hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪組織由来間葉系幹細胞と多能性前駆脂肪細胞の骨分化能の比較

骨芽細胞と脂肪細胞は間葉系幹細胞からの分化の最終段階で分かれることから系統上近接しており、脂肪細胞の骨分化誘導による骨欠損治療が行える可能性がある。しかし、脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞のどちらが分化系上、より骨芽細胞に近いかは明らかでない。我々は同一のヒト脂肪組織から採取した脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞を比較した結果、脂肪組織由来間葉系幹細胞の方が、骨分化マーカーの発現や基質石灰化能が高いことが明らかになった。我々は同一のヒト脂肪組織から採取した脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞が長期の継代後も脂肪細胞分化能の差異を保持していることを明らかにした。本研究の目的は、脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞の骨分化能の違いを明らかにすることである。ヒト皮下脂肪組織をコラゲナーゼ処理の後遠心分離していられる脂肪組織由来間葉系幹細胞を多く含む間質血管細胞群と、天井培養由来前駆脂肪細胞となりうる脂肪細胞が多く含まれている浮遊層細胞群の、メッセンジャーRNA発現を比較した結果、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ,レプチン、CCAAT/エンハンサー結合たんぱくデルタ浮遊層細胞群などの脂肪分化マーカーは浮遊層細胞群で高かった。7日間の培養後の脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞の両者の遺伝子発現はほぼ同程度となった。一方、ルント関連転写因子2,転写因子Sp7などの骨分化関連遺伝子発現は天井培養由来前駆脂肪細胞と比べて、脂肪組織由来間葉系幹細胞で発現が高かった。天井培養由来前駆脂肪細胞と脂肪組織由来間葉系幹細胞を骨分化培地で培養したところ、脂肪組織由来間葉系幹細胞の方がアリザリン染色で濃染した。骨分化と脂肪分化は密接に関係し、脂肪分化のマスターレギュレーターであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(ガンマ)は脂肪分化を促進する一方で骨分化を抑制することが知られている。本研究により、脂肪組織由来間葉系幹細胞は天井培養由来前駆脂肪細胞と比べ、より骨芽細胞に近い性質を保持していると考えられた。マウス鼠径部から採取した皮下組織から分離した脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞を骨誘導条件下で培養したところ、脂肪組織由来間葉系幹細胞の方がより強い骨分化傾向を示した。しかし、高い脂肪分化能を持つ天井培養由来前駆脂肪細胞も一定の骨分化能を持つことが明らかになった。マウスから採取できる細胞数が限られるため。天井培養由来前駆脂肪細胞に一定の骨分化能があることがin vitroの実験で明らかになった。骨分化を促進する条件が脂肪組織由来幹細胞とは異なる可能性があるため、良好な骨分化を誘導できる条件を明らかにしたい。また、ヒトでの骨欠損に対する脂肪移植治療への応用を考えて、移植動物モデルを用いた天井培養由来前駆脂肪細胞の骨形性能の検討を行う。マウスから採取した脂肪組織由来幹細胞、天井培養由来前駆脂肪細胞は増殖能がヒトの細胞より低いことなどから収量が限られたことが制限因子となり未使用額が発生した。今後、採取量を増やすことやより増殖能の高い培地を検討することで対処する予定である。1.骨欠損モデルマウスにおける脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞の細胞移植法による骨分化機能解析に用いる。In vitroで高純度β-TCPなどのscaffoldを使用した際の、脂肪組織由来間葉系幹細胞・天井培養由来前駆脂肪細胞の骨伝導能の違いを、骨発現マーカーによる免疫組織化学的

染色を行い、比較検証する。In vitroで脂肪組織由来間葉系幹細胞と天井培養由来前駆脂肪細胞の骨誘導促進因子由来のシグナル活性化機構を解析する。骨分化に及ぼすシグナル活性化とそのインヒビターおよびRNAiを用いたシグナル抑制および骨分化マーカーに及ぼす作用を検討する。骨欠損モデルマウスにおいて、脂肪組織由来間葉系幹細胞・天井培養由来前駆脂肪細胞の細胞移植時の骨誘導促進因子の負荷時の骨分化マーカー発現解析を行う。骨欠損モデルマウスにおいて、脂肪組織由来間葉系幹細胞・天井培養由来前駆脂肪細胞の細胞移植時の骨形性能を骨密度定量、骨強度測定、組織学的均一性で解析する。2.ヒト脂肪脂肪組織由来間葉系幹細胞・天井培養由来前駆脂肪細胞における骨分化能解析に用いる。これまでに我々はヒト由来脂肪細胞の採取・調整ならびに分化・培養の手法を確立している(Am J Physiol Cell Physiol, 2011)。すでに申請者は本研究を実施するためにヒト由来培養脂肪細胞を調整し解析することについて千葉大学倫理委員会の承認を得た。ヒト術中摘出余剰脂肪組織を用いて、脂肪組織由来間葉系幹細胞・単一脂肪細胞調整を行い、本調整ヒト細胞における骨分化条件下での骨分化マーカー発現プロファイル、誘導因子による発現調節解析を行う。次年度研究費は上記実験系に用いられる試薬・器具・実験動物に使用する予定である。
非国際的武力紛争の規範原理再考――その史的検証――

