hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素進化工学に基づくバイオポリエステル高機能化技術の開発

硬質性のポリ乳酸(PLA)と軟質性のポリヒドロキシブタン酸(PHB)とのハイブリッド化に適したPHBオリゴマーを作製するため、「PHB重合酵素の溶解度が合成ポリマーの分子量と逆相関する」という原理を応用し、溶解度の高い重合酵素を進化工学的に取得し、目的のPHBオリゴマーを大量に合成することを試みた。変異体の選抜には、溶解度と蛍光強度に相関がある緑色蛍光タンパク(GFP)の蛍光強度を指標にした。酵素溶解度とGFP蛍光強度の関係を調べたところ、両者に正の相関がある結果が得られた。進化工学的手法による多数の変異体プールからGFP蛍光強度を指標としてオリゴマー重合酵素の取得、および任意のポリマー分子量に重合可能な変異酵素を迅速に取得できる可能性が示された。硬質性のポリ乳酸(PLA)と軟質性のポリヒドロキシブタン酸(PHB)とのハイブリッド化に適したPHBオリゴマーを均一に作製するための手法としてバイオプロセスを利用した。以前の研究で得られた「PHB重合酵素の溶解度が合成ポリマーの分子量と逆相関する」という原理を応用し、極めて溶解度の高い重合酵素を進化工学的に取得し、目的の均一なPHBオリゴマーを大量に合成することを試みた。溶解度の高い変異重合酵素の取得のための方法として、溶解度と蛍光強度に相関があると報告されている緑色蛍光タンパク(GFP)の蛍光強度を指標にした。重合酵素のN末端側にGFPが付加されるように設計した遺伝子を構築し、それを大腸菌に導入することでGFP融合重合酵素を性産する大腸菌を作製した。進化工学的手法により重合酵素遺伝子に変異が導入されたGFP融合重合酵素を宿主菌体内で発現させ、得られた変異体の重合酵素遺伝子の発現条件および宿主菌株の培養条件等を検討した。その結果、同一条件下において変異体間での明らかな蛍光強度の違いを確認することができた。変異が導入されたGFP融合重合酵素を菌体から回収し、酵素溶解度とGFP蛍光強度の関係を調べたところ、両者が正の相関関係にあることを強く示唆する結果が得られた。この結果から、進化工学的手法によって得られた大規模な変異体ライブラリから得られるGFP蛍光強度を指標として選別することにより、PLAとPHBとのハイブリッド化に適したオリゴマー重合酵素の取得、および任意のポリマー分子量に重合可能な変異酵素を迅速に取得できる可能性が示唆された。以前の研究で得られた、「ポリヒドロキシブタン酸(PHB)重合酵素の溶解度が合成ポリマーの分子量と逆相関する」という原理を応用し、極めて溶解度の高い重合酵素を進化工学的手法により取得し、目的の均一なPHBオリゴマーを大量に合成することを試みた。重合酵素のN末端、またはC末端側にGFPが付加されるように設計した遺伝子を構築し、それを大腸菌に導入することでGFP融合重合酵素を生産する大腸菌変異株を作製した。進化工学的手法により重合酵素遺伝子に変異が導入したGFP融合重合酵素を宿主菌体内で発現させ、得られた変異体の重合酵素遺伝子の発現条件および培養条件を検討した。その結果、同一条件下において変異体間の明らかな蛍光強度の違いを確認することができた。変異が導入されたGFP融合重合酵素を回収し、酵素溶解度とGFP蛍光強度の関係を調べたところ、両者が正の相関関係にあることを強く示唆する結果が得られた。この過程において、重合酵素はN末端側にGFPを融合した場合のみ蛍光発色するという特徴を有することがわかった。また、発現に必要な培養条件を検討した結果、蛍光強度の比較に最適な培養温度を決定することができた。以上のことから、進化工学的手法によって構築された大規模な変異体ライブラリからGFP蛍光強度を指標とした優良変異体の選別において、重合酵素はGFPのN末端側への融合が必要であること、および、その培養条件の最適化によってPLAとPHBとのハイブリッド化に適したオリゴマー重合酵素を取得できる可能性が強く示唆された。
岩石破壊力学における新展開のための破壊靱性試験イノベーション

岩石を構成している岩石マトリックス、鉱物粒子、鉱物粒子境界の破壊靭性を評価するための試験法を開発した、その方法を用い、花崗岩中の長石および石英内に作製した10×10×50マイクロメートルの微小供試体の微視的な破壊靱性および変形特性を評価した。この結果、微視的破壊靱性は、通常の花崗岩供試体から得られる巨視的破壊靱性に比較して小さいこと、ばらつきが大きいことなどが明らかとなった。さらに、得られた値を用いて有限要素被膜法により巨視的破壊靱性試験における破壊進展数値シミュレーションを実施した。この結果、実験による破壊形状と解析結果はよい一致を示し、解析方法の妥当性が明らかとなった。研究代表者:尾原が中心となって、つぎの5つの項目について研究を遂行した。1マイクロ岩石試験片用破壊靱性試験装置の製作:金属材料のマイクロ材料試験装置のノウハウを用いて岩石に適した破壊靱性試験装置を改良し、十分な測定精度を持つ試験装置を完成させた。2マイクロ試験片の製作技術の開発:岩石試験片を磨き上げた3×3×7mmの直方体岩石の表面に金属を蒸着させて集束イオンビーム加工を行った後、製作する。また、この操作のなかで、薄片加工技術、金属蒸着技術を開発するなど、集束イオンビーム加工機を用いたマイクロ岩石試験片製作のノウハウを獲得し、数十マイクロメートルスケールの試験片製作が可能となった。3岩石組成物質の破壊靭性試験:花崗岩を構成する鉱物のうち、石英、斜長石、カリ長石の鉱物粒子内にマイクロ試験片を製作し、完成したマイクロ岩石試験片用破壊靱性試験装置を用いて破壊靱性試験を実施した。試験片を全部で6個製作したが、そのうち最初の1個は装置の不具合があったため実験は失敗したが、その不具合は解決し、5個の試験片の微視的破壊靱性を求めることができた。4岩石の破壊靱性試験:花崗岩や砂岩供試体(75mm半径)を用いた破壊靱性試験(SCB試験)を実施し、巨視的破壊靱性を評価した。5有限被膜法による破壊進展解析:き裂を含むSCB試験用供試体モデルを作成し、き裂の配向方向によって破壊面の凹凸の程度が変化する現象を解析することができた。本研究では、金属材料工学分野で開発された、マイクロ供試体の作製技術およびこの供試体を用いた微視的材料試験法の岩石への適用を試みた。まず、マイクロ供試体作製のために、集束イオンビーム(Focused Ion Bean; FIB)加工法を用いた。この手法は,細く絞ったガリウムイオンを電界で加速させ試料に照射し、表面の原子をはじき飛ばすことで微細加工を行うものである。本研究では、引出電流やドーズ量(単位面積当たりのイオンの照射量)などを変化させ様々な条件で岩石のFIB加工を試みることで,マイクロ岩石供試体作製のための最適な加工条件を決定した。つぎに、金属材料工学分野で開発された微視的材料試験装置を用いて、花崗岩を構成する鉱物である長石と石英内に作成したマイクロ供試体の破壊靱性試験を実施し、その適用性を調査した。そこで、試験装置を岩石用に改良し、作製した6つの供試体(長石内に3つと石英内に3つ)を用いて、破壊靱性試験を実施した。この結果、マイクロ供試体から得られる微視的破壊靱性は、通常用いる数センチの供試体から得られる巨視的破壊靱性に比較して、小さな値を示すとともに、そのばらつきが大きいことを明らかにした。この原因は、鉱物が形成されるときの劈開などの弱面の存在が関係していることを示した。また、供試体が小さくなっても、力学的挙動は脆性的であり、岩石のき裂先端の小規模降伏の領域は極小であることが明らかとなった。最後に、微視的破壊靱性試験より得られた結果と新しく開発した破壊進展数値解析法(有限被膜法)を用いて、通常実施される岩石破壊靱性試験をシミュレートした。この結果、実験後にX線CT撮影した破壊面の様子と解析で得られた破壊の結果はよい一致を示し、解析法の妥当性を確認することができた。岩盤工学マイクロ試験片の製作技術のノウハウを獲得するまでの期間が予想以上に短く、試験片の製作がスムースになり、試験本数が当初の予定より多くなった。しかし、製作のための集束イオンビーム加工機は全学共同利用装置であるため、試験片製作時間の確保が制限されている。有限被膜法による破壊進展解析では、き裂が配向しているモデルによる解析は終了し、鉱物粒子で構成されているモデルを作成し、その解析に年度内から着手している。申請時の計画通りに研究が進んでいるので、今年度も計画とおりに進めていく予定である。

