hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌治療後に誘起される後発転移活性化機構の解明

何十年にもわたって、抗がん剤治療の主流は白金系薬剤であった。しかしながら、抗がん剤治療は、使用するにつれ抗癌剤耐性化が生じ、最終的にはきかなくなってしまう。我々は、血小板成長因子受容体PDGFRがHGF受容体であるMet蛋白質の発現上昇を促すことで、抗がん剤耐性化に関与していることを見出した。抗がん剤治療依存的にMet蛋白質の発現が上昇する。抗がん剤とPDGF受容体阻害剤を併用することで、抗がん剤単独と比較して、有意な癌細胞死の上昇が確認された。PDGF受容体阻害剤は、臨床分野で幅広く使用されており、従来の白金系抗がん剤と併用することで、抗がん剤耐性化を阻止する可能性が示唆された。現在癌治療で使用されている放射線やCDDP等の抗癌剤の多くは活性酸素を利用して癌細胞にアポトーシスを誘導する。また外科手術自体もその後に生じる炎症反応に由来する酸化ストレスが発生する。活性酸素は、アポトーシスを誘導するのみならず後発転移に関与する多くの遺伝子の発現も促す。したがって、活性酸素依存的に後発転移が誘導される分子メカニズムを解明し、その抑制を図ることは喫緊の課題である。舌癌患者には、手術前に抗癌剤治療を受けた患者と手術を最初に行われた集団が存在している。当科を受診した舌癌の患者集団を術前化学療法を受けた群と手術を最初に施行した群とに振り分けて、retrospectiveに解析した。患者は、術前化学療法を受けた患者58人と手術を最初に施行した群55人に振り分けられた。患者は、腫瘍はcurativeに切除した。また術前化学療法は、ブレオマイシンとUFTあるいはS-1を併用して行った。primary outcomeは舌癌由来の癌死とした。術前化学療法は、舌癌の遠隔転移を有意に抑制した(P= 0.0185)。舌癌死は術前化学療法群で3%、切除のみの群で10%となりハザード比は、0.25であった。術前化学療法は、低中分化、および男性舌癌患者の5年累積生存率を有意に改善した(P = 0.0158, P = 0.0173)。術前化学療法は、男性舌癌および、低中分化型舌癌患者に有意な改善をもたらしたものの、女性舌癌、高分化型舌癌においてはなんら改善は観察されなかった。この目的を達成するために、我々はHPV陽性子宮頸がん細胞株を使用して、抗癌剤感受性を検討してきた。これらの細胞株は酸化ストレスに耐性を有していることが報告されている(Am J Obstet Gynecol. 2005May;192(5):1399-403.)。20μMのシスプラチンをCaski細胞に曝露した結果、細胞死が観察された。抗癌剤治療に反応するRTKを同定するために、シスプラチン曝露後のCaski細胞のlysateを使用して、様々なRTKの発現量をウェスタンブロットにより検討した。これまで抗癌剤反応性の報告なされていないRTKはEphA4である。過酸化水素曝露、Caski細胞中でEphA4の発現減少が観察され、過酸化水素処理によりEphA4のチロシンリン酸化が誘導された。EphA4は受容体型チロシンキナーゼEphのAサブクラスに属しており、Aタイプ、Bタイプ両方のエフリンとも結合する。シグナルは、受容体が発現している細胞内(順方向)および、リガンドが発現している細胞内(逆方向)の両方に生じる。腫瘍細胞において、エフリンファミリーは、癌の伸展に関与している(Nat Rev Cancer. 2010March; 10(3): 165-180)。続いて、活性酸素により誘導される細胞死がEphA4を阻害することで促進されるメカニズムを検討した。最終年度に実施した研究の成果舌癌に対する術前化学療法は、外科切除を最初に施行した場合と比較して、低中分化型腫瘍の無遠隔転移発生生存率を改善し、全生存率を向上させていた。しかしながら、後発転移の発生に対する効果は観察されなかった。研究期間を通じて実施した研究の成果何十年もの間、抗がん剤治療の主流は白金系薬剤であった。しかしながら、治療の過程で抗がん剤耐性化が生じ、患者の予後は著しく低下する。我々は、今回の研究によって、抗がん剤に曝露された癌細胞では、PDGF受容体の活性化が生じ、その後誘導されるHGF受容体Metの発現上昇が、抗がん剤耐性化の一つの重要なメカニズムになっていることを明らかにした。PDGF受容体を阻害した結果、抗がん剤曝露

依存的に生じるMetの発現上昇は抑制された。PDGF受容体阻害剤は、臨床現場で幅広く使用されている分子標的薬であり、本研究により、抗がん剤耐性化にPDGF受容体阻害剤の併用が効果を発揮する可能性が示唆された。最終年度に得られた実際の臨床実績を用いた解析より、得られた分子生物学的結果は、高分化型腫瘍の抗がん剤耐性化に関与している可能性も示唆された。本研究により、抗がん剤依存的に誘導される受容体型チロシンキナーゼの活性化は、抗がん剤耐性化の重要なメカニズムであることが判明した。受容体型チロシンキナーゼは、分子標的薬として現在臨床現場で幅広く使用されている。その使用法には、単剤での使用も数多く行われているが、化学療法と併用することでその効果が増大するメカニズムを分子生物学的に証明できた点で大変重要であると考えている。腫瘍分子生物学研究開始、一年目において、研究成果がある程度まとまり、Eur J Pharmacol. 2013Jan 15;699(1-3):227-32において筆頭筆者で論文がすでに受理されている。現在は、得られた成果を臨床例で合致しているかいなかの段階に伸展しており、研究はおおむね順調である。実験内容は、すでに論文作成の段階にとりかかっている。本年度5月中に、英文校正を終え、学術誌に投稿予定である。術前化学療法において、低中分化型腫瘍においては予後の有意な改善が認められたものの、高分化型腫瘍においては、予後の改善は認められていない。我々は現在、高分化型腫瘍特異的に発現が高くなっている受容体型チロシンキナーゼを見出しており、この受容体の解析を進めることで、高分化型腫瘍に対する術前治療抵抗性の原因を探る予定である。クラスター化されていないephrinA5-FcでEphA4のチロシンリン酸化が減弱しているか確認する。活性酸素依存的に誘導されるEphA4のチロシンリン酸化を、ephrinA5-Fcとは異なる阻害剤で阻害した場合にも細胞死が抑制されるか観察する。活性酸素依存的なEphA4活性化がどのようなメカニズムで細胞死を誘導しているか検討する。抗癌剤とEphA4の阻害剤を併用した場合、癌細胞死は抗癌剤単独と比較してどうなるか?複数の異なる種類の阻害剤を用いて確認する。臨床サンプルからの遺伝子発現を検討するために、予算を見積もっていた。しかしながら、既存の臨床情報から、患者の予後に大きな影響を与える因子(分化度)を見出し、遺伝子発現等の検討を行わずにある程度の結果が得られている。これまでに、得られた臨床上の予後因子(分化度、年齢、性別等)を説明しうる分子の解析を分子生物学的研究を通して深めていくEphA4の発現量と癌患者の予後との相関を検討するEphA4の配列と癌患者の予後との関連についての検討EphA4の発現量と患者の予後との相関を比較して、相関関係が得られた場合には、その相関から外れた患者群においては、どうして相関関係から外れたかを、EphA4の配列を比較することで、検討する。相関関係から外れた患者群に特定の変異が見つかった場合には、(Origene)から購入したEphA4ベクターにその変異をQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いて導入する。その後、これらの変異が生じているEphA4は通常のEphA4と比較して、チロシンリン酸化のされやすさに違いがないか検討する。
ボランティア参加を促すものは何か：フィールド実験による因果関係の推定

