hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゼブラフィッシュ脊髄神経細胞多様性形成機構の包括的解析

本研究は、ゼブラフィッシュを用いて、脊髄神経細胞多様性形成の包括的な理解を目指すものである。研究方針は、(1)発生期に神経系の少数の細胞で発現する転写因子に関して、その陽牲細胞をトランスジェニックフィッシュの手法でGFPおよびDsRedで可視化し、(2)GFP陽性細胞がどのような神経細胞に分化していくかを形態学的に調べ、つぎに、色の異なったライン同士の掛け合わせにより、2つの異なった遺伝子に関して陽性細胞同士の関係を調べる、である。実際には、Chx10,Vsx1,nkx2.1,Lim1,Lim5,BarH1,Dbx1,gsh1,gata3,Sim1b,Evx2,atoh1a,pax6aについて解析を進めた。すべての遺伝子に関して、まず、BACにGFPを挿入したコンストラクトを作製した。そのうち、Evx2,Sim1b以外のものに関しては、期待される細胞群にGFPの発現が見られた。これらポジティブなものに関して、トランスジェニックフィッシュの作製を行い、Vsx1,Chx10,BarH1,Dbx1に関してはGFPトランスジェニックラインが得られた。また、Chx10に関してはDsRedラインも得られた。また、神経伝達物質に関する遺伝子に関してもトランスジェニックフィッシュの作製を進め、glyt2(グリシン作動性ニューロンで発現)、vglut2a(グルタミン酸作動性ニューロンで発現)についてトランスジェニックフィッシュが得られた。得られたラインのうち、詳しい解析はChx10を中心に行った。その結果、Chx100陽性細胞はすべて同側下行性神経細胞であり、またグルタミン酸作動性の興奮性神経細胞であることを明らかにした。他の転写因子との関係ではChx10陽性細胞はすべてVsx1陽性細胞に含まれることが明らかとなった。
MHC関連遺伝子群の解析

本研究では、MHCクラスI関連遺伝子であるMR1の解析を進め、同時に脊椎動物におけるMHC関連遺伝子群全体の理解を発展させることを目的とする。1)MR1遺伝子産物の基礎的解析:MR1分子は、その予想されるアミノ酸配列より、細胞外ドメインにおける哺乳類中での非常に高い保存性が注目され、普遍的重要機能を有する可能性が示唆される。MR1遺伝子での蛋白レベルでの解析を行ない、MR1は、β_2-microglobulinと会合する事を明らかにした。更にその細胞内動態について検討した所、MR1分子は遺伝子導入して高発現させた細胞においては、細胞表面上に明確には検出されない。MR1がその細胞表面発現に特殊なリガンドを必要とするものかどうか検討を行なっている。2)脊椎動物におけるMHC関連遺伝子座の解析:軟骨魚類におけるMHCクラスI、クラスII両クラスの連鎖に関して多数の同複子のサザン解析を行ない検討した結果、MHCクラスI及びクラスII両遺伝子プローブによる分類が完全に一致し、両クラス遺伝子座の連鎖が示された。従って、硬骨魚類においてはMHC両クラス遺伝子座が連鎖しなくなったと推定され、基本的には脊椎動物のごく初期よりMHCクラスI及びクラスII遺伝子座は連鎖して存在しており、それは我々哺乳類まで保持されてきていると推測される。現在種々のMHC関連遺伝子座の解析を進めているが、今回の古典的MHC遺伝子座の解析は、重要な基礎的見地であると考えられる。
急性心筋梗塞におけるポンプ失調発症のメカニズムと心筋代謝

(目的)急性心筋梗塞に合併する重症ポンプ失調の機序を解明するため、成犬の冠動脈閉塞モデルを用い、左室収縮期圧(LVSP)の有意に低下した群における非梗塞部心筋の代謝障害について血行動態、心筋血流量(MBF)、心拍出量(CO)と対比検討し、更にカテコ-ルアミン(DOA,DOB)及びホスフォジエステラ-ゼ阻害薬(AMN)の心筋保護効果を研究した。(方法)雑種成犬50頭において回旋枝を基部で結紮しLVSPが70%以下に低下した群(D群)と非低下群(ND群)に分けた。水素クリアランス法でMBF、熱希釈法でCOを測定。D群、ND群では冠結紮120分後、そして群の一部に、心摘出30分前よりDOA,DOB及びAMNを点滴静注した。非梗塞部(NIZ)及び梗塞部心筋(IZ)から遠心分画法により小胞体(SR)、ミトコンドリア(Mt)を抽出しSR CaーATPase活性測定やSR蛋白分画の定量、及びMt呼吸活性、電子伝達系酵素群活性を測定した。さらに超微形態学的観察も行なった。(結果)D群ではCOも有意に低下し、NIZにおけるMBFもNDのそれに比し60%にまで低下し、同時にCaーATPase活性や呼吸活性、電子伝達系酵素群活性も有意な低下がみられたがSRのATPase主蛋白は保たれていた。これら心原性ショック状態における血行動態等改善の目的で用いたDOA,DOBにおいてはCO及びMBFの改善と伴にMt呼吸活性の回復をみた。AMNにおいてはCO,MBFの改善を認めないにもかかわらずMt機能の回復が同様に示された。超微形態学的にもND群NIZでは正常心筋と変らなかったが、D群NIZでMtの軽度の膨化、融合がみられ、これら変化がDOA,DOBそしてAMNで軽減された。(考案、結語)心筋梗塞に伴う重症心不全の発症機序としては梗塞サイズの大きさによるとの報告が多い。本実験においてはNIZのMBF低下と伴にSR及びMtの機能低下がみられ冠潅流の障害に基ずく悪性循環が形成され、DOA,DOBは血行動態を改善することにより、AMNは直接心筋に作用しD群のNIZの代謝を改善すると推察された。[目的]急性心筋梗塞に合併する重症ポンプ失調の機序の解明のため、冠結紮梗塞犬を用い、左室収縮期圧(LVSP)低下群と非低下群に分け、血行動態、心筋血流量(MBF)と非虚血部心筋小胞体(SR)とミトコンドリア(Mt)の活性との関連を検索した。[方法]雑種成犬25頭の回施枝結紮後LVSPが70%以下に低下した群(D群)と非低下群(ND群)に分けた。MBFは、水素ガスクリアランス法で、心拍出量(CO)は熱希釈法で測定した。

