hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IPTVサービスに向けた革新的な大規模ネットワーク制御技術

本研究課題において、IPTVを確率するGMPLSにおけるパス確立におけるネットワーク制御は、1)経路計算のためのリソース情報の配布,2)リソース情報に基づいた経路の導出,3)導出された経路上でのリソース予約および切り替え制御の3ステップによって達成される.P2MPパスの確立は従来のPoint-to-Pointから,2)および3)の点において拡張が必要となり,本年度は基礎技術確立を目的として3)の切り替え制御技術についてのアルゴリズム提案を行った.切り替えのプロトコルであるRSVP-TEへとP2MP拡張提案を加え,これを実際のネットワーク制御プレーンのプロトタイプへと実装し,そのアルゴリズム性能を評価するとともに,電子情報通信学会の論文誌へと投稿を行い、2012年10月号へと採録された。また一方2)の経路の導出に関しては、経路を最適化する際に必要となる計算を高速化する必要があり、そのためにGPGPUと呼ばれる技術を適用する研究を行っている。GPGPUは並列コンピューティングに関する技術であり、そのアーキテクチャに関する深い知識が無ければ高い性能を得る事が困難である。さらには、最適化に関してその実装をどのように設計すべきか数学的な観点から深く考慮する必要があり、こちらに関しても十分な知識を必要とした。現在は、GPGPUのアーキテクチャを考慮した上で、計算処理をGPU上へと実装している段階であり、既に従来の方式よりも高い性能が発揮されるという見積もりができている。今後はこれらの技術を定性的に評価した上で、学会誌へと投稿し世界へと公表する予定である。近年の情報化社会ではクラウドコンピューティングに代表されるように,コンピュータ通信ネットワークの存在は必要不可欠となり,現在ではインタネットアクセス環境は社会インフラとして扱われる.一方で,このインフラを提供する数々のインターネットサービスプロバイダ(ISP)のネットワークに着目すると,ネットワーク内を様々に飛び交うユーザデータトラヒックが通信リソースを逼迫し,至る所で通信輻較による帯域の低下,パケット損失を発生している.これらを改善し,トラヒックの管理(Traffic Engineering)や,遅延,ジッタ,QoSと言った通信品質の保証を実現する技術として,GMPLS(Generalized Multi Protocol Label Switching)は多くの研究者から注目されており,IPTVサービスの確立の上での必須技術として本研究の研究対象でもある.本年度は,動的な通信路確立に向けた,実現性を重視した大規模ネットワーク制御のための,基礎技術の確立を目的とした。GMPLSにおけるパス確立におけるネットワーク制御は,1)経路計算のためのリソース情報の配布,2)リソース情報に基づいた経路の導出,3)導出された経路上でのリソース予約および切り替え制御の3ステップによって達成される.P2MPパスの確立は従来のPoint-to-Pointから,2)および3)の点において拡張が必要となり,本年度は基礎技術確立を目的として3)の切り替え制御技術についてのアルゴリズム提案を行った.切り替えのプロトコルであるRSVP-TEへとP2MP拡張提案を加え,これを実際のネットワーク制御プレーンのプロトタイプへと実装し,そのアルゴリズム性能を評価するとともに,電子情報通信学会の論文誌へと投稿を行った.その結果,条件付き採録を受け,現在は採録に向けて原稿の修正中である.本研究課題において、IPTVを確率するGMPLSにおけるパス確立におけるネットワーク制御は、1)経路計算のためのリソース情報の配布,2)リソース情報に基づいた経路の導出,3)導出された経路上でのリソース予約および切り替え制御の3ステップによって達成される.P2MPパスの確立は従来のPoint-to-Pointから,2)および3)の点において拡張が必要となり,本年度は基礎技術確立を目的として3)の切り替え制御技術についてのアルゴリズム提案を行った.切り替えのプロトコルであるRSVP-TEへとP2MP拡張提案を加え,これを実際のネットワーク制御プレーンのプロトタイプへと実装し,そのアルゴリズム性能を評価するとともに,電子情報通信学会の論文誌へと投稿を行い、2012年10月号へと採録された。計画通り進展している.IPTVサービスの確立のためのネットワーク制御基礎技術が確立された次の課題として,アプリケーションレイヤの技術拡張が必要となる.次世代のIPTVサービスではネットワークの相互接続性からなユーザ毎に最適化されたコンテンツが配信される.具体的にはユーザの通信帯域や受信端末などのネットワークリソースの性能を評価し,様々な解像度や通信速度での視聴を実現する,そのためには,各ネットワークリソース上でコンテンツをリアルタイムに最適化する技術が必要となる.リアルタイムの動画リサイズ技術は従来のCPUでは実現が困難であり,現在ハイパフォーマンスコンピューティングとして利用されているGPGPUを用いる.これらによって達成されたリアルタイムリサイズ技術を評価し,研究成果として論文誌や国際会議を通して対外発表していく.
プレニルトランスフェラーゼの生成物鎖長変換に対する分子デザイン

先に得られた結果より,我々はプレニルトランスフェラーゼの基質結合サイトであるアスパラギンリッチな配列(DDXXDモチーフ)の近傍上流に存在するアミノ酸が生成物であるポリプレニルニリン酸の鎖長を決定する要因であると推測した。縮合反応が進むにしたがって酵素に結合したポリプレニルニリン酸の炭素鎖は上記のDDXXDモチーフが存在するαヘリックスに沿って伸長し,最終的にこのαヘリックス上の嵩高いアミノ酸側鎖にブロックされて酵素から解離すると考えられる。この仮説を確認すべく,ゲラニルゲラニルニリン酸合成酵素において生成物の伸長をブロックすると予想されるアミノ酸を小さい側鎖のものへと置換した。段階的にキャビティーが拡張された変異型酵素を作成すべく,変異導入を繰り返すことでαヘリックス一周分ずつ離れた位置に存在する1,2,3個のアミノ酸を側鎖の小さなものに置換したところ,それらの変異型酵素においてそれぞれC_<25>,C_<3035>,C_<40>のプレニルニリン酸が主生成物として得られた。さらに,その内2および3個の置換を行った変異型酵素においては最終生成物決定が曖昧になっており,C_<50>以上の長鎖の生成物が確認された。これらの変異型酵素はキャビティーの「底がぬけた」状態にあると予想される。以上の結果は全て我々の仮説を裏付けるものであった。また,上述した一連の実験とは反対にキャビティーを狭める方向での変異導入も行っている。
超音波ウェーブレット法による材料内部の損傷過程の非破壊評価システムの開発

