hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多点低電流電気刺激によるリエントリ時心筋興奮伝播制御に関する研究

通電刺激が心筋の電気的興奮状態に与える影響をより詳細に検証するため,光学計測を用いた以下の2種類のシステム開発を行い,興奮伝播現象の計測および解析を行うことを目的として研究を実施した.具体的には,心臓上の任意点での活動電位をリアルタイムで計測しながら,その波形信号に対して通電刺激を印加できるシステムフィードバック通電刺激システムを開発し実験に応用した.連続的に撮影した心臓興奮の光マッピング画像から計測点における活動電位波形をリアルタイムに導出する.一定区間の最大値と最小値を検出し,その平均値(活動電位波形振幅の50%)をthresholdとする.その後,活動電位値がthresholdを上回った時点を活動電位の立ち上がり,下回った時点を立ち下がりとし,その時点を基準とした遅延時間で通電刺激を印加することを可能とした.(1)活動電位の立ち上がりをトリガとし,そこから設定した遅延で通電刺激を印加するフィードバック刺激,(2)活動電位波形から拡張期間隔(Diastolic Interval : DI)を検出し,立下りからDI±αの遅延時間後に通電刺激を印加するフィードバック刺激,(3)複数設置した微小電極から,その近傍の心筋で先に活動電位が立ち上がった電極を選択して通電刺激を印加するフィードバック刺激を行うことが可能とした.検出したDIを元に遅延時間を設定したフィードバック刺激では,DIが正確に検出されたことを確認した.刺激電極を自動的に選択するフィードバック刺激実験では,先行興奮波の進行方向を考慮した形でフィードバック刺激を行うことに成功した.これにより通電刺激の時間的な制御だけでなく,位置の制御も行うことが可能となり,様々な除細動通電刺激プロトコルを実験的に検証できる.光学的マッピング計測により得られる心臓標本上の活動電位情報をリアルタイムでフィードバックし、標本上に複数配置した電極を選択し、目的の時間相で刺激を加えることを可能とする実験装置を開発するための第一段階として,0.1mmの微小な径を持つ,光学マッピングを妨げない電極を製作した。膜電位感受性色素Di-4-ANEPPSにより染色したウサギ灌流標本を高速度カメラ(256×256画素,MOS固体撮像素子,フレームレート490fps)で撮影することでその活動電位光シグナルを画像計測し,特定の活動電位光シグナル信号をトリガ信号として,透明電極中の1点から電気刺激を加えることが可能な膜活動電位光シグナルのリアルタイムフィードバック電気刺激システムを試作した。そして観測画像中の特定の観測点での活動電位を実時間で計測しつつ,その部位にある細胞の再分極レベルがあるレベルとなった時点から一定時間後に透明電極より心筋組織に刺激を加える実験を,ウサギ灌流標本を用いて行い,その動作を確認した。従来の一般的な刺激プロトコルである基本刺激と通電刺激の時間間隔を定めて刺激を行うS1-S2プロトコルでは,活動電位持続時間が種々の原因で延長あるいは短縮すると,刺激が加わる時点での細胞の興奮性はばらついてしまう。これに対して本システムでは再分極タイミングをリアルタイムで計測することで常に一定の興奮性を有するタイミングで心筋組織を電気刺激することを可能とした。再分極中の回復度合いをもフィードバックの閾値に利用可能としたことで,刻々変化する細胞の興奮特性の現れである活動電位の変化に様々な刺激パターンで心筋細胞,あるいは心臓全体の,微小な点から加えられた弱い刺激に対する応答を検討することが可能となった。通電刺激が心筋の電気的興奮状態に与える影響をより詳細に検証するため,光学計測を用いた以下の2種類のシステム開発を行い,興奮伝播現象の計測および解析を行うことを目的として研究を実施した.具体的には,心臓上の任意点での活動電位をリアルタイムで計測しながら,その波形信号に対して通電刺激を印加できるシステムフィードバック通電刺激システムを開発し実験に応用した.連続的に撮影した心臓興奮の光マッピング画像から計測点における活動電位波形をリアルタイムに導出する.一定区間の最大値と最小値を検出し,その平均値(活動電位波形振幅の50%)をthresholdとする.その後,活動電位値がthresholdを上回った時点を活動電位の立ち上がり,下回った時点を立ち下がりとし,その時点を基準とした遅延時間で通電刺激を印加することを可能とした.(1)活動電位の立ち上がりをトリガとし,そこから設定した遅延で通電刺激を印加するフィードバック刺激,(2)活動電位波形から拡張期間隔(Diastolic Interval : DI)を検出し,立下りからDI±αの遅延時間後に通電刺激を印加するフィードバック刺激,(3)複数設置した微小電極から,その近傍の心筋で先に活動電位が立ち上がった電極を選択して通電刺激を印加するフィードバック刺激を行うことが可能とした.検出したDIを元に遅延時間を設定したフィードバック刺激では,DIが正確に検出されたことを確認した.刺激電極を自動的に選択するフィードバック刺激実験では,先行興奮波の進行方向を考慮した形でフィードバック刺激を行うことに成功した.これにより通電刺激の時間的な制御だけでなく,位置の制御も行うことが可能となり,様々な除細動通電刺激プロトコルを実験的に検証できる.
前立腺癌における転移抑制遺伝子の同定と癌進展の解析

前立腺癌の進展に関連した抑制遺伝子を臨床検体からクローニングすることは、その手術症例数が比較的少ないことや癌組織の採取が難しいこと、また癌組織における癌細胞やその組織構築の多様性などにより非常に困難である。我々は肺に高率に転移するラット前立腺癌細胞にヒト染色体を1本導入し、その肺転移能などの性状の変化を指標としながら転移抑制遺伝子をクローニングする方法を開発した。前立腺癌の転移を抑制する遺伝子をクローニングすることができれば、癌の悪性度の診断や、将来的には遺伝子治療にも応用できる可能性がある。この方法を用いて8p21-p12に転移抑制遺伝子が存在することを示したが、この転移抑制遺伝子を含むと思われる約60Kbのバクテリア人工染色体を同定し、論文として報告した。塩基配列を解析したところ、そこには1個の未知の遺伝子が存在しており、その遺伝子全長を含むcDNAを単離し解析した。また、同様の方法を用いて17番染色体より同定されているMKK4遺伝子の発現が、前立腺癌の進行と逆相関していることを示し、論文として報告した。また、11p11.2より同定したKAI1転移抑制遺伝子も前立腺癌の進行と逆相関していることを示していたが、このKAI1蛋白の発現調節の一部にメチレーションが関与していることを示し、論文として報告した。前立腺癌臨床検体の解析について、我々の施設における結果や海外における報告例をまとめると、第8番染色体の短腕のLOHの他、第10、13、16、18番染色体などにおいてもLOHが高率に認められており、癌進展との関連性を示すことができた。さらに、12番染色体短腕にもLOHが認められることを示し、この領域に癌抑制遺伝子が存在する可能性を論文としてまとめた。その他、CD44遺伝子のメチレーションが前立腺癌の進行や転移と関連していることも示し、論文として報告した。前立腺癌の進行に関連した抑制遺伝子を臨床検体からクローニングすることは、その手術症例数が比較的少ないことや癌組織の採取が難しいこと、また癌組織における癌細胞やその組織構築の多様性などにより非常に困難である。我々はこの方法を用いて、11p11.2からKAI1/CD82遺伝子をクローニングし、この発現がヒト前立腺癌の進行と逆相関していることを示した。この方法を用いて8p21-p12にも転移抑制遺伝子が存在することを示したが、本研究では100万塩基対程度まで転移抑制遺伝子の存在する領域を限局し、その領域をカバーするバクテリア人工染色体を同定した。塩基配列を解析したところ、最低3個の未知の遺伝子が存在することがわかった。現在それぞれの遺伝子についてその全長を含むcDNAを単離しているところであり、今後ラット前立腺癌の転移を抑制するか否かをみた後、臨床検体についても解析する予定である。7番染色体にも転移抑制遺伝子が存在することを示したが、臨床検体における7番染色体のLOHの頻度は、再燃癌であっても1520%程度であった。13番では13q14に80%以上の頻度でLOHが認められ、これは転移抑制遺伝子の存在が予想される領域と一致していた。17番染色体についても、その短腕に存在する既知のMKK4遺伝子が転移抑制遺伝子の候補として報告されたため、臨床検体の解析をおこなったところ、約30%の癌死症例においてLOHを認めた。