有限被膜法による破壊進展解析はさらに複雑なモデルを用いた解析を実施し、その成果を国際会議で発表する予定である。今年度、他の経費でマイクロ材料試験機をほぼ完成させた。この完成後に実際に装置を稼働させながら本経費でさらなる改良を加えたり、必要な器具や測定装置を購入することとしたため、経費を次年度に繰り越した。次年度、マイクロ材料試験機にさらなる改良を加えたり、必要な改良や測定機器を購入し装置を完成させる予定であり、経費は次年度末までに使用を完了する。
項書換え系と木オートマトンに基づくプログラム安全性検証に関する研究

本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,プログラムの安全性などの性質を効率的に検証する技法の開発である.得られた成果は,車載LANプロトコルの検証,プログラムの等価性判定,プログラムのループ不変式の自動生成などの技法である.加えて,これらの検証技法の基盤となる技術に関して,項書き換え系の停止性検証,命題論理の充足可能性判定,等式理論を法とする充足可能性判定などの基礎的な成果を得た.本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,通信プロトコルを始めとするネットワークソフトウエアを含む並行プログラム一般の安全性について,効率的かつ適用範囲の広い検証技法を確立するとともに,検証システムを実装,評価することである本課題では,以下の項目を研究する計画である(1)応用pi計算における弱い非干渉性の定式化(2)応用pi計算における安全型の定式化(3)安全型と弱い非干渉性の関係の解明(4)項書換え系と木オートマトンに基づいた安全型の近似型推論システムの開発(5)近似型推論システムへの応用に特化された項書換え系と木オートマトンの解析技法の開発(6)近似型推論システムに基づく安全性検証システムの実装と実験による評価本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,プログラムの安全性などの性質を効率的に検証する技法の開発である.得られた成果は,車載LANプロトコルの検証,プログラムの等価性判定,プログラムのループ不変式の自動生成などの技法である.加えて,これらの検証技法の基盤となる技術に関して,項書き換え系の停止性検証,命題論理の充足可能性判定,等式理論を法とする充足可能性判定などの基礎的な成果を得た.本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,通信プロトコルを始めとするネットワークソフトウエアを含む並行プログラム一般の安全性について,効率的かつ適用範囲の広い検証技法を確立するとともに,検証システムを実装,評価することである.今年度行なった主な研究は以下のとおりである.●ビットエラー環境下での新世代車載LANプロトコルの動作解析に関する研究:通信路でビットエラーが発生した場合のプロトコルの振る舞いをモデル検査ツールを用いて網羅的に解析する手法を明らかにした.この結果は,新世代車載LANプロトコルが安全に振る舞うこと検証するための基礎となる結果である.通信エラーの確率モデルを与えて,ビットエラーがプロトコルのアプリケーションに影響を与える可能性を解析することは今後の課題である.●項書き換え系を応用した手続き型プログラム検証に関する研究:プログラムを等価な振る舞いをする制約付き項書換え系に変換し,得られた制約付き項書換え系の性質の証明技法を応用してプログラムの性質を検証する手法を開発し,実装作業を開始した.この結果をプログラムの安全性の検証に応用することは今後の課題である.その他に,項書き換え系の停止性に関する研究,充足可能性判定に関する研究も行なった.本研究の目的は,項書換え系やホオートマトンの解析技法を応用し,通信プロトコルを始めとするネットワークソフトウエアを含む並行プログラム一般の安全性について,効率的かつ適用範囲の広い検証技法を確立するとともに,検証システムを実装,評価することである.今年度行なった主な研究は以下のとおりである.・新世代車載LANプロトコルの見逃し誤りに関する研究:この研究では,充足可能性判定ツールを用いて新世代車載LANプロトコルのエラー検出機構をすり抜ける通信路上のビットエラーを解析する手法を明かにした.実験の結果,設計時には想定していなかった見逃し誤りが存在することが示された.・項書き換え系を応用した命令型プログラム検証に関する研究:命令型プログラムを等価な制約付き項書換え系に変換し,得られた制約付き項書換え系の性質を検証することでプログラムの性質を検証するという手法において重要な役割を果たす書換え帰納法のための自動補題生成法を開発した.その他に,項書き換え系の非干渉性に関する研究,項書き換え系の停止性に関する研究,充足可能性判定に関する研究を行なった.本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,通信プロトコルを始めとするネットワークソフトウエアを含む並行プログラム一般の安全性について,効率的かつ適用範囲の広い検証技法を確立するとともに,検証システムを実装,評価することである.今年度行なった主な研究は以下のとおりである.・抽象データ型の非干渉性に関する研究:従来の情報流解析によるプログラムの安全性は,メモリーの非干渉性に依存している.本研究では,メモリーを一般化した抽象データ型の非干渉性を定式化し,その検証法を考察した.・等式理論を法とするDPLL遷移系の提案と実装:プログラム検証の問題は,与えられた等式理論の下での論理式の充足可能性問題に帰着されることが多い.本研究では,与えられた等式理論と論理式に対して,自動的にその等式理論の決定手続きを生成し,論理式の等式理論を法とする充足可能性を判定する枠組みを提案し,その実装,評価を行った.その他に,木オートマトンの受理する言語の閉包性の研究,項書き換え系の停止性に関する研究,制約付き項書換え系の性質自動証明に関する研究を行なった.本研究の目的は,項書換え系や木オートマトンの解析技法を応用し,通信プロトコルを始めとするネットワークソフトウエアを含む並行プログラム一般の安全性について,効率的かつ適用範囲の広い検証技法を確立するとともに,検証システムを実装,評価することであり,今年度は次を研究実施計画とした.(1)抽象データ型の非干渉性に基づいたプログラムの安全性検証の枠組みの開発,(2)安全性検証への応用を目的としたプログラムのループ不変式自動発見手法の開発,(3)プログラムの安全性判定への等式

