hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

耐熱性酵は単に熱安定性に優れているだけではなく、プロテアーゼによる分解などの生物的な作用も受けにくいことから、センサーやバイオリアクターにおける安定な機能素子として利用されている。われわれは、基質特異性は異なるが同種の反応を触媒する、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンの各脱水素刻素を種々の好熱菌より単離し、それぞれの一次構造を決定するとともに、これまでに立体構造が決定された各種のNAD(P)依存脱水素酵素との構造比較から、これら3種のアミノ素脱水素酵素には、NAD(P)を結合し、ヒドリドイオンを転移し、酸化還元反応を行う場である触媒性ドメインと、アミノ酸の構造を認識し、これを結合して反応を行う基質結合ドメインの2つの部分から構成されることを示した。このうち後者については、基質認識を行っているいわば調節性のドメインとして機能していることを明らかにした。耐熱性酵素の各ドメインは常温菌由来の酵素のそれに比べて機能的、構造的に強い狭立性を持っていること、さらに、耐熱性酵素においては、各ドメインの独立性が高いため、調節性ドメインに何らかの修飾を加えてもヒドリドイオンの転移という酵素の触媒作用には障害を与えないことを想定し、耐熱性ロイシン脱水素酵素の機能性ドメインにフェニルアラニン脱水素酵の調節性ドメインを結合したキメラタンパク質を作成し、ロイシン脱水素酵素からフェニルアラニン脱水素酵素への変換の有無を検討し、このドメインの構造と機能と関連を検討した。これら一連の研究によって、耐熱声酵素の各ドメインをタンパク質工学の手法を用いて改変し、入れ換えることによって、複合的な機能を持つ素子としての新しい耐熱性酵素を作出できることをはじめて実証した。
短波長自由電子レーザーを用いた光解離性分子の時間分解分光

平成30年度は、X線自由電子レーザー施設SACLAの硬X線ビームラインBL3において、X線照射で誘起される超高速分子解離を観測した。重元素を含む分子にX線を照射すると、重元素サイトで選択的にX線吸収が起こり、オージェ過程による価数上昇、分子内での電荷再分配の後、多価になった分子がクーロン反発力により激しく解離する。一連の過程を解明するため、本研究では、放出される複数の原子イオンを、運動量多重計測装置により同時計測した。また、運動量相関から単一の分子から放出されたイオンの組合わせを抽出した。X線をポンプ光、近赤外光をプローブ光としたポンプ・プローブ計測により、フェムト秒オーダーの時間分解運動量相関計測に成功した。ジヨードメタン分子を標的試料とした実験からは、最終生成物であるイオン収量の時間依存性から、X線誘起により起こる過程の過渡励起状態の時間変化を抽出する解析法を考案した。2種類の重元素を含むブロモヨードメタン分子を標的試料とした実験からは、ヨウ素原子サイトで選択的にX線吸収を起こし、ヨウ素原子イオンと臭素原子イオンとで異なる時間依存性を観測した。この結果から、分子内での電荷移動に関する情報が得られると考えられる。期間全体を通じて、自由電子レーザーと光学レーザーという異なる光源を組み合わせたポンプ・プローブ計測を実施する手法を確立した。また、国内外の放射光施設等での実験により、自由電子レーザー施設で用いる試料や観測する過程を選定することで、限られた自由電子レーザーのビームタイムを効率よく運用することが出来た。東北大で所有する近赤外フェムト秒光学レーザーパルスを2分割して用いるポンプ・プローブ計測を、重元素を含むいくつかの分子に対して行った。実験では、レーザーパルス照射によって放出される分子イオンや原子イオンの収量を、2つのレーザーパルスが標的に到達する時間差(遅延時間)の関数として計測した。ジヨードメタン分子を標的分子とした際に、ヨウ素分子イオンの収量が遅延時間に対して振動することを見出した。このことは1つ目のレーザーパルスによって分子の変角振動を誘起していることを示唆している。この現象を最も観測しやすいポンプレーザーの条件を検討し、X線自由電子レーザー(XFEL)施設SACLAにおいて近赤外レーザーとXFELとによるポンプ・プローブ計測を実施した。SACLAでの実験では分子はバラバラに解離し、一つの分子から複数の原子イオンが放出され、炭素原子イオンやヨウ素原子イオンは多重にイオン化する。複数のイオンの収量および運動量を同時に計測しイオン種によって異なる遅延時間依存性を見出した。さらに詳細に解析し、複数のイオンの運動量の相関を抽出することで、分子が変形していく様子や、分子内で電荷が移動する様子を観測することが出来ると期待される。さらに、重元素を含む分子の次の標的試料を探索するため、重元素を含むクラスターの荷電粒子運動量多重同時計測実験を、大型放射光施設SPring-8の軟X線ビームラインで行った。当初計画では平成27年度はFELを用いた時間分解測定に先立ち、放射光を用いた定常状態測定を行う予定であったが、実験室光源を用いた予備測定により、FELを用いた時間分解測定の目途を付け、実施することが出来た為。また、放射光を用いて、新たな標的試料を探索することもできた為。X線自由電子レーザー施設SACLAの軟X線ビームラインBL1において、重元素であるキセノン原子、および重元素を含む分子であるジヨードメタンに自由電子レーザーを集光して照射し、放出されるイオンの収量と3次元運動量を計測した。さらに、近赤外レーザーも同時に照射し、2色レーザー照射によるイオン収量や運動量の変化を捉えることを試みた。キセノン原子を試料とした実験では、2色のレーザーを同時に試料に照射し、空間的なオーバーラップを容易に実現する手法を開発した。また、自由電子レーザー照射後に近赤外レーザーが照射された場合のみに起こる現象を捉えることに成功し、その立ち上がり時間から自由電子レーザーを利用したポンプ・プローブ実験ではカギとなる時間原点の決定手法の開発に成功した。これらの成果は、本課題で目標とする、ポンプ・プローブ計測による分子形状と電子状態の変化と相関を捉えることを達成するために必要な技術開発である。ジヨードメタン分子を標的とした実験では、一つの複数のイオンが運動量を持って放出され、それらの運動量は相関を持つ。これらの解析は現在進行中である。また、平成27年度に放射光を用いて実施した重元素を含むクラスターの荷電粒子多重同時計測実験による結果を、平成28年度に学術論文としてまとめ、公表した。さらに、平成27年度にSACLAの硬X線ビームラインBL3で実施したジヨードメタン分子へのX線自由電子レーザー照射実験の成果を、平成28年度にまとめ、学術雑誌に投稿中である。本課題ではポンプ・プローブ計測による分子形状と電子状態の変化と相関を捉えることが目標であるが、本課題の遂行に必要な技術開発が整ってきたため。また平成29年7月にビームタイムを取得することもでき、平成29年度も継続して自由電子レーザー利用研究を推進できる見込みであるため。X線自由電子レーザー施設SACLAの軟X線ビームラインBL1において、重元素を含む分子であるジヨードメタン分子を標的試料として、近赤外光学レーザーをポンプ光、軟X線自由電子レーザーをプローブ光とするポンプ・プローブ計測を実施した。平成28年度に実施した予備的な測定の問題点を明らかにし、2色のレーザーの空間的・時間的なオーバーラップを実現する手法を確立した。

