hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規心房特異的遺伝子の転写メカニズム解析と、心房筋精製方法への応用

ヒトiPS細胞への、心房特異的転写調節領域とレポーター遺伝子の結合配列を導入後のセレクションに失敗しているため。ノックアウトマウスの心臓を組織レベルでなく細胞レベルで解析することも検討する。当該遺伝子のレポーター遺伝子付加配列のヒトiPS細胞への導入はクリスパーなどの新技術を用いて行うことも検討する。循環器内科引き続き、ヒトiPS細胞への遺伝子導入およびセレクションを行う。モノクローナル抗体作成に必要な、ハイブリドーマの選択において、ヒト検体の取得が遅れているため、バイブリドーマ選択後の行程が未完となっており、その費用を使っていないため。本研究のテーマとする遺伝子のコードするタンパク質に対するモノクローナル抗体は現在商業ベースに存在せず、作成する必要があった。このための費用は計100万円以上かかる見通しである。作成の行程毎に費用を計上するため、作成の途上にある2014年度においてはその全てを費用として計上は出来なかった。バイブリドーマ選択、ERISA系の構築を迅速に進める。引き続きモノクローナル抗体の作成を継続する。
膵癌切除術後肝再発を予防するための外科治療補助療法の基礎的臨床的研究

研究目的:外科療法を中心とした膵癌の集学的治療の進歩は著しいが、術後肝転移再発による死亡率が未だにきわめて高く、肝転移抑制に有効な補助療法の工夫が必要とされている。そのような補助療法の開発を目的として4方面から検討した。1.癌局所動脈内抗癌剤+フィブリン糊充填法の開発と有効性の評価。2.膵術前照射の病理学的影響と、膵癌術後肝転移抑制に対する術前照射の臨床的有効性の評価。3.膵癌細胞のE-カドヘリンDNA・mRNAの変異の確認と、肝転移との関連性の探求。4.膵切除術中の肝の血行遮断や抗癌剤肝動脈注入による肝障害予防方法と結果:1.(1)市販医療用fibrin糊(ベリプラスト)を使い、fibrinogenとthrombinの血管内注入条件を決定し、抗癌剤との併用が可能なことを確認した。(2)不純物のplasmin系物質により、aprotinin非添加では血管内にて凝固したfibrinが一定時間後に自然溶解することが分った。(3)イヌの腸間膜動脈および膵支配動脈内にfibrin糊を注入して塞栓状況、再開通状況を検討した結果、本法は臨床応用可能であると考えられた。2.術前照射のサル膵への影響をみる実験を継続中である。臨床的には4例の患者に50Gyの照射を行ったが、その症例を増やして効果を評価する予定である。筑波大学付属病院における術前照射非施行期の膵癌治療成績は、肝転移率が高いが、膵癌切除、非切除群ともに術中あるいは術後照射症例の生存率が若干良好であった。3.膵癌細胞のE-カドヘリンDNA・mRNAの変異の検討では、19膵癌細胞株のうち、E-カドヘリンの発現が完全に消失している細胞株が4株見つかり、さらに膵癌組織における検討を続けている。4.(1)Trimethadioneを使った肝機能評価法を基礎的臨床的に確立した。(2)Caffeinを使った評価法の検討を行っている。他の癌に比較し、膵癌は切除可能症例が少ない上に、切除できても肝転移再発による死亡率がきわめて高く、治療成績は低いままにとどまっている。有効な肝転移抑制補助療法の工夫こそ、膵癌治療成績向上の鍵である。本研究は外科手術に加え、放射線、化学療法を行い、膵癌切除術後肝転移抑制を工夫することを目的とする。結果:1.従来の肝転移予防策である、術中操作による癌細胞の門脈内へのもみだし抑制法として、われわれは最近2年間、術中門脈内抗癌剤持続流入に加え、術中に膵動脈から切除範囲膵内に抗癌剤を充満させる方法を考案実施してきた。しかし、治癒切除を行った10例中8例に肝転移を来し、本法のみでは目的を達し得ないことが分った。そこで、抗癌剤の癌部充満を確実にするために、また癌細胞もみだし防止も確実にするために、膵動脈内にフィブリン糊を詰めることを考えた。フィブリン糊の至適凝固時間を得る条件と、目的以外の動脈内にフィブリンが詰った時に自然溶解を起させるための線溶剤プラスミンの混合率の検討をinvitroおよび動物実験にて行った。現在、動物実験にて本法の安全性の確認をしている。

2.術前短期間放射線照射により、手術待機期間中の癌細胞肝転移の抑制、術中癌細胞の血中散布防止、および癌発育阻止をはかることを考え、その臨床的および実験的検討を始めた。まず、臨床的に行ってきた、術中切除前、切除後照射の成績を検討したが、その方法による遠隔成績向上効果は末だ現れておらず、さらに症例を増やしたり、症例のstageを選ぶ必要があると考えられた。目的:膵癌治療成績向上の鍵である、膵癌切除術前後の肝転移抑制補助療法のとして、1.術中に癌占居部位膵動脈内に、抗癌剤とフィブリン糊を詰め、癌占居部位に満たした抗癌剤が流出せぬようにし、術中癌細胞血中散布を防ぐ。2.術前放射線照射により、手術持機期間中の癌発育阻止、肝転移の抑制および術中癌細胞の血中散布防止を図る。以上の2課題を目的として研究を行っている。方法と結果:1.フィブリノーゲンとトロンビンの血管内注入条件を検討した。市販医療用フィブリン糊(ベリプラスト)を使い、付属トロンビン液濃度を希釈することにより凝固時間調節が可能となったことから、実験に使うこととした。2.一度凝固したフィブリンが一定時間後に溶解する条件を決定した。アプロチニンを除いたベリプラストにプラスミノーゲンアクチベータを加えただけでは、フィブリン溶解は起きないことを昨年度実験で認めたが、今年度再実験を行った結果、昨年度と逆の結果が得られた。現在その現象がベリプラストのロット差によるものか否か検討している。3.上記のin vitroの実験から得られた条件で、イヌの腸間膜動脈および膵支配動脈内にフィブリン糊を注入し、塞栓状況、フィブリン糊溶解状況を確認するとともに、その動脈支配領域の組織学的変化を検討した。今回の条件では、in vivoではプラスミノーゲンアクチベータを加えずともフィブリン溶解が2時間程度で起きた。In vivoのフィブリン溶解時間を遅くする方法を来年度検討する必要がある。4.サルとイヌを使った膵への放射線照射実験は来年度行う予定である。5.術前照射開始前の筑波大学付属病院における膵癌治療の成績を総括したところ、肝転移率が高いが、膵癌切除、非切除群ともに照射症例の生存率が若干良好であった。なお、術前照射を本年度から開始した。研究目的:外科療法を中心とした膵癌の集学的治療の進歩は著しいが、術後肝転移再発による死亡率が未だにきわめて高く、肝転移抑制に有効な補助療法の工夫が必要とされている。そのような補助療法の開発を目的として4方面から検討した。1.癌局所動脈内抗癌剤+フィブリン糊充填法の開発と有効性の評価。2.膵術前照射の病理学的影響と、膵癌術後肝転移抑制に対する術前照射の臨床的有効性の評価。3.膵癌細胞のE-カドヘリンDNA・mRNAの変異の確認と、肝転移との関連性の探求。4.膵切除術中の肝の血行遮断や抗癌剤肝動脈注入による肝障害予防方法と結果:1.(1)市販医療用fibrin糊(ベリプラスト)を使い、fibrinogenとthrombinの血管内注入条件を決定し、抗癌剤との併用が可能なことを確認した。(2)不純物のplasmin系物質により、aprotinin非添加では血管内にて凝固したfibrinが一定時間後に自然溶解することが分った。(3)イヌの腸間膜動脈および膵支配動脈内にfibrin糊を注入して塞栓状況、再開通状況を検討した結果、本法は臨床応用可能であると考えられた。2.術前照射のサル膵への影響をみる実験を継続中である。臨床的には4例の患者に50Gyの照射を行ったが、その症例を増やして効果を評価する予定である。
NK細胞に3種のシグナルを同時に伝達する第3世代キメラ型人工受容体の新規開発

