hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療における安全行動分析に対する眼球解析アプローチの適用

本研究は,臨床工学技士業務における個人レベルでの安全行動分析に対して眼球運動解析アプローチを適用し,技士の注意の配分方略や技能について詳細に調査すること,そして一連の調査手順を整理し,臨床工学業務における認知タスク分析の方法論の確立することを目的として実施した.病院の透析室において技士に対する観察を実施し,一連の透析業務を遂行する複数の技士から眼球運動および行動データを獲得した,これらのデータに基づき,情報獲得行動,ならびに標準的作業手順からの乖離度合および各要素作業の完了時間といった観点から,技士の違いを明らかにした.本研究は,臨床工学技士業務における個人レベルでの安全行動分析に対して眼球運動解析アプローチを適用し,技士の注意の配分方略や技能について詳細に調査すること,そして一連の調査手順を整理し,臨床工学業務における認知タスク分析の方法論の確立することを目的として実施した.病院の透析室において技士に対する観察を実施し,一連の透析業務を遂行する複数の技士から眼球運動および行動データを獲得した,これらのデータに基づき,情報獲得行動,ならびに標準的作業手順からの乖離度合および各要素作業の完了時間といった観点から,技士の違いを明らかにした.本研究は,臨床工学技士業務における個人レベルでの安全行動分析に対して眼球運動解析アプローチを適用し,技士の注意の配分方略や技能について詳細に調査すること,そして一連の調査手順を整理し,臨床工学業務における認知タスク分析の方法論の確立することを目的としている.助成期間において,病院の透析室において技士10名に対する観察を実施し,一連の透析業務を遂行する複数の技士から眼球運動および行動データを獲得した.眼球運動データについては,注意配分の効率性,確認の冗長性,注意の網羅性,そして注意対象の偏りといった4つの観点から評価を与え,各技士の違いを明らかにした.行動データについては,標準的作業手順からの乖離度合,および各要素作業の完了時間といった2つの観点で評価し,眼球運動データと同様に各技士の違いを明らかにした.ここで明らかとなった技士間の違いと,技士の経験年数(技能レベルの代用特性)の間の関係を詳細の調査することで,技士の技能と注意・行動間の対応関係について示唆を得ることができた.さらに透析装置の配置に関する要因と注意の関係について検討し,確認のために行う注視に対して装置の配置が影響を与えている可能性を示唆として得ることもできた.上記の成果に加えて,ここで行った一連の分析手順を整理し体系化することで,臨床工学業務における技士の注意配分・情報確認の傾向を定量的に分析することを可能とするような,認知タスク分析の枠組みについても,新たに示すこともできた.
アミロイドβの毒性配座理論を基盤としたアルツハイマー病の新しい予防戦略

アルツハイマー病(AD)の原因物質の一つと考えられている42残基のアミロイドβ(Aβ)は、2、3量体を基本単位としてオリゴマー化することにより神経細胞毒性を示す。その際、Glu22及びAsp23付近にターン構造を有する毒性コンホマーがオリゴマー化しやすいことを、本研究代表者らは見いだしている。本研究では、毒性コンホマー特異的に結合する抗体ならびに核酸アプタマーを開発し、ADの迅速診断に応用することと、毒性コンホマーをとりやすいE22P-Aβ配列をノックインした新規ADモデルマウスを作出し、毒性オリゴマーのAD病態に及ぼす効果を調べることを主たる目的としている。最終年度は、残されていた核酸アプタマーと新規ノックインADモデルマウスに関する研究を重点的に行なった。まず、2016年度に作成した独自の2量体モデル(E22P-Aβ42-V40DAP dimer)から作成したプロトフィブリル(オリゴマーの一種)に対するRNAアプタマーをSELEX法にて作製したところ、Aβ42単量体やアミロイド線維よりも2量体に選択的に結合するアプタマー・E22P-AbD43を得ることができた。E22P-AbD43は、ADモデルマウス脳の免疫組織学的染色において、老人斑よりもオリゴマーを選択的に検出できる特性を有していた。一方、約5年をかけてヒト型E22P-Aβのホモのノックインマウスを12匹作出することに成功した。このモデルマウスは、6ヶ月齢でも脳内にアミロイドが蓄積しなかったのに対して、毒性オリゴマー量(特に3量体)が野生型マウスと比べて著しく高いことが判明した。また、新規物体認識試験において、このモデルマウスは野生型マウスと比べて有意に認知機能が低下していたことから、新しいタイプのADマウスとしての活用が期待される。さらに、抗毒性ターン特異抗体・24B3のFabドメインとハプテンペプチドフラグメント複合体の結晶化を行い、室内X線結晶解析装置で分解能2.8オングストロームの反射を確認した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アルツハイマー病(AD)の原因物質である42残基のアミロイドβペプチド(Aβ42)は、2あるいは3量体を基本単位としてオリゴマー化することにより神経細胞毒性を示す。その際、22,23番目にターン構造を有する毒性コンホマーがオリゴマー化しやすいことを、本研究代表者らは見いだしている。本研究では、2あるいは3量体を強く認識する抗体ならびに核酸アプタマーを開発し、ADの迅速診断に応用すること、また、毒性コンホマーをとりやすいAβ配列をノックインした新規ADモデルマウスを作出し、これを用いて、本研究で開発した抗体、核酸アプタマー及び機能性食品成分によるAD予防効果の検証を目的としている。今年度は、より優れた3量体認識抗体を開発するため、これまでに作製した22,23番目における抗毒性ターン抗体7種を詳細に機能解析した。その結果、以前開発した11A1抗体(昨年米国および中国で特許取得、免疫生物研究所より販売中)と比べて、22,23番目のターン構造を極めて特異的に認識する24B3抗体を見いだした(特許出願中)。24B3の免疫組織染色能は11A1と比べて低かったが、ヒト脳脊髄液を用いたAD診断には有望と考え、市販のN末抗体をプレートに固定したサンドイッチELISAを構築した。一方、2量体を特異的に認識する抗体がないので、ハプテンとして用いる2量体モデルペプチドを複数合成した。これらの中で、E22P-Aβ42の40番目のアミノ酸残基をL,L-ジアミノピメリン酸で置換(架橋)した2量体モデルペプチドは、ヒト神経芽細胞腫(SH-SY5Y)に対して毒性を示し、βシート構造を形成する一方で、フィブリル化しなかった。したがって、本モデルペプチドは、2量体特異抗体や核酸アプタマーを開発するためのハプテンとして有用と考えられる。アルツハイマー病(AD)の原因物質である42残基のアミロイドβ(Aβ42)は、2あるいは3量体を基本単位としてオリゴマー化(凝集)することにより神経細胞毒性を示す。その際、22,23番目に付近にターン構造を有する毒性コンホマーがオリゴマー化しやすいことを、本研究代表者らは見いだしている。本研究では、2, 3量体それぞれに特異的に結合する抗体ならびに核酸アプタマーを開発し、ADの迅速診断に応用すること、また、毒性コンホマーをとりやすいE22P-Aβをノックインした新規ADモデルマウスを作出し、抗体及び機能性食品成分などによる予防効果の検証を目的としている。今年度はまず、昨年度開発した毒性コンホマー特異抗体(24B3)の機能解析を行ったところ、E22P-Aβ42の2量体モデルペプチド(V40で架橋)を、E22P-Aβ42モノマーよりも強く認識する一方で、野生型Aβ42に対する反応性が非常に低いことが明らかになった。続いて、AD患者の脳脊髄液を、市販のN末抗体82E1(固相)と24B3(液相)を用いたサンドイッチELISAにより分析したところ、AD患者の毒性コンホマー量の全Aβ42量に対する割合は、健常人に比べて有意に高かった。

