hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シナプス形成誘導技術を用いたマイクロ流体デバイス内での3次元神経回路の構築

本研究の目的は新しい神経組織の再生・移植技術の開発のため、流体マイクロデバイス技術を用いて、思い通りの神経回路をin vitroで作成する事である。初年度開発した技術「初代培養神経細胞を利用した移植可能な神経スフェロイドネットワーク」、次年度、米国ジョージア州にあるジョージア医科大学のDr. Robert K. Yuの研究室で習得した神経幹細胞培養技術を利用し、今年度は2つの新規技術を開発をした。本研究の目的は新しい神経細胞の再生・移植技術の開発のため、流体マイクロデバイス技術を用いて、思い通りの神経回路をin virtroで作成する事である。具体的な研究計画は次の3つに大別された。(1)3次元神経細胞培養用流体マイクロデバイスの開発(2)神経細胞のパターン配列と神経突起伸展方向の誘導(3)流体マイクロデバイス内でのシナプス形成の誘導と神経回路の解析本年度の成果として全ての研究計画の基礎となる技術を確立する事が出来た。神経回路構築用にPDMSマイクロチャンバーアレイを構築し、初代培養神経細胞による神経細胞塊(神経スフェロイド)のアレイを作製した。本チャンバーアレイを利用して、神経スフェロイド間の神経突起の伸展の誘導に成功し、神経回路を作製する事が出来た。また、本系ではミリメートルサイズの巨大な神経回路の作製にも成功しており、さらにこれらの神経回路を階層化する事で3次元的な多層神経回路も作製する事が出来た。Ca2+イメージング法を用いて、本系により作製された神経スフェロイド回路は神経回路としての機能を有する事を確認した。さらに、本系で作成されえた神経スフェロイド回路を脳組織に簡単に移植する方法も開発し、来年度は動物移植実験も計画している。これらの研究内容は、本年度日本神経科学会、microTAS2009、MEMS2010で報告を行った。また特許出願もしており、現在は本内容で論文を執筆中である。本研究内容は研究者間での評価も高く、本研究のtissue engineeringへの応用や移植医療への応用が強く期待出来る。本研究の目的はしい神経細胞の再生・移植技術の開発のため、流体マイクロデバイス技術を用いて、思い通りの神経回路をin vitroで作成する事である。今年度は研究者海外派遣基金助成金(優秀若手研究者海外派遣事業)により、米国ジョージア州にあるジョージア医科大学のDr. Robert K. Yuの研究室で研究を行った(H22.3.29-H23.2.23)。申請者は学振研究の初年度(H21年度)に3次元神経細胞培養用流体マイクロデバイスを開発し、移植可能な神経回路の構築に成功した。本年度(H22年度)は昨年度の成果(移植可能な神経回路の形成)を論文にまとめ(M. Kato-negishi, Y. Tsuda, H. Onoe and S. Takeuchi, Aneurospheroid network-stamping method for neural transplantation to thebrain, Biomaterials, Vol. 31, pp8939-8945,2010)、現在は国際特許(特願2009-249621)も申請中である。本技術をさらに発展させ、移植医療への利用を目指して米国で神経幹細胞を使った神経回路の形成に着手した。本研究内容は研究者間での評価も高く、国際学会では質問者が多数訪れ、論文掲載時には海外の研究機関からの共同研究の依頼があり、本研究のtissue engineeringへの応用や移植医療への応用が強く期待されている。本年度は、渡米後すぐに神経幹細胞の培養技術を学び、PDMSマイクロチャンバーアレイ上での神経幹細胞の培養、分化誘導に成功した。2次元的な神経回路の形成には成功するが、残念ながら、申請者が本年度論文で報告している"大脳皮質のような3次元の神経回路を形成"は成功することが出来ず、マイクロチャンバーの改良の必要性が認められた。そこで来年度は、所属研究室(東京大学・生産技術研究所)にてチャンバー改良から進める方針である。派遣先の研究室では、神経幹細胞のアルツハイマー病治療への研究も盛んに行われており、申請者が本研究の目的にも掲げている神経疾患への神経幹細胞の利用を考えるうえでも、神経幹細胞の基礎的性質を知るための研究は重要であると考えられた。そこで神経幹細胞へのアルツハイマー病原因蛋白質の影響を観察する研究も行った。本結果は現在、論文執筆中である。
C-O軸性不斉エノラート化学の確立と展開

本研究では、安価で入手容易なL-乳酸より合成した誘導体の塩基処理により生成する短寿命C-O軸性不斉エノラート(ラセミ化障壁11.5kcal/mol)を経由する分子内不斉アルキル化ならびに不斉共役付加反応の開発に取り組んだ。アルキル化反応においては、基質の芳香環上置換基の嵩高さによりC-O軸の回転障壁を制御することで不斉誘導に成功した。共役付加反応では、マイケル受容体の検討により芳香環上置換基の嵩高さに依らない不斉誘導も可能となった。このように、L-乳酸を用いた分子変換において、短寿命C-O軸性不斉エノラートを経由する炭素-炭素結合形成反応により四置換炭素を有する多様な環状エーテル類を高エナンチオ選択的に構築する新規合成法を確立した。次に本研究では、アミノ酸誘導体の塩基処理により生成するC-N軸性不斉エノラートの直接的アリール化反応の開発に取り組んだ。直接的アリール化は、軸性不斉エノラートの分子内芳香族求核置換反応により達成可能と考えた。L-フェニルアラニンより合成したウレア骨格を有する基質を、DMF溶媒下-60°Cにおいて塩基で処理すると、エノラートの分子内芳香環に対する付加脱離が進行し目的とするアリール化体を最高で光学純度99% eeで与えた。さらに反応条件の検討を進めたところ、トルエン溶媒下0°Cにおける反応では、DMF溶媒下とは逆の絶対配置を有する生成物を最高で83% eeで与えることを見出した。以上のように、L-フェニルアラニンを出発物質とした分子変換において、軸性不斉エノラートの芳香族求核置換反応を利用することでアミノ酸誘導体の直接的アリール化に成功し、軸性不斉エノラート化学の新たな展開を示すことができた。C-O軸性不斉エノラートの一般性および有用性を示すことを目的とし、C-O軸性不斉エノラートを経由する分子内共役付加反応の開発に取り組んだ。分子内共役付加反応では、四置換炭素とそれに隣接する三置換炭素を一挙に構築することが可能である。そこで、エナンチオ選択性とジアステレオ選択性の同時制御を目指して反応条件を精査した。これまでの研究より、C-O軸性不斉エノラートを経由する分子内アルキル化反応では、キラルエノラートのラセミ化障壁を増大させるための芳香環上の置換基の嵩高さが、不斉誘導には必須であった。驚くべきことに、分子内共役付加反応では芳香環上の置換基が水素の場合でも不斉誘導が達成できた。この結果は、共役付加反応の反応速度が、分子内アルキル化反応に比べ速いことを示唆する。アルキル化と同様、芳香環上に置換基を有する基質を用いた環化では光学純度が向上した。次に、収率、ジアステレオ選択性、光学純度の向上を目指し、マイケルアクセプターの効果を検討した。マイケルアクセプターとしてジエステルを有する基質を用いて反応を検討した。その結果、収率、ジアステレオ選択性ならびに光学純度がいずれも向上した。光学純度が向上したのは、電子吸引基の増加により環化反応の速度がより速くなったためであると考えられる。以上のように、短寿命C-O軸性不斉エノラートを経由する分子内共役付加反応の開発に成功した。本反応では、四置換炭素とそれに隣接する三置換炭素を高いエナンチオ選択性およびジアステレオ選択性で一挙に構築できた。また本分子変換では、不斉源として用いた乳酸は官能基炭素資源として生成物に反映されていることから、アトムエコノミーの観点からも非常に優れている。以上の研究成果は、次年度の研究計画である生理活性天然物silvestrolの全合成研究において、威力を発揮するものと考えられる。
各種微生物及び細胞外高分子ポリマーによる環境汚染重金属の検出と回収除去技術の開発

