hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分解能衛星情報を使用したタイプの異なる森林のCO2吸収量の緊急推定方法の確立

材積を基準に、それとの誤差率を求めてみた。そうすると、森林簿の誤差率は41%、ランドサット衛星の誤差率35%、イコノス衛星31%となった。森林簿は材積式から推定しただけなので、誤差率が高くなる。一方、高分解能は最も低い値を示した。高分解能衛星IKONOS, QuikBirdを利用して、スギ人工林の炭素貯留量の推定を行った。対象地は新潟県巻町管内角田山周辺,及び津川町管内である。この管内一帯に、角田山周辺に調査プロット21個、津川町一帯に45個を設定し、プロットの材積とプロット位置に該当するバンド3の平均輝度値との相関を調べたところ、いずれの地域にも指数関係が成立した。そこで、新潟県森林GISを利用して、スギ人工林を抽出し、衛星画像と森林基本図を重ね合わせし、小班内の各画素の平均輝度値を算出し、これを上記の指数式に当てはめて、小班単位の材積を推定した。森林が貯留する炭素量は、材積に容積密度と炭素率を乗じることで推定可能である。スギの容積密度は0.32、炭素率は0.5である。一般的には、炭素は幹だけでなく、枝、葉、根にも含まれる。幹量から、全体の炭素量を推定するには拡大係数1.7が使われる。しかし、今回は材積の推定を主体に考慮しているので、材積から貯留する炭素量のみを推定した。その結果、角田山周辺のスギ人工林の炭素貯留量は39,988トン、津川町の炭素量は180,101トンと推定された。一方、わが国の民有林には材積が記載された森林簿がある。しかし、この森林簿はコンピューター内の成長式により、材積を計算するため、現状に合っていないとの指摘がなされている。そこで、森林簿材積と高分解能衛星から求めた材積を比較してみた。その結果、RMSE(残差平方の平均値)で比較したところ、角田山は高分解のRMSEは134m3/ha,森林簿は162m3/ha津川町は高分解能のRMSEは220m3/ha,森林簿は239m3/haとなり、高分解能衛星を利用した材積推定の方が精度のよいことが分かる。
『小右記』『中右記』による音楽史解明のための基礎的研究

藤原(小野宮)実資が記した日記『小右記』は平安時代の音楽を知る上で重要な資料である。この時代の音楽の実態を詳細に把握し、分析できるようにするために、大日本古記録『小右記』から、音楽関係記事を抽出し、諸本との比較を行った。これまでに、『延喜式』などの法律や故実書類を基礎とした研究が行われてきたが、『小右記』の記事によって、規範と実態との違いや、実態の変遷を知ることが出来た。今後は行事ごとに変遷をまとめて行きたい。一昨年度に引き続き、昨年度も小野宮実資の日記『小右記』における音楽を把握する為、同書の音楽記事抽出に多くの時間を費やした。この作業が本研究の根幹となる。そのため、作業方針の一貫性が必要になるわけだが、実際には作業を進めるに従って、大小の修正、調整が必要となった。大きな変更点は、計画当初の方針では、『小右記』記事のなかで音楽が行われた催事、日時、経緯、場所、規模、人物、曲種、楽器などについて日記の記事を抽出していく予定であったが、日記の記事が、仏教法会については予想以上に詳細である上、法会の次第通り、即ち時系列に沿って法会流れを記述しているため、むしろそのなかの音楽的要素のみを切り分けることは不適切と判断し、法会の次第のほぼ全体を音楽記事として扱うことにした。また、記事全体における法会の割合が著しく多く、そのことも作業が進まない要因となっている。しかし、こうした作業を通じて、音楽の場や演奏形態のみならず、当時における各儀礼の割合や軽重、各儀礼における音楽の比重の高さや実態を改めて客観的に捉えることが可能になって来た。このような事情により、また『小右記』の音楽記事のみでも相当の量があり、昨年度中には、各記事の詳細な分析には到らなかった。本年度は最終年度にあたっており、作業の遅れを取り戻すべく努力すると同時に、本年度内に一定の成果を出せるよう、特に『小右記』の音楽記事作成に作業を集中するよう心がけたい。本研究は、雅楽の最盛期である中古から院政期にかけての音楽の実態調査を目的としている。具体的には『小右記』『中右記』を対象として、音楽記事を抽出し、年譜を作成することを最終目的とする。本年度の予定は、1『小右記』諸本の書誌調査、2本文研究、3音楽記事集成の作成を行うこととした。本年度は、大日本古記録『小右記』(岩波書店)により音楽記事の採取およびデータ入力を進め、音楽記事略本系の宮内庁書陵部蔵伏見宮家旧蔵本と、広本系の諸本を対象に本文批判を行い、た。記事の採録にあたってみると、法会については、当初の予想以上に次第を詳細に記している記事が多く見られた。よって、後に記事を年譜化した際に、法会における音楽の在り方の変遷を辿れること、また法会全体に音楽的所作が含まれた可能性をも考慮し、法会の次第ほぼ全体を採るようにした。その為、直接音楽との関わりを認められない文言を多く含める結果となった。以前より古記録が記主の個性、社会的立場によって記事の性格も多様であるとは認識していた。さらに今回の精査によって、『小右記』のような後の規範として伝来したものについては、伝来の過程、すなわち目録化や記事の省略の在り方にも用途等の事情を反映している可能性を考慮すべきことに気づいた。音楽記事について、広本、略本それぞれの記述内容の傾向を意識しながら作業を進め、研究に発展させるようにしたい。次年度は、本年度に実際に史料に接して作業を進め、調整した方針を踏まえ、『中右記』の音楽記事についての調査を進めていく。『小右記』全巻を対象とし、音楽記事を抽出して、諸本との校合を行いながら、記事を読み下し・分析に着手した。記事を時系列でみて行くと、これまでの音楽史では触れられていなかった変遷が読み取れることに気づいた。たとえば、これまでは雅楽寮が、時代が下るにつれて存在意義が薄れ、次第に楽舞については宮廷の楽所にその職掌が移行したことが知られているが、さらに古い時代を視野に入れてみると、兵庫が縮小するにつれ、本来鼓笛(軍楽)が担当していた行幸時の立奏などが、雅楽寮の職掌に移行して雅楽寮に残った僅かな職務となっていったことが分かった。さらに各儀礼、盛儀毎にはさらにその都度大小の変化がみられ、道長の時代には諸々の点で画期が訪れたことが分かった。『源氏物語』「紅葉の賀」で著名な舞楽《青海波》の装束が、当時としては異例の色が用いられたことなどもその一つである。近世の雅楽復興に際して参考とされたのが、文学作品であった可能性等も含め、このような今後の研究課題の芽がいくつも得られた。今後はさらに主要な行事、盛儀、法会など毎に、変遷をまとめるべく努力したい。

