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血管内皮細胞障害と血液細胞

動脈硬化の発症・進展の分子機構を探るべく平成九年に発足した本研究班は、わが国における発生学、血液学といったこれまで血管研究から遠いと思われてきた分野から多数の先端的な研究者を班員に迎えることにより学際的な研究を展開した。これにより、世界的にみても最高水準の独創的な研究成果があげられるとともに、その成果を臨床医学に応用するいわゆるトランスレーショナルリサーチの基盤が組みあがった。とりわけ、動脈硬化を個体発生にさかのぼる形態形成過程ととらえることからのアプローチは、これまでの動脈硬化学の分野に参画しなかった研究者の参入を促し、血管研究が広範な研究領域に展開され、深く強固なものになったと考える。この取り組みの中で、動脈硬化の発生には血管内皮細胞の活性化と血球細胞の関与が必須であることを実証し、その分子機構に関わるCD36、Lox-1、SRPSOXに代表される新規受容体蛋白の同定が行なわれるとともに、脂肪細胞が多様なサイトカインを生成分泌する臓器システムであることが明らかにされた。また動脈硬化進展病巣における血管平滑筋細胞の形質転換の分子機構についても、関与する転写制御因子ならびにその発現調節の分子機構が詳細に解明された。このような研究成果一般市民に公開するべく、平成13年10月31日、11月1日の2日間にわたり東京都において「第16回大学と科学公開シンポジウム」を開催した。当シンポジウムは本研究班の班員がその大部分を担当し最新成果報告を行なうと共に、一般市民から質問を募った結果成功裏に終了した。この成功により、平成14年10月3,4日に仙台市において「第17回大学と科学公開シンポジウム」を企画している。このように4年間にわたる研究成果は当初の予想を大きく上回り、今後本研究分野を専攻する若手研究者の奨励に繋がったほか、広く最新成果を一般市民に公開することで、社会・公共的にも重要な使命を果たしたと考える。第二班「血管内皮細胞障害と血液細胞」では、粥状動脈硬化の成立を血管内皮細胞障害(活性化)に始まり、さらに血液細胞と血管構成細胞との相互連関として進行する過程とらえようとしてきた。このうち第一目標として血管内皮細胞障害(活性化)の分子機構の解明に力点をおいた。血管内皮細胞の活性化を促す因子のうち物理的、機械的刺激については、血管内皮細胞におけるずり応力の関知機構、さらにはその細胞内情報伝達系の解析を進めた。一方生物学的刺激としては酸化LDL、その主要成分であるリゾフォスファチジルコリン(Lyso-PC)が血管内皮細胞に対して如何なる機構で活性化を生じるのかにつき、細胞応答としての細胞接着因子や増殖因子の発現制御の機構について検索を行なう予定である。またE-セレクチンなどの接着分子のほか、インテグリン裏打ち蛋白であるパキシリンの細胞内シグナル伝達に果たす役割についても研究を進めた。第二目標として掲げた血液細胞ことにマクロファージの泡沫細胞化およびTリンパ球の役割につき研究をおこなった。マクロファージの泡沫細胞化については、最近酸化LDL受容体であることが明らかにされたCD36およびLOX-1の機構解析が行なわれた他、最近あきらかになったマクロファージの分裂増殖の機構の解析もあわせて検討をおこなった。第二班「血管内皮細胞障害と血液細胞」では、粥状動脈硬化の成立を血管内皮細胞障害に始まり、さらに血液細胞と血管構成細胞との相互連関として進行する過程をとらえようとしてきた。このうち第一目標として血管内皮細脹障害の解明に力点をおいた。血管内皮細胞障害を惹起する因子として物理的、機械的刺激としてずり応力の関知機構、さらにはその細胞内情報伝達機構の解析を進あた。

一方、生物学的刺激としては酸化LDLとその構成リン脂質リゾフォスファチジルコリン(LPC)による血管内皮細胞への作用を中心に研究を進めている。血管内皮細胞おいてずり応力に対して発現が抑制される接着分子VCAM-1遺伝子では転写因子AP-1・の関与が明らかにされた。また、血管内細胞において酸化LDLの細胞内への取り込みを支える新たな受容体LOX-1およびSR-ECが同定され、これらの発現調節、リガンド特異性、可溶性分子の存在などが明らかにされた。第二目標として掲げた血液細胞、ことにマクロファージに関しては、酸化LDHおよびLPCによる細胞増殖の分子機構の解明が進められ、また、酸化LDL受容体であるCD36の役割に関しても研究が進められた。また、血管内皮細胞にて同定された酸化受容体LOX-1のマクロファージにおける発現が見出され、この分子の泡沫細胞化における役割についでも検討が進められている。本研究では、粥状動脈硬化の初期病変に必須の事象として血管内皮細胞障害(活性化)およびそれに続く血液細胞と血管内皮細胞との相互作用に焦点をあて、血管内皮細胞活性化ならびに泡沫細胞形成の分子機構の解明を目指してきた。安藤らはずり応力の強さ及び作用時間依存性に、接着分子VCAM-1の蛋白量及びmRNAレベルの低下が引き起こされること、この反応が転写レベルで生じることをつきとめた。中尾らは血管内皮細胞に対して壁ずり応力とCNP、アドレノメジュリン(AM)、PGI2 synthase、エンドセリン(ET)、エンドセリン変換酵素の遺伝子発現を解析し、p160ROCKの関与を解析している。北らは、酸化LDLの主要成分リゾフォスファチジルコリン(Lyso-PC)活性化が転写因子であるCREBを介することを明らかにした。さらに新規酸化LDL受容体Lox-1の解析を進め、ヒト粥状動脈硬化病変において発現を認めることを明瞭に示した。さらに免疫グロブリン類似蛋白JAMを同定し、その生理的意義、特に血小板における機能について検討中である。丸山らはトロンボモデュエインが抗酸化作用を持つことを明らかにし、その生理的意義を解析している。山田らは、血管平滑筋細胞(SMC)が泡沫化する際に、M-CSFの受容体c-fmsが発現することから、その転写調節について解析した。今後c-fms、PDGFレセプターの発現と動脈硬化の発展につき研究をすすめる予定である。堀内(正)らは酸化LDL中のLyso-PCがマクロファージの増殖に直接関わること、酸化LDL受容体を介して取り込まれた酸化LDL中のLyso-PCが細胞内で作動しており、これにはGM-CSFの産生が関与することを見出していたが、その細胞内情報伝達機構につき、PKCとP13Kの役割について解析した。今後さらにその詳細な解明をめざす。松澤らは、泡沫細胞形成に中心的な役割を果たす酸化LDL受容体CD36の発現を検討してきたが、酸化LDLがCD36の発現を誘導することを示すとともに、ヒト血管壁における発現CD36欠損症の解析を行なっている。本班は、最終年度の研究を粥城動脈硬化の初期病変発症の必須事象としての血管内皮細胞障害(活性化)および血液細胞と血管内皮細胞との相互作用に焦点をあて、病変形成の分子機構の解明を目指してきた。
培養中枢ニューロン間シナプス形成過程の解析と機能分子の同定

