hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エステラーゼD cDNAによる遺伝子多型を利用した網膜芽細胞腫の早期診断

1.ヒト赤血球から、エステラーゼDー1とDー2を高度に精製し、その性質を調べた。2.精製エステラーゼDー1に対するウサギ抗体を作成し、生じた抗体がエステラーゼDに対して特異的に反応することをウェスタンブロット法で確かめた。3.精製エステラーゼDー1標品を、タンパク質分解酵素で消化後、高速液体クロマトグラフィーでペプチドを分取し、9個のペプチドについて、そのアミノ酸配列を決定した。4.2.で得た抗体を使って、ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングし、ポジティブクローンを得た。5.ポジティブファージクローンを増やし、cDNA部分を切り出して、pUC9へサブクローン化した。6.得られたcDNAの大きさは、約300塩基対で、ジデオキシ法で決定した塩基配列の中に、3で得られたペプチドのアミノ酸配列に相当する部分が含まれていた。7.さらに長いcDNAを含むクローンを入手すべく、再度ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングした所、約1200塩基対を含むcDNAクローンが得られた。8.このcDNAについて塩基配列を求めた所、5′ー末端部分にタンパク合成の開始コードンであるメチオニンが含まれていなかったので、cDNAの5′ー末端側部分をプローブとして、再度ヒト胎盤λgt_<11>cDNAライブラリーをスクリーニングしている。1.ヒト赤血球から,エステラーゼD-1とD-2を高度に精製し,その性質を調べた.2.精製エステラーゼD-1に対するウサギ抗体を作成し,ウェスタンブロット法にて,生じた抗体がエステラーゼDに対して特異的に反応することを確かめた.3.精製エステラーゼD-1標品を,たんぱく質分解酵素にて消化後,高速液体クロマトグラフィーでペプチドを分取し, 9個のペプチドについて,そのアミノ酸配列を決定した.4.2.で得た抗体を使って,ヒト胎盤入_<gt11>cDNAライブラリーをスクリーニングした.この時,入_<gt11>ファージを寒天培地に重層する際地ウォーターバス(東洋科学産業株式会社, WB-24S型)中につけて,寒天を溶液状に保ったものを使用した.5.抗体と反応した入_<gt11>クローンを単離し,入_<gt11>クローフゥージを増やし, cDNA部分を切り出し,電気泳動電源装置(アトー株式会社, AE-3105型)を使って分離した.6.切り出したcDNAを, pUC9ヘサブクローニングし,ジデオキシ法にてcDNAの塩基配列を決定した.7.得られたcDNAの大きさは,約300塩基対で,その配列の中に, 3.で得られたペプチドのアミノ酸配列を含んでいたので,得られたcDNAはエステラーゼDcDNAの一部を含むものと考えられた.8.7.で決定したcDNAをもとに,最長のcDNAを入手すべく,再度ヒト胎盤入_<gt11>cDNAライブラリーをスクリーニングしている.1.前年度において、精製エステラーゼDをタンパク質分解酵素で切断後高速液体クロマトグラフィーでペプチドを分取し、そのうちの9個のペプチドについて、そのアミノ酸配列を決定した。2.精製エステラーゼDに対するウサギ抗体を使って、ヒト胎盤λgt11cDNAライブラリーをスクリーニングし、cDNAクローンを1個得た。得られたcDNAの大きさは、約300塩基対で、その配列の中に、1.で得られたペプチドのアミノ酸配列を含んでいた。3.さらに長いcDNAを含むクローンを入手すべく、ニトロセルロースを使って再度ヒト胎盤λgt11cDNAライブラリーをスクリーニングした所、約1200塩基対を含むcDNAクローンが得られた。4.このλgt11クローンを増やし、cDNA部分を切り出し、puc9へサブクローン化し、多種類の制限酵素を使って制限酵素地図を作成した。また、ジデオキシ法にてcDNAの塩基配列を決定した。5.得られたcDNAは、タンパク合成の開始コードンであるメチオニンを5^1-末端部分に持っていなかった。精製標品のアミノ酸分析値とSDS-PAGEによって決定した分子量から計算して、得られたcDNAは、N-末端部分の約10アミノ酸残基を欠いたものと推定された。

6.3.で得られたcDNA部分の5^1-末端側部分をプローブとして、再度ヒト胎盤λgt11cDNAライブラリーをスクリーニングし、最長のcDNAを含むクローンを探している。
家族看護の視点から病障害児の入院や療育が同胞に与える影響と地域支援ネットワーク

