hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞接着分子CADM1を分子標的とする小細胞肺癌の治療法の開発

免疫グロブリン・スーパーファミリー細胞接着分子CADM1は非小細胞肺癌(NSCLC)を含む様々な上皮系の癌において腫瘍抑制に関与する.我々は,CADM1が小細胞肺癌(SCLC)において特異的なスプライシングを受けて高頻度に過剰発現し,悪性増殖能に関与することを見出した.次に,SCLCの分子生物学的特徴を検討するために,小細胞肺癌の手術症例の臨床病理学的因子と長期治療成績を後ろ向きに解析した.当院で肺切除術を行い小細胞肺癌と診断された42症例を対象としたところ,病理学的には混合型が12例で,リンパ管侵襲を22例,血管浸潤を29例に認め,病理病期(第8版)はIA1/IA2/IA3/IB/IIA/IIB/IIIA/IIIB/IVAが2/5/1/6/3/8/13/3/1例であった.腫瘍マーカー高値はNSE12例(38例中),Pro-GRP6例(20例中),CEA14例(42例中),SCC11例(36例中)であった.観察期間は58.7±68.9ヵ月で,5年生存率は57.2%であった.単変量解析では男性(p=0.048),術後補助化学療法なし(p<0.001),混合型(p=0.002),CEA高値(p=0.013),SCC高値(p<0.001)は有意な予後不良因子であった.さらに,SCLCにおけるCADM1発現の臨床病理学的意義を明らかにするために,手術検体の免疫組織化学染色を行った.CADM1の発現を検討したところ,CADM1は71%で強陽性であり、患者の予後不良と有意な相関を示した.従って、CADM1バリアントがSCLCの悪性増殖能や転移能と強く相関しており、治療の分子標的となる可能性を持つことが示唆された。以上の研究成果を「The IASLC19th World Conference on Lung Cancer (Toronto)」で発表する事が出来た.SCLCの分子生物学的特徴を検討するために,小細胞肺癌の手術症例の臨床病理学的因子と長期治療成績を後ろ向きに解析した.当院で肺切除術を行い小細胞肺癌と診断された42症例を対象としたところ,小細胞肺癌患者の術後5年生存率は57.2%と比較的良好であった.単変量解析では男性(p=0.048),術後補助化学療法なし(p<0.001),混合型(p=0.002),CEA高値(p=0.013),SCC高値(p<0.001)は有意な予後不良因子であった.従って,SCLCは病理学的に混合型で,NSCLCの腫瘍マーカーであるCEA,SCCが高値の時は腫瘍学的に悪性度が高い可能性が示唆された.さらに,SCLC手術検体におけるCADM1発現の解析では,免疫組織化学染色にてCADM1が71%で強陽性であり、患者の予後不良と有意な相関を示した。次年度に向けてはCADM1に着目したSCLCの血清学的診断法及び予後予測の検討を行っている.CADM1はその細胞外領域がsheddingされ,可溶性蛋白として存在する。さらにSCLCに特異的なスプライシングバリアントは正常肺に発現するバリアントと比較してsheddingを受けやすいことが明らかになった.そこで、SCLC患者の血清中に可溶性CADM1が存在することを検証するため、ELISA法の確立を行っている。また,血中循環腫瘍DNAやエクソソームを採取して,我々が見出した小細胞肺癌に特異的に発現するスプライシングバリアントを解析することにより,小細胞肺癌の新しい診断法及び治療方針に関わる血清マーカーとなる可能性を検討している。まず第一に,CADM1に着目した小細胞肺癌の血清学的診断法及び予後予測の検討を進める.CADM1はその細胞外領域がsheddingされて可溶性蛋白として存在し,さらにSCLCに特異的なスプライシングバリアントはsheddingを受けやすいことが明らかになっており,有意な血清マーカーとして期待できる.次に,SCLC細胞の転移抑制効果をマウスモデルで検証するために、NCI-H69細胞の尾静脈ー肺への転移形成を安定に行えるようにする。そして、CADM1機能阻害活性をもつヒト化抗体,又は,CADM1分子経路の機能阻害剤を用いて、ヒトSCLC細胞のヌードマウス転移モデルにおける転移抑制効果を判定する。さらに近年、癌治療の新しい柱として免疫チェックポイントを標的とした癌免疫療法が急速に発展し、肺癌の分野では、構造的に免疫グロブリン・スーパーファミリーに属するPD-1が臨床応用されている。免疫グロブリン・スーパーファミリーに属するCADM1はCRTAMと結合して癌細胞の免疫応答に関与すること,腫瘍細胞に発現するCADM1は活性化したVγ9Vδ2 T細胞のCRTAMと結合してT細胞の細胞死を導くことが明らかにされた。そこで我々は、CADM1の細胞外領域が担う免疫応答に焦点をあて、小細胞肺癌の免疫抑制に関わる分子機構をCADM1-CRTAMの経路に基づいて解明する。さらに、抗CADM1ヒト化抗体を用いて、培養細胞やマウス実験系における小細胞肺癌の浸潤転移抑制を試み、新規治療法の開発を目指す。免疫グロブリン・スーパーファミリー細胞接着分子CADM1は非小細胞肺癌(NSCLC)を含む様々な上皮系の癌において腫瘍抑制に関与する.