1.培養大脳皮質ニューロン間のシナプス形成とその定量的観察に成功し、グルタミン酸を伝達物質とする興奮性シナプスにより、多数のニューロンが同期した発火を起こしていることが判明した。2.このシナプス形成系を用い、細胞膜を透過しない蛋白質リン酸化酵素阻害剤(K252b)を長期添加したところ、ニューロンの同期発火が抑制された。大脳皮質ニューロン間のシナプス形成過程に、Ecto-protein Kinase(細胞外に活性中心をもつ蛋白質リン酸化酵素)が関与していることが示唆され、新しい機能分子の存在が明らかにされた。3.培養海馬ニューロン間のシナプス形成系に、PC-12細胞の細胞表面分子に対するモノクローナル抗体ライブラリーを順次長期添加し、シナプス形成に対する影響を検討したところ、47-67を始めとするモノクローナル抗体で、シナプス形成に関する抑制効果が見られた。ここでも、未知のシナプス形成に関与する分子の存在が示唆された。4.培養海馬ニューロン間のシナプス形成系に見られる多数のニューロンの同期した発火のメカニズムの解析として、細胞外カルシュウム濃度を低下させ、シナプス伝達の遮断を行った。シナプス伝達が停止した状態でも、いくつかのニューロンは、同期しない発火を示した。ニューロン回路網の同期した発火は、これらの自発発火ニューロンの活動が、形成されたシナプスを介して、回路網全体に広がったためであることが判明し、この同期した発火をシナプス形成の定量的解析に用いることの安当性が支持された。
限界電流式酸素センサの改質による都市ガスボイラ用一酸化炭素ガスセンサの開発

本研究では、水素共存雰囲気で一酸化炭素濃度が測定可能な限界電流式ガスセンサ開発のための基礎データの収集を行った。具体的には、固体電解質としてイットリア安定化ジルコニア、電極として白金、ガス拡散層としてアルミナを用いた一般的な限界電流式酸素センサのアルミナ拡散層上に白金、SiC、LaFeO_3、SmFeO_3のいずれかの微粒子膜を形成させたセンサを作製し、作製したセンサの1500ppm一酸化炭素雰囲気と1500ppm一酸化炭素+1500ppm水素混合ガス雰囲気でのセンサ応答特性を測定することにより、水素の共存が一酸化炭素応答特性に及ぼす影響を調べた。ペロブスカイト型酸化物微粒子(LaFeO_3、SmFeO_3)は、複合金属シアノ錯体を熱分解する方法により合成した。SiC、LaFeO_3、SmFeO_3の微粒子膜は電気泳動堆積法により形成させた。各センサは一酸化炭素や一酸化炭素+水素混合ガスに対して異なるセンサ応答を示した。また、センサ応答は作動温度(550-650°C)によっても大きく変化した。一酸化炭素雰囲気に水素ガスを混入させると、拡散層がアルミナのみの一般的なセンサではセンサ応答が増大し、アルミナ拡散層上に白金膜を形成させたセンサではセンサ応答が低下し、水素共存雰囲気中の一酸化炭素濃度を測定することができなかった。しかし、アルミナ拡散層上にLaFeO_3膜またはSiC膜を形成させることにより、作動温度550°Cでの一酸化炭素濃度測定において水素共存の影響がかなり低減された。得られた結果から、アルミナ拡散層上に堆積させた白金、SiC、LaFeO_3、SmFeO_3の各微粒子の分子径や水素または一酸化炭素の酸化反応に対する触媒作用(活性能や活性を示す温度)の違いがセンサ応答特性に影響を与えていることが予想される。分子径や触媒作用を利用することで、種々のガス共存雰囲気において、ある特定のガスの濃度を選択的に計測できる限界電流式ガスセンサの構築の可能性が示唆される。
ノンコーディングＲＮＡによる脂質代謝調節を担う転写因子間のクロストーク

1miR-33bのSrebf1へのノックインマウスの作成とその解析miR-33bノックインマウスおよびコントロールマウスにおいてLXRアゴニストを投与したところ、Srebf1およびmiR-33bは平行して発現上昇した。さらにヘテロおよびホモノックインマウスの両者において約35%のHDL-Cの低下を認めた。これらの結果はmiR-33ノックアウトマウスと鏡像関係にあり、生体内でのmiR-33aおよびmiR-33bが同じ標的遺伝子に作用していると考えられた。miR-33aおよびmiR-33bの有無による4種類のマウスの表現系についても検討中である。2miR-33欠損マウスを用いた解析:miR-33欠損マウスは正常食下でも加齢に伴い肥満と脂肪肝を呈する。高脂質食負荷では若年から肥満、脂肪肝となる。そこで12週令の体重差の無い状況で肝臓のマイクロアレイ解析を行ったところ、脂肪酸合成系遺伝子が最も変化していた。miR-33の標的遺伝子にはSrebf1があり、このヘテロマウスと交配したところ、miR-33欠損で認められた肥満と脂肪肝が消失した。このことから、Srebf2はイントロンのmiR-33aでSrebf1を制御していることになり、新たなSrebf1とSrebf2の間のクロストークがあることが明らかとなった。3細胞内コレステロール量により制御されるnon-codingRNAの検討:候補のlincRNAを複数見出し、機能解析中である。4ヒトでのmiR-33a/bの発現レベルと病態との関係についての検討:ヒト肝臓生検サンプルにおいて、発現と組織との関係を検討した。どちらもmiR-33a/bその相補鎖であるmiR-33a*/b*は発現していたが、明らかな脂肪肝との関与は認めなかった。また血中miR-33b*と血中HDL-Cの間には負の相関を認めた。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々が当初検討したところ、miR-33の生体での主たる標的遺伝子は、ABCA1とABCG1であった。しかしながら、miR-33の生体内での標的遺伝子はその他にもある可能性がある。そこで、肝臓、脂肪、心筋、骨格筋においてcDNAマイクロアレイ解析を行ったところ、他の標的遺伝子候補を見出すことができた。この標的遺伝子においては、miR-33欠損マウスの高脂肪食負荷での表現型を説明するのに十分であり、さらにこの標的遺伝子の欠損マウスとの交配により、その表現型が野生型と同様に戻ることが確認できた(論文投稿中)。さらに、Srebp1のイントロンにmiR-33bをノックインしたマウスの作成が完了した。今後、すでに我々が作成したmiR-33a欠損マウスとの交配により、miR-33a及びmiR-33bのそれぞれを持つかどうかについて、4種類のマウスを作出することが可能になる。それぞれの表現型を比較することにより、miR-33の役割、(げっ歯類以外の)哺乳類でのmiR-33aおよび33bが持つ機能について検討することが可能となる。コレステロール除去食(スタチン投与)、高脂肪食負荷に対する反応性を確認し、miR-33aと33bの役割を明らかにする。