2色のレーザーの遅延時間数か所においてイオン運動量太夫同時計測を実施し、単一のジヨードメタン分子から放出される2つのヨウ素原子イオン間の運動量相関を抽出することに成功した。現在、運動量相関の遅延時間依存性と、炭素原子イオンを含めた3体の運動量相関を抽出する解析を進行中である。また、大型放射光施設SPring-8の軟X線ビームラインBL17SUにおいて、ジヨードメタン分子を標的試料とした電子・イオン運動量多重同時計測実験を実施した。単一のジヨードメタン分子から放出される5つのイオン(プロトン×2+ヨウ素原子イオン×2+炭素原子イオン)の運動量相関の抽出に成功した、さらに、電子の運動量との相関の抽出にも成功した。同じく、SPring-8のBL17SUにおいて、半球型電子エネルギー分析器を用いた高分解能電子スペクトルの測定を実施し、電子状態に関する知見を得た。さらに、平成27年度にSACLAの硬X線ビームラインで実施したジヨードメタン分子へのX線自由電子レーザー照射実験の成果を学術雑誌にて出版し、さらにポンプ・プローブ計測の成果を投稿準備中である。本課題ではポンプ・プローブ計測による分子形状や電子状態の変化とそれらの相関を捉えることが目標である。平成29年度に実施した実験により、ジヨードメタン分子を標的としたポンプ・プローブ計測に成功したが、医師の診断により、平成29年10月から平成29年12月まで病気休暇となった。平成30年1月から研究を再開したが、データ解析を終えることが出来なかったため。平成30年度は、X線自由電子レーザー施設SACLAの硬X線ビームラインBL3において、X線照射で誘起される超高速分子解離を観測した。重元素を含む分子にX線を照射すると、重元素サイトで選択的にX線吸収が起こり、オージェ過程による価数上昇、分子内での電荷再分配の後、多価になった分子がクーロン反発力により激しく解離する。一連の過程を解明するため、本研究では、放出される複数の原子イオンを、運動量多重計測装置により同時計測した。また、運動量相関から単一の分子から放出されたイオンの組合わせを抽出した。X線をポンプ光、近赤外光をプローブ光としたポンプ・プローブ計測により、フェムト秒オーダーの時間分解運動量相関計測に成功した。ジヨードメタン分子を標的試料とした実験からは、最終生成物であるイオン収量の時間依存性から、X線誘起により起こる過程の過渡励起状態の時間変化を抽出する解析法を考案した。2種類の重元素を含むブロモヨードメタン分子を標的試料とした実験からは、ヨウ素原子サイトで選択的にX線吸収を起こし、ヨウ素原子イオンと臭素原子イオンとで異なる時間依存性を観測した。この結果から、分子内での電荷移動に関する情報が得られると考えられる。期間全体を通じて、自由電子レーザーと光学レーザーという異なる光源を組み合わせたポンプ・プローブ計測を実施する手法を確立した。また、国内外の放射光施設等での実験により、自由電子レーザー施設で用いる試料や観測する過程を選定することで、限られた自由電子レーザーのビームタイムを効率よく運用することが出来た。
マイクロバイオシステムによる微生物セルロースの階層構造を利用したハイブリッド化

昨年度に引き続き、マイクロバイオエンジニアリングシステム(MBES)を用い、連続的なフロー下で酢酸菌を培養するための諸条件の検討を行い、生成するバクテリアセルロースのミクロフィブリルサイズをコントロールするための因子の検討を系統的に、詳細に行った。また、高効率に酢酸菌の活性化を制御するため、所定の濃度でリン酸緩衝液中に分散させる方法を開発した。これらをベースに、蛍光増白剤やカルボキシメチルセルロースナトリウム塩などとのハイブリッド化についてもこのMBESを用いて、連続的に行う方法が開拓された。一方、ナノハイブリッド化を系統的に行うためには、バクテリアセルロースの階層構造形成を明らかにすることも重要である。この点についても前年度に引き続いて、バクテリアセルロースの生合成後の基本集合体であるサブエレメンタリーフィブリル(SEF)の構造と分子運動性について検討を行った。特に、今年度は^<13>Cエンリッチされたグルコースを通常のグルコースに10%添加して培養を行い、^<13>CエンリッチされたSEFを作製し、この試料について固体^<13>C NMR解析を行った。^<13>Cスピン-格子緩和時間の測定からは、側鎖はもちろん主鎖も著しく高い分子運動性をもつことが明らかになった。また、magic angle turning(MAT)法により、^<13>C化学シフト異方性(CSA)を測定した結果、各13C核のCSAが明瞭に観測可能なこと、主鎖は一軸配向状態で、この配向軸の周りで速い揺動運動を行っていることなどの重要な分子運動についての情報が明らかになった。これらの結果と、別途行っているセルロースの構造形成過程に関する分子動力学計算とを組み合わせ、セルロース系の新しい分子ハイブリッド化を開拓していく予定である。平成15年度から、検討していたマイクロバイオエンジニアリングシステム(MBES)が順調に稼動しはじめ、予備的なデータが出始めている。このMBESは、酢酸菌の培養を従来のようにマイヤーなどの中でバッチで行うのではなく、連続的に、高効率でバクテリアセルロースを生産できる。このシステムをナノハイブリッド化に利用するため、まず菌体を活性化したのち、リン酸媛衝液で置換する条件、置換後4°Cにおける保存時間の再活性化に対する影響、さらにリン酸緩衝液の凍結保存の影響などを明らかにした。一方、ナノハイブリッド化を系統的に行うため、まず、バクテリアセルロースの階層構造形成の基本構造単位であるサブエレメンタリーフィブリル(SEF)を蛍光増白剤を用いた培養を行うことにより、単離して、その構造を固体^<13>C NMR法により精密に解析した。その結果、SEFの各分子鎖のCH_2OH側鎖は、天然セルロース結晶のようにtrans-gauche(t-g)コンホメーションを取らず、g-tおよびg-g間で速い交換を行っていること、したがってO6-O5間の分子内水素結合は形成されておらず、液晶のような状態にあることを明らかにした。この結果に基づき、SEFの凝集により、O6-O5間の分子間水素結合と側鎖のt-gコンホメーションの形成により結晶核が生成すること、また分子鎖軸に沿った多重核の生成とその成長により、天然セルロースでも結晶-非晶からなる繰り返し構造が生成することを指摘した。今後は、このような階層構造を利用したナノハイブリッド化をMBESを利用して検討する。
歯周病原性細菌に対する16S rRNA特異プローブの開発