成果の公開には、細部の検討や他文献による裏付けなどが必要であると考えるため、いましばらく時間を要する。また、『中右記』についても『小右記』と同様の状況である。『小右記』の雛形を定めた後、『中右記』にも敷衍して、所属機関の研究年報などを発表媒体として、順次公開していく予定である。日本音楽史平成24年度・25年度を通じて主に『小右記』中の音楽記事抽出を行ったが、抽出の方針について、日記の記載内容に応じて調整を行っていることと、そのことによって計画当初の見込みよりも音楽記事として扱う分量が増加したことにより、音楽記事抽出作業自体に遅れが生じた。見込みが甘かった点は反省するが、実際の作業を通じて初めて分かったことであり、内容に即して方針・作業内容を調整することは必要であると判断した。音楽記事採取の際、特に法会に関わる記事のどこまでを音楽記事と認めて採取するかという問題について、たびたび調整と統一の必要が生じ、予想より大幅に時間を使ったことや、略本と広本との異同が大きく、両者の性格の違いを考慮しつつ対校する方法を模索する時間を必要としたこと、異体字の使用が多いために入力アルバイトが予想より漢字読解に時間を要したため、予定より遅れを生じた。いずれも予備調査の段階では予測しきれなかった。遅れについては、次年度の作業時間、入力アルバイトの時間増加等によって可能な限り解消する予定である。『小右記』音楽記事の抽出およびデータ入力と平行して、記事の校訂、分析を進めることで、昨年度の遅れを取り戻すよう、努力する。『小右記』の音楽記事集成については、本年度内に作成することを目標とする。また、『中右記』については詳細な記事作成を行う時間的余裕がないため、今年度は記事の抽出に力を注ぎたい。1)平成25年度は24年度に引き続き、『小右記』記事集成の作成、対校を続ける。2)一方で、『中右記』の書誌調査を開始する予定である。3)また、平成26年度の報告書作成に向けて、書式を決定し、文字入力作業をより充実させていく。諸本の性格の違い、年代の経過とともに儀礼、音楽が変容する様子を、可能な限り年譜や記事集成からも読み取れる方法を模索しながら、資料の充実を図る。1)平成25年度は24年度に引き続き、諸本のうち重要な写本と認められたものについて、文献の所蔵機関に赴き、撮影および複写を行う。このための交通費および複写費用として研究費を使用する。2)また、これと並行してアルバイトを雇用し、文字入力作業を進める。
分子レベル制御低温バッファ層によるヘテロエピタキシャルダイヤモンド基板の開発

本研究は大面積ダイヤモンドのヘテロエピタキシャル基板の作製を目的とし、異種基板への核形成および配向ダイヤの選択技術の開発を行った。分子を利用した核形成およびバイアスによる核形成を実施した。ダイヤモンドー下地界面の不純物が非配向核の原因であることを明らかにし、高プラズマパワー密度による多量の原子状水素が不純物形成を抑制することで、(100)ダイヤモンドの配向性を向上できることを見出した。また、(111)面方位においては、短時間バイアス処理および酸素添加による高精度界面制御を組み合わせることで配向ダイヤモンドの形成を可能とした。(100)および(111)両方位において高配向ダイヤ薄膜を合成した。ダイヤモンドは次世代の低損失パワーデバイスや原子レベルの欠陥を利用した高感度センサなどへの応用が期待されている。本研究は、これら応用のために課題となっているダイヤモンドの大面積合成の実現に向けた基盤技術の確立を目的とする。大面積化に向けて、本研究ではダイヤモンドを異種基板上へ形成するヘテロエピタキシャル成長を行う。ヘテロエピタキシャル成長において、ダイヤモンドー基板界面を原子・分子レベルで制御し、その界面を利用した高品質ダイヤモンド合成技術を開発する。ダイヤモンドのヘテロエピタキシャル成長では、異種基板上にダイヤモンドを核形成するプロセスが重要である。核形成には、プラズマに電圧を印加するバイアス促進核形成法および分子を利用する方法を用いた。バイアス促進核形成法により形成したダイヤモンド核に対して、下地基板との界面を透過電子顕微鏡による原子レベルでの評価を実施し、配向しているダイヤモンド核と配向していないものでは界面に大きな差があることを明らかにした。配向しているダイヤモンドは、下地との格子定数の違いからミスフィット転位があるが基板と小さな角度で繋がっているのに対し、配向してない核と基板との界面には不純物が存在し、ダイヤモンド核と基板の格子面が大きな角度を有していることがわかった。この不純物がダイヤモンド核の配向性に影響していると考えられ、その抑制が高品質ダイヤモンド薄膜形成には重要となる。また、分子を利用した方法においては、電圧などの特殊な環境を必要とせずにダイヤモンド核を形成することに成功しており、上記の不純物形成を抑制した新しい合成方法に繋がると期待できる。ダイヤモンド半導体はその優れた特性から次世代低損失パワーエレクトロニクスおよび高感度量子センサを構築する材料として期待されている。特に、(111)の面方位を有するダイヤモンドは大きな利点を有している。(111)面ダイヤモンド表面は(0001)面窒化物半導体と同一の結晶構造を有しており、ヘテロ接合デバイスやp型ダイヤモンドFET-n型窒化物FETによる相補型回路応用が可能となる。また、量子センサとして機能するダイヤモンド中のNVセンターは4方向の結晶軸が存在するが、(111)面を利用することにより1方向に揃えることができ感度を最大化することができる。本研究では、大面積(111)ダイヤモンド基板の作製を目指し、3C-SiC/Si(111)基板でのダイヤモンド核形成および薄膜合成を行った。3C-SiC(111)上での(111)ダイヤモンド核形成には、バイアス核形処理による3C-SiC(111)表面のラフネス増加および非配向ダイヤモンド形成という問題があり、これまでダイヤモンドの核形成および薄膜合成は実現されていなかった。本研究では、新規なパルスバイアス核形成法を開発し、3C-SiC(111)上での配向ダイヤモンド核の形成および薄膜合成に成功した。ダイヤモンドの核形成にはプラズマ中の基板にバイアスを印加し、正イオンを引きつける処理が必要であるが、この処理時間が長いと基板へのダメージおよび非配向ダイヤモンドの形成が起こってしまう。この問題を解決するために、通常5分以上行うバイアス処理時間を高バイアスにすることで10秒程度に短縮し、3C-SiC(111)の表面構造の保持および配向ダイヤモンド核の形成を両立した。配向核に対してダイヤモンド合成を行うことにより、基板全体を被覆したダイヤモンド(111)薄膜の作製に成功した。独自の核形成技術の確立により、ダイヤモンドのパワーデバイスおよび量子センサ応用にとって重要な(111)ダイヤモンドの配向形成および薄膜合成法の開発を行った。大面積基板実現に向けた基礎技術が着実に整い、デバイス・センサ応用へ適用可能な段階まで順調に進んでいる。ダイヤモンドのヘテロエピタキシャル成長において、最も重要なプロセスは異種基板上でのダイヤモンド核形成プロセスである。しかしながら、高密度かつエピタキシャルなダイヤモンド核を高い再現性で形成することはこれまで困難であった。本研究では、この課題を解決するために、核形成状態をその場モニタリングする手法を開発した。核形成プロセス時にプラズマを通し、アンテナから基板へ流れる電流を計測することにより、核の状態(密度および結晶性)をモニタリングできることを明らかにし、再現性良く高品質なダイヤモンド核を形成することに成功した。3C-SiC/Si(001)基板上に形成した高密度エピタキシャル核を用いて、高品質ダイヤモンド薄膜を合成した。膜厚を増加させるほど、薄膜のXRD評価による傾き分布は減少し膜質が向上することがわかった。膜厚75 umにおいて、XRDカーブの半値幅として0.52°を得た。過去の研究において3C-SiC(001)上で最も高品質な膜は膜厚300 umで半値幅0.62°であった。本研究では、より薄い膜厚でより優れた膜質を有するダイヤ薄膜を合成することに成功した。これは、核形成プロセスにおいて、高品質なダイヤモンド核を作り出すことに成功したためである。

