hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
髄鞘恒常性の破綻による精神症状発症機序の解明

情動・認知といった高次脳機能に障害を呈する精神・神経疾患の病態解明・治療法の開発が現代社会で早急に求められている。そのグリア細胞の中でもオリゴデンドロサイトは髄鞘を形成し神経伝導速度を制御し、約50倍程度まで速めることができる。この機能によって活動電位の到達時間を制御し、シナプスの発火タイミングを調節することが可能になり、情報伝達を効率化する役割を持っていると考えられる。本研究では神経活動依存性髄鞘化の神経回路活動に対する寄与を、これが損なわれているマウスを用いて、2光子顕微鏡下で運動学習を行わせその神経細胞集団活動の解析を行うことで明らかにした。中枢神経系において髄鞘化された軸索は白質を形成する。これまでアルツハイマー患者などにおいて白質に障害を同時に持つ患者はその認知機能低下が持たない患者に比して著しいことが知られている。また近年、統合失調症患者のスクリーニングで、統合失調症患者では髄鞘関連タンパク質の発現変化を認めることがわかっている。そこで本課題では髄鞘と行動異常の相関を検討するため髄鞘の恒常性に異常を認めるマウス(PLP-tg)を用いて、学習行動異常の原因を明らかにすることを目的とした。前肢レバー引きによる水報酬タスクを運動学習課題とし、2週間連日でマウスに行わせた。正常群に比し、PLP-tgでは初期の成功率は差を認めないが後期の成功率は低かった。また学習に伴う髄鞘タンパク質の発現変化も正常群では訓練前後で認めるもののPLP-tgでは認められなかったことから学習に伴う髄鞘制御がPLP-tgではなされないことがわかった。髄鞘制御不全の結果どのような回路基盤で学習行動が阻害されるかを検討するため、2光子顕微鏡下でカルシウム感受性蛍光タンパク質を導入したマウスに運動学習を行わせ、第一次運動野2/3層の活動パターンを数理学的に解析した。PLP-tgでは訓練期間を通してレバー引きとは関係のない神経細胞活動(自発活動)が認められた。またマルチユニットの記録から麻酔下における神経細胞活動に変化は認められないことがわかった。これまでスパインの構造的可塑変化は学習行動に必要であることが知られているため、入力先である第一次運動野2/3層の樹状突起のスパインのターンオーバー率を調べたところPLP-tgで正常群に比して低いことがわかった。これらのことより髄鞘の制御は学習行動に必須であり、これが阻害されることによって学習行動に異常をきたすことがわかった(Kato, Wake et al in preparation)。本課題では髄鞘化による神経回路制御機構の破綻による精神症状表出のメカニズムを検討するために、髄鞘の恒常性が破綻したマウスを用いて認知学習課題中の神経細胞の発火パターンを可視化しその変容を探る。さらに光刺激を用いて症状の改善を試みることを目的としている。平成27年度は平成26年度に継続して研究を行い、PLP遺伝子を過剰発現させたマウス(PLP-tg)の神経活動依存性の髄鞘化制御機構が損なわれていることを髄鞘関連タンパク質のmRNA発現を運動学習前後で比較することによって明らかにした。またPLP-tgの学習効率低下の神経回路基盤を検証するために運動学習中の第1次運動野2/3層錐体細胞にアデノ随伴ウィルスを用いてカルシウム感受性タンパク質を発現させ、神経細胞集団の活動を可視化したところ、行動に関連しない神経活動が上昇し、学習効率を低下させること見出した。さらにこの行動に関連しない神経活動の上昇は活動の入力の時間的分散に伴って生じるものであるということを覚醒下動物の2/3層の神経細胞活動を、多点電極記録を用いて計測することにより明らかにした。さらにではこの神経細胞活動の時間的分散を、光遺伝学的手法を用いた神経細胞活動操作によって補正することによって学習効率の改善を認めるかどうかを検証した。PLP-tgの視床にチャネルロドプシンをコードしたアデノ随伴ウィルスを注入し視床軸索を小動物の行動に関連してトリガーして第1次運動野2/3層で光刺激したところ学習効率の改善をみとめた。以上によって神経活動依存性の髄鞘化制御機構の破綻によって神経細胞の自発活動の上昇が引きおこされ、学習行動を阻害すること、この局所回路の同期性を促すことによって学習行動が改善することを明らかにした。系の構築に想定していた期間を短縮することができ、進捗が著しく、研究が想定していたよりもすすんだため。具体的には伝導速度の差を比較するための多点電極の系、およびその解析、光刺激の装置の組み込みに使用する期間の短縮高次脳機能に障害を呈する精神疾患の病態解明・治療法の開発が現代社会で早急に求められている。イメージング技術の革新からグリア細胞が神経回路活動の恒常性を維持し、その機能の破綻によって精神疾患を引き起こすことが報告されてきている。グリア細胞の中でもオリゴデンドロサイトは髄鞘を形成し神経伝導速度を制御し、この機能によって活動電位の到達時間を制御し、シナプスの発火タイミングを調節し、情報伝達を効率化する役割を持つ。髄鞘化された軸索で構成される白質はヒトのfMRIを用いた研究によって発達期および学習時に信号が変化することが知られている(Scholz et al., Nat Neurosci, 2009)。そこで今回はこの髄鞘の恒常性が損なわれているモデルマウス(PLP-tg)を用いて髄鞘化の学習時における神経回路活動への寄与を検証した。PLP-tgはこれまで2ヶ月齢においてわずかな神経伝導速度の低下を認めることが知られており、さらに行動実験によって統合失調様の表現系を持つことが知られている。

