hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境ストレスで生じた遺伝子変異による難治疾患の発症解明-網羅的解析とゲノム編集-

また、変異遺伝子を発症するゲノム編集ノックインマウスの作製に成功した。しかし、ヘテロでは明確な心筋症の発症は認められず、現在ホモマウスを作製している。次世代シーケンサーの不調で解析が遅れているが、修理が完了し、全エクソン領域の遺伝子解析が終了した。現在、大量のデータを解析している。様々な環境ストレスは臓器に遺伝子変異を誘発し、心筋症や癌など致死的な疾患に関与しているが、解析が困難であり、遺伝病以外ほとんど解明されていない。申請者は、組織特異的なストレス誘発変異を解明するため、疾患微量組織から高純度DNAを抽出し、次世代シーケンサーで点突然変異を正確に解析する手法を確立した。組織が微量であることから、2000箇所の既知の心筋症の報告がある変異領域をカスタムパネルで1本のチューブで増幅し、次世代シーケンス解析を行った。この技術を家族歴のない致死性拡張型心筋症の微量心筋に応用し、原因遺伝子を同定した。その結果、心筋のカルシウムを制御する遺伝子で1塩基の欠失した変異が見つかり、この変異は、タンパク質の欠損を誘発していた。この遺伝子の領域を含め全エクソン領域の次世代シーケンス解析を追加解析し、この変異を確認することができた。また、この変異箇所の1塩基手前の変異で家族性心筋症発症が報告されており、申請者が検出した変異が心筋症を誘発している可能性が高いことを示唆している。この変異遺伝子を細胞に導入した結果、細胞内での局在は変化しなかった。そこで、この変異遺伝子を発現するゲノム編集マウスの作製に取り組んだ。ゲノム編集マウスでは、卵管に直接ゲノム編集のためのガイドRNAなどを導入し電気穿孔法で卵管内の受精卵のゲノム編集を行った。その結果、10%前後の成功率で変異マウスの作出に成功したが、いずれも出生直後に死亡し解析まで進んでいない。さらに改良を重ね、疾患変異を再現する染色体相同組換えマウスを作製し拡張型心筋症治療の糸口を見いだす。既知の遺伝子変異では説明ができない心筋症も存在しており、未知の体細胞遺伝子変異を検出するために微量での全ゲノム解析を行う必要がある。現在、MDA法などが報告されているが、様々な問題が見つかっている。これらの問題を解決し未知の体細胞遺伝子変異を解明する必要がある。これまでの明確な遺伝子変異が検出されていない心筋症の組織から全ゲノムDNAを抽出し、全エクソン領域を増幅する。増幅遺伝子を次世代シーケンサーで解析し原因遺伝子の解明を行う。次世代シーケンサーのトラブルが連続したが、機器を新規の機器に入れ換え2回行ったテストランでは良好な結果が得られており、大量のゲノムデータを取得している。このデータ処理をさらに継続する。また、原因遺伝子の解明を加速するため、マウスの卵管内で直接ゲノム編集を行い、高速でノックインマウスを作製する技術を確立することに成功した。この技術を用いて今後、すべての変異ノックインマウスを作製する。次世代シーケンサーの試薬が不良品であり、交換対象になったが、試薬の到着に2ヶ月以上必要だったため。次世代シーケンサーのトラブルが連続し、修理やメンテナンスに時間が必要になった。さらに、修理後の点検でも正常の動作せず、最終的に機器を交換して動作が回復した。機器トラブルのため実験計画に若干の遅れが生じている。
脂肪乳剤による局所麻酔薬中毒治療メカニズムの解明－脳内薬物動態の観点から

ラットに対し脂肪乳剤を前投与することによりブピバカイン、レボブピバカインによる局所麻酔薬の中枢神経毒性(痙攣脳波の出現)・心毒性(血圧低下、心停止)が抑制され、中毒発生に関わる血中濃度閾値が上昇することが判明した。この結果は、脂肪による局所麻酔薬の取り込み(lipid sink)が、脂肪乳剤による局所麻酔薬中毒の治療のメカニズムとして有力であることを裏付ける。その後発表された研究で、容量負荷や直接の心筋収縮力増強作用、細胞内カルシウム濃度の安定化や、脂肪酸代謝の改善による心筋へのエネルギー供給の改善などが、脂肪乳剤による局所麻酔薬中毒の治療に関する新たなメカニズムとして提唱されるに至った。以下に示す実験データの再確認を行った。実験動物として8-9週齢のSprague-Dawley系雄ラットを用いた。実験数日前にケタミン麻酔下で定位脳固定装置に固定し、側座核(nucleus accumbens)に双極貼合せ電極(ユニークメディカル)を留置、歯科用セメントで固定の後に覚醒させた。実験当日、セボフルラン麻酔下で頸動静脈および大腿静脈にカテーテルを留置後に覚醒させ、ポリコーダを用いて血圧・心拍数の持続測定を行った。循環動態が安定し、血液ガスが正常範囲にあることを確認後にPower Lab (AD instrumentsジャパン)を用いて脳波測定を開始した。生食または脂肪乳剤(Intralipid,フレゼニウス・カービ)を3 ml/kg/minで5分間投与し、投与終了後、ブピバカインまたはレボブピバカインを1 mg/kg/minで持続投与を開始した。脂肪乳剤の投与により血圧・心拍数は変化せず、血液ガスデータにも変化は認められなかった。ブピバカインおよびレボブピバカインの投与に伴い、投与前に較べて平均血圧は有意に上昇、心拍数は有意に低下した。平均血圧が約50%上昇した時点で何れのラットにおいても脳波上で痙攣波が出現し、ほぼ同時にtonic-clonic movementが認められた。さらに投与を続けると血圧・心拍数の低下、心停止を生じた。痙攣発生時および心停止時に採血し、血液ガスおよびブピバカイン、レボブピバカインの血中濃度を測定したところ、脂肪乳剤の投与により、痙攣発生および心停止までのブピバカイン、レボブピバカインの投与量が増加し、痙攣誘発時および心停止時のブピバカイン、レボブピバカインの血中濃度とも、脂肪乳剤を投与しない場合に比べて有意に増加することが明らかになった。以上の結果を原著論文として欧文誌上で発表した。局所麻酔薬の中枢神経毒性・心毒性および局所麻酔薬による中毒症状に対する脂肪乳剤の効果に関するreviewを行った。動物としてラットを用い、覚醒状態で脳波、血圧、心拍数のモニタリングのもとに局所麻酔薬を静注した際のブピバカイン、レボブピバカインの痙攣誘発閾値の投与量は5.9、7.7 mg/kgで、20%脂肪乳剤の投与により各々8.8、10.0 mg/kgに有意に上昇した。また痙攣を生じた際の血中濃度は、脂肪乳剤を投与しない場合は7.9、10.9 micro g /mlで、脂肪乳剤の投与により各々12.9、17.5 micro g /mlへと有意に上昇した。従って脂肪乳剤はブピバカイン、レボブピバカインによる中枢神経毒性を有意に低下させることが明らかになった。また心停止を生じた際のブピバカイン、レボブピバカインの投与量は各々7.1、9.4 mg/kgで、脂肪乳剤の投与により10.2、13.7 mg/kgへと有意に増加した。心停止時のブピバカイン、レボブピバカインの血中濃度は各々21.6、29.2 micro g/mlで、脂肪乳剤の投与により41.4、47.6 micro g/mlへと有意な上昇が認められた。なお、一連の研究から、ブピバカインを用いた場合は痙攣発症から心停止までの時間が短い点がリドカインと異なるが、これはブピバカインの心毒性には中枢神経が大きく関与しているからであると考えられた。また、脂肪乳剤は心停止からの蘇生効果を有することが海外での動物実験から示されているが、その際には低酸素状態を避けるための人工呼吸が不可欠であるとされる。今回用いた実験系は中枢神経毒性の評価を目的とするため覚醒状態の動物を用いており、中枢神経毒性、即ち痙攣発症後に脂肪乳剤を投与し、その効果を検討することは困難であることが明らかになった。以上は原著論文として欧文誌上で発表するとともに、一連の研究についてreview articleとして発表した。局所麻酔薬の定量に関して、以下に示す実験結果の再確認を行なった。ラットに対して脂肪乳剤(20% Intralipid)を3 ml/kg/minで5分間投与後にブピバカインを投与した。

