hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
３次元外部領域における定常Ｎａｖｉｅｒ－Ｓｔｏｋｅｓ方程式の解の一意性について

私は昨年度に引き続き今年度も非圧縮粘性流体の運動を記述したナヴィエ・ストークス方程式の研究を行って以下のような研究成果を得、これを論文としてまとめて学術雑誌に投稿した。私は昨年度、信州大学の谷内教授とダルムシュタット工科大学のFarwig教授と共に外部領域における定常解の一意性を特別な場合として含むような3次元非有界領域での非定常ナヴィエ・ストークス方程式の解の一意性に関する論文を発表し、2つの解のうちの1つが(空間無限遠での最良減衰度1/|x|を捉えている)弱L_3空間で小さく、もう一方の解が弱L_3空間でプレコンパクトな軌道を持っていて更に若干の正則性を有するならば双方が一致することを示した。この結果において仮定したプレコンパクトな軌道を持つ解の典型例として時間周期解が挙げられるが、こうした性質を持つ解のクラスは時間周期解のクラスよりも大きく、またどのような条件のもとでプレコンパクトな軌道を持つ解が存在するのかも明らかではなかった。私は谷内教授とFarwig教授らとプレコンパクトな軌道を持つ解の存在に関して考察し、3次元全空間や半空間など幾つかの非有界領域において適当な関数空間でプレコンパクトな軌道をもつ小さい外力を与えたとき、L_3空間でプレコンパクトな軌道をもつ非定常解を構成した。この研究成果により、プレコンパクトな軌道を持つ解が存在するための十分条件が明らかになった。本研究課題の対象である3次元外部領域においては外部問題特有の困難の為にプレコンパクトな軌道をもつ解の存在を示すことができなかったが、これは今後の研究課題である。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は外部領域におけるNavier-Stokes方程式の解の一意性についての研究を行って2つの成果を得、それぞれを論文としてまとめて学術雑誌に投稿した。1つめの成果は空間3次元における時間周期解に代表されるような非定常解の一意性であり、信州大学の谷内氏とダルムシュタット工科大学のFarwig氏らとの共同研究によるものである。空間無限遠で最良減衰度1/|x|を有する2つの解が与えられたとき、1つの解だけが小さく他方の解が若干の正則性を持てば、双方が一致することを示した。定常解については既に研究代表者によってほとんど同様の一意性定理が示されているが、非定常解の一意性についての先行研究では追加的な正則性の仮定が2つの解に対し課されていたので、今年度得られた結果は定常問題についての結果を一般化し、かつ非定常問題の先行研究を改良したものとなっている。2つめの成果は空間2次元における定常解の一意性であり、Dirichlet積分有限なエネルギークラスの解が2つ与えられたとき、それらが共に弱い対称性を持ち、1つの解がエネルギー不等式を満たして他方の解が1/|x|程度で減衰する小さな解ならば、双方は一致することを示した。減衰する解はこれまでのところ対称性のもとでしか得られていないが、この結果においては解の減衰は保証するが可解性に関する先行研究で課されているよりも弱い対称性のもとで一意性を示すことが出来た。2次元定常外部問題では強い対称性を持つような与えられた2つの解が共に小さい場合の一意性しか先行研究では得られておらず、この成果によって一つの解のみが小さい場合の一意性定理が初めて示された。この結果の証明は3次元の場合にも有効であり、3次元定常外部問題について先行研究で得られている一意性定理の別証明を与えることもできる。今年度の研究成果である空間3次元における時間周期解に代表されるような非定常解の一意性は本研究課題の重要な発展課題であり、これを明らかにしたことは重要な成果である。

また、空間2次元における定常解の一意性は3次元の場合に比べて難しい問題であり、これを明らかに出来たこともまた重要な成果であると言える。本研究課題の解決方策として、Navier-Stokes方程式の与えられた2つの解の差が満たしている方程式に対応した双対方程式の解析にこれまで重点を置いてきたが、今後は別の方策にも力点を置く。具体的には、今年度の研究成果である非定常解の一意性の証明において用いた、与えられた解め1つが小さいならば他方の解もまた適当な意味で小さくなるという議論によって問題の解決を目指す。時間周期解など定常解よりも広いクラスの解に対しこのような主張が言えているので、特別な解と言える定常解に対してはより弱い仮定のもとで主張が成り立つと期待できる。解が小さい場合には方程式に与えられた外力も小さく、小さな外力に対応した解は適当な意味で小さくなることを示すのが自然な議論であると思われる。
枯草菌内で複数のσ因子の活性を調節する蛋白質複合体の機能解析

<背景と目的>:枯草菌内に8種あるRsbRパラログのうち、IspUとYojHの欠損がσ^H活性に負の影響を与えることを見出し、未解明のσ^H活性化機構への関与を示唆する結果を得た。また、細胞内でIspU、YojH、RsbRを含む複数の蛋白質が複合体を形成することを明らかにした。このことからRsbRパラログは複合体をなし、σ^Hとσ^Bを含む複数のσ因子の活性を調節する複合体を形成していると推察している。特にRsbRではT171、T205の2ヶ所でRsbTによるリン酸化を受け、σ^B活性化を抑制することが明らかとなっているので、パラログ複合体の活性そのものがリン酸化により制御されることが示唆される。本研究では、上記のモデルを検証するため、パラログ複合体下流のσ^B因子とσ^H因子に対する活性調節機構が独立したものかどうか明らかにする。さらに8種のパラログが実際に複合体を形成しているのか、またパラログ間でクロストークが存在するのか検討する。次に、IspUとYojHについてリン酸化の有無とその影響について検討する。さらにYqhA、YtvA、YetI及びYezBにより制御されるσ因子の同定を試み、最後にパラログ複合体の下流に位置して各σ因子の活性調節に関わる蛋白質を同定する。<検討結果及び考察>IspU、YojHではRsbRのリン酸化部位であるThr残基が保存されている。そこでRsbRのT205残基に対応するIspU、YojHのアミノ酸(共にT220)を、リン酸化状態をmimicする目的でAspに置換した変異株を作製し、σ^H依存のkinA-lacZ発現に与える影響を調べた。その結果、いずれの変異もkinA-lacZ発現を大きく上昇させ、特にIspU T220D変異では野生株の約4倍にまで上昇させることが明らかになった。これに対してRsbR T205D変異株を構築したところ、kinA-lacZ発現に対しては大きな影響を与えなかった。以上のことより、IspUとYojHは実際にσ^H活性の調節に関わることが明らかになり、またRsbRはσ^H活性の調節には何ら影響を与えないことが示された。
ヒストン脱アセチル化阻害剤を用いた細胞工学的手法による新規骨造成法