既存の治療を行っても絶対的予後不良である小児再発・難治性白血病には新規治療の開発が必要である。健常ヒトprimary NK細胞における抗CD19特異的キメラ型受容体のCD19抗原結合可変部位にCD3-zeta鎖をつなぎ(第1世代)、さらに4-1BBをつなぐと(第2世代)殺細胞効果が増強することが報告されてきた。この機能をさらに増強させるため、T細胞の共刺激因子を同時発現させた第3世代遺伝子改変キメラ受容体を作成し、受容体の発現および細胞障害活性を解析した。発現はコントロールと比較すると低い傾向であったが機能は保たれていた。発現および機能向上のためのさらなる工夫が今後の課題と考えられた。小児の再発、難治性白血病に対する新規治療方法を開発する目的で研究している。健常ヒトprimary NK細胞における抗CD19特異的キメラ型受容体の機能をさらに増強させるため、T細胞の共刺激因子であるCD28を同時発現させた第3世代遺伝子改変キメラ受容体を作成しその機能解析を行った。第3世代の遺伝子改変キメラ受容体(anti-CD19-BB-28-ζ)は、健常ヒトprimary NK細胞に発現することを確認した。しかしコントロール細胞と比較して受容体の発現が低い傾向を認めた。CD28を発現させたキメラ型受容体は、受容体発現が低下することが過去に報告されている(Nguyen P, etal. Blood 102:4320,2003)ため、NK細胞でも同様の機序が働く可能性は否定できない。T細胞では発現が低くなるにもかかわらず、機能は向上されていた。そこはNK細胞でも同様であるのかを検討していく必要がある。予備実験として、第3世代(anti-CD19-BB-28-ζ)受容体を発現した健常ヒトprimary NK細胞の活性化シグナルの増強の有無および、細胞障害活性の変化を解析した。第3世代(anti-CD19-BB-28-ζ)受容体を発現した健常ヒトprimary NK細胞は、コントロールの細胞と比較し、活性化シグナル(IL-2Rαchain CD25)を強く発現し、細胞障害活性も著明に増加した。しかし第1世代受容体を発現したNK細胞との比較では、細胞障害活性は同等か、健常供血者によってはやや劣るというデータもみられた。今後は、この遺伝子改変NK細胞の前駆B細胞性白血病細胞株に対する細胞障害活性をさらに増強させ、小児再発、難治性白血病の臨床応用につなげていきたいと考えている。小児再発及び難治性白血病に対する新規治療方法を開発する目的で研究している。平成25年度では、健常ヒトprimary NK細胞における抗CD19特異的キメラ型受容体の機能をさらに増強させるため、T細胞の共刺激因子であるCD28を同時発現させた第3世代遺伝子改変キメラ受容体を作成し、受容体の発現および細胞障害活性を解析した。発現はコントロールに比較すると低い傾向であったが、機能そのものは保たれていた。平成26年度は、この遺伝子改変NK細胞の前駆B細胞白血病細胞株に対する細胞障害活性をさらに増強させる目的で、新たな因子を加えた新規の遺伝子改変キメラ受容体の作成に取り組んだ。現在作成途中である。平成26年度は、この遺伝子改変NK細胞の前駆B細胞白血病細胞株に対する細胞障害活性をさらに増強させる目的で、新たな因子を加えた第3世代の新規遺伝子改変キメラ受容体の作成に取り組んだが、ベクター作成が上手くいかず時間を要した。平成27年度は、平成26年度で作成途中のベクターについて、新規因子のPCR配列の確認、制限酵素部位の配列確認、ligation kitの変更、形質転換に用いる大腸菌の変更など、様々な点を修正しながら新規の第3世代キメラ型受容体の作成を試みた。今後は、作成でき次第、細胞障害活性などの解析を行っていく方針である。新規受容体発現ベクターの作成に予想以上に時間を要したため。臨床に時間を割かれてしまったため。発現はコントロールと比較すると低い傾向であったが、機能そのものは保たれていた。平成27年度は、平成26年度で作成途中のベクターについて、新規因子のPCR配列の確認、制限酵素部位の配列確認、ライゲーションキットの変更、形質転換に用いる大腸菌の変更など、様々な点を修正しながら新規の第3世代キメラ型受容体の作成を試みた。

