hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌再建症例の筋機能MRI解析

口腔癌患者に対して術前のMRI撮影時より骨格筋機能的磁気共鳴画像(muscle functional Magnetic Resonance Image:mfMRI)を撮影し、術前後の変化を追うことでプレート再建や骨皮弁、軟性皮弁再建などの各種皮弁に応じた術後変化が理解できる。また、中期的な変化を追うことでリハビリテーション介入による変化、長期的に補綴治療前後での補綴治療の意義などが見いだされる。平成30年度は、平成29年度に引き続いて咀嚼筋活動分布の正常像を解明することを目的に、健常被験者の咀嚼筋の形態的標準化を行った。健常被験者に安静時と咀嚼時の咀嚼筋について、運動前後におけるT2値の変化(ΔT2)を測定したところ、両側咬筋のΔT2の上昇をすでに確認した。この結果から、咀嚼筋活動をmfMRIで評価可能であることが確認された。同方法を用い、体格や補綴状況の異なる健常成人に3.0Tの診断用MRI装置(3.0TAchievaQuasaldual、Philips社)を用いて撮像を行い、得られた画像データをDICOM規格にてPCに取り込み、その後画像処理はInteractive Data LanguageLanguage(IDL、ITT Visual Information Solutions,Boulder,CO)にて行った。T2値の算出は、各エコー時間のMR信号から単一指数関数とする直線回帰法により行った。これにより健常者の咀嚼前後における筋活動の変化が測定され、これに続く再建患者の基準値が設定でき、口腔癌で顎骨切除が必要な患者に対するmfMRI撮像に適した条件設定を行うことが可能となった。過去に、われわれが経時的な3次元CT解析(4DCT)での解析を行ってきた下顎歯肉癌腓骨皮弁再建患者にmfMRIを撮影し、得られた3次元MRI画像を重ね合わせることで、従来の硬組織のみの評価に対して切除した咀嚼筋の形態や筋力がどのように咀嚼に影響を与えているかを硬組織と軟組織を合わせた評価を検討する予定であった。しかしながら、「臨床研究法」の施行開始により新たな研究実施計画書作成が必要となる等、準備が進まず、顎骨切除後の再建群、非再建群に対するmfMRI撮影が行えていない。口腔癌で顎骨切除が必要な患者に対し、術前・術後にmfMRI像を撮影し、術前後の変化を追うことでプレート再建や骨皮弁、軟性皮弁再建などの各種皮弁に応じた術後変化、リハビリテーション介入による変化、補綴治療の意義などを調査する予定である。当科では口腔癌一次症例のみならず二次再建症例、良性腫瘍、薬剤関連顎骨壊死や放射線性顎骨壊死からの顎骨骨髄炎患者にも多数の切除・再建術が行われており、口腔癌患者以外にも同方法は展開・代替可能であると考えている。再建手術により進行口腔癌の根治性は向上し、長期生存は可能となってきているが、術後に生じる摂食嚥下障害によってQOLが大きく損なわれる場合がある。神戸大学では経時的な3次元CT解析を行うことで腓骨再建患者の咀嚼動態解析を行ってきたが、更なる機能解析には咀嚼筋や内外舌筋の詳細な解析が必要であり、骨格筋活動に伴うT2延長を筋活動の指標とするmuscle functional MRI(mfMRI)を応用し、再建術式やリハビリテーションの有効性の確立を目指したい。われわれの研究で過去に3次元CT解析を撮像した顎骨切除後の再建群、非再建群、健常成人に対し、追加でmfMRI撮影を行い、摂取している食事の疫学的データとの比較検証や平成30年度以降への前向き研究の際の撮像に適した条件設定を行うことを予定していたが、再建群、非再建群に対するmfMRI撮影がまだ行えていない。

過去に、われわれが経時的な3次元CT解析(4DCT)での解析を行ってきた下顎歯肉癌腓骨皮弁再建患者にmfMRIを撮影し、得られた3次元MRI画像を重ね合わせることで、従来の硬組織のみの評価に対して切除した咀嚼筋の形態や筋力がどのように咀嚼に影響を与えているかを硬組織と軟組織を合わせた評価を検討する予定であった。しかしながら、「臨床研究法」の施行開始により新たな研究実施計画書作成が必要となる等、準備が進まず、顎骨切除後の再建群、非再建群に対するmfMRI撮影が行えていない。過去に3次元CT解析を撮像した顎骨切除後の再建群、非再建群に対するmfMRI撮影を早急に行い、撮像に適した条件設定を行いたい。さらに、これにより得られた条件設定をもとに、平成30年度に実施を予定していた口腔癌で顎骨切除が必要な患者に対して術前・術後にmfMRI像撮像を実施し、術前後の変化を追う研究を進めていきたい。口腔癌で顎骨切除が必要な患者に対し、術前・術後にmfMRI像を撮影し、術前後の変化を追うことでプレート再建や骨皮弁、軟性皮弁再建などの各種皮弁に応じた術後変化、リハビリテーション介入による変化、補綴治療の意義などを調査する予定である。当科では口腔癌一次症例のみならず二次再建症例、良性腫瘍、薬剤関連顎骨壊死や放射線性顎骨壊死からの顎骨骨髄炎患者にも多数の切除・再建術が行われており、口腔癌患者以外にも同方法は展開・代替可能であると考えている。研究計画の遅れ等のため、次年度使用額が生じた。翌年度、引き続き物品の購入や口腔癌患者に対する骨格筋機能的磁気共鳴画像による咀嚼筋機能評価の研究を継続する予定である。
科学教育のための自由探索型マルチメディアCAIシステムの開発

