hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
同一薬効成分の医薬品適用時におけるヒト肝毒性イベントのリスク予測法に関する研究

同一薬効成分を有するものの製剤中の添加剤が異なる医薬品をヒトに使用する場合の薬剤性肝障害リスクを予測する方法を開発するため、ヒト肝細胞に高度に置換された肝臓を持つヒト肝細胞キメラマウスを用い、スタチン等の後発医薬品と先発医薬品の被験製剤投与後のヒト肝細胞遺伝子発現量の網羅解析を行った。その結果、様々な薬効成分の後発医薬品についてその先発医薬品とのヒト肝障害リスクに関する製剤同等性を明らかにした。そして、ヒト臨床試験とは別の方法で製剤由来のヒト肝障害発症リスクの予測が可能な本法をToxicity of Liver Examination法(TーLEX法)と命名し、その産業財産権を取得した。本研究の目的は、1ヒト肝細胞キメラマウスとトキシコゲノミクスの手法を活用することで、同一薬効成分を有するものの製剤中の添加剤が異なる医薬品をヒトに使用する場合の薬剤性肝障害リスクを予測する評価系を開発すること、ならびに2その評価系を用いて、重篤な肝障害の副作用が懸念されている後発医薬品のヒト肝障害の発症リスクに関する情報を精査し、臨床現場で必要とされている後発医薬品の品質に関する実用性の高い安全性情報を発信することである。そのため国内共同研究者である島田卓研究員(フェニックスバイオ)、長塚伸一郎研究員(積水メディカル)ならびに立木秀尚研究員(東和薬品)らと研究チームを組織し、平成24年度は、代表的なHMG-CoA還元酵素阻害薬のプラバスタチンとシンバスタチンの先発医薬品と後発医薬品をモデル製剤に選び、ヒト肝細胞キメラマウスを用いてヒト肝遺伝子発現の変動を解析し、平成23年度に得られたアトルバスタチンの実験結果との関連づけを試みた。その結果、ヒト肝細胞キメラマウスへ製剤を投与し、肝毒性イベントの原因ともなる18個の主要な代謝経路のヒト肝遺伝子群に関して製剤間の発現パターン変化を比較したところ、どの製剤でも多くの代謝経路でほぼ一致したパターン変化を示し、製剤間での有意差は見られなかった。このことから、3種類のHMG-CoA還元酵素阻害薬の先発医薬品と後発医薬品のヒト肝毒性イベント関連遺伝子群の発現変動には同等性が認められた。さらに臨床現場で先発医薬品の薬剤性肝障害リスクが問題となっているモサプリドの後発医薬品の品質試験に本法を応用した。本法は、ヒト臨床試験とは別の方法で製剤由来のヒト肝障害リスクの予測が可能なため、販売開始時に十分な規模の臨床試験データの提供が困難な後発医薬品を臨床現場で安心して使用するための有益な新技術になると期待できる。本研究の目的は、1ヒト肝細胞キメラマウスとトキシコゲノミクスの手法を活用することで同一薬効成分を有するものの製剤中の添加剤が異なる医薬品をヒトに使用する場合の薬剤性肝障害リスクを予測する評価系を開発すること、ならびに2その評価系を用いて肝障害の副作用が懸念されている後発医薬品の肝障害発症リスクに関する情報を精査し、臨床現場へ発信することである。そのため国内共同研究者である島田卓研究員(フェニックスバイオ)、長塚伸一郎研究員(積水メディカル)ならびに立木秀尚研究員(東和薬品)らと研究チームを組織し、平成25年度はこれまでの研究成果により本評価法の産業財産権を取得するとともに、本法の試験結果と臨床での肝障害発現頻度との比較、さらには他の後発医薬品の品質評価への応用を行うことで本法の確立に取り組んだ。その結果、本評価法をToxicity of Liver Examination法(T-LEX法)と命名し、その商標を登録した(第5617856号)。また、すでにT-LEX法による解析で先発医薬品と後発医薬品のヒト肝毒性イベント関連遺伝子群の発現変動に同等性が認められているアトルバスタチン錠について患者を対象に肝障害の発現頻度調査を行ったところ、両製剤の臨床での肝障害発現頻度も同程度であることが示され、T-LEX法により臨床での肝障害イベントの発症リスクを予測することが可能であるとの知見を得た。さらにメトトレキサートやHMG-CoA還元酵素阻害薬を含めた様々な薬剤や剤形の後発医薬品について肝障害リスクに関する実用性の高い情報を発信した。T-LEX法はヒト臨床試験とは別の方法で製剤由来のヒト肝障害リスクの予測が可能なため、販売時に十分な規模の臨床試験データの提供が困難な後発医薬品を臨床現場で安心して使用するための極めて有益な新技術になると期待できる。本研究の目的は、(1)ヒト

肝細胞キメラマウスとトキシコゲノミクスの手技を活用することで、同一薬効成分を有するものの製剤中の添加剤が異なる医薬品をヒトに使用する場合の薬剤性肝障害リスクを予測する評価系を開発すること、ならびに(2)その評価系を用いて、重篤な肝障害の副作用が懸念されている後発医薬品のヒト肝障害の発症リスクに関する情報を精査し、臨床現場で必要とされている後発医薬品の品質に関する実用性の高い安全性情報を発信することである。そのため国内共同研究者である島田卓研究員(フェニックスバイオ)、長塚伸一郎研究員(積水メディカル)ならびに立木秀尚研究員(東和薬品)らと研究チームを組織し、平成23年度は薬剤性肝障害が起こる危険性が高いにもかかわらず、抗リウマチ薬として汎用されているメトトレキサートカプセルの先発・後発医薬品をモデル製剤に選び実験を行った。その結果、ヒト肝細胞キメラマウスへ製剤を投与した群では、製剤を投与していないコントロール群に比べて様々なヒト肝遺伝子群の発現パターンに変化が認められたので、肝毒性イベントの原因ともなる18個の主要な代謝経路のヒト肝遺伝子群に関して製剤間の発現パターン変化を比較したところ、APRとsteatosisを除く16個の代謝経路でほぼ一致したパターン変化を示し、製剤間での有意差は見られなかった。このことから、メトトレキサートカプセルのヒト肝毒性イベント関連遺伝子群の発現変動には同等性が認められた。さらにヒト肝毒性イベントの発症リストが極めて高いHMG-CoA還元酵素阻害薬アトルバスタチン錠の先発・後発医薬品についても同様な実験を行い得られた結果を整理したところ、評価の方法論確立の目途がたった。本手法はヒト臨床試験を行わずに短期間に製剤由来のヒト肝障害の発症リスクを予測できるため、医薬品開発の効率化や倫理面において有益な技術になることが期待できる。本研究計画の遂行に当たっては、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた被験医薬品のヒト肝遺伝子発現解析が最も重要な実験であるが、平成24年度は研究実施計画に記載したとおりの検討を行うことができたため、「2おおむね順調に進展している。」と評価した。本研究計画の遂行に当たっては、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた被験医薬品のヒト肝遺伝子発現解析が最も重要な実験であるが、平成23年度は研究実施計画に記載したとおりの検討を行うことができたため、「(2)おおむね順調に進展している。」と評価した。当初計画どおりに今後も研究を推進していく計画である。しかし万が一当初計画どおりに進まない場合、確実に成果に結びつく研究計画を強力に推進する。また、本研究計画を遂行するための研究体制のなかで、適宜意見交換を行い、本研究計画を効率的に推進していく。本研究計画では、消耗品の実験用動物の購入費用が研究費の大半を占めているが、平成24年度はその購入に別の予算を充てることができたので、研究の推進に支障ない状態で、次年度に使用する予定の研究費が生じた。したがって、今後は当初の計画以上に本研究を進展させることを目標に、次年度の研究費とあわせて使用する計画である。本研究計画では、消耗品の実験用動物の購入費用が研究費の大半を占めているが、平成23年度はその購入に別の予算を充てることができたので、研究の推進に支障ない状態で、次年度に使用する予定の研究費が生じた。
ミトコンドリア酸化ストレス制御によるインスリン抵抗性の新たな治療法の開発

