヤ-膜を利用する分離プロセスの開発

高分子多孔質膜の濡れ特性を利用した高性能な高度不飽和脂肪酸の抽出装置の試作を行った。本抽出装置は、疎水性膜と親水性膜からなり、中央部分に原料溶液を供給するタイプのものである。分離対象の溶質系としてはオレイン酸/リノール酸およびそれらのメチルエステル系を用いた。有機相はヘプタンであり、親水性相としてアセトニトリルを用いた。溶質成分の分離特性について実験的検討とシミュレーションを行い、次の結論を得た。1.試作装置による抽出実験から、中央フィードによる供給方法が有効であり、その場合回収部には抽出相に濡れる膜を、濃縮部には原料相に濡れる膜を使用すれば効率が良いことがわかった。オレイン酸とリノール酸、およびそれらのメチルエステルを溶質成分に用いた実験結果から、装置の回収部と濃縮部を十分に機能させるためには、溶質の油-水相間の分配が重要であることが明らかとなった。2.膜の長さやアセトニトリル相流量を変化させてシミュレーションを行った結果、メチルエステルの分離特性は疎水性膜の長さに大きく依存し、親水性膜の長さの影響は小さかった。また、脂肪酸の分離特性は、疎水性膜および親水性膜の両方の長さに依存していた。アセトニトリル流量を大きくすると、一般的にアセトニトリル相での純度は低下するものの、ヘプタン相での純度は増加することが明らかとなった。さらに、脂肪酸や脂肪酸のメチルエステルを用いた実験結果は、方法で得られた計算結果と良好に一致した。従って、このような膜抽出法による高度脂肪酸の分離について、操作条件の設計指針が確立できたといえる。魚油を加水分解して得られる脂肪酸混合物から高純度の高度不飽和脂肪酸を選択的に分離精製するための、銀イオン固定キャリヤ-膜と膜抽出との複合プロセスの開発を目的に,本年度はこれらを個別に研究し次の結果を得た。1.固定キャリヤ-膜の開発市販のイオン交換膜(ナフィオン)を利用し作製した銀イオン固定膜を用いて,脂肪酸混合物からのDHAの分離を試み,溶媒としてエタノールを用いると,DHAの選択分離が可能なことを見つけた。さらに,分離係数,促進係数ともに溶媒中の水分率に大きく影響を受けることを見つけた。2.膜抽出装置の開発親水性中空糸膜と疎水性中空糸膜を用い,膜の濡れ特性が分離性能に及ぼす影響を検討した。すなわち,ヘプタン-アセトニトリルの2溶媒系でオレイン酸メチルとリノール酸メチルの抽出分離を行い,物質移動特性を検討した結果,目的成分により膜を使い分ける必要があることを明らかにした。DHAのような高度不飽和脂肪酸は極性溶媒に比較的よく溶けるため,親水性膜を用いた方が分離性能がよいことを確認した。このような結果を踏まえ,純度と回収率を同時に向上できるように濡れ特性のことなる2種の膜を組合わせた膜抽出装置の試作を行い,その安定した操作特性を検討した。

2.膜の長さやアセトニトリル相流量を変化させてシミュレーションを行った結果、メチルエステルの分離特性は疎水性膜の長さに大きく依存し、親水性膜の長さの影響は小さかった。また、脂肪酸の分離特性は、疎水性膜および親水性膜の両方の長さに依存していた。アセトニトリル流量を大きくすると、一般的にアセトニトリル相での純度は低下するものの、ヘプタン相での純度は増加することが明らかとなった。さらに、脂肪酸や脂肪酸のメチルエステルを用いた実験結果は、方法で得られた計算結果と良好に一致した。従って、このような膜抽出法による高度脂肪酸の分離について、操作条件の設計指針が確立できたといえる。
海馬CA1における脳虚血に対する 全身麻酔薬の保護効果

脳虚血においては、NMDAレセプタが活性化されることが知られている。前年度の検討結果から、吸入麻酔薬およびケタミンはNMDAレセプタを抑制するが、バルビツレートおよびプロポフォールは作用しないことが明らかとなった。したがってNMDAレセプタの抑制という観点からは、吸入麻酔薬およびケタミンが虚血における脳保護に対し有効である可能性が示唆されたが、この点を明確にするために、本年度は虚血脳モデルを用いた検討を行った。ラット海馬スライスのSchaffer collateral fiberに刺激電極を置き、CAl領域に細胞外電極を刺入して、集合電位(PS)を記録した。100μMNaCNを灌流してchemical hypoxiaのモデルを作成し、全身麻酔薬の保護効果について検討した。実験は37°Cで行った。NaCNの灌流(15分)は、PS amplitudeを不可逆性に抑制した。30分間のケタミン(1mM)前処置により、NaCNの効果が減弱する傾向を示したが統計学的な有意差は認められなかった。これは、(1)chemical hypoxiaの効果が脳スライス間でばらつく、(2)chemical hypoxiaとhypoxichypoxiaで細胞レベルの病態が異なる、(3)全身麻酔薬単独では充分な脳保護効果を得られない、などの理由によると考えられた。今後は、(1)低濃度のCNを長時間灌流する、あるいは(2)窒素ガスによるhypoxichypoxiaを誘導することにより、より安定した脳虚血モデルを作成して検討を重ねたい。さらに全身麻酔薬に低体温を付加し、脳保護効果について検討したい。脳虚血においては、NMDAレセプタが活性化されることが明らかにされているので、本年度は、NMDAレセプタに及ぼす全身麻酔薬の作用を検討した。ラット海馬スライスのSchaffer collateral fiberに刺激電極を置き、CA1領域に細胞外電極を刺入して、field potentialを記録した。選択的拮抗薬を用いてnon-NMDAおよびGABAレセプタをブロックすることにより、NMDAレセプタを単離して検討した。吸入麻酔薬(ハロセン、エンフルレン、イソフルレン、セボフルレン)は専用気化器を用いて気化させた後、灌流液中に溶解して適用した。バルビツレート、ケタミンは灌流液中に直接溶解した。プロポフォールは、イントラリピッド^Rに一旦溶解した後灌流液中に溶解した。本年度の検討結果から、吸入麻酔薬およびケタミンはNMDAレセプタを抑制するが、バルビツレートおよびプロポフォールは作用しないことが明らかとなった。したがってNMDAレセプタの抑制という観点からは、吸入麻酔薬およびケタミンが虚血における脳保護に対して有効である可能性が示唆されたが、この点を明確にするために、次年度は虚血脳モデルを用いた検討を行う。
枯草菌オートリシンオペロンの転写調節と多面形質遺伝子の作用部位

