hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フレキシブル高分子上への機能性酸化物エピタキシャル薄膜作製

本研究では圧電体や強誘電体など機能酸化物のエピタキシャル薄膜を高分子製フレキシブル基板上に形成するための基礎を確立することを目的とする。高分子製フレキシブル基板は耐熱1生に乏しく、機能性酸化物をエピタキシャル成長させるために必要な数100°C以上の加熱に耐えることができないため、耐熱性に優れるMgO基板上に良質の薄膜を作製したのち、これを高分子製フレキシブル基板に接着してからMgO基板を除去するという新しい作製プロセスを提案し、遷移金属酸化物のエピタキシャル薄膜をフレキシブル化するための基礎を確立した。本研究の目的は、遷移金属酸化物のエピタキシャル薄膜を、軽量で柔軟な高分子製フレキシブル基板上に形成し、機能調和酸化物エピタキシャル・フレキシブルデバイス創製の基礎を確立することである。酸で容易に溶解し、かつ多様な機能性遷移金属酸化物をエピタキシャル成長させる基板として有用なMgO(100)単結晶上に、圧電体Pb(Zr_<0.52>Ti_<0.48>)O_3(PZT)などの機能性酸化物をパルスレーザ堆積(PLD)法によってエピタキシャル成長させたのち、表面を高分子でコーティングしてからMgO基板をリン酸でエッチングすることで、目的とする「フレキシブル・機能性酸化物エピタキシャル薄膜」を得ることを提案した。平成22年度は、1.MgO(100)単結晶基板上にPZTをエピタキシャル成長させるための成膜条件を確立すること、2.エピタキシャル成長した機能性酸化物薄膜に良好な密着性を示す高分子材料を探索すること、の2点を行った。1.については、MgO(100)とPZTの格子不整合が大きい(約4.5%)ことが問題となり、良好なエピタキシャル成長が困難であったが、基板温度575°C、O_2分圧5×10^<-2>Pa、レーザフルエンス3J/cm^2、成膜速度0.1nm/レーザパルス、の最適条件にて(001)軸配向したエピタキシャルPZT薄膜を得ることに成功した。また、2.についてはポリイミドおよび厚膜レジスト材SU-8を用いることで、PZT薄膜表面に比較的良好な接着性を示すことがわかった。これにより目的とする「フレキシブル・機能性酸化物エピタキシャル薄膜」を得るための基本技術を確立することができ、次年度には通常では印加することが不可能な巨大な歪みをPZTなどの機能性酸化物薄膜に印加し、巨大歪みに対する電子物性の変化を詳細に調べるための準備を整えることができた。本研究の目的は、単結晶基板上にエピタキシャル成長させた機能性酸化物の薄膜を軽量で柔軟な高分子製フレキシブル基板上に接着したのち、もとの単結晶基板をエッチングして取り除くことで機能性酸化物エピタキシャル薄膜を高分子製フレキシブル基板へ転写する技術の基礎を確立することである。本研究においては、多様な機能性酸化物薄膜を高品質にエピタキシャル成長させることが可能なうえ、酸で容易に溶解するMgO(100)単結晶上に、誘電体SrTiO_3(STO)などの機能性酸化物をパルスレーザ堆積(PLD)法によってエピタキシャル成長させたのち、これを高分子製フレキシブル基板に接着し、MgO基板をリン酸でエッチングすることで「フレキシブル・機能性酸化物エピタキシャル薄膜」を得ることを提案した。平成23年度は平成22年度に明らかになった、転写した機能性酸化物エピタキシャル薄膜がクラック・剥離する問題を解決する目的で研究を行った。平成22年度に使用した高分子製フレキシブル基板である厚膜レジスト材SU-8は柔軟性が大きすぎる点が問題であると考え、SU-8を接着剤として代表的な高分子製フレキシブル基板のポリエチレンナフタレート(PEN)にSTOのエピタキシャル薄膜を接着することを試みた。その結果、STOの膜厚が500nm以下でクラックフリー転写に成功した。また、そのフレキシブル性を確認する目的で転写したエピタキシャルSTO薄膜にクラック・剥離が生じない最小の曲率半径を調べる実験を行った。その結果、膜厚300nm以下のSTO薄膜では曲率半径5mmまでクラック・剥離を生じることなく曲げることができた。本研究の結果、通常では印加することが不可能な巨大な歪みを機能性酸化物エピタキシャル薄膜に印加し、巨大歪みに対する電子物性の変化を詳細に調べるための基礎を確立することができた。
生体内軟骨再生技術の開発

ラットを用いて生体内軟骨再生を試みた。ラット骨髄から間葉系幹細胞を分離培養し成長因子TGF-β1を用いて軟骨細胞へ分化誘導した。分化誘導した細胞をコラーゲンゲルに包埋し三次元培養を行ったところ部分的に軟骨組織を認めた。生体内軟骨再生の母床作製のため、chamber methodを模倣した肉芽組織作製を行った。作製された肉芽には皮膚移植することができ、十分に軟骨再生の苗床となりえると考えられた。1.プロテオグリカン含有複合キャリアーの開発関節軟骨の再生も視野に入れて骨軟骨複合キャリアーを作製するため、ハイドロキシアパタイトを利用素材とし、これらの形状の形成を行った。プロテオグリカンを含ませる素材として使用を計画しているところである。2.体内軟骨再生方法の開発軟骨細胞の培養を行っている施設の研究者と軟骨細胞培養に関し検討した際、(1)軟骨細胞は増殖するが次第に軟骨基質を産生しな<なる、(2)軟骨基質を産生させ続けるにはサイトカイン(TGF-beta1など)が必要、との情報を得た。元々増殖能力が少なくin vivoでの採取量も少ない軟骨細胞を用いた軟骨組織再生は基質を産生させていく点からも問題を含む可能性があり、増殖能力に長け臨床的にも採取の容易な骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いての軟骨組織再生の方が有利であると我々は考えた。そこで、ラットを用いての実験系においてMSCを採取し軟骨細胞へ分化させ軟骨組織を再生できるのか検討した。SDラットの大腿骨から骨髄を採取、10%FCS含DMEMで培養し翌日に浮遊細胞を除去、接着細胞のみ培養した。3,4日に一度培養液を交換した。Confluent時に半分をストックする方法(population doubling)で継代していくと50継代以上培養可能なことを確認した。これらの細胞の表面抗原に対しFACSを用いて検討した。結果、CD31(-)、CD34(-)、CD29(+)、CD44(+)でMSCであることが示唆された。次にこれら細胞をTGFβ1含有培養液で培養し、軟骨細胞への分化を促した。軟骨細胞への分化の指標として(1)転写因子であるSOX9の発現、(2)II型コラーゲンの産生、を検討した。RT-PCRを用いてSOX9の発現を検討したところ、TGFβ1含有培養液で培養されたこの細胞では、TGFβ1の濃度依存性にSOX9の発現が増強した。現在、この細胞の2型コラーゲン産生に関してwestern blotを用いて検討中である。軟骨細胞の培養を行っている施設の研究者と軟骨細胞培養に関し検討した際、(1)軟骨細胞は増殖するが次第に軟骨基質を産生しなくなる、(2)軟骨基質を産生させ続けるにはサイトカイン(TGF-beta1など)が必要、との情報を得た。この接着細胞はpopulation doubhngで継代していくと50継代以上培養可能なことを確認した。これらの細胞の表面抗原に対しEACSを用いて検討した。Western Blottingを用いてII型コラーゲン産生について検討したところ、TGFβ1の濃度依存性にII型コラーゲンの産生が増加した。現在、これら分化誘導細胞をscaffoldに入れex vivoでの3次元培養を開始している。今後、最終目標であるin vivoによる軟骨再生方法の開発ならびにex vivoによる3次元培養との比較検討を行う予定である。