120分後心を摘出し、非虚血部(NIZ)と虚血部(IZ)から遠心法によりSR、およびMtを抽出し、Ca-ATPase活性と電気泳動法によるSR構成蛋白の分画定量、および呼吸活性、電子伝達系の諸酵素活性を測定した。さらに心筋組織ATP測定と、電顕観察を行った。[結果]D群では、LVSPは結紮前の70%に、COも同様に低下し、ショック状態を呈した。NIZのMBFは60%に低下し、冠低灌流状態を示した。ND群ではLVSP、COともに結紮前値と変わらず、NIのCBFも同様に保たれた。IZのSRのCa-ATPase活性、Mtの呼吸活性および電子伝達系諸酵素は、両群で前値の35%前後に低下し、SRのATPase主蛋白の崩壊をみとめ、ATP含量の著明な低下、電顕所見とともに、虚血心筋壊死を示した。D群NIZのSRのCa-ATPase活性は、前値の40%に低下し、MtのState III、Complex-I、DNP-ATPase活性も同様に低下した。ATPは心内膜側で有意に低下した。しかし、SRのATPase主蛋白の崩壊もみられなかった。電顕像では壊死所見はみられなかった。ND群ではSR、Mtの諸活性、電顕所見ともに結紮前の正常心筋と差がなかった。[考案および結語]心筋梗塞に伴う重症心不全の発症に関しては、梗塞の広範囲に伴うとする報告が多い。本研究では、実験的心筋梗塞に心原性ショックを合併した心の非虚血部にもSR、Mtの活性低下がみられ、冠灌流低下に基因する代謝障害によって収縮不全をきたし、ポンプ失調の一因となっていることが示唆された。(目的)急性心筋梗塞に合併する重症ポンプ失調の機序を解明するため、成犬の冠動脈閉塞モデルを用い、左室収縮期圧(LVSP)の有意に低下した群における非梗塞部心筋の代謝障害について血行動態、心筋血流量(MBF)、心拍出量(CO)と対比検討し、更にカテコ-ルアミン(DOA,DOB)及びホスフォジエステラ-ゼ阻害薬(AMN)の心筋保護効果を研究した。(方法)雑種成犬50頭において回旋枝を基部で結紮しLVSPが70%以下に低下した群(D群)と非低下群(ND群)に分けた。水素クリアランス法でMBF、熱希釈法でCOを測定。D群、ND群では冠結紮120分後、そしてD群の一部に、心摘出30分前よりDOA,DOB及びAMNを点滴静注した。非梗塞部(NIZ)及び梗塞部心筋(IZ)から遠心分画法により小胞体(SR)、ミトコンドリア(Mt)を抽出しSR CaーATPase活性測定やSR蛋白分画の定量、及びMt呼吸活性、電子伝達系酵素群活性を測定した。さらに超微形態学的観察も行なった。(結果)D群ではCOも有意に低下し、NIZにおけるMBFもNDのそれに比し60%にまで低下し、同時にCaーATPase活性や呼吸活性、電子伝達系酵素群活性も有意な低下がみられたがSRのATPase主蛋白は保たれていた。これら心原性ショック状態における血行動態等改善の目的で用いたDOA,DOBにおいてはCO及びMBFの改善と伴にMt呼吸活性の回復をみた。AMNにおいてはCO,MBFの改善を認めないにもかかわらずMt機能の回復が同様に示された。超微形態学的にもND群NIZでは正常心筋と変らなかったが、D群NIZでMtの軽度の膨化、融合がみられ、これら変化がDOA,DOBそしてAMNで軽減された。(考案、結語)心筋梗塞に伴う重症心不全の発症機序としては梗塞サイズの大きさによるとの報告が多い。本実験においてはNIZのMBF低下と伴にSR及びMtの機能低下がみられ冠潅流の障害に基ずく悪性循環が形成され、DOA,DOBは血行動態を改善することにより、AMNは直接心筋に作用しD群のNIZの代謝を改善すると推察された。
光合成の喪失と従属栄養の促進：長期継代培養による栄養性の進化

Leptolyngbyaboryanaは、完全暗所でも従属栄養的に生育が可能なシアノバクテリアである。L.boryana野生型から暗所従属栄養能が向上したvariantとしてdg5を単離しこれまでクロロフィル生合成などの研究に供してきた。本研究では、まずdg5を暗所で短期間(9日間)培養することで、さらに従属栄養能が高いコロニーを6個単離し、その後1014日毎に53回にわたり暗所従属栄養条件で継代培養を続けた。その結果、6株ともすべて光合成的に生育できず、1株は紫色の色素を漏出しコロニーの形態が野生型と明らかに異なっていた。これらの6株のゲノムリシーケンスの結果、4株で共通した遺伝子に変異が見つかり、色素漏出を示した1株ではフィコビリタンパク質リアーゼをコードする遺伝子cpcS-Iを含む約6 kbの欠失が認められた。この株のフィコビリンタンパク質含量は野生型の13%程度まで減少しており、この株の形質の主な原因はcpcS-Iの欠損であると推察されるが、この仮説を検証するために、この6-kb断片にコードされる各遺伝子についてdg5から改めて単独欠損株を単離し、各株が光合成的生育能を喪失した原因遺伝子の特定を進めている。さらに、野生型を暗所で比較的長期期間(40日間)培養することで、従属栄養能が向上したコロニーを23個単離し、暗所での継続培養を数ヶ月続けた後、光合成的生育を確認した。その結果、12株が光合成生育能を失っており、色調も極めて青い色を呈する株やコロニーの形状が明らかに変化した株など多様な形態を示した。これらの株のゲノムリシーケンスを進める予定である。本シアノバクテリアをもちいて光合成生育能を失った株のゲノムリシーケンスによりすでに複数の原因となる遺伝子を特定している。今年度は、暗所従属栄養条件に適応した変異株の収集を進める。特に、短期間の暗所培養により暗所適応株単離により効率的に光合成能を失った株を単離する系が確立できたので、この系を利用して変異株の収集とそれらのゲノムリシーケンス例を増やし、光合成生育能喪失の原因によって変異カテゴリーの分類を進める。
日本占領下の海南島における衛生・医療政策