私たちはPLP-tgマウスの運動学習が損なわれていることを明らかにし、その原因となるような神経回路基盤を示すために、このマウスの神経細胞の発火パターンをウィルスによるカルシウム感受性蛍光タンパク質の発現と2光子顕微鏡を組み合わせることによって可視化した。2光子顕微鏡下で学習行動を行わせることで学習時の神経細胞の発火パターンを正常群と比較した結果、正常に比してPLP-tgは自発活動の増加を認めた。この自発活動の増加は活動電位の伝搬の時間的分散によって生じる。さらに麻酔下では、自発活動の増加は認めないことから、行動依存的に生じる自発活動の増加であることが明らかとなった。さらに光遺伝学によるオプトジェネティックス法を用いて、この時間的分散を補正すると損なわれた運動学習効率が回復することを明らかにした。本研究は現在順調に進捗し、ほぼ完了しているオリゴデンドロサイトは髄鞘によって神経伝導速度を制御し、約50倍程度まで速めることができる。これによって活動電位の到達時間を制御し、シナプスの発火タイミングを調節し、情報伝達を効率化する役割を持っていると考えられる。本課題ではこの髄鞘の恒常性が損なわれているモデルマウス(PLP-tg)を用いて、運動学習としてレバー引きによる水報酬学習を組み合わせ学習時の髄鞘の神経回路活動への寄与を検討した。PLP-tgは正常群に比し、学習効率の低下を認めた。さらに大脳皮質運動野から組織を採取し、RNAを抽出し、訓練前後でのミエリン塩基性蛋白質(MBP)の発現を比較したところ、正常群で認められる運動前後でのMBPの発現上昇がPLP-tgでは認められなかった。またマウス大脳皮質運動野2/3層のカルシウムイメージングを学習行動中に行うことで学習時の神経細胞の発火パターンを正常群と比較した。正常のマウスに比してPLP-tgはレバーを引く行動と関連のない自発活動の増加を認めた。この自発活動と運動学習効率は逆相関することから自発活動が高いほど、運動学習の効率は低くなることが明らかとなった。さらに光遺伝学によるオプトジェネティックス法を用いて、活動電位到達時間の時間的分散を計測したところ、視床刺激によって引き起こされる大脳皮質運動野の神経細胞の活動は正常群に比してPLP-tgはspike latencyが長く、かつ1回の刺激で誘導されるスパイクの数が多いことが明らかとなった。この活動電位の到達するタイミングを人為的に補正し、同期させることでPLP-tgでも運動学習を改善させることができるかことがわかった。本研究により髄鞘の恒常性が損なわれた際におきる運動学習がどのような神経回路の異常によって起きるのかを明らかにし、髄鞘の恒常性維持機構の破綻による学習障害、情報処理異常の可能性を提案することができた。情動・認知といった高次脳機能に障害を呈する精神・神経疾患の病態解明・治療法の開発が現代社会で早急に求められている。そのグリア細胞の中でもオリゴデンドロサイトは髄鞘を形成し神経伝導速度を制御し、約50倍程度まで速めることができる。この機能によって活動電位の到達時間を制御し、シナプスの発火タイミングを調節することが可能になり、情報伝達を効率化する役割を持っていると考えられる。
レ-ザ-蛍光ATR法による深さ方向分析

レ-ザ-蛍光法が高感度であることはよく知られている。また、ATR(全反射)法で入射角やATR結晶の屈折率によって深さ方向分析が可能であることも、特に赤外領域で知られている。本研究では、両者の単なる組合せではなく、ATRを用いた新しい計測法を開発し、材料の深さ方向分析に応用することを目的として研究を行った。レ-ザ-蛍光ATR法の測定系は以下のように構成した。Arイオンレ-ザ-(15mW)からの励起光(457.9nm)をチョッパ-で変調(846Hz)し、試料に入射した。試料は半円柱状のLaSF15結晶に密着させ、回転ステ-ジにより入射角と観測角を変化させた。蛍光はモノクロメ-タで分光し、光電子増倍管により検出した。試料としてはPVC薄膜に吸着させた色素、ATR結晶上に直接累積したLB膜を作製し用いた。PVC薄膜にロ-ダミンBを吸着させたものを試料とし、入射角及び観測角による蛍光強度の変化を測定した結果、信号強度は臨海付近で最大となることが観測され、理論計算結果とも一致した。従来のATR法では臨海角よりも大きな角度で光を入射する配置がとられていたが、本法では垂直入射条件下でも観測角を変化させることにより試料の深さ方向分析が可能であることが分かった。また、色素吸着量と信号強度の関係については、両対数プロットで10^<-10>Mから10^<-7>Mまでの広い濃度範囲にわたって直線関係が得られ、定量分析にも応用可能であることが分かった。ロ-ダミン6G誘導体LB試薬とアラキン酸Cdを用いて、ATR結晶上に蛍光色素が濃度分布を持つ薄膜を形成させ、深さ方向分析について検討した。その結果、蛍光の偏光特性については、垂直偏光と水平偏光とで差異が観測され、観測角による信号強度変化も理論計算の傾向と一致した。以上より、本方法により深さ方向分析と配向解析とが行なえることが明らかとなった。
ロコモーションからリーチングへの進化仮説?霊長類の頚髄を対象とした実験的検証?

ロコモーション(歩行)とリーチングは一見全く異質の運動として捉えられ、それらを制御する神経機構についても別々の形で研究が行われてきた。しかし、四足歩行動物における「はしご渡り」や、二足歩行動物(霊長類)のリーチングにおける筋活動パターンの規則性などのように、実は両者間には多くの共通点がある。この相似性は、四足歩行から二足歩行への移行という環境の変化に対して、前肢の歩行運動を制御している脊髄固有神経回路(CPG)がリーチングを制御する神経回路網に適応的変化したことを反映しているのではないだろうか。本研究の目的は、この「リーチング運動は歩行運動の進化形である」という仮説を神経生理学的に実証することにあった。前年度開発した、把握運動時に脊髄ニューロン活動を慢性的に記録する方法を用いて、2頭のサルより把握運動遂行時の脊髄ニューロン活動を記録した。その結果、運動遂行のサイクルに同期して活動性を変化させるニューロンの多くは、複数の上肢筋運動ニューロンへの直接投射を持つことが明らかになった(Spike Triggered Averaging)。各筋への投射パターンは歩行運動に必要な筋シナジーと類似していることから、これらのニューロンが歩行と随意的上肢運動の制御の際に共有されている可能性が示された。さらに、当該部位に連続的(-3秒)電気刺激を与えると周期的な上肢運動(筋活動)が誘発された事からも、この可能性が確かめられた。そのため、覚醒サルの下位頚髄上に神経活動記録用チェインバーを装着し、サルにリーチング運動を行わせ、「CPG関連ニューロン」の活動を記録する。それによって歩行運動とリーチング運動において共通のニューロンまたはニューロン網が用いられている可能性を検討するという目標をたてた。本年度はリーチングの一要素である把握運動時に脊髄ニューロン活動を慢性的に記録する方法を開発した。つまり、サルの肘を固定することによって体幹部の動きを制限し、精密把握運動を親指及び人指指で行わせている間に、脊髄ニューロン活動を記録した。その結果、記録された半分以上の神経が課題に応じた活動性の変化を示していた。その活動性は1)緊張性、2)相動性、3)緊張性+相動性の3パターンが多かった。
気体水銀を用いた水蒸気噴火発生場の温度モニタリング

