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不活性sp3炭素－水素結合の選択的切断と結合生成の為の新方法論の創出

本研究では、炭素ー水素結合の切断を伴った芳香環およびヘテロ芳香環の官能基化反応につて取り組み、適切な遷移金属触媒を用いることによりsp2炭素ー水素結合のスルフェニル化、セレニル化およびスルフォニル化反応を開発した。さらに、銅触媒を用いた不活性なsp3炭素ー水素結合の分子内アミノ化反応によるインドリン合成手法を開発した。配位性官能基に依存しない新奇な炭素ー水素結合の切断反応を可能とする新規錯体触媒の開発研究に取り組み、超分子相互作用により基質を位置固定することが可能なシクロデキストリン連結ロジウム錯体を開発した。炭素ー水素結合の切断を経る官能基化反応は近年大きく発展しているが、主な検討対象は炭素ー炭素結合形成反応であり、分子の官能基化の観点から必要不可欠なヘテロ原子団の導入を実現する炭素ー水素結合官能基化反応の創出が必要不可欠である。そこで、研究開始にあたっては、sp3炭素ー水素結合よりも難易度の低いsp2炭素ー水素結合の切断を経るヘテロ原子団導入反応の開発から着手した。触媒探索の結果、パラジウム触媒を用い、配位性官能基としてピリジンおよびピリミジンを利用することにより、アレーンおよびヘテロアレーンの炭素ー水素結合の選択的切断を伴ったスルフェニル化およびセレニル化反応が進行することを明らかにした。本反応では、入手容易なジスルフィドおよびジセレニドを官能基化試薬として利用可能である。さらに、元素戦略の観点から更なる触媒探索を推進した結果、安価なニッケルおよび銅触媒により、類似の反応が進行することを明らかにした。これらの研究成果をもとに、より難易度の高いsp3炭素ー水素結合の切断を伴う官能基化反応を検討した結果、配向基を利用する事により銅触媒によるsp3炭素のスルフェニル化反応が銅触媒により円滑に進行することを見出した。萌芽的研究の趣旨から、配向基を活用する従来型の手法を超えた新規な方法論の創出を目指した研究を開始した。超分子認識による基質の固定化と位置選択的な炭素ー水素結合の切断は、基質の自由度の観点から配位性官能基を利用する手法に比べて大きな優位性があることから、アルカン包接能を有する環状オリゴ糖であるシクロデキストリンに金属触媒への配位部位を導入した配位子の合成を行った。比較的過酷な反応条件を必要とする炭素ー水素結合官能基化反応へと利用する為に、配位部位として含窒素複素環カルベンおよびシクロペンタジエニル配位子を選択し、その合成とロジウムとの錯体合成を行った。前年度には、配位性官能基としてピリジン、ピリミジン、アミドを利用することにより、アレーンおよびヘテロアレーンの炭素ー水素結合の選択的切断を伴ったスルフェニル化およびセレニル化反応がパラジウム、ニッケルおよび銅を触媒として用いることにより進行することを明らかにした。これらの成果をもとに、本年度は、より難易度の高いsp3炭素ー水素結合の官能基化反応に取り組んだ。その結果、銅触媒を用いることにより、オルト位にアルキル基を有するアセトアニリドのsp3炭素ー水素結合の切断を伴った分子内閉環反応が進行し、インドリン誘導体が得られることを見出した。本反応では、オルト位のアルキル基のsp3炭素ー水素結合が選択的に切断されることよりアミド基が配向基として機能しているものと考えられる。本触媒系では、ビアリール骨格を有する基質を用いた場合においても、近傍に存在するsp2炭素ー水素結合の切断に由来するカルバゾールはまったく生成せず、sp3炭素上の炭素ー水素結合が選択的に切断され官能基化される。この結果は、一般にsp2炭素ー水素結合の切断が有利なパラジウム触媒系と本銅触媒系が相補的な関係にあることを示すものである。加えて、超分子認識による基質の固定化と位置選択的な炭素ー水素結合の切断を実現する新規触媒系の創出を目指した。分子認識部位として環状オリゴ糖であるシクロデキストリンを選択し、これを部分構造として含む配位子を合成すると共に、遷移金属の錯化を行った。その中で、ロジウム錯体を触媒として用いることにより、sp2炭素ー水素結合の切断を伴った分子間環化反応が進行することを明らかにした。上記のように、当初目的の配位性官能基を足掛かりとするsp3炭素ー水素結合の官能基化反応の開発ならびに超分子認識能を有する錯体触媒を用いた炭素ー水素結合の官能基化反応の開発に向けての重要な基礎的知見を得た。当初計画に従い研究を推進した結果、パラジウム、ニッケルおよび銅触媒による炭素ー水素結合の切断を伴った高周期酸素族官能基の導入反応の開発に成功した。これらの触媒系は容易に入手可能なジスルフィドおよびジセレニドを利用することが可能である。また、ニッケル触媒系ではジスルフィドが酸化剤としての役割を担うことから、一般的な炭素ー水素結合の切断反応で必須の金属酸化剤を加える必要が無いことも今回見出した反応の特徴であると言える。

