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海洋産マクロライドｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙｏｌｉｄｅ　Ｃの触媒的不斉全合成

28年度までに既にleptolyngbyolideと構造的特徴を一部共有する海洋天然物scytophycinCの触媒的不斉形式全合成を完成し,学術誌上で論文として発表している.更に,leptolyngbyolide Cの触媒的不斉全合成を達成した.その中で,各種スペクトルデータと比旋光度の比較から,単離段階でのNMR解析等だけでは決定できなかったすべての立体化学を絶対配置も含めて決定した.今年度はまず上記の成果を論文誌上で公開した.さらに,leptolyngbyolide Cの類縁体合成を検討する中でルート短縮に寄与する可能性のある新たな触媒的不斉反応の開発を行った.カルボニル基α位にビニル基を有する求核種前駆体を基質とした立体選択的アルドール反応の開発事例は少なく,不斉補助基に基づくジアステレオ選択的反応を基軸としたいわゆるEvansアルドール反応が従来頻用されていた.一方で当該基質に対し,原子効率に優れた直接型触媒的不斉アルドール反応を利用した例はこれまで報告がなかった.本研究におけるleptolyngbyolide Cの全合成では,触媒的不斉チオアミドアルドール反応を鍵工程の一つとして採用している.これは一価銅とキラルな二座ホスフィン配位子からなる複合体が,より酸性度の高いαプロトンをもつアルデヒドの共存下でも選択的にチオアミドを活性化・脱プロトン化させるものである.今回はα位にビニル基を有するチオアミドを基質とした場合でも,触媒量のフェノール系添加剤を適切に選択することで高いジアステレオおよびエナンチオ選択性を発現することを見出した.広い基質一般性も確認した上で論文誌上での公開に至った.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。leptolyngbyolide CのC1-C18フラグメントの合成については,最初のステップとして酢酸由来のチオアミドとTBDPS基で保護された3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドを基質とした触媒的不斉チオアミドアルドール反応(所属研究室にて開発)を行い,対応する付加体を95% eeのエナンチオ選択性にて得た.以後これを足掛かりとし,全ての立体化学を適切に制御することが可能となった.特徴的な構造であるジヒドロピラン環部位については,δ-ヒドロキシ-α,β-不飽和アルデヒドに対しヨウ素をプロモーターに用いアリルトリメチルシランをアリル化剤としたallylative cyclization(Yadavら)により構築可能であった.その基質は適切な構造をもつ1級アルコールに対するIr触媒を用いたKrischeのアリル化と,これに続くアクロレインとのクロスメタセシスによって合成することができた.なお,当該フラグメント合成の途上,宮下らにより報告された海洋産マクロライドscytophycin Cの重要中間体であるC7-C18フラグメントの合成に成功し,形式全合成に関する論文として報告している.残るC19-C32についてはプロピオン酸由来のチオアミドを基質とした触媒的不斉チオアミドアルドール反応ジアステレオ選択的を第1工程として合成に着手した.ポリプロピオネート鎖の立体制御は,不斉補助基を用いたジアステレオ選択的クロチル化により行うこととし,反応条件の最適化段階にある.一方,テトラヒドロピラン環部位については既存法を応用した合成に成功しており,クロチル化の条件設定の終了後,クロスメタセシスによる縮合を予定している.leptolyngbyolide Cの絶対配置は未定であるが,近縁の天然物lobophorolideと一致するものと仮定し合成を行うこととした.全体計画として本化合物を3つのフラグメントに分割しそれぞれ平成27年度に合成を行うこととしたが,C1-C18フラグメントに関しては触媒的不斉チオアミドアルドール反応,Krischeのアリル化,およびYadavのジヒドロピラン環構築反応を鍵工程とした合成法を確立した.途中,宮下らによる別の天然物の合成中間体の供給も可能となり,論文発表を行った.残り2フラグメントのうち末端のテトラヒドロピラン部位相当についても既存法を応用し合成を終了している.残るフラグメントに関しては触媒的不斉チオアミドアルドール反応とジアステレオ選択的クロチル化を鍵工程として採用した効率的合成法が完成しつつある.27年度中に既にleptolyngbyolideと構造的特徴を一部共有する海洋天然物scytophycin Cの北倍的不斉形式全合成を完成し,学術誌上で論文として発表している.今回は前年度の成果に基づきleptolyngbyolide Cの触媒的不斉全合成について検討を継続の上これを達成し,未決定であった立体絶対配置を決定した.全合成においてはほぼ同等の構造上の複雑さをもつ2種のセグメントの触媒的不斉合成を行った後,これらを向山アルドール反応で結合,更に山口マクロラクトン化を行う戦略とした.セグメントの合成においては受け入れ研究機関で開発された,キラルなソフトルイス酸とハードなブレンステッド塩基を組み合わせた触媒を用いたダイレクト型チオアミドアルドール反応を基軸とし,合成初期の段階で鍵となる立体化学の制御を行った.本反応はα位水素の酸性度が高いアルデヒド存在下,酢酸もしくはプロピオン酸由来のチオアミドを選択的に活性化しエノラートを形成させ,更に単純な構造の基質では極めて高いジアステレオ選択性,およびエナンチオ選択性を発現するものであった.

天然物合成において今回利用したアルデヒドはより複雑な構造を有するものであったが,細部にわたる条件最適化により既報とそん色ない選択性を得ることが出来た.生じた立体化学を足掛かりに残りの不斉点も構築し,効率よくセグメント合成が達成された.途上,Krischeのアリル化,YadavのDHP環構築,および交差メタセシス反応等を重要な工程としている.また,各種スペクトルデータと比旋光度の比較から,単離段階でのNMR解析等だけでは決定できなかったすべての立体化学を決定した.成果は既に論文投稿を終えており,平成29年度中に公開予定である.当初の目的としたleptolyngbyolide Cの触媒的不斉全合成を達成し,その絶対立体配置を決定することができた.28年度までに既にleptolyngbyolideと構造的特徴を一部共有する海洋天然物scytophycin Cの触媒的不斉形式全合成を完成し,学術誌上で論文として発表している.更に,leptolyngbyolide Cの触媒的不斉全合成を達成した.その中で,各種スペクトルデータと比旋光度の比較から,単離段階でのNMR解析等だけでは決定できなかったすべての立体化学を絶対配置も含めて決定した.今年度はまず上記の成果を論文誌上で公開した.さらに,leptolyngbyolide Cの類縁体合成を検討する中でルート短縮に寄与する可能性のある新たな触媒的不斉反応の開発を行った.カルボニル基α位にビニル基を有する求核種前駆体を基質とした立体選択的アルドール反応の開発事例は少なく,不斉補助基に基づくジアステレオ選択的反応を基軸としたいわゆるEvansアルドール反応が従来頻用されていた.一方で当該基質に対し,原子効率に優れた直接型触媒的不斉アルドール反応を利用した例はこれまで報告がなかった.本研究におけるleptolyngbyolide Cの全合成では,触媒的不斉チオアミドアルドール反応を鍵工程の一つとして採用している.これは一価銅とキラルな二座ホスフィン配位子からなる複合体が,より酸性度の高いαプロトンをもつアルデヒドの共存下でも選択的にチオアミドを活性化・脱プロトン化させるものである.今回はα位にビニル基を有するチオアミドを基質とした場合でも,触媒量のフェノール系添加剤を適切に選択することで高いジアステレオおよびエナンチオ選択性を発現することを見出した.広い基質一般性も確認した上で論文誌上での公開に至った.現時点ではほぼ当初の計画通りに合成が進捗し,その上で別の天然物の形式全合成も達成した段階にある.フラグメント合成における個々の工程において,重大な問題は概ね解決したものと考えられ,大量サンプル供給にも特段の困難はない.今後は残されたジアステレオ選択的クロチル化反応の最適化を急ぎ,28年度の初期の段階での全合成の達成と絶対立体化学の確定を見込まれる.年度後半からはより難度の高いleptolyngbyolide A, B, Dの合成に着手したい.さらにより複雑な構造を有するleptolyngbyolide類の合成に着手済みであり,鍵工程となる触媒的不斉ダイレクト型チオアミドアルドール反応でこれまで利用することのできなかったチオアミド側の基質に対する適用範囲を拡大すべく検討を重ねている.既に望む結果が得られつつある.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
マルチパラメトリック拡散光イメージングを用いたがん薬物治療の超早期治療効果予測