歯周疾患の発症・進展を研究する上で,歯周病原性細菌の生体からの検出は非常に重要である。本研究の目的は,原核細胞固有の16S rRNAに着目し,その遺伝情報を用いた歯周病原性細菌に対する特異的かつ精度の高い検出法の確立を目指すことである。歯周疾患の病態と細菌叢との関連性の検討を行い,歯周病原性細菌の代表的菌種であるPorphyro-monas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitansを標的細菌として用いた。1.遺伝子情報の収集ならびに解析代表的な口腔細菌14菌種を含む68菌種に対する16SrRNAの遺伝子配列を収集し,遺伝子解析ソフトGeneworksによりアラインメント,ホモロジー解析を行った。この解析結果に基づき50-merのoligonucleotide probeの設計,作製を行った。Hybridization温度,washing温度の検討により,特異性の高い条件を決定した。3.プローブの特異性遺伝子系統樹で近縁に位置する9菌種との交差反応性を検討し,交差反応のほとんど認められないHybridization反応結果であった。歯周疾患の発症進展を研究する上で,歯周病原性細菌の生体からの検出は非常に重要である。本研究の目的は,原核細胞固有の16S rRNA配列を用いて,歯周病原性細菌に対して特異的かつより精度の高い検出法の確立を目指すことである。平成13年度は,16S rRNAの遺伝子情報を収集し,歯周病原性細菌に対する特異的なPCR用のプライマーならびにin situ hybridizationのためのオリゴヌクレオチドプローブを設計する。遺伝子のデータベースであるEMBLを用いて,Porphylomonas gingivalisやActinobacillus actinomycetemcomitans等の代表的な口腔細菌14菌種を含む68菌種に対する16SrRNAの遺伝子配列を収集した。遺伝子解析ソフトのジーンワークスによりアラインメントを行い,収集した遺伝子配列のホモロジー検索を行い,遺伝子的系統樹を作成した。その結果に基づき,P.gingivalis ATCC33277株ならびにA. actinomycetemcomitansY4株に対して上下流のprimerならびにin situ hybridizationによる検出のためのプローブに適する配列を抽出した。さらに,DNAsysを用いて20merのサイズのprimerの設計と性状のチェック行った。In situ hybridizationのためには50merのオリゴヌクレオチドを設計した。P. gingivalis ATCC33277株に対して設計した上流2個,下流2個のprimerを用いてPCR反応を行い,primerの特異性を調べた。その中の上下流1組が非常に特異性が高く,目的の配列のみのバンドを確認した。現在は,in situ hybridization用に作成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて,fluorescence in situ hybridization(FISH法)反応の検討を行っており,プローブのDIG標識による検出感度の増加を調べ,フルオレッセインやローダミン等の蛍光色素による反応性の違いを蛍光顕微鏡観察により検討している。歯周疾患の発症・進展を研究する上で,歯同病原性細菌を特異的に生体から検出することは非常に重要である。本研究の目的は、原核細胞に固有の16S rRNA配列を用いて,歯周病原性細菌に対する特異的かつより精度の高い検出法の確立を目指すことである。平成13年度に口腔細菌14菌種を含む68菌種に対する16S rRNAの遺伝子情報を収集し,Porphylomonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcomitansに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを作製した。平成14年は,この特異的なプローブを用いたFluorescent in situ hybridization法による標的細菌の検出を行い,作製したプローブの特異性の検討を行った。遺伝子解析により抽出されたP. gingivalis ATCC33277とA. actinomycetemcomitansY4に特異的な配列に基づきジゴキシゲニン(DIG)標識のオリゴヌクレオチド(50mer)を合成した。対象菌株は,P. gingivalis 2株,Prevotella 4株,A. actinomycetemcomitans 3株,Fusobacterium nucleatum 1株の計10株の標準菌を用いた。これらの菌株をスライドグラス上に固定し,エタノール系列に浸漬し風乾した。この標本にDIG標識オリゴヌクレオチドプローブを作用させ,ハイブリダイゼーションを行った。

さらにFITC標識抗DIG抗体と反応後,洗浄,風乾した。蛍光色素封入剤で封入後,落射型蛍光顕微鏡(オリンパス)を使用して観察を行った。その結果,P. gingivalis ATCC33277とA. actinomycetemcomitansY4のDNAプローブはいずれも標的細菌の菌体1細胞の検出が可能であった。P. gingivalisプローブは近縁関係のPrevotella菌種との交差反応もほとんど認められず,特異性の高い高感度な検出が可能であることが示唆された。さらに,F. nucleatumとの混合液からの標的細菌の検出像では,標的細菌のみが検出されており,細菌叢からの標的細菌の検出でも特異的な検出が可能であることが示唆された。歯周疾患の発症・進展をする上で,歯周病原性細菌を特異的に生体から検出することは非常に重要である。本研究の目的は,原核細胞に固有の16SrRNA配列を用いて,歯周病原性細菌に対する特異的かつより精度の高い検出方法の確立を目指すことである・平成13年度に口腔細菌14菌種を含む68菌種に対する16SrRNAの遺伝子情報からPorphyromonas gingivalis (Pg)とActinobacillusactinomycetem comitans (Aa)に対する特有の配列を分析し,その配列に基づいた特異的プローブを作製した。平成14年度にはこの特異的プローブを用いたFluorescent in situhybridization (FISH)法の反応条件の検討を行い,特異性の高い反応条件の確立を行った。最終年度である平成15年度は,作製したPgおよびAaに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて口腔内細菌叢からの標的細菌のFISH法による検出を試みた。被験者の歯肉縁下細菌をペーパーポイントを使用して採取し,Ringer液に懸濁した。菌液に4%パラフォルムアルデヒドを加えて固定後,スライドグラス上に滴下し,風乾固定を行った。この菌体塗抹標本を450CでDIG標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを行い,FITC標識DIG抗体と室温にて二次反応を行った。30°Cで洗浄液による洗浄を行い,滅菌水で短時間スライドを洗い流して風乾し蛍光封入剤で封入した。Olympus落射型蛍光顕微鏡で検鏡した。その結果,菌叢から標的細菌の検出が可能であった。また,標的細菌の良好な蛍光像が得られた。以上の所見より,本研究で設計したプローブの特異性が実証された。
有機微粒子を用いた水素発生光触媒系の開発

