hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国における企業合併・買収制度の成立及び運用状況に関する法史学的研究

その中で暫定的に固められた研究視覚として、共産党政権下における企業活動に対する種々の中央からのコントロールの契機と、各レヴェルの地方政府及びその保護下で形成される社会編成単位での利害関心から企業活動が中央からのコントロールを脱しようとする契機との、緊張・相克関係への着目が挙げられる。両契機が各々独自に歴史的多層性及び現代的問題を抱え、緊張・相克関係自体が一定の歴史性を有するという問題複合の中で、特に2年目以降解明すべき課題を特定して研究を進め、一部について論考を発表している。中央からのコントロールという契機については、中国の国有企業を対象に国有資産監督管理委員会による株式の間接的保有の構造及び共産党の全体的人事政策における国有企業の位置づけ等について検討を進め、特に松原が201112年度にアメリカに滞在した関係から、この点について先端的研究を行う研究者と討論を重ね、松原自身問題の歴史的基層を強調する報告をコロンビア大学で行っている。地方独自の展開については松原と石本茂彦(研究協力者。森・濱田松本法律事務所)の両名が、中国でM&A実務を行う日本企業を対象として、中国における各レヴェルの政府及び裁判所との関係及びそこでの戦略につきヒヤリングを行った。また歴史的基層として、財産保有構造と団体形成との関係が中心的な問題となり、これを扱う英語論稿を発表している。更にヴェトナムとの比較研究について、松原・石本が各々ヴェトナムに赴いて調査している。最終年度たる2014年度においては、前年度までに明らかになった中国における企業法の在り方を規定する歴史的基層の掘り下げを更に進めていくつかの場で発表すること、中国についての研究が進行する中で明らかになった歴史学的文脈に即したヴェトナム企業法制の法史学的研究について一定の見通しを示すこと、現代中国企業法文化についての歴史的文脈に即した理解を進めること、にあてられた。中国の企業法の歴史的基層については、企業法制の前提となる契約関連の諸制度がもつ重層性について、認識が深められた。主として土地契約文書の形で残されている基本的な文書形態が土地取引に限らぬ団体形成・契約のテンプレートとなったことは広く知られているが、父系親族団体が形成される際にも契約の契機が存在し、その内容が一方で祭祀の組織化・系譜認識の共有といった儀礼的な契機を、他方で族産の管理運営及びそこからの利益分配といった財産契約的な契機を、相互に未分節なまま内に含むことが確認された。ここには、伝統中国社会において企業活動を実質的に担った宗族・地縁的団体を支えた総合的な給付関係が見てとられた。こうした契約関連の諸制度、とりわけ物権的財産権との関係につき、昨年度に引き続き海外の研究協力者との議論が進められ、松原がフランス・アメリカに招待されて講演・報告を行っている。ヴェトナム企業法制の歴史的基層については、民間文書資料・阮朝政府の統治に関わる資料の情況から、阮朝の統治が中国の統治を一つの模範としながらも実質において大きく違ったタイプの関係を政府と民間社会編成との間に成立せしめていたことが見て取られ、こうした関係の中で成立した企業体・団体が、より国家の統治作用に密接に連関する形で財産保有・取引を行ったことが理解された。また現代の中国企業法制につき、上記の如き給付関係が保ち続ける影響について、一定の見通しが得られた。
光学的測定法による発生初期胚上頚神経節におけるシナプス機能の形成過程に関する研究

本研究では、シナプス回路を形成する最も単純な神経細胞群のモデルとして鶏胚上頚神経節をとり上げ、神経節内におけるシナプス伝達機能の初期形成過程について解析を行った。孵卵6-12日の鶏胚上頚神経節を、膜電位感受性色素(NK2761)で染色し、神経節へ向かう神経線維束の電流刺激に対するニューロン応答を、光学的多部位同時測定システムを用いて127ヶ所から同時に記録することに成功した。電流刺激によって誘発される光学的シグナルは、スパイク状の相とそれに続く時間経過のゆっくりした相の二相性の成分から成る形状を示した。0.1Hzの連続刺激によって、第一相は殆ど変化しないが、第二相は指数関数的に減衰した。さらに、第二相は低Ca^<2+>液やd-tubocuranineで抑制された。このことから、第一相はpre-synapticなシグナルで、第二相はcholinergicなシナプス伝達を介したpost-synapticなシグナルであることが同定された。個体発生の進行にともなうシナプス結合の発達を追跡し、そのマッピングを行った。明確なpost-synaptic responseは孵卵6日の神経節では観察されず、孵卵7日以降の神経節で発現し、post-synaptic responseの大きさとその発現領域は個体発生の進行にともなって発達してゆくのが見られた。
交通振動の無線2点計測に基づく表層地盤特性の評価