本研究の目的は、科学教育のための自由探索型のマルチメディア学習環境を開発することである。マルチメディア技術の革新・普及に伴って、教育への利用が盛んになってきている。従来型のコンピュータを組み込んだ学習環境は、伝統的CAIシステムを中心としたコースウエアに準拠して学習する方式であった。科学技術の新しい展開においては、学習者の主体的・主導的な学習環境が求められている。本研究は、従来型の学習環境とは異なる、学習者が主体的に自由探索して学習を確立できる環境をマルチメディアを用いて実現した。本学習環境は、学習者が関心あるテーマや課題を自由に選択しながら学習でき、しかもその過程において教育的効果がはかれるよう配慮されている。本システムは、ワークステーション(SPARC station IPX,X-video24SV)とパイオニア(株)製のLDプレーヤー(LDV540)より構成される。教材としては高校数学を選定に、自由探索型のソフトウエアを開発し、当該教材をカスタムLD-ROM上に実装し、学習者による予備実験評価を行い満足する結果を得た。この結果は、高校数学以外の科学教育に応用可能であることを示すものと考える。最後に、これらの成果を報告書の形式でまとめ、公表した。本年度は、学習者が主導的に学習ができるシステム、即ち自由探索型のCAIシステムをマルチメディアを用いて実現するための基本設計を行った。具体的な成果は、以下のとおりである。1.ハ-ドウェア構成の設計すでに開発したMacIIシステムとレ-ザ-ディスク(SWSD方式)によるプロトタイプ試作の経験を踏まえ、鮮明なマルチメディア画像が再生可能でかつ、並行して課題系列化などの教授戦略をリアルタイムに実行可能なシステム構成を設計した。本研究システムは、ビデオ信号表示ボ-ド(Parallax XVideo24)を内蔵したUNIXワ-クステ-ション(Sun SPARCstation IPX)とレ-ザ-ディスク・LD-ROMより構成される。2.基本ソフトウェアの開発自由探索型のCAIシステムの基本ソフトウェアとして下記のプログラムなどを作成した。平成4年度には、これらのプログラムを1.のシステムに移植する予定である。(1)学習課題を教授戦略により自動的に系列化するプログラム(2)数式をワ-プロ感覚で容易に入力するためのツ-ル(3)プロセス間通信により、他のプログラムからMathematicaを実行するツ-ル(4)レ-ザ-ディスクプレ-ヤのためのデバイスドライバ3.教材のハイパ-メディアへの対応数学および化学の教材をハイパ-メディアに対応するため、とくに化学では、欧米での事例等を検討し、MS-Windows上での教材作成の研究を開始した。平成3年度までに、数学の問題解決に必要な知識を数学的命題知識と問題解決の方略的知識に整理し、とくに方略的知識に基づく数学教材の探索学習法の概念を提案した。さらに、ハイパーメディアの技法を用いて、その探索学習システムを試作した。しかし、試作したシステムでは学習者の探索要求に対するユーザインタフェースの自由度が低いという課題があった。そこで各教材に対して、その内容を知識表現することと数学教材の関連構造を含む辞書機能によりある問題を解答しているときに、その低次の問題を参照したり、類題を参照したり、別の領域で同一の戦略や方略を用いている問題を参照したりすることができるように、また提示画面で解理できない用語や概念を自由に検索できるような構成にした。以上の機能仕様をもとに、平成3年度に講入したワークステーション(SPARC station IPX,X-video24SV)とLDプレーヤ(LDV540)を対象とした詳細設計を行い、詳細設計に基づき、自由探索型CAIソフトウエアを開発し、カスタムのLD-ROMをパイオニアにて作製した。平成4年度において基本開発を完了させた。

本学習環境は、学習者が関心あるテーマや課題を自由に選択しながら学習でき、しかもその過程において教育的効果がはかれるよう配慮されている。本システムは、ワークステーション(SPARC station IPX,X-video24SV)とパイオニア(株)製のLDプレーヤー(LDV540)より構成される。教材としては高校数学を選定に、自由探索型のソフトウエアを開発し、当該教材をカスタムLD-ROM上に実装し、学習者による予備実験評価を行い満足する結果を得た。この結果は、高校数学以外の科学教育に応用可能であることを示すものと考える。最後に、これらの成果を報告書の形成でまとめ、公表した。
神経変性疾患における神経細胞死関連分子の研究

ヒト筋萎縮性側索硬化症(ALS)、非神経疾患及び運動ニューロン疾患以外の神経疾患患者の剖検脊髄組織、さらに家族性ALS動物モデルであるSOD-1(G93A)トランスジェニックマウス(Tgマウス)の脊髄組織を対象とし以下の研究を行った。Tgマウスの脊髄組織において、ノントランスジェニックマウスと比較し多くの炎症関連遺伝子群で発現変動を認めた。これらについてreal-time RT-PCR・免疫染色を経時的に行った結果、TgマウスにおいてTNF-α、TGF-β1、Macrophage scavenger receptor等のmRNAおよびタンパク発現量は発症経過とともに増加することを観察した。発症前においてもTNF-αのmRNA発現量がすでに増加していたことから、TgマウスにおいてTNF-α等の炎症関連遺伝子産物が病態に関与する可能性が示唆された。
階層型ニューラルネットによる非線形多変量データ解析に関する研究

統計的パターン認識という柔軟な知的情報処理のもとで、パターン認識と多変量データ解析との融合が脚光を浴びている。本論文では、分類問題の視座から、パターン認識と密接な関係にある非線形判別分析について考究した。ベイズ理論の観点からネットワーク尤度を構成し、誤差評価関数である予測平方和規準とKullback-Leibler情報量規準との関係を明確にする定理を導出した。そして、ニューロン間のリンク荷重を未知パラメータとみなし、尤度原理による統計的推測を行った。従来、隠れユニット数の決定などのモデル選択の規準には、残差の正規性を前提にした予測平方和に基づくAIC(Akaike Information Criterion)を採用されてきた。しかし、判別分析などの分類問題の場合、残差の正規性を仮定することの矛盾点を明確にし、情報量基準のバイアス補正の観点からブートストラップ法による隠れユニット数の決定アルゴリズムを開発した。誤判別率に注視して、Fisherの線形判別,二次判別およびCART(Classification And Regression Trees)との性能比較を行い、提案法の有効性を示した。階層型ニューラルネットにおける未解決な問題の一つとして、過大なネットワークを用いることによる汎化能力の低下がある。そのため、リンク荷重の枝切り(pruning)によるコンパクト構造化が試みられてきた。この枝切りに関し、ペナルティ関数の導入や評価関数の二次導関数(ヘシアン行列)に基づく方法が提案されている。しかし、ネットワークを学習する際、ペナルティ項の追加やサイズの大きなヘシアン行列(およびその逆行列)の計算により学習時間が膨大になるなどの難点がある。本論文では、リンク荷重の有意性に着目した尤度比検定による冗長なリンク荷重の枝切りアルゴリズムを開発した。また、尤度比検定による説明変数の選択法も提唱した。このコンパクト構造化により、ネットワーク構造の解釈が容易になる。更に、多次元データの視覚化の観点から、階層型ニューラルネットワークの情報圧縮法を提案した。具体的には、圧縮スコアによる多変量データの次元縮約を行い、非線形判別の様態のグラフィカル表現を可能にした。1)本研究では、教師あり学習(supervised learning)であるロジスティック回帰モデルや判別分析に着眼し、一般化線形モデル(GLIM)からの再考察を試みた。最尤法を媒介にすれば、GLIMと単純ニューラルネットとの同等性を導出できる。更に、3層ニューラルネットに拡張することにより、GLIMにおける補対数-対数(complementary log-log)関数やプロビット(probit)関数にも適応されうる。単純ニューラルネットと3層ニューラルネットに関し、赤池情報量基準AICによるモデル選択や尤度比適合度検定についても言及した。2)近年のコンピュータの発展とともに、国内外における統計パッケージも整備されつつある。多くのユーザーを確保しているパッケージとしては、SASやSなどが著明である。しかし、非線形多変量データ解析に関する統計パッケージにはまだ未解決で不十分な点が多々ある。本研究では、データ解析法が理論的に整備された段階で、コンピュータ・ソフトウェアの開発・共有化を行う。ユーザのニーズに基づいたソフトウェアの性能を完備させ、ユーザーインターフェースの向上を図った。統計科学の分野では、「線形」を前提とした標準的な解析が、1)加法性2)分散一定性,3)正規性のもとで開発されてきた。

