hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型肝炎治療奏功の鍵を握る「小腸リバビリン輸送代謝連関装置」の実体解明

本研究では、リバビリン薬効発現の規定要因を明らかとすることを目的として、purine nucleoside phosphorylase(PNP)の機能解析をおこなった。その結果、ヒト小腸においてPNPはリバビリン代謝を担う主要な酵素であり、その機能レベルはリバビリン吸収量を規定することが明らかとなった。したがって、PNPの機能制御機構やその発現に影響を及ぼす遺伝子多型を解明することにより、リバビリン治療効果の個人差の要因が明らかとなると期待される。C型肝炎治療リバビリンの薬効発現ではその血中濃度が大きな規定因子となると考えられており、リバビリンの血中濃度はその吸収量が大きな規定因子となる。これまでにリバビリンは腸管においてpurine nucleoside phosphorylase (PNP)により代謝を受けると推測されているが、これまでに腸管PNPのリバビリン代謝における役割は解析されていない。そこで、本研究ではPNPのリバビリン代謝における役割を明らかとすることを目的とし、さらにPNP遺伝子に高頻度に存在する遺伝子多型PNP p.51G>Sのリバビリン代謝における機能を明らかとすることを目的とした。以上の結果から、PNPは高いリバビリン代謝活性を持つことが明らかとなった。また、PNP遺伝子に存在するPNP p.51G>Sはリバビリン代謝に影響を及ぼさないことが明らかとなった。したがって、PNPの発現量や機能の個人差は腸管におけるリバビリン吸収量を規定する要因となると考えられる。今後PNP p.51G>S以外のPNP遺伝子の遺伝子多型について薬理ゲノム学的解析を推進する必要があると考えられた。C型肝炎治療においては、リバビリンの血中濃度がその薬効発現の規定因子となると考えられており、リバビリンの血中濃度はその腸管からの吸収により規定されると考えられる。前年度までに我々は、リバビリンがpurine nucleoside phosphorylase(PNP)により代謝されることを明らかとした。そこで本年度では、腸管PNPのリバビリン吸収における役割を明らかとすること、さらにPNP遺伝子発現変動機構を明らかとすることを目的とした。ヒト小腸サイトゾルを用いてPNPによるリバビリン代謝活性を解析したところ、ヒト肝臓サイトゾルと比較し、ヒト小腸サイトゾルで約2倍高い活性が認められた。このリバビリン代謝活性はPNPの阻害剤であるガンシクロビルにより消失した。次に小腸モデル細胞であるCaco2細胞にPNPを強発現させ、リバビリン細胞透過におけるPNPの役割の解析をおこなった。その結果、PNP発現Caco2細胞ではコントロール(PNP非導入)細胞の約3倍高いPNP活性が認められ、これに伴いリバビリン細胞透過量はコントロール細胞の約半分に低下した。この時、Caco2細胞の密着結合能に差異は認められなかった。一方、PNP遺伝子発現量を変動させる要因を探索したところ、エタノールによりPNP mRNA発現量の上昇が認められた。以上本研究の結果から、ヒト小腸においてPNPはリバビリン代謝を担う主要な酵素であること、およびその機能レベルはリバビリン吸収量の規定要因となることが明らかとなった。今後、PNPとリバビリントランスポーターとの機能連関機構を明らかとし、PNP機能の規定要因を明らかとしていく必要がある。また、本研究の結果、PNP発現量はエタノールにより上昇する可能性が示唆されたことから、今後エタノールのリバビリン吸収量に与える影響を明らかとしていく必要があると考えられる。
ワーズワス・コウルリッジ・ブレイクの「哲学詩」における存在論―その現代への射程

採用第三年度目は、まず前年度に再確認した「習慣」と中世スコラ哲学の強固な結びつきを、コウルリッジの『ノートブック』を詳細に研究することで明確にし、その思想的背景を明示化した。アヘン中毒、すなわち悪癖としての習慣に悩まされていたコウルリッジは、自分の自由意志の障害となる習慣に対して否定的な評価を下すことが多く、先行研究も基本的にこうした理解を前提に議論を行うものが大半なのだが、日記の代替物でもあった性格上、それ自体が習慣的でもある『ノートブック』の記述には、こうした前提を覆すようなエントリーが多数存在する。これらの記述はコウルリッジの詩と哲学においていかに習慣が一貫したテーマであったかを物語っており、ワーズワスとともに創作を志した「哲学詩」の中心にこの問題があったことを示唆している。前年度より参加している東京コウルリッジ研究会において、これらのエントリーを共同で訳出し、出版に向けて継続した活動をつづけている。初期の計画では、もう一人のロマン派第一世代であるウィリアム・ブレイクを扱う予定であったが、ワーズワスとコウルリッジにおける「習慣」の問題を研究していくうちに、「哲学詩」のより具体的な内容記述を行うためには、その環大西洋的(Transatlantic)な影響、つまりアメリカへの影響を考えるべきであることが明瞭となった。環大西洋的な「哲学詩」の影響を辿ることによって、「哲学詩」の中核にあるロマン派的習慣概念がどのように変容しつつ、認識論を回避したプラグマティズムの伝統に接続することになったのかを明示化することが可能となる。これはロマン派研究に新たな知見を提供するものとなるだけでなく、研究領域として分離しがちなイギリス文学研究とアメリカ文学研究を橋渡しする役割も担うものとなるだろう。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、ロマン派第一世代を哲学的視点から体系的に論じることによって、その親近性と差異を存在論的に明示化すること、ならびにこれらの存在論の現代への射程を明らかにすることであるが、初年度の研究においてはまず「習慣」概念に焦点を当て、これをヒュームからカント、そしてヘーゲルへと至る思想史的文脈から詳細に検討することで、最終的にワーズワスの習慣概念とヘーゲルのそれとの重なりを明らかにし、彼らの存在論的な近さをより鮮明に描き出した。ワーズワスとヘーゲルのアナロジーは、Hartmanやde Manなどのいわゆる「イェール学派」の議論に通底するものであったが、マルクス的視座からロマン派のヘーゲル的イデオロギーを批判したJ. McGannのThe Romantic Ideology (1983)以来、彼を旗手とした新歴史主義の台頭によって一貫して批判的に取り上げられるようになった。これは新歴史主義的な批判からワーズワスを救い出そうとする批評においても明瞭に引き継がれており、例えばS.JarvisもWordsworth's Philosophic Song(2002)で両者の安易なアナロジーは避けるべきであると主張している。本研究はヘーゲルそれ自体に唯物論的契機を見出す新たな読解を取り上げ、これをワーズワスへと適用することによって、両者のアナロジーを本質的なレベルで、かつ積極的に新歴史主義的読解を乗り越えるものとして提示することを可能とするものである。またこれによってすでに思想研究が進んでいるコウルリッジとワーズワスを哲学的観点から比較することが可能となるのだが、初年度はコウルリッジにおける「習慣」の位置付けを検討することで、両者の存在論的なちがいを核心的なレベルで考察することが出来た。初年度はコウルリッジの一次資料を整理しつつ、その思想研究を重点的に行うことにより、それがワーズワスの存在論と異なるものであるかどうか、そしてさらに異なるのであればどのようなに異なるのかを検討することを計画していたが、彼のNotebooksにおける「習慣」に関する考察とワーズワスが念頭におく「ヘーゲル的止揚の活動としての習慣」を比較考察することでこの目標を達成することができた。具体的に両者の差異化のプロセスを以下に述べることとする。まずコウルリッジの考える習慣がつねに超越論的な主体に対する経験主義的な対立項として措定されていることを一次資料をもとに確認した。つぎに(カトリーヌ・マラブーが『ヘーゲルの未来』において指摘するように)カントの超越論的構想力とアリストテレスの(経験論的)習慣の両者に「止揚」が果たす「保存」と「廃棄」のふたつの機能を見出し、これら二つのエコノミーが同時に作動するような体系を自身の弁証法的プロセスとして思考していたのがヘーゲルであったということを示した。そしてワーズワスのLyrical Ballads「序文」における散文で書かれた詩の理論や彼の詩作品を検討することによって、彼の習慣がヘーゲルのそれと同様に「超越論」と「経験論」が差異化されつつも同時に統合されているような活動であることを示した。以上の過程によって「習慣」をめぐるコウルリッジとワーズワスの相違を前景化することによって、両者の存在論的な相違を浮き彫りにすることが可能となった次第である。第二年度はまずカントからヘーゲルへと「構想力」(=想像力)の概念がどのように取り込まれていったかについて、ドイツ観念論の著作とそれに関する先行研究を分析することによって確認した。そのことにより「構想力」概念それ自体が抱え込んだ不安定さ、矛盾を確認した。これは具体的には主観と客観、精神と自然のあいだに広がった深淵を乗り越えることの可能性と不可能として出来し、神学的には超越的な神と汎神論とのあいだの緊張関係として現れるものである。

