hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分裂制御キナーゼの分子連携とその調節異常による腫瘍形成機構

Auroraキナーゼは進化上高度に保存されている普遍的な分裂期キナーゼである。本研究は、詳細が不明であったAurora-Aの生理機能について調べ、ヒトの細胞分裂のメカニズムに迫ることを主題とした。本年度は、昨年度までに同定したAurora-Aの会合分子について、引き続き、それらの相互作用の解析を行った。さらに、最終年度として、これまでの結果を論文発表することも目標とした。以下に、本年度の成果を要約する。リン酸化部位認識特異抗体を用いることにより、Aurora-Aの活性化がG2後期の中心体において始まることを見出した。そこで、RNAi法を用いてAurora-Aの発現を抑制したところ、HeLa細胞はG2期で停止し分裂期への進入が著しく損なわれた。細胞分裂の開始に際しCyclinB1-Cdk1の活性化が中心的な役割を持つと考えられ、その最初の活性化は中心体で起こるが、我々はG2期後期においてAurora-Aが中心体で活性化することが、つづくCyclinB1-Cdk1の活性化に必要であることを示した。(2)AjubaはAurora-Aの自己リン酸化による酵素活性化を誘導する:Aurora-Aの会合分子としてヒトAjubaを同定した(GenBank Acc.No.AY169959)。Ajubaは3つのLIMドメインをもつタンパク質であり、LIM2およびLIM3を介してAurora-Aと結合することを見出した。分裂期においてAurora-AはAjubaと結合することで自己リン酸化を引き起こし、活性化することが明らかになった。AjubaはG2後期の中心体におけるAurora-Aの活性化を誘導する必須の調節因子であることが分かった。無秩序の細胞増殖を示す悪性腫瘍は、ゲノムの不安定性がみられ、細胞分裂期に何らかの異常を伴うと考えられるが、依然その分子背景は乏しい。われわれは種を超えて普遍的に存在するAurora-Aキナーゼに焦点を絞り、Aurora-Aのヒト細胞における役割を明らかにすることで、細胞分裂のメカニズムを解き明かし、さらに、その調節異常によって誘導されるゲノム安定性との関連を調べることを目的として本プロジェクトを開始した。昨年度までに、ツー・ハイブリッド法によるAurora-Aの会合分子の網羅的検索を行った。その結果、キネトコア構成たんぱくであるCENP-Aを同定し、両蛋白の相互作用をin vitroの実験等により示した。本年度は、引き続きAurora-AによるCENP-Aリン酸化の意義についてさらに詳細に解析し、それらを論文発表することを目標に研究を進めた。以下に本年度の成果を要約する。1)ヒト細胞に対して短鎖RNA干渉法によるAurora-Aの発現抑制を行い、CENP-Aのリン酸化状態を検討した結果、確かにin vivoでAurora-AがCENP-ASer7をリン酸化することが分かった。さらにこのリン酸化は、分裂前期はAurora-Aが、前中期はAurora-Bが、それぞれ連続的に担当していることを見出した。2)CENP-A Ser7のリン酸化はキネトコアと紡錘糸の接続に必要であったが、スピンドルチェックポイントシグナルを発信するというキネトコアの機能に関与していなかった。3)CENP-A Ser7のリン酸化を受けない細胞をタイムラプス顕微鏡で観察すると、染色体が不均等分配されるにもかかわらず、細胞は分裂することが分かり、このリン酸化が細胞の染色体安定性を保証するために必須の修飾であることが示された。
ヒト腫瘍におけるミトコンドリア呼吸鎖複合体遺伝子の機能異常の検索と分子機構の解明

大腸癌52例、胃癌59例の手術材料および培養細胞株7種(HCT116、HT29、DLD-1、LoVo、SW48、SW620、MKN1)を対象に、核ゲノム内のミトコンドリア複合体II遺伝子SDHDの解析を行い以下の結果を得た。1.点突然変異はいずれの症例、細胞株でも検出されなかった。2.遺伝子欠失(LOH)は大腸癌の14%、胃癌の13%で検出された。3.mRNA発現量の低下は79%の大腸癌で検出された(ただし完全消失はない)。4.5'上流プロモータ領域のCpG配列のメチル化はいずれの症例、細胞株でも検出されなかった。以上の結果から、大腸癌や胃癌においてSDHD遺伝子が癌抑制遺伝子として働く可能性が示唆された。ただし「2ヒット変異」およびmRNA発現量の完全消失が検出されないことから、典型的な癌抑制遺伝子の変異様式とは異なることがわかった。その理由として、エネルギー産生を担うSDHDの「ハウスキーピング遺伝子」としての特性が関係している可能性が考えられた。今回の研究結果は、ミトコンドリア機能に関係するその他のハウスキーピング遺伝子も癌抑制遺伝子様の役割を果たす可能性があることを示唆しており、癌の多様な性質を理解し治療に応用する上で重要な成果であったと思われる。また興味深いことに、SDHD遺伝子の変異(LOH)とミトコンドリアゲノム内の遺伝子変異(既報告)を同時に有する症例は1例のみであった。したがって、両ゲノムの異常が共通の呼吸鎖カスケードを介して、同様の役割で腫瘍の進展に寄与する可能性が考えられた。今後はSDHD遺伝子の機能解析を行い、分子機構の解明を試みる予定である。大腸癌52症例、胃癌59症例および培養細胞株7種を対象に、核内SDHD(複合体II)遺伝子の変異の検索を行い、下記の結果を得た。1 SDHD遺伝子内(エクソン14)の点突然変異はPCR-SSCP法を用いて検索した。変異はすべての症例、細胞株で検出されなかった。2 SDHD遺伝子座(11q22-23)における遺伝子欠失(LOH)は、5種のマイクロサテライトマーカー(D11S5014、D11S5015、D11S5017、D11S1347、D11S1328)を用いて検索した。LOHは大腸癌47症例中12例(26%)、胃癌52症例中9例(17%)で検出された。3 SDHD遺伝子のmRNA発現量の変化はTaqMan法によるリアルタイムPCR解析により評価した。発現量の低下は、大腸癌19症例中15例(79%)で検出された。4上記の大腸癌19例を対象に、sodium bisulfite処理およびPCR直接シークエンス法を用いて、SDHD遺伝子の5'上流プロモータ領域のCpG配列におけるメチル化を検索した。メチル化はすべての症例で確認されなかった。5ミトコンドリアゲノム内の複合体遺伝子の変異は、本症例の大腸癌33例中7例、胃癌59例中5例で検出された。これらの変異とSDHD遺伝子の変異(LOH)は逆相関の関係があることがわかった。6以上の結果から、SDHD遺伝子が大腸癌や胃癌において癌抑制遺伝子様のはたらきをする可能性が示唆された。本研究成果は第61回日本癌学会総会(平成14年)にて発表を行った。論文はOncology Reportsに掲載予定である。
脳梗塞の予後進展に及ぼす性差及びオキシトシンの影響

