hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗体産生免疫記憶細胞が生ずる分子機構の解明

1)前年度に作出したAID-Cre/R26R/AIDkoマウスに認められるパイエル盤のhCD2陰性LacZ陽性のB細胞集団は、過去にAID promoterの活性化を経験した細胞集団であり、メモリー分画を含むと考えられる為、更に詳細に解析を行なった。その結果LacZ陰性のナイーブなB細胞集団と比べて発現が顕著に増強する遺伝子を約360同定した。これらにはCD80等既知の活性化関連分子も含まれ、確かに活性化後の細胞集団を捉えている事が示唆される。2)更にAID-Cre/R26Rマウスをハプテンを用いて免疫する系で、抗原特異的抗体遺伝子に高親和型の体細胞突然変異をもつ細胞集団は、脾臓のhCD2陽性LacZ陽性のB細胞集団(胚中心細胞)に高頻度に現れるが、hCD2陰性LacZ陽性集団では低頻度に留まる。3)脾臓におけるhCD2陰性LacZ陽性集団の出現の経時変化を見ると、個体の加齢による増加は明らかでない。分化段階別の出現を調べると、未成熟B細胞の段階でLacZ陽性化する細胞が一部(約10%)現れ、しかもそれら細胞はhCD2を極めて僅かではあるが発現していることがわかった。この時内在性のAIDも僅かながら発現して居ることを確認した。この事からこのマウスの脾臓におけるhCD2陰性LacZ陽性集団は、胚中心反応時にAIDを強発現した後の細胞と、何らかの刺激により未熟B細胞の段階で僅かにAIDを発現した細胞の混合であると考えられる。今後更にそれぞれの段階におけるAIDの役割を区別して解析する必要が有る。1)AID-CreマウスとR26R(Cre発現依存的にLacZを発現するレポーターマウス)マウスを掛け合わせ、AID-Cre依存的にB細胞がLacZ陽性になるAID-Cre/R26Rマウスを作出した。更にAIDノックアウトに掛け合わせSHMとCSRを起こさないAID-Cre/R26R/AIDkoラインも樹立した。2)上記マウスの一次及び二次リンパ組織細胞をFDGを用いてLacZ陽性細胞をフローサイトメーターで解析し、以下の知見を得ている。(ア)hCD2の発現は胚中心B細胞マーカーと良く相関しそれ以外での強い発現は認めらなかった。これは、既知のAID発現パターンと良く一致し、よってAID-CreマウスはAID発現を正確に反映すると考えられる。(ウ)パイエル盤の解析からAIDkoのバックグラウンドにのみ認められる胚中心B細胞亜集団が存在する事を明らかにした。これは、SHMやCSRが起こらない事が胚中心反応に何らかの影響を及ぼしている事を示唆する。(エ)hCD2とLacZの発現により分離したパイエル盤B細胞集団からRNAを抽出し、Affymetrix社のGene chipを用いて転写産物の網羅的な解析を行なっている。
世界規模の気候変動と地域的な構造運動に関連した日本海の海洋循環の成立と進化

日本海の海洋循環は,固有で僅かな気候変動に対しても影響を受けやすく,更新世における気候変動や氷河性海水準変動に応答して著しく変化してきた.さらに,海洋循環のより長期的な変化の考察においては,構造運動に伴う地形の変化が海洋循環に与える影響を検討することが重要である.本研究では,2013年に国際深海掘削計画(IODP)の一環として行われたExp. 346で日本海7地点,東シナ海北部2地点から採取された掘削コアを用い,微化石の分析等から過去500万年間の海洋循環を復元した.日本海の海洋循環は、固有で僅かな気候変動に対しても影響を受けやすく、更新世における気候変動や氷河性海水準変動に応答して著しく変化している。さらに、海洋循環のより長期的な変化の考察においては、構造運動に伴う地形の変化が海洋循環に与えた影響を検討することが重要である。本研究の目的は、日本海および東シナ海北部の深海掘削コアを用い、堆積構造や微化石の分析等から過去500万年間の日本海の海洋循環システムを復元し、それらが気候・氷河性海水準変動に応答したものなのか、あるいは地域的な構造運動を反映したものなのかを明らかにすることである。本研究課題の研究代表者と研究分担者1名は、2013年89月に国際深海掘削計画(IODP)の一環として行われたExp. 346航海にそれぞれ微古生物学者および堆積学者として参加した。この航海では日本海7地点および東シナ海北部2地点で掘削が行われ、世界中から30名ほどの研究者が乗船して、それぞれの専門分野の分析を担当した。この航海においては、各掘削コアの詳細な記載などから堆積相の解析が行われ、海底の還元環境を示す暗色層や海氷の指標となる砕屑物が産出する層準を特定した。さらに、微化石の生層序を用いてコアの堆積年代を見積もった。その結果、日本海から採取されたコアは目標であった500万年前までの地層に達したものの、東シナ海北部では数十万年前までしか到達していないことが明らかとなった。そのため、航海終了後に琉球列島の約200万年前の地層から代替試料の採取を行った。日本海の海洋循環は,固有で僅かな気候変動に対しても影響を受けやすく,更新世における気候変動や氷河性海水準変動に応答して著しく変化してきた.さらに,海洋循環のより長期的な変化の考察においては,構造運動に伴う地形の変化が海洋循環に影響を検討することが重要である.本研究の目的は,日本海および東シナ海北部の深海掘削コアを用い,堆積構造や微化石の分析等から過去500万年間の海洋循環システムを復元し,それらが気候・氷河性海水準変動に応答したものなのか,あるいは地域的な構造運動を反映したものなのかを明らかにすることである.2013年に国際深海掘削計画(IODP)の一環として行われたExp. 346で日本海7地点,東シナ海北部2地点から掘削コアが採取された.現在,主にこの試料について放散虫および有孔虫などの微化石の分析を進めており,結果の一部を速報として国際学会や航海報告書に発表した.また,本研究を推進するために関連する先行研究をレビューし,それらを整理して国際誌に論文を投稿した.しかし,掘削コアの多くは採取水深が深く,炭酸塩の殻を持つ有孔虫に関しては保存されている量が少なかった.また,ここまでの研究成果から,日本海の海洋環境の発達史を理解する上で津軽海峡の重要性が明らかとなった.そこで,炭酸塩微化石も多く産出する津軽海峡周辺の陸上地質調査を実施し,微化石分析用の試料を採取した.これらの試料についても分析することで,掘削コアだけでは明らかにすることが出来ない重要な情報を取得されることが期待されている.日本海の海洋循環は,固有で僅かな気候変動に対しても影響を受けやすく,更新世における気候変動や氷河性海水準変動に応答して著しく変化してきた.さらに,海洋循環のより長期的な変化の考察においては,構造運動に伴う地形の変化が海洋循環に影響を検討することが重要である.本研究の目的は,日本海および東シナ海北部の深海掘削コアを用い,堆積構造や微化石の分析等から過去500万年間の海洋循環システムを復元し,それらが気候・氷河性海水準変動に応答したものなのか,あるいは地域的な構造運動を反映したものなのかを明らかにすることである.2013年に国際深海掘削計画(IODP)の一環として行われたExp. 346で日本海7地点,東シナ海北部2地点から掘削コアが採取された.主にこれらのコア試料について放散虫などの微化石の分析を実施し,結果の一部を国際学会や航海報告書,国際誌に発表した.また,本研究を推進するために関連する先行研究をレビューし,それらを整理した論文が国際誌に掲載された.これまでの研究成果から,日本海の海洋環境の発達史を理解する上で重要な知見が多数得られ,現在,論文を準備中である.日本海の海洋循環は,固有で僅かな気候変動に対しても影響を受けやすく,更新世における気候変動や氷河性海水準変動に応答して著しく変化してきた.さらに,海洋循環のより長期的な変化の考察においては,構造運動に伴う地形の変化が海洋循環に与える影響を検討することが重要である.本研究では,2013年に国際深海掘削計画(IODP)の一環として行われたExp. 346で日本海7地点,東シナ海北部2地点から採取された掘削コアを用い,微化石の分析等から過去500万年間の海洋循環を復元した.得られた試料の処理・分析は,研究分担者及び連携研究者の努力もあり,概ね順調に進んでいる.

