hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞融合法により作出した雑種細胞のDNAの解析

沈澱物を10mlのSGBに懸濁し、IM.MgCl_2、100μlとDNase0.5mgを加え撹拌し氷上で1時間反応させる。その後GMを加え20000×gで30分遠心.沈澱物を5mlGMで懸濁し、テフロンホモジナイザ-で処理後、B4バッファ-10mlに重層し13500×g10分遠心する。下層バンドをピペットで集めGMで懸濁遠心し、精製ミトコンドリアを得た。これにザルコシル、プロティナ-ゼKを加え37°C2時間処理、クロロホルム:フェノ-ル(1: 1)を加え、除タンパクを行う。その後エタノ-ル沈澱を行い最終精製作を得た。これらの試料は現在制限酵素処理して電気泳動を行い分析中である。2)染色体のパルスフィ-ルドによる分離醤油、玉葱培地で培養した菌体をセルラ-ゼ2%、ウスキザイム1%,キチナ-ゼ0.1%,0.5Mマニト-ルをいれたリンゴ酸緩衝液(pH5.6)で30°C3時間処理しプロトプラストを調製した。収量は6×10^8ml。寒天ゲル濃度0.6%、RNaseの前処理は1mg/ml、50mM Tri塩酸pH7.5 95°C10分処理、本処理はTE中で1/100容量の試料を入れ37°Cで1時間処理した。パルス時間を20ー22.5分で3本のバンドが得られた。現在より明確なバンドを得るために実験を行っている。1)担子菌のミトコンドリアDNAの制限処理と電気泳動抽出したミトコンドリアDNAの分析のために、制限酵素(HindIII)で処理した。TE緩衝液に溶解したミトコンドリアDNAは制限酵素を混合して、37°Cで2時間反応させた。反応はTAE緩衝液(40mMトリスー塩酸、2mM EDTA、pH8.0)に0.1%ブロムフェノ-ルブル-、0.1%キシレンシアノ-ルと50%グリセロ-ルを添加した混合液で停止させた。電気泳動は定電圧(60V)で行った。ゲルは1m1当り0.5μgエチジウムブロマイドを含んだ溶液で染色した。各株のミトコンドリアDNAのサイズはアガロ-ス電気泳動の結果より70ー90kbpの範囲であった。親株、一核菌糸(MoA11とMoP16)のいずれもアプラスミド様DNAを有し、9ー10kbpの範囲で測定された。MoA11とMoP16は12個の制限酵素断片をもっていた。両一核菌糸株は特有な制限酵素断片(3.2、3.5)を有していた。2)パルスフィ-ルド電気泳動法による核DNAの分離と解析サンプルブロックを適当な大きさに切りサンプル溝に入れた。チャンバ-にx0.5TBE緩衝液入れ、電圧値、パルス時間を入力した。モ-ド9で泳動開始した。泳動完了後ゲルは、0.5μg/mlのエチジウムブロマイド溶液で染色しDNAバンドを観察した。結果は、キクラゲ、アラゲキクラゲの染色体DNAは各4本で、キクラゲは6.1,5.8,4.2,3.5Mbであり、アラゲキクラゲは6.1,5.5,5.0,3.5Mbである。
骨格筋再生の機序とそれに影響する要因に関する基礎的研究

ニワトリの前広背筋(ALD)に凍結損傷を与え筋の再生を観察した。損傷後2-7日の再生筋線維の横断、縦断凍結切片を作成し抗ジストロフィン抗体、抗ビンキュリン抗体と抗心筋型C一蛋白質抗体で反応後、螢光色素標識された2次抗体とファロイジンで染色を行った。また観察には共焦点レーザー顕微鏡を使用した。凍結損傷後3日目には抗心筋型C-蛋白質抗体(以下CCP)に濃染される再生筋があらわれ、それらの中に抗ジストロフィン抗体に染まるものと染まらないものとがあった。染まるものは細胞膜に沿って非連続的に染色された。また抗ジストロフィン抗体には陽性であるが、抗ビンキュリン抗体には陰性の線維もみられた。損傷後7日目では再生筋線維のCCPによる染色性は、3日目のものと同じ程度に染色されるものと染色性が弱くなっているもの、また、中程度に染まるものとが混在していた。抗ジストロフィン抗体、抗ビンキュリン抗体の染色性を縦断切片より膜面にそって観察すると、正常な筋線維では抗ジストロフィン抗体、抗ビンキュリン抗体とも格子状に局在して観察された。損傷から7日目のCCPに強く染まる再生筋線維の膜表面では、抗ジストロフィン抗体は瀰漫性に染色され、CCPに弱く染まる再生筋線維では同様に瀰漫性に染色されるものや、明瞭な縞模様に染色されるものが観察された。またCCPに中程度染色される再生筋線維では抗ジストロフィン抗体は瀰漫性、あるいは不明瞭な縞模様に染色されていた。これらの結果からジストロフィンは骨格筋線維の再生においてビンキュリンより早期に発現し、その再生が進むにつれて細胞膜表面に沿って瀰漫性から縞模様構造、そして格子状構造に構築されていくことが示唆された。1.実験的損傷後の筋再生状況Wistar系雄ラット(6週令)を用い、凍結による筋損傷後の再生状況を検索したところ、光学顕微鏡的に2日後には壊死細胞と貧食細胞、小円形細胞浸潤を認め、4日後ではさらに線維芽細胞の増生も認められた。8日後には再生筋細胞が増殖し、以前の細胞に置き換わっていた。また、免疫組織学的に見ると4日目以降では再生筋細胞の胞体内に染色性の高まることが蛍光顕微鏡的に確認された。2.再生に影響する要因の解析再生初期の変化を知る目的で、実験的に筋細胞移植のための基礎研究を行った。培養した筋芽細胞(C2cell)を免疫抑制剤(シクロスポリン)投与のもとで移植したところ、2日後には移植細胞の生着が確認され、7日後には細胞増殖が認められた。また、蛍光顕微鏡的にも細胞増生の進展状況が明らかになった。3.以上の実験結果からして、筋損傷の後の再生は約1週間で明らかに増殖を認められていることから、壊死後の比較的早期に線維芽細胞が生じ、マクロファージなどの細胞因子が筋芽細胞の増殖を促進することがわかった。これらの因子は免疫蛍光染色によっても存在が明らかにされた。また再生と共に老化再生組織への筋移植のための基礎実験として、培養筋細胞の移植を行い、その免疫抑制剤の効果、投与方法などが検討できた。これによって、次年度の筋衛星細胞の移植実験が可能となり、初期の筋細胞の増生機序を解明することができると思われる。筋損傷後の筋細胞の再生過程を検討するため、ニワトリの前広背筋(ALD)に凍結損傷を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。

