hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化ストレスを基盤としたメタボリック症候群による乳癌発症機序の解明

本研究課題におけるテーマは、メタボリック症候群などの生活習慣病の病因と、がん発症の病因に機構に共通の基盤があることを仮定し、その機序を明らかにすることである。当初計画では慶應義塾大学病院外来の患者さんの検体を使用予定としていたが、研究代表者の転勤により研究に割けるエフォートが限定的になる等研究環境の変化がある一方、ゲノム解析の費用の減少によるより粒度の高い解析の可能性が出てくるなど、この3年間で状況が変わったため、計画を変更し、よりよい成果を目指してきた。当初の研究テーマの成果を出し、さらに発展的な研究につなげるために、今回、より精緻なゲノム解析と臨床データ解析実現のために、生化学データや既往歴など臨床情報が網羅されており、且つゲノムデータ解析の体制が確立しているKawasaki Wellbeing Cohortの検体を用いた。その264検体について、Illumina社Infinium Asian Screening Arrayを用いた網羅的SNP解析を行い、慢性炎症が増悪因子である生活習慣病により影響を受ける慢性腎機能障害(CKD)のマーカとしてe-GFRを用いてQTL解析をしたところ、CA10(carbonic anhydrase 10)のイントロンにあるrs117326847が見いだされた。また既往歴、家族歴から悪性疾患の有無を調べ、共通の病因としての慢性炎症の遺伝的背景と、また採血時点の慢性炎症の状態を血液検体の生化学データおよびメタボローム解析の結果から抽出し、CKDと悪性疾患発症における慢性炎症の関与について検討した。平成27年度より研究計画に従い研究を開始する予定であったが、研究代表者が日本医療研究開発機構に異動になったため、拙速な研究開始により研究の質が担保できなくなる可能性を鑑み、当初の研究計画にあるH27年度の症例収集の実施はH28年度に実施する予定とし、H27年度は、その後に収集予定のゲノム情報や生化学情報を含めた解析を考慮し症例収集にあたり採取する予定の各データ項目を再検討した。平成27年度より研究計画に従い研究を開始する予定であったが、研究代表者が日本医療研究開発機構に異動になり、予定されていたエフォートでの研究実施が危惧され、拙速な研究開始により研究の質が担保できなくなる可能性を鑑み、研究実施を繰り延べることとした。本研究では、メタボリック症候群において亢進している酸化ストレスや慢性炎症が、がんの発症に関与しているかどうかを、遺伝子解析と細胞機能解析の両者を行い、それらを統一して解析することで明らかにすることを目的としている。具体的には、乳がん症例からの採血によりBリンパ球を単離して不死化細胞株化し、PCR-RFLP法により酸化ストレス関連遺伝子の遺伝多型解析と、ROS(活性酸素種)の産生能や消去能といった細胞機能を解析し、遺伝型と細胞機能を比較することでより高精度で癌の発症に係る遺伝子とその遺伝多型を同定する予定であった。しかしながら研究の計画を立案した当時と比べて、次世代シークエンサーによるエクソーム解析など網羅的な遺伝子解析が容易にかつ安価に実施できるようになってきたため、また研究開始1年目に予期せぬ遅れが生じたため、2年目の平成28年度は、より少ない症例数で効果的な結果を見出すための方策を検討することに注力した。本研究では、メタボリック症候群によって亢進する酸化ストレスや慢性炎症が、乳がんの発症に関与しているか否かを検討することを目的とする。研究代表者が計画当初のエフォートを投入することが出来なかったため、より効率的な研究遂行と有意義な結果を導出するための方策を検討してきたところ、H29年度は学内におけるゲノムを含む臨床データをいかに細胞機能の解析に活用するかについてバイオインフォマティクスの観点を含めin silicoでの検討の可能性を検討した。研究代表者の異動により計画当初のエフォートを用いることが出来なかったため、より効率的な研究遂行と有意義な結果を導出するための方策を検討してきたところ、H29年度は学内におけるゲノムを含む臨床データをいかに細胞機能の解析に活用するかについてバイオインフォマティクスの観点を含めin silicoでの検討を先行させた。

今後は計画に従って、研究の質を担保しつつ、拙速になることなく研究を実施していく予定であり、そのために研究協力者を増加させる予定である。また遺伝的解析として当初の計画としてPCR-RFLP法によるSNP解析を予定しているが、次世代シークエンサーによるゲノム解析の費用は劇的に低下しており、計画を変更することにより、より大量で網羅的な遺伝的データをより少ないコストで得られる可能性があり、この部分の計画変更を検討している。各症例から単離したBリンパ球の不死化細胞株の作成は継続し、遺伝多型の解析については次世代シークエンサーを用いた解析とし、バイオサイエンスデータベースセンター(NBDC)や東北メディカル・メガバンク計画で公開されている情報を利用する計画を策定する。H30年度はH29年度に検討したより効率的な解析方法を用いて本研究目的に向けた研究を遂行予定である。新たな症例収集から最終的な解析までを1年間で終了させることは困難であることから、まず症例については、すでに外来を受診し、臨床データの臨床研究への使用に同意している乳がん症例の中から組み入れ基準に該当する症例を選択する。臨床データ、検査データは既存のデータを可及的に収集するものとする。細胞機能について、Bリンパ球の不死化細胞株を樹立してそれを用いた解析を予定していたが、不死化細胞株樹立には時間を要するため、先にすでにあるゲノム検体を用いて、遺伝解析を行い、遺伝子変異が細胞機能と関連していることがより明らかと思われる分子について、遺伝子発現解析やROSの産生能等の細胞機能を解析する。前述の通り、平成27年度に不十分なエフォートによる拙速な研究実施を避け、再度研究計画を丹念に再検討したため、実施のための予算は平成28年度に繰り延べた。当初計画通りのBリンパ球の単離と不死化細胞株の樹立と遺伝多型の解析の両方を実施するには時間的および人的資源が限定的であることから、困難であることが予想されたため、遺伝解析方法については研究実績の概要および今後の研究推進方策に記載に、有意義な結果を導き出せるようにするための研究体制の構築を含む堅牢な研究計画を策定していたため、予定していた使用額は来年度に繰越すことと致しました。研究代表者の異動により計画当初のエフォートを用いることが出来なかったため、より効率的な研究遂行と有意義な結果を導出するための方策を検討してきたところ、H29年度は学内におけるゲノムを含む臨床データをいかに細胞機能の解析に活用するかについてバイオインフォマティクスの観点を含めin silicoでの検討を先行させた。H30年度は研究を完結できるように、ゲノム解析及び、細胞機能解析の検体数を絞りながら研究を遂行する。今後の研究の推進方策に記載したように、まず既存の臨床データを可及的に収集し、既存のDNA検体を用いてゲノム解析を行う。細胞機能測定、遺伝子発現には試薬類、実験器具等の消耗品として1,303千円を予定し、残りは主にゲノム解析に使用予定とするが、近年ジェノタイピングシークエンシングなどより安価にジェノタイピングを可能とする手法も考慮し、なるべく多くの症例を解析できる方法を用いることとする。
放射光真空紫外円二色性による生体分子の構造解析