微生物は外的環境から微生物自身の遺伝や代謝に関係する物質を保護するために細胞外重合体(バイオポリマーと略する)を生成する。特に、微生物が致死量以下の毒性のある物質の存在下にさらされた場合、大量で特異的なバイオポリマーを創り出すことが知られている。生成されたバイオポリマーは外環境から細胞を守るバリアとして機能するだけではなく、時として、毒性物質と結合しその毒性を緩和することも知られている。バイオポリマーに関する研究はその特異的性質から多方面にわたっており、その利用方法も様々である。特にその優れた吸着性能の着目した研究は注目されている。本研究は、多種類の重金属を細胞外高分子ポリマーにより吸着除去し、更に吸着した重金属類を回収する技術を開発することを目的にした。また、吸着性の高分子ポリマーを生成し、かつ重金属耐性を持った微生物を分離・培養しその遺伝学的情報を得ることも重要な本研究の課題である。初年度及び第2年度は廃棄に当たり重金属の存在が問題となっている下水汚泥からの重金属の回収を微生物を利用して行った。その結果、鉱酸を用いた溶出法を上回る溶出効率を得た。また、最も有毒な重金属のひとつである水銀に耐性があり、更に常温で液体として存在する水銀を気化させ、固形物中から除去する作用を併せ持った細菌を単離することに成功した。また、その単離菌の遺伝子情報の検索にも手を付け、現在その研究は進行中である。最終年度の研究として嫌気性消化槽内細菌の発生するバイオポリマーによって形作られるグラニュール汚泥の特性を研究し、バイオポリマーの生成促進機構を研究した結果、構成主要因の物質として多糖類が挙げられその分子量は2万4万の間にあることがわかった。バイオポリマーは重金属によらず多くの物質を吸着することがわかり、更に多くの環境有害物質の吸着除去のための特異的バイオポリマーの開発研究が必要である。本研究において得られた結果は研究発表に示したように一部発表されているが、研究初年度でもあり、すべてが完結した内容にはなっていない。しかしながら、下水汚泥からの重金属回収技術についてはかなりの研究成果が得られている。下水汚泥からの重金属の溶出において、MnとCuは汚泥滞留時間を変化させた全てのRunにおいて溶出が起こった。Mnでは各Runの溶出量に差がほとんどみられなかったが、Cuでは各Runの溶出量に差が見られ、汚泥滞留時間が長いRun程溶出が起こった。このことからCuの溶出はMnより汚泥滞留時間の影響を受けやすいと考えられる。このとき、溶出実験前における形態毎の金属含有量は、Cuでは硫化物態、Mnでは有機結合態と炭酸塩態、Cuでは硫化物態が多くなった。溶出実験後における金属含有量はイオン交換態を除いた全ての形態で減少が見られた。イオン交換態の増加は他の形態から溶出した金属が移行したと考えられる。含有量の減少は、Cuでは硫化物態、Mnでは有機結合態及び炭酸塩態においてかなり見られた。さらに、Mnの有機結合態と炭酸塩態では各Runによってわずかではあるが含有量の変化に差が見られた。しかし、他の形態では各Runの含有量には余り差が見られなかった。汚泥滞留時間に対する各金属の平均溶出率は、定常状態における溶出量の平均値を汚泥中の金属含有量で除したものであるが、MnとNiが最も高く、Zn,Cd,Cu,Cr,Pbの順に低下がみられた。Pb,Crにおいては溶出がほとんど起こらなかった。

また、Znは全てのRunで70%の溶出率を示しており、滞留時間における溶出率の差はほとんど見られなかった。以上の結果から、汚泥滞留時間が長いほど金属の溶出率が高くなることが明らかになった。しかし、滞留時間1.5日の溶出率は3.0日の溶出率に近いことから、汚泥滞留時間は1.5日が最適であることがわかった。現在、我が国の下水処理場から産出される汚泥の24%は、土壌改良剤や建設資材として有効利用されている。下水汚泥は窒素やリン等の肥料成分を豊富に含んでいるため、有効利用される汚泥の大部分はコンポスト化を通じて緑農地へ還元されている。このような下水汚泥の有効利用は、処分地確保の問題や資源としてのリサイクルの観点から、今後増加するものと考えられる。しかし、下水汚泥中には各種の重金属が含まれているため、重金属を含む汚泥を直接土壌に還元することは、土壌を重金属で汚染する危険性があると考えられるこの下水汚泥から重金属を溶出させる方法としては、汚泥に酸を添加し、汚泥のpHを低下させる化学的処理(以下ケミカルリーチングと記す)と鉄酸化細菌や硫黄酸化細菌等の微生物を利用する生物学的処理(以下バイオリーチングと記す)等があり、また、著者らは下水汚泥からの重金属の溶出機横及び重金属の溶出に及ぽす第こ鉄藤加の効果について検討し、バイオリーチングがケミカルリーチングに比べ、経済的かつ効果的な処理方法であることが確認された。また、最も毒性の強い重金属の一つである水銀を除去するプロセスとして遺伝しレベルで操作を加えた細菌を用いて、気化させることにより固形物中から除去することに成功し、新しい重金属技術の開発に成功した。微生物は外的環境から微生物自身の遺伝や代謝に関係する物質を保護するために細胞外重合体(バイオポリマーと略する)を生成する。特に、微生物が致死量以下の毒性のある物質の存在下にさらされた場合、大量で特異的なバイオポリマーを創り出すことが知られている。生成されたバイオポリマーは外環境から細胞を守るバリアとして機能するだけではなく、時として、毒性物質と結合してその毒性を緩和することも知られている。バイオポリマーに関する研究はその特異的性質から多方面にわたっており、その利用方法も様々である。特にその優れた吸着性能の着目した研究は注目されている。本研究は、多種類の重金属を細胞外高分子ポリマーにより吸着除去し、更に吸着した重金属類を回収する技術を開発する事を目的にした。また、吸着性のの高分子ポリマーを生成し、かつ重金属耐性を持った微生物を分離・培養しその遺伝学的情報を得ることも重要な本研究の課題である。初年度及び第2年度は廃棄に当たり重金属の存在が問題となっている下水汚泥からの重金属の回収を微生物を利用して行った。その結果、鉱酸を用いた溶出法を上回る溶出効率を得た。また、最も有毒な重金属のひとつである水銀に耐性があり、更に常温で液体として存在する水銀を気化させ、固形物中から除去する作用を併せ持った細菌を単離することに成功した。また、その単離菌の遺伝子情報の検索にも手を付け、現在その研究は進行中である。最終年度の研究として嫌気性消化槽内細菌の発生するバイオポリマーによって形作られるグラニュール汚泥の特性を研究し、バイオポリマーの生成促進機構を研究した結果、構成主要因の物質として多糖類が挙げられその分子量は2万4万の間にあることがわかった。
α-メタロ(シリル,スタニル)ビニルリン化合物の創製と利用