コウルリッジの「想像力」論はカントやシェリングの想像力論に大きな影響を受けたものであったが、彼自身は超越的な審級としての神を前提として議論を行っているため、最終的には「想像力」が抱え込んだ矛盾を抑圧することとなる。対してワーズワスは、彼が「想像力」と「空想」のあいだに質的な差異を設けないことからもわかるように、この矛盾をそのまま受け入れている。具体的にはそれが彼において、超越論的な「想像力」と経験主義的「習慣」の同一視へと繋がることとなるのである。そしてこれは矛盾律をその弁証法的な精神の動きのなかに受け入れたヘーゲルと重なるものである。このような形で、「ワーズワスーヘーゲル」とコウルリッジとのあいだの差異化を行った。また「想像力」への注目は、この差異化の精度を上げるものともなる。「想像力」が孕んだ不安や矛盾は、詩人コウルリッジと神学者コウルリッジとのあいだの矛盾として立ち現れるため、コウルリッジ自身の抱え込んだ矛盾を表現するものとなるからだ。従来の研究においても、コウルリッジの神学とワーズワスの汎神論的性格との相違は繰り返し指摘されているが、「想像力」に注目することで、両者のあいだの共感と相違をより繊細で微妙な次元で論じることが可能となる。第二年度の研究では、ドイツ観念論哲学の精読によって、本研究の眼目である「存在論的差異化」の精度を上げることが可能となった。具体的にはデリダが"Pharmakon"(毒と薬の両方を意味する)という概念によって表現したような両義的な概念の有り様を、本研究が焦点を当ててきた力である「想像力」や「習慣」に見いだすことで、固定化された概念の対立によって差異化を行う(ヘーゲルでいうところの悟性的)研究とは違い、概念それ自体が動的に変容する現場に寄り添いながらの差異化が可能となった。このことは詩人同士の両価的な心の機微を確実に捉えた差異化を行う点でも不可欠であるが、批評史の文脈でも重要となる。本研究はワーズワスとコウルリッジが計画していた「哲学詩」の内実に光を当てるものであるが、彼らの詩的な存在論を適切に説明するためには、悟性的な批評にしばしば見られる安易な理解の欲望を斥けることが肝要であるからだ。こうした批評はしばしば哲学的知と詩的な知を分離し、詩的な存在論の説明を哲学的な概念で説明することで破壊してしまったり、逆に詩的な領域を哲学的な知によっては理解不可能なものとして神秘化することで、わからないものとしてわかった気になってしまう。最終的には詩人と哲学者との分離、ワーズワスとコウルリッジの分離へと通じるそのような批評的欲望が、これまでの批評史を貫いているが、これを斥けることによってはじめて「哲学詩」の描出が可能となる。それゆえ本研究においては批評の欲望そのものに意識的となり、差異化の精度を上げることが必須なのである。採用第三年度目は、まず前年度に再確認した「習慣」と中世スコラ哲学の強固な結びつきを、コウルリッジの『ノートブック』を詳細に研究することで明確にし、その思想的背景を明示化した。
歯周病原性菌の特異抗体を用いた治療法に関する基礎的研究

歯周病原性細菌のひとつであるPorphyromonas gingivalis(P・gingivalis)由来47kDa抗原性タンパク質に対する特異抗体産生ハイブリドーマ(mAbG 5)を10%FCS含有RPMI-1640倍地で培養した。その上清に対して80%硫安沈殿後、affinity chromatography kit(MAbTrap G2)を用いてモノクローナル抗体(mAb)を精製した後、centriconを用いて濃縮した。まず、マウスに投与するmAbの量とその抗体が生体内に持続して存在している期間を調べるために、このmAbを1,5,10mg/mlの濃度に調整し、8週齢BALb/cマウスの眼窩下静脈より1mlずつ投与した。その後、1,2,4,7日後に末梢血を採取し、ELISAで調べた。ELISAは抗原をP.gingivalis381の超音波破壊抽出物とし、1次抗体は採取した末梢血を5倍希釈して用いた。2次抗体は1000倍希釈のHRP標識抗マウスIgヤギ血清を用いてOD=490で測定した。その結果、mAb 10mgを投与した場合2日後までは末梢血中にmAbの存在が確認できた。しかし、投与するmAbの量と効果的な抗体価の上昇を考えあわせると、今回の投与方法は効率的とはいえなかった。そのため抗体産生ハイブリドーマ自体をマウス生体内へ直接眼窩下静脈より投与し、実験期間中生体内で抗体を産生させる方法なども考慮してさらに検討することが必要と思われた。次に、P,gingivalis 381のgrowth curveをJunior 2 spectrophotometerを用いて調べたところ対数増殖期は60-80時間であった。そこでこの対数増殖期の培養液中に滅菌した絹糸を浸し、その絹糸をマウスの下顎第一大臼歯の歯肉溝に挿入して歯周組織の破壊を惹起できるかについては現在実験を継続中である。
肝膵同時大量切除の研究-特に膵切除によるホルモンの変化に対する肝再生について

