hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性関節リウマチの初期にみられるHLA/DR陽性細胞の意義 ー慢性炎症化機構におけるKey細胞の特性についてー

1慢性関節リウマチ滑膜細胞の特性についてRA滑膜炎で著明に増殖する滑膜D細胞は、骨髄由来の可能性の高いD(M)細胞と間葉系由来が示唆されるD(F)細胞に分けられることが明かとなった。滑膜細胞を培養すると、D(F)細胞由来が考えられる細胞の増殖が強く、サイトカインの影響下に形態、機能を変え、D(F)細胞がin vivoにおいて観察される滑膜病変の多彩性に関与しているものと考えられた。D(M)細胞由来が考えられる細胞は強いclassll抗原の発現を持続し、D(M)細胞はRA滑膜炎の免疫学的活動性に大きく関与しているものと推測された。2慢性関節リウマチ滑膜初期病変の検討初期のRA滑膜において、血管周囲へのHLA/DR強陽性細胞出現、それに続くT細胞の浸潤、Bリンパ球の集簇、濾胞様構造の形成にいたる過程が把握された。DR強陽性細胞は形態的にマクロファ-ジとは異なり、表面マ-カ-的にはRA滑膜炎で特微的に造殖するD(M)細胞と同一であった。3in vivoにおけるDR陽性細胞動態ー薬剤投与による修飾ーRA初期例中、免疫調節剤ロ-ベンザリト投与後、症状の改善をみるものがあったが、効果の明かでない群の存在、DR陽性細胞の動態には有意な変化がないことなど、滑膜炎の形成過程における細胞間相互作用の複雑さが示唆された。4リウマトイド結節構成細胞と滑膜細胞の比較リウトイド結節のpalisadingcellは本質的にRA滑膜D細胞に類似するが、滑膜炎が慢性進行性、破壊性であることに対し、結節は一過性、非破壊性という相違を示す。組織学的観察では、滑膜炎により多数のTリンパ球浸潤が認められることより、滑膜炎の慢性化や破壊性の獲得にはTリンパ球の関与が大きいと考えられた。また、RA滑膜炎初期から出現するDR強陽性細胞とこれらTリンパ球の相互作用、言い替えれば情報交換はいかにして行われているのか、RAの本質にも関わる大きな興味であり、今後の課題の一つとなろう。慢性関節リウマチ(以下RA)の滑膜病変および骨破壊病変において重要な役割をはたしていると考えられる。classII抗原陽性細胞(DR陽性細胞)について以下の検討を行った。I.初期RAの滑膜組織像:発症1年以内の早期RA患者より採取した滑膜組織を、免疫組織学的、電顕的に観察した。いまだliningcellの増生やリンパ球浸潤の目立たない初期のRA滑膜において、すでに小血管周囲に細長い胞体を有したDR陽性細胞の出現がみられ、電顕的にはマクロファージ様の形態を示すものの貪食像はなく、リンパ球とのナーシング現象を示すなど免疫学的特異性が示唆された。今後、この細胞が病変の進行とともにどのような動態を示すかについて解析を行いたい。II.螢光抗体法二重染色によるDR陽性細胞の解析:螢光抗体二重染色を応用してDR陽性細胞のポピュレーションについて考察した。進行期のRAでは、リンパ球、血管内皮を含めて様々なDR陽性細胞が観察ささるが、今回はとくにマクロファージ系細胞の表面マーカーとHLA/DR抗原の二重染色を行い、組織球ないしマクロファージ様のDR陽性細胞について検討した。

この結果、これまで単にDR陽性細胞としてあつかってきたものは、表面マーカー的に数種のポピュレーションに分けられ、局在の違いも観察された。これがDR陽性細胞のheterogeneityを示すものか、あるいは異なった分化、機能段階を示すものか、今後の研究課題と考える。III.培養系におけるDR陽性細胞の形態:RA患者から採取した滑膜からDR陽性細胞のクローニングを試みた。得られたクローンは大部分線維芽細胞様の紡錘形細胞で、これらはHLA/DR抗原陰性であった。一方、DR陽性細胞として1クローンを得たが、自己Tリンパ球と混合培養すると、Tリンパ球は著名に分裂増殖を示した。このクローンが初期RAの血管周囲に存在したDR陽性細胞に相当するものか、またいかなる免疫学的機序が作用しているかについて興味がもたれる。慢性関節リウマチ(RA)の滑膜炎を特徴づけるHLA-DR陽性細胞の意義について以下の検討を加えた。1.HLA-DR陽性細胞のcharacterization昨年までの検討でHLA-DR陽性細胞には様々なpopulationが存在することを示した。今年度は、研究目標とした二重染色法を用い、これらの細胞の同定を試みた。その結果、RA滑膜炎において、その増殖性病変の中心となるsublining layerのHLA-DR陽性細胞(D細胞)は、非血液由来間葉系細胞のマ-カ-であるFU3が陽性の細胞とマクロファ-ジ系細胞のマ-カ-であるLeuM3と血液由来を示すLCA陽性の細胞に分けられ、前者をDF細胞,後者をDM細胞と呼ことにした。培養細胞を用いた実験結果を考え合わせると、DF細胞はサイトカインの影響下に形態、機能を容易に変える細胞であり、滑膜病変の多彩性に大きく関与しているものと考えられた。一方、DM細胞はRA滑膜炎の免疫学的活動性に大きく関与している細胞と考えられた。RA滑膜炎ではこのような複数種のHLA-DR細胞の混在した増殖が特徴であるが、今後はRA初期病変おにいて出現するHLA-DR陽性細胞とこれらのDF細胞、DM細胞の関連について検討する予定である。2.HLA-DR陽性細胞とcollagenase産生細胞の相互関係について滑膜細胞の機能のひとつであるcollagenase産生について、in situ hybridization法を用いcollagenase産生細胞の同定を試みた。collagenase産生細胞は主にsublinlng layerに観察されたが、症例毎に陽性細胞の数は大きな差を示した。これらの陽性細胞は前述のDF細胞に相当するものと考えられた。また、DF細胞のcollagenase産生は他の細胞との相互作用により促進あるいは抑制を受けているものと推測されるが、こられの点については今後培養細胞を用い、サイトカインの関与などを含め検討していきたい。慢性関節リウマチ(RA)の滑膜炎におけるKey細胞であるHLAーDR陽性細胞の意義について以下の検討を行なった。1.HLAーDR陽性細胞の機能前年度までの検討で、RA滑膜炎の増殖の中心となるのはSublining layerのD細胞であり、かつこれは2種(DM細胞,DF細胞)に分類されることを示した。今年度は主に培養糸を用いての検討を加えたが、滑膜組織を培養した場合にはDM,DF細胞それぞれに由来する細胞が得られ,とくに後者が培養系における主要な細胞となることが示された。
MIRAGE症候群: ゲノム編集による疾患モデルマウスの作成と病態解明

