hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語教育におけるブレンディッドラーニングの有効性の検証

本研究は、日本語教育におけるBlended Learning(以下BL)の有効性を定量的・定性的調査から検証したものである。BLを学習機関全体で行い、学習成果分析、質問紙調査分析に加え、ICTを利用した学習者のやり取りの微視的分析を行った。その結果、eラーニング利用率と到達度テストの間に有意な正の相関が確認され、それらを基にした統計的分析で有意差が認められたこと、質問紙調査で学習者はBLを肯定的に評価していたこと、定性的分析でICTの利用によって学習者間での問題共有、気づきや理解の確認、表現の多様性が促進されていたことから、BLが学習者の日本語学習に有用に機能するということがわかった。本研究の目的は、未だ研究が進んでいない日本語教育におけるブレンディッドラーニング(Blended Learning:以下BLとする)の有効性を検証することである。本年度は、授業内外で用いるeポートフォリオシステム及びシステムに実装したeラーニングの利用実態調査(ログ解析)、BLと学習者特性との関係性の分析、そしてBL環境下におけるマルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行った。その結果、まず、学習者のeラーニング利用実態調査では、平成24年度の結果では課題提出率が時間の経過とともに70%まで落ち、その要因として問題数の多さ、教員とのインターアクションの欠如が明らかにされていたが、それらを改善すること(問題数の削減、教員によるフィードバックの増加)によって課題達成率が約80%、最終成績との相関が平均0.7まで上昇した。そして、学期終了後のアンケート調査でもBLによる日本語の学習に効果があったと肯定的に回答している学習者は70%に上り、BLによって授業外での自律的な学習が促進されていることが明らかになった。また、BLと学習者の特性との関係性については、学習者個人の学習方略、eラーニングによる学習経験、学外での学習時間の3つの特性がシステムの利用及び課題達成率に影響を与えていることがわかった。次に、BL環境下における微視的分析では、講義、ディスカッション中にインターネット、クリッカーの使用を許可し、学習者間のやり取りを分析した結果、講義における内容理解に関して、学習者個人の問題がインターネットを介して学習者全体に共有され、問題に関する気づきや理解の促進が促され、学習者間のやり取りが公的な授業の流れにも寄与していること、また、ディスカッションにおいては、インターネットの情報を引用することによって表現の多様性が増し、議論の内容がより深化していることが明らかになった。本研究の目的は未だ研究が進んでいない日本語教育におけるブレンディッドラーニング(Blended Learning:以下BLとする)の有効性を検証することである。本年度は、eポートフォリオシステムを利用した来日前教育に関する調査、渡日後の日本語教育におけるBLの利用調査、及び学習者のeポートフォリオの利用観察を行った。その結果、まず、来日前教育に関する調査では、eラーニング教材のみの提供の場合より、教員のフィードバックを加えることにより提出率がほぼ100%と大幅に改善され、その後のアンケート調査結果でも学習者は教員とのインターアクションを望んでいること、そしてeポートフォリオシステムを用いた来日前教育が来日後のスムースな教育に貢献していることが明らかとなった。次に、渡日後の日本語教育におけるBLの利用調査では、eラーニング教材に関しては先行研究と同様、課題提出率が徐々に下がり70%まで落ちたこと、課題提出率と成績の相関は平均0.6で推移し、やや相関があることがわかり、期末のアンケート調査で今後の利用率を上げるためには、問題数、システム上での教員とのインターアクションの改善が必要であることがわかった。最後にeポートフォリオの利用観察では、課題の作成、他者・自己評価、振り返り、修正・改善、蓄積の学習サイクルが、学生の満足度・達成度に加え、メタ認知能力の向上にも寄与していることがわかった。BLは近年普及し始めた新しい教育法であり、今後ICT環境の整備、教材コンテンツの増加によりさらに普及が見込まれる分野である。本研究の成果は日本語教育における学習者のICTの使用実態の解明、そしてICTを活用したBLの有効性を見極める際の重要な情報を提供するものであり、また、今後ICTを活用したBLを行う教育機関の環境整備を考える際の貴重な資源としても広く貢献できるものであると考える。本研究の目的は、日本語教育におけるブレンディッドラーニング(Blended Learning:以下BLとする)の有効性を検証することである。本年度は、BLの一形態である、新たな学習内容をビデオ講義で宿題としてオンラインで視聴させ、授業内で演習を中心に行う反転授業(eラーニングを含む)の利用実態調査、効果検証、そして、BL環境下におけるマルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行った。その結果、まず学習者の利用実態調査では、動画視聴率は時間の経過とともに下がるものの、平均で70%を維持しており、到達度テストとの相関では0.49あり、積極的に利用している学習者は到達度テストでも高得点を得ていることがわかった。

また、前年度までの対面授業とeラーニングによるBLの取り組みとそれらに予習動画を加えた本年度のBLの取り組みの比較として、到達度テストによる比較を行った結果、予習動画を加えた反転授業の取り組みのほうが有意に高かった。これは、予習動画視聴及びそれに伴う授業外学習時間の増加、そして、授業内における導入時間の削減によって生まれる練習時間の増加によって、日本語の理解度、運用力が向上したためであると考えられる。そして、アンケート、インタビュー調査では、予習動画を含むBLに対して肯定的評価が88%にも上り、授業外学習時間の増加に負担を感じているものの、学習に効果的であるとして、積極的に利活用していることがわかった。次に、マルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析では、PBL(Project-Based Learning)クラスにおける学習者間のやり取りを分析した結果、学習者間のインターアクションにパソコンが介在することによって、パソコン画面の共同注視、指差し等が起こり、パソコン画面の文字やインターネットの情報を引用しながら、効果的な意味交渉が行われていることがわかった。日本語教育本研究の最終目的は、日本語教育において、広義/狭義両面におけるブレンディッドラーニングがどのように有効に機能しうるのか、ICT (information communication technology)利用環境下における授業やeポートフォリオシステム、eラーニングの利用状況を、数量的分析とマルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行うことによって検証し、その有効性を明らかにすることである。本年度は、調査の2年目として、初年度に引き続き、eポートフォリオシステム及びeラーニングの利用実態調査を行った。そして、マルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行うための学習者のICT利用のデータ収集を年間を通して行い、その文字化作業(言語、非言語行動の記述)もおおむね終了し、分析に入っている。本年度は以上の調査から学習者のeポートフォリオシステム、eラーニング利用実態状況、ICTを利用した学習者間のインターアクションの分析を行い、その成果の発信も行うことができたため、当初の計画通り、おおむね順調に進展していると考える。本研究の最終目的は、日本語教育においてブレンディッドラーニングがどのように有効に機能しうるのか、ICT環境下における授業やeポートフォリオシステムの利用状況を、数量的分析とマルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行うことによって検証し、その有効性を明らかにすることである。本年度は調査の初年度として、この目的を達成するために、来日前事前教育に関する調査、渡日後の日本語教育におけるブレンディッドラーニングの利用調査、及び学習者のeポートフォリオの利用観察の3つの調査を行った。また、マルチモーダルな視点を取り入れた微視的分析を行うため、1年間にわたる授業の内外における学習者のICT利用のデータ収集(ビデオ録画及びインタビュー)を行い、現在はその文字化作業に移っている。
海棲哺乳類の生活史と環境に関する研究