α位の典型金属のケイ素、ゲルマニウム、スズ等の官能基を導入したビニルホスホナ-トはビニルシラン、ビニルゲルマン及びビニルスタナンとしての特性とビニルホスホナ-トとしての特性の両反応性を兼ね備えているところから、極めて有用な試薬として期待されるにもかかわらず、未開拓の分野として残されていた。本研究では、(1)β位にアルキルチオ基(1a,b)、アルコキシ基(1c)、アリール基(1d)等の官能基を有するビニルホスホナ-トを合成した。(2)合成したビニルホスホナ-トと有機リチウム化合物から、α-リチオビニルホスホナ-トを調製した。続いてアルデヒドとのWittig-Horner反応より、β位にエタンジチオ基及びプロパンジチオ基を有するアレン中間体が生成し、さらにラジカル的な[2+2]シクロ付加反応によりシクロブタン化合物が立体特異的に得られた。(3)α-リチオビニルホスホナ-トとトリオルガノメタルハライドとの反応により、α-(トリオルガノメタロ)ビニルホスホナ-トを高収率で合成することに成功した。(4)ビニルシラン、ビニルゲルマンはアシルカチオンと反応して、α-アシルビニルホスホナ-トを高収率で与えた。(5)α-シリル-β-エトキシビニルホスホナ-トは種々の求核試薬のマイケル付加反応を受け、その後EtO基の脱離を伴い、立体特異的にβ-置換α-(シリン)ビニルホスホナ-トを与えた。(6)1aよりα-ヨードビニルホスホナ-トの合成に成功した。α-ヨードビニルホスホナ-トはPd触媒存在下、末端アセチレン類と温和な条件で容易に高収率でクロスカップリング生成物を与えた。以上のごとく、本実験は初期の目的を果たすことに成功したと言える。
パキスタン・ハザーラ地方における古代都市と交易路に関する考古学的・美術史学的研究

パキスタン北西辺境州ハザーラ地方シンキアリ村近郊に位置する仏教遺跡ザールデリーにおいて、第3次発掘調査を行なった。今回は、ストゥーパ区、僧院区からなる寺院遺構の内、ストゥーパ南東部、ストゥーパ区南側に設けられた寺院の主入口である南大階段の2ケ所で発掘を実施した。ストゥーパ南東部の調査により、ストゥーパの平面プラン、基壇部の建築意匠などについて知見を得た。方形基壇は1辺25.4mでダイアパー式石積みによって築かれる。基部にカンジュールと呼ばれる多孔質の石灰岩を用いてモールディング装飾を施した基壇の形状は、他のガンダーラ仏教寺院のそれとほぼ共通する。当初は、基壇壁全体を漆喰塗りで仕上げていたが、現状では剥落し、その痕跡をほとんど留めない。本ストゥーパは、約80m四方のプラットフォーム中央部に造営されている。昨年度の調査で、ストゥーパの拡張工事(増広)に関わると見られる銘文を記した石板が発見されているため、数次に亘る造営が行われたか否かの資料を得ることを目的として、ストゥーパ基礎部分を調査した。その結果、基礎部分築造→プラットフォームの整地→現ストゥーパの造営が、一連の作業としてなされていたことが判明し、基礎部の調査からは増広が行われたことを示す資料は発見されなかった。ガンダーラの仏教寺院では、石やタイルを用いて寺域を舗装することが一般に行われる。本寺院では東階段の周囲に舗装敷石が残存していたが、その他の区域では舗装の痕跡が発見されなかった。南大階段は、東西幅9.8m、南北長10.5mでステップ1段の高さは約40cmである。階段とプラットフォームの接合部には方形の突出装飾がつけられており、その部分では東西幅13.9mを計測した。主な出土品として、ストィーパ東階段横から、軒蛇腹に取り付けられていた建築部材の片岩製肘木が数点発見された。平成7年10月より12月にかけて、パキスタン北西辺境州ハザーラ地方のザールデリー遺跡の発掘調査を行なった。(平成6年度に測量調査を実施済)。本遺跡は、南西に傾斜した山裾に築かれた仏教寺院址で、東西80m、南北120m程の規模をもち、南にストゥーパ区(塔区)、北に僧院区が置かれる。今年度は、主塔中央から東西南北の4方向にトレンチを設定して発掘を実施し、主塔の現状側面図の作成と塔区の土層観察を行ない(別添レポート図69参照)、主塔築造の技法、塔区の整地の過程や、周囲の状況について幾つかの知見を得た。まず、主塔基壇の4方に設けられた階段の一部が、南面を除く三方で確認された(図23、24)。方形基壇上面では、舗装石板が露出した(図27)。断面観察により判明した舗装石板の築造行程は、まず比較的細かい片岩を敷き詰めてラフな平面を作った上で、約15cmの盛土をし、その上に石板を敷くというものである。盛土断面中央部には、土の硬く締った層がみられ、盛土作業中に土を一旦叩き締めたことがわかる。また、主塔表面の漆喰仕上も発見された(図26)。主塔の基礎部分は、上部構造と同様にダイアパーと呼ばれる石積法を用いて築かれ、南側で3.7mの深さを持つ(図21)。