さらに、高難易度のsp3炭素ー水素結合のスルフェニル化反応についても銅触媒系を利用可能であることを明らかにした。これらの触媒系を利用する事により、アリールチオ基およびアリールセレノ基を有する芳香族化合物の簡便な合成が可能になり、電子的、光学的に優れた機能を有する共役系分子の開発に貢献できると期待される。超分子認識能を有する配位子を新たに設計・合成しその錯形成挙動を明らかにした。これらの配位子系は遷移金属と炭素ー水素結合の切断に必要な高温条件に耐え得る強固な配位結合を形成可能である。超分子機能を有する基質としては、天然にも存在し、毒性の無いシクロデキルトリンを利用し、その包接作用を活用する事により、安全で汎用性の高い触媒反応系の構築につながると期待される。既に、金属に対して高い配位能を有する官能基をシクロデキストリンに結合させることに成功しており、研究は着実に進んでいる。上記のように、当初目的の配位性官能基を足掛かりとするsp3炭素ー水素結合の官能基化反応の開発は順調に進展しており、また、超分子認識能を有する錯体触媒の合成も十分な進展が見られた。有機合成化学本研究は、sp3炭素ー水素結合の官能基化に焦点を当て、遷移金属錯体を利用することにより炭素ー水素結合を選択的かつ効率的に切断する新しい手法を開発し、これを既に大きく発展しつつある遷移金属触媒反応に結びつける事により、炭化水素を基質とする直截的次世代型分子変換手法を開発する事を目指している。上記の如く、初年度には配向基を活用するsp3炭素ー水素結合の切断反応系の開発や、超分子機能を有する配位子の合成など、目標達成に向けて着実に成果が得られた。そこで、平成27年度には配位性官能基を利用したsp3炭素ー水素結合の切断を経る官能基化反応を継続して推進する。近年、sp3炭素ー水素結合の切断反応に関する報告例は増加しているものの、ヘテロ原子団の導入反応に関しては今なお反応形式は限られている。そこで、酸素族原子団の導入を中心にsp3炭素ー水素結合の官能基化について更なる検討を行う。また、平成26年度に開発した超分子認識能を有する錯体触媒によるsp3炭素ー水素結合の位置選択的官能基化反応についても検討を行う。超分子機能を有する官能基としては、シクロデキルトリンの他にオリゴチオフェンやカリックスアレーン等の環状構造を有する新規化合物の合成も試みる。また、配位部位の構造としては、Nーヘテロサイクリックカルベンやシクロペンタジエニル基のような、πー共役系分子を活用する。触媒として利用する金属としては、第1周期の遷移金属の応用の可能性を検討する。当初本研究の一部を担当する予定であった外国人研究員が急遽本国でのポスト取得に伴い帰国することとなった。そのため、実験担当者の選定作業に数ヶ月を要したため、当初検討予定であった脱水素反応を利用するsp3炭素ー水素結合の官能基化反応を含めて一部の研究を次年度に実施することとした。配位性官能基を利用するsp3炭素ー水素結合の官能基化および超分子認識能を有する錯体触媒によるsp3炭素ー水素結合の位置選択的官能基化反応について十分な進展が望めることから、上記二つの課題について研究資源を集中し、更なる発展を目指す。
環太平洋地域における鰭竜類(爬虫類双弓類)の進化

本研究では環太平洋地域における鰭竜類の進化に関する既存の仮説の検証などを通して、系統進化と絶滅パターンの解明を目指した。具体的には、標本の記載や再記載などを通じて分類学と生層序学的な分布についてのデータを集め、古生物地理の観点からもデータの分析を行った。本年度は研究の三年計画の2年目(研究代表者の身分変更のため、最終年度となる)にあたり、昨年度の研究活動で得られたデータの整理と解析などを進めて出版や学会発表を行った。また、更に新しい標本についての情報を中国とカナダで集めた。具体的な内容は以下のようにまとめられる。1.カナダ自然博物館において、同国北極圏のジュラ系及び白亜系の首長竜化石標本の記載や層序に関するデータのコンパイル、環太平洋地域との生層序学及び生物地理的な比較を行った。中生代の高緯度地域に生息した海生爬虫類として、ここまで詳細なデータが公表できるようになったのは初めてのことである。研究内容の一部は日本古生物学会のシンポジウムにて学会発表され、新属新種を記載する論文が現在印刷中である。2.中国の国立自然科学博物館(台湾)、古脊椎動物古人類学研究所(北京)、淅江自然博物館(杭州)において、中国南西部三畳系から多産する海生爬虫類のうち、鰭竜類ピストサウルス類及びタラットサウルス類の記載的研究及び系統解析を行った。タラットサウルス類の新種の記載論文が出版され、鰭竜類の研究も現在論文を執筆中であり、国際学会における発表を予定している。本研究では環太平洋地域における鰭竜類の進化に関する既存の仮説の検証などを通して,系統進化・絶滅のパターンの解明を目指している。1.本年度は研究の3年計画の初年度にあたることから,今後の研究活動でデータの整理・解析や出版物・学会発表などの準備を効率的に行えるように,携帯用パソコンとソフトウェア,地質調査用のGPSを購入した.2.以下の地域で野外調査を行い、これまでに報告された化石の産出層準を確認した。また、鹿児島県では追加標本を採取した。福島県いわき市(上部白亜系双葉層群)鹿児島県出水市獅子島(上部白亜系御所浦層群)3.以下の研究機関で関連する標本の観察を行い、解剖学的なデータと最新の情報収集につとめた。いわき市石炭化石館鹿児島大学理学部ドイツ国カールスルーエ州立博物館ドイツ国シュツッツガルト州立博物館フランス国ミヨー町立博物館カナダ国カナダ自然博物館カナダ国マニトバ州博物館4.以下の学会やシンポジウムへの参加や発表を通じて,関連する分野・地域の研究者と積極的に連絡を取りあって最先端の情報を入手した。Society of Vertebrate Paleontology(カナダ・オタワ)本研究では環太平洋地域における鰭竜類の進化に関する既存の仮説の検証などを通して、系統進化と絶滅パターンの解明を目指した。
インド・チベット仏教の二諦説と修道論-中観仏教思想史の解明-

二諦説,三性説及び修道論(1)凡夫の常識としての世俗のみならず(2)ヨーガ行者が止観の修習を通じ判定する世俗とがあることは、整合性(avisamvadaka)を有することに関しても段階を設けていることからも知られる。すなわち、凡夫の直接知覚は常識に関して、声聞などのヨーガ行者のそれは、人無我だけに関して、ブッダの直接知覚こそが、あらゆる真理と勝義に整合している。また(1)、(2)それぞれにも・実・邪世俗が設けられているものと考えられる。特に(1)に関しては、中観派内にあっても相違が見られる。つまり、世俗としても、依他起性二事物(vastu)を承認するか否かということにより、スヴァータントリカとプラーサンギカとに分化すると言ってよい。すなわち、BhavarivekaやJnanagarbhaをはじめとする後期中観派は、それを承認し、他方Candrakirtiは世俗としても依他起性二事物を承認しない。この点の相違をTson khapaは、依他起性二事物二自相(svalaksana)の有無という点に求めていることが知られる。この自相を観点としてTson khapaは、言葉(sabda)名称(naman)と三性説及び二諦説を焦点に唯識思想と中観思想を検証し、それらの思惟方法の相違のみならず、中観派内のプラーサンギカとスヴァータントリカとの相違をも指摘している。また後期中観派は(2)ヨーガ行者の世俗と位置付ける段階に、諸学説の吟味検証を当てている。特に唯心世俗説が、ヨーガ行者にとって判定される世俗である点は重要である。この段階が煖、頂、忍、世第一法位という修道論の構造を形成している。しかしこの学説の吟味検証を内容とする修道論はTson khapaにより批判される。すなわち彼によれば、その修習法は、輪廻の根本である生来の無明の克服に資するものではなく、学説論者の遍計の無明の排除を主眼としているにすぎないのである。彼が、Candrakirti系のプラーサンギカであるということは、有身見の克服を目指す修道論の設定にある。インド中観仏教の勝義,世俗の二諦説を探究する主なる資料としてはKamalasila(c.740-797)の『中観光明論』である。二諦説のうち世俗を実,邪世俗に区分する。その峻別の基準はDharmakirti(c.600-660)のプラマーナ論、直接知覚論を活用して設定される。これはJnanagarbha(c.700-760),Santaraksita(c.725-786)を継承するものである。勝義に関しては,paramarthaの意味をKarmadharaya,Bahuvrihiの文法的観点から解釈し,前二者を真実,真如を特徴とする勝義,第三のものを,智を本体とする「道」としての勝義とする。これは,Vasubandhuの解釈法を踏襲するものであり,また中期中観派のBharariveka(c.500-570)の影響を受けるものである。以上の点を明らかにし得ている。