本研究では、海棲哺乳類(イルカ、アザラシなど)の生活を理解する上で重要な要素である分布、回遊、成長、繁殖、食性、個体群判別などについて優れた成果をあげてきた。同時に、有機塩素系化合物(OCs)、有機スズ化合物(BTs.)、重金属類、放射性核種などの有害化学物質の生物濃縮特性を明らかにすると共に、その生物影響について国際的に注目される成果をあげてきた。その成果は、国内外の学会や講演会などで発表(英語:38回、日本語:39回)すると共に、レフリー付き学術論文(英文:88編、和文:4編)、著書(英文1編)、総説他(英文:4編、和文:19編)などに公表してきた。なかでも、イシイルカの有機塩素系化合物、有機スズ化合物、重金属類の蓄積特性に関する研究、およびカスピカピカイアザラシ、バイカルアザラシ、北極海のワモンアザラシがA型インフルエンザウイルスに感染していたことを明らかにした研究は、ともに世界的に高い評価を得ている。特に、1979年にタイのバンコックを中心に世界的に流行したA型インフルエンザウイルス(H3N2)が現在でもカスピカイアザラシの体内に保持されていることは、人間の世界で起きている感染症を考える際に、野生動物研究との連携が極めて重要であることを示唆した。また、海洋生態系における主要な海洋生物の生活史や環境応答に関する研究成果と比較することによって、海棲哺乳類が海洋生態系で果たす役割とその特性がより鮮明になってきた。特に、カスピ海に生息するカスピカイアザラシとその餌生物との関係やチョウザメの回遊履歴との関係の研究は国際的に注目されている。甲殻類のワレカラ類で得られた有機スズ化合物による生物影響との比較は、それぞれの有害化学物質の挙動の特性をより明確にした。今後は、本研究成果を生かして、有害化学物質による海洋汚染の環境モニタリング研究を海洋生態系全体で実施できるような研究体制を構築していく必要がある。平成13年度の研究実績の概要を以下に示す。1.日本古来から伝統的に行われているイルカ漁業で捕獲されるイシイルカの生物調査を岩手県大槌町大槌漁業市場で実施し、イシイルカの生活史研究とイシイルカを指標とした海洋環境モニタリング調査に必要な試料の採集と解析を実施した。2.本研究チームが採集したカスピカイアザラシの生物試料の解析を実施し、体長組成、年齢組成、成長特性を明らかにし、生物学的特性値(性比、性成熟年齢、妊娠率、粗生産率など)を推定した。同時に、カスピカイアザラシの血清をELISA法によって解析したところ、1979年にバンコックから世界中に広がったインフルエンザAのBangkok/1/79(H3N2)株がカスピカイアザラシの集団に約20年間リザーブされていることが明らかになった。これらの研究成果は、カナダのバンクーバーで開催された第14回国際海棲哺乳類学会で発表され、国際的に高い評価を得た。3.ロシアのニーズニー・ノボグラーで平成13年5月15-18日に開催された国際会議にはUNESCOの代表として招聘され、本研究チームが明らかにした有害化学物質に汚染されているカスピカイアザラシの実情を紹介し、国際共同研究体制の設立の重要性を訴え、参加者から熱烈な指示を受けた。その結果、UNESCOやロシア政府はカスピ海の環境問題に積極的に取り組む姿勢を示した。

本研究では、海棲哺乳類(イルカ、アザラシなど)の生活を理解する上で重要な研究項目である分布、回遊、成長、繁殖、食性、個体群判別などについて優れた成果をあげてきた。同時に、有機塩素系化合物(PCBs, DDTs, HCHs, etc)、有機スズ化合物(TBT, DBT, MBT, etc)、重金属類(Hg, Cd, Pb, etc)などの有害化学物質の生物濃縮特性を明らかにするとともに、その生物影響について国際的に注目される成果をあげてきた。その成果は、国内外の学会で発表するとともに、学術雑誌(英文論文:23編)、著書(英文:2編、和文:3編)、総説(和文:3編)などに公表してきた。なかでも、イシイルカの有機塩素系化合物や重金属類の蓄積特性、カスピカイアザラシやバイカルアザラシのジステンパーウイルスやインフルエンザウイルスの感染症の研究を実施し、すぐれた成果をあげてきた。特に、1979年にバンコックを中心に世界的に流行したインフルエンザウイルスのA型(H3N2)やB型がヒト以外の動物であるアザラシに発見され、長期間にわたってほとんど変異せずに保持されてきたことを明らかにした研究は、国際的に高い評価を得ている。また、これらの海棲哺乳類と同じ生態系に生活している主要な海洋生物の生活史や環境に関する研究成果と比較することによって、海棲哺乳類との生物相互関係に関する新しい知見を得ることが出来た。特に、カスピ海に生息するカスピカイアザラシとその餌生物、さらにはチョウザメの回遊履歴とその環境に関する研究は国際的に注目されている。今後は、本年度の研究成果をもとにしてさらなる研究の展開を目指す。本研究では、海棲哺乳類(イルカ、アザラシなど)の生活を理解する上で重要な研究項目である分布、回遊、成長、繁殖、食性、個体群判別などについて研究成果をあげてきた。同時に、有機塩素系化合物(PCBs, DDTs, HCHs, etc.)、有機スズ化合物(TBT, DBT, MBT)、重金属類(Hg, Cd, Pb, etc.)、放射性核種(Cs, Pu, Sr, etc.)などの有害化学物質の生物蓄積特性を明らかにするとともに、その生物影響について国際的に注目される成果をあげてきた。その成果は、国内外の学会などで25回発表するとともに(国際学会他:11、国内学会他:14)、学術雑誌(英文論文:24編)、総説(4編)などに掲載してきた。なかでも、本研究チームが開発した最新のデータロガーやとカメラロガーを装着して収集したバイカルアザラシの潜水行動記録および南極海のウエッデルアザラシの潜水行動記録は、これらの動物の生活史や生息環境を理解するうえでこれまでの常識を覆す科学的に大変インパクトのある情報を入手することができた。発表した国際ワークショップでの評価は極めて高く、世界的にこの分野をリードする研究成果と言える。また、日本近海に生息するイシイルカに蓄積している有機塩素系化合物、有機スズ化合物、重金属類の濃度データから、日本海や太平洋の海洋汚染の状況を比較した研究は、社会的に高い関心を得ている。さらに、バイカルアザラシ、カスピカイアザラシおよび北極海のワモンアザラシに蓄積しているセシウム濃度は高く、ロシア国内における放射性核種による汚染が進行していることが明らかになり、世界の研究者から注目されている。以上のように、本研究成果は、日本国内のみならず国際社会でも評価が高い本研究に関する業績として、原著論文24編と2著書を発表した。論文の内容としては、海棲哺乳動物の生活史研究と海棲哺乳動物を指標とした海洋汚染研究を実施した。
土壌微生物の多様性が特定微生物種の消長に与える影響とそのメカニズムの解析

