hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内1細胞モザイク解析法による樹状突起特異的なガイダンス機構の解明

樹状突起ガイダンスは正確な神経回路形成に必要な過程であるが、その形態の複雑さゆえ研究が進んでいない。本研究はショウジョウバエ嗅覚系「投射神経」を、脳内1細胞モザイク解析法により可視化及び遺伝子操作することで、樹状突起ガイダンスの分子機構を解明することを目的とする。遺伝学的モザイクスクリーニングにより得られたmeigo変異体は、投射神経の樹状突起ガイダンスに顕著な異常を示し、投射領域の正中線側へガイダンス先がシフトした一方で、軸索ガイダンスは正常だった。また、投射神経の前シナプス神経(嗅受容神経)のみを同様のモザイク解析法にてmeigo変異細胞とした結果、非常に類似した表現型を示した。原因遺伝子であるmeigo遺伝子にコードされる蛋白質は小胞体及びゴルジ体に局在し、糖核酸輸送体の機能を持つと共に、他の類似蛋白質には無い特異的な機能があることが示唆されている。本研究は、meigo遺伝子の機能と樹状突起ガイダンス機構の相互関係を解明することを目指す。本研究は、神経回路形成に重要な樹状突起ガイダンスの分子機構の解明を目指すものであり、嗅覚系投射神経において細胞自律的に機能することが必要とされる新規分子Meigoの機能解明を当初の予定としていた。その結果、Meigoは糖核酸輸送体としてだけではなく、小胞体の恒常性維持に重要な分子であることを明らかとした。更にmeigoと遺伝学的相互作用を示す分子を探索するスクリーニングにより、樹状突起ガイダンスにはephrinが特異的にmeigoと遺伝学的相互作用を示すという、予想外の結果を得た。以上の結果は生体内でのephrinの機能が小胞体において制御されることを示唆する初めての研究となった。したがって、Meigoの機能解明だけではなく、Ephrin分子を含めた包括的な樹状突起ガイダンスの分子機構の理解につながったため、当初の計画以上に進展している、と考えられる。本研究はこれまで主にショウジョウバエを用いた遺伝学的なアプローチを行い、生体内における単一細胞レベルでのMeigo分子の機能解明を進めてきた。その結果、嗅覚系投射神経では非常に特徴的な表現型を示し、Ephrinと特異的に相互作用することが明らかとなった。今後は、このMeigoの機能が他の神経、および組織においていかに必要とされるかを解明することは、Meigoの分子機構の一般性をとらえるうえで非常に興味深いと考えられる。また、Meigoの糖核酸輸送体、及び小胞体ストレス応答蛋白質としての機能を更に詳細に解析するためには、生化学的な実験に基づく定性・定量的なアプローチが必要と考えられるため、糖鎖生物学を専門に研究しているグループとの共同研究を計画中である。更に、本研究の過程でEphrinの嗅覚系回路形成における新たな機能が発見されたため、その分子機構についても追究していきたいと考えている。既に遺伝学的モザイクスクリーニングにより得られたmeigo変異体は、投射神経の樹状突起ガイダンスに顕著な異常を示し、投射領域の正中線側へガイダンス先がシフトした一方で、軸索ガイダンスは正常だった。本年度は、嗅受容神経にmeigo変異を誘導した際の表現型解析等により、シナプスのパートナーである投射神経(樹状突起)と嗅受容神経(軸索)のガイダンスには、それぞれ細胞自律的にmeigo遺伝子が必要とされることを明らにした。また、Meigo蛋白質の糖核酸輸送体活性を生化学的な手法で測定するため、酵母での発現を確認し、共同研究により測定が進んでいる。さらに、Meigoによって修飾制御されるターゲット分子の探索を進め、有力な候補を得ている。本研究の成果は「第42回日本発生生物学会(口頭発表)」をはじめとした複数の学会・研究会で発表した。既に遺伝学的モザイクスクリーニングにより得られたmeigo変異体は、投射神経の樹状突起ガイダンスに顕著な異常を示し、投射領域の正中線側ヘガイダンス先がシフトした一方で、軸索ガイダンスは正常だった。また、投射神経の前シナプス神経(嗅受容神経)のみを同様のモザイク解析法にてmeigo変異細胞とした結果、軸索ガイダンスが嗅覚葉の正中線側ヘシフトするという投射神経の樹状突起ガイダンスと非常に類似した表現型を示した。原因遺伝子であるmeigo初遺伝子にコードされる蛋白質は小胞体及びゴルジ体に局在し、糖核酸輸送体の機能を持つと共に、他の類似蛋白質には無い特異的な機能があることが示唆されている。

樹状突起ガイダンスは正確な神経回路形成に必要な過程であるが、その形態の複雑さゆえ研究が進んでいない。本研究はショウジョウバエ嗅覚系「投射神経」を、脳内1細胞モザイク解析法により可視化及び遺伝子操作することで、樹状突起ガイダンスの分子機構を解明することを目的とする。遺伝学的モザイクスクリーニングにより得られたmeigo変異体は、投射神経の樹状突起ガイダンスに顕著な異常を示し、投射領域の正中線側へガイダンス先がシフトした一方で、軸索ガイダンスは正常だった。また、投射神経の前シナプス神経(嗅受容神経)のみを同様のモザイク解析法にてmeigo変異細胞とした結果、非常に類似した表現型を示した。原因遺伝子であるmeigo遺伝子にコードされる蛋白質は小胞体及びゴルジ体に局在し、糖核酸輸送体の機能を持つと共に、他の類似蛋白質には無い特異的な機能があることが示唆されている。本研究は、meigo遺伝子の機能と樹状突起ガイダンス機構の相互関係を解明することを目指す。本研究は、神経回路形成に重要な樹状突起ガイダンスの分子機構の解明を目指すものであり、嗅覚系投射神経において細胞自律的に機能することが必要とされる新規分子Meigoの機能解明を当初の予定としていた。その結果、Meigoは糖核酸輸送体としてだけではなく、小胞体の恒常性維持に重要な分子であることを明らかとした。更にmeigoと遺伝学的相互作用を示す分子を探索するスクリーニングにより、樹状突起ガイダンスにはephrinが特異的にmeigoと遺伝学的相互作用を示すという、予想外の結果を得た。以上の結果は生体内でのephrinの機能が小胞体において制御されることを示唆する初めての研究となった。したがって、Meigoの機能解明だけではなく、Ephrin分子を含めた包括的な樹状突起ガイダンスの分子機構の理解につながったため、当初の計画以上に進展している、と考えられる。本研究はこれまで主にショウジョウバエを用いた遺伝学的なアプローチを行い、生体内における単一細胞レベルでのMeigo分子の機能解明を進めてきた。その結果、嗅覚系投射神経では非常に特徴的な表現型を示し、Ephrinと特異的に相互作用することが明らかとなった。今後は、このMeigoの機能が他の神経、および組織においていかに必要とされるかを解明することは、Meigoの分子機構の一般性をとらえるうえで非常に興味深いと考えられる。また、Meigoの糖核酸輸送体、及び小胞体ストレス応答蛋白質としての機能を更に詳細に解析するためには、生化学的な実験に基づく定性・定量的なアプローチが必要と考えられるため、糖鎖生物学を専門に研究しているグループとの共同研究を計画中である。更に、本研究の過程でEphrinの嗅覚系回路形成における新たな機能が発見されたため、その分子機構についても追究していきたいと考えている。
骨延長法の骨成熟過程に対する非浸襲性低出力超音波の影響