建物の地震防災を行う上で,表層地盤のS波速度構造と減衰定数を簡便に評価する手法を確立することが必須である.そこで本研究では,無線2点3成分計測システムを開発し,交通振動計測に基づいてレイリー波およびラブ波の複数点間位相差と距離減衰特性を抽出し,弾性波動論に基づく逆解析から表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同時に同定する手法を提案し,その有効性と適用限界を現場実験から検証し,さらに表層地盤の地震時挙動評価への応用の可能性を検討することを目的とする.平成19年度は,以下の内容を実施した.(1)前年度に開発した無線2点3成分計測システムを用いて,種々の地盤構造や車両交通条件下において,交通振動に含まれるレイリー波およびラブ波の複数点間位相差および距離減衰特性データを蓄積した.(2)(1)の計測データから表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同時に同定する逆解析法を開発した.(3)(1)の計測データと(2)の逆解析法を用いて,種々の表層地盤構造および車両交通条件下において,S波速度構造および減衰定数の同定を行うとともに,提案手法の有効性と適用限界を検討した.(4)強震記録が得られている複数地点において,提案手法を用いて表層地盤のS波速度構造および減衰定数を推定し,推定地盤構造に対する地震応答解析を行い,解析結果と実地震記録との比較から,提案手法を表層地盤の地震時挙動評価に応用する可能性を検討した.上記の検討は,主として2007年能登半島地震および新潟県中越沖地震の被災地域や強震観測点において実施し,提案手法の有効性をある程度確認した.建物の地震防災を行う上で,表層地盤のS波速度構造と減衰定数を簡便に評価する手法を確立することが必須である.そこで本研究では,無線2点3成分計測システムを開発し,交通振動計測に基づいてレイリー波およびラブ波の複数点間位相差と距離減衰特性を抽出し,弾性波動論に基づく逆解析から表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同時に同定する手法を提案し,その有効性と適用限界を現場実験から検証し,さらに表層地盤の地震時挙動評価への応用の可能性を検討することを目的とする.平成18年度は,以下の内容を実施した.(1)交通振動に含まれるレイリー波およびラブ波の複数点間位相差と距離減衰特性を現場で確認可能な無線2点3成分計測解析システムの開発.・無線LAN機能付きA/D変換器内蔵型短周期振動計を用いて,交通振動の無線2点3成分計測装置(ハードウェア)を構築した.この際,機能を特化させることで,従来の計測装置よりも格段に小型化・軽量化を図った.・交通振動の2点3成分計測データから,レイリー波およびラブ波の複数点間位相差および距離減衰特性を求める解析ソフトウェアの開発に着手した.・これらのハードウェアおよびソラトウェアに基づいて,交通振動に含まれるレイリー波およびラブ波の複数点問位相差および距離減衰特性を現場でリアルタイムに確認し,最適なセンサ配置を現場で選択可能な無線2点3成分計測解析システムを試作した.次年度以降,(2)計測データから表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同定する逆解析法の開発,(3)(1)のシステムを用いた,種々の交通条件下における交通振動の現場計測,(4)(2)の逆解析法と(3)の計測データに基づく表層地盤のS波速度構造と減衰定数の同定と,提案手法の有効性の検討,(5)同定された地盤構造に対する地震応答解析と解析結果の妥当性の検証を実施する予定である.建物の地震防災を行う上で,表層地盤のS波速度構造と減衰定数を簡便に評価する手法を確立することが必須である.そこで本研究では,無線2点3成分計測システムを開発し,交通振動計測に基づいてレイリー波およびラブ波の複数点間位相差と距離減衰特性を抽出し,弾性波動論に基づく逆解析から表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同時に同定する手法を提案し,その有効性と適用限界を現場実験から検証し,さらに表層地盤の地震時挙動評価への応用の可能性を検討することを目的とする.平成19年度は,以下の内容を実施した.(1)前年度に開発した無線2点3成分計測システムを用いて,種々の地盤構造や車両交通条件下において,交通振動に含まれるレイリー波およびラブ波の複数点間位相差および距離減衰特性データを蓄積した.(2)(1)の計測データから表層地盤のS波速度構造と減衰定数を同時に同定する逆解析法を開発した.(3)(1)の計測データと(2)の逆解析法を用いて,種々の表層地盤構造および車両交通条件下において,S波速度構造および減衰定数の同定を行うとともに,提案手法の有効性と適用限界を検討した.(4)強震記録が得られている複数地点において,提案手法を用いて表層地盤のS波速度構造および減衰定数を推定し,推定地盤構造に対する地震応答解析を行い,解析結果と実地震記録との比較から,提案手法を表層地盤の地震時挙動評価に応用する可能性を検討した.上記の検討は,主として2007年能登半島地震および新潟県中越沖地震の被災地域や強震観測点において実施し,提案手法の有効性をある程度確認した.
LECラットの肝炎・肝癌自然発症とメチル基代謝障害

我々は、LECラットの自然発癌過程における薬物代謝酵素の発現と科学発癌過程におけるそれとの相違を比較することにより発症のメカニズムを明らかにしようとしてきた。現在までに、LECラットの肝薬物代謝系酵素は、化学発癌過程で見られる前癌病変での酵素偏倚と極めて類似していることから、生化学的にもLECラットは肝癌の素因を生まれながらに有していることが明らかになった(Carcinogenesis,9,1569-1572,1988)。LECラットにおけるP-450発現量は分子種により挙動を異にしており、特にMC型分子種の増大が癌化の素因の一つと考えられた(Carcinogenesis,10,2155-2159,1989)。また、γ-GTPの遺伝子レベルでの発現を見ると、4週齢で発現上昇、8週齢で発現低下、そして16週齢で発現上昇という二相性のパターンを示した。更に、今回、これらの遺伝子の発現はDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子発現パターンとよく一致しており,LECラットの発癌機構にDNAのメチル化が強く関与していると思われた。実際、肝炎肝癌発症時には肝DNAのメチル化の程度は有意に低下しており、5-アザシチジンに対する感受性は対照(LEA)ラットよりも高かった(Biochem.Int.23,9-14,1991)。次にコリン欠乏食やメチオニン代謝阻害剤投与による肝炎の発症の影響を検討したところ、早期に肝炎を誘発でき、また酵素の発現も自然発症時と類似したパターンを示した(Jpn.J.Cancer Res.82,390-396,1991).以上の結果より、肝薬物代謝酵素の変動は、低メチル化による遺伝子発現異常によると思われた。また、肝炎肝癌自然発症は、メチオニン代謝障害による低メチル化と深く関連していることが示唆された.LECラットにおいて、肝炎は発症よりもかなり以前にすでに低メチル化が進行しており、これが肝炎肝癌発症の原因の一つと考えられた。LECラットは何らかの遺伝的な代謝異常をきたし、生後34カ月でヒト劇症肝炎に類似した黄疸を伴った症状を呈し死亡する。これまでにLECラットにおける薬物代謝系の酵素偏倚がコリン欠乏食投与時のそれと類似していることから,本ラットはメチオニン代謝系に何らかの異常が存在すると思われる。そこで,肝におけるメチル化のドナ-であるSーアデノシルメチオニン合成酵素の発現と肝等肝癌発症との関連性について検討した。肝Sーアデノシルメチオニン合成酵素のmRNA量は,ラット肝臓型酵素のcDNAおよび抗体を用いて半定量し,活性は生成物をHPLCにて測定した。対照のLEAラットのSーアデノシルメチオニン合成酵素の蛋白量は,生後から加齢とともに漸増するのに比し,LECラットのSーアデノシルメチオニン合成酵素の蛋白量は,生後8週以後急減し,肝炎肝癌発症時も引き続いて低値のままであった。Sーアデノシルメチオニン合成酵素活性は,mRNA量や蛋白量の変化ほど大きな差異は見られなかったが,癌化の進行につれて低下しほぼ半減した。以上の結果より,Sーアデノシルメチオニン合成酵素は肝炎発症に先行して低下しており,肝細胞内のDNAや種々の蛋白質へのメチル化を抑制する結果、肝炎肝癌の発症が引きおこされるものと考えられる。

