hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌化学療法の個別化のための遺伝子検査法の開発と臨床応用:抗癌剤代謝酵素の遺伝子多型と耐性遺伝子発現パターンの検出

癌の化学療法において、個々の患者で抗癌剤に対する治療反応性および副作用発現の程度は異なる。患者ごとに最適な治療効果を引き出し、副作用を最小限に抑えるには、腫瘍における抗癌剤耐性の状態を知る必要がある。本研究は、癌の治療反応性の違いが代謝や輸送および癌細胞の耐性機構に起因することに着目し、白血病細胞における葉酸拮抗剤methotrexate(MTX)耐性の分子機構を解明し、耐性の状態を検出する指標となりうる遺伝子情報を明かとすることを目的とした。酸化型葉酸PGAの供給下に作製した5000倍MTX耐性株化培養白血病細胞CCRF-CEMでは、薬剤膜輸送を担う還元型葉酸キャリア(RFC1)の46番コドンの2番目のヌクレオチド置換によりSer→Asnのアミノ酸置換をもたらすことが判明した。MTX大量療法と還元型葉酸leucovorin(LV)救済療法における耐性の分子機構を知るため、高濃度のLVの供給下にCCRF-CEM細胞をMTX耐性化した。メチルセルロースクローニングにて、in vitroの薬剤感受性試験で耐性度の異なる3クローンを得た。これら細胞において、DHFRの遺伝子発現は、耐性度に比例して増加が見られた。一方、RFC遺伝子発現には明らかな差を認めず、47番目コドンのアミノ酸置換(Ser→Phe)をもたらす遺伝子変異が明らかになった。高度耐性でさらに112番目コドンの遺伝子変異(欠失)が明らかになった。MTX細胞株でMTXの細胞内貯留に変化なく、耐性度の高い細胞株ほど膜輸送が低下していた。耐性度の高い細胞株ほど細胞増殖に高い還元型葉酸供給を必要とした。MTX耐性CCRF-CEMの主要な分子機構として、供給される葉酸様式や耐性度によって、DHFR遺伝子発現やRFC1の多様な遺伝子変異が関与していることが明らかとなった。一薬剤に対する耐性機構においても、複数遺伝子の発現異常と遺伝子変異が関与することが明らかとなった。これら遺伝子の発現パターンや変異が薬剤耐性の指標となりうると考えられる。我々は、癌の抗腫瘍剤に対する治療反応性低下すなわち耐性において、分子レベルで機構を解明し、その分子機構を指標とした耐性状態の遺伝子検査法の開発と臨床応用を試みてきた。葉酸拮抗剤のmethotrexate(MTX)治療反応性低下すなわち耐性の主要な分子機構として、薬剤の細胞膜輸送の低下が知られている。本研究では、薬剤耐性の状態を知り薬剤選択の指標となる耐性遺伝子発現の候補として、白血病細胞での薬剤膜輸送を担う還元型葉酸キャリアの遺伝子(RFC1)発現とその塩基配列をMTX耐性株化培養白血病細胞にて調べた。還元型葉酸leucovorinの供給下に作製した1600倍MTX耐性白血病細胞CCRF-CEMでは、標的酵素のジヒドロ葉酸dihydrofolatereductase: DHFRの遺伝子増幅に加え、RFC1発現増加を示した。一方、酸化型葉酸PGAの供給下に作製した5000倍MTX耐性白血病細胞では、RFC1の46番コドンの2番目のヌクレオチド置換によりSer→Asnのアミノ酸置換をもたらすことが判明した。MTXに耐性化した白血病細胞CCRF-CEMの主要な抗腫瘍剤耐性の分子機構として、DHFRに加え、RFC1の多様な遺伝子変異が関与していることが明らかとなった。MTXに対する耐性の診断には、DHFR、RFC1など複数の遺伝子の発現変化や点突然変異など多様な変異が検出の指標となると考えられる。我々は、癌の治療反応性低下すなわち耐性において、分子レベルで機構を解明し、その分子機構を指標とした耐性状態の遺伝子検査法の開発と臨床応用を試みている。

昨年度、酸化型葉酸PGAの供給下に作製した5000倍methotrexate(MTX)耐性株化培養白血病細胞CCRF-CEMでは、薬剤膜輸送を担う還元型葉酸キャリア(RFC1)の46番コドンの2番目のヌクレオチド置換によりSer→Asnのアミノ酸置換をもたらすことが判明した。今年度は過剰(1000nM)の還元型葉酸leucovorinの供給下に作製したMTX株化培養白血病細胞CCRF-CEMにおいて、耐性の分子機構を調べた。還元型葉酸leucovorinの供給下に作製したMTX耐性CCRF-CEM細胞をメチルセルロースにてクローン化し、耐性度の異なる3クローン(それぞれ約100,1000,10000倍耐性)を得た。MTX耐性度と耐性の分子機構との関係を調べた結果、DHFRの遺伝子発現は、耐性度に比例して増加が見られ、H^3標識MTXの細胞内取り込みにて評価したMTX膜輸送は、耐性度と反比例して低下が認められた。H^3標識MTXの細胞内保持には有意な差を認めなかった。RFC遺伝子発現には明らかな差を認めず、RFC遺伝子コード領域の塩基配列を検索した結果、47番目コドンのアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異が明らかになった。MTX膜輸送低下の分子機構として遺伝子変異により機能低下したRFC遺伝子発現が示唆された。MTX耐性白血病細胞CCRF-CEMにおける耐性の主要な分子機構として、供給される葉酸様式や耐性度によって、DHFR遺伝子発現やRFC1の多様な遺伝子変異が関与していることが明らかとなった。酸化型葉酸PGAの供給下に作製した5000倍methotrexate(MTX)耐性株化培養白血病細胞CCRF-CEMでは、薬剤膜輸送を担う還元型葉酸キャリア(RFC1)の46番コドンの2番目のヌクレオチド置換によりSer→Asnのアミノ酸置換をもたらすことが判明した。還元型葉酸leucovorinの供給下に作製したHTX株化培養白血病細胞CCRF-CEMにおいて、DHFRの遺伝子発現は、耐性度に比例して増加が見られ、RFC遺伝子発現には明らかな差を認めず、47番目コドンのアミノ酸置換をもたらす遺伝子変異が明らかになった。高度耐性において112番目コドンの遺伝子変異が明らかになった。MTX細胞株でMTXの細胞内貯留に変化なく、耐性度の高い細胞株ほど膜輸送が低下していた。耐性度の高い細胞株ほど細胞増殖に細胞外からの高い還元型葉酸供給を必要とした。MTX耐性白血病細胞CCRF-CEMの主要な分子機構として、供給される葉酸様式や耐性度によって、DHFR遺伝子発現やRFClの多様な遺伝子変異が関与していることが明らかとなった。MRP1、は発現なく、MRP2、MRP3、MRP4、MRP6に変化は認められなかった。一薬剤に対する耐性機構においても、複数遺伝子の発現異常と遺伝子変異が関与することが明らかとなった。これら遺伝子の発現パターンや変異が薬剤耐性の指標となりうると考えられる。
脳型プロスタグランジントランスポーターの分子的実体と生理的役割

