hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨分泌因子による神経系を含む全身調節機構の解明

その結果、157タンパク質が同定され、うち84が分泌タンパク質であった。平成26年度の研究では、候補タンパク質が実際にPC-12細胞に突起構造を誘導する活性を有するか否かを検討した。その結果、突起誘導活性を示すタンパク質としてIGF-1およびTIMP-2がみつかった。IGF-1は骨を含む全身のさまざまな組織から分泌されることが知られているが、骨芽細胞が産生するIGF-1が神経系に及ぼす影響については明らかにされていない。そこで骨芽細胞由来のIGF-1の神経系に対する作用を解析するためにIGF-1を骨芽細胞系の細胞特異的欠損するマウスの作製を進めている。今後、得られる骨芽細胞特異的Igf-1欠損マウスを用いて神経走行やマウスの行動異常の有無などを調べることで、神経系の制御における骨分泌因子の重要性が明らかになることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は計画した通り、骨芽細胞の培養上清中にPC-12細胞の神経突起伸長を誘導する活性を見出し、この活性分子の精製を進めた。イメージングサイトメーターを用いた神経突起誘導活性の評価系を立ち上げたのち、精製の条件検討を重ねた。その結果、精製条件は概ね定まり、現在、活性分子の同定まであと一歩のところまで来ている。今後の更なる実験によりこの分子が同定され、その生体内における機能が明らかになれば、骨による神経系の制御を示す初めての知見となることが期待される。以上のことから、研究はおおむね順調に進展したと評価する。平成25年度は、骨芽細胞が分泌する神経突起誘導因子の精製を試みた。その結果、5段の精製ステップを経て得られた活性画分中のタンパク質を質量分析により同定することに成功し、活性分子の候補を複数得るに至った。現在、活性分子の同定まであと一歩のところまで来ている。これまでのところ計画通りに研究が進行しているので、今後も当初の計画に則り、神経突起誘導活性を示す骨分泌分子を質量分析により同定しようと考えている。活性分子の候補が同定されたら、まずPC-12細胞にその分子を過剰発現することによって神経突起伸長が誘導されるかを調べ、骨芽細胞培養上清中の神経突起誘導活性をこの分子で説明できるかどうかを検証する。また、同定したタンパク質が初代培養の神経細胞の分化や生存に影響をおよぼすか否かを検討する。さらに、同定したタンパク質の生理的意義を明らかにするために、その分子をコードする遺伝子を骨芽細胞特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製し、神経系に表現型があらわれるかどうかを調べることを予定している。これまでのところ計画通りに研究が進行しているので、今後も当初の計画に則って推進するつもりである。平成25年度の研究から活性分子の候補が得られたので、今後PC-12細胞に候補タンパク質を作用させることによって神経突起伸長が誘導されるかを調べ、骨芽細胞培養上清中の神経突起誘導活性を説明できる分子を同定する。
神経芽腫腫瘍抗原に対する人工免疫グロブリンレセプターを利用した新規免疫療法の開発

神経芽細胞腫は極めて難治性の小児固形腫瘍であり、今まで抗癌化学療法に種々の工夫がなされて来たが、未だ確固たる治療法が存在しない。新たな発想による治療法の工夫が求められている所以である。われわれは、この小児悪性腫瘍に対する細胞療法の可能性を探るために、神経芽細胞腫の表面抗原として我々が発見したB2D抗原を利用した細胞療法の基礎実験を行った。得られた結果についてまとめる。1.胞障害性T細胞のモデル実験系として、EBウイルス感染自己B細胞株(自己B-LCL)に対するT細胞の応答系の作製を試みた。2x10^6/mlの末梢血に対し2分の1量の放射線照射自己B細胞を添加することで抗原刺激とし、2週後にIL-2を100u/ml添加し細胞障害を観察した。しかし、この方法による自己B-LCLに対する細胞障害性T細胞の誘導は確認されなかった。非自己同種B-LCL刺激による末梢血T細胞増殖には問題がないことから、至適培養条件確立は、間近と思われた。2.標的細胞のアポトーシス誘導の検出系としてcaspase3あるいはannexin Vとpropidium iodideを使用した場合のいずれが感度良くアポトーシスを検出可能かを検証したところ、caspase3の方が感度良くアポトーシスを検出する事がわかった。3.マウスIgG抗体をまぶしたダイナビーズに、抗CD3単クローン抗体、抗CD28単クローン抗体、B2D単クローン抗体を精製し、濃度を調整の上ダイナビーズに単独あるいは同時に結合させた。神経芽腫細胞に対する人工抗原提示細胞としての作用を期待している抗体・ダイナビーズ複合体であり、まず人末梢血リンパ球に対する増殖誘導能を検討した。培養3日目でIL-2を添加し、7日目まで細胞数を算定したところ、対照群に比較し3抗体を同時に結合させた群で約5倍の細胞数の増加が認められた。今後この現象の詳細な解析、実際の神経芽腫患者の末梢血での反応性、細胞障害活性などを検討する必要性が示唆された。神経芽細胞腫は、化学療法に極めて抵抗性の小児固形腫瘍であり、抗癌化学療法は、正に出口の見えない閉塞状況といっても良い状況にある疾患である。新たな発想による新たな治療法確立が求められている。我々はこの小児神経芽腫に対し、汎用性の人工抗原提示細胞aAPCを使用した細胞療法の可能性を探るために本研究を企画した。平成16年度の研究結果について報告する。1)従来細胞障害活性の検出はCrリリース法によっていた。実験を進めていく上での簡便性を優先させるために、まずフローサイトメーター法による細胞障害活性定量法の確立を行った。EBVにより樹立されたBリンパ芽球様細胞株と自己末梢血単核球をIL-2存在下に共培養する事により、細胞障害性T細胞を誘導した。この系にPKH26で染色したBLCLを加え、BLCL中のcaspase3活性化をフローサイトメーターで測定することで、クロミウムリリースによらないCTL活性の測定法を確立した。2)神経芽細胞腫を標的とする抗体として、当初抗ジアシアロガングリオシド抗体GD2を考えていたが、それに加えて我々が作成したB2D単クローン抗体を用いることとした。この抗体はTALLA-1を認識する抗体であり、T細胞白血病細胞と神経芽腫細胞に特異的に発現している抗原を認識する。汎用性の観点、および、われわれが作成した単クローン抗体であることからこの抗体を利用することとし、発現のあるT細胞白血病および神経芽腫細胞株の確認を行った。3)人工抗原提示細胞としては、T細胞活性化に係わる補助分子CD28と抗体を共結合させた免疫磁気ビーズを用いるか、あるいはCD28とHLA-Ig複合体を結合させた磁気ビーズを当面使用する。前者の準備はCD28抗体を精製すれば終了し、後者については、Johns Hopkins大学から分与されたベクターを用い、HLA-A24特異的なHLA-Ig分子を作成中である。

