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ＨＴＬＶ－１関連脊髄症で同定した制御性Ｔ細胞由来異常Ｔ細胞の病原性に関する研究

最近、我々はHTLV-1関連脊髄症患者においてHTLV-1 Taxの作用によりTregが可塑的に変化したと考えられる新規の異常T細胞を発見した。そこで本研究は、Treg特異的Tax発現マウスを用いて、この異常T細胞の病原性について個体レベルで検討することを目的とした。Foxp3発現細胞すべてにTaxを発現するマウスは6週齢以内に死亡し、一部のFoxp3発現細胞でTaxを発現するマウスは、増悪と寛解を繰り返す耳介の皮膚炎と尾の潰瘍を認めた。したがって、免疫を制御する働きを有するFoxp3発現細胞がTaxを発現することにより、個体レベルで炎症病態を惹起する病原性を発揮することが判明した。近年、免疫疾患の病態形成において「制御性T細胞(Treg)の可塑性」の重要性が注目されている(Zhou, Nat Immunol 2009)。これは一部のTregが置かれた環境によりFoxp3発現や抑制機能を失い,他のヘルパーT細胞へ"分化転換"することを意味するが、この「Tregの可塑性」がどのような原因によって生じるかという点については、いまだ不明である。HTLV-1関連脊髄症(HAM)は、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)感染者の一部に発症する脊髄の慢性炎症性疾患であるが、最近、我々はHAM患者においてHTLV-1の機能分子Taxの作用によってTregが可塑的に変化したと考えられる新規の異常T細胞を発見した。そこで本研究では、Foxp3を発現するTregだけにHTLV-1 Taxを発現させた“Treg特異的Tax発現マウス"を用いることで、HAM患者において見出されたTreg由来異常T細胞の発生機構や病原性について個体レベルで検討することを目的とした。今年度は、“Treg特異的Tax発現マウス"の表現型を主に検討した。その結果、Foxp3発現細胞すべてにTaxを発現したマウスは、6週齢以内に全例死亡した。一方、Foxp3発現細胞の一部でのみTaxを発現したヘテロマウスは、両耳介の皮膚炎と共に、尾の皮膚潰瘍、両耳介のレイノー現象や壊疽といった血管炎を疑わせる一定の表現型が認められた。このことから、本来Tregとして免疫を制御する働きを有するFoxp3発現細胞がTaxを発現することによって、個体レベルで炎症病態を惹起するような病原性が発揮されることが判明した。近年、免疫疾患の病態形成において「制御性T細胞(Treg)の可塑性」の重要性が注目されている。これは一部のTregが置かれた環境によりFoxp3発現や抑制機能を失い,他のヘルパーT細胞へ"分化転換"することを意味するが、この「Tregの可塑性」が生じるメカニズムについては、いまだ不明な点が多い。HTLV-1関連脊髄症(HAM)は、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)感染者の一部に発症する脊髄の慢性炎症性疾患であるが、最近、我々はHAM患者においてHTLV-1の機能分子Taxの作用によってTregが可塑的に変化したTh1様細胞が脊髄病変部に異常集積していることを発見した。そこで本研究では、Foxp3を発現するTregだけにHTLV-1 Taxを発現させた“Treg特異的Tax発現マウス"を作製し、HAM患者において見出されたTreg由来異常T細胞の発生機構や病原性について個体レベルで検討することを目的とした。昨年度、作製したマウスのうち、すべてのFoxp3発現細胞でTaxを発現するマウスは生後6週以内に死亡すること、また一部のFoxp3発現細胞でTaxを発現するマウスは増悪と寛解を繰り返す尾の潰瘍や耳介の皮膚炎といった慢性炎症像を呈することを報告した。今年度は、この後者のマウスを用いて免疫学的解析および病理学的解析を主に実施した。その結果、“Treg特異的Tax発現マウス"の脾細胞を培養すると、コントロールマウスでは認められない炎症性サイトカインの産生亢進が認められた。また病理学的には、潰瘍部の非特異的な炎症像の他に、神経周囲の浮腫や線維化が認められた。以上のことから、本来Tregとして免疫を制御する働きを有するFoxp3発現細胞がTaxを発現することによって、個体レベルで炎症病態を惹起するような病原性が発揮されることが判明した。HTLV-1関連脊髄症(HAM)は、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)感染者の一部に発症する脊髄の慢性炎症性疾患であるが、最近、我々はHAM患者においてHTLV-1の機能分子Taxの作用によってTregが可塑的に変化したTh1様細胞が脊髄病変部に異常集積し、病態に密接に関与していることを発見した。そこで本研究では、Foxp3を発現するTregだけにHTLV-1 Taxを発現させた“Treg特異的Tax発現マウス"を作製し、HAM患者において見出されたTreg由来異常T細胞の病原性について個体レベルで検討することを目的とした。これまでTreg特異的Tax発現ヘテロマウス(一部のFoxp3発現細胞でTaxを発現するマウス)は18週齢頃より増悪と寛解を繰り返す尾の潰瘍や耳介の皮膚炎といった慢性炎症像を呈することを報告した。これは本来Tregとして免疫を制御する働きを有するFoxp

3発現細胞がTaxを発現することによって、個体レベルで炎症病態を惹起するような病原性が発揮していることが示唆された。今年度、このTreg特異的Tax発現ヘテロマウスを用いてHAM患者で認められる脊髄病変部におけるTh1様細胞の集積を再現するため、MOG35-55ペプチドを免疫する実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを適用した。しかし、慢性炎症症状出現前の12週齢マウス(n = 2)を使用した場合には、本マウスはコントロールマウス(n = 2)と同様の臨床経過を示し、早期発症、重症化、慢性化を認めなかった。一方、31週齢のTax発現マウス(n = 2)は感作2日後に死亡した。さらなる検討が必要なもののTax発現マウスは週齢によってEAEに対する感受性が異なる可能性が示唆された。最近、我々はHTLV-1関連脊髄症患者においてHTLV-1 Taxの作用によりTregが可塑的に変化したと考えられる新規の異常T細胞を発見した。そこで本研究は、Treg特異的Tax発現マウスを用いて、この異常T細胞の病原性について個体レベルで検討することを目的とした。Foxp3発現細胞すべてにTaxを発現するマウスは6週齢以内に死亡し、一部のFoxp3発現細胞でTaxを発現するマウスは、増悪と寛解を繰り返す耳介の皮膚炎と尾の潰瘍を認めた。したがって、免疫を制御する働きを有するFoxp3発現細胞がTaxを発現することにより、個体レベルで炎症病態を惹起する病原性を発揮することが判明した。本来Tregとして免疫を制御する働きを有するFoxp3発現細胞がTaxを発現することによって、細胞レベルの異常のみならず、個体レベルで病原性を発揮することが明らかとなった。また、本マウスにEAE(実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデルを適用して、我々の想定しているHAMの病態モデル(IFNγ-CXCL10-CXCR3 positive feedback loop)をin vivoで再現する予備実験を実施し、方向性を決めることが出来た。一方で、予定していた“Treg特異的Tax発現マウス"のTreg細胞の評価がまだ実施できていないため、現在までの達成度を「おおむね順調に進展している」と判断した。神経病態免疫学今後は次の2つの方向性で本研究を進めることとする。1)“Treg特異的Tax発現マウス"におけるTreg細胞の評価当該マウスのTregがIFN-γを産生するような炎症性の異常T細胞に変化しているか、またTregとしての形質を保持しているか等の評価を実施する。当該マウスのFoxp3発現細胞はTax遺伝子を発現すると同時にRFP(赤色蛍光タンパク)も発現する。そのため、当初の予定では「Treg由来Tax発現T細胞」の表現型を明らかにするために、RFP陽性細胞を単離する予定であったが、予想に反して脾細胞中にRFP陽性細胞を認めなかった。したがって、その対応策として、RFP陽性細胞の代わりにCD4+CD25+ cellsを単離し、その表現型を解析するという計画へ変更する。2)“Treg特異的Tax発現マウス"へEAEモデルの適用当該マウスにEAEを誘導し、Treg由来の異常T細胞を脊髄へ侵入させることによって、我々が想定するHAMの病態モデルがin vivoで再現できるか否かを検証する。
高速多重極境界要素法の並列処理法の開発