我々が疾患概念を確立したMIRAGE症候群(以下本症候群)は、造血異常、易感染性、成長障害、先天性副腎低形成症、性腺症状、消化器症状を主症状とし、責任遺伝子はSAMD9である(Nat Genet 2016, 48: 792-797、http://omim.org/entry/617053)。本研究の目的は本症候群の病態をin vivoで解明することである。本年度は、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により、本症候群で認めたSAMD9点変異をマウスに導入し、本症候群モデルマウスを作成した。すなわち、まず先行研究で作成したROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側にred fluorescent protein (RFP)-野生型SAMD9をヘテロ接合性に有するROSA26/Sノックインマウス同志を掛け合わせ、ROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側にRFP-野生型SAMD9をホモ接合性に有するマウスを作成した。このホモ接合性マウスとCAGプロモーター制御下でタモキシフェン誘導型Creリコンビナーゼを発現するCAG/Cre-ERT2トランスジェニックマウスを交配し、タモキシフェン投与下にヒト野生型SAMD9を発現するマウス(以下対照マウス)を得た。対照マウスの精巣上体から精子を採取し、この精子と野生型マウスの卵子を体外受精させた。得られた受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入した。結果としてタモキシフェン投与下にp.R1293Wを発現する本症候群モデルマウスの作成に成功した。さらに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること、および出生後タモキシフェン非投与下において生存可能であることを確認した。予定通り、研究代表者(長谷川奉延)が本年度のすべての研究を総括し、研究分担者である石井智弘、鳴海覚志、天野直子の3名が対照マウスと疾患モデルマウスの作成を担当した。本年度もっとも困難が予想された研究過程は、対照マウスの精子と野生型マウスの卵子との体外受精による受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入するプロセスであった。第1に確実にSAMD9点変異(p.R1293W)を導入すること、および第2に標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入(オフターゲット効果)されないこと、の2点ともに満たすことが必要であった。この2点を確実に満たすために、マウス受精卵のゲノム編集技術に豊富な経験を有する研究分担者高田修治の指導を受けた。複数回のゲノム編集を行い、その都度、PCR-直接シークエンス法によりSAMD9点変異(p.R1293W)導入の成功の可否を確認した。目的の点変異導入を確認したマウスにおいて全エクソームシークエンスにより標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入されていないことも確認した。現在対照マウスおよび疾患モデルマウスをタモキシフェン非投与下において飼育中である。現時点までに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること(胎子致死ではないこと)、および出生後タモキシフェン非投与下において通常の飼育条件で生存可能であることを確認し、さらに飼育継続中である。すでに、対照マウスと本症候群モデルマウスの飼育を継続している。それぞれのマウスにおいて、出生時・2週齢・4週齢・8週齢・24週齢における体長および体重の計測、さらに本症候群における主要罹患臓器である胸腺、副腎、性腺、腸管の光学および電子顕微鏡学的評価、免疫組織学的評価を行う。副腎機能については血中ACTHおよびコルチコステロンの測定も行う。Preliminary dataではあるが、4週齢の本症候群モデルマウスの体調・体重は対象マウスより小さいかもしれない。このことは、タモキシフェン非投与下でも本症候群モデルマウスの各種臓器にSAMD9点変異(p.R1293W)がleaky expressionしている可能性を示唆する。現在、4週齢の本症候群モデルマウスを屠殺し、胸腺、副腎、性腺、腸管を含む全身各臓器からmRNAを抽出し、SAMD9点変異(p.R1293W)のleaky expressionの有無を確認中である。さらに、本症候群モデルマウスの胎児期(妊娠母体)、生下時あるいは離乳後にタモキシフェンを投与した後、上述と同様の評価をおこなう。本症候群の中核症状の1つである副腎低形成の病態を解明するため、副腎の経時的な網羅的遺伝子発現解析も予定している。

すなわち、まず先行研究で作成したROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側にred fluorescent protein (RFP)-野生型SAMD9をヘテロ接合性に有するROSA26/Sノックインマウス同志を掛け合わせ、ROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側にRFP-野生型SAMD9をホモ接合性に有するマウスを作成した。このホモ接合性マウスとCAGプロモーター制御下でタモキシフェン誘導型Creリコンビナーゼを発現するCAG/Cre-ERT2トランスジェニックマウスを交配し、タモキシフェン投与下にヒト野生型SAMD9を発現するマウス(以下対照マウス)を得た。対照マウスの精巣上体から精子を採取し、この精子と野生型マウスの卵子を体外受精させた。得られた受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入した。結果としてタモキシフェン投与下にp.R1293Wを発現する本症候群モデルマウスの作成に成功した。さらに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること、および出生後タモキシフェン非投与下において生存可能であることを確認した。予定通り、研究代表者(長谷川奉延)が本年度のすべての研究を総括し、研究分担者である石井智弘、鳴海覚志、天野直子の3名が対照マウスと疾患モデルマウスの作成を担当した。本年度もっとも困難が予想された研究過程は、対照マウスの精子と野生型マウスの卵子との体外受精による受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入するプロセスであった。第1に確実にSAMD9点変異(p.R1293W)を導入すること、および第2に標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入(オフターゲット効果)されないこと、の2点ともに満たすことが必要であった。この2点を確実に満たすために、マウス受精卵のゲノム編集技術に豊富な経験を有する研究分担者高田修治の指導を受けた。複数回のゲノム編集を行い、その都度、PCR-直接シークエンス法によりSAMD9点変異(p.R1293W)導入の成功の可否を確認した。目的の点変異導入を確認したマウスにおいて全エクソームシークエンスにより標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入されていないことも確認した。現在対照マウスおよび疾患モデルマウスをタモキシフェン非投与下において飼育中である。現時点までに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること(胎子致死ではないこと)、および出生後タモキシフェン非投与下において通常の飼育条件で生存可能であることを確認し、さらに飼育継続中である。すでに、対照マウスと本症候群モデルマウスの飼育を継続している。それぞれのマウスにおいて、出生時・2週齢・4週齢・8週齢・24週齢における体長および体重の計測、さらに本症候群における主要罹患臓器である胸腺、副腎、性腺、腸管の光学および電子顕微鏡学的評価、免疫組織学的評価を行う。副腎機能については血中ACTHおよびコルチコステロンの測定も行う。
磁気共鳴法による多孔質シリカに吸着した高分子鎖の構造と分子運動に関する研究