我々は乳癌の術前化学療法の臨床研究において、時間分解拡散光スペクトロスコピーイメージング装置(TRS)を用いて、治療前、1-3サイクル後に腫瘍ヘモグロビン濃度(tHb,μM)を計測し、その減少率が大きい治療反応群は非反応群と比較して、病理学的完全奏効率が高いことを報告した。腫瘍では正常組織に比べて水分量(Water,%)が多く、脂肪量(Lipid,%)が低いなど特徴を有し、WaterとLipidは腫瘍間質の浮腫、脂肪代謝を計測する上で重要な指標になる可能性がある。昨年度、ブロードバンドなセンシング技術を採用して光の波長を広げ、マルチパラメトリックな組織代謝パラメータの測定装置(以下TRS-21-6W)の開発が終了し、パイロット研究を実施した。(方法)原発性乳癌患者10名を登録した。腫瘍直上と正常乳腺の組織代謝パラメータを測定し、術前化学療法の開始前および早期(投与数日後、1-3サイクル終了後)に、腫瘍tHb、組織酸素飽和濃度(StO2,%)、Water、Lipidの4項目のマルチパラメータを同時測定した。統計解析はt-検定で行った。(結果)解析可能な症例は7例であった。治療前の腫瘍直上と対側正常乳房の値は、tHb (平均28.5μM±62.1 vs. 18.0μM±39.5, p=0.01), StO2 (平均76.5%±30.3 vs. 82.4%±8.3, p =0.02), Water (平均30.3%±81.3 vs. 16.4%±21.6, p = 0.003), Lipid (平均55.0%±30.5 vs. 66.2%±19.7, p = 0.001)であった。治療開始後2day,1week,および1-3サイクル後のパラメータ変動をFigureに示した。(結語)化学療法後、腫瘍tHbとWaterは低下する一方、Lipidは上昇する傾向にあった。TRS-21-6Wを用いた光学的生体機能の多面的計測により腫瘍の微小環境や薬物の治療効果の特性を数値化・可視化できるものと考える。1.装置の開発:新光学方式TFDRS法を用いた乳房組織中のヘモグロビン、水、脂肪など複数のパラメーターの非侵襲的計測を行う装置と専用のプローブを開発する。現在、半径3mmと6mmの円周上に配置した16本の受光ファイバーとその中心にハロゲンランプを置いた受発光用プローブを開発した。TFDRS方式の拡散光スペクトロスコピーと乳房計測用にカスタマイズしたプローブを開発した。ベッドサイドで計測できるように可搬式計測器を作成した。2.乳がんの早期検出能の検討:新光学方式TFDRS測定法によるプロトタイプを用いて乳がん患者さんの乳房を計測し、光の特性とがん組織の相関を検討した。まず6人の患者さんの乳房測定を実施し、安全性を確認した。担癌乳房は病変部を含む4cm×4cmの範囲をグリッド上に25ポイント測定し、その範囲のヘモグロビン濃度をマッピングした。また正常乳房の計測は病変部の対称となるようにグリッドマッピングした。またヘモグロビン濃度について比較するため、TRS20(浜松ホトニクス製)を用いて同部位を計測し、TFDRS方式との計測値の違いを検討した。結果:TFDRS方式を用いた拡散光スペクトロスコピーにより正常乳房(0)と担癌乳癌(1)の組織酸素飽和度(SO2)と組織ヘモグロビン濃度(tHb)を測定した。両群において有意差は認められなかった。一方、TRS20では、酸素飽和度は担癌乳房で平均値73.5%(SD3.8)、正常乳房で平均値72.5%(SD3.3)、p値0.1であった。組織ヘモグロビン濃度は担癌乳房で平均値26.1uM(SD7.9)、正常乳房で平均値16.7uM(SD8.0)、p値<0.0001であった。TRS20で同部位を計測した値と、TRDRS方式で計測した値を比較したところ、酸素飽和度の相関関係は相関係数でR=0.2977, p=0.044、組織ヘモグロビン濃度でR=0.3224, p=0.0019であった。データの測定内容に差が出たため、プローブに問題があると思われた。現在改良中である。一方、症例登録は順調に進み、データの蓄積が可能となった。近赤外光イメージング装置(浜松ホトニクスTRS20)を用いて、抗がん剤投与後24時間後から7日間の乳がん組織の酸素化ヘモグロビン濃度の変化を測定したところ、抗がん剤に感受性の高い乳がんでは、組織の酸素化ヘモグロビンが一時的に増加する現象を発見した。一方、抗がん剤に反応しない乳がんでは、この現象が見られない。我々はこの現象を酸素化ヘモグロビンの“フレア現象"と呼び、抗がん剤感受性のバイオマーカーになるのではないかと考えている。

