hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インシリコ分子設計法によるアポトーシス抑制因子を標的とした脳腫瘍分子治療薬の開発

脳腫瘍の中核をなす膠腫(グリオーマ)の発生には、複数のがん抑制遺伝子の変異や欠失が深く関わっていることが判明してきている。本研究では、脳腫瘍の発生に関わる遺伝子群のうちアポトーシス制御分子であるXIAPにターゲットを絞り、新しいゲノム創薬方法論を用いXIAPのCaspase阻害活性を抑制する化合物を私共が開発したin silico分子設計手法用いてデザインする。そして、該化合物を化学合成し、XIAPとの結合キネティクス、細胞レベル及び動物レベルでの生理活性を明らかにすることを目的とする。XIAP結合モチーフの,A-X-X-X(X :任意の20種アミノ酸)を,in silico分子設計手法を用いてDocking studyによってその結合親和性を評価することによって,予測結合親和性の高いSmac様ペプチドを順位づけしたところ、SmacのN末端部分よりもXIAPに親和性の高いペプチド配列が決定できた。そこでさらに該ペプチドの有効性、及び解析効率を高めるため1.ペプチド(ペネトラチン)による細胞内導入の検討を行う。2.ペプチドに蛍光標識する。3.高分子(シクロデキストリン)で内包する。以上を行った。ペプチド(FITG-RQIKIWFQNRRMKWKK-DEVD-AVPFAQ-amide)を作製し、該ペプチドをシクロデキストリンで8時間ミックスし、細胞に添加したところ、エトポシド10μg/mLではアポトーシス抵抗性のSK-MG1細胞において当該ペプチドにアポトーシス亢進性を見い出した。このことは本ペプチドデザイン法が有効であることを示している。本研究により、脳腫瘍の分子標的治療法が開発されることにより悪性脳腫瘍の治療の可能性が拓けてくると考えられる。以上を行った。
ダイノルフィンフラクメントによる抗痴呆薬の開発研究

生体内にある内在性オピオイドペプチドは,ペプチド分解酵素によって分解されやすく,また,血液-脳関門を通過しにくいため,末梢投与では有効な生理活性を示すものが少ない.そこで,よりペプチド鎖が短く,(CH_2NH)結合を導入して,ペプチド分解酵素に対する抵抗性を増強させた新規ダイノルフィン誘導体を合成し,抗侵害作用,および学習・記憶障害に対する効果について検討し,以下の結果を得た.1)ダイノルフィン誘導体(S-9:Tyr-D-Ala-Phe-Leu-Argψ(CH_2NH)Arg-NH_2)を皮下投与すると,投与後120分において酢酸ライシング数が有意に減少し,著明な抗侵害作用が認められた.また,S-9を側脳室内投与すると,投与後30分で有意に酢酸ライシング数が減少し,抗侵害作用が認められたが,この作用は投与後60分以降では消失した.2)S-9による抗侵害作用は,μ-オピオイド受容体拮抗薬であるnaloxoneにより完全に拮抗されたが,κ-オピオイド受容体拮抗薬であるnor-binaltorphimineでは拮抗されなかった.3)S-9には,dynorphinA-(1-13)により認められた,scopolamineにより誘発される学習・記憶障害を改善する作用は認められなかった.4)なお,S-10(Tyr-D-Ala-Phe-Leuψ(CH_2NH)Arg-Arg-NH_2)では,これらいずれの作用も認められなかった.κ-オピオイド神経系の学習・記憶に対する生理学的意義を明らかにするため,コリン作動性神経伝達を抑制するgalaninまたはcarbacholの投与,さらに一酸化炭素負荷により誘発される学習・記憶障害に対するk-オピオイド受容体作動薬の作用を,行動薬理学的および神経化学的に検討し,以下の結果を得た.1)一酸化炭素負荷マウスにdynorphinA(1-13)(1.5nmol/mouse,i.c.v.)を訓練試行または保持試行の15分前に投与すると,一酸化炭素負荷による学習・記憶障害が改善され,この作用はk-オピオイド受容体拮抗薬のnor-binaltorphimine(nBNI5.4nmol/mouse,i.c.v.)の前処置により有意に拮抗された.自発的交替行動においても同様に,一酸化炭素負荷により自発的交替行動率が低下し,dynorphinA(1-13)はこの作用を改善した.nBNIは,dynorphinA(1-13)による学習・記憶改善作用を抑制した.3)Galanin(0.32nmol)の投与により,海馬および前脳皮質の細胞外アセチルコリン濃度が有意に減少した.これらの作用は,dynorphinA(1-13)(0.5nmol)の前投与により有意に抑制された.DynorphinA(1-13)によるアセチルコリン遊離減少を消失させる作用は,nBNI(5.4nmol)の前処置によりほぼ完全に拮抗された.海馬および前脳皮質におけるアセチルコリン濃度に対して,dynorphinA(1-13)(0.5nmol)およびnBNI(5.4nmol)自身は何ら影響を与えなかった.生体内にある内在性オピオイドペプチドは,ペプチド分解酵素によって分解されやすく,また,血液-脳関門を通過しにくいため,末梢投与では有効な生理活性を示すものが少ない.そこで,よりペプチド鎖が短く,(CH_2NH)結合を導入して,ペプチド分解酵素に対する抵抗性を増強させた新規ダイノルフィン誘導体を合成し,抗侵害作用,および学習・記憶障害に対する効果について検討し,以下の結果を得た.1)ダイノルフィン誘導体(S-9:Tyr-D-Ala-Phe-Leu-Argψ(CH_2NH)Arg-NH_2)を皮下投与すると,投与後120分において酢酸ライシング数が有意に減少し,著明な抗侵害作用が認められた.また,S-9を側脳室内投与すると,投与後30分で有意に酢酸ライシング数が減少し,抗侵害作用が認められたが,この作用は投与後60分以降では消失した.2)S-9による抗侵害作用は,μ-オピオイド受容体拮抗薬であるnaloxoneにより完全に拮抗されたが,κ-オピオイド受容体拮抗薬であるnor-binaltorphimineでは拮抗されなかった.3)S-9には,dynorphinA-(1-13)により認められた,scopolamineにより誘発される学習・記憶障害を改善する作用は認められなかった.4)なお,S-10(Tyr-D-Ala-Phe-Leuψ(CH_2NH)Arg-Arg-NH_2)では,これらいずれの作用も認められなかった.生体内にある内在性オピオイドペプチドは,ペプチド分解酵素によって分解されやすく,また,血液-脳関門を通過しにくいため,末梢投与では有効な生理活性を示すものが少ない.そこで,よりペプチド鎖が短く,(CH_2NH)結合を導入して,ペプチド分解酵素に対する抵抗性を増強させた新規ダイノルフィン誘導体を合成し、抗侵害作用,および学習・記憶障害に対する効果について検討し,以下の結果を得た.1)ダイノルフィン誘導体(S-9:Tyr-D-Ala-Phe-Leu-Argψ(CH_2NH)Arg-NH_2)を皮下投与すると,投与後120分において酢酸ライジング数が有意に減少し,著明な抗侵害作用が認められた.また,S-9を側脳室内投与すると,投与後30分で有意に酢酸ライジング数が減少し,抗侵害作用が認められたが,この作用は投与後60分以降では消失した.

