hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グレリンの自律神経作用を介した新しい不整脈治療法の開発

雄Sprague-Dawleyラットの左冠動脈を結紮し30分間の心筋虚血を起こし、その間にグレリン(100μg/kg)あるいは生理食塩水(生食群)を投与した。また、グレリンに加えアトロピンを投与した群を作成し、カプサイシン塗布による迷走神経求心性線維を特異的にブロックした群も作成した。その間心電図的に心室性不整脈の頻度を調べ、その後摘出心の生化学的・病理学的検討を行った。なお、対照として正常ラットの摘出心を用意した。生食群と比べ、グレリン投与群では、心室性頻拍性不整脈の出現頻度は有意に抑制された。Western blotting法によるリン酸化Connexin 43の発現量は、心筋虚血後の生食群では正常群と比べ著明に減少していたが、グレリン投与により有意に改善した。免疫組織染色でも、グレリン投与により心筋虚血後のリン酸化Connexin 43の発現低下が明らかに抑制されていた。しかしながら、グレリンの抗不整脈作用並びにConnexin 43に対する効果は、アトロピン投与の併用あるいは迷走神経求心性線維ブロックにより明らかに減弱した。また、心電図の心拍変動スペクトル解析を行ったところ、グレリンの急性投与により、副交感神経活性の指標であるhigh-frequency power(HF)は増強し、交感神経活性の指標であるlow-frequency power/high-frequency power(LF/HF)比は低下していた。そして、この効果についても、アトロピン投与の併用あるいは迷走神経求心性線維ブロックにより明らかに減弱していた。これらの結果より、グレリンは副交感神経亢進並びに交感神経抑制作用を有し、その直接効果並びに心臓でのConnexin 43の発現調節などを介して虚血心筋に対し抗不整脈効果を発揮する可能性が示唆された。
オルファン型核内レセプターNR4A1に対する新規リガンドの膀胱癌治療への応用

本研究はオルファン型核内レセプターNR4A1の新規リガンドであるC-DIMsの膀胱癌治療への応用を目指し計画されたが十分な供給が得られず、C-DIMsと同じくSpecificity Protein(Sp)に作用する可能性のある甘草由来の新規化合物CF3DODA-Meの研究を行った。SpはGC-rich DNAに結合し転写を促進する蛋白質で、多くの腫瘍細胞で高発現しており、治療標的として近年注目されている。これらの結果は、CF3DODA-Meによって増加した細胞内のROSが、SpおよびSp-regulated proteinの発現抑制に繋がり、最終的に抗腫瘍効果を示す可能性を初めて裏付けるもので、CF3DODA-Meの膀胱癌治療への応用の可能性を示唆し、さらにはROSの抗腫瘍メカニズムが示すもので学術的インパクトは大きい。本研究はオルファン型核内レセプターNR4A1の新規リガンドであるC-DIMsの膀胱癌治療への応用を目指している。しかし、C-DIMsの十分な供給が得られない状況が続いており、C-DIMsを用いた研究は進行していない。そのため、補完研究として、C-DIMsと同様にSp(Specificity protein)を抑制することで抗腫瘍効果を発揮すると考えられるCF3DODA-Me(Methyl 2-trifluoromethyl-3,11-dioxo-18β-olean-1,12-dien-30-oate)を用いた実験を行っており、我々は膀胱癌細胞を対象として、CF3DODA-MeがSpを介して抗腫瘍効果を発揮することを確認した。その具体的な研究実績は、1)CF3DODA-Meが膀胱癌細胞に対して、濃度依存性、そして時間依存性に抗腫瘍効果を発揮することを確認するとともに(MTT assay、およびPI-FACSによるDNA fragmentationとWestern blotによるactive caspase-3の検出)、2)CF3DODA-MeがSpの発現抑制を介して膀胱癌細胞に対する抗腫瘍効果を発揮するメカニズムをsiRNAを用いたSp発現阻害実験にて証明した。3)さらに、CF3DODA-MeがROS(reactive oxygen species)の産生を介してSp抑制作用を発揮する可能性をつきとめ、4)CF3DODA-MeによるROS産生を、グルタチオンの共培養で阻害することで、CF3DODA-MeのSp発現低下やアポトーシス経路の活性化作用は打ち消されることを証明した。よって、CF3DODA-Meが膀胱癌細胞でROSの産生を誘導し、それに続くSp発現抑制を介して、最終的に抗腫瘍効果を発揮するメカニズムを証明できたと考えている。尚、このCF3DODA-Meは、甘草の主成分であるグリチルリチンより合成された新規化合物で、C-DIMs提供元のA&M大学より提供された。今後、in vivo実験に移行する予定である。しかし、C-DIMsの十分な供給が得られない状況で、C-DIMsを用いた研究は進行していない。一方で、CF3DODA-Meを用いて、膀胱癌細胞に対するSpecificity proteinの治療ターゲットとしての有用性を証明できている。この基礎実験結果は今後予定されるC-DIMsを用いた実験のきわめて重要な結果、かつ経験となるほか、CF3DODA-Meを用いた実験の結果は非常に有用な結果であり近日報告予定である。昨年度までに我々は、CF3DODA-Meが3種類の膀胱癌細胞において、それら癌細胞の増殖を抑制し、そしてアポトーシスを誘導することを確認した。さらにCF3DODA-MeがROS(Reactive Oxygen Species)の産生を誘導し、それに続くSp、およびSp-regulated proteinsの発現抑制を介して、最終的に抗腫瘍効果を発揮するメカニズムを証明した。今年度我々は、CF3DODA-Meの抗腫瘍効果が最も高かったRT4膀胱癌細胞株を対象とし、まずCDDP処理にて膀胱癌幹細胞を樹立した。その癌幹細胞において、CF3DODA-MeはSp、およびSp-regulated proteinの発現を低下させ、sphere formationを阻害したほか、colony formationも有意に抑制した。さらに我々は、RT4v6膀胱癌細胞株を用いたヌードマウス皮下腫瘍モデルを作製し、CF3DODA-Meが腫瘍成長を有意に抑制することを確認した。現在、腫瘍組織を用いた免疫組織染色、さらには蛋白の発現解析を予定しており、その後の論文化を目指す。これまでの我々の研究は、CF3DODA-Meによって増加した細胞内のROSが、SpおよびSp-regulated proteinの発現抑制に繋がり、最終的に抗腫瘍効果を示す可能性を初めて裏付けるもので、残る追加実験を経て論文化を目指している。