理論を法とする充足可能性判定法の適用,(4)非干渉性をはじめとするプログラム安全性検証への応用を目指した項書き換え系と木オートマトン理論の展開.これに対して,以下のような成果を得た.●プログラムのループ不変式自動発見手法の開発:関数呼出しを含むプログラムに対して,非線形不等式(関数呼出項も含む)の形のループ不変式を発見する手法を開発し,実験により評価した.●充足可能性判定法の効率的実現:基本対称節と節の連言からなる論理式の充足可能性判定にリテラル監視法を取り入れて効率化した充足可能性判定ツールを開発し,その有効性を評価した.●項書き換え系と木オートマトン理論の展開:停止性および到達可能性のそれぞれについて,それが決定可能である項書き換え系のクラスで,これまでに分かっているクラスより広いクラスを発見した.
高温環境に設置されるMEMSセンサからの信号読み出し技術の実証

数百°Cの高温環境に設置する容量型MEMSセンサのための信号読取り技術を実証した。高温環境に耐熱性容量型センサ,SiCダイオードブリッジ,およびカップリングキャパシタを設置し,そこから配線を室温環境に伸ばし,Siの信号処理回路に接続する。まず,pn接合SiCダイオードに白金電極を形成することで,400600°Cの高温でも動作することを確認し,各温度における特性を測定した。また,高温で利用できるダイボンディング,ワイヤーボンディングなどの実装技術を開発した。これらの要素技術を用いて,SiCダイオードブリッジ回路を構成し,高温で試験した。さらに,SiC微細加工技術を開発し,センサ基本構造を試作した。高温環境下ではSiの電子回路が利用できないため,センサからの信号読み取りに従来の方法が利用できない。本研究では,この課題に対して,高温環境にはセンサと最低限の素子のみを設置し,配線を介して室温環境に設置するSiの信号処理回路に繋ぐ新しい着想を実証する。具体的には,高温環境には高温に耐えられる容量型センサ,SiCダイオードブリッジ,キャパシタンスを設置し,そこから配線を室温環境に伸ばし,Siの信号処理回路に繋げる。そのため,まず,pn接合SiCダイオードが400600°Cの高温でも動作することを確認し,各温度における電流電圧特性を測定した。オーミックコンタクトのメタライゼーションのためNiとPtを比較利用し,Ni電極は酸化で劣化するのに対し,Pt電極は600°Cでも安定してダイオード動作をさせられることを実証した。次に,SiCダイオードをを用いてブリッジ回路を構成する実装法を開発した。ダイボンディングには耐熱性導電ペーストを利用し,そのキュアのレシピを最適化した。ワイヤボンディングにはNi線のウェッジボンディングを利用した。そして,SiCダイオードブリッジをサファイア基板上に構成し,耐熱キャパシタを用いてブリッジ回路の400°Cまでの高温動作を確認した。さらに,耐熱SiC MEMSセンサの加工技術を開発するために,センサ基本構造の試作を試みた。具体的には,プラズマCVDやRIEによってSiC薄膜を加工し,SiCビームによってSiマスが支えられた構造を試作した。本研究の目的は,Siの電子回路が使用できない数百°Cの高温環境に設置する容量型小形センサのための信号読み取り方法を実証することである。その方法は,高温環境に耐熱性容量型センサ,SiCダイオードブリッジ,およびカップリングキャパシタを設置し,そこから配線を室温環境に伸ばし,Siの信号処理回路に接続するというものである。これは,高温環境には,インピーダンスを下げ,配線を伸ばすための最低限の耐熱回路を設置し,主たる信号処理は室温環境で行うという発想による。まず,pn接合SiCダイオードに白金のメタライゼーションを施すことで,400600°Cの高温でも動作することを確認し,各温度における電流電圧特性を測定した。また,容量型センサを作製するためのSiC微細加工技術も開発した。平成27年度には,SiCダイオードを用いてブリッジ回路を構成し,また,簡易的な容量型センサを用意し,これらを接続して提案するセンサシステムを構成した。センサ読み取り部を高温環境に設置してセンサシステムを試験し,動作を確認するとともに,特性を取得した。また,前年度に取得したダイオード特性に基づいて,センサシステムの特性をシミュレーションした。さらに,SiC微細加工技術を引き続き開発し,SiCのセンサ基本構造を試作した。以上をもって,当初の研究目的を達成した。本研究の根幹は,高温で用いる作動型容量センサの読出しにpn接合SiCダイオードのブリッジ回路を用いる方法を実証することである。これに対して,本年度は,Ptメタライゼーションのpn接合SiCダイオードが600°Cの高温でも安定して動作することを確認した。そして,高温実装技術として耐熱性導電ペーストを用いたダイボンディングとNiワイヤボンディングを開発して,SiCダイオードブリッジ回路を構成し,これが400°Cの高温でも動作することを確認した。以上によって,本研究の根幹部分を実証できたと考えている。平成27年度,このSiCダイオードブリッジ回路のセンサへの適用性を実証すれば,研究目的を達成できるため,おおむね順調に研究が進展していると判断している。平成26年度には,Ptメタライゼーションのpn接合SiCダイオードが600°Cの高温でも安定して動作,そして,SiCダイオードブリッジ回路が400°Cの高温でも動作することを確認した。平成27年度には,このSiCダイオードブリッジ回路がセンサに適用可能であることを確認することを目的とする。そのために,簡易構造の作動型容量センサを用意し,これとSiCダイオードブリッジ回路を接続して,センサ信号の読出しを実証する。