また、THP-1細胞をPMAによってマクロファージに分化誘導し、10%FBS下で培養し(定常状態)、その後アセチル化LDLの負荷(コレステロール負荷状態)、あるいはコレステロール除去培地+スタチン投与(コレステロール除去状態)の3種を作成し、large intergenic non-coding RNA (lincRNA)のアレイ解析を行った。コレステロール代謝に関わるlincRNAを得ることができたため、さらにその機能解析を進めている。miR-33aおよび33bによるSREBPと他の転写因子のクロストーク制御の解明に向けて順調に計画が進んでいる。平成24年度に計画していた、1.miR-33aおよび33bによるSREBPと他の転写因子のクロストーク制御の解明においては、1miR-33欠損マウスにおける標的遺伝子の解明2臓器特異的miR-33過剰発現マウスの作成3高脂肪食負荷に対する影響の検討4miR-33bのSrebp1へのノックインマウスの作成とその解析5miR-33が抑制する転写因子の遺伝子欠損マウス(導入済み)との交配実験、についてはすべて予定通り遂行でき、miR-33欠損マウスの表現型を説明できる標的遺伝子の役割りを解明しつつある。実際に、候補となる標的遺伝子の欠損マウスとの交配により、表現型を戻すことができ、論文投稿まで行っている。さらに、Srebp1のイントロンにmiR-33bをノックインしたマウスの作成が完了した。今後、miR-33aおよび33bが持つ機能について検討していく。特にコレステロール除去食(スタチン投与)、高脂肪食負荷に対する反応性を確認し、miR-33aと33bの役割を明らかにする予定である。2.細胞内コレステロール量によって調節されるnon-coding RNAの網羅的検討においても、THP-1細胞をマクロファージに分化誘導し、定常状態、コレステロール負荷状態、あるいはコレステロール除去状態の3種において、large intergenic non-coding RNA (lincRNA)のアレイ解析を行った。さらにmiR-33欠損マウスの表現型解析によって、当初予想しない心血管系の変化も見出したため、臓器特異的miR-33欠損マウスの作成も開始した。miR-33aおよび33bによるSREBPと他の転写因子のクロストーク制御の解明に向けて順調に当初以上のスピードで計画が進んでいる。さらにmiR-33aおよび33bによるSREBPと他の転写因子のクロストーク制御の解明に向けて、研究を推進する。具体的には、肝臓、脂肪特異的なCreマウスとの交配によって、それぞれの臓器特異的miR-33過剰発現マウスを作製する。標的遺伝子の蛋白発現が減少していることを確認する。また、上記と同様に、組織重量、血中脂質のプロファイル、耐糖能、インスリン抵抗性について詳細に検討する。標的遺伝子の欠損マウスとの交配実験においては、miR-33欠損マウスの表現型の変化を起こす意義について、特に脂質のトレース実験において確認する。ノックインマウスを用いた実験においては、miR-33a及びmiR-33bのそれぞれを持つかどうかについて、4種類のマウスを作出し、コレステロール除去食(スタチン投与)、高脂肪食負荷に対する反応性を確認し、miR-33aと33bの役割を明らかにする。また、臓器特異的miR-33ノックアウトマウスの完成後、各臓器におけるmiR-33の働きについても検討を始める。
破骨細胞による骨吸収機構に関する電子顕微鏡的研究

破骨細胞の構造とその機能的意義を明らかにし、骨の吸収機構を究明するために、種々の条件下における骨吸収について形態学的に種々の技法を用いて観察し、その所見を総合的に比較検討して、以下の諸点を明らかにした。1.破骨細胞性骨吸収の形態像の比較検討:ラットを用い、骨吸収部を組織学的、走査電顕的、および透過電顕的に観察し、走査電顕像は、組織学的所見とよく対応し、その超微構造は透過電顕像ともよく一致することを明らかにし、形態像を総合的に検討することの有用性と必要性を確認した。2.破骨細胞性骨吸収に及ぼすインドメサシン(IM)の影響に関する研究:破骨細胞性骨吸収を抑性すると考えられているIMの影響を検索するために、IMを体重1kgあたり5mgの割合で、12時間毎に投与しているラットの上顎第1、第2臼歯間に矯正用ゴムバンドを挿入し、槽間中隔部における骨吸収の過程を組織学的および透過電顕的に検索し、IMの投与により骨吸収が抑制されることを明らかにし、その抑制には、IMによるプロスタグランジン(PGs)の産生の阻害が関与していることから、骨吸収におけるPGsの重要性を確認した。3.抜歯創治癒過程における破骨細胞性骨吸収の意義について:抜歯創の治癒過程における骨吸収の意義を明らかにする目的で、IMを投与したラットの抜歯創治癒過程を組織学的に、一部は電顕的に、検索し、IM投与群では、治癒過程は全般に遅延すること、および、この抜歯創治癒過程の遅延には、IMによるPGsの合成阻害に基づく骨吸収と改造機転の障害が関与していることを示唆する所見を得、抜歯創の治癒過程においても、PGsが化学的仲介物質として関与していること、および、破骨細胞は、骨芽細胞と共に、重要な役割を演じていることを明らかにした。1.破骨細胞性骨吸収の形態像の比較検討:破骨細胞による骨吸収機構を解明するためには骨吸収部における形態像の全貌を把握することが必要である.そこでラットを用い,その上顎臼歯部頬側の歯槽粘膜を歯科用クレンザーを用いて擦過した後,経時的に顎骨を摘出しその所見を比較検討し,以下の諸点を明らかにした.(1)正常ラットの顎骨の頬側面は,組織学的に緻密で滑沢な形状を示しており,走査電顕的にも比較的緻密な表面構造を示していた.(2)実験群では歯槽粘膜部を中心に炎症性細胞浸潤がみられ,顎骨の破骨細胞による吸収像が認められた.(3)出現する破骨細胞の大きさや数は,損傷の程度によって異なり,それに伴い骨の吸収量にも相違が認められた.(4)走査電顕的には,吸収窩は不規則な虫喰い状の陥凹として認められたが,その微細構造は透過電顕像ともよく対応する所見を示していた.2.破骨細胞性骨吸収に及ぼすインドメサシン(IM)の影響に関する研究:破骨細胞性骨吸収を活性化する化学的仲介物質の一つであるプロスタグランジン(PG)の産生を阻害することによって,骨吸収を抑制すると考えられているIMの影響を検索するための研究の一環として, IMを体重1kgあたり5mgの割合で, 12時間毎に投与しているラットの上顎第1・第2臼歯間に矯正用ゴムバンドを挿入し,槽間中隔部における骨吸収の過程を組織学的,一部電顕的に検索し,以下の諸点を明らかにした.(1)対照群では,ゴムバンド挿入後,歯間乳頭部を中心に強い炎症性変化が発現し,多数の破骨細胞による骨の吸収破壊像が観察された.(2)IM投与群では,炎症性変化は軽度で,表層部に限局しており,破骨細胞の数も少なく,骨吸収量は対照群に比し,著しく少なかった.(3)このようなIMの投与による骨吸収の抑制は, IMによるPGの産生の阻害によるものと思われ,骨吸収におけるPGに重要性を示唆する所見と考えられる.破骨細胞の構造とその機能的意義を明らかにし、骨の吸収機構を究明するために、種々の条件下における骨吸収について形態学的に種々の技法を用いて観察し、その所見を総合的に比較検討して、以下の諸点を明らかにした。

