hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウシの「ルーメン代謝－肝臓機能」を応用した飼料由来有害物質の毒性評価法

ウシにおける有害化学物質の毒性評価のため、簡易人工ルーメン培養法とウシ由来肝臓細胞培養系を組み合わせた新規の毒性評価法を確立することを目的とし、ウシの毒性評価に適した簡易人工ルーメン培養法の検討を行った。ホルスタイン牛の第一胃に装着したフィステルから、飼料給与約4時間後に第一胃内容液を採取し、二重ガーゼでろ過した。このルーメン液(RJ)のみ(100%RJ)、RJとMcDougall人工唾液(Buffer)との1:1混合液(50%RJ)およびBufferのみを三角コルベンに10ml採取し、窒素ガスを封入して密栓し、温水槽にて40°C、150rpmで振とう培養を行った。培養直後の100%RJには活発に動き回るプロトゾアが観察されたが、24時間後には約1/10以下に減少していた。一方、100%RJの培養24時間後のpHは0時間に比べて、大きな変動は認められなかった。また、ルーメン培養液中の総VFA量や酢酸/プロピオン酸比も変化はなく、正常の範囲内であった。さらに、ルーメン代謝後の有毒物質を評価するために、フザリウム属かび毒のうち、デオキシニバレノール(DON)またはゼアラレノン(ZEA)をルーメン液に添加すると、100%RJでは24時間後には培養直後のDONの約60%、ZEAの約35%に減少していた。また、50%RJでは同様の減少が認められたが、低下の割合はともに約20%に留まった。一方、プロトゾア等を失活させたRJでは、24時間後のDONおよびZEAの分解活性は認められなかった。DONの減少が認められた培養24時間後のRJには、脱エポキシ体の代謝物のピークが認められた。以上のことから、本培養法は、培養24時間までpHやVFA濃度が維持されたルーメン機能を保持しており、ウシにおけるDONおよびZEAの分解能を評価できることが明らかとなった。ホルスタイン牛の第一胃に装着したフィステルから、朝の飼料給与約4時間後に第一胃内容液を採取し、二重ガーゼでろ過した。このルーメン液(RJ)単独またはMcDougall人工唾液(Buffer)単独およびRJの1:1混合液(1:1)をフタ付きの三角コルベンに10ml採取し、窒素ガスを封入して密栓し、温水槽にて40°C、150rpmで振とう培養を行った。培養直後のRJには活発に動き回るプロトゾアが観察されたが、24時間後には約1/50に減少していた。一方、RJ単独および1:1のpHは、培養24時間後では0時間に比べて、ともに大きな変動は認められなかった。また、ルーメン培養液中の総VFA量および酢酸は24時間後に減少していたものの、正常の範囲内であった。さらに、ルーメン代謝後の有毒物質を評価するために、フザリウム属かび毒のうち、デオキシニバレノール(DON)をルーメン液に添加し、4または24時間培養後の残量をHPLCで測定した。Buffer単独では24時間後にDONの変化が認められなかったが、RJでは24時間後には培養直後のDONの約60%が減少していた。また、1:1では同様の減少が認められたが、低下の割合は約20%に留まった。一方プロトゾア等を失活させたルーメン液では、24時間後のDONの分解活性は認められず、DONの脱エポキシ体であるDOM-1のピークが認められた。以上のことから、ルーメン培養によるDONの消失は細菌やプロトゾアによる脱エポキシ化によるものと考えられ、簡易人工ルーメン培養が機能していることが明らかとなった。

DONの減少が認められた培養24時間後のRJには、脱エポキシ体の代謝物のピークが認められた。以上のことから、本培養法は、培養24時間までpHやVFA濃度が維持されたルーメン機能を保持しており、ウシにおけるDONおよびZEAの分解能を評価できることが明らかとなった。当初の計画に沿い、簡易人工ルーメン培養法を開発した。この簡易人工ルーメン培養法では、培養24時間までpHやVFA濃度が維持されており、DONの分解能を保持していることから、研究はおおむね順調に進展している。今回、フザリウム属かび毒のうち、デオキシニバレノール(DON)をモデル物質として簡易人工ルーメン培養を検討してきたが、DON以外の複数のマイコトキシンに適用することで、簡易人工ルーメン培養法の確立を目指す。また、簡易人工ルーメン培養と組み合わせるため、初代培養ウシ肝実質細胞およびクッパー細胞等を用いて、フザリウム属マイコトキシンの影響を定量的に評価可能な系を確立する。クッパー細胞は有害物質に暴露されると炎症性サイトカインを産生することから、フザリウム属かび毒の肝臓への影響を検討するため、リアルタイムRT-PCR法を用いてクッパー細胞の各種サイトカインのmRNA発現を解析する。また、初代培養肝実質細胞では、蛋白合成および薬物代謝について、フザリウム属かび毒の影響を評価する。
核融合炉心プラズマ中水素原子密度計測のための高ダイナミックレンジ分光法の開発