2)S-9による抗侵害作用は,μ-オピオイド受容体拮抗薬であるnaloxoneにより完全に拮抗されたが,κ-オピオイド受容体拮抗薬であるnor-binaltorphimineでは拮抗されなかった.3)S-9には,dynorphin A-(1-13)により認められた,scopolamineにより誘発される学習・記憶障害を改善する作用は認められなかった.4)なお,S-10(Tyr-D-Ala-Phe-Leuψ(CH_<>NH)Arg-Arg-NH_2)では,これらいずれの作用も認められなかった.
典型元素を含む新奇ポルフィリンπ空間の機能化と集積化

本年度では『典型元素の特性が最大限に発揮されるようなπ空間を創発し、その機能を利用する』ことを目的として、期間内に主に次の課題に取り組んだ。(i)メソ位に窒素を含むジアザポルフィリンの合成と、それらの構造・物性・配位挙動の解明。(ii)π系が高度に拡張されたジアザポルフィリン二量体の合成、(iii)ジアザポルフィリンの特性を活かした有機太陽電池の作製と性能評価。まず、アジ化ナトリウムとジブロモジピリンとの反応を利用して、β無置換ジアザポルフィリンフリーベースを20%程度の単離収率で合成する事に成功した。次いで、得られてフリーベースの錯形成により、各種金属錯体を構築し、その吸収特性、発光特性、および電子受容性・電子供与性を調べた。その結果、ジアザポルフィリンπ系の物性が、ポルフィリンの場合と同様、中心金属の種類に大きく依存することが明らかとなった。さらに、β無置換ジアザポルフィリンーニッケル錯体のβ位を位置選択的に臭素化した後、パラジウム触媒を用いて反応させることにより、ジアザポルフィリン二量体を合成する事に成功した。各種スペクトル測定および理論計算の結果、この二量体は高い平面性を持ち、π系は大きく拡張されていることを見いだしている。また、一部の誘導体についてはその吸収帯が近赤外領域に達することから、色素増感太陽電池への利用も検討している。以上の結果は、アザポルフィリン誘導体の構造ー物性相関を理解する上で重要な知見を与えるものである。24年度が最終年度であるため、記入しない。(i)β無置換ジアザポルフィリン金属錯体の高効率合成法の確立、(ii)(i)で合成した金属錯体の構造・物性の解明。(iii)β無置換ジアザポルフィリン金属錯体のペリ位化学修飾法の確立と物性の評価。まず、アジ化銅とジブロモジピリン-金属錯体の鋳型反応を利用して、β無置換ジアザポルフィリン-ニッケル錯体および-銅錯体を80%以上の高収率で合成する事に成功した。次いで、X線結晶構造解析、吸収スペクトル、芳香族性、酸化還元電位測定により、合成したπ系の結晶構造、吸収特性、および電子受容性・電子供与性を調べた。その結果、メソ位への窒素原子の導入によりβ無置換ポルフィリンπ系のフロンティア軌道が大きな摂動を受け、その電子受容性が高まることや、長波長領域の可視光に対する感受性が増すことなどが明らかとなった。さらに、β無置換ジアザポルフィリン-ニッケル錯体のβ位を位置選択的に臭素化する反応条件を最適化し、クロスカップリング反応を利用して四つのフェニル基をペリ位に導入することに成功した。この化学修飾により、ジアザポルフィリンのπ系は大きく拡張する。一方、(iv)ホスファメタラサイクルで架橋されたポルフィリン二量体の吸収特性や光物性の解明にも取り組み、架橋金属としてパラジウムや白金を用いた場合、π系全体の吸収特性や電気化学特性が金属d軌道とポルフィリンπ軌道との反結合性軌道相互作用の強弱に依存することを実験・理論両面から初めて明らかにした。当初は、合成した各種ポルフィリン誘導体を用いた有機薄膜太陽竃池の作製とテバイス特性の評価まで想定していたが、期間内に検討するには至っていない。しかしながら、今回確立したジアザポルフィリン金属錯体の高効率合成法や、ペリ位の位置選択的な化学修飾法は、今後ジアザポルフィリンを母核とする機能性材料を設計・開発するうえで、極めて有望な方法であると考えている。

24年度が最終年度であるため、記入しない。得られた知見を今後有機薄膜太陽電池などへ応用するには、固体状態におけるπ系の組織化と中心金属の選択が鍵を握ると考えている。そこで、外周部へ適切な置換基を導入することで平面指向性の高いジアザポルフィリン金属錯体を構築し、この問題に対応する。現在、さまざまな金属錯体の構築へ向けて、フリーベース体の合成法を最適化している段階である。
新規ペプチドＯＢＡＰの生理活性の検討