ボランティア活動への関与をより強く促す動機は何か。ボランティア活動とは、行政との関係において定義すると、「行政サービスの網からこぼれ落ちる市民のニーズを拾い上げ支援する無償の活動」と言えるだろう。このような活動へと人々を向かわせる動機は何か。その動機により効果的に働きかけ、より多くの人々のボランティア活動を引き出すにはどうしたらよいのか。これらの点はこれまで十分に分析されてきたとは言えない。本研究は、背後にありうる利己的動機を含む様々な動機がボランティア活動への関与に与える効果の解明を、大学生を対象とするフィールド実験により試みる。
慢性腎不全における鉄代謝異常とサルコペニア発症の分子メカニズム解明

慢性腎不全(CRF)関連骨格筋萎縮における鉄の影響について検討した。C57BL/6Jマウスにアデニンを投与しCRFモデルマウス(Adenine-CRF群)を作製し、Control群と比較した。Adenine-CRF群の骨格筋における鉄量の増加、トランスフェリン受容体とフェロポルチン発現の低下、フェリチン発現の増加を確認した。さらに、Adenine-CRF群の骨格筋において酸化ストレスが増大していた。以上の成果から、CRFにおいて鉄代謝異常による骨格筋への鉄蓄積が酸化ストレスを介して骨格筋萎縮を引き起こしている可能性が示唆された。慢性腎不全(Chronic Renal Failure:CRF)患者において、鉄排出輸送体フェロポルチン(FPN)の発現低下とFPNの作用を抑制する鉄制御ホルモンであるヘプシジンの発現増加により、生体内鉄代謝異常が引き起こされ、体内鉄量が増加していることが報告されているが、CRF関連サルコペニア(骨格筋萎縮)と鉄代謝異常の関連性ついては明らかにされていない。本研究の目的は、CRFにおけるサルコペニアについて鉄代謝異常の観点から、そのメカニズムを解明を目指し、治療法につながる基盤を確立することである。本研究では、8週齢の雄性C57BL/6Jマウスにアデニンを投与しCRFモデルマウス(CRF群)を作製し、vehicle投与対照群と比較検討した。CRF群ではvehicle投与対照群と比較して、有意に血清クレアチニン値・インドキシル硫酸濃度の増加が認められ、腎機能障害と尿毒症を確認した。また、CRF群では体重・骨格筋重量の低下とともに筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMAFbx/atrogin-1とMuRF-1(muscle ring finger-1)の遺伝子発現の増加が認められ、骨格筋萎縮が引き起こされていることも確認した。CRF群では血清ヘプシジン濃度が有意に上昇していた。血清フェリチン値と骨格筋における鉄量の増加も認め、生体内鉄量ならびに組織鉄量の増加を確認することができた。以上の結果から、CRFにおいて生体内鉄代謝異常が引き起こされ、骨格筋の鉄量が増加し、骨格筋萎縮が引き起こされている可能性が示された。CRFモデルマウスを作成し、骨格筋萎縮が引き起こされていることを確認した。また、CRF群の血清中で鉄制御ホルモンであるヘプシジン濃度が上昇し、生体内鉄代謝異常が引き起こされていることならびに骨格筋において鉄が蓄積されていることを確認できた。したがって、おおむね順調に進展していると考えられる。本研究の目的は、慢性腎不全(CRF)におけるサルコペニアについて鉄代謝異常の観点から、そのメカニズム解明を目指し、治療法につながる基盤を確立することである。前年度に、CRFモデルマウス(CRF群)を作製し、vehicle投与対照群と比較した結果、CRF群では体重・骨格筋重量の低下とともに筋特異的E3ユビキチンリガーゼであるMAFbx/atrogin-1とMuRF-1(muscle ring finger-1)の遺伝子発現の増加が認められ、骨格筋萎縮が引き起こされているとともに血清ヘプシジン濃度の上昇、生体内ならびに骨格筋鉄量の増加を確認することができた。本年度は、そのメカニズムを解明するために骨格筋における鉄蓄積と酸化ストレスの関連性について検討を行った。CRF群の骨格筋において鉄取り込みタンパク質トランスフェリン受容体と鉄排出輸送体フェロポルチンの発現低下が認められた。また、鉄貯蔵タンパク質フェリチン重鎖とフェリチン軽鎖の発現が増加していた。これらの結果より、骨格筋において鉄代謝異常が引き起こされ、鉄が蓄積されていることが示唆された。また、鉄はFenton/Haber-Weiss反応を触媒して、ヒドロキシルラジカルを生成し酸化ストレス障害を引き起こす。従って、Hydroxyphenyl Fluorescein染色とDihydroethidium染色を用いて、酸化ストレスについて検討を行ったところ、CRF群の骨格筋において、ヒドロキシルラジカルとスーパーオキサイドの産生増加が認められた。以上の結果より、CRFの骨格筋においては鉄代謝異常により、蓄積した鉄がFenton/Haber-Weiss反応を介して酸化ストレス障害を引き起こし、骨格筋萎縮の原因になっている可能性が示唆された。CRFモデルマウスにおいて、生体内鉄代謝異常、骨格筋における鉄蓄積、骨格筋萎縮を確認できたが、その詳細なメカニズムについては不明である。過剰な鉄はFenton反応を介してヒドロキシルラジカルを生成し酸化ストレス障害を引き起こすため、次に骨格筋における鉄蓄積と酸化ストレスの関連性について検討する。また、CRFでは尿毒症を呈し、尿毒素であるインドキシル硫酸が蓄積しているため、このインドキシル硫酸と鉄代謝異常の関連性についても検討する。医療薬学3月納品分の支払いが4月になったため、未使用額が生じた。未使用額は3月納品分として4月に使用する予定である。
異方的構造変化を発動する自己集合化有機薄膜の創製と環境応答機能創出