【平成10年度に得られた成果】ウサギを用いた骨延長モデルで、低出力超音波(超音波)照射により延長仮骨の成熟が刺激されていたことが、通常骨延長群では単純X線・骨強度試験の結果から、骨成熟不良延長群は単純X線による評価で確認できた。以上の結果を踏まえて、平成11年度はその効果発現機序の検討のため、以下の実験を行った。【平成11年度】実験方法:超音波照射により、肉眼的には仮骨延長部の色調が対照群よりも、やや赤みを帯びていたことから、超音波照射により、血管新生が誘導されている可能性が強く示唆された。これを定量的に評価するため、最も組織新生が活発と思われる時期すなわち、超音波照射後10日目の標本の大腿動脈から硫酸バリウムを処置側後肢に充満させ、micro-CTを用いて仮骨延長部の血管床体積を計測した。micro-CTは50μm幅で仮骨延長部1cmの長さを撮影し、これをコンピューターにより立体構築した。一方、同時期の標本を透過型電子顕微鏡(SEM)でその微細構造を観察した。結果:仮骨延長部の造影剤が充填された血管は、micro-CT画像から立体構築されたものを観察すると、超音波照射群で明らかに体積が大きいことが判明したが、標本数が少ないこと、立体像から面積を計算するソフトウェアーの開発が間に合わなかったことから、本年度中には定量的解析が終了しなかった。現在までに0、2、5、7、及び10日目の標本を各々5羽ずつ計45羽分の標本の内、約半数終了しており,また、ソフトウェアーの開発もほぼ終了している。一方、微細構造をSEMを用いて観察したところ、骨延長中心部の骨芽細胞内のミトコンドリアの数が超音波照射群で統計学的に有意に増加していた。この結果は上記の血管誘導の可能性を示唆する結果とも整合性を持つ。以上の結果から、超音波照射は新生血管を誘導し、かつ、骨形成細胞の好気性代謝を活発にすることで、骨延長仮骨の骨成熟を早めている可能性が、作用機序として考えられた。なお、in situ hybridizationによる組織形態学的検索も同時に行っていたが、現在までにtype Iおよびtype IIコラーゲンの発現を観察したが、両群に有意な差は認めなかった。今後、FGFs等の発現も観察する予定である。平成10年度はまず、骨延長モデルの作成を行い、次に低出力超音波の影響を検索した。1)方法:・骨延長モデルの作成:a.通常延長群:無菌的に骨切りされたウサギ脛骨を創外固定器で固定し、7日間の待機期間の後、一日1mmの骨延長を一日2回の頻度で10日間、つまり合計10mmの骨延長を行った(a.群)。b.骨成熟不良延長群:骨延長を7日間の待機期間を置かずに骨切り翌日から一日3.0mmの骨延長を一日2回の頻度で7日間、つまり合計21mmの骨延長を行った(b.群)。・低出力超音波照射:延長終了翌日から骨延長部に超音波を1日20分間で最大6週間照射した(照射群)。対照群は同じ期間無処置で飼育した(対照群)。なお超音波照射の出力は、照射部の組織温上昇が認められないとされる30mW/cm^2とした。・分析:上記の2群(a.群:54羽;b.群:6羽)に対し、毎週レントゲン撮影し、形成された仮骨面積を測定するとともに、骨延長部の力学的強度試験、組織学的検討を行った。2)結果:a.群での骨延長部はレントゲン上、約3週目に骨成熟に至った。一方、b.群では約4週後に骨癒合が得られるものの、延長中の延長部組織は同時期のa.群に比し、約70%の仮骨面積しか形成されず、成熟度が低いと考えられた。おのおのの群に対し、照射群、対照群の仮骨面積および力学的強度試験を行った結果、a.群では10日目から、b.群では3週目から、仮骨面積は統計学的に有意な差となり、超音波照射により、仮骨の成熟が刺激されていたことが確認できた。

結果:仮骨延長部の造影剤が充填された血管は、micro-CT画像から立体構築されたものを観察すると、超音波照射群で明らかに体積が大きいことが判明したが、標本数が少ないこと、立体像から面積を計算するソフトウェアーの開発が間に合わなかったことから、本年度中には定量的解析が終了しなかった。現在までに0、2、5、7、及び10日目の標本を各々5羽ずつ計45羽分の標本の内、約半数終了しており,また、ソフトウェアーの開発もほぼ終了している。一方、微細構造をSEMを用いて観察したところ、骨延長中心部の骨芽細胞内のミトコンドリアの数が超音波照射群で統計学的に有意に増加していた。この結果は上記の血管誘導の可能性を示唆する結果とも整合性を持つ。以上の結果から、超音波照射は新生血管を誘導し、かつ、骨形成細胞の好気性代謝を活発にすることで、骨延長仮骨の骨成熟を早めている可能性が、作用機序として考えられた。なお、in situ hybridizationによる組織形態学的検索も同時に行っていたが、現在までにtype Iおよびtype IIコラーゲンの発現を観察したが、両群に有意な差は認めなかった。今後、FGFs等の発現も観察する予定である。
筋・骨格形成および造血におけるシェディングの機能解析

