hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫工学的手法による機能性機材の創製に関する研究

そこで、高度の免疫化学及び細胞生化学的技術を駆使し、まず従来調製が困難とされるモノクローナル「抗メタタイプ抗体」及び「抗イディオタイプ抗体」、すなわち抗ハプテン抗体の可変領域を認識する抗体の創製を目的として以下の検討を行った。抗イディオタイプ抗体と抗メタタイプ抗体を同時に調製するために、そのパラトープをハプテンでアフィニティーラベルした第一抗体で免疫するのが効果的である。そこで、モデル化合物としてウルソデオキシコール酸7-N-アセチルグルコサミニド(UDCA7-NAG)を取り上げ、先に調製したモノクローナル抗体にUDCA7-NAG N-Succinimidyl esterを反応させたのち、ヘモシアニンとの結合体としてA/Jマウスに反復投与した。その脾細胞をP3/NS1/1-Ag4-1ミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリドーマの培養上清をELISAによりスクリーニングし、強い陽性反応を示したハイブリドーマをクローニングして6種の抗イディオタイプ抗体産生株を樹立した。対応するモノクローナル抗体6種のうちAb2-44、Ab2-45はELISAにおける結合反応がハプテンの添加により強く阻害され、第一抗体のパラトープを認識するβタイプ抗イディオタイプ抗体であることが判明した。他の4種では阻害は認められず、フレームワーク領域を認識するαタイプ抗体と推定された。これら抗イディオタイプ抗体のうち、αタイプ抗体Ab2-19とβタイプ抗体Ab2-45を組み合わせて、非競合型idiometric assayを試みた。すなわち、過剰量の第一抗体F(ab')_2フラグメントを固定化したプレートに測定対象のハプテン(UDCA7-NAG)、Ab2-45、及びビオチン標識したAb2-19を同時に添加して室温で2時間インキュベートした。次いで、固相に吸着されたビオチンをペルオキシダーゼ標識ストレプトアピジンを用いて検出(UV法)したところ、高感度な用量作用曲線(検出限界およそ100amole)を得ることができた本法は、従来低分子ハプテンに対する競合型イムノアッセイで得られている感度に比し十倍も高く、分子認識能に極めて優れることが判明した。今後、発光法等の高感度検出系を組み合わせることにより、zmoleレベルの感度も期待し得よう。高感度、高選択的な分析システムを構築するうえで、目的の分子構造を精密に認識する機能性器材が不可欠である。抗体は、免疫方法の工夫により種々の抗原に対して産生しうるため、利用価値の高い機能性分子として重用されてきた。しかしながら、動物の免疫応答性は遺伝的統御を受けるため、十分な結合特性を示す抗体が得られない場合も少なくない。一方、免疫工学的手法を用いて抗体分子の相補性決定領域(CDR)へランダムな変異を導入することにより、天然の抗体を凌ぐ特異性・親和力を保有し分析器材として有用な種々のミュータント抗体を創製することが可能と期待される.以上の観点から本年度は、副腎皮質ステロイドである11-デオキシコルチゾール(11-DC)に対するモノクローナル抗体(CET-M8)の一本鎖Fvフラグメント(scFv)をクローニングし、その諸性質に検討を加えた.すなわち、先に樹立したCET-M8抗体産生ハイブリドーマ株より全RNAを抽出し、RT-PCRによりH鎖及びL鎖可変部の遺伝子をクローニングした。
衛星画像からのウェーブレットニューラルネットワークを用いた海洋現象パターン認識

1993-2007年SAR、光学センサーおよびアルティメトリ衛星画像データを獲得した。18年度開発したOFID「海洋現象データベース」を更新した。2006年9月9-13日ロンボク海峡における、海洋現地調査で取ったデータを対象に海洋現象パターン認識を行った。現地調査と同一位置の衛星画像データを購入しウェーブレット解析した。ウェーブレット解析によって内部波を抽出し、発生した流れを確認した。2008年3月9-10日や25-27日男鹿半島における、油汚染現地調査を行った。ALOS・ASTER衛星画像を処理し検出した油汚染のデータは現地調査のデータとよく対応することを示すことができた。様々な天候や太陽の角度の状況で海洋現象を検出するために、ウェーブレットネットワーク研究した。そのために、Feed Forwardニュラルネットワークやシグモイド関数やLevenberg-Marquardtアルゴリズムを用いて、海洋現象認識を行った。検出結果は入力とほぼ同様の海洋現象、例えば内部波、にするには、最良の結果を与えた(r=1)。その他、様々なパターンやノイズが含まれた特徴の検出結果は小さくなり、r=0.9とr=0.3が得られた。ロンボク海峡や対島海峡における海洋災害・海洋現象のデータベース、例えばオイルスリックおよび内部波など、を開発するために、SARおよび光学センサー衛星画像データを獲得した。SARや光学センサーデータにはスペックルノイズや表面波からのノイズが含まれているため、ノイズフィルタリング処理を行った。位置をマッチングするために、位置校正を行った。SARおよび光学センサー衛星画像の電波・反射率を用いて、その現象を抽出するために海洋現象パターン認識を行った。オイルスリックおよび内部波は様々なスケールの現象が複雑に絡み合うので、2次元離散ウェーブレット変換による2次元多重解像度解析を提案した。ウェーブレット解析手法により内部波を検出した結果は用いる関数に影響され、本来第一波から第二波、第三波へと振幅が減少する現象が隠される傾向がある.これに対処するために、弱められた振動(damped oscillation)式を用いる、ウェーブレット変換を開発した。光学センサー衛星画像データを用いて、ロンボク海峡に検出された海洋現象の現地調査を行い、検出処理結果と現地データの対応が良効であることが検証できた。ロンボク海峡や対島海峡など日本近海における、海洋現象データベースを開発した。
放送映像とのリアルタイム結合を可能とする高機能ハイパーメディアシステムの開発