次にLECラット肝よりコラゲナ-ゼ潅流法,パ-コ-ル不連続密度勾配法で単離肝細胞を分画し,細胞の大きさとGSTーP蛋白量を測定した結果,40/60%分画に最も強く発現しており,また癌部は非癌部に比し約4.4板強く発現していた。以上の結果,巨大肝細胞の出現と肝炎発症とはよく相関しており,GSTーP蛋白は,前癌病変と考えられるやや小さい細胞に強く発現されており,発癌過程では,これらの二つの異なる細胞集団が混在していると考えられる。コリン欠乏食やメチオニン代謝阻害剤投与による肝炎の発症の影響を検討したところ、早期に肝炎を誘発でき、また酵素の発現も自然発症時と類似したパターンを示した(Jpn.J.Cancer Res.82,390-396,1991)。コリン欠乏食投与のLECラットにおいて、総シトクロムP-450量、シトクロムb_5量、NADH-シトクロムb_5還元酵素活性はいずれも30%に減少し、脱アルキル化活性も10%にすぎなかった。一方、γ-GTPの活性は約6倍ほど増大した。対照ラット(LEA)においても同様にγ-GTPの活性の増加が認められたが、P-450アイソザイムの減少はLECラットとは異なるパターンを示した。LECラットにおける肝薬物代謝酵素の発現パターンは、化学発癌においてみられる酵素偏倚と類似していたが、コリン欠乏食投与によりその発現は更に促進され、肝炎をより早期に誘発できた。DNAの低メチル化とこれらの薬物代謝系酵素の発現との関連性が強く示唆された。これらの遺伝子の発現はDNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子発現パターンとよく一致しており、LECラットの肝発癌機構にDNAのメチル化が強く関与していると思われた。実際、肝炎肝癌発症時には肝DNAメチル化の程度は有意に低下しており、5-アザシチジンに対する感受性は対照(LEA)ラットよりも高かった(Biochem Int.23,9-14,1991)。次に、12週令LECラットに0、1%DL-エチオニンを10日間自由摂水させたところ、全てのラットが黄疸を呈し、GOTの著明な上昇が見られた。また、5週令のLECラットにL-エチオニン(200mg/Kg/日)1週間腹腔内投与後、肝薬物代謝系酵素の変動を検索したところ、コリン欠乏食投与時とほぼ同様の結果を得た。
赤外吸収分光による巨大水和クラスターの相状態変化の研究

1.NH伸縮振動の観測,及び量子化学計算により,ピロールクラスターの水素結合構造の解明を行った。2量体はT字型,3,4量体は環状型で,NH-π電子間水素結合を形成することが明らかにした。また,クラスターサイズが巨大化すると,液体や固体の凝集系と類似の水素結合構造を有することを,NH伸縮振動数,及びバンド幅の解析から明らかにした。ピロールは生体内分子の最小構成要素として,様々な研究領域でモデル分子として重要視されているため,本研究で実験的に水素結合構造を解明したことは大変意義があると考えている。2.NH伸縮振動の観測,及び量子化学計算により,巨大アンモニアクラスターの水素結合ネットワーク構造の解明を行った。クラスターサイズが1000から10000量体へ増加するに伴い,モード3の相対強度増加とバンド幅の狭帯化が観測されたことから,巨大クラスターでは固体結晶と類似の水素結合構造を有していることを明らかにした。クラスターサイズの増加と相状態変化の相関を,スペクトル形状の変化として直接的に観測できたことは,本研究課題を遂行する上で大きなブレークスルーとなった。3.NH,OH伸縮振動の観測,及び量子化学計算により,ピロール溶媒和クラスターの水素結合構造の解明を行っている(現在,研究進行中)。水やアルコールを溶媒とした時,その種類に応じて水素結合構造が異なることを示唆する結果が得られている。現時点では,溶媒分子の数は数個レベルであり,本課題の対象である巨大水和クラスターへの到達はまだ遠いが,その第一歩となる研究という意味で大変意義があると考えている。巨大サイズクラスターの効率的な生成方法を模索している段階で、計画当初に想定していた水よりも、アンモニアの方がクラスターサイズや相状態の制御が容易であることがわかってきた。そこで、巨大アンモニアクラスターの生成法制御の確立、及び赤外キャビティリングダウン分光によるNH伸縮振動の観測を行い、水素結合構造、及び相状態についての解明を行った。以下に、詳細を述べる。(1)クラスター生成は、スリット型、ピンホール型の二種類のパルスノズルによる超音速ジェット法により行った。後者の方が前者よりもジェット冷却効率が良いことから、サイズの大きいクラスターの生成が容易であることがわかった。UBuckらのフラグメント赤外分光の結果と比較すると、スリット型で生成されるクラスターの上限サイズは約100量体、ピンホール型での上限サイズは約1000量体であることがわかった。(2)アンモニアクラスターの赤外スペクトルを測定すると、低波数側のモード1、高波数側のモード3が主に観測される。ジェット条件を変えてクラスターサイズを増加させると、モード1に対するモード3の吸収強度比が急激に増大し、更にモード3のバンド幅が減少していくことが観測された。これは、クラスターが1000量体程度の巨大サイズに成長すると、水素結合構造が固体結晶のような一定方向へ配列したような構造になることを示唆する結果である。(3)赤外分光により得られたモード3の狭帯化を理論的に説明するために、GAUSSIANプログラムを用いた量子化学計算(HF/6-31+G(d,p))を行った。7、19、31量体の安定構造を結晶配位に基づいて計算し、その基準振動を求めたところ、上記のような小さいサイズにおいても、狭帯化を再現する興味深い結果が得られた。
骨髄異形成症候群の発症と進展に関わる遺伝学的負荷と染色体遺伝子変異

本研究課題により骨髄異形成症候群の発症と進展に関わる染色体遺伝子異常とその臨床的意義を明らかにした。その成果の要約は以下に示す3点である。1、MDS85例を含む骨髄性白血病176例のうち、AML1遺伝子Runtドメイン内の点突然変異を5例(2.9%)で検出した。うち4例はde novo MDS症例で、いずれの症例においてもMDS診断時のDNA検体から異常が検出された。Silent変異の一例を除いて、他の4例ではframeshift変異が検出され、塩基欠失か挿入によりそれぞれでV93del、I150ins、I168ins、A120insを形成するものと推測された。AML1遺伝子の変異はMDSの発症・進展に関与する早期の分子機構の一つと考えられ、AMLに比較してframeshift変異が特徴的であることを指摘した。2、DNA修復に関与する遺伝子群のMDSにおける変異を検索する目的で、DNA修復遺伝子群68遺伝子の1108エクソンのうち、924についてエクソンの塩基配列を決定する条件を設定した。DNAミスマッチ修復遺伝子群に属する6種(hMLH1,hMSH2,hMSH3,hMSH6,hPSM1,hPMS2)を対象に、悪性リンパ腫48例および骨髄異形成症候群48例、急性骨髄性白血病48例で変異の解析を行い、97エクソンのうち79エクソンで解析を成功し、リファレンスのゲノム情報との相違が146箇所でみられた。うち31箇所がcoding領域での変異であった(hMLH1:7箇所,hMSH2:1箇所,hMSH3:3箇所,hMSH6:2箇所,hPMS1:0,hPMS2:9箇所)。3、MDSの予後因子としての遺伝子異常の重要性を指摘した。特にp53変異は重要で、多変量解析では国際予後スコアリングを凌ぐことを示し、スコアリングに遺伝子所見を加えることにより更なる改善が期待できることを提唱した。骨髄異形成症候群(MDS)発症の背景となりうる遺伝学的負荷を検索する目的で、本年度は代表的な薬物代謝酵素の多型に関するcase-control解析を行い、以下の結果を得た。対象は治療関連性白血病(TRL)25例、de novo MDS132例、de novo AML55例で、同意を得て解析した健常者98人のゲノムDNAとの多型頻度を比較した。GST-T1 nullはde novo MDSの66例(50%)で検出され、健常コントロールの38例(39%)に比較して有意に高頻度で(p=0.04)、オッズ比は1.68(95%CI;1.01-2.81)を示した。一方、TRLとde novo AMLではコントロールと有意差を認めず、さらにM1 null多型はすべての病型において健常人と同様の頻度であった。ベンゼン代謝に関与し、個体の酵素活性低下と白血病発症の関与が指摘されたNQO1コドン609でのアリル解析に関しては、de novo MDSでT/Tホモが16例(12%)にとどまり、健常人(24%)に比較して有意に低頻度であったが、他の病型では有意差を認めなかった。このことより609^Cのアリルはオッズ比1.86(95%CI;1.28-2.70)で、de novo MDS発症の遺伝的負荷である可能性が示された。