生体は高度に洗練された運動システムを備えている。例えば筋肉では、筋フィラメントが高い配向・配列規則性をもって階層的に集積化することで、優れた運動機能が実現されている。本研究では、分子の自己集合により得られる高規則性・高配向性の有機薄膜を用いて、筋肉組織のように異方的かつ可逆的に伸縮する新たな薄膜材料の創出を目指す。また、その伸縮運動のメカニズムを検討し、優れた動的特性を示す新たな有機材料の創製を図る。これら、原理探求型の取り組みを通じて、最終的には、微小な環境変化に対して劇的な力学応答を示す薄膜や、圧力に応じて異方的伸長運動を引き起こす薄膜など、特異な発動作用をもたらす有機薄膜の開発を目指す。
ムギ類を汚染する赤かび病発生とかび毒蓄積の微生物的防除研究

コムギ赤かび病菌等により産生されるかび毒デオキシニバレノール(DON)は人畜に毒性を示すだけでなく、コムギに対する病原性因子でもあることから、DON分解微生物を用いたコムギ上でのDON低減は赤かび病の発生も抑制できる可能性がある。そこで、本年度はこれまでに申請者らが分離した15種のDON分解細菌を用いてコムギ発病抑制効果を検証した。発病抑制試験には、コムギ赤かび病菌の病原性試験に用いられているPetri dish test (Purahong et al., 2012)の方法を参考にして、以下の方法で行った。表面殺菌したコムギ種子(農林61号)を発芽させたのち、OD600 0.1に調整したDON分解細菌を接種した後に、コムギ赤かび病菌Fusariumgraminearumの胞子を接種した。観察は胞子接種6日後に行い、葉の長さと病徴部位の長さをそれぞれ測定し、発病度(葉の長さに対して菌糸が広がっている割合)を算出した。その結果、葉の長さと発病度には強い相関が認められ、赤かび病の感染拡大すなわち菌糸の伸長の割合が大きいほど、葉の長さが短くなることが示された。さらに、複数のDON分解細菌株接種区で発病度の低下が示され、これら細菌株がコムギ赤かび病発病抑制能を持っている可能性が示された。一方、当初予定していた新規DON分解代謝酵素の同定については、細胞抽出液を調製したものの酵素精製に耐え得る十分な活性が検出法が確立できなかった。コムギ赤かび病の発生抑制細菌株の選抜については目処が立ったが、もう一つの目標であった新規DON代謝酵素の解明については進展しなかった。コムギ赤かび病の発生抑制細菌株の選抜については、コムギ種子を用いた選抜試験法が確立できたので、ポット試験による更なる選抜を行う。新規DON代謝酵素の解析については、同酵素活性の検出条件を再度探索する。すなわち、DON分解細菌の培養条件、DON代謝酵素活性の局在性、酵素活性の補酵素・補因子、安定化条件について検討し、同酵素の精製を試みる。
戦後日本における英米国際関係論の受容

戦後の日本の国際政治学は、英米の学説の〈輸入〉に過ぎないとしばしば言われてきた。対して、本研究では、E・H・カー、ハンス・モーゲンソー、ハロルド・ニコルソンという三人の理論家の議論がいかに受容されてきたかを精査することで、〈輸入〉の実態を検討した。結果、日本の知識人たちは近代とどう向き合うかという自身の問題意識を有しており、英米の理論家たちに対する関心はその問題意識に適う限りにおいてのみ維持されていたことが明らかになった。英米国際政治理論の受容が日本の国際政治学形成に与えた影響を探る本研究計画の内、本年度は特に、国際政治学の祖E・H・カーの著作がどのように読まれたかを検討した。具体的には、戦中から1950年代初頭を焦点に、同時代を生きた研究者の回顧録や当時の学術・総合雑誌の論文・座談会記録・書評などを読み解いた。現代の国際政治学において、カーは、『危機の二〇年』(1939)の著者として知られている。しかし、日本において、彼が最初に注目を浴びたのは、むしろその続編にあたる『平和の条件』(1942)を通じてであり、その読者も、社会学者の清水幾太郎や経済学者の都留重人など、政治学外の知識人が主であった。そして、同書中、彼らの関心を喚起したのは、西欧自由民主主義の没落を描き出した前半部であった。カーは、近代西欧の批判者として受容され始めたのである。この点は、次に受容された彼の書が、西欧へのソ連の挑戦を描いた『西欧を衝くソ連』(1946)であったことからも確認できる。1950年ころに『危機の二〇年』への言及を開始した政治学者たちも、こうした視点からカーを読んでいた。そのことは、日本政治学会会誌『年報政治学』初号に掲載された座談会の記録において窺われるところであり、ここで同書を取り上げた蝋山政道や岡義武といった当時の指導的政治学者たちは、カーを通じて国民国家以後の世界を展望していた。英米で現実主義者と理解されていたカーは、日本ではむしろその超克者と捉えられていたのであり、同じ理論家といえども、文脈の違いに応じて、その解釈のされ方は大きく異なっていた。以上の議論は、特に、2011年11月につくば国際会議場で行われた日本国際政治学会年次大会において発表の機会を得た。また、関連する内容について、2012年6月に東京大学の研究会で報告することが決まっている。なお、本課題の着想を生んだ直近の研究を著書として取りまとめる中でも、本研究の成果を一部反映させることができた。E・H・カーの受容に焦点を当てた前年度に続き、ハンス・モーゲンソーとハロルド・ニコルソンを検討の俎上に載せた。開始当初から問題となったのは資料の不足、具体的には彼らを取り上げた論稿の少なさであった。ただ、このことはかえって、前年度の知見を裏付ける結果となった。というのも、カーに関する検討で明らかになったのは、日本の知識人たちにとって、英米の国際関係論が輸入の対象ではなく共鳴の対象だったという点であり、モーゲンソーやニコルソンに関する論稿の少なさは、やはり英米の理論が偶像的に崇拝・摂取されたのでないことを示していると考えられるからである。この成果を受けて、資料調査では、日本の受容者の側へと視点を移し、その代表格と目された丸山眞男に焦点を当てた。具体的には、東京女子大学に所蔵されている丸山の蔵書や手稿を読み解き、本研究で対象とした理論家らの著作を彼がいかに読んでいたかを検討した。また、その読みが、丸山の学問的営為の中で占めた位置を明らかにするべく、丸山の日本思想史研究についても若干の検討を行った。以上の成果は昨年度から執筆していたカーの受容に関する論文を推敲する上で有用なものとなった。他方、モーゲンソーおよびニコルソンの受容に関しては、少なくとも現時点において、単体の論文としてまとめられる見込みはない。ただ、そうして論文として発表できる形でないまでも見えてきた彼らの受容に関する特徴は、前年のカー受容に関する研究の成果をさらに裏付ける形で、近代とどう向き合うかという問題が日本の受容者らの関心の中心となっていたことを示している。その点、日本の国際政治学の独自性を理解に向けて、その糸口を発見するという本研究の主目的自体は達成されたと言える。今後は、今回の成果をうけて、受容者たちの個別な検討をさらに進める中で、同じ問題の解明をさらに進めて行くこととしたい。当初の予定通りに学会報告を行い、学術誌に投稿できる論文を書き上げた。元の計画にあった研究会報告と資料調査は実施していないが、これは状況の変化に応じて効率化を図った結果である。ここでいう状況の変化とは、現論文草稿を2012年6月に東京大学で報告する機会を得たこと、国際政治学会会誌