また,予察結果についても国際学会で発表するなどして他の研究者らとの情報交換も行い,より効果的に成果を出せるようにしている.海洋地質学今年度3月に予定されているExp. 346の研究成果報告会に向け,予定している試料処理・分析を全て終わらせることを目標としている.また,有孔虫の試料採取のため陸上地質の調査も実施する予定である.得られた成果に関しては,学会や論文などで順次公表する.調査航海は概ね成功裏に終わり、航海中に取りまとめられた成果についても予察的な報告書が公開された。さらに今年の3月には、より詳細な分析を行うために得られたコアから各種分析用に試料の分取が行われ、それぞれの分担者および連携研究者らも作業を開始したところである。雇用していた契約職員の出勤日数が諸事情により予定よりも少なくなり,次年度使用が生じた.今後は、それぞれの分析担当者は今年度の末に予定している中間報告会を目処に公表も含めた成果を出せるよう計画的に作業を実施する。ただし、底生有孔虫分析に関しては、今回採取されたコアには十分な化石の保存が期待されないことが分かったため、これらの化石が保存良好な陸上地層の試料を中心に分析を行うこととした。これによって海底のコアのみでは明らかにできない事象の解明に挑戦する。得られた成果に関しては、学会や論文などで順次公表する。今年度は,年度半ばまで契約職員を雇用して全ての試料処理を終了させ,計画通り事業の目標を達成させる.また,陸上調査を実施し,試料の採取も行う.年度末までに分析を終了し,得られた成果は学会や論文で発表する.分析補助の人件費として予算を確保していたが、試料の確保が年度末になってしまったために人材の雇用には至らず当該予算の繰り越しを決定した。分析試料が確保できたため、4月より分析補助として人材1名を1年間の契約で雇用した。昨年度の計画遂行の遅れを取り戻すため、更に12名を追加で雇用する予定である。
新寄主獲得に伴う植食性昆虫の種分化機構の解明

前年度までの研究により,クルミホソガのクルミ利用レースとネジキ利用レース間には,内的な生殖隔離は発達しておらず,生態的な違いのみで両レースが隔離されていることが示唆された.F1世代がネジキ上では死亡することから,レース間の遺伝子流入はネジキレースからクルミレースへのみ生じると考えられる.しかし,雌成虫の産卵選好性はレース間で著しく異なることから,母性遺伝するミトコンドリアDNA等には遺伝子流入が生じないと予想できる.本年度は,仙台市青葉山に同所的に生息する両レースを用い,ミトコンドリアCOI+ND5,Z染色体上のTpi領域の部分配列を決定し,両遺伝子座における遺伝的分化と遺伝子流入を系統解析とcoalescent simulationにより比較した.その結果,ミトコンドリアの遺伝子系統樹は両レースの単系統性を支持したが,Tpiではクルミレースへの遺伝子流入が示唆された.Coalescent simulationの結果もTpiにおけるクルミレースへの遺伝子流入を支持しており,逆方向およびミトコンドリア遺伝子における流入は支持されなかった.この非対称的な遺伝子流入は,F1世代における寄主適応力に基づく予測と一致する.さらに,ミトコンドリア遺伝子とZ染色体上の遺伝子間に見られた分化・流入パターンの違いは,ホストレースという状態がゲノム全体に隔離をもたらすには不十分であり,モザイク状に遺伝的分化が生じていることを示唆する.今後はAFLPやマイクロサテライトを用いてレース間比較をゲノム全体で行うとともに,寄主適応遺伝子座を特定し,新寄主への適応がどこまでゲノム全体の分化に寄与できるかをより詳細に調べる必要がある.仙台市青葉山のクルミホソガAcrocercops transectaクルミ・ネジキ両個体群を持ちいて,累代飼育を戻し交配まで行い,メス成虫の産卵選好性と幼虫の寄主適応力の遺伝様式を推定した.戻し交配の結果は,両形質がそれぞれ1遺伝子座の1対の対立遺伝子によって支配されており,これらの遺伝子座は常染色体上に存在することを示唆していた.また,両形質には完全優性が存在し,産卵選好性はネジキが優性となるが,幼虫の寄主適応力はクルミが優性となることが示唆された.本結果は昨年度行った雑種第1・2世代の結果と一致しており,これらをまとめて投稿準備中である.また,同個体群を用いてメス成虫の産卵選好性に関する生物検定の手法を開発した.この方法をもとにネジキ個体群の生物検定を行ったところ,ネジキ単体の抽出液にクルミもしくは非寄主(フジ・コナラ)の抽出液を混ぜると選好性が著しく低下する一方,これらの非寄主植物単体の抽出液にネジキ抽出液を混ぜると,選好性が回復した.これらの結果から,植物体に含まれる「産卵刺激物質」と「産卵阻害物質」の両方が,本種の産卵選好性に寄与していることが示唆された.トリブバン大学(ネパール)のThapa教授の協力のもと,カトマンズ盆地周辺でクルミホソガ種群A.leucophaea complexの調査を5月と10月に行った.これにより,2005年度に行う予定のネパール産種A.leucophaea, A.defigurataを用いた交配・産卵選好性実験に最適な生息地を2ヶ所選定できた.また,得られたサンプルを用いて日本産クルミホソガとともに分子系統解析を行ったところ,本種群内でクルミ科・ツツジ科間の寄主転換が独立に複数回生じたこと,また本種群の共通祖先における寄主植物がクルミ科であったこと,がそれぞれ推定された.これらの分子系統解析に関する結果は現在投稿中である.69月まで、仙台市青葉山に生息するクルミホソガAcrocercopstrasnectaのクルミ・ネジキ両ボストレースを用いて、(1)交配場所の選好性の有無と、(2)寄主植物の有無が交尾頻度に与える影響を調べた。交配場所の選好性は、ネジキレースのメスで見られたが、ネジキレースのオスとクルミレースでは見られなかった。しかしながら、クルミレースではクルミの葉がある場合に比べ、ネジキの葉があるとき、および何も葉が無いときに交尾頻度の有意な低下がみられた。一方、ネジキレースでは、いずれの条件下(クルミ有、ネジキ有、何も無い)でも有意な交尾頻度の差はみられなかった。これらの結果から、本種においては交配場所の選好性はレース間の隔離機構としては不十分であることが示唆された。また昨年度までの結果から、F1世代はクルミ上では生存可能であることが分かっており、本結果はネジキレースからクルミレースへの遺伝子流入が生じるうることを示している。45月と1011月はネパール王国カトマンズ盆地周辺において、A.leucophaeaとA.defigurataの寄主特異性およびレース間交配能力を調べた。その結果、A.leucophaeaの幼虫はクルミ科のEngelhardtiaとツツジ科のネジキの両方を利用できることが分かった。メス成虫の産卵選好性は、クルミ上・ネジキ上いずれの集団でもネジキを好む傾向がみられた。同様に、交配場所も両集団ともネジキを選好したが、交配場所の選好性はメスのみでみられた。また、ネジキ上とクルミ上の集団間での交雑は、ネジキ間・クルミ間のコントロールと有意差無く起こった。以上の結果から、A.leucophaeaではクルミ上とネジキ上の集団間でホストレース分化が生じていないと考えられる。