従来の報告においてはTRLでは逆に609^Tアリルが高頻度であることが示されており、今回の解析結果からはde novo MDS発症の特殊性が示唆された。現在、MDS症例における染色体や遺伝子異常と酵素遺伝子多型との相関関係について、さらに詳細に検討中である。骨髄異形成症候群(MDS)とその関連疾患の発症と進展に関与する分子遺伝学的変異を同定する目的で、本年度はAML1/RUNX1遺伝子Runtドメイン内の点突然変異を検索し、以下の結果を得た。対象は治療関連性白血病(TRL)16例、de novoMDS85例(うち16例はAML進展例)、de novo AML 69例、CML 6例、総計176例の骨髄性白血病症例である。Runtドメインはexon3,4,5で構成され、これらに近傍のexon6を加えた4つのエクソンをPCR-SSCP法でスクリーニングし、移動度の異なる異常バンドをクローニング後、塩基配列を決定した。2.コドン122のsilent変異を示したRAの一例を除いて、他の4例ではframeshift変異が検出された。すなわち、1塩基欠失、3塩基挿入、4塩基挿入、19塩基duplicationに伴い、それぞれでV93del、I150ins、I168ins、A120insを形成するものと推測された。3.AML1変異のみられた5症例においては、全例で染色体異常(12p-、der(14)t(1;14)、+8,del(13)、t(9;22)、7モノソミー;各1例)、1例でTP53コドン205での変異、他の1例でNRASコドン13の変異を示すなど、全ての症例で何らかの他の分子遺伝学的異常を伴っていた。以上の結果より、AML1遺伝子runtドメインでの変異はMDSの発症・進展に関与する分子機構の一つと考えられ、病勢の進行に伴って蓄積する異常のなかでも比較的早期に位置付けられるものと推測された。また、AMLに比較してframeshift変異が特徴的であり、MDSの特殊性を伺わせた。今年度はDNA修復に関与する遺伝子群について、エクソン・イントロン構造の同定とエクソンの増幅に必要なPCRプライマーならびに増幅至適条件の設定を行い実際に変異のスクリーニングを行った。DNA修復遺伝子群68遺伝子のcDNA情報を新規ソフトウェア「Genalys」にロードし、NCBI-BLASTから得たゲノム情報との比較により、各遺伝子のエクソンイントロン境界を設定した。この結果明らかになったエクソンを増幅するように設定したPCRプライマーで、実際に産物が得られるかを検定した。次に塩基配列決定用プライマーを400塩基対以内で上流下流の双方から塩基配列が判読できるように設定し、実際にシーケンサでトレース像が得られることを確認、16検体分の情報をGenalys上にアプライして正確に判読できるか否かを検定した。以上の作業により、68種の修復遺伝子群の1108エクソンのうち、924については終了、940エクソンについては条件設定終了、972エクソンについてはPCR増幅まで完了した。条件設定の対象とした68種のDNA修復遺伝子のうち、DNAミスマッチ修復遺伝子群に属する6種(hMLH1,hMSH2,hMSH3,hMSH6,hPMS1,hPMS2)については、悪性リンパ腫48例および骨髄異形成症候群48例、急性骨髄性白血病48例で変異の解析を行った。97エクソンのうち79エクソンで解析を成功し、coding領域の塩基配列では17,961塩基中14753塩基(82.1%)をカバーしたことになる。
脂肪由来間葉系間質細胞を用いた重度脊髄損傷治療効果の検証および治療効果機序の検討

脂肪組織より分離された間質細胞(AD-MSC)は,新しい移植材料として多分野で着目されている。先行研究からは,AD-MSCは骨髄間質細胞と比較して細胞障害性ストレスに強く,移植後の定着率も良好であることが示唆されている。本研究では,ラット脊髄損傷モデルに対して同種AD-MSCを損傷部に移植し,歩行能力の評価を行い,さらに治療効果のメカニズムについてすることを主眼とする。
電源に含まれる高調波ノイズの低減と保安用統合接地の役割との相関関係に関する研究

「課題1人体及び機器間の電位差を検討するため、接地電極周囲の電位とその分布、および電位傾度を縮尺模型電極と数値計算によって検討するに関する研究」に関しては、新たに案出した電位計算式を基に、接地電極の接地抵抗値を電位降下法により確認する場合、被測定電極の周囲に存在する接地を意図しない埋設導体が測定結果に及ぼす影響について検討した。その結果、(1)埋設導体が何れの場所に存在しても接地抵抗は低く測定され、真値を確認することが出来ない。(2)しかし、埋設導体の規模が被測定電極の規模の1/16以下なら、測定結果に及ぼす影響が比較的少ない。(3)接地抵抗値は自然発生的に低くなる。等を明らかにした。従って、電気安全の確保を接地抵抗値(電位上昇のみ)ではなく歩幅・接触電圧を基本とするグローバルアーシングの概念を採用する事を提案した。結果の一部を平成17年度の電気学会と電気設備学会の全国大会で発表した。「課題2中性点接地方式における接地抵抗と接地インピーダンスに関する研究」に関しては、構造体接地方式を採用すると、一般的に接地端子は構造体の鉄骨或いは鉄筋に取られる。この時、各種の故障電流は、鉄骨或いは鉄筋の周囲に存在するコンクリートを介して大地に流出する。しかし現在、コンクリートの電気的な特性が明らかにされているとは言い難い。従って、接地特性を検討する上でコンクリートの特性を知ることは重要である。結果の一部として、含水率と電気抵抗率(周波数は一定)との関係を、平成17年度に(社)電気協会が担当する「電気設備技術基準国際化委員会高圧・特別高圧小委員会WG2」の資料として提出した。等を明らかにした。「課題1人体及び機器間の電位差を検討するため、接地電極周囲の電位とその分布、および電位傾度を縮尺模型電極と数値計算によって検討するに関する研究」に関しては、研究者は従前より、接地電極が埋設される大地が水平多層構成であると仮定して解析を行ってきた。しかし、接地極は崖や河岸の近傍に敷設される事もある。この様な観点より、本年度は垂直断層を有する2層構成大地に棒状接地電極が複数本敷設された場合を例に取り、この接地抵抗並びに接地極周囲の電位分布を、研究者が得た従来の結果の詳細を吟味し、新たに電位計算式を開発した。本式を水槽模型実験により検証した結果、実験値と計算値が良好に一致した。本計算式を基に、標準接地棒を例とした、地表面電位分布、接地抵抗並びに集合効果を、縦断層からの距離並びに電極中心間距離について評価した。結果の一部は平成15年度電気設備学会全国大会で発表した。「課題2中性点接地方式における接地抵抗と接地インピーダンスに関する研究」に関しては、内外の趨勢を調査し、国内の接地設計手法と国内法規との関連性についてその概要を整理した。その結果、各種規格の国際整合性が進められ、屋内配電系統もIEC規格に準拠したIT、TT及びTN方式に大別されることになった。接地方式では、TT方式が個別接地に、TN方式が統合接地に対応する。TT方式は機器接地が系統接地と電気的に分離出来る場合の接地システムであるが、他接地系統との相互関係と電気的な安定性の確保の観点から接地を独立して設ける事が困難となりつつある。一方、TN方式では機器接地が保護導体に取られ一点接地となるので等電位化されるが、保護導体は中性線と同一点に接続される為、地絡故障電流が短絡電流になり、しかも不要な電流が中性線を介して環流する可能性があることが危倶される。'「課題

