hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境化学物質曝露の影響を次世代に伝える精子 small RNA の解明

1)昨年度の結果を追試するために、再度C3Hマウス(F0)の妊娠8日から18日に通常の水または亜ヒ酸ナトリウム(85 ppm)を含む水を自由摂取させ、仔(対照群またはヒ素群F1)を得た。対照群およびヒ素群F1雄の精巣上体尾部から精子を取り出し、体細胞リシスを行って体細胞の混入のない精子を得、RNAを調製した。精子miRNA組成の変化をマイクロアレイ法およびreal-time PCR法で検討した。その結果、1種類のmiRNAがヒ素群の仔の精子で再現性をもって低下することが確認された。このmiRNAは精子から受精卵に持ち込まれ卵割に必要であることが報告されているが、さらに腫瘍発生への関与について文献検索等で検討を行った。3)受精卵へのmiRNAの導入および遺伝子発現解析の条件検討:体外受精によって作成したマウス受精卵に核酸をマイクロインジェクションし、一定時間培養するための至適条件を検討した。1)F1精子のmiRNA解析:対照群とヒ素群のF1精子RNAに関して、昨年度マイクロアレイ法でmiRNAの網羅的解析を行い、ヒ素群で存在量が変化するmiRNAを検出した。しかしreal-time PCRで適切な増幅ができず、存在量の検証ができないmiRNAも存在した。そこで昨年度取得したsmall RNA-seqデータで、それらのmiRNAの変化を検討し、妊娠期ヒ素曝露によって変化するmiRNAを明らかにする。さらにターゲットとなる遺伝子発現を複数のアプリケーションを用いて抽出し、影響を及ぼしうる経路を予測する。さらにそれらのmiRNA変化の受精卵における影響を体外受精の実験系や文献・データベース等を利用して検討する。2)F1精子のその他のsmall RNA解析:昨年度取得したsmall RNA-seqデータにおいて、多数のpiRNAやtRNAフラグメントのシークエンスが得られた。これらの中から妊娠期ヒ素曝露によって影響を受けるものを明らかにし、文献報告等のデータから受精卵における役割を検討する。1)妊娠期無機ヒ素曝露群(ヒ素群)F1の作製・繁殖と精子RNAの調製: C3Hマウス(F0)の妊娠8日から18日に通常の水または亜ヒ酸ナトリウム(85 ppm)を含む水を自由摂取させ、仔(対照群またはヒ素群F1)を得た。2)F1精子miRNAのマイクロアレイ解析:対照群およびヒ素群F1から調製した精子RNAについて、miRNA用マイクロアレイ(Affymetrix)を用いて解析を行い、対照群と比較してヒ素群で存在量が変化したmiRNAを明らかにした。さらにPubMed検索でCancerとの関連等が報告されているmiRNAを選抜し、発現量の変化をreal-time PCRで検証した。その結果、サンプル間のばらつきが大きいサンプルが多く見られたことから、有意差のある変化を検出するためには今後さらにサンプル数を増やして検討する必要性が考えられた。3)マウス受精卵のRNA調製法の検討:体外受精によってマウス受精卵を作製し、RNA調製を行って収量を検討した。対照群とヒ素群マウスF1の精子miRNAのマイクロアレイ解析を行い、発現量が変化したものについてreal-time PCRを行ったところ、同一の群の中でも発現量にばらつきが大きいmiRNAが多く認められた。それらがmiRNA発現のもともとの特徴であるのか検討するために、次年度に再度サンプル数を増やして実験を行うよう計画を変更した。

これらの中から妊娠期ヒ素曝露によって影響を受けるものを明らかにし、文献報告等のデータから受精卵における役割を検討する。1)F1精子の再調製とmiRNA解析:対照群と妊娠期ヒ素曝露群(ヒ素群)のF1より精子を調製し全RNA画分を精製する。マイクロアレイ法でmiRNAの網羅的解析を行い、ヒ素群で存在量が変化するmiRNAを明らかにする。マイクロアレイ法で得られた結果をReal-time PCRで検証する。またヒ素群F1の精子で変動したmiRNAのターゲットとなる遺伝子発現をmiRanda, TragetScan等のアプリケーションを用いて抽出し、影響を及ぼしうる経路を予測する。2)F1精子small RNA-seq用RNAの調製、ライブラリーの作製とsmall RNA-seq:対照群およびヒ素群F1精子全RNAよりsmall RNAの5'および3'末端へのアダプター付加、逆転写、増幅によってsmall RNA-seq用ライブラリーを調製する。次世代シークエンスを行い、初年度に構築したデータ解析パイプラインでmiRNA, tRF, piRNA等のsmall RNAの定量的解析を実施する。
医学生と研修医のアイデンティティと社会性の獲得