分子系統の結果は両集団間で遺伝的分化がみられないことを示しており(Ohshima and Yoshizawa 2006)、今回の寄主特異性の結果と一致する。A.defigurataに関しては、幼虫はクルミしか利用できず、メス成虫もクルミに産卵選好性を示した。よって、幼虫のネジキ利用能力はA.leucophaeaとA.transectaの共通祖先で獲得されたと考えられる。前年度までの研究により,クルミホソガのクルミ利用レースとネジキ利用レース間には,内的な生殖隔離は発達しておらず,生態的な違いのみで両レースが隔離されていることが示唆された.F1世代がネジキ上では死亡することから,レース間の遺伝子流入はネジキレースからクルミレースへのみ生じると考えられる.しかし,雌成虫の産卵選好性はレース間で著しく異なることから,母性遺伝するミトコンドリアDNA等には遺伝子流入が生じないと予想できる.本年度は,仙台市青葉山に同所的に生息する両レースを用い,ミトコンドリアCOI+ND5,Z染色体上のTpi領域の部分配列を決定し,両遺伝子座における遺伝的分化と遺伝子流入を系統解析とcoalescent simulationにより比較した.その結果,ミトコンドリアの遺伝子系統樹は両レースの単系統性を支持したが,Tpiではクルミレースへの遺伝子流入が示唆された.Coalescent simulationの結果もTpiにおけるクルミレースへの遺伝子流入を支持しており,逆方向およびミトコンドリア遺伝子における流入は支持されなかった.この非対称的な遺伝子流入は,F1世代における寄主適応力に基づく予測と一致する.さらに,ミトコンドリア遺伝子とZ染色体上の遺伝子間に見られた分化・流入パターンの違いは,ホストレースという状態がゲノム全体に隔離をもたらすには不十分であり,モザイク状に遺伝的分化が生じていることを示唆する.今後はAFLPやマイクロサテライトを用いてレース間比較をゲノム全体で行うとともに,寄主適応遺伝子座を特定し,新寄主への適応がどこまでゲノム全体の分化に寄与できるかをより詳細に調べる必要がある.
キメラゲノム細菌を用いた外来遺伝子サイレンシングの多段階機構の詳細解析

納豆菌の類縁菌で高い自然形質転換能をもつ枯草菌ゲノムに光合成細菌のシアノバクテリアゲノムを挿入した、キメラゲノム細菌シアノバチルスでは、興味深いことにシアノバクテリアゲノムが分断して組み込まれた3領域に特徴的に転写産物が検出されないことが、シアノバチルスの全転写産物のRNA-Sequencing解析により判明した。この現象を、水平伝播における外来遺伝子の発現を阻む機構を再現したものであり、実験室で解析することができる具体例と考え、その機構を、キメラゲノム細菌、シアノバチルスを使って分子レベルで詳細に解明することを目的として解析を行った。成果1)シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとして枯草菌由来の遺伝子発現システム、転写装置(RNAポリメラーゼホロ酵素[RNAP])やリボソームを含む翻訳装置がシアノバクテリア遺伝子に適合していないことが考えられる。枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。またシアノバクテリアのシグマFを枯草菌内で発現させ、枯草菌RNAPコア酵素とのホロ酵素を形成させ、転写活性を有することを確認した。SD配列の認識に関わるリボソーム中のS1リボソームタンパク質およびそれと密接に関わるS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。成果2)シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとしてDNAのメチル化や核様体タンパク質によるエピジェネティックな制御が考えられる。そこで、枯草菌内在性のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の4つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。本研究は当初以下の2つの実験過程に分けて、枯草菌宿主細胞内におけるシアノバクテリア由来のDNAの遺伝子発現抑制、遺伝子サイレンシングについて解析することとした。1)シアノバクテリアの遺伝子発現に適した、転写装置、翻訳装置を宿主である枯草菌細胞の中で構築すること。2)核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について解析すること。1)に関しては、枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。また、翻訳開始に関与する複数のリボソームタンパク質S1およびS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。これらの改変によりシアノバクテリア由来の遺伝子が枯草菌内で発現するかどうかの検討が今後の課題であるが、そこに移行する準備は整っていると判断した。2)に関しては、枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスにおいて、核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について未解析である。しかしながら、その解析の助けとなる異種細菌の4つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させる株を構築し、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。また、核様体タンパク質についても、現在その発現株を作製中である。以上のように当初予定した計画の準備段階のものもあれば、解析に移行できる状態になりつつある段階のものもあるため、区分は(2)とした。1)枯草菌内で構築できた、シアノバクテリア由来のRNAPコア酵素に加え、シアノバクテリア由来の主要シグマ因子シグマAも効率よく発現させ、シアノバクテリア由来のRNAPホロ酵素の構築を目指す。同様に枯草菌内で発現させることができた、シアノバクテリアのシグマFについても、シアノバクテリアRNAPコア酵素とホロ酵素を形成させる。それらのホロ酵素をシアノバチルス内で発現させ、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現誘導を観察する。また、シアノバクテリア由来の翻訳開始に関与する複数のリボソームタンパク質S1およびS2、S3、S14タンパク質を枯草菌内で発現させたことにより、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現が翻訳段階でも改善されたかどうかを検討する。2)枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスについて直接、増殖の各段階におけるDNAメチル化状態を次世代シーケンサーにより検出し、エピジェネティックな遺伝子発現制御について解析する。加えて、枯草菌内在のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の4つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、新たなDNAメチル化により枯草菌の遺伝子発現に変化を生じるかを解析する。また、核様体タンパク質については、枯草菌では現段階で一般的な核様体タンパク質として機能していると判明しているタンパク質がないため、大腸菌の核様体タンパク質を枯草菌内で発現させ、枯草菌遺伝子の発現に影響を及ぼすかを観察する予定である。3)導入したシアノバクテリアゲノムが、巨大なため、発現誘導の影響が大き過ぎることも考えられる。そこで、枯草菌ゲノムに導入する異種細菌のゲノムとして、シアノバクテリアのゲノムとは別に、枯草菌に比較的近縁のゲノムサイズの小さい難培養性の腸内細菌であるセグメント細菌のゲノムを導入する。納豆菌の類縁菌で高い自然形質転換能をもつ枯草