しかし近年、統計的多変量データ解析において、射影追跡、平滑化法、あるいは一般化加法モデルなどの有望な方法で、「非線形」に対する挑戦が続いている。人工知能に基づくエキスパートシステムのパターン認識への応用は広範に研究されている。パターン認識では、実世界のパターンのもつ曖昧さや不確かさを扱うためにも、さらには評価の観点からも、統計的な取扱いが肝要になる。一方、多変量解析はデータのもつ情報を効率よく要約・表現し、的確な評価や直観的な形にまとめる有力な武器として、広範に利用されてきた。本研究では、パターン認識の多変量解析的アプローチ、また多変量解析の立場からはニューラルネットによるパターン認識への応用という両分野の融合を究極の狙いとする。近年急激に発展してきたコンピュータを知的活動の道具として利用することにより、階層型ニューラルネットによる非線形多変量解析に関する方法論の確立およびコンピュータパッケージの構築を志向した。具体的には、統計的非線形判別分析やパターン認識との融合という観点から、現象の解明や情報圧縮を通じ、新たな生産的知見の獲得を志向した。近年、統計的多変量データ解析において、射影追跡、平滑化法、あるいは一般化加法モデルなどの有望な方法で、「非線形」に対する挑戦が続いている。本研究では、パターン認識の多変量解析的アプローチ、また多変量解析の立場からはニューラルネットによるパターン認識への応用という両分野の融合を究極の狙いとした。具体的には、統計的非線形判別分析やパターン認識との融合という観点から、現象の解明や情報圧縮を通じ、新たな生産的知見を獲得した。
非侵襲細胞分化追跡のための励起・蛍光マトリクス分光イメージング

細胞および細胞外マトリクスにおける生体分子の挙動を時間分解励起・蛍光スペクトルマトリクスのリアルタイム解析による追跡手法を開発することを目的とする。特に、以下の3点を特徴とする。1)生体分子の自家蛍光に基礎を置くトレース法の追求、2)多重分光情報を効率よく取得できるシステムの構築、3)レーザー誘起消光・増幅・化学反応等の新規マーキング手法の検討。励起・蛍光マトリクス分光による成分分離可能性を検証するために、均質系における実験的研究を行った。フェムト秒レーザーにより発生させた白色光を励起光源として、200psゲート付ICCDをディテクターとして用いることで、一括で時間分解励起・蛍光マトリクスデータを取得可能なシステムを構築した。励起波長・蛍光波長・蛍光寿命・蛍光強度という多重分光パラメータの取得と、差分・特異値解析等の数値解析手法を適用することにより、多成分混合系および光反応系において有効なターゲット追跡手法となることを示した。さらに、励起光に対してタイミング制御した可視フェムト秒パルス光(Dump光)を導入し、誘導放出を利用したPump(励起)-Dump(脱励起)過程を新規マーキング手法へと展開し、評価した。Dump光の波長を変えることで、電子励起状態において選択的に特定成分をマーキングし、成分分離能の向上を実証した。イメージング実現のためにラインフォーカス顕微分光システムへと展開させた。励起光源として再生増幅Ti:Sapphireレーザーまたは自動波長可変フェムト秒OPAを用いた。励起光をサンプルに対してライン状に集光し、空間走査軸をひとつ減らすことにより、高速イメージ取得を実現した。開発したラインフォーカス顕微分光システムを植物組織への感染応答の検出に用いた(班内共同研究)。蛍光スペクトル、蛍光寿命、空間分解等を組み合わせることで、通常、葉緑体蛍光などの強い自家蛍光に妨害されて観測が困難な、感染刺激に対する二次代謝産物の自家蛍光を捉え、その組織細胞上の分布情報を取得することに成功した。平成17年度においては、当初研究計画のうち、励起・蛍光マトリクス分光法の成分分離可能性検証と、イメージング可能なシステム開発を中心に行った。さらにイメージング実現のためにラインフォーカス顕微分光システムへと展開させた。班内共同研究として、励起・蛍光マトリクス顕微分光イメージングを植物組織への感染の検出に用いた。葉緑体蛍光などの強い自家蛍光に妨害されて、通常、観測することが困難な、感染刺激に対する防御物質の蛍光スペクトルの組織細胞上の分布情報を取得することに成功した。
遺伝子改変マウスを用いた胃がん形成における炎症反応の役割の解析

炎症が胃がん形成に与える影響を解析するために、マウスにヘリコバクターフェリスを感染させる実験を行った。しかしながら、惹起される炎症の度合いが個体によって大きく異なり再現性の精度に欠けたため、この実験系を用いての解析は終了させた。次に、マウス生体内で大腸がんのスクリーニングを行った実験に関しての解析を行った。Sleeping Beautyトランスポゾン挿入変異システムをマウスの腸上皮に導入し、腸の腫瘍を得た。これら腫瘍のゲノムをシークエンスすることで1333個の大腸がん形成に関わる遺伝子を同定した。また、悪性度の高い腫瘍で高頻度に変異の入る6つの遺伝子を同定した。CagA陽性のピロリ菌感染は、慢性炎症を引き起こし胃がん発症と強い相関を示す。CagAタンパク質の発がん作用に関する報告は蓄積されているが、炎症における作用は未知な部分が多い。本研究では、CagAタンパク質が炎症反応に促進的な働きをしているかを生体レベルで解析するために、野生型マウスとCagAトランスジェニックマウスにおいて胃炎を誘導し炎症の度合いを比較した。用いたマウスの系統はC57/BL6であり、予備実験においてHelicobacter Felis (HF)とH. pylori株の一つであるSS1を感染させて比較したところ、強い胃炎を誘導できるのはHFであった。HFを感染させてから40週後に胃のHE染色を行い観察したところ、胃の委縮、好中球やマクロファージ、リンパ球の浸潤を伴う強い炎症を野生型、CagAマウスで誘導することができた。HF感染による炎症反応は、幽門部ではなく、主に胃体部で観察された。次に、炎症の度合いに差があるかを、1)リンパ球の胃腺管への浸潤、2)好中球の胃腺管への浸潤、3)胃腺管の委縮の有無、4)腸上皮化生の有無について評価したところ、野生型マウスとCagAトランスジェニックマウスの間で有意な差は見られなかった。この実験から、CagAタンパク質の炎症を増強する作用はとても弱いと考えられた。一方で、CagAマウスにおけるCagAタンパク質の発現は弱いため、HF感染により強い炎症を惹起することでその効果が見えにくくなっている可能性も考えられる。本年度は、胃がんで変異のある遺伝子に注目し、そのがん化能を生体内で評価することを目的として研究を行った。これまでにマウス生体内で胃がん形成に関わる遺伝子のスクリーニングを行ってきたので、これより得られた結果と、TCGAデータベースにおいて公表されている人の胃がんゲノムシークエンスの研究結果を比べ、人とマウスで共通して変異が入っている遺伝子を抽出し、変異パターンから腫瘍抑制遺伝子の可能性が高いもの3つを選んだ。これら遺伝子に対するshRNAベクターを作成し、ヒト胃がん細胞株のAGSとMKN74において遺伝子発現をノックダウンした。また、これら3つの遺伝子に対するCRISPRベクターを購入し、AGS細胞に関してはゲノムレベルでノックアウトする方法も試みた。qPCRやウエスタンブロッティングを用い、遺伝子発現やたんぱく質発現を定量することでノックダウン効率を評価し、細胞株を樹立した。AGS細胞に関して、ノックダウン細胞株と親株をそれぞれヌードマウスとSCIDマウスの皮下に移植したが、移植後3ヶ月経過しても腫瘍形成を示さなかった。これはAGS細胞が移植可能であるという報告と異なる結果であった。これにより、ノックダウンした遺伝子の腫瘍形成能力を評価することができなかった。MKN74に関しては、STK3遺伝子をshRNAを用いてノックダウンした場合に、細胞増殖能が増加する傾向が見られた。MKN74の親株を用いたマウスへの移植の予備実験では、ヌードマウスではなくSCIDマウスにおいて腫瘍形成能が観察されたので、今後の実験においてはSCIDマウスを使う。腫瘍学CagAタンパク質の胃炎に与える影響を、CagAトランスジェニックマウスを用いた実験系で評価した。炎症が胃がん形成に与える影響について、次年度は胃がんで変異がある遺伝子、その中でも特に腫瘍抑制遺伝子に着目し、これら遺伝子の発現を、胃の器官培養や胃がん細胞株においてノックダウンする。これらの細胞をマウスへ移植することで、生体内での腫瘍形成能を評価する。次に、これらの細胞に対する炎症性サイトカインへの反応性を、がんシグナルの増強などの観点から生化学的に解析する。また、炎症性サイトカイン存在下の細胞の動態をタイムラプスイメージング技術を用いて解析することで、炎症が胃がん形成にどのように寄与しているかを明らかにしていく。
新規アッセイ法を利用した炭素環ヌクレオシドによる抗アデノウイルス剤の創製