1.インスリン抵抗性が心不全において誘導される心筋梗塞後心不全モデル動物に、糖負荷を行い、経時的に採血し、血糖とインスリンを測定するとメタボリックシンドロームの基本病態であるインスリン抵抗性が惹起されることが明らかとなった。2.心不全ではミトコンドリア酸化ストレスとミトコンドリアDNA傷害がみとめられるミトコンドリアDNAは、個々のミトコンドリア内に複数存在するが、不全心筋のミトコンドリアDNAをサザンプロットにより定量すると、ミトコンドリアDNAコピー数は減少し、さらにミトコンドリアDNAでコードされている電子伝達系複合体サブユニットのmRNAの低下および複合体酵素活性の低下を認めた。一方で、核DNAでのみ構成される複合体IIは、その活性低下を認めないことから、ミトコンドリアにおける活性酸素のターゲットは、ミトコンドリアDNAであると考えられる。3.ミトコンドリア転写因子A(TFAM)の活性化は、ミトコンドリア酸化ストレスおよびDNA傷害を軽減するヒトTFAM遺伝子過剰マウスに心筋梗塞後心不全を作成したところ、生存率が改善し、心筋の収縮機能の低下や心筋構築変化が抑えられた。このマウスでは、ミトコンドリアDNAの傷害が抑えられ、ミトコンドリアの機能も正常に保たれていることも確認しており、TFAM発現の活性化によってミトコンドリア機能が傷害から保護されることが明らかとなった。4,高脂肪食負荷によってインスリン抵抗性が惹起されるマウスに高脂肪食負荷を行うと高度の肥満とともに、耐糖能障害がみとめられ、インスリン抵抗性が惹起された。心不全モデルにおけるインスリン抵抗性とミトコンドリア酸化ストレス・DNA障害の関連は、メタボリックシンドロームにおけるインスリン抵抗性においても、同様にみとめられると考えられる。
地下生態系の「ブラックボックス」解明による群集理論の再検証

生態系内における生物間相互作用の研究は、従来、観察し易い地上の相互作用を対象に行われてきた。本プロジェクトでは、研究が進んでいない地下生態系内の生物間相互作用に着目し、その複雑相互作用ネットワークの根本的構造を、地上の生物間相互作用と比較した。一連の研究成果は、Nature Communications, Science Advances, Nature Ecology and Evolution, Nature Plantsといったハイインパクト科学誌で出版された。上記に加え、アメリカ、ブラジル、オランダの研究者との共同研究を継続中であり、ネットワーク構造の地理的な変異と統一性に関する論文を投稿した。また、共生ネットワーク構造のメタ群集レベルでの動態について、総説論文を執筆し、現在投稿準備中である。植物と地下真菌の相互作用に関する空間明示的な数理モデルに関する共同研究も、重厚な野外データによる検証が進み、論文執筆の段階にある。今年度はさらに、植物と地下真菌の共生ネットワークを大規模並列DNAバーコーディングを基に解明する基盤技術について、イルミナ社の次世代シーケンサーであるMiSeqを使ったよりハイ・スループットな基盤へと移行を進めた。これにより、得られるデータがこれまで使用していた次世代シーケンサーの100倍となり、また、塩基配列のデータ精度も大幅に向上した。この解析システムをニュージーランドのナンキョクブナ林で採取されたデータに適用したところ、従来の次世代シーケンサーによる解析では見えてこなかった詳細な相互作用ネットワークの構造が浮かび上がってきた。地下生態系の生物圏は、微生物が主体となっており、生態学および進化生物学における巨大なブラックボックスとして、新たな研究アプローチによる生態学的研究が待たれている。群集の安定性や種多様化の従来の研究では、目視で調査可能な動物や植物の群集を対象に、理論の設計と検証が行われてきた。しかし、地球上のどの生態系においても、極めて多様な微生物が存在し、動物や植物と相互作用しながら複雑な群集を構成している。こうした微生物群集に実証研究の網を広げることができれば、これまでの群集理論や種多様化の議論が生物全般に適用できるほどの一般性を持つのか、それとも根本的な修正が必要なのか、判断の試金石を提供できる。広大なフロンティアである地下の微生物群集を包括的に解析するため、申請者はこれまで、自動生物同定システムを核とする一連の最先端技術開発プロジェクトを主導してきた。次世代シーケンシングを用いたこのシステムは、環境サンプル中のありとあらゆる生物群の自動同定を可能にするだけでなく、微生物をめぐる肉眼では研究不可能な生物間相互作用を、群集全体レベルで一挙に解明する能力を持つ。この新たな研究アプローチを利用して、地上の生態系を主な対象として構築されてきた生態学理論が、地下の生態系にもそのまま当てはめることができるのかどうか、膨大な生物群集データとともに明らかにする。現在までの研究で、地下の微生物(真菌)とその宿主植物との関係性を表すネットワークの構造が、地域によって共通する部分と異なる部分をもっていることが明らかになってきた。また、地下の生態系で報告されてきた生物間相互作用のネットワーク(送粉共生ネットワークや種子散布共生ネットワーク)と比較して、地下の生物間相互作用ネットワークの構造が、根本的に異なる構造をもっていることがわかってきた。地上のネットワークで普遍的に存在すると報告されてきたnested構造は、しばしば、生物群集の安定性に寄与すると議論されている。しかし、地下の生物間相互作用ネットワークにおいては、このnested構造が壊れるような群集集合過程が存在し、地上のネットワークを基に構築されてきた理論が適用できない可能性がでてきた。4カ国の国際共同研究にもとづくこの成果は、Scienceの姉妹誌であるScience Advancesで出版された。その他にも、地下生物群集に関わる研究論文を3報出版した。本年度は、国内外から注目される論文成果を多数送り出すことができた。植物と真菌の地下における相互作用に関する研究としては、高山帯の極限環境におけるエリコイド菌根共生に関する論文をMolecular Ecology誌に発表した。この論文の中では、16種のツツジ科植物間で共生真菌の群集構造を比較したが、エリコイド菌根菌以外にも驚くほど多様な系統の真菌たちが共生していることが判明した。また、この群集データをもとに植物-真菌ネットワークの全体構造を統計的に評価したところ、地上の植物-動物ネットワークで一般的にみられるネットワーク構造とは根本的に異なっており、昨年度にScience Advances誌で提起した地上と地下の群集構造の違いを支持する内容となった。また、複雑な群集の動態をより空間的に大きなスケールであるメタ群集レベルで考察する研究成果をNature Ecology & Evolution誌で発表することができた。この論文では、「超」種多様な生物間相互作用ネットワークを次世代シーケンシングで解明し、メタ群集レベルの相互作用網である「メタ群集ネットワーク」を推定することを提案している。メタ群集動態と進化動態とつないで種多様な現実の生物群集を考察する土台となる研究成果であり、両分野の研究者の相互作用を活性化していくことが期待される。28年度は、前年度に増して論文成果の公表を進めることができた。まず、大きな成果として、種多様な群集における進化過程と進化過程のフィードバック機構に関する今後の研究展開を解説するPerspective論文が、Nature姉妹誌のNature Ecology and Evolutionに掲載された。この論文は、"Species-rich networks and eco-evolutionary synthesis at themetacommunity