本研究の目的は、境界要素法解析を高度に効率化することによって巨大問題(現在の目標は1000万要素程度)の解析を可能とし、複雑な力学問題におけるシミュレーション技術の適用範囲を大きく拡大しようとするものである。この目的に対して以下の課題の研究を行ない、成果を得た。・高速多重極法のアルゴリズムの改善:境界要素法を大規模問題において効率化するために高速多重極法を利用する。ここでは、多重極展開の項を多くとる必要のある問題に対して積形式の高速多重極法を導入し、計算速度の向上をはかった。この方法は、とくに、大きな波数を持つ波動問題において有効である。・反復法の性能向上のための前処理法:境界要素方程式の反復解法の性能を向上させるために、Haar wavelet変換を用いた前処理法を提案した。高速多重極境界要素法にも適用できる計算法を開発し、従来よりも効率の良い反復解析が可能となった。・並列処理による解析規模の増大:巨大規模の問題の解析を実用化するためには、計算速度の向上とともに必要な記憶容量を何らかの形で確保してやる必要がある。本研究においては、PCクラスターによるベオウルフシステムを構築し、高速多重極境界要素法の計算コードを並列化することを試みた。結果として、システムに加えるPCの総記憶容量に比例する規模の計算が可能となり、比較的簡便に大規模計算が実行できるようになる。・半空間問題、非均質問題への解法の拡張およびデータの自動生成:大規模解析の実用化において出現する問題のいくつかについて研究を進めた。野外音響問題で現れる半空間問題における高速多重極法の定式化、非均質領域問題における高速多重極法の定式化と適切な前処理法、巨大境界データの自動生成法についての基礎研究などを行なった。本年度は、高速多重極境界要素法を使った大規模解析・並列処理のための準備を行ない、とくに波動問題においてこれまでの手法の改善と拡張を行った。・境界要素法における反復解法の前処理法の開発。境界要素法の係数行列は特殊な性質を持っており、問題の種類によっては要素数の増加にともなって反復回数が著しく増大する。Wavelet変換を用いた前処理手法が有効に使え、高速多重極法の利用も可能であることを示した。(一部公表)・本格的な並列処理の予備段階として、2台のワークステーションを使った並列解析コードを開発中である。次年度以降に56台の機種の異なるワークステーションを使った並列処理を実現するための準備ができた。(未公表)・波動問題の大規模解析においては、必然的に波数の大きな問題を扱わなければならない。大きな波数の問題を経済的に扱うために高速多重極境界要素法の改善を行なった。また、3次元波動解析のための高速多重極境界要素法のコードを開発した。(一部公表)・大規模実用解析においては非均質領域(多相領域)を解析することが必然である。2次元動弾性問題および3次元静弾性問題において、非均質領域解析のためのコードを開発中である。(未発表)本年度は、PCクラスターの構築を行ない、高速多重極境界要素法の並列処理プログラムの開発を行なった。また、大規模解析に必要な反復法の前処理法についていくつかの手法を試行した。・並列処理コードの開発。9台のPCを使ったクラスターを構築して、高速多重極境界要素法の並列解析コードを開発中である。現在、本格的な解析のための計算コードを開発する目処がたった状態である。(未公表)・境界要素法における反復解法の前処理法の開発。昨年度に引続き、できるだけ効率良く計算するための前処理法を探索した。前処理法の適否は対象とする問題に依存するので、さらにいくつかの手法を加えて総合的に検討している。

現在のところ、コード化は難しいが、Wavelet変換を用いた前処理手法が各種の問題に有効であることがわかってきている。(一部公表)・非均質領域(多相領域)における前処理法の開発。2次元動弾性問題および3次元静弾性問題において、非均質領域解析のためのコードを開発中し、非均質領域解析に有効な前処理法を開発した。(一部公表)・半空間における波動問題を扱うための高速多重極境界要素法の開発を行ない、2次元および3次元音響解析に応用した。(公表)本年度は、PCクラスターの改善を試み、並列処理プログラムの開発を継続すると同時に、大規模境界要素解析のために必要な、データ生成法、反復解析のための前処理法について研究を行なった。・PCクラスターの改善と並列処理コードの開発。より効率の良い計算を実行するために、PCクラスターのOSのバージョンアップを行ない、ネットワーク性能を改善した。同時に、メッセージパッシング方式の並列計算コードの開発を行なっており、現在プログラム開発が進行中である。(未公表)・大規模解析のためのデータ生成法の研究。数100万要素を超える境界要素データを人力で作成することは不可能である。ここでは、CADデータやGISデータから境界要素データを自動的に作成するための手法を開発する。現在、任意の曲面(平面を含む)上の点を均質的にサンプリングする手法の開発に成功しており、サンプリングされた点集合から境界要素データを作成する手法を開発中である。(一部公表)・反復解法の前処理法の開発。昨年度に引続き、Wavelet変換を用いた前処理法の開発を行なった。高速多重極境界要素法に適用できるWavelet変換前処理法の開発に成功しており、従来よりも効率の良い反復解析が可能となった。(公表)・解析結果データの効率的生成法の開発。境界要素法においては、領域内部および境界上の解析結果データを境界値データから再計算して求める必要がある。領域内部のデータについては高速多重極法を使って効率的に計算値を求めることができる。境界上あるいはその近傍のデータを精度良く計算する方法について研究中である。(未公表)
糖尿病患者のインプラント周囲炎を見据えた先制歯科医療戦略の構築