元々増殖能力が少なくin vivoでの採取量も少ない軟骨細胞を用いた軟骨組織再生は基質を産生させていく点からも問題を含む可能性があり、増殖能力に長け臨床的にも採取の容易な骨髄間葉系幹細胞(MSC)を用いての軟骨組織再生の方が有利であると我々は考えた。そこで、ラットを用いての実験系においてMSCを採取し軟骨細胞へ分化させ軟骨組織を再生できるのか検討した。SDラットの大腿骨から骨髄を採取、接着細胞のみ培養したところ、50継代以上培養可能なことを確認し、また表面抗原検索の結果MSCであることが示唆された。次にこれら細胞をTGFβ1含有培養液で培養したところ、骨軟骨系の転写因子であるSOX9の発現が増強し、軟骨器質の一つであるII型コラーゲンの産生が増強することから軟骨細胞への分化が確認された。これら分化誘導細胞をcollagen gel scaffoldに埋入しex vivoでの3次元培養をTGF-β1含有培養液中にて4週間行い組織学的(HE染色, alcian blue染色, toluidine blue染色,抗H型コラーゲン免疫染色)に検討したところ、部分的ではあるが軟骨組織を認めた。今後、より完全な形での軟骨組織作製をex vivo, in vivo(生体内)で検討していく予定である。
イスラーム哲学におけるアリストテレス『デ・アニマ』受容と霊魂論の展開

1.シャハラズーリー著『比喩と象徴』に関する写本研究とテクストの校訂。(1)Nuruosmaniye, (2)Shehit Ali,(3)Carullah,(4)Laleli,(5)Escorial,(6)Ragip Pasha, (7)Haji Mahmut,(8)Landberg,(9)Vaticanの9写本を詳細に比較検討した結果、同書の写本は(1)(3)(5)(9)と(2)(4)(6)(7)(8)の2系統に分類しうること、前者の系統の方が原本により近く、かつ語法的にもより優れたテクストを伝えていることが明らかになった。そして、この知見をふまえて、(1)(3)(4)(5)(6)の5写本により同書を校訂し、アラビア語のクリティカル・エディションを完成させた。2.イスラーム照明学派の展開に関する研究。イスタンブールを中心に照明学派に関する文献資料を調査し、その伝存状況と内容とを確認した。その結果、トゥーディー(『閃光の書』註解)やアブハリー(『真理の開示』)などの著作に見られるように、スフラワルディーの思想的影響はこれまで考えられていたよりも早い時期に、またより広範囲に及んでいることが明らかになった。さらに、ムサンニファク(シャールーディー)(『味得の言葉』註解)に見られるように、照明学の伝統とスーフィズムの伝統とが融合している事例も見いだされた。3.スフラワルディー著『開示の書』の注釈に関する研究。同書に付されたシャハラズーリーおよびイブン・カンムーナの注釈を取り上げ、同書の中心問題の一つである「自己意識」がいかに解釈され受容されたかを具体的に明らかにした。また、従来の見解とは異なり、イブン・カンムーナの注釈の方がシャハラズーリーのものよりも時期的に先であり、後者は前者の影響を強く受けていることを明らかにした。研究計画調書に記載したように,平成13年度はシャハラズーリー著『比喩と象徴』al-Rumuz wa'l-Amthalの校訂と,スフラワルディー著『開示の書』al-Talwihatの研究を行なった。以下,それぞれについて概容を報告する。1.シャハラズーリー著『比喩と象徴』については,今回の写本調査によってms.Ragip Pasha707(トルコ共和国,イスタンブール,スレイマニエ図書館蔵)の重要性が明らかになったので,そのマイクロフィルムを取得した。そして,これまで用いてきた8写本とこの写本とを併せて校訂作業を継続中であり,現在はその最終段階にある。2.スフラワルディー著『開示の書』については,アリストテレスとスフラワルディーの間で交わされる「霊魂」とその認識をめぐる空想的対話に着目し分析した。その際,シャハラズーリーおよびイブン・カンムーナが同書に付した註釈を参照することにより,この対話の構造や問題点を明らかにするとともに,それぞれの註釈家の特徴や関係についても考察した。なお,前者についてはms.Koprulu880とms.Nuruosmaniye2694を,後者についてはms.Saray Ahmet3244を用いた。以上に述べた成果のうち,2.にかんしては平成13年8月1日から3日にかけて開催された「スフラワルディー国際会議」(イラン・イスラム共和国,ザンジャン大学)で報告した。また,シャハラズーリーを中心とする「照明学派」の思想的展開については,10月21日に開催された「日本オリエント学会年次大会」(東京,和光大学)において報告し,校訂したテキストの一部を資料として呈示した。
動的ラジカル高分子反応に基づく構造再編成高分子システムの構築