さらに24B3は、市販のN末抗体などとは異なり、Aβ42による神経細胞毒性に対する保護作用を示したことから、今後ヒト化することにより初期のAD患者に対する治療薬としての応用が期待される。一方、食材等に含まれる各種非カテコール型のフラボノイドによるAβ42凝集抑制機構を、15NラベルしたAβ42の1H-15N SOFAST-HMQC NMRにおける化学シフトの変化により解析した。さらに、ヒト型E22P-Aβ42ならびにE22V-Aβ42配列を含むアミロイド前駆タンパク質ノックインベクターを用いて、それぞれのノックイン動物の作製を開始した。本年度は、Aβ42の22,23番目における毒性ターン構造をきわめて特異的に認識する24B3抗体と市販のN末抗体(82E1)を用いたサンドイッチELISAを用いて、AD患者の脳脊髄液によるAD診断の可能性について検討した。その結果、AD患者の毒性コンホマー量(毒性ターン構造をもつAβ量)の全Aβ42量に対する割合は、健常人に比べて有意に高かった。毒性コンホマーは、ADの初期段階で増加していると考えられることから、24B3抗体は初期のAD診断において特に有効と思われる。なお、AD患者の脳脊髄液は、昨年度、京都府立医科大学附属病院において採取されたものを用いた。本研究計画は、京都府立医科大学ならびに京都大学の倫理委員会により承認されている。一方、食品中に広く含まれる非カテコール型フラボノイド類によるAβ凝集抑制機構を明らかにするとともに、凝集抑制活性の発現に必要な構造条件(B環上の2'位の水酸基ならびに平面性)も明確にできた。来年度以降に計画しているフラボノイド類の体内動態を調べるためのモデル化合物を選択する上で有用な知見である。近いうちにキメラマウスが誕生する予定である。以上により、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えている。アルツハイマー病(AD)の原因物質である42残基のアミロイドβ(Aβ42)は、2、3量体を基本単位としてオリゴマー化(凝集)することにより神経細胞毒性を示す。その際、Glu22及びAsp23付近にターン構造を有する毒性コンホマーがオリゴマー化しやすい。本研究では、2、3量体に特異的に結合する抗体ならびに核酸アプタマーを開発し、ADの迅速診断に応用することと、毒性コンホマーをとりやすいE22P-Aβ配列をノックインした新規ADモデルマウスを作出し、機能性食品成分による予防効果の検証を目的としている。まず、抗毒性コンホマー特異抗体(24B3)を用いて、Simoaシステム(1分子ELISA技術を用いた新規イムノアッセイプラットフォーム)によるヒト脳脊髄液中のAβの毒性コンホマーの定量を行ったところ、AD群では対照群よりも毒性コンホマー量が有意に高かった。これより、従来のサンドイッチELISAと比べてSimoa装置の優位性が明らかになった。次に、E22P-Aβ40の30、38番目でそれぞれ架橋した2量体モデルを合成したところ、38番目で架橋した2量体モデルは準安定なオリゴマーとして存在し、SH-SY5Y細胞に対してモノマーと同等以上の細胞毒性を示した。イオンモビリティー質量分析法により、この2量体モデルは1224量体として長時間存在することが明らかになり、C末端の疎水性コアの重要性が示唆された。さらに、E22P-Aβ42の40番目で架橋した2量体モデルも同様の挙動を示したことより、このモデルに対するDNAアプタマーの作製を試みたところ、高い選択性を示す濃縮プールが得られた。
地域環境知と超学際的アプローチの導入による地下水保全に向けた節水灌漑技術の開発

本研究の目的は、乾燥地における持続的農業を創出することを目指し、研究手法として地域環境知の発掘と超学際的アプローチを新規導入し、新たな節水灌漑技術を開発することである。2017年度初年度は基本データの収集、節水灌漑開発に関する地域環境知の収集、ワークショップによる地域が解決するべき問題とその課題の明確化を行う。各メンバーが基本情報の収集を行った。自然系では、土壌サンプル採取および土壌水分計設置により、基本的な土性情報と灌漑情報を得た。対象とした農地における栽培作物は天水コムギ、少量灌漑メロン、トウモロコシ畑である。灌漑情報については、農家への聞き取りを個別に行い、灌漑回数や灌漑量等のデータを得ることができた。一方で、地下水位変動に関しては国会水利局をはじめとする各機関に地下水位データー譲渡の打診を行ったが、政府内の混乱等があり残念ながら不調に終わった。社会系では、オープンマーケット調査を行い、農産物の流通・加工・販売に関する聞き取りを行った。マーケット調査では主にメロン関係の流通について、複数のトレーダーに聞き取りを行うことができた。予定していた初年度のワークショップは、対象地域であるカラプナール市の市長をはじめ国家水利局、コンヤ平原開発局、そしてローカルステークホルダーの参加を得て開催することができた。カラプナール市を含むコンヤ県では、節水灌漑の必要性はすでに十分理解されており、各農家をはじめとして省庁も水利用については非常に細かな管理を行っていることがわかった。しかしながら、節水を進めても大規模農業という農業形態がネックとなり、地下水に完全に依存する同市の地下水量は減少の一途をたどっていることが広く理解されていることも明らかとなった。つまり、現状、適切な水管理で農業がおこなわれているが、それは必ずしも地下水保全につながらないことが明確となった。政府機関の混乱があり、国家水利局およびコンヤ平原開発局との研究連携が思うように進まなかったことが原因である。これは、対象地域周辺のみでなく、トルコ全土で発生している事象であり、政局の混乱も相まって今後注意深く対応せねばならない。地域環境知の発掘を思うように進めることができなかった。基本情報の収集に手間取ったこともあり、インタビュー調査を進める中で新たに紹介される農家の地域環境知にまで手が十分に届かなかった。研究2年目は、研究1年目の内容を踏まえた上で、研究計画書に沿った形で進めていく。基礎データ収集の継続、地域環境知の発掘、地域農産物に付加価値を付けたフードチェーンの検討を主に実施していく予定である。
絵画刺激を用いたハトの短期記憶過程と自然概念の効果-SPR課題を用いて-