C-DIMs合成作業の問題で本実験の進行は遅れているが、同様の作用を有すると考えられるCF3DODA-Meの実験を並行することで対応する。C-DIMsが十分量合成できたのちに実験を再開するが、CF3DODA-Meで培った経験が活かせると考えており、研究の遅れと考えていない。我々は、C-DIMsの供給を受けることが出来ず、そのため同様の薬理作用を発揮すると考えられる新規化合物CF3DODA-Meを用いた研究を開始した。その研究成果は順調に蓄積されており、in-vivo実験で得らた組織を解析後に、それら成果をまとめた論文の公表を目指している。初年度、供給されるべき新規化合物であるC-DIMsが譲渡されず、代替研究で対応した。その代替研究にて本研究は着実に進んでいるが、予定していた研究の一部は施行することができず、それに伴い研究費は使用できなかった。本研究は順調に推移しているほか、実験室で既に整備されている機材を用いて遂行しているため、実際の実験経費は予定していた経費よりものよりも少なかった。今年度、C-DIMsが供給されるとともに、その研究は進行させる予定で、研究に係る直接経費は必要となる。初年度の繰越金も含めて研究実行に使用する予定である。
脳の老人性変化の生化学的性状と形成機序に関する研究

脳血管性痴呆のモデル動物を作製する目的のために、スナネズミの両側頸動脈に新たに考察したクリップを用いて狭搾を加えた慢性脳虚血動物を作製した。クリップ装着8週間後の実験動物の局所脳血流量は75%に低下していること、8週間の慢性脳血流量低下状態におかれた実験動物の行動については、学習能力の一つである電気ショックによる受動回避反応において成績が低下していること、形態的には海馬のCAI領域にも明かな細胞の脱落を認めず学習行動の障害は海馬の神経細胞の脱落を伴なわなくとも起こり得ること、マイクロチュブル付随蛋白の一つであるMAP2蛋白が減少していることが明らかにされた。また、神経化学的モデル動物としてウサギ脳にアルミニウムを注入することにより実験的神経原線維変化を作製したライソゾーム内酵素の活性を定量したところ、蛋白分解酵素であるカテプシンDの活性が上昇していた。カテプシンD酵素の生体内での作用を調べるために神経細胞内に存在する各種の線維性蛋白に対する作用を検討したところ、中性領域でも各種の細胞骨格蛋白を分解し、チュブリン・ニューロフィラメント・グリア線維酸性蛋白をよく分解することを明らかにした。次に、実験的神経原線維変化を生じたウサギ脳からカテプシンD酵素を分離精製しその酵素学的検討を行ったところ、実験動物から分離精製したカテプシンD酵素は、その分子量・アミノ酸組成・至適pH等に変化は認めないが、V^<max>値・K^m値が変化しており活性の低下した酵素が生じていること、および、熱に対する安定性が損なわれていることが示された。また、老化動物脳のライソゾームの安定性について、老化動物脳ではライソゾームの安定性が損なわれておりライソゾーム内酵素が細胞質中に逸脱し易い状態になっていることを明らかにした。本研究の過程で細胞骨格蛋白の中でもグリア酸性線維性蛋白(GFAP)に対する自己抗体がアルツハイマー患者血清中に存在していることが明らかにされ、この抗体価の定量が臨床での検査法の一つとして有用である可能性が示された。1.アルツハイマー型老年痴呆(SDAT)患者の脳内の変化を知る目的で,ライソゾーム内酵素について調べた.(1)SDAT剖検脳では,大脳皮質,海馬ともにcathepsin D活性が上昇していた.(2)実験的神経原線維変化(ENFC)作製家兎脳においてcathepsin Dとacid DNaseの組織蛋白当たりの活性上昇がみられ,とくに神経原線維変化の多くみられる上部精髄において著しい上昇を示した.また, acid DNase/alkaline DNaseの比の上昇がENEC脳においてみられた.(3)神経原線維変化の構成成分として線維性蛋白質が考えられているが,その中の1つであるneurofilament蛋白質は, cathepsin Dの基質となりうること,さらにpH6付近でも作用をうけ,脳内でcathepsin Dが線維性蛋白質の代謝に影響を与える可能性が認められた.(4)ENFC作製家兎脳より精製したcathepsin Dは,単位酵素蛋白当たりの活性の低下がみられ,病的状態における酵素の変化が示唆された.以上のことから, SDAT脳内においても,ライソゾーム内酵素の異常,それに基づく線維性蛋白質の異常が生じている可能性が示唆された.2.痴呆の発症と脳血流の関連性をみる目的で,砂ネズミを用いて脳虚血モデルを作製した.(1)両側総頸動脈を215分間閉塞し,再開通後の脳内蛋白質の変化を検討したところ,水溶性蛋白質のうちmicrotubule associated protein(MAP2),カルペクチン,クラスリンの各蛋白質が減少し, MAP2がとくに虚血に対して鋭敏に反応した.(2)虚血脳におけるMAP2の変化にはCa2+依存性蛋白質分解酵素が関与している可能性が示唆された.(3)両側総頸動脈をコイル状のステンレススチール線によって狭窄し,脳血流量を約30%低下させることによって,慢性脳血流低下モデルを作製した.処置1ヶ月後,われわれが開発し作製した実験動物行動観察装置OUSEMによって行動を観察した結果,学習,記憶に関連した能力が低下している傾向が示された.光顕レベルの形態には変化は認められなかった.脳血管性痴呆のモデル動物を作製する目的のために、スナネズミの両側頸動脈に新たに考察したクリップを用いて狭搾を加えた慢性脳虚血動物を作製した。

