hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝胆膵領域癌における細胞間相互作用制御分子機構の解明および先端治療開発

難治性癌である肝胆膵癌における細胞間相互作用に着目してその分子機序を明らかにするとともに治療開発を目的とした。aspartate beta-hydroxylase (ASPH)によるNotch経路制御が肝細胞癌だけでなく、膵臓癌、胆道癌にも有望な治療標的となり得ることが示された。膵神経内分泌腫瘍に対する細胞間相互作用解析実験基盤の確立および、肝胆膵領域癌における治療抵抗性獲得機序解析に有用なin vivo実験モデル開発に貢献した。肝胆膵領域癌は、外科的根治切除が施行されても、再発率は高く予後不良な症例が多い。近年、癌研究において癌幹細胞の存在など、癌細胞の不均一性が注目されており、癌の特性である転移、浸潤、治療抵抗性獲得のメカニズム解明に重要な概念である。生体内では細胞間相互作用により不均一性が誘導されるが、そのなかでもNotch経路はは細胞間情報伝達において非常に重要であり、癌組織においてもNotch経路の異常が多く報告されている。ASPH(aspartate beta-hydroxylase)は水酸化酵素のひとつであり、酵素としての機能はEGF likeドメインにおけるAsp(アスパラギン)、およびAsn(アスパラギン酸)を特異的に水酸化する酵素である。生体内での生理的機能は不明であったが、申請者はASPHが肝細胞癌においてNotch経路を制御しており、ASPH阻害が有望な治療標的であることを世界で初めて示した(Hepatology 2014)。今年度は膵癌に対するASPHの制御について、膵癌株でのASPH過剰発現が細胞の遊走能、浸潤能を亢進させ悪性の形質を誘導することを見出し、この形質を動物レベルでも確認した。さらにこれらの実験モデルでもASPH高発現によるNotch経路の活性化、ASPH抑制によるNotch経路の抑制を確認し報告した。同様に肝内胆管癌においてもASPHの高発現が知られている。第2世代のASPH阻害剤を用いた検討では肝内胆管癌においてもASPHによるNotch経路を介した形質変化が認められた。さらにNotch受容体と同様に細胞癌ドメインにEGF-likeドメイン構造を持つEpCAMについてもASPHによる制御を明らかにした。ASPH阻害剤の肝内胆管癌に対する有効性が示唆され、この結果を報告した。膵神経内分泌腫瘍におけるASPH発現と臨床病理学的因子の評価を行っている。ASPHはNotch経路の細胞外ドメインを修飾することにより、Notch受容体-リガンド間の親和性を変化させることが予想される。本研究ではASPH強制発現株、およびASPH特異的阻害剤を用い、ASPHによるNotch経路制御モデルを用い。膵癌、肝内胆管癌におけるASPH高発現によるNotch経路を介した悪性形質の亢進を明らかにすることができた。またASPH阻害剤による抗腫瘍効果の評価を行うことができた。また、ASPH、Notch経路による細胞間相互作用制御を評価するための実験系確立を試みている。ウイルスベクターを用いたASPH導入、shASPH導入の技術は確立しており、遺伝子導入、細胞株樹立を行っている。また新たに膵神経内分泌腫瘍におけるASPH高発現の意義を臨床病理学的因子との相関をもとに解析が進んでいる。肝胆膵外科領域の難治性癌に対して、細胞間相互作用制御分子解析による新規治療開発を目的とした。肝腫瘍、局所進行膵癌、転移性膵癌xenograftモデルを用いてその分子標的治療開発を行った。着目する分子としては生体内においてEGF like domeinのAsp Asn残基を特異的に水酸化するASPHがNotch受容体細胞外構造のEGF like domainを水酸化してNotch経路の受容体、リガンド親和性を制御して抗腫瘍効果を示す。ASPH阻害効果を示す低分子化合物が開発されているが、新世代ASPH阻害剤はASPH高発現胆管癌においてNotch経路を通して細胞周期制御分子であるcyclinD1抑制によりその進展抑制機序が解明された。膵神経内分泌腫瘍においてASPHの過剰発現を観察したが、その臨床病理学的意義について、臨床検体の解析を試みたが、現時点での症例数、観察期間では有意差は検出されなかった。並行して神経内分泌腫瘍における細胞間相互作用解析のために、臨床検体からの細胞株樹立実験基盤を確立した。今後の細胞株樹立が期待される。レンチウイルスベクターによるASPH過剰発言および抑制モデルに加えて、Clisper Cas 9によるASPH発現制御技術の開発に着手している。肝細胞癌における治療抵抗性機序解明にあたり、血管新生阻害剤に対する耐性獲得機序の解明のためのin vivoモデルについて共同研究を行い、血管新生阻害剤耐性肝細胞癌株樹立からthymosin beta-4による血管新生阻害耐性機序の解明に貢献した。肝胆膵領域癌に対する治療開発において、細胞間相互作用、難治性機序解明のための臨床検体解析、in vitro, in vivo解析技術基盤が開発できた。タイムラプス顕微鏡による細胞運動、増殖などのin vitroでのリアルタイム観察がを行う。ASPH

抑制では細胞の遊走能、浸潤能が抑制されることはすでに明らかになっているが、実際の細胞間接着などにどのような変化があるのかリアルタイム観察の報告はない。タイムラプス顕微鏡による観察を行うことにより、Notch受容体とリガンドの親和性変化が癌細胞の増殖、遊走能にどのような影響を与えるのかを直接観察が可能であり、新たな知見が得られると予想される。これらの細胞表現型変化の観察をもとに、細胞蛍光免疫染色、ウェスタンブロッティング等による、細胞内シグナル伝達解析を行う。特にNotch経路の細胞内ドメイン制御による転写活性変化ではなく、受容体ーリガンド結合阻害に特徴的な表現系変化に着目した解析を検討している。また、膵神経内分泌腫瘍におけるASPH発現、Notch経路制御についての解析も予定している。肝胆膵外科ASPH過剰発現株、shASPHによる発現抑制株を作成し、マウス皮下に投与し腫瘍増性能を評価する予定であった。そのための免疫抑制マウス購入を予定していたが、細胞株の樹立が間に合わなかったため。細胞株が樹立されたのちに、免疫抑制マウスを購入する予定である。
ひずみ速度と加工発熱を考慮した高強度鋼板の破断予測手法の確立