本研究は、アジア太平洋戦争期の日本軍占領下における海南島の衛生・医療政策についてその実態を明らかにすることを目的とした。特にペスト防疫を実施した軍の史料をもとに海南島のペスト流行と防疫活動の実態を明らかにした。軍側はこの防疫活動を成功例として喧伝した。しかし、ペスト防疫のために隔離をはじめ住宅を焼き払われるなど、生活に大きな損害と規制を受けた。さらに、海南島の防疫・医療には、博愛会や同仁会などの医療支援団体が動員された。本研究の目的は、アジア太平洋戦争期の中国海南島における衛生・医療政策とその実態を分析することによって、日本の植民地医学の中国進出とその展開を明らかにすることにある。研究開始初年度である本年度は、(1)海南島の歴史的概要を、戦前・戦中の資料をもとに把握するとともに、(2)海南島を訪問し現地で聞き取り調査を行った。(1)海南島の地理・歴史・民俗・民俗・自然・産業等に関する記録は、主として19世紀後半あたりから特に西欧人によって刊行される。日本人によって多数の関連書物が生産されるようになったり、外国人によって書かれた海南島関係の訳書が出版されるようになったりするのは、日中戦争開始後のことである。それらは、やはり海南島の軍事的重要性と経済的有用性を意識してのことであった。中でもスチューベル『海南島民俗誌』、台湾総督官房調査課『海南島事情』1、2、3などを通読して、海南島がどのように把握されたかを再認識した。そのことを通して気付かされたのは、海南島の住民を構成する漢族、レイ族、客家、苗族、蛋族、回教徒などの特徴を把握しようとしていたことである。日本軍による海南島支配については、民族の区別をあまり意識せずに語られてきた側面があるが、例えば田独・石碌鉄山の土建事業では、レイ族を労働力として使用した事実があり、医療政策について解明する際にも各民族への視点が欠かせないことを実感した。(2)海南島の定安海口、塔昌村等で戦争当時を知る人々から聞き取りを行った。日本軍の駐留した土地、建物について記録した。また、日本軍によって掃討作戦が行われた村々を訪れたが、このような草深い奥地にも分け入ったのか、という感慨を抱いた。本研究は、日中戦争期に日本軍が占領した海南島において実施された医療政策についてを実証することを目的とする。本年度は、1939年(昭和14)に同島で発生したペストに対して実施された強圧的な防疫について検討し、この防疫の実施にみられる軍の論理を明らかにし、『15年戦争と日本の医学医療研究会会誌』16(2)に投稿した。論文では、以下の点を明らかにした。海南島におけるペスト防疫は、軍による軍のための防疫であり、現地民に対する衛生管理の実施もペストを軍に波及させないことを目的とした。したがって、ペスト汚染地であっても軍は撤退せず作戦を遂行したため、防疫は作戦に資することを最優先の課題とし、ペスト流行地における「討伐」も実施され、兵に感染者を出した。同時に軍の駐留地では、ペストの蔓延を予防する措置として家屋の焼却、捕鼠、予防接種、患者と家族の強制隔離、交通遮断が断行され、住民の生活へ大きな影響を与えた。そして、結果的に防疫を実施する軍の支配は通常よりも格段に強まった。海南島のペスト制圧は、ペスト汚染地でも作戦を継続し、占領を継続した先例を作ることとなった。以上が論文の要約である。また、医療支援団体博愛会の海南島における活動に関する史料収集につとめた。台湾総督府博愛会の医療活動に関しても学会誌に投稿予定である。海南島をめぐる政策と台湾総督府との関係、および動員される台湾人の動向等にも注目して調査をすすめ、海南島支配の全体像の中に、医療政策を位置づけたいと思う。史料閲覧に時間をさいて、もう少し多くの史料を発掘できればと思う。また、大きな研究史の流れにどのように寄与するのかをじっくり考える必要がある。海南島におけるペスト防疫に、731部隊から南支那防疫給水部に赴任した江口豊潔が関与していたことを明らかにし、その地域防疫の実態を検討した。江口の防疫活動に関連した人物の論文等の著作を追究してみると、陸軍軍医学校や731部隊の人脈に行き着くことになった。これまで、細菌戦の側面からこれらの組織は注目されていたが、そればかりではなく、防疫、軍衛生、給水、諜報、兵要地誌等、多面的な把握が必要であると痛感した。そこで、今年度は、海南島から少し離れ、731部隊で兵要地誌やソ連の衛生状況を研究していた村上隆や、731部隊や北支那防疫給水部で昆虫を研究していた篠田統、京都帝国大学衛生学教室教授の戸田正三に対象を広げ、戦争と防疫および衛生の問題について研究発表を行った。村上はや篠田や戸田など個人が行った研究を検討すると、細菌戦や人体実験という側面だけではなく、住民の宣撫工作や軍隊の環境衛生研究、兵要衛生地図の作成といった軍事研究所の側面も浮かび上がってきた。軍事研究の実態に即して見ることによって、731部隊が当時の医学界の中で容認されていた理由がよりよく説明できると考える。

細菌戦は、細菌学や病理学だけで成り立つものではなく、気象学、地理学、航空学、昆虫学、植物学、獣医学、化学、薬学等の研究者や技術者が必要であることを軍上層部は知悉していたのであろう。だからこそ、哈爾浜郊外の平房に作られたのは、一大自然科学研究所である必要があったのである。本研究は、アジア太平洋戦争期の日本軍占領下における海南島の衛生・医療政策についてその実態を明らかにすることを目的とした。特にペスト防疫を実施した軍の史料をもとに海南島のペスト流行と防疫活動の実態を明らかにした。軍側はこの防疫活動を成功例として喧伝した。しかし、ペスト防疫のために隔離をはじめ住宅を焼き払われるなど、生活に大きな損害と規制を受けた。さらに、海南島の防疫・医療には、博愛会や同仁会などの医療支援団体が動員された。予定していた海南島調査は実施できたが、海南島には文献があまり残存しておらず、入手できなかった。また、基本的な、海南島の地理・歴史・民俗・民俗・自然・産業等に関する記録を通読するにとどまり、陸海軍の文書や台湾総督府の行政文書の読解にまで踏み込めなかった。今年度が最終年度なので、成果を論文にまとめて投稿したい。日本史まだ解読できていない、海南島を占領した陸軍の文書記録『飯田支隊海南島攻略戦闘詳報』(1939年1月2月)や海軍の文書記録である『海南警備府戦時日誌』(1941年12月1944年7月)をはじめとする軍の諸記録の中から衛生・医療に関する記述に注目して、この地の植民地医学の背景となる軍事作戦および占領地統治について把握したい。そのほか、陸海軍の文書や台湾総督府の行政文書の読解を順次すすめたい。
全身型若年性特発性関節炎におけるバイオマーカーの探索

