hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネ亜種間交雑における生殖的隔離障壁因子の単離及び機能解析

両候補遺伝子の相補性検定が終了し、日本晴とカサラス間で雑種花粉の不発芽を引き起こしている遺伝子は第1染色体上のDOPPELGANGER(DPL)1,第6染色体上のDPL2と名付けた機能未知の新規遺伝子であることが証明された。DPL1とDPL2は被子植物で高度に保存された重複遺伝子であり、遺伝子構造とRNA・タンパク質の発現解析からはカサラスアリルのDPL1遺伝子と日本晴アリルのDPL2遺伝子は機能欠損型であることが分かった。また、相補性検定の結果からはカサラスアリルのDPL2遺伝子と日本晴アリルのDPL1遺伝子は機能型であることが明らかとなった。リアルタイムRT-PCRとin situ hybridizationの結果から、機能的なDPLのmRNAは二核期の花粉内に蓄積されており、花粉発芽に対し何らかの重要な役割を持っていることを示唆している。また、ゲノム解析が終了した四種の被子植物(ヤマカモジグサ、ソルガム、トウモロコシ)とのシンテニーを元にDPLと名付けた原因遺伝子周辺のゲノム配列を比較することで、DPL遺伝子の重複はイネとヤマカモジグサが分岐した後に起きたことが分かった。本研究は種分化を隔離遺伝子の進化と隔離機構の成立という観点から種や属を超えて検証できた数少ない例である。発現解析からもこの遺伝子は花粉伝達に重要な新規遺伝子であることが示されており、今後DPLの機能を解明することはイネだけでなく、被子植物の生殖過程について有用な知見をもたらすことが予想される。現在、これまでの結果をまとめ、論文を投稿中である。【マッピング】第1染色体の候補遺伝子は日本晴では59kb以内の九個に、第6染色体上の候補遺伝子は11kb内の二個に絞り込むことが出来た。DNA配列比較の結果から、この第6染色体候補遺伝子二個のうちの一つは第1染色体候補遺伝子九個のうち一つと高い相同性を持つことが分かり、同祖遺伝子であることが示唆された。また、この候補遺伝子N1(日本晴第1染色体遺伝子)とN6(日本晴第6染色体遺伝子)はカサラスゲノム内にも相同遺伝子として存在することが分かった(K1:カサラス第1染色体遺伝子、K6:カサラス台染色体遺伝子)。【候補遺伝子の発現解析】RT-PCR解析を行った結果、N1,N6,K6は様々な組織で発現しており、花粉を含む穂・葯では他の組織よりも高い発現が見られた。K1はどの組織でも発現が見られなかった。マイクロアレイ解析の結果からはN1,N6は花粉成熟中期により強く発現することが示唆された。【cDNA配列の決定】3',5'RACE法により全長cDNA配列の決定を行った結果、N1,K6は3つのエキソンからなり、アミノ酸配列は高い相同性を持つことが分かった。一方、K1はORFの途中に挿入配列が存在するために機能欠損型、またはN1,K6とは異なる機能を持つ遺伝子になっていると考えられた。また、N6はORFの途中にストップコドンが出現し、第3エキソンが存在しないことから、こちらも機能欠損型、またはNl,K6とは異なる機能を持つ遺伝子になっていると考えられた。K1とN6が機能欠損型、または有害な機能獲得型であるという今年度の結果は、申請書3ページの【これまでの研究経過及び結果】に記載したK1とN6を併せ持つ花粉が後代に伝わらない現象を説明することが出来る。生殖的隔離障壁の相互作用因子を一挙に解析した例はまれであるため、今後遺伝子が単離出来れば大きな成果となると期待できる。【表現型の観察】隔離障壁がどのステージでどの様な表現型を示すのかを確認するため、隔離障壁の表現型を示す雑種個体の成熟花粉の観察を行った。その結果、花粉内の核の形態や数には影響は見られず、デンプン蓄漬にも異常は見られなかった。一方、培地上での花粉発芽を観察した結果、雑種個体で花粉発芽に異常が見られた。この結果は、この隔離遺伝子が花粉発芽に何らかの影響を与えていることを示唆している。【系統学的解析】栽培イネの起源であるAゲノム種を中心とした野生イネを用い、候補遺伝子の配列比較を行った。その結果、この候補遺伝子は様々な系統で高度に保存されており、いずれの系統も必ず機能型と思われるN1かK6、またはその両方を持っていた。また、機能欠損型と考えられるK1とN6を併せ持つ系統が存在しないことから、この遺伝子は花粉に重要な機能を持つことが示唆された。他の顕花植物でもこの遺伝子が高度に保存されていることもこのことを示唆している。【候補遺伝子のタンパク質の発現解析】この遺伝子のタンパク質の有無を確認するためにペプチド抗体を作成し、これを用いてウェスタンブロット解析を行ったところ、日本晴ではN1、KasalathではK6と思われる内在性のタンパクを検出することに成功した。今年度の結果から、この遺伝子は花粉伝達に重要な新規遺伝子であることが示唆され、そのメカニズムを解明することはイネの生殖過程について有用な知見をもたらすことが考えられる。

DPL1とDPL2は被子植物で高度に保存された重複遺伝子であり、遺伝子構造とRNA・タンパク質の発現解析からはカサラスアリルのDPL1遺伝子と日本晴アリルのDPL2遺伝子は機能欠損型であることが分かった。また、相補性検定の結果からはカサラスアリルのDPL2遺伝子と日本晴アリルのDPL1遺伝子は機能型であることが明らかとなった。リアルタイムRT-PCRとin situ hybridizationの結果から、機能的なDPLのmRNAは二核期の花粉内に蓄積されており、花粉発芽に対し何らかの重要な役割を持っていることを示唆している。また、ゲノム解析が終了した四種の被子植物(ヤマカモジグサ、ソルガム、トウモロコシ)とのシンテニーを元にDPLと名付けた原因遺伝子周辺のゲノム配列を比較することで、DPL遺伝子の重複はイネとヤマカモジグサが分岐した後に起きたことが分かった。本研究は種分化を隔離遺伝子の進化と隔離機構の成立という観点から種や属を超えて検証できた数少ない例である。発現解析からもこの遺伝子は花粉伝達に重要な新規遺伝子であることが示されており、今後DPLの機能を解明することはイネだけでなく、被子植物の生殖過程について有用な知見をもたらすことが予想される。現在、これまでの結果をまとめ、論文を投稿中である。
進行胃癌化学療法後切除例における組織マイクロアレイを用いた網羅的蛋白解析