本研究は、放送型映像から自動的にユーザーの所望する情報を部品情報として抽出・データベース化し、これらを組み合わせて表現能力の高い新しいメディア(ハイパーメディア)を作成する開発環境(プラットホーム)を実現し、マルチメディア情報の利用価値を高めることを目的とする。具体的には、従来困難であった映像の自動分類の問題を、創案する「映像シーン記述言語」をベースとした実現性の高い自動映像認識手法及びシーンデ-ダベースや複数メディアの協調を用いた高次構造化方式とにより、次にこれを媒介にして放送型のライブ情報とのリンクを柔軟に設定でき、しかも対象メディアを自在に操作できる新しいタイプのハイパーメディアシステムを研究開発することを目的とする。平成8年度は、平成7年度までに開発した基本システムを機能拡張し、方式の確立をはかった。即ち、(1)平成7年度の評価実験の結果により、ハイパーメディアの記述性、リアルタイムリンクの信頼性等を分析し、映像シーン記述言語及びリアルタイムリンク実現方式の改良を行って更に高い性能を実現した。(2)情報部品の高度な構造化により、より高度な映像ハイパーメディアを作成する方式を開発し、多数の対象による実現を行う具体的なシステムの作成により有効性を実証した。(3)平成8年度計上の映像データベース装置により、実験システムの拡張を行い、実験対象とする放送映像の種類をドラマや音楽番組、トピックス番組を含む形に増加し、またその複雑さの程度も段階的に増す形で評価実験を行い、有効性を実証した。平成7年度は、以下の各課題により、放送映像とのリアルタイム結合を可能とするハイパーメディアの基本システムを開発した。(1)対象物や構成部品全てを「オブジェクト」として定義、画像認識技術に基づく柔軟な操作や加工、データベース化を実現し、またそれらのオブジェクトの間に、リアルタイムな判断による情報結合を可能とするハイパーメディアシステムの基本構造を開発した。(2)放送映像中のカラーセグメントを抽出し、その属性、配置、相互関係、動き等をベースに、所望の映像の種類やシーン様相を記述する言語と、それに基づく放送シーンのモデルセットとを開発し、さらに放送番組の構成モデルの援用による認識確度向上手法を併用して、これによる自動認識を行ない、ハイパーメディアのノードとして「今放送された情報」をも扱うことのできるリアルタイムリンク機能の実現方式を開発した。(3)上記の方式を、本年度購入した映像処理ワークステーション上に実装、そのプラットホームを用いていくつかのユーザ主導のハイパーメディアシステムを実験的に作成した。次に、計上のビデオインタフェース装置により、ニュース、天気予報、スポーツ等のTV映像の代表的な放送シーンを入力し、ユーザが指定する情報とのリアルタイムリンクが所望の形で実現されるかの評価実験を行ない、当初目的の性能が得られることを確認した。本研究は、放送型映像から自動的にユーザの所望する情報を部品情報として抽出・データベース化し、これらを組み合わせて表現能力の高い新しいメディア(ハイパーメディア)を作成する開発環境(プラットホーム)を実現し、マルチメディア情報の利用価値を高めることを目的とする。具体的には、従来困難であった映像の自動分類の問題を、創案する「映像シーン記述言語」をベースとした実現性の高い自動映像認識手法及びシーンデータベースや複数メディアの協調を用いた高次構造化方式とにより、次にこれを媒介にして放送型のライブ情報とのリンクを柔軟に設定でき、しかも対象メディアを自在に操作できる新しいタイプのハイパーメディアシステムを研究開発することを目的とする。
レーザー多重共鳴法による励起状態ダイナミクスの研究

分子が可視・紫外光を吸収すると電子励起状態が生成する。電子励起状態は、励起状態ごとに特有な化学変化を示し、化学的に安定な基底状態とは全く異なる挙動を示すことが多い。このような多種多様な励起分子の化学変化は、近傍に存在する他の電子状態の構造や性質が異なるために生じることが多い。本研究では、ヨウ素分子、硝酸ラジカルなどの電子励起状態の特徴的な性質を示すとともに、その挙動が近傍にある他の電子状態により引き起こされる励起状態ダイナミクスのメカニズムを解明した。昨年度に引き続きヨウ素分子のイオン対状態の研究を継続するとともに、硝酸ラジカルの基底状態の振電構造に関わる研究を行った。ヨウ素分子のイオン対状態について、I+(1D) + I-(1S)の解離限界に相関するイオン対状態f'0g+(1D)に見られる緩和過程に関わる励起状態ダイナミクスの測定を行った。(1+1)光子遷移を利用した光ー光二重共鳴遷移で、f'0g+(1D)状態へ励起すると、同じ解離限界に相関するf0u+(1D)から紫外域の発光が観測される。この発光と同時に、指向性の強いf'0g+(1D)-f0u+(1D)の発光が赤外領域に生じることから、f'0g+(1D)への光励起に伴い、f'0g+(1D)とf0u+(1D)状態間に反転分布が形成され、f'0g+(1D)-f0u+(1D)の自然放射増幅過程が観測できることを明らかにした。また、f0u+(1D)状態から2つの価電子状態(0g+(bb), 0g+(ab))への発光スペクトルからそれらの離散状態および連続状態を解析して、ポテンシャル曲線を決定した。硝酸ラジカルの2つの同位体種(14NO3, 15NO3)を用いて、基底状態の振動モードの解明を試みた。D3hの対称性を持つ硝酸ラジカルには4つの基準振動モーが存在する。赤外活性なν2とν4モードがFT-IR分光法で新たに観測でき、その解析を行った。また、ν3振動準位に関しては、レーザー誘起スペクトルの解析から、ν1バンドが15NO3では2つの準位に分裂することから、14NO3ではν1とν4振動状態が偶然縮退している可能性を見出した。しかし、ν3とν4モードを含むE'振電準位の解析には、第二電子励起状態(2E')との振電相互作用を含めた解析が必要であることが分かった。ヨウ素分子のイオン対状態f'0g+(1D)に光ー光二重共鳴遷移で励起した時、F'0u+(1D)状態への効率の良い緩和過程が存在する。この緩和過程はf'状態からF'状態への自然放出増幅に起因すると推測されるが、この過程を2つの視点、分光学的および動力学的な側面から検討した。第一に、F'状態からの紫外発光を検出すると、緩和で生じたF'状態の振動分布が観測できる。一方、この緩和過程を引き起こす自然放射増幅過程に伴う赤外光を検知すると、その効率を直接検出できる。両者は緩和過程を理解する上で相補的な関係にあるが、これらの実験結果は良く一致した。第二に、F'とf'状態のケイ光強度の時間変化を測定すると、f'状態のケイ光寿命はF'状態より長く、レーザー励起により2つの励起状態間には容易に反転分布が形成されることを明らかにした。硝酸ラジカルの基底状態(X2A2')および第二電子励起状態(B2E')の電子構造を検討した。基底状態の振動状態を第二電子励起状態からのレーザー誘起ケイ光分散スペクトルおよびFT-IRスペクトルから解析した。D3hの対称性を持つ硝酸ラジカルは4つの基準振動をもつが、二つの縮退した振動モード(ν3、ν4)から生じるE'振電準位には第二励起状態との振電相互が顕著に見られた。一方、第二電子励起状態(E')をレーザー誘起ケイ光法で測定すると、スペクトルには構造のないブロードなバンドの上に、多くの回転線があらわれた。前者は基底状態や第一電子励起状態(A2E")の高振動状態との強いカップリングにより生じた状態密度の高い状態への遷移と推測できる。また、後者には等間隔なDoublet構造が数多く見られる。この間隔が基底状態のエネルギーの最も低い回転状態のスピン分裂の大きさに一致することやこれら遷移が示すゼーマン効果の測定から、この領域には複数の振電状態が数多く存在することが分かった。1.光ー光二重共鳴法によるイオン対状態の解析ヨウ素分子のイオン対状態について、I+(1S) + I-(1S)の解離限界に相関する2つのイオン対状態(0g+(1S)と0u+(1S))の測定を行った。

