hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周組織における仮足形成関連因子の発現・機能解析と制御機構の解明

歯周病は歯根膜および歯槽骨を含む歯周組織破壊を伴う疾患である。現在、歯周組織本来の機能・構造を回復する「歯周組織再生療法」が脚光を浴びているが、歯周組織再生の際、歯根膜および歯槽骨より、歯肉上皮および歯肉結合組織の増殖速度が速いため、歯肉のダウングロースが起こり、歯根膜の再生が困難であるため、歯肉上皮および歯肉結合組織の成長を抑制し、さらに歯根膜に対し再生を促す方法の確立が待望されている。本研究では、仮足形成関連タンパクであるPDZ-LIMファミリーに属するPDZ-LIM domain 5 (PDLIM5)に注目し、CRISPR-cas9によるPDLIM5ノックアウトおよびプラスミドベクターのトランスフェクションによりPDLIM5を過剰発現させたヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞を作製し、仮足形成、コラーゲンリモデリング、細胞の遊走能、線維形成能ならびにシグナリング経路の解析を行い、PDLIM5がヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞に及ぼす影響を検討する予定である。当初はプライマリーのヒト歯根膜細胞、ヒト歯肉上皮細胞として歯肉上皮癌由来の細胞株(Ca9-22細胞)を使用予定であった。しかし、より臨床に則すため、また安定した実験を進めるため、健常者の歯根膜細胞由来の株化されたヒト歯根膜細胞、健常者の歯肉上皮細胞由来の株化された歯肉上皮細胞を使用することとし、他機関の協力も得て、各々の細胞を使用可能としている。現在、CRISPR-Cas9の細胞への導入に期間を要したため、研究の進捗状況はやや遅れている。しかしながら、PDLIM5がヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞に及ぼす影響が証明されれば、歯周組織再生治療の際起こりうる、歯肉のダウングロース防止に応用できる可能性があると考えられるため、今後も研究計画通り実験を進めていく予定としている。当初はプライマリーのヒト歯根膜細胞、ヒト歯肉上皮細胞として歯肉上皮癌由来の細胞株(Ca9-22細胞)を使用予定であったが、より臨床に則すため、また安定した実験を進めるため、健常者の歯根膜細胞由来の株化されたヒト歯根膜細胞、健常者の歯肉上皮細胞由来の株化された歯肉上皮細胞を使用することとした。株化されたヒト歯肉上皮細胞使用に関し、他機関の承諾、また細胞を譲渡に多少期間を要した。しかし、各々の細胞を使用可能としている。また、CRISPR-Cas9の細胞への導入に期間を要したため、研究の進捗状況はやや遅れている。CRISPR-cas9によるPDLIM5ノックアウトおよびプラスミドベクターのトランスフェクションによりPDLIM5を過剰発現させたヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞における、仮足形成、コラーゲンリモデリング、細胞の遊走能、線維形成能ならびにシグナリング経路の解析の継続を行い、PDLIM5がヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞に及ぼす影響を検討する予定である。細胞は、より臨床に則すため、また安定した実験を今後も進めるため、健常者の歯根膜細胞由来の株化されたヒト歯根膜細胞、健常者の歯肉上皮細胞由来の株化された歯肉上皮細胞の使用を継続する。当初はプライマリーのヒト歯根膜細胞、ヒト歯肉上皮細胞として歯肉上皮癌

由来の細胞株(Ca9-22細胞)を使用予定であったが、より臨床に則すため、また安定した実験を進めるため、健常者の歯根膜細胞由来の株化されたヒト歯根膜細胞、健常者の歯肉上皮細胞由来の株化された歯肉上皮細胞を使用することとした。株化されたヒト歯肉上皮細胞使用に関し、他機関の承諾、また細胞を譲渡に多少期間を要した。しかし、各々の細胞を使用可能としている。また、CRISPR-Cas9の細胞への導入に期間を要したため、研究の進捗状況はやや遅れている。CRISPR-cas9によるPDLIM5ノックアウトおよびプラスミドベクターのトランスフェクションによりPDLIM5を過剰発現させたヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞における、仮足形成、コラーゲンリモデリング、細胞の遊走能、線維形成能ならびにシグナリング経路の解析の継続を行い、PDLIM5がヒト歯根膜細胞およびヒト歯肉上皮細胞に及ぼす影響を検討する予定である。細胞は、より臨床に則すため、また安定した実験を今後も進めるため、健常者の歯根膜細胞由来の株化されたヒト歯根膜細胞、健常者の歯肉上皮細胞由来の株化された歯肉上皮細胞の使用を継続する。当該助成金が発生して理由として、実験の進捗状況がやや遅れていることが考えられる。次年度は、実験が進むにあたり、実験材料費が前年度より生じる予定である。今後も、実験材料費、また、研究結果発表予定のため学会参加費、旅費として、使用予定である。
一過性局所脳虚血による脳傷害に及ぼす特異的σリガンドの治療効果に関する研究

平成8年度一過性局所脳虚血に対するPPBPの治療効果に関する研究ウィスター系ラットのオスでハロセン麻酔下に右総頚動脈より中大脳動脈分岐点まで4-0ナイロン糸を2cm挿入して、虚血を作成し、2時間後にこれを抜去し、再潅流を行った。虚血1時間後より、σレセプタに親和性の高いPPBP[4-phenyl-1-(4-phenylbutyl)piperidine]または生理食塩水を静脈内持続注入した。22時間の再潅流後、脳を2mmの厚さにスライスして、2%の2,3,5- triphenyltetrazolium chlorideにより染色し、大脳半球および、線条体の傷害体積とその比率を求めた。線状帯の傷害体積は、コントロール群が44±4mm^3に対して、PPBPで治療した群が19±4mm^3と小さかった。しかし、大脳皮質の傷害体積は統計学的な有意差を認めなかった(コントロール群136±27mm^3;PPBP群80±28mm^3)。この結果から、一過性の局所脳虚血に対して、σ受容体リガンドの投与は治療効果があることを示唆している。平成9年度一過性局所脳虚血に対するσレセプタサブタイプの脳保護効果に関する研究上記同様のモデルで、虚血1時間後より、σ_1レセプタに親和性の高い(+)ペンタゾシンまたは、σ_1レセプタに親和性のない(-)ペンタゾシンを静脈内持続注入した。線状帯の傷害体積は、(-)ペンタゾシン群は44±5mm^3に対して、(+)ペンタゾシンで治療した群が19±4mm^3と小さかった。また、大脳皮質の傷害体積は、(-)ペンタゾシン群134±29mm^3に比し、(+)ペンタゾシン群は26±12mm^3と小さかった。この結果と(+)ペンタゾシンがσ_1レセプタに強い親和性をもっていることから、一過性の局所脳虚血の保護作用に関して、σ_1受容体が重要な役割を演じていると考えられる。平成8年度1)一過性局所脳虚血に対するPPBPの治療効果に関する研究ウィスター系ラットのオスでハロセン麻酔下に大腿動・静脈にカテーテルを挿入し、それぞれ血圧・動脈血液ガスの測定、および薬液の注入に使用した。右総頚動脈より中大脳動脈分岐点まで4-0ナイロン糸を2cm挿入した。虚血1時間後より、σレセプタに親和性の高いPPBP〔4-pheny-1-(4-phenylbutyl)piperidine〕または生理食塩水を静脈内持続注入した。虚血2時間後、再度ハロセン麻酔下にナイロン糸を抜去し、麻酔から覚醒させ、22時間の再潅流後ハロセン麻酔下に断頭し、脳を取りだし、2mmの厚さにスライスした。2%の2,3,5-triphenyletrazolium chlorideにより、脳切片を染色し、出来上がった切片をマクロレンズで、写真撮影し、その写真をイメージスキャナでコンピュータに取込み、傷害面積を測定し、大脳半球および、線条体の傷害体積とその比率を求めPPBPの効果を判定した。線状帯の傷害体積は、コントロール群は44±4mm^3に対して、PPBPで治療した群が19±4mm^3と小さかった。

