hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キュウリのアスコルビン酸オキシダ-ゼ遺伝子の微生物における発現

キュウリのアスコルビン酸オキシダ-ゼ(以下AOと略)は同一サブユニットの2量体より成る分子量約130 kDaの糖タンパク質である。サブユニット当り銅4原子を含む酵素であり、その構造と機能の相間に興味が持たれている。我々は1989年にキュウリのcDNAの構造を決定したが、ほぼ同時にMax PlanckのHuberらはズッキニのAOの3次元構造を明らかにした。両者のアミノ酸配列は89%が一致した。部位特異的変異の導入などにより、機能と構造を調べる上で、このcDNAを大腸菌または他の微生物で大量に発現させることが、まず必須である。微生物での活性のあるAOの生成にはまだ成功していないが、以下に経過を報告する。1.AO遺伝子の微生物での発現:AOのcDNAを大腸菌での高発現ベクタ-、pKK233ー2のtacプロモ-タ-の下流に挿入し、E.coli JM105を宿主としてIPTGで発現を誘導した。SDSーPAGE、ウエスタンブロッティングにより、全タンパク質の10%がAOであったが、封入体を形成しており、培養条件を種々検討したが酵素活性は検出されなかった。封入体タンパク質を尿素または塩酸グアニジンで変性させ、種々の再構成実験を試みたが成功しなかった。細胞外への分泌させることを目的にとしたBacillus brevisの系ではAO mRNAを検出できなかった。cDNAを酵母の酸性ホスファタ-ゼまたはAOのリ-ダ-配列に連結しPHO5プロモ-タ-のもとでSaccharomyces cerevisiaeで発現させたが、活性のあるタンパク質は生成されなかった。2.AOゲノム遺伝子のクロ-ニング:cDNAは逆転写酵素のミスリ-ディングを含む可能性がある。cDNAをプロ-ブにゲノムライブラリ-からゲノム遺伝子をクロ-ニングした。4エキソンから成っていたが、コ-ド領域の塩基配列はcDNAと完全に一致していた。アスコルビン酸オキシダ-ゼ(以下ASO)はウリ科植物の果皮に多く存在する銅含有糖タンパクであり,臨床検査、食品中のビタミンC定量に用いられる有用酵素である。キュウリ由来のcDNAを用い、微生物でのASO生成を試みた。1.大腸菌で生成したASOタンパクの再構成組換え大腸菌細胞にはキユウリASO抗体と反応し,分子量も塩基配列から推定される値に一致するポリペプチドがかなりの量生成したが,酵素活性は検出されなかった。不溶性画分に存在するこのポリペプチドを塩酸グアニジン,尿素などで可溶化,透析,銅原子の導入の一連の実験を種々条件下で行った.CDスペクトルでは天然ASOとほゞ同一パタ-ンを示す再構成物も得たが,まだ酵素活性は認められず,研交は継続中である。2.酵母におけるASOの生成ASOcDNAを酸性ホスファタ-ゼ遺伝子,PHO5プロモ-タ-支配下に置き,S.cereciseae SH985株で,リン酸濃度の低下によりASOの合成を行った。N末端の分泌シグナル配列を有するもの,有しないものについて検討した結果,免疫反応性を有するASOポリペプチドが数種,いずれの場合にも合成され,糖付加に違いがあると推定された。細胞を分画し,可溶性画分,不溶性画分共に該ペプチドが存在し,やはり一部inclusion bodyを形成していると思われた。酸性ホスファタ-ゼのリ-ダ配列を付加した構築物の場合,可溶性画分に低いながらもASO活性が検出された。

現在、その詳細な実体につき検討すると共に,発現量を増大させる宿主,ベクタ-系,および培養法についても検討中である。キュウリのアスコルビン酸オキシダ-ゼ(以下AOと略)は同一サブユニットの2量体より成る分子量約130kDalの糖タンパク貭であり,サブユニット当り4個の銅原子を含む銅タンパク貭である。既にキュウリより本酵素のcDNAを得、塩基配列を決定した。本研究では、キュウリのcDNAをもとに構築したAOの成熟型酵素の遺伝子を大腸菌で高発現させ、次に部位特異的変異により銅結合部位を改変し,酵素活性との相関を明らかにすることを目的としたが,微生物で活性をもつAOの生成にまだ成功していない。その経過を以下にまとめた。1.AO遺伝子の大腸菌での発現:AOのcDNAを大腸菌での高発現ベクタ-,pkk233ー2のtacプロモ-タ-の下流に挿入し,E.coli JM105を宿主としてIPTGで発現を誘導した。SDSーPAGE,ウエスタンブロットにより、全タンパク貭の約10%がAOであったが,封入体を形成しており,酵素活性は検出されなかった。培養条件を種々検討したが、活性型は生成されなかった。次いで封入体タンパク貭を尿素または塩酸グアニジンで変性させ,種々の再構成実験を行ったが,成功しなかった。2.AOの酵母での発現:AO構造遺伝子を酵母の酸性ホスファタ-ゼまたはAOのリ-ダ-配列に連結し,PHO5プロモ-タ-のもとでS.cere ci siaeで発現させたが、酵素活性を認めることは出来なかった。3.AOゲノム遺伝子のクロ-ニング:cDNAは逆転写酵素の誤りのため、正しい塩基配列を有しない例がある。そこでcDNAをプロ-ブにゲノム遺伝子をクロ-ニングした。チエキソンから成っていたがコ-ド領域の塩基配列はcDNAと完全に一致していた。
上場廃止の要因分析及び上場廃止が企業活動に与える影響に関する研究