医師に求められる社会性とアイデンティティを医学生、研修医が獲得する過程とそれに及ぼす因子を明らかにするために、鹿児島大学医学科4年、6年、研修医、指導医を対象として自記式アンケートによる評価表の開発を行った。医師としての成長を評価するdeveloping scale、発達の各段階の資質を評価する4つのステージスケールのスコアは対象グループにより有意な差が認められたが性別、年齢は有意な因子ではなかった。本尺度によりプロフェッショナルとしての成長を量的に評価することが可能になった。医師は知識、技能だけではなく、医師としてのアイデンティティを有して社会の中で役割を果たす専門家である。本研究は医師育成をめざす教育プログラムにおいて、医学生、研修医が医師に求められる社会性(患者・社会に対する責任感、利他的対応など)とアイデンティティを獲得する過程とそれに及ぼす因子を明らかにすることを目的とする。臨床実習で学ぶ医学生と研修医を対象とした研究により、1)医学生から医師としてのアイデンティティへの変化と社会性獲得の実態、2)患者との関わりやロールモデルに対する振り返りの指導(役割への注目、関係構築への支援等)を受ける介入群と対象群間の解析によって、アイデンティティへと社会性獲得に対する教育効果を明らかにし、3)学習者個人、経験、支援とその相互作用の観点から医師育成の教育プログラムの改善点を検討する。平成27年6月にCruessら学術雑誌Academic Medicineに医師のアイデンティティに関する論文を発表し、アイデンティティ獲得過程のモデルとしてKeganの提唱する発達ステージの有用性が示された。アイデンティの自己評価を行うアンケートの作成と実施・解析を行うにあたり、研究協力者のSnell氏と検討した結果、Keganのステージ分類を自己評価するアンケートを開発し、その評価の妥当性を検証した上で、医学生と研修医の追跡を行うことが望ましいと結論した。ステージ分類と診療での行動の特性に基づき、因子として自己と他者との関係性、価値観、役割、感情のコントロール、自己意識、振り返り、並びにステージの意向を示す項目を抽出し、医師のアイデンティティ獲得の調査表として30項目を初期トライアルとして使用することとした。これに対象者の背景、診療の参加の程度に関する質問を加えた初回利用アンケートを作成し、平成28年度に研究計画の倫理審査に申請する準備が整った。平成27年度研究開始直後に医師のアイデンティティ獲得に関する知見が発表され、本研究の目的を達成するためには、当初予定していた自己評価に人の成長のステージ分類を加えた研究の遂行が望ましいと考えた。ステージ分類はインタビュー等の質的評価を基盤に行われており、調査用紙による集団の評価方法はまだ発表されていない。また人の成長は一方向への変化ではなく螺旋形の過程として説明されているため、総合点による量的判定が困難と考えられた。一方で本研究が目指す対象集団及び個人の経時的変化の解析には定量的評価が有用であるため、評価表の開発にあたり、各ステージの特性の理解のもとに各ステージの評価を行うことを検討した。これらのデータ収集と評価表の作成に時間を要することとなり、当初の予定よりも対象者の自己評価アンケートの開始が遅れることとなった。本研究は医学生、研修医が医師に求められる社会性(患者・社会に対する責任感、利他的対応など)とアイデンティティを獲得する過程とそれに及ぼす因子を明らかにすることを目的とし、1)医学生から医師へのアイデンティティへの変化と社会性獲得の実態、2)患者との関わりやロールモデルに対する振り返りの指導(役割への注目、関係構築への支援等)を受ける介入群と対象群間の解析によって明らかにする教育効果、3)医師育成の教育プログラムの改善点を検討する。アイデンティティ獲得過程のモデルとしてKeganの提唱する発達ステージ分類と診療での行動の特性に基づき、因子として自己と他者との関係性、価値観、役割、感情のコントロール、自己意識、振り返り、並びにステージの移行を示す30項目を抽出し、医師の自覚1項目を加えた医師のアイデンティティ獲得の調査表を作成した。これに対象者の背景、診療の参加の程度に関する質問を加えたアンケートを作成し、医学科4年次及び6年次学生、研修医終了時、指導医を対象とした調査と臨床実習中の介入研究を含む研究計画として倫理委員会の承認を得た。平成28年度には医学科4年、6年、研修医終了時、さらにアンケート調査票開発のために指導医を対象として調査を実施し、プロフェッショナルアイデンティティ評価表の検証を行った。評価項目として有用性が示された26項目を用いて各対照群の特性を解析した。臨床実習中の介入研究の同意を得られた医学科4年次学生を介入群、対照群に分け、振り返りの指導を開始した。平成29年度は介入研究を継続して教育効果の判定を行うとともに、医学科4年次及び6年次学生、研修医について再度調査を実施してアイデンティティへの変化と社会性獲得の実態について明らかにする。研究開始時にプロフェッショナルアイデンティティに関する論文発表等が相次ぎ、アンケート調査の内容と調査項目の吟味に時間がかかった結果、研究計画の倫理審査が平成28年度となり、情報収集が予定よりも遅れた。また、評価表の質を検証するために調査対象を指導医まで拡大し、研究の質の向上を図っている。その後の研究の進捗は予定通り進んでいる。本研究は医師に求められる社会性(患者・社会に対する責任感、利他的対応など)とアイデンティティを医学生、研修医が獲得する過程とそれに及ぼす因子を明らかにすることを目的とし、まず自記式アンケートによる「医師としての成長」を評価するための評価表の開発を行った。

医学生、研修医、指導医を対象とした調査により、医学生から医師へのアイデンティティへの変化と社会性獲得の実態とアイデンティティの獲得に影響する因子を解析した。2016年から2018年に鹿児島大学医学科4年123名、6年127名、研修医49名、指導医37名からアンケートの回答を得て、有効な回答であった322名(回収率53.7%)を解析対象とした。医師としての成長を評価するdeveloping scale、発達の各段階の資質を評価する4つのstage-specific attribute scaleを開発した。これらの尺度の得点は、学生よりも研修医、さらに指導医が有意に高く、多くの医学科学生はKeganのステージ3、指導医はステージ4あるいはそれ以上であることが示唆された。学習・研修段階によって医師としての成長に差があることが明らかになったが、性別、同一グループ内の年齢は有意な因子ではなかった。また、臨床実習・臨床研修中の主治医としての自覚、患者、指導医、医療職から主治医として認められた自覚は、developing scaleのスコアに影響することが明らかになった。本研究で開発した尺度により、従来、質的研究によってのみ評価が可能であったプロフェッショナルとしての成長を量的に評価することが可能になり、今後個人、グループ、教育プログラムの評価に有用な情報を提供する可能性が示唆された。医師に求められる社会性とアイデンティティを医学生、研修医が獲得する過程とそれに及ぼす因子を明らかにするために、鹿児島大学医学科4年、6年、研修医、指導医を対象として自記式アンケートによる評価表の開発を行った。医師としての成長を評価するdeveloping scale、発達の各段階の資質を評価する4つのステージスケールのスコアは対象グループにより有意な差が認められたが性別、年齢は有意な因子ではなかった。本尺度によりプロフェッショナルとしての成長を量的に評価することが可能になった。研究の学内承認を得たのちに、対象者のアンケート調査を行い、各学習段階における社会性とアイデンティティの変化を解析する。さらに臨床実習開始時期に合わせて介入研究を実施する。1.アイデンティの自己評価表の検証新たに開発した評価表によるアイデンティティ評価の妥当性を検証するために、倫理審査での承認が得られ次第、医学科6年次学生を対象とした無記名アンケートを行い、ステージ評価の信頼性検討と質問項目の修正、削除を含む調整を行う。同時に回答する診療への参加度との関連から評価表の妥当性を検討し、以後の調査に用いる評価表を完成する。2.アイデンティの現状調査臨床実習と臨床研修の実施時期に合わせて、臨床実習開始直前の医学科4年次学生、臨床実習終了後6年次学生、臨床研修修了時の研修医の調査を実施する。各学習段階での医師としての社会性や価値観(自己と他者との関係性)を含むアイデンティティ獲得の実態を明らかにする。3.介入研究の開始
細胞外二本鎖核酸による光合成細菌の自己凝集機構の解明とその生物工学的活用