近年,化学療法の進歩と共に高度進行胃癌に対する術前化学療法が奏功し手術可能となる症例が増加している.今回われわれは組織マイクロアレイ(TMA)および免疫組織化学染色(IHC)を用い,化学療法による治療効果・臨床病理学的特徴について検討した.2000年12月2007年12月まで,胃癌に対するTS-1を含む術前化学療法を施行し切除しえた計30例(男:女=22:8,平均61.2歳)を対象とし,治療前後の腫瘍サンプルからTMAを用いてp53,MIB-1,pancytokeratinの免疫染色を行った.レジメンはTS-1単独:5例,CDDP併用:17例,CPT-11併用:4例,TXT併用:3例(うち2例はi.p.),CDDP+CPT-11併用:1例であった.【結果】組織学的効果判定はGrade 0:7例,1a:16例,1b:2例,2:5例であり,臨床的効果判定別に見ると,PR症例では0:4例,1a:5例,1b:1例,2:2例,IR/SDでは各々2,4,1,3例,PDでは0,4,0,0例であった.Grade 3は判定していない.組織型の内訳はtub2:46.7%,por1:16.7%,por2:23.3%,muc:6.7%,sig・scc:各3.3%であった.HE染色では核濃縮・細胞質の好酸化・線維化・空胞化など多様な組織像を呈していた。化学療法前後の免疫染色における比較では,p53では変化のないものは63.3%,染色性の低下が36.7%であったのに対し,MIB-1では76.7%,pancytokeratinでは63.3%で染色性が低下していた.染色性の増加はpancytokeratinの一部でのみ認められた.組織マイクロアレイ(TMA)は,多数の検体を組織レベルでの形態情報を失うことなく蛋白発現の局在や程度を観察できる技術である.化学療法後の免疫染色、特にMIB-1では染色性の低下を高率に認めたが,組織型の違いによる染色性に明らかな傾向はなかった.臨床的に効果があった症例でも組織学的には顕著な効果が認められない,あるいはその逆の現象も確認された.必ずしも臨床的効果と組織学的効果が相関しないことから,さらに症例を蓄積して検討する必要がある.近年,化学療法の進歩と共に高度進行胃癌に対する術前化学療法が奏功し手術可能となる症例が増加している.今回われわれは組織マイクロアレイ(TMA)および免疫組織化学染色(IHC)を用い,化学療法による治療効果・臨床病理学的特徴について検討した.2000年12月2007年12月まで,胃癌に対するTS-1を含む術前化学療法を施行し切除しえた計30例(男:女=22:8,平均61.2歳)を対象とし,治療前後の腫瘍サンプルからTMAを用いてp53,MIB-1,pancytokeratinの免疫染色を行った.レジメンはTS-1単独:5例,CDDP併用:17例,CPT-11併用:4例,TXT併用:3例(うち2例はi.p.),CDDP+CPT-11併用:1例であった.【結果】組織学的効果判定はGrade 0:7例,1a:16例,1b:2例,2:5例であり,臨床的効果判定別に見ると,PR症例では0:4例,1a:5例,1b:1例,2:2例,IR/SDでは各々2,4,1,3例,PDでは0,4,0,0例であった.Grade 3は判定していない.組織型の内訳はtub2:46.7%,por1:16.7%,por2:23.3%,muc:6.7%,sig・scc:各3.3%であった.HE染色では核濃縮・細胞質の好酸化・線維化・空胞化など多様な組織像を呈していた。化学療法前後の免疫染色における比較では,p53では変化のないものは63.3%,染色性の低下が36.7%であったのに対し,MIB-1では76.7%,pancytokeratinでは63.3%で染色性が低下していた.染色性の増加はpancytokeratinの一部でのみ認められた.組織マイクロアレイ(TMA)は,多数の検体を組織レベルでの形態情報を失うことなく蛋白発現の局在や程度を観察できる技術である.化学療法後の免疫染色、特にMIB-1では染色性の低下を高率に認めたが,組織型の違いによる染色性に明らかな傾向はなかった.臨床的に効果があった症例でも組織学的には顕著な効果が認められない,あるいはその逆の現象も確認された.必ずしも臨床的効果と組織学的効果が相関しないことから,さらに症例を蓄積して検討する必要がある.化学療法の進歩と共に、高度進行・再発胃癌に対して化学療法が奏功して手術可能となる症例が増加している。標準治療として用いられるS-1+CDDPは代謝拮抗剤と白金製剤という異なる分子(群)を標的とする薬剤であるが、分子レベルでの相乗効果判定などについては推測の域を出ていない。

本申請では、術前化学療法が奏功して切除可能となった症例および化学療法なしに切除された症例を用いてその蛋白発現を比較し、化学療法後症例に特異的に発現している、あるいは発現していない蛋白を組織マイクロアレイ(TMA)・免疫組織化学染色(IHC)を用いて同定する。今年度は、1.サンプルおよび臨床的背景の収集とデータベース構築2.組織マイクロアレイの作成のためのトレーニング3.免疫組織染色のための抗体の選定を目標に掲げていた。抗体のパフォーマンスの確立の度合いを考慮し、構造・ハウスキーピング蛋白関連抗体、ストレス反応経路、細胞周期、アポトーシス関連蛋白を順次購入・テストを行った。現在までTMA作製においてはノウハウを蓄積し、安定した供給が可能となった。さらに、術前化学療法を施行された症例のパラフィンブロックの収集、臨床データの整理を終了し、TMA作製の段階に入っている。今後は免疫染色の条件決定をする予定である。化学療法の進歩と共に、高度進行・再発胃癌に対して化学療法が奏功して手術可能となる症例が増加している。標準治療として用いられるS-1+CDDPは代謝拮抗剤と白金製剤という異なる分子(群)を標的とする薬剤であるが、分子レベルでの相乗効果の機序については推測の域を出ていない。今年度は、1.サンプルおよび臨床的背景の収集とデータベース構築2.HE染色での病理学的効果判定と臨床像との比較、3.免疫組織染色を目標とする。計40例の術前術後症例の集積を完了しており、積極的に学会等での発表を行う。標準治療として用いられるS-1+CDDPは代謝拮抗剤と白金製剤という異なる分子(群)を標的とする薬剤であるが、分子レベルでの相乗効果判定などについては推測の域を出ていない。現在までの組織標本を観察すると、興味深いことにほぼすべての症例においてH&E染色における細胞障害における核の変化(karyorrhexisおよびkaryolysis)が見られた。一方、免疫染色ではKeratinの構造タンパクの染色性の低下が著しく、タンパク合成が阻害される機序が働いていることが示唆された。今年度は、各症例の化学療法の奏効率および再発までの期間と病理学的所見を比較し、化学療法により最も影響を受ける臨床病理学的パラメータの同定を目指す。
獣医臨床における腫瘍マーカーの有用性