アデノウイルスは強力な感染力を有するウイルスである。特に臓器移植を行った免疫不全状態の患者に対する感染は致死的なダメージを与えることが知られているが、現在アデノウイルス感染症に対する有効な治療薬はない。先行研究にて申請者らは化学修飾された核酸アナログのリン酸化を促進させる特殊な細胞を用いてアッセイを行ったところ、炭素環を有する核酸アナログが抗アデノウイルス活性を示すことを見出した。本研究では本核酸アナログをリード化合物とし、抗ウイルス活性に大きく影響する核酸塩基部分および糖部5'位に存在する水酸基について構造活性相関研究を行うとともに、新規アッセイ法の効果判定を行う。
遺伝子多型を用いた泌尿器系腫瘍の分子疫学的解析と発がんリスクモデルの構築

家族性・遺伝性前立腺がん感受性遺伝子の多型を用いて、孤発性前立腺がんのリスクの解析を行った。執印らはELAC2/HPC2の二つの遺伝子多型(Ser217Leu,Ala541Thr)を解析した。いずれも、日本人では、これら多型の頻度は少ないが、それぞれの多型は有意に患者群において高い(Leu217,p=0.0012;Thr541,p=0.0145)と報告した。渡邉らはSer217Leuにおいて、前立腺発がんリスクが高まると報告した(OR:3.11,95%CI:1.22-7.90)。鈴木らはmacrophage scavenger receptor 1(MSR1)遺伝子が前立腺発がんに関与することを報告した。ヨーロッパ系、アフリカ系アメリカ人の前立腺がん患者にArg293X、Asp174Tyrという同遺伝子の変異が有意に高いことが明らかにされた。鈴木、渡邉らは前立腺がん患者のアンドロゲン受容体遺伝子のCAG反復数と臨床病理学的因子との関係を解析した。CAG反復数の少ない患者の方が内分泌療法の反応性が良好であることを認めた。加藤らはST1A3の遺伝子多型(R213H)とNAT2(迅速・遅延型)の遺伝子型の尿路上皮がん感受性・および喫煙との関連性を解析した。ST1A3遺伝子多型の頻度に関し、尿路上皮がん患者群と健常者群の間には統計学的に有意差を認めなかったが、NAT2中間型、遅延型の頻度の関しては、統計学的に有意差を認めた(OR:1.49,95%CI:1.06-2.09,0R:3.23,95%CI:1.72-6.08)。ニトロサミンの主要代謝酵素であるCYP2A6遺伝子欠損型とCYP2E1(Rsal)遺伝子多型の頻度を分析し、尿路上皮がん発症との関連性を解析したが、有意な関係を認めなかった。NQO1(C609T)遺伝子多型と前立腺がん、尿路上皮がんとの間にも有意な関係は認められなかった。p27遺伝子の発現と関連する多型を利用して、腎がん、前立腺がんについて解析するも有意な結果を得ることが出来なかった。結論として、(1)家族性・遺伝性前立腺がんに関連する遺伝子多型は孤発性前立腺がんのリスクに対しても、有用であった、(2)尿路上皮系がんリスクと発がん物質代謝酵素多型の関係が確認された、(3)前立腺がんにおいてアンドロゲン受容体遺伝子のCAG反復数が治療反応性の予測に使える可能性を認めた。
水溶液中の有害なイオン種に選択的に応答する蛍光プローブの開発

