hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポリ環状エーテル海洋天然毒の合成研究

構造がユニークで生理活性の強力な海洋天然物の一群に、6員環から9員環のエーテル環が梯子状に規則的に連結されたポリ環状エーテル海洋毒が存在する。その化学構造と生理活性の相関を調べるためには、極微量しか得られない天然物の全合成や類縁体の合成による物質供給が重要となる。本研究では、二枚貝の下痢毒性成分と知られているホタテ貝のyessotoxinとムール貝のadnatoxinの全合成を目指し、その骨格構築法の開発研究を行うとともにその構築法を用いた全合成研究を実施、以下の研究成果を達成した。1.収束型6員環ポリエーテル合成法の開発2個の6員環エーテル誘導体をアセチレンで連結し、アセチレンの四酸化オスミウムによる1,2-ジケトンへの酸化、酸による2個のヘミケタール環の形成、メチルアセタール化、アセタールの還元反応により、4環性6員環ポリエーテルの収束的合成法を確立した。2.6-6-6-7の四環性システムの構築上記の収束型合成法の応用として、6員環エーテルと7員環エーテルを組み合わせた系に適用し、6-6-6-7の四環性システムを効率的に構築できることを明らかにした。3.YessotoxinとadriatoxinのABCDEF環の合成オキシラニルアニオンのアルキル化と6-エンド閉環反応による6員環エーテル合成法を用いて、アセチレン側鎖を有するA環とD環上にトリフラート基を有するDEF環を合成し、両者を連結後、酸化、アセタール化、還元反応に付してyessotoxinとadriatoxinのABCDEF環の収束的合成を達成した。海洋微生物である渦鞭毛藻が生産するポリ環状エーテル天然毒は,神経細胞のナトリウムチャンネルやカルシウムチャンネルに特異的に作用する強力な神経毒である。それらは,炭素数が25140個に及ぶ一本の炭素鎖が酸素原子によって6員環から9員環のエーテル構造を形成し,しかもそのエーテル環が連続的に梯子状に連結された極めてユニークな巨大分子構造体である。このポリ環状エーテル海洋毒に最も頻出する共通基本構造は,6員環エーテルが連続的に連結されたポリテトラヒドロピラン構造である。本研究では,このポリテトラヒドロピランの高効率的合成法の開発研究を実施した。今回開発した合成法は,まずはじめにヒドロキシメチル基を有するテトラヒドロピラン誘導体をトリフルオロメタンスルホネートに誘導したのち,リチウムアセチリドとカップリングしてアセチレン誘導体に変換した。次いで,この化合物を再びアセチリドとしたのち別のテトラヒドロピラン誘導体と反応させて両者を連結した。アセチレン部をルテニウム触媒をもちいた酸化反応により1,2-ジケトンに変換後,酸処理して一挙にジヘミケタール環を構築した。このジヘミケタールのアセタール水酸基をメチル化してメチルエーテルへと変換したのち,メチルエーテル部をルイス酸存在下トリエチルシラン還元することによって4環性の6員環エーテルシステムを効率良く合成することに成功した。本合成法は収束型合成法であるので,ポリ環状エーテル天然毒合成の有用な方法論となると思われる。ポリ環状エーテル海洋天然毒には,神経毒性,下痢毒性,抗真菌活性など強力な生理活性を示すものが多く存在する。本研究では,食中毒の原因物質の一つとして毒化したホタテガイより単離された11環性のポリ環状エーテル構造を持つエッソトキシンの下痢毒性と構造との関連を解明する目的でその合成研究を実施した。本年度の研究においては,6員環ポリ環状エーテル骨格構築の原料となる新しい四炭素キラルビルディングブロックとしてのエリスルトール誘導体を考案した。エリスリトールは対称構造を有するため光学的に不活性であるが,位置選択的な保護基の導入により,両光学対称体の合成が可能であり,それらを安価なグルコース誘導体から大量かつ簡便に合成する方法を開発した。本原料を用いた対称型四置換テトラヒドロピラン誘導体の効率的合成法も確立した。

この化合物を用いてエッソトキシンのBCDE環部の収束型合成を行った。同一の光学活性四置換テトラヒドロピラン誘導体から6員環のB環フラグメントおよび7員環のE環フラグメントを構築し,両フラグメントをアセチレンで連結したのちアセチレン部分を直接酸化して1,2-ジケトン誘導体に誘導した。これを酸処理して一挙にジヘミアセタール骨格を形成し,アセタール水酸基をメチル化後,トリエチルシランを用いる還元的エーテル化法でアセタール水酸基を除去することによって,エッソトキシンのBCDE環構造を構築することに成功した。ポリ環状エーテル海洋天然毒には、神経毒性、下痢毒性、抗真菌活性などの強力な生理および生物活性を示すものが多く存在する。本研究では、二枚貝による食中毒の原因物質の一つとして毒化したホタテガイから単離された11環性のポリ環状エーテル構造を持つyessotoxinの下痢毒性と構造との関連を解明する目的でその合成研究を実施した。本年度の研究では、グルコース誘導体から調製した新しい四炭素キラルビルデイングブロックであるエリスリトール誘導体を出発原料に用いて、オキシラニルアニオンのアルキル化反応と6-エンド閉環反応を組み合わせる合成法によりyessotoxinのA環を合成し、さらにこの合成法を繰り返し用いる反復型合成法と環拡大反応ならびに立体選択的にメチル基を導入する反応を組み合わせることによりDEF環を構築した。A環フラグメントにアセチレン単位を導入した後、DEF環フラグメントのトリフラート誘導体を調製し、両フラグメントをアセチレン部で連結した。アセチレン部を四酸化ルテニウムで酸化して直接1,2-ジケトン誘導体に変換し、これを酸処理することによって一挙に2個のジ(メチルアセタール)環(BC環部)を構築することができた。最後に、トリメチルシリルトリフラート存在下トリエチルシラン還元することにより、yessotoxinの左半分に相当する6環性のABCDEFフラグメントの合成を達成した。
パソコンによる言語地理学資料の処理と地図化の高度化に関する