また、エッチピット形成による欠陥密度評価を行い、膜厚の減少とともに欠陥密度も減少することを確認した。高感度磁気センサとしての応用が期待されている窒素-空孔(NV)センターの結晶配向を制御することができるため、(111)面ダイヤモンドは大面積センサプラットフォームを構築する材料として有望である。3C-SiC/Si(111)上にヘテロエピタキシャル成長したダイヤモンド薄膜において、NVセンターの形成を実施した。ヘテロエピダイヤモンド内においてもNVセンターが取り込まれ、一部領域ではNVセンターの配向を一方向に制御することに成功した。本研究は大面積ダイヤモンドのヘテロエピタキシャル基板の作製を目的とし、異種基板への核形成および配向ダイヤの選択技術の開発を行った。分子を利用した核形成およびバイアスによる核形成を実施した。ダイヤモンドー下地界面の不純物が非配向核の原因であることを明らかにし、高プラズマパワー密度による多量の原子状水素が不純物形成を抑制することで、(100)ダイヤモンドの配向性を向上できることを見出した。また、(111)面方位においては、短時間バイアス処理および酸素添加による高精度界面制御を組み合わせることで配向ダイヤモンドの形成を可能とした。(100)および(111)両方位において高配向ダイヤ薄膜を合成した。高品質なダイヤモンド薄膜合成に向けて、ダイヤモンドの核形成および基板との界面の評価を行った。異種基板上に形成したダイヤモンドー基板界面を原子レベルで評価し、ダイヤモンド核の配向を決める大きな要因を明らかにした。バイアス促進核形成のみならず、分子を利用したダイヤモンド核形成も確認しており、研究は順調に進んでいる。これまでの研究により、3C-SiC/Si基板上での(001)面および(111)面ダイヤモンド薄膜合成技術の開発に成功した。今後、この基板上でのダイオードやトランジスタなどのダイヤモンドパワーデバイスの作製、高感度量子センサに向けたヘテロエピタキシャルダイヤモンド基板上でのNVセンター軸の配向制御を実施していく。電気電子材料ダイヤモンドー基板界面での不純物形成を抑制するために、核形成条件の最適化を実施する。清浄な基板表面での核形成には条件選択が重要であり、不純物の状態とダイヤモンド核の配向性および密度との関係を明らかにし、大面積・高品質ダイヤモンド合成に向けた核形成技術を確立する。ダイヤモンドヘテロエピタキシャル成長用の基板や成果発表のための出張費を次年度予算と合わせて効果的に支出するため。研究が順調に進んでおり、基板や真空部品など実験に必要な材料を検討し、次年度において有効活用するため。ダイヤモンド薄膜合成用の基板および出張費。合成実験に必要な合成用下地基板、ガス・薬品および真空部品の購入や成果報告のための旅費として使用する。
糞化石を用いた古生代末大絶滅事変後の海洋食物網の復元

3年目は、国内外の様々な地域(宮城県、中国安徽省・雲南省・貴州省・湖北省、オランダ、米国ネバダ州)から採集された糞化石について、マイクロCT解析をはじめとした内部構造解析を行った。CT構造解析においては、国立科学博物館のラボ型CTを利用した一方で、放射光施設SPring8での試験的撮影も行い、位相差X線CTにより高解像度かつ高コントラストの断層画像が得られることが確認された。特にオランダWnterswijk産の中部三畳系産の糞化石から密集して見つかった内容物は、魚類の鱗・骨化石として非公式に認知されていたが、改めて断層画像を3D化し検討した結果、遊泳性軟体動物の一部である可能性が示された。さらに、2年目に引き続き宮城県における下部三畳系深海成層・大沢層の現地発掘調査を行い、既知の海生爬虫類や非遊泳性無脊椎動物のほか、同層準から多様な硬骨魚類、アンモナイト類、甲殻類が産出することを改めて示した。糞化石内容物と体化石について得られている予察的なデータを統合すると、前期三畳紀には脊椎動物同士の食う・食われるの関係が成立していただけではなく、甲殻類や軟体動物など、リン酸塩質の骨格を持たない生物を専食する動物が多様化していたことが示唆される。この成果に関して国際学会で発表し、現在論文として公表準備中である。また、2011年に報告された下部三畳系平磯層の脊椎動物化石密集層の再調査も行い、多様な水生脊椎動物の化石が産出することも確認された。特に板鰓類を主体とする大型魚類と大型両生類の化石が優先的であるなどの点で大沢層とは異なる。ただし後者の地層からは糞化石など生物間相互作用を示す記録は未だ得られておらず、今後さらなる発掘調査が進むことが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。2015年度は主に糞化石標本の採集、剖出および観察を行った。ヨーロッパ、北米、日本の三畳系海成層からすでに得られている糞化石標本については、剖出作業と、デジタル顕微鏡および簡易走査型電子顕微鏡を使った内容物の観察を行った。その結果、ヨーロッパの糞化石標本からは魚類や爬虫類など脊椎動物の化石が多く含まれていたのに対し、北米および日本の標本では骨格などの包有物は極めて稀で、大部分が有機物に富むリン酸塩質の基質で構成されていることがわかった。また、夏季には合肥工業大学と共同で、南部中国の三畳系海成層から得られる糞化石の発掘および標本調査を行った。その結果、下部・中部三畳系から多数の糞化石が得られた。特に、Hupehsuchiaなど特殊な海生爬虫類が発見されることで知られる湖北省の下部三畳系からは、大型の捕食者が排泄したとみられる糞化石が確認された。現時点での知見をまとめると、ペルム紀末の大量絶滅の直後にあたる前期三畳紀には、パンゲア超大陸の内陸海(テチス海)に位置していたヨーロッパや南部中国などでは、魚類や爬虫類など海棲脊椎動物同士の被食ー捕食関係が一般的に成立しており、多くの場合大型捕食者である海生爬虫類も被食者となり得た一方で、当時の外洋であるパンサラッサ海沿岸部にあたる日本や北米では、魚竜類など大型の捕食者も、脊椎動物以外の餌生物に依存していたと仮説付けられた。この仮説を地球化学的な手法により検証すべく、日本の三畳系から得られた糞化石の炭素および窒素安定同位体比を予察的に測定した。しかし、得られた炭素同位体比は現在の海洋棲捕食者から予想される値と比べ極端に低く、餌生物の栄養段階よりも、微生物の分解作用や続生作用が強く影響していることが示唆された。今後は、糞に含まれる餌生物の硬組織に対する微小領域の同位体分析など新たな手法も視野に入れ、実験計画の見直しを図る。採用初年度である平成27年度に、日本の東北地方や、ヨーロッパ各地方(オランダ、スイス、ドイツ)、北米のネバダ州などの三畳系から採集された糞化石について、標本の剖出作業と内容物の顕微鏡観察を行った。また、中国の研究者と連携し、貴州省、雲南省、安徽省の三畳系で活発にフィールドワークを行い、多数の糞化石サンプルを採集した。観察の結果、中国やヨーロッパなどの内陸海と、日本やネバダなど公海に接している海域では糞に含まれる生物の化石の組成に違いがあることが分かり、一定の成果が得られたといえる。ただし本研究の主軸のひとつである炭素・窒素安定同位体比分析に関しては、化石の保存状態による影響が大きく期待する程の成果が得られておらず、今後分析方法やデータの補正方法に改良の余地がある。本年度は,糞化石包有物の形態学的な解析,および古生態系復元の情報源としての体化石の調査に重きを置いた研究を行った.糞包有物の形態学的な解析に関しては,マイクロフォーカスCTスキャンを用いた糞化石内包有物の撮像を行った.三畳紀中期のテチス海浅海域に相当するオランダWinterswijkの中部三畳系産の糞化石には,脊椎動物化石とは明らかに異なる3次元構造を持った内容物が含まれていることが確認された.これにより,三畳紀中期の海洋生態系において重要な餌として,過去研究で想定されてこなかった無脊椎動物を特定できる可能性が高まったといえる.