繊維強化材料,ポリマーアロイ,傾斜機能材料などの新素材では,材料内部の微視的構造が巨視的な機械的特性を左右する場合が多い.したがって,機能や強度の優れた材料を開発し,それらを有効利用するためには,種々の負荷の下での微視的構造の変化やそれに伴う内部損傷を正確に把握することが重要である.このような目的に対しては非破壊的な材料評価手法である超音波法が有効であると考えられるが,超音波の波形データから有意な情報を的確に抽出することは容易でなかった.本研究では,超音波の波形データに対してウェーブレット変換による時間-周波数解析を適用することにより,材料内部の微視的構造の変化や損傷を非破壊的に評価するためのシステムを開発することを目的とした.本研究により得られた成果は以下の通りである.(1)ウェーブレット変換を用いた弾性波動データの時間-周波数解析に関する基礎的な検討を行った.(2)(1)の結果に基づき,ウェーブレット変換を用いた超音波データ解析によって,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータ(群速度と減衰率)を抽出するためのソフトウェアを開発した.(3)超音波試験を実施するための試験装置を製作した.(4)局所的に損傷した試験片を用意し,(3)の装置によって超音波試験を行って波形データを得た.(5)(4)のデータを(2)のソフトウェアによって解析し,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータを抽出した.(6)以上の成果を総括し,論文発表した.繊維強化材料,ポリマーアロイ,傾斜機能材料などの新素材では,材料内部の微視的構造が巨視的な機械的特性を左右する場合が多い,従って,機能や強度の優れた材料を開発して有効利用するためには,種々の負荷の下での微視的構造の変化やそれに伴う内部損傷を正確に把握することが重要である.このような目的に対しては非破壊的な材料評価手法である超音波が有効であると考えられるが,超音波の波形データから有意な情報を的確に抽出することは容易でない.本研究では,超音波の波形データ解析に対してウェーブレット変換を適用することにより材料内部の微視的構造の変化や損傷を非破壊的に評価するためのシステムを開発することを目的とした.本研究で開発しようとするシステムは,以下のような特徴を有する.(1)ウェーブレット変換を用いた超音波データ解析によって,材料の微視的構造に関する的確な情報を正確かつ簡便に抽出する.(2)局所的に超音波パルスを送受信して,これを走査することにより微視的構造や損傷の分布を評価する.本年度は,波形データ解析用ソフトウェアを製作し,超音波試験装置を検討した.(1)システムの基本設計を行った.(2)超音波の速度及び減衰率などの材料の微視的構造やその損傷に関連する情報を超音波データから的確に抽出するために,ウェーブレット変換を用いた波形解析処理手法を検討した.(3)(2)の検討結果に基づき,波形解析用ソフトウェアを開発した.(4)超音波試験装置を製作するための基礎的検討を行った.繊維強化材料,ポリマーアロイ,傾斜機能材料などの新素材では,材料内部の微視的構造が巨視的な機械的特性を左右する場合が多い.したがって,機能や強度の優れた材料を開発し,それらを有効利用するためには,種々の負荷の下での微視的構造の変化やそれに伴う内部損傷を正確に把握することが重要である.このような目的に対しては非破壊的な材料評価手法である超音波法が有効であると考えられるが,超音波の波形データから有意な情報を的確に抽出することは容易でなかった.本研究では,超音波の波形データに対してウェーブレット変換による時間-周波数解析を適用することにより,材料内部の微視的構造の変化や損傷を非破壊的に評価するためのシステムを開発することを目的とした.本研究により得られた成果は以下の通りである.(1)ウェーブレット変換を用いた弾性波動データの時間-周波数解析に関する基礎的な検討を行った.(2)(1)の結果に基づき,ウェーブレット変換を用いた超音波データ解析によって,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータ(群速度と減衰率)を抽出するためのソフトウェアを開発した.(3)超音波試験を実施するための試験装置を製作した.(4)局所的に損傷した試験片を用意し,(3)の装置によって超音波試験を行って波形データを得た.(5)(4)のデータを(2)のソフトウェアによって解析し,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータを抽出した.(6)以上の成果を総括し,論文発表した.繊維強化材料,ポリマーアロイ,傾斜機能材料などの新素材では,材料内部の微視的構造が巨視的な機械的特性を左右する場合が多い.したがって,機能や強度の優れた材料を開発し,それらを有効利用するためには,種々の負荷の下での微視的構造の変化やそれに伴う内部損傷を正確に把握することが重要である.このような目的に対しては非破壊的な材料評価手法である超音波法が有効であると考えられるが,超音波の波形データから有意な情報を的確に抽出することは容易でなかった.本研究では,超音波の波形データに対してウェーブレット変換による時間-周波数解析を適用することにより,材料内部の微視的構造の変化や損傷を非破壊的に評価するためのシステムを開発することを目的とした.本研究により得られた成果は以下の通りである.(1)ウェーブレット変換を用いた弾性波動データの時間-周波数解析に関する基礎的な検討を行った.(2)(1)の結果に基づき,ウェーブレット変換を用いた超音波データ解析によって,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータ(群速度と減衰率)を抽出するためのソフトウェアを開発した.