板材をプレス成形する際,金型の肩部では曲げ曲げ戻し変形が発生する.板材が金型肩部を通過するときに曲げられ,壁部を通過する時に逆向きに曲げ戻されて真っ直ぐになる.この曲げ曲げ戻し変形を受けた部分は板厚が大きく減少するため,成形時に破断が発生する要因となる.この破断を予め精度よく予測する手段として,本研究では成形限界応力を用いた予測手法について研究してきた.特に延性不足により成形時に破断が頻発する高強度鋼板を対象とし,成形時のひずみ速度および成形時の加工発熱による温度上昇を考慮した破断予測を行なった.さらに高強度鋼板と同様に延性不足による破断が頻発する6000系アルミニウム合金板に関しても同様の手法で破断予測が可能かについても検証した.高強度鋼板の単軸引張試験により成形時の温度上昇量を推定し,ひずみ速度と温度上昇を考慮可能な構成式を用いてその影響を定性的に考察した.その結果,ひずみ速度の上昇を考慮することは予測精度の向上に不可欠であるとの結論に達した.6000系アルミニウム合金板についても曲げ曲げ戻し試験と成形限界応力の推定を行なったところ,高強度鋼板とは異なった傾向が見られた.曲げ曲げ戻し破断時の応力は材料の成形限界応力よりも小さく,およそ8割程度の値となった.そのため高強度鋼板と全く同じ手法では破断予測は困難であることが分かった.その原因として曲げ時および曲げ戻し時に板表面で引張と圧縮の反転する応力を受けた影響を考え,実験を行なったが,それだけでは曲げ曲げ戻し破断時の応力低下は説明できないことが分かった.今後は曲げ時の板厚方向応力を考慮するなどし,応力低下の原因を探るとともに,アルミニウム合金板についても曲げ曲げ戻し破断を精度良く予測する手法を提案する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。プレス成形時に材料が金型の肩部を通過するときに曲げられ,逆向きに曲げ戻される変形を曲げ曲げ戻し変形という.曲げ曲げ戻し変形を受けることで顕著な板厚減少が起こり,破断が誘発される.破断の発生は金型の修正回数の増加に繋がり,ひいては金型製作コストが増大する.そのため,曲げ曲げ戻し変形に起因する破断の予測精度向上が課題となっている.本研究では,成形限界応力線は材料が等方硬化する場合には変形経路に依存しないことが実験的および解析的に立証されていることに注目し,成形限界応力による曲げ曲げ戻し破断の高精度化に取り組む.本年度は,高速曲げ曲げ戻し試験機を用いた高強度鋼板の曲げ曲げ戻し破断時の応力の算出および,実成形条件下における曲げ曲げ戻し破断予測に取り組んだ.曲げ曲げ戻し試験において試験速度を三段階に変化させ,実成形とほぼ等しいひずみ速度水準における破断応力を得ることに成功した.また,二軸バルジ試験により供試材の平面ひずみ引張変形状態下における成形限界応力を取得した.その結果,本研究で用いた高強度鋼板では,破断時の応力は準静的なひずみ速度で測定された成形限界応力よりも大きくなった.よって,成形限界応力を破断判定基準とすることで,曲げ曲げ戻し破断を安全側に予測し,実用上有効であることを示した.さらに,ひずみ速度の影響を考慮した成形限界応力を破断判定基準として用いることにより,曲げ曲げ戻し破断の予測精度がさらに向上することを立証した.590MPa級高強度鋼板の曲げ曲げ戻し破断時の応力をひずみ速度3水準において測定することに成功した.また,二軸バルジ試験により供試材の平面ひずみ引張変形状態下における成形限界応力を取得した.その結果,本研究で用いた高強度鋼板では,破断時の応力は準静的なひずみ速度で測定された成形限界応力よりも大きくなった.よって,成形限界応力を破断判定基準とすることで,曲げ曲げ戻し破断を安全側に予測し,実用上有効であることを示した.レーザー変位計を用いてシリンダの変位を測定することで,成形中の一時停止(ストップモーション)の組み込みが可能となった.成形中に速度変化させる場合,従来の手法(試験片上に転写した格子の変形からひずみを算出する方法)では成形中のひずみ進展挙動を観察出来ないため,新たなひずみ測定手法を採用する必要がある.そのため,デジタル画像相関法を用いた非接触ひずみ測定手法を開発中であり,試験段階では適用可能であることを確認している.プレス成形時に材料が金型の肩部を通過するときに曲げられ,逆向きに曲げ戻される変形を曲げ曲げ戻し変形という.曲げ曲げ戻し変形を受けることで顕著な板厚減少が起こり,破断が誘発され,金型の修正回数が増加し金型製作コストが増大する.そのため,曲げ曲げ戻し変形に起因する破断限界の予測精度向上が課題となっている.板材の破断予測に広く用いられる成形限界線は,ひずみ経路に依存して形状が著しく変化するため,複雑なひずみ経路を辿る変形には適用できない.一方,成形限界応力線は材料が等方硬化する場合には変形経路に依存しないことが実験的および解析的に立証されている.本研究では,成形限界応力線を用いた曲げ曲げ戻し破断予測手法の開発に取り組んでおり,今年度はデジタル画像相関法(DIC)を用いたひずみ測定手法の開発に取り組んだ.破断直前のひずみ及びその時点の測定荷重を用いて曲げ曲げ戻し破断時の応力を算出するために,非接触ひずみ測定方法の一つであるDICを用いた曲げ曲げ戻し試験法を開発した.その結果を従来のひずみ測定結果および応力算出結果と比較し,本測定法の精度検証を行った.

高速度カメラを用いることにより,曲げ曲げ戻し試験中の試験片の変形を逐次追跡した.破断直前の画像を取り出すことにより,その瞬間の試験片全面のひずみ分布を得ることに成功し,破断部近傍の板幅方向ひずみ分布を測定した.さらに,連続画像から曲げ曲げ戻しを受けた金属薄板の破断前後のひずみ発展挙動の実測に成功した.そしてそれら測定結果から,従来法と同様に曲げ曲げ戻し破断時の応力を得ることに成功した.デジタル画像相関法(DIC)を用いた曲げ曲げ戻し試験中のひずみ分布連続測定手法の開発とその精度検証に取り組み,高速度カメラを用いることで,曲げ曲げ戻し試験中の試験片の変形を逐次追跡することに成功した.破断直前の画像を取り出すことにより,その瞬間の試験片全面のひずみ分布を得ることに成功し,破断部近傍の板幅方向ひずみ分布を測定した.さらに、連続画像から曲げ曲げ戻しを受けた金属薄板の破断前後のひずみ発展挙動の実測に成功した.そしてそれら測定結果から,従来法と同様に曲げ曲げ戻し破断時の応力を得ることに成功した.デジタル画像相関法を用いたひずみ測定を行うことで,試験の効率化が可能となった.板材をプレス成形する際,金型の肩部では曲げ曲げ戻し変形が発生する.板材が金型肩部を通過するときに曲げられ,壁部を通過する時に逆向きに曲げ戻されて真っ直ぐになる.この曲げ曲げ戻し変形を受けた部分は板厚が大きく減少するため,成形時に破断が発生する要因となる.この破断を予め精度よく予測する手段として,本研究では成形限界応力を用いた予測手法について研究してきた.特に延性不足により成形時に破断が頻発する高強度鋼板を対象とし,成形時のひずみ速度および成形時の加工発熱による温度上昇を考慮した破断予測を行なった.さらに高強度鋼板と同様に延性不足による破断が頻発する6000系アルミニウム合金板に関しても同様の手法で破断予測が可能かについても検証した.高強度鋼板の単軸引張試験により成形時の温度上昇量を推定し,ひずみ速度と温度上昇を考慮可能な構成式を用いてその影響を定性的に考察した.その結果,ひずみ速度の上昇を考慮することは予測精度の向上に不可欠であるとの結論に達した.6000系アルミニウム合金板についても曲げ曲げ戻し試験と成形限界応力の推定を行なったところ,高強度鋼板とは異なった傾向が見られた.曲げ曲げ戻し破断時の応力は材料の成形限界応力よりも小さく,およそ8割程度の値となった.そのため高強度鋼板と全く同じ手法では破断予測は困難であることが分かった.その原因として曲げ時および曲げ戻し時に板表面で引張と圧縮の反転する応力を受けた影響を考え,実験を行なったが,それだけでは曲げ曲げ戻し破断時の応力低下は説明できないことが分かった.今後は曲げ時の板厚方向応力を考慮するなどし,応力低下の原因を探るとともに,アルミニウム合金板についても曲げ曲げ戻し破断を精度良く予測する手法を提案する.デジタル画像相関法を用い曲げ曲げ戻し変形中に試験片に加わるひずみの進展を連続的に測定可能な手法を開発したため,さらに調整を行う.この手法の適用によって成形中の速度変化が破断に及ぼす影響をより詳細に考察出来る.また,温度変化が曲げ曲げ戻し破断に及ぼす影響を調査するため,温度上昇可能な金型を開発する.引張の予変形が加わった高強度鋼板について,曲げ曲げ戻し破断の予測手法として成形限界応力が適用可能かを検討する.
正常及び病的表皮(乾癬、皮膚癌)における葉酸受容体の発現と機能の解析