研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地理学的データ処理システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応するためにシステムの改良を進め、平成6年度にMS-DOS版BASICのコンパイラ版、平成9年度にはWindows版を発表した。この結果、操作性の向上、既存のソフトとの連繋の容易化、地図のカラー化、印刷の精緻化、データ処理の高度化などの点で改良された。本研究では、このSEALシステムの改訂・整備を継続するとともに、日本語方言資料への応用分析を進めた。1 SEALシステムの改訂・整備研究代表者自身の分析研究上の要請とSEALユーザーの要望に基づいてSEALシステムの改訂・整備を行った。ホームページ「言語地理学のへや」http://www.nicol.ac.jp/2 SEALを使った言語地理学的研究奄美徳之島方言の言語地理学的資料の分析、地図化を行った。特に人称代名詞については追調査を行い、その調査データをSEALを使って分析した。第10回方言学の方法国際会議(平成11年夏、カナダ)、第3回国際方言学者会議(平成12年夏、ポーランド)において研究成果を発表した。他に論文発表も行った。3その他最終報告書として、「パソコンによる言語地理学:その方法と実践」を出版した。研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地理学的データ処理システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応するためにシステムの改訂を進め、平成6年度にはMS-DOS版BASICのコンパイラ版、平成9年度にはWindows版に移行した。この結果、操作性の向上、既存のソフトとの連携の容易化、地図のカラー化、印刷の精緻化などの点で改良された。本研究は3年をかけて、実際のデータへのさらなる応用分析を進めながら、このSEALシステムの改訂・整備を継続することを計画している。今年は、1年目にあたり、次のことを行った。1)昨年度末に開設した言語地理学ホームページ(http://www.nicol.ac.jp/fukusima)を通じてSEALの紹介につとめ、SEALシステムをフロッピィディスク送付あるいはダウンロードにより公開した。また、ユーザーの希望により、より大規模な調査にも適用できるような改訂を行ったり、実際の操作にあたっての様々なトラブルへの対応法などの相談に応じたりした。また、調査や学会発表などでSEALシステムを活用できるように、ノートパソコンによるシステムを導入し、周辺機器やソフトを整備した。2) SEALを活用しての日本語方言データ(特に、奄美徳之島方言)の入力と分析、関連調査を行った。成果は来年度の学会で発表予定である。研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地理学的データ処理システムSEALを開発、その後も械器の進歩に対応するためにシステムの改訂を進め、平成6年度にはMS-DOS版BASlCのコンパイラ版、平成9年度にはWindows版に移行した。本研究は3年をかけて、実際のデータヘのさらなる応用分析を進めながら、このSEALシステムの改訂・整備を継続することを計画している。2年目の今年は、次のことを行った。(1)研究代表者自身の分析研究上の要請とユーザーの要望に基づいてSEALシステムの再改訂を行った。ver.5.5さらにver.5.6を言語地理学ホームページ(http://www.nicol.ac.jp/fukusima)を通じて公開、フロッピィディスク送付あるいはダウンロードにより提供した。改訂のポイントは、地図の大きさ指定や併用時のはんこの位置設定、フォントのサイズと種類の指定ができるようにしたこと、凡例にあげる語形が多い場合に対応できるようにしたことなどである。(2)SEALを活用しての日本語方言データの入力と分析を継続した(奄美徳之島方言、出雲西南部方言)。特に、奄美徳之島方言データの分布状況について夏の国際学会(Methods X)で発表、さらに論文にまとめた。また、来年度の夏の国際学会(3rd ICDG)において、昨年度の補充調査の成果を加えた研究成果の発表を予定している。

研究代表者は、昭和58年パソコンを利用した最初の言語地理学的データ処理システムSEALを開発、その後も機器の進歩に対応するためにシステムの改良を進め、平成6年度にMS-DOS版BASICのコンパイラ版、平成9年度にはWindows版を発表した。この結果、操作性の向上、既存のソフトとの連繋の容易化、地図のカラー化、印刷の精緻化、データ処理の高度化などの点で改良された。本研究では、このSEALシステムの改訂・整備を継続するとともに、日本語方言資料への応用分析を進めた。3年目の研究実績は次の通りである。1 SEALシステムの改訂・整備研究代表者自身の分析研究上の要請とSEALユーザーの要望に基づいてSEALシステムの改訂・整備を行った。ホームページ「言語地理学のへや」http://www.nicol.ac.jp/fukusima/でプログラムを公開し自由にダウンロードできるようにしたので、ユーザーも増え、要望や質問が直接e-mailで送られてくるようになった。本研究の1・2年目にversion 5.1,5.2,5.5,5.6と改訂を続けてきた。最新のバージョンはversion6.0で、英語版Windowsで動く英語版も作成した。2 SEALを使った言語地理学的研究奄美徳之島方言の言語地理学的調査(特に人称代名詞について)を行い、調査データをSEALを使って分析し、第3回国際方言学者会議(平成12年夏、ポーランド)において研究成果を発表した。他に論文発表も行った。3その他最終報告書として、「パソコンによる言語地理学:その方法と実践」を出版した。
サルコペニア肥満モデル動物の確立と病態解明

研究代表者は、鳥類の視床下部から新規分泌性小タンパク質であるNPGLを発見している。ラットやマウスを用いたNPGLの脳室内投与や前駆体遺伝子の過剰発現の解析から、摂食行動の亢進や白色脂肪組織における脂肪蓄積が生じることを明らかにしている。一方、体重の増加は顕著ではなく、その原因を調べたところ、骨長や骨格筋の減少が引き起こされていることがわかった。体重減少を伴わず、脂肪が増え、筋肉が減少することが知られているサルコペニア肥満が近年注目されている。したがって、本研究課題では、NPGLの生理作用を有効に活用することで、サルコペニア肥満様状態を呈するモデル動物の産出が可能であると考えた。つまり、モデル動物の産出とその表現型解析から、病態に至る過程を詳細に明らかにできると考え、研究を進めている。今年度は、ゲノム編集技術を使ったNPGL遺伝子改変動物の作製に取り掛かった。各ステップに時間が要するため、その間、正常ラットを用い解析を進めた。ラットにNPGL前駆体遺伝子を過剰発現し、脂肪蓄積と筋肉重量の減少が生じることを再度確認し、その際の脳下垂体ホルモンレベル及び血中ホルモンレベルを解析した。NPGLは成長ホルモンの合成・分泌の抑制を介して、脂肪分解の阻害、骨と筋肉の成長を抑制していると仮説を立てた。しかしながら、脳下垂体中の成長ホルモンmRNA量及び血中成長ホルモンレベル、さらに、インスリン様成長因子(IGF-1)の血中レベルにも変化は認められなかった。本研究により、NPGLの脂肪蓄積・骨と筋肉の成長抑制作用は、成長ホルモンの作用とは独立して生じていることが示唆された。サルコペニア肥満様の病態モデル動物の産出のため、ゲノム編集技術により遺伝子改変動物の着手を行い、次年度以降の病態解析へ向けた研究を進めることができた。ゲノム編集技術により作製した遺伝子改変動物は、NPGL遺伝子の下流にCre配列を組み込んだものであり、loxP系による細胞及び時期特異的なNPGL産生細胞の活性化・不活性化が可能である。そのため、DREADDシステムを用いたNPGL産生細胞の活性化・不活性化が可能なレセプターを発現させ、リガンド投与を行うことで表現型の解析が可能となる。今後はこのDREADDシステムを用いた解析を積極的に進めていく予定である。当初の実験計画よりも効率的に研究を進めることができたため、次年度使用額が生じた。ただし、次年度はより多くの実験試薬・消耗品を必要としているため、次年度使用額も含め、効率的な予算執行をしていきたい。
下痢症治療薬創出を目指したノーウォークウイルスタンパク質の構造と機能に関する研究