level"というタイトルで、群集生態学と進化生物学をメタ群集レベル(空間構造を考慮)した上で統合することを目指す挑戦的な内容であり、世界トップレベルの群集生態学者と進化生物学者との息の長い共同執筆作業を本研究代表者がまとめた成果である。新しく創刊されたNature姉妹誌に掲載された日本人責任著者の論文ということで、解説記事やインタビュー記事が作成されている。上記の成果以外にも、土壌中における共生微生物間相互作用を扱った先駆的な論文など、国内外から注目度の高い論文成果を数多く出すことができた。また、本年度は招待講演6件や学会でのシンポジウム企画を通じて、本研究プロジェクトの視点を幅広い分野の聴衆に広めることができた。微生物を主体とする地下の生物圏は、生態学および進化生物学における巨大なブラックボックスである。本研究では、多様性の維持・創出機構の理論に存在する上記の矛盾を解決するため、新たな概念的枠組みを提案し、最先端の技術群を用いた野外研究をもとに先端理論を検証することを目的とした。前年度までに、Molecular Ecology, Nature Communications, Science Advancesといった一流誌に成果を公表していたが、さらなる研究成果発表を目標とした。次世代シーケンシングとネットワーク理論を駆使して知られざる地下の生物間関係の全体像を解き明かす試みは、原著論文および総説論文として結実した。まず、植物体内や根圏に共生する微生物群集(微生物叢)全体を制御することを提案するPerspective論文が、Nature Plants誌に受理された。この論文の中では、種間ネットワークのハブに位置する種に着目する研究戦略を提案している。また、花蜜の中に生息する微生物のメタ群集動態に関する論文が、Oikos誌で出版された。Nature Ecology and Evolution誌で2017年に発表した論文と合わせ、群集生態学分野の挑戦的テーマについて、独自性の高い研究成果を発表することができたと言える。国内外における招待講演等も数多く行い、オランダ、スイス、中国、アメリカの研究期間に在籍する国際的に著名な研究者たちとの共同研究も実施することができた。総じて生産性の高いプロジェクトとして最終年度を完結することができた。生態系内における生物間相互作用の研究は、従来、観察し易い地上の相互作用を対象に行われてきた。本プロジェクトでは、研究が進んでいない地下生態系内の生物間相互作用に着目し、その複雑相互作用ネットワークの根本的構造を、地上の生物間相互作用と比較した。一連の研究成果は、Nature Communications, Science Advances, Nature Ecology and Evolution, Nature Plantsといったハイインパクト科学誌で出版された。
窒化アルミニウム粉末を原料とする窒化アルミニウム単結晶成長技術の開発