(3)超音波試験を実施するための試験装置を製作した.(4)局所的に損傷した試験片を用意し,(3)の装置によって超音波試験を行って波形データを得た.(5)(4)のデータを(2)のソフトウェアによって解析し,材料の微視的構造や損傷に関連するパラメータを抽出した.(6)以上の成果を総括し,論文発表した.
D周期欠損変異型リコンビナントコラーゲンの人工臓器材料への基礎的研究

各カセットの遺伝子配列を確認後,三本鎖の一連のD-periodsを限定する4.4ブロックの234アミノ酸と78アミノ酸の一つを欠損させた新規のリコンビナントtype I procollagen cDNAを設計した.以上の6つのカセットを順次PCR2.1 transformationvector内で構築した.今後は,構築したカセットcDNAをtransfection vectorに移し,哺乳動物細胞に遺伝子導入,リコンビナント蛋白の抽出,精製を行い,安定したリコンビナント発現系の開発を行う.そして各蛋白について生化学的解析,温度安定性などについて解明していくことを計画している.
担子菌のファミリー131に属する二種類のタンパク質の構造と機能の解明

糖質加水分解酵素ファミリー131(GH131)に属する酵素は、セルロース系バイオマスによって発現が誘導されることが知られている。いくつかの酵素は、さまざまなβ-グルカンに作用することが報告されているが、大半の酵素の機能は不明である。本研究では担子菌Coprinopsiscinerea由来GH131に属する2種類の機能未知酵素CcGH131AとCcGH131Bおよび関連酵素について、その構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成30年度は、主にCcGH131Bを材料とした研究を行った。1. CcGH131Bの基質の探索を行う目的で、触媒残基であるGlu161を改変したCcGH131BE161Aの結晶にさまざまな糖をソーキングし、結合する糖を探索したところ、セロトリオースと複合体を形成することが分かった。セロトリオースは、サブサイト-3、-2、-1に結合していた。2. GH131の活性中心にはアルギニン残基が保存されており、加水分解酵素でアルギニン残基が酵素活性に関与する例はあまり知られていないことから、本酵素ファミリーの特徴であると言える。本研究では触媒残基の変異酵素CcGH131BE161Aを元に、保存されているArg112を改変した酵素CcGH131BR112Q-E161Aを作製した。結晶にグルコースをソーキングしたところ、グルコースはサブサイト-2および+1に結合していた。3.糖質加水分解酵素の活性中心には、いくつかのアスパラギン酸およびグルタミン酸残基が存在していることが知られている。そこで、CcGH131Bの活性中心付近に存在するGly165を改変し、改変酵素G165DおよびG165Eを作製し薄層クロマトグラフィーで活性を調べたが、加水分解活性は検出されなかった。4.関連する酵素として、デキストラナーゼの構造を決定した。本研究は、担子菌Coprinopsis cinereaのバイオマス分解に関与する二種類の機能未知酵素CcGH131AおよびCcGH131Bおよび関連酵素について構造と性質を解明することにより、バイオマス分解に果たす機能を明らかにすることを目的とする。平成28年度は以下の研究を行った。1. CcGH131Aについては、等温滴定カロリメトリーを用いどのような糖と反応するか測定を行った。野生型酵素とキシランを用いて実験を行ったところ、吸熱反応となり測定することができなかった。これは、野生型酵素の場合基質と結合した後何らかの酵素反応が起こる結果であると考えられた。そこで、触媒残基と考えられるグルタミン酸138をアラニンに置換した変異酵素E138Aを構築し測定を行った。その結果、CcGH131Aはキシランに対して反応が見られたが、キシロテトラオースに対する反応は見られなかった。2. CcGH131Bについては、結晶に各種糖をソーキングし、どのような糖が結合するか見るためX線結晶構造解析を行った。その結果、キシロオリゴ糖のソーキングにおいて、触媒クレフトにキシロビオースと考えられる電子密度が二つ存在していることが判明した。糖質加水分解酵素と生成物との複合体の立体構造は、通常、多数の水素結合による相互作用が観察される。CcGH131Bとキシロビオースの複合体においては、水素結合はあまり存在せず、枝があるような糖を認識しているように思われた。キシロビオース結合部位は、CcGH131Aの相当する部位に比べて深いクレフトが形成されていることが分かった。3.関連する酵素としてC. cinereaのバイオマス分解酵素CcAbf62Aなどの立体構造を決定した。CcGH131AおよびCcGH131Bが分類される酵素ファミリーGH131に属する酵素は、多くの子嚢菌および担子菌が有している。GH131に属する酵素で唯一活性が報告されているものは子嚢菌Podospora anserinaのPaGluc131Aしかない。このPaGluc131Aは、幅広い種類のβ-グルカンに対して分解活性を示すと報告されている。しかしながら、他の酵素の特異性がどのようなものなのか全く分かっていなかった。本研究によって、CcGH131A、CcGH131Bともβ-グルカンではなくキシロースで構成される糖に対して作用する可能性があること、および、CcGH131AとCcGH131Bの糖結合部位の構造には差があることから、両者の特異性はかなり異なることが明らかになった。本研究で用いたキシランは、枝構造を有するヘテロな多糖の混合物である。また、CcGH131Aはキシロテトラオースには反応しなかったことから、どのような構造を持つ糖に作用するのか直接的な同定は達成していないが、立体構造解析から多糖の枝構造のような複雑な構造を認識する可能性が考えられた。以上のことから、CcGH131AとCcGH131Bとも特異性はPaGluc131Aとは異なり、GH131に属する酵素には多様性があることが示された。本研究は、これまでさまざまな研究によっても機能がよく分からなかった酵素であることから、その機能を完全に明らかにするのは難しく比較的挑戦的な研究であると言え、今回キシロースで構成される糖に対して作用する可能性を見い出したことから、標記の評価とした。