観測には、対称性を考慮して、B3Π(0u+)状態経由の(1+1)光子遷移および(1+2)光子遷移を利用した光ー光二重共鳴分光法を用いた。しかしながら、これらの励起状態付近には、I+(3Pと1D) + I-(1S)に相関するイオン対状態が多数存在し、これらの状態からのAmplified Spontaneous Emission (ASE)が強いために二重共鳴遷移の観測が妨害され、目的とするイオン対状態の十分な解析はできていない。2.レーザー多重共鳴法による励起状態ダイナミクスの解明上記の問題を解決するために、イオン対状態間に見られるASE過程を発光スペクトルから検討した。0g+(1D)状態に励起すると、同じ解離限界に相関する0u+(1D)状態から基底状態への遷移(0u+(1D)-X1Σg+)が、0g+(1D) - B3Π(0u+)遷移とほぼ同じ強度で観測された。同時に一番エネルギーの低い解離限界に相関する0g+(1D) - 0u+(3P2)へのΔΩ=0遷移も観測できる。これは、第一に、イオン対状態間の遷移がσσ*型の平行遷移で、遷移モーメントが非常に大きい事実と一致する。第二に、0u+(1D)や0u+(3P2)イオン対状態の放射寿命が、励起した0g+(1D)状態のものに比べて、約1ケタ短いため、励起状態間に反転分布が生じて、ASEが起こり易い状況にあるためであると考えられる。現在、イオン対状態からの時間分割発光スペクトルや遷移モーメントの計算結果をもとに、ASEによる緩和ダイナミクスを明らかにするとともに、ASE過程を利用した高分解能分光法の開発を進めている。ヨウ素分子のイオン対状態f'0g+(1D)に光励起した時、f0u+(1D)状態への自然放射増幅過程による効率の良い緩和過程が存在することを明らかにした。この研究結果は、本研究の目的であるこの過程を利用した価電子状態の高分解能分光法の開発が可能となる重要な結果である。しかしながら、本研究における他の目的の一つであるヨウ素分子のエネルギーの一番高い解離限界に相関する2つのイオン対状態(0g+(1S)と0u+(1S))の光ー光二重共鳴法による解析と、これらの状態をプローブ遷移の上準位として用いたイオン対状態間の衝突緩和過程の研究に、十分な成果が得られていない。平成23年度に計画したヨウ素分子のエネルギーの一番高い解離限界に相関する2つのイオン対状態の分光学的な解析がまだ不十分である。一方、この測定中に、ヨウ素のイオン対状態からのASE過程が顕著に見られることを新たに見出したことで、平成24年度に計画していたASE過程を利用した高分解能分光法の開発に着手することができた。当初の計画通り、イオン対状態からの自然放射増幅過程を利用した高分解能分光法を開発して、状態密度の高い原子価状態の離散準位の観測に適用する。この観測データーをもとに原子価状態のポテンシャル曲線の全貌を明らかにして、State to State Chemistryの立場から、原子価状態(B3Π0u+)の前期解離メカニズムを解明する。また、より複雑な電子構造を有する分子系として硝酸ラジカルの励起状態ダイナミクスを研究課題に取り上げる。ここでは、基底状態に見られる励起状態との振電相互作用が振動励起状態のダイナミクス与える影響、また電子励起状態を利用した二重共鳴法などの高分解分光法の開発を行う。イオン対状態からのASE過程を利用した高分解能分光法を開発して、状態密度の高い原子価状態の離散準位の観測に適用する。
骨格筋線維の損傷および回復・再生機構:筋損傷モデルマウスにおける検討

デュシェンヌ型筋ジストロフィー症のモデルであるmdxマウスの骨格筋が損傷と再生を繰り返す機構の解明を目指した。また、その一手段とした炎症反応の影響を追求する実験では、炎症性サイトカインであるインターロイキン6(IL-6)の受容体ブロック(MRI6-1)やマクロファージコロニー刺激因子欠損マウス(op/op)も使用して、筋再生機構の解明に迫った。筋衛星細胞は筋線維膜下に存在し、筋の発育や負荷の増大に伴う肥大、および筋損傷からの再生時における核の形成に非常に重要な役割を果たす。逆に抗重力筋活動抑制は、衛星細胞数および活性を低下させる。その結果誘発される筋核数の減少に起因してタンパク質合成が抑制されるために、筋萎縮が起こるという示唆もある。そこで我々は、筋の可塑機構における衛星細胞の役割に注目した研究を実施した。さらに、機械的負荷等に対する衛星細胞の反応に、マクロファージやIL-6が如何なる役割を果たすのかも追求した。その結果、筋の萎縮からの回復には、衛星細胞数の増加が重要な役割を果たしているという示唆が得られたが、op/opマウスではそれが起こらず、萎縮の回復も認められなかった。マクロファージの重要な関与が示唆される。そこで、他のマウスで増やしたマクロファージをop/opマウスに移植する実験に着手した。腱切断および神経切除により機械的負荷および神経活動を除去した場合、mdxマウス骨格筋の壊死からの再生は促進されなかったのみならず、深刻な筋線維萎縮を招いた。また、機械的負荷そのものが、骨格筋におけるタンパク質合成を促進する生理的刺激となっていることも分かった。デュシェンヌ型筋ジストロフィー症は、男児3500人に1人の割合で見られる遺伝性筋疾患であるが、膜タンパク質であるジストロフィンの遺伝子変異により、骨格筋および心筋における進行性の弱化が見られる。そこで、損傷と再生を繰り返すデュシェンヌ型筋ジストロフィー症のモデルであるmdxマウスの骨格筋を利用した。また炎症反応の影響を追求する実験では、炎症性サイトカインであるインターロイキン6(IL-6)の受容体ブロックやマクロファージコロニー刺激因子欠損マウス(op/op)も使用して、筋再生機構の解明に迫った。その結果、腱切断および神経切除により機械的負荷および神経活動を除去した場合、mdxマウス骨格筋の壊死からの再生が促進されなかったのみならず、深刻な筋線維萎縮を招いた、また、機械的負荷そのものが、骨格筋におけるタンパク質合成を促進する生理的刺激となっていることも分かった。肥大には、リボゾームタンパク質S6および27kD熱ショックタンパク質のリン酸化が重要な因子であり、個々の核に存在する核小体数の増加も伴うという結果も得られた。
中世歌学の享受から見た心敬の文学作品の創造と新撰菟玖波文学圏への影響に関する研究