本研究では、可逆的な結合・解離システムを高分子材料に導入することにより、動的な特性を有する次世代型高分子材料を創製することを目的とする。前年度は、アルコキシアミン骨格のラジカル交換反応を利用した直鎖状ポリマーと星型ポリマー間の構造変換について検討した。今年度は、ラジカル交換反応のダイナミクス解析および、交換反応により得られた星型ポリマーのキャラクタリゼーションを走査プローブ顕微鏡観察に基づき行った。具体的には、原子移動ラジカル重合により合成した、自己架橋型ブロック共重合体の結合組み換え反応により星型ナノゲルを合成した。反応は副反応を伴わず速やかに進行し、系のゲル化は観測されなかった。得られた高分子高次構造体の形状は、多角度光散乱測定、小角X線散乱測定、プローブ顕微鏡観察などにより行い、それぞれ分子量、回転半径、形状に関する情報を得た。これらの結果より、数十ナノメートル程度のゲルより複数の高分子鎖が伸張した星型構造を有していることが明らかとなった。また、反応時間依存性を評価することで、星型ナノゲルの構造が熱力学的に再安定であることを明らかにした。さらに、ブロック共重合体の組成により星型ナノゲルの形状を制御できることを示した。星型ナノゲルからブロック共重合体への構造変換反応についても検討し、過剰のアルコキシアミン存在下、結合組み換え反応を行うことで、直鎖状の高分子が再生することが明らかとなった。自己架橋型ブロック共重合体にも、二種類の相補的な反応性を有するブロック共重合体を設計・合成し、同様に直鎖状ポリマーと星型ナノゲルの可逆的な構造変換系が成立することを示した。一般に、架橋高分子は溶媒に対して不溶不融であり、化学的に分解させない限り構造を再編成させることは不可能である。今年度は、アルコキシアミン誘導体を架橋部位に導入することで、室温で材料としての安定性を有し、外部刺激(加熱)存在下では構造再編成能を有する3次元架橋高分子の合成と脱架橋反応について検討した。加熱下で構造再編成能を有することが期待される3次元架橋高分子の合成を試みた。ポリメタクリレート系の3次元架橋高分子骨格を構築するために、アルコキシアミン骨格を含有し、二種類のメタクリレートモノマーを合成した。これらのモノマーでは、異なる位置で重合性官能基に連結するように分子設計を行った。得られた二種類のモノマーとメタクリル酸メチルとの共重合反応により、2種類のランダム共重合体の合成を行った。反応条件を制御し、比較的低温でラジカル重合を行うことで、直鎖状高分子を得た。アルコキシアミン部位は加熱により可逆的解離し、ラジカル的な交換反応が進行するため、2種類の共重合体を混合し加熱することで架橋反応が進行することが明らかとなった。得られた架橋高分子のキャラクタリゼーションは、元素分析、赤外吸収分光法などにより行った。さらに、アルコキシアミン誘導体を含む溶媒で膨潤させ加熱を行うことで、動的な構造変換を利用した脱架橋反応が進行することを明らかとした。このように架橋高分子系において構造再編成可能な高分子システムの構築に成功した。前年度は、アルコキシアミン誘導体を架橋部位に導入することで、室温で材料としての安定性を有し、外部刺激(加熱)存在下では構造再編成能を有する架橋ポリマーの合成と脱架橋反応について検討したが、今年度は、アルコキシアミン骨格のラジカル交換反応を利用した直鎖状ポリマーと星型ポリマー間の構造変換について検討した。原子移動ラジカル重合により、側鎖にアルコキシアミンを導入したブロック共重合体を合成した。ブロック共重合体のアニソール溶液を調製し、100°Cで24h加熱することにより高分子反応を行い、GPC測定により分子量を評価した。加熱によりブロック共重合体のゲルパーミエーションクロマトグラフィー曲線が高分子量側にシフトし、比較的分子量分布の狭いポリマーが得られた。ラジカル交換反応により、ドメイン選択的に架橋反応が進行したためであると考えられる。また、平衡反応であるため、濃度や溶媒、ブロック共重合体の組成などの反応条件を反映した熱力学的に安定な構造を形成し、分子量分布の狭いスターポリマーが生成したものと推測される。また、本系では過剰のアルコキシアミンやニトロキシドラジカルで処理することにより、線状高分子への返還することにも成功した。

得られた高分子高次構造体の形状は、多角度光散乱測定、小角X線散乱測定、プローブ顕微鏡観察などにより行い、それぞれ分子量、回転半径、形状に関する情報を得た。これらの結果より、数十ナノメートル程度のゲルより複数の高分子鎖が伸張した星型構造を有していることが明らかとなった。また、反応時間依存性を評価することで、星型ナノゲルの構造が熱力学的に再安定であることを明らかにした。さらに、ブロック共重合体の組成により星型ナノゲルの形状を制御できることを示した。星型ナノゲルからブロック共重合体への構造変換反応についても検討し、過剰のアルコキシアミン存在下、結合組み換え反応を行うことで、直鎖状の高分子が再生することが明らかとなった。自己架橋型ブロック共重合体にも、二種類の相補的な反応性を有するブロック共重合体を設計・合成し、同様に直鎖状ポリマーと星型ナノゲルの可逆的な構造変換系が成立することを示した。
静的筋収縮時の負荷形式の比較研究 ‐錘を牽引すべきか,不動の物体 を押すべきか‐

静的筋収縮時の負荷形式には,一定の外力(錘など)に抗して所定の関節角度を保持する肢位制御課題と,関節角度は固定された状態で一定の筋力を保持する筋力制御課題がある.ニュートン力学的に同一関節トルクを必要とする静的筋収縮を二つの負荷形式によって行った時に,筋力制御課題の運動持続可能時間は,肢位制御課題より二倍長いとの報告がある.本研究は,肢位制御課題では一定の筋力を保持するために,筋力制御課題と比較して末梢からの固有受容感覚と皮膚感覚情報をより多く必要とすることを明らかにした.静的筋収縮時の負荷形式には,一定の外力(錘など)に抗して所定の関節角度を保持する肢位制御課題と,関節角度は固定された状態で一定の筋力を保持する筋力制御課題がある.ニュートン力学的に同一関節トルクを必要とする静的筋収縮を二つの負荷形式によって行った時に,筋力制御課題の運動持続可能時間は,肢位制御課題より二倍長いとの報告がある.本研究は,肢位制御課題では一定の筋力を保持するために,筋力制御課題と比較して末梢からの固有受容感覚と皮膚感覚情報をより多く必要とすることを明らかにした.静的筋収縮時の負荷形式には,一定の外力(錘など)に抗して所定の関節角度を保持する肢位制御課題(Position control task : PcT)と,関節角度は固定された状態で一定の筋力を保持する筋力制御課題(Force control task : FcT)がある.本研究は,ニュートン力学的に同一関節トルクを必要とする静的筋収縮を二つの負荷形式によって行った時に,感覚フィードバソクの経路や皮質感覚運動関連領野での運動制御様式が異なるのか否か検証することを目的とした.健常成人11名が示指外転位10°で最大随意筋力の20%を保持する第一背側骨間筋の静的収縮を,PcTとFcTでそれぞれ3分間行った.この時に,正中及び尺骨神経に経皮的電気刺激(3.3Hz)を行い,頭皮上C3'に設置した電極より感覚誘発電位(Somatosensory evoked potentials : SEP)を記録した,両タスクによる静的筋収縮中に記録されたSEP振幅の早期成分N35は,刺激される神経に関わらず安静時と比較して共に有意に低下した.尺骨神経刺激時には,SEP振幅の早期成分N35がPcTにおいてFcTより有意に低値を示した.一方,正中神経刺激時にはSEP振幅の早期成分N35の変化にタスク間の差は認められなかった.運動時のSEP振幅が安静時のそれより低下する現象はGatingと呼ばれ,随意的に皮質感覚運動連関係の神経基盤を使用した結果,電気刺激に対する反応性が低下することが,その機序として考えられている.尺骨神経刺激時でのみ,PcT実施時のSEP GatingがFcT実施時より大きかったという本研究の結果は,一定の筋力を保持する際に,FcTと比較して,PcTではIa群感覚神経を介した固有受容感覚によるフィードバックが,より必要とされる可能性が示唆された.静的筋収縮時の負荷形式には,一定の外力(錘など)に抗して所定の関節角度を保持する肢位制御課題(Position control task : PcT)と,関節角度は固定された状態で一定の筋力を保持する筋力制御課題(Force control task : FcT)がある.本研究は,ニュートン力学的に同一関節トルクを必要とする静的筋収縮を二つの負荷形式によって行った時に,感覚フィードバックの経路や皮質感覚運動関連領野での運動制御様式が異なるのか否か検証することを目的とした.健常成人11名が示指外転位10°で最大随意筋力の20%を保持する第一背側骨間筋の静的収縮を,PcTとFcTでそれぞれ3分間行った.この時に,正中及び尺骨神経に経皮的電気刺激(3.3Hz)を行い,頭皮上C3'に設置した電極より感覚誘発電位(Somatosensory evoked potentials : SEP)を記録した.両タスクによる静的筋収縮中に記録されたSEP振幅の早期成分N35は,刺激される神経に関わらず安静時と比較して共に有意に低下した.尺骨神経刺激時には,SEP振幅の早期成分N35がPcTにおいてFcTより有意に低値を示した.一方,正中神経刺激時にはSEP振幅の早期成分N35の変化にタスク間の差は認められなかった.運動時のSEP振幅が安静時のそれより低下する現象はGatingと呼ばれ,随意的に皮質感覚運動連関系の神経基盤を使用した結果,電気刺激に対する反応性が低下することが,その機序として考えられている.尺骨神経刺激時でのみ,PcT実施時のSEP GatingがFcT実施時より大きかったという本研究の結果は,一定の筋力を保持する際に,FcTと比較して,PcTではIa群感覚神経を介した固有受容感覚によるフィードバックが,より必要とされる可能性が示唆された.静的筋収縮時の運動負荷形式による感覚運動調節様式の違い-筋力制御と肢位制御-【目的】静的筋収縮時の負荷形式には筋力(FcT)と肢位(PcT)制御課題があり,PcTで疲労が速く進行する.今回,両課題でIa感覚神経-α運動神経ループの興奮性の違いを比較した.【方法】10名の被験者が右示指外転位20°で最大筋力の20%を保持するFDIの2種類の静的収縮課題を行った.