SWCNTsのベンゼン分散液にパルスレーザー光を照射すると効率的に水素が発生し、2時間のレーザー光照射における発生量は100 μmolに達した。初期の水素発生速度はレーザー光強度の4乗に比例し水素発生の量子収率は最大130%と非常に高い値を観測した。次に、リチウムイオン内包フラーレンの水分散液に、窒素雰囲気下パルスレーザー光を照射することで、平均30 nmの大きさにナノ粒子化した高分散水溶液が得られた。酸素飽和重水溶液中、このナノ粒子の一重項酸素生成の量子収率は55%に達した。以上の結果より、ナノカーボンをレーザー光で高分散化させることによって、新しい機能が創出されることを見いだした。1.カーボンナノチューブを光触媒とする水素発生反応SWCNTsのベンゼン分散液にパルスレーザー光を照射すると効率的に水素が発生し、2時間のレーザー光照射における発生量は100 μmolに達した。また、反応溶液のGC-MS、HPLC分析によりビフェニルおよびターフェニルの生成が確認され、同時に水素が生成していることが分かった。初期の水素発生速度はレーザー光強度の4乗に比例し、4光子が関与する反応であることがわかった。また、82 mJ per pulseのレーザー光強度における水素発生の量子収率は130%となった。水素発生のメカニズムは次のように考えられる。カーボンナノチューブが2光子吸収により励起され、この励起状態がベンゼンを1電子還元する。生じたベンゼンラジカルアニオンは2分子でダイマー化し水素発生を伴いながらビフェニルのジアニオンを生成する。このジアニオンが再びベンゼンを還元し、生成したラジカルアニオン同士のカップリングによりさらに水素が発生する。このようなサイクルが連鎖的に起こることにより量論量以上の水素が発生し、量子収率が100%を越えたと考えられる。また、本水素発生系では2光子励起で生成するベンゼンラジカルアニオンを2分子必要とするため合計4光子が必要になる。2.レーザーパルス光照射により高分散化されたリチウムイオン内包フラーレンナノ粒子を用いた水中一重項酸素生成リチウムイオン内包フラーレン(Li+@C60)の水分散液に、窒素雰囲気下パルスレーザー光(λ= 355 nm)を照射することで、平均30 nmの大きさにナノ粒子化した高分散水溶液が得られた。酸素飽和重水溶液中、このナノ粒子(Li+@C60)nの一重項酸素生成の量子収率は55%に達した。また、(Li+@C60)nとpBR322 DNAを含むバッファー溶液(pH 8.0)に光照射(λ> 380 nm)を行った後、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、一重項酸素により切断されたDNAが検出された。また、82 mJ/pulseのレーザー光強度における水素発生の量子収率は130%となった。2.ピレンを有機光触媒前駆体とする水素発生反応ピレンのシクロヘキサン溶液にパルスレーザー光を照射するとピレン分子が凝集した微粒子が生成した。90分のレーザー光照射後の粒子径は1100 nmに成長することがわかった。さらに、紫外可視吸収スペクトルの変化、溶液のTEM画像測定からも粒子の生成が確認できた。また、微粒子の生成に伴い水素が触媒的に発生し、7時間のレーザー光照射による水素の発生量は250 μmolとなり、仕込みピレン基準のターンオーバー数は2000、水素発生の量子収率は7.9%であった。3.レーザーパルス光照射により高分散化されたリチウムイオン内包フラーレンナノ粒子を用いた水中一重項酸素生成リチウムイオン内包フラーレン(Li+@C60)の水分散液に、窒素雰囲気下パルスレーザー光を照射することで、平均30 nmの大きさにナノ粒子化した高分散水溶液が得られた。また、(Li+@C60)nとpBR322 DNAを含むバッファー溶液(pH 8.0)に光照射を行った後、アガロースゲル電気泳動を行った。レーザー光照射下、有機微粒子の作成がカーボンナノチューブやフラーレンで効率よく起こることが見いだされたので、一気に研究が進んだ。

カーボンナノチューブ微粒子は非常に効率の良い水素発生触媒、フラーレンナノ微粒子は一重項酸素発生触媒となることを発見し、それぞれ、各種分光学的測定によって、反応機構の詳細について調べることができた。その成果が学術論文2編に投稿し、すでに受理または掲載されている。これまでの水素発生触媒系では、金属錯体などの触媒が必要であったが、本発明はメタルフリーの条件で行うことが可能であるのでグリーンケミストリーの観点からも優れている。また、これまでに知られている光触媒系では、プロトンを還元するために電子源として酸化的犠牲剤(アスコルビン酸やアミンなど)が、水素発生量と等モル量またはそれ以上必要であったが、本触媒系では、全くそのような物質を必要とせず、溶媒を水素源として利用できる点が従来の水素発生触媒系に比べ格段に優れている。また有機ナノ微粒子を光触媒として利用した系は、本研究が初めてであり、さらに興味深いことは、微粒子かすることで元々の有機化合物の有する反応性以上の触媒反応活性を起こすことが可能となることである。無機半導体などを用いたケミストリーが、無機ナノ粒子化したことで、爆発的に飛躍したのと同じように、今後、この研究をベースとした学術領域が飛躍的に拡がると確信する。有機光触媒酸素発生触媒との組み合わせによる水の完全分解水中水素発生系が構築できたので、酸素発生触媒と組み合わせ、水の光分解について検討を行う。ナノ粒子中に発生する電子はプロトンの還元に利用され水素を発生するが、ホールは酸素発生触媒に移すことで水の完全分解が可能となる。Pyラジカルカチオンの一電子還元電位1.2 V vsSCE程度と予想され、これは水の酸化触媒として知られているルテニウムポリオキソメタレート錯体RuIIIPOM ([RuIII(H2O)GeW11O39)の酸化電位(1.0 V vs SCE)よりも高いので、RuIIIPOMから電子を取り出し、高原子価RuIV=O種の生成が可能であると考えられる。これまでの研究によって高原子価RuIV=O種(RuV(=O)POM)できれば非常に効率よく、水を酸素に酸化することができることが分かっているが(J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 11605)、犠牲的酸化剤である[CoIII(NH3)5Cl]2ーが必要であった。本研究で提案する光触媒系では、犠牲剤が不要となり2H2O →2H2 + O2の反応量論式で光触媒反応が進行する。水素は次世代燃料として最近注目されていることから、挑戦の価値は十分にある。また、水の酸化触媒は、RuIIIPOM以外にも様々なものが知られているので、それらの中から最適な触媒を探索するとともに、より活性の高い触媒系への最適化を行う。当初予定していた、色素分子の有機合成が、市販品で代用が可能になったために大幅にコストを削減することができた。平成26年度でコストカットできた余剰金を使って、高価な金属触媒などの購入に充てることによって、本研究を加速度的に進展させたいと考えている
輝尽性蛍光体中に深く捕獲された電子を利用したワイドダイナミックレンジ線量計の開発