平成28年度は、上記の如く試行錯誤を重ね、目的の新規第3世代キメラ型受容体作成が完了し、遺伝子導入、受容体発現および機能発揮を確認した。第2世代と比較すると発現が低い傾向であり今後の検討課題と考えられた。既存の治療を行っても絶対的予後不良である小児再発・難治性白血病には新規治療の開発が必要である。健常ヒトprimary NK細胞における抗CD19特異的キメラ型受容体のCD19抗原結合可変部位にCD3-zeta鎖をつなぎ(第1世代)、さらに4-1BBをつなぐと(第2世代)殺細胞効果が増強することが報告されてきた。この機能をさらに増強させるため、T細胞の共刺激因子を同時発現させた第3世代遺伝子改変キメラ受容体を作成し、受容体の発現および細胞障害活性を解析した。発現はコントロールと比較すると低い傾向であったが機能は保たれていた。発現および機能向上のためのさらなる工夫が今後の課題と考えられた。新規受容体発現ベクターの作成を試みたが、これまでの制限酵素サイト(EcoRIおよびXho1)を利用した発現ベクター作成方法ではインサート挿入が成功せず、予想以上に時間を要しているため。現在のキメラ型受容体よりも細胞障害活性の強い受容体を作成する目的で、NK細胞でのアダプタープロテインであるDAP10、DAP12、FcRγを一つずつシングルシグナルとして受容体を作成し細胞障害活性、サイトカイン産生、アポプトーシス抑制の最も高い分子がどれかを検証する。この結果により最も効果の高かった因子を使用して新たな第3世代遺伝子改変キメラ型受容体を作成、その機能解析を行っていく予定である。医歯学新規受容体発現ベクターを完成させるため、primerを作成しなおす、大腸菌を新たに購入するなど、他の試薬、方法を試みていく。今後は、現在のキメラ型受容体よりも細胞障害活性の強い受容体を作成する目的で、NK細胞でのadaptor proteinであるDAP10, DAP12, FcRγ,ダブルシグナル受容体で報告のある2B4シグナルを、一つずつシングルシグナルとして受容体を作成し細胞障害活性、サイトカイン産生、アポプトーシス抑制の最も高い分子がどれかを検証する。期間前半は、臨床医としての仕事に費やす時間が多くを占めており、実験に時間を割くことが困難だったため。実験薬品が既存のもので使用可能であったため、購入予定であった試薬は既存のものを使用した。今年度必要となる機器、試薬、消耗品の購入に使用予定である。現在作成されているキメラ型受容体より細胞障害活性の強いキメラ型受容体を作成する目的で、現在候補にあげているNK細胞でのadaptor proteinであるDAP10、DAP12、FcRγ、ダブルシグナル受容体で報告のある2B4シグナルを、まずは一つずつシングルシグナルとして受容体を作成し細胞障害活性、サイトカイン産生、アポトーシス抑制の最も高い分子がどれかを検証する。この結果を踏まえてbest receptorを決定する。
「昭和三陸地震」後の生活指導実践に関する基礎的研究ー岩手県気仙郡を対象としてー

本研究は、昭和三陸地震(1933.3)後の岩手県気仙郡を対象に、津波被災地の人びとの生活現実に直面した小学校教師たちの教育活動(生活指導実践)の意義について、行政の論理/地域社会の変容/教育の論理という三つの研究視角から捉えようとするものである。具体的には、国及び岩手県行政の復興政策とそれに伴う地域社会の変容を視野に入れるべく、岩手県の行政資料及び統計資料を分析するとともに、それらの成果をふまえながら学校資料や学級文集、教師の教育記録等を検討していく。以上の研究を通じて、東日本大震災後の日本社会における「教育と福祉」の連携という課題に対して、歴史的視座からの参画を試みたい。
地域の大気・熱環境を題材とした理科学習活用型・探究型学習プログラムの開発

理科学習活用型・探究型学習プログラムの開発のために,九州地域を対象として,火山噴煙・ガスや越境大気汚染,大気環境,ヒートアイランド現象に関する基礎研究を行った.その成果を教育用の素材・教材としてデータベース構築し,インターネットを介して提供できるようにした.理科学習活用型の授業実践や簡易測定器を用いて環境放射線や大気中二酸化炭素濃度を児童生徒が実測する体験的な活動を含む探究型学習プログラム開発を行った.簡易測定器の学校現場への貸出しを行い,教諭による授業実践も行われた.児童・生徒にとって身近な地域の大気・熱環境を題材として,理科の学習で習得した知識や概念を活用しながら総合的に考察・分析し解釈して自分の考えを持って表現する理科学習活用型学習プログラムを開発することを目的として,以下の研究を実施した.簡易測定器を用いて通年で連続測定を行って得られた大気中二酸化炭素濃度データを分析して,都市域(熊本市)における大気中二酸化炭素濃度の日変化のパターン分けを行った.また,簡易測定器やGPSロガーを実際に持ち歩いて熊本市街地の大気中二酸化炭素濃度を移動測定し,場所や周囲の環境変動による濃度の変動を考察した.連続測定と移動測定の結果をもとに,小学校理科における大気中二酸化炭素濃度に関する授業案を4時間構成で作成した.PM2.5教材化のための基礎研究として,国立環境研究所の環境GISの日本全国の年平均PM2.5濃度分布(2011年度2013年度)よりPM2.5濃度の地域性を調べた.さらに各月の月平均PM2.5濃度分布と気団との関係を考察してPM2.5濃度の季節性を調べた.また,熊本市天明測定局のPM2.5時間値データを解析して越境汚染によるPM2.5高濃度パターンの教材化に適した事例を検討した.これらの結果を用いて,中学校理科の気象に関する活用型授業の授業案を作成した.なお,簡易測定器を用いて身近な微小粒子状物質濃度の測定を試みたが,小・中学校の学習での使用にはあまり適さないことがわかった.環境放射線の簡易測定器を用いて九州内を走行サーベイして得たデータを地形図と地質図上にマッピングし,県ごとの環境放射線線量マップ(PNG・pdf)をホームページに掲載した.大気汚染物質のメソスケールでの移流・拡散を教材化するための基礎研究として,阿蘇噴煙の挙動を衛星画像と地上観測映像から解析し,教材化に適した事例の有無を検討した.平成27年度の研究計画にしたがって研究を実施し,実績概要欄に記載した成果が得られた.記載事項以外についても情報収集・データベース化が進んでいる.児童・生徒にとって身近な地域の大気・熱環境を題材として,理科の学習で習得した知識や概念を活用しながら総合的に考察・分析し解釈して自分の考えを持って表現する理科学習活用型学習プログラムを開発することを目的として,以下の研究を実施した.ヒートアイランド現象の教材化のために,地球観測衛星データを用いて九州の地表面温度分布画像と植生分布画像を作成した.中・高等学校の教員や生徒が各自の関心領域について調べることができるようにするために,フリーの解析ソフトを使ってフリーの衛星データを解析する手順書を作成した.また,生徒自身が地域の気象データを用いて都市の温暖化や地域の気候変動を考えることができるようにするために,気象庁のデータを用いて気温や夏日などの長期変化を捉えるためのグラフを作成するための手順書も作成した.2016年は教材に適した顕著な黄砂イベントがなかったため,過去のイベントの解析結果を用いて越境大気汚染の教材化を行った.中学3年生を対象に,中学校第2学年の気象学習で獲得した知識や科学概念を活用して,黄砂の発生や発生源から日本までの長距離輸送を説明させる授業を行い,ワークシートやアンケートなどから実践結果を分析した.さらに,この授業を単元の導入に位置づけて,越境大気汚染について探究型の単元を構想した.メソスケールの輸送理解のための素材として,阿蘇噴煙の衛星データ解析および地上観測画像から動画を作成し,データベースを更新した.学習教材・素材用のデジタルコンテンツとして,これまでに作成してホームページ上で公開してきた動画は,パソコンでの利用を想定したものであった.しかし,最近の学校現場においては,タブレット端末の利用が多くなっているため,コンテンツなどを修正してタブレット端末利用に対応した.簡易測定機器の学校現場への貸し出しおよび教諭による授業実践が行われた.平成28年度の研究計画にしたがって研究を実施し,実績概要欄に記載した成果が得られている.児童・生徒にとって身近な地域の大気・熱環境を題材として,理科の学習で習得した知識や概念を活用しながら総合的に考察・分析し解釈して自分の考えを持って表現する理解進化型の理科学習活用型学習プログラムおよび既習事項や概念などをもとに課題解決していく探究型学習プログラムの開発を目的として,以下の研究を実施した.大学生を対象として放射線に関するアンケートを実施・分析した結果,学習経験の有無によって放射線のイメージや関心に大きな差がみられることや,大学入学までに放射線測定を経験したことがある学生は非常に少ないことがわかった.そこで,中学生が安価なγ線測定器を用いて身近な環境放射線を測定する体験的活動を取り入れた,放射線に関する学習プログラムを作成した.学習プログラムには,エネルギーの観点だけでなく,気象や防災教育の観点を取り入れることにより,理科学習の活用や総合的な考察,自分自身のこととして課題を捉えて主体的・探究的に取り組めるようにした.また,大学生の放射線測定活動の様子を観察した結果,大学生でも放射線に関する素朴概念を有していることがわかった.