次に、実験的神経原線維変化を生じたウサギ脳からカテプシンD酵素を分離精製しその酵素学的検討を行ったところ、実験動物から分離精製したカテプシンD酵素は、その分子量・アミノ酸組成・至適pH等に変化は認めないが、V^<max>値・K^m値が変化しており活性の低下した酵素が生じていること、および、熱に対する安定性が損なわれていることが示された。また、老化動物脳のライソゾームの安定性について、老化動物脳ではライソゾームの安定性が損なわれておりライソゾーム内酵素が細胞質中に逸脱し易い状態になっていることを明らかにした。本研究の過程で細胞骨格蛋白の中でもグリア酸性線維性蛋白(GFAP)に対する自己抗体がアルツハイマー患者血清中に存在していることが明らかにされ、この抗体価の定量が臨床での検査法の一つとして有用である可能性が示された。神経原線維変化の形成には、脳内細胞骨格蛋白の代謝異常が関与していることが強く示唆されているが、今回、アルツハイマー病脳内のライソゾーム酵素を定量し、蛋白分解酵素であるカテプシンDの活性が上昇していることを示した。カテプシンDによる細胞骨格蛋白の作用の検討から、生体内にニューロフィラメント蛋白がカテプシンDにより分解されてできたと考えられる約50kの分子量の分解産物が存在していることが強く示唆された。測定したライソゾーム酵素のなかから最も著明な活性の変化を示した脳カテプシンD酵素に対する抗体を作製し、カテプシンD酵素蛋白の変化と分布とを検索した。カテプシンD酵素は脳内神経細胞内に局存していたが、神経原線維変化や老人斑といったアルツハイマー病脳に特徴的な構造に多く集積するということはなかった。現在他の蛋白分解酵素・蛋白分解酵素の阻害剤に対する抗体を用いて、同様の検索を続けている。一方、グリア線維酸性蛋白の変化に関する実験から、アルツハイマー病患者血清中には、グリア線維酸性蛋白に対する抗体値が上昇していることが明らかになった。このグリア線維酸性蛋白に対する抗体値の上昇は、脳血管性痴呆患者では認められず、老年期にみられる痴呆症の臨床的鑑別に役立つものと考えられる。現在、グリア線維酸性蛋白に対する抗体値の上昇の機序が、免疫反応系の変化によるものか、クリア線維酸性蛋白自体の変化によるものかの検討を進めているが、現在までの結果からは、アルツハイマー痴呆の病態の発現にグリア線維酸性蛋白の変化が関与していることが示唆されている。
近赤外ラマン円偏光二色性分光法を用いて光受容タンパク質中間体の構造を明らかにする

本研究の大きな目的は申請者らが開発してきたラマン円偏光二色性分光装置の更なる高感度化と、生命科学における重要課題への適用である。本手法は円二色性分光(いわゆるCD)のラマン分光版で、通常のラマン分光に比べて極めて多くの構造情報を提供する。特に溶液中では平面構造の分子がタンパク質中ではキラルな非平面構造になることに注目し、活性中心である補欠分子の構造的な歪みを検出できることを示してきた。特に、本研究では分子動力学計算と量子化学計算を用いたスペクトル解析法を確立することができた。また光受容タンパク質の応用に関しては、その励起波長依存性に関して顕著な成果を得ることができた。本研究では我々が開発した装置の飛躍的な性能向上を図るとともに、光受容タンパク質における中間体の構造解析に挑戦する。平成26年度においては装置改良として、可視光装置の安定性の向上をめざした。さまざまな可能性を検討した結果、不安定性の原因を特定することができた。この安定性を悪くする原因を改良することで、装置を長期間運用した際の安定性を格段に向上することができた。この装置改良により本手法を用いた応用研究が大いに進展した。特に本年度はイエロープロテイン(Photoactive Yellow Protein)のラマン円偏光二色性スペクトルの励起波長依存性を検討することに世界で始めて成功した。また分子動力学計算と量子化学計算を併用した解析法に関しても取り組み、多くの計算の自動化に成功した。自動化によって分子動力学計算と量子化学計算を併用した解析をルーチンワーク的に実行することが可能となり、光受容タンパク質の系に応用することにも成功した。今後、この手法は新たな解析法になると期待している。平成27年度においては、青色光センサータンパク質のイエロープロテイン(Photoactive Yellow Protein)をモデルとして用い、ラマン円偏光二色性スペクトルの励起波長依存性を検討することに世界で始めて成功した。特に、電子吸収帯に近い励起波長で測定したラマン円偏光二色性スペクトルの形状はラマンスペクトルの形状と同じであることを見出した。この結果はNafieによって1997年に提唱された共鳴ラマン円偏光二色性分光の理論と一致する結果であり、本理論を実験的に初めて証明することに成功した。また今回の結果より、ラマン円偏光二色性分光を用いた色素タンパク質の研究では適切な励起波長を選択する必要があることがわかった。この結果は今後の研究を進める上で、重要な実験指針となり、特に本手法を反応中間体に応用する際には鍵を握る情報だと考えられる。本年度はラマン円偏光二色性スペクトルの励起波長依存性を検討した。研究対象としてSalinibacter ruber由来のイエロープロテイン(Photoactive Yellow Protein)を用いることで、近赤外励起だけでなく可視光励起のラマン円偏光二色性スペクトルを測定することに成功した。その結果、近赤外励起では前期共鳴効果により発色団のラマンバンドが増大されているが、可視光励起では共鳴ラマン円偏光二色性スペクトルが観測されることを見出した。この結果はNafieによって提唱された共鳴ラマン円偏光二色性分光に関する理論を実験的に証明する初めての証拠であり、ラマン円偏光二色性分光に関する研究分野に大きなインパクトを与える成果と言える。平成28年度においては、青色光センサータンパク質のイエロープロテイン(Photoactive Yellow Protein)について、同位体標識した発色団を再構成した試料を合成し、そのラマン円偏光二色性スペクトルを測定した。その結果、発色団エチレン部位のC-H面外変角振動モードの帰属に成功した。またテトラアラニンの系についてラマン円偏光二色性スペクトルを測定した。さらに分子動力学計算と量子化学計算を併用した解析からスペクトルの解析を行い、主なバンドの帰属に成功した。