菌ゲノムに光合成細菌のシアノバクテリアゲノムを挿入した、キメラゲノム細菌シアノバチルスでは、興味深いことにシアノバクテリアゲノムが分断して組み込まれた3領域に特徴的に転写産物が検出されないことが、シアノバチルスの全転写産物のRNA-Sequencing解析により判明した。この現象を、水平伝播における外来遺伝子の発現を阻む機構を再現したものであり、実験室で解析することができる具体例と考え、その機構を、キメラゲノム細菌、シアノバチルスを使って分子レベルで詳細に解明することを目的として解析を行った。成果1)シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとして枯草菌由来の遺伝子発現システム、転写装置(RNAポリメラーゼホロ酵素[RNAP])やリボソームを含む翻訳装置がシアノバクテリア遺伝子に適合していないことが考えられる。枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。またシアノバクテリアのシグマFを枯草菌内で発現させ、枯草菌RNAPコア酵素とのホロ酵素を形成させ、転写活性を有することを確認した。SD配列の認識に関わるリボソーム中のS1リボソームタンパク質およびそれと密接に関わるS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。成果2)シアノバチルスにおける、シアノバクテリア由来の遺伝子の発現がおきない原因の一つとしてDNAのメチル化や核様体タンパク質によるエピジェネティックな制御が考えられる。そこで、枯草菌内在性のDNAメチル化酵素に加えて、異種細菌の4つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させ、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。本研究は当初以下の2つの実験過程に分けて、枯草菌宿主細胞内におけるシアノバクテリア由来のDNAの遺伝子発現抑制、遺伝子サイレンシングについて解析することとした。1)シアノバクテリアの遺伝子発現に適した、転写装置、翻訳装置を宿主である枯草菌細胞の中で構築すること。2)核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について解析すること。1)に関しては、枯草菌内でシアノバクテリア由来のRNAPの各サブユニットについて改変を加え、RNAPコア酵素の構築に成功した。また、翻訳開始に関与する複数のリボソームタンパク質S1およびS2、S3、S14タンパク質について、シアノバクテリア由来のこれらのタンパク質を枯草菌内で発現させる株を作製した。これらの改変によりシアノバクテリア由来の遺伝子が枯草菌内で発現するかどうかの検討が今後の課題であるが、そこに移行する準備は整っていると判断した。2)に関しては、枯草菌+シアノバクテリアであるシアノバチルスにおいて、核様体タンパク質やDNAメチル化によるエピジェネティックな遺伝子発現制御について未解析である。しかしながら、その解析の助けとなる異種細菌の4つのDNAメチル化酵素を枯草菌内で発現させる株を構築し、枯草菌ゲノムをメチル化していることを確認した。また、核様体タンパク質についても、現在その発現株を作製中である。
歴史的建造物保存修復技術の考え方と方法-地域文化財修復指針案の作成-