ノーウォークウイルスはヒトに感染して急性胃腸炎(下痢症)を引き起こす。生カキ等の喫食による集団食中毒の原因ウイルスとしても注目され、小型球形ウイルス(SRSV)としてよく知られている。本ウイルスは細胞培養系で増殖させることができず、生化学的、分子生物学的研究はほとんど進展していない。本研究では、本ウイルスによる下痢症の治療薬開発を目指し、ノーウォークウイルスのひとつ、チバウイルスを研究対象とし、そのゲノムにコードされる3C様プロテアーゼの構造機能解析を行った。まず、本プロテアーゼがHis30とCys139の2残基から成る活性中心(catalytic dyad)を有することを明らかにした。キモトリプシン様プロテアーゼの活性中心は通常catalytic triadであり、この点でノーウォークウイルス3C様プロテアーゼはユニークである。更に精製酵素を用いて生化学的性状を調べたところ、至適pHが9.0付近、至適温度は37°C、低塩濃度(25mM NaあるいはK)で比較的活性が高い、2価陽イオン非依存性などが明らかになった。次いで、本プロテアーゼの立体構造をX線結晶構造解析で明らかにするために、結晶化を行った。N末端にHisタグを導入した本プロテアーゼを精製し、結晶化を行ったところ、結晶解析に供与しうる結晶を得ることができた。X線照射実験を行い、現在4.5Å程度の解像度のデータを得ている。まず、本プロテアーゼの活性中心アミノ酸の同定を行った。本プロテアーゼはキモトリプシン様酵素であることに着目し、変異導入解析を行ったところ、His30とCys139の2アミノ酸残基から成る活性中心(catalytic dyad)を有することが明らかになった。この結果を検証し、コンピュータに基づいた創薬を可能にするためには、3次元立体構造の解明が必要になる。また、メチオニンの代わりにセレノメチオニンを導入したプロテアーゼの結晶も得られた。
14MeV中性子による核融合材原子ノックオンスペクトルの研究

核融合炉の開発にあたっては、14MeV中性子による原子はじき出しとガス生成による炉材料の損傷が重大問題となっている。高フルエンスである炉条件を模疑出来る大出力14MeV中性子源が存在しない現在、原子炉による照射実験を利用せざるを得ないが、その場合、核融合炉と核分裂炉との間の損傷相関則を明らかにする必要がある。本研究においては、損傷相関則を得るための理論計算コードシステムを開発することを目的としている。従来の研究により、中性子核反応データがかなり良い精度で整備されてきたので、これをもとにして原子ノックオンスペクトルを二重微分断面積データとして材料毎に与える計算コード(PKAS)をまず作成した。二重微分PKAデータは、原子はじき出しとガス生成及び核発熱の最も基本となるデータであるが、その利用に注目したのは本研究と米国LANLのものが初めてで、今後重要性が増大すると思われる。本計算コードによる解析から、原子はじき出しは殆んど前方向に生ずることが明らかにされた。次にリンドハードの原子衝突モデルに基いて、損傷エネルギーとDPAを計算するコード(DPAS)を開発した。更にこのモデルの妥当性をテストし、混成元素材料の解析に適用出来るようにするため、はじき出しシュミレーションコード(RUCAS)を開発中である。今年度は、PKAS,DPAS,RUCASの三つのコードを用いて、トランジスタ(Si)、アルミナ(【Al_2】【O_3】)及びSVS(Fe,Cr,Ni)について、はじき出し損傷の解析を行った。その結果、はじき出し数(DPA)は普通用いられている理論(キンチンピースモデル)より大巾に少くなること、はじき出しカスケードは前方への線状分布となることが明らかとされた。損傷相関係数は今のところ1.61.7程度を与えているが、今後結晶効果や原子化学結合による非弾性散乱をとり入れてのコードの改良が必要である。
自然免疫と獲得免疫をリンクする新規アダプター分子STAP-2の機能解析

STAP-2は自然免疫系・獲得免疫系シグナル間クロストークの中核を担う、非常に多機能なアダプター分子である。本年度は次の3つの研究よりその機能を明らかにした。(1)T細胞は炎症部位より産生された走化性因子により炎症局所に遊走・集積し、接着分子を介して組織へ浸潤し獲得免疫の担い手となる。この浸潤過程において、フィブロネクチン(FN)などの細胞外マトリックスとの接着が重要となる。そこで、T細胞の接着能へのSTAP-2の関与、および接着・遊走に関与するチロシンキナーゼFAKとの相互作用について解析を行った。STAP-2ノックアウトマウスにおいて脾臓由来T細胞のFNへの接着の亢進と、FAKタンパク量の増加が観察された。さらに、ヒト白血病細胞株Jurkat細胞STAP-2安定発現株において、コントロール株に比べFN接着の有意な低下と、FAKタンパク量の減少が観察された。このFAKタンパク量の減少メカニズムとして、E3リガーゼCblをSTAP-2がリクルートすることを明らかにし、STAP-2がFAKのユビキチン化・分解を促進するという新たな細胞接着抑制メカニズムを解明した。(2)STAP-2は転写因子STAT3と結合し、IL-6サイトカインファミリーのシグナル伝達を亢進させることが報告されている。STAP-2は4箇所のリン酸化部位が同定されているがその機能は不明であった。IL-6ファミリーサイトカインLIFによりSTAP-2の250番目のチロシン残基がリン酸化されること、またそのリン酸化がSTAT3活性亢進に必要であることを明らかにした。(3)STAP-2はc-fms結合分子としてクローニングされたが、その機能的な相互作用は未解明であった。本研究において、STAP-2がマクロファージ細胞内でc-fmsと結合し、M-CSFシグナルを抑制することでその運動能を制御していることを明らかにした。STAP-2は自然免疫系・獲得免疫系シグナル間クロストークの中核を担う、非常に多機能な新規分子である。T細胞は感染後期に炎症局所に遊走・集積し、獲得免疫の担い手となる。血中を循環しているT細胞は、血管内皮細胞上を転がるように移動(rolling)しているが、炎症により産生されたケモカインなどの走化性因子により局所にリクルートされる。さらにインテグリンなど接着分子の活性化を介して血管内皮細胞を通過し、組織へ浸潤する。この組織浸潤過程において、インテグリンを介したフィブロネクチン(FN)などの細胞外マトリックスとの接着が重要となる。本申請研究では、T細胞の接着能へのSTAP-2の関与、および接着・遊走に関与するチロシンキナーゼFAKとSTAP-2の機能的な相互作用について解析を行った。STAP-2KOおよびWTマウス脾臓細胞をPMAにより活性化し、FNへの接着を比較した。STAP-2KOにおいて細胞接着の顕著な亢進が観察され、さらに脾臓由来T細胞においても接着の亢進が認められた。インテグリンシグナル下流の分子をウェスタンブロットにより解析するとFAKのタンパク質量がSTAP-2KO T細胞で増加していた。続いて、ヒト白血病細胞株Jurkat細胞のSTAP-2安定発現株を用い、FNへの接着能を解析した。β1インテグリン刺激後、コントロール株に比べSTAP-2株でFN接着の顕著な減少が観察された。またFAKのタンパク質量はSTAP-2株で顕著に減少していた。そして、このSTAP-2によるFAKタンパク量の減少メカニズムは、E3リガーゼCblをSTAP-2がリクルートし、FAKのユビキチン化を亢進することによることを示した。