対象:化学療法が必要な局所進行および転移・再発乳がん患者で、臨床研究参加の同意が得られた者(目標40名)TRS装置による測定は治療前、抗がん剤投与直後(24時間後を含む)、1週間後、2サイクル後、3サイクル後、4サイクル後、6サイクル後、治療終了後の8回の腫瘍ヘモグロビン動態について評価した。50名の乳癌患者の登録を終了し、術前化学療法を施行している。我々は乳癌の術前化学療法の臨床研究において、時間分解拡散光スペクトロスコピーイメージング装置(TRS)を用いて、治療前、1-3サイクル後に腫瘍ヘモグロビン濃度(tHb,μM)を計測し、その減少率が大きい治療反応群は非反応群と比較して、病理学的完全奏効率が高いことを報告した。腫瘍では正常組織に比べて水分量(Water,%)が多く、脂肪量(Lipid,%)が低いなど特徴を有し、WaterとLipidは腫瘍間質の浮腫、脂肪代謝を計測する上で重要な指標になる可能性がある。昨年度、ブロードバンドなセンシング技術を採用して光の波長を広げ、マルチパラメトリックな組織代謝パラメータの測定装置(以下TRS-21-6W)の開発が終了し、パイロット研究を実施した。(方法)原発性乳癌患者10名を登録した。腫瘍直上と正常乳腺の組織代謝パラメータを測定し、術前化学療法の開始前および早期(投与数日後、1-3サイクル終了後)に、腫瘍tHb、組織酸素飽和濃度(StO2,%)、Water、Lipidの4項目のマルチパラメータを同時測定した。統計解析はt-検定で行った。(結果)解析可能な症例は7例であった。治療前の腫瘍直上と対側正常乳房の値は、tHb (平均28.5μM±62.1 vs. 18.0μM±39.5, p=0.01), StO2 (平均76.5%±30.3 vs. 82.4%±8.3, p =0.02), Water (平均30.3%±81.3 vs. 16.4%±21.6, p = 0.003), Lipid (平均55.0%±30.5 vs. 66.2%±19.7, p = 0.001)であった。治療開始後2day,1week,および1-3サイクル後のパラメータ変動をFigureに示した。(結語)化学療法後、腫瘍tHbとWaterは低下する一方、Lipidは上昇する傾向にあった。TRS-21-6Wを用いた光学的生体機能の多面的計測により腫瘍の微小環境や薬物の治療効果の特性を数値化・可視化できるものと考える。マルチパラメトリックイメージング装置とプローブの改良を進める。生体機能を測定するシステムを構築する。症例集積を進め、データ解析をするとともに、乳癌患者さんの術前化学療法の治療効果モニターリングに測定装置を利用し、繰り返し測定をする臨床研究を立ち上げる。今後は術後病理診断による効果判定の結果をもって、2群で比較をする。今年度は計画通り、主に統計解析や分子生物学的な分析に時間を充てる。測定装置とプローブの不具合が見つかり、改良のために外部発注をかけ、見積もりを立てている。そのため、次年度に予算を繰り越しした。学会参加費の旅費を使用しなかったため改良した測定装置とプローブを導入して、臨床研究を再開する。
三次元多様体の幾何学的手法による研究と展開

本研究では2以上の各nに対して,距離がnとなるようなHeegaard分解が存在することを示したほか,これに関連して距離がnとなる結び目の橋分解が存在することを示した.またこの手法を発展させてkeenと呼ばれる新しい概念を定義した上で距離がnのkeenなHeegaard分解が存在することを示したほかいくらでも橋指数の大きな既約橋分解を持つ結び目が存在する事を示した.また2次元トーラスの相似構造を用いた平坦折り可能な折り紙構成について研究を行いこのような構成方法を定式化したほか,相似構造では構成できない折り紙が存在する事を示した.この他球面曲線の間の距離を定義しこれに関する研究を行った.本研究においては「1.三次元多様体論、特にHeegaard理論における手法の精密化・展開」、と「2.低次元トポロジーにおいてこれまでに得られている様々な成果や定式化をより広い幾何的問題に適用」という二つの目的を設定している。これらに関して次のような成果が得られた。1.Heegaard分解の距離、3次元多様体の絡み目の橋分解の距離に関して、井戸絢子、張娟姫との共同研究により任意の自然数nに対して、距離が丁度nとなるようなHeegaard分解、3次元多様体の絡み目の橋分解が存在することを示した。これらの結果については専門誌Algebraic and Geometric Topology及びTopology and its Applicationsに掲載予定である。また、市原一裕、Yo'av Rieckと共同で一次元球面上の曲面バンドルのファイバーがstrongly acylindricalとなるための条件を与えた。この結果については論文が専門誌Proc.Amer.Math.Soc.に掲載される予定である。その他次の2つの研究を行った:(1)Yo'av Rieckと共同で三次元多様体内の結び目のトンネル数の増大度に関する研究を行った。結果として小さな結び目のトンネル数の増大度が一般化された橋数を用いて表示できることが示せたが、現在この結果を論文にまとめている。(2)高尾和人、小沢誠、張娟姫と共同でいくらでも橋数の高いunstabilized橋分解をもつ結び目が存在することを示した。この結果は現在論文にまとめているところである。2.双曲的3次元多様体のカスプ近傍の構造の記述に用いられた「2次元トーラスの相似構造」による平面折り紙の構成について村井紘子と共同研究を行い、これまでの(n,0)型のもの以外に(p,q)型(但しqは0ではない)の平面折り紙が存在するかどうかを調べた。本研究においては「1.三次元多様体論、特にHeegaard理論における手法の精密化・展開」、と「2.低次元トポロジーにおいてこれまでに得られている様々な成果や定式化をより広い幾何的問題に適用」という二つの目的を設定している。本年度はそれぞれに関して次のような成果が得られた。1.Heegaard分解の距離に関して、井戸絢子氏、張娟姫氏との共同研究でKeenなHeegaard分解と呼ばれる概念を定義して,任意のg(>2)と任意の自然数n(>2)に対して、距離がちょうどnとなるような種数gのHeegaard分解でkeenであるようなものが存在することを示した。この結果については現在論文にまとめている段階である.またこれまでに張娟姫氏、小沢誠氏、高尾和人氏と共同でいくらでも橋数の高い既約な橋分解を持つ結び目が存在することを示しているが、これらの橋分解が安定化の操作でどのように関連するかを明らかにすることができた.この結果については現在論文にまとめている段階である2.双曲的3次元多様体のカスプ近傍の構造を記述するために用いられた「2次元トーラスの相似構造」を用いた平面折り紙の構成について村井紘子と共同研究を行い、3次元多様体内の流れの閉軌道を記述するために導入されたテンプレートにそのような定式化を適用して構成される平面折が存在することを発見した.これらの結果については現在論文にまとめている段階である.本研究においては「1.三次元多様体論、特にHeegaard理論における手法の精密化・展開」、と「2.低次元トポロジーにおいてこれまでに得られている様々な成果や定式化をより広い幾何的問題に適用」という二つの目的を設定している。1.Heegaard分解の距離に関して、井戸絢子、張娟姫との共同研究でKeenなHeegaard分解と呼ばれる概念を定義して,任意のg(>2)と任意の自然数n(>2)に対して、距離がちょうどnとなるような種数gのHeegaard分解でkeenであるようなものが存在することを示した。この結果については現在論文を専門誌に投稿中である.またこのテーマに関連してこのほか結び目のbi-compressibleなザイフェルト曲面に対して距離を定義しその性質について調べたほか曲面の曲線複体の“細かい幾何学(:fine geometry)"に関する研究を行った.またHeegaard分解に関連して三次元球面内の橋分解の多様性に関する研究を行った。2.双曲的3次元多様体のカスプ近傍の構造を記述するために用いられた「2次元トーラスの相似構造」を用いた平面折り紙の構成について村井紘子と共同研究を行い、そのような定式化を適用して構成される平面折が存在することを発見した.これらの結果については現在論文にまとめているところで間もなく専門誌に投稿予定である.またこのテーマに関して,剛体的な折紙(rigid origami)や折紙タイル張り(:origami tessellation)に関する研究を行った.