全身型若年性特発性関節炎(JIA)の血清診断を目的に、疾患特異的バイオマーカーの探索を行った。ネイティブPAGEを組み合わせた二次元電気泳動法でプロファイリングを行い、鉄代謝関連蛋白、リポ蛋白、免疫関連分子等の発現を認めたが、発現パターンは他の発熱性疾患と類似していた。全身型JIAではHp2-2型ハプトグロビン遺伝子型を示し、トランスサイレチン関連蛋白複合体のコンポーネントが異なっていた。その詳細を検討しバイオマーカーを明らかにする予定である。小児期不明熱の代表的疾患である全身型若年性特発性関節炎(sJIA)はいまだ病因が不明であり、早期診断および予後予測は極めて困難である。最近、HMGB1を始めとする炎症メディエーターがsJIAの病態に関わる知見が示されたが、それらは特異度が低いため診断に用いるととはできない。そこで本研究では臨床応用を目的に疾患特異的バイオマーカーの探索を行った。血清を用い非変性状態を取り入れた二次元電気泳動法を用いた方法で検討した。既報に従い非変性ゲルで一次元泳動を行った後SDS処理の上でSDS-PAGEを行い、Coomassie brilliantblue染色でスポットを可視化、解析を行いプロファイリングマップを作成した。解析結果では鉄代謝に関わる蛋白群、脂質代謝に関わるリポ蛋白、補体をはじめとした免疫およびスカベンジング機能に関する分子群の発現をみとめたが、現在のところ他の炎症性疾患との明らかな差異を認めていない。より疾患特異性の高い分子群を拾うため銀染色を用いた解析系を確立する予定である。一方、同一患者の異なった時相に関する解析ではプロファイリングデータに差異が認められた。sJIAでは最も予後の悪いマクロファージ活性化症候群に移行する型が知られているため、これらの知見が病態予測に有用であるか否かを検討する。またバイオマーカー不在のため、診療上、ステロイド剤や生物学的製剤などが過剰投与される傾向にあるが、寛解、治癒を的確に判断する分子群およびプロファイリングパターンの解析を引き続き行う。このような炎症を多数蛋白の発現様式の変化から捉えるアプローチはsJIAのみならず他の炎症性疾患診療に役立つ重要な方法と考える。全身型若年性特発性関節炎(sJIA)は病因が不明で、確立されたバイオマーカーが無いため診断は症状によって行われている。今回、血清学的診断を目的に、プロテオミクスの手法を用い疾患特異的バイオマーカーの探索を行った。解析には4名のsJIA患者血清を用い、非変性状態で一次元泳動を行った後SDS-PAGEを行い、Coomassie brilliantblueあるいは銀染色でスポットを可視化、プロファイリングを行い二次元ゲル上に分子マップを作成した。結果として鉄代謝に関わる蛋白群、脂質代謝に関わるリポ蛋白、補体やグロブリンなど免疫関連分子等の発現をみとめた。その発現パターンは過去に行った他の炎症性疾患と似通っていた。一方、解析全例でハプトグロビン遺伝子型はHp2-2であった。ハプトグロビン遺伝子多型は糖尿病や動脈硬化、薬物代謝などの罹患リスクにかかわることが示されており、sJIAに関しても病態における解析が必要と考えられた。またトランスサイレチンは全例で増加を認めた。トランスサイレチンはrapid turnover proteinであるが、sJIAで認められる肝障害や低タンパク状態では低下すると予想された。しかし今回の解析では相反する結果を認めた。トランスサイレチンはレチノールの全身への供給に関わるが、その制御については不明であり、レチノールや甲状腺ホルモンなど結合蛋白を含めた複合体解析をsJIAの病態解明のため今後の研究で行う予定である。sJIAは最重症例でマクロファージ活性化症候群(MAS)に移行することが知られている。当初はMAS移行の危険予測を解析目的の一つとして取り上げたが、該当症例が得られず解析できなかった。今後の検討課題としたい。今回行ったアプローチ方法はsJIAのみならず他の炎症性疾患診療に役立つ重要な解析手法と考えられ臨床への応用が期待できる。
VERAによる銀河系シェルの3次元的運動の解明と回転曲線の高精度計測

報告者は本年度、VLBI電波干渉計を用いて大質量星形成領域の年周視差(距離)を高精度で計測し、銀河系の渦状構造と円盤の回転運動を測定する研究を行った。VERA望遠鏡とVLBA望遠鏡を用いて、銀河系いて座腕に付随する大質量星形成領域4天体の22GHz水メーザー源の年周視差を高精度で検出した。計測した距離は、G14.33-0.64が1.12±0.13kpc、W51 Main/Southが5.41+0.31-0.28kpc、OH43.8-0.1が6.02+0.27-0.24kpc、G45.07+0.13が5.95+0.38-0.33kpcである。G14.33-0.64の距離から、いて座腕までの距離は運動学的距離の半分の約1kpcと考えられる。W51の距離から幾何学的に、銀河系中心までの距離をR_0=8.3±0.46±1.0kpcと見積もった。さらに、VERAとVLBAによる最新結果から31の星形成領域に基づき、渦状腕の位置と銀河回転に対する運動を求め、LSRにおける銀河系回転速度を、Theta_0=233±9km/sと求めた。また、渦状腕の巻き込み具合を示すピッチ角を、3つの銀河系渦状腕(いて座腕、ペルセウス腕、オリオン腕)それぞれについて求めた。いて座腕とペルセウス座腕のピッチ角は銀河系の4本腕モデルとよく一致している。オリオン腕はおそらく、いて座腕からW51やG45.07+0.13の位置付近で分岐していると考えられる。あるいは、もう一つの可能性として、いて座腕がより内側の渦状腕から大きなピッチ角で分岐していることも考えられる。後者の解釈は、最新の数値シミュレーション結果ともよく一致する。以上、本研究では、大質量星形成領域の正確な年周視差(距離)計測に成功し、その結果にもとづく銀河系腕構造と回転運動の議論を進めた。本研究の目的は、銀河系内大規模シェル構造の3次元的運動と起源を解明することである。報告者は今年度、本研究の最初のターゲット天体であるNGC281大規模シェルの水メーザー天体について、国立天文台の超長基線電波干渉計(VLBI)であるVERAを用いて年周視差の高精度直接計測に成功し、距離2.82±0.24kpcを得た。この計測結果を日本天文学会欧文研究報告(PASJ)に論文で投稿し、2008年10月に出版した(Sato et al.2009)。論文内において、同シェル上にある別の水メーザー天体(IRAS00420+5530;距離2.17kpc)との比較により、視線(奥行き)方向650pcにおよぶNGC281シェル全体の大きさを明らかにし、今回の観測によって初めてシェルの3次元的構造と運動について議論が可能になった。また、シェルの質量、速度、エネルギー、膨張のタイムスケールなどの重要な物理量も計算した。理論シミュレーションとの比較から、シェルが銀河系円盤方向に伸びた膨張をしており、磁場によって膨張が拘束されている可能性を示した。こうした大規模シェル構造は、銀河系のエネルギー循環において重要な役割を果たすと考えられている。報告者は、今回の成果と議論について、2008年8月に銀河の円盤-ハロー間の相互作用をテーマとした国際研究会において発表した。また、報告者は、銀河系内シェル構造の解明と並行して、VERAプロジェクトの最大テーマでもある銀河系の腕構造と円盤の回転運動の解明をテーマにした水メーザー複数天体の年周視差・絶対固有運動計測プロジェクトを行っている。特に、銀河系いて座腕(Sagittarius arm)について、VLBIメーザー天体観測による距離と運動計測を開始し、現在も継続している。本プロジェクトの最初のターゲット天体として、VERAを用いていて座腕に付随する水メーザー天体G14.33-0.64の年周視差計測に成功した。今回年周視差により直接決定した距離1.12kpcはこれまでの運動学的距離2-3kpc(天体の視線速度の情報のみから、円運動等の銀河回転モデルを仮定して導かれる予想距離)の半分以下である。この計測によって、運動学的距離にもとづく現在の銀河系モデルにおける、いて座腕の銀河中心方向への「くぼみ」が実際には存在せず、運動学的距離の誤差によるものであると示唆される。また、データの解析手法の改善についても、シミュレーションによる独立した研究を行い、論文化を予定している。報告者は本年度、銀河系内シェル構造の解明と並行して、国立天文台VERAプロジェクトの最大テーマでもある銀河系の腕構造と円盤の回転運動の解明をテーマにした水メーザー複数天体の年周視差・絶対固有運動計測プロジェクトを行ってきた。特に、銀河系いて座腕について、VLBIメーザー天体観測による距離と運動計測を行った。銀河系いて座腕は、我々の太陽系よりも銀河系内側に位置し、北半球からの観測(低赤緯方向)では望遠鏡の仰角が低いため、高精度での距離計測が困難とされ、近年のVLBI年周視差計測による銀河系構造の研究においては、ペルセウス渦状腕など太陽系よりも銀河系外側方向(高赤緯方向)にある天体の観測が先行してきた。