我々は,CADM1が小細胞肺癌(SCLC)において高頻度に過剰発現し,悪性増殖能に関与することを示した.機能解析では,siRNAによりCADM1発現を抑制したSCLC細胞において球状細胞集塊の形成が抑制された.これは,CADM1がSCLCの悪性増殖能に関与するとともに,癌幹細胞マーカーと似た働きをもつ可能性を示している.癌幹細胞は自己複製能や多分化能を有する未分化な細胞で,治療後の再発や薬剤耐性の重要な原因と考えられている.そこで,SCLCにおけるCADM1と癌幹細胞マーカー候補(CD133,CD44,ALDH1)の発現について,外科的切除されたSCLC34例及びNSCLC27例を対象に,免疫組織化学染色にて比較検討を行った.結果,CADM1はSCLC34例中24(71%)が強陽性,7(21%)が弱陽性,3(9%)が陰性で,CADM1の高発現を示す腫瘍は患者の予後不良と有意な相関を示した.一方,CD133は,SCLC 34例中1例(3%)が強陽性,6例(18%)が弱陽性,27例(79%)が陰性で,SCLCでNSCLCより有意にCD133陰性例が多かった.さらに,CD44は,SCLCは34例中3例(9%)が強陽性,6例(18%)が弱陽性,25例(74%)が陰性,ALDH1は,SCLCは34例中10(29%)が強陽性,6例(18%)が弱陽性,18例(53%)が陰性であった.癌幹細胞マーカー候補の発現はCADM1の発現と有意な相関はなく,全生存率にも有意差を認めなかった.小細胞肺癌幹細胞の性状解析や特異的マーカーの同定には更なる研究が必要と思われた.以上の研究成果を「第57回日本肺癌学会学術集会(福岡)」で発表した.科研費交付以前から継続しているSCLCの病態解明の研究成果を,今年度は「第57回日本肺癌学会学術集会(福岡)」において発表する事が出来た.また,SCLCで特異的に発現するCADM1のスプライシングバリアントは,マウス正常組織では精巣のみに発現しており,ヒト精巣腫瘍の一部にもその発現を認めた.精巣腫瘍はSCLCと同様に早期に他臓器転移を来たす特徴を持つ.そこで,精巣腫瘍におけるCADM1バリアントの発現の意義を検討するため,まず,化学療法後に肺切除術を行った精巣腫瘍肺転移32症例の臨床病理学的特徴と長期治療成績を後ろ向きに解析して予後因子を検討した.結果,切除した肺転移巣が5個以上の症例,最終病理診断でviableな腫瘍細胞を認めた症例,肺切除術前フリーβHCG,インタクトHCG,及びLDHが高値であった症例が有意に予後不良であった.以上の研究成果を「第69回日本胸部外科学会定期学術集会(神戸)」で発表する事が出来た.次年度に向けてはCADM1に着目した小細胞肺癌の血清学的診断法及び予後予測の検討を行っている.CADM1はその細胞外領域がsheddingされ,可溶性蛋白として存在する。そこで我々は、SCLC患者の血清中に可溶性CADM1が存在することを検証するため、サンドイッチELISA法の確立を行っている。また,血中循環腫瘍DNAを採取して,我々が見出した小細胞肺癌に特異的に発現するスプライシングバリアントを解析することにより,小細胞肺癌の新しい診断法及び治療方針に関わる血清マーカーとなる可能性を検討している。免疫グロブリン・スーパーファミリー細胞接着分子CADM1は非小細胞肺癌(NSCLC)を含む様々な上皮系の癌において腫瘍抑制に関与する.
2次元アモルファス・タングステン超薄膜の超伝導-絶縁体転移

アモルファス・タングステン(a-W)超薄膜は最低1.2mmの厚さでも超伝導を誘発し、金属系2次元不均質超伝導体の特性を研究する上でのモデル系として大変有益な物質である。本件旧ではa-W超薄膜とSi膜を組み合わせ、ヘテロ構造Si/W/Si、多層構造Si/W/Si...W/Siの試料を作成し、その2次元超伝導体の特性について研究を行った。Disorder誘発型超伝導・絶縁体転移の観測ヘテロ構造試料でW膜の厚さを1nm10nm変化させた試料の面抵抗の温度依存性を0.1K5Kの温度領域で測定した。W膜厚が1.2nm以上で超伝導を示し、1nm以下では超伝導を消失し、面抵抗の温度依存性がexp(T^<1/3>)則に従う2次元variable rangehopping伝導を示した。超伝導臨界温度T_<cO>の常伝導面抵抗依存性から超伝導が消失する面抵抗を推測すると、理論的に計算される超伝導・絶縁体転移を起すユニバーサルな量子面抵抗値6.45KΩに近い値を示し、典型的なdisorder誘発型超伝導・絶縁体転移であることが確認された。KT転移とは臨界温度近傍で超伝導秩序関数の位相の熱的に揺らぎにより、Vortex-Antivortex対が誘起される相転移である。Si/W多層膜のゼロ磁場での電流電圧特性を詳細にしらべ、Si膜厚変化によりW超伝導層間結合状態とKT転移の関係、積層数の変化とKT転移に伴うVortex loop excitationの関係を明らかにした。この知見は高温超伝導体で起きるKT転移に関する特性の研究に有益な情報を与えた。磁場誘発型超伝導・絶縁体転移の観測ヘテロ構造Si/W/Siで超伝導を示す1.23nmのW膜厚の試料について、磁場印加による超伝導・絶縁体転移を観測し、その転移が超伝導秩序変数の位相のゆらぎに原因したVortex glass/Bose glass転移であるかどうかをFisherの提案した理論的考察によるスケーリング則を用いて解析を行った。その結果、転移を起す磁場Bc近傍の臨界領域ではスケーリング則に従い、より高磁場領域では面抵抗の温度依存が弱局在効果によるInT的振る舞いを示し、Bose Glass相からFermi Glass相への転移の可能性を示唆した。本研究ではアモルファス・タングステン(a-W)超薄膜をSi/a-W/Siサンドイッチ形態で作製した。Si膜厚を5nmに固定し、a-W膜の厚さd_wを1nm10nmの間で変化させた試料を超高真空蒸着法で用意した。1.Disorder誘発型超伝導・絶縁体転移(SIT)の観察ゼロ磁場中での面抵抗の温度依存性をすべての試料について0.1Kから5.0Kの温度領域で測定した。その結果、W膜厚が1.2nm以上の領域で超伝導を示し、それ以下の膜厚d_w=1nmでは超伝導が消失し、面抵抗の温度依存性がexp(T^<-1/3>)則に従う二次元variable range hopping電気伝導を示した。

超伝導を示す領域では超伝導臨界温度の4.2Kの常伝導面抵抗依存性から臨界温度が消失すると推測される面抵抗を見積もると理論から計算される超伝導-絶縁体転移の臨界面抵抗R_Q=6.45KQに近い値を示した。したがって、ゼロ磁場での面抵抗の温度依存性から、この系は膜厚を制御による典型的なdisorder誘発型超伝導・絶縁体転移を示す系であることが確認された。2.磁場誘発型超伝導・絶縁体転移の観察超伝導を示す試料について、磁場印加による超伝導-絶縁体転移をしらべた。その結果、W膜厚が1.23.0nmにおいて、磁場誘発型SITが観測された。これが超伝導オーダーパラメーターの位相ゆらぎに原因した現象であるかどうかはFisherらが理論的提案しているスケーリング則を適用して解析を試みた。その結果、2nm以下の膜厚領域では良くスケーリング則に従い、超伝導から絶縁体に相転移を起す臨界磁場B_cを見い出した。しかし、B_cにおける面抵抗は理論値である臨界面抵抗R_Q=6.45KQに一致しなかった。3.今後の課題Si/a-W/Si系がDisorderと磁場の両誘発型超伝導-絶縁体転移を一つの系でもつことが発見されたが、上記の知見を基により詳細な電気伝導機構を実験的にしらべ、理論的計算と対応しながら探求してゆく必要がある。アモルフアス・タングステン(a-W)超薄膜は最低1.2nmの厚さでも超伝導を誘発し、金属系2次元不均質超伝導体の特性を研究する上でのモデル系として大変有益な物質である。本研究ではa-W超薄膜とSi膜を組み合わせ、ヘテロ構造Si/W/Si、多層構造Si/W/Si...WSiの試料を作成し、その2次元超伝導体の特性について研究を行った。Disorder誘発型超伝導・絶縁体転移の観測へテロ構造試料でW膜の厚さを1nm10nm変化させた試料の面抵抗の温度依存性を0.1K5Kの温度領域で測定した。W膜厚が1.2nm以上で超伝導を示し、1ml以下では超伝導を消失し、面抵抗の温度依存性がexp(T^<1/3>)則に従う2次元variable rangehopping伝導を示した。超伝導臨界温度T_<C0>の常伝導面抵抗依存性から超伝導が消失する面抵抗を推測すると、理論的に計算される超伝導・絶縁体転移を起すユニバーサルな量子面抵抗値6.45KΩに近い値を示し、典型的なdisorder誘発型超伝導・絶縁体であることが確認された。KT転移とは臨界温度近傍で超伝導秩序関数の位相の熱的に揺らぎにより、Vortex一Antivortex対が誘起される相転移である。Si/W多層膜のゼロ磁場での電流電圧特性を詳細にしらべ、Si膜厚変化によりW超伝導層間結合状態とKT転移の関係、積層数の変化とKT転移に伴うVortex loop excitationの関係を明らかにした。この知見は高温超伝導体で起きるKT転移に関する特性の研究に有益な情報を与えた。磁場誘発型超伝導・絶縁体転移の観測ヘテロ構造Si/W/Siで超伝導を示す1.23nmのW膜厚の試料について、磁場印加による超伝導・絶縁体転移を観測し、その転移が超伝導秩序変数の位相のゆらぎに原因したVortex glass/Bose glass転移であるかどうかをFisherの提案した理論的考察によるスケーリング則を用いて解析を行った。
グラフに付随するトーリックイデアルとグレブナー基底の研究