3.抜歯創治癒過程における破骨細胞性骨吸収の意義について:抜歯創の治癒過程における骨吸収の意義を明らかにする目的で、IMを投与したラットの抜歯創治癒過程を組織学的に、一部は電顕的に、検索し、IM投与群では、治癒過程は全般に遅延すること、および、この抜歯創治癒過程の遅延には、IMによるPGsの合成阻害に基づく骨吸収と改造機転の障害が関与していることを示唆する所見を得、抜歯創の治癒過程においても、PGsが化学的仲介物質として関与していること、および、破骨細胞は、骨芽細胞と共に、重要な役割を演じていることを明らかにした。破骨細胞の構造とその機能的意義を明らかにし、骨の吸収機構を究明するための研究の一環として、今年度は抜歯創の治癒過程を中心に検索し、さらに、2年間にわたる本研究の結果を総合して比較検討した。1.抜歯創治癒過程における破骨細胞性骨吸収の意義について:抜歯創の治癒過程における骨吸収の意義を明らかにする目的で、IMを投与したラットの抜歯創治癒過程を、組織学的に、一部は電顕的に検索し、次の諸点を明らかにした。(1)対照群では、抜歯後23日目にかけて、中隔歯槽骨部に、多数の破骨細胞による活発な骨吸収像が観察された。(2)IM投与群では、治癒過程は全般に遅延する傾向を示したが、特に初期においてその傾向が著しかった。(3)IM投与群でも、抜歯後間もなく、中隔歯槽骨部に破骨細胞が出現したが、その数は少なく、骨の吸収量も減少した。(4)抜歯後2週以降には、抜歯窩は新生骨によって充されるようになるが、骨質は対照群に比し不均質で、特有なモザイクパターンを示し、改造機転の障害を示した。(5)IM投与群における抜歯創治癒過程の遅延には、IMにるPGsの合成阻害に基づく、骨吸収と改造機転の障害が関与していること、および、抜歯創の治癒過程においても、破骨細胞は骨芽細胞と共に重要な役割を演じていることが示唆された。2.総括と今後の展望:今回の研究により、種々の条件下での骨吸収に際して、破骨細胞が重要な役割を演じていること、および、その構造が機能と密接に関係していることが確認された。また方法論的には、組織学的、透過電顕的、および走査電顕的観察を併用して、総合的に検索することの有用性と必要性が確認された。本研究により破骨細胞による骨吸収機構の一端が解明されたが、この研究はようやく緒についたところであり、解決すべき多くの問題を残しており、今後さらに検索をすすめる予定である。
アメリカ生命倫理学の黎明期における歴史的・社会的背景についての包括的研究

当初、「黎明期のアメリカ生命倫理学」の特徴を剔抉することを目指すことで始まったこの研究は、エンゲルハートとキャラハンの大著『倫理の基礎と、その科学との関係』の詳細な分析を遂行する形でその前半の山場を迎えた。その後、神学や哲学の因子が周辺化され、医療経済的思考が生命倫理内部で優勢になるという傾向を確認するにつれ、その歴史をそのまま追跡しても思想的には若干二次的な興味しか引かないという判断に到達した。よって、その後若干研究方向を修正し、生命倫理学史そのものではなく、生命倫理学の周辺で作動する生命概念の追跡を開始した。そして、現代の生命論で興味深い意味をもつ概念対、「ビオスとゾーエー」に逢着し、その思想的・生命論的含意を掘り下げることのために研究期間の後半部分を費やすことになったのである。アメリカの1960-70年代の生命倫理学成立期の文化的背景の分析当初、「黎明期のアメリカ生命倫理学」の特徴を剔抉することを目指すことで始まったこの研究は、エンゲルハートとキャラハンの大著『倫理の基礎と、その科学との関係』の詳細な分析を遂行する形でその前半の山場を迎えた。今年は初年度であるために、試行錯誤的な作業を余儀なくされた。まず最初に、D・キャラハンが70年代前半に編纂した『倫理の基盤とその科学との関係』叢書を読破した。その結果分かった若干意外なことは、70年代前半の時点では、まだアメリカでも生命倫理学に固有の議論場が確立しているとは言いがたく、宗教関係者、哲学者、法学者など、普通の意味での医療分野からは外的な位置にいる人々が、どのような権利や根拠によって、医学の理論的発展や医療現場での作業について介入・干渉・提言をしていくのか、その理由付けを模索する段階にあったということである。ところが70年代終盤には、ケネディ研究所が中心になってとはいえ、生命倫理を題材とする大きな百科事典が公刊されるまでになる。だから70年代半ば以降の数年にかけての歴史的推移について、より綿密な調査が必要だろうという推測が可能になった。今年度は,学会活動を活発に行うことができた。我が国の生命倫理学会で二つ発表した以外にも、北京の国際生命倫理学会、パリの科学哲学・科学史研究所やコイレセンターで講演をすることができた。これらが最も大きな成果だといえるだろう。ちなみに論文では、ギリシャ以来存在していた二つの生命概念、つまりビオスとゾーエーに着目し、現代の状況のなかでビオス概念がもつ哲学的・生命倫理的含意を掘り下げることができたのは幸いであった。それは「装甲するビオス」として公刊され、それを敷衍して英語に書き直したものが現在印刷中である。また、医療現場での患者の扱いを支える発想を陰に陽に規定するいろいろな生命観や哲学を剔抉していく過程で、医療活動を一種の<自然>の延長と見なす自然主義に対抗するために論陣を張った。<自然>を多少とも規制し、支配していく<文化のガバナンス>への配慮ができたのは、今年度のもう一つの成果だったと考えている。なお、それと並行して、アメリカ公衆衛生史上有名な事例であるチフスのメアリーの事例を中学生・高校生にも分かるように易しく解説した新書を公刊することができたということも付け加えておく。今年度は、基本的に前年度の継続的な作業が主体となった。つまり、60年代終盤から80年代初頭くらいにかけての生命倫理学上の主要な文献を特定し、読解し分析するという作業である。具体的には、エンゲルハート、ペレグリーノ、ビーチャム、キャラハンなどの哲学系の人間、そしてラムジー、マコーミックなどの神学者、フォックスなどの社会学者というように、生命倫理学という学問がその成立時点から多重領域の専門家たちが結集して分野を成立させていたということ、つまりいわゆる学際性などが話題になる前から、文字通りその最良の一形態を例証していたものだということが明らかになった。ただ、同時に、古来、法学と共に最も専門性の高い知識として君臨していた医学を習得した医師たちが、それら異領域の専門家たちと、どのように対抗して医療行為の航跡を描こうとしていたのかということも、興味深い主題となった。生命倫理は、ほぼ必当然的に生命政治学となった。こうして、生命倫理(bioethics)の調査の過程で否応なく直面した新たなる問題構制、それは生命政治学(biopolitics)だった。この特性が最も露わになった具体例としては、例えば70年代半ばに全米を二分したカレン・クィンラン事件があげられる。遷延性植物状態にある患者の最終的な処遇を巡る問題は、個人の内面の行動規範にかかわる倫理の枠を超え、類似事例の統合的な処遇にも意味を持つことになる政策分析や政策決定の場面にまで到達せざるを得ないのである。