基礎部は1辺約43mの方形プランを有すると推測される。主塔は約70m四方のプラットフォーム上に造営されている。南北トレンチの土層観察の結果、まず主塔基礎部を築造し、それを覆うように大量の土を一度に被せ、その後にプラットフォームを築き上げながら、先の埋土との隙間に徐々に土を埋めていった過程が明らかとなった(図6、9)。本遺跡は、自然・人為的破壊のため、今年度の調査でも出土遺物は極めて少なかった。仏教寺院で大量に発見される彫刻作品は、殆ど完全に収奪され、僅かに建築装飾断片等が発見されたにすぎない。一方、土器は、ほぼ全層位から出土し、主塔造立と同時もしくはそれ以前とみられるものもある。パキスタン北西辺境州ハザーラ地方に位置するザールデリー遺跡の発掘調査の第2期となる本年度は、ストゥーパ区西側を調査区域とし、ストゥーパ区における主ストゥーパ以外の遺構の存在の有無の確認、ストゥーパ区西側における寺域の確認を目指した。その結果、この区域から2件の石造建造物の遺構を検出した。さらに94年度の調査の際に一部を確認していた。ストゥーパ区を形成するおよそ70m四方のプラットフォームの西側土留め壁の位置を確認した。2件の石造建造物は、南北に並んで配置される。破壊が甚だしいが、いずれも東側すなわちストゥーパ側に開口部をもつ建造物と見られる。北側の遺構は、南北9m、東西16mの長方形プランを有し、壁の厚みは1.4mを超える。壁はガンダーラの建築遺構では一般的なダイアパー式で積まれる。南側の遺構は、およそ8m四方のほぼ正方形プランで、一部を除いてダイアパー式の石壁を築く。壁の厚みは1.2m。いずれも遺構の性格を特定できる材料に乏しいが、主ストゥーパに関連する建造物、すなわち寺院伽藍の付随施設と見られる。猶、プラットフォーム西側土留め壁付近に設けられた後代のピットより、カロ-シュテイー文字の刻銘をもつ長方形石板を3点発見した。この石板は、50×40×10cm程の大きさで、横断面が弧状に湾曲するように鑿で加工整形され、平瓦のような形状を呈する。表裏のほぼ全面にわたって鑿痕を残すが、凸面側中央部に平坦に加工した個所を設け、そこに銘文を刻している。これらの石板は当初の設置場所から現位置へ投棄されたものとみられ、出土状況からはどの遺構に属する遺物であるかが判断できない。銘文は2つが「自己の資金において」、1つが「ボイレアの増広(にかかりしもの)」と記される。仏教寺院において一般に行われていたストゥーパの増広が、本寺院においてもなされていたことがこの銘文から窺え、寺院の歴史を辿る上で極めて貴重な資料を提供している。パキスタン北西辺境州ハザーラ地方シンキアリ村近郊に位置する仏教遺跡ザールデリーにおいて、第3次発掘調査を行なった。今回は、ストゥーパ区、僧院区からなる寺院遺構の内、ストゥーパ南東部、ストゥーパ区南側に設けられた寺院の主入口である南大階段の2ヵ所で発掘を実施した。ストゥーパ南東部の調査により、ストゥーパの平面プラン、基壇部の建築意匠などについて知見を得た。方形基壇は1辺25.4mで、ダイアパー式石積みによって築かれる。基部にカンジュールと呼ばれる多孔質の石灰岩を用いてモールディング装飾を施した基壇の形状は、他のガンダーラ仏教寺院のそれとほぼ共通する。当初は、基壇壁全体を漆喰塗りで仕上げていたが、現状では剥落し、その痕跡をほとんど留めない。本ストゥーパは、約80m四方のプラットフォーム中央部に造営されている。
プロテオーム解析による新規インスリン反応性リン酸化蛋白質cDNAの発見

インスリンは代謝調節、細胞増殖因子として生体必須のホルモンであり、その作用メカニズムを解明することは医学・生物学上極めて重要な課題である。我が国には約700万人のインスリン非依存型(II型)糖尿病患者がおり、4大疾患の1つに指定されている。それは標的細胞のインスリン作用不全に1つの主な原因があると考えられており、その病因の解明が緊急の課題となっている。インスリンの代表的作用である「細胞内へのグルコース取り込み促進」には、細胞増殖シグナル伝達因子であるPI3-キナーゼの活性化が必須であることを世界に先駆けて報告した(BBRC,1993.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,1994.)。PI3-キナーゼの下流にはAkt, atypical PKCがあることが報告されている。しかしAkt, atypical PKC (PKCζ,PKCλ)のどちらがインスリンによるGLUT4のトランスロケーションに関与しているのか、異なる多くの報告がなされており、まだコンセンサスを得ていない。そこで我々が開発したGLUT4mycを安定に発現させた培養細胞に、Akt1,2,3を特異的に抑制するRNAiを合成し導入した。その結果Akt1,2共にGLUT4のトランスロケーションに関与するが、Akt2の経路が主であると考えられた。また、アデノウイルスの系を用い活性型Akt、ドミナントネガティブ型Aktを一過性に発現させ、AktがGLUT4トランスロケーションに関与していることを明らかにしている。そこで次にAktのPHドメインと結合するタンパクがインスリン作用を伝達する因子である可能性が考えられる。PHドメインを大量精製し、それも結合するタンパクを抽出、プロテオミクスの手法でAktの基質を探索する計画を進めている。インスリンは膵臓β細胞より分泌され、糖代謝のホメオスタシスを担う主要なホルモンであり、その固有の作用である細胞内糖取り込み・グリコーゲン合成以外にも多くの細胞に対して各種の作用を持つ。研究分担者によるインスリン受容体cDNA単離同定(Cell,1985 Ebina et al.)に始まり、その作用メカニズムの解明は飛躍的になされてきた。しかしながら、多くの研究者の精力的取り組みにも拘わらず、その全容の解明は未だなされてはいない。そこで、申請者らは近年急速的に発達してきたプロテオーム解析の手法を用い、インスリンによりチロシンリン酸化されうる細胞内の全タンパク質のcDNAを網羅的に単離同定するべく解析を進めている。肝臓、骨格筋またはCHO細胞に大量にインスリンレセプターを発現させた細胞をインスリン刺激前、後でcrude extarctをとり、数種の抗ホスホチロシン抗体で沈降後、電気泳動をし、その断片をトリプシン消化後、プロテオーム解析を行っている。

インスリンの代表的作用である「細胞内へのグルコース取り込み促進」には、細胞増殖シグナル伝達因子であるPI3-キナーゼの活性化が必須であることを世界に先駆けて報告した(BBRC,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1994.)。PI3-キナーゼの下流にはAkt, atypical PKCがあることが報告されている。しかしAkt, atypical PKC (PKCζ, PKCλ)のどちらがインスリンによるGLUT4のトランスロケーションに関与しているのか、異なる多くの報告がなされており、まだコンセンサスを得ていない。そこで我々が開発したGLUT4mycを安定に発現させた培養細胞に、Akt1,2,3を特異的に抑制するRNAiを合成し導入した。その結果Akt1,2共にGLUT4のトランスロケーションに関与するが、Akt2の経路が主であると考えられた。また、アデノウイルスの系を用い活性型Akt、ドミナントネガテイブ型Aktを一過性に発現させ、AktがGLUT4トランスロケーションに関与していることを明らかにしている。そこで次にAktのPHドメインと結合するタンパクがインスリン作用を伝達する因子である可能性が考えられる。PHドメインを大量精製し、それも結合するタンパクを抽出、プロテオミクスの手法でAktの基質を探索する計画を進めている。
神経発達-脳代謝連関におけるATP感受性カリウムチャネルの役割