障害児の出生や発病による家族への影響について,障害児をもつ家族の育児負担と家族外支援ネットワークを対照群と比較した第1次調査ときょうだいへの影響をみるためにきょうだいの関わりを直接観察することにした.第1次調査は,障害児をもつ家族とその対照となる一般家族各14組への面接聞き取り調査を行った.第2次調査は障害児をもつきょうだいの関わりを直接観察した.方法は日常生活でよく見られるビデオ視聴場面とおやつ場面とおもちゃ遊び場面を半構成し30分間撮影した.そのビデオを10秒間隔のインターバルに分けてどのような相互作用が起こっているのかをカテゴリーに分類した.結果をまとめると,以下のようになった.1)母親からの聞き取りにより健常きょうだいが障害児と心理的に母親の取り合いをしていることがわかった.2)子どもの誕生による育児負担感の「プラスの変化」は一般群が障害児群の2倍の値であったが,「マイナスの変化」に違いは認められなかった.3)「家族関係の変化」は障害児群と一般群の間で差は認められなかった.4)家族からの支援は,一般群よりも障害児群が多様性があった.5)きょうだいの関わる3つの活動場面のビデオ分析から健常きょうだいが上であり,障害児の障害が重度の場合,楽しい滑動の遊びとなり得ていないケースが見られた.6)「ビデオ視聴」「おやつ」「おもちゃ遊び」の3つの活動では、障害児のきょうだいへの働きかける行動は,「ビデオ視聴」場面で多く出現していた.障害児の出生や発病による家族への影響について,障害児をもつ家族の育児負担と家族外支援ネットワークを対照群と比較した第1次調査ときょうだいへの影響をみるためにきょうだいの関わりを直接観察することにした.第1次調査は,障害児をもつ家族とその対照となる一般家族各14組への面接聞き取り調査を行った.第2次調査は障害児をもつきょうだいの関わりを直接観察した.方法は日常生活でよく見られるビデオ視聴場面とおやつ場面とおもちゃ遊び場面を半構成し30分間撮影した.そのビデオを10秒間隔のインターバルに分けてどのような相互作用が起こっているのかをカテゴリーに分類した.結果をまとめると,以下のようになった.1)母親からの聞き取りにより健常きょうだいが障害児と心理的に母親の取り合いをしていることがわかった.2)子どもの誕生による育児負担感の「プラスの変化」は一般群が障害児群の2倍の値であったが,「マイナスの変化」に違いは認められなかった.3)「家族関係の変化」は障害児群と一般群の間で差は認められなかった.4)家族からの支援は,一般群よりも障害児群が多様性があった.5)きょうだいの関わる3つの活動場面のビデオ分析から健常きょうだいが上であり,障害児の障害が重度の場合,楽しい滑動の遊びとなり得ていないケースが見られた.6)「ビデオ視聴」「おやつ」「おもちゃ遊び」の3つの活動では、障害児のきょうだいへの働きかける行動は,「ビデオ視聴」場面で多く出現していた.子どもの入院や障害の発病により家族の生活にどのような変化を及ぼすのか。特に同胞への影響についての研究を、もう一度検索した。GathやMillerの行ったイギリスでの詳細な調査結果は見つかったが、日本での研究は見当たらなかったので、その研究を参考に、幼障害児を持つ父母を対象に面接した結果、父親の家事・育児への協力についての父母の見解には相違がみられ、父親が認識しているほど母親は協力してもらっているとは思っていなかった結果であった。次に同胞への影響と同胞に病障害児への思いを知るために数名の母親への面接結果を検討したが、母親の語った言葉では、客観性が乏しく、一般化するには困難でありため、きょうだいの姿を観察調査することにした。観察調査に至るまでには、次の経過を辿った。Patricia F. Vadasyらの障害児の同胞関係を調べた総説論文を読むと、障害児を同胞に持つ大学生を対象に面接法を行い、同胞についてどのように思って成長したのかを想起にてデータを得ていたり、母親から同胞関係について聞き取りをしている研究は、アメリカにおいては多く見られた。それらの結果について報告がなされていた。しかし、同胞関係を直接観察をしてデータを得ている研究は、1984年までには1件しか報告がなされていなかった。それらの報告を考慮し、観察調査をすることにした。観察は、普段家庭でよく起こる同胞の関係-おやつを食べる、ビデオを見る、おもちゃで遊ぶ-をビデオに撮影し、後に分析することにした。パイロット・テストで家庭で行ったが、幼児を対象にしているため色々他のことが気になり目うつりがして関係を見るための同胞のやりとりが一定の時間にするなかった。そのため本調査では、プレイルームで、条件を一定にして行っている。現在進めているところである。障害児の家族に関する欧米でなされた研究は,親や健常なきょうだいに対する面接から引き出され,面接調査では対立する結果が見いだされた.それらの研究の積み重ねから研究上の問題点が指摘され,調査の方法,分析手法の整備の必要性を確認している.日本においては,中西らが児童心理学とその近接領域のきょうだいに関する研究を概括し,障害児の陰に隠されている健常きょうだいの心理的問題についてより関心がもたれるべきであると指摘した。きょうだい関係を親など第三者からの情報で判断するには疑問が残った.

ジョージア大学のBrody,Stoneman(1987,1991)らが、一連の研究の中で,1983年から精神発達遅滞児とのきょうだいの相互作用を家庭での遊び場面で役割行動について報告していたので,この方法を参考にきょうだいの関係をおもちゃ遊び,ビデオ視聴,おやつの三場面をビデオに撮影し観察にて調査を行った.併せて母親に面接を行い,障害児をもつ家族が,子育てをしていく上で生じる問題を明らかにした.今回の結果は,Brodyらの結果と異なりきょうだいの役割の逆転現象はみられなかった.3場面において,相互作用の働きかける行動はビデオ場面では,障害児が多く働きかけ,おもちゃ遊び場面では健常児が働きかける行動を起こしていた.おやつ場面ではその中間であった.
C群色素性乾皮症細胞におけるタン白性欠損因子の精製と機能解析

C群色素性乾皮症細胞(XP)に欠損しているDNA修復因子(C因子)の機能を解明するため,大量の細胞が入手可能なエールリッヒ腹水癌細胞より,不定期DNA合成(UDS)の回復を指標としてC因子の精製を試みた. C因子は核タン白で核内では極めて安定である.細胞質より核への移行は,多くの核タン白がそうであるようにレクチンWGA(Weat Germ Agglutinin)により抑えられる.ゲル濾過による推定分子量は低イオン強度下では約60万であるが,高イオン強度下では約30万となる.現在,イオン交換,ゲル濾過, DNAーアガロース等のカラム操作を組み合わせて比活性にして約千倍まで精製することができている.この精製段階の標品をSDSーPAGEにかけると分子量約10万13万の範囲に数本のバンドがほぼ同一濃度で検出されることから, C因子はこれらのタン白の会合体である可能性が強い.部分精製されたC因子はAH群のXP細胞においてC群においてのみUDSを回復させることができた.これまでに報告されているC群XP細胞に関する情况証拠から, C因子は修復酵素(エンドヌクレアーゼ)自身ではなく,酵素量を調節する機能か,もしくはクロマチンの高次構造を変換させ,損傷部位を露出させるような機能を有している可能性が高い.事実我々の部分精製したC因子にはUVーエンドヌクレアーゼ, APーエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった.またC因子はタン白合成を阻害した状態のXP細胞でも有効なことから,その機能発現にはあらたなタン白合成は必要としない.しかしながらC因子にはクロマチンの構造変換に関与すると考えられるDNAヘリケース(DNA依存性ATP分解酵素活性で測定),トポイソメラーゼ活性は検出されない.今の所,唯一のC因子活性に付随する活性は, DNA結合能であるが,今後更に精製を進めると同時に,クロマチンの構造変換に関与する諸活性の測定を併行して進めたい.C群色素性乾皮症細胞(XP)に欠損しているDNA修復因子(C因子)の機能を解明するため,大量の細胞が入手可能なエールリッヒ腹水癌細胞より,不定期DNA合成(UDS)の回復を指標としてC因子の精製を試みた. C因子は核タン白で核内では極めて安定である.細胞質より核への移行は,多くの核タン白がそうであるようにレクチンWGA(Weat Germ Agglutinin)により抑えられる.ゲル濾過による推定分子量は低イオン強度下では約60万であるが,高イオン強度下では約30万となる.現在,イオン交換,ゲル濾過, DNAーアガロース等のカラム操作を組み合わせて比活性にして約千倍まで精製することができている.この精製段階の標品をSDSーPAGEにかけると分子量約10万13万の範囲に数本のバンドがほぼ同一濃度で検出されることから, C因子はこれらのタン白の会合体である可能性が強い.部分精製されたC因子はAH群のXP細胞においてC群においてのみUDSを回復させることができた.これまでに報告されているC群XP細胞に関する情况証拠から, C因子は修復酵素(エンドヌクレアーゼ)自身ではなく,酵素量を調節する機能か,もしくはクロマチンの高次構造を変換させ,損傷部位を露出させるような機能を有している可能性が高い.事実我々の部分精製したC因子にはUVーエンドヌクレアーゼ, APーエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった.またC因子はタン白合成を阻害した状態のXP細胞でも有効なことから,その機能発現にはあらたなタン白合成は必要としない.しかしながらC因子にはクロマチンの構造変換に関与すると考えられるDNAヘリケース(DNA依存性ATP分解酵素活性で測定),トポイソメラーゼ活性は検出されない.今の所,唯一のC因子活性に付随する活性は, DNA結合能であるが,今後更に精製を進めると同時に,クロマチンの構造変換に関与する諸活性の測定を併行して進めたい.
ヒト第22番染色体上の癌抑制遺伝子の単離