本研究において目的としていたHeegaard分解の研究に関連して、bi-compressibleなザイフェルト曲面に対する距離、および、三次元球面内の絡み目の橋分解の多様性に関する研究など、当初設定していなかった研究対象が見つかり、それに関する研究を実施、これに関するいくつかの興味深い事実を見つけることができた。このことから「当初の計画以上に進展している」と判断した。本研究においては「1.三次元多様体論、特にHeegaard理論における手法の精密化・展開」、と「2.低次元トポロジーにおいてこれまでに得られている様々な成果や定式化をより広い幾何的問題に適用」という二つの目的を設定している。本年度はそれぞれに関して次のような成果が得られた。1.Heegaard分解の距離に関して、井戸絢子氏、張娟姫氏との共同研究でkeenなHeegaard分解と呼ばれる概念を定義して,任意のg(>2)と任意の自然数n(>2)に対して、距離がちょうどnとなるような種数gのHeegaard分解でkeenであるようなものが存在することを示しこの結果を専門誌に投稿していたが、レフェリー・編集部と何回かのやり取りの後に出版が受理された。現在はこの結果に関連して曲面の曲線複体の局所的な構造に関する研究を推し進めている。また張娟姫氏、小沢誠氏、高尾和人氏と共同でいくらでも橋数の高い既約な橋分解を持つ結び目が存在することを示し、この結界について既に論文を出版しているが、この中で与えられている同じ結び目の異なる既約な橋分解の間の安定化距離を確定することができた。この内容については現在論文を投稿中である。また、これに関連して、結び目の同値な橋分解に関する研究を行っている。2.本年度は低次元トポロジーに関連して、球面上の閉曲線に関する研究を東京大学の伊藤昇氏他と共同して行った。ここでは制限されたライデマイスター移動で互いに移り合う2つの球面曲線の間に、移り合うために必要となるライデマイスター移動の回数で距離を定義し、更に有限型不変量と関係するコード図式で定まる関数を用いて、この距離を評価する方法を得ることができた。また折り紙に関して剛体的な折紙(rigid origami)や折紙タイル張り(origami tessellation)に関する研究を行った.本研究では2以上の各nに対して,距離がnとなるようなHeegaard分解が存在することを示したほか,これに関連して距離がnとなる結び目の橋分解が存在することを示した.またこの手法を発展させてkeenと呼ばれる新しい概念を定義した上で距離がnのkeenなHeegaard分解が存在することを示したほかいくらでも橋指数の大きな既約橋分解を持つ結び目が存在する事を示した.また2次元トーラスの相似構造を用いた平坦折り可能な折り紙構成について研究を行いこのような構成方法を定式化したほか,相似構造では構成できない折り紙が存在する事を示した.この他球面曲線の間の距離を定義しこれに関する研究を行った.
「ポスト・ヒューマン」時代のメランコリー

当計画は、人間の主観性及び人文主義的理想等が疑問視されるいわば「ポスト・ヒューマン」の現代において、芸術、文学、思想の領域で扱われてきたメランコリーの持ちうる意味を探ろうとした。パノフスキー等の「土星とメランコリー」、J.クレール等の「メランコリー:西洋の天才と狂気」の延長線上で、主に絵画的表象の研究がなされた。メランコリーは自己の反省・反射と不可分であり(屈んだ姿勢がその象徴)、それは常に自分と自分を取り巻く環境を巡る懸念を伴う。だがかつてのメランコリー(創造的でもありえる悲しい情熱)がいわゆる鬱に取って代わられたかのような現代、我々はこの(自己)省察の意義について自問する必要がある。2015年度の「ポスト・ヒューマン時代のメランコリー」は、ある意味では極めてヒューマン(「あまりに人間的」)な時代であったバロック期の芸術表現の研究を中心に進められた。夏期にフランスと英国に出張を行い、フランスではシャンティイでプッサン、ナンシーでカラヴァッジォ、ラトゥールとフェティ、英国ではダルウィッチでのプッサン調査ならびにロンドン(The Warburg Institute Library等)における資料収集を行った。この調査結果をもとに、既に準備にかかっていた「カラヴァッジォ/プッサン:鏡とメランコリー」という論考を完成させた(「学術研究」2016年3月刊行)。バロック期のメランコリーの表現を巡る調査が主な成果となる。カラヴァッジオの「悔悛するマリア・マグダレーナ」と幾つかの隠された自画像のメランコリーの表現、及びプッサンのローマ時代の初期作品幾つか(同じく隠された自画像の表現)等を対象とし、両画家の隠された共通点を考察した。年度末の調査はマドリッドとバルセロナで、同じくバロック期の主題と、モダン・アートの主題二つについて行った。一つは、17世紀に一定の需要があった哲学者のメランコリーの表現を巡る調査であり、この時期にしばしば扱われた(笑う)デモクリトスと(嘆く)ヘラクレイトスの想像上の肖像等を調べることになった。マドリッドではリベラ(の「デモクリトス」)とベラスケスの「マルス」、ゴヤ(「黒い絵」のシリーズ等)のメランコリーの表現を調べ、さらにレイナ・ソフィアの図書館で、近代美術関連の資料収集を行った。バルセロナでは、モダン・アートの領域に対象を移した。タピエス財団並びにミロ財団の図書館とアーカイヴで資料を収集。ミロについては、ピカソと比較可能な、1930年代の怪物の表現を巡る調査を行ったほか、ピカソについては、「青の時代」の背景考察も簡単に行った。研究初年度ではあったが論考を一つ完成させることができた。ただ美術関連の分野から始めたため、(詩等)文学の領域の研究はまだ進んでいない。2016年5月に、別課題の研究発表の後ルーアンで、ベラスケスの「デモクリトス」を調査、これは前年度3月のベラスケスを巡る調査の続きとなった。同年末、ドレスデンとフランクフルトで主にレンブラントとその弟子による作品、およびドイツ、オーストリアの表現主義(新即物主義)の作品を巡る調査を行った。また2017年3月には、デュッセルドルフでO.ディクスとJ.ボイス、アムステルダムでレンブラントとテル=ブリュッヘン(及び20世紀ではC.ウィリンクなど)、ウィーンでレンブラント、ロザ(及びバーデンでA.ライナーならびに表現主義関連ではシーレ)関連の調査を行った。ヨーロッパでは昨年5月パリでのクレーのアイロニーを巡る展覧会、あるいは今年のディクス、シーレの企画等、いずれも第一次大戦から100年を経過し、その後の「ヨーロッパ」の運命とその時代の芸術家個人ならびに社会のメランコリー、デプレッションの表象が意識的に展示されていることが確認された。この点についてはできれば次の論文で触れたい。前年度からの17世紀のバロック期の美術作品については、2017年3月末に発表された論文、「<ポスト・ヒューマン>のメランコリー(3):思考の肖像」で、アイロニーを経た哲学者のメランコリーの表象をめぐる調査と研究の結果をとりあえずまとめている。A.ライナー、J.ボイス、ないし(可能な限り)19-20世紀の美術作品を巡っては次の論文で取り組みたいと考えている。他の研究成果をまとめる作業に大きな時間を割く必要があったため、本課題自体の研究は思ったほどは進展していない。今年度の研究対象となった主な芸術家はJ. Beuys, A. Rainerで、当該研究の枠内でようやく二十世紀の芸術家を扱った。この内最初のBeuysについては、「ポスト・ヒューマンのメランコリー(4):ボイスとライナーの傷(正)」という論文を紀要の学術研究第66号に発表している。ライナーについては次年度掲載予定である。どちらもドイツ語圏の現代芸術作家が、それぞれアウシュヴィッツ、ヒロシマ(原爆の写真)を自らのトラウマとして抱え込み、それを作品として表現する(不)可能性に取り組んだかを扱っている。この種の作品において想起されるいわゆるアドルノの「黒の理想」だが、その黒はメランコリーの胆汁の色あるいは日の光が忘れる犯罪の場である(バディウ)。調査を行ったドイツではO.ディクスの回顧展を始め、1920-30年代の芸術の展覧会が多く、現代ドイツにおける歴史意識が確認できた。この他はドガの(女性像などによく表れる)メランコリー、イタリアのノヴェチェント・グループのM.シローニのメランコリーなどをも対象に調査を進めた。

