hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
官能性シリルリチウムとオレフィンの分子内反応の開発と立体選択的合成反応への応用

研究代表者らは,これまでに橋頭位にリン原子およびケイ素原子を有するホスファシラトリプチセンの合成および構造についての研究をおこなってきた。今回,ケイ素上にメチル基を導入したホスファシラトリプチセン1の遷移金属触媒反応へのホスフィン配位子としての活用を検討した。トリス(o-ブロモフェニル)ホスフィンとtert-ブチルリチウムとの反応によりトリリチオ体を発生させた後,四塩化ケイ素と反応させることでケイ素上に塩素を有するホスファシラトリプチセンを合成した。これとメチルリチウムとの反応により目的化合物1を合成した。この1のリン原子の配位能力を調べるため,1を対応するセレニド2へと誘導し,2のリン31NMRにおけるリンとセレンとの結合定数を測定した。その結果,1のリン原子上の非共有電子対のs性はトリフェニルホスフィンよりも大きく,最もs性の大きい部類であるトリ(2-フリル)ホスフィンと同程度であることがわかった。従って1はσ供与性の低いホスフィンであることが明らかとなった。このs性の増大は,リン原子まわりの炭素原子との結合角の和がトリフェニルホスフィンと比較して減少したことによるものと考えられる。このことから1のホスフィン配位子としての有用性を期待し,小杉-右田-Stilleカップリング反応を試みた。トリフェニルホスフィンを用いた場合と比較して1を用いた場合に転化率・収率ともに向上し,トリ(2-フリル)ホスフィンと同等の効果が見られた。(アリルオキシ)シリルリチウム化合物の分子内転位反応において,オレフィン末端の置換基により位置選択性が異なることを見出した。ヘキシル置換体では[2,3]-シラ-Wittig転位が進行し,アリルシランが生成したのに対して,フェニル置換体ではシリルリチウムはオレフィンの2位炭素上で反応し,シクロプロピルシランが生成した(シクロプロパン化反応)。アリル炭素上に不斉を導入することで,これらの転位反応において高い不斉保持率で不斉転写が進行することを見出した。位置選択性をさらに無置換体,トリメチルシリル,トリフェニルシリルおよびチエニル置換体で検討した。その結果,無置換体およびトリメチルシリル置換体では[2,3]-シラ-Wittig転位が進行したのに対して,トリフェニルシリルおよびチエニル置換体ではシクロプロパン化反応が進行することを明らかにした。さらに(プロパルギルオキシ)シリルリチウム化合物において同様の置換基をアセチレン末端に導入し,置換基効果を検討した。ヘキシル置換体では[2,3]-シラ-Wittig転位が進行し,アレニルシランが生成した。これに対してフェニル,トリメチルシリル,トリフェニルシリル,およびチエニル置換体においては,シリルリチウムはアセチレンの2位炭素上で反応し,ビニルシランを与えた。この置換基効果を非経験的分子軌道法により解析した。その結果,置換基がオレフィンまたはアセチレンの炭素上の最低空軌道の係数に大きな影響をおよぼしており,これが反応の位置選択性を決定していることがわかった。
斜面崩壊地におけるアーチ型挿し木の適応試験

長く採った挿し穂の基部と先端の両端を挿しつけアーチ状にしたアーチ型挿し木の実用方法として、小崩壊が起こり、裸地化した林道法面への緑化を考える。アーチ型挿し木での緑化の特徴は、アーチ部分へ土砂が堆積、固定されると、その土砂に植物が侵入してくることも期待できることにある。今回はアーチ型挿し木の可能な崩壊地の形態や、有効な挿し穂の配置方法の検証を目的とする。試験は東京大学附属演習林である千葉演習林と秩父演習林で行った。挿し穂の長さは80cm、両端の挿しつけ深さは各20cmとし、挿し穂を階段状に配置した。一部の挿し穂には挿し穂の抜け防止針金を実施した。樹種は千葉演習林でウツギを、秩父演習林ではフサフジウツギとバッコヤナギを使用した。また、秩父演習林では挿し付け直後にシカによる食害が発生したため、柵を設置した。千葉演習林では試験区を3ケ所設置したが、全体の生存率は35.2%と非常に低い。これは主に水分条件の悪さが影響したためと考えられる。挿し穂の抜け防止針金は非常に有効であったが、挿し穂が枯死してしまうと挿し穂が折れることが多く、それでは意味を成さないので、やはり挿し穂の生存率を上げることが重要であると言える。秩父演習林は、秋までの生存率がフサフジウツギで81.7%と非常に高かった。フサフジウツギは、シュートの成長もよく、ウツギと比べて葉も大きいため、視覚的な緑化効果は非常に高い。しかし、今回の試験地は冬季に積雪があり、その重量に耐えきれず多くの挿し穂が流亡し、3月には生存率が38.3%まで落ち込んだ。結果として、アーチ型挿し木だけで崩壊の進行や積雪による挿し穂の流亡を防ぐことは困難であり、実用するためには、斜面長の短い斜面に限るか、間伐材を利用した方法との併用など対策が必要であると言える。また、今回は試験期間が短かったため、アーチ部分への土砂の体積は観察されなかった。
骨髄不全におけるCXCR4陽性造血幹細胞を標的とした新規治療法の開発