放射線の過照射により、BaFBr(I): Eu2+輝尽性蛍光体中の深い準位に電子が捕獲される。この電子を読み取ることにより大線量計としての開発を行った。捕獲準位を調べた結果、特定の波長にピークを持つこと、波長のピーク高さは照射線量に依存することがわかった。ピーク高さはX線による照射35. 0 Gyまで上昇していた。この電子は、UV光を光源として固有の波長で選択的に励起後、630nmのレーザー光で読み出せる。イメージングプレート(IP)などとして汎用されているBaFBr(I):Eu^<2+>輝尽性蛍光体では、ミリグレイ以上の比較的高い線量のX線を照射した試料や繰り返し使用した試料に、白色可視光を長時間照射しても、潜像が消去されずに600nm近傍の励起光で読み出されてくる現象(以下「消去不全現象」といい、観察される光を「消去不全光」というが生じる。これらの試料では、従来の読み取りに用いられている600nm付近の電子以外に短波長側の深い準位に捕獲された電子が存在し、これが消去不全光の原因となっていると考えられる。これらの電子を利用することで、大線量側にダイナミッタレンジを数桁拡大した線量計として開発することを目的として、本年度は以下の項目を実施し、それぞれ成果を得た。1.消去不全光がPSLであることの検証2.輝尽性蛍光体中に深く捕獲された電子及びその励起-PSL発光モデルの考案これまでの研究成果と本結果を総合し、X線照射後のIPにおいて600nm付近の捕獲電子及び短波長領域に深く捕獲されている電子とその励起モデルを考案した。3.IPにおける短波長領域電子捕獲準位(波長)の特定短波長側の準位に捕獲されている電子を利用するためには、どの準位(波長)に捕獲されているのかを正確に特定する必要がある。そこで、UV光を分光して消去不全光を生じているIP試料を励起することにより、波長の特定を行った。その結果、ガンマ線を高感度に検出するBAS-MSタイプのIPでは、320nm付近にそのピークがあると特定することができた。また、これまでの研究でBAS-TRでは短波長側の電子捕獲部位は290nm付近にあると考えてきたが、BAS-MSとBAS-TRては、電子が捕獲されている部位(バンドギャップにおける深さ)が異なることがわかった。BaFBr(I):Eu2+輝尽性蛍光体では、ミリグレイ以上の比較的高い線量のX線を照射した試料や繰り返し使用した試料に、白色可視光を長時間照射しても、潜像が消去されずに600nm近傍の励起光で読み出されてくる現象(以下「消去不全現象」といい、観察される光を「消去不全光」という)が生じる。本研究の目的は、これらの電子を利用することで、大線量側にダイナミックレンジを数桁拡大した線量計として開発することである。これまでの研究で、消去不全光がPSL(輝尽発光,Photo-Stimulated Luminescence)であることを検証したうえで、蛍光体中に深く捕獲された電子及びその励起-PSL発光モデルの考案を行なった。短波長側の準位に捕獲されている電子を利用するためには、どの準位(波長)に捕獲されているのかを正確に特定する必要がある。本年度はいく種類かの汎用プレートにおける短波長領域電子捕獲準位の特定と.その励起について検討した。UV光を分光して消去不全光を生じている蛍光体試料を励起することにより、波長の特定を行った。BaFBr組成蛍光体の汎用されている代表的な3種Agfa,Kodak及びFujiについて調べた結果、Agfa,Kodakではいずれも324nmに、またFujiでは320nmに大きなピークをもつことが示された。これ以外に、Agfaでは、345,375及び420nmに、また、Kodakでは345nmに、Fujiでは345,380nmに小さなピークをもつ。さらに、いずれのプレートにおいても、それぞれの波長のピークの大きさは照射線量に依存していることがわかった。これらの電子は、UV光を光源として各波長の干渉フィルターを用いて固有の波長で選択的に励起後、630nmのレーザーで読み出せることがわかった。BaFBr(I):Eu^<2+>輝尽性蛍光体では、ミリグレイ以上の比較的高い線量のX線を照射した試料や繰り返し使用した試料に、白色可視光を長時間照射しても、潜像が消去されずに600nm近傍の励起光で読み出されてくる現象(以下「消去不全現象」といい、観察される光を「消去不全光」という)が生じる。

これらの試料では、従来の読み取りに用いられている600nm付近の電子以外に短波長側の深い準位に捕獲された電子が存在し、これが消去不全光の原因となっていると考えられる。本研究の目的は、これらの電子を利用することで、大線量側にダイナミックレンジを数桁拡大した線量計として開発することである。本研究では以下の成果を得た。1.消去不全光がPSL(輝尽発光,Photo-Stimulated Luminescence)であることを検証したうえで、蛍光体中に深く捕獲された電子及びその励起-PSL発光モデルの考案を行なった。2.BaFBr組成の輝尽性蛍光体の汎用されている代表的なプレート3種Agfa,Kodak及びFujiについて、短波長側のどの準位(波長)に電子が捕獲されているのか、分光したUV光を用いて波長の特定を行った。Agfa,Kodakではいずれも324nmに、またFujiでは320nmに大きなピークをもつがこれ以外に、Agfaでは、345,375及び420nmに、また、Kodakでは345nmに、Fujiでは345,380nmに小さなピークをもつことが明らかになった。3.5.035.0GyのX線を照射したところ、いずれのプレートにおいても、それぞれの波長のピークの大きさは照射線量に依存しており、35.0Gyまでピーク高さは上昇していることが観察された。4.これらの電子は、UV光を光源として各波長の干渉フィルターを用いて固有の波長で選択的に励起後、630nmのレーザー(2段階励起法)で読み出せることがわかった。さらに、未使用試料を2段階励起法で調べた所、照射試料より量は少ないもののそれぞれの特定波長に電子が存在することが示された。この電子は紫外-白色蛍光灯光同時照射法で消去することができたが、室温に3ヶ月放置すると再び短波長側の深い準位に戻ることが観察された。
ヘリカーゼ関連因子による哺乳類着床前胚発生の制御