1.葉酸受容体のヒト表皮における発現RT-PCR法により正常ヒト表皮及び乾癬病変部で発現が見られたが、我々の方法では発減量の差は評価できなかった。葉酸受容体に対するポリクローナル抗体を用いた組織染色では角層への被特異的染色により、局在を同定できず角層抗体の吸収などを試みている。2.生理的条件下で細胞増殖に最小限必要な細胞当たりの受容体数の決定3.各種クローンに対するMTXの感受性の解析vectoraloneのMTXに対するLD50は300nMであったのに対し、FR-3では100nMと低下していた。このことはMTXは葉酸受容体を介しても効率的に細胞内に取り込まれていることを示唆している。今後、FR-3のMTX結合能を調べる予定である。
生体適合・機能材料のナノシステム設計法の開発

長距離相関を考慮した,場の量子論に基づく物性論.原子や分子の距離が非常に大きくなると,非相対論的な量子論は正しい答えを与えなくなり,相対論的効果を取りいれることが必要になる.カシミール相互作用は,非常に遠方で,いずれにせよ相互作用が小さいところで,従来の式を修正するもので通常は重要な働きをしないが,生体内などで良く.見かける大きな分子の分子間または分子内の力や,マクロな世界で重要となる可能性が指摘されている.このために,相対論的な場の理論による枠組みの構築を目指した.我々は,相対論的に不変なQEDの4元ラグラジアンから出発し,正準量子化により光子,電子がカップルした方程式を導いた.有限多体量子系の方程式にするために,古典的な状態(平均場近似部分)と量子効果の項とに分離した.古典的な部分には,バリオン密度が定義でき,電子の古典解はポアソン方程式になる.また,平均場近似法を用いて,重原子をセルフコンシステントに計算した.結果は,過去の実験データを高い精度で再現できた.さらに,Schwinger-Dyson法を用いて量子的な効果を計算することに着手した,この方法は,非摂動論的に高次効果の補正を取りこむ方法であり,共同研究者の中野が核力で成功した非常に強力な計算アルゴリズムである,これは,RFA,ハートリー・フォック法,及びハートリー法を包括する.我々は,光子と電子の場の方程式を経路積分法から導出し,光子と電子の自己相互作用の効果を定式化した.これにより,電子と光子は対等に相対論的に扱われることになり,媒質効果が含まれた相対論的な場の量子論の方法が完成したことになる.高分子材料の機能構造設計を行うためには,高分子の構造や官能基の反応性を電子密度分布や双極子モーメント,分子軌道の見地から知る必要が有る.そこで,手始めに高分子の構造を分子レベルから分析する方法の開発に取り組んだ.高分子(ポリウレタン)に慢性的に荷重をかけて伸張して分析用試料とした.固相の高分子を有機溶媒に溶解することなく観察するために,小角X散乱法を用いた実験を行い,その結果にフラクタル次元解析を実施した.すると,ある分子量(移行帯)より大きな分子は格子間隔の拡張する方向に変化し,逆に低級分子は格子間隔が縮小する方向に変化を起こした.さらに,一年以上の長期にわたり山羊の人工心臓に使用したJellyfish弁では,ポリウレタンの粘弾性効果によるゆっくりとした変形現象がみられ,移行帯がより高分子領域まで上昇していた.この理由は,次のように考えられた.分子鎖の短い高分子は,他の高分子との絡み合いも少なく外部からの荷重に対して移動しやすく,他方,鎖の長い高分子は外部からの荷重にたいしてよく耐える,このために,移動しやすい短鎖高分子は外圧に対してつぶれやすく,結果として格子間隔が短くなる.逆に長鎖高分子は移動しにくいために短鎖高分子がい移動した分だけ格子間隔が広がって観察される.そこで,次年度は分子計算による実験結果の再現を行いたい.1,計算科学的な方法材料設計を分子理論からおこなうために量子力学を用いて散乱振幅を計算した.これにより,以下のことが判明した.K-IIIに荷重が加えられると,1.K-IIIにおいては,棍棒状分子塊中の各クラスター間の距離が縮小する.しかし,荷重方向の進展が大きいために,散乱強度が減少する.また,棍棒状高分子塊はクラスターが比較的大きく圧縮されにくい.このために,K-III内に空間ができ散乱領域が拡大した.2.荷重負荷時間が長く荷重が十分であれば,圧縮が進行して面方向の伸びと圧縮が均衡し散乱強度に変化が見られなくなる.3.さらに塑性変形が進行すると,クラスター同士が接触し,終にはクラスターも圧縮変形をうける.これにより散乱強度が増加する.しかし時間の進行に伴い応力緩和が起こり,照射野中の電子総数が減少し,徐々に散乱強度が減少する.2.組織構築制御法に関して.繊維化の組織構築法の開発を行い,転移ガンの抑制に関して研究をもくろんだ.人間のアルコール依存性のライフサイクルを真似て,一週間置きに滋養食CE2と煮物としてSPFラット用餌を与え,アルコール性の繊維化を作成した.この過程では,低いVitAの濃度下でVitC,VitB1のファジーON/OFFが基本になっていると考え,実際にON/OFFの制御プログラムを作成しアルコール性線に繊維化の有無や程度を制御できた.この技術を応用することで,術後に転移して来るガン細胞の周囲を繊維芽細胞で囲み増殖を抑制できる可能性がある.長距離相関を考慮した,場の量子論に基づく物性論.原子や分子の距離が非常に大きくなると,非相対論的な量子論は正しい答えを与えなくなり,相対論的効果を取りいれることが必要になる.カシミール相互作用は,非常に遠方で,いずれにせよ相互作用が小さいところで,従来の式を修正するもので通常は重要な働きをしないが,生体内などで良く.見かける大きな分子の分子間または分子内の力や,マクロな世界で重要となる可能性が指摘されている.このために,相対論的な場の理論による枠組みの構築を目指した.我々は,相対論的に不変なQEDの4元ラグラジアンから出発し,正準量子化により光子,電子がカップルした方程式を導いた.有限多体量子系の方程式にするために,古典的な状態(平均場近似部分)と量子効果の項とに分離した.