今後は、このバイオポリティクス的な問題関心を前面に押し出した分析を継続する予定である今年度は、当初の計画を進めるべく、60年代、70年代の医学批判論をかなり細かく読み込んだ。例えばイリイチなどの根源的批判を立ち上げた人々である。また、同時にエンゲルハートらの生命倫理・哲学の文献集を綿密に読み込んだ。そこで明らかになったことがある。それはイリイチなどの根源的批判は、かえって、現場の医療関係者たちの違和感と反感をもたらし、充分に受け止められなかった、ということである。つまりあまりに過激な批判は医療の実質的改良にはなかなか届かないまま、外在的な非難に留まるという重要な事実であった。他方、エンゲルハートらの生命倫理学の立ち上げの努力については、70年代前半から半ばにかけて、数多くの異領域の専門家たちと出会い、彼らなりに十分な努力がなされているということが分かった。例えば、神学者、哲学者、社会学者などとの邂逅である。特にこの時代に於いては神学者たちの果たした役割は重要なものだった、と評価できるだろう。ただ、これらの文献を現時点で読むなら、それは、まだ模索的な色彩が強く、手探りのような対話が行われているという印象が強い。その意味では、これらの作業に、現時点ではそれほどの面白さを感じることができなかった。というわけで、この研究計画は、4年の内の3年が終わった段階で一種の壁にぶち当たってしまった。このまま続けても、現代社会にとってはそれほど興味深い論点が出されないのではないのか、という不安である。そこで私なりに、もてる知識の総動員をして打開策を図った。すると、興味深いものがみつかった。それはちょうど1970年代半ば頃あたりをひとつの起点として立ち上げられつつあった特殊な生命論、というより生命を政治的に把握するための生政治論、生権力論という主題への照射である。具体的にはフーコー、アガンベン、ネグリ、エスポジトなどの作業のことだ。幸運なことに、私は本研究とは同時並行的に長年フーコーには慣れ親しんでいた。そして、上記のような認識の元に、生命倫理学の黎明期をそのまま調査するよりも、それとほぼ同時代に立ち上げられつつあった、生命と政治論とのリンクという微妙に異なる主題設定に若干この研究の中心軸をずらせた方がいいのではないかという認識を持つに至ったのである。そして、早速今年度の後半から、フーコーをその観点から改めて読み直し、また、アガンベン、ネグリの主要なものを読み始めた。だから、来年度はこれをより十全に展開したい、と考えている。今年はこの研究の最終年度であった。顧みるに、本来この研究は1960年代終盤から70年前後に成立したアメリカの生命倫理学(bioethics)の特徴を見るために、その直前期、つまり60年代と、成立直後の時期、つまり70年代におけるアメリカの生命倫理学的話題の分析を目的とするものだった。ところが、実際に当時の関連文献をあたってみると、まだ模索的色彩が強く、例えばエンゲルハート・カラハン共編の『倫理学の基礎とその科学との関係』数巻を分析してみると、複数関係領域の研究者たちの出会いと自領域での問題構制の他領域への開示という程度の議論に終始しているということが分かった。その意味では、それ自体をそのまま掘り下げることの意味を見いだしにくいという状況になり、研究計画自体の若干の軌道修正を余儀なくされた。ただ、その過程で、生命倫理学に対するより政治学的なアプローチという視点に逢着したことは幸運であった。
表面応力を考慮したナノサイズ領域に対する応力解析の新展開と検証

平成14,15年度にわたり表題の研究を行い以下のような結果を得ることができた.表面ひずみによる表面応力の変動はかなり小さく,解析結果に大きい影響は与えないと考えられる.そこで,表面応力を境界条件に考慮した解析方法を様々な表面現象の解析に適用するための基礎的研究を行った。1.表面応力がステップ状に変化する表面の変位を異方性弾性論により解析し,簡単な表示式を導出することができた.この関係式をもとに,Si表面をAs, Geなどの異原子で覆った場合に表面近傍のSi原子の原子間距離が変化すること,その変化した原子間距離が表面応力の差{Siの表面応力-(異原子とSi間の表面応力)}で計算できることを示した.これらの表面応力は第一原理計算で得られた値を使っている.2.表面応力を考慮した2物体間の凝着に関する応力解析を行った。凝着を起こすと,その周囲の部分の表面エネルギより凝着した部分の表面エネルギが低下する。そのために低下した領域の縁にプリズマティック転位ループが発生する。これが凝着力の一部を形成する。さらに,表面エネルギを導入することにより2物体を引き離すに要する力と変形の関係を調べた。その結果、表面応力を考慮したJRK理論に相当する理論を新たに構築することができた。ここで導出した関係式を用いて球面と平面間の凝着力と凝着半径について実験結果と比較した.マイクロメータサイズの球面については理論と一致することが示せた.しかし,現在のところナノメータサイズの球面については実験が困難であるため,十分な比較を行うことが出来ない.理論的には表面応力の影響はナノメータサイズの球面で現れることから,これについては今後継続的に検討する.3.表面にステップがある場合の解析において,表面グリーン関数と表面ダイポールの関係が必要であることがわかってきた.そこで,表面応力を考慮した表面グリーン関数の導出を行い,表面ステップ近傍の変形状態を分子動力学の結果と比較し,式の妥当性を検討した.その結果,ナノメータ領域における応力解析に有効であることがわかった.平成14,15年度にわたり表題の研究を行い以下のような結果を得ることができた.表面ひずみによる表面応力の変動はかなり小さく,解析結果に大きい影響は与えないと考えられる.そこで,表面応力を境界条件に考慮した解析方法を様々な表面現象の解析に適用するための基礎的研究を行った。ここで導出した関係式を用いて球面と平面間の凝着力と凝着半径について実験結果と比較した.マイクロメータサイズの球面については理論と一致することが示せた.しかし,現在のところナノメータサイズの球面については実験が困難であるため,十分な比較を行うことが出来ない.理論的には表面応力の影響はナノメータサイズの球面で現れることから,これについては今後継続的に検討する.3.表面にステップがある場合の解析において,表面グリーン関数と表面ダイポールの関係が必要であることがわかってきた.そこで,表面応力を考慮した表面グリーン関数の導出を行い,表面ステップ近傍の変形状態を分子動力学の結果と比較し,式の妥当性を検討した.その結果,ナノメータ領域における応力解析に有効であることがわかった.本研究は、表面応力を一定のものとせず表面のひずみに伴い変化するものとして定式化した新しい境界条件を用いて応力解析システムを開発し、これからの技術展開に必要な解析手法を研究開発するもので、理論と実験から成る。研究の初年度は、これまでの研究で作成してきた境界要素法応力解析システムに表面応力の新しい境界条件を導入すための基礎研究を行った。1.分子動力学法を用いて表面応力・表面エネルギと表面ひずみの関係を調べた。表面応力は、表面エネルギと結晶面上のひずみに対する表面エネルギの変化(表面剛性:Surface Rigidityと呼ばれている)を加えたものである。この表面剛性が表面応力の異方性を生じる原因である。そこで、はじめに固体表面の表面エネルギを分子動力学法にEAM(Embedded Atomic Method)ポテンシャルを用いて求めた。今回はFeとCrおよびWの表面エネルギーと表面剛性を併せて求めた。さらに、表面剛性率のひずみ依存性についても求めた。その結果、表面応力は材料固有の値として求めることが出来た。さらに、表面剛性率についても、ひずみゼロにおける値を求めることができた。一方、有限ひずみに対する表面剛性率は極めて小さくなった。この点については、今後検討する。

