hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
状態空間モデルにおけるマルコフ連鎖モンテカルロ法を用いた逐次的な推定手法

特に金融時系列分析で用いられるような複雑なモデルの分析を行う場合にはこのフィルタリングは難しい問題となり,この問題に対しての計算統計学的なアプローチの一つが粒子フィルタと呼ばれる.金融データのモデルのための粒子フィルタの手法は既存研究によって提案されていたが,数学的正当化の議論を欠いていた.そこで本研究では,この既存手法を改良した上で,数学的な正当化を与えた.そして,人工的に発生させたデータを用いたパフォーマンスの評価を行い,新たな提案手法によって精確な推定結果が得られることを確認した.本研究は金融データに基づいた分析や予測のための信頼できるツールを与えるものであり,その点で大きな意義を持つ.まず第一に,数値実験による提案手法のパフォーマンスのさらなる確認が必要である.これまで得られた実験結果により提案手法はローリング推定やオンライン推定において先行研究よりも効率的に推定を行う能力を持つことが十分に期待できる結果を得ているが,より説得力のある結果を得ることにより,提案手法が多くの分析の現場において利用されるものとなることを目指す.また第二に,適用できるモデルの範囲を拡大することが目標となる.既にこれまでの研究により,提案手法は状態空間モデルと呼ばれるクラスのモデルについて,弱い制約のもとで適用可能であることが理論的に示されている.また実際に数値実験を行うことにより,推定が困難な状態空間モデルである確率的ボラティリティモデルを用いた分析が可能であることが示されている.しかし他の金融時系列モデル,例えば最近入手が容易になった高頻度データの分析に用いられるモデルを用いた分析については未検証であり,人工データや実際の債券市場のデータを用いたパフォーマンスの検証を行う必要がある.またその先の課題として,これら他のモデルを用いて分析を行うことにより,債券市場の構造を様々な視点から明らかにするという目標も存在する.30年度が最終年度であるため、記入しない。30年度が最終年度であるため、記入しない。
環状オレフィン系非晶高分子フィルムの逐次2軸延伸過程における分子配向挙動の解明

環状オレフィンコポリマーフィルムの延伸過程における複屈折形成メカニズムについて検討を行った結果、高温・低歪速度で延伸を行った場合はゴム成分とガラス成分の2成分モデルで説明できるが、ガラス転移温度に近い温度で高歪速度にて延伸を行った場合は負の複屈折を有し、中程度の緩和時間を持つ第3成分が生じていることが明らかになった。本年度は環状オレフィンコポリマー(COC)フィルムの1軸延伸過程における応力および複屈折の変化を、様々な延伸温度と延伸速度において詳細に測定した。その結果、COCフィルムの延伸過程における延伸挙動および構造形成挙動について、下記の事が明らかとなった。1.延伸温度が十分に高い場合、延伸応力と複屈折は緩やかに上昇する。これは変形がゴム的であり、複屈折は応力光学則に従って生じている。2.延伸温度がTgに近い場合、延伸初期に大きな延伸応力の上昇が見られる。その一方で複屈折は緩やかに上昇する。これは、プラスチック的な変形とゴム的な変形の組み合わせからなることを示しており、プラスチック的な変形で発生する初期の大きな応力はほとんど複屈折の生成に寄与せず、ゴム的な部分の応力と複屈折が比例し、その比例定数は1の応力光学係数と等しい。3.延伸温度がTgに非常に近く、延伸速度が速い場合、延伸初期に2より大きな延伸応力が発生する。その一方で複屈折は2よりも小さくなる。これは、この条件における変形が単純なプラスチック的な変形とゴム的な変形の組み合わせではなく、第3の変形成分が存在することを示している。以上の結果のうち、1および2はこれまでにポリスチレン等の他の非晶性高分子で観察された結果と同様な結果であったが、3で示された第3の変形成分は、他の非晶性高分子では見られていないCOC特有の現象である。これはCOCの分子構造を反映している可能性があり、そのメカニズムを解明し制御手段を開発することができれば、液晶ディスプレイなどに使用されている位相差フィルム等の光学機能性フィルムの設計・製造に大きく寄与することが可能と考えられる。昨年までの検討により、環状オレフィンコポリマー(COC)フィルムをガラス転移温度に近い温度で延伸を行った際に、発生する複屈折が非常に低くなることが明らかとなっている。本年度は、この現象の原因が未延伸フィルムの構造にあると仮定し、数種類の未延伸フィルムを用いて延伸検討を行った。その結果、下記のことが明らかとなった。1.未延伸フィルムによって、複屈折が低くなる現象が発生したりしなかったりする。2.同じ未延伸フィルム内においても、複屈折が低くなる現象が発生する部位と発生しない部位が存在し、発生する部位のサイズはおおよそ10cm程度である。3.複屈折が低くなる現象は未延伸フィルム作製からの年月に影響を受けない。これらの結果より、複屈折が低くなる現象は、フィルム内に存在するある種の「むら」によって生じていることが判明した。環状オレフィンコポリマーは環状オレフィンとエチレンとのランダム共重合体であるが、環状オレフィンとエチレンの配置は完全にはランダムでなく、多少のブロック性が存在する。このため、現時点においては複屈折が低くなる現象は、部分的に環状オレフィンとエチレンの存在比に偏りが生じたことにより発生したものと考えている。しかし、複屈折が低くなる現象が見られるのは特定の延伸条件においてのみであり、通常の延伸においては複屈折が低くなる現象は見られないことから、実際に分子がどのように動いているかについて、より詳細な検討が必要と考えられる。
COPD増悪機序と制御の研究-好中球活性化におけるtoll-like受容体の役割