チベット仏教の二諦説を究明する資料としてはTson kha pa(1357-1419)の『菩提道次第論』(Lam rim chun ba)観(vipasyana)の章を中心としている。そのチベット語テクスト校定を,さらなる綿密な校定を必要とするが,A4版65枚に収めている。またその訳出も,ほぼ全体のものを終えているが,なお正確な解読を必要とする。インド仏教との関係という点での問駿点は,Candrakirti(C.600-650)を正統的な中観思想として継承するTson kha paはKamalasilaの著述をも引用し,二諦説を論じるが,そこには解釈の相違が存在する。その主なる点は,二諦説(世俗と勝義)を凡夫と聖者の知識領域の問題として扱うか,あるいは,修習次第という凡夫と聖者の階梯の問題として捕えるかという点に表われていると言えよう。この点は「観」の修習が,二諦説とどう関係するのかを克明にする必要がある。それにはLam rim chunbaに示される二諦説の分析と引用されるKamalasilaの『修習次第』の意義を十分に理解する必要がある。二諦説と三性説中観派と唯識派との論争及び思推方法の相違は、二諦説と三性説、換言すれば「空」に対する解釈の相違となって現れている。その問題点を以下の点から検証した。I.唯識派の〈実在(vastu)における言葉の空〉の見地、それに対し後期中観派は、言葉のみならず言葉を離れた事物自体(vastum〓tra)をも世俗と位置付け、空と見る。II.唯識派の〈依他起性における遍計所執性の空〉の見解、それに対し中観派の遍計所執性を邪世俗、依他起性を実世俗とし、両者とも勝義としては空と見る見地。実世俗の基準は、明瞭な顕現を有し、無分別であり、かつ因果効力(arghakriy〓-samartha)に関して整合性を有することである。(二依他起性)邪世俗とは、逆に分別に基づき、因果効力に関して整合性を有さないもの(=遍計所執性)である。この実、邪世俗の設定はJ〓〓nagarbhaの『二諦論』8,12偈、〓〓ntaraksitaの『史観荘厳論』64偈などに見られる【.encircled1.】凡夫の常識としての“世俗"である。他方、【.encircled1.】ヨーガ行者が止観の修習による吟味検証を通じ判定する“世俗"である。これは『中観荘厳論』91偈やKamala〓ilaの修習次第に見られるものである。これにも実・邪世俗が設けられると考えられる。【.encircled1.】の凡夫の世俗(実・邪)と【.encircled2.】の唯心世俗説はレヴェルの異なる世俗である。
卵巣機能におけるG-CSF、IL-6などサイトカインの作用解明と臨床応用について

卵巣機能における各種サイトカイン、特にG-CSFとIL-6の作用を以下のように解明した。1)卵巣周期における各サイトカインの動態の解明排卵に関係があると既に報告されているTNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF、M-CSFとG-CSFの卵巣周期における血清中濃度変動を検討し、排卵前期のG-CSFが他の時期に比べて唯一有意な高値を示すことを明らかにした。また、IL-6については統計学的有意差を認めなかったものの、黄体後期に上昇する傾向を示した。2)卵巣局所でのIL-6の変動と黄体退行との関連に関する研究ヒト退行期黄体でIL-6mRNAの発現が有意に増強し、かつIL-6蛋白やレセプター発現を証明し、黄体退行機序におけるIL-6の関連を強く示唆した。この結果は黄体機能異常に基づく不妊・不育症などを中心とした様々な病態の原因究明・治療に寄与するものと考えている。排卵障害のうち卵胞壁破綻機構の障害が主因であると考えられる黄体化未破裂卵胞(Luteinized Unruptured Follicle:LUF)患者を対象としてインフォームド・コンセントを得た後、以下の臨床試験を実施した。b)投与25日後に経腟超音波検査での卵胞の消失の有無で確実に排卵が行われたか、もしくはLUFであったかを確認した。その結果、本対象症例では62周期中54周期(87.1%)で排卵を認め、G-CSFによるLUF治療効果が確認された。少子化対策のひとつである不妊症治療の分野で高額な生殖補助技術(ART)を用いることなく、より安価な方法で妊娠を成功に導く方法を確立した。卵巣機能における各種サイトカイン、特にG-CSFとIL-6の作用解明について、本年度は以下のことを明らかにしえた。1)卵巣周期における各サイトカインの動態排卵に関係があると既に報告されているTNF-α、IL-1β、IL-6、GM-CSF、M-CSF、G-CSFについて、卵巣周期におけるこれらサイトカインの血清中濃度を測定した。その結果、有意な血清中の濃度変動を認めたのは、排卵前期のG-CSFが他の時期に比べて高値を示したことだけであった。これから排卵にG-CSFが深く関与することが強く推察された。また、IL-6については統計学的有意差を認めなかったものの、黄体後期に上昇する傾向が認められ、黄体の退行機序に関与する可能性が示唆された。次に、非卵巣病変で婦人科手術を行った性成熟期の患者さんから得られた卵巣組織を用いて、上記で関連性が多少とも考えられたG-CSFとIL-6のmRNAについてReal-time quantitative RT-PCR法による検討を試みた。現在のところ排卵前期にG-CSFが他の時期の10倍近く増加することと、黄体後期にIL-6が他の時期の2倍以上増加することが判明した。上記で明らかにされた排卵とG-CSFの関係から、幸い薬剤として広く用いられているG-CSFを排卵誘発補助薬として用いるべく、その臨床試験プロトコールを作成した。また、臨床研究に協力してくれる全国の不妊専門クリニックを確保した。平成17年度の研究で各種サイトカインのうちG-CSFのみが排卵直前に有意に増加するなど、卵巣周期上明らかな変動を示したので、本年度は「G-CSFの排卵誘発補助薬としての可能性に関する臨床試験」に研究の重点を移した。昨年度に作成した臨床試験プロトコールに従い、本学ならびに関連不妊治療施設において排卵障害の一病態である黄体化未破裂卵胞(Luteineized Unruptured Follicle : LUF)既往患者を対象としてインフォームド・コンセントを得た後、以下の臨床試験を実施した。