本研究では膜型タンパク質分解酵素ADAM17およびADAM10の機能を多岐にわたって解析を行った.本研究結果から,1)ADAM17が成長軟骨の吸収を制御していること,2)ADAM17はIL-1のII型受容体を特異的に切断し,IL-1シグナルを正に制御しうること,また3)ADAM17その活性が転写・翻訳レベルでの制御をほとんど受けないことを明らかにした.一方,ADAM10に関しては,筋衛星細胞の恒常性維持に必須であることを解明した.またこれらの研究と並行し,破骨細胞における小胞体ストレスの機能を解析し,小胞体ストレスセンサーIRE1αを介し破骨細胞分化を制御することを明らかにした.種々の膜型蛋白質は細胞膜上に発現したのち,蛋白質分解作用を受け,可溶型蛋白質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,様々な生命現象に深くかかわっていることが解明されつつある.TACE並びにADAM10はこのectodomain sheddingの中心的な役割を担う酵素であり,研究代表者はこれまで,TACEおよびADAM10遺伝子改変動物の解析を通して本酵素が造血・皮膚・骨など多くの組織・臓器の機能維持にかかわっていることを明らかにした.本研究でプロジェクトでは骨代謝および造血制御に重点を置いて解析を行っている.H24年度は主に以下の研究成果を得た.1)TACEの活性制御メカニズムはTNFαの活性を制御する上でも重要な問題であるが,未だ不明な点が多く残されている,従来はTACEの蛋白質発現レベルとその活性には正の関係があるとされていたが,TACE過剰発現マウスの解析から,これまでの仮説と異なり,TACEの活性は蛋白質発現レベルとは独立していることを示した(Yoda et al.PloS One).2)ectodomainsheddingは個体発生の様々な局面で機能することがこれまでの研究から明らかになっているが,骨成長に関する知見は極めて限られていた.TACEを軟骨細胞特異的に欠損した遺伝子改変動物の解析を通して,TACE-EGFRシグナリングがosteoprotegerin,RANKL,MMP13の発現を制御し,間接的に石灰化した成長軟骨板の吸収を制御することを明らかにした.またTACE-EGFRシグナリングを欠損した結果,長管骨の成長障害をきたすことを動物モデルで示した(Saito et al.PloS One).種々の膜型蛋白質は細胞膜上に発現したのち,蛋白質分解作用を受け,可溶型蛋白質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,様々な生命現象に深くかかわっていることが解明されつつある.本研究プロジェクトではectodomain sheddingの中心的な役割を担うADAM10およびADAM17遺伝子を中心に運動器・造血器などにおける機能解明を目標としている.またこれに併せ,膜型蛋白質を含めた分泌蛋白質全般の品質管理と細胞内恒常性維持に必須の機構である小胞体ストレス応答機構の運動器における機能解明に関わる研究を行っている.25年度は主に以下の研究成果を得た.1.ADAM10は細胞の分化決定,増殖,未分化能維持に関わるとされるNotchシグナルを制御することが,われわれを含めた研究グループから解明されつつあるが,今回われわれは,筋衛星細胞特異的に欠損させた遺伝子改変マウスを作成し,本遺伝子改変マウスでは筋損傷後の回復が著しく阻害されることを見出した.これはADAM10-Notchシグナリングが筋衛星細胞の機能調節に関わっていることを示唆する所見であり,また,in vitroからの実験からもADAM10による筋衛星細胞の未分化能維持に関与するデーターを得ている.次年度に引き続き詳細なメカニズムの検討を行う予定である.2.小胞体ストレス応答は上述のように分泌蛋白質の品質管理に関わる機構であるが,破骨細胞分化過程において小胞体ストレス応答が惹起され,その小胞体ストレス応答にて活性化される分子が破骨細胞分化を正に制御しうることを見出した.本研究結果に関しては現在論文を投稿中である.種々の膜型タンパク質は細胞膜上に発現した後,タンパク質分解作用を受け,可溶型タンパク質として放出されることが知られている.この現象はectodomain sheddingと呼ばれ,様々な生命現象に深く関わっていることが解明されつつある.本研究課題ではADAM10およびADAM17を中心に,骨代謝,筋代謝分野におけるectodomain sheddingの機能解明を目指し研究に従事している.またこれに併せ,分泌タンパク質全版の品質管理と細胞内恒常性維持に必須の機構である小胞体ストレス応答機構の骨代謝における機能解析を行っている.26年度には主に以下の研究成果を得た.1.ADAM10を筋衛星細胞特異的に不活化したマウスを作成し,このマウスが筋損再生能に著しい障害を有することを明らかにした.本遺伝子改変マウスでは筋衛星細胞のNotchシグナリングが低下しており,その結果,筋衛星細胞の未分化状態を維持できなくなり,筋芽細胞に分化してしまうことを見出した.実際,本遺伝子改変マウスでは筋衛星細胞がほぼ完全に消失しており,このことからADAM10が筋衛星細胞の未分化状態を保つのに必須の分子であることが明らかとなった.現在論文投稿中である.2.感染や自己免疫疾患の炎症反応に中心的な機能を担うサイトカインであるIL-1には2種の受容体(IL1R,IL1R2)が存在するが,ADAM17が選択的にデコイ受容体であるIL1R2を切断し,IL-

1シグナルを正に制御していることを明らかにした.3.小胞体ストレスが破骨細胞分化過程において一過性に活性化され,その小胞体ストレス応答にて破骨細胞分化に必須の転写因子であるNFATc1の転写が制御されていることを明らかにした.現在論文投稿中である.本研究課題ではADAM10およびADAM17を中心に,骨代謝,筋代謝分野におけるectodomain sheddingの機能解明を目指し研究に従事している.またこれに併せ,分泌タンパク質全版の品質管理と細胞内恒常性維持に必須の機構である小胞体ストレス応答機構の骨代謝における機能解析を行っている.平成27年度には主に以下の研究成果を得た.1.ADAM10を筋衛星細胞特異的に不活化したマウスを作成し,このマウスが筋損再生能に著しい障害を有することを明らかにした.本遺伝子改変マウスでは筋衛星細胞のNotchシグナリングが低下しており,その結果,筋衛星細胞の未分化状態を維持できなくなり,筋芽細胞に分化してしまうことを見出した.実際,本遺伝子改変マウスでは筋衛星細胞がほぼ完全に消失しており,このことからADAM10が筋衛星細胞の未分化状態を保つのに必須の分子であることが明らかとなった.本論文は平成27年度内に受領済みである(Mizuno et al. J Biol Chem 2015).3.小胞体ストレスが破骨細胞分化過程において一過性に活性化され,その小胞体ストレス応答にて破骨細胞分化に必須の転写因子であるNFATc1の転写が制御されていることを明らかにした.また,小胞体ストレスのセンサー分子として機能するIRE1αを欠失した遺伝子マウスでは,破骨細胞分化に障害が生じ,その結果骨量の増加を呈することを示した.これらの内容は論文として投稿し,本論文は平成27年度内に受領済みである(Tohmonda et al. J Clin Invest 2015).また,これまでの研究から,ADAM17を皮膚から欠損した遺伝子改変動物ではアトピー性皮膚炎に類似した重篤な皮膚炎を呈することが観察されているが,共同研究にて,ADAM17を皮膚から欠損した遺伝子改変動物では,皮膚のバリヤー機能が著しく低下し,その結果皮膚の常在菌のコローニーに異常をきたすことを明らかとした(Kobayashi et al. Immunity 2015).本研究では膜型タンパク質分解酵素ADAM17およびADAM10の機能を多岐にわたって解析を行った.本研究結果から,1)ADAM17が成長軟骨の吸収を制御していること,2)ADAM17はIL-1のII型受容体を特異的に切断し,IL-1シグナルを正に制御しうること,また3)ADAM17その活性が転写・翻訳レベルでの制御をほとんど受けないことを明らかにした.一方,ADAM10に関しては,筋衛星細胞の恒常性維持に必須であることを解明した.
ゲーム理論において現れる不連続な非線形項を持つ放物型方程式系の研究