都市生活を営む上で直流ー交流変換などの電力変換は不可欠である。本研究では、高品質かつ低コストのAlN単結晶基板の成長技術を確立し、次世代AlN系パワーデバイス開発の加速に貢献することを目的とする。目的達成に向けて、AlN固体ソース溶液成長中の高温固ー液界面のその場観察装置を開発し、成長初期過程の観察を行った。成長温度1250°Cでは樹脂状成長様式が、1350°Cでは多段ステップの移動による成長様式が観察された。得られたAlNは多結晶であったが、高温固ー液界面のその場観察技術の開発およびAlN固体ソース溶液成長プロセスの解明に成功した。都市生活を営む上で電力変換は必要不可欠である。例えば、火力・風力発電等から供給された交流(AC)電力が直流(DC)電力に変換され大規模演算サーバーやPC端末で使用されている。また、電気自動車やHV車では、蓄電池から供給されたDCをACに変換してモーターを駆動している。これらのAC-DC変換(電力変換)を行う際に、現在、シリコンパワーデバイスが用いられているが、変換効率が悪く約1020%の電力エネルギーを熱として損失している。本研究では、電力変換の高効率化に資する次世代パワーデバイス用窒化アルミニウム(AlN)結晶の作製技術開発を目的としている。AlN結晶は従来のシリコン結晶よりも高耐圧、低オン抵抗を実現できる材料であり、この材料を用いることにより電力損失を5%程度にまで低減することが期待される。電力変換時の電力損失を低減させることにより、都市における電力需要の低減や電気自動車・HV車の航続距離の延長が期待される。目的達成に向けて次の研究計画を予定している。[H25年度]その場観察を可能とする成長炉の開発。[H26年度以降]成長表面(固ー液界面)のその場観察により成長プロセスの解明および新規AlN成長技術の確立を行う。H25年度は当初目標に沿って、その場観察装置の設計・製作を行った。装置設計を開始する前に、フラウンホーファー研究機構IISB(ドイツ)を訪問し、研究協力者と意見交換を行った。研究協力者との意見交換により得た情報を基にその場観察装置を設計し、製作を行った。H25年度は当初の研究計画の通り順調に進展している。都市生活を営む上で直流ー交流変換などの電力変換は必要不可欠である。現在、シリコンパワーデバイスを用いた電力変換システムが広く普及しているが、変換効率が悪く約1020%のエネルギーを熱として損失している。AlN結晶は従来のシリコン結晶よりも高耐圧、低オン抵抗を実現できる材料であり、この材料を用いたパワーデバイスを開発することにより電力変換時の損失を5%程度にまで低減することが期待される。[H26年度以降]成長表面(固ー液界面)のその場観察および成長プロセスの解明と新規成長技術の開発。H26年度は、H25年度(初年度)に作製したその場観察用成長炉を用いて実際に固ー液界面の観察を行った。観察窓を設けることにより固ー液界面(成長表面)のその場観察が可能となったが、同時に放熱による炉内の温度低下が生じることとなった。炉内の基板保持台や断熱材の形状を見直すことにより、観察窓周辺部からの放熱を抑制することに成功し、高温の固ー液界面を観察するに至った。Al融解の観察により原料部と基板部の温度差は約40°Cであり温度勾配は10°C/cmとなっていることがわかった。原料部温度を1250°Cに設定して成長実験を行ったところ樹脂状結晶の成長様式が観察された。1350°Cにおける成長では多段ステップの移動を伴う成長様式が観察された。但し、成長速度が速く生成物が多結晶となっているため成長条件の最適化が必要である。以上のようにH26年度は当初計画の通り順調に進展している。最終年度(H27年度)はその場観察技術の有用性を最大限に活用して成長条件の最適化を行い新規成長技術を確立する。現在、Siパワーデバイスを用いた電力変換システムが広く普及しているが、変換効率が悪く約1020%のエネルギーを熱として損失している。本研究では、電力変換の高効率化に資する次世代パワーデバイス用窒化アルミニウム(AlN)結晶の作製技術開発を目的とした。AlN結晶は従来のSi結晶よりも高耐圧、低オン抵抗を実現できる材料であり、この材料を用いたパワーデバイスを開発することにより電力変換損失を5%程度にまで低減することが期待される。本研究では(1)高温固ー液界面のその場観察を可能とする特殊な溶液成長炉の開発、(2)溶液成長プロセスの解明と新規AlN成長技術の開発を行った。(1)では、成長炉底面に石英の観察窓を設置し、その直上に置かれた無色透明のAlN/サファイア基板を通して、高温溶液と基板表面との界面(高温固ー液界面)の観察を可能とした。炉内の基板保持台や断熱材の形状を改良することで観察窓周辺部からの放熱を抑制し、当初予定していた基板表面温度に達することができた。

結果として高温固ー液界面のその場観察に成功した。また、基板表面に置かれたAl粉末の融解を観察することにより、基板表面と熱電対位置(基板直上10 cmの位置)の温度差を評価した。温度差は40°Cとなっており炉内鉛直方向の温度勾配が4°C/cmとなっていることがわかった。この縦型温度勾配炉を用いて熱電対温度1250、1350°CにおけるAlN固体ソース溶液成長を行った。低温(1250°C)ではデンドライト成長(樹脂状成長)様式が観察され、高温(1350°C)では多段ステップの移動(ステップフロー)による成長が観察された。本研究により、高温固ー液界面のその場観察技術の開発およびAlN固体ソース溶液成長プロセスの解明に成功した。都市生活を営む上で直流ー交流変換などの電力変換は不可欠である。本研究では、高品質かつ低コストのAlN単結晶基板の成長技術を確立し、次世代AlN系パワーデバイス開発の加速に貢献することを目的とする。目的達成に向けて、AlN固体ソース溶液成長中の高温固ー液界面のその場観察装置を開発し、成長初期過程の観察を行った。成長温度1250°Cでは樹脂状成長様式が、1350°Cでは多段ステップの移動による成長様式が観察された。得られたAlNは多結晶であったが、高温固ー液界面のその場観察技術の開発およびAlN固体ソース溶液成長プロセスの解明に成功した。H26年度は以下の目標を設定していた:H25年度に作製したその場観察用成長炉によるAlNの成長実験。断熱材等の構造を最適化することにより炉内の温度低下を抑制し、高温の固ー液界面形状を直接観察することに成功した。これまでは、成長後のサンプルの破壊検査により成長様式や成長機構を解析・考察することしかできなかったが、本装置の開発により成長表面(界面)のその場観察が可能となり、成長様式をリアルタイムで詳細に解析することが出来るようになった。半導体結晶成長当初の研究計画の通り、初年度(H25年度)に装置を作製し、2年目(H26年度)に稼動・観察に成功した。最終年度となるH27年度は本装置の有用性を最大限に活かし、成長条件の最適化を加速してAlN単結晶の新規成長技術の確立を目指す。H25年度は以下の目標を設定していた:(1)研究協力者(フラウンホーファー研究機構IISB、ドイツ)との意見交換、(2)その場観察を可能とする成長装置の設計・製作。(目標1)H25年4月下旬5月上旬の期間、客員研究員(Guest Scientist)として当該機関を訪問し、研究協力者と意見交換および装置見学を行った。意見交換および装置見学により、その場観察用成長装置の設計・製作に関わる貴重な情報を得ることに成功した。(目標2)ドイツから帰国後、装置を設計し製作に取り掛かった。H25年度内に装置の製作・搬入・設置までを完了した。以上のように、当初の研究計画に沿って順調に進展している。また、研究協力者から得た装置設計に関する情報・指針は大変貴重なものであり、当初の予定を超えた装置設計・製作が可能となった。当初の研究計画の通り、初年度(H25年度)にその場観察装置の設計・製作を終えることに成功した。H26年度以降も当初計画に沿って、装置の稼動・観察を行い、AlN結晶表面(固ー液界面)における成長プロセスの解明および新規結晶成長技術の開発を遂行する。
日本人におけるトブラマイシン母集団パラメータの算出

