hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エクソソーム膜脂質を利用した血液がん細胞へのsiRNA導入技術の開発

血液がん細胞に対して効率的にsiRNAを導入する技術は未だ開発されていない。本研究の前年度成果において、MLL遺伝子の再構成がみられる血液がん(以下MLL白血病)細胞株数種(THP-1、RS4;11)が自身の分泌するエクソソームを再取り込みすることを見出している。そこで本年度は、同エクソソームに治療薬となるsiRNAを導入しその有効性を検証した。蛍光標識したsiRNAとエクソソームの混合液に一定の電圧をかけたのち(電気穿孔法)、それを細胞に処置するとsiRNA由来蛍光が細胞内で検出された(共焦点レーザー顕微鏡による観察)。電圧をかけずに処置した場合には細胞内にて蛍光が観察されなかった。よって、siRNAを電気穿孔法にてエクソソーム内へ搭載し細胞内に送達させることに成功した。続いて、MLL再構成遺伝子mRNAの一つ(MLLAF9)を標的とするsiRNAを上記の方法で細胞内に導入し、それが機能するかを検証した。MLL白血病発症の責任分子を発現抑制することにより細胞死が生じると考え、細胞毒性評価を行った(LDHアッセイ)。siRNA導入により有意な細胞毒性は検出されなかった。siRNAが分子レベルで機能しているかを確認するためにqRT-PCR解析を行った。MLLAF9の発現量はsiRNA導入の有無により変化しなかった。以上より、RNAi干渉を引き起こすに十分なsiRNAが導入されず細胞毒性が確認できなかったことが可能性として示唆された。解決策として、エクソソームの取り込みを活性化する刺激因子との併用によりsiRNAの細胞内導入量の向上を図る。血液がん細胞に対して移行性を示すエクソソームおよびその脂質成分で再構成されるリポソームを同定するために、各種血液がん細胞株よりエクソソームを単離し分泌元細胞への取り込み能について網羅的なスクリーニング解析を行った。血液がん細胞培養上清から得られるエクソソームの精製量は固形がん細胞からのものよりも少なかったため、精製プロトコルを一部改変した。これまでに固形がん細胞に対して高い移行性が確認されているグリオブラストーマ分泌エクソソームおよびその脂質成分リポソームにおいて、血液がん細胞株数種への移行性はみられなかった。一方で、多発性骨髄腫細胞(MM)株(OPM-2)やMLL遺伝子の再構成がみられる血液がん(以下MLL白血病)細胞株数種(THP-1、RS4;11)によるエクソソームのオートクライン現象を共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析により見出した。またMM低酸素適応株のがん幹細胞分画において、TGF-β/Smadオートクラインシグナルが幹細胞性維持に寄与していることを同時に明らかにしている。本シグナルがエクソソーム膜表面上のTGF-βを介したものである場合、そのシグナル伝達に乗じてsiRNAを細胞内に導入できるのではないかと考えている。すなわちMM幹細胞を標的とした薬物送達も可能になると予想している。siRNAなどの核酸医薬品を用いた遺伝子治療は血液がん細胞への有効なデリバリー技術の不在により進んでいない。本研究成果は、その解消に繋がる大変意義深い成果である。乳児白血病の多くを占めるMLL白血病は既存の化学療法に対する抵抗性が高く、これまでにない有効な治療法の開発が求められている。このような難治性がんに対する新規治療法開発の基盤となる本研究成果は極めて重要であり、今後も引き続き推進していくべき課題と考えられる。当初の目標である「血液がん細胞への移行性を示すエクソソームおよびその脂質成分で再構成されるリポソームを同定」において、前半部のエクソソームの同定は完了している。しかし、そのエクソソームの脂質成分リポソームが同様の移行性を示すかについては検討できていない。よって目標の少なくとも50%は達成されていると判断した。再構成されたMLL遺伝子を標的とした核酸医薬品を同定したエクソソームに搭載し、その治療効果を評価する。

再構成された塩基配列を認識するsiRNAは標的配列を含まない正常細胞に作用しないと考えられるため、有望な治療法の一つになると考えられる。生物由来であるエクソソームをデリバリー担体として臨床応用する場合にはハードルが高いため、本来は製造や品質の管理が比較的容易な脂質リポソームとして最適化されたものを用いるべきではある。しかし、新規治療法の開発を急ぐMLL白血病を対象としていることから、上記で進めることとした。
ダイオキシン受容体（ＡＨＲ）のリガンド認識及び転写活性化機構の構造科学的解明

本研究ではダイオキシン受容体(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)についてリガンドの詳細な認識機構及び一連の転写制御機構の解明を目指し、構造生物学的な研究を行った。具体的には転写活性化複合体であるAHR/ARNT/リガンド/DNA複合体、転写抑制複合体であるAHRR/ARNTについてX線結晶構造解析または電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指した。本年度はAHR/ARNTについて、フラグメント抗体であるFv-claspとの複合体での結晶化を目指した。Fv-claspは従来のフラグメント抗体に比べて構造の柔軟性が少なく、結晶性が良いという特徴を持つ。抗体にはPAペプチド(GVAMPGAEDDVV)を認識するNZ-1を用いた。PAペプチドはそれ自身がβターン構造を形成するという特徴を持つことから、AHR、ARNTのβターンまたはループ領域にPAペプチドを挿入した。PAペプチドを挿入したAHR/ARNTについて発現量及びNZ-1結合能が良好なペプチド挿入位置をAHR、ARNTそれぞれ2か所、5か所見出した。それらの挿入位置を組み合わせて16か所PAペプチドを挿入したAHR/ARNTの高純度サンプルを調製した。得られたサンプルについてNZ-1 Fv-claspとの結合を確認し、NZ-1との複合体を調製した。得られたサンプルを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、結晶を得ることはできなかった。また、AHR/ARNT/リガンド/DNAについて、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行い、12オングストロームと低分解能ではあるが三次元密度マップを得ることに成功した。得られたマップはHIF/ARNTなどのbHLH-PASファミリーの結晶構造から予測されるモデルと同様の形状をしていた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではダイオキシン受容体(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)についてリガンドの詳細な認識機構及び一連の転写制御機構の解明を目指し、構造生物学的な研究を行っている。具体的にはAHRの細胞質での複合体であるAHR/Hsp90/XAP2/p23の四者複合体について、また転写活性化複合体に関してAHR/ARNT/リガンド/DNA複合体やさらにCBP/p300、pCIP、SRC1など各種コアクチベータが結合した複合体について構造情報を取得することを目的としている。本年度において、まず細胞質での複合体であるAHR/Hsp90/XAP2/p23についてはHEK293細胞を用いてそれぞれの全長体単独での発現を確認した。また、大腸菌を用いて発現させたAHRの部分領域体と昆虫細胞Sf9を用いて発現させたHsp90全長体についてプルダウンによる結合を確認した。転写活性化複合体についてはAHR/ARNT/リガンド/DNA複合体の結晶化について検討を行った。AHR、ARNTに変異を導入することで熱安定性を向上させる検討を行った。その結果、AHRについて12か所、ARNTについて4か所熱安定性が向上する変異を見出した。これらの変異を導入したコンストラクトについて高純度サンプルを調製し、結晶化スクリーニングを行った。細胞質での複合体であるAHR/Hsp90/XAP2/p23の四者複合体についてはそれぞれの発現を確認できている。また、AHRとHsp90の結合が確認できている。今後、このAHR/Hsp90複合について高純度サンプルを調製するとともに、他の因子(XAP2及びp23)との結合を確認し、高純度サンプルを調製することで、細胞質での複合体構造解析を行うことができると考えている。転写活性化複合体AHR/ARNT/リガンド/DNAについては大きく進展したと考えている。AHR/ARNTは熱安定性が低く、それが結晶化を妨げている可能性がある。本年度の研究によってAHR/ARNTの熱安定性向上変異を見出すことができ、結晶化の可能性を上昇させることができた。