『国際政治』175号で本論文を投稿するのに最適な特集「歴史的文脈の中の国際政治理論」が組まれると判明したことである。研究会については、開催日が2012年3月31日で、所属移転の関係から参加できなかったこともあるが、資料調査については、同特集の投稿期限が10月末日であること、2012年2月に予定していた調査と2012年夏予定の調査では、対象資料が大きく重なることを考えて、二度の調査を後者に一元化する方が適当と考えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り、ハンス・モーゲンソーやハロルド・ニコルソンといった他の主要な英米理論家の受容へと検討を進めていく。今年度の成果に鑑みる限り、文献の読解など実質的な面での研究遂行については、現時点で特別な困難や問題は見つかっておらず、上の項目11に記した変更の結果、新たに必要となった資料の購入費も捻出できるなど、状況は、全体として、むしろ当初予定していたよりも良い。ただ、やはり11記載の通り、所属・職分が変更になったこともあり、計画通りに夏に論文の発表を行うことは困難と予想される。この点については、現在すでに、冬から春にかけての学会・研究会で報告することを検討し始めている。
核内転写因子ｃＪｕｎ阻害を利用した非小細胞肺癌の癌幹細胞を標的にした治療法の検討

複数の非小細胞肺癌(NSCLC)細胞で癌幹細胞の指標である無血清培地下のsphere形成能がcJun阻害によって低下することを見出したが、sphere形成細胞はSCIDマウスでの腫瘍形成能の上昇を認めなかった。一方、エピジェネティック制御を介し幹細胞の維持に関係するヒストンメチル化酵素EZH2の阻害薬が、NSCLC細胞の増殖を強く抑制した。共にエピジェネティック制御を担うヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬との併用により、相乗的な増殖抑制効果を認めた。幹細胞シグナルの一つであるEZH2とHDACとの同時阻害によるエピジェネティック治療が、肺癌の新しい治療戦略となる可能性が示唆された。平成24年度は、spheroid形成細胞が癌幹細胞の特徴である高い造腫瘍能を有しているか検討した。spheroid形成培養したNCI-H1299細胞とA549細胞をNOD/SKIDマウスへ移植したところ、コントロールの単層培養した細胞と比較し有意な腫瘍形成能の上昇を認めなかった。一方、研究代表者は幹細胞の維持に関係するポリコーム遺伝子EZH2が非小細胞肺癌で高発現し予後不良因子であることを報告していたが、siRNAによるEZH2のノックダウンやEZH2阻害効果を有する小分子化合物DZNepが上記4種類の非小細胞肺癌細胞の増殖を抑制し、G1期停止とアポトーシスを誘導することを見出した。不死化正常気管支細胞や線維芽細胞ではこれらの効果は有意に小さかった。EGFR遺伝子異常を有するH1975とPC-3においてDZNepの効果はより強くみられ、cyclin Aの発現を低下とp27の発現亢進を認めた。DZNepはEZH2の発現とEZH2依存的なヒストンH3リジン27のトリメチル化を低下させることを確認した。以上の結果、幹細胞シグナルの一つであるEZH2の抑制が肺癌細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究ではcJun阻害を利用した非小細胞肺癌(NSCLC)の癌幹細胞を標的にした治療法の開発を目標とし、その基盤となる研究を行った。昨年度までの研究で、癌幹細胞が濃縮されると考えられている無血清培地によるspheroid形成培養を、種々のNSCLC細胞株(PC-3、NCI-H1975、NCI-H1299、およびA549)で確立し、NCI-H1299細胞においては、cJun dominant negative mutantの誘導によって、spheroid形成能が低下することを見出した。しかし、spheroid形成培養したNCI-H1299細胞とA549細胞をNOD/SKIDマウスへ移植したところ、コントロールの単層培養した細胞と比較し有意な腫瘍形成能の上昇を認めなかった。一方、研究代表者は、エピジェネティクス制御を介し幹細胞の維持に関係するヒストンメチル化酵素EZH2がNSCLCで高発現し予後不良因子であることを報告していたが、昨年度の研究で、EZH2阻害剤のDZNepが、正常細胞と比べ上記のNSCLC細胞の増殖を強く抑制し、G1期停止とアポトーシスを誘導することを見出した。本年度は、EZH2阻害の抗腫瘍効果を高めるために、エピジェネティクス制御の中心を担うヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の阻害剤SAHAとの併用効果を検討した。DZNepとSAHAの併用は各細胞株の増殖を相乗的に抑制し、EZH2の発現とヒストンH3K27のトリメチル化をDZNep単独よりも低下させた。併用によりp27上昇とcyclin A低下を強く認め、相加・相乗的にアポトーシスを誘導した。以上より、幹細胞シグナルの一つであるEZH2の抑制がNSCLC細胞の増殖に重要な役割を果たし、共にエピジェネティクスを制御するHDACとの同時阻害によって、相乗的な抗腫瘍効果が得られる可能性が示唆された。研究代表者は多くの増殖シグナルに関与する核内転写因子cJunの阻害が肺癌細胞の増殖とin vivo造腫瘍能を抑制することを報告し、その標的遺伝子を同定した。一方、肺癌を含む多くの悪性腫瘍は、幹細胞の性質を持ち薬剤抵抗性を示す少数の細胞集団(癌幹細胞)から形成されることが明らかになってきたが、乳癌幹細胞の自己複製にはcJunが必須であることが報告された。本研究はcJun阻害を利用した非小細胞肺癌の癌幹細胞を標的にした治療法の開発を目標とした。平成23年度は、癌幹細胞が濃縮されると考えられているlowattachmentplate上でのEGF・bFGF添加/無血清培地によるspheroid(球状細胞集塊)形成培養を、種々の非小細胞肺癌細胞株(PC-3、NCI-H1975、NCI-H1299、およびA549)を用いて行った。