特定のイオン種に対して選択的に蛍光挙動を変化させる蛍光プローブは、迅速かつ簡便にイオン種の定性・定量分析ができるため、生化学や環境分析の分野で注目を集めている。しかしながら、従来の蛍光プローブの応答は有機溶媒中に限られており、水溶液中で機能する蛍光プローブの報告例は少ない。本研究では、水溶液中の有害イオン種を選択的に検出できる蛍光プローブの開発を目的としている。本年度は、極めて性質の類似した亜鉛イオン(Zn^<2+>)およびカドミウムイオン(Cd^<2+>)に対して異なる波長の蛍光を示すプローブの開発に取り組んだ。クマリンにアミドおよびジピコリルアミンを連結させた分子を開発した。本分子は中性水溶液中では無蛍光だが、Zn^<2+>およびCd^<2+>の存在下では、それぞれ437nmおよび386nmを極大とする蛍光を示す。一方、他の金属イオンに対しては蛍光を示さない。つまり、本分子はZn^<2+>とCd^<2+>に対して選択的に発光し、これらのイオン種を蛍光波長から識別できる。この異なる蛍光応答はZnおよびCd錯体の配位構造に起因する。これらの錯体は2つのピリジン窒素、アミン窒素、カルボニル酸素を配位子として含むが、Zn錯体は水酸化物イオンが金属中心に配位した構造を形成する。非経験的分子軌道計算によりCdおよびZn錯体の電子密度分布を求めたところ、Cd錯体のHOMOのπ電子はクマリン部位に局在化しているが、LUMOではクマリン部位からピリジン部位にかけて分布する。これは励起によりクマリン部位からピリジン部位への分子内電荷移動が起こることを示している。一方、Zn錯体の場合、HOMOおよびLUMOのπ電子はクマリン部位に局在化しており、電荷移動は起こらない。そのためクマリン部位の電子密度が増加し、Zn錯体は長波長蛍光を出現させる。特定のイオン種に対して選択的に応答する蛍光プローブは、簡便かつ迅速にイオン種の定性・定量分析ができるため、生化学や環境分析の分野で注目されている。本年度は、簡便な操作で再生できる蛍光プローブの開発に取り組んだ。1.クマリン-スピロピラン(CS)複合体とN-イソプロピルアクリルアミドから成るコポリマーを合成した。本ポリマーは、紫外線照射下、水中のシアン化物イオン(CN^-)を認識して青色蛍光を示す。この選択的な蛍光は、CN^-がCS部位のスピロ炭素へ求核相互作用することにより、CS部位の電子密度が局在化するためである。また、本ポリマーは簡単な酸処理・加熱により再生・回収が可能であり、高い感度を保持したまま再利用できることを明らかにした。また、2.フルオレセインとスピロピランを複合化したCN^-発色プローブを開発した。本分子は、紫外線照射下、水溶液中のCN^-と選択的に相互作用することにより、512nmを極大とする新たな吸収を出現させる。この吸収の変化は、CN^-とスピロ炭素が求核相互作用することにより、電子密度が局在化するためである。関連研究として、3.キノリンとジピコリルアミンをスチリル基で結合させた分子を開発した。本分子は、緑色の蛍光を示すが、金属イオン存在下では異なる蛍光色を示す(Cd^<2+>:青色、Hg^<2+>:黄色、Pb^<2+>:橙色)。これは、金属イオンへの配位により、分子内電荷移動特性が変化することによる。また、二種の金属イオンを同時に添加すると中間色を作り出すことが可能であり、特に、Cd^<2+>とPb^<2+>の共存下では白色発光を示した。さらに4.スピロピラン誘導体のメロシアニン構造への熱異性化が粘性溶媒中で促進されることを見出した。この異性化促進は、粘性溶媒の強い溶媒間相互作用によりメロシアニン種に対する溶媒配向が抑制され、異性化エントロピーが増大するためである。

非経験的分子軌道計算によりCdおよびZn錯体の電子密度分布を求めたところ、Cd錯体のHOMOのπ電子はクマリン部位に局在化しているが、LUMOではクマリン部位からピリジン部位にかけて分布する。これは励起によりクマリン部位からピリジン部位への分子内電荷移動が起こることを示している。一方、Zn錯体の場合、HOMOおよびLUMOのπ電子はクマリン部位に局在化しており、電荷移動は起こらない。そのためクマリン部位の電子密度が増加し、Zn錯体は長波長蛍光を出現させる。研究代表者は、シアンを検出する分子プローブとして水中で使用でき回収再利用の可能な蛍光プローブの開発に成功した。また、金属イオンによって異なる発光色を示す新規発光分子を開発した。この分子は、二種の金属イオンを適切な割合で加えることにより中間色を発光させることができ、白色発光も可能であるという非常に珍しい材料である。この研究成果は、著名な学術論文誌への論文発表のほか、2011年光化学討論会における発表で、専門家によるポスター発表ならびに口頭発表の厳しい審査を経て、最優秀学生発表賞を受賞した。したがって区分(1)に該当すると判断した。本研究では、特定のイオン種だけを選択的に検出するための蛍光プローブの開発を行ってきた。今後は、性質の類似したイオン種を同時に検出し、なおかつ識別可能なプローブ分子の開発に取り組みたいと考えている。これまでに、クマリン-アミド-ピコリルアミンから成る連結分子が、水中の亜鉛(II)とカドミウム(II)イオンに対して応答し、異なる蛍光色を示すことを見出している。また、レゾルフィンにジニトロフェニルエーテルを導入した分子が、芳香族チオラートと脂肪族チオラートに対して異なる吸収応答を示すことを見出している。プローブ分子がイオン種に応じて異なる挙動を示すメカニズムを明らかにすることで、類似した性質を持つイオン種を識別できるプローブの設計指針を得ることができると考えられる。
脂肪由来幹細胞を用いた血管内皮・周皮細胞分化誘導法の開発

ヒト皮下脂肪組織の損傷後に放出される4つの因子(bFGF,EGF,PDGF,TGF-β)を混合し、脂肪組織創傷治癒関連因子カクテル(AIC: Adipose injury cocktailと命名)を作成した。AICは主に脂肪由来幹細胞(Adipose derived Stem Cell)を活性化し、増殖、遊走を促進し、脂肪および血管内皮系統への分化傾向を高めた。急性虚血脂肪組織や糖尿病脂肪組織へのAIC局所投与により、ASCを主とする細胞増殖を生じ、血管新生および脂肪新生所見がもたらされた。AICは虚血脂肪組織に対する血管新生治療として有用であることが示唆され、虚血性難治性潰瘍などに対する血管新生治療に適用できると考えられた。1)in vitro脂肪組織傷害モデル(injuryカクテル)の作成と増殖能、間葉系への多分化能の測定術後ドレーン廃液の解析結果に基づき、受傷早期に増加する増殖因子(EGF,PDGF,bFGF,TGF-beta)を含んだ溶液(injuryカクテル)を作成した。Injuryカクテルは、脂肪由来幹細胞(ASC)及び血管内皮細胞(EC)の増殖を促進した。またinjuryカクテルで刺激されたASCは脂肪分化傾向を増し、骨分化および軟骨分化傾向は抑制された。2)injuryカクテルによるASCの血管内皮分化誘導とその評価Injuryカクテルの投与によりASCの遊走能、血管網形成能は著明に亢進したが、ECでは変化を認めなかった。培養ASCのmRNA発現解析ではFlk-1、CD31が増加し、Flow cytometryや細胞免疫染色でも血管内皮マーカー発現の亢進を認めた。Injuryカクテルに曝されたASCが作成した血管網はvWF陽性、lectin陽性で、ECとの共培養では混在した状態で血管構造を呈した。3)injuryカクテルの作用メカニズムの解明Injuryカクテルから各増殖因子を除いた条件下で評価し、より影響の強い増殖因子の特定を試みた。増殖能はどの一因子を除いても亢進が維持され、遊走能にはEGF,PDGF,TGF-betaの影響が強いことが分かった。また血管網形成能にはbFGFの影響が強いが、他の因子による相乗効果も確認できた。これまでの研究により、脂肪組織傷害後早期に高濃度に存在する4つの創傷治癒因子をASCに暴露して擬似的な傷害環境を再現したところ、ASCは増殖、遊走し、血管内皮細胞への分化傾向をもつことが示された。一方で脂肪分化傾向も亢進したことから、傷害環境下のASCは脂肪および血管細胞へ分化することで組織再構築に寄与することが示唆された。またこれらの現象は、複数の増殖因子の相乗的相補的作用によってもたらされていることを確認した。今後はこの傷害関連増殖因子が生体内のASCを活性化し、組織の血管新生をもたらし得るかどうかを検証するvivoの実験を継続する予定である。ヒト皮下脂肪組織において創傷早期にドレーン廃液から検出された4種類の増殖因子(bFGF, EGF, PDGF, TGF-β)を調整混合し、脂肪組織創傷治癒関連因子カクテル(AIC : Adipose injury cocktailと命名)を作成した。AICは主に脂肪由来幹細胞(Adipose derived Stem Cell)を活性化し、増殖、遊走を促進し、脂肪および血管内皮系統への分化傾向を高めるとともに他系統への分化傾向を抑制した。AICを構成する各因子は、ASCの増殖・遊走・分化にそれぞれ異なる程度の関与を示した。またAICは血管内皮細胞(Endothelial Cell)の増殖も促進した。単独因子、またはシンプルな組み合わせでは、ASCに明らかな血管内皮分化傾向を誘導することはできなかった。また過度なAIC濃度を用いても増強効果は得られなかった。動物実験では、急性虚血脂肪組織や糖尿病脂肪組織へのAIC局所投与により、ASCを主とする細胞増殖を生じ、血管新生および脂肪新生所見がもたらされ、酸素分圧が上昇した。本研究の結果により、AICは急性脂肪組織や糖尿病脂肪組織に血管新生および脂肪新生を生じ、適切な脂肪再構築と酸素化改善がもたらすことが示された。糖尿病脂肪組織は慢性的に虚血状態であることを考慮すると、AICは虚血脂肪組織に対する血管新生治療ツールとして有用であることが示唆され、虚血性難治性潰瘍などに対する血管新生治療に適用できると考えられた。
日本語母語話者と非母語話者の語りの談話における「話段」についての研究