しかし、いて座渦状腕をはじめとする銀河系内側方向は銀河系の最重要部分であり、その構造と運動を計測することは、銀河系の力学構造を知る上で不可欠である。したがって、これらの領域におけるVLBI年周視差計測の高精度化が求められる。この問題を解決するために、報告者は米国ハーバード・スミソニアン天体物理学センターに滞在し、VLBIによる銀河系構造研究の先駆者であり、世界的第一人者であるMark Reid氏との共同研究を行った。報告者は、これまでのVERAと米国VLBA望遠鏡の解析手法を見直し、シミュレーションと実際の観測データの比較・検証を行うことで、観測データにおいて位置決定精度を最大にする方法(使用仰角の最適値)を求め、これによって最大で約3倍の年周視差計測精度向上を実現した。報告者は、この方法をVERAの観測データに応用し、銀河系いて座腕の星形成領域G14.33-0.64の年周視差による距離を1.12±0.13kpcという高精度で求めた(日本天文学会欧文研究報告(PASJ)に2010年査読論文発表済)。これは、VERA望遠鏡で初めての低赤緯天体の年周視差検出成功である。これまで、いて座腕は太陽系から約23kpcの距離と推定されてきたが、報告者の計測により、予想の約半分にあたる1kpcという距離にあることが明らかになった。さらに、報告者は、VLBAを用いて銀河系いて座腕方向の大質量星形成領域W51を含む3天体において、世界的にも非常に高い精度での年周視差計測に成功した(現在、米国The Astrophysical Journalに査読論文投稿中)。報告者らの研究によって、いて座渦状腕の正確な構造が既に見え始めている。今後、本研究を発展させ、観測天体数をさらに増やすことで、銀河系いて座腕構造を解明することが確実に期待される。報告者は本年度、VLBI電波干渉計を用いて大質量星形成領域の年周視差(距離)を高精度で計測し、銀河系の渦状構造と円盤の回転運動を測定する研究を行った。VERA望遠鏡とVLBA望遠鏡を用いて、銀河系いて座腕に付随する大質量星形成領域4天体の22GHz水メーザー源の年周視差を高精度で検出した。計測した距離は、G14.33-0.64が1.12±0.13kpc、W51 Main/Southが5.41+0.31-0.28kpc、OH43.8-0.1が6.02+0.27-0.24kpc、G45.07+0.13が5.95+0.38-0.33kpcである。G14.33-0.64の距離から、いて座腕までの距離は運動学的距離の半分の約1kpcと考えられる。W51の距離から幾何学的に、銀河系中心までの距離をR_0=8.3±0.46±1.0kpcと見積もった。さらに、VERAとVLBAによる最新結果から31の星形成領域に基づき、渦状腕の位置と銀河回転に対する運動を求め、LSRにおける銀河系回転速度を、Theta_0=233±9km/sと求めた。また、渦状腕の巻き込み具合を示すピッチ角を、3つの銀河系渦状腕(いて座腕、ペルセウス腕、オリオン腕)それぞれについて求めた。いて座腕とペルセウス座腕のピッチ角は銀河系の4本腕モデルとよく一致している。オリオン腕はおそらく、いて座腕からW51やG45.07+0.13の位置付近で分岐していると考えられる。あるいは、もう一つの可能性として、いて座腕がより内側の渦状腕から大きなピッチ角で分岐していることも考えられる。後者の解釈は、最新の数値シミュレーション結果ともよく一致する。
摂食・嚥下障害に適した食品開発および分類

昨年度に行った食品の分類((1)比較的破断応力が低いけれども粘性率は高いもの、(2)破断応力は(1)と同じだが粘性率は低いもの、(3)破断応力が大きく、粘性率が高いもの)に基づいて、3種類を被験食品とした。舌圧の測定にあたっては、測定部位を口蓋の最深部とし、直径1cm、厚さ2mmの圧歪みセンサーを、厚さ3mmの即時重合型レジンで作成した床を用いた。被験者はこの研究を理解し、同意をした20代の男性5名とした。被験者には実験4週間前から一日5時間以上レジン床を装着してもらい、キャリブレーションを行った。測定は分類(1)、(2)、(3)の順に行い、一つの食品で5回ずつ行った。測定項目は最大圧、最大陰圧、圧積分値(圧開始から終了までの積分値)とした。解析はパーソナルコンピュータを用いて行った。結果は、1).最大圧は破断応力が最も大きい被験食品(3)がいずれの被験者でも大きい値を示した。2).隠圧は被験食品(1)と(2)で比較すると(1)の方が大きい値を示す被験者が多かったが、1名はあまり値に違いは認められなかった。3).圧積分値は、被験食品によって一定の傾向は認められなかった。以上の結果から、食品のかたさは舌でも同様に感じることができるが、付着性は個人差が多いのではないかと推察された。
がん転移関連遺伝子産物ARK5を標的とした新規阻害剤開発