体化石に関しての研究は,主に,日本の東北地方の下部三畳系における発掘調査,中国における下部ー中部三畳系の体化石コレクション調査およびフィールド調査,近年得られた極東ロシアの下部三畳系から発見された体化石の記載などを通じて行った.特筆すべき成果は,日本の下部三畳系からこれまでほとんど発見されていなかった硬骨魚類を複数種確認したこと,ロシアから発見された化石が世界最古の魚竜化石であり,当時爬虫類がすでに他の捕食性脊椎動物を体サイズで圧倒していたことを明らかにしたこと(いずれも論文準備中)である.また,本研究では糞化石の内部に多く含まれる微小な化石骨組織から分類群を特定する方法論の確立を目指している。このメソッドの現段階での応用例として,中央ー東アジアの下部白亜系非海成層から多数発見されている水生カメ類の断片的化石を用い,その骨組織学的解析を行った.その結果,偏光顕微鏡下での骨組織学的観察により,膠原線維束の立体構造を復元することで,科レベルでの分類群同定が可能であることを実証し,この研究成果をJournal of Vertebrate Paleontology誌に発表した.前年度に計画した糞化石の有機炭素・窒素同位体比分析は,窒素の含有量が極端に少ないことがわかったため,計画の見直しを図った.古生態系復元の情報源としてCN分析にかわり,糞化石包有物の形態学的な解析及び体化石の調査に重きを置いた研究を行った.糞化石包有物の形態学的な解析に関しては,東北大学総合学術博物館と共同でマイクロフォーカスCTスキャンを用いた非破壊の内部構造解析に挑戦している.同博物館では,大型化石と微化石両方に対応したCTスキャナを運用しており,数100μmー数mmレベルの糞化石内包有物を3次元で撮影することができると期待された.三畳紀中期のテチス海浅海域に相当するオランダWinterswijk産の糞化石には,当初骨や鱗が含まれていることはすでに確認されていたが,新たに脊椎動物化石とは明らかに異なる3次元構造を持った内容物が含まれていることが確認された.同時代から同様の無脊椎動物の包有物を含む糞化石は報告されておらず,三畳紀中期の海洋生態系において重要な餌として,過去研究で想定されてこなかった無脊椎動物を特定できる可能性が高まったといえる.また,東京大学・東北大学などの共同で行った東北地方の下部三畳系大沢層の発掘調査においては,複数種の硬骨魚類化石が発見されるなど,期待をはるかに上回る成果が得られた。これまで同層からは,海生爬虫類とサメ類など大型の捕食者および小型の無脊椎動物だけが化石として発見されていたが,本年度の発見により,被食者とも捕食者ともなりうる小型,中型の多様な魚類が確認された.これらの生物が,当時最大の海洋であったパンサラッサの西縁域で共存していた可能性が初めて示されたといえる.3年目は、国内外の様々な地域(宮城県、中国安徽省・雲南省・貴州省・湖北省、オランダ、米国ネバダ州)から採集された糞化石について、マイクロCT解析をはじめとした内部構造解析を行った。CT構造解析においては、国立科学博物館のラボ型CTを利用した一方で、放射光施設SPring8での試験的撮影も行い、位相差X線CTにより高解像度かつ高コントラストの断層画像が得られることが確認された。特にオランダWnterswijk産の中部三畳系産の糞化石から密集して見つかった内容物は、魚類の鱗・骨化石として非公式に認知されていたが、改めて断層画像を3D化し検討した結果、遊泳性軟体動物の一部である可能性が示された。さらに、2年目に引き続き宮城県における下部三畳系深海成層・大沢層の現地発掘調査を行い、既知の海生爬虫類や非遊泳性無脊椎動物のほか、同層準から多様な硬骨魚類、アンモナイト類、甲殻類が産出することを改めて示した。
FTAが日本企業のサプライチェーン与える影響に関する実証分析