本年度は,土壌ガスとして地上へ放出される揮発性成分の1つである単体の気体水銀(以下,GEM)の面的分布を明らかにするため,草津白根山周辺の合計81点においてGEM放出率分布を測定した.熱水系やその周辺に存在する変質鉱物に含まれる水銀は温度変化に鋭敏に応答し,揮発して大気へ放出される.このようなGEMは,周囲よりも透水性の高い破砕帯を優先的に経由し地上へ放出されるであろう.そのため,GEM放出率分布は地下浅部透水係数の不均質を反映していることが期待される.得られたGEM放出率の範囲は0.8 - 67×10^-3 ng/m2/s,中央値は3.1×10^-3 ng/m2/sである.この範囲は,世界各地の火山熱水系周辺で測定されたGEM放出率の値の範囲に概ね一致する.白根火砕丘南側斜面では,水釜南部から南西(Aと呼ぶ)・南東方向(Bと呼ぶ)に伸長する高GEM放出率帯が初めて観測された.これらの領域のGEM放出率は白根火砕丘周辺の背景値より約10倍高い.高放出率帯(A)は過去の火口列,すなわち割れ目噴火の位置にほぼ一致するほか, MT探査から示唆される地下構造の不連続にも矛盾しない.すなわち,Aは地下の破砕帯を反映していると思われる.一方,南東方向へ伸びる高放出率域(B)には対応する火口列が確認できない.過去の噴火記録によれば,湯釜内部にはBと同じ北西ー南東方向の割れ目が出現したことがある.すなわちBも伏在した破砕帯に対応すると考えられる.地表面で火口列が確認されないのは,この領域が過去の噴出物に厚く覆われているためであろう.その事実は,Bの先端付近で2017年度に実施したトレンチ掘削結果からも明らかである.Bの南東端は湯釜火口中心から700 m離れた国道付近まで伸びており,Bは将来的に水蒸気爆発を起こし得る領域として留意する必要がある.白根火砕丘の南側斜面周辺において,地下透水係数の不均質を反映していると考えられるGEM放出率の不均質が認められた.特に東京工業大学の観測局舎(KSR)周辺で比較的大きなGEM放出率が認められる.KSRでは商用電源やデータを遠隔地の伝送するシステムも存在する.すなわち,次年度以降に予定している水銀連続観測点の設置候補地としてKSRが有望であることが判明した.これは,本年度に得られた大きな成果の一つである.この高いGEM放出域周辺では,若干地温の高い領域も見つかった.一方で,土壌CO2放出率に有意な値は認められていない.高いGEM放出率が認められる背景は必ずしも自明ではなく,別の化学的手法も併せてGEMの起源を検討する必要がある.一方,近年は草津白根山の火山活動が不安定であり,噴火等の危険もあることから専門業者や学生による十分な調査ができていない.これまで実施したGEM放出率観測点の間隔は100m前後あり,本課題の主テーマである連続観測の設置点は,より短い空間スケールでのGEM測定結果を待って最終決定する必要がある.また,土壌気体水銀を自動連続観測するシステムの詳細を検討した.ひろく内外から調達可能な測定装置を検討した結果,ある海外製の測定装置が最適であるとの結論に至った.一方で,火山観測としての実績に乏しい.装置の仕様を検討したところ,周辺大気に気体水銀が存在する状況では,測定の信頼性に問題が生じることが分かった.実際に,設置候補地周辺では周辺大気に環境基準前後に達する気体水銀が測定されたことがあり,測定装置をそのまま導入しても意味のあるデータは得られないと思われる.測定の仕組みを変更し,濃度から放出率へと換算するための新たな定式化を行なうことで対応する.以上のように,当初計画通りに進捗している状況とは言えないものの,目的達成に向かって概ね順調に進んでいると考えている.本研究課題の主要テーマは,火山観測として意味のある場所に測定感部を設置することである.これまで,本年度までに設置候補となり得る高水銀放出帯を見出したことで,その実現可能性が高まった.この高放出帯は,東京工業大学が運用している局舎に近接しており,測定装置本体は同局舎内に設置すればよい.同局舎には商用100V電源,非常用電源および通信回線が整備されており,8 km離れた東京工業大学観測所へデータをリアルタイムで通年送信できる.一方,センサ部分の具体的な設置場所が未定であり,それを絞り込むために,局舎周辺で多点水銀放出率観測を実施する必要がある.ただし,現地環境は必ずしも連続観測に好ましいとは言えない.現地は除雪作業による車両進入や観光用の諸設備が存在する.冬季は積雪するために現地作業が不可能となるほか,ガス導入部分管内の結露が凍結する等によって目詰まりを起こし,観測が停止する等のリスクも考えられる.そのため,本年度試験的測定と位置付けて,測定装置本体を導入するとともに,まずは数日間の連続観測を実施して問題点の整理を行う.一方,設置予定場所で測定される水銀の起源に関しても研究を進める.具体的には,地中温度分布,土壌CO2放出率測定を同一地点で行う.特に高い放出率が認められる地点においては地中ガスを採取する.

そのガス中のCO2やHeなどの濃度や同位体比などを測定することで,土壌ガスに対する火山ガスの関与の程度を検討する.また,周辺から湧出する熱水を繰り返し採取し,水銀をはじめとする各陽イオン濃度の時間変動を明らかにし,今後測定される土壌水銀放出率変化との関係を検討する.本年度は,土壌ガスとして地上へ放出される揮発性成分の1つである単体の気体水銀(以下,GEM)の面的分布を明らかにするため,草津白根山周辺の合計81点においてGEM放出率分布を測定した.熱水系やその周辺に存在する変質鉱物に含まれる水銀は温度変化に鋭敏に応答し,揮発して大気へ放出される.このようなGEMは,周囲よりも透水性の高い破砕帯を優先的に経由し地上へ放出されるであろう.そのため,GEM放出率分布は地下浅部透水係数の不均質を反映していることが期待される.得られたGEM放出率の範囲は0.8 - 67×10^-3 ng/m2/s,中央値は3.1×10^-3 ng/m2/sである.この範囲は,世界各地の火山熱水系周辺で測定されたGEM放出率の値の範囲に概ね一致する.白根火砕丘南側斜面では,水釜南部から南西(Aと呼ぶ)・南東方向(Bと呼ぶ)に伸長する高GEM放出率帯が初めて観測された.これらの領域のGEM放出率は白根火砕丘周辺の背景値より約10倍高い.高放出率帯(A)は過去の火口列,すなわち割れ目噴火の位置にほぼ一致するほか, MT探査から示唆される地下構造の不連続にも矛盾しない.すなわち,Aは地下の破砕帯を反映していると思われる.一方,南東方向へ伸びる高放出率域(B)には対応する火口列が確認できない.過去の噴火記録によれば,湯釜内部にはBと同じ北西ー南東方向の割れ目が出現したことがある.すなわちBも伏在した破砕帯に対応すると考えられる.地表面で火口列が確認されないのは,この領域が過去の噴出物に厚く覆われているためであろう.その事実は,Bの先端付近で2017年度に実施したトレンチ掘削結果からも明らかである.Bの南東端は湯釜火口中心から700 m離れた国道付近まで伸びており,Bは将来的に水蒸気爆発を起こし得る領域として留意する必要がある.白根火砕丘の南側斜面周辺において,地下透水係数の不均質を反映していると考えられるGEM放出率の不均質が認められた.特に東京工業大学の観測局舎(KSR)周辺で比較的大きなGEM放出率が認められる.KSRでは商用電源やデータを遠隔地の伝送するシステムも存在する.すなわち,次年度以降に予定している水銀連続観測点の設置候補地としてKSRが有望であることが判明した.これは,本年度に得られた大きな成果の一つである.この高いGEM放出域周辺では,若干地温の高い領域も見つかった.一方で,土壌CO2放出率に有意な値は認められていない.高いGEM放出率が認められる背景は必ずしも自明ではなく,別の化学的手法も併せてGEMの起源を検討する必要がある.一方,近年は草津白根山の火山活動が不安定であり,噴火等の危険もあることから専門業者や学生による十分な調査ができていない.これまで実施したGEM放出率観測点の間隔は100m前後あり,本課題の主テーマである連続観測の設置点は,より短い空間スケールでのGEM測定結果を待って最終決定する必要がある.また,土壌気体水銀を自動連続観測するシステムの詳細を検討した.ひろく内外から調達可能な測定装置を検討した結果,ある海外製の測定装置が最適であるとの結論に至った.一方で,火山観測としての実績に乏しい.装置の仕様を検討したところ,周辺大気に気体水銀が存在する状況では,測定の信頼性に問題が生じることが分かった.
胎盤関門における薬物透過機構解明のための胎盤組織内への遺伝子導入方法の構築