本研究では、脳梗塞の病態進行に及ぼすオキシトシンの効果を検討するために、脳梗塞モデルラットを用いて脳梗塞後におけるオキシトシン受容体(OXTR)の発現変化を解析した。ラットの脳を、施術6時間7日後に摘出し、梗塞巣、その周辺領域、正常領域を回収し、OXTR mRNAの発現量を解析した。その結果、施術1日後の梗塞巣周辺領域においてOXTR mRNAの発現が上昇した。更に、これらの発現上昇は前頭葉の梗塞巣周辺領域で著しく高いことが分かった。以上より、OXTRは脳梗塞後特定の期間に梗塞巣周辺領域で発現が亢進することが分かった。これらの結果をもとに、オキシトシンを脳梗塞の治療に結びつける予定である。オキシトシンが、虚血性疾患に対する保護作用をもつことが報告されている。しかしながら、その詳細な作用メカニズムについては明らかになっていない。本研究では、脳梗塞の病態進行に及ぼすオキシトシンの効果を検討するために、脳梗塞モデルラットを用いて脳梗塞後におけるオキシトシン受容体の発現変化を解析した。脳梗塞モデルはラットの中大脳動脈を一過性に閉塞し、作成した。術後2-15日目のラットから脳を摘出し、梗塞巣、その周辺領域、正常領域において解析した。その結果、施術後2日目の梗塞巣の周辺領域においてオキシトシン受容体の発現が高度に認められ、その発現はその後経時的に減少した。一方、梗塞巣および正常領域においてはオキシトシン受容体発現について有意な変化は認められなかった。この結果から、脳梗塞後のオキシトシン受容体の発現には経時的・空間的変化があることが明らかになった。そこで、さらに、この梗塞巣周辺領域において、オキシトシン受容体を発現している細胞種の特定を試みた。この細胞種をオキシトシンのターゲット細胞として、現在はオキシトシンの効果を分子細胞レベルで検討している。これまでの実験的検討から、オキシトシン受容体は脳梗塞後特定の期間に梗塞巣周辺領域で発現が亢進することが明らかになった。今後は、これらの結果をエビデンスとして、オキシトシンを脳梗塞の治療に結びつける予定である。オキシトシンは様々な虚血性疾患において保護作用をもつことが報告されている。しかしながら、脳梗塞に対するオキシトシンの詳細な作用メカニズムについては明らかになっていない。本研究では、脳梗塞の病態進行に及ぼすオキシトシンの影響を検討するために、脳梗塞後におけるオキシトシン受容体の発現変化を解析した。一過性中大脳動脈閉塞モデルラットの脳を摘出し、梗塞巣、その周辺領域、正常領域においてオキシトシン受容体の発現量を解析した。その結果、施術後2日目の梗塞巣の周辺領域においてオキシトシン受容体の発現量の増加が認められ、その後経時的に減少した。施術後2日目の梗塞巣周辺領域には、変性細胞が多く存在している。その中でも、神経細胞およびアストロサイトがオキシトシン受容体を発現していることが明らかになった。この変性細胞が存在する領域の拡大(=梗塞巣領域の拡大)を抑制することは脳梗塞の予後に大きく影響を及ぼす。従って、これらの細胞種をオキシトシンのターゲット細胞として、現在はオキシトシンの効果を分子細胞レベルで検討している。今後は、これらの結果を踏まえ、オキシトシンを脳梗塞の治療に結びつける予定である。産前・産後休暇のため研究を一時中断した。そのため、当初の研究計画に遅延が生じてしまった。術後6時間、1-7日後のラットから脳を摘出し、梗塞巣、その周辺領域、正常領域におけるオキシトシン受容体の発現量を解析した。その結果、施術1日後の梗塞巣の周辺領域においてオキシトシン受容体の発現が高度に認められ、その発現はその後経時的に減少した。一方、梗塞巣および正常領域においては有意な変化は認められなかった。更に、これらの発現上昇は施術1日後の前頭葉の梗塞巣周辺領域で著しく高いことを発見した。そこで、オキシトシン受容体を発現している細胞種の特定を試みた。

以上より、OXTRは脳梗塞後特定の期間に梗塞巣周辺領域で発現が亢進することが分かった。これらの結果をもとに、オキシトシンを脳梗塞の治療に結びつける予定である。研究機関を異動したことにより、研究環境の確立に時間がかかってしまった。次年度は、当初の計画以上に推進する。今年度は、脳梗塞後のオキシトシン受容体の発現分布、オキシトシンのターゲット細胞を明らかにすることができた。オキシトシンが変性神経細胞や変性アストロサイトにどのような影響を及ぼすのかを分子細胞レベルで明らかにすることが、喫緊の課題である。そのため、虚血ストレス条件(低グルコース、低酸素)下で、各細胞を培養する。その後、各細胞の生存状態(免疫染色、イムノブロット)や神経保護または増悪関連因子を測定することにより解析を行う。これらの結果を足がかりに脳梗塞の治療薬としてのオキシトシンの効果をin vitro、in vivoの両面から評価する。医歯薬学今年度は当初の計画で予定していたin vivo実験の確立に時間を要した。しかしながら、脳梗塞後のオキシトシン受容体の発現分布、オキシトシンのターゲット細胞を明らかにすることができた。従って、次年度は、今年度得られたデータを足がかりに脳梗塞の治療薬としてのオキシトシンの効果をin vitro、in vivoの両面から解析する。産前・産後休暇により研究を一時中断したため、使用を計画していた実験を遂行するまでに至らなかった。そのため、使用を計画していた実験を遂行するまでに至らなかった。研究費は細胞培養関連試薬一式、実験動物、生化学研究用試薬、各種抗体購入費および成果発表費用(国内・国外学会参加、外国語論文校正費用、論文印刷費等)、共同機器使用料として使用する。
超高速時間分解分光による分子内電子移動系の環境依存発光特性の研究:蛍光分子プローブの開発に向けて