分光計測のダイナミックレンジは,計測に用いるCCDカメラのダイナミックレンジと,分光器内での光の回折による像の広がりにより制限されることを明らかにした.まず,読み出しノイズが小さく読み出し速度の大きいCMOSカメラと信号の平均操作を組み合わせることで光検出器のダイナミックレンジを向上した.次に,刻線数・実効面積の大きな回折格子を用いて,回折による像の広がりを抑制し,併せて6桁のダイナミックレンジの分光計測システムを開発した.本分光システムを核融合科学研究所で生成される高温水素プラズマからの発光計測に適用し,計測した水素原子線スペクトルからプラズマ中の中性水素原子密度を導出する手法を開発した.分光計測のダイナミックレンジは,計測に用いるCCDカメラのダイナミックレンジと,分光器内での光の回折による像の広がりにより制限されることを明らかにした.まず,読み出しノイズが小さく読み出し速度の大きいCMOSカメラと信号の平均操作を組み合わせることで光検出器のダイナミックレンジを向上した.次に,刻線数・実効面積の大きな回折格子を用いて,回折による像の広がりを抑制し,併せて6桁のダイナミックレンジの分光計測システムを開発した.本分光システムを核融合科学研究所で生成される高温水素プラズマからの発光計測に適用し,計測した水素原子線スペクトルからプラズマ中の中性水素原子密度を導出する手法を開発した.本研究の目標は6桁のダイナミックレンジを有する分光計測システムを開発し,磁場閉じ込め高温プラズマからの発光を計測することである.平成25年度は,2種類の分光器とCMOSカメラを用いて,原理上決まる計測システムのダイナミックレンジの上限を評価した.その結果,分光システム内で光学素子の開口部の大きさが有限であることに由来するフラウンホーファー回折によりシステムのダイナミックレンジが制限されることを明らかにした.焦点距離1m,回折格子の大きさ100mmの一般的な高分解分光器だと6桁程度,焦点距離300mm,回折格子の大きさが170mmの研究室保有の低Fナンバー分光器で7桁程度のダイナミックレンジが限界であることがわかった.一方で,実際の計測では光検出システムの読み出しノイズと計測可能な最大の光強度との比がダイナミックレンジを制限する.一般的には4桁程度である.そのため,読み出しノイズが実効的に小さい光電子増倍管を用いた光検出システムの設計を行った.本研究の目標は6桁のダイナミックレンジを有する分光計測システムを開発し,磁場閉じ込め高温プラズマからの発光を計測することである.分光器の原理上決まる計測システムのダイナミックレンジの上限を評価した.光線が分光器内の光学素子を通過する際,光学素子の端で光線が遮られる.このようにして生まれた光線断面での不連続な強度分布が,回折の影響により結像面での像の広がりをもたらし計測のダイナミックレンジを制限していることを明らかにした.回折格子の大きさが170mmの研究室保有の低Fナンバー分光器で6桁程度のダイナミックレンジが限界であることがわかった.分光器内での回折効果の抑制により,さらなる高ダイナミックレンジ分光計測の実証を目指した.我々は分光器内の光路上に,透過率がガウス分布状であるアポダイジングフィルタを設置し,光線断面端部を減光することで,なめらかな強度分布を有する光線を生成した.その結果,分光器のスループットは減少するが,計測のダイナミックレンジをさらに10倍程度向上できることも明らかになった.低Fナンバー分光器を用いた分光システムを,核融合科学研究所で生成される高温水素プラズマからの発光計測に適用した.スペクトル裾部に重畳されて計測される連続光強度の不確かさによりダイナミックレンジが約5桁と理論値よりも減少したが,これまで報告されたことのない高いダイナミックレンジでの水素原子線プロファイルの計測に成功した.計測した水素原子線プロファイルとプラズマ中のイオン温度,密度分布を用いて,プラズマ中の中性水素原子密度を導出する手法を開発した.さらに,動的シュタルク効果によりスペクトル裾部が偏光することを利用して計測スペクトルを連続光と分離する手法を提案し,高精度偏光分離装置も開発した.現状の計測原理の有する根本的なダイナミックレンジの限界を評価することができている.実際の目標達成には,以下に述べるように光検出器の製作や,現有装置を用いた計測法の改良などが必要であるが,その設計や計測方針も完成しており,予定通りに研究が遂行できている.25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,昨年度設計を行った光検出システムの製作を行う.光検出素子である光電子増倍管と,64チャンネルのアナログ・デジタル変換ボードの購入は完了しており,前置増幅回路と筐体の製作を残すのみである.また,計測手法を工夫することにより,現有のCMOSカメラを用いてダイナミックレンジを実効的に増大させる手法についても試行する予定である.開発する上記計測システムを核融合科学研究所に持ち込み,高温プラズマからの水素原子発光線の計測への適用までを行う.25年度が最終年度であるため、記入しない。
道徳性発達の社会心理学的基礎

1.外面的行動傾向と内面的形成水準の継時的変化、前年度作成になる道徳性テストでの結果によれば、この両側面とも学年が上がるにつれ、かえって低下する傾向が認められた。では道徳教育の実践とはどう関係するか。小学校16年、13学級、322名を対象に、1学期末と3学期末に約8ヶ間間隔で2度このテストを施行した。その結果、外的行動傾向には有意な変化がなかったが、内的形成水準は、総合と思いやりの領域で有意な上昇傾向が認められた。また道徳教育に熱心な教師の学級では、一般の学級より、両側面とも向上の比率が高かった。2.道徳性と社会測定的地位との関連。道徳性の指標を、各道徳内容別、行動傾向、形成水準の3得点でとり、社会測定的地位との関連を検討した。小学校1、2、3、5年各1学級、計100名を対象とした。その結果、道徳性のいずれの指標も、被選択数、相互選択数、被排斥数の少なさなど、地位得点・地位指数などと、予測通り、正の有意な相関が認められた。道徳性テストの妥当性に関するひとつの傍証でもある。3.中学生の道徳性データ。小学生高学年用版を用いて、中学生の道徳性データを得、分析した。小学生と同様、学年が上がるにつれ、かえって道徳性の各指標は低下することが認められた。女子は男子よりも高い傾向にあった。さらに、かつて問題行動の多発した荒れた学級では、普通の学級に較べ、一貫して、道徳性の各指標・得点は低かった。4.テスト改訂の作業。テストB(形成水準)では、"あなたなら"と二人称で問う形式のものを作成したが、典型的児童名を付して"その子なら"との認知を問う版も試作し、両者を比較した。結果に有意差はなかった。さらに選択肢数の統一、設問の工夫など改訂作業を進めている。5.道徳性は道徳的価値とも解せられるが、より広く、価値観との関係の吟味をも進行させつつある。中・高・大学生・成人を対象として。1.道徳性診断検査の作成, (1)外面的行動傾向.まず文部省学習指導要領に示されている28の道徳内容に関して,その実現度を調べるためのテストを作成した. (テストA)(2)内面的形成水準.ついで道徳的行動の実現度の背景にある理由・構造を問うために,先行諸研究をも十分に参照の上,I.欲求充足型,II.他者志向型,III,規範連的型,IV.自律的・愛他型,の発達的4類型から成るテストを作成した. (テストB)2.結果,(1)被険者.このテストを小学校児童2,263名(男子1,199名,女子1,064名)に施行した.また55名の教師に自らの担任する児童495名に評価を依頼した.(2)テストAの結果,(1)28の道徳内容の中26内容に関し,統計的に有意な水準で,低学年の方が高く,中学年がこれに次ぎ,高学年が最低というショッキングな結果が得られた.(2)性差に関しては,大多数の項目において,女子の方が男子よりも高い得点が得られた.(3)因子分析の結果,(A)思いやり,(B)自己確立,(C)生活規範,(D)対社会,の4因子が抽出されたが,そのいずれにおいても低学年の方が高得点を示していた.(3)テストBの結果,テストAでの高得点群,低得点群に分けて分析した.(1)高得点群の中では,領域(A),(B)において,低学年から高学年にかけ,内面的形成水準得点は有意に上昇していた.(2)低得点群の中では,領域(A)では,中学年から高学年にかけて内面的形成水準得点の有意な上昇が認められた. (4)テストの妥当性の検証,(1)道徳教育に熱心なベテラン教師の学級の児童と,一般学級の児童とを比較すると,テストA・Bとも,4領域のいずれにおいても,前者は後者よりも有意に高く,テストの妥当性を示す知見が得られた.(2)児童の自己評価と教師評価を比較検討すると,各種の有意な関連が認められ,児童の自己記述方式による道徳性診断検査による測定の試みが,方法的に妥当であることが示された.1.外面的行動傾向と内面的形成水準の継時的変化、前年度作成になる道徳性テストでの結果によれば、この両側面とも学年が上がるにつれ、かえって低下する傾向が認められた。