またこのラット前立腺癌はマトリックスメタロプロテイナーゼを産生しているが、ヒト染色体の導入により転移が抑制されても、その産生能の変化は一律ではなく、転移抑制の機序の多様性が明らかとなった。前立腺癌の進展に関連した抑制遺伝子を臨床検体からクローニングすることは、その手術症例数が比較的少ないことや癌組織の採取が難しいこと、また癌組織における癌細胞やその組織構築の多様性などにより非常に困難である。我々は肺に高率に転移するラット前立腺癌細胞にヒト染色体を1本導入し、その肺転移能などの性状の変化を指標としながら転移抑制遺伝子をクローニングする方法を開発した。前立腺癌の転移を抑制する遺伝子をクローニングすることができれば、癌の悪性度の診断や、将来的には遺伝子治療にも応用できる可能性がある。この方法を用いて8p21-p12に転移抑制遺伝子が存在することを示したが、本研究では70万塩基対程度まで転移抑制遺伝子の存在する領域を限局し、その領域をバクテリア人工染色体にクローニングした。さらに転移抑制遺伝子を含むと思われる約60Kbのバクテリア人工染色体を同定した。塩基配列を解析したところ、そこには1個の未知の遺伝子が存在しており、その遺伝子全長を含むcDNAを単離した。前立腺癌臨床検体の解析について、我々の施設における結果や海外における報告例をまとめると、第8番染色体の短腕のLOHの他、第10、13、16、18番染色体などにおいてもLOHが高率に認められており、癌進展との関連性を示すことができた。しかし、癌の進展は、LOHのような染色体の欠失のみでなく、遺伝子の増幅や染色体の増加によっても生じることが示されている。これらの増幅や増加を検出するには、従来行ってきたPCR法を用いたLOH解析では不可能であるため、comparative genomic hybridization(CGH)法を用いて、PCR法では解析できなかった染色体の増幅についても解析した。その結果、一部の症例では8番染色体長腕の増幅が生じていることがわかった。この方法を用いて8p21-p12に転移抑制遺伝子が存在することを示したが、この転移抑制遺伝子を含むと思われる約60Kbのバクテリア人工染色体を同定し、論文として報告した。塩基配列を解析したところ、そこには1個の未知の遺伝子が存在しており、その遺伝子全長を含むcDNAを単離し解析した。また、同様の方法を用いて17番染色体より同定されているMKK4遺伝子の発現が、前立腺癌の進行と逆相関していることを示し、論文として報告した。また、11p11.2より同定したKAI1転移抑制遺伝子も前立腺癌の進行と逆相関していることを示していたが、このKAI1蛋白の発現調節の一部にメチレーションが関与していることを示し、論文として報告した。前立腺癌臨床検体の解析では、第8番染色体の短腕のLOHの他、第10、13、16、18番染色体などにおいてもLOHが高率に認められている。
創発に基づく大規模神経回路網の自動設計

本研究の目的は,仮想生物の進化プロセスにおける創発(emergence)によって,従来は設計することができなかったタイプの神経回路網を自動的に生成するための方法論を確立することであり,本年度はその第1段階の研究として,神経回路網の進化において重要な機能単位ブロックが出現した場合にそれが保持されるような神経回路網の自動設計について検討した.そして特に,2次元または3次元格子の各格子点に神経細胞を配置し,神経細胞間の入出力結合が自分自身の近傍に限定される一種のセルオートマトンであるセル状神経回路網(Artificial Cellular Neural Network; ACNN)について検討した結果,以下のような研究結果を得た.1.セル状神経回路網(ACNN)の遺伝的自動生成法の確立:ACNNを,改良型の遺伝的アルゴリズム(GA)を用いて,扱う問題に適した構造と神経細胞間結合荷重をもつよう最適化するための方法を確立した.2.2次元ACNNによる入出力フィルタの自動設計:2次元ACNNの両端に入力ユニットと出力ユニットを接続し,入力信号に対する正しい応答を出力する問題を扱い,本提案手法によって適切な機能をもつ神経回路網を自動生成することができることを示した.3.3次元ACNNによる群行動シミュレータの自動生成:昆虫や動物の群れがとる集団行動を生じさせるような個々の個体の脳に相当する神経回路網を本手法によって自動生成する問題について検討した.その結果,個体の脳のモデルとして3次元ACNNを用いることにより,基本的な行動戦略を自動獲得できることを実験的に示した.今後は本年度で得た知見をもとに,さらに高度な情報処理機能をもつ大規模神経回路網の自動生成を目指す.本研究の目的は,仮想生物の進化プロセスにおける創発(emergence)によって,従来は設計することができなかったタイプの神経回路網を自動的に生成するための方法論を確立することであり,本年度はその第1段階の研究として,神経回路網の進化において重要な機能単位ブロックが出現した場合にそれが保持されるような神経回路網の自動設計について検討した.そして特に,2次元または3次元格子の各格子点に神経細胞を配置し,神経細胞間の入出力結合が自分自身の近傍に限定される一種のセルオートマトンであるセル状神経回路網(Artificial Cellular Neural Network; ACNN)について検討した結果,以下のような研究結果を得た.1.セル状神経回路網(ACNN)の遺伝的自動生成法の確立:ACNNを,改良型の遺伝的アルゴリズム(GA)を用いて,扱う問題に適した構造と神経細胞間結合荷重をもつよう最適化するための方法を確立した.2.2次元ACNNによる入出力フィルタの自動設計:2次元ACNNの両端に入力ユニットと出力ユニットを接続し,入力信号に対する正しい応答を出力する問題を扱い,本提案手法によって適切な機能をもつ神経回路網を自動生成することができることを示した.3.3次元ACNNによる群行動シミュレータの自動生成:昆虫や動物の群れがとる集団行動を生じさせるような個々の個体の脳に相当する神経回路網を本手法によって自動生成する問題について検討した.その結果,個体の脳のモデルとして3次元ACNNを用いることにより,基本的な行動戦略を自動獲得できることを実験的に示した.今後は本年度で得た知見をもとに,さらに高度な情報処理機能をもつ大規模神経回路網の自動生成を目指す.
アルツハイマ-型痴呆脳におけるガングリオシドの生化学的、免疫組織化学的、神経病理学的研究

