hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
栄養膜幹細胞におけるリプログラミング因子ＬＩＮ２８Ａの機能解析

マウスTS細胞におけるLIN28Aの生理的機能を明らかにすることを目的に、RIP-SeqによるLIN28A結合RNAの網羅的な同定と、LIN28Aの発現抑制実験(KD)を行った。LIN28A結合mRNAは、ヒトES細胞で同定されていた標的RNAと大きく異なっており、生理的機能も細胞種により異なると考えられた。KDは幹細胞の維持に影響しなかったが、分化誘導すると細胞死が誘導された。TS細胞において、LIN28Aは分化誘導直後の生存に重要である。RNA結合タンパク質LIN28Aは、そのパラログであるLIN28Bと共に胚性幹細胞で発現する。マウス栄養膜幹細胞(TS細胞)においてもLIN28Aは未分化時特異的に発現するがLIN28Bはほとんど発現していない。LIN28Aの発現はその他の幹細胞や未分化細胞でも認められるが、LIN28Bが発現していないTS細胞における機能は特に興味深い。本研究は、TS細胞におけるLIN28Aの生理的機能を明らかにすることを目的とする。本年度は、まず、抗LIN28A抗体を用いたRIP-seqの予備検討を行った。文献上RIP-seqに用いられた実績のある抗体が日本国内では販売されておらず輸入も不可能であったため、複数の抗体を購入し、その特異性やRIPへの有用性を比較検討した。その結果、ES細胞抽出液を用いておこなったパイロット実験により、LIN28A結合RNAとして報告されているRNAが、2種類の市販抗体で濃縮されることを確認した。テトラサイクリン(Tc)応答性のLIN28A発現抑制TS細胞クローンの作製は難航している。すでにTetリプレッサー遺伝子を導入したTS細胞クローンは複数樹立したが、Tc応答性を確認した結果期待通りの応答性を示すものが存在しなかった。そこでその原因を追及すると共に、Lin28a mRNAに対するshRNAの発現ベクターを導入したTS細胞の樹立を進めた。現在10以上のクローンを得、shRNAの発現とノックダウン効率などの確認を進めている。最後に、TS細胞の分化が血清成分により左右されることがわかったため、新たに血清代替物(KSR)を用いた無血清培養条件の確立を試みた。その結果、細胞外基質でディッシュをコートし、さらに培地に2種類の化合物を加えることで、未分化TS細胞の維持が可能な条件を見出すことに成功している。マウス栄養膜幹細胞(TS細胞)において、RNA結合タンパク質であるLIN28Aは未分化時特異的に発現するが、そのパラログであるLIN28Bはほとんど発現していない。LIN28AとLIN28Bの発現は胚性幹細胞(ES細胞)でも認められるが、LIN28Bが発現していないTS細胞における、LIN28Aの生理的機能は特に興味深い。本年度はまず、抗LIN28A抗体を用いたRNA免疫沈降(RIP)を行い、得られたRNAの配列を大規模シークエンスにより網羅的に決定した。その結果、LIN28A-RNA複合体には様々なmRNAが含まれること、また、そのmRNAの種類は、既報にあるES細胞におけるLIN28A-RNA複合体に含まれるものとは異なることが示された。すなわち、LIN28Aは両幹細胞で共通の標的RNAを持つのではなく、細胞種特異的に標的となるRNAを変えていることが示唆された。LIN28Aの発現操作がこれらのmRNA、および、TS細胞マーカー遺伝子の発現に与える影響を知るために、昨年度樹立したLIN28A発現抑制TS細胞株1ラインにおける遺伝子発現を解析した。すると、このラインにおいては、TS細胞の未分化マーカーであるCdx2の発現が、mRNAレベル、およびタンパクレベルの両方で有意に低下していた。しかし、分化マーカー遺伝子の発現は有意に上昇しておらず、未分化状態の破綻は起こっていないものと思われる。この結果は、TS細胞ではLIN28AがCdx2の発現量の安定化に寄与していること、しかしそれは必ずしもTS細胞の未分化状態の維持には必須ではないことを示唆する。一方、LIN28A強制発現株は、本年度中(および、繰越後の平成26年7月まで)の樹立には至らなかった。LIN28Aの強制発現がTS細胞の維持を阻害する可能性も想定される。本年度は、昨年度に引き続きLIN28AノックダウンTS細胞株の樹立を試み、ノックダウン効果が十分認められる安定形質転換株(KD株)を複数得た。

昨年度解析した1ラインに、更に2ラインを加え遺伝子発現を解析すると、いずれのKD株においても、TS細胞の未分化マーカーであるCdx2、および、Sox2の発現が有意に低下しており、LIN28Aがこれらの遺伝子発現の安定化に関わるという結果が得られた。ただし、いずれのラインも分化マーカーの発現が有意に上昇していないことから、未分化状態は維持されていると判断された。実際に、TS細胞の未分化維持に必要な因子であるFGF4を除くことで分化を誘導すると、KD株における分化マーカーの上昇が認められた。RNA-seqによるトランスクリプトーム解析においても、野生型TS細胞と非常によく似た遺伝子発現パターンが維持されていることが判明した。興味深いことに、KD株はいずれも野生型TS細胞に較べ増殖速度が遅く、また、分化誘導直後の生存率が著しく低下していた。LIN28Aは、未分化TS細胞の増殖や、分化細胞の生存に関わる遺伝子産物の発現調節に関与することが示唆される。トランスクリプトーム解析では、インプリント遺伝子であるMestを含む一部の遺伝子発現の、KD株における顕著な低下が認められた。これら複数の遺伝子産物の発現量調節が、TS細胞の増殖活性に重要であることが示唆される。26年度が最終年度であるため、記入しない。抗LIN28A抗体を用いたRIP-seqによる、LIN28A結合RNAの候補となるmRNAの網羅的同定は、予定通りの進捗を見た。しかし、LIN28Aを強制発現させた安定形質転換株が得られておらず、LIN28Aを過剰発現させた場合のLIN28A結合RNA、あるいはその産物タンパク質の発現変化の解析をすることができていない。一方、LIN28A mRNAに対するshRNAを恒常的に発現させたLIN28AノックダウンTS細胞株は樹立することができたが、十分なノックダウン効果が認められる株は1ラインのみで、解析結果の信頼性を確保できていない。細胞生化学LIN28A mRNAに対するshRNAを恒常的に発現させたLIN28AノックダウンTS細胞株の追加樹立を優先して進め、最低でも3ラインを用いた解析を行う。これにより、突発的なライン特異的な現象と、LIN28Aの発現抑制によって引き起こされる現象との区別を可能とする。更に、これらのノックダウン株のトランスクリプトーム解析、および、分化誘導実験を行い、LIN28Aの発現抑制による表現型を解析し、TS細胞におけるLIN28Aの生理的機能を明らかにする。当初計画では抗Lin28A抗体を用いたRIP-seqを本年度中に行う予定であったが、抗体の入手やその有用性の比較検討に手間取ったため、来年度に持ち越すこととなってしまった。しかし、ES細胞を用いたパイロット実験による予備検討では、既報でLin28A結合RNAであることが報告されているPou5f1 mRNAが、抗LIN28A抗体を用いた免疫沈降後確かに濃縮されていることを確認済みであり、RIP-seqの準備は整っている。TS細胞の無血清培養条件の確立は大きな前進である。TS細胞を未分化のまま継代維持するためには、マウス胎仔繊維芽細胞の培養上清(MEF-CM)に含まれる因子とFGF4が必須である。またMEF-CM因子はActivinAで代替可能であることが報告されている。
月周時計の実体解明への挑戦：月周産卵フグを用いた分子基盤の確立