(3)STAP-2はc-fms結合分子としてクローニングされたが、その機能的な相互作用は未解明であった。本研究において、STAP-2がマクロファージ細胞内でc-fmsと結合し、M-CSFシグナルを抑制することでその運動能を制御していることを明らかにした。
損傷乗り越えDNA合成を介したアクリルアミド誘発突然変異の分子機構の解析

アクリルアミドは国際がん研究機関発がん性分類において2A(人に対しておそらく発がん性がある)に分類される遺伝毒性発がん性物質であり、炭水化物を多く含む食品の加熱調理により非意図的に生成することから食品安全上の重要な課題となっている。本研究ではアクリルアミドの慢性曝露による影響の中でも特に懸念すべきハザードである遺伝毒性(DNAや染色体の構造または塩基配列を変化させる毒性)に焦点を当て、アクリルアミドの活性代謝物であるグリシドアミドのN7位デオキシグアノシン付加体による遺伝毒性・突然変異誘発機序を解析する。
低出力レーザーが培養骨系細胞に与える影響について

半導体レーザーの照射が顎骨内に植立したチタンインプラントの創傷治癒を促進する可能性をin vitroにおける細胞レベルで検討する目的で以下の研究を行った。下顎骨片由来の骨系細胞と下顎第一小臼歯由来の歯根膜細胞は同一外科矯正患者より同時に得た。継代6代目の両細胞を24穴プラスティック培養皿に1穴当たり5×10^3個播種し、72時間培養した。この際、培養皿底面に適合するチタン板を用い、その上に細胞を播種するもの(チタン群)と培養皿に直接細胞を播種するもの(プラスティック群)とに分類した。また半導体レーザーを照射しない対照群とレーザーを培養24時間後に1回照射する1回群、培養24時間、48時間後に2回照射する2回群とに分けた。培養終了後の両細胞を用いてDNA量とALP活性を定量したところ次のような結果が得られた。1.骨系細胞のプラスティック培養下では種々のレーザー照射による有意なDNA量とALP活性の変化は認められなかった。一方、チタン培養下ではレーザー照射により対照群に比べて有意なDNA量とALP活性の増加が認められ、特に1回10分照射群では、同条件のプラスティック群との有意差(DNA量とALP活性)もみられた。2.歯根膜細胞については骨系細胞とは異なり、チタン板の有無、レーザー照射の有無にかかわらず、定量されたDNA量とALP活性はほとんど一定であり、唯一レーザーの2回10分照射群でのDNA量が対照群に比べて有意に高い値を示した。以上の結果よりチタン板上で培養した骨系細胞の増殖能と分化能は半導体レーザーの照射により促進される可能性が示唆された。当初使用を予定していたラット頭蓋冠由来骨系細胞をヒト下顎骨由来骨系細胞に変更した。これは1人の外科矯正患者から手術時に下顎皮質骨由来の細胞と下顎第1小臼歯由来の細胞を同時に採取することが出来、両細胞の比較が容易になったためである。また既に確立されている改良型伸展力反復負荷装置が24時間を越える長時間の培養において、モーター部付近の熱が原因と思われる培養細胞の変性や感染を引き起こすことが問題となった。そこで培養細胞に付与するメカニカルストレスとして遠沈器の改良により、細胞に種々の程度の持続的もしくは間欠的な遠心力(G)を付与する実験モデルに変更した。上記のヒト骨系細胞に遠心力を付与して3日間培養したところ、持続的ならびに間欠的な弱い遠心力では細胞の増殖能(DNA量)は遠心力を付与しないもの(対照群)に対してわずかな増加傾向が認められたが統計学的な有意差はみられなかった。一方骨系細胞の産生するアルカリフォスファターゼ活性はDNA量にみられる傾向がより顕著になり、持続的な弱い遠心力ならびに間欠的な中等度あるいは強い遠心力で対照群より有意に増加した。またヒト歯根膜細胞ではDNA量、アルカリフォスファターゼ活性ともに中等度の持続的遠心力と強い間欠的遠心力で対照群に対する有意な増加が認められた。さらに遠心力を用いない静置培養を両細胞を用いて行い、60m w GaAIAs半導体レーザーを照射して両細胞の産生するアルカリフォスファターゼ活性やDNA量を測定したがレーザー照射により両測定項目に有意な変化はみられなかった。現在半導体レーザーの照射時間等の詳しい条件を検討中であり、静置培養細胞に対するレーザー照射の効果を十分に考察したうえで遠心力による回転培養とレーザー照射の組み合わせを計画していきたい。
湖沼植物プランクトンに対する,環境要因の時間的変動の影響

湖沼植物プランクトンのおかれている環境条件では、光・温度等の環境要因は時間的に一定でなく常に変動している。この変動は植物プランクトンに多大な影響を与えていて、湖沼植物プランクトンの増殖・競争等の解明には無視できないものである。本研究では、この変動(特に光変動)の植物プランクトン光合成・窒素利用活性への効果を調べ、湖沼での増殖について考察した。まず、冬期混合期にある竜ケ崎市郊外の中沼で、植物プランクトンの上記活性を測定した。この測定結果は、光合成とアンモニア態窒素の取込が暗条件下で挙動が異なることを示し、光の時間的変動に対する植物プランクトンの反応として解釈しうることを示した。時間的変動の影響を更に調べるため、成層期・混合期における炭素・窒素取込の一日のうちでの変化について測定した。炭素取込(光合成)活性は、昼には高いが、夜間にはほぼゼロになった。しかし窒素取込は夜間ゼロにならず、また暗条件下では活性の最大が夕方にあった。数式モデルを用いて検討すると、光合成で生成された貯蔵炭水化物が窒素化合物取込に寄与していると解釈できた。即ち、植物プランクトンは、光の強いときと、光合成で生成された炭水化物を貯蔵し、弱光下あるいは夜間の栄養塩取込を支え、ひいては増殖生育を維持していると説明できた。異なるタイムスケール(週単位)での活性測定でも、同様の結果が得られ、上記解釈の妥当性が示唆された。以上の結果は溶存炭酸が比較的多い中性湖でのものであるが、溶存炭酸の少ない酸性湖沼などでは異なる結果がでるとも考えられ、今後の検討課題である。
臨界実験に頼らない臨界安全性の予測精度向上：未臨界実験を活用したデータ同化手法