○研究目的:トプラマイシン(TOB)はグラム陰性桿菌感染症に対し用いられるアミノグリコシド系抗菌薬である。TOBは濃度依存的に殺菌作用が認められるが、高濃度暴露が長期間続くと腎機能障害や、聴覚障害を引き起こすことが知られている。そのため、我々は母集団薬物動態(PPK)パラメータを用いてTOBを初回投与から有効かつ安全な投与スケジュールを推奨しているが、その予測精度には限界があり、その要因に母集団が外国人パラメータであることと考えている。TOBの投与設計精度向上を目的として日本人の母集団パラメータを算出することを目的とする。○研究方法:過去5年間(2006-2011年)のTOB投与患者の血中濃度データ、疾患、合併症、各種検査値を診療支援電子カルテより抽出しデータベースを作成する。PPKパラメータの算出には非線形混合効果モデル(NONMEM ver.6)を使用する。モデルの構築においてはTOB投与前と投与終了後1時間値の2点採血が8割を占めることから、1-compartment modelを採用する。先ず、至適な変量効果モデルを含むbaseモデルを構築し、その後TOBの体内動態に影響を及ぼす可能性のある様々な影響因子(年齢、性別、体重、疾患、臨床検査値等)を考慮に入れたfinalモデルを構築する。構築したfinalモデルは、ブートストラップ法にてモデルバリデーションを行う。○研究成果:TOB投与患者の血中濃度データ、疾患、合併症、各種検査値を診療支援電子カルテより抽出しTOB投与患者のデータファイルを作成した。NONMEMの作動可能な環境を整えたため、作成したデータファイルを用いて母集団パラメータの算出に取り組む。今回得られた患者群は小児および成人の血液疾患患者が最も多く、次いで肺炎を合併した敗血症患者が多かったため、疾患別の母集団パラメータ算出を考慮にいれる必要があると考えられた。
骨における圧刺激感受機構の解明:摘出骨標本におけるカルシウムイメージング

本研究においては、運動・圧負荷による骨組織のメカニカルストレス感受機構の解明を究極の目標とし、骨組織内に存在する生きた細胞を対象とした従来にない実験系を確立するため、メカニカルストレスに対する骨内細胞応答へのカルシウムイメージングの応用を試みた。平成14年度には基本的な方法論の検討を行ったが、その検討結果に基づいて平成15年度には標本作成法・カルシウム蛍光指示薬の選択・標本染色法・実験プロトコールを改良し、安定した成績を得ることができるようになった。具体的な方法としては、約7日齢の若齢ラットから麻酔下で大腿骨を摘出、縦切し、骨内丙面にリンゲル液を噴射して骨髄を除去した。カルシウム蛍光指示薬・fluo-3/AMで染色後、共焦点正立蛍光顕微鏡下でのカルシウムイメージングにより大腿骨内側表面の細胞集簇を観察しえた。ホルマリンやアルコールで固定処理した標本では、カルシウムイメージは得られず、またカルシウムイオノフォア添加により細胞内カルシウムの上昇を認めたことから、これらは骨表面に存在する生きた細胞であることを証明した。次に、骨内側の表面を灌流するリンゲル液速度、すなわち骨へのシェアストレスを変化させ、それに対する骨組織内細胞の応答を動画像として解析した。標本にシェアストレスを加えると、一過性に蛍光輝度の上昇、即ち細胞内カルシウムの上昇を示す細胞を見出した。標本に加えるシェアストレスを変化させて、シェアストレスの大きさとカルシウムイメージングにおける細胞の蛍光輝度変化とに正の相関性があることを見出した。さらに電顕標本を作製しリンゲル液噴射により骨髄除去後にも、骨梁表面に存在する骨芽細胞を形態学的にも確認した。これは、骨組織内の生きた細胞のメカニカルストレスに対する応答を検出した初めての研究である。現在、本研究成果を報告するため、英文原著論文を準備中である。本研究においては、運動・圧負荷による骨量減少予防メカニズムの第一段階である骨組織のメカニカルストレス感受機構を解明することを究極の目標とし、従来の単離細胞・培養細胞を用いた実験系ではなく、骨組織内に存在する生きた細胞を対象とした実験系を確立することを目的とし、メカニカルストレスに対する骨内細胞応答のカルシウムイメージング法による解析を試みた。本年度は、まず、基礎的方法論、すなわち標本作成法・カルシウム蛍光指示薬の選択・標本染色法・実験プロトコールについて検討を行った。各種年齢のラットを対象とした予備実験から約7日齢の若齢ラットを用いることとした。標本作成のため、麻酔下で大腿骨を摘出・縦切し、骨内面にリンゲル液を噴き付け、骨髄を除去したが、骨髄除去の際に大腿骨内面に存在する骨芽細胞が剥離してしまうことが電顕による観察で判明した。そこで、骨髄除去のためのリンゲル液噴射法を検討し、その至適条件を決定した。カルシウム蛍光指示薬としてはfluo-3/AMを選択した。共焦点正立蛍光顕微鏡を用いたカルシウムイメージング法により大腿骨内側表面に骨芽細胞と思われる細胞の集簇を観察しえた。ホルマリンやアルコールで固定処理した標本ではこのような細胞は観察されず、また灌流液へのカルシウムイオノフォア添加によりこの細胞の輝度が上昇したことから、これらは骨表面に存在する生きた細胞であることを証明した。本研究の成果は第17回日本整形外科学会基礎学術集会において発表した。
映画教育において学生に与える映像テクストの作成に関する研究

1年間の本研究課題は、文学の授業のためのデジタル教材をつくることだった。英文学の授業を行うさい、映画というメディアを導入して、とかく敬遠されがちな文学を学生に身近なものにしようという狙いである。文学+映画の視点にたった授業に関して、これまで学生が予習したり復習したりするための適切な教材は、皆無だった。もっとも、教育目的として、映画ビデオを学生たちに貸し出すことは可能である。しかし、映画を見流すだけでは、何に着眼して、どこから何を読みとればいいのかは、さっぱりわからないままだろう。そこで、本研究が目指したことは、英文学作品と映画作品をリンクさせたデジタル教材をつくって、学生が自分で予習や復習ができるようにするだけでなく、もっと低次の現実的な次元で、学生たちが文学作品やそれを映画化したビデオを探して、図書館や書店やレンタルビデオ屋を右往左往することをなくす、ということだった。作成した電子的教材の概要は、以下のとおりである。1.文学の主要なテーマ(キーワード)の選定とその解説文の作成2.テーマ(キーワード)を表象する文学作品の相当箇所を引用し、キーワードにリンク3.文学に基づいた映画作品から、テーマ(キーワード)を表象する部分を抜粋し、文学作品にリンクこのように映画というメディアの媒介によって、なかなか理解できなかった文学テーマが、まるで痒いところに手が届くといってもいいほどに理解や学習が可能となったのである。今後の課題は、文学と映画がリンクされたデジタル教材をじっさいの授業で用いて、その効果を確認することである。著作権の問題から、学生たちにはCD-ROMとして提供する予定である。
リボフラノシル環内Cー1ーO結合の還元的開裂反応