そこで,それらの事項についても中学生向けの学習プログラムのなかに取り入れることにより,放射線に関する理解を深められるように工夫した.小学校における微小粒子状物質の教材化を行った.目に見えない大きさの粒子状物質を取り扱うことから,発達段階を考慮して,できるだけモデル教材を取り入れて可視化するなど,児童がイメージや実感しやすくなるよう教材や学習活動を工夫した.メソスケールの物質輸送の学習用素材・教材を提供するために,桜島二酸化硫黄ガスの高濃度事象について解析した結果や噴煙観測画像を用いて作成したデジタルコンテンツや小学校高学年以上向けの教材パンフレット,関連情報を提供するためのホームページを作成した.理科学習活用型・探究型学習プログラムの開発のために,九州地域を対象として,火山噴煙・ガスや越境大気汚染,大気環境,ヒートアイランド現象に関する基礎研究を行った.その成果を教育用の素材・教材としてデータベース構築し,インターネットを介して提供できるようにした.理科学習活用型の授業実践や簡易測定器を用いて環境放射線や大気中二酸化炭素濃度を児童生徒が実測する体験的な活動を含む探究型学習プログラム開発を行った.簡易測定器の学校現場への貸出しを行い,教諭による授業実践も行われた.大気・熱環境に関する基礎研究・データ収集および教材化・データベース補充を継続して実施する.児童・生徒の使用に適したPM2.5簡易測定器を引き続き検討する.九州のヒートアイランド現象の教材化のために,衛星データを解析して教材化する.また,中・高等学校の教員や生徒が各自の関心領域を解析できるようにするために,フリーの衛星データをフリーの解析ソフトを使って解析する手順書を作成する.越境大気汚染およびメソスケールの物質輸送の教材化のために,衛星データを用いて越境大気汚染物質や火山噴煙の可視化を行い,素材・教材のためのデータベースを作成する.環境に関する素材・教材はできるだけ新しいものを取り入れることが望ましい.新たに得られた研究成果をもとに教材化をすすめて学習プログラムの充実を図る.環境に関する素材・教材はできるだけ新しいものを使用することが望ましいため,大気・熱環境に関する基礎研究・データ収集および教材化・データベース補充を継続して実施し,活用型・探究型学習プログラムを作成する.平成28年度までに作成した理科学習活用型学習および探究型学習用の学習パッケージ(指導案,ワークシートなど)を教員研修会における演習等で試用したり,出張授業を行ったりすることで改善点を改善点を明らかにして改良し,完成させる.研究成果を広く社会・国民に発信し,学校現場で有効活用してもらうために,平成28年度までに作成したデータベースやホームページをよりわかりやすく,利用しやすくするとともに,内容を充実させる.科学教育
次世代シーケンスによリ同定された個別遺伝子変異を標的としたがんワクチンの開発

我々は、次世代シーケンスとMHCクラスI結合予測アルゴリズムを組み合わせることで、腫瘍特異的な遺伝子変異から候補固有抗原を同定するシステムを、膵がん組織を用いて構築した。また、候補固有抗原に対する免疫反応をマウス生体で検証するアッセイ法も確立した。肺がん6例(喫煙者3例と非喫煙者3例)においては、遺伝子変異(ミスセンス変異)の数は喫煙者で平均280個に対し、非喫煙者で平均75個であった。予測された候補固有抗原(エピトープ)の数は、それぞれ平均535個と140個であった。将来の個別化がん免疫治療の準備段階として、抗原同定システムを構築し、肺がんで候補固有抗原を同定することが可能であった。本研究の目的は、個々の肺がんにおける遺伝子変異に基づく固有抗原の同定と肺がんの個別化がん免疫治療の開発である。次世代シーケンスとMHC class I bindingprediction法を用いて、肺がん患者から免疫原性の強い固有抗原の同定を行う。肺がん組織のがん部と非がん部から次世代シーケンサーによりがん特異的なミスセンス変異を同定する。この変異によりつくられる変異ペプチドのアフィニティをImmune Epitope Database and Analysis Resourceを用いて計算し候補となる固有抗原を選出する。肺がんに先立ち、既に当院でがん組織のがん部と非がん部の両方がセットで入手可能であった膵がん組織計5例PK001PK005で解析した。まず、全エクソームシーケンスにより、がん部と非がん部のエクソームを比較することで1例あたり平均1028個(719-1673個)の腫瘍特異的変異を同定し、その中でコーディング領域に存在する変異を平均147個(86-299個)同定した。さらに、全RNAシーケンスのデータをもとにRNAの発現が見られるものに絞り、最終的には1例あたりミスセンス変異を平均128個(78-251個)同定した。この変異由来の変異ペプチドのMHC class Iへのアフィニティ(比較的強いと考えられるIC50<500)を指標にして、固有抗原数(HLA-A2あるいはHLA-A24拘束性のいずれか)を計算したところ、1例あたり平均53個(11-116個)となった。膵がんに続き、肺がんにおいてもがん部と非がん部が両方そろうものを5例収集しシーケンスを開始した。膵がん組織を用いて構築した固有抗原同定システムをそのまま肺がんにも応用し固有抗原を同定していく。本研究期間内に、将来個別化がん免疫治療を行っていく準備段階としての抗原同定システムを構築することができた。肺がん組織のがん部と非がん部(コントロール)からRNAシーケンスとエクソームシーケンスにより、がん特異的なミスセンス変異を同定する。この変異により新しくつくられる変異ペプチドのアフィニティをImmune Epitope Database and Analysis Resourceを用いて計算し候補となる固有抗原を選出する。肺がんに先立ち、既に当院でがん組織のがん部と非がん部(コントロール)の両方がセットで入手可能であった膵がん組織2例、PK001(HLA-A1101, 2402)とPK002(HLA-A0201, 2402)を用いて、RNAシーケンスとエクソームシーケンスによりそれぞれの患者に固有のミスセンス変異を同定した。PK001ではRNAシーケンスにより874個の塩基置換を認め、エクソームシーケンスの結果を合わせSNPsやシーケンスエラーを除くとがん特異的なミスセンス変異は6個に絞られた。この中でMHC class I bindingprediction法でHLA-A24に高いアフィニティを示すものが3個あった。同様にPK002ではRNAシーケンスにより1650個の塩基置換を認め、エクソームシーケンスの結果を合わせるとがん特異的なミスセンス変異は41個に絞られた。さらにMHC class I bindingprediction法でHLA-A2に高いアフィニティを示すものが25個あった。現在、これらの膵がんの固有抗原の候補となる変異ペプチドを合成中である。本研究の目的は、個々の肺癌における遺伝子変異に基づく固有抗原の同定と肺癌の個別化がん免疫治療の開発である。次世代シーケンスとMHC class I bindingprediction法を用いて、肺癌患者から免疫原性の強い固有抗原の同定を行う。肺癌組織の癌部と非癌部から次世代シーケンサーにより癌特異的なミスセンス変異を同定する。

