hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高齢者の唾液α-アミラーゼ活性値の検討―要介護高齢者の白粥の誤嚥予防のために―

主食として要介護高齢者に食事援助される白粥は、食事援助の際、経時的に液状化が進行し、高齢者の誤嚥の危険性は極めて高くなる。この原因は、高齢者の唾液が食事援助に伴って粥に頻回に混入し、唾液α-アミラーゼが粥の米デンプンを分解するためであることを、我々は初めて明らかにした。先行研究のない基礎研究であったため、これまでは、若年の健康女性を被験者として実験を行ってきた。しかし唾液α-アミラーゼ活性値や唾液分泌量は、性や年齢によって異なる可能性が推測される。そこで本研究では、1健康な若年男女の唾液を採取し、性別の唾液α-アミラーゼ活性値を測定して比較検討する、2医師に処方された薬を飲んでいない高齢者の集団が見当たらず、高齢者については唾液分泌に関する調査を男女別に行い、文献に基づき、比較検討を行うこととした。3実験条件をさらに統一し、精度の高い実験を実施することを目的として、被験者の口腔ケアの影響を避けるため、入念に統一した口腔ケアを行った。被験者の唾液採取の条件として、13日間連続して昼食直前の正午に唾液を採取する、2午前10時に実験を開始し、朝食後の入念な口腔ケアを実験室で行う、3唾液採取1時間前に精製水を飲み、その後、唾液採取まで絶飲食とする等について、20代の健康男女各12名を被験者として実験を行った。そして前回の実験結果である20代の健康男女の唾液α-アミラーゼ活性値と比較検討を行った結果、20代の男女では、今回の準備実験のほうが唾液α-アミラーゼ活性値が安定しており、ばらつきの大きかった男性にもばらつきはほとんどなくなった。しかし適切な高齢被験者の集団に出会えず、被験者男女各12名、計24名を対象に3日間の準備実験を実施するのみとなり、平成28年度は20代の被験者だけを対象とした実験となった。研究代表者は、平成29年4月1日付けで、国立大学法人滋賀医科大学(大津市)から私立大学の安田女子大学(広島市)に異動した。しかし、教育研究環境が大きく異なり、業務の多忙や、研究環境の大きな相違により、研究の遂行が困難となった。研究代表者は、要介護3の老父の介護のため、老父の広島市への転居等による介護負担が大きく、研究の遂行に困難をきたした。結果として、研究代表者は病気および怪我をし、研究の遂行が困難となった。したがって、平成29年度は、これまでの資料の検討が主となり、実験研究実績に成果を上げることができなかった。健康な高齢者(医師に薬を処方されていない高齢者)が対象であるのかどうかは明らかではないが、高齢者の唾液分泌量は若年者より少ないと言われている。唾液分泌量は、唾液α-アミラーゼ活性値の比色定量に影響する。しかし、健康な被験者の1日の唾液量を測定することは不可能である。医師に薬を処方されていない高齢者の集団が見当たらない場合は、男女別に面接調査を行う。若年被験者には調査票調査を行い、年齢別、性別に唾液分泌量を文献を用いながら検討する。

結果として、研究代表者は病気および怪我をし、研究の遂行が困難となった。したがって、平成29年度は、これまでの資料の検討が主となり、実験研究実績に成果を上げることができなかった。健康な高齢者(医師に薬を処方されていない高齢者)が対象であるのかどうかは明らかではないが、高齢者の唾液分泌量は若年者より少ないと言われている。唾液分泌量は、唾液α-アミラーゼ活性値の比色定量に影響する。しかし、健康な被験者の1日の唾液量を測定することは不可能である。医師に薬を処方されていない高齢者の集団が見当たらない場合は、男女別に面接調査を行う。若年被験者には調査票調査を行い、年齢別、性別に唾液分泌量を文献を用いながら検討する。平成28年度は、実験に予定以上の時間がかかり、時間不足で、予定した実験の約半分しか実験が実施できなかったため等である。平成29年度は「7.現在までの進捗状況」に記載した理由等により、これまでの資料の検討に留まったためである。今後の使用計画については、上記「8.今後の研究の推進方策」に基づいて、立てる予定である。
北京版チベット大蔵経のデジタルイメージと思想史研究

デジタルイメージにもとついてチベット語フォントを用いた校訂テクストを作成した。それをデルゲ版と対校して批判テクストを作成した。さらにサンスクリット語テクストAbhidharmakosavyakhya Sphut arthaの入力されたデータを校正し、サンスクリット語テクストとチベット語テクストとの対照を容易にするため、テクスト間相互対照ハイパーテクストを作成した。本研究による大きな成果の一つである。アビダルマ文献の批判テクスト作成は、仏教思想の基本的な概念を解明していくために必須の研究過程である。本研究代表者が目指すものは、アビダルマ文献に現われる教義概念の整理に終わるものではない。それらの教義思想が形成されてきた背景には、大乗経典の成立という大きな動きがあり、それと連動した思想運動と考えられる。今回の成果であるアビダルマの諸法、信仰、般涅槃、仏土というテーマは、いずれも仏教思想史を形成する基本概念である。今後の研究のために必要な基礎概念の研究をなしたといえるであろう。本研究は、北京版チベット大蔵経の電子データ化を基礎にした思想史研究を目指すものである、従来からの電子化のための作業は継続して行いつつある。資料全体の量がきわめて膨大であるので、電子化にあたっては、35mmのカラーフィルムによる写真撮影をし、それをスキャナーによって取り込み、補正するという方法をとってきた。撮影されたフィルム上における分解能の測定、グレイスケールを資料と同時に映し込むことによる色の補正法など、これまでの研究の成果を十分にいかして、作業が行われている。チベット大蔵経のイメージ電子データから、文字ベースのテキストデータ化についての研究作業も開始しだした。このテキストデータを用いて思想研究に入っていくために解決しておかなければならない課題の一つは、チベット語のソートの問題である。大谷大学が開発したマッキントッシュコンピュータのシステムで動くTibetan Language Kitは、テキストデータを作成するにあたってきわめて有用である。しかしまだソートのプログラムが完成していない。その理由は、チベット語の複雑さにある。きわめて複雑なプログラムを書かなければソートができない。しかし本研究においては、きわめて簡易な方法によってソートを実行することにした、サンスクリットからの音写語を除くならばチベット語におけるシラブルの全数はすでに確定していて、4000あまりである。この全シラブルに確定した番号をつけ、それを基礎にして諸テキストをソートするというものである。これによってほぼ目的は達せられる。本研究は、北京版チベット大蔵経の電子データ化を基礎にした思想史研究を目指すものである。イメージデータとしての電子化作業は継続して行ってきたが、基礎作業上の問題点がいくつか残っている。写真撮影したものをスキャニングした後、画像処理によって補正する作業に取りかかるとき、数値データ上どうしても明るさむらを検出してしまうことである。写真撮影の過程で、照度計でデータに明るさむらがないように、細心の注意を払うにもかかわらずである。本研究としては、文字データ化することによっての思想研究に目標を設定している限り、このようなわずかの数値データにおいて現われる明るさむらは、無視してもいいと判断できるのであるが、文化財のデータ保存という観点からは、この問題はなお技術上の未解決点である。次年度には解決して、本格的な電子化作業に入っていかなければならない。この作業に平行して、思想研究に取り組むための文字べースでの電子化作業にも着手してきた。とりわけ、本研究代表者の専門領域であるアビダルマ教義学に焦点を合わせることとして、『阿毘達磨倶舎論』の注釈書であるSthiramatiのTattvarthaのテクスト作りに取りかかってきた。さらには、同じ『倶舎論』の注釈書であるYasomitraのSphutarthaのテクスト作りにも着手しつつある。本年は、北京版チベット大蔵経のイメージデータの電子化作業にもとづいて、アビダルマ教義学のテクストの電子化とその批判的テクストの作成を試みた。この批判的テクストによる仏教思想史研究が本研究の最終日標であるが、従来の研究とは異なった研究成果を目指している。テクスト研究は、電子化されたものであったとしても、文字を基本にするという点では変わるところがない。電子化されたテクスト研究の利点を生かすためには、自由な用語検索の機能を十分に駆使するということでなければならない。チベット語による仏教テクストの研究状況は、かなり進展しているのであるが、特に教義学の翻訳チベット語テクストの場合、チベット語の語法研究がまだまだ不十分である。