1.発病抑止型土壌で栽培したトマト植物体では、発病型土壌で栽培したトマトと比較して、トマト根面、根内、ならびに地上部での青枯病原細菌の増殖が抑えられていることが明らかになった。2.トマト根面から好気性細菌を培養・単離し、得られた菌体からDNAを抽出し、1.6S rRNA遺伝子をPCR法により増幅後、2種類のRFLPパターンを解析し、細菌群集構造を調べた。その結果、発病抑止型土壌の根面細菌群集は多様な種類の細菌から成る集団であることが明らかになった。3.発病抑止型土壌および発病型土壌で生育させたトマト根面の微生物画分およびこれらの画分からの分離株について、発病抑止型土壌の微生物に特徴的な性質を検索するため、ペクチン培地における増殖速度ならびにペクチン分解酵素の1つであるポリガラクトウロナーゼ活性を調べた。またこの実験に先立ち、ペクチンがトマト根からの主要分泌多糖類であることを液体クロマトグラフィを用いて確認した。実験の結果、根面微生物画分のペクチン培地における増殖速度およびポリガラクトウロナーゼ活性は、pH4.0および6.0のいずれの場合にも、発病抑制型土壌で生育させたトマト根面の微生物画分の方が高い値を示した。このことより、発病抑制型土壌で生育したトマトの根面は、主要な根分泌物であるペクチンをめぐる競争という点において、青枯病原細菌にとって厳しい環境であると推察された。4.発病抑止能における土壌微生物性の寄与について検討するため、クロロホルム燻蒸消毒した発病抑止型土壌に発病抑止土壌および発病型土壌(いずれも生土)を微生物源として少量混合して発病試験を行った結果、発病抑止土壌を混合した場合に発病が抑止された。この結果から、発病抑止土壌の発病抑止能には、土壌の微生物性が関与しているものと考えられた。特定の微生物種の消長と土壌微生物多様性との関係を明確に示すことを目的とし、対象系として、これまでに申請者が取り扱い、知見を蓄積してきたトマト青枯病系を用いた。まず、土壌微生物多様性の異なる土壌試料を16種類調整した。この際後の解析を容易にするために、微生物多様性以外の土壌因子ができるだけ同一になるような土壌試料を調整した。具体的には、基本とする土壌試料をクロロホルムで燻蒸処理し、ここに少量の有機資材を加え前培養することによって主に微生物多様性のみが異なる土壌試料を作成した。これら土壌試料に青枯病原菌を接種後トマト幼苗を移植し、発病試験を行ったところ、7土壌において発病し、9土壌では発病しなかった。各土壌試料で病原菌を接種せずに生育させたトマト植物について、根面および根内のDNAを抽出し、細菌の16Sリボソーム遺伝子をPCR反応にて増幅し、DGGE法により電気泳動した。得られたDNA泳動パターンをクラスター解析した結果、非発病型土壌試料と発病型土壌試料は異なる2つのクラスターに分けることができた。このことから、発病型土壌で生育した根ならびに非発病型土壌で生育した根はそれぞれ特徴的な細菌集団構造を有する可能性が考えられた。しかし、DGGEから得られるバンド数が多くなかったことから、細菌集団の多様性と発病性あるいは非発病性との関連については検討するに至らなかった。ある特定の微生物の消長と土壌微生物多様性との関係を明らかにする目的で、トマト青枯病系における青枯病原細菌の消長と蛍光性Pseudomonas属細菌の数および多様性との関連性について検討した。母体となる土壌として、滅菌した土壌に少量の生土を混合し、これに各種有機物を加えた6種の土壌を調整した。

この土壌に病原細菌を接種しトマトを栽培した際のトマトの発病性、およびトマト根面ならびに根内における蛍光性Pseudomonas属細菌の数と多様性(REP-PCR解析)の関連について検討した。その結果、3土壌においてトマトが発病し、このうち2土壌で生育不良の兆候が見られた。蛍光性Pseudomonas属細菌の数は、発病土壌において病原菌接種後に増加した。一方、非発病土壌では病原菌接種後も蛍光性Pseudomonas属細菌数の大きな増減はなかった。また、REP-PCRによる蛍光性Pseudomonas属細菌集団の多様性解析の結果、発病土壌に存在する蛍光性Pseudomonas属細菌集団よりも非発病土壌に存在する蛍光性Pseudomonas属細菌集団の方がより多様な集団として存在していた。土壌環境が変動した際の微生物集団の応答性と病原細菌の消長との関連を明らかにする目的で、根面細菌集団の物質代謝能の変化をBIOLOGを用いて測定し、現在、分析試料数を増やし解析を継続している。
膜タンパク質の再構成マトリックス材料となる含フッ素擬環状型人工脂質の開発