本年度は「マトロイドに付随するトーリックイデアルとグレブナー基底」について研究を行ってきた。マトロイドには「マトロイドに付随するトーリックイデアルは2次の二項式で生成される」という予想が存在する。この予想が肯定的に解決されているのは、一部のマトロイドのみである。更にグレブナー基底に関しては、良いグレブナー基底に対応する単項式順序を見つけることは難しい。そこで、既に解決されているマトロイド以外についても予想が成り立つのかどうか研究を行ってきた。マトロイドにはseries-parallel connection、2-sumといった2つのものを組み合わせる操作がある。この操作を行った際に「トーリックイデアルの生成系やグレブナー基底に変化はあるのか」という問題について考察した。この問題について計算実験や既存の結果を用いることにより「series-parallel connection、2-sumの操作で組み合わせたマトロイドのトーリックイデアルの生成系やグレブナー基底の次数は元のマトロイドのトーリックイデアルの生成系、グレブナー基底の次数を超えない」という結果を証明することに成功した。この結果を用いることにより新たなクラスにおいて予想が成り立つことを証明することができた。また、現段階では計算実験の結果ではあるが、正則マトロイドにおいても予想が成り立つことを確認した。更に、予想が成り立つのかどうか調べるには、3連結マトロイドにクラスを限定して予想が成り立つのかどうか調べれば良いこともわかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は「切断イデアルのグレブナー基底とそれに対応するトーリック環の強Koszul性」について研究を行ってきた。切断イデアルはグラフのcutに対応するトーリックイデアルのことであり、切断イデアル、および、それに対応するトーリック環は、代数統計学を背景としてよく研究されており、トーリック環の環論的性質や、トーリックイデアルの生成系の元の最大次数等について、多くの結果が知られている。切断イデアルについて、「2次の二項式で生成されることと、グラフが4次の完全グラフをminorに持たないことは同値である」ことが知られている。しかし、4次の完全グラフをminorにもたない場合に、いつ2次のグレブナー基底をもつかはほとんど知られていない。非自明なグレブナー基底を構成した例としては、ring graphについて2次のグレブナー基底を構成した結果しか知られていない。そこで、上記以外のグラフにおいても切断イデアルが2次のグレブナー基底をもつかどうか計算実験を行い調べた。その結果、「グラフが4次の完全グラフ、および、長さ5のサイクルをminorに持たないならば、切断イデアルは2次のグレブナー基底をもつ」ことを示し、切断イデアルが2次のグレブナー基底をもつための十分条件をグラフのminorの言葉で表すことに成功した。更に、「切断イデアルに対応するトーリック環が強Koszulであることと、グラフが4次の完全グラフ、および、長さ5以上のサイクルをminorにもたないことは同値である」ことも示し、切断イデアルに対応するトーリック環が強Koszulとなるための必要十分条件をグラフのminorの言葉で明確に示すとともに、非自明な強Koszulトーリック環(多項式環のSegre積やテンソル積で構成することができないトーリック環)の無限系列を理論的に構成することに成功した。平成26年度研究計画で挙げた「切断イデアルのグレブナー基底の構成」について、切断イデアルが2次のグレブナー基底をもつための十分条件をグラフのminorの言葉で表した。これは一般の4次の完全グラフをminorにもたないグラフに拡張できるかどうか、興味深い結果となっている。平成26年度の研究成果をもとに、より一般的な理論の構築を目指し、トーリックイデアルのグレブナー基底の構成、および、トーリック環の環論的性質について研究を行う。具体的には1.切断イデアルのグレブナー基底の構成、および、トーリック環の正規性2.マトロイドに付随するトーリックイデアルの生成系の次数に関する予想について研究する。

切断イデアルについて、2次のグレブナー基底をもつための必要十分条件をグラフの言葉で特徴づけていく。更には、切断イデアルのイニシャル単項式がいつスクエアフリーとなるかどうか計算実験を行い、切断イデアルに対応するトーリック環がいつ正規となるかどうか調べていく。マトロイドについて、3-連結マトロイドに限定して、予想が成り立つのかどうか調べれば良いことが知られている。この3-連結マトロイドのトーリックイデアルのグレブナー基底を構成する方法を模索し、予想が成り立つのかどうか調べていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。
1型ヒト免疫不全ウイルスのVpr蛋白質の構造と機能に関する研究