日本中世文学において、高い文学的達成を示した心敬の文学作品に対して、その独自性と、他者への影響力という二点を主眼として研究をすすめた。連歌作者心敬の多様な文学作品(連歌、和歌、連歌論)に対する分析では、特に百韻や句集の注釈作成により見える作品の特徴を論じ、心敬と有力連歌師との関わりの分析では、『新撰菟玖波集』編者である宗祇、兼載などへの影響を細かく考察した。本年度は、昨年度にひきつづき、心敬が宗匠として参加した早大図書館蔵『「撫子の」百韻』の注釈を行ない、完成させた。『「撫子の」百韻』は、管領細川勝元とその家臣団による百韻であり、在京時の心敬の交友圏中、彼が最も密接に関係した有力武士との間の百韻を注釈、分析することで、武士の句作の特質と、それを指導し百韻の流れを作って行く心敬の手法を明らかにしえた。この百韻の訳注は、平成26年度に笠間書院より刊行予定の『心敬連歌訳注と研究』に掲載し成果を発表する。さらに、心敬には和歌と連歌の自作をおさめた全八冊からなる『芝草』があり、その自注が存している。今年度は、その自注のうち連歌の発句及び付句の自注である本能寺本『芝草句内岩橋上』を選び、訳注を開始した。心敬の自句、自歌解説は、彼の創作を理解する上で最も重要な指標であるが、これまでのところ、本能寺本と大田氏蔵二本の翻刻が終戦直後に出され、本能寺本の影印が『連歌貴重文献集成第五集』におさめられたのみで、内容面の研究は未だ進んでいなかった。今回、新たに翻刻と注釈にとりくみはじめたことで、研究に新しい段階をひらきえたこととなる。今後、『芝草句内岩橋上』『芝草句内岩橋下』の訳注を完成させることで、心敬の連歌と和歌の創作の源泉を明らかにすることができ、正徹から心敬へと流れ込む冷泉派和歌の実体もより詳細に把握できうる。加えて、心敬から流れ出す連歌の、宗祇のみならず兼載への影響を論じうることとなり、新撰菟玖波文学圏への影響の新たな分析をなしうる。本年度は、研究対象心敬の連歌表現分析や心敬の属する文化圏の研究に必須と思われる百韻として、彼が宗匠として参加した早大図書館蔵『「撫子の」百韻』を選び、まずその注釈を行なった。さらに、注釈をもとに、宗匠心敬の百韻の運営方法と影響力をはかり、式目の実施、百韻の進行のさせ方などについて考察を行ない、論をまとめた。また、今までの百韻注釈の成果を基に、心敬の和歌の師である歌人正徹の和歌と、心敬の和歌・連歌について解説したコレクション日本歌人選『正徹と心敬』(笠間書院・2012)を刊行した。『「撫子の」百韻』は、心敬と管領細川勝元及びその家臣が同席して張行した百韻であり、この百韻の注釈によって、法華宗徒・有力武士を中心とする関東下向以前の心敬の交友関係のうち、管領細川氏との関係を調査することができ、心敬がその和歌の師、正徹の影響によって属した文化圏の概要、という重要な問題の解明が進んだ。かつ、和歌の影響の濃い心敬の句作を見ることにより、武士たちの参加する稚拙な部分もある百韻に、歌の詞がいかに取り入れられ学ばれていたかが把握でき、武士の参加する百韻の句の特質解明につながった。さらに、心敬の指導方法に着目した分析で、百句をいかに進行させていくか、複数の作者の出句の順をいかに決めておくかといった、これまで明らかにされてこなかった百韻進行手順を句の詳細な検討から推定しうることを論じえたのは、具体的な注釈によって導き出したものである点、説得力のある成果となった。この百韻には宗祇も同座しており、両者の句作の影響関係、また相違点が指摘でき、初学期の宗祇の句風の研究にも有効であった。宗祇とその弟子兼載につながっていく、心敬の指導が推定でき、心敬に流れ込み、また心敬から流れ出す和歌の連歌への影響のありさまを明らかにしていくという、今後の研究課題がよりはっきりと見通せた。本年度はまず、昨年度までに完成させた早大図書館蔵『「撫子の」百韻』などの三注釈の総合的な検討を行った。これらの百韻には、心敬が宗匠として関わり、百句の流れをつくっている。それゆえ、式目とその運用の吟味をなし、心敬が百韻を指導し付合を作っていく手法を厳密に検討しあきらかにすると共に、相互に関連する内容、参加者などについてもあらためて詳細に検討した。その成果と、三百韻の訳注をもとにした研究論文とは、平成27年度に笠間書院より『心敬連歌訳注と研究』として刊行する。また、昨年度から開始している本能寺本『芝草句内岩橋上』の翻刻・訳注をさらにすすめた。心敬には自歌、自句をまとめた全八冊の作品『芝草』があり、現在その自注である『芝草句内岩橋上』『芝草句内岩橋下』が存している。

心敬自身による歌・句の解説こそは、彼の創作を理解する上で最も重要な指標であることは論を待たず、しかも、これまで学界においては『芝草句内岩橋上』『芝草句内岩橋下』の内容面の研究はたちおくれていた。それゆえ、訳注はユニークな試みであり、また急務とされるものである。今年度、心敬の春の発句の注釈をすることで、心敬と漢詩文、心敬の独特な感性について、さらに詳細で新しい見通しが得られる見込みを得た。今後は、訳注をいそぎ進め、和歌の訳注にも及ぶことで、正徹から心敬に流れ込む冷泉派和歌の特徴も解明でき、心敬を指導者として、兼載、宗祇が発展させる新撰菟玖波文学圏の特色を明確に論ずることができると思われる。本年度は、心敬が宗匠として参加した三つの重要な百韻の訳注と、その訳注をもととして、心敬の指導方法及び付合の創作方法などを論じた研究論文の成果をまとめた著書『心敬連歌訳注と研究』(笠間書院)を刊行した。この著書の刊行により、京都在住時における心敬の式目運用・実作指導の様子や、心敬の句作と本歌取など和歌の詠法との関係、後に宗祇や兼載それぞれに継承される連歌作句の理論などを明らかにしえたと考える。さらに、一昨年度から開始している心敬の自句自注である『芝草句内岩橋上』の翻刻・訳注を進めた。「芝草句内岩橋』には句の自注を付した上巻と、自歌に自注を付した下巻が存し、いずれも内容面の研究は立ち遅れている現状である。それゆえ、『芝草句内岩橋』の訳注はまず急務であるが、四季の部の発句注釈をすすめていくうちに、漢詩の知識を駆使した心敬の作句方法、正徹から心敬に流れ込む冷泉派和歌の特質など、新たな問題点が浮き彫りになってきている。今後は、訳注をさらに進め、和歌の自注も加えた両自注の総合的な検討に及ぶことで、心敬の文学作品の創造性をつまびらかになすことができると思われる。本研究の目的は、心敬の作品(連歌・連歌論・和歌・自注など)を総合的に読解していくことで、心敬の文学的・思想的ネットワークを明らかにし、慈円などの新古今歌人や、直接の師匠であった正徹などの冷泉派歌人がいかに心敬に影響を与えたかを詳細に論ずると共に、また宗祇や兼載などの新撰菟玖波集編者がいかに心敬の影響を受けていたかも解明するところにある。今年度はこれまでの研究に補訂を加えた『心敬連歌訳注と研究』を刊行し、また次の課題である「芝草句内岩橋上』の訳注も順次進めた。『芝草句内岩橋上』の訳注から、心敬が漢詩文から受けた影響という新しい問題点もクローズアップされ、さらなる論究をなす必要性が確認された。こうした新視野が開けたことで、計画以上に進展しているということができ、また新たな研究の準備をすすめる必要がある。本年度は、心敬の『芝草句内岩橋上』の訳注を前年度に引き続き進めていったが、それにより、心敬の詠法、宗祇の詠法に関する幾つかの分析視点を得ることができた。今年度の注釈部分には、心敬の非常に大きな特徴である色彩表現(「青し」)を用いた句が見られ、用例研究を通して、和歌表現との関わりの中での心敬の句の位置について分析をなした(2017年7月に論文発表予定)。これにより、新古今時代の和歌(特に藤原定家、順徳院の和歌)から京極派へ、さらに京極派(特に花園院)から正徹和歌に影響が及び、そこから新たな視点で心敬が和歌や連歌を詠じたことが明らかになり、心敬の特徴ある発句の詠法の系譜が明らかにできた。加えて、制詞、俗語の扱いなどに関し、心敬の師である正徹に大きな影響を与えた今川了俊の冷泉派歌学を分析することで、歌学と連歌論を常に一体として考える心敬が、どのように歌学をとりいれたかが明らかにしえた。加えて、やはり注釈部分に存した、心敬の、夏の「葉」の句の詠法は、「病葉」にも関係し、宗祇の句集名にもつながる重要な観点であることが本年度の分析から考えられ、新たに宗祇の詠法に関して切り込む視点を得た。今年度は本科研費の研究成果に対して、これまでの心敬研究で得られた知見を総合して、あらためて「心敬の詩学」と題して講演した。また、研究分担者奥田勲氏は本科研費での研究成果を新たに盛り込み、2017年4月に『連歌史中世日本をつないだ歌と人びと』を刊行する。2015年秋にこの研究の成果である『心敬連歌訳注と研究』を刊行することができた。
積雪地域の住宅と仕様式に関する比較研究