2018年度は、非国際的武力紛争の国際化に関する旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所(ICTY)判例の総合的な検討を主軸に据えて研究を遂行した。本テーマは、当初は科研テーマとは関係が希薄であると考えていたものの、分析を進めていくうちに実は密接に関連していることが後に判明した。旧ユーゴスラビア紛争においては、政府と叛徒との間に非国際的武力紛争が発生している最中、外国が叛徒の側に立って干渉するという事態が多々生じた。この事態に直面して、ICTYは、どのような条件が満たされれば、非国際的武力紛争が全体として国際的武力紛争と見なされるかという問題に対処することを迫られることになった。検討の結果、次の諸点を解明することができたと言える。第一に、国際的武力紛争と非国際的武力紛争という二つの「武力紛争」の併存がICTYにとっての起点となっている。第二に、この併存を起点とした上で、判例全体の傾向として言えば、外国の二つの関与、すなわち、干渉と支配に基づきそれぞれ非国際的武力紛争の国際化を導くというアプローチにICTYは立っている。第三に、非国際的武力紛争の国際化のメカニズムとして、支配は、従来の国際的武力紛争の概念を維持するのに対し、干渉は、政府対叛徒の紛争それ自体を新たに同概念に取り込むべく同概念の拡大をもたらす契機を内包している。第四に、この点に鑑みると、支配とは対照的に、干渉は、これまで非国際的武力紛争として分類された政府対叛徒の紛争それ自体に国際的武力紛争の規則を適用することを可能とすることから、武力紛争法の発展を導くもと捉えることができる。第五に、しかし、その一方で、この武力紛争法の発展は、叛徒の地位に関する問題に顕著であるように、基本的に国家にとって受け入れることのできない要素を抱えるものであるため、看過し得ない限界を抱えている。科研テーマに直結するICTY判例の展開の一端を総合的に検討することができた。もっとも、ICTY判例の展開の分析としては、2018年度に取り扱ったこの非国際的武力紛争の国際化に関する論点探求のほかに、いわゆる人道化言説(慣習国際人道法上の非国際的武力紛争への国際的武力紛争の規則の移植)を考察することが求められている。これらの二つを深く掘り下げることが科研テーマにとって必要不可欠であるところ、ひとまず、2018年度は、非国際的武力紛争の国際化に関する論点探求に対して検討の区切りを付けることができたと言える。次年度からの研究の推進計画として、二つの柱があると言える。第一は、ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程の検討であり、第二は、1990年代中葉以降のいわゆる人道化言説の検討である。第一の検討は第二の検討の前段階として位置付けることができる。ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程においては、(国際的武力紛争に適用可能である)敵対行為規則の非国際的武力紛争への導入の提案が幾度も見られたものの、最終的にこの提案は諸国によって拒絶されることになった。この一連の経緯において、諸国は何を根拠として非国際的武力紛争への敵対行為規則の導入を否定したのだろうか。2018年度中に赤十字国際委員会(ICRC)の図書館・アーカイブスにおいてジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程に関係する文書はすでに入手済みである。これらの文書を読み解くことを通じて上記問いに答える必要がある。これに対して、1990年代中葉以降、ICTYは、慣習国際法上、非国際的武力紛争への敵対行為規則の導入を可能とする判例を積み上げてきた。この結果、条約・慣習国際法の法源上の相違はあるものの、非国際的武力紛争への敵対行為規則の導入は、ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程において拒絶された一方、ICTYによって強力に推し進められることになった。では、ICTYは、どのような論理を用いて、この非国際的武力紛争への敵対行為規則の導入を図ったのだろうか。ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程からいわゆる人道化言説に関するICTY判例までに至る展開を検討・分析することが、次年度からの研究の推進計画の柱である。平成29年度は、第1にジュネーヴ諸条約共通第3条の成立過程の実証研究を、第2に冷戦期と1990年代の非国際的武力紛争への外国干渉の論点探求を軸に据え、非国際的武力紛争を規律する武力紛争法の歴史的展開を跡付けた。両者とも、如何にして非国際的武力紛争に国際的武力紛争の充実した規則を適用するかという問題意識を共有するという点において、共通の側面を有している。しかし、基本的に、前者が、非国際的武力紛争に国際的武力紛争の規則を移植する手法(「規則移植論」)の系譜に立つのに対し、後者は、本来は非国際的武力紛争である政府対叛徒の紛争それ自体を国際的武力紛争として分類する手法(「概念拡大論」)の系譜に立つという点において、両者は違いを持っている。まず、前者の検討からは、国際的武力紛争の規則のうち、非国際的武力紛争に適合的なもの(傷病者・海上傷病者)と非国際的武力紛争に非適合的なもの(捕虜・文民)という2つのカテゴリーがあることが明らかとなった。次に、後者の検討からは、政府対叛徒の紛争それ自体を国際的武力紛争として分類する概念拡大に問題があること、これに伴って同紛争に国際的武力紛争のすべての規則を適用することに限界があることが明らかとなった。

これらの2つの分析結果は、1990年代中葉以降の武力紛争法のいわゆる「人道化」言説を考察するにあたって、重要な指標を提供するものと思われる。この分析結果を踏まえ、次年度以降、ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程の実証研究、さらに1990年代中葉以降から本格化する裁判実践(ICTY)を中心とする「人道化」言説の批判的考察に取り組むことが次の課題であるものと考えられる。ジュネーヴ諸条約共通第3条の成立過程の実証研究に対して、一区切り付けることができたことに加え、当初想定していなかった争点(非国際的武力紛争への外国干渉の論点探求)が本研究課題のテーマと密接に関連するものであったことが後に判明し、本争点に対しても、一定の解答を与えることができた。ただし、本争点に関しては、ICTYの判例が相当に複雑であり、この点に関して包括的な研究を実施する必要性を同時に感じている。2018年度は、非国際的武力紛争の国際化に関する旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所(ICTY)判例の総合的な検討を主軸に据えて研究を遂行した。本テーマは、当初は科研テーマとは関係が希薄であると考えていたものの、分析を進めていくうちに実は密接に関連していることが後に判明した。旧ユーゴスラビア紛争においては、政府と叛徒との間に非国際的武力紛争が発生している最中、外国が叛徒の側に立って干渉するという事態が多々生じた。この事態に直面して、ICTYは、どのような条件が満たされれば、非国際的武力紛争が全体として国際的武力紛争と見なされるかという問題に対処することを迫られることになった。検討の結果、次の諸点を解明することができたと言える。第一に、国際的武力紛争と非国際的武力紛争という二つの「武力紛争」の併存がICTYにとっての起点となっている。第二に、この併存を起点とした上で、判例全体の傾向として言えば、外国の二つの関与、すなわち、干渉と支配に基づきそれぞれ非国際的武力紛争の国際化を導くというアプローチにICTYは立っている。第三に、非国際的武力紛争の国際化のメカニズムとして、支配は、従来の国際的武力紛争の概念を維持するのに対し、干渉は、政府対叛徒の紛争それ自体を新たに同概念に取り込むべく同概念の拡大をもたらす契機を内包している。第四に、この点に鑑みると、支配とは対照的に、干渉は、これまで非国際的武力紛争として分類された政府対叛徒の紛争それ自体に国際的武力紛争の規則を適用することを可能とすることから、武力紛争法の発展を導くもと捉えることができる。第五に、しかし、その一方で、この武力紛争法の発展は、叛徒の地位に関する問題に顕著であるように、基本的に国家にとって受け入れることのできない要素を抱えるものであるため、看過し得ない限界を抱えている。科研テーマに直結するICTY判例の展開の一端を総合的に検討することができた。もっとも、ICTY判例の展開の分析としては、2018年度に取り扱ったこの非国際的武力紛争の国際化に関する論点探求のほかに、いわゆる人道化言説(慣習国際人道法上の非国際的武力紛争への国際的武力紛争の規則の移植)を考察することが求められている。これらの二つを深く掘り下げることが科研テーマにとって必要不可欠であるところ、ひとまず、2018年度は、非国際的武力紛争の国際化に関する論点探求に対して検討の区切りを付けることができたと言える。第1に、ジュネーヴ諸条約追加議定書の成立過程の実証研究を遂行する。この検討からは、非国際的武力紛争への敵対行為規則の導入がどのような理由によって否定されたかという論点に一定の手がかりを得ることが期待できる。
ミオシン分子の2つの頭部ABの構造と機能

