hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜表面型プロテオグリカンの遊離を介した新規骨格筋再生機構の解明

本研究は、筋再生時に骨格筋間葉系前駆細胞(MPC)に由来する遊離型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)が担う機能の解明を目的とするものである。本研究でMPCモデルと位置付けているラット2G11細胞は、bFGF依存性に脂肪分化能を獲得し、TGFβ誘導性に線維芽細胞へ分化する。本年度は、1MPCの分化に伴うCSPG4の産生変化と2骨格筋の線維化・脂肪蓄積を示すジストロフィン欠損ラット(DMDラット)でのCSPG4欠損の影響を調べた。12G11細胞にbFGFを添加したところ、CSPG4分子全長相当の約310 kDaの分子の発現量増加とともに、約120 kDaの短いCSPG4分子が検出された。これらの変化はTGFβ添加時にはみられなかった。筋再生過程では間質内のbFGF量の一過的な増加がみられることから、短いCSPG4分子はこの過程でMPCにおけるbFGF依存性の脂肪分化能獲得を仲介している可能性が考えられた。2CRISPR/Cas法を用いて作出したCSPG4欠損ラットとDMDラットの交配によって得られたCSPG4欠損DMDラットから、速筋である前脛骨筋および遅筋であるヒラメ筋を採材した。脂肪蓄積量については、前脛骨筋、ヒラメ筋共にCSPG4欠損による影響はみられなかった。線維化についてはヒラメ筋でのみ亢進がみられた。この結果から、生体内においてCSPG4は線維化に対し抑制的に機能し、この機能は骨格筋の種類により異なる制御を受ける可能性が考えられた。遅筋と速筋では再生能に違いがあるとされている。bFGFを含む成長因子やCSPG4の切断に関わるプロテアーゼの発現や産生が遅筋と速筋では異なることから、それが発現するCSPG4の量や分子種の違いを生み、遅筋と速筋での再生能の差異を生み出している可能性が考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、筋再生において骨格筋内脂肪前駆細胞に由来する遊離型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)が担う機能を明らかにしようとするものである。本課題の遂行中、我々が骨格筋内脂肪前駆細胞のモデルとして利用する2G11細胞が、TGFβ依存性に線維芽細胞分化能をも示す間葉系前駆細胞クローンであることが判明した。そこで本年度は2G11細胞を脂肪分化能と線維芽細胞分化能の両者をもつ間葉系前駆細胞と位置づけ、その分化特性を調べるとともに、その分化制御機構におけるCSPG4の関与について検討を加えた。その結果、bFGFにより脂肪分化能を獲得した後であっても、TGFβ依存性の線維芽細胞への分化能は維持されていることが判明した。一方、TGFβにより線維芽細胞への分化過程に入った2G11細胞にbFGF処理をおこなうと線維芽細胞への分化はおこるものの、αSMAの発現量やストレスファイバー形成は低下することがわかった。また、siRNAを用いた遺伝子発現抑制によりCSPG4の発現を低下させた場合、bFGFによる脂肪分化能獲得が阻害されるとともに、TGFβにより線維芽細胞へ分化した際のαSMAの発現量やストレスファイバー形成は低下した。筋ジストロフィーなどの筋原生疾患では骨格筋内に線維化や脂肪化がみられる。以上の知見は、これらの病態成立過程における各種細胞成長因子とCSPG4との相互作用による間葉系前駆細胞の分化制御機構解明の一端となることが期待される。今後は、bFGFやTGFβの作用を調節するCSPG4分子のドメイン探索を目的とした変異型CSPG4発現2G11細胞の作成や、筋組織の線維化や脂肪化といった病態を示すジストロフィン遺伝子変異ラットでのCSPG4欠損の影響について調べる予定である。本課題は、筋再生が周囲に存在する他の非筋細胞由来の因子により制御されるというコンセプトに基づくものである。本課題でそれを担う因子として着目したCSPG4は、骨格筋に存在する脂肪前駆細胞に由来する因子という位置づけで研究を開始したが、CSPG4を発現する脂肪前駆細胞が線維芽細胞への分化能をも有する間葉系前駆細胞であること、さらに、CSPG4分子が間葉系前駆細胞自身の分化制御にも関与するという知見が得られたことは当初の予想を上回る成果であった。筋ジストロフィーなどの筋原性疾患では間葉系前駆細胞に加えて、そこから分化した線維芽細胞や脂肪細胞などが骨格筋内に共存した状態にある。このことは遊離型CSPG4の産生が細胞の分化段階によって異なっている新たな可能性を示すもので、今後、遊離型CSPG4がもつ筋再生における役割を追究していくにあたっては、その供給源となる細胞の種類という新たな視点を加える必要がある。特に、本課題で利用を計画しているジストロフィン遺伝子変異ラットでは実際に筋組織の線維化や脂肪化といった病態を示すことから、当該ラットにおけるCSPG4欠損の影響を調べていくうえで、本年度に得られた知見が大きく役立つと思われる。以上の理由により、現在までの進捗状況を評価した。本課題は、筋再生時の遊離型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)が担う機能の解明を試みるものである。本課題で遊離型CSPG4の産生源として位置付けているラット骨格

筋間葉系前駆細胞(MPC)のモデルである2G11細胞は、bFGF依存性の脂肪分化能とTGFβ誘導性の線維芽細胞分化能を併せ持つ。これまでに、未分化MPCによって骨格筋の再生が促進される一方で、分化後の線維芽細胞によって細胞外マトリクスが過剰に産生されると、筋分化が抑制されることが判明している。遊離型CSPG4が筋再生に対し機能を有するならば、MPC系譜細胞の分化に伴いその産生動態が変化する可能性が考えられる。この可能性を検討する上では、MPCおよびそこから分化した線維芽細胞の特性理解が重要である。そこで、本年度は、MPCから分化した線維芽細胞の分化特性を調べた。2G11細胞をTGFβ処理することで誘導した線維芽細胞をbFGF存在下で培養すると、線維芽細胞マーカーであるαSMAの発現が低下した。また、この細胞では脂肪分化能が回復していた。同様の現象は、低密度で培養した線維芽細胞でもみられた。以上の結果から、MPC由来の線維芽細胞はbFGF存在下や低密度といった環境では、MPCに脱分化する可能性が考えられた。以上の成果は、筋再生を制御するMPCと線維芽細胞がその分化状態を双方向に変化させることを示すものである。CSPG4の遺伝子発現量は、線維芽細胞分化に伴って上昇するが、遊離型CSPG4の産生も同様に変化するとは限らない。今後、遊離型CSPG4の産生源となるMPC系譜細胞の同定およびその動態を明らかにするとともに、骨格筋の損傷・再生がみられるジストロフィン遺伝子変異ラットにCSPG4欠損を導入し、その病態変化を調べる予定である。本年度は、MPCから分化後の線維芽細胞の分化特性に着目し、研究を実施した。その結果、bFGFの添加や低密度での培養によって、線維芽細胞が再びMPCに脱分化する可能性を示す知見を得ることができた。この知見によって、MPCから線維芽細胞への分化という一方向からだけでなく、線維芽細胞からMPCへの脱分化という別方向からMPCの可塑性を捉えることが可能となったのは、当初の予想を上回る成果であった。筋ジストロフィーなどの筋原性疾患の病態では、未分化MPCや線維芽細胞だけでなく両者の中間にあたる細胞も存在すると考えられ、これらの細胞の存在割合は病期によって大きく変動する。CSPG4の遺伝子発現は線維芽細胞分化に伴って上昇するが、遊離型CSPG4の産生もこれと同調して変動するとは限らない。したがって、遊離型CSPG4の産生源となるMPC系譜細胞の同定だけでなく、分化に伴う産生量変化という新たな視点を加えることが、骨格筋再生時の遊離型CSPG4の機能を明らかにする上で必要である。また、本課題では、CSPG4欠損を導入したジストロフィン遺伝子変異ラットの骨格筋の損傷・再生に与える影響を調べることで、遊離型CSPG4の機能を解明することを計画している。現在までに、CSPG4欠損ラットを作出し、ジストロフィン遺伝子変異ラットとの掛け合わせを開始している。以上の状況を踏まえて、本課題の進捗状況を概ね順調に進展していると判断した。本研究は、筋再生時に骨格筋間葉系前駆細胞(MPC)に由来する遊離型コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)が担う機能の解明を目的とするものである。本研究でMPCモデルと位置付けているラット2G11細胞は、bFGF依存性に脂肪分化能を獲得し、TGFβ誘導性に線維芽細胞へ分化する。
軟骨分化、軟骨再生における組織由来間葉幹細胞の特性と多様化に関する研究