広島大学放射光科学研究センターの真空紫外円二色性(VUVCD)分散計を用い,多糖類や変性タンパク質のVUVCDスペクトルを測定し、VUVCD分光法の生体分子構造解析への有用性を検討した。硫酸基やカルボキシル基を持つ6種類の多糖類(コンドロイチン・コンドロイチン硫酸(A, B, C)・ヒアルロン酸・ヘパリン)のVUVCDスペクトルを160nmまで行い、これら発色団の位置や配向に依存した特徴的なCDを得ることができた。また、分光学的解析法からCDと多糖類の立体構造との関係を明らかにすると共に、単糖類と同様に多糖類においてもC-5位のヒドロキシメチル基の平衡状態(トランス・ゴーシュ)の変化が、CDに大きく寄与していることが分かった。3種類のタンパク質(Metmyoglobin・thioredoxin・staphylococcal nuclease)の酸・熱・低温変性状態のVUVCDスペクトルを172nmまで測定し、塩酸グアニジン変性状態との比較からこれら変性状態においても多くの二次構造が保持されていることが分かった。31種類の天然タンパク質のVUVCDスペクトルを参照データとし、プログラムSELCON3で二次構造解析をした結果、天然状態に比べHelixは減少、Strand・PPII・Unorderedは増加することが確認された。また、これらの変性状態には、水素結合を持たないStrand構造が多く存在していることが明らかとなった。以上の結果から、VUVCD分光法が、生体分子の構造解析に対して有効であることが示された。
高純度かつ高耐性な単一光子発生源の探求

本研究は、量子暗号鍵配送技術に基づく量子情報通信を、実験室段階から実際の通信網への応用へと昇華・発展させることを目的としている。その目的遂行の為に、既存の光ファイバー通信網への接続効率が高く、かつ振動や温度変化など外乱に対し強固で恒久的利用が可能な単一光子発生源の開発を行なっている。外乱に対し強固で恒久的利用が可能な単一光子源として、半導体量子ドット成長膜をナノピラーアレイ状に微細加工し、ファイバー端面に直接接続する構造を提案した。当該年度では単一光子源からの光子取り出し効率の向上を目的とし、半導体ピラー構造を金属内に転写した金属埋め込み型光源の作製を行なった。半導体ピラー構造を金属内に転写するために、ピラー構造上への金属成膜後a)裏面より基板研磨、もしくはb)犠牲層(Alリッチ層)より基板を剥離し、ピラー下部の基板部分を取り除くといった手法が一般に用いられている。a)基板研磨は試料の膜構造に依存せず対応可能ではあるが、傾斜なく広い面積で一様な研磨面を得る事は難しく歩留まりが悪い。これに対しb)犠牲層を用いる手法は、広い面積で金属転写が可能ではあるが、元々の試料の膜構造として犠牲層が付加されている場合にのみ適用可能である。本研究では、元々犠牲層が付加されていない試料を用いナノピラーアレイ構造を作製し、そのピラーアレイ構造に50nm程度のAl層を犠牲層として蒸着する。更にその上からAgを数μm成膜し塩酸でAl部分のみ選択的に溶解し下部基板部分を切断することで、擬似的に犠牲層による金属埋め込みが実現された。またこれまでは作製したピラーアレイを単独のファイバーへ接続していたが、当該年度では12連装のファイバーアレイに接続し、単一光子生成の多チャンネル化に取り組んだ。また外部歪みにより発光波長のチューニングが可能な単一光子光源の開発にも取り組んだ。半導体量子ドット試料における微細構造の最適化により、高純度で長期間安定な単一光子発生源を製造した。使用した量子ドット成長膜は犠牲層(Alリッチ層)を持たない膜構造であるが、ナノピラーアレイ構造作製後のAg埋め込み層成膜時にAl層を50nm程度挿入した2層構造を作製することにより、擬似的に犠牲層を挿入した。この擬犠牲層であるAl層を塩酸で選択的に溶解し下部基板部分を切断することで、半導体ピラーの金属層(Ag)への転写が可能となった。作製した金属埋め込み型単一光子発生源の性能評価は未だ十分にはなされていないが、元々犠牲層を有しない試料に対し擬似的に犠牲層を挿入し金属転写を可能にした意義は大きい。十分な光学評価は来年度に行なうとして、本年度は本構造の作製に成功したことによって、「おおむね順調に進展している」と判断する。本来の研究計画に加え、次の2点も行なった。(a)横長のピラーアレイ光源を作製し、12連装光ファイバーアレイに接続した。これにより単一光子発生源の多チャンネル化を可能とした。(b)外部歪みによる発光波長のチューニングが可能な単一光子発生源の作製を行なった。これら(a)(b)により、本構造の応用範囲が更に広まったと言える。当該年度において、犠牲層を持たない半導体量子ドット成長膜においても擬似的に犠牲層を挿入し金属転写が可能となる作製方法を開発した。今後は本方法による試料作製過程の最適化を行ない、得られた試料に対する光学測定を詳細に行なう。今後は主に冷凍機結合型の単一光子発生源の開発を行なう。冷凍機結合型光源の実現により、永続的な単一光子生成が現実のものとなる。また当初の研究計画には含まれていないが、今年度は(a)12連装ファイバーアレイへ接続可能な単一光子源の作製による単一光子発生源の多チャンネル化と、(b)外部歪みによる発光波長のチューニングが可能な単一光子発生源の開発を行なった。これら2点についても、今後更に研究開発を推し進める予定である。情報化社会の持続的発展において、情報通信の安全性の確保は必須課題である。現在の暗号通信方式は解読に要する膨大な計算コストにより安全性が担保されるのに対し、量子暗号通信は量子力学的な現象である観測による波束の収縮を用いるので、原理的にありとあらゆる盗聴が検知可能である。そのため情報通信の恒久的な安全性を保証するものとして、量子暗号鍵配送技術の確立に大きな期待が寄せられている。本研究は量子暗号鍵配送技術に基づく量子情報通信を、実験室段階から実際の通信網への応用へと昇華・発展させることを目指し、その目的遂行のため、既存の光ファイバー通信網への接続効率が高く、かつ振動や温度変化など外乱に対し強固で恒久的利用が可能な単一光子発生源の開発を行なう。単一光子発生源としては、既存の半導体技術との親和性が高く現実的なデバイス作製を検討する上で有利である半導体量子ドット(QD)成長膜を用いる。一般に分子線エピタキシー(MBE)法により成長されたQDは1e+81e+10個/cm2の数密度を持つが、単一光子発生源として用いるためには、巨視的数のQDより選別されたごく少数のQDに個別にアクセスできなければならない。計測で用いる単一モードファイバーは数マイクロメートルのコア径を持つが、母体QD試料を加工せずファイバーコアにそのまま結合すると、結合するQDの数が数百個に及ぶため単一光子としての純度を維持することが困難になる。