本研究では、未臨界状態において直接測定しやすい量を有効活用することで、数値計算による核燃料の臨界安全性(実効中性子増倍率keff)の予測精度を向上することを目的とし、研究期間全体を通じて以下で述べる研究に取り組んだ。まず、遅発中性子先行核の効果を陽に取り扱ったω固有値方程式に対して一次摂動論を適用することで、任意の核データに対する即発中性子減衰定数αの感度係数について効率的な評価手法を新たに考案した。自作のエネルギー多群拡散計算およびSn法に基づく中性子輸送計算により、直接摂動法による感度係数の参照値と比較することで提案手法の妥当性を確認した。次に、運転停止中の京都大学臨界集合体実験装置(KUCA)で測定された原子炉雑音(中性子計数の時間的揺らぎ)に対して、ブートストラップ法を活用したFeynman-α法によりα測定値を求めた。こうして得られたα測定結果を活用したデータ同化(バイアス因子法、炉定数調整法)により、核データに起因したkeff予測結果の不確かさが低減でき、数値計算における入力パラメータの一つであるウラン235核データ(核分裂スペクトル、ν値)の不確かさも低減できることを確認した。また、中性子計数率の時系列データを活用したデータ同化として、粒子フィルタ法による未臨界度の逆推定について検討した。粒子フィルタ法では、逆推定したい状態パラメータ(未臨界度など)にシステムノイズを与えた上で、一点炉動特性方程式に基づいた数値計算による予測を多数回実施し、実際に測定された中性子計数率との尤度が高くなるように、ベイズ推定により状態パラメータを逐次更新する。近畿大学原子炉およびKUCAで測定された中性子計数率の時間変化に対して本手法を適用することで、制御棒操作などに起因した未臨界度の変化を逆推定できることを確認した。以上の研究成果より、本研究の目的を達成することができた。数値計算による核燃料の臨界安全性(実効中性子増倍率keff)の予測精度向上および不確かさ低減を目的とした、未臨界状態における核特性(即発中性子減衰定数α)の測定値を活用したデータ同化手法に関する研究として、平成29年度は以下に述べる研究を実施した。遅発中性子先行核の効果を陽に取り扱ったω固有値方程式に基づいて、エネルギー多群拡散計算コードを試作した。一次摂動論に基づくことで、ω固有値方程式のforward/adjoint固有関数を用いた即発中性子減衰定数αの感度係数評価手法を新たに考案した。試作したエネルギー多群拡散計算コードを用いて、直接法により得られたαの感度係数の参照値と比較することで、摂動論に基づいたα感度係数評価手法の妥当性を確認した。未臨界実験測定結果を活用したデータ同化手法に関する予備検討として、過去に京都大学原子炉実験所で実施された加速器駆動未臨界実験を対象として、ランダムサンプリング法に基づいたバイアス因子法、および尤度を利用したベイズ推定手法による双子実験を実施した。また、パルス中性子法により直接測定可能な"面積比"と"即発中性子減衰定数α"を組み合わせてデータ同化することで、実効遅発中性子割合の核データ起因不確かさも低減できる可能性を見出した。新たな未臨界実験の手法開発として、原子炉物理学分野における一点炉動特性方程式に対する、データ同化法の一種である"粒子フィルタ法"の適用可能性について調査した。仮想的な数値実験により、中性子計数率の時系列データに対して粒子フィルタ法を適用することで、未臨界度の逆推定が可能であることを確認した。加えて、未臨界体系における任意のステップ状の状態(未臨界度、中性子源強度、一点炉動特性パラメータ)変化に対して"積分法"を利用することで、ドル単位未臨界度の概算が可能であることも明らかにした。平成29年度の研究では、即発中性子減衰定数αの感度係数評価手法として摂動論に基づいた手法開発に注力し、既存の決定論的手法に基づいた中性子輸送計算コード(例:PARTISN)を用いたαの感度係数評価が実現できる見通しを得ることができた。この成果により、αの測定結果を活用したデータ同化手法については、ランダムサンプリング法に基づいた手法だけでなく、摂動論に基づいた効率的な手法も利用できる見込みである。また、新たな未臨界実験手法として、粒子フィルタ法や積分法についても仮想数値実験を通じたフィージビリティスタディを実施し妥当性を確認できた。平成29年度に得られた研究成果を踏まえて、京都大学臨界集合体実験装置や近畿大学原子炉において平成30年度に未臨界実験を実施できるよう、両施設の共同利用実験申請を行った。

こうして得られたα測定結果を活用したデータ同化(バイアス因子法、炉定数調整法)により、核データに起因したkeff予測結果の不確かさが低減でき、数値計算における入力パラメータの一つであるウラン235核データ(核分裂スペクトル、ν値)の不確かさも低減できることを確認した。また、中性子計数率の時系列データを活用したデータ同化として、粒子フィルタ法による未臨界度の逆推定について検討した。粒子フィルタ法では、逆推定したい状態パラメータ(未臨界度など)にシステムノイズを与えた上で、一点炉動特性方程式に基づいた数値計算による予測を多数回実施し、実際に測定された中性子計数率との尤度が高くなるように、ベイズ推定により状態パラメータを逐次更新する。近畿大学原子炉およびKUCAで測定された中性子計数率の時間変化に対して本手法を適用することで、制御棒操作などに起因した未臨界度の変化を逆推定できることを確認した。以上の研究成果より、本研究の目的を達成することができた。離散座標法に基づいた中性子輸送計算コードPARTISNを活用して、即発中性子減衰定数αの感度係数評価を実施する。パルス中性子法で直接測定可能な面積比ARについても、摂動論に基づいた感度係数評価手法の開発を試みる。京都大学臨界集合体実験装置および近畿大学原子炉において未臨界実験を実施し、データ同化手法に用いる測定データの取得、および粒子フィルタ法を適用した未臨界度測定について検討する。以上の結果を活用して、バイアス因子法あるいは炉定数調整法によるデータ同化を実施し、未臨界実験の結果を活用して、核特性(実効中性子増倍率keff、一点炉動特性パラメータ)の数値計算予測結果に生じる核データ起因のバイアス・不確かさをどの程度低減することが可能か、引き続き検討を実施する。平成29年度に得られた研究成果について、論文投稿および国際会議での発表に使用する計画であったが、予定通り執行することができなかった。物品費として、ランダムサンプリング法による並列計算を目的として計算機購入を当初計画していたが、限られた費用内で研究目的を達成することができるよう、摂動論に基づいた効率的な手法の開発に重点的に取り組むよう平成29年度の研究計画を変更した。平成30年度において論文投稿料、学会参加費、物品購入費として使用する計画である。
プラズマ発光分光分析の高感度化と高精度化に関する研究