肝切除を70%のみおこなった群とこれに膵切除を50%加えた群で、術後3、7、14、28日目の肝再生率をみると、肝切除のみの群ではそれぞれ28.0%、57.7%、69.6%、78.9%、107.6%であった。また膵切除50%加えた群では、それぞれ28.6%、40.8%、56.2%、69.5%、92%であった。実験前の予測どおり、膵切除を加えることで肝再生率は、肝切除のみのときと比較して低下していた。統計学的には、術後3、14、28日目に有意差をもって肝切除のみの群で再生率が高かった。この違いを膵ホルモンの変化であるかをみるため門脈血中のインスリンとグルカゴンを測定した。またコントロールとして単開腹(n=10)したときの門脈血中のインスリン濃度は31.2muq/ml、グルカゴン濃度は152.4pq/mlであった。肝切除のみのインスリン濃度は術後3、7、14、28日目それぞれ10、19.2、13.5、23.3と術後14日目にやや低下するが全体に上昇傾向を示したが、膵切除群では27、16、9.5、14と上昇傾向は示さなかった。またグルカゴンでは肝切除群では348、387、250、242で膵切除を加えたものとあまり変化はなかった。そこでグルカゴン/インスリン比をみると肝切除のみでは34.8、20.2、18.5、10.4で、経過ごとにグルカゴンの上昇にみあったインスリンが分泌されてくるが膵切除を加えると16.2、20.1、20.3、20.3とグルカゴン/インスリン比が低下してこなかった。これはインスリンが十分分泌されないためと思われた。動脈血のGOT、GPT、NH3には差はみられていない。また網内系の機能として肝DNA中へのthymidineの取り込み率は実施中であるが、検体数がすくなく現在実験中で結論は出ていない。
遺伝子解析によるアドレノメデュリンの循環器系における病態生理的意義の解明

新しい降圧ペプチド、アドレノメデュリン(AM)の血中濃度は種々の循環器疾患において上昇しているが、身体各部位の血中濃度には明らかな違いがなく、循環血液中のAMは主として血管壁の内皮細胞や平滑筋細胞に由来することが推測される。本研究では、AM遺伝子の5′上流領域DNAをルシフェラーゼ・ベクターに組み込み、ヒト大動脈由来培養血管内皮細胞(HAEC)に導入し、プロモーター活性を検討した。ヒトAM遺伝子5′上流領域は、HAECにおいて、SV40ウィルスのプロモーターの1/10程度の発現活性を示した。DNA鎖長を漸次短くしていくと、100base付近で約40%,50base付近で約80%発現活性が低下し、TATA boxを失うとほとんど発現活性がなくなった。転写開始点より上流-85-93baseの部位にはNF-IL6,-33-68baseには7つのAP-2結合部位のコンセンサス配列が存在し、NF-IL6の3塩基に変異を導入するとルシフエラーゼの発現が42%低下した。また、センス,ノンセンスのオリゴDNAを用いたゲルシフト・アッセイにて、HAECより抽出した核蛋白中にNF-IL6およびAP-2のコンセンサス配列と特異的に結合するバンドが認められた。以上の成積より、ヒト血管内皮細胞においてAM遺伝子の発現にはRNAポリメラーゼのTATA boxへの結合が重要であり、その他に転写因子としてNF-IL6やAP-2が発現調節に関与すると考えられる。IL-1,TNFなどのサイトカインやLPSはAM産生を刺激するが、これには転写因子としてNF-IL6が関与することが推測される。また、我々は血中のAMとノルエピネフリンが正相関することを観察したがα1受容体によるホスホリパーゼC,プロテインキナーゼCの活性化がAP-2を介し、AM遺伝子の発現を促進する機序が考えられる。ヒト大動脈由来の培養血管内皮細胞(HAEC)よりRNAを抽出し、ヒト・アドレノメデュリン(AM)のcDNAをプローブとしてノザン・ブロット解析を行なった結果、HAECにおいてAMのmRNAが発現していることが確認された。次にAMcDNAの第1エキソンにおいて3'→5'方向に24baseのプライマーを作成し、HAECのRNAをテンプレートとしたプライマー伸長法によりAM遺伝子の転写開始部位を決定した。AM遺伝子にはTATA boxの下流21baseおよび25baseの位置に2箇所の転写開始部位が認められた。そこで、この転写開始部位より上流1534baseのプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだプラスミド・ベクターを作成し、リポゾーム法にてHAECに導入した。発現したルシフェラーゼ活性による蛍光を測定し、同時に遺伝子導入したβ-ガラクトシダーゼの発現活性にて補正して、AM遺伝子上流のプロモーター活性を定量した。AM遺伝子のプロモーター領域1534baseは、SV40ウィルスのプロモーターを有する対照ベクターに比して1/10程度の発現活性を示した。この1534baseのプロモーター領域DNAを5'側よりエキソヌクレアーゼで消化することにより、あるいは新たにPCR産物を組み込むことにより漸次鎖長を短くしてプロモーター活性の推移を検討した。AM遺伝子上流DNAのプロモーター活性は200baseまでは変わりがなかったが、200base以下の鎖長ではプロモーター活性が減少し、TATA boxを失った鎖長ではほとんど発現活性が認められなかった。以上、ヒト血管内皮細胞においてAM遺伝子の発現を確認し、その転写開始部位を決定した。

AM遺伝子の発現にはその5'上流200baseの中に存在するcis elementが関与し、RNAポリメラーゼのTATA boxへの結合が必須であると考えられる。新しい降圧ペプチド、アドレノメデュリン(AM)の血中濃度は種々の循環器疾患において上昇しているが、身体各部位の血中濃度には明らかな違いがなく、循環血液中のAMは主として血管壁の内皮細胞や平滑筋細胞に由来することが推測される。本研究では、AM遺伝子の5'上流領域DNAをルシフェラーゼ・ベクターに組み込み、ヒト大動脈由来培養血管内皮細胞(HAEC)に導入し、プロモーター活性を検討した。ヒトAM遺伝子5'上流領域は、HAECにおいて、SV40ウィルスのプロモーターの1/10程度の発現活性を示した。DNA鎖長を漸次短くしていくと、100base付近で約40%,50base付近で約80%発現活性が低下し、TATA boxを失うとほとんど発現活性がなくなった。転写開始点より上流-85--93baseの部位にはNF-IL6,-33--68baseには7つのAP-2結合部位のコンセンサス配列が存在し、NF-IL6の3塩基に変異を導入するとルシフェラーゼの発現が42%低下した。また、センス,ノンセンスのオリゴDNAを用いたゲルシフト・アッセイにて、HAECより抽出した核蛋白中にNF-IL6およびAP-2のコンセンサス配列と特異的に結合するバンドが認められた。以上の成績より、ヒト血管内皮細胞においてAM遺伝子の発現にはRNAポリメラーゼのTATA boxへの結合が重要であり、その他に転写因子としてNF-IL6やAP-2が発現調節に関与すると考えられる。IL-1,TNFなどのサイトカインやLPSはAM産生を刺激するが、これには転写因子としてNF-IL6が関与することが推測される。また、我々は血中のAMとノルエピネフリンが正相関することを観察したが、α1受容体によるホスホリパーゼC,プロテインキナーゼCの活性化がAP-2を介し、AM遺伝子の発現を促進する機序が考えられる。
「大学教育とキャリア」関係の日本的形成メカニズム