1.胎盤由来細胞株に対するファイバー改変型Adベクターによる遺伝子導入効率の検討ヒト由来胎盤細胞株であるJAR、JEG-3、BeWo細胞は未分化なサイトトロホブラスト細胞株として考えらている。これらの細胞において、Ad-L2においても遺伝子導入が可能であり、CARの発現が確認された。妊娠初期に単離されたヒトの初代培養胎盤細胞においても多量に存在するサイトトロホブラストではCARを発現しており従来型のAdベクターにおいても遺伝子導入可能である。また、ラット由来胎盤細胞株であるRcho-1、TR-TBT18d-1、TR-TBT18-2細胞もトロホブラスト細胞として知られており、これらラットトロホブラスト細胞においてもAd-L2での遺伝子導入が可能であり、CARのmRNAの発現が確認された。ヒトおよびラット由来胎盤細胞株を用いた遺伝子導入実験の結果、Ad-RGD(HI)-L2はすべての細胞においてAd-L2以上の遺伝子導入活性を示し、最大で76倍の遺伝子導入効率の改善が認められた。この結果は、用いた胎盤由来細胞にはインテグリンが高発現していたことに起因すると推察される。しかし、インテグリンとヘパラン硫酸の両方を認識するAd-RGD(HI)K7(C)-L2ではAd-RGD(HI)-L2程の高い遺伝子発現は見られなかった。これは、本検討で用いたAd-RGD(HI)K7(C)-L2はRGD配列とポリリジン配列の2つの外来ペプチドをファイバーに発現していることからファイバーの立体構造が不安定になり、生物学的濃度が低くなったのではないかと考えられる。2.胎盤由来細胞株に対するファイバー置換型Adベクターによる遺伝子導入効率の検討ヒト由来胎盤細胞株を用いた遺伝子導入実験の結果、CD46を受容体とするAd-F35-L2はいずれの細胞においてもAd-L2以上の遺伝子導入効率を示し、最大で6倍の遺伝子導入効率の改善が認められた。よって、Ad-F35-L2は胎盤細胞への遺伝子導入においてAd-L2以上の有用性の高いベクターであると考えられる。35型のファイバーを持ったAdベクターはヒト造血幹細胞などの未分化な細胞に対し従来型Adベクターよりも高い遺伝子導入を示すことが知られており、ヒト由来胎盤細胞株においても高い遺伝子発現を示した。1)胎盤組織への遺伝子導入効率を高めるためのベクター開発アデノウイルス(Ad)のファイバーノブにRGD配列、およびK7(KKKKKK)配列を発現させることにより、αvインテグリン、ヘパラン硫酸を感染受容体とするファイバーミュータントAdベクターを作製した。本ベクターは従来のAd感染受容体であるcosakievirus and adenovirus receptor (CAR)の発現の少ない細胞に対しても効率良く遺伝子導入可能であり、CAR陰性細胞に対し従来型Adベクターの101000倍の遺伝子発現を示した。2)標的細胞への遺伝子導入効率評価の基礎検討ヒト胎盤由来細胞株(BeWo、JEG-3、JAR)を用いて、これら細胞株のAd受容体であるCAR、およびintegrinの発現を遺伝子レベルにおいて調べた。

各細胞への遺伝子導入効率を検討するために、従来型Adベクター、αvインテグリンに高親和性を示すAdベクター、およびヘパラン硫酸に親和性を示すAdベクターを細胞に作用させ、ルシフェラーゼ発現を指標に遺伝子導入効率を測定した。BeWo、JEG-3、JAR細胞においてCARおよびintegrinの発現が認められた。各細胞への遺伝子導入については、従来型Adベクターで高いルシフェラーゼ活性が得られ、上記の各細胞へ遺伝子導入できることが示された。従来型Adベクターよりも広い感染域を持つファイバーミュータントAdベクターでは、従来型Adベクターに比べてルシフェラーゼ活性が最大で100倍以上に増大した。本実験結果から、ヒト胎盤由来細胞株への遺伝子導入にAdベクターが有用であり、またファイバーミュータントAdベクターを用いることによりさらに高い遺伝子導入効率が得られることが明かとなった。1.胎盤由来細胞株に対するファイバー改変型Adベクターによる遺伝子導入効率の検討ヒト由来胎盤細胞株であるJAR、JEG-3、BeWo細胞は未分化なサイトトロホブラスト細胞株として考えられている。これらの細胞において、Ad-L2においても遺伝子導入が可能であり、CARの発現が確認された。妊娠初期に単離されたヒトの初代培養胎盤細胞においても多量に存在するサイトトロホブラストではCARを発現しており従来型のAdベクターにおいても遺伝子導入可能である。また、ラット由来胎盤細胞株であるRcho-1、TR-TBT18d-1、TR-TBT18d-2細胞もトロホブラスト細胞として知られており、これらラットトロホブラスト細胞においてもAd-L2での遺伝子導入が可能であり、CARのmRNAの発現が確認された。ヒトおよびラット由来胎盤細胞株を用いた遺伝子導入実験の結果、Ad-RGD(HI)-L2はすべての細胞においてAd-L2以上の遺伝子導入活性を示し、最大で76倍の遺伝子導入効率の改善が認められた。この結果は、用いた胎盤由来細胞にはインテグリンが高発現していたことに起因すると推察される。しかし、インテグリンとヘパラン硫酸の両方を認識するAd-RGD(HI)K7(C)-L2ではAd-RGD(HI)-L2程の高い遺伝子発現は見られなかった。これは、本検討で用いたAd-RGD(HI)K7(C)-L2はRGD配列とポリリジン配列の2つの外来ペプチドをファイバーに発現していることからファイバーの立体構造が不安定になり、生物学的濃度が低くなったのではないかと考えられる。2.胎盤由来細胞株に対するファイバー置換型Adベクターによる遺伝子導入効率の検討ヒト由来胎盤細胞株を用いた遺伝子導入実験の結果、CD46を受容体とするAd-F35-L2はいずれの細胞においてもAd-L2以上の遺伝子導入効率を示し、最大で6倍の遺伝子導入効率の改善が認められた。よって、Ad-F35-L2は胎盤細胞への遺伝子導入においてAd-L2以上の有用性の高いベクターであると考えられる。35型のファイバーを持ったAdベクターはヒト造血幹細胞などの未分化な細胞に対し従来型Adベクターよりも高い遺伝子導入を示すことが知られており、ヒト由来胎盤細胞株においても高い遺伝子発現を示した。
コラーゲン代謝異常の病因・病態解析