本研究では、好中球におけるtoll-like受容体、主にTLR8がCOPD病態で重要である酸化ストレスによりNF-κB経路の活性化を介してその機能が促進されることを示した。この機序がウイルスによるCOPD増悪時の好中球性炎症に関与している可能性が示唆された。慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease : COPD)は世界的にみて罹患率と死亡率の高い疾患であり、急性増悪はその病態進行のみならず増悪時の入院費増大など社会的負荷の観点からもその制御が重要である。増悪因子のひとつとしてウイルス感染が考えられるがウイルス感染によるCOPD急性増悪の機序は未だ不明である。近年、ウイルス感染時に産生される1本鎖および2本鎖RNAがtoll-like受容体を介することで炎症を惹起する報告が散見される。本研究では、toll-like受容体を介した好中球活性化機序がCOPD急性増悪の病態に重要であると考え、次の4点に着目し検討する。1)COPDの病態で重要な酸化ストレスによる好中球のTLR8シグナル経路の活性化2)酸化ストレスによるNF-kB系の増強メカニズムの検討3)健常者およびCOPD群におけるTLR8受容体刺激に対しての免疫応答性の比較4)増悪時におけるTLR8受容体刺激反応性について検討する。1)酸化ストレスによる好中球のTLR8シグナル経路の活性化および2)酸化ストレスによるNF-kB系の増強メカニズムの検討本検討は、すでに完了し、酸化ストレスによりNF-kB経路が増強することでTLR8のシグナルが活性化することを英文誌に発表した。(Yanagisawa S, Koarai A et al. Respir Res 2009)3)健常者およびCOPD群におけるTLR8受容体刺激に対しての免疫応答性の比較COPD患者の末梢血好中球を用いてTLR8リガンド刺激によるIL-8などのサイトカインおよびケモカイン産生能を調べ、健常者と比較する。現在、検討中である。4)増悪時におけるTLR8受容体刺激反応性についての検討増悪時に末梢血好中球を分離しTLR8リガンド刺激によるIL-8産生能が安静時と比べ増強しているのかを検討する。今後の検討課題である。慢性閉塞性肺疾患(COPD)は世界的にみて罹患率と死亡率の高い疾患であり、急性増悪はその病態進行のみならず増悪時の入院費増大など社会的負荷の観点からもその制御が重要である。1)2)についての検討本検討は、すでに完了し、酸化ストレスによりNF-kB経路が増強することでTLR8のシグナルが活性化することを英文誌に発表した。(Yanagisawa S, Koarai A et al. Respir Res 2009)3)についての検討COPD患者の末梢血好中球を用いてTLR8リガンド刺激によるIL-8などのサイトカインおよびケモカイン産生能を調べ、健常者と比較した。COPDでは健常者に比しIL-8産生能が亢進する傾向が認められたが、年齢マッチングによるさらなる検討が必要である。4)についての検討増悪時に末梢血好中球を分離しTLR8リガンド刺激によるIL-8産生能が安静時と比べ増強する否かに関し検討を試みたが、少数例での検討にとどまり、さらなる症例の蓄積が必要である。近年、ウイルス感染時に産生される1本鎖および2本鎖RNAがtoll様受容体を介することで炎症を惹起する報告が散見される。本研究では、toll様受容体を介した好中球活性化機序がCOPD急性増悪の病態に重要であると考え、COPDの病態で重要な酸化ストレスによる好中球のTLR8シグナル経路の活性化機序に注目し、そのメカニズムの解明およびその病態への関与を検討した。

また、上記機序に関し、他の炎症細胞やレジデント細胞においてTLR受容体反応性を検討し、COPDおよびその増悪機序におけるTLR受容体システムの役割を解明する上での糸口を模索した。前年度までに、好中球において酸化ストレスがNF.B経路を介してTLR8のシグナルを活性化、IL-8産生を増強すること示したが、(Yanagisawa S,Koarai A et al.Respir Res 2009)、本年度は、COPD患者の末梢血好中球は健常者に比し、TLR8リガンド刺激によるIL.8産生能が有意に亢進していることを明らかにした。さらに、COPD増悪時における好中球TLR8反応性が亢進する可能性について検討を試みたが、増悪時の好中球は活性化のためか分離が困難であり、検討困難であった。加えて、末梢血単核球由来マクロファージを用いたマクロファージにおけるTLR3および酸化ストレスに対する反応性に関し検討を試みた。以上から、酸化ストレス下ではウイルス感染時の好中球によるIL-8産生が増強し、オートクライン機序による好中球性炎症が増強する可能性が示唆された。
カザフスタン共和国東カザフスタン州における皮膚基底細胞癌の分子疫学的調査

セミパラチンスク核実験場はカザフスタン共和国北東部に位置し、旧ソ連邦時代1949年から50年近くにわたって、地上、地下核実験が行われたところである。核実験場周辺地区住民についての健康影響調査は、旧ソ連邦時代の秘密主義の影響もあり、まだまだこれからであるのが現状である。一方で最近、同地区周辺では、皮膚がんの増加が問題となっており、放射性降下物の慢性低線量被爆の影響が懸念されている。基底細胞癌の原因としては、いくつかの環境因子が知られており、特に日光または他の紫外線、遺伝因子、化学物質などが知られているが、その他にも放射線への過剰被曝もそのリスクとなりうることが知られている。最近になって、本腫瘍の発生に9番染色体長腕9q22.3に座位するPTCH遺伝子、さらにその上流に存在するXPA遺伝子の異常が関与していることが明らかになってきた。今回、本申請において我々は、同核実験場に多発している基底細胞癌におけるPTCH及びXPAの遺伝子解析を行うため、病変部及び正常部を特異的に抽出し、PTCH及びXPA遺伝子中、及び近傍のLoss of Heterozygosity (LOH)の有無を観察すると同時に、各遺伝子の塩基異常を検索し、セミパラチンスク核実験場周辺におけるこれら遺伝子の基底細胞癌の発生に対する関与の解明を試みた。その結果、9q22.3領域におけるLOHの頻度は17.8%で、対照群(3.8%)に比して有意に高頻度に見られた。このことは、本領域による遺伝子の欠失が、電離放射線被ばくによる基底細胞癌の発症メカニズムに関与している可能性を示唆するものであり、今後の更なる調査が必要であると考えられる。今後、同地区における皮膚基底細胞癌の発症メカニズムの解明のため、他の関連遺伝子の遺伝子変異の検索や、より信頼性の置ける腫瘍登録データの入手等を行っていく予定である。
抗生物質生合成酵素群に見出したグリシンオキシダーゼ様酵素の機能解析と応用利用