また、AHR/ARNT/リガンド/DNAについて、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行い、12オングストロームと低分解能ではあるが三次元密度マップを得ることに成功した。得られたマップはHIF/ARNTなどのbHLH-PASファミリーの結晶構造から予測されるモデルと同様の形状をしていた。AHR/Hsp90/XAP2/p23複合体については、現時点でHEK293細胞によってそれぞれ全長体での発現に成功しているが、複合体の形成は確認できていない。今後、発現条件やバッファー条件、タンパク質濃度などを検討し、複合体を調製する。また、大腸菌、Sf9を用いて発現させたAHR/Hsp90複合体ついては今後高純度サンプルの調製法を検討するとともに、XAP2やp23との結合確認を行う。AHR/Hsp90/XAP2/p23複合体試料が得られ次第、結晶化スクリーニングを行うとともに、ネガティブ染色電顕画像を取得する。試料の状態を確認し、試料調製法にフィードバックする。十分な質の複合体試料が得られたらクライオ電顕解析を行う。AHR/ARNT/リガンド/DNA複合体については結晶化スクリーニングを行うとともに、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行う。現在ネガティブ染色電顕画像を取得しており、分子量相当の粒子を観察できている。今後クライオ電顕解析による高分解能画像の取得を行う予定である。また、PAtagシステムを活用した結晶化を検討する。PAtagシステムは12残基からなるPAペプチドとその抗体NZ-1を用いたタグシステムである。PAtagシステムの特徴として、非常に高い親和性と特異性を持つこと、PAペプチドがβターン構造をとることが挙げられる。これらの特徴を生かし、AHR、ARNTに多数存在するβターンまたはループ領域にPAtagを挿入し、NZ-1 Fabとの複合体での結晶化を検討する。NZ-1との複合体についても結晶化だけでなくクライオ電顕による構造解析を並行して行う予定である。CBP/p300、pCIP、SRC1などの各種コアクチベータが結合した転写活性化複合体については、HEK293細胞を用いた共発現により複合体調製を試みる。これについても複合体試料が得られ次第、ネガティブ染色電顕画像取得とそれに続くクライオ電顕解析を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
(特異な非局在電子系の創出297-AO1)拡張共役電子系

前年度に引き続き、構造・物性・機能の観点から有望な種々のタイプの新規な拡張型共役電子系の開発に向けて、分子設計、合成、構造解析、物性解析を行い、新展開を図った。(1)環状パラフェニルアセチレン([n]CPPA)の内、[6]CPPA1のヘキサメチルベンゼンやC60誘導体との錯体のX-線構造解析に成功し、1のベルト状構造やC60が内部に包摂されていることを実証した。また1と[9]CPPAが結晶性錯体を形成すること見いだし今後の展開が予想される。新規な拡張キノン類、高極性共役系、拡張トリメチレンメタン類、三次元かご型化合物などの合成にも成功した(小田)。(2)可溶性オリゴチオフェンの合成と機能の研究をさらに発展させ、ポーラロンパイダイマーのモデルとして[2.2]quinquethiophenophaneを合成し、近赤外部にパイダイマーの吸収を確認した。また分子ワイヤとしての機能の観点から、末端にフラーレンC60やポルフィリンをもつオリゴチオフェン類を合成し、電荷分離や光励起光電流を観測し光応答分子素子としての機能を確認した(大坪)。(3)新規なシグマ-パイ共役系の創出をさらに推進し、シグマ-パイ共役に基づく含シリコン7員環共役カチオンの初めての合成に成功した。また、ビシクロ[2.1.1]ヘキセン導入システムのベンゼンおよびシクロオクタテトラエンの合成と性質について研究しベンゼンの高反応性など興味ある知見を得た(小松)。(4)高反応性3次元ポリインの発生とフラーレンへの変換の研究をさらに遂行するとともに、環の内外に官能基をもつブタジイン架橋二次元大環状分子の合成と会合・包摂能等を研究し、双極子-双極子相互作用により互いに形状を認識しつつ会合する事などを明らかにした(戸部)。(5)先にテトラチアフルバレンビニローグの構造・物性の精密制御を明らかにしたが、さらにビピリジンや1,2-ビス(2-ピリジル)エチレンの水素結合能を利用して新規な超分子体を構築した(山下)。(6)トリアリールアミン誘導体やp-セクシフェニルなどを用いて、有機層におけるバンドの曲がり、有機/金属系と金属/有機系における膜成長モードと電子構造、また、側鎖にパイ共役系を有するポリアセチレンの電子構造、種々の炭素-フッ素系におけるパイ共役、シグマ共役などについて研究した(関)。構造・物性・機能の観点から発展が期待される種々のタイプの新規な拡張型共役電子系の開発を目的として、分子設計、合成ならびに構造と物性解析を遂行した。(1)単離して詳細な研究が可能な曲面共役系として、フェニルアセチレンのパラ位での環状68量体(サイクリックパラフェニルアセチレン[n]CPPA;一部は2年前に合成を発表)および誘導体の合成に成功した。[8]CPPAのトルエン包摂単結晶のX線構造解析によりベルト状の構造が明らかにされ、また[6]CPPMがその内空孔にフラーレンC60,C70を取り込んで錯体を形成することが見いだした(小田)。(2)分子ワイヤーとして興味深い1次元拡張共役系として、可溶性オリゴチオフェンの系統的合成を達成した(最長のものは34量体で、10ナノメートルを越える)。各種スペクトル、電気化学的性質、ドープしたフィルムの電気伝導度の測定から、27量体でポリチオフェンの性質に近づくことが明らかになった(大坪)。(3)シグマ電子が深く関与する拡張共役電子系として、ビシクロ[2.2.2]オクテンが縮環したナフタレン、アントラセン、ビフェニレンやシラトロピリウムイオンの合成を達成しそれらの構造と物性を明らかにした。特に前3者の酸化により安定なカチオンラジカルの生成は注目に値する(小松)。(4) 2次元、3次元に拡張された大環状ポリインは構造・物性の観点から興味深いが、内部にシアノ基やsp2窒素などの官能基を有するプタジイン架橋メタシクロファンの合成を達成し鋭意機能を検討してている。また高反応性3次元ポリインの発生に成功し、フラーレンへの変換が質量スペクトルより強く示唆された(戸部)。(5)テトラチアフルバレン(TTF)ビニローグのビニール部に種々の置換基を導入すると、物性や構造の精密制御が可能であることを見いだし、結晶構造を解明するとともに構造-物性・機能相関を検討している(山下)。(6)有機電子デバイス開発の観点から、種々の拡張共役系化合物を薄膜化し、紫外光電子分光法やペニングイオン化電子分光法などの物理化学的手段を用いて、それらの電子構造および金属との界面における電子構造を解明した(関)。前年度に引き続き、構造・物性・機能の観点から発展が期待される種々のタイプの新規な拡張型共役電子系の開発に向けて、分子設計、合成、構造解析、物性解析を遂行した。(1)サイクリックパラフェニルアセチレン([n]CPPA)の内、約13Å(PM3)の空孔を持つ[6]CPPA1の包摂能について詳細な検討を行い、1がヘキサメチルベンゼンやフラーレンC60,C70と錯体を形成することが明らかになり、特にフラーレン類とは約10^7におよぶ大きな錯形成定数が観測された。