塩でありながら常温で液体であり、多くのユニークな特性が注目されているイオン液体の構造に関する研究を行った。イオン液体を構成する典型的なカチオンである1-butyl-3-methylimidazolium([bmim])と、ハロゲンアニオンを組み合わせたイオン液体の液体および結晶状態における構造を、ラマン散乱とX線回折により調べた。塩素イオンをアニオンとする[bmim]Clについて結晶多形を発見した。単結晶を作成してX線結晶構造解析を行ったところ、ブチル基のコンホメーションの違いが結晶多形の原因であることがわかった。さらに、ラマン分光により、一般的液体とは異なって、イオン液体では結晶のような部分構造が共存する可能性を示唆する結果を得た。この部分構造の存在を証明するため、さらに異なるアニオンのイオン液体の研究を計画している。NBD(7-nitro-2,1,3-benzaoxadiazole)の4-アミノ類似体は、溶液の極性の指標であり、生物学でも使用される。NBD類似体のアミノ基と極性溶媒の影響について調べるために、蛍光物質でも測定可能な近赤外ラマン分光を用いた研究を行った。1300cm^<-1>付近の強いバンドのバンド形と位置は極性溶媒に、1540cm^<-1>付近のバンドはアミノ基に敏感であることがわかった。また、四塩化炭素/重アセトニトリル混合溶媒中で重アセトニトリルの濃度を高くすると、1422cm^<-1>のバンドが減少することがわかった。振動バンドの帰属のための類似体の調製と、DFT計算を計画している。この6ヶ月間で、Sahaはフェムト秒チタン:サファイアレーザーシステムおよびストリークカメラを用いた分光システムの使用法に習熟し、単独で時間分解蛍光分光の実験を開始した。提案した研究計画に沿って、2種類のNBD(4-アミノ-7-ニトロベンズオキサジアゾール誘導体、分子内電荷移動分子)分子の系列について広範に研究を進めている.さらに、Si基板上に吸着したフルオレセインおよびポルフィリンの誘導体についても測定を行い、吸着による蛍光寿命の変化を調べている。光励起時の蛍光プローブ分子の構造変化を調べるうえで、ラマンスペクトルの測定は極めて有用な情報を与える.しかし、試料の発する蛍光の妨害のため、NBD類縁体は固体・溶液状態共に、基底状態のラマンスペクトルすら測定が行われていなかった.そこで、プローブ分子が吸収を持たない波長(1064nm)の励起レーザーを用い、新たに開発された近赤外マルチチャンネル検出器(InP/InGaAsP)によりラマンスペクトルの測定を試みた.実験はNBD分子の固体および重アセトニトリル溶液について行った.興味深いことに、NBD分子の電子供与部位のサイズを変化させるといくつかのラマンバンドのピーク位置がシフトすることがわかった.また最近、イオン液体物質である塩化1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムの単結晶を作製することに成功し、x線結晶構造解析により、この物質の2種類の結晶多形のうちの1つについて正確な構造を得ることができた.この結果は、イオン液体の液体構造解明につながると期待される.塩でありながら常温で液体であり、多くのユニークな特性が注目されているイオン液体の構造に関する研究を行った。
海洋炭素循環を駆動する凝集体ポンプの微生物制御機構

採用2年度目は、まず以下の課題について解明を試みた。(課題I)微生物による凝集体の大型化促進機構の解明(課題II)凝集体上の微生物種の同定および環境条件変化に伴う凝集体の大型化促進効果の評価詳細なデータを得るため、複数回、人工小型凝集体が懸濁した濾過海水中で細菌群集の培養を繰り返し行い、凝集体の沈降速度、細菌群集組成などのパラメータを得た。採用初年度の研究成果と合わせて、国際誌に投稿し、受理された(Yamada et al. Aquat Microb Ecol (Accepted))。次に(課題III)現場海洋環境における凝集体と微生物群集把握、および凝集体ポンプの定量的解析、に関して、2012年に観測された西部北極海における研究航海(MR12-E03航海)のデータの分析を引き続き行い、採用初年度までの研究成果と合わせて、国際誌に投稿し、採択された(Yamada et al. 2015 J Geophys Res-Oceans, 120,4638-4653)。2013年に行った太平洋熱帯・亜熱帯域の研究航海(KH13-7)により測定した現場凝集体の濃度を、他海域のデータ(上記の北極のデータを含む)と比較し、ポスターにまとめ、国際発表を行った(Yamada et al. Ocean Sciences Meeting, New Orleans, USA)。現在、その内容をさらに検討した上で、現場海水中の凝集体と細菌パラメータとの関係について論文をまとめ、国際誌への投稿を準備中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に取り組んだ内容は以下のとおりである。課題I.微生物による凝集体の大型化促進機構の解明:(1)凝集体の濃度変化、(2)凝集体の顕微鏡観察、(3)微生物群集の活性の経時的測定、(4)微生物数、細胞外酵素活性、海水中栄養塩濃度を測定した。これらのパラメータと凝集体大型化の関連性および、それぞれの寄与についての検討を行った。課題II.凝集体上の微生物種の同定および環境条件変化に伴う凝集体の大型化促進効果の評価:CARD-FISH法(Pernthaler et al. 2004)を用いて、沿岸細菌群集によって大型化した凝集体の付着細菌種の同定を行った。その結果、特定の細菌種が大型化に大きく寄与している可能性を見出した。課題III.現場海洋環境における凝集体と微生物群集把握、および凝集体ポンプの定量的解析:2012年に観測された西部北極海における研究航海(MR12-E03, JAMSTEC)のデータを用い、凝集物および細菌に関するデータの解析を行った。具体的には、光学的に測定した現場海水中の有機凝集体の存在量、および海水を濾過後、測定した細菌存在量の分布および相互作用について検討を行った。また、2013年に行った太平洋熱帯・亜熱帯域の研究航海(KH13-7, JAMSTEC)により、現場海水中の有機凝集体の存在量を測定した。以上によって得られた結果は、取りまとめた上、国内外における学会において発表を行った。設定した課題IからIIIの全てにおいて大きな進展がみられ、本研究目的の半分以上は達成されたと考えられるため。各種パラメータを変化させた時の凝集体大型化効果の検証をさらに行い、異なる細菌株を用いた実験も行う。
Wntシグナル伝達系因子の離合集散を制御するDIXドメインの構造生物学