3.中学生の道徳性データ。小学生高学年用版を用いて、中学生の道徳性データを得、分析した。小学生と同様、学年が上がるにつれ、かえって道徳性の各指標は低下することが認められた。女子は男子よりも高い傾向にあった。さらに、かつて問題行動の多発した荒れた学級では、普通の学級に較べ、一貫して、道徳性の各指標・得点は低かった。4.テスト改訂の作業。テストB(形成水準)では、"あなたなら"と二人称で問う形式のものを作成したが、典型的児童名を付して"その子なら"との認知を問う版も試作し、両者を比較した。結果に有意差はなかった。さらに選択肢数の統一、設問の工夫など改訂作業を進めている。5.道徳性は道徳的価値とも解せられるが、より広く、価値観との関係の吟味をも進行させつつある。中・高・大学生・成人を対象として。
異種移植臓器の開発を目指した糖鎖抗原の改変

昨年に引き続き、ブタ血管内皮細胞を利用して、糖鎖構造の改変を試みた。2、3のα2-6STの導入しクローンを得た。これらのクローンでは、コントロールのブタ血管内皮細胞に比べ、ヒト正常血清(NHS)やalpha1-3Galactosyl epitopeを認識する1B4レクチンに対する反応性は60-80%低下した。ヒト正常血清を用いた細胞傷害性試験でもはほぼ同様で、傷害性は60-80%低下した。2)次に、これまでに調べた、GnT-IIIとα2-3ST(ST3Gal III)の共発現による相乗効果を検討した。得られたクローンは3種類で、それぞれのGnT-IIIとα2-3STの酵素活性はコントロールに用いたGnT-III、α2-3ST単独発現のクローンに比べ低いにもかかわらず、ヒト正常血清(NHS)や1B4レクチンに対する反応性は同程度かより低下していた。また、ヒト正常血清を用いた細胞傷害性試験でもはほぼ同様の結果を得た。ブタ血管内皮細胞にGnT-IIIを導入し細胞表面の糖鎖デザインのリモデリングがヒト自然抗体に対する抗原性を抑制するかを検討した.遺伝子導入は発現ベクターpCAGGS(β-actin promoter)にヒトGnT-III,ヒトα1,2Fuc Tのc-DNAを挿入し,リピッド法によりSECに導入した.抗原性ではGnT-III transfectantsはparental SECに比しNHSで6580%,IB-4レクチンで5070%の抗原性の低下を示した.一方、全臓器にGnT-III活性を過剰発現したGnT-IIIトランスジェニック=マウスを用い、ヒトに対する抗原性の制御に有効かどうかを生体レベルで検討,解析した.本来,正常マウスでも高い活性を認めていた腎臓ではヒト正常血清に対する反応性は変化しなかった.しかし,過剰活性を認めた心臓,肺では66KDa以下の糖タンパク質について劇的に反応性が減少した.また,脾細胞を用いた抗原性の解析では,トランスジェニック=マウスは,正常マウス脾細胞に比し約80%ヒトに対する抗原性の低下を示した。今回我々は,GnT-IIIトランスジェニック=マウスを用い、ヒト自然抗体に対する抗原性がGnT-IIIの活性発現に伴い抑制されることをつきとめた。糖鎖遺伝子導入による糖鎖デザインモリデリングの可能性は,“もともと活性のない臓器"に過剰に酵素活性を発現させることができるかが重要なポイントであることも明らかになった。(1)抗原性の解析としてヒト正常血清(NHS)の細胞表面との反応性をFACSで解析した.タンパク糖鎖の変化は(2)ウエスタン及びレクチンブロット法にて解析した.(細胞より抽出した糖タンパク質3μgをSDS-PAGEで電気泳動し,IB-4及びNHSを用いて解析した.)また,細胞傷害性は(3)LDHアッセイ(細胞を20%,40%NHSと反応させ%cytotoxicityを測定した)にて解析した.Transdfectantsは,ネオマイシンにより選択し,4つのα23ST高発現クローンを樹立した。同様にα1,2FT Transfectantsも2つの高発現クローンを樹立した.抗原性ではα23ST transfectantsはparental SECに比しNHSで65-80%,IB-4レクチンで55-80%の抗原性の低下を示した.一方,α1,2FT TransfectantsはNHSで40-50%,IB-4レクチンで55-65%抗原性が低下した.ウエスタン及びレクチンブロット法では,α23ST,α1,2FT Transfectants両者ともに66KDa以下の糖タンパク質について,NHS,IB-4両者に対する反応性が著明に減少した.また,ブタ血管内皮に対する細胞傷害性では23ST Transfectantsでは,6080%,α1,2FT Transfectantsでは70% cytotoxicityを抑制した。2)次に、これまでに調べた、GnT-IIIとα2-3ST(ST3GalIII)の共発現による相乗効果を検討した。

得られたクローンは3種類で、それぞれのGnT-IIIとα2-3STの酵素活性はコントロールに用いたGnT-III、α2-3ST単独発現のクローンに比べ低いにもかかわらず、ヒト正常血清(NHS)や1B4レクチンに対する反応性は同程度かより低下していた。また、ヒト正常血清を用いた細胞傷害性試験でもはほぼ同様の結果を得た。
多能性幹細胞特異的受容体の同定による骨格筋内脂肪蓄積機構の解明

本課題は、申請者が取得した筋分化能・脂肪分化能の両者を併せ持つ多能性幹細胞クローン2G11を抗原として単クローン抗体を作成することにより、多能性幹細胞の細胞膜上に特異的に発現するような受容体分子の同定を試みるものである。昨年度までに、2G11細胞を抗原とした単クローン抗体の作成を行った。2G11Balb/cマウスへの数回の免疫により、2G11細胞に対する抗体価が上昇したのを確認したのち、免疫マウスの脾細胞とミエローマ細胞を融合しハイブリドーマを作出した。合計614個のハイブリドーマが得られ、このうちラット骨格筋から採取した単核の細胞群を染色するものを20候補選択した。本年度は得られた20候補のハイブリドーマが産生する抗体により認識される標的抗原の同定を進めた。その結果、いずれの抗原も当初の目的に合致したものではなかった。そこで、2G11細胞を抗原として免疫する方法やスクリーニングの方法に改良を加え、再度単クローン抗体の作成を試みることにした。本年度は、2G11細胞を抗原とした単クローン抗体の作成を行った。今後は得られた20候補のハイブリドーマが産生する抗体により認識される細胞群の分化能について解析を行うとともに、その標的抗原の同定を進める予定である。
放射線治療後にみられる再増殖腫瘍細胞の運動特性の解析