この研究で意図したのが,これまで余り総合的に捉えられていない積雪地域の住宅あるいは住空間の全体を捉えることである.以下にこの研究によって得られた知見を,分析の視点ごとに示す.1.住戸群空間・住戸廻り空間8つの計画指標によって各都市の住戸を比較した結果,札幌,秋田は低い密度によって,北陸4都市は住宅規模が大きいことによって,東京と異なっていることが分かった.敷地面積が大きいものほど主庭空間と前庭空間との分離の程度が高いことが分かる.2.生活空間と住宅空間の構成札幌が住宅規模の大小に係わらず様式の居間を大きくとり,通路空間を小さくしているのに対して,金沢,長岡では,座敷の茶の間や様式のLDKを持つものが混在し,接客空間を別に持つものが多い.住空間構成を分類して,各都市の比較すると,札幌はE型が大半で,他の5都市とは異なっていることが分かった.また,神戸では, 1階に洋間公室と和室, 2階に個室という構成多く,東京と似ていると思われた.3.室空間,暖房方式,構法炊事,食事,だんらん,接客,世帯主の睡眠の5つの生活行為を取り上げ生活型を分類すると,札幌と長岡では「接客併用型」,秋田,上越,金沢では「居間集中型」,新潟では「接客分離型」が多いことが分かった.また,居間の起床様式は札幌では椅子式が中心で10-12帖,長岡,金沢では座式が多く8帖程度である.新潟,長岡,上越では1戸あたりの暖房器具数が4台近くになり,開放型の石油ストーブが多い.構造部材では,各地域とも材木の樹種に関しては少しずつ違いがあり,入手しやすいものを多用する傾向がある.4.デザイン観,住居観,住意識デザイン観は,札幌は近代性の好みが極めて強いのに対して,金沢は逆に圧倒的に伝統的デザインが好まれており,長岡は両者に分れている.この研究で意図したのが,これまで余り総合的に捉えられていない積雪地域の住宅あるいは住空間の全体を捉えることである.以下にこの研究によって得られた知見を,分析の視点ごとに示す.1.住戸群空間・住戸廻り空間8つの計画指標によって各都市の住戸を比較した結果,札幌,秋田は低い密度によって,北陸4都市は住宅規模が大きいことによって,東京と異なっていることが分かった.敷地面積が大きいものほど主庭空間と前庭空間との分離の程度が高いことが分かる.2.生活空間と住宅空間の構成札幌が住宅規模の大小に係わらず様式の居間を大きくとり,通路空間を小さくしているのに対して,金沢,長岡では,座敷の茶の間や様式のLDKを持つものが混在し,接客空間を別に持つものが多い.住空間構成を分類して,各都市の比較すると,札幌はE型が大半で,他の5都市とは異なっていることが分かった.また,神戸では, 1階に洋間公室と和室, 2階に個室という構成多く,東京と似ていると思われた.3.室空間,暖房方式,構法炊事,食事,だんらん,接客,世帯主の睡眠の5つの生活行為を取り上げ生活型を分類すると,札幌と長岡では「接客併用型」,秋田,上越,金沢では「居間集中型」,新潟では「接客分離型」が多いことが分かった.また,居間の起床様式は札幌では椅子式が中心で10-12帖,長岡,金沢では座式が多く8帖程度である.新潟,長岡,上越では1戸あたりの暖房器具数が4台近くになり,開放型の石油ストーブが多い.構造部材では,各地域とも材木の樹種に関しては少しずつ違いがあり,入手しやすいものを多用する傾向がある.4.デザイン観,住居観,住意識デザイン観は,札幌は近代性の好みが極めて強いのに対して,金沢は逆に圧倒的に伝統的デザインが好まれており,長岡は両者に分れている.61年度の研究では、住居観・生活実態・住宅平面の構成という視点から住生活の地域差を捉えることを課題とし、調査・分析が行われた。北海道大学グループでは、昭和61年7月に、札幌、長岡両市でそれぞれ都市独立住宅を対象にして居住者アンケートおよびヒアリングを実施した。調査対象数は、札幌2地区、長岡3地区で合計510戸である。この調査は主として居住者の住宅評価の実態、および規模,形態,空間構成などについての居住者の住居観念の解明を目的としたもので、他グループによる同地域の居住実態研究と対をなすものである。現在集計分析作業を進めている段階であるが、この研究を通じて多雪地域の住宅、住様式を規定する特有の生活観、住居観の実態が明らかになっている。金沢工業大グループでは、金沢の現代住宅(1戸建)の平面分析を完了した。格式的な系譜、近代の合理的系譜に加えて、様式化と同時に和風の格式的空間の生活化が進行しつつあることが判明した。北大グループとの共同調査の金沢分の調査は完了し、現在集計・分析が北大グループによって進行中である。多雪地域地方都市型住宅と対照的な温暖地域大都市型住宅の一例として、神戸市の新築一戸建の住宅の平面分析を開始した。住宅規模・室規模の狭小性,L.D.Kの流動的工夫,和室の1室確保等が予測される。新潟大学グループでは、札幌,秋田,新潟,石川の6地域の住宅1888戸を対象とした調査を行った。屋根雪処理の実態,生活行為と住空間との対応、暖房方法と住空間の使われ方及び結露の発生状況等の地域的特徴が捉えられた。現在、間取図の分析を行っている。
ニューロペプタイドYは成長ホルモンの分泌を調節するか

NPY神経細胞は弓状核に存在し、神経線維をGRF神経細胞が局在する腹外側領域に送っている。弓状核にはNPY受容体が存在する。一方、絶食により弓状核のNPY遺伝子発現は顕著に増加し、GRF遺伝子発現は激減する。これらの事実に基づいて、視床下部弓状核のNPYはGRF神経細胞に抑制的に作用するのではないかと仮説し、さらに検討を続けている。
クラスターイオンの素反応過程に関する研究