Wingless(Wnt)は分泌性細胞間シグナル伝達タンパク質で,線虫やショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を越えて保存されており,細胞の増殖や分化・運動・初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の重要な生物学的機能を制御する.Wntの細胞内シグナル伝達機構はAxinやβ-カテニンなど複数のタンパク質複合体により制御されている.本研究ではWntシグナル伝達経路の重要な3種類のタンパク質(Axin,Dishevelled(Dvl),Coiled-coil-DIX1(CCD1))が有するDIXドメインの結晶構造を解明し,それぞれのホモおよびヘテロオリゴマー化の本質を理解することを目的とした.平成22年度は,CCD1-DIXドメインの結晶解析を行い,結晶中で7個のDIX分子が分子間のβ-ブリッジ相互作用により,らせん状オリゴマーを形成していることを見いだした.また,このらせんは,2本で逆方向の2重らせんを形成していた.平成23年度は,Dvl-DIXの点変異体の結晶解析に成功した.その結果,Dvl-DIXは,2種類の空間群に属する結晶が得られ,その結晶中でDIXドメイン分子は,それぞれ6回および8回のらせんを形成していることを明らかにした.らせんの1巻分のピッチや半径は異なるが,2番目と4番目のβ-ストランドによる分子間相互作用は,すべてのDIXドメインのホモオリゴマーで共通の相互作用様式であることがわかった.しかし,このDvl-DIXも2重らせんを形成するが,CCDl-DIXとは異なり,2本のらせんが,順方向に寄り添ってらせん間相互作用をしていることが明らかになった.Wingless (Wnt)は分泌性細胞間シグナル伝達タンパク質で,線虫やショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を越えて保存されており,細胞の増殖や分化・運動・初期胚発生時の体軸形域や器官形成等の重要な生物学的機能を制御する.Wntの細胞内シグナル伝達機構はAxinやβ-カテニンなど複数のタンパク質複合体により制御されている.本研究ではWntシグナル伝達経路の重要な3種類のタンパク質(Axin, Dishevelled (Dvl), Coiled-coil-DIX1 (CCD1))が有するDIXドメインの結晶構造を解明し,それぞれのホモおよびヘテロオリゴマー化の本質を理解する.平成22年度は,CCD1-DIXドメインの大腸菌での発現系を構築し,精製・結晶化をおこなった.その結果,分解能3.0Åの回折データを収集することに成功した.セレノメチオニン置換体結晶をもちいて多波長異常分散法による位相決定を行い,R_<work>/R_<free>=24.8/28.9(%)まで精密化した.結晶の非対称単位中には5つのβストランドと1本のαヘリックスからなるユビキチン様構造をもつCCD1-DIXドメインが7分子含まれていた.これらの分子は,近接する分子間のβ2とβ4のストランド間で平行βブリッジ相互作用をして7回らせん状オリゴマーを形成していた.Wingless(Wnt)は分泌性細胞間シグナル伝達タンパク質で,線虫やショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を越えて保存されており,細胞の増殖や分化・運動・初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の重要な生物学的機能を制御する.Wntの細胞内シグナル伝達機構はAxinやβ-カテニンなど複数のタンパク質複合体により制御されている.本研究ではWntシグナル伝達経路の重要な3種類のタンパク質(Axin,Dishevelled(Dvl),Coiled-coil-DIX1(CCD1))が有するDIXドメインの結晶構造を解明し,それぞれのホモおよびヘテロオリゴマー化の本質を理解することを目的とした.平成22年度は,CCD1-DIXドメインの結晶解析を行い,結晶中で7個のDIX分子が分子間のβ-ブリッジ相互作用により,らせん状オリゴマーを形成していることを見いだした.また,このらせんは,2本で逆方向の2重らせんを形成していた.平成23年度は,Dvl-DIXの点変異体の結晶解析に成功した.その結果,Dvl-DIXは,2種類の空間群に属する結晶が得られ,その結晶中でDIXドメイン分子は,それぞれ6回および8回のらせんを形成していることを明らかにした.らせんの1巻分のピッチや半径は異なるが,2番目と4番目のβ-ストランドによる分子間相互作用は,すべてのDIXドメインのホモオリゴマーで共通の相互作用様式であることがわかった.しかし,このDvl-DIXも2重らせんを形成するが,CCDl-DIXとは異なり,2本のらせんが,順方向に寄り添ってらせん間相互作用をしていることが明らかになった.
価格決定メカニズムの実証的・文献的研究

昭和60.61年度の2年間において、価格決定について、次の事項に重点をおいて研究を行ってきた。1.価格決定に関連する内外の文献を読破すること。外国文献は主にアメリカであったが、イギリス,カナダもある。国内文献は経済関係が多く、経営,会計はほとんど存しなかった。この成果は、『現代の価格決定実践-アメリカ,カナダの実態調査から-』で発表した。2.わが国上場企業の実態調査を実施し、あわせてその分析を行った。郵送企業740社中回答企業394社(53.2%)と高い回収率であった。その結果、数々の新事実を発見することができた。そのため、この結果をいろいろな角度から分析し、発表した。まず、全般的分析は、『わが国の価格決定に関する実証的研究-アメリカ,カナダ企業との対比において-』で行った。次に、その要約と新事実の発見を、『わが国の価格決定実践』で発表した。更に、実証的研究の必要性を学会報告の場で立証し、価格決定とからめて、『変革期における管理会計研究の方法』を発表した。3.ソフトウェア価格決定の機構を研究し、その成果を発表した。ソフトウェア価格決定を研究するには、その前提としてソフトウェア原価計算を研究する必要があり、昭和60年度はその研究を行った。その基礎の上に、『ソフトウェア価格決定の機構』を発表し、世に問うた。
リステリア感染マクロファージからのTh1細胞誘導因子クローニング

OVA特異的TCRトランスジェニックマウスDO11.10を用いて、リステリア感染を受けたマウスからのマクロファージが、CD4+Th応答にどのような役割を果たしているかを検討してきた。その結果、リステリア生菌を感染させたマウス脾臓からのマクロファージの抗原提示ではTh2タイプのサイトカイン応答が抑制され、IFN-γの産生が強められることをみいだしている。この現象は抗原非特異的に起こり、リステリア感染を受けた個体の免疫系は無関係の抗原刺激に対してもTh1タイプのサイトカイン応答を起こさせることを示している。そこで、マクロファージのどのような因子が関わっているかを調べるため、リステリア感染マクロファージに表現されるmRNAについてcDNA-RDA法を用いて、微妙な変化を増幅およびサブトラクトして解析を試みた。マクロファージ分泌蛋白ライブラリーをスクリーニングして、COS細胞にトランスフェクションし、Th1細胞を誘導する因子をアッセイ系に加えて、IFN-γの産生を指標に調べたが、どのクローンも有意なIFN-γの増強は認められなかった。そこで、細胞側因子の解析と並行してリステリア菌の責任遺伝子の解析を始めた。パスツール研究所から供与されたトランスポゾンを導入したリステリア変異株をin vitroでマクロファージに感染させ、変異によってIFN-γの産生の増強を起こすことが出来なくなったリステリア菌をスクリーニングしている。一方、Th2サイトカイン応答を抑制するリステリア菌の遺伝子はTh1を増強させるものとは別の遺伝子であることがリステリア変異株のスクリーニング結果より判明しており、これらの2つのクローンを得ることでマクロファージ側因子の解析にも新たな進展が期待される。リステリア生菌を感染させたマウス脾臓からのマクロファージの抗原提示ではTh2タイプのサイトカイン応答が抑制され、IFN-γの産生が強められることを見い出した。この現象は抗原非特異的に起こり、リステリア感染を受けた個体の免疫系は無関係の抗原刺激に対してもTh1タイプサイトカイン応答を起こさせることを示している。そこで、リステリア感染マクロファージに強く表現されるmRNAについてcDNA-RDA法、シグナルシークエンストラップ法を用いることによりマクロファージの産生する分泌蛋白に的を絞り込む。結果1.リステリア感染マウス脾細胞よりマクロファージを回収し、抽出したmRNAから非感染マクロファージのcDNAでサブトラクトする。cDNAを合成してファージに組み込んでcDNAライブラリーを作製した。2.マウスにリステリアを感染させ3日後に脾細胞を回収した。非感染細胞からmRNAを回収して2本鎖cDNAを作製してRBAプライマーで増幅しドライバーアンプリコンを得た。一方、感染細胞のmRNAから2本鎖cDNAを作製し、NBAアダプターを結合させてテスターアンプリコンを得た。テスターアンプリコンと過剰量のドライバーアンプリコンを混合し熱変性後、ハイブリダイズさせる。Taq polymeraseを用いて末端を修復した後、NBAプライマーを用いてPCRを行い、テスターからドライバーをサブトラクトした。これをアダプターを換えて数回繰り返した。これをプローブにして先のマクロファージ分泌蛋白ライブラリーをスクリーニングし、リステリア感染によって差のみられる分泌蛋白遺伝子を同定をおこなった。3.クローニング後、COS細胞にトランスフェクションしTh1細胞を誘導する因子をスクリーニングするためのアッセイ系を現在準備している。その結果、リステリア生菌を感染させたマウス脾臓からのマクロファージの抗原提示ではTh2タイプのサイトカイン応答が抑制され、IFN_<-γ>の産生が強められることをみいだしている。