放射線治療は癌の非侵襲的治療法の一つとして重要で有効な治療方法の一つである。近年の著しい放射線治療技術の進歩は治療成績を大きく向上させた。しかし、これらの技術進歩にも関わらず、放射線治療後に発生する再増殖腫瘍細胞の制御は困難である。再増殖腫瘍細胞は、照射前の腫瘍と比較して悪性度が高く、患者の生命予後を悪化させる。しかし残念ながら、腫瘍の再増殖を引き起こす分子メカニズムは未だに解明されていない。そこで本研究では、再増殖腫瘍の性質を分子レベルで理解し制御することが放射線治療による寛解率を改善する上で重要な要素であると考え、再増殖腫瘍細胞のモデル細胞群IR株の細胞特性を解析した。IR株はマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現量が親株と比較して高く、IR株のゼラチナーゼ活性も親株と比較して高かった。また、ボイデンチャンバー法を用いてトランズウェルを通過するIR株の細胞数を親株と比較した結果、IR株は親株と比較して、I型コラーゲンをコートしたウェルに対する浸潤能力が高かった。Wound healing assayの結果、IR株は親株と比較して、高い運動能力を持つことがわかった。一方、両株の細胞増殖能力に大きな差はなく、EGF受容体のチロシンキナーゼ活性やERKの活性化もウェスタンブロット法による検討では大きな差異はみられなかった。しかし、IR株の細胞接着能は親株と比較して大きく増加しており、インテグリンβ1、パキシン、FAKなどの細胞基質間接着分子の接着斑への局在が増大していた。一方、これら接着分子の細胞内発現量は両株において変わらなかった。IR株における運動能亢進は、細胞接着分子の局在の変化によるものである可能性が考えられた。放射線治療は癌の非侵襲的治療法の一つとして非常に重要な治療方法の一つである。近年の著しい放射線治療技術の進歩により、治療精度が大幅に向上し治療成績は大きく上昇した。しかしながら、これらの進歩にも関わらず、再増殖腫瘍細胞の制御は大きな課題として残っている。放射線照射後に出現する再増殖腫瘍細胞は、照射前の腫瘍と比較して悪性度が高いため、再増殖腫瘍の出現は患者の生命予後を悪化させる。そこで申請者は、再増殖腫瘍の性質を分子レベルで理解し、これを制御することが放射線治療による寛解率を改善する上で重要な要素であると考えた。本研究では、ヒト肺非小細胞癌H1299株を放射線照射後に分裂能・増殖能を有した細胞群を再増殖腫瘍細胞のモデル細胞群IR株とし、IR株の運動能および浸潤能を親株と比較・検討した。予備実験においてIR株におけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現量が親株と比較して高かったことに着目し、Zymogramによるゼラチナーゼ活性試験を行ったところ、IR株のゼラチナーゼ活性が親株と比較して高かった。この結果に基づきボイデンチャンバー法を用いてトランズウェルを通過するIR株の細胞数を親株と比較した結果、IR株は親株と比較して、Type-Icollagenをコートしたwellに対する浸潤能力が高かった。また、Wound healing assayの結果、IR株は親株と比較して、高い運動能力を持つことがわかった。一方、IR株と親株の増殖能力をMTS試験によって比較したところ、両者はほぼ同程度に増殖することがわかった。20年度の研究結果により、再増殖腫瘍細胞モデル細胞群IR株は、増殖能は親株と変わらないが、浸潤能、運動能とも親株と比較して高いことがわかった。しかし、これらの技術進歩にも関わらず、放射線治療後に発生する再増殖

腫瘍細胞の制御は困難である。再増殖腫瘍細胞は、照射前の腫瘍と比較して悪性度が高く、患者の生命予後を悪化させる。残念ながら、腫瘍の再増殖を引き起こす分子メカニズムは未だに解明されていない。申請者は、再増殖腫瘍の性質を分子レベルで理解し、制御することが放射線治療による寛解率を改善する上で重要な要素であると考えた。本研究では、再増殖腫瘍細胞の運動能と浸潤能に焦点を絞り、申請者が樹立したモデル細胞群IR株の細胞特性を解析した。IR株の運動能を検討したところ、IR株は親株と比較して運動能が増加していた。両株の細胞増殖能に大きな差はなく、EGF受容体のチロシンキナーゼ活性やERKの活性化にもウェスタンブロット法による検討では大きな差異はみられなかった。しかし、IR株の細胞接着能は親株と比較して大きく増加しており、インテグリン、パキシン、FAKなどの細胞基質間接着分子の接着斑への局在が増大していること免疫染色により観察した。これら接着分子の細胞内発現量は両株において変わらなかった。IR株における運動能亢進は、細胞接着分子の局在の変化によるものである可能性が考えられた。また、最終年度の本年は、得られた研究成果を米国治療放射線腫瘍学会議で発表するとともに、Cell Structure and Functionに筆頭著者兼責任著者として公表した。
霊長類における出典記憶大脳ネットワークの解明：fMRI・光遺伝学の複合アプローチ