本研究は、誘導結合高周波プラズマ(ICP)およびマイクロ波誘導プラズマ(MIP)のプラズマを励起光源に用いる発光分光分析の高感度化と高精度化を目指したものであって,本研究(2年間)で得られた成果は下記の通りである。1.現有するICP発光分光分析装置に改造を加え,170190mmの波長範囲の真空紫外域での分光分光を可能にした。この改造されたシステムを用いてホウ素182.64,208.86nm線および硫黄180.73,182.04,182.62nm線を用いるホウ素および硫黄のICP発光分光分析法を確立した。その結果を利用して鉄鋼中のホウ素および硫黄の定量を行った。2.MIP発光分光分析装置を試作するために,現有するモノクロメ-タ-,光電子増倍管用高圧電源,直流増幅器,シグナル積分器,記録計などを連結した新しいMIP発光分析システムを完成した。またマイクロ波共鳴キャビティ-として現有するBeenakkerタイプのほかに、表面波を利用する“surfatron"キャビティ-を設計,試作した。さらにMIP発光分光分析装置を改良して170190nmの真空紫外波長域での分光測光ができるように窒素パ-ジ光学素を完成した。3.ヨウ素のMIP発光分光分析において,当初水銀の還元気化反応に対するヨウ化物イオンのボ干渉を利用して水銀の発光強度の測定からヨウ素の間接定量法の確立した。その後,ヨウ化物イオンを酸化して揮発性のヨウ素に変換してMIPに導入し,183.04,206.16nm線を用いて検出限界0.74ng/mlの高感度を得た。本法でかん水や海水の分析を行った。4.MIP中に気相試料導入する方法を発揮させ,臭化物イオンを酸化して臭素蒸気に変換したり,さらに硫化物イオンを硫化水素に,亜硫酸イオンを二酸化硫黄に変換してMIPに導入する新しい高感度な臭素および硫黄の大気圧ヘリウムMIP発光分光分析法を開発した。本研究は誘導結合高周波プラズマ(ICP)およびマイクロ波誘導プラズマ(MIP)のプラズマを励起光源に用いる発光分光分析の高感度化と高精度化を目的とするものであって、本年度(研究の初年度)に行った研究の成果は下記の通りである。1.現有するICP発光分光分析装置に改造を加えることによって、通通の紫外波長領域のほかに、170190nmの波長範囲を含む真空紫外域でのスペクトル線の測定が可能となった。このことによって分光干渉の少ないホウ素の真空紫外域ICP発光分光分析法(ホウ素の波長:182.64nm)を確立し、その結果を利用して鉄鋼中の微量ホウ素の定量を行い、十分に満足すべき成果を挙げることができた。2.MIP発光分光分析装置を試作するこめに、現有するモノクロメ-タ-、光電子増倍管用高圧電源、直流増幅器、シグナル積分器、記録計などを連結し、調整して装置全体を完成した。3.MIPを発生するために不可欠なマイクロ波共鳴キャビティ-として現有のBeenakkerタイプのほかに、表面波を利用するsurfatronキャビティ-を設計し、試作した。このキャビティ-の特性は次年度に検討する。4.今年度完成した大気圧ヘリウムマイクロ波誘導プラズマ発光分光分析装置をさらに改造し、170190nmの真空紫外波長域における発光スペクトル線測定を可能にした。5.水銀の超高感度

MIP発光分光分析法を確立し、ヨウ化物イオンと水銀イオンの安定な錯体の生成によって水銀の測定にヨウ化物イオンが干渉することを利用して、ヨウ素のMIP発光分光分析による間接定量法を確立し、検出限界0.74ngI^-/mlの高感度が得られた。6.ヨウ素のMIP発光分光分析による間接定量法の応用例として、海水やかん水中の微量ヨウ素の定量を行い、満足すべき結果が得られた。本年度(研究の最終年度)に行った研究の成果は下記の通りである。1.表面波を利用する新しいタイプの“surfatron"キャビティ-を試作し、その性能を調べるために水銀のMIP発光分光分析を検討した。溶液中の水銀イオンを還元して水銀蒸気を発生し,これをヘリウムMIP中に連続的に導入する方法を用いて水銀の検出限界0.25ng/mlを得た。さらに本法を本学廃水処理施設に流入する廃水中の極微量水銀(0.651.65ng/ml)の定量に応用し,満足すべき結果を得ることができた。2.溶液中の臭化物イオンを酸化反応によって臭素蒸気に変換し,大気圧ヘリウムMIP中に導入する新しい臭素のMIP発光分光分析を確立した。最滴化された測定条件で得られた最高の検出限界は,100mMぺルオキソニ硫酸カリウム(5M硫酸)を酸化剤として用いた場合に得られ,Br(II)470.49nmで7.46ng/ml,またBr(I)734.86nmで18.4ng/mlの検出限界であった。さらに本法を海水中の臭化物イオンの定量に応用したところ,イオンクロマトグラフィ-やICP質量分析による分析値とよく一致する定量結果を得ることができた。3.真空紫外波長領域でのMIP発光分析システムを実現し,硫黄の新しい大気圧ヘリウムMIP発光分光分析を確立した。この場合,溶液中の硫化物イオンを硫化水素に,また亜硫酸イオンを二酸化硫黄に変換してMIP中に導入し,特に硫化水素導入法の検出限界がS(I)180.73nmで0.14ng/mlという高感度な値が得られた。4.MIP発光分析と同様にICP発光分光分析では,真空紫外波長領域での鉄鋼中の硫黄の定量を行い,さらにゲルマニウムの高感度分析のために水素化物発生法を結合し,0.06ng/mlの検出限界を得た。5.前年度と今年度の2年間に実施した研究の成果をまとめて総括し,合わせて今後の発展のために反省点を挙げて本研究に終止符を打った。
断層近傍地震動および長周期地震動に対する建物の陽な極限的弾塑性応答に関する研究