本研究では各種腫瘍マーカーを小動物の臨床例に応用し、獣医臨床における腫瘍マーカーの有用性を明らかにすることを最終目的として実験を行ってきた。研究年度内には(1)血清(漿)中腫瘍マーカー,(2)細胞内テロメラーゼおよびテロメラーゼ逆転写酵素,(3)細胞内P53蛋白・MDM_2蛋白の発現およびp53遺伝子の変異、(4)細胞クローナリティー、(5)染色体分析、(6)多剤耐性に関与するP糖蛋白(P-gp)の6項目についておいて腫瘍マーカーとしての有用性を検討してきた。主な研究成果は以下の通りである。1.染色体末端に存在するテロメアの長さと細胞内テロメラーゼ酵素の活性について犬の乳腺腫瘍症例を用いた研究を行い,獣医学領域においても、我々は、テロメラーゼが犬の腫瘍マーカーとして利用できる可能性を見い出した。2.犬および猫の自然発生腫瘍症例を用いてp53遺伝子について検討を行い、とくに犬においてはヒトと同様に約半数の腫瘍症例でp53遺伝子の異常が検出されることを見い出し、動物における腫瘍マーカーとして利用可能であると考えられた。またp53を不活化するMDM2についても解析を進め,特定の腫瘍においては過剰発現があることを明らかにしており,p53と同様腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。3.猫白血病ウィルス(FeLV)に感染した猫の末梢血または腫瘍、骨髄、リンパ節の生検材料から抽出したDNAについて、外来性FeLVプローブを用いたサザンブロット解析を行い、腫瘍性疾患(白血病および骨髄異形成症候群:MDS)ではモノクローナル/オリゴクローナルなバンドとして検出され,FeLV感染猫における新たな腫瘍マーカーとなりうることが確認された。4.犬および猫のP糖蛋白質(P-gp)をコードするmdr (multi-drug resistance)遺伝子の塩基配列を決定し,これをもとに作製したプライマーを用いたRT-PCR,およびP-gpに対するモノクローナル抗体(C219)を用いた免疫組織(細胞)化学染色によって腫瘍症例とくにリンパ腫におけるmdr/P-gp遺伝子の発現を検出した。また実際にP-gpのを過剰発現して薬剤耐性となった症例に対して多剤耐性克服薬剤を併用して抗癌剤を使用することによって化学療法による治療成績の向上が確認された。獣医臨床における腫瘍マーカーの有用性を確立するため、以下のような研究を行った。(1)血清中腫瘍マーカー:犬の肝癌症例について血清中腫瘍マーカーの検討を行ったところ、AFPの上昇が高頻度に認められ、またそのレクチン分画の解析が非腫瘍性疾患との鑑別に有用であったが、PIVKAII,CA19-9,CEA,SLKについては検出されなかった。また、犬の各種悪性腫瘍症例においてVEGFを測定したところ、約60%の症例でその上昇が認められた。(2)テロメラーゼおよびTERT:犬の乳腺腫瘍症例において検討した結果、テロメラーゼおよびTERTは95%以上の症例で検出され、マーカーとして有用であることが示された。テロメア長は、乳腺腫瘍組織においても維持されていることが明らかとなったが、腫瘍の悪性度との関連は認められなかった。

(3)p53およびMDM2:犬の悪性腫瘍症例においてp53遺伝子の解析を行ったところ、約50%の症例においてその変異が検出され、それらの多くはP53のDNA結合ドメインや多量体形成ドメインなどの機能ドメインに存在することがわかった。MDM2は犬の悪性腫瘍症例の約80%においてその発現増強が認められた。(4)細胞のクローナリティー:猫の各種骨髄疾患において骨髄細胞のクローナリティーを解析した結果、モノクローナルな細胞集団がAMLおよびMDSにおいて検出されたのに対し、再生不良性貧血においては検出されなかった。このことから、MDSがAMLの前白血病状態であり、クローナリティーの解析が腫瘍性疾患の診断に有用であることが示された。(5)P糖蛋白(P-gp):猫のP-gpをコードするmdr1遺伝子の一次構造を明らかにし、その発現が薬剤耐性に関連することを示した。犬のリンパ腫症例においては、薬剤耐性の症例のうち、約60%の症例でmdr1遺伝子の発現増強が認められた。このことからP-gpが腫瘍細胞の薬剤耐性マーカーの一つとなることが示された。本研究においては、DNAワクチンによるアレルギー性疾患の根治的治療法を確立するため、アレルギー性疾患の自然発症犬および実験的感作犬を用いて、in vitroにおけるアレルギー反応の基礎的解析、さらにそれを応用してin vivoにおける臨床有効性の検討を行なった。最初に、スギ花粉抗原に感作されたアトピー性皮膚炎のイヌを対象としてスギ花粉抗原に対するアレルギー反応を解析した。すなわち、スギ花粉主要抗原のひとつであるCry j 1に感作された症例が多いことを明らかとし、それら症例においてはCry j 1に対するIgE産生がスギ花粉飛散時期と一致していることを解明した。さらに、これら症例においてCry j 1のオーバーラッピングペプチドを用いてT細胞エピトープ部分を同定した。また、Cry j 1DNAワクチンの治療試験を4頭の症例を用いて実施し、治療群においてはいずれの症例もアトピー性皮膚炎症状の改善とともに、スギ花粉粗抗原を用いた皮内反応の陰性化およびスギ花粉に対する末梢血リンパ球の芽球化反応の低下を認めた。一方、スギ花粉を実験的に感作した犬において、スギ花粉抗原気道内曝露によってスギ花粉特異的な気道過敏性を誘導することが可能であった。これを用いてCry j 1DNAワクチンによる治療試験を行なったところ、治療群においては、IgE値やリンパ球の芽球化反応においては顕著な変化は認められなかったが、スギ花粉抗原に対するin vivo反応性においては皮内反応の陽性閾値の上昇、気道過敏性反応の閾値の上昇が認められた。さらに、肺の組織においても、対照群と比較して肥満細胞の数が有意に低下していた。以上のことから、DNAワクチンはアレルギー性疾患の臨床症状をコントロールすることができる根治的治療法であることがわかった。
北アメリカ大陸におけるアジア関連温帯要素のフロラ並びに生態に関する調査研究