また,前年度,実測したSiCダイオードの特性を用いて,センサ読出し回路の動作を回路シミュレーションによっても確認する。以上によって,本研究の目的である高温環境に設置されるMEMSセンサからの信号読み出し技術の実証を達成する計画である。これに加え,耐熱性MEMSセンサを作製するための基本技術の開発も行う。平成26年度から引き続き,プラズマCVDやRIEによってSiC薄膜を加工し,作動型容量センサの基本構造を試作する。試作を通じて,加工技術の課題を明らかにし,その解決をはかることで,耐熱性MEMSセンサの実現に必要なキー技術を獲得する。実験を進めるにあたり必要な物品の在庫が研究室にあったため,本年度は予定していた物品購入を行わなかった。また,萌芽的研究を開始して1年目であったため,今年度の学会発表を見送り,その結果,旅費を執行しなかった。予定していた研究を遂行するために,必要な物品を購入する。また,センサー開発のための微細加工を学内の共用施設で行うため,その利用料を負担する。本研究に利用予定である装置が,最近,不調となり,その修理等に費用がかかる可能性がある。
C末端アンカータンパク質の細胞内輸送、膜挿入、機能構造形成へのシャペロンの関与

C末端アンカー型小胞体膜タンパク質(シトクロムb5)およびミトコンドリア外膜タンパク質(モノアミン酸化酵素、外膜シトクロムb5)のターゲット膜への特異的挿入に関与する因子(膜挿入可能な構造を保証する因子)、の検索とそれらの作用機構およびターゲティングシグナルと因子との分子認識機構を解明することを目標としている。本年度は、次の2点について解析した。1.シトクロムb5のターゲティングシグナル部と特異的に結合する細胞質タンパク質をシトクロムb5アフィニティクロマトグラフィーにより検索し、35kDおよび100kDの2つのタンパク質が候補として得られた。現在、構造解析のため両者を精製中である。2.ターゲティングシグナルに見られる「一見共通性のない曖昧な構造を厳密な情報として受け取る」機構の解明のモデル系としてミトコンドリアタンパク質前駆体のプロセシング酵素(ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ)の基質認識機構を酵素と基質の両面から解析した。酵素には数個の基質認識に与る部位があり、基質はそれらに対応する構造のうち、切断部位付近の必須な構造と別の部分の一つ以上の部位に対する構造をもっていればよく、そのことが基質の多様性と酵素の厳密性を与えていることが示唆された。
脂肪酸β酸化系の臓器特異性に関する基盤構築

高脂血症による引き起こされる動脈硬化と脂肪肝は、虚血心疾患や肝硬変などの重篤な生活習慣病のリスクファクターとなる。細胞内における脂質代謝の改善により、高脂血症の予防と治療が行える可能性がある。ミトコンドリア脂肪酸β酸化系は全ての脂肪酸を異化し、エネルギー産生で中心的な役割を演ずるが、未解明の部分が多い。全身臓器・培養細胞を材料として、分布とPPARを介する代謝制御について調べ、生理的な意義を研究した。脂肪酸β酸化系は、肝細胞において、エネルギー産生とケトン体産生を担い、2種の細胞小器官に存在する代謝系である。虚血性心疾患や脂肪肝などの生活習慣病のリスクは、高脂血症の栄養学的治療により回避できる。細胞内のミトコンドリアとペルオキシゾームに局在する脂肪酸β酸化系は全ての脂肪酸に共通した異化代謝系あり、その異常は肝臓を含む様々な臓器に脂肪沈着をもたらす。ペルオキシゾームの系については、全身の細胞における分布、核内受容体PPARを介した酵素誘導機構が明らかになってきたが、意外なことに、二つの代謝系のうち圧倒的に重要なミトコンドリアの系については、十分調べられていない。全身の肝臓および肝臓外臓器・培養細胞について、脂肪酸β酸化系酵素の抗体アレイを用い、酵素蛋白質の分布量を調べると共に、初代培養細胞を用いてin vitro probe assayと非放射性同位元素を用いたトレーサー実験で、脂肪酸β酸化能とケトン体産生能を測定する。さらに、幹細胞からの分化誘導実験により臓器特異性の成立過程を知る。以上によって高脂血症・臓器内脂質沈着是正における脂肪酸β酸化系の栄養学的な学術基盤を形成する目的で研究を行っている。細胞内のミトコンドリアとペルオキシゾームに局在する脂肪酸β酸化系は全ての脂肪酸に共通した異化代謝系であり、その異常は肝臓を含む様々な臓器に脂肪沈着をもたらす。脂肪酸β酸化系は、肝細胞においてはエネルギー産生とケトン体産生を担い、2種の細胞小器官に存在する代謝系である。虚血性心疾患や脂肪肝などの生活習慣病のリスクは、栄養学的治療により回避できる。ミトコンドリアとペルオキシゾームに局在する脂肪酸β酸化系は全ての脂肪酸に共通した異化代謝系である。加えて後者は多価不飽和脂肪酸合成も担う。それらの異常は様々な器官に脂肪沈着を、脳においては機能異常をもたらす。ペルオキシゾームの系については、全身の細胞における分布、核内受容体を介した酵素誘導機構が明らかになってきたが、二つの代謝系のうち圧倒的に重要なミトコンドリアの系については、十分調べられていない。全身の器官・培養細胞について、脂肪酸β酸化系酵素の抗体アレイ・qt-PCRを用い、酵素の分布を調べるとともに、初代培養細胞を用いてin vitroprobe assayとトレーサー実験で、脂肪酸β酸化能とケトン体産生能を測定する。幹細胞からの分化誘導実験により臓器特異性の成立過程を知る。さらに、正常・酵素欠損異常症に由来する培養細胞を用いて酵素誘導機構を検討する。以上により脂肪酸β酸化系の栄養学的な学術基盤を形成する目的で研究を行っている。両代謝系の分布については、脳において全酵素の分布量が極めて少ない例外を除き、全身の器官に共通した分布を示した。複数のラット初代培養細胞において、量的には大きな差があるものの全酵素が共通して存在し脂肪酸β酸化能を有するため、それらが脂質代謝を研究するモデル細胞となると示した。神経幹細胞からの分化誘導実験は、均一な分化細胞が得られないため中止し、初代培養神経細胞の分化過程の解析に変更した。病態解析に有用な線維芽細胞での酵素誘導現象は、程度は弱いものの存在すると思われた。器官と細胞における代謝系の量的差と酵素誘導についての多様性の成立機構が今後の課題である。肝臓・肝臓外臓器と培養細胞を用いて、1細胞内:栄養代謝系の動態、2細胞外:栄養代謝産物の濃度、3細胞問:細胞機能維持における相互作用の解析を行う。