2)投与25日後に経腔超音波検査での卵胞の消失の有無で確実に排卵が行われたか、もしくはLUFであったかを確認した。その結果、2006年のQublanらの報告によると78.6%もの再発率を認めるといわれるLUFが、本対象症例では17週期中15周期88.2%でLUFとはならず、排卵を認めた。再発率は11.8%となり、G-CSFによる有意な排卵促進効果が確認された。これらの結果によっで、G-CSFを既往排卵誘発薬に加えで投与することにより、LUF患者に排卵を誘発されることが明らかになったため、今後はさらに協力施設を追加して症例数を増加させる必要があり、本臨床試験に協力しでくれる全国の不妊専門クリニックをさらに多く確保した。平成17年度の研究で各種サイトカインのうちG-CSFのみが排卵直前に有意に増加するなど、卵巣周期上明らかな変動を示したので、平成18年度以降は「G-CSFの排卵誘発補助薬としての可能性に関する臨床試験」に研究の重点を移した。平成17年度に作成した臨床試験プロトコールに従い、本学ならびに関連不妊治療施設において排卵障害のうち卵胞壁破綻機構の障害が主因であると考えられる黄体化未破裂卵胞(Luteineized Unruptured Follicle: LUF)患者を対象としてインフォームド・コンセントを得た後、以下の臨床試験を実施した。2)投与25日後に経腟超音波検査での卵胞の消失の有無で確実に排卵が行われたか、もしくはLUFであったかを確認した。その結果、2006年のQublanらの報告によると78.6%もの再発率を認めるといわれるLUFが、本対象症例では88.9%でLUFとはならず、排卵を認めた。対象患者のG-CSF投与周期以前の排卵率は53.5%であり(p<0.01)、G-CSFによるLUF治療効果が確認された。これらの結果によって、G-CSFを既往排卵誘発薬に加えて投与することにより、LUF患者の治療に有用であることが明らかにされた。少子化対策のひとつである不妊症治療の分野で高額な生殖補助技術(ART)を用いることなく、より安価な方法で妊娠を成功に導く方法を確立しつつある。
リパーゼ触媒アシル化によるアントシアニン色素の高機能化

アントシアニン色素の高機能化を目指して,基質-ビニルエステルーシクロヘキサノン-リパ-ゼ系によるアシル化反応を検討した結果,基質の反応性はアルブチン,サリシン〉アスコルビン酸,グルコ-スであった。目的のアントシアニン類(フラボノイド配糖体を含む)は用いた全てのリパ-ゼで反応しなかった。今後,リパ-ゼ類に対するアントシアニン類の阻害性や特異性などを検討する必要があると考える。本課題研究は,入手容易で比較的単純な構造をもつアントシアニン(AN)基質から,芳香族有機酸(Ar)や脂肪族有機酸(Al)を複数もち,天然型相当あるいはそれ以上の,もしくは新規な機能性が期待できる非天然型のポリアシル化アントシアニン(Ar/Al-AAN)類を,酵素(リパーゼ)触媒で合成することを目的とした。そのため,平成21年度は必要な色素基質類の調製を行った。まず,市販の紫トウモロコシ色素製剤を入手し,主要成分であるC3Gを各種吸着(XAD-2000, PVP)カラムクロマトグラフィーや分取ODS-HPLCシステムなどを用いて大量単離精製・調製を行った。単離色素の酸加水分解による化学分析,フォトダイオードアレイ検出器-HPLC分析,UV-Visスペクトル測定,及びESI-TOF/MSによる分子量及びフラグメンテーション観察を行い,標準C3Gとの比較した結果,C3Gと確認できた。最終的に純度90%以上のC3Gのトリフルオロ酢酸塩が約3g得られた。同様に,市販の紫甘しょ"アヤムラサキ"より得た粗抽出色素からモノアシル化AN類のYGM-2(約0.5g)やYGM-5b(約1g)を,市販の紫シソ葉よりシソニンを約1g得ることができた。さらに,紫甘しょ粗抽出色素のアルカリ加水分解物より,ペオニジン3-ソホロシド-5-グルコシドを約0.5g得ることができた。これらの単離AN類についてもC3Gと同様の手法で構造確認できた。今後,単離できたC3Gおよび関連AN類を用い,リパーゼ酵素合成の試み,及び調製Ar/Al-AAN類の健康維持食品への応用のための各種特性を検討したい。このようなAr/Al-AAN類が大量調製できれば高度有効利用や応用分野の拡大にも貢献しうるものと期待される。平成22年度は,単離アントシアニン5種類以外の基質として,アスコルビン酸や関連配糖体(アルブチン,ナリンギン,イソクエルシトリンなど)10種類を,酵素としてLipozyme【○!R】TL 100Lなどの遊離型リパーゼ類やNovozym【○!R】435などの固定化型リパーゼ類の10種類を,有機酸基質として,遊離型(カフェ酸やパルミチン酸など)やエステル型(安息香酸メチルやケイ皮酸ビニルなど)の15種類を,反応溶媒として,n-ヘキサン,シクロヘキサノン,2-メチル-2-プロパノール,ジメチルスルホキシドなど12種類を入手した。次に,リパーゼ触媒アシル化の最適反応条件を検討した。すなわち,(単離C3G及び関連化合物)-(各種酸基質)-(各種溶媒)-(Novozym【○!R】435)を組み合わせてアシル化反応の最適条件を検討した結果,(1)酸基質としては,遊離の酸よりエステル体の反応性が高く,メチルエステルよりビニルエステル(ケイ皮酸ビニルなど)のほうが高かった。(2)溶媒としては,アルコールやケトン系は不適であったが,シクロヘキサノンのみは適していた。(3)基質としては,(ケイ皮酸ビニル)-(シクロヘキサノン)-(Novozym【○!R】435)系で検討した結果,反応性はアルブチン,サリシン>アスコルビン酸,D-グルコース>C3Gであった。このように,本反応系ではモノフェノールモノグリコシドであるアルブチンやサリシンが最も反応性が高く,次に単純な構造のアスコルビン酸やD-グルコースで,フラボノイド配糖体では(C3G以外は)未反応であるなどの構造-反応性相関が見られた。結果的に,目的のC3Gは反応性が低くアシル体の調製まで至らなかったので,次年度は酵素の種類を広げるなど最適条件を更に検索し,C3G及び他のアントシアニンのアシル体を調製したい。平成22年度のリバーゼ触媒アシル化の研究結果では,アルコール基質-ビニルエステル-Novozym[○!R]435-シクロヘキサノンが最適な反応の組み合わせと判明したものの,シアニジン3-グルコシド(C3G)を含むフラボノイド配糖体類はほとんど反応しなかった。1.酵素検討;そこで,C3G-ケイ皮ビニル(vCn)/オクタン酸ビニル(vOct)-シクロヘキサノンの組合せ反応系で,Novozym[○!R]435以外の各種リバーゼによる反応を検討したが,用いた5種の酵素はいずれも反応しなかった。