そこで、QD成長半導体膜に微細加工を施しピラーアレイ化することで、擬似的にQD数密度を減少させる手法をとる。H29年度はピラーサイズおよびピラー間隔といった形状最適化を行ない、本研究の第一関門である「光子の単一化」を十分な純度および十分な安定性をもって実現することに成功した。本研究では高純度かつ高耐性な単一光子発生源を実現するために、半導体量子ドット試料に対する1微細構造の最適化(単一光子としての高純度化)、2金属埋め込み構造の作製(光子取り出し効率の向上)、3冷凍機結合型光源の開発(長期間連続運転が可能な光源の開発)を主に行なう。このうちH29年度の主要課題は1微細構造の最適化である。単一光子発生源は半導体量子ドット試料をピラーアレイ(円柱格子)構造に成形することで実現されるが、ピラーサイズ・格子定数といった形状最適化を行なうことにより高純度な単一光子生成が可能となった。作製された光子発生源において、光子の自己相関測定を行なうことにより光子の単一性を検証し、更には数日間に及ぶ連続実験により単一光子発光源としての長期安定性を確認するに至った。本研究は、量子暗号鍵配送技術に基づく量子情報通信を、実験室段階から実際の通信網への応用へと昇華・発展させることを目的としている。その目的遂行の為に、既存の光ファイバー通信網への接続効率が高く、かつ振動や温度変化など外乱に対し強固で恒久的利用が可能な単一光子発生源の開発を行なっている。外乱に対し強固で恒久的利用が可能な単一光子源として、半導体量子ドット成長膜をナノピラーアレイ状に微細加工し、ファイバー端面に直接接続する構造を提案した。当該年度では単一光子源からの光子取り出し効率の向上を目的とし、半導体ピラー構造を金属内に転写した金属埋め込み型光源の作製を行なった。半導体ピラー構造を金属内に転写するために、ピラー構造上への金属成膜後a)裏面より基板研磨、もしくはb)犠牲層(Alリッチ層)より基板を剥離し、ピラー下部の基板部分を取り除くといった手法が一般に用いられている。a)基板研磨は試料の膜構造に依存せず対応可能ではあるが、傾斜なく広い面積で一様な研磨面を得る事は難しく歩留まりが悪い。これに対しb)犠牲層を用いる手法は、広い面積で金属転写が可能ではあるが、元々の試料の膜構造として犠牲層が付加されている場合にのみ適用可能である。本研究では、元々犠牲層が付加されていない試料を用いナノピラーアレイ構造を作製し、そのピラーアレイ構造に50nm程度のAl層を犠牲層として蒸着する。更にその上からAgを数μm成膜し塩酸でAl部分のみ選択的に溶解し下部基板部分を切断することで、擬似的に犠牲層による金属埋め込みが実現された。またこれまでは作製したピラーアレイを単独のファイバーへ接続していたが、当該年度では12連装のファイバーアレイに接続し、単一光子生成の多チャンネル化に取り組んだ。また外部歪みにより発光波長のチューニングが可能な単一光子光源の開発にも取り組んだ。半導体量子ドット試料における微細構造の最適化により、高純度で長期間安定な単一光子発生源を製造した。使用した量子ドット成長膜は犠牲層(Alリッチ層)を持たない膜構造であるが、ナノピラーアレイ構造作製後のAg埋め込み層成膜時にAl層を50nm程度挿入した2層構造を作製することにより、擬似的に犠牲層を挿入した。
早産発生過程における前方視的サイトカインネットワークの動態と早産予知の検討

前方視的検討として妊娠22週から妊娠24週の妊婦健診受診例と頚管短縮及び既往妊娠で頚管無力症が疑われた症例で、妊婦からインフォームドコンセントを得たうえで、膣分泌液及び頚管粘液中の炎症性サイトカインとその受容体を測定し、早産発生過程におけるサイトカインネットワーク動態と発症予知について検討した。結果:1)測定妊婦数は2462例であったが、母児合併症、分娩週数追跡不能例を除く対象妊娠例は1705例であった。2)妊娠34週までの早産発症予知に関して統計学的に、IL1β,IL8,TNFα,IL10,GM-CSFの関与は少ないと考えられた。ただし、IL1receptor antagonist, TNR可溶性受容体I及びIIの消去系に有効性があったことからネットワーク全体としては活性化されている可能性が強い。3)膣分泌物と頚管粘液を比較すると発症予知には頚管粘液の方が統計学的に有意で適していた。4)発症予知に有効であった頚管粘液中の各オッズ比はIL1receptor antagonist (Odds:1.95;95%C.I.1.19-3.20;p<0.012)IL6(Odds:2.24;95%C.I.1.19-4.19;p<0.022),TNR可溶性受容体I(Odds:1.96;95%C.I.1.11-3.45;p<0.03)及びII(Odds:2.06;95%C.I.1.25-3.41;p<0.008)であった。統計学的に有効性があったとは言え、検査費が高額なことから全例の妊婦にスクリーニングとして行うことはコスト・ベネフィットの面から疑問が残る。一方頚管短縮例や早産リスクが高い妊婦においては、治療開始前からサイトカイン高値例が多く治療開始後も持続的高値例では予後不良であることから測定患者を選択して検査すればより有効性が実証されると思われる。前方視的検討として妊娠22から24週の妊婦健診受信例と予防的頸管縫縮例23例と頸管縫縮術無効の切迫早産2例の頸管縫縮術前と術後1日から5日までの期間計6回、患者からインフォームドコンセントを得たうえで、頸管内にダクロン綿棒を挿入20秒間静置した後、アルブミン加燐酸緩衝液中に抽出し-80°Cに保存し測定に供した。IL1β、TNFα、IL6、IL8の各サイトカインは、BIOSOURCE社製ELISA測定キットを使用した。結果:正常妊娠例と予防的頸管縫縮術23例術前の頸管粘膜中サイトカイン濃度はそれぞれIL1β(17.0±5.0vs38.2±15.3pg/ml,Mean±SE)、TNFα(8.8±2.8vs2.0±2.0)、IL6(36.1±6.7vs185.8±80.7)、IL8(3654.2±292.2vs2704.6±458.6)で有意差はなかった。術前と術後24時間後から5日間の頸管粘液中