本研究は、新月と満月の日に繰り返し産卵するクサフグを用いて、半月周性の産卵リズムを刻む生物時計の分子基盤を確立することを目的とする。そのため、クサフグの視床下部のトランスクリプトーム解析を行い、月周時計を構成する分子群と月周時計の調節を受ける分子群の候補を探索した。また、月周リズムの発振に関わると考えられる概日時計遺伝子の一つであるクリプトクローム(Cry)の月齢に伴った発現変動を解析すると共に、脳内発現細胞の同定を行った。具体的には、平成30年度では下の2つの研究成果を得た。1.H29年度の産卵期に月齢に合わせて5日おきに6回採取した脳試料を用いて、視床下部を含む終脳/間脳領域のRNAを調製した。これらのRNA試料からcDNAライブラリーを作製してNovaSeq6000を用いてRNA-Seq解析を行った。約17700個の発現遺伝子の中で約6790個の遺伝子が月齢に伴った発現変動を示した。それらのうち約3650個の遺伝子が半月周性の発現変動パターンを示し、そのうち550個の遺伝子は新月と満月にピークを持つ変動パターンを、また3100個の遺伝子は新月と満月に発現量が低下する変動パターンを示した。これらの遺伝子の中には、15時間周期の発現変動を示すmel1b、npas3、isyna1が含まれていた。15時間周期の変動遺伝子が半月周性に発現振動することは、半月周性リズムが概潮汐時計と概日時計の干渉作用によって駆動されることを示唆している。2.Cryのパラログ遺伝子のうち、cry1は新月と満月に発現量が低下する半月周性の変動パターンを示したが、cry2とcrydashは変化しなかった。脳内のCry発現細胞の同定には至っておらず、継続して解析を進めている。本研究は、新月と満月の日に海岸で繰り返し産卵するクサフグを用いて、半月周性の産卵リズムを刻む生物時計の分子基盤を確立することを目的とする。そのため、クサフグの視床下部と松果体のRNA-seq解析と概日時計遺伝子の一つであるクリプトクローム(Cry)の発現抑制実験を行い、Cryと相互作用を持つ月周発現分子を網羅的に探索する。これらの実験から、月周時計を構成する分子群と月周時計の調節を受ける分子群の候補を同定する。平成29年度では、下の2つの研究を実施した。1.産卵期にクサフグを採集し、水槽内で自然光条件下で飼育した。月齢に合わせて5日おきに7回、暗期の中点(23時30分)に脳と血液を採取した。脳から視床下部と松果体の試料を、また血液から血漿試料を調製した。血漿中のメラトニン濃度を質量分析法により測定した結果、暗期におけるメラトニン濃度は月齢に伴って変化することが明らかになった。2.Cryの発現抑制実験系を確立するための基礎的知見として、脳内のCry発現細胞の局在を明らかにするため、Cry遺伝子の特異的RMAプローブを調製し、産卵期にクサフグを採集して脳固定試料を調製した。本研究では、月周発現遺伝子の網羅的解析として、RNA-Seq法による解析を予定していたが、本実験用に調整した松果体試料が解析に十分な量に足りなかったため、松果体のRNA-seq解析が実施できなかった。また、Cryの発現抑制実験については、脳内の発現細胞の同定に至らなかったため、発現抑制の解析に用いる実験系の検討ができなかった。

RNA-Seq法による解析用の脳試料について、産卵期に採集するクサフグの個体数を増やして解析に十分な量を確保し、視床下部と松果体試料のRNA-seq解析を実施する。月齢発現変動する遺伝子群を選び出し、その発現細胞の脳内局在を同定する。また、Cry発現細胞について、抗Cry抗体を作製し、in situハイブリダイゼーション法に加えて免疫染色法によって発現細胞の同定を行う。そして、月周発現遺伝子産生細胞とCry発現細胞の神経解剖学的な関係を多重免疫染色法で明らかにすると共に、Cryの発現抑制による月周発現遺伝子群の発現量の変化を解析して、月周発現分子群とCryとの機能形態学的な関係を明らかにする。月周発現遺伝子の網羅的解析として、RNA-Seq法による解析を予定していたが、解析に必要な脳試料を採取することができず、実施できなかった。H30年度においては、クサフグの採集個体数を増やして、解析に十分な脳試料を確保し、繰越金額を当初の予定通りにRNA-seq解析に使用する。
新しい高精度心電信号解析を用いた小児期遺伝性不整脈の診断と致死的不整脈の発生予測