1. 25年度の計画:成体・発達過程の動物肝臓と肝外臓器の胎生から老化に至る各段階の特性を調べる。現在、定性的な結果は得られ、定量を行った。2. 26年度の計画:培養細胞(神経幹細胞、肝細胞;アストロサイト;神経細胞;セルトリ細胞;線維芽細胞;血管内皮細胞)と(神経幹細胞から神経細胞・星状膠細胞・希突起膠細胞に分化する過程)における特性を調べる。現在、初代培養細胞については、結果が得られ論文作成途上であるが投稿が遅れている。3. 27年度の計画:脂肪酸β酸化系を制御して解析を行う。細胞間の相互作用を調べる。論文投稿を行う予定である。細胞生物学25年度の計画で、研究が遅れていた定量的な解析を26年度には遂行した。当初は、26年度の計画である培養細胞を用いた研究については、初代培養細胞の結果が予想より早く得ることができたため、論文作成を26年度の目標としたが、投稿には至っていない。神経幹細胞の分化と脂肪酸代謝については、26年度の主な研究課題とした。27年度は実験を補足して論文投稿を目指す。肝臓・肝臓外臓器と培養細胞を用いて、1細胞内:栄養代謝系の動態、2細胞外:栄養代謝産物の濃度、3細胞間:細胞機能維持における相互作用の解析を行う。25年度の計画:成体・発達過程の動物肝臓と肝外臓器の胎生から老化に至る各段階の特性を調べる。現在、定性的な結果は得られ、定量の途上である。26年度の計画:培養細胞(神経幹細胞、肝細胞;アストロサイト;神経細胞;セルトリ細胞;線維芽細胞;血管内皮細胞)と(神経幹細胞から神経細胞・星状膠細胞・希突起膠細胞に分化する過程)における特性を調べる。現在、初代培養細胞については、60%の結果が得られ論文作成途上である。27年度の計画:脂肪酸β酸化系を制御して解析を行う。25年度には行わなかった。25年度の受領額を概ね支出することができた。25年度の受領額を超えないように注意して支出したために、26年度使用額が0より大きくなった。26年度は実験計画に遅れが生じたため、27年度使用額が0より大きくなった。25年度の計画で、現在研究が遅れている定量的な解析を26年度には遂行する。当初は、26年度の計画である培養細胞を用いた研究については、初代培養細胞の結果が予想より早く得ることができたため、論文作成を26年度の目標とする。神経幹細胞の分化と脂肪酸代謝については、26年度の主な研究課題となる。ほぼ予定通り、使用する計画である。25年度の受領額を超えないように注意して支出したために、次年度使用額が0より大きくなった。
ナノチャンネルを有する金属材料のチャンネル形態制御と機能化

nmサイズの開口型チャンネルを含むナノポーラス金属膜は、著しく増大した内部表面積とナノ構造化の相乗効果による特異物性発現の可能性から、新機能材料への応用が期待されている。チャンネル形態を制御したナノポーラス金属の作製とともにその物性変化について検証する目的で、ガスジェット流によりAu超微粒子を堆積固化するガスデポジション法及びAgAu合金からAgのみを優先溶出させる選択腐食法を用いてAuナノポーラス膜を作製し、その組織や力学特性、さらにはガス透過性や電気伝導性を調べた。また、作製後の圧縮加工によるチャンネル形態の制御についても検討した。表面観察やガス透過性評価から、作製手法及び条件により面積密度が数20%で数60nm径の開口型チャンネルを有するナノポーラスAuが作製可能であること、そして作製後の圧縮加工によってチャンネルの低面積密度化・細径化が制御して行えることが分かった。力学特性評価からは、圧縮加工によりほぼ稠密な状態となってもその界面(粒界)状態は高密度Auナノ結晶とは異なっていることが示唆された。ナノポーラスAuの室温での電気抵抗率は、チャンネルの面積密度が約20%で平均径約40nmのものでバルクAuの約20倍、平均径10nmと微細なものでは約800倍ときわめて高い値であった。また、真空中から大気中へと準静的に測定雰囲気を変えた場合にナノポーラスAuの電気抵抗率は約0.1%の減少を示したが、再び真空状態とすると元の値に回復したが、水分除去したガスを用いた場合にこの変化は明瞭に見られなかった。水分子の物理吸着によりナノポーラスAuに特有な界面で伝導性が向上していることが考えられる。これら研究結果はナノポーラス金属の新機能性材料としての高いポテンシャルを示している。ナノメートルオーダーのオープンチャンネルを有するナノポーラス構造の金属材料は耐熱耐衝撃性に優れたウルトラフィルタや増大した内部表面による高性能触媒などへの応用が期待される。これまでに、完全固溶系の金-銀合金の電解研磨により銀を選択的に溶出させることで、nmオーダーのチャンネル径を有し気体透過性を示すナノポーラス金ナノ結晶薄膜の作製が可能であることを報告してきた。今年度は電解研磨に加えてより簡単な濃硝酸による化学腐食によってもナノポーラス金薄膜を試み、さらに電解研磨法とあわせて研磨条件によるチャンネル形態制御について調べた。その結果、SEM観察ではナノチャンネルが明瞭に見られなかった電解研磨法で作製された試料に対して、その破断面SEM観察などから化学腐食法ではより空隙率高く、直径数10nmの開口チャンネルを有するスポンジ状ナノポーラス構造の形成が確認された。この組織の違いに対応して、電解法で作製された試料の室温におけるHeのガス透過率約10^<-11>molm^<-1>s^<-1>Pa^<-1>に比べて2桁以上大きな値を化学腐食法で作製された試料は示した。また、電解法では電流密度を増大させるほど、化学腐食法では電解液の液温が高いほどガス透過能が高い膜が得られたことから、これらの条件によりナノチャンネル径及び数密度を制御できることが明らかになった。これらを踏まえて、やはり完全固溶系であるが選択腐食実験の報告例がほとんどない白金-銅合金に対しても同様な実験を進めているが、濃硝酸を用いたCu_<70>Pt_<30>固溶体の化学研磨では全体的にもほとんど腐食が進まず、ナノポーラス白金薄膜の作製には現時点で至っていない。今後、より銅濃度の高い合金組成及びより酸化力の強い電解液での化学腐食を行うとともに、電解研磨による銅選択腐食でのナノポーラス白金薄膜を試みる計画である。