ゲーム理論において,ナッシュ均衡の概念は解概念として重要な役割を果たしてきた.しかしながら,複数のナッシュ均衡を持つゲームの場合,各プレイヤーはどのナッシュ均衡を選ぶべきかという問題に直面する.これを均衡選択の問題という。この問題を扱うために,Hofbauerはある不連続な非線形項を持つ放物型方程式系の(もとになるゲームのナッシュ均衡に対応する)定数定常解のコンパクト開位相の意味での安定性を用いて空間支配の概念を提案した.ナッシュ均衡が空間支配的であるとは,初期時刻に空間の大部分で他の均衡より優勢であれば,それは最終的に全空間に広がるということを意味する.Hofbauerは2x2ゲームに対して,対応する放物型方程式の連続解の存在性,空間支配の概念の有効性を示したが,一般のゲームに対する連続解の存在性,空間支配の概念の有効性は知られていない.本年度は,まず,一般の対称ゲームの場合に生じる不連続な非線形項を持つ放物型方程式系に対する初期値問題の連続解の存在性を証明した.次に,複数のナッシュ均衡を持つ対称ゲームのあるクラスに対して,対応する放物型方程式系の(ナッシュ均衡に対応する)定数定常解の安定性を議論し,ナッシュ均衡が空間支配的であるための必要十分条件を得た.また,海外での研究活動として,オーストリアのヴィエナ大学のHoermann先生,Hofbauer先生を訪問し,研究課題について共同研究を行った.ゲーム理論において,ナッシュ均衡の概念は解概念として重要な役割を果たしてきた.しかしながら,複数のナッシュ均衡を持つゲームの場合,各プレイヤーはどのナッシュ均衡を選ぶべきかという問題に直面する.これを均衡選択の問題という。この問題を扱うために,Hofbauerはある不連続な非線形項を持つ放物型方程式系の(もとになるゲームのナッシュ均衡に対応する)定数定常解のコンパクト開位相の意味での安定性を用いて空間支配の概念を提案した.ナッシュ均衡が空間支配的であるとは,初期時刻に空間の大部分で他の均衡より優勢であれば,それは最終的に全空間に広がるということを意味する.Hofbauerは2x2ゲームに対して,対応する放物型方程式の連続解の存在性,空間支配の概念の有効性を示したが,一般のゲームに対する連続解の存在性,空間支配の概念の有効性は知られていない.本年度は,まず,一般の対称ゲームの場合に生じる不連続な非線形項を持つ放物型方程式系に対する初期値問題の連続解の存在性を証明した.次に,複数のナッシュ均衡を持つ対称ゲームのあるクラスに対して,対応する放物型方程式系の(ナッシュ均衡に対応する)定数定常解の安定性を議論し,ナッシュ均衡が空間支配的であるための必要十分条件を得た.また,海外での研究活動として,オーストリアのヴィエナ大学のHoermann先生,Hofbauer先生を訪問し,研究課題について共同研究を行った.
ニーマンピック病C型の神経細胞傷害に対するグリア細胞の関与に関する研究

幾つかの神経変性疾患では,神経細胞のみならずアストロサイトを含めたグリアに障害が生じている可能性がある。この病理・病態をヒトを含めて,動物種間でかつ経時的な変化も含めて検討し,新たな治療法の可能性を探ることは,今後神経疾患の病態・治療を研究して行く上で重要な課題である。この点をニーマンピック病C型に関して検討した。ニーマンピック病C型のヒト,マウス,ネコの脳組織を用いて,動物種間でのグリア細胞との係り方の差について比較検討し,動物種による表現型の差を認めた。マウスでは小脳皮質の萎縮とプルキンエ細胞の脱落が著明であり,ヒトC型と類似していた。ネコではプルキンエ細胞への脂質の蓄積は認めるが,細胞の数的減少は少なくこの点で大きく異なっていた。このマウスの症状未出現期に,大脳皮質の神経細胞内とその周辺のマクロファージにユピキチン陽性構造物を検出し,更に白質にも陽性反応を示す構造物を認めた。またアストロサイト内にもユビキチン陽性物質を確認し,神経細胞保護の機能が早期から障害され,その増強と共に死に至る可能性が示唆された。前述の変化は加齢が進むにつれ,より強く広汎に生じていた。しかし,骨髄移植を行った8週齢の羅患マウスでは,細胞間のユビキチン陽性・変性蓄積物が殆ど消失し,同時にマクロファージが神経細胞に隣接する形で認められた。しかし,神経細胞内の蓄積は電顕的には改善されたが,光顕像での改善には乏しかった。移植後はアストロサイトが減少し,蓄積物も消失した。本病では骨髄移植による神経症状の改善は認めないものの,脳内でも異常蓄積物の処理が行われる点が確認された事から,進行の遅い神経変性疾患の中には骨髄移植が臨床的にも有効な例も期待される。幾つかの神経変性疾患では,グリア内に異常な封入体を認め,グリアに障害が生じている可能性が示唆されている。神経細胞のみならずアストロサイトを含めたグリアの病理・病態をヒトを含めて,動物種間でかつ経時的な変化も含めて検討することは,今後神経疾患の病態・治療を研究して行く上で重要な課題と考えられる。本年度はニーマンピック病C型のヒト,マウス,ネコの脳組織を用いて,動物種間での神経細胞とグリア細胞との係り方の差について比較検討した。その結果マウスではヒトと同様に,小脳の変化が強いが,それに対してネコでは乏しい。またイヌでは肝脾腫が目立たなく,ヒトでは振戦が他種に比べると著明でない等,動物種による表現型の差が認められた。脳の病理組織所見は,マウスでは小脳皮質の萎縮とプルキンエ細胞の脱落が著明であり,この所見はヒトC型と類似していた。ネコでは,プルキンエ細胞への脂質の蓄積は認めるが,細胞の数的減少は少なくこの点で大きく異なっていた。このマウスの臨床症状が出現していない時期に,大脳皮質の神経細胞内とその周辺のマクロファージにユビキチン陽性構造物を検出し,更に白質にも陽性反応を示す構造物を認めた。そしてGFAP,ユビキチンの二重染色でGFAP陽性アストロサイト内にもユビキチン陽性物質を確認した。この結果は神経細胞とマクロファージ系への脂質の蓄積と同時に,アストロサイトにも蓄積物質が確認され,神経細胞保護の機能が早期から障害され,その増強と共に死に至る可能性が示唆された。昨年度の研究結果からニーマンピックマウスでは,神経細胞とマクロファージ系への脂質の蓄積と同時に,アストロサイトにも蓄積物質が確認され,神経細胞保護の機能が早期から障害され,その増強と共に死に至る可能性が示唆された。