研究代表者が所属する筑波大学附属病院、茨城県立こども病院をはじめとする小児循環器関連病院、および他県の病院で先天性QT延長症候群(LQTS)、カテコラミン誘発多形心室頻拍症(CPVT)、その他の遺伝性不整脈または心筋症と診断された小児例およびその家系メンバーを対象として、次世代シークエンサーを用いて既知の遺伝子変異のスクリーニング検査を行った。H30年度末までにLQTS 20例、その他の不整脈8例、心臓突然死症例3例、心筋症6例の計37例の解析を行った。その結果、通常の学校心電図検診や症状で検出されるLQTSから頻度の高いLQT1、LQT2、LQT3の変異が検出され、新たな遺伝性不整脈家系が診断された他、胎児新生児期に発症する重症型LQTSや新生児のBrugada症候群など、世界的にみても報告の価値のある遺伝性不整脈を診断することができた。周波数2,000ヘルツのサンプリングが可能な新しい高精度デジタル心電計を用いた研究では、主にLQT7型(Andersen-Tawil症候群)の心電図記録を行った。H30年度末までに13例のデータを収集をすることができ、再分極過程を解析対象として、通常の時間・振幅指標のほかに、独立成分分析、主成分分析を行った。その結果、T波を構成する独立成分の数はLQT7群では全例で健常対象者と同じ4個であったが、LQT7型に特徴的なU波が、T波成分とは関連しない独立な独立成分で構成されるという新しい知見が得られた。健常者でも大きなU波が見られることは少なくないが、その場合はT波を構成する独立成分の一部がU波を形成している。この結果はLQT7の診断に有用な情報を提供するものと思われた。LQTSで頻度の高いLQT1LQT3のデータを収集し、再分極過程(T波領域)に独立成分分析(ICA)、主成分分析(PCA)、およびmorphological combination score (MCS)解析を適用して、その結果から遺伝子型を判定する研究について、LQT2の症例数が十分集まらなかったため、LQT1とLQT3の解析にとどまり、LQT2との比較検討が十分できなかった。その理由の一つとして、他施設の協力を得るために、それぞれの施設で倫理委員会申請をしてもらう必要があったが、それに時間を要し、今年度に持ち越している施設もある。既にさまざまな不整脈や心筋症症例のDNAが多数保管されているため、すべてを解析する時間的余裕がなかったことも一因であった。また、研究者らが以前から行っている胎児期から乳児期の早期に発症するLQTSの全国レベルでの調査に関しては、個々の施設における症例数が非常に少ないため、解析可能な症例数に達するのに時間を要する内容である。また、前記と同様にそれぞれの施設で倫理委員会申請をしてもらうのに時間を要している。LQTSで頻度の高いLQT1LQT3のなかで、他の遺伝子型に比べて今まで集積されたデータが少ないLQT2の症例を重点的に収集する。特に家系メンバーの心電図スクリーニングを行って、症例数を増やせるよう努める。それらの心電図の再分極過程(T波領域)に独立成分分析(ICA)、主成分分析(PCA)、およびmorphological combination score (MCS)解析を適用して、その結果からLQT1、LQT2、LQT3を鑑別できるかどうかを検討する。胎児期から乳児期の早期に発症するLQTSの全国調査に関しては、できるだけ多くの他施設への協力を呼びかけ、オプトアウト方式を含めて、各施設での倫理委員会申請をサポートする。本研究開始以前に登録された症例で、当時、遺伝子型が判明していなかった症例について、最近の技術の進歩によって確定できる可能性があるため、あらためて患者本人、家族の同意を得た上で遺伝子検査と心電図検査を行う。

この結果はLQT7の診断に有用な情報を提供するものと思われた。LQTSで頻度の高いLQT1LQT3のデータを収集し、再分極過程(T波領域)に独立成分分析(ICA)、主成分分析(PCA)、およびmorphological combination score (MCS)解析を適用して、その結果から遺伝子型を判定する研究について、LQT2の症例数が十分集まらなかったため、LQT1とLQT3の解析にとどまり、LQT2との比較検討が十分できなかった。その理由の一つとして、他施設の協力を得るために、それぞれの施設で倫理委員会申請をしてもらう必要があったが、それに時間を要し、今年度に持ち越している施設もある。既にさまざまな不整脈や心筋症症例のDNAが多数保管されているため、すべてを解析する時間的余裕がなかったことも一因であった。また、研究者らが以前から行っている胎児期から乳児期の早期に発症するLQTSの全国レベルでの調査に関しては、個々の施設における症例数が非常に少ないため、解析可能な症例数に達するのに時間を要する内容である。また、前記と同様にそれぞれの施設で倫理委員会申請をしてもらうのに時間を要している。LQTSで頻度の高いLQT1LQT3のなかで、他の遺伝子型に比べて今まで集積されたデータが少ないLQT2の症例を重点的に収集する。特に家系メンバーの心電図スクリーニングを行って、症例数を増やせるよう努める。それらの心電図の再分極過程(T波領域)に独立成分分析(ICA)、主成分分析(PCA)、およびmorphological combination score (MCS)解析を適用して、その結果からLQT1、LQT2、LQT3を鑑別できるかどうかを検討する。胎児期から乳児期の早期に発症するLQTSの全国調査に関しては、できるだけ多くの他施設への協力を呼びかけ、オプトアウト方式を含めて、各施設での倫理委員会申請をサポートする。本研究開始以前に登録された症例で、当時、遺伝子型が判明していなかった症例について、最近の技術の進歩によって確定できる可能性があるため、あらためて患者本人、家族の同意を得た上で遺伝子検査と心電図検査を行う。(理由)過去にデータ収集したさまざまな不整脈や心筋症症例のDNAが多数保管されていたため、それらを先に解析する必要があった。そのため、今年度施行する予定であった次世代シークエンサによる遺伝子解析が次年度へ持ち越すことになった。また、一部の遺伝子型の登録数が少なかったため、遺伝子型間での比較検討研究の進行が遅れた。研究者らが以前から行っている胎児期から乳児期の早期に発症するLQTSの全国集計に関しても、個々の施設からの登録症例数が非常に少なかった。また、他施設の協力を得るために、各施設で倫理委員会申請をしてもらう必要があり、それにも時間を要した。これらの症例の解析に関して、次年度へ持ち越すこととなった。(使用計画)次世代シーケンサによる遺伝子解析、デジタル心電図解析ともに、症例数を増やして解析を進めるため、その消耗品購入に充てる。また、デジタル心電図解析に関しては、他大学の症例のデータも提供してもらうため、申請者および研究協力者がそれぞれの施設へ出張する必要があり、旅費にも使用する予定である。2年目となるため、学会等における成果発表のための費用としても使用する予定である。
カルパスタチンによる細胞機能調節の解明