まずOBAPは胃から抽出されたペプチドであるため胃から分泌されている可能性があるため、胃からの分泌を検討するためガストリン投与によるOBAP分泌が刺激されるかについてOBAP濃度の変化をELISAを用いて検討した。結果、ガストリンの投与によるOBAP濃度変化は認めなかった。OBAPが生体内で分泌されているのかどうかについては今回の検討では不明であった。ペプチドの生理活性を検討するためにラットへのペプチド投与によるカルシウムイオン濃度、カルシトニン、PTH、pHについて繰り返し検討した。結果、ラットにおいてカルシウムイオン濃度はOBAP投与により低下することが確認された。OBAP2mg/kgにおいてカルシウムイオン濃度は投与から20分、60分で有意な低下を認めた。pHの変化は対照群、OBAP1mg/kg、2mg/kg群において差を認めなかった。このことよりOBAPが生体内のカルシウムイオン濃度を低下させることが確認された。次にOBAP投与によりPTH、カルシトニンがどのように変化するかを検討した。カルシウムイオン濃度が変化すればPTH、カルシトニンが変化するはずであり、理論上はPTHが上昇、カルシトニンが低下することが予想された。結果、PTHは1mg/kgでは変化を認めなかったが、2mg/kgにおいて投与から20分、60分で有意な低下を認めた。またカルシトニンは1mg/kgでは変化を認めなかったが、2mg/kgにおいて投与から20分、60分で有意な低下を認めた。このことよりOBAPはPTH、カルシトニン分泌に対して抑制的に働いている可能性があることが示唆された。今後、さらなるカルシウム代謝におけるOBAPの働きを詳細に検討していく必要があると考える。ペプチドの生理活性について検討するためにペプチド投与による骨芽細胞の変化についてDNAマイクロアレイを用いて網羅的遺伝子解析を行った。骨代謝、細胞内シグナルについての遺伝子変化に注目して解析を行った結果、十数種類の遺伝子が大きく変化することが判明した。そこで再現性を確認するためペプチド濃度によって濃度依存的に変化する遺伝子について検討を追加した。結果、再現性をもって、さらに濃度依存的に変化する、骨代謝、細胞内シグナルに関連する遺伝子の明らかな変化は認められなかった。網羅的遺伝子解析では変化する遺伝子が膨大であり細胞の条件によって大きく結果が変化するため生理活性を特定することが困難と考えられた。(1)ペプチドの生理活性について検討するため、まずペプチド投与による骨芽細胞の変化についてDNAマイクロアレイを用いて網羅的遺伝子解析を行った。1回目のマイクロアレイにて変化のある遺伝子を解析した。骨代謝、細胞内シグナルについての遺伝子変化に注目して解析を行った結果、十数種類の遺伝子が大きく変化することが判明したが、再現性を確認するため現在2回目の解析中である。(2)ペプチドを骨芽細胞へ投与しRANKLなどの変化をreal-time PCRにて検討した。骨芽細胞はラット胎児の頭蓋骨より初代培養した細胞を用いた。新規ペプチドを骨芽細胞に各種濃度で投与し24時間後にRNAを採取しreal-time PCRにてRANKLの変化を測定した。結果有意な変化は認めなかった。現在、ペプチドの投与量やRNAの回収時間などを再検討し、再度同様の実験を行っている。(3)ペプチドの発現についての検討のためペプチドの抗体の作成を試みているが、まだ抗体作成には至っていない。マイクロアレイにおいて結果が安定せず、マイクロアレイに用いるサンプルの条件設定を繰り返したために実験が遅れたと考えられる。またマイクロアレイのデータ解析に時間がかかったことも理由の一つである。マイクロアレイのデータ解析に時間がかかったため。再現性を確認するためマイクロアレイを再度行っているためにデータ解析に時間がかかっている。またリアルタイムPCRの解析においてプライマーの設計、データ解析について繰り返し実験を行ったために計画より実験が遅れている。RANKLの変化については予想した結果が得られず、ペプチドの投与量など実験方法の再検討が必要である。

ペプチドの抗体作成を試みているが、まだ成功していないためにペプチド発現の解析が進んでいない。網羅的遺伝子解析では変化する遺伝子が膨大であり条件によって大きく結果が変化するため生理活性を特定することが困難と考えられ、今後はペプチドの血中カルシウムイオン濃度調節への作用を追求していく。また試薬メーカーから発売されたOBAPのELISAキットを使用し血中濃度の検詳細な検討を行う。研究計画が遅れており次の対策、工夫にて研究の推進を図っていく。ペプチド発現解析においては試薬メーカーから発売している抗体やELISAキットの購入を検討し研究を進めていきたい。骨芽細胞への作用については遺伝子マイクロアレイの解析を急ぎ、遺伝子変化について検討していく。骨代謝への作用については投与量や投与期間、方法を再検討する必要がある。そのために、まずは細胞レベルでの遺伝子の変化について再検討し、動物実験の計画を立てていく。A)血中内のペプチドの確認を行う。1ラットから血清を採取しELISAを用いて新規ペプチドの血中内への存在を確認する。2また新規ペプチドの血中濃度の日内変動や食事の影響などを検討する。朝・昼・夕・深夜と各時間ごとにラットの血清を採取し新規ペプチドの濃度を測定する。また食前、食後でのペプチド濃度の変化を確認する。3ガストリンにより胃からのペプチド放出が促進されるという報告もあり、OBAPについてもガストリン投与による変化を確認する。B)ラットへの静脈内投与を行い血中カルシウム濃度調節への作用を検討する。今回我々が発見したペプチドは胃の抽出液より分離・精製しており、骨芽細胞の細胞内Ca濃度を上昇させる。したがって、新規ペプチドは血中のカルシウム濃度にも影響している可能性がある。現在までの初期検討において新規ペプチドは血中カルシウム濃度を低下させた。そこでペプチドをラットへ静脈内投与し血中カルシウム濃度調節への作用を詳細に検討する。C)骨肉腫細胞に対する新規ペプチドの作用の検討を行う。骨肉腫細胞にたいしても新規ペプチドは作用する事を現在までに確認した。そこで、骨肉腫細胞に対する作用をペプチド、抗体を用いて検討する。骨肉腫細胞:U2OS、SaOS2、MG63を使用する。ペプチドを作用させ細胞の増殖能、浸潤能を検討する。D)ラットへの投与(8週間腹腔内投与)を行い骨代謝への作用の詳細を検討する。新規ペプチドの骨代謝への影響を骨形態計測を行い組織における詳細な変化を検討する。A)マイクロアレイを行い、変化があった遺伝子についてしぼりこみを行い、ペプチド投与による変化をReal-time PCRにて検討する。
アトピー性皮膚炎におけるバリア破綻がもたらす炎症の惹起機構の解明