またシアノバクテリアと呼ばれる光合成をする微生物において、光合成系タンパク質の保護機能をもったオレンジ・カロテノイドタンパク質について、暗状態と光反応中間体のラマン円偏光二色性スペクトルを測定することに成功した。その結果、このタンパク質の光反応機構を明らかにすることができた。本研究の大きな目的は申請者らが開発してきたラマン円偏光二色性分光装置の更なる高感度化と、生命科学における重要課題への適用である。本手法は円二色性分光(いわゆるCD)のラマン分光版で、通常のラマン分光に比べて極めて多くの構造情報を提供する。特に溶液中では平面構造の分子がタンパク質中ではキラルな非平面構造になることに注目し、活性中心である補欠分子の構造的な歪みを検出できることを示してきた。特に、本研究では分子動力学計算と量子化学計算を用いたスペクトル解析法を確立することができた。また光受容タンパク質の応用に関しては、その励起波長依存性に関して顕著な成果を得ることができた。本年度は自作の可視光励起ラマン円偏光二色性分光装置を長期間運用した際の不安定性について、その原因の検討と改善を行った。その結果、長期間運用に耐え得る安定性を示すように改良できた。またこの装置改良のため、光受容タンパク質のラマン円偏光二色性スペクトルについて、その励起波長依存性を検討することに成功した。また分子動力学計算と量子化学計算を併用した解析法を確立し、さまざまな系に応用できる準備が整った。平成28年度はさまざまな試料および反応中間体への応用研究に本格的に取り組む。研究対象としては、本申請者が今まで研究対象としてきた光受容タンパク質とヘムタンパク質に注目する。これらの試料は可視光を吸収する発色団を含むため、可視光励起のラマン円偏光二色性分光では測定できなかった代表例であり、発色団やその周辺の構造情報やタンパク部分の構造に関する知見が期待できる。具体的にはp-クマル酸を発色団とする光センサーのイエロープロテインやバクテリオロドプシンについて、中間体のラマン円偏光二色性スペクトルの測定を試みる予定である。これらの試料は連携研究者の方々など(松山大学・田母神純助教、東京工業大学・増田真二准教授、オクラホマ州立大・W. D. Hoff教授)から提供して頂く予定である。分子分光学平成27年度はさまざまな試料および反応中間体への応用研究に本格的に取り組む。
英語の史的コーパス構築とその利用による歴史社会言語学的研究

4年間の研究期間に、パイロット版のEarly Modern English Prose Selections (EMEPS)(1500年から1700年の英語の史的コーパス、約800万語)を構築し、その有用性を確認するために、これを利用して、英語の動詞の構文の発達を中心に言語分析を行った。研究から、さまざまな動詞が不定詞や動名詞の構文を徐々に発達させていく過程を明らかにすることができたと同時に、EMEPSをほかのコーパスと組み合わせて利用することにより、より有効な分析が可能になることを明らかにすることができた。本研究は、既製のコーパスの使用からオーダーメイドのコーパスを使用する言語研究へのシフトの可能性を示すことを目的としている。平成22年度においては、ICAMET (Innsbruck Computer Archive of Machine-Readable English Texts)のように、既製のコーパスの中でもジャンルなどの枠組みが比較的緩く、コーパスの中から自由にテキストを選び取ることが可能なものを選んで、否定構文の発達や、副詞の-ly語尾の発達などを調査した。また一方で、すでに存在するデータベースを利用しながら、研究目的に合わせて自由にコーパスを構築する試みにも着手した。Early English Books Onlineは、初期近代英語期のテキストをそのままの形で提供している貴重なデータベースであり、この中から、16世紀前半、16世紀後半、17世紀前半、17世紀後半の4つの時代区分でほぼ同量の語彙数からなるテキストの組み合わせを作成する作業を行い、パイロットスタディを行う準備を整えることができた。次頁の業績表にある雑誌論文"Early Modern English Prose Selections : Directions in Historical Corpus Linguistics"は、その作成の方法をまとめた論文である。また小さなパイロットスタディとして、動詞forbidのcomplementationの研究を行い、このようなコーパスの構築の方法が有効である可能性を示した。Forbidは、中英語期までは自由にthat節を従えていたものの、初期近代英語期以降は、急速にこの構文が衰退して、to不定詞の構文が増加することが知られている。今回Early English Books Onlineを利用して個人の研究目的のために構築したコーパス、EMEPS (Early Modern English Prose Selections)においてもこれを裏付ける結果を得ることができたことから、このようなオーダーメイドのコーパスの利用価値が高いことを確認できた。ただし、これは研究の一事例に過ぎないので、今後、さらなるパイロットスタディを重ねていくことが必要であろう。本研究の主要な目的は、オーダーメイドのコーパスの作成とそれを利用した言語研究の有効性を示すことにある。平成23年度においては、平成22年度に引き続き、Early English Books Onlineをもとに作成したコーパスEMEPS (Early Modern English Prose Selections)を使用して、試験的な言語研究を遂行した。コーパスの性質から、扱った時代は初期近代英語期が中心ではあるが、英語史全体を視野に入れながらの言語研究を心がけた。平成22年度は、否定を含意する動詞の中で特にf。rbidに焦点をあてたが、23年度は、さらにこの研究を発展させるべく、動詞doubtの歴史的発達を扱った。この分野については、すでにThe Oxford English Dictionaryの例文データを利用した詳細な先行研究(この研究も研究代表者によるもの)があるので、これを踏まえた上でEMEPSを分析し、新たに作成したコーパスの有効性を検証した。また、初期近代英語期の構文の変化は現代英語の実態と関係していることも多い。現代英語の研究にはEMEPSは不向きであるので、Web上に公開されているコーパスを利用しながらこの不足を補い、初期近代英語と現代英語の間に観察できる言語変化の連続性にも焦点を当てた。具体的には、動詞convinceが現代英語(特にアメリカ英語)においてto不定詞の特殊な用法を発達させていることに着目し、これと関係する、あるいは萌芽ともいえる現象が古い時代の英語に観察できるのではないかという仮説をEMEPS等のコーパスを利用しながら検証した。以上のような分析を通して、本研究のために構築したコーパス、E詑PSの有効性をある程度裏付ける結果を得ることができたといえる。ただし、これらの研究はまだ一事例に過ぎないので、来年度以降も、さらなるパイロットスタディを重ねていくことが必要であろう。昨年度に引き続き、研究目的に応じた自由なコーパスの構築と、それを利用した英語の発達史研究をおこなった。具体的には、自ら構築し、パイロット版としての使用が可能になっているEarly Modern English Prose Selections (EMEPS)(1500年頃から1700年頃の英語の史的コーパス、約800万語)を使い、動詞の構文の変化や、動詞にかかわる副詞の形態上の変化、統語上の変化に焦点を当てるとともに、そのほかの電子テキストも用いながら、史的コーパスの構築と、その可能性を探った。

