hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
VR実験室を共有する初等力学の体験型協調学習支援システム

VR技術を用いて複数の学習者が同時に,実際に「体験する」ことが可能な協調学習環境の開発を目的とした.その結果, 1) 2人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法, 2) 3人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法, 3) 2人の学習者がオブジェクトを交互に操作する方法での, 3つのCSCLでのVR実験室のプロトタイプシステムが完成した.評価実験を通じて各タイプのシステムの特徴について明らかにした.VR技術を用いて複数の学習者が同時に,実際に「体験する」ことが可能な協調学習環境の開発を目的とした.その結果, 1) 2人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法, 2) 3人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法, 3) 2人の学習者がオブジェクトを交互に操作する方法での, 3つのCSCLでのVR実験室のプロトタイプシステムが完成した.評価実験を通じて各タイプのシステムの特徴について明らかにした.平成20年度までに,初等力学の分野を対象として,1人の学習者が能動的にVR型の実験環境を操作し,実際に力を感じながら実験と学習が行えるプロトタイプシステムを開発している.本研究課題は,協調学習とグループ学習の概念を導入し,複数人の学習者が同時にVR型の実験環境を共有し,互いに協力しながら操作をし,学習を進めることが可能なシステムの枠組みの設計を行うことが目標であるが,平成21年度は,ひとつのオブジェクトを同時に2人の学習者が操作する題材を想定し,具体的に「てこ」の題材に焦点をあて,遠隔地にある反力提示装置(反力デバイス)2台の同時操作が可能となるプロトタイプシステムの設計を行った.対象教材として「てこ」を用いた初等力学の題材を選択し,2人で「てこ」に対して様々な力をかけることができる環境の構築を行ったその環境を用いて,学習者らは力のつり合いの分野に対して,体験を通した,仮説の設定,実験による検証,法則性の発見などを通じて,知識を習得することが部分的ではあるが,可能となった.具体的には,力のつり合いの公式について,学習者らは操作と状態変化の因果関係を理解し,振る舞いと因果関係に内在する規則を学習する環境のプロトタイプシステムが完成し動作確認を終えている.本プロトタイプシステム上で,2人の学習者は,各々仮想実験室(学習環境構築モジュール,VR環境制御部,反力デバイス制御部の3つのモジュールから成る)を持ち,それぞれ自由に操作できるようになった.今後は,プロトタイプシステムの評価を行う予定である.平成21年度に2人の学習者で仮想環境を共有する(同時にオブジェクトを操作)プロトタイプシステムが完成している.本年度は本システムを用いた学習実験を行い学習効果について検証を行った.具体的には4名の被験者(大学院生,2名づつの2グループ)を選定し実験を実施した.その結果,体験を伴う学習の効果が見られると同時に,協調学習による役割分担と学習促進の一定の効果を確認することができた.また平成21年度に作成したプロトタイプシステムは2人で仮想環境を共有するものであったが,平成22年度ではこれを3人以上の学習者で共有できるように拡張した.具体的には,対象教材として盤面を用いた初等力学の題材に着目し,3人で盤面に対して様々な位置で力をかけることができる環境を構築した.学習者らが力のつり合いの分野に関して,体験を通した仮説の設定,実験による検証,法則の発見などの方法で知識を習得することを支援するプロトタイプシステムが完成した.本プロトタイプシステムを用いることにより,学習者らは力のつり合いの公式に関して,操作と状態変化の因果関係を理解し,振る舞いと因果関係に内在する規則を学習できると考える.対象者は,未修学習者,初修学習者,既修学習者全てであり,未修学習者は対象題材に対して興味を持ってもらいながら体験を行うことができるようになった.初修学習者は学習シナリオにそった実験が可能となり,既修学習者は,複数人数が同時に環境に作用することによる状況の複雑さを伴う新たな体験が可能となった.23年度は実践を通して本拡張システムの評価を行う予定である.平成21年度に2人の学習者で仮想環境を共有する(同時にオブジェクトを操作)プロトタイプシステムが完成し,平成22年度ではこれを3人以上の学習者で共有できるように拡張した.平成23年度ではオブジェクト操作方法に工夫を加え,オブジェクトを同時に操作して学習するタイプと,交互に操作して学習するタイプと両方扱えるようにシステムを拡張しプロトタイプシステムを作成した.これにより,協調学習時におけるオブジェクト操作方法による学習プロセスの差や,学習者の役割の割り当てやその変化等を考察し,より適切な教授戦略を検討することが可能となった.具体的には,ボールのようなオブジェクトのキャッチボールを題材として検討し,投げる行為を行う学習者と,受ける行為を行う学習者とを想定した.2人の学習者はそれぞれ役割が異なり,また役割が入れ替わる事により,さまざまな学習プロセスが発生することを確認した.また評価実験の結果から以下の知見を得た.1)2人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法:2人の場合,傍観者になる学習者が発生せず,体験を伴いながらの効率的な協調学習が発生する.議論(会話)が常に発生し学習活動が促進しやすい.2)3人の学習者がオブジェクトを同時に操作する方法:3人の場合,リーダ役となる学習者が発生した場合,上記の1)と同様な状況が観察される.リーダー役となる学習者がいない場合,傍観者となる学習者が発生し,議論(会話)が発生しないケースもある.役割を与える工夫がシステムに必要となる.

3)複数の学習者がオブジェクトを交互に操作する方法:同時操作のシステムと比較し,投げる側,受ける側と役割が明確になり,議論(会話)が発生しやすくなる.また最初の役割を交代させることにより,さらに議論(会話)が発生しやすくなる傾向が見られた.
海産天然中分子の高効率的合成法の開発と新機能創製