動脈血を採取し、通常速度(3,000 rpm)で10分間遠心したところ、脂肪と血漿が同一層内で分離せず、ブピバカイン濃度の定量が困難であることが判明した。次に脂肪の除去のため、同ラットより得られた全血0.1 mlにブピバカインを加えた上で2段階の抽出を試みた。炭酸ナトリウム(1 mol/l)によりアルカリ化を行い、酢酸エチルを加えて撹拌・遠心した。上層(有機層)を採取し、硫酸を入れた試験管に移して撹拌・遠心し、有機層から再度水層への抽出を行なった。その後上層(有機層)を除き、残った層に水酸化ナトリウムを加え、減圧下で蒸発乾固した。得られた固体を高速液体クロマトグラフー質量分析装置用移動相(5 mM炭酸アンモニウム(pH 5.0)とアセトニトリルを容量比1:1で混合)に溶解したところ、脂肪が完全に除去されていないことが判明した。そこで脂肪乳剤を含んだ血液を、高速遠心装置を用いて15,000 x gで10分間遠心を行なったところ脂肪層と血漿が分離され、上述の方法でブピバカインを抽出した結果脂肪を含まず、定量が可能であった。高速液体クロマトグラフー質量分析装置により、リドカインと同様の分析条件で定量が可能で、さらに本法はヒト血漿に対しても応用が可能であることが判明した。ラットを用いた以下のin vivoの実験結果を再検した。定位脳固定装置を用いてラット脳内に留置した電極で脳波を測定したところ、ブピバカインの持続投与により徐波化が生じ、その後痙攣波が出現した。以上の結果について学会発表予定であるとともに、今年度中に論文の投稿を予定している。脂肪乳剤による薬物中毒の治療に関する新たな情報を収集し、そのメカニズムについて学会講演とともに論文発表を行った。中毒の原因となる局所麻酔薬は主にブピバカイン、レボブピバカイン、ロピバカイン等の長時間作用型局所麻酔薬で、中毒症状としては従来報告されている重度の不整脈や徐脈、心停止に加え、興奮や痙攣などに関する報告が多かった。一方市販薬に含まれるジブカインによる中毒も新たに報告された。局所麻酔薬中毒の治療薬として脂肪乳剤の効果はほぼ周知されたと考えられ、ほとんどの症例で中毒症状の発現後、早期に脂肪乳剤の投与がなされていた。従来から脂肪による局所麻酔薬の取り込み、すなわちlipid sinkが、脂肪乳剤による局所麻酔薬中毒の治療のメカニズムとして提唱されてきたが、パッチクランプ法を用いた最近の電気生理学的検討でも、脂肪乳剤が細胞内のブピバカインの濃度を大きく低下させることが裏付けられている。薬物動態に注目して血中および組織内の濃度を検討した研究では、脂肪乳剤の投与により心筋・脳・肺組織でのブピバカインの濃度は20-50%低下し、肝臓内の濃度は上昇することから、脂肪乳剤により肝臓での取込みおよび代謝が増加していることが裏付けられた。一方近年の研究からはlipid sinkのみではその効果を説明するには不十分で、脂肪乳剤の多量投与による容量負荷や直接の心筋収縮力増強作用、脂肪酸代謝の改善による心筋へのエネルギー供給の改善などが新たなメカニズムとして明らかにされるに至った。とくに脂肪酸代謝の改善については、拮抗薬を用いた場合には脂肪乳剤による蘇生効果が消失する点からも、直接の関与が示唆される。
アフリカのエイズ問題改善策:医学と歴史、雑誌と小説からの包括的アプローチ