HIVのインテグラーゼに対するマウスモノクローナル抗体を作製し、このマウスモノクローナル抗体から単鎖抗インテグラーゼ抗体分子(scAbE)を作製した。scAbEとHIVのアクセサリータンパク質であるVprとの融合タンパク質(scAbE-Vpr)、およびVprと結合することが明らかになっているペプチドモチーフ(WxxF)を付加したscAbE分子(scAbE-WxxF)を作製した。さらにscAbEとHIVのキャプシッドタンパク質(CA)との融合タンパク質(scAbE-CA)も作製した。これらタンパク質を発現するヘクターDNAをHIV infectious clone DNA(pLAI)とともにヒト細胞293Tにtransfectして培養上清中のウイルスを回収した。ウイルス粒子のタンパク質について、ウェスタンブロット法で調べたところscAbE-VprとscAbE-WXXFは効率よくウイルス粒子内に取り込まれていた。しかし、scAbEあるいはscAbE-CAはウイルス粒子には取り込まれなかった。これらウイルスの感染性をMAGIアッセイ法にて調べた。同じ量のRT活性で比較した場合、野生型ウイルスに比べてscAbE-Vprを取り込んだウイルスとscAbE-WxxFを取り込んだウイルスとでは、感染性が最大で、それぞれ10^3倍、10^4倍低下した。scAbE-WxxFを安定に発現するHeLa細胞を樹立できたが、その一方で、scAbE-Vprを安定に発現するHeLa細胞は得られなかった。このようにウイルス粒子に取り込まれてそのウイルス粒子の感染性を低下せしめる分子は全く新規の抗ウイルス治療分子であるので、packageable ativiral therapeutics(PAT)と命名した。scAbE-Vprとは異なりscAbE-WxxFは細胞毒性を呈さず、より理想的なPAT分子と思われた。この分子はAIDSの遺伝子治療に応用できるだろう。本研究はHIVのviral protein R(Vpr)の構造と機能を調べ、治療に応用する技術の開発を目的としている。ウイルスのインテグレースに対するマウスモノクローナル抗体から作製した単鎖抗インテグレース抗体分子をHIV-1のVprに融合せしめた(scAbE-Vpr)。このタンパク質を発現するベクターDNAをHIV infectious cloneDNA(pLAI)とともにヒト細胞293Tにcotransfectしてウイルスを回収した。ウイルス粒子のタンパク質について、ウェスタンプロット法で調べたところ、scAbE-Vprは効率よくウイルス粒子内に取り込まれていた。そのウイルスの感染性をMAGIアッセイ法にて調べた。同じ量のRT活性で比較した場合野生型ウイルスに比べてscAbE-Vprを取り込んだウイルスでは感染性は最大で1000倍低下した。取り込まれた融合分子がこの感染性低下に寄与しでいるものと推測できた。従って、この分子はAIDSの遺伝子治療に応用できるだろう。
呼吸筋群の誘発筋音図を用いた新しい呼吸機能検査法の開発

本研究では、簡便で再現性の良い新しい呼吸機能検査法を開発するため、横隔膜筋の誘発筋音図に着目した。本手法は、従来のスパイログラムによる呼吸機能検査法とは異なり、皮膚表面から電気刺激を行い、呼吸筋群の誘発筋音図を測定するだけで良い。若年者と高齢者を対象とした比較実験では、高齢者の筋音図振幅は有意に減少し、換気機能指標(肺活量、予備吸気量、予備呼気量)や口腔内圧(PImax、PEmax)とも相関関係が認められた。したがって、誘発筋音図は横隔膜の収縮を直接測定できる手法であり、PEmaxやPImaxと併用することで、より詳細な呼吸筋機能を評価できる可能性があることが示唆された。本研究では、簡便で再現性の良い新しい呼吸機能検査法を開発するため、呼吸筋群(横隔膜筋,腹壁筋)の誘発筋音図に着目した。そのため、被験者に強制呼吸の努力を強いる必要がなく、臨床検査技師の声かけ技術にも左右されないため、正確で再現性の良い呼吸機能検査を実施することが可能となる。本手法は、現在問題となっている長期間の喫煙による慢性閉塞性呼吸器疾患(COPD)の予防、早期発見、早期治療にも役立つことが期待される。本研究の目的は、「横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図を用いた簡便かつ再現性の良い新しい肺機能検査法の開発」の提案であり、昨年度(H23年度)はその可能性を検討するために、健常者を対象として横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図とスパイログラムの各肺機能パラメータ(肺活量、1秒量、1秒率)を測定し、誘発筋音図の有用性について考察したが、測定条件が定まらず、データのばらつきが大きいため、測定データを増やすことが困難であった。したがって、H24年度は測定条件の見直しと共に、海外学会(欧州呼吸器学会)への研修に行くなど、積極的に研究推進への努力を行った。本研究では、簡便で再現性の良い新しい呼吸機能検査法を開発するため、呼吸筋群(横隔膜、腹壁筋)の誘発筋音図に着目した。本手法は、従来のスパイログラムによる呼吸機能検査法と異なり、皮膚表面から電気刺激を行い、呼吸筋群の誘発筋音図を測定するだけで良い。本研究の目的は「横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図を用いた簡便かつ再現性の良い新しい肺機能検査法の開発」の提案であり、H23年度はその可能性を検討するために、健常者を対象として横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図とスパイログラムの各肺機能パラメータ(肺活量、1秒量、1秒率)を測定し、誘発筋音図の有用性について考察したが、測定条件が定まらず、データのバラツキが大きいため、測定データを増やすことが困難であった。H24年度は測定条件の見直しと共に、海外学会(欧州呼吸器学会)へと研修に行くなど、積極的に研究推進に努力した。最終年度であるH25年度は、帝京大学から名古屋大学に移籍し、環境の変化があったものの、実際に健常若年者と健常高齢者の横隔膜筋音図とスパイロメトリ・呼吸筋指標の比較を行い、その成果がアメリカ呼吸器学会(ATS2014: American Thoracic Society)のポスター演題に採択されるに至った。また、現在これらの研究結果は、国際学会誌である"Physiological Measurement"に投稿中である。本研究では,簡便で再現性の良い新しい呼吸機能検査法を開発するため,呼吸筋群(横隔膜筋,腹壁筋)の誘発筋音図に着目した.本手法は,従来のスパイログラムによる呼吸機能検査法とは異なり,皮膚表面から電気刺激を行い,呼吸筋群の誘発筋音図を測定するだけで良い.そのため,被験者に強制呼吸の努力を強いる必要がなく,臨床検査技師の声かけ技術にも左右されないため,正確で再現性の良い呼吸機能検査を実施することが可能となる.

本手法は,現代問題となっている長期間の喫煙による慢性閉塞性呼吸器疾患(COPD)の予防,早期発見,早期治療にも役立つことが期待される.本研究の目的は,「横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図を用いた簡便かつ再現性の良い新しい肺機能検査法の開発」の提案であり,本年度はその可能性を検討するために,健常者を対象として,横隔膜および腹壁筋の誘発筋音図とスパイログラムの各肺機能パラメータ(肺活量,1秒量,1秒率)を測定し,誘発筋音図の有用性について考察した.本来であれば、COPD患者を対象とした臨床研究へと移行したいと考えているものの、患者を対象とする以上、計測時間や計測項目を最適化する、電気刺激の強度ないしはその苦痛をいかに最低限にするか、またそれにともなう倫理委員会の承認など超えるべきハードルは高いため、基礎的な検討には多大な時間と労力が必要になるため。本研究担当者は臨床検査技師国家資格を持ち,誘発筋音図および呼吸機能検査に関しての充分な知識および測定技術を有しているため,基礎実験に関して繰り返す必要がなく,スムースに実験に移行できたため.H23年度とH24年度において、被験者に苦痛を与えず、また必要最低限の計測項目を選ぶことができたため、最終年度はさらなる健常被験者のデータ採取と平行して、老齢者のデータ採取にも挑戦する。今年度の実験を通じて,健常者についての誘発筋音図と各呼吸器パラメータ(肺活量,1秒量,1秒率)との関係性について考察できたため,次年度以降は高齢者を対象として,呼吸筋群の筋力低下とスパイログラムの各肺機能パラメータの関係について考察する.研究代表者は、H25年4月より、名古屋大学医学系研究科へ新しく移籍した。それに伴って、前所属大学で使用できていた機材を新しく購入する必要がでてきたため、専用の筋音図測定機器であるメディセンス製の筋音計(約60万円)を新しく購入する。また、その他にも研究成果に応じて国内・海外学会への参加、データ解析のためのソフトウェア、被験者への謝金支払いなど、これらの費用として計112万7881円を計上している。昨年度の繰り越し金(約1,790,000円)が生じたのは,もともと購入を予定していたスパイロメータやA/D変換器などの物品を購入する必要がなくなったからである.次年度は,最新の呼吸器検査についての学術調査を目的として,欧州呼吸器学会(ERS VIENNA2012)への参加を予定しているが,その他にも研究成果に応じて国内・国際学会への参加も考慮している.これらの費用として600,000円を計上する.また,その他にもスパイロメータおよび誘発筋音図の消耗品,データ解析のためのソフトウェア開発,さらに必要に応じて被験者への謝金支払い等で1,690,000円を計上している.
表現型と遺伝子型が連携する人工細胞モデルの創成