アプリシアトキシン(ATX)、オシラトキシン(OTX)類は、海洋シアノバクテリアから単離された中分子量のポリケチド系天然物である。アプリシアトキシンは、プロテインキナーゼC(PKC)の活性化によって、強力な発ガン促進や炎症作用を示すことが明らかにされているが、オシラトキシン-Dは、L1210細胞に対する細胞毒性があると報告されているがその詳細はまったく明らかでない。本研究では、これらATX/OTX群を統一的に網羅合成することを目的としている。本年度は、合成計画に従ってATX/OTX類に共通の骨格を有する鍵中間体(フェノール性水酸基をTIPSで保護したもの)を、左右のセグメントをカップリングすることで合成した。これを使って、Ferrier転位を介した分子内向山アルドール反応によってスピロエーテル骨格を構築し、まずオシラトキシン-Dとその30-メチル体の全合成に成功した。ついで最近発見された天然類縁体であるオシラトキシン-EとFの世界初の全合成にも成功した。これらの合成は、鍵中間体からわずか数工程という効率の良いものである。また、これら合成品を使った細胞毒性試験を実施し、はじめてそのL1210細胞に対する活性の詳細を明らかにした。さらに、PKCへの親和性を調べたろころ、この細胞毒性はPKCの活性化によるものではないことも明らかにした。本年度は、まずATX/OTX類に共通の骨格を有する鍵中間体を、左右のセグメントをカップリングすることで合成した。次に,Ferrier転位を介した分子内向山アルドール反応によってスピロエーテル骨格を有するオシラトキシン-Eへと変換し、続くエステル交換反応によってラクトン環を導入することでオシラトキシン-Dと30-メチル-オシラトキシン-Dを合成した。さらに本反応の検討過程で,オシラトキシン-Dを弱塩基性条件に付すとラクトン部分の脱離と脱炭酸を伴ってオシラトキシン-Fへと変換されることが判明した。従って,鍵中間体から5段階で4種の類縁体を全合成することに成功した。一方、鍵中間体からアプリシアトキシンへの合成についても検討をすすめた。鍵中間体からブロモ環化反応によってスピロアセタールを形成、ケトンの立体選択的還元によってアプリシアトキシンのセコ酸部分の合成に成功した。しかし、スピロアセタールの不斉中心をアプリシアトキシンの立体配置に異性化することはできていない。アプリシアトキシン(ATX)の合成は、最後にマクロラクトン化(分子内エステル化)をする方針から、内部アルキンを含むマクロリドを合成してから、スピロアセタールを形成する方法へと方針変換する。まず、鍵中間体の合成前駆体(アルキンを含む中間体)を使ってマクロジオリドを形成し、金属触媒を用いたアセチレンとジオールの渡環的なスピロアセタール形成反応を試みる。さらに、ごく最近発見されたATX/OTXの新規類縁体の全合成にも挑戦する。すべて、鍵中間体を使って合成する計画である。ネオデブロモアプリシアトキシンBは、オシラトキシンFのハロラクトン化によって合成し、そのラクトンを加水分解し、ヒドロキシカルボン酸と縮合することで、ネオデブロモアプリシアトキシンAを合成する。

鍵中間体からブロモ環化反応によってスピロアセタールを形成、ケトンの立体選択的還元によってアプリシアトキシンのセコ酸部分の合成に成功した。しかし、スピロアセタールの不斉中心をアプリシアトキシンの立体配置に異性化することはできていない。アプリシアトキシン(ATX)の合成は、最後にマクロラクトン化(分子内エステル化)をする方針から、内部アルキンを含むマクロリドを合成してから、スピロアセタールを形成する方法へと方針変換する。まず、鍵中間体の合成前駆体(アルキンを含む中間体)を使ってマクロジオリドを形成し、金属触媒を用いたアセチレンとジオールの渡環的なスピロアセタール形成反応を試みる。さらに、ごく最近発見されたATX/OTXの新規類縁体の全合成にも挑戦する。すべて、鍵中間体を使って合成する計画である。ネオデブロモアプリシアトキシンBは、オシラトキシンFのハロラクトン化によって合成し、そのラクトンを加水分解し、ヒドロキシカルボン酸と縮合することで、ネオデブロモアプリシアトキシンAを合成する。
ギャップ結合と細胞の増殖,分化との関連およびその遺伝子の発現について

は軟骨様組織の形成が著名で、胞巣上に発育し石灰化する。組織学的には、移植1カ月後は未分化な間様系細胞様細胞が見られ。包巣内にタイプIコラーゲンが認められる。24カ月後に軟骨細胞様細胞が出現し、3カ月後にはメタクロマジ-が明らかになる。3カ月後の石灰化が見られる部位には、タイプXコラーゲンが認められその周囲にタイプIIコラーゲンが豊富に見られ、これらの所見は成長軟骨の分化過程に非常に類似している。従って、この移植腫瘍は軟骨肉腫のon cologyのみならず、ヒト軟骨の初期石灰化機構を研究するうえで極めて有用なモデルとなり得ると考えられる。そこで今回のこの移植腫瘍を用いて、経時的に腫瘍におけるギャップ結合の局在を検索すると共に、細胞の増殖、分化とギャップ結合の局在との関連を抗コネクシン43抗体を用いて免疫組織化学的に検討し、加えてコネクシンのmRNAの発現をin situ hybridization法を用いて検索した。その結果、移植1か月後の腫瘍では、腫瘍中心部の類円形の細胞に小さな点状のギャップ結合の局在が認められた。2か月目では、軟骨細胞様細胞の周囲に移植1か月後腫瘍より多くのギャップ結合が認められた。移植3か月後では、軟骨細胞様細胞に多数のギャップ結合の局在が認められた。また、m-RNAの発現については、移植1、2、3か月後のどの時期の腫瘍でもm-RNAが認められた。この腫瘍におけるギャップ結合の局在は、経時的に数を増したこと、およびコネクシンのm-RNAの発現が認められたことにより、この移植腫瘍の分化過程において軟骨細胞様細胞間のギャップ結合により互いの細胞間に栄養供給や情報伝達がなされ、腫瘍が分化していくであろうと推測された。
心房周囲脂肪における心房細動の進展の解明：肥満犬心房細動モデルを用いた検討