2.表面応力を考慮した2物体間の凝着に関する応力解析を行った。凝着を起こすと、その周囲の部分の表面エネルギより凝着した部分の表面エネルギが低下する。そのために低下した領域の縁にプリズマティック転位ループが発生する。これが凝着力の一部を形成する。さらに、2物体を引き離すに要する力と変形の関係を調べた。その結果、表面応力を考慮したJRK理論に相当する理論を新たに構築することができた。境界要素法にこれらの境界条件を導入することを次年度行う予定である。3.表面に異原子が付着した場合に生じる原子表面の変形について理論および分子動力学の結果を比較し、よい一致が得られた。4.凝着過程の物体変形の様子を観察・計測するために、レーザー光源を含む光学干渉系を購入した。5.次年度製作する予定の表面応力を駆動力とするセンサーの基礎データを収集するため、表面応力を考慮した異方性弾性体のカンチレバーの解析を分子動力学を用いて行っている。特に異なる材料がコーティングされ表面・裏面の表面応力が異なるカンチレバーの変形解析を行い、表面応力の差とカンチレバーのたわみの関係を調べている。昨年度の研究成果から,表面ひずみによる表面応力の変動はかなり小さく,解析結果に大きい影響は与えないと考えられる.そこで,表面応力を境界条件に考慮した解析方法を様々な表面現象の解析に適用するための基礎的研究を行った。1.表面応力がステップ状に変化する表面の変位を異方性弾性論により解析し,簡単な表示式を導出することができた。この関係式をもとに,Si表面をAs,Geなどの異原子で覆った場合に表面近傍のSi原子の原子間距離が変化すること,その変化した原子間距離が表面応力の差{Siの表面応力-(異原子とSi間の表面応力)}で計算できることを示した.これらの表面応力は第一原理計算で得られた値を使っいる.2.表面応力を考慮した2物体間の凝着に関する応力解析を行った。さらに,表面エネルギを導入することにより2物体を引き離すに要する力と変形の関係を調べた。ここで導出した関係式を用いて球面と平面間の凝着力と凝着半径について実験結果と比較した.マイクロメータサイズの球面については理論と一致することを示すことができた.3.表面にステップがある場合の解析において,表面グリーン関数と表面ダイポールの関係が必要であることがわかってきた.そこで,表面応力を考慮した表面グリーン関数の導出を行い、表面ステップ近傍の変形状態を分子動力学の結果と比較し,式の妥当性を検討した.その結果,ナノメータ領域における応力解析に有効であることがわかった.
初期新宗教における災因論とその歴史的展開－近現代日本の救済観をめぐる考察

本年度の研究計画では、(1)金光教の組織構造の把握、(2)教派神道体制での教義表明の問題、(3)戦後における初期新宗教の課題という点を主な研究内容に掲げていた。約4ヶ月の研究期間であったがいずれにもアプローチした。(1)については、2015年6月「宗教と社会」学会にて「金光教の制度化過程における組織の結合原理」と題する報告を行い、金光教の組織構造を組織結合という観点から明らかにした。宗教組織の問題について個別事例に即した実証的研究により精緻化が必要であることを改めて問うた点、戦前期における宗教行政と宗教運動の応答関係、すなわち組織形成における法制度の重要性を指摘できた点で先行研究にインパクトを有すると考える。(2)については、今年度末刊行予定の論文集に「教派神道体制における金光教の組織形成(仮)」という論文を発表する。金光教の教派神道体制への編入は、主に「国家神道への従属のみち」という視角から論じられてきた。そこで、金光教の主体的な意思決定能力とそれに基づく組織形成という観点から、教派神道体制やそれに関連する宗教政策がどのように作用していったのかを検証することで、救済を提供する組織基盤がどのような社会環境の中で形成されたのかを明らかにした。(3)については、2015年11月に「金光教の制度化過程における布教論の展開(仮)」という論文を発表する。金光教の救済原理である「取次」は、新宗教の生命線である布教を「座して待つ」スタイルとして規定してきた。しかし、高度経済成長による社会変化や運動の制度化等を背景に、「布教する教団」への転換が図られていた。戦後の社会変化の中で、幕末維新期に生じた初期新宗教はどのような課題に直面しつつ、民衆に救済財を提供してきているのかという同論文で扱う問題は、日本における近現代の宗教運動の展開を考える上で重要な意味を含んでいると思料される。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、初期新宗教(金光教、天理教を主な対象とする)の災因論とその歴史的展開を明らかにし、近現代日本の救済観の考察を目指すものである。この目的に沿い、本年度は以下の通り研究を実施した。研究計画に掲げた研究1「教団の教義としての災因論の分析」については、金光教の災因論に関して口頭発表及び論文発表を行った。同論文では、金光教において、教祖存命中に体系化されなかった苦難へ意味付与する「めぐり」の概念が、大正期になり教義的に重要な意味を担うことになる教義形成の過程を論じた。先行研究では時代ごとの変化をあまり考慮せず、どちらかと言えば均質的に捉えられることの多い新宗教の教えについて、資料の性質の違いや変化のプロセスに着目したものである。次に、研究2「教団の各単位における災因論の分析」については、文献収集や研究枠組みの検討などの基礎的作業を行った。既に研究計画にて、新宗教の救済観を問うには、教えの変化要因と教団組織の構造について細分化されたいくつかのレベルで把握する必要性を示したが、研究1を進める過程で、組織構造と教えとの関係性の解明などの、教えを分析する上での基礎的作業の重要性を改めて感じた。そこで次の通り研究を進めた。まず、金光教や天理教の教義的基盤を形成した教団第二世代が、明治末期にどのような社会環境の中で教団アイデンティティを築いていったのかという点に着目して口頭発表を行った。次に、教団第二世代を育む土壌となった教団立の教育機関の整備状況とその機能について口頭発表を行った。この二点は直接的に救済観を明らかにする研究ではないが、世代間の信仰継承による教義の変化、組織内の学習体系と教内教化の関係など、初期新宗教を対象とする研究では従前あまり論じられなかった視点を導入したものであり、表層的な教義レベルでの論証に留まらない研究を可能にする基盤になると考えている。計画では、(1)組織構造の把握、(2)教派神道体制での教義表明の問題を中心課題としていた。(1)については、神道教派と仏教宗派に対して教師養成につき再考を迫った内務省訓令第九号(明治二八年)が金光教の一派独立に与えた作用について検証することで、宗教行政の要請(訓令)と教団の内発的展開(教師養成の整備)が相互作用し、金光教が当時の社会環境に適合的な組織を備えた神道教派となったことを明らかにし、口頭発表及び論文発表を行った。同研究成果は、国家神道教義への従属過程とされてきた金光教・天理教の独立について、組織面の拡充が明治三〇年代の諸状況を踏まえて要請されていた点を実証できたこと、及び、先行研究の少ない明治中期以降の宗教行政と宗教運動の関係を資料に即して論じたことに意義がある。同時に、金光教と天理教の外部環境への順応性を組織面から明らかにできたこと、「教育」を研究の軸に据えることができたことの二点において本研究の進展に資するものであったと考える。組織構造の把握については引き続き、金光教について宗教運動の組織発生過程としての分析、及び、教団内で教えの伝播の回路となる本部と教会の組織結合についての分析を発表することが決定している。(2)については、日露戦争以降に国家政策に同調する形で金光教が社会的救済を打ち出していく様相を具体的に論じた。