1.コスミドマーカーの単離ヒト第22番染色体のみを含む雑種培養細胞のDNAを用いてコスミドライブラリーを作製した。ヒトDNAの繰り返し配列を指標として、ヒトDNA断片を含むコスミドクローン2000個を選別し、グリセリンストックを作製した。この内の191クローンを解析した内訳は、多型性を検出するもの63(33%),多型性を検出するが対応するアレルが明らかではなく、サブクローニングを要するもの17(9%),多型性は検出しないがシングルコピーであるもの88(46%)であった。多型性を検出するものは、検出するアレルの長さやその頻度を明らかにした。この内の5クローンはVNTRタイプの多型性を示した。2.コスミドマーカーのマッピングスウェーデンのDumanski博士より22番染色体を5つの領域に分別可能な雑種細胞のパネルを分与された。多型性を示すクローンを優先的にマップしており、既に52クローンのマッピングが完了した。3.各種腫瘍組織におけるLOHの検討大腸癌組織およそ100例を収集し、DNAを抽出した、その内の35例についてLOHを検討したが従来の報告より22番染色体の欠失頻度は低く、17%程度である副腎褐色細胞腫では、17例中の9例でLOHが検出され、22番染色体上の褐色細胞腫の発生・進展に関与する癌抑制遺伝子が存在することが確実になった。さらに22例を解析し、1番染色体短腕上でのLOH(55%)との関係を調べたところ、褐色細胞腫の発生には複数の癌抑制遺伝子が関与する多段階発癌説が当てはまるものと考えられた。ヒト髄膜腫は40例の収集を完了し、LOHの解析を開始したところである。
放射光X線回析法による心筋クロスブリッジ動態解析-不全心のナノ診断から治療評価へ

本研究はSPring-8を用いて分子ナノオーダーのダイナミクスを観察することにより心不全を診断する方法の開発を目的とした。特に心筋の収縮タンパクに注目し、複雑な形態と多重の代償機構を保持した標本(生体位全心臓標本)ならびにその破綻を来した心不全モデル標本を用いてアクチン・ミオシンの相互作用(クロスブリッジ動態)とミオシン線維格子間隔の変化を解析した。本研究では、イソプロテレノールによる肥大心モデル(ラット)での計測を行った。肥大心における収縮期および拡張期におけるクロスブリッジ動態を解析し、不全心のクロスブリッジ動態を評価した。本研究はSPring-8を用いて分子ナノオーターのタイナミクスを観察することにより心不全を診断する方法の開発を目的とした。本研究では特に心筋の収縮タンパクに注目し,複雑な形態と多重の代償機構を保持した標本(生体史全心臓標本)ならびにその破綻を来した心不全モデル標本を用いてアクチン・ミオシンの相互作用(クロスブリッジ動態)とミオシン線維格子間隔の変化を心臓全体のマクロスコピックな心機能データと総合的に解析し,その機能情報から心臓の合目的性と心不全の病態のナノ診断を試みた。左心室にX線を照射すると二重の円弧環状のX線回析が得られる。内側の回折像は1,0赤道反射と呼ばれミオシン線維を,外側の回析像は1,1赤道反射と呼ばれアクチン,ミオシン両方の線維の情報を反映する。心臓の収縮に伴い,ミオシン頭部がアクチンと結合(クロスブリッジの形成)すると,ミオシン線維による回折像が減少するため,1,0赤道反射の輝度が低下する。また,収縮に伴い照射位置がずれると,X線が通過する部位のミオシン線維の量も変化するが,1,1赤道反射はアクチン,ミオシン両方の線維による回析像なので,その輝度は通過した部分のタンパク量を反映する。したがって,1,0赤道反射の輝度変化を,1,1赤道反射の輝度で補正すれば,クロスブリッジの形成・解離動態が観察できる。また,X線と1,0赤道反射の為す角度は,X線の波長(0.082nm)とミオシン線維の格子間隔により規定される。試料と撮影管の距離と1,0赤道反射の出現位置から,ミオシン線維の格子間隔(約3540nm)を解析できる。今回の研究のモデルはイソプロテレノールによる肥大心モデルのクロスブリッジ動態解析を行った。肥大心と正常心を比較検討することで,その本質に迫ることができると考える。さらに他の不全心モデルでも測定を行い,ナノレベルでの診断を行うことを目標とする。内側の回折像は1,0赤道反射と呼ばれミオシン線維を、外側の回析像は1, 1赤道反射と呼ばれアクチン、ミオシン両方の線維の情報を反映する。心臓の収縮に伴い、ミオシン頭部がアクチンと結合(クロスブリッジの形成)すると、ミオシン線維による回折像が減少するため、1, 0赤道反射の輝度が低下する。また、収縮によるずれはアクチン、ミオシン両方の線維による回析像である1, 1赤道反射で補正すれば、クロスブリッジの形成・解離動態が観察できる。また、X線と1, 0赤道反射のなす角度は、X線の波長(0.082nm)とミオシン線維の格子間隔により規定される。試料と撮影管の距離と1, 0赤道反射の出現位置から、ミオシン線維の格子間隔(約3540nm)を解析できる。現在、収縮期、拡張期におけるクロスブリッジの形成・解離に着目し、解析を進めている。同時に、ラット摘出ランゲンドルフ灌流心標本にて、心機能評価も行った。心拍数の増加とともにクロスブリッジ形成が減少を来すことや、低酸素環境下ではクロスブリッジ形成の変化を伴わずに、左室発生圧が低下することを確認している。この標本でもイソプロテレンールによる肥大心モデルの測定を行っており、生体位全心臓標本との結果を合わせて解析を行うことで、今後新たな所見が得られると考えている。
次元が無限大に発散するような空間列の研究