3.マウスIgG抗体をまぶしたダイナビーズに、抗CD3単クローン抗体、抗CD28単クローン抗体、B2D単クローン抗体を精製し、濃度を調整の上ダイナビーズに単独あるいは同時に結合させた。神経芽腫細胞に対する人工抗原提示細胞としての作用を期待している抗体・ダイナビーズ複合体であり、まず人末梢血リンパ球に対する増殖誘導能を検討した。培養3日目でIL-2を添加し、7日目まで細胞数を算定したところ、対照群に比較し3抗体を同時に結合させた群で約5倍の細胞数の増加が認められた。今後この現象の詳細な解析、実際の神経芽腫患者の末梢血での反応性、細胞障害活性などを検討する必要性が示唆された。
高精度線検出の高速化と医療用画像診断支援システムへの応用

線集中度フィルタ処理により複雑な線構造を適切に理解する総合的な画像理解を踏まえた上で、がん病変検出の高効率化・高精度化診断支援システムを構築することを目標とし、本年度は高速化された線集中度フィルタと従来型との比較を行い、双方の特徴の解析を行った。また、診断支援システムに高速化された線集中度フィルタを用い、従来型では計算速度の問題から積極的に導入できなかった、多重解析度の解析についても検討を行い、認識手法の高度化を行った。(1)高速化線集中度フィルタの実画像での検証NF線集中度により高速化された線集中度フィルタを胃X線二重造影像データベースに適用し、従来のFA線集中度フィルタとの特性比較を行った。本年度の解析により多様な線幅を持つ実画像においても線の構造解析に十分な精度で尾根線を検出することができることがわかった。ただし、あくまでも尾根線の検出のみであり、線領域の検出にはFA線集中度が有効であることも知れ、検出目的に応じた使い分けが必要であることも知れた。また、高速演算法であるベクトル集中度蓄積法では、実画像においても100倍程度の高速化が確認された。(2)多重解像度の解析による医用画像理解処理の高度化基本的な線による画像の理解では構造の理解が主となるため、NF線集中度フィルタによる高速演算が可能である。そこで、胃X線二重造影像における胃輪郭・脊柱・胃のひだというスケールの異なる線構造理解に対して、それぞれの理解に適したスケールでの画像処理を実現した。一般に多重解像度解析では画素レベルで行うことが多いが、本研究では画素レベルと線集中度フィルタの計算領域を組み合わせることで、線という異方性の強い対象を効率的にスケール分類する手法を開発した。また、これらの手法を統合することで、胃における陥凹型病変の92%を維持しつつ、誤検出の23%削減に成功した。線集中度フィルタの性質の解析を行い、輝度・コントラスト・幅の影響を受けず、線状領域を極めて感度良く、かつ雑音に影響されにくいという性質を維持しつつ、高速化するための手法について検討した。また、従来型の線集中度フィルタを用いた診断支援システムについても更なる高度化を検討した。1線集中度フィルタの高速化従来の線集中度フィルタではGAWHTを利用して注目点ごとに独立して集中度の計算していた。しかし、注目点が異なっている場合でも、計算対象となるベクトルの位置が同一である場合、条件によっては集中度の計算が同一となる。この条件は、計算の注視点を集中度を計算する注目点から計算対象となるベクトルの位置に変えることにより、条件判別を劇的に簡素化できる。この性質を利用し、計算の冗長性をなくしつつ、計算の簡素化を実現するアルゴリズムとして、ベクトル集中度蓄積法を開発した。実験により、ベクトル集中度蓄積法の計算時間は、計算範囲などのパラメータを等価にした場合の従来のGAWHTによる手法に比べて、約100分の1となることを確認した。2診断支援システムの高度化線集中度フィルタのコントラストに対する非依存性と方向検出の精度を利用し、方向を第3軸とするオブジェクト空間表現を定義した。この空間表現では、交叉する線を異なる空間上に配置することができる。この性質を利用し、3次元的に交叉していない2本の線に対する2次元投影像での交叉を解消し、胃壁ひだ集中の安定な検出が可能を実現した。また、曲線端点の進行方向の延長線上にひだが集中する領域を想定し、その内部への投票により求めたひだ集中度の分布の局所的ピークとして病変を検出することができた。
トキソプラズマ性髄膜脳炎の発症機序の解析とその診断ならびに治療への応用