古典的な部分には,バリオン密度が定義でき,電子の古典解はポアソン方程式になる.また,平均場近似法を用いて,重原子をセルフコンシステントに計算した.結果は,過去の実験データを高い精度で再現できた.さらに,Schwinger-Dyson法を用いて量子的な効果を計算することに着手した,この方法は,非摂動論的に高次効果の補正を取りこむ方法であり,共同研究者の中野が核力で成功した非常に強力な計算アルゴリズムである,これは,RFA,ハートリー・フォック法,及びハートリー法を包括する.我々は,光子と電子の場の方程式を経路積分法から導出し,光子と電子の自己相互作用の効果を定式化した.これにより,電子と光子は対等に相対論的に扱われることになり,媒質効果が含まれた相対論的な場の量子論の方法が完成したことになる.
音声の実時間認知処理におけるプロソディの活用

本年度は,有意味語/無意味語音声というタスクの違いにおいて生じる反応の違いについて検討した。また,音声のセグメンテーションにとって重要な位置情報に着目し,マスキング課題を用いた実験を行った。それぞれの音声は,2つのアクセントフレーズ(以下,AP)からなり,マスキングには,擬似的な白色雑音を用いた。実験音声は,(1)マスキングされていない有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(2)前APの前半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(3)前APの後半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(4)後APの前半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(5)後APの後半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,を用いた。本実験の結果,セグメンテーション位置が有意味語音声と同じアクセント規則に従った割合は,(1)84.9%,(2)79.3%,(3)81.1%,(4)70.5%,(5)64.5%だった。これらの結果を,有意味語音声,無意味語音声に分類すると,セグメンテーション位置が有意味語音声と同じアクセント規則に従った割合は,有意味語音声は85.2%,無意味語音声は66.9%だった。条件ごとの割合は,有意味語音声が(1)92.0%,(2)90.1%,(3)91.1%,(4)78.6%,(5)74.1%,無意味語音声が(1)77.8%,(2)68.6%,(3)71.0%,(4)62.3%,(5)54.9%だった。これらの結果は,セグメンテーションに重要な情報は,後APにある可能性を示唆している。特に,わずかではあるが,条件(4)ではなく,条件(5)の位置がマスクされたほうが正しいセグメンテーションをしにくいという結果は,実験参加者の内省と矛盾しており,興味深い結果であった。本研究は,音声言語の認知過程で,プロソディ情報がどのくらいセグメンテーションに利用され得るかを明らかにすることを目的としており,高品質な合成音声を用いた認知実験を計画し,検討を進めている。心理学的観点から音声の実時間認知処理を考える際,要因を切り分けて考える必要がある。第一に,認知が「いつ」「どこで」行われているかを切り分けた実験を行う必要があること,第二に,実験タスクによる処理レベルの違い(心的辞書にアクセスするかどうか)を切り分けること,である。本研究は,これらの要因を分けた実験を試みている。今年度は,音声データの加工手法の検討と,無意味語音声タスクを用いた実験を行った。1.音声データの加工手法の検討高品質音声分析変換合成システムSTRAIGHT(開発者:和歌山大学・河原英紀教授)を用いて,収録済みの音声を再合成し,実験音声の作成を行った。分析した音声は,モーラ数の総数が9になるように,3+6,4+5,5+4,6+3の範囲でアクセント型を組み合わせた,有意味語音声76音声と,これを模倣した無意味語音声76音声である。この有意味語音声と無意味語音声の,高さ,強さ,時間構造をそれぞれ分析した後,モーフィングという手法を用いて音声を合成し,有意味語音声の時間構造と高さの情報を持った,76の無意味語音声を作成した。2.無意味語音声タスクを用いた,心的辞書アクセス前のセグメンテーションについての検討今年度は,心的辞書にアクセスする前にタスクが行われる状況を想定した実験を計画した。実験は,1.で作成した無意味語音声の合成音を用いて行い,意味手がかりを持たないタスクにおいて,プロソディ情報だけでセグメンテーションができるかどうかを確認した。本年度は,昨年度実験で用いた実験音声の組み合わせのうち,アクセント規則からは二通りの解釈が可能となるアクセントフレーズの組み合わせ(例えば,LHHHLHLLLは,LHHHL+HLLLでもLHHH+LHLLLでもアクセント規則に従う)を用いて実験を行った。実験で用いた音声は,有意味語音声24と,それぞれの有意味音声を模倣した無意味語音声24であった。これらの音声試料から,STRAIGHTのモーフィング手法を用いて,有意味語音声のパラメーターを保持した,以下の特徴を持つ3種類の実験音声を76(24種類×3セッション)作成した。(1)基本周波数→有意味語音声,時間周波数座標→有意味語音声,音韻→有意味語音声(2)基本周波数→有意味語音声,時間周波数座標→無意味語音声,音韻→無意味語音声(3)基本周波数→有意味語音声,時間周波数座標→有意味語音声,音韻→無意味語音声実験は小集団で行い,音声はスピーカーから出力した。実験参加者は,実験音声の切れ目を感じた場所の評定と,アクセントの聞こえについての評定を行った。

本実験の結果,セグメンテーション位置がアクセント規則に従った割合は,(1)99.5%,(2)89.6%,(3)92.2%,アクセント規則に従うセグメンテーション位置を判断でき,且つアクセント型の判断もできた割合は,(1)56.8%,(2)40.1%,(3)41.2%であり,アクセント型の判断ができなくても,高い精度で,アクセント規則に従うセグメンテーション位置が判断されるという結果が得られた。この結果から,連続音声処理時のセグメンテーションとアクセント型の判断は,同一ではなく,異なる処理過程である可能性が示唆された。本年度は,有意味語/無意味語音声というタスクの違いにおいて生じる反応の違いについて検討した。また,音声のセグメンテーションにとって重要な位置情報に着目し,マスキング課題を用いた実験を行った。それぞれの音声は,2つのアクセントフレーズ(以下,AP)からなり,マスキングには,擬似的な白色雑音を用いた。実験音声は,(1)マスキングされていない有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(2)前APの前半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(3)前APの後半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(4)後APの前半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,(5)後APの後半2モーラがマスクされた有意味語音声48音声,無意味語音声48音声,を用いた。本実験の結果,セグメンテーション位置が有意味語音声と同じアクセント規則に従った割合は,(1)84.9%,(2)79.3%,(3)81.1%,(4)70.5%,(5)64.5%だった。これらの結果を,有意味語音声,無意味語音声に分類すると,セグメンテーション位置が有意味語音声と同じアクセント規則に従った割合は,有意味語音声は85.2%,無意味語音声は66.9%だった。条件ごとの割合は,有意味語音声が(1)92.0%,(2)90.1%,(3)91.1%,(4)78.6%,(5)74.1%,無意味語音声が(1)77.8%,(2)68.6%,(3)71.0%,(4)62.3%,(5)54.9%だった。これらの結果は,セグメンテーションに重要な情報は,後APにある可能性を示唆している。特に,わずかではあるが,条件(4)ではなく,条件(5)の位置がマスクされたほうが正しいセグメンテーションをしにくいという結果は,実験参加者の内省と矛盾しており,興味深い結果であった。
国産針葉樹造林からの新しい合板製造技術の確立に関する基礎的研究

