hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
母体経鼻免疫における仔マウスにおける免疫学的メモリーの研究

母体経鼻免疫由来の仔マウスでは血清中抗PspA特異的IgG抗体が上昇することから母体経鼻免疫により仔マウスへの免疫移行は確認された。さらに、PspA母体経鼻免疫を行なった母マウスから出生した母体免疫由来仔マウスでは、出生後にPspAの追加免疫を行なうことで良好な抗PspA特異的IgG抗体の再上昇が認められるとともに、これらのPspAを追加免疫された母体免疫由来仔マウスでは肺炎球菌の腹腔内感染後の生存率が有意に高いことが認められた。また、母体免疫母マウスの血清中にはIL-17が有意に上昇していること、母体免疫由来仔マウスの脾臓リンパ球にはIL-17産生細胞が含まれることから、母体経鼻免疫後に得られた新生児マウスにおいて誘導された抗肺炎球菌特異的免疫応答が成熟後にも観察され長期的な免疫学的メモリーを有することが確認された。さらに、母体免疫母マウスにグリーンマウスを用いることで、母体免疫由来仔マウスでは母体免疫母マウス由来の免疫担当細胞が移行する可能性が示唆された。肺炎球菌表面蛋白抗原PspAを用いた母体経鼻免疫による仔マウスへの免疫誘導のメカニズムと免疫学的記憶についての検討を行った。とりわけ、(1)母体経鼻免疫による駒薄野の肺炎球菌に対する特異的免疫応答の記憶と、(2)母乳栄養を介した新生児マウスへの肺炎球菌特異的免疫応答の変化について検討した。(1)雌マウス(BALB/c、4週齢)を1週間に2回、計6回の経鼻免疫を行った。第14免疫はコレラトキシンBをアジュバントとして用い、第56免疫はPspA単独で行った。免疫後に雄マウスと交配し約3週間後に新生児マウスを得た。新生児マウスを6週齢まで哺乳飼育した後にPspAにより再度刺激を行ない、免疫応答の変化について血清中抗PspA特異的IgG抗体価の変化を検討した。母体経鼻免疫母マウス由来の新生児マウスでは、6週齢ではすでに1週齢で認められた抗PspA特異的IgG抗体価は測定感度以下に低下していたが、PspA単独にて再刺激することで2週例より抗PspA特異的IgG抗体の上昇を認め、3週齢では有意に高い抗PspA特異的IgG抗体価をみとめた。(2)肺炎球菌表面蛋白抗原PspAにて免疫後雄マウスと交配し、約3週間後に新生児マウスを得る。同時期に出産するように非免疫雌マウスを設定し、免疫母乳栄養マウス:PspA経鼻免疫母マウスが自分の出産した仔マウスを育てる群、非免疫母乳栄養マウス:PspA経鼻免疫母マウスが非免疫母マウスが出産した仔マウスを育てる群を作成した。新生児マウスの血清中抗PspA特異的抗体価は、免疫母乳マウスでは3週齢までで有意に上昇した。これらの結果から、母体経鼻免疫では母乳を介して新生児マウスに免疫応答が移行し、仔マウスでの免疫学的な記憶が誘導されることが判明した。肺炎球菌表面蛋白抗原PspAを用いた母体経鼻免疫による仔マウスへの肺炎球菌に対する特異的免疫応答の記憶と、母乳栄養を介した特異的免疫応答の誘導について検討した。母体経鼻免疫母マウスより生まれた仔マウスでは、6週齢でPspAにより再度刺激を行なった結果、抗PspA特異的IgG抗体の再上昇を認めた。また、免疫母乳栄養を受けた仔マウスでは、抗PspA特異的IgG抗体は3週齢において有意に上昇した。
感圧ゴムセンサを利用した人の感性解析

自動車運転者の注視動作に伴う覚醒特性を眼球運動と頭部挙動に基づいて評価し、覚醒度の低下に伴って眼球の可動範囲が狭小化し、覚醒回復のためのまばたき回数が著しく増加すること等を明示した。同時に、筋肉の弛緩に伴う頭部の前方傾斜傾向も明示した。人の疲労と立位姿勢制御感覚を、感圧センサにより足底圧力を測定して評価した。特に、下肢のスクワット運動による筋疲労では、足底圧力の周期特性が喪失し、姿勢制御機能の低下が見られること等を明示した。人の恐怖感覚、特に階段昇降に伴う恐怖感覚を足底圧力と大腿直筋・二頭筋、ヒラメ筋の表面筋電位を測定した。急傾斜の階段下降時に最も恐怖感を抱くと共に踵の接地時間が短くなり、下肢の各関節角度変化を大きくして下降姿勢のバランスに極めて留意する傾向を明示した。快適感の中でも特に、各種運動靴の履き心地と車椅子の乗り心地を評価した。例えば、テニスシューズを着用した制止立位状態では、前足部の圧迫感が最も支配的であり、歩行時には足部の微小な動きが脳の圧迫感覚を減少させると共に最も快適感を意識させること等を明示した。一方、車椅子の乗り心地感覚を着座圧力分布と着座姿勢を利用して評価した。座面圧力が快適感に対する最重要因子であり、特に座骨結節部周辺の圧力分散が快適感の向上に効果的であることなどを明示した。人の動作制御感覚を解明する研究の一環としてスポーツ、特にテニスプレーでのボールコントロールとラケットの握り、上肢・下肢の使用方法および体幹の動き等の関連性を解析した。フラット時のフォアハンドストロークでは、グリップ圧力と各関節角度を共にコントロールしてラケット面を維持する感覚を有することやラケットを強く握ろうとして手首を硬直化する感覚によってトップスピンを行うこと等を明示した。人間にとって最も我慢し難い感覚感性の一つである眠気を詳細且つ総合的に研究した。特に,悲惨な交通事故の原因の一つである居眠り現象を力学的環境を測定することによって解明出来ることを示した。人が感ずる眠気の特性パターンを先づ明示するために本科研費により購入したロガーマスタおよびシグナルプロセッサを感圧ゴムセンサと組み合わせて力の測定に基づく感性解析システムを開発した。このシステムが十分な測定能力を有していることを確認した後,車両運転時の居眠り現象解明のため適用した。予め睡眠時間を制限した被験者の手掌部に感圧ゴムセンサを貼り着け,被験者の運転時の状況と覚醒度の低下を確認するために被験者の前方顔面映像と上肢後方からの映像をそれぞれ2台の8mmビデオ・カメラで記録した。同時に,停止・直進する自動車で被験者のハンドルを握る力の変化パターンと覚醒状態から居眠り状態への移行の関連性を測定した。比較のために一定の経路を一定走行する場合の上記パターン解析をも行った。右利きの被験者の場合,左手人指し指と中指に最も大きな感性表現があり,利き手側の右手中指は他の4指に比べて最も大きな反応を示すが左手側のそれと比べて半分以下の反応を示した。これらを含めて得られた測定結果より,運転者が居眠り状態に移行する場合,眠気が襲って来るとともに筋肉の瞬間時な弛緩により手掌部の握力に基づく測定圧力は一端低下する。次いで,瞬間的に意識を正常状態に戻そうとして握りを強くし,危険を意識するが,更に眠気が強くなって同様な繰り返しを行う。この後,睡魔に負けてハンドルを握る力が急激に低下するとともに居眠り状態に陥入ってしまう明白なパターンが存在することを明らかにした。