余剰造血幹前駆細胞(HSPC)のマーカーであるCXCR4陽性のHSCPを活性化できれば、再生不良性貧血(再不貧)患者の造血機能を改善させられる可能性がある。免疫不全マウスの骨髄内にヒトCD34(+)細胞を移植したところ、3.3-20.4%のヒトCD45陽性細胞の再生を確認した。6pLOH陽性の再不貧患者単球由来iPS細胞からHSPCを誘導し、同じマウスに移植したところ、患者体内で優勢であった6pLOH(+)HSPCのCXCR4(+)細胞割合(平均10.2%)は野生型(50.7%)に比べて有意に低値であった。野生型CXCR4(+)HSPCをin vivoで活性化させる方法を現在検討中である。BRGSマウス6-8週齢18頭に9回のlineage(-) CD34(+)骨髄細胞、同じく9回のlineage(-)CD34(+)臍帯血由来造血幹細胞(hematopoietic stem cells: HSCs)を骨髄内移植し、ヒト由来の造血構築を試みたが、現在のところヒト造血の再構築は確認さできていない。移植前のHSCの純化が不十分であったことや照射線量が多すぎたことが原因のと考えられたため、分化抗原に対する抗体の種類を12から18種類に増やし、放射線照射を5.8Gyから5.5Gyに減らして検討を続けている。造血幹/前駆細胞(HSPC)におけるCXCR4発現レベルを明らかにするため、当初臍帯血を解析したが、CXCR4発現いずれの分化段階のHSPCにも同定されなかった。一方、健常者由来骨髄では、未分化なCD34(+)CD38(-)細胞とCD34(+)CD38(+)細胞間ではCXCR4陽性細胞比率(48.8% vs. 52.2%)に差は認めなかったが、最も未分化なCD49f陽性のCD34(+)CD38(-)CD45RA(-)CD90(+)分画とCD49f陰性の同分画間ではCXCR4陽性細胞比率に大きな差(5.5% vs. 40.0%)がみられた。また、さらに一段階成熟したCD34(+)CD38(-)CD45RA(-)CD90(-)のMPPではCXCR4陽性細胞比率は41.1%、HPCのうち、CD34(+)CD38(+)CD45RA(-)CD10(-)のCMPのCXCR4陽性細胞比率は55.7%、CMPから分化するGMPとMEPにおける陽性比率はそれぞれ55.8%、38.8%であった。以上から、CXCR4は、最も未分化なHSCでは発現が低いものの、HPCへと分化が進むにつれて陽性率が高くなり、さらに成熟すると逆に発現レベルが低下すると考えられた。BRGSマウスにおけるヒト造血幹/前駆細胞(HSPC)の再構築の確立が遅れているため、CXCR4陽性とCXCR4陰性のHSPCによる造血構築能の違いがまだ検討できていない。最近になって問題点が明らかになり、さらに、ヒト骨髄細胞中のCXCR4未分化HSPC分画が同定・純化されているため、今後は当初の計画通り、細胞周期、in vitroコロニー形成能、免疫不全マウスにおける造血再構築能などを明らかにできると考えている。BRGSマウス(4-6週齢)22頭に対し、7回のlineage(-)CD34(+)臍帯血由来造血幹細胞(hematopoietic stem cells: HSCs)、同じく15回のlineage(-) CD34(+)骨髄細胞を骨髄内移植し、ヒト造血の構築を試みた結果、全例で構築を確認した。前年度からの改善点は、1移植前の放射線照射量を5.8Gyから5.5Gyに減らし、2HSCをより純化するために分化抗原の種類を12から18に増やし、3ヒト造血が構築されるために必要な移植細胞数の下限値を調べるための基礎検討を実施した点である。ヒト造血の構築確認は、骨髄移植4-8週が経過した時点でBRGSマウスを安楽死させ、マウスの骨髄、胸腺、脾臓、末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより、human-CD45陽性細胞中の各血球マーカーにより確認した。キメラ率は、骨髄細胞を移植した場合(4.9-28.1%)とHSCsを移植した場合(3.3-20.4%)とで同等であり、両者とも二次移植まで成功している。骨髄細胞の中で、最も未分化なCD34(+)CD38(-)CD45RA(-)CD90(+)CD49f(+)分画、分化が一段階進んだCD34(+)CD38(-)CD45RA(-)CD90(-)のMPP分画、さらに分化が進んだCMP分画、MEP分画、GMP分画においてCXCR4の発現を継続的に検討したところ、CXCR4は最も未分化なHSCでは発現が低いものの、造血前駆細胞へと分化が進むにつれて陽性率が高くなり、さらに成熟すると逆に発現レベルが低下することが明らかになった。また、再生不良性貧血患者のiPS細胞から誘導したCD34陽性細胞においても、CXCR4が高発現しており、この細胞をBRGSマウスの骨髄内に移植することにより、3.58.9 %のCD45陽性細胞の生着が各臓器で確認された。

余剰造血幹前駆細胞(HSPC)のマーカーであるCXCR4陽性のHSCPを活性化できれば、再生不良性貧血(再不貧)患者の造血機能を改善させられる可能性がある。免疫不全マウスの骨髄内にヒトCD34(+)細胞を移植したところ、3.3-20.4%のヒトCD45陽性細胞の再生を確認した。6pLOH陽性の再不貧患者単球由来iPS細胞からHSPCを誘導し、同じマウスに移植したところ、患者体内で優勢であった6pLOH(+)HSPCのCXCR4(+)細胞割合(平均10.2%)は野生型(50.7%)に比べて有意に低値であった。野生型CXCR4(+)HSPCをin vivoで活性化させる方法を現在検討中である。1.健常者の骨髄CD49f(-)CD34(+)CD38(-)CD45RA(-)CD90(+)分画におけるCXCR4(+)細胞とCXCR4(-)との間で、遺伝子発現の差異をcDNAマイクロアレイ法で比較する。両者の間で発現レベルに大きな差がみられる遺伝子を同定し、CXCR4の陰性化を誘導するサイトカインやリガンドを、単離した骨髄由来CXCR4陽性細胞及びiPS細胞から誘導したCD34陽性細胞を用いてスクリーニングする。2.in vitroのコロニー形成法とBRGSマウスへの移植実験により、1.で得た各HSPC分画の造血支持能を評価する。血液内科学
BNCTに最適化した決定論的手法による超高速線量計算アルゴリズムの開発