2.最適反応系で反応性が高かった基質アルブチンとサリシンおよびvCnとvOctを用いて大スケールでのアシル化を行った。単離はHPLC分取を用いれば比較的容易であった。また,単離物の分子量測定の結果,いずれも目的のモノアシル化体であった。3.アントシアニン(AN)類の化学的アシル化法(1)C3Gと酸クロリドを反応させた結果,脂肪族酸クロリド類のみに速やかな反応が起こった。(2)5種類の脂肪族酸クロリド類を用いて,大スケールで反応させ,HPLC分取後,NMRによる構造解析の結果,脂肪酸アシル化C3G体はいずれも脂肪酸1分子がC3Gのグルコースの6-位OH基にアシル化したモノアシル化体であった。以上の検討より,アルコール基質に最適の反応系において,他のリバーゼ類を用いた場合でも,C3Gを含むフラボノイド配糖体は反応性が悪く,結果的に目的のC3Gのアシル体の調製まで至らなかった。一方で,C3GなどのAN類は化学的に脂肪酸-アシル化されたことにより,原理的にAN類のアシル化は可能であることが示された。今後,(1)基質の構造的な違いによる酵素特異性の差,(2)AN(フラボノイド)類によるリパーゼ阻害の有無などを追求する必要があると考えられた。
癌の発生とその治療困難性における癌幹細胞の遺伝学的解明

背景と目的;大腸発癌は多因子疾患でありこのために治療困難性が生じる。特に大腸癌は多因子疾患であり、遺伝子多型であらわされる遺伝的背景と疫学因子との交互作用が重要である。対象と方法;われわれは1511例の大腸癌症例と2098例の対照症例とにおいてGWAS研究および既知の遺伝子多型における発癌関連リスクを確認した。さらに多型を調べた症例については疫学因子との関係を(年齢および地域補正の後)調べた。結果と考察:8q24遺伝子多型(rs6983267OR=1.16(1.06-1.27),p=0.0015).が大腸発癌関連多型であることを明らかにしえた。また、Meta GP解析の結果、non-risk allele症例群において、有意に発現する遺伝子pathwayを同定し、糖代謝関連遺伝子群が有意に相関することを明らかにした。さらに大腸癌進展に関する遺伝子群を同定し、その機能を明らかにした。特にp53を制御するPICT1遺伝子が発癌関連多型19q13の近傍に存在し、大腸癌の予後予測因子となることを明らかにした。本研究の最終目的は癌の多様性(heterogeneity)をもたらす遺伝子群とこれを調節する遺伝子群とを明らかにして、それがどの様な連鎖(過程)を介して連携するか所謂pathwayを明らかにすることにある。まず第一に特に癌幹細胞については、細胞の多様性の起源となる細胞であり、造腫瘍能はもちろんのこと治療抵坑性あるいは転移再発とも関連することが報告されつつある(Ishii et al. Cancer Sci2008)。従って、われわれは固形癌における幹細胞様性質を有する細胞マーカーの検索を行い、大腸癌においてはCD133^+CD44^+分画のみが造腫瘍能を有する分画であることを明らかにした(Haraguchi et al. Ann Surg Oncol2008)。肝臓癌ではGO期にあるpyroninY染色により細胞集団を同定分離した(Kamohara et al. Surgery2008)。次に癌細胞が多様性を示し治療抵抗性を示す上で上皮一間葉移行(epithelial mesenchymal transition;EMT)が重要な性質と考えられている。EMTを誘導する蛋白としてTGFbetaが知られるが、そのfamilyのひとつとしてActivinについて注目し食道癌の悪性度を規定する因子として重要であることを示した(Yoshinaga Ann Surg Oncol2008),逆にMETをきたす因子としてBMP7が知られるが、大腸癌におけるBMP7の発現意義を明らかにした(Motoyama K. Ann Surg Oncol2008)。また、ごく最近われわれは大腸癌細胞特異的に発現する某遺伝子を同定し、その形質導入によりEMTを誘導し、内因性に発現する株のKDによりMETを来すことを明らかにした。同遺伝子は免疫染色により直腸癌のtumor buddingに一致して描出されることも示した。さらに同遺伝子導入株はCD133発現細胞のみ造腫瘍能を有することから、「癌幹細胞様の性質を有するEMT誘導遺伝子」として現在論文投稿中である。この他にも癌の多様性を示す原因として宿主側の因子(すなわち間質の反応)にも着目している。大腸癌癌細胞に隣接する間質細胞および癌細胞をそれぞれLMD法を用いて採取し、それぞれRNAを抽出しマイクロアレイを行った,その結果、癌間質特異的に発現する遺伝子群の変異率は、健常組織間質に比べて高く、間質における反応の違いも癌の多様性を決定する上で重要であることを示した(論文投稿中)。【1】癌幹細胞からのアプローチ癌幹細胞における治療抵抗性、難治性機構の解明のために、まず正常幹細胞の培養を試みた。Ootaniらはマウス腸管培養を行い、Lgr5+マウス腸管幹細胞は筋線維細胞などのnicheが存在しなくてもin vitroで増殖可能であることを明らかとした(Ootani A,Nature 459,262,2009)。われわれはこの実験手技を踏襲し、マウス大腸粘膜の培養に成功し実験の再現性を得た。また、ヒト組織については、小腸粘膜の再生に成功した。さらに現在ヒト大腸粘膜における大腸幹細胞が同様の培養システムで培養可能なのかについて着手し、発癌付加を加え抗癌剤の耐性実験を行う。