そこで、マクロファージのどのような因子が関わっているかを調べるため、リステリア感染マクロファージに表現されるmRNAについてcDNA-RDA法を用いて、微妙な変化を増幅およびサブトラクトして解析を試みた。マクロファージ分泌蛋白ライブラリーをスクリーニングして、COS細胞にトランスフェクションし、Th1細胞を誘導する因子をアッセイ系に加えて、IFN_<-γ>の産生を指標に調べたが、どのクローンも有意なIFN_<-γ>の増強は認められなかった。そこで、細胞側因子の解析と並行してリステリア菌の責任遺伝子の解析を始めた。パスツール研究所から供与されたトランスポゾンを導入したリステリア変異株をin vitroでマクロファージに感染させ、変異によってIFN_<-γ>の産生の増強を起こすことが出来なくなったリステリア菌をスクリーニングしている。現在、2500のクローンから2次スクリーニングをおこなっている。一方、アレルギーを抑制する顕著な実験例として、リステリア感染を受けたマウスは寄生虫N. brasiliensisを感染させた場合でもlgE産生の誘導が減弱することを見い出した。このTh2サイトカイン応答を抑制するリステリア菌の遺伝子は先のTh1を増強させるものとは別の遺伝子であることがリステリア変異株のスクリーニング結果より判明しておりこれらのクローンを得ることでマクロファージ側因子の解析にも新たな進展が期待される。
リユース橋梁のための主桁連結構造の設計法確立に関する研究

本研究は,組立・解体が容易なリサイクル・リユース橋梁の部材連結構造を具現化するために,これまでに研究代表者らが提案してきた高力ボルト引張接合と摩擦接合を併用した新しい主桁連結構造の高強度化およびその設計法の確立を目的としたものである.フランジ連結部の構造詳細の違いが継手強度および変形性状に与える影響を検討した結果,フランジ連結部の補剛リブを主桁フランジ平行に取り付けた構造よりも垂直に取り付けた構造の方が,最大強度および最大強度字の変形量が増大し,より延性的な破壊モードとなることなどを明らかにした.さらに,従来の強度算定法よりも精度の良い曲げ強度算定法を提案した.本研究は,組立・解体が容易なリサイクル・リユース橋梁の部材連結構造を具現化するためのブレークスルー技術として,これまでに申請者らが提案してきた引張ボルト接合と高力ボルト摩擦接合を併用した新しい主桁連結構造の高強度化および設計法の確立を目的としたものである.平成25年度は,鋼I桁のフランジ連結に引張ボルト接合を,ウェブ連結に高力ボルト摩擦接合を用いた連結構造に対してFEM解析を実施し,提案連結構造の力学挙動を詳細に検討するとともに,フランジ引張ボルト接合部の構造詳細の違いが連結構造の強度および変形性状に与える影響を詳細に検討した.その結果,申請者がこれまでに提案してきた連結構造のように,フランジ引張ボルト接合部の補剛ウェブを主桁フランジに平行に取り付けた構造よりも垂直に取り付けた構造の方が最大強度および最大強度時の変形量が増大し,より延性的な破壊モードとなることなどがわかった.また,過去に行われた実大載荷実験結果とFEM結果とを比較した結果,実験では初期不整,特にウェブの目違いによる高力ボルト摩擦接合部のすべり係数の低下に影響し,連結構造の力学性状にも大きな影響を与えていることなども明らかになり,初期不整が本提案連結構造の力学挙動に与える影響をより詳細に検討する必要があることなどが課題である.本研究は,組立・解体が容易なリサイクル/リユース橋梁の部材連結構造を具現化するためのブレークスルー技術として,これまでに申請者らが提案してきた高力ボルト引張接合と高力ボルト摩擦接合とを併用した新しい主桁連結構造の高強度化および設計法の確立を目的としたものである.平成26年度は,鋼I桁のフランジ連結に高力ボルト引張接合を用いた連結構造を対象としてFEM解析および載荷実験を行い,ボルト配置の違いが連結部の力学挙動に与える影響を検討するとともに,提案連結構造の耐力算定式を提案した.その結果,鋼I桁腹板から接合部に伝達される応力を考慮することで従来の強度算定法よりも精度よく継手耐力を評価できることなどを明らかにした.本研究は,組み立てと解体が容易なリサイクル/リユース橋梁の部材連結構造を具現化するためのブレークスルー技術として,これまでに申請者らが提案してきた高力ボルト引張接合と高力ボルト摩擦接合とを併用した新しい主桁連結構造の高強度化および設計法の確立を目的としたものである.平成27年度は,本研究で対象としている高力ボルト引張接合と高力ボルト摩擦接合とを併用した連結構造のうち,鋼I桁のフランジ接合に用いる高力ボルト引張接合の高強度化を目的として,従来の1,000MPa級高力ボルトに対して1.8倍程度の強度を持つ1,800MPa級超高力ボルトを用いた引張接合の力学性状を有限要素解析により詳細に検討し,1,800MPa級超高力ボルトの適用可能性と実用化する際の課題をまとめた.その結果,1,800MPa級超高力ボルトを用いた引張接合では,ティーフランジにもSBHS材などの高降伏点鋼や厚板を用いることで継手の高強度化が可能となること,またティーフランジに従来の鋼材や薄板を使用した場合でも,1,800MPa級超高力ボルトを用いることで接合面間の接触圧力が高くなるため,継手剛性の上昇が期待できることなどを明らかにした.また,その他,鋼I桁のウェブ接合に用いる高力ボルト摩擦接合について,接合面に種々の金属溶射を施した摩擦接合継手試験体を製作し,載荷実験により高力ボルト摩擦接合の高強度化について検討した.当初予定どおりに研究が進められている.本研究は,組み立てと解体が容易なリサイクル/リユース橋梁の部材連結構造を具現化するためのブレークスルー技術として,これまでに申請者らが提案してきた高力ボルト引張接合と高力ボルト摩擦接合とを併用したあたらしい主桁連結構造の高強度化および設計法の確立を目的としたものである.本研究では,これまでに鋼I桁のフランジ接合に用いる高力ボルト引張接合の高強度化を目的として,従来の1000MPa級高力ボルトに対して1.8倍の強度を持つ1800MPa級超高力ボルトを用いた引張接合の適用性について検討してきた.その結果,1800MPa級超高力ボルトを用いた場合は,母材にSHBSなどの高降伏点鋼あるいは厚板を用いることで継手の高強度化を実現できること,従来鋼を用いた場合には,継手剛性の向上が期待できることなどを明らかにした.そして,最終年度は,鋼I桁のフランジ部に設けた高力ボルト引張接合のボルト配置をパラメータとしたパラメトリック解析を実施し,高力ボルト引張接合のボルト配置の違いが高力ボルト摩擦接合と高力ボルト引張接合の断面力分担割合に与える影響を詳細に検討するとともに,これらを併用した鋼I桁連結部の簡易な強度算定方法を提案した.