本年度はこのモデルマウスに骨髄移植を行い,神経細胞の傷害とアストロサイトの関与がどの様に変化するかを検討した。spm/spmマウスでは既に5週齢で大脳および小脳にユビキチン陽性の変性蓄積物を神経細胞周囲の間質に認め,その周囲には陽性のマクロファージが存在していた。8週齢、13週齢と加齢が進むにつれ、前述の変化がより強く広汎に生じていた。しかし,骨髄移植を行った8週齢のspm/spmマウスでは,細胞間にユビキチン陽性の変性蓄積物は殆ど消失しており,正常のコントロールマウスとほぼ同様の所見を示した。なおマクロファージ系の細胞には一部でユビキチン陽性物質の蓄積を認めた。またマクロファージは神経細胞に隣接する形で認めた。しかし,神経細胞での変化は乏しかった。神経細胞の電顕像では,陽性物質はMCB様構造物として認められ,perikaryon, neuropilのいずれにも存在したが,移植後はperikaryonの領域のみ存在した。移植前のアストロサイトの増加は,神経細胞傷害による反応性のものと考えられた。移植後はこのアストロサイトが減少し,かつ蓄積物質は確認できなかった。本病では骨髄移植による神経症状の改善は認めないものの,脳内でも異常蓄積物の処理が行われる点が確認された事から,神経変性疾患の中には骨髄移植が臨床的にも有効な例も期待され,今後の治療法の取組みに示唆を与えるものと考える。
口腔乾燥を誘発する中枢性ノルアドレナリン受容機構の解明

血漿浸透圧の上昇や循環血液量の減少によって口渇感が惹起される。このような現象を生じる原因となる脱水や出血時に、視床下部室旁核や脳室周囲器官の脳弓下器官領域でノルアドレナリンのレベルが上昇し、飲水によって減少されることが報告されている。また不安や焦燥、怒りなど精神的なストレス状態に陥ったときも、のどがからからに渇き口渇感を覚える。安静時の唾液分泌が50%以下に減少すると口渇感が生じるといわれる。ノルアドレナリンはストレス時に交感神経系から分泌され唾液腺に作用することは良く知られているが、ノルアドレナリンは中枢性にも作用し、唾液分泌を調節していると考えられる。唾液分泌量の減少の結果としての口渇感の発生、それに伴う飲水行動の誘発には、脳神経核が強く関与する。我々の講座では、最近、中枢性に唾液分泌が抑制されることを報告している。(Ito et al.,2002)これらのことをふまえ、口腔乾燥感と中枢性ノルアドレナリン受容との関係を明らかにする目的で実験を行った。ラット脳スライス標本を用い、パッチクランプ法にて調べる。膜電流および膜電位固定を行い、脳弓下器官のノルアドレナリンや種々のアドレナリンアナログに対する反応を調べた。ニューロン自体の反応やシナプス入力にどのように作用するかを電気生理学的に調べた。その結果、脳弓下器官ニューロンは、α1アドレナリン受容体を介して、直接興奮性入力を受けていることがわかった。また、GABA作動性シナプス前線維のα2アドレナリン受容体の活性化による抑制性入力の減少により、脳弓下器官ニューロンは興奮性を増していることも判った。唾液分泌と中枢性アドレナリン受容との関係を明らかにすることは今後の問題として残された。精神的ストレス状態に陥ったときに渇きを覚える。交感神経系の緊張は中枢性に延髄のA1,A2領野からカテコールアミン性線維によって脳弓下器官(SFO)に伝えられる。交感神経緊張による唾液は粘稠で少量分泌されるために渇きを覚えるとされているが、中枢性に作用するノルアドレナリン(NA)も渇きの中枢(SFO)などに作用し唾液分泌などの調節に関与しているのではないか。しかし、NAの脳弓下器官(SFO)ニューロンへの作用やその作用がNAのどの受容体を介しているかについて知られていない。従って、これらの問題について調べるためにラット脳スライス標本を用いパッチクランプ法によりNAやそのアナログのSFOニューロンにおける作用について調べた。膜電流固定法では、10100μMのNAの添加によって27例中17例、63%のニューロンが脱分極、6例、22%のニューロンが過分極反応を示した。膜電位固定法では、1100μMのNAの添加によって61例中42例、69%のニューロンが内向き電流、14例、23%のニューロンが外向き電流を発生した。これらの電流はテトロドトキシン存在下でも観察された。内向き電流を発生した37例のニューロンのうち28例において、NA添加中、ランプ波刺激や過分極パルス刺激によって、膜コンダクタンスの変化が認められなかった。同様な現象はα1アドレナリン受容体のアゴニストであるフェニレフリンによっても観察された。また、フェニレフリンによる内向き電流はα1アドレナリン受容体のアンタゴニストであるプラゾシンによってほぼ完全に抑制された。α2アドレナリン受容体のアゴニストであるクロニジンにより、抑制性シナプス電流の頻度が減少したが、振幅の分布には変化がなかった。

従って、SFOにおいて、NAはシナプス前ではα1受容体を介し、シナプス後膜についてはα2受容体を介してその興奮性を修飾していると考えられた。血漿浸透圧の上昇や循環血液量の減少によって口渇感が惹起される。このような現象を生じる原因となる脱水や出血時に、視床下部室旁核や脳室周囲器官の脳弓下器官領域でノルアドレナリンのレベルが上昇し、飲水によって減少されることが報告されている。また不安や焦燥、怒りなど精神的なストレス状態に陥ったときも、のどがからからに渇き口渇感を覚える。安静時の唾液分泌が50%以下に減少すると口渇感が生じるといわれる。ノルアドレナリンはストレス時に交感神経系から分泌され唾液腺に作用することは良く知られているが、ノルアドレナリンは中枢性にも作用し、唾液分泌を調節していると考えられる。唾液分泌量の減少の結果としての口渇感の発生、それに伴う飲水行動の誘発には、脳神経核が強く関与する。我々の講座では、最近、中枢性に唾液分泌が抑制されることを報告している。(Ito et al.,2002)これらのことをふまえ、口腔乾燥感と中枢性ノルアドレナリン受容との関係を明らかにする目的で実験を行った。ラット脳スライス標本を用い、パッチクランプ法にて調べる。膜電流および膜電位固定を行い、脳弓下器官のノルアドレナリンや種々のアドレナリンアナログに対する反応を調べた。ニューロン自体の反応やシナプス入力にどのように作用するかを電気生理学的に調べた。その結果、脳弓下器官ニューロンは、α1アドレナリン受容体を介して、直接興奮性入力を受けていることがわかった。また、GABA作動性シナプス前線維のα2アドレナリン受容体の活性化による抑制性入力の減少により、脳弓下器官ニューロンは興奮性を増していることも判った。唾液分泌と中枢性アドレナリン受容との関係を明らかにすることは今後の問題として残された。
学生相談実践におけるカウンセリングの効果に関する評価方法の開発