動物を用いた自然概念の形成とカテゴリイ化の研究では、従来はgo/no-go型の経時弁別が行われ、動物が弁別すべきカテゴリイと使用されるスライド写真刺激はヒトである実験者によって任意に決定されていた。本研究では実験者の恣意性から自由な実験パラダイムとして、サルに適用されているSerial-Probe-Recognition(SPR)課題と同様のSAME/DIFFERENT短期記憶弁別課題のハトへの適用の可能性を検討し(62年度)、同様の課題を用いてハトがスライド写真をどのように認知しているかについての基礎的検討(63年度)を試みた。1.実験I:動物や風景などのスライド120枚を用いて、前試行と現試行のスライドが同じか異なるかの弁別訓練をgo/no-go型の経時弁別事態で行った。訓練完成の後、試行間間隔を150秒に順次変化して保持テストを行った。最長の50秒でも弁別比は高く維持され、色や線分などの記憶材料を用いた場合に較べて、かなり長期的な記憶がなされている事が明らかにされた。2.実験II:実験2-1では前実験と同じスライドをSAME試行で左右逆転、上下逆転、左右上下逆転、正立の4条件の角度で呈示した。逆転によって弁別では低下したが、左右逆転は上下逆転より弁別は良く、スライド写真の方向による効果がみとめられた。訓練に伴って逆転試行での弁別は回復し、新しいスライドによる転移テストを行った。正立条件では完全な転移が生じたが、逆転条件での弁別比は低下した。実験2-2では、実験2-1の転移テストで用いられたスライドで訓練した後、親近性はあるが今まで1度も逆転されたことのない刺激への転移を測定した。親近性があれば逆転していてもほぼ完成な転移がみられ、ハトのスライド写真認知には長期的な記憶が介在しまた、刺激の部分的要素ではなくまとまりのある全体としてのスライド写真が弁別の手がかりである事が明になった。動物における自然概念の成立は従来,弁別課題を用いて行われてきた.本研究は短期記憶課題を用いることによって,ハトにおける自然概念の成立の一般性を求めると同時に,自然概念が短期記憶課程にどのような効果をもつかを検討した.動物,建物,風景,昆虫,物体などのカラースライド(計120枚)を継時呈示し,今呈示されている刺激が/試行前に呈示された刺激と異なる(DIFF)が同じか(SAME)の弁別をmultipie VI6"(FR5)-Extスケジュールで訓練した.刺激呈示はSAME試行で10秒, DIFF試行で210秒,試行間隔は1秒であった.訓練完成の後,試行間隔を延長して保持テストを行った.弁別比は保持時間の関数として減少し,かつ, SAME試行では前試行での刺激呈示時間が短いほど誤反応が出現する傾向がみられた.その後, SAME試行での刺激呈示角度を3段階に変化して,同様の訓練を行った.訓練完成の後,新しいスライドを刺激とする転位テストを行って,訓練で用いられなかった刺激についても呈示角度の違う同一刺激間のSAME判断が可能であるか否かをみた.以上の2実験の結果より,本研究で開発された課題(SAME/DIFF弁別又は1セッション内でのFAMICIAR/NOVEL弁別)はハトの短期記憶と自然概念を検討するパラダイムとして有効であることが認められた.次年度は本年度の成果を踏まえて,自然概念の短期記憶過程への効果を更に検討する.

その1つとして,個々のスライド刺激についてのSAME/DIFF弁別ではなく,自然概念としてのカテゴリイクラスについてのSAME/DIFF弁別が可能か否かをみる予定である.また,ヒトを被験者とする短期記憶課題でみられるような刺激タテゴリイによるProactive Interferenceと,カテゴリイ移行によるRelease from Proactive Interferenceがハトにおいてもみられるかを検討する.前年度は、サルで用いられたSerial-Probe-Recogrition(SPR)課題と同様のSAME/DIFFERENT弁別がスライド写真刺激を用いてハトにも適用しうることが確認された。また、試行間間隔を操作した保持テストでは、かなり長期的な記録がスライド写真に対して生じていることも明らかにされた。これらの知見に基づいて、本年度はハトが物理的には非常に複雑なスライド写真刺激のなにを手がかりにしてSAME/DIFFERENT弁別を行っているかについての基礎的検討を試みた。動物、風景、昆虫、人工物などのスライド120枚を用いて62年度と同様のgolno-go型のSAME/DIFFERENT継時弁別を行った。訓練完成の後、新しい90枚のスライド写真を用いて、それらをSAME試行で正立、左右逆転、上下逆転、左右・上下逆転の4条件で呈示した。正立SAME試行では新しいテスト刺激に対して訓練時と同様の低い反応率がみられたが、逆転SAME試行では比較的高い反応率が示され弁別比は低減した。テスト刺激を用いた訓練に伴って、逆転SAME試行での反応率は急速に低下し約40日で再び弁別は完成基準に達したが、上下逆転より左右逆転で反応率の低下は急速で、呈示角度による効果がみとめられた。尚、この訓練期間中、90枚のスライドから無作為に選ばれた18枚のスライド刺激は正立SAME試行またはDIFFERENT試行でのみ用いられ、逆転して呈示されたことはなかった。訓練完成の後、これら18枚のスライドを逆転SAME試行で初めて呈示し、弁別の転移をみた。左右、上下、左右・上下逆転による反応率の有意な差はなく、いずれも訓練期や正立SAME試行と同様の低い反応率が維持された。以上の結果から、ハトのスライド写真認知には比較的長期な記憶が介在し、また、ハトはスライド写真の部分的要素ではなく、まとまりのある全体としてのスライド写真をSAME/DIFFERENT弁別の手がかりとして用いていることが明らかに示された。
波動場を用いたアメーバ様運動モデルの理論構築と応用に関する基礎研究