サイトカイン濃度は、術前に比べ術後はサイトカインとも濃度上昇を認めるが、IL6以外は有意な上昇ではなかった(IL6:509.6±106.2,309.1±82.1,222.9±51.2,147.7±41.2,160.5±55.6)。さらにすべてのサイトカインともに術後72時間後には術前値レベルを示した。これに対し無効例のうち1例は、術前より1.1(IL1β),0.36(TNFα),1.8(IL6),42.8(IL8)ng/mlと高値を示し、他1例は術後72時間後も0.8(IL1β),0.08(TNFα),0.4(IL6),24.1(IL8)ng/mlと高値が持続し術前からの感染の存在が疑われた。以上、本年度の結果から、サイトカイン高値例や持続高値例では早産リスクが高く対策が必要と思われる。妊娠2224週において頚管粘液中のサイトカイン測定を行った妊婦は3720例のうち、妊娠30週未満に早産となった例の頚管粘液中サイトカイン濃度は、IL1β:168.6±45.1TNFα:55.8±24.1、IL6:201.1±104.3、IL8:27743.2±6964.9(pg/ml)で、満期産群のIL1β:15.4±5.4、TNF:120±4.1、IL6:38.2±8.5、IL8:8970.4±846.1(pg/ml)に比較して有意に高値をしめした。ただし、IL1β、TNFα濃度の多くは測定感度以下を示すものが多く、早産予測にはIL6、1L8測定が有効と考えられた。これに対しIL10、GM-CSF、TNFsRI、TNFsRII、IL1R antagonistに優位な差はなかった。この中でIL10、GM-CSF濃度は多くが測定感度以下で測定の意義は少ないと思われる。またTNFsRI、TNFsRII、IL1R antagonist濃度は頚管粘液中に高濃度存在しており、この事がIL1β、TNFα濃度の多くが測定感度以下を示すものが多く存在した理由とも考えられる。今後は、IL6、IL8濃度上昇例を継続的に測定し、このIL1β受容体拮抗、TNFα受容体濃度との比較検討を行うと共に、膣内にクロマイ膣錠を投与し、抗細菌治療を行う事で早産を抑制可能かを検討する。前方視的検討として妊娠22週から妊娠24週の妊婦健診受診例と頚管短縮及び既往妊娠で頚管無力症が疑われた症例で、妊婦からインフォームドコンセントを得たうえで、膣分泌液及び頚管粘液中の炎症性サイトカインとその受容体を測定し、早産発生過程におけるサイトカインネットワーク動態と発症予知について検討した。結果:1)測定妊婦数は2462例であったが、母児合併症、分娩週数追跡不能例を除く対象妊娠例は1705例であった。2)妊娠34週までの早産発症予知で統計学的に、IL1β,IL8,TNFα,IL10,GM-CSFに有意な結果は認められなかった。ただし、IL1 receptor antagonist, TNF可溶性受容体及びII消去系に有効性があったことからネットワーク全体としては活性化されている可能性が強い。3)膣分泌物と頚管粘液を比較すると発症予知には頚管粘液の方が統計学的に有意で適していた。4)発症予知に有効であった頚管粘液中の各オッズ比はIL1 receptor antagonist(Odds:1.95;95%C.I,1.19-320;p<0.012)IL6(Odds:224;95%C.I.1.19-4.19;p<0.022>TNR可溶性受容体I(Odds:1.96;95%C.I.1.11-3.45;p<0.03)及びII(Odds:2.06;95%C.I.1.25-3.41;p<0.008)であった。結論:統計学的に有効性があったとは言え、検査費が高額なことから全例の妊婦にスクリーニングとして行うことはコスト・ベネフィットの面から疑問が残る。一方頚管短縮例や早産リスクが高い妊婦,においては、治療開始前からサイトカイン高値例が多く治療開始後も持続的高値:例では予後不良であることから測定愚者を選択して検査すればより有効性が実証されると思われる。
ALS患者iPS細胞由来アストロサイトを用いた非自律性運動ニューロン変性の解明

変異SOD1を発現するアストロサイトが運動ニューロン変性を誘導することがトランスジェニックマウスやES細胞を用いた研究で明らかにされている。しかしながら、SOD1変異を有する患者由来のアストロサイトについては運動ニューロン変性を誘導するかどうかは不明である。そこで、当研究室で既存の方法を改変し、これまでの80日に比較して短期間でアストロサイトへ分化誘導する新たな方法を確立した。その後、SOD1変異を有する患者由来のiPS細胞からアストロサイトへの分化誘導を行った。アストロサイト特異的にtdTOMATOを発現するレンチウイルスを作製し、分化誘導で得られた細胞に感染した。その結果、約50日でtdTOMATO陽性でかつI型アストロサイトに類似した細胞を確認することができた。変異SOD1を過剰発現するマウスおよびコントロールマウスから初代培養アストロサイトを単離し、マイクロアレイで遺伝子発現解析を行った。その結果、変異SOD1マウス由来アストロサイトで生理活性脂質の合成に関与する特定のプロスタグランジン合成酵素、シクロオキシゲナーゼの発現量が上昇していた。さらに定量的PCR法により、変異SOD1マウス由来アストロサイトで上記プロスタグランジン合成酵素の発現が有意に上昇していることを確認した。これらの結果から、上記プロスタグランジン合成酵素、シクロオキシゲナーゼによって産生される特定のプロスタグランジンの増加が予想された。そこで、アストロサイト培養上清中に含まれる各種プロスタノイドの定量を行ったが、測定系の問題で、上昇を予想したプロスタグランジンの定量には至らなかった。しかしながら、有意差はないものの、定量可能であったプロスタグランジンは変異SOD1マウス由来アストロサイトで高い傾向にあった。このことから、SOD1変異を有する患者由来のアストロサイトでも上記のプロスタグランジン合成酵素、シクロオキシゲナーゼ経路が活性化している可能性が示唆された。家族性ALSの一つである変異SOD1関連ALSの研究から、SOD1の発現量が病態に寄与していること、特に変異SOD1を高発現しているアストロサイトが非自律的に運動ニューロン変性に寄与していることが明らかとなっている。しかしながら、MS患者のアストロサイトが同様の効果を有しているかは明らかになっていない。まず、細胞死を評価する実験系を確立した。ヒトiPS細胞から運動ニューロンを分化誘導し、レンチウイルスを用い運動ニューロン特異的にGFPを発現させた。GFP陽性細胞数を測定することにより、細胞死を評価した。既報の研究を再現するために、変異SOD1を高発現させたマウスおよびコントロールのマウスから初代アストロサイトを採取し、GFPでラベルした運動ニューロンとの共培養を行った。運動ニューロンとコントロールマウス由来アストロサイトとの共培養と比較し、運動ニューロンと変異SOD1を高発現させたマウス由来アストロサイトとの共培養では、共培養開始37日後でGFP陽性細胞が有意に減少した。次に、ヒトiPS細胞由来アストロサイトの解析において、純化プロトコールの確立が重要である。そこで、下記二通りの方法を検討した。第一の方法として、CD24,CD44,CD184の組み合わせによるソーティングを行った。参考論文ではアストロサイトはCD24,CD44,CD184のいずれも発現していることが報告されているが、ヒト初代アストロサイトはCD44のみ染色が確認され、CD24,CD184の染色は確認されなかった。第二の方法として、アストロサイト特異的マーカーの一つであるグルタミン酸・アスパラギン酸トランスポーターに対する抗体を用いマウスアストロサイトおよびヒトアストロサイトのソーティングを行った。マウスアストロサイトの染色は確認されたが、ヒトアストロサイトの染色を確認することができなかった。
遺伝子治療薬の生体内投与後の毒性発現機構解析