本研究は、骨髄、滑膜、軟骨、脂肪組織由来間葉幹細胞の軟骨分化能の違いに関する実験を行うもので、骨髄、滑膜、軟骨、脂肪組織由来幹細胞の高密度培養とコラーゲンゲル培養により軟骨分化能を比較するin vitro実験(平成19年度)と骨髄、滑膜、軟骨、脂肪組織由来幹細胞-コラーゲンゲル複合体をウサギ軟骨欠損部およびラットの骨膜近傍に移植して軟骨分化能を比較するin vivo実験(平成20年度)から成っている。in vitro実験では、骨髄、滑膜、軟骨組織由来の軟骨分化誘導過程を比較し、論文および学会に発表した。in vivo実験では滑膜、骨髄組織由来の軟骨分化能を確認し、論文および学会に発表した。組織由来間葉幹細胞の特性と多様化に関する研究を以下のごとくに実施した。ヒト骨髄液、滑膜、軟骨、骨膜、脂肪組織から接着系のコロニー形成細胞を回収した。血清を含むαMEM培地で培養後、ペレット培養では遠心して凝集塊を作製し、コラーゲンゲル培養では市販のコラーゲンゲルと幹細胞を混合し幹細胞-コラーゲンゲル複合体を作製し、軟骨分化培地中で、37°C、21日間培養を行った。得られたペレットおよびコラーゲンゲル複合体は光顕および電顕で観察し、免疫組織化学により検討した。その結果以下のことが、明らかになった。ペレット培養では、1.培養1日で幹細胞は凝集し、凝集塊を形成した。凝集能は骨髄由来幹細胞で最も高く、滑膜由来、軟骨由来幹細胞の順であった。2.培養7日で凝集塊の表層部は線維芽細胞様細胞層で被われ、凝集塊内部は軟骨細胞様細胞層に分化した。線維芽細胞様細胞層の厚さに由来組織による違いがみられ、滑膜由来幹細胞で最も厚く、軟骨由来幹細胞でわずかであった。3.培養21日で凝集塊内部の軟骨細胞様細胞はcollagen type IIとproteoglycanから成る軟骨マトリックスを生成したが、生成領域および生成量に由来組織による違いが認められた。滑膜由来間葉幹細胞は軟骨マトリックスの生成量も豊富で優れた軟骨分化能を有し、臨床応用が期待される。コラーゲンゲル培養では、1.培養開始時に幹細胞は球状を呈しコラーゲンゲル中に分散して存在した。培養1日で幹細胞は突起を伸ばし細胞外基質分子を産生した。2.培養3日で幹細胞はさらに突起を伸ばして細胞間の接着が認められた。この時点で由来組織による違いがみられ、骨髄由来幹細胞と滑膜由来幹細胞で細胞間は強く結合したのに対し、軟骨由来幹細胞で弱い傾向であった。3.培養14日および21日で、いずれの幹細胞の場合もproteoglycanに富む基質内に軟骨細胞様細胞が分散する軟骨様組織を形成した。本研究は、骨髄、滑膜、軟骨、脂肪組織由来間葉幹細胞の軟骨分化能の違いに関する実験を行うもので、高密度培養とコラーゲンゲル培養により軟骨分化能を比較するin vitro実験(平成19年度)と動物に移植して軟骨分化能等を比較するin vivo実験(平成20年度)から成っている。平成19年度は、高密度培養で良い成績を示した骨髄、滑膜、軟骨組織由来の軟骨分化誘導過程を比較し学会発表し、論文投稿中である。続いてのコラーゲンゲル培養では、コラーゲンゲルに対し幹細胞の比率を高めたことで細胞接着を促進し滑膜由来、骨髄由来の幹細胞で優れた軟骨分化能を示した(学会発表し、論文投稿中)。この方式で脂肪組織由来幹細胞の軟骨分化誘導も期待できると予測し、コラーゲンゲル培養を行っている。平成20年度は、異なる組織由来の幹細胞を用いたin vivo実験であるが、骨髄、滑膜に脂肪組織由来幹細胞を加える予定である。移植する幹細胞は、DiIおよびQdotナノクリスタルで標識した。結果は以下に示す。1.ウサギ滑膜由来幹細胞-コラーゲンゲル複合体を軟骨欠損部に移植する実験では、移植後1日で、幹細胞は、球状を呈しコラーゲンゲル中に分散して存在した。移植後4週で、DiIで標識した幹細胞は、軟骨細胞様細胞に分化し、軟骨基質様マトリックス中に分散して存在した。2.ラット骨髄由来幹細胞-コラーゲンゲル複合体をラットの骨膜下および筋肉中に移植する実験を行った。移植後2日で、Qdotナノクリスタルで標識した幹細胞は骨膜下および筋肉組織内で確認された。電顕像においてもQdotナノクリスタルは、細胞質内の超微粒子として確認出来た。移植後1週、3週、5週の試料を採取し解析を急いでいる。2年間ですべての実験を終了することが出来ず、脂肪組織由来幹細胞のin vitroおよびin vivo実験と、骨髄由来幹細胞を動物に移植する実験データの解析が残されている。投稿中2通、投稿準備中1通があり、成果報告書の提出延期を予定している。
自己発電型ナノマシンに向けたスピンを介した電力－動力間変換に関する理論的研究