In vivoラット脳室内投与法及びin vitroラット単離脈絡叢を用いた取り込み解析によって、脳内主要プロスタグランジンであるPGD_2及びPGE_2は血液脳脊髄液関門を介し、脳室内から排出輸送されることが示唆された。申請者が単離した脳型プロスタグランジントランスポーター(PGT-Br)の関与を明らかにするため、PGT-Br発現アフリカツメガエル卵母細胞を構築した。本細胞にて、PGD_2輸送活性は、コントロール(水注入)と比較し上昇傾向は示されたものの、有意ではなかった。脳内プロスタグランジン(PG)濃度は神経活動の恒常性維持に重要でありながらも、脳において酵素的なPGの不活化はほとんど行われていないことが示唆されている。我々は脳脊髄液(CSF)と循環血液を隔てる血液脳脊髄液関門(BCSFB)において新規脳型PGトランスポーター(PGT)の存在を示唆する結果を得ており、本研究では新型PGTの分子実体を明らかにすること、新型PGTの脳内PG濃度調節への関与を明らかにすることを目的とした。新型PGTが有すると考えられる既報PGTオリゴ配列を用いnorthern blot解析を行った結果、マウス脈絡叢には既報のPGT mRNAよりも分子量の低い(約200-300 base低い)PGT様のmRNAが発現することが示唆された。その候補配列を元に、マウス脈絡叢から、RACE法によって既報のPGTとは異なるPGT様の配列を数種類クローニングした。既報のPGT配列もマウス肺からのクローニングに成功し、新規PGTと既報のPGTとの比較解析を行う準備が整った。また、CSF中に存在するPGの中で、発熱等に重要なPGE_2のCSFからの消失を輸送実験にて解析した。ラット脳室内に投与した[^3H]PGE_2の消失クリアランスは40μL/minであり、CSF bulk flowマーカーである[^<14>C]D-mannitolの値(4.9μL/min)と比較して約8倍高い値であった。さらに、非標識PGE_2投与によってCSF中[^3H]PGE_2残存量は上昇した。また、ラットBCSFBの実体である脈絡叢に[^3H]PGE_2は取り込まれ、非標識PGE_2やペニシリンG、タウロコール酸等の有機アニオン輸送担体に親和性を有する化合物によって阻害された。従って、ラットBCSFBには有機アニオン化合物感受性のPGE_2輸送担体が存在することが示唆された。血液脳脊髄液関門(BCSFB)を介してPGE_2の排出に、既報のprostaglandin transporter(PGT/Slco2a1)が関与するか明らかにするため、ラット単離脈絡叢へのPGE_2取り込み様式を詳細に解析した。ラット単離脈絡叢への[^3H]PGE_2取り込みは濃度依存性が示され、飽和性コンポーネントのKm値は23μMと算出され、既報のrat PGTに対するPGE_2のKm値とは近似しなかった。その一方でラットorganic anion transporter 3(Oat3/slc22a8)発現アフリカツメガエル卵母細胞(oocyte)を作成し、PGE_2取り込みの濃度依存性を解析した結果、Km値は4.2μMと算出され、本値と近似した。また、Oat3発現oocyteへのPGE_2取り込みに対する薬物等の阻害効果を解析した結果、ラット単離脈絡叢へのPGE_2取り込みに対する阻害効果を解析した結果と類似した。その一方で、PGT発現oocyteを作成し、本細胞への[^3H]PGD_2輸送解析を行った結果、単離脈絡叢へのPGE_2取り込みを阻害するbenzylpenicillinを始めとした薬物(Oat3を阻害すると言われている)について、一部阻害効果は示されなかった。ラットに対し脳室内投与法によって、脳脊髄液中からの消失に対する、Oat3特異的阻害剤であるbenzylpenicillin (25mM)の阻害効果を検討した結果、5mM非標識PGE_2共存下と同程度まで排出が阻害された。以上の結果から、脳脊髄液からのPGE_2排出については既報のPGTの寄与が小さく、他の有機アニオン化合物輸送担体としてOat3がBCSFBを介したPGE_2輸送に関与することが明らかとなった。Prostaglandin(PG)D2は睡眠・覚醒サイクルに関係することから、血液脳脊髄系関門(BCSFB)におけるPGD2排出輸送、そしてその過程へのPGTの関与を明らかにすることは重要である。そこで、既報のマウスPGTを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を用い解析を行った結果、[3H]PGD2取り込みが示され、そのKm値は1.1μMと算出された。各種有機アニオン性化合物による阻害効果を検証した結果、PGB1などによって阻害された。[3H]

PGD2のBCSFBを介した排出輸送を脳室内投与法によって評価した結果、bulkflowと比較し約20倍高いクリアランス値が得られた(153μL/(min・rat))。さらに、単離脈絡叢への[3H]PGD2取り込みはPGB1などのin vivo PGTを介した[3H]PGD2輸送を阻害した薬物によって阻害された。従って、BCSFBを介したPGD2排出輸送に一部PGTが関与することが示唆された。このPGD2排出輸送について、申請者が単離した新型PGTが関与するか明らかにすることは重要である。昨年度までに数種の新型PGT open reading frame (ORF)単離が成功していたが、予備的な検討結果にてアフリカツメガエル卵母細胞へ新型PGTを発現させても、大きな輸送活性は示されなかった。過去の報告では、アフリカツメガエル卵母細胞と、HEK293細胞などのほ乳類細胞の両発現系間では有機アニオン輸送担体の活性が異なることが示されている。現在、新型PGT ORFをほ乳類細胞発現系ベクターへの組み替えが完了し、現在その発現系の評価及びPG輸送活性の解析に着手している。
マルコフ性を有するカオス拡散符号を用いた非同期DS/CDMAシステム