三つの成果がありました。(1)性感染症でもあるために、アフリカのエイズの状況がかなり複雑で、危機的になっているのが再認識された、(2)免疫不全の病気と戦うためには病気をより広い観点から捉える必要性があるのを再確認した、(3)利益を最優先し、多剤治療一辺倒の先進国や製薬会社が報道を恣意的に操って来たために、先進国ではアフリカのエイズの誤ったイメージが定着しているのを再認識した、ことです。それらを活字にしました。アフリカのエイズの問題をより広い観点から包括的に捉えるために、雑誌やアフリカ文学からアフリカ人の声に耳を傾けて現在のアフリカのエイズ問題を改善する方策を探るのが全体の課題です。平成21年度は、「雑誌とメディアからアフリカ人の声を聞く(1New African, 2AIDS Conference 2000とムベキ発言の真意)」を軸にアフリカ人がエイズをどう捉えているのか、エイズのとらえ方がどう変遷したのか、などに焦点をあてました。特に、2000年のダーバンの国際エイズ会議でのムベキ元大統領の発言を検証するなかで、ムベキの真意とその提言の意図するものを検証しました。同時に、次年度「アフリカ文学からアフリカ人の声を聞く」に向けて、東アフリカや南部アフリカの小説を読み進めています。ケニアの小説を扱った"Human Sorrow : -AIDS Stories Depict An African Crisis-"を大学英語教育学会九州沖縄支部ESP研究会の「ESPの研究と実践」第8号(2009年)に発表し、次年度以降にも取り上げるWamugunda Geteria著Nice Peopleの翻訳(抄訳11本)とエイズとアフリカについての記事(9本)を横浜の門土社のメールマガジン「もんど通信MonMondo」に連載しました。連載は現在も継続中です。(基本的には一月に翻訳一本、記事一本の連載です。)門土社からは過去7冊(うち英文書4冊)の図書を出版してもらっていますが、本年度11月刊行に向けて『ナイスピープル』(Nice People)の翻訳の仕上げをしています。また、平成21年度最大の課題であった2000年のダーバン会議でのムベキの発言については「タボ・ムベキの伝えたもの:エイズ問題の包括的な捉え方」にまとめて「ESPの研究と実践」第9号(2010年出版予定)に投稿しました。平成22年度は、前年度に引き続き「雑誌とメディアからアフリカ人の声を聞く」趣旨で、(1 New African)を軸にアフリカ人がエイズをどう捉えているのかに焦点をあて、(1)エイズの起源、(2)統計の正確さ、(3)エイズ検査の正確さ、(4)薬剤の毒性、(5)報道の取材範囲、(6)貧困の6つの点に絞ってまとめているところです。同時に、最終年度のシンポジウムの第1回打ち合わせを服部晃好医師と行ない、東アフリカや南部アフリカの小説も継続して読み進めています。「タボ・ムベキの伝えたもの:エイズ問題の包括的な捉え方」を大学英語教育学会九州沖縄支部ESP研究会の「ESPの研究と実践」第9号(2010年)に発表し、Wamugunda Geteria著Nice Peopleの翻訳(抄訳12本)とエイズとアフリカについての記事2本)を横浜の門土社のメールマガジン「もんど通信MonMondo」に連載しました。門土社からは過去7冊(うち英文書4冊)の図書を出版してもらっていますが、本年度11月刊行(一年延期)に向けて『ナイスピープル』)(Nice People)の翻訳の最終作業に入っています。また、「マスメディアと『ニューアフリカン』」(仮題)を「ESPの研究と実践」第10号(2011年出版予定)に投稿するために準備中です。アフリのエイズの問題をより広い観点から包括的に捉えるために、雑誌やアフリカ文学からアフリカ人の声に耳を傾けて現在のアフリカのエイズ問題を改善する方策を探るのが全体の課題てす。平成23年度は引き続き「雑誌とメディアからアフリカ人の声を聞く」という趣旨で、(1 New African)を軸にアフリカ人がエイズをどう捉えているのかに焦点をあてました。論文にまとめ、「『ニューアフリカン』から学ぶアフリカのエイズ問題」を大学英語教育学会九州沖縄支部ESP研究会の「ESPの研究と実践」第10号(2011年)に発表しました。エイズとアフリカについての記事(10本)とジンバブエ滞在記(10本)を横浜の門土社のメールマカジン「もんど通信MonMondo」連載しました。

(門土社からは過去7冊(うち英文書4冊)の図書を出版してもらっていますが、近日刊行予定の『ナイスピープル』(Nice People)の翻訳の最終作業に入っていますが、まだ出版されていません。)まとめとして、11月26日に宮崎大学医学部でシンポジウム「アフリカとエイズを語る-アフリカを遠いトコロと思っているあなたへ-」を開催しまた。私は「アフリカと私:エイズを包括的に捉える」を発表しました。他の発表者と演題は以下この通りです。服部晃好:「HIV/AIDSとアフリカ:東アフリカでの経験から考える」山下創:「ウガンダ体験記:半年の生活で見えてきた影と光」小澤萌:「ウニア体験記:国際協力とアフリカに憧れて」天満雄一:「ザンビア体験記:実際に行って分かること」が発表南部みゆきさん(同僚の講師)が司会進行役をつとめました。毎日新聞の取材があり、翌日の新聞に報告記事「アフリカの現実を知って宮大医学部でHIVシンポ」が出ました。
分子生物学的解析によるスギのカリウムイオン膜輸送機構の解明

本研究は、針葉樹のカリウム(K)イオン膜輸送メカニズムを分子レベルで解明し、成長・生理過程へのKイオン膜輸送の関連性を明らかにすることを目的としている。本年度は、主に以下の点について研究を行った。(1)スギKイオンチャネル遺伝子(CjTPK1)のcDNAを鋳型として、cRNAの合成を行った。昨年度難航したcRNA合成について、手法を確立した。しかし、合成したcRNAを用いたKイオン電流の測定には至らなかった。(2)CjTPK1およびスギKイオントランスポーター遺伝子(CjKUP2-4)を対象として、分化中木部における発現パターンについて定量RT-PCRによりさらに解析を行った。その結果、CjTPK1とCjKUP3の発現量は、晩材形成期よりも早材形成期の方が有意に高いことが分かった。一方、CjKUP2の発現量は晩材形成期の方が早材形成期と比べて有意に高かった。また、CjKUP4の発現量は早材形成期と晩材形成期の間で大きな差は見られなかった。以上の結果から、スギの分化中木部では、Kイオン膜輸送体遺伝子の発現は遺伝子によってパターンが異なり、また時期によってKイオン膜輸送を担う主要な輸送体が異なる可能性が示された。(3)RACE法により、新たなスギのKイオントランスポーター候補遺伝子(Cj6570)を単離した。配列解析を行った結果、Cj6570がコードするタンパク質は既知のKUP/HAK/KT系トランスポーターと相同性を有することが明らかになった。さらに、KUP/HAK/KT系トランスポーターに特徴的な構造をすべて持つ(膜内にN末端、12個の膜貫通部位、2番目と3番目の膜貫通部位間に長いループ)と推定された。カリウム(K)イオンは、樹木の成長や生活に必須な陽イオンである。樹木の様々な生理過程におけるKイオンの働きは、細胞の生体膜を横切るKイオンの選択的取り込み・排出調節(膜輸送)と密接に連動しており、この膜輸送はチャネル、トランスポーターと呼ばれる膜タンパク質(膜輸送体)が担っている。本研究は、針葉樹(スギ)のKイオン膜輸送メカニズムを分子レベルで解明し、成長・生理過程へのKイオン膜輸送の関連性を明らかにすることを目的としている。本年度は、スギのKイオンチャネル候補遺伝子のCjTPK1とCKT1、Kイオントランスポーター候補遺伝子のCjKEA1について、機能解析と発現解析を行った。機能解析では、大腸菌のKイオン取り込み能欠損株(LB2003株)を用いた相補性試験を行い、Kイオン取り込み機能の解析を行った。その結果、CjTPK1、CKT1、CjKEA1ともにKイオン取り込み活性を持つことが明らかになった。また、CKT1によるKイオン取り込みはセシウム、マグネシウム、アンモニウムの各イオンに影響を受け、CjKEA1によるKイオン取り込みはセシウム、カルシウムの各イオンに影響を受けることが分かった。発現解析では、スギの苗木から針葉、分化中木部、内樹皮、根の試料を採取し、リアルタイムRT-PCRにより各遺伝子の発現量を定量的に解析した。その結果、CjTPK1は分化中木部で他の部位よりも発現量が高かった。CKT1の発現量は根よりも地上部で高く、地上部では針葉と分化中木部で高かった。そして、CjKEA1の発現量は内樹皮よりも針葉、分化中木部、根で高かった。本年度の研究から、3個のスギKイオン膜輸送体候補遺伝子について、遺伝子産物(輸送体)のKイオン輸送機能や樹体内での発現の特性について新規の知見を得た。3個のスギ由来Kイオン膜輸送体遺伝子(Kイオンチャネル遺伝子2個、Kイオントランスポーター遺伝子1個)について、機能解析によりKイオン取り込み活性に関する知見を得ることができた。そして、発現解析により、4部位(針葉、分化中木部、内樹皮、根)における各遺伝子の発現量データを多く得ることができた。並行して、雄花と雌花の試料採取、RNA抽出、そして逆転写によるcDNA合成も行った。次年度以降、より多くの部位で詳細に発現解析を進めていくための準備は完了している。本年度は、スギのKイオントランスポーター候補遺伝子であるCjKUP2について、機能解析と発現解析を行った。さらに、新たなKイオントランスポーター候補遺伝子であるCjKUP4をスギからRACE法により単離し、CjKUP2と同様の解析を行った。機能解析では、大腸菌のKイオン取り込み能欠損株(LB2003株)を用いた相補性試験を行った。その結果、CjKUP2、CjKUP4ともにKイオン取り込み活性を持つことが明らかになった。また、CjKUP2によるKイオン取り込みはセシウム(Cs)イオン、カルシウム(Ca)イオン、マグネシウムイオン、アンモニウムイオンの各イオンに影響を受け、CjKUP4によるKイオン取り込みはCsイオンとCaイオンに影響を受けることが分かった。発現解析では、スギの苗木または成木から針葉、分化中木部、内樹皮、根、雄花、そして雌花の試料を採取し、リアルタイムRT-PCRにより各遺伝子の発現量を定量的に解析した。その結果、CjKUP2、CjKUP4ともに、今回解析を行った全ての部位で発現が見られた。