本研究プロジェクトの目的は,北半球温帯圏において最も日本列島の暖温帯要素・冷温帯要素と類縁関係の深い植物群が数多く分布・生育する北米大陸の東岸と西岸の両地域を選び,これらの第3紀周極要素の生育環境,群落,生態分布を解析すると同時に,構成要素のうち特にアジア関連植物の200種余りを選び,その生活史特性に関する詳細な研究を行うと同時に,これらの植物群の類縁関係を,変異の集団解析や細胞分類学的な手法のみならず,酵素タンパクの多型や分子レベル(DNA)の新たな解析法の導入を計って研究することにある。研究成果1.目的とした生品材料植物の採集は,単子葉・双子葉併せて54属,135種,シダ植物は15属35種と,ほぼ当初の目的は達成することができた。単子葉植物は,エンレイソウ属32種,チゴユリ属亜属Prosartes全5種,ユキザサ属3種,マイヅルソウ属2種,ツバメオモト属全4種,アマドコロ属2種,Uvularia属3種,Helonias属1種(ショウジョウバカマ属に近縁),Chamaelirium属(シライトソウ属に近縁)1種,カタクリ属6種,Scoliopus属2種,Medeola属1種,ネギ属3種,リシリソウ属1種,ユリ属6種,バイモ属2種,イワショウブ属1種,タケシマラン属1種,Calochortus属2種,ミズバショウ属1種,テンナンショウ属2種,ヒガンバナ科3種,コウヤザサ属1種,双子葉植物は,トチバニンジン属1種,カンアオイ属2種,ナンブソウ属1種,ルイヨウボタン属1種,イワナシ属1種,ノブキ属1種,ケマンソウ属4種,ミヤオソウ属1種,Vancouveria属2種,ツルアリドウシ属1種,スハマソウ属1種,ルイヨウショウマ属2種,オウレン属1種,ミツバ属1種,チャルメルソウ属1種,ズダシャクシュ属1種,アラシグサ属1種,ハエドクソウ属1種,モミジカラマツ属1種,ヒトリシズカ属1種,ノコギリソウ属1種,ノコンギク属1種を含む合計54属である。2.これらの植物群のうち,生活史特性がほぼ完全に解析できたのがエンレイソウ属の30種で,この他同じくエンレイソウ科(狭義)のScoliopus bigeloviiとScoliopus halliiに関してもデ-タの集約が終了し,すでに論文として投稿中である。同じくエンレイソウ科のMedeola,ユリ科のUvularia属の3種U.grandiflora,U.perfoliata,U.sessilifoliaに関しても現在,生活史諸形質の解析とアイソザイムの分析が鋭意進められている。3.チゴユリ属Prosartes亜属の5種の染色体数,核型,休止期の核の形態が詳細に観察されたが,その結果,北米産のこれら5種すべてが染色体基本数,中期染色体の相対長,休止期の核の形態など,すべての点でアジア産の種群と明瞭に異なり,別属とみなすのが妥当であるとの結論に達した。この結果は,後述するクロロプラストDNAのRFLP分析の結果ともよく一致し,分子系統学的解析法の有効性が証明された。現在,rbcL遺伝子のsequencingが進められており,その結果が期待される。4.ここ12年間における分子系統学的解析法の急速な進歩によって,上述した生品材料のうち,ユリ科,エンレイソウ科,サトイモ科の主だった植物群に関してはクロロプラストDNA(cpDNA)のRFLP解析,rbcL遺伝子の構造解析と種間および属間の類縁関係の解析が可能となった。特に,生活史特性の解析が進んでいるエンレイソウ属と,その他の近縁属のcpDNAの解析によって,グル-プ間の類縁関係の解析はもとより,生活史特性の進化がどのようなtempoとmodeで進んで来たかを評価できる重要な知見が得られたことになる。この他,ユリ科のアマドコロ連,ショウジョウバカマ連に関しても,各分類群の類縁関係と進化的距離を推定する上で極めて重要な知見が得られつつある。サトイモ科に関しても属間の類縁,種間の類縁を評価する上で重要な新事実が得られつつある。5.温帯性のシダ植物は,オシダ,シシガシラ,イノデ,の各属で,葉の脈理の発達,地理的変異の解析が進められている。6.調査地域の環境,群落,種の生態分布等に関しては別途集約が進められている。將来,さらに分子的解析法を導入した集団解析を進める上でも,重要な基礎的知見となるであろう。

単子葉植物は,エンレイソウ属32種,チゴユリ属亜属Prosartes全5種,ユキザサ属3種,マイヅルソウ属2種,ツバメオモト属全4種,アマドコロ属2種,Uvularia属3種,Helonias属1種(ショウジョウバカマ属に近縁),Chamaelirium属(シライトソウ属に近縁)1種,カタクリ属6種,Scoliopus属2種,Medeola属1種,ネギ属3種,リシリソウ属1種,ユリ属6種,バイモ属2種,イワショウブ属1種,タケシマラン属1種,Calochortus属2種,ミズバショウ属1種,テンナンショウ属2種,ヒガンバナ科3種,コウヤザサ属1種,双子葉植物は,トチバニンジン属1種,カンアオイ属2種,ナンブソウ属1種,ルイヨウボタン属1種,イワナシ属1種,ノブキ属1種,ケマンソウ属4種,ミヤオソウ属1種,Vancouveria属2種,ツルアリドウシ属1種,スハマソウ属1種,ルイヨウショウマ属2種,オウレン属1種,ミツバ属1種,チャルメルソウ属1種,ズダシャクシュ属1種,アラシグサ属1種,ハエドクソウ属1種,モミジカラマツ属1種,ヒトリシズカ属1種,ノコギリソウ属1種,ノコンギク属1種を含む合計54属である。2.これらの植物群のうち,生活史特性がほぼ完全に解析できたのがエンレイソウ属の30種で,この他同じくエンレイソウ科(狭義)のScoliopus bigeloviiとScoliopus halliiに関してもデ-タの集約が終了し,すでに論文として投稿中である。同じくエンレイソウ科のMedeola,ユリ科のUvularia属の3種U.grandiflora,U.perfoliata,U.sessilifoliaに関しても現在,生活史諸形質の解析とアイソザイムの分析が鋭意進められている。3.チゴユリ属Prosartes亜属の5種の染色体数,核型,休止期の核の形態が詳細に観察されたが,その結果,北米産のこれら5種すべてが染色体基本数,中期染色体の相対長,休止期の核の形態など,すべての点でアジア産の種群と明瞭に異なり,別属とみなすのが妥当であるとの結論に達した。この結果は,後述するクロロプラストDNAのRFLP分析の結果ともよく一致し,分子系統学的解析法の有効性が証明された。現在,rbcL遺伝子のsequencingが進められており,その結果が期待される。4.ここ12年間における分子系統学的解析法の急速な進歩によって,上述した生品材料のうち,ユリ科,エンレイソウ科,サトイモ科の主だった植物群に関してはクロロプラストDNA(cpDNA)のRFLP解析,rbcL遺伝子の構造解析と種間および属間の類縁関係の解析が可能となった。特に,生活史特性の解析が進んでいるエンレイソウ属と,その他の近縁属のcpDNAの解析によって,グル-プ間の類縁関係の解析はもとより,生活史特性の進化がどのようなtempoとmodeで進んで来たかを評価できる重要な知見が得られたことになる。この他,ユリ科のアマドコロ連,ショウジョウバカマ連に関しても,各分類群の類縁関係と進化的距離を推定する上で極めて重要な知見が得られつつある。サトイモ科に関しても属間の類縁,種間の類縁を評価する上で重要な新事実が得られつつある。5.温帯性のシダ植物は,オシダ,シシガシラ,イノデ,の各属で,葉の脈理の発達,地理的変異の解析が進められている。6.調査地域の環境,群落,種の生態分布等に関しては別途集約が進められている。將来,さらに分子的解析法を導入した集団解析を進める上でも,重要な基礎的知見となるであろう。
I型及びII型超新星における元素合成の研究