皮膚バリア機能の障害はアトピー性皮膚炎の一因として重要と考えられている。本研究課題では、インフラマゾームに注目し、アトピー性皮膚炎における皮膚バリアの脆弱化に起因する炎症惹起のメカニズム解明を目指した。昨年度は、培養ケラチノサイトを用いた検討において、乾燥状態に関与するインフラマゾームの候補因子としてNOD2とNLRP10の可能性を見出し、アトピー性皮膚炎での発現等につき検討した。本年度は、他の慢性炎症性皮膚疾患のひとつである尋常性乾癬におけるこれらの因子の発現について比較検討を行った。その結果、皮膚組織免疫染色において、乾癬皮疹部はアトピー性皮膚炎に比べNOD2の発現は非常に僅かであり、NOD2はアトピー性皮膚炎の病態に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また、培養ケラチノサイトを乾燥状態にした際のS100A8、S100A9の発現状況を調べたところ、NOD2の発現と類似していることが明らかになった。我々のこれまでの研究からS100A8/A9は炎症の慢性化に働く因子であることが明らかになっていることから、NOD2とS100A8、S100A9との関連性について検討を行った。ケラチノサイトにおけるNOD2の発現をノックダウンしたところ、S100A8、S100A9の発現は優位に抑制され、逆にNOD2を過剰発現させるとS100A8、S100A9の発現が亢進した。これらのことから、NOD2はシグナル伝達においてS100A8、S100A9の上流に位置し、NOD2の活性化がS100A8、S100A9の産生を促している可能性が示唆された。本年度はアトピー性皮膚炎の病態への関与が疑われるインフラマゾームの候補因子についてさらなる検討を行い、また炎症の慢性化に働くS100A8/A9の発現との関連性についての検証も行い、おおむね順調に進めることができた。平成30年度に得られた結果を基にして、S100A8/A9がNPTNβ/EMMPRINレセプターを介した信号の免疫系への影響などについて検討を進める。慢性炎症性皮膚疾患の代表であるアトピー性皮膚炎の発症要因の一つとして、皮膚バリアの脆弱化が注目されている。皮膚バリア破綻を引きがねとする炎症の惹起と慢性化に至るメカニズムの解明がアトピー性皮膚炎の病態解明に重要と考える。我々はこれまでに、炎症の慢性化に関与する因子としてS100A8/A9の存在を明らかにし、それらの新規レセプターを同定した。本研究では、バリア破綻がもたらす炎症惹起機構としてインフラマゾームに注目した。インフラマゾームの構成要素であるNLRには23種類存在することが報告されているが、複数のNLRが一つのインフラマゾームに構成要素になりうることから、インフラマゾームの種類は非常に多いと推測される。アトピー性皮膚炎では皮膚バリア障害と乾燥が病態に関与することから、培養ケラチノサイトに様々な刺激を行い、空気暴露刺激による乾燥状態に関与するインフラマゾームの構成要素について検討を行った。その結果、NOD2とNLRP10の発現が特異的に亢進していた。これらの候補因子をケラチノサイトに過剰発現させると、NOD2では細胞形態に異常が生じた。NLRP10では明らかな変化は認めなかったが、両者を共発現させるとNOD2による細胞へのダメージが緩和されたことから、NOD2が炎症の惹起、NLRP10が炎症の抑制に寄与している可能性が示唆された。実際、皮膚組織染色ではNOD2は正常に比べてアトピー性皮膚炎の皮疹部では表皮全体に発現が強く亢進し、NLRP10は正常に比しアトピー性皮膚炎では発現が抑制されていることが確認できた。本研究課題の目標は、皮膚バリア破綻に伴う炎症の惹起メカニズムとしてインフラマゾームに注目し、また炎症の慢性化へのプロセスを明らかにすることでアトピー性皮膚炎の病態解明を目指すものである。本年度は皮膚の乾燥状態に起因するインフラマゾームの候補因子の検討を行い、おおむね順調に進めることができた。

ケラチノサイトにおけるNOD2の発現をノックダウンしたところ、S100A8、S100A9の発現は優位に抑制され、逆にNOD2を過剰発現させるとS100A8、S100A9の発現が亢進した。これらのことから、NOD2はシグナル伝達においてS100A8、S100A9の上流に位置し、NOD2の活性化がS100A8、S100A9の産生を促している可能性が示唆された。本年度はアトピー性皮膚炎の病態への関与が疑われるインフラマゾームの候補因子についてさらなる検討を行い、また炎症の慢性化に働くS100A8/A9の発現との関連性についての検証も行い、おおむね順調に進めることができた。平成29年度に得られた結果を基にして、アトピー性皮膚炎に関与するインフラマゾームの候補因子について炎症の慢性化に働くS100A8/A9の発現への影響などについて検討を進める。平成30年度に得られた結果を基にして、S100A8/A9がNPTNβ/EMMPRINレセプターを介した信号の免疫系への影響などについて検討を進める。本年度はおおむね計画どおりに使用した。次年度は、実験に必要な抗体、細胞培養関連試薬、免疫染色関連試薬などの購入に使用予定である。次年度も実験に必要な抗体、細胞培養関連試薬、免疫染色関連試薬などの購入に使用予定である。
超強磁場下のミュオン物理

62年度中に20テスラの磁場を2万回(約11時間)繰り返し発生させることに成功した。63年度は6月にμSRの実験を行うべく強磁場発生装置を実験室に持込みテストを行ったが検出器の位置調整に予想以上に時間がかかり、物理的測定までに至らなかった。即ちミュオンから崩壊してでてくるポジトロンが強磁場によって曲げられるため最適の検出位置を探さなければならないが、通常なら50ミリ秒毎にくるビームを検出しながら検出器の位置を動かし最適位置を見つけるところが、繰り返し強磁場を使う場合は2秒に一度しかビームを検出できないのでこの作業に時間がかかったわけである。しかし2月のマシンタイムで再挑戦しμSRの実験に成功した。一方サンプルを液体ヘリウム温度に冷却するためのデワーを設計したが、その段階においてシングルショットのパルス磁場ならば問題のなかったステンレススチールが、繰り返しパルス磁場の場合は蓄熱のために温度が上がりデワーの材料として使用できないことが判明した。そのため絶縁体で熱伝導度のいいサファイヤの筒を熱シールドに使ったデワーを制作しヘリウム温度の実験にも成功した。また今年度はもっと強度の高い材料を使って30テスラ用のマグネットの設計と制作を平行して行った。この研究の中核をなす繰り返しパルス強磁場発生の技術研究はまだ世界のどこでもなされておらず、本研究課題がはじめてである。これをミュオンの実験に応用し、新しい研究分野を開くのも全く初めてである。20テスラの磁場の2万回繰り返しの成功は本年7月ベルギーのリューベンで開かれた第2回強磁場磁気国際シンポジウムで発表され高く評価された。また繰り返しパルス磁場とパルス的にくるミュオンビームとの組合せという発想は、パルス中性子な加速器を用いた自由電子レーザーの研究家にも関心を呼び大きな反響があった。
中欧資本主義の比較経済学的考察:国際体制編入形態と国内経済社会制度・政策の関連