我々はナノレベルでの表面改質を行うことで,硬組織誘導能を付与したナノシート析出チタンが糖尿病患者のインプラント治療に有効ではないかと考え,高血糖モデル培地を用いて,チタン平板上における硬組織形成能について評価を行った。ALP活性はグルコース濃度が上昇するにつれて抑制されていくが, OCN産生量とCa析出量はグルコース濃度が8.0mMの時に急激に減少し,その後はグルコース濃度の上昇とともに増加に転じる傾向にあった。またカルシウムとリン比はグルコース濃度が8.0 mMでは減少し,グルコース濃度の上昇とともに増加に転じることが明らかになった。加熱ナノ表面処理を行うことで,表面粗さとぬれ性を獲得し不純物が除去でき細胞にとって良好な環境となり,ALP,OCN,Ca,Pともに上昇したと考えられる。寺田らは高グルコース環境では細胞内情報伝達が阻害されALP、OCN、Ca、Pが低下することが予想されると報告しており,またガルシアらはLPS存在下で形成される硬組織と同様な幼弱な硬組織が多量に形成されると報告している。本研究でも8.0mMのグルコース濃度でOCN、Ca、Pが大きく変化しており、この時点で何かのスイッチがはいったのではないかと示唆される。Tzaphlidouらは骨粗鬆症の治療とモニタリングにおいて高いCa/P比は病状進行の重要な基準であると報告しており,Ca/P比が高くなると骨質の低下が疑われる。リンは,リン酸エステルをALPが無機りんとアルコールに分解することで生じるが,高グルコース状態ではALP活性が低下し,Pの量が低下する。その結果としてCa/P比が高くなり、骨粗鬆症と同様な脆弱な骨が形成されることになると示唆される。細菌感染によるインプラント周囲炎惹起モデルについては,現状のところ評価はできていない。平成31年度に行う動物実験による臨床模擬試験と並行して行う予定である。炎症惹起モデルの策定には更なる条件の設定が必要と考えられる。これらの結果から,グルコース濃度はチタン表面上の骨量と骨質に大きく関与しており,高グルコース状態であっても,ナノシート析出チタンを用いることで,通常グルコース濃度と同等の骨質と骨量を獲得できる可能性が明らかになった。したがって,このナノシート析出処理を施したインプラント体を適切に調製し使用することによって,糖尿病患者のインプラント治療におけるオッセオインテグレーションの獲得がより堅固なものとなり,糖尿病患者におけるインプラント治療の適応範囲が拡大されていくのではないかと考えられる。しかし,ナノシート析出チタンの詳細な作用機序の検討やイヌなどの大型動物による臨床モデル試験による検証が必須であり,今後の臨床応用に向けての課題として,検討していく必要があると考えている。申請者らは,純チタンプレートを10M水酸化ナトリウム水溶液に室温で24時間浸漬し,1時間600°Cで加熱処理を行うことによって,表面に酸化ナノ構造(TNS構造)を析出することを明らかにした.1時間600°Cで加熱処理を行うことによってチタン金属表面の酸化層において炭素分子の検出が減少しそのことが硬組織再生に適した環境になると考えられる.TNS構造析出チタン表面上にGK系ラットの骨髄間葉系細胞を播種し,空腹時血糖値を参考に,通常グルコース群(5.5mM),コントロールされた糖尿病患者群(8.0mM),非コントロール糖尿病患者群(12.0mM,24.0mM)の4群に濃度調整し,硬組織分化誘導を行った.ALP活性はグルコース濃度の上昇とともに減少したが,これとは対照的にOCN産生量とCa析出量はグルコース濃度8.0 mMで著明に減少したが,これより高濃度になると増加した.Ca/P比はグルコース濃度に関係しており,OCN産生量およびCa析出量に類似した傾向を示した.炎症性サイトカインは高グルコース濃度によって高い発現を認めたが,ナノレベル表面制御構造チタン表面では,高グルコース濃度の効果においても発現は上昇しなかった.以上の結果から,高グルコース濃度では硬組織形成は増加したが,硬組織の質は低下した.すなわち,糖尿病による高血糖状態はナノレベル表面構造制御チタン表面において,インプラントフィクスチャーの初期固定やインプラント周囲炎予防に重要な役割を果たす骨髄細胞の硬組織形成に影響を及ぼすことが示唆された.数種の骨分化誘導タンパクの定量は現在検索が終了していないが,培養上清や細胞抽出液等の試料は超低温下で保存しており,続けて平成30年度にELISA等で測定を予定している。

本研究でも8.0mMのグルコース濃度でOCN、Ca、Pが大きく変化しており、この時点で何かのスイッチがはいったのではないかと示唆される。Tzaphlidouらは骨粗鬆症の治療とモニタリングにおいて高いCa/P比は病状進行の重要な基準であると報告しており,Ca/P比が高くなると骨質の低下が疑われる。リンは,リン酸エステルをALPが無機りんとアルコールに分解することで生じるが,高グルコース状態ではALP活性が低下し,Pの量が低下する。その結果としてCa/P比が高くなり、骨粗鬆症と同様な脆弱な骨が形成されることになると示唆される。細菌感染によるインプラント周囲炎惹起モデルについては,現状のところ評価はできていない。平成31年度に行う動物実験による臨床模擬試験と並行して行う予定である。炎症惹起モデルの策定には更なる条件の設定が必要と考えられる。平成29年度で未達成な検索を平成30年度の実験計画と並行して行う。具体的には平成30年度に予定している炎症惹起下のインプラント周囲炎モデルについてin vitroでの検索を行う。これらの結果から,グルコース濃度はチタン表面上の骨量と骨質に大きく関与しており,高グルコース状態であっても,ナノシート析出チタンを用いることで,通常グルコース濃度と同等の骨質と骨量を獲得できる可能性が明らかになった。したがって,このナノシート析出処理を施したインプラント体を適切に調製し使用することによって,糖尿病患者のインプラント治療におけるオッセオインテグレーションの獲得がより堅固なものとなり,糖尿病患者におけるインプラント治療の適応範囲が拡大されていくのではないかと考えられる。しかし,ナノシート析出チタンの詳細な作用機序の検討やイヌなどの大型動物による臨床モデル試験による検証が必須であり,今後の臨床応用に向けての課題として,検討していく必要があると考えている。実験計画の一部が次年度にずれ込み,助成金の使用も次年度にずれ込んだため。当該実験計画は既に開始しており,次年度の上半期には使用する予定である。43600円と少額ではあるが,次年度に繰り越すことになったのは実験に使用した消耗品費に多少の予算との差異が生じたからだと考えられる。次年度の動物実験に生じる費用を充当する予定である。
陽極接合による接合界面が透明化するガラス同士の接合法の開発