本研究は細胞工学的手法を用いた治療技術の確立を目的としており、この細胞処理および処理細胞の解析が重要となる。本年度はラット骨髄より未分化間葉細胞を採取、培養そのほかラット骨膜、ヒト及びラット歯根膜、歯髄、歯根端部未分化細胞を採取培養しヒストン脱アセチル化阻害剤(HDACI)処理系と非処理系について、HDACIに対する反応性、分化誘導に対する反応性について検討し、現在も進行中である。ヒストン脱アセチル化阻害剤(HDACI)として使用しているTrichostatine A,Valproic acid,Sodium Butyrateはそれぞれ至適濃度が異なり、過剰な投与は細胞毒性を示すことが判明し、細胞別に反応性も異なっている。HDACIにより骨形成性細胞のALP活性は上昇することが判明したが、HDACIの種類による作用期間や作用濃度によりALP活性の上昇と組織中蛋白量の減少が観察され、HDACIによって細胞単位でのALP活性が上昇しているのか、細胞集団中のALP賛成細胞数が上昇しているのかについては今後解明していく必要がある。今後遺伝子発現の変化や実験動物への投与実験を行っていく予定である本研究は細胞工学的手法を用いた治療技術の確立を目的としており、この細胞処理および処理細胞の解析が重要となる。今後遺伝子発現の変化や実験動物への投与実験を行っていく予定である
含窒素多環芳香族化合物の代謝の分子機構と構造活性相関

【目的】芳香族化合物は、一般に酸化的代謝を受けて解毒されるが、その際にある種のアレンオキシドが生成すると遺伝子を傷害し発癌に至る。しかし多くの医薬品や環境物質の構成分子である、窒素などを含む複素環芳香族化合物の代謝については系統的な知見は殆ど得られていない。そこで我々は、キノリンを基本骨格とするモデル化合物を選び、含窒素芳香族化合物の代謝的活性化の構造活性相関の検討を行い、その遺伝子傷害の分子機構を明らかにする事を目的として研究を開始した。本研究から期待される成果は、(1)環境物質や医薬品の基本骨格の一つである含窒素芳香族化合物の代謝的活性化、あるいは解毒機構の解明に手掛かりを与える、(2)代謝様式の構造依存性を明らかにする事によって、逆に、適当な構造修飾によって毒性発現を防止したり、薬物の代謝的排せつを遅らせ、薬物効果の持続性を高める事などが期待される。さらに本研究の後半においては、含酸素芳香族化合物であり、生物活性を有するリグニン類の代謝を含む体内動態についても検討を行った。【結果】1.発癌性を有するキノリン誘導体をモデル化合物として、その代謝に及ぼす種々の置換基の効果を検討した。キノリンの主代謝経路は、5,6ーエポキシド経由、あるいはNーオキシド経由でありこれらの経路はいずれも解毒機構である。これは、Jerinaらが提唱する機構と一致する。一方、我々は、発癌活性体への代謝は、ピリジン部の1,4位へ水が付加した後に生成する2,3ーエポキシド体を経由する事を提唱した。これらの作業仮説に立つと、2ー位あるいは3ー位にハロゲン原子が導入されるとその遺伝毒性を失う事が期待される。F,Cl,Br置換体を合成しその変異原性を検討した所、期待どうり全く変異原性を示さなかった。2ー位、3ー位以外の位置にハロゲン原子を導入しても遺伝毒性の消失は見られない。一方、メチル基を導入した場合には、2ー位、3ー位を含めて全べての位置異性体に変異原性が認められた。これらの知見は、発癌活性化機構として我々が提唱した2,3ーエポキシド説を強く支持するものである。更に、3ーFー置換体の解毒代謝はキノリンと同様に進行し、強い細胞毒性を示さなかった事は、適当な位置にF原子を導入する事により有用芳香族化合物の遺伝毒性を除去できる可能性を示唆するものである。本研究で提唱した代謝的活性化機構は、含窒素芳香族化合物の発癌活性化機構において一般性のある重要な仮説であり、Jerinaらのbayーregion説に加えて、今後、普遍的な法則(エナミンオキシド仮説)へと展開される事が期待される。Jerina、Yagiとの研究討論は極めて有効であったし、今後の共同研究を通じ更に大きな成果が得られるものと期待している。2.我々は、酸素を含む複素環芳香族化合物の一種である天然あるいは合成リグニン類に抗ウイルス性、抗菌性、及び免疫賦活化能のある事を見出だした。そこで、本研究の延長線の一端として、当該リグニン類の代謝を含む体内動態についての検討を、本研究分担者であるNonoyamaらと協力して研究を展開した。木質化植物の熱水、あるいはアルカリ抽出液から得られる高分子分画に上記生物活性が認められ、更に、パルプ産業廃棄物としてのリグニンにも一部の活性があり、また、phenylpropenic acids(合成リグニン)の化学的重合体にも同様の活性が認められた。抗ウイルス活性は、リグニン骨格構造に基ずく事を明らかにし、一方、抗菌活性は寄主仲介性であり、寄主の免疫能が増強される事による事を明らかにした。抗菌活性は、リグニン構造のみならず、その骨格に結合するヘミセルロ-ズ部分も活性発現に必要である。病原性細菌をマウスに移植する2日前に、当該リグニン類を投与して置くと、発病が完全に予防できた。投与法は、静脈、皮下などが有効で、経口投与では減弱した。これは、当該リグニン類が高分子である為、消化管からの吸収が充分でなかったためと考えられる。吸収された当該リグニン類は、一過性に、肝臓、じん臓に貯留され、大部分は、尿中より排せつされる。今後、木質化分子の医薬品開発への応用研究が期待される。【結果】

