hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複眼動画像立体視認識による自律型水中ロボットの誘導嵌合制御の確立と実海域実証実験

また、深海海底での嵌合を想定し、夜間の漆黒混濁環境下での勘合実験を行った。発光マーカーを用いることによって、漆黒混濁環境での模擬充電実験に成功した。この成功は、深海海底での自動充電実現の可能性を示すものであり、今後充電実証実験を進める重要なステップとなった。[自由航行ー帰還ー模擬充電繰り返し充電循環自律行動の準備完了]水中ロボットは企業との共同研究での支援を受けて改良、製作した。このROVは前年度までの水中ロボットに比べて推進能力に優れているが、自己位置保持などの制御性能では劣る。しかし推進能力が優れているため運動能力は良いものの、ROVの最大の欠点である制御用ケーブルの張力の影響を受けて勘合動作などのビジュアルサーボ動作の精度が悪く、安定性に欠けるという問題点があった。この問題を解決するため船体上部に浮力体を付け、船体下部におもりを取り付けた。さらに船体後方に三角形の尾翼をスタビライザーとして取り付けた。この船体を用いて繰り返し充電循環自律行動を実証する実海域実験を進める予定である。【気中での両眼転導複眼立体視によるロボット制御実現】申請者らは実時間3次元空間認識に基づくロボットの運動制御について研究を続け,(a)ステレオビジョンを用いビデオレート(30画面/s,1画面当たり33ms)の映像通信速度で供給される動画像速度に時間的に遅れることなく3次元位置姿勢を実時間で計測できる空間認識方法を確立し,(b)上記計測結果をフィードバック情報としてハンドアイロボットの位置姿勢を制御し安定した実時間ビジュアルサーボ制御が可能であることを気中で実証した.上記制御に加え,両眼転導機能を実現し精度を向上させたビジュアルサーボ系を構築した.ハンドアイロボットの両眼転導複眼立体視によるビジュアルサーボ制御はユニークな制御方法である.両眼転導は,対象物を常に画面中央に撮像できるためレンズひずみによる収差の影響が少なく高精度の制御が可能である.以上の成果により複眼動画像立体視を用いた空間認識に基づく制御技術の気中での機能及び実用性について実証を終え,複眼空間認識を水中ロボットへ応用する段階に進んだ.【科学研究費による研究活動】ROVを用いてプールや瀬戸内海牛窓の実海域での連続勘合実験を行い,(1)海水濁度レベルが低い(5FTU以下),(2)昼間の光環境,(3)海流方向に対し模擬充電ステーションの嵌合穴方向の平行を維持,が満足されれば最大90回程度(約1時間)の連続嵌合(嵌合ストローク600mm)が可能であることを実証した.さらに嵌合穴とROVの相対位置・姿勢を測定する3次元マーカーを発光型に改良し,(a)濁度レベルが12FTU程度,(b)深夜の光環境,という深海模擬環境において連続勘合が可能であることを実証した[2017年12月].以上の研究成果より,基盤研究一般(C),課題番号16K06183の研究目標を達成した.[実海域帰巣性能確認実験]広和(株)より提供を受けている水中ロボットは50m水深まで潜航可能であり、岡山県地域の入江での帰巣性能確認実験を行うことができる潜航能力を持つ。
多層的プロテオーム解析による小児先天性腎疾患尿中バイオマーカー開発

先天性腎尿路異常やネフロン癆は腎不全に至る小児腎疾患としては稀ではない。しかしこれらの尿中バイオマーカーが存在せず、早期診断が困難である。本研究では患者の尿中に放出される微小分泌小胞「エクソソーム」を解析し、簡便かつ鋭敏な診断が可能となる疾患マーカーの同定を目指す。東京大学小児科ほか協力施設から小児腎疾患患者(ネフロン癆、先天性腎尿路異常など)の尿サンプルを収集し、尿中エクソソーム分画の精製ののちに質量解析により蛋白を網羅的に解析した。これらの結果は早期診断への道を開くのみならず、いまだ明らかになっていないCAKUTやネフロン癆の発症や進行における分子メカニズムの解明に繋がる可能性がある。先天性腎尿路奇形や若年性ネフロン癆の早期診断マーカーは現在存在しない。これらの患者は検尿のみでは見逃され、末期腎不全の状態で発見される例も多い。尿中バイオマーカーの探索を目的とした研究はこれまでに数多く行われてきたにもかかわらず、CAKUTやネフロン癆の早期発見につながるマーカーは開発されていない。その原因はこれらの疾患では血尿蛋白尿を生じず、また希釈尿となることが多いため尿そのものの解析では尿中に極微量含まれる疾患特異的マーカー候補の検出が困難だったからである。また海外においては本邦のような三歳児検尿や学校検尿システムが存在せず、小児腎疾患の早期発見を目指した社会的体制の確立が困難であることも原因である。近年、産生元細胞の分子的特徴が複製された微小分泌小胞「エクソソーム」が尿にも豊富に含まれることが分かってきた。本研究では、腎病変組織由来エクソソームを尿中より単離し、網羅的なプロテオーム解析から各種腎疾患特異的タンパク質を同定することによって、早期発見が難しい小児腎疾患の新規診断法の開発を目指す。早期診断マーカーの道程を目的として、平成28年度として協力医療機関での倫理審査の承諾を得て(1)先天性腎尿路奇形患者(低形成腎、水腎水尿管症、膀胱尿管逆流症)、(2)ネフロン癆患者のサンプルと(3)正常コントロールサンプルのサンプルを収集した。目標症例数の三分の二ほどにに到達している。これらのサンプルからの尿エクソソーム分画の精製を行い、解析に供するための準備を整えている。エクソソーム分画の精製に用いる超遠心機の故障のため一部のサンプルのエクソソーム精製が遅れていた。使用できる機材が別のものになった場合に精製方法が変わってしまいサンプル間の比較ができないため、新たに全サンプルで精製を行い解析に供することとなった。尿中バイオマーカーの探索を目的とした研究は、これまでに数多く行われてきたにもかかわらず、先天性腎尿路異常(CAKUT)やネフロン癆の早期発見につながるマーカーは開発されていない。近年、産生元細胞の分子的特徴が複製された微小分泌小胞「エクソソーム」が尿にも豊富に含まれることが報告された。本研究では、腎病変組織由来エクソソームを尿中より単離し、網羅的なプロテオーム解析から各種腎疾患特異的タンパク質を同定することによって、早期発見が難しい小児腎疾患の新規診断法の開発を目指した。早期診断マーカーの同定を目的として、協力医療機関での倫理審査の承諾を得て(1)先天性腎尿路奇形患者(低形成腎、水腎水尿管症、膀胱尿管逆流症)、(2)ネフロン癆患者のサンプル合わせて44検体と(3)正常コントロールサンプルを目標数収集し得た。エクソソーム分画の精製に用いる超遠心機の故障のため一部のサンプルのエクソソーム精製が遅れ、最終的には超遠心機を用いない新たな手法で尿よりエクソソーム分画を精製することとなり、その手法の確立に想定以上に時間を要した。以前の方法で精製したサンプルとの比較ができないため、新たに全サンプルで精製を行うこととなった。新たに精製した尿エクソソーム分画の質量解析により最終的なバイオマーカーの探索を行うまでに至った。