調査、資料収集を行った場所はドイツ(Gemaldegalerie-Berlin [Kunstbibliothek, Friedlander Studien Saal], Staatsgallerie-Stuttgart, Pinakothek der Moderne-Munchen, Lenbachhaus-Munchen, Hamburer-Kunsthalle)、イタリア(Musel del Novecento, Fondazione Boschi de Stefano, Accademia Carrara)、フランス(Musee d'Orsay, Le Petit Palais)アメリカ(The Art Institute of Chicago)等。当計画は、人間の主観性及び人文主義的理想等が疑問視されるいわば「ポスト・ヒューマン」の現代において、芸術、文学、思想の領域で扱われてきたメランコリーの持ちうる意味を探ろうとした。パノフスキー等の「土星とメランコリー」、J.クレール等の「メランコリー:西洋の天才と狂気」の延長線上で、主に絵画的表象の研究がなされた。メランコリーは自己の反省・反射と不可分であり(屈んだ姿勢がその象徴)、それは常に自分と自分を取り巻く環境を巡る懸念を伴う。だがかつてのメランコリー(創造的でもありえる悲しい情熱)がいわゆる鬱に取って代わられたかのような現代、我々はこの(自己)省察の意義について自問する必要がある。新しいテーマを設定しており、それを巡っての資料収集、調査が必要となっている。時代が二つに及ぶので、実施に一定の時間が必要となる。前述の他の研究成果をまとめる作業に早く区切りをつけ、本課題に再び集中できるように準備を整える。ヨーロッパ文学、思想、美術当初は新しいデスクトップ型のコンピュータと関連用品の購入を検討していたが、まだコンピュータが使えること、購入を考えていた年度末多忙だったことから、翌年度にまわした。最大の理由は、年度末にコンピュータを購入する予定だったが、購入を考えた時点で価格が急上昇したため、購入を一時的に見合わせたことである。次に、既に記した通り、研究がやや遅れ気味であることもあり、より支出が大きくなる見込みの今年度のため予備資金をためておこうと考えた。今年度コンピュータ等を購入するか、ないし調査用の旅費等として使用する予定。コンピュータの購入、ないし調査費用、一応現時点で予定しているシンポジウム開催のための資金として使用したい。
近代の城下町都市における文化的景観形成の思想と計画技術

本研究はわが国固有の都市基盤である近世城下町を起源とする城下町都市の明治以降の都市づくりを文脈的に解釈し、その延長上で計画論へと応用する方法論を確立しようとする構想である。そこで歴史的環境を基盤とした文化的景観における継承、破壊あるいは創出の観点から空間履歴、空間利用および議論から近代都市づくりの思想と計画技術を、価値化と評価を切り口として解き明かすことを目的としている。その目的を達成するために以下の諸点について研究を進めた。第一に天守の「利用」からみた文化的景観形成の思想について分析を進めた。藩政期から残る天守が、近代において内部が公開された福山や岡山のケースにおいて、資料をもとに都市社会や市民生活上の意義を検討した。第二に城址の「公園化」における文化的景観形成の思想と計画技術について分析を進めた。城址公園が誕生した契機において、その意義を保存思想の視点から明らかにした。また城址が有する固有の風致の取り扱いや位置づけを切り口として設計、整備、維持管理等の側面から実態的に検討し、風致の破壊を伴う公園設計の存在を明らかにした。第三に橋の架け替えにおける文化的景観形成の度合いについて分析を進めた。藩政期に城下町の中心になった橋を対象として、近代の架け替えにおける文献調査や資料収集を行い、現地の調査を踏まえ、文化的な景観形成の意識の度合いや考え方、また計画理念について検討を行った。資料調査や景観調査において同一対象地で効率的に行うことができた。これまでの研究成果をもとに、調査方法や研究の枠組みを効果的に組み立て、他の研究対象事例に応用して効果的な手法により研究を推進する。特に天守の「利用」や城址の「公園化」において、事例間の時系列化による相関性を分析し、近代化における文化的景観形成の意義を検討する。その目的を達成するため以下の3点について研究を進めた。藩政期から残る天守が、近代において内部が公開されたケースにおいて、当時の都市社会や市民生活上の意義を検討した。例えば和歌山城址では建物がシロアリの被害を受ける一方、物産陳列場の一つとして近代の産業化の一端として利用されていたことが明らかになった。城址公園において城址が有する歴史的風致の取り扱いの観点から公園の設計や整備等について検討した。明石城址では公園管理者が変遷し、段階的に濠が埋め立てられるなど、歴史的風致の滅失の過程を明らかにした。和歌山城址では公園設計において歴史的風致の一部毀損が含まれ、それに対する議論が勃興した経過、また公園整備においてその毀損が回避された経過を明らかにした。第三に橋の架け替えにおける文化的景観創出にみられる思想と計画技術について分析を進めた。藩政期において城下町の中心だった橋を対象に近代の架け替えの経過と景観形成について資料収集を進め、その分析の枠組みを検討した。その目的を達成するため以下の2点について研究を進めた。和歌山城址の公園化の経過、本多静六による和歌山公園の設計思想の抽出、さらにその設計における風致の破壊に対する南方熊楠をはじめとする反対論の展開などを明らかにした。また近代の造園家である長岡安平が設計した千秋公園(久保田城址)や岩手公園(盛岡城址)、本多静六が設計した徳島公園(徳島城址)や和歌山公園(和歌山城址)を対象として、比較対照した相対化分析により、当初は風致を維持する設計だったが、時代を経るごとに風致を破壊する傾向にあったことが明らかになった。