中欧諸国は、共産主義から資本主義へのシステム転換過程において経済構造転換も追求してきた。多国籍企業の積極的誘致もその一環であった。しかし、地場企業育成のための産業政策は弱かった。製造業における「二重構造」(外資系企業と地場企業の関係の弱さ)と金融面での「外銀支配」が、2008年秋以後の世界不況の中欧諸国への波及要因となった。中欧諸国の持続的発展のためには地場企業発展を促す産業政策が必要である。中欧資本主義の比較経済学的考察という本研究課題遂行のため,関連文献収集・読解のほか国内外の専門研究者との学術交流に力を注いだ。(1)ハンガリーとイギリスを訪問しハンガリーでは科学アカデミー経済研究所のチャナーディ氏(Canadi,M),ガーチ氏(Gacs,J.),中欧大学のボーレ氏(Bohle,D),イギリスのバーミンガム大学ロシア・東欧研究センターのクーパー所長(Cooper,J.)などと本研究課題と関連する意見交換を行った。その成果は,2007年度の業績にも反映されている((2),(3)参照)。(2)国内では,2007年9月に(主に関西在住の旧ソ連・中東欧経済専門研究者が会員である)「比較経済体制研究会」において「比較政治経済学とポスト共産主義」というタイトルの報告を行った。そして,それを踏まえて2007年末に論文「比較政治経済学とポスト共産主義諸国の資本主義の多様性」(研究発表の欄参照)を出版した。中欧資本主義及びポスト共産主義諸国の資本主義の物質と多様性という論点解明に向けて一室の貢献ができたと考えている。中欧資本主義の比較経済学的考察という本研究課題遂行のため現地調査・内外専門研究者との学術交流及び文献収集・読解を行った。(1)現地調査(2008年9月)はハンガリーで実施したが、ハンガリーの商業銀行OTPの幹部からの聞き取りなどを通じて、中欧諸国では外資系金融機関が圧倒的であること、それらの外資系現地法人は外貨建て住宅ローン、自動車ローンなどに力を入れており、企業への融資はハンガリーを除けばそれほど大きくないことが明らかとなった。現地調査以後に起きた国際金融危機の影響はハンガリーをはじめ中欧諸国で大きかったが、それは外資系金融機関現地法人の融資削減に起因している。中欧資本主義の金融分野での過度の外資依存の問題が明らかになったといってよい。(2)在ブダペストILOサブリージョナル・オフィスの労使関係専門スタッフ等との交流を通じて、中欧に多く進出している外資系製造企業の労使関係についていえば、ドイツ系現地法人においてドイツ的労使関係が一定程度持ち込まれているものの、一般的にいえば中欧諸国の労働組合の影響力は大きくないことが明らかになった。(3)文献読解及びイギリスでの学術交流(バーミンガム大学ロシア東欧研究センター)を通じて、スロヴァキアが減税政策などを通じて、外資導入面でハンガリー、チェコなど先行国に追いつこうとしていること、またスロヴァキアの社会政策にはEU社会政策の近年の傾向(勤労福祉)が強い影響を及ぼしていることが明らかになった。中欧資本主義の比較経済学的考察という本研究課題最終年度(平成21年度)の目的は、平成19、20年度の現地調査と研究を踏まえ、文献読解を通じ研究を深めることであった。2008年秋以降、国際金融危機・経済不況は中欧にも及んだがハンガリーとスロヴァキアの生産低下はチェコより大きかった。ポーランドは2008年第4四半期GDPが前期比でマイナスを示したが2009年度を通じ低い率であるとはいえプラス成長をおさめた。こうした差異は、中欧諸国の間の国際体制編入形態の相違とも関連を持つ。中欧4ヵ国は1990年代後半以後、外資系企業による輸出主導の成長を遂げてきたが、輸出依存度はハンガリー、スロヴァキア、チェコの3国が7080%(2006年度)であるのに対し、ポーランドは40%(2007年)である。国際体制(主に、EU市場)に強く組み込まれているハンガリーとスロヴァキアはEU中心国における市場収縮から大きな打撃を受けたが、欧州の人口大国であるポーランド(約4000万人)は内需が大きいことに加え輸出依存度の相対的低さのため欧州中心国の不況の影響が小さかったといえる。チェコがスロヴァキアと比較して生産低下の規模が小さかったのは、スロヴァキアが2004年以後低い法人税率で外資誘致を促進しつつ社会保障削減など「小さな政府」を志向したのに対し、チェコは相対的に高い社会支出を維持してきたため輸出減少を補うより広い国内基盤を有していたからである。ハンガリーは20012006年に賃金及び年金引き上げなど生活者重視の政策をとった。しかし、それに伴う財政赤字増大についてEUから警告を受け2006年以後緊縮政策に転じ、2007年以後同国経済は停滞していた。そこに欧州不況による輸出減少が加わり、ハンガリーの2008年以後の生産低下規模は大きくなったのである。
立ち上り動作時の依存度を表示できる立ち上り支援装置の開発研究

高齢者人口はますます増加する一方で、起立動作の支援は介護者に依存することが多い。高齢者の自立支援が求められると同時に、起立動作を補助装置の開発が望まれている。現在、立ち上がり動作を補助する装置は開発されているものの、フィードバック制御を有効に活用し、使用者の立ち上がりの依存度を推定し、これを使用者へ視覚情報としてフィードバックする立ち上がり補助装置はこれまで開発されてこなかった。このような背景のもと、本研究では下肢の機能が低下した人を対象に、立ち上がり支援機能と機能回復のトレーニングの際の支援システムを提案した。得られた成果は以下のとおりに要約される。1.立ち上がり補助装置を開発試作し、立ち上がり補助機能を持ち、かつ補助の際の患者や使用者の依存度を推定する装置を製作した。また、この装置が十分な性能を持つことを示した。2.依存度を推定したデータは機能回復を支援する理学療法士等に管理可能な資料を提供するとともに、訓練者に直接視覚によって状態をフィードバックできるシステムを構築できた。3.理論面においては、状態フィードバックによるH∞制御の解の存在や特性について明らかにし、内部モデル制御、一般化内部モデル制御に組み込み、より性能の良い制御が可能となることを示した。とくにフィードバック制御が有する外乱推定特性を積極的に活用した。以上の成果を、特許申請、論文、国際会議論文としてまとめ公表した。当該研究課題について、今年度の実施事項及び得られた成果は以下に示すとおりである。1.老人あるいは脚力低下した対象者の立ち上り動作を解析しこれをもとに、立ち上り補助装置の機構の決定と装置の設計を行い、これをもとに実際に製作を行った。2.装置の駆動部制御には一般化安定化補償器を利用した制御を用い、これをマイコンに実装し1.で製作した装置に組み込み、依存度が表示できる立ち上り補助装置を試作、その性能を評価した。この結果、立ち上り動作を十分支援する装置であり、立ち上り動作時の依存状況は筋電計データ、試作した依存度表示システムから妥当な結果が得られること、及び立ち上り姿勢に見合った支援が達成できる装置であると評価できる。この際理学療法士からの助言として、立ち上り初期における補助や依存度の表示について改善指摘があり、これらの結果をもとに特許申請の為の準備を実施中である。一方基礎理論については、未知入力系低次元オブザーバに基づく一般化安定化補償器を用いて、外乱出力間のH_∞ノルムを制御する制御系を提案し、その成果を以下のように公表並びに公表予定している。とくにフィードバック制御が有する外乱推定特性を積極的に活用した以上の成果を、特許申請、論文、国際会議論文としてまとめ公表した。
移動プラズマによるスパッタリングの超高速化と極薄アモルファス薄帯の作製

薄膜もしくは数ミクロン以上の厚みの非晶質磁心材料をスパッタリングを高速化する事により作製する。膜の形成速度を上げるため、プラズマを移動させる方式を考案し、通常の電力では有効に働く事を確認している。本実験では、定電流高圧電源を購入し、放電電流を1Aから7Aに増やし、ターゲットの過熱状態,膜形成速度,膜の透磁率,抗磁力を調べた。プラズマを固定した時は、約3Aで鉄ターゲット表面に再結晶が見られるが、移動した時は5Aまで変化がなく、膜形成速度は、0.75ミクロン/分が得られた。更に、7Aでは1ミクロン/分を越えたが、若干の再結晶が起った。現在、ターゲット冷却を間接から直接水冷へ改善中であり、更に数倍の速度が期待できる。以上の結果から、極薄非晶質薄帯の作製は5Aで行った。ポリイミドフィルム上にCo-Zr-Nb,Co-Ni-Mo-Zr合金を連続形成した。これに熱処理を旋し、磁心損失,透磁率を調べた。以下は、その結果である。1.従来報告されている強磁性体の高速スパッター法に比べて、最も高速の膜形成が可能になった。ターゲット冷却法の改善により更に高速化する事が期待できる。2.厚さ数ミクロンに形成した長尺の磁心材料は、ガラス基板上の試料に比べて抗磁力が大きく、また従来の非晶質薄帯に比べてヒステリシス損失が大きいが、MHz帯における動的な損失は小さい。ヒステリシス損失を約半分にできれば、新しい高周波用磁心となる。現在、ポリイミトフィルムを基板としているが、セラミック基板上では損失が小さいので、基板表面処理により改善できる。
Dural specific phosphataseによるTh1/2分化制御機構