糖質加水分解酵素ファミリー131(GH131)に属する酵素は、セルロース系バイオマスによって発現が誘導することが知られているが、その機能はほとんど不明である。本研究では担子菌Coprinopsiscinerea由来GH131に属する2種類の酵素CcGHおよび関連酵素について、その構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成29年度は以下の研究を行った。1. CcGH131Bについて、触媒残基と考えられるアミノ酸残基グルタミン酸161をアラニンに置換した酵素E161Aを結晶化しさまざまな糖とソーキングしてX線結晶構造解析を行った。その結果、セロビオースの明瞭な電子密度がマイナス側のサブサイトに、緩衝液として使用したMES分子の電子密度がプラス側のサブサイトに観察された。リガンドとCcGH131Bとの相互作用を解析するため、セロビオースおよびMES分子より4Å以内に存在するアミノ酸残基を調べたところ、16もの残基があることが分かった。セロビオースはいくつかのアミノ酸残基と直接水素結合を形成していた。これに対してMES分子の周囲にある残基はロイシンやバリンなど疎水性のものが多く、水素結合はほとんど見られなかった。このことからプラス側のサブサイトは糖ではなく疎水性の分子を認識するものと考えられた。2.基質とどのように反応するか探索するため、フッ化セロビオシドを合成しフッ化物イオンの遊離を測定することとした。しかしながら、フッ化セロビオシドは分解しやすいため正確な測定が難しく、酵素による反応かどうか特定するには至らなかった。3.関連する酵素として、β-フルクトフラノシダーゼ、α-アミラーゼの構造を決定した。これまでに機能と構造が研究されているGH131タンパク質としては、本研究の材料であるC. cinerea由来の二つのタンパク質CcGH131AとCcGH131Bの他に、子嚢菌Podospora anserina由来のPaGluc131Aがあげられる。PaGluc131AはCcGH131Aと42%の相同性があるが、我々のこれまでの研究でCcGH131AにはPaGluc131Aに見られるような活性は観察されておらず、CcGH131Aの真の基質を明らかにするには至っていない。本研究では、C. cinereaのもう一つのGH131タンパク質であるCcGH131Bに着目することで、GH131タンパク質の研究を進展させることを目指している。CcGH131Bについても真の基質を明らかにしたとは言えないので、飛躍的に進展しているとは言えないが、立体構造よりCcGH131Bは活性中心の溝がCcGH131Aより深いことが明らかになり、さらに変異酵素の解析によりサブサイトマイナス側ではセロビオースが結合すること、サブサイトプラス側では糖ではなく何らかの疎水性分子が結合することが明瞭に示された。これらのことから、CcGH131Bの基質探索はCcGH131Aと比較しかなり候補が絞られてきたと言えるため、標記の評価とした。糖質加水分解酵素ファミリー131(GH131)に属する酵素は、セルロース系バイオマスによって発現が誘導されることが知られている。いくつかの酵素は、さまざまなβ-グルカンに作用することが報告されているが、大半の酵素の機能は不明である。本研究では担子菌Coprinopsiscinerea由来GH131に属する2種類の機能
敗血症におけるオートファジーの役割とその制御

敗血症の病態で,オートファジーが重要臓器細胞で如何に関与しているかを解明し,その制御による病態の改善を企図した.マウス盲腸結紮穿孔腹膜炎(敗血症)モデルの肝においてオートファジー誘導を示すLC3-IIタンパク発現は一過性に上昇しその後下降した.GFP-LC3トランスジェニックマウス肝では,術後6-24時間におけるオートファゴソームとリソソームとの癒合を免疫染色法で確認し,それらは電子顕微鏡所見とも矛盾しなかった.一方,オートファジー阻害薬投与による肝障害と生存率低下を確認した.よって,敗血症においてオートファジーは生体保護的に働いていることが示唆された.敗血症の病態で,オートファジーが重要臓器細胞で如何に関与しているかを解明し,その制御による病態の改善を企図した.マウス盲腸結紮穿孔腹膜炎(敗血症)モデルの肝においてオートファジー誘導を示すLC3-IIタンパク発現は一過性に上昇しその後下降した.GFP-LC3トランスジェニックマウス肝では,術後6-24時間におけるオートファゴソームとリソソームとの癒合を免疫染色法で確認し,それらは電子顕微鏡所見とも矛盾しなかった.一方,オートファジー阻害薬投与による肝障害と生存率低下を確認した.よって,敗血症においてオートファジーは生体保護的に働いていることが示唆された.【目的】重症敗血症は,集中治療室(ICU)において最も問題となる,いまだ救命困難な病態であり,敗血症に罹患した患者の重要臓器ではあらゆる形態の細胞死が起こっているとされている.しかし,オートファジーと敗血症との関与を報告する研究は未だほとんど無い.今回,敗血症の病態で,オートファジーが如何に関与しているかを解明し,その正もしくは負の制御によって敗血症病態を改善させることを目的とする.【初年度の成果】敗血症時にオートファジーが促進されているか抑制されているかを,マウス腹膜炎敗血症モデル(盲腸結紮穿孔;CLP,cecal ligation and punctureモデル)にて検討を開始した.対象臓器としては,我々の既報で,マウスのCLP手術24時間後のオートファゴソーム数の増加が電子顕微鏡で確認されている肝臓において,Western blottingを行い,6,12,18,24時間後のオートファジー・マーカであるLC3タンパクの経時的定量を行った.その結果,現時点で各時間の施行検体数が少なく有意差はまだ得られていないが,6,12,18時間後では,LC3タンパク発現は,CLPでShamに比し上昇する傾向にあったが,24時間では逆にCLPモデルで低下傾向となった.これをリピートすることによって敗血症時のオートファジーの肝臓における振る舞いが判明すれば,敗血症の予後を大きく左右する敗血症性肝不全への有用な治療効果の機序の一つとして,オートファジー現象の制御という概念を臨床応用可能になると考える.また,GFP-LC3トランスジェニックマウスの胚を既に購入済みであり,それらを繁殖させた後にCLP手術を施し,各重要臓器細胞のオートファジーの動態をモニタリンクする予定である.肺炎モデルに関しては,感染実験用の動物実験施設の一室を確保し,国立感染症研究所から細菌を取り寄せるところである.【目的】重症敗血症は,集中治療室(ICU)において最も問題となる,いまだ救命困難な病態であり,敗血症に罹患した患者の重要臓器ではあらゆる形態の細胞死が起こっているとされている.しかし,オートファジーと敗血症との関与を報告する研究は未だほとんど無い.今回,敗血症の病態で,オートファジーが如何に関与しているかを解明し,その正もしくは負の制御によって敗血症病態を改善させることを目的とする.【平成23年度の成果】敗血症時にオートファジーが促進されているか抑制されているかを,マウス腹膜炎敗血症モデル(盲腸結紮穿孔;CLP,cecal ligation and puncture)にて検討した.C57BL/6雄マウスでCLPと単開腹(sham)を作成し,各臓器のオートファジー関連蛋白LC3の経時的発現をwestern blotting法にて解析した.その結果,CLPによりオートファジー誘導を示す膜結合型のLC3-II発現は,全臓器においてsham群に比しCLP群で増強していた.肝,心,脾においてLC3-II発現は顕著に増加し,CLP6時間にピークとなったが,その後減少しCLP24時間ではsham群と同程度となった.よって,CLPモデルの重要臓器において敗血症急性期にオートファジーが強く誘導され,次第に抑制されることが示唆された.また,GFP-LC3トランスジェニックマウスの繁殖に成功し,それらにCLP手術を施し,肝細胞のオートファジーの動態を免疫蛍光染色にて解析した.術後6時間の標本では,LC3の発現は増強しており,24時間で現弱傾向となった.一方で,オートファゴソームとリソソームの癒合時に増強するLAMP1は,6時間よりも24時間で増強しており,急性期にオートファゴソームの生成が促進していたが,亜急性期には相対的にオートファゴソーム分解のフェーズにシフトしていることが示唆された.オートファジーは,細胞内のタンパク分解機構の一種であり,生命維持に必須であるが,過剰になると細胞死を惹起する.一方,重症敗血症は,いまだ救命困難な病態であり,敗血症に罹患した患者の重要臓器ではあらゆる形態の細胞死が起こっているとされている.