雄花におけるCjKUP2の発現量は他の部位よりも高く、雄花の分化が進むにつれて増加した。CjKUP4の発現量も雄花において他の部位よりも高く、特に分化中の雄花で高かった。本年度の研究から、2個のスギKイオントランスポーター候補遺伝子について、遺伝子産物(トランスポーター)のKイオン輸送機能や樹体内での発現の特性について新規の知見を得た。2個のスギ由来Kイオントランスポーター遺伝子について、機能解析によりKイオン取り込み活性に関する知見を得ることができた。そして、発現解析により、スギ樹体内の各部位(針葉、分化中木部、内樹皮、根、雄花、雌花)における2遺伝子の発現量データを得ることができた。各部位の試料からのRNA抽出、逆転写によるcDNA合成も新たに行った。次年度、機能解析および発現解析を引き続き行うための準備は完了している。本研究は、針葉樹のカリウム(K)イオン膜輸送メカニズムを分子レベルで解明し、成長・生理過程へのKイオン膜輸送の関連性を明らかにすることを目的としている。本年度は、スギのKイオントランスポーター候補遺伝子であるCjKUP3遺伝子について、機能解析と発現解析を行った。機能解析では、大腸菌のKイオン取り込み能欠損株(LB2003株)を用いた相補性試験を行った。その結果、昨年度まで解析を行ってきた他のスギ由来Kイオン膜輸送体と同様に、CjKUP3タンパク質はKイオン取り込み活性を持つことが明らかになった。そして、CjKUP3タンパク質によるKイオン取り込みは、セシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオンの存在に影響されることが分かった。発現解析では、スギの様々な部位・発達段階におけるCjKUP3遺伝子の発現量を、定量RT-PCRにより測定した。雄花では、発現量は花粉母細胞期から減数分裂期にかけて大きく上昇し、四分子から小胞子が分離する時期にはさらに上昇した。その後、発現量は大きく低下し、成熟期まで低いままだった。減数分裂期や小胞子分離期の雄花での発現量は、その他の部位(針葉、内樹皮、分化中木部、根、雌花)と比べて高かった。雌花での発現量は、減数分裂期と小胞子分離期の雄花よりは低かったものの、雄花の他の発達段階や針葉、内樹皮、分化中木部、根よりも高かった。以上のことから、CjKUP3遺伝子は主に生殖器官の細胞においてKイオンの取り込みに関与していることが示唆された。本年度はさらに、スギKイオンチャネルについてKイオン輸送機能の電気生理的解析を試みた。しかし、作業が想定以上に難航し、対象チャネルcDNA由来cRNAの合成やKイオン電流の測定までは至らなかった。平成29年度は、実施期間の最終年度として全ての解析を完了させ、国内・国際学会での発表や成果報告書の発行による研究成果の公表を目指していた。新たに1個のスギKイオントランスポーター遺伝子について、Kイオン取り込み活性とスギ樹体内での発現パターンに関する知見を得ることができたが、研究代表者の学内・学外業務が多忙で、さらに電気生理解析も想定以上に難航するなど、研究に遅れが生じた。そのため、補助事業期間延長の申請を行い、平成30年度での研究完成を目指すこととなった。本年度は、主に以下の点について研究を行った。
動脈硬化発症機序としての血管ミトコンドリア異常

ミトコンドリアは呼吸・エネルギー産生を通じて細胞の生存に必須の細胞内器官であるが、その課程で大量の酸素を消費し電子伝達系からのelectron leakageが頻発することから、体内で最大の活性酸素種発生源となっている。ミトコンドリア遺伝子異常による先天性疾患・ミトコンドリア脳筋症MELASにおいては異常ミトコンドリアが血管に集積し脳血管障害を多発することが知られており、その機序の一つに酸化ストレスのが報告されている。そこでMELAS児において高解像度超音波診断装置にて評価した内皮を介した血流依存性血管拡張反応を評価したところ、所謂古典的危険因子を有しないにも関わらずMELAS児ではその反応が殆ど消失していた。これに対して抗酸化ビタミンCを急性投与したところ内皮依存性血管拡張反応はほぼ正常レベルまで回復した。この事実は、ヒトのミトコンドリア機能異常において過剰に活性酸素種が産生され血管内皮機能異常を通じて心血管病をもたらすことを示唆する。CoQ10は,ユビキノンと呼ばれる脂溶性のビタミンE様物質で,生体内では還元型のCoQH_2(ユビキノール)としてラジカル捕捉活性を示し,ミトコンドリア電子伝達系の抗酸化防御反応に重要な役割を果たしている。そこで、健常集団を対象に動脈硬化と血中CoQH_2濃度との関連について検討した。解析の結果、血中CoQH_2濃度は、メタボリックシンドロームの関連因子であるBMI, TG,血圧,インスリン抵抗性の指標HOMA-R,酸化ストレスマーカーのMDA-LDLと、予想に反して有意な正の相関を示した。また,CoQH_2は血管内皮機能の低下,総頸動脈プラークスコアの進展とともに上昇し、重回帰分析の結果,CoQH_2はこの両者の独立した規定因子であることが判明した。即ち、メタボリックシンドロームに伴う無症候性動脈硬化においてはCoQH_2の欠乏はみられず、むしろCoQH_2が酸化ストレス存在下で代償的に上昇する可能性が示唆される。近年、高血圧・高脂血症・糖尿病などの所謂「生活習慣病」急激な増加に伴い、これらの症候群にもたらされる心血管合併症の機序解明と対策が急務となっている。活性酸素種による脂質過酸化や核酸や蛋白の修飾は、加齢や癌の発症プロセスに密接に関連することが示唆されてきたが、高血圧・高脂血症・糖尿病における血管病変形成に重要な役割を果たすことが明らかになっている。活性酸素種の産生源であるキサンチンオキシダーゼ・NAD/NADPHオキシダーゼなどが動脈硬化病変において発現しており、炎症性サイトカインや血管収縮ペプチドなどの種々の動脈硬化促進因子により、活性酸素種産生が刺激されることが報告されているが、これらをターゲットとした治療戦略が必ずしも成功しているとは言い難い。そこで、我々は先天的なミトコンドリアtRNAの変異により起こるミトコンドリア脳筋症において、若年発症の血管病が多発しその血管内皮細胞に異常ミトコンドリアが集積することに着目した。血管内皮は一酸化窒素NOを始めとする多くの血管作動物質を産生し局所血流を維持するのみならず血球成分の接着迷入抑制・脂質沈着や細胞外基質増加抑制などを通じてそれ自身で血管保護作用を有する。