本研究では,上場廃止前の企業の財務状況,株主といったステークホルダーの状況を調べ,どのような企業が上場廃止を行っているのか明らかにした.分析の結果,株主集中度が上場廃止に有意に正の影響を与えていた.さらに,キャッシュフロー仮説,エージェンシー・コスト削減効果仮説,アンダーバリュー解消仮説,上場維持コスト削減仮説,富の移転効果仮説の5つの自発的上場廃止の仮説をもとに,自発的上場廃止の要因について,建設業と不動産業で比較を行った.建設業と不動産業ともに,富の移転効果仮説が支持された.建設業では,上場維持コスト削減仮説が維持された.不動産業では,アンダーバリュー解消仮説が支持された.本研究の主な目的は,上場廃止前の企業の財務状況,株主といったステークホルダーの状況を調べ,どのような企業が上場廃止を行っているのか明らかにすることである.平成27年度は,東京証券取引所で上場している企業を実証分析し,どのような企業がどのような理由で非自発的上場廃止と自発的上場廃止を行っているか分析を行った.分析の結果,自発的上場廃止では,これまで提唱されてきた節税効果仮説,富の移転効果仮説,上場維持コスト削減仮説,アンダーバリュー仮説が支持されることとなった.さらに,「実質破綻による上場廃止」企業を除く,「自発的上場廃止」,「流動性に関する非自発的上場廃止」,「信頼性に関する非自発的上場廃止」を行った企業は,株主集中度が高い傾向にあることが分かった.一方,実質破綻による上場廃止に対しては株主集中度が有意でないため,株主集中度は上場廃止には影響を与えるが,倒産,清算,企業再生などのいわゆる倒産イベントの発生には影響を与えないということが分かった.株主集中度が高い企業とはオーナー企業,同族企業,あるいは少数の投資グループによる支配されている企業の可能性が高い.このような企業には,上場廃止というリスクがあるということを示すことが出来たことが本研究の貢献である.平成27年度は,自発的上場廃止及び非自発的上場廃止をどのような企業が行っているか,そしてどのような理由で行っているかについて明らかにするために,企業の株価データ,財務データ及びステークホルダーのデータを用いた実証分析を行うことを予定していた.これらに関しては,研究計画・方法で平成27年度に設定した内容をすべて達成することができた.研究成果に関しては,学会発表やワークショップでは公表したが,これから論文としてまとめジャーナルに投稿する予定であることから,総合的に勘案して上記の達成度とした.日本には400万社以上の企業があるが,そのうち上場している企業は,2014年末の時点でわずか約3600社となっている.上場を目標としている中小企業も多いが,上場していた企業が,どうして上場廃止となってしまうかについては,ほとんど研究がなされていない.また,上場廃止には自発的上場廃止と非自発的上場廃止があるが,その要因の違いについてもほとんど研究がなされていない.本研究では,上場廃止前の企業の財務状況,株主といったステークホルダーの状況を調べ,どのような企業が上場廃止を行っているのか分析を行った.これにより,自発的上場廃止について,企業金融やコーポレートガバナンスの観点から,経営者がどのような理由で自発的上場廃止が行われているのかについて明らかにした.また,非自発的上場廃止を行う企業の特徴を上場廃止前の企業の情報から読み取ることができることを示した.本研究は,これまで日本では研究されてこなかった上場廃止理由の違いを考慮した上場廃止予測について包括的な実証分析を行うことが独創的である.本研究の意義は,自発的上場廃止について,上場廃止を行う企業の特徴を明らかにすることで,どのようなメカニズムで上場廃止が行われるのか企業金融やコーポレートガバナンスで議論されてきた問題を明らかにすることができる.さらに,経営者はどのような状況で上場廃止の判断を行うべきか示唆を与えることができる.非自発的上場廃止については,上場廃止を行う企業の特徴が分かり,投資家にとって有益な情報となると考えられる.本研究では,上場廃止前の企業の財務状況,株主といったステークホルダーの状況を調べ,どのような企業が上場廃止を行っているのか明らかにした.分析の結果,株主集中度が上場廃止に有意に正の影響を与えていた.さらに,キャッシュフロー仮説,エージェンシー・コスト削減効果仮説,アンダーバリュー解消仮説,上場維持コスト削減仮説,富の移転効果仮説の5つの自発的上場廃止の仮説をもとに,自発的上場廃止の要因について,建設業と不動産業で比較を行った.建設業と不動産業ともに,富の移転効果仮説が支持された.建設業では,上場維持コスト削減仮説が維持された.不動産業では,アンダーバリュー解消仮説が支持された.平成28年度は,研究計画・方法に従って,引き続き研究を進めていく予定である.具体的には,上場廃止とその理由が,上場廃止後の経営にどのような影響を与えたのか分析を行う予定ある.また,平成27年度に得られた研究成果の中で,上場廃止の要因が業種ごと異なることが読み取れたので,今後は業種の違いについても着目して研究を行っていきたい.その他にも,企業の投資行動や敵対的買収に対する防衛策導入の有無と上場廃止の関係など,様々な観点から分析を行う準備を進めている.研究成果に関しては,今後も学会やワークショップで積極的な発表を行い,多くの研究者とディスカッションをすることで,より内容をブラッシュアップする.また,成果をジャーナルに投稿する予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。ファイナンス28年度が最終年度であるため、記入しない。
微小重力環境実験による三次元離散化燃料系の燃焼ダイナミズム解明研究

三次元離散化燃料系としてほぼ球形となるように配置された燃料液滴群を実際に作成し,これを急速に高温の空気雰囲気中へ移動させて,蒸発,自発着火,燃焼させる実験を行い,光学観測により蒸発,自発着火,燃焼の挙動や特性時間,火炎形態を測定,検討した.とくに構成液滴がより微細な場合と不均質性な場合に着目し,その影響について検討した.その結果,寸法効果に関する知見,数値が蓄積されたほか,構成液滴の一部が消滅(蒸発)してから着火する状況が再現されることを初めて確認した.三次元離散化燃料系としてほぼ球形となるように配置された燃料液滴群を実際に作成し,これを急速に高温の空気雰囲気中へ移動させて,蒸発,自発着火,燃焼させる実験を行い,光学観測により蒸発,自発着火,燃焼の挙動や特性時間,火炎形態を測定,検討した.とくに構成液滴がより微細な場合と不均質性な場合に着目し,その影響について検討した.その結果,寸法効果に関する知見,数値が蓄積されたほか,構成液滴の一部が消滅(蒸発)してから着火する状況が再現されることを初めて確認した.本研究の目的は,実験研究により三次元離散化燃料系である燃料液滴群が蒸発,自発着火して燃焼する一連の非定常過程について,それらの過程に及ぼす燃料液滴直径,液滴間距離,燃料性状といった主要因子の影響を明らかにすることである.現象を複雑化する自然対流の影響を低減するために,微小重力環境を利用して実験を行い,光学観測によって蒸発速度,自発着火挙動,自発着火の遅れ時間,非定常性の強い火炎および燃料液滴の挙動,燃焼速度,燃焼時間などを数値データ化する.本年度は予定どおり,比較的大きな液滴を実験対象として,液滴直径の不均質性と液滴間隔の影響について検討した.本年度の条件では着火位置に大きな違いは見られなかったが,ある程度まで周囲液滴が大きく,または近くなると,いわゆる外部群燃焼に近い火炎形態が見られた.次年度以降液滴の微細化を進めることで,さらに群燃焼に特有な現象が観測ざれると思われる.液滴直径の経時変化や液滴寿命については,周囲液滴が大きいほど,また周囲液滴が近いほど,蒸発が遅れる実験結果が得られた.蒸発速度は一般に液滴直径二乗の減少速度と定義されるが,周囲液滴が大きく近いと現象の非定常性が強くなり,前半の蒸発速度は小さくなる一方で,後半の蒸発速度は逆に高まるような結果が得られた.これについては,今後も引続いて検討を行う予定である。また,以上の実験に先だって,微小重力環境を実現するための自由落下装置の改良を行った.本研究の目的は,実験研究により三次元離散化燃料系である燃料液滴群が蒸発,自発着火して燃焼する一連の非定常過程について,それらの過程に及ぼす燃料液滴直径,液滴間距離,燃料性状といった主要因子の影響を明らかにすることである.現象を複雑化する自然対流の影響を低減するために,微小重力環境を利用して実験を行い,光学観測によって蒸発速度,蒸発時間,自発着火挙動,自発着火の遅れ時間,火炎挙動,燃焼速度,燃焼時間などをデータベース化する.本年度は予定どおり,比較的大きな液滴を実験対象として,液滴直径の不均質性と液滴間隔,初期液滴直径の影響について検討した.液滴直径の経時変化や液滴寿命については,周囲液滴が大きいほど,また周囲液滴が近いほど,現象の非定常性が強くなり,前半の蒸発速度は小さくなる一方で,後半の蒸発速度は逆に高まることが確認されていたが,その影響と周囲液滴の距離と寸法との積との間に相関が見られるものの,初期液滴直径が小さくなると非定常性はさらに強くなることが明らかになり,実験結果のデータベースが充実した.今後も引続いてデータベースの充実を行う.また,第二段階としたインクジェット技術を応用した液滴生成手法についても,その試作と確認を終え,実験に供する直前の段階まで進むことができた.火炎形態モードマップが微細側(左下方)を拡張するなど,データベースの充実を進める.本研究の目的は,実験研究により三次元離散化燃料系である燃料液滴群が蒸発,自発着火して燃焼する一連の非定常過程について,それらの過程に及ぼす燃料液滴直径,液滴間距離,燃料性状といった主要因子の影響を明らかにすることである.実際に三次元離散化燃料系を用意し,それを高温雰囲気に急激に接触させて,蒸発させるか,さらに自発着火をへて燃焼に移行させる.微小重力環境を利用して,光学観測をもとに蒸発速度,蒸発時間,自発着火挙動,自発着火の遅れ時間,火炎挙動,燃焼速度,燃焼時間など三次元離散化燃料系の燃焼関連特性を定量化,データベース化する.本年度は,三次元離散化燃料系の製作手法として,これまでの提案者固有の手法とともに,インクジェット技術を応用した液滴生成手法を新たに採用した.前年度に導入準備を行った,極少量の液滴を高精度で吐出できる液滴ディスペンサシステムを使用し,ディスペンサヘッドから極細線交差点に向けて液滴を吐出し付着させた.こうして従来より微細化された三次元離散化燃料系が製作されるようになり,実験結果を微細側に拡張することができた.前者の方法では,前年度に引続き三次元離散化燃料系を構成する燃料液滴に2種類の液滴直径を振分けて,液滴直径の不均質性の影響を検討するとともに,液滴間隔の影響も併せて検討した.後者の方法では,とくに液滴直径の影響に着目し,液滴間隔の影響と併せて検討することで,寸法効果に関する知見の拡大を図った.