従来,DS-CDMA通信では,シフトレジスタ回路によって生成されるGold系列やKasami系列がスペクトル拡散符号として広く用いられている.研究代表者らは,信号の到着遅延時間がユーザごとに異なる非同期CDMA通信の場合,1チップ以下の遅れは不可避であるとの立場から,チップ非同期CDMA通信の性能評価を行った.本年度は,ユーザ間干渉の総和値であるTSC(total square correlation)のチップ非同期版を定義し,その下界を与えた.チップ非同期版TSCは,スペクトル拡散符号に加えて送信パルスの形状に依存するので,従来別々に設計されていた拡散符号とパルス波形は,同時最適化されるべきである.パルス波形に関しては,単一ユーザによるBPSK通信用のレイズドコサイン波形がCDMAでもそのまま利用されている.レイズドコサイン波形は,シンボル間干渉ゼロを補償するナイキスト条件を満足するが,チップ非同期CDMA通信では,シンボル間干渉よりもユーザ間干渉により信号の劣化が起こるので,研究代表者らはナイキスト条件を緩和することを提案した.波形と拡散符号の同時設計を行い,帯域外エネルギーがレイズドコサイン波形に等しくなるように調整したガウス波形とカオス力学系に基づくマルコフ符号の組み合わせが,従来のレイズドコサイン波形とシフトレジスタ系列の組み合わせよりも,ユーザ間干渉を下げることを示した.ビット誤り率に関しては,接続しているユーザ数が少ない場合は,ユーザ間干渉の減少よりも,ナイキスト条件を満たさないことによる信号の劣化度の方が強いので,ガウス波形とマルコフ符号の組み合わせの性能は悪いが,ユーザ数が多い通常のCDMAの運用環境では,この組み合わせの方が従来の符号と波形よりも優れていることを,理論的に示すとともにシミュレーション実験により確認した.従来,DS-CDMA通信では,シフトレジスタ回路によって生成されるGold系列やKasami系列がスペクトル拡散符号として広く用いられている.研究代表者らは,信号の到着遅延時間がユーザごとに異なる非同期CDMA通信の場合,1チップ以下の遅れは不可避であるとの立場から,チップ非同期CDMA通信の性能評価を行った.本年度は,ユーザ間干渉の総和値であるTSC(total square correlation)のチップ非同期版を定義し,その下界を与えた.チップ非同期版TSCは,スペクトル拡散符号に加えて送信パルスの形状に依存するので,従来別々に設計されていた拡散符号とパルス波形は,同時最適化されるべきである.パルス波形に関しては,単一ユーザによるBPSK通信用のレイズドコサイン波形がCDMAでもそのまま利用されている.レイズドコサイン波形は,シンボル間干渉ゼロを補償するナイキスト条件を満足するが,チップ非同期CDMA通信では,シンボル間干渉よりもユーザ間干渉により信号の劣化が起こるので,研究代表者らはナイキスト条件を緩和することを提案した.波形と拡散符号の同時設計を行い,帯域外エネルギーがレイズドコサイン波形に等しくなるように調整したガウス波形とカオス力学系に基づくマルコフ符号の組み合わせが,従来のレイズドコサイン波形とシフトレジスタ系列の組み合わせよりも,ユーザ間干渉を下げることを示した.ビット誤り率に関しては,接続しているユーザ数が少ない場合は,ユーザ間干渉の減少よりも,ナイキスト条件を満たさないことによる信号の劣化度の方が強いので,ガウス波形とマルコフ符号の組み合わせの性能は悪いが,ユーザ数が多い通常のCDMAの運用環境では,この組み合わせの方が従来の符号と波形よりも優れていることを,理論的に示すとともにシミュレーション実験により確認した.良質な擬似乱数の生成法は、高度の情報セキュリテイを確立するための根幹・必須技術の一つである。従来擬似乱数系列として多用されていた有限体理論に基づくシフトレジスタ系列の代替物として、数多くのカオス系列が様々な分野で提案されているもののカオスの応用可能性の評価は定まっていなかった。しかしながらProceedings of the IEEEの特集号(20002年5月号)に見られるように、カオスの情報通信システムへの応用の重要性が漸く認識され始めた。本研究代表者はその特集号でカオスi.i.d.2値系列とそのストリーム暗号通信、スペクトラム拡散符号、CDMA通信に基づく画像伝送・電子透かしへの応用等に関する総説の招待論文を執筆した。本年度本研究代表者は実数値カオスから生成すべき系列のとり得る値が、p【greater than or equal】2値で有限の場合(実数値で無限の場合)、p値量子化関数(実数値系列のべき系列関数)を入力分布としたときの非線形写像による出力分布と写像の不変測度との相似則の成否が系列のi.i.d.条件であることを明確にした。本研究分担者の一人は、非同期およびチップ同期CDMA通信システムにおいて、不可避の同期ずれを含んだ正確なビット誤り率を用いて受信器の出力信号のモデルを作成し、旧来のシフトレジスタ系列・カオスi.i.d.2値系列対カオスマルコフ系列に対する、事後確率に基づく同期確立法を論じた。また他の研究分担者は、秘密通信システムの安全性を多端子通信システムの理論的評価を行った。また、木構造の情報源をカオスで生成するための実現法を与えた。カオスの情報通信システムヘの応用の重要性が認識されたのは最近のことである。コイン投げの数学的モデルであるi.i.d.(independent and identically distributed)2値系列の生成法としては、従来の区分線形関数や三角関数で規定される多項式型1次元力学系以外に,Jacobi楕円関数有理型1次元力学系が自然に導入される。

研究代表者は,さらにJacobi楕円関数の微分を新たな変数y_nとして導入することにより,有理関数型2次元力学系を提案した.本年度の成果は以下の3点に纏められる.(1)2次元の実数値系列をビット展開して得られる2値系列がi.i.d.となることの数学的証明を与えている.このことは,第一に,長いブロック長を持つAES等ブロック暗号強度評価に際し,大量な英文の取得が困難な現状を鑑みると,乱数平文系列が容易に生成できることを意味する.第二に,現在多用されているWeierstrass型楕円暗号のアルゴリズム実装法との密接な関連研究の必要性を示唆する.(2)カオスを利用した実数値型ElGamal公開鍵暗号系の脆弱性を明らかにした.このことは,冪演算の可換性を利用したElGamal型の暗号系に実数値の多項式を安易に適用できないことを意味する.(3)スペクトル拡散に基づく電子透かしシステムにおいて透かし情報の耐性を評価した.また,従来提案した方法と別のより簡便な電子透かし法も併せて提案した.CDMAの受信方式は,事前情報の前提により2つに大別できる.割り当てられた一人分の擬似乱数しか利用できないシングルユーザ受信と,同時利用者すべての擬似乱数を利用できるマルチユーザ受信(MUD)である.受信器が送信された信号とタイミングを取ることを同期捕捉と呼ぶが、MUD技術を利用すれば従来よりも多くのユーザを許容することができる反面、同期捕捉がさらに難しくなる。本年度の結果は以下にまとめられる.1)MUDの一つである干渉除去法を用いた同期捕捉法に関する結果をまとめた論文が英文論文誌IEICEに受理・掲載された.2)統計学に基づく判定法による同期捕捉法を新たに提案した.これは,本来連続値の相関器出力を適当な閾値により2値化することで,回路規模を縮小できる.しかも,統計学的視点から十分な精度と効率性が確認されたので,英文論文誌IMAに掲載された.3)MUD受信器がニューラルネットワークにおける連想記憶モデルの動作原理と同一であり,MUD受信器と従来の相関受信器の構造が,連想記憶における係数重みの決定法(相関型・直交射影型)に対応していることを示した.さらに,非同期CDMAから導かれるニューラルネットワークを提案し,このネットワークがまったくランダムなパターンよりも,マルコフ連鎖をなすパターンを記憶しやすいことを示した.4)非同期CDMA通信の誤り率特性が,擬似乱数である拡散符号とチップ波形の2者に依存することを指摘した.これは,同期CDMA通信とは大きく異なる特徴である.すなわち,最適な拡散符号はチップ波形の設計に深く関係し,前述のイタリアの研究者によるマルコフ符号は,チップ波形が矩形の場合に限られる.一方,理想帯域制限フィルタを用いる場合は,独立同分布(independent and identically distributed)2値系列が最適となる.
特殊な両親媒性物質による表在性膜蛋白質の選択的可溶化