アデノウイルス(Ad)ベクターは既存のベクターの中では最も遺伝子導入効率に優れており、in vivoでの遺伝子導入も可能なことから、種々の疾患に対する遺伝子治療用ベクターとして使用されている。しかし、Adベクターを生体へ投与した場合、炎症性サイトカインやインターフェロン(IFN)の産生をはじめとする自然免疫応答が惹起されることが知られており、Adベクターの安全性向上のためには、Adベクターにより誘導される自然免疫応答のメカニズムを解明することが重要な課題と考えられている。そこで本年度は自然免疫応答を惹起するようなウイルス側因子の同定を試みた。ウイルス側責任因子としては、(1)ウイルスの殻であるカプシドタンパク質、(2)ウイルスゲノムDNA、(3)ウイルスの転写産物などが考えられる。昨年度の結果より、AdベクターによるIFNの産生にRNAが関与している可能性が示唆されていたこと、Adと同じくDNAウイルスであるEBウイルスがコードする小分子RNAであるEBERが自然免疫応答の受容体に認識されその後IFNの産生を惹起するとの報告があったことから、Adがコードする小分子RNAであるVA-RNAに着目した。VA-RNAがRNAポリメラーゼIIIにより転写されることから、まずRNAポリメラーゼIII阻害剤を用いて検討を行った。その結果、阻害剤の濃度依存的にAdベクターによるIFNの産生が低下していた。このことからRNAポリメラーゼIIIにより転写されるRNAがAdベクターによるIFNの産生に関与していることが示唆された。次に、VA-RNAの直接的関与について検討を行うため、野生型AdもしくはVA-RNA領域を欠損させたAdを用いた。その結果、骨髄細胞よりGM-CSFを用いて誘導を行った樹状細胞だけでなくマウス胎児線維芽細胞においてもVA-RNAによりIFNの産生が惹起されることがはじめて明らかとなった。しかしながら、Adベクターを用いた遺伝子治療臨床研究において投与後初期に生じる炎症等の自然免疫応答の誘導が最も問題となっている。実際、Adベクターを動物個体へ投与した場合、炎症性サイトカインの産生をはじめとする自然免疫が惹起されることが知られており、Adベクターの安全性向上のためには、Adにより誘導される自然免疫応答のメカニズム解明が必要であると考えられる。そこで、自然免疫誘導に関与する受容体として最もよく知られているtoll-like receptor(TLR)シグナル伝達のアダプター分子であるMyD88およびCpGモチーフを含んだDNAを認識するTLR9の遺伝子欠損マウスを用い、単離した樹状細胞や腹腔内マクロファージにAdベクターを作用させた後のサイトカイン産生を検討することにより、Adベクターによる自然免疫誘導にTLRsが関与しているかどうかについて検討を行った。その結果、樹状細胞におけるAdベクター作用後のIL-6産生には、MyD88ならびにTLR9経路が関与していることが明らかとなった。一方、腹腔内マクロファージではMyD88/TLR9非依存経路を介しIL-6を産生していることから、樹状細胞とマクロファージでは、Ad作用後のサイトカイン産生経路が異なることが示された。さらに、マウス生体内にAdベクターを投与した結果、MyD88およびTLR9遺伝子欠損マウスの血清においても野生型と同程度のサイトカイン量が観察された。これまで、Adベクターによる炎症性サイトカインは主に樹状細胞から産生されることが報告されていたが、in vivoではMyD88およびTLR9非依存的にサイトカイン産生が観察されたことから、樹状細胞以外の細胞もAdベクターによる炎症性サイトカインの産生に関与していることが示唆された。前年度、MyD88欠損およびTLR9欠損マウスより調製した樹状細胞もしくはマクロファージにAdベクターを作用させた結果、樹状細胞ではMyD88/TLR9依存的に、マクロファージではMyD88/TLR9非依存的にIL-6産生が行われており、細胞種によってAdベクターによる炎症性サイトカイン産生経路が異なることを明らかにした。そこで、本年度では、TLR非依存経路に関わる分子として、現在までにウイルスを認識する受容体として報告されているRIG-IやMda5ならびに、それらの分子のアダプター分子であるIPS-1に着目し検討を行った。その結果、IPS-1欠損マウス由来線維芽細胞にAdベクターを作用させると、野生型マウス由来細胞と比較しIFN-βの産生が顕著に抑制された。一方、RIG-IもしくはMda5欠損マウス由来細胞では野生型マウス由来細胞と同程度のIFN-βが産生された。このことから、線維芽細胞におけるAdベクターによるIFN産生にIPS-1が関与していることが示唆された。