本研究の目的は,日本語母語話者や非母語話者(英語,中国語,韓国語の母語話者)がアニメーションのストーリーについて日本語で語る談話や文章をデータとして取り上げ,ストーリーの内容的なまとまりと関連する助詞の「は」,主観的表現,節のくりかえしという3つの表現の使われ方について分析すること,そして談話における「話段」が,どのような手がかりで認識されるのかについての調査・考察を行うことである。「は」の使われ方に関する母語話者データの分析では,書きことばにおいて話しことばよりも約2倍「は」が使われていること,「は」の使われ方には,トピックの継続性だけではなく有生性もその要因になっていることが明らかになった。文章データに現れる主観的な表現の使われ方について,日本語母語話者の場合は,事態が予想外であることを示す「てしまう」が冒頭部や展開部で高い頻度で用いられるが,ストーリーの終結分では使われなかったのに対し,非母語話者の場合は,終結部でも用いられていたこと,などが指摘された。同一話者によって同一命題が隣接してくりかえされる現象と定義される節のくりかえしについては,南(1974,1993)の階層モデルをもとに,1)統語的には,先行する節はそれより前の文脈と結びつき,後続する節はそれより後ろの文脈に結びついていること,2)その反映としてくりかえされる命題は意味的に異なる2つの談話のまとまりに属していること,などが明らかになった。「話段」については,内容区分調査の結果,1)新しい内容が始まると指摘された発話の70%は,全体の15%に過ぎない有生の名詞句と接続表現の両方を含む発話であったこと,2)指示表現と接続表現を組み合わせが「話段」認定の重要な基準になっているということが明らかになった。本研究の目的は,日本語母語話者や非母語話者がストーリーを持った内容を日本語で語るときに,ストーリーの中のエピソードや場面など内容的な談話のまとまりを表す「話段」がどのような手段によって示されているかを明らかにすることである。書きことばにおける「段落」に当たるような内容のまとまりが,話しことばにおいてはどのような形で表されているのか,言語表現,イントネーションやポーズなどの音声的な特徴,身振りや視線などの非言語行動などの観点から分析を行っていく。《平成16年度の研究実績》1.中国語・韓国語を母語とする非母語話者による談話データ収集語り手役のインフォーマントに約5分間のアニメーションを見せ,その後そのストーリーをアニメーションを見ていない聞き手役のインフォーマントに説明してもらうという手順で,語り手役の母語および日本語の談話データを収集した。2.談話データのデータベース作成日本語母語話者による談話データと上記の非母語話者による談話データのデータベース作成のために,談話データの文字化を行い,イントネーションやポーズに関する情報も記述した。3.研究発表談話の内容的なまとまりと関連の深い助詞「は」の使われ方について,談話データを分析し,その成果を学会での口頭発表や論文として公表した。また,イントネーション単位や情報単位など,談話データを分析する際に用いる単位に関する口頭発表も行った。《平成17年度の研究実績》1.談話データのデータベース作成日本語母語

話者による談話データと非母語話者による談話データのデータベース作成のために,談話データの文字化を行い,イントネーションやポーズに関する情報も記述した。2.話段区切り調査録画・録音された談話をインフォーマントに見せて,どこに内容のまとまりの区切りがあるかを尋ねる調査を5回,約170人を対象に行った。3.研究発表談話の内容的なまとまりと関連の深い助詞「は」の使われ方について,また,くりかえしと談話のまとまりとの関連について談話データを分析し,その成果を論文や学会での口頭発表として公表した。本研究の目的は,日本語母語話者や非母語話者がストーリーを持った内容を日本語で語るときに,ストーリーの中のエピソードや場面など内容的な談話のまとまりを表す「話段」がどのような手段によって示されているかを明らかにすることである。書きことばにおける「段落」に当たるような内容のまとまりが,話しことばにおいてはどのような形で表されているのか,言語表現,イントネーションやポーズなどの音声的な特徴,身振りや視線などの非言語行動などの観点から分析を行つていく。《平成18年度の研究実績》1.談話データのデータベース作成日本語母語話者による談話データと非母語話者による談話データのデータベースを作成した。2.話段区切り調査の分析平成17年度に行われた話段区切り調査(録画・録音された談話をインフォーマントに見せ,どこに内容のまとまりの区切りがあるかを尋ねる調査)のデータ集計と分析を行った。3.研究発表話段区切り調査についての分析の成果,および,談話のまとまりとの関連する主観的表現やくりかえしについての分析の成果を論文や学会での口頭発表として公表した。
硫酸還元菌由来のヒドロゲナーゼとチトクロームc_3との間の電子移動過程の解明