全サンプルのプロテオーム解析結果から同定されたバイオマーカー候補分子の機能解析として腎組織を用いた解析やヒト腎細胞株を用いた解析を行い、新たなバイオマーカーの病態への関与について分子生物学的な検討を実施する。また得られた新規マーカー候補についてELISA方による定量評価系を構築し、マススクリーニングとして有用であるかどうかを検証する。小児科学超遠心機の故障のため解析が予定より遅れていること、及びそのために全サンプル調整をやり直す必要があり本年度質量解析に供するサンプル数が限られていた。これらの解析を次年度行う必要が生じた。H28年度に計画していたサンプルの解析も含めてH29年度に行う予定である。
金属含有アルミノホスフェートを基盤とする液体燃料合成用触媒の開発

本年度は、ケイ素を含むアルミノホスフェート)(SAPO-n)の合成と触媒特性に重点をおいて研究を行った。SAPO-11について最適の合成条件を検討するとともに、ケイ素の仕込量を変えて合成を行い、合成物中のケイ素量と仕込量との関係を求めた。また、合成物のNMR、(Al、Si、P)を測定し、焼成処理によりアルミニウムが骨格構造から離脱することを明らかにした。SAPO-11へのピリジン吸着により、SAPO-11はブレンステッド酸性を有することが分かった。また、アンモニアの昇温脱離スペクトルの結果からSAPO-11の酸強度はZSM-5よりも弱く、MAPO-5よりも強く、HYゼオライトと同程度であることが分かった。SAPO-11を触媒として、エタノールの脱水反応およびメタノールの炭化水素への転化反応を行った。SAPO-11、SAPO-5はMAPO-n、MnPO-nにくらべて高い活性を示した。活性はHYとほぼ同程度であったが、HYの方が高い活性を与えた。アルミノホスフェートの骨格を2価金属で置換するよりも、4価のケイ素で置換する方が高酸性、高活性の触媒が得られることが明らかになった。MAPO-nがメタノールからの炭化水素の合成に活性をもたないのに対し、SAPO-11は700Kで炭化水素収率77%を与えた。生成物は低級オレフィンが多く、芳香族炭化水素の多いZSM-5の場合と対照的である。生成物分布の違いは、両者の酸強度の違いを反映したもので、SAPO-11では水素移動反応が起こりにくいことを示している。活性はケイ素含量の増加とともに増大したが、生成炭化水素の分布はケイ素含有量により変化しなかった。
多様な反応選択性の自在制御に向けた水素結合供与型不斉ルイス酸触媒の開発

有機合成技術が著しく進歩した現在においても、反応の化学・位置・立体といった様々な選択性を思いのままにコントロールするのはいまだに困難である。本研究は、基質を強力に活性化するルイス酸触媒作用に柔軟な水素結合を組み合わせる「水素結合供与部位を有する配位子設計」により、多様な選択性を自在に制御可能な分子触媒を開発することを目的としている。前年度に見出したγ-ブテノリドとα-ケトエステルのα位選択的付加反応について、立体選択性の向上を目指した検討を行った。立体選択性が発現しない原因は、触媒構造の自由度が高過ぎることおよび触媒中の水素結合供与部位が適切に基質を認識できていないことにあると推測した。そこで、本年度は、より剛直な母骨格の選択と水素結合供与官能基のスクリーニングを指針として触媒構造を検討した。しかし、いずれの場合も位置選択性は低下し、当初見出した触媒構造がα位選択性発現に重要であることがわかった。一方、本研究の当初の計画である分子認識部位としての水素結合供与官能基を持つキラルルイス酸の開発にも引き続き取り組んだ。今回、金属の配位子として汎用される2,2'-ビピリジン骨格に対し、ウレアを有するキラル側鎖を導入した不斉配位子を新たに設計し、その合成経路を確立した。合成した本配位子の触媒機能を評価するため、種々の反応を検討したところ、不斉Henry反応を始めとする種々の反応が中程度の立体選択性で進行することを見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。触媒系が持つ位置及びエナンチオ選択性の同時制御能を評価するためのモデル反応としてブテノリドの求電子剤に対する求核付加反応を取り上げた。水素結合供与部位を持つ不斉配位子と各種金属塩を組み合わせたルイス酸触媒を用い、α-ケトエステルへのブテノリド付加を試みたが、反応は進行しなかった。そこで上記検討に用いた配位子の構造を改変した有機塩基を新たに合成し、塩基触媒として用いたところ、ブテノリドがα位で優先して付加することを見出した。ブテノリドの直接的触媒的付加反応は、ほとんどの場合γ位で進行することが知られており、通常とは異なる位置選択性を達成することができた。一方得られた付加体はラセミ体かつジアステレオマー比が約1:1であり、立体制御には至っていないことがわかった。ジアステレオマー比に関してはC-C結合形成後に最初にできる生成物が塩基触媒によって異性化する過程で低下することを強く示唆する実験結果が得られている。他の求電子剤を用いた反応も実施したが、α-ケトエステルの場合に比べて位置選択性は低下した。現在立体選択性の獲得に向けて、触媒構造のさらなる改良を行っている。当初目的としていた水素結合供与型ルイス酸触媒による多様な選択性制御には至っていないが、新たに合成したキラル塩基触媒を用いることで類例の少ないブテノリドのα位選択的付加反応を見出すことができた。一方で、立体選択性は発現しておらず、母骨格の変更を含めた触媒構造の改良が必要である。反応の立体選択性が発現しない原因として、触媒構造が比較的柔軟であり基質に対し適切な不斉場を提供できていない可能性が考えられる。そこで1.剛直な母骨格の利用、2.より強力な水素結合供与部位の導入による求核種、求電子種の同時認識という二つの方針に基づき、最適な触媒構造の探索を行う。また当初予定していた水素結合供与型ルイス酸の開発に向け、柔軟な水素結合供与部位を持つ新たな不斉配位子の開発を行っていく。
脊髄後根神経節細胞における未知なる痛覚伝達物質の検索および機能解析-新たな鎮痛薬の開発を目指したオーファンレセプターの解析-