本研究室で単離した光合成細菌Rhodovulum sp.PS88株の自己細胞凝集は、可逆的で非常に強いために,静置後数分内に細胞が凝集沈降し清澄な上澄み液を与える.凝集した本菌を,DNA分解酵素またはRNA分解酵素で処理すると細胞が分散するのに対し,タンパク質分解酵素や種々の多糖分解酵素は全くその効果がなかったので,核酸依存性の細胞外高分子物質(Extracellular Polymeric Substance,EPS)の関与が示唆された.このような核酸を主体とする微生物凝集は,これまでほとんど知られていない.それゆえ,本研究では、微生物による有用物質生産系において,なおざりにされがちな細胞の分離回収プロセスの改良に向けた新規手法を開発することを目的に、本菌の核酸成分に依存する凝集メカニズムを解明した。細胞表層から抽出した核酸画分には、16S rRNAと電気泳動的に同一バンドが存在したので、対応する同rDNAのSmall subunit(SSU)プライマに用いて、抽出画分の核酸RNAをPCR増幅し、凝集活性をもつRNAとの関係を証明した。さらに、凝集活性画分の核酸成分について検討した結果,1.7kbp付近にRNA核酸画分が検出された.この低分子量の核酸は食塩濃度1%で培養したときの非凝集性細胞には見られず,2%以上の培養時に限定して検出された.一方、大腸菌由来の16S rRNAにも本菌由来のEPSと同程度の凝集活性があることを見いだした。本菌の凝集菌体には、非凝集性菌体に比べて、高い含量の16S rRNAが含まれていることが判明した。
反応場としての高分子固体電解質の放射線効果と金属イオンの酸化還元応答の増感作用

前年度までに、固体電解質中の放射線誘起反応およびその放射線耐性は構成要素であるイオン液体の種類に大きく依存することを明らかにした。本年度は、イオン液体中の主要な活性種である溶媒和電子の反応挙動を研究協力者と調べるとともに、水溶液を媒質とした酸化物添加による金属イオンの促進還元の初期過程を研究した。さらに、国内外の会議に参加して、これまでの研究成果を広く発表するとともに、専門家との議論による研究動向調査を通じて、今後のイオン液体や固体電解質の研究・開発を展望した。放射線照射でイオン液体中に発生した溶媒和電子の過渡吸収を、阪大産研LINACを用いたパルスラジオリシス法で観測した。ナノ秒パルスラジオリシスでは添加物のピレンとの反応を測定し、ピレンが溶媒和電子だけでなく溶媒和前のドライ電子とも反応することを明らかにするとともに、イオン液体の分解および電子の発生収量を評価する上で重要になる溶媒和電子のモル吸光係数を定量した。さらに、ピコ秒パルスラジオリシスでは電子の溶媒和挙動を測定し、イオン液体の粘性度および構成イオン濃度に依存して80ピコ秒程度で溶媒和することを明らかにした(論文2件投稿済み)。また、酸化物添加による金属イオンの促進還元の研究では、酸化物のイオン化で発生した二次電子がおもに促進還元に関与し、酸化物に白金族元素を分散すると、酸化物の励起で生成した表面電子も関与することを実験的に明らかにした(招待講演で発表)。以上の成果をもとに、引き続き国内外の会議で発表するとともに、投稿論文や特許で発表する予定である。本課題で系統的に明らかにした固体電解質の構成要素であるイオン液体の放射線耐性や材料創製・有害物分解の反応場としての特性、ならびに反応を促進する酸化物の添加効果をもとに、放射線照射下の反応場として最適な固体電解質の開発が期待できる。本年度は固体電解質の放射線誘起反応の素過程に関する準備実験として、構成要素であるイオン液体のパルスラジオリシス実験を行い、液体中に発生する電子の分光・反応特性を測定して電子の溶媒和構造と反応の関係を調べた。また、固体電解質のフィルム化に着手してその水分量や電気化学挙動を測定する装置を整備するとともに、Co-60γ線や加速電子線による酸化物共存の水溶液中の金属イオンの放射線誘起還元の実験を行い、様々な線質(γ線、電子線、制動X線など)の放射線を用いた実験を可能にした。パルスラジオリシス実験では、イオン液体中の電子の吸収スペクトルが含有水分量の増加とともに短波長にシフトすること(水和による溶媒和エネルギーの上昇)や、電子の水和が水溶液中とは異なり第1配位圏で留まることを明らかにした。また、上記液体に陽イオンのユウロピウム(III)を添加するとスペクトルが長波長にシフトする一方、中性分子のアセトンを添加するとシフトしない(共存イオン/分子と電子の水和の競争)ことを見出した。さらに、水分量に比例して電子の1次減衰定数が増減すること(主に電子の水和による対再結合反応の抑制)などを明らかにした。以上の成果は国内および国際会議で発表するとともに、今後、雑誌論文や特許などの形で発表する予定である。本年度の成果は構成要素であるイオン液体の放射線耐性や液体中の反応挙動に対する知見を与え、今後行う固体電解質での実験の比較データとして有益であるだけでなく、様々な溶媒和構造を持った電子を活用して金属ナノ粒子生成や有機物分解などの反応を制御する反応場としてイオン液体が適用可能であることを示している。本年度は固体電解質の構成要素であるイオン液体を各種選びその放射線分解挙動などを研究協力者と調べるとともに、水溶液を媒質とした酸化物粉末添加による金属イオンの促進還元を研究した。さらに、国内外の会議への参加・発表などを通してイオン液体や固体電解質の研究の動向を調査し、固体電解質への酸化物粉末の固定化などの合成・分析法の整備や、Co-60 γ線や加速電子線を用いた様々な線質(γ線、電子線、制動X線)の放射線によるイオン液体および固体電解質の照射実験に着手した。イオン液体の放射線分解では研究協力者と液体中の有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化を中心に研究し、水中から有機物の抽出能や放射線耐性があり、効果的に脱ハロゲン化を起こす液体として四級アンモニウムカチオンとTFSIアニオンの塩が最適であることを明らかにするとともに、各種イオン液体中で溶媒和電子の反応挙動をパルスラジオリシス法により観測した。また、イオン液体中の光化学反応により水溶液中では不安定なユウロピウムやウランの酸化物微粒子の生成が可能であることを見いだした。さらに、放射線照射下の水溶液中ではほとんど還元しない白金族元素などの金属イオンが、酸化物粉末添加により顕著に還元することを確認した。以上の成果は基礎科学的にも実用的にも重要な知見であるため、今後、雑誌論文や特許などの形で発表する予定である。本年度の成果は固体電解質を構成するイオン液体として当初予定したアンモニウム塩が放射線に対して優れた耐性を有すること、その液体では酸化物粉末が凝集せずに分散するために電解質中で効率的な金属イオンの反応促進が期待できることを示している。