放電フロー法をイオン源とするクラスターイオンビーム装置を世界に先駆けて開発し、熱エネルギー領域でのArN_2^+クラスターイオンと低級炭化水素,Kr,CO_2とのイオン-分子反応を質量分析法を用いて研究した。これより、クラスターイオンの自由イオンとは異なる特異な反応性を明らかにした。またこの装置をCO_2^+,CF_3^+と低級炭化水素、ベンゼン置換体を中心とする芳香族化合物とのイオン-分子反応にも適用し、クラスターイオンの生成素過程を検討した。例えばCO_2^+/CH_4,CF_3^+/C_2H_2,CF_3^+/PhX(X=C_2H,CN,OCH_3,COH,COCH_3,COOCH_3)反応でクラスターイオンが生成することを見いだした。さらに高圧放電フロー法を用いた希ガスヘテロクラスターイオンの電子構造に関する系統的研究を行った。Ar放電フロー、Kr放電フローでのKr,Xeの反応でArKr^+,KrXe^+の新規発光スペクトルを発見し、クラスターイオンの電子構造を決定した。また希ガス背圧をさらに上昇させることにより、HeAr_2^+のような希ガスヘテロトリマ-イオンのbound-free型の発光スペクトルの観測に成功した。これらの発光は、真空紫外領域での新規エキシマーレーザーとして使用できる可能性が強い。本研究補助金で購入した四重極質量分析管を装備した反応セルを中心に、マイクロ波イオン源、高速排気系、発光観測系から成るクラスターイオンビーム装置を試作した。装置の試作後にArN_2^+クラスターイオンと低級炭化水素(CH_4,C_2H_2,C_2H_4,C_2H_6,C_3H_6,C_3H_8,n-C_4H_<10>,iso-C_4H_<10>)との反応を質量分析法を用いて系統的に研究した。各反応でのイオンの生成分岐比と生成速度定数を高精度で決定した。実測の生成イオン分岐比を既知の親イオンの分解曲線と比較することによりArN_2^+クラスターイオンとイオン化電圧の低い低級炭化水素との反応では、近共鳴電荷移動で反応が進行することがわかった。また標的分子のイオン化電圧の効果を検討するためにArN_2^+とCO_2、Krとの反応を研究した。その結果、イオン化電圧の高いCO_2、Krではイオン化直前にArN_2^+のAr-N_2間の核間距離が伸びることを発見した。これはAr-N_2^+間のvan der waals結合エネルギーが通常の共有結合のイオンよりも小さいためと結論した。さらに標的分子の永久双極子の効果を検討するためにArN_2^+とCH_3Cl、CH_2Cl_2との反応を研究し、これらの永久双極子を持つ分子のイオン化過程は、永久双極子を持たない低級炭化水素と同様に近共鳴的に進行することを見いだした。これよりクラスターイオンの反応性は、標的イオンのイオン化電圧に強く依存するが、永久双極子には依存しないという新知見を得ることができた。ArN_2^+イオンの反応速度は、標的分子のイオン化のフランク・コンドン因子に依存せず、研究したいずれの反応でもLangevanまたはADO理論値に近い値が得られた。このことから、ArN_2^+の電荷移動反応は、遠距離での電子移動で進行することがわかった。当初の研究計画に従い、本年度は初年度に試作したクラスターイオンビーム装置を用いてAr_2^+,He_2^+クラスターイオンとCS_2,NOとの電荷移動反応によるCS_2^+(A-X),NO^+(A-X)発光スペクトルを測定した。反応(1)で生成するCS_2^+(A)状態の方がAr^+/CS_2反応で生成するCS_2^+(A)と比較して著しく低振動・回転励起されていることを見いだした。

一方、反応(2)で生成するNO^+(A)の方が、He(2^3S)/NOペニングイオン化で生成するNO^+(A)よりも若干振動励起されていることがわかった。これより反応(2)でのエネルギー移動機構が非フランク-コンドン的なイオン化過程で進行することが明らかになった。来年度は当初の計画を変更し、混合希ガスクラスターイオンの生成・素反応過程の発光法による研究を中心とする研究を展開する計画である。当初の研究計画に従い、本年度は二体・三体クラスタリング反応で生成する希ガスのヘテロクラスターイオンの発光スペクトルの観測を真空紫外から可視領域で試みた。その結果、ArKr^+のC_13/2-A_13/2,B1/2-X1/2,C_21/2-A_21/2遷移、KrXe^+のC_13/2-A_13/2遷移に帰属できる新規発光種を発見した。スペクトルの振動解析からこれらのテヘロクラスターイオンの平衡構造を決定した。また希ガスの背圧を上昇させることにより、ヘテロクラスターイオンの発光近傍に下記の二体・三体クラスタリング反応で生成する希ガスヘテロトリマ-の発光スペクトルを観測できた。反応例系統的な研究により、これまでにHeKr_2^+,NeAr_2^+,NeKr_2^+,NeXe_2^+,ArKr_2^+,KrXe_2^+に帰属可能なbound-free遷移の連続発光を発見した。多くの場合、これらの連続発光は、ヘテロクラスターイオンのB,Cバンドに収斂する第一バンドとDバンドの長波長側に出現する第二バンドから成る。これらの発光の希ガス背圧依存性から第一バンドをヘテロトリマ-イオンのC_13/2-A_13/2,B1/2-X1/2遷移、第二バンドを、そのB1/2-A_21/2遷移の発光に帰属した。これらのいくつかは真空紫外領域で強く発光し、今後、新真空紫外エキシマーレーザーとしての実用化研究が期待される。
広帯域ランダム波長同調可能な中赤外光源の開発とその生体試料識別への応用