過去2年間の班員による研究実績をふまえ,本年度は,コラーゲン代謝異常症病因解析法の確立と,組織形成に異常をもたらす非コラーゲン性マトリックス成分の解析に焦点を絞って研究を行った.まず, Ehlers-Danlos症候群(EDS)および骨形成不全症(OI)患者皮膚生検組織からの線維芽細胞取得,放射活性標識プロリンのとり込みによる産生コラーゲンおよび非コラーゲン性タンパク量の定量法, SDS-PAGEによる産生コラーゲンの型分析から,過去3年間に依頼を受けた50症例以上のうち, I型コラーゲンのα2鎖欠損例2例,フィブロネクチン欠損例, 4例(以上いずれもEDS), I型α1鎖中のGly→Cysへの変異例, 1例(致死性OI),プロテオデルマタン硫酸欠損例, 1例(EDS)が検出された(永井,新海),また,コラーゲン生合成過程における修飾酵素のひとつ,リジルオキシダーゼの微量定量のため,ニワトリ大動脈由来の精製酵素に対する單クローン抗体を作成し,ヒト臍帯由来同酵素と交叉反応を示すクローンを選択し(IgM), ELISAによる定量法を確立した(早川),藤田班員は先天性ビタミンC欠乏症のモデルと考えられる,遺伝性骨形成異常ラット(ODラット)における骨減少の病態を骨潅流系を用いて調べ,アスコルビン酸は,骨芽細胞の増殖,分化に重要な役割を果しており,その障害がODラットにみられることを明らかにした.先天性結合組織異常と同組織内架橋成分との関係を明らかにするため,剖検別ヒト大動脈壁および尿中ヒスチジノアラニンの定量を行い,大動脈壁においては加令とともに含量が上昇すること,尿中では乳幼児では成人より高く, EDS, OI(各1例)においても高値を示した(藤本).鈴木班員は,種々の先天性軟骨形成異常マウスの硝子軟骨中に分布するII型コラーゲンとIX型コラーゲンの分布に相関があるかどうかを,各抗体を用いて発生過程を調べ,とくに相関はみられなかったが, IX型のマトリックス形成における重要性を示唆した.過去2年間の班員による研究実績をふまえ,本年度は,コラーゲン代謝異常症病因解析法の確立と,組織形成に異常をもたらす非コラーゲン性マトリックス成分の解析に焦点を絞って研究を行った.まず, Ehlers-Danlos症候群(EDS)および骨形成不全症(OI)患者皮膚生検組織からの線維芽細胞取得,放射活性標識プロリンのとり込みによる産生コラーゲンおよび非コラーゲン性タンパク量の定量法, SDS-PAGEによる産生コラーゲンの型分析から,過去3年間に依頼を受けた50症例以上のうち, I型コラーゲンのα2鎖欠損例2例,フィブロネクチン欠損例, 4例(以上いずれもEDS), I型α1鎖中のGly→Cysへの変異例, 1例(致死性OI),プロテオデルマタン硫酸欠損例, 1例(EDS)が検出された(永井,新海),また,コラーゲン生合成過程における修飾酵素のひとつ,リジルオキシダーゼの微量定量のため,ニワトリ大動脈由来の精製酵素に対する單クローン抗体を作成し,ヒト臍帯由来同酵素と交叉反応を示すクローンを選択し(IgM), ELISAによる定量法を確立した(早川),藤田班員は先天性ビタミンC欠乏症のモデルと考えられる,遺伝性骨形成異常ラット(ODラット)における骨減少の病態を骨潅流系を用いて調べ,アスコルビン酸は,骨芽細胞の増殖,分化に重要な役割を果しており,その障害がODラットにみられることを明らかにした.先天性結合組織異常と同組織内架橋成分との関係を明らかにするため,剖検別ヒト大動脈壁および尿中ヒスチジノアラニンの定量を行い,大動脈壁においては加令とともに含量が上昇すること,尿中では乳幼児では成人より高く, EDS, OI(各1例)においても高値を示した(藤本).鈴木班員は,種々の先天性軟骨形成異常マウスの硝子軟骨中に分布するII型コラーゲンとIX型コラーゲンの分布に相関があるかどうかを,各抗体を用いて発生過程を調べ,とくに相関はみられなかったが, IX型のマトリックス形成における重要性を示唆した.
西南日本の地震間地殻変動におけるマントル粘性流動の力学的役割の解明

本研究では、プレート境界の固着によって生じる応力がマントルの粘性流動により緩和する粘弾性緩和の影響を考慮した上で、南海トラフのプレート境界における固着の空間分布と西南日本の内陸活断層への応力蓄積のメカニズムを明らかにする。この目的のために以下の研究を行う。(1)現実的な粘弾性媒質モデルを用いて、プレート境界や内陸活断層における固着分布を現在観測されている地殻変動から推定する。(2)プレート境界の固着によって駆動される内陸活断層のすべりの物理モデルを構築し、このモデルと観測されている地殻変動を用いて内陸活断層への応力蓄積のメカニズムを検討する。
アジア諸国の教科書分析に基づくドイツ語教育のカリキュラムと到達度テストの開発研究