ミオシンの2つの頭部A,B間の構造の違いを利用して、2つの頭部ABに特異的な抗体の作製に成功した。ミオシンがABの2種の頭部を持っていることはすでに明らかにされていたが、1つのミオシンがABの異なる頭部をもつのかどうかは明らかにされていなかった。そこで、担体に結合させたプロテインAに抗体を結合させ、これにS-1ならびにミオシンがどのように結合するかを調べた。その結果、ミオシンはいずれの抗体によっても強く結合することから分子の大部分はABのヘテロマ-であることが示された。これまで、ミオシン2つの頭部の化学構造の違いはN末端から86番目の活性リジン残基周辺以外は調べられていなかった。そこで、頭部ABに対する抗体を用いてS-1のトリプシン分解の様式の違いを調べた。ミオシン頭部(S-1)はトリプシンで分解するとN末端から25K、50K、ならびに21Kの3つのペプチドに分解される。AB両抗体ともに86番目のリジン残基を含む25Kのペプチドと強く結合した。25Kペプチドは25K-50K連結部の2Kのペプチドを含む27Kペプチドを経て形成される。この27Kペプチドは抗B抗体では強く染色されるが抗あ抗体では殆ど染色されなかった。この結果は27K-50K連結部は頭部ABでその構造が異なっており、頭部Bでのみ25Kに2Kのついた27Kga形成されることを示している。ATPase活性部位は頭部の結晶解析から25Kと50Kの両ドメインにはさまれて存在しており、上記の結果はATPase活性中心の構造も頭部ABで異なることを示唆している。筋収縮の中心的な役割を果たしているミオシンは2つの頭部を持っており、その両方の頭部がアクチンと結合しATPと反応する。このそれぞれの頭部が筋収縮の際にどの様な役割を果たしているかはまだ明らかにはされていない。そこで、本研究ではミオシンの2つの頭部ABそれぞれに特異的な抗体の作成することを試みた。ミオシンの片方の頭部AはATPと反応するとミオシン-ATP複合体を形成し、もう一つの頭部Bはミオシン-リン酸-ADP複合体を形成することはすでに我々によって明らかにされている。筋収縮と共役するアクトミオシン-ATPase反応は頭部Bで行われる。さらに我々は2つの頭部はN末から86番目の活性リジン残基周辺の一次構造が異なることを明らかにした。そこで、これらの部分に相当するペプチドを化学的に合成し、これらのペプチドに対する抗体を作成した。抗体はそれぞれのペプチドと強く結合した。また、ミオシンならびにミオシンの頭部(S-1)とも強く結合した。抗体とミオシンの結合は抗体を作成したペプチドによっては完全に阻害されるが相対するペプチドでは阻害されないことから抗体は頭部ABと特異的に結合するものと考えられる。実際、得られた抗体を担体に結合させてカラムを作成し、頭部(S-1)をカラムに流してS-1を抗体に結合するものとしないものに分離すると、S-1はM-P-ADPを形成する頭部Bと形成しない頭部Aに分離された。また、ミオシンの片方の頭部が抗体Aと反応し、他の頭部がもう一方の抗体Bと反応し、ミオシンはABのヘテロダイマー構造を示された。ミオシンの2つの頭部ABは活性リジン残基周辺の一次構造が異なっている。そこで、これらの部分に相当するペプチドをそれぞれ合成し、これらに対するウサギ抗体を作成した。抗体はもとの両方のペプチドと結合する不特異的な抗体とABのどちらかにだけ結合する特異的な抗体の両方が存在した。抗A抗体ならびに抗B抗体のいずれもミオシンならびにS-1(ミオシン頭部)と結合した。

抗体とミオシンの結合は相対するペプチドでは殆ど抑えられないことからABに特異的な抗体のみがミオシンと結合すると考えられる。抗体のカラムによってS-1をEDTA-ATPase活性を持つS-1Bと持たないS-1Aに分離することに成功した。前者はミオシン-リン酸-ADP複合体を形成するのに対し、後者は形成しなかった。ウエスタンブロッティングによって抗体は活性リジン残基を含む25Kのペプチドとのみに結合することが示された。さらに、ブロッティングした後でも抗Aならびに抗B抗体はS-1AならびにS-1Bを認識することが示された。これまでにミオシンがABの2種の頭部を持っていることは明らかにされていたが、1つのミオシンがABの異なる頭部をもつのかどうかは明らかにはされていなかった。そこで、プロテインAを結合させた担体に抗体を結合させ、これにS-1ならびにミオシンがどのように結合するかを調べた。その結果、ミオシンは8割以上がA-Bのヘテロダイマー構造をとることが明らかにされた。ミオシンがABの2種の頭部を持っていることはすでに明らかにされていたが、1つのミオシンがABの異なる頭部をもつのかどうかは明らかにはされていない。その結果、ミオシンはいずれの抗体によっても強く結合することから分子の大部分はABのヘテロマ-であることが示された。これまで、ミオシン2つの頭部の化学構造の違いはN末端から86番目の活性リジン残基周辺以外は調べられていなかった。そこで、頭部ABに対する抗体を用いてS-1のトリプシン分解の様式の違いを調べた。ミオシン頭部(S-1)はトリプシンで分解するとN末端から25K、50K、ならびに21Kの3つのペプチドに分解される。AB両抗体ともに86番目のリジン残基を含む25Kのペプチドと強く結合した。25Kペプチドは25K-50K連結部の2Kのペプチドを含む27Kペプチドを経て形成される。この27Kペプチドは抗B抗体では強く染色されるが抗あ抗体では殆ど染色されなかった。この結果は27K-50K連結部は頭部ABでその構造が異なっており、頭部Bでのみ25Kに2Kのついた27Kga形成されることを示している。ATPase活性部位は頭部の結晶解析から25Kと50Kの両ドメインにはさまれて存在しており、上記の結果はATPase活性中心の構造も頭部ABで異なることを示唆している。
在日ネパール人の子どもの教育課題―エスニシティ・移民形態・教育ニーズの観点から

本研究は、ネパール人家族や関係者へのインタビューをもとに、近年急増している在日ネパール人の子どもの教育ニーズと課題とは何かを包括的に探求するものである。この調査では以下の4つの観点を重視する。その4つとは、1)ネパールというエスニシティや国の特性にかかわる文化・慣習・制度と、日本のそれらとの親和性・葛藤・矛盾・不整合等、2)在留資格や日本への移住や滞在のあり方の特徴、3)親の教育ニーズ・子どもへの教育期待と日本の教育環境との関係、4)日本の教育や支援団体への実践的な示唆、の4つである。
ニトロ化合物による血管弛緩効果ならびに耐性発現に関する研究