ATP感受性カリウム(K_<ATP>)チャネルは細胞内ATPの低下により開口し、そのチャネルポアはKir6.2またはKir6.1サブユニットにより形成される。Kir6.2の脳における機能について申請者らは低酸素センサーとして脳保護の役割を果たすことを示してきたが(Yamada K, et al.,Science,2001)、血管平滑筋型と言われるKir6.1の機能は不明であった。そこでKir6.1のKOマウスを用いて組織学的解析、並びに脳神経活動と局所脳血流変化の同時解析を試みた。KOマウスは野生型に比し体重が有意に軽く生後5-6週で死亡した。機能の違いを見る為にマウスのヒゲを機械刺激し、対側の皮質バレル野から神経活動を記録すると同時に興奮領域の脳血流変化をレーザードップラー法で計測したところ、KOマウスではヒゲ刺激に同期した神経活動は野生型と同様に見られたが対応する局所脳血流上昇に違いを認めた。すなわち野生型では5Hz、2秒刺激に対し血流上昇が見られるのにKOマウスでは上昇を認めず、更に4-30秒の刺激では二相性変化を示すなど野生型と異なる応答を示した。神経組織構築ならびに血管構築に野生型と違いが見られるかどうかを検討したところ、KOマウスにもバレル構造は存在し、血管構築には野生型と顕著な相違を認めなかった。以上の結果から、Kir6.1は生理的範囲でのATP変化を生じると考えられる神経活動依存的な局所脳血流増大に関与する可能性を示唆しており、Kir6.2が極端なATP変化に対して応答して生理的範囲の変化には鋭敏でない事と対照的で興味深い(Yuan, Yamada et al.,2004)。現在神経興奮時の微小脳血管弛緩をよりダイレクトに観察する目的で、脳スライスを用いて皮質神経活動を誘発し、同時に近赤外装置を用いて近傍の微小血管変化を更に解析中である。
海洋大気の有機態窒素エアロゾル：生成量を制御する海洋微生物活動の支配要因は何か？

大気エアロゾル中の有機態窒素は気候変動に影響し、特に海洋上での生成は、海洋表層の微生物活動の影響を強く受け、大気ー海洋間の窒素収支の理解においても鍵となる。しかし、有機態窒素の起源や生成量を支配する要因の多くは分かっていない。本研究は、複数の海域で同時に採取した大気と海水の試料を用い、元素分析や同位体測定、有機物組成の蛍光分析、さらに微生物パラメターの測定を統合し、詳細に比較することで、海洋上の大気有機態窒素エアロゾルの起源とその生成量を支配する海洋表層の微生物活動の要因(量、組成、活性の変化)を明らかにする。
細胞分化における遺伝子発現のゆらぎとその制御

細胞分化過程での遺伝子発現を定量的にとらえるために、人工酵素ジンクフィンガーヌクレーアーゼ(ZFN)を用いたレポーター遺伝子のゲノム標的遺伝子への挿入システムの確立を行った。この方法を用いて、ウニ胚一次間充織細胞の分化遺伝子であるHpEts遺伝子の発現レベルを、発生過程を通して1細胞レベルで定量化し、分化に伴って細胞間の発現のゆらぎが増大することを明らかにした。本年度は以下の通り研究を実施した。1)発生過程における遺伝子発現のゆらぎの解析...発生過程での1細胞レベルでの遺伝子発現ダイナミクスを測定するために、GFP遺伝子をゲノム遺伝子に1コピー導入する方法の検討を行った。ウニ胚発生過程の中胚葉細胞分化に関わる3つの遺伝子(HesC, Ets, Tb)のゲノム遺伝子配列中で、多型レベルが低い領域を選び、各遺伝子を特異的に切断するZinc Finger Nuclease(ZFN)を作製した。作製したZFNの標的配列への結合特異性を大腸菌のツーハイブリッド系で調べたところ、HesC遺伝子に対するZFNは特異性が見られたが、Ets遺伝子およびTb遺伝子のZFNには特異的な結合が検出されなかった。現在ウニ胚への導入条件の検討と平行して、ZFNが作製できていない2つの遺伝子についてライブラリースクリーニングによるZFNの作製を進めている。さらに、導入したウニ胚での遺伝子発現を1細胞レベルで検出するための準備として、複数コピーのレポーター遺伝子を導入したウニ胚において蛍光を経時的に観察し、取得データの解析を行った。2)細胞応答のゆらぎと細胞間相互作用に基づく細胞運命決定の解析...細胞運命の決定過程における"細胞応答のゆらぎ"を調べるために、動的な遺伝子発現のin vivo観察系の開発を行った。モデル動物であるツメガエル胚の外胚葉細胞を中胚葉誘導因子・アクチビンで刺激後、Goosecoid遺伝子およびMix2遺伝子の発現を発光ライブイメージングで観察する実験系の構築を試みた。3)多能性幹細胞における遺伝子発現のゆらぎの解析...分化過程におけるステロイドホルモン応答性のダイナミクスを1細胞レベルでリアルタイムに測定するため、レポーターコンストラクトの作製を行った。また、このコンストラクトを培養細胞に導入し、レポーター活性検出の条件検討を行った。1)発生過程における遺伝子発現のゆらぎの解析...昨年度作製した2つの遺伝子(Ets, HesC)に対するzinc-finger nuclease (ZFN)をウニ胚に導入し、標的遺伝子の切断活性を調べたところ、標的配列への欠失変異あるいは挿入変異が確認できた。さらに、Ets遺伝子に対するZFNとレポーター遺伝子を共導入したところ、Ets遺伝子の発現する一次間充織細胞においてレポーター蛍光を観察することに成功した。2)細胞応答のゆらぎと細胞間相互作用に基づく細胞運命決定の解析...細胞運命の決定過程における"細胞応答のゆらぎ"を調べるために、動的な遺伝子発現のin vivo観察系を構築した。具体的には、中胚葉誘導因子・アクチビンに応答するMix2遺伝子プロモーターにルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を連結したプラスミドをツメガエル胚の外胚葉細胞に導入した。アクチビン刺激後、Lucとルシフェリンの反応による発光イメージを、35分間隔で取得し、Mix2遺伝子の発現状態を約5時間(胞胚期から後期原腸胚期に相当)にわたってライブ観察することに成功した。3)多能性幹細胞における遺伝子発現のゆらぎの解析...核内受容体の発現をモニターするレポーター構築を組み込んだEC細胞を単離・継代することによって複数の安定発現細胞株の樹立に成功した。4)トランスジェニックカエルを用いたホルモン応答性ゆらぎの解析...両生類の形態形成における遺伝子発現の揺らぎをin vivoでモニターするため、甲状腺ホルモン感受性プロモーターと各種レポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックガエル数種類のライン化を行った。1)発生過程における遺伝子発現のゆらぎの解析...前年度確立したzinc-finger nuclease利用したレポーター遺伝子挿入システムを用いて、ウニゲノムのHpEts遺伝子座へGFP遺伝子をノックインし、胚発生過程における1細胞レベルでの蛍光量測定および発現ダイナミクスを解析した。その結果、一次間充織細胞の分化に伴って、HpEts遺伝子の発現のばらつきが大きくなっていくことが明らかになった。また、標的遺伝子座へのレポーター遺伝子導入効率をあげるシステム改善を行い、導入胚の約20%で蛍光遺伝子を発現させることに成功した。2)細胞応答のゆらぎと細胞間相互作用に基づく細胞運命決定の解析...細胞運命の決定過程における"細胞応答のゆらぎ"を調べるために、動的な遺伝子発現のin vivo観察系を前年度までに構築した。しかし、定量的な解析を行うためには、いくつかの問題点が明らかになった。本年度は、これらの問題点を解決するために、細胞の接着条件の調節や阻害剤を利用して細胞形態の安定化を行なった。その結果、経時的な発現定量解析が可能になり、個々の細胞での発現ピークの違いなどが検出できるようになった。