1.発癌性を有するキノリン誘導体をモデル化合物として、その代謝に及ぼす種々の置換基の効果を検討した。キノリンの主代謝経路は、5,6ーエポキシド経由、あるいはNーオキシド経由でありこれらの経路はいずれも解毒機構である。これは、Jerinaらが提唱する機構と一致する。一方、我々は、発癌活性体への代謝は、ピリジン部の1,4位へ水が付加した後に生成する2,3ーエポキシド体を経由する事を提唱した。これらの作業仮説に立つと、2ー位あるいは3ー位にハロゲン原子が導入されるとその遺伝毒性を失う事が期待される。F,Cl,Br置換体を合成しその変異原性を検討した所、期待どうり全く変異原性を示さなかった。2ー位、3ー位以外の位置にハロゲン原子を導入しても遺伝毒性の消失は見られない。一方、メチル基を導入した場合には、2ー位、3ー位を含めて全べての位置異性体に変異原性が認められた。これらの知見は、発癌活性化機構として我々が提唱した2,3ーエポキシド説を強く支持するものである。更に、3ーFー置換体の解毒代謝はキノリンと同様に進行し、強い細胞毒性を示さなかった事は、適当な位置にF原子を導入する事により有用芳香族化合物の遺伝毒性を除去できる可能性を示唆するものである。本研究で提唱した代謝的活性化機構は、含窒素芳香族化合物の発癌活性化機構において一般性のある重要な仮説であり、Jerinaらのbayーregion説に加えて、今後、普遍的な法則(エナミンオキシド仮説)へと展開される事が期待される。Jerina、Yagiとの研究討論は極めて有効であったし、今後の共同研究を通じ更に大きな成果が得られるものと期待している。2.我々は、酸素を含む複素環芳香族化合物の一種である天然あるいは合成リグニン類に抗ウイルス性、抗菌性、及び免疫賦活化能のある事を見出だした。そこで、本研究の延長線の一端として、当該リグニン類の代謝を含む体内動態についての検討を、本研究分担者であるNonoyamaらと協力して研究を展開した。木質化植物の熱水、あるいはアルカリ抽出液から得られる高分子分画に上記生物活性が認められ、更に、パルプ産業廃棄物としてのリグニンにも一部の活性があり、また、phenylpropenic acids(合成リグニン)の化学的重合体にも同様の活性が認められた。抗ウイルス活性は、リグニン骨格構造に基ずく事を明らかにし、一方、抗菌活性は寄主仲介性であり、寄主の免疫能が増強される事による事を明らかにした。抗菌活性は、リグニン構造のみならず、その骨格に結合するヘミセルロ-ズ部分も活性発現に必要である。病原性細菌をマウスに移植する2日前に、当該リグニン類を投与して置くと、発病が完全に予防できた。投与法は、静脈、皮下などが有効で、経口投与では減弱した。これは、当該リグニン類が高分子である為、消化管からの吸収が充分でなかったためと考えられる。吸収された当該リグニン類は、一過性に、肝臓、じん臓に貯留され、大部分は、尿中より排せつされる。今後、木質化分子の医薬品開発への応用研究が期待される。
ヒト線維芽細胞の延命・不死化に関わる細胞遺伝子のクローニング

ヒト正常細胞は細胞分裂の可能回数に有限の限界があるが、典型的なガン細胞はこの性質を失って無限に増殖する能力を獲得している。正常細胞の分裂寿命の表現は細胞老化とも称される。本研究の目的は、正常細胞の分裂寿命の限界期において細胞の増殖を停止させるように働いている遺伝子をクローニングし、その機能的役割を明らかにすることにある。従来の同様な試みにおける問題点をのりこえるためにサブトラクションcDNAライブラリーを新たに工夫調製し、老化細胞で発現が上昇する9クローンを得た。塩基配列を決定した結果、4クローンは従来報告されていないものであった。他の4クローンは既知遺伝子と相同性の高いものであった。さらに1クローンはインターフェロン(IFN)誘導遺伝子6-16と同一の配列を含んでいた。IFNは細胞増殖抑制活性をも有することが知られているが、分裂寿命との関係は全く報告されていなかったので、まずこの点について注目し、本研究で以下のことを明らかにした。正常細胞・トランスフォーム細胞を問わず、IFNによって誘導される3種類の遺伝子は、いずれも分裂寿命の限界に近づくと急激に発現が上昇した。これは異なった3種類の細胞株で認められ、一般的な現象と思われた。延命期の細胞は明らかに増殖抑制活性のある因子を培地中へ放出していた。培地中のIFNをアッセイしたところ、IFN-βが検出された。しかし、IFN-αとIFN-γは検出されなかった。若い細胞にIFN-βを投与すると、IFN誘導遺伝子が発現し、細胞増殖が阻害された。一方、老化細胞や延命細胞に抗IFN-β抗体を処理すると、高い発現をしていたIFN誘導遺伝子の発現が顕著に抑制された。また、老化期に近くなり、増殖速度の低下した正常細胞にたいして抗IFN-β抗体を処理すると、増殖が促進される傾向を示した。以上の結果を総合すると、分裂寿命の末期に近づくに従って、IFN-βの発現・分泌が上昇し、その結果IFN-β誘導遺伝子の発現が上昇し、細胞増殖が抑制されるものと考えられる。分裂寿命の末期になぜIFN-βの発現が昂進するかが次のプロジェクトとなるであろう。ヒト正常細胞に顕著に見られる細胞老化(分裂寿命)に関わる細胞遺伝子をクローニングするため、SV40のT抗原遺伝子でトランスホームした線維芽細胞株を樹立し、分裂寿命を越えて延命中の細胞に由来するcDNAを作成し、これを若いトランスホーム細胞由来のcDNAで差し引いて、サブトラクションライブラリーを作成した。若い細胞と延命細胞の各々のcDNAをプローブとして数回のスクリーニングを行い、延命細胞に特異的に発現の見られるcDNAをクローニングした。各クローンについて塩基配列を決定し、データバンクの配列と照合した。配列が既に登録されていたクローンはインターフェロン(IFN)誘導遺伝子であったので、老化・延命細胞における他のIFN誘導遺伝子の発現についても調べたところ、いずれも若い細胞に比べて発現が上昇していることが解った。若い細胞にIFNを処理すると増殖誘導が抑制された。以上の結果は、老化細胞が増殖できなくなる原因の少なくともひとつは、IFN誘導遺伝子の発現が高まることに起因することを示唆する。この場合でも、T抗原を有するトランスホーム細胞は、T抗原の働きによってさらに増殖を続ける(延命)ものと考えられる。

次の問題は、老化細胞でIFN誘導遺伝子の発現が高まることの原因であるが、これは次年度に継続して解析する予定である。一方、データバンクに未登録の配列をもつcDNAもクローニングされた。これらについては、現在、cDNAライブラリーから全長のcDNAを得ることを急いでおり、得られ次第、全塩基配列を決定する予定である。これを若い細胞に導入し、細胞増殖抑制効果を持つか否かなどを次年度で継続する予定である。以上、本研究課題については、順調に初期の目的を達成し、次年度は更にこれを継続して解析する見通しが明かになった。以上の成果は、現在、論文としてまとめているところである。ヒト正常細胞は細胞分裂の可能回数に有限の限界があるが、典型的なガン細胞はこの性質を失って無限に増殖する能力を獲得している。正常細胞の分裂寿命の表現は細胞老化とも称される。本研究の目的は、正常細胞の分裂寿命の限界期において細胞の増殖を停止させるように働いている遺伝子をクローニングし、その機能的役割を明らかにすることにある。前年度の研究では主にサブトラクションcDNAライブラリーからのクローニングに力をそそぎ、得られた遺伝子(cDNA)の塩基配列決定と、遺伝子バンク情報との照合の結果、インターフェロン(IFN)誘導遺伝子とホモロジーが高いクローンがあったことに注目した。IFNは細胞増殖抑制活性をも有することが知られているが、分裂寿命との関係は全く報告されていなかったので、その点について注目し、本研究で以下のことを明らかにした。まず、得られたIFN誘導遺伝子6-16の全長cDNAをクローニングして全配列を決定した。正常細胞・トランスフォーム細胞を問わず、IFNによって誘導される3種類の遺伝子は、いずれも分裂寿命の限界に近づくと急激に発現が上昇した。これは異なった3種類の細胞株で認められ、一般的な現象と思われた。延命期の細胞は明らかに増殖抑制活性のある因子を培地中へ放出していた。培地中のIFNをアッセイしたところ、IFN-βが検出された。しかし、IFN-αとIFN-γは検出されなかった。若い細胞にIFN-βを投与すると、IFN誘導遺伝子が発現し、細胞増殖が阻害された。一方、老化細胞や延命細胞に抗IFN-β抗体を処理すると、高い発現をしていたIFN誘導遺伝子の発現が顕著に抑制された。また、老化期に近くなり、増殖速度の低下した正常細胞にたいして抗IFN-β抗体を処理すると、増殖が促進される傾向を示した。以上の結果を総合すると、分裂寿命の末期に近づくに従って、IFN-βの発現・分泌が上昇し、その結果IFN-β誘導遺伝子の発現が上昇し、細胞増殖が抑制されるものと考えられる。分裂寿命の末期になぜIFN-βの発現が昴進するかが次のプロジェクトとなるであろう。
細菌から探る, コミュニケーションの地理的な系統と推移