前年度に引き続いて自動車の居眠り運転に起因する交通事故の防止等への応用を目的とする人の覚醒度低下に伴って生ずる力学的および生理学的変化を測定・解析を行った。前年度の研究では、感圧ゴムセンサのみを利用した手掌圧力測定システムを利用していたが、本年度では、本科学研究費により購入した生体電気信号用アンプシステムを併用した総合的な測定手法により、脳波および筋電の生体信号による生理学的基礎データを含む測定を行った。その結果、脳波および筋電のみによる覚醒度低下状態の把握は困難であるが感圧ゴムセンサーによる指先の力学的変化を総合することにより微妙な覚醒度変化が把握できることを明示した。本年度のもう一つの研究目的として、ヒューマンエラーおよび労働災害・事故の防止に関連する作業労働従事者の作業形態と作業負担量の適正化を取り上げた。ここでは特に、作業労働従事者の生体疲労を力学的環境の変化として測定・解析するために、組立ラインでの作業労働に伴う疲労感覚特性を対象とした。比較的重量のある部品の組立ラインでの作業を模式的に再現した作業条件を設定し、立位運搬・組付け作業時の疲労感覚特性に深く関係していると思われる手掌圧力および足底圧力を測定するために感圧ゴムセンサーを手袋および靴の中敷きに取り付けて測定した。時間経過に伴う生体の疲労と手掌および足底圧力変化を解析し、一定時間の組立ラインを想定した流れ作業の中でも運搬組付け作業においては、生体の疲労が進行すると下肢の疲労をカバーするようになると共に上肢の作業負担量が次第に大きくなる傾向が認められた。また、下肢の疲労に起因して一定の姿勢保持が困難になり、体幹制御の不安定性が生じることを足底圧力変化特性パターンにより明示した。自動車運転者の注視動作に伴う覚醒特性を眼球運動と頭部挙動に基づいて評価し、覚醒度の低下に伴って眼球の可動範囲が狭小化し、覚醒回復のためのまばたき回数が著しく増加すること等を明示した。同時に、筋肉の弛緩に伴う頭部の前方傾斜傾向も明示した。人の疲労と立位姿勢制御感覚を、感圧センサにより足底圧力を測定して評価した。特に、下肢のスクワット運動による筋疲労では、足底圧力の周期特性が喪失し、姿勢制御機能に低下傾向が見られること等を明示した。人の恐怖感覚、特に階段昇降に伴う恐怖感覚を足底圧力と大腿直筋・二頭筋、ヒラメ筋の表面筋電位を測定した。急傾斜の階段下降時に最も恐怖感を抱くと共に踵の接地時間が短くなり、下肢の各関節角度変化を大きくして下降姿勢のバランスに極めて留意する傾向を明示した。快適感の中でも特に、各種運動靴の履き心地と車椅子の乗り心地を評価した。例えば、テニスシューズを着用した静止立位状態では、前足部の圧迫感が最も支配的であり、歩行時には足部の微少な動きが脳の圧迫感覚を減少させると共に最も快適感を意識させること等を明示した。一方、車椅子の乗り心地感覚を着座圧力分布と着座姿勢を利用して評価した。座面圧力が快適感に対する最重要因子であり、特に座骨結節部周辺の圧力分散が快適感の向上に効果的であることなどを明示した。人の動作制御感覚を解明する研究の一環としてスポーツ、特にテニスプレーでのボールコントロールとラケットの握り、上肢・下肢の使用方法および体幹の動き等の関連性を解析した。フラット時のフォアハンドストロークでは、グリップ圧力と各関節角度を共にコントロールしてラケット面を維持する感覚を有することやラケットを強く握ろうとして手首を硬直化する感覚によってトップスピンを行うこと等を明示した。
生物活性糖鎖迅速合成プロセスの開発

糖鎖は著しい構造多様性を持っており、その機能の解明において合成化学的な切り口が推進力として機能するためには合成手法の迅速化が重要である。糖鎖の合成は多段階にならざるを得ないが、その殆どのステップにおいてクロマトグラフィーによる分離精製操作が必要になりこれが合成の迅速化を妨げている。これを踏まえて、本研究はより実践的な糖鎖迅速合成法の確立に向け、1)精製操作を必要としない糖鎖液相合成、2)糖鎖伸長反応(グリコシル化)のハイスループット最適化法、の2点について検討を行なう予定で開始した。1)については以下の成果を得た。無精製合成プロセスを実現するために、i)ろ過、分液操作等の後処理で副生物を除去できるチオグリコシドまたはグリコシルフルオリド活性化系を用いる、ii)一時的保護基として選択的な脱保護が可能揮発性の副生物を与えるものを用いる、iii)最終段階で、本研究室で開発したCapture-release法による糖鎖の釣り上げを行う、iv)あらかじめ還元末端に導入した置換基の疎水性を利用して選別を行う、という4つの方策を組み合わせることを検討した。その結果、揮発性保護基としてはペンタフルオロプロピオニル基、t-ブチルジメチルシリル基が有効であることを見いだし、最終段階でのCapture-release法による糖鎖の釣り上げができることも確認した。2)に関しては、重水素ラベルした保護基を導入した糖ブロックを合成し、これらを用いたグリコシル化反応の結果(収率、選択性)をMALDI-TOF-MSとNMRにより評価できることを見いだした。
サイクリックGMP関連遺伝子導入による実験的肺高血圧治療