本研究の目的は、大学教育とキャリアとの関係を実証的に描き出すことである。具体的な対象として経済学部卒業生を取り上げて質問紙調査を実施し、大学時代の過ごし方と現在の学習状況、そして社会経済的地位との関係について、過去に実施した工学系卒業生への調査結果と比較しつつ分析した。そのうえで「大学教育が役に立たない」という言説がなぜ生み出されているのかについて検討を加えている。本研究の目的は、大学教育のレリバンスについて、とくにキャリアとの関係に焦点を当てながら、明らかにすることである。具体的な課題の設定にあたっては、研究代表者自身が関わってきた研究プロジェクトの成果である「まなび習慣仮説」を出発点とした。「まなび習慣仮説」とは、工学系の大卒者に実施した質問紙調査の分析から抽出した「大学教育とキャリア」との関係に関する1つの仮説であり、「大学時代の学習経験は、現在のキャリアに直接的な影響は与えないが、現在の学習経験を経由することによって、間接的に影響を及ぼしている」と考えるもりである。本研究は、対象を工学系から経済・経営系に切り替え、この「まなび習慣仮説」が文系でも実証されるかどうかを検討する。そのために、本年度は次の2点の作業を行った。(1)いくつかの経済・経営学系学部に調査協力を依頼し、1大学から協力を得ることができた。121月に質問紙調査を設計、2月に調査対象者の選定と発送準備をし、3月に調査を実施した。現段階で回収作業はほぼ終了しており、これからデータ入力作業に入る予定である。(2)並行して、調査会社に協力を依頼し、調査会社のモニターから経済・経営系学部の卒業生をスクリーニング、約500名を対象に(1)と同じ内容の調査を平成21年度4月に実施する予定である。平成20年度は、そのための準備と調整を行った。学部単位の調査だけでなく、調査会社を通じての調査も同時に行うという変更が加わっているものの、研究目的どおりの分析ができるよう順調に作業が進んでいるものと評価されうる。大学教育とキャリアの関係はどう理解されるべきか。大学教育のレリバンスはどこにあるのか。高等教育が大衆化し、専門分野と卒業後の仕事とのリンクがみえにくくなった日本において、これは政策選択の土台としなければならない基本的な問題である。にもかかわらず、この問題に対する解は見出せておらず、それどころか根拠のない大学教育無用論が飛び交っているのが現状であろう。本研究では、こうした状況の打破に重要な手がかりを与えてくれるのが「学び習慣仮説」だと考える。この仮説は工学系卒業生調査の実証分析から導き出されたものであり、「大学時代の学習経験は現在のキャリアに直接的な影響は与えないが、現在の学習経験を経由することによって、間接的にキャリアに影響を及ぼしている」というものである(詳細は、矢野眞和,2009「教育と労働と社会-教育効果の視点から」『日本労働研究雑誌』No.588, 5-15)。本研究では、工学系の実態を踏まえたこの仮説を経済学部卒業生にあてはめた場合の説明力をみることによって、大学教育のレリバンスについてさらなる検討を加えるものである。質問紙調査を実施して分析した結果、主に次の3点が明らかになった。(1)経済学部卒業生に関しても「学び習慣仮説」の基本構図が認められた。(2)ただし、工学系卒業生調査の結果と経済学部卒業生調査の結果とを比較すると、工学系卒業生にとっての「大学時代の学習」のほうが、所得向上により大きな効果を与えていた。データによると、工学系の場合、「大学時代の学習」の効果の大きさは「現在の学習」の効果の約3分の1。他方で経済学部の場合は約8分の1という値だった。(3)経済学部卒業生の大学教育への評価は、工学系卒業生のそれに比べて低いものになっている。こうした結果には、以上で示した「効果のつながりの弱さ」が関係していると考えられる。
硫酸基糖転移酵素の発現クローニングと癌転移との関連についての研究

我々の研究室で作製した硫酸化糖脂質を認識する種々のモノクローナル抗体を利用することにより、真核細胞発現ベクターを用いてこれまで困難であった硫酸化糖転移酵素の遺伝子を、発現クローニングし酵素学的な研究と細胞接着物質、細胞間マトリックス、及び血液凝固物質などとの反応性の検討が行えるなどの発展を目指して研究を進めた。1.真核細胞発現ベクターを用いて作製した、硫酸化糖鎖抗原陽性のHepG2細胞のcDNAライブラリーをCOS細胞にトランスフェクションを行った。硫酸化糖鎖特異的モノクローナル抗体を付着させたフレート上に、トランスフェクタント細胞を反応させ、Hirt法によるplasmid DNAの回収を行った。この一次Panningを2ク-ル施工した。現在継続中である。2.末端ガラクトースに硫酸基の結合した構造の中で、最も単純な構造(SM3)の合成に関与する、糖脂質特異的硫酸基糖転移酵素が先日報告されたが、そのcDNAのcoding regionの断片を用いて、硫酸化糖脂質の存在が証明された(Hiraiwa,N.,etal.Cancer Res.50:2917-2928,1990)ヒト肝癌細胞株、胆肝癌および硫酸化糖脂質の合成を認められなかったヒト正常肝由来細胞の同酵素の転写発現をNorthern blotで調べたところ、同糖脂質合成量と遺伝子転写発現量とは正の相関を見た。現在、同酵素遺伝子を正常肝由来細胞に安定発現させ、硫酸化糖脂質の合成、細胞接着などの機能変化を研究している。3.細胞接着に関与する他の酸性糖鎖を合成する糖転移酵素遺伝子のヒト癌組織及び癌細胞における発現を検討し、特定の酵素遺伝子の発現増大が認められた。一部の糖転移酵素遺伝子の転写発現調節をゲノム解析した。現在継続中である。血液凝固系関連物質や細胞間接着物質との相互作用が注目される硫酸化糖鎖の合成を司る糖転移酵素のクローニングを目指し、平成7年度の研究計画に従って以下の研究を行った。1.抗硫酸化糖鎖モノクローナル抗体の精製および検討:末端ガラクトースに硫酸基が結合した構造の一群の糖鎖に対するモノクローナル抗体及びその腹水由来精製抗体を得た。その抗体の抗原特異性は、TLC-immunostaining, ELISAにより確認し、細胞表面での抗原認識能については、FACSによりヒト肝臓癌細胞株HepG2に硫酸化糖脂質が細胞表面に認められた。また末梢神経組織やNK細胞に特異的に認められる、グルクロン酸に硫酸基が付加された特異抗原HNK-1に対する特異モノクローナル抗体では、ヒト肺小細胞癌株の細胞表面に強く発現されていることがFACSにより判明した。これらの細胞株に対して、モノクローナル抗体がPanning法に適切か調べたところ、肯定的所見を得た。2.cDNAライブラリーの作製:硫酸化糖鎖抗原陽性のHepG2細胞、肺小細胞癌株から、mRNAを抽出し、oligo-dTをプライマーにして、cDNAを合成した。BstXIアダプター付加後、真核生物発現ベクターpCDM8に組み込み、cDNAライブラリーの作製を行った。得られたcDNAライブラリーの検討は、インサート部分のサイズ確認やNorthernblot、RT-PCRにより適正なライブラリーと判断された。以後、得られたcDNAライブラリーを、前駆物質を細胞表面に持つ真核細胞株にトランスフェクションし、一時的発現を生じしめ、発現された抗原物質について、硫酸化糖鎖を認識するモノクローナル抗体を用いて、Panning法を行う。これを繰り返し、特異的な糖鎖遺伝子のクローニングに持っていく。血液凝固系関連物質や細胞間接着物質との相互作用が注目される硫酸化糖鎖の合成を司る糖転移酵素のクローニングを目指し、平成8年度の研究計画に従い、以下の研究を行った。1.cDNAライブラリーを用いた硫酸化糖鎖の発現SV40 T