再生を開始した3日目の筋細胞においては、膜タンパクであるDystrophinにより細胞膜部が染色され、その後、少し遅れてVinculinにより染色されることが明かとなった。またEmbryo typeのC-Proteinは再生筋細胞を単に染めるだけではなく、再生過程によって、筋細胞の染色性に相違を生じることから、再生筋芽細胞の発生過程の標識のひとつとして適していることがわかった。今後、培養した筋芽細胞の移植による宿主の筋組織内での筋線維の発生過程を解明するつもりである。ニワトリ前広背筋(ALD)に凍結損傷を与え、筋細胞の再生過程を調べた。筋損傷後3日目からC-proteinとdystrophinが発現し、やや遅れてvinculinが発現することが観察された。C-proteinは筋細胞の再生程度によって染色濃度に差異がみられ、再生初期(3日目)のものほど濃く染まり、再生が進むに従い(7日目)淡く染色される。また、dystrophinも3日目には細胞膜の全周に染色されるようになり、7週目には染色性が弱くなる。膜タンパクの再生過程を共焦点レーザ顕微鏡で観察するとdystrophinが膜面に部分的に生じるのではなく、diffuseに発現し、その後、次第に縞模様構造を作り、格子様に再生構築されていくことがわかった。
セルロースから化学品への直接合成を実現する環境調和型触媒反応システムの構築

循環型社会構築のために化石資源などの枯渇性資源ではなく、再生可能な資源を化成品原料として利用する研究が求められている。本研究では、硫酸などの強酸を使用せず、非可食性バイオマス資源であるセルロースを直接イソソルビド(高機能化成品原料)に変換する担持金属触媒および反応システムの開発を行った。担持金属触媒としてルテニウム/カーボンブラック、イオン交換樹脂としてAmberlyst 70を用いることでセルロースの水素化分解反応・ソルビトールの脱水反応が水溶媒中にて進行し、ワンポットでセルロースからイソソルビド(収率55.8%)への変換が可能であることを明らかにした。循環型社会構築のために枯渇性資源ではなく再生可能な資源を原料として利用する研究が進められている。特に、非可食性バイオマスのセルロースから有用物質に変換する反応が研究されている。本研究では、非可食性バイオマス資源であるセルロースを直接イソソルビド(高分子添加剤や医薬品原料)に変換する担持金属触媒および反応システムの開発を行う。この研究により硫酸などの強酸を使用せず、水素化分解反応・脱水反応を水溶媒中にてワンポットで進行させる新しい環境調和型化学を開拓できる。現行の技術でセルロースから複数の反応ステップを経ることでイソソルビドへ変換可能であり、また、最終ステップとなるソルビトールの脱水反応によるイソソルビドの生成は、硫酸を用いることにより進行することが報告されている。しかし、反応後に中和・中和により生成する塩の分離・生成物の精製と煩雑な過程が必要である。本年度は、セルロースの水素化分解反応・ソルビトールの脱水反応を水溶媒中にてワンポットで進行させるのに高活性な担持金属触媒および固体酸の組み合わせの探索を行った。担持金属触媒としてルテニウム金属、固体酸としてイオン交換樹脂を用いることにより高効率でセルロールからイソソルビドへの変換が可能であることを明らかにした。本反応プロセスでは、反応後の中和操作が不要であり、非可食性バイオマスのセルロースから有用化学物質であるイソソルビドへと一段階で変換可能となった。特に、食糧と競合しない非可食性のセルロースから有用物質に変換する技術が重要である。本研究では、非可食性バイオマス資源であるセルロースを直接イソソルビド(高機能化成品原料)に変換する担持金属触媒および反応システムの開発に取り組んでいる。現行の技術でセルロースから複数の反応ステップを経ることでイソソルビドへ変換可能であるが、最終ステップとなるソルビトールの脱水反応によるイソソルビドの生成は、強酸である硫酸を用いる必要がある。従って、反応後に中和・中和により生成する塩の分離・生成物の精製と煩雑な過程が必要である。本反応プロセスでは、反応後の中和操作が不要であり、非可食性バイオマスのセルロースから有用化学物質であるイソソルビドへと一段階で変換可能とする。本年度は、セルロースの水素化分解反応・ソルビトールの脱水反応を水溶媒中にてワンポットで進行させる高活性な担持金属触媒と固体酸(イオン交換樹脂)の開発および反応条件の最適化を行った。担持金属触媒としてルテニウム/カーボンブラック、イオン交換樹脂としてAmberlyst 70を用い、反応条件を最適化することによりセルロールからイソソルビド(収率55.8%)への変換が可能であることを明らかにした。セルロースの水素化分解反応・ソルビトールの脱水反応を水溶媒中にてワンポットで進行させる高活性な担持金属触媒と固体酸(イオン交換樹脂)の開発および反応条件の最適化を行った。担持白金触媒を用いたときは、良好な結果は得られなかったが、担持金属触媒としてルテニウム/カーボンブラック、イオン交換樹脂としてAmberlyst 70を用い、反応条件を最適化することによりセルロールからイソソルビド(収率55.8%)への変換が可能であることを明らかにした。

担持金属触媒としてルテニウム/カーボンブラック、イオン交換樹脂としてAmberlyst 70を用いることでセルロースの水素化分解反応・ソルビトールの脱水反応が水溶媒中にて進行し、ワンポットでセルロースからイソソルビド(収率55.8%)への変換が可能であることを明らかにした。強酸を用いずにセルロースからイソソルビドに高効率(収率55.8%)で変換可能であることを明らかにした。論文3報、学会発表6件の実績を上げた。27年度が最終年度であるため、記入しない。触媒化学セルロースからイソソルビドへの変換をワンポットで進行させるのに高活性な担持金属触媒および固体酸の開発および最適化を行った。今後は目的生成物の収率を最大化するために触媒キャラクタリゼーションに立脚した触媒最適化を行う。調製した担持金属触媒の反応前後の状態を各種キャラクタリゼーションで評価し、触媒活性点の構造および安定性を明確にして、触媒設計の指針を得る。強酸を用いずにセルロースからイソソルビドに高効率で変換可能であることを明らかにし、さらに、セルロース源として木粉そのものを使用可能であることを明らかにした。論文1報投稿中、学会発表3件の実績を上げた。当初LC-MSを購入予定であったが、研究所内の共有機器でかなりの頻度で使用可能であることから、LC-MSの購入を見送った。反応後の酸性度を効率よく測定するために自動滴定装置を購入したが、LC-MSよりも非常に安価であった。セルロースからイソソルビドへの変換をワンポットで進行させるのに高活性な担持金属触媒および固体酸の組み合わせの探索を行った。今後は目的生成物の収率を最大化するために特定の反応条件で反応生成物組成の経時変化を測定し、速度論解析を行うことにより、収率を最大化する。さらに、高温水中で安定な触媒担体として炭素系担体(活性炭、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、メソポーラスカーボン)、酸化チタン、酸化ジルコニウムなどを用い、本年度に得られた結果を生かして触媒調製を行う。特に炭素系担体の表面官能基とセルロースとの相互作用が予想され、炭素系担体の前処理(表面官能基の制御)も検討する。平成27年度は、最終年度であり、研究を加速するため、高額機器の購入でなく研究補助者の雇用に予算を使用する。本年度入札により購入した機器(GC-MS)が、予定価格していた価格より大幅に低い価格で納入されたため残額が生じた。予定していた高圧反応装置や消耗品のほか、前年度残予算を使用して、より研究を加速させるため研究に必須なGCの購入を行う。
戦後再定住期アメリカ・カナダにおける日系作家の創作活動