重要文化財は百年の蓄積をもって充実した修復がおこなわれている。一方の地域文化財は、その地域において欠くことのできない文化遺産であり、また近年、急激に修復の数を増しているが、重要文化財に比較して修復技術の考え方や方法に大きな隔たりがある。地域文化財においても、重要文化財にみるような修復にふさわしい事業形態、十分な学術調査、保存の理念にもとづく技術による修復、確かな記録の作成などを取り入れて、体制づくりや技術の向上をはかるとともに、地域文化財独自の指針となり得る修復技術の考え方と方法を研究し、その成果を早急に普及させることが必要である。本研究は、まず重要文化財にみる修復技術の考え方と方法を、これまで修復に携わってきた自己の経験と修理工事報告書を参考にして整理した。それと同時に可能な限り地域文化財の実地調査をおこない、事業の状況について、事業の流れ・行政の指導と学識経験者の助言・設計と監理・施工形態・記録の作成などを把握し、実際の修復技術については、破損部分の修理・復原・構造診断と耐震対策・維持保存の措置・活用のための改修や設備・施設などを調査分析した。そして、重要文化財と地域文化財で比較検討のうえ、地域文化財の問題点をあげ、今後の地域文化財にふさわしい修復技術のあり方を検討した。それらをまとめ、地域文化財保存修復技術の考え方と方法の指針案の作成を試みたものである。なお本研究は、活用や耐震対策を含めて最も社会性のある近代建築を調査対象とし、全国を範囲として指定件数や修復が多い地域を選んだ。(1)重要文化財の場合の保存修復の考え方と方法の整理これまで百年の蓄積をもつ重要文化財の修復技術は、その要素を三点に集約することができる。1)十分な調査、2)技術の保存、3)記録の作成である。文献、現地取材、関係者への聞き取りによってそれらを整理した。(2)修復された地域文化財のリストの作成今年度は、東北・北海道に地域をしぼり、北海道と各県に、市町村指定の文化財指定の情報提供を依頼したうえ、個々の市町村に問い合わせることによってすでに修復された文化財に関する情報を得た。(3)地域文化財の修復状況の実地調査作成したリストにしたがい東北・北海道すべてを範囲としたが、修復されたすべての文化財を扱うと膨大にすぎるので、明治以降で洋風建築を主体とすることにし、大半を実地調査した。調査内容は、事業の態勢、事業の計画、調査の内容、修復方針の検討、実施計画、記録の作成、維持管理態勢、活用状況などがどのようになされているかを、建物を観察するとともに、関係者に聞き取り取材した。今後さらに各地の実地調査をすすめたい。(4)現在までの調査における所感これまで把握されいない(3)について、今後、全国的な調査をすすめる予定であるが、現在までのところでも、各地・各建物によって修復の考え方や方法はかなり異なることが明らかになりつつある。異なるというよりも、修復の目的やあり方の基本が認識されていないまま、一般建築と変わらない改修がなされている場合も多い。共通の指針の必要性を強く感じる。なお、今回訪ねて寒冷降雪地帯の冬場の管理や活用の困難さが理解できた。(1)修復された地域文化財のリストの作成昨年度に倣い、群馬県、東京都と千葉県の一部、島根県・岡山県、長崎県、佐賀県の一部など、比較的集中している地域にしぼり、各県へ、県指定及び市町村指定の文化財指定物件の情報提供を依頼したうえ、各市町村に問い合わせることによって文化財建造物に関する詳細な情報を得た。(2)地域文化財の修復及び活用状況の実地調査作成したリストにしたがい、文化財建造物を実証調査した。調査内容は、事業の態勢、事業の計画、調査の内容、修復方針の検討、施工状況、記録の作成、維持管理態勢、活用状況などがどのようになされているかを、建物を観察するとともに、関係者に聞き取り取材した。また、神戸市の重要伝統的建造物群保存地区北野町山本通地区の建造物の震災復旧におけるさまざまな考え方・方法による修復状況を調査した。(3)現在までの調査における所感

これまで把握されていなかった(2)について、今後さらに選択しながら全国的に調査をすすめる予定である。現在までのところ、各地・各建物によって修復の考え方や方法はかなり異なることが明らかになりつつある。異なるばかりでなく、修復の目的やあり方の基本が認識されていないまま、一般建築と変わらない改修がなされている場合も多い。一方、指導者の存在によって優れた修復のおこなわれている地域もある。共通の指針の必要性を強く感じる。なお、今回訪ねた地域は過疎地が多く、それらの地域の歴史的建造物はほとんどが「郷土資料館」として利用されているが、展示のために建物の内部空間が損なわれていること、見学者・利用者が少なく、日常管理も不十分で、建物が活かされているとは言いがたいものが多くあった。(1)地域文化財の修復状況実地調査の補足(1)事業の態勢:事業主、学識経験者の指導、設計監理者、施工者、伝統技能者の構成(2)当初の計画:基本方針の策定、修復程度の判断/全体計画/解体の程度と範囲(3)解体調査:素屋根の必要性、解体部材の保管など/解体時におこなうべき調査と方法、調書の整理と公表(4)調査結果の分析と修復方針の検討:調査結果にもとづく建造物の再評価/復原方針の検討/具体的修理方法の検討/構造補強方法の検討/活用方法の検討/活用にともなう諸施設、諸設備と本体の関係の検討(5)実施計画と修理工事:遺存する在来施工(部材・材料・施工自体)を尊重した修理、破損に応じた手立て、重要度に応じた遺し方/復原仕様、伝統的仕様の踏襲とその限界/維持のための仕様変更/保存の科学的な処置のあり方と方法/古色着けのあり方/近代の工業製品の復原と修理/構造補強の納め方/新しい設備類の納め方/工事期間の設定/技能者の選定/工事発注形態と事業の運営(6)記録の作成:報告書の刊行/映像による記録保存/野帳の保存/案内書などの作成(2)地域文化財保存修復技術に関する研究会「地域文化財保存修復の現状」の開催地域文化財の保存修復が比較的活発におこなわれている県を対象に、修復事業の形態、行政の指導体制、保護審議会の機能、学識経験者・研究者の指導・助言、調査及び設計監理の実態、施工の実態、記録の作成、問題点と課題などについて、報告と意見交換をおこなった。(3)調査結果による総合的な検討と研究成果報告書の作成地域文化財の修復状況の分析、重要文化財と地方文化財の比較検討、地方文化財の問題点の提起とその対策の検討などをふまえた保存修復技術のあり方について総合的な検討をおこない、「地域文化財保存修復技術の考え方と方法」指針案を作成した。
テーブルトップ型超高速電子線を用いたソフトクリスタルの光誘起現象の動画撮影

本研究提案では、テーブルトップ型超高速時間分解電子線回折法を駆使して、光応答性の結晶・液晶(ソフトクリスタル)の分子動画の撮影を行う、すなわちその分子の立体構造を理解し、光誘起構造変化ダイナミクスの詳細を解明することを目的とする。我々は、日本で先駆けて時間分解能500フェムト秒(フェムト秒:1000兆分の1秒)を持つテーブルトップ型の超高速時間分解電子線回折装置を完成させている。有機物質のダイナミクスを観察できる電子線回折装置は日本においては、我々の開発した装置に限られる。本装置を用いて、分子間相互作用が深く関わる結晶・液晶などのいわゆるソフトクリスタルの分子凝集系を対象として、光によって変化の生じる分子構造をダイナミックに観測する。2018年度は、フェムト秒からピコ秒の物質の動的ダイナミクスとナノ秒からミリ秒における物質の動的ダイナミクスを連続的に測定可能なテーブルトップ型時間分解電子線回折装置の改良を行うために、ナノ秒レーザーの導入を行った。さらに、一部に長距離周期をもつような液晶(酸化グラフェン及びアゾベンゼン液晶)の構造ダイナミクス計測を行った。酸化グラフェンの構造ダイナミクス計測は、光照射と過熱による還元過程が異なることを見出すことに成功した。また、アゾベンゼンの構造ダイナミクス計測では、これまでミリ秒やマイクロ秒で生じると考えられてきた共同的な運動が100ピコ秒で生じることを世界で初めて示すことに成功した。これらは現在、ともに論文投稿を行い査読中である。本研究提案では、テーブルトップ型超高速時間分解電子線回折法を駆使して、光応答性の結晶・液晶などのソフトクリスタルの分子動画の撮影を行う、すなわちその分子の立体構造を理解し、光誘起構造変化ダイナミクスの詳細を解明することを目的とする。2018年度は、ナノ秒レーザーの導入・いくつかのソフトクリスタルの構造ダイナミクス計測に成功し、非常に大きな成果を得ている。ただし、2018年度に、岡山大学から筑波大学へ異動したため、2019年度は装置の再構築を行う必要がある。このような達成状況から区分(2)を選択した。2018年度に、岡山大学から筑波大学へ異動したため、2019年度の前半は装置の再構築を行う。さらに、時間分解電子線回折装置を用いてソフトクリスタルの光応答中の構造ダイナミクス計測を実施する。当該新学術研究領域の領域会議内で議論を行った様々なソフトクリスタル試料に対して、光照射直後から一連の光応答中の分子の構造ダイナミクスの計測を行う。特に以下の項目を注力的に遂行する。・結晶に近いスメクチック液晶の構造ダイナミクス計測・光照射によってアモルファス・結晶相転移を行うイオン液体の構造ダイナミクス計測・時間分解電子線回折法と他の時間分解計測法(時間分解X線回折法や時間分解赤外分光法)との相補的な実験・時間分解電子線回折法で得られた結果を計算科学の結果と照らし合わせることで見えてくる構造ダイナミクスの展開本研究提案では、テーブルトップ型超高速時間分解電子線回折法を駆使して、光応答性の結晶・液晶(ソフトクリスタル)の分子動画の撮影を行う、すなわちその分子の立体構造を理解し、光誘起構造変化ダイナミクスの詳細を解明することを目的とする。