メチルβシクロデキストリン(MCD)やクロモサポニン(CSI)といつた特殊な構造をした両親媒性物質によって膜表在性蛋白質が選択的に可溶化されという発見から,本研究計画の実施に至った.その結果、(1)薬剤が脂質修飾膜蛋白質を可溶化する分子メカニズムは,蛋白質の脂質修飾部位への直接的な結合による可能性が示唆された.(2)MCDで可溶化された脂質修飾膜蛋白質は安定化されており,これまで不可能とされたカエル視細胞外節膜のcGMP加水分解酵素(PDE6)の活性型と不活性型両方の可溶化と精製に成功した.(3)不活性型トランスデューシンの精製にも成功し,これをBlue-Sepharoseにかけることで,Tα及びTβγを簡単にほぼ単一にまで精製できた.(4)ファルネシル基で修飾されているロドプシンキナーゼについても視細胞外節膜MCD抽出物から陽イオン交換カラムで100%の精製物が得らた.上記のいずれの蛋白質精製においても回収率は80%を越えている.(5)MCDによるトランスデューシンやPDE6の可溶化の度合はこれら蛋白質と膜との相互作用を反映しており,暗黒中ではいずれもK_<1/2>が約2mM MCDであつたが,光照射でトランスデューシンは不溶となった.また,PDE6はGTPgSと光による恒常的活性化によってK_<1/2>が5mMに増加した.これらの知見は信号系蛋白質と膜との相互作用の理解に大きく貢献する.CSIについてはMCDより一桁ほど低濃度で有効であること,トランスデューシンと光退色ロドプシンとの相互作用にも影響を与えることなどが判明しているがまだ検討が進んでいない.PIらは以上の成果を活用して,活性型PDE6を蛍光標識した阻害サブユニットと再構成することにも成功し、生きた視細胞円板膜上でのPDE6の一分子観察を計画している。また,MCDによる信号系蛋白質の選択的可溶化と蛋白質精製への利用については論文執筆中である.メチルβシクロデキストリン(MCD)やクロモサポニン(CSI)といつた特殊な構造をした両親媒性物質によって膜表在性蛋白質が選択的に可溶化されという発見から,本研究計画の実施に至った.その結果、(1)薬剤が脂質修飾膜蛋白質を可溶化する分子メカニズムは,蛋白質の脂質修飾部位への直接的な結合による可能性が示唆された.(2)MCDで可溶化された脂質修飾膜蛋白質は安定化されており,これまで不可能とされたカエル視細胞外節膜のcGMP加水分解酵素(PDE6)の活性型と不活性型両方の可溶化と精製に成功した.(3)不活性型トランスデューシンの精製にも成功し,これをBlue-Sepharoseにかけることで,Tα及びTβγを簡単にほぼ単一にまで精製できた.(4)ファルネシル基で修飾されているロドプシンキナーゼについても視細胞外節膜MCD抽出物から陽イオン交換カラムで100%の精製物が得らた.上記のいずれの蛋白質精製においても回収率は80%を越えている.(5)MCDによるトランスデューシンやPDE6の可溶化の度合はこれら蛋白質と膜との相互作用を反映しており,暗黒中ではいずれもK_<1/2>が約2mM MCDであつたが,光照射でトランスデューシンは不溶となった.また,PDE6はGTPgSと光による恒常的活性化によってK_<1/2>が5mMに増加した.これらの知見は信号系蛋白質と膜との相互作用の理解に大きく貢献する.CSIについてはMCDより一桁ほど低濃度で有効であること,トランスデューシンと光退色ロドプシンとの相互作用にも影響を与えることなどが判明しているがまだ検討が進んでいない.PIらは以上の成果を活用して,活性型PDE6を蛍光標識した阻害サブユニットと再構成することにも成功し、生きた視細胞円板膜上でのPDE6の一分子観察を計画している。また,MCDによる信号系蛋白質の選択的可溶化と蛋白質精製への利用については論文執筆中である.
ナノサイズ重合反応場の開拓

本研究では、縮合反応を進行させることが一般的に困難である水中においてアミノ酸の重縮合を効率よく進行させるために、環境に与える負荷が少なく、調製が簡便でリサイクル可能なナノサイズ重合反応場の開拓に取り組んだ。具体的には、これまで反応場としては注目されていなかった多核錯イオンや金属ナノ粒子をテンプレートとしたアミノ酸の重縮合、ルイス酸によるアミノ酸重縮合に及ぼす効果とともに金属ナノ粒子を基盤とした新たなナノサイズ反応場の開拓を目指した研究を行った。以下に結果の概要を示す。1.鉄コロイドを用いた水中でのL-フェニルアラニンの重縮合塩化鉄(III)水溶液にアルカリを加えていくと、オール化やオキソ化を伴って鉄(III)コロイドが得られる。これをナノサイズ反応場として、L-フェニルアラニン(Phe)の重縮合の検討を行いPheの鉄コロイドへの吸着が縮合反応の促進に重要な役割を果たしていることを示した。2.金ナノ粒子を用いた水中でのL-システインの重縮合チオール基を有するアミノ酸であるL-システインを金ナノ粒子の保護剤として金ナノ粒子を調製した後、金ナノ粒子をナノサイズ反応場としてL-システインの重縮合を行った。金ナノ粒子は酸化剤により金イオンに戻すことが可能でありリサイクル可能なナノサイズ重合反応場であることを示した。3.ルイス酸存在下における活性エステル化アミノ酸の重縮合溶液中での重合制御可能なアミノ酸の新規重縮合法の開発を目的に、活性エステル化バリンの重縮合に及ぼすルイス酸の影響について検討を行った。本研究では、水中でのアミノ酸の重縮合を効率よく進行させるために、環境に与える負荷が少なく、調製が簡便なナノサイズ重合反応場を開拓することを目的とした。具体的には、金属ナノ粒子または多価金属イオンのオール化およびオキソ化を伴って得られるコロイド状の多核錯イオンを用いて、水中における疎水場や静電相互作用場などを構築することにより、ナノサイズでの特殊環境を設計した。また、これらのナノサイズの反応場と種々のアミノ酸との相互作用を詳細に検討することにより、アミノ酸の認識および濃縮を行った。さらに、縮合剤添加もしくは金属イオンの酸化還元能を利用した重縮合を検討し、重合反応場としての機能を探索した。(1)鉄多核錯イオンへのアミノの吸着挙動多価金属イオンとして鉄イオンを用いて、いろいろなpHまたは濃度で種々のアミノ酸の吸着挙動を調べ、鉄多核イオンとアミノ酸との相互作用様式を明らかにした。(2)鉄多核錯イオンを用いたアミノ酸の重縮合鉄多核錯イオンの存在下、種々のアミノ酸を用いて水溶性カルボジイミドを添加して重合の検討を行った。(3)金属ナノ粒子を用いたアミノ酸の重縮合金属ナノ粒子への配位能を有する側鎖官能基をもつアミノ酸を用いて、その吸着挙動を評価した後、水溶性カルボジイミドを添加して重合の検討を行った。得られた高分子を解析することによって、最適の重合条件を考察した。塩化鉄(III)水溶液にアルカリを加えていくと、オール化やオキソ化を伴って鉄(III)コロイドが得られる。これをナノサイズ反応場として、L-フェニルアラニン(Phe)の重縮合の検討を行った。また、対イオンと鉄コロイドの濃度依存性を検討するため、硝酸鉄(III)水溶液から得られる鉄コロイドを用いてPheの重縮合を行った。さらに、Pheの鉄コロイドに対する吸着量と得られる縮合体との収率との関係を検討した。得られた白色沈殿は1H-NMRおよびFT-IRによりフェニルアラニン縮合体であることを確認した。得られた縮合体の数平均分子量を末端基定量法で評価したところ、重合度は10(M_n=1500)まで伸長していることが判った。pHを変化させて得られた白色沈殿の収率はpHに大きく依存した。pH6.3において最大の収率(15%)が得られた。この値は鉄コロイドが存在しない場合の2.5倍であった。