従来の日系文学研究は、第二次大戦中の強制収容に研究の焦点を集中させてきた結果、日系作家をともすれば、アメリカやカナダにおける人種主義の犠牲者としてのみ位置づけることに終始し、日系作家の多様性が見逃されてきた。そこで、本研究においては、収容所から解放された日系人がアメリカやカナダの主流社会に復帰していった戦後の再定住期における日系作家の創作活動を検討することを主な目標とすることで、日系文学の変容および多様性について明らかにすることにした。本報告書は、このような研究の成果の一部を纏めたものである。日系作家の中でも戦後、特に、注目すべき活動をおこなったのは、ヒサエ・ヤマモトである。ヤマモトは、1945年から3年間、黒人系の新聞記者となり、その後、1953年から2年間は、カトリック・ワーカーのコミュニティで生活をしている。公民権運動にも参加したヤマモトは、やがて平和主義に関心を寄せ、平和主義者としての活動に熱心に取り組むようになった。戦後の二世が同化志向を強化させた中で、他のマイノリティとの関係に関心を持ち、日系社会の外に目を向けたヤマモトに日系作家としての異質性を認めることが出来る。本報告書では、この二つの活動期に書かれたヤマモトのコラムやエッセイ、およびテキストの検討を通して、戦後のヤマモトがどのように日系二世としての主体意識を構築したか、その過程を探り、日系作家としてのヤマモトの出発点にあったものを明らかにした。第二次大戦後、各地の強制収容所を出た日系アメリカ人がアメリカ社会に復帰していった戦後の再定住期(1945年1959年)における日系作家の創作活動を検討し、戦後の日系アメリカ人のエスニシティや日系社会の変容を考察することが今年度の本研究の主要な目標である。戦後の日系作家は、Rafu ShimpoやPacific Citizenに作品を発表し、創作活動を再開させた。この二つの新聞及び機関誌は、既にマイクロフィルム化されているため、それらを購入し、戦前から活躍していたトシオ・モリ、戦後、本格的な創作活動を始めたヒサエ・ヤマモト及びその他の二世作家による小説やエッセイ等をテーマ別に分類・整理を行いながら、戦争中の強制収容については沈黙を守りつつ、アメリカ社会との新たな関係を探る日系作家の模索の跡を明らかにした。また、これらのマイクロフィルムの検討を通じて、従来の日系文学研究において紹介されてこなかった作家や詩人の作品を検討することもできた。特に日系アメリカ人の歴史研究においても戦後の再定住期における日系アメリカ人に関する研究は現在でもなお空白のままとなっているため、これらの資料を体系的に纏めることは、今後の日系アメリカ人研究において新たな視座を付与するものとなろう。以上のような予備的作業に加えて、夏にはアメリカのカリフォルニア大学のアジア系アメリカ文化研究センターに出張を行い、センターの図書館で日本では入手できない日系文芸誌や絶版となった日系人の戦後再定住期に関する歴史的資料などを収集することができた。今年度の研究を通して明らかにされたのは、戦後の日系作家の多様性である。特に注目されるのは、日系社会からの逸脱を意識的に試みたヒサエ・ヤマモトの戦後の創作活動である。戦後の黒人系新聞の記者としての経験がヤマモトに与えた影響を検討することで、再定住期の日系作家の意識の変容を辿ることができた。この成果を現在、進行中のヤマモトの評伝の一部に収める予定である。本研究の二年目にあたる平成18年度の研究目標は、昨年度の研究成果を踏まえて、戦後のカナダにおける日系作家の創作活動を検討し、戦後の日系カナダ人がカナダ社会に復帰する過程で示された日系カナダ人のエスニシティおよび日系カナダ社会の変容を明らかにすることにあった。まず、そのための予備的作業として、本年度は戦争中も発行されていた代表的な日系新聞、The New Canadian(1940年代後半-1960年)のマイクロフィルムを購入し、戦後の日系作家の活動を収集と整理を行った。戦後の日系カナダ文学といえば、ジョイ・コガワやケリー・サカモトおよびヒロミ・ゴトーなどリドレス運動後の作家に焦点が置かれてきた。

それ以前の、特に戦後の再定住期における日系カナダ文学についての研究はまだ本格的には行われておらず、日系カナダ文学研究においては空白のままである。本研究で戦後再定住期のThe New Canadianを検討することで、コガワ以前に日系社会で評価され、活躍した作家の活動の整理及び体系化を通じてその空白を埋める予備的作業を進めることが出来た。戦後の日系カナダ人作家スエ・サダやジャック・ナカモトらをはじめとする作家の短編や詩においては、人種差別に対する日系カナダ人の葛藤が示唆され、主流社会への同化を進めながらも強制収容のトラウマを払拭できずに、揺れ動く日系カナダ人の状況を理解する上で、再定住期における日系作家のテキストは重要な示唆を与えているものであることが了解された。以上のような研究をさらに進めるために夏にはカリフォルニア大学のアジア系アメリカ研究センターで研究を行った。日系コレクションなどで、日系アメリカ人と日系カナダ人の戦後期における再定住過程の差異や、日系アメリカ人によるリドレス運動が日系カナダ人に与えた影響などが明らかにされた。これらの成果を踏まえて、来年度は、戦後の日系アメリカ文学と日系カナダ文学の比較検討を行い、多人種社会であるアメリカとカナダにおける戦後の日系人が置かれた社会状況の差異を明らかにすることが来年度の目標となる。本研究の最終年度にあたる平成19年度の研究目標は、平成17年度からの3年間に及ぶ研究や調査を踏まえて、戦後再定住期における日系カナダ大作家及び日系アメリカ大作家の創作活動の比較を行うことにあった。戦後再定住用を1945年から1952年までとすることで、アメリカとカナダにおける戦後の創作活動を主として、それぞれの代表的なコミュニティ新聞を通して比較検討を試みた。アメリカの場合は、主としてRafu Shimpo及びPacific Citizenの文芸欄に掲載された短編やエッセイなどを収集し、そこに見られるテーマを分析しながら、戦後の日系アメリカ人にとりコミュニティの再建や日系人としてのアイデンティティの再構築に伴う葛藤や揺らぎを特に二世に共通の問題として示されている。一方、日系カナダ人の創作活動については、日系カナダ社会の中心的な新聞であったNew Canadianの文芸欄を読み、エッセイや短編、詩などを収集し、テーマ別に整理・分類しながら戦後の日系カナダ人が強制収容というトラウマをどのように乗り越え、カナダ社会に復帰したかその過程を検討した。その結果、二世の様化及び、他人種との関係など共通点がありながらも、強制収容のあり方の差異がそれぞれの社会における日系人の状況にも影響を及ぼしていることが了解された。さらに両国の日系人再定住期の比較をさらに進めるべく、3月にはアメリカのカリフォルニア大学で二世による雑誌の調査と研究者との意見交換も行い、報告書作成の準備を進めた。
ネウボラの可視化と評価から新日本版ネウボラ子育て支援構築とその課題や展望