今回,敗血症の病態で,オートファジーが重要臓器細胞で如何に関与しているかを解明し,その正もしくは負の制御によって敗血症病態を改善させることを目的とした.まず,オートファジー誘導を示す膜結合型のLC3-IIタンパク発現は,多くの重要臓器においてsham群(単開腹手術)に比しCLP群(C57BL/6雄マウス敗血症モデル;盲腸結紮穿孔手術)で増強していた.特に肝,心においてLC3-II発現は顕著に増加し,CLP6時間にピークとなったが,その後減少しCLP24時間ではsham群と同程度となった.そして,生体における唯一のオートファジーモニタリング手法とされるGFP-LC3トランスジェニックマウスを導入して免疫組織染色法にてオートファジー動態を肝組織で観察し,さらにオートファジー阻害薬(クロロキン:CQ)投与による肝障害度と生存率の変化を比較した.その結果,GFP-LC3(オートファゴソーム)とLAMP1(リソソーム)の共局在は,CLP6時間から24時間まで経時的に増加し分解過程まで至っていることが判明し,CLP群におけるオートリソソームの増加は電子顕微鏡でも確認された.またクロロキン投与後の平均生存時間はCLP 72.4hr,CLP+CQ 38.9hr,sham 144hr,sham+CQ 144hrと,オートファジー抑制により生存率が有意に低下した.さらにクロロキン投与により,肝細胞障害増悪(血清AST値上昇)も確認された.これらのことから,腹膜炎敗血症においてオートファジーは生体保護的に働いていることが示唆された.GFP・LC3トランスジェニックマウスの作成に思いのほか難渋したため,オートファジーの抑制もしくは促進の介入実験に及んでいない.しかしながら現在は,同マウスは順調に繁殖し,注目している重要臓器の一つである肝について,すでに免疫蛍光染色による解析が前記のごとくすすんでいる.今後はこの若干の遅れを十分取り戻すことが可能と考えられる.24年度が最終年度であるため、記入しない。GFP・LC3トランスジェニックマウスに対する,免疫蛍光染色を用いた実験結果から,敗血症病態においてオートファジーが抑制されていると判断された場合は,autophagy hlducerであるrapamycinを,逆にオートファジーが亢進していると判断された場合は,autophagyinhibitorであるbafnomycinA1をCLP手術施行1時間後に腹腔内投与し,オートファジーの制御を試みる.そして,この24時間モデルにおいて,各主要臓器においてCLPによる侵襲が制御されているか否かにつき検討し,survival studyへと進展させる.その他のオートファジーの制御因子としては,インスリンや,侵襲早期の栄養投与なども検討し,オートファジー動態とサイトカイン発現やsurvivalとの関連につき検討を重ねる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
細菌感染による腎炎モデルマウスの作製と新規治療法の開発-CpGモチーフを用いて-

本研究計画では、CpGモチーフを用いたANCA関連腎炎および抗基底膜抗体腎炎のモデルマウスの確立を目的とする。ANCA関連腎炎モデルマウス作製にはmyeloperoxidaseを用い、抗基底膜抗体腎炎モデルマウス作製にはGoodpasture症侯群の原因とされているcollagen type IV alpha3鎖NC1ドメインを用いた。CpGモチーフはB細胞やマクロファージ、樹状細胞が発現しているToll-like receptor 9(以下TLR9)をreceptorとし、免疫グロブリンやサイトカイン産生、補助機能分子発現誘導等を介して自然免疫における重要な役割を担っていると考えられている。Recombinant myeloperoxdase(以下rMPO)とCpGオリゴDNAをアジュバントとともにマウスの腹腔に投与(0週、2週、4週の3回)し、第8週まで観察した。マウスはB6およびbalb/cの2系統を使用したところ、balb/cマウスにおいて第6週目よりMPOに対する抗体を認めた。コントロール群(rMPOとnon-CpGオリゴDNAを投与)では8週目まで抗MPO抗体の上昇は見られず、抗MPO抗体の出現にCpG DNAが関与している可能性が示唆された。第8週目に腎組織像を観察したが、明らかな糸球体病変は確認できなかった。B6マウスでは実験群、コントロール群ともに血清学的および病理組織学的に変化は認めなかった。今後、balb/cマウスを用いANCA関連腎炎モデルマウスとしてふさわしい条件を検討していく予定である。加えて、TLR 9に対して抑制性に働くinhibitory CpG DNAの開発を行い、腎障害の改善あるいは予防に有効かどうか検討する予定である。本研究計画では、1年目にCpGモチーフを用い抗基底膜抗体腎炎およびANCA関連腎炎のモデルマウスの確立を目的とした。抗基底膜抗体腎炎モデルマウス作製にはGoodpasture症候群の原因とされているcollagen typeIV alpha3鎖NC1ドメインを用い、ANCA関連腎炎モデルマウス作製にはmyeloperoxidaseを用いた。Collagen type IVについては塩基数がおよそ800塩基で全長を大腸菌に発現させることが可能であったが、大量培養したところそのほとんどが不溶性分画に存在し、可溶性分画には極小量しか得られず免疫原として十分な量を得るにいたっていない。またmyeloperoxidaseに関しては塩基数がおよそ3500塩基でありその全長を大腸菌に発現させることは不可能であった。そこで国立感染症研究所の鈴木和男先生より全長のmyeloperoxidase組換え蛋白質の分与をうけた。Myeloperoxidaseについても可溶性にすることは困難であり、現在これらの不溶性蛋白質の免疫原性を高めるよう条件検討中である。一方、モデルマウスの腎機能評価のためにポリクローナル抗マウスネフリン抗体を作製した。これはマウスネフリンの細胞内ドメイン前半部分を組換え蛋白質として大腸菌にて作製し、ウサギへ反復投与し得られた血清をアフィニティークロマトグラフィーにて精製して作製した。現在、ネフリンの染色態度と腎機能との相関についてSLEモデルマウスを用いて検討中である。
神経活動の人工制御システムを用いた空腹・満腹中枢神経を介した味覚制御機構の解明