Global Value Chainに関する理論モデルにFTAの効果を取り入れて拡張し、東南アジア・インドといった日本とのFTA締結国に進出している日系企業だけでなく、米国・中国等の対日FTA非締結国に進出している日系企業も含めて実証分析を行う。実証分析においては、調達・販売の地理的な違いおよびそれらへの外部ショックの影響、ネットワークのコアにあたる研究開発の現地化が生産性、マークアップおよび収益率へ与える効果の進出先での違いを比較するGlobal Value Chainに関する理論モデルにFTAの効果を取り入れて拡張し、東南アジア・インドといった日本とのFTA締結国に進出している日系企業だけでなく、米国・中国等の対日FTA非締結国に進出している日系企業も含めて実証分析を行う。実証分析においては、調達・販売の地理的な違いおよびそれらへの外部ショックの影響、ネットワークのコアにあたる研究開発の現地化が生産性、マークアップおよび収益率へ与える効果の進出先での違いを比較する
インフルエンザウイルス感染阻害活性を示す特殊環状ペプチドの探索

インフルエンザウイルスHAタンパク質をbaitとした特殊環状ペプチドライブラリーのスクリーニングを実施し、H5亜型HAに強い結合性を示す特殊環状ペプチドを4種得た。これらはいずれもH5亜型ウイルスに対し感染阻害活性を示すが、このうちの1種はH5に加え同じGroup1に属するH1, H2亜型ウイルスに対しても感染阻害活性を示した。また、高病原性H5N1ウイルスの致死性感染マウスモデルにおいて、この特殊環状ペプチドはZanamivirよりも高い治療効果を示した。本研究により、インフルエンザウイルスの亜型を超えた感染阻害活性を示し、既存薬とは作用機序が異なるHA結合性特殊環状ペプチドを取得した。特殊環状ペプチドのスクリーニングに用いるbaitを、従来のバキュロウイルスベクターで発現した精製HAタンパクからワクシニアウイルスベクターで発現したH5亜型の組換えHAタンパクに変更して一次スクリーニングを実施し、H5亜型HAに結合性を示す特殊環状ペプチドを4種得た。このうちの一つは、H5に加え同じGroup1に属するH1, H2亜型ウイルスに対しても増殖阻害活性を示すことを見出した。また、高病原性H5N1ウイルスを用いた致死性感染マウスモデルにおいて、この特殊環状ペプチドは既存の抗インフルエンザ薬Zanamivirよりも強い抗ウイルス活性(感染防御効果および治療効果)を示した。特殊環状ペプチドの結合部位の解析により、HAタンパク質のうち亜型間で保存性の高いstem領域に結合していることが示唆された。作用機序解析において、特殊環状ペプチドはHAによる膜融合活性を阻害することも明らかとなった。このHA膜融合活性はstem領域のfusion peptideが担うものであり、この結果からも特殊環状ペプチドがHAの保存性の高いstem領域を標的として結合することで膜融合活性を阻害していると考えられる。次に、Group2の亜型ウイルスに対する抗ウイルス活性も備えた特殊環状ペプチドの取得を目指し、Group2のHAタンパク質を用いた二次スクリーニングを実施するべくH3亜型のHAを基にHA stemコンストラクトを構築し、これを発現する組換えワクシニアウイルスベクターを作製した。この組換えワクシニアウイルスベクターを用いて特殊環状ペプチドのスクリーニングに使用する抗原タンパクの発現・精製を行い、現在これを用いた特殊環状ペプチドのスクリーニングを実施している。平成26年度は、二次スクリーニングで得られる特殊環状ペプチドについて、Group1, Group2の全ての亜型ウイルスに対する感染阻害効果を検証し、その作用機序の解析を進めていく予定である。平成26年度は、A型インフルエンザウイルスに対するパントロピックな特殊環状ペプチドの開発を目指し、Group2に属するH3亜型のHA (HA FL)を基にHA stemコンストラクトを構築した。このコンストラクトはA型インフルエンザの現存する16亜型のHA全てに共通するstem領域のみから成り、抗原性が高く多様なglobular head領域を含まないため、より効率的にstemに結合する特殊環状ペプチドをスクリーニングできると期待された。HA stemの抗原性および立体構造を確認するため、pCAGGSベクターに搭載し、マウス大腿筋へのDNA vaccineを実施し、抗体誘導をELISAで検討したところ、血清中にH3亜型HAに結合する抗体に加え、H5亜型HAに交叉反応を示す抗体も検出され、亜型・groupを超えた抗体誘導のポテンシャルが示唆された。一方、この免疫マウスに実際にH3亜型ウイルスを致死量で感染したところ全く防御できず、感染防御に有効な中和抗体は誘導されない(HA stemはintactなHAと同様の立体構造をとっていない可能性)ことが明らかとなった。そこで、目標をGroup2の亜型ウイルスに対する抗ウイルス活性を示す特殊環状ペプチドの取得に切り替え、HA stemに替えてHA FLでのスクリーニングを進めている。また、前年度に取得に成功したGroup1の亜型ウイルスに抗ウイルス活性を示す特殊環状ペプチドについてもさらなる解析を進め、抗ウイルス活性の新たな作用機序として感染細胞内のウイルス抗原(HA)の分解・排除機構を明らかにし、さらに霊長類モデルとしてH5N1のヒト分離株(Vietnam/UT3040株)の感染カニクイザルを用いた投薬実験を実施し、感染2日目からの投与でも治療効果を示すことを確認することができた。現状ではvehicleへの溶解性の低さといった課題があるため、今後は薬剤としての可能性を向上させるため、溶解性の亢進に向けた改良(環状ペプチドの糖鎖修飾など)を検討していく。ウイルス学Group1のH5亜型のHAをbaitとした一次スクリーニングで得られている特殊環状ぺプチドについては作用機序解析とin vivoでのインフルエンザウイルス感染防御効果および治療効果の検証まで進めており、おおむね順調である。さらに、Group2に属する亜型ウイルスに対する抗ウイルス活性も示す特殊環状ペプチドの取得を目指し、現在Group2のH3亜型のHAをbaitとした二次スクリーニングを進めている。

これまで進めてきた一次スクリーニングで取得した特殊環状ペプチドの解析結果および現在世界中で進められているインフルエンザのパントロピックワクチン作製の研究報告などを踏まえると、ある亜型に特異性が高い抗体および特殊環状ペプチドは亜型を越えた抗ウイルス活性を示さない可能性が示唆されたことから、スクリーニングを1種類の亜型のHA stemコンストラクトだけで進めていくという当初の方針では全ての亜型ウイルスに対する抗ウイルス活性を示す特殊環状ペプチドの取得という本研究目的の達成につながらない可能性がある。そこで、スクリーニングの段階で複数の抗原性が大きく異なる亜型HAを用いることで高い特異性に収束せず全てのHA亜型において保存性の高い構造に結合する特殊環状ペプチドの取得を目指す。当初の実験計画では平成25年度で特殊環状ペプチドのスクリーニングに関わる物品費を想定して計上していたが、スクリーニングの一部が平成26年度にずれこんだために次年度使用額が生じた。平成26年度にずれ込んだスクリーニングの実施により、これに係る物品費として使用する予定である。
魚類におけるカルシトニンの生理作用:レセプターによる解析