藩政期から残る天守が、近代において内部が公開された福山や岡山のケースにおいて、資料をもとに都市社会や市民生活上の意義を検討した。第二に城址の「公園化」における文化的景観形成の思想と計画技術について分析を進めた。城址公園が誕生した契機において、その意義を保存思想の視点から明らかにした。また城址が有する固有の風致の取り扱いや位置づけを切り口として設計、整備、維持管理等の側面から実態的に検討し、風致の破壊を伴う公園設計の存在を明らかにした。第三に橋の架け替えにおける文化的景観形成の度合いについて分析を進めた。藩政期に城下町の中心になった橋を対象として、近代の架け替えにおける文献調査や資料収集を行い、現地の調査を踏まえ、文化的な景観形成の意識の度合いや考え方、また計画理念について検討を行った。資料調査や景観調査において同一対象地で効率的に行うことができた。これまでの研究成果をもとに、調査方法や研究の枠組みを効果的に組み立て、他の研究対象事例に応用して効果的な手法により研究を推進する。特に天守の「利用」や城址の「公園化」において、事例間の時系列化による相関性を分析し、近代化における文化的景観形成の意義を検討する。
超音波刺激による関節軟骨細胞活性化の可能性と危険性

低出力超音波パルス(LIPUS)が軟骨細胞に及ぼす影響について調べた。具体的には、LIPUSの刺激強度が軟骨細胞のmatrix metalloproteinase-13(MMP13)のmRNA発現に及ぼす影響を解析した。ウイスター系雄ラットの膝関節から関節軟骨を採取し、この採取軟骨をコラゲナーゼ処理して軟骨細胞を単離した。軟骨細胞を単層培養してLIPUS刺激を与えた。単層培養軟骨細胞にはIL-1ベータを無添加、100ピコグラム/ml添加、1000ピコグラム/ml添加し、0、7. 5、30、120 W/cm2の強度でLIPUS刺激を与え、mRNAをReal-time PCRで分析した。その結果、LIPUSはMMP13 mRNAを即時的に抑制した。また、その抑制はLIPUS強度依存生に高まった。理学療法では骨格筋や靭帯、腱、関節包等の軟部組織由来の拘縮状態の関節に対し超音波治療を行うことがあるが、関節軟骨の軟骨細胞を標的とする超音波治療はまだ行われていない。最近、超音波刺激(LIPUS:低出力超音波パルス)が骨芽細胞を刺激し骨折治療において効果的であることが明らかにされた。しかしLIPUSが軟骨細胞に及ぼす影響についてはほとんど調べられていない。超音波刺激強度が適切であると軟骨細胞に良い影響がある可能性があるが、逆に超音波刺激強度が強すぎると生体組織は破壊される危険があるので、低強度のLIPUSでさえも軟骨細胞にとって安全かどうか不明である。そこで今回、理学療法治療への応用を視野に入れ基礎研究を実施した。具体的には、LIPUSの刺激強度が軟骨細胞に及ぼす影響を調べた。体重約100Kgのブタの膝関節から現有のOATS(Arthrex, USA)を用いて骨軟骨柱を複数個採取した。この骨軟骨柱から関節軟骨だけを鈍的に切離し、器官培養した。培養軟骨をLIPUS刺激群と非刺激対照群とに分けメッセンジャーRNAを測定した。LIPUS刺激群では、非刺激モデル対照群と比べMMP13は減少した。一方、Col2a1が減少した。他にもTIMP1、TIMP2、ACAN、MMP1などを測定した。またLIPUS刺激以外にも超音波刺激関連の研究を実施した。加えて国内の学会等に出席して研究に必要な最新で最先端の情報・研究資料を収集するとともに研究成果を発表した。ウイスター系雄ラットの膝関節から関節軟骨を採取した。この採取軟骨をコラゲナーゼ処理して軟骨細胞を単離した。単層培養軟骨細胞にはIL-1ベータを無添加、100ピコグラム/ml添加、1000ピコグラム/m1添加し、0、7.5、30、120W/cm^2の強度でLIPUS刺激を与え、mRNAをReal-time PCRで分析した。その結果、LIPUSはMMP13mRNAを即時的に抑制した。さらにIL-1ベータの濃度にも影響を受けた。加えて国内外の学会等に出席して研究に必要な最新で最先端の情報・研究資料を収集するとともに研究成果を発表した。
可搬型人口弁機能異常診断システムの研究開発

人口弁機能の客観的な診断指標として、筆者らは人口弁音のウィグナー分布に基づく最高瞬時周波数に注目し、その有望性を明らかにしてきた。また最近、従来から知られている8kHz程度までの人口弁音の他に、20kHzから100kHz以上までにおよぶ超音波領域の人口弁音成分を発見し、診断指標への応用可能性も報告した。本研究は、これらの指標の臨床応用評価を進めるためのベッドサイドで使用可能な診断システムを開発評価することを主な目的として行った。人口弁音センサとしては、通常の心音センサの他に特に超音波領域成分の記録用として高域用の加速度センサを使用した。また、心周期計測用に汎用の心電計を用いた。記録分析系はカラーノートパソコンと高速AD変換器をベースとし、アナログ信号処理回路とデータ収集分析用のソフトウェアを新規に開発した。システム全体としては、ベッドサイドの小テーブルに収まるサイズとなり、かつリアルタイムで625kHzまでの超音波領域信号成分を解析する機能を実現した。臨床での評価試験においても十分な操作性が確認され、従来ならオフライン的にしか得られなかった結果が、ベッドサイドで得られるようになった。また、特筆するべき事項として、以前のシステムでは100kHz程度までしか確認できなっかた超音波領域成分が、実は500kHz付近まで存在し、かつ240kHz近傍の成分が特に重要である可能性があることが確認された。これらの成果は、近日中に学会報告する予定である。今後は本システムを積極的に臨床応用し、血栓弁をはじめとする人工弁機能異常のより明確かつ客観的な診断指標の実用化を目指す予定である。
科学捜査におけるヒトインスリン及びインスリンアナログの質量分析法の開発