しかし、大脳皮質の傷害体積は統計学的な有意差を認めなかった(コントロール群136±27mm^3,PPBP,80±28mm^3)。この結果から、一過性の局所脳虚血に対して、σ受容体リガンドの投与は治療効果があることを示唆している。平成8年度一過性局所脳虚血に対するPPBPの治療効果に関する研究ウィスター系ラットのオスでハロセン麻酔下に右頚動脈より中大脳動脈分岐点まで4-0ナイロン糸を2cm挿入して、虚血を作成し、2時間後にこれを抜去し、再潅流を行った。虚血1時間後より、σレセプタに親和性の高いPPBP[4-phenyl-1-(4-phenylbutyl)piperidine]または生理食塩水を静脈内持続注入した。22時間の再潅流後、脳を2mmの厚さにスライスして、2%の2,3,5-triphenyltetrazolium chlorideにより染色し、大脳半球および、線条体の傷害体積とその比率を求めた。線状帯の傷害体積は、コントロール群が44±4mm^3に対して、PPBPで治療した群が19±4mm^3小さかった。しかし、大脳皮質の傷害体積は統計学的な有意差を認めなかった(コントロール群136±27mm^3;PPBP群,80±28mm^3)。平成9年度一過性局所脳虚血に対するσレセプタサブタイプの脳保護効果に関する研究上記同様のモデルで、虚血1時間後より、σ_1レセプタに親和性の高い(+)ペンタゾシンまたは、σ_1レセプタに親和性のない(-)ペンタゾシンを静脈内持続注入した。線状帯の傷害体積は、(-)ペンタゾシン群は44±5mm^3に対して、(+)ペンタゾシンで治療した群が19±4mm^3と小さかった。また、大脳皮質の傷害体積は、(-)ペンタゾシン群134±29mm^3に比し、(+)ペンタゾシン群は26±12mm^3と小さかった。この結果と(+)ペンタゾシンがσ_1レセプタに強い親和性をもっていることから、一過性の局所脳虚血の保護作用に関して、σ_1受容体が重要な役割を演じていると考えられる。
高等教育で求められる手話通訳スキルの研究―話者の論理・態度伝達のための訳出方略―

本研究では、高等教育における手話通訳の中でも、特に音声日本語から手話への通訳における通訳にいて「話者の論理や態度の伝達」を、どのような訳出方略が可能にするのかを明らかにすることを目的とし、複数のモデル手話通訳の分析及び複数の聴覚障害者による評価を実施した。モデル手話通訳の分析の結果、話者の論理や態度が含まれる主題、及び主題に関する説明を、少ない語彙数で、起点談話に近い語順で訳出した場合、主に「語または文の省略」によって主題または主題に関する説明が欠落していた。一方、語彙数が多く、起点談話の語順と必ずしも一致しない通訳の場合、つまり、音声日本語の語順に則した手話ではなく、日本手話の語順に翻訳した通訳の場合、主題の訳出が正確になされることが明らかになった。このことから、起点談話の文意や起点談話内に登場するものの関係性を明確に伝えるための翻訳を行うことが重要であると言える。このような手話通訳は、大学院で手話通訳利用経験のある聴覚障害者、または手話を用いて大学院で研究経験のある聴覚障害者が「話者の論理や態度の伝達」を基準に評点した際にも、そうではない手話通訳と比較して評価が高かった。よって、このような技術が高等教育の手話通訳において重要であると言える。また、高等教育機関において上記のような手話通訳を実現するには、どのような手話通訳体制が必要で、またどのような養成を行えば上記のような訳出技術が身につくのかは、これまで明らかになっていなかった。そこで、大学内の手話通訳体制が充実し、かつ手話通訳者養成カリキュラムを持つ、米国ギャローデッド大学の実態を調査した。この結果、専門分野の知識の習得と、その分野のディスコースを理解し訳出する技術を、並行して学ぶことが重要であることが明らかになった。本研究は、高等教育場面における手話による聞き取り通訳(音声日本語から手話への変換)における方略について、「話者の論理や態度の伝達」の視点から明らかにすることを目的としている。研究は二段階に分けて実施し、第一段階では、高等教育場面における手話通訳経験の豊富な手話通訳者5名に依頼し、モデル手話通訳を撮影する。第二段階では、これらのモデル手話通訳映像を、高度専門領域において職務を行うろう者またはろう大学院生により評価する。これにより、発話内容に含まれる論理や態度を、どのように訳出することによってろう者に伝達しているのかを明らかにする。今年度は第一段階のモデル手話通訳撮影を実施し、分析を行った。(1)期間:平成29年1月(2)方法:高等教育場面における手話通訳経験豊富な手話通訳者5名に依頼し、モデル手話通訳撮影を実施した。通訳内容は、あらかじめ収録された哲学に関する講義20分間であり、音声日本語から手話への聞き取り通訳を行う様子をビデオカメラにて撮影した。手話通訳者には約1週間に講義に関する資料を送付し、事前学習をした状態で通訳を行った。また、手話通訳は通常、手話通訳を見るろう者に合わせて訳出方法を変更するが、今回は実際のろう者はいないため、大学院修士課程レベルのろう者と仮定して通訳を行った。(3)分析:ELAN(マックスプランク心理言語学研究所が開発・提供するソフトウェア)を用い、各モデル手話通訳の訳出を語レベルで書き出し、どのような訳出傾向が見られるか分析中である。2016年4月の障害者差別解消法施行にともない、高等教育における手話通訳に対するニーズは高まりつつあり、高度専門領域における手話通訳が可能な人材の養成は急務である。このことから、平成29年度は日本手話通訳学会等で発表し、研究成果を多くの関係者に還元することで、課題解決の一助としたい。第二段階の「ろう者によるモデル手話通訳評価」は、当初平成28年度内に実施予定だったが、これを平成29年度に延期した。その理由としては、第一段階の「モデル手話通訳撮影」の打診に多くの時間を要したことが挙げられる。対象者となる手話通訳者は、高等教育における手話通訳経験が豊富であることを条件としているが、これにあてはまる人材がもともと少なく、さらに高い技術を持つ通訳者は多忙であるため、スケジュールの調整も難しかった。また、高等教育における手話通訳技術が自らに足りないと考える通訳者が存在し、これらの理由で撮影を辞退されたケースも想定より多かった。当然のことながら、撮影を辞退した手話通訳者が責められることはない。多くの手話通訳者が高等教育における手話通訳技術に確証を持てずにいると考えられ、本研究を進めることでこの状況の改善に寄与したいと考える。まずモデル手話通訳を撮影・分析し、次にろう者による評価を実施することで、論理や態度の伝達をどのような訳出が可能にしているのか明らかにする。また、通訳技術や、それを習得するために必要な体制を検討するため、先進的な取り組みを行う米国Gallaudet大学を訪れ、実態を調査することとした。平成29年度は、モデル手話通訳の分析を引き続き行い、発表及び論文投稿を行った。また、予定していたろう者による評価を平成30年度に回し、米国における調査を優先して実施した。1)モデル手話通訳分析及び成果報告平成29年1月5月、モデル手話通訳の訳出を語レベルで書き出し、訳出傾向の分析を行った。この結果、主題や主題に関する説明を訳出する際(1)起点談話の文意や起点談話内に登場するものの関係性を明確に伝えるための翻訳を行うことが重要であること