これらの錯体においてフラーレンは常温では速く出入しているが、低温温度可変NMRにより約10kcal/molと比較的大きな解離の活性化自由エネルギーが測定された(小田)。(2)昨年度、分子ワイヤーとして興味深い1次元拡張共役系として、可溶性オリゴチオフェンを34量体まで系統的合成した(鎖長>10nm)が、さらに41、48量体の合成を達成し、これらのオリゴマーの導電性に関して詳細な検討を行い、20量体程度の共役セグメントが電導性に寄与しているとの結論が得られた(大坪)。(3)昨年、シグマ電子が深く関与する拡張共役電子系として、ビシクロ[2.2.2]オクテンが縮環したナフタレン、アントラセン、ビフェニレンなどの合成を達成しそれらの構造と物性を明らかにしたが、今年度は硫黄原子を含む3種類の新規化合物の合成に成功し、それらの性質について詳細に検討した(小松)。(4)前年度に高反応性3次元ポリインの発生に成功し、フラーレンへの変換が質量スペクトルより強く示唆されたが、さらに進めて塩素誘導体の合成を行い、その陽イオンモードのLD MSおいてより明確にフラーレンのピークが観測され、マクロ量のフラーレン合成に向けて一歩前進した(戸部)。(5)先にテトラチアフルバレンビニローグのビニール部に種々の置換基を導入すると、物性や構造の精密制御が可能であることを見いだしたが、さらに進めるとともに構造-物性・機能相関を検討している(山下)。(6)有機電子デバイス開発の観点から、種々の拡張共役系化合物を薄膜化し、紫外光電子分光法やペニングイオン化電子分光法などの物理化学的手段を用いて、それらの電子構造および金属との界面における電子構造を解明を続行し、新たに新置換ポリアセチレンの電子構造も共同研究により解明した。(関)。前年度に引き続き、構造・物性・機能の観点から有望な種々のタイプの新規な拡張型共役電子系の開発に向けて、分子設計、合成、構造解析、物性解析を行い、新展開を図った。(1)環状パラフェニルアセチレン([n]CPPA)の内、[6]CPPA1のヘキサメチルベンゼンやC60誘導体との錯体のX-線構造解析に成功し、1のベルト状構造やC60が内部に包摂されていることを実証した。また1と[9]CPPAが結晶性錯体を形成すること見いだし今後の展開が予想される。新規な拡張キノン類、高極性共役系、拡張トリメチレンメタン類、三次元かご型化合物などの合成にも成功した(小田)。(2)可溶性オリゴチオフェンの合成と機能の研究をさらに発展させ、ポーラロンパイダイマーのモデルとして[2.2]quinquethiophenophaneを合成し、近赤外部にパイダイマーの吸収を確認した。また分子ワイヤとしての機能の観点から、末端にフラーレンC60やポルフィリンをもつオリゴチオフェン類を合成し、電荷分離や光励起光電流を観測し光応答分子素子としての機能を確認した(大坪)。(3)新規なシグマ-パイ共役系の創出をさらに推進し、シグマ-パイ共役に基づく含シリコン7員環共役カチオンの初めての合成に成功した。また、ビシクロ[2.1.1]ヘキセン導入システムのベンゼンおよびシクロオクタテトラエンの合成と性質について研究しベンゼンの高反応性など興味ある知見を得た(小松)。(4)高反応性3次元ポリインの発生とフラーレンへの変換の研究をさらに遂行するとともに、環の内外に官能基をもつブタジイン架橋二次元大環状分子の合成と会合・包摂能等を研究し、双極子-双極子相互作用により互いに形状を認識しつつ会合する事などを明らかにした(戸部)。(5)先にテトラチアフルバレンビニローグの構造・物性の精密制御を明らかにしたが、さらにビピリジンや1,2-ビス(2-ピリジル)エチレンの水素結合能を利用して新規な超分子体を構築した(山下)。
事実の学習における既有知識の利用に関する実験とモデル化