1.基礎的材質:スギ,ヒノキ間材木から900×2700(mm)の実大LVBを多数製造し材質試験を行い,次の結果を認めた.(1)比重,耐水性は針葉合板と全く同等である.(2)反りの発生は小さく,利用上支障を伴わない.(3)曲げヤング係数はLVBの単板縦つぎ部の影響を受けない.しかし曲げ強さは,その影響を受け,ヒノキLVBで約7割に強度は低下する.(4)スギLVBはヒノキLVBよりも性能が悪い.しかし全体としてパーティクルボードよりも軽量で強度が大きい.2.床・壁下地材としての性能:LVBを住宅構造部材として実際使用したときの性能を検討した.すなわち,ヒノキLVBを用いた床パネルについて局部集中曲げ試験を, 2×4工法による壁体試験体について水平加力試験をそれぞれ行い,ラワン構造用合板を用いたパネルに勝るとも劣らぬ性能を保持することを認めた.3.LVBの単板構成に関する理論的考察:複合材の基本式をLVBに適用して単板構成と曲げ性能の検討を行い,クロス単板を表層に用いる,いわゆるBタイプLVBが,クロス単板をエアーに挿入するAタイプよりもバランスのとれた使いやすい性質を持つことを認めた.4.実際の工場におけるLVB製造ラインを検討し,ロボットと連続一段平板プレス(3台のプレスを連結したもの)を導入した完全自動化ラインを設計した.以上, 2年間にわたる研究結果から,国産造林木から作るLVBは,十分にラワン合板を代替できる製品であることを認めた.1.基礎的材質:スギ,ヒノキ間材木から900×2700(mm)の実大LVBを多数製造し材質試験を行い,次の結果を認めた. (1)比重,耐水性は針葉合板と全く同等である.(2)反りの発生は小さく,利用上支障を伴わない.(3)曲げヤング係数はLVBの単板縦つぎ部の影響を受けない.しかし曲げ強さは,その影響を受け,ヒノキLVBで約7割に強度は低下する.(4)スギLVBはヒノキLVBよりも性能が悪い.しかし全体としてパーティクルボードよりも軽量で強度が大きい.2.床・壁下地材としての性能:LVBを住宅構造部材として実際使用したときの性能を検討した.すなわち,ヒノキLVBを用いた床パネルについて局部集中曲げ試験を, 2×4工法による壁体試験体について水平加力試験をそれぞれ行い,ラワン構造用合板を用いたパネルに勝るとも劣らぬ性能を保持することを認めた.3.LVBの単板構成に関する理論的考察:複合材の基本式をLVBに適用して単板構成と曲げ性能の検討を行い,クロス単板を表層に用いる,いわゆるBタイプLVBが,クロス単板をエアーに挿入するAタイプよりもバランスのとれた使いやすい性質を持つことを認めた.4.実際の工場におけるLVB製造ラインを検討し,ロボットと連続一段平板プレス(3台のプレスを連結したもの)を導入した完全自動化ラインを設計した.以上, 2年間にわたる研究結果から,国産造林木から作るLVBは,十分にラワン合板を代替できる製品であることを認めた.国産針葉樹造林木の有効利用の一つとして、短尺単板を用いる合板(Laminated Veneer Board:LVB)の製造条件と材質の関係について実験を行った。1.曲げ性能に及ぼす単板縦つぎ部間の距離の影響最大曲げモーメントMoは、ラワン材を用いたものよりもはるかに変動が大きかった。これは針葉樹材の組織構造がラワンに比べて不均質であり、縦つき部底部に春材が来るとMoは小さくなる。また、Moは縦つぎ部間の距離Dを80mm以上にとればプライ数に関係なくほぼ一定値を示し、第2局に縦つぎ部のないもの(D=∞)と同等の性能を有することが認められた。なお、最外層縦つぎ部の上部の健全な部分の厚さtoに対するDの比D/toは最外層と第2層にジョイントのあるものの強度Onと最外層のみにジョイントのあるものの強度Ooとの比On/Ooとつよい関係があり、D/toが10以上であればOn/Ooは一定となり、その値はほぼ1.0になることが分った。2.スギ,ヒノキ,カラマツ単板の接着性ヒノキ,カラマツ単板の接着は、とくに問題がなかったが、スギ単板については、やや問題があることが判明した。スギ単板では、ロータリー切削の仕上りが悪く、裏割れが多数発生すること、表面性がよくないこと、また厚さムラが生ずることなどが接着性能を低下せしめているようである。ロータリー切削の条件を再検討しなくてはならない。3.実大LVBの材質曲げ性能,集中曲げ荷重に対する抵抗性、パネルシァーせん断弾性係数等を測定したが、ラワン構造用合板に匹敵する値が得られた。実際の使用上もラワン合板と同等に使用できるものとの結論を得た。
関節軟骨、軟骨下骨を同時に再生可能なインテリジェントマテリアルの開発