昨年にひきつずき電子スピン共鳴法により多孔質シリカに吸着した分子量3千、9万6千、38万の単分散ポリスチレン(PS)の構造と分子運動を観測した。特にポリエチレンオキサイド(PEO)をシリカにグラフト化させ、PSの吸着にグラフト鎖が与える影響を詳しく調べ次のような事実が明らかとなった。(1)PSの吸着速度、吸着量はPEOのグラフト率に強く依存し2%程度のグラフト率をもつシリカにおいて準安定的に吸着したポリスチレン鎖が脱着する現象も見いだされた。(2)吸着PS鎖とシリカとの吸着力、分子運動は分子量に強く依存する。分子量3千の場合、低グラフトのシリカのみにおいて、強い吸着を行う。分子量9万6千、38万のPSを2%程度のグラフト率をもつシリカに吸着させた場合、強い吸着時間依存性がある。最初テ-ル、ループ状に弱く吸着し、時間とともにトレイン状の強い吸着セグメントが増加する。又38万の方が強い吸着低い分子運動性を示した。更にグラフト率にも強く依存したが、運動の転移点が20°CとPSバルクより80°Cも低い。(3)グラフトPEO鎖の末端部位のスピンラベル化によりグラフト率の吸着力、分子運動も観測した結果、PSの分子量が9万6千の場合、吸着PSの方がより速く運動しており、グラフトPEO鎖はシリカに強く吸着している。一方、PSの分子量が38万の場合、PS鎖はグラフトPEO鎖を押し広げてシリカに強く吸着し、PEO鎖はつったった形態に変化し末端部位は非常に速い運動を示した。以上の様に、シリカ-PEO-PSの複合系においてPEO鎖とPS鎖の運動性を区別して観測することができ、吸着の機構を明らかにすることができた。電子スピン共鳴法(ESR)により、ポリスチレンの分子運動を観測する為、分子量3千、9万6千、70万の単分散ポリスチレンに低濃度で磁気分子をラベルした。そのラベル化ポリスチレンを孔径の異なる(小穴直径:約、30nm(MB-300),100nm,200nm)三種の多孔質シリカに吸着させた。これらの吸着したラベル化ポリスチレン鎖のESRスペクトルを測定温度を変化させたところ、次の様な事実が明らかとなった。ラベル分子の窒素原子による超微細構造の大きさとその異方性の平均化により、シリカとポリスチレンの相互作用の大きさ及び吸着ポリスチレンの分子運動の速さを評価できた。(1)ポリスチレン高分子の慣性半径の2倍が小穴直径より、小さい場合、容易にその細孔内に拡散し、シリカに非常に強く吸着された形態をとり、分子運動転移点もポリスチレンバルク試料に比し相当に高温となる。(2)慣性半径の大きい、分子量70万のポリスチレンの吸着形態、吸着鎖の分子運動はシリカの孔径依存性が非常に大きく観測された。また吸着時に用いる溶媒依存性も観測された。例えば、Θ溶媒であるシクロヘキサン中で分子量70万のポリスチレンの慣性半径の2倍はシリカゲル、MB-300の小穴直径30nmよりわずかに大きいがこの系で、ポリスチレンの顕著な吸着依存性が見いだされた。即ち、短時間では小穴の入口で弱く吸着されているが時間の増大と共に小穴の中に拡散し、シリカとの相互作用を強め、分子運動の速さも遅くなることが明らかとなった。(3)多孔質シリカにポリエチレンオキサイドをグラフト化させ、同様にポリスチレンを吸着させた。グラフト鎖に吸着したポリスチレン鎖は異常に速い分子運動の速さを示した。

昨年にひきつずき電子スピン共鳴法により多孔質シリカに吸着した分子量3千、9万6千、38万の単分散ポリスチレン(PS)の構造と分子運動を観測した。特にポリエチレンオキサイド(PEO)をシリカにグラフト化させ、PSの吸着にグラフト鎖が与える影響を詳しく調べ次のような事実が明らかとなった。(1)PSの吸着速度、吸着量はPEOのグラフト率に強く依存し2%程度のグラフト率をもつシリカにおいて準安定的に吸着したポリスチレン鎖が脱着する現象も見いだされた。(2)吸着PS鎖とシリカとの吸着力、分子運動は分子量に強く依存する。分子量3千の場合、低グラフトのシリカのみにおいて、強い吸着を行う。分子量9万6千、38万のPSを2%程度のグラフト率をもつシリカに吸着させた場合、強い吸着時間依存性がある。最初テ-ル、ループ状に弱く吸着し、時間とともにトレイン状の強い吸着セグメントが増加する。又38万の方が強い吸着低い分子運動性を示した。更にグラフト率にも強く依存したが、運動の転移点が20°CとPSバルクより80°Cも低い。(3)グラフトPEO鎖の末端部位のスピンラベル化によりグラフト鎖の吸着力、分子運動も観測した結果、PSの分子量が9万6千の場合、吸着PSの方がより速く運動しており、グラフトPEO鎖はシリカに強く吸着している。一方、PSの分子量が38万の場合、PS鎖はグラフトPEO鎖を押し広げてシリカに強く吸着し、PEO鎖はつったった形態に変化し末端部位は非常に速い運動を示した。以上の様に、シリカ-PEO-PSの複合系においてPEO鎖とPS鎖の運動性を区別して観測することができ、吸着の機構を明らかにすることができた。
結晶中における環状アルキルアンモニウムイオンのコンフォメーション