多くの細菌は低分子化合物を用いてお互いにコミュニケーションをとっている。ヒトを含めた多くの生物は同種であっても用いる"言語"が生息地域によって変化している。しかしながら、細菌におけるコミュニケーション能力が環境に応じてどのように変化するのかについては明らかになっていない。我々は,河川から外洋まで広範囲に渡って単離された緑膿菌を用いたところ,シグナル物質産生量,及びシグナル応答性が異なることが明らかにした。興味深いことに外洋から単離された株は,シグナル物質産生量,あるいはシグナル応答性が著しく低下しており、遺伝子変異によるものであることを明らかにした。今年度はこの遺伝子変異について詳細に解析したところ、細菌間コミュニケーションに関わる遺伝子にある配列が挿入されることによって、変異が入ることが明らかになった。培養を続けていくと、挿入配列がターゲット遺伝子から抜けたり、挿入されたりしており、その可動性を保持していることが明らかとなった。ゲノム解析の結果から同様の挿入配列がいくつかゲノム上に存在することも明らかにしている。さらに、近年細菌間コミュニケーションへの関与が明らかとなっている、メンブレンベシクルについて、解析すると、各単離株でのベシクル生産能は違っていた。メンブレンベシクルは遺伝子の水平伝播を仲介することが分かっているが、本メンブレンベシクルにも可動性因子DNAが含まれており、メンブレンベシクルを介して、細胞間で可動性因子が伝播している可能性も示唆された。今後は、可動性因子である挿入配列の制御を明らかにすることで、細菌間コミュニケーションの環境適応を明らかにしていく。環境単離株における細菌間コミュニケーションの地理的な変遷についての知見が得られており、そのメカニズムにも迫る成果が得られている。これまでに同定した、挿入配列についてその可動性を検証し、細菌間コミュニケーションへの関与を明らかにしていく。多くの細菌で低分子化合物を言葉の代わりに用いて,お互いに情報交換して遺伝子発現を調節し,集団行動を統制していることが知られている。しかしながら,異なる環境中に生息する細菌が同じ言語能力を持つのかどうか分かっていない。同種においても,それぞれの環境に適した情報交換能力を独自に発達させ,調節される遺伝子群も変化している可能性がある。本研究では異なる水環境中から単離された緑膿菌を用いて,その言語能力(シグナル物質産生・認識・応答性)の違いを明らかにし,系統地理学的解析により,同種内でコミュニケーションがどのように変化して環境への適応に貢献しているのか解析する。本年度は,河川から外洋まで広範囲に渡って単離された緑膿菌23株について,そのシグナル物質生産性及び応答性について解析した。シグナル物質生産性はシグナル物質の定量やシグナル物質に応答する指示菌体を作製することで解析した。また,シグナル応答性は外部からシグナル物質を添加して,シグナル物質制御下の表現型を観察することで評価した。その結果,緑膿菌は単離された環境によって,シグナル物質生産性及び応答性が異なっていることが明らかとなった。これらの違いは,株が単離された環境,つまりは生息環境と相関があり,外洋ほど,シグナル生産性が低下する傾向が観察された。以上の結果から,同種においても環境に応じて情報交換能力に違いが表れることが示された。今後はシグナル物質生産や応答に関する遺伝子の配列情報を中心に解析することで,情報交換能力の違いが何に起因するかについて,その遺伝的な背景を明らかにしていく。本年度は予定通り,得られた環境単離株についてそのシグナル生産性および応答性を解析した。その成果により,環境によって,シグナル生産性および応答性が変化していることが明らかになり,細菌の情報交換能力の系統地理学的な解析を今後進めていく上で興味深い結果が得られた。多くの細菌は言語の代わりに低分子化合物を用いてお互いにコミュニケーションをとって,集団の行動を統制している。このようなコミュニケーション能力が環境に応じてどのように変化するのかについては明らかになっていない。我々は,緑膿菌を用いた研究により,生息環境によって,細菌間コミュニケーション能が異なることがわかってきた。河川から外洋まで広範囲に渡って単離された緑膿菌を用いたところ,シグナル物質産生量,及びシグナル応答性が異なることが明らかとなった。特に,外洋から単離された株は,シグナル物質産生量,あるいはシグナル応答性が著しく低下していた。それぞれに関わる遺伝子の配列を調べたところ,変異が入っていることが明らかとなった。株によって変異の入り方も異なっており,異なる機構に変異が依存していることが示された。興味深いことに,単離株をある条件で培養すると,変異から復帰し,細菌間コミュニケーションを行えるようになる細胞が出現することが明らかとなった。これらの結果は,生育環境に応じて緑膿菌の細菌間コミュニケーションのON/OFFが遺伝子レベルで切り替えられることを示唆している。本成果は地理的な条件と細菌間コミュニケーション能力が異なることを示しており,環境に応じてコミュニケーションがどのように変遷したのかについての基礎的な知見が得られた。メンブレンベシクル(MV)の細菌間コミュニケーションへの関与も明らかとなったため,各環境単離株のMV形成能とシグナル分子の伝達についても今後は解析していく。細菌間コミュニケーションの変異株は臨床現場でも頻繁に単離されており,その背後にあるメカニズムの解明にも繋がることが期待される。緑膿菌の環境単離株を解析し,シグナル物質産生量,及びシグナル応答性が異なることが明らかとなった。さらに,それらに関わる遺伝子の配列を解析することで,変異の種類が明らかになった。