がん組織でのARK5の活性化を迅速・簡便に検出するため、得られた抗リン酸化ARK5抗体を用いた酵素免疫定量法(ELISA)を確立した。AMPKおよびその関連遺伝子産物ARK5の活性化を阻害する化合物の検索により、糸状菌Aspergillus terreus NBRC 6123株の菌体抽出物asterriquinone(ARQ)およびARQのdihydroxy-p-benzoquinone部分の水酸基を化学修飾したARQ誘導体が、栄養飢餓耐性解除作用を有し、マウス肺がん細胞の造腫瘍性を抑制する傾向が認められた。ARK5のリン酸化部位のリン酸化ペプチドを抗原として、リン酸化ARK5を特異的に認識する抗体を作成し、がん組織でのARK5の活性化を迅速・簡便に検出するため、得られた抗リン酸化ARK5抗体を用いた酵素免疫定量法(ELISA)を確立することを目的とした。ARK5はヒトのアミノ酸一次構造から、Thr211/Ser600がリン酸化部位である。Thr211はNdr2でSer600はAKTによるリン酸化部位である。まず、ARK5の上位タンパク質リン酸化酵素AKTによるリン酸化部位であるKLH-SVLSSDSFDLLDLQENRPARQRIRSのC末端のセリン残基のリン酸化ペプチドをウサギに免疫して得られた抗体を、免疫に用いたペプチド配列の非リン酸化およびリン酸化ペプチドを抗原として用いたELISA法により抗体価とそれぞれの特異性を検討した。その結果、リン酸化ペプチドに対して100,000倍以上の抗体価が得られ、リン酸化ペプチドに特異的に反応し、非リン酸化ペプチドとは全く反応しない抗体を得ることができた。ARK5のSer600の抗リン酸化抗体作成の成功により、本研究の活性化の迅速・簡便な検出法の開発の目標をほぼ達成したと考えられる。現在、得られた抗Ser600リン酸化ARK5特異抗体を用いた細胞内でのリン酸化の動態、がんの臨床材料を用いた悪性度とARK5リン酸化との関連性を、ELISA法を用いて検討するとともに、その活性化を阻害すると考えられる抗酸化剤や新規化合物の多検体スクリーニングを行い、ARK5を介したがんの進展抑制薬の検索を行っているところである。ARK5の活性化を阻害する化合物を検索することを目的とした。ARK5は細胞増殖シグナル伝達の中心的なリン酸化酵素AKTにより活性化し、AMP活性化リン酸化酵素(AMPK)活性によりがん転移を促進することが知られている。ARK5の活性化を阻害する化合物を見いだすことは、がん進展の治療薬となりうる。糸状菌Aspergillus terreusNBRC6123株の菌体抽出物asterriqulnone(ARQ)およびARQのdihydroxy-p-benzoquinone部分の水酸基を化学修飾したARQ誘導体を被験化合物として、培養細胞を用いたAKTの活性化およびAMPKの活性化の抑制を検討した。ARQ、ARQDAc、ARQAcMe、ARQAc、ARQMeは、大腸がん細胞株SW480の低栄養培地でのAMPKの活性化を顕著に抑制した。また、低栄養培地への血清添加によるAKTの活性化も抑制した。腫瘍移植モデルマウスによる抗がん作用の検討では、ARQはマウスの顕著な体重減少を示し治療目的としては用いることが出来なかった。一方、ARQAcMeは、投与マウスに対する影響は認められず、コントロール群に比しマウス肺がん細胞の造腫瘍性を抑制する傾向が認められた。このことから、本研究で見いだされたARQ誘導体は、新たな作用機序を持つ抗がん剤の候補になりうることが示された。
新たな膵性糖尿病治療法の開発に向けた膵線維化に伴う膵島障害機序の解析

近年、膵星細胞が膵の炎症と線維化に中心的役割を担っていることが解明されつつあるが、膵性糖尿病進展への関与については明らかでなかった。ラット膵島細胞株RIN-5F細胞に対し膵星細胞が与える影響について検討した。ラット活性化膵星細胞はRIN-5F細胞のインスリン発現を抑制するとともにアポトーシスを誘導することが明らかになった。膵星細胞が膵島細胞に量的ならびに質的な変化をもたらすことにより、膵性糖尿病進展に関与していることが示唆された。慢性膵炎に伴う膵性糖尿病では、膵切除標本の病理組織学的解析や膵内分泌負荷試験、実験動物モデルにおける解析などに基づいて、膵線維化と血管障害の進展に伴う膵島数の減少、インスリン分泌障害、ならびにインスリン抵抗性の関与などが報告されているが、その進展機序の詳細は明らかでない。近年、膵星細胞が膵の炎症と線維化に中心的役割を担っていることが解明されつつあるが、膵性糖尿病進展への関与については明らかでない。平成22年度は、ラット膵島細胞株RIN-5F細胞に対し、膵星細胞が与える影響について検討した。膵星細胞はWistar系雄性ラットより分離し培養により活性化したものを実験に用いた。1.0μm径の孔のあいたカルチャーインサートを用いて、ラット膵島細胞株RIN-5F細胞と活性化ラット膵星細胞を非接触下に共培養し、RIN-5F細胞の1.インスリンmRNA発現をreal time PCR法により、2.インスリン分泌をELISA法により、3.アポトーシスを細胞内ヒストン結合DNA断片化の定量により検討した。活性化膵星細胞との共培養により、RIN-5F細胞のインスリンmRNA発現は低下した。インスリン基礎分泌も低下したが、グリベンクラミドによる分泌刺激に対する反応性は保たれていた。また、活性化膵星細胞との共培養は、RIN-5F細胞のアポトーシスによる細胞死を誘導した。本検討により、ラット活性化膵星細胞はRIN-5F細胞のインスリン発現を抑制するとともにアポトーシスを誘導することが明らかになった。平成22年度は、膵星細胞がラット膵島細胞株RIN-5Fにアポトーシスを誘導することを明らかにした。平成23年度は、アポトーシス誘導メカニズムについて解析を行った。1)膵島細胞のアポトーシスにおけるinducible nitric oxide synthase(iNOS)発現が非膵性の糖尿病において報告されている。本実験系では、膵星細胞はRIN-5FにおけるiNOS発現を誘導しないことが確認され、膵星細胞による膵島細胞のアポトーシス誘導にはiNOS発現の関与は乏しいと考えられた。2)膵星細胞はNOSを発現しnitric oxide(NO)産生能を有していると考えられており、膵星細胞から産生されたNOが膵島細胞を傷害している可能性について検討した。共培養系における有意なNOの存在は確認されず、この系におけるNOの関与は乏しいと考えられた。3)蛍光免疫染色法により検討したところ、膵星細胞はRIN-5Fのcleaved caspase-9を増加させた。caspase-9の活性化が下流のカスパーゼカスケードを活性化し、膵島細胞にアポトーシスを誘導することが示唆された。4)膵島細胞のアポトーシス誘導における小胞体ストレスの関与についても検討を行った。蛍光免疫染色法により検討では、小胞体ストレス誘導時に上昇が報告されているCHOPは、この実験系では有意な上昇を確認しえなかった。リアルタイムPCR法により、小胞体ストレス関連分子の発現(BiP、Ero1L)を検討したが、有意な上昇を確認しえなかった。以上より、膵星細胞による膵島細胞のアポトーシス誘導にはcaspase-9を介するカスパーゼカスケードの関与が示唆された。本研究では膵線維化において中心的役割を担う膵星細胞が膵性糖尿病における膵島障害に関与している可能性が示され、膵性糖尿病予防に対する新たなアプローチが今後期待される。
ハロゲンをドープされたフタロシアニンのバルク反強磁性