本研究は,組立・解体が容易なリサイクル・リユース橋梁の部材連結構造を具現化するために,これまでに研究代表者らが提案してきた高力ボルト引張接合と摩擦接合を併用した新しい主桁連結構造の高強度化およびその設計法の確立を目的としたものである.フランジ連結部の構造詳細の違いが継手強度および変形性状に与える影響を検討した結果,フランジ連結部の補剛リブを主桁フランジ平行に取り付けた構造よりも垂直に取り付けた構造の方が,最大強度および最大強度字の変形量が増大し,より延性的な破壊モードとなることなどを明らかにした.さらに,従来の強度算定法よりも精度の良い曲げ強度算定法を提案した.当初予定どおりに研究が進められている.今年度は,フランジに高力ボルト引張接合を,ウェブに高力ボルト摩擦接合を用いた桁連結構造の試験体を製作し,載荷実験およびFEM解析を通してそれぞれの接合部が伝達する部材断面力の分担割合について検討する.そして,最終年度の研究取りまとめとして,これまでの検討結果を踏まえ,提案連結構造の簡易な強度算定法を提案する.構造工学・地震工学・維持管理工学平成27年度は,これまでに引き続きFEM解析による検討に加え,FEM解析結果の妥当性を検証するための載荷実験を実施する予定である.当初の予定では,平成25年度は部分要素モデルを用いた載荷実験を実施する予定であり,全体モデルのFEM解析は平成27年度に実施する予定であった.実施年度の違いはあるが,ほぼ計画通りの内容を検討できている.実験供試体を当初見積もり額よりも安価に製作できたため,消耗品費の支出が少なくなった.一方で,当初は予定していなかった国内外での学会でも研究成果を発表できたため,それらの差額により次年度繰越金が生じた.実験供試体を当初見積もり額より安価に製作できたため.実験供試体の製作費およびひずみゲージ等の消耗品購入費として使用する予定である.研究実績の概要にも示したように,過去に実施された載荷実験では,試験体の初期不整の影響が大きいことが明らかとなった.したがって,今後は,まず,初期不整が連結構造の全体の挙動に与える影響を実験およびFEM解析により明らかにし,設計法確立のための基礎データの収集を行う.そして,初期不整の影響を考慮した上でパラメトリック解析を実施し,より詳細な力学挙動を確認するとととも,強度算定法などの確立を目指す.平成27年度の実験供試体製作費およびひずみゲージ等の消耗品購入費として使用する予定である.当該年度は,当初は部分要素モデルを用いた実験を実施する予定であったが,全体モデルを対象としたFEM解析による検討を中心に実施した.そのため,試験体製作費とFEMプログラム使用料との差額により当初計画と使用額とに差額が生じた.全体モデルを用いた載荷実験のために,複数体の試験体を作製する予定である.
有機金属錯体を出発原料とする新しい機能性ナノサイズセラミックスの調整と応用

愛媛大学工学部とイタリアのローマ大学"Tor Vergata"との共同で、有機金属錯体の熱分解による機能性複合酸化物の合成について研究を行なった。まず、多核複金属有機錯体を合成し、これを熱分解することによりペロブスカイト型複合酸化物を得る新しい合成法について検討を行なった。材料としては、LaMn-系,LaFe-系などについて、特に低温における複合酸化物の生成挙動を調べた。その結果、LaMn-系では600°Cで結晶化が始まり、この温度では約20nmの均質微粒子が得られた。LaFe-系は、希土類とFeの系で最も低温で複合酸化物を形成することがわかっており、350°Cの低温で長時間焼成することによりLaFeO_3微粒子が得られている。さらに、3成分の錯体の熱分解を行ない、La_<1ーx>Sm_xFeO_3、YBa_2Cu_3O_7などの様々な複合酸化物の均質微粒子が合成され、その結晶のキャラクタリゼーションがなされた。さらに、この方法で、SmFeO_3を合成しNO_2ガスセンサへ応用したところ、一般的に用いられる固相反応法により得たものよりもかなり優れたセンサ材料になりうることが明かになり、表面分析の結果より多核錯体法で作製した方が、吸着サイトの数が多く均質性が優れていた。一方、ゾルーゲル法により新しいNa^+イオン伝導体の開発も行ない、極めて緻密で伝導度の高いセラミック固体電解質を作製した。これを用いて、CO_2ガスセンサへ応用したところ優れた起電力応答が得られた。有機金属錯体法による高性能・高機能を有するナノサイズセラミックスの調製確立と応用展開のため組成制御された多核複合金属錯体出発原料とした機能性均質微粒子複合酸化物の調整法を確立し、表面分析・結晶構造解析などの手法をもちい、本法の優位性を確認した。すなわち、超伝導体、触媒材料、電子・イオン伝導体となる、Y-Ba-CU、Ln-Ba-Cu系酸化物の原料となる多核複合金属錯体を合成し、複合酸化物の低温合成を行った。出発原料となる複合金属錯体の配位子となるフォルミルメチルサリシリデンアルキルアミンを開発し、さらに、この配位子をもちいて、M2+とM3+を含む多核金属錯体を合成した。Y-Ba-Cuを含む多核金属錯体の熱分解挙動を検討し、高温超伝導体として知られる123複合酸化物の微粒子の生成は、結晶水の脱離、配位子の分解、炭酸塩の生成にひきつづき900度附近で単相形成のプロセスを経由することが明かとなった。得られた123複合酸化物はX線学的には、単相であり、表面分析の結果から均一性・均質性に優れていることが明かとなった。一方、酸化物・炭酸塩混合物の熱分解では、単相は、熱処理を繰り返さなければ得られないことも確認した。また、格子酸素数が、比較的低温で酸素分圧に対応して可逆的に変化することも確認した。現在、この酸化物微粒子を原料として、多孔質厚膜形成性について検討しており、酸化性ガスセンサとしての特性、オゾンセンサとしての特性について検討を進めている。多核錯体の熱分解による複合酸化物の合成は、均質な微粒子を低温で得る新しい合成法として期待できる。本研究ではCuY1/3Ba2/3(dhbaen)(NO3)1/3(H2O)n錯体の熱分解による超伝導酸化物YBa2Cu3O7の作製を試み、得られた材料について検討を行った。また一般的な固相反応法との比較のために、Y2O3,BaCO3,CuOをY:Ba:Cu=1:2:3の割合でそれぞれボールミル混合し、900°Cで1h焼成したものについても検討した。