放射線照射でイオン液体中に発生した溶媒和電子の過渡吸収を、阪大産研LINACを用いたパルスラジオリシス法で観測した。ナノ秒パルスラジオリシスでは添加物のピレンとの反応を測定し、ピレンが溶媒和電子だけでなく溶媒和前のドライ電子とも反応することを明らかにするとともに、イオン液体の分解および電子の発生収量を評価する上で重要になる溶媒和電子のモル吸光係数を定量した。さらに、ピコ秒パルスラジオリシスでは電子の溶媒和挙動を測定し、イオン液体の粘性度および構成イオン濃度に依存して80ピコ秒程度で溶媒和することを明らかにした(論文2件投稿済み)。また、酸化物添加による金属イオンの促進還元の研究では、酸化物のイオン化で発生した二次電子がおもに促進還元に関与し、酸化物に白金族元素を分散すると、酸化物の励起で生成した表面電子も関与することを実験的に明らかにした(招待講演で発表)。以上の成果をもとに、引き続き国内外の会議で発表するとともに、投稿論文や特許で発表する予定である。本課題で系統的に明らかにした固体電解質の構成要素であるイオン液体の放射線耐性や材料創製・有害物分解の反応場としての特性、ならびに反応を促進する酸化物の添加効果をもとに、放射線照射下の反応場として最適な固体電解質の開発が期待できる。
腎摘除術すなわち機能的腎容積減少の糖尿病性腎症に与える影響の解析

糖尿病患者の増加に伴い、糖尿病性腎症を有する患者に腎摘除術を行う機会も増えている。当該研究では、腎摘除術すなわち機能的腎容積減少と高血糖が腎組織に与える影響について動物モデルを用いて検討した。雄SDラットに、streptozotocin(STZ)を注射し、糖尿病を誘発させた。1週間後に高血糖を確認し、腎手術を施行した。この手術で4群-第1群(開腹のみ)、第2群(一側腎の上半腎部分切除)、第3群(一側腎の腎摘除)、第4群(一側腎の腎摘除および対側腎の上半腎部分切除)に分けた。また、正常血糖ラットを対照群とした。術後4週間の観察期間中、1週毎に体重など生理指標の測定、血液、尿、組織(屠殺)の採取を行った。血液、尿からcreatinine clearance(CCr)を算出した。組織からRNAを抽出しTGF-β1、IV型collagen、fibronectinなどの発現を定量した。組織標本からは、間質面積の算出やAGE検出を行った。CCrは早期に低下後、第4群を除く糖尿病ラットで顕著に上昇、第4群では却って低下した。このことから、50%を越す腎容積減少では、たとえ早期の糖尿病性腎症であっても、容積減少と高血糖とが相加的に働き、残存腎に早期から機能障害をもたらす可能性のあることが示唆された。TGF-β1の発現は第4群の糖尿病ラットで顕著であり、その後も発現は高水準に維持された。この機序としては、著しい容積減少によるangiotensin IIの増加や高血糖によるAGE蓄積がTGF-β1の発現を刺激したとするモデルが考えられる。しかし、第4群の糖尿病ラットについても、この観察期間内には腎硬化はいまだ観察されず、TGF-β1の下流に属するIV型collagenやfibronectinに明らかな変化がみられず、間質面積にも増加は認められなかった。現在は、より長期に渡る観察を実施している。動物モデルについて、当初の実験計画書にはdb/db mouseの使用を予定していたが、血管の結紮処理などの実験手技が、より容易であるratを用いることに変更した。ratモデルとして、当初、病理学的に結節性病変が得られることを条件としたが、妥当な種が得られなかったことから、ストレプトゾシン(STZ)誘発ラットを用い、その投与量は60mg/kg体重とした。基礎データより、STZ誘発後1週間目(初期)、2週間目(中期)とに分類することが適当である判断した。さらに、最近の我々の投稿中の論文内では、ヒト糖尿病性腎症第1、2期患者における腎摘除術後成績を示し、1/2 nephrectomyが、顕性腎症への移行頻度や腎機能の悪化速度に影響を与えないとの結果をえた。そこで、臨床データと照らし合わせた結果、当初の実験計画にあった5/6 nephrectomy群を置くことには臨床的な意味会いはないものと判断するとともに、実際に糖尿病ラットで5/6 nephrectomy群を生存させること技術的に困難でもあった。群分けは、sham-operation群、部分切除に相当する1/6nephrectomy群、片腎摘群に相当する1/2 nephrectomy群の3群とした。