(2)起点談話の語順のまま伝えることが望ましいキーセンテンスは、これが聴覚障害学生にも伝わる訳出方略が必要であること、等が明らかになった。2)米国Gallaudet大学における調査平成30年3月3日13日、同大において、通訳技術及び大学における通訳体制に関する調査を行った。手話通訳学科長に通訳者養成プログラムについてインタビューを行い、ゼミの見学を行った。さらにGallaudet Interpreting Service(GIS;同大学の通訳派遣部署)ディレクター及び通訳者2名もインタビューを行い、同大の通訳派遣の実態と技術的な向上を目指すための取り組みについて詳細に伺った。また、GISの見学および通訳者が派遣されている授業の見学を行った。この成果は、障害学生支援関係の研究会等で発表予定である。平成29年度前半は、高等教育場面のモデル手話通訳分析を行い、この成果を日本手話通訳学会で発表し、同学会研究紀要に論文を掲載することができた。このことで、高等教育の手話通訳に困難を感じる多くの手話通訳者に、知見を届けることができたと言える。平成29年度後半は、米国Gallaudet大学における調査のための準備と、渡米後の現地での調査に注力した。この結果、高等教育場面において必要な手話通訳技術と、これを身に付けるために必要な研修内容、また聴覚障害学生の手話習得に通訳者が寄与するために必要な体制について、重要な示唆を得ることができた。本調査が平成29年度末に実現したため、成果報告を年度内に実施することが不可能であったこと、またモデル手話通訳のろう者による評価が未実施であったため、これらを平成30年度に実施することとした。本研究では、高等教育における手話通訳の中でも、特に音声日本語から手話への通訳における通訳にいて「話者の論理や態度の伝達」を、どのような訳出方略が可能にするのかを明らかにすることを目的とし、複数のモデル手話通訳の分析及び複数の聴覚障害者による評価を実施した。モデル手話通訳の分析の結果、話者の論理や態度が含まれる主題、及び主題に関する説明を、少ない語彙数で、起点談話に近い語順で訳出した場合、主に「語または文の省略」によって主題または主題に関する説明が欠落していた。一方、語彙数が多く、起点談話の語順と必ずしも一致しない通訳の場合、つまり、音声日本語の語順に則した手話ではなく、日本手話の語順に翻訳した通訳の場合、主題の訳出が正確になされることが明らかになった。このことから、起点談話の文意や起点談話内に登場するものの関係性を明確に伝えるための翻訳を行うことが重要であると言える。このような手話通訳は、大学院で手話通訳利用経験のある聴覚障害者、または手話を用いて大学院で研究経験のある聴覚障害者が「話者の論理や態度の伝達」を基準に評点した際にも、そうではない手話通訳と比較して評価が高かった。よって、このような技術が高等教育の手話通訳において重要であると言える。また、高等教育機関において上記のような手話通訳を実現するには、どのような手話通訳体制が必要で、またどのような養成を行えば上記のような訳出技術が身につくのかは、これまで明らかになっていなかった。
大腸菌発現系による蛋白質アルギニン脱イミノ酵素の特性解析と高機能キメラ酵素の創製

蛋白質中のArg残基をCa2^+依存的に脱イミノ化しCit残基に変換するPeptidylarginine deiminase(PAD)にはアイソフォームtype I,II,IIIが存在する。これらの内typeIとIIIは表皮・毛嚢に特異的であるが、その酵素化学的性質は殆ど不明である。先に我々は、新生児ラット表皮からPADtypeIおよびIIIのcDNAクローニングに成功し、その全一次構造を決定した。本研究では、未だ不明のPADtypeIおよびIIIの酵素化学的諸性質を明らかにするため、これらcDNAの大腸菌発現系と発現酵素の精製法を確立した。PADtypeI,IIIcDNAの翻訳領域にフレームが合うよう制限酵素EcoRIならびにHindIIIサイトを付与したプライマーを合成、上述cDNAを鋳型としてPCRにより翻訳領域を増幅、この増幅DNAを発現ベクターpKK223-3のEcoRI-HindIIIサイト間に挿入した。PCR増幅に伴う塩基変異がそれぞれ3カ所存在したが、これらはもとのcDNAと入れ替えることで解決した。本発現ベクターは我々が開発したTwo-Cistron発現ベクターであり、IPTGにより菌体可溶性全蛋白質の約5%を誘導合成させることができた。つぎに発現酵素の精製は、30-50%硫安塩析、無坦体等電点電気泳動法、ついで大豆Kunitz型trypsin inhibitorをリガンドとする親和性クロマトグラフィーによりほぼ単一まで純化する方法を確立した。これらの精製組換え酵素についてその酵素化学的諸性質を調べた。特に、表皮ならびに毛嚢ケラチン結合蛋白質として知られるフィラグリンおよびトリコヒアリンに対する反応性について検討した結果、PADtypeIはフィラグリンに対し、またtypeIIIはトリコヒアリンに対し極めて高い反応性を示し、さらにこれらの蛋白質は修飾に伴いトランスグルタミナーゼによる架橋反応が著しく促進されることが見出された。これらの知見は上記PADの機能を推測する上で極めて重要な発見である。さらに本研究ではPADtypeI,III遺伝子のエキソンマップを解析し、両遺伝子がすでに明らかにしているPADtypeII遺伝子と同様16個のエキソンから構成されることが判った。現在、各ドメイン毎の大腸菌発現系を構築し、発現ドメイン蛋白質の機能解析を進めているが、今後各機能ドメインを相互交換し高機能キメラ酵素を創製したい。
脳機能発達臨界期におけるメタ可塑性を基盤とした恐怖記憶制御機構の解明