・結晶に近いスメクチック液晶の構造ダイナミクス計測・光照射によってアモルファス・結晶相転移を行うイオン液体の構造ダイナミクス計測・時間分解電子線回折法と他の時間分解計測法(時間分解X線回折法や時間分解赤外分光法)との相補的な実験・時間分解電子線回折法で得られた結果を計算科学の結果と照らし合わせることで見えてくる構造ダイナミクスの展開
肺炎クラミジアの新規エフェクター分子ＣｐＢ０８５０の細胞分裂調節機構の解明

本研究では市中肺炎の原因菌である肺炎クラミジアの宿主に対する影響を調査した。その結果、肺炎クラミジア感染が宿主細胞のシグナル情報伝達経路を調節し、宿主細胞の細胞増殖抑制を行う機構の一旦が明らかにされた。また、肺炎クラミジアの潜在的な毒素タンパク質と考えられるCpB0850分子が宿主細胞の核内に局在し、宿主細胞の核内タンパク質ヒストンH3との相互作用ならびにリン酸化の調節を介して、宿主細胞の細胞周期に影響を与えている可能性が明らかになった。これまでの研究により、市中肺炎や動脈硬化などの炎症性疾患の原因菌の一つであるChlamydia (Chlamydophila) pneumoniae(以下、肺炎クラミジア)の病原性分泌タンパク質と考えられるCpB0850分子が、宿主細胞の細胞分裂を阻害する可能性が示唆されている。本研究では、CpB0850分子がどのような分子機構を介して宿主細胞の細胞分裂を阻害するかについて分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて明らかにすることにより、肺炎クラミジア感染によりどのように宿主細胞の細胞周期、あるいは細胞増殖が抑制されるかについて明らかにすることを目的としている。前年度に得られたCpB0850の欠失変異体を用いた検討により、CpB0850の核内への局在、細胞分裂への影響についてはN末端部分が重要であることが示唆されているため、本年度はこれらCpB0850分子の欠失変異体を4-ヒドロキシタモキシフェン(4HT)の存在下でのみ発現する発現誘導細胞の樹立をおこない、解析を進めている。また、肺炎クラミジア感染が引き起こす宿主細胞の細胞増殖の抑制については病原性分泌タンパク質の介在のみならず、他の経路でも引き起こされることが想定されていた。本研究により肺炎クラミジア感染により、AKTキナーゼのリン酸化(活性化の指標)は引き起こされるものの、その下流のp70S6Kキナーゼのリン酸化(活性化の指標)は抑制されており、この肺炎クラミジアによる細胞増殖の抑制がmTORを含む別経路の調節により行われていることが示唆された。また、この肺炎クラミジアによる宿主細胞増殖の抑制にはアポトーシスは関与していないことも併せて示唆された。この研究実績は論文発表するに至った。本研究では、CpB0850分子がどのような分子機構を介して宿主細胞の細胞分裂を阻害するのかについて分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて明らかにすることにより、肺炎クラミジア感染によりどのように宿主細胞の細胞周期、あるいは細胞増殖が抑制されるかについて明らかにすることを目的とした。前年度までに得られたCpB0850の欠失変異体を用いた検討により、CpB0850の核内への局在、細胞分裂への影響についてはN末端部分が重要であることが示唆されているため、これらN末端からの欠失変異体緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質の形で4-ヒドロキシタモキシフェン(4HT)の存在下でのみ発現する発現誘導細胞の樹立を行った。その結果、CpB0850N末端の欠失変異体を発現する細胞に比較して、野生型のGFPCpB085の発現により細胞増殖速度の低下が観察されるという予備的な結果が得られた。しかしながら、これら一連のCpB0850発現誘導細胞におけるCpB0850分子の宿主細胞内での安定性は著しく悪く、安定的にCpB0850分子の発現細胞が得ることが困難であったため、CpB0850分子による宿主細胞の細胞分裂速度低下作用を確認するには至らなかった。CpB0850分子を一過性に発現させた細胞では、細胞周期の分布が変化し、タイムラプスによる観察においても異常な細胞分裂を起こすCpB0850発現細胞が観察されている。また、ヒスチジンタグを付加したCpB0850分子を一過性に発現する細胞ライセートを用いた免疫沈降実験では、CpB0850分子によってヒストン分子が共沈されることが確認されているため、何らかの作用があることが示唆された。これまでの研究により市中肺炎や動脈硬化などの炎症性疾患の原因菌の一つであるChlamydia (Chlamydophila) pneumoniae(肺炎クラミジア)の病原性分泌タンパク質と考えられるCpB0850分子が、宿主細胞の細胞分裂を阻害する可能性が明らかになっている.本研究では、CpB0850がどのような分子機構を介して宿主細胞の細胞分裂を阻害するかについて分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて明らかにすることを目的としている.CpB0850分子による宿主細胞機能調節の解析においては欠失変異体の作製が必須となるため,本研究では新たにN末端からの欠失変異体を作製し,HEK293T細胞における安定性を確認し,同時に細胞周期のG2/Mアレストについて検討を行った.