そこで、この遺伝的ミトコンドリア機能異常症の患者において、内皮由来NOにより制御されている血流依存性血管拡張反応を評価したところ、その反応が殆ど消失していることを発見し、これが抗酸化ビタミンであるアスコルビン酸・トコフェロールの投与により劇的に改善することを報告した。この事実は、ヒトのミトコンドリア機能異常において過剰に活性酸素種が産生され血管内皮機能異常を通じて心血管病をもたらすことを示唆する。ミトコンドリアは呼吸・エネルギー産生を通じて細胞の生存に必須の細胞内器官であるが、その課程で量の酸素を消費し電子伝達系からのelectron leakageが頻発することから、体内で最大の活性酸素種発生源となっている。ミトコンドリア遺伝子異常による先天性疾患・ミトコンドリア脳筋症MELASにおいては異常ミトコンドリアが血管に集積し脳血管障害を多発することが知られており、その機序の一つに酸化ストレスのが報告されている。そこでMELAS児において高解像度超音波診断装置にて評価した内皮を介した血流依存性血管拡張反応を評価したところ、所謂古典的危険因子を有しないにも関わらずMELAS児ではその反応が殆ど消失していた。これに対して抗酸化ビタミンCを急性投与したところ内皮依存性血管拡張反応はほぼ正常レベルまで回復した。CoQ10は,ユビキノンと呼ばれる脂溶性のビタミンE様物質で,生体内では還元型のCoQH_2(ユビキノール)としてラジカル捕捉活性を示し,ミトコンドリア電子伝達系の抗酸化防御反応に重要な役割を果たしている。そこで、健常集団を対象に動脈硬化と血中CoQH_2濃度との関連について検討した。解析の結果、血中CoQH_2濃度は、メタボリックシンドロームの関連因子であるBMI, TG,血圧,インスリン抵抗性の指標HOMA-R,酸化ストレスマーカーのMDA-LDLと、予想に反して有意な正の相関を示した。また,CoQH_2は血管内皮機能の低下,総頸動脈プラークスコアの進展とともに上昇し、重回帰分析の結果,CoQH_2はこの両者の独立した規定因子であることが判明した。即ち、メタボリックシンドロームに伴う無症候性動脈硬化においてはCoQH 2の欠乏はみられず、むしろCoQH2が酸化ストレス存在下で代償的に上昇する可能性が示唆される。
「越境的文化」と文化的アイデンティティの「領域性」再考

文化的アイデンティティと「領域性」の問題を、国境地帯における文化的アイデンティティをめぐる言説と、領土をもたないが主権をもつという国際法主体をめぐる言説の分析を通して再検討した。そこから、文化的アイデンティティがしばしば特定の領域と結びつけてとらえられることの背景には国民国家的思考が埋め込まれていること、また領域に縛られない文化的空間概念を提示していく必要性が浮かび上がった。本研究は、「越境的文化」をめぐる言説に着目することにより、文化的アイデンティティと領域性の関係、そして従来の空間概念について再考することを目的としている。本年度はまず、1.グローバル化による「脱領土化」に関して行われてきた先行研究を丁寧に収集するとともに、批判的に検討した。同時に、2.グローバル化とは異なる文脈のなかで、文化的アイデンティティと「領域」との関係を問い直していこうとする言説に着目し、考察を行った。そして、3.海外調査を、領土をもたないが主権をもつという「マルタ騎士団(国)」について調べるために実施した。具体的には、(1)フランス・パリ市の「マルタ騎士団(国)」の事務所での文献や資料の収集並びにインタビュー調査、そして(2)イタリアのローマ市にある「マルタ騎士団(国)」の本部ビル内の図書館での文献調査を実施した。また(3)「マルタ騎士団(国)」が最後に統治をしていた領土であるマルタ島において、現在の「マルタ共和国」の人々が「マルタ騎士団(国)」の歴史をどのように継承しようとしているのかについて調査を実施し、関連する文献や資料の収集を行った。そうしたなかで、近代国民国家形成の過程で成立した「領域性」の概念について、また「国民国家的思考」にとらわれない文化的アイデンティティと「領域性」の問題について再検討した。その際、4.他大学の研究者と空間概念や文化的アイデンティティと領域性の問題についての意見交換も行った。次年度は、今年度の調査結果を踏まえながら、フランスのアルザス地方で調査を実施し、「越境的文化」をめぐる言説、そして文化的アイデンティティと「領域性」の問題について、研究を深める予定である。本年度は、1.ひきつづきグローバル化による「脱領土化」に関して行われてきた先行研究を批判的に検討するとともに、2・海外調査を中心に研究を実施した。まず、(1)今日では領土をもたないが主権をもつ国家となっている「マルタ騎士団(国)」(Sovereign Mihtary Hospitaller Order of St.John of Jerusalem of Rhodes and of Malta)が、13世紀後半から14世紀前半まで本拠としていたキプロス島、およびその後14世紀前半から16世紀前半まで本拠としていたロドス島を訪れ、騎士団(国)の歴史が現在どのように継承されているのか、調査を行った。また今日のキプロスでは、北キプロス・トルコ共和国とキプロス共和国(南キプロス)の間で島の分断が続いており、国連が緩衝地帯(グリーン・ライン)を設けて管理しているが、その境界地帯にも赴いて現在の状況を観察するとともに、住民への聞き取り調査を実施した。かつて統一されていた島の分断が、文化的アイデンティティや空間概念にどのような影響をおよぼしているのか、考察を行った。それと同時に、関連する文献・資料も収集した。次に、(2)ドイツやスイスと国境を接しているフランスのアルザス地方において調査を実施した。アルザスの言語文化政策にかかわっていた議員や、県の地域言語文化政策担当者、アルザスの言語・文化の復権運動を続けている活動家にインタビュー調査を行った。また、言語復権運動団体が主催する文化イベントにおいて、観察調査も行った。これらを通して、文化的アイデンティティと領域性の問題、また空間概念について考察を行った。本研究は、「越境的文化」をめぐる言説に着目することにより、文化的アイデンティティと領域性の関係、そして従来の空間概念について再考することを目的として実施した。最終年度である本年度の研究では、1,先行研究で示されてきた新しい空間認識や相互関係を捉えるための概念を、引き続き批判的に検討した。そして2.海外での補足調査をフランスのストラスブール市およびパリ市で実施した。(1)ストラスブール市では、アルザスの歴史や文化、言語が学校でどのように教えられているのか、また教えていけばよいと考えられているのかについて、研究者や教員、地域圏や県の言語・文化問題担当者、地域運動家に話を聞き、これまで得られてきた知見を補足する調査を行った。また、アルザスの文化や文化的アイデンティティについて、詩人や作家がどのように表現してきたのか、関連する資料の収集を行った。他方、フランス・マルタ騎士団の支部の方に「マルタ騎士団(国)」のメンバーや組織の活動について、また領土のない国家であることにかかわりインタビュー調査を実施し、関連する資料の収集も行った。(2)パリ市では、本研究テーマに関連して、研究者と意見交換を行った。また、大統領選挙が近づく中、各政党が人々の間の差異、国家間やEU域内/域外といった境界をどのように設定しようとしているのか、その見解を確認した。