臨床・病理学的にアルツハイマ-型痴呆(ATD)と診断された5例(死亡時年齢4589歳、死後時間114時間)と精神神経学的・神経病理学的に問題のない対照群3例(死亡時年齢6172歳、死亡時間110時間)を対象として(いづれも昨年度に対象とした症例とは異なる症例)、剖検時に-70°Cに凍結保存された脳半球の前頭葉・側頭葉・頭頂葉・後頭葉の各皮質・白質からpunch outした組織について、薄層クロマトグラフィ-使用して、総ガングリオシド、GMCC1DD,GDCC1aDD、GDCC1bDD、GTCC1bDDを測定した。その結果、総ガングリオシドおよび各ガングリオシドの濃度は大脳皮質では大脳白質より高く、脳葉のなかでは頭頂葉で最も高く、後頭葉でも最も低い傾向がみられた。また、皮質・白質ともGMCC1DDが最も多く、GDCC1bDD、さらにGDCC1aDDが続き、GTCC1bDDが最も少ない傾向がみられた。総ガングリオシド濃度はATD群では頭頂葉皮質でのみ有意差がみられた。GMCC1DDも後頭葉白質を除きATD群では減少傾向を示したが、いずれの部位でも統計学的に有意差はみられなかった。しかし、初老期のATD群のみについてみると、頭頂・後頭葉白質以上のすべての部位で明らかな減少がみられた。GDCC1aDDは頭頂葉皮質でのみATD群で有意な減少をみた。GDCC1bDD・GTCC1bDDはATD群の頭頂葉皮質のみで有意な減少をみる以外には大した変化はなかった。これらのガングリオシド変化と神経病理学的変化との関係については現在なお検討中であるが、現時点では両者の間には直接的な関係がないように思える。一方、免疫組織化学的研究としては、昨年度に抗GMCC1DD抗体が腫大アストログリアをラベルし、とくに老人斑内でラベルされたアストログリアの突起の腫大が目立つことを示したが、今年度は抗GDCC1aDD抗体による研究を行ない、それが老人斑内のNFTを含まない変性神経突起をラベルすることが示された。今年度はまずpreliminary studyとして、臨床・病理学的にアルツハイマ-型痴呆(ATD)と診断された3例(死亡時年齢4888歳、死後時間313時間)と精神神経学的にも神経病理学的にも問題のない対照例6例(死亡時年齢3483歳、死後時間220時間)を対象として、剖検時に-70°Cに凍結保存された脳半球の前頭葉、側頭葉、頭頂葉、後頭葉の各皮質・白質からpunch outした組織について、鈴木らが開発した高感度ガングリオシド測定法(従来の薄層クロマトグラフィ-法に酵素免疫染色法を応用した方法)により、GM1、GD1a、GD1b、GT1bを測定した。

その結果、1)対照群において、各ガングリオシド値は年齢および死後時間により差がないこと、2)ATD群と対照群との間で、いずれの部位でもGM1,GD1a,GD1b、GT1bに明らかな差はみられないこと、3)各部位におけるGM1,GD1a,GD1bGT1bの組成を見ると、GD1aが前頭葉皮質・白質で低下していることが示された。新しい方法では、ATD脳のガングリオシドに目立った変化がみられなかったが、文献ではATD脳で低下するという報告が多いことから、次のstudyとして、ATD5例、対照例3例について、従来から使用されている薄層クロマトグラフィ-法を使用して、各脳葉皮質・白質における種々のガングリオシドを測定し再検討している。まだ充分なデ-タの解析はなされていないが、GM1を中心にガングリオシドの低下がATDのいくつかの部位で認められている。この点、および神経病理学的変化との関係については次回に報告する。1方、免疫組織化学的研究では、抗GM1抗体により、ATD脳のhypertrophic astrocytesとある種の老人班が染め出されることが明らかになり、現在両者の関連を検討中である。また、抗GD1a抗体による剖検脳の染色も現在試行中であり、これをATD脳にも適用する予定である。臨床・病理学的にアルツハイマ-型痴呆(ATD)と診断された5例(死亡時年齢4589歳、死後時間114時間)と精神神経学的・神経病理学的に問題のない対照群3例(死亡年齢6172歳、死亡時間110時間)を対象として(いづれも昨年度に対象とした症例とは異なる症例)、剖検時に-70°Cに凍結保存された脳半球の前頭葉・側頭葉・頭頂葉・後頭葉の各皮質・白質からpunch outした組織について、薄層クロマトグラフィ-を使用して、総ガングリオシド、GM_1,GD_<1a>、GD_<1b>、GT_<1b>を測定した。その結果、総ガングリオシドおよび各ガングリオシドの濃度は大脳皮質では大脳白質より高く、脳葉のなかでは頭頂葉で最も高く、後頭葉で最も低い傾向がみられた。また、皮質・白質ともGM_1が最も多く、GD_<1b>、さらにGD_<1a>が続き、GT_<1b>が最も少ない傾向がみられた。総ガングリオシド濃度はATD群では頭頂葉皮質でのみ有意差がみられた。GM_1も後頭葉白質を除きATD群では減少傾向を示したが、いずれの部位でも統計学的に有意差はみられなかった。しかし、初老期のATD群のみについてみると、頭頂・後頭葉白質以外のすべての部位で明らかな減少がみられた。GD_<1a>は頭頂葉皮質でのみATD群で有意な減少をみた。GD_<1b>・GT_<1b>はATD群の頭頂葉皮質のみで有意な減少をみる以外には大した変化はなかった。これらのガングリオシド変化と神経病理学的変化との関係については現在なお検討中であるが、現時点では両者の間には直接的な関係がないように思える。一方、免疫組織化学的研究としては、昨年度に抗GM_1抗体が腫大アストログリアをラベルし、とくに老人斑内でラベルされたアストログリアの突起の腫大が目立つことを示したが、今年度は抗GD_<1a>抗体による研究を行ない、それが老人斑内のNFTを含まない変性神経突起をラベルすることが示された。
慢性疼痛における神経成長因子シグナリングの解明と新規治療薬の開発