ANP遺伝子をセンダイウイルスエンベロップ(大阪大学金田教授)に組み込み、経気管的に肺に導入した。遺伝子導入3日後に肺組織のANPに対するPCRを行い遺伝子導入の成否を確認した。一回の実験で14匹のラットにANP遺伝子を組み込み、3匹の肺について、PCRを行い、少なくとも一匹にはANPの発現が認められた場合に、この14匹について遺伝子導入が成功していると判断し、残りの5匹をコントロールとし、6匹を低酸素(0.5気圧、10%酸素)に暴露した。ANPの発現が認められなかった肺の部分にはANP遺伝子が到達できず、PCR用の検体部分でANPが認められなかったということである。一方、PCRで3匹ともANP発現が認められなかった場合、ベクターに問題があったと判断し、この実験群は遺伝子導入不成功と判断した。遺伝子導入が成功していると判断された実験群のうち、PCRに供しなかった残り11匹のラットを低酸素暴露群とコントロール群に分けた。低酸素暴露として、0.5気圧(10%酸素)に10日間暴露した。低酸素暴露により、平均肺動脈圧は18mmHgから37mmHgに上昇した。ANP遺伝子導入群では、肺動脈圧の上昇が30mmgに有意に抑制されていた。直径100200μmの小筋性動脈の中膜の外径に対する割合は、正常ラット2.5%から低酸素暴露で3.5%に上昇したが、低酸素暴露ANP遺伝子導入ラットでは2.6%に有意に抑制されていた。まとめると、ANP遺伝子導入ラットでは、慢性低酸素暴露による肺高血圧と肺高血圧血管病変の発生が抑制された。本年度、ラット肺への遺伝子導入法を確立した。肺への効率よい遺伝子導入法を見出すため、ラット肺動脈、上大静脈、気管内にレポーター遺伝子としてβ-Gal reportergeneを組み込んだHVJ-envelope vectorを注入投与しtransfectさせ肺組織のβ-Gal reporterの免疫染色を行い、肺へのtransgene expressionの特異性を検討した。ラットにペントバルビタール麻酔下で肺動脈カテーテル、中心静脈カテーテル、または気管内チューブを挿入しベクターの投与経路とした。肺における、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肺胞上皮細胞、線維芽細胞、などの構成細胞のいずれもβ-Gal reporter遺伝子が導入された。投与法が最も簡便なのは、経気道投与であるので、ANP遺伝子のプラスミドを組み込んだHVJ envelope vectorの投与経路を気道にすることにした。cGMP上昇は肺血管平滑筋細胞増殖を抑制する作用があり、cGMPは治療上の標的となりうる。本研究の最終目的は、cGMPを上昇させる生体内活性物質である心房ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の肺血管への遺伝子導入を行うことによりcGMP上昇を介し肺高血圧血管病変の発生抑制を試みることである。本年度、第一段階として、経肺動脈、経中心静脈、経気道的にレポーター遺伝子を組み込んだベクターにより、いずれの経路でも肺組織への遺伝子導入が可能であることが判明した。

遺伝子導入が成功していると判断された実験群のうち、PCRに供しなかった残り11匹のラットを低酸素暴露群とコントロール群に分けた。低酸素暴露孝して、0.5気圧(10%酸素)に10日間暴露した。低酸素暴露により、平均肺動脈圧は18mmHgから37mmHgに上昇した。ANP遺伝子導入群では、肺動脈圧の上昇が30mmgに有意に抑制されていた。直径100200μmの小筋性動脈の中膜の外径に対する割合は、正常ラット2.5%から低酸素暴露で3.5%に上昇したが、低酸素暴露ANP遺伝子導入ラットでは2.6%に有意に抑制されていた。まとめると、ANP遺伝子導入ラットでは、慢性低酸素暴露による肺高血圧と肺高血圧血管病変の発生が抑制された。
水素処理による微細粒チタン合金の超塑性加工法による歯科補綴物の試作と評価

歯科補綴物の一つであるメタルフレームの作製方法には様々な問題が存在する。例えば、鋳造法であれば表面酸化や内部欠陥の問題が挙げられる。そこで本研究では、それらの諸問題を解決するために水素処理(水素吸蔵ー溶体化・マルテンサイト化ー熱間圧延ー脱水素)によって結晶粒を微細組織化した微細粒Ti-6Al-4V合金を用いた超塑性加工法を提案し、メタルフレームの試作を行った。その結果、適切な温度及び加工圧力、保持時間を与えることで、メタルフレームの輪郭を形成させることができ、超塑性加工法によるメタルフレームの作製が可能であることを示すことができた。昨年度、寸法の比較的大きな供試材(Ti-6Al-4V合金)への水素処理(水素吸蔵ー溶体化・マルテンサイト化ー熱間圧延ー脱水素)の適用及びその処理によって得られた微細粒チタン合金の超塑性特性の把握は完了した。また、超塑性加工の予備試験において、メタルフレームの試作を行った結果、メタルフレームの頭頂部を含めた大まかな輪郭を形成させることができた。よって本年度は超塑性加工によるメタルフレームのさらなる精度向上を目指し、板厚、加工温度、加工圧力、保持時間を変化させて最適超塑性加工条件を探索した。その結果、板厚を0.70mmと若干薄くし、かつ最適加工温度及び圧力、保持時間にて超塑性加工を行うことで、外見上、優れたメタルフレームを作製することができた。また、鋳造法で作製したメタルフレームとは異なり、表側の表面酸化は見受けられなかった。試作したメタルフレームの断面板厚を測定したところ、板厚は辺縁部と頭頂部で0.20.6mmとやや不均一であった。以上のことより、板厚の均一性については若干の課題を残したが、水素処理による微細粒チタン合金を用いた超塑性加工法による歯科補綴物(メタルフレーム)の作製可能性を示すことができた。また、鋳造法によるメタルフレームは板厚が23mmと厚いが、超塑性加工による製作であれば、その板厚は0.5mm程度で済み、このことは健康な歯をできるだけ残した状態で疾患を治癒させることが可能になるものと考えられる。本年度は、従来の研究で行ったことがない大型の供試材(α+β型Ti-6Al-4V合金、サイズ:25×40×50mm)に水素処理(水素吸蔵ー溶体化・マルテンサイト化ー熱間圧延ー脱水素)を適用させて微細組織化した後、この材料の超塑性特性を調べた。そして超塑性加工による歯科補綴物の試作を行った。まず、大型供試材への水素処理の適用のために最適水素吸蔵量を求めた。水素吸蔵量の異なる2種類の試料(0.5wt.%、0.4wt.%)を準備し、これらに溶体化・マルテンサイト化、熱間圧延、脱水素処理を行った。また、熱間圧延は従来の一方向圧延では超塑性加工の後、リジングの発生が懸念されるので、本実験では一方向及びクロス圧延の2通りを実施したものを準備した。そして超塑性伸びに及ぼす水素吸蔵量及び圧延方式(一方向、クロス)の影響を調べた結果、水素吸蔵量を従来の最適量である0.5wt.%から0.4%へと低下させたクロス圧延材の超塑性伸びは、一方向圧延材とほぼ同等の値を示した。次に一方向圧延材及びクロス圧延材の変形応力に及ぼす初期ひずみ速度の影響を調べた結果、水素吸蔵量0.4wt.%のクロス圧延材は一方向圧延材と比較して同等、もしくはやや低い良好な値を示し、水素吸蔵量を下げることによって超塑性特性の向上が見受けられた。このことより、大型の供試材への水素処理の適用が可能であり、さらにこの材料は歯科補綴物作製のための充分な超塑性特性を有していることがわかった。超塑性加工によるメタルフレームの試作を、加工温度:1123K、圧力:1.5MPa、保持時間:10.8ksにて、水素吸蔵量0.4wt.%のクロス圧延材を用いて行った結果、頭頂部を含めた大まかな輪郭を形成させることができた。今後、さらなる最適な加工条件の探索によって精度の高い歯科補綴物が可能であると考えられる。本年度の研究目的は(1)大型供試材への水素処理の適用(2)水素処理材の超塑性特性の把握(3)超塑性加工法による歯科補綴物(メタルフレーム)の試作であった。(1)と(2)については、水素吸蔵量を従来の最適吸蔵量であった0.5wt.%から0.4wt.%に低下させることで、超塑性特性の改善が見受けられるなど、大型供試材への水素処理の適用条件は把握できたと考えている。