いずれの細胞株においてもspheroidが形成された。また、通常培養時と比べて癌幹細胞マーカーの一つであるALDH高活性細胞の増加を認めた。NCI-H1299細胞においては、tet-onシステムによるcJun dominant negative mutantの誘導によって、spheroid形成能が低下した。一方、研究代表者は幹細胞の維持に関係するポリコーム遺伝子EZH2が非小細胞肺癌で高発現し予後不良因子であることを報告していたが、通常培養において、siRNAによるEZH2のノックダウンやEZH2阻害効果を有する小分子化合物DZNepが上記4種類の非小細胞肺癌細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導することを見出した。以上の結果より、非小細胞肺癌細胞の中に癌幹細胞の可能性のある細胞があり、それらの細胞の増殖にcJunが関係していることが示唆された。また、幹細胞の維持に関係するEZH2の阻害が肺癌細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。平成23年度に長期継代の難しかったspheroid形成培養は、培養面にすり鉢状のマイクロウェルが施されているlowattachmentplate培養容器を用いることにより可能となったが、癌幹細胞の特徴である高いin vivoでの腫瘍形成能を示さなかった。このため、癌幹細胞については、現在ALDHとCD44によるFACSでの細胞選択を試みている。一方、特に胎生期の幹細胞シグナルとして重要なEZH2がヒト肺癌で発現が亢進し、その発現や活性を抑制することにより、肺癌細胞の増殖が抑制されることを示すことができた。ヒストンメチル化酵素であるEZH2は肺癌のエピジェネティクスを制御する新しい分子標的と考えられる。本研究の成果は、平成24年度の日本癌学会シンポジウムで発表し、Lung Cancer誌に掲載することができた。DZNepは、獲得耐性遺伝子異常を含むEGFR遺伝子異常のある肺癌細胞により強い効果が見られるという興味深い結果も得られ、現在その機序を分析中である。更に、同じエピジェネティクスに関わるヒストン脱アセチル化酵素の阻害が、EZH2の阻害と相乗効果を示す予備的な実験結果も得られている。low attachment plate上でのsphoid形成は、細胞間接着によってしばしば大集塊を形成し、徐々に継代が困難になる現象が認められ、一時研究の遂行に支障が生じた。しかし、培養面にすり鉢状のマイクロウェルが施されている培養容器により細胞間接着の影響をなくし、長期継代可能なシステムを確立することができたため、現在はおおむね順調に計画を進めている。また、通常培養の検討ではあるが、幹細胞維持に関わるポリコーム遺伝子EZH2のノックダウンやEZH2阻害効果を有するDZNepが非小細胞肺癌細胞に対する優れた増殖抑制効果があることを見出し、平成23年度の日本癌学会で発表し、現在論文投稿中である。DZNepとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤SAHAとの併用効果について、MTT法、アポトーシスアッセイ、Western blot法やFACS法を用いて解析する。予備実験では相乗的な細胞増殖抑制効果を認めている。更に、in vivo腫瘍形成能における抑制効果を検討する。EGFRシグナル経路への影響を検討し、EGFR遺伝子変異陽性細胞については、EGFR阻害剤との併用効果を検討する。
始生代地球における初期生命進化を導いた地質ー生物相互作用に関する研究

始生代地球における初期生命進化を導いた地質-生物相互作用としての独創的かつ魅力的な「UltraH^3リンケージ」作業仮説を発表した。フィールドワークに基づく検証では、大西洋中央海嶺のRainbowフィールドとインド洋中央海嶺KaireiフィールドにおけるUltraH^3リンケージを実証した。また実験に基づく検証では、世界で初めて「始生代超マフィック岩」であるコマチアイトの熱水反応より水素が生成することを証明した。本研究は,「{超マフィック岩-熱水活動-水素-ハイパースライム}リンケージ(UltraH^3リンケージ)が,初期地球において生命の起源の場を準備し,それに続く初期生命生態系の誕生を導き,現在に至るまでその生態系を支えてきた」とする仮説を,分野横断型研究アプローチによって検証することを目的とする。この目的のために、(1)フィールドワークに基づいたモダンタイプとしての現世の低・中速拡大中央海嶺域における,マントルの不均一性に支配されるUltraH^3リンケージの検証と,(2)実験に基づく現世および始生代の超マフィック岩(かんらん岩,コマチアイト),マフィック岩(玄武岩,ドレライト,はんれい岩)を用いたUltraH^3リンケージの再現と具体的な諸過程の解明を2本柱として研究を進めている。これまでのところ、極めて独創的かつ魅力的な作業仮説の提唱論文を発表し、研究アイデア自体の独自性を広く喧伝した。さらにフィールドワーク及び再現実験を用いたアプローチによって以下の様な具体的な成果が挙がりつつある。実験に基づいたUltraH^3リンケージの検証(1)フローリアクター式及びバッチ式の高温高圧水熱反応装置での実験を開始し、単純な熱水-岩石反応系における実験生成物,天然試料のガス、元素及び有機分析システムを完成させた。(2)これまで困難であった原始的エネルギー代謝を有する微生物の高圧培養実験系を確立した。フィールドワークに基づいたUltraH^3リンケージの検証(1)大西洋中央海嶺及びインド洋中央海嶺における様々な熱水活動域の調査を行い、UltraH^3リンケージの検証を完了した。(2)両中央海嶺のフィールド調査の結果から「UltraH^3リンケージの形成条件及び深海底熱水活動域における熱水依存性の微生物生態系の存在様式(水素ワールド)」を導き出した。この目的のために,(1)フィールドワークに基づいたモダンタイプとしての現世の低・中速拡大中央海嶺域における,マントルの不均一性に支配されるUltraH^3リンケージの検証と,(2)実験に基づく現世および始生代の超マフィック岩(かんらん岩,コマチアイト),マフィック岩(玄武岩,ドレライト,はんれい岩)を用いたHltraH^3リンケージの再現と具体的な諸過程の解明を2本柱として研究を進めている。これまでのところ,フィールドワーク及び実験に基づいたどちらの方法論によっても,UltraH^3リンケージの存在様式と諸過程を明らかにする新しい成果が挙がりつつある。実験に基づいたUltraH^3リンケージの検証実験に基づく検証に関しては,蛇紋岩化に伴う微量元素変動及び生成ガスの迅速定量法の開発と蛇紋岩化高温高圧実験システムを立ち上げた。それらのシステムを用いて,実際の海水を模して塩化ナトリウム,塩化マグネシウム試薬を用いて合成した人工海水を用いた蛇紋岩化高温高圧実験システムを用いた実験を開始し,蛇紋岩化による水素生成を実験的に再現した。フィールドワークに基づいたUltraH^3リンケージの検証インド洋中央海嶺かいれいフィールドにおけるUltraH^3リンケージの存在様式が、従来の単純なマントルかんらん岩の海底面への露出に起因する場合(例えばRainbow、Logatochez、Lost Cityといった大西洋中央海嶺の典型)とは大きく異なり、「かんらん石に富んだはんれい岩」のようなホモ遷移帯付近におけるマントルとマグマの相互作用にて特異的に形成される岩石においても形成される場であることを明らかにした。本研究は、「{超マフィック岩-熱水活動-水素-ハイパースライム}リンケージ(UltraH^3リンケージ)が,地球史のごく初期に生命の起源の場を準備し,引き続き初期生命生態系の誕生を導き,現在に至るまでその生態系を支えてきた」とする独自の作業仮説を,分野横断型研究アプローチにより検証することを目的とする。上記目的の達成のため、1初期海底熱水系のモダンタイプとしての現世の低・中途拡大中央海嶺域における海洋地殻の不均一性に支配されるUltraH^3リンケージへのフィールドワークによる検証、2現世および始生代の超マフィック岩(かんらん岩,コマチアイト),マフィック岩(玄武岩,ドレライト,はんれい岩)を用いたUltraH^3リンケージに対する実験室内再現実験による検証による具体的な諸過程の解明を目指した。<実験に基づいたUltraH^3リンケージの検証