本研究により、幼若期ストレスによって、成長後恐怖記憶の消去障害が生じることが明らかになった。その背景には海馬CA領野ならびに皮質前頭前野(mPFC)のシナプス可塑性の変化すなわちメタシナプス可塑的変化が生じている可能性がある。この仮説は、海馬CA1およびmPFCのERK活性の変化によっても支持された。以上の結果から幼若期ストレス負荷によって生じた成長後の恐怖記憶制御機構の障害には、脳部位特異的な情動調節の機能変化あるいは情動神経回路網の形成不全により生じている可能性が強く示唆された。本研究は、脳発達臨界期における幼児期ストレスにより、脳内神経回路網の形成不全あるいは機能的異常が生じ、成長後の消去記憶に関わる神経可塑性が変化するとの仮説をもとに、可塑性の変化いわゆるメタ可塑性という新たな視点から恐怖記憶制御機構の解明を試みた。この目的のため、幼若期ストレス負荷ラットを用いて、心的外傷後ストレス(PTSD)の病態の背景と考えられている恐怖記憶の消去障害に着目し、消去記憶に関わる情動神経回路のシナプス機能を、皮質前頭前野の統合的役割に焦点を当てて、追究した。その結果、生後3週齢時に電撃刺激を負荷すると、成長後、恐怖記憶の消去障害を引き起こすことが明らかになった。幼若期にストレスを負荷しなかったラット(対照群)は、最初の消去試行では皮質前頭前野のシナプス伝達効率が抑制されるが、消去試行を繰り返すことにより、その抑制は減弱し元のレベルに戻った。また消去試行の翌日には、シナプス伝達効率の持続的な促進、すなわちシナプス可塑性がみられるが、3週齢時ストレス負荷ラットでは、消去過程に伴うシナプス伝達効率の変化は生じなかった。従って幼児期ストレスにより情動神経回路の機能不全、言い換えれば消去記憶に関わる神経可塑性そのものを変化させる、いわゆるメタ可塑的変化が生じている可能性を示唆した。またNMDA受容体部分作動薬であるdicycloserineを用い、投与時間や投与タイミングを考慮した薬物治療を従来の曝露療法と併用することで、治療期間の短縮あるいは新たな治療戦略につながる可能性を示唆した。この目的のため、不安・恐怖の行動評価法である文脈的恐怖条件付け試験を用い、ラット幼若期[生後2週齢ならびに3週齢時]に嫌悪ストレスを負荷すると、成長後(11-14週齢時)、ストレス負荷時期に応じて恐怖記憶制御機構が障害されることが明らかになった。すなわち幼若期ストレスには臨界期が存在していると考えられる。以上の行動解析結果から、脳発達時期におけるストレスは、情動神経回路網である皮質辺縁系機能に影響を与えていると推測された。この可能性を追究するため、皮質-辺縁系におけるシナプス伝達効率を指標とした電気生理学的研究ならびにextracellular signal-related kinase(ERK)のリン酸化(pERK)評価による分子生物学的研究を行った。その結果、2週齢時ストレス負荷により生じた不安水準の低下には、海馬CA1領域のシナプス応答変化ならびに海馬CA1と扁桃体のERK活性の低下が関わっていると考えられた。また生後3週齢時のストレス負荷により生じた恐怖記憶の消去(消去試行ならびに消去記憶の想起過程)障害は、海馬CA1ならびに海馬-皮質前頭前野(mPFC)神経回路のシナプス可塑性の変化すなわちメタシナプス可塑性が生じている可能性が示唆された。この仮説は、消去試行によりみられた海馬CA1のERK活性の増強、ならびに消去記憶の想起過程で生じたmPFCのERK活性の増強反応が、3週齢時ストレス負荷ラットではみられなかった事実によっても支持された。幼児期の不幸な体験による心的外傷が、不安障害やうつ病などの精神疾患の病態や病因の背景になっている可能性が指摘されている。これらの精神疾患は、情動神経回路である扁桃体-海馬-大脳皮質における階層的情報処理機構の障害あるいは機能不全という側面から捉えることが出来る。本研究は、脳発達臨界期における幼児期ストレスにより、脳内神経回路網の機能的異常が生じ、成長後の恐怖記憶に関わる神経可塑性が変化するとの仮説をもとに、可塑性の変化いわゆるメタ可塑性という新たな視点から恐怖記憶制御機構の解明を試みた。不安・恐怖の行動評価法である文脈的恐怖条件

付け試験とこの行動評価に基づいた消去試行を行った結果、ラット幼若期[生後2週齢時:2wFS]に嫌悪刺激(Footshock;FS)を負荷すると、成長後(11-14週齢時)に不安水準の低下が生じ、生後3週齢時のストレス負荷(3wFS)では、消去障害が生じることを明らかにした。すなわち、幼若期ストレス負荷時期には臨界期が存在している可能性が示唆された。2wFSにより生じた不安水準の低下には、扁桃体調節下における海馬CA1領域のシナプス応答変化が関わっていることが明らかになった。一方、3wFSでは消去試行に伴う海馬CA1のシナプス伝達の増強ならびに消去記憶の想起における皮質前頭前野(mPFC)のシナプス増強反応がみられなかった。このシナプス伝達効率の変化は、extracellular signal-related kinase(ERK)のリン酸化(pERK)評価による分子生物学的実験結果からも強く支持された。また消去試行に伴う海馬CA1のシナプス増強はNMDA受容体拮抗薬MK801で完全に抑制され、3wFSでみられた消去障害(行動とシナプス伝達効率ならびにERK活性の変化)は、NMDA受容体部分作動薬DCSにより改善されたことより、消去過程はNMDA受容体を介していると考えられた。言い換えれば、3週令時におけるストレス負荷は、NMDA受容体の発現あるいは機能に影響を与え、結果的に情動神経回路網の形成不全が生じ、成長後の恐怖記憶制御機構の消去過程に障害を引き起こしている可能性がある。以上の結果から幼若期ストレス負荷によって生じた成長後の恐怖記憶制御機構の障害には、臨界期が存在し、脳部位特異的な情動調節の機能変化あるいは情動神経.回路網の形成不全により生じている可能性が強く不唆された。
食道、胃術後機能の臨床的検査法の確立-アイソトープ法と不透過マーカー法の比較-