また、従来、水素処理の第3工程の熱間圧延は一方向圧延だったが、これをクロス圧延に変更しても超塑性特性はほぼ同等であるなど、大型水素処理材の超塑性の基本特性は把握できたと考えている。(3)については、超塑性加工によってメタルフレームの輪郭が形成されるなど、製造工程の確立の可能性を示すことは出来た。大型供試材への水素処理の適用及び水素処理によって得られた材料の超塑性特性の把握は完了したので、今後は最適超塑性加工条件の把握を行っていく。超塑性加工の条件である加工用薄板の厚さ、加工温度、加工圧力、保持時間が超塑性加工の可否を決めるパラメータなので、加工後の試作品を観察しながら最適条件を探索していく。その後、超塑性加工による試作品(メタルフレーム)の成形型との適合性の他、機械的性質、金属組織の変化、不純物の進入状態を把握する。適合性については、成形型と試作品を密着させ、その隙間を光学顕微鏡で調べる予定にしている。機械的性質については、マイクロビッカース硬度計を使用して加工前後の強度変化を調べ、金属組織の変化については、光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察し、結晶粒径やボイドの存在状況を把握する。不純物の侵入状態については電子線マイクロアナライザーで酸素などの分布状況を調べる予定にしている。以上の調査によって従来の方法(鋳造法)で作製したクラウンおよびメタルフレームと比較し、超塑性加工によるクラウンおよびメタルフレームの優位性を明確にしていく。次年度に使用する予定の研究費が発生したのは、超塑性加工による歯科補綴物の試作が僅かな回数しかできなかったことにある。本年度は超塑性加工法の最適条件の把握を行うために数多くの試作を行う予定であり、そのためには多くのアルゴンガス及び水素ガスと供試材(チタン合金)が必要となってくる。また、超塑性加工の最適条件が把握した後は、この試作品の優位性を示すために、金属組織観察や機械試験等を行っていくが、金属組織観察用試料作製のための研磨腐食設備や透過型電子顕微鏡といった装置は所有していないので、外部に依頼する必要がある。
介護老人福祉施設の看取りケアを遺族が評価する評価尺度の開発

日本人の約75%は病院で死亡しているが、近年老人ホームでの死亡が増加傾向にある。質の高い看取りケアを提供するためにがん患者の遺族を対象とした評価尺度は開発されているが、老人ホームの入所者の遺族を対象としたものはない。そのため、本研究では特別養護老人ホームで望ましい看取りを実現するために、遺族による看取りケア評価尺度を作成し信頼性と妥当性を検討することを目的とした。43項目の質問項目を作成し、郵送法による質問紙調査を実施した。427人を分析対象とし、項目分析、探索的因子分析、基準関連妥当性の検討、信頼性係数の算出により、信頼性と妥当性を検証した。本研究の目的は、介護老人福祉施設内で亡くなった入所者のご遺族が、施設が行った看取りケアを評価する尺度を開発することである。ご遺族から評価を受けることで介護老人福祉施設が行う看取りケアの質の向上が期待できる、と考えている。平成23年と平成24年に挑戦的萌芽研究の助成を受けて介護老人福祉施設内で看取りを行った遺族に対して、看取りケアについてどのようなケアを良かったと感じたか、反対に嫌だったと感じたかについて、看取り介護加算を取得している3つの施設で18ケースにインタビューを行った。本年度はインタビューを質的に分析した結果と分析結果から作成した質問項目について、内容妥当性と信頼性を検討するためにインタビューを実施した施設の医師、看護師、介護スタッフ、生活指導員などの専門家に意見を伺った。その後、質問項目を45項目作成し先にインタビューを実施した18ケースのご遺族にパイロットスタディを実施した。その結果、削除すべき項目が2項目、追加すべき項目が1項目、意味がわかりにくいため文章の修正が必要な項目が6項目となり、最終的に質問項目は43項目となった。平成26年1月に全国の介護老人福祉施設のうち看取り介護加算を取得し、かつ入所者定員が50人以上の施設を抽出し、約6割の2,005施設を対象に調査協力依頼を行った。その結果協力施設は176施設(8.8%)で、528人のご遺族に質問紙を配布していただいたが返送があったのは300人(56.8%)であった。分析に必要な数が不足しているため、今後は施設数を拡大して、看取り介護加算を取得し、かつ入所定員50人以上の施設すべてに協力依頼を行う予定である。全国の介護老人福祉施設のうち平成25年10月の時点で看取り介護加算を取得しかつ入所者定員が50人以上の施設は3,342施設のうち、平成23年と24年の遺族インタビューで協力依頼した3つの介護老人福祉施設を除いた約6割の2,005施設に対して平成25年度末に質問紙調査の協力依頼を行った。協力が得られた施設は145施設(8.8%)で、平成23年と24年の遺族インタビューを分析した結果から作成した看取りの時期のケアを評価する43項目の質問紙を435人の遺族に配布をしたが、分析に必要な数が不足していた。そこで、平成26年度は、残りの1,334施設にも協力依頼を行った。その結果31施設(2.3%)から協力が得られ58人に質問紙を配布した。協力が得られた施設は3,339施設中176施設(5.3%)、合計493人の遺族に質問紙を配布し487人(98.8%)から回答を得た。分析は427人を対象とした(有効回答86.6%)。調査対象者である遺族の年齢は26歳98歳、約半数の対象者が自宅介護を経験していた。死亡する時は必ずそばについていたいと考えていたのは85.2%、夜間などの場合はついていなくてもよいと考えていたのは9.1%であった。入所者の死亡時の年齢は64109歳で、死亡した介護老人福祉施設で2312ヶ月(中央値42ヶ月)生活していた。死亡までの1ヶ月間に胃ろうや経管栄養を受けていた入所者は約1割、死亡の数日前まで意思を伝えることができた入所者は約4割であった。対象者が平日の日中に医師がいつもいたと回答したのは14.8%、夜間に看護師がいつもいたと回答したのは48.7%であった。死亡する1ヶ月前のケアを想起してもらい10点満点で評価してもらった結果、9.2±1.14点と高く43項目中20項目で天井効果がみられた。今後は尺度開発に必要なそのほかの分析を実施する予定である。本研究は介護老人福祉施設での看取りケアを遺族が評価するスケール(遺族評価スケール)を開発することを目的としている。全国の介護老人福祉施設のうち平成25年10月の時点で看取り介護加算を取得し、かつ入所者定員が50人以上の施設である3,339施設中、協力が得られた176施設(5.3%)、493人の遺族に、平成23年と24年に実施した遺族インタビューから得られた結果をもとに作成した43項目の遺族評価スケールを配布し487人(98.8%)から回答を得た。除外基準を参考に405人を分析対象とした。遺族評価スケールで看取りケアの全体的満足度を10点満点で評価してもらった結果、平均点は9.2±1.14点であった。