収縮時間は100秒間とし,間に3分間の休憩時間をはさみ,50秒間ずつ行った.収縮中に右尺骨及び正中神経刺激による感覚誘発電位(SEP)をC3'より,短潜時反射(SLR)及び長潜時反射(LLR)をFDIより記録した.また,左M1に磁気刺激を行い,運動誘発電位(MEP)を記録した.【考察】PcTでFDI支配の尺骨神経刺激でのみSEPのgating量が増加したことは,FDIの筋紡錘からの固有知覚入力が尺骨神経刺激時の求心性入力に干渉し,いわゆるcentripetal gatingが生じたと考えられる.SLR及びLLRの振幅増加も同様な解釈が可能であり,PcTの遂行には,FcTと比較して,末梢からの筋感覚情報をより多く必要とすることが示唆された.一方,FcTにおけるSP延長は,皮質脊髄路が末梢ループに抑制性に何らかの作用を及ぼし,SLR及びLLR振幅がPcT遂行時より減少したのではないかと推察した.磁図計測用シールドルーム内において,関節角度計と筋張力計から生じる微弱なノイズ信号を除去する作業に時間を要し,本実験を行うことができていない.24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,肢位制御,筋力制御の両運動負荷形式による筋力トレーニング効果及びトレーニング中の循環系応答の違いについて実験を行う予定であった.しかし,前年度の課題遂行中の脳磁界反応の計測が順調に進んでいないために,前年度の実験を優先して行う.今年度予定されていた実験については,前年度の実験が終了次第取りかかる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
麻酔薬の心筋減作作用における中枢神経性因子の解明

本研究はハロセン-エピネフリン不整脈に対して中枢性のイミダゾリン受容体が及ぼす作用を検討中であるが,現在までの概要は以下の様である1-α2リセプター作動薬であるデクスメデトミジンが中枢性の機序によりハロセン-エピネフリン不整脈を抑制することが知られている(Anesthesilogy 1991)。しかしながらデクスメデトミジンは弱いながらもイミダゾリン受容体に親和性を持つためデクスメデトミジンの抗不整脈作用におけるイミダゾリン受容体の関与を検討した.雑種成犬を用いてイミダゾリン環を持つα2拮抗薬(イダゾキサン,アティバメゾール)あるいは持たないα2拮抗薬(L-659066,ラワルジン)がデクスメデトミジンの抗不整脈作用に与える影響を調べた結果,イミダゾリン環を持つα2拮抗薬のみがデクスメデトミジンの抗不整脈作用に拮抗した(Anesthesiology 1993)よってハロセン-エピネフリン不整脈にイミダゾリン受容体が関与している事が示唆された.2-上記知見をもとに選択性の高いイミダゾリン作動薬であるリルメニジンのハロセン-エピネフリン不整脈に対する影響を調べた結果,リルメ二ジンはハロセン-エピネフリン不整脈を抑制した.またこの抗不整脈作用はイミダゾリン環を持たないα2拮抗薬であるラワルジンの中枢投与で拮抗されず,イミダゾリン拮抗薬であるイダゾキサンの中枢投与で拮抗された.よってハロセン-エピネフリン不整脈に中枢性のイミダゾリン受容対が関与していることが解明された.これらの知見は学術雑誌に投稿予定中である.またラットを用いて中枢性のイミダゾリン受容体の抗不整脈作用の作用機序の解明を行なった結果イミダゾリン受容体の作用にG-Proteinが関与している可能性が示唆された.3-イミダゾリン受容体刺激がハロセン-エピネフリン不整脈を抑制する機序として中枢神経系を介した交感神経系の抑制が示唆されているが,今後はラットを用いた不整脈のモデルにおいて腎臓の交感神経の活動を記録しイミダゾリン受容体刺激による交感神経の抑制が上記不整脈に与える影響の評価を検討中である.本研究はハロセン-エピネフリン不整脈に対して中枢性のイミダゾリン受容体が及ぼす作用を検討中であるが,現在までの概要は以下の様である1-α2リセプター作動薬であるデクスメデトミジンが中枢性の機序によりハロセン-エピネフリン不整脈を抑制することが知られている(Anesthesilogy 1991)。しかしながらデクスメデトミジンは弱いながらもイミダゾリン受容体に親和性を持つためデクスメデトミジンの抗不整脈作用におけるイミダゾリン受容体の関与を検討した.雑種成犬を用いてイミダゾリン環を持つα2拮抗薬(イダゾキサン,アティバメゾール)あるいは持たないα2拮抗薬(L-659066,ラワルジン)がデクスメデトミジンの抗不整脈作用に与える影響を調べた結果,イミダゾリン環を持つα2拮抗薬のみがデクスメデトミジンの抗不整脈作用に拮抗した(Anesthesiology 1993)よってハロセン-エピネフリン不整脈にイミダゾリン受容体が関与している事が示唆された.2-上記知見をもとに選択性の高いイミダゾリン作動薬であるリルメニジンのハロセン-エピネフリン不整脈に対する影響を調べた結果,リルメ二ジンはハロセン-エピネフリン不整脈を抑制した.またこの抗不整脈作用はイミダゾリン環を持たないα2拮抗薬であるラワルジンの中枢投与で拮抗されず,イミダゾリン拮抗薬であるイダゾキサンの中枢投与で拮抗された.よってハロセン-エピネフリン不整脈に中枢性のイミダゾリン受容対が関与していることが解明された.これらの知見は学術雑誌に投稿予定中である.またラットを用いて中枢性のイミダゾリン受容体の抗不整脈作用の作用機序の解明を行なった結果イミダゾリン受容体の作用にG-Proteinが関与している可能性が示唆された.3-イミダゾリン受容体刺激がハロセン-エピネフリン不整脈を抑制する機序として中枢神経系を介した交感神経系の抑制が示唆されているが,今後はラットを用いた不整脈のモデルにおいて腎臓の交感神経の活動を記録しイミダゾリン受容体刺激による交感神経の抑制が上記不整脈に与える影響の評価を検討中である.本研究はハロセン-エピネフリン不整脈に対して中枢性のイミダゾリン受容体が及ぼす作用を検討中であるが,現在までの概要は以下の様である1-α2リセプター作動薬であるデクスメデトミジンが中枢性の機序によるハロセン-エピネフリン不整脈を抑制する(Anesthesilogy1991)が,このデクスメデトミジンの抗不整脈作用におけるイミダゾリン受容体の役割を検討した.雑種成犬を用いてイミダゾリン環を持つα2拮抗薬(イダゾキサン,アティパメゾール)あるいは持たないα2拮抗薬(L-659066,ラワルジン)がデクスメデトミジンの抗不整脈作用に与える影響を調べた結果,イミダゾリン環を持つα2拮抗薬のみがデクスメデトミジンの抗不整脈作用に拮抗した.