これを詳細に解析することによって,変異のメカニズムを今後解明できることが期待される。多くの細菌は低分子化合物を用いてお互いにコミュニケーションをとっている。ヒトを含めた多くの生物は同種であっても用いる"言語"が生息地域によって変化している。しかしながら、細菌におけるコミュニケーション能力が環境に応じてどのように変化するのかについては明らかになっていない。我々は,河川から外洋まで広範囲に渡って単離された緑膿菌を用いたところ,シグナル物質産生量,及びシグナル応答性が異なることが明らかにした。興味深いことに外洋から単離された株は,シグナル物質産生量,あるいはシグナル応答性が著しく低下しており、遺伝子変異によるものであることを明らかにした。今年度はこの遺伝子変異について詳細に解析したところ、細菌間コミュニケーションに関わる遺伝子にある配列が挿入されることによって、変異が入ることが明らかになった。培養を続けていくと、挿入配列がターゲット遺伝子から抜けたり、挿入されたりしており、その可動性を保持していることが明らかとなった。ゲノム解析の結果から同様の挿入配列がいくつかゲノム上に存在することも明らかにしている。さらに、近年細菌間コミュニケーションへの関与が明らかとなっている、メンブレンベシクルについて、解析すると、各単離株でのベシクル生産能は違っていた。メンブレンベシクルは遺伝子の水平伝播を仲介することが分かっているが、本メンブレンベシクルにも可動性因子DNAが含まれており、メンブレンベシクルを介して、細胞間で可動性因子が伝播している可能性も示唆された。今後は、可動性因子である挿入配列の制御を明らかにすることで、細菌間コミュニケーションの環境適応を明らかにしていく。環境単離株における細菌間コミュニケーションの地理的な変遷についての知見が得られており、そのメカニズムにも迫る成果が得られている。今後は緑膿菌の情報交換能力がどのようにして変化したのかを解明するために,遺伝子配列情報を明らかしてその遺伝的な背景を解析していく。特に情報交換能力に関わることが報告されている遺伝子を中心に解析し,株間で比較する。さらにその違いがどのような機構によって生じるのかについて配列情報をもとに仮説を立てて検証していく。シグナル物質産生量,及びシグナル応答性に関わる遺伝子に入っている変異の特徴が明らかになったので,その知見を基盤にして,変異が入るメカニズムについて,分子生物学的,及び生態的な解析を行っていく。さらに,シグナル分子の伝達性に着目した解析も行う。これまでに同定した、挿入配列についてその可動性を検証し、細菌間コミュニケーションへの関与を明らかにしていく。これまで研究が順調に進み、細菌間コミュニケーションの新たな制御メカニズムが明らかになってきた。本事業は2018年度で終了の予定だったが、その成果のインパクトを考慮し、詳細なメカニズムを解析してまとめ上げるために、補助事業期間の延長をし、承認された。
新規腎不全モデルラットを用いた腎疾患における小胞体ストレスの病因論解明

腎特異的セリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)、メグシンの高発現ラットは腎不全を伴う腎セルピノパシー(セルピンが細胞内に重合・蓄積することによる疾患)を呈する。本研究では、メグシン高発現ラット腎障害の解析を通じて、腎セルピノパシー、特に小胞体機能異常(小胞体ストレス)の病態生理学的意義を解明し、腎不全における新しい病因論提唱の可能性を検討した。早期腎機能低下と重篤な蛋白尿を呈するメグシン高発現ラットでは、1)過剰発現メグシンが腎細胞内小胞体の形態・機能異常、ひいては小胞体ストレスを引き起こす、2)その回避機構として、小胞体ストレス応答性シャペロン分子、細胞死誘導分子などの発現誘導が生じることを明らかにした。よって、メグシン高発現ラットは重度の小胞体機能障害を伴う新規腎不全モデル動物と考えられる。次いで、各種腎疾患モデルラットを用いて、各種腎疾患における小胞体ストレスの関与、ひいては腎疾患における小胞体ストレスの病態生理学的意義を網羅的に解析した。その結果、1)糸球体腎炎(Thy-1腎炎)、ネフローゼ(PAN腎症)、進行性糖尿病性腎症(高血圧を伴う:SHR/nd)モデルにおいて、病変部(主に糸球体足細胞や尿細管上皮細胞)に小胞体ストレスが誘導される、2)急性腎不全モデルでは、虚血時に尿細管上皮細胞において恒常的に発現しているシャペロン分子の発現レベルが一過性に低下する、3)小胞体ストレスを軽度に惹起しておくと、糸球体腎炎や急性腎不全の病態形成や腎機能障害が軽減する、などが明らかにされた。以上、各種腎病変部で小胞体ストレスが誘導され、病態形成に関与すること、小胞体ストレスを軽減することで病態の一部が改善することが示された。これらの事実から、小胞体ストレスは新しい腎病因論、ひいては新しい腎疾患治療概念であることが示唆された。我々はこれまでに、腎臓特異的メグシンセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)として、メサンギウム細胞に高発現する新規セルピンである"メグシン"を単離同定し、その分子機能解析に関する研究を積極的に遂行してきた。その中でメグシン高発現ラットが腎不全を伴う腎セルピノパシー(セルピンが細胞内に重合・蓄積することで生じる疾患)を呈することを示してきた。メグシン高発現ラットは、早期に腎機能低下と重篤な蛋白尿を呈する。その機序解明を経時的腎病理解析、血液・尿生化学、電子顕微鏡解析、メグシン抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析などを用いて行ったところ、過剰発現メグシンが腎細胞内小胞体の形態・機能異常を引き起こすため生じる事が明らかにされた。さらに、過剰発現メグシンが腎臓細胞の小胞体内腔に蓄積し、小胞体構造異常(小胞体ストレス)を引き起こす際に、回避機構の一端として、小胞体ストレス応答性シャペロン分子(ORP150,GRP78/94)、細胞死誘導分子(caspase12)などの発現誘導が生じることを明らかにした。また、セルピノパシーにおける小胞体ストレス応答性は臓器によって著しく異なり、腎臓、膵臓、脳は高い感受性を示しメグシン高発現ラットで各臓器障害(腎機能低下、高血糖、脳機能障害)を呈したのに対し、心臓、肺などはメグシンを高発現しているにも関わらず、臓器障害や小胞体ストレスをまったく認めなかった。