カルパスタチンは組織、細胞によって分子量が異なり、赤血球型ではドメインLおよび1を欠く。ドメインLのN末オリゴペプチドを合成し、抗体を調製しようと試みたが、抗体価が低く実験に用いることができなかった。しかし全長カルパスタチンを抗原にして、モノクロナ-ル抗体を作成することにより、赤血球型と筋肉型を区別することが可能となった。すなわち、抗体CSF1ー2はドメイン1を認識し、筋肉型に特異的であるが、抗体CSL1ー5はドメイン3を認識し、筋肉型、赤血球型に共通領域を認識する。一方、トリ赤血球では他の組織と同様の分子量をもつ.ほ乳類の赤血球は鳥類と異なり細胞核をもたないことから、赤血球進化とカルパスタチンの分子多様性の関係、また多様分子間の機能的相違の解析が今後の課題として提起された。カルパイン、カルパスタチン系の生理的機能探究の一端として、細胞増殖との関係を調べた。mーカルパインおよびカルパスタチンのレベルはHTLVー1感染リンパ球系細胞株で顕著に増加している。一方、HTLVー1 Taxは宿主細胞遺伝子の発現を制御し、ラット線維芽細胞をトラスフォ-ムさせる作用をもつ.そこで、ウエスタンブロッティング法およびノ-ザン法を用いて、ラット線維芽細胞系においてTaxによる形質転換がカルパイン・カルパスタチンのレベル変化をもたらすかどうかを調べた。この結果、リンパ球系とは異なり線維芽細胞系におけるmーカルパイン・カルパスタチンのレベルはすでに高く、Taxによる発現増強作用は認められなかった。カルパスタチンはカルパイン(Ca^<2+>依存性細胞内プロテア-ゼ)の内在性阻害タンパク質である。一次構造上の特徴として区別できる領域を5つもち、そのうち4つは互に類似している。我々はブタカルパスタチンについて、遺伝子工学的手法を用いた構造-機能相関の解析から、繰返しドメイン(約140残基)単独で阻害機能をもつこと、そして、中央部保存配列が重要であることを既に報告した。今回ヒトカルウパスタチンについても同様の結果を得た。さらに、ヒトゲノムDNAの部分構造解析した結果、ドメイン1は4つのエキソンに分断され3ケ所の高保存配列はそれぞれ別々のエキソンにコ-ドされていることが判明した。このうちエキソン1Bは27アミノ酸残基をコ-ドし中央部保存配列を含む。化学合成した27残基オリゴペプチドはカルパインを強く阻害することからこのエキソンは機能サプドメインに対応することが明らかとなった。現在カルパインに特異的低分子性阻害剤は存在しないため、上記の結果は将来ドラッグデザインによって合成阻害剤を開発することが可能であることを示唆し期待される。カルパスタチンin vivoでリン酸化される。ヒトカルパスタチンcDNAの機能ドメイン断片を動物細胞発現ベクタ-に接続し、トランスフェクション法により培養細胞に遺伝子導入を行い発現させたところ、生産物はリン酸化されることを見い出した。機能ドメインのリン酸化が阻害活性にどのような影響を与えるのか今後の検討課題である。また、機能ドメインの中のどの部位がリン酸化されるかについても明らかにする必要がある。プロテインキナ-ゼC(PK-C)はTPAによって代謝分解が促進されるが、カルパスタチンの合成オリゴペプチドを細胞培養液に添加するとこの現象が抑えられた。in vivoでカルパインがPK-Cのダウンレギュレ-ションに関与していることを示す。1.カルパスタチンの細胞増殖,分化に及ぼす影響を調べるため、カルパスタチンcDNAを正あるいは負方向に動物細胞発現ベクタ-につなぎ、ラット線維芽細胞および神経芽腫細胞に導入した。外来カルパスタチン遺伝子を発現する幾つかの細胞株を樹立したが、細胞の増殖性や薬剤による神経突樹誘導能には差が認められなかった。用いた細胞株は、内在性のカルパスタチンのレベルが既に十分に高く、外来遺伝子発現による増加量が23倍にしかならないこと,またアンチセンスRNA発現ベクタ-の場合も抑制量が十分でないことの理由により、導入遺伝子の効果が観察されなかった可能性がある。

2.Rat1細胞は、ヒト成人T細胞白血病ウイルスHTLVーIのtax遺伝子産物によって悪性形質転換させることができる。形質転換細胞と対照細胞でウエスタンブロッティング法でカルパイン、カルパスタチンレベルを比較したが顕著な差は認められなかった。3.ヒトゲノムDNAの解析を前年度から引続き行った。カルパスタチンは一次構造上、4つの繰返しドメインと1つの非相同性領域ドメインLをN末側にもつ。今回、ドメインLは6つのエキソンに分れ、さらにS'非翻訳領域にも1つのイントロンの存在が判明した。4.赤血球,K562細胞のカルパスタチンは他細胞と較べ分子が小さい。スプライシングに帰因する翻訳領域の差異の可能性を探るため、mRNAをcDNAに変換後PCR解析を行った。網状赤血球,K562細胞,T細胞,B細胞いずれの場合も、予想される大きさが得られ、mRNAの異型性は存在せず、細胞の種類によるカルパスタチン分子の大きさの違いは、翻訳後のタンパク質分解に帰因すると推定される。このことは、有核赤血球であるニワトリ赤血球では他組織と同一大きさであったことからも支持される。カルパスタチンは組織、細胞によって分子量が異なり、赤血球型ではドメインLおよび1を欠く。ドメインLのN末オリゴペプチドを合成し、抗体を調製しようと試みたが、抗体価が低く実験に用いることができなかった。しかし全長カルパスタチンを抗原にして、モノクロ-ナル抗体を作成することにより、赤血球型と筋肉型を区別することが可能となった。すなわち、抗体CSF1ー2はドメイン1を認識し、筋肉型に特異的であるが、抗体CLS1ー5はドメイン3を認識し、筋肉型、赤血球型に共通領域を認識する。一方、トリ赤血球では他の組織と同様の分子量をもつ。ほ乳類の赤血球は鳥類と異なり細胞核をもたないことから、赤血球進化とカルパスタチンの分子多様性の関係、また多様分子間の機能的相違の解析が今後の課題として提起された。カルパイン・カルパスタチン系の生理的機能探究の一端として、細胞増殖との関係を調べた。mーカルパインおよびカルパスタチンのレベルはHTLVー1感染リンパ球系細胞株で顕著に増加している。一方、HTLVー1Taxは宿主細胞遺伝子の発現を制御し、ラット線維芽細胞をトランスフォ-ムさせる作用をもつ。そこで、ウエスタンブロッティング法およびノ-ザン法を用いて、ラット線維芽細胞系においてTaxによる形質転換がカルパイン・カルパスタチンのレベル変化をもたらすかどうかを調べた。この結果、リンパ球系とは異なり繊維芽細胞系におけるmーカルパイン・カルパスタチンのレベルはすでに高く、Taxによる発現増強作用は認められなかった。
オプティカルフローによる動きの分類とその画像理解への応用

本研究では、徒来とは性質の異なるオフティカルフローの算出法を提案と、その理論的背景について解析を行った。具体的には、オプティカルフローの平滑化を行う正則条件からなる制約付き停留値問題をラグランジュ乗数法によって解くことを提案した。この理論により、見かけ上不連続な運動を計算することと、従来経験的に決められていた正則化係数を理論的に決定することができた。また、本理論の数値計算の安定性解析により、反復計算が画像列に依存せずに解析解に収束する条件を示した。この条件により、安定に数値計算が行えるようになった。また、一般の画像列でオプティカルフローの精度を測るためにオプティカルフロー制約式の残差を用いた誤差評価方法を提案した。この評価法により、動きの真値のない画像列でもオプティカルフローの精度評価が可能となった。以上の理論を2次元画像列のオプティカルフロー計算手法および3次元医用画像列の3次元変位場計算手法に適用し、本理論が問題の次元に依存しないことを示した。また、複数台のCPUを用いて並列計算を行うことで、計算時間を半分以下に削減することができた。また、以上の理論の枠組みおよび高速化手法がさまざまなデータ項および正則条件に対して適用可能であることを示した。これにより、今後さまざまなデータ項及び正則条件を用いたオプティカルフロー計算法に対して本理論を適用できるようになると考えられる。従来のオプティカルフローとは性質の異なる運動を算出できるオプティカルフロー算出法を提案し、その理論的背景について解析を行った。具体的には、データ項を表すオプティカルフロー制約式と平滑化を行う正則条件からなる制約付き停留値問題をラグランジユ乗数法によって解くことを提案した。この理論により、見かけ上不連続な運動を計算することと、従来経験的に決められていたパラメータを理論的に決定することができた。
CBCT画像を用いた線量評価に基づく治療効果誘導放射線治療技術の開発