よってハロセン-エピネフリン不整脈にイミダゾリン受容体が関与している事が示唆された.2-上記知見をもとに選択性の高いイミダゾリン作動薬であるリルメニジンのハロセン-エピネフリン不整脈に対する影響を調べた結果,リルメニジンはハロセン-エピネフリン不整脈を抑制した.またこの抗不整脈作用はイミダゾリン環を持たないα2拮抗薬であるラワルジンの中枢投与で拮抗されず,イミダゾリン拮抗薬であるイダゾキサンの中枢投与で拮抗された.よってハロセン-エピネフリン不整脈に中枢性のイミダゾリン受容体が関与していることが解明された.これらの知見は学術雑誌に投稿予定中である.また今後の研究としてラットを用いて中枢性のイミダゾリン受容体の抗不整脈作用の作用部位の同定を計画中である.本研究はハロセン-エピネフリン不整脈に対して中枢性のイミダゾリン受容体が及ぼす作用を検討中であるが,現在までの概要は以下の様である1-α2リセプター作動薬であるデクスメデトミジンが中枢性の機序によりハロセン-エピネフリン不整脈を抑制することが知られている(Anesthesilogy 1991)。しかしながらデクスメデトミジンは弱いながらもイミダゾリン受容体に親和性を持つためデクスメデトミジンの抗不整脈作用におけるイミダゾリン受容体の関与を検討した。雑種成犬を用いてイミダゾリン環を持つα2拮抗薬(イダゾキサン,アティパメゾール)あるいは持たないα2拮抗薬(L-659066,ラワルジン)がデクスメデトミジンの抗不整脈作用に与える影響を調べた結果,イミダゾリン環を持つα2拮抗薬のみがデクスメデトミジンの抗不整脈作用に拮抗した(Anesthesiology 1993)。よってハロセン-エピネフリン不整脈にイミダゾリン受容体が関与している事が示唆された。2-上記知見をもとに選択性の高いイミダゾリン作動薬であるリルメニジンのハロセン-エピネフリン不整脈に対する影響を調べた結果,リルメニジンはハロセン-エピネフリン不整脈を抑制した。またこの抗不整脈作用はイミダゾリン環を持たないα2拮抗薬であるラワルジンの中枢投与で拮抗されず,イミダゾリン拮抗薬であるイダゾキサンの中枢投与で拮抗された。よってハロセン-エピネフリン不整脈に中枢性のイミダゾリン受容対が関与していることが解明された。これらの知見は学術雑誌に投稿予定中である。またラットを用いて中枢性のイミダゾリン受容体の抗不整脈作用の作用機序の解明を行なった結果イミダゾリン受容体の作用にG-Proteinが関与している可能性が示唆された。3-イミダゾリン受容体刺激がハロセン-エピネフリン不整脈を抑制する機序として中枢神経系を介した交感神経系の抑制が示唆されているが,今後はラットを用いた不整脈のモデルにおいて腎臓の交感神経の活動を記録しイミダゾリン受容体刺激による交感神経の抑制が上記不整脈に与える影響の評価を検討中である。
難治性心不全に対する自己骨髄幹細胞を用いたテーラーメイド再生治療法の開発