また、Pheの鉄コロイドに対する吸着量を調べた結果、得られる縮合体の収率はPheの吸着量に相関していることが見出された。さらに、塩化金酸水溶液にL-システインの酸化体であるL-シスチンと水素化ホウ素ナトリウム混合水溶液を滴下して室温で1時間撹拌した後、縮合剤として水溶性カルボジイミド(EDAC)を加え、0°Cで24時間撹拌した。金ナノ粒子がない場合に水中でL-システインの重縮合を行ったところ、縮合体は全く得られなかった。塩化金酸水溶液にL-シスチンと水素化ホウ素ナトリウム混合水溶液を滴下して室温で1時間撹拌した試料について透過型電子顕微鏡観察を行ったところ、粒径35nmの金ナノ粒子が生成していることを確認した。我々は、縮合反応を進行させることが一般的に困難である水中においてアミノ酸の重縮合を効率よく進行させるためナノサイズ重合反応場を開拓することを目標として研究を行っている。かご型アミノプロピルシルセスキオキサンは配位子が放射状に配置された特異な形状を有している。これらに対して金属イオンを配位させると3次元的な会合体が得られることがこれまでに本研究室にて見出されている。かご型アミノプロピルシルセスキオキサン(1)は球状配位子として金属イオンとネットワーク構造を形成し、ナノメートルスケールの構造体を形成する点で従来にない系である。これらはこれまでにない反応場、触媒、電子光特性などが期待できる。本年度は、水酸化ナトリウムの添加により、水中において金イオンの1による自発的還元が進行し、水溶液中で安定な金ナノ粒子が生成されることを確認した。また、ルイス酸によるアミノ酸重縮合に及ぼす効果についても明らかになった。本研究では、新たなナノ粒子集積場の構築を行った。金属ナノ粒子は量子サイズ効果により、金属原子ともバルクの金属とも異なる興味深い特性を示すため、ナノテクノロジー基幹材料のひとつとして幅広い分野への応用が期待されており、その合成手法や粒径・形状の制御については、数多くの報告がされてきた。一方で、金属ナノ粒子の物理的性質はその二次構造、すなわち凝集状態や配列にも大きく依存する。そのため近年、次世代ナノ材料や医療用イメージング及びターゲティング材料開発の観点から、自己組織化を用いて金属ナノ粒子を組織化させる手法や、特定の外部刺激に応答させて金属ナノ粒子の凝集状態を制御する手法の開発が注目を集めている。本研究では、イミダゾリウムカチオンで表面を被覆したカチオン性の金ナノ粒子を合成し、その水溶液中にポリアニオンとしてポリアクリル酸を共存させることによって、静電相互作用を利用してpH変化によって金ナノ粒子の凝集状態を制御することに成功した。また、磁性ナノ粒子である酸化鉄ナノ粒子においても、シランカップリングの手法を用いてイミダゾリウムカチオンで修飾したものを合成し、そのカウンターアニオンの交換による疎水化を利用して凝集状態を変化させることに成功した。
ミリ波広帯域分光観測による宇宙初期の星生成史の解明

本研究の目的は、初期宇宙でまさに形成期の銀河である可能性の高いサブミリ波天体の赤方偏移量を決めるための、広い波長域を同時に分光できる高感度ミリ波分光装置(波長1-1.5mm)を開発することである。この研究開発は、米国NASA/ジェット推進研究所・カルフォルニア工科大学との共同研究である。平成12年度は、3回にわたり渡米し米国の研究協力者他と研究打ち合わせを行い、分光系の仕様及び分光光学系及び装置全体をおさめ冷却するためのクライオスタット及びついて検討した。また平成12年8月にイギリスで行われた国際天文学連合のシンポジウムにて発表した。平成13年度は液体ヘリウムクライオスタットの詳細な設計と製作を日本側では行った。平成14年度は、日本側ではクライオスタットの性能評価を行い、最終的に熱負荷のない状態で4日以上の保持時間という良好な性能を確認した。完成したクライオスタットは、米国カルフォルニア工科大学に輸送し、米国で並行して開発中の3He冷凍機などの試験に供された。分光光学系についてはスケールモデルによる8GHz帯での効率や分光性能の測定を行った。分光系・検出器系の開発に遅延が見られ、最終的な装置のインテグレーションは平成15年度に実施される。これらの開発と並行して、サブミリ波天体の近赤外波長での同定を行うため、国立天文台すばる望遠鏡(米国ハワイ州)の共同利用観測を2晩行い、良質なデータを取得した。また7月に米国ハワイ州のマウナケア山天文台の一つCFHTにおいて可視光撮像観測も行ったが天候にはめぐまれなかった。本研究の目的は、初期宇宙の銀河である可能性の高いサブミリ波天体の赤方偏移量を決めるための、広い波長域を同時に分光できる高感度ミリ波分光装置を開発することである。研究開発は、米国NASA/ジェット推進研究所との共同研究である。米国側が、検出器系及びその補助冷凍器、データ処理系、そして望遠鏡とのインターフェース調整を主に担当し、日本側が、分光光学系及び装置全体をおさめるクライオスタットの製作及び評価を担当する。平成12年度は、平成12年6月、10月、平成13年2月の3回にわたり、研究代表者(及び分担者の一人)が渡米し、米国側との打ち合わせを行った。この打ち合わせの結果、本年度本研究費補助金にて購入する予定であった備品:液体ヘリウムクライオスタット及びスターリング冷凍機の購入を見送ることになった。理由は、検出器系は大変機械的振動に弱く、スターリング冷凍機との併用は困難であること、また、補助冷凍機の仕様・分光光学系の仕様が明確でなく、クライオスタットの発注が著しく遅れると予想されたためである。従って本年度は、主に分光光学系の仕様決定と部品の手配、および液体ヘリウムクライオスタットの仕様の検討、の二つの作業を主に行った。また、これらの開発と平行して、本研究で開発するミリ波分光装置のターゲットである天体が含まれる天域、特に赤外宇宙天文台ISOによる遠赤外ディープサーベイが行われた「ロックマンホール」についてのデータの詳細な解析結果の論文発表、及び近赤外追及観測を実施した。この結果については、研究代表者が平成12年8月にイギリスで行われた国際天文学連合のシンポジウムにて発表した。また研究分担者2名が米国で行われた技術ワークショップに出席し、ミリ波分光技術の情報収集を行った。