事実の学習における領域固有の内容的知識と一般的記憶術的技能の交互作用を明らかにする。1)リストの形で呈示された野球の事実の学習についてのKuhara-Ko.jima & Halano(1991)の論文のデータの再分析をした。野球の知識が高いあるいは低い大学生の事実の学習を記憶術的技能の高低2群で比較し、3つの実験から求めたeffect sizeを統合した。野球の知識が高い場合には、野球の事実の学習への記憶術的技能の貢献度は小さいことが分かった。2)実験1では、野球の知識の高い被験者に個人実験で野球の事実(野球の選手と野球の試合での行動の対)のリストの学習をさせ、どのように覚えたかの言語報告を求めた。知っている選手についてはその選手についての知識が自動的に引出されたが、知らない選手についてはこじつけや語呂合せをして、なんとか覚えようとした。1つの項目に対して野球の知識の使用と記憶方略の使用とが同時に報告されることはほとんどなかった。3)実験2・3では、2種類のリストの学習成績を比較した:リストKは知っている選手の示差的な行動からなり、リストMは知らない選手の類似した行動からなる。野球の知識高群の結果は、リストKでは記憶方略の訓練の有無に関わらず高い成績を示すが、リストMでは訓練あり群は無し群より高い成績を示した。野球の知識低群の結果はどちらのリストでも訓練あり群が訓練なし群より高い成績を示した。4)事実の学習のおける領域の内容的知識の利用と記憶方略の適用についてのモデル化を試みた。ある領域の内容的知識の高いエキスパ-トが、その領域での新しい事実の学習の際に、1)その領域のどのようなタイプの知識をどのように利用しているか、2)その領域の知識の使用と記憶術的方略の使用はどのように関連するかを検討した。具体的には、プロ野球の選手についての知識の高い大学生で、記憶術的技能を高い群と低い群の被験者に、「AがXという行動をした」という形の文(プロ野球の選手名とその選手がしそうな行動との対連合)からなるリストを覚えさせた。ステトでは「Xをしたのは誰か」を問い、選択肢の中から選んで答えさせた。どのように覚えたかについての言葉報告も求めた。記憶成績、エラ-の型、言語報告から、次の2点が明らかになった。1)利用したと報告された野球の知識のほとんどは、主語となっている選手についての情報(イメ-ジ、成績、エピソ-ドなど)であって、他の選手についての情報や野球一般についての知識を報告したものはほとんどいなかった。その選手についての情報は記銘時に自動的に喚起されることが多く、その場合には記憶の誤りはほとんどなかった。テスト時にその選手についての情報を使って推論して答えることもあったが、その場合には正答率は低い。2)記憶術学的技能が高い群でも、1つの項目を覚えるのに、野球の知識と記憶術的方略と両方を使用することは少ない。知っている選手についてはその選手についての情報を使用し、記憶術的方略は使用しなかった。知らない選手にさいては記憶術的方略をよりしばしば使用した。その領域の知識が高いと、それは記憶術的方略の使用を抑制するらしい。ある領域での新しい事実を学習する際に、その領域の内容的知識の高い人がどのように既有知識を柔軟に利用しているかを明らかにするために野球を材料として野球の知識のある大学生を被験者とした2つの実験を行った。第1の実験では、知っている選手についてはその選手についての情報が使用され、知らない選手については記憶術的方略に頼るという昨年度の実験の言語報告の分析に基づく結果を確認した。良く知っている選手からなるリストA、あまり知らない選手の多いリストBを作成した。

両リストの述部は共通、主部と述部の対は全ての選手のことを良く知っている人にとっては同じ程度に「おこりそうな」ものとした。リストAの学習成績はリストBの成績より高かった。リストAの成績と野球の知識との相関は有意だが、記憶術的技能との相関は有意ではなかった。リストBの成績と野球の知識との相関は有意ではなく、記憶術的技能との相関は有意であった。第2の実験では、特定されない主体(「パの外人打者が」など)に対して具体的に選手を当てはめて覚えるという形で野球の知識が利用されていることを明らかにした。特定されない主体が野球に関連した行動をしたという文の述部(行動)を覚えるという課題を用意した。主体の記述にあったその行動をしそうな選手を当てはめた場合、主体の記述とはずれているが、その行動をしそうな選手を当てはめた場合、個人を当てはめたわけではないが、そういう場面を思い出したと報告された場合には、そうではない場合より学習成績が高かった。主体の記述とはずれているが、その行動をしそうな選手(例えば、別なリーグの選手や現役を引退した選手)を当てはめるという柔軟性は記憶術的技能の高い被験者に見られた。ある領域での新しい事実を学習するさいに、その領域の内容的知識の高い人が新しく学習した事実を利用しているかどうかを明らかにするために、野球を材料として野球の知識の高い大学生(BK群)の学習成績を、野球の知識はないが記憶術的技能が高い大学生(MS群)の学習成績と比較した。野球の知識の高い被験者が良く知っていると思われる15人の野球選手について、おこりそうな試合中の行動を3個ずつ用意した。これを使って選手名を主語とし、行動を述部とする文のリストを2種類作成した。3種類のリストについて学習-マッチングテストを繰り返した後、全リストを対象として自由再生および遅延マッチングテストを行なった。その結果次の点が明らかになった。1)BK群ではリスト1で85%の被験者が満点を取った(平均14点)。学習-テストを重ねると量はごくわずかであるが、成績が低下する。リスト1と3を比較すると40%の被験者が低下(平均点で1点)を示した。2)MS群ではリスト1の成績は平均9点で、BK群よりずっと低いが、リスト3では79%の被験者が上昇を示し、12点となりBK群と有意差はなくなった。MS群では学習を重ねると、「覚え方のこつがわかり、やさしくなる」との言語報告が得られている。3)遅延テストではリスト3の歩留り率がもっとも高いことが、どちらの群でも見られた(新近性効果)。4)自由再生についてはBK群では「同一選手の行動が連続して再生される」という結果を予想したが、この点について群差は見られなかった。これらおよび査問の結果からBK群ではそれぞれのリストを覚える時には選手についての知識を利用しているが、リストの内容を関連づけて利用してはいないらしいとみなされた。
アジア移行諸国の経済構造と経済改革に関する国際比較研究 -東アジア・ラ米の経験・教訓と日本の支援の観点から-