本研究はヒドロゲナーゼとチトクロームc_3との間の電子移動速度に対するチトクロームc_3の電荷の影響及び、チトクロームc_3とヒドロゲナーゼの電子移動部位に存在するアミノ酸の同定を目的としている。まずチトクロームc_3とヒドロゲナーゼの間の電子移動速度をストップトフローを用いて測定したところ、天然の基質であるチトクロームc_3はヒドロゲナーゼとの間で効率の良い電子伝達が可能であることが分かった。チトクロームc_3とヒドロゲナーゼが効率よく電子伝達することが分かったので、ヒドロゲナーゼとチトクロームc_3との電子伝達複合体に関与する電荷の効果について検討した。チトクロームc_3中の主要な塩基性アミノ酸であるリジン残基を2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いた。このTNBS修飾チトクロームc_3とヒドロゲナーゼとを組み合わせた水素発生反応の結果、TNBS修飾チトクロームc_3を用いた場合、未修飾のチトクロームc_3に比べ活性が低下することが分かった。これは修飾されたリジン残基がヒドロゲナーゼとの電子伝達に重要な役割を果たしているためであると考えられる。さらにヒドロゲナーゼと組み合わせた水素吸収反応でも修飾されたリジン残基が電子伝達に重要な役割を果たしていることがわかった。まずチトクロームc_3とヒドロゲナーゼの間の電子移動速度をストップトフローを用いて測定した。あらかじめ過剰量のジチオナイトを用いて還元したチトクロームc_3によるヒドロゲナーゼの還元反応を測定した結果、見かけの速度定数は110s-1であった。またまた人工の基質であるメチルビオローゲンを用いて同様の事件を行った結果、見かけの速度定数は0.1s-1と求められた。このことから天然の基質であるチトクロームc_3はヒドロゲナーゼとの間で効率の良い電子伝達が可能であることが分かった。チトクロームc_3は塩基性のタンパク質であるためチトクロームc_3中の主要な塩基性アミノ酸であるリジン残基の化学修飾を試みた。修飾剤として2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム(TNBS)を用いた。修飾後、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。飛行時間型質量分析計で質量分析を行った結果、一つのリジン残基が修飾されていることが分かった。これは修飾されたりジン残基がヒドロゲナーゼとの電子伝達に重要な役割を果たしているためであると考えられる。
癌特異的糖鎖抗原の合成酵素遺伝子プロモーターを用いた遺伝子治療

1)転写調節領域の解析ヒトGM2/GD2合成酵素(β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase)ゲノム遺伝子を単離した。次に、転写開始点a、b、cより始まるエキソン1a、1b、1cの5'上流域の転写活性を検討した結果、エキソン1a及び1bの上流域にイントロン1を加えると転写活性は著しく上昇し、この活性の細胞特異性は本酵素遺伝子発現と相関していた。2)GM2/GD2合成酵素遺伝子プロモーターを連結した殺細胞遺伝子発現ベクターによる殺細胞効果の特異性の検討。GM2/GD2合成酵素遺伝子のプロモーター/エンハンサー領域(エキソン1bの上流からイントロン1領域まで)と殺細胞遺伝子(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子)を連結したレトロウイルス発現ベクターを作製した。これを、本酵素遺伝子の高発現細胞株(AS:アストロサイトーマ)に導入し、stable transfectantを樹立した。細胞培養溶液にガンシクロピル(GCV)を添加し細胞増殖抑制効果を検討した結果、親株ではGCV:5v10^<-4>Mにおいても、増殖抑制が認められないが、stable transfectantにおいては、GCV:5x10^<-6>Mで70%以上の増殖抑制が認められた。同様に、本酵素遺伝子の低発現細胞株MeWoに上記のレトロウイルスペクターを導入したstable transfectantでは、GCV添加による増殖抑制がほとんど認められなかった。更に、HSV-TKcDNAをプローブとした各種stable transfectantのSouthern blotを行い、同一コピー数のTK遺伝子が導入されたASおよびMeWoを選出してGCVに対する感受性を比較検討した。この場合においても、TK遺伝子導入ASにおいてGCVによる増殖抑制が認められたが、TK遺伝子導入MeWoでは、ほとんど抑制が認められなかった。癌関連抗原の多くは糖鎖抗原であり、幾つかの癌関連糖鎖抗原は癌の診断、抗体治療に応用されている。その中で、神経外胚葉由来の腫瘍では、酸性糖脂質GD2やGD3が、HTLV-I^+細胞ではGD2の特徴的な発現が認められる。私達はGM2/GD2合成酵素のゲノム遺伝子を単離し、そのプロモーター/エンハンサー領域を解析した。本研究では、このように明らかにされた癌細胞特異的発現を担うプロモーター/エンハンサーと、細胞毒性遺伝子を利用した癌の特異的遺伝子治療法への応用を目的とし、今年度は以下の結果を得た。1)本酵素遺伝子の癌細胞特異的発現を担うプロモーター/エンハンサーとHSV-TK(単純ヘルペスチミジンキナーゼ)遺伝子を連結したレトロウイルス発現ベクターを作製した。2)本酵素遺伝子の高発現細胞株AS(アストロサイトーマ)に上記レトロウイルスベクターを導入し、stable transfectantを樹立した。3)細胞培溶液に種々の濃度のガンシクロビル(GCV)を添加し、細胞増殖抑制効果を検討した結果、親株ではGCV:5x10^4Mでも増殖抑制が認められないが、stable transfectantではGCV:5x10^<-6>Mで70%以上の増殖抑制が認められた。今後、ウイルス溶液を作製し、本酵素遺伝子高発現細胞株および非発現細胞株における殺細胞効果の比較、更にはin vivoにおける抗腫瘍効果について検討を進める。次に、転写開始点

a、b、cより始まるエキソン1a、1b、1cの5 ́上流域の転写活性を検討した結果、エキソン1a及び1bの上流域にイントロン1を加えると転写活性は著しく上昇し、この活性の細胞特異性は本酵素遺伝子発現と相関していた。2)GM2/GD2合成酵素遺伝子プロモーターを連結した殺細胞遺伝子発現ベクターによる殺細胞効果の特異性の検討。GM2-GD2合成酵素遺伝子のプロモーター/エンハンサー領域(エキソン1bの上流からインロトン1領域まで)と殺細胞遺伝子(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子)を連結したレトロウイルス発現ベクターを作製した。これを、本酵素遺伝子の高発現細胞株(AS:アストロサイトーマ)に導入し、stable transfectantを樹立した。細胞培養溶液にガンシクロビル(GCV)を添加し細胞増殖抑制効果を検討した結果、親株ではGCV:5x10^<-4>Mにおいても、増殖抑制が認められないが、stabletransfectantにおいては、GCV:5x10^<-6>Mで70%以上の増殖抑制が認められた。同様に、本酵素遺伝子の低発現細胞株MeWoに上記のレトロウイルスベクターを導入したstable transfectantでは、GCV添加による増殖抑制がほとんど認められなかった。更に、HSV-TK cDNAをプローブとした各種stable transfectantのSouthern blotを行い、同一コピー数のTK遺伝子が導入されたASおよびMeWoを選出してGCVに対する感受性を比較検討した。この場合においても、TK遺伝子導入ASにおいてGCVによる増殖抑制が認められたが、TK遺伝子導入MeWoでは、ほとんど抑制が認められなかった。
細胞膜に存在するチューブリンを含む顆粒とセルロース合成の機構