本研究ではホウ素中性子捕捉療法に最適化した拡散方程式を用いた新たな計算プログラムを開発した.本プログラムによって,均質ファントム内における中性子束空間分布計算を,従来のモンテカルロ法に比べ圧倒的に高速化することに成功した.また,中性子束から線量を算出する換算係数も整備し,臨床的に必要な種々の線量への換算も実現した.さらに実際の治療計画を想定し,CT画像ベースでの線量計算ができるようプログラムを改良した.それにより,人体頭部ファントムを用いた中性子束空間分布および線量計算にも成功した.本研究で開発したプログラムは従来法に比べ高速演算が可能であり,今後新たなツールとして活用できると期待される.これまでBNCTにおける線量導出には,専ら確率論をベースとしたMonte Carlo計算が用いられていた.Monte Carlo計算は中性子の挙動をつぶさに追跡するため,導出される線量の精度が高いという利点がある一方,計算に要する時間が長くなるという欠点があった.本研究では,BNCTの線量導出にMonte Carlo計算を用いず,決定論的に高速計算する,新たな線量計算コードの開発と実用化を目指している.平成26年度は,決定論的線量計算コードの基盤プログラムを開発し,高速線量計算を実現するために,取り扱いデータの多群化について検証した.BNCTにおいて線量を導出するためには,中性子フラックスの空間分布を計算し,カーマ係数と呼ばれる換算係数を乗じる必要がある.カーマ係数は中性子エネルギーに応じた関数であるため,データを群構造に分け,その群構造に応じた中性子フラックスを計算する必要がある.そこで,人体の軟部組織を想定した均質なファントムに対し,BNCT用のビームを照射する計算体系において,従来から用いられているMonte Carlo計算と,新たに開発した決定論的線量計算コードとで,比較評価を実施した.Monte Carlo計算で導出される線量を真値とし,開発中の決定論的線量計算コードにより算出された結果を,エネルギー群構造の違いごとに評価した.本評価により,エネルギー群構造の違いによって,導出された線量精度と計算に要する時間が異なることが確認できた.また,開発中の決定論的線量計算コードは,将来的に人体での線量評価に適応させることを目標としている.その際基準とするのは,従来使用実績のあるMonte Carlo計算による線量である.そこで,次年度以降人体のCT画像のように複雑な計算体系についても比較評価できるよう,大容量データに対するMonte Carlo計算の実施環境も構築した.本研究は,BNCTにおける線量評価に関し,これまで広く使用されてきたMonte Carlo計算に対して,計算速度で優位な新たな線量計算法(決定論的線量計算コード)の開発と実用化を目指すものである.平成26年度には,決定論的線量計算コードの基盤プログラムを開発し,取り扱いデータを群構造とすることで,高速な線量計算ができることを確認した.平成27年度は,前年度に得られた結果を鑑み,基盤プログラムに潜在する課題を抽出した.人体のような比較的大きな対象を想定したファントムにおいて,Monte Carlo計算と決定論的線量計算コードで,中性子束の深度分布を取得した場合,Monte Carlo計算においては,ビーム深部に進むほど,中性子束が減衰することが確認できた.一方,決定論的線量計算コードを用いて計算を行うと,ファントム深部10 cm程まではMonte Carlo計算と同等の結果を取得できるが,それより深部においてMonte Carlo計算結果と乖離が生じることが分かった.また,中性子束とカーマ係数を乗じることで算出した線量の深部分布に変換した場合,Monte Carlo計算の計算値と乖離する傾向は,取り扱うデータの群構造に依存して異なることも確認でき,取り扱い群構造が少ない場合には,その乖離が大きくなることを突き止めた.これを解決する方法として,決定論的線量計算コードで中性子束の空間分布を取得するときに,加速パラメータを設け,それを最適化するなどの工夫が必要であるとの見解を得た.平成26年度には,開発した基盤プログラムによって,簡易的な水ファントム内において中性子束の空間分布を計算することができ,かつ従来のMonte Carlo計算よりも高速計算が可能であることを実証した.平成27年度には,本プログラムによって,BNCTの線量評価で必要となる中性子に由来する3種類の線量(ホウ素線量,水素線量,窒素線量)を算出できることも確認した.一方で,本プログラムに潜在している課題,すなわち,ファントムの深部(10 cm以上深い部分)において,中性子束の値が真値に収束していないことを突き止めたことは,今後より良いプログラムを開発するために重要な成果である.平成26年度には,拡散方程式を解くことによって中性子束の空間分布を決定論的に導出する計算コードの基盤プログラム(NCT-HighSpeed)を開発し,並行して中性子束から線量へと換算するためのデータセット(カーマ係数)を整備した.平成27年度には,内部構造が均質なファントムモデルに対して,NCT-HighSpeedで求めた熱中性子束の空間分布と,従来のMonte Carlo法で求めた熱中性子束の空間分布を比較し,ファントム深部10 cm程度までの範囲で,NCT-HighSpeedの計算値が,Monte Carlo法とほぼ同等の値を得られることを確認した.また,NCT-HighSpeedによる計算時間は,Monte Carlo法に比べて格段に短いことを確認した.一方,中性子束とカーマ係数とを乗じて線量を算出した場合,NCT-HighSpeedの値が,Monte Carlo法の値に比べて乖離することがあり,その原因が,中性子束を算出する際のエネルギー群構造に依存しており,エネルギー群構造を細かく設定すれば,その乖離は小さくなる一方で,計算時間は長くなることを突き止めた.

平成28年度には,複雑な形状を有する人体ファントムのCT画像においても,NCT-HighSpeedが動作するための環境を整備し,均質なファントムでの試験と同様,Monte Carlo法との比較を実施した.人体ファントムモデルにおいても熱中性子束の空間分布は良好な結果を示し,その計算を応用した内容について論文化した.本研究ではホウ素中性子捕捉療法に最適化した拡散方程式を用いた新たな計算プログラムを開発した.本プログラムによって,均質ファントム内における中性子束空間分布計算を,従来のモンテカルロ法に比べ圧倒的に高速化することに成功した.また,中性子束から線量を算出する換算係数も整備し,臨床的に必要な種々の線量への換算も実現した.さらに実際の治療計画を想定し,CT画像ベースでの線量計算ができるようプログラムを改良した.それにより,人体頭部ファントムを用いた中性子束空間分布および線量計算にも成功した.本研究で開発したプログラムは従来法に比べ高速演算が可能であり,今後新たなツールとして活用できると期待される.決定論的線量計算コードの基盤プログラムを構築し,簡易的なファントムモデルに対して,決定論的線量計算コードを用いて線量を算出できる環境を整えた.また,今後は従来BNCTにおいて線量計算を担ってきた,Monte Carlo計算による線量と比較していくことが必要となることを鑑み,人体のCT画像から構成する計算モデル(ボクセルモデル)のような,大容量のメモリが必要となる体系について,計算を実行できる環境も整えた.平成27年度に得られた課題をどのように解決していくかを検討する.まず,決定論的線量計算コードに,上述のような加速パラメータ(ウェイト)を使用した場合,どの程度の深部まで中性子束の空間分布が改善されるか,について検討する予定である.ただし,本プログラムが活用できるBNCTにおいては,比較的浅い領域(皮膚面およびそこから数cm内)が治療対象領域であるので,現状比較的良好な結果が得られている10 cm内に限って運用する,という解もあると考えている.そのような場合には,これまで得られている成果以上の高速化を目指し,並列化計算システムを導入することも検討する.医学物理学開発中の決定論的線量計算コードは,エネルギーを群構造として扱うため,その群構造が粗ければ線量計算精度は落ちる反面,計算時間は短くすることができる.一方,群構造を細かくすれば,線量計算精度を高めることができるが,計算時間が長くなってしまう.平成26年度に実施した評価によって,線量計算精度と計算時間との間に,トレードオフの関係があることが把握できた.
前虚血操作の虚血再灌流障害に対する腎保護作用とｒｅｍｏｔｅ作用の検討