糖尿病や高血圧を含むメタボリック症候群は、全身の炎症の惹起することにより、心房細動の進行に寄与するだけでなく、心房細動の合併症である脳塞栓症のリスクを上昇させる。また、メタボリック症候群やその表現型である心房周囲脂肪が心房筋の電気的、構造的リモデリングを引き起こすことが知られているが、その正確なメカニズムは明らかでない。本研究では、申請者が開発したメタボリック症候群イヌ高頻度心房刺激モデルを用いて、メタボリック症候群によって促進された心房筋の構造的リモデリングの機序を明らかにするともに、その表現型である心房周囲脂肪の心房細動進展における機序を解明する。動物実験:ビーグル犬15頭を対象に高カロリー食を給与し、1012週間の長時間高頻度心房刺激を行う肥満合併長時間高頻度心房刺激群(MetS-L-AF群:5頭)、通常食に長時間高頻度刺激を行う群(L-AF群:5頭)、高脂肪食のみを与える肥満群(MetS群:5頭)に分ける。電気生理学的検査を行い、心内電位や心房細動の誘発性を評価し、組織学的、分子生物学的解析を行う。先行研究の通常食を与えた対照群、高カロリー食を給与し、48週間の短期間高頻度刺激を行ったMetS-S-AF群(5頭)、通常食に短期間高頻度刺激を行ったS-AF群(5頭)とも総合的に比較検討する。臨床研究:カテーテルアブレーション前のMRI画像のADASソフトによる線維化の評価は限界があり、正確には判定が困難であった。現在、MRI画像での線維化定量法を模索している。我々は、心エコー上、右室前面に描出される心外脂肪の厚さがアブレーション後に減少することを報告している。今回の臨床研究では、3次元CT画像上に描出される左房周囲の心外脂肪のアブレーション後の経時的変化についての観察を行っている。現在、MetS群1頭終了し、現在4頭に高カロリー食を給与しMetSモデルを作成中である。MetS群の4頭は67月に電気生理学的検査を行い、その後に組織学的検討を行う予定である。また、1頭はペースメーカ移植を行い通常食を給与し、L-AFモデルを現在作成中である。2019年にL-AF群をさらに2頭、MetS -L-AF群2頭を作成し、2020年に残りのL-AF群2頭、MetS-L-AF群3頭を行い実験終了する予定である。現在、先行研究の組織学的検証は終了した。今後、先行研究と同様に、炎症、線維化関連マーカーの遺伝子解析およびWestern blottingによるタンパク発現に関して行う予定である。心外脂肪からの心房筋への脂肪浸潤が、対照群、S-AF群、MetS-S-AF群と段階的に認められた。線維化も同様の傾向を呈していたが、統計的な有意差を認めなかった。しかしながら、線維化関連マーカーであるI,III型コラーゲン、フィブロネクチン1のmRNAは、段階的に対照群、S-AF群、MetS-S-AF群と増加しており、潜在的な線維化は有意にMetS-S-AF群で高かった。また、組織学的な心外脂肪からの心房筋への脂肪浸潤の程度が、心房筋の障害を反映する左房不応期の短縮と有意に関連していた。以上から心外脂肪からの脂肪浸潤が心房筋障害を促進している可能性が示唆された。臨床研究では、3次元CT画像上に描出される左房周囲の心外脂肪のアブレーション後6ヵ月の解析を10例終了した。心エコーと同様に縮小を認めており、今後も経時的変化についてデータを集積していく。当初の実験計画では、従来の心房ー心室同期ペーシングを応用した方法で心房連続刺激を行うことでAFモデルを作成する予定であった。この方法では心房連続刺激頻度が320/分であったため、線維化が十分作成できなかった。そこで、新規に400/分の高頻度連続刺激を可能である高頻度連続刺激用のペースメーカを購入した。このペースメーカは脳神経刺激用のものであるため、心房リードと接続するコネクションを作製する必要があった。その作成に時間を要したため、やや遅延した。しかしながら、本ペースメーカにより良好な高頻度刺激が得られることから、当初の刺激期間を16週間から1012週間に短縮することとした。刺激期間の短縮により、実験計画全体を短縮することが可能となると考えている。先行研究とほぼ同様の方法で、電気生理学的検査と並行して、組織学的、分子生物学的検証を行うため、今後の研究をスムーズに行うことが可能になると考えている。臨床研究は症例数の集積は連続的に増加しているが、3次元画像作成や解析に時間を要する。画像解析専属のドクターを一人当てることで、さらに研究を推進したいと考えている。

本研究では、申請者が開発したメタボリック症候群イヌ高頻度心房刺激モデルを用いて、メタボリック症候群によって促進された心房筋の構造的リモデリングの機序を明らかにするともに、その表現型である心房周囲脂肪の心房細動進展における機序を解明する。動物実験:ビーグル犬15頭を対象に高カロリー食を給与し、1012週間の長時間高頻度心房刺激を行う肥満合併長時間高頻度心房刺激群(MetS-L-AF群:5頭)、通常食に長時間高頻度刺激を行う群(L-AF群:5頭)、高脂肪食のみを与える肥満群(MetS群:5頭)に分ける。電気生理学的検査を行い、心内電位や心房細動の誘発性を評価し、組織学的、分子生物学的解析を行う。先行研究の通常食を与えた対照群、高カロリー食を給与し、48週間の短期間高頻度刺激を行ったMetS-S-AF群(5頭)、通常食に短期間高頻度刺激を行ったS-AF群(5頭)とも総合的に比較検討する。臨床研究:カテーテルアブレーション前のMRI画像のADASソフトによる線維化の評価は限界があり、正確には判定が困難であった。現在、MRI画像での線維化定量法を模索している。我々は、心エコー上、右室前面に描出される心外脂肪の厚さがアブレーション後に減少することを報告している。今回の臨床研究では、3次元CT画像上に描出される左房周囲の心外脂肪のアブレーション後の経時的変化についての観察を行っている。現在、MetS群1頭終了し、現在4頭に高カロリー食を給与しMetSモデルを作成中である。MetS群の4頭は67月に電気生理学的検査を行い、その後に組織学的検討を行う予定である。また、1頭はペースメーカ移植を行い通常食を給与し、L-AFモデルを現在作成中である。2019年にL-AF群をさらに2頭、MetS -L-AF群2頭を作成し、2020年に残りのL-AF群2頭、MetS-L-AF群3頭を行い実験終了する予定である。現在、先行研究の組織学的検証は終了した。今後、先行研究と同様に、炎症、線維化関連マーカーの遺伝子解析およびWestern blottingによるタンパク発現に関して行う予定である。心外脂肪からの心房筋への脂肪浸潤が、対照群、S-AF群、MetS-S-AF群と段階的に認められた。線維化も同様の傾向を呈していたが、統計的な有意差を認めなかった。しかしながら、線維化関連マーカーであるI,III型コラーゲン、フィブロネクチン1のmRNAは、段階的に対照群、S-AF群、MetS-S-AF群と増加しており、潜在的な線維化は有意にMetS-S-AF群で高かった。また、組織学的な心外脂肪からの心房筋への脂肪浸潤の程度が、心房筋の障害を反映する左房不応期の短縮と有意に関連していた。以上から心外脂肪からの脂肪浸潤が心房筋障害を促進している可能性が示唆された。臨床研究では、3次元CT画像上に描出される左房周囲の心外脂肪のアブレーション後6ヵ月の解析を10例終了した。心エコーと同様に縮小を認めており、今後も経時的変化についてデータを集積していく。当初の実験計画では、従来の心房ー心室同期ペーシングを応用した方法で心房連続刺激を行うことでAFモデルを作成する予定であった。この方法では心房連続刺激頻度が320/分であったため、線維化が十分作成できなかった。そこで、新規に400/分の高頻度連続刺激を可能である高頻度連続刺激用のペースメーカを購入した。このペース
光応答性分子のモジュール化と蛋白質の光制御系構築