我々がクローニングしたJNK特異的dual specificphosphatase (DUP)をコードするDUP16遺伝子とそのシステインをセリン置き換えたdominant negative DUP16遺伝子をT細胞にのみに発現する1ck-promoterで発現させたトランスジェニック(Tg)マウスをもちいて、Th1/Th2応答を検討した。TgマウスのナイーブT細胞を用いて抗CD3抗体/抗CD28抗体で刺激しIFN-γ、IL-4、IL-2の産生を調べたところ、DUP16-TgマウスでIL-2,IL-4産生の低下が、dominant negative抑制された。Mycobacterium bovis (BCG)と卵白アルブミン(OVA)に対するTh1/Th2応答を検討した。BCGを感染させて、臓器内菌数を調べたところ、DUP16-Tgマウスで菌数の低下、dominant negative DUP16-Tgマウスで菌数の増加を認めた。さらにPPD抗原で刺激した細胞内サイトカインによってTh1機能分化を調べたところ、DUP16-TgマウスでTh1細胞数の増加、dominant negative DUP16-TgマウスでTh1細胞数の低下を認めた。これらの結果よりT細胞に発現されるDUP16はTh1細胞の産生・維持にはネガティブに働く可能性が示唆された。次にこれらのTgマウスに卵白アルブミン(OVA)/CFAで免疫して、OVA特異的抗体産生を調べたところ、DUP16-TgマウスIgEの産生が低下、dominant negative DUP16-Tgマウスで上昇した。OVA特異的CD4Th細胞のサイトカイン産生を細胞内サイトカインによって調べたところ、DUP16TgマウスでTh2細胞応答の有意な低下を,dominant negative DUP16-Tgマウスで上昇を認めた。これらの結果よりT細胞に発現されるDUP16はTh2細胞応答を制御することによってTh1/Th2応答を制御すると考えられる。我々は単球/マクロファージで多量に発現される新規のdual specific phosphatase(DSP)をクローニングし、MKP-M(MAP kinase phosphatase-macrophage=DUP16)と名付けた.このDSPは3種のMAPキナーゼのうち特異的にJNKの脱リン酸化をおこすことがわかった。成熟T細胞にのみに発現する1ck-distal promoterでMKP-Mとそのシステインをセリン置き換えたdominant negative MKP-MCSを発現したトランスジェニック(Tg)マウスを作製した。ともに胸腺細胞、リンパ組織(脾臓、リンパ節、パイエル板、腸管上皮間リンパ球)、非リンパ組織(肝臓、粘膜固有層)でのTリンパ球の分化に変化は認めらなかった。次に二種類のトランスジェニックマウスのナイーブT細胞を用いて抗CD3抗体で刺激してJNKの活性化をc-JUNのリン酸化で検討したところ、MKPM-TgマウスでJNK活性の早期低下、MKPMCS-TgマウスでJNK活性の遷延化がみられた。これらのマウスに卵白アルブミン(OVA)産生Listeria monocytogenesを感染させて、臓器内菌数を調べたところ、MKPM-Tgマウスで菌数の低下、MKPMCS-Tgマウスで菌数の増加を認めた。さらにリステリア抗原およびOVA特異的CD4T細胞の産生をテトラーマーを用いた染色で調べ、細胞内サイトカインによってTh1機能分化を調べたところ、MKPM-TgマウスでTh1細胞数の増加、MKPMCS-TgマウスでTh1細胞数の低下を認めた。これらの結果よりT細胞に発現されるMKP-MはTh1細胞の産生・維持にはネガティブに働く可能性が示唆された。
微生物由来の細胞周期阻害剤の単離と作用機作に関する研究

新規細胞周期阻害物質の単離を目的として、土壌より分離した放線菌及び糸状菌代謝産物のスクリーニングを行った。細胞周期阻害活性は、cdc2 kinase温度感受性変異株tsFT210細胞に微生物抽出液を添加後、フローサイトメータを用いて検定した。その結果、長崎県野母崎付近で採取した糸状菌Curvularia sp.97-F166株の培養液より新規物質curvularolを単離した。Curvularolは、97-F166株の培養液から、各種カラムクロマトグラフィーを経て、無色針状結晶として得られた。高分解能FAB-MSから、分子量266、分子式C_<15>H_<22>O_4と決定された。^1H及び^<13>CNMRを用いた詳細な構造解析により、トリコテセン骨格に一部類似した新規セスキテルペン化合物であることを決定した。Curvularolは、高濃度(100μg/ml)でもバクテリア・真菌に弱い抗菌活性しか示さなかったが、各種動物培養細胞に対しては、低濃度(50500ng/ml)で強い細胞毒性を示した。放射性前駆体を用いて生体高分子の合成に与える影響を調べた結果、curvularolは、動物細胞の蛋白質合成を阻害することが明らかになった。Curvularolは、tsFT210細胞、src^<ts>-NRK細胞(ラット腎細胞NRKに温度感受性v-srcを導入した細胞)の細胞周期をG1期で停止させた。さらに、50ng/mlの濃度でsrc^<ts>-NRK細胞を癌細胞様形態から正常細胞様形態に復帰させた。細胞は,遺伝子(DNA)を複製して2つの娘細胞へ分配するという一連の過程(細胞周期)を経て増える。細胞周期の調節機構が解明されるにしたがって、癌細胞とは,その制御機構に異常が生じて,無秩序に増殖する状態にあると理解されるようになった。こうした背景から,細胞周期を阻害する薬剤が新しい抗癌剤として期待されている。我々は本研究課題で、微生物代謝産物より新しい細胞周期阻害剤の探索を行い,細胞周期阻害剤の作用解析を行うことを目的とした。【探索】細胞周期阻害剤の探索系には、マウス乳癌FM3A細胞から樹立したp34^<cdc2>キナーゼ温度感受性変異株tsFT210細胞を用いた。本細胞は、39°Cでcdc2キナーゼの酵素活性が失活するためにG2期で細胞周期の進行を停止し、32°Cに戻すと再び細胞周期の進行を開始した。この条件下で、微生物培養サンプルを細胞培養液に添加し、細胞周期の停止作用をフローサイトメーターで測定した。スクリーニングの結果、カビの1種Phoma属の株が新しいサイトカラシン類縁化合物RKS-1778を生産することを見出した。RKS-1778は,細胞周期をM期で停止させる。さらに糸状菌Aspergillus terreusが、新規なペプチド系化合物テルペプチンを生産することを明らかにした。【作用解析】すでに我々が細胞周期阻害剤として見いだしていたホスミドシンの阻害作用を詳細に解析した結果,ホスミドシンはG1サイクリンの1つサイクリンD量を減少させることによってRBタンパク質のリン酸化を阻害し,細胞周期の進行をG1で停止させることを明らかにした。細胞周期を制御する薬剤は,細胞生物学研究に重要なツールとなるとともに新しい抗癌剤としても期待される。我々は本研究課題で,微生物代謝産物より新しい細胞周期阻害剤の探索を行い,その作用機構の解明を目的として研究を行った。1.酵母を用いたスクリーニング:出芽酵母の接合因子シグナルカスケードは動物細胞のMAPキナーゼカスケードと共通性が高いことに着目し,シグナル伝達阻害剤のスクリーニングを行った。