平成13年度は、液体ヘリウムクライオスタットの詳細な設計をすすめ、次にクライオスタットの個々の部品(液体ヘリウムタンク、液体窒素タンク、コールドプレート、熱シールド板など)の設計及び製作を太陽東洋酸素(株)に発注した。製作した部品を組み立てることにより、平成14年2月にクライオスタットとして完成した。既に予備的な冷却試験は終了しており、要求した仕様(持ち時間など)を満足する結果を得ている。4月に最終的な性能試験を行い、米国NASA/ジェット推進研究所へ輸送する予定である。分光光学系については、多重分岐型導波路による周波数分割方式の実現性が見えず、導波板結合型回折格子による分光系へ、大きな設計変更を行った。また、これらの開発と平行して、14年3月初頭に韓国ソウル大学で行われたサイエンスワークショップに出席し、ミリ波観測の重要性についての講演を科学衛星ASTRO-Fの観測計画と関連付けて行った。本研究の目的は、初期宇宙でまさに形成期の銀河である可能性の高いサブミリ波天体の赤方偏移量を決めるための、広い波長域を同時に分光できる高感度ミリ波分光装置(波長1-1.5mm)を開発することである。この研究開発は、米国NASA/ジェット推進研究所・カルフォルニア工科大学との共同研究である。平成14年度は、日本側では分光光学系及び装置全体をおさめ冷却するためのクライオスタットの性能評価を行い、最終的に熱負荷のない状態で4日以上の保持時間という良好な性能を確認した。完成したクライオスタットは、米国カルフォルニア工科大学に輸送し、米国で並行して開発中の3He冷凍機などの試験に供された。分光光学系については昨年に引き続き、導波板結合型回折格子を利用した分光系の設計をすすめ、スケールモデルによる8GHz帯での効率や分光性能の測定を行った。分光系・検出器系の開発に遅延が見られ、最終的な装置のインテグレーションは平成15年度に実施される。これらの開発と並行して、サブミリ波天体の近赤外波長での同定を行うため、国立天文台すばる望遠鏡(米国ハワイ州)の共同利用観測を2晩行い、良質なデータを取得した(旅費は国立天文台負担)。また7月に米国ハワイ州のマウナケア山天文台の一つCFHTにおいて可視光撮像観測も行ったが天候にはめぐまれなかった。このように開発研究はまだ継続しているが、現時点での達成点を研究成果報告書に近日中にとりまとめ公表する予定である。
高血圧ラットの高血圧発症、維持における脳内NOの役割・アンチセンスによる脳内NO合成酵素発現抑制を用いての検討

内皮由来血管拡張物質であるNOの合成酵素は中枢神経系にも局在し交感神経活動や血圧調節に関与する。NO合成阻害剤を中枢内に急性投与すると交感神経活動が亢進し血圧上昇がみられるが、長期の循環調節に対する中枢性NOの役割については未だ明らかでない。そこで今回末梢血管内皮に影響を与えない量のNO合成阻害剤を浸透圧ポンプを用い脳内に長期間微量注入し血行動態の変化を検討した。7週齢の雄性Wistar ratの大槽に浸透圧ポンプに接続したシリコンチューブを挿入し、N^G-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)及び対照としてNO阻害作用を有しない光学異性体であるD-NMMAを一週間かけて持続投与し、この間の無拘束・覚醒状態の24時間血圧・心拍数の変化をテレメトリーにより持続測定した。観察終了後脳採取しNO産生の指標として脳内硝酸・亜硝酸(NOx)含量を測定した。L-NMMAによる漫性NO合成阻害はD-NMMA対照群に比し脳内NOx含量を明らかに低下させた(p<.05)。無拘束・自由行動下の血圧・心拍数及びそれらの変動性は24時間・日中・夜間何れにおいてもNO合成阻害によっては有意に変化しなかった。即ち、中枢内慢性L-NMMA投与は脳内NO合成を明らかに阻害したにも拘わらず血圧・心拍数に影響を与えなかった。このことは、既に神経型NO合成酵素ノックアウトマウスの血圧が正常であるという報告と一致しており、慢性的には神経性NOが必ずしも降圧に作用しないことを示唆する。NO合成酵素のアイソフォームや機能局在についてのより詳細な検討は、今後アンチセンスやノックアウトマウスなど細胞工学的手法を用いて行う予定である。中枢神経系は血圧調節に重要な役割を果たす。一酸化窒素(NO)合成酵素は血管のみならず、血圧調節に重要な役割を果たす弧束核(NTS)や延髄腹側外野(VLM)に存在するので、中枢性NOは血圧調節に何らかの役割を担っている可能性がある。事実、NTSニューロンはNOの基質であるL-アルジニンに反応し、その活動性を増す。又NO合成阻害剤のL-NMMAの脳糟内やVLMへの急性投与は交感神経活動亢進、血圧上昇を来す。しかしこれらの実験は急性で、しかも麻酔下動物での実験であるので、中枢性NOが本当に慢性的に血圧調節、高血圧の発症に関与するかは不明である。そこで本年度は無麻酔、無拘束の条件下で中枢性NOの阻害が血圧に変化を来すかを検討した。(方法)正常血圧ウィスターラットの脳糟内にカニューレを挿入した。血圧及び心拍数は腹部大動脈内に挿入したカテーテルにより又テレメトリーシステムを用い記録した。脳糟内にL-NMMA又はD-NMMAを2.2nmol/Kg/min 1週間投与した。また別のグレープに3倍量のL-NMMAを投与した。(結果)L-NMMA又はD-NMMAの投与は脳のNOの量(NOx)を有意に低下させたにも関わらず、血圧及び心拍数に影響しなかった。3倍量のL-NMMAにおいても同様の結果であった。これらの事は中枢性NOが血圧調節に関与する可能性は無いか、あっても非常に小さいと考えられる。