本研究については、愛知県B市の保健センターの協力を得て母子支援の在り方について検討会を継続している。本年度の4月には保健師を中心にして、愛知県B市の保健センターに、初めてネウボラ的支援センター室(子育て支援の場)が新設された。そこでは、月に100名程度の妊婦から5歳児ぐらいの母親が適宜育児の相談を受けに足り、子供を遊ばせたりの目的で気軽に訪問して育児のアドバイスを受けている。その設営のアドバイスなどは本研究で実施した、フィンランドのネウボラ視察時の、インタビュー内容や、写真などに基づいてBセンターの保健師に何回か会議を通じて伝達活動に努めた。また、本研究計画の日本におけるネウボラ支援実施の保健師の実態調査は、研究倫理委員会審査の承認が得られたが、まだ調査の実施に向けて、継続準備中である。フィンランドでネウボラを20年間の間に利用した母親達のインタビュー調査は、日本母性衛生学会誌に投稿して、掲載され、社会へ研究成果を公表することができた。また、フィンランドの保育園視察から、その特徴とネウボラとの関係や日本に見られない視点での育児方法については、研究成果をまとめて、日本看護養護福祉研究学会誌に投稿した。現在、学会誌は印刷中で近日には本研究の一部は社会に公表することができる。フィンランドのネウボラの母親が各自で利用した年間回数、相談内容、よかったこと、困ったことの評価を分析して、日本家族看護学会で口演した。これらは、今後の日本の助産師、保健師、看護師、医師などによる0-6歳児の母子支援に関して、ネウボラ的あり方についての貴重な研究成果となりえると考えた。本研究について愛知県B市の保健センターの協力を得て母子支援の在り方について検討会を継続している。本年度4月には保健師を中心にして、愛知県B市の保健センターに、初めてネウボラ的支援センター室(子育て支援の場)が新設された。そこでは、月に100名程度の妊婦から5歳児ぐらいの母親が相談に訪問している。また、本研究計画の日本におけるネウボラ支援実施の保健師の実態調査は、研究倫理委員会審査の承認が得られたが、まだ継続準備中である。主なリ理由は、勤務大学の博士後期課程の博論指導などのため、調査の実施は、期間延長して次年度実施とした。フィンランドでネウボラを利用した母親のインタビュー調査は、日本母性衛生学会誌に投稿し、掲載され、社会へ研究成果を公表することができた。また、フィンランドの保育園視察からその特徴とネウボラとの関係について研究をまとめて、日本看護・教育・福祉学研究学会に投稿した。現在学会誌は印刷中で近日には本研究の一部は社会に公表することができる。フィンランドのネウボラの母親が各自で利用した年間回数、相談内藤、よかったこと、困ったことの評価を分析して、日本家族看護学会で口演した。本研究は期間延長が承認されたので、本年度内に完了を目指して進める。特に、本研究計画の日本におけるネウボラ支援実施の保健師の実態調査は、研究倫理委員会審査の承認が得られたが、まだ継続準備中であるので、調査を実施する予定である。研究環境の問題としては、勤務大学が他県の新設大学に異動したので、研究時間を捻出して、地域とのつながりを新たに構築したり、パソコン機器の環境を整備しながら、研究を推進する予定である。今後は、海外で2020年にインドネシアのバリ島で開催される国際助産師連盟学術大会(ICM)や、他の国内の関連学会にて、研究成果の一部を公表予定である。また、勤務地の新設大学にて、「大学発ネウボラ的母子継続支援研究センター」が新たに設営できたので、その教育設備を十分活用して、地域の妊娠期の妊婦や0歳児から6歳児を育てている母子、家族、祖父母への支援の拠点とする予定である。そして、助産師、保健師、看護師、医師、薬剤師、臨床心理士などの協力を得て、大学生の参加も呼びかけて、未来の「パパ・ママ」の若者にも「子どもの発達の観察体験学習」や「ほんまの赤ちゃん抱っこ体験学習」の「場」へと教育的・研究的実践活動を持続可能な行動目標を立て、研究を推進予定である。最終的には、「ネウボラの可視化と評価から新日本版ネウボラ子育て支援とその課題や展望」の研究課題を達成予定である。本研究は、第1段階として、平成27年に日本版ネウボラを実施していると報告のある全国の5市の運営とシステムをWebや文献から調査した。次に、フィンランドのネウボラ運営とシステムについて、ネウボラ企画者とネウボラ担当者およびネウボラを利用した母親そして、ネウボラと関連している保育士に対する質問票とインタビューガイドを和文と英文で作成した。その後、東京の在日フィンランド大使館子育て関係者にヘルシンキ市近郊で調査対象者の紹介を依頼し、THL(フィンランド国立保健健康研究所)の統括部長を紹介された。平成28年夏に通訳とコーディネーターの協力で、ヘルシンキ市近郊にて十数名の調査とインタビューを実施した。本研究は全てA大学の研究倫理審査会の承認後に、対象から承諾書又は同意書の署名を得たのちに開始した。利益相反は認められない。帰国後、ICレコーダーに録音したインタビュー内容の分析を行った。