1.フッ化グリコシル誘導体の合成:ベンジル基,イソプロピリデン基,シクロヘキシリデン基,あるいはアセチル基を保護基として有する1位水酸基遊離の糖誘導体を塩化メチレン中,室温でヘキサフルオロプロペンージエチルアミン付加体と処理することにより相当する保護基を有する各種フッ化グリコシル誘導体を合成した。2.グリコシルベンゼン誘導体の合成:上記1で合成したフッ化グリコシルとアニソ-ル,1,4ージメトキシベンゼン,あるいは1,3,5ートリメトキシベンゼンを三フッ化ホウ素ジエチルエ-テラ-トで処理することによりそれぞれ相当グリコシルモノ,ジ,あるいはトリメトキシベンゼン誘導体を合成した。また、フエニルマグネシウムブロミドと処理することによりグリコシルベンゼン誘導体を合成した。3.フラノシル環内Cー1ーO結合の還元的開裂反応:上記2で合成したグリコシルベンゼン誘導体をメタノ-ル中蟻酸を水素供与剤として接触水素移動還元を行った。フラノ-ス誘導体は全て高収率でCー1ーO結合が開裂した生成物を与えたが、ピラノ-ス誘導体は殆んど定量的な原料回収であった。さらに、ピラノ-ス誘導体について、トリフルオロ酢酸を含む酢酸を溶媒として中圧(約10気圧)接触還元を行ったところ水素化分解ではなくベンゼン環の水素添加が起り、シクロヘキサン誘導体が定量的に得られた。このような極端な反応性の違いは非常に興味深い現象でありさらに詳しい研究を続けるべく計画中である。4.3ーデオキシアルドー2ーウロソン酸の合成:上記3で合成した開環型糖誘導体をオゾンで分解することにより3ーデオキシアルドー2ーウロソン酸類を好収率で合成した。これらの一連の反応を2,3;5,6ージーOーイソプロピリデンーDーマンノフラノ-スに適用して3ーデオキシーDーマンノー2ーオクツロソン酸(KDO)を合成した。
睡眠呼吸障害による耐糖能異常発現の機序解明を目的としたコホート研究

申請者らは、詳細な睡眠呼吸障害ならびに糖尿病・循環器疾患調査を実施しているコホート研究において、睡眠呼吸障害による耐糖能異常出現の相対危険度等を算出し、睡眠呼吸障害と耐糖能異常との因果関係について究明することを目的とした。愛媛県東温市で実施している「東温スタディ」において実施した横断研究の結果、睡眠呼吸障害が重症なほど耐糖能異常有病者割合が高く、またイビキの頻度が多い(睡眠呼吸障害の特徴)ほど血圧が高かった。コホート研究の結果、睡眠呼吸障害と耐糖能異常発症との因果関係は立証できなかったが、5年間の追跡期間を通じて軽度以上の睡眠呼吸障害の者は肥満度が5年間通じて高いことが認められた。本年度は、睡眠呼吸障害とインスリン抵抗性、家庭血圧、psychomotor vigilance task(PVT)検査との関連について、平成21年24年度に実施した東温スタディ参加者約2,000名において、横断的検討を実施した。主たる結果として、1夜間就寝中の3%ODI(oxygen desaturation index)を5回未満、5-15回未満、15回以上/時間の3群に分けて、75gブドウ糖負荷試験により評価した糖尿病判定との関連を分析した結果、5回未満/時間に対しての耐糖能異常のオッズ比は、15回以上/時間において1.69(95%信頼区間:1.03-2.75、傾向性p=0.04)であった。2夜間就寝中の呼吸障害指数を0-10回未満、10-20回未満、20回以上/時間の3群に分けて、家庭血圧との関連を分析した結果、多変量調後の起床時と就寝時の血圧差(最高/最低)は、男性で3.6/5.6、4.6/5.7、6.9/7.5 mmHg、女性で2.5/3.4、2.8/3.8、4.3/4.8 mmHg (傾向性:p<0.05)であった。33%ODIを0-0.88, 0.89-2.35, 2.36-6.04, 6.04回以上/時間の4群に分けて、PVTにより評価した客観的な注意・覚醒度との関係を分析した結果、6.04回以上/時間では、それ以下の群と比較して反応時間の逆数の平均値が有意に低く、反応時間の中央値、反応速度上位10%の反応時間の平均値、反応遅延、反応間違い、主観的眠気(エプワース眠気尺度)は有意に高値であった。以上のように、本年度は横断的検討により、主目的である睡眠呼吸障害と耐糖能異常との関連の可能性を示すとともに、家庭血圧や注意力といった本研究の特長的な検査指標との関連性も示した。平成26年度は、21年に受診した453名の受診者の内322名(71.0%)に対して、追跡調査を実施した。21年時に糖尿病でなかった283名の、5年後の糖尿病発症率を分析した結果、糖尿病(空腹時血糖が126mg/dL以上または、2時間値が200 mg/dL以上、または服薬)を発症した者は男性で73名中7名(9.6%)、女性で210名中14名(6.7%)であった。さらに平成26年度も25年度に引き続き横断研究も実施した。欧米の疫学研究では、睡眠呼吸障害の代表的な症状であるいびきの頻度が多いほど、糖尿病に合併することの多い高血圧の割合や発症が高いという関連が報告されているが、日本人を対象とした疫学研究によるエビデンスは少ない。そこで、いびきの頻度と血圧との関連を分析した。いびきをしない者に比べて、週2回以下する者は最大血圧が3.08mmHg、最小血圧が2.10mmHg有意に高く、週3回以上の者ではそれぞれ4.40、2.52mmHg有意に高かった。飲酒の有無や肥満の有無で層別解析を行った結果、この傾向は飲酒や肥満の有無に関わらず認められた。したがって、睡眠呼吸障害が背景にあるいびきもまた、糖尿病とともに生活習慣病対策上重要な疾患である高血圧の原因になる可能性が示された。さらに、糖尿病とも深くかかわっている生活習慣である短時間睡眠について、その要因を探索的に分析した。その結果、女性においては、仕事時間の増大が短時間睡眠と有意に関連していた。男性においては、仕事時間と短時間睡眠には有意な関連は認められなかった。平成28年度は、5年後調査(平成27年11月)が終えた777名についてコホート研究デザインでの解析を行った。777名のうち、調査前後の睡眠呼吸障害のデータがそろっている者は本報告現在343名であり、現在もデータクリーニングを実施している。343名中ベースライン時に3%Oxygen Desaturation Indexが5回/時間以上(軽度睡眠呼吸障害)の者は111名(32.4%)、5年後調査では135名(39.4%)と増加した(p<0.05)。調査の終えた777名中、ベースライン時に糖尿病判定であった者は85名(10.9%)、5年後調査では111名(14.3%)と増加した(p<0.05)。調査の終えた777名にて、ベースライン時の睡眠呼吸障害と糖代謝指標変化・糖尿病発症の関連を分析した。