太陽質量の10倍以上の星の重力崩壊型超新星爆発に伴う爆発的元素合成の計算を詳細に解析し,白色わい星の爆発による超新星(Ia型)元素合成と組み合わせることにより,超新星爆発で生成される元素を太陽系組成比と比較した.その結果,炭素から鉄までの太陽系元素(質量数が60程度まで)のうち7-8割を超新星爆発により説明できることが解った.しかし金属量の少ない星雲では観測値とのずれが大きくなる場合があり原紙核データの検討を含めて爆発的元素合成の再検討を必要とすると結論した.さらに大質量星の爆発の際生成されるp-元素と呼ばれる重元素(質量数が100以上)を調べた.その結果34のp-元素のうち6割程度は同時に生成されることが解った。しかし全体として太陽系組成比の数分の1しか説明できないのでI型超新星の寄与と爆発前の段階でのp-元素の生成を検討する必要があることが解った.大質量星の進化に重大な影響を与える核反応率^<12>C(α,γ)^<16>Oが大質量星の進化に与える影響を調べた.天体物理学的S-因子として100keV barns,240keV barns,さらに最近理論的に求められた135keV barnsの場合についても星理論を改良する必要があると結論した.大質量星の爆発後,熱い中性子星が残った場合,その中性子星が冷却したときどれほど速く回転できるかを典型的な状態方程式をいくつか使って調べた.最も柔らかい状態方程式を使うことにより回転速度の上限が求められた.その結果周期が1ミリ秒以下で回転することが困難であると結論した.太陽質量の10倍以上の星の重力崩壊型超新星爆発に伴う爆発的元素合成の計算を詳細に解析し,白色わい星の爆発による超新星(Ia型)元素合成と組み合わせることにより,超新星爆発で生成される元素を太陽系組成比と比較した.その結果,炭素から鉄までの太陽系元素(質量数が60程度まで)のうち7-8割を超新星爆発により説明できることが解った.しかし金属量の少ない星雲では観測値とのずれが大きくなる場合があり原紙核データの検討を含めて爆発的元素合成の再検討を必要とすると結論した.さらに大質量星の爆発の際生成されるp-元素と呼ばれる重元素(質量数が100以上)を調べた.その結果34のp-元素のうち6割程度は同時に生成されることが解った。しかし全体として太陽系組成比の数分の1しか説明できないのでI型超新星の寄与と爆発前の段階でのp-元素の生成を検討する必要があることが解った.大質量星の進化に重大な影響を与える核反応率^<12>C(α,γ)^<16>Oが大質量星の進化に与える影響を調べた.天体物理学的S-因子として100keV barns,240keV barns,さらに最近理論的に求められた135keV barnsの場合についても星理論を改良する必要があると結論した.大質量星の爆発後,熱い中性子星が残った場合,その中性子星が冷却したときどれほど速く回転できるかを典型的な状態方程式をいくつか使って調べた.最も柔らかい状態方程式を使うことにより回転速度の上限が求められた.その結果周期が1ミリ秒以下で回転することが困難であると結論した.
遺伝性不整脈患者iPS細胞由来心筋細胞を用いた薬物誘発性QT延長症候群の病態解明

遺伝的不整脈疾患Andersen症候群患者由来のiPS細胞から分化誘導した心筋細胞を用い、病態の解明と有効な薬剤の検索を行った。多電極アレイを用いた解析にて、疾患群で不整な細胞外電位と異常な細胞内Ca2+濃度上昇を認めた。これらはフレカナイド(FL)で抑制され、他のNaチャネル抑制剤で抑制されなかった。NaCa交換系(NCX)のreverse mode阻害剤KB-R7943にて異常な細胞内Ca濃度上昇は抑制され、FLはNCX電流を増大した。以上より、Andersen症候群でFLはNCXを介して不整脈を改善すると考えられ、疾患特異的なiPS細胞は病態の解明や新しい治療法の開発に有益と考えられた。Andersen症候群は、心室性不整脈、周期性四肢麻痺、骨格異常を三徴とする遺伝性疾患であり、KCNJ2遺伝子異常によりコードするKir2.1(内向き整流Kチャネル)に変異を生じ、IK1電流の減少が心電図U波と特徴的な二方向性の心室性期外収縮をもたらす。機序として細胞内Ca2+濃度の上昇により異常な膜電位振動とそれによる遅延後脱分極が推察されているが、実際には未だまったく解明されていない。我々は、MEAを用いた細胞外電位測定とCa蛍光指示色素Fluo-4をもちいた細胞内Ca動態の解析により、iPS細胞由来の心筋細胞を用いることにより世界で初めて細胞内Ca過負荷状態がAndersen症候群に伴う不整脈発生機序であることを示すことができた。その成果の一部は平成26年3月の日本循環器学会総会で発表することができた。現在論文を作成中である。本研究計画3ヵ年で、主として第7番目のLQT症候群すなわちAndersen症候群の患者から樹立したiPS細胞を用い、その不整脈原生の機序とその治療法について検討する。すでに、Andersen症候群患者について、遺伝子変異の判明している3名(KCNJ2R218W、KCNJ2R67W、KCNJ2R218Q)についてiPS細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて、その機序と薬剤を用いた治療法について検討した。Andersen症候群は、心室不整脈、周期性四肢麻痺、骨格異常を三徴とする遺伝性疾患であり、KCN2遺伝子異常によりコードするKir2.1(内向き整流Kチャネル)に変異を生じ、IK1電流の減少が心電図U波と特徴的な二方向性の心室期外収縮をもたらす。機序としては、細胞内Ca濃度の局所的な上昇により異常な膜電位振動とそれによる遅延後脱分極が推定されているが、今日に至るまでそれを実証した報告はない。我々は、MEA(多電極アレイ)を用いた細胞外電位測定とCa蛍光指示色素Fluo-4を用いた細胞内Ca動態解析により、世界に先駆けて細胞内Ca過負荷状態がAndersen症候群に伴う不整脈発生機序であることを示した。また抗不整脈薬フレカイニドが特異的にAndersen症候群由来の心室不整脈を抑制するのに対し、ほかのNaチャネル抑制剤ではこのような抗不整脈作用がないこと、その機序がNa/Ca交換機構の逆モードの抑制に基づくことを見出した。その成果の一部は、平成27年4月の日本循環器学会にて発表することができた。本研究計画3か年で、主として第7番目のLQT症候群すなわちAndersen症候群の患者から樹立したiPS細胞を用い、その不整脈原生の機序とその治療法について検討する。その後心筋各種イオンチャネルに対する個別的な作用を検討しているが、iPS細胞イオンチャネルから心筋細胞イオンチャネルへの分化が安定せず、電流電圧測定実験にて一定の結果が得られていない。実験の遂行が停滞しているので、現時点での知見をまとめてCardiovascular Research等欧米学術雑誌に投稿している。現在までに研究計画に使用する細胞群である(1)健常者および遺伝性QT延長症候群(LQT7)患者からのiPS細胞樹立、(2)ヒトiPS細胞からの心筋誘導、についてはこれを達成することができ、通常の実験には順調に使用されて成果を上げている。