ウルトラフィルターなどへの応用に向けたナノメートルオーダーのオープンチャンネルを有するナノポーラス構造の金属材料作製及びその形態制御を目指し、完全固溶系の金-銀合金の電解研磨及び化学腐食金により直径数10nmの網の目状開口チャンネルを有するナノポーラス構造金薄膜の作製・物性評価を昨年度に引き続き行った。合金組成や電解条件などによるチャンネル径やその面積密度の制御に取り組むことで、室温のヘリウムに対するガス透過率が約10^<-12>10^<-8>molm^<-1>s^<-1>Pa^<-1>のナノポーラス金薄膜の作製が現在可能となっている。さらなるチャンネル形態制御に向けて、チャンネル径が比較的大きく高いガス透過性を有する化学腐食にて作製されたナノポーラス金薄膜の圧縮を試みた。圧縮率のコントロールでチャンネル径及びその面積密度が均質的に減少し、それによりガス透過率を2桁以上低下させることも可能で、ポスト圧縮加工がチャンネル形態制御に有効であることが分かった。併行して内部表面積増大によるガスセンサー効果について検証すべく、ガス透過性を示すナノポーラス金薄膜の電気抵抗を種々のガス雰囲気下で調べた。特に、真空中から大気中へ暴露時に試料の温度変化だけでは説明できない約0.7%の電気抵抗減少が見出され、またこの変化は真空減圧-大気圧暴露の繰り返しで可逆的に観測された。他方、単元系の酸素、窒素、炭酸ガス、ヘリウムに対する測定では大気の場合の約1/3以下の電気抵抗変化しか見られなかった。さらには、真空中から大気圧へ昇圧時のみに電気抵抗変化に圧力変化に対する分単位の時間遅れが見られた。これら観測結果から、この電気抵抗変化は内部表面での物理的な分子吸着に起因する可能性が高いが、その詳細な機構については現在検討中である。新機能性金属材料の創製を目指し、AgAu合金のHNO_3溶液中Ag選択腐食により数10nm径の開口型チャンネルを有するナノポーラス(np-)Auを作製した。前年度までに、腐食条件や腐食後の圧縮加工によりチャンネルサイズや面密度の制御可能なことに加え、大気中と真空中で電気抵抗率が異なることを見出した。本年度は、特にナノチャンネル構造のサイズによるnp-Auの電気抵抗率変化及び各種ガスに曝したときの真空中からの電気抵抗率変化を調べた。BET法にて評価した内部表面積(BET表面積)のnp-Auの真空中での電気抵抗率はBET表面積2.6m^2/gのもので約7.1μΩcmと通常のAuの値の約3倍であるが、30m^2/gのものでは約790μΩcmと非常に高い。このBET表面積30m^2/gのnp-Auでの繊維状Au部の平均径は10nm程度であり、真空蒸着法で作製された線幅10nmのAu線では13μΩcmの値が報告されている。ポーラス化による幾何学的効果で電気抵抗は稠密な場合に比べて約5倍になることを考えても、この非常に高い電気抵抗率は単なる表面・界面散乱効果では説明できない。また、いずれのnp-Auにおいても真空中に比べて大気圧中では約0.7%の電気抵抗率の減少が見られた。特にBET表面積が大きなnp-Auでは暴露するガス種によって抵抗変化の様子が大きく異なり、HeやN_2中の電機抵抗率は真空中の値とほぼ同じで、また乾燥させた空気中では電気抵抗率の減少が半分以下になった。
ごく少数のＤＮＡ分子の定量を可能とする標準ＤＮＡの開発

本研究では、既存のリアルタイムPCRをはじめとするDNA定量技術を評価するために、一桁台を含むごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAの開発を試みた。そのために、標的DNAが直列にN個つながったDNA試料(標準DNA-N)を作製した。標準DNA-Nには、予め各PCR標的DNA配列間に制限酵素の認識配列を配置しておき、一定体積中に標準DNA-Nが1分子以下になるまで限界希釈し、さらに、制限酵素処理することによって、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。現在、PCRの標的配列を16個含む標準DNA-16までの開発に成功した。PCR技術は、様々な研究分野から検査業務に至るまで、幅広く利用されている。定性的なPCR分析においては、僅か1分子のDNAをも検出可能であると考えられているが、その一方で、PCRによるDNA定量分析の技術的限界に関しては、これまで全く検証されてこなかった。これは、そのような検証が可能な、ごく少数のDNA分子を含む標準試料が存在していないことが原因である。本研究では、そのような一桁台を含むごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAを開発し、さらに、既存のDNA定量技術の限界を検証する。具体的には、標的配列をN個含む標準DNA-Nの場合には、PCR標的配列をN個直列につなぎ、さらに、それらの標的配列の間に制限酵素の認識配列を配置した状態でプラスミドDNAに導入する。この標準DNA-Nを含む限界希釈溶液(試料溶液中に標準DNAが1個ないしは0個しか入っていない状態)を分析する直前に制限酵素処理することにより、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。今年度は、ごく少数分子のDNA定量の可否が検証可能な標準DNAの設計及び構築を行った。本研究では、遺伝子組換え(GM)検知での適用を主要目的としていることから、GM検知に用いられているDNA配列を中心に設計を行う予定であるが、今年度は、その中でも、我が国のGMダイズ検知における標準分析法で利用されている、ダイズ内在性配列Lectin1 (Le1)を用いた。また、本研究では、限界希釈溶液を、PCR分析する直前に制限酵素によってN個に分離する必要があることから、PCRマスターミックス中においても活性を持った制限酵素の存在が不可欠である。そのため、上記の検討に先立ち、リアルタイムPCRマスターミックス中でも活性を有する制限酵素の選抜も行った。PCR技術は、様々な研究分野から検査業務に至るまで幅広く利用されている。定性的なPCR分析では、僅か1分子のDNAも検出可能であると考えられているが、その一方で、DNA定量分析の技術的限界に関しては、これまで全く検証されてこなかった。これは、そのような検証が可能な、ごく少数のDNA分子を含む標準試料が存在していないことに起因する。本研究では、そのようなごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAを開発し、さらに、既存のDNA定量技術の限界を検証する。具体的には、標的配列をN個含む標準DNA-Nを作製する場合には、PCR標的配列をN個直列につなぎ、さらに、それらの標的配列の間に制限酵素の認識配列を配置した状態でプラスミドDNAに導入する。この標準DNA-Nを含む限界希釈溶液(試料溶液中に標準DNAが1個ないしは0個しか入っていない状態)を、分析直前に制限酵素処理することにより、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。本研究では、遺伝子組換え(GM)検知での適用を主要目的としていることから、GM検知に用いられているDNA配列を中心に設計を行っており、今年度は、我が国のGMダイズ検知における標準分析法で利用されているダイズ内在性配列Lectin1 (Le1)を用いた。ただし、昨年度の検討から、単純に同じ配列を繰り返すと、何らかの立体障害等が発生するのか標準DNAの構築がうまくいかなくなったことから、繰り返し配列の周辺に無関係なジャンクション配列を導入させた。ジャンクション配列には、A、T、G、Cのバランスの取れたランダム配列を採用した。これにより、Le1配列が16個導入された標準DNAの構築に成功した。さらに、Le1以外の組換え配列に関しても、標準DNAの設計を行った。今年度は標準DNAの構築を行う予定であったが、ほぼ予定通り進んでいる。具体的には、Le1配列を、それぞれ1個、2個、4個、8個、16個含む標準DNAを構築した。構築の際には、昨年度、本研究目的に適した制限酵素の選抜を行った際に比較的良好な結果を示した3種類の制限酵素KpnI、PstIおよびSphIの認識配列を、各Le1配列の間に配置した。また、標準DNAの構築にあたっては、昨年度までは、対象配列を制限酵素等によって切りだしてから平滑末端化を行い、DNAライゲーション反応によって既にある配列の隣につなげて伸長を行っていたが、この方法は非効率的であり、また、繰り返し配列が8個、16個と長くなるにつれてライゲーション効率が著しく悪くなるといった問題がみられた。今年度は、この点を改良すべく、ゲノム編集等に利用されるTALENタンパク質の人工遺伝子構築に利用されているゴールデンゲート法を導入し、一度に4個のLe1配列をつなげる方法を開発した。