本研究は、どのような文脈で出来事が起きたかについての記憶(出典記憶)のうち、時間的文脈の記憶を調べる時間順序識別記憶課を用いて、大脳記憶ネットワークにおける前頭葉の果たす役割の解明を目的としている。機能的磁気共鳴画像法(fMRI)により同定された課題遂行中に活動する脳領域(Osada et al., PLOS Biology, 2015)に対し、光遺伝学的手法による介入を当初は予定していたが、技術的困難により手法が変更となり、ムシモル(GABAA受容体アゴニスト)を用い、神経活動抑制をする薬理学的介入実験を行うこととなった。課題遂行中のfMRI実験により同定された前頭葉領域に対して薬理学的介入を行い、2頭のサルで実験を進めた。課題遂行への影響を調べたところ、神経活動抑制により課題遂行に影響が出ることが認められた。本研究は、出来事がどのような文脈で起きたかに関する記憶である出典記憶のうち、時間的文脈の記憶を調べる課題である時間順序識別記憶課を用いて、大脳記憶ネットワークにおける前頭葉の果たす役割の解明を目的としている。機能的磁気共鳴画像法(fMRI)により同定された課題遂行中に活動する脳領域(Osada et al., PLOS Biology, 2015)に対して、領域の神経活動と行動との直接的な因果関係を調べた。具体的には、神経活動不活性化を薬理学的介入で行い、介入による課題遂行への影響を検証した。薬理学的不活性化の予備実験を行い、本番実験を1頭のサルにおいて行った。なお、当初の研究計画では、神経活動抑制型の光活性化タンパク質をウイルスベクターを用いて導入し、留置型剣山型光ファイバプローブを使った広域大脳皮質へのレーザー光照射による神経活動抑制を予定していたが、予備実験で検討した結果、技術的困難が解消できないため、薬理学的介入による神経活動抑制を行うよう研究計画を変更した。当初はfMRI実験により同定された前頭葉領域に対して、神経活動抑制型の光活性化タンパク質ArchT3.0をウイルスベクターを用いて導入し、留置剣山型光ファイバプローブを使った広域大脳皮質レーザー光照射を用い、神経活動抑制を行うことを計画していた。しかし、留置剣山型光ファイバプローブの開発・留置や神経細胞抑制システムの検討などの予備的実験を重ねた結果、いくつかの技術的問題点が解消できないため、当初の予定を変更することとした。そのため、ムシモル(GABAA受容体アゴニスト)を用いて、fMRI実験により同定された領域に対して薬理学的介入を行い、課題遂行への影響を検討する実験デザインへと進めることとした。薬理学的介入実験について予備実験を行い、実験システムセットアップおよび手技の検討を1頭のサルを用いて行った。予備実験を行ったのち、本番実験においては、fMRI実験により同定された前頭葉領域に対して薬理学的介入を行い、課題遂行への影響を検討する実験を1頭のサルで進めており、予備的データも出ている。また、2頭目のサルについても課題訓練は終了している。機能的磁気共鳴画像法(fMRI)により同定された課題遂行中に活動する脳領域(Osada et al., PLOS Biology, 2015)に対し、神経活動不活性化を薬理学的介入で行い、介入による課題遂行への影響を検証した。昨年度に引き続き、2頭のサルにおいて介入実験を行った。大脳記憶前頭葉ネットワークにおける上記の介入実験を行うとともに、未知の出来事を「未知」と判断するメタ認知に関わる脳領域ネットワークのfMRIによる同定および神経活動不活性化による介入の効果について報告し、この研究成果は学術雑誌Neuronに掲載された(Miyamoto, Setsuie, Osadaand Miyashita, Neuron, 2018)。さらに、fMRIを用いた脳ネットワーク分析を、ヒトを対象とした研究かつ皮質下領域である視床下部にも適用し、視床下部の種々の核をfMRIにおいて生きたままの状態で機能的に同定する方法を開発し、その上グルコース摂取後の核の活動変化を計測することに成功した。この成果を学術雑誌(Osada et al., Neuroimage, 2017)、国際学会など(第40回日本神経科学大会など3件)において発表した。昨年度の技術的手法の変更を受け、ムシモル(GABAA受容体アゴニスト)を用いて、神経活動抑制をする薬理学的介入を行い、課題遂行への影響の検証についての実験を引き続き行った。時間順序識別記憶課題遂行中のfMRI実験により同定された前頭葉領域に対して薬理学的介入を行い、課題遂行への影響を検討する実験を2頭のサルで進めた。課題の遂行成績への影響を調べ、影響が出ることが認められた。薬理学的介入実験でのデータ取得は完了しており、現在論文発表の準備中である。上記の出典記憶を司る大脳ネットワークへの介入実験を行うとともに、(1)未知の出来事を未知と判断することについてのメタ認知に関わる脳領域・ネットワークのfMRIによる同定および神経活動不活性化によるメタ認知能力への影響の検証(Miyamoto et al., Neuron, 2018)、(2)ヒトを対象とした研究かつ皮質下領域である視床下部にも適用し、ヒト視床下部の種々の核を生きたままの状態でfMRIにより機能的に同定する手法の開発・グルコース摂取後の核の活動変化の計測(Osada et al., Neuroimage, 2017など)といったようにfMRIによる脳ネットワーク分析手法の適用の幅を広げてきている。

本研究は、どのような文脈で出来事が起きたかについての記憶(出典記憶)のうち、時間的文脈の記憶を調べる時間順序識別記憶課を用いて、大脳記憶ネットワークにおける前頭葉の果たす役割の解明を目的としている。機能的磁気共鳴画像法(fMRI)により同定された課題遂行中に活動する脳領域(Osada et al., PLOS Biology, 2015)に対し、光遺伝学的手法による介入を当初は予定していたが、技術的困難により手法が変更となり、ムシモル(GABAA受容体アゴニスト)を用い、神経活動抑制をする薬理学的介入実験を行うこととなった。課題遂行中のfMRI実験により同定された前頭葉領域に対して薬理学的介入を行い、2頭のサルで実験を進めた。課題遂行への影響を調べたところ、神経活動抑制により課題遂行に影響が出ることが認められた。当初の留置型剣山型光ファイバプローブを使った広域大脳皮質へのレーザー光照射による神経活動抑制を行うという研究計画が予定変更となったが、薬理学的介入による課題遂行への影響を見ることで、大脳記憶ネットワークにおける前頭葉の果たす役割の解明という当初の目的の達成を目指している。薬理学的介入による行動の変化から、fMRI実験において同定された前頭葉領域の大脳ネットワークにおける機能の解明が期待される。平成29年度は、平成28年度で進めている実験を引き続き継続し、実験データをまとめ、学術雑誌への原著論文の発表を行う予定である。昨年度の技術的手法の変更はあったものの、薬理学的介入による課題遂行への影響を見ることで、大脳記憶ネットワークにおける前頭葉の果たす役割の解明という当初の目的の達成を目指している。薬理学的介入による行動の変化が確認されるという結果が得られたため、平成30年度はこの成果をまとめ、学術雑誌への原著論文の投稿・発表を行う。また、得られた成果は、研究室のウェブページやプレスリリースなどを用いて、積極的に社会に発信する。研究計画の変更や他予算の都合により、備品購入などに変更が生じた。また、研究補助について計上していた人件費の執行についても変更が生じた。そのため、一部使用予定を変更し、次年度に使用するようにした。研究結果から当初の予定より精緻に研究遂行をする必要が生じたため、次年度に使用するようにした。平成28年度で執行する予定であった研究補助の人件費として使用する予定である。
WWWに基づく電子商取引支援のためのエージェント間の協調機構とその応用