本年度は、これらの群に分け、予備的に、腎機能の推移や尿蛋白量などのデータを集めたが、現在のモデルも問題点として、は顕性化しないかわりに進行が早く、手術の影響を除外できないことがあげられた。なお、TGF-βをはじめとする因子については、計画書通り、RT-PCTがいつでも可能となるように準備を済ませた。ストレプトゾシン(STZ)誘発ラットを用い、STZの投与量は前年度同様に60mg/kg体重とした。機能的腎容積によって非腎摘に相当するsham-operation群、部分切除に相当する1/6nephrectomy群、片腎摘群に相当する1/2nephrectomy群の3群に分け、STZ誘発前、STZ誘発後1週間目(初期)、2週間目(中期)のそれぞれ3期における体重、尿量、尿蛋白総量、血清クレアチニン値、インスリン値、病理組織所見(結節像)、組織内TGF-beta1ならびにその受容体であるTGF-beta type II receptor、fibronectin、IV collagenの発現量について検討を行った。体重、尿量、血清クレアチニン値、インスリン値については、sham-operation群及び1/6nephrectomy群間で、全期に渡り、有意な相異は認められなかった。これに対し、1/2nephrectomy群では、前二者に比し、体重、尿量、血清クレアチニン値で有意な上昇を認めた。これに対し、3群とも、インスリン値や病理像については明らかな違いは得られなかった。一方、TGF-beta1、TGF-beta type II receptor、fibronectin、IV collagenの発現量については、sham-operation群に対し、1/6nephrectomy群では初期ならびに中期のTGF-beta1に低下傾向がみられ、1/2nephrectomy群では、初期、中期のTGF-beta1に有意な低下、中期のTGF-beta type II receptorに有意な低下、中期のIV collagenに有意な上昇が認められた。糖尿病(DM)の誘導には、引き続きストレプトゾシン(STZ)を用い、STZの投与量は、これまで同様に60mg/kg体重とした。群分けについても、これまで通り、第1群;sham-operation群(非摘除群)、第2群;1/6nephrectomy群(部分切除群)、第3群;1/2nephrectomy群(片腎切除群)の3つに分けた。STZの暴露期間によって、前期;STZに暴露前、初期;STZ暴露1週間後、中期;STZ暴露2週間後に分けて、昨年を行ったTGF-β1、その受容体TGFR-βII、fibronectin、type IV collagenの発現について、再現性の確認を行った。その結果、第1群に比し、第2群は、初期、中期でTGF-β1の発現が低下、第3群では、さらに中期でGFR-βII、fibronectinの低下、type IV collagenの上昇が認められ、ほぼ同様の結果が得られた。一方、今回は、血中AGEとその受容体RAGEの組織発現、HGFとその受容体Metの組織発現の検討も行った。血中AGE濃度は、第2,3群の初期から増加し、RAGEの発現も同時期から認められた。一方、内因性HGFの発現は、第2,3群で認められたが、STZの暴露期間には、有意な相関は認められなかったのに対し、Metでは、両群ともに初期から発現の上昇が認めらた。今回、HGFなどの投与の影響などは行ってはおらず、これらを含めた薬剤の抑制効果まで引き続き検討を行う予定である。
生理機能解明を指向したウーロン茶ポリフェノールの生成機構解明及びその合成

ウーロン茶ポリフェノールの一つであるウーロンテアニン類の生成機構の解明を目指し、茶カテキン類での酸化反応を行いその変化について詳細に追跡を行った。その結果、ウーロンテアニンはカテキンから3つの生成中間体I-IIIを経た4段階の反応で変換されることが明らかとなった。それぞれの構造を決定することで生成機構を明らかにした。さらにこの生成機構をもとに、有機化学的に4種類のウーロンテアニン類を合成する方法を開発した。得られた化合物を用いてその機能性について評価したところ、ウーロンテアニン類には元のカテキン類より強いコレステロール吸収抑制作用がある可能性が示唆された。ウーロンテアニン類の生成機構の解明を目指し、本年度はカテキン類であるエピガロカテキンガレート(EGCg)およびエピガロカテキン(EGC)を用いて酸化反応中の変化について機器分析等を用いて詳細に追跡した。その結果、EGCg及びEGCは、3段階の反応を経てウーロンテアニン類へと変換されており、2種の中間体I、IIの存在が明らかとなった。各種機器分析及び誘導化反応を用いてその単離、構造決定を行ったところ中間体Iは、同じくウーロン茶中から単離されているテアシネンシン類の中間体として報告されているDehydrotheasinensin CとAであることが明らかとなった。このことは、ウーロンテアニン類とテアシネンシン類が同じ中間体を経て生成されることを示している。また、中間体IIは、分子内にラクトン構造を持った新規化合物であり、Prooolongtheanin類と命名した。さらにNMRチューブ中で中間体IIと水を反応させ、反応経過を追跡したところ、さらに中間体IIIの存在が明らかとなり、その構造決定を行った。これら中間体I、II及びIIIの構造、及びGC-MSを用いた脱二酸化炭素の確認の結果からEGCg及びEGCからウーロンテアニン類への生成機構は、以下のとおりであることが明らかとなった。1カテキンの酸化的カップリングと分子内環化による中間体Iの生成、2脱水及び転位反応による中間体IIの生成、3ラクトン部の加水分解及び再環化反応による中間体IIIの生成、4脱二酸化炭素及び酸化反応。さらにこの生成機構を元に、合成反応条件を詳細に検討した結果、2%程度だった収率を35%まで改善することに成功した。ウーロンテアニンは、ウーロン茶ポリフェノールの一種であり、2分子のカテキンが酸化縮重合した構造を持つ。ウーロンテアニンの生成機構解明及び効率的合成法の確立を目指し、本年度はこの反応のモデル反応の構築と酸化条件の検討を行なった。カテキンB環部のモデル化合物として、5位に各種アルキル置換基を持つ各種ピロガロール誘導体を用いて反応を行なったところ、目的とは異なる位置選択性を示し、2段階酸化され縮合した酸化2量体が得られることが明らかとなった。5位にカルボニル基をもつ誘導体では目的の位置選択性を示したことから置換基の立体障害あるいは相互作用が反応の位置選択性に関与している可能性が示唆された。一方、カテキン類の一つであるEGCgの酸化反応を行ったところ、目的のウーロンテアニンが低収率ながら得られ、モデル反応で得られた酸化2量体と同様の部分構造を持つ生成物は全く得られなかった。この結合の位置選択性が異なる原因として、EGCgA環部の芳香環間での相互作用の関与を推定している。現在、この点を考慮し、これまで検討したピロガロール類縁体以外のモデル化合物を考案し検討している。さらに酸化剤に種類を検討したところ、塩化銅(II)を用いた場合に最もウーロンテアニンが多く得られることが明らかになった。この反応について詳細に追跡したところ、反応中間体と推定される化合物の存在を確認し、それらの単離に成功した。それぞれの化合物より、最終生成物であるウーロンテアニンの生成が確認できたことから、反応中間体であることを立証した。そのうち1種については、NMR等の機器分析により構造決定し、分子内にビシクロ環構造を持つ化合物であることが明らかとなった。本年度は昨年度明らかになったOolongtheanin類の反応機構を元に、EGCg及びEGCの組み合わせによる4種類のOolongtheanin類の効率的合成法の開発を行った。EGCgのみあるいはEGCのみからなるOolongtheanin類については、様々な改良の結果40%の収率で得られた。特に、Catechinの3位にガレート基を持たないEGCでは、当初収率が低く副生成物が見られた。検討の結果、副生成物の構造決定には至っていないが目的のDesgaloyloolongtheaninとの平衡混合物であることが明らかとなり、溶媒条件の検討の結果、EGCgの場合と同様に40%の収率で得られることが明らかとなった。