【背景】社会的反響の大きいインスリン製剤を使用した殺人事件や交通事故の発生に伴い、迅速かつ的確に事件事故に使用した製剤の特定が必要とされている。インスリン製剤の成分であるインスリンヒト及びインスリンアナログはアミノ酸21個からなるA鎖とアミノ酸3032個等からなるB鎖がSS結合でつながった分子量5000以上のペプチドであることから、イムノアッセイ法、HPLCやLC/ESI-MS等で測定されてきた。イムノアッセイ法は抗体の調整、交差反応、多種類分析には不向き等の問題がある。また、HPLCやLC/ESI-MSを用いても、インスリンヒトと分子量が同じインスリンリスプロとの区別は困難である。【目的】本研究ではインスリンヒトおよびインスリンアナログの質量分析の一環として、酵素分解することなくアミノ酸配列解析可能なMALDIインソース分解(以後MALDI-ISD)に着目し、国内で販売されているすべてのインスリン製剤の成分であるインスリンヒトおよびインスリンアナログ6種の定性、定量分析方法を開発する。【意義】本法は科学捜査では他に類を見ないものであり、全国の犯罪捜査にも貢献できるものである。【研究過程】2017年度はインスリン製剤を200400倍希釈したもの1μLをそのまま試料とし、マトリックスDANを用いたMALDI-ISDによってインスリン製剤成分7種の識別が可能であること示した。また、さらに希釈な試料もチップカラムを用いた前処理方法を用いれば識別可能であることも確認した。本法は迅速かつ簡便なMALDI-ISDを利用してヒトインスリン及びインスリンアナログ6種を識別するもので、従来法では困難であった分子量が同じインスリンリスプロとの識別も可能となり、事件事故に使用した付着物の鑑定において有益な方法であることを示した。
内因性アンドロゲンによる去勢抵抗性前立腺がんの発症機序

脂質代謝酵素群の一つであるACSL3は脂肪滴の産生以外にも様々な役割を持つ。ACSL3を前立腺がん細胞に過剰発現、または発現抑制させると、内因性アンドロゲンを合成する酵素群の発現が有意に変動した。ACSL3は去勢抵抗性前立腺がん細胞株において発現が高く、副腎性アンドロゲンで細胞を刺激すると精巣性アンドロゲンの有意な上昇とともに増殖能の亢進が見られた。以上から、ACSL3は副腎性アンドロゲンから精巣性アンドロゲンを合成する酵素群の発現を促進し、腫瘍内のアンドロゲン濃度を維持することにより、去勢抵抗性を獲得していることが示唆された。臨床の前立腺がんではホルモン治療により、大部分のがん細胞にアポトーシスが誘導されるが、生き残った細胞はいずれ再び増殖を始める。最近の報告では、アンドロゲン除去後においても腫瘍内のアンドロゲン濃度は維持されている事やアンドロゲンレセプター(AR)も活性化されているとされ、アンドロゲン非依存性増殖の重要なメカニズムの一つとして注目されている。精巣や副腎などの外来性アンドロゲンに依存しない、内因性のアンドロゲン合成機構の存在が示唆されている。我々は脂質代謝酵素であるACSL3がアンドロゲン応答性があり、ヒト前立腺がん細胞株、およびヒト前立腺がん組織において高発現していることを確認した。ACSL3を過剰発現させると、いくつかのステロイド合成に関わる酵素の発現が上昇し、逆にACSL3の発現を抑制するとこれらのステロイド合成酵素の発現が低下することを確認した。前立腺がんにおいてACSL3が内因性ステロイド合成を制御している可能性があり、その分子レベルでのメカニズムを解析している。前立腺がんはホルモン依存性増殖を特徴とし、アンドロゲンの除去が治療の上で最も有効であるが、やがて耐性を獲得し転移性、難治性となる。前立腺がんではDe novo脂肪酸合成が盛んである事がよく知られている。アンドロゲン枯渇環境下でもがん細胞が増殖できるメカニズムとして、がん細胞がde novo脂肪酸合成系を介して、内因性アンドロゲンを合成することにより、自律性増殖を可能にしているという仮説を立てている。アンドロゲン依存性前立腺がん細胞株LNCaPにおいて、De novo脂肪酸合成酵素の一つであるAcyl-CoA synthetase (ACSL)の発現をノックダウンすると、増殖の抑制が確認された。また、この細胞にACSLを過剰発現させ、安定発現株を得た。この細胞株ではコントロール細胞に比べてde novo androgenesisに関わる酵素群の有意な発現の上昇を認め、アンドロゲン応答性遺伝子群の発現上昇も認めた。現在、細胞と培地の混合物からステロイドを抽出し、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)にてテストステロン、ジヒドロテストステロンの濃度を測定している。また過剰に産生された脂肪酸のリガンドとしての機能を調べるため、その標的となる転写因子や下流遺伝子の同定を進めている。前立腺がんはアンドロゲンが刺激となり増殖が促進される。一方、前立腺がんの治療ではアンドロゲンの除去によりがん細胞の細胞死が誘導されたり、増殖が抑制される。しかし、やがて前立腺がんはアンドロゲン除去に対して耐性となり、再び増殖を獲得する。我々は前立腺がんのアンドロゲン除去療法に対する耐性メカニズムとして、脂質代謝酵素であるlong-chain acyl-CoA synthase 3 (ACSL3)の機能に注目した。ACSL3は通常、アンドロゲンに応答して脂肪酸からacyl-CoAを合成するが、我々はアンドロゲン除去耐性がん細胞株ではACSL3が過剰発現しており、いくつかのアンドロゲン合成酵素を介して、がん細胞内の内因性アンドロゲン濃度を維持していることを見つけた。前立腺がんは主に男性ホルモン(アンドロゲン)によって増殖が制御され、アンドロゲンを除去する(ホルモン療法)ことにより大部分の前立腺がんはアポトーシスを来すことが知られている。臨床的には前立腺がんに対してホルモン療法により一定の治療効果が認められるが、ほとんどの症例はホルモン療法に耐性となり(去勢抵抗性前立腺がん)、やがてがんは進行する。しかし、去勢抵抗性前立腺がんの発症機序には不明な点が多い。最近の研究ではアンドロゲン除去後においても腫瘍組織内のアンドロゲン濃度は維持されており、核内転写因子として働くアンドロゲンレセプターも活性化されていることがわかってきた。さらに、精巣や副腎などのアンドロゲンに依存しない、腫瘍による内因性のアンドロゲン合成機構の存在も明らかとなってきている。我々は脂質代謝酵素のひとつであるLong chainacyl-CoA synthase 3 (ACSL3)がアンドロゲン応答性のある酵素であり、ヒト前立腺がん細胞株と前立腺がん組織において高発現していることを認めた。また、ホルモン療法に耐性を示す前立腺がん細胞株においてもACSL3の顕著な発現亢進が見られた。ACSL3の強制過剰発現細胞では内因性ステロイド合成系遺伝子の発現が亢進し、逆にACSL3の発現を抑制するとそれらが低下した。ACSL3による内因性ステロイド合成系遺伝子群の制御メカニズムとして、acyl-CoAにより活性化されるある転写因子に着目した。この転写因子の発現を抑制したところ、内因性ステロイド合成系遺伝子の発現が低下した。以上から、去勢抵抗性前立腺がんの発症機序として、ACSL3の発現亢進による内因性のアンドロゲン合成の活性化が関わっていることが考えられた。