【2】EMTからのアプローチ癌細胞の転移能獲得には上皮細胞が間葉系移行する機構(EMT)が重要であるといわれている。また、EMTを来した癌細胞は幹細胞様性質を有することが報告されており、その臨床的意義が注目されている。ごく最近われわれは、EMTを誘導する分子(iEMT)を同定した。治療標的分子としての意義を明らかにするために、iEMT抑制作用により、METへの回帰とEMTによる抗癌剤耐性を示した大腸癌株化細胞の治療感受性の回復を確認し、治療標的分子としての意義を確認した。【3】宿主側因子からのアプローチ癌進展における癌間質関連因子が注目されている。本研究では癌間質細胞特異的に癌進展において重要な役割を担う遺伝子を包括的解析を用いて明らかにする。特にmicroRNAの注目して解析を行った結果、癌間質において特異的に発現するmicroRNAを同定した。今年度のpreliminaryな解析の結果、癌細胞と同等のmiR発現変異を認め、癌細胞とほぼ同等の変異を来すことが明らかとなった。癌の多様性は根治性を妨げるものであり、「原発巣におけるheterogeneity」、「転移・再発」そして「治療抵抗性」が多様性を形成している。これらの原因として癌幹細胞の存在が知られ、癌幹細胞を正確に捉え制圧することが、癌の根治を実現する上で極めて重要である。われわれは平成21年度から22年度まで3年間助成をいただき、癌幹細胞を検出し制圧するための様々なアプローチを行い成果を上げた。初年度はLaser microdissection(LMD)を用いて発現profileを明らかにし、H21年度は癌転移において重要な役割を担う上皮間葉移行(EMT)を制御する遺伝子を同定した。本年度は特に大腸癌と肝臓癌における癌幹細胞マーカーの同定において成果を上げた。まず、大腸癌幹細胞は造血幹細胞、神経幹細胞のマーカーとして知られるCD133が発現することが知られている。われわれは大腸癌細胞株においてCD133+細胞がCD133-細胞に比較して高い腫瘍形成能を有することを明らかにした。さらに、CD133のみならずCD44+細胞において造腫瘍能を示すことを明らかにした。一方、肝臓癌の幹細胞マーカーとしてわれわれは、CD13発現細胞がGO期にあり、造腫瘍能を有することを明らかにした。また、CD13陽性細胞では化学/放射線による活性酸素(reactive oxygen species : ROS)誘導によるゲノムDNA損傷に対して、アポトーシスから回避させること示した。また、CD13抑制により肝癌細胞は自己複製能および造腫瘍能を喪失することを明らかにした(J. Clin Invest 2010)。癌幹細胞を標的として治療戦略は難治性の進行癌克服のための非常に有望と考えられている。しかし正常幹細胞と癌幹細胞は多くの共通点があり単純な幹細胞シグナルの阻害のみでは癌幹細胞を特異的に標的とする治療とならず副作用の問題が生じる。今後は癌幹細胞特異的な分子の同定、またそれを治療標的するためのさらなる研究が必要とされる。
情報工学的方法による酸化物触媒の構造活性相関

本研究では情報化学的方法と実験化学的な触媒研究を融合して高機能触媒を論理的かつ効率的に設計する方法論の確立を目的とした。個体触媒の構造と活性の相関を例として取り上げ、(1)実験事実から構造活性相関などの知識情報の抽出、(2)構造活性相関を中心とする触媒知識情報ベースの概念構築、(3)実験化学との融合による触媒設計システムの概念設計、について分子論的なレベルでの触媒構造と触媒作用の相関性の解明を行った。分子レベルで構造を制御した触媒の設計、活性中心近傍の局所構造を解析するためのキャラクタリゼーションの開発、表面反応機構解明のためのin-situ測定法の開発、ミクロ細孔反応場における分子拡散の効果の検討を行うことにより、分子レベルでの触媒作用の理解を深め、より普遍性を持った構造活性相関の一般則をいくつかの触媒反応系で解明した。これらの検討は、(1)知識情報ベース設計の基礎的データ収集、(2)ニューラルネットへの適用を目指した触媒活性支配因子の抽出、(3)最終システムでの実験化学的な方法論の確立を狙ったものである。また、情報システム側の問題としては、実験化学的に整理された結果を情報処理するだけでは予測の精度に限界があり、特に、化学的な新発見とも言うべき特異点の予測が不可能であった。そこで、以下の触媒反応系における課題において情報処理に適した形に実験結果を整理することを試みた。1.貴金属触媒上での燃焼反応における担体効果2.NO選択還元酸化物触媒における反応機構の解明3.NO選択還元ゼオライト触媒におけるミクロ細孔拡散4.酸化物上でのN_2O分解反応における活性制御因子5.実験結果と情報処理システムの融合これらの課題において本研究では分光学的なキャラクタリゼーションを中心とした酸化物触媒の構造解析および各種触媒反応における構造活性相関の解明を行い、実験化学との融合による触媒設計システムの概念設計と触媒知識情報ベースのあり方を検討するための基礎的データを収集することができた。また、ニューラルネットの情報処理システムの見直しにより、新規触媒創出型システム構築の可能性を示した。本研究では、情報化学的方法と実験化学的な触媒研究の融合による高機能触媒の論理的かつ効率的な設計法の確立を目指して、種々の酸化物触媒の構造と活性の相関に関する検討を行った。本年度実施した個々の触媒系における検討結果について、以下に要約を示す。(a)メソポーラスシリカ系触媒上での炭化水素のクラッキング反応における活性サイトについて検討した。通常のゼオライト等の酸型触媒とは異なる、ラジカルサイトが存在することを見いだした。(b)貴金属触媒上での炭化水素の燃焼反応において、担体の酸強度が触媒活性に著しく影響することを明らかにした。また、本触媒系においては担持貴金属の酸化状態が活性の制御因子であることをXANESスペクトルにより明らかにした。(c)アルミナ系触媒上でのNO選択還元反応を例として、in-situ FT/IR法が表面反応機構解明に有効な手法であることを示した。反応条件下におけるアルミナ表面にはナイトレーと種とアセテート種が共存し、これら表面種同士の反応により窒素への選択還元が進行することが見いだされた。