1.ニトログリセリンおよびイソソルビド2ナトリウムは耐性を生じた。ニトロプルシッドナトリウム、ニプラジロールでは、軽度の耐性が生じた。しかし、亜硝酸ナトリウムおよびニコランジルでは耐性は認められなかった。2.冠動脈平滑筋細胞内のグルタチオン量およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ活性は、耐性を生じた血管平滑筋細胞と対照の血管平滑筋細胞で、差は見られなかった。また、グルタチオン量を減少させた血管平滑筋においてニトロ化合物の欠陥弛緩作用に変化は見られなかった。グルタチオンS-トランスフェラーゼ活性を低下させた場合には、ニトロ化合物の血管弛緩作用は明らかに低下したが、NO産生量は変化しなった。NO産生量は、ニトログリセリンが最も多く、ついでイソソルビド2ナトリウムがニトログリセリンの約半分、続いて、それよりさらに少ないニプラジロールとニコランジルの順番であった。グアニレート・シクラーゼ活性は、その抑制剤とされるメチレンブルーを使用して検討した。メチレンブルーは、ニトログリセリンおよびイソソルビド2ナトリウム、ニコランジル、ニプラジロールでは血管の弛緩反応を抑制したが、ニトロプルシッドナトリウムおよび亜硝酸ナトリウムでは抑制しなかった。また、cyclic GMP量は、ニトログリセリンを作用させた場合約10倍に増加した。以上より、亜硝酸エステル構造を持つニトログリセリンおよびイソソルビド2ナトリウム、ニプラジロールでは、耐性を生じ、メチレンブルーで弛緩が抑制されたが、ニコランジルでは耐性は見られなかった。直接NOを発生させるとドナナトリウムでは高濃度作用時に耐性を生じた。耐性発現と血管弛緩作用に血管平滑筋細胞内のグルタチオン量は、関係しないことが明らかとなった。また、グルタチオンS-トランスフェラーゼ活性は、NO産生には直接には関与していない可能性があるが、血管弛緩作用の一部に関与している可能性が示唆された。cyclic GMPに関しては、今後さらに検討していく予定である。
炎症低減化を目指した新たな生体適合素材の開発

我々は切除不能進行腹部腫瘍に対する粒子線治療を行う際、正常組織への暴露を減弱し腫瘍への根治線量を照射することを目的として、医療機器ゴアテックス(R)ソフトティッシュ等をスペーサーとして正常組織と腫瘍との間に留置するスペーサー併用粒子線治療を2007年開始した。しかしゴアテックスは異物として生涯残存して自覚症状や有害反応を惹起し、場合によっては感染の原因や経年変化にて硬化し腸管等を損傷する問題があると判断した。その問題を解決するために、生体内で吸収されるスペーサーの研究開発に着手し、企業との共同研究を重ね特許出願した。その成果が結実し2018年12月医療機器として薬事承認されるに至ったが、その研究開発過程で、吸収性スペーサーが組織と癒着することが判明したことから、癒着しないあるいは癒着を防止する新たな生体適合素材の研究に着手した。スペーサー癒着防止材として用いられているセプラフィルム(R)がヒアルロン酸(HA)とカルボキシメチルセルロース(CMC)との重合体、インターシード(R)が酸化再生セルロースであることから、これらをポジティブコントロールとしてHA単独、CMC単独、HA・CMC重合体等のラット埋植モデルでの評価を継続した。現状では癒着防止効果は認められたものの不十分であった。次年度には企業との共同研究契約を結び研究を加速させる計画である。加えて、今年度は当院にて施行してきたスペーサー併用粒子線治療における手術成績、合併症、治療成績を総合的に検証し、スペーサー併用粒子線治療及びスペーサーの現状と課題を明らかにして学会発表した。計画通り進行中である。・合成や分析に長けた企業との共同研究を結び、研究を加速させる計画である。・癒着防止効果の機序・炎症細胞の関与について検討する。・有望な素材が絞り込めた場合に「イヌなどの大型動物での評価」を計画しているため、今年度は経費を抑制した。
細胞外環境依存的な毛包幹細胞の恒常性維持機構の解明

本研究では、成体毛包幹細胞の多様性とその維持に寄与する細胞外環境の誘導機構を明らかにするため、分子マーカー非依存的な2つの手法:マウス毛包発生のex vivo4次元ライブイメージング法と1細胞トランスクリプトームを統合させたマルチオミックス解析を行った。ライブイメージングにおいて、毛包の細胞動態を網羅的に追跡することで、毛包幹細胞の起源と細胞系譜を同定することに成功した。さらに、胎児期毛包組織から経時的に取得したsingle cell transcriptomeの解析から、幹細胞が分化・成熟していく過程の細胞状態の変遷を明らかにした。組織や臓器の恒常性を支える幹細胞は、生涯に渡り細胞の供給源として機能するために、細胞外環境(ニッチ)と密接にリンクした柔軟でロバストな維持機構を構築している。また、成体毛包に存在する幹細胞は、均一な単一細胞集団ではなく、マーカー遺伝子の発現と毛包再生への寄与を基準にupper bulge、bulge、hair germの3領域に分類されている。成体毛包幹細胞の多様性とその維持機構は、胎仔(児)性の組織前駆細胞の集団から増殖と分化の時空間的発展の結果生み出される。これまでの幹細胞研究により、成体において組織幹細胞が維持・増殖・分化する仕組みの理解は進んだが、発生過程において幹細胞の多様性が正しい場所に正しい時に誘導される(生み出される)機構については、ほとんど理解されていない。毛包幹細胞の発生過程の解析が進まない一因に、初期幹細胞を標識しうるマーカー遺伝子がいまだ同定されていないことが挙げられる。この問題を克服するため、本研究では、マウス毛包発生のex vivo4次元ライブイメージング法を確立し、1細胞解像度での毛包器官発生の4次元イメージングと1細胞トランスクリプトームを統合させることにより、毛包表皮幹細胞が誘導される動的システムの解明を目指した。本年度は、マウス毛包発生のex vivo4次元ライブイメージング法を確立し、毛包の全細胞の動態と系譜を追跡することで、毛包幹細胞の起源と細胞系譜を、時空間情報を元に同定することに成功した。さらに、イメージングから明らかとなった毛包幹細胞の系譜とその時空間情報に、構成細胞の状態変化に関する情報を付加するため、特定のマーカーに頼らずに、任意の時間、空間に存在する細胞集団を標識し、組織から単離するまでの手法を確立した。「研究実績の概要」で述べたとおり、すでに毛包発生過程(胎齢11.5-17.5日)の細胞動態解析を進め、幹細胞の系譜とその発生予定領域を同定することに成功している。そこで次の課題として、毛包幹細胞の前駆細胞の細胞状態が他の細胞とどのように異なるのか、またどのような状態変化を経て組織幹細胞へと発展するのかを明らかにすることが挙げられる。イメージングから明らかとなった毛包幹細胞の系譜とその時空間情報に、構成細胞の状態変化に関する情報を付加するため、特定のマーカーに頼らずに、任意の時間、空間に存在する細胞集団を標識し、胎仔期毛包組織からsingle cellをFACSにより単離し、single cell RNA-seqまでの一連の実験を実施することで、胎齢13.5日, 15.5日毛包の幹細胞予定領域を構成する細胞の1細胞トランスクリプトームデータを得ている。バイオインフォマティクスでの発現解析は現在進行中であるが、高品質な発現データが得られている。一連の実験を通して、発生過程の幹細胞系譜、動態、遺伝子発現の変化を結びつけて解析することが可能となってきた。以上の事由より、本研究は当初の計画以上に進展しているものと考えている。毛包組織の恒常性を支える成体毛包幹細胞は、マーカー遺伝子の発現と毛包再生への寄与を基準に、複数種類の細胞から構成される多様な細胞集団であると考えられているが、こうした幹細胞の多様性とその維持に寄与する細胞外環境(ニッチ)が、発生過程において正しい場所に正しい時に誘導される機構については、ほとんど理解されていない。幹細胞発生過程の解析が進まない一因に、初期幹細胞を標識しうるマーカー遺伝子がいまだ同定されていないことが挙げられる。そこで本研究では、分子マーカーに依存しない2つの手法:マウス毛包発生のex vivo4次元ライブイメージング法と1細胞トランスクリプトームを統合させたマルチオミックス解析から、多様な成体毛包幹細胞の起源とその誘導メカニズム、さらに維持機構の成立過程を明らかにすることを目指した。本年度は、昨年度に確立したマウス毛包発生過程のライブイメージングを用いて、毛包の細胞動態を網羅的に追跡することで、毛包幹細胞の起源と細胞系譜をプラコード期にまで遡り同定することに成功した。また、上皮組織が陥入したプラコード期以降は、細胞が一定の領域を越えて移動することはなく、領域ごとに伸長・成熟しながら、組織が成長していく様子が観察された。