外部刺激として光は高時空間分解能にて制御可能である上、非侵襲的な側面を持つことから生体分子制御において有効な手段となる。本研究では、反応性官能基を導入することで光受容蛋白質PYPを由来とする光応答性モジュールを開発した。改変型PYPは蛋白質のモデル分子となる親水性高分子と定量的に反応し、粘性を有するPYP-高分子複合体を形成した。複合体中において改変型PYPは光反応性を保持していることが明らかとなり、光照射に伴う粘度の可逆的な低下が認められた。したがって、光応答性モジュールPYPによる蛋白質制御への足掛りとなるコンセプトを提示すると共に、光応答性材料への応用の可能性を示唆することが出来た。本年度は、非天然アミノ酸を導入した改変型PYPの構築とそれらの物性評価を行った。N末端のメチオニン部位へ非天然アミノ酸L-homopropargylglycine (L-Hpg)を導入したHpg1-PYP(M18A/M91A/M100A/M109A)は、光照射下、非照射下における紫外可視吸収スペクトルおよび円偏光二色性スペクトル測定において、光照射によって450 nm付近の吸光度および楕円率が上昇し、野生型PYPが示すような光応答とは逆の挙動を示した。これについて紫外可視吸収スペクトルの時間分解測定および経時変化を解析した結果、Hpg-PYPは吸光度光反応サイクルを保持しておらず、光応答の可逆性もないことが明らかとなった。そこで、Hpgの導入をN末端に限らず野生型PYPに由来するM18, M91, M100, M109へも同時に導入したHpg5-PYPを新たに調製し、その分子特性評価を行った。まず、L-Hpgを添加したM9最少培地にて大腸菌B834(DE3)株を用いた大量培養を行い、再構築後、Hpg5-PYPを収率10 mg/ 1L cultureで得た。次に、紫外可視吸収スペクトルおよび円偏光二色性スペクトル測定にて解析した結果、Hpg5-PYPは野生型PYPに類似した光応答性を示し、かつ光反応中間体の寿命は野生型と比較して16倍以上長いことが明らかとなった。また、Hpg残基の反応性について評価したところ、5つのアルキニル基のうち23つがアジド基に対する良好な反応性を有していることが示唆された。さらに、PYPのモジュール化に向けて、アルキニル基の代わりにアジド基導入に向けて研究を進めている。これまでに、非天然アミノ酸L-azidohomoalanine (L-Aha)の合成を行い、目的化合物を得ることが出来た。これを用いて、現在、PYPのアジド基導入体を発現および調製法を確立している段階である。本年度は、これまでに構築したモジュール化改変型PYP(Hpg5-PYP)を基盤とした光応答性分子の構築と機能評価を行った。当初の目的であるタンパク質の光操作のモデル実験として、まず、親水性高分子への化学修飾によってHpg5-PYPを導入することを目指した。アルキニル基を有するHpg5-PYPでは、アジド基を有した合成親水性高分子と室温条件下にて高効率でクリック反応が進行し、高分子複合体を得た。また、条件を検討することで最終的にハイドロゲルを形成するに至った。合成親水性高分子と連結した状態のHpg5-PYPは、光中間体の寿命が長くなっていたものの野生型PYPおよび未反応のHpg5-PYPと同様に青色光に対する反応性を持ち、光反応サイクルを有することが分光学的解析から明らかとなった。さらに、水晶振動子による粘弾性計測システムを用いて得られた高分子複合体を解析したところ、青色光照射下では粘度が低下することが明らかとなった。これらの結果は、単にモデル実験としてHpg5-PYPの有効性を示すばかりではなく、タンパク質材料を基盤とした光応答性マテリアルの開発に繋がるものと期待できる。また、前年度までに合成に成功した非天然アミノ酸L-azidohomoalanine (L-Aha)を用い、アジド基を導入したモジュール化改変型PYP(Aha5-PYP)を構築した。質量分析の結果、アジド基導入体もアルキニル基と同様にPYPの5つのメチオニン残基がL-Ahaに置き換わっている分子として得られた。この新規分子は、円偏光二色性および紫外可視吸収スペクトル測定による分光学的解析の結果、野生型PYPおよびHpg5-PYPと同様に青色光に対する反応性を持ち、光反応サイクルを有することが明らかとなった。さらに、親水性合成分子との段階的な化学反応を踏ませることで、Aha5-PYPの多量体の生成も確認出来た。外部刺激として光は高時空間分解能にてコントロールが可能である上、非侵襲的な側面を併せ持つことから、生体分子制御において有効な手段の一つである。本研究では、光受容蛋白質photo active yellow protein (PYP)に着目し、反応性官能基を導入することによって蛋白質を基盤とする光応答性モジュールを開発した。PYPは、分子量が14 kDaと比較的小さく水溶性であり、光照射に伴い大きな構造変化を起こす特長がある。まず、PYPのN末端部位にのみ官能基を導入した改変体を構築した。しかし、分光学的解析にて光応答性が観察されたが明瞭な光反応サイクルの存在は確認できなかった。

一方、分子内に5つのアルキニル基を導入した改変型PYPでは野生型PYPと類似した分光学的特性が観察され、光反応サイクルの存在が明らかとなった。中間体の寿命に関しては、野生型PYPと比較して延長していることが示唆された。本年度は、特に光応答性モジュールとしての反応性を向上させるため、PYPへ導入する官能基、連結の際に用いるリンカーの検討を行い、無触媒下でのクリック反応を利用することで効率良く反応が進むことを見出した。蛋白質制御への足掛りとして改変型PYPを合成親水性高分子へ化学反応を介して連結し、得られた複合体の光応答性を含めた分子特性について議論した。構築した複合体中において改変型PYPは、中間体の寿命が未反応のものと比較して延長していたものの青色光に対する反応性かつ光反応サイクルを有することが分光学的解析から示された。さらに、水晶振動子による粘弾性計測システムを用いて得られた高分子複合体を解析したところ、青色光照射下では粘度が低下することが明らかとなった。これらの結果は、光応答性モジュールの有効性を示すばかりではなく、蛋白質を用いた光応答性マテリアル開発へ貢献するものと期待できる。外部刺激として光は高時空間分解能にて制御可能である上、非侵襲的な側面を持つことから生体分子制御において有効な手段となる。本研究では、反応性官能基を導入することで光受容蛋白質PYPを由来とする光応答性モジュールを開発した。改変型PYPは蛋白質のモデル分子となる親水性高分子と定量的に反応し、粘性を有するPYP-高分子複合体を形成した。複合体中において改変型PYPは光反応性を保持していることが明らかとなり、光照射に伴う粘度の可逆的な低下が認められた。したがって、光応答性モジュールPYPによる蛋白質制御への足掛りとなるコンセプトを提示すると共に、光応答性材料への応用の可能性を示唆することが出来た。前年度に構築したモジュール化改変型PYP(Hpg5-PYP)を用いて、光応答性を有する機能性分子の構築を達成することができた。これについては、現在、論文を準備中である。また、アジド基を有する非天然アミノ酸L-Ahaを導入した新たな改変型PYP(Aha5-PYP)の構築と分子特性評価を達成した。この新規分子については、段階的に化学反応を行うことで多量体形成させ、新たな機能性分子構築への道筋を見出している。蛋白質工学本年度中に達成したモデル実験の結果を踏まえ、標的タンパク質に対してモジュール化改変型PYPの導入を行う。遺伝子工学的手法を用いてPYPを融合させたホスホジエステラーゼでは、既に光応答性付与を実現しており、化学修飾を用いた本方法を用いて更なる光応答性の向上を目指す。また、モデル実験で得られたモジュール化改変型PYPの高分子体としての興味深い光応答挙動をさらに発展させるため、Hpg5-PYPあるいはAha5-PYPを用いて多量体形成を行い、光応答性バイオマテリアルとしての応用を見据えた基礎実験を展開していく予定である。今年度は、研究計画に基づき、アルキニル基を有する非天然アミノ酸L-Hpgを導入した2種類の改変型PYPの構築と分子特性評価を行い、PYPの光応答性モジュール化に向けた研究基盤を構築した。一方、アジド基を有するL-Ahaについては合成が完了した段階であり、本年度中に予定していたPYPへの導入は今後の検討課題となっている。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。本年度中に構築したHpg-PYP、Hpg5-
レプチンの新しい心筋保護作用と治療応用