本研究は細胞性粘菌アメーバの柔軟性の高い行動パターン(自在変形運動)をモデル化することを目的として,平成8年度からの2年間を通して,生物学的知見の整理,アメーバの運動様式の数理モデル展開,シミュレーション実験を用いたモデルの検証,アメーバ様運動機能の自動抽出システム制作,の順で実施し,以下の成果を得た.平成8年度において,アメーバ様運動モデルとシミュレータシステムの構築を行った.アメーバモデルの構成要素間の通信のために,波動の場(波動場)を導入しシミュレーションモデルを構築し,運動パターンの生成実験行った.これにより,さらに,平成9年度において細胞性粘菌アメーバは環境変動に応じて自己の形態を柔軟に変形させたり,単細胞状態と多細胞状態とを適応的に変化させるなどの機能を有する特徴的生物であることが知られている.本研究は,そのようなアメーバなどの軟体動物が狭路においてみせる柔軟性の高い行動パターン(自在変形運動)による自己組織的動作(障害物回避,物体把持など)を生成可能な方法論を開発し,その将来的発展性を検証することを目的としたものである.研究は,生物学的知見の整理,アメーバの運動様式の数理モデル展開,シミュレーション実験を用いたモデルの検証とシステム制作,の順で実施し,以下の成果を得た.1.アメーバ様の変形動作可能な構造体表現の包含する問題空間の明示,2.群情報処理メカニズムにおける研究マップの構築,3.相互通信を有する生物群行動モデルの理論的枠組み,4.計算機シミュレーションを行うための理論構築,5.アメーバ様運動シミュレータシステムの構築.さらに,特筆すべき成果として,数理展開の章ではアメーバモデルの構成要素間の通信のために,波動の場(波動場)を導入しシミュレーションモデルを構築し,運動パターンの生成実験を行った.これにより,6.波動場を用いた群情報メカニズムを構築し,その特性を明らかにし,「Distributed Autonomous Robotic Systems 2」において論文を公表.7.相互通信の結果生じる組織的運動の様相の問題と,全体の流動性と局所的組織の様相との関係の問題が明らかとなり,「Journal of Robotics and Mechatronics」において論文を公表.8.情報処理機能を確かめるために組み合わせ最適化問題のベンチマークテストであるTravelling Salesman Problemに応用し,アメーバモデルの解探索の性能を確かめ,「Intelligent Engineering System through Artificial Neural Networks」において論文を公表.本研究は細胞性粘菌アメーバの柔軟性の高い行動パターン(自在変形運動)をモデル化することを目的として,平成8年度からの2年間を通して,生物学的知見の整理,アメーバの運動様式の数理モデル展開,シミュレーション実験を用いたモデルの検証,アメーバ様運動機能の自動抽出システム制作,の順で実施し,以下の成果を得た.平成8年度において,アメーバ様運動モデルとシミュレータシステムの構築を行った.アメーバモデルの構成要素間の通信のために,波動の場(波動場)を導入しシミュレーションモデルを構築し,運動パターンの生成実験行った.これにより,さらに,平成9年度において
リン酸化ユビキチンとミトコンドリア機能障害に着目したパーキンソン病発症機構の解析

(1)作製済の高感度抗リン酸化ユビキチン抗体で免疫染色を行った。健常脳と比較してパーキンソン病患者脳では複数の部位において有意にリン酸化ユビキチンが蓄積しているかどうかについて、解析を進行中である。(2)行動解析および病理学的解析を通じて、ヒトパーキンソン病様の症状を呈するかどうか検討するために、POLGA遺伝子に変異をもつmutator/PARKINノックアウトマウスを作出した。年齢依存的に運動協調機能の低下とドパミンニューロンの脱落が生じるかどうかRota-rod試験と免疫染色法で調査している。1.パーキンソン病患者脳切片を用いたリン酸化ユビキチンの免疫染色パーキンソン病患者の剖検脳から作製した脳切片を使用し、抗リン酸化ユビキチン抗体で免疫染色を行った。パーキンソン病において、特徴的に神経細胞が変性・脱落する中脳黒質のみならず、他の脳部位においても、抗リン酸化ユビキチン抗体陽性の所見が観察された。神経細胞内のレビー小体の内部だけではなく、周囲にもリン酸化ユビキチンの集積が観察されたことが興味深い。現在、健常脳と比較して、リン酸化ユビキチンの蓄積が有意に高いかどうかを調べている。また、性別、年齢、脳部位、パーキンソン病の診断ステージに応じて細かく分類し、リン酸化ユビキチンの蓄積が孤発性パーキンソン病の診断マーカーのひとつとして利用できる可能性を検討する予定である。2.PARKINノックアウトマウスを用いたパーキンソン病疾患モデルマウスの作製と表現型解析mtDNAポリメラーゼ・ガンマ(以下、POLG)は、ヒトのミトコンドリアにおいて見出されている唯一のDNAポリメラーゼである。POLGの校正機能を触媒する部分に点変異を導入したmtDNA mutatorマウス(POLG D257A/D257A)は、mtDNAの変異が蓄積することで野生型よりも早く老化現象が出現することが報告されている。本年度、mtDNA mutatorマウスとPARKINノックアウトマウスを交配し、POLG D257A/D257A, PARKIN-/-マウスを作製した。現在、比較対照群となる野生型マウス、POLG D257A/D257Aマウス、PARKIN-/-マウスとともに、個体数を増やしながら、行動解析の準備を進めている。パーキンソン病の発症機構を根本から理解するためには、試験管内での実験のみならず、より生理的で複雑な条件下での検討が必須である。本研究では、パーキンソン病患者の脳切片やマウス個体を用いた解析を進めている。現時点において、抗リン酸化ユビキチン抗体による組織染色や、パーキンソン病疾患モデルマウスの作製が良好に進行している。1.パーキンソン病の脳神経細胞において、リン酸化ユビキチンの集積が認められた。しかしながら、リン酸化ユビキチンと結合している蛋白質についても解析する必要がある。そこで、抗リン酸化ユビキチン抗体に加え、抗ミトコンドリア抗体や、コントロールとして抗ユビキチン抗体などを用いた染色も同時に行うことで、今後より進展する結果が得られると考えている。2.mtDNA mutatorマウス(POLG D257A/D257A)の表現型が現れる時期は、生後約1年齢である。比較対照群を含めた4群の個体数を十分に増やしながら、体重測定や行動解析(pole test、ロータロッドテスト)を進めていく予定である。細胞生物学
短波長領域に光発色するフォトクロミック分子の開発

フォトクロミック色素をフルカラー表示材料に用いるには、室内光では容易に退色しない光安定な黄色に発色するフォトクロミック化合物が望まれる。本研究では、黄色に光発色する新たなフォトクロミック色素の合成とそのフォトクロミック挙動の解明を目的とし、1-オキサゾリル-2-ビニルシクロペンテン誘導体の合成を行い、これらのフォトクロミック挙動を検討した。フォトクロミック色素をフルカラー表示材料に用いるには、室内光では容易に退色しない光安定な黄色に発色するフォトクロミラク化合物が望まれる。本研究では、黄色に光発色する新たなフォトクロミック色素の合成とそのフォトクロミック挙動の解明を目的とし、1-オキサゾリル-2-ビニルシクロペンテン誘導体1aおよび2aの合成を行い、これらのフォトクロミック挙動を検討した。1-アリール-2-ビニルシクロペンテン誘導体は、分子のπ共役長が短いため紫外光照射により短波長領域の黄色から橙色の発色が報告されている。近年、オキサゾールをアリール部位にもつビスオキサゾリルエテンの着色体はビスチアゾリルエテン、ビスチエニルエテンのそれよりも短波長領域の光発色が確認されている。そこで、アリール部位にオキサゾール基を導入した1-オキサゾリル-2-ビニルシクロペンテン誘導体1aおよび2aの合成を行い、吸収スペクトル測定を行った。1aのヘキサン溶液に紫外光(300nm)を照射すると淡い黄色に着色し、その時の可視領域での吸収極大波長は395nmであった(図1)。チアゾールをアリール部位にもつ化合物3aの着色体と比較してオキサゾール基の導入で30nmの短波長シフトが観測された。しかし、1aおよび3aともに紫外光照射による光転換率は悪く可視光を照射しても元の吸収スペクトルに完全には戻らなかった。また、化合物2aのヘキサン溶液に紫外光(300nm)を照射すると淡い黄色に着色した。その時の極大吸収波長は395nmであり、化合物1と比較して20nmの長波長シフトが観測されたが、可視光を照射しても元には戻らない吸収スペクトル変化を示した。
無視不可能な欠測のあるカテゴリカルデータの解析