1人体及び機器間の電位差を検討するため、接地電極周囲の電位とその分布、および電位傾度を縮尺模型電極と数値計算によって検討するに関する研究」に関しては、新たに案出した電位計算式を基に、メッシュ状接地電極が垂直断層の2層構成大地に埋設された場合を想定して接地特性を検討した。その結果、(1)電極が埋設された大地抵抗率と垂直断層を境とした反対側の大地抵抗率の比が100倍あるいは1/100以内の検討を行えばよい。(2)垂直断層からの距離がメッシュ状接地電極の1辺の長さの約10倍で均質大地に対する検討で良い。(3)垂直断層と接地電極の間の電位傾度は、崖を想定した場合ではが緩和されるが河岸等を想定した場合では急峻となるなどを明らかにした。結果の一部は平成16年度の電気学会と電気設備学会の全国大会で発表した。「課題2中性点接地方式における接地抵抗と接地インピーダンスに関する研究」に関しては、TN方式で問題となる地洛故障が短絡故障となり、不要電流が中性線を介して環流する問題点を回避するため、中性線に挿入する抵抗と高周波ノイズ除去用広域減衰器とを同時に併用した場合の利点と新たな問題点を整理した。一方、接地電極のインピーダンス特性では、建築廃材・工業廃材のFRPを有効利用するため、超微粒子状に粉砕したFRPに炭素微粒子と凝固剤を混入して創製した新たな接地電極材料を開発した。この材料の周波数特性を測定した結果、約5MHzまで低インピーダンスでしかも容量性となり、有効な接地電極であるとの知見を得た。この概要は、清華大学(中国:シンセン)で開催された"The 12^<th> Asian Conference on Electrical Discharge"にて発表した。「課題1人体及び機器間の電位差を検討するため、接地電極周囲の電位とその分布、および電位傾度を縮尺模型電極と数値計算によって検討するに関する研究」に関しては、新たに案出した電位計算式を基に、接地電極の接地抵抗値を電位降下法により確認する場合、被測定電極の周囲に存在する接地を意図しない埋設導体が測定結果に及ぼす影響について検討した。その結果、(1)埋設導体が何れの場所に存在しても接地抵抗は低く測定され、真値を確認することが出来ない。(2)しかし、埋設導体の規模が被測定電極の規模の1/16以下なら、測定結果に及ぼす影響が比較的少ない。(3)接地抵抗値は自然発生的に低くなる。等を明らかにした。従って、電気安全の確保を接地抵抗値(電位上昇のみ)ではなく歩幅・接触電圧を基本とするグローバルアーシングの概念を採用する事を提案した。結果の一部を平成17年度の電気学会と電気設備学会の全国大会で発表した。「課題2中性点接地方式における接地抵抗と接地インピーダンスに関する研究」に関しては、構造体接地方式を採用すると、一般的に接地端子は構造体の鉄骨或いは鉄筋に取られる。この時、各種の故障電流は、鉄骨或いは鉄筋の周囲に存在するコンクリートを介して大地に流出する。しかし現在、コンクリートの電気的な特性が明らかにされているとは言い難い。従って、接地特性を検討する上でコンクリートの特性を知ることは重要である。結果の一部として、含水率と電気抵抗率(周波数は一定)との関係を、平成17年度に(社)電気協会が担当する「電気設備技術基準国際化委員会高圧・特別高圧小委員会WG2」の資料として提出した。
心臓におけるメタボロームイメージングの確立および移植心筋の代謝マップ作製

質量分析計の開発改良に伴い、臓器の代謝イメージングが実現可能となってきたが、心臓は死後の代謝変化が著しく、解糖系やクエン酸回路などの中心代謝産物の正確な代謝イメージングは難しかった。そこで、死後の代謝変化を最小限にするため、マイクロウェーブによる固定法を開発した。さらに、炭素13(13C)でラベルした基質を用いて、心筋梗塞モデルのグルコースおよび乳酸のトレースイメージングも成功した。虚血の中心部ではグルコースを乳酸に変換するとともに、乳酸を積極的にTCAサイクルで代謝していること、虚血の周辺部位ではグルコースを積極的にTCAサイクルで代謝していることがトレースイメージングにより明らかとなった。●マイクロ波を用いた心臓サンプルの処理の有用性の検証10週のマウス(C57BL6J)の心臓サンプルを、麻酔下で1マイクロ波にて心臓を処理後に凍結保存、2頸椎脱臼後、速やかに心臓を冷却したPhosphate buffered saline (PBS)で洗浄し、液体窒素での急速凍結保存で、心臓サンプルを摘出する。それぞれの心臓サンプルをCapillaryelectrophoresis-mass spectrometry (CE-MS)法にて解析し、低分子代謝産物の変化を検証した。これまでは形態を保つ心臓サンプル処理法として、2が低分子代謝産物の分解抑制に有効であると考えられていたが(S hori, 1988 JMCC 21 203)、マイクロ波による心臓サンプルの処理が代謝産物の保存に対し最も有効な技術であることを証明した。またこれまでもっとも代謝産物の死後の代謝を抑制すると考えられていたfreeze cramp法と比較しても、マイクロ波によるサンプル処理は死後の虚血性変化を抑制していることが明らかになった。●心臓の急性虚血モデルの代謝イメージング法の確立マウスの心筋梗塞モデルを使用し、メタボリックイメージングやfluxマップの作製に成功した。13Cでラベルされた糖の代謝に関しては、これまでの報告通り、心筋梗塞モデルで糖代謝が亢進していた。特記すべきことに、解糖系は心筋梗塞の中心部で最も亢進していたが、糖のクエン酸回路への流入は虚血の周辺部で更新していた。また、13Cでラベルした乳酸を用いたフラックス解析では、心筋梗塞の中心部位で乳酸の取り込み及びクエン酸回路への流入が確認された。このような結果は、代謝マップの作製により、代謝の局在を把握することが可能となったこと、マイクロウェーブを用いて代謝を瞬時に止めることが可能になったことが大きく貢献したと考えられた。マウスの心筋梗塞モデルを使用し、メタボリックイメージングやfluxマップの作製に成功した。特に、13Cでラベルした乳酸を用いたフラックス解析では、心筋梗塞の中心部位で乳酸の取り込み及びクエン酸回路への流入が確認された。重症虚血部位で乳酸を利用した代謝が好んで行われていることが示唆され、重症虚血に対する乳酸を利用した治療戦略の開発につながる発見と考えられた。本研究はマウス心臓の代謝イメージングに関するものである。質量分析計の開発改良に伴い、近年、臓器の代謝イメージングが実現可能となってきたが、心臓は死後の代謝変化が著しく、解糖系やクエン酸回路などの中心代謝産物の正確な代謝イメージングは難しかった。従来の凍結保存を用いた保存法では、質量分析の際に代謝が変化し、死後直後の正確な代謝状態の把握が困難であった。この方法は、心臓のみに5kWのマイクロウェーブを約1秒間焼灼し、心臓を固定する。従来の急速凍結保存に比較し、乳酸の蓄積が半分ほどに抑えらえ、さらには虚血のマーカーであるNADHの蓄積もほぼ消失した。心臓の中心代謝産物のイメージング法を初めて確立したとともに、部位による代謝の違いを解明した画期的な研究である。これらの成果を2016年にscientific reports(Sci Rep. 2016Sep 1;6:32361.)に報告した。中心代謝産物の量および分布を正確に把握するためにマイクロ波による心臓サンプル固定法が非常に重要であることが、様々な実験結果より示されたため。当初の実験計画に沿った実験の進捗と考えられる。重症虚血モデルの心筋における乳酸の利用に関する、詳細な検討が必要となる。