1.5員環アミンの塩である(C_4H_8NH_2)_2MCl_6(M=Sn,Te,Pt)について,^1H NMR,^<35>Cl核四極共鳴(NQR),単結晶X線回折,熱分析(DTA,DSC)および半経験的分子軌道計算を行った。室温における結晶構造を決定し,結晶中におけるピロリジニウムイオンのコンフォメーションならびにコンフォメーション変化に関る運動,固相-固相相転移の機構についての知見を得た。6員環および7員環アミンの塩である(C_<.5>H_<10>NH_2)_2MCl_6,(C_6H_<12>NH_2)_2MCl_6(M=Sn,Te,Pt)について,単結晶X線回折,熱分析(DTA,DSC)を行った。室温における結晶構造を決定し,結晶中におけるC_5H_<10>NH_2^+,C_6H_<12>NH_2^+のコンフォメーションならびに固相-固相相転移についての知見を得た。2 5員環,6員環,7員環アルキルアンモニウム(C_4H_8NH_2^+,C_5H_<10>NH_2^+,C_6H_<12>NH_2^+)について非経験的分子軌道法(ab initio MO法及びDFT-HF MO法)を用いて,各イオンの安定構造および遷移状態の構造とそのエネルギーを計算した。5員環アルキルアンモニウム(C_4H_8NH_2^+)はシクロペンタン(C_5H_<10>)と異なりC2型が安定であり,Cs型は鞍点になることを見出した。3.6員環アミンおよび5員環アミンの塩である(C_5H_<10>NH_2)PF_6,(C_4H_8NH_2)ClO_4と(C_4H_8NH_2)PF_6を合成し,^1H,^2H,^<19>F,^<31>Pおよび^<35>Clの核磁気共鳴(NMR),粉末法X線回折,熱分析の実験を行い,固相-固相相転移の存在を明らかにするとともに,各固相中における陽イオンと陰イオンの運動状態についての知見を得た。(C_4H_8NH_2)ClO_4においては250,306,310,342Kに固相-固相相転移が,(C_4H_8NH_2)PF_6においては244と282Kに固相-固相相転移が見出された。両塩の最高温固相の構造はCsClタイプの立方晶であることが分かった。低温側の固相では陽イオンは主にパッカリング運動を,最高温固相においては等方的回転運動に加え自己拡散運動を行っていることを明らかにした。4.6員環アミンに分類されるモルフォリンとクロラニル酸(C_4H_8NH_2O)(C_6HCl_2O_4)の塩を合成し,室温での結晶構造を単結晶X線回折実験より決定し,モルフォリニウムイオンのコンフォメーションと結晶中の水素結合についての知見を得た。結晶中ではクロラニル酸のみでO...H...O型の一次元水素結合鎖をつくりモルフォリニウムイオンはこの鎖をN-H...O型の水素結合で結んでいることを明らかにした。(1) 6員環アミンの塩であるC_5H_<10>NH_2PF_6を合成し, ^1H,^<19>F,^<31>P核磁気共鳴線および緩和時間の温度変化,粉末法X線回折,熱分析の実験を行い,固相一固相転移の存在を明らかにするとともに,各固相中における陽イオンと陰イオンの運動状態についての知見を得た。結果は欧文誌のBer.Bunsenges.Phys.Chem.に発表した。(2) 5員環アミンの塩であるC_4H_8NH_2ClO_4とC_4H_8NH_2PF_6について,^1H,^2H,^<19>F,^<31>P,^<35>Cl核磁気共鳴線および緩和時間の,温度変化,粉末法X線回折,熱分析の実験を行い,結晶中における陽イオンと陰イオンの運動状態と固相-固相転移についての知見を得た。結果を取りまとめ,欧文誌のPhys.Chem.Chem.Phys.に投稿した。(3) 5員環アミンの塩である(C_4H_8NH_2)_2MCl_6(M=Sn,Te,Pt)について,^1H核磁気共鳴,単結晶X線回折,^<35>Cl核四極共鳴,熱分析の実験を行い,室温における結晶構造を明らかにするとともに,結晶中における陽イオンと陰イオンの運動状態と固相転移についての知見を得た。結果は1998年分子構造総合討論会(松山)で発表した。

6員環および7員環アミンの塩である(C_<.5>H_<10>NH_2)_2MCl_6,(C_6H_<12>NH_2)_2MCl_6(M=Sn,Te,Pt)について,単結晶X線回折,熱分析(DTA,DSC)を行った。室温における結晶構造を決定し,結晶中におけるC_5H_<10>NH_2^+,C_6H_<12>NH_2^+のコンフォメーションならびに固相-固相相転移についての知見を得た。2 5員環,6員環,7員環アルキルアンモニウム(C_4H_8NH_2^+,C_5H_<10>NH_2^+,C_6H_<12>NH_2^+)について非経験的分子軌道法(ab initio MO法及びDFT-HF MO法)を用いて,各イオンの安定構造および遷移状態の構造とそのエネルギーを計算した。5員環アルキルアンモニウム(C_4H_8NH_2^+)はシクロペンタン(C_5H_<10>)と異なりC2型が安定であり,Cs型は鞍点になることを見出した。3.6員環アミンおよび5員環アミンの塩である(C_5H_<10>NH_2)PF_6,(C_4H_8NH_2)ClO_4と(C_4H_8NH_2)PF_6を合成し,^1H,^2H,^<19>F,^<31>Pおよび^<35>Clの核磁気共鳴(NMR),粉末法X線回折,熱分析の実験を行い,固相-固相相転移の存在を明らかにするとともに,各固相中における陽イオンと陰イオンの運動状態についての知見を得た。(C_4H_8NH_2)ClO_4においては250,306,310,342Kに固相-固相相転移が,(C_4H_8NH_2)PF_6においては244と282Kに固相-固相相転移が見出された。両塩の最高温固相の構造はCsClタイプの立方晶であることが分かった。低温側の固相では陽イオンは主にパッカリング運動を,最高温固相においては等方的回転運動に加え自己拡散運動を行っていることを明らかにした。4.6員環アミンに分類されるモルフォリンとクロラニル酸(C_4H_8NH_2O)(C_6HCl_2O_4)の塩を合成し,室温での結晶構造を単結晶X線回折実験より決定し,モルフォリニウムイオンのコンフォメーションと結晶中の水素結合についての知見を得た。結晶中ではクロラニル酸のみでO...H...O型の一次元水素結合鎖をつくりモルフォリニウムイオンはこの鎖をN-H...O型の水素結合で結んでいることを明らかにした。(1) 5員環アミンの塩である(C_4H_8NH_2)ClO_4と(C_4H_8NH_2)PF_6について,^1H,^2H,^<19>F,^<31>Pおよび^<35>Clの核磁気共鳴(NMR)と熱分析(DTA,DSC),粉末法X線回折の実験を行い,固相-固相相転移と各固相における陽イオンの運動についての知見を得た。結果はBulltin of the Chemical Society of Japan(1999)に発表した。(2) 6員環アミンに分類されるモルフォリンとクロラニル酸(C_4H_8NH_2O)(C_6HCl_2O_4)の塩を合成し,室温での結晶構造を単結晶X線回折実験より決定し,モルフォリニウムイオンのコンフォメーションと結晶中の水素結合についての知見を得た。結晶中ではクロラニル酸のみでO_...H_...O型の一次元水素結合鎖をつくりモルフォリニウムイオンはこの鎖をN-H_...O型の水素結合で結んでいることを明らかにした。結果はActa Crystallographica C(1999)に発表した。
血管機能検査による内腸骨動脈塞栓に伴う臀筋跛行の予測