7週齢の雄性Wistar ratの大槽に浸透圧ポンプに接続したシリコンチューブを挿入し、N^G-monomethyl-L-arginine(L-NMMA)及び対照としてNO阻害剤を有しない光学異性体であるD-NMMAを一週間かけて持続投与し、この間の無拘束・覚醒状態の24時間血圧・心拍数の変化をテレメトリーにより持続測定した。観察終了後脳採取しNO産生の指標として脳内硝酸・亜硝酸(NO_x)含量を測定した。L-NMMAによる慢性NO合成阻害はD-NMMA対照群に比し脳内NO_x含量を明らかに低下させた(p<.05)。無拘束・自由行動下の血圧・心拍数及びそれらの変動性は24時間・日中・夜間何れにおいてもNO合成阻害によっては有意に変化しなかった。即ち、中枢内慢性L-NMMA投与は脳内NO合成を明らかに阻害したにも拘わらず血圧・心拍数に影響を与えなかった。このことは,既に神経型NO合成酵素ノックアウトマウスの血圧が正常であるという報告と一致しており、慢性的には神経性NOが必ずしも降圧に作用しないことを示唆する。NO合成酵素のアイソフォームや機能局在についてのより詳細な検討は、今後アンチセンスやノックアウトマウスなど細胞工学的手法を用いて行う予定である。
河川水害時の高齢者・障がい者の避難生活環境整備と救援体制システムの開発

京都市右京区内の高齢者や障がい者が災害時などで避難する場合に,避難所の生活環境の状況をどのような環境であるのかを調査するために、平成17年9月から12月にかけ、右京区内の16か所の指定避難所を対象に調査票を用いて実態調査を行った.その継続として、平成18年5月から7月にかけて、右京区内の18か所の指定避難所を対象に調査票を用いて実態調査を行った.合計34か所の指定避難所を北部地域と南部地域に分け、避難所マップ、各避難所のスロープ、車いす用トイレの場所、状況などの写真を掲載したホームページを作成した。サイトは「右京区避難所マップ」である.(https://jpn01.safelinks.protection.outlook.com/?url=http%3A%2F%2Fkyoto-hinan.org%2Fukyo%2F&amp;data)ここには、各避難所のスロープ状況、体育館、車いす用トイレの場所、状況などを掲載している。今後は、このサイトを対象者に見ていただくようにアピールする活動を行う予定である.京都市右京区内の指定避難所である60か所のうち京都市教育委員会の許可が得られた小中学校、その他指定避難所で調査の承認を得られた3か所の調査を終え、ホームページを立ち上げることができた。また、そのサイトの評価として調査票を作成し、研究倫理委員会の承認を得て、サイトとして立ち上げている。「右京区避難所マップ」のアピールを地域や障がい者関係団体に行うとともに、各避難所のスロープ状況、体育館、車いす用トイレの場所、状況などについて。今後は、このサイトを高齢者・障がい者の対象者に見ていただき、避難所の設備の希望、避難所の情報の適切さ、適切性、不安などの調査項目の「調査票」をサイトに立ち上げ、現在調査中である。京都市右京区内の車いす利用者が災害時などで避難する場合に,避難所の生活環境における状況をどのように理解し、必要な施設の環境が整っているのかを明らかにすることを目的に施設管理者の意識を調べた.京都市右京区内の避難所の現状について調査の依頼状を京都市教育委員会と右京区に送り,承諾を得て避難所について調査を行った.対象者は右京区の第1次避難所として指定されている避難所として65か所と福祉避難所として32か所の施設管理者である.調査内容は、防災の避難所としての理解、車いす利用者や高齢者の理解、避難所としての適切性、車いす利用者への適切性、対策や改修、各施設の有無と適切さについて調べ、指定避難所と福祉避難所を比較した。事前調査を2017年9月20日10月15日の間で行った。回収数は京都市右京区内指定避難所40か所(回収率61.5%)、福祉避難所20か所(回収率62.5%)であった。対象者の年齢は52.4歳、男性43人、女性16人、不明1人であった。防災研修を受けたものが指定避難所28人(46.7%)、福祉避難所14人(23.3%)であり、防災研修年数は指定避難所3.1年、福祉避難所2.8年で有意な差はなかった。防災に関する理解として「車いす利用者の援助への理解」は、福祉避難所が「とても」33.3%で有意に多かった。救援物資の体制が整っているかで「あり」が指定避難所が13か所(36.1%)、福祉避難所が8か所(40.0%)であり、今後の物資に関する不安を感じていることが示された。また、車いす利用者に対する不安については、「あり」が指定避難所で15か所(37.5%)、福祉避難所で8か所(40.0%)であり、バリアフリー環境への対応も求められていた。また、右京区内の16か所の指定避難所を対象に環境の調査票を用いて実態調査を行い、ホームページを作成するため、現在情報整理中である。京都市右京区内の避難所の施設代表者に事前の調査を行い、その集計を行っている。また、右京区内の16か所に施設に実態調査を行い、バリアフリー環境であるのかの環境に関する調査を終えている。

また、そのサイトの評価として調査票を作成し、研究倫理委員会の承認を得て、サイトとして立ち上げている。本年度は、京都市右京区の指定避難所の20か所について計画を立て、実態調査を行う予定である。実態調査で得られたデータをもとに右京区避難所マップの作成に取り掛かる予定である。その後、各施設からのホームページ立ち上げの内容について了解をいただき、サイトを立ち上げる予定である。「右京区避難所マップ」のアピールを地域や障がい者関係団体に行うとともに、各避難所のスロープ状況、体育館、車いす用トイレの場所、状況などについて。今後は、このサイトを高齢者・障がい者の対象者に見ていただき、避難所の設備の希望、避難所の情報の適切さ、適切性、不安などの調査項目の「調査票」をサイトに立ち上げ、現在調査中である。「右京区避難所マップ」のホームページの作成と立ち上げの経費が予定より減額されたことと、調査票作成の経費が減額されたことにより残額が発生した。また、調査を3月から開始しているが謝金の発生がなかったために残額が発生した。これは次年度の調査の謝金として必要になる。
フェナントレン等を含むシクロファンの配座・光物理的性質の制御と錯形成への応用