多面形質変異であるsin(flaD1)変異は、オートリシン(cwlB)オペロンの発現を顕著に抑圧した。この作用がsin(flaD1)遺伝子のcwlBに対する直接作用であるかどうかを検討する為、Sin(FlaD)蛋白をヘパリソ-アガロースカラム、TSKゲルG3000SWXLのHPLCで精製し、cwlB遺伝子とのゲルシフト法による結合実験を行ったところ、結合が知られているaprEのコントロールではゲルシフトが認められたのに対し、cwlBでは認められなかった。本結果はsin(flaD1)変異がcwlBオペロンを直接に制御していないことを示唆している。一方、分解酵素の生産、細胞の繊維状化、運動性の低下、コンピテンスの欠損等に影響を与える変異としてdegS(Hy)、deg〓(Hy)が知られている。これらの多面形質変異のcwlBオペロンに対する作用を、cwlBオペロンの転写開始点、転写量から解析したところ、それらの変異ではσ^Aで転写されるPaプロモーターからの転写には影響しないのに対し、σ^Dで転写されるPdプロモーターからの転写は完全に抑圧された。この効果もまたsigD遺伝子の発現調節を介して制御されているかどうかを検討するため、sigD-lacZ融合遺伝子をdeg〓32(Hy)、deg〓146、△deg〓株に導入し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果deg〓32(Hy)株ではβ-ガラクトシダーゼ活性がまったく認められず、それゆえsigD発現を通じてcwlBオペロンを調節していることが解った。さらに本実験からsigD遺伝子の調節は、リン酸化Deg〓蛋白により行なわれていることを示唆した。枯草菌主オートリシン遺伝子(cwlB)は上流にリポタンパクをコードするlppX遺伝子、オートリシン活性を修飾するタンパクをコードするcwbA遺伝子があるが、cwlB下流以外には適当なターミネーター構造が認められない為オペロンの形成が考えられた。そこで枯草菌からmRNAを抽出し、cwlB遺伝子をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーションを行ったところ、401kbの転写物が認められた。それゆえ転写開始点はlppX上流に存在すると推測される。次にlppX上流領域を種々のサイズで欠失したオートリシンオペロンを持つプラスミドを構築し、オートリシン活性を調べたところ、lppX翻訳開始点上流98bpまでが転写に必要な領域であった。そこでlppXの5'末端住近の配列に相補的なプライマーを合成し、プライマー伸長法により転写開始点を調べたところ、2箇所に転写開始点が認められた。その内上流の転写開始点(Pa)は各種σのコンセンサスとの比較からσ^Aで転写されると考えられる。一方その下流に主要な転写物を作る開始点(Pd)があり、その付近にσ^Dコンセンサス配列が認められた。そこでσ^D転写であるか明瞭にするため、σ^D欠損の枯草菌変異株よりmRNAを抽出し、プライマー伸長分析を行ったところ、σ^D転写間始点からの転写は完全に抑えられた。一方多面形貭の変化を示すsin(flaD)変異株においてcwlBオペロンの転写を調べたところ、σ^A、σ^D両転写開始点からの転写が完全に抑圧された。そしてsin(flaD)変異の標的部位は翻訳開始点から54塩基上流までに存在した。それゆえsin(flaD)変異は転写のレベルでオートリシンの発現を制御していた。多面形質変異であるSin(flaD1)変異は、オートリシン(cwlB)オペロンの発現を顕著に抑圧した。この作用が、sin(flaD1)遺伝子のcwlBに対する直接作用であるかどうかを検討する為、Sin(FlaD)蛋白をヘパリン-アガロースカラム、TSKゲルG3000

SWXLのHPLCで精製し、cwlB遺伝子とのゲルシフト法による結合実験を行ったところ、結合が知られているaprEのコントロールではゲルシフトが認められたのに対し、cwlBでは認められなかった。本結果はsin(flaD1)変異がcwlBオペロンを直接に制御していないことを示唆している。一方、分解酵素の生産、細胞の繊維状化、運動性の低下、コンピテンスの欠損等に影響を与える変異としてdegS(Hy)、deg〓(Hy)が知られている。これらの多面形質変異のcwlBオペロンに対する作用を、cwlBオペロンの転写開始点、転写量から解析したところ、それらの変異ではσ^Aで転写されるPaプロモーターからの転写には影響しないのに対し、σ^Dで転写されるPdプロモーターからの転写は完全に抑圧された。この効果もまたsigD遺伝子の発現調節を介して制御されているかどうかを検討するため、sigD-lacZ融合遺伝子をdeg〓32(Hy)、deg〓146、△deg〓株に導入し、β-ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果deg〓32(Hy)株ではβ-ガラクトシダーゼ活性がまったく認められず、それゆえsigD発現を通じてcwlBオペロンを調節していることが解った。さらに本実験からsigD遺伝子の調節は、リン酸化Deg〓蛋白により行われていることを示唆した。
かご型構造を有する化合物の高選択的な反応を利用した有機-無機ハイブリッドの創製