陽極接合における導体側材料の酸化を利用して,導体層を仲立ちとしたガラス同士の貼り合わせ陽極接合で接合界面が可視光に対して透明になる継手を作成する手法を開発した.仲立ちとする導体層にアルミニウムもしくはチタンを選び,導体層の厚さと接合条件を適切に設定することで,ソーダライムガラスや多くの品種の光学ガラスで,70-80%の光透過率を持つ継手を作成することができた.透明度の高い継手では,接合の仲立ちに用いた導体層が酸化によって消尽しており,そのため接合界面は透明化すると同時に導電性を失うことを見出した.チタンと各種ガラスの適切な陽極接合条件,また一部のガラスが通電によって着色する現象も見出した.ホウケイ酸ガラス2種,ソーダライムガラス1種のガラス基板上に真空蒸着によって厚さの異なるアルミニウム層を製膜し,アルミニウム層を陽極,ガラス基板を陰極として両者の間に電圧を印加し,ガラス基板から供給される酸素によるアルミニウム層の酸化に伴うアルミニウム層の透明化と,微視的レベルでの酸化の進行を観察した.その結果,厚さ約50 nmのアルミニウム層において,製膜ままでは可視光に対してほぼ不透明であったものが,電圧印加後は硝種と電圧印加の条件によって約10%から25%の透過性を示すことが見いだされた.これらのアルミニウム層とガラス基板の界面近傍を透過電顕観察すると,界面上に層状に生じるものと,界面からガラス内部に向かって樹枝状に成長するものの2通りのアルミニウム酸化物が生成しており,それに伴い,特に電圧印加で光透過率が大きくなった試料では金属アルミニウム層の厚さが明らかに減少しているのが観察された.開発しようとする接合法の応用対象として有望な光学ガラスから,クラウン系ガラス1種と,鉛フリーフリントガラス,バリウムフリントガラス,ランタンフリントガラスそれぞれ1種を選定し,これらのガラスおよびソーダライムガラスの,シリコン,アルミニウム,チタンとの陽極接合性を実験的に検証した.クラウン系ガラスとソーダライムガラスでは,接合電圧印加中にガラスを流れる電流は陽極接合に典型的な変化を示し,使用した3種すべての導体と強固な接合界面が形成されたが,フリント系のガラスでは組成によって,電圧印加中に流れる電流の量や変化のパターンに違いがみられた.流れる電流量が小さかったランタンフリントガラスでは,特にアルミニウムとのあいだで健全な継手を得ることができなかった.チタンは多くの硝種とのあいだで優れた陽極接合性を示し,また線膨張率がガラスと近いため,残留応力による接合後のガラスの破損が生じなかった.予備実験によってアルミニウムとの良好な陽極接合性が確認された2種類の光学ガラス、FD110フリントガラスとSFL6フリントガラスを用いて、アルミニウムを仲立ちとした陽極接合によって接合界面が透明化する継手の作成を試みた。FD110ガラス板表面に、50 nm、100 nmの2通りの厚さのアルミニウム膜を蒸着し、ガラスと蒸着膜を接合パラメータを系統的に変化させながら陽極接合し、接合後の蒸着膜の状態を観察した。その結果、厚さ50 nmの蒸着膜は適切な条件下でほとんど透明になった。SFL6ガラスを用いた実験でも同様の結果を得た。そこで、厚さ50 nmのアルミニウム膜を蒸着したガラス板の蒸着面に同種のガラス板を重ね、サンドイッチされた蒸着膜を仲立ちとして2枚のガラス板を陽極接合した。イ)蒸着膜をつけたガラス板を陽極とした、直流電圧印加、ロ)電圧印加中、何度か電圧を加える向きを入れ替える交番電圧印加、ハ)アルミニウム蒸着膜を陽極に、これをはさむ両側のガラス板を共に陰極にしての直流電圧印加、以上3通りのパターンの電圧印加で陽極接合を行った。その結果、イ、ロの電圧印加法による接合では、接合界面が密着した継手は得られるものの、接合界面の蒸着膜は黒変して透過する光はわずかであった。そこでハの方法での接合を行うと、FD110ガラス、SFL6ガラスいずれの継手でも適切な条件下で、十分に密着した接合界面を通して反対側を透視できる継手が得られた。接合中に継手を流れる電流を観察すると、電圧印加開始後しばらくして電流が急激に減少するのが観察された。これは、電圧印加に伴う蒸着膜の酸化によって電流の経路が失われたためであると考えられた。前年度に続いて、光学ガラスと、貼り合わせ接合の中間材の候補となるチタンとの陽極接合の試験を行い、TEM観察によって接合界面近傍の組織の詳細な構造を明らかにした。前年度に引き続き,アルミニウム蒸着膜を仲立ちとした重フリントガラスFD110の陽極接合を行った.FD110ガラスの継手は接合を仲立ちするアルミニウムの酸化によって界面の透明化は生じるものの,継手自体が黒く着色して光透過率が上がりにくい.そこで,FD110ガラスのみに電圧を加えたところ,流れた電流量に応じてガラスの着色が生じることがわかった.そこで仲立ちのアルミニウム層の厚さを最適化して,光透過率約50%の継手を得ることができた.ソーダライムガラスとバリウムフリントガラス

BAF11についてもアルミニウム層を仲立ちとした接合を行い,ソーダライムガラスでは光透過率約70%,BAF11でも反対側を透視できる継手を得ることができた.多くのガラスと高い陽極接合性を持つことがわかったチタンを仲立ちとして,ソーダライムガラスや,FD110ガラス他数種類の光学ガラスの陽極接合を行った.チタン層の厚みを最適化することで,ソーダライムガラス,FD110ガラスで光透過率がそれぞれ80%,70%を超える継手が,またフリントガラスSFL6,バリウムフリントガラスBAF11,クラウンガラスBK7でも高い光透過率を持つ継手が得られた.このようにして,当初の研究の目的である陽極接合による接合界面が透明化するガラス同士の継手の作成の可能性を実証した.ソーダライムガラス,FD110ガラス同士の陽極接合界面のTEMによる微細組織観察を行い,アルミニウム,チタンをを仲立ちとした継手で,それぞれγ-Al2O3とルチル型のTiO2が界面に生成しており,光透過率の高い継手界面では酸化によって仲立ちの金属層がほぼ消尽していることを微細組織から立証した.接合条件を系統的に変えたソーダライムガラスの継手界面の強度評価をビッカース硬さ試験によって行い,強固な継手界面が形成されていることを明らかにした.陽極接合における導体側材料の酸化を利用して,導体層を仲立ちとしたガラス同士の貼り合わせ陽極接合で接合界面が可視光に対して透明になる継手を作成する手法を開発した.仲立ちとする導体層にアルミニウムもしくはチタンを選び,導体層の厚さと接合条件を適切に設定することで,ソーダライムガラスや多くの品種の光学ガラスで,70-80%の光透過率を持つ継手を作成することができた.透明度の高い継手では,接合の仲立ちに用いた導体層が酸化によって消尽しており,そのため接合界面は透明化すると同時に導電性を失うことを見出した.チタンと各種ガラスの適切な陽極接合条件,また一部のガラスが通電によって着色する現象も見出した.本研究の主たる目的は、導体膜を仲立ちとしたガラス同士の陽極接合において、導体膜の酸化を利用して接合界面が透明化する接合法を開発することであるが、これまでに適当な品種のガラスを選定して複数の方法による試験を行い、実際に界面を透視できる継手の製作に成功している。これまでに得られた継手の界面組織等の問題点を検討を通じてさらに方法を改良し、光透過率の高い継手を得る方法を見出すことができると期待される。また、これまでに試した方法で界面が透明化する継手が製作できていない材料についても、接合の仲立ちとする導体材料を変更するなどの方法を検討しており、用いる導体材料の剪定を進めている。材料加工,金属組織25年度、26年度に行った研究から、適切な品種のガラスにおいて、陽極接合を用いた貼り合わせ接合で実際に接合界面が透明化した継手が得られることを実証した。しかし,接合電圧の印加中に流れる電流が小さい等の理由でこれまでに開発した方法で接合界面が透明化しないガラスもあるので、それらのガラスについては、接合の中間材に用いる導体材料の変更やガラスの表面改質等の方法で界面の透明化を促進する方法を探索する。また、これまでに透明化した継手についても、接合時の電流経路の改善などによってさらに接合界面の光透過率を改善することを試みる。得られたガラス同士の貼り合わせ継手については、接合界面の光透過性やその他の光学的性質、また継手としての強さや、高温・腐食環境に対する耐久性の確認を行う。
がん抗原の発現調節と免疫系による認識