一方、EGCgとEGCから生成する2種のヘテロ型のOolongtheanin類については、反応性の差を利用することで片方を優先的に合成できることが明らかとなった。詳細な検討の結果、この反応性の差は、反応1段階目の酸化反応に起因しており、EGCの方がEGCgよりもわずかに酸化されやすいことがわかった。また、もう一方のヘテロ型Oolongtheaninについては、EGCgのみからなるOolongtheaningallateを加水分解酵素タンナーゼで処理することのより選択的に脱ガレート反応が進行することが明らかとなり、この反応を利用することで効率的に得られることがわかった。得られたOolongtheanin類とEGCg及びEGCについては、ウーロン茶の機能性として知られるコレステロール吸収抑制作用についてコレステロールミセル溶解性試験により評価した。その結果、EGCgの2量体であるOolongtheaningallateに高コレステロール血症薬として知られるコレスチラミンに匹敵する非常に強い阻害活性が見られた。また、コレステロールのミセルへの溶解性の抑制にはEGCgのガレート基の存在が重要であると報告されているが、EGCの2量体であるDesgaloyloolongtheaninにも、比較的強い活性が見られることが明らかとなった。天然物化学ウーロンテアニンの生成反応をEGCg及びEGCを用いて詳細に追跡し、3つの生成中間体の単離構造決定に成功した。さらにそれらの構造及び、それらを用いた誘導化反応等の結果から、当初推定していた生成機構の立証に成功した。さらに、反応条件の詳細な検討により、2%程度だったカテキンからのウーロンテアニンの合成収率を約35%まで改善することに成功している。以上のことから、研究の進捗状況は、計画通りであると判断した。申請者はウーロンテアニンの化学反応機構を、カテキン2分子のB環部におけるイオン的なカップリング反応⇒酸化に伴う分子内環化反応⇒一酸化炭素の脱離反応の三段階であると推定し、この仮説を立証するために、24年度は、生成機構解明のためのモデル反応系の構築を行なう計画であった。しかし、計画当初にデザインしていた複数のモデル化合物が、カテキンからウーロンテアニンが生成する際と異なる反応性を示したり、モデル化合物自身が不安定であることが判明し、現在のところモデル反応系の構築に至っていない。そのため、計画を一部変更し、カテキン自身(EGCg)を用いた推定生成機構の証明を検討した。その結果、反応条件(温度、溶媒、反応時間など)を制御し、HPLC追跡やNMR実験により2種類の反応中間体と推定される化合物の存在を確認し、それらの単離に成功した。単離したそれぞれの化合物より、最終生成物であるウーロンテアニンの生成が確認できたことから、反応中間体であることを立証した。また、そのうちの1種類は各種機器分析により構造決定に至った。以上のことから、今年度の計画のうち、モデル反応に関しては未達成であるが、カテキン自身を用いることで推定反応機構の立証が進みつつあるといえるため、研究の進捗状況はほぼ計画どおりであると判断した。次年度は、以下の3点について研究を進める。1.EGCg同士及びEGC同士のホモダイマーについては、本年度確立した合成法を用いて、活性評価に必要な量を合成する。
眼窩前頭皮質-嗅結節経路を介した摂食行動の意思決定メカニズムの解明

動物の摂食行動は反射的なものではなく、食物のおいしさや安全性などの報酬価値の予測にもとづいて食べるか食べないかを決定する。申請者のこれまでの実験で、腹側線条体の一領野である嗅結節は食物を探し摂食するモチベーションに関わること、また過去の経験や周囲の状況に応じてその活動性が変わることが見いだされていた。平成27年度の研究では嗅結節の機能ドメインの組織構造解析を進めた。マウスを用いた行動実験と神経活動の組織化学的解析により、食べ物に関連した匂いで餌探索行動が生じると嗅結節では前内側ドメインが活性化し、危険に関連した匂いで警戒行動が生じると嗅結節では外側ドメインが活性化した。嗅結節へ食べ物の特に匂いの情報が伝えられる主要な経路の1つが眼窩前頭皮質からの入力である。過去の経験にもとづく摂食行動の意思決定に、眼窩前頭皮質から嗅結節への神経経路がいかに関わるかを検証するため、改変型狂犬病ウイルスを用いた神経回路の逆行性標識実験を進めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目標は、過去の経験にもとづく摂食行動の意思決定に、眼窩前頭皮質から嗅結節への神経経路がいかに関わるかを明らかにすることである。先行研究と申請者の予備実験で、腹側線条体の一領野である嗅結節は食物を探し摂食するモチベーションに関わること、また過去の経験や周囲の状況に応じてその活動性が変わることが見いだされていた。平成26年度の研究では、嗅結節の活動性変化を解剖学的な特徴にもとづくドメイン分けと対応させて評価した。その結果、嗅結節は対象物の価値によって活性化ドメインが切り替わり、摂食モチベーション行動の誘起には主に前内側ドメインが関わることを見いだした(論文投稿中)。平成26年度は嗅結節自体の機能解析が進んだ。対象物の価値に応じた嗅結節活性化ドメインの切り替わりの観察と並行して、この嗅結節ドメイン構造の発達過程を調べ、嗅結節の発達がマウスの離乳行動に関わる可能性が見いだされた。また、嗅結節の神経細胞除去実験より、嗅結節が飼料探索行動の柔軟性に関わる可能性が示唆された。以上の成果を土台として、今後は嗅結節への主要な入力元の1つである眼窩前頭皮質まで研究対象をひろげていく。平成27年度では、はじめにマウス嗅結節の亜領域の特定の細胞腫に投射する眼窩前頭皮質のニューロンを標識するシステムを構築する。これにより、嗅結節の摂食促進ドメインもしくは摂食拒否ドメインへと投射する眼窩前頭皮質ニューロンを可視化する。その後、最初期遺伝子の発現応答を指標にして、マウスが飼料を探索し摂食するまでの行動時の眼窩前頭皮質ニューロンの神経活動を評価し、嗅結節への投射ドメインの違いにもとづいて比較する。また、塩化リチウム投与によりマウスは食べた飼料と腹部不快感を関連づけ、以後その飼料を食べなくなる。この摂食拒否の獲得による眼窩前頭皮質ニューロンの神経活動の変化をあわせて評価する。
肝門脈レプチンセンサーによって制御される食行動・エネルギー代謝調節