生体内模倣傾斜機能アパタイト(functionallygradedhydroxyapatite:fg-HAp)の骨軟骨欠損修復材料としての有用性について、既存の連通性多孔体ハイドロキシアパタイトセラミック(以下IP-CHA)と比較検討した。約20週齢の成熟家兎の顆間窩に作成した骨軟骨欠損(直径4.5mm、深さ4mm)に、欠損とほぼ同サイズのfg-HApならびにIP-CHAを単独で移植し、術後4、12週で屠殺、大腿骨を摘出し、肉眼的・組織学的に比較検討した。移植後4週、12週のいずれにおいても、有意にfg-HAp群が優れていた。体液・血液を吸収し、血液親和性にきわめて優れた、吸収特性の高いバイオセラミックスであるfg-HApは、培養細胞や成長因子を必要としない骨軟骨欠損修復材料として有用である。赤澤らの考案した生体内模倣傾斜機能アパタイト(functionally graded hydroxyapatite:fg-HAp)とは、天然の海綿骨構造を保持しながら、材料表面にナノオーダーの針状結晶とマイクロオーダーの球状結晶を有するアパタイトである。fg-HApの骨軟骨欠損修復材料としての有用性について、既存の連通性多孔体ハイドロキシアパタイトセラミック(以下IP-CHA)と比較検討した。北海道産のウシ四肢骨海綿骨を出発材料として、焼成、硝酸水溶液への含浸等の行程を経てfg-HApを作製した。約20週齢の成熟家兎の顆間窩に作成した骨軟骨欠損(直径4.5mm、深さ4mm)に、欠損とほぼ同サイズのfg-HApならびにIP-CHAを単独で移植した。術後4、12週で屠殺、大腿骨を摘出し、肉眼的・組織学的に比較検討した。移植後4週のIP-CHA群、fg-HAp群の肉眼的所見のスコアはそれぞれ4.2±2.59、8.8±3.27(平均値±標準偏差)であり、有意にfg-HAp群が優れていた。また、移植後12週のIP-CHA群、fg-HAp群の組織学的所見のスコアはそれぞれ11.8±8.11、21.0±3.54であり、有意にfg-HAp群が優れていた。fg-HApは、既存のIP-CHAと比較し、骨軟骨欠損に対する軟骨下骨再建、関節軟骨再生のscaffoldとして有用であることが示唆された。体液・血液を吸収し、血液親和性にきわめて優れた、吸収特性の高いバイオセラミックスであるfg-HApは、培養細胞や成長因子を必要としない骨軟骨欠損修復材料として有用である生体内模倣傾斜機能アパタイト(functionallygradedhydroxyapatite:fg-HAp)の骨軟骨欠損修復材料としての有用性について、既存の連通性多孔体ハイドロキシアパタイトセラミック(以下IP-CHA)と比較検討した。(1)fg-HApの準備、作成北海道産のウシ四肢骨(北海道畜産公社、札幌)を原材料とし、煮沸、洗浄、乾燥、焼成の過程を経て緻密骨、海綿骨由来のアパタイトを作成した。緻密骨由来のアパタイトを粉砕後、5%硝酸水溶液にて完全溶解後、硝酸溶解液中に海綿骨由来アパタイトを含浸しエッチングと部分溶解を行った、次にアンモニア水を添加し室温でpH911のアパタイト安定領域で熟成する。濾過、洗浄後、室温で乾燥させ、120°Cで24時間焼結することでfg-HApが作成された。(2)骨軟骨欠損への移植(fg-HAp、IP-CHA、β-TCPの比較)家兎骨軟骨欠損モデル(体重2.5-3.0kgの日本白色家兎の大腿骨滑車に、直径5mm、深さ4mmの骨軟骨欠損を作成)を用いて移植実験を行う。実験群はfg-HAp群、IP-CHA群の2群で、各群12膝(4週6膝、12週6膝)とする。術後4および12週で各群(n=6 at each time point)の再生組織を採取し、肉眼的評価およびHE、Safranin-O染色による組織定量評価(Niederrauerらのscoring system)を行った。さらに、HE染色像から移植したfg-HAp、IP-CHA、β-TCPの残存面積を測定し、その吸収性につき定量評価を行った。力学的評価として、4および12週で独自に開発した力学試験機を用いて再生軟骨の圧縮強度(n=6 at each time point)および軟骨表面の摩擦係数の測定(n=6 at each time point)を行った。fg-HAp群において、有意な関節軟骨の再生と軟骨下骨の再建が得られた。(1)fg-HApの準備、作成作製方法については、高い再現性を持って計画通りの円柱状のfg-HApを作成することが可能になった。(2)骨軟骨欠損への移植(fg-HAp、IP-CHA、β-TCPの比較)家兎骨軟骨欠損モデル(体重2.5-3.0kgの日本

白色家兎の大腿骨滑車に、直径5mm、深さ4mmの骨軟骨欠損を作成)を用いた移植実験を行った。fg-HAp群、IP-CHA群についての肉眼的評価およびHE、Safranin-O染色による組織定量評価(Niederrauerらのscoring system)は終了した。力学試験に使用するサンプルに関しても冷凍保存してあるため、次年度に予定している長期モデルのサンプル採取後にまとめて行う予定である。さらに、HE染色像から移植したfg-HAp、IP-CHAの残存面積を測定し、その吸収性につき定量評価を行う予定である。(1)移植後1, 2週のfg-HAp群における評価骨軟骨欠損部の修復組織に関して、生化学的解析(DNA定量、real time RT-PCRによる細胞外基質のmRNAの発現量、ALP定量)を行うとともに、組織学的評価(HE染色)、免疫組織化学染色(Type I, II ,X collagen)、TRAP染色による破骨細胞数の定量などを行い、骨軟骨修復メカニズムについて明らかにする。(2)fg-HAp群の長期移植モデル(26週ならびに52週)実験群はfg-HAp群、IP-CHA群、β-TCP群の3群とする。各群12膝(26週6膝、52週6膝)とする。術後26および52週で各群(n=6 at each time point)の再生組織を採取し、肉眼的評価およびHE、Safranin-O染色による組織定量評価(Niederrauerらのscoring system)を行う。さらに、HE染色像から移植したfg-HAp、IP-CHA、β-TCPの残存面積を測定し、その吸収性につき定量評価を行う。軟骨下骨の質的評価としては、各サンプルのマイクロCTを撮像し、骨梁構造などを定量的に評価する。力学的評価として、26および52週で独自に開発した力学試験機を用いて再生軟骨の圧縮強度(n=6 at each time point)および軟骨表面の摩擦係数の測定(n=6 at each time point)を行う。
薬物性肝障害の発現に関与する炎症・免疫性因子の分子機構