がん遺伝子の活性化に伴って発現されるがん抗原の同定と免疫系による認識、発現機構の解明、支配遺伝子および関連遺伝子の解析を行なうことによって免疫系に重要ながん抗原の分子免疫学的研究を行い次の成果を得た。1.腫瘍抗原の同定:(1)ras遺伝子導入細胞およびメラノーマ細胞から免疫学的(T細胞が認識)に同定された抗原はhsp、内在性ウィルスenv蛋白等の内在性抗原であり、これらの一部は遺伝子クローニングに成功し、発現様式を解析した。がん遺伝子活性化によって通常では出現しない内在性抗原の発現が重要であることを示した。(2)精製src誘発がん抗原(60kd)を用いたAgーpulsedマクロファージで効率良く腫瘍抵抗性を誘導した。2.腫瘍関連抗原発現機序に関するもの:(1)NGAの新しい遺伝子ファミリーのcDNAクローン化に成功。膜での表現型はCEAと同様蛋白が脂質を介して結合していることが判明。(2)マウスβ1ー4ガラクトース転移酵素遺伝子(65kb)のcDNAおよびゲノムDNAクローン化に成功。遺伝子構造解析の結果Exon1、2、4、5、6、7を使用しExon6にUDPーgal結合部があることが判明。糖鎖抗原発現の分子メカニズム解明に貢献した。3.腫瘍化、脱腫瘍化に関与する遺伝子と腫瘍抗原の発現:(1)Antisenseーcーmycで誘導される74kd蛋白の精製に成功。一部アミノ酸配列を決定した。(2)核または細胞膜に局在する抗原分子のcDNAをクローン化するtag付ベクターを開発。がん遺伝子活性化から抗原発現までのカスケードの解析に有用。(3)幼若リンフォーマによる特異的に発現する遺伝子αcDNAクローン化に成功。
超電導単極機の高電圧化に関する研究

従来,単極機は低電圧・大電流の特性から,実用化は困難と考えらられてきたが,超電導マグネットによる強力な磁界の導入と,電機子回転円板の多重化ならびに大直径化を行えば,数万V級の電圧が得られる可能性がある。本研究では,将来の大容量直流送電用のAC/DC変換機への応用を狙って,高電圧化の基礎となる多重電気子回転円板を備えた実験機の試作と試験,および,500kV,500MWの高電圧機の概念設計を行った。その結果,以下の研究成果を得た。(1)室温ボア150mm,磁束密度4Tの冷凍機冷却型超電導マグネットを用いて,この中に多重化を狙い2枚の回転円板挿入した超電導単極機を試作し,これら2枚の回転円板の個別の起電力,および直列に接続した場合の機械全体としての起電力を測定した。この結果,全起電力は各回転円板の起電力の合計になっていることを確認した。(2)2枚の回転円板に挟まれる空間にホール素子を取り付け磁束密度を測定し,界磁磁束が回転円板により遮蔽されないことを確認した。(3)集電ブラシとして,リン青銅の板バネ状ブラシを放出状に配置する方式を試み,これと黒鉛粉末とを併用することにより安定した集電特性を得た。(4)将来の大容量超電導単極機の概念設計を行い,発電所において直接原動機に直結する方式をとれば,変換効率として99.7%程度が得られ,現在の同期発電機,変圧器,整流器,フィルタ等を用いる静止型変換器に比べて,損失が1/10程度に低減することが判った。(5)水車発電機としての,縦軸型500kV,500MW級超電導単極機の概念設計を行い,将来の遠距離大電力HVDC送電用の超電導直流発電機の可能性を見いだした。将来の超電導長距離直流送電用の高効率の交直変換装置や、超電導エネルギー貯蔵装置(SMES)用の入出力装置、あるいは、50ノット以上の高速船用の推進装置等として超電導単極機が期待されているが、その実用化の鍵は高電圧化にある。今年度はそのための予備実験、大容量機の概念設計、ならびに、超電導マグネットの製作を行なった。(1)予備実験予備実験として、ソレノイドコイル中の単一の回転導体円板による磁界の遮蔽効果の確認、および流起電力の確認の実験を行なった。実験は既設の超電導マグネット内に銅の回転円板を挿入し、液体ヘリウム中に浸漬して延長軸により常温部より駆動して行なった。回転円板の直下には磁界測定用のホール素子を設置した。また、ブラシの接触抵抗を常温ならびに低温中において実測した。その結果、回転子の回転に伴ない、磁界は変化せず渦電流は流れていないことが確認された。また、ブラシ間には起電力が発生していること、また負荷を接続すると電流が流れることが確認された。これにより、超電導マグネット内に多重に回転円板を積層することに電磁気的には問題がなく、高電圧化の可能性が確かめられた。(2)大容量機の概念設計大容量高電圧超電導単極発電機の概念設計を行ないその可能性を検討した。その結果、大容量化には、回転円板の最大直径、漏洩磁界の遮蔽、およびブラシの圧接機構が重要であることが判った。(3)超電導マグネットの製作来年度からの本格的な実験用の常温ボア150mmのヘリウムフリー冷凍機冷却型の超電導マグネットシステムを完成して、予定の性能が出ていることを確認した。また、周辺空間の磁界分布の測定を行なった。