哲学的な思索を可能にするほどに用語の意味確定ができてはいない。翻訳チベット語の特殊性は、チベット人自身によって作られたチベット文と異なり、チベット語のみによる思索がほとんど不可能であるという点にある。したがって、必ず原語であるサンスクリット語を想定しつつ解読するということ以外には、テクスト研究が成立しないのである。それ故、チベット語とそれに対応するサンスクリット語との対照インデックスが必須の道具となってくる。すでに優れた対照インデックスがいくつか作成されてきているが、しかしそれらは主として教義学におけるテクニカルタームの索引というべきものであった。今後の研究のさらなる進展のためには、語法研究が可能な対照インデックスを作成しなければならない。本年度は、上記のような語法研究を可能にするような、対照インデックス機能のついた電子テクストの作成を試みてきた。このようなテクストの一部公開をもって、本研究の成果とする予定である。
犬血管肉腫に対するTRAIL経路の活性化によるアポトーシス誘導治療法の基礎的研究

ウエスタンブロッティングでは,いずれの細胞株についてもcaspase-3の活性化が観察された。また,JuB4およびRe12ではcleaved caspase-8も有意に検出され,TRAIL経路で活性化するcaspase-8の活性化も確認された。caspase-3もしくはcaspase-8の阻害剤により,izTRAILの細胞傷害効果は抑制され,さらにフローサイトメトリーによるSub-G1細胞の減少も観察された。今回の結果から,TRAILは,その外因性経路を経たアポトーシス誘導により犬血管肉腫細胞株に細胞傷害効果を示すことが明らかとなった。予定通り,TRAILの血管肉腫への腫瘍細胞傷害効果を証明でき,論文として報告した。犬血管肉腫細胞株において、細胞株間でもTRAIL感受性に差がみられたことから、これらの感受性に寄与すると考えられる因子について検索する予定である。犬の血管肉腫細胞株に対するTRAILの細胞傷害効果を,市販されている3種類のヒト組み換えTRAIL(大腸菌発現組み換えヒトTRAIL Thr95-Gly281,哺乳類発現組み換えヒトTRAILVal114-Gly281,イソロイシンジッパー構造導入哺乳類発現組み換えTRAIL)を用いて評価した。方法としてWST-1法を用い,24,48および72時間後に,細胞生存率をプレートリーダにより測定した。その結果,大腸菌発現組み換えヒトTRAIL Thr95-Gly281はほとんど効果を示さなかった。さらに哺乳類発現組み換えヒトTRAILVal114-Gly281ではある程度の効果はあったものの,イソロイシンジッパー構造を導入し,三量体形成を容易かつ強固にしたizTRAILが最も効果があることが明らかになった。さらに,ウェスタンブロッティングによるCaspase-3およびCaspase-8の開裂による活性化,Caspase-3の基質の一つである,Poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)の分解,蛍光顕微鏡下での核断片化の評価およびフローサイトメトリーによるAnnexin V/PIによるアポトーシス解析,PI染色による核断片化細胞の検出及び細胞周期解析を,TRAIL処理後,早期の1-6時間を加え,48時間までで行った。その結果,形態的変化として核断片化,生化学的変化としてCaspase-3およびCaspase-8の開裂による活性化が観察され,さらにPARPの分解の確認され,また,Annexin V+/PI-の細胞が増加し,izTRAILで誘導される細胞死は,TRAIL経路の活性化を示すCaspase-8の活性化を介したアポトーシスであることが分かった。また,TRAILは,感作後,数時間という早い時期からその作用を示し始めることが分かった。目標としていた有効性の高いTRAILの選定ができ,さらにそのTRAILの殺腫瘍細胞効果が細胞内のTRAIL経路を介したアポトーシスであることが分かったから。次年度は予定通り,内在性TRAILの誘導物質であるTIC10の犬の血管肉腫細胞に対する細胞傷害効果を検討する。さらに,TRAILの作用を増強するとされるZerumboneの効果も併せて評価する。
有明海人食いバクテリアの微生物学的性状解析および防除法

バルニフィカス症患者由来Vibrio vulnificusMY株を用いたマウス感染モデル系を構築することに成功したため、Vibrio vulnificus MY株を宿主としたバクテリオファージの分離を試みたが、分離できなかった。また、有明海底泥から分離した、Vibrio vulnificusNBRC 15645^Tに感染性を示したファージについてはVibrio vulnificusMY株に対して感染性を示さなかった。ファージセラピーの応用を考慮した場合、様々なビブリオ・バルニフィカス株に感染する、すなわち宿主特異性の低いバクテリオファージの分離が必要であるため、ビブリオ・バルニフィカス感染症患者由来株や有明海より分離された株を指示菌として引き続き有明海からのバクテリオファージの分離を行う予定である。さらに現行のマウス足底部への皮下注射による感染モデル系は、バルニフィカス症感染経路である経口摂取を再現していないために、経口投与によるマウス感染モデル系の構築も行う予定である。佐賀大学医学部検査部保有のVibriovulnificus株に対して16S rRNA解析を行い、Nilssonらの報告に従って区分した結果、患者株でTypeBが多数を占める結果であることはNilssonらの報告と同様であったが、非患者(環境)株でもほとんどがTypeBであるという結果はNilssonらの結果と全く異なる結果であった。この結果から有明海由来Vibrio vulnificusはTypeBが優占株であると考えられるが、この識別では毒素生産や発症メカニズムとの相関が明らかとされていないため、有明海由来Vibrio vulnificusのほぼ全てが病原性株ということではない。また、病原性・非病原性別の抗体価の検討ではどちらのタイプでも感染を惹起し、発症させることが明らかとなった。有明海における2つの異なる地点の泥からそれぞれ2種類の合計4種類のバクテリオファージを分離した。いずれのバクテリオファージもVibrio vulnificusNBRC 15645^Tにのみ感染する高い宿主特異性を示した。ファージセラピーの応用を考慮した場合、様々なビブリオ・バルニフィカス株に感染する、すなわち宿主特異性の低いバクテリオファージの分離が必要である。そこで、Vibrio vulnificusNBRC 15645^T以外にビブリオ・バルニフィカス感染症患者由来株や有明海より分離された株を指示菌として引き続き有明海からのバクテリオファージの分離を行う予定である。また、マウスによる感染モデル系を構築することに成功したため、分離したバクテリオファージ投与によるファージセラピーの開発を行う。分離源が異なることから分離したバクテリオファージは最低2種類であることが示唆された。
非線形弾性波動方程式系に対する初期境界値問題