腎虚血再灌流障害モデルを作成し、ischemic preconditioningの有効性とその背景を明らかにすることを目的とし研究を行った。このモデルにより尿細管障害の程度はpreconditioningを行うことにより有意に改善することが分かった。網羅的遺伝子発現解析を行った結果、虚血再灌流後の組織障害に関与する因子としてPICAに着目した。HK2細胞を低酸素状態におくとこの因子がmRNAレベルで発現上昇していることが確認できた。この分子はATF4などの小胞体ストレスに関わる分子を制御することが示されている。この結果に基づき、小胞体ストレスとこの遺伝子の関連について現在解析中である。虚血再灌流実験後の組織障害の程度について血清のクレアチニン値、BUN値では有意差を認めなかった。このためpreconditioningの有無による腎機能障害の程度を組織切片の尿細管障害をスコア化することにより評価した。また、網羅的遺伝子発現解析の結果、虚血再灌流後の組織障害に関与する可能性のある因子として遺伝子Aに着目した。虚血再灌流にこの因子が関わることを示すためにヒト正常尿細管由来細胞であるHK2を用いてin vitroでの実験を行った。阻血に伴う腎機能の低下を最小限にすることを目的として、ischemic preconditioningの腎保護作用とその機序の解明、および心臓へのremote作用の解明を目的として研究を行った。まず、腎虚血再灌流障害モデル作成し、腎虚血再灌流障害に対するischemic preconditioningの至適設定条件の検索を行った。評価は血液学的検査と病理学的検査における虚血後変化を観察することにより行った。腎機能障害の高度であったモデルにおいては、組織全体の障害の程度には差は認めないものの、摘出腎での尿細管壊死の所見も高度であり、相関が認められた。一方で、ischemic preconditioningによる血液学的検査の腎機能障害および組織障害の程度はコントロール群と比較して低減される傾向はみられるものの有意差が認めなかった。その結果、尿細管障害の程度はpreconditioniingを行うことにより有意に改善することが分かった。続いて、この組織を用いて網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、虚血再灌流後の組織障害に関与する可能性のある因子として遺伝子Aに着目した。この遺伝子AはATF4などの小胞体ストレスに関わる分子を制御することが示されている。今後はこの遺伝子AとHIF-1αとの関係の解明、下流分子の制御機構の解明を通して、虚血再灌流後の腎尿細管障害からの再生メカニズムに関わる重要な遺伝子であるかどうかさらに研究を進めてゆく予定である。小径腎細胞がんに対する腹腔鏡下腎部分切除術が多く施行されるようになっている。同手術の際に生じる阻血に伴う腎機能の低下を最小限にすることを目的として、ischemic preconditioningの腎保護作用とその機序の解明、および心臓へのremote作用の解明を目的として研究を行った。腎虚血再灌流障害モデル作成においては、まず、右腎の摘出を行い体側腎の代償性腎機能のファクターを取り除いた。続いて腎虚血再灌流障害に対するischemic preconditioningの至適設定条件の検索を行うため、左腎動脈5分間単回阻血や左腎動脈1分間阻血およびその後の再灌流を繰り返す方法などを行い、最大限のischemic preconditioning効果が得られる方法を検討した。評価は血液学的検査(BUN,Cr)と病理学的検査における虚血後変化を観察することにより行った。血液学的検査にて腎機能障害の高度であったモデルにおいては、摘出腎での尿細管壊死の所見も高度であり、相関が認められた。一方で、現時点では、ischemic preconditioningによる血液学的検査の腎機能障害および組織障害の程度はコントロール群と比較して低減される傾向はみられるものの有意差が認められていない。今後、最大限のischemic preconditioning効果が認められる条件の検討を進め、至適設定条件を決定したのちに、VEGF、HIF-1、EPOなどの分子が腎虚血再灌流障害の低減に果たす役割、分子機構の解明および他臓器へのremote作用について解明していく予定である。preconditioningの有無による虚血再灌流後の腎機能障害に与える影響を評価が困難でありその評価方法の検討に時間を要した。23年度中にischemic preconditioningの至適設定条件の決定が終了する予定であったが、現時点で、その設定条件が決定していない。

現在着目している遺伝子Aはその遺伝子の5'にHRE(Hipoxia responce element)を持つ可能性がin silicoの実験で示唆されている。このことからまずこの因子が低酸素によるHIF1αの活性化により誘導される因子であることを確認する。方法としてはHIF1αでのChip assayやルシフェラーゼassayにより確認する。また遺伝子Aは小胞体ストレスに関与する遺伝子として着目されておりPreconditioningの有無と小胞体ストレスの関連について検討することを予定している。次年度への繰越額はHIF1αでのChip assayやルシフェラーゼassayに必要な物品の購入や小胞体ストレスの評価に必要な抗体の購入、PCRなどを行う経費として使用する予定である。最適化されたischemic preconditioning下で得られた虚血再灌流モデルの腎組織を使用し、マイクロアレイによる腎保護の分子機構のスクリーニングおよびWestern blotting、リアルタイムPCR等による解明を予定している。繰越分に対しては、経時的遺伝子発現解析をマイクロアレイを用いて行う予定である。
精神疾患病態解明を目的としたNG2(+)細胞時期特異的障害マウスの作製

本研究では、統合失調症の発症メカニズムやその病態に対してNG2(+)細胞がどのように関与しているかを明らかにするため、時期特異的にNG2(+)細胞を障害(細胞死)させることが可能なマウス(NG2(+)細胞時期特異的障害マウス)を作製した。このNG2(+)細胞時期特異的障害マウスに薬剤(tamoxifen)を連続投与することで、半数のNG2(+)細胞に障害を与え、細胞死させることが可能であった。統合失調症は重篤な精神疾患の代表例であるが、原因や病態メカニズムには不明な点が多い。我々は、これまでに死後脳遺伝子発現解析、集団遺伝学的解析、および実験動物を用いた多方面からの解析を行った結果、多能性を有するNG2(+)細胞が統合失調症の発症に重要な役割を担っていることを示唆するデータを得ている。そこで本研究では、統合失調症の発症メカニズムやその病態に対してNG2(+)細胞がどのように関与しているかを明らかにするため、時期特異的にNG2(+)細胞を障害させることが可能なマウス[時期特異的NG2(+)細胞障害マウス]を作製した。このマウスは、NG2プロモーター制御下でCreERを発現するtransgenic(Tg)マウス(NG2-CreER)とCAGプロモーターの下流にfloxed Neo-DTAを配置したTgマウス(CAG-floxed Neo-DTA)を交配することで作製した。この時期特異的NG2(+)細胞障害マウスでは、全身のNG2発現細胞が障害されるため、中枢神経系(CNS)のNG2(+)細胞特異的に障害を与えるマウス[CNS特異的NG2(+)細胞障害マウス】の作製も行った。CNS特異的NG2(+)細胞障害マウス作製するために、CNSのNG2(+)細胞特異的に発現している遺伝子を調べた。NG2(+)細胞が赤色蛍光蛋白質DsRedで標識されるNG2-DsRed Tgマウスの脳切片をNestin、PDGFRA、Olig2、FABP7の抗体で免疫染色した結果、ほとんどのNG2(+)細胞においてPDGFRAが発現しており、他のNG2発現細胞(pericyteなど)では、PDGFRAの発現が見られなかった。この結果より、NG2とPDGFRAのプロモーターを用いることでCNSのNG2(+)細胞特異的に発現制御が可能なことが明らかとなった。
咀嚼機能低下と動脈硬化・認知機能との関係：特に遺伝要因との交互作用の検討