3)多能性幹細胞における遺伝子発現のゆらぎの解析...前年度までに作製したレチノイン酸応答レポーター遺伝子発現構築を安定的に発現するEC細胞株を用い、細胞塊中での細胞分化とレチノイン酸応答レポーター遺伝子発現の相関を解析した。その結果、レチノイン酸による分化誘導過程での発現のばらつきは観察されず、本システムではゆらぎを検出することができなかった。
遺伝子増幅法を用いたヒト主要組織適合性抗原とインスリン依存性糖尿病との関連の解明

近年、Toddらはインスリン依存性糖尿病(IDDM)の発症感受性を規定するのはHLA-DQ抗原であり、特にDQB鎖57位がアスパラギン酸(Asp)であると発症抵抗性が生じると報告した。今回、我々は自治医科大学内分泌代謝科通院中のIDDM患者72例と非糖尿病対照者85例についてHLA-DR抗原とDQβalleleの同定を行い比較した。DQβalleleの同定においては遺伝子増幅法(polymerase chain reaction, PCR法)とオリゴヌクレオチドをプロ-ブとしたdot-blot hybridization法を用いた。その結果、IDDMとの関連については、DR抗原でDR9との正の相関、DR2,DRw11(5)との負の相関を認め、DQβalleleでDQβ3.3(DQw9),DQβBlank(DQw4)との正の相関、DQβ1.2,DQβ1.9,DQβ3.1との負の相関を認めた。ハプロタイプとしては、日本人でIDDMと正に相関するのは主としてDR4-DQw4,DR9-DQw9であることが分かったが、両者ともDQβ鎖57位はAspであり、全体としても両群ともAspの頻度が高く、Toddらの仮説は日本人では成立しないことが明らかとなった。日本人においてはDQβ鎖のみならずDRβ鎖あるいはDQα鎖もIDDMの発症に関与することが考えられ、今後の検討が必要である。DRβ鎖、DQα鎖のIDDM発症への関与の可能性はそれぞれ白人、黒人における検討によっても報告されている。本研究の成果は、第32回日本糖尿病学会(金沢、1989)、第49回米国糖尿病学会(Detroit,1989)、第1回分子糖尿病学シンポジウム(和歌山、1989)において口演で発表した。また、1990年度の日本糖尿病学会、日本内分泌学会の各シンポジウムにおいて発表予定である。論文としてはDiabetes(Vol39,No.2,266-269)に発表され、第1回分子糖尿病学シンポジウムのプロシ-ディングとして印刷予定となっている。今後は、DRβ鎖、DQα鎖を含めたより詳細な解析を行っていく予定である。
海底砂の浮遊・運搬にともなう海浜変形の予測

近年、砕波帯内の底質の浮遊・運搬を解明するために、砕波帯内の流速測定が活発に行われ、乱れの特性等が明らかにされ始めている。その結果として、波が砕けた後、水表面近くに形成される水平渦や斜降渦と呼ばれる組織渦によって底質が巻き上がることが報告されている。我々は、現地観察に基づいて砕波直前にすでに底質の大きな浮遊が生ずることを確認しており、この現象は従来言われている組織渦には無関係であると思われた。そこで、我々は上記の科学研究費補助金の援助のもとに二次元造波水槽を作成し、砕波帯内の可視化実験ならびに流速測定を行い、浮遊の直接的原因である組織渦の存在を明らかにした。造波水槽として、長さ12m,幅15cm,深さ30cmの全面透明アクリル製水槽を作成した。水路内に勾配4/100の斜板を設置し、サージング型砕波が生ずる振動条件のもとで実験を行った。数多くの可視化実験により、砕波帯内では沖向きの流れが底面近傍で卓越しており、砕波点より沖側では振動境界層内に強い岸向きの質量輸送が認められた。この様な流体運動により、砕波点近くに沿岸砂洲が形成されることがわかった。この振動境界層内の岸向き流れは、砕波点より岸側では形成されず、砕波帯外の全水深にわたったゆっくりとした沖向き流れとなる。砕波点付近では、波の谷の通過のための強い沖向き流れと次の波の峰による岸向き流れが強く衝突し、境界層が剥離する。この剥離渦によって底質は巻き上がり、沖側からの境界層内の質量輸送は砕波帯内に入ることができず、補流となって再び沖に向うものと思われる。可視化によるこれら種々の特性は、砕波帯内外の流速測定によっても確められた。以上の結果から、砕波帯内における底質の浮遊の第1ステップは、砕波点の底面付近に周期的に形成される剥離渦によるものであることが明らかとなった。
ヒト口腔癌細胞におけるスフィンゴ糖脂質遺伝子の発現制御と抗癌剤低抗性に関する研究