落痛のメカニズムは末梢、脊椎レベルでの機序が明らかとなり、イオンチャネルやG蛋白共役型受容体(GPCR)が疼痛発生に関与しているという報告がなされてきた。しかし、吸入麻酔薬や静脈麻酔薬が脊椎レベルでこれらの受容体やイオンチャネルにどのように影響を与えて鎮痛作用を引き起こしているかについては未だにはっきりした結論が出ていない。脊髄後根神経節(Dorsal Root Ganglia以降DRG)細胞は各種の痛覚伝達に関する神経伝達物質を多く含み侵害刺激の神経伝達において重要で、麻酔薬の作用部位になっていると考えられるが総合的な解析は進んでいない。今年度は、脊髄レベルでの麻酔薬の抗侵害作用を総合的な解析を行う目的で培養DRG細胞とアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて以下の研究を行った。1.培養DRG細胞におけるサブスタンスP(Sub P)刺激による細胞内Ca^<2+>の変動に対する麻酔薬の影響を解析した結果、麻酔薬ハロセンが、Sub P刺激によるCa^<2+>の上昇を抑制する結果を得た。またアフリカツメガエル卵母細胞系を用いてSub P受容体を吸入麻酔薬の多くは抑制する結果を得た。2.電位依存性Naチャネルやニコチン性アセチルコリン受容体にどのように影響するかも解析し、麻酔作用をもつアルファキサロンや麻酔薬の一部が抑制することを確認した。現在は、培養DRG細胞を用いて麻酔薬がグルタミン酸受容体にどのように影響するかをパッチクランプ法を用いて解析しているところである。今後はCGRP受容体にいかに作用するかを検討する。最終的にはDRGの疼痛刺激伝達物質の受容体としてSub P受容体とCGRP受容体のノックアウトマウスを用いて行動薬理学的に麻酔薬の抗侵害作用がどのようになるかを検討している。以上の検討をすることにより、麻酔薬の鎮痛作用機序を総合的に解析し麻酔薬の脊椎レベルで作用機序にGPCRが多いに関与していると考えられる結果が得られた。疼痛のメカニズムは末梢、脊椎レベルでの機序が明らかとなり、イオンチャネルやG蛋白共役型受容体(GPCR)が疼痛発生に関与しているという報告がなされてきた。

最終的にはDRGの疼痛刺激伝達物質の受容体としてSub P受容体とCGRP受容体のノックアウトマウスを用いて行動薬理学的に麻酔薬の抗侵害作用がどのようになるかを検討する。以上の検討をすることにより、麻酔薬の鎮痛作用機序を総合的に解析し麻酔薬の脊椎レベルで作用機序を明らかにしたいと考えている。疼痛のメカニズムは末梢、脊椎レベルでの機序が明らかとなり、イオンチャンネルやG蛋白結合受容体(GPCR)が疼痛発生に関与しているという報告がなされてきた。しかし、吸入麻酔薬や静脈麻酔薬が脊椎レベルでこれらの受容体やイオンチャネルにどのように影響を与えて鎮痛作用を引き起こしているかについては未だに結論が出ていない。脊髄後根神経節(Dorsal Root Ganglia以降DRG)細胞は各種の痛覚伝達に関する神経伝達物質を多く含み侵害刺激の神経伝達において重要で、麻酔薬の作用部位になっていると考えられるが総合的な解析は進んでいない。今年度は、脊髄レベルでの麻酔薬の抗侵害作用を総合的な解析を行う目的で培養DRG細胞とアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて以下の研究を行った。(1)培養DRG細胞におけるサブスタンスP(Sub P)、ムスカリン刺激による細胞内Ca^<2+の変動に対する麻酔薬の影響を解析した結果、麻酔薬ハロセン、エタノールが、Sub P刺激やムスカリン刺激を抑制する結果を得た。またアフリカツメガエル卵母細胞系を用いてSub P受容体やムスカリン受容体を吸入麻酔薬の多くは抑制する結果を得た。(2)現在は、培養DRG細胞を用いて麻酔薬がグルタミン酸受容体にどのように影響するかをパッチクランプ法を用いて解析しているところである。(3)今後はCGRP受容体やTRP受容体イオンチャネルに対していかに作用するかを検討する。最終的にはDRGの疼痛刺激伝達物質の受容体としてSub P受容体、ムスカリン受容体、CGRP受容体のノックアウトマウスを用いて行動薬理学的に麻酔薬の抗侵害作用がどのようになるかを検討する。以上により、麻酔薬の鎮痛作用機序を総合的に解析し麻酔薬の脊椎レベルで作用機序を明らかにしたいと考えている。疼痛のメカニズムは末梢,脊椎レベルでの機序が明らかとなり,イオンチャネルやG蛋白共役型受容体(GPCR)が疼痛発生に関与しているという報告がなされてきた。しかし,吸入麻酔薬や静脈麻酔薬が脊椎レベルでこれらの受容体やイオンチャネルにどのように影響を与えて鎮痛作用を引き起こしているかについては未だにはっきりした結論が出ていない。脊髄後根神経節(Dorsal Root Ganglia以降DRG)細胞は各種の痛覚伝達に関する神経伝達物質を多く含み侵害刺激の神経伝達において重要で,麻酔薬の作用部位になっていると考えられるが総合的な解析は進んでいない。今年度は,脊髄レベルでの麻酔薬の抗侵害作用を総合的な解析を行う目的で培養DRG細胞とアフリカツメガエル卵母細胞系を用いて以下の研究を行った。1.培養DRG細胞におけるサブスタンスP(Sub P)刺激による細胞内Ca^<2+>の変動に対する麻酔薬の影響を解析した結果、麻酔薬ハロセンが、Sub P刺激によるCa^<2+>の上昇を抑制する結果を得た。またアフリカツメガエル卵母細胞系を用いてSub P受容体を吸入麻酔薬の多くは抑制する結果を得た。
α線核種によるがん治療の線量評価に基づく正常細胞障害の解明に関する研究

本研究の概要は、腫瘍モデルに211At標識化合物を投与して吸収線量と抗腫瘍効果を評価し、治療後に摘出した正常組織から採取した細胞および211Atを反応させたヒト正常細胞株の染色体異常を解析してα線による細胞毒性を明らかにするとともに、α線による二次発癌について検討を行う研究である。
低次元カーボン系チャネルエンジニアリング