本研究は局在スピンを介した伝導電子ー分子運動間相互作用Vに関する理論的研究である.このVはd軌道の状態に強く依存し,その状態は交換分裂エネルギーEex(∝磁化),結晶場エネルギーΔ及びスピン軌道相互作用Vsoに依る.今回我々は,昨年に引き続き,d軌道の状態を調べるための手法である異方性磁気抵抗(AMR)効果について研究を行った.特に[001]方向に正方歪みを持つStrong Ferromagnet及びハーフメタルに注目し,そのAMR比の磁化方向依存性を調べた.ここで,AMR比はAMR(φ)=[r(φ)-r(π/2)]/r(π/2)であり,φは磁化と電流の間の相対角,r(φ)は角φでの抵抗率である.さらに磁化は(001)面内にあり,電流IはI//[100],[110],[001]とした.主な結果は次の通りである.ボルツマン理論を用いてr(φ)をもとめ,そのr(φ)からAMR比を導出した.電流方向をi(=[100], [110], [001])とするとき,AMR比はAMR^i(φ)=Σ_{j=2,4,6,8} C_j^icosjφとなった.ここで,C_j^iは,Vsoの係数,Δ及び軌道ごとのフェルミ準位上の部分状態密度(PDOS)等で表された.特に,C_4^i(iによらない),C_6^[110]及びC_8^[110]は,dε軌道間のPDOSの差に比例した.また,dε軌道内の1軌道とdγ軌道の2軌道のPDOSが全て等しいとき,C4^[100]=-C4^[110]になった.この関係はNiなどで実験観測されている.2.ハーフメタルのAMR比結晶場を持つ本モデルでは,iによってAMR比の符号が変わり得ることが分かった.なお,我々の結晶場無しのモデル[JPSJ(2012)]では,ハーフメタルは必ず負のAMR比を示した.2015年度に発表した論文J. Phys. Soc. Jpn. 84 (2015) 094710で用いたパラメーターに間違いが見つかり,数値計算をやり直したため.詳細は次の通りである.2015年度の論文では,Feのスピン軌道結合定数λの値として,専門書に載っている値をそのまま用いていた.しかし論文のλと専門書のそれは定義が異なることが判明した.そこで定義の違いを考慮に入れて,正しいλを用いて数値計算をやり直した.結果はJ. Phys. Soc. Jpn. (2019)のErratumに報告される予定である.1.スピン軌道相互作用と結晶場を考慮に入れた模型を用いて局在スピンを介した伝導電子ー分子運動間相互作用を求める.2.電流Iと磁化Mが任意の方向の場合の異方性磁気抵抗効果の理論を構築する.3. 2の理論を用いて,ハーフメタリック強磁性体を含むさまざまな強磁性体の異方性磁気抵抗比を数値計算により求める.本研究は局在スピンを介した伝導電子ー分子運動間相互作用Vに関する理論的研究である.このVは3d軌道の形状に強く依存し,その形状は交換分裂磁場H(∝磁化)とスピン軌道相互作用Vsoに依る.今回我々は3d軌道の波動関数を解析的にもとめ,その形状を調べるための実験的手法である異方性磁気抵抗(AMR)効果について研究を行った.特にAMR効果については強磁性体のAMR比の磁化方向依存性を調べた.ここで,AMR比はAMR(φ)=[rho(φ)-rho(π/2)]/rho(π/2)であり,φは磁化と電流の間の相対角,rho(φ)は角φでの抵抗率である.さらに磁化は(001)面内にあるとし,電流IはI//[100]とした.強磁性体は代表的物質のNiを考えた.このNiは支配的な伝導(s)電子がアップスピン電子であり,フェルミ準位上のdバンド状態密度(DOS)はダウンスピンDOSがアップスピンDOSより大きい.得られた結果は以下の通りである.結晶場エネルギーΔ,Vso(結合定数はλ),Hから成る3d電子のハミルトニアンに対して摂動理論により波動関数を求めた.その波動関数は主成分の軌道に他の軌道(混成軌道)が僅かに混ざっており,その混成軌道の確率振幅はcos2φまたはsin2φを含む形となった.2.強磁性体NiのAMR比上記3d軌道とボルツマン理論を用いて抵抗率をもとめ,その抵抗率からAMR比を導出した.AMR比はAMR(φ)=C0+C2cos2φ+C4cos4φとして表された.ここでC0,C2,C4はΔ,H,λからなり,C2cos2φ項は混成軌道の確率振幅の実部,C4cos4φ項は混成軌道の確率と関係付けられた.さらにC4は軌道ごとの部分状態密度の値によって符号が変わるものの,C2は常に正になることがわかった.なお実験ではC2とC4はともに正が観測されている.1. 3d軌道におけるスピン軌道相互作用の影響を調べるため,異方性磁気抵抗(AMR)効果に注目し,そのAMR効果の理論を構築した.ただし,電流IはI//

[100]とし,磁化は(001)面内にあるとした.2.この理論を用いてNiのAMR効果を調べた結果,AMR比の式内の2回対称係数が正になり,実験結果と一致することが確認された.本研究は局在スピンを介した伝導電子ー分子運動間相互作用Vに関する理論的研究である.このVはd軌道の状態に強く依存し,その状態は交換分裂エネルギーEex(∝磁化),結晶場エネルギーΔ及びスピン軌道相互作用Vsoに依る.今回我々は,d軌道の状態を調べるための実験的手法である異方性磁気抵抗(AMR)効果について理論的研究を行った.特に今回は[001]方向に正方歪みを持つハーフメタリック強磁性体に注目し,そのAMR比の磁化方向依存性を調べた.ここで,AMR比はAMR(φ)=[r(φ)-r(π/2)]/r(π/2)であり,φは磁化と電流の間の相対角,r(φ)は角φでの抵抗率である.さらに磁化は(001)面内にあるとし,電流IはI//[100],[110]とした.主な結果は以下の通りである.まず無摂動系が縮退している場合の摂動論の波動関数(一般式)を導出した.次にその一般式を用いて,Eex,Δ及びVsoを持つd軌道の波動関数を求めた.2.ハーフメタリック強磁性体のAMR比上記d軌道とボルツマン理論を用いて抵抗率をもとめ,その抵抗率からAMR比を導出した.電流方向をi(=[100], [110])とするとき,AMR比はAMR^i(φ)=C0^i+C2^icos2φ+C4^icos4φ(ただし,C0^i=C2^i-C4^i)となった.ここで,C2^iとC4^iは,Vsoの係数,Δ及び軌道ごとのフェルミ準位上の部分状態密度(PDOS)等で表された.さらにC2^iはdε軌道とdγ軌道間のPDOSの差,C4^iはdε軌道間のPDOSの差に比例した.また,dε軌道内の1軌道とdγ軌道の2軌道のPDOSが全て等しいとき,C4^[100]=-C4^[110]になることが確認された.この関係はFe4Nなどの強磁性体に対して実験で観測されている.昨年度行なった摂動計算に一部間違いが見つかり,計算を最初からやり直したため.詳細は次の通りである.昨年度,ボルツマン理論を用いて電気抵抗率を導出した.その抵抗率の中には,d軌道の波動関数が含まれていた.その波動関数はスピン軌道相互作用等を摂動項とする摂動計算により求められた.しかし再計算した際,一部の高次項が取りこぼされていたことが分かった.そこで今回,摂動計算を最初からやり直し,正しいd軌道の波動関数を得た.さらにそのd軌道を用いて電気抵抗率をもとめた.本計算結果はJ. Phys. Soc. Jpn.のErratum,Phys. Status Solidi CのCorrectionに報告された.本研究は局在スピンを介した伝導電子ー分子運動間相互作用Vに関する理論的研究である.このVはd軌道の状態に強く依存し,その状態は交換分裂エネルギーEex(∝磁化),結晶場エネルギーΔ及びスピン軌道相互作用Vsoに依る.今回我々は,昨年に引き続き,d軌道の状態を調べるための手法である異方性磁気抵抗(AMR)効果について研究を行った.特に[001]方向に正方歪みを持つStrong Ferromagnet及びハーフメタルに注目し,そのAMR比の磁化方向依存性を調べた.ここで,AMR比はAMR(φ)=[r(φ)-r(π/2)]/r(π/2)であり,φは磁化と電流の間の相対角,r(φ)は角φでの抵抗率である.さらに磁化は(001)面内にあり,電流IはI//[100],[110],[001]とした.主な結果は次の通りである.ボルツマン理論を用いてr(φ)をもとめ,そのr(φ)からAMR比を導出した.電流方向をi(=[100], [110], [001])とするとき,AMR比はAMR^i(φ)=Σ_{j=2,4,6,8} C_j^icosjφとなった.
嗅球-終脳神経回路形成機構の解析