Gromovは測度距離空間全体の集合にオブザーバブル距離を考えた空間のコンパクト化を構成した。このコンパクト化の元はピラミッドというある種のヒエラルキーをもつ空ではない測度距離空間の族で記述される。ピラミッドの特別な元として、極小なピラミッドである1点測度距離空間のみからなるものと極大なピラミッドである測度距離空間全体の集合がある。ピラミッドの列P_nが相転移性質をもつとは、ある正の実数列c_nが存在し、正の実数列t_nに対してc_n/t_nが0に収束するときにスケールしたピラミッドt_nP_nが極小なピラミッドに収束し、c_n/t_nがが無限大に発散するときt_nP_nが極大なピラミッドに収束することをいう。このc_nのオーダーを臨界スケールオーダーとよぶ。Elekは直径1以下の測度距離空間全体の集合にボックス距離を考えた空間のコンパクト化を構成した。このコンパクト化の元は量子測度距離空間とよばれる。量子測度距離空間は直径1以下の測度距離空間の一般化で、ポーランド位相空間とボレル確率測度と量子距離の三つ組である。量子距離とはポーランド位相空間の2点に対して閉区間[0, 1]上のボレル確率測度を対応させる写像でランダムに三角不等式をみたすものである。今年度得ることができた結果は以下の通りである。(1)ピラミッドの列の相転移性質に関わる研究として閉区間[0, 1]に通常の距離と1次元ルベーグ測度を入れた測度距離空間のl_p直積測度距離空間(1≦p≦2)の直積の個数nに関する列が臨界スケールオーダーnの(-1/p+1/2)乗の相転移性質をもつことを示した。(2)量子測度距離空間全体の集合上にコンパクト化に適合する距離で直径1以下の測度距離空間全体の集合から量子測度距離空間全体の集合への埋め込み写像がボックス距離とこの距離の意味で1-Lipschitzとなるようなものを構成した。26年度が最終年度であるため、記入しない。25年度はピラミッドの列の相転移現象に関する研究を行った.ピラミッドとはあるヒエラルキーをもつ測度距離空間の集合族のことであり, Gromovによる測度距離空間全体の空間のオブザーバブル距離が生成する位相でのコンパクト化の元である.ピラミッドの列P_nが相転移性質をもつとは,ある正の実数列c_nが存在し,正の実数列t_nに対してc_n/t_nが0に収束するときにt_nP_nが1点測度空間のみからなる集合に収束し, c_n/t_nが無限大に発散するときt_nP_nが測度距離空間全体の集合に収束することをいう. c_nを臨界スケールオーダーとよぶ.この性質が重要な理由は,相転移性質をもつリーマン多様体の列をc_nでスケールしピラミッドとして極限を考えるとある無限次元空間を表現するピラミッドを得ることができる.今年度得ることができた結果は以下の三つである.いずれも塩谷隆氏(東北大学)との共同研究で得られた結果である.一つ目はGromovが測度集中性を判定するために導入したκ-オブザーバブル直径とよばれる測度距離空間の不変量をピラミッドに拡張し,その極限公式を証明した.二つ目は極限公式を応用して,ピラミッドの列が相転移性質をもつための必要十分条件がそのオブザーバブル直径が0<κ<1によらないオーダーをもつことであることを示した.三つ目は1≦p≦∞と1点ではない測度距離空間Xに対して,その1-p直積測度距離空間Xanは相転移性質をもつことを示した.ただし1<p<∞の場合はXにinf_x≠yd (x, y)>0という離散的な仮定をおく.三つ目の結果の応用としてコンパクトで連結なリーマン多様体Mに対して,その直積リーマン多様体M^nが相転移性質をもつことがわかった.Gromovは測度距離空間全体の集合にオブザーバブル距離を考えた空間のコンパクト化を構成した。

(1)ピラミッドの列の相転移性質に関わる研究として閉区間[0, 1]に通常の距離と1次元ルベーグ測度を入れた測度距離空間のl_p直積測度距離空間(1≦p≦2)の直積の個数nに関する列が臨界スケールオーダーnの(-1/p+1/2)乗の相転移性質をもつことを示した。(2)量子測度距離空間全体の集合上にコンパクト化に適合する距離で直径1以下の測度距離空間全体の集合から量子測度距離空間全体の集合への埋め込み写像がボックス距離とこの距離の意味で1-Lipschitzとなるようなものを構成した。26年度が最終年度であるため、記入しない。Gromovによる測度距離空間全体の集合のコンパクト化の理論の解明が進んだことにより, 26年度に行う予定だった次元が無限大に発散する空間列の研究を実施できたので順調に進展している.今後の方針は今年度の研究の続きとして,相転移性質をもつリーマン多様体の列を臨界スケールオーダーでスケールした列のピラミッドとしての極限の具体例を構成することと,本来25年度に行う予定であったオブザーバブル距離を二つの無限測度をもつ点付き空間の間距離へと拡張し,測度距離空間に対して定義される「リッチ曲率が下からおさえられている」という条件である曲率次元条件の安定性を調べる予定である.
新規トリテルペン配糖体生合成マシナリーの構築