さらに、標準DNAの評価に関しては、Le1だけでは頑健性に問題があると考えられたので、Le1以外に、GMトウモロコシ検知における標準分析法で利用されているトウモロコシ内在性配列Starch synthase IIb (SSIIb)遺伝子および多くのGM作物に導入されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(P35S)に関しても、PCRの標的配列をタンデムに複数個つなげた標準DNAを構築すべく、設計等を行った。PCR技術は、様々な研究分野から検査業務に至るまで、幅広く利用されている。定性的なPCR分析においては、僅か1分子のDNAをも検出可能であると考えられているが、その一方で、PCRによるDNA定量分析の技術的限界に関しては、これまで全く検証されてこなかった。これは、そのような検証が可能な、ごく少数のDNA分子を含む標準試料が存在していないことが原因である。本研究では、そのような一桁台を含むごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAを開発し、さらに、既存のDNA定量技術の限界を検証する。具体的には、標的配列をN個含む標準DNA-Nを作製するために、PCR標的配列をN個直列につなぎ、さらに、それらの標的配列の間に制限酵素の認識配列を配置した状態でプラスミドDNAに導入する。この標準DNA-Nを含む限界希釈溶液(試料溶液中に標準DNAが1個ないしは0個しか入っていない状態)を分析する直前に制限酵素処理することにより、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。今年度は、ごく少数分子のDNA定量の可否が検証可能な標準DNAの構築を行った。本研究では、遺伝子組換え(GM)検知での適用を主要目的としていることから、GM検知に用いられているDNA配列を中心に設計した。昨年度までの検討から、単純に同じ配列を繰り返すと、何らかの立体障害等が発生するのか標準DNAの構築がうまくいかなくなったことから、繰り返し配列の周辺に無関係なジャンクション配列を導入させた。ジャンクション配列には、A、T、G、Cのバランスの取れたランダム配列を採用した。これにより、Le1配列が16個導入された標準DNAの構築に成功した。本研究では、既存のリアルタイムPCRをはじめとするDNA定量技術を評価するために、一桁台を含むごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAの開発を試みた。そのために、標的DNAが直列にN個つながったDNA試料(標準DNA-N)を作製した。標準DNA-Nには、予め各PCR標的DNA配列間に制限酵素の認識配列を配置しておき、一定体積中に標準DNA-Nが1分子以下になるまで限界希釈し、さらに、制限酵素処理することによって、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。現在、PCRの標的配列を16個含む標準DNA-16までの開発に成功した。今年度は標準DNAの構築を行う予定であったが、現在までのところ、ほぼ予定通り順調に進んでいる。まず、標準DNAの構築に先立って、リアルタイムPCRマスターミックス中においてもDNAの切断活性を有する制限酵素の選抜を行った。検討する制限酵素に関しては、専用バッファーの組成や失活のしやすさ、さらに価格等の観点から、ApaI、BamHI、ClaI、EcoRI、KpnI、PstI、SacI、SalIおよびSphIの9種類を試した。
低酸素腫瘍に対するＸ線・重粒子線感受性の分子生物学的機構の解明に関する基礎的研究

通常酸素,低酸素条件におけるmTOR阻害剤による放射線感受性の修飾について検討した.実験にはヒト肺腺癌細胞株A549を使用し,タンパク質発現はウェスタンブロット、細胞生存率はcolony assay法で解析した.細胞の生存が10%となる線量(D10)から酸素増感比(OER)を求めた.Temsirolims併用により低酸素条件下で誘導されるHIF-1aの発現は減少した.X線単独での通常酸素,低酸素条件下のD10は、それぞれ5.1Gy、14.2Gyで、OERは2.8であった.Temsirolimus併用下では通常酸素,低酸素条件下のD10はそれぞれ4.8Gy,5.4GyでOERは1.1であった.Mammalian target of rapamycin(mTOR)はAkt-PI3 kinase経路の下流の蛋白であり、近年、mTORが低酸素条件下の細胞生存に関連する蛋白として注目されているが、低酸素条件下の放射線抵抗性に関するmTORの関連については解明されていない点が多い。通常酸素、低酸素状態におけるmTOR阻害剤による放射線感受性の修飾について検討した。実験にはヒト肺腺癌由来細胞株A549を使用した。mTOR阻害剤は最終濃度1nMに希釈し、X線照射前48時間暴露させた。低酸素条件として低酸素照射機(京都科学)を使用し、酸素分圧<0.1mmHgで24時間培養後に照射し、1時間<0.1mmHgで培養後に希釈培養し、細胞生存率をcolony assay法で解析し、細胞の生存が10%となる線量(D10)から酸素増感比を求めた。結果、X線単独では通常酸素、低酸素条件下のD10は、5.1Gy、14.2Gyで、酸素増感比は2.8であった。mTOR阻害剤併用下では通常酸素、低酸素条件下のD10は、4.8Gy、5.4Gyで、酸素増感比は1.1であった。タンパク発現はウェスタンブロット法で解析した。通常酸素、低酸素条件下ともmTOR阻害剤併用下ではmTORの発現は同様に抑制された。また、mTOR阻害剤併用により、低酸素条件下で誘導されるHIF-1aの発現は濃度依存性に減少した。リン酸化p70 S6キナーゼとリン酸化4E-BP1の発現については、これらの発現は低酸素条件下では観察されず、通常酸素条件下での発現がmTOR阻害剤併用により抑制された。mTOR阻害薬により、低酸素条件下での放射線増感効果が認められ、mTORが低酸素細胞の放射線治療抵抗性に関連する因子である可能性が示唆された。その作用メカニズムにはmTOR阻害薬によるHIF-1a発現低下が関連している可能性が考えられた。通常酸素,低酸素条件におけるmTOR阻害剤による放射線感受性の修飾について検討した.実験にはヒト肺腺癌細胞株A549を使用し,タンパク質発現はウェスタンブロット、細胞生存率はcolony assay法で解析した.細胞の生存が10%となる線量(D10)から酸素増感比(OER)を求めた.Temsirolims併用により低酸素条件下で誘導されるHIF-1aの発現は減少した.X線単独での通常酸素,低酸素条件下のD10は、それぞれ5.1Gy、14.2Gyで、OERは2.8であった.Temsirolimus併用下では通常酸素,低酸素条件下のD10はそれぞれ4.8Gy,5.4GyでOERは1.1であった.低酸素条件下の細胞は放射線抵抗性を示すことが知られている。mammaliantarget of rapamycin(mTOR)はAkt-PI3 kinase経路の下流の蛋白であり、近年、mTORが低酸素条件下の細胞生存に関連する蛋白として注目されており、低酸素条件下の放射線治療抵抗性にmTORが関連している可能性を考え、通常酸素状態・低酸素状態におけるmTOR阻害剤による放射線感受性の修飾について比較・検討した。mTOR阻害剤は最終濃度1nMに希釈し、X線照射前48時間、A549に暴露させた。低酸素条件として、低酸素照射機(京都科学)を使用し、酸素分圧<0.1mmHgの条件で24時間培養の後に照射し、そのまま1時間<0.1mmHgで培養した後に、細胞のタンパク質発現に関してはウェスタンブロット、細胞生存率はcolony assay法により解析した。また、細胞の生存が10%の値となる線量(D10)から酸素増感比を求めた。その結果、通常酸素条件下、低酸素条件下ともに、mTOR阻害剤併用群においてmTORの発現は同様に抑制された。また、mTOR阻害剤併用により、低酸素条件下で誘導されるHIF-1aの発現が減少していることが確認された。X線単独での、通常酸素条件、低酸素条件下のD10は、それぞれ5.1Gy、14.2Gyで、酸素増感比は2.8であった。mTOR阻害剤を併用した場合では、通常酸素条件・低酸素条件下のD10は、それぞれ4.8Gy、5.4Gyで、酸素増感比は1.1であった。mTOR阻害薬の併用により、低酸素条件下で放射線増感効果が認められ、mTORが低酸素細胞の放射線治療抵抗性に関連する因子である可能性が示唆された。