かご型シルセスキオキサンの高分子に3-メルカプトプロピル基や3-ヒドロキシプロピル基を導入することにより有機ー無機ハイブリッドを合成する。また,かご型シルセスキオキサンを剛直なスペーサーで連結することにより,かご型シルセスキオキサンの外側に大きな空隙を生成する。さらに,かご型シルセスキオキサンに電子求引基や電子供与性基を導入してかご型シルセスキオキサンの電子密度を変化させて反応を制御し,かご型シルセスキオキサンの反応性を制御するための知見を得る。一方,チタンホスホネートクラスターなどのかご型構造を有する化合物を用いた材料調製に応用し,多孔性材料の創製とその機能化を目的として研究を推進する。
局所麻酔薬の神経毒性の神経線維選択性に関する研究

局所麻酔薬の神経毒性の神経線維選択性に関する研究の第一段階で、われわれはラットクモ膜下腔に投与されたリドカインとブピバカインの神経毒性の比較を行った。そしてその結果、われわれのラットモデルで組織学的検討が可能であること、特に電子顕微鏡下での検討が容易に出来、有髄線維と無髄線維の組織学的な検討が可能であることを発見した。第二段階は、ラセミ体のブピバカインの2つの光学異性体であるレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性を同様の方法で行い、光学異性体が神経毒性に与える影響を電子顕微鏡下で有髄・無髄線維ともに観察した。その結果、等価のラセミ体ブピバカインとその光学異性体のレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性には差がないこと、そして3種類の薬剤の神経毒性の影響は有髄線維、無髄線維共に出現することを明らかにした。第三段階では硬膜外腔に投与された局所麻酔薬の神経毒性について観察した。その結果、硬膜外腔に投与した局所麻酔薬の神経毒性も用量依存的におこり、有髄線維、無髄線維共に発現することがわかった。またその組織像から硬膜外腔に投与された局所麻酔薬の神経毒性はくも膜下腔を介して発現することが示唆された。その後、われわれは免疫組織学的手法を用いて、ラットくも膜下腔に投与された局所麻酔薬による有髄線維、無髄線維の損傷の程度を質的に比較することに成功した。予備実験結果は無髄線維の損傷の程度が強かったことを示しており、麻酔作用と同様に毒性も無髄線維が有髄線維より感受性が高い可能性が示唆された。局所麻酔薬の神経毒性の神経線維選択性に関する研究の第1段階で、われわれは当該研究期間の中でラットクモ膜下腔に投与されたリドカインとブピバカインの神経毒性の比較を行った。そしてその結果として、われわれのラットモデルで組織学的検討が可能であること、特に電子顕微鏡下での検討が容易に出来、有髄線維と無髄線維の組織学的な検討が可能であることを発見した。詳細を記すと、この研究では、ラットのクモ膜下腔に等価のリドカインとブピバカインを投与し脊髄神経に与える機能的、組織学的影響を比較すると同時に、電子顕微鏡下で神経線維の種類別に検討した。方法としては、ラットの第4-5腰椎間からクモ膜下カテーテルを挿入した。大きく分けて2つの研究を行い、実験1で0(生食)、0.125、0.25、0.5、1%ブピバカインあるいは0、0.625、1.25、2.5、5%リドカイン20μlを投与し、90分間のtail-flick(TF)値から各薬剤のEC50を算出し相対力価を求めた。実験2ではラットを無作為に3群に分け、生食、10%リドカイン、2.13%フピバカイン20μlを投与し4日間TFテストを施行した。脊髄および脊髄神経根を摘出し、標本を光学および電子顕微鏡で組織学的に評価した。質的評価と共に、既存の神経損傷スコアを用いた定量的評価を光顕下で行った。結果は、リドカインとブピバカインの相対力価は1:4.70であった。リドカイン投与後4日目のTF値の%MPEは49.4±55.1(平均値±標準偏差)で、ブピバカイン後の値-4.1±4.8より有意に高かった。神経根の神経損傷スコアは前者で高く、電顕像でも有髄無髄線維共により強い損傷が認められた。

以上の結果から、等価のリドカインとブピバカインをラットのクモ膜下腔に投与すると、その毒性は機能的および組織学的見地から明らかに前者で強いこと、そしてリドカインによる神経毒性の影響は有髄線維、無髄線維共に出現することが明らかとなった。局所麻酔薬の神経毒性の神経線維選択性に関する研究の第I段階で、われわれはラットクモ膜下腔に投与されたリドカインとブピバカインの神経毒性の比較を行った。そしてその結果、われわれのラットモデルで組織学的検討が可能であること、特に電子顕微鏡下での検討が容易に出来、有髄線維と無髄線維の組織学的な検討が可能であることを発見した。今回は当該研究期間の2年目にあたり、ラセミ体のブピバカインの2つの光学異性体であるレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性を下記の方法で行い、光学異性体が神経毒性に与える影響を電子顕微鏡下で有髄・無髄線維ともに観察した。方法としては、ラットの第4-5腰椎間からクモ膜下カテーテルを挿入した。ラットを無作為に3群に分け、2.5%ブピバカイン、2.5%レボブピバカインと2.5%デキストロブピバカインを毎分2plの速度で1時間持続投与し、4日後にTFテストを施行した。その後、脊髄および脊髄神経根を摘出し、標本を光学および電子顕微鏡で組織学的に評価した。質的評価と共に、既存の神経損傷スコアを用いた定量的評価を光顕下で行った。尚、この実験の前に3種類の局所麻酔薬が等力価であることを証明している。結果は、3種類の麻酔薬投与後4日目のTF値の%MPEは等しかった。神経根の神経損傷スコアも3種類で等しかった。電子顕微鏡像では、3種類の薬剤を投与された馬尾神経が有髄線維、無髄線維ともに同程度の損傷を受けている所見が認められた。以上の結果から、等価のラセミ体ブピバカインとその光学異性体のレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性には差がないこと、そして3種類の薬剤の神経毒性の影響は有髄線維、無髄線維共に出現することが明らかとなった。局所麻酔薬の神経毒性の神経線維選択性に関する研究の第1段階で、われわれはラットクモ膜下腔に投与されたリドカインとブピバカインの神経毒性の比較を行った。その後、ラセミ体のブピバカインの2つの光学異性体であるレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性を同様の方法で行い、光学異性体が神経毒性に与える影響を電子顕微鏡下で有髄・無髄線維ともに観察した。その結果、等価のラセミ体ブピバカインとその光学異性体のレボブピバカインとデキストロブピバカインの神経毒性には差がないこと、そして3種類の薬剤の神経毒性の影響は有髄線維、無髄線維共に出現することを明らかにした。当該年度は3年目にあたり、硬膜外腔に持続的に投与した局所麻酔薬が神経毒性を示す様子を観察した。方法は、ラットに硬膜外カテーテルを挿入し、持続注入時間を変えてリドカインを投与し、4日後に機能テストを施行した。結果は、リドカイン投与後4日目のTF値の%MPEは用量依存的に上昇した。神経根の神経損傷スコアも同様に用量依存的に上昇した。電子顕微鏡像では、馬尾神経が有髄線維、無髄線維ともに同程度の損傷を受けている所見が認められた。以上の結果から、硬膜外腔に投与した局所麻酔薬の神経毒性も神経の種類を問わず発現することがわかった。
膵移植の基礎的研究(特に急速凍結保存とreplicatory activityについて)