以上、メグシン高発現ラットは重度の小胞体機能障害を伴う新規腎不全モデル動物と考えられる。我々は昨年度までに、腎臓特異的メグシンセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)であるメグシンを高発現させたラットが、腎不全を伴う腎セルピノパシー(セルピンが細胞内に重合・蓄積することで生じる疾患で、conformational diseaseの一つ)を呈すること明らかにし、その病態に小胞体機能障害(小胞体ストレス)が関与することを明らかにした。そこで本年度は、代表的腎疾患モデルラット(糖尿病性腎症、糸球体腎炎、ネフローゼ、高血圧性腎症、急性腎不全、慢性腎不全)を用いて、各種腎疾患における小胞体ストレスの関与、ひいては腎疾患における小胞体ストレスの病態生理学的意義を網羅的に解析した。その結果、1)糸球体腎炎(Thy-1腎炎)、ネフローゼ(PAN腎症)、進行性糖尿病性腎症(高血圧を伴う:SHR/nd)モデルにおいて、病変部(主に糸球体足細胞や尿細管上皮細胞)に小胞体ストレスが誘導(小胞体ストレス応答性シャペロンGRP78,ORP150の発現亢進)されること、2)急性腎不全モデルでは、虚血時に尿細管上皮細胞において恒常的に発現しているGRP78の発現レベルが一過性に低下すること、3)高血圧性腎症(アンギオテンシンII持続投与)や慢性腎不全(5/6腎摘)モデルでは有意な小胞体ストレスの亢進を認めないこと、4)糸球体腎炎(Thy-1腎炎)や急性腎不全(虚血再灌流)誘導前に、小胞体ストレスを軽度に惹起(0.3mg/Kgツニカマイシン前処理)しておくと、病態形成、並びに腎機能障害が著しく軽減すること、などを明らかにした。以上、各種腎疾患においてその病変部で小胞体機能異常(小胞体ストレス)が誘導され、病態形成に関与すること、小胞体ストレスを軽減することで病態の一部が改善することが示された。これらの事実から、小胞体ストレスは新しい腎病因論、ひいては新しい腎疾患治療概念であることが示唆された。
血小板凝集時に放出されるSDFー1による骨髄細胞動員増強作用と臓器線維化の誘導

マウス背部皮下にマトリゲルを接種し、必要に応じてbFGFを混入させることで、肉芽組織の増殖を促し、線維化が進行するか否か検討を加えた。このモデルでは、2週間にわたって血管新生(肉芽組織内ヘモグロビン濃度、CD31発現量で評価)が進行した。その後、4週まで同程度のレベルを保ったあとで、8週目で急激に低下した。肉芽組織内のコラーゲン量を線維化の指標として測定すると、2週目までに急激に増加し以後高値を8週目まで示した。肉芽内には好中球はほとんど存在せず、主要細胞成分はMac-1陽性のマクロファージとMac-1/CD3double negativeのfibroblast様細胞であった。後者の中にはCD34陽性の骨髄から動員されたfibrocyte様の細胞が多くを占め、骨髄機能が重要な血管新生、線維化の制御要因であることが推定された。PGE2の作用に加え、さらに血小板でのトロンボキサン(thromboxane)の役割を解析するために、マトリゲルモデルマウスにOKYO46(トロンボキサン合成酵素阻害薬)あるいはS-146(トロンボキサン受容体TP拮抗薬)を連日投与し、血管新生、線維化を評価した。肉芽組織を4%PFAで固定し、パラフィン抱埋し、組織切片標本を作成、線維芽細胞をVimentin抗体、S100抗体で免疫染色して同定すると、TPシグナリングが血管新生、線維化を増強していることが判明した。コラーゲン沈着量も同様にTPシグナリングが増強していることが判明した。同組織内のSDF-1およびVEGF-AをELISAで測定すると、TPシグナリングを阻害することにより、低下することが判明した。生体顕微鏡下で新生血管床に接着する血小板を調べると、TPシグナリングにより接着が増強していることが判明した。我々の既報に従いトロンボキサン合成酵素を過剰発現するfibroblastを作成し、ゲル局所に投与すると血管新生、線維化が増強することが判明した。(713字)8週令の雄性C57B16マウス背部皮下にウレタン製のスポンジを移植し、経時的に血管新生をCD31発現量とヘモグロビン組織内濃度で、線維化をコラーゲンの肉芽組織内濃度で評価した。血管新生は2週まで増加しその後4週まで同程度の値を保った後に、8週までに急激に減少した。一方、コラーゲンは2週までに急増した後に、ほぼ8週間の観察期間中、プラトーを示し、血管新生と異なる推移を示した。肉芽内の細胞はマクロファージ様、線維芽細胞様の細胞が主体で、好中球等の顆粒球はほとんど認めなかった。FibrocyteのマーカーであるCD34を免疫組織化学で染色したところ、肉芽組織中に2週目から出現し、高い頻度を維持していた。Real time PCRでもCD34mRNAが2週目から高値を示すようになり、以後でも高値を持続した。対照的に血管新生増強因子のVEGF-Aは、スポンジ移植後1-2週の早期の間に高値を示すのみにとどまり、以後は急激に減少していった。TGFβのmRNAレベルは、スポンジ移植後3週以降で高値を示すことが判明した。以上のように、線維化と血管新生の時間経過は異なり、CD34陽性のFibrocyte様の細胞がスポンジ肉芽組織に動員されてくることが判明した。線維化と血管新生のスイッチングがこのモデルで起きていること、VEGFの減少とCD34陽性のFibrocyte様の細胞の動員が、キーとなることが推定される。今後は、いくつかの液性因子に焦点を当て、線維化と血管新生のスイッチングの制御系を解明していきたい。マウスの背部皮下にウレタン製スポンジを植えるスポンジモデルでは、2週間にわたって血管新生(肉芽組織内ヘモグロビン濃度、CD31発現量で評価)が進行した。肉芽組織内のコラーゲン量を線維化の指標として測定すると、2週目までに急激に増加し、以後高値を8週目まで示した。本年度は、さらに血小板でのトロンボキサン(thromboxane)の役割を解析するために、スポンジ移植モデルにOKYO46(トロンボキサン合成酵素阻害薬)あるいはS-146(トロンボキサン受容体TP拮抗薬)を連日投与し、血管新生、線維化を評価した。

我々の既報に従いトロンボキサン合成酵素を過剰発現するfibroblastを作成し、スポンジ局所に投与すると血管新生、線維化が増強することが判明した。マウス背部皮下にマトリゲルを接種し、必要に応じてbFGFを混入させることで、肉芽組織の増殖を促し、線維化が進行するか否か検討を加えた。このモデルでは、2週間にわたって血管新生(肉芽組織内ヘモグロビン濃度、CD31発現量で評価)が進行した。その後、4週まで同程度のレベルを保ったあとで、8週目で急激に低下した。肉芽組織内のコラーゲン量を線維化の指標として測定すると、2週目までに急激に増加し以後高値を8週目まで示した。肉芽内には好中球はほとんど存在せず、主要細胞成分はMac-1陽性のマクロファージとMac-1/CD3double negativeのfibroblast様細胞であった。後者の中にはCD34陽性の骨髄から動員されたfibrocyte様の細胞が多くを占め、骨髄機能が重要な血管新生、線維化の制御要因であることが推定された。PGE2の作用に加え、さらに血小板でのトロンボキサン(thromboxane)の役割を解析するために、マトリゲルモデルマウスにOKYO46(トロンボキサン合成酵素阻害薬)あるいはS-146(トロンボキサン受容体TP拮抗薬)を連日投与し、血管新生、線維化を評価した。肉芽組織を4%PFAで固定し、パラフィン抱埋し、組織切片標本を作成、線維芽細胞をVimentin抗体、S100抗体で免疫染色して同定すると、TPシグナリングが血管新生、線維化を増強していることが判明した。コラーゲン沈着量も同様にTPシグナリングが増強していることが判明した。同組織内のSDF-1およびVEGF-AをELISAで測定すると、TPシグナリングを阻害することにより、低下することが判明した。生体顕微鏡下で新生血管床に接着する血小板を調べると、TPシグナリングにより接着が増強していることが判明した。我々の既報に従いトロンボキサン合成酵素を過剰発現するfibroblastを作成し、ゲル局所に投与すると血管新生、線維化が増強することが判明した。(713字)
顧客関係性の評価と戦略的管理の方法についての研究