陽子線治療において、治療期間中の患者様態の変化に対して治療計画を適合させるadaptive陽子線治療の要否判断を的確に行うためには、治療期間中の患者の体形等の変化が線量分布すなわち治療効果に与える影響を定量的に掌握することが重要である。本研究では、陽子線治療の患者位置合わせの目的で取得されたコーンビームCT(CBCT)画像を用いた水等価厚の評価に基づく線量分布への影響の推測手法を開発した。水等価厚の評価には、得られたCBCT画像をそのまま用いる方法およびCBCT画像に対する治療計画CT画像の変形レジストレーションによって得られた変形CT画像を用いる方法が一般的であるが、本研究では治療計画CT画像とのヒストグラムマッチングによりCT値の定量性を改善させたCBCT画像を用いる手法を採用した。水等価厚の評価は陽子線スポットスキャニング照射の各スポット照射ビームを想定し、各門の入射角度における全スポットに対して行った。水等価厚比の算出には治療計画装置に登録されているCT値-水等価厚比変換テーブルを用いた。本手法の有効性検証として、頭頚部癌患者のCBCT画像および経過観察CT画像を用いた水等価厚算出の精度評価を行った。CT値改善後のCBCT画像を用いた水等価厚と経過観察CT画像を用いた水等価厚の差分の平均は最深部が10cm程度に位置する腫瘍において3mm程度であり、誤差3%程度での算出が可能であった。しかし、全スポットの水等価厚算出誤差の標準偏差は5mm程度であり、特に鼻腔等の密度が急峻に変化する領域を通過するビームにおいて不確定性が高くなるためであると推察された。また、水等価厚の算出誤差と標的のcoverageには相関が確認された。当初の研究実施計画に記載の内容を過不足なく実施できているため。本補助事業の目的である治療効果誘導放射線治療の実現においては、CBCT画像を用いた線量評価の精度がその成否を大きく左右する。これまでの研究により、ヒストグラムマッチング法を用いてCBCT画像の画質を向上させることで、変形レジストレーション等の不確実性を伴う作業を介することなく線量評価の精度が改善可能であるとの見込みが得られた。本手法を深化させることにより、治療効果誘導放射線治療の精度向上による更なる有効性の改善を図り、本事業の目的をより精緻に達成することを目指す。当初の研究実施計画に従い、北大病院陽子線治療センターにおける患者CBCT画像の画質評価を行った。位置決め等の目的で撮影されたCBCT画像から、骨や腸管ガスの存在、およびそれらの動きに起因するアーチファクト、体輪郭形状の正確性、また腫瘍および各正常組織の視認性等を詳細に評価した。補助的に画質評価ファントムを用いた画質の定量評価も実施した。また、動きのある部位に対するCBCT撮影を目的とした四次元CBCT撮影・再構成手法の要素技術開発として、二軸CBCT撮影技術の開発を行った。二軸CBCT撮影・再構成試験を行い、二軸撮影時の画質評価、特に同時X線曝射に起因する散乱X線の詳細な影響評価を実施した。さらに、四次元CBCT再構成に必要不可欠な要素技術である逐次近似再構成アルゴリズムの開発を行った。動く腫瘍を模した対象を内包する数値ファントムに対して開発した逐次近似アルゴリズムを適用し、四次元再構成の実現可能性試験を行った。逐次近似アルゴリズムにより、四次元位相分割時の少数投影データからの再構成においてもストリーク状アーチファクトが低減されたCBCT再構成画像が得られることが確認された。また、CBCT-CTレジストレーションの基礎技術開発として、既存ソフトウェアを用いた変形レジストレーションおよび線量評価を行い、既存技術における課題抽出を行った。治療期間中に撮影された頭頸部CBCT画像と治療計画CT画像の変形レジストレーションを行い、標的および重要臓器の線量分布を詳細に評価した。治療期間中の解剖学的変化が線量分布に与える影響を明らかにすると同時に、課題として、変形レジストレーションの精度が線量評価に与える影響が指摘された。当初の研究実施計画に従い、逐次近似再構成アルゴリズムの開発を行った。本アルゴリズムの検証、特に動きのある部位のCBCT撮影におけるモーションアーチファクト低減のための四次元再構成における本アルゴリズムの有効性検証のため、動体ファントムを模した数値ファントムによる評価を実施した。角度欠損のある投影データからの再構成において、フィルタ補正逆投影法と比較してストリーク状アーチファクトの低減が確認された。また、治療効果誘導放射線治療の要素技術となる治療経過評価指標の決定のため、治療の経過による治療効果の変化を定量的に評価し治療方針を決定するための指標について検討を行った。初期検討として、評価には正常組織障害発生確率(NTCP)を用いた。強度変調陽子線治療(IMPT)を施行した頭頚部症例において、耳下腺、咽頭収縮筋、喉頭、口腔等に対して、唾液流量低下、嚥下障害、口渇、味覚障害等に関するNTCP評価を行った。また、比較のため、強度変調放射線治療(IMRT)の治療計画も作成し、同じ評価項目に対するNTCP評価を行った。これらのデータを用い、次年度以降においても引き続き治療効果評価および治療方針決定に最適なパラメータの探索調査を行う。加えてNTCP評価を行ったIMPT症例については週一回のコーンビームCT(CBCT)撮影を行い、治療効果誘導放射線治療の基礎データとなる治療期間中の経過観察データを蓄積するとともに、CBCT画像を用いた線量評価のための技術的検討を開始した。