基準関連妥当性のために測定したFamily Perception on Care Scale(FPCS、25項目、7ポイントリッカートスケール)で平均値が高かった項目は、「職員は私(遺族)が家族のそばにいることを歓迎してくれた」、「職員は私に対して親切だった」、「家族(入所者)が過ごしたフロアは適切だった」であった。反対に平均値が低かった項目は、「家族が話ができるように誰かがそばにいた」、「職員は死に関する儀式や作法についてたずねてくれた」であった。FPCSの25項目を合計した平均値は175点中142.9±24.0点で、43項目の遺族評価スケールの全体的満足度との相関係数はr=0.568で、相関が確認された。一方FPCSは、全体的な満足度をのぞいた24項目中13項目で天井効果が確認され、それらを除外した11項目で探索的因子分析を行った。その結果、「入所者と家族に対するケア」と「葬儀に関する事項」の2因子となり、FPCSオリジナルとは異なった結果となった。したがって、カナダで開発されたFPCSに手を加えることなく日本に導入するのは難しいことが確認された。平成27年度は作成した43項目の遺族評価スケールを分析し、質問項目を見直したのち、再度質問紙調査を実施する予定であった。しかし、遺族評価スケールの43項目のうち20項目に天井効果がみられた。Family Perception on Care Scaleの分析結果とあわせて、遺族評価スケールで天井効果がみられた20の質問項目の取捨について、介護老人福祉施設で看取りケアを実施している専門家の意見を聞き、質問項目の精査をするために予想以上に時間を要した。その結果、計画通りに実施できなかった。本研究は介護老人福祉施設での看取りケアを遺族が評価する尺度を開発することを目的とした。全国の介護老人福祉施設のうち平成25年10月の時点で「看取り介護加算」を取得し、かつ入所者定員が50人以上の施設3,335施設に協力依頼を行い、遺族を対象に質問紙調査を実施した。平成23年と24年に実施した遺族インタビューから得た結果をもとに43項目5段階評定法の質問紙を作成した。176施設(5.3%)の協力が得られ、493人の遺族に質問紙を配布、487人(98.8%)から回答を得た。今年度は43項目の項目分析後に探索的因子分析を行った。分析対象者数は427人、項目間相関r≧0.7の組合せはなく、I-T相関分析ではr<0.2は14項目にみとめられた。I-T相関分析結果のr>0.2の29項目で主因子法、プロマックス回転でスクリープロットを用いて因子負荷量0.4未満であるものを削除しながら探索的因子分析を行った。その結果、19項目3因子構造からなる尺度となった。第1因子(8項目)は、「入所者の意識がなくなっても、職員は意識があるように声をかけてくれていた」、「床ずれができないようにしてくれた」、「亡くなった時の表情は安らかだった」などの【入所者への丁寧で安楽なケア】、第2因子(6項目)は「私は亡くなる日が近いことを知っていた」、「職員は私が入所者の側で十分時間を過ごすことができるように面会や宿泊について配慮をしてくれた」などの【家族への臨終に向けたケア】、第3因子(5項目)は、「好きな音楽をかけることや好きな食べ物を食べるなど入所者が喜ぶことをしてくれた」、「職員は入所者がなにをしたいか聞いてくれた」などの【入所者の希望にそうケア】であった。信頼性係数(Cronbach α)は全体で0.941、第1因子0.911、第2因子0.858、第3因子0.855であり、概ね内的妥当性が確認できた。日本人の約75%は病院で死亡しているが、近年老人ホームでの死亡が増加傾向にある。質の高い看取りケアを提供するためにがん患者の遺族を対象とした評価尺度は開発されているが、老人ホームの入所者の遺族を対象としたものはない。
細胞外マトリックスを用いた、ヒルシュスプルング病に対する内科的治療法への挑戦