地域高齢者の疫学研究の結果から,残存歯数と平均歯周ポケット深さは,高血圧,認知機能といずれも有意な関連がみられた.一方,いくつかの循環器系疾患ならびに認知症関連遺伝子と歯数ならびに平均歯周ポケット深さとの間に,有意な関連がみられた.一般線型モデルによる分析の結果,高血圧,認知機能を従属変数とした場合,遺伝因子と歯数ならびに歯周ポケット深さの間に交互作用は見られなかった.以上の結果より,歯科疾患と循環器系疾患や認知機能との間には,共通の遺伝素因があることが示唆された.我々は,疫学研究から,これまでに,従来言われてきた歯周病とは独立して,咬合状態が動脈硬化と関連のあることを疫学的研究で示した.これには,どちらか一方が他方に影響を与えていることや,両者に共通の環境要因や遺伝要因があることが考えられる.本研究では,歯の欠損と心血管系疾患との関係の一部を明らかにするため,歯の状態と心血管系疾患の候補遺伝子との関係を分析した.遺伝子解析の同意の得られた兵庫県伊丹市,朝来市在住の70歳,80歳の計936名(男性456名,女性480名)を対象とした.老化・動脈硬化との関連が示唆されたKlotho遺伝子の一塩基多型(SNP)であるrs650439,長寿・メタボリックシンドロームとの関連が示唆されたADAR遺伝子のSNPであるrs2805533,rs17221652,高血圧・動脈硬化との関連が示唆されたRGS2遺伝子のSNPであるrs2746071の遺伝子型をTaqMan PCR法により決定した.上記の4SNPの遺伝子型と平均ポケット深さ,最大ポケット深さ,残存歯数との関連について,Kruskal-Wallis検定ならびにMann-WhitneyのU検定を用いて検討を行った.統計学的有意水準は5%とした.4SNPとも,最大ポケット深さ,平均ポケット深さについては遺伝子多型間で有意な差を認めなかった.一方,rs2746071のAA遺伝子型の者は,歯数が有意に少なかった.(AA: 17.3本,AG+GG: 18.8本,P<0.05)他の3SNPについては,残存歯数との関連はみられなかった.すなわち,一部の心血管系疾患の候補遺伝子と残存歯数との間に有意な関連がみられた.目的:動脈硬化性疾患の代表的指標である,頸動脈内膜中膜複合体肥厚度(以下IMT)に着目し,口腔健康とIMTとの関係が,遺伝因子を考慮した上でも成立するのかを,量的遺伝学の手法を用い,検討することを目的とした.方法:50歳以上を今回の分析対象者とした.最初の解析は,対象者全体において,年齢,性別,喫煙の他,歯数,平均歯周ポケット深さ,咀嚼能率など,それぞれの変量とIMT値との2変量間の関連を検討した.次に,ふたごという対象内相関を一般化線形モデルに取り込み,一般化推定方程式Generalized Estimating Equations (GEE)を用いて,口腔健康と動脈硬化の関連を検討した.本分析において,最大IMT値が1.0mmより高値である者を動脈硬化罹患群,1.0mm以下を動脈硬化非罹患群とした.さらに,一卵性ペア全体を抽出し,非喫煙者のみで,ペア間でのIMT値の差を目的変数に,同様にペア間での歯数の差を説明変数とした上で,ふたご内の差を用いた回帰分析を行い,これらの関連を検討した.いずれの検定においても有意水準は5%とした.結果:被験者数は268名(平均年齢66.6±10.1歳)で,そのうち236名(男性:86名,女性:148名)が一卵性,32名(男性:16名,女性:16名)が二卵性であった.残存歯数は,平均21.2±9.0本であった.2変量間の関係では,高年齢,男性,喫煙経験あり,歯数が少ない,歯周ポケットが深い,咀嚼能率が低いほど,IMT値は有意に高値となった.GEEの結果,歯数,歯周ポケット,咀嚼能率は動脈硬化の罹患と有意な関連が認められたが,年齢,性別,喫煙の有無を調整したところ,歯数のみに有意な負の関連が認められた.5本を単位としたodds比は0.72 (95%CI: 0.52, 0.99)であった.最後に,遺伝因子が等しい一卵性ペア内の差を用いて回帰分析を行った結果,歯数の差は,IMTの差と有意な正の関連が認められた(p=0.01).

我々は,疫学研究から,これまでに,従来言われてきた歯周病とは独立して,咬合状態が循環器系疾患や認知機能と関連のあることを疫学的研究で示した.これには,どちらか一方が他方に影響を与えていることや,両者に共通の環境要因や遺伝要因があることが考えられる.今回は,歯数や歯周病と循環器系疾患や認知機能との関係のを明らかにするため,歯の状態と心血管系疾患ならびに認知症,またそれら疾患の候補遺伝子との関係を分析した.遺伝子解析の同意の得られた兵庫県伊丹市,朝来市在住の70歳,80歳の計1855名を対象とした.動脈硬化関連遺伝子ACE,ACE,RGS2の一塩基多型(SNP),老化関連遺伝子KlothoのSNP,高血圧関連遺伝子CASZ1,CSK,ATP2B1のSNP,長寿・メタボリックシンドローム関連遺伝子ADAR遺伝子のSNP,認知症関連遺伝子のAPOE,TOMM40,BDNF-AS,BLMHのSNIPをTaqMan PCR法により決定した.その結果,残存歯数は高血圧,糖尿病,認知機能といずれも有意な関連がみられた.また,平均歯周ポケット深さは,高血圧ならびに認知機能と有意な関連がみられた.一方,BDNF-AS,BLMHと歯数,ならびにCSK,RGS2,BDNF-ASと平均歯周ポケット深さとの間に,有意な関連がみられた.一般線型モデルによる分析の結果,高血圧,認知機能を従属変数とした場合,歯数ならびに歯周ポケット深さに交互作用は見られなかった.以上の結果より,歯数や歯周病と循環器系疾患や認知機能との間には,共通の遺伝素因があることが示唆された.地域高齢者の疫学研究の結果から,残存歯数と平均歯周ポケット深さは,高血圧,認知機能といずれも有意な関連がみられた.一方,いくつかの循環器系疾患ならびに認知症関連遺伝子と歯数ならびに平均歯周ポケット深さとの間に,有意な関連がみられた.一般線型モデルによる分析の結果,高血圧,認知機能を従属変数とした場合,遺伝因子と歯数ならびに歯周ポケット深さの間に交互作用は見られなかった.以上の結果より,歯科疾患と循環器系疾患や認知機能との間には,共通の遺伝素因があることが示唆された.被験者のデータも順調に集まり,遺伝子の解析も順調に進んでいる.27年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学今回は双子のデータを中心に解析したが,今後は80歳,90歳の疫学データの解析のスピードを速めて行きたい.被験者の血液サンプルも順調に集まり,遺伝子の解析も順調に進んでいる.27年度が最終年度であるため、記入しない。被験者数が,予想を若干下回ったため.27年度が最終年度であるため、記入しない。80歳,90歳のサンプルもあるので,遺伝子解析スピードを速めて行きたい.候補遺伝子の種類を増やし,遺伝子解析をより詳細に行い,遺伝・環境交互作用の解明ににつなげる.27年度が最終年度であるため、記入しない。物品費が予想より安く抑えられたため.候補遺伝子を増やし,分析を充実させる.
寄生虫と耳石を生物標識として活用したニホンウナギの生活履歴の高精度解析