現在は、学会報告に向けて準備中である。第2段階では、愛知県B市の保健センターの保健師と会議を重ねて、同市の健康文化部長から、本研究の検討会を共同で会議することの承諾書を得て、研究実施体制の充実を図った。第3段階では、ネウボラ的地域包括継続子育て支援を実施している市町村の保健センターの担当者に、子育て支援の運営やシステムの現状と課題、展望と担当者が満足している内容やQOL、今後の希望などを、具体的な内容の質問票とインタビューガイドを作成中であり、次年度に倫理的側面の審査を得て、実施予定である。平成28年度は、研究計画に即して、フィンランドのヘルシンキ市を訪問して、THL(フィンランド国立保健健康研究所)の研究協力の承諾が得られた。その結果、ネウボラ関連施設8か所の視察や写真撮影、ネウボラ担当者の複数人やリーダーのインタビューが実施できた。また、ネウボラを利用した母親の質問紙調査やインタビュー調査が可能であった。更に、保育園の保育士の複数人や園長から、フィンランドの幼児教育と、ネウボラとの連携の実際がインタビューできた。そして、そのデータの分析も進んでおり、学会報告の縦鼻中である。国内のネウボラ的地域継続包括子育て支援を実施している保健センタ-の運営とシステム、実施内容などの分析も推進中である。以上から、本研究の計画案は、おおむね順調に進展していると考えられる。平成29年度は、まず、海外調査ではフィンランド国立保健福祉研究所(THL)でネウボラ施策運営統括者やネウボラ保健師、プレスクールや保育園長等のインタビューやネウボラを利用した母親達の質問紙調査やインタビューの分析結果からネウボラの実態を、国内学会で公表することとした。分析内容は7つの課題別に分析して、下記の1から3の学会で7テーマで発表を試みた。フィンランドからはTouvi Hakulinen博士も共同研究者として日本公衆衛生学会に参加した。次は国内でネウボラ標榜の施設にて調査の為、研究倫理審査委員会承認後の調査実施が現在進行中である。そして、研究成果の論文公表では、フィンランドのネウボラを利用した母親の調査とプレスクールと保育園のネウボラとのつながりの実態について、調査結果をまとめた2論文を投稿中である。さらに、国内の議員立法作成経験者を招聘してネウボラ研究成果を、施策に提言する方法についてシンポジュウムを実施した。分担研究者を追加して、研究視点の広がりを持たせて、計画は概ね当初のとうりに進んでいると思われる。本研究については、愛知県B市の保健センターの協力を得て母子支援の在り方について検討会を継続している。本年度の4月には保健師を中心にして、愛知県B市の保健センターに、初めてネウボラ的支援センター室(子育て支援の場)が新設された。そこでは、月に100名程度の妊婦から5歳児ぐらいの母親が適宜育児の相談を受けに足り、子供を遊ばせたりの目的で気軽に訪問して育児のアドバイスを受けている。その設営のアドバイスなどは本研究で実施した、フィンランドのネウボラ視察時の、インタビュー内容や、写真などに基づいてBセンターの保健師に何回か会議を通じて伝達活動に努めた。また、本研究計画の日本におけるネウボラ支援実施の保健師の実態調査は、研究倫理委員会審査の承認が得られたが、まだ調査の実施に向けて、継続準備中である。
中性子結晶解析法によるヒドロゲナーゼの反応機構およびプロトン経路の解明

本研究では,[NiFe]-ヒドロゲナーゼのNi-Fe活性部位における水素活性化の反応機構を中性子結晶解析法により解明するために,良質の巨大単結晶の調製を目指した.重水溶液中での[NiFe]-ヒドロゲナーゼの結晶化においては,沈殿剤として2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を用いるが,これが酸化されると4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(HMPO)が生成されヒドロゲナーゼの結晶性を著しく劣化させることをつきとめた.また,巨大単結晶にダメージを与えることなく,凍結させる条件を見出した.その結果,11mm3の大きさの良質の単結晶の調製に成功した.本申請研究では,巨大タンパク質・ヒドロゲナーゼのNi-Fe活性部位における水素活性化の反応中間体を,中性子結晶解析法により直接観察することを主目的とした.また,水素を分解した後の産物・プロトンのタンパク質中の移動経路の解明を目指してきた.平成25年度は,日本原子力研究開発機構の原子炉が稼働されなかったため,中性回折実験を行うことはできなかった.平成25年度は,下記の3点について研究を遂行した.1.重水溶液中での[NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良.平成24年度に,沈殿剤として利用していた2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)が酸化されると4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(HMPO)が生成され,それがヒドロゲナーゼを変性させることなどを見出していた.平成25年度は,HMPOを利用した場合には,結晶化母液のpHが設定値よりも変動することが酵素の結晶化に大きく影響することを確認した.2.酸素耐性膜結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化.水素酸化細菌のもつ酸素耐性ヒドロゲナーゼについて,重水溶液中での初期スクリーニングを行ったが,現時点では,良質の結晶は得られていない.3.巨大単結晶の凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立.これまでの研究では,酵素にCOを結合させることで,活性部位に基質・水素をトラップできることが判明している.この方法で基質の反応水素を活性部位に固定することを目的に,回折実験を80 Kの低温で行う条件検討を引き続き行った.その結果,MPDを結晶化沈殿剤として利用する場合に限って,大きなダメージを与えることなく巨大結晶を凍結できることがわかった.実験室X線装置を用いて1.3 A分解能のX線回折像を得ている.本研究では,[NiFe]-ヒドロゲナーゼのNi-Fe活性部位における水素活性化の反応機構を中性子結晶解析法により解明するために,良質の巨大単結晶の調製を目指した.重水溶液中での[NiFe]-ヒドロゲナーゼの結晶化においては,沈殿剤として2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を用いるが,これが酸化されると4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(HMPO)が生成されヒドロゲナーゼの結晶性を著しく劣化させることをつきとめた.また,巨大単結晶にダメージを与えることなく,凍結させる条件を見出した.その結果,11mm3の大きさの良質の単結晶の調製に成功した.本申請研究では,巨大タンパク質・ヒドロゲナーゼのNi-Fe活性部位における水素活性化の反応中間体を,中性子結晶解析法により直接観察することを主目的とする.また,水素を分解した後の産物・プロトンのタンパク質中の移動経路の解明を目指している.平成24年度は,下記の3点について研究を遂行した.1.重水溶液中での[NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良.本実験を試みた結果,平成23年度までに得られていた方法で,2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を結晶化沈殿剤として,5mm3の単結晶調製に成功した.また,MPDが酸化されると4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(HMPO)が生成され,それがヒドロゲナーゼを変性させることなどを見出した.2.酸素耐性膜結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化.本実験については,現時点では良好な結晶化条件は見出されていない.今後,さらに多くの条件で結晶化スクリーニングするために十分な量の酵素試料の調製条件の検討が急務である.3.巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立.これまでの研究では,酵素にCOを結合させることで,活性部位に基質・水素をトラップできることが判明している.この方法で基質の反応水素を活性部位に固定することを目的に,回折実験を80 Kあるいはそれ以下(30 K程度)の低温で行うための条件検討を行った.その結果,上記1で得られた単結晶(5.0 mm3)に大きなダメージを与えることなく凍結することに成功し,実験室X線装置を用いて1.4 A分解能のX線回折像を得ることに成功した.平成25年度は,上記13についてさらに研究を推進したい.研究計画に記載されている3つの課題のうち1と3について,下記のように概ね順調に進行しているからである.2.酸素耐性膜結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化.本実験については,現在,実験計画を練り直している.3.巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニング

および結晶還元条件の確立.上記1で得られた単結晶(5.0 mm3)に大きなダメージを与えることなく凍結することに成功し,実験室X線装置を用いて1.4 A分解能のX線回折像を得ることに成功した.研究計画に記載されている3つの課題のうち13について,下記のように研究を進めていきたい.1.重水溶液中での[NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良.本実験で,2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を結晶化沈殿剤として,重水中においてさらに大きくて良質の単結晶の調製を目指す.平成25年度中にそのような単結晶の調製に成功した場合には,海外機関での中性子回折実験の申請および実施も考慮したい.2.酸素耐性膜結合型[NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化.本実験については,現在,酵素試料の発現系の構築を進めてる.これに成功すれば,結晶化ロボットを使って結晶化条件のスクリーニングを開始したい.3.巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立.これまでの技術の蓄積で巨大結晶についても大きなダメージを与えることなく凍結することに成功している.上記2で得られる予定の重水緩衝溶液注の巨大結晶についても問題なく凍結処理が可能と考えている.該当なし
多元的イメージングによる系列操作の神経基盤の統合的解明

タイミングの認知と生成は系列行動の最も重要な基本要素の一つである。タイミング認知・生成に関わる脳領域と領域間の機能連関を明らかにするため、健常成人14名においてfMRI研究を行った(Aso et al. in press)。被験者は、数百msの刺激間隔(ISI)で提示される視覚刺激のISI長短判定(タイミング認知)、提示された刺激のISIを二回のボタン押し運動として再生(タイミング再生)する課題を行った。対照条件として、視覚刺激のサイズの大小判定課題とボタンの即時押し課題をそれぞれ用いた。fMRIは3テスラ装置を用いたエコープラナーイメージ撮像により行った。タイミング認知と再生は、それぞれの対照条件との比較において、共通して前頭前野、島皮質、下頭頂葉から上側頭回、小脳の有意な活動増加を伴った。また小脳の活動はタイミング認知課題において右半球、タイミング再生課題において左半球でより著明であった。これら小脳のタイミング認知・再生における活動は、大脳皮質と小脳が形成する神経回路の機能を反映すると仮定し、小脳の活動部位をシード領域として用いるpsycho-physiological interaction解析を行った。その結果、小脳活動との相関が課題依存性に変化する部位としてSMAが同定され、このSMA領域はタイミング認知課題の際に右小脳と、タイミング再生課題の際に左小脳と大きな相関を示していた。タイミング認知と再生機能に、SMAと小脳の機能連関が重要であることが示された。この結果は、タイミングの認知と生成がともにSMAと小脳が構成する神経回路の機能に依存していることを示唆する。再生の場合、SMAが生成する運動計画指令に基づき、小脳が次に運動を生成すべきタイミングを予測していると考えられるが、タイミング認知の際にも同じ回路が使われていると解釈できる。平成20年度は多元的イメージング手法の開発を中心に行った。経頭蓋磁気刺激(TMS)、筋電図と磁気共鳴画像(MRI)の同時計測系を開発し、運動野に対するTMS刺激により、運動野を中心とする神経回路を介して遠隔地運動野に誘発される脳活動を測定することに成功した(Cerebral Cortex印刷中)。刺激された運動野と遠隔地運動野の活動は、運動閾値下刺激に対して線形に増加し、閾値付近で非線形な応答を示した。また、MRI拡散強調画像を用いた確率的トラクトグラフィーと手指タッピング、言語読み課題の機能的MRI実験を組み合わせ、線条体構造のプラインドセパレーションを行った。運動課題による皮質活動との線条体結合は被殻後外側部、言語課題による皮質活動との結合は尾状核から線条体前部に認められた。線条体ブラインドセパレーションの結果を、課題として運動・認知系列操作を用いた機能的MRI実験の結果と組み合わせ、系列運動と系列認知操作の負荷に相関して変化する線条体活動を同定することができた。これら多元的イメージングの手法により、神経回路の構造と機能を客観的に可視化できることを証明できた。また平成20年度に、人差し指から薬指への連続したタッピング課題中に、どの指を動かすかを「空間配列」、それぞれの指につき何回ずつタッピングするかを「時系列」と定義し、空間配列と時系列を系列要因の2つのレベルとして扱った2要因デザインによる機能的MRI実験を開始し、現在被験者数を増やしている。
植物－菌共生系を使った菌従属栄養植物の保全技術の確立

菌従属栄養植物の生息域外保全の核心となる3つの課題、1)共生する特定の菌のみの分離・精製、2)分離した菌の培養・保存、3)植物ー菌共生系の構築、以上の解決をめざした技術開発を行った。1)に関しては、菌糸コイルを抗生物質水溶液で洗浄することにより、特定の菌を大量に分離することが可能となった。2)に関しては、自生地の腐植を菌糸に覆土することによって、効率よく子実体を形成させることが可能となった。3)に関して菌従属栄養植物と菌の2者共生系は確立したが、独立栄養植物-菌根菌-菌従属栄養植物の3者共生系では更なる技術開発が必要である。菌従属栄養植物の中には、樹木と共生する難培養性の外生菌根菌から養分を得て生育する種が存在する。本研究は、このような特性を持つ希少野生植物の生息域外保全に向け、人工培地上で培養が困難な外生菌根菌について、樹木に菌根形成させた状態で培養・保存する技術の開発を目的とする。さらに、樹木・菌根菌・菌従属栄養植物の3者共生系構築を目指す。菌従属栄養植物の材料として、外生菌根性で難培養性の担子菌類と菌根共生することが知られているマヤラン(ラン科)を主に用いた。まず菌根菌の菌糸塊の分離に関して、より大量の菌糸塊を純粋に分離する手法を開発した。続いて、抽出した菌糸塊を、共生パートナーであるクロマツ(マツ科)の根に直接接種し、外生菌根を形成させる実験を行った。その結果、接種後3ヶ月目に外生菌根を形成させることに成功した。先行研究で菌従属栄養植物からの分離菌糸塊を外生菌根の接種源として利用する手法が報告されているものの成功率は1割程度と低く、再現性に問題があった。本実験では根と菌糸塊の接触面を広くし、加えて接種した菌糸塊が動かないよう固定する工夫を行った。その結果、菌糸塊を接種した苗すべてにおいて菌根形成が確認された。現在、菌根菌の保存法についても手法の開発を進めている。さらに、樹木・菌根菌・菌従属栄養植物の3者共生系を構築すべく、準備を進めている。菌従属栄養植物の中には、樹木と共生する難培養性の外生菌根菌から栄養を得て生育する種が存在する。28年度は菌従属栄養植物の材料として、外生菌根性で難培養性の担子菌類と菌根共生することが知られているヒメノヤガラとマヤラン(ラン科)をおもに用いた。ヒメノヤガラの根より菌根菌の菌糸塊を取り出し、樹木苗(モミ)の根に直接接種する手法を試みた。その結果、3ヶ月後に外生菌根と同様の形態的特徴を示す菌根が形成された。マヤランについては菌根形成効率を向上させるため、アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムを用いて菌糸コイルを根に固定する方法の改良を試みた。さらにモイワランにおいては、根から分離された菌根菌を単離培養し菌の子実体を形成させることに成功した。形態と分子データの双方により,これがナヨタケ科のCoprinellus属であることを明らかにした。またこれらのCoprinellus属の菌糸をモイワランに接種したところ、根茎形成が誘導される反面、根は誘導されなかった。モイワランにおいてはもっぱら根茎が菌根の形成部位であることから、特定の菌が特定の器官形成を誘導することを介して、植物の菌従属栄養性に影響を与えることが示唆された。植物の菌根組織より抽出した菌糸塊を接種源とし外生菌根を形成させる実験系は高い新規性を有しているため、実験を28年度中に完結し、続いて論文にまとめる。植物系統分類学消耗品を当初見積もった価格より安く購入できたため。当初の予定より実験の種類を増やし、物品費に充てる。
神経伝達物質受容体とイオンチャネルの細胞膜上における二次元的な分布状態の解析