アデノウイルス(Ad)ベクターは既存のベクターの中では最も遺伝子導入効率に優れており、in vivoでの遺伝子導入も可能なことから、種々の疾患に対する遺伝子治療用ベクターとして使用されている。しかし、Adベクターを生体へ投与した場合、炎症性サイトカインやインターフェロン(IFN)の産生をはじめとする自然免疫応答が惹起されることが知られており、Adベクターの安全性向上のためには、Adベクターにより誘導される自然免疫応答のメカニズムを解明することが重要な課題と考えられている。そこで本年度は自然免疫応答を惹起するようなウイルス側因子の同定を試みた。ウイルス側責任因子としては、(1)ウイルスの殻であるカプシドタンパク質、(2)ウイルスゲノムDNA、(3)ウイルスの転写産物などが考えられる。昨年度の結果より、AdベクターによるIFNの産生にRNAが関与している可能性が示唆されていたこと、Adと同じくDNAウイルスであるEBウイルスがコードする小分子RNAであるEBERが自然免疫応答の受容体に認識されその後IFNの産生を惹起するとの報告があったことから、Adがコードする小分子RNAであるVA-RNAに着目した。VA-RNAがRNAポリメラーゼIIIにより転写されることから、まずRNAポリメラーゼIII阻害剤を用いて検討を行った。その結果、阻害剤の濃度依存的にAdベクターによるIFNの産生が低下していた。このことからRNAポリメラーゼIIIにより転写されるRNAがAdベクターによるIFNの産生に関与していることが示唆された。次に、VA-RNAの直接的関与について検討を行うため、野生型AdもしくはVA-RNA領域を欠損させたAdを用いた。その結果、骨髄細胞よりGM-CSFを用いて誘導を行った樹状細胞だけでなくマウス胎児線維芽細胞においてもVA-RNAによりIFNの産生が惹起されることがはじめて明らかとなった。
低温光化学プロセスを用いる精密有機合成

本特定研究班は精密有機合成に役に立つ新しい光化学反応プロセスを開発し、低温で反応制御することにより高効率な光化学合成プロセスを確立し応用開発に結びつけることを目的とする。本年度の研究実績は以下の通りである。1.生理活性天然物の骨格合成ならびに官能基変換に有用な光化学反応の開発。立体特異的な光閉環反応を利用するβ-ラクタム骨格の不斉合成法の確立(金子)および光電子移動反応を用いるリボヌクレオシドからデオキシ体への一般的変換法の開発(松浦)に成功した。特に、後者の反応は最近注目されているエイズの治療薬であるデオキシシチジンを簡便に合成できる方法を提供したものでその実用化が期待される。2.特異な骨格をもつ機能分子の合成.分子内ドナー・アクセプター系の低温光化学反応により新奇骨格であるイソベンゾフルベンを世界で始めて合成した(向井)。低温光化学により発生するカルベンの反応場-分子構造-反応パターンの担関を明らかにした(伊沢)。3.人工生体機能系,分子設計。人工フラボ脂質類を人工リポゾームを利用して始めて合成することに成功した(田伏)。抗ガン剤ブレオマイシンの骨格変換により非天然型ブレオマイシンを合成した(松浦)。ロドプシンの特異的な光異化を模倣する新しい立体特異的光異化反応系を蛋白を利用することにより達成した(大橋)。
気相ダイヤモンド成長における核前駆体の生成機構

(1)マイクロ波CVDに直流バイアスを重畳して性性イオンを分離した。(2)活性炭素を基板に衝突させることにより,炭素クラスターを形成させた。(3)炭素クラスターにイオンが衝突することにより,Sp^2からSp^3相移動を行わせ,ダイヤモンドプリカーサ形成を行った。この結果より,初期の研究目的である核発生メカニズムおよび形成のイオンによるモデルを構築した。(6)このモデに立って核の高密度(10^<12>/cm^2),選択成長(1.4μm幅ストライプ),ヘテロエピタキシャル成長(60%の部分的方位整合)など新しい応用について報告した。(7)このイオン効果による形成モデル及びその応用について内外の学会で報告し,高い評価を得た。(8)今後はこの研究を基礎としてダイヤモンドヘテロエピタキシャル成長を完成させる計画である。ダイヤモンド薄膜を応用するためにはエピタキシャル成長を実現しなければならない。そのためには核発生機構を解明し、結晶成長を制御しなければならない。本研究はイオンを利用して核発生を制御し、機構を解明することを目的としている。初年度はこれまでの研究を整理し、機構の解明を行ない、それに基づく核発生モデルを提案した。さらに、このモデルに沿った装置の設計、製作を行なった。本装置は炭素イオンを低エネルギーで照射できるよう設計されており、核形成、結晶成長をイオンエネルギーで制御することが可能となっている。次年度にはこれらの装置を使って、当初の目的であるダイヤモンド核前駆体の生成機構を解明する。(1)マイクロ波CVDに直流バイアスを重量して活性イオンを分離した。(2)この活性炭素を基板に衝突させることにより、炭素クラスターを形成した。(3)炭素クラスターにイオンが衝突することによりSp^2からSp^3相転移を行わせ、ダイヤモンド核のプリカーサ形成を行った。(5)この結果より初期の研究目的である核発生メカニズムおよび核前駆体形成のイオンエネルギーによるモデル構築に成功した。(6)このモデルに立って核の高密度化(10^<12>/cm^2以上),選択成長(0.4μ幅ストライプ),ヘテロエピタキシ(60%部分的方位整合)など新しい応用についても報告した。(7)このイオン効果による核形成モデル及びその応用について内外の学会で報告し高い評価を得た。
光圧を利用した高分子コロイドの結晶化・会合プロセスの単一粒子計測