ストレプトスリシン(ST)類縁抗生物質BD-12は抗菌活性を示すのに重要なN-ホルムイミドイルグリシン側鎖を有している。これまでの研究により、BD-12は生合成中間体であるグリシルスリシンおよびグリシノスリシンを経由して生合成されることを明らかにした。グリシノスリシンは、その後N-ホルムイミドイル化を経て最終産物BD-12に変換されると考え、BD-12生合成遺伝子群に見出したN-ホルムイミドイル基転移酵素遺伝子(orf 1遺伝子)の破壊株を構築した。その破壊株はグリシノスリシンを生産蓄積したため、その遺伝子産物(Orf 1)の基質はグリシノスリシンとグリシンであり、FADを介した酸化反応を経てBD-12を生成すると考えられた。実際に、組換えOrf 1(rOrf 1)の酵素活性についても確認している。しかし興味深いことに、rOrf 1の酵素反応を行った際にBD-12の他にもう一つ化合物の生産を確認した。本化合物は、その分子量からグリシノスリシンに縮合したグリシンが脱炭酸していない生合成中間体であると推定した。しかしながら本化合物については、構造解析に必要な量の精製が困難であった。興味深いことに本酵素の基質特異性は低く、側鎖にβ-リジン1残基を有するST-Fも基質として認識することがわかった。その酵素反応溶液においても生合成中間体とみられる化合物の生産を確認できたため、本化合物を単離精製してNMR解析を行った。その結果、本化合物は推定通りの化学構造であることが判明した。本化合物は新規ST類縁抗生物質であり、本酵素の基質特異性を利用して新規化合物の創製に成功した。以上より、本酵素の反応機構はグリシノスリシンのアミノ基にグリシンが縮合した後、最後に脱炭酸反応が触媒されると推定した。N-ホルムイミドイル基転移酵素Orf 1の詳細な生化学実験によって、本酵素は一般的なフラビン酵素と同様に酸化型FADによってグリシンを酸化し、生成された還元型FADが酸素によって酸化型FADに変換されるとともに過酸化水素を放出する反応機構を有する事が明らかになった。本酵素はST-Fも基質として認識するが、酵素反応によって生産された生合成中間体は、β-リジン側鎖にグリシンが縮合した化学構造であることが判明した。さらに、グリシンが縮合するのはβ-リジン側鎖のβ位もしくはε位のどちらのアミノ基かLCMS分析では不明であったが、構造決定の結果から、本酵素はβ-リジン側鎖のε位のアミノ基にグリシンを縮合することが明らかになった。しかし推定した本酵素の反応機構において、脱炭酸反応のメカニズムについては不明であるため、本酵素のX線結晶構造解析によってこれを解明したい。これまでのOrf1結晶化実験の結果、分解能2.7オングストロームの反射データを与えるネイティブの結晶を得ている。そこでセレノメチオニン化酵素を作製することにした。放線菌でのセレノメチオニン化酵素の作製は例がなく大腸菌のセレノメチオニン化酵素の作製法を参考に、セレノメチオニンを用いた放線菌の培養条件検討を行った。これによりセレノメチオニン化酵素の取得に成功し、結晶化を行ったが、高い分解能を示す結晶の作製には至っていない。さらに重原子置換体結晶を作製し、放射光実験施設にてX線単結晶回折測定を行ったが、Orf 1の位相を決定することはできなかった。そこで、日本学術振興会若手研究者海外挑戦プログラムを利用してUniversity of British ColumbiaのKatherine Ryan博士の研究室にて3ヶ月間、X線データの解析方法および実験技術について学んだ。これを本酵素の結晶化実験に応用し、現在実験を進行中である。2019年4月より1年間University of British ColumbiaのK. Ryan博士の研究室にてrOrf 1の結晶化実験を引き続き行う。さらに、本酵素のホモログ酵素であるN-ホルムイミドイルホーチミシン生合成酵素(Fms14)の結晶化も同時に進める予定である。すでに放線菌を用いたFms14の組換え酵素を構築済みであり、活性型酵素として発現することを確認している。また、Orf 1は抗生物質カスガマイシン生合成酵素(KasN)わずかに相同性を有する。本酵素は、Orf 1と同じくグリシンを基質とするが、Orf1とは異なり、脱炭酸を伴わずにN-カルボキシホルムイミドイル基を導入する酵素である。このようにOrf 1とKas Nの反応機構の相違点は脱炭酸するか否かであるため、X線結晶構造解析を基盤とした反応メカニズムの相違点解析を実施したい。また、Orf 1とこれに相同性を示すグリシン酸化酵素のアミノ酸配列を比較したところ、約100残基ほど短いグリシン酸化酵素がいくつか見られた。よって、より安定なrOrf 1を得るためにC末端領域のアミノ酸配列を欠損した変異体も作製し、結晶化実験を行う予定である。また、C末端領域を欠損したことによる脱炭酸反応の触媒の有無も生化学実験によって確認する。Orf 1は、脱炭酸を伴いながらグリシンを酸化するという有機化学的にも珍しい反応を触媒するため、本研究によって新規グリシン酸化酵素の触媒機構の解明につながる可能性がある。得られた実験結果は取りまとめて学会発表、論文作成を行う予定である。計画通りに本酵素およびホモログ酵素の結晶化が進行しない場合には、K. Ryan博士に酵素の結晶化に関して協力を求める。

ストレプトスリシン(ST)類縁抗生物質BD-12は抗菌活性を示すのに重要なN-ホルムイミドイルグリシン側鎖を有している。これまでの研究により、BD-12は生合成中間体であるグリシルスリシンおよびグリシノスリシンを経由して生合成されることを明らかにした。グリシノスリシンは、その後N-ホルムイミドイル化を経て最終産物BD-12に変換されると考え、BD-12生合成遺伝子群に見出したN-ホルムイミドイル基転移酵素遺伝子(orf 1遺伝子)の破壊株を構築した。その破壊株はグリシノスリシンを生産蓄積したため、その遺伝子産物(Orf 1)の基質はグリシノスリシンとグリシンであり、FADを介した酸化反応を経てBD-12を生成すると考えられた。実際に、組換えOrf 1(rOrf 1)の酵素活性についても確認している。しかし興味深いことに、rOrf 1の酵素反応を行った際にBD-12の他にもう一つ化合物の生産を確認した。本化合物は、その分子量からグリシノスリシンに縮合したグリシンが脱炭酸していない生合成中間体であると推定した。しかしながら本化合物については、構造解析に必要な量の精製が困難であった。興味深いことに本酵素の基質特異性は低く、側鎖にβ-リジン1残基を有するST-Fも基質として認識することがわかった。その酵素反応溶液においても生合成中間体とみられる化合物の生産を確認できたため、本化合物を単離精製してNMR解析を行った。その結果、本化合物は推定通りの化学構造であることが判明した。本化合物は新規ST類縁抗生物質であり、本酵素の基質特異性を利用して新規化合物の創製に成功した。以上より、本酵素の反応機構はグリシノスリシンのアミノ基にグリシンが縮合した後、最後に脱炭酸反応が触媒されると推定した。N-ホルムイミドイル基転移酵素Orf 1の詳細な生化学実験によって、本酵素は一般的なフラビン酵素と同様に酸化型FADによってグリシンを酸化し、生成された還元型FADが酸素によって酸化型FADに変換されるとともに過酸化水素を放出する反応機構を有する事が明らかになった。本酵素はST-Fも基質として認識するが、酵素反応によって生産された生合成中間体は、β-リジン側鎖にグリシンが縮合した化学構造であることが判明した。さらに、グリシンが縮合するのはβ-リジン側鎖のβ位もしくはε位のどちらのアミノ基かLCMS分析では不明であったが、構造決定の結果から、本酵素はβ-リジン側鎖のε位のアミノ基にグリシンを縮合することが明らかになった。しかし推定した本酵素の反応機構において、脱炭酸反応のメカニズムについては不明であるため、本酵素のX線結晶構造解析によってこれを解明したい。これまでのOrf1結晶化実験の結果、分解能2.7オングストロームの反射データを与えるネイティブの結晶を得ている。そこでセレノメチオニン化酵素を作製することにした。放線菌でのセレノメチオニン化酵素の作製は例がなく大腸菌のセレノメチオニン化酵素の作製法を参考に、セレノメチオニンを用いた放線菌の培養条件検討を行った。これによりセレノメチオニン化酵素の取得に成功し、結晶化を行ったが、高い分解能を示す結晶の作製には至っていない。
フェノール性物質が葉の被食・分解過程を通じて生態系プロセスに果たす役割の解明