自己骨髄幹細胞を用いた心血管再生治療は難治性重症心不全患者に対する新しい有効な治療法として期待されている。しかし、心不全の発症原因としては、虚血、心筋症、あるいは双方に起因するなど様々なケースがあり、それぞれの患者の病態に応じたテーラーメイド再生治療が求められる。我々は骨髄幹細胞をex vivoで心筋細胞へ分化誘導させ、梗塞心筋へ移植後の心筋再生効果を調べた。マウスCD117陽性骨髄幹細胞を分離採集し、TGF-βを添加し培養したところ細胞の心筋構造蛋白(myosin, troponin)と転写因子(GATA4,NKx2.5)の発現が有意に上昇した。24時間TGF-βを添加し培養した細胞(2x10^5)をマウス梗塞心筋内に注入したところ、治療後の心機能(EF%)は培養しない骨髄幹細胞を移植した群に比べ、有意に良好であった(P<0.01)。また、治療後90日目に、TGF-βを添加し培養した骨髄幹細胞を移植した群のみ・梗塞心筋内に約30%の骨髄幹細胞がmyosin陽性であり、梗塞領域に心筋様組織が再生したことも組織学的に観察された。移植前のTGF-βの添加培養処置は骨髄幹細胞の心筋細胞への分化を誘導し、骨髄幹細胞移植による心筋再生の効果を一層高めると思われた。一方、骨髄幹細胞を用いる血管新生治療に関しては骨髄細胞の投与前低酸素培養刺激によって、血管新生が高まるか否かを調べた。ラットから骨髄細胞を採集し、単核球を分離した。低酸素培養刺激(2%酸素状態)によって、骨髄細胞のVEGFとVE-cadherinのmRNAは著明に増加した。また、24時間低酸素培養した骨髄細胞をラット下肢虚血筋肉内に注入したところ、治療後の虚血下肢の血流量は培養しない細胞を注入した群に比べ有意に高値であった。骨髄細胞に対する注入前の低酸素培養刺激は骨髄細胞の血管再生効果を高めることが可能であった。以上の結果から、異なる前処置(preprogramming)は骨髄幹細胞の心筋再生と血管再生効果をそれぞれ高めることが可能であった。難治性心不全に対する自己骨髄幹細胞を用いた心血管再生治療は移植細胞の異なる前処置により、患者の病態に応じたテーラーメイド再生治療が実現できると思われた。骨髄幹細胞を用いる心筋再生治療に関しては、マウス骨髄細胞から85%以上のpurityでCD117陽性骨髄幹細胞を分離採集することが可能であった。分離採集した骨髄幹細胞をTGF-betaを添加し、培養した。培養後13日目に細胞の心筋分化に特異的な転写因子(GATA4,NKx2.5)の発現が有意に上昇し、37日目には細胞の心筋構造蛋白(myosin,troponin)が免疫染色法とRT-PCR法により認められた。また、5ng/mlというTGF-betaの濃度は培養細胞の心筋分化に最も適しており、100ng/mlの高濃度TGF-betaは培養細胞から骨芽細胞へ分化を誘導することも確認した。今後はTGF-betaを添加培養(preprogramming)した骨髄幹細胞をマウス梗塞心筋内に注入し、治療後の心筋再生による心機能改善効果と安全性を調べる予定である。

一方、骨髄幹細胞を用いる血管新生治療に関しては骨髄細胞の投与前低酸素培養刺激(preprogramming)によって、血管新生が高まるか否かを調べた。ラットから骨髄細胞を採集し、単核球を分離した。低酸素培養刺激(1%酸素状態)によって、骨髄細胞のVEGFとVE-cadherinのmRNAは著明に増加した。また、24時間低酸素培養した骨髄細胞をラット下肢虚血筋肉内に注入したところ、治療後の虚血下肢の血流量は培養しない細胞を注入した群に比べ有意に高値であった。骨髄細胞に対する注入前の低酸素培養刺激(preprogramming)は血管新生誘導効果を一層高めると考えられた。今後は血管新生に至適な細胞分画を選別していく予定である。我々は骨髄幹細胞をex vivoで心筋細胞へ分化誘導させ、梗塞心筋へ移植後の心筋再生効果を調べた。マウスCD117陽性骨髄幹細胞を分離採集し、TGF-βを添加し培養したところ細胞の心筋構造蛋白(myosin, troponin)と転写因子(GATA4,NKx2.5)の発現が有意に上昇した。24時間TGF-βを添加し培養した細胞(2 x 10^5)をマウス梗塞心筋内に注入したところ、治療後の心機能(EF%)は培養しない骨髄幹細胞を移植した群に比べ、有意に良好であった(P<0.01)。また、治療後90日目に、TGF-βを添加し培養した骨髄幹細胞を移植した群のみ、梗塞心筋内に約30%の骨髄幹細胞がmyosin陽性であり、梗塞領域に心筋様組織が再生したことも組織学的に観察された。移植前のTGF-βの添加培養処置は骨髄幹細胞の心筋細胞への分化を誘導し、骨髄幹細胞移植による心筋再生の効果を一層高めると思われた。一方、骨髄幹細胞を用いる血管再生治療に関しては骨髄細胞の投与前低酸素培養などの刺激によって、血管再生効果が高まるか否かを調べた。低酸素培養刺激により骨髄細胞のVEGFとVE-cadherin mRNAは著明に増加した。移植前の低酸素培養刺激は骨髄細胞の血管再生効果を高めることが可能と思われた。以上の結果から、異なる前処置は骨髄幹細胞の心筋再生と血管再生効果をそれぞれ高めることが可能であった。難治性心不全に対する自己骨髄幹細胞を用いた心血管再生治療は移植細胞の異なる前処置により、患者の病態に応じたテーラーメイド再生治療が実現できると考えられる。
命題の素地を育てる図形指導II

本研究は,中学1年生の作図指導で演繹的な推論の素地を培う作図指導について,教材開発と授業づくりを行い,効果的な作図指導の在り方を検討することを目的とする。作図した一部の性質が図形を決定づける条件と自覚することは十分条件の種となり,命題の素地をつくるうえでやがて芽を出すという考えに基づき,図形を決定づける条件として作図の性質を自覚させることを視点として単元を構成し,授業を実践した。作図の単元の中には,図形の中に論理を見つける活動を豊かにできる教材として,導入段階で与えられた1つの角を内角にもつ二等辺三角形を作図する課題を設定した。また,授業実践では目的とする図形を決定づける条件として「図形の性質」を自覚させるために,「動的」にとらえさせ,目的とする図形をつくるために必要な条件が見えやすくなることを期待し, Geometric Constructorという作図ツール(以下GCと略す)を活用した。その結果として,筆者が従来の授業で同様の課題を実践した際とは異なる生徒の反応を得ることができた。従来では10%程度の生徒しか目的とする図を完成させることができなかったが,本実践では目的とする図形を作図できた生徒が50%程度に増加した。本研究では中学1年生「作図」の単元において,性質を決定条件として自覚させるよう単元を構成し,その中でGCの活用を行った。その成果, GCにより動的に見せることによって,生徒が作図の決定条件を発見することへの効果が期待できるという示唆をえることができた。今後も,命題の認識へとつなげることに効果的な作図指導と論証指導の在り方について実践研究を行い検証することを課題としたい。
個別要素法を応用したアスファルト混合物の粘弾性挙動のシミュレーションに関する研究