これまでに我々は、ビニルフェナントレン誘導体の[2+2]光環化付加反応によりさまざまな構造をもつフェナントレノファン類を合成し、その構造と蛍光発光挙動、特にエキシマー形成挙動との関連を明らかにしてきた。この場合、フェナントレノファンに架橋鎖として含まれているシクロブタン環は、芳香環の配座の固定には極めて有効であったが、光により開裂しやすく光安定性の点で問題があった。そこで本年度は、より光化学的に安定なものを目指して、シクロブタン環を含まないフェナントレノファンの合成に着手した。その中で、シクロブタン環の代わりに-CH_2-O-CH_2-結合を架橋鎖ユニットとして含むフェナントレノファンの合成に成功した。1,3-ビス(3-ヒドロキシメチル-9-フェナントリル)プロパンの酸触媒存在下での分子内エーテル化反応により、目的のオキサ[3.3](3,9)フェナントレノファンが単一の異性体(1a)として得られた。^1H-NMRスペクトルの検討により、1aは芳香環が部分的に重なったanti体であることが分かった。1aの蛍光スペクトルにおいては、409nmに極大をもつブロードなエキシマー蛍光が観測され、またその蛍光寿命を3-メチルペンタン中で測定したところ、室温では19ns,77Kでは24nsであった。1aは従来のシクロブタン環を有するフェナントレノファンよりも光化学的に安定であり、これらの測定中にほとんど分解は認められなかった。同様の方法でオキサ[3.4](3,9)フェナントレノファン(1b)の合成にも成功し、この場合はsyn体、anti体の両異性体の単離に成功した。前年度までに、2つの芳香環が部分的に重なったanti体のフェナントレノファンのうち、フェナントレンを構成する六員環の2つあるいは1つで重なったanti-[2.3](2,7)-及び[2.3](3,9)フェナントレノファン(1及び2)がエキシマー蛍光を与えることを示したが、本年度はフェナントレンのエキシマー形成に必要な重なりを明らかにする目的で、さらに重なりの小さいanti-[2.3](3,10)フェナントレノファン(3)を分子設計し、実際に合成し、その蛍光挙動を明らかにした。対応する前駆体ビニル化合物を合成し、その分子内[2+2]光環化付加反応により目的の3が得られ、さらにHPLCによりそのanti体を単離した。anti-3の蛍光スペクトルにおいては、振動構造を有するモノマー蛍光が観測された。分子力場計算によると、anti-3においてはフェナントレンを構成する六員環の1つの半分程度でのみ重なっており、フェナントレンのエキシマー形成にはanti-2のように六員環1つ程度の重なりが少なくとも必要であることが明らかとなった。このように、本年度の当初の研究目的がまず達成された。また、これまで合成してきたフェナントレノファンに架橋鎖として含まれているシクロブタン環は、芳香環の配座の固定には極めて有効であったが、光により開裂しやすく光安定性の点で問題があった。そこで本年度は、より安定なものを目指して、シクロブタン環を含まないフェナントレノファンの合成にも着手した。その結果、シクロブタン環の代わりに-C-O-C-という架橋鎖を含むフェナントレノファンの合成に成功した。現在、その光物理的性質について詳細に検討している。
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの匂い応答行動を制御する神経ネットワークの統合的機能解析

脳・神経系の複雑なネットワークの機能はその構造と密接に結びついているが、実際にその機能と構造の関連を詳しく明らかにした例は限られている。本研究では、全ニューロン間の接続様式が明らかになっているモデル動物・線虫C. elegansを対象として、特定のニューロンの活動が神経細胞のネットワークを介してどのように行動を制御するのかを統合的に解析した。具体的には、「C. elegansの匂い忌避行動とその増強」(Kimura et al., J. Neurosci. in press)を制御する神経回路の活動を解析した。まず、独自に開発した線虫行動計測装置により、C. elegansが匂い物質2-ノナノンを忌避する際に、非常に高確率で匂い勾配を下る事を明らかにした。この結果は、従来からのbiased random walkモデルや風見鶏機構では説明困難であり、C. elegansの2-ノナノンへの応答行動は新たな原理によって制御されている可能性が高いと考えられた。さらに、非拘束下で行動するC. elegansをリアルタイムで追跡しながら任意の匂い刺激を行い、この時の神経細胞活動をカルシウムイメージングと光遺伝学によって解析する統合型顕微鏡システムを、橋本浩一教授(東北大学)との共同研究で開発した。この統合型顕微鏡システムを用いた研究により、匂い上昇と匂い減少に応答する感覚神経細胞をそれぞれ同定し、行動を制御する感覚神経活動に関して新たなモデルを提唱した。この統合型顕微鏡システムはショウジョウバエやゼブラフィッシュなど小型モデル動物の化学応答行動にも応用可能であり、動物の行動を制御する脳機能の高精度の解明に大きな役割を果たすと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、全ニューロン間の接続様式が明らかになっているモデル動物・線虫C.elegansを対象として、特定のニューロンの活動が神経細胞のネットワークを介してどのように行動を制御するのかを統合的に解析することを目標としている。具体的には、「C.elegansの匂い忌避行動とその増強」(Kimura et al.,J. Neurosci. 2010)を制御する神経ネットワークの機能と構造との関連を明らかにする。これまでの我々と計画班員・岩崎唯史博士との共同研究から、C.elegansは匂い物質2-ノナノンの空間勾配と自らの行動との角度(方位角)を認識して忌避行動を制御している可能性が強く示唆された。この結果は、従来からのbiased random walkモデルや風見鶏機構では説明困難であり、C.elegansの2-ノナノンへの応答行動は新たな原理によって制御されている可能性が高い。そこで、この興味深い神経機能の基盤を明らかにする目的で、2-ノナノンに対するC.elegansの忌避行動に関わると考えられるニューロンの活動をカルシウムイメージングによって明らかにし、さらにそのニューロン活動が行動に与える影響を光遺伝学的手法によって証明することを目指した。H23年度は、カルシウムイメージングにより、2-ノナノンを感ずるAWB感覚神経細胞がOFF応答を示す事を見出した。そこで、光遺伝学的手法により、channelrhodopsinを用いてAWB感覚神経細胞を人為的に活性化した結果、2-ノナノン忌避行動に特徴的な行動パターンを再現することができた。これにより、2-ノナノン忌避行動が新たな行動戦略により制御されている可能性が強く示唆された。H23年度当初に、カルシウムイメージングとoptogeneticsにより、C.elegansの2-ノナノン忌避行動に関わる神経活動を解析、および操作することを目指したが、これがほぼ達成できたため。H24年度の研究をより発展させて、神経ネットワークの動作原理を明らかにする。
傷により活性化される植物の46-kDaプロテインキナーゼの精製とその遺伝子の単離

我々は、タバコの成熟葉において傷によりきわめて早く一過的に活性化される、大きさが46 kDaのプロテインキナーゼの存在を酵素化学的に明らかにした(研究発表参照)。このキナーゼは傷以外にも、キトサン、タバコ細胞壁の分解物、サリチル酸、シクロヘキシミド酸により各々、異なるパターンにより活性化されることも明らかにし、このキナーゼに対しplant multisignal-activated protein(PMSAP)kinaseと命名した。PMSAPキナーゼはその性質から細胞外刺激を細胞内に伝えるシグナル伝達系に関っていると予想される(研究発表参照)。本年度はこのキナーゼの活性化機構を生理学的に解析するとともに(上記知見等)、キナーゼの精製を行ってきた。タバコ成熟葉を出発材料として、PMSAPキナーゼの活性化条件、抽出条件の検討後、タンパク質の精製法に従って、陰イオン交換カラム(mono-Q)、逆相カラム(フェニルセファロース)、ヒドロキシアパタイトカラム等を用いて精製を行ってきた。タバコ成熟葉を用いた場合、多量に存在する光合成関連タンパク質がPMSAPキナーゼと分離されないことから、最終的に成熟葉からの精製を中止した。代わって、精製材料としてタバコ培養細胞BY-2を用いることを検討した。タバコ培養細胞BY-2における種々の刺激に対するPMSAPキナーゼの応答性を調べた結果、成熟葉における応答性と多少異なるものの(刺激の種類により活性化パターンが異なる。)、基本的には同一であることが明らかになったことから、培養細胞BY-2を用いてPMSAPキナーゼの精製を行っている。現在のところ、まだ数百倍程度にしか精製されていないが、成熟葉における精製法を利用できることから、精製は時間の問題であると予想される。