脂質二分子膜に利用されているジミリストイルホスファチジルコリンの化学安定性を向上させたジテトラデシルホスファチジルコリン二分子のアルキル鎖片端を共有結合にて二量化した擬環状型リン脂質およびアルキル鎖の一部をユニークな特性を有するフッ素で置換した擬環状型リン脂質を開発した。脂質の擬環状化およびフッ素化は適度な流動性を有する安定な二分子膜を形成することが分かった。膜タンパク質バクテリオロドプシンと擬環状型リン脂質または含フッ素擬環状型リン脂質からなる再構成膜を調整した。本研究では、安定人工脂質膜の設計・機能評価、膜タンパク質ハンドリング剤の設計・機能評価、人工脂質・膜タンパク質複合化、複合体の機能性基板への固定化・機能評価により、安定な脂質・膜タンパク質複合体を利用したバイオセンサの開発研究を行うことを目的としている。人工脂質として含フッ素擬環状型人工脂質を提案し、含フッ素擬環状人工脂質の合成経路の確立(高純度・高収量で多種多様な脂質群の合成可能な経路探索)を行った。二鎖型炭化水素系(天然型)脂質の含フッ素化体、擬環状型炭化水素系脂質および同じ炭素骨格を有する含フッ素擬環状脂質(親水基はホスホコリン基)の合成を試みた。まず初めにアルキル鎖の炭素鎖長14のDMPCの含フッ素脂質合成を検討し、アルキル鎖末端にペルフルヘキシル基(F6)およびペルフルオロオクチル基(F8)を導入できる高効率な合成経路を確立した。炭化水素系擬環状脂質の合成経路を基に含フッ素擬環状脂質合成を行い、最終目的物を得ることに成功した。合成した含フッ素脂肪酸(F4, F6, F8)の界面特性評価として表面圧-面積等温線(Π-A等温線)測定により単分子膜挙動を観察した。F4とF6はLE相、F8はLC相を形成して崩壊する興味深い結果を得た。さらに膜タンパク質バクテリオロドプシン(bR)の再構成基材としての有用性として、含フッ素脂質膜へのbRの再構成条件の検討を行い、bRの光サイクルについて検討した。天然紫膜から可溶化したbRを含フッ素化脂質(F4-DMPC)に再構成することに成功した。この再構成bRは膜が流動状態であっても天然紫膜と同様に3量体を形成し、天然紫膜bRに近い光サイクル挙動を示した。光サイクルの中間体の寿命が10倍程度長くなることも分かり、膜タンパク質の機能・安定性が周囲の脂質膜の物性に依存する明確な例を示せた。本研究では、安定な脂質・膜タンパク質複合体を利用したバイオセンサの開発研究を行うことを目的としている。古細菌の生体膜の主成分である向かい合う二本鎖リン脂質分子がアルキル鎖末端の分子間共有結合により二量体化した構造を持つ環状リン脂質の擬環状化およびフッ素化、またこれらの脂質・膜タンパク複合体の創成を試みた。合成した脂質の擬環状化および含フッ素化が膜物性に及ぼす影響および膜に再構成した膜タンパク質バクテリオロドプシン(bR)の構造・機能に及ぼす効果について検討した。DSC測定において、PC-DTPCのゲル相-液晶相転移温度は、DTPCより約25°C高温度となった。さらにPC-DTPCのHは、DTPC二分子換算のものと比較すると、約7 kJ/mol大きい値を示した。また、擬環状リン脂質PC-DTPCおよびDTPCへのbRの再構成は、いずれの脂質においても、80%を越える十分高い収率で再構成試料を得ることができた。bR分子の集合状態を可視円二色性分光法により調べたところ、いずれの試料もゲル相においては、正と負のピークからなる典型的なスペクトルパターンを示し、天然紫膜と類似した三量体構造を形成していると考えられる。脂質の擬環状化は、膜タンパク質の機能・安定性を天然脂質同様の環境を提供できることを示した。本研究では、安定人工脂質膜の設計・機能評価、膜タンパク質ハンドリング剤の設計・機能評価、人工脂質・膜タンパク質複合化、複合体の機能性基板への固定化・機能評価により、安定な脂質・膜タンパク質複合体を利用したバイオセンサの開発研究を行うことを目的とした。まず初めにアルキル鎖の炭素鎖長14のDMPCの含フッ素脂質合成を検討し、アルキル鎖末端にペルフルオロブチル基(F4)およびペルフルオロエチル基(F2)を導入できる高効率な合成経路を確立した。炭化水素系擬

環状脂質の合成において、中間体での純度および収量の低下が見られたが、最終目的物を得ることに成功した。本合成経路を基に含フッ素擬環状脂質合成を検討している。合成した含フッ素脂質の界面特性評価として、Wilhelmy法による平衡拡張圧(πe)測定、示差走査熱量(DSC)測定および環境変化敏感プローブを用いた蛍光測定を行った。機器測定の結果から、ペルフルオロアルキル基の導入により気水界面における単分子膜安定性が向上すること、ゲルー液晶相転移温度はペルフルオロアルキル基の導入により低くなること、膜表層付近の流動性が高いこと、などの知見を得た。さらに膜タンパク質バクテリオロドプシン(bR)の再構成基材としての有用性として、含フッ素脂質膜へのbRの再構成条件の検討を行い、bRの再構成膜の作製に成功(紫外・可視吸光(UV)測定および円偏光二色性(CD)測定により確認)した。本研究では、安定な脂質・膜タンパク質複合体を利用したバイオセンサの開発研究を行うことを目的としている。古細菌の生体膜の主成分である向かい合う二本鎖リン脂質分子がアルキル鎖末端の分子間共有結合により二量体化した構造を持つ環状リン脂質の擬環状化(Pseudo-cyclicphosphatidylcholine:PC-DTPC)およびフッ素化(PC-F-DTPC)、またこれらの脂質から成る膜タンパク複合体の調製および安定性評価を試みた。膜流動性に興味深い影響を及ぼすペルフルオロブチル基(F(CF2)4基:F4)に着目し、F4を含む含フッ素擬環状リン脂質(PC-F4-DTPC)を合成し、それから再構成した膜タンパク質バクテリオロドプシン(bR)の構造および機能評価により、長期および熱安定性について検討した。PC-DTPCおよびPC-F4-DTPCへのbRの再構成は、いずれの脂質においても、70%以上の高い収率で再構成試料を得ることができた。それらの再構成bRの集合状態は、可視円二色性分光法(CD)から天然紫膜と類似したCDスペクトルを示したことより、bRの三量体構造を形成していると考えられる。また、再構成bRの熱安定性試験において、加熱前後のCDおよびUV-VISスペクトル測定を比較することで評価した。PC-F4-DTPCから成る再構成bRでは、1液晶相にも拘わらず再構成bRの変性がほとんど見られず、さらに、2CDスペクトルにおいては70度付近まで負のピークが観測されたことより、70度付近までは天然紫膜と同様にbRの三量体構造を保持している、ことが分かった。従って擬環状リン脂質(PC-DTPCおよびPC-F4-DTPC)は天然紫膜と同様の環境を提供し、さらに長期および熱安定性においても同様に安定化させることが分かった。有機フッ素化学含フッ素擬環状型人工脂質の基本構造(基準物質)となる擬環状型炭化水素系脂質の合成は合成スキーム通りに進めることができた。擬環状型人工脂質へのフッ素部位の導入においては、反応条件の検討、精製時の分離条件の検討など種々の検討事項が増えたことより手間取ったが、最終目的物である含フッ素擬環状型人工脂質の合成に成功した。また、二鎖型ホスホコリン脂質の基礎物性情報が擬環状型人工脂質の物性測定を解析するにおいて必要であることが分かり、二鎖型リン脂質の合成およびそれらの物性測定も同時に検討している。
PLAP-1を介した肥満病態と歯周病との関連機構の解明