>実験に基づく検証に関しては、実際の海水を模して塩化ナトリウム,塩化マグネシウム試薬を用いて合成した人工海水を用いた蛇紋岩化高温高圧実験システムを確立した。その確立した実験システムを用いて、世界で初めて、「始生代超マフィック岩」であるコマチアイトの熱水反応より水素が生成することを証明した。<フィールドワークに基づいたUltraH^3リンケージの検証>インド洋中央海嶺かいれいフィールドにおけるUltraH^3リンケージの存在様式が、従来の単純なマントルかんらん岩の海底面への露出に起因する場(例えばRainbow、Logatochez、Lost Cityといった大西洋中央海嶺の典型)とは大きく異なり、「かんらん石に富んだはんれい岩」のようなモホ遷移帯付近におけるマントルとマグマの相互作用にて特異的に形成される岩石においても形成される場であることを明らかにした。
国際法における難民流出国の国家責任について

1.本年度の研究実施計画は,難民の大量流出に伴う本国(難民の国籍国)の受け入れ国に対する国際法上の国家責任を認めうるか否かについて,(1)問題の所在の明確化,(2)具体的ケースの分析,(3)関連学説の検討,であった.2.本年度の主な成果は,次の二点に大別することができる.(1)1980年から1986年までの関連する国連の第一次資料を収集・分析することによって, 1)この問題が国連で取り上げられるにいたった背景2)本主題るおける伝統的「難民」の法的定義の非妥当性3)大量難民流出をもたらす政治的及び自然的原因と社会・経済的諸要因の存在,それらの内容および相互の複雑な交錯性,について新たな知見を得た.(2)関連の学説を分析することによって, 1)政治的に且つ意図的に大量難民を流出する国家政策の遂行は,その合法性が国際法上疑わしく, 2)そこでは,従来の人道的・人権保護のアプローチではなく,国際法の基本原則に基づく国家責任追及のアプローチが必要であり, 3)難民の国籍国に対して,理論上いわゆる領域管理責任原則に基づく違法行為責任を追及しうること,さらに4)領域管理責任原則を基礎に国際協力義務の履行を関係国に要求しうる(この協力義務の内容については,国連国際法委員会が現在作成中の越境損害の発生の防止・賠償に関する条約草案で具体化されるはずである),との一応の結論に達した.3.今後,この研究のまとめの段階に入るが,本年度には必ずしも十分に検討することができなかった具体的ケースの分析を継続,完了することによって,研究成果の公表は次年度に行う予定である.1.本年度の研究実施計画は,難民の大量流出に伴う本国(難民の国籍国)の受け入れ国に対する国際法上の国家責任を認めうるか否かについて,(1)問題の所在の明確化,(2)具体的ケースの分析,(3)関連学説の検討,であった.2.本年度の主な成果は,次の二点に大別することができる.(1)1980年から1986年までの関連する国連の第一次資料を収集・分析することによって, 1)この問題が国連で取り上げられるにいたった背景2)本主題るおける伝統的「難民」の法的定義の非妥当性3)大量難民流出をもたらす政治的及び自然的原因と社会・経済的諸要因の存在,それらの内容および相互の複雑な交錯性,について新たな知見を得た.(2)関連の学説を分析することによって, 1)政治的に且つ意図的に大量難民を流出する国家政策の遂行は,その合法性が国際法上疑わしく, 2)そこでは,従来の人道的・人権保護のアプローチではなく,国際法の基本原則に基づく国家責任追及のアプローチが必要であり, 3)難民の国籍国に対して,理論上いわゆる領域管理責任原則に基づく違法行為責任を追及しうること,さらに4)領域管理責任原則を基礎に国際協力義務の履行を関係国に要求しうる(この協力義務の内容については,国連国際法委員会が現在作成中の越境損害の発生の防止・賠償に関する条約草案で具体化されるはずである),との一応の結論に達した.3.今後,この研究のまとめの段階に入るが,本年度には必ずしも十分に検討することができなかった具体的ケースの分析を継続,完了することによって,研究成果の公表は次年度に行う予定である.
恙虫病リケッチア新株の確定と媒介ツツガムシのル-ツを求めて

現在までに岐阜県下の恙虫病患者13人よりリケッチア(Rt)が分離できた。これらと標準3株にて作成したモノクロナル抗体(MA)との反応性で分類を試みた。MAはKarp(Kp)、Kato(Kt)もしくはGilliam(GI)に特異的な(sp-MA)と2株もしくは全て反応する交又反応抗体(crs-MA)に分けられるが、13分離Rt中1株(KN-3)のみがKp-sp-MAと反応した。12Rtはいかなるsp-MAとも反応せず、いくつかのcrs-MAと反応した。shimokosi株(新潟)も同様であった。shimokosiは最も反応性が低く、crs-MAの1F11とC6にのみ反応した。岐阜分離株のKN-1はさらにもう一つのcrs-MAである3B2にも反応した。さらにKN-2は1C10にも反応し、GJ-1はさらに3C2と反応した。以上から、sp-MAと反応しない12分離Rtは3群に分けられ、しかも、shimokosi→KN-1→KN-2→GJ-1とMAで検出できる抗原せい増していくという連続性が推察できた。この連続性が南方へ向かっているのか、それとも九州、四国地方の株とこれら分離株が同一かといった問題点がクロ-ズアップされたことになる。この地方で、Kp系1株と新かぶ3株が確認されたとの結論であるが、Kp系のKN-3はマウスに対しKpとほぼ同程度の病毒性を有するが、KN、GJシリ-ズはG1よりさらに弱毒であった。感染後各時期に脾細胞を採取し、PHA、Con-A、LPSの反応性を検討したところ、強毒株感染では全ての反応が低下し、死亡した。G1で全てが感染後710日で低下したが2週で回復した。KNではCon-A反応のみが5日に一過性に軽度抑制されたのみであった。以上より、抗原性の差異は病毒性の差異にもつながっているようである。さらに多地域での共同研究の必要性を痛感する。
癌の転移を予防する食生活の探索