(5)水車発電機としての,縦軸型500kV,500MW級超電導単極機の概念設計を行い,将来の遠距離大電力HVDC送電用の超電導直流発電機の可能性を見いだした。超電導マグネットの強力な磁界を利用して高電圧・大容量の直流発電/電動機を実現し将来の超電導長距離直流送電用の高効率の交直変換装置や、超電導エネルギー貯蔵装置(SMES)用の入出力装置、あるいは、50ノット以上の高速船用の推進装置等への応用を狙って超電導単極機の高電圧化の研究を進めているが,今年度は新規に稼働を始めた冷凍機冷却型の超電導マグネットを用いて本実験を行った。その結果、以下の知見を得た。(1)起電力の確認本年度から本格的な運転を開始した常温ボア150mmのヘリウムフリー冷凍機冷却型の超電導マグネットシステムを用いて4Tの磁界を発生し,その中で回転円板を回転させた。その結果、円板1枚当たり0.6Vの起電力があることを確認した。また,この起電力は理論値とよく一致していることを確かめた。(2)回転円板により磁束が遮蔽されないことの確認ソレノイドコイル中の単一の回転導体円板による磁界の遮蔽効果をホール素子を用いて測定した。その結果,軸対称磁場中に円形回転板が回転しても磁束は遮蔽されないこと,また電機子電流が流れても磁束には変化がないことを確認した。この事実は、電機子円板を多重に接続しても磁束は弱まらないことを意味しており,本方式の基本的な可能性が確認されたものである。(3)概念設計の実施500MW(50kV,10kA)の容量を持つ単極発電機の概念設計いを行った。直径3mの電機子円板を合計100枚直列に接続し,これを毎分回転数1500rpmで回転させれば,一枚当たり500Vの起電力が得られ,これを100枚直列に接続すれば所期の起電力が得られることが判った。従来,単極機は低電圧・大電流であり実用化は困難と考えられてきたが,超電導マグネットによる強力な磁界を導入し,電機子回転円板の多重化ならびに大直径化を行えば,数万V級の電圧が得られる可能性がある。本研究では,将来の大容量直流送電用の変換機への応用を狙って,高電圧化の基礎となる多重電機子回転円板を備えた実験機の試作と試験,および,500kV,500MWの高電圧機の概念設計を行った。その結果,以下の研究成果を得た。(1)室温ボア150mm,磁束密度4Tの冷凍機冷却型超電導マグネットを用いて,この中に多重化を狙い2枚の回転円板挿入した超電導単極機を試作し,これら2枚の回転円板の個別の起電力,および直列に接続した場合の機械全体としての起電力を測定した。この結果,全起電力は各回転円板の起電力の合計になっていることを確認した。(2)2枚の回転円板に挟まれる空間にホール素子を取り付け磁束密度を測定し,界磁磁束が回転円板により遮蔽されないこを確認した。(3)集電ブラシとして,リン青銅の板バネ状ブラシを放射状に配置する方式を試み,これと黒鉛粉末とを併用することにより安定した集電特性を得た。(4)将来の大容量超電導単極機の概念設計行い,発電所で直接原動磯に直結する方式をとれば,変換効率として99.7%程度が得られ,現在の同期発電機,変圧器,整流器,フィルタ等を用いる静止型変換器に比べて,損失が1/10程度に低減するとが判った。(5)水車発電機としての,縦軸型500kV,500MW級起電導単極機の概念設計を行い,将来の遠距離大電力HVDC送電用の超電導直流発電機の可能性を見いだした。(6)超電導単極機の実用化のため残された技術的課題は,1)集電ブラシの高性能化,2)回転子の大直径化,3)漏洩磁束の遮蔽であることが判った。
Gp130からのシグナルによる樹状細胞の抗腫瘍活性及び自己免疫の制御

リンパ球依存性の自己免疫性関節炎を自然発症する、サイトカイン受容体gp130のY759F変異ノックインマウス(gp130F759)の樹状細胞(DC)機能異常が自己免疫疾患発症と抗腫瘍免疫に及ぼす影響を分子レベルで明らかにすることを目的とした。1.BMDCの成熟・機能におけるSTAT3の役割解析LPS刺激によりBMDCに誘導されるクラスII MHC(MHCII),CD40,CD80,CD86の発現量増加は、gp130F759由来BMDCにおいては、IL-6により著明に抑制された。この抑制効果は、STAT3への情報伝達経路を欠くgp130FXXQマウス由来のBMDCでは観察されず、レトロウイルスベクターを用いてドミナントネガテイブSTAT3を遺伝子導入したgp130F759-BMDCで回避されたことからSTAT3を介していることが示された。3.免疫寛容、自己免疫応答および抗腫瘍免疫の関係。gp130F759マウスでは外来抗原に対する免疫応答の遷延傾向が認められた。自己反応性T細胞の頻度解析により、gp130F759の抗原提示細胞は野生型リンパ節T細胞から自己反応性T細胞を誘導する能力が亢進しているがgp130F759のリンパ節T細胞からの誘導能は低下していることが明らかとなった。4.DNAマイクロアレイ解析gp130F759マウス由来のBMDCにおいてIL-6刺激の有無により発現量の変化した遺伝子140個(増加109,減少31)を検出した。今後はgp130F759のDC機能異常が抗腫瘍免疫に及ぼす影響とIL-6により変動する遺伝子群との関連を解析してゆく。
環状ペプチドクオルモンを用いた腸内細菌の新奇共生戦略

「クオルモン」とは単細胞生物である微生物が細胞間のコミュニケーション“クオラムセンシング"に用いるシグナル分子のことで、これにより菌密度依存的に特定の遺伝子の発現を同調させ、同種菌間の集団行動を統制している。グラム陽性菌では、これらの環状ペプチド分子を用いることで、種特異的なクオラムセンシングを自在に展開している。本研究では、腸内ヒト共生菌のクオルモンペプチドが、本来の同種菌間のコミュニケーションシグナルとしての機能に加えて、ヒトの細胞に対して作用し、免疫系やホルモンのシグナル伝達系に作用し、ヒト腸管の共生的定着を成立させている可能性を、分子・細胞レベルで検証する。
アレルギー反応を制御するメモリーTh2幹細胞の同定