顧客関係性を会計情報として可視化して評価することと、可視化された情報の戦略的利用・管理可能性について明らかにすることを目的としている。具体的には「課題1:小売業における顧客関係性の評価と戦略」「課題2:企業間関係における顧客関係性が企業価値・コスト構造に与える影響」についてそれぞれ分析を行った。課題1については、先行研究のサーベイとアンケート調査を実施し、顧客関係性はロイヤリティプログラムによって一定の可視化がされているものの、戦略的利用には至っていないことが明らかになった。課題2については、顧客関係性よりも戦略やライフサイクルが企業価値やコスト構造に与える影響が大きいことが明らかになった。課題1:小売業における顧客関係性の評価と戦略的管理の利用可能性本テーマでは、顧客関係性を構築・維持するツールとして考えられているロイヤリティプログラムがうまくその機能を果たしているか、またそれらはどのように管理・評価されているか、予算や業績評価との結びつきはどうなっているか、ということを明らかにするものである。5年前にロイヤリティプログラムと値引きについては日本の小売業者を対象として調査したが、それからロイヤリティプログラム、とくにポイント制は大きく変化した。また、統合されたプログラムもあり、顧客関係性の管理について、日本の小売業者に新たに問い、その管理可能性について考える。そこで、2013年度は、ロイヤリティプログラムの使用状況に関する実態調査と、管理会計との結びつき(予算・業績評価)についての質問票を作成した。質問票の作成・実施については、2014年度4月に行った。2014年5月現在、回収と集計作業を行っている。成果は夏以降順次公表していく。課題2:企業間関係における顧客関係性が企業価値・コスト構造に与える影響2012年度に引き続き、コスト構造が企業業績に与える影響について調べた。企業の戦略(コスト戦略、差別化戦略)とライフサイクルがコスト構造に与える影響を調査することで、顧客関係性と企業価値、コスト構造に与える影響についても分かるのではないか、と考えたからである。日本企業の財務データを使用して分析した結果、企業のライフサイクルがコスト構造、特に下方硬直性に大きな影響を与えることが分かった。課題1:小売業における顧客関係性の評価と戦略的管理の利用可能性2012年度は日本の全小売業を対象にアンケート調査を行う予定であったが、東日本大震災の影響がまだ残っていること、私鉄交通のポイント付き電子マネーが共通化することなどから、1年先送りすることとなった。一方で、東日本大震災で被災した企業の復興状況について、被災地宮城県を中心として聞き取り調査を行った。アンケートの対象となる小売業の状況については、仙台商工会議所などから被災状況を聞くことができたが、沿岸部ではまだ仮設店舗での営業をしているところが大半であることがわかった。東日本大震災においてはポイント付き電子マネーはほとんど役に立たず、キャッシュが顧客にとっても小売業者にとっても重要であったことが判明し、被災企業の聞き取り調査が2013年度に行うアンケート調査の質問項目として役立つものとなった。課題2:企業間関係における顧客関係性が企業価値・コスト構造に与える影響企業間関係が企業価値、原価態様に与える影響について、日本の製造業のデータを用いて調査した。企業間関係の強さがコストドライバーとしてどのように作用するかについて研究する中で、組織間関係構築の要因であるコスト戦略や差別化戦略が財務的結果にどのように関係するかを検討する必要が生まれた。そこで、東日本大震災でコスト戦略をとる企業がサプライヤーの被災によってどのような影響を受け対応したかについてを聞き取り調査をおこなった。また、戦略選択の要因となる企業ライフサイクルが企業財務にどのような影響を与えるかについても財務データを用いて実証した。【課題1】小売業における顧客関係性の評価と戦略2011年の東日本大震災の発生によって延期していた、ロイヤリティプログラムに関する実態調査を小売業者に対し実施し、その回答について分析した。その結果、ロイヤリティプログラムは、電子マネーの発展とともに多くの企業が取り入れており、プログラムの効果の予測を行いながら導入しているということがわかった。しかし、プログラムの導入によって予想した通りの結果が得られているという企業は少なく、かつある程度の財務数値との結び付けができているものの、戦略的な利用には至っていないということも明らかになった。これらの結果については、回答した企業に対して報告書という形で公表している。そして現在は2009年に同じく行った質問票分析の結果と比較研究を行っている。なお本調査の結果は、論文化し近々投稿する予定であり、今年度の計画をほぼ遂行することができた。【課題2】企業間関係における顧客関係性が企業価値・コスト構造に与える影響企業間の顧客関係性が企業価値やコスト構造に影響を与えるとすれば、それはどのような現象として現れるかに着目し、コストの下方硬直性とコストの下方硬直性を考慮したCVP分析についての新たな研究の視点を見つけた。

それによって、コスト戦略や差別化戦略、ライフサイクルなどの顧客関係性の構築に関連する他の変数とコスト構造に与える影響を調査した。その結果、企業のコスト構造に与える影響は、ライフサイクルや企業戦略の方が、顧客関係性よりも強い影響があることが明らかになった。これらについては、Sasaki,I., A.Shiiba, and K.Takahashi(2014)として国際学会で発表している。現在はこれらについてデータを追加し再分析しつつ論文化しているところであり、今年度の計画をほぼ達成することができた。管理会計課題1については、質問票を送付・回収中であり、2014年度中には一定の成果を示すことができる。課題2については、発展した研究成果をだすことができた。2014年度には再び企業間関係における顧客関係性とコスト構造、企業価値との関係を調査分析する予定である。東日本大震災の影響が2012年後半になっても残り、正確なデータを収集できないと判断したため、当初実施する予定であったアンケートを2013年度に延期せざるを得ない状況が生じた。課題1については、4月に実施した質問票調査の結果を踏まえて、ロイヤリティプログラムによる顧客関係性の評価と戦略的管理の利用可能性について示す。課題2については、新たな財務データの追加とこれまでの発展研究の成果を公表していく。なお、サプライチェーンをはじめとする顧客関係性については、震災関連の調査もおこなっており、こちらも別途研究を行う予定である。平成25年度は,課題1に使用する質問票の送付と結果の分析および企業インタビューを行う。これら2つの研究に使用するデータは企業業績(財務データ)を除いて共通なため,2つの研究は同時に行う。また,質問票調査は7月8月にかけて行う予定いる。課題2については,平成24年度同様,積極的な対外発表を行いながら,データの収集・分析を行うことで,課題の解明を行っていく予定である。この課題については,国外学会でより積極的に議論されているものも多く関係するので,国外学会での発表と,平成25年度に引き続き海外研究協力者からの協力を得ながら行っていきたいと考えている。課題1にかかわるアンケートの実施を2014年4月に行うことにより、その準備にかかる印刷代、発送費、人件費等が使用されなかったため。2014年4月に、アンケート作成を行い発送、回収作業をする。その際に、繰り越した金額については使用する予定である。1アンケート調査の作成・送付・集計作業のための費用、2対外発表および論文投稿のための費用(旅費を含む)3海外学会・ジャーナルへの投稿のための翻訳・校正費用、4研究打ち合わせのための旅費、5企業ヒヤリングのための旅費を考えている。
マスト細胞機能に対する紫外線照射の影響