その結果,実験結果のデータベースを充実させることができたほか,構成液滴の一部が消滅(蒸発)した後に着火する条件が成立することを確認した.寸法,配置が制御された三次元離散化燃料系での一部蒸発後の着火は,微細化された条件で初めて観察された現象であることから,引続き確認実験などの検証と考察を慎重に進めて,学会発表,雑誌論文を中心に,これまでの成果とあわせて順次公表を進める.
チャネルラストプロセスによる歪み制御縦型Ｇｅトランジスタの作製と電気特性評価

急速加熱処理による液相エピタキシャル法により単結晶Ge細線を作製し、そのトランジスタにより電気特性を評価した。熱処理時間を最適化することにより良好なトランジスタ特性を得ることができた。正孔移動度はピーク値で500 cm2/Vsに達し、比較用Siデバイスに対して約1.6倍の値を示した。また、光学特性評価により直接遷移に起因する発光ピークの90 nmの長波長側へのシフトを測定し、約0.4%の引張り歪みに起因する45 meVのバンドギャップの減少を確認した。本研究課題は、局所液相エピタキシャル成長によるGeワイヤ作製法を進化させ、歪み制御した縦型Geワイヤを作製し、縦型歪みGeトランジスタを実現し、次世代の高度情報化社会を担う高速かつ低消費電力の光・電子デバイスへの応用を目指すものである。本年度は、局所液相エピタキシャル成長における歪み制御技術の基礎的知見の取得を行った。局所液相エピタキシャル成長法により作製したGeワイヤについて、ラマン分光法による歪み及び組成分析を行い、これら特性と熱処理条件との関係を取得した。さらに、本手法により作製したGeワイヤをチャネルとするトランジスタを試作し、キャリア移動度を算出し本手法の有効性の検証を行った。ラマンスペクトルにおいては、390cm^<-1>付近においてSi-Ge結合に起因したピークが観測された。これ・は熱処理中にSi原子がシード領域から液相Ge中へ拡散したことに起因すると考えられる。また、1035°C、1分間の熱処理条件から950°C、1秒の低温、短時間熱処理にすることによりSi組成を低減できることがわかった。シード近傍で数%、十分離れたところではラマン分光法の検出限界以下にSi組成を低減できる。ラマンスペクトルのGe-Geピークのシフト量から格子歪みの算出を行ったところ、約O.4%の引張り歪みが印加されていることがわかった。これは、成長時と室温とのGeとSiとの熱膨張係数差による効果によると考えられる。作製したトランジスタのI_d-V_g特性より、1x10^<-7>μA/μmの低いオフリーク電流に加え、ドレイン電流のオン/オフ比は10^6程度という良好な結果を得た。I_d-V_g特性より見積もった正孔移動度はピーク値で500cm^2/Vsに達した。これらの結果は本手法の有効性を実証するものとしてとらえることができる。本年度は、局所液相エピタキシャル成長法により作製した歪みGeワイヤの発光特性の評価と、歪み制御に加えn型ドーピングとSn添加を検討し、Geの電子バンド構造変調と発光特性の向上技術の検討を行った。局所液相エピタキシャル成長法により作製したGeワイヤについては、成長時と室温でのGeとSiとの熱膨張係数差に起因する約0.4%の引張り歪みが印加されていることを確認していたが、フォトルミネッセンス測定により歪み起因の電子バンド構造変調の評価を行った。その結果、Γ点における直接遷移発光スペクトルが無歪みのGeと比べ90 nmのレッドシフトを示すことを確認した。その温度依存性から、このレッドシフトがΓ点での45 meVのバンドギャップの減少を示していることがわかった。この値は0.4%の引張り歪みから予想される値と一致しており、歪み印加により間接遷移型バンド構造から直接遷移型バンド構造へより近づいたことを示している。さらにエピタキシャル成長前のアモルファスGe中にP(リン)をイオン注入することによりn型ドーピングを試みた。局所液相エピタキシャル成長後に、ワイヤの電気伝導度測定からP濃度を見積もったところ1E18/cm3であることを確認し、フォトルミネッセンス測定において直接遷移の発光強度がノンドープ試料に比べ大幅に増加することがわかった。さらに局所液相エピタキシャル成長においてSn添加を検討し、固溶度を超えるSnの添加が可能であることがわかった。直接遷移発光のスペクトルも大幅なレッドシフトを示し、Geのバンド構造が変調されていることがわかった。本年度は、局所液相エピタキシャル成長法により作製したSn添加歪みGeワイヤの優先結晶方位測定とその制御、バックゲートトランジスタの試作と電気特性評価、シードレス局所液相エピタキシャル成長法の検討と石英基板による歪み量の向上技術の検討を行った。GeにSnを添加することにより電子バンド構造が変調され、キャリア移動度の向上、間接遷移型から直接遷移型に近づくことが知られている。昨年度はSn添加により直接遷移型バンド構造へより近づいたことをフォトルミネッセンス法により確認した。