本研究では光圧によるナノ粒子光捕捉技術と、高感度分光測定を組み合わせ、高分子及び金属コロイドの結晶化・会合プロセスを一粒子・一分子レベルでその初期段階から追跡し、そのメカニズム解明を目指している。本年度の主な研究成果を以下に挙げる。1、表面修飾したコロイド粒子の会合プロセスの測定光圧により作製した金コロイドのミクロ集合体の吸収スペクトル測定法を開発し、吸収スペクトルの形状が光圧の大きさに依存することを見出した。これらの結果から、光圧によりコロイドの集合構造と表面プラズモン共鳴に基づく光学特性が制御できることを明らかにし、Physical Review E誌に発表した。また、分子長の異なるアルカンオールで金コロイド表面を修飾することにより、光圧で出来る集合構造やその光学特性が制御できることも明らかにした。2、単一粒子レベルで捉える高分子コロイドの秩序構造形成過程の解析色素を含有するポリスチレンナノ粒子が、光圧により集光位置に一粒つつ捕捉される様子を、二光子励起蛍光を利用して検出し、レーザー強度や粒径の関数として解析した。集光位置近傍で形成された会合体が選択的に捕捉されることや、光圧の大きさで会合プロセスを制御できることを明らかにし、Physical Review E誌に発表した。また蛍光相関分光法により,光圧により高分子コロイドの会合が進んでいく様子を捉えることに成功した。3、作製したコロイド結晶・会合体の基板上への転写とその評価光圧を利用してコロイド溶液中の高分子ナノ粒子をガラス基板上に一粒つつ任意の位置に固定化する技術を開発し、Japanese Journal of Applied Physics誌に発表した。2個の金ナノ粒子を光捕捉して光の偏光方向に配列させて固定化する手法や、任意の位置に微粒子を固定化した3次元構造の作製に成功し、Proceedings of SPIE誌に発表した。本研究では光圧によるナノ粒子光捕捉技術と、高感度蛍光分光測定を組み合わせ、高分子コロイドの結晶化・会合プロセスを一粒子・一分子レベルでその初期段階から追跡し、そのメカニズム解明を目指している。(1)倒立型顕微鏡にアバランシェフォトダイオードと精密自動ステージを組み込み、制御計測プログラムを自作して共焦点顕微蛍光分光システムを開発した。光源として近赤外YAGレーザー光と青色ダイオードレーザー光を導入し、ナノ粒子の光捕捉と、200nmの空間分解能で単一分子レベルの高感度蛍光分光測定を一つのシステムで可能にした。(2)集光スポット内に捕捉されたコロイド粒子の集合状態を調べるためのモデル系として金コロイドを取り上げ、光捕捉時の吸収スペクトルを測定した。その結果、スペクトル形状がレーザー強度に強く依存することを明らかにし、光圧によって集光スポット内におけるコロイドの濃度、集合状態を制御できることを証明した。この研究成果は第63回応用物理学会学術討論会、第55回コロイドおよび界面化学討論会において発表した。さらにこの光捕捉技術と紫外パルスレーザーによる光熱反応を利用して、直径80nmの金コロイドを一粒づつ光捕捉し、基板上の任意の場所に固定化する手法を開発した。この研究成果はApplied PhysicsLetters誌に掲載された。(3)高分子コロイドとしてワイヤー型デンドリマーのテトラヒドロフラン溶液を取り上げ、そのゲル状集合体の体積を光捕捉により可逆的に制御することに成功した。蛍光分光測定を同時に行い、体積変化に伴う分子構造の変化も突き止めた。この研究成果はThe Journal of Physical Chemistry誌に掲載された。1、ガラス基板上に展開した高分子溶液の溶媒蒸発過程にレーザー光を集光すると、液膜の厚さ、溶液濃度、基板と集光スポットの距離などに依存して、大きさ、形状の異なる高分子会合体がガラス基板上のレーザー照射位置に局所的に形成される新しい現象を見出した。昨年度開発した共焦点蛍光分光システムを用いて、1分子レベルで蛍光解析を行った結果、溶媒の蒸発に伴い溶液中に形成されたゲル状の高分子会合体が、光圧により集光位置に集められ、基板上に会合体を形成すると考察し、第64回応用物理学会学術討論会において研究成果を発表した。現在、高分子や生体分子を基板上の任意の位置にサブミクロンの大きさで配列させる新技術として確立するため、メカニズムの解明に取り組んでいる。3、光捕捉を用いて金コロイド、高分子コロイドを一粒づつ、基板上の任意の位置に配列、固定化する技術の開発に引き続き取り組み、それらの成果をまとめてアメリカ・カリフォルニアで開かれたSPIE学会で報告し、Proceedings of SPIE誌に発表した。4、光捕捉により作製される高分子コロイド集合体の形成プロセスを2光子励起蛍光を利用した単一粒子計測により解析し、粒径40nmのコロイドにおいてレーザー強度に依存した特長的な会合プロセスを見出し、第56回コロイドおよび界面化学討論会で報告した。

これらの結果から、光圧によりコロイドの集合構造と表面プラズモン共鳴に基づく光学特性が制御できることを明らかにし、Physical Review E誌に発表した。また、分子長の異なるアルカンオールで金コロイド表面を修飾することにより、光圧で出来る集合構造やその光学特性が制御できることも明らかにした。2、単一粒子レベルで捉える高分子コロイドの秩序構造形成過程の解析色素を含有するポリスチレンナノ粒子が、光圧により集光位置に一粒つつ捕捉される様子を、二光子励起蛍光を利用して検出し、レーザー強度や粒径の関数として解析した。集光位置近傍で形成された会合体が選択的に捕捉されることや、光圧の大きさで会合プロセスを制御できることを明らかにし、Physical Review E誌に発表した。また蛍光相関分光法により,光圧により高分子コロイドの会合が進んでいく様子を捉えることに成功した。3、作製したコロイド結晶・会合体の基板上への転写とその評価光圧を利用してコロイド溶液中の高分子ナノ粒子をガラス基板上に一粒つつ任意の位置に固定化する技術を開発し、Japanese Journal of Applied Physics誌に発表した。2個の金ナノ粒子を光捕捉して光の偏光方向に配列させて固定化する手法や、任意の位置に微粒子を固定化した3次元構造の作製に成功し、Proceedings of SPIE誌に発表した。
クリック反応による高解像度パルスチェイス法の開発