耳石と寄生虫を生物標識として用いることにより、これまでほとんど知見がなかった、ニホンウナギの汽水域における生態を明らかにすることができた。特に、汽水域に生息するニホンウナギに寄生する線虫類の1種(ヘリコネマ・アンギレ)に注目して研究したところ、本種の中間宿主がカニ類であり、ニホンウナギは汽水域でカニ類を含む底生生物を捕食していることを明らかにすることができた。また、汽水域のニホンウナギには、単生類の1種(シュウドダクチルス・カメガイイ)が寄生していた。これは、この寄生虫が個体群を維持できるほど,汽水域にはニホンウナギ資源が安定して存在することを示している。昨年度に引き続き,愛媛県にある御荘湾と流入河川において採集したニホンウナギを対象に,耳石の微量元素分析を実施して主な生息域を特定するとともに,寄生虫を採集して,それら寄生虫の出現状況が生息域とどのように対応するかを検討した。その結果,流入河川の淡水域で生活していたニホンウナギはアカントケファルス属鉤頭虫の寄生を高率に受けており,淡水域で中間宿主の等脚類を餌生物として利用していることが明らかになった。また,中間宿主候補と考えられた等脚類を実際に採集して検査したところ,鉤頭虫の幼虫を検出できた。一方,御荘湾の汽水域で採集したニホンウナギの胃にはヘリコネマ属線虫の重度寄生が見られた。このため,御荘湾沿岸域において,中間宿主の可能性のあるカニ類等を採集して,ヘリコネマ属線虫の寄生の有無を調べたところ,ウナギへの感染能力を有する幼虫を見出した。このことから,ニホンウナギは汽水域においてカニ類等を多く捕食して,ヘリコネマ属線虫の感染を受けると推測された。また,流入河川でニホンウナギと同所的に生息するオオウナギの寄生虫相を調べた結果,淡水域のニホンウナギの寄生虫相と大きな差がないことが明らかになった。以上の調査に加えて,他地域からもニホンウナギを採集して,寄生虫相を調べた。その結果,過去にニホンウナギから報告されていない寄生虫(例えばイソパロルキス属吸虫)が見いだされ,寄生虫相に関する新たな知見を得ることができた。愛媛県にある御荘湾と流入河川において採集したニホンウナギを対象に,耳石の微量元素分析を実施して回遊型を識別するとともに,鰓に寄生する単生虫類を同定して,各種の出現状況を回遊型ごとに検討して,調査地におけるニホンウナギの水域利用と単生虫類の分布特性を明らかにした。具体的には,御荘湾の湾奥部と流入河川の蓮乗寺川と僧都川の下流域においてニホンウナギを採集して頭部から耳石を摘出し,ストロンチウムとカルシウムの濃度を測定してその比に基づいて,ニホンウナギの回遊型を識別した。また,耳石を摘出したニホンウナギの鰓に寄生する単生虫類を採集して,種の同定を行った。その結果,ニホンウナギには4つの回遊型(I型:淡水域のみに生息した個体,II型:淡水域と低塩分域を交互に移動した個体,III型:淡水域で生活後に汽水域に移動した個体,IV型:汽水域に留まった個体)が認められた。また,単生虫類にはシュードダクチルスPseudodactylogyrus属の3種が認められ,それらはアンギレP. anguillae,ビニP. bini,カメガイイP. kamegaiiであった。これら単生虫類は,アンギレがニホンウナギI型,ビニがI型,カメガイイがIV型に主に寄生していた。これにより,ニホンウナギには異なる水域を利用する複数の回遊型が確認されるとともに,それら回遊型には異なる単生虫類が寄生していることが明らかになった。特に,汽水域での生活履歴があるニホンウナギにカメガイイが見られたことは,この寄生虫が個体群を維持できるほど,汽水域にはニホンウナギ資源が長期的に安定して存在することを示した。愛媛県御荘湾における昨年度の研究成果に基づき,ニホンウナギの胃に寄生するヘリコネマ属線虫の中間宿主を探索する調査を鹿児島県錦江湾に流入する河川の河口汽水域で行った。この水域に生息するニホンウナギにもヘリコネマ属線虫の重度寄生が見られ,河口域で採集したカニ類にも本線虫の幼虫が高頻度で寄生していた。この結果は,昨年度の愛媛県御荘湾での結果を裏付けるものであり,ヘリコネマ属線虫がに汽水域のカニ類を中間宿主に用いて生活環を回していることが明らかになった。換言すれば,ヘリコネマ属線虫の寄生は,ニホンウナギが汽水域においてカニ類を捕食したことを示す証拠であると言える。上記調査に加えて,ヘリコネマ属線虫の種レベルでの分類を検討したところ,従来,言われてきたヘリコネマ・ロンギシマムではなく,ヘリコネマ・アンギレに同定するのが適切であることが明らかになった。鹿児島県錦江湾の流入河川と佐賀県有明海の流入河川の河口域において,ニホンウナギを採集して,その胃内容物と胃に寄生するヘリコネマ・アンギレの寄生状況を調べた。その結果,ニホンウナギはこれら水域で多様な底生動物を捕食し,そのなかにはヘリコネマ・アンギレの中間宿主となっているケフサイソガニ属2種(ケフサイソガニとタカノケフサイソガニ)を含んでいることが明らかになった。前年度の調査により,ニホンウナギにおける本線虫の寄生は,本魚種によるカニ類捕食の間接的な証拠であることが示唆されていたが,本年度の調査結果はそれを裏付けた。また,大分県豊後水道に流入する河川の河口域で採集したニホンウナギにヒダビルの寄生を認めた。