しかし、Sn添加によりGeワイヤの結晶方位がワイヤに沿って回転する現象が確認され、その回転機構と制御法の検討を行った。その結果、Sn添加により(110)面が優先されることを確認し、この現象を利用することで単一方位のSn添加Geワイヤを作製することができた。また、バックゲートトランジスタの電気特性評価よりSn添加によりスイッチング特性が向上することも確認した。さらに、液相エピタキシャル成長時の熱処理において温度勾配を形成することでシードを用いずにSn添加単結晶Ge細線を形成できることを確認した。また、この手法により石英基板上でSn添加単結晶Ge細線を作製したところ、シリコン基板上に比べ、より高い歪み量を有する細線を作製することができ、フォトルミネッセンス測定によりその発光特性が著しく向上していること確認することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。電子デバイス材料26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画通り局所液相エピタキシャル成長における歪み制御技術の基礎的知見の取得を行うことができたので。当初計画通り局所液相エピタキシャル成長により作製した歪みGeワイヤの発光特性評価とn型ドーピングとSn添加により発光特性向上を実現できたので。今後は、引き続き歪み制御のための成長条件の検討とトランジスタのデバイス特性の向上を進める。局所液相エピタキシャル成長により作製した歪みGeワイヤの発光特性については不明な点も多くあり、基礎的知見の取得によりその理解を進めると同時にデバイス応用への展開を図る。直接経費次年度使用額は5万円程度であり、ほぼ計画通りに予算を使用した。翌年度は、当初計画通りに予算を執行する。
糖尿病患者遺伝子解析に基づくゲノムコピー数維持機構の解明

2型糖尿病の発症には遺伝的因子が大きく関わる。我々は、既に報告した第4染色体に加え、さらに2個所のサブテロメア領域において、糖尿病と高頻度・高寄与度で相関する新たなコピー数欠失を見出し、これらの3つのサブテロメア領域におけるCNVは同一患者に集積することを示した。さらに、4p16.3領域におけるマスアレイ解析により、少なくとも一部の患者にはゲノム変化が生じていることを証明した。4p16.3の領域のゲノムシークエンスにより、一部の患者に広範囲のゲノム変化を示唆する所見を得ており、詳細な解析により、2型糖尿病発症メカニズムと関連するゲノム変化を検出できることが期待される。我々が見出したコピー数減少を示す領域のうち、本年度は、最も2型糖尿病発症について、寄与度も頻度も高い第4染色体のサブテロメア領域について、検討を進めた。この領域の多型患者をさらに見出すことにより、CNV糖尿病の臨床的特徴を明らかとし、遺伝形式や発症原因特定につながるとともに、将来の臨床応用や治療薬開発にもつながると考えられる。そこで、まず、簡便かつ安価で実施できる方法を模索した。高密度カスタムメイドオリゴヌクレオチドタイリングアレイでの解析データに基づき、種々のプライマーを設定し、マスアレイを行ったところ、コピー数減少を示した11名中5名で、実際にコピー数が1であるとして減少を検出できた。このことから、タイリングアレイでのシグナル低下として検出された現象が別の手法でもゲノム変化として確認されたこととなり、簡便な診断法の開発に大きく発展するとともに、本ゲノム構造異常の実態解明に前進した。しかし一方で、タイリングアレイ解析でコピー数減少が見出されたすべての患者が検出できたわけではなく、アレイによるプローブの結合不良が示すゲノム構造変化について、第4染色体のサブテロメア領域に生じている現象は多様性を有していることが明らかとなった。以上の結果に基づき、本ゲノム構造異常の実態と機序解明につながるものと考え、この領域のゲノムシークエンス解析と全エキソーム解析を進めている。35歳未満発症の2型糖尿病患者に非常に高い寄与度・特異度で見出されるゲノム構造異常について検討している。その中でも100人の35歳未満発症2型糖尿病患者のうち、13人に認められ、100人の正常対照者のうち1人しか認められなかった(オッズ比14)、特に寄与度、特異度の高い4p16.3に焦点をあてた解析を進めた。まずこの異常の発見のきっかけはタイリングアレイやカスタムメイドオリゴヌクレオチドアレイでの結合率低下であった。さらに、前年度PCRマスアレイでも部分的ながら低下は確認された。そこで、本年度はその実態を明らかにするべく、アレイ解析で4p16.3のコピー数に有意な異常が見出された11名と対照4名について、この領域のゲノムシークエンス、および、全エキソームシークエンスを行った。ビッグデータであるため、まだ解析はすべては完了してはいない。これまでのところ、両者の解析において、アレイでの異常検出者に共通する異常は見出されていない。アレイ解析で異常が見出され、シークエンス解析ではその異状が確認できないということは、従来の解析技法では説明のつかないゲノム異常の存在を示唆していると考えられる。このことは、これまでの報告とは桁違いの寄与度特異度の異常を我々が見出していることの理由とも考えられ、大変興味深いものである。引き続きビッグデータ解析を行う一方、シークエンスサンプルの調整段階の詳細な分析などを進めることで、これらの一見矛盾する結果が意味する真のゲノム構造異常の実態解明につなげる。マスアレイという新しい手法を加えることで、簡便かつ安価で実施できる新たな解析手法を見出した点で当初の計画以上の進展と考えられる。この結果、第4染色体のサブテロメア領域に生じている現象は多様性を有しているという予想外の結果が得られた。この領域のコピー数多型におよぼす機序や糖尿病発症につながる機序も含め、生物学的に新たな発見につながるものと考えられる。内科学第4染色体のサブテロメア領域に生じている現象は多様性を有していることから、この領域について、コピー数減少を見出している11名全員について、シークエンスを行い、各サンプルにおいて第4染色体のサブテロメア領域に生じている現象の実態を明らかとする。これにより、コピー数多型におよぼす機序が明らかとなり、新たな検査法の開発にもつながるものと期待される。
離島・へき地における海辺の自然史教育

自然に恵まれた離島やへき地において、海岸漂着物や海岸堆積物(砂や礫)を、海辺の自然史教育の視点から再認識し、身近な自然史教材としての活用を試みる。また、自然体験学習の実践として、大学の授業でビーチコーミングや海岸の野外実習を行い、自然の多様性を理解し、それらを読み解く自然史教育のリテラシー能力を高めてゆく。アウトリーチでは、実際の自然史試料の観察に加え、タブレット端末を利用したインタラクティブな電子教材を用いて、地域の子どもたちに体験型アクティビティを提供する。離島やへき地における身近な自然史教材を活用したアプローチは、自然史教育のリテラシーに新たな視点をもたらす。
部位特異的な上皮間葉系相互作用を通じた皮膚疾患病態解明及び再生医療に関する研究