また触媒の活性選択性制御の方策を立てる上で、反応機構解析が有効であることを示した。(d)酸化カルシウム上でのN_2O分解反応が構造敏感反応であることを明らかにした。以上のように本年度は分光学的なキャラクタリゼーションを中心とした酸化物触媒の構造解析および各種触媒反応における構造活性相関の解明を行い、実験化学との融合による触媒設計システムの概念設計と触媒知識情報ベースのあり方を検討するための基礎的データを収集することができた。本研究では情報化学的方法と実験化学的な触媒研究を融合して高機能触媒を論理的かつ効率的に設計する方法論の確立を目的とした。固体触媒の構造と活性の相関を例として取り上げ、(1)実験事実から構造活性相関などの知識情報の抽出、(2)構造活性相関を中心とする触媒知識情報ベースの概念構築、(3)実験化学との融合による触媒設計システムの概念設計、について分子論的なレベルでの触媒構造と触媒作用の相関性の解明を行った。分子レベルで構造を制御した触媒の設計、活性中心近傍の局所構造を解析するためのキャラクタリゼーションの開発、表面反応機構解明のためのin-situ測定法の開発、ミクロ細孔反応場における分子拡散の効果の検討を行うことにより、分子レベルでの触媒作用の理解を深め、より普遍性を持った構造活性相関の一般則をいくつかの触媒反応系で解明した。これらの検討は、(1)知識情報ベース設計の基礎的データ収集、(2)ニューラルネットへの適用を目指した触媒活性支配因子の抽出、(3)最終システムでの実験化学的な方法論の確立を狙ったものである。また、情報システム側の問題としては、実験化学的に整理された結果を情報処理するだけでは予測の精度に限界があり、特に、化学的な新発見とも言うべき特異点の予測が不可能であった。そこで、以下の触媒反応系における課題において情報処理に適した形に実験結果を整理することを試みた。1.貴金属触媒上での燃焼反応における担体効果2.NO選択還元酸化物触媒における反応機構の解明3.NO選択還元ゼオライト触媒におけるミクロ細孔拡散4.酸化物上でのN_2O分解反応における活性制御因子5.実験結果と情報処理システムの融合これらの課題において本研究では分光学的なキャラクタリゼーションを中心とした酸化物触媒の構造解析および各種触媒反応における構造活性相関の解明を行い、実験化学との融合による触媒設計システムの概念設計と触媒知識情報ベースのあり方を検討するための基礎的データを収集することができた。また、ニューラルネットの情報処理システムの見直しにより、新規触媒創出型システム構築の可能性を示した。
高温高圧下における有機物PAHの安定性とその惑星科学的適用の研究

本研究においては、星間空間や炭素質コンドライトのなかの有機物として認められるケロジェンおよび有機物PAHであるコロネンの高温高圧下における安定性を明らかにした。コロネンの安定領域はダイヤモンドアンビルおよびマルチアンビルを用いて、2-6Gpaの条件で1000Cまでの高温で明らかにした。その結果、6Gpaで数100Cの条件で回収した試料の質量分析計による測定によって、この試料中では、コロネンの二量体であるジコロニレン、三量体などの重合体が生成することを明らかにした。この多量体のラマンスペクトルと赤外吸収スペクトルの測定を行い、振動のモードを同定することができた。この実験結果は、宇宙塵や彗星などに含まれるコロネンは木星や土星の衛星の内部の温度圧力条件で重合してジコロニレンなどの多量体が安定に存在する可能性があることを明らかにした。さらに、上記の有機物とともに、揮発性の物質の代表として、硫化マグネシウムと水の系のそう関係を、ダイヤモンドアンビルを用いて明らかにした。この系の溶融関係を約2Gpaまでの圧力で明らかにした。その結果を用いてエウロパやガニメデなどの氷衛星の内部状態を推定した。宇宙空間の有機物としてPAHと炭素質コンドライト中の有機物の安定条件や存在環境を調べることは太陽系形成前後の炭素質物質の挙動のみでなく,惑星形成のメカニズムに関しても重要な情報を提供する.ここでは,PAHの一種であるコロネンと,炭素質コンドライトに存在する有機物のモデル物質としてケロジェンの,温度圧力に対する安定性を実験的に明らかにした.コロネンは針状の(500μm)固体結晶の試薬を使用した.ケロジェンは宮城県亘理郡亘理町鳥の海で採取してきた干潟の土から抽出したものを使用した.これらの試料をクランプタイプのダイヤモンドアンビルセルに封入し,外熱法によって加熱することによって,これらの物質の安定領域を明らかにした.コロネンについては,今回の赤外吸収スペクトルによる観察では,Yamamoto et al.(1994)によって報告されている2GPaの構造相転移に対応するような顕著なスペクトルの変化は観察されなかった.また,26GPaの領域においても,ピーク位置がジャンプするような目立った変化は見られず,高圧下での吸収ピークは6GPaまで直線的に高波数側へシフトするのみであった.ケロジェンは常圧で,200°C以上で熱分解して,炭化水素を放出することが知られている(森田,1998;武田,1986),この熱分解の特徴と1.5GPa,250°Cの回収試料の赤外吸収スペクトルの変化がよく一致することから,1.5GPaの高圧下においてもケロジェンは250°C以下で熱分解すると考えられる.今後さらにこれらの安定領域を解明するために,ダイヤモンドアンビルセルとともに,オートクレーブを用いた実験を行なう計画である.本研究においては、星間空間や炭素質コンドライトのなかの有機物として認められるケロジェンおよび有機物PAHであるコロネンの高温高圧下における安定性を明らかにした。
上皮細胞によるアレルギー疾患の誘導機序の解明

IL-33はIL-1ファミリーに属する新規サイトカインであり、肥満細胞、樹状細胞もしくはT細胞を刺激しTh2応答を増強し、アレルギー疾患の増悪に関与する。最近の研究により、その切断された成熟型のみならず全長のプレ型のIL-33にも生理活性があることが明らかにされた。したがって、IL-33の発現上昇自体がアレルギー疾患の発症ならびに増悪に重要な役割を果たしていると考えられる。しかしながら、IL-33の発現誘導機構は未だに良く分かっていない。本研究で我々はIL-33のタンパク質ならびにmRNAの発現制御機構をRagweed pollenによるアレルギー性鼻炎ならびに喘息モデルマウスを用いて検討した。さらに、IL-33 mRNAの発現誘導機構をより詳細に検討するために、我々はRagweed pollenもしくはRMA+Ionomycin誘導性のIL-33発現機構の検討をヒト気道上皮細胞株BEAS-2Bを用いて行った。平成22年度の研究において、非アトピー型アレルギー疾患とpro-allergic cytokineの関係を明らかにする目的で、ブタクサ花粉連続点鼻による鼻炎ならびに喘息モデルを樹立した。マウスが覚醒した状態でブタクサ花粉粒子を14日間連続点鼻することにより非アトピー型アレルギー性鼻炎モデルを樹立することができた。また、同様に麻酔下においてブタクサ花粉を週二回、二週間、計四回点鼻することにより、喘息症状を誘導することができた。最終点鼻の翌日にマウスを解析したところ、杯細胞からムチン産生の亢進および気管支肺胞洗浄液(BALF)中への炎症性細胞(好酸球、好中球、単球)の浸潤がみられ、血清中にブタクサ抗原特異的IgEならびにIgG1抗体の上昇が誘導された。さらに肺門リンパ節においてブタクサ抗原特異的Th2細胞の誘導がみられた。本喘息モデルマウスでは肺組織中において、上皮細胞におけるIL-33の発現量が遺伝子およびタンパク質レベルで上昇しており、またTSLP mRNAの発現量が上昇していた。また、ブタクサ花粉粒子の単回投与においても花粉投与後3時間からIL-33mRNAの増加が、また6時間後からIL-33タンパク質の増加が誘導された。したがって、ブタクサ花粉により肺上皮細胞から誘導されるIL-33は喘息症状の誘導やTh2型免疫応答の惹起において重要な役割を果たしていると考えられ、今後本モデルマウスにおけるIL-33の関与ならびにその産生メカニズムの検討を行っていく。本研究においてアトピー型および非アトピー型アレルギー疾患とpro-allergiccytokineの関係を明らかにする目的で種々のアレルギー疾患モデルマウスの作製を行った。アトピー性素因のある鼻炎モデルとして、マウスに水酸化アルミニウムゲルでブタクサ花粉を免疫し、二週間後に花粉を4日間連続点鼻し鼻炎を誘導した。また、非アトピー型アレルギー疾患モデルとしてマウスが覚醒した状態でブタクサ花粉粒子を14日間連続点鼻することにより非アトピー型アレルギー性鼻炎モデルを樹立することができた。最終点鼻の翌日にマウスを解析したところ、杯細胞からムチン産生の亢進進および気管支肺胞洗浄液(BALF)中への炎症性細胞(好酸球、好中球、単球)の浸潤がみられ、血清中にブタクサ抗原特異的IgEならびにIgG1抗体の上昇が誘導された。また、アトピー性素因のある鼻炎モデルにおけるIL-33の役割を検討するために、IL-33KOマウスを用いて点鼻を誘導したところIL-33KOマウスにおいては鼻炎症状が顕著に抑制されていた。これにはFceRIを介して活性化された肥満細胞および好塩基球が関与しておりIL-33はこれらの細胞からのサイトカイン、ケモカインおよびヒスタミンの産生を亢進することが明らかとなった一方で、ブタクサ花粉誘導性の喘息モデルではIL-33KOマウスにおいてTh2細胞からのIL-5およびIL-13産生が低下はするものの抗原特異的なIgEおよびIgG1産生、さらにはムチンの産生といった喘息症状はあまり低下が見られなかった。したがって、肺においてはIL-33以外にもアレルギー症状の誘導に必要な分子が存在すると考えられ、今後それらの分子の同定ならびに機能の解析を行っていく必要がある。
皮質求心性線維の分枝形成機構の研究