(3)すなわち、これらの分化誘導心筋細胞に対してMEAを用いた細胞外電位記録により、Andersen症候群では遅延後脱分極(DAD)による自発興奮が生じ、カテコラミンにより増幅され、フレカイニドにて抑制されることが示された。(4)また、浜松医科大学の渡邊教授グループとの共同実験により、フレカイニドの抗不整脈作用はNa/Ca交換機構の逆モードの抑制に起因することが判明した。(5)更に、Ca蛍光指示色素Fluo-4を用いた細胞内Ca動態の解析実験により、Andersen症候群患者iPS細胞由来の分化心筋細胞では、細胞内における不規則なCa放出がみられ、フレカイニドによってこの不規則なCa放出が抑制されることを見出した。(3)患者由来iPS細胞を用いたNaチャネル、Kチャネル、Caチャネルなどのイオン電流の測定に関しては、滋賀大学堀江教授グループとの共同実験を継続しているが、いまだ十分な成果を得られていない。その原因は、主としてヒトiPS細胞が脆弱で扱いが難しく安定した電流記録が得られないことが挙げられる。そこで現在は(4)iPS細胞から分化した心筋細胞を用いて、Naチャネル、Kチャネル、Caチャネルなどのイオン電流の測定を開始した。安定した電流記録が得られず現在それが障壁になり新しい知見が得られてない。今回の研究計画では、はじめてAndersen症候群疾患特異的iPS細胞から分化誘導した心筋細胞を用いて、病態の解明と有効な薬剤の検索を行った。電気生理学的解析の結果、疾患群では不整な細胞外電位及び異常な細胞内カルシウム濃度[Ca2+]上昇を認め、これらはフレカナイドにより抑制されることを見出した。ナトリウム・カルシウム交換系(NCX)のreverse modeを阻害するKB-R7943により、異常な細胞内カルシウム濃度上昇は抑制されたので、フレカナイド投与前後NCX電流を測定すると、フレカナイドはNCX電流を増大させることが明らかとなった。これらの結果によりAndersen症候群においてフレカナイドはNCXを介して不整脈を改善させる可能性が示唆され、疾患特異的なiPS細胞は病態の解明や新しい治療法の開発に有益なツールと考えられた。iPS細胞間の性質にはばらつきがあり、この問題の解決にはiPS細胞クローンの樹立法や評価・選別法の確立が必要と考えられた。iPS細胞由来心筋の品質においても問題点が存在するが、疾患遺伝子変異が保存されたヒト心筋細胞を用いて得られる知見も有益と考えられる。今回我々も、NCX電流をモルモット心室筋で測定してiPS細胞由来心筋で得られた結果を確認したが、このようにほかの実験系を併用して総合的に解釈することで結果の精度を高めることができると考えた。遺伝的不整脈疾患Andersen症候群患者由来のiPS細胞から分化誘導した心筋細胞を用い、病態の解明と有効な薬剤の検索を行った。多電極アレイを用いた解析にて、疾患群で不整な細胞外電位と異常な細胞内Ca2+濃度上昇を認めた。これらはフレカナイド(FL)で抑制され、他のNaチャネル抑制剤で抑制されなかった。NaCa交換系(NCX)のreverse mode阻害剤KB-R7943にて異常な細胞内Ca濃度上昇は抑制され、FLはNCX電流を増大した。以上より、Andersen症候群でFLはNCXを介して不整脈を改善すると考えられ、疾患特異的なiPS細胞は病態の解明や新しい治療法の開発に有益と考えられた。
ガンマ線バーストで読み解く太古の宇宙・研究の総括

本領域の目的は、宇宙最大の爆発であるガンマ線バースト(GRB)を用いて、謎に包まれた太古の宇宙を解読することである。具体的には、GRBの宇宙論への応用、星形成率の歴史の推定、また、重元素の合成と宇宙の再電離の歴史の解明などを領域の目標として4年間の研究を行ってきた。計画研究としてガンマ線、X線で観測するバースト本体の爆発的放射と、可視光・近赤外領域の残光のための観測装置の開発を進めるとともに、人工衛星および国内の専用望遠鏡と「すばる望遠鏡」を用いた観測を行ってきた。また、GRB発生のメカニズムを明らかにし、宇宙の初代の星からのGRB観測をサポートするための理論研究を計画研究として実施し、関連する研究を公募研究として実施した。その結果、領域開始現在までに50を超える査読論文として研究成果を発表した。この研究のとりまとめとして、本年度は平成24年2月6-8日に領域シンポジウムを実施した。さらに3月1216日にIAU(国際天文連合)シンポジウム"Death of Massive Stars"(組織委員長:河合、P.Roming,E.Pian、実行委員長:前田啓一)を日光で共催した。このシンポジウムには、国外からの参加者99人を含む159人が参加し、大質量星の一生を締めくくる巨大な爆発現象である中心核崩壊型超新星とガンマ線バーストに関して、本領域の成果など最新の知見を交換し、様々な観点からの議論を通じて理解を深めた。さらに集録を単行本として発行し、本領域の活動の集大成とした。本領域の実施によって、ガンマ線バースト研究は、いままでの高エネルギー天体物理の小さなコミュティの研究テーマから、光赤外天文学、銀河天文学、恒星天文学、宇宙論など広い分野において重要性を認識される天文学の主要テーマの一つに成長した。また、国際的にも本領域の成果により、日本のガンマ線バースト研究が高く評価され、二回の国際シンポジウムに多数の海外からの参加者が集まった。その成果は2冊の集録に結実した。本領域は計画どおりの研究成果を上げて終了したが、「宇宙の一番星」からのガンマ線バーストを直接検出するという最終目標は、将来の観測に委ねられる。これは、「われわれの住む宇宙はどのように始まったか」という自然科学の根本問題に寄与する重要な課題である。本領域で得られた研究上の知見、観測装置開発の成果、研究を通じて形成された国内および海外研究者との交流ネットワークを基盤として、宇宙再電離期以前の宇宙からのガンマ線バーストの詳細観測を実現するため、衛星ミッションおよび地上観測装置の開発と、観測体制の構築の実現をめざした努力を継続していかなくてはならない。本特定領域研究では、GRBを手段として、太古の宇宙における星と銀河の形成の歴史を解明することを目的として、A01「爆発的X線・γ線から探るガンマ線バーストの起源と環境」、A02「ガンマ線バーストの光学・近赤外残光から読み解く太古の宇宙」、A03「ガンマ線バーストの起源の理論的研究」という3つの計画研究と公募研究を実施する。総括班は領域の研究計画全般を統括し、領域の推進に必要な調整を行なう。また、年に一回、研究会を開催して関連研究分野(高赤方偏移天体と高エネルギー天体現象)と積極的に情報交換を行なって、本領域の研究立案に役立てるとともに、本領域の成果を研究コミュニティーに還元する。また、国際的なガンマ線バースト観測コミュニティーと積極的に情報の交換を行い、協力関係を築き、必要に応じて少人数の国際研究協力打合せを行なう。さらに、領域の一般広報を総括班が担当し、ホームページを作成して関連研究コミュニティーと一般社会に研究成果を広報する。特定領域「ガンマ線バーストで読み解く太古の宇宙」はガンマ線バーストを手段として星と銀河が形成され始める初期の宇宙を探ることを目的とする。本特定領域の研究全体を統括し、各研究班の調整および領域外関連研究分野研究者を含めた情報交換を目的として、領域シンポジウム(毎年度)と国際シンポジウム(2回)を開催した。さらに関連研究会の実施および参加の支援、市民講演会・高校生講座などを通じた研究成果の市民への普及などの活動を行った。これらの活動の結果、ガンマ線バースト研究は天文学・宇宙物理学の重要な領域として定着した。ビッグバンによって生じた一様な「混沌」から銀河や星が初めて生まれる現場である太古の宇宙を、ガンマ線バースト(GRB)という宇宙で最も明るい光源を用いて解明するのが本研究領域の目的である。総括班は、X線・γ線観測班、近赤外観測班、および理論研究班の3つの計画研究の統括、公募研究班を含めた領域内の連携、および領域外研究コミュニティーとの交流と広報を任務とする。平成19年7月末に採択の通知を受け、8月8日に領域メンバー(全研究代表者・分担者・協力者29名参加)によるキックオフ領域会議を実施し、全計画研究の実施計画を確認し、4年間にわたるシンポジウム等のスケジュールの概要を決定した。平成20年1月21-23日には領域外へもよびかけて第1回領域シンポジウムを開催した(講演数48,参加者107名)。MAXI, GLAST, Subaruなどの衛星ミッションや望遠鏡を用いた国際共同研究のための打合せ旅費を支給し、国際的なガンマ線バースト研究コミュニティーとの交流、情報交換、および協力関係を築くための活動を支援した。また、領域の研究内容を広報するためのウェッブページを製作し、公開した。