続いて、細胞状態の変化を明らかにする目的で、発生過程を通して経時的に胎児期毛包上皮細胞を単離し、single cell RNA-seqを実施した。1000細胞を超えるTranscriptome解析では、ライブイメージングの動態解析結果と一致して、プラコード期の細胞から細胞運命が分岐して、それぞれの細胞系譜ごとに分化・成熟していく過程が明らかになった。さらに、既知マーカーでは分類されなかった新規の幹細胞集団も同定され、本研究において、幹細胞予定細胞の存在とその時間的発展を、これまでにない精度で詳細にプロファイリングされたことが示唆された。上記記載の予備的実験の成功を受けて、今後は、幹細胞が生み出される過程において見出されるであろう、幹細胞予定細胞の存在とその時間的発展を、細胞動態解析とRNA seqの両面からより詳細にプロファイリングしていく。そのために、RNA seqにおける解析対象とする発生ステージおよび細胞数を増やして解析を進めていく方針を固めている。また、発生過程の自然な幹細胞動態を明らかにするだけでなく、時空間的に加えられた環境変化に対する細胞の応答や動態の変化を、遺伝子発現の変化とともに解析することで、幹細胞の誘導や維持における細胞外環境の役割を理解する。さらに、RNA-seqから新規に同定される幹細胞前駆細胞のマーカーを用いて、single cell RNA-seqから得られたトランスクリプトームデータをライブイメージングの動態データに統合させ、マルチオミックスデータの統合的解析から、多様な成体毛包幹細胞の起源とその誘導メカニズム、さらに維持機構の成立過程をこれまでにない解像度で理解することを目指す。幹細胞生物学今年度は、画像解析が多用されるため、施設内の顕微鏡使用料として年間21万円を計上していたが、検討を進める過程で課金されない機器の使用に転換したことから、予定していた支出額よりも支出が抑えられることとなった。また抗体を使用した組織学的な解析の必要性が見込まれるため、生化学実験に50万円を計上していたが、本年度はよりLive imagingによる動態解析が優先され、組織学的な解析は今年度の解析を受けて次年度の重要検討事項となった。さらに参加を検討していた学会が震災の影響で開催されなかったことから、旅費の使用もなくなり、その結果当初の予定よりも使用額が少なくなる結果となった。次年度は、今年度の繰越金と翌年度分として請求した助成金により、5つの発生ステージについて大規模なSingle-cell RNA seq解析を予定している。また本解析から特定される新規マーカーを用いた遺伝子改変動物の作成や組織学的な解析を予定している。
マッコウクジラにおける社会化行動の機能

五島南方海域において、オスのマッコウクジラの行動および社会構造調査を行った結果、この海域のマッコウクジラは、高緯度の根室海峡のものよりも体長が小さく、社会性が高く、より長い時間を水面での社会化行動に費やしていることが明らかとなった。このことは、社会性の高い個体の方が、頻繁にかつ長時間社会化行動を行なっていることを示しており、長期的な社会性の維持に親和的社会行動が重要であることを示唆している。五島福江島南方海域に来遊するマッコウクジラの行動調査を行うために、長崎大学水産学部の附属練習船および上五島町のダイビングショップ所有の船舶を利用して、2015年6月に1回、7月に2回、8月に1回の計4回の現地調査を行った。このうち8月末を除く調査で、マッコウクジラを発見した。初夏に来遊したマッコウクジラは8月末頃にはこの海域を離れるものと思われる。3回の調査で、尾びれの写真から11頭のマッコウクジラを個体識別し、このうち2頭について、赤外線距離計による距離と写真上の大きさから、個体の推定体長を得た。これまでに得られた5頭の推定体長は8から14mであり、根室海峡で記録したマッコウクジラの推定平均体長よりもかなり小さかった。これまでに子連れを含む群れが確認されていないことと合わせて、この海域には主に性成熟前のワカオスが来遊すると考えられる。2015年7月には当海域では同じ5頭が繰り返し確認された。この5頭は水面で密な集団(クラスター)を形成するのが観察されたほか、やや離れている場合でも潜水浮上が同調しているのが観察された。また、この集団では浮上前に頻繁にスロークリックを発していた。このような行動の同調やスロークリックスの発声は根室海峡では稀であり、ワカオス集団特有の行動と考えられる。7月の調査では、1頭に衛星タグを装着した。得られたデータから、この個体は昼夜で異なる深度へ潜水していること、夜半から早朝にかなりの時間を水面で過ごしていることが明らかとなった。調査海域である五島南方海域において、これまでに計13頭の個体を識別し、5頭について推定体長のデータを得ている。また。これらの個体の水面での行動観察データを得たほか、1頭に衛星タグを装着し、移動データを得た。これらより、この海域におけるマッコウクジラの滞在、移動と行動パターンの基礎的な情報を得ることができた。このことから概ね順調に進展していると判断する。2016年5月、7月に長崎大学水産学部練習船にて五島南方海域のマッコウクジラの調査を行った。また6月には新上五島町のダイビングショップの船舶を傭船して、吸盤装着型データロガーの装着調査を行った。これらの調査で8頭が個体識別された。この内7頭は過去にも識別されており、この海域を利用している個体は毎年繰り返し来遊するものが多いことが明らかとなった。識別写真から体長推定を行った結果、平均12.4mで根室海峡よりも小型の個体が来遊していることが確認された。これまでに識別された15頭の社会分析の結果、同伴指数は根室海峡よりも高く、互いに同伴指数が高い4頭と5頭からなる集団が見出された。この集団の個体は海面で近接するクラスターをたびたび形成することが観察された他、潜水浮上のタイミングが同調する傾向が見られた。このようなクラスターは根室海峡ではまれにしか観察されていない。これらの結果は五島のマッコウクジラは根室海峡のものより社会性が高いことを示している。2頭に吸盤装着型データロガータグを装着し、それぞれ9時間弱、28時間の水中行動データを得た。この2頭の行動データ中、社会行動が含まれると考えられる水面滞在時間は、それぞれ5時間50分と4時間15分であり、装着時間に占める割合は27%であった。根室海峡において、より大型のマッコウクジラ11頭についてこれまでにロガーデータから得られた値は11%であり、五島のマッコウクジラは2倍以上の時間を水面で過ごし、より多くの時間を社会行動に費やしていることが示唆された。この2年間で、五島南方海域において11頭の個体識別を行い、その内7頭については体長データが得られている。これらの個体について水面での行動データ、鳴音データも順調に収集されている。また昨年度は当該海域で2頭に吸盤装着型データロガータグを装着し、9時間と28時間の行動データが得られている。これらのことから計画はおおむね順調に進展していると判断される。2017年4から6月に長崎大学水産学部附属練習船と新上五島町のダイビングショップ所有の船舶を利用して、五島南方海域のマッコウクジラの調査を行った。これらの調査で11頭のオスのマッコウクジラが個体識別された。このうち今年度新たに識別されたのは5頭で、6頭は再発見された個体であった。これまでに得られた識別データを利用した並び替え検定の結果、五島沖のマッコウクジラの同伴関係はランダムではないことが示された。2015年以来、同じ5頭が繰り返し同じ日に識別され、この5頭は長期的な社会的関係にあると考えられた。これらの個体は海面付近で頻繁に密なクラスターを形成し、社会行動や休息行動をともに行っている場面も観察された。このような多くの個体の長期的関係やクラスター形成は根室海峡ではほとんど見られない。