これまでに、先天性無痛無汗症V型での神経成長因子(nerve growth factor; NGF)の変異を再現したノックインマウス(hR100E NGFマウス)がcomplete Freund's adjuvantの足関節内投与による関節炎モデルにおいて、痛み様行動が著しく減弱していることを見出していた。2018年度はこのhR100E変異による痛みの減弱が関節炎症モデル以外でも見られるかを調べるために、種々の急性・慢性痛モデルの確立を試みてきた。結果、神経障害性疼痛モデルであるspared nerve injuryモデル(SNIモデル)と深部組織に及ぶ手術後の痛みを再現するモデルであるBrennanモデル、および骨関節の整形外科的手術を再現した骨折/ピンニングモデルを野生株マウスを用いて、所属研究室で確立することができた。今後hR100E NGFマウスのこれらのモデルにおける表現系を評価する際に、痛みに関する評価が障壁となるが、関節炎モデルと同様、Brennanモデルにおいても各肢にかかる荷重をリアルタイムで測定することが可能であるAdvanced Dynamic Bearingシステムを用いることで、客観的かつ定量的に自発痛を評価することが可能であることを見出した。一方、hR100ENGFマウスでの無痛の機序探索に関しては、協力者であるスウェーデン・カロリンスカ医科大学のDr. Camilla Svenssonのラボにて、リコンビナントhR100E NGFタンパクが、NGF受容体を発現した培養細胞PC12細胞にて、mTORを介したシグナリングに異常をきたしていることを突き止めた。3年計画の2年目にあたる2018年度までに、hR100Eマウスの関節炎症時の無痛の機序の解明につき、mTORを介したシグナルの異常が関与していることを見出すことができ、本研究の目的の一つを達成できたと考えられる。また、もう一つの目的であるhR100Eマウスにおける無痛に関して、骨関節炎以外のモデルへの応用があるが、その準備段階としてのマウスモデルおよび痛み評価系の確立に成功することができた。本研究の最終年である2019年度では、これまで得られた知見を元にして臨床に還元できるような研究に発展させていく。hR100Eマウスの無痛の機序に関しては、さらに共同研究先のスウェーデン・カロリンスカ医科大学と協力し、阻害薬投与が可能な標的の同定を試みる。また、hR100Eマウスでみられるシグナル異常による無痛の機序が、骨関節炎以外の病的疼痛においても応用が可能であるかを検討するため、hR100EマウスおよびNGFシグナリングにおける阻害薬をこれまで確立してきたマウスモデル(神経障害性疼痛モデル、術後痛モデル)に用いて評価する。これらの知見をまとめて、hR100Eマウスの無痛機序、そしてこれを発展させた新規鎮痛標的の同定につき研究を総括していく。本研究の初年度にあたる平成29年度は、主に神経成長因子(NGF)の変異体であるR100ENGFマウスの関節炎症時における無痛の機序解明に努めてきた。R100ENGFマウスの唾液腺を用いたウェスタンブロットでは、R100ENGFマウスも野生株と同様に成熟NGFを生成することがわかり、R100E変異による無痛現象はおそらく、NGFの生成・分泌の低下ではなく、NGFシグナリングの異常によるものであることが裏付けられた。ウェスタンブロットの結果を詳しく見ると、R100E変異NGFでは、N-terminal octapeptideを欠いたshort formであるB-chainがdominantであることが判明した。このマイナーは違いは、NGFの神経成長因子としての機能に大きく影響を与えることは報告されていないが、もしかしたら無痛を生じるシグナリグ異常の原因になっている可能性がある。R100ENGF変異によるシグナリングの変化を調べるため、足関節炎症モデルにおける脊髄後根神経節での痛覚神経の活性化を調べた。phospho-p38、pERK、CGRPなどの活性化を示すマーカを標的として免疫染色を行なったが、野生株でもこれらの上昇は認められず、比較検討に至らなかった。R100E NGFによるシグナリングの変化は今後、共同研究先であるKarolinsk Institutetと協同で野生種NGFとR100E変異NGFの精製タンパクを用いて、後根神経節の分散培養を用いたin vitroアッセイにより突き詰めていく。マウスの疼痛の行動解析においては、本研究の特徴であるDynamic Weight Bearingシステムを用いた自発痛の評価が順調に稼働している。平成31年度に計画していた手術後痛モデルにおいてもマウスの自発痛評価に有用であることが示されたR100ENGF変異マウスの無痛機序を調べるために、関節炎症モデルでの免疫染色を計画していたが、Day7において野生株でもphospho-p38、pERK、CGRPなどの既知の痛覚神経系活性化マーカーが上昇を示さなかったため、比較検討ができなかった。組織摘出のタイミングや活性化マーカーの変更の必要があることが判明した。

2018年度はこのhR100E変異による痛みの減弱が関節炎症モデル以外でも見られるかを調べるために、種々の急性・慢性痛モデルの確立を試みてきた。結果、神経障害性疼痛モデルであるspared nerve injuryモデル(SNIモデル)と深部組織に及ぶ手術後の痛みを再現するモデルであるBrennanモデル、および骨関節の整形外科的手術を再現した骨折/ピンニングモデルを野生株マウスを用いて、所属研究室で確立することができた。今後hR100E NGFマウスのこれらのモデルにおける表現系を評価する際に、痛みに関する評価が障壁となるが、関節炎モデルと同様、Brennanモデルにおいても各肢にかかる荷重をリアルタイムで測定することが可能であるAdvanced Dynamic Bearingシステムを用いることで、客観的かつ定量的に自発痛を評価することが可能であることを見出した。一方、hR100ENGFマウスでの無痛の機序探索に関しては、協力者であるスウェーデン・カロリンスカ医科大学のDr. Camilla Svenssonのラボにて、リコンビナントhR100E NGFタンパクが、NGF受容体を発現した培養細胞PC12細胞にて、mTORを介したシグナリングに異常をきたしていることを突き止めた。3年計画の2年目にあたる2018年度までに、hR100Eマウスの関節炎症時の無痛の機序の解明につき、mTORを介したシグナルの異常が関与していることを見出すことができ、本研究の目的の一つを達成できたと考えられる。また、もう一つの目的であるhR100Eマウスにおける無痛に関して、骨関節炎以外のモデルへの応用があるが、その準備段階としてのマウスモデルおよび痛み評価系の確立に成功することができた。R100E NGF変異マウスの関節炎症時の無痛機序をさらに突き詰めていくため、共同研究先のKarolinska InstitutetのCamilla Svenssonと協同で、野生株NGFとR100E変異NGFの精製タンパクを唾液腺から精製し、脊髄後根神経節の分散培養を用いたin vitroアッセイにより、R100E NGFによるシグナリング異常を解析する。また、このR100E NGFタンパクを関節内に投与することで、野生株NGFと比較した疼痛惹起性を検討することが可能となる。平成30年度はこれら並行して、当初の予定である、NGF変異によるシグナリング異常をその受容体であるp75を標的とした阻害薬を投与することにより再現し、関節炎症モデルによる鎮痛効果を評価していく予定である。本研究の最終年である2019年度では、これまで得られた知見を元にして臨床に還元できるような研究に発展させていく。hR100Eマウスの無痛の機序に関しては、さらに共同研究先のスウェーデン・カロリンスカ医科大学と協力し、阻害薬投与が可能な標的の同定を試みる。また、hR100Eマウスでみられるシグナル異常による無痛の機序が、骨関節炎以外の病的疼痛においても応用が可能であるかを検討するため、hR100EマウスおよびNGFシグナリングにおける阻害薬をこれまで確立してきたマウスモデル(神経障害性疼痛モデル、術後痛モデル)に用いて評価する。これらの知見をまとめて、hR100Eマウスの無痛機序、そしてこれを発展させた新規鎮痛標的の同定につき研究を総括していく。
起炎菌不明とされてきた感染性心内膜炎の感染機序の解明および新規予防法の開発