そこで、本研究ではマウスを用い、視床下部摂食中枢神経の活動をコントロールし、いわば人為的に空腹状態を再現することで、味覚感受性の制御機構を解析した。その結果、空腹に伴い甘味感受性が高まるのに対し、苦味感受性が低下した。視床下部が空腹に伴う味覚の調節を担うことが明らかになった。食物は栄養・味覚・生体調節の3つの機能を併せ持つ。しかし、これまで各因子は独立に研究されてきた。このため、これらを統合しなければ分からない課題、例えば栄養状態や体調の変化により味の感じ方が変わる原因は未だに不明である。本研究では最新の神経科学的手法により食欲中枢の神経活動を制御し、いわば人工的に満腹・空腹状態を再現することで味の感度・閾値や食の嗜好性が変化するかどうかを検証する。また、そのような変化を引き起こすメカニズムの解明を目指す。栄養因子・エネルギー状態の変化は末梢の臓器や様々な神経の様々な応答を誘導する。本研究は、これら末梢の臓器による副次的な影響を排除し、脳内における味・栄養情報の統合・評価機構を解明するはじめての取組みであり、食品科学分野に新たな学問領域を拡げるものといえる。本年度は、DREADD法という最新の神経科学的手法を用い、マウス脳視床下部に存在する摂食亢進神経を人工的に活性化し、空腹状態を再現できるかどうかを検証した。その結果、摂食亢進神経を人工的に活性化すると、マウスは絶食後に再給餌した場合と同様にエサを短時間に大量に摂取することを確認した。そこで、このマウスを用いて様々な味溶液に対する感受性の評価を行った。その結果、人工的に空腹状態を再現したマウスでは味に対する感受性が通常状態から変化すること見出した。また、この変化はマウスを実際に絶食させた場合にも観察された。このことから摂食中枢の神経の活動に応じて味覚感受性が調節されることが示唆された。視床下部の食欲中枢神経を起点とした神経ネットワークを選択的に活性化することで、人工的に空腹状態を再現できることを確認した。このマウスを用いて味感受性の評価を行ったところ、マウスを絶食状態にした場合と同様に味に対する感受性が通常状態から変化すること見出した。例えば、空腹のときの方がそうでない場合と比べ、甘味に対してより敏感に感じられるということは経験的には知られているもののそのメカニズムは不明である。本研究では最新の神経科学的手法によりマウスの摂食中枢の神経活動を制御し、いわば人工的に満腹・空腹状態を再現することで味の感度・閾値や食の嗜好性が変化するかどうかを検証する。昨年度までの成果により視床下部の摂食中枢の活動に応じて味覚感受性が調節されることが示唆された。そこで、本年度はこの神経の役割について詳細な解析を行った。視床下部弓状核に細胞体が存在するため、この神経が脳内のどの部位に投射しているのかを抗体染色により解析した。その結果、投射先は1か所ではなく脳内の複数の部位であることが明らかになった。そこで、光応答性のイオンチャネルをこの神経細胞に導入し、光ファイバーを複数の投射先のうちの1か所に挿入した。これにより、特定の部位に投射している神経のみをレーザー光依存的に活性化できる。各投射先の摂食および味覚に与える影響を評価したところ、視床下部の特定の神経核に投射する一部の神経が味覚感受性に影響を及ぼすことが明らかになった。視床下部の食欲中枢神経を起点とした神経ネットワークが味覚感受性に影響を与えることから、ネットワーク内のどの部位が味覚に影響を与えるかを検証した。光遺伝学的スクリーニングにより、視床下部の特定の神経核を介した経路により味覚感受性が調節されることが示唆された。平成28年度までの成果により、視床下部が味覚感受性を調節することが明らかになった。そこで、本年度はその作用点を検証する為、視床下部弓状核のAgRP神経を人工的に活性化させた際の味覚伝導路の中継点の神経活動の評価を行った。脳幹の橋に存在する結合腕傍核には味覚を伝達する神経が存在することが知られている。そこで、この部位における味刺激依存的な応答を神経活動マーカーc-fosの発現を指標に測定した。その結果、AgRP神経の活動が高まると、味覚依存的なc-fos発現の上昇が抑制されることが示唆された。

重要な事にこのような変化は生理的に空腹な場合でも観察された。以上より、視床下部の活動が脳幹における味覚伝導路の一部に作用することで、味覚感受性の修飾がなされることが示唆された。そこで、本研究ではマウスを用い、視床下部摂食中枢神経の活動をコントロールし、いわば人為的に空腹状態を再現することで、味覚感受性の制御機構を解析した。その結果、空腹に伴い甘味感受性が高まるのに対し、苦味感受性が低下した。視床下部が空腹に伴う味覚の調節を担うことが明らかになった。味覚感受性の制御を担う摂食中枢の神経が味情報を伝達する神経に及ぼす影響を明らかにするため、両者の位置関係を多重蛍光免疫組織染色にて詳細に解析する。また、視床下部の神経の投射先のどの神経が味や嗜好性の変化に影響を及ぼすかを探索する。味覚感受性に影響を及ぼす視床下部の神経の分子特性・投射先を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。味覚科学、神経科学、食品科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
糸状菌が大量分泌する脂肪球の膜構成分子の解析と応用