本研究では、1)植物トリテルペン配糖体の生合成/構造多様化の過程において重要な役割を果たしている糖転移酵素(UGT)を単離し、機能を解析するとともに、各種トリテルペノイドアグリコンをインビボ生産する組換え酵母においてUGTを共発現することにより、「組換え酵母における多様なトリテルペン配糖体のインビボ生産」の実行可能性を検証することを目的とした。平成25年度内に、酵母内在の2,3-オキシドスクアレンから4-エピ-ヘデラゲニンを生産するように改変した組換え酵母に、さらにタルウマゴヤシUGT73F3遺伝子を導入することで、酵母内在の糖供与体(UDP-グルコース)を利用して4-エピ-ヘデラゲニンの28位配糖体をインビボ生産する酵母の作出に成功した。平成26年度は、同システムを利用して様々なトリテルペン配糖体を生産することを目指して、新規のトリテルペン配糖体生合成関連UGTの単離を進めた。その結果、マメ科カンゾウからグリチルレチン酸の3位および30位それぞれにグルコースを転移することが強く示唆される新規UGTを同定した。同時に、酵母が生産する糖供与体のバリエーションを増やすことを目的として、UDP-グルコースをUDP-グルクロン酸に変換するUDP-グルコースデヒドロゲナーゼの候補遺伝子をカンゾウから6種単離し機能解析を行ったところ、4種について酵母内在のUDP-グルコースを基質としてUDP-グルクロン酸を生成する活性を認めた。今後、研究代表者らがこれまでに既に作出している各種トリテルペノイド生産酵母に平成26年度内に単離した新規UGTおよびUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することで、組換え酵母での各種トリテルペン配糖体の生成が可能であると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、1)植物トリテルペン配糖体の生合成/構造多様化の過程において重要な役割を果たしている糖転移酵素(UGT)を単離し、機能を解析することで「植物界におけるトリテルペン配糖体構造多様化の分子基盤を明らかにする」とともに、各種トリテルペノイドアグリコンをインビボ生産する組換え酵母において上記UGTを共発現することにより、「組換え酵母におけるトリテルペン配糖体のインビボ生産」の実行可能性を検証することを目的とする。β-アミリン合成酵素とシトクロムP450モノオキシゲナーゼに加え、さらにUGT遺伝子を組み合わせて酵母に導入することにより、組換え酵母における植物トリテルペン「配糖体」のインビボ生産が可能かを検証した。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)は内在するエルゴステロール生合成経路の中間代謝産物として2,3-オキシドスクアレンを生産する。研究代表者らはタルウマゴヤシ由来のP450を導入することにより、酵母内在の2,3-オキシドスクアレンを基質として4-エピ-ヘデラゲニンを生産する組換え酵母を作出した(Fukushima et al., 2013)。一方、マメ科モデル植物であるタルウマゴヤシから、ヘデラゲニンのC-28位にグルコースを付加するUGTとしてUGT73F3が同定されていた。そこで、UGT73F3を上記の4-エピ-ヘデラゲニン生産酵母に導入し、酵母内在の糖供与体を利用してインビボでの配糖体化が可能かを検証した。組換え酵母培養液の溶媒抽出物をLC-MSを用いて分析した結果、4-エピ-ヘデラゲニンに1分子のグルコースが付加したと推定される化合物が検出された。以上の結果から、組換え酵母におけるインビボ(酵母内在の糖供与体を利用)でのトリテルペン「配糖体」の生成が可能であることが示唆された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度中に、マメ科カンゾウ、タルウマゴヤシ、ミヤコグサ、ダイズから複数の機能未知のUGTのcDNAを単離しインビトロ酵素活性試験を行なった結果、数種のUGTがトリテルペノイドアグリコンへの糖転移活性を有することを確認した。さらに、OSC、P450、UGTを組み合わせて導入した組換え酵母内において、酵母内在のUDP-グルコースを利用してインビボでのトリテルペン配糖体の生産が可能であることを示した。より具体的には、ミヤコグサ由来のβ-アミリン合成酵素、タルウマゴヤシ由来のP450(CYP93E2およびCYP716A12)を導入することにより、酵母内在の2,3-オキシドスクアレンを基質として4-エピ-ヘデラゲニンを生産する組換え酵母を作出し、さらに、UGT73F3を導入することにより4-エピ-ヘデラゲニンのモノグルコシドを生成することに成功した。これにより、酵母内在の糖供与体を利用して、組換え酵母におけるインビボでのトリテルペン「配糖体」の生成が可能であることを示唆した。酵母に導入する各種オキシドスクアレン環化酵素(OSC、トリテルペン骨格形成酵素)、シトクロムP450酸化酵素(P450、トリテルペン骨格の酸化修飾酵素)およびUGTの組合せの数を増やし、生成するトリテルペン配糖体の構造多様化を目指す。また、UGTの糖供与体選択性決定に重要と推定されるアミノ酸残基への部位特異的変異を導入した機能改変UGT分子の設計を試みる。同時に、本来は酵母が生産しない植物由来の各種糖ヌクレオチドを生産するための酵素遺伝子を単離し、酵母に導入することにより、トリテルペノイドアグリコンに結合する糖のバリエーションの増加にもトライする。
大腸菌におけるエネルギー生産系の遺伝子の総検索

大腸菌のvisA(hemH)遺伝子を欠失したミュータントは全くヘムを作れないが、グルコースを含む完全培地上ではminute colonyを作る。この表現型に着目して、ヘミンを培地に加え、プロトヘム以前のステップに欠損が生じたものは排除するようにした上で、visA欠失株と同様の表現型を示すミュータントの分離を試みた。この場合、大腸菌はヘミンの透過しないので、まずhemin-permeable mutant(visA欠失株よりヘミン添加の培地上で大きなコロニーを作るもの)を分離し、この株を用いてNTGで処理した後、ヘミン添加のトリプトン培地中でペニシリン・スクリーニングにかけた。生き残ったバクテリアをヘミン添加のLBプレートにまき、暗所、37°Cで72時間保温後、minute colonyを単離した。次に大腸菌ゲノムのほぼ全域をカバーする小原らの整列クローンで相補性を調べた。相補したクローンにつき遺伝子地図から新しい遺伝子であるかどうかを判定すると共に、サブクローニング、塩基配列決定などの遺伝子解析を行なった。その結果、32箇所にマップされたミュータントのほとんどが新しいものであり、中には大腸菌染色体地図の複数箇所にマップされるものも見い出された。このうちミュータント#2-20と#1-10について詳しい解析を進めたが、#2-20はリボフラビン合成に関与する遺伝子のribHにホモロジーがあり、また#1-10はB・subtilisのgerC遺伝子とホモロジーがあった。この様に本研究で得たミュータントの多くはエネルギー代謝と直接関係をもつ遺伝子の変異したものであり、今後大腸菌細胞のエネルギー系関連遺伝子の全体像を明らかにするため役立つものと考えられる。
pHを指標にした生体内特異点の可視化を目指した蛍光プローブの創製

本研究において、動物体内にて起こる特異的な生命イベントを、pH変化を指標にして非侵襲的に広視野かつ長時間観察することを可能にする蛍光プローブの開発を目指す。例えば、生体内において、臓器のpHは厳密に制御されている一方、がんのような活発に細胞増殖が起こる組織においては弱酸性pHを示すなど、pHを観察することで、幅広い生命現象における特異点を検出できる可能性がある。そこで本研究において、合成化学を駆使し、これら目的を達成する、動物体内のpH変化を非侵襲的に観察可能とする蛍光プローブの開発を行う。
心材形成メカニズム解明に向けた放射柔細胞に特異的な遺伝子発現プロファイリング

心材の形成は樹木の特徴であり、特に心材の美しい色と高い耐腐朽性は木材利用にとって極めて重要な考慮すべき特性である。より美しい、より耐腐朽性の高い木材を得るために心材の性質の改良が望まれている。例えばスギでは黒色を呈する異常材が現れ、その林業上の価値は極めて低いものとなってしまう。色、耐腐朽性において、有利な心材の特徴を遺伝的に改良する需要が高い一方で、心材形成関連遺伝子研究の進歩は遅れている。これらを遺伝的に改良するには、その原因物質(セイクリンC、アガサレジノールなどの重合物)の動態および、生合成される分子メカニズムを知る必要がある。本研究は、放射柔細胞に焦点を当て、心材化(主に細胞死、心材成分の生合成、蓄積)に関与している放射柔細胞を時空間的な視点から決定し、さらに心材化制御因子のリスト化、同定を目的とした。レーザーマイクロダイセクション(LMD)法を用いれば放射柔細胞のみを単離でき、しかも放射方向に段階的に単離することが可能である。特異的または網羅的な遺伝子発現解析および代謝物解析によって、心材化に関与する候補遺伝子をリスト化後、機能検証することによって心材化制御因子の同定を試みる。本年度は昨年度に引き続き、平成29年5月に農学部附属演習林(福岡県糟屋郡篠栗町)において、心材を形成している樹齢25から40年のスギからサンプルからのcDNA合成条件の検討、およびセイクリンC、アガサレジノールの検出条件の検討を行った。多糖類を非常に多く含むサンプルからRNAを抽出するにあたり、遺伝子解析に使用するために必要な質および量を満たすRNAを得ることができず、安定した結果を得ることが現状難しい。量を確保するために凍結サンプルに対するRNA later処理について、質を確保するために多糖類除去処理についてそれぞれ検討を行う。本年度は、平成29年5月に農学部附属演習林(福岡県糟屋郡篠栗町)において、心材を形成している樹齢25から40年のスギからサンプルを採取し、クライオスタットを用いた新鮮凍結薄切切片の作製条件の検討およびレーザーマイクロダイセクション装置を用いて、新鮮凍結薄切切片から切取りとった放射柔細胞から発現定量解析および代謝物解析が可能な量(面積×厚さ)について検討を試みた。クライオスタットを用いて樹齢25-40年の心材を形成している生木から、新鮮凍結薄切切片を作製することに成功した。しかし、29年度に予定していたLMDによって切り出した放射中細胞から次世代シーケンサーを用いた発現解析を行うのに十分な質と量を安定して確保する方法の確立には至っていない。