本年度は、電子商取引を支援するためのエージェント間の協調・交渉機構と、その応用システムの実現を目指した。具体的には,主に以下の3点を行った.(a)電子商取引における売り手を支援するために、売り手エージェントの協調機構を提案した。本協調機構では、2エージェント間の個人合理性に基づく割り当てを保証する。また、本協調機構に基づき、P2Pに基づく電子商取引支援モデルを提案した。(b)買い手の支援のために、エージェント間の協調的入札機構に基づく複数オークション入札支援システムBiddingBotを試作し、その有用性を実験を通して示した。(c)電子商取引支援のためのエージェント間の交渉機構の理論的な設計を行った。まず、取引される財の質に注目し、質を見極められる専門家とそうでない非専門家が存在する状況(自然の選択に関する非対称情報が存在する状況)で、真の申告が支配戦略となるようなオークションメカニズムを提案した。また、指名入札に注目し、買い手が売り手を指名した上で売り手がオークションを行うメカニズムの談合に対する頑健性等を示した。以上をまとめ、3本の雑誌論文(和文1、欧文2)に採録済みであり、3つの関連国際会議で発表、または発表予定である。その中でも、特に(a)の成果の一部は、国際会議PAIS2001での発表論文の質の高さが評価され雑誌論文(欧文)としてセレクトされた。また、(c)の成果の一部は、国際的に評価の高いAAMAS2002に受理された。本研究の成果は以下の3点である。(1)電子商取引支援のための売り手のエージェント間交渉における協調方式を提案した。(2)買い手の電子商取引を支援するための複数オークション入札支援システムを試作し、その有用性を実験により示した。(3)自然の選択に関する非対称情報が存在する状況でのオークションメカニズム、および、指名入札に基づくオークシヨンメカニズムの理論的な分析を行った。
膵島不全におけるオートファジーの役割

(1)後天的膵β細胞特異的オートファジー不全モデルマウスの確立と解析:我々はMIP-CreERマウスとAtg7fl/flマウスを交配することにより、MIPCreER;Atg7fl/flマウスを作成し、十分膵発生が終了した段階でタモキシフェンを投与することにより、膵β細胞に後天的オートファジー不全を導入するモデルを作成した。タモキシフェン投与2週後では耐糖能に全く異常を認めないが、投与6週後に著明な耐糖能悪化を認めることを確認している。この機序に迫る目的で、タモキシフェン投与2週後と6週後のマウスから膵島を単離し、RNA-seq解析を行い、投与後2週からコントロールマウスと発現量の異なる遺伝子Xを同定した。その後の解析で、本遺伝子の膵β細胞における発現は糖尿病モデルマウスで早期から亢進することが分かった。また、膵β細胞株を用いて本遺伝子発現を抑制したところ、オートファジー不全下で細胞死の増加が認められたため、オートファジー不全による細胞死抑制因子であることが示唆された。(2)膵α細胞におけるautophagy statusの評価と膵α細胞特異的Atg7KOマウスの確立:Glucagon-CreERマウスとAtg7 floxマウスを交配しTamoxifenを投与することで、膵α細胞特異的かつ後天的にAtg7遺伝子を欠失するモデルマウス、αAtg7KOマウスを作製した。現在までには膵α細胞数の増加以外に大きな異常を認めていない。(3)膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスの作製:膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスを作製し、週齢を追って膵β細胞機能の評価を行った。後天的膵β細胞特異的オートファジー不全モデルマウスの確立と解析のプロジェクトに関しては、予定通りに研究が進展しており、さらにオートファジー不全による膵β機能不全の代償機構のkey moleculeの可能性のある遺伝子Xの単離に成功した。したがって、このプロジェクトに関しては当初の計画以上に研究は進展している。膵α細胞におけるautophagy statusの評価と膵α細胞特異的Atg7KOマウスの確立に関しても当初の予定通り、研究は進展しているが、膵α細胞数の僅かな増加という以外大きなphenotypeは認めていない。結果のインパクトは予想外であったが、膵α細胞機能維持においてオートファジーのインパクトが小さいことを明らかにしたことは意味のある結果と考えている。さらに、膵β細胞におけるマイトファジー制御分子、BCL2L13の解析においては、計画通り、膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスの作製に成功しており、当初の計画通り、研究は進んでいる。(1)後天的膵β細胞特異的オートファジー不全モデルマウスの確立と解析:上述した通り、オートファジー不全による細胞死抑制因子の可能性のある遺伝子Xを単離した。そこで本年度は遺伝子Xの膵β細胞死機構における作用を検討する目的で、培養細胞を用いて、本遺伝子がアポトーシス機構にどのような作用を有しているか検討を行う。さらに、遺伝子Xのin vivoでの膵β細胞機能における作用を検討する目的で遺伝子Xfloxマウスを作製し、膵β細胞特異的遺伝子Xノックアウトマウスを作製する。(2)膵α細胞におけるautophagy statusの評価と膵α細胞特異的Atg7KOマウスの確立:作成したαAtg7KOマウスにおいて様々な解析を行ったがが、現在までには膵α細胞数の著明な増加以外に大きな異常を認めていないため、この結果を論文に報告する。(3)膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスの作製:膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスを作製し、週齢を追って膵β細胞機能の評価を行ったが現在までに明らかなphenotypeを認めていないが、本年度は高脂肪食負荷とインスリン受容体拮抗薬であるS961投与を行いインスリン抵抗性状況における膵β細胞のBCL2L13の機能に関して検討する。(1)膵β細胞機能における後天的オートファジー不全の役割の検討:後天的オートファジー不全が膵β細胞機能に与える影響に関して検討するため、MIP-CreERマウスとAtg7fl/flマウスを交配することにより、MIP-CreER;Atg7fl/fl mマウスを作成し、十分膵発生が終了した段階でタモキシフェンを投与することにより、後天的オートファジー不全を導入するモデルを作成し解析を行った。その結果、タモキシフェン投与2週後(post TM 2W)では耐糖能に全く異常を認めないが、投与6週後(post TM 6W)に著明な耐糖能悪化を認めた。すなわち、オートファジー不全による膵β細胞機能不全はオートファジー不全による異常たんぱくの集積がその原因となっていることが示唆された。(2)膵α細胞におけるオートファジーの検討:膵α細胞特異的かつ後天的にAtg7遺伝子を欠失するモデルマウス、αAtg7KOマウスを作製しTamoxifenを投与後16週齢のマウスを用いて膵α細胞におけるオートファジーの意義を検討した。膵α細胞でp62の蓄積が認められ、実験系が機能していることが確認されるとともに、膵α細胞数の増加した膵島の存在が確認された。しかしながらグルカゴン分泌、耐糖能ともに明らかな異常は認められなかった。したがって、膵α細胞においてオートファジー不全は膵島機能に大きな障害をもたらさないことが明らかとなった。