この変異によりつくられる変異ペプチドのアフィニティをImmune Epitope Database and Analysis Resourceを用いて計算し候補となる固有抗原を選出する。肺癌に先立ち、当院で癌組織の癌部と非癌部のが既にそろっていた膵癌組織5例で固有抗原同定システムを構築した。全エクソームシーケンスにより、癌部と非癌部のエクソームを比較することで1例あたり平均1028個(719-1673個)の腫瘍特異的変異を同定し、その中でコーディング領域に存在する変異を平均147個(86-299個)同定した。さらに、全RNAシーケンスのデータからRNA発現が見られるものに絞り、最終的には1例あたりミスセンス変異を平均128個(78-251個)同定した。この変異由来の変異ペプチドのMHC class Iへのアフィニティ(IC50<500)を指標とし、固有抗原数(HLA-A2あるいはHLA-A24拘束性のいずれか)を計算すると、1例あたり平均53個(11-116個)となった。肺癌では、癌部と非癌部がそろう症例6例(喫煙者・非喫煙者各3例)でシーケンスを行った。これまでの報告と同様、喫煙者のミスセンス変異は平均280 (102-491),非喫煙者は平均75個(24-154個)と前者で多かった。固有抗原同定システム解析では、ミスセンス変異由来の候補となる固有抗原の数(IC50<500)は、喫煙者で平均535個(421-716)、非喫煙者で平均140個(51-212)であった。将来個別化がん免疫治療を行っていく準備段階としての抗原同定システムを構築し、肺癌6例で固有抗原の候補を同定することが可能であった。呼吸器外科学膵がん組織を用いて構築した固有抗原同定システムをそのまま肺がんにも応用し固有抗原を同定していく道筋を立てることができた。すなわち、本研究期間内に、将来個別化がん免疫治療を行っていく準備段階としての抗原同定システムを構築することができた。平成24年度は次世代シーケンスとMHC class I bindingprediction法を用いて固有抗原を同定するために、当院で既にがん組織のがん部と非がん部の両方がセットで入手可能であった膵がんの組織を用いた。この2例の膵がん組織から、RNAシーケンスとエクソームシーケンスにより、それぞれ3個と25個の固有抗原の候補を選出することができた。現在、これらの候補となる変異ペプチドを合成し、それらが実際に免疫反応を起こすか検証している。原発性肺癌においても、肺癌組織の癌組織部と非癌組織部が両方の検体を倫理委員会の承認、本人のインフォームドコンセントを取得した上で取得することができた。このような組み合わせについては既に3例集まっており、RNAシーケンスとエクソームシーケンスを開始できる状態である。次世代シーケンスとMHC class I bindingprediction法を用いて、肺がんの候補となる固有抗原を選出するが、膵がんで行なった方法をそのまま肺癌に応用するだけなので、時間はかからない。
DNA認識分子による自然免疫系の活性化及び免疫応答調節機構