抗原産生細胞COS細胞表面には、目的とする硫酸化糖鎖の前駆体である構造の存在をモノクローナル抗体を用いた抗原解析及び糖脂質抽出にて認めた。真核細胞発現ベクターを用いて作製した、硫酸化糖鎖抗原陽性のHepG2細胞、及び肺小細胞癌株のcDNAライブラリーを、COS細胞にトランスフェクションを行った。硫酸化糖鎖特異的モノクローナル抗体を付着させたプレート上に、トランスフェクタント細胞を反応させ、Hirt法によるplasmid DNAの回収を行った。この一次Panningを2ク-ル施行した。以後、Panning法を繰り返し、特異クローンを求めていき、その中で硫酸基糖転移酵素活性を発現するクローンの同定を行う。2.糖脂質特異的糖転移酵素との類似性末端ガラクトースに硫酸基の結合した構造の中で、最も単純な構造(SM3)の合成に関与する、糖脂質特異的硫酸基糖転移酵素が先日報告されたが、2型膜糖蛋白構造のそのカルボキシル末端側のアミノ酸部に硫酸基基質と反応する部位が存在すると考えられ、その部分のdegenerative核酸配列を合成した。上記のcDNAとそのdegenerative primersを用い、RT-PCRを施行し、数種の産物を得た。以後、得られたPCR産物の核酸配列を決定し、糖転移酵素をコーディングしている可能性のあるものに関して、得られているcDNAライブラリーとのColony-Hybridizationを行う。を行なう。我々の研究室で作製した硫酸化糖脂質を認識する種々のモノクローナル抗体を利用することにより、真核細胞発現ベクターを用いてこれまで困難であった硫酸化糖転移酵素の遺伝子を、発現クローニングし酵素学的な研究と細胞接着物質、細胞間マトリックス、及び血液凝固物質などとの反応性の検討が行えるなどの発展を目指して研究を進めた。1.真核細胞発現ベクターを用いて作製した、硫酸化糖鎖抗原陽性のHepG2細胞のcDNAライブラリーを、COS細胞にトランスフェクションを行った。現在継続中である。2.末端ガラクトースに硫酸基の結合した構造の中で、最も単純な構造(SM3)の合成に関与する、糖脂質特異的硫酸基糖転移酵素が先日報告されたが、そのcDNAのcoding regionの断片を用いて、硫酸化糖脂質の存在が証明された。(Hiraiwa,N.,et al.Cancer Res. 50:2917-2928,1990)ヒト肝癌細胞株、胆管癌および硫酸化糖脂質の合成を認められなかったヒト正常肝由来細胞の同酵素の転写発現をNorthern blotで調べたところ、同糖脂質合成量と遺伝子転写発現量とは正の相関を見た。現在、同酵素遺伝子を正常肝由来細胞に安定発現させ、硫酸化糖脂質の合成、細胞接着などの機能変化を研究している。
RNAスプライシングを介したEMT制御の転移性頭頸部がん治療への応用にむけた研究

本年度は頭頸部癌におけるEMT過程の進行に伴い、がん細胞の運動能が増強し血管内移動(TEM)を起こし遠隔転移を起こす過程においてESRP1分子の低下がどの様に関与しているのか頭頸部癌細胞株を用いてin vitroに研究を進めた。まず我々はESRP1発現が低下した細胞においてアポトーシスの形態がどう変化するのかを調べた。siRNAを用いて頭頚部扁平上皮癌細胞株であるSASおよびHSC4細胞においてESRP1をノックダウンし、抗がん剤(docetaxel)添加して24時間後のアポトーシスを調べた。ESRP1発現細胞に比べて発現低下している細胞ではアポトーシス抵抗はなかったが、細胞質に泡沫状変化が顕著に見られた。この形態変化からは細胞死の一種であるpyroptosisの可能性があることが示唆された。Pyroptosisの特徴として炎症誘導性サイトカイン(IL-1bやIL-18)の増加があるため、次にESRP1ノックダウン細胞において、炎症誘導を起こしうるサイトカインが分泌されるかどうか調べた。頭頸部癌細胞株SAS, HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, KUMA1, Gun1細胞株それぞれでESRP1ノックダウンを行い、48時間後の上清を回収、TNF-alfaおよびIL-1betaサイトカインの分泌の程度をELISAで調べた。TNF-alfa分泌についてはいずれの細胞株ではほとんど発現上昇していなかったが、IL-1betaについてはSAS, HSC4, Ca9-22. KUMA1細胞において分泌が上昇していた。これらからESRP1発現が低下している頭頸部癌細胞では炎症誘導性サイトカインであるIL-1betaの分泌亢進が起こっていることがわかり、炎症が誘導されうることが示唆された。次にIL-1betaを誘導する機序を調べたところHMGB1遺伝子の発現が増強し、ESRP1ノックダウンしたがん細胞の上清中にもHMGB1分泌が亢進していた。これらの結果から頭頚部がん細胞においてEMTが起こり、ESRP1が低下している状況下ではアポトーシスの形式が異なり、炎症誘導を効率的に起こす可能性が高いことがわかった。
長寿関連ミトコンドリアDNA多型を用いたテーラーメイド予防法の確立