胃、食道術後の残胃機能、再建臓器機能の判定のため、固形食摂取時にアイソトープ法とレントゲン不透過マーカー法による機能検査法を同時に行い比較し、簡便な臨床的検査法としてレントゲン不透過マーカーによる検査法が有用であるか検討することを目的として、健常人7例、本研究の主旨を十分に説明し同意の得られた幽門輸温存胃切除術後患者群4例、食道切除後胸骨後胃管再建患者3例、食道切除後後縦隔胃管再建患者6例にアイソトープ法とレントゲン不透過マーカー法による検査を行った。適切な評価指標の検討として健常人においてアイソトープ法とマーカー法の胃内残存率(60分,120分,180分,240分値),排出開始時間,1/2排出時間,全排出時間を比較検討した.その結果,アイソトープ法とマーカー法の間に強い相関が認められたのは全排出時間のみであった.すなわち,マーカー法は簡便な検査法ではあるが健常人において詳細な経時的胃排出動態の評価法としては用いることはできないが,全排出時間の測定により定性的な胃排出能検査法としては臨床的に有用である可能性が考えられた.さらに,術後症例においてアイソトープ法とマーカー法の検査を行い全排出時間を比較検討を行った.食道切除後胃管再建患者ではこれらの検査法は強い相関がみられたものの,幽門輪温存胃切除術後患者では排出の遅延がみられたため4時間の検査時間内では全排出時間の検出が不可能な症例が多く相関係数の算出が不可能であった.したがって,幽門輪温存胃切除術後患者においては,マーカー法は臨床的な残胃機能検査法として有用とはいえなかった.術後患者においては,残胃機能、再建臓器機能検査法としてのマーカー法の有用性については,今後もさらに検討が必要と考えられた.胃、食道術後の残胃機能、再建臓器機能の判定のため、固形食摂取時にアイソトープ法とレントゲン不透過マーカー法による機能検査法を同時に行い比較し、簡便な臨床的検査法としてレントゲン不透過マーカーによる検査法が有用であるか検討することを目的として、健常人2例、本研究の主旨を十分に説明し同意の得られた幽門輪温存胃切除術後患者群4例、胃全摘回結腸再建患者1例、食道切除後胸骨後胃管再建患者3例、食道切除後胸壁前胃管再建患者1例、食道切除後骨後回結腸再建患者1例にアイソトープ法とレントゲン不透過マーカー法による検査を行った。検査時間が施設の都合で限られるため、検査施行できる患者を優先したことから、本年度の対象は実施計画と若干変更した。健常人においては、アイソトープ法での胃内残存率が1020%になるとマーカーの排出が始まり、その排出速度は急激であった。幽門輪温存胃切除術後患者においては術後6ヶ月から1年の症例はアイソトープ法に比べマーカー法の排出は遅延がみられたが3年を経過した症例にはアイソトープ法とマーカー法の結果には相関がみられた。胃全摘回結腸再建患者においてはアイソトープ法での測定では排出は急激であったがマーカー法の測定では4時間の検査時間内では全く排出がみられなかった。食道切除後患者はアイソトープ法では貯留傾向を示した胸壁前再建患者を除いて他の4例は急速な排出を示し、マーカー法の結果は術後8ヶ月以上経過した胃管再建例3例においてアイソトープ法と相関がみられた。以上よりマーカーの排出には、健常人では空腹期収縮の関与が考えられ、術後症例では、術後経過期間、再建臓器の貯留能、の関与が考えられた。今後は検症例数をさらに増やし、レントゲン不透過マーカーによる検査法の有用性を検討していく予定である。適切な評価指標の検討として健常人においてアイソトープ法とマーカー法の胃内残存率(60分,120分,180分,240分値),排出開始時間,1/2排出時間,全排出時間を比較検討した.その結果,アイソトープ法とマーカー法の間に強い相関が認められたのは全排出時間のみであった.すなわち,マーカー法は簡便な検査法ではあるが健常人において詳細な経時的胃排出動態の評価法としては用いることはできないが,全排出時間の測定により定性的な胃排出能検査法としては臨床的に有用である可能性が考えられた.さらに,術後症例においてアイソトープ法とマーカー法の検査を行い全排出時間を比較検討を行った.食道切除後胃管再建患者ではこれらの検査法は強い相関がみられたものの,幽門輪温存胃切除術後患者では排出の遅延がみられたため4時間の検査時間内では全排出時間の検出が不可能な症例が多く相関係数の算出が不可能であった.したがって,幽門輪温存胃切除術後患者においては,マーカー法は臨床的な残胃機能検査法として有用とはいえなかった.術後患者においては,残胃機能、再建臓器機能検査法としてのマーカー法の有用性については,今後もさらに検討が必要と考えられた.
生物資源の加工におけるエネルギーの有効利用

(1)生物資源の分離・加工における省エネルギー;大豆蛋白分離・加工プロセスにおいて凍結・熟成工程でのエネルギー消費改善に資するため凍結条件による氷結晶の状態の制御を検討し、その可能性を見出した。(2)穀物乾燥における品質と省エネルギー;混合貯留方式について麦類の場合を中心として、水分移動速度および外観・臭い・発芽率等に関する測定を行い、本方式が乾燥能力および品質低下防止においてすぐれていることを解明した。(3)食パン焼成プロセスにおける省エネルギー:食パン焼成プロセス(6000斤/時)において、焼成オーブンの排熱を吸収冷凍機によって回収することを目的として計測を行った結果、ブレッドクーラに必要な冷熱はオーブン排ガスを熱源とする吸収冷凍機によって十分賄えることが明らかになった。(4)農産物の熱処理・冷凍貯蔵における立地条件と省エネルギー;寒冷地における冷凍エネルギーを節減する外気導入予冷機開発のため、フレンチフライ製造工程に外気吸入ファンを設置した結果、外気導入による冷却能力がファン駆動所要動力を上まわり、省エネルギー効果を得ることの可能性が示唆された。(5)液状食品の凍結濃縮における品質と省エネルギー;液状食品の濃縮法としてすぐれており、エネルギー的にも有利である凍結濃縮法について動力学パラメーターを測定した結果、簡単な非定常法に基くデータから実際の連続凍結濃縮に近い系での氷結晶粒径分布等の挙動が予測できることが明らかになった。(6)農産物の搾油・精製のエネルギー分析と省エネルギー簡易精製法に関する基礎研究;米ぬか原油から食用油を精製するための小型実験装置を試作し、エネルギー必要量と物質収支を測定した結果、脱臭工程が最も多くエネルギーを消費(42%)しており、精製油1Kg当りの全エネルギー必要量は14.2MJであった。
NOS遺伝子導入自家静脈内皮細胞播種によるハイブリット型・人工血管移植に関する研究