ベースライン時ならびに5年後調査時のインスリン抵抗性指標(HOMA-IR、Matsuda index)の性・年齢調整後平均値は軽度睡眠呼吸障害群の有意に悪い状態であったが、5年間の変化との関連はみられなかった。また、多変量調整ロジスティック回帰分析で、ベースライン時の軽度睡眠呼吸障害の有無と5年後の糖尿病・高血糖(メタボリックシンドローム基準)との関連を分析したが、軽度睡眠呼吸障害の有無と糖尿病、高血糖との関連はみられなかった。さらに、ベースライン・5年後ともに正常、ベースライン時のみ軽度睡眠呼吸障害、5年後のみ軽度睡眠呼吸障害、ベースライン・5年後ともに軽度睡眠呼吸障害の4群に、ベースライン時と5年後調査時それぞれについて糖代謝指標、Body mass index(BMI)について分析した結果、糖代謝指標では関連がみられなかったが、BMIはベースライン、5年後調査時ともに軽度睡眠呼吸障害群が最もBMIが高く、ついで5年後のみ軽度睡眠呼吸障害群が高かった(p<0.05)。申請者らは、詳細な睡眠呼吸障害ならびに糖尿病・循環器疾患調査を実施しているコホート研究において、睡眠呼吸障害による耐糖能異常出現の相対危険度等を算出し、睡眠呼吸障害と耐糖能異常との因果関係について究明することを目的とした。愛媛県東温市で実施している「東温スタディ」において実施した横断研究の結果、睡眠呼吸障害が重症なほど耐糖能異常有病者割合が高く、またイビキの頻度が多い(睡眠呼吸障害の特徴)ほど血圧が高かった。コホート研究の結果、睡眠呼吸障害と耐糖能異常発症との因果関係は立証できなかったが、5年間の追跡期間を通じて軽度以上の睡眠呼吸障害の者は肥満度が5年間通じて高いことが認められた。当該年度は、前年度に引き続き、研究テーマに関連して、既存データを用いた横断的研究を実施しており、学術論文に1本(睡眠呼吸障害の重症度と糖代謝異常の関連)が採択されている。また学術会議にて3演題の発表も行っている。平成27年度の5年後調査の準備も予定通り進んでいる。また、地域での成果に関する情報発信を目的としたホームページの開設も平成27年度の前期にはできるように着手している。27年度が最終年度であるため、記入しない。疫学・予防医学平成27年度は、計画通り平成22年度受診者約600名、ならびに平成21年度受診者で、26年度に受診できなかった約130名に対し、5年後調査を実施する。また、横断的研究についても継続的に実施する。当該年度は、研究テーマに関連して、既存データを用いた横断的研究を実施しており、学術論文に1本(睡眠呼吸障害の重症度と糖代謝異常の関連)投稿中であり、また学術会議にて3演題の発表を行っている。平成26年度からの研究準備も予定通り進んでいる。また、地域での成果に関する情報発信を目的とした、愛媛県東温市における本研究の成果報告のためのシンポジウムを本年46月の間に開催する予定で進んでいる。当該年度予定していた受診者数よりも少なかったため、検査費用等が少なかったため。平成26年度以降は、計画通り平成21年度受診者約460名に対し、5年後調査を実施する。27年度はより多くの受診者を、繰り越す金額にて検査する。
HTLV-I関連ぶどう膜炎(HAU)のHLAの検索

【目的】etiologyunknown HTLV-I positive uveitis(HAU)の臨床像を細分類すること.【手段】etiology unknown HTLV-I negative uveitis (EUU)のHLAを検索し,比較した。【対象】HAUのHLAの研究(平成4年度文部省がん特別研究総括班の研究の一環として,九州と沖縄の9大学病院と首都圏の2大学病院を受診したEUU97例.【方法】各大学病院で患者(EUU)の同意を得た後,検体(EUUの血液)が採取された.検体は鹿児島大学眼科に送られ,鹿児島大学ウイルス学教室の設備を使用して検体からリンパが分離され,一旦液体窒素(タンク)に保管された.検体は後日取り出され(解凍され),HLAが検索された.【結果】(1)EUUのHLAの遺伝子頻度をみると,HAUと比較してDQ7が有意に少なかった。また、コントロールと比較して,HLA-A26やB27,B51,DR14,DQ4が有意に多く,Cw1とCw3が有意に少なかった.(2)過去に眼疾患との関連が指摘されているHLA,即ちB7,やB27,B51,DR2,DR4,DR5(DR11,DR12),DQ4のいずれかを保有する頻度みると,HAUもEUUもコントロールと比較して有意に多かった.HAUとEUUの間には有意差はなかった.(3)A2,もしくはA24を保有する保有する頻度みると,EUUはHAUより有意に少なかった.コントロールとは有意差はなかった.(4)EUUのhaplotypeの頻度をみると,A26 Cw3 B61 DR4 DQ4(4.6%)やA2 Cw- B54 DR4 DQ4(2.7%),A2 Cw- B51 DR4 DQ4(2.1%)などがコントロールと比較して有意に多かった.(5)HAUの臨床症状とHLAとの間には有意な相関は認められなかった.【結論】HAUの臨床像の細分類には至らなかったが,HAUもEUUも眼疾患の素因のある集団であることが考えられ,またHAU発症にHLA-A2,もしくはA24が関与している可能性が示唆された.【目的】etiologyunknown HTLV-I positive uveitis(HAU)の臨床像を細分類すること.【手段】etiology unknown HTLV-I negative uveitis (EUU)のHLAを検索し,比較した。また、コントロールと比較して,HLA-A26やB27,B51,DR14,DQ4が有意に多く,Cw1とCw3が有意に少なかった.(2)過去に眼疾患との関連が指摘されているHLA,即ちB7,やB27,B51,DR2,DR4,DR5(DR11,DR12),DQ4のいずれかを保有する頻度みると,HAUもEUUもコントロールと比較して有意に多かった.HAUとEUUの間には有意差はなかった.(3)A2,もしくはA24を保有する保有する頻度みると,EUUはHAUより有意に少なかった.コントロールとは有意差はなかった.(4)EUUのhaplotypeの頻度をみると,A26 Cw3 B61 DR4 DQ4(4.6%)やA2 Cw- B54 DR4 DQ4(2.7%),A2 Cw- B51 DR4 DQ4(2.1%)などがコントロールと比較して有意に多かった.(5)HAUの臨床症状とHLAとの間には有意な相関は認められなかった.【結論】HAUの臨床像の細分類には至らなかったが,HAUもEUUも眼疾患の素因のある集団であることが考えられ,またHAU発症にHLA-A2,もしくはA24が関与している可能性が示唆された.
ヘリコバクター・ピロリと気管支喘息の関連における免疫学的機序の関与