コロニー形成法による細胞生残率の評価、および低酸素分画に対するmTOR阻害剤の増感効果については予定通りの解析が進められている.ただし、ウェスタンブロットでの検証は一部検討を必要とするものがある。平成25年度については前年の実験計画の検証を引き続き行う。特にウェスタンブロットの再現性、定量的解析は課題である。また、上記検討をX線のみでなく、炭素イオン線を用いた場合における増感効果の可能性について検証する。残額はわずかであり、細胞培養液、もしくはフラスコなどの物品への用途である。
トウモロコシ幼葉鞘先端部におけるインドール酢酸合成細胞の特定

オーキシン(IAA)は植物の全生活環を通して極めて重要な植物ホルモンであり、植物におけるメリステムの形成・構築機構においても位置情報因子として働いている。申請者等はこれまでに、IAAはトウモロコシ幼葉鞘先端部でTrpから合成され、合成されたIAAは速やかにZmPINを介して下方に輸送されることを明らかにしてきた。本年度は、AtPIN1抗体を用いてZmPIN1(s)の幼葉鞘における分布の詳細を明らかにするとともに、NPAによる輸送阻害、あるいは重力刺激後の先端から下方へのIAAの流れを詳細に観察した。先端から下方への移動は、NPAの先端局所的処理によりほぼ完全に阻害され、同時に屈曲が強く抑制された。さらに、幼葉鞘の伸長部で発現するIAA誘導性遺伝子ZmSAUR2は、内生IAAの動的な分布変化にほぼ対応した発現を示した。すなわち、重力刺激後およそ30分で上側での発現は大きく減少し、下側では増加した。また、オーキシン受容体TIR1の特異的阻害剤(PEO-IAA)を処理すると、ZmSAUR2発現が抑え照れ、同時に屈曲も停止した。これらの結果は、先端で作られIAAはZmPIN1により下方に輸送され、IAAの濃度差に対応したオーキシンF-Box受容体依存遺伝子の発現制御が伸長帯で行われ、重力刺激後の上下側での細胞伸長に差が生じることにより屈曲が起こることを示すものである。
内因性カンナビノイドとプロスタグランディン転換代謝物測定法開発とその生理的意義

臨床試料における内因性カンナビノイド(アナンダミド及び2-AG)の測定法を開発した。当初、報告されていたHPLCによる測定法を試みたが、感度その他の理由で測定不可能と断定し、新しい高感度測定法開発を目指した。結果、研究代表者が前より行っていたプロスタグランディンのガスクロマト質量分析法(GCMS)による測定法を改変・応用し、同位体希釈法を用いたGC/MS/SIM法による、アナンダミド・2-AG・F2-イソプロスタン一斉分析法を開発した。その後、高速液体クロマト質量分析装置(LCMS)が導入され、同位体希釈法を用いたLC/MS/MS法による内因性カンナビノイド一斉分析法を開発し、現在に至っている。両測定法を駆使し、臨床試料を測ることで、多くの臨床研究者と共同研究を行った。代表的なものは、「Sepsisに対するPMX-DHPの治療効果検討研究会」への参加で、研究代表者小幡は、全国21施設の参加する多施設臨床研究において、内因性カンナビノイド測定を全て行い、2004.2-2005.3までに38症例、52施行例、約400本の臨床試料を測定し、結果を検討に供した。また他に全国15の大学及び研究施設から共同研究の形で測定を依頼され、様々な動物種・臨床試料について測定を行った。一方、測定法開発という本来の研究の残り半分である内因性カンナビノイドのプロスタグランディン転換代謝物測定法については、標品を入手して、LCMSによる測定法開発を試みた。現在までに、実験レベルにおいては血液中の測定が可能となってきたが、適正な内部標準がないため、臨床試料のルーチン測定まで至っていないのが実情である。現在、重水素標識内部標準を磁力で合成するため、準備している。またプロスタグランディン転換代謝物を測定し、臨床的に追跡する意義を明らかにするため、ウサギを用いた実験的敗血症モデルを作成し、内因性カンナビノイドの効果を検討した。その中で、転換を阻害する物質を入れることで、モデル動物の敗血症ショック様症状が緩和される実験結果を得て、報告書を投稿準備中である。既にガスクロマト質量分析法(GC/MS/SIM)を用いて内因性カンナビノイドの一斉分析法を確立していたが、ルーチンに多数の臨床試料を迅速処理できるよう、高速液クロ質量分析法(LC/MS/MS)による分析法を検討し、GC/MS/SIM法に替わりうる測定システムを確立した(投稿中)。現在は、それらを用いて臨床試料での内因性カンナビノイドの定量を行い、臨床指標としての可否を検討している。そのうち、敗血症における血液浄化カラムの効果について、実際の試料での検討を行い、カラムによって血中の内因性カンナビノイド(特に2-AG)が除去出来ること、またその結果、臨床症状の改善につながる血液浄化が、2-AGの除去による可能性を示唆する結果を得た。ウサギを用いた実験で、内因性カンナビノイドを打つことで、血圧の低下を起こすこと、またLPS同時投与で実験的な敗血症ショックを起こせることを確認した。この実験で、プロスタグランディン転換酵素の阻害剤をあらかじめ投与しておくと、ショックの程度が緩和されることを見いだした。このことは、内因性カンナビノイドがプロスタグランディン類似化合物に転換し、作用している可能性を示唆するものである(投稿準備中)。