本研究課題ではPLAP-1の脂肪分化及び肥満病態への関与、歯周病の発症・進行への影響について細胞レベル、分子レベルで検討を行っている。平成28年度の研究成果について以下に報告する。まず、siRNA (small interfering RNA)を用いて脂肪前駆細胞である3T3-L1細胞のPLAP-1をノックダウンし、脂肪分化誘導を行った結果、脂肪分化関連遺伝子であるAdiponectin及びFabp4の発現が低く、脂肪滴の形成も低下することが明らかとなった。また、PLAP-1アデノウイルスを3T3-L1細胞に感染させることで作製したコンディションメディウム存在下にて3T3-L1細胞の脂肪分化誘導を行った結果、Adiponectin及びFabp4の発現は高く、脂肪滴の形成も上昇した。これらの結果より、3T3-L1細胞においてPLAP-1が脂肪分化を促進することが明らかとなった。さらに、トリグリセリドを脂肪滴として脂肪細胞に取り込むLipoprotein lipase(LPL)活性をWT及びPLAP-1 KOマウスの脂肪組織及び血清において検討した結果、差は認められなかった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
蝸牛支持細胞の細胞周期再活性化による有毛細胞の再生

生後の正常動物ではP27kip1が蝸牛支持細胞の増殖のブレーキとして働いていると考えられている。このことから成熟動物においてもP27kip1をダウンレギュレートすることより支持細胞のG0-G1移行(細胞周期への再進入)を引き起こすことができると考えられる。本研究においてP27^<kip1>は、正常マウスコルチ器においては支持細胞に局在しており、P27^<kip1>に対するsiRNA投与による支持細胞の細胞周期の活性化・細胞増殖が引き起こされたが、有毛細胞への分化は起こらなかった。感音性難聴の原因の多くは有毛細胞(HC)の消失によるものである。このHCは鳥類においては消失後、支持細胞が増殖・分化することにより再生するのに対して、哺乳類において支持細胞は生後G0期(静止期)にあるため増殖・分化することはなく、結果としてHCは再生せず難聴は不可逆性である。近年、細胞周期に関する研究が急激に進歩しG0-G1移行のメカニズムも少しずつ明らかになって来た。その鍵となる分子はP27kip1でありCyclin D2、CRM1、KPCを介したP27kip1の分解によりG0-G1移行が起こることが線維芽細胞、リンパ球を用いた基礎研究によりわかってきた。一方27kip1ノックアウトマウスでは蝸牛支持細胞の増殖が生後も持続することが報告されており、生後の正常動物ではP27kip1が支持細胞の増殖のブレーキとして働いていると考えられている。厚生労働省の遺伝子治療のガイドライン(平成13年)により禁止されている「生殖細胞の操作」を伴わないP27kip1のダウンレギュレーションの方法としては、a)P27kip1の分解促進因子であるCyclin D2、CRM1、KPCの過剰発現、b)small interfering RNA(siRNA)を用いたP27kip1遺伝子mRNAのノックアウトが考えられる。本研究においてはa)b)の方法のin vitro、in vivoでの効果について検討する。支持細胞の細胞周期への再進入は単に支持細胞の分裂・増殖のみではなく、鳥類と同様に支持細胞をHCへと分化を誘導できる可能性もあり非常に魅力的な研究テーマである。本年度はP27kip1のダウンレギュレーションのための基礎実験として、まず正常動物蝸牛におけるP27kip1、Cyclin D2、CRM1、KPCの局在を免疫染色法による検討を行った。このHCは鳥類においては消失後、支持細胞が増殖・分化することにより再生するのに対して、哺乳類において支持細胞は生後GO期(静止期)にあるため増殖・分化することはなく、結果としてHCは再生せず難聴は不可逆性である。その鍵となる分子はP27kip1でありCyclinD2、CRM1、KPCを介したP27kip1の分解によりG0-G1移行が起こることが線維芽細胞、リンパ球を用いた基礎研究によりわかってきた。厚生労働省の遺伝子治療のガイドライン(平成13年)により禁止されている「生殖細胞の操作」を伴わないP27kip1のダウンレギュレーションの方法としては、a) P27kip1の分解促進因子であるCyclin D2、CRM1、KPCの過剰発現、b) small interfering RNA (siRNA)を用いたP27kip1遺伝子mRNAのノックアウトが考えられる。本年度は正常動物蝸牛におけるP27kip1、Cyclin D2、CRM1、KPCの発現抑制の効果を見るために、それぞれの遺伝子に対するsiRNAを作成し、エレクトロポレーション法を用いて検討を行った。

近年、細胞周期に関する研究が急激に進歩しG0-G1移行のメカニズムも少しずつ明らかになって来た。その鍵となる分子はP27kip1でありCyclin D2、CRM1、KPCを介したP27kip1の分解によりG0-G1移行が起こることが線維芽細胞、リンパ球を用いた基礎研究によりわかってきた。一方27kip1ノックアウトマウスでは蝸牛支持細胞の増殖が生後も持続することが報告されており、生後の正常動物ではP27kip1が支持細胞の増殖のブレーキとして働いていると考えられている。このことから成熟動物においてもP27kip1をダウンレギュレートすることより支持細胞のG0-G1移行(細胞周期への再進入)を引き起こすことができると考えられる。厚生労働省の遺伝子治療のガイドライン(平成13年)により禁止されている「生殖細胞の操作」を伴わないP27kip1のダウンレギュレーションの方法としては、a)P27kip1の分解促進因子であるCyclin D2、CRM1、KPCの過剰発現、b)small interfering RNA (siRNA)を用いたP27kip1遺伝子mRNAのノックアウトが考えられる。本研究においてはa)b)の方法のin vitro、in vivoでの効果について検討する。支持細胞の細胞周期への再進入は単に支持細胞の分裂・増殖のみではなく、鳥類と同様に支持細胞をHCへと分化を誘導できる可能性もあり非常に魅力的な研究テーマである。本年度は正常動物蝸牛におけるP27kip1、Cyclin D2、CRM1、Kpcの発現抑制の効果を見るために、それぞれの遺伝子に対するsiRNAを作成し、エレクトロポレーション法を用いて検討を行った。
クローン化HTLV-1感染T細胞の産生するサイトカインと表皮細胞におよぼす影響