ビッグバンによって生じた一様な「混沌」から銀河や星が初めて生まれる現場である太古の宇宙を、ガンマ線バースト(GRB)という宇宙で最も明るい光源を用いて解明するのが本研究領域の目的である。総括班は、X線・γ線観測班、近赤外観測班、および理論研究班の3つの計画研究の統括、公募研究班を含めた領域内の連携、および領域外研究コミュニティーとの交流と広報を任務とする。本年度は、5月8日に領域メンバー(全研究代表者、研究分担者など)による領域会議を実施して全計画研究の進行状況の報告と公募研究の実施計画の発表を行った(参加者40名)。11月27-29日には領域外へもよびかけて第2回領域シンポジウムを開催した(講演数48,参加者85名)。また、6月のMAXI Workshop、3月のFermi衛星公開シンポジウムなど、領域に関連する国際研究集会を共催した。このような場を利用して、国際的なガンマ線バースト研究コミュニティーとの交流、情報交換、および協力関係を築くための小集会を行った。その他、領域メンバーが研究成果発表、情報収集、および国際協力を進めるための旅費の支援を行った。本年度は、5月9日に領域メンバー(計画研究と公募研究の研究代表者、研究分担者、研究協力者)による領域会議を実施して全計画研究の進行状況の報告と公募研究の実施計画の発表を行った(参加者34名)。11月27-29日には領域外へもよびかけて第3回領域シンポジウムを開催した(講演数49,参加者66名)。また、2010年4月に開催する国際会議"Deciphering the Ancient Universe with Gamma-Ray Burst"の準備を進めた。また、Fermi宇宙ガンマ線望遠鏡の研究協力会議、Swift衛星の5周年記念会議などに参加し、国際的なガンマ線バースト研究コミュニティーとの交流、情報交換、および協力関係を築くための小集会を行った。本年度は、平成22年4月1923日に、京都にて国際会議"Deciphering the Ancient Universe with Gamma-Ray Burst"を開催し、原則としてすべての計画研究メンバーと公募研究メンバーが参加して研究成果を発表した。この会議には200人を越える参加登録があったが、会議開始3日前に起きたアイスランドの火山の噴火のために約40名が参加をキャンセルした。それでも、16カ国から159人が参加し(うち日本人は82名、外国人77名)、活発な議論が行われた。
静電加速器により高感度に微量環境ヨウ素129を測定する方法の研究

本学の12UDタンデム静電加速器システムの高度利用の一環としての環境中のヨウ素129の検出を目指した"静電加速器により高感度に微量環境ヨウ素129を測定する方法の研究"を本研究の独創的アイデアである^<97>MoO_2分子パイロットビーム法"により成功裡に終了する事が出来た。平成10年度には研究の遂行に必要不可欠な装置の開発研究に集中し、(1)^<127>I/^<129>I高速走査型機構付きヨウ素負イオン源システム、(2)ヨウ素129測定用2分割スリットコントロール装置、(3)3連電気炉型ヨウ素試料抽出・精製装置、(4)超高速ゼロ時間信号発生装置、(5)実時間粒子飛行時間測定システムの開発を行なった。平成11及び12年度には開発した装置類を12UDタンデム加速器システムに組み込み、日本では初めての大型タンデム静電加速器によるヨウ素129質量分析シ不テムを建設した。試験測定を繰り返し性能を確認下。得られた性能等を列挙する。(1)被測定物質は土壌、海底堆積物、陸水、海水、生物試料等、(2)試料形態はAgI、(3)パイロット物質は^<97>MoO_3、(4)試料混合比はAgI:^<97>MoO_3=10:1、(5)イオン強度はI^-=10μA、^<97>MoO_2^-=10nA、(6)感度は^<129>I/^<127>I比で5×10^<13>、(7)精度は15%、(8)測定時間は1試料60分(標準+試料+標準測定の総計)である。以上のごとく環境中のヨウ素を測定するのに十分な性能を有している事が分かり、^<129>I-AMSの開発に成功した。なお、土壌より採取したヨウ素試料の実験研究を開始すると共に、研究の新たな手段として広く全学に供する準備を始めている。研究初年度の今年度は、来年度から^<129>I測定実験を行う為に必要な装置の開発及び準備とタンデム静電加速器システムに本研究遂行に必要な改良を施す作業を行った。以下に箇条的に経過と実績を述べる。1)ヨウ素試料抽出方法の確立と試料作製装置の開発を行った。(関担当)多段電気実験炉を用いたヨウ素抽出テスト実験を精力的に行い、測定に妨害となるTe元素を極力排除しつつ、植物、生体臓器(甲状腺)及び岩石に含まれるヨウ素を効率よく抽出する方法を開発した。1200°C,1000°C、150°Cの3連電気炉により、酸素及び窒素雰囲気中で試料の燃焼、酸化を行い、活性炭で目的ヨウ素を抽出する試料作製装置の開発を行った。現在、海水中のヨウ素を取り出すテスト運転をしている。2) ^<129>I検出用粒子飛行時間測定装置の開発を行った。(長島、青木担当)静電加速器で加速された^<127>Iを用いて^<129>I測定のシュミレーション実験を行い、^<129>I測定に必要とされる時間分解能とエネルギー分解能の見積もりを行った。