Strawberry Notch1 (Sno1)はヘリカーゼ関連因子として知られる核タンパク質である。Sno1 KOマウス胚では、着床前胚発生において、特に栄養外胚葉分化が阻害されており、胎生致死となる。着床前胚発生におけるSno1の分子基盤を明らかにするために、Sno1と相互作用しているタンパク質の検索を行った。その結果、ヒストン結合タンパク質の1つがSno1と物理的に相互作用することを明らかにした。このことは、これまでに明らかにしているSno1が強い転写活性化能を示すこと、DNA損傷部位へSno1が集積することと関連して、Sno1がヒストン結合タンパク質と共にクロマチンリモデリングを介して、転写制御、DNA修復に関与していることを示唆している。栄養外胚葉分化においては、Yap-Tead4転写複合体による栄養外胚葉因子の遺伝子転写制御が重要であるが、in vitroのルシフェラーゼアッセイの結果から、Sno1がYap-Tead4による転写活性化に関与している可能性が示されている。加えて、Sno1と相互作用するヒストン結合タンパク質を含む複合体が、Tead4とも相互作用することを見いだした。この結果は、Sno1が、ヒストン結合タンパク質-Tead転写複合体による転写活性化に関与していることを示唆している。また、マウス胚性幹細胞(ES細胞)においてSno1を欠失させると細胞死が起こる。Sno1と相互作用するヒストン結合タンパク質を含む複合体はDNA損傷-修復に関与しており、Sno1自身もDNA損傷部位へ集積する。ES細胞でSno1が存在しないと、DNA損傷-修復過程に異常が生じるため細胞死が引き起こされている可能性がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度はヘリカーゼ関連因子であるSno1の機能の分子メカニズムを解明するために、システインクラスターを含むSno1-C末領域にHisタグを付加したものを精製し、磁性ナノビーズに結合した後に、マウス胚性幹細胞(ES細胞)から採取した細胞抽出液と反応させてSno1-C末領域と相互作用するタンパク質の同定を質量分析により解析した。同定されたタンパク質については、現在、共免疫沈降法によりSno1との結合を確認している。また、Sno1ノックアウト(KO)マウス胚は胎生3.5日目で致死となるため、Sno1の生理的機能の解析は困難であった。そこでSno1 KO ES細胞を樹立することにより、材料面での不足を補い、さらに未分化性維持におけるSno1の機能を解析することとした。Sno1flox/flox (cKO)ES細胞をSno1 cKOマウス胚から樹立し,このSno1 cKO ES細胞にPiggybac-MerCreMerをトランスポゾンシステムを用いて導入し、薬剤選別によりMerCreMerが導入されたSno1 cKO;MerCreMer ES細胞を作製した。このES細胞に、タモキシフェン処理を施すことにより、Cre組換え酵素の発現を誘導してSno1をノックアウトすることに成功した。このSno1 KO ES細胞は、数日の間に細胞死を起こした。現在、Sno1 KO ES細胞での遺伝子発現変化や、細胞死の原因を解析中である。Sno1はヘリカーゼドメインを含む核タンパク質であるため、遺伝子の転写制御における機能について、ルシフェラーゼアッセイを用いて解析した。その結果、Sno1は非常に高い転写活性化能を示すことが明らかとなり、転写の制御に関与していることが覗えた。平成24年度の計画として1Sno1と相互作用する因子の同定、2Sno1ノックアウトES細胞の樹立とその表現型解析、3マウス着床前胚でのDNA損傷ー修復におけるSno1の関与の解析を掲げていた。Sno1タンパク質の結合タンパク質を同定に関しては、計画どおり進行していると判断する。

磁性ナノビーズにHisタグ-Sno1-Cを結合させた後、マウス胚性幹(ES)細胞からの細胞抽出液と反応させた。結合タンパク質を精製した後、質量分析にてタンパク質同定を行なった。以上の解析により、幾つかのタンパク質を同定できた。現在は、同定タンパク質が共免疫沈降法によっても結合しているかどうかを確認中である。Sno1 KO ES細胞の樹立については成功した。当初予定したCAG-Creベクターの導入では、Creが発現された細胞が死んでしまうためSno1 KO細胞の樹立は困難であった。よって、トランスポゾンシステムと、薬剤誘導によるコンディショナルなCre発現の系を用いることにより、Sno1 cKO ES細胞の樹立に成功した。しかし、このES細胞は薬剤誘導によるSno1ノックアウトにより細胞死してしまうため、表現型解析という点ではまだ解析途中であるが、遺伝子発現変化、細胞周期変化などを観察中である。Sno1-C末領域は培養細胞を用いた解析からDNA損傷部位に速やかに集積してくる性質を示した。そこで、マウス着床前胚でのDNA損傷ー修復におけるSno1の関与の解析に関して、酸化DNA損傷マーカー(8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine、チミジングリコール)でコントロール及びSno1 KO着床前胚を染色したが、明確な差は得られなかった。他のDNA損傷マーカー(1重鎖切断マーカー(XRCC)、2重鎖切断マーカー(γH2AX, 53BP1))については未解析である。Sno1機能や分子基盤の解明にはSno1と相互作用する因子の同定と解析が不可避である。平成24年度に同定しているSno1と相互作用するタンパク質の物理的結合の確認を行なった後、結合タンパク質の機能からSno1機能を想定し研究を進める。ES細胞でのSno1ノックアウトの解析から、Sno1は発生、細胞分化のみならず、細胞の生存に必須な因子であるといえる。Sno1がヘリカーゼ様のモチーフを含むことから、特に転写、DNA複製-細胞周期の観点からSno1と、Sno1結合タンパク質の関係と機能を解析し、Sno1の分子基盤を解明していく。25年度が最終年度であるため、記入しない。
即時機能回復を目指した新しい補綴主導型インプラント治療システムの開発

本研究の目的は,1)光学印象採得した3次元顎模型データ上で,対合関係を考慮したインプラント上部構造の3次元モデルを構築し,2)顎骨の3次元CT画像データ上に,インプラントフィクスチャーの形状データを合成するシステムを構築するとともに,3)上部構造の3次元モデルとフィクスチャーを埋入した3次元モデルを統合したデータから,フィクスチャー埋入用サージカルステントと即時機能回復を目指した上部構造の製作システムを開発することである。尚,データ構築・解析における自主開発できないソフトについては,既製ソフトを使用して行った。以下に得られた結果を示した。1.光学印象採得した3次元顎模型上でのインプラント上部構造3次元モデルの構築を行った。2.顎骨の3次元CT画像データ上における残存歯およびインプラントフィクスチャーの咬合支持能力を指標とした診断方法を確立した。3.上部構造の3次元モデルとフィクスチャーを埋入した顎骨3次元モデルの統合における新しい概念を確立した。以上の結果より,本研究の目的1および2に関する基礎的データを構築し,目的3の概念を提言することまで行うことができた。しかしながら,インプラント治療により即時機能回復を行うための予知性の高い補綴主導型インプラント治療を構築するためには,新たな課題が残り,引き続き,検証を行う必要がある。本年度は,光学印象採得した3次元顎模型データ上で,対合関係を考慮したインプラント上部構造の3次元モデルを構築し,顎骨の3次元CT画像データ上でインプラントフィクスチャーの形状データを合成するシステムを構築した.(1)対合関係を考慮したインプラント上部構造の3次元モデルを構築した.顎模型を光学印象採得し3次元顎模型データを構築.インプラント上部構造の3次元モデルを製作.3次元顎模型データと上部構造の3次元モデルを合成.(2)インプラントフィクスチャーの形状データを合成するシステムを構築した.インプラントフイクスチャー形状データを作成.顎骨の3次元CT画像データを作成.顎骨の3次元CT画像データとインプラントフィクスチャー形状データを合成.この結果をふまえて,最終年度となる来年度は,上部構造の3次元モデルとフィクスチャーを埋入した顎骨の3次元モデルを統合したデータから,フィクスチャー埋入用サージカルステントと口腔機能即時回復を目指した上部構造の製作システムを開発する.本研究の目的は,1)光学印象採得した3次元顎模型データ上で,対合関係を考慮したインプラント上部構造の3次元モデルを構築し,2)顎骨の3次元CT画像データ上に,インプラントフィクスチャーの形状データを合成するシステムを構築するとともに,3)上部構造の3次元モデルとフィクスチャーを埋入した3次元モデルを統合したデータから,フィクスチャー埋入用サージカルステントと即時機能回復を目指した上部構造の製作システムを開発することである。
流域スケールでの水域生態系保全を目的としたダム群の評価と提言