長寿関連ミトコンドリア遺伝子多型(Mt5178C/A多型)と飲酒習慣との高血圧症リスクおよび高尿酸血症リスクへの交互作用、Mt5178C/A多型と喫煙習慣との呼吸機能への交互作用、Mt5178C/A多型とコーヒー飲用との高血圧症リスクおよび耐糖能異常リスクへの交互作用を論文発表した.また、Mt5178C/A多型と心血管疾患の危険因子の重積との関連について検討し、Mt5178C型の男性においては毎日の飲酒が心血管疾患危険因子の重積と関連することを学会報告した.長寿関連ミトコンドリア遺伝子多型(Mt5178C/A多型)と飲酒習慣との高血圧症リスクおよび高尿酸血症リスクへの交互作用、Mt5178C/A多型と喫煙習慣との呼吸機能への交互作用、Mt5178C/A多型とコーヒー飲用との高血圧症リスクおよび耐糖能異常リスクへの交互作用を論文発表した.また、Mt5178C/A多型と心血管疾患の危険因子の重積との関連について検討し、Mt5178C型の男性においては毎日の飲酒が心血管疾患危険因子の重積と関連することを学会報告した.我々は長寿関連ミトコンドリア遺伝子多型(Mt7178C/A)を用いた生活習慣病のテーラーメイドの予防法の確立を目指している。今年度について以下のことを明らかにした。(1)男性321名(53.0±7.7歳)を解析対象として、BMI25未満とBMI25以上の2群に分けて尿酸値について検討した。飲酒頻度を考慮した上で、年齢、BMIなどで調整したところ、BMI25未満の群においてMt5178C/A多型と飲酒頻度との交互作用を認め、Mt5178C型で毎日飲酒する習慣を有する人はそうでない人に比較して尿酸値が高かった。また、毎日飲酒する習慣を持つMt5178C型の毎日飲酒する習慣を持つMt5178A型に対する高尿酸血症(血清尿酸値6.5mg/dl以上)のオッズ比は3.26(95%CI:1.14-9.29)、同じく毎日飲酒する習慣を持たないMt5178C型に対する高尿酸血症のオッズ比は3.22(95%CI:1.39-7.45)であった。本研究は、長寿関連ミトコンドリア遺伝子多型(Mt5178C/A多型)と喫煙習慣、飲酒習慣との血圧、血清脂質濃度、血糖値及び耐糖能、血球係数、眼圧、血清蛋白分画濃度、血清電解質濃度、血清尿酸値、呼吸機能などへの交互作用を詳細に検討することを目的とし、最終的には長寿関連ミトコンドリアDNA多型に基づく生活習慣病のテーラーメイドの予防法の確立を目指すものである。本年度の成果としては、(1)Mt5178C/A多型と呼吸機能成績との関係、及びMt5178C/A多型と喫煙習慣との呼吸機能成績への交互作用についての論文の発表(Kokaze A, et. al.J.Hum.Genet.52:680-685,2007)、(2)Mt5178C/A多型とコーヒー飲用との耐糖能異常への交互作用についての学会発表がある(第78回日本衛生学会総会)。(1)の論文では、55歳未満において長寿関連Mt5178C/A多型と%肺活量との関連が認められたこと、および55歳以上においてMt5178C/A多型と喫煙習慣の1秒率への交互作用が示唆されたことを報告した。(2)の学会発表では、コーヒー飲用について1日0杯、1-3杯、4杯以上の3群に分け、年齢、BMI、飲酒習慣、喫煙習慣、血清中性脂肪値で調整したところ、Mt5178C型においてコーヒー飲用が1日4杯以上の人は0杯の人に比較して耐糖能異常リスクの有意な低下を認めたことを報告した。今後はMt5178C/A多型と酸化ストレスマーカーである8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)、Plasminogen Activator Inhibitor(PAI-1)、酸化LDL、Lipid Peroxides(LPO)などとの関係についても明らかにしたいと考えている。
ニーチェにおける科学主義と反科学主義の再検討―ショーペンハウアーとの対比のなかで

2018年8月26日28日に青森中央学院大学にて第2回研究会を開催、個人研究発表、研究構想発表、ワークショップを行った。また、研究成果を一般市民に公開すべく、8月28日に青森県むつ市の「むつ来さまい館」にてシンポジウム「ショーペンハウアーとニーチェー意志の否定か、意志の肯定か?」を、むつ市市民講座のプログラムとして開催した。個人発表は、1関塚正嗣「ニーチェの真理論と科学批判ー命令としての矛盾律」、2齋藤智志「ショーペンハウアーにおける超越論哲学と自然哲学」、3竹内綱史「ニーチェによるショーペンハウアーの共苦道徳批判」、4梅田孝太「ニーチェの力の思想ー生成としての自然理解から見たニーチェの科学主義」の4本、研究構想発表は、1鈴木克成「ニーチェとクーンー可謬性を前提とし、「反証」に基づかない「真理」」、2高橋陽一郎「ショーペンハウアーにおける自然哲学の諸問題」、3伊藤貴雄(創価大学)「意志のアナロジーに関する一考察」の3本、ワークショップは、1「科学と生」(1):「ショーペンハウアーの自然科学批判(承前)」、2「科学と生」(2):「ニーチェ『悦ばしき科学』における科学と芸術」の2本であった。また、むつ市でのシンポジウムでは、上記表題のもと、齋藤智志と本郷朝香が提題を行った。本研究は、ニーチェ哲学の4つの主要概念(権力への意志、超人、芸術の生理学、永遠回帰)を、彼の先駆者にして批判対象でもあるショーペンハウアーと対比しつつ科学主義の視点から整合的に解釈することでニーチェ解釈を刷新し、可謬的な科学の営みが哲学に対して持つ意義と、「絶対的真理」と化してしまう科学の陥穽とを複眼的に精査する視点を得ることを目指しているが、今年度の研究は昨年度に引き続き、上記研究会を核としてこの目的の達成に必要な直接的および間接的な成果を蓄積した。本研究は、「研究概要の実績」にも示した通り、ニーチェ哲学における4つの主要概念である、権力への意志、超人、芸術の生理学、永遠回帰を対象とし、それらを科学主義的側面、反科学主義的側面、ショーペンハウアーとの対比といった観点から分析したうえで、科学主義的ニーチェ解釈という新機軸を呈示することを目指しているが、むろんこうした概念や観点の切り分けは本研究チームの問題意識と分析の対象をクリアーにするためのマトリックスであって、実際にはこうした概念や観点はニーチェ哲学のなかでは密接に融合し、一つの全体を形成している。したがって、昨年度の研究に引き続き本年度の研究も、ニーチェの科学主義と反科学主義、ならびにその比較対象であるショーペンハウアーの自然科学観に関する多角的で包括的な研究と、それを支えるテクストの綿密な読解作業を継続する必要があった。以上の観点からすると、「研究概要の実績」に示した個人研究発表や研究構想発表は、総合的に見て本年度に期待されていた内容をおおむね満たすものであった。また、ワークショップでのショーペンハウアーとニーチェのテクスト読解は、期待されていた内容を十分に満たすものであった。加えて第2回目のニーチェ・セミナー(日本ショーペンハウアー協会主催、2018年12月16日開催)時には、当初の計画通り、自然主義に関する優れた研究書を上梓している井頭昌彦氏に、自然主義の最新動向についての講演を行ってもらい、研究メンバーの自然主義理解をより深めることができた。以上より、本研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」に該当すると判断する。本研究は、メンバー全員による研究会を核とし、それに、ワーキンググループによる随時のメール会議と、日本ショーペンハウアー協会「ニーチェ・セミナー」時(年2回)のワーキンググループ会議を加えることで進めることを当初の計画としたが、進捗状況は上記の通りおおむね順調であるので、次年度も引き続きこの方法で進めるとともに、次年度が本研究の最終年度であるので、総括シンポジウムを開催する予定である。第3回研究会については、8月25日27日に龍谷大学で開催することが決定している。また、2019年度第1回目のニーチェ・セミナーが5月3日・4日に八王子セミナーハウスで開催されることも決定している。研究会は、個人研究発表5本とワークショップ2本を内容とし、それに加えて総括シンポジウムに向けた研究総括企画会議も実施する予定である。総括シンポジウムの内容の詳細は、第3回研究会を含むこれまでの研究会等での成果を総合的に勘案して上記会議で決定するが、当然ながらそうした成果の蓄積に基づいて本研究テーマについての一定の結論を提示する予定である。なお、本シンポジウムは当初の計画通り、3年間の研究成果を広く世に問うべく公開シンポジウムとする。加えて、本シンポジウムでは優れたニーチェ研究を公にしている研究者を複数招いて講演をしてもらうとともに、その研究者も含めた参加者全員で本研究会での成果をどのように評価するかも論じ合い、次なる研究のありうべき展開も模索する予定である。2017年8月27日29日に諏訪東京理科大学にて第1回研究会を開催、研究代表者である齋藤智志による本研究全体の趣旨発表に続き、個人研究発表、研究構想発表、ワークショップを行った。個人発表は、1竹内綱史「ニーチェにおける「自然主義的転回」の帰趨ー第四『反時代的考察』から『人間的、あまりに人間的』へ」、2岡村俊史「価値の価値を測ることはいかにして可能か?ーニーチェにおける「価値」概念の分析を通して」、3上野山晃弘