弾性ポテンシャルを持つ等方的な非線形弾性波動方程式系に対する初期値問題の大域解が、非線形項がnull conditionを満たすとき存在することを研究代表者とT.C.Siderisが独立に示した。物理的には初期条件のほかに境界条件(Neumann typeまたはDirichlet)を課すのが自然である。一般的な状況で大域解の存在を示すのは困難と思われるので、解を球対称、境界を球面、境界条件をtraction problemと呼ばれるNeumann typeの境界条件とし、本研究ではこの条件のもとで非線形方程式と境界条件を具体的に導き大域解の存在証明を目指してきた。研究の第一歩として、線形の初期境界値問題のエネルギー不等式がどのような媒体に対して成立するかを調べた。昨年度の実績報告書で、外部問題では任意の媒体に対しエネルギー不等式が成立するが、内部問題ではボアソン比の値によって必ずしもエネルギー不等式が導けないことを報告した。本年度、研究協力者が新しいエネルギー等式を導き、昨年度のエネルギー不等式に加えることによって、任意の媒体に対してエネルギー不等式が成立することを示した。現在、特性多様隊に垂直な方向微分に対して局所エネルギー減衰を研究中である。他方、Dirichlet境界条件を満たす外部問題に対しては、初期値問題のとき表れたnull conditionの下で大域解の存在をJ.Wetcalfe-B.Tomasesが昨年示した。公立はこだて未来大学は数学の欧文雑誌が少ないので本年度も欧文雑誌Communication in Partial Differential Equationsを購入した。弾性ポテンシャルをもつ等方的な非線形弾性波動方程式系に対する初期値問題の大域解は、非線形項にいわゆるnull conditionを課すときのみ存在することが、研究代表者とT.C.Siderisによって独立に2000年に証明された。物理的には初期条件のほかに境界条件を課すのが自然であるが、その研究(初期境界値問題)は世界で殆んどなされていないので、本研究で取り上げたしだいである。一般的な状況で問題を解決するのは困難と思われるので、本年度は境界を球面とし、未知ヴェクトルである転位ヴェクトルuが球対称、即ち、u_i=x_iφ(t,r)(r=|x|)の形の場合を取り扱った。質量、運動量保存則から導かれる必ずしも弾性ポテンシャルを持たない等方的な非線形弾性波動方程式系と自然な境界条件はRivlin-Ericksenの定理として知られている。この定理を基にしてφについての方程式と境界条件を決定したのが最初の結果である。この問題設定で、外部境界値問題を考えるとラメ定数達の正値性と密接な関連があり線型方程式に対しては機能しているが、非線形項をどのように取り込んでいくかが今後の問題である。広い意味でこれらの間題に関連した研究分担者の論文Mixed amplitude solutions of semilinear systems of 3-dimensional waveequationsを欧文雑誌Asymptotic Analysisに投稿中である。なお、この大学は歴史が浅く図書関係が整備されていないので、偏微分方程式関係の書籍と欧文雑誌Communications in partial differential eqnationsを購入した。弾性ポテンシャルをもつ等方的な非線形弾性波動方程式系に対する初期値問題の大域解の存在は、2000年に研究代表者とT.C.Siderisによって独立に解決された。物理的には初期条件のほかに境界条件(Neumann又はDirichlet type)を課すのが自然であり、また、世界的に見ても手が付けられていないので、その研究、即ち、初期境界値問題の研究を本研究の課題とした。一般的な状況で問題を解決するのは困難と思われるので、昨年度は未知ベクトルである転位ベクトルがいわゆる球対称であり境界は球面と仮定して、変分問題のEuler方程式より、単独の非線形双曲型方程式とそれに対応するNeumann typeの境界条件を導いた。この方程式の線形部分は5次元の波動方程式の球対称解が満たすべき方程式であることに注意しておく。本年度は線形の初期境界値問題を考え、新しいタイプのエネルギー不等式を導き、解の存在を示した。方法は内部問題と外部問題とでは異なる。

外部問題に対しては初期値問題に対するエネルギー不等式を導いた恒等式を用い、どんな弾性体に対してもエネルギー不等式が成立することを示した。内部問題に対しては、上で述べた方程式に原点からの距離の二乗を掛けると三次元的に見ることが出来き、縮みの度合いを表すPoisson比が三分の一より真に大である弾性体に対してエネルギー不等式が成立することを示した。従って、銅やアルミニュウム、ラバーに対してはエネルギー不等式が成立し、鉄やガラス、スチールに対してはエネルギー不等式が成立しない。これらの事実は平成17年8月に開かれた第30回編微分方程式札幌シンポジュウムにおいて発表し、その報告集Proceedings of the 30^<th>Sapporo Symposium on Partial Differential Equationsに掲載されている。研究分担者の論文が欧文雑誌Nonlinear Analysisに受理された。弾性ポテンシャルをもつ等方的な非線形弾性波動方程式系に対する初期値問題の大域解が,非線形項がnull conditionを満たすとき存在することを研究代表者とT, C.Siderisが独立に示した。物理的には初期条件のほかに境界条件(Neumann typeまたはDirichlet)を課すのが自然である。一般的な状況で大域解の存在を示すのは困難と思われるので,解を球対称とし,境界を球面とし,境界条件をtraction problemと呼ばれるNeumann typeの境界条件とし,非線形方程式と境界条件を具体的に導き大域解の存在証明を目指してきた。研究の第一歩として,線形の初期境界値問題の解のエネルギー不等式がどのような媒体に対して成立するかを調べた.昨年度の実績報告書で,外部問題では任意の媒体に対してエネルギー不等式が成立するが,内部問題ではポアソン比の値によって必ずしもエネルギー不等式が導けないことを報告した。本年度,研究協力者が新しいエネルギー等式を導き,昨年度のエネルギー不等式に加えることによって,任意の媒体に対してエネルギー不等式が成立することを示した。現在,解空間の方向の微分に対して局所エネルギー減衰を研究中である。他方,Dirichlet境界条件を満たす外部問題に対しては,初期値問題のとき表れたいわゆるnull conditionの下で時間大域解の存在をJ, Wetcalfe-B.Tomasesが昨年示した。公立はこだて未来大学は数学の欧文雑誌が少ないので本年も欧文雑誌Communications in Partial Differential Equationsを購入した。
消化器癌の浸潤増殖における炭酸脱水酵素の意義