腹部大動脈瘤・腸骨動脈瘤手術は破裂を予防するために不可避の治療ではあるが、術後のQOL低下をきたし得る合併症の一つに臀筋跛行がある。これは腸骨動脈領域に動脈瘤が及ぶ場合に臀筋への主たる血液供給路である内腸骨動脈を閉塞した症例の約1/4に生じると言われている。ステントグラフト治療が全盛の昨今、内腸骨動脈を閉塞したことによりADLの低下を来した患者が増加していると考えられる。我々は内腸骨動脈閉塞時の血流代償機転には側副血行路の血流調節機能が関与していると考えており、この調節機構は側副血行路の血管機能に依存していると推察している。そこで、内腸骨動脈塞栓を伴うステントグラフト治療術後の臀筋跛行出現の有無・重症度と自然経過と血管機能との関連を明らかにして内腸骨動脈再建の適応において血管機能による新たな基準を提示することを目的に研究を行っている。研究開始後、現在のところ19名の患者が登録され、14名の解析データが得られた。術前の血管機能と歩行能力(近赤外線分光法を用いたトレッドミル歩行負荷試験、および6分間歩行)を評価した後に手術を行い、術後の歩行を継時的に前向きに評価している(手術毎月一回、6ヶ月後まで)。現在、登録途中であるが内腸骨動脈塞栓を行ったほぼ全症例に程度の差はあるが臀筋跛行が出現し、多くの患者は半年までに回復している事が明らかになった。また片側内腸骨動脈塞栓症例の臀筋跛行の自然予後は良好であるが、両側塞栓例のQOLは片側に比べて有意に低下する事が明らかになった。今後、さらに症例登録を増やし、内腸骨動脈塞栓後の臀筋跛行の自然経過を明らかにして血管機能との関連を解析する方針である。2017年報告時には患者登録が遅れていたが、その後の登録は順調に推移している。科研費研究期間を一年間延長したことで目標の30症例に到達出来る見込みである。研究計画の変更予定は目下のところ無く、研究遂行上の問題も無いため順調に研究計画を進められている。今後も引き続いて登録を進め、目標の30症例の解析に繋げたい。1研究の承認と必要書類の作成:当研究の倫理申請を東北大学病院倫理委員会に申請し承認を得たが、申請から承認まで4ヶ月を要した。血管機能検査は一般的に広く行われている検査ではあるが動脈瘤検査では行っていない施設もある点、トレッドミル歩行負荷試験も一般的ではあるが動脈瘤患者では行っていない施設が多いことから侵襲を伴う臨床試験と位置付けられ、その観点から厳格な倫理委員会による審査を経た。被検者への説明と同意文書に関しても血管機能検査の合併症(時にめまいやふらつきなどのニトログリセリン投与による副作用の発現)やトレッドミル歩行負荷試験実施によって増える患者負担額(保険承認されている)について十分に説明を行う内容とした。2プロトコールの作成:手術前および手術後に行うトレッドミル歩行負荷試験の実施に関するプロトコール作りをリハビリテーション部の協力の下に行った。年齢および日常のADLによって症例ごとに調整して一定の負荷量を設定することとし、負荷量と臀筋跛行の出現に関して継時的に比較できる設定とした。また、臀部への近赤外線分光法を用いた臀部血流の評価については近赤外線分光法プローブの貼付位置を実験を通して同一の部位に調布するように症例ごとに貼付位置を腸骨稜、坐骨結節からの距離で明記することとした。3血管機能検査の有用性の再検討:当院では血管機能検査の有用性をこれまで論文に発表して来たが、さらに症例数を追加して学術誌に報告するため、データの集積を開始した。4研究の実施:2017年度始めから研究を開始する体制が整い、患者のinclusionを開始したところである。東北大学病院倫理委員会における審査と承認までに約4ヶ月を要し研究計画に遅れを来した。そこで、内腸骨動脈塞栓を伴うステントグラフト治療術後の臀筋跛行出現の有無・重症度と血管機能との関連を明らかにして内腸骨動脈再建の適応において血管機能による新たな基準を提示することを目的に研究を行っている。研究開始後、現在のところ10名の患者が登録されてる。

現在、登録途中であるが内腸骨動脈塞栓を行ったほぼ全症例に程度の差はあるが臀筋跛行が出現し、多くの患者は時間の経過とともに回復している。今後、さらに症例登録を増やし、内腸骨動脈塞栓後の臀筋跛行の自然経過を明らかにして血管機能との関連を解析する方針である。申請当初は年間10症例程度の登録を見込んでおり、2年を経過した段階の予定では20症例を超えていると見込んでいた。しかし、初年度の大半を当施設の倫理委員会の承認手続きに要したことが進捗が遅れている大きな理由である。また、昨年末に内腸骨動脈再建用のステントグラフトデバイスが市販されたため、内腸骨動脈閉塞手術例がやや減少傾向にあることも進捗の遅れの原因と考えている。腹部大動脈瘤・腸骨動脈瘤手術は破裂を予防するために不可避の治療ではあるが、術後のQOL低下をきたし得る合併症の一つに臀筋跛行がある。これは腸骨動脈領域に動脈瘤が及ぶ場合に臀筋への主たる血液供給路である内腸骨動脈を閉塞した症例の約1/4に生じると言われている。ステントグラフト治療が全盛の昨今、内腸骨動脈を閉塞したことによりADLの低下を来した患者が増加していると考えられる。我々は内腸骨動脈閉塞時の血流代償機転には側副血行路の血流調節機能が関与していると考えており、この調節機構は側副血行路の血管機能に依存していると推察している。そこで、内腸骨動脈塞栓を伴うステントグラフト治療術後の臀筋跛行出現の有無・重症度と自然経過と血管機能との関連を明らかにして内腸骨動脈再建の適応において血管機能による新たな基準を提示することを目的に研究を行っている。研究開始後、現在のところ19名の患者が登録され、14名の解析データが得られた。術前の血管機能と歩行能力(近赤外線分光法を用いたトレッドミル歩行負荷試験、および6分間歩行)を評価した後に手術を行い、術後の歩行を継時的に前向きに評価している(手術毎月一回、6ヶ月後まで)。現在、登録途中であるが内腸骨動脈塞栓を行ったほぼ全症例に程度の差はあるが臀筋跛行が出現し、多くの患者は半年までに回復している事が明らかになった。また片側内腸骨動脈塞栓症例の臀筋跛行の自然予後は良好であるが、両側塞栓例のQOLは片側に比べて有意に低下する事が明らかになった。2017年報告時には患者登録が遅れていたが、その後の登録は順調に推移している。科研費研究期間を一年間延長したことで目標の30症例に到達出来る見込みである。倫理委員会の承認を受け、プロトコールの作成と必要物品の購入も済んだため今年度以降は速やかに研究の遂行が可能と考えている。今後、申請期間中に目的とする症例の登録と解析は問題なく行える。内腸骨動脈瘤塞栓を実施するステントグラフト治療患者の登録は現行の基準で進めていく。また本研究の主目的は内腸骨動脈閉塞に伴う臀筋跛行の自然経過を明らかにすること、臀筋跛行と血管機能との関連を明らかにすることの二点であるため、開腹手術において内腸骨動脈を閉塞する症例の解析も行う方向で検討している。この場合、本研究に関連する研究課題として東北大学倫理委員会に申請して審査を受けた上で実施する。研究計画の変更予定は目下のところ無く、研究遂行上の問題も無いため順調に研究計画を進められている。今後も引き続いて登録を進め、目標の30症例の解析に繋げたい。倫理委員会の承認に予定よりも時間を要したため研究にやや遅滞が生じ次年度使用額が生じた。今年度の実施症例が予定登録症例を下回ったことと、消耗品の破損が見込みよりも少なかったため繰越金が生じた。
高自由度近可積分ハミルトン力学系の大域的相空間構造