本研究を通じて、アジア通貨・経済危機がアジア移行諸国ならびに、アジアNIES、ASEAN諸国に与えた影響とそれから脱却するための日本の役割を以下のように明らかにした。1)アジア通貨・経済危機の原因とその処方箋について。東アジアに特有な「構造的問題」にその原因を求める見解が存在するが、短期の国際資本移動という「国際」要因がそれと並ぶー場合によってはそれ以上のー役割を果たしたことを明らかにした。2)アジア危機が発生しまずその「洗礼」を受けた、ASEAN諸国とアジアNIESとの国際比較研究を行った。IMFの処方箋を受け入れたタイと「資本移動規制」を採用したマレーシア、深刻な影響を被った韓国と軽微の内に回復の道を模索した台湾とを比較した。3)アジア移行諸国に対する危機のインパクトに関して。アジア危機は、移行諸国の市場経済化に伴う問題と困難を増幅しているが、その内容と各国の対応は異なっている。ドイモイ以来積極的に市場経済化を進めてきたベトナムと、軍事政権下にはあるもののASEANなどの外貨を受け入れて一定の市場経済化への道を歩んできたミャンマー、改革と対外開放を模索している中でアジア危機に遭遇した北朝鮮とでは大きな違いが生まれている。4)アジア危機の展開を通じて、日本の果たすべき役割が鮮明になってきている。民間資本の撤退とその後の不振はみられるが、それをカバーする「新宮沢構想」など公的資本の役割は大きい。本年度の研究活動を通じて得られた研究実績として、以下の事柄を挙げることができる。本研究課題に即してまず指摘しなければならないことは、昨年(1997年)7月2日のタイ・バ-ツ切り下げ以降のアジア通貨危機とリセッシオンが与えたインパクトが当初の予想以上に大きいことである(すでに、1994-5年の「メキシコ・ペソ危機」を上回るものである)。それは、アジアNIESやASEAN諸国の目覚ましい経済発展(「東アジアの奇跡」)のモデル(外資依存の輸出指向型工業化政策)の再検討を余儀なくさせた。それのみならず、アジア移行諸国(中国、ベトナム、ミャンマー等)へも次第に影響を及ぼしつつあることが明らかになった。(1)改革開放政策の正念場として株式制度の導入によって国有企業改革に取り組んでいる中国にとって、その香港市場への上場が困難になってきている、(2)ドイモイ政策を推進してきたベトナムにとって、外資導入額の減少と輸出の伸びの低下が現れてきている、また(3)同じく市場経済化を目指しているミャンマーにとって、外資受け入れが停滞し貿易収支の赤字が深刻な状態になってきている。アジア通貨危機に対する処方箋としてタイ、インドネシアや韓国等が受け入れたIMF(国際通貨基金)によるコンディショナリティの効果と影響が現れてくるのは実は1998年から99年にかけてであり、アジアNIESやASEAN諸国のみならずアジア移行諸国へのその影響もいよいよ本格化するものと思われる。次年度の研究課題としては、その影響の国際比較研究が重要な柱のひとつなろう。97年7月のタイ・バーツ切り下げ以降のアジア通貨・経済危機は98年度においても依然として回復の兆しを見せていない。東アジアのNIES、ASEAN諸国のこの深刻な危機を前にして、(1)IMFによる処方箋(コンディショナリティ)の限界を解明し(西口)、(2)日本の対アジア援助の新たな方向として「貿易保険制度」の役割を明らかにし(茶谷)、さらに(3)これまでその影響が軽微であった台湾経済の特質に迫った(宋)。他方、アジア移行諸国に対してもアジア通貨・経済危機の影響は次第に大きな影響を及ぼした。「成長のエンジン」たる外資導入と工業製品輸出の停滞は共通にみられるが、(4)中国の国有企業改革に切り札たる株式制度にとって香港株式市場での上場の停滞と資本導入の遅れが持つ意味は大きく(松野・井手)、(5)「東アジアの経済発展モデル」たる輸出指向型工業政策(EOI)のベトナム版たるドイモイ政策への批判的検討が行われ(藤田)、(6)より根源的にビルマ式社会主義の限界についての検討も行われた(西澤)。

さらに(7)乏しい資料・統計類の制約あるものの北朝鮮(朝鮮民主主義人民共和国)経済の現状への接近も試みられている(斐)。これらの研究成果を踏まえて、次年度は全体的な取り纏めを行う。その際、アジア経済の回復のための日本の役割の検討がひとつの中心テーマとなろう。日本の投資・技術移転(米倉)、開発金融(田口)、ODA(川原)等々についてより深く研究し、アジア移行諸国の市場経済化と環境保全(唐沢)のための政策提言を仕上げる予定である。今年度の研究実績は、本年を含む3ヵ年の研究を以下のようにまとめたことである。1)アジア通貨・経済危機の原因とその処方箋に関して。アジア危機が始まった当初はもっぱら東アジアに特有な「構造的問題」にその原因を求める見解が強かった。そうした見解は十分に理解できるが、「国内」要因のみならず、短期の国際資本移動という「国際」要因がそれと並び、場合によってはそれ以上の役割を果たしたことを明らかにした。2)アジア危機が発生しまずその「洗礼」を受けた、ASEAN諸国とアジアNIESとの国際比較研究を行った。同じく「伝染」効果が働いていたものの、例えば、ASEAN諸国の中のタイとマレーシアとでは前者がIMFの処方箋を受け入れるのと180度異なる「資本移動規制」を後者が採用し、また同じアジアNIESの範略に属するものの深刻な影響を被った韓国と軽微の内に回復の道を模索した台湾との比較研究を行なった。3)アジア移行諸国に対してアジア危機が及ぼしたインパクトに関して。アジア危機は、アジア移行諸国の市場経済化に伴う問題とと困難を増幅している。その点に関しては同様の影響を受けたものの、例えば1986年のドイモイ以来積極的に市場経済化を進めてきたベトナムと、89年以降軍事攻権下にはあるもののASEAN諸国を中心として外資を受け入れ一定の市場経済化への道を歩んできたミャンマー、改革と対外開放を模索している中でアジア危機に遭遇した北朝鮮とでは大きな違いが生まれ、政策的な対応も異なってきていることが明らかになった。4)アジア危機の展開を通じて、日本の果たすべき役害が大きくかつ鮮明になってきたことを示すことができた。民間資本のアジアからの撤退とその後の不振はみられるものの、それをカバーする公的資本の役割は大きく、この点を「新宮沢構想」を軸にして検討を加えた。また、アジアにおける地域経済統合の積極的意義についても明らかにした。
生体関節力学機能計測のための6軸ロボットシステムの開発