どのようなタイミングで、どのような量の乳酸を投与することが、心筋の生存を延ばすのか、どのような分子メカニズムが作用しているのか、等の解明により、重症虚血心に対する新たな薬剤の開発につながると予想される。循環器内科マイクロ波による心臓サンプル処理の重要性に関してまずは論文を作成を試みる。また、以下の実験を計画に沿い実行する。●メタボリックイメージングを応用し、梗塞部、梗塞周囲部の代謝マップ、fluxマップを作成10-15週のマウス(C57BL6J)も用いて心筋梗塞モデルおよび心臓虚血再灌流モデルを作製し、マイクロウェーブ法にて心臓サンプルを処理後、13C-glucose, 13C lactate, 13C palmitic acidを用いてメタボリックイメージングによるFlux解析が可能かを検証する。また梗塞部、梗塞周辺部、非梗塞部での代謝の変化、並びに代謝産物を介した心筋組織内の細胞間コミュニケーションを解析する。虚血部位の代謝の変化を時空間的な分布を詳細に把握する。●メタボリックイメージングを用いた梗塞部、梗塞周囲部の新規代謝産物の同定:質量分析のスクリーニング能力を生かし心筋梗塞および虚血再灌流流域の新規の代謝産物を探索する。その結果を踏まえ、未知のバイオマーカーの同定や、虚血再灌流障害軽減のための創薬の開発を行う。この結果が、下記に述べる心筋移植の効率改善に向けた創薬の開発につながる。●iPS細胞から誘導した心筋をマウスの心筋梗塞部位に移植し、移植部位の代謝マップを作成:iPS細胞から樹立した心筋やcardiac fibroblastから直接誘導した心筋(iCM)は今後、心臓移植の重要なツールとなる。しかし、現時点ではこのような細胞の心筋移植後の定着効率に関しては未知な部分が多い。我々は、メタボリックイメージングを応用し、移植心筋の代謝の変化を時空間的に追跡し、効率の良い移植技術の開発を目指す。研究計画にのっとり、順調に研究を進め、現在、論文の投稿作業を行っている。査読者のコメントに従い、次年度も追加実験などの研究の継続が必要となったため。また、本研究成果を広く認識し、我々の開発した方法を様々な研究者に使用してもらうため、学会などでの発表の必要があるため。本年度は実験段階であり、発表のための旅費などの申請が少なかったため研究の消耗品や学会発表、また投稿作業の際に発生する費用として使用を予定している。引き続き実験を進めるとともに、実験結果の学会での発表や論文作成も踏まえた使用計画を予定している。
ヒト骨肉腫のFas/Fas ligand遺伝子異常発現による免疫監視からの回避

ヒト骨肉腫の発育・転移形成において重要な役割を演ずると推定される腫瘍細胞の免疫回避機構に関し、腫瘍細胞におけるFas発現・機能異常、Fas ligand(Fas L)発現形質獲得の関与と、その修飾による腫瘍発育と転移の制御法の確立を目的とし研究を遂行し、以下の成果を得た。1.ヒト骨肉腫細胞株(HOS,OST,Saos2)及びヒト骨肉腫腫瘍組織3例におけるFas及びFas L mRNA及び蛋白発現がRT-PCRならびにwestern blot法で検出された。発現されたFas及びFas L mRNAと蛋白には構造的異常は見られなかった。2.骨肉腫組織では膜型及び可溶型Fasが検出されたが、骨肉腫細胞3株とも可溶型Fasの発現が優勢で、膜型Fasの発現はOSTで検出されるのみであった。抗Fas抗体を用いた蛍光抗体法によりOSTは細胞膜にFasの局在を検出したが、他の2細胞株では検出されなかった。免疫組織化学によりヒト骨肉腫腫瘍組織22例中17例(85%)で骨肉腫細胞におけるFasの発現が観察された。陽性例中11例(65%)は膜型が優位、6例(35%)では発現は細胞質内に局在していた。3.骨肉腫に発現されるFas Lは膜型で、可溶型は検出されなかった。抗Fas Lモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学によりヒト骨肉腫腫瘍組織20例中17例(85%)で骨肉腫細胞におけるFas Lの過剰発現が観察された。発現強度、発現細胞頻度と化学療法に対する感受性や予後との明かな関連は認められなかった。4.骨肉腫腫瘍細胞に発現されるFas Lの機能が、Fas感受性ヒトTリンパ球(Jurkat cell)に対するアポトーシス誘導により示された。このアポトーシス誘導は抗Fas L中和抗体(NOK1)で抑制され、Fas/Fas L系を介したものであることが確認された。5.アドリアマイシン心筋症の発生にFasの過剰発現を介したアポトーシスの亢進が関与していることを明らかにした。平成11、12年度の研究結果を総合すると、ヒト骨肉腫腫瘍は腫瘍発生早期からFas L発現に形質を獲得し細胞傷害性Tリンパ球をカウンターアタックすると共に、Fas発現の低下や局在異常、可溶型Fas発現などを介し免疫監視機構から回避していることが示唆された。ヒト骨肉腫の発育・転移形成において重要な役割を演ずると推定される腫瘍細胞の免疫回避機構に関し、腫瘍細胞におけるFas発現・機能異常、Fas ligand(Fas L)発現形質獲得の関与と、その修飾による腫瘍発育と転移の制御法の確立を目的とし研究を遂行し以下の成果を得た。2.同骨肉腫細胞及び腫瘍組織におけるFas Lの蛋白レベルでの発現がwestern blot法により示された。発現されたFas Lの分子量には明かな異常は見られなかった。可溶性