2017年5月の調査で3頭に吸盤装着型データロガータグを装着し、18.7、2.5、2時間のデータを得た。18.7時間の行動データ中、社会行動が含まれる水面滞在時間は3時間46分であった。これまでに得られた3頭のデータで、装着時間に占める水面滞在時間の割合は24.7%で、根室海峡で得られた同様の値(11%)の倍以上であった。この3年間の研究の結果、五島沖のオスのマッコウクジラは、根室海峡のものより推定体長が小さく、社会性が高く、より長い時間を水面での社会行動に費やしていることが明らかとなった。本研究は、血縁や繁殖に基づかない群れを作るオスのマッコウクジラが、親和的社会行動により社会性を維持していることを確認することを主目的として行った。その結果、より社会性の高い若いオスのマッコウクジラは、より頻繁にかつ長時間社会行動を行なっていることが明らかとなった。このことは、社会的な動物にとって、短期的な関係修復だけでなく、長期的な社会的関係の維持にも親和的社会行動が重要であることを示している。五島南方海域において、オスのマッコウクジラの行動および社会構造調査を行った結果、この海域のマッコウクジラは、高緯度の根室海峡のものよりも体長が小さく、社会性が高く、より長い時間を水面での社会化行動に費やしていることが明らかとなった。このことは、社会性の高い個体の方が、頻繁にかつ長時間社会化行動を行なっていることを示しており、長期的な社会性の維持に親和的社会行動が重要であることを示唆している。本年度は、上五島のダイビングショップ所有の船舶を傭船し、五島南方海域においてマッコウクジラに吸盤装着型データロガータグの装着を行い、詳細な水中行動データを得る予定である。そのほか、昨年度に引き続き個体識別写真の撮影、体長推定、水面行動データ、鳴音データの取得に努める。これらの結果から、社会行動時間、クラスター形成頻度、スロークリックス、コーダの発声頻度を算出し、根室海峡のマッコウクジラとの比較を行っていく。5月および6月に長崎大学水産学部練習船を用いて、五島南方海域のマッコウクジラの個体識別、体長推定、水面行動データ、鳴音データを取得する。また6月には、昨年度に引き続き新上五島町のダイビングショップの船舶を傭船して吸盤装着型データロガーを装着し、水中行動データを得る予定である。これらの結果から、社会行動時間、クラスター形成頻度、コミュニケーション音声の発生頻度を算出して、根室海峡のマッコウクジラとの比較を行っていく。海棲哺乳類学
抗体の初期レパートリーと親和性成熟の相関に関する研究

本年度は、前年度に行った、親和性成熟の過程を反映する一連の抗NPモノクローナル抗体のCDR-H3の構造と成熟の程度の相関についての研究を論文として発表した(J.Biol.Chem.276,27622-27628)。次に、これらの基準を用い本研究テーマの目的である、初期抗体レパートリーの親和性成熟能を実際に検討してみた。まず、NP免疫後1週目の抗体レパートリーの配列解析を約200クローン程度行った。その結果、免疫前と比べ、特にIgGlにおいて、胚細胞型のVH186.2を持つクローンが増えることが確認された。興味深いことに、これらのクローンのjunctionalアミノ酸は、免疫後2週目以降にモノクローナル抗体として採られたクローンより多様であった。言い換えると、免疫後1週目の環境は、ある程度の抗原親和性を持つために必須と考えられたH99=Tyr or Gly以外のアミノ酸を持つクローンでも、抗原の選択により淘汰されることなく存在できるものであることを示している。つまり、これら親和性成熟の過程に入る前のクローンで、かつ、親和性成熟の過程で淘汰される可能性のあるクローンが、この段階で存在していると考えられた。次に、この1週目の環境からモノクローナル抗体を作成した。11種類のクローンについて、そのH鎖、L鎖の可変領域のDNA配列解析を終了した。両鎖とも変異は導入されていなかった。H鎖のjunctionalアミノ酸については、抗体レパートリーの解析と同じく、H99がTyr or Gly以外のものも含まれた。さらに、これらのモノクローナル抗体を精製し、それらのCDスペクトルプロファイルの取得し、また、抗原結合に伴うCDスペクトル変化から抗原親和性も求めた。その結果、1)抗原親和性は全て10^5後半から10^6前半であり、低親和性の抗体でも十分に存在できる環境であることが確認された、2)CDプロファイル、および、「H3ルール」により予測されるCDR-H3の構造より、少なくとも、免疫後26週で活躍するであろうクローンの祖先と思われるものが確認できた、3)しかしながら、9週目以降で活躍するであろうクローンの祖先と思われるものは、確認できなかった、4)また、2週目以降、淘汰されるであろうクローンも確認できた。これらのことから、後期型のクローンは、必ずしも免疫初期から存在し長い時間をかけて成熟するのではなく、ある時期を境に現れるクローンが祖先となっていることが示唆された。現在、これらの結果の投稿準備中である。今後は、これらの研究により得られたクローンを試験管内で成熟させ、本結果を検証していく予定である。本研究の目的である、抗体の初期レパートリーと親和性成熟能の関係を明らかにするためには、まず、親和性成熟そのものをいかなる基準で評価するべきか検討しなければならない。そこで、本年度は、まず第一に、親和性成熟の過程を反映する一連の抗NPモノクローナル抗体のCDR-H3の構造と成熟の程度にどのぐらいの相関があるか調べた。CDR-H3の構造に着目した理由は、これまでの研究で、親和性成熟能を左右するアミノ酸残基がCDR-H3の根元に位置することがわかっているからである。CDR-H3の高次構造は、一般の高次構造既知の抗原結合部位を帰納的に解析して得られた「H3ルール」を用いてアミノ酸配列から予測した。また、合わせて各抗体の円二色性測定も行い、抗原結合の際の抗体の構造変化を検討した。その結果、以下のことが明らかとなった。1)時間がかかるものの、非常に高い抗原親和性を得ることのできたクローンは、CDR-H3の構造がkinked-baseであり、かつ、ループの構造がフレキシブルであるという共通の特徴を持っていた。2)これらのクローンは、フレキシブルな特徴を反映するように、抗原結合に伴う構造変化のパターンも複数親察された。3)中程度の抗原親和性しか得られないが、短時間で成熟を完了したクローンのほとんどは、CDR-H3の構造がkinked-baseであり、かつ、ループの構造がrigidである特徴を持っていた。4)これらのクローンは、抗原結合に伴う構造変化のパターンが共通であり、共通の抗原結合様式を持っていることが示唆された。5)「H3ルール」による分類を決めるアミノ酸残基は、B細胞分化の初期段階で導入されるものであることから、これらの構造特性はB細胞発生段階で既に決定されていたと考えられた。現在、これらの結果を論文として投稿中である。次年度は、これらの知見を踏まえ、初期レパートリーの解析を行うこととする。