本研究は、比較的急速な冷却速度(25°C/分)を用いたラ島の凍結保存法の確立が目的であり、凍結保存ラ島のviabilityについて移植効果、再生能を含め検討した。その結果、インスリン分泌能では従来の緩徐な冷却速度で凍結保存されたラ島と、ほぼ有意差のない状態で保存が可能であった。またラ島の組織学的検索でも凍結保存ラ島には核配列の乱れもなく、対照とした非凍結ラ島と同様の組織像を示し良好に保存されたと考えられた。しかし、生物学的機能としてはほぼ十分に保存されているものの、ラ島のインスリンおよびDNA含有量の結果では、対照とした非凍結ラ島のそれと比較すると約30%の減少が認められ、凍結一解凍過程でラ島細胞は若干の障害(細胞数の減少)を被ることが明らかとなった。この細胞障害は、ラ島細胞内外での氷晶形成により惹起されたと推察されたが、ラ島の凍結保存においては完全には回避できない問題点の一つであり、如何に細胞障害を最小限にとどめるかは、凍結保存を行う上での今後の重要なポイントであろう。凍結保存ラ島の移植実験も本研究で行われたが、凍結保存ラ島1000個の移植で糖尿病ハムスターの血糖値は、移植後直ちに正常に回復し腎摘出するまで正常値を維持した(非凍結ラ島移植では約500個前後で移植効果がみられる)。これまでラ島のviabilityに関しては、インスリンの分泌能のみで評価されていたが、本実験では^3H-thymidineを用いオートラジオグラフィー法を応用して、凍結保存ラ島細胞の再生能についても検索した。凍結保存されたラ島細胞の再生能はin vitroでは2.04±0.21、in vivoでは1.38±0.24であり、対照群と同等の値であった。これにより凍結保存されたラ島も移植後に再生、増殖する可能性があり得ると思われた。以上、本研究によって分離されたラ島は比較的急速な冷却速度(25°C/分)を用いた凍結保存が可能であり、移植後に十分にその生物学的機能を発揮しうると結論した。Wistar系ラットより膵ラ氏島を分離し凍結保存を行い、その内分泌能の検索と糖尿ラットへの移植効果を検討した。凍害防止剤としては10%【Me_2】SOを用い冷却速度は25°C/minで-70°Cまで冷却し、その後-196°C液体窒素内で2週間凍結保存し、解凍は37°C温浴槽内で急速解凍した。なお、凍結解凍操作の前後に培養保存(3日間)を付加した。まず、凍結保存されたラ氏島を解凍後、実体顕微鏡下で観察した。一般的には凍結・解凍操作により、ラ氏島はかなりの損傷(凍害)を被ると想像されるが、本凍結法では比較的良好に保存され、組織学的にも良好な形態を示した。しかし、一部のラ氏島ではその細胞の核配列のみだけが認められた。凍結保存ラ氏島の内分泌能はグルコース負荷によるインスリン分泌能,含有量より検討した。これらの結果では対照とした非凍結培養ラ氏島と同程度の反応性を示し、内分泌能維持を確認しえた。一方、凍結保存ラ氏島のreplicatory capacityの検討では非凍結培養ラ氏島と同定度のlabelling indexが得られ、また、これら凍結保存ラ氏島の糖尿ラットへの移植実験でもその有効性が認められた。