これらの調査を通して、地域レベルでみられる「越境的文化」や国家に縛られない空間概念についての言説と、国家レベルでみられる文化的アイデンティティについての言説をまとめるとともに、特定の領土に縛られることのない文化的アイデンティティについて、一定の知見を得ることができた。
複数筋群協同作業時の末梢血流分配に関する研究

本研究は、複数の筋が同時に活動した時に、末梢血流量が各筋にどのように分配されるかを明らかにして、筋量の増加に伴う末梢循環系の調節システムを明らかにすることを目的としている。血流量の測定はラバ-ストレンゲ-ジを用いた静脈閉塞法によった。対象とした運動は、仰臥位姿勢での、足底屈運動(P)、掌握運動(H)、肘屈曲運動(EF)、肘伸展運動(EE)であり、いずれも60回/分の動的運動とした。5種類のプロトコ-ルで実験を行い、次のような結果が得られた。1、10%MVCの負荷運動を(P10)を30秒間行い、その後30,50,70%MVC負荷の掌握運動(H30,H50,H70)を付加した手足同時運動を3秒間実施したところ、P10H50,P10H70運動後の下腿血流量(CBF)はコントロ-ルのP10・60s運動に対して有意な減少を示した。下腿血流抵抗は、P10H70運動後に有意な増加を示した。2、H10にP30,50,70運動を付加するとFBFはH10P50では有意な減少を示したが、H10P70では有意な増加を示した。3、P10運動の2,5,10分目からExhaustionまでのH50運動を付加すると、CBFはいずれも有意な減少を示した。4、P10運動の10分目からH50を付加してExhaustionまで行わせると、CBFと下腿血管コンダクタンスの有意な減少と同時に、微小神経電図法により記録した膝窩部脛骨神経からの交感神経活動の亢進が見られた。5、P10運動に、EF10,EF50,EE10,EE50運動を付加するとEF50,EE50ではCBFの減少が見られたが、有意であったのはEF付加のみであった。以上の結果から、複数筋群が同時に活動すると、活動筋への血流量減少が起こることが認められた。そして、この減少が低強度の運動に50%MVC以上の高い強度の筋運動が付加された場合に起こり得ることが確認された。本研究は、複数筋群が活動する運動時の末梢循環調節を明らかにすることを目的とし、次の2種類の実験を行った。1)下腿と前腕に1/3MVC相当の負荷を与えた60秒間の動的運動(60回/分)を、それぞれ単独に、あるいは同時に行わせて、下腿と前腕の血流量(Venous Occluslon Method)、VO2,HRを測定した。2)10%MVC相当の足底屈運動を30秒間行い、その後も安静を保っている場合と、30,50,70%MVC相当の手掌握運動を30秒間加えて、手・足同時に運動した時の、運動終了直後の下腿と前腕の血流量を測定した。得られた結果を要約すると以下の通りである。1、前腕・下腿ともに30%MVC強度の運動を同時に行った時の前腕・下腿血流量は、それぞれが単独に運動した時と有意差がなかった。しかし、全身のVo2とHRは各運動の単純加算より小さく、両体肢の血流が局所的には影響されないような運動において、中枢性の呼吸循環系応答は抑制的加算になっていることが明らかになった。

2、前腕を非活動状態にして、10%MVC相当の足底屈運動を行った時の下腿血流量は、9.836±0.961ml・100ml^<-1>・min^<-1>であった。30%MVC相当の手掌握運動を加えても、下腿血流量は有意な変化を示さなかった。しかし、50,70%MVC相当の手掌握運動を加えると、それぞれ8.489±0.675と7.038±0.66850ml・100ml^<-1>・min^<-1>となり、30%MVC運動時に比べて50%MVCでは5%、70MVCでは1%の危険率で有意に減少した。前腕血流量は10,30%MVCで有意に増加して、50,70%MVCでプラ-ト-に達していた。3、以上のように、前腕・下腿ともに1/3MVC強度の運動では、同時に運動しても各体肢の血流が影響されることはなかったが、軽度の下腿運動に50%MVC以上の強度の高い前腕運動を加えると、血流増加が抑制されることがわかった。したがって、他の体肢の活動による末梢血流の再分配には運動強度の影響の大きいことが示唆された。本研究は、複数の体肢が同時に運動した場合の各体肢への血流再分配を明らかにすることであった。前年度までの研究に於いて、低強度の足底屈運動に高強度の掌握運動を付加すると、下腿血流量の増加抑制の起こるのに対し、両体肢の強度が同等であれば、血流量の増加抑制は起こらないことが明らかにされている。そこで、本研究では、足底屈運動に上腕運動を付加して、同時運動時にみられる血流量増加抑制が、前腕より活動筋量の多い上腕運動の付加によっても起こるかどうかを明らかにすることを目的としている。被検者は20ー22歳の健康な女性6名とし、仰臥位で10%MVC相当の負荷を持ち上げる動的運動を10分間実施させた。足底屈運動(P)実施に加えて、2ー4分迄の2分間は10%MVC相当の上腕運動、6ー8分の2分間は50%MVC相当の上腕運動を付加した。上腕運動は肘関節90°Cの位置から10°C伸展する肘伸展運動(EE)と10°C屈曲する肘屈曲運動(EF)の2種類とし、それぞれ別の日に実施した。運動中、心拍数(HR)、酸素摂取量(Vo2)、血圧(BP)を連続的に測定し、血流量(Venous occlusion method)は毎分5秒間、運動を停止して測定した。その結果、HR,Vo2,BPともに10%MVCの上腕運動付加時には大きな変化は見られなかったが、50%MVC運動付加所には有意な増加を示した。P運動実施中の活動肢の下腿血流量は安静時に対して平均4ー7ml/100ml/minの有意な増加を示した。上腕運動付加時にはEE、EF運動ともに付加前に比べて減少する傾向を示したが、その差は有意ではなかった。しかし、血管コンダクタンス(血流量/平均血圧)を求めると、50%MVC強度のEF運動付加時には付加2分後に有意な減少を示した。50%MVC強度のEF運動付加時には非活動肢である対側肢のコンダクタンスも有意に低下した。したがって、活動肢の血流量増加抑制が起こるかどうかは、相対的な運動強度や筋量だけでなく、加算される体肢の部位によっても異なると考えられる。
音声対話理解のための言語解析手法に関する基礎的研究