本研究課題では、水中で情報分子の情報を読み取り、その情報をもとに境界膜の生産を行うような人工細胞モデルの構築を目的としている。申請者は境界膜として、両親媒性分子が袋状に閉じたベシクルと呼ばれる分子集合体を選択した。現在では、検討していた分子をやや改良設計し、水中で化学反応するために必要な分子を合成している。室温でかつ水中で両親媒性分子を形成するために、申請者はネイティブケミカルライゲーションと呼ばれるシステイン骨格とチオエステル基のカップリング反応を選んだ。本研究ではベシクルを構成する分子群として、シスチン骨格にチオエステルを備えた分子を合成した。この分子は、やや塩基性条件下の水溶液中で還元剤を添加すると、ジスルフィド結合が切断されてシステイン構造が出現し、自発的にネイティブケミカルライゲーションを行った。質量分析などで、3-4量体などのペプチドオリゴマーを形成していることが確認された。現在、この反応を膜分子合成に活かせるように反応条件等を精査している。当初考えていた分子に難点がみつかったため、改良設計した。すぐにネイティブケミカルライゲーションを基盤とする両親媒性分子の設計に取り組んだが、システイン骨格に関連する分子の合成に時間がかかった。これは液相反応で分子合成を計画しているが、固相合成におけるシステイン保護基の取り扱いの違いに苦労し、最終的にはシスチン骨格へと変更を行ったためである。本研究では不定形な状態から代謝に必要なたんぱく質モデルを合成したのちに、人工細胞の境界膜であるベシクルを形成する概念を提案した。現在は、システインを基本骨格とした自発的ペプチド形成を軸にしているが、他のアミノ酸や高分子でも検討している。内部の情報がどのように境界膜に送達されるのか、ネイティブケミカルライゲーションによる分子重合が境界膜に与える影響を調べる予定である。また高分子が重合する際の細胞内のこみあい状態を表現したモデルとして、ベシクルよりもより作成しやすい液滴などのソフトマテリアルにも挑戦したいと考えている。
2次元電子と第3音波による超流動ヘリウム3薄膜の研究

本研究は,液体Heの表面に乗った2次元電子系や液面下に蓄えられたイオン,液体He表面に吸着した原子状水素,超流動He膜を伝播する第3音波など,単一の表面で十分な感度を有する現象を総合的に用いて超流動3He薄膜の研究に道標を立てることを目指した.そのために,世界的にこれらの研究をリードするグループ間で共同研究を企画し,2年間に亙って有意義なアイデアの交換と相互作用を活性化させた.これまでの研究成果はバルク液体の表面と^4He薄膜での実験に関するものが,多いが,予想もしなかった現象の発見が多くなされた.これらの成果を^3Heに応用し超流動^3He膜での画期的な研究成果が現われることが,多いに期待される.具体的な研究業績は,He液面上2次元電子の非線形伝導に関する研究,超流動^3He表面上の2次元電子に関する実験,超流動^4He薄膜の第3音波の実験,超流動^3He薄膜に流れを誘起して超流動特性を調べる手段の開発,^4He薄膜を用いた1次元電子系の実現,He液面上に吸着した原子状水素と2次元電子の反応の実験,^3He液面下に蓄積したイオンの伝導度測定などである.本研究は,液体Heの表面に乗った2次元電子系や液面下に蓄えられたイオン,液体He表面に吸着した原子状水素,超流動He膜を伝播する第3音波など,単一の表面で十分な感度を有する現象を総合的に用いて超流動3He薄膜の研究に道標を立てることを目指した.そのために,世界的にこれらの研究をリードするグループ間で共同研究を企画し,2年間に亙って有意義なアイデアの交換と相互作用を活性化させた.これまでの研究成果はバルク液体の表面と^4He薄膜での実験に関するものが,多いが,予想もしなかった現象の発見が多くなされた.これらの成果を^3Heに応用し超流動^3He膜での画期的な研究成果が現われることが,多いに期待される.具体的な研究業績は,He液面上2次元電子の非線形伝導に関する研究,超流動^3He表面上の2次元電子に関する実験,超流動^4He薄膜の第3音波の実験,超流動^3He薄膜に流れを誘起して超流動特性を調べる手段の開発,^4He薄膜を用いた1次元電子系の実現,He液面上に吸着した原子状水素と2次元電子の反応の実験,^3He液面下に蓄積したイオンの伝導度測定などである.本年度は.以下の事項について研究を行った.1.超流動ヘリウム3薄膜の作成と第3音波探索インターディジタル(櫛型)電極を用いた第3音波検出器を作成し、超流動ヘリウム3薄膜上での第3音波の検出の実験を行った。今年度4月5月にかけてのWilliams教授の来日によって、ヘリウム4を用いた予備的な実験に飛躍的な進展があった。その成果を踏まえ、秋頃から超低温における本格的な実験を開始した.10kHz程度の周波数領域で、10μm波長の第3音波を探索したが、検出には至らなかった.ただし、超流動転移と思われる、流動性の急激な回復を見出し、フィルムフローがおきていることを明らかにした。今後、櫛型電極の形状を改良し、超流動ヘリウム3薄膜の超流動特性を明らかにして行く予定である。2.ヘリウム膜上2次元電子系コンスタンツ大学のグループは、ヘリウム4膜上2次元電子の直流伝導特性の測定をおこない、予備的な結果をえた。ヘリウム3膜上で同様な実験を行うべく、九州大学のグループが実験装置を開発中である。2次元電子系の実験計画の立案に最して、バーミンガム大学のVinen教授との討論が有益であった。3.理論的研究と今後の課題大阪大学のグループで、量子液体の表面と2次元電子の散乱メカニズムの理論的考察が行われ、今後実験との比較を行う予定である.また、超流動ヘリウム3膜の理論的研究との連携が必要であることが痛感された.本研究は,液体Heの表面に乗った2次元電子系や液面化に蓄えられたイオン,液体He表面に吸着した原子状水素,超流動He膜を伝播する第3音波など,単層表面でも十分な感度を有する現象を総合的に用いて超流動^3He薄膜の研究に道標を立てることを目指した.そのために,世界的にこれらの研究をリードするグループ間で共同研究を企画し,2年間に亙って有意義なアイデアの交換と相互作用を活性化させた.本年度は,超流動^3He表面上の2次元電子に関する実験,超流動^4He薄膜の第3音波の実験,超流動^3He薄膜に流れを誘起して超流動性を調べる手段の開発,^4He薄膜を用いた1次元電子系の実現,He液面上に吸着した原子状水素と2次元電子の反応の実験,^3He液面下に蓄積したイオンの伝導度測定を行った.^4He膜上2次元電子系のマイクロ波伝導度測定はコンスタンス大学に日本から河野,新井の2名が出かけて行って実験に加わった.この系では2次元電子の量子融解が起きている可能性があり,とても興味深い.今後,日本国内においても同様の測定が可能となるように装置を整備する.マイクロ波領域の実験には量子計算の可能性など今後の研究を必要とするテーマが数多い.外国人研究分担者の来日による積極的な参加を得て,研究は順調に進展し,その成果を国際会議等で発表した.
順序尺度・自由回答項目データのコウホ-ト分析