本研究では、初年次に日韓のドイツ語教科書を語彙および導入される文法項目の点から比較分析を行い、翌年度には日韓のドイツ語学習者のプロフィールや学習方法について、アンケートおよびインタビューを実施し調査した。最終年度には、韓国の高等学校におけるドイツ語教育の実態を現地調査した。これらの調査・分析結果から、外国語教育および異文化理解教育において、韓国は日本に比べ大きくリードしており、成果を挙げていることが浮き彫りとなった。初年度は、本研究の基盤となる(1)韓国および日本のドイツ語教科書の収集と分析、(2)韓国および日本の大学におけるカリキュラムの調査を行った。(1)では、平成19年度に広島大学において教養教育としてのドイツ語授業で用いられた教科書12冊と、韓国で出版されているドイツ語教科書7冊を対象に、それぞれの教科書に登場する語彙(異語数)をカウントした。このうち、内容や学習目標が似通った教科書、日韓それぞれ4冊ずつを対象に語彙の量的比較も行った。(2)では、甲南大学、関西学院大学、大阪学院大学、慶應義塾大学湘南藤沢キャンパスにおいて、それぞれの大学のドイツ語担当教員からカリキュラムや教材、学習者の到達度等について聴き取り調査を行った。また、韓国人留学生の協力を得て、韓国の主要な大学(ソウル大学、延世大学、梨花女子大学、淑明女子大学、嶺南大学)の第2外国語としてのドイツ語のカリキュラムや、大学入学試験でのドイツ語試験について、インターネットでの情報収集を行った。これらの調査および分析により、韓国の教科書は日本の教科書に比べ2倍近い異語を含んでおり、学習される文法項目も日本に比べ多いことが判明した。また、韓国では高等学校において第2外国語が導入されているが、勧告の高校における語彙や文法の学習量は、日本の大学における教養科目としての第2外国語(週2時間1年間の学習として算出)の学習量に相当することも分かった。これらの中間的な分析結果は、『広島外国語教育研究』第11号(印刷中)に論文として発表した。2年次以降の研究では、教科書と学習者の到達度について、ハンブルク大学のサマーコースの日韓参加者を対象にした聴き取り調査を行い、今年度に得られた知見とあわせて、より具体的な分析を試みる。初年度に行った韓国および日本のドイツ語教科書の分析と韓国および日本の大学におけるカリキュラムの調査により、韓国の教科書では日本の教科書に比べ2倍近い異語が学習され、また文法項目も日本に比べ多いことが判明した。本年度は、この結果が実際の学習にどのように表れているのかを調査すべく、ハンブルク大学のサマーコースの日韓参加者を対象にアンケート調査とインタビューを行った。現地での調査は2008年8月10日14日を準備期間とし、協力者の募集とアンケート用紙の配布を行い、8月18日22日にアンケートの回収および個別のインタビューを行った。今回の調査では日韓学習者の到達度や学習歴、学習方法の比較が目的であるため、対象を少なくとも1年程度はドイツ語の学習経験がある者とした。そのため、サマースクールにおける習熟度別上位クラスに在籍する参加者を対象とし、韓国人12名および日本人14名からデータを収集することができた。また、より高度なドイツ語の習得に成功した学習者のサンプルとして、同年4月よりハンブルク大学に留学している韓国人2名と日本人1名にも協力を得た。アンケートは同一内容の物で、参加者の母語である韓国語または日本語で行い、インタビューはドイツ語母語話者によりドイツ語で行った。アンケートの結果からは、韓国人被験者14名中9名は高等学校ですでに平均148時間のドイツ語を学習しており、全員が大学でドイツ語を始めた日本人被験者とは全く異なる学習歴があった。また、ドイツ語学習の動機付けや学習方法にも日韓では差異が見られた。これらのデータは、『広島外国語教育研究』第12号(印刷中)に発表した。次年度の研究では、アンケートとインタビューの結果をより精査し、同時に韓国におけるドイツ語教育のカリキュラムについてさらに調査を進め、効率的にドイツ語を学習するためのカリキュラム開発に寄与する知見を得る。また、昨年度はこの結果が実際の学習にどのように表れているのかを調査すべく、ハンブルク大学のサマーコースの日韓参加者を対象にアンケート調査とインタビューを行った。これらの調査結果から、韓国と日本のドイツ語教育には制度やその方法において大きな差異があることが判明したが、これまでに収集した情報やデータが韓国のドイツ語教育の実情をどの程度反映しているのかを確認すべく、今年度は韓国での現地視察を行った。視察は2009年9月13日18日に行った。ソウルにある韓国ドイツ文化センター(Goethe-Institut Korea)の協力のにより、ソウル大学付属高等学校、ソウル藝術高等学校、梨花女子外国語高等学校の3校から学校見学および授業見学が許可された。今回の視察では、韓国の高等学校において質の高い授業が展開されていることが確認された。

その背景には社会的・経済的理由による外国語習得に対する高い関心や、激しい受験競争に打ち勝っためにそれぞれの高等学校が行っている課外授業による時間数の確保等があることも確認できた。この調査結果については『広島外国語教育研究』第13号(印刷中)に発表した。これらの知見は本研究の目標とするところのカリキュラムや到達度テストの開発について、十分に考慮すべきものである。本研究は科学研究補助金の枠内においては今年度を以って終了するが、これまでの調査において、韓国のドイツ語教育を精査するためには、社会的および政治的な側面からのアプローチも必要であることが判明した。今後は、より充実したカリキュラムとより精度の高い到達度テストを開発すべく、さらなる包括的な研究を継続して行う予定である。
脳組織移植による銅代謝異常マウス脳障害の発生機序に関する研究。

目的:Menkes kinky hair病(以後MKHDと略す)のモデル動物であるMacular mauseのhemizygoteは自毛で生後10日目頃から、失調、けいれん、体重減少を示し、生後15日前後に死亡する。このマウス脳では、銅含有量は低下し、生後7日目頃から神経細胞の樹状化が遅れ、その内に異常ミトコンドリアが出現し、cytochrome c oxidase(CCO)活性が低下する。MKHDの患児の中枢神経系の病態をより深く知るためにこれらのマウスを用い脳移植を行い、移植片と宿主側の脳についてその病理的変化を研究する。方法:(1)hemizygoteの胎令18日目の大脳皮質と出生時の小脳皮質を日令2日目の正常マウス大脳皮質に移植した場合、および(2)正常マウスの胎令18日目の大脳皮質をhemizygoteの大脳に移植した場合について、Golgi染色、組織化学(CCO活性)および電顕にて観察した。結果:(1)の場合、移植後14日目の観察では、hemizygoteの移植片のPurkinje細胞の樹状化は遅れ、大脳、小脳ともCCO活性も低下し、腫大した異常ミトコンドリアが神経細胞内に見られた。(2)の場合、移植後10日目の観察では、正常マウスの移植片の大脳皮質神経細胞にはhemizygoteの神経細胞で見られたような変化は観察されなかった。結論:hemizygoteの移植片にみられる病理所見は正常マウス脳では消失せず、正常マウスの移植片の神経細胞もhemizygote脳内でhemizygoteと同じ変化を示さなかった。このことはhemizygoteの病理所見がhemizygote内で二次的におこる銅不足のみに起因するのではなく遺伝子に起因した変化である可能性も推測された。[目的]Menkes kinkyhair症のモデル動物であるMacular mouseのhemizygoteは白毛で生後10日目頃から,失調,けいれん,体重減少を示し,生後15日前後に死亡する。このマウス脳では,銅含有量が低下し,生後7日目頃から神経細胞の成熟が遅れ,その内に異常ミトコンドリアが出現し,チトクロムCオキシタ-ゼ(CCO)活性が低下する。このような病理所見を有する脳組織を日令2日目の正常マウス脳に移植し,これらの病理所見が改善するか否かを明らかにすることが本研究の目的である。[方法]出生時のhemizygoteの小脳を日令2日目の正常マウス大脳に移植を試み,生着したものについて,生後7日,10日,14日目に移植片の病理学的について検討した。出生時のhemizygoteの同定はその大脳の銅含有量の測定によっておこなった。[結果]小脳Purkinje細胞の樹状化は遅れ,そのCCO活性も対照群に比し低下した。また,Purkinje細胞内にはクリステの少ない明るく腫大した異常ミトコンドリアが観察された。[結論]hemizygoteの移植片にみられる病理所見は,正常マウス脳内では消失していなかった。このことは,(1)移植片が宿主側から十分な銅と血流が与えられなったためか,それとも(2)hemizygoteの病理所見が二次的に銅の減少のみに起因するのではなくて,移植片を構成する細胞の遺伝子に起因した変化である可能性もある。これを明らかにするためになお本研究を続けたい。目的:Menkes kinkyhair病のモデル動物であるMacular mouseは白毛で生後10日頃から失調、けいれん、体重減少を示し、生後15日頃に死亡する。