発生時に、嗅球の僧帽細胞の軸索は終脳の外側表面を選択的に伸長し、嗅索を形成する。我々は、僧帽細胞の軸索伸長経路である予定嗅索領域に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、嗅索周辺の細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体MAb lot1(31C2を改名)を得た。今年度はこの抗体の認識するlot^+細胞についての解析を行った。lot^+細胞はマウス胎生12.0日目(E12.0)から終脳表層の予定嗅索領域で観察され始め、E12.5になると予定嗅索領域に帯状に分布した。蛍光色素で嗅球から伸長する軸索の標識を行うと、E12.5で初めて嗅球から終脳に向かって伸長し始める軸索が観察されたが、これらの軸索は全てlot^+細胞の帯の上を選択的に伸長していた。さらに発生が進んでE13.5になると、僧帽細胞の軸索の本数は増加し嗅索を形成し始める。この形成された嗅索は必ずlot^+細胞の帯の上に位置していた。E14.5にlot^+細胞の数は最大になったが、それでもなお嗅索のすぐ近傍の梨状葉第I層のみに分布していた。更に発生が進むとMAb lot1による染色性は急速に弱まり、生後には完全に染色性が失われた。lot^+細胞は神経細胞のマーカーであるMAP2を発現しており神経細胞であった。ブロモデオキシウリジン(BrdU)の取り込みから、lot^+細胞がE9.5-E10.5という非常に早いステージに細胞分裂を終えることが示された。発生期の非常に早いステージに最終分裂を終える細胞としてカハールレチウス細胞が知られている。この細胞は形態的にもlot^+細胞に類似している。そこでカハールレチウス細胞のマーカーであるcalretininとreelinに対する抗体で終脳を免疫染色してみた。その結果、calretininはlot^+細胞の約半数において発現していたが、reelinを発現するlot^+細胞はほとんどなかった。
中枢神経系の局所神経回路を解析する遺伝子工学ツールの開発

1.Vesicular glutamatetransporter(VGluT)を認識する抗体を作成し、中枢神経系の局所神経回路の解析に応用した。VGluT1は主として大脳皮質の出力ニューロンが使用しており、VGluT2は視床のニューロンが用いているために、線条体・大脳皮質などの領域で、大脳皮質由来および視床由来の興奮性神経終末を区別して標識出来るようになった。Sindbisvirusなどの遺伝子工学的手法によりGolgi染色様に標識された一個の大脳皮質ニューロンあるいは線条体ニューロンに、どの様にそれぞれの興奮性入力が入るのか現在解析中である。さらに、VGluT1およびVGluT2の分布を小脳皮質と脊髄後角・延髄後角で調べ、両者が異なる分布をしていることを見出した。小脳皮質では平行線維終末は専らVGluT1を使用し、登上線維はVGluT2を用いていること、面白いことに苔状線維終末にVGLuT1とVGluT2の両方を使用していることなどを明らかにした。一般にVGluT1はsynaptic facilitationを示すシナプスに多く、反対にVGluT2はsynaptic depressionを示すシナプスに認められることから、VGluTの使い分けとこういったシナプスの応答特性との関連が考えられる。2.今まで線条体のニューロンに今までわかっていた2種類以外に、preprpotachykinin B(PPTB)発現と特異的な無名質投射で特徴づけられる第3の投射系が存在することを明らかにしてきているが、腹側線条体にも同様な第3の投射系が存在するかどうか検索した。腹側線条体の側座核にはPPTB陽性のニューロンが存在し、少なくともその一部は投射ニューロンであることを明らかにした。一方、腹側線条体の嗅結節にはこうしたニューロンが存在せず、嗅結節がこの点で背側線条体・側座核とは異なる組織であることが明らかになった。現在さらに側座核を中心とするPHTB陽性投射系の詳しい投射先を検討している。また、投射先の無名質ニューロンはPPTBの産物であるニューロキニンBに対する受容体を発現しているが、この無名質ニューロンがニューロキニンBに対してどの様な反応を示すか電気生理学的に検索している。1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により、前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を作成した。微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録してニューロンを分類し、Biocytinを注入した。スライス標本を固定した後、組織学的な検索として免疫蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。次に、Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidin-biotinylated peroxi-dase complex法によって青黒色に染色し、逆行性に標識された出力ニューロンの樹状突起をPeroxidase anti-peroxi-dase酵素免疫染色法で赤く染色し、1個のニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンへの連絡を調べた。その結果、興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンへ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンへはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。さらに、VI層の錐体ニューロンへの入力を調べII/III層及びV層の錐体ニューロンからの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだしており、報告をまとめている。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。現在、GABAニューロンのマーカーであるParvalbuminとCalretininというカルシウム結合タンパク質の遺伝子をBACを用いてクローニングしている。Calretininトランスジェニックマウスは作成済みで、pDFPの発現特異性を検討している。