当初、DNA含有量を併せ検討予定であったが、ターナー製,蛍光光度計の購入が遅れているので今後検討予定である。ところで最近の膵ラ氏島移植の臨床では胎児膵が応用されている。これは胎児膵ラ島の増殖能を期待するものであるが、これらに関して今後、胎児ラット膵を用い、その増殖能を検討するとともに、その凍結保存の可能性についても検討する予定である。5ー8週令のゴールデンハムスター雄より,コラゲナーゼ法で膵ランゲンルハンス島(ラ島)を分離し凍結保存を試みた.凍結法は分離後, 3日間の培養を行ったラ島を15%Me_2SO及び10%牛血清を含むHanks′液内に収容, programmableーfreezerにて25°C/minの冷却速度で-70°Cまで冷却,その後-196°C液体窒素内に2週間保存するものである.解凍は37°C温浴槽内で急速に行い,その後さらに,培養を付加した.凍結保存ラ島のviabiltyは1)グルコース負荷によるインスリン分泌能および,含有量, 2)蛍光分光度計によるラ島細胞内DNA含有量, 3)オートラジオグラフィーを用いたラ島細胞のDNA複製能(in vitro), 4)糖尿ハムスターへの移植効果より判断した.まず,凍結ラ島の形態を実体顕微鏡下および組織学的に検討するとほぼ非凍結倍養ラ島(対照)と相違ない形態であり,良好に保存されたと思われた.インスリン分泌能は基礎分泌では対照とほぼ同等であり,グルコース刺激を300mg/dlにするとそれぞれ基礎分泌の3倍以上の増加をみた.DNA含有量は対照群,凍結群はそれぞれ0.588±0.075, 0.465±0.067ng/10isletsであり,凍結群で約20%の減少がみられた.インスリン含有量でも同様の傾向であった.しかしラ島細胞あたりのそれは対照群とほぼ同様の値であり,以上より凍結ー解凍過程で若干のラ島細胞が障害を被ると推察した.一方, DNA複製能をlabelling indexでみると両群とも約2%であり,凍結後も再生能は保持されていた.腎被膜下に凍結ラ島1000個を移植しその効果を近交系間でみると,移植直後に8匹全例の血糖値は正常化し,尿量の減少,体重の増加をみた.次に,新生児ハムスター膵よりラ島分離を試みた.膵摘出後,細切しmildな条件下でコラゲナーゼを作用させ,更に培養を付加することにより,純粋なラ島分離が可能であった.現在, labelling indexよりの再生能および,生物学的機能について検討を行っている.実験1.凍結保存ラ島の移植実験(1)方法:前年度の実験の結果、ハムスター膵ラ島はviableな状態で保存が可能であると判明した。そこで近交系ハムスターGN種より分離し、急速凍結保存したラ島1000個をSTZにより糖尿病を誘発させた同系の腎被膜下に移植した。移植後は血糖、体重、尿量を測定して効果を判定、移植後56日目にIVーGTTを施行して、その後腎摘した。移植ラ島細胞の再生能の検索では、^3Hーthymidine 30μCiを腹腔内に8時間毎4回投与し、最終投与の1時間後に犠牲死させ、腎を摘出してオートラジオグラフィー法によりラ島細胞を標識して、そのlabelling indexより移植ラ島の再生能を検討した。(2)結果:糖尿群および対照群(非凍結培養ラ島移植)の両群では、移植後直ちに血糖は正常化し、腎摘するまで正常値を維持した。尿量は移植前において多尿であったが、移植後3ml/日と正常化し、体重も移植後次第に増加した。
光音響法による内部-表面複合欠陥の同時映像化と非破壊評価に関する研究

本研究は、内部-表面複合欠陥を光音響顕微鏡を用いて、その内部と表面欠陥を同時に映像化し、その欠陥の位置や形状に関する情報を光音響信号強度から推定することを試みた。そこで、実験用試験片として加工が容易であるアルミニウム金属板を使用し、この試料に機械加工等により複雑な形状の欠陥を作製した。第一の試験片は表面欠陥としてピンホール欠陥と内部欠陥として円形欠陥を作製し、それぞれの欠陥を結合するように導入した。内部欠陥は直径および深さを変化させた。第二の試験片は試料表面上にスリット状の欠陥を作製し、この表面欠陥の側面に垂直にドリル(直径0.2mm)により内部欠陥(枝分かれ欠陥)を導入した。これらの試験片に対して、変調周波数を変化させて測定した結果、複合欠陥の光音響振幅像および位相像が得られた。第一の試験片において、表面欠陥であるピンホール欠陥が存在している位置においては、光音響振幅強度はその位置で高いピークの信号を示した。また、位相像およびその信号分布からは位相が進んでいることが示された。さらに、内部欠陥までの深さ情報やその形状(円形形状)および大きさも推定できることが分かった。また、表面欠陥であるピンホール欠陥の大きさも推定可能であることが示された。第二の試験片において、スリット状表面欠陥と内部欠陥が鮮明に検出された。得られた映像から、スリット状表面欠陥および内部欠陥形状(円筒形の投影された形状)の推定や深さ方向の定量的解析が可能であることを示した。さらに、試料表面欠陥の源となる孔食の光音響像を得るために、NaCl水溶液を使用し、アルミニウム試料を溶液に浸せきし、表面に実際の孔食を発生させた。測定を行った結果、振幅像および位相像が得られ、位相像は孔食の断面深さをほぼ表していることが分かった。本研究は、内部-表面複合欠陥を光音響顕微鏡を用いて、その複合欠陥を映像化し、その欠陥の位置や形状に関する情報を光音響信号強度から推定することを試みた。第一の試験片として、内部欠陥のみを有する試験片をエンドミル加工により直径を変化させて導入した。さらに、その深さも変化させた。この試験片は次の内部-表面複合試験片との比較のために作製した。第二の試験片として、内部欠陥として使用した試験片と同様の試験片を作製し、その試験片の反対側表面より表面欠陥としてピンホール欠陥を内部欠陥と結合するように導入した。内部欠陥試験片において、変調周波数を変化させて測定した結果、光音響振幅像および位相像から、その欠陥までの深さ情報、円形欠陥形状さらにその大きさが推定できた。また、振幅強度分布および位相分布からも上記の情報が得られた。同様に、変調周波数を変化させ、内部-表面複合欠陥の同時測定を行い、複合欠陥の光音響画像(光音響信号・位相像)が得られた。得られた信号は、内部欠陥のみの信号とは異なり、表面欠陥であるピンホール欠陥が存在している位置においては、光音響振幅強度はその位置で高いピークの信号を示した。さらに、この複合欠陥においても、内部欠陥までの深さ情報やその形状および大きさも内部欠陥のみの結果と同様に推定できることが分かった。本研究は、内部-表面複合欠陥を光音響顕微鏡を用いて、より複雑な複合欠陥である表面欠陥と内部欠陥が結合した枝分かれ状欠陥検出を試みた。