腸管神経堤由来細胞(以下ENCC)が可視化されたトランスジェニックマウスとエンドセリンBレセプター欠損マウスを交配し、新しいヒルシュスプルング病(H病)モデルマウスを作製し、H病モデルの胎仔腸管におけるENCC先進部でのラミニンの発現がコントロールと比べ変化していることを示した。また、ENCCのmigrationをライブイメージング法にて観察し、3D/4D画像解析ソフトを行い、H病マウスにおけるENCC先進部において、個々のENCCの移動速度はコントロールに比べ低下するものの、方向性に差はみとめられないことを示した。さらに、細胞培養を施行し細胞レベルでのH病マウスのENCCの動態研究を行った。SOX10-VENUS Tg (ヘテロ接合:+/-)マウスとH病モデルマウスEDNRB(ヘテロ接合:+/-)の交配を行い、SOX10-VENUS(+)/ EDNRB(-/-)マウスを作製し、HDモデルとした。また、SOX10-VENUS(+)/ EDNRB(+/+)マウスをコントロールとして使用し、H病腸管におけるラミニンの発現と分布の解析、コントロールとの比較検討を行った。胎生13.5日と胎生16.5日の腸管各部位(中腸、近位後腸、遠位後腸)における腸管神経堤由来細胞の移動(以下ENCC migration)の評価及びラミニン-1の発現をHDとコントロールとで比較した。ENCCのmigrationの先進部は、コントロールでは、胎生13.5日には遠位後腸に到達しているのに対し、HD腸管ではまだ中腸にとどまっていた。胎生16.5日になると、コントロールではすでにENCCは腸管遠位端まで到達していたが、HDでは、まだ遠位後腸にあった。部位別(中腸、近位後腸、遠位後腸)におけるラミニン-1の発現は、胎生13.5日では、全ての部位においてHD群でコントロールに比べ高く発現していた。両群とも、13.5日のENCC先進部にて高く発現しておりその後ENCCの支配が完了すると発現が低下する、という同一の傾向がみられた。しかしながら、胎生16.5日になっても無神経節腸管であるHDの遠位後腸においては、ラミニン-1の発現が高いままであった。すなわち、通常は、ラミニン-1の発現が上昇がENCCのmigrationに先行し、神経支配後にはその発現が低下すること、ENCCのmigrationが停止するHDでは、無神経節腸管でラミニン-1の発現が高いままとなっていることが示された。以上の結果より、ENCC migirationは時間的空間的なラミニン-1の発現の変化に制御されており、HDではそれが変化していることにより、無神経節腸管となることが示唆された。今回我々は、ENCCが蛍光標識されたトランスジェニックマウス(Sox10-Venus Tg)と、エンドセリンレセプターB(Ednrb)欠損マウスを交配し作製された、ENCCが可視化できるHDモデルマウス(Sox10-Venus+/Ednrb-/-)における、ENCC先進部の動態を蛍光ライブイメージング法にて観察し、その速度と方向性の解析を行った。胎生15.5日齢のSox10-Venus+/Ednrb-/-のマウスと胎生12.5日齢のコントロールマウスの後腸を実体顕微鏡下で摘出した。培養環境下で、共焦点レーザー顕微鏡(LSM)を用いた蛍光ライブイメージング法にて360分間リアルタイムに観察した。腸管の長軸をY軸とし、高精細3D/4D画像解析ソフトを用いて、先進部における個々のENCCをX,Y,Z座標上にてトラッキングし、解析した。コントロール腸管における平均移動速度は248.29マイクロm/hであったのに対し、HD腸管では72.87マイクロm/hと著明に低下していた。しかし、Y移動距離/XZ移動距離、すなわち、短軸方向に対する肛門側への移動の割合は、2群間で有意差はみられなかった。HDマウスの後腸におけるENCC先進部の移動速度は、コントロールに比べ著明に低下するものの、その方向性に有意な差は認められなかった。H病腸管における、ラミニンの神経発達促進効果の検討を行うにあたり、それに先立ち、神経発達効果を評価するための方法として、腸管神経堤細胞の、方向性を含めたより詳細な動態の情報を得るため、従来の2次元解析ではなく、3D4D解析ソフトを用いて、コントロール腸管とH病腸管とを比較した。(研究計画B-1,2,3をまず、コントロール腸管とH病腸管で検討を行った。)したがって、本年度中に、本法を用いてH病腸管における、ラミニンの効果を検討するまでは至らなかったが、より詳細な情報が得られる本法を確立することにより、次年度より、本法を用いてH病腸管におけるラミニンの効果を検討することが可能となった。前年度までの研究にて、我々は、ヒルシュスプルング病(H病)マウスモデルの胎仔腸管(後腸)の器官培養を行い、タイムラプスイメージングにて得られた画像を高精細3D4D解析ソフトにて解析し、H病モデルマウスにおける腸管神経堤由来細胞の動態を、3次元で評価した。本年度は、器官培養に加え細胞培養を施行し、細胞レベルでの、H病モデルマウスにおける腸管神経堤由来細胞の動態の研究を行った。

胎生13.5と15.5日のSox10-Venus+/Ednrb-/-マウス(H病モデル)及びSox10-Venus+/Ednrb+/+マウス(コントロール)から胎仔腸管(後腸)を採取し、Venus陽性の腸管神経堤由来細胞のみをFACS(fluorescence-activated cell sorting)を用いて遊離し、7日間培養した。SOX10-VENUS陽性細胞は、ニューロスフェアを形成していたが、H病群のニューロスフェアの細胞数はコントロールに比べ、有意に減少しており、細胞増殖が妨げられていることが示された。また、GFAPの発現はH病群で有意に亢進しており、グリアへの分化が亢進していることが示唆された。一方、ニューロンのマーカーであるPGP9.5の発現2群で差がなかった。以上より、H病では、腸管神経堤由来細胞の、グリアへの分化が亢進し、増殖が妨げられており、分化・増殖の不均衡が生ずることにより、正常な腸管神経系の構築が妨げられている可能性が示唆された。腸管神経堤由来細胞(以下ENCC)が可視化されたトランスジェニックマウスとエンドセリンBレセプター欠損マウスを交配し、新しいヒルシュスプルング病(H病)モデルマウスを作製し、H病モデルの胎仔腸管におけるENCC先進部でのラミニンの発現がコントロールと比べ変化していることを示した。また、ENCCのmigrationをライブイメージング法にて観察し、3D/4D画像解析ソフトを行い、H病マウスにおけるENCC先進部において、個々のENCCの移動速度はコントロールに比べ低下するものの、方向性に差はみとめられないことを示した。さらに、細胞培養を施行し細胞レベルでのH病マウスのENCCの動態研究を行った。新しいヒルシュスプルング病モデル作製が順調に進み、動物の確保が安定してきたため、初年度に計画していた、病気モデルにおける、各発達段階でのラミニンの発現を評価することが可能であった。またその研究発表も行った。ラミニンの発現の評価に関しては、in situ hybridizationのセットアップに時間を要しているため、今年度は免疫染色での評価のみにとどまってはいるが、おおむね計画通りに実験が進んでいるといえる。本実験で使用したSOX10-VENUS Tgマウスは、1胎生期から成体まで2生きたまま3明るい蛍光シグナルで4免疫染色などの病理組織学的手技を加えずに神経堤細胞が観察できる、という4つの大きな利点を持っている。H病モデルマウスをかけあわせることにより、H病における神経ネットワークの形成及び無神経節部腸管の発生過程をライブイメージングで観察することが可能である。その培養液にラミニンを加えることで、生きたまま、H病腸管における、ラミニンの効果を可視化することができる。さらに、この実験系が確立されれば、これまでH病との関連を示唆されてきた、他の細胞外マトリックスや細胞増殖因子に関しても、比較的容易にその効果を次々と試すことができるという、実験系としての将来性も秘めている。一方、ENCCの動態は、ライブセルイメージング法により徐々に解明されつつあるが、多くは2次元解析であり、より詳細な動態を得るには限界があった。
睡眠時無呼吸症と高血圧症の関連 : 脳幹部神経回路とメカニズム