「近代批判としての自然哲学ーショーペンハウアーの動物倫理再考」の3本、研究構想発表は、1五郎丸仁美「自由と必然を巡る中期ニーチェの思考と科学主義」、2本郷朝香「「自己分割する霊魂」としての英雄の悲劇」の2本、ワークショップは、1「科学と生」(1):「ショーペンハウアーの自然科学批判」、2「科学と生」(2):「ニーチェの自然科学批判」の2本であった。本研究は、ニーチェ哲学の主要概念を、彼の先駆者にして批判対象であるショーペンハウアーと対比しつつ科学主義の視点から整合的に解釈することでニーチェ解釈を刷新し、可謬的な科学の営みが哲学に対して持つ意義と、「絶対的真理」と化してしまう科学の陥穽とを複眼的に精査する視点を得ることを目指している。具体的にはニーチェ哲学における4つの主要概念ー1権力への意志、2超人、3芸術の生理学、4永遠回帰ーに的を絞り、それらをショーペンハウアー哲学と対比させつつ、科学主義的視点から整合的に解釈するという方向性を打ち出そうとしているが、今年度の研究は、上記研究会を核とし、メンバーの個人研究や共同作業を通して、この目的の達成に必要な直接的および間接的な成果を蓄積した。また、ワークショップでは綿密なテクスト読解と検討を行い、メンバーによる基礎資料への理解を深めた。本研究は、「研究概要の実績」にも示した通り、ニーチェ哲学における4つの主要概念である、権力への意志、超人、芸術の生理学、永遠回帰を対象とし、それらを科学主義的側面、反科学主義的側面、ショーペンハウアーとの対比といった観点から分析したうえで、科学主義的ニーチェ解釈という新機軸を呈示することを目指しているが、むろんこうした概念や観点の切り分けは問題意識と分析の対象をクリアーにするためのマトリックスであり、こうした概念や観点はニーチェ哲学のなかでは密接に融合し、一つの全体を形成している。したがって、本研究への着手年である2017年度は、何よりもまずニーチェの科学主義、ならびにその比較対象であるショーペンハウアーの自然科学観に関する多角的で包括的な研究と、それを支えるテクストの綿密な読解作業が必要であった。以上の観点からすると、「研究概要の実績」に示した個人研究発表や研究構想発表は、総合的に見て本年度に期待されていた内容をおおむね満たすものであった。またワークショップは、期待されていた内容を十分に満たすものであった。以上より、本研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」に該当すると判断する。2018年8月26日28日に青森中央学院大学にて第2回研究会を開催、個人研究発表、研究構想発表、ワークショップを行った。また、研究成果を一般市民に公開すべく、8月28日に青森県むつ市の「むつ来さまい館」にてシンポジウム「ショーペンハウアーとニーチェー意志の否定か、意志の肯定か?」を、むつ市市民講座のプログラムとして開催した。個人発表は、1関塚正嗣「ニーチェの真理論と科学批判ー命令としての矛盾律」、2齋藤智志「ショーペンハウアーにおける超越論哲学と自然哲学」、3竹内綱史「ニーチェによるショーペンハウアーの共苦道徳批判」、4梅田孝太「ニーチェの力の思想ー生成としての自然理解から見たニーチェの科学主義」の4本、研究構想発表は、1鈴木克成「ニーチェとクーンー可謬性を前提とし、「反証」に基づかない「真理」」、2高橋陽一郎「ショーペンハウアーにおける自然哲学の諸問題」、3伊藤貴雄(創価大学)「意志のアナロジーに関する一考察」の3本、ワークショップは、1「科学と生」(1):
マウス脳内性ホルモンによる神経保護作用と脳の脆弱性の性差