そこで、実験用試験片として加工が容易であるアルミニウム金属板を使用し、この試料に機械加工等により内部-表面複合欠陥を作製した。第一の試験片は、内部欠陥のみを有する試験片として、円筒形の内部欠陥を直径0.2mmのドリルを用いて、試料表面から深さを変化させて導入した。また、この試験片は枝分かれ状欠陥を有する試験片との比較のために作製した。第二の試験片として、試料表面上にスリット状の欠陥を作製し、この表面欠陥の側面に垂直にドリル(直径0.2mm)により内部欠陥(枝分かれ欠陥)を導入した。円筒形の内部試験片において、変調周波数を変化させて測定した結果、光音響振幅像および位相像から、円筒形欠陥形状さらにその大きさが推定できた。また、振幅情報から、その欠陥までの深さ方向の定量的解析が可能であることを示した。同様に、変調周波数を変化させ、枝分かれ状欠陥の同時測定を行った結果、その複合欠陥の光音響画像が得られた。これらの情報から表面欠陥および内部欠陥形状の推定や深さ方向の定量的解析が可能であることを示した。さらに、試料表面欠陥の源となる孔食の光音響像を得るために、NaCl水溶液を使用し、アルミニウム試料を溶液に浸せきし、表面に実際の孔食を発生させた。測定を行った結果、振幅像および位相像が得られ、位相像は孔食の断面深さをほぼ表していることが分かった。
糖尿病モデル動物における脳機能および循環器機能のイメージング

1型および2型糖尿病モデル動物脳におけるグリア代謝および糖代謝、乳酸代謝のイメージングに関する検討を主に行った。14C-酢酸の取込みは1型および2型糖尿病モデルマウス脳において著明な増加を示した。18F-FDG(もしくは14C-DG)の取込みは1分値、30分値のどちらも低下を示したが、30分値の方がより鋭敏に反応し、ヘキソキナーゼによるリン酸化過程が影響を受けやすいことが明らかとなった。2型糖尿病モデルマウスでは乳酸代謝が増加しており、エネルギー基質が移行している可能性も示された。またムスカリン性アセチルコリン受容体のインビボ結合の一部に低下を認めたが、詳細は今後の検討課題である。平成24年度にストレプトゾシン(STZ)誘発1型糖尿病モデルマウスおよび2型糖尿病モデルマウスであるBKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb(以下、dbdbマウス)において糖代謝の低下およびグリア代謝の亢進について明らかにした。平成25年度はこれらのモデルマウスに薬物治療を施した際に脳のエネルギー代謝異常に回復がみられるか否かについての検討を中心に行った。STZ誘発1型糖尿病モデルマウスにインスリンを投与することにより血糖値の回復が認められたマウス脳の糖代謝およびグリア代謝を検討したところ、14C-DGの取込み低下はインスリンにより血糖値を回復させることでコントロールレベルまで回復した。1型糖尿病モデルマウスでは心筋においても14C-DGの取込み低下を認めているがインスリン処置により14C-DGの取込みは増加を示した。14C-酢酸の取込みはインスリン処置によりコントロールと比較すると高値ではあるもののSTZ群と比較すると有意に低下を示した。またDARを用いて評価すると1型糖尿病モデルマウスにインスリン処置を行ったマウスはコントロール群と同程度の取込みを示した。dbdbマウスについては薬物治療のための最適投与量を現在検討中である。また脳におけるエネルギー代謝のうち、グリア細胞における代謝をより詳細に検討するために1位標識および2位標識酢酸の取り込みをグリア細胞代謝抑制モデルをラットを用いた基礎検討を行った。さらに血流トレーサーである99mTc-HMPAOの取り込みがグリア細胞の活性に依存するという知見より同一個体を用いた2種類の血流トレーサー(99mTc-HMPAOおよび14C-IMP)の差異に関する検討を併せて行い、STZ誘発1型糖尿病モデルマウスでの検討を試みた。ストレプトゾシン(STZ)誘発1型糖尿病モデルマウスを用いて、脳循環代謝についての検討を行った。14C-酢酸、14C-デオキシグルコース(以下、DG)、14C-乳酸、99mTc-HMPAOを用いて、グリア代謝、ブドウ糖代謝、脳血流の検討を行った。14C-酢酸の取込みはモデルの進行に伴う血糖値の増加と並行して増加し、早期に代謝異常が生じていることが明らかになった。14C-DGの取込みは1分値、30分値共に低下し、14C-乳酸の取込みは逆に増加することを明らかにした。一方で、99mTc-HMPAOの取込みに変化は認められず、脳血流の異常はこの時点では生じないことが判明した。さらに、2型糖尿病モデルマウスであるBKS.Cg-+Leprdb/+Leprdbマウス(以下、dbdbマウス)についての検討を行った。14C-DGの取込み1分値では有意な変化を認めなかったが30分値では約50%の取込み低下を認めた。これはグルコースの取込み過程よりもヘキソキナーゼによるリン酸化の過程がより影響を受けていることを示している。db/dbマウスは糖尿病症状を自然発症するが、より症状の進んだ状態では脳における14C-DGの取込み1分値も有意に低下しており、リン酸化の過程は取込み過程よりも早期に影響を受けることが明らかとなった。14C-酢酸の取込みは約80%の増加を認め、2型糖尿病モデルマウスにおいても1型糖尿病モデルマウスと同様の反応を示すことが明らかとなった。14C-乳酸の取込みは約60%取込み増加を認めた。さらに血中乳酸濃度もdb/dbマウスでは顕著に高値を示した。さらにグルタミン酸神経系の関連を検討する目的で、正常動物を用いてグルタミン合成酵素阻害剤がマウス脳循環代謝に及ぼす影響を明らかにした。本研究は糖尿病モデル動物の脳における代謝異常を検出し画像化することを目的としている。