たとえば、alwayにsを付加してalwaysとするようになるのは中英語(1100年頃から1500年頃)の後半であり、その急速な定着を見るのは初期近代英語期であるが、比較的頻繁に現われるこの副詞を使うことで、EMEPSの有用性を確かめることに、ある程度成功したといえる。研究期間の初期から継続的に調査を行っているテーマであるが、25年度においては、論文として、その成果をまとめるところまで研究を進めることができた。そのほか、prohibitなどの動詞の構文の変化についても、EMEPSを利用することにより、その史的変遷を明らかにすることができた。一般に公開されているコーパスに限定することなく、研究目的に応じて研究者が個別にコーパスを作成することで、扱う資料の可能性を広げることができる点を、おおむね明らかにすることができたと考えられる。本研究は、カスタムメイドのコーパスの作成とそれを利用した言語研究の有効性を示すことを主要目的としている。平成24年度においては、平成23年度に引き続き、自作のコーパスEMEPS (Early Modern English Prose Selections)の言語分析を行い、その有効性を確認するための研究を進めた。EMEPSは、インターネット上で利用可能なEarly English Books Onlineをもとに作成したコーパスである。扱った主な時代は、1500年から1700年までの初期近代英語期であるが、中英語後期にも焦点を当てながら、個別の動詞の構文の変化等を研究対象とした。特に、使役動詞のmakeがうしろに原形不定詞を従えるか、to不定詞を従えるか、についての詳しい分析を行い、現代英語で一般的である原形不定詞の構文の確立が、中英語後期から初期近代英語期に発達する過程を明らかにした。同時に研究では、社会言語学的視点も重視した。特に15世紀の『パストン家書簡集』は、著者名が明らかな書簡資料を時系列的に提供してくれるという意味で貴重であり、研究では、この資料における副詞節と主節の談話的な関係を明らかにした。When, though, ifなどの接続詞に導かれた節は、主節に前置される場合と後置される場合があり、その位置関係には談話機能が明確に関与しているようである。電子テキストを利用した社会言語学的研究は本研究が目指すところの一つであるが、昨年度まではあまり進展しなかった領域であるので、今年度は貴重なデータを得ることができたと考える。初期近代英語期以降の時代についても、同様の研究が必要であるが、これは25年度以降に広げていきたい領域の一つである。研究はおおむね順調に進展しているということができる。すでにオーダーメイドのコーパスとしてEMEPS (Early Modern English Prose Selections)の作成が進み、これをもとにしたいくつかのパイロット研究によって、その有効性が確認されつつある。
新型薬剤溶出性ステントの血管機能異常発現に与える効果についての検討

新世代薬剤溶出ステントであるエベロリムス溶出ステント(EES)及びバイオリムス溶出ステント(BES)留置後の血管機能について検討し、第1世代薬剤溶出ステントで認められた異常血管反応がでは改善するがEESにおいては改善が認められない事を明らかにした。この機序として、免疫組織学的検討によりDES留置後の炎症反応および冠動脈外膜のVasa vasorum(VV)の増生がBESにおいて抑制されていることを明らかにし、更に光干渉断層装置を用いて生体内でVVが評価可能であることをブタモデルおよび臨床研究にて明らかにした。1年目の研究において第3世代薬剤溶出ステント(Drug eluting stent, DES)であるバイオリムス溶出ステント(Biolimus eluting stent, BES)では、第1世代DESで認められた異常血管反応が改善することが示唆された。昨年度は、BESの異常血管反応抑制効果の機序として、冠動脈外膜のVasa vasorumに着目した。冠動脈外膜のVasavasorumは、近年冠攣縮の機序として注目されている。我々は動物(ブタ)およびヒトの剖検組織を用い、冠動脈外膜のVasa vasorumの観察における新世代冠動脈イメージング・光干渉断層画像(Optical coherence tomography, OCT)の有用性を検討し、実臨床において冠動脈外膜のVasa vasorumを定量的に評価し、Vasa vasorumの様相を立体的に描出する手法を確立した。増生と炎症性変化を減衰し、冠動脈過収縮反応を軽減し得ることも確認した。第1世代DESであるシロリムス溶出ステント(Sirolimus eluting stent, SES)とBESを留置したブタ冠動脈外膜のVasa vasorumを、免疫染色標本、Micro CT、そしてOCTにて評価したところ、SESではVasa vasorumの増生がステントの端まで確認できたが、BESにおいてはその増加が抑制されていた。以上の検討から、DESの異常血管反応に冠動脈外膜のVasa vasorumが関与し、BESの異常血管反応抑制効果の機序として冠動脈外膜のVasa vasorumの抑制効果が示された。第3世代薬剤溶出性ステント(DES)であるバイオリムス溶出性ステント(BES)と第1世代DESであるシロリムス溶出性ステント(SES)をブタ左冠動脈に留置し、1ヶ月目および3ヶ月目でIn vivoでの血管反応を検討した。SESではセロトニン冠動脈内投与によりステント留置近傍の過収縮反応が認められ、この過収縮反応はRhoキナーゼ阻害薬であるハイドロキシファスジルの前投与によって抑制された。一方BESにおいては、ステント留置近傍の過収縮がSESと比して有意に抑制されていた(BES 22±10 vs. SES 54±24%, P<0.01, n=8 each)。また3ヶ月目での血管反応性評価では、SESのステント近傍ではセロトニンによる過収縮反応が認められていたが、BESでは過収縮反応抑制効果が持続していた(BES 18±12 vs. SES 36±16%, P<0.05, n=8 each)。一方でブラディキニンによる内皮依存性弛緩反応やニトログリセリンによる非内皮依存性弛緩反応は2群間で差を認めた。In vivoでの検討後ステント留置部の冠動脈を摘出し組織学的評価を行ったところ、第1世代DESであるSESでは炎症反応の亢進や微小血栓の形成が認められたが、第3世代DESであるBESではこれらの反応が有意に抑制されていた。以上から第3世代DESであるBESでは、第1世代DESで認められた異常血管反応が改善することが示唆された。昨年度は、Vaso vaorumの評価をブタのみならずヒトにおいても確認することが出来た。更にこの知見を基に第2世代DESと第3世代DESを比較したところ、第2世代DESと比較しても尚、第3世代DESにおいてVasa vasorumの減少を観察した。第3世代DESでは生体分解性のポリマーが用いられており、その生体分解性ポリマーがその機序と考えられた。第2世代DESは現在広く使用されているが、先のVasovasorumの検討において第2世代DESにおける冠攣縮の存在が考えられた。そこで、現在の第2世代DESの主流であるエベロリムス溶出ステントを留置された症例においてアセチルコリン負荷試験を施行し、第2世代DESにおいても有意な冠攣縮が出現することを明らかにした。更に、その冠攣縮に対して長時間作用型カルシウム拮抗薬ニフェジピンの長期投与が有用であることを明らかにした。循環器内科学これまでの研究により第3世代DESが第1世代DESで認められた血管異常反応を改善しうること、その機序が冠動脈外膜のVasa vasorumによるものであることが示された。