ATL患者末梢血から樹立したHTLV-1感染T細胞クローンを筆者らは4種類持っている。その中には無刺激状態でTh0、あるいはTH1に相当するサイトカイン産生パターンを示すものが含まれている。これらの細胞について、PMAやレクチン刺激下での各種サイトカイン、主にIFN-gammaとIL-4の産生をELISA法で調べた。また、そのmRNAの発現についてRT-PCR法で調べた。その結果、ELISAで検出感度をやや越えるレベルのIFN-gammaが産生される細胞株の「35T」では、レクチン刺激ではほとんどIFN-gammaの産生に増加がなく、PMA刺激によって10倍以上にタンパクの産生が増加した。この結果から、PMAがリンパ球へ直接作用してサイトカインの産生を増加させていることが伺えた。また、Th0型の細胞株である「16T」のIL-4産生においても、PMA刺激では約3倍の顕著な増加をみた。次に、タンパクレベルよりもより鋭敏にサイトカインの産生を検出できると期待されるRT-PCR法を行った。概ねタンパクレベルでの結果を裏付ける結果を得た。タンパクレベルではIFN-gammaおよびIL-4の産生が検出されなかった細胞株「KS-2」では、mRNAレベルでIL-4のバンドが見られた。IFN-gammaのバンドは出なかったことから、このクローンはTh2型と考えられた。ICAM-1を発現させた培養ヒト表皮角化細胞と、各種クローンとの接着を見る試みも行った。MTTを取り込ませ、角化細胞に接着したT細胞を光学的に測る実験系を組んだ。検出感度に難があり、はっきりした結果を得るには至っていないが、今後さらに検討を加えたい。
構造的および機能的な生体模倣性を有する三次元筋組織の構築と疾患モデルとしての応用

生体の構造を模倣した筋組織モデルの構築を目指して研究を行った。パターン化温度応答性基材を用いて筋芽細胞を同一方向に配向させ、3次元ゲルに貼りつけた状態で分化誘導することにより、サルコメア構造を有する筋管組織を得ることに成功した。この筋組織は電気刺激により収縮する機能的な筋組織であり、薬剤に応答して筋収縮が抑制される様子も確認された。さらに、神経細胞および血管内皮細胞を筋組織内に導入し、より複雑な構造を持つ筋組織を得ることにも成功した。これらの細胞が神経や血管として機能するまで成熟した組織を構築することができれば、薬剤スクリーニング等に有用な筋組織モデルとして応用できると期待される。生体の構造(特に配向性)を模倣した筋組織モデルの構築を目指して研究を行った。具体的には、神経細胞および血管内皮細胞を筋芽細胞シートと共培養し、複数種の細胞によって構成された3次元筋組織を作製した。まず、パターン化温度応答性培養基材を用いてヒト骨格筋由来筋芽細胞が同一方向に配向した状態の細胞シートを作製した。次に、2枚の配向制御細胞シートを積層する際、ヒトiPS細胞より分化誘導した神経細胞およびヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を細胞シート間に挟む形で共培養を行った。共培養5日後、神経細胞および血管内皮細胞は筋芽細胞シート組織内でそれぞれネットワークを形成していることを確認した。さらに、このネットワーク構造は筋芽細胞シートの配向性に依存した特異な方向性を持っていることがわかった。生体における骨格筋組織は配向方向の揃った神経/血管/筋組織によって構成されていることから、生体に近い構造を構築することができたと言える。また、筋芽細胞シートの上に神経細胞・内皮細胞を播種した後に積層せずに培養したところ、これらの細胞はそれぞれ単独の種類のみで集合体を形成した。一方、別の細胞シートを上から積層して神経細胞・血管内皮細胞を挟み込むと、前述のとおり、2種類の細胞は組織内でネットワークを均一に形成することから、細胞シートが与える3次元環境が神経細胞および血管内皮細胞の自己組織化ネットワーク形成において必須であることが分かった。この細胞挙動のメカニズムは現時点で明らかになっていないが、細胞シート技術によって組織を層状に構築できる結果として3次元環境の重要性を示すことができた。以上の結果より、細胞シート技術を用いて複数種の細胞からなる複雑な組織構造を制御することに成功した。この組織作製技術をベースとして、今後はそれぞれ神経・血管・筋としての機能化を目指す。具体的には、収縮能を有する配向した筋管組織を作製し、薬剤応答性を観察することで組織モデルとしての有用性を評価した。まず、パターン化温度応答性培養基材を用いてヒト骨格筋由来筋芽細胞を同一方向に配向させた。次に、この配向制御された筋芽細胞シートをコラーゲンゲルまたはフィブリンゲルに張り付けた状態で低温培養を行い、細胞シートをゲルごと基材から剥離させた。この状態で3週間程度分化誘導(たとえば、2%ウマ血清培地で培養)することにより、サルコメア構造を有する筋管組織を得ることに成功した。この筋組織を電気刺激(10 V, 10 msec)したところ、筋管が収縮する様子が観察された。ゲルに張り付けた状態で培養することにより、より長期間筋管を培養でき、さらに電気刺激によりゲルごと収縮できるよう設計することができた。電気刺激により十分に収縮する筋組織が得られたことから、次に薬剤に対する応答性を確認した。筋収縮の様子を画像解析によりトラッキングし、収縮距離から収縮運動の増減を評価するシステムを構築した。カルシウムイオンチャネルに作用するリアノジンやニフェジピンを培地に添加したところ、電気刺激下においても筋収縮が抑制される様子を確認することができた。さらに、薬剤による抑制効果が濃度依存的であることも明らかにした。筋収縮が完全に停止するまでの時間を計測したところ、高濃度条件でより早く収縮が停止することがわかった。以上の結果から、薬剤の効果を筋収縮挙動から評価することができる筋組織を構築することに成功した。この筋組織は薬剤スクリーニング等に有用な組織モデルとして今後の応用が期待される。さらに、この組織作製技術をベースとして神経組織を機能的に導入することができれば、神経筋疾患にも適応できる組織モデルになると考えている。筋芽細胞シートからなる組織内で神経細胞および血管内皮細胞を共培養する手法を確立することに成功しており、また、その結果として組織内に形成される細胞のネットワーク構造を確認するに至っている。当初の計画どおり、観察された神経細胞ネットワーク・内皮細胞ネットワークはいずれも筋芽細胞シートの配向性を制御することで異方的な構造になっており、組織の配向性に着目した筋組織の形成という観点において成果をあげている。