平成26年度は1型および2型糖尿病モデルマウスを用いてグルコースの代替エネルギー基質とされる14C標識乳酸の取込みおよび、1型糖尿病モデルマウスにおいてはインスリンによる治療を行った際の14標識乳酸の取込み、2型糖尿病モデルマウスにおいては平成25年度に引き続き薬剤治療の効果を14C標識デオキシグルコースの取込みを指標に検討を行った。14C標識乳酸の取込みはグルコース代謝との比較を容易にするため、18F標識フルオロデオキシグルコース(FDG)とのダブルトレーサー法とし、オートラジオグラフィー法を用い脳内分布を測定した。STZ誘発1型糖尿病モデルマウスにおける18F標識FDGの取込みは脳、心筋、大腿筋で著明に低下した。一方14C標識乳酸の取込みは有意な変化を認めなかった。さらに18F標識FDGの取込みは脳の領域ごとに局在分布を示したのに対し、14C標識乳酸の取込みは比較的均一な分布を示した。2型糖尿病モデルマウスにおける18F標識FDGの取込みは1型糖尿病モデルマウスと同様に著明な低下を示したが、14C標識乳酸の取込みは脳内の多くの領域で取込み増加を示した。病態の重症度との関連も検討する必要があるが、2型糖尿病モデルマウスではより多くの乳酸をグルコースの代替エネルギー基質として利用している可能性が示された。またインスリンにより治療効果を認めた1型糖尿病モデルマウスにおいて脳における18F標識FDGの取込みはコントロールの70-100%まで回復した。一方、心筋における取込みはコントロールの200%と著明な増加を認め、大腿筋では逆に35%低下した。14C標識乳酸についてはインスリン治療により心筋での取込みが増加し、末梢組織におけるエネルギー基質の変遷も明らかとなった。医歯薬学1型糖尿病モデル動物で生じた脳のエネルギー代謝異常は薬物治療により回復することを明らかにした。一方、2型糖尿病モデル動物では薬物治療効果が明瞭に出なかったために現在、至適量を検討している。またPETによるイメージングを試みるために、糖尿病モデル動物のエネルギー代謝異常が麻酔下でも生じるか否か検討したところ、麻酔下では代謝異常の検出は不可能であった。そのため麻酔の影響を受けないイメージング方法を開発中である。1型および2型糖尿病モデルマウス脳における脳循環代謝の変化の概要を明らかにした。グリア細胞に選択的に取り込まれる標識酢酸の取込みのみではなく、標識デオキシグルコース、標識乳酸の取込みを比較することで、神経・グリアの弁別測定が可能となっている。糖尿病モデル動物の脳においては神経細胞の活性の低下、グルコースから他の物質へとエネルギー基質が変換していることを明らかにした。一方で、当初予定していたBMS747158-02を用いた実験は実施できなかった。また治療薬による治療効果とエネルギー代謝への影響に関する予備実験も進んでおり、平成25年度以降はこれら治療薬の効果と標識化合物の取込みとの関連が明らかになることが予想される。さらに、脳における循環代謝以外にも、心筋における標識デオキシグルコースの代謝異常を明らかにし、その過程のうちトランスポートのプロセスよりもグルコースのリン酸化のプロセスがより影響を受けやすいことが明らかとなった。今後、糖尿病原性の各種疾患の解明につながると考えられる。2型糖尿病モデル動物の脳のエネルギー代謝異常が薬物治療により回復可能か否かを明らかにする。また神経受容体結合の変化についてはこれまではムスカリン性アセチルコリン受容体の変化を検討したが、ドーパミン系、ベンゾジアゼピン系受容体結合についても検討を追加する予定である。
新規人工核酸"グライコ核酸"の創製

本研究ではペプチド核酸に糖鎖を導入したグライコ核酸を設計・創製する。そして1)糖鎖導入で従来のPNAに両親媒性を付与することで20mer以上の長鎖DNAに対する二重鎖形成能を飛躍的に高める、2)糖鎖の持っ親水性を活用して疎水性の高いインターカレーターの導入を可能にする、ことを目標とする。18年度の研究成果において本研究の目標に掲げた親水性の付与を実現したので、19年度は得られたグライコ核酸のタンパク質との特異的相互作用について検討した。まず18年度に確立したグライコ核酸の"ヌクレオシド"モノマーの合成法に従い、アミノ酸リンカーにD-およびL-Lysを用いて機能分子としてマンノースを導入したカートリッジモノマーを設計・合成した。さらにFmoc固相合成法によりマンノースユニットを持った"グライコ核酸"を合成し、マンノースに特異的なレクチンであるConcanavalin A(ConA)を使用して、グライコ核酸との相互作用を蛍光強度の変化で評価した。その結果、PNA中にマンノースユニットを1つ導入したグライコ核酸のConA認識能力は単糖と同程度であったが、二つ導入した系では糖のクラスター効果に由来する高い認識力が認められた。このように、任意の場所に任意の数の糖モノマーを導入できる本研究のグライコ核酸の特徴を活かすことで、高いタンパク質認識能を付与可能なことも明らかとなった。本研究者はアゾベンゼンのような疎水性の高いインターカレーターをPNA中に導入する方法も併せて確立したので、本申請研究のグライコ核酸と組み合わせることで更なる高機能化が期待できる。そして1)糖鎖導入で従来のPNAに両親媒性を付与することで20mer以上の長鎖DNAに対する二重鎖形成能を飛躍的に高める、2)糖鎖の持つ親水性を活用して疎水性の高いインターカレーターの導入を可能にする、ことを目標とする。平成18年度はグライコ核酸の"ヌクレオシド"モノマーの合成方法を確立した。導入する糖としては、グリコシル化の際の立体制御が比較的容易なマンノースを選択した。ここでは既に合成方法が確立している2,3,4,6-tetra-O-acetl-p-succinylamidophenol-α-D-mannopyranosideを、D-Lysの側鎖のアミノ基に導入した(Boc法用)building blockを合成した。まずはBoc法を用いてマンノースで修飾したD-Lysを、付加的にPNA中に導入することを検討した。その結果、Boc法では樹脂からの切り出しの際に使う強酸のためO-グリコシド結合が開裂してしまうことが判明した。そこでFmoc法用のbuilding blockを新たに合成し、Fmoc法でPNAへの導入を試みたところ、O-グリコシド結合の開裂を伴わずにPNAへ導入することに成功した。得られたマンノース導入PNA(8mer)と対応するDNAとの融解温度は、マンノースを導入していない従来のPNAより低下したものの、DNAと二重鎖形成可能なことが明らかとなった。また糖鎖の導入で期待通り親水性が向上することも判明した。
大気中フミン様物質の動態と大気環境に及ぼす影響評価