Granulicatella adiacens表層にあるフィブロネクチン結合タンパク質Chaを同定した。Chaは相同性の高いStreptococcus gordonii DL1のcshAの2351アミノ酸残基を持ち、N末端側はユニークな配列、C末端領域は9個と1つの不完全な115アミノ酸残基の繰り返し領域からなる。他の4菌種においてもFn結合能を示したが、その強さはCha遺伝子の存在とは直接の関係がみられなかった。しかしN末領域および繰り返し領域ともよく保存されていた。G.adiacensのFn結合タンパクから、N末領域とC末端側の繰り返し領域を含む組み換えタンパクの作製し、作製したタンパクを用いて、レンサ球菌やブドウ球菌との関連を検討することを本年度の計画とした。Fn結合タンパクにおいてはC末端側の繰り返し領域に結合部位が存在する。しかし、ホモロジーの高かったCshAとの相同領域はN末端の固有領域に存在している。そのため、両部位をそれぞれに含むような組み換えタンパクを作製した。それぞれの領域を含むようにプライマーを設計しPCRの後、制限酵素で切り出し、発現ベクター(pGEX-6P)に組み込み、大腸菌で当該タンパクを発現させて精製した。これらの結果からN末端側の固有領域はほぼ精製できた。しかし、C末端側は繰り返し回数が多いためか、繰り返し領域の少ないタンパクは得られたものの、全長を満たすタンパクの精製には至らなかった。今後はプライマー等再検討して、再度タンパクの精製を行う予定である。組み換えタンパクはpET-28a(+)から得られたプラスミドに発現させた。N末領域のユニーク領域の産生には、F5とR5プライマーを用いた。繰り返し領域であるC末端側の産生にはF7とF7プライマーを用いた。C末端側では、C末細胞のアンカー部にある結合領域を除いて4個の繰り返し領域を含むように設計した。またレンサ球菌群等では複数のFn結合タンパクがあると報告されているがNVSでは報告されていない。そこで今回得られたG. adiacensのFn結合タンパク分布をGranulicatella群およびAbiotrophia defective 8菌株を用いて検討した。この検討に際してi)遺伝子のユニークなN末端側の領域を含む(F5-R5)、ii)繰り返し領域を全て含む(F6-R6)、iii)繰り返し領域の一単位の中にプライマーを設計し、複数個の繰り返し領域を増幅する(F7-R7)、3つのプライマーのセットを準備した。各菌株から全DNAを通法に基づき抽出・精製したものを鋳型として、3種をセットにしてPCRを行って遺伝子の有無を判定した。その結果、G. adiacens G40、G. adiacens HHP-1、A.defective 49176において、G. adiacens 49175で発現したFn結合タンパクの発現が認められた。Granulicatella adiacens表層のフィブロネクチン(Fn)結合タンパク質であるChaを同定した。Streptococcus gordoniiのFn結合タンパクのひとつであるcshAシーケンスをプローブとして使用しプラーク・ハイブリダイゼーション法によって求めた。データベースによるホモロジー検索により、Streptococcus gordoniiのFn結合タンパクのひとつであるCshAのC末端のFn結合領域である繰り返し配列と高いホモロジーが得られた。Chaシーケンスは、351のアミノ酸残基からなり、N末領域側半分ではユニーク配列を含む。C-末端領域は115のアミノ酸残基からなる9個の完全な繰り返し領域と1つの不完全なアミノ酸残基を持つ領域からなる。タイプ株を含むNVSの6株についてCha遺伝子の他の菌への分布の程度および各菌株のFn結合能を調べた。その結果3つのG.adiacens菌株と1つのAbiotrophia defective菌株でFn結合能を示したが、その強さはCha遺伝子の存在とは直接の関係がみられなかった。この複数の菌株におけるCha遺伝子発現はChaが固相化したFnに付着し、その機能は特異領域に存在することを示唆する。また組み換えChaタンパク質自体も固相化したFnに付着しさらにFnへのG.adiacensの付着を部分的に濃度依存的に一部抑制した。これらの結果から、ChaがFnへのG.adiacensが付着する際に関与する細胞表面タンパク質であることを示唆された。
北海道における民間信仰「カワシモサマ」の伝播と定着についての基礎研究

本研究の目的は、北海道内外に現存するカワシモ信仰の実態を明らかにして、近世以降、北海道に流入した民間信仰が、どのように受容し継承してきたかを究明することである。この目的を明らかにするために本年度は、北海道西南部のカワシモの信仰形態を調査するとともに、カワシモと同様に女性の祭祀がみられる明神講を中心に調査を行った。この調査の結果、北海道西南部の明神は、すべてお産の神として信仰しており、本殿の末社のひとつとして合祀されている。明神は、本殿を維持する氏子組織とは別に、女性だけの講で管理するものであった。講の祭りでは、宿の祭壇に神体を遷し、女性が集まって参拝と安産祈願のまじないをおこなう。由来は不明であるが、明治後期から大正初期には、すでに祭がとりおこなわれていたのである。一方、北海道西南部のカワシモ(カワスソ)社は、17世紀末から19世紀中頃に建立しており、本州の夏越祓の影響をうけて成立したものである。この神社の幕末頃の祭には、神職が関与していたが、女性も川清めという祓の神事に関わっていた。カワシモの信仰形態にお産の神として女性の祭祀が定着するのは、明治期から大正期にかけてである。カワシモの神像の一部は、明治初頭の廃仏毀釈によって神体を和弊に取り替えるように指導がなされているが、なかには祭神や神像が明神として祭られて定着している事例があった。以上のことから、北海道西南部のカワシモ信仰は、夏越祓の神事であったものが、幕末にかけて女性の信心が高まり、明治初期における神仏混淆の整理を経て、お産の神として女性の祭祀が中心になるとともに、一部において明神講という別称で、女性のために神として定着したものである。
硝酸呼吸系に含まれる銅タンパク質の構造と機能の研究