本研究では、植物の被食防衛物質であるフェノール性物質が、森林生態系の栄養塩循環に果たす役割を解明するために、同所的に多様な樹木が共存する東南アジア熱帯林において、1)群集レベルで樹木の葉中フェノール性物質濃度を決定する要因、と2)生葉の被食率、葉寿命、落葉の分解速度におけるフェノール性物質の役割、を明らかにした。この2点の結果から、森林生態系の栄養塩循環に植物の被食防衛による正のフィードバックがかかるかどうかを考察した。本年度は上記2)について、葉の寿命を精確に算出するための葉回転率の継続調査、および野外における被食率の継続調査を、熱帯樹種40種について林冠部で行った。その結果、落葉分解速度はフェノール物質の中でも、特にリグニンに強く制御されるのに対し、生葉の被食率、葉寿命はフェノール性物質では説明されないことが明らかとなった。このことから高い樹木多様性をもつ熱帯林では被食防衛戦略も多様であり、フェノール性物質のみが有効な被食防衛ではないと考えられた。また、7月にハワイで行われた第47回国際植生学会に出席し、上記1)の、樹木群集の葉中フェノール性物質濃度は土壌栄養塩によって決まり、中でも総フェノール・縮合タンニン濃度は貧栄養な場所で高く、リグニンはその逆の傾向を示した、という結果を「Factors explaining plant defensive investments in tropical rain forests in Borneo」という題名でポスター発表し、ポスター賞を受賞した。上記1)2)の結果をあわせると、調査地の森林の栄養塩循環においては、植物の被食防衛による正のフィードバックはかからないことが予測された。この結果は8月に釧路で行われた第51回日本生態学会で「植物の被食防衛は森林生態系栄養塩循環に正のフィードバックをかけるか」という題で口頭発表した。東南アジア熱帯林において、植物の被食防衛物質であるフェノール性物質が、森林生態系の栄養塩循環に果たす役割を解明するために、まず(1)群集レベルで樹木の葉中フェノール性物質濃度を決定する要因、と(2)フェノール性物質が落葉の分解速度に与える影響、を明らかにした。(1)樹木群集の葉中フェノール性物質濃度の決定要因として、1)森林の組成(分類群)2)二次遷移に沿った森林発達段階、3)土壌栄養塩、の3つに注目し研究を行った。マレーシアサラワク州ランビルヒルズ国立公園の原生林とその周辺の二次林に、土壌栄養塩と森林発達段階の異なる10調査区を設置し、各調査区の土壌栄養塩濃度と、ランダムに選択した構成樹種(全調査区で約260種)の葉中フェノール性物質(総フェノール、縮合タンニン、リグニン)を測定した。解析の結果、群集の葉中フェノール性物質濃度は、分類群や森林発達段階からは説明できず、土壌栄養塩との相関が高いことが明らかとなった。樹木群集の葉中総フェノール濃度は土壌栄養塩の少ないところで有意に高く、縮合タンニンも有意差はないものの、同じ傾向であった。逆に葉中リグニン濃度は、土壌栄養塩の少ない森林より高い森林で有意に高かった。(2)上記260樹種の葉特性のばらつきを網羅するように選ばれた40樹種の落葉をもちい、葉の様々な性質と葉の被食率、分解速度との間に成り立つ関係を明らかにした。その結果、幅広い分類群に属する熱帯樹種について、落葉中のフェノール性物質濃度(特にリグニン・縮合タンニン)は落葉の分解速度を遅くすることが明らかとなった。一方、葉の被食に関しては、それらを説明する葉の性質を特定出来なかった。樹木の防衛戦略は植物-植食者相互作用の中で複雑に決まっており、群集内で一つの戦略が卓越していない可能性があるが、被食防衛物質の一つであるリグニン・縮合タンニンは、森林生態系の栄養塩循環を遅くする可能性があることが明らかになった。

この結果は8月に釧路で行われた第51回日本生態学会で「植物の被食防衛は森林生態系栄養塩循環に正のフィードバックをかけるか」という題で口頭発表した。
脳腫瘍における癌遺伝子の発現と核DNAの解析

本研究の成果は、平成1年、平成2年の間に14の論文と1つの書籍、27の学会に発表され、本研究課題と研究成果として評価できると考えられた。1)フロ-サイトメトリ-による脳腫瘍のcell kinetics種々の脳腫瘍の生物学的特性を研究する上で、フロ-サイトメトリ-は有効な方法となってきた。脳腫瘍の培養細胞についても特徴がみられた。すなわち、悪性腫瘍であっても必ずしも培養では増殖力が高くなく、良性でも髄膜腫では増殖指数が高く、培養しやすいことが判明した。DNAーploidyについては、新しい分類を提案し、推性度と関連があることも判明した。2)フロ-サイトメトリ-による抗癌剤の作用機序我々は、DNA/BrdU二重染色を用いて抗癌剤の作用機序についても研究した。この方法により、シスプラチン、カルボプラチンの作用機序が判明した。3)フロ-サイトメトリ-を用いた脳腫瘍患者の免疫能およびNK細胞による抗腫瘍送果フロ-サイトメトリ-を用いて、脳腫瘍患者のT細胞サブセットにより患者免疫能が把握でき、リンパ球よりNK細胞を無菌的に分取し、in vitroで抗腫瘍効果がみられ、臨床的で応用できることが期待される。4)脳腫瘍における癌遺伝子の発現in vitroで脳腫瘍株化細胞を用いて、cーmyc癌遺伝子の発現を免疫染色およびフロ-サイトメトリ-により確認することができた。次に、種々の脳腫瘍の手術材料を培養し、cーmyc陽性細胞を測定することができた。さらに、本法がgliomaの悪性度と相関することも判明し、臨床的意義のあることも新しい知見として得られた。1.種々の脳腫瘍のDNA-aneuploidyの検討2.FCMを用いた脳腫瘍のC-MYC発現の検討各種の脳腫瘍のC-MYC発現に関して、まずKMU430gliama株化細胞を用いて、C-MYC抗モノクロ-ナル抗体濃度を変化させ、至適濃度Poで陽性細胞率測定の基礎的実験を施行した。又propidumiodideによる二重染色により、細胞周期とC-MYC発現の関係を検討し、S期、G_2M期にその発現が強いことが判明した。第48回癌学会、第48回脳神経外科学会で発表近畿脳腫瘍研究会で発表4.C-MYC発現とDNA-aneuploidy細胞の関連DNA-aneuploidy細胞にC-MYC発現陽性細胞が多くみられる傾向を認め、又、C-MYC発現パタ-ンより、悪性gliomaにmultinodalityの存在がみられ、heterogenetyが考えられた。フロ-サイトメトリ-研究会で発表1)脳腫瘍のDNAーploidyの検討2)FCMを用いた脳腫瘍のcーmyc発現の検討3)Aneuploidy細胞におけるcーmyc遺伝子産物とGFAP発現の相違glioma細胞において、PI染色によるDNAーhistogram、更にFITC標識ーcーmyc、FITC標識GFAPの二重染色を施行し、DNAーhistogramよりaneuploidy細胞についてcーmyc発現とGFAP発現について比較すると、cーmyc発現が強い細胞にGFAP発現は弱いことが判明し、腫瘍(glioma)の悪性化、あるいは分化してcーmycとGFAP発現に差があるという新知見が得られた(第8回日本ヒト細胞学会8月1990年,第8回日光脳腫瘍カンファレンス11月1990年)
植物工場技術を活用し子どもを中心として地域交流を生み出す体験プログラムの開発