ヘリコバクター・ピロリ感染は胃炎、潰瘍、胃癌と密接な関連があり、病原菌と認識されているが、疫学調査では逆にピロリ感染が気管支喘息発症を予防することが報告されている。動物モデルを用いてピロリ感染が気管支喘息発症に及ぼす影響について検討した。ピロリ感染させたスナネズミに卵白アルブミン感作暴露による喘息を誘導した。喘息はピロリ感染の有無に関わらず同程度に誘導され、浸潤細胞数・種類、サイトカイン濃度、組織評価に差は認めなかった。ピロリ感染は喘息発症に関連がないと示唆された。C57BL/6Jマウス(5週齢)にSydney strainであるH. pylori(SS1)を経口投与し感染させH. pylori感染胃炎を作成し、肉眼的・組織学的にH. pylori感染の有無を確認した。感染マウスの胃炎の程度を組織学的に評価するとともに、好中球浸潤に関してはMPO活性にて評価した。結果、H. pylori感染が確認でき、組織学的にも炎症細胞浸潤を伴う胃炎の変化が確認された。気管支喘息は水酸化アルミニウムをアジュバントとしてOVAを腹腔内投与することによりOVA特異的Th2細胞を誘導させ、OVA吸入により気管支喘息を惹起させた。喘息の評価は肺胞洗浄液中の浸潤細胞数、Th2サイトカインであるIL-13およびTh1サイトカインであるIFNgammaをELISA法にて測定した。OVA感作群ではOVA吸入よりBALF中の好中球、マクロファージ、リンパ球を含めた浸潤細胞、特に好酸球数の増加が観察された。またIFNgammaは影響を受けなかったが、IL13,IL-5などTh2サイトカインは有意に上昇していた。H. pylori感染1年後では非感染群に比較してOVA感作曝露によるBALF中の炎症細胞を有意に抑制しなかったことから、感染2か月のマウスを用いてOVA感作曝露による喘息への影響の検討を開始した。H. pylori感染により、気管支喘息の発症を抑制することが報告されていることから、マウスを用いて1H. pylori長期感染(12カ月)、2H. pylori長期感染+除菌、3H. pylori短期感染(1カ月)モデルで喘息の程度に差があるかを検討した。C57BL/6Jマウス(5週齢)にH. pylori(SS1)を6×107 CFU経口投与し、H. pylori感染胃炎を作成した。気管支喘息モデルは、Day1・14にovalbumin(20μg)、水酸化アルミニウム(2.25 mg)を腹腔内感作後、Day29・30・31に1%ovalbuminを吸入暴露し作製した。評価は、肺胞洗浄液(BALF)を回収し、総細胞数・細胞分画を解析した。またBALF内に含まれるTh2サイトカイン(IL-5, IL-13)やINF-γについてELISA法にて測定を行った。気管支及び胃を採取固定し、病理組織学的検討を行った。長期感染マウスは、HP+PBS群・HP-PBS群、HP+OVA群、HP-OVA群における喘息惹起の違いについて検討した。ovalbumin暴露により、PBS群に比してOVA群では気管支肺洗浄液(BALF)内の総細胞数・マクロファージ数・好中球数・好酸球数が有意に低下していたが、HP感染の有無では明らかな差は認められなかった。ELISA法によるIL-13の測定でも、PBS群に比してOVA群では有意差は認められるも、HP感染有無では有意差は認められなかった。胃炎の評価は、HE染色・MPO活性の測定で行ったが、HP陽性マウスでは、胃炎が存在していることが判明した。C57BL/6Jマウス(5週齢)にSydney strainであるH. pylori(SS1)を経口投与し感染させH. pylori感染胃炎を作成し、肉眼的・組織学的にH. pylori感染の有無(除菌)を確認した。結果、H. pylori感染が確認でき、組織学的にも炎症細胞浸潤を伴う胃炎の変化とMPO活性の上昇が確認された。喘息の評価は肺胞洗浄液中の浸潤細胞数、Th2サイトカインであるIL-13およびTh1サイトカインであるIFNgをELISA法にて測定した。BALF液中のIL-13は有意に増加していたが、IFNgの増加は観察されなかった。

H. pylori感染によるこれらOVA感作・吸入による影響は今回の感染期間における検討では明らかに抑制するかどうかの結果は十分得られなかった。ヘリコバクター長期感染では喘息発症に影響を及ぼさなかったため、短期感染群での検討を行っている。H. pylori感染による喘息の悪化が充分検討できなかったことは、感染時期と期間による影響が一因と思われた。当科基盤研究費取得後に海外の研究者らが報告したものによると新生児時期にH. pylori感染を起こすことで喘息の誘導が抑制された(Arnold I, et al. JCI 2011)と報告されており感染時期が重要な可能性が示唆された。ヘリコバクター長期感染では喘息発症に影響を及ぼさなかったため、短期感染群での検討を行い感染の影響を検討するとともに、長期感染で喘息に影響を及ぼさなかった機序をBALFおよび胃粘膜サンプルを用いて詳細に検討する予定である。長期感染群を現在飼育中であり、新生児時期感染とも含めてその影響を検討する。Arnoldの報告では新生児期感染による喘息抑制機序にTh17を介したTh2免疫系の抑制が報告されたので、本研究は別の面から抑制機序を検討するため、最近喘息を含めたアレルギー機序に重要な役割を担っていると報告されている好塩基球の役割に標的を絞って研究を推進する。ELISAなど測定用試薬はおおむね用意できているので、残りの若干必要な分子生物試薬、抗体などに用いる。また、最終年度であるため、研究成果報告するように論文作成用費用、学会出張費などに用いる予定である。H. pyloriの感染長期のマウス(12か月)および11か月で除菌したマウスおよび新生児期に感染させたマウスを用いてOVA腹腔内投与し2週後にOVAを吸入させることで喘息を惹起させ肺胞洗浄液中の浸潤細胞数の解析およびTh2サイトカインの動態を検討する。Cytospinにより細胞をスライドグラスに固定し、Gimza染色により好酸球、免疫組織染色にてCD4陽性細胞数および好塩基球特異的抗体を用いた方法により浸潤細胞をカウントする。また肺胞洗浄液内に含まれるTh2サイトカインや好塩基球のマーカーであるMMCP-8についてELISA法やReal-time RT-PCR法にて測定する。同時に胃粘膜局所における好塩基球浸潤やそのマーカーの発現動態を受容体抗体であるCD200R3を用いて検討する。さらに気管支及び肺を採取固定した後、病理組織学的検討するとともに、マウスに気管挿管し、メタコリンを吸入による気道内圧の変化を測定し、気道過敏性を評価することにより、喘息の程度の機能的解析を行う。