脳における情報伝達は,神経細胞やグリア細胞の細胞膜に存在する機能分子である受容体やイオンチャネルを介して細胞内に伝えられることによって達成される.細胞膜にはこれらの機能を発現するために特殊化された膜領域(コンパートメント)が存在し,機能的に関連する分子が集積していると考えられる.シナプスはその代表的なものであり,それ以外にもコンパートメントが存在すると推定されているが,その実体は不明である.本研究では,コンパートメントの解明のためには,神経系に発現している機能分子の膜上における二次元的な分布状態を,フリーズフラクチャーレプリカを用いた免疫細胞化学的標識によって電子顕微鏡レベルで解析することを目的とした.本研究期間において,小脳におけるP/Q型カルシウムチャネル分子がシナプス膜のみではなく,プルキンエ細胞の細胞膜に凝集して存在している可能性を示唆する所見が得られた.ラット小脳の150ミクロン厚スライスを加圧凍結装置で新鮮凍結固定を行った.凍結試料を凍結割断装置で凍結割断後,白金と炭素蒸着を行った.割断・蒸着した試料をSDS処理し,レプリカ膜を回収した.レプリカ膜を抗P/Q型カルシウムチャネルalAサブユニット抗体,ついでコロイド金標識二次抗体で標識し,電子顕微鏡用グリッドに回収,透過型電子顕微鏡Tecnai10で観察した.P/Q型カルシウムチャネルの局在を示すコロイド金粒子は,平行繊維-プルキンエ細胞間のシナプス前膜のP面に認められた.金粒子は神経伝達物質の開口分泌に対応すると考えられる膜の陥凹に近接した膜領域(active zone)には見られず,active zoneを取り囲むように,やや離れた膜領域に観察された.また,プルキンエ細胞の樹状突起では,膜内粒子の凝集をともなった膜領域に金粒子の集積が認められた.小脳の凍結超薄切片を用いた免疫標識では,シナプス領域の周囲部の膜とプルキンエ細胞の樹状突起の細胞膜に金粒子の結合が見られた.金粒子が結合した樹状突起の細胞膜の直下には,小胞体が頻繁に観察されたことから,IP3受容体との関連が示唆された.今後,IP3の微細局在を解析するとともに,P/Q型カルシウムチャネルとIP3の相互作用について細胞生物学,分子生物学的な解析を試みる.脳機能は,神経回路網の作用の統合によって達成されるが,その機能的基本は神経細胞の興奮の伝導と伝達にある.伝導は神経細胞が興奮すると活動電位が細胞体から軸索末端へ下行する過程であり,伝達は活動電位が軸索末端に到達することによって,神経伝達物質が放出され,シプナス後膜に存在する受容体に作用し,その神経細胞を興奮させる過程である.この十数年間に,分子生物学あるいは細胞工学的手法によって,これらの過程に直接関係すると考えられる多種多様な受容体やイオンチャネルのような細胞膜貫通型タンパク質分子が同定され,そしてそれらの分子の生化学的特性が急速に明らかにされてきている.しかし,現時点において,これらの分子の特性を総合しただけでは,個々の神経細胞の持つ固有の興奮の伝導の特性やシプナス可塑性を十分に説明することはできない.これらを解明するには,個々の機能分子の生化学的反応の解析だけではなく,その分子の膜上における微細局在,分布密度やそれに関連する他の分子との位置関係というような「場」の情報が必要であろうと思われる.本研究では,私たちはsodium dodecyl sulfate(SDS)処理フリーズフラクチャーレプリカ標識法を用いて神経伝達物質受容体,主としてチャネル型ならびに代謝調節型グルタミン酸受容体,GABA受容体のシナプス領域あるいはシナプス外領域の神経細胞膜上における二次元的な分布状態を解析することを目的とする.本年度は,代謝調節型グルタミン酸受容体3と水チャネルであるアクアポリン4がアストロサイト細胞膜で共存して存在しており,orthogonal arrays of particlesと呼ばれる特殊な構造を形成していることを明らかにした.脳における情報伝達は,神経細胞やグリア細胞の細胞膜に存在する機能分子である受容体やイオンチャネルを介して細胞内に伝えられることによって達成される.細胞膜にはこれらの機能を発現するために特殊化された膜領域(コンパートメント)が存在し,機能的に関連する分子が集積していると考えられる.シナプスはその代表的なものであり,それ以外にもコンパートメントが存在すると推定されているが,その実体は不明である.本研究では,コンパートメントの解明のためには,神経系に発現している機能分子の膜上における二次元的な分布状態を,フリーズフラクチャーレプリカを用いた免疫細胞化学的標識によって電子顕微鏡レベルで解析することを目的とした.本研究期間において,小脳におけるP/Q型カルシウムチャネル分子がシナプス膜のみではなく,プルキンエ細胞の細胞膜に凝集して存在している可能性を示唆する所見が得られた.ラット小脳の150ミクロン厚スライスを加圧凍結装置で新鮮凍結固定を行った.凍結試料を凍結割断装置で凍結割断後,白金と炭素蒸着を行った.割断・蒸着した試料をSDS処理し,レプリカ膜を回収した.レプリカ膜を抗P/Q型カルシウムチャネルalAサブユニット抗体,ついでコロイド金標識二次抗体で標識し,電子顕微鏡用グリッドに回収,透過型電子顕微鏡Tecnai10で観察した.P/Q型カルシウムチャネルの局在を示すコロイド金粒子は,平行繊維-プルキンエ細胞間のシナプス前膜のP面に認められた.