カーボンナノウォ-ルは、基板に対して垂直成長した積層グラフェンシートで構成されたカーボンナノ材料の一種であり、その特徴的な形状と、優れた電気的特性から次世代のデバイス材料としてその応用が期待されている。本研究では、カーボンナノウォ-ルの結晶構造、配向性および電気的特性を制御するために、プラズマ化学気相堆積法によるカーボンナノウォ-ル成における成長機構を解明し、カーボンナノウォ-ルの制御合成技術を確立した。精密なプラズマ気相計測と制御に基づいた制御合成技術により、ラジカルやイオンの個別制御が可能となる。また活性種の組成だけではなく、イオンのエネルギーとフラックスが、カーボンナノウォ-ル成長や形態の決定要因であることと、カーボンナノウォ-ル成長に最適なラジカル、イオンの照射条件を明らかにした。スケーリング則によるSi-MOSFETデバイスの限界を打開するために、ナノメーターサイズのグラフェンシートが自己組織的に2次元成長したカーボンナノウォール(CNWs)とSiデバイスとの融合を目指す。本研究では、カーボンナノチューブと成長機構や構造を大きく異とする積層グラフェンシートの電子物性制御技術の確立と新機能を探索する。これによりCNWsを用いたリソグラフィーの解像度に制限されない自己組織化ナノプロセス技術とプロセッシング科学の構築を基にして、新機能付加超高速集積デバイスの可能性を明らかにする事を目的とする。また、位置、サイズ、形状を制御したCNWsはグラフェンシート構造に起因する移動度(10,00015,000cm^2/Vs)、大電流密度(10^8A/cm^2)を潜在的に有している。これらの物性を最大限に活用するためにCNWsの伝導特性の制御、低コンタクト抵抗、高移動度・電流を実現する技術を確立する。さらに、NおよびBのドーピングあるいは窒化を行い、電気伝導度(p/n)の制御を行ない、低次元カーボン系をベースにした縦型、平面チャネルデバイスを作製し、高速かつ高電流駆動能力の新機能デバイス創成の可能性を明らかにする。ナノメーターサイズのグラファイトによって構成されているカーボンナノウォールの電子物性制御技術の確立と新機能を探索することを目的に、下記に示す研究課題を実行し、知見を得た。1.ナノグラファイト構造の制御カーボンナノウォールはナノメーターサイズのグラファイトによって構成されている。そのため、電子物性はグラファイトの構造に由来していると考えられている。そこで、電子物性制御のためにナノグラファイト構造の制御を行った。投入電力をパラメーターとしてカーボンナノウォールを作製し、走査型電子顕微鏡で評価した結果、形状の変化は得られなかった。内部のグラファイト構造評価のためにラマン分光法を行った結果、投入電力が低いほどグラファイトの端や欠陥の減少により黒鉛化度が高くなっていることが判明した。投入電力を変化させることでグラファイト構造の異なるカーボンナノウォールの作製を可能とした。2.電気的特性の制御カーボンナノウォールを構成するナノメーターサイズのグラファイトを修飾することにより電気的特性の制御を試みた。実験としてはカーボンナノウォール成長ガス中に微量窒素添加を行った。X線光電子分光法の結果、窒素に起因するピークが検出され、窒素がカーボンナノウォール中に存在することが判明した。ラマン分光法からグラファイト構造が変化するという知見も得たことから、ナノグラファイトが窒素によって修飾されていると考えられる。ホール測定結果から、窒素添加流量に伴ってカーボンナノウォールの抵抗率が減少した。一般的な半導体に不純物ドーピングを行った場合と同様に考えると、窒素が電子を供給する役割を果たすために、抵抗率が減少したと考えられる。以上、カーボンナノウォールのドーピングによる電気特性制御を実現した。1.カーボンナノウォールと基板・金属界面構造と金属接触特性カーボンナノウォールの電気特性を調べる上で、基板・金属界面と金属接触特性の評価は重要である。そこで、カーボンナノウォールをSi、石英、Ti金属膜上に成長させ、基板・金属界面構造に対してX線回折を用いて構造評価を行った。その結果、Si、Tiではそれぞれアモルファス層、TiCの中間層が見られたのに対して、石英基板上では中間層は殆ど見られなかった。基板・金属を変えることで、界面に生成される中間層が変ることが判明した。また、カーボンナノウォールと種々の金属の接触抵抗の評価に対してトランスミッションラインモデル法を用いて行った。アルミニウム、チタン、銅、金、ニッケル、白金をカーボンナノウォールの表面に蒸着した結果、金で1.3×10^-4Ω・cm^2と最も低い値となった。

さらにラピッドサーマルアニールにより熱処理を行った結果、カーボンナノウォールと金の接触抵抗は3.9×10^-5Ω・cm^2となり熱処理によりさらに低下させることに成功した。これはX線回折の評価から熱処理によって金の結晶性が向上したことによると考えられ、結晶構造・界面状態は電気特性に重大な影響を及ぼす事が分かった。2.単一架橋カーボンナノウォールの作製独立した一枚のカーボンナノウォールの物性解明、およびカーボンナノウォールをデバイスへ実装するための基盤技術の確立を目的として、単一架橋カーボンナノウォールの作製を行った。ナノオーダーの溝構造をもつトレンチ基板を用いて電子ビーム励起プラズマにより作製した結果、トレンチの溝に架橋する単一のカーボンナノウォールの作製に成功した。本年度はチャネルエンジニアリングに向けて、カーボンナノウォール(CNWs)を構成するグラフェンシート構造・形状制御及び電気特性の解明を目指し、下記の新たな知見を得た。電子デバイス応用に向けて、CNWsの電気特性と合わせて電子状態を調べる事は重要である。そこで、n型にドープしたCNWsの電子状態を調べるために、ラジカル注入型プラズマCVDを用いてCNWsの作製を用いて行った。との際、ドープ量および形状制御のために添加ガスとしてN2 : 05sccm及びN2/02 : 5/5sccmを導入した。添加N2ガス0, 1, 5sccm及びN2/O2混合ガス添加を用いて作製したそれぞれのCNWsを走査型電子顕微鏡で観測した結果、N2ガス流量が大きいときには形状が密になっているのに対して、O2ガスの効果によってより基板から垂直方向に配向し、一枚岩の形状となることが判明した。これまで成長中のO2添加の効果について報告してきたが、O2は成長中の不純物等を除去し結晶性を向上させる効果がある。従って、N2添加にO2を混合添加することでO2添加と同様に一枚岩の形状を得ることに成功した。また、この時O2・N2混合添加CNWの膜中のNの量は同じ量のN2添加CNWと同じであり、その電気的特性はN2添加同様にn型伝導を示した。そこで、形状を変化させたCNWsに対して電子状態の変化を調べるために赤外吸収測定を行った。観測された赤外吸収スペクトルは価電子帯と伝導帯の有効状態密度を示しており、0, 1, 5sccmの順に吸収スペクトルが大きくなることがわかった。従って、N2添加量と共に有効状態密度が大きくなっていることがわかる。この時、N2添加5sccmとN2/O2混合添加CNWsでは波形が全く同じであり、N2添加において、CNW膜中のN2が電子状態を決めていることがわかった。つまり、N2ガス添加によって電子状態を制御可能であり、さらにN2/O2混合添加はその電気的特性と形状を独立に制御できるため、CNWsの作製法として非常に有効であることがわかった。
アルツハイマー病の神経回路長期可視化による機能破綻過程の解明