2018年度は、対象地である宮城県名取市閖上地区への継続的な調査を行った。同地区で活動するNPO法人名取ハマボウフウの会と協働し、地域のシンボルである要保護海浜植物・ハマボウフウをテーマに、植物工場を用いて子どもと連携する方法を探った。その結果、地域の復興の鍵を握る閖上小中一貫校にて、中学2年生の技術の時間を利用し、子どもたちが自分の手で植物工場を組み立てる授業を行うことができた。ここで制作した植物工場は、次年度浜への定植会に向け栽培していくためのハマボウフウの苗を、冬の間枯らさずに育てることに用いられた。定植会は毎年名取ハマボウフウの会が主催し、地域の人々の連携を図るイベントでもあるため、今回の植物工場組み立てによって子どもを中心とした地域振興に寄与することができたと考えられる。またこれらの苗の一部は、小中学校に常設する予定の校章をかたどった花壇に用いることも考えられている。この花壇づくり計画も来年度以降の研究として進めていく。一方、同地区はカーネーションをはじめとした切り花の生産が有名な産業となっており、年度末より名取花卉生産組合の方々とつながりを作ることができた。これまで名取市で使用していたコンテナ型の植物工場を組合の方の農園に設置し、今後子どもの学びと連携できるよう、計画していく方針を立てた。今後は、同地域の海側の特徴であるハマボウフウ、陸側の産業であるカーネーションをはじめとした花卉類について、子どもの学びと関連付けながら地域復興に活かすプログラムについて明らかにしていきたい。対象地としている閖上小中一貫校との関係性を築けており、またこれまで関係のあったNPO法人名取ハマボウフウの会に加え、名取花卉生産組合の方々とも連携できる体制が整い始めている。2018年度より閖上小中一貫校で植物工場を用いて栽培しているハマボウフウは、海浜保護を行っているNPO法人名取ハマボウフウの会が主催する浜への定植会に活用する。また、苗の一部は、ハマボウフウを中心とした校章花壇制作に活用し、地域の人々が小中学校に関わることのできる場づくりを目指していく。一方、同地区はカーネーションをはじめとした切り花の生産が有名な産業となっており、昨年度末より名取花卉生産組合の方々との連携も始めている。2019年度は組合の方々の協力を得て、小学生を対象とした農園見学や体験学習等の授業を実施していく予定である。こうした活動を足掛かりとして、今後、植物工場を用いた花苗栽培学習などにつなげていく。上記取り組みは、閖上小中一貫校で進めようとしている、地域で学び地域の人々とつながる「閖上学」の一環として実施する。この実践を通し、地域の人々を継続的に巻き込むことができ、地域振興につながる閖上学のカリキュラムの一部を完成させることを目標とする。

上記取り組みは、閖上小中一貫校で進めようとしている、地域で学び地域の人々とつながる「閖上学」の一環として実施する。この実践を通し、地域の人々を継続的に巻き込むことができ、地域振興につながる閖上学のカリキュラムの一部を完成させることを目標とする。対象となる閖上小中学校の状況と合わせながら研究を進めており、都合により今年度訪問する回数が想定より少なかったため。次年度は連携して授業を行える機会が10時間分あるため、事前事後の打ち合わせも含め今年度使用できなかった分の交通費を使うことを計画している。
枯草菌におけるタンパク質分泌装置構成成分の構造と機能の解析

グラム陽性細菌である枯草菌は細胞膜に外膜を持たず、細胞膜を通過した分泌タンパク質はプロセシングされ、直ちに倍地中に遊離される完全分泌型タンパク質分泌装置を備えている。しかもタンパク質分泌能が非常に高いためにα-アミラーゼやプロテアーゼなどの有用酵素の工業的生産菌としても利用されている。枯草菌におけるタンパク質分泌系を解析する為に、大腸菌のタンパク質分泌装置を構成しているSec蛋白質群と真核高等生物のタンパク質系で主に解析されているSRP(シグナルペプチド認識粒子)系の両者について解析を進めてきた。SecA蛋白質はSec分泌装置の中心的働きをしているため、枯草菌SecAと大腸菌SecAとの機能的類似性について解析した。多種類の枯草菌SecAのC末端側欠損変異株を作成し、大腸菌SecA51変異タンパク質との相補性について解析した。完全長の枯草菌SecAは大腸菌SecA51を相補できないが、枯草菌SecAのN末端側234アミノ酸からなるポリペプチド(BN234)は相補することができた。またBN234は大腸菌SecA51とinteractionして、分子量の大きい複合体を形成し、部分的に細胞膜上に局在していた。一方C末端側約450アミノ酸を欠失したポリペプチド(BN396)は細胞質中にあって、SecA51と複合体を形成しなかった。N末端234から396アミノ酸残基の間に枯草菌SecAの特異性を決める領域があることを明らかにすることができた。枯草菌SRPに関連してはホ乳類SRP54タンパク質と類似性を持つ枯草菌タンパク質(Ffh)の遺伝子をクローン化し、枯草菌細胞内でFfhとscRNAが復合体をつくりRNPを形成していることを明らかにした。枯草菌SRP様粒子を細胞膜から抽出し、ほぽ単一な複合体にまで純化した。
精密制御ラジカル重合に基づく配列制御ビニルポリマーの構築