【背景】魚類におけるカルシトニン(CT)の生理作用は不明な点が多い。そこでその作用を解明する為、レセプターに注目した。また、リガンドであるCTもクローニングし、その発現をレセプターと比較した。さらに、同一の遺伝子から生じるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)についても解析し、CT特有の作用を調べた。【研究実績】1)ヒラメCT及びCGRPの塩基配列を決定し、その発現を調べた。その結果、CGRPは脊椎動物を通じて73-81%の相同性を示したが、CTは哺乳類との相同性は低く、哺乳類とは異なった作用がある事が示唆された(Suzuki et al., PePtides, 2001)。一方、CGRPは脳、心臓、腸、生殖巣で発現し、CTはそれ以外に肝臓に検出された。今後、これらの器官における作用を詳細に調べていく予定である。2)初期発生におけるレセプター及びリガンドの発現をRT-PCR法により調べた。その結果、受精直後からレセプター及びCTの発現がみられ、96時間後にこれらの発現が急激に上昇した(平成13年度日本動物学会発表)。CGRPもこの時期に発現が上昇している事から、96時間後の形態形成にこれらのホルモンが重要な役割を果たしている事がわかった。3)海水から淡水移行に伴うCT及びCGRPレセプターの発現をエラで調べた。その結果、CGRPレセプターの発現は淡水移行に伴い減少した(Suzuki et al., Fisheries Sci.2002)。しかしながら、CTレセプターの発現は変化せず、浸透圧以外の調節に働いている事が示唆された。4)生殖期に血中CTレベルが上昇する事から、性ホルモンとCTとの関係を調べた。その結果、エストロゲン投与により血中CTレベルが上昇した。さらにCTの分泌器官である鰓後腺にエストロゲンレセプターが検出され(投稿準備中)、生殖期におけるCTの重要性が示された。【背景】哺乳類においてカルシトニンは、骨の破骨細胞に働き、その活性を抑制することにより血中Ca濃度を低下させるペプチドホルモンである。一方、魚類における生理作用は不明である。そこで申請者は、その作用を解明するため、レセプターに注目した。【研究実績】1)ヒラメのカルシトニンレセプターcDNAであると推測されるレセプターcDNAの構造を決定した。なお、詳細は(Suzuki et al.,2000)に記載してある。2)このcDNAがカルシトニンレセプターであるという確証を得るため、リガンドであるカルシトニンの構造をヒラメの受精後5日目の胚からRT-PCR法により決定した。ヒラメのカルシトニンはマコガレイのカルシトニンと遺伝子レベルでは98%の相同性を示し、アミノ酸に変換すると同一の配列であった。しかしながら、哺乳類のカルシトニンとの相同性は低く、31-50%だった。3)さらにレセプターの特異性を確かめる為に、カルシトニン遺伝子から組織特異的なスプライシングにより作られるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)も同様に構造決定し、カルシトニンと比較する必要がある。そこで、申請者は、ヒラメのカルシトニン遺伝子の配列を基にしたプライマーを作成し、ゲノムウオーキングによりヒラメのCGRPの配列を決定した。ヒラメのCGRPはサケ、カエル、ニワトリ及びヒトのそれとのアミノ酸レベルの相同性はそれぞれ78、78、81及び76%であり、カルシトニンとは異なりCGRPは脊椎動物の中で保存されていることがわかった。なお、ヒラメのカルシトニンとCGRPの構造についての成果は、現在Peptidesに投稿中である。これらヒラメのカルシトニンとCGRPの塩基配列を基に、ペプチド合成を行ったので、次年度はこれらの合成ペプチドを用いてレセプターの発現実験を行う予定である。

しかしながら、CTレセプターの発現は変化せず、浸透圧以外の調節に働いている事が示唆された。4)生殖期に血中CTレベルが上昇する事から、性ホルモンとCTとの関係を調べた。その結果、エストロゲン投与により血中CTレベルが上昇した。さらにCTの分泌器官である鰓後腺にエストロゲンレセプターが検出され(投稿準備中)、生殖期におけるCTの重要性が示された。
HPVによる発がんと抑制の研究

Leydig細胞腫瘍好発系E6E7Tgマウス(HPVE6E7トランスジェニックマウス)を用い、腫瘍発生に対するp53遺伝子の役割につき検討し、HPVのE6E7遺伝子による発がんにはp53の不活性化に依存する系(例Tリンパ腫)と非依存性の系(例Leydig腫瘍)が存在する可能性を示唆する結果を得た。Transformation抑制遺伝子の検索1.ラット初代培養細胞(REF)中に存在が予想されるHPVE6E7遺伝子やv-srcなどによるtransformationを抑制する遺伝子の分離をサブトラクション法により試み、REF細胞で特異的に発現している21種類の遺伝子について検討し、12種類が未知遺伝子、残り9種類が既知遺伝子であることが分かった。上記既知遺伝子中、性状解析を行ったlumican遺伝子はH-ras遺伝子によるtransformationを抑制する結果を得た。2.proteoglycanの一種であるsyndecan-1のm-RNA発現が調べた子宮頚癌由来のすべての細胞株で特異的に減少しており、syndecan-1遺伝子を過剰発現させると細胞増殖能や、軟寒天培地中でのコロニー形成能を抑制させることを見い出した。3.v-srcやv-K-rasなどのがん遺伝子の発現によってdownregulateされる新しい遺伝子(drs)はこれらがん遺伝子によるtransformationに抑制的に働くことを明らかにした。ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頚がんをはじめ外陰がん、陰茎がんやある種の皮膚がん等の発生に重要な働きをしているウイルスである。上記腫瘍中、特に子宮頚がんは、わが国で年間約5,000人が死亡しており、女性にとって重要な疾患である。本研究は子宮頚がんに関係するHPV16型、18型のがん遺伝子であるE6E7遺伝子の機能をin vitro、in vivoの両面から解析すると同時に、正常細胞中に存在すると考えられるE6E7遺伝子によるがん化を抑制する遺伝子を分離することにより、子宮頚がんの発生機構の解明を治療法の開発を目指している。2.16型E6遺伝子による培養細胞増殖昴進や造腫瘍性の獲得にはp53分解は直接関与しておらず、E6遺伝子の持つ他の機能(trans活性化能、p53結合能)などが関与する可能性を示した。4.子宮頚がん抑制遺伝子の候補と考えられるAF3 cDNAについて解析し、この遺伝子が転写因子様の蛋白をコードする新しい遺伝子であること、また、大腸がんや肺がんの抑制遺伝子p5と同様細胞の増殖を負に調節するがん抑制遺伝子である可能性を示唆する結果を得た。本年度はHPVによるがん化機構を明らかにするとともに、HPVによるがん化の抑制法開発への指標とすることを目的として以下の結果を得た。1 Tgマウス(C57BL/6嫌発がん系)とBALB/c(好発がん系)との交配により、BALB/cマウスのgenetic back groundを持つcongenic Tgマウスを作成し、同マウスでLeydig細胞腫瘍発生の早期化と増殖能の促進を認めた。またTgマウスでのE6E7遺伝子が第18番染色体に挿入されていることを明らかにした。p53遺伝子欠損E6E7Tgマウスを作成し、同Tgマウスの全例に悪性リンパ腫が早期に発生することを認めた。Transformation抑制遺伝子の検索1ラット初代培養細胞(REF)中にはHPVE6E7遺伝子やv-srcなどによるTransformationを抑制する遺伝子の存在が推定されている。抑制遺伝子の分離を目的としてREFcDNAをF2408(抑制機能なし)mRNAでsubtractionを行い、F2408で有意に発現が抑制されているcDNAを30種類得た。上記cDNA中HPV16型E6E7による不死化細胞からprogress(悪性化)した細胞でその発現が特異的に抑制されているcDNA3種類を同定した。v-src transform細胞にREFcDNAを導入し、得られた正常復帰株よりv-srcの発現にdependしてその転写がdownregulateされている新しい遺伝子を見い出した。がん抑制遺伝子候補として、新しい転写因子様構造を持つ遺伝子(AF337)を分離し、この性状解析を行った。
ポリマー/気相成長炭素繊維系ナノコンポジット融液の粘弾性計算技術構築と応用