急性心筋梗塞でのレプチン変化は、梗塞サイズの大きいほどレプチン濃度が変化していなかった。梗塞心筋におけるレプチンは保護的作用を示すことが判明した。レプチンノックアウト(ob)マウスと野性型マウスを比較し、更にobマウスにレプチン投与し、治療効果を解析した。野性型マウス,obマウスにencephalo-myocarditisウイルスを腹腔内投与し、生存率、臓器重量、ウイルス量、心筋内TNFmRNAとNK細胞活性の程度を比較した。更に、obマウスにレプチンをウイルス投与と同時に10日間連日、腹腔内投与し、効果を検討した。野性型の生存率はウイルス接種14日目で78%であったが、obマウスは20%と明らかに低下した。感染4日目で、心、肺、胸腺重量に差はなかったが、脾重量はobマウスで野性型マウスに比較し有意に低下していた。心筋内ウイルス量は、ob群で有意に増加した。ウイルス接種3,10日目で、心筋内のtumor necrosis factor-a(TNF-a)mRNA発現はob群で有意に増加していた。ウイルス接種3日目のNK細胞活性はob群で野性型群に比し低下していた。レプチン投与でTNF-amRNAの抑制とNK細胞活性の上昇が認められた。レプチン欠乏がウイルス感染を増悪させ、レプチン投与により感染を抑制した。レプチンはTNF-aを抑制し、NK細胞活性を賦活化させることにより感染防御に作用することが明らかとなった。STAT3を介して心筋細胞の肥大、増殖、分化に関与し、心筋を保護することを検証する目的で、STAT3遺伝子が心臓に挿入されたマウスを用いた。心筋内ウイルス活性、心筋内インターフェロンーg誘導,TNF-a, Interleukin-1,Interleukin-6遺伝子を、ノーザンブロット法にて、遺伝子レベルでの抑制程度を確認した。STAT3遺伝子の有無での有為な変化は認めなかった。以上から、レプチンは心筋障害因子のTNF-aを抑制することで、心筋保護に作用すると考えた。また、レプチンは感染防御にも作用するので、治療応用できると確信した。レプチンの心血管系疾患との関わりを解析し、心血管系に対する治療法の開発を目的とする。レプチンがgp-130,STAT3を介して心筋細胞の肥大、増殖、分化に関与し、心筋を保護することを検証し、心不全の治療応用の可能性を示した。実験結果は以下のごとくである。心血管系疾患における血中レプチン濃度を検討した。急性心筋梗塞や狭心症では、発症後48時間をピークに上昇するが、約20%の症例で低レプチン血症(<2.5ng/mL)であった。このグループは有意にMaxの心筋逸脱酵素が高く梗塞範囲が大きかった。このように低レプチン血症は心筋梗塞の悪化に関連した。また、動物実験で低レプチン血症と心臓病との関連を調べる目的で、レプチンのノックアウトされたobマウスに心筋炎ウイルスを投与した。

野性型マウスでは2週間以上生存したが、obマウスは6日目で全滅し、心筋炎の増悪を認めた。更に心筋解析で、心筋細胞径がobマウスでは有意に小さくなっていた。野性型は心筋肥大と間質の繊維化がありobマウスではこの適応機構の破綻があった。そこで低レプチン血症は心筋炎、心肥大の防御に重要な役割を持つと考えた。以上心血管系疾患の進展にレプチンは作用し、欠乏状態を補う治療が必要であると考えた。レプチンノックアウト(ob)マウスと野性型(WT)マウスを比較し、更にobマウスにレプチン投与し、治療効果を解析した。WTC57/6Jマウス(n=12),obマウス(n=12)にencephalo-myocarditisウイルスを腹腔内投与(500pfu/マウス)し、生存率、臓器重量、ウイルス量、心筋内TNF-amRNAとNK細胞活性の程度を比較した。更に、obマウスにレプチンをウイルス投与と同時に10日間連日、腹腔内投与(1mg/マウス)し効果を検討した。WTの生存率はウイルス接種14日目で78%であったが、obマウスは20%と明らかに低下した(P<0.05)。感染4日目で、心、肺、胸腺重量に差はなかったが、脾重量はobマウスでWTマウスに比較し有意に低下(P<0.05)していた。心筋内ウイルス量は、ob群で有意に増加した(P<0.05)。ウイルス接種3,10日目で心筋内のtumor necrosis factor-a(TNF-a)mRNA発現はob群で有意に増加していた。ウイルス接種3日目のNK細胞活性はob群でWT群に比し低下していた(P<0.05)。レプチン投与でTNF-amRNAの抑制とNK細胞活性の上昇が認められた。(レプチン欠乏がウイルス感染を増悪させ、レプチン投与により感染を抑制した。レプチンはTNF-aを抑制し、NK細胞活性を賦活化させることにより感染防御に作用することが明らかとなった。STAT3を介して心筋細胞の肥大、増殖、分化に関与し、心筋を保護することを検証する目的で、STAT3遺伝子が心臓に挿入されたマウスを用いた。心筋内炎症性サイトカインとiNOS遺伝子発現,脾臓のNatural Killer Cell活性を測定を経時的に測定する。心筋内ウイルス活性、心筋内インターフェロンg誘導,TNF-a, Interleukin-1,Interleukin-6と心筋障害マーカーANPとBNP遺伝子を、ノーザンブロット法にて、遺伝子レベルでの抑制程度を確認した。STAT3遺伝子の有無での有為な変化は認めなかった。急性心筋梗塞でのレプチン変化は、梗塞サイズの大きいほどレプチン濃度が変化していなかった。梗塞心筋におけるレプチンは保護的作用を示すことが判明した。
環境中に極めて低濃度で存在する芳香族塩素化合物の微生物による無機化技術の開発