Dr. LungはオーストラリアNew South Wales大学で2008年に生化学・分子遺伝学の分野で学位を取得後、シドニーのMacquarie大学においてProf. Paul M Pilowskyの指導下にポスドク研究を展開し、脳幹部神経回路における自律神経中枢の研究に携わった。睡眠時閉塞性無呼吸症において高頻度に発症する高血圧症に興味を持ち、血圧を調整する脳幹部位と脳幹部の呼吸中枢との関連を明らかにすることを考えた。特に、心臓血管制御中枢である吻側腹外側延髄RVLMとノルアドレナリンA5 groupに注目し、これらの部位と呼吸中枢とを結ぶ神経回路に興味をもった。そこで、京都大学・医学研究科・高次脳形態学で独自に開発した様々な技術を用い、形態学的な検索を中心に上記にかかわる神経回路を明らかにするために、今回、留学して上記教室でこれらの神経回路を研究・解析することを計画した。(1)呼吸中枢から、交感神経を制御しているニューロン(プレ交感神経ニューロン)群への投射を調べる:そのためには、既に研究室で開発済みの、軸索を可視化するウイルストレーサー(膜移行性シグナルのついたGFPあるいはmRFPを発現するSindbisvirus、lentivirus、AAV)を用いて、高感度に神経連絡を検索する実験を進めた。(2)急性間欠性低酸素状態(睡眠時無呼吸症のモデル)を負荷して、反応するニューロンをc-Fos免疫活性で検出し、上記の実験系と組み合わせて、睡眠時無呼吸症から高血圧症への病態発生機序を探る研究:低酸素状態を実現できるセットアップを整え、c-fos mappinngを進めた。(抄録なし)Dr.LungはオーストラリアNew South Wales大学で2008年に生化学・分子遺伝学の分野で学位を取得後、シドニーのMacquarie大学においてProf.Paul M Pilowskyの指導下にポスドク研究を展開し、脳幹部神経回路における自律神経中枢の研究に携わった。そこで、京都大学・医学研究科・高次脳形態学で開発したウィルストレーサーによる神経回路解析ツールなどを用いて、形態学的な検索を中心に上記にかかわる神経回路を明らかにするために、今回、留学して上記教室でこれらの神経回路を研究・解析することを計画した。(2)急性間欠性低酸素状態(睡眠時無呼吸症のモデル)を:負荷して、反応するニューロンをc-Fos免疫活性で検出し、上記の実験系と組み合わせて、睡眠時無呼吸症から高血圧症への病態発生機序を探る研究:この部分に関しては低酸素状態を実現できるセットアップを整えた。Dr.LungはオーストラリアNew South Wales大学で2008年に生化学・分子遺伝学の分野で学位を取得後、シドニーのMacquarie大学においてProf. Paul M Pilowskyの指導下にポスドク研究を展開し、脳幹部神経回路における自律神経中枢の研究に携わった。そこで、京都大学・医学研究科・高次脳形態学で開発したウィルストレーサーによる神経回路解析ツールなどを用いて、形態学的な検索を中心に上記にかかわる神経回路を研究・解析することを試みた。(1)まず呼吸中枢から、交感神経を制御しているニューロン(プレ交感神経ニューロン)群への投射を調べる:軸索を可視化するウィルストレーサー(膜移行性シグナルのついたGFPあるいはmRFPを発現するvirus vector)を用いて、高感度に神経連絡を検索を試みた。そのためにadenoassociated virus(AAV)のサブタイプ2/1,2/2,2/5を試みたが、カテコラミンニューロンのマーカーデあるチロシン水酸化酵素TH陽性細胞への感染効率は悪く、陰性ニューロンへの感染が目立った。さらに、アドレナリン作動性ニューロンマーカーであるPNMTpromoter下でGFPもしくはRFPを発現するウイルスを作ったが、良い結果を得られなかった。(2)急性間欠性低酸素状態(睡眠時無呼吸症のモデル)を負荷して、反応するニューロンをc-Fos免疫活性で検出し、上記の実験系と組み合わせて、睡眠時無呼吸症から高血圧症への病態発生機序を探る研究:この部分に関しては低酸素状態を実現できるセットアップを用いて、低酸素に反応してc_fos陽性になるニューロンの分布を脳幹で検討する実験を行った。現在、PMT,VIAAT(GABAergic marker),VGluT(glutamatergic marker)等のin situ hybridizationと組み合わせて、どのようなニューロンが低酸素に反応するのか検索している。

そこで、京都大学・医学研究科・高次脳形態学で独自に開発した様々な技術を用い、形態学的な検索を中心に上記にかかわる神経回路を明らかにするために、今回、留学して上記教室でこれらの神経回路を研究・解析することを計画した。(1)呼吸中枢から、交感神経を制御しているニューロン(プレ交感神経ニューロン)群への投射を調べる:そのためには、既に研究室で開発済みの、軸索を可視化するウイルストレーサー(膜移行性シグナルのついたGFPあるいはmRFPを発現するSindbisvirus、lentivirus、AAV)を用いて、高感度に神経連絡を検索する実験を進めた。(2)急性間欠性低酸素状態(睡眠時無呼吸症のモデル)を負荷して、反応するニューロンをc-Fos免疫活性で検出し、上記の実験系と組み合わせて、睡眠時無呼吸症から高血圧症への病態発生機序を探る研究:低酸素状態を実現できるセットアップを整え、c-fos mappinngを進めた。来日して半年余りなので、顕著な研究成果が出ている状態ではない。しかし、実験準備等は整いつつあり、概ね順調に進展していると考える。(1)のvirus vectorを用いた実験では成功できずに、結果が得られなかったことが遅れの原因として大きい。本人が主体的に実験できているので、このまま見守っていく方針である。もちろん、必要な援助・アドバイスは適宜与えることを予定している。あと半年を切った研究期間しか残されていないので、これまで以上に(2)の急性間欠性低酸素負荷実験に集中して、研究結果を出してもらうように指導する。帰国前には学内の神経科学セミナーで成果発表の講演を予定している。(抄録なし)
チオレドキシンを高発現する骨髄間質細胞を用いた劇症肝炎・肝不全治療

目的:劇症肝炎・肝不全に対する治療は従来の血漿交換などの保存的治療から肝移植へと移行している。しかし、ドナー不足の問題により移植治療には限界がある。移植に替わる次世代の治療として細胞療法が開発されつつある。本研究では、肝障害に対する骨髄間質細胞の治療効果を検討するとともに、抗酸化作用、抗アポトーシス作用をもつチオレドキシンをex vivoにて遣伝子導入した骨髄間質細胞を細胞移植することにより劇症肝炎・肝不全に対する治療効果を検討することを目的とする。方法:肝炎モデルの作成、TRX高発現の骨髄間質細胞の培養と細胞療法結果:1)チオアセトアミドによる劇症肝炎モデル作成TAA100mg/kgi.p.投与にて24時間後に劇症肝炎を認めた。2)TRX高発現の骨髄間質細胞の培養3)劇症肝炎モデルにTRX高発現骨髄間質細胞を投与PBSコントロール群と比較して、WTマウスからの骨髄間質細胞を投与した群では肝炎マーカーのALTが上昇した。TRX高発現骨髄間質細胞はWTの細胞とほぼ同等のALTであり、コントロールよりも改善傾向は認めなかった。4)慢性肝線維化・肝硬変への細胞療法ラットにTAAを長期投与6週間すると、肝線維化を認めた。そこに骨髄間質細胞を投与すると、肝線維化の改善傾向を認めた。結論:急性肝炎モデルには骨髄間質細胞はむしろ悪化傾向を示した。しかし、肝線維化モデルには改善傾向を示し、今後の検討が必要である。Embryonic stem cellはさまざまな種類の細胞に分化しうると期待されているが、倫辺土の問題、奇形腫形成などいまだ問題は多い。そこで注目されているのが、bone marrow-derivedmesenchymal stem cell(骨髄由来間質系幹細胞)である。しかし、肝疾患治療への応用については知見が乏しい。そこで、本研究では、肝障害に対する骨髄間質細胞の治療効果を検討するとともに、抗酸化作用、抗アポトーシス作用をもつチオレドキシンをex vivoにて遺伝子導入した骨肋間質細胞を細胞移植することにより劇症肝炎・肝不全に対する治療効果を検討することを目的とする。方法:1)肝炎モデル作成2)骨肋間質細胞の培養条件設定3)TRX高発現の骨髄由来間質系幹細胞による細胞療法結果:1)急性モデルはチオアセトアミド(TAA)を100mg/kg投与にて劇症肝炎を認め、慢性モデルはチオアセトアミドを50mg/kg反復投与することにより、肝線維化を認めた。急性肝炎モデル、および慢性肝炎・肝硬変モデルヘの骨髄間質細胞の治療効果を検討している。
１４－３－３　εａ　を介したホヤ脊索管形成機構の解析