押出成形で見られる円管押出流れについて検討した。融液の押出実験から,押出物の直径は気相成長炭素繊維(VGCF)含有量の増加と共に減少する結果を得た。融液のレオロジー測定の結果,この現象は伸長流れの特性が寄与していると考えられた。そこで,伸長流れの特性を独立に設定できるPTTモデルにより押出実験を模擬したところ,実験結果と計算結果は定性的に一致した。以上より,既存の粘弾性モデルを用いてポリマー/VGCFナノコンポジット融液の有用な流動計算を実施できることが示された。本年度は,主としてポリプロピレンおよびポリカーボネートを母材としたナノコンポジット(以下,複合体とする)の着目し,溶融混練により複合体を作成し,検討を行った。得られた成果を以下にまとめる。(1)ポリプロピレンを母材としたコンポジットについては,マレイン酸変性ポリプロピレンを少量添加することにより複合体成形物の引張特性が向上し,複合体溶融体のゼロせん断粘度が増加した。以上より,マレイン酸変性ポリプロピレンはポリプロピレンと気相成長炭素繊維の親和性を向上させることがわかった。さらに気相成長炭素繊維の添加により複合体の熱伝導率は増加し,加えて,低い周波数領域での貯蔵弾性率も増加し,気相成長炭素繊維が溶融体の長時間緩和成分の増加に寄与することがわかった。(2)ポリカーボネートを母材とした複合体溶融物のスウェル比(押出物の直径とノズルの直径との比)は,せん断速度の増加とともに大きくなり,気相成長炭素繊維の含有率を増加させると減少するという繊維懸濁液の流動特性と類似した結果を得た。固体のSEM観察より気相成長炭素繊維はマトリックス中で比較的良好に分散していることから,ポリマー/気相成長炭素繊維系複合体融液の流れは,繊維含有懸濁液の流れを表す流体モデルがよく表しうる可能性が示唆された。ただ,一部のデータでスウェル比が1を下回る結果が得られ,ダイスウェルの測定方法やダイスウェル測定の際の母材の選定を含めた再検討が必要となでった。本年度は,ポリマー/気相成長炭素繊維(VGCF)系複合体融液の流動現象に対する既存の粘弾性モデルによる流動計算技術の適用性・可能性・限界を吟味することを主たる目的として,溶融混練で作製した複合体について,複合体融液のダイスウェル現象を中心とした検討を行った。(1)ポリカーボネート/VGCF系複合体は,引張特性が母材の溶融粘度に依存すること,アスペクト比の大きい気相成長炭素繊維を加えると,熱伝導率が効果的に大きくなることがわかった。(2)ポリエチレン/VGCF複合体融液のダイスウェル現象を測定した。複合体融液の周波数分散によるせん断流動特性は,VGCF含有量が高々5wt%と少ないこともあり,VGCFの添加による大きな変化はなかった。しかし,同じ流量における複合体融液のスウェル比(押出物の直径とノズルの直径との比)は,VGCFの含有率を増加させると減少した。また,複合体中のVGCF含有率を上げると,メルトフラクチャーを起こしにくくなることがわかり,少量のVGCFの添加によりせん断流動特性を大きく変化させることなく,材料のメルトフラクチャーの発生を抑えられる可能性が示唆された。(3)上記(2)の結果および既往の研究の知見から,複合体融液の流動特性は,VGCFの添加により,せん断流動特性は大きく変化しないが,伸長流動特性が大きく変化するのではないかという考えを立てた。そこで,複数の粘弾性モデルからこの考えに合うモデルを吟味した結果,PTTモデルが有用と判断し,PTTモデルによる複合体融液のダイスウェルシミュレーションを行った。その結果,定性的ではあるが,実験結果と一致する複合体融液のダイスウェル現象を計算で捉えることができた。今後は,今回用いた考えの妥当性の検証が必要がある。本年度は,前年度で検討した高密度ポリエチレン(HDPE)を母剤とした気相成長炭素繊維(VGCF)との複合体のフラットヤーン成形プロセスに着目し,ナノコンポジット溶融体を用いたダイスウェル問題を含む押出成形プロセス設計に対する粘弾性流動シミュレーションの有用性を検討した。得られた結果を以下にまとめる。(1)流路の縮小角が異なる二種類のダイを想定してナノコンポジット複合体融液のフラットヤーン押出の三次元シミュレーションを実施した。流路の縮小角が小さいとダイ出口直後のスウェル現象は大きくなるが,延伸した後のフラットヤーンの断面形状はほとんど同じになること,ダイ内を通過する流体に作用するトータルの伸長ひずみは流路の縮小角が小さい場合が大きくなること,などが明らかになった。(2)(1)で計算した流路形状を有するダイを用いてフラットヤーンの押出成形実験を行った。冷却時の収縮を考慮して,高々10%以下の範囲内で計算結果の断面形状と近い寸法の押出物が得られた。

また,得られたフラットヤーンの引張強度と熱伝導性を測定すると,引張強度は縮小角が大きい場合が大きくなり,局所の伸長速度が寄与することが示唆された。一方,熱伝導性は縮小角の小さい場合で大きくなり,ダイ内におけるトータルの伸長ひずみが寄与することが示唆された。(3)以上の研究成果より,伸長粘度特性を独立に変化できるPTTモデルのような粘弾性モデルを用いることで,ポリマー/気相成長炭素繊維系ナノコンポジットの成形加工プロセスの検討に対して有用な粘弾性流動シミュレーションを実施できることが示された。また,少なくとも成形時の樹脂の流れを検討することで,ポリマー/繊維状ナノフィラー系複合材料の成形品の物性を向上できる可能性が示唆された。
ヒト21番染色体上のDNA複製開始領域(ARS)の探索:ポリプリン/ポリピリミジン配列の分布との関係