「ヒト成人においても、上皮間葉系相互作用(真皮線維芽細胞がその上にある上皮系細胞に与える作用)により部位特異性(皮膚のさまざまな部位で性質が異なること)を決定付けていること」を実証してきた。手のひら・足のうらの皮膚は、分厚い皮膚で外からの刺激に強い・毛が無い・色素が薄いという3つの特徴がある。手のひら・足のうらの真皮線維芽細胞で発現が高いDKK1が、メラノサイトの機能を抑えるだけでなく、表皮細胞のメラニン取り込み能を抑制すると同時に、重層化を促進している結果を得ることが出来た。皮膚における部位特異性という独創的な観点から多数の研究成果を揚げた。成人における上皮間葉系相互作用の部位特異性に関する研究では、メラノサイトに焦点を向け著書を出版した(Humana Press社)。またメラノサイトに及ぼすDickkopf1(DKK1)の影響をマイクロアレイによる解析を含めた分子生物学的手法を用いて更に詳しく調べ論文発表した(J Invest Dermatol 127 in press)。掌蹟真皮線維芽細胞にて発現増強しているDKK1がメラノサイトの分化・増殖を抑制する機序の更なる解明につながった。更にメラノサイトも腺細胞や表皮角化細胞と同様に極性を有することを解明した(J Cell Sci 119など)。またメラノサイトの受容体として最も有名なMelanocortin 1 receptorのアイソフォームに関する報告もし、黒人は白人より多く発現していることを証明した(FASEB J 20(11))。部位特異性からの病態解明から派生した悪性黒色腫に関する研究として、CapGがメチレーションを介してどのように黒色腫株を抑制するかの研究に加わった(Oncogene 25)。また皮膚癌発症にも部位特異性があり、露光部に多く紫外線の影響を多分に受けているものが多い。人種間の皮膚癌発生頻度の差を比較検討することから、新しい皮膚癌発症機序として、紫外線によるアポトーシス(細胞死)が白人ではうまく誘導できない可能性が高いことを証明した(FASEB J 20(9))。またこの機序にはCaspase 3は関与しないがp53は関与することを示し、総説も執筆した(J Dermatol Sci in press)。またAPE/Ref-1がこの機序に関連することも示した(J Invest Dermatol 126)。このような一連のヒト皮膚に関する色調を司る因子(紫外線や部位特異的なサイトカインの発現様式)についての総説執筆にも参加した(Pigement Cell Res 20)。また最後に部位特異性を応用した難治性潰瘍治療法開発から派生した研究が実際の臨床でも活かされ、数々の潰瘍治療に役立った(Arch Dermatol in press)。DKK1が表皮細胞に与える影響について投稿中であり、更に多数の研究成果を来年度も揚げる事ができればと努力している。「皮膚が場所により違うのは,真皮線維芽細胞という間葉系由来細胞が,最外層に存在する表皮細胞やメラノサイトに影響を及ぼすから」という独創的な立場・観点から多数の研究成果を揚げた。私は3年前にStanford大学Howard Y.Changから招聘されたので,この独創的な概念の講演をした。本年度彼らのグループは,NatureやCellに同様の成果を公表し,「今までジャンクとされていたNon-codingRNAが皮膚真皮線維芽細胞において,その場にふさわしい組織に分化・形質を維持するのに重要な働きをしていること」を証明した。私も臨床論文(特に難治性皮膚潰瘍や皮膚癌に関する論文で,研究課題の再生医療を臨床応用するもの)を公表する傍ら,同様の基礎研究を地道に行ってきた。「ヒト成人においても,上皮間葉系相互作用(真皮線維芽細胞がその上にある上皮系細胞に与える作用)により部位特異性(皮膚のさまざまな部位で性質が具なること)を決定付けていること」を実証してきた。具体的には,メラノサイトに焦点を向け本年度のJ Biol Chemの総説特集号のカバーを飾った。またメラノサイト(J Invest DermatolというNature Publishing Groupの皮膚科領域で一番Impactfactorの高い雑誌)および表皮細胞(FASEB J)に及ぼすDickkopf 1 (DKK1)の影響をマイクロアレイによる解析を含めた分子生物学的手法を用いて更に詳しく調べ、ともにFirst及びCorrespondingで論文発表した。また皮膚癌発症にも部位特異性があり,露光部に多く紫外線の影響を多分に受けているものが多い。人種間の皮膚癌発生頻度の差を比較検討することから,新しい皮膚癌発症機序を提唱し続けた。このような一連のヒト皮膚に関する色調を司る因子(紫外線や部位特異的なサイトカインの発現様式)についての総説執筆にも参加した。また最後に部位特異性を応用した難治性潰瘍治療法開発から派生した研究が実際の臨床でも活かされ,数々の潰瘍治療に役立った。更に多数の研究成果を来年度も揚げる事ができればと努力している。

(782字)「皮膚が場所により違うのは、真皮線維芽細胞という間葉系由来細胞が、最外層に存在する表皮細胞やメラノサイトに影響を及ぼすから」という独創的観点から多数の研究成果を揚げた。表皮のみを効率良く採取する方法を編み出し公表するなど、難治性皮膚潰瘍や皮膚がんに関する論文で、研究課題の再生医療を臨床応用する論文を発表した。基礎研穿においては、「ヒト成人においても、上皮間葉系相互作用(真皮線維芽細胞がその上にある上皮系細胞に与える作用)により部位特異性(皮膚のさまざまな部位で性質が異なること)を決定付けていること」を実証してきた。手のひら・足のうらの皮膚は、分厚い皮膚で外からの刺激に強い・毛が無い・色素が薄いという3つの特徴がある。表皮細胞(FAsEBJ)に及ぼすDickkopfl(DKK1)の影響をマイクロアレイによる解析を含めた分子生物学的手法を用いて更に詳しく調べた。手のひら・足のうらの真皮線維芽細胞で発現が高いDKKIが、メラノサイトの機能を抑えるだけでなく、表皮細胞のメラニン取り込み能を抑制すると同時に、重層化を促進している結果を得ることが出来た。また皮膚がん発症には部位特異性があり、露光部に多く、紫外線の影響を受けているものが多い。ヒト皮膚に関して色調を司る因子(紫外線や部位特異的なサイトカインの発現様式)の研究にも従事し、成果を上げた。またマウス毛包形成におけるDKK1を含めたWnt系、Shh系、Bmp系の相互作用も調べDKK1が制御するb-カテニン系の重要性を調べた。
産業構造の変動に対する地域社会・地域中小企業の適応