1.大腸癌培養細胞株(Lovo)への遺伝子移入によりCA-RP VIIIの強制発現細胞株(Lovo-CA8)を作製し、細胞能(MTTアッセイ)および浸潤能(Chemotaxis chamber)を検討した。その結果、Lovoに比べLovo-CA8の増殖細胞数、浸潤細胞数が有意に多かった(p<0.05)。2.LovoおよびLovo-CA8細胞3x10^6個をヌードマウス(6週齢、雌、n=5)の背部に移植し、経時的に腫瘍径を測定した結果、移植後1-3週間の観察期間において、Lovoに比しLovo-CA8の腫瘍径が有意に大きかった(p<0.05)。4.GISTの培養細胞株(GIST-T1)への遺伝子導入により、CA-RP XIの強発現株(T1-CA11)を作製した結果、T1-CA11Iはwild typeのT1に比べ、増殖能および浸潤能が増強した。5.消化器癌以外の癌種として、肺癌におけるCA-RP VIIIの発現を免疫染色法により検討した結果、正常では肺胞繊毛上皮細胞にのみ弱い発現が見られたのに対し、扁平上皮癌の75%(n=24)、腺癌の68%(n=25)では浸潤先端部において強い発現が確認された。また、培養肺癌細胞株(PC9)への遺伝子導入によりCA-RP VIIIを強制発現させた結果、増殖能の増強が見られた。これまでCA-RPの生物学的機能は不明であったが、本研究によりCA-RP VIIIおよびXIが消化器癌の増殖および浸潤能を増強することが示された。同様の結果は肺癌でも確認されたことより、CA-RPはひろく癌細胞の進展に関わっていると考えられた。3、GISTの培養細胞株(GIST-T1)にcDNAを導入し、CA-RP XIの強発現株(T1-XI)を作製した。In vitroの検討でT1-XIはwild typeのT1に比べ、増殖能およぴ浸潤能が増強していた。また、T1およびT1-XIにおけるCA-RPの発現を免疫染色で検討した結果、CA-RP XIの発現の増強とともに、T1では核周囲に分布していたCA-RP VIIIの発現がT1-XIでは細胞質にびまん性に認められた。2、LovoおよびLovo-CA8細胞のin vitroでの増殖能をMTTアッセイにて検討した結果、培養24時間および48時間後において、Lovoに比べLovo-CA8の細胞数が有意に多かった(p<0.05)。また、in vitroでの浸潤能をChemotaxis chamberを用いて検討した結果、Lovoに比べLovo-CA8の浸潤細胞数が有意に多かった(p<0.05)。3、LovoおよびLovo-CA8細胞3x10^6個をヌードマウス(6週齢、雌、n=5)の背部に移植し、経時的に腫瘍径を測定した。その結果、移植後1-3週間の観察期間において、Lovoに比しLovo-CA8の腫瘍径が有意に大きかった(p<0.05)。5、CA-RP VIIIの発現を肺癌組織で免疫染色法により検討した結果、正常では肺胞繊毛上皮細胞にのみ弱い発現が見られたのに対し、扁平上皮癌の75%(n=24)、腺癌の68%(n=25)では浸潤先端部において強い発現が確認された。また、培養肺癌細胞株(PC9)にCA-RP VIII遺伝子導入により同蛋白の強制発現細胞株(PC9-CA8)を作製し、in vitroでの増殖能をMTTアッセイにて検討した結果、PC9-CA8ではPC9に比べ増殖能の増強が見られた。
細胞内でのｎｏｎ－Ｂ　ＤＮＡの構造変化のダイナミクス研究

Non-B DNAの代表的構造であるi-motifとG-四重鎖の構造安定性と構造変化のダイナミクスを解明し、ナノ生命工学への応用するためにi- motifとG-四重鎖中の電荷分離を研究した。その結果、i- motif四重鎖がワイヤ(電子キャリア)として有用であり、G-四重鎖のG-カルテットの優れた正孔捕獲能によって効率的に進行することを見出し、G-四重鎖のG-カルテットが、G一つや2・3つ連続したGより低い酸化電位を有するがわかった。更に、DNAの相同組換えを触媒するタンパク質RecAに注目し、ヒトテロメア配列との相互作用をバルクレベル、単一分子レベルの両面から明らかにした。DNAは細胞内では二重らせん構造だけではなく、三重らせん、四重体DNAなどの非B型構造をとり、遺伝子発現過程に影響する。我々、最近、四重体DNAの電荷分離過程を解明し、その特異性について明らかにした。癌遺伝子やテロメアで観察されるシトシン(C)からなる塩基配列は、酸性条件下でのi-motifという四重体構造を形成する。テロメア配列であるd(5'-(CCCTAA)2CCC-PyUAA-CCC-AQU-3'))のDNA 22-mer一本鎖中に、ピレン(Py)とアントラキノン(AQ)をそれぞれ電子供与体(D)と電子受容体(A)として修飾し、二重らせん構造のDNAとi-motif四重体での光誘起電子移動を観察したところ、前者ではDとA間の電子移動が起こらないが、i-motif四重体では電子移動が速く効率的に起こった。これは、i- motif四重鎖がワイヤ(電子キャリア)として有用であることを示す。さらに、DNAの相同組換えを触媒するタンパク質RecAに注目し、ヒトテロメア配列(配列:5'ーTAG3(T2AG3)3T2ー3')との相互作用をバルクレベル、単一分子レベルの両面から明らかにした。得られた結果から、あらかじめRecA@単鎖DNAを形成しておいた状態からでもK+によってヒトテロメア配列がG-四重鎖を形成することから、K+存在下においてはG-四重鎖構造がより有利な構造であることが示された。さらに、ヒトテロメア配列におけるG-四重鎖はRecA2つと結合して複合体を形成し、そのG-四重鎖は特異的にmajor体構造をとることが明らかになった。DNAの酸化と還元は様々な生命現象における本質的な過程であり、その重要性は明確であり、さらに生命化学やナノ生命工学への応用の可能性からも、近年、DNA中の電子・正孔移動が注目されている。今回我々はレーザーフラッシュフォトリシスとパルスラジオリシスを用いてnon-B DNAの一つであるG-四重鎖中における正孔移動と捕獲についての研究を行った。G-四重鎖はグアニン(G)を多く含む様々な配列によって形成されるDNA二次構造であり、生体外においてテロメアーゼの結合を阻害することや、転写抑制因子として働くことから注目を集めている。近年、DNA中における正孔移動の全体的な効率を決定する上で、正孔捕獲は重要な過程であると考えられるようになった。これまでDNAの酸化における、G-カルテットの役割についての知見は得られていなかった。本研究では、リボフラビンが修飾されたG-四重鎖(Rf-Gーq)では、リボフラビンとG塩基間の電荷分離が、平面構造を有するG-カルテットの優れた正孔捕獲能によって効率的に進行することが明らかになった。1さらに、リボフラビンからG塩基への効率的な電荷移動の後、電荷分離状態が生成し、その後、電荷再結合によるリボフラビンの三重項励起状態(3Rf*)の生成が0.7ns程度の時間領域で起こることが観察された。すなわち、G-四重鎖のG-カルテットがG一つや2・3つ連続したGより低い酸化電位を有するがわかった。このことはG-四重鎖が遺伝子の酸化損傷に対する捕捉剤として働きうることを意味する。本研究で得られた知見から、DNAの損傷と修復において、G-四重鎖の果たす役割が注目され、今後の解明が待たれる。グアニン(G)を豊富に含みGGGTTAの繰り返し配列から成るヒトテロメア鎖はin vitroでK+やNa+存在下においてG四重鎖を形成することが知られていて、2013年にはBalasubramanianらによって生細胞中での存在も示唆された。ヒトテロメア3'末端ではTTAGGGの繰り返しが150塩基以上続くため、理論的にはどの位置でもG四重鎖を形成しうるが、実際にどの位置で優先的に形成されるかは明確でない。また、このような比較的長鎖のヒトテロメア鎖が形成するG四重鎖の構造多様性についてもほとんど知られていない。