つまり、これら親和性成熟の過程に入る前のクローンで、かつ、親和性成熟の過程で淘汰される可能性のあるクローンが、この段階で存在していると考えられた。次に、この1週目の環境からモノクローナル抗体を作成した。11種類のクローンについて、そのH鎖、L鎖の可変領域のDNA配列解析を終了した。両鎖とも変異は導入されていなかった。H鎖のjunctionalアミノ酸については、抗体レパートリーの解析と同じく、H99がTyr or Gly以外のものも含まれた。さらに、これらのモノクローナル抗体を精製し、それらのCDスペクトルプロファイルの取得し、また、抗原結合に伴うCDスペクトル変化から抗原親和性も求めた。その結果、1)抗原親和性は全て10^5後半から10^6前半であり、低親和性の抗体でも十分に存在できる環境であることが確認された、2)CDプロファイル、および、「H3ルール」により予測されるCDR-H3の構造より、少なくとも、免疫後26週で活躍するであろうクローンの祖先と思われるものが確認できた、3)しかしながら、9週目以降で活躍するであろうクローンの祖先と思われるものは、確認できなかった、4)また、2週目以降、淘汰されるであろうクローンも確認できた。これらのことから、後期型のクローンは、必ずしも免疫初期から存在し長い時間をかけて成熟するのではなく、ある時期を境に現れるクローンが祖先となっていることが示唆された。現在、これらの結果の投稿準備中である。今後は、これらの研究により得られたクローンを試験管内で成熟させ、本結果を検証していく予定である。
肺小細胞癌におけるPRC2の重要性と遺伝子特異的エピゲノム治療可能性の検討

2016年度までの条件検討で、バスタブ型ソニケーション装置では破砕が不均一で解析に耐える検体を得ることが出来なかったためプローブタイプのソニケーション装置を導入して条件検討を行い、クロマチン免疫沈降法に用いる肺小細胞癌細胞株NCI-H209検体に対するソニケーション条件を決定していた。しかしその後同条件で施行してみたが、電気泳動では210kbpsの長いDNA断片が多数残存していた。DNA長断片が残存している状況でのシークエンシング結果の信頼性が低下するためソニケーション条件をさらに強くして検討したが、安定的な結果が得られなかった。ホルマリン固定条件やソニケーション装置機種およびソニケーション条件では固定できない何らかの要因が考えられた。最近相分離がヘテロクロマチンドメイン形成に関わっているという報告(Phase separation drives heterochromatin domain formation., Strom AR et al., 2017, Nature)がされた。発現亢進しているPRC2が本研究で認められたSonication抵抗性のヘテロクロマチンドメインをPhaseseparationを通じて形成していると考えられるため、Phase separationを解除する条件を探索し、新しいアプローチでの治療可能性を追求する予定である。癌ゲノム解析の結果、エピゲノム修飾関連遺伝子の変異が多く報告され、エピゲノム制御異常による癌化メカニズムが示唆されている。EZH2(Enhancer of Zeste 2)はヒストンH3K27me3修飾酵素活性を持つPRC2(Polycomb Repressive Complex 2)の酵素活性サブユニットで、肺小細胞癌(SCLC)でも高発現し癌化との関与が推測されている。申請者は既報でSCLCにおけるPRC2標的候補遺伝子群を同定し、EZH2阻害剤によるSCLC細胞株の増殖抑制を報告した。しかしEZH2阻害剤が実際にヒストン修飾変化により遺伝子発現を変化させているか未知である。本研究はEZH2阻害剤がSCLC細胞株にもたらすエピゲノム変化を明らかにし、増殖や転移に関わる重要な標的遺伝子および標的遺伝子選択に関わる制御因子を発見し、治療応用可能性を見出すことを目的とする。昨年度までの検討によりクロマチン免疫沈降に持ちいるサンプル調整条件を決定していたが、実際に進めてみると決定した条件でのクロマチン断片化がうまくいっておらず、条件を再検討している。具体的には同じプロトコルで断片化を行っても、実験毎にうまく断片化できている場合と、そうでない場合が起こっているようである。さらに断片化が不十分な場合は極端に長い210kbpsものDNA断片が大量に残存しており、クロマチン免疫沈降の原理から考えると免疫沈降に進むには質が不十分と考えられた。これを受けて現在ソニケーションの際の手技を安定化するとともに、それ以外の原因(夾雑物によるDNA断片の集合)について検討を続けている。このことからクロマチンの断片化が不十分であり、実験を進めるには不適当と考えられた。現在ソニケーション条件をさらに細かく振って検討を進めている。今までの経験から、同じ条件でのソニケーションやDNA抽出を行っても、サンプルによってアガロース電気泳動での泳動条件にばらつきがあることが多かった。今まではソニケーション時のわずかな条件の差であり、プロトコルを確立し、手技習熟することで安定化できるのではなかと考えていたが、様々な報告をみると細胞株によっては通常のキットを用いたDNA抽出を行ってアガロース電気泳動を行うとバンドが尾を引いたり、210kbpの長断片があるように見えても実際には夾雑物でトラップされてそのように見えることがあるようである。実際に同じラボで他の細胞株を使用した実験を見ていると、むしろ容易に目的のサイズのDNA断片を得られているようである。このことから今後は細胞株を変更して行う方向を考えている。またソニケーションによるDNA断片化が不十分に見えても解析可能である可能性もあり、より安価に条件を検討できるようnanoporeによるインハウスでのクロマチン免疫沈降シークエンシング解析系を確立する予定である。発現亢進しているPRC2が本研究で認められたSonication抵抗性のヘテロクロマチンドメインをPhase