本研究の目的は,NOS遺伝子導入内皮細胞を用いたハイブリッド型小口径人口血管を開発することにある.血管内皮細胞分離・培養本研究に用いる血管内皮細胞は成犬の外頚静脈よりコラゲナーゼ法にて採取し,血管内皮細胞増殖因子を含む液体培地中での培養を確立した。同時に臨床応用に向けて,より低侵襲で自家内皮細胞を採取する方法についても検討を行った。具体的には,末梢血中から血管内皮の前駆細胞であるCD34陽性単核細胞を磁気ビーズ法を用いて分離し,血管内皮増殖因子を加え培養することで,形態学的に内皮細胞へと分化した細胞を得た。遺伝子構築・導入・発現・機能解析NOS遺伝子を非ウイルスベクター内に遺伝子組み換え技術を用いて構築し,in vitroでの遺伝子導入を行い,その遺伝子発現および機能を検討している。in vivoでの遺伝子導入は当初,リポソームやウイルスベクターを試みたが,充分な導入効率は得られなかった。このため遺伝子導入法を遺伝子銃によるパーティクルデリバリー法に変更し,遺伝子導入実験を行い,これまでにマウスおよびラットの各種臓器において遺伝子導入および遺伝子発現を確認している。本研究の目的は,NOS遺伝子導入内皮細胞を用いたハイブリッド型小口径人工血管を開発することにある.1.成犬より外頸静脈を、採取し,コラゲナーゼ法にて血管内皮細胞を分離し血管内皮細胞増殖因子を含む液体培地中で培養,増殖させ本研究に使用した.2. NOS遺伝子導入に用いるベクターについては当初リポソームをもちいた導入を試みたが,満足できる導入効率が得られなかったため,現在アデノウイルスやアデノ関連ウイルスを用いて導入効率の改善を試みている.遺伝子導入の確認はRT-PCRあるいは申請備品であるGeneRapidシークエンサを用いて行った.3.遺伝子導入による血管内皮細胞の抗原性(CD31,E-selectin,Tie-2,Flk-1)や,内皮細胞機能の変化の有無についてフローサイトメトリー,RT-PCR法,ウエスタンブロット法を用いて検討を行った.5.遺伝子導入に使用する血管内皮細胞について,臨床応用に向けてより低侵襲で採取する方法を検討しており,末梢血中から血管内皮の前駆細胞であるCD34陽性単核細胞をビーズ法を用いて分離し,培養することにより形態学的な血管内皮細胞への分化を確認している.今後はさらに分子生物学的手法を用いて内皮細胞への分化を確認した後に導入効率の良好なベクターを用いて,血管内皮前駆細胞へのNOS遺伝子導入を試みる予定である.本研究の目的は,NOS遺伝子導入内皮細胞を用いたハイブリッド型小口径人工血管を開発することにある.血管内皮細胞分離・培養本研究に用いる血管内皮細胞は成犬の外頚静脈よりコラゲナーゼ法にて採取し,血管内皮細胞増殖因子を含む液体培地中での培養を確立した。具体的には,抹消血中から血管内皮の前駆細胞であるCD34陽性単核細胞を磁気ビーズ法を用いて分離し,血管内皮増殖因子を加え培養することで,形態学的に内皮細胞へと分化した細胞を得た。In vitroでの遺伝子導入は当初,リポソームやウイルスベクターを試みたが,充分な導入効率は得られなかった。
東京裁判の国際関係

下記の未公刊文書を調査収集し、逐次、その内容と文書の位置づけについて分析を加えた。文書とは、アメリカ、GHQ/SCAP文書中の国際検察局ファイル、アイゼンハウア・ライブラリーの文書(いずれも国立国会図書館憲政資料室所蔵)等である。さて作業結果は、二つのテーマに分かれる。第一に、東京裁判を準備する過程で、国際検察局が裁判の基本法に相当する極東国際軍事裁判所憲章をいかに作成したかという問題である。同憲章が先行事例であるドイツのニュルンベルク裁判所憲章をベースとしていることは従来からわかっていたが、子細に両憲章を比較すると、細部に微妙な相違点があり、この憲章がいかなる意図と背景のもとに作成されたのかは従来まったく不明であった。しかし本助成受領者は、憲章草案や部内覚書ほかの諸資料を収集分析し、憲章の作成過程をトレイスした結果、上記の相違点が日本固有の事情に適合させた結果であって、ここに対日処罰政策の特質の一端が見てとれることを確認した。現在その成果をまとめているさなかであり、近く発表しうるであろう。第二に、1950年代、いかにして連合国が日本人戦犯(いわゆるBC級を含む)の釈放を決定し、そこに日本外交がどのような役割を果たしたのかという問題である。ただ、こちらの資料はあまりに膨大であり、今年度では、その情報の一部を入手したにすぎない。とはいえ、現段階においても、世論の高揚を背景に日本の歴代政権が連合国側の各政府にバイラテラルな交渉を持ちかけ、他方の各政府側は講和後の対日関係に配慮するという様相が徐々に明らかとなっている。この点も従来は指摘されなかったものであり、さらに検討を継続することで、大きな成果が出ることを期待しうる。
物質輸送機能の修飾・制御を目的として新材料の開発に関する研究

生体の物質輸送機能を解明することによって材料化学の立場から、医薬等の生理活性物質を効率よく目標部位に送達させる新材料の開発を目的として、(1)生体の皮膚、(2)歯牙等の硬組織および(3)細胞膜に着目した物質輸送機能の修飾・制御について総合的に検討し、以下に示す結果が得られた。(1)疎水性薬物の主要な皮膚透過経路は角質層の細胞間隙に存在する脂質二重層であると考えられているので、細胞間隙の脂質モデルとしてリン資質を用い、これより調製されたリポソームの膜の流動性に対するdーリモネンの影響を調べた。その結果、リポソームの膜成分としてDPPCを用いた場合はdーリモネン添加による変化はほとんど認められなかったのに対し、膜成分としてコレステロールが共存する場合には著しい膜の流動化が観察された。従ってdーリモネンで認められている優れた経皮吸収促進作用は、皮膚角質層の細胞間隙に存在するコレステロールに対するdーリモネンの親和性により発現するものと推測される。(2)モノマーが歯質中に浸透、拡散して重合したハイブリッド層を界面に形成して重合体を結合させ、これのう蝕予防への実用化を目指した研究を実施した結果、歯質のエナメル小柱間質に4ーMETAを含むモノマーを拡散し重合させると、エナメル小柱を包み込む形で生体分子と新規な構造体を形成することが明らかとなった。(3)αー2ーマクログロブリンにシトクロムCとBrCN分解によるフラグメントを結合し、このハイブリッド抗原をマクロファージに与え、その取り込みが遊離の抗原を与えた時に比べて有意に高いことを確認した。一方、同じ抗原で免役した動物の脾臓細胞を先のハイブリッド抗原を含む様々な形の抗原を与えたマクロファージにより活性化し、Tー細胞の活性化と抗体の生産効率を測定した。その結果、Tー細胞の活性化、抗体の生産効率はいずれも有意に高い値が得られた。
リンパ管奇形に対する漢方薬による制御メカニズムの解明