(3)新規マイトファジー鍵分子の機能解明:海外からの搬入の問題でBCL2L13floxマウスの入手が遅れていたが、何とか搬入に成功し、膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスの作成に成功した。研究計画で上げた4つのプロジェクト(1)膵β細胞機能における後天的オートファジー不全の役割の検討(2)膵α細胞におけるオートファジーの検討(3)新規マイトファジー鍵分子の機能解明(4)膵β細胞におけるオルタナティブオートファジー機構の解明のうち、上述したしたとおり、(1)、(2)に関しては計画通りに進行している。(3)に関してもマウスの作成に成功したとことである。(4)膵β細胞におけるオルタナティブオートファジー機構の解明の評価法の確立はチャレンジングな研究内容であり、成果は得られていない。(1)後天的膵β細胞特異的オートファジー不全モデルマウスの確立と解析:我々はMIP-CreERマウスとAtg7fl/flマウスを交配することにより、MIPCreER;Atg7fl/flマウスを作成し、十分膵発生が終了した段階でタモキシフェンを投与することにより、膵β細胞に後天的オートファジー不全を導入するモデルを作成した。タモキシフェン投与2週後では耐糖能に全く異常を認めないが、投与6週後に著明な耐糖能悪化を認めることを確認している。この機序に迫る目的で、タモキシフェン投与2週後と6週後のマウスから膵島を単離し、RNA-seq解析を行い、投与後2週からコントロールマウスと発現量の異なる遺伝子Xを同定した。その後の解析で、本遺伝子の膵β細胞における発現は糖尿病モデルマウスで早期から亢進することが分かった。また、膵β細胞株を用いて本遺伝子発現を抑制したところ、オートファジー不全下で細胞死の増加が認められたため、オートファジー不全による細胞死抑制因子であることが示唆された。(2)膵α細胞におけるautophagy statusの評価と膵α細胞特異的Atg7KOマウスの確立:Glucagon-CreERマウスとAtg7 floxマウスを交配しTamoxifenを投与することで、膵α細胞特異的かつ後天的にAtg7遺伝子を欠失するモデルマウス、αAtg7KOマウスを作製した。現在までには膵α細胞数の増加以外に大きな異常を認めていない。(3)膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスの作製:膵β細胞特異的BCL2L13ノックアウトマウスを作製し、週齢を追って膵β細胞機能の評価を行った。後天的膵β細胞特異的オートファジー不全モデルマウスの確立と解析のプロジェクトに関しては、予定通りに研究が進展しており、さらにオートファジー不全による膵β機能不全の代償機構のkey moleculeの可能性のある遺伝子Xの単離に成功した。したがって、このプロジェクトに関しては当初の計画以上に研究は進展している。膵α細胞におけるautophagy statusの評価と膵α細胞特異的Atg7KOマウスの確立に関しても当初の予定通り、研究は進展しているが、膵α細胞数の僅かな増加という以外大きなphenotypeは認めていない。
窒化物半導体量子構造に基づくサブバンド間遷移機能光デバイスの研究

本研究の目的は、(1)MOVPEによるGaN/AIN単原子層急峻ヘテロ界面の形成MOVPEでは、成長が1100度以上の高温で行われること、原料ガスの対流が生じること、ガス切り替え時にそれまでの原料ガスが残留することを主因として界面のボケが生じ、サブバンド間遷移波長の短波長化を阻害する。中でも高温成長の問題が大きい本研究では、III族原料のパルスインジェクションという新たな技術を開発し、高品質なAINをMOVPEとしては画期的な800度で成長することに成功した。平成18年度は、同じパルスインジェクションでGaNを成長する条件を確立し、単原子層急峻ヘテロ界面を有すると考えられるGaN/AIN多重量子井戸構造の形成を実際に行った。(2)窒化物半導体多層構造のハイメサ導波路加工平成18年度は、AINの加工に際しドライ加工後にウェット加工を追加する方式を導入し、非常に良好なストライプ導波路を得ることに成功した。特にストライプ導波路側面平滑性の格段の改善によって、これまで作製が困難であったリッジ型導波路を実現した。具体的には、ドライ加工におけるAINのダメージ層をTMAHまたはKOHで取り除く。ただしGaNがこの溶液ではほとんどエッチングされることがないため、ハイメサ型導波路において良好な側面を得るには、いま少しの研究が必要な状況である。(3)相互吸収変調型超高速全光スイッチの試作実際にこの技術を使用してデバイスを作製し、動作確認を行った。現状では成長装置の問題から動作の低エネルギー化を実現するまでには至っていないが、AINを緩衝膜とした構造で初めてリッジ導波路における動作を実現し、吸収の生じないTEモードにおいて素子の長さに対して損失がほとんど変化していない結果を得た。1.MOVPEによるGaN/AlN単原子層急峻ヘテロ界面の形成MOVPEでは,成長が1100度以上の高温で行われること,原料ガスの対流が生じること,ガス切り替え時にそれまでの原料ガスが残留すること,を主因として界面のボケが生じ,サブバンド間遷移波長の短波長化を阻害する.中でも高温成長の問題が大きい.本研究では,III族原料のパルスインジェクションという新たな技術を開発し,高品質なAlNをMOVPEとしては画期的な800度で成長することに成功した.現在同じパルスインジェクションでGaNを成長することに取り組んでいる.この技術を利用して,次年度はMOVPEで単原子層急峻ヘテロ界面の形成が可能になると期待される.2.窒化物半導体多層構造のハイメサ導波路加工窒化物半導体は,As系やP系の化合物半導体に比べ極めて固く,導波路などのエッチング加工が難しい.本研究では,塩素系誘導結合プラズマ反応性イオンエッチングを利用して,GaN,AlNからなる多層構造を垂直性高くエッチングする技術を開発した.作製したハイメサ導波路において導波特性を詳細に測定評価し,結晶欠陥に起因する導波損失が期待通り低減されていることを確認した.3.相互吸収変調型超高速全光スイッチの試作今年度はMOVPEによる1.55μm帯サブバンド間遷移がまだ得られていないので,分子線エピタキシー(MBE)とMOVPEのハイブリッド成長により同波長帯のサブバンド間遷移吸収を有する量子井戸構造を形成し,(2)を適用して導波路加工した.スーパーコンティニューム光を利用して吸収特性を評価し,実際に1.55μm帯でのサブバンド吸収の実現されていることが確認された.同導波路における相互吸収変調全光スイッチ動作を測定評価したところ,過去最少の制御光パワーで全光スイッチングの得られていることがわかった.本研究の目的は、(1)MOVPEによるGaN/AIN単原子層急峻ヘテロ界面の形成MOVPEでは、成長が1100度以上の高温で行われること、原料ガスの対流が生じること、ガス切り替え時にそれまでの原料ガスが残留することを主因として界面のボケが生じ、サブバンド間遷移波長の短波長化を阻害する。
神経細胞膜ラフト可視化のためのガングリオシドプローブの開発