1.自由回答項目データについて(1)継続的な社会調査における自由回答項目について,事後コーディングを今日的観点から見直して,再コーディングを行なう方法について検討した.(2)第1次第9次の国民性調査の自由回答項目について,個票にもどって回答をテキストデータとして再入力し,データベース化を行なった.(3)回答内容を吟味・検討して,表記の揺れの統合法,異なり回答の抽出など,事後コードを再構成する方法を開発・適用した.(4)既存のコードと再コードを比較し,回答分布の傾向について検討した.2.順序尺度項目データについて(1)順序尺度項目を1つの項目として分析する累積ロジットモデルについて研究した.(2)上記をベイズ型コウホ-トモデルとして実現した.3.これまで分析が十分でなかった自由回答・順序尺度項目データに対してベイズ型コウホ-トモデルを適用し,戦後昭和期から平成にわたる日本人の意識変化の動態について新たな知見を得た.1.自由回答項目データについて(1)継続的な社会調査における自由回答項目について,事後コーディングを今日的観点から見直して,再コーディングを行なう方法について検討した.(2)第1次第9次の国民性調査の自由回答項目について,個票にもどって回答をテキストデータとして再入力し,データベース化を行なった.(3)回答内容を吟味・検討して,表記の揺れの統合法,異なり回答の抽出など,事後コードを再構成する方法を開発・適用した.(4)既存のコードと再コードを比較し,回答分布の傾向について検討した.2.順序尺度項目データについて(1)順序尺度項目を1つの項目として分析する累積ロジットモデルについて研究した.(2)上記をベイズ型コウホ-トモデルとして実現した.3.これまで分析が十分でなかった自由回答・順序尺度項目データに対してベイズ型コウホ-トモデルを適用し,戦後昭和期から平成にわたる日本人の意識変化の動態について新たな知見を得た.
リグノセルロース超分子構造形成におけるリグニン生合成の寄与

木質(リグノセルロース)の利活用が次世代バイオマスエネルギー利用技術の開発において喫緊の課題となっている。ここで、木質バイオリファイナリー・バイオ燃料生産技術基盤確立の本質的なボトルネックは、リグノセルロースを構成する各成分の存在状態(超分子構造)が未だ十分には解明されていないことに帰結される。そこで、本研究は、さまざまなリグニン含量を持つ大型のイネ科植物やリグニン生合成関連の遺伝子の発現を制御した組換えイネにつき、各種化学分析、遺伝子発現解析、組織観察を行い、このリグノセルロース超分子構造解明のための研究を進めた。木質バイオリファイナリー・バイオ燃料生産技術基盤確立の本質的なボトルネックは、リグノセルロース超分子構造が未だ十分には解明されていないことに帰結される。本研究は、既に申請者らが独自に作出した、リグニン生合成関連の一連の遺伝子それぞれの発現を個々に制御した組換えイネを用い、各種化学分析、遺伝子発現解析、組織観察をもとに、各遺伝子がリグノセルロース超分子構造形成に果たす役割を解析することを目的としている。昨年度に引き続き本年度は、リグニン生合成遺伝子の発現を制御した組換えイナワラ等のリグニンおよび酵素糖化残渣の分析などを行い、リグノセルロース超分子構造を解析した。その結果、リグニン量と酵素糖化反応性には必ずしも相関がなく、リグノセルロース超分子構造構築におけるケイ皮酸類特にフェルラ酸二量体の効果が大きいことなどが一層強く示唆された。そこで、フェルラ酸二量体構造の精緻な解析に注力するため、まず一連のフェルラ酸二量体について、非標識標品の化学合成を進めた。フェルラ酸の二量体構造は、基本的にリグニン二量体構造(サブストラクチャー)と類似しているが、末端カルボキシ基の存在などにより、多くのバリエーションを有している。これらのバリエーションには、不安定で相互変換するものがあるが、本研究では不安定型を誘導体化し補足することに成功した。次いで、高速液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた安定同位体希釈法による精緻な定量を行うため、重水素標識体の合成を進めている。一般にリグノセルロースの酵素糖化性はリグニン量と逆相関を示すことが知られているが、我々は既に、イネ科植物ではこの逆相関が見られない場合があることを示し、この原因のひとつとして、フェルラ酸二量体構造の関与の可能性を指摘した。そこで、昨年度に引き続き本年度は、リグノセルロース超分子構造構築におけるケイ皮酸類特にフェルラ酸二量体の寄与について検討した。すなわち、フェルラ酸二量体構造の精緻な解析に注力するため、一連のフェルラ酸二量体について、非標識標品と重水素標識標品を合成した。その結果、フェルラ酸二量体のうちには、かなり不安定で容易に異性化するものがあることが示され、異性化を抑えるための誘導体化条件について検討した。ついで、高速液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた安定同位体希釈法による精緻な定量系を構築し、大型イネ科植物の解析に適用した。その結果、フェルラ二量体類は微量であり、その酵素糖化性に及ぼす影響は限定的であることが示唆された。本年度は、10種の遺伝子についての分析を行った。すなわち、組換え体から茎(イナワラ)を分離し、一部は凍結・粉砕後、発現遺伝子解析に供した。残りの試料は乾燥後、粉砕・溶媒抽出処理を行い、リグニンおよび糖化残渣の分析などによるリグノセルロース超分子構造の解析に供した。すでに行った研究の結果、リグノセルロースの多糖の反応性が多糖を被覆するリグニンの量と必ずしも相関しない原因として、フェルラ酸二量体構造の関与が示唆された。よって、機構をさらに詳細に解析するため、当初の予定にはなかった、一連のフェルラ酸二量体に対する標識および重水素標識標品の化学合成を進めた。当初計画が順調に進行していることに加え、当初予定されていなかったフェルラ酸二量体の分析系の確立を進めたことによる。