メタノールやメチルアミンなどの炭素原子1個を含む有機物を炭素源とし、同時に脱窒によりATPを獲得する菌体、C1資化性脱窒菌Hyphomicrobium sp.A3151からの亜硝酸還元酵素を単離して、各種分光学的性質やその電子供与タンパク質を検討した。この亜硝酸還元酵素は酸性タンパク質で、分子量4.9万のサブユニット4つからなる。酵素は青色で、その可視吸収スペクトルは456nm(ε=1,500)と605nm(ε=2,600M^<-1>cm^<-1>)に吸収帯を示しており、今までに報告されているものと全く異なるものであった。EPRがタイプ1銅と2銅の存在を示している点は、一連の銅型亜硝酸還元酵素に見られる特徴と同じである。従って、本酵素の新奇な点は、タイプ1銅の配位子(2His,Cys,Metと考えられる)の種類ではなく、構造が異なるところにあると結論された。(2)銅型亜硝酸還元酵素の電子供与体、シュウドアズリンの変異体の作成脱窒菌Achromobacter cycloclastes IAM 1013からの亜硝酸還元酵素と電子供与体であるシュウドアズリンとの相互作用を検討するために、シュウドアズリンの変異体を作成した。シュウドアズリンのブルー銅には、His40、His81、Cys78、Met86が配位しており、銅は歪んだ四面体構造である。また、Cys78の一つ隣にはLys77が結合して、この部位が酵素との相互作用および電子移動反応に関与している可能性がある。そこで、そのLys77をHisに置換して変異体(Lys77His)およびMet86をGlnに置換した変異体(Met86Gln)を、大腸菌を用いて発現することができた。現在、Lys77Hisを多量に得て分光学的測定を完了したところである。
排出権取引市場でのコンプライアンス行動を促す制度の検討：経済実験を通じた制度分析

仮想の排出権取引市場を作り、そこで罰金や違反者名の公開等の罰則を設定し、それらが市場参加者のルール順守行動にどのような影響を与えるかを経済実験の手法を用いて検証した。計12回の経済実験を実施した。たとえ少額であっても罰金が最もコンプライアンスを高めることが確認され、次いで金銭的な影響はないものの違反者名を公表することも違反抑制に有用であることが確認された。一方で、間接的な情報となる違反者IDの公表は、違反を抑制することができたものの、大きな違反をする参加者を増加させるという、違反誘発効果があることも確認された。そのため、違反抑制として名前等の情報公開を用いることは注意が必要となる。本研究は排出権取引市場を想定し、その市場内における参加者による違反行動をどのように抑止できるかという点に着目し、経済実験を通じて検証を試みている。経済実験については1回あたり20名の被験者(学生ではなく一般の方)に参加してもらい、計12回を実施した。そのため、これまでに240名の被験者に本研究の被験者として参加をしてもらっている。研究計画に沿って実験は進めているため、実験では被験者に対して共通のルールを課している。そして、実験の設定上はルールを破る(違反する)方が得になるような設計を行っている。その上で、12回の実験毎に、違反がある場合の罰則に変化を加えている。具体的な罰則としては、1)違反の度合いに応じた低額罰金、2)違反者のIDの実験室内での公表、3)違反者の氏名の実験室内での公表の3つである。2と3については排他的であるため、計6つのトリートメント(各トリートメント2回の実験)を実施している。実験結果の詳細分析は現在行っているが、違反抑制にとって最も有用であると確認されたのは1の罰金であった。ただし、罰金額については違反する方が得になる程度の低額に設定している。それにも関わらず、2と3と比較して最も違反抑制効果が認められている。これは単純な損得勘定のみで人は行動していないことを示唆しているものである。このことは、人々は違反を行うことに対する嫌悪感あるいは罪悪感のようなマイナスの感情を抱いていることも指す。これは、いわゆる社会的規範が機能しているといえる。そのため、社会的規範を考慮した制度設計を検討する必要があるといえる。本研究は、市場における参加者のコンプライアンス遵守を高める手段に関して、既存研究とは異なり、違反者の公表を取り上げ、その有効性を経済実験を用いて検証した。実験は2014年度中に予定通り全て完了し、研究期間最終年度である2015年度は実験結果の分析および論文の執筆、そして研究報告を実施した。これらは全て予定通りに進捗し、論文の執筆も2016年3月に完了し、現在は投稿への準備を行っている。分析の結果、違反者名の公開は罰金と同等の違反抑制効果をもたらすものの、違反者IDの公開(違反者名よりも緩い罰則)の場合には、大きな違反を誘発する負の効果も存在することが確認された。本研究の成果は経済実験の成功にかかっている。経済実験については、2014年度も含め、計12回を実施し、いずれについても失敗することなく予定通り実験を実施できている。そのため、本研究は十二分なデータを収集することができているといえる。また、分析については2015年度に詳細に実施するものの、簡単な分析では予想通り、違反の抑制に対して、たとえ少額であっても罰金が大きく有用であることが確認できた。今後は他の2つの違反者公表制度の効果も定量的に分析していく必要がある。環境経済学2015年度については、これまでに実施した経済実験のデータを元に、定量分析をし、論文を執筆する予定である。特に、違反者のIDの実験室内での公表と、違反者の氏名の実験室内での公表の2つの制度の違反抑制効果の測定を試みる。そして、それらの制度が市場全体にどのような影響(価格の分散や収束速度、あるいは社会構成)にどのような影響を与えるかを識別していく。それが終わった後の年度後半では、英語雑誌への投稿を見据えて、追加の関連論文をレビューしつつ論文を作成していく。経済実験が失敗することがなかったため、追加の経済実験の必要性がなくなったことが、次年度使用額が生じた最も大きな理由となっている。また、経済実験で収集したデータの整備年度内には終わっているものの、下半期までかかってしまったため、学会発表に間に合わなかった点も繰越が生じた理由となっている。繰越金額については、本研究に関連する書籍や論文の購入に充てると同時に、分析用のソフトウェアの購入、学会や研究会での情報収集・発表等の旅費に充当する予定である。
細胞接着因子ギセリンの治療への応用と腫瘍マーカー化