日本の学生相談に適したカウンセリング効果の測定手法の開発のために以下の研究を行った。1カウンセリング効果に対する意識調査:学生・教職員を対象に,学生相談のカウンセリング効果に対するイメージについて調査した。2カウンセリング効果の実践における測定:評価尺度であるOQ-45を使用し,日本への適用可能性を検証し,その応用可能性と限界について明らかにした。3先進的取組を行っている学生相談機関への視察調査:活動評価に関して国内外の大学等に対する調査を行った。4尺度作成のための基礎研究:学生相談実践で測定すべき効果について検討し,測定すべき効果の内容について学生相談実践の中から抽出した。平成27年度は,カウンセリングの効果測定への取り組みに向けて,その基盤となる研究を行った。「学生相談におけるカウンセリングの効果をどのようにとらえるか」「その効果をいかに評価するか」という2点を検討するために,質問紙によるカウンセリング効果に対する意識調査(研究1),Outcome Questionare-45.2(OQ-45)を用いた学生相談のカウンセリング効果測定(研究2),各大学の学生相談における効果測定への試みを収集,検討するための視察調査(研究3)を行った。研究1学生相談におけるカウンセリング効果に対する意識調査:学生対象の調査を平成27年11月に実施し,すでに調査を実施していた教職員対象のデータと学生相談カウンセラー対象のデータとともに解析を行った。研究2学生相談におけるカウンセリング効果の測定:アメリカで用いられているカウンセリングの効果測定するための尺度である,OQ-45を学生相談実践で使用し,日本の学生相談への適用可能性を検証した。それをもとに,学生相談において評価すべき効果について具体的に検討を行った。研究3効果測定を実施する学生相談機関への視察:海外視察としては,10月に,Association for University and College Counseling Center Directors(AUCCCD)の年次大会に参加して,アメリカにおける学生相談の評価の実態について調査を行った。また,国内視察としては,12月に,学生相談活動の評価を行っている九州大学キャンパスライフ・健康支援センターを訪問し,学生相談実践の場における運用の工夫,困難事例などについて調査した。本研究課題の進捗状況については,平成27年度の研究実施計画がほぼ達成され,おおむね順調に進展している。当初の計画通り,質問紙によるカウンセリング効果に対する意識調査(研究1),OQ-45を用いた学生相談のカウンセリング効果測定(研究2),各大学の学生相談における効果測定への試みを収集,検討するための視察調査(研究3),の3つの研究を実施した。平成28年度は,日本の学生相談の実践に適したカウンセリングの効果測定の導入に向けて,平成27年度に実施した,学生相談におけるカウンセリング効果に対する学生・教職員・カウンセラーを対象とした意識調査(研究1),Outcome Questionnaire-45.2を用いた学生相談におけるカウンセリング効果の測定(研究2),効果測定を実施する学生相談機関への視察調査(研究3)の各研究成果を踏まえて,カウンセリングの効果測定のための新たな尺度作成(研究4)を行った。研究4日本の学生相談に適したカウンセリングの効果測定のための尺度を作成するために,研究代表者と研究分担者を含むワーキンググループを2回(8月・2月,ともに東京大学にて)開催し,尺度内容について具体的に検討を行った。具体的には,(1)学生相談における初回面接の学生の祖運談内容のテキストデータを分類することで,学生のネガティブな主観的な感情や心身の症状に関するカテゴリを作成し,評価項目を作成する上での材料とした。また,(2)学生生活上で充実感や自らの成長を学生がどのように実感しているかについて,自由記述でデータを収集し,それテキストマイニングによって分析することで,学生の成長と充実感に関するカテゴリを作成し,評価項目を作成する上での材料とした。その後,上記(1)(2)の結果を統合して,学生のネガティブな感情や心身症状,充実感や成長感を測るための尺度項目を選定し,学生相談におけるカウンセリングのアウトカムを測定するための尺度のプロトタイプを完成させた。本研究課題の進捗状況については,平成28年度の研究実施計画がほぼ達成され,おおむね順調に進展している。当初の計画通り,教育的・成長促進的な機能も重視する日本の学生相談に適した新たなカウンセリング効果測定尺度を作成する研究を実施した。平成29年度は,前年度までの研究成果にもとづき,日本の学生相談の実践に適したカウンセリングの効果測定の導入に向けて,OutcomeQuestionnaire-45.2を用いた学生相談におけるカウンセリング効果の測定(研究2),カウンセリングの効果測定のための新たな尺度作成に向けた検討(研究4)を引き続き実施した。研究2:アウトカム評価の尺度であるOQ-45を学生相談実践で用いたデータについて,初回からの利用回数や経過時間によって,問題が改善したクライエントの比率の変化を検討する用量反応(dose-response)分析を実施し,日本の学生相談におけるアウトカム尺度の利用の有用性と限界について具体的に検討した。研究4:平成28年度に作成した,学生相談におけるカウンセリングのアウトカム尺度(プロトタイプ版)の完成に向けて,東海・関東地方の3大学の学生321名を対象に質問紙調査を行い,その妥当性と信頼性について検討した。

3先進的取組を行っている学生相談機関への視察調査:活動評価に関して国内外の大学等に対する調査を行った。4尺度作成のための基礎研究:学生相談実践で測定すべき効果について検討し,測定すべき効果の内容について学生相談実践の中から抽出した。平成28年度は,前年度に実施した研究を踏まえて,日本の学生相談に適した効果測定尺度の作成を目指す(研究4)。具体的には,効果測定尺度を作成し,その尺度の信頼性・妥当性の検証を行う。平成29年度には,前年度までの研究結果を総合し,作成した尺度の運用をして,その有用性について総合的に検討する(研究5)。平成29年度は,前年度までの知見を総合しながら,本研究チームが作成したカウンセリング効果測定尺度の有効な運用方法について,実際の学生相談活動の中で信頼性や妥当性を検証する(研究5)。臨床心理学当初計画に比べて,研究遂行のための物品の購入が遅れたことと,国内の視察先が想定以上に少なく,旅費の使用が抑えられた。当初計画に比べて,旅費の使用が抑えられた。研究遂行のための機器の購入を進め物品費を使用し,成果発表のための学会参加や打ち合わせ会議を行い旅費を使用する予定である。研究遂行のための機器の購入のため物品費を使用し,成果発表のための学会参加や打ち合わせ会議を行い旅費を使用する予定である。
大規模な銀河・QSOサーベイの統計的解析における理論的数値的方法の開発とその応用