さらに、本研究の発展的展開を見据え、治療効果予測手法の開発に着手した。当初の研究実施計画に記載の内容を過不足なく実施できているため。陽子線治療において、治療期間中の患者様態の変化に対して治療計画を適合させるadaptive陽子線治療の要否判断を的確に行うためには、治療期間中の患者の体形等の変化が線量分布すなわち治療効果に与える影響を定量的に掌握することが重要である。本研究では、陽子線治療の患者位置合わせの目的で取得されたコーンビームCT(CBCT)画像を用いた水等価厚の評価に基づく線量分布への影響の推測手法を開発した。水等価厚の評価には、得られたCBCT画像をそのまま用いる方法およびCBCT画像に対する治療計画CT画像の変形レジストレーションによって得られた変形CT画像を用いる方法が一般的であるが、本研究では治療計画CT画像とのヒストグラムマッチングによりCT値の定量性を改善させたCBCT画像を用いる手法を採用した。水等価厚の評価は陽子線スポットスキャニング照射の各スポット照射ビームを想定し、各門の入射角度における全スポットに対して行った。水等価厚比の算出には治療計画装置に登録されているCT値-水等価厚比変換テーブルを用いた。本手法の有効性検証として、頭頚部癌患者のCBCT画像および経過観察CT画像を用いた水等価厚算出の精度評価を行った。CT値改善後のCBCT画像を用いた水等価厚と経過観察CT画像を用いた水等価厚の差分の平均は最深部が10cm程度に位置する腫瘍において3mm程度であり、誤差3%程度での算出が可能であった。しかし、全スポットの水等価厚算出誤差の標準偏差は5mm程度であり、特に鼻腔等の密度が急峻に変化する領域を通過するビームにおいて不確定性が高くなるためであると推察された。また、水等価厚の算出誤差と標的のcoverageには相関が確認された。当初の研究実施計画に従い、平成28年度の検討結果に基づき四次元CBCT再構成のための逐次近似再構成のアルゴリズム改良を行う。また、CBCT画像を用いた線量計算の更なる精度向上のためのレジストレーション技術の開発を行う。さらに、治療効果誘導放射線治療の実現のための生物学的評価指標の検討に着手する。治療効果誘導放射線治療有効性評価として、前年度までに確立された治療効果誘導放射線治療技術に対し、実患者のCBCT画像を用いた検証を行う。検証は動きの影響が少なく体輪郭全体がCBCT視野に含まれ、かつ位置決め目的のCBCT画像が頻繁に取得される頭頸部領域を対象とする。当面は変形CT画像を用いた線量計算の妥当性および治療経過評価指標の適切性の評価を主眼に、治療が終了した症例に対して本手法の検証を行う。最終的に実症例での治療効果誘導放射線治療フローの実施を目指す。また、動きのある体幹部への適用可能性検証として、四次元CBCT再構成、CBCT視野外再構成等の要素技術を結集し、動く部位での治療効果誘導放射線治療の実現可能性を評価する。
腎結石の発生機序における尿細管細胞と結晶の相互作用に関する研究

培養尿細管細胞(MDCK細胞)と蓚酸カルシウム結晶の付着・取り込みに関する定量的接触実験を確立した。形態学的に結晶付着は細胞間隙よりむしろMDCK細胞自身の表面に多く見れ、走査電顕像では単なる付着でなくendocytosisによる捕獲を示唆するものであった。こうした尿細管細胞と結晶の相互作用を、結石形成に至る初期過程の重要な現象のひとつとする考えを基本として、研究を進めた。付着結晶量に影響する因子について、種々のglycosaminoglycanや界面活性剤を用いた細胞表面の前処理によって付着結晶量は有意に減少することを確認し、結晶特異性の検討では、MDCK細胞への付着よび細胞増殖促進作用は蓚酸カルシウム1水塩に特異的であることを認めた。次に、ヒト尿が結晶付着に及ぼす影響について検討し、濃度依存性に結晶付着に対して強い抑制作用のあることが確認され、かつヒ結晶付着抑制は主として結晶側に作用することを明らかにした。そこで、ヒト尿中の結晶付着抑制物質の分離を試み、健常人尿を対象として、分子量約60,000の強い抑制活性を有する分画が分離された。結石患者尿と健常人尿における結晶付着抑制作用の比較では、有意差は得られなかったが、結石患者尿で抑制作用が強い傾向を認めた。一方、高カルシウム食および蓚酸ナトリウム腹腔内投与によるラット結石モデルでの組織学的検討では、尿細管内に蓚酸カルシウム結晶沈着を見るが、大部分の結晶は尿細管腔に浮遊した状態よりも上皮細胞に付着したかたちで認められ、一部ではendocytosisと思われる所見が動物実験においても確認された。以上の成果を踏まえ、尿細管細胞における蓚酸カルシウム結晶の付着に対するヒト尿の影響を検討するに当たって、既に知られているところの尿中結石関連因子の定量をキャピラリー電気泳動法によって検討し、尿中蓚酸およびクエン酸の同時測定を可能とした。ヒト尿による尿細管細胞への結晶付着抑制と、尿中結石関連因子との関連について今後も検討する予定である。培養尿細管細胞(MDCK細胞)と蓚酸カルシウム結晶の付着・取り込みに関する定量的接触実験系を確立した。形態学的に結晶付着は、細胞間隙よりむしろMDCK細胞自身の表面に多く見られ、走査電顕像では単なる付着でなく何らかの物質を介したあるいはendocytosisによる細胞表面からの捕獲を示唆するものであった。また、Hank's液による細胞表面の洗浄や、トリプシン処理によっても結晶は細胞から離れることがなかった。こうした結晶付着は、結石形成に至る初期過程の重要な現象のひとつと考えられた。付着結晶量に影響する因子の検討において、種々のglycosaminoglycan (GAG)を用いた細胞表面の前処理によって付着結晶量は有意に減少した。また、界面活性剤(Triton X 100)や、尿細管細胞障害を起こすところの0.1N塩酸およびゲンタシンの前処理によっても結晶の付着は抑制された。以上の成果を踏まえ、尿細管細胞における蓚酸カルシウム結晶の付着・取り込みに対するヒト尿の影響を検討するに当たって、既に知られているところの尿中結石関連因子を定量し、臨床的にこれらの測定をルーチン化することを優先させた。すなわち、尿中結石関連因子の中でも蓚酸およびクエン酸は、各々最も強い結石形成促進および抑制因子とされ、従来その測定には時間と高価な試薬を要することからルーチン化の妨げとなっていたが、新しい分析技術であるキャピラリー電気泳動法によって可能とした。