腹側線条体の側座核にはPPTB陽性のニューロンが存在し、少なくともその一部は投射ニューロンであることを明らかにした。一方、腹側線条体の嗅結節にはこうしたニューロンが存在せず、嗅結節がこの点で背側線条体・側座核とは異なる組織であることが明らかになった。現在さらに側座核を中心とするPHTB陽性投射系の詳しい投射先を検討している。また、投射先の無名質ニューロンはPPTBの産物であるニューロキニンBに対する受容体を発現しているが、この無名質ニューロンがニューロキニンBに対してどの様な反応を示すか電気生理学的に検索している。
安定同位体自然存在比を用いた下水汚泥コンポスト由来炭素のオオムギによる固定の解析

下水汚泥コンポストは有機炭素を多量に含むが、長期連用した農地での炭素の実態は明らかになっていない。本研究は炭素安定同位体比(δ<13>^C値),を自然のトレーサーとして、下水汚泥コンポスト長期連用試験圃場での下水汚泥コンポスト由来炭素の土壌-植物-大気間の循環を追跡し、栽培作物であるオオムギの生長による固定の変化を検討した。1978年に開始した下水汚泥コンポスト長期連用試験圃場のモミガラコンポスト区、オガクズコンポスト区、化学肥料区(対照区)の3試験区で栽培したオオムギの分けつ期、出穂開花期、成熟期の茎葉および穂部を分析し、それら試料のδ13^C値を次式により求めた。δ<13>^C(‰)=〔(<13>^C/<12>^C試料)/(<13>^C/<12>^C標準物質)〕-1〕×10002つの下水汚泥コンポスト施用区のオオムギ茎葉のδ<13>^C値は、分けつ期、出穂開花期、成熟期のいずれでも化学肥料区に比べ低く、これらは土壌のδ<13>^C値を反映していたことから、オオムギは大気中に放出された下水汚泥コンポスト由来CO_2を光合成によって固定したことを示した。即ち、下水汚泥コンポスト長期連用によって土壌炭素が増加し、土壌のδ<13>^C値は下水汚泥コンポストの小さなδ<13>^C値を反映した。土壌中で下水汚泥コンポストが分解することによって放出されたCO_2は、下水汚泥コンポスト施用区地表面付近の大気のδ<13>^C値に影響してその値を小さくし、これら試験区茎葉のδ<13>^C値はその大気中CO_2を固定して小さい値となったと推定した。生育にともなう変化は少なく、下水汚泥コンポストの分解は施用後まもなく起こり、5ヶ月ほどが経過した分けつ期には下水汚泥コンポストの分解は低下し安定していたと考えられた。
高周波磁界励起型超伝導量子干渉素子の研究

本研究は、高周波磁界励起型超伝導量子干渉素子の特性について、数値計算と実験による検証を行うと共に、各応用に必要となる基礎データを得ることを目的として行われた。まず、数値計算による特性解析においては、素子特性の(i)高周波磁界周波数依存性、(ii)高周波磁界パワー依存性、(iii)外部直流磁界依存性、(iv)スイッチング応用を念頭においた動作マージンとパワー利得、などの結果を得た。次に、YBa_2Cu_3O_<7-δ>粒界ジョセフソン接合(以下YBCO-GBJJ)を用いた実験として、H型アンテナ構造を付加した素子の20GHzの高周波信号応答を測定し、低パワー時に数値計算と同様の特性を得た。さらに、高周波磁界の印加方法改善として、素子とは別に用意した高周波共振器上に素子を配置する方法について実験を行った。その利点としては、高周波信号から磁界成分のみを素子に印加するための構造を素子とは別個に設計できる、利用する周波数帯域にあわせて高周波磁界受信機構を設計することで応答周波数帯域を広く取ることができる、同一の超伝導量子干渉素子を用いることで応答特性の周波数依存性を系統的に得ることができる、などが挙げられる。YBCO-GBJJからなる超伝導量子干渉素子とコプレーナ共振器とを結合させた系について、高周波信号を印加した際の応答特性を測定した。その結果、20GHzの周波数領域において高周波磁界駆動型超伝導量子干渉素子の特徴となる応答特性が得られ、この高周波磁界印加法の有効性が示された。最後に、高周波磁界駆動型量子干渉素子をこれまでの2接合のものから3接合のものに拡張した素子について検討した。数値計算の結果、位相の異なる2つの高周波磁界を素子に印加した場合に、ゼロクロス電流ステップが発生することが示され、プログラマブル電圧標準器への応用が可能であることが分かった。本年度では、高周波磁界励起型超伝導量子干渉素子の数値計算による特性解析、およびYBa_2Cu_3O_<7-δ>粒界ジョセフソン接合(以下YBCO-GBJJ)を用いた実験検証を行った。まず、数値計算による素子特性の解析結果について述べる。得られた主な結果は、(I)素子特性の高周波磁束周波数依存性、(II)素子特性の高周波磁束パワー依存性、(III)素子特性の外部直流磁束依存性、(IV)スイッチング素子応用を念頭においた素子特性の評価(特に動作マージンとパワー利得)、(V)スイッチング動作波形のシミュレーション(単一素子動作波形、カスケード接続時の動作波形、RSフリップフロップ動作波形、4ビットA/D変換器動作波形)である。次にYBCO-GBJJを用いた実験結果について述べる。MgOバイクリスタル基板上のYBCO薄膜を、フォトリソグラフィーとArイオンミリング法を用いて微細加工し、YBCO-GBJJを2個含む超伝導量子干渉素子を作製した。予備実験の結果、通常の構造では高周波信号を磁束として素子に印加することができないことが判明したことから、高周波磁束を素子に印加するためのアンテナ構造を付加することとした。アンテナはH型とし、共振周波数が19GHzになるように設計した。この素子に20GHzの高周波信号を印加し、素子特性の高周波信号パワー依存性、外部直流磁束依存性、およびスイッチング素子応用を念頭においた動作マージンの評価を行った。その結果、高周波信号のパワーが小さい場合には、数値計算結果と同様の素子特性が得られた。一方、高周波信号パワーが大きい場合は数値計算結果とのずれが見られたことから、さらに効率よく高周波磁束を素子に印加する必要があることが判明した。

本年度においては、高周波磁界の印加方法改善に関する実験と超伝導量子干渉素子を3接合のものに拡張した際の高機能化に関する数値計算を行った。YBa_2Cu_3O_<7-δ>粒界ジョセフソン接合(以下YBCO-GBJJ)を用いた超伝導量子干渉素子に高周波磁界を印加する方法として、素子とは別に用意した高周波共振器上に素子を配置する方法について実験を行った。その利点としては、1.高周波信号から磁界成分のみを素子に印加するための構造を、素子とは別個に設計できる、2.利用する周波数帯域にあわせて高周波磁界受信機構を設計することで、応答周波数帯域を広く取ることができる、3.同一の超伝導量子干渉素子を用いることで、応答特性の周波数依存性を系統的に得ることができる、などが挙げられる。まず数値計算により、マイクロストリップライン型共振器、およびコプレーナ型共振器の特性について、素子への磁界印加効率を求めた。その結果、コプレーナ型共振器において共振周波数での結合効率が高いことが判明した。次に、YBCO-GBJJからなる超伝導量子干渉素子とコプレーナ共振器とを結合させた系について、高周波信号を印加した際の応答特性を測定した。その結果、約20GHzの周波数領域において高周波磁界駆動型超伝導量子干渉素子の特徴となる応答特性が得られ、この高周波磁界印加法の有効性が示された。次に、高周波磁界駆動型量子干渉素子をこれまでの2接合のものから3接合のものに拡張した素子について検討した。数値計算の結果、位相の異なる2つの高周波磁界を素子に印加した場合に、ゼロバイアス電流においても定電圧ステップが発生することが示され、プログラマブル電圧標準器への応用が可能であることが分かった。この結果はNbジョセフソン接合集積回路を用いた測定においても実証された。
19世紀中期のアメリカにおける大衆詩と大衆音楽-その交流と共鳴を中心に-