最近我々が新規に同定した細胞質内DNAセンサー分子、DAI(DNA-dependent activator of IRFs)の細胞質内DNAによる活性化機構について詳細な解析を行い、DAIタンパク内の新規DNA認識ドメインやDNA依存性の自然免疫応答惹起に重要なリン酸化修飾サイトを明らかとした。またin vivoにおいてさらに詳細に生理的機能を解析するため、Dai遺伝子欠損マウスを作製した。このマウスは正常に成長し、リンパ器官における細胞群の構成も野生型マウスと比較して正常であったがDai遺伝子欠損細胞ではいくつかの抗ウイルス遺伝子のmRNA誘導が起こらないことを見出した。自然免疫系の活性化にはToll様受容体に加え,細胞質に存在する受容体(cytosolic PRRs)の存在も明らかとなり,特に病原体由来のDNA認識の仕組みについては未だよく知られていない。本研究では我々が見いだしたDNA認識による免疫応答に関与すると思われる二つの遺伝子,DNA-dependent activator of IRFs(DAI)及びその関連分子について,DAI分子がいかにしてDNAを認識し免疫系を賦活化するか,そのメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成19年度において,我々はZα,Zβドメインに加えて,新たなDNA結合ドメイン(D3)が必須であることを明らかにした。またDAIによるDNA刺激時のインターフェロン産生には,DAI分子のリン酸化が必要であることを明らかにした。このリン酸化はSer352,Ser353のセリン残基であると予想された。実際これら残基をアラニンに置換した変異体ではDAI過剰発現によるインターフェロン産生の増強効果が認められなかった。また,DAIはDNA刺激時に多量体を形成することが免疫沈降の実験から示唆され,人工的にDAIの二量体を形成させることで,DNA刺激非依存的にインターフェロンを誘導することを見出した。これらのことから,我々は以下のようなモデルを考えている。まず細胞内に取り込まれたDNAをDAIはZα,Zβ,D3ドメインを介して認識する。その後DAIはDNAを介して多量体を形成しIRF3やTBK1など,インターフェロン誘導に関与する因子をリクルートする。このモデルにおいて,DAIのリン酸化が多量体形成前,形成後どちらに起きているか,そのシーケンスは不明だが,DAIのリン酸化はIRF3,TBK1のリクルートに必要である。今後,リン酸化が実際どの残基で起きているのか,多量体形成との関係なども検討していく予定である。またZα,Zβドメインを有するADAR1ノックアウト細胞を用いた解析から,ADAR1はDNA刺激時のインターフェロン誘導を負に制御していることが明らかとなった。これらのことをまとめ,本年度論文として発表した(Wang et al)。昨年度までに、我々が新規に同定した細胞質内DNAセンサー分子、DAIついての機能解析を進め、DAIの新規DNA結合ドメインを明らかにし、DAIの多量体化による活性化についても知見を得ることことができた。最新の成果については本年度の国際学会において報告した。本年度はin vivoにおけるDAIの生理的機能を明らかとするため、Dai遺伝子を欠損したノックアウトマウスの作製を進め、これを確立するに至ったoDAI遺伝子欠損マウスは正常に成長し、リンパ器官における細胞群の構成も野生型マウスと比較して正常であった。今後はDAIノックアウトマウスより様々な免疫担当細胞群を調製し、これらの細胞を用いることでDNA刺激におけるDAIの詳細な機能解析が進むと予想される。またDAI遺伝子欠損マウスにDNAウイルスなどを用いて感染実験を行い、DAIの感染防御における役割についても検討していく予定である。またDAIのトランスジェニックマウスについても作製を進め、DAIの自己免疫疾患発症との関わりについても解析を行う予定である。一方で、最近DAI以外のDNAセンサー分子の存在も示唆する結果も得られていることから、DAI以外にも核酸認識分子シグナル経路が複数存在し、これらが協調的あるいは競合的に働くことで細胞の免疫応答における冗長性の確保や、ホメオスタシス維持などに寄与している可能性も視野に入れ、さらなる解析を進めている。自然免疫系の活性化にはToll様受容体に加え、細胞質に存在する受容体(cytosolic PRRs)が重要な役割を果たしていることが明らかとなりつつある。PRRsの中では核酸認識受容体である、RIG-I (retinoic acid-inducible gene-I)及びMDA5がRNAを認識する受容体として解析が進んでいるが、一方で、DNAを認識する仕組みについては不明なままであった。本研究では、我々が見いだしたDNA認識による免疫応答に関与すると思われる遺伝子、DNA-dependent activator of IRFs(DAI)について、DAI分子がいかにしてDNAを認識し免疫系を賦活化するか、そのメカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでに、我々はZα、Zβドメインに加えて、新たなDNA結合ドメイン(D3)が必須であることを明らかにした。またDAIによるDNA刺激時のインターフェロン産生には、DAI分子のリン酸化が必要であることを明らかにした。

また、DAIはDNA刺激時に多量体を形成することが免疫沈降の実験から示唆され、人工的にDAIの二量体を形成させることで、DNA刺激非依存的にインターフェロンを誘導することを見出している。平成21年度は、我々はDai遺伝子欠損マウスを作製し、DAI欠損細胞を用いてDNA刺激時の遺伝子誘導に与える影響、及び生体でのDAIの役割について解析を行った。その結果、DAIのDNA刺激における役割は細胞種特異的であることが判明し、DAI以外にもDNAを認識する受容体が存在することが想定された。また、マイクロアレイを用いた解析から、DAIがDNA刺激時に制御する遺伝子群を同定することができた。今後、これらの結果をふまえ、DAIのDNA刺激における役割について考察をすすめ、論文として報告するべく詳細をまとめていきたい。
過去の土地利用が生態系の炭素、養分の蓄積及び植物の養分利用に与える影響

八ヶ岳南西麓において、明治初期からの森林の土壌は全て褐色森林土で、それ以降に森林になった場所では黒色土と褐色森林土の双方が見られた。常に草原の場所はほぼ黒色土であった。黒色土では褐色森林土に比して多くの炭素蓄積があると考えられる。カラマツ生葉の窒素濃度は森林の履歴が長くなるにつれて上昇し、草地利用による収奪が終了後、土壌窒素の蓄積が進んだと考えられた。ろ紙分解試験では、老齢な林の方が草地よりは分解が早くなった。以上の結果から、草地から森林への転換は、時間に伴う土壌特性、分解特性、窒素利用パターンの変化をもたらすことが示唆された。過去の森林からの収奪の歴史及び、草地から森林への転換の生態系に及ぼす影響を解明するために、長野県と山梨県に位置する八ヶ岳南西麓(長野県茅野市、原村、富士見町)を対象にして、明治以降の植生および土地利用の変化を把握することを試みた。対象地域の陸地測量部および国土地理院作成の旧版地形図、空中写真および古写真を収集した。旧版地形図ごとに地形図上に記載された地図記号を読み取り、地理情報システム(GIS)化して植生と土地利用に関する基礎的な時系列データを作成した。旧版地形図から読み取った情報の精度を確認するため、旧版地形図が測量された年と近い時期に撮影された空中写真と古写真、GIS化した地図との比較を行った。対象地域には、明治から第二次世界大戦直後にかけて継続して荒れ地(採草地や牧草地も含む)として利用されていた場所が多かった。現在、対象地域はカラマツを主体とする針葉樹林となっているが、針葉樹林化が進んだのは第二次世界大戦後であることが確認できた。空中写真および古写真では荒れ地として見える場所が、旧版地形図では針葉樹林として記載される場所があった。植林直後の幼齢林では樹高が低く、開放的な空間となっているため、写真では荒れ地のように見えてしまう可能性が考えられた。陸地測量部作成の地形図に記載されている大樹と小樹を示す地図記号を確認するか、森林簿などの記載との比較などを行い、植生の復元精度を高める必要がある。今後は、GIS化した時系列データから植生および土地利用の変化をパターン化し、パターン毎に自然科学的調査を行う地点を決める予定である。昨年度GIS化した地図および、空中写真と古写真、江戸、明治期の古文書、絵地図を基に、対象地域内の土地利用の異なる地点を抽出した。調査地域の土地利用は大まかに以下の4つの区分に分けることができ、それぞれ以下のように調査地を設定した。1)明治初期に森林が成立していた4サイト、2)明治から昭和初期に森林が成立した4サイト、3)昭和初期から第2次大戦以降に森林が成立した4サイト、4)常に草地として維持されてきた5サイト。各地点において、30mX 30mのコドラートを設置した(但し、4)のうちの3サイトは10m X 90m)。各サイト内にランダムに5ポイントを選び、寒冷紗で作った袋内にろ紙(advantec toyo No.2,直径110mm,0.75-0.80g)を1枚づつ封入したものを2個づつ設置した。ろ紙1枚の乾燥重量は、それぞれ異なるので、72時間60°Cで風乾した後、重量を測定し、番号付けすることで重量変化を測定する。6ヶ月後、12ヶ月後に各ポイントより1個づつこれらを回収して各地点のセルロース分解能を測定する予定である。また、各地点の、土壌物理、化学性、炭素及び養分量を測定するために、土壌の採取を開始した。上記の結果に次年度行う植生の調査をあわせることにより、土地利用によって生じたと考えられる土壌、及び植物の養分利用への影響を考察する。過去の森林からの収奪の歴史及び、草地から森林への転換の生態系に及ぼす影響を解明するために、長野県と山梨県に位置する八ヶ岳南西麓を対象にして、明治以降の植生および土地利用の変化を把握することを目的とした研究を行った。対象地域の地形図、空中写真および古写真を元データとして、地理情報システム(GIS)化して植生と土地利用に関する時系列データを作成した。その結果以下の4つの区分が可能であった。