我々は各種分光学的手法によってGGG配列を6つ含むヒトテロメア鎖のK+存在下でのG四重鎖形成に関する研究をおこなった。まず観測対象として蛍光標識単鎖DNA(3'-FAM-TAGGG(TTAGGG)5TT-TAMRA-5', 37htel)と、その一部のGをイノシン(I)に置換した単鎖DNAを合成した。GGGの中心のGをIに置き換えたGIG連続配列はG四重鎖形成の構成要員でなくなるため、形成しうるG四重鎖の種類を減らすことができる。これを利用してそれぞれ主に1つのG四重鎖を形成するように設計した5種類のG-I置換ヒトテロメア配列と37htelを熱力学的に解析することによって、比較的長鎖のヒトテロメア鎖のK+存在下における構造と安定性を明らかにした。それに加えて、流体力学半径の変化を一分子レベルで観測することにより得た37htelのG四重鎖形成過程に関する知見も得られたので学会に報告した。研究計画通りに進んでおり、これまでに得られた結果をもとに論文を作成しているからである。in vitroで得られた結果をもとに生きている細胞内でG-quadruplex DNAの構造変化のダイナミクスを明らかにする。細胞内で分解される蛍光分子をもっと安定した蛍光受容体(Acceptor)および供与体(Donor)に交換して、細胞内に投入した後、高い空間分解能(数nm-数十nm)と時間分解能(<50 ps)を持つ共焦点蛍光顕微鏡システムを使用して蛍光強度を測定し、細胞内での構造変化を解明する。得られた結果をもとに生きている細胞内でG-quadruplex DNAの構造変化のダイナミクスを明らかにする。高い空間分解能(数nm-数十nm)と時間分解能(<50 ps)を持つ共焦点蛍光顕微鏡システムを使用して細胞内での構造変化を解明する。平成24年度の研究費が繰越されて、平成25年度の研究費が増加したので研究費が残るました。DNA Sequence外注と細胞培養試薬及び実験道具の消耗品購入する予定です。そして、学会発表の旅費としで使用する予定です。1.遺伝子導入装置購入2.データ解析のためのコンピュータおよびプログラムの購入
呼吸器病原菌のヒト上皮細胞付着因子解明による感染予防戦略への応用

私共は呼吸器感染症の病原因子と発症メカニズムを明らかにし、これらの成果を感染予防戦略に生かすべく研究を続けてきた。これまでの研究の成果として、代表的呼吸器病原細菌のヒト咽頭上皮細胞への付着因子としてモラキセラ・カタラーリスの菌表面の線毛が、また上皮細胞側のレセプターとしてモラキセラ・カタラーリスではGM1、インフルエンザ菌(nontypable株)ではGD2が重要であることを明らかにした。さらに、これらの病原細菌と上皮細胞の付着の経過における荷電の役割についても世界で初めて明らかにした。これらの研究課程で、呼吸器における下気道感染症のファースト・ステップとして上気道上皮細胞への細菌付着があり、これらの付着率と下気道感染症発症が比例するものであることから上気道上皮細胞への細菌付着を口腔ケア、ガーグリング(うがい)などで防止することが下気道感染症を減少させることをすでに報告した。今回は付着メカニズムでこれまでに明らかとなった、細胞側のレセプターとして重要な糖鎖に影響して細菌の付着を防止することで予防を可能にする呼吸器疾患治療薬の存在を見出し、これらの精細なメカニズムの検討を行った。まず、去痰薬と位置づけられているS-Carboxymethylcysteine(S-CMC)にはモラキセラ・カタラーリスやインフルエンザ菌(nontypable株)の上皮細胞付着を抑制する作用があることをin vitroおよびin vivo実験で明らかにした。一方、ambroxolにはその作用は全く認められなかった。他の薬物での検討およびもう一つの代表的呼吸器病原細菌である肺炎球菌についても同様の検討を行い、菌株による差異はあるもののS-CMCに強力な付着抑制作用を見出した。これらの成績は感染予防戦略への薬物の応用を可能としたものであり、今後さらに、研究の発展が期待できるものである。最近の研究の成果として、代表的呼吸器病原細菌のヒト咽頭上皮細胞への付着因子としてモラクセラ・カタラーリスの菌表面の綿毛が、また上皮細胞側のレセプターとしてモラクセラ・カタラーリスではGM1、インフルエンザ菌(nontypable株)ではGD2が重要であることを明らかにした。さらに、これらの病原細胞と上皮細胞の付着の過程における荷電の役割についても世界で初めて明らかにした。これらの研究過程で、呼吸器における下気道感染症のファースト・ステップとして上気道上皮細胞への細菌付着があり、これらの付着率と下気道感染症発症が比例するものであることから上気道上皮細胞への細菌付着の口腔ケア、ガーグリング(うがい)などで防止することが下気道感染症を減少させることをすでに報告した。まず、去痰薬と位置づけられているS-Carboxymethylcysteine(S-CMC)にはモラクセラ・カタラーリスやインフルエンザ菌(nontypable株)の上皮細胞付着を抑制する作用があることをin vitroおよびin vivo実験で明らかにした。他の薬物での検討およびもう一つの代表的呼吸器病原細菌である肺炎球菌についても同様の検討を行う準備中である。いずれにしても、これらの成績は感染のファースト・ステップである病原体の細胞付着を確実に抑制する薬物を見出すことで,感染予防戦略への応用を可能にしたものであり,今後さらに,研究の発展が期待できるものである。