その結果,比較的発現量の確認される欠失変異体を作製することができたため,これらの欠失変異体を用い,今後のヒストンとの結合,ヒストン修飾の可能性などの解析に用いることとした.肺炎クラミジアが宿主細胞の染色体にどのような影響を与えるかを確認する目的で,感染細胞を抗RPA70抗体を用い染色したところ,肺炎クラミジア感染により宿主細胞の染色体にDNA障害が起こっていることが観察されたため,CpB0850分子のこれら宿主染色体DNAの障害への関与についても検討するまた,新たな遺伝子導入,遺伝子ノックアウト系としてその樹立を目指している組み換えクラミジオファージについては,クラミジオファージを構成すると考えられている7つの遺伝子を同時に大腸菌宿主内で発現させる目的で,これら7つの遺伝子をクローニングし,同時に大腸菌を形質転換可能な4種類の発現プラスミドをすでに構築している.これら4種類の発現プラスミドを用い,組み換えクラミジオファージ系の構築を検討する.これまでに肺炎クラミジアによる宿主細胞の増殖抑制に関しては新たな知見が得られたことから全般的にはおおむね順調に進展しているといえると思われる。しかしながら、新規毒素タンパク質CpB0850を介した分子機構については、まだ全容を明らかにするに至っていないことから、当初の計画より多少のずれが生じているため、その点に留意しさらに研究に集中していくことを予定している。本年度は本研究における初年度であり,肺炎クラミジアが分泌すると考えられるCpB0850タンパク質のいくつかの変異体の作製や新たな発現系の構築に多少時間を必要とした.また,当初の研究計画を実際の研究の進捗状況と照らし合わせ,当初研究計画にはない項目についても,研究全体での必要性から積極的に行ったことにより,当初の計画とは多少のずれが生じている.しかしながら,これらの研究により,当初想定した結果のみならず副次的な研究成果も得られ始めていることから,研究全体としてはおおむね順調に進展していると考えることができる.また,当初計画していた項目については遅れが出ないよう留意し平成24年度に集中的に実施することを予定している.平成25年度も引き続き研究計画に即した形で進めていく。平成23年度、24年度に計画していてこれまでに完全には達成していない研究項目については積極的かつ発展的に継続していく。平成24年度以降も引き続き研究計画に即した形で進めていく.ただし,平成23年度に計画していた研究項目については平成24年度にも実施し,さらに副次的に結果が得られ始めている研究項目についても積極的かつ発展的に研究を継続して行う.平成25年度の研究代表者の所属研究機関の移動に伴い、50万円を超す機器の購入が必要となっているため、次年度当初に当該機器を購入し研究を進めていく。平成24年度についても研究計画に従い,計画的に使用していく.
近現代ロシアにおける国家・教会・社会:ロシア正教会と宣教団

本研究の目的は、ロシア近現代史におけるロシア正教会およびロシア正教宣教団の役割を具体的に明らかにすることであった。日本のロシア正教会を半世紀にわたって率いた宣教師ニコライの遺した日記は、本研究を進める上で最も重要な素材である。すでに1994年にロシア語テキストの一部が公刊されていたニコライの日記は、中村健之介ほかによって抄訳が北海道大学図書刊行会から刊行され、さらに中村によって未公刊のニコライの帰国時(1870-1880年)の日記の翻訳と注解が発表された(「研究成果報告書別冊(1)」および「研究成果報告書別冊(II)」)。これらの成果は、今後の宣教師ニコライ研究のみならず、ロシア宗教史や日露交渉史の研究にも重要な手がかりを与えるものである。本研究への補助金によってスラブ研究センターの資料コレクションに加えることが可能となった歴史資料は少なくない。北京駐在宣教団紀要、キニフ神学大学紀要、カザン神学大学紀要、正教雑誌『巡礼者』などである(なお、これらの出版物の資料的価値については『スラブ研究センター・ニュース』No.81,82,85各号「新規受入資料の紹介」の項を参照されたい)。今回の『成果報告書』に収録されたロシア近現代史分野の論文は、多かれ少なかれこれらの新規購入資料に立脚する研究成果である。本研究では、ウラジオストクとペテルブルグからロシア正教会と宣教団の専門家を招聘し、ロシアにおける最新の研究動向に接した(『成果報告書』iiページ参照)。このことを通じて、当該分野における国際学術交流を高い水準に引き上げることができたのは大きな収穫であった。3年計画で進める本研究の初年度に当たる本年度は、研究集会の企画・実施(国外からの専門家の招聘を含む)と基本文献の共有(所在確認、ビブリオグラフィー作成、海外発注による収集、マイクロ起こし、各分担者への送付等を含む)に重点を置いた。研究集会は東京大学で1回、北海道大学で2回開催されたが、北海道大学で開催された2回のうち、1回はスラブ研究センターで実施された国際シンポジウムの一部(「日露の歴史的絆」と題するセッション)としてロシア語で行われ、他の1回はシンポジウムの翌日にロシアの日本学者を交えて日本語で行われた。上記のセッションでは、ロシアから招聘した2名のゲスト・スピーカーによる研究発表に、日本側から2名の討論者がコメントし、フロアからも内外のスラブ研究者によって活発なディスカッションが行われたのは有益であった(本研究の代表者が司会をつとめた)。提出されたペーパーは他の研究報告とともに、次年度の早い時期に刊行物にまとめる予定である。基本文献の共有に関しては、スラブ研究センターの所蔵する明治期の日本正教会出版図書コレクションの目録を整備したこと、同じくジョージ・レンセン・コレクションの中の膨大なロシア宣教団関係書目についても目録を整備し、かつマイクロフィルムを起こしたこと、等が挙げられる。以上の活動により、次年度以降における研究代表者、各分担者の共同研究に向けて確実な手がかりがえられた。本研究に期待される国際学術上の貢献は、ロシア正教会日本宣教団の歴史的意義、とりわけ日本における正教会を半世紀にわたって率いた宣教師ニコライの事績を解明することにあろう。平成12年度における最大の研究実績は、国内外における宣教師ニコライ研究の第一人者で本研究の分担者をつとめる中村健之介によって、膨大な『宣教師ニコライの日記:18701880ロシア帰国時の全日記』の翻訳が本研究の「研究成果報告書別冊(I)」として北海道大学スラブ研究センターから2001年2月に出版されたことである。