本研究では、二年間にわたって、19世紀中期のアメリカの詩と音楽の接点に光を当てて考察した。まず、平成17年度には、19世紀アメリカを代表する国民的詩人ヘンリー・ワズワース・ロングフェローと、同時代に活躍したコーラス・バンド、ハッチンソン・ファミリーとの関わりを中心に研究をおこなった。とくに、ハッチンソン・ファミリーがロングフェローの詩「イクセルシオ」にメロディを付してうたった歌がどのような歌であったのか分析した。その結果、歌「イクセルシオ」は、きわめて素朴な旋律の歌であって、「単調」な「詠唱」という評価もあったにもかかわらず、広く歓迎されていたことが分かった。すなわち19世紀中期には、メロディやリズムよりも詩を重視した歌が受け入れられていたのである。大衆詩という文学が広く受け入れられた当時は、音楽の分野でも詩が大きな位置を占めていたことが分かる。さらに平成18年度には、学生歌に注目し、学生歌と大衆詩との関係について考察した。とくに19世紀の中頃から20世紀初頭にかけて、ハーバード大学で人気のあった歌「ユパイディ」に焦点を合わせて研究した。「ユパイディ」は、同じくロングフェローの詩「イクセルシオ」を使った歌だった。原詩の「イクセルシオ(いや高く)」というリフレインを、「ユパイディ、ユパイダ」という、意味不明の剽軽なサビに置き換えていた。元来、この歌は、特定の同級生や教員を即興的にからかう歌だった。したがってつねに流動的な歌詞で歌われていたが、その詩を固定化したいときに使われたのが、詩「イクセルシオ」だった。この歌は、その後、イェール大学やプリンストン大学で、さらに南北戦争中には南軍でもうたわれるようになった。大衆詩は、まさに広く知られているが故に、口承的で流動的な大衆歌を固定化させるためにも利用されていたのである。平成17年度は、19世紀の中盤に活躍した、詩人のヘンリー・ワズワース・ロングフェローとコーラス・バンドのハッチンソン・ファミリーを中心に研究をおこなった。ハッチンソン・ファミリーは1840年代から、メンバーを変えながら1880年代まで、バラッドや家庭歌謡、社会改革の歌などをうたって、いわゆる「シンギング・ファミリー」の流行を導いた。アメリカ大衆音楽研究では、その活躍が深く追求されてこなかったバンドだが、興味深いことに、彼らはロングフェローやホイッティアの詩にメロディを付してうたっていた。そこで、19世紀のアメリカ大衆音楽全体の動きに注意しながら、まずハッチンソン・ファミリーの足跡を一次資料を使って辿った。そして、とくにロングフェローの詩「イクセルシオ」にメロディを付した「イクセルシオ」がどのような歌であったのか、具体的に分析してみた。その結果、歌「イクセルシオ」はメロディよりも詩を重視した歌だったことが明らかになった。きわめて素朴な旋律が付せられていて、「単調」な「詠唱」という評価もあったくらいだった。けれども面白いことに、この歌は当時のアメリカやイギリスで広く歓迎されていた。すなわち19世紀中期には、メロディやリズムよりも詩を重視した歌があって、それが受け入れられていたのである。大衆詩という文学が広く受け入れられた当時は,音楽の分野でも詩が大きな位置を占めていたのである。なお、ここまでの研究は、すでに本年度中に論文にまとめて発表した。平成18年度は、17年度の研究を発展させ、19世紀アメリカ大衆音楽のなかから学生歌を選び、学生歌と大衆詩の関係について考察した。とくに19世紀の中頃から20世紀初頭にかけて、ハーバード大学で人気のあった歌「ユパイディ」を中心に研究した。「ユパイディ」は、はじめ

1859年に公刊された。編曲者として学生H.G.スポールディングの名前があるだけで、作詞者も作曲者も明記されていなかったが、じつはロングフェローの詩「イクセルシオ」を使った歌だった。原詩の「イクセルシオ(いや高く)」というリフレインを、「ユパイディ、ディーダ、ユパイディ、ユパイダ」という、意味不明の剽軽なサビに置き換えている。元来、この歌は、即興的に同級生や特定の教員をとりあげてからかう歌だった。したがってつねに流動的な歌詞で歌われていた。そこで、その流動的な詩を固定化させる必要があるときに使われた歌詞が、詩「イクセルシオ」だったのである。この詩は誰にも知られていたし、原詩のリフレイン「イクセルシオ(いや高く)」を「ユパイディ」というサビに置さ換えることによって、原詩に込められた荘重な主題が、いっぺんに茶化されるからだった。本研究では、さらに、この歌の由来や伝播について探った。すると、この歌は、中部ヨーロッパあたりの民謡に起源があることがわかった。ドイツでは、"Juppheidi"というタイトルでもっともよく知られ、オクトバーフェストなどでビールを飲みながらうたわれる。またアメリカでは、その後、イェール大学やプリンストン大学でもうたわれるようになり、さらに南北戦争中には南軍でもうたわれるようになった。大衆詩は、まさに広く知られているが故に、口承的で流動的な大衆歌を固定化させるために使われたのである。
鉱物における構造,相変化及び物性の動的解析に基づく研究