本研究は、土壌から直接DNAを抽出し定量的PCR法によって増幅しペンタクロロフェノール(PCP)資化性菌を推定し、菌数を増加させPCP無機化活性を高めるのに適した土壌への添加基質を明らかにすることを目的とした。1)土壌中のDNAの定量的PCR法の確立:PCP分解遺伝子(pcpB)のシークエンスをDNAデータベースとe-mail/DDBJを用いて比較し、最も特異性の高いプライマーを2組設計した。土壌中のDNAは、ドデシル硫酸ナトリウム入り緩衝溶液を用い凍結-融解法で抽出した。アガロースゲル電気泳動によりキメラDNAの可能性の高い10Kb以下のDNA断片を除いた後、スパンカラムで精製した。得られた土壌DNAをPCR法により増幅したところ、予想される大きさの増幅バンドが見られた。pcpB遺伝子を持つFlavobacterium属菌を土壌に添加し、そのpcpB遺伝子の増幅バンドを得るのに成功した。2組のプライマーでnested PCR法を用いることも可能となり、感度が高く培養法(4週間必要)に較べて迅速な(1日)分解菌の検出法が確立した。2)各種基質の添加のPCP資化性菌数への影響:有機物添加により、PCP分解菌数は減少した。3)分解速度の促進一方、各種有機物の添加により、PCP分解速度は促進された。このことより、PCP分解菌は、土壌への基質添加により活性化されることが明らかとなった。以上より、土壌のPCP分解活性は、基質の添加によって高まるものの、それはPCP分解菌数の増加によるものではなく分解菌の活性化によることが明らかにされた。分解菌数と分解活性が必ずしも相関しないことが今後のバイオレメディエーション技術における重要課題であることが明らかにされた。
無限次元表現論及び関連した話題

平成12年度得られた成果:1.滑らかなコンパクト多様体M上のC^k smooth diffeomorphismのなす群Diff^<fk>(M)上にsmooth diffeomorphismの作用で準不変な確率測度μが存在すること,2.Smooth diffeomorphismのなす群Diff(M)の連続ユニタリ表現には,自然な条件の下に稠密なsmooth vectorのなす集合があること,3.上記の結果は自然に非コンパクトな場合にも拡張できること,をもとに平成13年度はこれらに続く問題およびその応用について考えた.それらは下記の通りである.1.上記の測度μから得られた自然表現の既約性,2.μ自身のエルゴード性.これらに関して現在,検討中であるが未だはっきりとした結論は出ていない.また量子力学の第2量子化に伴って現れるcurrent algebraへの応用も期待されるが,こちらも現在検討中である.他方,位相群の帰納極限の問題は平成12年度以降進展し,位相空間の帰納極限と直積構造,あるいは他の代数的構造,測度構造との整合性に関する諸問題の検討と言う形に進んで,現在それぞれに一応の結論がでている.(下記の文献[T.Hirai et al.]を参照のこと)本年度の成果Mを滑らかな多様体、Diff_0(M)をM上の微分同相写像の群でその台がcompactなものの全体とする。(1)Mがcompactなとき。このときはDiff_0(M)は滑らかな微分同相写像の群全体、それをDiff(M)とする、になる。さらにDiff^k(M)をM上のk回微分可能な同相写像の全体とする。これまでDiff^k(M)上にはDiff_0(M)の左平行移動で準不変な確率測度μが存在するとの指摘がShavugulidzeによってなされてきたが、その主張の正当性が確認できた。さらに、これらの結果はDiff^k(M)のある種の部分群にも拡張出来ることが判った。このような拡張可能性を調べておくことは、下記(3)の結果を得るために必要な仕事である。(2)上記の測度はJacobianの滑らかさをもっていることが示され、それにより、任意のDiff(M)の連続ユニタリ表現にはsmooth vectorが稠密に存在することがわかった。このあたりの手法は、通常の局所compact群のユニタリ表現で使われるものを真似たものであるが、calculusはそれらと比べて大変繁雑である。(3)さらに、一般のnon compactな多様体に対しても(2)で得られた結果は、当のDiff_0(M)の表現が、ある自然数kにたいするDiff^k(M)にまで連続的に延長できるとの仮定の下に正しいことがわかった。残された仕事(4)ここしばらくの仕事として、上記のμから自然に作られる正則表現の既約性、あるいはμのエルゴード性を調べることが残っている。平成12年度得られた成果:1.滑らかなコンパクト多様体M上のC^k smooth diffeomorphismのなす群Diff^<fk>(M)上にsmooth diffeomorphismの作用で準不変な確率測度μが存在すること,2.Smooth diffeomorphismのなす群Diff(M)の連続ユニタリ表現には,自然な条件の下に稠密なsmooth vectorのなす集合があること,3.上記の結果は自然に非コンパクトな場合にも拡張できること,をもとに平成13年度はこれらに続く問題およびその応用について考えた.それらは下記の通りである.1.上記の測度μから得られた自然表現の既約性,2.μ自身のエルゴード性.これらに関して現在,検討中であるが未だはっきりとした結論は出ていない.また量子力学の第2量子化に伴って現れるcurrent algebraへの応用も期待されるが,こちらも現在検討中である.他方,位相群の帰納極限の問題は平成12年度以降進展し,位相空間の帰納極限と直積構造,あるいは他の代数的構造,測度構造との整合性に関する諸問題の検討と言う形に進んで,現在それぞれに一応の結論がでている.(下記の文献[T.Hirai et al.]を参照のこと)昨年度得られた成果:1.滑らかなコンパクト多様体M上のC^k smooth diffeomorphismのなす群Diff^k(M)上にsmooth diffeomorphismの作用で準不変な確率測度μが存在すること,3.上記の結果は自然に非コンパクトな場合にも拡張できること、をもとにこれらに続く問題およびその応用について考えた:1.上記の測度μから得られた自然表現の既約性,2.μ自身のエルゴード性.これらに関して現在,検討中であるが未だはっきりとした結論は出ていない.また量子力学の第2量子化に伴って現れるcurrent algebraへの応用も期待されるが,こちらも現在検討中である.他方,位相群の帰納極限の問題はその後進展し,位相空間の帰納極限と直積構造,あるいは他の代数的構造,測度構造との整合性に関する諸問題の検討と言う形に進んで,現在それぞれに一応の結論がでている.(下記の文献[T.Hirai et al.]を参照のこと)
炎症とがん:転写因子NF-κBによる抗アポトーシス機構と発がん促進作用

炎症起因性を持つフォルボールエステルなどの化合物が発癌プロモーターとしての活性を持つことなどから、炎症と発がんとの関連が注目されてきた。NF-κB(nuclear factor κB)は炎症応答遺伝子群の転写活性化因子として知られるが、発がんとがんの進展にも重要な役割を演じている。NF-κBの主要サブユニットであるp65(RelA)は、がん遺伝子c-Relと同じファミリーに属し、またアポトーシス抑制機能を持つ。我々はp65と結合する因子の包括的遺伝子スクリーニングを酵母two-hybrid screening法を用いて実施し、これらの生物機能の解析を進めてきた。その結果、今年度はp65の転写活性化ドメインに結合する因子として新たに転写コレプレッサー蛋白AES/TLE(Groucho related genes)とTAFII蛋白に属すと考えられるFUS/TLSを同定し、作用機構を明らかにした。コレプレッサーとTAFII蛋白の競合作用の発見は一般的な転写制御の立場からも重要な意義を持つ。また、p65中央部分に結合する因子としてすでに同定した53BP2/Bbp/ASPP2のアポトーシス誘導作用とそのがん細胞株での発現の意義を明らかにし、NF-κBのアポトーシス抑制機構には遺伝子発現を必要としない経路があることを確かめた。今後は、NF-κBを中心とする相互作用因子の同定をさらに進めるとともに、これらの分子間相互作用の全体像を細胞という限られた空間の中で解き、NF-κBによる発がんとがん進展のメカニズムとその弱点を明らかにし、新たながん治療開発の基礎を確立したいと考えている。
方位選択エピタキシによる複合面方位構造形成における異種方位領域間の完全分離技術