separationを通じて形成していると考えられるため、Phase separationを解除する条件を探索し、新しいアプローチでの治療可能性を追求する予定である。クロマチン免疫沈降シークエンシングの問題の一つにシークエンスのコストが高すぎることがある。このため限られた実験しか行えずタイムコースや条件を多く設定した実験の遂行は困難であった。しかし最近nanopore社より安価かつ、リード長が長く、ほとんど設置場所を必要としない新たなシークエンサーであるMinIONが発売された。本研究ではシークエンス部分は外注する予定であったが、MinIONを導入することで数分の1のコストでシークエンスが可能となり、詳細な条件検討が可能となるため本機器の導入を予定している。MinIONおよびスモールサンプルに対応するアダプターであるFlongleが発売される2018年中旬に購入し、実験に用いる予定とした。このため外注する予定であったシークエンス分を発注せず、次年度に繰り越すこととした。ソニケーション条件検討では細胞培養とホルマリン固定、一部のバッファーやDNA精製キットを用いて行った。このため多くは研究室の共用物品で賄った。今後実験を進めるにあたり、phase separation解析のため蛍光標識蛋白発現系や蛍光顕微鏡使用料等に使用する予定である。
食欲促進、抗ストレス及び抗肥満作用を有する新規ペプチドによる鶏肉の高生産法の開発

α-MSH受容体アンタゴニストの中枢投与はブロイラーの摂食に影響を及ぼさなかったことから、ブロイラーにおいては視床下部α-MSH発現量が少ないことが示唆された。CRF受容体アンタゴニストの中枢投与は、血中副腎皮質ホルモン濃度を低下させ、摂食量を増加させたことから、CRF受容体アンタゴニストが食欲促進、抗ストレス及び抗肥満作用を併せ持つことが示唆された。しかしながら、これらの効果はレイヤーにおいては鼻腔内投与時にも認められたが、ブロイラーにおいては認められなかった。それ故、ブロイラーにおいては、鼻腔内から中枢神経系へのペプチドの移行率が低いことが示唆された。本研究は、成長促進効果を有する「食欲促進ペプチド」、筋肉量増加効果を有する「抗ストレスペプチド」並びに体脂肪量減少効果を有する「抗肥満ペプチド」の3種のペプチドを分散性の高い微粉末として経鼻投与して、ブロイラーの「成長促進」、「筋肉量増加」並びに「体脂肪量減少」の3者を同時に達成することにより鶏肉の生産性を飛躍的に高めようとするものである。本年度の成果は以下の通りである。まず、「食欲促進ペプチド」として、強力な食欲抑制ペプチドであるα-MSHの受容体アンタゴニストを中枢投与したが、摂食量の増加は認められなかった。そこで、ブロイラーの視床下部α-MSH前躯体遺伝子の発現を調べた結果、ブロイラーはその他の鶏種に比べα-MSの発現量が極めて少ないことが明らかになった。このことから、ブロイラーにおいてはα-MSHの産生量が少ない為、アンタゴニストによるα-MSHの阻害効果が表れず、摂食促進効果が認められないことが示唆された。次に、「抗ストレスペプチド」として、ストレスペプチドであるCRFの受容体アンタゴニストを中枢投与した結果、ストレスの指標となる血中副腎皮質ホルモン濃度の低下と摂食量の増加が認められた。このことから、CRFの受容体アンタゴニストは抗ストレス作用と食欲促進作用を併せ持つことが明らかになった。更に、「抗肥満ペプチド」として、脂肪分解促進作用を有するVIPのアナログを中枢投与した結果、血中遊離脂肪酸濃度の上昇と摂食量の減少が認められた。このことから、VIPアナログの抗肥満作用のみを発現させるべく、VIPアナログによる脂肪分解促進機構と食欲抑制機構との関連を解明する必要があると考えられた。最後に、我々が開発したVIPアナログ吸着微粉末を用いてVIPアナログの分散性と安定性の向上をin vivo条件下で調べ、その有効性を確認した。まず、昨年度に、「食欲促進」、及び、「抗ストレス」の両作用を有することが確認されたCRF受容体アンタゴニストを、鶏雛に脳室内或いは鼻腔内投与した結果、脳室内投与時においてのみストレスの指標となる血中副腎皮質ホルモン濃度の低下と摂食量の増加が認められることが明らかになった。このことから、CRF受容体アンタゴニストを経鼻投与剤として用いる為には、このアンタゴニストの中枢への移行性を更に高める必要があることが明らかになった。次に、昨年度に見出した、鶏におけるVIPアナログによる脂肪分解促進機構と食欲抑制機構との関連を明らかにする目的で、種々の食欲抑制関連受容体アンタゴニストの投与がVIPによる食欲抑制効果に及ぼす影響について調べた。その結果、上述のCRF受容体アンタゴニストが、VIPによる食欲抑制と血中遊離脂肪酸濃度の上昇(即ち、脂肪分解促進)の両者を消失させることが明らかになった。これらの結果は、VIPはCRFを介して脂肪分解の促進と食欲の抑制を引き起こすことを示唆することから、VIPを用いて脂肪分解促進効果のみを発現させることは困難であると判断された。ここで、「筋肉量増加」は、基礎代謝量の増加、即ち、消費エネルギーの増加、を伴う為、「筋肉量増加」によって「体脂肪量減少」が達成できる可能性が高い。それ故、上述のCRF受容体アンタゴニストの中枢への移行性を高めることができれば、食欲促進による「成長促進」と抗ストレスによる「筋肉量増加」に加え、「体脂肪量減少」も同時に達成できる可能性があることから、今後は、CRF受容体アンタゴニストに焦点を絞って検討を進めることとした。昨年度までの研究成果により、食欲促進による「成長促進」と抗ストレスによる「筋肉量増加」並びに筋肉良増加に基づく「体脂肪量減少」の総てが、CRFの受容体を遮断することによって、達成し得ることが示唆された。しかしながら、ブロイラー雛においては、CRF受容体アンタゴニストの脳室内投与によって認められる効果が鼻腔内投与によっては認められなかったことから、本年度は、この投与経路による効果の違いが、動物種或いは日齢による違いに基づく可能性について明らかにするべく、種々の品種及び日齢の鶏を用いて、CRF受容体アンタゴニストの鼻腔内投与試験を行なった。