用いた機種はウォーターズ社クォンタ4000Eであるが、種々の基礎検討より泳動液を25mMリン酸2Na+0.5mManion-BT、印可定電圧を14KV、尿検体の希釈率10倍の条件下で、蓚酸およびクエン酸を同時測定することが出来た。培養尿細管細胞(MDCK細胞)における蓚酸カルシウム結晶の付着およびendocytosisは、結石形成に至る初期過程の重要な現象のひとつと考え、本研究を進めてきた。今年度はこの現象に対するヒト尿の影響を検討する予定であったが、より基礎的な研究を優先させ以下の成果が得られた。(1)結晶が細胞増殖に及ぼす影響について:MDCK細胞を、蓚酸カルシウム1水塩結晶(COM)0-200μg/mlの存在下で12時間培養し、結晶量による細胞増殖促進作用を検討した。150μgまでは結晶量に依存して細胞数は増加し、それ以上は平衡となりかつ対照に比して有意な細胞数増加を示した。この細胞増殖促進作用を他の定量的方法から見るため、MTTassayを用いて同じ実験系で測定し、同様にCOM200および400μg存在下では対照に比して有意差が得られた。(3)ラット結石モデル:4週齢の雄Sprague-Dawleyラットへの高カルシウム食および蓚酸ナトリウム腹腔内投与による結石モデルを作成し、偏光顕微鏡を用いた腎の組織学的検討を行った。尿細管内に蓚酸カルシウム結晶沈着を見るが、大部分の結晶は尿細管腔に浮遊した状態よりも上皮細胞に付着したかたちで認められ、一部ではendocytosisと思われる所見が認められた。同実験系へのゲンタマイシン投与の影響をみたが、近位尿細管細胞障害が示され、結晶のendocytosisや細胞のdebrisと一塊になった結晶が尿細管腔に多く認められる傾向にあった。以上の結晶付着やendocytosisの所見は、乳頭部でなく皮質、髄質優位に見られた。尿細管細胞と結晶の相互作用は、付着およびendocytosisという現象で観察され、結石形成に至る重要な初期過程のひとつと考え、本研究を進めてきた。今年度はこの現象に対するヒト尿の影響を検討し、以下の成果が得られた。(1)ヒト尿が結晶付着に及ぼす影響について:これまでの実験系と同様、MDCK培養細胞に蓚酸カルシウム1水塩(COM)結晶の懸濁液を反応させ、この系にヒト尿を添加して結晶付着への影響を検討した。トリス塩酸緩衝液で10倍および100倍希釈した尿を用いたが、濃度依存性に結晶付着に対して強い抑制作用を認めた。(2)ヒト尿の結晶付着抑制作用点の検討:MDCK細胞とCOM結晶の反応の前に、COM結晶を尿で処理した場合と、MDCK細胞を尿処理した場合とで比較した結果、ヒト尿による結晶付着抑制は主として結晶側に作用するものであった。(3)ヒト尿中の結晶付着抑制物質の分離:健常人尿をイオン交換クロマトグラフィーにより画分し、そのうち抑制活性のある分画を、さらにゲル濾過クロマトグラフィーにより画分して、分子量約60,000の強い抑制活性を有する分画が分離された。しかし、この物質の同定および精製には至らず、今後の課題である。(4)結石患者
ニューロン樹状突起のリモデリングを制御する細胞外環境の研究

ニューロンは、軸索と樹状突起という機能・構造的に異なる2つの神経突起を介して情報の受け渡しを行なっている。神経突起を介したニューロン間ネットワークの大枠は、ヒトでは胎生後期から生後にかけて構築されるが、その後、各ニューロンの神経活動が活発化すると、ネットワークの切り替えが頻繁に行われる。特に、視神経や体性感覚神経などの感覚ニューロンは、外界からの入力に依存して樹状突起形態を大きく変化させることにより、最終的に適切な受容領域を獲得する(1)。このような樹状突起の可塑的形態変化(リモデリング)は、神経回路が機能的に成熟するための必須ステップであるが、簡便な解析システムが確立されていないために、樹状突起リモデリングを制御する分子・細胞メカニズムに関しては未だ情報が乏しい。我々は、ショウジョウバエ感覚ニューロンをモデルとして、樹状突起構造のリモデリング機構について研究を行った。ショウジョウバエ成虫が羽化してから24時間以内に、感覚ニューロンの樹状突起が放射状から格子状へと劇的にリモデリングされることを見出した。この樹状突起リモデリングは、神経活動に依存的であり、感覚刺激を遮断すると、顕著に阻害されることを見出した。さらに、ニューロンの周辺組織から一過的に供給されるマトリックス・メタロプロテアーゼ(Mmp)により、感覚ニューロン樹状突起の"足場"である細胞外マトリックスが局所分解をうけることが、樹状突起構造のリモデリングを誘導するトリガーであることを示した。これらの発見は、生理的もしくは病理的条件下において、ヒト脳内で起きる樹状突起リモデリングの分子基盤に関する手がかりを明示したと考えられる。私達は、ショウジョウバエ腹部に位置する体性感覚ニューロンの樹状突起が、ハエ成虫が羽化してから24時間以内に、放射状からラダー状へと劇的にリモデリングすることを見出した。羽化後24時間は、ハエ成虫が、温度・匂い・機械刺激など様々な外界情報を受容し始める時期であり、感覚ニューロンにおいて感覚刺激依存的な神経活動(sensory-evoked neural activity)が急激に上昇する時期と合致する。続いて、この樹状突起リモデリングに異常をもつ変異体のスクリーニングを行い、細胞外マトリックス・メタロプロテアーゼMmp-2の機能変異体ではリモデリングが著しく抑制されることを発見した。更に体細胞クローナル解析を行い、Mmp-2は上皮組織から一過的に分泌されることを明らかにした。一方で、樹状突起のリモデリング過程をタイムラプス観察できるシステムを確立し、リモデリングは「既存突起の側方移動」と「新たな突起のDV軸方向への伸長」という2ステップにより構築されることを見出した。さらに網羅的RNAiスクリーニングにより、後者のステップには、Mmp-2により分解されなかった基底膜と、突起上のインテグリンとの相互作用が重要である可能性を見出した。現在、遺伝学的手法およびライブイメージングを駆使して、上記の細胞メカニズムを制御する分子メカニズムを明らかにしようとしている。
小児期発症1型糖尿病および自己免疫性甲状腺疾患における遺伝因子の解析