ヒトの口腔扁平上皮癌細胞株を対象に細胞膜表面のガングリオシドGM3の発現量と抗癌剤感受性との関連の解明を目的として本研究をおこなった.JCRBより入手した14種類のヒトの口腔扁平上皮癌細胞(Ca9-22,HSC-2,HSC-3,HSC-4,Ho-1-N-1,Ho-1-U-1,KON, Kosk2-c13,SAT, SAS, SCC4,SKN3,OSC-19,OSC-20)を対象とし,ガングリオシド画分を薄層クロマトグラフィーで検出した.各細胞株のGM3合成酵素(SAT-1)遺伝子の発現量をReal time PCR法にて測定した.GM3産生量とSAT-1遺伝子の発現量は細胞株により量的差異がみられ相関傾向が認められた.シスプラチン投与3日後の50%有効濃度(Ic50)をMTTアッセイで分析したところSAT-1遺伝子の発現量とシスプラチンのIc50は正の相関傾向(R=0.717)を示した.次に,GM3の発現量を同一細胞株で制御することによりシスプラチン感受性が変化するかを検討した.Ca9-22株はGM3の前駆体であるLac-Cerを多く発現し,GM3の発現量が少ない性質を持っており,この株にマウスのSAT-1遺伝子を導入したクローンを作製した.SAT-1遺伝子導入株でガングリオシド発現を調べたところ,GM3の発現量は増えておらずGM3の代謝産物であるGM2が増えていた.このSAT-1遺伝子導入株とMockではシスプラチンの感受性に差がみられなかった.また,ガングリオシド合成阻害剤であるD-PDMP, PBPP, P4にて24時間処理して細胞内のガングリオシドを枯渇した状態でのシスプラチン感受性を調べたが,細胞株Ca9-22,OSC20,SCC4ではいずれも対照と比べてシスプラチン感受性の差を示さなかった.以上の結果よりGM3が単独でシスプラチン感受性に関与するのではなく,より多くの要因が関与すると考えられ,抗癌剤によるアポトーシス誘導のシグナル伝達におけるガングリオシドの役割究明が次なる課題として考えられた.ヒトの口腔扁平上皮癌細胞株を対象に細胞膜表面のガングリオシドGM3の発現量と抗癌剤感受性との関連の解明を目的として本研究をおこなった.JCRBより入手した14種類のヒトの口腔扁平上皮癌細胞(Ca9-22,HSC-2,HSC-3,HSC-4,Ho-1-N-1,Ho-1-U-1,KON, Kosk2-c13,SAT, SAS, SCC4,SKN3,OSC-19,OSC-20)を対象とし,ガングリオシド画分を薄層クロマトグラフィーで検出した.各細胞株のGM3合成酵素(SAT-1)遺伝子の発現量をReal time PCR法にて測定した.GM3産生量とSAT-1遺伝子の発現量は細胞株により量的差異がみられ相関傾向が認められた.シスプラチン投与3日後の50%有効濃度(Ic50)をMTTアッセイで分析したところSAT-1遺伝子の発現量とシスプラチンのIc50は正の相関傾向(R=0.717)を示した.次に,GM3の発現量を同一細胞株で制御することによりシスプラチン感受性が変化するかを検討した.Ca9-22株はGM3の前駆体であるLac-Cerを多く発現し,GM3の発現量が少ない性質を持っており,この株にマウスのSAT-1遺伝子を導入したクローンを作製した.SAT-1遺伝子導入株でガングリオシド発現を調べたところ,GM3の発現量は増えておらずGM3の代謝産物であるGM2が増えていた.このSAT-1遺伝子導入株とMockではシスプラチンの感受性に差がみられなかった.また,ガングリオシド合成阻害剤であるD-PDMP, PBPP, P4にて24時間処理して細胞内のガングリオシドを枯渇した状態でのシスプラチン感受性を調べたが,細胞株Ca9-22,OSC20,SCC4ではいずれも対照と比べてシスプラチン感受性の差を示さなかった.以上の結果よりGM3が単独でシスプラチン感受性に関与するのではなく,より多くの要因が関与すると考えられ,抗癌剤によるアポトーシス誘導のシグナル伝達におけるガングリオシドの役割究明が次なる課題として考えられた.細胞膜の超分子複合体であるラフトにみられるスフィンゴ糖脂質の中でGM3はガングリオ系の最初に合成される単純なガングリオシドであり,細胞の癌化により発現量が増えることが知られている.本研究はヒトの口腔癌の細胞株を対象にしてGM3の発現量と抗癌剤抵抗性との関連を明らかにすることを目的とし,本年度は以下の実験を行った.各細胞株の産生する総脂質を抽出後にガングリオシド画分を分離抽出し、抗ガングリオシド抗体を対照として薄層クロマトグラフィーを用いて組成を検出し同定した.各細胞株のGM3合成酵素(SAT-1)遺伝子の発現量をReal time PCR法を用いて測定した.抗癌剤抵抗性試験では,抗癌剤は臨床に広く用いられているシスプラチンを選択した.シスプラチン濃度を段階的に希釈した培地で3日間培養後,試薬としてセルカウンティングキットを用いて吸光度測定を行い,生存細胞数比から容量-効果曲線を描くことで50%有効濃度を推定した.それらの結果は以下のようであった.GM3産生量とSAT-

1遺伝子の発現量は相関傾向を示しており,細胞株により量的差異がみられた.SAT-1遺伝子の発現量とシスプラチンの50%有効濃度は正の相関傾向を示した.ヒトの口腔癌細胞株におけるGM3合成酵素遺伝子の発現量とシスプラチン抵抗性は密接な関連性があり,両者は正の相関傾向を持つことが現時点の結論である.ヒトの口腔扁平上皮癌細胞株を対象に細胞膜表面のガングリオシドGM3の発現量と抗癌剤感受性との関連の解明を目的として本研究をおこなった.JCRBより入手した14種類のヒトの口腔扁平上皮癌細胞株(Ca9-22,HSC-2,HSC-3,HSC-4,Ho-1-N-1,Ho-1-U-1,KON,Kosk2-c13,SAT,SAS,SCC4,SKN3,OSC-19,OSC-20)を対象とし,ガングリオシド画分を薄層クロマトグラフィーで検出した.各細胞株のGM3合成酵素(SAT-1)遺伝子の発現量をReal time PCR法にて測定した.GM3産生量とSAT-1遺伝子の発現量は細胞株により量的差異がみられ相関傾向が認められた.シスプラチン投与3日後の50%有効濃度(Ic50)をMTTアッセイで分析したところSAT-1遺伝子の発現量とシスプラチンのIc50は正の相関傾向(R=0.717)を示した.次に,GM3の発現量を同一細胞株で制御することによりシスプラチン感受性が変化するかを検討した.Ca9-22株はGM3の前駆体であるLac-Cerを多く発現し,GM3の発現量が少ない性質を持っており,この株にマウスのSAT-1遺伝子を導入したクローンを作製した.SAT-1遺伝子導入株でガングリオシド発現を調べたところ,GM3の発現量は増えておらずGM3の代謝産物であるGM2が増えていた.このSAT-1遺伝子導入株とMockではシスプラチンの感受性に差がみられなかった.また,ガングリオシド合成阻害剤であるD-PDMP,PBPP,P4にて24時間処理して細胞内のガングリオシドを枯渇した状態でのシスプラチン感受性を調べたが,細胞株Ca9-22,OSC20,SCC4ではいずれも対照と比べてシスプラチン感受性の差を示さなかった.以上の結果よりGM3が単独でシスプラチン感受性に関与するのではなく,より多くの要因が関与すると考えられ,抗癌剤によるアポトーシス誘導のシグナル伝達におけるガングリオシドの役割究明が次なる課題として考えられた.
デジタルヒューマニティーズを促進するオープンデータ環境およびシステム基盤の構築

本年度は、まず、オープンデータのために貴重資料をデジタル化した。研究資料として価値が高いと判断される雅俗文庫の中から、120点を選択し、デジタル化した。画像数にすると計4,270枚となる。これらは、データリポジトリ用の試験的データでもあるが、順次、IIIF対応し、九州大学附属図書館のデジタルコレクションでも公開予定である。また、オープンデータ、デジタルヒューマニティーズの啓蒙のため、シンポジウム「オープンデータと大学」を後援した。このシンポジウムにおいては、オープンデータに関して大学がどのように向き合っていくかを議論した。デジタルヒューマニティーズ研究の一環として、くずし字の自動認識手法を2つ提案した。一つ目は、CNN(Convolutional Neural Networks)の画像特徴を抽出する特性を利用し、文字枠の選定を行うと同時に、当該文字の枠も学習させる方法である。二つ目は、区切り枠のみの予測であり、従来の手書き文字認識によく使われる多文字画像を単一文字ずつに分割してから認識するという手順をくずし字の認識に適用するという手法である。これらの提案手法を、誤認識率と枠の一致率という評価手法を用いて評価した。7万個の3文字データを用いて訓練し、7000個のテスト用データを用いて評価したところ、二つ目のの提案手法の誤認識率は、すでに開催されたくずし字チャレンジ最優秀賞チームの誤認識率に比べ、よい結果を示した。また、枠の評価については、一つ目の提案手法の枠予測結果は、二つ目の提案手法よりよい結果を示した。オープンデータの啓蒙やデジタルヒューマニティーズの研究は行っているが、オープンデータのためのデータリポジトリの試験的運用が実現できていないため、やや遅れているといえる。今後は、データリポジトリの試験的運用を検討するが、オープンデータの推進は大学全体で議論が始まっているため、それらの動向も把握しながら、どのような方向や方法が最適化を検討する。また、貴重書のデジタル化についても、他組織の試みも把握しながら、今まで焦点が当てられなかった貴重書についてもデジタル化の価値があるかどうかを検討する。交付決定時期が7月だっため、研究プロジェクトの立ち上げと準備が遅くなってしまい、、計画していたオープンデータの動向調査やデータリポジトリの試験的運用が実施ができなかった。次年度ではこれらも年間計画に含める。
脳内神経幹細胞の分化誘導によるパーキンソン病新規治療法の開発