本研究では,生体関節の力学機能試験を行うことの可能な,6自由度力学機能試験ロボットシステムを開発し,このシステムを用いて,生体関節構成要素の機能発現のメカニズムを明らかにすることを試みた。(システムの開発)試験対象である生体関節を6自由度のリンク機構にモデル化し,リンク機構の数学的な記述を行った。位置と姿勢に関する記述には同次変換を,力とモーメントに関する記述にはヤコピアンを用いた。対象関節を,膝関節,股関節,肩関節,肘関節とし,それぞれの関節の臨床における運動表現方法を考慮して,リンク機構へのモデル化を行った。その後,既設の6軸マニピュレータのハンド先端部に新たな機構を付加するための設計・製作を行い,システムのハードウエアを完成した。このハードウエアをロボットシステムの駆動部として使用し,先に求めたマニピュレータの機構記述の結果,およびシステムに関する機構記述の結果を用いて,システムを完成させた。軟組織に生じる張力の測定のために,6軸力センサの出力を座標変換し,軟組織に生じる張力を測定する方法を採用し,計測プログラムを作成した。システムの性能評価試験において,500N負荷時の誤差が120μm以下,剛性は上下方向に970N/mm.前後方向に1040N/mm,左右方向に310N/mmであることが分かった。(計測・解析)システムを用いて,ヒト,およびブタ膝関節を試験関節とし,外荷重作用時における膝の運動挙動,及び靭帯,半月の機能を調べた.その結果,1)前十字靭帯内の張力分布が屈曲角度に依存し,伸展位及び軽度屈曲位では前内側部と後外側部が,屈曲位では後外側部が緊張していること,2)膝への直動負荷に対しては主として十字靭帯が,回転負荷に対しては主として半月板が抗していること,3)半月板の機能が,関接間力や十字靭帯損傷の影響を受けること,4) Bi-socket再建法による前十字靭帯再建術は,術後の膝安定性を良好に保つ方法であること,等が分かった.本研究では,生体関節の力学機能試験を行うことの可能な,6自由度力学機能試験ロボットシステムを開発し,このシステムを用いて,生体関節構成要素の機能発現のメカニズムを明らかにすることを試みた。(システムの開発)制御対象である生体関節を6自由度のリンク機構にモデル化し,リンク機構の数学的な記述を行った。位置と姿勢に関する記述には同次変換を,力とモーメントに関する記述にはヤコビアンを用いた。対象関節を,膝関節,股関節,肩関節,肘関節とし,臨床において用いられているそれぞれの関節の運動の表現方法を考慮して,リンク機構へのモデル化を行った。機構の記述が完了した後,既設の6軸マニピュレータのハンド先端部に新たな機構を付加するための設計・製作を行い,システムのハードウエアを完成した。改良されたマニピュレータをロボットシステムの駆動部として使用し,先に求めたマニピュレータの機構記述の結果,およびシステムに関する機構記述の結果を用いて,システムの制御プログラムを完成した。なお、各軸の駆動アクチュエータをドライバが制御し,ドライバをコントローラが総括する構成とした。軟組織に生じる張力の測定のために,以前に代表者が開発した方法である,6軸力センサの出力を座標変換し,軟組織に生じる張力を測定する方法を採用し,計測プログラムを作成した。

性能評価試験において,500N負荷時の誤差が120μm以下,剛性は上下方向に970N/mm,前後方向に1040N/mm,左右方向に310N/mmであった。(計測・解析)システムを用いて,ヒト,ヤギ,およびブタ膝関節を実験対象とし,外力作用時における膝の運動挙動,及び靱帯,半月に生じる内力の測定を行った。その結果,1)十字靱帯内の張力分布が屈曲角度に依存し,伸展位及び軽度屈曲位では前内側部と後外側部が,屈曲位では後外側部が緊張していること,2)健常膝と前十字靱帯切離膝では半月に作用する荷重が異なり,特に前十字靱帯の後外側部の切離により,半月への負担が急増すること,等が分かった。本研究では,生体関節の力学機能試験を行うことの可能な,6自由度力学機能試験ロボットシステムを開発し,このシステムを用いて,生体関節構成要素の機能発現のメカニズムを明らかにすることを試みた。(システムの開発)試験対象である生体関節を6自由度のリンク機構にモデル化し,リンク機構の数学的な記述を行った。位置と姿勢に関する記述には同次変換を,力とモーメントに関する記述にはヤコビアンを用いた。対象関節を,膝関節,股関節,肩関節,肘関節とし,それぞれの関節の臨床における運動表現方法を考慮して,リンク機構へのモデル化を行った。その後,既設の6軸マニピュレータのハンド先端部に新たな機構を付加するための設計・製作を行い,システムのハードウエアを完成した。このハードウエアをロボットシステムの駆動部として使用し,先に求めたマニピュレータの機構記述の結果.およびシステムに関する機構記述の結果を用いて,システムを完成させた。軟組織に生じる張力の測定のために.6軸カセンサの出力を座標変換し,軟組織に生じる張力を測定する方法を採用し.計測プログラムを作成した。システムの性能評価試験において,500N負荷時の誤差が120μm以下,剛性は上下方向に970N/mm.前後方向に1040N/mm.左右方向に310N/mmであることが分かった。(計測・解析)システムを用いて,ヒト,およびブタ膝関節を試験関節とし,外荷重作用時における膝の運動挙動,及び靭帯,半月の機能を調べた。その結果,1)前十字靭帯内の張力分布が屈曲角度に依存し,伸展位及び軽度屈曲位では前内側部と後外側部が,屈曲位では後外側部が緊張していること.2)膝への直動負荷に対しては主として十字靭帯が,回転負荷に対しては主として半月板が抗していること,3)半月板の機能が,関節間力や十字靭帯損傷の影響を受けること,4)Bl-socket再建法による前十字靭帯再建術は術後の膝安定性を良好に保つ方法であること.等が分かった。
αキメリン変異マウスを用いた中枢神経回路の形成と機能の研究