本研究では、空間認知障害を引き起こすアルツハイマー病の症状が神経回路レベルでどのように進行していくか明らかにするために、空間の認識・記憶の障害に関係する海馬CA1領域に緑色蛍光カルシウムプローブG-CaMP7を発現するアルツハイマー病モデルマウス(AppNL-G-F/NL-G-F)を用いて、in vivo二光子カルシウムイメージングにより、同一個体の約650個からなる同一神経細胞集団の活動を数ヶ月に亘り観察し、神経回路レベルでのアルツハイマー病病態の進行に対して、いくつかの興味深い所見を見出した。(1)アルツハイマー病モデルマウスでは、海馬上昇層でG-CaMP7と共発現している赤色蛍光蛋白質DsRed2の蛍光シグナルとして観察されるアミロイド斑様凝集体が、3か月齢から発生し、加齢と共に数、大きさともに増大し、さらに、毒性の高いアミロイド付近に存在すること(2)神経活動においては、過活動を示す細胞が増加すること(3)場所細胞においては、安定性が4か月齢減少することと(4)数が7か月齢から減少すること(5)これらの異常な神経活動はアミロイド斑様凝集物の周囲で起こりやすいことがわかった。したがって、アルツハイマー病の海馬CA1領域の機能回路は、アミロイド蓄積が増加した後に場所細胞を含む神経機能回路が破綻していくと考えらえる。また本研究の実験系は、数か月に亘るアルツハイマー病症状の進行と細胞活動を同時観察できるため、新規アルツハイマー病薬の有効な評価に応用されていくことが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。アルツハイマー病(AD)の初期症状として、空間の認知障害が挙げられる。しかし、ADの症状が神経回路レベルでどのように進行するかについてはわかっていない。本研究では、空間認識や記憶障害に関係する海馬の神経回路に注目し、海馬CA1領域に緑色蛍光カルシウムセンサータンパク質G-CaMP7を発現する次世代型ADモデルマウス(AppNL-G-F/NL-G-F)を用いて、同一個体の同一神経細胞集団の活動を、数ヶ月に亘って1細胞の解像度で二光子カルシウムイメージングにより観察し、AD病態の神経回路レベルでの進行を観察した。ADモデルマウスでは、海馬上昇層でG-CaMP7の蛍光シグナルとして観察されるアミロイド斑様凝集体が、3ヶ月齢から発生し、加齢と共に数、大きさともに増大した。また、免疫染色により、この凝集体はアミロイド斑付近に存在していたことから、アミロイド斑の位置の指標となった。神経活動においては、4ヵ月齢でアミロイド斑様凝集体付近でのみ発火頻度の高い神経細胞が増え、7ヶ月齢以降になると、発火頻度の高い細胞が領域全体で観察された。また、仮想現実環境下の探索行動で観察される場所細胞は、4ヶ月齢で発火場所領域の安定性に異常が見られはじめ、7ヶ月齢になると安定性はさらに悪くなり、場所細胞の数も減少した。従って、ADの海馬CA1領域の神経回路において、場所細胞を含む様々な神経細胞の活動パタンは異なった破綻様式を持つことが明らかになり、この知見がADの有効な薬物評価へ応用されることが期待される。本研究では、海馬CA1領域にG-CaMP7を発現するADモデルマウスとコントロールマウスの同個体で、4, 7, 10, 13ヶ月齢から海馬の400-700個からなる同一の神経細胞群の記録に成功している。また、7ヶ月齢以降になると、発火頻度の高い細胞が領域全体で観察された。また、仮想現実環境下の探索行動で観察される場所細胞は、4ヶ月齢で発火場所領域の安定性に異常が見られはじめ、7ヶ月齢になると安定性はさらに悪くなり、場所細胞の数も減少したことを証明した。さらに、アルツハイマー病モデルマウス由来の凝集体は免疫染色によりアミロイド斑の近くに存在していたことも証明した。このことから研究はおおむね進んでいる。

また本研究の実験系は、数か月に亘るアルツハイマー病症状の進行と細胞活動を同時観察できるため、新規アルツハイマー病薬の有効な評価に応用されていくことが期待される。アルツハイマー病モデルマウスの大脳皮質の一部を除去する事で海馬を露出し光学窓を設ける。回復後、マウスを空気圧で浮かせた発泡スチロールのボールに載せて頭位を固定する。その歩行をモニタし仮想直線路と同期させる。前年の結果を踏まえ残り2つの以下の実験を行っていく。S.A.1知的行動によるアルツハイマー病の予防とアミロイド形成、微小回路破綻過程への影響仮想現実空間上で報酬場所学習課題を行わせる。神経回路破綻過程のどの段階で記憶障害を生じていくかを観察する。また、この仮想空間学習課題を用いた知的行動をマウスに行わせることで破綻がどのように回復・遅延されるか調べていく。S.A.2薬物による神経回路保護の観察上記S.A.1で観察された、病態の進行状況に応じたタイミングで薬物の投与を行い、異常活動および神経回路の破綻がどのように回復・遅延されるか観察する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
臨床応用を目指す レチノイドの研究

新規のレチノイドについて:レチノイン酸の毒性は特異的なレチノイドとしての活性に基づくもののほか、脂肪酸として膜の障害など非特異的な毒性がある。後者の消去のためより親水性の化合物としてウレア誘導体を合成したが弱い活性しか認めなかった。ウレア構造のNーメチル化によって立体構造を変化させると活性が発現する。さらに系統的な合成を進めている。構造に特徴のあるレチノイドとして,siあるいはGe原子を含むレチノイドを合成した.そのうちの幾つかは非常に強力な作用をもつ。そして特にSi分子を二原子含むam55Sは毒性が軽徴であるという特徴をもつ。臨床へ応用可能な分子としてRe80をとりあげ,アメリカNIHのプロトコ-ルに基づく毒性試験を行った。その結果をもとにより長期の毒性試験の準備を開始した。アメリカニュ-ヨ-ク州RMPIの協力をえている。レチノイドアンタゴニストの合成を続けている。エストロケンに類似する構造のレチノイドとして合成したBE16Eはレチノイド活性を示さなかったがAM80の作用を阻害するという興味深い結果をえた。合成レチノイドとして報告すべき重要な作用は形態形成に対する作用である。トリの胚芽形成におけるAm80,Ch55もレチノイン酸と同様にトリの胚芽形成における位置情報として作用することが明らかとなった。Ch55がCRABPに結合しないことから,胚芽形成においてもCRABPは決定的な役割を果たしていないことが明らかである。合成レチノイトによる転移防止および腫瘍組織の血管新生の抑制を見いだした。より詳しい結果をうるべく研究が進行中である。
固気混相媒体による核融合ブランケット冷却