1.石油ショック以降の日本の産業構造の転換に対して、地方の産業がどのように対応してきたか、この問題を解明することが本研究の課題である。我々はその一例として地方に立地している電子産業を取り上げ、調査地として長野県の上伊那(特に駒ケ根市)と山形県の米沢の二箇所を実態調査し、工業化の過程と現状を比較した。2.両地域は第二次大戦下の工場疎開が電機工業立地の端緒となり、高度成長初期にその集積をみたという点で共通性を持っている。また、成長の条件は地方において豊富に存在する低賃金労働力であった。3.このような条件は石油ショックおよびG5以降の円高不況によって完全に崩壊した。それとともに、地域内の生産構造も大きく変化した。4.駒ケ根の場合、親企業が農村部に下請工場を作り出し、いわゆる「納屋工場」の形成がみられた。しかしこのような形態は石油ショック以降衰退へと向い、これに代って少数の実力ある独立企業が産み出された。これに対し米沢の場合、高度成長期に比較的規模の大きい第一次下請企業層が形成され、石油ショック以降はこの層を中心にしてネットワーク型の構造が作られて行った。さらに米沢においては、このような変化に対して行政の果した役割は大きい。5.現状を比較した場合、駒ケ根においては一部の小企業の技術水準は極めて高いが、全体としては低い。米沢はこれと逆である。6.一般にこれまでのような、低賃金労働力を誘因とした地方工業化のシナリオは、すでに破綻したと言って良い。地方の工業においても、知織集約化・技術集約化を進めることが重要な課題となろう。地域の産業構造のレベルアップを考える場合、各企業の努力に頼るだけでは限界がある。米沢のように、政策的に地域内に企業間ネットワークを作り出すことは、地域の産業そのものをレベルアップし、技術集約化の方向に変えてゆく一つの手段となるであろう。
マイクロマニュピレーション・直接PCR法を用いたDNA分析による木材の樹種識別

木材や木材製品の樹種を種レベルで識別するために、長期間の保存や高温処理による木材中のDNAの劣化による影響を分析した。また、それらの結果をもとに木材のDNA分析に有効な超音波処理によるDNA抽出手法を開発した。さらに、その手法を用いて、東南アジア産木材で製造された合板用単板および製材からDNAを抽出し、データベースをもとに分析することによって木材の樹種を特定することに成功し、樹種や産地の確認のためにDNA分析手法の有効性を検証した。本年度は(1)市販のDNA抽出キットを用いて木材からDNAを抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法による増幅が可能かどうかを検討した。伐採直後のスギ木材からはDNAが効率よく抽出できたが、1983年に伐採された木材の抽出液からは電気泳動や紫外線吸光測定でDNAを検出できなかった。しかし、葉緑体遺伝子を増幅できるプライマーを用いてPCRを行ったところ、電気泳動によってどちらの抽出液からもDNAの増幅が確認でき、DNA分析による樹種の識別が可能であると判断された。(2)木材細胞内でのDNA残存部位を解析する条件を確立するため、伐採年の異なるスギの木材標本を親水性の樹脂で包埋し、薄切片を作製した後、DAPIで染色し顕微鏡で観察した。伐採直後の木材では、辺材中のDNAは軸方向柔細胞、放射柔細胞の核、アミロプラスト等に局在していた。1983年に伐採された木材においても、同様に柔細胞の核、アミロプラストにDNAが局在する様子が確認できた。一方、1966年に伐採された木材では、柔細胞中の核やアミロプラスト等オルガネラの明確な構造が確認できなかったが、柔細胞内にDAPIで染色される物質が観察された。これらの結果は、顕微鏡によって木材細胞中のDNAの局在部位が可視化できること、及び従来の方法ではDNAが抽出できない木材中にもDNAが残存しうることを示している。今年度得られた成果は、木材中のDNAを効率よく取り出して、増幅し、解析することによって樹種の識別を行う技術の開発の基礎となる。この成果を用いて、次年度以降、木材、特に古い材のDNA分析による効率的な樹種識別に取り組む。木材から簡便に短時間で、しかも少ないコンタミネーションの可能性でDNAを取り出す手法を考案し、特許を出願した。この手法をスギ、クヌギ、レッドメランティ材に適用したところDNAの増幅が確認され、その有効性が検証された。また、DNA量と分布の経年変化についてスギ材における解析した。通常のDNA抽出キットを用いて、木材中に残存するDNA量を調べたところ、心材では辺材よりもDNA量が少なく、また、木材の伐採後の経過年数の増加とともにDNA抽出およびその増幅効率が低下し、それらの効率の低下には心材化による細胞オルガネラ等の消失よりも、伐採後の経過年数による影響が大きいことが分かった。蛍光顕微鏡によって、木材中のDNA分布を観察し、辺材中ではDNAは主に放射柔細胞と軸方向柔細胞の細胞オルガネラに分布するが、軸方向柔細胞のオルガネラは伐採後1年以内に消失し、放射組織のオルガネラに含まれるDNAは時間経過とともに消失していくが、晩材部の放射組織においてはDNAが消失しにくいことが分かった。また、心材中の柔細胞には心材成分と思われる褐色の物質が沈着するが、辺材においても伐採後の経過時間の延長とともに、柔細胞中に褐色物質が沈着する。これらの褐色の物質がDNAの抽出および増幅効率を低下させている可能性が示唆された。レーザーマイクロダイセクション法を用いてスギ材からDNAを含む細胞組織を取り出し、増幅行うための最適条件の検討を行った。樹脂包埋せず、1020ミクロンの放射切片から組織を切り出すのが有効であった。本年度得られた結果を組み合わせることで、次年度は古材からDNAを切り出して直接増幅し、分析するための手法を確立する。それを用いることで、長期間にわたって保管されていたような木材の微小な破片からでも木材の樹種の識別が可能になる。これまでに開発した簡易な方法によってShorea属木材から抽出したDNAが含まれる溶液について、PCRによる増幅時にポリビニルポリピロリドンを添加したところ、DNAを増幅できるケースが増加し、DNA増幅に対するポリビニルピロリドン添加の効果が示唆された。Shorea属Rubroshorea節木材の合板用単板からDNAの抽出し、PCRによる増幅を行ったところ、工場ラインで乾燥処理を受けた単板においては著しく増幅効率が低下していた。また、DNA抽出木材中に残存するDNA量の経年変化を分析するため、伐採後の保管期間の異なるスギ辺材において、定量PCR法を用いてDNA量の変化を評価した結果、伐採後23年経過した木材においては、伐採後1年経過した木材のDNA量の約40%になっていた。一方、心材においては、PCR増幅によって推定されるDNAの残存量は、伐採後の年数の増加に伴によって減少すると思われるものの、むしろ個々の試料ごとに異なっていた。
炭素同位体とチャンバー法を用いた海草・海藻による直接的大気中CO2吸収の実証

本研究の目標は,沿岸沈水植物による水塊を介さない直接的CO2吸収について,以下の3点を明らかにすることである.1)普遍性:構成種(海草・大型海藻から複数種を選定)や気候帯(亜寒帯亜熱帯)の異なる植物群落において一般性を検証する.2)規模:沿岸沈水植物の直接的CO2吸収による大気中CO2吸収フラックスを定量化し,大気ー水塊間CO2交換フラックスと比較する.3)規定要因:生息深度,季節変化,日周期変動等の環境要因が直接的CO2吸収に与える影響を明らかにする.本研究では,現地調査を主体として放射性炭素同位体法およびフローティングチャンバー法により,沿岸沈水植物による直接的CO2吸収の定量化を行う.本研究の目標は,沿岸沈水植物による水塊を介さない直接的CO2吸収について,以下の3点を明らかにすることである.1)普遍性:構成種(海草・大型海藻から複数種を選定)や気候帯(亜寒帯亜熱帯)の異なる植物群落において一般性を検証する.2)規模:沿岸沈水植物の直接的CO2吸収による大気中CO2吸収フラックスを定量化し,大気ー水塊間CO2交換フラックスと比較する.3)規定要因:生息深度,季節変化,日周期変動等の環境要因が直接的CO2吸収に与える影響を明らかにする.本研究では,現地調査を主体として放射性炭素同位体法およびフローティングチャンバー法により,沿岸沈水植物による直接的CO2吸収の定量化を行う.
中国における多国籍企業のグローバル調達