談話は無関係な文の単なる集まりではなく,談話中の文は互いに何らかのつながりを持っている.本研究では,この談話のつながりを明示する表層的な情報である語彙的結束性を用いて,談話を首尾一貫した談話の単位である意味段落に分割する手法について述べる.意味段落は,談話の構造を解析する時の基本単位でもあり,段落分割は,談話の構造解析の第1ステップと考えられる.語彙的結束性を表す語彙的連鎖は,談話中の互いに関連する語の連鎖であり,連鎖が存在する談話の部分の意味的まとまりを反映していると考えられるので,語彙的連鎖を用いて談話を意味段落に分割するための尺度を計算することができる.本研究では,語彙的連鎖の開始・終了位置および,ギャップの位置から,段落境界を推定する手法について述べ,国語の現代文の問題集の段落分割の問題に対して実際に段落分割の実験を行う.談話は無関係な文の単なる集まりではなく,談話中の文は互いに何らかのつながりを持っている.本研究では,この談話のつながりを明示する表層的な情報である語彙的結束性を用いて,談話を首尾一貫した談話の単位である意味段落に分割する手法について述べる.意味段落は,談話の構造を解析する時の基本単位でもあり,段落分割は,談話の構造解析の第1ステップと考えられる.語彙的結束性を表す語彙的連鎖は,談話中の互いに関連する語の連鎖であり,連鎖が存在する談話の部分の意味的まとまりを反映していると考えられるので,語彙的連鎖を用いて談話を意味段落に分割するための尺度を計算することができる.本研究では,語彙的連鎖の開始・終了位置および,ギャップの位置から,段落境界を推定する手法について述べ,国語の現代文の問題集の段落分割の問題に対して実際に段落分割の実験を行う.
重度障害児のコミュニケーション方法の研究

1.音声語によるコミュニケーションが困難な重度障害児、特に最重度精神遅滞児や無言語の広汎性発達障害(自閉性障害)児の絵記号による意思伝達方法に関しては、なお問題が多く、いっそうのパイロット的研究を必要としている。本研究で使用した絵記号(弘前大学PSL-88)は、対象のコピーではなく、それとわかる程度に、単純な輪郭線で象った象形文字に近い、ある程度抽象化された絵記号で、いまだ部分的に改変を繰り返し、試作の途上にある。2.訓練は、具体物と絵記号(色、形、事物、人物など)カードとを単一に利用することから始めて、さらに多肢選択法、見本合わせ法によって複数絵記号カード(ピクトグラム)中から適切カードを選択し配列することで、視覚的イメージによる理解が可能であるか否かについて検討した。3.(1)重度精神遅滞児の場合、ポインティングができ、3原色と円・三角・四角形との弁別が可能な水準では、比較的小数回の訓練試行により、否定文と命令文の理解と実行、かんたんな絵記号文の配列・構成において課題達成がみられ、パソコンのタッチ・パネルを利用した試験的学習系列にも適応し、成功的であった。(2)これらの方法・手続きは、かんたんな動作的指示理解が出来る水準にあれば、最重度精神遅滞児においても可能である。(3)自閉性障害児では、ほぼ8カ月、35回にわたる訓練の範囲では、刺激定位や選択行動の条件付けに多数試行を要し、容易ではなかったが、6カ月ほどで、単純な事象系列の認知と平叙文再構成課題の成就が見いだされるようになった。しかし、自発的絵記号文の記憶再生までには至らず、パソコン学習系列については、タッチ・パネルの図絵の指さし訓練を目下継続中である。
密度揺らぎの制御による超低損失ファイバ用ガラスの開発

マルチメディア時代を迎えるにあたって、中継距離の増大による通信コストの低減や、通信網の拡大のために、現在実用化されている石英ファイバを凌ぐ低損失性を有するファイバの開発が必須である。従来、ファイバの伝送損失の主要因であるレーリー散乱を低減化させるために、ガラス組成探索が活発に行われてきた。本研究グループでは、これらの研究とは一線を画し、ガラスが本来有する究極の伝送特性を得ることを目的として、石英ガラスの液体ガラス状態での諸物性の研究を進めてきた。本研究では、レーリー散乱の原因である密度揺らぎを制御するためにガラス転移近傍の構造緩和過程を詳しく調べ、以下の結果を得た。1。凍結した密度揺らぎの構造緩和過程及びその不純物効果OHやCl、Naなどの不純物は、粘性流動に支配されたa緩和を促進する。さらにこれらの不純物により副緩和過程が生ずることを光散乱およびFTIR測定より明らかにした。2。副構造緩和の過程における不純物の役割副緩和は、不純物の拡散による局所的な構造緩和に起因することを誘電緩和測定より明らかにした。これらの知見をもとに、不純物を利用した構造緩和制御法を確立した。この制御法は、超低散乱ガラスの開発に直結する基盤技術であると同時に、耐紫外ファイバや超耐熱ガラスの開発に有用であることが明らかとなった。1。2。従来のガラス組成探索による超低損失ガラスの研究開発とは一線お画し、ガラス本来有する究極の伝送特性を得ることを目的として、石英ガラスの液体ガラス状態での諸物性の研究を進めている。本年度の進捗状況は以下のとおりである。(1)シリカガラスの構造緩和過程を光散乱測定および赤外吸収測定により詳細に調べた。その結果以下のことが明らかとなった。(1)Cl,Na,AlおよびOH基などの不純物の添加により、粘性流動に支配されたα緩和が促進される。(2)CL,Na,AlおよびOH基などの不純物の添加により、α緩和以外の副緩和が発生し、添加量の増加に伴って緩和が促進される。(2)超広温度領域真空紫外分光測定装置(-269°C2000°C)を開発し、(1)Urbach端の測定による電子の局在状態の研究、(2)欠陥の凍結過程の研究、および(3)構造緩和過程と紫外線誘起欠陥生成量の研究を開始した。(1)の結果は不純物の添加によりシリカガラスの構造緩和過程を系統的に制御できることを示しており、目的とする超低損失ファイバ用ガラスの開発にとって重要な知見が得られたと考える。また、(2)の結果は、紫外用ファイバの開発や欠陥を機能中心としたさまざまな機能性材料(例えばファイバグレーティングや2次非線形材料)の開発につながると考えている。1。凍結した密度揺らぎの構造緩和過程及びその不純物効果OHやCl、Naなどの不純物は、粘性流動に支配されたα緩和を促進する。2。副構造緩和過程における不純物の役割副緩和は、不純物の拡散による局所的な構造緩和に起因することを誘電緩和測定より明らかにした。
マイクロRNAの発現・成熟に関わる分子の網羅的探索とその機能解析