ガス冷却方式ブランケットの伝熱改善策として気体中に固体微粒子を分散させた固気混相流を利用するという構想に基づき,とくに今年度は,トリチウム増殖部分の冷却に擬せられる曲円管内流の伝熱特性に及ぼす粒径の影響を明らかにするとともに,ブランケットで予想される複雑な幾何形状の伝熱流動解析に資する目的でストカスティックモデルによる固気混相媒体の数値計算コードを開発した.前者では,グラファイトまたは大きさの異なる数種のガラス粒子を使用した混相媒体を用いて一連の伝熱実験を行ない,微細な粒子では粒子の添加によって熱伝達係数は大きく増加する一方,比較的粗大な粒子では,伝熱量そのものは増加するものの媒体の熱容量の増加を考慮した平均ヌセルト数はそれほど増加せず場合によっては単相流よりも低下することを明らかにした.また,曲率比の大きな曲管ほど粒子添加による伝熱促進効果が大きいことを明らかにした.さらに一連の実験を通じて微細なグラファイト粒子では管路に対するエロージョンは軽微であることが分った.一方,ストカスティックモデルの開発では, (1)壁と粒子との相互作用の定式化, (2)粒子の運動を追跡する際のレイノルズ応力場の反映のさせかた, (3)気流の基礎式,特に乱流モデルに対する粒子の影響の定式化,などの問題点を解決して鉛直上昇管内流の計算コードを試作した.これにより粒子相の平均速度,粒子数密度,気流の乱流エネルギーなどを合理的に予測できることを示した.本計算手法の確立によって,かなりの複雑な体系の伝熱流動解析を行う基礎が得られたので,今後はこれとふく射輸送方程式を組合わせた衝突噴流体系の流動伝熱解析コードを作成し,本構想の核心である第一壁での伝熱特性の評価をより正確に行なって本構想の具体化を目指す.さらに,実際に予想される温度圧力条件や構造材料に立脚して管路のエロージョンの定量的評価を行なう予定である.ガス冷却方式ブランケットの伝熱改善策として気体中に固体微粒子を分散させた固気混相流を利用するという構想に基づき,とくに今年度は,トリチウム増殖部分の冷却に擬せられる曲円管内流の伝熱特性に及ぼす粒径の影響を明らかにするとともに,ブランケットで予想される複雑な幾何形状の伝熱流動解析に資する目的でストカスティックモデルによる固気混相媒体の数値計算コードを開発した.前者では,グラファイトまたは大きさの異なる数種のガラス粒子を使用した混相媒体を用いて一連の伝熱実験を行ない,微細な粒子では粒子の添加によって熱伝達係数は大きく増加する一方,比較的粗大な粒子では,伝熱量そのものは増加するものの媒体の熱容量の増加を考慮した平均ヌセルト数はそれほど増加せず場合によっては単相流よりも低下することを明らかにした.また,曲率比の大きな曲管ほど粒子添加による伝熱促進効果が大きいことを明らかにした.さらに一連の実験を通じて微細なグラファイト粒子では管路に対するエロージョンは軽微であることが分った.一方,ストカスティックモデルの開発では, (1)壁と粒子との相互作用の定式化, (2)粒子の運動を追跡する際のレイノルズ応力場の反映のさせかた, (3)気流の基礎式,特に乱流モデルに対する粒子の影響の定式化,などの問題点を解決して鉛直上昇管内流の計算コードを試作した.これにより粒子相の平均速度,粒子数密度,気流の乱流エネルギーなどを合理的に予測できることを示した.本計算手法の確立によって,かなりの複雑な体系の伝熱流動解析を行う基礎が得られたので,今後はこれとふく射輸送方程式を組合わせた衝突噴流体系の流動伝熱解析コードを作成し,本構想の核心である第一壁での伝熱特性の評価をより正確に行なって本構想の具体化を目指す.さらに,実際に予想される温度圧力条件や構造材料に立脚して管路のエロージョンの定量的評価を行なう予定である.
植物細胞に特有の液胞の形成・拡大とそれらに伴うオートファジーの解析

液胞形成とオートファジー経路の関係を調べた。シロイヌナズナにおいて、マクロオートファジー経路が既存の液胞の拡大化に寄与していることを明らかにした。一方で、タバコ培養細胞から調製したプロトプラストから液胞を取り除くと液胞が再形成されるが、その過程は、マクロオートファジーとは別のオートファジー経路によって細胞質が分解されることによって形成されることを示した。シロイヌナズナ根の先端部の細胞では、マクロオートファジー経路とは別のオートファジー経路が実際に起こっていた。1.ミニプロトプラストを調製する技術を整備した。オートファゴソームのマーカータンパク質であるGFP-Atg8タンパク質を恒常的に発現するタバコ培養細胞より調製したミニプロトプラストにおける液胞形成の過程を観察した。この過程ではオートファゴソームがまれではあるが観察された。膜透過性システインプロテアーゼ阻害剤E-64dで処理すると形成される液胞には細胞質未分解物が蓄積していた、すなわち、液胞はオートファジーを行いながら形成されることが確認された。このとき、オートファジー阻害剤3-メチルアデニンで処理すると、オートファオゴソームは見られなくなったが、形成される液胞内への細胞質未分解物の蓄積は起こった。すなわち、液胞は3-メチルアデニンに非感受性のオートファジーにより形成されることが示唆された。2.シロイヌナズナの野生株(WT)とATG5遺伝子が破壊されたatg5株の芽生えより根端5 mmを切り取り、3%ショ糖を含む1/2MS培地で23°C、1日間培養した。WTの根は2.9 mm伸びたのに対し、atg5株が2.0-2.1 mmしか伸びず、WTとatg5株の間には統計学的に有意な差があった。培養1日後の根断片の細胞を明視野顕微鏡で観察すると、atg5株はWTに比べて、根端から約400 μm以降の表皮細胞が小さかった。ヨウ化プロピジウムで細胞壁を蛍光染色して根冠に隠れた細胞を観察すると、根端から100-300 μmの伸長領域の表皮細胞においてもatg5株はWTより細胞が小さいことが分かった。さらに、ショ糖を含まない培地で培養するとオートファジーはさらに活性化し、ショ糖を含む培地で培養したときよりもWTとatg5株で細胞の大きさの差がより開いた。以上の結果はオートファジーが根の細胞伸長に寄与することを示している。液胞は新奇のオートファジーに伴ってできることを証明するという研究目的を達成した。タバコBY-2細胞より調製したミニプロトプラスト(液胞を脱落させたプロトプラスト)を培養すると液胞が再形成される。電子顕微鏡で観察すると、形成された液胞内には細胞質の未分解物と考えられる構造が見られた。膜透過性システインプロテアーゼ阻害剤E-64dで処理して液胞内でのタンパク質分解を阻害すると、液胞膜で囲まれた液胞の形成それ自体は阻害されなかったが形成される液胞内には細胞質の未分解物の蓄積がさらに増加した。さらに、液胞型H+-ATPaseを阻害することにより形成される液胞の酸性化を阻害し結果として液胞内の加水分解酵素の活性を低下させるconcanamycinで処理すると、形成される液胞内には、細胞質ゾルと同様な構造が満たされていた。このようなE-64dやコンカナマイシンの効果に対してconventionalなオートファジーの阻害剤3-methyladenineは影響を与えなかった。オートファゴソームのマーカータンパク質であるGFP-Atg8融合タンパク質を恒常的に発現するBY-2細胞より調製したミニプロトプラストでも液胞形成は同様に起こった。この過程では、GFP-Atg8タンパク質が局在するオートファゴソームが観察され、栄養飢餓状態に置くとその数は増加した。ミニプロトプラスト内で起こるオートファゴソームの形成は3-methyladenineによってほぼ完全に阻害された。以上の結果は、ミニプロトプラスト内においては、液胞は従来のオートファジーとは異なるオートファジーによって形成されることを示している。1.研究計画「様々なオルガネラマーカーを導入したタバコ培養細胞作製する」に対して。オートファゴソーム、液胞膜、ミトコンドリアをGFPで標識した細胞の調製を完了した。2.研究計画「シロイヌナズナ野生株・オートファジー欠損株の根の断片を培養して液胞形成・拡大や根の成長を測定・比較する」に対して。シロイヌナズナの根断片(先端から5 mm)を調製し、3日間培養して、根断片の伸長と細胞の大きさを測定した。1日間の培養で野生株の根は2.9±0.8 mm (n=15)伸びたのに対し、ATG5破壊株では野生株の約70%にまで成長が低下していた。根の先端から一定距離の細胞の大きさを測定すると、ATG5破壊株は野生株に比べ細胞が小さかった。