本年度は,制約のあるEMアルゴリズムとその応用について研究を行った.ここで言う制約とは,解析者の考えを等式の形で表現した制約式のことである.EMアルゴリズムは,欠測値や潜在変数が含まれた統計的モデルのパラメタ推定に用いられるアルゴリズムである.EMアルゴリズムによって,目的関数を単純に変形し,安定的・簡単にパラメタ推定を行うことができる.しかし,制約がある場合には,EMアルゴリズムはうまく働かないことが報告されている.特に離散分布に基づくモデルに対しては,制約がある場合にはEMアルゴリズムは,パラメタ空間に入ちない推定値を返したり,制約を満たさない推定値を返したりすることが多々ある.制約のあるEMアルゴリズムはこの問題に対処するための方法である.まず本アルゴリズムを,無視不可能な欠測のある2×2分割表における推定の問題に適用した.また,等式制約・等値制約のある潜在クラスモデルにおける推定問題にも適用した.これらは,多項分布と呼ばれる離散分布に基づくモデルである.前者の無視不可能な欠測の問題に対しては,本アルゴリズムだけでなく漸近分布についての研究も行っている.後者の潜在クラスモデルに対しては,本アルゴリズムを適用するだけでなくStep-halvingと呼ばれる方法を用いた.本アルゴリズムは,いわゆるCoordinate Cyclic methodであるため,更新幅を調節できず単調増加しない欠点があったが,Step-halvingを用いることにより,更新幅を調節し単調増加を達成することができた.今年度の研究は,無視できない欠測を持つ分割表における独立性の検定について行った.無視できない欠測とは,欠測する理由がその値に依存しているというものである.そしてこのような欠測は,典型的な場合として,分割表の形で得られる.そして分割表の形で得られたデータに対してもっとも頻繁に行われる検定が,独立性の検定である.ところが,無視できない欠測が存在する場合には,独立性の検定は,識別性(パラメータを正しく推定すること)が失われるために実行が不可能になる(Ma,Geng and Li,2003),本研究では,無視できない欠測が存在するときに,新たな仮定を設けることにより識別性を確保し,尤度比検定を行う場合の検出力への影響を調べた,まず,無視できない欠測を生じさせるメカニズムのうち分解可能(Lauritzen, 1996)と呼ばれる性質を持つものを選び出した.このメカニズムは,実際データに対してももっとも想定されうるものである.このメカニズムに基づき,欠測モデルを想定し,尤度比検定統計量を構成した.先にも述べたように独立性の仮定の下では,このモデルは想定されないので,解析者が前もって与えることにより識別性を確保するパラメタを想定した.この想定したパラメタを色々と変えることによる検出力に対する影響を調べるために計算方法を提唱し,数値実験を行った.その結果によると欠測メカニズムを正しく特定できている(パラメタを正しく入れる)ことが出来ていれば,欠測メカニズムを考慮した尤度比検定等計量は,欠測メカニズムを考慮しない統計量に比して高い検出力を持っていること,そして欠測メカニズムの特定の間違いの度合いが大きくなればなるほど,欠測メカニズムを考慮した尤度比検定等計量の検出力は下がっていき,最悪の場合には欠測メカニズムを考慮しない尤度比検定等計量よりも検出力が低くなる場合があるということである.本年度は,制約のあるEMアルゴリズムとその応用について研究を行った.ここで言う制約とは,解析者の考えを等式の形で表現した制約式のことである.EMアルゴリズムは,欠測値や潜在変数が含まれた統計的モデルのパラメタ推定に用いられるアルゴリズムである.EMアルゴリズムによって,目的関数を単純に変形し,安定的・簡単にパラメタ推定を行うことができる.しかし,制約がある場合には,EMアルゴリズムはうまく働かないことが報告されている.特に離散分布に基づくモデルに対しては,制約がある場合にはEMアルゴリズムは,パラメタ空間に入ちない推定値を返したり,制約を満たさない推定値を返したりすることが多々ある.制約のあるEMアルゴリズムはこの問題に対処するための方法である.まず本アルゴリズムを,無視不可能な欠測のある2×2分割表における推定の問題に適用した.また,等式制約・等値制約のある潜在クラスモデルにおける推定問題にも適用した.これらは,多項分布と呼ばれる離散分布に基づくモデルである.前者の無視不可能な欠測の問題に対しては,本アルゴリズムだけでなく漸近分布についての研究も行っている.後者の潜在クラスモデルに対しては,本アルゴリズムを適用するだけでなくStep-halvingと呼ばれる方法を用いた.本アルゴリズムは,いわゆるCoordinate Cyclic methodであるため,更新幅を調節できず単調増加しない欠点があったが,Step-halvingを用いることにより,更新幅を調節し単調増加を達成することができた.
肝癌におけるCTGFの意義の解明と新規治療の開発