Si(100)基板上のCeO2薄膜のエピタキシャル成長において、基板表面電位分布制御により、成長する結晶面方位が自由に選択可能となる方位選択エピタキシの応用研究を進めた。電子ビームを照射して局所的に表面電位を変化させる方法を採用し、Si(100)基板上にCeO2(100)と(110)領域の複合面方位構造の形成に成功した。この2つの面方位領域間に両方の方位成分を含んだ遷移領域が存在し、その幅がSi基板の比抵抗の対数に比例して縮小することが分った。絶縁基板上Si層にリソグラフィにより溝を設けてSi島を形成して、複合面方位領域間を完全分離することが再現性良く実現できることを実証した。電子ビーム誘起方位選択エピタキシャル成長法により、シリコン(100)基板上にCeO2(100)とCeO2(110)領域から成る複合面方位構造形成の研究を進め、両領域間に存在する遷移領域の大きさを支配している基板表面電位分布の拡がりを決定する要因の解析を進めた。本研究による複合面方位構造形成技術のデバイスプロセスへの応用性を高めるためには遷移領域幅を大幅に縮小乃至は無くする必要がある。そこで先ず、低速電子銃のアパーチュアの内径を変化させて、1 mm迄小さくする検討を行い、電子ビーム照射サイズの精密制御を図った。遷移領域幅とシリコン基板の比抵抗の関係を詳細に検討し、その幅が比抵抗の対数に比例して減少し、電子ビーム径程度まで縮小できることが明らかとなった。更に、抜本的に遷移領域を縮小するために、絶縁層上シリコン膜(Silicon-on-Insulator, SOI)基板を用い、リソグラフィーによりSOI層にストライプ状のトレンチを形成して、トレンチで分離されたシリコン領域間の電気的絶縁を図って、異種方位領域間の完全分離を目指す新たな手法を提案し、その実現性を追及するための実験を進めた。シリコン層の厚さが3マイクロメータ以上の場合に完全分離が可能であることを実証できた。電子ビーム誘起方位選択エピタキシャル成長法により、シリコン(100)基板上にCeO2(100)とCeO2(110)領域から成る複合面方位構造形成の研究を進め、両領域間に存在する両結晶方位成分を含む遷移領域の大きさを支配している基板方面電位分布の拡がりを決定する要因の解析を進めた。本研究による複合面方位構造形成技術のデバイスプロセスへの応用性を高める為には遷移量機器幅を大幅に縮小乃至は無くする必要がある。遷移領域幅とシリコン基板の比抵抗の関係を詳細に解析し、その幅が比抵抗の対数に比例して減少し、電子ビーム径程度迄縮小できることが分かった。更に、抜本的に遷移領域幅を縮小するために、絶縁層上シリコン膜(Silicon on Insulator, SOI)基板を用い、リソグラフィーによりSOI層にストライプ状のトレンチを形成して、トレンチで分離されたシリコン領域間の電気的絶縁を図ることにより遷移領域を無くして、異種方位領域間の完全分離を目指す新たな手法を提案し、その実現性を追及するための実験を進めた。トレンチ形成にフッ酸、硝酸系のエッチャントを用いたウェットエッチングを用いた場合、SOI層の厚さが厚い場合は異種結晶方位領域間の完全分離ができることが明らかとなった。その薄さの限界は0.3 μm程度であることも分かった、SOIを用いたLSI製造への応用に鑑みて、更に薄いSOI層での完全分離を実現するために反応性イオンエッチング法によるドライエッチングでのトレンチ形成を検討し、88 nmの薄さでも完全分離が可能であることを実証できた。これはトレンチの断面が垂直に削れているため、トレンチで分けられた両側のシリコン層間の良好な電気的絶縁が確保できたためであることが分かった。バルクシリコン(100)基板での複合面方位構造形成のためのパラメータ解析、特にシリコン基板の比抵抗依存性について、ほぼ十分に解明することができた。その結果、異種結晶方位領域間に存在する遷移領域幅を電子ビーム径(1 mm)程度まで縮小可能であることが分かり、ファインビーム電子光学系の開発により更なる遷移領域幅の縮小が可能であるという将来への指針が得られた。SOI基板を用い、リソグラフィーによりSOI層にストライプ状にトレンチを形成して、互いに電気的に絶縁分離されたシリコン層領域を形成して、異種結晶方位領域間の完全分離に成功した。その際、シリコン層と埋め込み酸化層をエッチオフして形成したトレンチの断面形状が重要であることが分かった。SOIのシリコン層が比較的厚い場合はウェットエッチングによるトレンチ形成でも際限性良く完全分離できることが実証できた。SOI基板は高価なため、その構造パラメータのバリエーションを数多く揃えて検討することは容易ではないが、科研費のお陰で現在までにシリコン層の厚さで0.088から80 μmまで、シリコン層の比抵抗で0.01から1,000Ωcmまで、8種類のSOI基板について実験的検討ができた。その中で、異種結晶方位領域間の分離特性にはSOIのSi層の比抵抗の大小による依存性は無いことが実験から判明した。また、昨年度迄の研究ではウェットエッチングでは完全分離が困難であった0.3 um以下の極薄SOI層でも、反応性イオンエッチングの採用により良い結果が得られることが実証できた。