これにより,汽水域でヒダビルがニホンウナギを宿主として利用することが明らかになった。耳石と寄生虫を生物標識として用いることにより、これまでほとんど知見がなかった、ニホンウナギの汽水域における生態を明らかにすることができた。特に、汽水域に生息するニホンウナギに寄生する線虫類の1種(ヘリコネマ・アンギレ)に注目して研究したところ、本種の中間宿主がカニ類であり、ニホンウナギは汽水域でカニ類を含む底生生物を捕食していることを明らかにすることができた。また、汽水域のニホンウナギには、単生類の1種(シュウドダクチルス・カメガイイ)が寄生していた。これは、この寄生虫が個体群を維持できるほど,汽水域にはニホンウナギ資源が安定して存在することを示している。本研究は,寄生虫と耳石を生物指標に用いてニホンウナギの生態を解明するものであり,宿主のニホンウナギを採集することが研究の第一歩である。しかし近年,ニホンウナギの資源が著しく減少しているため,材料魚の入手にしばしば困難を伴うことがあり,研究の進展がやや遅れ気味である。水産増殖学これまでは愛媛県御荘湾と鹿児島県錦江湾を中心として,ニホンウナギの採集を行ってきたが採集した尾数は不十分である。今後は,採集範囲を拡大して,材料魚の確保に努める。本研究は,魚類の耳石微量元素分析と寄生虫相解明という異なる手法を用いて,多くが未解明であるニホンウナギの生態を明らかにするものである。研究第2年目の平成25年度には,耳石からのデータに基づいてニホンウナギの生活履歴をより明確した後に,主要な寄生虫の中間宿主に焦点を当てて研究した結果,淡水域や汽水域において等脚類やカニ類がニホンウナギの餌生物として重要であることを明らかにすることができた。換言すれば,寄生虫研究を通して,ニホンウナギの食性を解明しつつあると言える。本研究は,魚類の耳石微量元素分析と寄生虫相解明という,異なる手法からの生物情報に基づいて,宿主魚類(ニホンウナギ)の生態を解明しようとするものである。研究第1年目の平成24年度には,両者の研究結果がうまくかみ合って,ニホンウナギの多様な生活様式と寄生虫の生態(特に分布特性)を明らかにすることができた。本研究はニホンウナギの寄生虫を対象としているため,研究の遂行には,日本各地で生きたニホンウナギを購入する必要があった。しかし近年,ニホンウナギ資源が減少しているため,当初計画していた採集地でのニホンウナギの購入が困難になり,未使用額が生じた。御荘湾地域に加えて,日本各地でニホンウナギを採集して,耳石微量元素分析と寄生虫相解明を継続して行い,地域による寄生虫相の違いなどから,ニホンウナギの多様な生活様式の解明を図る。特に,生態的知見が極めて不足している汽水域のニホンウナギに焦点を当てて研究を進める。愛媛県の御荘湾とその流入河川において標本採集を継続するとともに,日本国内の他水域においてもニホンウナギを採集して,耳石微量元素分析と寄生虫相解明を行い,ニホンウナギの多様な生活様式の解明を図る。未使用額を主に旅費として用いる:具体的には,これまでの採集地である愛媛県御荘湾と鹿児島県錦江湾に加えて,山口県の瀬戸内海流入河川において,ニホンウナギを採集する計画である。ニホンウナギ資源が著しく減少しているため,当初予定していた場所でのサンプリング・購入が容易に実施できなかったことが,前年度に未使用額が生じ,その結果として次年度の使用額に変更が生じた。
核酸のエピジェネティック修飾の化学的検出

RNAのエピジェネティックな修飾は、遺伝子発現、細胞分化、転写後の多くの生物学的機能を制御しており、その検出に対する研究が分子レベルで進められなければならない。しかしながら、RNA修飾に対する効果的な研究手法が未熟であり、チャレンジングな挑戦課題として残されている。上述のm6Aは以前からその存在は指摘されているところであるが、それを効率的に検出できる手法は開発されていない。したがって、配列選択的でかつ簡便で信頼できるm6A検出法が求められている。m6Aを認識する新しい酵素ALKBH5と呼ばれる酵素は、ノンヘム鉄と2-ケトグルタル酸を含む酸化酵素であり、m6Aを酸化的に脱メチル化する。ALKBH5は、m6Aの認識分子として有効かもしれない。本研究では、ALKBH5の核酸修飾を用いて、m6Aを配列特異的に認識する系を開発した。1)酵素群の発現:ALKBH5 FL、ALKBH5 CD、Sortase Aを発現させた。ALKBH5については、特に精製を簡便化するためにチオレドキシン部分を連結したものを用意した。2)トランスペプチデーション:ALKBH5と核酸を結合するために、まずSortaseAを用いた。アジド基を含むGGGK-アジドとDBCO基を含むRNAを用意した。ALKBH5のC末端は、LPETGGで終えているので、それとGGGK-アジドおよびSortaseAと混合することにより、トランスペプチデーションを引き起こし目的のアジド修飾C末端を含むALKBH5を得ることができた。さらに、DBCO標識したRNAとアジド修飾ALKBH5を混合することにより、RNAが連結したALKBH5を得ることができた。3) m6Aの配列選択的脱メチル化について:候補になるm6A修飾RNAを合成した。前項で得られたRNA連結ALKBH5の量が本事件を行うには十分な量ではなかったため、追合成中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。エピゲノム解析で新たに発見されたm6Aを始めとするDNA・RNA修飾を選択的に標識する化学的手法の確立を目指した。興味の対象は、メッセンジャーRNA中に散見されるN6-メチルアデノシン(m6A)の検出のための化学反応である。m6Aや3-メチルウリジンなどのRNAエピジェネティクスに関係する天然微量化学修飾は、翻訳異常に由来する疾病の原因になることが示唆されており、その効果的検出は興味のある研究対象である。われわれは、最近、DNAエピジェネティクスの根幹をなす天然微量化学修飾5-メチルシトシンや5-ヒドロキシメチルシトシンと選択的な化学反応を見出している。これらの反応は、他の未修飾シトシンに対する反応性がきわめて低いため、染色体DNA内の修飾シトシンの配列選択的蛍光観察を可能にした。しかし、RNAを含めた多様な天然微量化学修飾を網羅するにはまだ到達していない。特に、m6Aや3-メチルウリジンに対してはその変化の小ささのため、未修飾塩基と区別できる化学反応を特定するに至っていない。単純な化学反応ではなく、当該修飾塩基を認識する酵素を化学的に改変することが修飾塩基の標識への最も近道だと考え、この研究を推進する。まず、細胞機能制御の中で重要な位置を占めるm6A脱メチル化酵素FTOの効率的検出をターゲットとし、m6A近傍に光親和性クロスリンクジアジリンを導入したRNAを合成することを試みた。まず、m6Aを3段階で化学合成し、RNAへ固相合成法を用いて導入した。現在、この合成m6A-RNAを用いて、FTOの結合を評価している。

前項で得られたRNA連結ALKBH5の量が本事件を行うには十分な量ではなかったため、追合成中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた実験計画を逸脱することなく、着実に実験が進行している。当初の予定にしたがって、m6A近傍に光親和性クロスリンクジアジリンを導入したRNAを合成し、FTOとの光クロスリンクを目指す。
新規核内IκB分子IκBLによる炎症反応制御