研究課題:「高自由度近可積分ハミルトン力学系の大域的相空間構造」の研究を日本学術振興会の特別研究員(ポストドクター)制度と科学研究費補助金制度の協力を得て行なった.研究テーマ(A):『4次元シンプレクティックマップの低次元共鳴島の解析的表現』(出版済論文)研究テーマ(A)の意義:高自由度の力学系は必然的に高次元の相空間が研究対象となり,幾何学的直観による理解が困難となる.更に近可積分系の相空間では,カオス領域が相空間で混在していることにより力学系の統計的な記述が困難である.従って,本研究課題「高自由度の近可積分ハミルトン系の大域的相空間構造」への接近には工夫が必要となる.特異摂動法としての『くりこみ法』はこのような難問にアプローチする理論的枠組の候補である.それはこの摂動法が系統的な手順により,与えられた近可積分系の簡約化が可能になるからである.上記の相空間構造の理解の中で特に,相空間大域的なカオスの発生起源となる意味で重要な,「共鳴島の相空間中での配位の確定」は基本的な問題である.それゆえ,これを「くりこみ法」により議論した.研究テーマ(A)の成果:4次元の相空間内で定義されたシンプレクティックマップ(ハミルトン力学系)の共鳴島構造を解析的に与え,それを2次元低次元共鳴島の場合に数値的に確認した.研究テーマ(B):『不安定周期軌道からリアプノフ数とマクロ変数期待値へ-周期軌道依存性-』(投稿中論文)研究テーマ(B)の意義:大自由度ハミルトン系のマクロ変数期待値という統計力学の適用対象とその周期軌道という力学系の相空間の情報を結び付ける意味で,興味が持たれ近年研究が活発になりつつある研究領域が研究テーマ(B)である.しかし,その相空間内で見付かる周期軌道をどのように選べばマクロ変数期待値を再現するかは未知である.それゆえ,マクロ変数期待値を周期軌道から決定する際にこの研究は重要となる.研究テーマ(B)の成果:解析的に表現される周期軌道が少なくとも自由度の数見付かる「離散非線形シュレーデインガー方程式」においてマクロ変数期待値とリアプノフ数を周期軌道による予言と数値計算による評価の比較を行った.予言に用いるべき周期軌道は系の対象性を反映しているべきである事を示唆した結果となった。科研費の使途:数値データ等の保持に必要な「計算機に接続する外部記憶媒体」の購入,また,昨年度得られた成果発表等及を行なうため,国内外で開催された会議出席等のための旅費にも科研費を使わせて頂いた.研究課題:「高自由度近可積分ハミルトン力学系の大域的相空間構造」の研究を日本学術振興会の特別研究員(ポストドクター)制度と科学研究費補助金制度の協力を得て行なった.(1)摂動法としての「くりこみ法」の研究カオスの生成機構や基本的性質を調べるため,対象として応用も多い古典ハミルトン系(以後,単にハミルトン系と省略),特に可積分系に摂動が加わっているという意味で最も基本的な力学系である近可積分ハミルトン系,特にその目的を達成するための数理的手法として『摂動法としての「くりこみ法」の研究』を行なった.また,(1)とは別に,(2)大自由度長距離相互作用ハミルトン系における力学(正準方程式)の数値計算とカノニカル統計理論から導かれるマクロ変数の期待値の相違について研究した.統計力学はミクロな法則から緩和後のマクロ変数の期待値を予言する理論体系で物性論のみならず,経済物理学等でもその威力を発揮する.しかし孤立系に対し,カノニカル統計理論の予言とミクロカノニカル統計理論,力学の予言に相違が生じ得る大自由度の長距離相互作用ハミルトン力学系に対しての研究は未だ研究途上である.また,統計力学はエルゴード仮説のもとに構築されているので,力学系の視点で見た大自由度ハミルトン系の相空間構造とも関連が深い.そこで,『大自由度長距離相互作用ハミルトン系における力学(正準方程式)の数値計算とカノニカル統計理論から導かれるマクロ変数の期待値の相違』に関する研究を行なった.(1)の課題に対して,具体的にはハミルトン方程式と数学的構造が等しい差分方程式(:シンブレクティックマップ)に対して,ハミルトン系の特徴を保存した摂動法の系統的枠組を構成し,査読付き論文に投稿,受理された.また,この成果を科研費による旅費の援助を受け,各地で行なわれた研究会等で発表した.(2)の課題に関しては,科研費により購入した高速計算機により正準方程式を数値計算を行なう事,及びカノニカル統計力学の解析的な予言,の双方でマクロ変数の平衡期待値を比較した.それにより系の相転移点エネルギー近傍では大自由度極限での統計力学期待値への漸近が遅いことを発見した.この成果を科研費による旅費の支援を受け,物理学会等で発表した.相互作用距離が1パラメータでコントロールされる大自由度古典ハミルトン力学系族を調べた.この力学系族はαXYモデルと呼ばれ,1998年頃に導入された.このモデルは古典力学系における長距離力の役割について調べるために用いられている.長距離力領域において,この力学系族は,自由エネルギーは熱力学極限で相互作用距離に依らないが,アプノフ数の自由度依存性は相互作用距離に依存することが知られている.この事は統計力学的性質と力学系としての性質が異なることを端的に表している.

今回我々はマクロ変数である温度とオーダーパラメーターの自由度依存性に注目し,ハミルトン力学による時間平均値と,熱力学極限でのカノニカル平均値との相違を観察することにより有限サイズ効果の相互作用距離依存性を調べた.長距離力系の場合自由度無限大であっても,一般に系に相加性が無いため,力学系で定義されたマクロ変数の平衡期待値とカノニカル平衡期待値とが一致する保証は無い事が知られている.このαXYモデルの場合においては,充分に自由度数が大きい場合,力学系で定義されたマクロ変数の期待値とカノニカル期待値とが一致することが先行研究により示されている.しかし,有限サイズ効果までもが力学の場合とカノニカル統計の場合で一致するかどうかについては議論は無く,その検証は我々の研究を待つ事になる.また,自由度数が少いαXYモデルでの緩和過程等を議論する際に非常に基礎的な知識となる.我々はこの有限サイズ効果を,高エネルギー領域でカノニカル分配関数を用いて理論的に予言し,それが力学系の時間発展を数値的に積分から得られる有限サイズ効果と矛盾しない事を確認することができた.また低エネルギー領域では力学系の時間発展の数値的積分を行ない,その有限サイズ効果のα依存性を調べる事ができた.研究課題:「高自由度近可積分ハミルトン力学系の大域的相空間構造」の研究を日本学術振興会の特別研究員(ポストドクター)制度と科学研究費補助金制度の協力を得て行なった.研究テーマ(A):『4次元シンプレクティックマップの低次元共鳴島の解析的表現』(出版済論文)研究テーマ(A)の意義:高自由度の力学系は必然的に高次元の相空間が研究対象となり,幾何学的直観による理解が困難となる.更に近可積分系の相空間では,カオス領域が相空間で混在していることにより力学系の統計的な記述が困難である.従って,本研究課題「高自由度の近可積分ハミルトン系の大域的相空間構造」への接近には工夫が必要となる.特異摂動法としての『くりこみ法』はこのような難問にアプローチする理論的枠組の候補である.それはこの摂動法が系統的な手順により,与えられた近可積分系の簡約化が可能になるからである.上記の相空間構造の理解の中で特に,相空間大域的なカオスの発生起源となる意味で重要な,「共鳴島の相空間中での配位の確定」は基本的な問題である.それゆえ,これを「くりこみ法」により議論した.研究テーマ(A)の成果:4次元の相空間内で定義されたシンプレクティックマップ(ハミルトン力学系)の共鳴島構造を解析的に与え,それを2次元低次元共鳴島の場合に数値的に確認した.研究テーマ(B):『不安定周期軌道からリアプノフ数とマクロ変数期待値へ-周期軌道依存性-』(投稿中論文)研究テーマ(B)の意義:大自由度ハミルトン系のマクロ変数期待値という統計力学の適用対象とその周期軌道という力学系の相空間の情報を結び付ける意味で,興味が持たれ近年研究が活発になりつつある研究領域が研究テーマ(B)である.しかし,その相空間内で見付かる周期軌道をどのように選べばマクロ変数期待値を再現するかは未知である.それゆえ,マクロ変数期待値を周期軌道から決定する際にこの研究は重要となる.研究テーマ(B)の成果:解析的に表現される周期軌道が少なくとも自由度の数見付かる「離散非線形シュレーデインガー方程式」においてマクロ変数期待値とリアプノフ数を周期軌道による予言と数値計算による評価の比較を行った.予言に用いるべき周期軌道は系の対象性を反映しているべきである事を示唆した結果となった。
子どものしつけ・教育戦略の社会学的研究-階層性・公共性・プライヴァタイゼーション