本研究では、合成高分子における究極の課題であるモノマー配列制御に関して、ビニルモノマーを原料として用い、一分子ラジカル付加反応、ラジカル連鎖重合、ラジカル逐次重合などを駆使して、配列制御ビニルポリマーを構築することを目的としている。本年度は、(1)ラジカル連鎖重合と(2)ラジカル逐次重合に基づき、より高次のモノマー配列制御を引き続き検討した。また、(3)ラジカル付加反応により配列を組み込んだモノマーを、他の重合法を用いて高分子化の検討を行った。(1)ラジカル連鎖重合による制御:オレフィン系モノマーとしてサビネンを用い、アクリル酸エステルやメタクリル酸エステルの共重合において、フルオロアルコールを用いることで、共重合性が向上し配列に影響を与えることを明らかとした。(2)ラジカル逐次重合による制御:非共役の二重結合を2つ有するモノマーと、炭素ー塩素結合を2つ有するモノマー間でのラジカル逐次重合により、高次の配列を有するビニルポリマーの合成を検討した結果、最高で11個の規則的なモノマー連鎖から成る配列制御ビニルポリマーの合成が可能であることが示された。(3)一分子ラジカル付加と他の重合法による制御:二重結合を2つ有するジエンモノマーを合成し、非環状ジエンメタセシス重合に加え、ジエンモノマーを閉環メタセシス反応により環状オレフィンとし、開環メタセシス重合により、高分子量の配列制御ビニルポリマーの合成が可能なことが示された。また、新しい重合法としてチオール・エン反応を用いた重付加の取り組みを開始し、その可能性を明らかとした。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、主に、(1)ラジカル連鎖重合と(2)ラジカル逐次重合において、高度なモノマー配列制御を可能とする重合系の開発を行った。また、(3)一分子ラジカル付加反応により構築した側鎖配列組込モノマーのラジカル連鎖重合についても検討し、主鎖と側鎖の配列制御について検討を行った。(1)ラジカル連鎖重合における選択的連鎖生長反応による配列制御ポリマーの開発:リモネンと、種々の置換基を有する2種類のマレイミド誘導体との三元共重合をフルオロアルコール中で行うことで、リモネンとマレイミド誘導体は1:2の連鎖を保ちつつ、2種類のマレイミド誘導体はグラジエント構造を有するような配列制御ポリマーの合成が可能であった。さらに第三成分モノマーとしてメタクリル酸エステルなどのモノマーを用い、より高度なモノマー配列制御を検討した。(2)配列組込モノマーのラジカル逐次重合による配列制御ポリマーの開発:非共役二重結合と活性な炭素ー塩素結合の間に、種々のビニルモノマーがABCDなどの配列で組み込まれたモノマーを一分子ラジカル付加により合成し、これらをラジカル逐次重合することで新規配列制御ビニルポリマーの合成を行った。(3)配列組込モノマーの選択的ラジカル連鎖重合による主鎖・側鎖配列制御ポリマーの開発:同様な一分子ラジカル付加により、マレイミドの側鎖にビニルモノマー配列が組み込まれた一連のオリゴモノマーを合成し、スチレンなどとのラジカル共重合を行い、側鎖と主鎖に配列の制御されたビニルモノマー連鎖をもつ配列制御ポリマーの合成に成功し、ポリマーの物性に及ぼす影響を考察した。初年度における本研究では、(1)ラジカル連鎖重合、(2)ラジカル逐次重合、(3)一分子ラジカル付加反応により構築した側鎖配列組込モノマーのラジカル連鎖重合について検討することを予定し、それぞれについて成果が得られた。ラジカル連鎖重合については、予期せぬ結果が得られたため、科研費の繰越を行い、それについても検討することで新たなモノマー配列を見出した。また、(3)主鎖および側鎖の配列が制御されたポリマー合成では、側鎖に規則的に官能基を導入し、ポリマー物性に与える影響を調べた。さらに、(4)ラジカル付加反応により配列を組み込んだモノマーを、他の重合法を用いて高分子化の検討を行った。(1)ラジカル連鎖重合による制御:オレフィン系モノマーとしてカリオフィレンを用い、アクリル酸エステルやメタクリル酸エステルの共重合において、フルオロアルコールを用いることで、共重合性が向上し配列に影響を与えることを明らかとした。(2)ラジカル逐次重合による制御:非共役の二重結合を2つ有するモノマーと、炭素ー炭素二重結合を2つ有するモノマー間でのラジカル逐次重合により、高次の配列を有するビニルポリマーの合成を検討した。(3)一分子ラジカル付加とラジカル連鎖重合による制御:カルボン酸やアミノ基を有するビニルモノマーユニット配列を側鎖に組み込み、マレイミド誘導体との1:1交互ラジカル共重合により、主鎖と側鎖が配列制御されたポリマーを合成し、官能基配列がポリマーの物性に影響を与えることを明らかとした。(4)一分子ラジカル付加と他の重合法による制御:

二重結合を2つ有するジエンモノマーを合成し、非環状ジエンメタセシス重合により、配列が制御されたポリマーの合成を行った。さらに、ジエンモノマーを閉環メタセシス反応により環状オレフィンとし、開環メタセシス重合により、高分子量の配列制御ビニルポリマーの合成を検討した。本研究では、(1)ラジカル連鎖重合、(2)ラジカル逐次重合、(3)一分子ラジカル付加反応により構築した側鎖配列組込モノマーのラジカル連鎖重合、(4)他の重合系との併用による配列制御ポリマーへの展開、(5)規則的官能基の導入とポリマー物性・構造解析を行うことを項目としてあげており、これまでにそれぞれについて成果が得られている。本年度は、他の重合系との併用による配列制御ポリマーへの展開について、予期せぬ結果が得られたため、科研費の繰越を行い、さらに検討することで新たな進展が得られた。本研究では、合成高分子における究極の課題であるモノマー配列制御に関して、ビニルモノマーを原料として用い、一分子ラジカル付加反応、ラジカル連鎖重合、ラジカル逐次重合などを駆使して、配列制御ビニルポリマーを構築することを目的としている。本年度は、(1)ラジカル連鎖重合と(2)ラジカル逐次重合に基づき、より高次のモノマー配列制御を引き続き検討した。また、(3)ラジカル付加反応により配列を組み込んだモノマーを、他の重合法を用いて高分子化の検討を行った。(1)ラジカル連鎖重合による制御:オレフィン系モノマーとしてサビネンを用い、アクリル酸エステルやメタクリル酸エステルの共重合において、フルオロアルコールを用いることで、共重合性が向上し配列に影響を与えることを明らかとした。(2)ラジカル逐次重合による制御:非共役の二重結合を2つ有するモノマーと、炭素ー塩素結合を2つ有するモノマー間でのラジカル逐次重合により、高次の配列を有するビニルポリマーの合成を検討した結果、最高で11個の規則的なモノマー連鎖から成る配列制御ビニルポリマーの合成が可能であることが示された。(3)一分子ラジカル付加と他の重合法による制御:二重結合を2つ有するジエンモノマーを合成し、非環状ジエンメタセシス重合に加え、ジエンモノマーを閉環メタセシス反応により環状オレフィンとし、開環メタセシス重合により、高分子量の配列制御ビニルポリマーの合成が可能なことが示された。また、新しい重合法としてチオール・エン反応を用いた重付加の取り組みを開始し、その可能性を明らかとした。初年度における本研究では、(1)ラジカル連鎖重合、(2)ラジカル逐次重合、(3)一分子ラジカル付加反応により構築した側鎖配列組込モノマーのラジカル連鎖重合についても検討することを予定し、それぞれについて成果が得られた。ラジカル連鎖重合については、予期せぬ結果が得られたため、科研費の繰越を行い、それについても検討することで新たなモノマー配列を見出した。これまでの研究成果も踏まえながら、(1)ラジカル連鎖重合、(2)他の重合系との併用による配列制御ポリマーへの展開、(3)モノマー配列がポリマー物性や構造に与える影響を明らかとすることなどにより、引き続き配列制御ビニルポリマーの構築に関する研究に取り組んでいく予定である。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
戦後日本語文学と解放後韓国文学における脱植民地主義の比較研究