神経毒としてメチル水銀を用いた場合,ICRマウスではメスのほうが脆弱である。この性差の解明を目指して研究を行った。同時に,低用量のメチル水銀投与で観察された脳室の拡大という新たな神経毒性指標の分子機構の追及も,合わせて行った。昨年度は,ICRマウスにメチル水銀を投与した場合に,協調運動障害が現れる半分以下の投与量で中脳水道の狭窄が生じること,水道周囲灰白質(PAG)特異的にアクアポリン4の発現量が増加するという新規の知見が得られた。今年度は,まずメチル水銀投与マウスで脳部位別に水分含量を測定したところ,PAGで特異的に浮腫が生じていることを明らかにした。PAGで浮腫が生じることで中脳水道が狭窄し,脳室が拡大したと推定できる。さらにその分子機構として,比較的低用量のメチル水銀投与でPAG特異的に酸化ストレスが誘導され,アストロサイトが活性化し,アストロサイトでのアクアポリン4の発現が亢進される事を明らかにした。アクアポリン4は浮腫を引き起こすタンパク質であり,アストロサイトの活性化で発現が亢進される。また,アストロサイトは酸化ストレスによって活性化されるとの報告がある。よって,昨年度の研究成果と合わせて,脳室拡大の分子機構の少なくとも一部は,メチル水銀投与ー>PAG特異的な酸化ストレスの亢進ー>アストロサイトの活性化ー>アクアポリン4の発現上昇ー> PAGでの浮腫の生成ー>中脳水道の狭窄ー>脳せき髄液の滞留による脳室の拡大であることが,推定された。この研究は,メチル水銀による脳室の拡大という形態変化の観察から始まったが,平成29, 30年度の研究により,その分子メカニズムがかなり明らかになった。すなわち,低用量のメチル水銀投与により,水道周囲灰白質という脳内の特異的部位において酸化ストレスが亢進し,アストロサイトが活性化され,そしてアストロサイトでのアクアポリンの発現量が増加して浮腫が発生するというメカニズムである。水道周囲灰白質での浮腫は中脳水道を圧迫するのでそこが狭窄し,その結果脳室が拡大してMRIで検出が可能になったと推定することには矛盾点はない。分子メカニズムの一部が明らかになったことから,次年度の性差の研究で何をどのように測定すればよいかが明確になり,本研究の目的達成にむけ,大きく前進した。現在までに,ICRマウスのオスを用いた低用量のメチル水銀毒性メカニズムに関する研究成果が得られている。最終年度は,メスマウスにメチル水銀を投与してオスとの比較を行い,性差のメカニズム解明に迫る。オスと同じ投与条件でメスにメチル水銀を投与し,酸化ストレス酵素のmRNA,アストロサイト活性化マーカーのmRNA,アクアポリン4のmRNAをリアルタイムPCRで測定することにより,高精度でオスとの比較が可能である。そして,オスおよびメスの脳内,特に水道周囲灰白質での性ステロイドホルモン濃度を定量し,それとの相関を解析する。さらに,脳内性ステロイド濃度を変動させて同様の測定を行い,神経毒性の性差と性ステロイドホルモンとの関係を明らかにする。神経毒としてメチル水銀を用い,脳の脆弱性の性差の解析を行った。今年度は,ICRマウスへの亜急性投与実験による神経毒性の新たな検出手法を開発した。メチル水銀投与では,先行実験により協調運動障害に顕著な性差が観察された。一方,同じ投与条件で協調運動障害に先立ち,脳室の拡大がみられた。脳室の拡大についての性差を検討するために,脳室周囲と中脳水道灰白質の組織染色を行った。脳室周囲の線条体を,チロシンヒドロキシラーゼの免疫染色により視覚化し,その体積を計測した。また大脳皮質の厚みを,脳全体の厚みとの比として計測した。その結果,脳室が拡大した条件では,線条体体積や大脳皮質の厚みに有意な変動は見られなかった。脳室の拡大は,中脳水道の狭窄でも生じる。今回の実験で,脳切片の解析によってメチル水銀投与マウスでの中脳水道の狭窄が検出された。狭窄の原因を明らかにするため,中脳水道灰白質での器質的変化を精査したところ,メチル水銀投与によりアクアポリンー4の発現が増加し,GFAPやS-100βの発現も亢進していた。この変化は,大脳皮質では見られなかった。これは,メチル水銀によって中脳水道灰白質特異的にアストログリアが活性化され,アクアポリンの発現が増加したことを示唆する結果である。中脳水道灰白質特異的にアクアポリンの発現が増加すると,中脳水道周囲に浮腫が生じて圧迫による狭窄が起こると思われる。このメカニズムにおける性差について,現在検討している。メチル水銀毒性の性差を追及するための,特異的で顕著な器質的変化を,中脳水道灰白質で見出した。この予想しなかった発見により,性差における分子メカニズムの解析が容易になり,最終目的達成を確実に行える可能性が高まった。

昨年度は,ICRマウスにメチル水銀を投与した場合に,協調運動障害が現れる半分以下の投与量で中脳水道の狭窄が生じること,水道周囲灰白質(PAG)特異的にアクアポリン4の発現量が増加するという新規の知見が得られた。今年度は,まずメチル水銀投与マウスで脳部位別に水分含量を測定したところ,PAGで特異的に浮腫が生じていることを明らかにした。PAGで浮腫が生じることで中脳水道が狭窄し,脳室が拡大したと推定できる。さらにその分子機構として,比較的低用量のメチル水銀投与でPAG特異的に酸化ストレスが誘導され,アストロサイトが活性化し,アストロサイトでのアクアポリン4の発現が亢進される事を明らかにした。アクアポリン4は浮腫を引き起こすタンパク質であり,アストロサイトの活性化で発現が亢進される。また,アストロサイトは酸化ストレスによって活性化されるとの報告がある。よって,昨年度の研究成果と合わせて,脳室拡大の分子機構の少なくとも一部は,メチル水銀投与ー>PAG特異的な酸化ストレスの亢進ー>アストロサイトの活性化ー>アクアポリン4の発現上昇ー> PAGでの浮腫の生成ー>中脳水道の狭窄ー>脳せき髄液の滞留による脳室の拡大であることが,推定された。この研究は,メチル水銀による脳室の拡大という形態変化の観察から始まったが,平成29, 30年度の研究により,その分子メカニズムがかなり明らかになった。すなわち,低用量のメチル水銀投与により,水道周囲灰白質という脳内の特異的部位において酸化ストレスが亢進し,アストロサイトが活性化され,そしてアストロサイトでのアクアポリンの発現量が増加して浮腫が発生するというメカニズムである。水道周囲灰白質での浮腫は中脳水道を圧迫するのでそこが狭窄し,その結果脳室が拡大してMRIで検出が可能になったと推定することには矛盾点はない。分子メカニズムの一部が明らかになったことから,次年度の性差の研究で何をどのように測定すればよいかが明確になり,本研究の目的達成にむけ,大きく前進した。30年度は中脳水道灰白質に的を絞り,そこに生じるメチル水銀神経毒性の性差を追及する予定である。現在までに,ICRマウスのオスを用いた低用量のメチル水銀毒性メカニズムに関する研究成果が得られている。最終年度は,メスマウスにメチル水銀を投与してオスとの比較を行い,性差のメカニズム解明に迫る。オスと同じ投与条件でメスにメチル水銀を投与し,酸化ストレス酵素のmRNA,アストロサイト活性化マーカーのmRNA,アクアポリン4のmRNAをリアルタイムPCRで測定することにより,高精度でオスとの比較が可能である。そして,オスおよびメスの脳内,特に水道周囲灰白質での性ステロイドホルモン濃度を定量し,それとの相関を解析する。さらに,脳内性ステロイド濃度を変動させて同様の測定を行い,神経毒性の性差と性ステロイドホルモンとの関係を明らかにする。マウスを用いた性差の新たな実験系を確立したところ,予定より安価で研究が実施できた。30年度には,マウスの使用匹数を予定よりやや増やして,より精度の高い実験を実施する。また,ステロイドの測定の外注が増える可能性があり,そこでの支出が多くなると予想される。