本研究は、近年の教育改革、教育の市場化と私事化の進行が、親の意図的・無意図的な教育戦略に与える影響について、その問題点を明らかにするために、関東圏における子育て中の父母に対する大規模な質問紙調査ならびに親や保育園、小・中学校の教員等へのインタビュー調査を実施した。本研究は、子育てをめぐる親のストラテジーや教育意識を、階層やハビトゥス、文化資本,社会関係資本などのブルデューの理論枠組みを用いながら、社会学的に検討した。教育を通じた階層閉鎖性の問題や教育の私事化傾向、教育における公共性の議論についても、データに基づいて検討した。主たる知見は、以下のとおりである。(1)新自由主義的な教育改革や教育政策の導入に対して、親のとっている教育戦略は階層によって異なる。とくに子どもへの教育期待、教育実践などさまざまな教育と子育ての側面で、階層変数、とくに親の文化資本、経済資本、社会関係資本によって差異が生じている。(2)近年のゆとり教育改革は、公立学校への信頼の低下とあいまって、早期受験(小・中学校受験)を拡大したが、受験の有無は親の収入や文化資本などの階層的格差によって大きく異なると同時に、同質性を求める親たちの社会的閉鎖戦略でもある。(3)親たちの学校教師への信頼度、尊敬度は高く(約8割)、とくに高学歴の親ほど教師への信頼度は高かった。また学校に多くの要望を出す親ほど、教師への信頼度は高いという結果が得られ、「学校に不信感をもつ高学歴の親がクレームをつける」というマスコミなどで流布している教育言説とは逆の結果が得られた。(4)競争する親と競争から降りる親の特徴を明らかにした結果、競争的な価値をもつ親ほど、教育を子の将来への投資とみる考え方をもち、知識重視・ゆとり教育見直し論であり、また家庭責任論と性役割分業観が強く、学校(制度)に多くを求める親であった。(5)子育て不安について社会学的に分析した。子どものしつけと教育戦略の実態と問題を社会学的な理論と方法を用いて実証的に検討するために、初年度は質的調査を実施した。幼児から小学生を対象とし、その社会化主体である親、保育士、小学校教員、子育てNPO、心理カウンセラーなどがかかえる教育困難の実態と意見、また彼らがいかなる教育戦略を用いているかについて、東京、神奈川、山梨、千葉、大阪でインタビュー調査ならびに観察を実施した。また子育て関連施設やボランタリーな父親の会の活動を観察し、インタビューを実施した。質的調査の結果から、理論仮説ならびに来年度に実施する量的調査の調査枠組みの設計を行った。またインタビュー結果は文字化してデータ資料として整理検討した。さらに質的データの量的分析法(内容分析)と分析ソフトの情報を収集し、父親の子育てに対する意見データを用いて、コンピュータソフトを利用した内容分析の試験的分析を実施し論文を報告した。理論面では、文化的再生産論や象徴統制論から先行研究の整理を行った。また階層性の視点からは、「お受験」を体験した親へのインタビュー、教育の市場化と階層性の問題を整理した。公共性とプライヴァタイゼーションに関する先行研究を検討するとともに、幼児をもつ親へのインタビュー結果を中心に検討した。また来年度に実施する量的調査を来年度すぐに着手できるようにサンプリング作業を開始し、調査設計と地点サンプリング作業を業務委託して実施した。また調査員による不正を防止するための手法を検討し、調査設計を工夫するなど調査方法の綿密な検討を行なった。

子どものしつけと親の教育戦略について、社会学的な理論と方法を用いて実証的に検討するために、2年目にあたる平成18年度は、子どもを持つ親への量的調査を実施した。調査名は「子どもの教育に関する実態調査」とし、調査の母集団は、関東1都7県(東京、神奈川、千葉、埼玉、栃木、群馬、山梨)の満3歳中学3年生の子どもを持つ親(男性保護者と女性保護者)とした。世帯単位で層化2段無作為抽出法により、該当する子どものいる世帯を3000世帯抽出し、その保護者に質問紙調査を実施した。調査地点数は、150地点である。なお、子どもは各世帯1名をランダムに選び、その子どもについて親の子育てをめぐる意見や実態を調査した。調査方法は、郵送法で質問紙(男性保護者用と女性保護者用)を郵送し、自記式で記入を依頼し、郵送で別々に返送してもらった。調査期間は平成18年11月1日11月30日とした。回収率を上げるために、未回収世帯に対し12月1日に同じ調査票を再送し、12月15日までの期間で回収した。最終的に回収した調査票は、計2284票で、その内訳は父親1016票、母親1264票、不明4票である。これらのうち無効票は1票であった。全部で1321世帯からの回収がなされ、世帯単位の回収率は44.03%である。また父親票の回収率は33.9%、母親票の回収率は42.1%であった。調査内容は、階層性の視点からは、学校選択やしつけなど、公共性とプライヴァタイゼーションに関しては、受験をめぐる親の意識と実態などを調査した。また教育改革にかかわる親の意見なども調査している。今年度は、調査票作成に多くの時間を割き、実査は民間業者に業務委託して、実施した。その後、データ・クリーニングを実施し、調査データの統計解析にかかる前の準備を行なった。データの分析は平成19年度に行い、結果の公表とともに報告書を作成する予定である。平成19年度は、3歳中学3年生の子どもをもつ親(父母)に対して18年度に実施した大規模調査データを社会学的視点から詳細に分析し、報告書の刊行のほか、調査結果報告ホームページを公開した。本研究の特徴は、社会学的な理論と方法を用いて、親の意図的・無意図的な教育戦略を「階層性」「公共性」「私事性」「信頼」などの視点から分析した点にある。一般化できる精度の高いデータ分析から親の教育戦略の階層間格差と私事化の進行を明らかにするとともに、親たちの、学校教育や教師、教育改革(ゆとり教育や学校選択制、学力競争など)に対する意見やそれを支える親自身の価値観、ハビトゥスを明らかにした。例えば6割の親がゆとり教育見直しを肯定、知識重視の教育を肯定するももの、同時に親の7割は、学校での学力競争を否定していた。さらに子どもの学校の先生を信頼する親は約8割で、教師への信頼感は高いものの、教師を信頼する親ほど、学校に要望を出していた。さらに親の子育て不安意識や小中学校受験に対する意見、地域とのかかわり方など、親の教育戦略の実態と意識を、学校、教師、地域のレベルとの関連で分析した。また子育ての困難性や子育てニーズの特徴についても、その社会文化的な背景(経済資本、文化資本、社会関係資本)と教育問題の出現メカニズムを社会意識との関連について理論的・実証的に検討し、現代の家族と教育、地域社会の課題を明らかにした。
水供給における腸管系ウイルス監視のためのウイルス粒子検出法開発及び感染リスク評価