薬物性肝障害への炎症・免疫性因子の関与について、ラット四塩化炭素(CCl4)肝障害モデルで解析した。四塩化炭素をラットの皮下あるいは腹腔内に投与すると、それぞれ8時間及び4時間の比較的早期に血中にIL-6の上昇が起ったが、経口投与では血漿中にIL-6活性は観察できなかった。肝酵素の血中逸脱の動態は投与経路によって差異はあるが、逸脱のピークは、2428時間の範囲で、皮下および腹腔内投与に比べ経口投与の方が肝酵素の逸脱は大であった。肝酵素逸脱は肝組織障害を伴っていることは顕微鏡観察で明らかであった。四塩化炭素に対する溶媒(コーンオイル)量を増加させ四塩化炭素を皮下投与するとIL-6の誘導は低下し、逆に肝酵素の血中レベルは上昇した。また四塩化炭素を皮下または腹腔内投与する数時間前にdexamethasoneを投与すると、1mg/kg量で四塩化炭素によるIL-6の誘導は著しく低下したが、逆に肝酵素のレベルは顕著に上昇した。一方IL-6誘導が引き起こされない四塩化炭素経口投与系でもdexamethasone投与により肝酵素の上昇は起ったが、その程度は小さかった。以上の結果は四塩化炭素によるIL-6の誘導と肝障害の間には密接な逆相関性があり、四塩化炭素の皮下あるいは腹腔内投与後初期に誘導される内因性IL-6が、肝障害の進展に抑制的に働く可能性を示している。本研究成果は肝障害機構に関する新しい知見であり、また肝障害モデル選択上での実用的意議を提供している。薬物性肝障害の発症には、薬物の直接作用に加えて、炎症・免疫性因子の関与が示唆されていることから、四塩化炭素(CCl_4)肝障害をモデルに、薬物性肝障害におけるサイトカインの役割を検討した。1. CCl_4 0.1ml/kg経口的にマウスに与えると、血漿肝障害マーカーであるSDH、ALT活性はCCl_4投与4時間から上昇し、18時間で高レベルに達し、24時間まで増加した。腫瘍壊死因子(TNFα)は投与後18時間でわずかに検出された(ELISA)が、細胞障害活性試験では、TNFα換算でTNFαの30倍量以上の非特異的な細胞障害性因子の存在が認められた。インターロイキン(IL)-6はCCl_4投与後8時間から上昇し始め18時間後にピークを示した。TNFαの発現レベルは低く、また遅延して発現すること、肝障害は抗TNFα抗体によって抑制されなかったことなどから、本肝障害の発症においてTNFαが関与する可能性は少ないと判断された。2. Kupffer細胞は肝臓における主なサイトカインの産生細胞であるため、Kupffer細胞機能修飾剤を前投与してCCl_4肝障害の発症への影響を調べた。Kupffer細胞機能の抑制剤のガドリニウム及び硫酸デキストランはCCl_4肝障害に影響を与えないが、刺激剤のエンドトキシン(LPS)はCCl_4投与の16-18時間前、0.3mg/kg体重以上で肝障害を抑制した。この抑制作用は抗TNFα抗体投与により減弱し、また組替え型マウスTNFα投与により弱いながら再現したため、LPSの作用はTNFα介在性と推測された。以上の結果は、サイトカインは急性CCl_4肝障害発症に促進的に働く可能性は低く、逆にCCl_4肝障害発症を抑制することを示している。薬物性肝障害の発症における炎症・免疫性因子、特にサイトカインの介在性について、ラット四塩化炭素(CCl_4)肝障害モデルで検討した。1. Wistar系雄性ラット(約6週齢)にCCl_45ml/kg(50%コーンオイル)を背部皮下に投与すると、肝酵素である血漿SDH、ALTが投与18時間から血漿に増加し、48時間にピークに達した。しかしこれらの最高値はALTで300units/ml、SDHで2000units/ml程度で、マウスモデルにおける酵素の逸脱度に比べてかなり低かった。

2.血漿中のインターロイキン6(IL-6)活性(IL-6依存性細胞株の増殖性を指標に測定)はCCl_4投与後1.5時間から上昇傾向を示し、8時間後に最高値の約10ng/mlを示した。その後やや緩慢に低下するが32時間後でも低いながらIL-6は検出された。腫瘍壊死因子活性(感受性細胞の増殖阻害を指標に測定)は72時間の観察時間では検出されなかった。3. CCl_4投与後のIL-6産生と投与局所の炎症反応あるいは疼痛との関連性が推測されたので、抗炎症薬およびβ受容体遮断薬のIL-6産生への影響を検討した。IL-6産生はデキサメサゾン前投与によって有意に抑制されたが、インドメサシン及びシメチジンによっては影響を受けなかった。アドレナリンは疼痛に伴って遊離されると予想されるが、アドレナリン投与がIL-6をラット血漿中に誘導することが報告されている。しかし、CCl_4投与によるIL-6の産生誘導はプルプラノロール投与では抑制されなかった。現在、CCl_4投与による肝酵素の逸脱がデキサメサゾン前投与により上昇するという予備的結果を得ており、本モデルにおけるCCl_4投与後に出現するIL-6が部分的に肝細胞の破壊を予防している可能性が示唆された。前年度に引き続き、薬物性肝障害の発症における炎症・免疫性因子、特にインターロイキン(IL)-6の介在性について、ラット四塩化炭素(CCl_4)肝障害モデルで検討した。四塩化炭素をラットの皮下あるいは腹腔内に投与すると、それぞれ8時間及び4時間の比較的早期に血中にIL-6のピークが観察されたが、経口投与ではこの時期にはIL-6の誘導は起らなかった。肝酵素の血中逸脱は投与経路によって異なるが、ピークは2448時間であり、経口投与では皮下および腹腔内投与に場合に比ベピーク時の肝酵素レベルは高値であった。同時にHE染色で肝組織像を顕微鏡観察したところ、組織障害は肝障害マーカー酵素の上昇と同様に見られた。皮下投与系で四塩化炭素を投与する際、四塩化炭素に対する溶媒(コーンオイル)量を増加させると、IL-6の誘導は低下し、逆に肝酵素の血中レベルは上昇した。また四塩化炭素を皮下または腹腔内投与する数時間前にdexamethasoneを投与すると、1mg/kg量で四塩化炭素によるIL-6の誘導は著しく低下したが、逆に肝酵素のレベルは顕著に上昇した。一方IL-6誘導が引き起こされない四塩化炭素経口投与系でもdexamethasone投与により肝酵素の上昇は起ったが、その程度は小さかった。以上の結果は四塩化炭素によるIL-6の誘導と肝障害の間に密接な逆相関性が存在することを示すものであり、四塩化炭素の皮下あるいは腹腔内投与後初期に誘導された内因性のlL-6が、肝障害の進展に抑制的に働く可能性を示している。本研究成果は肝障害機構に関する新しい知見を含むとともに、薬物性肝障害モデルを使用する上で重要な考慮点を提出している。
受精促進作用を示す環状オリゴ糖を用いた新規不妊治療法の開発