このマウス脳では、銅含有量が低下し、生後7日目頃から神経細胞の成熟が遅れ、その内に異常ミトコンドリアが出現し、cytochrome c oxidase(CCO)活性が低下する。このような病理所見をきたしてくる日令2日目のhemizygoteの脳に正常胎仔大脳片を移植し、移植片がhemizygoteと同じ病理所見を呈するかどうか明らかにするのが本研の目的である。方法:hemizygoteの日令2日目の大脳に胎令18日目の正常マウス大脳皮質片を移植し、生着したものについて生後7、10、14日目に移植片の病理的検討をおこなった。結果:移植を受けたhemizygoteはすべて生後15日前後で死亡した。そのためか14日目まで生着するものは無かった。生後10日目(移植後8日目)まで生着した移植片ではCCO活性の明確な低下や異常ミトコンドリアは認められなかった。移植片の神経細胞樹状化の遅れの有無については評価は困難であった。結論:移植によるhemizygoteへの臨床的効果は無かった。移植片でhemizygoteと同じ病理所見が見られなかったことは短期間の銅の不足だけでは成長期の神経細胞はあまり影響を受けないのかも知れない。
STAP2のメモリーCD8陽性T細胞における機能解析と癌免疫療法への応用

STAP2は、様々な免疫系細胞において細胞内シグナルを正および負に制御するアダプター分子である。本研究では、CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)におけるSTAP2の機能に焦点を当て、メモリーCTL誘導におけるSTAP2の機能的役割の解明を行った。その結果、STAP2は抗原特異的メモリーCTLに高発現し、メモリーフェノタイプへの分化を制御する事を明らかにした。つまり、STAP2はメモリーCTLの分化誘導を制御する重要な分子であることが示唆された。In vitroでの抗原特異的CTLのメモリータイプ分化におけるSTAP2の機能解析CD8陽性メモリーT細胞のin vitro分化系を用い、分化時におけるSTAP2の機能解析を行った。9m抗原特異的TCRを発現したTCRトランスジェニックマウス(DUC18マウス)より脾臓細胞を回収し、その培養の際に、STAP2 siRNAを電気穿孔法にて導入した。その後、siRNAを導入したDUC18由来培養CD8陽性T細胞を生体内に移入し、メモリーCTL分化におけるSTAP2の関与について検討した。その結果、陰性対象siRNA導入群と比較し、STAP2 siRNA導入群において生体内におけるメモリーCTLの機能が消失していることが明らかとなった。本結果は、STAP2がメモリーCD8陽性T細胞の分化機構に機能的に関与していることを示唆する重要な所見である。In vivoでのメモリー抗原特異的CTLにおけるSTAP2の発現検討これまでに明らかにされていない、in vivoにおけるSTAP2の詳細な発現様式を明らかにした。DNAワクチンを投与したマウスに誘導される抗原特異的CTLをリンパ節もしくは脾臓より回収し、STAP2の発現解析を行った。この時、回収する抗原特異的CTLはIL-7R陽性もしくは陰性細胞群で分離回収する事で、in vivoにおけるメモリーCTL分画とSTAP2発現の相関を検討した。その結果、In vitro同様、In vivoにおいてもメモリーCTL(IL-7R陽性細胞群)でSTAP2が高発現している事を見出した。以上より、In vitroのみでなくIn vivoにおいてもSTAP2がメモリーCD8陽性T細胞の形成に関与している可能性が示された。メモリーCD8陽性T細胞の分化誘導におけるSATP2の機能を解析する為、野生型マウスにワクチンを施しワクチン抗原特異的CD8陽性T細胞におけるSTAP2の発現ついて検討した。その結果、抗原特異的CD8陽性T細胞がメモリーT細胞へと分化するに伴い、STAP2の発現が上昇することを明らかにした。この結果は、In vitroにて分化させた抗原特異的CD8陽性T細胞のものと同様であった。さらに、生体内におけるSTAP2の機能を解析するため、STAP2ノックアウトマウスを用いて検討を進めた。STAP2ノックアウトマウスにワクチンを施し、ワクチン抗原特異的CD8陽性T細胞のメモリー分化を検討した。しかし、野生型マウスと比して、抗原特異的メモリーCD8陽性T細胞の分化誘導についての違いは見いだせなかった。これは、STAP2がCD8陽性T細胞のみならず、CD4陽性T細胞やマクロファージ等にも発現していることより、それらの影響によりCD8陽性T細胞におけるSTAP2の機能を直接的に検討できていない可能性がある。そこで、野生型マウスとSTAP2ノックアウトマウスの骨髄キメラマウスを作製し、より詳細な検討を行った。作製した骨髄キメラマウスにワクチンを施しワクチン抗原特異的メモリーCD8陽性T細胞の分化誘導を検討した。その結果、野生型マウス骨髄由来CD8陽性T細胞と比して、STAP2ノックアウトマウス骨髄由来CD8陽性T細胞におけるワクチン特異的メモリーT細胞がより多くに生体内に誘導されていることが明らかになった。本結果は、STAP2がメモリーCD8陽性T細胞の分化誘導に関与している事を示唆している。腫瘍免疫学In vitroにおけるSTAP2の機能解析とIn vivoにおける発現解析を完了し、おおむね予定通り進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、より生理的条件下でのSTAP2の機能の解明を目的とした、In vivo系でのSTAP2の機能解析を進めて行く。また、更にSTAP2を介した記憶CD8陽性T細胞に関わるシグナル解析も随時進めて行く。・24年度が最終年度であるため、記入しない。
機能オントロジーに基づく設計・製造知識コンテンツ管理と活用