ゲノムワイド関連解析により、関節リウマチなど各種自己免疫疾患に関連する遺伝子として報告されていたI kappa B-like (IkBL)の炎症反応制御への寄与について検討した。過剰発現マウスでは関節炎が緩和したが、主としてマクロファージなど自然免疫系細胞の機能低下によるものであった。一方KOマウスに盲腸結索穿刺による敗血症、LPS投与による急性炎症を誘導したところ、有意の差が認められなかった。IkBLは核への移行に依存してNFkBの活性を抑制し、RelB蛋白に特異的に結合した。RelBの機能修飾を介して炎症反応制御に関わることが示唆されたが、生理的意義についてはさらなる検討が必要である。炎症反応の遷延は様々な難治性疾患の要因となる他、老化に伴う諸症状の基盤の一つともなっている。IκBL(IκB like)は関節リウマチ患者のゲノムワイド関連解析から、疾患感受性との関連が示唆された遺伝子である。国内外のいくつかのグループにより、関節リウマチの他、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、Takayasu血管炎等各種自己免疫疾患との関連も報告されている。IκBLートランスジェニックマウス、IκBLーKOマウスにコラーゲン誘導関節炎を起こしたところ、前者では関節炎の重症度が有意に低下し、後者では関節炎発症の早期化が見られた。この事はIκBLが関節炎発症に抑制的に働く事を示している。IκBL遺伝子を、HEK293細胞、RAW264.7細胞にκB配列依存にルシフェラーゼ活性を発現するレポーター遺伝子とともに遺伝子導入したところ、NFκB活性は有意に抑制した。この活性にはIκBLに含まれる核移行シグナル(NLS)に依存する事から、IκBLは核内IκB分子の一員であると思われる。遺伝子改変動物並びに遺伝子導入細胞を用いて、IκBLが炎症反応の制御に果たす役割と分子機構について明らかにしていきたい。関節リウマチほか、全身性エリテマトーデス、高安血管炎などの自己免疫疾患患者のゲノムワイド関連解析から、疾患感受性遺伝子候補として同定されたのがIκBL(IκB-like)である。IκBLトランスジェニックマウスはコラーゲン誘導型関節炎(Collagen-induced arthritis, CIA)に対して抵抗性に働く事から、IκBLは関節炎の抑制因子であると考えられる。この際、マウスのT細胞機能はむしろ亢進の傾向があり、関節炎の抑制は主として樹状細胞、マクロファージなどの機能低下が要因と思われた。例えば、トランスジェニックマウス骨髄由来樹状細胞では、LPS刺激によるCD86発現誘導、IL-6, TNFαの産生が優位に低下していた。この結果は、HEH293, RAW264.7細胞を用いたレポーターアッセイで、κB配列に依存する転写活性がIκBLにより抑制される事と一致するものと思われた。以上はIκBLがNFκBの抑制因子である事を示唆するが、その機序は明らかではない。そこで各種deletion mutantを作製して解析したところ、IκBLのNFκB抑制効果は、N末側に存在するNLS(核移行シグナル)に依存する事があきらかとなった。、また、各種NFκB分子との結合を共沈実験により検討したところ、唯一RelBとの特異的結合が認められた。この事は、古典的なIκBファミリーが細胞質でパートナーと結合して核移行を阻害するのに対し、IκBLは核内でパートナー分子(主としてRelBと思われる)と会合して、その機能を修飾するものと考えられた。次にIκBLの生理的機能を調べる目的で、IκBLノックアウトマウスの解析を行った。まずは急性期炎症への影響を検討するため、(1)LPS腹腔内投与、(2)盲腸を結索し、針により腸内菌を腹膜内に播種するCLIP法を試した。(1)においてKOマウスの感受性がやや高い傾向を認めたが、優位な差とは認められなかった。結論を得るためには、更なる条件検討が必要と思われた。関節リウマチなど各種の自己免疫疾患患者のゲノムワイド関連解析から、疾患感受性遺伝子候補としてIkBL(NFKBIL1)が同定された。本研究計画では、IkBL遺伝子改変マウス及び各種培養細胞を用いて、IkBLの炎症反応制御について検討した。マウスへのコラーゲン投与による関節炎モデル(Collagen-induced-arthritis; CIA)において、IkBL過剰発現マウスでは症状が緩和された。これは主としてマクロファージなど自然免疫系細胞の機能低下によるものであった。そこでHEK293細胞、またRAW264.7細胞を用いて調べたところ、NFkBの転写活性がIkBL存在下で有意に低下し、この抑制活性はIkBLの核移行シグナル(NLS)に依存していた。NFkBの核移行を阻害する細胞質因子として各種IkBが知られているが、IkBLはこれら細胞質IkBと一部相同性を有しながら、核内で働く点が異なる。IkBLはBcl-3, IkBζ, IkBNSなどと同様、核内IkBファミリーの一員と考えることができる。IkBLの生理的機能を探索する目的でKOマウスを作成した。急性炎症モデルとして、盲腸結索後穿刺による敗血症モデル(CLIP法)、LPS投与を行い、生存率、血清内各種サイトカイン濃度、体温などを継時的に測定したが、コントロール群との有意差を認めなかった。また、KOマウス骨髄由来マクロファージのLPS刺激によっても、有意差が無かった。

以上より、IkBLはNFkBの転写活性を核内で抑制する能力を有するが、そのloss of function解析による生理的重要性については明らかにならなかった。一方、生化学的実験から、IkBLはNFkBファミリー分子の中でも、RelBとのみ強く結合することが明らかとなり、RelBの機能修飾を行う可能性が示唆された。今後の検討課題とすべきと思われる。ゲノムワイド関連解析により、関節リウマチなど各種自己免疫疾患に関連する遺伝子として報告されていたI kappa B-like (IkBL)の炎症反応制御への寄与について検討した。過剰発現マウスでは関節炎が緩和したが、主としてマクロファージなど自然免疫系細胞の機能低下によるものであった。一方KOマウスに盲腸結索穿刺による敗血症、LPS投与による急性炎症を誘導したところ、有意の差が認められなかった。IkBLは核への移行に依存してNFkBの活性を抑制し、RelB蛋白に特異的に結合した。RelBの機能修飾を介して炎症反応制御に関わることが示唆されたが、生理的意義についてはさらなる検討が必要である。昨年度はKOマウスの産仔数が思うように増えず、動物実験を行うのに支障があったが、本年はこの問題は解決した。実験数としてはまだ不十分なので、引き続き継続して行っていきたい。免疫学細胞生物学細胞株を用いた実験で、IκBL分子がどのように働くかについては基礎的知見が集積してきた。特に結合パートナーがRelBである事が明らかとなった事は重要で、主としてRelBにより担われる生体反応に着目してKOマウスでの挙動を検討すべきと思われる。遺伝子欠損マウスの繁殖効率が不良である。原因の詳細は不明であるが、マウスの健常な生存に当該遺伝子が何らかの寄与している可能性も考えられる。このため動物を用いた実験の実施が遅れており、改善を必要としている。一方、培養細胞への遺伝子導入による各種実験は順調に進行しており、いくつかの知見が明らかになりつつある。更なる進展を心がけたい。納入された消耗品が安価ですんだため。遺伝子変異動物の不足については、コロニーの拡大を行い改善したい。一方、培養細胞を用いた生化学的、分子生物学的実験を着実に進めて、IκBLがどのような分子機序によって炎症反応の制御に関わるのか、また、特に炎症反応の遷延化への関与が疑われるので、これを明らかにするためのin vitro, in vivo実験系の構築を目指したい。その一環として、高齢者における敗血症がしばしば重症化する事に着目している。敗血症はサイトカインストームによる超急性期のショック症状と、これに続く免疫抑制状態が予後を左右する重要な因子である事が明らかになってきた。これはヒト検体並びに老化実験動物を用いた敗血症モデルにおいても観察できる。このモデルにおける炎症反応制御システムの一環としてIκBLの関与について、検討を進めたい。今年度予算の物品費(培養関係試薬)として加算して使用したい。