1)明治初期に既に森林が成立(4地点)、2)明治から昭和初期に森林が成立した(4地点)、3)昭和初期から第2次大戦以降に森林が成立した(4地点)、4)常に草地として維持されてきた(5地点)。上記4区分において、土壌断面調査、林冠木および林床植生調査、ろ紙分解試験、カラマツ生葉の窒素濃度の分析(区分13のみ)を行った。区分1では黒色土はみられず、全て褐色森林土と区分された。一方、区分2では場所によって異なり、黒色土と褐色森林土の双方が見られた。区分3、4は、ほとんど黒色土であった。黒色土では褐色森林土に比して多くの炭素蓄積があると考えられる。利用履歴の違いは、上層木の種組成・断面積合計等には影響を与えているとはいえないものの、カラマツ生葉の窒素濃度は森林の履歴が長くなるにつれて上昇した。これは草地利用による収奪が終了後、土壌中での窒素プールの蓄積が進んだ結果と考えられた。セルロース分解能の違いを調べるために設置したろ紙を回収した所、設置後1、2年目ともに老齢な林の方が草地よりは分解が早くなる傾向があった。一方、明治以降成立した森林では草地と同程度の分解しか示さない場合もあり、これは、下刈り、間伐などにより林床植生が薄くなったためと思われる。以上の結果から、同調査地における草地から森林への転換は、森林化への時間に伴う土壌特性、分解特性、窒素利用パターンの変化をもたらすことが示唆された。過去の森林からの収奪の歴史及び、草地から森林への転換の生態系に及ぼす影響を解明するために、長野県と山梨県に位置する八ヶ岳南西麓を対象にして、明治以降の植生および土地利用の変化を把握することを目的とした研究を行っている。4つの区分の17サイトで、植生調査および土壌調査を行った。4つの区分は以下の通りである。1)明治初期に森林が成立していた4サイト、2)明治から昭和初期に森林が成立した4サイト、3)昭和初期から第2次大戦以降に森林が成立した4サイト、4)常に草地として維持されてきた5サイト。各地点において、30m X 30mのコドラートを設置した(但し、区分4のうちの3サイトは10m X 90 m)。林冠木植生調査では、各コドラート内の樹種を判別し、直径、樹髙を計測した。また林床植生バイオマスの測定のでは、サイト内5ポイントで、面積0.5m2の円形の枠内の植物を刈り取り、要素ごとに重量を測定した。土壌調査では、各サイト2箇所(区分4の1サイトでは1箇所のみ)で断面調査(深さ40-100cmまで、サイトごとに異なる)を行った。現在、森林である場所で黒色土が出てきた場合、地表付近よりも1030cm程度の深さの所が著しく黒い傾向が認められ、当該地点での過去の草地利用の履歴を示唆していた。セルロース分解能の違いを調べるために昨年設置したろ紙を回収した所、老齢な林の方が草地よりは分解が早くなる傾向があった。当初計画通り、さまざまな土地利用遍歴を持つプロットの設定が完了し、分解速度測定用のろ紙が設置された。また、先行研究の一部成果も発表されつつある。25年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度を前に、土地利用の履歴の異なるサイトを設定し、植生、土壌の現地調査を終え、試料を採集した。リターバッグ試験は一年目を終えた。当初の計画通り進捗している。
経営のグローバル化における連結業績評価システム導入に関する実態調査研究

経営のグローバル化が進展する中で、トップ・マネジメントや製品別事業部長がワールドワイドな事業経営を行なう上で不可欠になってきたのが国内事業と海外事業を製品事業部別に連結ベースで捉える業績評価システムであるが、本調査研究は、日本企業の親会社についての実態調査を実施することによって、連結業績評価システムの実態や問題点に加え、連結経営や連結事業部制など、導入の背景について明らかにした。具体的には、東洋経済の調査による売上高・純利益についての連結ベースと単独ベースの差の大きい企業上位50社リストに基づいて、両項目で上位20位に入る7社のうち4社、どちらかの項目で50位以内にあり連結経営企業として取り上げられることの多い企業7社、合計11社が選定され、聞き取りによるフィールド・サーベイが実施された。11社の業種別内訳は、繊維1社、窯業1社、電機5社、自動車・同部品3社、精密機器1社である。聴取内容は、連結業績評価シスデムを中心に、グループ経営や事業部門への分権など連結経営に係わる経営方針、カンパニー制などの事業組織、国内外の関係会社経営管理など組織運営に係わる問題、グループ内人材登用など、広く連結業績評価システム導入の背景・関連と考えられることに渡っている.ヒアリング対象は各企業とも総括的な経営貰任者もしくは全般的な経営管理業務部門の長で、ケースによって管理会計・システム担当者のヒアリングを合わせて行なっている。本年度は,第一に企業団体、シンクタンク、コンサルティング会社などが集積している連結経営、連結業績評価システムに関する事例・資料の調査・収集を計った。この面で実際に連結業績評価システムの導入事例や導入企業数などのヒアリング成果があったのはコンサルティング会社で、日本企業においても製品事業戦略を連結ベースで考えようとする動きが確認できた。これに反して、企業団体における連結経営、連結業績評価システム問題への取り組みはまだ端緒についたばかりで、専門委員会を組織しての検討が始まった段階であると言える。グローバリゼーションへの対応はコーポレート・ガバナンス問題から始まり、次いで国際会計基準問題が取り上げられている。シンクタンクにおける取り組みの本格的なものは多くなく、いくつかの調査レポートの収集に止まった。第二に、平行して来年度の本格調査における調査項目の設定、調査対象企業の決定を目的に、受け入れ可能企業の打診および予備訪問調査を実施した。予備訪問調査の対象企業としては製品多角化度の高い企業、製品多角化度の低い企業、新しくカンパニー制を導入する企業などを選択した。製品多角化度の低い企業においては連結業績評価システムのニーズは低いものの、海外事業に関して地域別損益把握の強化が指摘された。製品多角化度の高い企業の場合においても、事業部制採用の歴史は古いものの事業部別損益計算書の作成に止まっており、97年に社長直轄の連結プロジェクトチームができてから事業部別貸借対照表の作成まで行なうシステムに改めたというケースがあった。次年度の本調査においては製造業を中心に、一部非製造業を含めて対象企業を選択し、連結業績評価システム導入の経緯、海外事業管理との関連、システムの具体的内容、人事評価との関連などについてヒアリングを行なう。本年度は、前年度に実施した予備調査及び受け入れ可能企業調査に基づいて調査対象企業を選定し、連結業績評価システムに関する具体的なヒアリング調査を行なった。具体的には、東洋経済の調査による売上高・純利益についての連結ベースと単独ベースの差の大きい企業上位50社リストに基づいて、両項目で上位20位に入る7社のうち4社、どちらかの項目で50位以内にあり連結経営企業として取り上げられることの多い企業7社、合計11社を選定した。11社は全て製造業で、業種別内訳は、繊維1社、窯業1社、電機5社、自動車・同部品3社、精密機器1社である。調査は聞き取りによるフィールド・サーベイで、設定した質問項目は連結業績評価システムを中心に、グループ経営や事業部門への分権など連結経営に係わる経営方針、カンパニー制などの事業組織、国内外の関係会社経営管理など組織運営に係わる問題、グループ内人材登用など、広く連結業績評価システム導入の背景・関連と考えられることに渡っている。ヒアリングの相手は各企業とも総括的な経営責任者もしくは全般的な経営管理業務部門の長で、ケースによって管理会計・システム担当者のヒアリングを合わせて行なっている。