1)ギセリンの発現による造腫瘍性の検討ヌードマウスを用いた実験系において腫瘍細胞の浸潤、転移能とギセリンの関係を検討した。以前、私たちはギセリンには細胞内領域の長さが違う2種類のアイソフォームが存在することを見いだしており、これら2つのアイソフォームは細胞接着力が異なる。マウスの線維芽細胞由来の細胞L-929細胞とラット線維肉腫由来細胞株に2種類のギセリンアイソフォームを導入し発現細胞を作製後、発育鶏卵の漿尿膜上に接種した。その結果、ギセリン発現細胞はともに漿尿膜の深部へと浸潤増殖しておりL-ギセリン発現細胞においては胚子の肺への転移が高頻度に認められた。次に、上記の発現細胞をヌードマウスに皮下移植した。その結果、ギセリン導入した細胞では2種類ともに、細胞異形が強く、皮下での腫瘍性増殖と周囲組織への浸潤能が促進されていた。特にL-ギセリン導入細胞では肺への血行性転移率も高くなっていた。ヌードマウスの尾静脈接種実験においても、L-ギセリン導入細胞では肺動脈の血管内皮細胞との接着性が増しており、血管壁への浸潤さらには肺実質への浸潤増殖が顕著に認められた。2)ギセリンのゲノミッククローニングと上流解析トランスジェニックマウス及びノックアウトマウス作成を視野に入れてマウスギセリンのゲノミッククローニングを行い、上流域8kを含む15kbpのクローンを単離し、全エクソンイントロン構造と上流域の決定を行った。この結果、ギセリン遺伝子は16個のエクソンから成り、アイソフォームはエクソン15のスプライシングによるものであることが確認できた。さらに、上流域の解析のために、各種の長さの上流域をルシフェラーゼレポーターにつなぎ、現在転写シスエレメントの解析を行っている。その結果、特定の増殖因子に反応し、発現が上昇することが確認された。
化学増幅を利用した高感度バイオセンサ

1.目的バイオセンサの中でも免疫センサは抗体分子のすぐれた分子識別機能を利用して複雑な有機物質を検出定量することのできるセンサであるが、その高感度化に関する研究はあまりおこなわれていない。本研究では特定抗体に対し均一な結合能を有するモノクロナール抗体を化学増幅機能を有する酵素で標識した複合体を分子識別機能物質として用いることにより、高感度に抗原物質を検出定量するバイオセンサを設計作成することとした。2.方法および成果最近食物中に見出され大きな問題となっている毒素の1種であるオクラトキシンA(OTA)を測定対象とした。抗体産生ハイブリドーマを用いてマウス腹水より生成した抗OTAモノクロナール抗体に化学増幅機能の大きな酵素カタラーゼを化学結合させ、OTA識別分子とした。OTAを結合した高分子膜を酸素電極に装着しOTA微量計測用センサとした。このセンサ部をカタラーゼ標識抗OTA抗体溶液に浸漬し、免疫結合反応を行わせ、洗浄後膜抗原に結合したカタラーゼ標識抗体の酵素活性を酸素電極により電流計測し、微量なOTAと抗OTA抗体との結合反応を検出できることを示し、OTAセンサの基本応答特性を明らかにした。ついでセンサ部を測定対象OTA溶液に浸漬し、カタラーゼ標識モノクロナール抗体を添加して膜結合OTAと溶液中のOTAへの競争結合反応を行わせ、洗浄後センサ出力を測定することによって測定溶液中のOTAを検出定量できることを示した。微量な抗原-抗体反応がカタラーゼの反応によって増幅され、大きな電流出力として計測され、【10^(-8)】【10^(-6)】g・【mL^(-1)】の範囲のOTAを検出定量できた。3.今後の展開酵素の増幅機能を利用して高感度に抗原物質を検出定量する免疫センサの設計指針が得られたが、さらに分子識別反応を高感度に計測する方法として化学発光など光学的検出法の利用が有効であり、オプティカルバイオセンサの開発が期待できる。
高速増殖炉2次冷却系のタンク化による高性能・簡素化研究

本研究は、高い安全性を確保しつつ高速増殖炉の経済性の向上を図るため、中間熱交換機と蒸気発生器を一体化して簡素化する独自案AIHX(Advanced Intermediate Heat eXchanger)の展開研究である。本科研により昨年度に制作した長尺加熱装置を試験部本体として熱媒体ガリウムを追加し、本年度に購入した液体金属ガリウム循環ポンプおよび液体金属循環装置用架台を付加して昨年度の自然循環実験に引き続いて、中間熱媒体ガリウムの強制循環(Pe【less than or equal】500)熱伝達実験を行った。(1)新型中間熱交換機(AIHX)内の液体金属Gaの強制循環熱伝達特性(2)温度揺らぎの測定と局所的な流体移動・伝達メカニズムの解析経路が単純形状の加熱側では、相互相関による局所流速は電磁流量計流速と一致する。温度揺らぎのRMS値は流速増加とともに一旦増加してから減少する。これは発生メカニズムが加熱面近傍の温度勾配に流れの乱れが加わって発生することを示している。(3)高速増殖炉実用化への適応性の検討強制循環させれば優れた熱伝達特性が得られるが、実機のような長尺では自然循環でも「もんじゅ」同等以上の特性が期待される。実験結果を精査して、詳細検討を行い、結果は学会誌に発表の予定。本研究の目的は、安全性と経済性の優れた高速増殖炉開発のため、中間熱交換器と蒸気発生器とポンプを一体化して簡素化する独自の新概念中間熱交換器(AIHX:Advanced Intermediate Heat eXchanger)の基礎研究の展開にある。既存の小型実験装置(短尺加熱)を参考に、新規に長尺加熱部装置を製作した。円筒容器環状空間に、直径12mmで有効加熱長400mmの直棒状の電気加熱ヒーター12本を円環状配列し、外周に外径12mmの二重螺旋状水冷管を配して、中間熱媒体として液体金属Gaを用いた。(1)新型中間熱交換器(AIHX)内の液体金属の自然循環熱伝達特性加熱部と冷却部に円筒仕切板ありの場合は、自然循環伝熱特性は加熱長が半分の短尺に較べて約3倍に向上した。この煙突(Chimney)効果により、実機では更に優れた自然循環伝熱特性が期待できる。仕切板がない場合は、伝熱特性は元来良好だが、長尺にしても伝熱特性の大幅な向上はなく、加熱管と冷却管の近接配置により、局所的渦状の流体移動により伝熱が支配されている。(2)温度ゆらぎの測定と局所的な流体移動・伝熱メカニズムの解明新規に購入した高精度多温度計測・動的解析装置を用いて、熱電対二点間の温度ゆらぎの相関関数より局所的な流体移動速度を求めた。仕切板がある場合は、円環状流路に沿った流速34cm/seの流れが主流であるのに対して、仕切板がない場合は、温度ゆらぎが大きく振動数は0.10.3Hzで、流体の移動が加熱管と冷却管の間で局所的な渦状であることが確かめられた。成果は、原子力学会口頭発表2件、ロシアでの国際研究集会1件に発表。学会誌投稿を検討中。次年度は、装置にGa用ポンプを取付け、強制循環熱伝達特性を測定、実機適用の設計的検討を行う。本研究は、高い安全性を確保しつつ高速炉増殖炉の経済性の向上を図るため、中間熱交換器と蒸気発生器を一体化して簡素化する独自案AIHX(Advanced Intermediate Heat eXchanger)の展開研究である。本科研により昨年度に製作した長尺加熱装置を試験部本体として熱媒体ガリウムを追加し、本年度に購入した液体金属ガリウム循環用ポンプおよび液体金属循環装置用架台を付加して、昨年度の自然循環実験に引き続いて、中間熱媒体ガリウムの強制循環(Pe≦500)熱伝達実験を行った。(1)新型中間熱交換器(AIHX)内の液体金属Gaの強制循環熱伝達