前年度よりKras変異肝発癌モデルマウス(KrasG12Dマウス)おいて肝細胞特異的にCTGFを欠損させたマウスを作成を行っていた。本年度は8カ月齢における表現型解析を行ったところ、CTGFの欠損により肝癌の増大進展が抑制されることが明らかとなった。またKrasG12Dマウスに対しCTGFの中和抗体を投与した際の表現型について解析したところ、CTGF欠損マウスほどの肝癌抑制効果は得られなかったが、中和抗体の投与により腫瘍増大が抑制される傾向を認めた。これらの結果から、CTGFは肝癌の増大進展を促進していることが示された。またヒト肝癌切除検体において癌部でのCTGFの発現量と腫瘍背景因子との関連について検討した。前年度の検討において、CTGFは非癌部に比し癌部で高発現していることが明らかとなっていたが、本年度の検討によりCTGFを高発現する肝癌は臨床的悪性度の高い病変であることが明らかとなった。CTGFが肝癌の進展を促進する機序について細胞株を用いて検討した。前年度の検討により、肝癌細胞株のCTGFの発現を変化させても増殖能は変化しないことが明らかになっていたため、本年度は肝癌組織中に存在する肝星細胞による腫瘍間質反応に着目して検討した。その結果、CTGFを高発現する肝癌細胞株は肝星細胞と共培養/共接種すると増殖が促進されることが明らかとなった。その機序として、肝癌細胞の産生するCTGFが肝星細胞からIL-6等のサイトカインを分泌させ、肝癌細胞の増殖を促進することが明らかとなった。以上の検討により、前年度における検討と併せて、CTGFは肝癌細胞と肝星細胞の腫瘍間質反応に関与して肝癌の増大進展を促進する分子であることが示された。本研究内容は複数の学会にて発表するとともに、Cancer Research誌に論文発表を行った。細胞株を用いた解析においては、各種肝癌細胞株(HepG2, Huh7, HLF, Alex, Hep3B)においてCTGFの発現量を比較したところ、HepG2が最も高発現であり、Alexが最も低発現であった。そこでAlexに対しCTGFのリコンビナントタンパクを添加し、細胞増殖能の変化について検討したが、CTGFを添加しても増殖能に変化は認めなかった。さらにAlexに対しCTGF発現プラスミドを導入してCTGF強制発現株を作成した。強制発現株の増殖能についてin vitroおよびxenograftモデルを用いて検討したが、コントロール細胞と比較し差を認めなかった。またHepG2に対しsiRNAを用いてCTGFの発現を抑制したが、増殖能に変化は認めなかった。モデルマウスを用いた解析においては、交配により肝細胞特異的CTGF欠損KrasG12Dマウス(Alb-Cre KrasG12D CTGF fl/fl)を作成した。8か月齢での解析を予定しており、現在解析をすすめている。また3か月齢のKrasG12Dマウスに対してCTGF中和抗体の投与を開始しており、8か月齢での表現型について平成30年度に解析する予定である。また8か月齢時点において発癌を認めたKrasG12Dマウスに対しCTGF中和抗体を投与し、経時的にCTを撮像し腫瘍増殖を評価する予定としているが、交配によりKrasG12Dマウスの作成は完了しており、平成30年度に中和抗体の投与および解析を行う予定としている。臨床試料を用いた解析においては、ヒト肝細胞癌切除試料を用いて癌部・非癌部におけるCTGFの遺伝子発現を比較した。その結果癌部では非癌部に比しCTGFの発現が上昇しており、CTGFを高発現する肝癌は臨床的悪性度が高いことが明らかとなった。今後はCTGFの発現量と予後との関連について解析を進めていく予定としている。細胞株を用いた解析においては、各種肝癌細胞株においてCTGFの発現量を評価し、発現抑制や強制発現の実験系に用いる細胞を決定し、解析を開始した。CTGFの発現変化が細胞増殖に及ぼす影響については平成29年度にin vitroの検討、平成30年度にxenograftモデルで評価する予定としていたが、強制発現株の作成が順調に進んだため、xenograftモデルでの解析は平成29年度に前倒しして実施可能であった。ただしCTGFのshRNA導入細胞の作成は完了しておらず、平成30年度に引き続き継続する。モデルマウスを用いた解析においては、肝細胞特異的CTGF欠損KrasG12Dマウスおよび中和抗体投与予定のKrasG12Dマウスのいずれも作成済であり、平成29年度の予定は達成している。臨床試料を用いた解析においても、肝細胞癌切除検体の癌部・非癌部の遺伝子発現の評価は完了しおり、平成29年度の予定は達成している。

またヒト肝癌切除検体において癌部でのCTGFの発現量と腫瘍背景因子との関連について検討した。前年度の検討において、CTGFは非癌部に比し癌部で高発現していることが明らかとなっていたが、本年度の検討によりCTGFを高発現する肝癌は臨床的悪性度の高い病変であることが明らかとなった。CTGFが肝癌の進展を促進する機序について細胞株を用いて検討した。前年度の検討により、肝癌細胞株のCTGFの発現を変化させても増殖能は変化しないことが明らかになっていたため、本年度は肝癌組織中に存在する肝星細胞による腫瘍間質反応に着目して検討した。その結果、CTGFを高発現する肝癌細胞株は肝星細胞と共培養/共接種すると増殖が促進されることが明らかとなった。その機序として、肝癌細胞の産生するCTGFが肝星細胞からIL-6等のサイトカインを分泌させ、肝癌細胞の増殖を促進することが明らかとなった。以上の検討により、前年度における検討と併せて、CTGFは肝癌細胞と肝星細胞の腫瘍間質反応に関与して肝癌の増大進展を促進する分子であることが示された。本研究内容は複数の学会にて発表するとともに、Cancer Research誌に論文発表を行った。細胞株を用いた解析においては、CTGFが肝星細胞に及ぼす影響については未解析であるため、in vitroでの検討を行う。また平成29年度に作成した強制発現株を用いて肝星細胞と共培養・混合し、in vitroおよびxenograftモデルを用いて増殖能の変化について検討する。さらにHepG2にCTGF shRNAを導入し、肝星細胞との共培養・混合による増殖能の変化について検討する。また肝癌細胞と肝星細胞の共培養・混合下においてCTGF中和抗体を投与し、CTGF中和抗体が肝癌細胞と肝星細胞の腫瘍-間質反応に及ぼす影響について検討する。モデルマウスを用いた解析においては、肝細胞特異的CTGF欠損KrasG12Dマウスおよび中和抗体投与KrasG12Dマウスの表現型解析をすすめる。またCTGFが肝再生に及ぼす影響について検討するため、CTGF欠損マウスに対し部分肝切除モデルを行い、肝再生能の評価を行う。臨床試料を用いた解析においては、CTGFの発現量と肝切除術後の予後との関連について解析をすすめる。
新型核スピンメーザーの電気双極子モーメント測定への適用