本年度(平成18年4月1日平成19年3月31日)は、昨年度構築した「高速広帯域波長制御中赤外コヒーレント光源」の高出力化および高安定化を行い、分子分光測定・2次元マッピング測定装置として発展させる事を主目的として研究を行ってきた。(1)広帯域ランダム波長同調可能なコヒーレント中赤外光源の高出力化高安定化従来の非線形光学結晶を用いた中赤外光源では結晶角度により波長制御を行っている。本研究では、励起波長同調によって波長制御を行う為、課題であったウォークオフ角やフレネルロスによる変換効率の減少などが改善でき、従来方法よりも中赤外領域を広帯域にわたり高出力発生可能であった。2μm励起光源のエネルギースケーリングおよび共振器構成の改善により、出カmJオーダー(ピークパワー数百kW)を保ったまま、510μmという広帯域波長同調特性が得られた。また高安定性に関しては、検出器を2個使用し2ch測定を行う事でパルス間の強度揺らぎ補正を行い、1%よりも高い安定性を実現した。(2)2次元マッピング分光測定装置の設計および試作本研究で開発を行ったコヒーレント中赤外光源の大きな特徴として、所望の波長をmsオーダーでランダムアクセス出来る点にある。これは、ガルバノ制御2μm帯励起光源により実現できるものである。この波長ランダム性能を活かし、サンプル吸収ピーク位置とそれ以外の波長をスイッチングし信号を得る事で、リアルタイムモニタリングおよび差分イメージング測定が可能であった。本研究で開発を行った「広帯域ランダム波長同調可能な中赤外光源」は、高出力を保ったまま広帯域にランダム発生できる点で、他に類例がなく、今後の実用装置として展開が見込めるものである。本年度は、中赤外領域(510μm帯)において、高速広帯域波長制御可能なコヒーレント中赤外光源の構築を主目的に研究開発を行ってきた。1.2μm帯励起波長同調によるコヒーレント中赤外光源の開発非線形光学効果を用いた従来の中赤外光発生では、結晶角度同調や温度同調により波長制御を行っていた為、ウォークオフ角やパスずれ、フレネルロスにより変換効率が減少する点が課題に挙げられる。しかし、本研究で設計・開発を行った「高速広帯域ランダム波長同調中赤外コヒーレント光源」は、非線形光学結晶固定のまましかも高速に波長制御を行うことが出来、これらの課題をクリアできる。開発した中赤外光源は、大きく分けて2つのコンポーネントから成る。(1)ガルバノ制御2μm帯励起光源部:共振器内に2つのKTP結晶を配置した、1.064μm励起の2μm帯励起光源であり、チューニングレンジ1.82.5μmを有する。KTP結晶角度はガルバノスキャナ制御であるので、精密かつ再現性良く高速に励起波長をコントロールできる点が大きな利点である。(2)結晶角度固定中赤外光源部:非線形光学結晶にはZnGeP_2(ZGP)を用いた。(1)の励起光源が高速制御可能な為、ZGP結晶角度同調が不要で、格段に高速で再現性の良い中赤外光発生の自動制御が可能となった。中赤域のチューニングレンジは5.59.2μmを有し、この範囲でランダムアクセスおよびスキャニングが可能である。システム自体は1kHz応答が可能であるが、現在は使用するレーザの繰返し周波数により制限されている。2.励起波長高速同調可能な中赤外光源の高出力化ガルバノスキャナにより2つのKTP結晶を自動制御している為パスずれの補正はもとより、これと同時に2μm帯励起光源の高出力化が実現できる。現在では55mJ/pulseを得ており、高出力化に成功している。今後、後段のZGP-OPOの出力も高出力・高効率化が期待出来る。

本研究で開発を行った「広帯域ランダム波長同調可能な中赤外光源」は、高出力を保ったまま広帯域にランダム発生できる点で、他に類例がなく、今後の実用装置として展開が見込めるものである。
哺乳類酸味受容体候補PKD1L3/PKD2L1の構造・機能相関解析

酸味受容体PLD1L3/PKD2L1複合体のチャネルポア領域の同定を目指した。PKD1L3全長とPKD2L1全長をそれぞれpDisplayに挿入したコンストラクト(それぞれ、PKD1L3-FL、PKD2L1-FLと命名)を作製し、これらを鋳型として各種点変異体を作製した。アミノ酸点変異は、推定ポア領域のアスパラギン酸、グルタミン酸を、それぞれアスパラギン、グルタミンに置換した。PKD2L1-FLとPKD1L3各種変異体の共発現、および、PKD1L3-FLとPKD2L1各種変異体の共発現により、両分子のHEC293T細胞表面への移行が認められた。PKD2L1-FLとPKD1L3各種変異体の共発現、および、PKD1L3-FLとPKD2L1各種変異体の共発現によるクエン酸応答を、Ca2+イメージング法で解析したところ、PLD2L1のD523が複合体のCa2+透過性を決定することが明らかとなった。次に、複合体の酸応答機能に重要な領域の解明を目指した。PKD1L3とPKD1L2のキメラ体を複数種作製し、キメラ体とPKD2L1との共発現により、両分子のHEC293T細胞表面への移行を観察した。PLD1L3のN末端細胞外領域、TM1-5領域、TM6-C末端細胞内領域のいずれの部分をPKD1L2に置換しても、PKD2L1との共発現による細胞表面への移行が認められなかった。さらに、PKD2L1とPKD2のキメラ体を複数種作製し、キメラ体とPLD1L3との共発現により、両分子のHEC293T細胞表面への移行を観察した。PKD2L1のC末端細胞内領域以外の領域をPKD2に置換すると、PKD1L3との共発現による細胞表面への移行が認められなかった。現在、PKD2L1とPKD2のキメラ体のうち、細胞表面への移行が認められたものに関し、PKD1L3との共発現によるクエン酸応答の有無を解析中である。酸味受容体候補PLD1L3/PKD2L1複合体のチャネルポア領域の同定を目指した。推定ポア領域のグルタミン酸・アスパラギン酸残基の点変異が、Ca2+透過性を低下させると仮定した。PKD1L3の推定ポア領域には、アスパラギン酸残基(D2049)が1つとグルタミン酸残基(E2072)が1つ存在し、PKD2L1の推定ポア領域には、3つのアスパラギン酸残基(D523, D525, D530)が存在する。そこで、PKD1L3全長を発現ベクターpDisplayに挿入したコンストラクト(PKD1L3-FLと命名)とPKD2L1全長をpDisplayに挿入したコンストラクト(PKD2L1-FLと命名)を作製し、これらを鋳型として各種点変異体を作製した。アミノ酸点変異は、アスパラギン酸、グルタミン酸を、それぞれアスパラギン、グルタミンに置換し、中性化するように導入した。過去の報告により、PKD1L3とPKD2L1の両分子は、HEK293T細胞に共発現させると細胞表面へと移行することが知られている。そこで、PKD2L1-FLとPKD1L3各種変異体の共発現、および、PKD1L3-FLとPKD2L1各種変異体の共発現により、両分子のHEC293T細胞表面への移行が認められるかを細胞表面発現解析法にて観察したところ、いずれの共発現においても細胞表面への移行が認められた。続いて、PKD2L1-FLとPKD1L3各種変異体の共発現、および、PKD1L3-FLとPKD2L1各種変異体の共発現により、25mMクエン酸(pH=2.7)に対する応答が認められるかを、Ca2+イメージング法を用いて解析したところ、PKD2L1のD523の点変異体において、Ca2+透過性が低下した。以上より、PLD2L1のD523がPLD1L3/PKD2L1複合体のカルシウム透過性を決定することが明らかとなった。平成23年度の研究計画は、酸味受容体候補PLD1L3/PKD2L1複合体のチャネルポア領域の同定をめざすことであった。これまでの研究で、PLD2L1の523番目のアスパラギン酸残基がPLD1L3/PKD2L1複合体のカルシウム透過性を決定するという知見を得ており、研究の目的は概ね順調に進展していると考えられる。酸味受容体候補PLD1L3/PKD2L1複合体の酸応答機能に重要な領域の解明を目指す。これまでの当研究室における研究成果から、PKD2L1のC末端細胞内領域に存在するEF-handドメインとcoiled-coilドメインが酸応答に不要であり、PKD1L3のC末端細胞内領域は酸応答に重要であることが示唆されている。PKD1L3とPKD1L2やPKD1、PKD2L1とPKD2といった各種キメラ体を作製し、酸応答に重要な領域の特定を試みる。また、酸味受容体候補PKD1L3/PKD2L1複合体の多量体分析を行うことを計画している。BN-PAGE法やショ糖密度勾配法を用いて、多量体分析を行う事を計画している。