その結果,あるカビの培養産物中に阻害活性を見出したので,阻害剤の精製を行っている。さらに精製したtubulin,MAP2,Tauを用いた再構成系を用いてTPS-Aの作用を検討したところ,TPS-AはtubulinのC末と相互作用して微小管結合蛋白質(MAP)依存的なtubulin重合を特異的に阻害した。他の7種の類縁体のうち6種は微小管重合阻害活性を示したのに対本研究課題では、微生物代謝産物から動物細胞の細胞周期進行を阻害する化合物を単離し、その化学構造の決定、化学修飾、構造活性相関を明らかにするとともに、阻害剤をプローブとして細胞周期の制御機構の解析を目的とする。今年度は、細胞周期のM期阻害剤であるピロネチンの標的因子がチューブリンであることを明らかにした。ラット線維芽細胞3Y1をピロネチンで処理すると、チューブリンネットワークが消失した。牛脳から微小管たんぱく質を精製し、ピロネチンがin vitroでも微小管重合を阻害することを明らかにした。放射標識したチューブリン作用薬(コルヒチン、ビンブラスチン)との競争実験により、チューブリンへのピロネチンの作用部位は、ビンカアルカロイドの結合部位近傍であることが示された。さらに、ビオチン標識ピロネチンを合成してチューブリンへの結合を検討した結果、ピロネチンは他の細胞内蛋白質にはほとんど結合せずチューブリンに特異的に共有結合することが明らかとなった。これまでに知られている薬剤とチューブリンとの結合は可逆的であったが、ピロネチンはチューブリンと共有結合するので、結合部位などに関する詳細な研究が可能になった。新規細胞周期阻害物質の単離を目的として、土壌より分離した放線菌及び糸状菌代謝産物のスクリーニングを行った。細胞周期阻害活性は、cdc2 kinase温度感受性変異株tsFT210細胞に微生物抽出液を添加後、フローサイトメータを用いて検定した。その結果、長崎県野母崎付近で採取した糸状菌Curvularia sp.97-F166株の培養液より新規物質cutvularolを単離した。Curvularolは、97-F166株の培養液から、各種カラムクロマトグラフィーを経て、無色針状結晶として得られた。高分解能FAB-MSから、分子量266、分子式C_<15>H_<22>O_4と決定された。^1H及び^<13>C NMRを用いた詳細な構造解析により、トリコテセン骨格に一部類似した新規セスキテルペン化合物であることを決定した。Curvularolは、高濃度(100μg/ml)でもバクテリア・真菌に弱い抗菌活性しか示さなかったが、各種動物培養細胞に対しては、低濃度(50500ng/ml)で強い細胞毒性を示した。放射性前駆体を用いて生体高分子の合成に与える影響を調べた結果、curvularolは、動物細胞の蛋白質合成を阻害することが明らかになった。Curvularolは、tsFT210細胞、src^<ts>-NRK細胞(ラット腎細胞NRKに温度感受性v-srcを導入した細胞)の細胞周期をG1期で停止させた。さらに、50ng/mlの濃度でsrc^<ts>-NRK細胞を癌細胞様形態から正常細胞様形態に復帰させた。
外資主導工業化の中での発展途上国都市の構造変動-メキシコ北部の事例研究

本研究の結果、メキシコにおける輸入代替工業化路線から輸出志向工業化路線への産業戦略の転換は、都市化のパターンを大きく変猊させつつあることが明らかになった。メキシコの人口統計分析は、これまでの大都市、特に主座都市(primate city)であるメキシコ・シティへの極端な人工集中から、新しく勃興しつつある北部の工業都市への人工移動の方向の転換を示した。これらの都市では、アメリカや日本の企業の投資が急激に拡大し、特にカリフォルニア州に隣接するティファナ市では、テレビやパーソナル・コンピューターを中心とする電子産業の地域圏(industrial district)が形成されつつある。そこでは、一方で多国籍企業の横断的な企業間ネットワークが形成されながらも、他方で外国企業へのメキシコ部品企業の連関(linkage)が未発達なまま、産業都市としての急速な膨張が続いている。このような産業構造上の問題点は、都市の空間構造にも反映している。CD-ROM化された1990年メキシコ国勢調査データの分析は、職業、所得、教育レベルといった諸側面でティファナ市の内部での地区間の社会的格差が非常に大きなものであることを示した。特に、都市膨張に伴って拡散した工業地帯の周辺の地域には、居住期間が短い農村からの移住民が集中し、様々な指標からみてこの都市の社会的な底辺を形成している事が明らかになった。特に、居住環境、基本的な公共サービスの面での問題は深刻である。この萌芽的研究では、このような旧市街地区、新興の中間階層居住区、そして周縁的な地域の工業労働者街の比較が焦点であったが、今後は労働者街の中の異なるタイプの比較分析が課題となるだろう。
CDK4/6阻害薬によるがん細胞の自食胞形成を伴う新規細胞死誘導の分子基盤の解明