研究では、日欧米多国籍企業が中国に設置する購買調達拠点(IPO)に焦点をあて、IPOの設置動機や役割、全社調達戦略に与える影響について国際比較を行い、グローバル調達の拡大を強化している日系多国籍企業の実態と直面する課題を検討した。中国IPOは調達可能な部品群の範囲と量を拡大するだけではなく、全社調達戦略や事業戦略にも影響を及ぼす存在になりつつあることを明らかにした。また、本社における職位とそれに伴うパワーを持つ駐在員は、IPOの成果に好影響を与える傾向が見られた。生産のみならず、調達やサービスなど海外拠点の機能が多様化する中、駐在員の役割やグローバル人的資源のあり方への示唆が得られた。『アジア経営研究』(No.20)に公刊予定の論文では、中国IPOの展開プロセスを明らかにした。中国における多国籍企業の多くは、グローバル調達において、販売業者から調達を行っていたが、調達規模の拡大やその重要性の高まるにつれ、在中国生産拠点の中にIPOを設置することによってグローバル調達の機能も保持し始め、その後、生産拠点からIPOを独立することによって調達機能を強化してきた。中国IPOの設置によって、現地サプライヤーの新規開拓や安定した供給体制を維持し、グローバル調達の拡大と効率化を図っていることを明らかにした。また、サプライヤーの能力開発に伴って高品質かつ低コストの部品や資材を安定調達するための環境整備を進める中で、中国IPOは多国籍企業本社のグローバル調達戦略や事業戦略に影響を及ぼす存在になりつつあり、その役割とグループ全体における位置づけはさらに大きくなると考えられる。『国際ビジネス研究』(第6巻,第1号)に公刊予定の論文では、中国進出している日台2社の事例を取り上げ、戦略提携をベースとした企業内・間国際分業とグローバル調達の展開過程について考察した。日本工作機械メーカーであるT社は、中国事情を熟知する台湾企業との合弁により、中国への市場参入や事業展開を迅速に実現させた。この中国拠点は生産機能だけにとどまらず、グローバル調達機能も持つ拠点になりつつある。このことから、国際提携が、国際分業体制の構築とグローバル調達に重要な役割を果たすことを示唆される。研究計画通り,2年間にわたって多国籍企業の本社及びその中国IPOでインタビュー調査を行った。それまでの調査内容に基づき,学会・研究会で報告を行い,論文を作成した。その中から2本紹介する。『アジア経営研究』に公刊予定の論文では,中国での事業展開とグローバル調達に与える影響などを分析する中で,海外駐在員と帰任者が重要な役割を果たしていることを明らかにした。取引先の海外進出や国内市場の縮小に対応するため海外進出をしているA社は,海外事業の拡大に伴い駐在員人材の不足に頭を悩ませている。同社は,1年短期滞在の若手技術者を派遣することで,問題を緩和しながら派遣コストを抑えることにした。技術指導など多様な役割をこなしていく中,若手技術者の成長を促すことも可能にした。こうした駐在員経験者が多数日本拠点に戻ったため,現地事情と問題点を踏まえて適切な対応と支援を可能にし,迅速に問題解決できた。そういう意味で,駐在員の役割は赴任中に限られず,帰任後にも海外拠点へのサポートや拠点間の連携を促進することが期待できると考えられる。『経済理論』に公刊予定の論文では,先行研究のレビューを行い,グローバル調達がさらに重要性を増す中,駐在員が担う役割は益々重要となってくるにもかかわらず,調達における駐在員の役割をとりあげた研究は皆無であり,重要な課題として残されていることを指摘している。駐在員を中心としたIPOスタッフが本社や世界各地の生産拠点など様々な部門と調整するため,長期にわたり一貫して諸国に分散している各量産拠点に情報提供を行い,自社とサプライヤーとの間のコミュニケーションをサポートすることによって企業間取引関係を管理する。このことから,海外駐在員が拡大する企業内貿易やグローバル調達の担い手として重要な役割を果たすと示唆される。本研究の目的は、多国籍企業の中国におけるIPOに焦点をあてて、中国IPO設置の動機やIPOの役割とグローバル調達の戦略に与える影響について日欧米多国籍企業の国際比較を行い、グローバル調達の拡大を強化している日系多国籍企業の実態と直面する課題を明らかにする。昨年度で行った、米系多国籍企業を研究対象にした事例研究では、同社の中国での調達活動及びその問題点を考察した(2014年学会報告)。事例から発見事実として、まず、中国IPOはグローバル調達の機能にとどまらず、サプライヤー基盤の整備と強化の機能も発揮することで、新たな生産拠点の中国シフトを後押しすることになり、本国本社の対中投資を促進している。また、本社における職位とそれに伴うパワーを持つ駐在員は、中国IPOの持続的な成長やK社の中国での調達の推進に重要な役割を果たしている。生産のみならず、調達やサービスなど海外拠点の機能の多様化が進む中、海外に派遣する駐在員の役割やグローバル人的資源の育成の重要性が浮き彫りになった。それまでの研究調査と議論を踏まえて、本年度は、日系多国籍企業を研究対象にし、事例研究を通じて中国での調達活動および問題点を考察した。グローバル調達に関する意思決定がIPOに移管する傾向にある欧米系多国籍企業に比べ、日系多国籍企業のそれは本社に集中している傾向が見られる。本事例により、全社のグローバル調達戦略、さらに対中直接投資に大いに影響を及ぼす欧米系IPOに比べると、日系IPOは調達活動の実行にとどまっていると言えよう。グローバル調達を促進するには、異なる事業分野間の横連携の強化や、IPOの責任範囲の拡大など課題に取り組む必要があると示唆される。