まずはリンパ管内皮細胞に対する越婢加朮湯の増殖抑制効果の検証を行おうと考えた。文献検索を含めた症例検討では、越婢加朮湯の方が効果が高いとする報告が多いためである。正常なリンパ管内皮細胞を培養・継代し、越婢加朮湯を培地に加えたが、有意な変化は無かった。手術を受けるような症例が集積しなかった関係で、リンパ管奇形患者のリンパ管内皮細胞を取得することが、2017年度には困難であった。そのため、現在は、実際にリンパ管奇形から得られたリンパ管上皮細胞を採取し、継代・培養する手法を動物細胞にて習得して準備し、待機中である。さらに、同様な研究が行われていないかを学会に参加して情報収集を行った。リンパ管奇形に対する研究は無かったが、悪性腫瘍に対する増殖抑制効果に関する植物製剤の検討については報告が有り、参考にすべき点もあった。また、学会での発表に際しては、漢方薬による薬物保存治療に対する注目も高かった。また、越婢加朮湯の抗炎症作用や細胞増殖抑制作用、を明らかにするために、既に実験細胞として確立している成人の頭頸部がん細胞でのmTOR、Akt、ERKなどのリン酸化と発現/分布の解析を行った。さらに、同様な研究が行われていないかを学会参加や文献検索にて情報収集を行い、黄耆建中湯の構成生薬に上記のような報告が多いことを確認した。漢方薬による薬物保存治療に関する報告も多く認められ、実験手法も含めて検討している。申請者は、リンパ管奇形に対して越婢加朮湯を投与すると病変が縮小することから、mTORシグナルネットワークを介したリンパ管増殖抑制効果により病変を縮小させるという仮説の立証をおこなう目的で、まずはリンパ管内皮細胞に対する越婢加朮湯の増殖抑制効果の検証を行おうと考えた。しかし、リンパ管奇形のリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初の予定よりもやや遅延している。リンパ管奇形由来の組織とリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初の予定よりもやや遅延している。そのため、まずは越婢加朮湯の抗炎症作用や細胞増殖抑制作用を明らかにするために、既に実験細胞として確立している成人の頭頸部がん細胞でのmTOR、Akt、ERKなどのリン酸化と発現/分布の解析を行った。今後、この結果を解析し、追加実験を行う予定である。また、同様な研究を黄耆建中湯についても検討している。さらに、リンパ管奇形由来細胞を取得するため、新たな分担研究者による内視鏡的アプローチでの組織取得を予定している。申請者は、リンパ管奇形(LM:Lymphatic Malformation)に対して越婢加朮湯を投与すると病変が縮小することから、mTORシグナルネットワークを介したリンパ管増殖抑制効果により病変を縮小させるという仮説の立証をおこなう目的で、本研究を計画した。また、越婢加朮湯の抗炎症作用や細胞増殖抑制作用、を明らかにするために、既に実験細胞として確立している成人の頭頸部がん細胞でのmTOR、Akt、ERKなどのリン酸化と発現/分布の解析をウェスタンブロット法による検討を開始している。しかし、リンパ管奇形のリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、正常なリンパ管内皮細胞にて検討したが、有意な結果は無かった。そのため、現在は、実際にリンパ管奇形から得られたリンパ菅上皮細胞を採取する手法を習得して準備し、待機中である。そのため、当初の予定よりもやや遅延している。

手術を受けるような症例が集積しなかった関係で、リンパ管奇形患者のリンパ管内皮細胞を取得することが、2017年度には困難であった。そのため、現在は、実際にリンパ管奇形から得られたリンパ管上皮細胞を採取し、継代・培養する手法を動物細胞にて習得して準備し、待機中である。さらに、同様な研究が行われていないかを学会に参加して情報収集を行った。リンパ管奇形に対する研究は無かったが、悪性腫瘍に対する増殖抑制効果に関する植物製剤の検討については報告が有り、参考にすべき点もあった。また、学会での発表に際しては、漢方薬による薬物保存治療に対する注目も高かった。また、越婢加朮湯の抗炎症作用や細胞増殖抑制作用、を明らかにするために、既に実験細胞として確立している成人の頭頸部がん細胞でのmTOR、Akt、ERKなどのリン酸化と発現/分布の解析を行った。さらに、同様な研究が行われていないかを学会参加や文献検索にて情報収集を行い、黄耆建中湯の構成生薬に上記のような報告が多いことを確認した。漢方薬による薬物保存治療に関する報告も多く認められ、実験手法も含めて検討している。申請者は、リンパ管奇形に対して越婢加朮湯を投与すると病変が縮小することから、mTORシグナルネットワークを介したリンパ管増殖抑制効果により病変を縮小させるという仮説の立証をおこなう目的で、まずはリンパ管内皮細胞に対する越婢加朮湯の増殖抑制効果の検証を行おうと考えた。しかし、リンパ管奇形のリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初の予定よりもやや遅延している。実際にリンパ管奇形から得られたリンパ管上皮細胞を採取する手法を習得して準備し、待機中である。リンパ管奇形からの内皮細胞取得を迅速に行えるよう、分担研究者である金沢大学附属病院小児外科の酒井清祥助教、日本大学医学部小児外科の上原秀一郎准教授と、大阪大学附属病院IVRセンター長の大須賀慶悟講師には、リンパ管奇形症例のリクルートと切除標本提供についてご協力を頂き、細胞取得もしくは同様な細胞モデルの獲得に全力を尽くす。リンパ管奇形由来の組織とリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初の予定よりもやや遅延している。そのため、まずは越婢加朮湯の抗炎症作用や細胞増殖抑制作用を明らかにするために、既に実験細胞として確立している成人の頭頸部がん細胞でのmTOR、Akt、ERKなどのリン酸化と発現/分布の解析を行った。今後、この結果を解析し、追加実験を行う予定である。また、同様な研究を黄耆建中湯についても検討している。さらに、リンパ管奇形由来細胞を取得するため、新たな分担研究者による内視鏡的アプローチでの組織取得を予定している。申請者は、分担者より、リンパ管内皮細胞の提供を受け、リンパ管内皮細胞に対する越婢加朮湯の増殖抑制効果の検証を行う予定であった。しかし、手術を受ける患者が昨年度はいなかったため、リンパ管奇形のリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初計上していた予算を分担者が使用しなかった。そのため、次年度使用額が発生した。今年度残額分は次年度に各分担者が研究打合せ等に使用することとする。しかし、分担者の異動があったこと、手術を受ける患者がいなかったことにより、リンパ管奇形のリンパ管内皮細胞が入手困難であったため、当初計上していた予算を分担者が使用しなかった。
ヒト皮膚resident memory T細胞と皮膚疾患の関わりに関する解析

研究代表者は乾癬、固定薬疹、円板状エリテマトーデスより皮膚T細胞を単離し、その表現型をflow cytometryにて検討した。その結果、乾癬においては、病変部だけでなく非病変部にもIL-17産生傾向を有するCD103陽性CD8 resident memory T細胞(TRM)が多く分布していることが分かり、この細胞群が皮疹準備段階を構築していると考えられた。また、固定薬疹、円板状エリテマトーデスにおいては、境界明瞭な皮疹であっても浸潤細胞にcentral memory T細胞が豊富であることが判明した。これはT細胞の可塑性の可能性をうかがわせる結果であり、今後経時的な変化を追いたい。平成28年度の研究計画では、末梢血中T細胞を分画別に皮膚類似環境で培養し皮膚TRMの表面マーカーを発現しやすい分画を同定すること、分画別にヒトT細胞追跡マウスモデルに移入し、移植したヒト皮膚片への移入T細胞の移行の程度や皮膚TRMの表面マーカーの獲得の程度を比較することを目標としており、TCM分画を皮膚TRMを構築する前駆細胞として候補に挙げることができたことから、おおむね研究計画は順調に進展していると評価した。実験数が有意差を定めるには至っておらず、データの蓄積が必要であるが、平成29年度の実験計画と併行して継続することができる。皮膚疾患に関しては、尋常性乾癬において、健常人皮膚T細胞と病変部・非病変部皮膚T細胞のプロファイルを比較検討した。その結果、乾癬皮膚ではCD8 TRMの割合が高いことが分かった。尋常性乾癬はTh17疾患とされるが、病変部ではCD4のみでなくIL-17産生CD8 T細胞が多く分布し、特に非病変部においてはIL-17産生CD4 T細胞の割合は高まっておらず、IL-17産生CD8 TRMが優位であった。この非病変部として病変未形成の皮膚を選択しており、まだ病変を形成していない正常に見える皮膚でも既に乾癬の病態形成の準備がなされていることが分かった。上述のように、平成28年度の実験計画の中で有意差に至らなかった点は、実験系を繰り返しより明確な結果を導けるように継続していきたい。また、平成29年度の研究計画に挙げた通り、ヒト疾患の皮膚検体の解析も計画通り進行していく予定である。現在までで大きな障壁はみられていない。皮膚科学
マウス呼吸神経回路発達過程におけるGABAの役割