近年、多くの先進国では、晩婚化に伴う生殖環境の悪化により、不妊治療を必要とする患者数が急激に増加している。しかしながら、生殖機能改善に関する研究は、十分に進んでおらず、不妊治療法の開発が遅れている。そこで本研究では、不妊治療へのシクロデキストリンの応用を目指して有用性や作用機序を評価した結果、シクロデキストリンが精子の脂質環境を変化させることによって受精機能を向上することが明らかになった。近年、多くの先進国では、晩婚化に伴う生殖環境の悪化により、不妊治療を必要とするカップルが増加している。しかしながら、生殖科学に関する研究は十分に進んでおらず、不妊症に対する対策が遅れているのが現状である。これまでに申請者らは、環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリンが、精子の受精能向上に有用であることを見出している。そこで本研究では、シクロデキストリンを用いた生殖機能改善薬への応用を目指し、シクロデキストリンによる受精能促進作用に関して詳細な検討を行った。今年度は、精子の活性化作用を有するシクロデキストリンを探索し、構成グルコース数が異なる3種類のシクロデキストリンが有用であることを明らかにした。次に、精子受精能マーカーに対する作用を調べたところ、各種シクロデキストリン処理により精子頭部の脂質ラフトの再構成や先体反応が誘起されることが明らかになった。さらに、精子の受精能活性化に必須であることが知られるコレステロールの漏出について調べたところ、コレステロールおよびリン脂質を漏出させるシクロデキストリンとリン脂質のみ漏出させるシクロデキストリンが確認された。本知見からシクロデキストリンによる精子の活性化において、リン脂質の漏出を介した新規経路が関与することが推察された。近年、多くの先進国では、晩婚化に伴う生殖環境の悪化により、不妊治療を必要とするカップルが増加しています。しかしながら、生殖科学に関する研究は十分に進んでおらず、不妊症に対する対策が遅れているのが現状です。これまでに申請者らは、環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリンが、精子の受精能向上に有用であることを見出しています。そこで本研究では、シクロデキストリンを用いた生殖機能改善薬への応用を目指し、シクロデキストリンによる受精能促進作用に関して詳細な検討を行いました。今年度は、精子の生体膜脂質に着目して解析を行い、シクロデキストリンにより除去される脂質の種類がリピッドラフトの局在パターンを経時的に変化させることを明らかにしました。また、新たな過剰排卵誘起法を開発し、本法を利用したin vivoにおける低受精能マウスモデルを樹立しました。以上、本研究により、シクロデキストリンによる精子の活性化過程における生体膜脂質の特徴的な変化の解明およびin vivoにおける受精能の新たな評価系を構築し、生殖機能改善薬の開発に必要な研究基盤を構築しました。本事業では、受精能改善に有用なシクロデキストリンの探索(1)、シクロデキストリンによる受精機能の活性化機構の解明(2)および受精能低下マウスを用いた受精機能の改善の検証(3)を目的としています。上記の(1)および(2)は、概ね順調に進んでいるが、(3)において、精度の高い薬効評価系の構築に時間を要したため、当初の予定より研究進行が遅延しています。したがって、現在の進捗状況について、やや遅れていると判断しました。しかしながら、生殖科学に関する研究は、十分に進んでおらず、不妊症に対する対策が遅れているのが現状である。これまでに研究代表者は、環状オリゴ糖であるシクロデキストリンが、精子の受精能向上に有用であることを明らかにしている。そこで本研究では、シクロデキストリンによる精子の受精能活性化作用に着目し、シクロデキストリンによる精子の受精能活性化機構の解明およびシクロデキストリンの生殖機能改善薬として応用に向けた基礎情報の収集を行った。まず、シクロデキストリンが誘導する精子の受精能活性化の標的を明らかにするために、標的脂質の異なる各種シクロデキストリンを精子に処理し、精子の受精能と漏出脂質の解析を行った。その結果、シクロデキストリンが誘導する精子の受精能獲得には、生体膜中コレステロールの漏出だけではなく、リン脂質の漏出が関与することを新たに明らかにした。また、シクロデキストリンは、精子頭部、中編部および尾部より脂質の漏出を促進し、精子の先体反応の誘起とハイパーアクチベーションを促進することが明らかになった。さらに、低温保存により受精機能が低下した精子に対して、シクロデキストリンを処理することにより、生体膜流動性が改善され、受精機能が回復することを明らかにした。最後に、シクロデキストリンを人工授精に応用し、受精卵が得られることを確認した。本知見は、シクロデキストリンによる受精機能改善の作用機構を明らかにすると共に、シクロデキストリンを活用した不妊治療法に有用な基礎的知見を提供するものである。本年度は、受精能促進作用を有する新たなシクロデキストリンの発見、各種シクロデキストリンによる精子の受精能マーカー上昇を確認、さらに精子の受精能活性化におけるリン脂質の漏出を介した新規経路を見出した。

これらの成果から、当初計画した研究目的はおおむね順調に進展していると判断した。次年度は、本事業で計画しているシクロデキストリンによる受精機能の活性化機構の解明(2)および受精能低下マウスを用いた受精機能の改善の検証(3)を実施します。まず、精子の活性化機構の解明を目指し、生体膜脂質の組成変化および活性化経路に着目し解析を進めます。次に、受精能低下マウスに対する薬剤投与が、体内における受精、発生および着床機能に及ぼす影響を明らかにします。なお、本研究に使用するマウスは、生殖工学技術を用いて効率的に繁殖し、迅速に研究を遂行する予定です。生物系薬学、発生生物学、生殖工学次年度は、各種シクロデキストリンによる精子の活性化機構の解明および生殖機能低下マウスに対するシクロデキストリンの有用性について評価する。精子の活性化に関与する脂質を同定するために、シクロデキストリン処理精子から回収した上清を用いて、質量分析機器を用いた解析を行う。また、本研究に使用するマウスは、生殖工学技術を用いて効率的に繁殖し、迅速に研究を遂行する予定である。次年度の使用額が生じた理由は、各種シクロデキストリンの有用性評価や受精能活性化機構の解明に関して目的とする結果が順調に得られたことで安価に研究が遂行されたことや、in vivoにおける受精能評価について精度の高い薬効評価系の構築に時間を要したので当初の予定より研究進行が遅延したためです。次年度の使用額が生じた理由は、各種シクロデキストリンの有用性評価や受精能活性化機構の解明に関して目的とする結果が順調に得られたことで安価に研究が遂行されたことや実験に必要となるマウスを繁殖中であり、次年度予定していた実験を実施するためである。本研究を遂行するために、動物実験の繁殖や飼育に必要となる費用、精子の機能解析用の試薬および消耗品費、脂質解析用の試薬および消耗品費、本研究に関する成果報告および情報収集のための学会参加費、論文投稿費として研究費を使用します。次年度は、マウスを使用してシクロデキストリンによる精子の受精促進作用について解析を行う。本研究を遂行するために、動物実験の繁殖や飼育に必要となる費用、精子の機能解析用の試薬および消耗品費、脂質解析用の試薬および消耗品費、本研究に関する成果報告および情報収集のための学会参加費、論文投稿費として研究費を使用する。
癌細胞増殖におけるクロライドイオン要求性の分子メカニズム

・胃ガン細胞由来の細胞株であるMKN28細胞・MKN45細胞を用いて、細胞増殖に対するNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体活性とその阻害剤の影響および細胞外クロライドイオン濃度の影響を調べることにより、胃ガン細胞増殖制御の新たなる展開を目指して研究を進めた。・培養液中のクロライドイオン濃度を低下させることにより、MKN28・MKN45ともに増殖速度の低下を示した。・細胞内へのCl^-取り込みを担っているNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体が、分化度の高い癌細胞株(MKN28細胞)に比べ、分化度の低い未分化な癌細胞株(MKN45細胞)において、より高発現していることを明らかにした。・分化度の高い癌細胞株(MKN28細胞)に比べ、分化度の低い未分化な癌細胞株(MKN45細胞)において、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体阻害剤であるフロセミド(ループ利尿剤の一種)が細胞増殖を低下させることを明らかにした。・CDK2活性が、MKN28細胞に比べ、MKN45細胞において、より大きいことを明らかにした。・上記のこの関係が、クロライドイオン濃度依存的であることを検証する。・CDK2活性を制御しているp21発現を調節することを通じて、クロライドドイオンがCDK2活性に影響を与えているかを検証し、この効果がMKN28細胞に比べ、MKN45細胞において、より高いことを明らかにした。・p21活性を制御しているp53発現・活性のクロライドイオン依存性を調べたところ、p53発現・活性はクロライドイオンには依存しないことが明らかとなった。