大気エアロゾルや大気水相中には、水圏や土壌圏のフミン物質と化学構造が類似した高分子有機化合物であるフミン様物質(HULIS)が存在し、大気環境において有害大気汚染物質の輸送や気候変動に大きな影響を及ぼしていることが示唆されている。しかし、それらの定量方法が研究者間で統一されていないことや、化学構造や起源については決定的な方法が確立されていない等の問題から、大気中におけるHULISの実態については不明な点が多い。本研究は、(1) HULISの定量方法の確立、(2)各種分析装置を用いた化学構造解析、(3)安定および放射性同位体を用いた起源解析を行うことで、大気環境中におけるHULISの実態を解明することを目的としている。本年度は、X線光電子分光(XPS)による窒素官能基組成の解析およびフーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析(FT-ICR MS)による網羅的分子解析を行った。XPSのN1sスペクトルを解析したところ、HULISの窒素の主要な化学形態は芳香族窒素(ピリジン、イミン、アニリン誘導体)とペプチド/アミド窒素(ピロール、第2および第3アミンを含む)であった。芳香族窒素は化石燃料などの燃焼排ガスに多く含まれ、ペプチドは生体高分子であることから、起源推定に応用できる可能性が示唆された。実際に、東京都新宿区にて秋季と冬季に採取したエアロゾルから得たHULISの芳香族窒素とペプチド/アミド窒素の量比を調べたところ、秋季はペプチド/アミド窒素の存在比が高かったが、冬季は芳香族窒素の存在比の方が高くなった。同様に、窒素安定同位体比も秋季と冬季で異なる値を示した。FT-IRCR MSによる分析は完了したが、現在データ解析中である。本年度は最終年度であるため昨年まで得られた知見をまとめ、国際誌に2報投稿し、受理された。大気エアロゾルや大気水相中には,水圏や土壌圏のフミン物質と化学構造が類似した高分子有機化合物であるフミン様物質(HULIS)が存在し、大気環境において有害大気汚染物質の輸送や気候変動に大きな影響を及ぼしていることが示唆されている.しかし、それらの定量方法が研究者間で統一されていないことや、化学構造や起源については決定的な方法が確立されていない等の問題から、大気中におけるHULISの実態については不明な点が多い。本研究では、(1) HULISの定量方法の確立、(2) NMRを用いた化学構造解析、(3)安定および放射性同位体を用いた起源解析を行うことで、大気環境中におけるHULISの実態解明を行うことを目的とする。本年度は、HULISの起源と化学構造特性の関係性を中心に検討した。東京都新宿区において、春季と夏季に集中サンプリングを行い、大気エアロゾル中HULIS濃度に気象因子と大気汚染物質が及ぼす影響を調べた。その結果、春季にはCOおよび花粉、夏季にはNO2およびOXによって大気中HULIS濃度が規定されていた。このことから、HULISの起源は、春季では燃焼と花粉、夏季では自動車排ガスと二次生成の影響を強く受けており、季節によってHULISの起源や生成プロセスが異なることが示唆された。次いで、HULISの起源と化学構造の関係性を明らかにすることを目的に、それぞれの季節に採取したエアロゾルからHULISを抽出し、1H NMRの測定を行った。その結果、季節間でHULISの化学構造に明瞭な差が確認され、(1)燃焼と花粉の影響を強く受けている春季では芳香族性が高いことに加え、植物起源と考えられる糖類の寄与がより大きいこと、(2)二次生成の寄与が大きい夏季は芳香族性が低く、メチレン鎖がより発達していることが明らかとなり、起源と化学構造の関係を明確にすることができた。当初の予定通り、東京都心におけるHULISの起源と化学構造特性の関係を明らかにする事ができたため。二年目であるH29年度はHULISの定量方法の検討を中心に行った。HULISの分離にはDEAE樹脂が多用されているが、各メーカーから材質が異なるDEAE樹脂が販売されており、材質の違いによる定量値の変化など詳細な検討は行われていない。そこで、セルロース系とメタクリレート系のDEAE樹脂によるHULISの定量値を比較・検討した。その結果、メタクリレート系のDEAE樹脂を用いた場合、不可逆吸着と思われる現象が起こり、定量値が有意に低い値を示すことが明らかとなった。これらのことから、分離に用いた樹脂が異なる場合、得られる定量値や化学構造を単純に比較することができず、分析方法の標準化が必要であるとの結論に至った。さらに、DEAEセルロース樹脂によって分離されたHULISに対して、TOC計およびUV-visによる測定値の比較を行ったところ、両者は高い正の相関関係があったが、回帰直線の傾き(変換係数)はサンプリングサイトや採取時期によって変動が生じた。変換係数は都市域で特に低くなる傾向があり、HULISの化学構造特性の違いを反映していることが示唆された。検討した分析条件をもとに、HULISのバックグラウンド濃度および越境大気汚染の影響を評価するために自由対流圏に位置する富士山頂において観測を行った。大陸南部からの空気塊が流入した際、COやO3濃度の上昇と共にHULIS濃度の上昇が確認された。また、海洋からの空気塊が流入した際、最も低濃度となり、ヨーロッパの山岳サイトにおけるバックグラウンド濃度とほぼ同等の値を示した。このことからHULISのバックグラウンド濃度は全地球的にほぼ一様であることが示唆された。