1型糖尿病は遺伝因子と環境因子の関与のもとで,自己免疫反応によりインスリンを産生する膵ベータ細胞が障害される疾患である.Graves病では,同様に自己免疫反応により産生されたTSHレセプター抗体によって甲状腺機能亢進症が引き起こされる.我々はこれまで,日本人小児期発症1型糖尿病患者およびGraves病患者を対象として,HLAクラスII遺伝子およびCTLA4遺伝子の検索をすすめてきた.対象は,1型糖尿病患者46例(女子29例,男子17例,発症年齢は0.5-16歳)とGraves病患者44例(女子34例,男子10例,発症年齢は3-16歳)である.APECED患者で既に見出されているAIRE-1遺伝子のエクソン2のK(aag)83E(gag)変異,およびエクソン6のR(cga)257X(tga)変異についてそれぞれプライマーを作成し,PCR-RFLP法によって変異の有無を解析した.その結果,今回の対象者の中にはこの部位の遺伝子変異は検出されなかった,従って,日本人小児期発症のこの二疾患については,AIRE-1遺伝子のK83E変異とR257X変異は関与していないと考えられた.1型糖尿病は遺伝因子と環境因子の関与のもとで,自己免疫反応によりインスリンを産生する膵ベータ細胞が障害される疾患である.Graves病では,同様に自己免疫反応により産生されたTSHレセプター抗体によって甲状腺機能亢進症が引き起こされる.我々はこれまで,日本人小児期発症1型糖尿病患者およびGraves病患者を対象として,HLAクラスII遺伝子およびCTLA4遺伝子の検索をすすめてきた.対象は,1型糖尿病患者46例(女子29例,男子17例,発症年齢は0.5-16歳)とGraves病患者44例(女子34例,男子10例,発症年齢は3-16歳)である.APECED患者で既に見出されているAIRE-1遺伝子のエクソン2のK(aag)83E(gag)変異,およびエクソン6のR(cga)257X(tga)変異についてそれぞれプライマーを作成し,PCR-RFLP法によって変異の有無を解析した.その結果,今回の対象者の中にはこの部位の遺伝子変異は検出されなかった,従って,日本人小児期発症のこの二疾患については,AIRE-1遺伝子のK83E変異とR257X変異は関与していないと考えられた.対象は,小児期発症1型糖尿病患者(男子50例,女子75例,発症年齢0.5-16歳),およびGraves病患者38例(男子9例,女子29例,発症年齢3-16歳)である.これらの症例についてHLA-DRB1,DQB1遺伝子型およびCTLA4 exon1,49位の遺伝子多型(A/G)の解析が終了した.本研究ではHLAおよびCTLA4遺伝子多型の判明した症例について,さらにAIRE遺伝子の解析を行うものであり,遺伝素因の相互関係についても解析を行う予定である.1型糖尿病は遺伝因子と環境因子の関与のもとで,自己免疫反応によりインスリンを産生する膵ベータ細胞が障害される疾患である.Graves病では,同様に自己免疫反応により産生されたTSHレセプター抗体によって甲状腺機能亢進症が引き起こされる.我々はこれまで,日本人小児期発症1型糖尿病患者およびGraves病患者を対象として,HLAクラスII遺伝子およびCTLA4遺伝子の検索をすすめてきた.対象は,1型糖尿病患者46例(女子29例,男子17例,発症年齢は0.5-16歳)とGraves病患者44例(女子34例,男子10例,発症年齢は3-16歳)である.APECED患者で既に見出されているAIRE-1遺伝子のエクソン2のK(aag)83E(gag)変異,およびエクソン6のR(cga)257X(tga)変異についてそれぞれプライマーを作成し,PCR-RFLP法によって変異の有無を解析した.その結果,今回の対象者の中にはこの部位の遺伝子変異は検出されなかった.従って,日本人小児期発症のこの二疾患については,AIRE-1遺伝子のK83E変異とR257X変異は関与していないと考えられた.
有明海産ムツゴロウの資源の回復に関する基礎的研究

劣悪な状態にある有明海産ムツゴロウ資源の回復を目指して有明海周辺の干潟と河口域で以下に述べるような生態学的研究を行った。生息域の環境条件を知るため、有明海全周でのムツゴロウ分布調査の結果にもとづいて周辺の干潟に8トランセクトを設け、底質条件を調べた。その結果、ムツゴロウは、干潟表層がMd.φ4.95より細かい粒度、含泥率78.39%以上の干潟に生息するが、主な分布域での両値は、7φ前後と90-100%で、その範囲のなかで干潟の高さと傾斜、餌の豊富さ、その他の条件によって分布を決定しているとみられた。干潟の餌料量、魚体の栄養状態、成長度と孕卵数について調査を行い、成長度に年級群間の差が見られ、これが餌料条件の年変化にもとづく成育状態の変化を反映しているとみられた。発生年の成育は、当歳魚の越冬期の減耗と関係することも示唆された。また魚体の栄養状態と産卵量との対応から、餌料条件が再生産量を決定しうると考えられた。ムツゴロウに対する環境収容力については、索餌面積、索餌頻度、摂餌時間などと密接に関係すると考えられたので、ムツゴロウの索餌行動を調べるため、佐賀県六角川河口の干潟で行動のビデオ撮影を行った。現在その資料に基づき行動様式を解析中であり、その結果により、個体の索餌面積、その時間的・空間的変化、干潟の餌料量と行動との関係など、多くの成果が期待できる。浮遊仔魚の分布については、佐賀県六角川で調査を行い、仔魚が有明海に広く分散することなく、ほとんど河口内に生息すること、河川内で感潮域の広い範囲に分散して分布することなどを明らかにした。
水源涵養林施業マニュアルの作成に関する研究

本研究は、水源涵養機能を高度に発揮させる森林の整備を推進するための「施業マニュアル」を作成し、それを森林管理の現場に普及させるために必要な「既往研究の整理」と「森林整備を有効に進めるための地域区分」、マニュアル作成に資する「東京大学愛知演習林の70年間にわたる水文資料の解析」及び「東京大学千葉演習林における総合対照流域試験の実施」、さらには、「森林施業マニュアルの構築」を目的としている。本研究におけるおもな成果は以下のとおりである。(1)東京大学愛知演習林白坂水文試験流域の1930年以降の日雨量データから日流量を再現し、流出特性の長期変化を明らかにした。(2)東京大学千葉演習林袋山沢水文試験流域で、1999年3月5月に、70年生スギ・ヒノキ人工林の皆伐試験(B流域)を行い、森林伐採の影響が流出量、水質、土砂流出、土壌水分、土壌呼吸量などにどのように現れるかを、伐採しない対照流域(A流域)と比較した。(3)全国の既往水文資料を収集し、洪水流出・基底流出に関する解析・整理を進めた。(4)国土数値情報として統一された標準グリッドで作成された、国土地理院の標高データ・土地利用データ・環境庁の植生データ、気象庁の気候値データ等のデータセットを用いて、水源涵養林の施業に有効な地域区分を検討した。(5)「水源涵養と森林施業」の関係を検討する会議を多数回開催し、「水源涵養林施業マニュアル」を作成した。おもな内容は、森林の水源涵養機能の平易な解説と、水源涵養機能の向上をめざす、単層林施業、複層林施業、長伐期施業の具体的方法の本立てとした。なお、報告書では(4)及び(5)を重点的に報告した。本研究は、水源涵養機能を発揮する森林整備指針を気候、地質による地域別に、主要林分を毎に提示することを目的としている。研究は、(1)東大愛知演習林の70年間にわたる水文資料の解析、(2)東大千葉演習林における対照流域試験の実施、(3)降雨、流出から見た全国の地域区分と水文特性の解析、(4)森林施業マニュアルの構築に向けたモデル開発からなる。本年度の研究は、(1)について、流況曲線の年々変動が流況曲線の部分によって、その年の最大日雨量の大小に関係する部分、年雨量に関係する部分、いずれとも強い関係を持たない渇水流量部分からなることを明らかにするなど、新しい知見を得た。また、過去の水文資料のコンピュータへの入力、データベース化が進められた。(2)について、実際に森林を伐採して水循環に対しての影響を評価する試験が準備され、次年度に伐採予定となった。土壌水分、地下水位、水質の観測も含め伐採前の事前調査が詳細に進められた。(3)について、全国の既往水文資料を収集し、地域ごとの洪水流出、基底流出の特性に関する解析が進められた。(4)について、「水源涵養と森林施業」を論ずる会議を4回にわたって開催し、森林整備指針の作成についての基本構想の深化を図った。