本研究ではダム群が河川下流域や汽水域の生態系に与える影響を物質輸送と流況に着目して解明することを目的とした。相模川水系と揖斐川水系を対象とし、個別ダムおよびダム群が物質動態、流況、魚類相に与える環境影響を、現地調査とモデル解析により解明した。その結果、ダム貯水池に由来する粒状態有機物は森林河川においても約3km以上下流に輸送されること、また流量安定時には支川や各種排水の影響を受けるため、溶存態有機物に対するダムの影響はセグメントスケールに留まることが示唆された。そして、流況と魚類群集の解析および魚類分布モデルによる解析結果を踏まえると、河川生態系の種多様性を維持するためには流量の平均的規模だけでなく、出水などの時間的変動および最低流量が重要な要素であることが分かった。これらの成果およびモデルを活用することで、下流河川の生態系も考慮した最適な水資源配分やダム運用方法を検討することが可能となった。本研究では個別のダムの影響評価だけでなく、複数のダムの相互作用にも着目し、河川下流域や汽水域の生態系に与える影響を流況と物質輸送に着目して解明することを目的としている。今年度は、複数のダムが設置されている揖斐川流域と相模川流域を対象に調査研究を開始した。揖斐川流域では、ダム湖の循環期における流域スケールでの水中有機物と金属動態に着目し、本川にダムのない長良川を比較対象とすることで、ダム群による生元素動態への影響の累積効果を解明した。各物質の濃度変化だけでなく、調査で得られた有機物の元素組成や分子構造解析、そして逐次抽出法による金属分析の結果、微細な粒状有機物はダム湖を得るごとに芳香族化合物の割合が増加し、それに伴い鉄やアルミニウムなどの粒状態金属の流下量が著しく増加することが示された。一方、相模川流域においては、既存のデータを整理した上で宮ヶ瀬ダムの管理者に聞き取り調査を実施し、ダム群による河川流況や河川性魚類への影響に関して作業仮説を設定した。その上で、分布型流出モデルを対象流域に適用するために、地形モデルや河道モデルなどを作成し、1990年から10年間の流出計算に必要な降雨データやダム放流情報を収集した。これにより、各流域内におけるダムの有無やダム群の配置などが下流域の河川流況に与える影響をシナリオ解析が可能となる。さらに、アユなどの淡水魚への影響を解明するために、個体群存続可能性分析(PVA)を空間的に拡張することにより流出モデルと組み合わせるための検討を行い、ダム群が水生生物の存続可能性に与える影響を定量評価するための分析手法を準備した。本研究では複数のダムの相互作用に着目し、流況と物質輸送に視点から下流域生態系に与える影響を解明することを目的としている。昨年度に引き続き、相模川や揖斐川流域において物質輸送および魚類生息場に対するダム群の影響を調査研究することで、以下のような成果を得た。複数のダム貯水池や河川で採水調査した結果、ダム貯水池と河川で有機物の濃度や化学特性が溶存態と粒状態の両者で異なるだけでなく、溶存有機物では貯水池による影響がダム下流5km以上に伝播することが示唆された。また、相模川流域の場合、ダム貯水池が溶存態有機物(DOM)動態に対する影響を、分子量分布や蛍光分光光度計(EEM)により調べたところ、DOMの化学特性が中津川と相模川本川で異なっていた。これらの結果は、下流河川への影響がダム貯水池における栄養塩濃度や富栄養化レベルに依存していることを示した。そして、標準フミン物質を使って鉄錯体形成の解明を試みた結果、DOMの芳香族炭素の割合が重要であることが明らかとなり、ダム群が有機物に関連する物質輸送に与える影響を評価するために、紫外部吸光度や蛍光分析などの手法が活用できる可能性が示された。一方、相模川流域の流量変化を記述するために分布型流出モデルを適用して、物理、水質、水文条件等の環境条件と、淡水魚の生息状況をもとに、淡水魚の出現確率と個体密度をセクションごとに推定するモデルを作成した。このモデルを淡水魚39種に適用し、生息場評価した結果、物理条件や水質のみでなく、流況も淡水魚の分布に影響を与え、魚種の分布に寄与する環境条件は種ごとに異なることが示唆された。また、モデル解析の結果、河川横断構造物が多くの淡水魚種の出現確率を低下させるが、流域内に広く分布する一般種の個体密度に対しては大きな影響を与えないことも示された。次年度はこれらの手法を組み合わせ、水域生態系保全を目的としたダム群の評価および評価手法の提案を行いたい。