そこで浮上した、初期新宗教が社会的順応性の高さゆえに不可避的に抱えた国民道徳的な救済観の問題については、引き続き検討課題としたい。(3)に掲げた教団第二世代の救済観の検討については、上記の組織結合の分析を進める上で、「教団の救済」という論点が浮上しているので、これを大正期から戦中期の社会問題などと連関させるとともに、教義の普遍化の鍵はどこにあるのかを考察する予定である。本年度の研究計画では、(1)金光教の組織構造の把握、(2)教派神道体制での教義表明の問題、(3)戦後における初期新宗教の課題という点を主な研究内容に掲げていた。約4ヶ月の研究期間であったがいずれにもアプローチした。(1)については、2015年6月「宗教と社会」学会にて「金光教の制度化過程における組織の結合原理」と題する報告を行い、金光教の組織構造を組織結合という観点から明らかにした。宗教組織の問題について個別事例に即した実証的研究により精緻化が必要であることを改めて問うた点、戦前期における宗教行政と宗教運動の応答関係、すなわち組織形成における法制度の重要性を指摘できた点で先行研究にインパクトを有すると考える。(2)については、今年度末刊行予定の論文集に「教派神道体制における金光教の組織形成(仮)」という論文を発表する。金光教の教派神道体制への編入は、主に「国家神道への従属のみち」という視角から論じられてきた。そこで、金光教の主体的な意思決定能力とそれに基づく組織形成という観点から、教派神道体制やそれに関連する宗教政策がどのように作用していったのかを検証することで、救済を提供する組織基盤がどのような社会環境の中で形成されたのかを明らかにした。(3)については、2015年11月に「金光教の制度化過程における布教論の展開(仮)」という論文を発表する。金光教の救済原理である「取次」は、新宗教の生命線である布教を「座して待つ」スタイルとして規定してきた。しかし、高度経済成長による社会変化や運動の制度化等を背景に、「布教する教団」への転換が図られていた。戦後の社会変化の中で、幕末維新期に生じた初期新宗教はどのような課題に直面しつつ、民衆に救済財を提供してきているのかという同論文で扱う問題は、日本における近現代の宗教運動の展開を考える上で重要な意味を含んでいると思料される。年初の段階で、初期新宗教の教義の変化とその内的・外的な要因を把握すること、また、教団の教義が教内にどのように普及するかを教団組織の構造を明らかにしつつ検証することを目的として掲げていたが、予定通り明治期から昭和期に時代を限定してこれらの点の検証は進められたと考える。特に内外の諸状況の把握、組織構造の把握に焦点化して研究を進めたが、これは先行研究との差別化を図るために、救済観を検証するいわば外堀の作業を戦略的に行っているためである。27年度が最終年度であるため、記入しない。年初の推進方策として当面は明治期から昭和期に時代を限定して研究を進めることが有益であるとし、これに従い研究を行ってきたが、今後もこの路線を維持しながら研究を進める予定である。昨年度に想定した通り、戦前期の問題を扱うには近代日本における国家と宗教との関係、あるいは日本社会の近代化というマクロな問題が包摂されていることが研究を進める中で明らかになってきており、新宗教研究にて不足しているといわれる大正・昭和期の解明という点にも寄与し得る研究になると考える。このため、研究対象とする時期や視角等に大きな変更を加えずに、二六年度の研究を維持・継続しながら進展させていく。
体性幹細胞を用いたバイオドラッグデリバリーシステムによる新規癌治療法の開発