我々は、糸状菌による高度不飽和脂肪酸生産研究の過程で、脂質を大量に菌体外へ分泌する変異株を得ることに成功した。昨年度において、この変異株における脂質分泌生産機構の解明へ向け、分泌される脂肪球膜を構成する分子種の解明を試み、セレブロシド様物質が分泌脂肪球膜の主要極性脂質であり、特異な界面活性機能を担っていることを明らかにした。本年度は、このセレブロシド様物質の構造解析を試みた。脂質分泌性変異株V6株の培養液上清よりBligh-Dyer法にて全脂質画分を抽出した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフを用いて単離精製を行った結果、薄層クロマトグラフ上でウシ由来のセレブロシド標品の移動度に近い3つのスポットが確認され、それぞれサンプル1、サンプル2、サンプル3とした。ガスクロマトグラフ及び質量分析の結果から、サンプル1はステロールにグルコースが結合したステロール配糖体であることが判明した。また、ガスクロマトグラフ、質量分析及び核磁気共鳴解析の結果から、サンプル2はグルコース、炭素数14、15、16の2-ヒドロキシ飽和脂肪酸、炭素数19で、9位にメチル基、4位と8位に二重結合を持つスフィンガジエニン型長鎖塩基から構成されるセレブロシドであると同定された。またガスクロマトグラフ、質量分析及び核磁気共鳴解析の結果、ならびに薄層クロマトグラフ上での移動度の違いから、サンプル3はグルコース、炭素数14、15、16の2-ヒドロキシ飽和脂肪酸、炭素数19で、2つの二重結合と2つの水酸基を持つヒドロキシスフィンガジエニン型長鎖塩基から構成されるセレブロシドであると推定された。本研究ではこの変異株における脂質分泌生産機構の解明へ向け、分泌される脂肪球膜を構成する分子の構造と機能の解明を試みた。アラキドン酸生産性糸状菌Mortierella alpina 1S-4株から変異処理により得られた脂質分泌性変異株V6株の培養液上清より、分泌脂肪球を濃度勾配遠心法にて精製し、精製分泌脂肪球よりBligh-Dyer法にて全脂質画分を抽出した後、薄層クロマトグラフィーにより極性脂質分子種を解析した結果、主成分としてセレブロシド様物質を、また、リン脂質を微量成分として同定した。そこで、分泌脂肪球膜の主要極性脂質であったセレブロシド様物質の単離・精製および構造解析を試みた。脂質分泌性変異株V6株の培養液上清よりBligh-Dyer法にて全脂質画分を抽出した後、各種クロマトグラフィーによりセレブロシド画分を精製した。その結果、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて挙動が異なる2つの分子種が得られた。これらをSphingolipid ceramide N-deacylaseにて処理し、薄層クロマトグラフィーにより分析したところアミノ基の存在が認められ、これらの極性脂質はセレブロシドであることが確認された。GLC、GC-MSの結果から、これらのセレブロシドはいずも炭素数14、15、16の2-ヒドロキシ飽和脂肪酸を主要構成脂肪酸とし、構成糖はグルコースであることが判明した。従って、これら2つの分子種の差異は長鎖塩基部分の構造の違いによるものと予想された。
非可逆画像符号化に耐性を持つステガノグラフィに関する研究

本年度は、提案手法をカラー画像へ適応させた。具体的には、まず色空間が埋め込み抽出に与える影響を調査し、次いてカラー印刷物をカバーメディアとした場合の提案手法の能力について調査した。フルカラービットマップ表現からJPEG圧縮、伸張そしてフルカラービットマップ表現というデータの流れを考える。カラー画像は計算機上では一つの色空間内で表現される。RGB色空間がよく利用されるが、JPEG等のカラー画像圧縮ではYCbCr色空間が利用される。この2種類の色空間を用い、ビットマップ表現時に埋め込んだ情報が、JPEG圧縮を経由することにより、どの程度抽出できるのかを調べた。実験の結果、YCbCr色空間を利用した場合に良好な結果が得られた。これは、途中で経由するJPEG圧縮がYCbCr色空間内で行われる、Y成分をできるだけ保存するような方式である,という2点からRGB色空間よりも良好な結果が得られたと考えられる.カラー印刷物をカバーメディアとして実験を行った。フルカラービットマップ表現時に情報を埋め込み、そのデータをプリンタへ出力する。紙面上に印刷された画像データをスキャナで読み取り、計算機内でフルカラービットマップ表現に変換する。ビットマップ表現時に情報を埋め込み、再構成されたフルカラービットマップ画像から情報を抽出する。従来法の場合、埋め込み位置が第2ビットプレーンであることと隠匿情報を表すパターンが規則的な特徴を持つため、画像を拡大するとパターンの存在をはっきりと認識することができる。一方,提案法の場合、埋め込み位置が第5ビットプレーンであることと秘密情報を表すパターンが画像上の雑音に近い変化をしているため、拡大しても不自然なパターンが生成されていなかった。本年度は、M系列の位相検出能力の調査、濃淡画像に対する提案アルゴリズムの実装および種々のフォーマットに対する頑健性を調査した。M系列は、ランダムなビット系列であり、ある種によりその系列が生成される。このビット系列を構成するそれぞれのビットに対して、ある確率でエラーを発生させる(ビットを反転させる処理を行うことに相当する)。そのビットエラーが発生したM系列の位相をある程度変化させ、新たなM系列を生成する。本年度は,生成されたM系列とオリジナルのM系列との位相差を計算し、正確な位相差が計算できるビットエラーの限界値を、実験的に調査した。画像データには濃淡画像、限定色カラー画像やフルカラー画像等があるが、本年度は,データ構造が最も単純な濃淡画像をカバーデータとする場合の埋め込みアルゴリズムを,C言語を用いて計算機上に実装した。非可逆符号化としてJPEGが最も有名であるが、近年、JPEG2000なる新たなフォーマットが提案され、次世代フォーマットとしての期待が高まっている。そこで、本研究では、JPEGとJPEG2000を非可逆画像符号化フォーマットとして利用する。非可逆符号化では、符号化後のデータ量は可変であり、そのデータ量が少ないと画素値の変化も大きくなり、埋め込まれた情報を抽出することが困難になる。JPEGおよびJPEG2000には、符号化後のデータ量を調節するパラメータ(JPEGではQ-Factor、JPEG2000ではrate値)が存在する。そこで、本年度は,本アルゴリズムで情報埋め込みを行った場合に、それらのパラメータ値をどの程度まで変化させても、埋め込まれた情報が正確に抽出できるかを実験的に調査した。
生化学領域における活用を目指した動的光散乱電気泳動装置の試作