アルキル基、アジド基を持つ前駆体を細胞に取り込ませた後、急速凍結し、凍結割断レプリカ上のクリック反応を用いて膜脂質、膜蛋白質を金コロイド標識し、電顕観察した。他の方法では解析が困難なphosphatidylcholineを示す標識は前駆体負荷後、経時的に増加した。出芽酵母では、小胞体、核膜、ミトコンドリア、液胞の膜両葉のphosphatidylcholine密度がほぼ同じであるのに対し、形質膜では顕著な非対称性分布を示すことを見出だした。PEMT経路を欠き、choline依存性となった出芽酵母変異株(cho2Δopi3Δ)を用い、クリック反応でホスファチジルコリンを検出するために使用するpropargylcholineが完全なcholineの代替物となり得るか否かを検証した。細胞はpropargylcholine添加培地でもcholine添加培地と遜色なく増殖し、propargyl基を持つホスファチジルコリンが生理的機能を維持していることを示唆した。propargylcholine添加培地で培養した出芽酵母の脂質組成を薄層クロマトグラフィーで解析し、通常培地の場合と大きな変化がないことを確認した。propargylcholine存在下に1日以上培養した出芽酵母を急速凍結し、作製した凍結割断レプリカ上のpropargyl基をbiotin-azideと結合させたのち、抗biotin抗体、金コロイド標識二次抗体で標識した。陰性対照として、propargylcholineを与えない酵母サンプルでは標識が生じないことを確認した。核膜(内核膜・外核膜)、小胞体、液胞、ミトコンドリア(内膜・外膜)、ゴルジ体、エンドソームについては内葉・外葉間の標識密度に顕著な差はなく、ホスファチジルコリンは対称に分布していると考えられた。一方、形質膜ではほぼ内葉に限局して標識が認められた。これに対して哺乳類細胞の形質膜では内葉・外葉ともに標識が見られた。アルキン基を持つpropargylcholineおよびアジド基を持つL-azidohomoalanineをそれぞphosphatidylcholine、蛋白質の前駆体アナログとして取り込ませ、クリック反応で検出するための実験条件について検討した。哺乳類培養細胞および酵母の両方を用いて、0.15 mMの濃度の前駆体アナログを数時間1日間培養液中に添加したのち、アルデヒド固定し、propargylcholineについてはCy3-azide, biotin-azide, Fluor488-azide、L-azidohomoalanineについてはbiotin-acetyleneと反応させることにより、特異的な蛍光標識を得ることができた。またpropargylcholineについては細胞の増殖等への影響はなく、cholineと同様に利用されることを確認した。さらに同一サンプル上でクリック反応と、抗体による標識あるいはGFPを蛍光二重観察する方法を確立した。また上記前駆体アナログを取り込ませた細胞を急速凍結し、凍結割断レプリカ上でクリック反応を行わせ、電顕レベルで新規合成されたphosphatidylcholineを可視化することも可能になった。哺乳類細胞と酵母ではphosphatidylcholine分布に大きな違いがあり、その意義について検索中ある。光顕レベルでの膜分子前駆体の投与条件、およびクリック反応による可視化のための反応条件について、決定することができた。また電顕レベルでもクリック反応による可視化が可能なことが分かった。これにより次年度の計画を予定通り行うことが可能になった。1)Kennedy経路で合成されるホスファチジルコリンの動態について、種々のflippase, scramblaseなどの遺伝子を改変した酵母を作製し、クリック反応を用いる方法で解析する2)上記ホスファチジルコリンおよび新規合成蛋白質の電顕レベルでの局在解析を、凍結割断レプリカ法と低温重合樹脂切片法を併用して行う。凍結割断レプリカを用いた方法では膜の内葉と外葉の違いについても解析を進める。3)新たな膜脂質合成を必要とするオートファゴソームや脂肪滴の形成過程について、ホスファチジルコリンの動態を検索する。1)の結果をもとに、特定の遺伝子の改変が及ぼす影響について解析し、膜脂質合成とオートファジー、脂肪滴形成の関連を明らかにする。1)消耗品費:1)薬品:膜分子前駆体、クリック反応のための蛍光標識試薬、酵母の遺伝子改変などに必要な分子生物学用試薬、酵母や哺乳類細胞を培養するのに必要な試薬、血清などを購入する。2)培養器具:哺乳類細胞を培養するためのプラスチック器具などの購入に充当する。3)実験器具:凍結割断レプリカ作製に必要な白金、アルミ試料台など、樹脂包埋切片を作製するのに必要な低温重合樹脂などを購入する。2)旅費:関係分野の動向調査および研究成果の発表のために、国内学会に参加する費用を申請する。3)その他:研究成果を論文発表する際の投稿料、カラー印刷費等に充当する。
大規模ゲノム関連解析を用いた筋萎縮性側索硬化症感受性遺伝子の単離・同定

筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS)は、大脳皮質運動野の第一次運動ニューロンと脳幹、脊髄の第二次運動ニューロンが選択的かつ進行的に変性・脱落する原因不明の神経変性疾患である。2-3年の経過で四肢や顔面、舌などの筋肉の萎縮と筋力低下が進行し、人工呼吸器を用いなければ呼吸筋の麻痺により2-4年で死亡すると言われている。その病因論については、現在まで幾つかの仮説(例えば、フリーラジカル説、興奮性アミノ酸説、免疫異常説等)が提唱されているが、未だその詳細は明らかになっていない。そこで、本研究ではALSの病因の解明、治療法の開発を目指し、大規模ゲノム関連解析による未知のALS感受性遺伝子の単離・同定を試みた。本年度は、特にALS候補SNPを絞り込むためのゲノムスクリーニングを重点的に行った。まず、ALS94症例と日本人一般集団由来のDNAを用い、ヒトゲノムに散在する50,268ヶ所の一塩基多型(SNP)について、マルチプレックスPCR-インベーダー法により相関解析を行った。さらに、サンプル数を増やして解析を行い、最終的に有意な相関を認める複数のSNP同定した(P<0.00001)。絞り込まれた候補SNP領域については、ハップマップデータよりタグSNPを選別して、相関解析を行いながら、遺伝子地図を基にした高精度SNP地図、連鎖不平衡地図を構築している。現在までに、それぞれの候補遺伝子領域について、遺伝統計学的解析によりランドマークSNPよりも一層疾患と有意な相関を示す複数のSNPを見いだした。今後は、解析が終了していない遺伝子領域の構造解析、並びに疾患候補SNPについて、どのSNPが真の疾患感受性SNPを見極めるために機能解析を行う。平成20年においても、昨年度同様、大規模ゲノム関連解析(ゲノムスクリーニング)を重点的に行った。本年度は検体数を増やしてさらに詳細に解析した。ALS検体はバイオバンクジャパンに登録された約700例のDNA、コントロールDNAは日本人一般集団由来の約2,000例を用いて関連解析を行った。Single nucleotide polymorphism(SNP)マーカーには日本人標準多型データーベースに登録されているものを使用した。SNPのタイピングはマルチプレックスPCR-インベーダー法を用い、全ゲノムを段階的にスクリーニングした。第1次スクリーニングはALS92例とコントロール239例(1stセット)を用いて52,608SNPsを解析した。ここでP<0.01を示したSNPsについてALS約450例、コントロール965例(2ndセット)をタイピングした。更に段階的スクリーニングで用いなかった検体と対照を用いて関連解析を行った。結局、ゲノムスクリーニングで用いた検体とは重複しない、独立の検体を用いた二度の追試の結果、遺伝学的に有意な相関を示すSNPを同定した。その有意な相関を持つSNPは機能未知の遺伝子のイントロン12に存在していた。当該SNPを含む領域について連鎖不平衡マッピングを行い、候補遺伝子領域を約100kbに限局した。その領域には5つの遺伝子がマップされていた。次いで候補領域から未知のSNPを単離するために48サンプルを用いて、候補領域に含まれる5遺伝子座について再シークエンスを行い、詳細なSNP地図を構築した。本研究は、以上のようにSNPを用いた大規模ゲノム関連解析により、ALS感受性候補遺伝子領域を同定した本邦初の報告である。