TGAとXRDの結果により、800°C以下では、炭酸塩が残っており、900°Cで分解した試料はYBa2Cu3O7の単相であることが明らかになった。また、このTGAの結果と、H,N,Cの元素分析とY,Ba,Cuの蛍光X線分析が理論値とほぼ一致していたことにより、目的の異核錯体が形成されていることを確認している。この試料の均質性を調べるために一般的な固相反応法を用いて作成した試料とAESにより比較した。その結果、本錯体法により得た酸化物の各元素は比較的均一に分布していることが明らかになった。一方、固相反応法でのXRD結果は、ボールミル混合の時間により多少異なるものの、複合酸化物の単相がXRDにより確認された。しかし、AESによりその表面状態を調べたところ、元素分布はかなり不均一で、固相反応法では均一な表面をもつ材料を作るのは困難であることがわかった。これらの結果より多核錯体を用いることは均質な材料を得るうえで有効な方法であることがわかった。さらに、Ln=Yのx=0.33だけでなく、x=の値を変化させたものや他の希土類元素を用いた系についても検討を行っている。愛媛大学工学部とイタリアのローマ大学"Tor Vergata"との共同で、有機金属錯体の熱分解による機能性複合酸化物の合成について研究を行なった。まず、多核複金属有機錯体を合成し、これを熱分解することによりペロブスカイト型複合酸化物を得る新しい合成法について検討を行なった。材料としては、LaMn-系,LaFe-系などについて、特に低温における複合酸化物の生成挙動を調べた。その結果、LaMn-系では600°Cで結晶化が始まり、この温度では約20nmの均質微粒子が得られた。LaFe-系は、希土類とFeの系で最も低温で複合酸化物を形成することがわかっており、350°Cの低温で長時間焼成することによりLaFeO_3微粒子が得られている。さらに、3成分の錯体の熱分解を行ない、La_<1-x>Sm_xFeO_3、YBa_2Cu_3O_7などの様々な複合酸化物の均質微粒子が合成され、その結晶のキャラクタリゼーションがなされた。さらに、この方法で、SmFeO_3を合成しNO_2ガスセンサへ応用したところ、一般的に用いられる固相反応法により得たものよりもかなり優れたセンサ材料になりうることが明かになり、表面分析の結果より多核錯体法で作製した方が、吸着サイトの数が多く均質性が優れていた。一方、ゾルーゲル法により新しいNa^+イオン伝導体の開発も行ない、極めて緻密で伝導度の高いセラミック固体電解質を作製した。これを用いて、CO_2ガスセンサへ応用したところ優れた起電力応答が得られた。
定位的laser温熱療法による悪性脳腫瘍の治療

脳深部に発生した比較的小さな悪性腫瘍、特に悪性グリオーマに対し新しい治療方法、即ちNd:YAGレーザー(以下レーザー)を用いた定位的温療法の臨床応用を行う目的で実験を行った。レーザーファイバーは光が先端で80°C屈曲する直径600μのU1tra Line^<TM>ファイバー(Heraeus LaserSonics,Inc.)を用いた。利点は、術中レーザーファイバーを回転させることにより、照射方向が変えられる。次に術中ファイバー先端の温熱効果を高めるため、周辺組織を虚血、乏血にする。その為熱に強く(<200°C)、またレーザーの透過生の良いシリコンシートで7Fバルーンカテ-ルを作製し、このカテーテル内へレーザーファイバーを挿入する。至適生食水量0.6mlでバルーンを膨らませる。この時のバルーンの厚さ0.04mm、バルーンの直径8.2mm、長さ15.9mmとなる。これにより術中レーザーファイバー先端に炭化巣が付着せず、また目的方向の広い範囲に温熱を効率良く加えることができる。In vivo:全麻下でウサギの脳にレーザーバルーンプローブを刺入し、レーザー光の方向にレーザーファイバーより10mm,15mm,18mm離れた部位にそれぞれ温熱測定プローブ(直径600μ)を挿入。10mmの温度測定プローブを45°Cにレーザー装置を自動制御。約4分で目的の温度(10mm,45°C)に到達する。8匹のラット皮下移植グリオーマモデル(RGC6-CL2)を用い、それぞれ全麻下に腫瘍内へレーザープローブを刺入。ファイバーより10mm離れた部位を45°Cに設置し、5W,45分間加温した。術中0.6ml生食水でバルーンを膨らませると、腫瘍組織の血流量は10mmの離れた部位で約45%低下している。術後5日目のレーザーポローブに軸切片の組織検索では、レーザーファイバーを中心に約100°Cの扇形で、10mmの範囲内に境界鮮明な熱凝固層が作製された。10mmを越えた腫瘍細胞には何ら組織変化は認められなかった。以上より腫瘍の広がりに応じてレーザーポローブを回転させる事により、定位的laser温熱療法が効果的に、最小限の侵襲で行える。定位温熱療法では温熱の方向付けと組織の虚血が重要な条件となる。従来のYAG laser probe先端を斜めに切って断端をcoatingし、光が断端面の反対側へ80°屈曲する600mum石英fiber(Ultraline Laser Fiber)を作製した。またこの先端をlatex balloonで被包し〓以下の実験結果を得た。一方光拡散物質である0.25%intralipidでballoonをinflateした。同条件下ではballoonを中心に円形で前回の約2/3の凝固層となった。この事は生食水の方が効率よく,凝固層の方向付けが出来有効である。in vivo:日本白色家兎の脳(4羽,8大脳半球)に対し,in vitroと同条件下でlaser照射を行った。照射後の組織では,10mm以内の白質は海綿状変化(浮腫)と神経細胞核の濃縮がみられる。

次にballoonをinflation(0.6ml)させた問いの周辺組織の血流測定では,balloonより10mm以内で45%減少,18mmでは逆に36%増加しhyperemicとなる。以上より温熱効果を効率良く発揮させるには,腫瘍の広がりに対応できるUltraline Laser Fiberを用い,またこの先端をballoonで被包し,周辺組織を虚血にしながら行うlaser温熱療法が良い。レーザーファイバーは先端で軸に80°光が屈曲するUltra Line^<TM>レーザーファイバー(以下ファイバー)を用いた。またシリコンシートで作製した7Fバルーンカテーテル内へファイバーを挿入し,レーザー・バルーンプローブをin vivoの温熱療法実験に用いた。レーザーの温熱効果と殺細胞効果,及びレーザー先端で,目的方向に広く温熱が加わり,炭化物を付着させず虚血をきたすには,バルーン内の生理的食塩水(生食水)の至適量は0.6mlであった。この時のレーザーの透過性は98%,またバルーンの直径8.2mm,長径15.9mm,バルーン壁0.04mm,耐熱性は200°C以下。出力は5W(10Wではバルーンは穿孔する)。この条件下で,8匹のラット皮下移植グリオーマモデル(RGC5-CL2)にそれぞれレーザープローブを刺入し,ファイバーより10mm離れた部位の組織温度を45°Cにコンピーターを介して自動制御し,バルーンを生食水0.6mlで膨らませ,5Wで45分間,6,5007,200 joule量を加えた。術後5日1週間の組織検索で,腫瘍はレーザー光に向かって,扇形に約100°,10mmの巾で境界鮮明な熱凝固層が作製されていた。この事実は術中レーザーファイバーを回転させる事により,目的とする方向へ温熱を効果的に加える事が出来,不整形の広がりを示す腫瘍には効率が良い方法である。
頭頸部癌におけるシスプラチン耐性機序と新規治療標的分子の解明