近年、CDK4/6を分子標的とする阻害薬が3種類(abemaciclib, palbociclib及びribociclib)開発され、乳癌等で臨床応用されつつある。これまでの研究から、CDK4/6が細胞周期停止のみならず殺細胞効果を示すこと、阻害薬のうちabemaciclibのみが強力な自食胞形成を誘導することを明らかにし、abemaciclibによる細胞死がアポトーシス等の典型的なものとは全く異なる新規細胞死であることが示唆された。これを踏まえ、本研究では「abemaciclibによる自食胞形成を伴う新規細胞死誘導メカニズムの解明」を目的とした。初年度はまず、癌細胞における自食胞形成とオートファジーの関連を検討した。東京大学の水島研究室で開発された蛍光プローブを用いたアッセイにより、CDK4/6阻害薬はオートファジーを阻害することが明らかになった。また、オートファジー阻害薬を用いた細胞死レスキュー実験や、オートファジー必須因子のノックアウト細胞株を樹立して用いた実験から、abemaciclibによる自食胞形成及び細胞死はオートファジーとは独立して起こる現象であることが示された。さらに、オートファジーマーカーやリソソームマーカーの蛍光プローブを用いたタイムラプス観察により、自食胞はリソソームに由来することが明らかになった。加えて、abemaciclibによりリソソームが酸性化、膨化することでリソソームでのタンパク質分解機能が阻害されていることを示唆する結果が得られた。現在、これらの結果について論文投稿準備中である。初年度の当初予定である、自食胞形成とオートファジーの関連に関しての検討は完了した。また、初年度から進める予定の自食胞形成の分子スイッチ同定は、自食胞形成がバフィロマイシン(V-ATPase阻害薬)で阻害されることを念頭に、V-ATPaseのノックダウン株作製を開始している。自食胞形成の分子スイッチについては、候補の一つであるV-ATPaseについて、ノックダウン株作製を進め、解析に供する。また、CDK4/6阻害薬としての作用と自食胞形成を介した細胞死への寄与とを切り分けるため、CDK4/6のノックアウトもしくはノックダウン株の構築も行い、解析することでCDK4/6との関連についても検討する。加えて、機能性磁気ナノビーズを用いたハイスループットアフィニティ精製およびマススペクトル解析によるabemaciclibの標的分子の探索も行い、分子スイッチの同定を進める。
カテナン分子の機能探索を拓く、フルオラスタグを利用したカテナンライブラリーの構築

昨年度に引き続き、カテナンの窒素原子にフルオラスタグを導入するための条件検討を行った。クラウンエーテルにより動的保護されていて、非常に反応性に乏しい窒素原子ではあるが、スルホニル基を良好な収率で導入できることが明らかとなったことから、フッ素原子を有するスルホニル基の導入を試みた。その結果、トリフルオロメタンスルホニル基、ペンタフルオロベンゼンスルホニル基が良好な収率でカテナンの窒素原子上に導入できることが明らかとなった。フルオロ置換スルホニル基が導入された[3]カテナンでも、対称性の高いD2h対称をもつ異性体と、対称性の低いC2v対称性を持つ異性体が存在することがNMR測定により明らかになり、この結果はフルオロ置換されていないスルホニル基と同様の結果であった。導入したスルホニル基が大きさの小さいメタンスルホニル基の場合、D2h対称をもつ異性体とC2v対称性を持つ異性体の間に平衡が存在し、対称性の高いD2h対称をもつ異性体のほうが安定であった。一方、ペンタフルオロベンゼンスルホニル基が導入された[3]カテナンは、嵩高いペンタフルオロベンゼンスルホニル基が立体障害となるため、両異性体間に平衡はなかった。次に、クラウンエーテルにフルオラスタグを導入するため、クラウンエーテル用のエステル基を加水分解し、カルボン酸へと変換した。トリフルオロメタンスルホニル基が導入されたカテナンは、対応するカルボン酸体を得ることに成功した。しかしペンタフルオロベンゼンスルホニル基が導入されたカテナンでは、加水分解とともに、ペンタフルオロベンゼン環上で求核置換反応が容易に進行し、加水分解の補助溶媒として用いていたアルコールでフッ素が置換された誘導体が得られた。D2h対称をもつ異性体は良好な単結晶が得られ、X線結晶構造解析により、分子内で環状分子同士が水素結合していることが判明した。オレフィンメタセシス反応、末端アルキンのカップリング反応、およびアルキンとアジドのHusigen反応を用いてカテナンの合成を行った。すでにオレフィンメタセシス反応で[2]-、[3]カテナンを効率的に得る条件を見いだしているが、カテナンライブラリーを構築するには、多種のカテナンが一度に効率的に得られる条件を見つける必要がある。そこでまず、オレフィンメタセシス反応における多種のカテナンが一度に効率的に得られる反応条件(基質濃度とアンモニウム塩の鎖長)を探索した。反応条件を変えてカテナンを合成し、合成したカテナンは核磁気共鳴測定、および質量分析により、含まれているカテナンの種類の同定、定量を行った。その結果、高濃度、短いアンモニウム塩を用いた場合、多種のカテナンが一度に効率的に生成することが明らかとなった。[2]-、[3]カテナンを分離・精製することはできたが、[4]以上の高次カテナンは分離・精製が困難で、混合物として得るに留まった。引き続き、末端アルキンのカップリング反応、アルキンとアジドのHusigen反応における多種のカテナンが一度に効率的に得られる反応条件(基質濃度とアンモニウム塩の鎖長)を探索した。オレフィンメタセシスと同様、高濃度、短いアンモニウム塩を用いた場合、多種のカテナンが一度に効率的に生成することが明らかとなった。高次カテナン分離・精製の足がかりとなるフルオラスタグのカテナンへの導入のため、フルオラスタグ化されたクラウンエーテルの合成を行った。オレフィンメタセシス反応、末端アルキンのカップリング反応、およびアルキンとアジドのHusigen反応を用いたカテナン合成において、高次カテナンを一度に効率的に得られる条件を見出したことから、当初の計画通りに進展していると考えている。またフルオラスタグ化されたクラウンエーテルも合成し、カテナンのライブラリー化に向けた準備も整い、研究は順調に進呈している。カテナンの窒素原子にフルオラスタグを導入するための条件検討を行った。窒素原子はアンモニウム塩となっており、クラウンエーテルとの水素結合により動的保護されていて、非常に反応性に乏しい。種々条件を検討したところ、スルホニル基を良好な収率で導入できることが明らかとなった。スルホニル基の導入により、カテナンを構成する環状分子同士の回転運動が妨げられ、トポロジカル異性体が発現することが明らかになった。[3]カテナンでは、対称性の高いD2h対称をもつ異性体と、対称性の低いC2v対称性を持つ異性体が存在することを、NMR測定により明らかにした。導入したスルホニル基が大きさの小さいメシル基の場合、D2h対称をもつ異性体とC2v対称性を持つ異性体の間に平衡が存在し、対称性の高いD2h対称をもつ異性体のほうが安定であった。両異性体の安定性は溶媒により変化し、極性溶媒より非極性溶媒で、対称性の高いD2h対称をもつ異性体の安定性が増加した。この傾向は環サイズの異なる[3]カテナンでも観測された。D2h対称をもつ異性体は良好な単結晶が得られ、X線結晶構造解析により、分子内で環状分子同士が水素結合しており、この水素結合の効果が、D2h対称をもつ異性体の安定性に寄与していることが判明した。大きさの大きいトシル基を導入した場合、D2h対称をもつ異性体とC2v対称性を持つ異性体の間に平衡は無く、両異性体が安定に単離できた。