特性加熱ヒーター群側では熱伝達特性はSobbotinの式(Nu=5+0.025Pe^<0.8>)と比較して、中流速領域(100≦Pe≦500)では高い熱伝達を示し、Nu=5+0.05Pe^<0.8>となる。ヘリカル状冷却管側ではHoeの式(Nu=0.43+0.228Pe^<0.67>)に較べて高く、中Pe領域で6.34+0.256Pe^<0.67>となった。これらの結果については、尚、精査し確認を要するが、良好な熱伝達特性を示す結果である。(2)温度ゆらぎの測定と局所的な流体移動・伝達メカニズムの解析流路が単純形状の加熱側では、相互相聞による局所流速は電磁流量計流速と一致する。温度ゆらぎのRMS値は流速増加とともに一旦増加してから減少する。これは発生メカニズムが加熱綿近傍の温度勾配に流れの乱れが加わって発生する事を示唆している。(3)高速増殖炉実用化への適用性の検討強制循環させれば優れた熱伝達特性が得られるが、実機のような長尺では自然循環でも「もんじゅ」同等以上の特性が期待される。実験結果を精査して、詳細検討を行い、結果は学会誌に発表の予定。
フェムト秒レーザー誘起タンパク質結晶核発生の原理解明と高度化

タンパク質の詳細な立体構造を解析する最も有効な手法は、結晶を利用したX線回折法であるが、タンパク質は分子間相互作用が小さいため核発生が困難であり、高品質結晶作製のボトルネックとなっている。そこで、申請者はフェムト秒レーザーを過飽和溶液に集光照射することにより強制的に核発生を誘起する技術の原理解明と高度化に取り組んだ。昨年度の研究より、レーザー照射時に発生するキャビテーションが分子を移動させ、局所的に分子の高濃度領域を形成し、核発生を促すことが明らかになった。本年は、高濃度領域の緩和時間を長くして核発生確率を高めるため、タンパク質溶液のゲル化を行った。タンパク質分子の拡散定数は、1 wt%のゲル中で0.50.8倍程度になることが報告されている。1 wt%のアガロースを添加して溶液をゲル化し、レーザー照射を行った結果、ニワトリ卵白リゾチームの結晶化において、通常の低粘性溶液の5分の1以下の低過飽和度条件下で核発生を誘起することに成功した。また、この時のキャビテーション挙動を観察した結果、ゲル中ではキャビテーションが崩壊しないことが明らかになった。キャビテーション崩壊時には、熱や圧力波の発生および化学反応などが誘起されることが知られており、これらの抑制も核発生促進に有効に働いたと考えられる。また、細胞増殖必須因子SATや膜タンパク質AcrBといった、実際に構造解析が求められている難結晶化タンパク質においても、溶液をゲル化することにより、より低過飽和度で核発生を誘起できることを明らかにした。さらに、アガロース添加による溶液のゲル化そのものが核発生を促進することを新たに見出した。以上の結果から、溶液のゲル化とフェムト秒レーザー照射の組み合わせは、タンパク質核発生促進に大きく貢献する技術であると考えられる。レーザー誘起タンパク質核発生をより有用な技術にするため、そのメカニズム解明と手法の高度化に取り組んでいる。これまでに、核発生のレーザー光強度やパルス時間幅依存性を調べ、あるしきい値強度以上でのレーザー照射により発生するキャビテーションが核発生を誘起しうることを明らかにした。そこで本年は、より効果的なレーザー照射条件の探索を目的とし、キャビテーションの挙動に大きな影響を与えうる粘性をパラメータとして、核発生への影響を調べた。粘性はアガロースゲルを用いて制御を行った。アガロースゲルを1%添加した高粘性リゾチーム溶液にレーザー照射を行った結果、通常の低粘性リゾチーム溶液よりも低過飽和度で核発生が誘起された。さらに、蛍光低分子を修飾して可視化したリゾチーム分子を用いて、レーザー照射直後(μs)におけるゲル中のタンパク質濃度分布の測定を行った結果、キャビテーションの収縮時に蛍光リゾチーム分子の凝集と思われる強い蛍光信号が観察された。これより、キャビテーションの収縮過程が分子を濃縮し、核発生を促進するというメカニズムが示唆された。この分子凝集は通常の低粘性溶液では観察されなかったことから、溶液の高粘性化により、溶質拡散が抑制されて局所的な高濃度状態が維持されやすくなったと考えられる。また、この時のキャビテーションの挙動を高速度カメラを用いて観察したところ、キャビテーション収縮後の再膨張及び崩壊が無くなり、崩壊時に発生する熱や高圧化などの核発生を阻害する要因が抑制されていることがわかった。以上の結果から、高粘性な溶液条件は核発生誘起に適している可能性が示唆された。
租税条約における受益者概念の意義に関する法政策学的研究

1 1992年OECDモデル租税条約は、10条(配当)〔11条(利子)及び12条(使用料)も同旨〕において、配当の支払いの受領者が居住者としての地位を有する締約国でそれらの支払いに対して課税されることを定めると同時に、支払い者側の締約国においても一定の場合に課税することを認めている。しかし、「当該配当の受益者が他方締約国の居住者である場合」には当該課税に対し税率上の制限を設けている。本研究の問題意識は、この税率上の制限が「当該配当の受領者」ではなく「当該配当の受益者」を要件としているのは何故か、であった。2米国で知られている、条約上の軽減税率その他の恩典措置の第三国居住者による享受は「トリティ・ショッピング」(以下、TS)称され、米国が締結・改訂する近時の租税条約においてはそのような行為は恩典措置による税負担軽減排除を認めない「条約便益制限条項」を導入している。その制限テストとして外国所有や課税ベース浸食などが用いられている。米国はこの「条約便益制限条項」によって条約適用対象取引をすべてチェックし、それを通過した取引にのみ恩典措置を認める。そこには、条約便益を享受すべき者は誰かということを取引・当事者組織類型的に把握し、個別具体的なTSを排除するテストを設定するという政策がうかがえる。3一方、OECDは、1992年の抜本改訂に際して、このような米国型の規制条項の導入を見送り、むしろ締約国の居住者とはどのようなものかを検討することによって米国の規制条項と同様の規制効果をあげようとしている。しかし、OECD加盟国によっては、租税以前に、経済活動を行なう企業形態への法規制が異なり、就中、法人格の有無は加盟国によってかなり相違し、投資形態(特に集団投資のそれ)もまた大きく異なる。これらのことから、「居住者」を一義的に定義し企業形態とは無関係に租税条約上の規準を定位することは、さらに企業形態・投資形態を比較検討しない限り困難であること、今後は「受益者」の概念の幅(射程距離)と我が国条約政策への影響が論点となろうことが明らかとなった。