今年度の研究集会は、平成12年10月(明治大学)と平成13年3月(大妻女子大学)の2回開催され、研究代表者、各研究分担者のほか2名の研究協力者がそれぞれの研究テーマをもって積極的に参加したが、とくに3月の研究集会では各参加者が中村の訳業を精読し、それを素材にしてそれぞれの視点から論評を加える形式をとった。そこでの論評と討論は、訳注・人名索引を掲載する予定の近刊「研究成果報告書別冊(II)」に活かされることになっている。また、10月と3月の研究集会に提出された各参加者のペーパーは前年度の国際シンポジウムにロシアから招聘した2名のゲスト・スピーカーによる研究発表とともに、次年度の早い時期に刊行物にまとめる予定である。また、次年度の国際シンポジウムに向けてのゲスト・スピーカーについて企画から折衝にいたる招聘準備をすすめた。本研究に期待される国際学術上の貢献は、ロシア正教会日本宣教団の歴史的意義、とりわけ日本における正教会を半世紀にわたって率いた宣教師ニコライの事績を解明することにあろう。平成13年度におけるこの面での成果としては、中村健之介によって昨年度訳出された『宣教師ニコライの日記: 18701880ロシア帰国時の全日記』の注解が本研究の「研究成果報告書別冊(II)」として北海道大学スラブ研究センターから今年度末に出版されることである。また、本研究はスラブ研究センターの今年度夏期(2001年7月)および冬期(2002年1月)の国際シンポジウムに合わせて、ゲストスピーカーとしてウラジオストクからYu. V.アルグジャエヴァ、ペテルブルグからN.A.サモイロフの両ロシア人研究者を招聘し、それぞれ「極東の東スラブ人の正教と宗教グループの満州への移民」(夏期)、「中国におけるロシア宣教団、その歴史と近年の研究」(冬期)について研究報告を聴く機会をもった。このような場を設けることにより、当該分野における国際学術交流を高い水準に引き上げることができたのは大きな収穫であった。最終年度を終了するに当たって取りまとめる研究成果報告書には、上記外国人による2本のペーパーを収録することにした。
ストレス応答型転写因子Nrf2の新規生理機能の発見

Nrf2は環境ストレスに応答して活性化する。Nrf2は通常Keap1により抑制されているが、Keap1を欠失した場合にはストレスがない状態でもNrf2は常に活性化する。Keap1欠失マウスは、食道閉塞による母乳摂取不全のため生後間もなく死亡してしまい、詳細に調べることが困難であった。そこで、食道におけるNrf2の発現を欠失することで、成獣まで生育できるKeap1欠失マウスを作製し、食道以外の全身組織でのNrf2過剰活性化による影響を検討した。その結果、腎臓発生期のNrf2活性化は尿崩症を呈することを発見した。今後、腎性尿崩症の発症機序の理解およびその治療や予防に役立つと期待される。転写因子Nrf2はストレス刺激に応答して誘導的に生体防御遺伝子群を活性化する。Nrf2の抑制因子Keap1の欠失マウスでは恒常的Nrf2活性化により様々な生体防御遺伝子群を活性化するが、同時に食道扁平上皮過角化による摂餌障害のため致死になる。このことは、恒常的Nrf2活性化は生体防御能亢進だけでなく細胞運命決定にも大きな影響を与えることを示唆する。しかし、Keap1欠失マウスは生後間もなく死に至るため食道以外の他組織における解析が進まなかった。そこで本研究では、扁平上皮特異的Nrf2欠失によってKeap1全身欠失マウスの致死性を回避し、扁平上皮以外の組織においてNrf2活性化が及ぼす影響を明らかし、Nrf2による新たな生理機能発見を目指す。平成26年度は全身Keap1欠失マウスの致死性を回避するため、全身Keap1欠失かつ扁平上皮特異的Nrf2欠失マウスの作製に成功した。このマウスは、食道の過角化が改善され、成獣まで生存可能になることがわかった。しかし、食道の表現型が改善されたにも関わらず、顕著な発育不全が観察され、著しく生存率が悪いことがわかった。さらに、この食道以外全身Nrf2活性化マウスの尿は浸透圧の低く量が著しく増加することから水再吸収能が低下していることが考えられた。さらに、このマウスの腎臓は髄質部分が退縮し腎構造が失われていることがわかった。今後、遺伝子発現解析や血液生化学などの解析により、腎臓の表現型の原因を探る。また、腎尿細管特異的Keap1欠失マウスを作製し、食道以外全身Nrf2活性化マウスの腎臓の表現型が再現されるか検討する。平成26年度に全身Keap1欠失かつ扁平上皮特異的Nrf2欠失マウスの作製し、その致死性を回避することに成功した。このマウスをNEKOマウスと名付けた。平成27年度はNrf2活性化が及ぼす影響を明らかにすることを目的に、NEKOマウスの表現型解析を進めた。その結果、NEKOマウスは多尿を呈し、尿浸透圧が低いことから、NEKOマウスは尿の水再吸収が低下した病態(尿崩症)を呈することがわかった。その結果、腎盂に圧がかかり腎臓は水腎症のような構造変化を起こした。視床下部で産生される水再吸収制御ホルモンのバソプレッシンの血中濃度はNEKOマウスにおいて有意な変化はなかったことから、中枢性の尿崩症ではないと考えられた。一方、腎臓の集合管において水再吸収を担うAQP2チャネルのタンパク質レベルの発現低下がNEKOマウスにおいて観察されたことから、腎性の尿崩症であると考えられた。さらに、ドキソサイクリン誘導的な腎尿細管特異的Keap1欠失マウスを作製し、成獣期にドキソサイクリン投与を行ったところ尿崩症は呈さなかったが、胎児期からドキソサイクリンを投与したところ尿崩症を呈した。以上の結果より、Nrf2活性化による尿崩症の発症には、胎児期の腎尿細管においてNrf2が活性化する必要があることがわかった。Nrf2活性化は抗酸化や異物代謝の反応を促進することから、腎臓を含めて様々な臓器を標的にNrf2活性化剤の開発が進んでいるが、以上の研究成果は、Nrf2活性化剤の投与時期について注意が必要であることを示唆するものである。平成28年度はさらなるメカニズム解明に挑み、論文発表を目指す。初年度に作製にしたマウスの表現型解析が進み、腎性の尿崩症を呈すること、および幼若期の腎臓においてNrf2が活性化することが尿崩症を呈するのに必要であることを突き止めることができた。そこで本研究では、扁平上皮特異的Nrf2欠失によってKeap1全身欠失マウスの致死性を回避し、扁平上皮以外の組織においてNrf2活性化が及ぼす影響を明らかし、Nrf2による新たな生理機能発見を目指した。このKeap1全身欠失かつ扁平上皮特異的Nrf2欠失マウスをNEKOマウスと名付け、表現型解析を行なった結果、NEKOマウスは低張多尿で、バソプレシン不応答であったことから、腎性尿崩症を呈することがわかった。