前年度に引き続き、リグニン合成関連遺伝子の発現を制御した組換えイネの種子を順次組換え温室で栽培し、各組換え体を大量に調製する。得られた組換え体から茎(イナワラ)を分離し、一部は凍結・粉砕後、発現遺伝子(メッセンジャーRNA)抽出試料とする。残りの試料は乾燥後、粉砕・溶媒抽出処理を行い、化学分析用試料とする。化学分析については、特にフェルラ酸二量体の定性定量に注力し、リグノセルロース超分子構造の解析を進めるとともに、リグノセルロース糖化残渣の分析、リグニン分析等をおこなう。また、遺伝子発現解析については、標的遺伝子の発現を定量的RT-PCR法により解析する。以上に基づき、リグノセルロース超分子構造の詳細解明を行う。化学分析については、酵素糖化反応表面分析、糖化残渣の分析、リグニン分析、細胞壁結合型フェルラ酸分析等をおこない、遺伝子発現解析については、標的遺伝子の発現を定量的RT-PCR法により解析する。該当なし当初の予定通り、実験推進に必要な消耗品の購入、成果発表などのための旅費、および実験補助のための人員に対する謝金に使用する。
カロリー制限における新規の血糖制御機構と糖毒性への小胞体ストレス反応について

カロリー制限(CR)による寿命延長効果の解明を目的に、小胞体ストレスおよびFoxO1に着目して検索を行った。ES-TRAPマウスでは、小胞体ストレス反応はCRにより減弱する傾向であった。FoxO1ノックアウトマウス(koマウス)では、CRによる酸化ストレスによる細胞周期やDNA修復に関連する遺伝子の発現上昇が抑制された。また、CRによる抗腫瘍効果がko-CRマウスでは認められなかった。このことから、FoxO1がCRによる酸化ストレスへの応答や抗腫瘍効果に関与することが示唆された。カロリー制限は、メタボリックシンドロームの病態とは対照的な表現型とともに寿命の延長を示すが、その分子機構については解明されていない。カロリー制限動物は、ストレス耐性であることおよびインスリン非依存性のグルコース恒常性機構の存在が示唆されている。そこで本研究課題では、カロリー制限における新規のグルコース恒常性機構の同定および糖毒性に対する小胞体ストレスの動向ならびにそれらの寿命延長への関連について検索することを目的とする。低濃度および高濃度のグルコースを、6ヶ月齢のラットに一晩絶食後投与すると、低濃度での投与では以前の報告と同様に、カロリー制限動物では投与後15分での血中インスリン濃度の上昇がみられなかった。さらに、投与後7.5分においても、カロリー制限動物では、血中インスリン濃度の上昇は見られなかった。このことから、低濃度グルコース刺激時において、カロリー制限動物ではインスリン非依存性の糖代謝機構が働いていることが示唆された。一方、高濃度グルコースの投与では、カロリー制限動物では対照群である自由摂食動物よりも、血中インスリン濃度が上昇した。以上より、カロリー制限動物のグルコース恒常性機構は、グルコース濃度依存性に異なる機構が働いていることが示唆されたことから、グルコース刺激時のインスリンシグナルの変化やインスリン非依存性シグナルの同定・解析を現在行っているところである。また、グルコース刺激時のストレス応答について、ERストレスと中心に検索中である。自由摂食およびカロリー制限下にある6ヶ月齢のC57BL/6Jマウスの摂食前後2時間において、自由摂食群での血糖値ならびに血中インスリン濃度に変化はみられなかった。カロリー制限群において、血糖値は自由摂食群に比べて優位に減少していたが、摂食前後に差はなく、血中インスリン濃度は摂食後に優位に上昇していた。また、カロリー制限群の肝臓でのインスリン受容体のリン酸化は、摂食後において優位に上昇していたが、その下流に位置するAktのリン酸化に変化がみられなかつた。以上のことから、マウスにおいてもインスリン非依存性のグルコース恒常性気候が存在することが示唆された。現在、インスリン感受性臓器である骨格筋や脂肪組織でのインスリンシグナルについても同様に解析中である。また、小胞体ストレスを経時的に観察できるES-TRAPマウスについて、カロリー制限群では血糖値、血中インスリンおよびアディポネクチン濃度が、自由摂食群に比べて優位に減少していた。現在、摂食の変化によるERストレスの変化を検索中である。カロリー制限は寿命の延長を示すが、その分子機構については解明されていない。カロリー制限動物はストレス耐性であり、その寿命延長機構にインスリンシグナルの関与が示唆されている。そこで、小胞体ストレスを経時的に観察できるES-TRAPマウスを用いて、血糖値や血中インスリンおよびアディポネクチン濃度を測定したところ、同マウスのカロリー制限群では自由摂食群に比べて優位に減少していた。ES-TRAPマウスにおいて小胞体ストレスのモニターとなる血清中のSEAP活性を測定したが、カロリー制限群と自由摂食群間に有意な差は認められなかった。次に、カロリー制限マウスでは摂食前では血中インスリンの腕が低下し、摂食後は上昇することから、肝臓や骨格筋、脂肪組織におけるインスリンシグナルについて検索を行った。骨格筋や脂肪組織では、血中インスリン濃度の変化に対応してインスリン受容体およびその下流のAktのリン酸化が摂食後に有意に上昇するが、肝臓ではAktのリン酸化に変化がみられなかった。また、カロリー制限マウスではインスリンシグナルの下流に位置する転写因子FoxO1の核内での発現が、摂食状態に関係なく有意に上昇していた。そこで、FoxO1のカロリー制限における役割を検索するために、FoxO1ノックアルトマウスを導入した。カロリー制限マウスでは、酸化ストレスに対する応答(FoxO1、p21の核内移行、ストレス応答遺伝子発現)は増強し、腫瘍発生頻度は減少していたが、これらの効果はFoxO1ノックアウトマウスで減弱した。よって、FoxO1は、カロリー制限における酸化ストレス応答と抗腫瘍効果に強く関与していることが推察された。
反応拡散を利用した超高圧下のTiーAl系状態図の作成と状態図計算