Rac特異的GTPase activating protein(GAP)の一つであるαキメリンに着目し、中枢神経回路の形成と機能におけるその役割を明らかにすることを目的として研究を行った。全身性およびCre/loxPシステムを用いた領域特異的αキメリン変異マウス、さらに、α1およびα2イソフォームのそれぞれに特異的なノックアウトマウスを作成した。それらのマウスを行動学的、および、組織学的に解析することにより、海馬機能におけるαキメリンの働きの一端を明らかにした。我々は,これまでに,両足をそろえてウサギのような歩行をする新規突然変異マウス(ミッフィー変異マウス)の発見,および,その原因遺伝子の同定を通じて,αキメリンというRac特異的不活化蛋白質(GAP)が,エフリンB3-EphA4の下流として運動系神経の軸索誘導に重要な働きをすることを明らかにした。本年度はキメリン蛋白質の機能をより詳細に解析した。主な研究成果は以下の通りである:(1)キメリンにはαとβが存在するがβタイプはどのような性質を持つのだろうか?京都大学の加藤らとの共同研究として,βキメリンの機能を調べた。免疫沈降により,βキメリンもまたEphAと結合することを明らかにした。また,αキメリンと同様,EphAとの結合はEphAのリン酸化活性には依存しないことを明らかにした。EphAと結合したβキメリンは,エフリン刺激に応答してRacを抑制し,細胞移動を制御していることが示唆された。αキメリンとβキメリンは機能的に重複するようである。(2)我々が以前開発したEmx1-Creマウスとαキメリンfloxマウスを交配することにより,大脳皮質特異的αキメリンノックアウトマウスを作製した。現在,そのマウスに関して,歩行などの解析を行っているところである。(3)ミッフィー変異マウス,および,αキメリンノックアウトマウスに関して,小脳学習への関与を調べるため,瞬目条件反射の実験を行ってきた。また,プルキンエ細胞特異的αキメリンノックアウトマウスの作製,解析も行ってきた。我々は,両足をそろえてウサギのような歩き方をする自然発生変異マウス(ミッフィー変異マウス)の発見を端緒とする一連の解析により,Rac(RhoファミリーGTPaseの1種)を不活化する蛋白質(Rac-GAP)であるαキメリンが,運動系神経回路の軸索誘導において鍵となる働きをすることを見つけた。本研究課題では,それを発展させ,αキメリンの,神経回路の発達と機能の幅広い局面における役割を解明することを目的とした。我々はαキメリンノックアウトマウスでは,ある種の小脳学習に異常があることを見つけた。αキメリンはα1とα2スプライシングアイソフォームを持つが,それぞれ特徴的な生化学的特徴および発現パターンを示す。α2特異的抗体を用いることにより,α2キメリンが小脳プルキンエ細胞に強く発現することを見出した。小脳学習におけるプルキンエ細胞でのαキメリンの働きを調べるために,プルキンエ細胞特異的αキメリンノックアウトマウス(α1とα2の両方が欠損したマウス)を作製し,小脳学習の解析を行った。また,αキメリンの作用部位を詳細に調べる目的で,in situハイブリダイゼーション実験を行い,成体および各発達段階におけるα1およびα2キメリンの発現パターンを調べた。さらに,歩行および小脳学習においてα1とα2のどちらのアイソフォームが重要な働きをするのかを知るために,サブユニット特異的ノックアウトマウスの作製を試みた。ES細胞での相同組換えの頻度は染色体領域によって大きく異なることが経験的に知られているが,この領域は組換えが起こりにくいことを示す結果を得た。前後肢とも左右をそろえて歩くという特徴をもつ自然発生変異マウス(ミッフィー変異マウス)の発見を端緒とする一連の解析により、αキメリンというRac (RhoファミリーGTPaseの1種)を不活化する蛋白質(Rac-GAP)が、運動系神経回路の軸索誘導において鍵となる働きをすることを見つけた。本研究課題では、それを発展させ、αキメリンの、神経回路の発達と機能の幅広い局面における役割を解明することを目的とした。神経回路の異常は最終的には動物の行動の異常となって検出できると考えられる。それを知る目的で、αキメリン変異マウスの網羅的行動解析(オープンフィールド、高架式十字迷路、恐怖条件付け、ロータロッド、ホームケージ活動)を行った。その結果、解析を行ったほとんどの項目で、異常が検出された。これらの行動パラダイムの基盤となる神経回路はそれぞれ異なると考えられるので、これらの結果は、αキメリンが様々な神経回路の発達(機能)で重要な働きをすることを強く示唆するものである。αキメリンが、脳のどこで働くかを知るために、Cre/loxP組換えシステムを用いた。まずは、大脳皮質、海馬など背側終脳の興奮性神経細胞でのみCre組換え

酵素を発現するマウスとαキメリンのfloxマウスを交配し、目的のマウスを手に入れた。また、αキメリンにはスプライシングアイソフォームが存在し、生化学的特徴に違いがあるだけでなく、その発現時期にも大きな違いがある。αキメリン変異マウスではすべてのスブライシングアイソフォームが欠損しているので、それぞれの行動パラダイムに関して、どちらのアイソフォームがどのような働きを担うのかを知るために、アイソフォーム特異的ノックアウトマウスを作製し、解析を行ってきた。
ヒト神経膠芽腫における壊死巣形成機構を標的とした治療の基礎的研究

神経膠芽腫は外科的全摘出が不可能で、残存腫瘍に対する効果的治療がない。一方、本腫瘍の病理学上の特徴である壊死巣の原因は十分解明されておらず、壊死巣の形成機構が同定できればこれを利用した治療の開発に結び付く。ヒト神経膠芽腫の細胞死に結び付く遺伝子としてFas/AP01(CD95)の発現と壊死細胞との関係を報告し、Fas-ligand(FasL)のヒト神経膠芽腫における発現も見いだした。しかし、なぜFasとFasLが同時に発現するのかは不明である。FasLと強い親和性を示すdecoy receptor 3(DcR3)に注目し、Fas、FasLおよびDcR3の遺伝子発現および蛋白の過剰発現を神経膠腫の症例に対して解析を行った。PcR3遺伝子の増幅の有無を半定量的PCR法を用い、DcR 3mRNAの発現をリアルタイム半定量的逆転写一PCR法にて、Fas蛋白及びFasL蛋白の発現を免疫組織化学法を用いてそれぞれ検討した。手術標本より得られた57例の星細胞系神経膠腫を対象とした。DcR3遺伝子増幅を星細胞腫(7例)では1例も認めず、退形成星細胞腫では16例中の1例に、神経膠芽腫では34例中の7例に認めた。DcR3mRNAの発現は、神経膠芽腫群でより高い傾向にあった。DcR3のDNAコピー数の異常とmRNA発現量との間には統計学的相関関係を認めた(p=0.02)。Fas蛋白は星細胞腫群では陽性反応を呈するものは1例も認めなかったが、退形成星細胞腫では16例中3例に、神経膠芽腫では34例中21例において腫瘍細胞に発現を認めた。FasL蛋白は星細胞腫7例中3例に、退形成星細胞腫16例中9例に、神経膠芽腫では34例中29例において腫瘍細胞に発現を認めた。以上より、DcR3は星細胞系神経膠腫の悪性化において重要な役割を果たしていることが示唆された。また、DcR3はFasやFasLに陽性を示す神経膠芽腫群で多く発現することから、Fas/FasL依存性の細胞死を回避する機能を有する可能性が推察された。FasLと強い親和性を示すdecoy receptor 3(DcR3)に注目し、Fas、FasLおよびDcR3遺伝子発現および蛋白の過剰発現を神経膠腫の症例に対して解析を行った。DcR3遺伝子の増幅の有無を判定量的PCR法を用い、DcR3 mRNAの発現をリアルタイム判定