標準理論を超える物理の明らかな証拠となる129Xe原子永久電気双極子モーメント(EDM)を高感度で探索するために、独自の方式による核スピンメーザーを開発し、その動作と周波数変動の調査・改良を行って、スピン歳差周波数の決定精度7.9 nHzを達成した。さらに磁場変動に起因する擬似信号を除去するため、参照スピン系である3Heを129Xeと混在させた2核種同時スピンメーザーを構築、異核種の同時偏極生成・維持およびスピン検出に関する詳細な調査・試行・改良を行なった。その結果この2核種同時メーザー発振に成功し、129Xe EDM探索のための装置及び手法的基盤が確立された。電気双極子モーメント(EDM)はCP変換に対する不変性を破っており、標準理論では観測にかからないほど小さい一方、標準理論を超えて提唱されている有力な理論の多くは、現在の測定限界からもう一歩で届く領域にEDMを予言する。したがって測定感度を上げた新たな実験手法の導入によって、標準理論を超える物理の明確な証拠を提示できる可能性がある。本研究は、外部フィードバックによるスピン歳差維持機構である新型核スピンメーザーを用いたEDMの計測技法を実体化し、^<129>Xe原子の高感度探索を実現することを目指す。平成21年度はメーザーの心臓部である^<129>Xeスピン歳差セルをポンピング部とメーザー部に分離したセル(ダブルセル)を設計・試作し内壁面コーティングを実施して、オプティカルポンピングによる偏極達成度の試験とそのためのAFP-NMR観測テストベンチ構築を行い、細い連結部を介しての偏極にもかかわらずシングルセルに劣らぬ偏極度、23.5%が得られることがわかった。今後さらに改良するために連結部の内径への依存性、セル内面の洗浄・コーティング法の改良、ポンピング光の強化等を進める。また磁気シールドに関してはシールド自体の磁化が認められたので磁化除去の方法を検討し実施して残留磁場の改善に成功した。今後はメーザー周波数の高角度計測のための信号処理系および計算機インターフェースの整備とポンピング光のシールド内導入法の検討等が必要である。低磁場で発振が可能な新しいタイプのスピンメーザーである光検出・外部フィードバック型核スピンメーザーを開発し、これを、核スピンの歳差計測が本質的な役割を果たす^<129>Xe原子の永久電気双極子モーメント(EDM)の高感度探索に応用することを目指している。平成22年度は高性能の^<129>Xeセルの作製に重要なセル焼き出し真空系においてターボ分子ポンプの更新とスクロール型ドライポンプの導入を行って真空度の改良を行い、セルを10^<-7>Torrの真空度で量産することが可能となった。スピンメーザーの発振に関しては任意波形発生器を導入してフィードバック信号処理系を整備した。またレーザー光導入部をファーバー化してメーザー装置と偏極度評価装置との間の切り替え使用を可能にした。さらに、メーザーによるスピン歳差周波数の観測データに関する解析手法を計算機シミュレーションにより検討し、観測時間塩の伸長とともに1/T_m^<3/2>から1/T_mの振る舞いに変わることが分かった。メーザー周波数の安定化のために緩急磁場の変動を精密に計測する必要がある。このための高感度磁場測定法として原理提案されている非線形磁気光学回転効果(NMOR)を用いた磁力計の開発を進めた。このため新たに電気炉を導入してルビジウム封入試料セルの作製装置の整備を行った。試料セルの内壁処理法、サイズ、封入バッファーガスの種類を変えて作成し、磁気光学回転シグナルの大きさ、Rbスピン緩和時間について試験を行なった結果、セル内壁を硝酸で洗浄」、パラフィン剤でコーティングすることにより緩和時間が長いセルが得られること、シールド内の残留横磁場成分が磁場測定地に幅をもたらすことが分かった。今後さらにセルの性能向上と残留磁場の除去、磁気光学回転シグナルにおけるノイズの抑制が重要な開発要素と考えられる。スピンメーザーはスピン歳差を無制限の長さの時間維持する機構である。本研究では、低磁場で発振が可能な新しいタイプのスピンメーザーである光検出・外部フィードバック型核スピンメーザーを開発し、これを核スピンの歳差計測が本質的な役割を果たす^<129>Xe原子の永久電気双極子モーメント(EDM)の高感度探索に応用することを目指している。平成23年度はメーザーセルの作製について、ターボ分子ポンプを強化して焼き出し中の真空度の改善を行うとともに、セル内壁の洗浄およびコーティングの方法を系統的に変えて多数のセルを作成し、偏極度及び緩和時間に対する最適条件を明らかにした。これによって恒常的に歳差信号の十分大きいセルを利用することが可能となった。

また、^<129>Xe核スピン偏極の源であるRb原子のスピン偏極度を、円偏光/直線偏光レーザー誘起蛍光強度比の測定から求める実験を行い、レーザー強度の増大によって偏極度のさらなる増強の余地があることを明らかにした。今後テーパーアンプの増強等によりこれを進める。高耐圧リレーを用いた電場印加・制御システムを構築しテストを行って、EDM測定セットアップの自動作動を実現した。スピン偏極Rb原子を用いた精密マグネトメトリのため、レーザー光に振幅変調をかけて、ストロボスコピックなNMOR観測から有限磁場でのNMOR測定を行う振幅変調NMOR装置を構築した。測定の結果、変調NMOR観測によって有限磁場30mGにおいて5mG/Hz^<1/2>の精度での磁場計測を実現した。スピンメーザーはスピン歳差を無制限の長さの時間維持する機構である。本研究では、低磁場で発振が可能な新しいタイプのスピンメーザーである光検出・外部フィードバック型核スピンメーザーを開発し、これを核スピンの歳差計測が本質的な役割を果たす129Xe原子の永久電気双極子モーメント(EDM)の高感度探索に応用する。前年度までの開発で、129Xeのメーザー発振の周波数精度に129Xeガス封入セルの温度変化に伴うRb原子の数密度変化が大きく影響することを明らかにし、これを抑制するためのダブルセル形状のガスセル開発を行ってきた。ダブルセル形状を採用することで、磁場の長期的な変動を抑制するための3He共存磁力計の本来の性能を発揮することが期待されるが、この新規形状では129Xeのメーザー発振が達成できているものの、3Heに対しては達成できていなかった。3HeではRbとのスピン交換率が低いため、発振において横偏極緩和時間が決定的な役割を担う。そこで、平成25年度は3Heの横偏極緩和時間を改善するために、磁場一様性の改善を実施した。横偏極緩和時間には測定環境の磁場の一様性が直接的に影響するため、大型三層磁気シールドを設計製作し、これまでの磁気シールドに比べて磁気遮断率にして10倍以上の改善を達成した。また、静磁場発生用コイルも新たに設計製作し、セル全体が磁場勾配にして5 μG/cm以内の範囲に収まる測定環境を得た。その結果、3Heの横緩和時間として2000秒以上を達成(従来よりも2桁以上の改善)した。その結果、3Heに対してもメーザー発振を行うことに成功した。これにより、3He共存磁力計を組み合わせた能動帰還型129Xe核スピンメーザーの本来の性能が発揮できるシステムが実現したことになり、目標とする1 nHzの周波数決定精度をめざし、未踏の領域の129XeのEDM測定への足がかりが得られた。本研究では、低磁場で発振が可能な新しいタイプのスピンメーザーである光検出・外部フィードバック型核スピンメーザーを開発し、これを核スピンの歳差計測が本質的な役割を果たす129Xe原子の永久電気双極子モーメント(EDM)の高感度探索に応用することを目指している。前年度までの開発で、129Xeのメーザー発振の周波数精度には129Xeガス封入セルの温度変化に伴うRb原子の数密度変化が大きく影響することが明らかになった。これは偏極Rbとの衝突シフトによって129Xeの周波数が変化するためである。
自由電子レーザー用分布帰還型導波路の研究