以上の結果はオートファジーが根の細胞伸長に寄与することを示している。オートファジーを阻害する効果を持つ薬剤である3-メチルアデニンとE-64dは、野生株において培養の最初の0-1日間で間の根の伸長をatg5-1と同程度にまで抑えた。このことは、2つの薬剤が短時間の処理ではシロイヌナズナ根においてオートファジー阻害剤として働くことを示唆しているする。しかしどちらの薬剤も2日目以降の根の伸長を大きく抑え、さらにatg5-1に対しても伸長抑制効果をみせた。よって2つの薬剤が、長時間処理のする際にはオートファジー阻害以外の効果を持つことが示された。3.研究計画「タバコ培養細胞を用いて、液胞拡大のモデル実験系を確立する」に対して。タバコ培養細胞を植物ホルモン2,4-Dを欠いた培地に移すと、細胞が成長し、培地にマクロオートファジー阻害剤3-メチルアデニンを加えると成長が阻害されることを確認した。しかし、細胞の大きさの偏差は大きかった。同調培養を行い、2,4-D飢餓処理する細胞のステージをそろえると細胞の大きさの偏差が少しだけ小さくなることを見出した。ミニプロトプラストを用いた液胞形成の解析に関しては、計画していたほとんどのオルガネラマーカーの導入が終わった。さらに、ミニプロトプラストが効率的に調製できるようになった。シロイヌナズナ根を用いた液胞の形成・拡大の解析に関しては、計画していた実験をほとんど終了した。タバコ液胞拡大モデルを用いた液胞の拡大に解析に関しては、前年度にほぼ計画を達成しており、今年度は実験を実施しなかった。以上、計画のほとんどを達成できたので、このように評価した。1.ミニプロトプラストを用いた液胞形成とオートファジーの解析に関しては、出発材料として様々なオルガネラマーカーを導入したタバコ細胞の調製を行う予定であったが、予定していたすべてのオルガネラマーカー導入細胞を調製できなかった。その意味でやや遅れていると自己評価した。2.シロイヌナズナ根断片を用いた液胞形成・拡大とオートファジーの解析に関しては、当著の計画通りに進んだ。3.タバコ培養細胞で液胞拡大モデルを作製し、そのモデルを用いた液胞拡大とオートファジーを解析する計画に関しては、当初の計画通り行ったがモデルを洗練させることができなかった。そこで、当初計画通りに進まない時の対応として考えていた同調培養系を導入してみたが、大きな進歩はなかった。その意味で、やや遅れていると自己評価した。以上、おしなべて、やや遅れていると評価した。ミニプロトプラストを用いた液胞形成の解析に関して。様々なオルガネラマーカータンパク質を発現するタバコ培養細胞から調製したミニプロトプラストを用いて、液胞形成の過程とオルガネラの関係を解析していく。さらに、生物材料としてヒメツリガネゴケを加える。ヒメツリガネゴケではオートファジー関連遺伝子ATG5をノックアウトした株(atg5株)をすでに得ており、atg5株と野生株の原糸体より調製したミニプロトプラストを用いて、タバコ細胞と同様の実験を行なうことで、液胞形成に伴う新奇のオートファジーの存在を証明する。1.様々な(オートファゴソーム、ER、液胞、ゴルジ装置、ペルオキシゾーム、ミトコンドリア、プラスチド、細胞質基質)のオルガネラマーカーとGFPとの融合タンパク質を恒常的に発現しているタバコ培養細胞の作製を行う。
子宮頸癌におけるPIK3CA遺伝子変異をターゲットとした新規分子標的治療の探索