量的逆転写-PCR法にて、Fas蛋白及びFasL蛋白の発現を免疫組織化学法を用いてそれぞれ検討した。手術標本により得られた57例の星細胞系神経膠腫を対象とした。DcR3遺伝子増幅を星細胞腫(7例)では1例も認めず、退形成星細胞腫では16例中の1例に、神経膠芽腫では34例中の7例に認めた。DcR3 mRNAの発現は、神経膠芽腫群でより高い傾向にあった。DcR3のDNAコピー数の異常とmRNA発現量との間には統計学的相関関係を認めた(p=0.02)。Fas蛋白は星細胞腫群では陽性反応を呈するものは1例も認めなかったが、退形成星細胞腫では16例中3例に、神経膠芽腫では34例中21例において腫瘍細胞に発現を認めた。FasL蛋白は星細胞腫7例中3例に、対形成星細胞腫16例中9例に、神経膠芽腫では34例中29例において腫瘍細胞に発現を認めた。以上により、DcR3は星細胞系神経膠芽腫の悪性化において重要な役割を果たしていることが示唆された。また、DcR3はFas Lに陽性を示す神経膠芽腫群で多く発現することから、Fas/Fas L依存性の細胞死を回避する機能を有する可能性が推察された。
放射線生物学的研究に用いる株化がん幹細胞の樹立

平成30年度は平成29年度に明らかにした結果を別の実験方法によって追認した。具体的には1次スフェロイドの分散細胞から形成させた2次スフェロイド内にも脳腫瘍がん幹細胞マーカーであるCD133の陽性細胞が出現することを免疫蛍光染色法のみならずFACScan法によって追認できた。さらに、2次スフェロイド内のCD133陽性細胞の放射線感受性をコロニー形成法で調べたところ、CD133陰性細胞に比べ放射線抵抗性であることが分かった。一般的にがん幹細胞は放射線抵抗性であることから、2次スフェロイド内のCD133陽性細胞はがん幹細胞様細胞であることが示唆された。これらの結果から、スフェロイド形成法によって神経膠芽腫のがん幹細胞様細胞を継代培養できることが明らかとなった。スフェロイド内のCD133陽性細胞のみを継代維持する方法の確立についてはさらに検討を要する。がん幹細胞は放射線および抗がん剤に対して抵抗性を示し、治療後に残存したがん幹細胞は再発や転移の要因となると言われている。しかし、がん幹細胞の性質は、腫瘍内微小環境の変化に強く影響を受け、培養系において安定的にその性質を維持することは難しい状況にある。我々は、腫瘍のin vitroモデルである3次元細胞塊(スフェロイド)の低酸素微小環境にがん幹細胞マーカーかつ未分化細胞マーカーに対し陽性を示す細胞が可塑的に出現すること、さらに、この細胞が放射線抵抗性を示すことを明かにしている。本研究は、放射線生物学的研究にがん幹細胞のモデル細胞を安定的に供給できるよう、このCD133陽性細胞から株化がん幹細胞様細胞を樹立することを目的としている。28年度は、スフェロイドを増殖させ継代維持できる培養法について検討した。その結果、スフェロイドをα-MEM培地入り非接着性シャーレ内で継代維持できることを明らかにした。スフェロイドの作製及び継代手順は以下の通りである。1.α-MEM培地入り96穴非接着性U字プレートに細胞を1万個播種2.10日後、形成したスフェロイドをα-MEM培地入り非接着性10cmシャーレに移す3.さらに約5日後、最初に形成したスフェロイドから自然剥離した細胞から娘スフェロイドが形成される4.その後、適時α-MEM培地を交換することにより、長期間、娘スフェロイドを継代維持今後、娘スフェロイドにCD133陽性細胞が存在すること、このCD133陽性細胞ががん幹細胞の性質を示すことを調べる。当初の目的とするスフェロイドを増殖させ継代維持できる培養法について検討したところ、継代維持できる方法を見出すことができた。平成28年度に神経膠芽腫の分散細胞から形成された1次スフェロイドの継代維持法を検討し、その継代法を明らかにした。この方法によって作製された2次スフェロイド内に脳腫瘍がん幹細胞マーカーであるCD133の陽性細胞が出現するかを平成29年度に検討した。その結果、2次スフェロイドにもCD133陽性細胞が出現することを免疫蛍光染色法などによって明らかにした。。1次スフェロイドの継代によって作製される2次スフェロイドにもCD133陽性細胞が出現することが分かった。継代維持したスフェロイド内のCD133陽性細胞が、がん幹細胞様性質(未分化性、放射線抵抗性、非対称分裂性及び腫瘍形成能)を保持しているか調べる。本研究では特に、非対称分裂性及び腫瘍形成能について調べる。非対称分裂性については、分裂によって生じた2細胞それぞれのシングルセル遺伝子発現解析を行うことにより、がん幹細胞としての形質を確認する。腫瘍形成能については、ヌードマウスに細胞を移植し、腫瘍形成に必要な最小細胞数について検討する。平成30年度に2次スフェロイドに出現するCD133陽性細胞を分散培養し、継代できるかを検討する。年度末の緊急な予算使用の必要性を見込んだため残金が生じた。研究の進展状況から当該年度に予定していた消耗品の使用量が少なくなったため。翌年度分の物品費と合わせて使用する計画である。