本年度では、前年度から進めていたガングリオシドGD3およびGQ1bのプローブの合成を継続して進めた。GD3の有するシアル酸二量体の末端シアル酸にアミノ基を有するシアル酸二量体類縁体の合成法を確立し、これを用いてシアル酸二量体を含む三糖骨格を構築した後、脂質導入部とのグリコシル化を経てGD3骨格を構築した。その後、全保護基を除去した後、蛍光色素を導入し、糖鎖修飾型のGD3プローブの合成を達成した。また、このGD3骨格の構築法をGQ1bの合成に応用した。ジシアリルガラクトース構造を二つ有するGQ1bの分子構造に蛍光標識する部位として、六糖からなる糖鎖主鎖の末端に位置するシアル酸の9位を選択した。上述のGD3蛍光プローブの合成法に準拠して、9位に保護アミノ基を有するジシアリルガラクトース骨格を構築し、適切に保護した糖供与体へと誘導した。一方で、シアル酸二量体を含む四糖受容体を合成した。三糖供与体と四糖受容体とのグルコシル化反応により、分岐七糖を得て、糖供与体へ誘導した後、脂質部分との最終グリコシル化反応、全脱保護反応、蛍光色素の導入を経て糖鎖修飾型のGQ1bプローブの合成も達成することが出来た。また、脂質修飾型プローブの合成では、脂質部位にジアジリン基を有するGM1プローブの合成に成功した。合成したプローブの生物物理的評価を連携研究者の鈴木博士の協力の下実施し、天然のガングリオシドと同様の動態を細胞膜上で示すことが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、光応答性ガングリオシドプローブの合成として、糖鎖修飾型プローブ(GD3,GD1b, GT1b)脂質修飾型プローブ(GM3,GM1)を標的化合物として合成研究を進めた。シアル酸二量体を含むガングリオシドであるGD3,GD1b,GT1bのうち、分岐構造を有するGD1b、GT1bの合成については、GM2,GM1蛍光プローブの合成法に準拠し、当研究室で確立したGD3コアユニットを共通ユニットとして合成を進め、糖鎖末端にアミノ基を有するアミノGD1b、GT1bの合成に成功した。今後は、合成の最終段階である光応答性官能基を有するユニットの導入を経て、標的構造を得る予定である。一方、脂質修飾型プローブの合成では、脂質部分であるセラミドを構成する脂肪酸の末端に光応答性官能基を結合させたユニットの合成を検討し、目的の修飾脂肪酸を得ることが出来た。GM3プローブの合成では、すでに確立したGM3プローブの合成法を基に脂質部分にアミノ基をもつGM3へと導き、修飾脂肪酸を導入することで目的の脂質修飾型光応答性GM3プローブの合成を達成した。現在は、GM1の合成も進めており、間もなく完了の予定である。合成したGM3プローブの生物物理的評価において、天然ガグリオシドと同様のラフト親和性を有することが示された。当初の計画に基づき、本年度は糖鎖修飾型光応答性プローブ3種類と脂質修飾型光応答性プローブの合成2種類の合成を目標として研究に着手した。その結果、糖鎖修飾型においては最終段階の反応を残すのみとなり、合成上の課題をすべて解決することが出来た。また、脂質修飾型では一つのプローブの合成を完了し、さらに生物物理学的評価も終えている。以上のことから、概ね計画通りに進んでいると判断した。初年度に得られた成果を基として、糖鎖および脂質修飾型のプローブの合成を推進する。合成完了したプローブは順次生物物理学的評価を行い、プローブのラフト親和性を確認していく。

良好なラフト親和性を確認できたものは、神経細胞モデルに対する神経突起伸展活性試験に供し、生理活性の保持を確認する。活性が確認された場合は、細胞膜でのプローブの挙動を一分子イメージングにより解析し、神経細胞成長因子受容体との相互作用を調べる。さらに、細胞にプローブを添加して、光架橋反応によりガングリオシドと相互作用する膜分子の特定を試みる。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトテロメアRNA分子における修飾の探索

本研究では8,2'-環状グアノシンおよび5',8-環状グアノシンのような核酸塩基の自由度を制限したヌクレオシドを導入したヒトテロメアRNAを合成し、このRNAで形成される四重鎖構造中の修飾の影響を調査した。主な成果として、核酸塩基の自由度を制限したヌクレオシドの導入が四重鎖構造の巻きやトポロジーの変化を誘起することを見出した。これらの成果はヒトテロメアRNAの新たな構造と機能を解析する上で重要な知見と期待される。本申請研究の目的は、限りなく天然に存在しうる修飾核酸を合成し、ヒトテロメア部位におけるグアニン四重鎖構造形成への影響を明らかにすること、またそれらの修飾核酸とテロメア関連タンパク質との結合能を評価し、生体内での機能解明につなげることである。現在まで申請書の予定通りに、グアニンの8位とリボースの2'位が酸素を介して環状となっている8,2'-環状グアノシンを含む核酸およびリボースの2'位と5'位の水酸基がホスホジエステル結合で連結された核酸の合成を達成するために、それぞれのホスホロアミダイト化合物の合成を遂行した。各反応条件を最適化しながら、それぞれ目的化合物の合成に成功した。またこれらのホスホロアミダイト化合物が核酸合成中に用いられる脱保護条件などで分解などはしないことも同時に検討した。その後、これらのホスホロアミダイト化合物を核酸オリゴの所定の位置に導入し、RP-HPLC精製後、MALDI-TOF MSによる質量分析により、目的の修飾核酸の合成を達成した。現在はその修飾核酸を用いて着目した修飾がグアニン四重鎖構造形成に及ぼす影響についてin vitroで評価中である。主な成果として、核酸塩基の自由度の制限されたヌクレオシドの導入が四重鎖構造の巻きやトポロジーの変化を誘起することを見出した。26年度が最終年度であるため、記入しない。化学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通りに目的のアミダイトモノマーおよび修飾核酸の化学合成を達成し、その修飾核酸を用いた物性評価について検討中である。目的の修飾核酸を用いた物性評価および構造解析について検討し、申請目標の達成を目指す。具体的な内容については、CDによるグアニン四重鎖構造形成の確認および熱安定性の評価、NMR測定によるグアニン四重鎖構造の構造解析、さらにテロメア関連タンパク質との結合能を評価することを予定している。