本研究において確立した組織の構造制御法は細胞シート技術の独自性を利用しつつ、技術的には比較的シンプルであり再現性も良い。したがって、簡便に同様の組織を効率よく構築できることから、この手法に基づいて組織を作製し、その機能化を目指すことで引き続き研究を遂行できると考えている。さらに、組織の機能化についてもすでに着手しており、予備実験レベルではあるが筋収縮挙動を示す組織を作製することも可能となってきている。本研究の目標を達成するためのアプローチについてはいくつかの具体的な手法をすでに考案しており、その手順に沿って次年度も引き続き研究を遂行することができると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。組織工学・バイオマテリアル今後は作製した筋組織の機能化に焦点を当てて研究を行う予定である。具体的には、筋組織・神経組織・血管組織としてそれぞれ機能するような、より成熟した組織を構築し、最終的には組織全体として機能する組織モデルとすることを目指す。まずはじめに、配向した筋管組織を構築し、培地成分・培養期間等の条件を検討することで組織の成熟化を図る。外部より電気刺激することで筋収縮挙動を観察し、筋組織としての機能化を評価する。次に、神経組織と筋組織が生理的に相互作用するためのジャンクション形成を目指して培養条件を検討する。神経細胞の薬剤刺激等による活動電位の発生・伝達および筋組織の反応を確認することで評価する。さらに、当研究所において開発されたバイオリアクターを用いた組織の培養手法を参考にして、血管内皮細胞の成熟化(主に管腔構造の形成)を実現し、機能的な血管組織としての利用を目指す。血管網導入による効果については、細胞シートを積層することでより厚い組織を作製し、組織内部の細胞生存率から評価する。以上のように、それぞれの細胞が組織として機能し、さらに相互作用することで筋組織全体として機能化することができれば、新規な組織モデルとして有用であると期待される。その有用性を確認するため、可能であれば特異的な疾患を持つiPS細胞から作製した神経細胞等をこの組織モデルに利用することについても検討する。
高速核磁気共鳴画像を用いた腸管蠕動運動の定量解析および腸管機能診断への臨床応用

消化管の収縮運動、機能状態を観察、把握することは腸管病変の診断や評価に重要と考えられるが、その臨床的評価法は未だ確立されていない。本研究では、低侵襲のMRIを用いて、腸管収縮の動画像を撮像し、定量的機能評価法を開発した。MRIの高速撮像法を用いることにより腸管の収縮運動が明瞭に捉えられることが明らかとなり、手動計測法とコンピュータを用いた自動計測法でその定量評価が得られた。(1)前処置法、MRI撮像法の確立消化管収縮運動の生理的、病理的解析のため、空腹時撮像と食事負荷後の撮像法の確立を目指した。空腹時撮像は8時間の食事制限で十分であったが、腸管が虚脱しており、腸管径の測定による消化管蠕動運動の定量評価は困難であることが明らかになった。食事負荷後の評価のための検査食として非吸収性検査食(ニフレック:味の素社)1500mLを使用したが、腸管径の測定、収縮運動の評価に十分な拡張が得られることが示された。しかし、飲用量が多く術後症例などの評価には使用困難であると考えられた。MR撮像法については、3軸補償型のsteady-state撮像法による連続撮像が有用であることを確認した。(2)健常例のデータ収集ならびに、MRIデータの定量解析法の確立非吸収性検査食(ニフレック:味の素社)1500mLを使用した8名の解析の結果、MR画像から、腸管収縮運動の振幅、周波数の算出が可能で、それをパラメーターとして腸管の収縮運動状態や充満度による収縮パターンの相違を定量評価できることが示され、その成果を論文報告した(下記)。また、10名の健常例のデータを用い、腸管蠕動運動につき、"連続MR画像間の信号変化量"=ΣxΣy√(I_<t+1>(x,y)/I_0-I_t(x,y)/I_0)^2を用いた手法による評価を行った。初期成績は、SEDEM2010(下記)で報告したが、本法では、腸管内容物の信号強度による補正が必要であることが明らかになり、現在、改良を試みているところである。(3)薬剤使用前後および腹部手術後の腸管蠕動運動評価23年度以降の研究のため、22年度後半より、上記目的のデータ収集を開始した。(1)前処置法、MRI撮像法の確立(2)健常例、術後症例、薬剤付加症例のデータ収集ならびに、MRIデータの定量解析法の確立健常例、および肥満術前後(胃形成術)の症例においてグルコース(OGTT試薬)飲用前後のcine-MRIを撮像し、現在も症例を重ねているところである。また、健常ボランティア8名に対し、空腹下に漢方薬(大建中湯)投与前後での消化管蠕動運動の比較を行った。また、同様のデータを腹部術後の症例で現在もデータ収集中である。その結果、グルコース飲用後、肥満術後、漢方薬飲用後に明らかな蠕動亢進が肉眼評価で確認された。コンピュータを用いた定量評価では、これら少量の経口付加では腸管の径測定は困難であった。そのため、1)短い区間の腸管の面積変化、2)関心領域の信号変化量から腸管蠕動運動の定量評価を試み、一定の成果を得たが、腸管内信号の指標への影響が問題として残る。(1)健常例および臨床例(上腹部手術後、肥満患者に対する減量手術対象群)の腸管運動シネMR撮像を行いデータ収集した。MR画像撮像は、本年までの研究で確立された高速撮像法(Balanced Steady-State Free Precession Sequence)を用い、呼吸停止下に20ー30秒間のシネ画像を撮像した。検査に際しては、経口洗薬ニフレック(味の素ファルマ株式会社)あるいは、経口糖負荷試験薬経口投与し、0、15分、30分、45分、60分など経時的にMR撮像を行った。その結果、本撮像法により消化管収縮運動の肉眼的計測とコンピュータによる解析が可能な画質のシネ画像が得られることが明らかになった。(2)画像解析法については、まず、MRIの画像をピクセル濃度に閾値を設けることにより、経口造影剤で高濃度を呈する腸管と、それ以下の濃度を呈するその他の領域を区別して、白黒の二値化画像に変換することを試みたが、腸管内の信号強度のばらつきから腸管のみを高精度に抽出することは困難であった。そこで、信号補正を行わない元画像で解析を行うこととした。検討の結果、有用性が高いと考えられた解析法は、連続MR画像の各画像間の信号変化量を画像ピクセルごとに計測し、すべてのピクセルの信号変化量をスカラー和として算出し、さらに、その値の一定時間内のスカラー和を算出して相当時間内の消化管運動量を表す指標としようとする方法である。指標算出に用いる計算式は、“一定時間内の信号変化量"=ΣxΣy