私共は呼吸器感染症の病原因子と発症メガニズムを明らかにし、これらの成果を感染予防戦略に生かすべく研究を続けてきた。これまでの研究の成果として、代表的呼吸器病原細菌のヒト咽頭上皮細胞への付着因子としてモラキセラ・カタラーリスの菌表面の線毛が、また上皮細胞側のレセプターとしてモラキセラ・カタラーリスではGM1、インルエンザ菌(nontypable株)ではGD2が重要であることを明らかにした。さらに、これらの病原細菌と上皮細胞の付着の経過における荷電の役割についても世界で初めて明らかにした。これらの研究課程で、呼吸器における下気道感染症のファースト・ステップとして上気道上皮細胞への細菌付着があり、これらの付着率と下気道感染症発症が比例するものであることから上気道上皮細胞への細菌付着を口腔ケア、ガーグリング(うがい)などで防止することが下気道感染症を減少させることをすでに報告した、今回は付着メカニズムでこれまでに明らかとなった、細胞側のレセプターとして重要な糖鎖に影響して細菌の付着を防止することで予防を可能にする呼吸器疾患治療薬の存在を見出し、これらの精細なメカニズムの検討を行った。まず、去痰薬と位置づけられているS-Carboxymethylcysteine(S-CMC)にはモラキセラ・カタラーリスやインフルエンザ菌(nontypable株)の上皮細胞付着を抑制する作用があることをin vitroおよびin vivo実験で明らかにした。一方、ambroxolにはその作用は全く認められなかった。他の薬物での検討およびもう一つの代表的呼吸器病原細菌である肺炎球菌についても同様の検討を行い、菌株による差異はあるもののS-CMCに強力な付着抑制作用を見出した。これらの成績は感染予防戦略への薬物の応用を可能としたものであり、今後さらに、研究の発展が期待できるものである。
X線マイクロアナリシスによる骨微細構造構築の主要元素分布に及ぼすCdの影響の検索

X線マイクロアナリシス(EPMA)方法を用いて,骨微細構造に及ぼすCdの影響を検索することを目的として,昭和61年度は,本方法の確立を目ざした.そのために,骨試料の調製方法の検討, EPMA分析条件の決定および検出した元素の定量化を試みた.昭和62年度は,前年度の結果をもとにして, Cd, 10ppmを4週間投与した幼若ラットの上腕骨についてEPMA分析をおこなった.EPMA分析は,まず,走査電子顕微鏡で骨試料を観察しその同地点について定性分析及び面分析をおこなった.骨の主要構成元素:Ca, P, K, Na, Mg等の場合は15KV;0.050.10μA,ビーム径120μmで容易に検出できるが,微量元素の場合は,それぞれについて最適条件を決定することが必要である. Cdの検出については,使用した機種にはCd:K_αの波長を検出するための結晶分析器が装備されていないので, Cd:Lαについて検出を試みた.このCdの検出については,試料の調製方法,測定部位の検討ならびに分析条件の検討などをおこない,骨端部の数箇所において,かなり小さなものではあるが, Cd:Lαと思われるピークを検出した.しかし,バックグランドを減じるための操作をするとこのピークは検出できなくなることから,現段階ではCdの局在を見い出したとはいえない.骨の主要構成元素については,骨での分布と大まかな量を求めてCd投与群と対照群とを比較したが, Ca, P, K, Na, Mg, Clについては,両群の間に差はみとめられなかった. S, Zn, Fe, F等の元素は10μmの照射径で波長とピーク高さを調べる定性分析をおこなうと,はっきりとみとめられるが,但し, Cd投与群と対照群の間には差はみとめられない.これらの元素の面分布の分析による局在部位の同定もまた,試みたが,元素より発生するX線の信号が小さく,明確な面分布はまだ得られていない.X線マイクロアナリシス(EPMA)方法を用いて,骨微細構造に及ぼすCdの影響を検索することを目的として,昭和61年度は,本方法の確立を目ざした.そのために,骨試料の調製方法の検討, EPMA分析条件の決定および検出した元素の定量化を試みた.昭和62年度は,前年度の結果をもとにして, Cd, 10ppmを4週間投与した幼若ラットの上腕骨についてEPMA分析をおこなった.EPMA分析は,まず,走査電子顕微鏡で骨試料を観察しその同地点について定性分析及び面分析をおこなった.骨の主要構成元素:Ca, P, K, Na, Mg等の場合は15KV;0.050.10μA,ビーム径120μmで容易に検出できるが,微量元素の場合は,それぞれについて最適条件を決定することが必要である. Cdの検出については,使用した機種にはCd:K_αの波長を検出するための結晶分析器が装備されていないので, Cd:Lαについて検出を試みた.このCdの検出については,試料の調製方法,測定部位の検討ならびに分析条件の検討などをおこない,骨端部の数箇所において,かなり小さなものではあるが, Cd:Lαと思われるピークを検出した.しかし,バックグランドを減じるための操作をするとこのピークは検出できなくなることから,現段階ではCdの局在を見い出したとはいえない.骨の主要構成元素については,骨での分布と大まかな量を求めてCd投与群と対照群とを比較したが, Ca, P, K, Na, Mg, Clについては,両群の間に差はみとめられなかった. S, Zn, Fe, F等の元素は10μmの照射径で波長とピーク高さを調べる定性分析をおこなうと,はっきりとみとめられるが,但し, Cd投与群と対照群の間には差はみとめられない.これらの元素の面分布の分析による局在部位の同定もまた,試みたが,元素より発生するX線の信号が小さく,明確な面分布はまだ得られていない.骨微細構造に及ぼすCdの影響を検索するために、Cd投与ラット骨におけるX線マイクロアナリシス(EPMA)法を確立することが本年度の計画であった。そのため(1)骨試料の調製方法の検討、(2)EPM分析条件の決定および、(3)EPMAによる元素の定量化を試みた。結果は、骨皮質および海綿骨の構造を走査電子顕微鏡で観察しながらEPM分析をおこなうためには、(1)骨を液体窒素中で凍結割断し乾燥後、割断面に100【A!°】の厚さに金を蒸着し、(2)EPM分析条件は、1523KV;0.050.10μA;照射ビーム径120μが最適であった。この場合、Ca,【K_α】3.36【A!°】,【K_β】3.09【A!°】;P【K_α】6.15【A!°】,【K_β】5.80【A!°】;Mg,【K_α】9.89【A!°】;Na,【K_α】11.91【A!°】,【K_β】11.57【A!°】,11.73【A!°】;S【K_α】5.37【A!°】;Zn,【L_α】12.28【A!°】;Cu