本研究は、196070年代戦後日本文学と解放後コリア文学における冷戦(南北分断)体制批判および脱植民地主義の比較文学・思想史研究である。植民地朝鮮生まれの小説家小林勝の総合的研究を中心に研究を進め、戦後日本文学研究史における盲点としての植民者文学の重要性を提起した。「日本と朝鮮の旧「皇国少年」たちは戦後/解放後どのように出会うのか」というテーマのもと、192030年代に日本帝国の各地で生まれ、帝国崩壊後に多様な経験をした日本と朝鮮の文学者たち(後藤明生、李浩哲、李恢成)の戦後/解放後の接触に着目し、彼らのポストコロニアルテキストの比較分析をおこなった。本研究は、戦後日本語文学と解放後韓国語文学において脱植民地主義がどのように追究されたかを検討する比較研究である。第一年目となる今年度は、日本語論文と韓国語論文1本ずつ計2本の執筆を中心に、研究活動をおこなった。日本語論文は、国際高麗学会の学会誌『コリアン・スタディーズ』5号の特集論文として執筆した。同誌は、2017年6月に刊行予定であり、現在最終校正を終え、印刷中である。韓国語論文は、同志社コリア研究センターと高麗大学民族文化研究院による国際共同研究「朝鮮半島と日本を越境する植民地主義および冷戦の文化」に参画し、その一環として執筆した。現在、受理済みの段階である。同論文を収録した著作物は、国際共著論文集『冷戦研究の最前線』(高麗大学民族文化研究院、2017年)として、韓国で2017年6月に刊行予定である。研究発表を2回おこなった。1回目は、原佑介「一人一人の死を数えるー日本人作家が描いた朝鮮人虐殺を通して」(国際ワークショップ「戦争の記憶の継承と写真の役割」立命館大学国際平和ミュージアム、2016年6月11日)である。同発表の研究成果をもとに、今後、中西伊之助「不逞鮮人」・湯浅克衛「カンナニ」・小林勝「万歳・明治五十二年」の比較研究をおこなった韓国語論文の執筆を進め、「3・1独立運動」100周年に当たる2019年に、韓国の雑誌に投稿する予定である。2回目は、原佑介「『引揚げ文学』と在日朝鮮人文学」(「『引揚げ文学論序説』を受け止める」立命館大学国際言語文化研究所、2017年1月29日)である。同発表の原稿を整理し、『立命館国際言語文化研究』(立命館大学国際言語文化研究所)の2017年度秋季もしくは冬季の号の特集論文として投稿する予定である。口頭発表「一人一人の死を数えるー日本人作家が描いた朝鮮人虐殺を通して」(国際ワークショップ「戦争の記憶の継承と写真の役割」立命館大学国際平和ミュージアム、2016年6月11日)では、おもに植民地期に活躍した作家中西伊之助の「不逞鮮人」の分析をおこなった。文学史的にみて中西は、本研究の核心的な対象である戦後作家小林勝の先行者という位置づけにある。同発表は、今後近現代日本文学における脱植民地主義の系譜を整理していくための準備作業とした。口頭発表「『引揚げ文学』と在日朝鮮人文学」(「『引揚げ文学論序説』を受け止める」立命館大学国際言語文化研究所、2017年1月29日)では、本研究がいう「戦後日本語文学における脱植民地主義」のおもな担い手である引揚者たちの文学について、研究史上初めて体系的に取り上げた朴裕河『引揚げ文学論序説』を手がかりに、その可能性と今後の課題、そして在日朝鮮人文学との比較の必要性という論点を検討した。論文「植民地郷愁を撃てー小林勝「「懐しい」と言ってはならぬ」と「日本人中学校」」(『コリアン・スタディーズ』5号、国際高麗学会、2017年6月刊行予定)では、1970年前後の小林勝の文学と思想の要点を整理し、金石範をはじめとする同時代の在日朝鮮人作家たちとの比較研究をおこなった。また、韓国語論文「植民者の息子が闘った朝鮮戦争ー小林勝の反戦運動と文学」(太田修・許殷編著『冷戦研究の最前線』高麗大学民族文化研究院、2017年8月発行予定)では、朝鮮戦争期の小林勝の動向を、研究史上初めて詳細に明らかにした。これらの成果を通じて、1950年代初頭から1970年前後にかけての小林勝の文学的・思想的変遷を検討するとともに、1960年代から70年代にかけての金石範と高史明を中心とする在日朝鮮人文学における引揚者文学との関連性を明らかにした。本研究は、おもに196070年代の日本と韓国のポストコロニアル文学が、脱植民地主義の主題をどのように追究したかを比較研究するものである。最終年度となる本年度は、これまでの研究成果をまとめる作業を中心に研究を進めた。植民地朝鮮生まれの戦後日本人小説家小林勝の総合的研究の成果をまとめた単著の執筆を終えた。時期がずれこみ、本年度中の出版には間に合わなかったが、2018年度中に新幹社から刊行することが決定している。戦後日本ポストコロニアル文学史における最重要作家の一人に挙げられる小林勝の総合的研究書は、研究史上本書が初となる。朴裕河が『引揚げ文学論序説』において提唱した日本人引揚者の戦後文学の研究に、少ならかぬ進展をもたらすことが期待される。本年度は、口頭発表を2回おこない、日本語論文2本、日本語書評1本、韓国語論文1本を発表した。