本研究では、まず、プロセシング過程が抑制されているマイクロRNA(miRNA)をハイスループットに同定する方法を開発し、いくつかの候補miRNAを特定した。さらに、RNAエディティングに関わる酵素であるAdenosinedeaminaseactingonRNA(ADAR)について、miRNAの成熟過程における機能の解析を行い、24のmiRNA前駆体において48カ所の新規エディティング部位を見出した。また、ADARアイソフォームごとに、miRNAのプロセシングは異なる制御を受けている考えられる結果が得られた。本研究では、マイクロRNA(microRNA)の発現・成熟を制御する分子を網羅的に同定し、その分子によるmicroRNAの発現調節機構を解明することを目的とする。miRNAは、タンパク質をコードしないnoncoding RNAの一種で、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'タンパク質非翻訳領域(3'UTR)に不完全に対合して、標的mRNAの翻訳を抑制する。これまでは、microRNAがどのような標的mRNAに対合して、その翻訳を抑制するのかという研究に焦点が当てられていたため、microRNAの発現・成熟過程についてはよくわかっていない。しかし、microRNAの発現および成熟過程の解析は、未知の多様な高次生命現象の解明には重要である。本研究では、この点に焦点を絞り、microRNAの発現・成熟に関わる分子について、それらによるmicroRNAの発現調節機構を明らかにすることを目的とした。microRNAの生合成過程では、まずprimary-microRNA(pri-microRNA)と呼ばれる長いmicroRNAがゲノムから転写され、Droshaという2本鎖RNA切断酵素によって切断されたprecursor-microRNA(pre-microRNA)が生成される。Pre-microRNAは、さらにDicerという2本鎖RNA切断酵素によって切断されて、成熟型のmature microRNAとなる。このような成熟過程に関わっている分子として、Lin-28が知られている。本年度は、このLin-28がイントロンに位置するmiRNAの発現制御を行っていることを明らかにした。さらに、イントロン性miRNAの発現機構がスプライシングの機構と関連していると考えられる知見を得ており、現在、検討中である。本研究では、マイクロRNA(microRNA)の発現・成熟を制御する機構を明らかにすることを目的としている。miRNAは、タンパク質をコードしないnoncodingRNAの一種で、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'タンパク質非翻訳領域(3'UTR)に不完全に対合して、標的mRNAの翻訳を抑制する。本研究では、この点に焦点を絞り、microRNAの発現・成熟に関わる機構について明らかにすることを目的とした。もともと細胞に内在的に存在するmicroRNAは、このような過程を経て細胞内のほぼすべてのRISCに取り込まれ、飽和していると考えられている。そのため、細胞外から導入した外来性microRNAは、RISC中の内在性microRNAと置換したとき、あるいは新規に合成されたRISCを内在性microRNAと奪い合って取り込まれたとき、初めてサイレンシング効果を示すと考えられる。すなわち、外来性microRNAはサイレンシングを誘導するだけでなく、内在性microRNAによるサイレンシングを抑制する作用があると考えられ、外来性microRNAの導入によるグローバルな遺伝子発現制御機構を理解するためには、外来性microRNAによるサイレンシング機構だけでなく、内在性microRNAによるサイレンシング抑制機構も明らかにする必要がある。平成22年度の研究では、外来性miRNAによる内在性microRNAのサイレンシング効果抑制の機構についてレポーターアッセイおよびマイクロアレイによる解析を行なった。その結果、外来性miRNAの種類によって内在性microRNA活性の抑制の程度が異なると考えられる結果が得られた。さらに、このような違いが生じる原因を明らかにするために、内在性microRNA活性抑制効率の定量化を試みた。miRNAは、タンパク質をコードしないnoncoding RNAの一種で、メッセンジャーRNA (mRNA)の3'タンパク質非翻訳領域(3'UTR)に部分的に対合して、標的mRNAの翻訳を抑制する。平成23年度は、RNA結合タンパク質であり、let-7 family microRNAの成熟過程を制御することがわかっているLIN28AおよびLIN28BによるmicroRNAの成熟を制御する機構の網羅的解析を行った。タグ付きのLIN28AおよびLIN28Bをヒト培養細胞で過剰発現させ、タグを利用して免疫沈降を行った。

免疫沈降物中に含まれるRNAを抽出して、次世代シーケンサーで解析し、LIN28AおよびLIN28Bが結合することによって、成熟過程におけるプロセシングが抑制されていると考えられるmicroRNAを網羅した。それらについて、個別にノザンブロットを行い、LIN28AおよびLIN28Bのノックダウンで発現量が変動するprecursor-microRNAとmature microRNAを選択し、LIN28による成熟過程制御機構の解析を行っている。本研究では、マイクロRNA(miRNA)の発現・成熟を制御する機構を明らかにすることを目的としている。miRNAは、タンパク質をコードしないnoncoding RNAの一種で、メッセンジャーRNA (mRNA)の3'タンパク質非翻訳領域(3'UTR)に部分的に対合して、標的mRNAの翻訳を抑制する。これまでは、miRNAがどのような標的mRNAに対合して、その翻訳を抑制するのかという研究に焦点が当てられていたため、miRNAの発現・成熟過程についてはよくわかっていない。しかし、miRNAの発現および成熟過程の解析は、未知の多様な高次生命現象の解明には重要である。本研究では、この点に焦点を絞り、miRNAの発現・成熟に関わる機構について明らかにすることを目的とした。RNAエディティングは様々な種類のRNAで起こることが報告されているが、近年、miRNAでもエディティングが起こることが明らかになり、その機能的意味が注目されている。エディティングは2本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ(ADAR)によってRNAの2本鎖部分のアデノシンが脱アミノ化されてイノシンに変換されることによって起こる。ヒトではADAR13の3種のADARファミリー遺伝子が存在するが、ADARの各アイソフォームによって、ターゲットとするRNAの種類やエディティング部位が異なるかどうかは明らかではない。そこで、平成24年度は、ADARの各アイソフォームと相互作用するRNAを次世代シーケンスによって網羅的に同定し、エディティングを受けたpre-miRNAを同定することによってアイソフォームによる機能の違いを検討した。また、miRNAの標的識別領域とされるシード領域にエディティングが起こると、標的mRNAの抑制効果に影響を与えることが明らかになった。本研究では、microRNAの発現・成熟過程を制御する機構を明らかにすることを目的としている。