肝門脈レプチンセンサーの食行動およびエネルギー代謝調節における意義を明らかにするためレプチン門脈内投与による、食行動変化、肝臓内脂肪代謝、褐色脂肪組織(BAT)交感神経活動変化を解析した。またレプチンと同様にエネルギー代謝を調節する脂肪組織由来物質として新規に発見されたアデイポネクチンについても末梢投与による影響を調べ、レプチンのそれと比較検討した。1.肝門脈内レプチン投与による食行動変化:肝門脈へのレプチン1000μg/rat末梢投与で認められた自由摂食条件下での24時間摂食量の減少は、100μg/ratおよび10μg/ratの少量投与では認められなかった。すなわち通常量投与時の反応は肝門脈系に特異的ではなく全身性に視床下部に運ばれたレプチンによって生じていることが示唆された。2.肝門脈内レプチン投与による肝臓内脂肪代謝:肝門脈内レプチン投与により肥満動物モデルの肝臓内中性脂肪含量が減少した。脂肪合成系系の転写因子であるsterol regulatory element binding protein 1cの発現が低下しており、それのともなってその下流に存在する脂肪酸代謝酵素のmRNA発現が低下していた。3.肝門脈内レプチン投与によるBATエネルギー消費系の応答:肝門脈内レプチン投与(1000μg/rat)によりBATに分枝する交感神経活動が増加した。しかしレプチン100μg/rat投与時に活動増加傾向が認められたものの有意差はなく、より少量のレプチン投与でも反応がなかった。4.神経ヒスタミンの脳内神経ネットワーク:ヒスタミンの脳室内投与により視床下部では室傍核および弓状核に強いc-fosの発現が認められた。視床下部外では海馬および扁桃体にc-fosの発現が認められた。レプチンの下流でエネルギー代謝を調節する神経ヒスタミンの脳内作用部位が明らかになった。4.アディポネクチンの末梢性エネルギー代謝調節作用:アディポネクチンの末梢投与により肥満動物モデルの体重増加抑制と内臓脂肪の減少が認められた。またBAT交感神経活動促進作用がレプチンと同様に認められた。一方、摂食行動には変化がなかった。これらの作用はアディポネクチンの中枢投与では観察されなかった。以上より肝門脈レプチンセンサーは肝臓内脂肪代謝脚節に関与していること、またアディポネクチンが末梢エネルギー代謝調節作用を有し、肝門脈センサーを介して作用を発現する可能性が示唆された。肝門脈レプチンセンサーの食行動およびエネルギー代謝調節における意義を明らかにするため本年度はレプチン門脈内投与による、食行動変化、視床下部における神経ヒスタミン動態、褐色脂肪組織(brown adipose tissue : BAT)交感神経活動変化を解析し、また遠心性の経路を確かめるためにヒスタミン脳内投与に対する脳内c-fos発現部位、BAT交感神経活動変化を調べた。1.肝門脈内

レプチン投与による食行動変化:肝門脈へ慢性的に留置したカテーテルを介して、レプチン100μg/ratを末梢性に投与し、食行動への影響を調べた。1回急性投与による反応では投与後24時間摂食量の減少が認められた。より少量のレプチンの門脈内投与の効果を現在解析中である2.神経ヒスタミン動態:レプチン投与による神経ヒスタミン反応をHPLC法で解析した。レプチン門脈内投与後、ヒスタミンの主要代謝産物であるtele-methylhistamineの視床下部内濃度が増加した。レプチン投与によって神経ヒスタミンの代謝回転が亢進することが示唆された。視床下部各中枢の部位別の反応をみるためRIA法による検討も行っている。3.神経情報伝達経路の同定:脳内での神経ネットワークを明らかにするため、ヒスタミンを脳室内に投与し、c-fos発現部位を検討した結果、視床下部ではPVN、ARCに発現亢進が認められ、視床下部外では扁桃体、海馬などでc-fosの発現が亢進していた。4.BAT交感神経活動変化:レプチン門脈内投与によってBATへ分枝する交感神経の活動が増加した。ヒスタミンの脳室内投与によってもBAT交感神経の活動増加反応が観察された。以上の実験結果より肝門脈のレプチンセンサーは食行動調節、エネルギー代謝調節に重要な役割を果たしており、その調節メカニズムに視床下部神経ヒスタミンの関与があることが判明した。引き続き本調節系の特異性、機能的意義を明らかにするため研究を継続中である。肝門脈レプチンセンサの食行動およびエネルギー代謝調節における意義を明らかにするため本年度は昨年度に続き、レプチン少量門脈内投与による、食行動変化、肝臓内脂肪代謝、褐色脂肪組織(BAT)uncoupling protein(UCP)発現変化を解析した。また本年度は新たに、レプチンと同様にエネルギー代謝を調節する脂肪組織由来物質として新規に発見されたアディポネクチンについても末梢投与による影響を調べ、レプチンのそれと比較検討した。1.肝門脈内レプチン少量投与による食行動変化:昨年度明らかにした、肝門脈へのレプチン100μg/rat末梢投与で認められた自由摂食条件下での24時間摂食量の減少は、10μg/ratおよび1μg/ratの少量投与では認められなかった。すなわち通常量投与時の反応は肝門脈系に特異的ではなく全身性に視床下部に運ばれたレプチンによって生じていることが示唆された。しかし24時間絶食後の制限給餌下では10μg/ratの門脈内投与で、食事摂取4時間での短期的な摂食抑制効果が認められた。すなわち肝門脈でのレプチン信号は24時間摂食量に影響するほど強くはないが、短期的な摂食調節系に関与していることが考えられる。2.肝門脈内レプチン投与による肝臓内脂肪代謝:肝門脈内レプチン投与により肥満動物モデルの肝臓内中性脂肪含量が減少した。脂肪合成系の転写因子であるsterol regulatory element binding protein 1cの発現が低下しており、それにともなってその下流に存在する脂肪酸代謝酵素のmRNA発現が低下していた。3.肝門脈内レプチン投与によるBATエネルギー消費系の応答:肝門脈内レプチン投与により、BAT UCPl mRNA発現が亢進した。
原発性線毛桟能不全症の病理学的研究.2.WIC-Hyd糸ラットを用いた遺伝子診断のための基礎研究