1.目的TiーAl系合金は近年軽量耐熱材料として注目を集めており、多くの研究者によってこの系の状態図は研究されている。しかし常圧下の状態図ですら、研究者によって異なっており未だ不明な点が多い。そこで、本研究では反応拡散法を用いて、まず常圧力下のTiーAl系状態図を作成し、さらに超高圧力下の状態図についても研究を行った。2.実験方法99.79wt%Tiと99.99wt%Alからア-ク溶解によりTiー9.3,18.5,39.1wt%Al合金を作製し、均一化焼純を、行った。常圧実験の拡散対は、これらの合金を抵抗溶接により接合したものを用い、これをArガスとともに封入して973ー1623kの温度範囲で焼純した。なお、ガスの圧力は焼純温度でほぼ常圧となるように設定した。一方、常圧と同じ上記の合金を4×2.5mmの円板に加工し、これを組み合わせて高圧実験の拡散対とし、立方体WCアンビル型装置を使って高圧を負荷して焼純を行った。温度は、1123ー1623Kの範囲で、±1K程度に制御され、40K/S以上の速度で冷却した。焼純後、拡散対はEPMAにより相境界濃度を測定し、状態図を作成した。2.結果(1)常圧実験の結果(1)Murrayによるとα相は1558K以上では存在しないとしているのに対して、最近のMcCilloughらの高温X線の結果とHuangらの組織観察による結果はいずれも約1700Kの高温までα相が安定していることを示した。本研究においては1558K以上の高温度地域でもα相が反応相として形成され、その塑性範囲も後者の実験結果とよく一致している。(2)Ti_3AlがMurrayの状態図よりも70K程度高い約1523Kの温度域まで存在した。(3)1400K以下の温度域では、Murrayの状態図は本研究の結果とよく一致した。(2)高圧実験の結果(1)2.2GPaの高圧を加えることにより、αTiおよびTiAlの存在領域は常圧よりさらに50K高い1573K付近まで拡大した。(2)Ti_3Al、TiAlの存在領域は高圧力により大きく変化しなかった。
無脊椎動物の血球細胞機能とその生体防御系における役割

我々が研究対象としているカブトガニでは、血球細胞のLPSに対する反応性が極めて高く、瞬時に細胞の脱顆粒をへて、体液凝固が引き起こされる。また、この血球抽出液は、β-グルカンによっても凝固反応が惹起され、1981年に我々はβ-グルカン感受性プロテアーゼ前駆体の存在を確認し、Factor Gと命名した。Factor Gは、単離の過程で活性化を受けやすく、さらにその活性型は数日で酵素活性を失う極めて不安定な性質をもつことからその、精製は困難を極めたが、最近、再現性のよい精製法を確立した。精製Factor Gは72kDaのサブユニットαと37kDaのサブユニットβの二つのポリペプチドが非共有結合で会合したヘテロダイマーの構造をもつ。活性化に伴って、両サブユニット共に、Arg-Glu,Arg-I1eという特定の配列が限定水解を受け、サブユニットαは55kDaと17kDaのフラグメントに、サブユニットβは34kDaのフラグメントに変換される。Factor Gは種々の(1→3)-β-1inkageを含むグルカン類によって活性化されるが、中でも、直鎖上のcurdlanあるいはparamylonに最も強く反応した。また、Factor Gの活性化においては、curdlanとのモル比が重要であり、β-グルカンと結合したFactor G分子間の相互作用によって活性化が起きる。さらに精製標品を用いた再構成実験により、活性型Factor GはLPS感受性凝固カスケード中のProclotting enzymeを特異的に活性化することが明らかになった。また、cDNA Cloningの結果より、サブユニットαは(1→3)-β-D-glucanase A 1,Xylanase Zと相同性の高いドメインからなるモザイクタンパク質であり、一方、サブユニットβはセリンプロテアーゼ前駆体そのものの構造をもつことが分った。以上の結果より、Factor Gは酵素活性を担うサブユニットβと、β-グルカンとの結合を介してサブユニットβの活性を制御するサブユニットαから構成される新しいタイプのセリンプロテアーゼ前駆体であることが示された。我々がとり挙げてきたカブトガニの体液凝固は、血リンパに存在する顆粒球の凝集-崩壊によって起きる。こうした反応に関与する体液凝固については、リポ多糖によって惹起される凝固系を中心に、すでにC因子やB因子、Proclotting enzyme、コアギュローゲンが同定され、それらの分子構造も明らかにされた。一方、カブトガニの血球細胞には、β(1→3)-D-グルカンによって惹起される凝固系も存在し、Proclotting enzymeの活性化を介してゲルを形成する。β(1→3)-D-グルカンは真菌類の細胞壁の主要な構成成分であり、この凝固系もカブトガニの異物排除機構において重要である。本年度、我々はβ(1→3)-D-グルカン感受性プロテアーゼチモーゲン(G因子と命名)を血球抽出液から精製するとともに、そのcDNAクローニングを行った。G因子はa(72kDa)とb(37kDa)の2つのサブユニットから構成されており、β(1→3)-D-グルカンの存在下、自己触媒的に活性化される。先ずa、b両サブユニットの部分アミノ酸配列をもとに、オリゴヌクレオチドプラトマーを合成し、このプライマーを用いPCRを行い血球由来poly(A)^+RNAより、それぞれのサブユニットに対応するDNAフラグメントを得た。このDNAフラグメントをプローブに用い、cDNAライブラリーをスクリーニングした。

bサブユニットについては、full lengthのクローンが得られ、全塩基配列を決定した。その結果、bサブユニットは、典型的なセリンプロテアーゼであることが明らかになった。一方、aサブユニットについては、一部の塩基配列及び予想されるアミノ酸配列が明らかになったが、既知のタンパク質との有意な相同性は見いだせなかった。現在、aサブユニットのcDNA cloningは進行中である。1.血球細胞内顆粒に含まれるdefensin様タンパク質の化学構造カブトガニの血球細胞は、大小2種類の細胞内顆粒を密に持ち、その中には体液凝固因子群の他、抗リポ多糖因子やタキプレシンなど複数種のLPS結合タンパク質・ペプチドが含まれている。我々は血球細胞内の2種類の顆粒を分離し、その成分を生化学的に分析したところ、小顆粒中に新規のLPS結合タンパク質(分子量8000/SDS-PAGE)が含まれることを見い出した。それをS5と命令し、その化学構造を決定した結果、S5はアミノ酸79残基から成り、そのNH_2-末側に疎水性残基の富む領域を含み、一方COOH未側には塩基性残基のクラスターのある両親媒性物質であることが明らかとなった。また、相同配列のデータ検索から、S5は従来ヒト多形核白血球の顆粒中に見い出されていたdefensin類似物であることが分かった。海産動物でのdefensinの発見は、これが初めてである。2.血球細胞に存在するレクチン様タンパク質の同定カブトガニ血球はLPS刺激によって脱顆粒現象を起こすが、この事実は血球膜にLPSと相互作用するリセプターやLPS結合タンパク質の存在を示唆する。本年度は上記の研究と平行して、血球膜からLPS-Sepharose6Bカラムを活用しつつLPS結合タンパク質の精製を行なった。その結果、EDTAより溶出される分子量27,000の単一タンパク質を一挙に精製する事に成功し、L6と命名、その一次構造を決定した。L6は全配列22E残基で、10数残基の相同配列を持つモチーフが12回繰り返す構造から成ることが明らかとなった。また、L6のCys残基の周辺配列はCRQPC,CPKPC,CTKPCと相互に類似しており、となり同士のCys残基間でジスルフィド結合されていた。また、L6に対するポリクロナール抗体を用い、大、小顆粒に対するドットブロットを行なったところ、L6は大顆粒に特異的に存在することが判明した。L6には、ウサギ赤血球凝集活性は見い出させなかったが、LPS-Sepharose 6Bカラムから各種の単糖により溶出されるので、LPSの糖鎖を特異的に認識するレクチンである可能性が高い。