Fas Lは骨肉腫では検出されなかった。3.抗Fas Lモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学によりヒト骨肉腫腫瘍組織20例中17例(85%)で骨肉腫細胞におけるFas Lの過剰発現が観察された。正常骨芽細胞では発現はみられなかった。発現強度、発現細胞頻度と化学療法に対する感受性や予後との明かな関連は認められなかった。4.骨肉腫腫瘍細胞に発現されるFas Lの機能が、Fas感受性ヒトTリンパ球(Jurkat cell)に対するアポトーシル誘導により示された。このアポトーシス誘導は抗Fas L中和抗体(NOK1)で抑制され、Fas/Fas L系を介したものであることが確認された。以上の結果から、ヒト骨肉腫腫瘍は腫瘍発生早期からFas L発現形質を獲得し、細胞傷害性Tリンパ球をカウンターアタックし、免疫監視機構から回避していることが示唆された。骨肉腫は高頻度に肺転移を来す.がん細胞の転移形成には、免疫監視機構からの回避が必須のプロセスと考えられている。平成11年度の研究から、骨肉腫細胞はFas ligand(Fas L)の過剰発現により、in vivoにおいて腫瘍組織浸潤性免疫監視リンパ球に対しアポトーシスを誘導し、免疫監視機構から積極的に回避している可能性が示された。平成12年度は、骨肉腫細胞の免疫監視細胞からの回避機構におけるFas遺伝子の発現及び機能異常に注目し検討を行ない以下の結果を得た。また、骨肉腫に対する主要な抗癌剤の一つであるアドリアマイシンの副作用(心筋症)の発症機序をFasに注目し解析した。1.ヒト骨肉腫細胞株(HOS,OST,Saos2)及びヒト骨肉腫腫瘍組織3例におけるFas遺伝子のmRNAレベルでの発現がRT-PCRにより検出された。発現されたFas遺伝子mRNAに構造的異常がないことがシークエンスにより確認された。2.同骨肉腫細胞及び腫瘍組織におけるFas Lの蛋白レベルでの発現がWestern blot法により示された。骨肉腫組織では膜型及び可溶型Fasが検出された。一方、ヒト骨肉腫細胞3株とも可溶型Fasの発現が優勢で、膜型Fasの発現はOSTで検出されるのみであった。膜型、可溶型両型Fasともその分子量には明かな異常は見られなかった。3.抗Fas抗体を用いた蛍光抗体法によりヒト骨肉腫細胞OSTでは細胞膜にFasの局在を検出したが、他の2株では検出されなかった。免疫組織化学によりヒト骨肉腫腫瘍組織22例中17例(85%)で骨肉腫細胞におけるFasの発現が観察された。陽性例中11例(65%)は膜型が優位、6例(35%)では発現は細胞質内に局在していた。4.発現強度、発現頻度、局在部位と骨肉腫の化学療法に対する感受性や予後、TUNEL法による腫瘍細胞標識率との間に明かな関連は認められなかった。5.アドリアマイシン心筋症の発生にFasの過剰発現を介したアポトーシスの亢進が関与していることが明らかになった。平成11、12年度の研究結果を総合すると、ヒト骨肉腫は腫瘍発生早期からFas L発現形質を獲得し細胞傷害性Tリンパ球をカウンターアタックすると共に、Fas発現の低下や局在異常、可溶型Fas発現などを介し免疫監視機構から回避していることが示唆された。
骨髄ミクロキメリズムによる抗原特異的免疫寛容の導入

昨年度までに我々は骨髄キメラマウスにおいて、そのキメリズムが30%あればドナーに対する特異的な免疫寛容が誘導できることを示し、ドナー特異的免疫寛容誘導における部分キメリズムの有用性を実験的に証明することができた.一方でピッツバーグ大学移植外科のStarzl教授のグループは肝臓移植後の患者を詳しく解析し、拒絶反応を示さない患者では血液細胞の一部がドナー由来細胞で置き代わっていることを報告し、これがドナーに対する免疫寛容の誘導に関与している可能性を示した.我々は肝臓移植後の患者における骨髄キメラが移植肝臓中に存在する造血幹細胞によるものではないかと考え、マウスをモデルとして肝臓中での造血幹細胞の存在について検討を行った.その結果、adultマウス肝臓中にも骨髄中の造血幹細胞と同じc-Kit+Sca-1+Lin-の表現系を持つ細胞が存在することが明らかになった.この細胞は骨髄中の造血幹細胞と同様にin vitro、in vivoでコロニーを形成するだけでなく僅か500個を致死量放射線照射したマウスに移植するだけで全ての血球細胞を長期にわたり供給することが示された.これらの結果はStarzlらの報告した肝臓移植後のドナー血球による血液キメラが、移植した肝臓中に含まれていた造血幹細胞によるものである可能性を強く示唆しており、肝臓移植後のドナー特異的寛容の導入に骨髄部分キメリズムが重要な役割を果たしているという説が裏付けられた.昨年度までに我々は骨髄キメラマウスにおいて、そのキメリズムが30%あればドナーに対する特異的な免疫寛容が誘導できることを示し、ドナー特異的免疫寛容誘導における部分キメリズムの有用性を実験的に証明することができた.一方でピッツバーグ大学移植外科のStarzl教授のグループは肝臓移植後の患者を詳しく解析し、拒絶反応を示さない患者では血液細胞の一部がドナー由来細胞で置き代わっていることを報告し、これがドナーに対する免疫寛容の誘導に関与している可能性を示した.我々は肝臓移植後の患者における骨髄キメラが移植肝臓中に存在する造血幹細胞によるものではないかと考え、マウスをモデルとして肝臓中での造血幹細胞の存在について検討を行った.その結果、adultマウス肝臓中にも骨髄中の造血幹細胞と同じc-Kit+Sca-1+Lin-の表現系を持つ細胞が存在することが明らかになった.この細胞は骨髄中の造血幹細胞と同様にin vitro、in vivoでコロニーを形成するだけでなく僅か500個を致死量放射線照射したマウスに移植するだけで全ての血球細胞を長期にわたり供給することが示された.これらの結果はStarzlらの報告した肝臓移植後のドナー血球による血液キメラが、移植した肝臓中に含まれていた造血幹細胞によるものである可能性を強く示唆しており、肝臓移植後のドナー特異的寛容の導入に骨髄部分キメリズムが重要な役割を果たしているという説が裏付けられた.
神経筋接合部の正常分子構築解明と先天性筋無力症候群の分子病態研究