シスプラチンは頭頸部癌化学療法のkey drugであるが抗癌剤耐性獲得が治療の妨げとなることがしばしばある。今回われわれは頭頸部癌においてLamin A/Cの発現とシスプラチン耐性機序との関連を検討した。まず異なる3種の細胞株でシスプラチン耐性株を樹立したところ,耐性株では野生株と比較してLamin A/Cは強発現していた。またLamin A/Cの発現と関連してシスプラチンおよびカルボプラチンの感受性に変化が見られ,Lamin A/Cの発現と白金製剤の感受性との関連が示唆された。さらにLamin A/C強制発現株ではactinの発現が増強し,頭頸部癌の浸潤・転移にも関連する可能性が示唆された。前年度の研究に引き続き頭頸部癌における抗癌剤耐性獲得機序についての検討を行った。樹立したIMC-3(ヒト上顎洞扁平上皮癌),T3M-1(ヒト口腔扁平上皮癌),SAS(ヒト舌扁平上皮癌)のシスプラチン耐性株と野生株を用い検討した。まずシスプラチン添加後48時間の細胞をPI、Annexin Vで蛍光染色し、フローサイトメトリーで解析を行ったところ、耐性株ではPE、Annexin V陽性細胞は野生株と比較して減少していたが、laminA/C siRNA導入後は有意にPE、Annexin V陽性細胞が増加していた。この結果、lamin A/Cの発現はシスプラチンにより誘導される頭頸部癌のアポトーシスに関連することが明らかとなった。また、同様にlamin A/C発現ベクター導入後の細胞形態の変化を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、核の形態の変化は明らかではなかったが、laminA/C強制発現株ではactinの発現が増強し細胞膜からのfilopodiaやlamellipodiaの形成が増加する傾向があった。この結果よりlamin A/Cはplatinum製剤の感受性のみならず、頭頸部癌の浸潤・転移にも関連する可能性が示唆された。以上のことよりlamin A/Cは頭頸部癌における治療のターゲットとして多方向から有用である可能性が考えられた。シスプラチンは頭頸部癌化学療法のkey drugである.抗癌剤耐性獲得が治療の妨げとなることがあるがその耐性機序は解明されていない。われわれはシスプラチン耐性機序に関わる新たな標的分子を解明するためにシスプラチン耐性株を異なる数種の頭頸部癌細胞株で樹立した。またシスプラチン耐性化に関与する可能性のある分子のひとつとしてLamin A/Cに注目した。本研究では,頭頸部癌においてLamin A/Cがシスプラチン耐性機序に関与するか,また将来的に新たな治療標的分子となりうるか検討を試みた。まずIMC-3(ヒト上顎洞扁平上皮癌),T3M-1(ヒト口腔扁平上皮癌),SAS(ヒト舌扁平上皮癌)のシスプラチン耐性株と野生株を用い,数種の抗癌剤を用いてMTT assayで薬剤感受性を検討した。いずれの細胞もシスプラチン耐性を獲得しており,耐性株ではLamin A/CはmRNAレベルおよびタンパクレベルで強発現していた。またこれらの細胞株では同様に白金製剤であるカルボプラチンにも耐性を示したが,異なる作用機序をもつ5-FU,ドセタキセル,メトトレキセート,ペプレオマイシンへの感受性は耐性株と野生型とで差はみられなかった。さらに,これらの細胞株にLamin A/C発現ベクターあるいはLamin A/C siRNAを導入し,Lamin A/Cを強発現あるいは発現抑制させると,発現ベクター導入群ではいずれもシスプラチンおよびカルボプラチンの耐性増強が,siRNA導入群ではシスプラチンおよびカルボプラチンの感受性増強がみられた。この結果よりLamin A/C発現量とシスプラチンおよびその他の白金製剤の感受性とに相関があることが示唆された。現在,細胞周期解析をフローサイトメトリーで行っている。平成24年度の研究課題として1頭頸部癌細胞株における抗癌剤感受性の検討および2シスプラチン投与後の細胞周期解析を計画した。1についてはほぼ計画通りに遂行できており,2についても現在解析中である。1から得られた結果より白金製剤の感受性とLamin A/Cの発現とに関連性があることが予測されるが,白金製剤の作用機序は主にDNA合成阻害であり,主にG1期に作用すると考えられている。Lamin A/CはG1期にLAP2αとともにpRb/E2F complexと結合することが知られており,その点を中心に細胞周期解析を行っている。平成25年度は以下の内容の実験を計画している。1シスプラチンの核内でのDNA架橋形成阻害について検討;細胞周期停止以外の耐性機序にシスプラチンのDNA架橋形成阻害が関連しているのではないかと予測した。この点を解明するためにIMC-3,T3M-1,SASを用いて検討する。

核内のDNA中のplatinumの含有率を解析し,核内に取り込まれたシスプラチン量を推測する。また,シスプラチン投与後の細胞の形態学的特徴や細胞内でのplatinumの局在をみるため,走査型電子顕微鏡や透過型電子顕微鏡,共焦点レーザー顕微鏡で観察する。特に核内でのDNAとplatinumの結合の観察を試みる。野生型と耐性株とで差があるか検討する。上記の実験はLamin A/C発現ベクターやsiRNA導入細胞でも検討を行う。2臨床検体でのLamin A/C発現と機能の検討;Lamin A/Cの発現を手術摘出標本や生検組織を用いて免疫組織科学的に検討し,予後やシスプラチン感受性,病期分類など臨床経過について比較することで,in vivoでもLamin A/Cの発現と機能との関連を検証する。併せて,平成24年度に実験を行っていた細胞周期解析についても継続して研究していく。以上の研究を系統的に遂行し,これまでのデータをあわせて随時国内外の学会等で発表し,また必ず英語論文として国際誌に発表する。可能な限りインパクトファクターの高い雑誌に掲載されることを目標とする。平成25年度の研究費として,DNA抽出キット,原子吸光分析機運用代,電子顕微鏡,共焦点レーザー顕微鏡などの試料作成・各種抗体,トランスフェクション試薬,siRNA生成等の消耗品を中心に予算を計上した。また,6月にソウルで開催される第20回世界耳鼻咽喉科会議出席のための旅費,データ解析用のパソコン購入費用にも使用予定としている。