本研究では地球上で最も普遍的に出現する鉱物である石英やその同型鉱物であるベルリナイト(AlPO_4)について、高温における結晶構造のダイナミックスと物性について研究を行った。本研究における主な成果を以下に列挙する。1.石英結晶中の原子の異方性Debye-Waller因子を用いて、phonon振動数、弾性定数を再現できる格子力学モデルを求めるための方法を開発しながら、相転移機構の研究を進めた。その結果、(1)今までNaClなどの高対称性の単純な物質でしか行われたことが報告されていなかった原子のDW因子の計算が極めて容易に石英などの複雑な鉱物結晶で、しかも十分満足できる正確さをもって実行できることが明らかになった。(2)石英のα-β転移の近傍でみられるDW因子のcusp状の異常は転移の原因と考えられている、光学ソフトモードだけではなく、それに結合していると思われる、6回対称軸方向の低振動数の音響phononからの寄与が極めて大きいことが明らかになった。2.AlPO_4のα-β転移は秩序-無秩序型ではなく、変位型である可能性が極めて高いことを明らかにした。これは石英と同様の研究方法によって同様の結果が得られたということによるものであり、今後の研究によってこれらの構造に見られる相転移の機構について総合的な解釈が可能になるものと期待される。3.転移点近傍においてDW因子、弾性定数、phonon振動数を総合的に最適化する格子力学計算によって、結晶解析の結果として得られるDW因子を格子力学モデルの作成に用いることが出来ることがわかった。本研究の主題は地球物質の諸性質をより深く理解するためには原子レベルの観点からの研究が不可欠であるということに基づいており、そのため、結晶構造の精密解析結果をどのように取り入れることができるのかという点を吟味し、その方法を確立する事である。以下に本研究年度に於ける成果ならびに進行状況を述べる。具体的な鉱物としては地球上に産する鉱物の代表である水晶(石英、SiO_2)を取り上げた。本研究代表者による精密な結晶構造デ-タが既に得られているということもその理由である。石英の構造デ-タ特に原子の熱振動デ-タを用いて、それ等を格子力学計算によって再現するための計算機プログラムパッケ-ジの整備、開発を行い、ほぼ完了した。これにより、原子の異方性熱振動因子をモデル計算によって求めることが出来ることが明らかになり、さらに、ラマン散乱、中性子散乱デ-タと総合することにより、正確な動的な構造情報を得ることが可能になった。ただし原子の異方性熱振動因子だけを用いる場合には、格子力学計算によるシミュレ-ションでは、弱い原子間相互作用について一義的な解が得られないことがあるということも明らかになった。石英の高温ー低温構造相転移にともなうソフトフォノンモ-ドの異方性熱振動因子に対する寄与は正確に(見事に)再現されることがわかり、このアプロ-チによって転移に伴う原子間の力の変化、熱エネルギ-のフォノンモ-ドに対する再配分の仕方等に就いて詳しい知見を得ることができるという確証が得られた。石英以外の物質については構造デ-タを得る努力を開始したところであり、次年度の課題とする。今年度に於いては、石英(SiO_2)の結晶構造の解析結果に基づいて、格子力学計算を中心とする研究を行った。また石英と同様の構造相転移を示すベルリナイト(AlPO_4)2ついては詳細なX線回折強度を室温から転移点直下までの7つの温度で測定した。この物質については現在、解析が進展中であり、格子力学計算は次年度に持ち越すが、相転移について以下に示するような興味ある結果が得られている。今年度の主な成果を以下に列挙する。

1.石英結晶中の原子の異方性DebyeーWaller因子を用いて、phonon振動数、弾性定数を再現できる格子力学モデルを求めるための方法を開発しながら、相転移機構の研究を進めた。その結果、(1)今までNaClなどの高対称性の単純な物質でしか行われたことが報告されていなかった原子のDebyeーWaller因子の計算が極めて容易に石英などの複雑な鉱物結晶で、しかも十分満足できる正確さをもってい実行できることを明らかにした。(2)石英のαーβ転移の近傍でみられるDW因子のcusp状の異常は転移の原因と考えられている、光学ソフトモ-ドだけではなく、それに結合していると思われる、6回対称軸方向の低振動数の音響phononからの寄与が極めて大きいことが明らかになった。2.AlPO_4のαーβ転移は秩序一無秩序型ではなく、変位型である可能性が極めて高いことを明らかにした。これは石英と同様の研究方法によって同様の結果が得られたということによるものであり、今後の研究によってこれらの構造に見られる相転移の機構について総合的な解釈が可能になるものと期待される。3.転移点近傍においてDebyeーWaller因子、弾性定数、phonon振動数を総合的に最適化する格子力学計算によって、結晶解析の結果として得られるDebyeーWaller因子を格子力学モデルの作成に用いることが出来ることがわかった。本研究計画の最終年度として次の事を行った。1石英関連物質であるA1PO_4について、800°Cまでの範囲における10点の温度において、X線回折強度を測定し、構造解析を行った。この過程でα-β転移温度が約581°Cで、±2°Cの履歴が存在する事を見いだした。2 1の構造研究の結果、A1PO_4におけるα-β転移は石英と極めて類似した様相を示し、秩序-無秩序型ではなく、変位型の転移であると結論した。3本研究計画全体を通じて、作成・整備した動的構造解析のためのソフトウェアパッケージ、DEBYE-WALLERの整備をさらに進めた。DEBYE-WALLERでは以後の全ての計算の基礎としてまず結晶の群論解析を行う。本年度では複雑な結晶構造のもの(単純格子単位胞中の原子数を40個まで可能)にも適用できるように改めた。特に従来入手できるプログラムでは少し複雑になるとうまく行かない場合があったが、以下に述べるA1PO_4を初めとしてチタン石(珪酸塩鉱物)等にも試みたが、今の所、良い結果を得ている。4 DEBYE-WALLERを用いてA1PO_4の群論解析を行った。この物質の格子振動解析、原子の異方性熱振動因子、比熱などのマクロ量の計算は現在引き続いて研究中である。従来この種の計算は対称性の高い単純な物質のみで行われていたので、A1PO_4のような少し複雑な鉱物に適用された例は殆どないもの思われる、ということを付記する。
高度侵襲手術および重度外傷症例における呼吸不全の発生とサイトカインの関係について

高度侵襲手術後の生体反応および呼吸不全を初めとするMOF発症時におけるサイトカインの変動について以下の研究成果を得た。手術侵襲により末梢血中にはIL-6の速やかな増加が認められたが、血中IL-1、TNFは検出感度以下であった。IL-6については手術侵襲の大きさに応じて上昇の程度が異なり、その最高値の平均は胆嚢摘除術において58±27pg/ml、胃亜全摘術では67±32pg/ml、胃全摘術では136±42pg/ml、食道亜全摘術では932±375pg/mlであった。IL-6の産生部位について、末梢血中の白血球を分離し、RT-PCR法でm-RNAの発現を調べたところ、全く存在せず、手術侵襲後のIL-6は手術創あるいは腹膜の細胞と考えられた。IL-1、TNFについても手術侵襲後の末梢血中白血球にはm-RNAの発現は認められなかった。MOF発症症例ではIL-6は著しい増加を呈し、IL-6濃度が1000pg/ml以上をきたした症例11例中10例がショック状態から改善しなかった。従って、臨床的にショック患者でのIL-6測定は予後の指標として極めて有用であることが判明した。また、MOF症例ではIL-1は全く検出されなかったが、TNFは11例中4例で検出され、いずれも予後不良であった。IL-6高値と共にTNFの検出は重症度をよく反映すると考えられた。MOFにおいて使用されるプロテアーゼ・インヒビターであるウリナスタチンの使用症例ではIL-6の上昇が抑制されることが判明した。手術侵襲後にこのウリナスタチンを投与し、IL-6の血中濃度を追跡したところ、明かに抑制作用が認められ、今後サイトカインの産生・抑制とプロテアーゼ・インヒビターの作用機構について検討を加える予定である。
臨床的下顎運動診断法の高速処理システム