本研究は,粒状体の解析に考案された個別要素法を拡張し,アスファルト混合物の変形解析に適用しようとするものである。最初の取り組みとして,アスファルト混合物と粒状体との差異を整理し,新たに考え入れなければならない特性と数値解析の際の解の安定性を考慮して,粒子相互の法線方向の力学モデルを選定した。アスファルト混合物の最大の特徴である粘弾性的挙動,すなわち応力緩和とクリープ現象が表現可能で,基本的には流体である3要素流体モデル(Voigtモデルとダッシュポット要素を直列に繋いだもの)が最も適した粒子モデルであることを導いた。そして,通常の粒状体と最も異なる点である引張力に対する抵抗性と,圧縮と引張とで作用力が同じでないことも考慮して解析プログラムを作成した。ここで構築した解析モデルの妥当性を評価するために圧縮および引張試験のシミュレーションを行い、実物の試験結果と比較検討した。さらに,局所的な変形挙動がシミュレートできているかどうかをアルミ棒をストレートアスファルトで固めた単純化供試体を用いて評価した。その結果,載荷開始から破壊に至るまでの比較的大きな変形過程の応力-ひずみ関係をトレースすることができ,局所的な変形も実際の試験とほぼ同様に表現することができた。個別要素法では,粒子モデルを構成する個々の力学要素(バネとダシュポット)の物理定数をどのような考えに基づいて決定するかが問題となる。本研究では,要素の物理定数をパラメトリックに変化させた広範囲のシミュレーションを実施し,各要素の抗力と粒子集合体の挙動との関係を検討した。パラメトリック解析により,集合体の挙動は主にバネ係数と付加ダッシュポットの粘性係数および圧縮と引張の強度比によって決まることになり,Voigtモデルのバネ係数と粘性係数は解の安定性に大きく影響することが明らかとなった。特にVoigtモデル部分のバネ係数と粘性係数の組み合わせは重要である。本研究では,時間的な制約からtime history的な検討,すなわちシミュレーションにおける経過時間と実物の挙動における時間経過の対応づけが十分に検討できなかった。シミュレーションの際の間分割Δtも含めて今後の課題である。
圧力変化によるタンパク質の立体構造変化と酵素活性の圧力依存性の相関

平成18年度は、(1)高圧力下その場X線結晶構造解析装置内での適切な大きさの結晶の育成、および100MPaまでの結晶構造解析と、(2)高圧力下結晶ステップ前進速度の温度依存性の測定を行うことを目的としていた。目的(1)に関しては、高圧力下核生成の結晶構造解析を行うのに必要不可欠な、ガラスキャピラリー中での結晶化および溶液存在下での構造解析を行った。その結果、溶液存在中でも問題なく構造解析できることがわかった。また、高圧力(100MPa)下核生成および結晶化を行った結晶を常圧下で構造解析した結果、常圧下で結晶化したものと比較すると、(a)主鎖部分はほとんど変化がなかったが、(b)側鎖の部分には多少の変化があった。また、興味深いことに、(c)観測にかかる水分子の数は高圧力下の方が多いということと、(d)格子定数は高圧力下で結晶化した結晶のほうが大きいという結果が得られた。以上は、以前の研究(Suzuki, et al. J. Phys. Chem. B 109,3222-3226,2005)で推測した、高圧力下での水和数の増加を支持する結果となり興味深い。現在、高圧力下でのその場測定に向けて準備が進んでいる。目的(2)に関しては、昨年度の実験で使用していた高圧容器の取り扱いにくさを解消するべく、光学窓が二つあるタイプを購入して実験を行った。ところが、実験操作自体はかなり改善されたものの、実際に溶液を完全に入れ替える作業が予想以上に難しいことがわかった。特にタンパク質溶液の総量が非常に少ないため、交換時に気泡が入ったり、圧力漏れがあったりということで、簡単に失敗してしまうことがわかった。様々な試行の結果、観察側のサファイヤ窓にガラス管を接着した、「半内部セル方式」とでもいう方式で溶液の交換が容易にかつ正確に行えるようになった。平成16年度は、各実験装置の立ち上げと、ニワトリ卵白リゾチーム斜方晶系(o-HEWL)結晶・グルコースイソメラーゼ(GI)結晶・α-キモトリプシン(α-CHT)結晶を用いて100MPaまでの溶解度測定と、核生成頻度・結晶成長速度に及ぼす圧力効果を明らかにする予定であった。しかし、ニワトリ卵白リゾチーム単斜晶系(m-HEWL)結晶の結晶成長速度が高圧力下で速度論的に促進されるという現象が明らかになり、o-HEWL結晶とα-CHT結晶の替わりに急遽このm-HEWL結晶の研究を行うことに計画変更した。m-HEWL結晶とGI結晶について、まずは結晶成長速度に及ぼす圧力効果に関する実験を行った。その結果、m-HEWL結晶とGI結晶の双方とも、圧力印加によって速度論的に結晶成長速度が増加することが明らかになった。特にGI結晶の結果は世界で初めて圧力が結晶の成長を速度論的に促進したことを示したものである(J.Phys.Chem.B 109)。更に二次元核成長の多核成長モデルで解析した結果、GI結晶についてはステップレッジ表面自由エネルギーの減少が加圧に伴う結晶化の促進の原因であることが明らかになった。また、m-HEWL結晶では、それに加えて、ステップ上のキンク間距離の減少もしくは結晶化の各素過程における活性化エネルギーの減少の可能性もあるということが明らかになった(Cell.Mol.Biol.50)。核生成頻度に関しては、GI結晶についてのみ実験を行ったが、加圧によりやはり速度論的に核生成頻度が促進されることが明らかになった。この結果については現在投稿準備中である。核生成頻度が速度論的にも促進されるということは、高圧力下X線結晶解析用のキャピラリー中での結晶化も容易に出来ることを意味している。平成17年度以降は実際に高圧力下での結晶構造解析を実施していく予定である。平成17年度は、(1)高圧力下その場X線結晶構造解析に必要な最適結晶化条件の探索と、それをもとにした定常的な構造解析の実現と、(2)高圧力下における結晶表面ステップの成長速度の研究を目的としていた。それぞれの目的に対して本年度の進捗状況を以下にまとめる。まず、目的(1)について。本研究においては、高圧力下で核生成した結晶を構造解析し、位相問題については分子置換法を用いて解決する予定である。しかし、分子構造の変化が小さい場合に、分子置換法だけでは信頼性が低くなる点をクリアする必要があるとの指摘を受けた。そこで、今年度は高圧力下で重原子置換を行うための、重原子との共結晶化の予備実験としてglucose isomeraseとK_2PtCl_4の共結晶化を試みた。その結果、現在までに常圧、7°C、K_2PtCl_4 0.1mMの条件で結晶化に成功している。目的(2)については、glucose isomeraseの{101}面上における結晶表面ステップの高圧力下におけるその場観察に世界で初めて成功した。また、速度論的な解析を行うため、溶液濃度に対するステップ前進速度の温度変化から溶解度測定も行い、結晶成長速度で求める方法よりも更に高精度で溶解度の圧力依存性を測定することが出来た。また、それを元に、速度論的な解析を行った結果、やはり加圧による速度論的な成長の促進があることが明らかになった。今年度に出版済みの論文はないが、上記目的(2)の溶解度の測定に関する内容で、International Journal of Modern Physics Bに投稿した論文は現在印刷中である。