最近我々が見いだしたドープ法を用いて,アルミニウムフタロシアニン(A1PcF)粉末にヨウ素あるいは臭素をドープし,その結晶構造をX線回折により,また磁性を電子常磁性共鳴(EPR)および磁化率測定により調べた。X線結晶構造解析により,A1PcF高分子軸は正方晶系のc軸に平行に走っており,軸方向のフタロシアニン環の配列には著しい乱れがあることがわかった。この乱れはフタロシアニン環の面間距離とI_3(あるいはBr_3)のI-I^-(あるいはBr-Br^-)原子間距離とが等しくないことによって起こると考えられる。EPR信号線巾の異方性から,この系の磁気的相互作用は3次元的であることが明らかになった。また,室温でのEPR信号強度から,スピンは局在していることがわかった。EPR信号強度は温度を下げるにつれて,150Kあたりから減少し,80K付近で消失する。同時に,線巾は80K付近で発散し,磁化率はこの温度でブロードなピークを持つ。これらの結果は,この系が80K付近で3次元的な反強磁性転移を起すことを示している。EPR信号強度および線巾の異常は,すでに薄膜で観測されているが,磁化率のピークの検出は,粉末を扱った本研究で初めて可能となったのであり,これにより,80Kでの磁気異常が反強磁性転移によることが確証された。この反強磁性発現には,結晶構造の乱れが重要な役割を果たしていると考えられる。すなわち,乱れがスピンを局在させ,この局在が反強磁性転移が起こるための必要条件となっていると考えられるのである。本研究は,この乱れと磁気転移との関係を初めて指摘するものとなった。
光受容体タンパク質が自発的に作る2次元秩序構造についての構成的研究

本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。これまでの研究から、ラフト領域(秩序液晶相:lo相)と非ラフト領域(無秩序液晶相:ld相)をパターン化した人工膜を開発し、Rhの脂質ラフトへの親和性をlo/ld相への分配から定量的に評価することに成功した。この技術を発展させ、ラフト領域の脂質組成やRh濃度を調節することで、人工膜にRh超分子クラスターなどの2次元秩序構造を再構成する。平成30年度には、1パターン化人工膜作製、2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、3Rh超分子クラスターの形成、4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する技術開発を行った。1パターン化人工膜作製では、ガラス基板に流動性脂質膜(100%生体脂質)と部分重合膜(生体脂質とポリマー脂質の混合膜)を持つパターン化膜を作製し、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製した。2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))の再構成を行いラフト・非ラフト領域の分配を定量した。3Rh超分子クラスターの形成は、円板膜より再構成した膜を高速AFMで観察し、完全暗黒下でRhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の観察に成功した。4数理モデルの構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現してロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量し、クラスター形成を評価した。以上の研究成果により、円板膜におけるロドプシン光受容体の2次元秩序構造が光シグナル伝達に果たす役割について、知見を得ることができた。平成30年度には、1パターン化人工膜作製、2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、3Rh超分子クラスターの形成、4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する基盤技術の開発を行うことができた。1パターン化人工膜の作製では、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製して、光シグナル伝達に関わる分子群のラフト親和性を定量した。2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))を機能を保持した形で再構成する技術を開発した。3Rh超分子クラスターの形成では、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体を完全暗黒下で高速AFMで観察することに成功し、Rhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察した。4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現し、ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量してクラスター形成を評価した。以上の結果は、視細胞円板膜の2次元秩序を人工膜に再構成し、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションで詳細に解析することで、自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な基盤となる。平成31年度は、以下の検討を行うことで、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する技術を開発したい。1パターン化人工膜への膜タンパク質の再構成:2次元秩序構造形成にはRh二量体が重要であると考えられるため、導入条件(界面活性剤濃度、希釈率、攪拌、脂質組成など)を改善することで、Rhを二量体形成に必要な密度(およそ100分子/平方マイクロメートル以上)で再構成することを試みる。Rh拡散、二量体形成を観測して導入条件を最適化する。2Rh超分子クラスターの形成:超分子クラスターの動的形成過程、分子集合状態、二量体、オリゴマーとの平衡を、1分子蛍光観察および高速AFMを用いて詳細に観察する。3Rh超分子クラスターの機能解析:高速AFMを用いてRh超分子クラスターを暗中で観察しながらRh分子を光活性化し、Rh分子の構造と集合状態の変化を調べる。暗室中で、Rhのみ、Gt添加、光照射、GTP添加、の条件で分子解像度の観察像を得ることを目指す。4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルの構築:平成29年度に引き続き、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現する。Rh凝集状態(単量体多量体)に応じてラフト、非ラフト脂質への親和性が変化する、Rh凝集体の解離定数が周辺の脂質組成によって影響されると仮定して、これらの寄与の重みを変えつつシミュレーションを行い、Rh超分子クラスター形成を考察する。

この技術を発展させ、ラフト領域の脂質組成やRh濃度を調節することで、人工膜にRh超分子クラスターなどの2次元秩序構造を再構成する。平成29年度には、1パターン化人工膜作製、2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、3Rh超分子クラスターの形成、4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する技術開発を行った。1パターン化人工膜の作製:ガラス基板に流動性脂質膜(100%生体脂質)と部分重合膜(生体脂質とポリマー脂質の混合膜)を持つパターン化膜を作製し、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製した。2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成:パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))の再構成を行った。3Rh超分子クラスターの形成:円板膜を再構成して、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体の観察に成功した。ただし、観察像をGtと特定するにはデータが弱いため、今後、暗室中で1Rhのみ2Gt添加3光照射4GTP添加、の条件で、1Gtがみられない、2Gtが動き回っている、3GtがRh上で止まる、4Gtが動き始める、という像を確認する。4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルの構築:粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現した。ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量し、クラスター形成を評価した。本研究は、円板膜における2次元秩序構造を人工膜に再構成して形成原理と機能を構成的に解析する。平成29年度には、1パターン化人工膜作製、2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成、3Rh超分子クラスターの形成、4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築、に関する基盤技術の開発を行うことができた。1パターン化人工膜の作製では、ラフト領域(lo相)および非ラフト領域(ld相)とを定量的に分配したラフトモデル人工膜を作製する技術を改良し、定量性を改善した。2パターン化人工膜への膜タンパク質再構成では、パターン化人工膜に、ロドプシン光受容体(Rh)、光情報伝達関連タンパク質(トランスデューシン(Gt))を機能を保持した形で再構成する技術を開発した。3Rh超分子クラスターの形成では、Rhクラスター、Gt、Rh-Gt複合体を高速AFMで観察することに成功した。特に、Rhクラスターに対するGtの結合をリアルタイムで観察することに成功した。4膜内分子分布・凝集状態や機能をシミュレートする数理モデルを構築では、粗視化モデルでRhとラフト脂質、非ラフト脂質の挙動を再現し、ロドプシン周辺のロドプシン、ラフト脂質の数を定量してクラスター形成を評価した。以上の結果は、視細胞円板膜の2次元秩序を人工膜に再構成し、1分子蛍光観察、高速AFM、および粗視化分子動力学シミュレーションで詳細に解析することで、自発的秩序形成メカニズムと機能的役割を分子レベルで理解するための重要な基盤となる。これまでの研究から、ラフト領域(秩序液晶相:lo相)と非ラフト領域(無秩序液晶相:ld相)をパターン化した人工膜を開発し、Rhの脂質ラフトへの親和性をlo/ld相への分配から定量的に評価することに成功した。
分節パターンが規定する神経系及び血管系の器官形成