本研究は、呼吸神経回路の発達過程におけるGABAの役割を解明するため、GAD67(GABA合成酵素;グルタミン酸デカルボキシラーゼ)遺伝子ノックアウトマウス(GAD67-/-)を用い、その中枢性の呼吸調節について検討することを目的とした。GAD67-/-マウスは出生後約6時間で死亡するが、これは上気道奇形(口蓋裂)に伴う換気障害によるものと考えられていた。生後2-4時間のGAD67-/-新生マウスの呼吸様式を無麻酔非拘束(in vivo)状態でwholebodyplethysmographyにより解析を行った。室内気吸入下でGAD67+/+は規則正しい呼吸を示したのに対し、GAD67-/-は大きなgasp様呼吸とそれに続く不規則で浅い異常呼吸を示し、無呼吸も頻繁に出現した。また、低酸素や高炭酸ガスに対する、呼吸応答も減弱していた。次に、末梢の影響を除外した単離脳幹脊髄(in vitro)標本を作製し、C4前根からの呼吸性神経活動を解析した。この条件においても、GAD67-/-の呼吸性リズムは不規則であり、吸息時間の短い呼吸パターンを示していた。低酸素液あるいは高炭酸ガス液潅流に対する呼吸応答、すなわち化学感受性も減弱していた。さらに、ホールセルパッチ法を用いて延髄腹外側部の呼吸性ニューロンの活動を記録した結果、GAD67+/+では吸息時に大きな脱分極を示す吸息性ニューロンも、GAD67-/-においては脱分極持続時間が短く発生する活動電位の数も少なかった。以上の結果より、GAD67-/-は気道の形態異常だけでなく中枢性の呼吸調節機構においても機能異常をもつことが確認された。胎児期における中枢神経内のGABAは呼吸神経回路網機能の発達に必須であり、その不足により重篤な呼吸機能障害が惹起されると結論した。本研究は、呼吸神経回路の発達過程におけるGABAの役割を解明するため、GAD67(GABA合成酵素;グルタミン酸デカルボキシラーゼ)ノックアウトマウス(GAD67-/-)を用い、その中枢性の呼吸調節について胎生期から新生期まで経時的に検討することを目的としている。GAD67-/-マウスは出生後数時間以内に死亡するが、これは上気道奇形(口蓋裂)に伴う換気障害によるものと考えられていた。しかしながら、脳内のGABA濃度はワイルドタイプ(GAD67+/+)に比較して著しく減少しているため、呼吸中枢の異常を併発している可能性が高い。本年度は、まず最初に、GAD67-/-新生マウスの呼吸様式を無麻酔非拘束(in vivo)状態でwholebodyplethysmographyにより解析を行った。胎児期における中枢神経内のGABA欠乏は呼吸神経回路網機能の発達障害(未熟性)を惹起すると考えられた。

胎児期における中枢神経内のGABAは呼吸神経回路網機能の発達に必須であり、その不足により重篤な呼吸機能障害が惹起されると結論した。本研究は、呼吸神経回路の発達過程におけるGABAの役割を解明するため、GAD67(GABA合成酵素;グルタミン酸デカルボキシラーゼ)ノックアウトマウス(GAD67-/-)を用い、その中枢性の呼吸調節について胎生期から新生期まで経時的に検討することを目的としている。GAP67-/-マウスは出生後数時間以内に死亡するが、これは上気道奇形(口蓋裂)に伴う換気障害によるものと考えられていた。昨年度は、GAD67-/-新生マウスは大きなgasp様呼吸とそれに続く不規則で浅くて速い異常呼吸を示すことを報告した。本年度は、GAD67-/-マウスのCO_2呼吸増強反応、低O_2呼吸抑制反応、すなわち呼吸の化学感受性について解析を行った。wholebodyplethysmography法により測定されたin vivo GAD67-/-マウスにおける呼吸の化学感受性は、ワイルドタイプ(GAD67+/+)に比し減弱していた。更に、in vitro脳幹脊髄標本を作成し、高CO_2液、低O_2液灌流に対する呼吸出力応答を検討したところ、GAD67-/-マウスにおいて化学感受性の減弱傾向が認められた。このことから、GABAは新生マウスのCO_2呼吸増強反応、低O_2呼吸抑制反応に重要な役割を果たしていると思われた。これまでの結果からGAD67-/-は気道の形態異常だけでなく中枢性の呼吸調節機構においても機能異常をもつことが確認された。胎児期における中枢神経内のGABA欠乏は呼吸神経回路網機能の発達障害(未熟性)を惹起すると考えられた。本研究は、呼吸神経回路の発達過程におけるGABAの役割を解明するため、GAD67(GABA合成酵素;グルタミン酸デカルボキシラーゼ)遺伝子ノックアウトマウス(GAD67-/-)を用い、その中枢性の呼吸調節について検討することを目的とした。GAD67-/-マウスは出生後約6時間で死亡するが、これは上気道奇形(口蓋裂)に伴う換気障害によるものと考えられていた。生後2-4時間のGAD67-/-新生マウスの呼吸様式を無麻酔非拘束(in vivo)状態でwholebodyplethysmographyにより解析を行った。室内気吸入下でGAD67+/+は規則正しい呼吸を示したのに対し、GAD67-/-は大きなgasp様呼吸とそれに続く不規則で浅い異常呼吸を示し、無呼吸も頻繁に出現した。また、低酸素や高炭酸ガスに対する、呼吸応答も減弱していた。次に、末梢の影響を除外した単離脳幹脊髄(in vitro)標本を作製し、C4前根からの呼吸性神経活動を解析した。この条件においても、GAD67-/-の呼吸性リズムは不規則であり、吸息時間の短い呼吸パターンを示していた。低酸素液あるいは高炭酸ガス液潅流に対する呼吸応答、すなわち化学感受性も減弱していた。さらに、ホールセルパッチ法を用いて延髄腹外側部の呼吸性ニューロンの活動を記録した結果、GAD67+/+では吸息時に大きな脱分極を示す吸息性ニューロンも、GAD67-/-においては脱分極持続時間が短く発生する活動電位の数も少なかった。