これらの成果の多くは、小林勝の朝鮮戦争期の動向、朴裕河『引揚げ文学論序説』の批判的検討などを含み、上記の単著の一部を構成する。本年度以降の本研究の主要な比較研究のテーマは、「日本と朝鮮の旧「皇国少年」たちは戦後/解放後どのように出会うのか」というものであり、192030年代に日本帝国の各地で生まれ、帝国崩壊後に多様な経験をした日本と朝鮮の文学者たちの戦後/解放後の接触に着目した。本年度は、後藤明生、李浩哲、そして李恢成という日本と朝鮮のポストコロニアル文学史における重要作家たちのポストコロニアルの出会い(再会)の様相を明らかにした。本研究は、196070年代戦後日本文学と解放後コリア文学における冷戦(南北分断)体制批判および脱植民地主義の比較文学・思想史研究である。植民地朝鮮生まれの小説家小林勝の総合的研究を中心に研究を進め、戦後日本文学研究史における盲点としての植民者文学の重要性を提起した。「日本と朝鮮の旧「皇国少年」たちは戦後/解放後どのように出会うのか」というテーマのもと、192030年代に日本帝国の各地で生まれ、帝国崩壊後に多様な経験をした日本と朝鮮の文学者たち(後藤明生、李浩哲、李恢成)の戦後/解放後の接触に着目し、彼らのポストコロニアルテキストの比較分析をおこなった。国際的な比較研究をおこなう本研究の問題意識からみて、昨年度に韓国語論文を1本仕上げたことは、大きな収穫であった。このような成果を踏まえ、今年度以降も、韓国語論文の執筆や韓国の学会・研究会での発表など、韓国の学界に向けた研究成果の発信をいっそう積極的におこなう。本研究の最重要課題のひとつである解放後韓国文学の研究を進める上でも、同志社コリア研究センターと高麗大学民族文化研究院による国際共同研究は、非常に有意義な研究活動の場を提供してくれるため、今後も積極的に参画し、研究者ネットワークの形成を積極的に進める。2017年5月現在、1本の日本語論文の執筆を進めている。前年度の研究発表の成果を踏まえたものであり、「引揚げ文学」(朴裕河)の研究史をまとめる。本稿は、秋以降の『立命館国際言語文化研究』に掲載される予定である。また、1本の韓国論文の執筆を進めている。小林勝の初期小説「フォード・一九二七年」の作品分析を中心に、戦後日本文学にあらわれた植民地朝鮮における日本人と朝鮮人の出会いの表象について論じるものである。この論文は、秋以降、『SAI』もしくは『尚虚学報』など、しかるべき韓国語雑誌に投稿する。そのほか、在日朝鮮人文学および解放後韓国文学における脱植民地主義の問題について、積極的に研究を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。戦後日本文学29年度が最終年度であるため、記入しない。
胚性多分化能細胞から中胚葉系列細胞への分化におけるTGF-βファミリー

胚性多分化能細胞から中胚葉系列細胞への分化過程において細胞分化因子群であるTGF-βファミリーが果たす役割を明らかにすることを目的とした。胚性多分化能細胞ではTGF-βファミリーの受容体群および情報伝達分子群が発現しており、とくに、中胚葉系列細胞への分化には、Nodal/Cripto軸が重要な役割を果たしていることが分かった。また、従来の情報伝達モデルでは説明できないリガンド-受容体-情報伝達分子の組み合わせが存在することが分かった。動物の個体はたった1個の受精卵から発生する。個体の正しい発生には精緻な細胞増殖と分化が不可欠である。すなわち、受精卵や発生初期の細胞は分化における全能性を有しており、各胚葉の幹細胞に分化した後、多段階の分化過程を経て個体は形成される。細胞の分化制御に関して詳細の多くは依然として不明である。そこで、胚性多分化能細胞から中胚葉系列細胞への分化におけるTGF-βファミリーの意義を探ることを目的として研究を行っている。本研究では、マウス胚性腫瘍細胞P19を用いた。この細胞はマウス発生初期の胚盤胞内部細胞塊に類似した性質を持つ多能性細胞で、培養条件に応じ三胚葉のいずれにも分化することができる。最初に、本細胞株の通常の培養(6%FCS存在下)時における各種分化マーカー遺伝子の発現を調べた。その結果、TGF-Rファミリーによって正に制御されていることが知られている中胚葉マーカー遺伝子であるBrachyury (Bra)とGoosecoid (Gsc)の発現が認められた。BraとGscの発現量は培養開始後96時間目以降に激減した。TGF-βファミリーの各種メンバーの遺伝子発現量を調べたところ、Braと(iSCと類似した変化を示したものはNodalのみであった。またNodalのシグナル伝達に必要なR-SmadであるSmad2/3のうちSmad2のリン酸化が96時間目で減少し、Nodal受容体であるAlk4/7の阻害剤SB431542によりBraとGscの発現量が用量依存的に減少した。これらのことからBraとGscはNodalによって誘導されているのではないかと推測された。次に、Nodalの遺伝子発現制御について検討するために120時間培養した培地上清を用いP19細胞を培養した。その結果、長期間の培養することによりNodalの発現を阻害する因子が産生されていることが分かった。本年度は、P19胚性腫瘍細胞を用いて、TGF-βファミリー添加に対応した情報伝達経路の解析を行った。TGF-βファミリーの情報伝達分子であるSmadタンパク質は受容体セリンキナーゼによってそのC末端に位置するセリン残基がリン酸化され、活性化することが知られている。Smadタンパク質のリン酸化を高感度に検出するため、Wiestern blotのブロッキング液の影響を調べたところ、Atto社のEzBlockを利用することによってSmadタンパク質のリン酸化の高感度検出が可能となった(Funaba and Murakami,印刷中)。この方法を利用して、TGF-βファミリーを培地中に添加した時のSmadリン酸化の様相を調べたところ、P19細胞は、基本的に、TGF-β1に応答性が見られないこと、ならびに、BMP-2に対してはBMP応答Smadとして知られるSmad1/5/8がリン酸化される一方、アクチビン/TGF-β応答Smadとして知られるSmad2がリン酸化されないこと、が明らかとなった。興味深いことに、アクチビンAに対しては、BMP応答Smad、アクチビン/TGF-β応答Smadのいずれもがリン酸化されることが分かった。アクチビンAによって両系統のSmadがリン酸化されることは、文献上、知られていないことから、今後、このリン酸化の分子機構ならびにその意義について検討する必要がある。受精卵や発生初期の細胞は分化における全能性を有しており、各胚葉の幹細胞に分化した後、多段階の分化過程を経て個体は形成される。そこで、胚性多分化能細胞から中胚葉系列細胞への分化におけるTGF-βファミリーの意義を探ることを目的として研究を行った。前年度までに、TGF-βファミリーの情報伝達分子であるSmadタンパク質の活性化状態を鋭敏にモニターできる系を開発した(Funaba &Murakami, J. Biochem. Biophys. Methods, 70: 816. 2008)。

この方法を利用して、分化過程におけるTGF-βファミリーの活性化を調べたところ、分化初期段階において、activin/Nodal/TGF-βの情報伝達分子の活性化が見られることが分かった。各リガンドの遺伝子発現を調べたところ、分化初期段階において、Nodal/Cripto系が活性化していることが判明し、この活性化が中胚葉形成に重要な分子であるBrachyuryとGoosecoidの発現を制御していることが明らかになった(Nakaya, Murakami, Funaba, J. Cell. Biochem.,105: 801.2008)。また、研究を進める上で、TGF-βのI型受容体にはalternative splicingによって2つの受容体アイソフォームが存在することが分かり、各アイソフォームの分化過程における発現ならびに機能の際について調べた(Murakami, Kondo, Funaba, Cell Biol. Int., 32: 848. 2008)。