接着分子CD62Lとケモカイン受容体CXCR3発現を指標にメモリーTh2細胞を4つのサブセットに分画し、その性質と分化機構の違いについて検討した。その結果、Th2細胞から分泌されアレルギー性炎症において好酸球の増加と遊走に重要であるIL-5は、メモリーTh2細胞の中でもCD62L-low/CXCR3-lowのサブセットから主に産生されることを明らかにした。また、CD62L-low/CXCR3-lowメモリーTh2細胞サブセットの遺伝子発現をDNAマイクロアレイで解析したところ、オステオポンチンやIL-10、IL-6などの炎症性サイトカインを大量に産生することが分かった。そこで、このサブセットの制御がアレルギー炎症の新規治療法の提唱につながると考え、低分子化合物のスクリーニングをおこない、石原産業がIL-5産生阻害剤として合成したチオアミド系化合物SH-2251を見出した。SH-2251は、IL-5のみならずオステオポンチンやIL-10の産生誘導を抑えることが分かった。これらの結果は、SH-2251によりCD62L-low/CXCR3-lowメモリーTh2細胞サブセットの機能を抑制することで、アレルギー性炎症の治療が行える可能性を示唆している。本研究では、Th2細胞記憶(メモリーTh2細胞)をモデルに用い、アレルギー疾患の病態に深く関与していることが予想されるメモリーTh2幹細胞の存在を証明することを目的とする。本年度は、メモリーTh2細胞をCD62L、DX5、IL-2受容体β鎖、CXCR3の発現を指標に分画し、それぞれの機能の違いについて検討を行った。その結果、CD62L/CXCR3でメモリーTh2細胞を4分画することで、メモリーTh2細胞を機能の異なった細胞群に分けることが可能であることを明らかにした。アレルギー炎症の特徴である好酸球浸潤に重要なサイトカイン、IL-5はCD62L low/CXCR3 lowの分画からのみ産出される。一方、IL-4やIL-13はいずれの細胞群からも産出される。このことは、CD62L low/CXCR3 lowの細胞を生体内から除くことで、好酸球の浸潤を抑制できる可能性を示唆している。そこで、次にCD62L low/CXCR3 lowの細胞の生体内における役割を証明するため、メモリーTh2細胞移入によるアレルギー性気道炎症モデルの確立を行った。まず、OVA特異的TCR TgマウスからエフェクターTh2細胞をin vitroで分化誘導し、それをヌードマウスに移入する。移入4週間後、脾臓よりメモリーTh2細胞を調整し、BALB/cマウスに再移入し、OVAを吸入させることでメモリーTh2細胞依存的アレルギー性気道炎症を誘発した。この系を用いて、移入するメモリーTh2細胞からCD62L/CXCR3の発現を指標に4分画した細胞をそれぞれ除去することで、アレルギー炎症病態形成における役割について解析する予定である。1、メモリーTh2細胞サブセットの同定接着分子CD62Lとケモカイン受容体CXCR3の発現を指標にメモリーTh2細胞を4つのサブセットに分画し、その性質とアレルギー気道炎症おける役割について検討を行った。その結果、Th2細胞から分泌されアレルギー性炎症において好酸球の増加と遊走に重要であるIL-5は、メモリーTh2細胞の中でもCD62L-low/CXCR3-lowのサブセットから主に産生されることが明らかとなった。このメモリーTh2細胞サブセットのアレルギー性気道炎症における役割について、メモリーTh2細胞移入によるOVA依存的マウスアレルギー性気道炎症モデルを用いて検討したところ、CD62L-low/CXCR3-lowのサブセットの除去により、気道炎症の発症が顕著に抑制されることが分かった。この結果は、メモリーTh2細胞中の、CD62L-low/CXCR3-lowサブセットはアレルギー炎症の病態形成に大きく寄与しており、このサブセットの機能を抑制することで疾患の治療が行える可能性を示唆している。2、メモリーTh2細胞マスター転写因子の同定本年度は、(1)の項で述べた、CD62L-low/CXCR3-lowメモリーTh2細胞に特異的に発現する遺伝子を同定する目的で、DNAアレイ解析を行った。現在、注目遺伝子についてレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入とノックダウンアッセイによりサイトカイン産生能を中心に解析中である。

アレルギー反応を誘発するメモリーTh2サブセット同定と機能解析、機能制御法についての解析を継続的におこなった。具体的には、接着分子CD62Lと発現を指標にメモリーTh細胞を2つのサブセットに分画し、その性質と分化機構の違いについて検討した。その結果、Th2細胞から分泌されアレルギー性炎症において好酸球の増加と遊走に重要であるIL-5は、メモリーTh2細胞の中でもCD62L-low(エフェクターメモリーTh)のサブセットから主に産生されることが明らかとなった。また、エフェクターメモリーTh細胞サブセットの遺伝子発現をDNAマイクロアレイで解析したところ、オステオポンチンやIL-10、IL-6などの炎症性サイトカインを大量に産生することが分かった。このサブセットの制御がアレルギー炎症の新規治療法の提唱につながると考え、低分子化合物のスクリーニングをおこない、石原産業がIL-5産生阻害剤として合成したチオアミド系化合物SH-2251が、IL-5のみならずオステオポンチンやIL-10の産生誘導を抑えることを見出した。また、SH-2251はIL-5産生を阻害するだけではなく、ナイーブCD4 T細胞からIL-5産生細胞への分化そのものを抑制することも明らかになった。これらの結果は、SH-2251によりエフェクターメモリーTh2細胞サブセットの機能を抑制することで、疾患の治療が行える可能性を示唆している。
ターゲット・プロテオミクスによる核果類アレルゲンタンパク質の一斉定量法の開発