複数のダムの相互作用に着目し、河川下流域や汽水域の生態系に与えるダムの影響を流況と物質輸送に着目して解明することを目的としている。そのために、相模川水系(山梨県、神奈川県)を対象とし、1)複数のダム湖による河川水質への影響の解明、2)流況に着目した流域スケールでの魚類分布モデルの開発を実施した。ダム群と河川水質の関係については、流域の水利用や貯水池の影響を受けやすい溶存有機炭素(DOM)に着目して進めた。まず、多様な起源をもつ国際標準腐植物質を対象とした化学構造データベースを整備し、その上で、蛍光分光光度計を用いた3次元蛍光スペクトル(EEM)のPARAFAC分析も取り入れて、相模川流域のダム湖水も含めた水質評価を進めた。その結果、DOC濃度は0.291.0 mg/Lの範囲で安定していたが、PARAFAC分析の結果として得られた腐植物質に類似した各第13成分の寄与は調査地点ごとに異なっていた。そして、貯水池前後での第13成分の変化は貯水池の栄養塩レベルで異なることも明らかとなった。次に昨年度までに適用した分布型流出モデルを活用して、相模川流域の物理、水質、水文条件等の環境条件に基づき、淡水魚の出現確率と個体密度をセクションごとに推定するモデルの構築を進めた。その結果、出現確率では18種、また個体密度では10種の流域内分布を精度よく記述することが可能となった。そして、流域内でのダムや堰の配置を変えた状況やダムの放流操作を変化させた状況をモデル上で再現し、流域スケールでの横断構造物の影響を流況および魚類分布の視点から評価した。このような魚類分布モデルにより、ダムによる河川の分断化なども考慮して水資源利用の影響を多面的に評価でき、最適な水資源配分やダム運用方法を検討する知見を提供することが可能となった。ダム群の影響を評価する手法を主に河川の物質動態および魚類生息場の観点から開発しており、物質動態については溶存有機物の分析に時間がかかることから計画より若干遅れているが、魚類生息場に関しては当初の計画以上に進展している。総じて評価すると、おおむね順調に進展していると判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。2つのアプローチ(物質動態、魚類生息場)での評価手法の開発を、最終成果を見据えてバランスよく進めることで、最終年度の研究を推進する。
対照的な集団構造を持つ樹種での遺伝子進化特性に関する集団遺伝学的研究

生物種間には小集団への分割の有無(集団構造)や生活様式等に関する違いが見られる。本研究ではこのような違いがどのように遺伝子進化に影響を与えるかを、それぞれ特徴を持つ3樹木種(ヒノキ科、ミカン科)を材料とし遺伝的変異を調査することにより調べた。その結果、それぞれの種が集団構造や集団の歴史が反映された遺伝的構造を持つことが明らかになり、またその構造や生活様式を反映して特徴的に働く自然淘汰の例を見つけることが出来た。本研究では異なる集団構造と生活史を持つ3樹種(スギ、ヌマスギ、カラスザンショウ)を材料とし、集団動態の情報を得るとともに遺伝的多様性を集団遺伝学的手法により解析する。得られた結果を使って3樹種間で遺伝子進化の様相を比較することにより、集団構造と遺伝子適応進化の関係を明らかにする。カラスザンショウについては、九州の集団で核4遺伝子座の多型を調査し、集団間に遺伝的分化が見られることを明らかにした。またagpL遺伝子座が他の遺伝子座に較べ有意に多型の程度が低く、この遺伝子座で最近適応的置換が起こったことを示唆した。更に九州大学伊都キャンパスの生物多様性保全ゾーン3ケ所より、種子、稚樹および親木の葉を採集し、マイクロサテライト9マーカーを用いてこれらの個体間の遺伝的関係を調査し、少数の母樹が次世代に寄与していることを明らかにした。一花粉PCR法を使った核遺伝子の塩基配列決定については現在条件の検討中である。スギについては、既に7遺伝子の塩基配列データを得ているので、残りの5遺伝子について48個体の種子胚乳より得られた半数体DNAを使って塩基配列を決定した。両データを合わせて解析することにより、スギでは集団が緩やかに縮小していることを明らかにした。また屋久島と岩手の集団それぞれから得た8個体についてCD657多重遺伝子族(R遺伝子)遺伝子の多様性を調査し、非同義置換率が同義置換率を大きく上回り、この遺伝子族で適応進化が起こっている可能性を示唆した。ヌマスギについてはミシシッピー川沿岸から得た45個体の胚乳由来半数体DNAを用いて、10遺伝子座で塩基配列決定を行った。その結果スギ集団と異なりヌマスギでは集団の増大が起きていること、またヌマスギの二変種baldcypxessとpond cypressで遺伝的分化を起こしている遺伝子座が少数存在することを見いだした。カラスザンショウの日本での分布域をカバーする10集団から265個体を採集し,昨年度開発した9マイクロサテライトマーカーを使って集団構造を調べた。その結果、集団間には強い遺伝的分化が見られ、しかも距離が遠くなるほど分化の程度が高くなっていることがわかった。最も分化の程度が高かった鹿児島と伊豆の集団を含む4集団で昨年度見つかった適応候補遺伝子AgpLの多型を調査したところ,九州各集団と同じように殆ど多型が無いことが明らかになった。マイクロサテライトデータから推定した移住率を用いて中立モデルのミュレーションよりこのようなパターンを得る確率を推定したところ大変低く、この遺伝子座に自然淘汰が働いていることが強く示唆された。ヌマスギについては広い分布域での集団構造を推定するために、12個のマイクロサテライトマーカーを開発した。このマーカーを使って現在ミシシッピー川,及びフロリダの遺伝的構造を推定しつつ有る。植物耐病性遺伝子族R遺伝子をアラビドプシス、イネ等5種の植物ゲノムデータから抽出し、これらの遺伝子が持つLRR(ロイシンリッチリピート)数の進化を解析した。リピート数の変化率を推定したところ,種によりまた遺伝子族中のクラスにより変化率が大きく変わることが示され、このような変化が耐病性遺伝子の適応進化に関与している可能性が示唆された。-花粉PCRによる直接塩基決定法はまだ効率が低く、次年度に更なる改善を行う予定である。今年度はカラスザンショウと同じく撹乱依存種であるが樹高等が異なるため林内での分布や集団動態が若干異なっている近縁種イヌザンショウ(Zanthoxylum schinifolium)も加え、10核遺伝子座の塩基配列を用いて、3集団(福岡、南九州、伊豆)の遺伝的構造を両種で比較した。

その結果、1)両種とも集団間の遺伝的分化の程度(F_<ST>)は福岡-南九州間で高く、福岡-伊豆間で低い、2)イヌザンショウの方が平均的にF_<ST>の推定値が高い、3)Tajima's D等の中立性検定統計量は、イヌザンショウでは負、カラスザンショウでは正を示す傾向が強く、スギ・ヌマスギの場合と同様に集団の歴史の違いが明らかになった。一方スギの近縁種ヌマスギ(Taxodium distichum)についてはマイクロサテライト12遺伝子座を用いて生育域をほぼカバーする北米中部および東部の合計18集団を解析した。その結果この種では全遺伝的変異のうち地域間の変異が9.75%、地域内集団間の変異が15.4%となり、スギに較べて集団間に強い遺伝的分化があることが明らかになった。三年間の成果をまとめると、競争種スギ・ヌマスギ、撹乱依存種カラスザンショウ・イヌザンショウの比較から、後者のペアの樹種では前者に較べ集団間分化が進んでいるが明らかになった。それだけではなく同じグループに属する近縁種間でも集団(サイズの増減等)の歴史が異なっており、遺伝子進化に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。