本年度は、まずGenogroup IVノロウイルスに特異的なSemi-nested RT-PCRを開発し、多摩川河川水および下水試料からのGenogroup IVノロウイルスの検出調査および遺伝子解析を実施した。その結果、環境水試料中から冬期に高頻度に検出される傾向が認められ、遺伝学的に多様なGIVノロウイルス株(新たに見出された遺伝クラスターを含む)が環境水中に存在することが明らかとなった。また、前年度に開発したアイチウイルスのReal-time RT-PCRを使用して下水および河川水中のアイチウイルスの挙動を定量的に解析するとともに、その遺伝的多様性を解析した。検出されたアイチウイルスのほとんどがGenotype Aに分類されたことから、今回調査対象とした地域では、主にGenotype Aに属するアイチウイルス株が年間を通じて流行していると考えられる。アイチウイルスは水試料から年間を通じて検出され、ノロウイルスやサポウイルスよりも水環境中に優占して存在していることが示唆された。本研究は、下水および河川水中におけるアイチウイルスの挙動を定量的に解析した初めての研究事例である。サポウイルスについても、国内で採取した下水試料中における存在状況、季節変動および遺伝的多様性を解析した。その検出率は冬期に高く、検出株の分子系統解析を実施したところ、今回検出された株は10種類の遺伝子型に分類された。本研究で得られた結果は、下水中におけるサポウイルスの存在状況、季節性、そして遺伝子型分布に関する新たな知見であり、冬期を中心として遺伝学的に多様なサポウイルスが日本のヒト集団と水環境の間を循環していることが明らかとなった。上記の結果を含むこれまでの「水中ウイルスの検出法開発およびリスク評価」に関する研究成果について、学術雑誌上に査読付き論文の形で発表している。今年度は、筆頭著者論文と共著論文とを合わせて計10報の査読付き論文が学術雑誌に掲載された。多摩川河川水および下水(流入水および処理水)を対象に、試料中の腸管系ウイルス(ノロウイルス、サポウイルスおよびアイチウイルス)の遺伝子をPCRにより増幅し、塩基配列を決定してこれらの腸管系ウイルスの遺伝的多様性および水環境中における季節変動を解析した。その結果、今回解析対象とした環境水試料中には遺伝学的に多様なノロウイルス株が存在することが明らかとなった。ヒトに感染するノロウイルスは遺伝学的に異なる合計32種類以上の遺伝子型に分類されるが、異なる遺伝子型はウイルス粒子の表面構造のアミノ酸配列の違いから異なる抗原性を示すことが既に明らかにされている。このノロウイルスの遺伝的多様性こそが、毎年流行を繰り返す原因の一つであり、ノロウイルス感染症の抑制を困難にしている理由の一つでもあると考えられる。さらに、上記の環境水試料中からこれまで水環境中からの検出事例が少ないサポウイルスおよびアイチウイルスを検出することにも成功した。水環境中から検出されるノロウイルスおよびサポウイルスは遺伝学的多様性に富むのに対し、アイチウイルスの遺伝学的多様性は乏しいことが明らかとなった。さらに、急性胃腸炎の発生事例の原因に占めるアイチウイルスの割合はノロウイルスおよびサポウイルスよりも低いのに対し、水環境中からの検出頻度はこれらのウイルスよりも高いことを明らかにした。このことから、アイチウイルスは水供給における腸管系ウイルス監視の際の有力なウイルス指標となり得ると考えられた。しかしながら、現時点ではアイチウイルス遺伝子定量のためのリアルタイムPCR系が報告されていないため、水環境中における存在量に関しては解析できないのが現状である。そこで、現在アイチウイルスのリアルタイムPCR系の開発に取り組んでいる。H1N1およびH5N3亜型に属する2種類のA型インフルエンザウイルスを使用し、水中のインフルエンザウイルスの濃縮法の開発に取り組んだ。陽電荷膜および陰電荷膜を使用した既存の濃縮法によるインフルエンザウイルスの濃縮回収率をリアルタイムPCRおよびプラックアッセイにより測定したところ、これらの濃縮法はインフルエンザウイルス粒子の濃縮には適さないことが明らかとなったため、インフルエンザウイルス粒子を効率良く濃縮するための新たな濃縮法を開発した。また、水の消毒法として広く使用されている遊離塩素、モノクロラミンおよび紫外線消毒におけるインフルエンザウイルスの感染力価およびウイルスRNAの消長を解析した。インフルエンザウイルスは、通常の上水処理で施されている塩素消毒および紫外線消毒により速やかに不活化することが分かった。さらに、既に報告されている他のウイルスの実験結果と比較したところ、インフルエンザウイルスは,塩素,モノクロラミンおよび紫外線のいずれの消毒処理についても腸管系ウイルスよりも速やかに不活化することを明らかにした。続いて、米国・Drexel大学のHaas教授の指導のもとでH5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスのヒトへの感染リスクの定量的評価モデル開発に取り組んだ。感染リスクを計算するためにはDose-Response関係式が必要不可欠であるが、これまでH5N1ウイルスのDose-Responseモデルは報告されていない。また、ヒトにおけるH5N1感染は感染後経時的に致死率が上昇するため、感染から死亡までの時間を考慮したモデルの開発が必要であると考え、従来型Dose-Responseモデルに時間項を組み込んだTime-Dose-Responseモデルを開発した。さらに、遊泳による水系感染(一次感染)および空気を介した二次感染リスクを評価するためのモデルを開発した。H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス感染リスクを定量的に評価するための基礎的モデルを構築することに成功したと言える。