研究では、日欧米多国籍企業が中国に設置する購買調達拠点(IPO)に焦点をあて、IPOの設置動機や役割、全社調達戦略に与える影響について国際比較を行い、グローバル調達の拡大を強化している日系多国籍企業の実態と直面する課題を検討した。中国IPOは調達可能な部品群の範囲と量を拡大するだけではなく、全社調達戦略や事業戦略にも影響を及ぼす存在になりつつあることを明らかにした。また、本社における職位とそれに伴うパワーを持つ駐在員は、IPOの成果に好影響を与える傾向が見られた。生産のみならず、調達やサービスなど海外拠点の機能が多様化する中、駐在員の役割やグローバル人的資源のあり方への示唆が得られた。当初の予定通り,先行研究の検討やインタビュー調査を行った結果を学会や研究会で報告し,原稿の作成を進めた。よって,「おおむね順調に進展」と判断することにした。国際経営今年度は,学会や研究会でいただいたコメントを参考し,論文の完成度を高める。同時に,グローバル調達と中国IPO設置に関する国際比較を行い,そこでの課題について検討する予定である。そのため,日本や中国でのインタビュー調査を行うとともに,海外の研究者との連携を強化し,欧米企業の本社について調査を進めることを予定している。現行通り,インタビュー調査と学会での研究報告を行い,成果を継続して出せるようにする。当初の予定通り、先行研究の検討やインタビュー調査を行った結果を学会や研究会で報告し、原稿の作成を進めた。また、並行して進めている研究を査読付き学術誌に投稿していたが、それら査読過程も比較的順調に進んだ。よって、「おおむね順調に進展」と判断することにした。現行通り、インタビュー調査と学会での研究報告を行い、成果を継続して出せるようにする。ここまでおおむね順調に進捗しているため、大きな変更は必要ないと考えている。
ヒト好中球におけるオゾン産生の機序解析ならびに殺菌増強作用への応用

好中球が産生する活性酸素は、病原微生物に対する生体防御に重要な役割を果たす一方、その強い反応性のため組織傷害を引き起こす。活性化した好中球は、NADPHオキシダーゼの活性化を介して、スーパーオキシド・過酸化水素・ヒドロキシラジカル・一重項酸素などの活性酸素を産生する。最近、免疫グロブリンの作用により、一重項酸素からオゾンが産生されることが報告されたが、その詳細な機序や生体防御における役割は明らかでなかった。本研究で我々は、4種のアミノ酸(Trp, Met, Cys, His)が免疫グロブリンと同様に一重項酸素からオゾン産生を触媒する作用があること、そしてこれらアミノ酸の触媒作用により産生したオゾンがヒト好中球において殺菌に寄与することを明らかにした。貪食した好中球が産生する活性酸素は、生体内に侵入した病原微生物に対する生体防御に重要な役割を果たしている。抗体の触媒作用により、ヒト好中球が一重項酸素からオゾンを産生し、このオゾンが殺菌作用に寄与していることが報告されていた(Science 298,2195-9,2002,PNAS 100,3031-4,2003)が、その詳細については明らかでなかった。本研究において、先ず我々は、我々が独自に開発した一重項酸素を特異的に産生する無細胞系を用いて、Trp,Met,His,Cysの4種アミノ酸が、抗体と同様に、一重項酸素からオゾン産生を触媒する作用を有することを明らかにした。次に、活性酸素産生酵素(NADPHオキシダーゼ)の先天的異常を認める特殊な慢性肉芽腫症患者の好中球を用いることにより、ヒト好中球においてオゾンが産生されることを確認した。そして、これらアミノ酸の触媒作用により産生したオゾンが、この無細胞系あるいはヒト好中球において、大腸菌や腸球菌などの細菌に対する殺菌に寄与することを明らかにした。この殺菌増強作用は、ヒト好中球が高用量(5-10倍)の細菌に暴露されたときに顕著であった。これらの所見は、特に高用量の病原体に暴露されたときの生体防御系において、好中球が産生するオゾンが殺菌能を増強する可能性を示唆するものであり、好中球の殺菌作用に関して新たな生物学的洞察を与えるものと考えられた。上記の研究成果は、PNAS 105,16912-7,2008に発表した。好中球が産生する活性酸素は、病原微生物に対する生体防御に重要な役割を果たす一方、その強い反応性のため組織傷害をきたすことが知られている。昨年度我々は、Trp, Met, His, Cysの4種アミノ酸が活性酸素の一種である一重項酸素からオゾン産生を触媒する作用を有すること、そしてこれらアミノ酸の触媒作用により産生したオゾンが、ヒト好中球において大腸菌や腸球菌などに対する殺菌に寄与することを明らかにした(Yamashita K et al. PNAS 105, 16912-7, 2008)。今年度は、一重項酸素やオゾンなどによる組織傷害作用を検討するために、急性前骨髄球性白血病細胞株であるNB4 cellを用いて、血管内皮細胞の透過性を調べた。NB4 cellはレチノイン酸によって成熟好中球へ分化誘導させることができ、この成熟好中球が活性酸素産生能を獲得した場合、活性化好中球から放出された活性酸素が血管内皮細胞の透過性を亢進させると仮説を立て、実験を立案・遂行した。この実験系は、我々が臨床でしばしば経験するATRA症候群のin vitroモデルと考えられる。その結果、レチノイン酸無処理のNB4 cellは活性酸素産生能が極めて低く、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)の透過性を変化させなかったが、レチノイン酸処理して好中球に成熟した場合、活性酸素産生能を獲得し、PMA刺激によって産生した活性酸素がHUVECの透過性を亢進させた。また、この血管透過性の亢進はミエロペロキシダーゼ阻害薬で有意に抑制され、ミエロペロキシダーゼの下流で産生する一重項酸素などの活性酸素が深く関与していることが示唆された。この所見は、ATRA症候群に対して活性酸素消去剤投与による治療法の確立に結びつく可能性がある。本成果は、専門誌(Leuk Res, 34, 373-8, 2010)に発表した。好中球が産生する活性酸素は殺菌に重要である一方、その強い反応性のため組織傷害を引き起こすことが知られている。

平成20年度、我々は、Trp, Met, His, Cysの4種アミノ酸が活性酸素の一つである一重項酸素からオゾンを産生する触媒作用を有すること、そして産生したオゾンがヒト好中球において、大腸菌や腸球菌などに対する殺菌に寄与することを明らかにした(PNAS 105, 16912-7, 2008)。平成21年度は急性前骨髄球性白血病細胞株NB4細胞を用いて、活性酸素による血管内皮細胞傷害(透過性の変化)について検討を行った。その結果、NB4細胞は活性酸素産生能を認めず、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)の透過性に変化を及ぼさなかったが、レチノイン酸によりNB4細胞が好中球に成熟すると活性酸素産生能を獲得し、PMAなどの刺激により産生した活性酸素がHUVECの透過性亢進をもたらすことを明らかにした。また、この透過性の亢進がミエロペロキシダーゼ阻害薬で抑制されることを明らかにし、ミエロペロキシダーゼの下流で産生する一重項酸素などが本病態に深く関与することを示した。(Leuk Res 34, 373-8, 2010)。今年度は、敗血症における活性酸素産生の役割をNADPH oxidase 1 (Nox1)に着目して検討を行った。その結果、HUVECにおいて、Nox1はリポ多糖類(LPS)やinterleukin-8(IL-8)刺激により発現が誘導されること、LPS刺激で産生したIL-8がNox1を介して活性酸素産生を誘導し、組織因子の発現を亢進することを明らかにした。この所見は、Nox1の生体における新たな役割を明らかにし、また敗血症の凝固異常にIL-8/Nox1系が深く関与することを示した。本研究の成果は専門誌(Immunology 131, 331-9, 2010)に発表した。