断層近傍地震動を模擬したダブルインパルス(DI)を受ける免震建物と地盤との動的相互作用を考慮した1自由度系モデルについて、極限応答(応答を極大化する最悪DI時間間隔の決定)の閉形表現を誘導した。元モデルに何段階かの縮約手法を適用し、1自由度系弾塑性モデルを構成する方法を展開した。種々の地盤について提案極限外乱法を適用し、地盤特性による極限応答の変化を明らかにした。入力の加速度振幅を一定にした場合では、地盤特性による応答への影響はある程度存在するが、速度振幅を一定にした場合では、地盤による影響はほとんどないことを明らかにした。長周期長時間地震動を模擬したマルチインパルス(MI)を受ける線形粘弾性ダンパーを有するバイリニアー1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した。MIの入力レベルに依存して、解の分類が必要となる。長周期長時間地震動を模擬したMIを受ける非線形粘弾性ダンパーを有する完全弾塑性1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した。閉形表現の導出により、非線形ダンパーと構造物の応答領域に依存して、数種類の解の分類が必要となることを明らかにした。断層近傍地震動を模擬したDIを受ける完全弾塑性型復元力特性を有する多自由度モデルに対する極限外乱法を展開し、極限タイミングは1層の層せん断力(復元力と減衰力の和)が0となる時であることを明らかにした。DIの振幅を漸増させて極限応答のレベルとの関係を調べるダブルインパルスプッシュオーバー(DIP)という概念を新たに定義し、それが多自由度モデルへの粘性ダンパーの最適配置問題において重要な役割を果たすことを明らかにした。弾塑性型モデルでは応答が複雑な応答特性を呈するため、ダンパーの有効な配置法を見出すには、2つの設計問題(特定層への集中配置と全層への分散配置)を組み合わせることが有効であることを明らかにした。交付申請書に記載した内容のほとんどを着実に実行している。また、非線形粘弾性ダンパーを有する完全弾塑性1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した点は当初計画にはなかったものであり、当初計画以上の成果を得ている。本研究では、2017年に、断層近傍地震動と長周期長時間地震動に関する研究成果を5編の国際誌論文として掲載し、2018年においても既に3編の国際誌論文として発表している。ただし、これらはすべて1自由度モデルに対する研究成果である。現在、インパルスを用いた提案手法を多自由度系に拡張しており、それに関する研究成果も得つつある。2019年度に研究期間を延長し、それらの成果を論文にまとめて発表する予定である。2018年度には、1自由度モデルに加えて2自由度および多自由度モデルに対する極限外乱法の定式化を行ってきたが、今後は多自由度モデルに対する極限外乱法をさらに深化させて展開する予定である。特に、ダブルインパルスプッシュオーバー(DIP)という概念は、入力地震動や建物さらには地盤特性に関する種々の不確定性を同時に考慮する上で極めて有効と思われるため、その概念をさらに多くの入力地震動タイプや建物種別にも拡張できるように準備したいと考えている。断層近傍地震動を2, 3個のインパルスで表現し、与えられた弾塑性構造物に対するクリティカルインパルス間隔の陽な表現と極限応答を陽に導いた。入力レベルと極限的応答の関係を無次元化した形式で陽に誘導することにより、種々の入力レベルと構造物パラメターの『極限的な組み合せ』を直接見出すことを可能とした。理論検証のため、クリティカルインパルス間隔に対する数値実験を行った。また、記録地震動について、提案手法の適用可能性を検討し、十分な精度を有することを明らかにした。長周期地震動を多数個のインパルスで表現し、与えられた弾塑性構造物に対するクリティカルインパルス間隔の陽な表現を入力レベルごとに導いた。クリティカルインパルス間隔が見出された後には、運動エネルギーと消費・ひずみエネルギーとのエネルギー平衡則を有効利用して極限的変形を陽に導出した。入力レベルと極限的応答の関係を無次元化した形式で陽に誘導することにより、種々の入力レベルと構造物パラメターの『極限的な組み合せ』を直接見出すことが可能となった。本年度の研究の前半では、与えられた構造物に対して、断層近傍地震動や長周期地震動の極限的なパラメター(インパルスのクリティカルなタイミング等)を見出すことに主眼が置かれていたが、後半では、そのような極限的な応答を考慮したもとで、与えられた入力地震動に対して構造物を安全に設計する方法を提案した。具体的には、2016年の熊本地震のように震度7の揺れを2回経験する場合の強度割増の理論を展開した。そこでは、建物倒壊を考慮するため、P-Δ効果と損傷による耐力低下モデルを適切に込みこむ方法を採用した。さらに、震度7の揺れを複数回受ける場合の理論へと発展させた。また、免震建物と地盤との動的相互作用を考慮したモデルに提案極限外乱法を拡張した点は当初計画にはなかったものであり、当初計画以上の成果を得ている。種々の地盤について提案

極限外乱法を適用し、地盤特性による極限応答の変化を明らかにした。入力の加速度振幅を一定にした場合では、地盤特性による応答への影響はある程度存在するが、速度振幅を一定にした場合では、地盤による影響はほとんどないことを明らかにした。長周期長時間地震動を模擬したマルチインパルス(MI)を受ける線形粘弾性ダンパーを有するバイリニアー1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した。MIの入力レベルに依存して、解の分類が必要となる。長周期長時間地震動を模擬したMIを受ける非線形粘弾性ダンパーを有する完全弾塑性1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した。閉形表現の導出により、非線形ダンパーと構造物の応答領域に依存して、数種類の解の分類が必要となることを明らかにした。断層近傍地震動を模擬したDIを受ける完全弾塑性型復元力特性を有する多自由度モデルに対する極限外乱法を展開し、極限タイミングは1層の層せん断力(復元力と減衰力の和)が0となる時であることを明らかにした。DIの振幅を漸増させて極限応答のレベルとの関係を調べるダブルインパルスプッシュオーバー(DIP)という概念を新たに定義し、それが多自由度モデルへの粘性ダンパーの最適配置問題において重要な役割を果たすことを明らかにした。弾塑性型モデルでは応答が複雑な応答特性を呈するため、ダンパーの有効な配置法を見出すには、2つの設計問題(特定層への集中配置と全層への分散配置)を組み合わせることが有効であることを明らかにした。交付申請書に記載した内容のほとんどを着実に実行している。また、非線形粘弾性ダンパーを有する完全弾塑性1自由度系モデルについて、極限応答の閉形表現を誘導した点は当初計画にはなかったものであり、当初計画以上の成果を得ている。本研究では、2017年に、断層近傍地震動と長周期長時間地震動に関する研究成果を5編の国際誌論文として掲載し、2018年においても既に3編の国際誌論文として発表している。ただし、これらはすべて1自由度モデルに対する研究成果である。現在、インパルスを用いた提案手法を多自由度系に拡張しており、それに関する研究成果も得つつある。2019年度に研究期間を延長し、それらの成果を論文にまとめて発表する予定である。免震建物は断層近傍地震動や長周期・長時間地震動に対して課題を有するため、その地震時の安全性を明らかにする必要がある。また、免震建物と地盤との動的相互作用も重要な課題となる。そこで、ダブルインパルスを受ける地盤で支持された免震建物の極限応答を解析的に見出す方法を展開する。H29年度においても基本的な部分は展開したが、さらに精度上の問題を解決する。免震層に付加ダンパー(粘性ダンパー)が多く挿入される場合には、提案手法の精度が低下することが指摘されており、その精度向上のための方策を新たに考える。さらに、これまでは1自由度モデルに限定した定式化を行ってきたが、モデルパラメターによっては1自由度モデルへの縮約が精度上困難となる場合も予想されるため、多自由度モデルに対する極限外乱法を展開する予定である。
筋：腱複合組織発生メカニズムの解明と疾患研究への応用