概日リズムを調節している時計遺伝子の発現は24時間周期の増減がみられるが、マウスを通常休息している昼間に摂食させると、時計遺伝子の発現ピーク時刻がずれ、肺への癌転移数が有意に増加した。また時計遺伝子の機能異常があるclock変異マウスでは野生型より癌転移数が有意に増えたことから、概日リズムが乱れると癌転移が亢進することが分かった。さらに通常とは異なる食事時刻が続くと、マウス肺の接着因子であるP-selectinとVcam-1の発現が亢進した。以上により、規則正しい食生活が維持できないと時計遺伝子の概日リズムが乱れ、一部の接着因子の発現に影響が及んで、癌転移が亢進する可能性があると考えられた。高脂肪食摂取が時計遺伝子の発現にどのような影響を与えるかを検討した。ICR雄性マウスを、マウスが通常行動する暗期に食餌摂取する夜給餌群と、休息時刻である明期12時間中の11:0017:00に制限して餌を与える昼給餌群に分け、普通食(4.8% Fat)あるいは高脂肪食(35% Fat)を8週間与えた後、解剖した。昼給餌群の一部のマウスを解剖2日前に夜給餌に変更して解剖した。解剖は、1日の発現リズムを調べるため、午前8:00から6時間毎に行い、肺を採取した。肺からRNAを単離回収し、時計遺伝子のmRNA量の変化をリアルタイム-PCR法で検討した。飼育期間中、普通食および高脂肪食摂取群共に、昼給餌群の摂取量と同量の餌を夜給餌群に与えた。また、高脂肪食摂取群の1日の平均エネルギー摂取量は普通食群とほとんど同じであった。したがって、1日平均エネルギー摂取量は4群ともほぼ同じであった。普通食摂取マウスの時計遺伝子per-2とbmal-1は、夜給餌群に対して昼給餌群で約6時間位相が前進した。高脂肪食摂取マウスのper-2とbmal-1のピーク時刻は、夜、昼給餌群ともに普通食摂取のマウスの各々の群と同じで、高脂肪食摂取でも夜給餌群に比べ昼給餌群は約6時間位相が前進した。また、昼給餌を夜給餌に変えて2日後の普通食摂取マウスのper-2とbmal-1のピーク時刻は、昼給餌群と夜給餌群のピーク時刻の間、すなわち昼給餌群に比べて約3時間位相が後退し夜給餌群に近づいた。昼給餌を夜給餌に変えた高脂肪食摂取マウスでもほぼ同様の結果が得られた。これらの結果から、末梢組織の概日リズムに及ぼす高脂肪食摂取の影響は普通食摂取と大きな差はなく、また、高脂肪食摂取が昼給餌によって変化した概日リズムを通常のリズムに戻しにくくするという影響はみられないことが示された。1.食餌摂取時刻がメラノーマ癌細胞のマウス肺転移に及ぼす影響野生型マウスと、時計遺伝子clockの変異マウス(clock変異マウス)を各々、マウスが通常行動する暗期に食餌摂取する夜給餌群と、休息時刻である明期12時間の内11:0017:00に制限して餌を与える昼給餌群に分け、普通食を8週間与えた。給餌開始から6週目にマウスメラノーマ細胞を尾静脈内投与し、8週目に解剖して肺への転移癌結節数を計測した。その結果、野生型マウスの夜給餌群に比べ、野生型マウスの昼給餌群及びclock変異マウスの昼夜両群の転移癌結節数は多かった。2.マウスの食餌摂取時刻が時計遺伝子および癌の転移に関わる接着因子の発現に及ぼす影響同様に昼あるいは夜に給餌して、7週目に癌細胞を投与し、その4日後の8:00から6時間毎に肺を採取してRNAを単離回収し、時計遺伝子および癌転移関連因子のmRNA量の変化をRT-PCR法で検討した。野生型マウスの時計遺伝子per-2とbmal-1は癌投与、非投与群ともに夜給餌群に対して昼給餌群で612時間位相が前進した。clock変異マウスでは何れの群も時計遺伝子の発現に一定のリズムは見られなかった。接着因子vcam-1、P-セレクチン、E-セレクチンの発現は何れの場合も日内リズムがほとんどみられなかったが、癌非投与群ではvcam-1及びP-セレクチンmRNA量が、癌投与群では、vcam-1及びE-セレクチンmRNA量が、野生型マウスの夜給餌群より昼給餌群で増加する時刻が存在した。