細胞培養用器具と試薬に400,000円、および、その他分子生物学用試薬に200,000円使用する予定である。また、国内旅費に150,000円、外国旅費に300,000円使用する予定である。以上、1,050,000円の使用を予定している。
ミオシン・スーパーファミリー異常症の病態解析

「ミオシン・スーパーファミリー」の一つであるmyosinVIのヒト血液細胞における発現と局在を種々の阻害剤を用いて解析した。単球・マクロファージ、巨核球及び形質細胞においてmyosinVIはRab8とcomplexをつくりゴルジ体から細胞膜やリソソームなどの細胞内小器官への輸送の関与が示唆された。MYH9異常症の遺伝子解析で2つの新規のin-frame欠失変異を発見した。また、3つ目の20-kDa light chainisoform (MLC-2C)を同定した。MLC-2C遺伝子導入によりJurkat細胞は付着性およびCD3の発現強度・陽性率が増加した「ミオシン・スーパーファミリー」の一つであるmyosinVIのヒト血液細胞における発現と局在を種々の阻害剤を用いて解析した。MLC-2C遺伝子導入によりJurkat細胞は付着性およびCD3の発現強度・陽性率が増加した【研究実績の概要】本研究の目的4項目の1つ『正常血液細胞の各系統への分化成熟段階における「ミオシン・スーパーファミリー」の発現分布の変化の解析、および血液腫瘍細胞に発現する「ミオシン・スーパーファミリー」の変異ミオシン発現マッピングを作成する』においていくつかの結果を得た。ミオシン・スーパーファミリーのmyosin VIは、唯一アクチンのプラス方向へのslidingをおこなうため、顆粒分泌やendocytosisへの関与が示唆されている。本年度は、このmyosin VIに関しての成果がまとまった。【結果と考察】1)Myosin VIの正常血液細胞での発現を、RT-PCRおよび免疫蛍光顕微鏡・免疫電子顕微鏡で観察した。末梢血の単球および血小板に強く発現すること、骨髄巨核球にも強く発現することが確認された。2)次に、12種類の白血病細胞株において、RT-PCR法にて発現を調べた。血小板核球系細胞株Meg-01、CMK、TPAで単球マクロファージへ分化させたHL60に強く発現し、その他の細胞株ではほとんど確認できなかった。ただ、Golgi complexが発達しているU266(骨髄腫細胞株)では発現を認めた。以上のことから、myosin VIは、血液細胞において、顆粒分泌やendocytosisに重要な役割を果たしていることが示唆された。本年度の成果の一部は、既に第48回日本血栓止血学会総会(2006.7.20)で発表した。また、国際血栓止血学会(2007.7)でも発表予定である。【研究実績の概要】本研究の目的4項目のうち2つを主に研究できた。1)『正常血液細胞の各系統への分化成熟段階における「ミオシン・スーパーファミリー」の発現分布の変化の解析:スーパーファミリー18クラスの中で唯一アクチンフィラメントをマイナス端方向へ移動し、マウス及びヒトの難聴や癌の播種の原因でもあるmyosin VIに注目し、ヒト血液細胞におけるmyosin VIの発現と局在を解析した。【方法】白血病細胞株の培養、分化誘導、サイトカラシン、コルヒチン、BFA処理、RT-PCR、共焦点レーザー顕微鏡および電子顕微鏡を用いた。【結果と考察】TPA処理を施したHL60、CMK及びMeg-01において、myosin VIはTGN領域においてRab8と関わりがある事が考えられた。また、CMK及びMeg-01(TPA 3 days)においてBFA処理によりER-ゴルジ体間輸送を阻害したことで、myosin VI及びRab8が核の周辺のみに局在したが共存はしていなかった。myosin VIとRab8が直接あるいは他の蛋白を介して結合し、これらの複合体がTGN領域に結合しているが、BFA処理により解離して局在が変化したことが考えられた。また、分泌型および非分泌型骨髄腫細胞株における検討では、非分泌型においてのみmyosin VIが核の周辺に存在し、Rab8は細胞全体に瀰漫性に存在し、両者の共存はみられなかったことより、非分泌型ではmyosin VIとRab8の共存は阻害されていることが考えられた。以上の結果から単球・マクロファージ、巨核球及び形質細胞においてmyosin VIは少なくともRab8とcomplexをつくりゴルジ体から細胞膜やリソソームなどの細胞内小器官への輸送に関与している事が示唆された。2)ヒト血液細胞から3つの20-kDa light chainisoformを同定した。それぞれ異なる遺伝子によりcodeされていた。MLC-2Cは、HL-60には発現していないが、TPAでmonocyte/macrophageに分化させると発現することが判明した。今後、この3つの機能の違いを明らかにすることである。本年度の成果の一部は、第49回日本平滑筋学会、国際血栓止血学会(2007.7)で発表した。J.Smooth Muscle Res(in press,2008)以外に、投稿中が2編ある。【研究実績の概要】正常血液細胞の各系統への分化成熟段階における「ミオシン・スーパーファミリー」の発現分布の変化の解析をおこなった。2007年度においてはmyosinVIに注目し、ヒト血液細胞におけるmyosinVIの発現と局在を解析した。

それを受けて、2008年度は、myosin VIに関する実験の追加を行い、更に新しくmyosinXに焦点を当て、以下の研究成果を得た。【方法】白血病細胞株の培養、分化誘導、サイトカラシン、コルヒチン、BFA処理、RT-PCR、共焦点レーザー顕微鏡および電子顕微鏡を用いた。【結果と考察】(1)Myosin VIのKO mouseを購入し、その造血器分化機能を解析した。KO mouseにおいては、WTに比較し、赤芽球系、巨核球系の比率、分化の差異はみられなかった。しかし、骨髄球系・単球マクロファージ系においては、KO mouseにおいて、明らかな異形成が見られた。機能異常を伴うか否かについては、今後の課題となった。(2)多発性骨髄腫細胞の抗体分泌におけるmyosin VIの関わりの解析のために、非分泌型多発性骨髄腫患者由来のcell lineでの検討をおこなった。非分泌型においてのみmyosinVIが核の周辺に存在し、Rab8は細胞全体に瀰漫性に存在し、両者の共存はみられなかった。非分泌型ではmyosin VIとRab8の共存は阻害されていることが考えられた。非分泌型多発性骨髄腫患者4名の骨髄標本でも同様の染色様式を確認できた。(3)Myosin Xの免疫染色で、巨核球系細胞株(HEL, Meg-01)でTPA処理後のfilopodiaにおいてactinとの共染色がみられた。(4)我々はヒト血液細胞から3つの20-kDa light chainisoformを同定したが、MLC-2Cは、平滑筋miosinとhomologyが強く、Jurkat細胞(ATL cell line)に発現をみない。そこで、MLC-2C geneをJurkat細胞にtransfectionし、wild typeと形態、付着性および表面形質の差異を比較した。MLC-2C導入Jurkat細胞は付着性が0から23%に増加した。TPAでmonocyte/macrophageに分化させたHL60が付着性を持つことに似た現象であった。興味あることに、表面抗原であるCD3の発現陽性率が増加した。