【L_α】13.35【A!°】;F,【K_α】18.30【A!°】は容易に検出され、また、Ge,Cdはかなり困難ではあるが技術の習熟および改良により検出できた。(3)これら元素のEPMAによる定量化については標準試料の作製も含めて現在検討中である。軟骨細胞等の骨細胞のEPM分析については(1)試料の固定方法は、グルタルアルデヒドで固定後脱水,臨界点乾燥した標本およびアルコール固定による標本あるいは固定せずに凍結乾燥した標本について走査電顕像の観察及びEPM分析をおこない比較検討したが、それぞれ一長一短があり、なお検討の必要がある。(2),(3)については上記と同様である。来年度は、骨細胞のEPM分析方法および元素の定量については本年度に引きつづき検討,改良を加えることとし、さらにCd投与ラットの骨皮質および海綿骨組織についてEPM分析をおこなって、Cdの投与濃度に応じて各元素がどのような変化を示すのかをたしかめる。また、骨強度試験によって亀裂が生じた部位について、微細構造の変化を走査電顕で観察するとともにEPM分析をおこない、骨強度低下と構造変化ならびに構成成分の変化との関係を明らかにする。
発癌プロモーターによる癌遺伝子癌抑制遺伝子転写促進に対するHBV-X及びHCV遺伝子移入の影響

発癌プロモーターやHBVあるいはHCVなどの肝炎ウイルスは細胞増殖調節機序に何らかの影響を及ぼし発癌に寄与すると考えられる。発癌プロモーターであるテレオシジンは肝癌の増殖を抑制し,形態を著明に変化させる。このテレオシジン作用のシグナル伝達には通常のプロテインキナーゼCとは構造的に異なると考えられるプロテインキナーゼCが関与することを見出した。このプロテインキナーゼは,おそらく細胞内の小胞体のカルシウムイオンチャンネルのリン酸化を介してカルシウムの細胞質への動員を抑制している可能性が示唆された。またテレオシジンはc-fosやp53の発現を促進することも示唆された。同じ発癌プロモーターであるタプシガルジンは小胞体カルシウムを涸渇させ,核内カルシウムを変化させることによりクロマチン構造を変化させアポプトーシスを促進させる。マイトマイシCやエトポシドとは異なりp53を著増させることはないことから,これらの抗癌剤とは異なる機序でアポプトーシスを誘導すると考えられる。一方テレオシジンはそれ自体アポプトーシスを誘導することはないが,マイトマイシンCやエトポシドによるアポプトーシスの誘導を阻止する。これらの事実から発癌プロモーターは細胞のアポプトーシスの調節機序を介して癌化を促進させる可能性が示唆される。一方,肝炎,肝硬変,肝癌患者からC型肝炎ウイルスRNAをRT-PCR法で検出し,ウイルスの非構造領域の増幅を行なってきた。さらにこのウイルスのエンベロープ領域やN_2,N_3領域の増巾を続けている。これらの遺伝子断片を発現ベクターやレトロウイルスベクターに組み込む作業を行っている。発癌プロモーターであるテレオシジンは肝癌細胞の増殖を抑制し、形態を著明に変化させる。このテレオシジン作用のシグナル伝達には通常のプロテインキナーゼCとは構造的に異なると考えられるプロテインキナーゼCが関与することを見い出した。このプロテインキナーゼは、おそらく細胞内の小胞体のカルシウムイオンチャンネルのリン酸化を介してカルシウムの細胞質への動員を抑制している可能性が示唆された。このことは肝癌細胞の分化誘導にプロテインキナーゼCやカルシウムが密接に関与していることを示唆している。またテレオシジンはc-fosやp53の発現を促進することも示された。従って癌遺伝子と考えられるc-fosの発現の促進が直接癌化の促進に関与するとは考えにくい。同じ発癌プロモーターであるタプシガルジンは、c-fosやp-53の発現を促進するなどテレオシジン作用と類似した作用をもつ。細胞増殖を抑制するとともにテレオシジン作用に括抗し、細胞骨格蛋白の重合や空胞状構造の形成を阻害する。タプシガルジンは小胞体カルシウムATPaseの特異的阻害剤であり、小胞体による細胞質カルシウムの調節が細胞の形態や機能に重要な働きをしていることが示された。一方、肝炎、肝硬変、肝癌患者からC型肝炎ウイルスRNAをRT-PCR法で検出し、ウイルスの非構造領域や構造領域の増巾を行なってきた。ウイルスのエンベロープ領域やN2、N3領域を増巾し、また肝癌からDNAを抽出し、PCRでα-スエトプロティンエンハンサーを増巾した。これらの遺伝子断片を発現ベクターPRC/CMUやレトロウイルスベクターに組み込む作業を行っている。発癌プロモーターであるタプシガルジンは肝癌細胞の増殖を抑制し,形態を著明に変化させる。タプシガルジンの存在下で培養した細胞は小型になり核クロマチンも凝集する。数日後にはDNAのフラグメンテーションがおこり,細胞はアポプトーシスにより死滅する。タプシガルジンは小胞体カルシウムATPaseの特異的阻害剤であり,タプシガルジン処理により細胞質カルシウムは急速に増加する。しかしこの増加は一過性でありまもなく細胞質カルシウムはもとのレベルにまで低下する。

しかし小胞体カルシウムは減少したままであり,上皮細胞増殖因子(EGF)やバゾプレシンによるカルシウム動員作用も阻止される。タプシガルジンによる小胞体カルシウムの涸渇作用は長時間持続し,このことが核のカルシウムレベルを変化させ,クロマチンの凝集,さらにはDNAの断片化をもたらしアポプトーシスの原因となると考えられる。タプシガルジンによるアポプトーシスの誘導は,マイトマイシンCやエトポシドとは異なり核内のp53の増加を伴わない。このことはp53に対するp53特異抗体を用いたウエスターンブロッティングとフローサイトメトリーで証明される。この事実から肝癌細胞におけるアポプトーシスの誘導には少なくとも2つの異なる経路の存在が推測された。マイトマイシンCやエトポシドによるアポプトーシスの誘導はP53による細胞周期の遅延あるいはDNAの修復の過程を含むが,タプシガルジンはこのプロセスとは別にクロマチン構造の変化をもたらすと考えられる。
炎症・免疫系シグナルと骨形成の新たな接点の探索