銀河分布の直接の観測空間である赤方偏移空間のクラスタリングを用いて宇宙モデルを決定する方法の開発を推し進めた。これにより具体的な解析コードをより完成に近づけて、さまざまに宇宙モデルを変化させた時の効果を取り入れられるようになった。スローンサーベイ等、具体的な観測あるいは観測デザインが与えられた時に、どの程度宇宙モデルを決定できるかを詳細に調べ上げた。その結果、どのような観測により、どのような宇宙の側面が見えるのかを定量的に明らかにした。近年着目されている真空エネルギーの性質を明らかにするための条件として、銀河等、観測される対象の密度と観測体積のバランスの重要性を初めて指摘した。これによりスローンサーベイの中でLRGサンプルはこの条件を満たしていることが明らかになった。大規模構造の統計量のうち、スムージングされた場を用いる一連の方法があるが、これについて重力非線形性の効果を解析的手法により統一的に扱う方法を開発した。これにより現在拡大を続けている大規模構造の観測データに対し、理論的な解析のガイドを提供することが出来るようになった。大規模構造を特徴づける統計量として、分布のトポロジカルな量を用いる方法があるが、これを近年観測可能となってきたweakLensingfieldに初めて応用し、理論的にその特性を調べた。特に非線形領域について数値シミュレーションの方法を用いて宇宙モデルへの保存性を明らかにし、近い将来にこの方法が有力な宇宙論のテストになることを示した。また、宇宙の新しい解析法であるKL変換の方法について、その基本的なコードを発展させた。特に、コードのアルゴリズムに関して大きく改善し、ある有効な近似を用いることにより、計算時間を大幅に短縮させることが可能になった。この進展によりKL変換の有効性がますます高まり、現在、このコードを用いて実際のデータ解析を行っている。また、このアルゴリズムを用いて宇宙論パラメータの制限がどのように可能かを調べるのにフィシャー行列の方法が知られているが、特に宇宙定数の制限について調べた。その結果、SDSSサーベイのLuminous Red Galaxyと呼ばれるサンプルを用いると、驚くほどの宇宙定数の制限を得られることが明らかになった。
Ｕ型側溝等の極限水力の有効利用に向けたハンディタイプ水車の開発

U型傾斜側溝等の浅水流の水力に対して水路を堰止めて入口ノズル付きダリウス水車を設置することを提案し、その運転特性と有効利用の可能性を傾斜角が異なる水路に対して調査した。その結果、次の諸点を得た。(1)提案の水車設置により総流下流体エネルギーの20%30%が発電出力として取り出せる(出力割合は水路傾斜角が小さいほど高い)。(2)水車の落差を適切に評価すれば水路傾斜角に関係なく運転特性が整理できる。(3)垂直形ダリウス水車の高出力化には下流水位に対する没水翼スパン長の最適選定が必要である。(4)傾斜水路での水車設置時には跳水損失を伴うが、落差評価における影響については今後の調査が必要である。本研究では、規格化された側溝の流下水力エネルギーを対象に、小型・軽量で携帯も可能な高出力水車の開発をめざす。これまで没水型水車として開発してきた入口ノズル付きダリウス形水車の設計資料を基に、側溝水力利用の場合には非没水型になることを考慮して5枚のNACA0018対称翼で翼弦長と水車の回転半径との比0.4、翼スパン長150mm、回転直径150mmの水車を絞り角30度で入口幅が回転直径の0.8倍となる入口ノズル付き水車を試作し、側溝を模した幅400mm、高さ450mmの模型水路を用い、次の調査項目について試験した。(1)非没水型である水車の没水下での試験結果は、没水型水車で得られるべき性能より格段に低い値を示した。今後、構造設計の再考から議論したい。(2)水路傾斜角の影響については、水路傾斜角が約1度を超えると、水車上流側では「跳水」が生じることが確認された。そして、その跳水損失の見積もりにより「水路傾斜角による性能評価」が異なってくることが知られた。水車の性能試算上、跳水損失の評価法を明確にしておく必要がある。(3)流下流量の変化による影響については、低流量すなわち浅い水深ほど単位流量当たりの性能が良いことが知られた。これは水車構造と非没水型水車の没水状態の違いよるものと推察された。(4)非没水時の水車下流水深の影響については、当初より水車の一部が非没水状態となることを想定して設計されたためか、高出力・高効率となる最適非没水状態となる下流水深があるとの結果を得た。これは水車の作動原理(出力と損失発生のメカニズム)から論じておく必要があると判断している。側溝での使用を想定したハンディタイプの水車を試作調査し、出力所得は確認されたものの、水路の流れ状態に対する高出力・高効率化に向けた最適水車構造の提案とその設計法の確立については、これからの課題である。本研究では、側溝の極限水力を有効利用するべく、小型・軽量で携帯も可能な高出力水車の開発をめざしており、これまでの非没水型水車として高性能設計法を確立してきた堰き止め式入口ノズル付きダリウス水車のデータをもとに、非没水型水車を試作し、非没水型試作水車の没水時における性能評価、水路傾斜角・流下流量・下流水深の影響について調査し、高性能・高効率化に向けた、今後の研究展開に対する指針を得た。これらの結果を、次年度の研究に結び付ける。本研究では、規格化された側溝の流下エネルギーを対象に、小型・軽量で携帯も可能な高出力水車の開発を目指した。これまで没水型水車として開発してきた入口ノズル付きダリウス水車の試験データを基に、側溝水力利用時に非没水型となることを考慮して、ダリウス翼弦長と回転ピッチ円半径との比が0.4で翼スパン長150mm、回転直径150mm、NACA0018形状の5枚翼から成る水車と絞り角30度で入口幅が回転直径の0.8倍となる入口ノズルを組み込み、その試作水車を幅400mm、高さ450mmの側溝を模した水路を用いて、次の調査項目について試験を行った。(1)非没水型として試作した水車の完全没水下での試験結果は、没水型水車で得られる性能より格段に低い。(2)水路傾斜角が少しでも付くと(>0)射流流下となり、水車付設により上流で「跳水」が生じる。(3)水車性能に及ぼす水路傾斜角の影響については、水路傾斜時の跳水開始点をもとにした水位差による性能評価はゼロ傾斜角時の性能に一致する。「跳水」が性能に及ぼす影響についての考察の必要性とゼロ傾斜角での性能試験で水車性能の評価が可能であることが知られた。(4)ゼロ傾斜角時の水車通過時の流水状況を見ると水車通過後に「超水」が生じていることが確認され、傾斜水路時の「超水」と同様に、性能評価時の水位差に「跳水損失」が含まれることが(3)の性能評価に傾斜角が影響しないことが解明された。(5)水車通過時と下流での非没水状況が性能に及ぼす影響を調べたところ、水車を通過した水が速やかに水車下部を通過し、非没水型を積極的に利用したほうが高性能となることが明らかとなった。(6)水車設置前の流下流速が持つエネルギーと設置時の出力の関係を整理し、ここに開発した水車が流下エネルギーの高出力化に極めて有効であることを示した。