金粒子は神経伝達物質の開口分泌に対応すると考えられる膜の陥凹に近接した膜領域(active zone)には見られず,active zoneを取り囲むように,やや離れた膜領域に観察された.また,プルキンエ細胞の樹状突起では,膜内粒子の凝集をともなった膜領域に金粒子の集積が認められた.小脳の凍結超薄切片を用いた免疫標識では,シナプス領域の周囲部の膜とプルキンエ細胞の樹状突起の細胞膜に金粒子の結合が見られた.金粒子が結合した樹状突起の細胞膜の直下には,小胞体が頻繁に観察されたことから,IP3受容体との関連が示唆された.今後,IP3の微細局在を解析するとともに,P/Q型カルシウムチャネルとIP3の相互作用について細胞生物学,分子生物学的な解析を試みる.
統合失調症の新たな治療法開発-薬物・細胞combined療法は有効か-

胎生期にPoly I:Cを処置することで統合失調症モデルラットを作成した。モデルラット群は,新奇物体探索試験における記憶・認知機能,社会相互作用試験における社会コミュニケーションの各機能に異常を示した。これに対し,モデル動物に神経幹細胞を経静脈的に移植した群では,その異常が正常対象群に近いレベルへ改善されることが分かった。また,モデルラットに移植した標識神経幹細胞は,1ヶ月6ヶ月以上の期間,前部帯状回,海馬,扁桃体を含む脳の諸領域に分布,生存し,移植3ヶ月の脳内では,海馬,および扁桃体でGAD陽性の細胞(GABAergic neuron)に分化・成熟していることを観察した。加えて,抗精神病薬のオランザピンを併用処置することで,移植細胞がより高率で脳に移行,生存する可能性が示唆された。本研究の目的は,統合失調症の認知・行動の異常に対する新たな治療手段としての,薬物・細胞combined療法の可能性について,検討・開発を進めることである。これまで我々は,精神疾患の薬物療法における認知・行動異常の改善について,治療薬が神経細胞,および神経幹細胞に作用して,“神経保護効果"と“神経新生促進効果"を発揮し,脳の神経回路網の維持・修復を促進させることの重要性を明らかとしてきた。今回,薬物・細胞コンバインド療法の可能性について,胎生期poly I:C (ウイルス感染をmimicさせる薬剤)投与による統合失調症モデルラットを作製し, RIおよび蛍光色素標識した神経幹細胞を経静脈的に移植する方法で検討した。一部の病態モデル動物には,神経幹細胞移植と同時に,細胞の生存・分化促進効果を有することを明らかとした向精神薬としてオランザピンを投与し,各群における行動異常の改善効果に関して行動薬理学的評価を実施するとともに,移植した標識神経幹細胞の脳内動態を解析した。その結果,神経幹細胞を経静脈的に移植した統合失調症モデルラットの脳内において,移植細胞の側脳室近傍(SVZ),海馬を含む諸領域への移行を認めるとともに,細胞移植によってモデル動物の行動異常改善が示された。加えて幹細胞移植にオランザピンを併用処置することで,移植細胞がより高率で脳に移行する可能性が示された。今後,標識幹細胞を経静脈的に投与する本方法,および外来性神経細胞を用いたin vitro解析法を用いて,種々のサイトカイン,および幹細胞の末梢脳移行,脳神経回路修復に対する関与の仕方を明らかにしていく予定である。本研究は,統合失調症モデル動物を作製し,モデルに神経細胞保護・新生促進薬と神経幹細胞移植の両方を処置した際の,脳諸領域の神経回路網の変化と,モデルの認知・行動異常の変化を解析し,統合失調症障害の(社会的)認知障害に対する新たな治療法としての薬物・細胞combined療法の可能性を検討することを目的としている。今年度は,胎生期にpoly I:C(ウイルス感染をmimicさせる薬剤)を処置する方法による統合失調症モデル動物を作成し,(1)コントロール群,および作成した病態モデル群の一部に(蛍光)標識神経幹細胞(胎児脳由来)を経静脈的に移植した。細胞移植による行動障害の改善効果について,新奇探索性認知・記憶評価装置を用いた認知・記憶機能,および社会的コミュニケーションの機能等についての行動薬理学的解析を実施した。また,(2)移植細胞の脳移行,既存脳内神経ネットワークへの組み込みについて,社会的認知との強い関わりが指摘されている領域(前部帯状回,扁桃体,海馬)を含む脳諸領域の組織切片(移植36ヶ月後)を用いて,特にGABA系ニューロン特異的抗体を用いた免疫化学的解析を実施した。Poly I:C処置群では,新奇物体探索試験における記憶・認知機能,社会相互作用試験における社会コミュニケーションの各機能に異常が認められた。これに対し,それぞれのモデル動物に神経幹細胞を移植した群では,その異常が正常対象群に近いレベルへ改善されることが分かった。また,モデルラットに移植した標識神経幹細胞は,1ヶ月6ヶ月以上の期間,前部帯状回,海馬,扁桃体を含む脳の諸領域に分布,生存し,移植23ヶ月の脳内では,海馬,および扁桃体でGAD陽性の細胞(GABAergic neuron)に分化・成熟していることを観察した。加えて,向精神薬のオランザピンを併用処置することで,移植細胞がより高率で脳に移行,生存する可能性が示唆された。

これまでに,胎生期にpoly I:Cを処置した統合失調症モデル動物の,記憶・認知機能,社会コミュニケーション機能の異常が,神経幹細胞の系静脈的移植によって,正常対象群に近いレベルへ改善されること,また,移植した神経幹細胞は,海馬や,脈絡層・側脳室経由で脳の種々の領域に移行し,尾状核でACh,扁桃体でGABA系のinterneuronに分化している可能性を示しした。今年度は,移植した神経幹細胞が,既存の脳内神経ネットワークに対してどういった作用を示すのかについて,in vitroでの解析を実施し,外来から加えた神経幹細胞が,非接触条件であっても既存の神経細胞の生存を増強するとともに神経幹細胞の神経分化を強力に促進することを明らかとした。また,外来神経幹細胞の上述した効果に,神経栄養因子の放出を介したhost側のERK,Akt系細胞内シグナル伝達系の増強作用が関係することを示した。また,これまでに,経静脈的に移植した神経幹細胞は,向精神薬のオランザピンを併用処置で高率で脳に移行,生存する可能性を示しているが,今年度は末梢から投与した標識神経栄養因子(BDNF-FITC)が,海馬の歯状回の細胞に取り込まれていることを明らかとし,BDNFが移植細胞の生存・機能的分化を促進させる併用薬物としての有効である可能性を示した。