本研究では、運動機能に必須の筋・腱複合組織の形成について、筋で発現し、筋発生に重要な転写抑制因子RP58と、腱・靭帯で発現し、腱発生に重要な転写抑制因子Mkxを起点とした研究を行った。Mkxの発現誘導機序を明らかにする為にプロモーター・エンハンサーの同定と発現制御因子の同定を実施し、Mkxの発現誘導に関わる可能性のある3つの転写因子を同定した。またMkxが制御する遺伝子についても同定した。RP58はde novoDNAメチル化酵素であるDNMT3Aに結合することから、DNAメチル化をゲノムワイドに解析し、メチル化変動のある領域を同定した。MkxおよびRP58のプロモーターにCreをつないだトランスジェニックマウスを作製し、ROSA-LacZマウスと掛け合わせた。Mkx/RP58のダブルノックアウトマウスにおける筋:腱組織の表現型と、MkxもしくはRP58がリニエージ特異的に恒常的に発現したときの表現型をHE染色ならびに、筋および腱に特異的な抗体染色で検討した。Mkx-GFPノックインマウス胚(E14.5)からのセルソーティングにより、Mkx陽性細胞を採取し、この細胞が腱と筋の両方に分化可能な前駆細胞であるかの解析を行った。また、Mkx陽性細胞を、当研究室で稼働しているマウスアキレス腱損傷・靱帯損傷モデルに適用し、治療研究も行った。本研究では腱・靭帯特異的遺伝子Mkxのプロモーター領域の同定と、この領域に結合する候補転写因子の同定を行った。Mkx遺伝子の上流領域を乗せたLacZベクターを用い、トランスジェニックマウスを作成し、染色した。更に上流領域をLuciferaseベクターに乗せhigh throughput screeningを行った。6049のexpression vectorの中から、Luciferase活性を上昇させるものとして3つの候補転写因子を同定し、免疫染色にて腱での発現を確認した。また、マウスのアキレス腱より腱細胞を採取し、Mkxノックアウトマウス、MkxGFPへテロマウスにおいて-GFPの発現を確認した。更に野生型とMkxノックアウトマウスより採取した腱細胞にメカニカルストレッチを加えmicro-arrayを行い組織特異的遺伝子の発現を確認し、ストレッチ前後と、細胞間での変化を比較した。さらに、腱前駆細胞の発生に重要であると考えられる腱周囲組織であるendotenon, epitenonやparatenonにおいてのMkx-GFPの発現を解析した。また、Mkxの腱損傷における機能を検討する為に、腱損傷モデルを実施した。アキレス腱を損傷させ、経時的に観察し、免疫染色とquantitative PCRでの評価を行った。筋肉においては、筋特異的転写抑制因子RP58はde novo DNAメチル化酵素のDNMT3Aと結合することから、RP58が筋分化においてDNAメチル化に関わる可能性がある。そこで筋分化におけるDNAメチル化の変動をゲノムワイドに調査した。その結果、de novo DNAメチル化が起こるDNA領域を複数同定した。研究において支障はなく、ほぼ計画どうりに研究をすすめることができたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、「Mkx(腱)とRP58(筋)転写因子の相互制御による筋:腱複合組織の構築メカニズムの解明」をさらに進める。これまでにMkxおよびRP58のプロモーターにCreをつないだトランスジェニックマウスを作製し、ROSA-LacZマウスと掛け合わせた。本年度はこのマウスを用いてMkx、RP58陽性細胞それぞれのリニエージを調べ、腱・筋前駆細胞の相互乗り入れ・相互形質転換について解析を進める。Mkx/RP58のダブルノックアウトマウスにおける筋:腱組織の表現型と、MkxもしくはRP58がリニエージ特異的に恒常的に発現したときの表現型をHE染色ならびに、筋および腱に特異的な抗体染色で検討する。また、腱・筋それぞれの分化誘導に必須なTGF-β、IGFシグナルによるMkx、RP58の制御機構を、TGF-β、IGFノックアウトマウスを用いて解析する。

さらにマニピュレーションの容易なニワトリ胚も併用し、Mkx陽性細胞のリニエージ解析を行い、Mkx過剰発現やノックダウンの効果を解析する。また、腱発生に重要なTGF-βシグナルなどを用いて、Mkx-GFPノックインES細胞からMkx陽性細胞の誘導方法を確立する。また、腱への初期分化に必須であるScx遺伝子と山中因子とを組み合わせ、Mkx-GFPノックインマウスから採集したMEFからのMkx陽性細胞の誘導方法を樹立する。ここで誘導されたMkx陽性細胞がどれだけ腱に分化が特異化されているか、間葉系幹細胞をコントロールとして、脂肪分化、骨分化誘導などに対する抵抗性の検討を行う。さらに誘導されたMkx陽性細胞を、当研究室で稼働しているマウスアキレス腱損傷・靱帯損傷モデルに適用し、治療研究も行う。25年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、「Mkx(腱)とRP58(筋)転写因子の相互制御による筋:腱複合組織の構築メカニズムの解明」をさらに進める。これまでにMkxおよびRP58のプロモーターにCreをつないだトランスジェニックマウスを作製し、ROSA-LacZマウスと掛け合わせた。本年度はこのマウスを用いてMkx、RP58陽性細胞それぞれのリニエージを調べ、腱・筋前駆細胞の相互乗り入れ・相互形質転換について解析を進める。Mkx/RP58のダブルノックアウトマウスにおける筋:腱組織の表現型と、MkxもしくはRP58がリニエージ特異的に恒常的に発現したときの表現型をHE染色ならびに、筋および腱に特異的な抗体染色で検討する。また、腱・筋それぞれの分化誘導に必須なTGF-β、IGFシグナルによるMkx、RP58の制御機構を、TGF-β、IGFノックアウトマウスを用いて解析する。