ポリプリン/ポリピリミジン配列を含むクローン化DNAを,プラスミドpTIR10をプローブとして用い,ヒト21番染色体由来コスミドライブラリーから多数分離した.これらのコスミドクローンを制限酵素で切断し,サザンブロットハイブリダイゼーションを行い,ポリプリン/ポリピリミジン配列を含むDNA断片を同定し,その部分塩基配列を決定した.この配列情報から,プライマーDNAを設計し,ヒト21番染色体の各部分を含むヒト/CHO雑種細胞由来ゲノムDNAを用いて,それらの染色体領域マッピングを行った.この結果,クローンcGA3は長腕端部,cGA6は短腕部にマップされた.現在,細胞培養中にBr-dU標識を行ったゲノムDNAを用いて,当該領域のDNA鎖合成方向について検討中である.クローンcGA3に隣接する染色体領域では,約0.5Mbにわたるコスミドコンティグが作成されており,さらに,この領域は遺伝子の存在頻度が高いと推定されている.そこで,この0.5Mb領域の中で,ポリプリン/ポリピリミジン配列の存在をしらべた.その結果,この内部に少なくとも3ヶ所のポリプリン/ポリピリミジン配列がマップされた.現在,上述のDNA鎖合成方向を検討するため,近傍の塩基配列決定をすすめている.また,この領域の細胞内存在状態を知るため,単離細胞核をヌクレアーゼ処理し,クロマチン構造の解析を行っている.ポリプリン/ポリピリミジン配列を含むクローン化DNAを,プラスミドpTIR10をプローブとして用い,ヒト21番染色体由来コスミドライブラリーから多数分離した.これらのコスミドクローンを制限酵素で切断し,サザンブロットハイブリダイゼーションを行い,ポリプリン/ポリピリミジン配列を含むDNA断片を同定し,その部分塩基配列を決定した.この配列情報から,プライマーDNAを設計し,ヒト21番染色体の各部分を含むヒト/CHO雑種細胞由来ゲノムDNAを用いて,それらの染色体領域マッピングを行った.この結果,クローンcGA3は長腕端部,cGA6は短腕部にマップされた.現在,細胞培養中にBr-dU標識を行ったゲノムDNAを用いて,当該領域のDNA鎖合成方向について検討中である.クローンcGA3に隣接する染色体領域では,約0.5Mbにわたるコスミドコンティグが作成されており,さらに,この領域は遺伝子の存在頻度が高いと推定されている.そこで,この0.5Mb領域の中で,ポリプリン/ポリピリミジン配列の存在をしらべた.その結果,この内部に少なくとも3ヶ所のポリプリン/ポリピリミジン配列がマップされた.現在,上述のDNA鎖合成方向を検討するため,近傍の塩基配列決定をすすめている.また,この領域の細胞内存在状態を知るため,単離細胞核をヌクレアーゼ処理し,クロマチン構造の解析を行っている.
アミロイドβペプチド(Aβ)埋込蛍光タンパク質の構築とAβ集合体のFRET検出

アミロイドβペプチド(Aβ)の集合化・オリゴマー生成は、アルツハイマー病の発症と密接に関連している。本研究では、バレル構造を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)中のβシート上にAβ配列を挿入したGFP変異体(Aβ埋込GFP)を基に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)型センサータンパク質を構築した。この構築したセンサータンパク質を用いることで、試験管内においてAβの集合体形成過程をFRETにより検出できることが示された。本研究め初段階として、安定なバレル構造を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)をスキャフォードとして用い、GFP中のシート上にAβ配列を挿入した種々のGFP変異体(Aβ埋込GFP)を構築し、Aβとの相互作用およびAβの集合化阻害能について評価した。構築したAβ埋込GFPとAβとの相互作用およびAβの集合化を解析するために、表面プラズモン共鳴(SPR)法や抗Aβ抗体・抗GFP抗体を用いたEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)法により結合特性を評価した。構築したAβ埋込GFPのうち、2種類の変異体がAβとの高い結合能およびAβの集合化阻害能を示した。このことから構築したAβ埋込GFPはAβと結合することでAβの集合化を抑制していることが明らかとなった。さら比結合能に優れた2種類の変異体を組み合わせた新規Aβ埋込GFP(SFAB4)を構築した。このSFAB4はAβとさらに強く結合し、約107の結合定数をもつことがわかった。次に、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法によるAβ集合体の検出を達成するために、SFAB4を土台として、アミノ酸配列置換により、黄色蛍光を発するSFAB4-YFPおよびシアン色蛍光を発するSFAB4-CFPを構築した。これを適切なリンカー配列で連結し、Aβ集合体の大きさに依存してFRETシグナルが劇的に変化する系の構築が可能になると期待できる。本課題研究では、安定なバレル構造を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)中のβシート上にAβ配列を挿入したGFP変異体(Aβ埋込GFP)を基に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)型センサータンパク質を構築し、Aβ集合体のFRET検出を目的とした。昨年度の研究成果からGFP表面の4つのβストランド部位にAβ配列を挿入したAβ埋込GFP(SFAB4)は、表面プラズモン共鳴(SPR)法によりAβとの結合定数が約10^7と強い結合親和性を有することを明らかにした。本年度は、このSFAB4タンパク質および以前に構築した2本のAβ配列を挿入したP13Hタンパク質を土台として、シアン色蛍光を発するP13H-CFPおよび黄色蛍光を発するSFAB4-YFPの2つをフレキシブルなリンカー配列で連結したFRET型センサータンパク質(CFAB6)を構築した。構築したCFAB6タンパク質の蛍光特性を評価したところ、Aβ配列を挿入していないものと比較して若干蛍光強度が低いものの、CFP部位からYFP部位への効率的なFRETが観測された。次に、CFAB6存在下にてAβをインキュベートし、Aβの集合化に伴うFRET効率の変化について評価した。その結果、Aβの集合化に伴いFRET効率がわずかながら上昇し、さらにインキュベートすることで、FRET効率が劇的に減少することが分かった。他の実験に基づく議論から、このFRETの変化は、Aβのオリゴマー形成(FRET効率の上昇)とAβのアミロイド線維形成(FRET効率の減少)に対応している可能性が示唆された。今後はこのFRET変化の詳細を明らかにし、より鋭敏にAβの集合体の大きさに依存してFRETシグナルが変化するセンサータンパク質の構築に繋げる。