我々は、大電流誘導加速器とヘリカルウィグラーを組み合わせ、いわゆる自由電子レーザー(FEL)として用い、サブミリ波領域での自然放出光および超放射光を観測してきた。この放射光をスペクトル幅の狭いレーザーへと成長させるには、分布帰還(DFB)型導波路を用いるなどの工夫をする必要がある。本研究においてはこのDFB型導波路の(1)計算機シュミレーションによる解析、(2)光励起サブミリ波レーザーを用いての伝搬特性測定、(3)誘導加速器を用いたFEL装置への適用、を目指して研究を推進した。計算機シュミレーションに於いては、伝送線回路の立場から解析することにより、ピッチ数に等しい数だけ金属メッシュが並行に並ぶFabry-Perot型干渉計に対応づけて取り扱えることが判った。この結果、定性的にはスペクトル幅の先鋭化とレーザーとしての高出力化の条件は、DFBの単一周期構造の実効的反射率を小さくして全ピッチ数を増加させると良いことが明らかとなった。この結果をもとにピッチ0.40.8mm(0.1mm毎に変化可能)のブラッグ反射型導波路を設計試作し、その伝搬特性を波長430μmと450μmで同時発振させた光励起サブミリ波レーザーを用いて実験的に調べた。その結果ある条件のもとでは片方の波長のレーザーの透過率が他方より40%高くなることが判ったが、レーザー装置の度重なる故障の故、残念乍らモード測定にまでは至らなかった。一方この導波路をFEL装置に適用して回折格子ポリクロメーターで放射光を分光測定した結果、15GHzのスペクトルの先鋭化が測定されDFB導波路の有効性を実証することができた。今回は短形断面のDFB構造を持つ導波路についてのみ実験を行ったが、例えばネジ構造などのDFB導波路を用い、その分光特性の測定を通じFELに最適なDFB導波路が設計できるものと期待される。
内殻電子励起座標空間におけるカーボンsp混成制御

sp軌道混成に多様性を有するカーボン系新物質を電子励起を用いて合成できる非熱的ルートが存在することを実証する目的で、走査トンネル顕微鏡(STM)の金属探針を用いて、数eVまではトンネル電流によって、数eVから数百eVまでは電界放射によって、比較的低いエネルギーの電子線をSi(111)7×7表面上にMBE堆積したフラーレン(C_<60>)FCC単結晶膜試料に照射し、照射前後の構造を直接STM観察して電子励起の効果を調べた。その結果、サンプルバイアス電圧V_sと照射電流I_tによって、質的に異なる二種類の構造変化が起こることがわかった。比較的弱い励起条件V_s +5V I_t 0.3nAでは、隣接するC_<60>クラスタ間で光重合と同じ(2+2)シクロ重合が起こったと解釈できる回転凍結したクラスタ(P欠陥と命名)が時間とともに増加する。生成効率が場所に依存すること、Incubation時間が存在し飽和現象を示す事実は、圧縮応力サイトでの不均一核形成を強く示唆する。また、電流注入効果は注入点から10nm程度三次元的に広がることがわかった。いっぽう、強励起条件(V_s +5V,I_t0.3nA)では、巨大クラスタの生成もしくはアモルファス化が起こる。走査トンネル分光で測定した局所状態密度はC_<60>膜に比べHOMO-LUMOギャップの減少を示した。V_s=+310Vで起こるアモルファス化は、炭素の1s内殻励起のしきいエネルギーが290eVであることから、内殻励起を引き金に起こっていることが示唆される。しかし、V_s=+5+6Vの低バイアスでも、電流量が0.3nA以上になると、形態上は良く似たアモルファス化が起こり、内殻励起が本質的な役割をしているのかどうか明らかではない。P欠陥の形成と異なり注入電流に非線型に依存する兆候もあり、励起エネルギースペクトルの詳細測定も含めて、今後の課題である。
低分子量G蛋白質Rasの標的蛋白質RalGDSの生理機構の解析

低分子量G蛋白質Rasの標的蛋白質は、蛋白質リン酸化酵素RafやRalGDSをはじめ複数見出されており個々の標的蛋白質がそれぞれ固有の細胞内情報伝達経路を介して細胞機能を制御する。RalGDSは低分子量G蛋白質Ralに対するGDP/GTP交換反応促進蛋白質である。私共は、RalGDSがRafと協同的に遺伝子発現を促進することやRalを活性化することを見出していた。Ralは細胞膜と細胞内小胞に存在するため分泌に関与することが予想されていたが、Ralが制御する細胞機能は不明であった。Ralは下流のRalBP1、POB1にシグナルを伝達し、POB1がEps15やEpsinなどエンドサイトーシスを制御する蛋白質と結合することを明らかにした。そこで本研究では、RalGDSの下流のこれら分子の種々の変異体を培養細胞で発現させて、RalGDSを介するシグナル伝達経路がインスリンやEGF受容体のエンドサイトーシスに関与するか否かを解析した。培養細胞にドミナントアクティブ型Ralやドミナントネガティブ型Ral、膜移行不能型Ralを導入したところ、EGFやインスリン受容体のエンドサイトーシスが抑制された。したがって、これら受容体のエンドサイトーシスには、RalのGTP型とGDP型を変換することおよび翻訳後修飾を受けて細胞膜に局在することが重要であることが明らかになった。RalBP1のC末端側のRalやPOB1と結合する領域を発現させた細胞では、EGFやインスリン受容体のエンドサイトーシスが抑制された。したがって、Ras/RalGDSを介するシグナル伝達経路は、下流のRal/RalBP1/POB1を介してEGFやインスリン受容体のエンドサイトーシスの制御に関与することが明らかとなった。Rasに代表される低分子量G蛋白質は、細胞の増殖や分化など多彩な細胞機能を制御することが明らかになっている。Rasの標的蛋白質は、蛋白質リン酸化酵素RafやRalGDSをはじめ複数見出されており個々の標的蛋白質がそれぞれ固有の細胞内情報伝達系を介して細胞機能を制御することが明らかになりつつある。RalGDSは別種の低分子量G蛋白質Ralに対するGDP/GTP交換反応促進蛋白質である。Ralの生理機能は不明であったが、私共は、Rasのシグナルの一部がRalGDSを介してRalに伝えられることを見出した。私共はすでに、RalGDSが遺伝子発現を制御することを明らかにした。しかし、それ以外にRalGDSの機能が存在するか否かは不明である。本研究では、これまでに知られていなかったRalGDSの新しい生理機能を明らかにすることを目的としている。RasからRalGDSを介して別種の低分子量G蛋白質Ralヘシグナルが伝達される際に、RalGDSは細胞質から細胞膜に移行することが報告されている。Ralは細胞膜と細胞内小胞に存在するため分泌に関与することが予想されていたが、Ralの機能は不明であった。そこで、培養細胞にドミナントアクティブ型Ralやドミナントネガティブ型Ralを導入したところ、EGFやインスリンの受容体のエンドサイトーシスが抑制された。したがって、Ralは受容体のエンドサイトーシスに関与していることが明らかとなった。私共は、EGF刺激によってRas依存性にRalGDS/Ralが活性化することを見出しているので、Ras/RalGDS/Ralを介するシグナル伝達系がEGF依存性の受容体のエンドサイトーシスを制御する可能性が示唆された。