高等植物細胞の形や伸長方向は細胞壁,特にセルロース微繊維の配向により決定されると考えられている。このセルロース微繊維の配向はどのような機構によって決まるのかは植物の形態形成や細胞分裂の機構を理解するうえで最も重要な課題の一つである。1963年LedbetterとPorterにより細胞表層微小管と細胞壁セルロース微繊維の配向が常に一致することが報告されてから微小管がセルロース微繊維の配向をコントロールしているのではないかと考えられるようになった。その後、多くの観察によりこれは認められることになった。また、ターミナルコンプレックスに発見により微小管とセルロース微繊維の関係を分子レベルで理解しようとする試みもなされてきた。そして多くのモデルが提出されたが、実際分子レベルでその機構を証明するという試みはいまだに成功しなかった。それは、セルロース合成酵素複合体が同定されていなかったことがその理由であった。私は種々の高等植物細胞からチューブリンが主構成成分と思われるセルロース合成酵素複合体粒子を単離することに成功し、その構成分子の構造・性質・機能の解析を行ってきた。このセルロース合成酵素複合体はチューブリンのほか33、42、120kDタンパクなどから構成されていることが明らかになった。33kDタンパクについてはその特異的抗体を用いて金コロイドによる免疫電顕を行うと粒子がラベルされ、さらにセルロース合成も完全に阻害された。また基質であるUDP-グルコースの^<32>Pラベルが33kDタンパクと結合することよりこのタンパクがセルロース合成酵素複合体の中で重要な機能を果たしていることが示唆された。遺伝子のクローニングを行いシークエンスを決定したところ類似タンパクはシロイヌナズナなどにも機能未知の膜タンパクとして存在は知られていることがわかった。33kDタンパクについては特許出願中である。42、120kDタンパクについても進行中である。高等植物細胞はその形態の形成・維持、分裂、分化の過程で微小管をはじめとして細胞骨格系が重要な働きをしているが、それらの機構と関連するセルロース合成制御機構はとりわけ重要である。しかしながら最近までセルロース合成酵素複合体の同定が高等植物において成功していなかったのでその制御機構や表層微小管との相関関係など重要な課題が未解決のまま今日まで残されてきた。我々はチューブリンが組み込まれた直径10nmの顆粒が植物の細胞膜に存在し、しかもこの顆粒がin vitroでセルロースを合成することを発見し、この顆粒の性質・機能の解明に取り組んできた。この10nm顆粒はチューブリンのほか15、33、35、40、42kDのペプチドから構成されており更に65kDタンパクが表面に付随していると考えられた。抗体をウサギから作成し、それぞれの構成タンパクの機能をある程度推測することができた。35kDタンパクに対する抗体をin vitroセルロース合成系に添加すると顕著な阻害効果がみられたが、15kDタンパクに対する抗体ではセルロース繊維の長さの促進がみられた。現在これらの構成タンパクの一次構造の同定と遺伝子のクローニングを目的としてアズキcDNAライブラリーよりこの抗体を用いたスクリーニングによりおよそ100個の陽性コロニーを分離することに成功しているので近い将来これらのタンパクのアミノ酸シークエンスが明らかにできるはずである。バクテリアのセルロース合成酵素には勿論チューブリンは存在しないしそのほかのタンパクもかなり異なっておりその制御機構もかなり植物のものとは異なっているようである。このような植物独自の仕組みを明らかにすることがこの系では可能であると思われる。高等植物細胞の形や伸長方向は細胞壁、特にセルロース微繊維の配向により決定されると考えられている。

このセルロース微繊維の配向はどのような機構によって決まるのかは植物の形態形成や細胞分裂の機構を理解するうえで最も重要な課題の一つである。1963年LedbetterとPorterにより細胞表層微小管と細胞壁セルロース微繊維の配向が常に一致することが報告されてから微小管がセルロース微繊維の配向をコントロールしているのではないかと考えられるようになった。その後、多くの観察によりこれは認められることになった。また、ターミナルコンプレックスの発見により微小管とセルロース微繊維の関係を分子レベルで理解しようとする試みもなされてきた。そして多くのモデルが提出されたが、実際分子レベルでその機構を証明するという試みはいまだに成功しなかった。それは、セルロース合成酵素複合体が同定されていなかったことがその理由であった。私は種々の高等植物細胞からチューブリンが主構成成分と思われるセルロース合成酵素複合体粒子を単離することに成功し、その構成分子の構造・性質・機能の解析を行ってきた。このセルロース合成酵素複合体はチューブリンのほか33、42、120kDタンパクなどから構成されていることが明らかとなった。33kDタンパクについてはその特異的抗体を用いて金コロイドによる免疫電顕を行うと粒子がラベルされ、さらにセルロース合成も完全に阻害された。また基質であるUDP-グルコースの^<32>Pラベルが33kDタンパクと結合することよりこのタンパクがセルロース合成酵素複合体の中で重要な機能を果たしていることが示唆された。遺伝子のクローニングを行いシークエンスを決定したところ類似タンパクはシロイヌナズナなどにも機能未知の膜タンパクとして存在は知られていることがわかった。33kDタンパクについては特許出願中である。42、120kDタンパクについても進行中である。
受精における血小板活性化因子の役割に関する基礎的研究

精子は受精に先立って先体反応を起こすが、その誘起物質としてはZP3・卵胞液・progesterone等が知られている。血小板活性化因子(Platelet-activating factor:PAF)はリン脂質性のケミカルメディエーターであるが、PAFも先体反応を誘起する事が知られている。昨年度の本研究では、精子におけるPAF合成系のkey enzymeであるalkylglycerophosphate:acetyl-CoA acetyltransferase活性がprogesteroneによって亢進する事を明らかにしたが、本年度は精子における本酵素の活性調節機構を検討した。哺乳類の精子は受精に先立って受精能獲得・先体反応といった一連の機能的・形態的変化を起こす。先体反応を誘起する物質としてはZP3・卵胞液・プロゲステロン等が知られているが、リン脂質性のケミカルメディエーターである血小板活性化因子(Platelet-activating factor:PAF)も先体反応を誘起し、プロゲステロンは精子のPAF産生を亢進する事が報告されている。PAFの合成経路には一般にremodeling系とde novo系があるが、我々はラット精子ではPAFは主にde novo系により合成されることを報告した(Mugurauma K,etal:Biol Reprod 56,529,1997)。そこで本研究ではラット精子で、PAFのde novo合成系のkey enzymeであるalkylglycer opheosphate:acetyl-CoA acetyl transfer ase活性が受精能獲得・先体反応の際に変化するかを検討した。