昨年度までに14-3-3 εaクライアントタンパク質として三種類同定したが,これらをノックダウンしたところ,ホヤ脊索管形成阻害しなかったことから,これらは脊索管形成に関与しないことがわかった.そこで,ヒトにおいて14-3-3タンパク質と直接結合し(Chen et al., 2014),またホヤにおいて脊索細胞に強く発現,脊索管形成に実際に関与していることが知られているEzrin/Radixin/Moesin (Dong et al., 2011)に着目した.大腸菌より精製したホヤの14-3-3 εaとERMはin vitroで直接結合し,免疫染色では脊索細胞の収縮環において共局在することを見出した.しかし,UTKO1を処理した個体では,in vitroの直接結合を阻害し,脊索細胞における共局在もキャンセルした.この収縮環における14-3-3 εaとERMの局在がどのように脊索管形成を誘導するのかさらに検証するため,ホヤ脊索細胞特異的なBrachyury promoterから蛍光タグした14-3-3 εaおよびERMを発現させて挙動を調べたところ,収縮環から管腔に向けて周期的に移動していることを見出した.さらにこの時細胞質全体も同時に収縮環から管腔に向かって流動を引き起こしていることを見出した.しかしながら,UTKO1を処理した個体や,14-3-3 εaおよびERMをノックダウンした個体では,そのような流動は見られなかった.これらのことから,収縮管における14-3-3 εa及びERMの相互作用が収縮環から管腔に至る細胞質流動を誘導し,これがホヤの脊索管形成に貢献していることが示唆された.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究はケミカルバイオロジーの手法でカタユウレイボヤの発生の分子機構を解明する.これまでに申請者らは細胞遊走阻害剤UTKO1がホヤの脊索管形成を特異的に阻害することを見出していた.UTKO1は14-3-3εaを標的とすることをこれまでに見出していたため,本研究では14-3-3 εaがホヤ脊索管形成の分子機構にどのように関与しているのかUTKO1を用いて更なる検証を行うことを研究の目的とした.14-3-3はアダプタータンパク質として多様なクライアントタンパク質と相互作用することでさまざまな生命現象を引き起こす.平成28年度ではホヤにおける,この14-3-3クライアントタンパク質を同定し,その機能を解析することにした.大腸菌より精製したGSTあるいはHis融合型の14-3-3 εaをホヤの可溶化液と混合し,GSHあるいはNiビーズを用いて結合タンパク質をプルダウンした結果,14-3-3 εaクライアントタンパク質を4つ見出した.ホヤにおける遺伝子の機能解析は従来モルフォリノオリゴによるノックダウンが主であったが,近年これに代わる新たなloss of functionの実験法としてCRISPR/Cas9やTALEN法によるノックアウト法が報告された.そこでまずCRISPR/Cas9法を試みたところ,多様なターゲット部位においていずれもゲノム変異効率が低かったため,次にTALEN法を試みた.TALEN法は変異効率こそ十分であったものの毒性が強く,ホヤの脊索管形成を正しく評価することができなかった.今後は従来通りモルフォリノオリゴを用いて14-3-3 εaクライアントタンパク質の機能解析を行う.平成28年度は14-3-3 εaのクライアントタンパク質を4つ見出した.当初の予定ではこれらがUTKO1によって14-3-3との結合が阻害されるか調べることにしていたが,それほど数は多くないのでノックアウト法による脊索管形成への関与を調べる方が早いと考えられた.したがって平成29年度の内容を一部本年度に繰り上げ,CRISPR/Cas9法やTALEN法を試みた.しかしながら,CRISPR/Cas9法はCas9ヌクレアーゼ活性が低い,またTALEN法は毒性が強い等の理由から,いずれもホヤの脊索管形成の表現型を評価するのには適していないことが示唆された.昨年度までに14-3-3 εaクライアントタンパク質として三種類同定したが,これらをノックダウンしたところ,ホヤ脊索管形成阻害しなかったことから,これらは脊索管形成に関与しないことがわかった.そこで,ヒトにおいて14-3-3タンパク質と直接結合し(Chen et al., 2014),またホヤにおいて脊索細胞に強く発現,脊索管形成に実際に関与していることが知られているEzrin/Radixin/Moesin (Dong et al., 2011)に着目した.大腸菌より精製したホヤの14-3-3 εaとERMはin vitroで直接結合し,免疫染色では脊索細胞の収縮環において共局在することを見出した.しかし,UTKO1を処理した個体では,in vitroの直接結合を阻害し,脊索細胞における共局在もキャンセルした.この収縮環における14-3-3 εaとERMの局在がどのように脊索管形成を誘導するのかさらに検証するため,ホヤ脊索細胞特異的なBrachyury promoterから蛍光タグした14-3-3 εaおよびERMを発現させて挙動を調べたところ,収縮環から管腔に向けて周期的に移動していることを見出した.さらにこの時細胞質全体も同時に収縮環から管腔に向かって流動を引き起こしていることを見出した.しかしながら,UTKO1を処理した個体や,14-3-3 εaおよびERMをノックダウンした個体では,そのような流動は見られなかった.

これらのことから,収縮管における14-3-3 εa及びERMの相互作用が収縮環から管腔に至る細胞質流動を誘導し,これがホヤの脊索管形成に貢献していることが示唆された.平成29年度は上記4つの遺伝子がホヤ脊索管形成に関与しているのかモルフォリノオリゴを用いて検証する.またこれらの遺伝子をクローニングし,大腸菌よりGSTあるいはHis, MBP融合タンパク質として精製し,14-3-3 εaとの直接相互作用,およびUTKO1による結合阻害を検証する.またこれらの遺伝子をGFP. mCheerry融合タンパク質としてホヤ脊索細胞特異的に発現させライブイメージングによりこれらの挙動を観察する.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。