下顎運動の記録、診査を必要とする顎機能異常者は近年増加の傾向にある。そこで、過去20数年にわたる教室の下顎運動研究の成果を日々の臨床に生かすべく、患者に苦痛なく容易に適用でき、かつ臨床に必要とされるに十分な精度を備えた下顎運動の解析、診断装置として昭和60年度科学研究費補助金で光電センサを内蔵したセルスポットカメラと赤外発光ダイオード応用の下顎運動測定装置の処理システムを開発した。しかし多数例の患者データの採取、ディスクへのファイル収集処理、ソフトウェアを介したデータ処理など処理能力が計測装置自体より劣るため十分な活用が出来なかった。そこで現有の処理システムより高速で、記憶容量の大きい処理能力の高いCPUシステムを導入し、臨床応用に対応できる高速で新しい高速処理システムを開発することを本研究の目的としている。そこで、DESKTOP GENERATION-MODEL-N10(日本データゼネラル社製)を導入して、CPU容量を512KBとし、micro-ECLIPSE,intel-8086-2のデュアル・プロセッサ・システムにより高速演算処理と個別プログラムの並行処理を可能とし、データ処理時間の大幅な短縮、高速化を計った。また、記憶容量38MBのハードディスク・モジュールとして、ディスク装置(記憶容量38MB、平均アクセスタイム71.3msec以下)と記憶容量737KB×2台のディスケット・モジュールとして、ディスケット装置(記憶容量737KB×2台、平均アクセスタイム94msec)を導入し、データ収集、収納時間の大幅な短縮とデータ記憶容量の拡大を測り、下顎運動測定装置の臨床応用を容易にし、多数例の患者のデータ収集、収納を可能にした。これらのことによって、短時間の内にデータの収集、収納ができ、分析処理時間も大幅に短縮でき、高速処理化されたデータの出力結果の分析、解析を行い、臨床診断に役立てることができた。
プロテインキナーゼを網羅的に検出する抗体の新しい活用法とその応用研究

プロテインキナーゼを網羅的に検出する抗体(マルチPK抗体)の様々な利用法を検討した。キノコ、植物、ゼブラフィッシュなどを材料として、発現スクリーニングを行い、取得した新規プロテインキナーゼの解析を行った。また、マルチPK抗体を利用した新しいプロテインキナーゼ解析法を確立し、その手法を用いて糖尿病の発症と密接に関わるプロテインキナーゼを同定した。これらの研究から、マルチPK抗体が様々なプロテインキナーゼの研究に利用できる有用なツールとなることが明らかになった。本研究課題実施期間の初年度には、マルチPK抗体の活用法に関して、以下に示すように一定の成果を得ることができた。(1)マルチPK抗体を用いた未知PKの同定法の確立研究計画に記載したゲル内でのブロムシアン分解を導入した二次元電気泳動法により、分離したPKスポットをマルチPK抗体を用いて検出する手法について最適条件を検討した。その結果、大腸菌で発現させたCaMキナーゼIIやDoublecortin-like protein kinaseなどを用いた解析により、この手法がPKの同定法として有効に活用できる可能性が示された。(2) INS-1細胞においてインスリン分泌に関連するPKの解析INS-1細胞は、ラット膵臓β細胞腫瘍由来の培養細胞であり、糖尿病研究におけるモデル細胞としてしばしば利用されている。このINS-1細胞を高濃度(11.2mM)のグルコース存在下に培養するとインスリン分泌の増大と比例して発現量が顕著に増加する63kDaのPKが見出された。このインスリン分泌に深く関与する可能性のあるPKを同定するために、今回開発した手法が利用できるかどうか試してみた。この二次元泳動において、マルチPK抗体の認識部位を含むペプチドのサイズが約19kDaであることが判明した。またミクロロトフォアにより決定したこのPKの等電点が約5であることも考慮にいれてデータベースで検索したところ、このPKはCaMキナーゼIVであることが判明した。CaMキナーゼIVの発現とインスリン分泌との関連を説明するための分子メカニズムについて詳細な解析を行い、その成果を学術論文として発表することができた。本研究課題実施期間の2年目である平成22年度には、マルチPK抗体を用いた研究により、以下に示した成果を得ることができた。・糖尿病の発症とリンクして発現するプロテインキナーゼ(PK)の解析糖尿病モデル細胞として知られるINS-1細胞を用いた実験から、インスリン分泌に密接に関わるPKとして、CaMキナーゼIVを同定し、詳細な解析を行い2011年に学術論文として発表した。また、糖毒性を引き起こす高糖濃度において顕著に発現量が増大する2種類の高分子PKを、マルチPK抗体により検出し、その解析を開始した。これらのPKは、推定分子量ならびに等電点からデータベース検索を行い、MRCKとROCKであることが推測されたので、クローニングを行うとともに、その解析を進めているところである。また、2型糖尿病モデルラットであるOLETFとその対照ラットとなるLETOの各臓器に発現するPKについて、マルチPK抗体を用いたウエスタンブロッティングによるプロファイリングを行った。糖尿病の発症にともなって膵臓において、58kDaのPKの著しい発現量低下が見られたことから、このPKと糖毒性の発症との関わりについて解析を進めているところである。・キノコの菌糸体に発現するCoPK32の機能解析マルチPK抗体を用いた発現クローニングにより、CoPK12とCoPK32を取得したが、これらのうちCoPK12については、酵素化学的性質を明らかにしており、すでに論文を発表している。本年度は、もう一方のCoPK32について解析を行った。CoPK32は、菌糸体の成長先端に特に豊富に存在するPKであり、菌糸の成長と密接に関わるPKであることが示された。また、その他の解析から、CoPK32は、浸透圧刺激などのストレスに応答性を示すMAPKAPKのキノコホモログであることが明らかになった。本研究課題実施期間の最終年度である平成23年度には、以下に示す研究成果を得た。・キノコ菌糸体に発現するCoPK12の局在と機能解析マルチPK抗体を用いた発現スクリーニングにより、キノコ菌糸体から見出されたCoPK12の細胞内局在について解析を行った。CoPK12は、CaM依存性プロテインキナーゼであることが判明しているが、細胞質ではなく、主に細胞膜に結合した形で存在する。可溶性酵素と考えられていたCoPK12が、膜結合性を示す原因を探る目的で、CoPK12の様々な変異体酵素を作製し解析したところ、アミノ末端領域がミリストイル化されていることが明らかになった。このミリストイル化の生理的意義については、さらに解析を進めているところである。・ゼブラフィッシュの胚発生に与するCaMキナーゼの解析ゼブラフィッシュの胚発生過程において発現するプロテインキナーゼとして見出されたzCaMKIδの解析を行った。zCaMKIδにはC末端配列の異なるzCaMKIδ-Sとδ-Lの2種類のスプライスバリアントが存在した。これらのスプライスバリアントの比較解析を行い、ノックダウン実験により胚発生に必須のキナーゼであることを確認した。