Wntリガンドの胎生期におけるアセチルコリン受容体(AChR)のクラスタリングに関わる分子機構は十分に解明されていない。マウス脊髄前角細胞(SMN)の網羅的な遺伝子発現解析により、細胞外分泌タンパクRspo2がSMNに特異的に発現することを見出し、Rspo2はLgr5を筋終板受容体とするAChRクラスタリング分子であり、agrinの80%の活性を有し、agrin/Lrp4/MuSKシグナル系に次ぐ重要なAChRクラスタリング誘導因子であることを明らかにした。加えて、GFPT1遺伝子変異を有する本邦先天性筋無力症候群患者から樹立したiPS細胞を用いて病態分子機構の解明研究を開始した。Wntリガンドが胎生期におけるアセチルコリン受容体(AChR)のクラスタリングに重要であることが知られてきたがそのシグナル伝達に関わる分子は十分に解明されていない。マウス脊髄前角細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションサンプルをマイクロアレイならびにRNA-seqにより解析を行い網羅的な遺伝子発現を調べた。脊髄前角細胞特異的に発現する複数の遺伝子を同定し、Wntシグナルを制御することが知られている細胞外分泌タンパクRspo2に着目して解析を行った。C2C12筋芽細胞に対するRspo2の付加ならびにsiRNAによるRspo2のノックダウン、並びに、Rspo2ノックアウトマウスの解析にてRspo2はWntを介するAChRクラスタリングに必須の分子であり、agrinとは独立してagrinの80%のAChRクラスタリング活性を有することを明らかにした。さらにRspo2の筋終板受容体がLgr5であることを明らかにし、Rspo2とLgr5がagrin/Lrp4/MuSKに次ぐ重要なAChRクラスタリング誘導因子であることを明らかにした。先天性筋無力症候群のexome capture resequencing解析, whole genome resequencing解析においてRSPO2とLGR5を候補遺伝子として解析を行ったが、いずれの遺伝子にも変異は存在しなかった。先天性筋無力症候群の新規遺伝子変異の検索をexome capture resequencing解析, whole genome resequencing解析により行い、新規遺伝子変異の機能解析を開始した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により前角細胞特異的に発現をする遺伝子の網羅的な解析により、Rspo2がagrinに次ぐ重要な脊髄前角細胞由来細胞外分泌タンパクを同定した。同時にその受容体がLGR5であることを同定した。研究は計画通り進捗している。マウス脊髄前角細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションのマイクロアレイならびにRNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析により、Wntシグナルを制御する細胞外分泌タンパクRspo2が脊髄前角細胞に特異的に発現することを見出した。C2C12筋芽細胞に対するRspo2タンパク付加ならびにsiRNAによるRspo2ノックダウン、さらに、Rspo2ノックアウトマウスの解析にてRspo2はLgr5を筋終板受容体とするWntを介するAChRクラスタリングに必須の分子であり、agrinの80%の活性を有し、agrin/Lrp4/MuSKシグナル系に次ぐ重要なAChRクラスタリング誘導因子であることを明らかにした。加えて脊髄前角細胞特異的なRspo2発現レスキューマウス、骨格筋特異的なRspo2発現レスキューマウスを作出し、脊髄前角細胞から分泌されるRspo2がAChRクラスタリングに重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに、マウス脊髄前角細胞において高発現の2分子のノックアウトマウスを入手し機能解析を行っている。さらに、本邦先天性筋無力症候群患者2症例において同定したDOK7遺伝子の4変異がC2C12筋管ならびに患者iPS細胞由来筋管においてAChRクラスタリングを抑制することを明らかにした。加えて、GFPT1遺伝子のエキソンスキッピング治療法開発を開始した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により前角細胞特異的に発現をする遺伝子の網羅的な解析により、Rspo2がagrinに次ぐ重要な脊髄前角細胞由来細胞外分泌タンパクを同定し、その受容体がLGR5であることを同定するとともに、脊髄前角細胞特異的Rspo2レスキューモデルマウスと骨格筋特異的Rspo2レスキューモデルマウスを作出し、予想通り脊髄前角細胞の神経終末から分泌されるRspo2がAChRクラスタリングを誘導することを明らかにした。マウス脊髄前角細胞(SMN)のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションのマイクロアレイならびにRNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析により、Wntシグナルを制御する細胞外分泌タンパクRspo2が脊髄前角細胞に特異的に発現することを見出した。Rspo2をSMN特異的にレスキューするvAChT-Rspo2 x Rspo2-/-マウス、ならびに、Rspo2を骨格筋特異的にレスキューするMCK-Rspo2 x Rspo2-/-マウスを作出して神経筋接合部(NMJ)構築の解析を行った。SMNに発現させたRspo2は、異常に拡大したAChR領域・NMJ超微細構造の約半数のパラメータ・SMNと骨格筋の遺伝子発現を正常化させた。

一方、骨格筋特異的に発現させたRspo2は、NMJ超微細構造のすべてのパラメータを改善させたが、光学顕微鏡レベルのAChRクラスタリング・NMJ形成、ならびに、遺伝子発現には効果を認めなかった。SMN由来のRspo2がAChRクラスタリングとNMJ構築に重要な役割を担っていることが示された。分泌タンパク質のためNMJにおけるRspo2の起源の同定は困難であるが、骨格筋由来Rspo2にも一定の効果が認められた。さらに、GFPT1遺伝子変異を有する本邦先天性筋無力症候群患者から樹立したiPS細胞を用いて病態分子機構の解明研究を開始した。Wntリガンドの胎生期におけるアセチルコリン受容体(AChR)のクラスタリングに関わる分子機構は十分に解明されていない。マウス脊髄前角細胞(SMN)の網羅的な遺伝子発現解析により、細胞外分泌タンパクRspo2がSMNに特異的に発現することを見出し、Rspo2はLgr5を筋終板受容体とするAChRクラスタリング分子であり、agrinの80%の活性を有し、agrin/Lrp4/MuSKシグナル系に次ぐ重要なAChRクラスタリング誘導因子であることを明らかにした。加えて、GFPT1遺伝子変異を有する本邦先天性筋無力症候群患者から樹立したiPS細胞を用いて病態分子機構の解明研究を開始した。先天性筋無力症候群のexome capture resequencing解析、whole genome resequencing解析をさらに多くの症例で行い、新規原因遺伝子の同定を進める。脊髄前角細胞特異的に発現をする遺伝子群の中に2つの新規AChR誘導分子を同定し解析を開始した。RiboTagマウスを用いて脊髄前角細胞特異的ならびに筋終板特異的に発現する遺伝子の網羅的な解析を開始した。これらの解析によりさらなる神経筋接合部構成分子の解析ならびに先天性筋無力症候群病態における役割を明らかにする。脊髄前角細胞特異的に発現をする遺伝子群の中に2つの新規AChR誘導分子の解析をさらに進める。RiboTagマウスを用いて脊髄前角細胞特異的ならびに筋終板特異的に発現する遺伝子の網羅的な解析を開始し、予備的なデータを得るとともに、BIO ID法を用いてAChRクラスタリングに関わる新規分子の同定を開始した。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経遺伝情報学29年度が最終年度であるため、記入しない。