炎症・免疫系シグナルのBruton's tyrosine kinase(Btk)およびC reactive protein(CRP)/FcRシグナル伝達系は、骨芽細胞分化を抑制するシグナルであることが示唆された。また、様々な機能があると思われるMEK5シグナル伝達系も骨芽細胞分化を抑制していることが示唆され、これらシグナル伝達系を抑制する化合物は骨形成促進のための薬剤候補として考えられた。我々は、免疫系組織を構成するB細胞に重要な役割を果たしているB cell antigen receptor (BCR)シグナル伝達系の構成タンパクであるspleen tyrosine kinase(Syk)が、骨芽細胞や間葉系幹細胞様の性質をもつ骨髄間質細胞に発現していることを確認、報告し、同時にSykが骨芽細胞分化の負の制御因子であることも報告した。この報告ではさらに、骨芽細胞におけるSykシグナル伝達系の下流に、以前我々が報告してきたMAPKやPKCが関与している可能性を示した。これらのことから、これまでの我々の一連の研究が更なる免疫系シグナルと骨形成との接点とその広がりを示唆していると考えられたため、BCRシグナル伝達系を構成する別のタンパクであるBruton's tyrosine kinase(Btk)について、骨芽細胞や間葉系細胞における発現とその機能について検討した。Btk阻害剤は、マウス前骨芽細胞株MC3T3-E1、マウス骨髄間質細胞株ST2およびマウス頭蓋冠より採取した骨芽細胞の骨芽細胞分化を促進(骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ、オステオカルシンmRNA発現の亢進と細胞外基質石灰化促進)することを見出した。また、阻害剤の効果を確認するためにBtkのRNAiによるノックダウン実験を行い、Btkノックダウンによっても骨芽細胞分化促進を確認することができた。一方、ICRマウスを用いたヒトBMP-2含浸コラーゲンコンポジット移植による異所性骨形成においては、Btk阻害剤の腹腔内投与は消化管障害を引き起こし、十分な異所性骨形成促進作用の解析は困難であった。このため、動物実験における骨形成促進作用の解析は、他の実験系を用いる必要があると考えられ、再考を要した。我々は、B cell antigen receptor (BCR)シグナル伝達系の構成タンパクであるBruton's tyrosine kinase(Btk)について、骨芽細胞や間葉系細胞における発現とその機能について解析し、論文報告をおこなった。これに引き続き、Mitogen-activatedprotein kinase kinase 5 (MEK5)シグナルの骨芽細胞分化への影響を検討した。MEK5阻害剤は、骨芽細胞の分化を促進(骨芽細胞分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ、オステオカルシンmRNA発現の亢進と細胞外基質石灰化促進)することを見出した。また、阻害剤の効果を確認するためにMEK5のRNAiによるノックダウン実験を行い、MEK5ノックダウンによっても骨芽細胞分化促進を確認、これらの論文報告をおこなった。また、一方、炎症性サイトカインとして知られているインターロイキン6(IL-6)の骨芽細胞分化におけるシグナル伝達の解析中に見出したMEK1およびMEK2の骨芽細胞分化への機能の違いについて新たに検討をおこなった。これらのシグナル伝達系タンパクは細胞増殖に加え、免疫などの様々なシグナル伝達に関与しているとされる。我々の検討において、MEK2の抑制は骨芽細胞分化の促進に働くが、MEK1抑制は骨芽細胞分化への影響が少ないという予備実験での結果が得られた。これら結果をもとに学会報告をおこないつつあり、また論文投稿の準備中である。整形外科骨代謝炎症シグナルとしてのBtkやMEK5の骨芽細胞への作用の解明については、ほぼ結果が得られている。このため、今後は他のシグナル系やキナーゼなどの骨芽細胞分化に対する影響を解析していく予定であり、さらなる炎症系シグナルと骨形成の関連を解析しうるため。炎症系シグナルに関与するキナーゼ等の骨芽細胞分化への作用を予備実験にて確認している。これらを踏まえて、今後はこれらのタンパクの骨芽細胞分化への影響をRNAi実験や阻害剤実験を通じて解析予定である。時間的経済的に可能であれば、動物実験も開始したいと考えている。今年度の実験結果をまとめ、論文投稿を準備していたため、相対的に実験、特に動物実験を行うことが少なかった。このため、今年度想定してたより実験の消耗品使用が少なく、次年度使用額が生じたと考えている。すでにいくつかの実験ターゲットとなる分子を同定しており、これを同時に解析していくこととなる。このため、次年度には以下の実験により消耗品を多量に使用する予定である。In Vitro実験では、骨芽細胞株およびBMPを作用させることにより骨芽細胞分化することが示されている骨髄間質細胞株ST2を用い、阻害剤およびRNAiによる機能阻害とウイルスベクターによる過剰発現を行い、ターゲット分子の機能解析予定である。In Vivo実験では、水溶性阻害剤によるBMP-2含浸ペレットによる骨形成実験と骨粗鬆症モデルや骨折モデルマウスによる骨形成実験を予定している。
高温型燃料電池の開発とその高性能化

エネルギーは利用に便利な電力か、貯蔵、輸送に便利なガソリンや都市ガスなどの燃料の形で利用末端に供給されている。このようなシステムの中で、環境汚染の心配が少なく、しかも燃料を高い効率で直接に電力に変換できる燃料電池の開発はエネルギー有効利用の見地から重要な課題と考えられる。そこで、天然ガス、石炭ガス、メタノール、エタノールなどの合成燃料の高いエネルギー変換効率での電力への変換が期待できる6001000°Cで作動する高温型燃料電池に焦点を絞り、その開発と高性能を目的として、次の3項目について研究を行った。1.溶融炭酸塩用耐食材料の開発・・・電池の電解質に溶融アルカリ炭酸塩を用いる溶融炭酸塩型燃料電池の電極の活性化と耐食性材料の開発を目指して研究を進め、電極反応、材料の腐食反応の機構を明らかにするとともに、分極の低減、材料の耐食性向上のための新しい方法として、ステンレス鋼への第三成分としてのアルミニウムの添加、ニッケル表面のイットリウムでの改質などを提案した。2.触媒電極の開発・・・燃料電池内部で燃料の改質を行うと発電中に発生する熱を燃料の改質反応に利用でき、発電効率の向上が期待できる。そのための内部改質型燃料電池に用いる改質触媒の開発を進め、ニッケルやルテニウムをセリアなどの希土類酸化物をサーメットにした触媒が改質反応、電極反応両面ですぐれた特性をもつことを明らかにした。3.固体電解質燃料電池の実用化のための新材料・新技術の確立・・酸化物イオン導電性を示す固体酸化物電解質を用いた全固体型燃料電池の実用化を目指して、電極・固体電解質・反応ガスの三相界面を設計するとともに、電池を高性能化するための新材料・新技術を提案した。平板型積層構造をとるためのアルミナを添加した新しい電解質や均等な熱発生が期待できるプロトン、酸化物イオン混合導電性電解質を提案した。