その理由は、高分解能電界放出電子顕微鏡によるトレンチの断面形状の精密観察の結果からトレンチの断面が垂直に削れていることが分かり、その為トレンチで分けられた両側のシリコン層間の良好な電気的絶縁が確保できたためであることが分かった。本研究計画の2年目迄の研究進捗状況としておおむね順調に進んでいる。シリコン基板上の二酸化セリウム(CeO2)薄膜のエピタキシャル成長において、基板表面電位分布制御により成長する結晶面方位が自由に選択可能となる方位選択エピタキシの応用研究を進めた。電子ビームを照射して局所的に表面電位を変化させる方法を採用し、Si(100)基板上にCeO2(100)と(110)領域の複合面方位構造の形成に成功した。しかしこの2つの面方位領域間に両方位成分を含んだ遷移領域が存在することが分り、デバイスプロセスへの応用上の問題として顕在化した。この遷移領域幅の縮小を図るためのパラメータ解析の結果、その幅がSi基板の比抵抗の対数に比例して縮小することが分った。つまり、極めて低い比抵抗の基板を使えば電子ビーム径程度まで縮小が可能であることを実証したが、応用面からは制約が大きい。遷移領域幅を決める因子は電子ビーム照射による高電位領域と低電位の非照射領域との間の空間幅の大きさであることが判明した。絶縁基板上Si層(SOI)にリソグラフィにより溝を設けてSi島を形成し、それらの間を絶縁して複合面方位領域間を完全分離する手法の実用性を検討した。種々の厚さと比抵抗のSOI基板を用いて実験を重ねた結果、複合面方位領域間の完全分離達成にはSOI基板の比抵抗は影響しないこと、SOI層が0.1μm以下の薄さでは完全分離が難かしいことが分った。CeO2層のエピタキシャル成長は、初めに極薄の金属Ce層を堆積後、昇温してエピタキシャルCeSi2層を形成し、反応性スパッタでCeO2層を成長させる2段階成長法を用いるが、この第1段階での導電層が溝での電気的絶縁性に悪影響を及ぼすことが分った。そこでSEMによる溝の断面構造の解析結果から、溝の形成にそれまでのウェットエッチングに代えてドライエッチングを採用して垂直断面の溝を実現することにより完全分離を再現性良く実現できることを実証した。Si(100)基板上のCeO2薄膜のエピタキシャル成長において、基板表面電位分布制御により、成長する結晶面方位が自由に選択可能となる方位選択エピタキシの応用研究を進めた。この2つの面方位領域間に両方の方位成分を含んだ遷移領域が存在し、その幅がSi基板の比抵抗の対数に比例して縮小することが分った。絶縁基板上Si層にリソグラフィにより溝を設けてSi島を形成して、複合面方位領域間を完全分離することが再現性良く実現できることを実証した。バルクシリコン(100)基板での複合面方位構造形成のためのパラメータ解析、特にシリコン基板の比抵抗依存性について、ほぼ充分に解明することができた。その結果、異種方位領域間に存在する遷移領域幅を電子ビーム径(1 mm)程度まで縮小可能であることが分かった。
レム睡眠P波発生メカニズムの電気生理学的探究

哺乳類の睡眠ステージは、レム(急速眼球運動)睡眠とノンレム睡眠からなる。睡眠は本能行動のひとつとして考えられているが、現在のところ、「何のために眠るのか?」「何故夢を見るのか?」という根本的な問いに、的確に回答することは難しく、睡眠の機能は、脳科学分野における最大の謎のひとつとされている。特に夢をみているとされるレム睡眠の機能は、実はまだほとんど分かっていない。レム睡眠時には、特徴的な脳波が測定される。海馬のシータ波と、橋(Pons)で発生するPonto-Geniculo-Occipital(PGO)波である。海馬のシータ波は、探求行動をしている覚醒時にも観察されるが、PGO波は、専らレム睡眠時に観察される。PGO波はネコで発見され、当初、同様の波形が次々と伝播し、外側膝状体(Lateral Geniculate Nucleus)や後頭葉(Occipital Cortex)でも記録されたことから、PGO波と命名された。その後、ラットでも報告されたのだが、橋でのみ観察されるため、P波と呼ばれている。一方、マウスでは、P波の測定に成功した例は皆無に等しい。本研究では、遺伝学的手法が使えるマウスにおいて、in vivoでP波を計測する手法を確立した。マウスにおいて、これまで存在しないとさえされてきたP波の測定に成功した。さらに、P波発生メカニズムを電気生理学的に詳細に解析した。具体的には、睡眠覚醒を繰り返す頭部固定状態のマウスの脳幹に、32チャンネル記録電極を搭載するシリコンプローブを刺入し、一度に数十個の神経活動を記録した。P波の発生に先行して、強く発火する神経細胞群の存在を明らかにした。これらの神経発火の集合電位が、P波という局所フィールド電位を生み出していると考えられる。本研究により、P波の生理的役割、さらにはレム睡眠そのものの生理的機能にも迫る新たな切り口が開拓された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。睡眠は本能行動のひとつとして考えられているが、現在のところ、「何のために眠るのか?」「何故夢を見るのか?」という根本的な問いに的確に回答することは難しく、睡眠の「機能」は脳科学分野における最大の謎のひとつとされている。特に、夢をみているとされるレム睡眠の機能は、実は、まだほとんど分かっていない。海馬のシータ波は、探求行動をしている覚醒時にも観察されるが、PGO波は、レム睡眠時にしか観察されない。PGO波は、ネコで発見され、当初、同様の波形が次々と伝播し、外側膝状体(Lateral Geniculate Nucleus)や後頭葉(Occipital Cortex)でも記録されたことから、PGO波と命名された。ラットを用いた先行研究においでは、コリン作動薬を脳幹に投与すると、P波の発生頻度が増加し、P波と記憶学習との関連を示唆する行動実験が報告されている。しかし、薬理学的手法では、レム睡眠時のみならず、ノンレム睡眠時にもP波を発生させてしまい、さらに解析の時間解像度も低い。本研究では、遺伝学的手法が使えるマウスにおいて、in vivoでP波を測定し、さらにP波発生メカニズムを電気生理学的に詳細に解析する。また、オプトジェネティクスを用いることで、レム睡眠時のみに、人為的にP波を光惹起し、記憶定着への影響を検討する。本研究では、今まであまり注目されてこなかったP波の役割、また、レム睡眠そのものの機能をも追究する。本研究では、まず、マウスにおけるP波の計測、ならびに、P波の発生に関与する、橋に局在する神経核の同定を目的としている。そのため、本年度は、マウスを用いたP波の測定、および脳幹より、神経活動の記録を行った。無麻酔・頭部固定下の状態で、睡眠覚醒を繰り返すマウスの脳に、32チャンネル記録電極を搭載したシリコンプローブを急性的に刺入し、橋の神経からin vivo細胞外記録を行った。睡眠覚醒ステージを判定するために、脳波と筋電位も、同時に測定した。当初の予定では、ガラス電極を刺入し、1個の神経細胞から記録を行う予定であったが、4シャンクのシリコンプローブを用いることで、一度に数十個程度の神経細胞の活動を、橋広範囲かつ、長時間(5時間程度)連続して記録することに成功した。P波は、刺入したシリコンプローブの局所フィールド電位をもとに測定し、レム睡眠時に最も発生頻度が高くなることを確認した。刺入したシリコンプローブの位置は、あらかじめ、DiI(赤色色素)を塗布しておき、記録後、脳スライス標本を作成することで確認した。P波のようなスパイク状の脳波が発生する際には、局所で、神経のバースト発火が起こっていると考えられる。そこで、得られたデータを詳細に解析したところ、内側傍小脳脚核、青斑下核、橋脚被蓋核、前庭神経内側核に局在する神経が、P波に先行して、バースト発火することを見出した。