その結果を基として、高真空槽の大きさ、粒子飛行距離の決定、マイクロチャンネルプレートの選定を行い、^<129>I検出用粒子飛行時間測定装置の開発を行った。3月中旬に納入される予定となっており、加速ビームによる性能の確認、来年度からの測定実験に使用する予定である。3)タンデム静電加速器に^<129>I測定に必要な改良を施した。(長島担当)イオン源のエミッタンスを小さくし、測定精度の誤差を1%程度に改善した。静電偏向器の電源を10^<-6>の高安定にし、ビーム転送安定性を改善した。加速電圧安定化帰還システムを改善し、0.1nA程度の極微少電流での加速電圧安定化を可能とした。今年度は、昨年度開発した装置をタンデム静電加速器に組み込み、^<129>I測定実験を可能にするとともに、本研究の独創的アイデアである^<129>I測定法としての"分子パイロットビーム法"の確立と性能の確認を行った。以下に箇条的に経過と実績を述べる。1)^<129>I検出用粒子飛行時間測定装置の性能確認昨年度開発した^<129>I検出用粒子飛行時間測定装置を本学加速器センターのAMSコース中に設置し、加速ビーム(30MeV,^<127>I)を用いて、性能の確認と改良点の洗い出しを行った。その結果、飛行時間分解能が約1ナノ秒、粒子検出効率100%の性能を持っていることが解ったが、ノイズレベルが高く、その為に動作が不安定になることが判明した。新たにイオン真空ポンプを追加し装置内真空度を改善(10^<-5>Torrより10^<-7>Torr程度)する事で、ノイズを減少させることができ、安定に動作させることができた。2)"分子パイロットビ-ム法"の確立と性能の確認本研究の^<97>MoO^^<16>__2分子をパイロットビームとする"分子パイロットビーム法"アイデアが正しく^<129>I測定実現に有効であるが、加速器センターにおいて確認の実験を行った。AgI標準試料に^<97>MoO^^<16>__2を少量混ぜたテスト試料を用いて、加速された^<97>Moで静電加速器を精密に制御しつつ、目的とする^<129>Iの測定を試みた。その結果、129Iの検出に成功し、本アイデアの基本的に正しいことを確認することができた。ノズルが多いなど解決しなければならない問題点も解り、現在鋭意改良を進めている。研究最終年の今年は、昨年度までに開発したヨウ素試料作製装置を用いて作成した3種類のAgI試料を用いて、^<129>I検出用粒子飛行時間測定装置をタンデム静電加速器に組み合わせて開発した^<129>I超高感度加速器質量分析システムの総合的な性能の確認と改良すべき点の洗い出しを行ない、研究のまとめを行なった。1.ヨウ素試料抽出方法の確立とAgI試料の作成法初年度に開発した、酸素及び窒素雰囲気中で試料の燃焼、酸化を行い、活性炭で目的ヨウ素を抽出する試料抽出装置を用いて、植物、生体臓器(甲状腺)及び岩石に含まれるヨウ素を抽出する時の抽出効率の向上を追求する事を行ない、初期に比べ2倍程度効率を向上させる事が出来た。抽出したヨウ素を最終的には本分析システムに試料として用いる事の出来るAgI化合物にする方法の確率を行ない、ほぼ100%の効率でAgIを製作する事を可能とした。2.総合性能の確認上記の方法で作成した^<129>I/^<127>I比で10^<-10>から10^<-12>の試料を用いて、本研究で我々独自のアイデアである"分子パイロットビーム法"に基づき開発した^<129>I
活性化KIT遺伝子の導入によるマスト細胞腫高発マウスの作製

c-kitレセプター・チロシンキナーゼ(KIT)のAspをValに置換した活性型KIT遺伝子をインターロイキン(IL)-3依存性の培養マスト細胞株(IC-2)に導入すると、導入細胞はIL-3とKITのリガンドであるstem cell factorの両方を含まない培地でも活発に増殖するようになりヌードマウスにおいて造腫瘍性を示した。自律性に増殖する培養マスト細胞腫株(FMA3)ではKITが構成的に二量体を形成するために活性化していた。この原因はjux tamembrane領域の7つのアミノ酸が欠失することに求められた。この新しいタイプの“gain-of-function"突然変異をもつ変異型KIT遺伝子をIC-2細胞に導入すると、導入細胞は自律性に増殖するようになりヌードマウスにおいて腫瘍を形成した。この結果は突然変異によるKITの構成的な活性化がマスト細胞の腫瘍化に深く関与していることを示した。そこでマスト細胞で強く発現するプロテアーゼの1つであるmouse mast cell protease-6(MMCP-6)遺伝子のプロモーターで制御されるヒトの活性型KIT遺伝子(Asp→Val)を導入したトランジェニックマウスを作製した。このトランスジェニックスマウスは突然変異によるKITの構成的な活性化がマスト細胞の腫瘍化に直接的に関与していることを示す良いモデルになると考えられる。
子宮内膜症発生・発癌機構へのゲノム多様性の関与

子宮内膜幹細胞に変異型K-Rasを発現させると、長期増殖能・造腫瘍能・ERの発現の亢進・ER転写能の亢進をみとめた。Ras/ER/AP-1/MDM2/p53/p21経路に関与する遺伝子群のプロモーター領域の遺伝子多型を解析したところ、MDM2 SNP309 GG型とTP53 72codonArg/Argのかけあわせは、子宮体癌症例で有意にリスクの上昇をみとめ、子宮内膜の増殖への関与が示唆された。今年度は順天堂大学産婦人科を受診した子宮内膜症患者の血液を収集している。Ras/ER/AP-1/MDM2/p53/p21経路に関与する遺伝子群のプロモーター領域のプライマーを設計した。患者血液が集まり次第、DNA多型を解析し、子宮内膜症に頻度の高いDNA多型を決定する。また、子宮内膜症の発生機構を解析するため、ラット子宮内膜細胞株RENT4細胞から幹細胞の分画を含むことが報告されているsidepopulation細胞とnon-SP細胞を分取した。Estrogen Receptorの発現はSP細胞に有意に亢進していた。それぞれの細胞に内膜症の発生に関与があることが報告されているK-ras遺伝子を形質導入した。SP細胞にK-ras遺伝子を形質導入したときのみ、長期増殖能・造腫瘍能・ERの発現の亢進・ER転写能の亢進をみとめた。さらに、SP細胞とnon-SP細胞の間で発現に差がある遺伝子をマイクロアレイで解析したところ、エストロゲンシグナルに関与する遺伝子やサイトカインの発現の亢進をみとめた。子宮内膜症合併卵巣癌のサンプルを用いて、免疫染色を行ったところ、正常腺上皮に比べて異型内膜腺上皮の部分にepithelial-mesenchymal transitionに関与する遺伝子の発現亢進がみられた。以上より、子宮内膜症の発生に子宮内膜幹細胞が関与し、エストロゲンやサイトカインのシグナルが重要であることが示唆された。2.子宮内膜症の患者サンプル数が目標解析数に達していないため、まず、同意を得た子宮体癌125症例、健常者200例から血液を採取し、DNAを抽出後、PCRとRFLPにより上記遺伝子多型を解析した。3.MDM2 SNP309 GG型はTT型に比べ、子宮体癌患者でのオッズ比が上昇していたが、有意差はなかった(OR 1.79[0.93-3.30])。TP53,ERα,p21の多型はいずれも関連をみとめなかった。5.P53とMDM2の結合阻害剤であるRITAを用いて子宮体癌細胞株の増殖抑制効果を検討したところ、非添加群に比べてMDM2 SNP309 TT型のHec6は90%、TG型のHHUAは54%、GG型のSawanoは49%であり、MDM2 SNP309のGアリルの存在が阻害剤の効果に影響することが示された。今後子宮内膜から内膜症への変化の過程にこの多型が関与するのかを検討する。