本研究では,Webコンテンツの中から設計・製造に役立つ機能的な知識に焦点を絞り,共有可能な設計知識コンテンツの記述(生産)・活用環境を概念設計することを目的とした.コンテンツに意味的基盤を与える概念体系(オントロジー)を構築することで,設計・製造用の概念レベルのWebコンテンツにおける機能的概念の不均一性と観点への依存性を緩和することを目指した.特に,設計の結果を表す設計図などには明示的に記述されず,自然言語文でアドホックに記述されている設計者の意図(設計意図と呼ばれる)を表す「機能的知識」の共有を促進することを目指した.まず,昨年度までの研究成果に基づいて,オントロジー構築・利用環境を拡張し,オントロジーベースのXMLタグの構築支援環境の実装を進めた.また,この環境上で,ここまでで得られたXMLタグの諸性質を考慮しつつ機能オントロジーに基づいて,生産技術者が持つ知識の記述に必要なXMLタグセットを構築した.特に,生産現場では一つの設備に関する評価・検討は様々な観点から行われるため,その際に必要なさまざまな種類の知識を統合することを目指して,不具合と機能の関連に関する知識モデルに基づいて,それを表現するXMLダグセットを開発した.これらのタグを用いた記述された知識は設計図などの背後に隠されている設計意図情報を表現するメタデータであるとみなすことができる.さらに,このモデルを知識利用者の視点に合わせて必要な部分を動的に表示すことで,タグ付けされた知識の活用を促進する枠組みを構築した.本研究では,Webコンテンツの中から設計・製造に役立つ機能的な知識に焦点を絞り,共有可能な設計知識コンテンツの記述(生産)・活用環境を概念設計することを目的とした.コンテンツに意味的基盤を与える概念体系(オントロジー)を構築することで,設計・製造用の概念レベルのWebコンテンツにおける機能的概念の不均一性と観点への依存性を緩和することを目指した.特に,設計の結果を表す設計図などには明示的に記述されず,自然言語文でアドホックに記述されている設計者の意図(設計意図と呼ばれる)を表す「機能的知識」の共有を促進することを目指した.まず,昨年度までの研究成果に基づいて,オントロジー構築・利用環境を拡張し,オントロジーベースのXMLタグの構築支援環境の実装を進めた.また,この環境上で,ここまでで得られたXMLタグの諸性質を考慮しつつ機能オントロジーに基づいて,生産技術者が持つ知識の記述に必要なXMLタグセットを構築した.特に,生産現場では一つの設備に関する評価・検討は様々な観点から行われるため,その際に必要なさまざまな種類の知識を統合することを目指して,不具合と機能の関連に関する知識モデルに基づいて,それを表現するXMLダグセットを開発した.これらのタグを用いた記述された知識は設計図などの背後に隠されている設計意図情報を表現するメタデータであるとみなすことができる.さらに,このモデルを知識利用者の視点に合わせて必要な部分を動的に表示すことで,タグ付けされた知識の活用を促進する枠組みを構築した.
後縦靭帯骨化症の発症に関与する疾患関連遺伝子の検索、異所性骨化機 序の解明

後縦靭帯骨化症患者由来の皮膚組織また血液から人工多能性幹細胞(iPS)を作成した。作成したiPS細胞から骨芽細胞を誘導し、正常人由来のiPS細胞と骨芽細胞分化能を比較した結果、両細胞間で分化能に差は認められなかった。次に作成したiPSから靭帯前駆細胞を誘導した。正常人由来iPSから誘導した靭帯前駆細胞との間で網羅的遺伝子解析を行い、異所性骨化機序に関与する可能性のある候補遺伝子を抽出した。今年度実施した研究内容は以下のとおりである。1)対象患者の選定今年度は4名の方にご協力をいただいた。前年度の3名と合わせて、対象者は7名となった。2)体細胞の採取とOPLL患者由来iPS細胞の作製4名から皮膚組織を採取し、山中4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc)をプラスミドベクターで導入する方法により、iPS細胞を作製した。得られた細胞は多分化能及び事故複製能を持つことを確認した。3)靱帯細胞のマーカー遺伝子として知られるスクレラキシス遺伝子を、作成したiPS細胞にレトロウィルスを用いて導入した。4)靱帯細胞への分化誘導スクレラキシスを導入したiPS細胞に骨形成タンパク質の一つであるBMP-12を添加して培養することにより、I型コラーゲン、ラミニン、テノモジュリンの発現が増加し、すなわちiPS細胞が靭帯細胞への分化形質を持つことを確認した。5)靱帯細胞の発現プロファイルの把握OPLL患者から樹立誘導した靱帯前駆細胞3株と健常人由来iPS細胞から誘導した靱帯前駆細胞1株の遺伝子発現を、マイクロアレイにより比較した。この結果、OPLL患者由来靱帯細胞で共通して発現量が2倍以上異なる遺伝子を85種類選択した。現在、他の4検体においても発現の変化が共通しているかどうかを確認中である。本来の目的は発現量の異なるこれらの遺伝子群の全領域の塩基配列を次世代シークエンサーにより決定し、相違点を同定することにある。今年度は対象者の獲得と靭帯細胞への分化誘導法の樹立、発現プロファイルの把握に時間がかかり、塩基配列解析には至らなかった。今後引き続き計画を継続し、成果を得る予定である。1)対象患者の選定京都大学医学部整形外科において、治療中の患者より下記の選択基準で解析対象となるものを選定した。(1)胸椎に広範な連続型の骨化巣を有する(2)糖尿病等、治療対象となる明らかな疾患を合併していない。これらの基準を満たすものとして、今年度は3名にご協力をお願いした。2)体細胞の採取京都大学大学院医学研究科・医学部医の倫理委員会に申請・承認済みの「ヒト疾患特異的iPS細胞の作成とそれを用いた疾患解析に関する研究」の内容に基づいて説明を行い、同意を取得した後、上記の3名より皮膚組織を採取した。3)iPS細胞の作製皮膚組織の組織培養を行い、得られた線維芽細胞にyamanaka's 4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Myc)をレトロウィルスで導入する標準的方法により、iPS細胞を作製した。細胞は多分化能および自己複製能を持つことを確認した。4)靭帯細胞のマーカー遺伝子として知られるスクレラキシス遺伝子を、作成したiPS細胞に導入した。現在、靭帯前駆細胞としての機能を有しているかどうかを確認中である。1.検体数が不十分である侵襲的な検体採取(皮膚採取)が必要となることから、検体採取は主に手術時となる。厳密な選択基準を設けていることもあり、基準を満たす手術症例は予想以上に少なく、上記の検体数となっている。今後も患者さんに研究の意義を十分ご理解いただき、検体数の確保につとめる予定である。2.靭帯細胞への分化誘導iPS細胞から軟骨、骨など他の間葉系細胞への分化誘導は既に確立されつつあるが、靭帯細胞あるいは靭帯前駆細胞への誘導はその分化形質の確認が困難であることもあり、未だ不明確な部分が多い。今後も検討を重ねていく必要がある。ご協力いただける患者数をより増やし、できるだけ多くのOPLL患者由来のiPS細胞を樹立する。そこから靭帯細胞を誘導し、正常人由来のiPS細胞から誘導した靭帯細胞との遺伝子発現プロファイルの比較を行う。上記解析でOPLL疾患関連遺伝子の候補となる遺伝子の全領域の塩基配列を次世代シークエンサーを用いて解析し、複数の解析対象者で共通したゲノム変異、あるいはSNPを検索し、遺伝性素因関連遺伝子を同定する。次世代シークエンサーの解析に最も費用がかかる。対象とする領域のシークエンス費用は、iPS研での実績より200万円と試算し、平成24年度の予算に計上している。正確なコストは未確定であるが、十分実行可能であると考える。