今後は高効率化に向けた最適水車構造について継続調査する.U型傾斜側溝等の浅水流の水力に対して水路を堰止めて入口ノズル付きダリウス水車を設置することを提案し、その運転特性と有効利用の可能性を傾斜角が異なる水路に対して調査した。その結果、次の諸点を得た。(1)提案の水車設置により総流下流体エネルギーの20%30%が発電出力として取り出せる(出力割合は水路傾斜角が小さいほど高い)。(2)水車の落差を適切に評価すれば水路傾斜角に関係なく運転特性が整理できる。(3)垂直形ダリウス水車の高出力化には下流水位に対する没水翼スパン長の最適選定が必要である。(4)傾斜水路での水車設置時には跳水損失を伴うが、落差評価における影響については今後の調査が必要である。今年度の研究で明らかとなった(1)非没水型試作水車の没水状態での低性能の原因については、入口ノズルと水車間の漏れ、水車への流入状態等が推察され、水車構造から再考していく予定である。(2)傾斜水路に発生する水車上流の跳水に関しては、水車性能とは直接関係ないものの、実験と数値計算の両面から水路傾斜角と跳水損失との関係を明らかにし、見積もり精度の向上を図る。(3)流下流量および水車下流水深と性能の関係については、水車の作動原理と損失発生メカニズムと関連付けて考察し、高出力・高効率となる最適非没水状態のデータ取得に努める。そして、その結果をもとにハンディタイプ水車の構造を提案し、その性能を提示したい。流体工学、機械工学
富栄養化防止を目的とした集水域と受水域の対話型システムモデルの開発

閉鎖性水域を、集水域と受水域および各種水質汚濁抑制方法に分けてその各々の構造の解析を行った。その解析に基づいて、閉鎖性水域の全システムのモデルを構築した。その上で、集水域とそれに付属する水処理法と受水域とその水質改善処理法を含みうる集水域と受水域の対話型式の普遍的シミュレーションのプログラムを作成した。1.集水域についてはまず発生負荷の総量とその内容を可能な限り正確に把握することが必要である。その為には、汚濁物質(COD,窒素,リン)の各種の発生源からの発生の原単位とその数量(人数,頭数,面積等)をほぼ行政区域に対応する流域ブロック毎にいかにして正確に調査するかを検討することと並んで、複雑な負荷算出を誤りなく行なう必要がある。ここではその為の表計算の柔軟なマイコンソフトを作成した。表計算は、信頼度表示を含んで学習可能な原単位などのデータベースを持つ。発生量の次に排出率を処理法に応じて入力し、排出量を求める。次に各行政区画間の距離,河川状況等を入力し、河川ネットワークの中での浄化を実態的なモデルに基づいて計算し、流達量を求めるプログラムを付加した。2.各汚濁源よりの総流達量の計算に基づいて、受水域の水質予測を行なうプログラムを作成した。ここでは2種の生態系モデル(1層モデル及び2層モデル)を作成し、Vollenweiderモデルと比較できるものとした。3.この対話型負荷算出富栄養化予測ソフトを用い、相模湖及びその上流地域について予測計算を試み、妥当な結果を得た。
Rhbdl3の機能解析による細胞死研究の新展開

全身性炎症反応症候群の中心的なメディエーターであるTNFαは細胞膜タンパク質として産生されたのち、限定分解をうけることで可溶型の活性化分子として細胞外に放出される。我々は、TNFαによる細胞死に耐性を示す新規分子のスクリーニングを行い、細胞膜内プロテアーゼ・ロンボイドファミリー遺伝子の1つであるRHBDF2を同定した。本研究は、RHBDF2が新たな自然免疫反応の制御分子であることを示した研究である。申請者は、サイクリックパッケージングレスキュー法を用いて、TNF誘導細胞死に耐性となる新規分子の単離を試みたところ、ロンボイドファミリー遺伝子の1つRhbdl3ロンボイドを同定した。ロンボイドは、細胞膜内プロテアーゼであり、進化的には原核細胞から保存されている。また構造的にはポリペプチド鎖が細胞膜を6回もしくは7回貫通する特徴を有し、膜の脂質二重層内で基質蛋白質を切断するプロテアーゼであると考えられているが、ロンボイドファミリー分子の機能はまだ研究が始まったばかりでRhbdl3ロンボイドはエストロゲン受容体陽性の乳癌組織で強く発現することがこれまでに報告されているが機能解析研究に関しては他に報告されていない。そこで、Rhbdl3の過剰発現細胞およびRhbdl3の欠損マウスを作製し、(1)TNFシグナルにおけるRhbdl3の位置づけ、(2)Rhbdl3による細胞死抵抗性はTNF刺激に特異性(3)Rhbdl3の基質の同定(4)Rhbdl3欠損マウスにみられる表現型等を解析することによりRhbdl3の生理機能を明らかにすることを目的としている。これまでに申請者はRhbdl3ホモ欠損マウスが胎生早期に致死となること、さらにRhbdl3はTNFのみならず低酸素刺激による細胞死も抑制すること、Rhbdl3による細胞死抑制は活性酸素の産生抑制を伴うこと、また低酸素刺激によってRhbdl3は転写レベルで著しく亢進することを見出している。現在胎生致死の詳細な原因について検討を行っている。さらに、低酸素シグナルや活性酸素産生シグナルにおけるRhbdl3作用点やRhbdl3依存性の解明について検討を加えていく予定である。自然免疫反応は病原体防御のために必要不可欠な反応であるが、過剰な生体反応は無秩序なサイトカイン産生を誘発し、その結果細菌感染に伴う全身性炎症反応症候群(SIRS)の悪化を引き起こすことが知られている。全身性炎症反応症候群での中心的なメディエーターとしてTNFαを介したシグナル伝達経路が注目されている。TNFαは細胞膜タンパク質として産生されたのち、膜結合型メタロプロテアーゼであるTACE (TNFαconverting enzyme)により限定分解をうけ細胞膜から切り離されることにより可溶型の活性化分子として細胞外に放出される。一方、TNFαシグナルは多くの炎症性疾患に関与することが知られているが、TNFαシグナルの制御に関しては、まだ十分に理解されていないのが現状である。そこで我々は、TNFαによる細胞死に耐性を示す新規分子のスクリーニングをサイクリックパッケージングレスキュース法にて行い、細胞膜内プロテアーゼ・ロンボイドファミリー遺伝子の1つであるRHBDF2を同定した。さらにRHBDF2の過剰発現細胞およびRHBDF2の欠損マウスを作製したところ、RHBDF2はTACEと相互作用することでTNFαの切断を制御する分子であることを見出した。またRHBDF2欠損マウスではLPSによる刺激後、血清中のTNFα濃度の低下が観察され、致死量のLPS投与に対して抵抗性を示した。さらにRHBDF2欠損マウスは細胞内寄生性リステリアに対して免疫応答性の低下を示した。以上の結果よりRHBDF2はTNFαシグナル制御を介した新規の自然免疫反応分子として重要な役割を果たしていると考えられる。これらの研究成果は、現在論文投稿中である。