抗がん剤(Pirarubicin)を生体吸収性ポリマーPLGAナノ粒子に封入した粒子を作製した。次に、ヒト脂肪由来幹細胞にこのナノ粒子を取り込ませた細胞複合体を合成した。ヒト膵癌細胞株(KP1N)とこの抗がん剤ナノ粒子抱合脂肪幹細胞との共培養実験では、抗がん剤ナノ粒子を多く抱合した脂肪幹細胞で膵癌細胞の遊走能や増殖能が抑制され、また、アポトーシスも誘導されるという実験結果を得た。今後は、免疫不全マウスの背部にヒト膵癌細胞を移植した担癌マウスに抗がん剤ナノ粒子抱合脂肪幹細胞を静脈内投与し、抗がん剤ナノ粒子単独投与群や脂肪幹細胞単独投与群に比較しながら腫瘍の発育の程度を経時的に観察する予定である。H25年度は、腫瘍集積性を有するヒト脂肪組織由来幹細胞(adipose-derived stem cell: AdSC)に抗癌剤含有ナノ粒子を包合させ、細胞外への抗癌剤徐放の最適化を目的として実験を行った。ピラルビシン含有ナノ粒子(200-300nm径)のAdSCへの包合に関する実験では、粒子に対する抗体修飾などは必要無く、単純に培養液中で粒子と細胞を37°Cで1時間程度インキュベーションすることによって細胞内に粒子が抱合されることが確認できた。次に、ピラルビシン含有ナノ粒子包合AdSCからの培養液中への薬剤徐放を確認したところ、3-4週間以内で全ての薬剤が放出され予想通りの結果が得られた。しかし、薬剤徐放中の細胞死が予想よりも早い段階(48時間以内)で認められたため、今後のin vivo実験におけるマウス皮下腫瘍実験では腫瘍集積性の低下が予想される。上記の実験結果から、細胞での粒子包合後の抗癌剤の放出タイミングが早いことに起因すると考えられたため、当初の計画に加えて抗癌剤を温度感受性リポソームに内包の後にAdSCに取り込ませる方法も今後試みる。これはリポソーム包合AdSCを適当な温度(42-3°C)で加温することによって、リポソームの性状を変化させて含有している薬剤を放出できるシステムであり、in vitro実験だけでなくin vivo実験においても薬剤放出のタイミングをコントロールできる利点がある。次年度には、脂溶性抗癌剤であるピラルビシンの代わりに水溶性抗癌剤のテラルビシンを用いて温度感受性リポソームを作製し、今年度と同様に細胞外への薬剤徐放試験を行い、最適化を行う予定である。昨年度の実験結果では、ピラルビシン含有ナノ粒子(200-300nm径)のAdSCへの包合に関する実験では、粒子に対する抗体修飾などは必要無く、単純に培養液中で粒子と細胞を37°Cで1時間程度インキュベーションすることによって細胞内に粒子が抱合されることが確認できた。しかしながら、ピラルビシン含有ナノ粒子包合AdSCからの培養液中への薬剤徐放を確認したところ、薬剤徐放スピードが予想よりも速く、細胞死が早い段階(48時間以内)で認められた。平成26年度は、昨年度の問題点を克服するためにピラルビシンのナノ粒子からの徐放スピードを遅くするための工夫として、脂溶性のピラルビシンを水溶性のドキソルビシンに変更し、またPLGAナノ粒子の組成も変更しようとしたが、粒子の作製が困難であり薬剤徐放の確認にまでは至っていない。また、抗癌剤の徐放スピードコントロール目的で、当初の計画に加えて抗癌剤を温度感受性リポソームに内包の後にAdSCに取り込ませる方法を試みた。これはリポソーム包合AdSCを適当な温度(42-3°C)で加温することによって、リポソームの性状を変化させて含有している薬剤を放出できるシステムであり、in vitro実験だけでなくin vivo実験においても薬剤放出のタイミングをコントロールできる利点が考えられる。(参考文献:Kono, et al. Biomaterials 31 (2010) 7096e7105)しかしながら、リポソームが細胞に取り込まれた後に温度上昇させるまでもなく約48時間以内に細胞死が確認された。これは、細胞内に存在するライソゾームなどの酵素によってリポソームが分解されたためと推察できる。本研究課題で最も重要な抗癌剤封入PLGAナノ粒子の作製段階において、当初の予定を変更して温度感受性リポソームをPLGAナノ粒子の代わりに作製し、抗癌剤であるドキソルビシン(DOX)を封入したリポソームを作製した。次に、DOX封入リポソームをヒト由来脂肪幹細胞に抱合させて複合体を作製し、その細胞機能を評価した。まず、DOXの毒性による脂肪幹細胞自体の細胞死がどの程度の粒子濃度(密度)で細胞に影響を及ぼすかを検討するため、10, 50, 100, 200ug/mLの濃度で細胞に抱合させたところ、最も低い濃度である10ug/mLの濃度で抱合させた細胞でも培養開始後12hで効率にアポトーシス陽性細胞が認められた。これは、リポソームがリン脂質で構成される細胞膜と融合し、抱合段階でリポソーム内部のDOXが速やかに細胞質内に溶出したことに起因する結果と考えられた。したがって、DOX封入温度感受性リポソームは作製できたものの、このリポソームを脂肪幹細胞を単体としたバイオドラッグデリバリーのためのツールとして利用することは不可能であると判断された。

計画を一部変更し、温度感受性リポソームを活用しようとしたが実験目的に適さなかったため、当初の予定どおりPLGAナノ粒子にDOX類似薬である脂溶性のピラルビシンを封入した粒子を作製(連携研究者に作製依頼)し同様の実験を計画した。目的の粒子は作製されたが、予想以上に上記実験(条件検討など)に時間を要した。結果:AdSCにPLGAに抗癌剤(ピラルビシン:Pir)を封入した薬剤徐放化ナノ粒子(Pir-PLGA)を抱合させ(AdSC1.0×10^5コに対してPir-PLGA10、25、50μg)、増殖能、アポトシーシスの有無、遊走能の評価を行った。血清存在下では、Pir-PLGAを多く抱合したAdSCほど増殖能の低下を認め、培養開始24時間後にはアポトーシスを起こしていることが示唆された。無血清下では、早期では有意差を認めないが培養開始24時間以降ではPir-PLGAを多く抱合したAdSCほどviabilityの低下を認めた。遊走能については、粒子を抱合しても低下を認めなかった。次に、Pir徐放化ナノ粒子を抱合させたAdSCとヒト膵臓癌細胞株(KP-1N)との共培養を行い48時間後にKP-1Nの増殖能を評価したところ、Pir-PLGAを多く抱合したAdSCが最も増殖抑制するという結果が得られた。考察・今後の方針Pirは細胞分裂時に作用するため、血清存在下では早期からAdSCのviabilityに影響を及ぼす反面、Pir-PLGAナノ粒子を多量に抱合したAdSCは癌細胞の増殖を強く抑制した。一方、Pir-PLGAナノ粒子はAdSCに抱合後16時間以内では遊走能に影響を与えなかったため、in vivoにおけるバイオDDSとしてAdSCを利用できることが示唆された。今後はPir徐放化PLGAナノ粒子抱合AdSC移植による抗腫瘍効果について、ヒト膵臓癌細胞株(KP-1N等)皮下移植担癌マウスモデルを用いて検討する。また、PLGAの乳酸とグリコール酸の配合比率を変えることで、封入した薬剤の徐放期間が変化するため、今回in vitroで用いた粒子以外に薬剤徐放期間のさらに長い粒子を作製して実験に用いる予定である。抗がん剤(Pirarubicin)を生体吸収性ポリマーPLGAナノ粒子に封入した粒子を作製した。次に、ヒト脂肪由来幹細胞にこのナノ粒子を取り込ませた細胞複合体を合成した。ヒト膵癌細胞株(KP1N)とこの抗がん剤ナノ粒子抱合脂肪幹細胞との共培養実験では、抗がん剤ナノ粒子を多く抱合した脂肪幹細胞で膵癌細胞の遊走能や増殖能が抑制され、また、アポトーシスも誘導されるという実験結果を得た。今後は、免疫不全マウスの背部にヒト膵癌細胞を移植した担癌マウスに抗がん剤ナノ粒子抱合脂肪幹細胞を静脈内投与し、抗がん剤ナノ粒子単独投与群や脂肪幹細胞単独投与群に比較しながら腫瘍の発育の程度を経時的に観察する予定である。今年度の実験目標であるin vivoでの抗癌剤含有ナノ粒子抱合AdSCの治療効果の確認実験には至っていない。その理由として、抗癌剤含有ナノ粒子抱合AdSCの最適化ができていないためである。AdSCからの抗癌剤徐放については有用な結果が得られず、細胞内での抗癌剤徐放によるAdSC自身への影響についても予想と異なる結果がえられたことが挙げられる。そのため、粒子あるいはリポソームの作製方法の検討に時間を費やしている。当初の予定通りに実験が進まなかったため、事業期間を延長して継続研究することとなった。今年度は、すでに作製済みであるピラルビシン封入PLGAナノ