クライオスタットとLMDを用いたスギの盤状サンプルから必要十分量の放射柔細胞を回収するのは、労力と時間を要する作業である。この過程に時間を要することが、安定してRNAを確保できない一因となっている。安定してRNAを確保するためにはなるべく早く新鮮凍結切片作成LMDによる切り出し過程の操作を終わらせる必要がある。そこで、テクニカルスタッフを雇用し、協力して可能な限り早くこの過程を終了させることによって研究の推進を図る。世代シーケンサーを用いた発現解析を行うのに十分な質と量を安定して確保する方法が確立でき次第、速やかに発現解析と代謝物解析に移行する。量を確保するために凍結サンプルに対するRNA later処理について、質を確保するために多糖類除去処理についてそれぞれ検討を行う。端数(1万円以下)が生じたため。2018年度に実施予定の遺伝子解析および代謝物解析実験をを2019年度に回し、それに伴い、消耗品の購入が2019年度に回ったため。
非コンパクト多様体上の測度保存同相群・微分形式保存微分同相群の位相的研究

非コンパクト多様体の(微分)同相群のコンパクト-開・Whitney・一様位相の下での位相的性質を研究した。コンパクト-開C∞位相の下で,体積形式に関するMoserの定理のパラメータ版を非コンパクト多様体の場合へ拡張した。また,WhitneyC∞位相に関して,非コンパクトC∞多様体の微分同相群及びコンパクト台を持つ微分同相の成す部分群の組が,1?の加算box積・small box積の組と局所同相になることを示した。一様位相に関しても,一様埋め込みの空間や一様同相群に対して変形定理を得た。多様体上の与えられた幾何構造を保つ微分同相写像の成す群の位相的・代数的性質の解明は,幾何学の研究において重要なテーマの1つである。本研究では,非コンパクトC^∞多様体Mの微分同相群D(M)や体積形式wを保つ微分同相写像の成す群D(M;w)のコンパクト-開C^∞位相の下での位相的性質に関して考察した。Mのエンドに向かう体積の移動のデータを微分同相写像で実現する問題を考察し,まず,体積形式に関するMoserの定理のパラメータ版を非コンパクト多様体の場合へ拡張した。さらに,Alpern-Prasadのエンドチャージ準同型が連続なセクションを持つ事を示した.この応用として,単位連結成分について,群D(M)_0が部分群D(M;w)_0に,さらにD(M;w)_0がエンドチャージ準同型の核に,それぞれ強変形レトラクトする事がわかった。さらに,2次元多様体の場合に,群D(M)_0,D(M;w)_0及びコンパクト台を持つ微分同相の成す部分群D^c(M)_0,D^c(M;w)_0のホモトピー型の分類についても結果が得られている。一方,Whitney(C^∞)位相の下での,(微分)同相群や位相群への連続写像の成す空間の位相的性質の研究を連携研究者酒井・嶺・Banakh氏と進め,(自明な例外を除いて)非コンパクト局所コンパクト可分距離空間Xから可分完備ANR位相群Gへの連続写像全体の成す空1間C(X,G)とコンパクト台を持つ連続写像の成す部分空間C_c(X,G)の組(C(X,G),C_c(X,G))が1_2の加算box積・small box積の組と局所同相になる事を示した。さらに,非コンパクトC^∞多様体Mに対して組(D(M),D^C(M))も同様の性質を持つ事を示した。これらの結果に関しては,国際会議,国内の学会・シンポジウム等において積極的に発表を行った。本研究では,非コンパクトC^∞多様体Mの微分同相群D(M)や体積形式wを保つ微分同相写像の成す群D(M;w)のコンパクト-開C^∞位相・Whitney C^∞位相・一様位相等の下での位相的性質に関して考察している。Whitney C^∞位相に関する主要な結果として,非コンパクトC^∞多様体Mの微分同相群及びコンパクト台を持つ微分同相の成す部分群の組(D(M),D^c(M))は,1_2の加算box積・small box積の組と局所同相になる。特に,部分群D^c(M)はパラコンパクト1_2×R^∞多様体になる.位相多様体の場合も,Mの次元が2以下の場合は同様の結果が成り立つ(3次元以上の場合は未解決予想)。また,部分群D^c(M)は位相群のカテゴリーの中で自然に順極限となっている.これは,順極限位相の下でD^c(M)が位相群にならないことと対比される(共著出版論文2011)。さらに,Mが2,3次元の場合には,コンパクト多様体の微分同相群のホモトピー型に関して知られている結果からD^c(M)のホモトピー型に関する結果も得られている。また,無限型曲面に対して,コンパクト台を持つ同相写像の群から定義される写像類群の研究も進んでいる。(研究会における口頭発表)。さらに,コンパクト多様体の被覆空間上の一様同相の成す群の一様位相の下での位相的な性質の研究も進展している。本研究では,非コンパクト多様体の(微分)同相群の位相的性質に関して考察してきたが,本年度は,特に,一様同相写像の成す群の一様位相の下での位相的性質の解明が進展した。一様位相は解析の分野でも基本的な位相として現れるが,一様位相の下での同相群の性質は,十分に理解されていなかった。