モモアレルゲンタンパク質Pru p1およびPru p 3とオウトウアレルゲンタンパク質Pru av 1、Pru av 3およびPru av 4の抽出に適したタンパク質抽出法を明らかにするため、以下の研究を行った。液体窒素下で、乳鉢と乳棒を用いて、モモおよびオウトウ果実を粉末化した。これらの粉末から、トリクロロ酢酸/アセトン抽出法、チオ尿素/尿素抽出法またはフェノール抽出法により、総タンパク質を抽出した。これらの総タンパク質抽出物を、加熱条件下、グアニジンとジチオスレイトールで変性させ、さらに、ヨードアセタミドで処理した後、総タンパク質濃度を測定した。各アレルゲンタンパク質に対応した安定同位体標識内部標準ペプチド存在下、モモおよびオウトウタンパク質をトリプシン消化した。トリプシン消化物を、昨年度までに開発した、オクタデシルシリル(C18)カラムを用いた逆相クロマトグラフィー条件およびmultiple reaction monitoring(MRM)条件に設定した高速液体クロマトグラフィー三連四重極型質量分析計(LC-MS/MS)で分析し、各アレルゲンタンパク質を定量した。これらの研究の結果、モモアレルゲンタンパク質およびオウトウアレルゲンタンパク質を最も多く抽出するタンパク質抽出法を明らかにした。本研究課題で使用しているLC-MS/MSが故障し、その修理のため、半年ほどLC-MS/MSを使用できなくなり、研究計画に遅延が生じた。研究期間(補助事業期間)を1年延長し、研究目標を達成させる。ターゲット・プロテオミクスによるモモアレルゲンタンパク質Pru p 1、Pru p 2、Pru p 3およびPru p 4の一斉定量法を開発するため、以下の研究を行った。UniProtKBに登録されているPru p 14のアミノ酸配列情報を用いて、in silicoでのトリプシン消化を行い、安定同位体標識内部標準ペプチド(AQUAペプチド)に適した配列を持つ、Pru p 14に対応した4つのペプチドを選定し、それらを合成した。LC-MS/MSの質量分析部へAQUAペプチドをインフージョンし、フルスキャン測定およびプロダクトイオン測定を行い、これらペプチドのMRMトランジションを決定した。次に、AQUAペプチドおよびモモタンパク質トリプシン消化物を用いて、オクタデシルシリル(C18)基を持った逆相クロマトグラフィーや親水性相互作用クロマトグラフィー(ZIC-HILIC)の分離モード、水/アセトニトリルの比率等の移動相などの液体クロマトグラフィー(LC)条件を検討し、Pru p 1およびPru p 3の分析に適したLC条件を決定した。Pru p 2およびPru p 4については、トリプシン消化により生成する、AQUAペプチドに対応した内生ペプチドを検出できなかった。Pru p1およびPru p 3の定量法について、マトリックスへ添加したAQUAペプチドの濃度系列の測定による直線性の確認、モモ生鮮品を対象に日内変動と日間変動の調査による再現性の確認を行い、定量法の妥当性を評価した。Pru p 2およびPru p 4については、トリプシン消化により生成する、AQUAペプチドに対応した内生ペプチドを検出できず、定量法を開発することができなかったため。モモのPru p 2およびPru p 4含量が、本分析法の検出下限値以下であることなどが、検出できない理由の一つと考えられる。ターゲット・プロテオミクスによるオウトウアレルゲンタンパク質Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3およびPru av 4の一斉定量法を開発するため、以下の研究を行った。UniProtKBに登録されているPru av 14のアミノ酸配列情報を用いて、in silicoでのトリプシン消化を行い、安定同位体標識内部標準ペプチド(AQUAペプチド)に適した配列を持つ、Pru av 14に対応した4つのペプチドを選定し、それらに対応したAQUAペプチド合成品を調製した。次に、AQUAペプチドおよびオウトウタンパク質トリプシン消化物を用いて、オクタデシルシリル(C18)基を持った逆相クロマトグラフィーでの、水/アセトニトリルの比率等の移動相などの液体クロマトグラフィー(LC)条件を検討し、Pru av 1、Pru av 3およびPru av 4の分析に適したLC条件を決定した。Pru av 2については、トリプシン消化により生成する内生ペプチドおよびAQUAペプチドに適したLC条件を見出せなかった。Pru av 1、Pru av 3およびPru av 4の定量法について、マトリックスへ添加したAQUAペプチドの濃度系列の測定による直線性の確認等を行い、定量法の妥当性を評価した。親水性が高いため、C18基へ保持しなかったことが原因と考えられる。すでに、親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)での定量法を確立しているので、Pru av 2を定量する際は、HILICを用いることとする。

これらの粉末から、トリクロロ酢酸/アセトン抽出法、チオ尿素/尿素抽出法またはフェノール抽出法により、総タンパク質を抽出した。これらの総タンパク質抽出物を、加熱条件下、グアニジンとジチオスレイトールで変性させ、さらに、ヨードアセタミドで処理した後、総タンパク質濃度を測定した。各アレルゲンタンパク質に対応した安定同位体標識内部標準ペプチド存在下、モモおよびオウトウタンパク質をトリプシン消化した。トリプシン消化物を、昨年度までに開発した、オクタデシルシリル(C18)カラムを用いた逆相クロマトグラフィー条件およびmultiple reaction monitoring(MRM)条件に設定した高速液体クロマトグラフィー三連四重極型質量分析計(LC-MS/MS)で分析し、各アレルゲンタンパク質を定量した。これらの研究の結果、モモアレルゲンタンパク質およびオウトウアレルゲンタンパク質を最も多く抽出するタンパク質抽出法を明らかにした。本研究課題で使用しているLC-MS/MSが故障し、その修理のため、半年ほどLC-MS/MSを使用できなくなり、研究計画に遅延が生じた。平成29年度は、平成28年度と同様の研究手法を用いて、オウトウのアレルゲンタンパク質Pru av 1、Pru av 2、Pru av 3およびPru av 4の一斉定量法を開発する。平成30年度は、平成28および29年度に開発した、モモおよびオウトウアレルゲンタンパク質の定量法を用いて、モモおよびオウトウ国内主要品種のアレルゲンタンパク質含有量を調べる。研究期間(補助事業期間)を1年延長し、研究目標を達成させる。実験補助員の雇用が遅れ、人件費が見込額より少なくなったことや有機溶媒の使用量が少ない定量法を開発したため、有機溶媒の費用が少なくなったことなど。(理由)LC-MS/MSのターボ分子ポンプを交換せずに済んだことと、有機溶媒の使用量が少ない定量法を開発したため、消耗品費が少なくなったことなど。本研究課題で使用しているLC-MS/MSのターボ分子ポンプが故障し、その修理のため、半年ほどLC-MS/MSを使用できなくなり、研究計画に遅延が生じたため。また、研究代表者が所属する研究部門の経費を用いて、ターボ分子ポンプを交換したため。研究期間(補助事業期間)を1年延長し、当該助成金を用いて、研究目標を達成させる。また、本研究課題から得られた成果を公表するため、当該助成金を用いて、学会や論文で研究成果を発表する。試薬、分析カラムやバイアル等の物品購入に使用する。
膜輸送蛋白高次構造の解明

グラム陽性細菌と陰性細菌の薬剤排出蛋白の膜内構造を決定し、比較研究を行った。まず、代表的なテトラサイクリン排出蛋白Tet(B)のCys-free変異体をベースにして、任意の位置にCysを導入し、SH試薬との反応性から、その位置が1)膜の疎水性領域内にあるかまたは溶媒に露出した部位にあるか、2)溶媒に露出した位置の場合、それは細胞質側かそれともペリプラズム側か、を正確に判定できることを示し、詳細な膜蛋白質のトポロジー決定法を確立した。この方法は、従来のPhoA蛋白融合法にくらべ、自然の状態に近い膜蛋白をもとにした構造決定であるため、はるかに信頼性が高い。また、PhoA融合法では不可能な、膜貫通領域と溶媒露出領域の正確な境界決定が可能である。ついで、グラム陽性細菌のTet(K)の構造決定を行った。その結果、Tet(K)はTet(B)と全く同様の機構でテトラサイクリンを排出するにも関わらず、膜貫通構造は大きく異なることが明らかになった。すなわち、Tet(B)は多くの二次性能動輸送体と共通の12回膜貫通構造を持つのに対し、Tet(K)は14回膜貫通構造であった。12回貫通構造は、膜輸送体に広く保存された基本構造であるにも関わらず、なぜ同じテトラサイクリン排出蛋白の中でこのような異形が許されるのか、今後の興味ある検討課題である。