生化学の研究ではゲル電気泳動法が広く活用されている.この方式を,かつては電気泳動の主流であったチセリウスの移動境界法電気泳動と比較すると次のような利点と欠点があげられる. :(1)利点:簡便・高分解能・試料の必要量が僅か;(2)欠点:低い定量性・即時測定の不可能・検出に際しての試料の損壊.これ程までに,電気泳動が普及しているのに関わらず,その基礎的研究を行う研究者が僅かであり,最近は新規な手法の開発のペースも鈍ってきている.我々は,電気泳動の基礎的研究を盛んにする為のひとつの手だてとして,自由溶液中での蛋白質の電気泳動を正確・簡便・迅速に測定できる,言わばチセリウスの電気泳動装置の現代版の製作を企画し,本研究費補助金の援助を得て試作研究を進めてきた.幸い,試作は成功裡に終了し満足できる動的光散乱電気泳動装置が完成した.試作装置の構成・性能などの詳細は成果報告書に記載した通りである.バイオテクノロジーの進展に伴って,蛋白質から細胞に到るまで,特性を評価すべき新規な対象は日毎にその数を増してきている.電気泳動挙動はそれら特性の中にあって特に重要なものである.試作装置を母体として優れた市販装置が誕生しようとしている.蛋白質から細胞まで,汎用的に自由な溶液中で電気泳動移動度を決定できる装置を本試験研究によって世に送り出すことが出来たのは,代表者として喜びに耐えない.今後は試作機を我々の研究のあらゆる局面で活用して,その有用性を確認・顕現してゆきたい.生化学の研究ではゲル電気泳動法が広く活用されている.この方式を,かつては電気泳動の主流であったチセリウスの移動境界法電気泳動と比較すると次のような利点と欠点があげられる. :(1)利点:簡便・高分解能・試料の必要量が僅か;(2)欠点:低い定量性・即時測定の不可能・検出に際しての試料の損壊.これ程までに,電気泳動が普及しているのに関わらず,その基礎的研究を行う研究者が僅かであり,最近は新規な手法の開発のペースも鈍ってきている.我々は,電気泳動の基礎的研究を盛んにする為のひとつの手だてとして,自由溶液中での蛋白質の電気泳動を正確・簡便・迅速に測定できる,言わばチセリウスの電気泳動装置の現代版の製作を企画し,本研究費補助金の援助を得て試作研究を進めてきた.幸い,試作は成功裡に終了し満足できる動的光散乱電気泳動装置が完成した.試作装置の構成・性能などの詳細は成果報告書に記載した通りである.バイオテクノロジーの進展に伴って,蛋白質から細胞に到るまで,特性を評価すべき新規な対象は日毎にその数を増してきている.電気泳動挙動はそれら特性の中にあって特に重要なものである.試作装置を母体として優れた市販装置が誕生しようとしている.蛋白質から細胞まで,汎用的に自由な溶液中で電気泳動移動度を決定できる装置を本試験研究によって世に送り出すことが出来たのは,代表者として喜びに耐えない.今後は試作機を我々の研究のあらゆる局面で活用して,その有用性を確認・顕現してゆきたい.電気泳動は今日の生化学の研究に欠かすことの出来ない手段となっているが、ゲル電気泳動などの相対的な手法が中心になっている。しかし、電気泳動移動度の絶対値を必要とする局面も少なくない。かつて広く用いられたチセリウスの電気泳動装置は今日の現場の要請に応えがたい。本研究はこの状況を踏まえて、今日的な電気泳動移動度の絶対値の測定装置を試作しようとするものである。試作に当っては最初から普及装置に円滑に移行できるものを手掛けるという設計思想を採用し、コンパクトな光学台の上下に光源、泳動セルそして測光系をすべて収容した。正負の電圧を交互に発生する電気泳動用の電源を含めて主要部分は製作を終わっている。試作装置は30、60そして90度の角度において散乱光を測定することができる。前二者は動的光散乱電気泳動そして第三は単純な動的光散乱測定用である。測定された散乱光強度の揺らぎはコンピューター(PC 9801/VMO)により相関計算を行っている。現在、ラテックスを試料として予備測定を行なって、移動速度と印加電圧の間に直線性を認めうる段階に達している。上記の試作の進行に当っては大学関係者とユニオン技研(株)の関係者の間で密接な連絡及び協議を行ってきた。両者の合同打合せ会は既に昭和60年の7月26日、9月21日、12月27日、そして61年1月19日、2月26日の5回にわたって開催している。大阪圏以外の分担者にあっては、白浜(佐賀大)が2回来阪して打合せに参画した。また、須沢(広島大)は標準ラテックスを調製し、ゼーターポテンシャルを顕微鏡電気泳動法で確定してから供給し、装置の性能検定に寄与した。今後は試作装置の性能のテストに入るので、これまでに勝る緊密な協力体制で進むことにしている。蛋白質の溶液に電場をかけると、蛋白質分子は自己の荷電の符号と逆の電極へ向かって電気泳動を開始する。この時に、レーザー光を照射していると、蛋白質分子に当って散乱される光の周波数がドプラー効果のためにシフトする。

本研究はこの周波数変化を測定することにより蛋白質の電気泳動挙動を評価できる装置を試作しようとするものである。試作装置は製作を終わっており、本年度においてはテスト測定そして得られた結果にもとずく改良の施行を繰り返してきた。特に泳動セル部分について入念な設計変更を行ない、またフーリエ変換を中心としてプログラムの改良に努力した。昨年度は強い散乱光を発するラテックス粒子について電気泳動の測定に成功している。本年度の成果として強調したいのは、まず分子量13万のポリスチレンスルフォネートそして次には分子量6万強のウシ血清アルブミンについて電気泳動の測定に成功したことである。しかし、残念ながらウシ血清アルブミン免疫グロブリンの分離には成功しなかった。分離能の向上が今後に残された最大の課題である。本研究は蛋白質を対象として日常的に安定に作動する動的光散乱電気泳動装置を試作し、最終的には市販装置として通用するものの完成を目指している。今年度は目標の達成に向かって着実な前進を成し得たものと確信している。