これまでの研究により第3世代DESが第1世代DESで認められた血管異常反応を改善しうることが明らかにされ、本研究における仮説が証明されたと考える。しかし現段階においてはまだ現象を捉えているのみであり、今後はその機序について分子生物学的検討を行う必要がある。これまでの研究により第3世代DESが第1世代DESで認められた血管異常反応を改善しうること、その機序が冠動脈外膜のVasa vasorumによるものであることが示された。また実臨床において同等の事が確認されるのか、薬剤による改善は認められるのかについて更に検討を薦めたい。これまでの我々の研究により第1世代DESでは血管の炎症反応が亢進することによりRhoキナーゼが活性化し、血管の過収縮反応を呈している事が明らかになっている。様々な研究によりこの炎症反応は、薬剤を包埋しているポリマーによって惹起されることが明らかになっているが、本研究で用いている第3世代DESバイオリムス溶出性ステントBESは、生体吸収性ポリマーを使用し且つ血管壁側のステントストラットのみに塗布されることによりポリマーの量も抑えられているという特徴を有している。今後はまずBES留置部においてRhoキナーゼの活性が抑えられているかを免疫組織学的検討によって明らかにしたい。また、今回得られた知見がこのポリマーの改善によるものであると考え、ポリマーのみのステント、ポリマーなしの通常の金属ステントを用いたIn vivoでの血管反応評価により、この点を明らかにしたい。該当なし
染色体バンド境界の分子レベルでの特定とその機能探索

高等脊椎動物の染色体バンド領域は、S期内の複製時期やGC%のMbレベルの区分構造に関係しており、遺伝子密度や発現様式を異にしたゲノムの機能ドメインと考えられるようになってきた。バンド境界は複製タイミングのスイッチ点やGC含量のモザイク境界として、塩基配列レベルで特定できる可能性が高く、境界を特徴づけるシグナル群が存在する可能性が考えられる。ヒト21番染色体長腕の全域と、ヒト11番染色体の長腕の全域を対象に、詳細な複製時期地図をゲノム配列レベルで作成した。染色体11qおよび21qの両方において、S期前半と後半の複製領域がRとGバンド領域に対応することが判明し、複製時期がS期前半から後半に明瞭に転換している領域を約30箇所、塩基配列レベルで特定できた。GC含量の区分境界と複製時期の転換部位とが密接に関係することも明らかになり、これらの転換部位をバンド境界の構造上ならびに機能上の要件を満たす部位として塩基配列レベルで特定した。バンド境界に対応する複製時期の転換部位には病因遺伝子、特に脳神経疾患遺伝子および癌関係遺伝子が集中して存在するとの予想外の知見を得た。複製時期の転換領域では、DNA複製フォークの進行が休止する可能性が指摘されており、組み換え頻度が上昇していると予想されてきた。染色体転座や遺伝子増幅と関係した癌関係遺伝子が、この領域に局在することと関係すると考えられる。バンド領域は複製時期と関係するだけではなく、クロマチン構造の粗密度と関係することも知られている。従って、染色体バンド境界においてはクロマチン構造の粗密度が転換している可能性が考えられる。バンド境界の持つこれらの特殊事情が、病因と関係する可能性を考えている。今回の研究は、病因の分子機構を知る手がかりを与えるだけでなく、あらたな病因遺伝子を能率的に探索する方法としても発展すると予想している。温血脊椎動物の染色体DNAがGC含量のMbレベルでの区分的分布よりなり、この区分構造がバンド領域と関係することが判明してきた。バンド領域はS期内の複製時期にも関係しており、遺伝子密度や組換え頻度等を異にする機能上のドメインとも考えられるようになってきた。バンド領域がGC含量の区分構造や複製タイミングゾーンと関係している点に着目し、バンド境界を分子レベルで特定することを試みた。着目した領域の第一は、ヒトX染色体のXICとその周辺領域である。X染色体の不活性化に重要な役割を果たすXICは、Xq13領域内に位置し、Xq13.1とq13.2の境界附近と推定されている。XICおよびその周辺領域については、塩基配列の情報が蓄積しており、複製タイミングを詳細に解析することで、バンド境界の分子レベルでの特定および境界の特徴構造の探索が可能であった。XICのセントロメア側に位置する大型逆位配列の近傍、ならびにXIST遺伝子領域において、複製時期がS期前半から後半へ転換していた。XIST遺伝子の5'上流およびエクソン1の部位がS期前半に複製するのに対して、遺伝子の3'側や3'下流が後半に複製し、XIST遺伝子内部において(特に3'側部位で)、複製タイミングが大きく変移している。XICの属するXq13は通常のRバンドである。ヒトゲノムの一般的な性質として、丁型のRバンド領域は明瞭にGCに富み、GバンドはAtに富む。しかしながら、通常のRバンドは中間的で複雑な性格を持つ。XIST領域の複製時期の変移部位においてもGC含量の変化は見られたが、Tバンドに属するMHCの場合よりは、その差は小さいものであった。ゲノム上にバンド境界と関係したランドマークを特定していく方法としては、複製時期の測定のほうが広い適用性を持つと結論できる。ヒト11番染色体長腕の約80Mbの全域を対象に、詳細な複製タイミング地図を作成しており、同様な結論を得ている。
アズピレンを用いたナノグラフェンおよび類縁体の合成と応用