ACSL3は去勢抵抗性前立腺がん細胞株において発現が高く、副腎性アンドロゲンで細胞を刺激すると精巣性アンドロゲンの有意な上昇とともに増殖能の亢進が見られた。以上から、ACSL3は副腎性アンドロゲンから精巣性アンドロゲンを合成する酵素群の発現を促進し、腫瘍内のアンドロゲン濃度を維持することにより、去勢抵抗性を獲得していることが示唆された。過去の論文報告の結果と一部一致しないところがあり、整合性の解釈をめぐり追加実験が必要なため。腫瘍学細胞株においてACSL3がステロイド合成酵素の発現に影響を与えることが明らかになり、その具体的な分子が判明した。がん細胞における脂肪酸合成の亢進の生物学的意義については未だに不明な点が多い。今回の研究の目的の一つは、脂肪酸合成の亢進によるアンドロゲン代謝への影響を調べる事であるが、今回アンドロゲン代謝に関わる酵素群の発現上昇などが初めて確認された。これらの制御メカニズムや具体的な代謝異常経路はまだ決定されていないが、最終的なアンドロゲン応答性の亢進が確認できたことから、がん細胞自らが代謝のリプログラミングを行うことよりホルモン代謝を生存に有利に導いていることが予想される。予定していた学会参加を一つ、キャンセルしたため、旅費の差額分が生じた。ACSL3もしくはその代謝産物であるAcyl-CoAが何らかの共通の転写因子の発現や活性に影響を及ぼしている可能性があり、現在のその転写因子の同定を行っている。アンドロゲン代謝に関わる酵素群の発現レベルを確認し、責任代謝経路を同定する。また、テストステロン合成に関わる液性因子(コレステロール、脂肪酸、アンドロゲン前駆体など)で細胞を刺激し、どのような因子ががん細胞のアンドロゲン合成に関わっているのかを調べる。過去の報告結果と一部一致しない結果があり、整合性をみるために追加実験が必要であるため、消耗品を追加購入にあてる予定。細胞実験の結果が予想どうりの結果であり、想定していた実験を行う必要がなくなった。よって、関連する実験の物品費を抑制することが出来た。実験結果の普遍性を高めるため、細胞株の種類を増やし、ノックダウンや過剰発現の実験を行う。細胞内アンドロゲンや中間代謝産物の濃度測定のための企業への委託費用など。その他、細胞株の維持、RNA/タンパク発現解析、蛍光染色、免疫組織化学などに必要な材料、キットの購入に使用する。
組織幹細胞から心筋細胞への分化に必要な外的シグナルの解明

組織幹細胞から心筋細胞への分化誘導に必要な細胞外シグナルを明らかにし、効率的な心筋細胞移植法を開発することを目的に研究を行った。われわれは圧負荷培養が組織幹細胞に対し心筋の遺伝子発現を亢進させるか否かを検討にした。また、拍動する細胞に分化したときに細胞内カルシウム動態の解析をFluo-3を細胞内に負荷し、レーザー共焦点顕微鏡を用いて解析した。さらに細胞間の電気的結合を仲介するgap junctionの発現を検討するために細胞内にCalcein-AMを負荷し、ラット新生児心筋細胞との共培養下でのgap junction形成をdye transfer methodにより検討した。まず、C57/BL6マウスの心筋のSCA-1陽性細胞の心筋細胞への分化に及ぼす生理的な圧負荷の影響について検討した。120mmHgの圧負荷培養により、NKX2.5の発現がより早期に、またより強く発現することをRT-PCRによって証明した。次に、C57/BL6マウスの舌筋から0.2%コラゲナーゼ処理により単離した、SCA-1陽性細胞および陰性細胞がDM EM+10%FBSをベースにした培養液に,種々の成長因子(EGF,PDGF-bb、LIF)を加え、37°C、5%CO_2のもとで培養することにより2週間後に心筋特異的マーカーである、NKX2.5,connexin 43,ANPを発現することをRT-PCRおよび免疫染色法で確認した。これらの細胞は自己拍動を起こし、細胞内カルシウム濃度解析により、同期して収縮することが確認された。また、圧負荷はこれらの細胞の自己収縮の頻度を増加させた。さらに、calceinのdye transferが確認され機能的なgap junctionの形成ができていることを確認した。これらの検討により舌由来幹細胞が心筋再生に有用であるとともに生理的圧負荷が分化促進に有用である可能性が示された。6・8週齢のオスC57/BL6マウスの心筋を0.2%コラゲナーゼ中で、30分間振盪し、単離した細胞を表面マーカーSCA-1を用いて磁気分離カラムMACSで分離採取し、10%FBS DMEM培地で培養した。このとき、われわれが自作した圧負荷装置を用いて、120mmHgの高圧を負荷した状態で2-4週間培養したものと、常圧で培養したものを比較検討した。心筋特異的遺伝子、NKX2.5,GATA4,MEF2C,Cx43,ANP,Troponin I, MLC2V, αMHCなどの発現は高圧負荷培養細胞で有意に亢進したが、4週後でも自己拍動する心筋細胞の出現は見られなかった。これらの変化は、ERK阻害薬、Rho kinase阻害薬によっても抑制されず、これら以外の経路を介していることが示され、PI3kinase-AKT-GSK3β-Wntの経路について、阻害薬を用いた検討、および、PI3kinase knockout mouseを用いた検討を進めている。また、培養皿のコーティングにラミニンを用いたものがもっとも心筋の遺伝子発現が亢進することが判明した。これにはインテグリンを介する細胞外からの刺激が関与していると考えられ、受容体の特定、細胞内シグナル伝達経路についてさらに検討を進める予定である。心筋の遺伝子発現が認められるにもかかわらず自己拍動する細胞が認められないことについては、細胞内カルシウム制御タンパクの未発達、収縮タンパクの成熟が不十分などの原因が考えられ、さらに分化、成熟を進める因子の探索を行わなければならない。