〔目的〕光感作物質存在下における長波紫外線(UVA)照射が、ラット腹腔肥満細胞脱顆粒に及ぼす影響を、作用機序の異なるいくつかの光感作物質を用いて検討した。更に、ヒト皮膚由来肥満細胞について検討を加える必要があり、その採取法ならびにヒスタミン遊離能について検討した。2)酵素処理により正常ヒト包皮ならびに神経線維腫より得られた肥満細胞は、脱顆粒刺激により正常ヒト包皮由来、神経線維腫由来とも同様にヒスタミンを遊離し、calcum ionophore (10^<-6>M)で最も強い脱顆粒がみられた。〔結論〕種々の光感作物質が紫外線照射により肥満細胞の脱顆粒を抑制することが示され、今後の展開としてその抑制機序の解明、光感作物質のinvitro検出法としての有用性、光感作物質による皮膚アレルギー性疾患の治療への応用などが期待される。またヒト皮膚由来肥満細胞が酵素処理にて皮膚組織より分離でき、脱顆粒刺激によりヒスタミン遊離を惹起しうることが示され、今後ヒト皮膚肥満細胞を用いた研究が可能となった。ヒスタミン遊離物質であるcompound48/80による、ラット腹腔マスト細胞からのヒスタミン遊離は、PUVA【8-methoxypsoralen(8-MOP)添加後、長波紫外線(UVA)照射】処置により有意に抑制された。PUVA処置自身はマスト細胞のviabilityに影響を与えなかった。対照として行った8-MOP添加のみの群では、マスト細胞からのヒスタミン遊離は変化しなかったが、UVA照射のみの群でヒスタミン遊離は一部抑制された。この点について、中波紫外線(UVB)のみ照射する実験を追加した所、UVB単独照射でもマスト細胞からのヒスタミン遊離は抑制された。このことよりUVAの光源として用いた蛍光ランプ中に混在しているUVBが、先の実験結果に影響を与えたものと解釈した。以上よりPUVA処置またはUVB単独照射は、マスト細胞からのヒスタミン遊離を抑制することが見出され、この系が光感作物質のスクリーニングならびに作用機序の解明に用いられる可能性が示唆された。緒言:我々は61年度までの研究で,脱顆粒刺激による肥満細胞からのヒスタミン遊離が,中波紫外線ならびにソラーレン+長波紫外線(UVA)照射(PUVA)により抑制されることを明らかにした. 62年度の研究においてはソラーレンとは異なる作用機序を持つと考えられる光感作物質(Tetrachlor-salicylanilide(TCSA)とAfloqualone(AQ)を用いて光毒性反応が肥満細胞機能に与える影響を検討した.また平行して光溶血反応にてこれら物質の光感作能を評価し,肥満細胞を用いた実験と比較検討した.方法:ラット腹腔より精製分離した肥満細胞浮遊液に各種濃度のTCSAまたはAQを添加した後, UVAを照射した.compound48/80(48/80)を添加して脱顆粒を起こさせ,上清中と肥満細胞内に残存するヒスタミン量をそれぞれ螢光法にて測定し,ヒスタミン遊離率を算出した.光溶血反応は1000倍ヒト赤血球浮遊液に光感作物質を加えた後, UVA照射を行い,溶血度を測定した.結果:48/80による肥満細胞からのヒスタミン遊離は500ng/mlのTCSA添加後12.5-50KJ/m^2のUVA照射および500-1000ng/mlのAQ添加後50KJ/m^2のUVA照射にて有意に抑制された.光感作物質のみ, UVA照射のみでは,抑制されなかった.光溶血反応ではTCSAは肥満細胞脱顆粒より高濃度,高照射量の条件で溶血がみられ, AQでは溶血は認められなかった.考按:今回の実験結果は, DNA障害以外の機序を持つ光感作物質でも肥満細胞の脱顆粒を抑制することが確認された.その詳細な機序は今後の解析を待たねばならないが,本実験系が未知の光感作物質のスクリーニングに応用可能であることが示された.〔目的〕63年度は光感作物質によるラット腹腔肥満細胞の脱顆粒抑制現象が、これまで検索した以外の光感作物質について起こり得るか、最近光線過敏型薬疹の発生が報告されている2種の新薬(Afloqualone,Piroxicam)について検討した。更にヒト皮膚由来肥満細胞について検討するため、その採取法ならびにヒスタミン遊離能について検討した。〔方法〕

1)精製ラット腹腔肥満細胞(1×10^4個/ml)に種々の濃度のafloqualone,piroxicamを添加後、UVA照射した。照射終了後compound48/80(48/80)を添加し脱顆粒を起こさせ、ヒスタミン遊離率を測定した。〔結果〕1)afloqualone(500ng/ml+UVA(50KJ/m^2)で処理した肥満細胞からの48/80によるヒスタミン遊離は無処置群と比較して有意に抑制された。光感作物質添加のみ、UVA照射のみの群では抑制は認められなかった。piroxicamでは対照群との間に有意差はみられなかった。2)酵素処理により正常ヒト包皮ならびに神経線維腫より肥満細胞を分離することができた。脱顆粒刺激に対する反応性は包皮由来、神経線維腫由来とも同様であり、calcium ionophore(10^<-6>M)で最も強い脱顆粒がみられた。〔結論〕前に検討した8-methoxypsoralen,tetrachlorosalicylanilide以外に、AfloqualoneもUVA照射により、肥満細胞の脱顆粒を抑制することが示された。しかしながらpiroxycamでは認められなかった。その理由として、piroxicamはその代謝産物が光毒性を有しているという報告がある。一方、ヒト皮膚由来肥満細胞が分離できたことより、今後それを用いた研究が可能となった。