視床ニューロンの軸索は大脳皮質の4層で終止し、枝分かれを形成することが知られている。我々はこれまでに培養下においてもin vivoと同様な視床皮質投射が形成されることを示してきた(Yamamoto et al.,1989,1992,1994,1997)。本研究では、4層で生ずる軸索の停止や枝分かれを制御する膜結合型の因子の特性を明らかにするために、化学的に一旦固定した大脳皮質切片上で視床組織片を培養し、視床からの軸索伸長ならびに枝分かれ形成について調べた。まず神経成長活性に層特異性があるかどうかを調べるために、視床軸索を層と平行に侵入させたところ、視床ニューロンの軸索は5、6層から白質にかけて成長が著しかった。ところが、固定皮質切片をあらかじめPI-PLCよって処理すると、深層での成長は変化しないのに対して浅層での伸長が有意に増加した。また、ノイラミニダーゼ処理によって深層での軸索伸長が若干減少した。分枝については、固定皮質切片上においても標的である4層で特異的に枝分かれが生ずることが分かった。皮質切片をあらかじめノイラミニダーゼで処理しておくと枝分かれの個数が有意に増加し、標的層特異性は若干弱まることが示された。以上の結果から、皮質浅層に分布するGPIアンカー型の分子が軸索伸長に抑制的に働いて層特異的な視床軸索の終止に貢献していること、並びにシアル酸自身あるいはそれを含む分子が軸索伸長には促進的に逆に分枝形成には抑制的に作用して層特異的な枝分かれの形成に関与している可能性が示唆された。視床ニューロンの軸索は大脳皮質の4層で主として枝分かれを作りシナプス結合を作ることが知られている。我々はこれまでに培養下において視床ニューロンの軸索がin vivoと同様に皮膚4層で枝分かれを形成し,シナプス結合を作ることを示した(Yamamoto et al.,1989,1992,1994,1997)。さらに本研究では4層で生ずる軸索の停止や枝分かれを制御する因子を明らかにしようとした。これまでの経時的な軸索伸長の観察によって視床軸索の成長停止や枝分かれが4層に局在していることから、これらを制御する因子は膜に結合したものであると予想される。そこで、このような皮質中に存在すると考えられる膜結合型の軸索成長制御因子の存在並びにその特性を明らかにすることを目的として、一旦固定した皮質切片と視床組織片の共培養において視床軸索の投射パターンを解析した。まず神経成長活性に層特異性があるかどうかを調べるために、視床組織片を層と平行に侵入させたところ、視床ニューロンの軸索は5、6層から白質にかけて成長が著しかった。ところが、固定皮質切片をトリプシンやヘパリチナーゼによって処理すると、深層での成長は変化しないのに対して浅層での伸長は有意に増加した。また、ノイラミニダーゼ処理によって深層での軸索伸長は若干減少した。以上の結果から、皮質浅層に分布するヘパラン硫酸関連分子が軸索伸長に抑制的に、また深層に存在するシアル酸を含むNCAMなどが軸索伸長に促進的に働くことが示唆された。皮質求心性線維が層特異的な枝分かれを形成する機構を明らかにする目的で、化学的に一旦固定した大脳皮質切片上で視床組織片を培養し、視床からの軸索伸長について調べた。この条件下では、拡散性分子の影響を排除して細胞膜表面あるいは細胞外マトリックスに存在する糖鎖やタンパク質などの分子の機能を解析できる。さらに、固定皮質切片に酵素処理を施すことによって軸索の枝分かれがどのように変化するかを調べることも可能である。

その結果、視床軸索は固定皮質切片上においても標的である4層で特異的に枝分かれを形成することが分かった。次にノイラミニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ヘパリチナーゼ、PI-PLCなど細胞膜表面や細胞外マトリックスの環境に変化を与える酵素で皮質切片をあらかじめ処理してから視床との培養を行った。ヘパリチナーゼやPI-PLC処理では未処理のものと比較して枝分かれの層分布にほとんど変化がみられなかったのに対し、ノイラミニダーゼおよびコンドロイチナーゼ処理を施したものにおいては枝分かれの標的層特異性が若干弱まった。またノイラミニダーゼ処理によって分枝の数、中でも20μm以下の細かい分枝の数が有意に増加した。これらの結果から、層特異的な膜結合型の因子が枝分かれの形成を担っていること、ならびにノイラミニダーゼによって除去されるシアル酸の成分とコンドロイチナーゼによって処理されるコンドロイチン硫酸が、標的層以外で軸索の分枝形成を抑制することによって層特異的な枝分かれの形成に貢献している可能性が示唆された。