グラフェンの部分構造を切り出したナノグラフェン類は,新しい機能性材料として近年特段の興味を集めているが,そのほとんどがグラフェンの規則構造である六員環を骨格とした設計である.本研究では,グラフェンの欠陥として存在することが知られる五員環や七員環を含む新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成と,その機能開拓に取り組む.共通中間体を経る効率的合成法と,高分解能電子顕微鏡による構造解析を駆使し,様々なアズピレン誘導体を合成し,その物性を探索する.全く新しい構造をもったこれら化合物は従来のナノグラフェン類にない光学特性,および電子特性を示すことが予想されている.本研究では当初,新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成に取り組んだが,目的の化合物を得ることができなかった.そこで,アプローチを変えて,適切に官能基化したフラーレンの自己集合によって二分子膜を作製し,これを後に有機小分子によってドーピングして積層グラフェン様の薄膜を形成させる方針に変更して研究を進めた.その結果,両親媒性フラーレンを水面上に注意深く配列させることで厚さ3nmの膜を生成させることに成功し,電子顕微鏡観察および電子線回折によって,これがアモルファスの膜であることを確認した.また様々な有機分子をドーピングしても安定に膜が形成することを見いだした.様々な単離法を案出して,空気中でも独立に存在する膜として取り出し,この膜に対して,紫外可視光吸収,赤外吸収,ラマンスペクトルなどの基本物性を精査し,また,X線回折,中性子線回折による構造解析および電子顕微鏡によって分子集合体の集合構造の解析に取り組んだ.その結果,単離した膜は,プロトン移動による導電性を示す数ナノメートルの厚さの分子性の膜であることが分かった.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。グラフェンの部分構造を切り出したナノグラフェン類は,新しい機能性材料として近年特段の興味を集めているが,そのほとんどがグラフェンの規則構造である六員環を骨格とした設計である.本研究では,グラフェンの欠陥として存在することが知られる五員環や七員環を含む新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成と,その機能開拓に取り組む.共通中間体を経る効率的合成法と,高分解能電子顕微鏡による構造解析を駆使し,様々なアズピレン誘導体を合成し,その物性を探索する.全く新しい構造をもったこれら化合物は従来のナノグラフェン類にない光学特性,および電子特性を示すことが予想されており,有機薄膜太陽電池や発光デバイス,トランジスタなどの有機デバイスへの応用が期待される.本研究では当初,新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成に取り組んだが,目的の化合物を得ることができなかった.そこで,アプローチを変えて,適切に官能基化したフラーレンの自己集合によって二分子膜を作製し,これを後に有機小分子によってドーピングして積層グラフェン様の薄膜を形成させる方針に変更して研究を進めた.その結果,両親媒性フラーレンを水面上に注意深く配列させることで厚さ3nmの膜を生成させることに成功し,電子顕微鏡観察および電子線回折によって,これがアモルファスの膜であることを確認した.また様々な有機分子をドーピングしても安定に膜が形成することを見いだした.当初計画のスコープを大きく上回ると期待される,斬新な薄膜形成法を発展した.グラフェンの部分構造を切り出したナノグラフェン類は,新しい機能性材料として近年特段の興味を集めているが,そのほとんどがグラフェンの規則構造である六員環を骨格とした設計である.本研究では,グラフェンの欠陥として存在することが知られる五員環や七員環を含む新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成と,その機能開拓に取り組む.共通中間体を経る効率的合成法と,高分解能電子顕微鏡による構造解析を駆使し,様々なアズピレン誘導体を合成し,その物性を探索する.全く新しい構造をもったこれら化合物は従来のナノグラフェン類にない光学特性,および電子特性を示すことが予想されている.本研究では当初,新規ナノグラフェンとして,アズレンを縮環したアズピレンを基本骨格とするナノグラフェンの合成に取り組んだが,目的の化合物を得ることができなかった.そこで,アプローチを変えて,適切に官能基化したフラーレンの自己集合によって二分子膜を作製し,これを後に有機小分子によってドーピングして積層グラフェン様の薄膜を形成させる方針に変更して研究を進めた.その結果,両親媒性フラーレンを水面上に注意深く配列させることで厚さ3nmの膜を生成させることに成功し,電子顕微鏡観察および電子線回折によって,これがアモルファスの膜であることを確認した.また様々な有機分子をドーピングしても安定に膜が形成することを見いだした.様々な単離法を案出して,空気中でも独立に存在する膜として取り出し,この膜に対して,紫外可視光吸収,赤外吸収,ラマンスペクトルなどの基本物性を精査し,また,X線回折,中性子線回折による構造解析および電子顕微鏡によって分子集合体の集合構造の解析に取り組んだ.その結果,単離した膜は,プロトン移動による導電性を示す数ナノメートルの厚さの分子性の膜であることが分かった.平成29年度に発見した薄膜形成法の展開を図り,当初目的に記載した従来のナノグラフェン類にはない特性を持つ薄膜を形成する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
トロンビン増幅経路に関与する凝固因子の相互作用に着目した凝固因子濃縮製剤の開発

研究初年度にあたる本年度では、候補となる凝固因子濃縮製剤の作成を用いて実験を遂行する予定であった。予備実験として、第II因子、第V因子、第VII因子、第X因子を用いて凝固因子の混合と全血調整を行った。しかしながら、血漿から赤血球を加えて全血調整する際に、混合後の候補製剤の安定性が得られず、研究の遂行が遅延している。今後、安定した製剤モデルの作成方法が確立され次第に研究を推進する。今後は、作成された第II因子、第V因子、第VII因子、第X因子新規混合物を用いて、各種、血漿およひ全血凝固時間測定をおこなう。また、各種凝固因子活性の定量やトロンビン生成試験による生体内トロンビン量を測定を行う予定としている。研究初年度にあたる本年度では、候補となる凝固因子濃縮製剤の作成を用いて実験を遂行する予定であったが、目的凝固因子の混合と全血調整を行う予備実験において、混合後の候補製剤の安定性が得られなかった。そのため目的とした測定系でのデータ取得に難渋している。そのため、実験の開始と進捗が遅延している。凝固因子の混合調整とに時間を要しているが、安定した製剤の作成方法が確立され次第に研究を推進する。作成された第II因子、第V因子、第VII因子、第X因子による新規混合物を用いて、今後、血漿およひ全血凝固時間測定をおこなう。また、各種凝固因子活性や、トロンビン生成試験による生体内トロンビン量の定量を行う予定としている。そのため、実験の開始と進捗が遅延しているが、モデル作成が安定次第にデータ取得を開始予定である。
Hybrid Artificial Liverの開発に関する研究