一様位相は距離に依存し,適した距離を選ぶ事が重要である。本研究では,コンパクト多様体上の距離被覆空間となる非コンパクト距離多様体Mを考察した。まず, Edwards - Kirbyのコンパクト部分集合の位相多様体への埋め込みに関する局所変形定理とArzela-Ascoli定理から, Mへの一様埋め込みに関する局所変形定理を得た。この変形定理は,一様埋め込みの定義域に関して加法性を持つので,より一般の距離多様体,例えば,幾何的な群作用を持つ距離多様体に関しても成り立つ事が分かる。特に,これらの多様体の一様同相群は一様位相の下で局所可縮となることが分かる。我々は,一様同相群の大域的な性質により関心がある。ユークリッド空間の無限遠に関しては,相似変換と組み合わせることによって,局所変形定理から一様同相群の大域的な変形定理が導かれる。これから,さらに,ユークリッド空間の無限遠とリプシッツ同値な有限個のエンドを持つ距離多様体の一様同相群に関する変形定理が得られる。特に,ユークリッド空間自身の有界一様同相群は,一様位相の下で可縮になることが分かる。また,本年度は,6ECM (Poland, July)に参加し,幾何トポロジーに関するサテライト研究集会において,非コンパクト多様体の体積保存微分同相群についてこれまでに得た結果に関して研究発表を行った。研究代表者が主体的に行っている研究に関しては,おおむね順調に進展しているが,共同研究の部分で,研究者間の仕事分担の調整に遅れが生じている。24年度が最終年度であるため、記入しない。(体積保存)微分同相群のコンパクト・開位相,Whitney位相の下での位相的性質の研究を,これまでの研究を基礎にさらに推進する。一方,一様位相も同相群に対する基本的な位相の1つであるが,その性質はこれまでのところあまり解明されていなかった。共同研究により既に実数直線の一様同相の成す群及びその典型的な部分群の一様位相の下での位相型を決定している(共著出版論文2011年3月)。この研究の発展として,n次元ユークリッド空間や,さらにコンパクト多様体の被覆空間となる非コンパクト多様体の一様同相の成す群についての研究を前進させることができた。H24年度は,この研究をさらに発展させ,微分同相群の場合に一様C^∞位相の基本的な性質やコンパクト・開位相,Whitney位相との相違を明らかにする。
レーザー励起光散乱分光法による2次元濃度分布測定法の開発

本研究の目的は、建築分野における応用を目指し、レーザー励起光散乱分光法により、散乱体の粒子数分布や形状分布を求めて、その空間分布すなわち濃度を2次元で高速・高精度で測定可能な装置を開発することである。昨年度までに狭い室内環境で煤煙散乱体粒子の濃度、距離測定を可能にしてきた。しかし、室内測定において更なる高精度化や屋外測定を行うには測定系のうち、受光系の改良が必要になる。本年度は屋外測定を視野にいれ、室内でもさらに高精度測定できるように受光系の改良とコンパクト化を行った。改良点としては、以前の集光器は単レンズ(φ60)であったが、高い集光能力、狭い視野を持つシュミット・カセグレン式反射望遠鏡(SC望遠鏡、φ200)を使用した。屋外測定を行うためには、透過率、分光性能が良い分光器を使用するのが最善であるが、大きさ、重量の面で持ち運びが不便となるため、今回は小さく軽量な干渉フィルター(φ25)を使用した。このように受光部を改良して5,10,15,20,25m各地点に散乱体としてポリスチレン板を設置し距離、ミー後方散乱光信号強度(濃度)測定を行った。距離を測定するためのトリガー信号を得るためにバイアス無しのフォトダイオードを使用した。その結果、各地点に対する散乱光信号強度のピークが、ほぼ設置点をと同じ位置で得られた(実際には数m^数10cmのズレが生じた)。昨年度50cmに設置したときと、今回の実験で行った5mに設置したときでは後者のほうが2倍以上の信号強度を得ることが出来た。この結果から、距離の測定精度の改善とSC望遠鏡の高い集光能力により微弱な散乱光信号を感度良く測定できる様になった。(1)空気中のトレーサーや粉塵等のレーザー励起光散乱分光法による2次元・3次元濃度分布計測装置を開発する。(2)まずCO_2を対象として、レーザー励起光散乱分光法による1次元の濃度分布測定技術を確立し、測定精度の基礎的な検証を行う。(3)次に2次元測定装置を試作して、補間関数によるデータ処理アルゴリズムにより2次元計測を行い、精度を検証する。また3次元に拡張するための装置構成を与える。今年度は、研究計画に基づき、ミー散乱レーザーレーダを試作した。励起光源としてQスイッチNd:YAGレーザー(パルス幅3ns)の第2次高調波(波長532nm)を使用して、空間中に配置した既知の濃度の散乱体からの後方散乱光を距離の関数として測定した。機知の濃度の散乱体としてアクリル板(厚さ1mm)とモルタル壁両方からの後方散乱光を測定し、それぞれの空間中での位置と濃度に対応した信号を測定することができた。既知の距離に設置した散乱体からの信号測定により、トリガーパルス用の検出器の動作条件を検討し直す必要があることがわかった。レーザー光軸上の1次元の濃度分布を測定できるミー散乱レーザーレーダシステムを構築することができた。今後はこのシステムを基本として、より希薄な散乱体からの後方散乱光を測定できるシステムの開発と、レーザー光で空間を走査して2次元・3次元濃度分布を測定できるシステムへの拡張を目指して検討を進める予定である。
脂肪幹細胞を用いた骨芽細胞シートの開発研究

本研究は脂肪由来幹細胞(ASC)を用いた骨芽細胞シートの作成を目的として行われた。脂肪幹細胞は骨髄由来幹細胞と比較し採取が容易なことから、現在細胞の供給源として注目されている。本研究ではASCはICRマウスの背部皮下組織から採取した脂肪組織をコラゲナーゼ処理を行い脂肪細胞を分離した。これを75cm2培養用フラスコにて大量培養した(D-Mem,100mg/ml Penicillin-Streptomycin)。さらにASCをAscorbic Acid,Hydrocortisone,β-Glycerophosphateを添加した骨誘導培地にて培養し骨芽細胞へ分化誘導を行った。この手法にて骨誘導を行ったASCの骨芽細胞マーカーは細胞上清をELISA法にて計測し、アルカリフォスファターゼおよびOsteocalcinの活性にて確認した。こうして分離したASCを移植するための基剤には同種(ICRマウス)より採血し、分画したトロンビンおよびフィブリノーゲンから精製したフィブリンシートに着目した。マウス血液から作成したフィブリンシートは精製後に物性試験を行った。無血清培地での耐性試験では約1週間程度形状維持されていたが10日目以降萎縮し約14日程度で吸収され消失した。フィブリンシートの生成実験後に骨芽細胞シートの生成実験を行った。トロンビンおよびフィブリノーゲンはガラス製シャーレ内で反応させ、同時に骨分化を行ったASCを混和させた。その後CO2インキュベーターで24時間培養し、培養後位相差顕微鏡にて細胞内でのASCの定着を確認した。H26年度の研究実績としては骨芽細胞シートの生成実験までを主体として行われた。以後の研究内容としては生成した骨芽細胞シートの移植実験を計画している。26年度が最終年度であるため、記入しない。
肝局所薬物動態と治療効果の最適化を図る製剤設計に基づく二層型シート製剤の開発