√(It+1(x,y)/I0-It(x,y)/I0)2で、I:信号強度、x,y:ピクセル座標、であり、コンピュータを用いて算出した。検討の結果、肉眼による周波数測定と本法で得られる指標の間に良好な相関関係が確認され、腸管運動の程度を示す新しい指標として有用性が確認された。初年度で、経口造影剤付加を行う、cine-MRIで腸管運動を定量評価する方法を検討して一定の成果を得て、その成果は本領域で代表的な国際雑誌(JMRI)に採択された。また、平成23年度は、当初の目的であった、少量の経口造影剤の開発と、健常例、術後症例、薬剤付加症例におけるのデータの収集をし、MRIデータの定量解析法の確立に向けて研究を進めることができた。また、その成果は、下記、国際学会で報告した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、疾患患者でも許容可能である少量の経口造影剤投与下のcine-MRI検査、現在研究中のMRI定量評価法について精度の向上に努めたい。また、その成果を用いて、消化管蠕動運動に対する薬剤の効果や、腹部術後の消化管運動、糖尿病患者における消化管機能障害についてのcine-MRI評価に取り組みたい。現在、研究遂行における大きな障害はなく、計画変更の予定はない。
SMP30が持つアポトーシス抑制作用の分子生物学的解析

1.肝臓や腎臓におけるアポトーシスの加齢変化をHE染色、TUNEL法を用いた組織染色により解析した。その結果、アポトーシス陽性細胞は加齢に伴い増加することがわかった。また、SMP30ノックアウトマウスでは早期からアポトーシス陽性細胞が出現してくることもわかった。加齢に伴うアポトーシス陽性細胞の増加はSMP30の減少によるためと考えられる。2.SMP30ノックアウトマウスの肝細胞はアポトーシスに対して非常に高感受性であった。電顕による細胞内微細構造の観察から、ミトコンドリアの著しい障害が観察された。即ち、ミトコンドリアが膨潤化し、クリステが非常に不明瞭であった。また、アポトーシス誘導時に観察されるミトコンドリアから細胞質へのチトクロームCの遊離が定常状態でも観察された。3.SMP30を高発現させたHepG2細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を示した。また、SMP30高発現HepG2細胞では、生存シグナル系に働くAktの活性化(リン酸化)が強く起こっていた。これは、SMP30がAktを介する生存シグナル系に促進的に働いていることを示している。更に、カルモジュリン阻害剤のtrifluoperazineを同時に加えるとAktのリン酸化が強く阻害された。これは、SMP30がカルモジュリンを介して細胞内カルシウム濃度の調節を行い、カルシウム濃度の上昇が引き金となるアポトーシスの誘導を制御していることを示している。4.遺伝子の相同性解析からSMP30が高等生物におけるグルコノラクトナーゼ(GNL)であることが分かった。GNLはアスコルビン酸(ビタミンC)生合成系に働く重要な酵素である。従って、SMP30ノックアウトマウスはビタミンC欠乏マウスとなる。ビタミンCの欠乏はアポトーシスの誘導を促進する可能性が非常に高い。加齢指標蛋白質30(SMP30)は、ホルモンによる影響を受けず、雄雌共に加齢に伴い肝臓や腎臓で減少する蛋白質として発見した。SMP30遺伝子を欠損させたSMP30ノックアウトマウスの肝細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに非常に高感受性であった。また、Fas抗体を用いたin vivo実験に於いても同様の結果が得られた。本課題では、SMP30が持つアポトーシス抑制作用の分子機構を明らかにすることを研究目的としている。今年度、以下に示す研究成果を得ている。(1)SMP30を高発現させたHepG2細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を示すことを明らかにした。また、SMP30高発現HepG2細胞では、生存シグナル系に働くAktの活性化(リン酸化)が起こっていた。これは、SMP30がAktを介する生存シグナル系に促進的に働いていることを強く示唆している。(2)SMP30ノックアウトマウスの肝細胞はアポトーシスに対して非常に高感受性であった。今年度、SMP30がAktを介する生存シグナル系に関与することを明らかにした。また、SMP30の遺伝子を欠損させることにより、アポトーシスに非常に高感受性になる。

今後は、この研究成果を踏まえ、SMP30がAktを介する生存シグナル系にどのように作用しているのかをSMP30高発現HepG2細胞やSMP30ノックアウトマウスを用いて詳細に解析する。加齢指標蛋白質30(SMP30)は、ホルモンによる影響を受けず、雄雌共に加齢に伴い肝臓や腎臓で減少する蛋白質として発見した。SMP30遺伝子を欠損させたSMP30ノックアウトマウスの肝細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに非常に高感受性であった。また、Fas抗体を用いたin vivo実験に於いても同様の結果が得られた。本課題では、SMP30が持つアポトーシス抑制作用の分子機構を明らかにすることを研究目的としている。今年度、以下に示す研究成果を得ている。(1)肝臓や腎臓におけるアポトーシスの加齢変化をHE染色、TUNEL法用いた組織染色により解析した。その結果、アポトーシス陽性細胞は加齢に伴い増加することがわかった。更に、SMP30ノックアウトマウスでは早期からアポトーシス陽性細胞が出現してくることもわかった。加齢に伴うアポトーシス陽性細胞の増加はSMP30の減少による可能性が考えられる。(2)SMP30を高発現させたHepG2細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を示すことを明らかにした。また、SMP30高発現HepG2細胞では、生存シグナル系に働くAktの活性化(リン酸化)が強く起こっていた。これは、SMP30がAktを介する生存シグナル系に促進的に働いていることを示している。今年度、加齢に伴い肝臓や腎臓でアポトーシス陽性細胞が増加することを明らかにした。また、SMP30ノックアウトマウスでは早期にアポトーシス陽性細胞が出現することもわかった。加齢に伴うSMP30の減少は、アポトーシス高感受性になる。今後は、この研究成果を踏まえ、SMP30がアポトーシス抑制系にどのように働いているのかをSMP30ノックアウトマウスを用いて詳細に解析する。SMP30(加齢指標蛋白質30)は、雄雌共に加齢に伴い肝臓や腎臓で減少する蛋白質として発見した。(1)SMP30を高発現させたHepG2細胞では、TNF-αとアクチノマイシンDにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を示した。更に、カルモジュリン阻害剤のtrifluoperazineを同時に加えるとAktのリン酸化が強く阻害された。これは、SMP30がカルモジュリンを介して細胞内カルシウム濃度の調節を行い、カルシウム濃度の上昇が引き金となるアポトーシスの誘導を制御していることを示している。