肝臓の複雑多岐にわたる機能のうち、代射機能の補助を行わせるには、現時点では生体肝素材によらねばならない。本研究では、遊離肝細胞を代謝のリアクターとする代謝補助装置の開発を目的にしており、本年度は、初年度において試作された装置の基礎実験が行われ評価された。1、遊離肝細胞の大量採取代謝補助装置のリアクターとなる肝細胞は、初年度による方法で、コラゲナーゼ酵素灌流法を用い、主として成犬の肝臓より得られた。2、試作代謝補助装置のin-vitro実験成績遊離肝細胞を約40g、代謝槽中で浮遊培養を行ない、動物血液側としては代謝能を検討するために、ハンクス氏液にフルクトースやアンモニア負荷を行ない、1012時間の灌流実験を施行した。その結果、グルコース産生量3.9mg/gcell/h、アンモニア処理量215μg/gcell/h、尿素窒素産生能0.567mg/gcell/hで、肝細胞のviabilityは10時間後でも80%を維持し、細胞胞内ATP量も灌流中良好に維持された。3、試作代謝補助装置のin-vivo実験成績灌流方法の全体システムは、上記と同様あり、ガラクトサミン投与急性肝不全モデルを用い、代謝の補助、システムの安全性などを検討した。その結果、灌流中の動物の循環系への影響はなく、約10時間の実験が可能であり、血液生化学検査値も著名な変動を示さず、動物の生存時間は、無治療群に比し有意に延長した。浮遊培養液をラット腹腔内に投与したが異状はみられず、また、ガラクトサミン肝不全ラットへの投与では生存率の改善をみた。以上、遊離肝細胞をリアクターとした装置の開発と、評価ならびに安全性を検討した結果、本システムの有用性が確認され、今後の臨床応用への可能性が示された。肝臓は生体の物質代謝の中枢であり、生命維持に最も重要な役割を担う臓器である。したがって、ひとたび重篤な機能不全に至ればその予後は極めて不良であり、その8090%はいかなる保存的療法によっても救命できない。しかしながら、肝臓は本来、極めて旺盛な再生能力を有しているので、この重篤な肝障害の一定期間を何らかの方法で機能を補助してやれば救命しうる可能性がある。この機能の代行法が、即ち人工肝臓である。今日、人工肝機能補助装置として臨床的にも使用されているのは、吸着剤や血漿交換療法に代表される、いわゆる除去療法であり、これらの治療成績は意識の回復率には著効を認めるものの、救命率の改善には至っていないのが現状である。その最も大きな理由のひとつとして、肝臓が本来有している二大機能(解毒能と代謝能)のうち、これらの除去療法は解毒能の一部を補助しているに過ぎないという点が指摘される。そこで本研究では、代謝能の補助に主眼をおき、代謝のリアクターとして保存ならびに機能の長期維持に有利な遊離肝細胞を使用したhybrid artificial liverの開発を目的とする。(1)遊離肝細胞の大量採取・保存法の確立:代謝補助装置には大量の遊離肝細胞が必要であり、犬、豚、牛などのように大動物の肝臓を遊離するには、コラゲナーゼ酵素の循環潅流システムが有用であり、全肝細胞の約70%を分離しえた。また、液体窒素中に保存する方法が最も機能を長期間保存できることが判明した。

(2)遊離肝細胞利用代謝補助システムの試作:遊離肝細胞の機能を、いわゆる遊離培養系で引き出す方法と、細胞浮遊液の培地のみ潅流させる方法を検討でき、かつ、あらゆる血液浄化法にも対応できるシステムを試作し、来年度の基礎的研究に供される。
自己分泌型がん細胞運動刺激因子の構造生物学的研究

ヒト黒色腫細胞、ヒト繊維肉腫細胞から単離された、ヒト由来自己分泌型がん細胞運動刺激因子(human autocrine motility factor,以下hAMFと略)は、細胞外に分泌され、産生細胞自体の運動を刺激する、ホモ2量体(2x558アミノ酸残基)サイトカインである。本研究では、がん転移抑制剤の合理的デザインへ向けた手掛りを得るため、hAMFとその阻害剤との複合体の立体構造、およびhAMFの受容体である、hAMFRの立体構造を解明することを目指している。蒸気拡散法により、ポリエチレングリコール8000を沈殿剤として用い、組換え型hAMFの結晶化を行った。細い柱状結晶が再現性良く得られるようになった。筑波のフォトンファクトリーにおいて、回折強度データの収集を行い、1.9Å分解能までの回折強度データを得ることができた。得られた結晶の空間群はP2_12_12_1、格子定数はa=80.58Å,b=107.4Å,c=270.7Åであり、結晶の非対称単位中には4サブユニット(2分子の2量体:2x2x558アミノ酸残基)が含まれていた。結晶の溶媒含量は、47%であった。ウサギ由来ホスホグルコースイソメラーゼをサーチモデルとした分子置換法により位相を決定し、1.9Å構造精密化を行った。次いで、AMFとAMFのサイトカイン活性を阻害する阻害剤との複合体の立体構造を解明するため、数種の阻害剤との複合体結晶の調製を試みた。その結果、エリスロース4リン酸(E4P)との複合体結晶の調製に成功し、hAMF/E4P複合体の立体構造を2.4Å分解能で決定することができた。マウスAMF(mAMF)に関しても、大腸菌を用いた組換えタンパクの大量調製を行い、結晶化条件の探索を行った。その結果、mAMFに関しても、阻害剤フリーおよび数種の阻害剤存在下で、X線結晶構造解析に使える単結晶を得ることに成功した。ヒト黒色腫細胞、ヒト繊維肉腫細胞から単離された、ヒト由来自己分泌型がん細胞運動刺激因子(human autocrine motility factor,以下hAMFと略)は、細胞外に分泌され、産生細胞自体の運動を刺激する、ホモ2量体(2×558アミノ酸残基)サイトカインである。得られた結晶の空間群はP2_12_12_1、格子定数はa=80.58Å,b=107.4Å,c=270.7Åであり、結晶の非対称単位中には4サブユニット(2分子の2量体:2×2×558アミノ酸残基)が含まれていた。

その結果、エリスロース4リン酸(E4P)との複合体結晶の調製に成功し、hAMF/E4P複合体の立体構造を2.4Å分解能で決定することができた。マウスAMF(mAMF)に関しても、大腸菌を用いた組換えタンパクの大量調製を行い、結晶化条件の探索を行った。その結果、mAMFに関しても、阻害剤フリーおよび数種の阻害剤存在下で、X線結晶構造解析に使える単結晶を得ることに成功した。