肝臓など腹腔内臓器表面からの薬物吸収を利用するDDS製剤を、臨床応用するための基盤を確立することを目的として、病巣部位選択的な薬物送達を可能にする肝臓表面投与法を提案し、抗癌薬含有シート製剤の開発に着手した。これまでに生分解性を有する高分子の基剤のみで構成するシート製剤を試作したところ、薬物放出速度が極めて遅く、臨床応用への障壁となる可能性が高いことが推察された。したがって、シート製剤の臨床応用では適切な薬物放出速度制御が重要になる。そこで本年度は、薬物放出速度の向上が期待できる添加剤を併用した、抗癌薬Doxorubicin(DOX)を含有する二層型シート製剤を作製し、薬物放出性とマウスでの体内分布を評価した。シート製剤の基剤には、生分解性高分子Poly(D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA)を用い、添加剤としてPolyvinylpyrrolidone K30 (PVP)、Hydroxypropyl cellulose (HPC)を選択した。DOX、基剤および添加剤の混合液をガラス製円筒に滴下し風乾させた。直径12 mmの半円に切り取りPLGAのみのシート製剤と重ね合わせ、二層型とした。DOXを含有したシート製剤にPVPおよびHPCを10%(w/w)併用することができた。PVPおよびHPCを併用し、基剤量を調節することにより、シート製剤からのDOX放出に適度な徐放性が認められた。添加剤を併用したシート製剤をマウス肝臓に貼付したところ、6日後まで貼付部位近傍にDOXの集積が認められた。一方、DOXは血漿と心臓にほとんど移行しておらず、全身への副作用は低いものと推察された。以上の結果より、DOX含有シート製剤に添加剤を併用することで薬物放出性や体内分布を制御できる可能性が示唆された。今年度の大きな目的である、マウス肝臓表面へ適用可能な、抗癌薬と添加剤を封入した徐放化に優れた、片面からの薬物放出を可能にする二層型シート製剤を作製し、体内動態の評価を予定通り達成できた。しかしながら、次年度に計画している担癌モデル動物における二層型シート製剤の効果判定のための、腫瘍細胞の播種条件などの最適化に、当初予定していた以上の時間を費やした。また、担癌モデル動物において、組織透明化の手法を活用した抗癌薬の肝臓内分布の可視化の予備検討も進めている。さらに、遺伝子デリバリーへの二層型シート製剤の適用を想定して、活性酸素種などの細胞内イベントの遺伝子発現への影響を検証している(論文業績)。均一な形状の片面からの薬物放出を可能にする抗癌薬ドキソルビシン含有二層型シート製剤の作製方法を確立できたので、マウスを用いて、癌細胞(Hepa1-6など)移植により、肝癌の病態モデル動物を作製する。ドキソルビシンの二層型シート製剤を、肝癌モデル動物の肝臓表面の癌病巣に貼付する。抗癌薬の肝臓などへの体内分布、および治療効果・副作用の指標となる細胞死や酸化ストレスレベルを、組織透明化の手法を活用して可視化する。さらに、ここまでのデータに基づいて、肝臓表面へ貼付後の抗癌薬の肝局所動態を生理学的モデルを活用して薬物速度論的に解析し、副作用をシミュレーションする。

また、担癌モデル動物において、組織透明化の手法を活用した抗癌薬の肝臓内分布の可視化の予備検討も進めている。さらに、遺伝子デリバリーへの二層型シート製剤の適用を想定して、活性酸素種などの細胞内イベントの遺伝子発現への影響を検証している(論文業績)。均一な形状の片面からの薬物放出を可能にする抗癌薬ドキソルビシン含有二層型シート製剤の作製方法を確立できたので、マウスを用いて、癌細胞(Hepa1-6など)移植により、肝癌の病態モデル動物を作製する。ドキソルビシンの二層型シート製剤を、肝癌モデル動物の肝臓表面の癌病巣に貼付する。抗癌薬の肝臓などへの体内分布、および治療効果・副作用の指標となる細胞死や酸化ストレスレベルを、組織透明化の手法を活用して可視化する。さらに、ここまでのデータに基づいて、肝臓表面へ貼付後の抗癌薬の肝局所動態を生理学的モデルを活用して薬物速度論的に解析し、副作用をシミュレーションする。(理由)組織透明化の予備検討を開始し、正常動物における実験手法は確立できた。しかしながら、担癌動物における組織透明化の手法を検証するために、肝臓内の局所への癌移植のための基礎的な安定した条件設定に想定以上の時間を要し、動物実験が予備的検証にとどまってしまったため、次年度使用額が生じた。(使用計画)シート製剤作製のための抗癌薬(ドキソルビシン)、高分子添加剤(PLGA, HPC)などの薬品類を購入する。その他、抗癌薬などの定量用のガラス・プラスチック器具の購入を予定している。一方、シート製剤の大部分の評価をin vivo系で行うこと、実験的担癌モデル動物(マウス)を作製することから、実験用動物の購入に多額の経費を見込んでいる。さらに、DDS、薬物動態、薬物治療に関する学会に参加し、製剤設計やがん化学療法に関する最新の研究成果の情報収集および成果発表のための旅費を見込んでいる。
非線形複合システムの自己繊織化機能とカオス

1.非線形複合システムの分岐現象とカオスの研究非線形複合システムの自己組織化機能の基礎研究として、まずシステムのパラメータの微少変化により、システムのふるまいが位相的に変化する分岐現象にいつて研究した。一般にパラメータ集合を求めることが高次の系では困難であるが、システムの線形部が可制御標準形に変形できるときは、分岐集合は1次元システムの分岐集合を求める方法に帰着できる。このことを使って、複合システムの分岐集合を比較的簡炭に求める方法を研究し、多くの例題を使って種々の複合システムに発生する分岐現象とカオスの発生を示した。2.非線形複合システムの自己組織化機能の研究複数個のシステムが結合して自律的なふるまいを示すモデルとして、2つの非線形発振器を考え、この結合パラメータにより、2つの発振器の周波数および位相が同期するメカニズムを研究した。するのち、結合システムに対し、あるポテンシャル関数を考え、そのポテンシャル関数の極値を検討することにより、周波数および位相の同期がとれることを明らかにした。この結果から、非数形複合システムのポテンシャル関数が求められる場合には、自己組織化機能のメカニズムが解明されることが明らかになった。3.ニーラルネットワークによる連想記億の研究非線形複合システムの自己組織化モデルとして、連想記憶をとりあげた。本研究は2層のニューラルネットワークモデルを用いて、相互相関型連想記憶の実現を考えたもので、従来の方法では実現できなかったすべての記憶パターンを、ネットワークの平衡点として記銘する方法を示した。これにより従来よりも記憶容量が増加し、その連想能力もすぐれているシステムが実現できた。