原発性線毛桟能不全症(Immotile-dyskinetic cilia syndrome)は呼吸器系の三大遺伝性疾患の一つとしての地位を確立しつつあるが、〓胞性線維症に比べるとその本態や遺伝的背景等にまだ不明の点が多く残されている。WIC-Hyd♂ラットは顕著な水頭症と内臓逆位症を発症するものがあり、それらの動物の全身の線毛は動いておらず、人のimmotile cilia症候群の疾患モデルとして有用であることは既に報告した(Am.J.Path1991)。この動物系はArmed Forces Institute of Pathology、Washington DC(AFIP)の人の疾患モデル動物の特集(Huid Series Froc.19)にも納められることになっており、世界初の原発性線毛桟能不全症の動物モデルと考えられる。平成4年度中には、極めて稀な♀ラットの重篤水頭症合併例を見い出し、呼吸器線毛を電子顕微鏡的に検察した結果、♂例を同様のdynein armの欠損を認めた。WIC-Hyd系ラットにこの病態を発理させる遺伝子はX遺伝子上に乗っていると予想されているが、この症例は遺伝子の発現を考える上でも貴重な一例と考える。Dynein armの形態異常を確める目的で気道線毛を急速凍結、ディープエッチング法を用いて観察中である。数nmの極小変化であるがこの方法で異常所見がつかまりつつある(都立老人研、臨床病理部の協力による)。Dynein蛋日質に対する抗体を用いた免液電子顕微鏡観察は、複数の抗体を用いて継続中である。固定法等に改善の余地を残しているが、自信がついてきた。本格的な遺伝子解析は中外製薬株式会社、研究所と協同で近々着手する予定である。この一年間に、内臓逆位症を伴わない女児症例を見い出し、電子顕微鏡的にも内則dynein armの欠損のあることを確認した。本例は、我々のコレクションの第10例目である。
ナノダイヤモンドを用いた新規MRI造影剤のMRリンパ管造影への応用

リンパ系の画像化技術は,血管系画像に比して大きく遅れをとっている.本研究の目的は,新規MRI造影剤として開発されたGd-DTPA-Ndナノ複合粒子(Gd-DTPA-Nd)を用いた安全で有効なリンパ系の画像化に応用することである.本研究では,in vitroにおいて,既存のMRI造影剤(Gd-DTPA)と比較して,強い造影効果を有することが示された.次に,細胞生存性実験により,Gd-DTPAとの差が無いことが明らかなとなった.現在,ラットを用いてin vivoでのGd-DTPA-Ndの注入によるリンパ系描出能の評価が進行中である.リンパ系の画像化は,血管系の画像化に比べて大きく遅れをとっている。その中にあって核磁気共鳴画像法( M R I )を用いたリンパ管造影( M Rリンパ管造影)が,近年の画像技術の進歩に伴い注目されている。本研究は、生体適合性が高く化学的に安定なナノダイヤモンド(Nd)とGd-DTPAとの結合物質(Gd-DTPA-Nd)をMRリンパ管造影に応用することを目的としている。そのために、平成26年度はGd-DTPA-Ndを用いたMRリンパ管造影を臨床応用に展開するため、以下の2点の基礎的検討を行った。臨床で用いられているMRI装置でGd-DTPA-ND分散液のT1強調画像を撮影したところ、Gd-DTPA-ND分散液は既存のMRI造影剤よりも低いGd濃度でも高い信号強度を示すことが証明された。(2)安全性を確認するための細胞生存性の比較HEP G2 cellを用いて既存の細胞外液性造影剤であるGd-DTPAとGd-DTPA-Ndとで細胞生存性の比較試験を行った.この試験では,Gd-DTPAとGd-DTPA-NDとの間に差は認められなかった。以上のことから,Gd-DTPA-NDが高い造影能を有し,かつ安全であることが確認された.今後,MRリンパ管造影に適した新規MRI造影剤の動物実験を含む検討が期待される.リンパ系の画像化は,血管系の画像化に比べ大きく遅れをとっている。これまで,臨床において,足背リンパ管を直接露出し,油性造影剤を注入する古典的リンパ管造影が行われてきた。しかし,この古典的リンパ管造影は,難易度が高く,肺塞栓症などの重篤な合併症も報告されているため,低侵襲で簡便なリンパ系画像検査を開発することが強く望まれている。その中にあって核磁気共鳴画像法(MRI)を用いたリンパ管造影(MRリンパ管造影)が,近年の画像技術の進歩に伴い注目されている。さらにMRリンパ管造影で詳細な画像を得るために,造影剤を足背皮内注射し,間質のリンパ管から造影剤が吸収された後に撮像する方法が検討されている(間質MRリンパ管造影)。1)ラットが1.5T MRIで撮像可能であることを確認した後、ラット尾静脈からGd-DTPA-Ndを静注後,同様の1.5T MRIで撮像したところ,造影効果が確認された。2)インターベンショナルラジオロジーの手技を用いることによってラットリンパ管造影の手技を確立した。リンパ系の画像化技術は,血管系画像に比して大きく遅れをとっている.本研究の目的は,新規MRI造影剤として開発されたGd-DTPA-Ndナノ複合粒子(Gd-DTPA-Nd)を用いた安全で有効なリンパ系の画像化に応用することである.本研究では,in vitroにおいて,既存のMRI造影剤(Gd-DTPA)と比較して,強い造影効果を有することが示された.次に,細胞生存性実験により,Gd-DTPAとの差が無いことが明らかなとなった.現在,ラットを用いてin vivoでのGd-DTPA-Ndの注入によるリンパ系描出能の評価が進行中である.当初、平成26年度で予定していた基礎的検討は終了しつつある。ただし、動物実験申請に予定より時間を要している。すなわち、東海大学伊勢原研究推進部生命科学統合センター動物部門に、動物実験の詳細について相談し、申請をしているが、申請許認可にやや時間を要している。しかし、これについても2週間以内に認可されることがすでに内定されている。以上から、全体の状況としては、概ね順調な進展と判断する。放射線医学(血管内治療・画像化治療)当初の予定通り、動物実験を行う。動物実験は、東海大学伊勢原研究推進部生命科学統合支援センター動物部門で動物実験の支援を得て行う予定である。現在、動物実験申請が進展中である。in vitroの試験は概ね順調であった。しかし、動物実験申請に予定していたより、時間を要している。このため、本年度に予定していた動物実験ための物品費が未使用となった。次年度に予定している動物実験のための物品費と合わせて使用する。