野生型マウスの夜給餌群に比べて昼給餌群及びclock変異マウスの癌転移数が増加したこと、野生型マウスの昼給餌群の時計遺伝子発現の位相が変化したことから、休息時刻に摂食することによって末梢組織の概日リズムが乱れ、一部の接着因子の発現が亢進して、癌の転移が起こりやすくなることが示唆された。clock変異マウスは交配して得ているが、予想より供給匹数が少なかったこと、実験条件設定に時間がかかったことなどから、若干研究が遅れている。平成24年度中に癌の転移に関わる接着因子の発現に及ぼす食餌摂取のタイミングの影響について検討したが、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)やそのインヒビター(TIMPs)、あるいは細胞周期や増殖に関わる因子の遺伝子発現変化の検討まで至っていない。1.マウスの食餌摂取時刻が癌の転移に関わるMMP、細胞増殖などに関わる因子の発現に及ぼす影響引き続き、食餌摂取時刻が癌の転移に関わる因子に及ぼす影響について調べるため、昼あるいは夜給餌群マウスの肺から単離回収したRNAを用いて、MMP、TIMP、c-Myc, p53などのmRNA発現を比較検討する。2.概日リズムを介した癌転移抑制効果を示す食餌中の成分の探索概日リズムに影響を与え、癌転移を増悪あるいは抑制する食餌中の成分を探索するため、高炭水化物飼料、高脂肪飼料、高タンパク質飼料、高食塩飼料などの特殊飼料を調製し、(1)普通食あるいは上記の特殊飼料を明期に給餌し、給餌開始から1週毎に肺を採取して時計遺伝子の発現を調べ、時計遺伝子の発現パターンへの影響を普通食と比較検討する。(2)普通食を明期に8週間摂食させた後、普通食あるいは上記の特殊飼料を暗期に与え、どの飼料によってより早く普通食の夜給餌群の時計遺伝子の発現パターンに回復するかを検討する。(3) (1)と(2)で何れの特殊飼料でも普通食群との違いが見られなかった場合、普通食を1日摂取量の7割にした制限食、普通食を自由摂食、高カロリー食(高脂肪食)を自由摂食という給餌条件で(1)、(2)と同様の実験を行い、検討する。(1)、(2)、(3)の結果から食餌摂取のタイミングを昼夜逆転させたときの概日リズムを乱しやすい食餌成分、あるいは概日リズムを早期に改善する飼料成分や摂取カロリー量を調べる。合わせて(1)(3)の条件で概日リズムに影響を与える特殊飼料を給餌し、マウスメラノーマ癌細胞の肺転移に及ぼす影響も検討し、概日リズムを乱すことにより癌転移を亢進あるいは概日リズムを改善することによって癌転移を防ぐ食餌成分を探索する。当該研究助成申請時には、制限給餌器を使用予定経費として申請したが、別予算で購入したため、研究費が残った。現在、研究試料(動物臓器、RNA試料など)や試薬を保存するための冷凍庫が不足しているため、本研究費で購入する予定である。また、研究を遂行するため、プライマー、標識試薬、酵素やプラスチック製品などの消耗品と、動物実験用の動物と特殊飼料を研究費として使用する予定である。
RIG-I様受容体経路を基盤とする放射線感受性制御機構の解明と癌放射線治療戦略

RIG-I様受容体(RLR)はウイルスセンサーとして機能し,ミトコンドリアを介して抗ウイルス応答を誘導する。また,近年では,RLRの活性化による抗癌効果も報告され,RLRが癌治療の標的として期待されている。申請者はこれまでにRLR刺激因子の抗癌効果が放射線との併用により増強されること,またRLR刺激因子の放射線増感効果を見出したが,そのメカニズムについては未解明である。本研究では,RLRの抗ウイルス活性において重要な働きをするミトコンドリア動態制御等が放射線応答性に果たす役割を明らかにすることで,RLR活性化による癌細胞の放射線感受性制御機構の解明を目指す。初年度は,肺癌細胞A549に対するRLR刺激因子の放射線増感効果のメカニズムの探索と,RLR刺激因子と放射線の併用による細胞死増強機構におけるミトコンドリア制御因子の関与を解析した。まず,RLR刺激因子による抗癌効果増強とI型IFNであるIFN-βの関連を検討した。RLR刺激因子によりA549におけるIFN-βのmRNA発現が劇的に増加したこと,X線照射前または照射後の外因性IFN-βの添加によりA549の放射線感受性が低下したことから,RLR刺激因子がIFN-βを介して放射線増感効果を誘導している可能性が考えられた。一方で,外因性のIFN-βはA549に対して顕著な細胞死を誘導しなかったことから,RLR刺激因子による細胞死誘導作用はIFN-β非依存的であると考えられた。次にミトコンドリア動態制御因子に着目し解析を行った。RLR刺激因子と放射線の併用処理細胞ではミトコンドリア分裂因子Drp1のタンパク発現が低下していたため,Drp1の発現抑制細胞を調製し,RLR刺激因子および放射線誘発細胞死との関連を検討したが,それら細胞死とDrp1の関連は認められなかった。また,ミトコンドリア融合因子との関連も認められなかった。本年度はRLR刺激因子の放射線増感効果のメカニズムの解明を目指した結果,RLR活性化による放射線増感効果にIFN-βが関与する可能性を示した。また,RLR刺激因子による細胞死誘導作用はIFN-β非依存的であること,RLR活性化と放射線の併用による細胞死増強とミトコンドリア動態制御との関連も低いことが明らかとなった。また,これら研究を進める中で興味深い知見を得ることができたため,次年度における大きな進展が期待できる。次年度は,ミトコンドリア-小胞体膜の接触領域に関わるMFN2に着目してRLR活性化による癌細胞の放射線感受性制御機構の解明に取り組む。また,今年度得られた興味深い知見に関しても詳細な解析を進める。その他の検討項目に関しては,当初の研究計画の通りに遂行する。概ね当初の予定通り研究を遂行したため,ほぼ当初の予定通りの支出となった。繰り越した分の助成金1,844円は次年度の消耗品に使用する。
新規アンチセンス核酸を用いるHIV-nefタンパク質の発現制御

現在、エイズウイルス遺伝子を標的としたアンチセンス法はある種の限界に到達しており、飛躍的な新しいアイディアの出現が待たれているのが現状である。そこで、本研究では全く新しいアンチセンス核酸であるボラノホスフェートDNAに着目した。ボラノホスフェートDNAは天然型DNAの非架橋酸素原子の一つをボランで置換した構造を持ち、酸や塩基に対して極めて安定である。また、天然型DNAより脂溶性が高く、細胞膜透過性に優れ、ヌクレアーゼによる分解に耐性を示す。さらに、ボラノホスフェートDNAは、相補的な塩基配列を持つRNAとが形成する二重鎖がRNase Hの基質となることなどから、アンチセンス核酸として有望である。しかし、副反応などの問題から、これまでにA,G,C,T4種類の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドボラノホスフェートの合成例は無い。このような状況から、本年度はボラノホスフェートDNAの新規合成法を確立することを目標として研究を開始した。従来のボラノホスフェートDNA合成法は、ホスホロアミダイト法やH-ホスホネート法を用いて3価のオリゴヌクレオチド鎖を構築し、合成の最後のステップでインターヌクレオチドのボラノ化を行うために、核酸塩基部がボラノ化試薬と反応してしまう。従って、この副反応の比較的起こりにくいチミジル酸誘導体のみが合成されている。我々は、あらかじめリン原子にボランが導入された新規ボラノホスホリル化剤を開発し、これを用いてヌクレオシドをボラノホスホリル化することにより、従来法における核酸塩基に対するボラノ化剤の副反応の問題を本質的に解決した。本年度は新規合成法における核酸塩基の保護基の選択、縮合反応系の開発を行い、4種類の2量体TT,CT,GT,ATの合成に成功した。現在、HIV-nef mRNAに対するボラノホスフェート型アンチセンス核酸の合成を検討している。