脊椎動物の初期発生過程において出現する体節中胚葉の分節化は、体節以外の組織、たとえば神経系や血管系などの分節パターンをも規定する.本研究では、分節パターンに沿って出現する血管前駆細胞に注目し、これらの細胞による血管形成の過程と、それを制御する分子メカニズムの解析を行った.血管前駆細胞は各体節の後半部に出現し、その後腹側方向に移動して背側大動脈の内皮組織を形成する.これらの細胞挙動は、主にNotchとその下流で働くエフリンによって制御されていることが明らかとなった.脊椎動物の初期発生過程において出現する体節中胚葉の分節化は、体節以外の組織、たとえば神経系や血管系などの分節パターンをも規定する.本研究では、分節パターンに沿って出現する血管前駆細胞に注目し、これらの細胞による血管形成の過程と、それを制御する分子メカニズムの解析を行った.血管前駆細胞は各体節の後半部に出現し、その後腹側方向に移動して背側大動脈の内皮組織を形成する.これらの細胞挙動は、主にNotchとその下流で働くエフリンによって制御されていることが明らかとなった.平成19年4月11日14日にスペインバルセロナで開催された、第一回国際トリ発生生物学会議に出席し、細胞移動と器官形成に関する発表、及びトリ胚操作に関する新規方法論であるトランスポゾンTol2を用いだ半永久的細胞標識法とコンディショナル発現法に関する発表を行った。またスペインのNieto教授との研究打ち合わせを行い、細胞挙動の分子制御と遺伝子発現制御に関する情報を交換した。これらの研究打ち合わせで得られた情報をもとにして、さらに研究を続行させ、以下の成果を得た。pTP1-Venusレポーターで遺伝子のエレクトロポレーション法により、内在性のNotchは各体節内の後端部で活性化されることを見出した。またこれらの細胞は、のちに腹側に向かって移動し、背側大動脈にたどり着いた後、血管内皮細胞へと分化することを観察した。これらの挙動を分子レベルで詳細に解析するために、恒常的活性型であるNotchコンストラクトを用いてエレクトロポレーションしたところ、Notch活性細胞はやはり体節の後端部に集積した。この集積は、前端部における細胞死が大きな原因であることを突き止めた。またNotch活性細胞は、背側大動脈方向へと積極的に移動し、血管内皮細胞へと分化した。生体内3次元環境での血管形成において、細胞の移動が大きく関与し、またその細胞移動がNotchによって制御されているというこれらの知見は全く新しく、その一部は論文として発表された。初期発生の過程において、からだの前後軸に沿って規則正しく並ぶ中胚葉組織に、体節がある。体節は、主に骨格筋や中軸骨格を形成する前駆体としてよく知られている一方で、そのうちのいくつかの細胞集団は、背側大動脈などの血管形成にも寄与することが知られている。これまでの研究から、1)正常発生過程において、各体節の後半部でNotchシグナルが特異的に活性化している、2)活性化Notchを体節に発現させると、これらの細胞は体節の後半部に局在する。このとき前半部においては細胞死をおこす。3)Notch活性化細胞はその後腹側に移動し、最終的には背側大動脈の血管内皮へと分化する。4)これらの細胞移動は、背側大動脈によって誘因される。5)この細胞移動には、Notchの下流で働くephrinB2が必要である、などを見出している。体節由来のNotch細胞が参入する以前では、背側大動脈は異なる組織(側板中胚葉)に由来する細胞により構成されている。そこで本年度は、昨年度の成果を受け、背側大動脈に辿りついた体節後半部由来細胞の、その後の運命を追跡した。この目的のために、最近我々が開発したトランスポゾンTol2-Tet-in ovoエレクトロポレーション法を組み合わせた(Sato, et. al., Dev. Biol.,2007'Watanabe, et. al.,Dev. Biol.,2007).この方法を用いると、導入遺伝子が染色体上に安定的に組み込まれ、かつ発現時期を人工的にコントロールできる。解析の結果、Notch活性細胞は、分節パターンに従って背側大動脈に移動した後、徐々に背側大動脈の広域領域に拡がり、最終的には側板中胚葉由来の細胞をおしのけて動脈すべての内皮組織を構築することがわかった。血管形成過程における細胞のふるまいとその分子メカニズムに関して、全く新しい知見を得ることができた。脊椎動物を特徴づける現象のひとつに、からだの前後軸に沿って繰り返し配置される構造がある。この繰り返し構造は、体節とよばれる中胚葉組織によって構成される。体節は、主に骨格筋や中軸骨格を形成する前駆体であるが、一方で、体節内のある細胞集団は、背側大動脈などの血管形成にも寄与することが知られている。これまでの研究から、体節細胞による背側大動脈の形成過程において、まず体節細胞がNotch活性化を介して、すでに形成されている原始背側大動脈方向に積極的に誘引され、次に移動してきたこれらの体節細胞が背側大動脈全体の内皮細胞を構成するようになることなどを見出してきた。H20年度においては、これらの発見をまとめて学術誌「Developlnental Cell」に発表するとともに、記者発表による全国紙報道をとおして、広く社会に発信した(平成20年6月16日付け日本経済新聞など)。

加えてH20年度においては、体節の分節化のしくみにっいても研究を行った。体節は初期発生過程において、未分節中胚葉組織の前方から一対ずつくびれ切れることにより形成される。我々はこれまでに、このくびれ切れ(境界形成)の現象が、ある一部の細胞同士の相互作用によって引き起こされることを見出している(Development,2002)。本年度は、これらの細胞間相互作用の実体がEph/Ephrinシグナルであること、またEphrinシグナルの下流ではCdc42の活性が抑制されることなどを見出した。本研究により、体節の分節形成、そしてそれに続く体節からの動脈形成という、一連の形態形成を制御する分子カスケードの一端を解明することができた。