局所進行子宮頸癌の標準治療はシスプラチン併用同時化学放射線療法であるが、その5年生存率は3050%と未だ不良であり、新規治療戦略の開発が強く望まれる。PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路は多くの癌において発癌機序に関与する重要な経路であり、PI3-kinaseを構成する触媒サブユニットであるp110α蛋白をコードするPIK3CA遺伝子は、子宮頸癌の1336%に変異が報告されている。また、PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路はシスプラチン耐性および放射線耐性の双方に関与することが知られているが、PIK3CA遺伝子変異とCCRTによる反応性・予後との関連性の報告はこれまで非常に数少ない。そこで、局所進行子宮頸癌におけるPIK3CA遺伝子変異の予後への関連性を明らかにするために、シスプラチン毎週投与併用同時化学放射線療法を施行したIIIIV期子宮頸癌50症例において、PIK3CA遺伝子変異を解析した。PIK3CA遺伝子変異・増幅と臨床病理学的因子との相関はFisher's exacttest、予後との相関はKaplan-Meier法およびlog-rank testにより解析を行う。各因子の生存期間との相関性をCox比例ハザードモデルにより検討した。治療前の生検検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、腫瘍組織DNAにおいてPIK3CA遺伝子変異および増幅をdirect sequencing法およびreal-time PCR法により検索した。また免疫染色によりAktなど下流蛋白のリン酸化を調べ、PI3K/Aktシグナル経路の活性化や子宮頸癌細胞株を用い分子標的治療薬によるPI3K/Akt経路阻害を確認する。ヒト子宮頸癌細胞6株においてPIK3CA遺伝子変異をエクソン9および20においてdirect sequencingにより解析したところ、2株で変異を認めた。次にシスプラチン毎週投与併用CCRTを施行した進行期IIBIVA期の子宮頸癌患者59名において、治療前の生検腫瘍検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、同様にPIK3CA遺伝子変異を解析したところ、7名(12%)に変異を認めた。認めた変異は全てPIK3CA遺伝子がコードするp110α蛋白のヘリカルドメインまたはキナーゼドメイン内に位置していた。PIK3CA遺伝子変異の有無により臨床病理学的因子に有意な相違は認められなかった。変異の有無により癌特異的生存期間を比較したところ、正常症例は変異症例と比較して有意に予後良好であった。次に生存分析を行ったところ、PIK3CA遺伝子変異は全生存および癌特異的生存に関して、有意な予後不良因子であった。従って、分子標的薬によりPI3K/Aktシグナル経路をブロックすることにより、PIK3CA遺伝子変異を有する子宮頸癌においてCCRTの効果を増強し、予後を改善できる可能性が示唆された。腫瘍組織検体から薄切標本を作製し、免疫染色によりAktなどPI3K/Akt経路下流蛋白のリン酸化を調べ、シグナル経路の活性化について調べる。PIK3CA遺伝子変異を有する子宮頸癌細胞株Caskiを用い、分子標的薬によるPI3K/Akt経路の阻害による効果を調べる。標的分子が実際に阻害されているかをウェスタンブロットおよびRT-PCRにより、蛋白・RNAレベルで確認する。また以下の方法により各細胞機能への影響を評価する。MTTアッセイにより細胞増殖の変化を調べる。アポトーシスの検出のためTUNEL染色およびAnnexin Vアッセイを行う。細胞周期の評価のため、フローサイトメトリーを行い、アポトーシスおよびG1アレストの有無を評価する。細胞浸潤能を調べるため、ボイデンチャンバーを用いた浸潤アッセイを行う。ヒト子宮頸癌細胞6株においてPIK3CA遺伝子変異をエクソン9および20においてdirect sequencingにて解析したところ、2株において変異を認めた。次に患者50名の治療前の生検検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、同様にPIK3CA遺伝子変異を解析したところ、7名(14%)に変異を認めた。

認めた変異は全て、p110α蛋白のヘリカルドメインおよびキナーゼドメイン内に位置していた。遺伝子変異の有無により臨床病理学的因子に有意な相違は認められなかった。次に変異の有無により全生存期間を比較したところ、変異症例は正常例に比べ有意に予後不良であった(p=0.016)。さらに予後不良因子の単変量解析を行ったところ、進行期、骨盤リンパ節転移、PIK3CA遺伝子変異の3因子が有意な予後不良因子であった(それぞれp=0.033, 0.047, 0.024)。これら3因子においてさらに多変量解析を行ったところ、進行期およびPIK3CA遺伝子変異が有意な独立した予後不良因子であった(それぞれp=0.034, 0.0085)。シスプラチン併用同時化学放射線療法で治療された局所進行子宮頸癌では、PIK3CA遺伝子変異例は正常例に比して有意に予後不良であることから、分子標的薬によりPI3-kinaseをブロックすることにより、CCRTによる予後を改善できる可能性が示唆された。このことがもし証明されれば、現在いまだ不良である局所進行子宮頸癌予後の改善効果が期待される。局所進行子宮頸癌の標準治療はシスプラチン併用同時化学放射線療法であるが、その5年生存率は3050%と未だ不良であり、新規治療戦略の開発が強く望まれる。PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路は多くの癌において発癌機序に関与する重要な経路であり、PI3-kinaseを構成する触媒サブユニットであるp110α蛋白をコードするPIK3CA遺伝子は、子宮頸癌の1336%に変異が報告されている。また、PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路はシスプラチン耐性および放射線耐性の双方に関与することが知られているが、PIK3CA遺伝子変異とCCRTによる反応性・予後との関連性の報告はこれまで非常に数少ない。そこで、局所進行子宮頸癌におけるPIK3CA遺伝子変異の予後への関連性を明らかにするために、シスプラチン毎週投与併用同時化学放射線療法を施行したIIIIV期子宮頸癌50症例において、PIK3CA遺伝子変異を解析した。PIK3CA遺伝子変異・増幅と臨床病理学的因子との相関はFisher's exacttest、予後との相関はKaplan-Meier法およびlog-rank testにより解析を行う。各因子の生存期間との相関性をCox比例ハザードモデルにより検討した。治療前の生検検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、腫瘍組織DNAにおいてPIK3CA遺伝子変異および増幅をdirect sequencing法およびreal-time PCR法により検索した。また免疫染色によりAktなど下流蛋白のリン酸化を調べ、PI3K/Aktシグナル経路の活性化や子宮頸癌細胞株を用い分子標的治療薬によるPI3K/Akt経路阻害を確認する。ヒト
消化器癌における染色体11q13の増幅ユニットと臨床腫瘍学的特性に関する研究

1.対象と方法:対象を、当院で1980年4月より1989年3月手術を施行した胸部食道扁平上皮癌症例122例(C-0症例を除く)とし,それぞれのホルマリン固定パラフィン包埋切片からHE染色で腫瘍部と正常部を検鏡下に同定後DNAを抽出し、^<32>Pでラベルしたcyclin D1及びint-2のプローブを用いてスロットブロット法を施行した。各遺伝子の3コピー以上を遺伝子増幅とした。2.結果:胸部食道扁平上皮癌122例において、CyclinD1遺伝子増幅はint-2遺伝子の同時増幅を伴い、122例中28例(23.0%)で遺伝子増幅を認めた。これら増幅群28例では、非増幅群94例に比し術後生存率は有意に低下していた(Kaplan-meier法,p<0.01)。また,増幅群28例中20例(71.4%)に術後再発を認め、その再発形式は28例中18例(64.3%)で遠隔臓器再発であり、いずれも非増幅群と比較し有意に高率であった(χ2検定、P<0.01)。しかし、再発形式としてのリンパ節再発には両群間に差を認めなかった。また、増幅群と非増幅群の2群間に背景因子(年齢、性、術式、進行度、補助療法等)及び、病理学的因子(分化度、浸潤形式、n因子、深達度、脈管侵襲等)において差を認めなかった。またCyclinD1遺伝子増幅の有無とTMN因子やその他の臨床腫瘍学的因子をCoxの比例ハザードモデルを用いた多変量解析を行い,n因子につぐ術後生命予後への寄与を認めた。