他方、ヒアリング調査と平行して、連結経営、連結事業部制、連結業績評価システムに関連する各社の事例に関する調査報告書などの資料収集を行なった。経営誌の特集、大学紀要の掲載論文、シンクタンクのレポート掲載論文、シンクタンクによる調査報告書などである。これらの調査結果・資料の整理・分析は今後も継続して行ない、連結業績評価システム導入の経緯、背景を含めて取りまとめを行なう。
角膜上皮細胞の特異機能におけるエピジェネティック制御および機能的RNAの関与

角膜上皮細胞は角膜組織の無血管性等の特異的な機能に大きく関与していると考えられている。今回この角膜上皮細胞における機能的RNA、特にmiRNAの発現について検討した。また多くのコーディングRNAのゲノムレベルでの制御にゲノムメチル化が関与していることが報告されているが、角膜上皮細胞特異的マーカーであるケラチン12遺伝子のゲノムメチル化状態についても検討した。結果として角膜上皮細胞のセルラインではmiR-21がもっとも多く発現していることが明らかとなった。また正常角膜上皮細胞と比較するとHCE-T細胞では約7倍ほどmiR-21の発現が亢進していることが明らかとなった。またmiR-21をノックダウンすると若干ながらHCE-Tの細胞増殖が低下することがわかった。さらに阻害剤をもちいてHCE-TにおけるmiR-21の発現がPI3Kおよびp38のシグナルによって負に制御されていることがわかった。またリポーターアッセイによってHCE-TにおけるmiR-21の発現制御を検討したところ、HCE-T細胞の定常状態におけるmiR-21の転写活性はpri-miR-21の転写開始点上流800塩基から1000の間の領域で正に制御され、0から+500塩基の領域によって負に制御されていることがわかった。レーザーマイクロキャプチャーを用いて角膜上皮の各領域からゲノムDNA10ngを採取して角膜上皮細胞において最も特異的に発現している分子であるケラチン12遺伝子のゲノムメチル化状態を検討した。結果として、輪部基底のケラチン12陰性の角膜上皮ではケラチン12遺伝子のメチル化率は高いことが明らかとなった。角膜上皮細胞の特異機能におけるエピジェネティック制御および機能的RNAの関与について以下の検討を加えた。まずbisulfited genomic DNAが増幅できるかどうかについてであるが、様々な反応条件を検討したもののレーザーマイクロキャプチャーで得られるナノグラム程度のサンプルに対応することは困難であった。そこでなるべく多くのサンプルを集めるようにしたところ、限られた領域ではあるがケラチン12遺伝子プロモーターの解析が可能であった。その結果角膜輪部基底細胞のケラチン12遺伝子のゲノムメチル化率は高い事がわかり、角膜上皮細胞がステムセルから分化する過程で脱メチル化が生じていることが示唆された。次にmiRNAの角膜上皮細胞における生理機能を調べるためmiRNAのクローニングを行った。角膜上皮細胞の不死化細胞を培養してtotal RNAを抽出し、miRNAのフラクションを得た。逆転写したのちPCRで増幅してプラスミドに組み込み大腸菌に形質転換した。得られたコロニーのシーケンス解析を行い、配列をさらに解析して既に登録されているmiRNAとの比較を行ったところ、角膜上皮細胞ではmiR-21が圧倒的に優位に発現していることがわかった。miRNAはアポトーシスを阻害して細胞増殖を促進するとの報告があるため、様々な阻害剤を用いてmiR-21の上流シグナルを調べたところ、WortmanineとLY294002にてmiR-21の発現が抑制された。このことからmiR-21はPI3K-Aktのシグナルによって抑制的に制御されていることが示唆された。またmiR-21のプロモーター領域に対しルシフェラーゼアッセイを行ったところ、転写開始点の上流800塩基までは全く活性がなかったが、800塩基から1000塩基の間で転写活性が見られ、このあたりに転写調節因子の結合配列があるのではないかと推察された。今年度は昨年度にHCE-T細胞で圧倒的に発現量が多いことが判明したmiR-21についてゲノムコピー数が変化していないかを検討した。まずHCE-T細胞ゲノムを抽出し、市販のヒトゲノムDNAをリファレンスとしてarray-CGHにてゲノムコピー数の変動を調べた。

結果としてmiR-21遺伝子が存在している17q23.1領域ではゲノムコピー数の増幅は生じていないことがわかり、HCE-T細胞におけるmiR-21遺伝子発現量が多いことについては内因性の何らかのメカニズムが関与しているのではないかと想定された。またmiR-21の発現量を調節するシグナル経路についても昨年の検討をさらに拡大させて行なった。結果として昨年と同様miR-21はPI3K-Aktのシグナル経路で抑制されていることが明確となった。既報ではmiR-21はアポトーシスを阻害して細胞増殖を促進するとされており、PI3K-Akt経路は一般的に細胞生存・細胞増殖・オンコジェネシスに関連しているとされていることから、今回の我々の結果は既報と相反する。想定される可能性として、miR-21の機能は細胞種依存的であり、HCE-T細胞では既報のようなアポトーシス抑制・細胞増殖促進に関与していないのかも知れない。またmiR-21のアンチセンスRNAを用いてmiR-21発現を抑制させたが、HCE-T細胞の細胞増殖能に変化は見られなかった。miR-21のHCE-T細胞における機能については上述の抑制実験でも特に明瞭な変化を得られていないため、同定は困難であると考えられた。