また、高圧力下におけるステップ前進速度の測定結果については、高圧力下の生物科学(さんえい出版)に分担著書として投稿済みであり、夏には出版予定である。また、速度論的な解析結果については現在欧文誌に原著論文を執筆中である。平成18年度は、(1)高圧力下その場X線結晶構造解析装置内での適切な大きさの結晶の育成、および100MPaまでの結晶構造解析と、(2)高圧力下結晶ステップ前進速度の温度依存性の測定を行うことを目的としていた。目的(1)に関しては、高圧力下核生成の結晶構造解析を行うのに必要不可欠な、ガラスキャピラリー中での結晶化および溶液存在下での構造解析を行った。その結果、溶液存在中でも問題なく構造解析できることがわかった。また、高圧力(100MPa)下核生成および結晶化を行った結晶を常圧下で構造解析した結果、常圧下で結晶化したものと比較すると、(a)主鎖部分はほとんど変化がなかったが、(b)側鎖の部分には多少の変化があった。また、興味深いことに、(c)観測にかかる水分子の数は高圧力下の方が多いということと、(d)格子定数は高圧力下で結晶化した結晶のほうが大きいという結果が得られた。以上は、以前の研究(Suzuki, et al. J. Phys. Chem. B 109,3222-3226,2005)で推測した、高圧力下での水和数の増加を支持する結果となり興味深い。現在、高圧力下でのその場測定に向けて準備が進んでいる。目的(2)に関しては、昨年度の実験で使用していた高圧容器の取り扱いにくさを解消するべく、光学窓が二つあるタイプを購入して実験を行った。ところが、実験操作自体はかなり改善されたものの、実際に溶液を完全に入れ替える作業が予想以上に難しいことがわかった。特にタンパク質溶液の総量が非常に少ないため、交換時に気泡が入ったり、圧力漏れがあったりということで、簡単に失敗してしまうことがわかった。様々な試行の結果、観察側のサファイヤ窓にガラス管を接着した、「半内部セル方式」とでもいう方式で溶液の交換が容易にかつ正確に行えるようになった。
NK細胞活性化制御機構の解明

本研究はNK細胞の活性化に関わる分子を明らかにする目的で、転写因子NFATを活性化する分子の探索を行った。方法として、NFAT-GFPレポーター遺伝子を導入した指示細胞株に、CD8とのキメラ分子として発現するように設計したレトロウィルスcDNAライブラリーを導入し、該細胞を抗CD8抗体で刺激した際にレポーター(GFP)を発現する細胞クロンをセルソーターによつて単離する手法(NFAT-activator cloning system)を新たに開発し、これを用いた。脾臓細胞のcDNAライブラリーを導入した指示細胞のうち刺激後GFP陽性となる細胞を、3-4回ソーティングを繰り返し、最終的に限界希釈法によってクロンを得た。それそれの細胞に導入されているcDNAを解析すると、既存のNFAT活性化分子以外に数種の新規分子が同定された。この一連の分子をNFAT activating Molecule(NFAM)と命名し、その機能の解析を開始した。まず、最初の分子NFAM1は、その全長cDNAを単離、配列を決定したところ細胞表面に発現される分子としての特徴を備えていた。さらに、細胞内部位にITAM様の配列YxxLx(7-8)YxxMが認められた。本ITAM様配列が、NFAT活性化に関与しているか否かを明らかにするため、ITAM様部位のチロシン(Y)をフェニルアラニンに置換し、T細胞ハイブリドーマに導入したところ、野生型NFAM-1とは対照的に、活性化シグナルを伝えなくなることから、確かにこのITAM様配列がNFAM1のシグナル伝達に必須の領域であることが判明した。本分子のNK細胞活性化における機能に関しては現在検討中である。その他の分子NFAM-2および-3についても現在全長cDNAを単離しつつあり、引き続いて解析を行う予定である。NKT細胞やNK細胞は、腫瘍細胞等に対して細胞傷害性を持っており抗腫瘍免疫応答等において重要な機能を担っていると考えられる。しかし、それらの細胞がどのようにして腫瘍細胞等を認識して活性化されるかは明らかでない。そこで、NK細胞の活性化機構について研究した。1.NK細胞はTCRのシグナル伝達分子であるCD3ζ鎖を発生しているが、その機能は明らかではない。CD3ζ欠損マウスによりNK細胞を採取し、解析するとFcγRIIIの発現および機能が正常マウスと比べて顕著に高いことが明らかになった。そこで、正常マウスとCD3ζ鎖欠損マウスのNK細胞におけるFcγRIIIの細胞表面でのturnoverを解析すると、CD3ζ鎖欠損マウスのNK細胞では低下していることを明らかにした。これらのことから、CD3ζ鎖はNK細胞においてFcγRIIIの細胞表面でのturnoverを制御することによってNK細胞の活性化を制御していると考えられた。2.NK細胞やNKT細胞の生体内における機能を明らかにするために、NK細胞欠損マウスの作成を試みた。遺伝子工学的手法を用いて、NK細胞に特異的な細胞表面マーカーであるNK1.1分子の遺伝子をdiphthelia toxin遺伝子と置き換え、NK細胞ではtoxin遺伝子が発現するマウスを作成した。これらのマウスにおいては、NK細胞は欠落し、NK活性も低下していた。これらのことから、diphthelia toxin遺伝子を用いたこの方法は特定の細胞の機能を明らかにする上で非常に有用であることが判明した。方法として、NFAT-GFPレポーター遺伝子を導入した指示細胞株に、CD8とのキメラ分子として発現するように設計したレトロウィルスcDNAライブラリーを導入し、該細胞を抗CD8抗体で刺激した際にレポーター(GFP)を発現する細胞クロンをセルソーターによって単離する手法(NFAT-activator cloning system)を新たに開発し、これを用いた。

脾臓細胞のcDNAライブラリーを導入した指示細胞のうち刺激後GFP陽性となる細胞を、3-4回ソーティングを繰り返し、最終的に限界希釈法によってクロンを得た。それぞれの細胞に導入されているcDNAを解析すると、既存のNFAT活性化分子以外に数種の新規分子が同定された。この一連の分子をNFAT activating Molecule(NFAM)と命名し、その機能の解析を開始した。まず、最初の分子NFAM1は、その全長cDNAを単離、配列を決定したところ細胞表面に発現される分子としての特徴を備えていた。さらに、細胞内部位にITAM様の配列YxxLx(7-8)YxxMが認められた。本ITAM様配列が、NFAT活性化に関与しているか否かを明らかにするため、ITAM様部位のチロシン(Y)をフェニルアラニンに置換し、T細胞ハイブリドーマに導入したところ、野生型NFAM-1とは対照的に、活性化シグナルを伝えなくなることから、確かにこのITAM様配列がNFAM1のシグナル伝達に必須の領域であることが判明した。