成人脳には側脳室下層および海馬に神経幹細胞が存在し、これらの神経幹細胞は神経細胞、星状グリア細胞、およびオリゴデンドログリア細胞に分化しうる。最近の研究で、側脳室下層の神経幹細胞は側脳室内に突起を出し、生物活性物資の作用を受け得ることが判明してきた。神経変性疾患であるパーキンソン病では、枯渇するドパミンを補う治療法はあるが、これは根本的治療法とはならない。パーキンソン病は黒質線条体路の変性により線条体内のドパミンが欠乏することにより発症する疾患であり、側脳室下層から線条体へは近距離であることから、ここに存在する神経幹細胞の増殖、遊走および分化が首尾よく行われれば、上記の種々の問題はすべて解決されることとなる。この度、Eph/ephrin系がこのような作用を発揮できないかどうかを調べるために、ラットおよびマーモセットでパーキンソン病モデル動物を作製し、ephrinを側脳室内に注入することによりその効果を調べた。ラットにおいては、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、線条体内への遊走、ドパミン作動性神経細胞や星状細胞への分化、および血管新生の亢進が認められ、行動の改善も認められた。これらの組織学的および行動上の改善は治療開始後12週間の時点でも持続して認められた。マーモセットにおいては、脳室が小さく、正確に側脳室に注入することは困難であったが、側脳室近傍への注入により、Supermexにより測定した行動の明らかな改善が認められた。ephrin分子に関しては、Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP)のcoiled-coil domainにephrin-A1分子を融合したものも使用したが、蛋白の沈殿を生じるくらいの多重合の状態となり、ephrin-A1-Fcをanti-IgG(Fc)で重合させたほうがより効果的な結果が得られた。パーキンソン病の再生医療のために、脳室下層神経幹細胞を増殖させ、線条体内に遊走させ、ドパミン作動性神経細胞に分化させる薬剤を脳室内に注入する治療法の開発を目標とする。私どものこれまでのマウスおよびラットの実験から、ephrin-A1(+/-)FGF2の脳室内注入がこのような作用をもつことを発見した。脳室下層から線条体への遊走経路はこれまでに発見されたものとは異なるため、細胞の遊走が真に脳室下層からかどうかの証明を要する。Ephrin-A1の多量体化は必須であるため、この多量体化を促進する分子を組み換えにて付加することにより融合産物として作製することとした。また、今回の計画では、下等動物のみではなく、マーモセットでも同じ効果があることを組織学的および行動学的に調べる。私達はパーキンソン病の再生医療的治療法を開発する目的で、神経幹細胞の増殖分化機構を探索し、線維芽細胞増殖因子受容体と複合体を形成して作用するEphA4受容体を発見した。このEphA4のリガンドであるephrin-A1の多量体が神経幹細胞の増殖およびドパミン作動性神経細胞への分化に有効である事を発見し、パーキンソン病の治療にephrin-A1多量体の側脳室内注入が有効であるかどうかを調べるために以下の実験を実施した。計画[1]ephrin-A1多量体の持続的注入および間歇的注入の効果に関する研究:パーキンソンモデルラットにおける脳内ephrin-A1多量体注入効果を注入方法別に調べた。浸透圧ポンプによる多量体化ephrin-A1-Fcの側脳室内

1週間持続注入は1-2μg/日で効果があり、3μgの1回注入よりも良好な行動解析結果が得られた。間歇注入の効果は現在調べている所である。計画[2]強力な生物活性をもつ組み換えephrinの開発:ephrin-A1-Fcをanti-IgG(Fc)抗体で多量体化する方法に比べてより効率的に、また抗体のような余分なものを加える事なく多量体化するためにCartilage Oligomeric Matrix Protein(COMP)をephrin-A1のC端に融合した。COMPを1コピー挿入したもの、2コピー挿入したものの2種類を作製した。これらの組み換え蛋白はin vitroの実験ではephrin-A1-Fcと同様の効力を保持していた。計画[3]パーキンソンモデルサルにおける効果の検定:MPTPの腹腔内注入によりパーキンソンモデルマーモセットを作製した。また、行動解析手法としてスーパーメックス法が有効であることを確認した。今後、これらのマーモセットを用いて種々の多量体化ephrin-A1の効果を調べる計画である。平成20年度においては、平成19年度に引き続いて、パーキンソンモデルラットにおけるephrin-A1脳室内注入による治療効果に関する研究とパーキンソンモデルマーモセットの作製を主体として計画を実行して来た。Cartilage Oligomeric Matrix Protein(COMP)のCoiled-Coil domainを融合させた組み換えephrinの作製および精製を行い、パーキンソン病モデルラットにて試験を行った。現時点の解析では従来の方法であるephrin-Fcのanti-IgG(Fc)抗体による多量体化より有効であるという結果は得られなかった。このため、今後のパーキンソンモデルマーモセットを用いての研究においてはephrin-Fcをanti-IgG(Fc)抗体により多量体化したものを主に使用する事とした。しかし、ephrin-A1-COMPの持続注入使用も視野に入れて研究を進める。パーキンソン病モデルマーモセット3匹において脳室内注入の予備的実験を施行した。Ephrin-A1注入により行動に改善が認められた。また、組織所見でもephrin-A1注入動物でTH陽性細胞の増加が認められた。このため、さらにマーモセット12匹においてMPTP注入によりモデル作製を実施した。注入後の死亡率が高く、このうち5匹が体長不良で死亡した。現在7匹でパーキンソンモデル作製が完了し、行動解析実施中である。パキンソンモデルラットにおける成果は投稿後改善点を指摘された。追加実験を完了しつつある。パーキンソン病の新規再生医療法を開発するために、パーキンソン病モデルマーモセットを用いて、行動解析および脳の組織学的解析を実施した。まずはMPTP皮下注にてパーキンソンモデルマーモセットを作製し、行動解析を実施したのちに脳を取り出して免疫組織学的に調べた。まずは2頭で浸透圧ポンプにて右側側脳室には多量体化したephrin-A1-Fcを、左側側脳室にはIgG(Fc)を注入した。4-6週間後の行動解析では行動の改善傾向を認めた。しかし、マーモセットの脳室は狭く、注入用カニューレの脳室内留置を確認することが難しい状態であった。このため、脳室および線条体部位を狙って左右それぞれ6か所にone shotで注入することとした。