トキソプラズマ性髄膜脳炎(TE)はエイズ患者に多発する深刻な日和見感染症の一つであるが、その発症機序については不明な点が多い。そので、筆者らが作製したTEのマウスモデルを用いて、TEの発症機序ならびにその防止機序につき解析を行った。1.TEの発症を制御する宿主側の遺伝子について:種々の近交系マウスならびにB10コンジェニックマウスにトキソプラズマを感染させTEの発症の有無を調べた。その結果、TEの発症は主要組織適合遺伝子複合体のH-2D領域に存在する遺伝子により厳密に抑制されている事実が明らかとなった。同領域の遺伝子はCD8^+T細胞の活性化に重要な働きを担っていることから、同T細胞がTEの発症もしくは防止に関与している可能性が示唆された。2.TEの発症に関与する虫体側の要因について:同一の系統の近交系マウスに種々の株の虫体を同数感染させた場合、マウスの脳内に誘発される炎症反応の程度は、感染させる虫体の株によって著しく異なる事実が明らかとなった。それにおいては、脳内にシストを多数形成する株ほどTEを誘発しやすい傾向がみられた。3.TEの発症防止に関与する.サイトカインについて:筆者らはインターフェロン・ガンマ(IFN-γ)がTEの発症防止に非常に重要な働きをしていることは既に明らかにした。そこで、IFN-γと密接な関連をもつサイトカインである腫瘍壊死因子(TNF)につきTE発症防止におけるその役割を調べた。その結果、感染マウスに抗TNFモノクローナル抗体を投与し体内のTNF活性を消去した場合、脳内における虫体の増殖とそれに伴う炎症が著しく増強される事実が判明した。したがって、TNFはTEの発症防止に重要な働きを担っていることが明らかとなった。
成人T細胞白血病の病態モデルとしての牛白血病：新規がん抑制遺伝子DOKの解析

牛のDOK遺伝子に関する論文がほとんどないため、GenBankより牛のDOK遺伝子を検索し、DOK1、DOK2およびDOK3さらに内在性コントロールとしてβ-actin遺伝子のPCRおよびreal-timePCRの各プライマーを設計、作製した。これらプライマーが使用可能であるか、健康な牛の血液よりリンパ球を採取後、RNAを抽出し、RT-PCRを行った。DOK1およびDOK2に関しては目的の位置にバンドが検出されたが、DOK3は非常に弱かった。次に牛白血病由来細胞株であるKU-1を用いてRT-PCRを行ったところ、DOK1は健康な牛と同様に検出されたが、DOK2はほとんど検出されなかった。また、DOK3の発現は弱く、健康な牛とほぼ同じレベルであった。T細胞が主にDOK1およびDOK2、B細胞がDOK1およびDOK3、骨髄系細胞はDOK1、DOK2およびDOK3をすべて発現するとされている。KU-1株はB細胞由来の腫瘍細胞株であるため、DOK2と反応しなかったものと思われた。一方、屠場由来の牛白血病の腫瘍細胞ではDOK2が健康牛と比較し弱いものの発現が確認された。また、DOK3の発現レベルも、健康牛および牛白血病由来細胞株と比較し、高発現のものもあり、牛における各血液細胞におけるDOK遺伝子の発現レベルは検討する必要があると思われた。Western blot法を用いた健康牛血液細胞のDOKのタンパクレベルの解析では、市販の各抗体がアミノ酸配列から牛DOKタンパクと交差することが予想されているにもかかわらず、検出できなかった。他の市販抗体でも同様であり、タンパクレベルでの解析のためには、牛のDOKタンパクを認識する抗体が必要である。想定されるアミノ酸配列より、ペプチドを合成し、抗体を作製することも検討課題である。平成30年度は、牛のDOK遺伝子の発現の意義等に関する論文がほとんどないことから、マウスおよびヒトのDOK遺伝子解析技術を応用したがDOK3の発現の弱さ等、発現レベルで解析しなければならないことがわかった。また、市販のマウスおよびヒト用抗DOK抗体では検出できない可能性もあるため今後検討しなければならない。ヒトおよびマウスでは、血液細胞にDOK1,DOK2およびDOK3が発現しており、T細胞は、DOK1およびDOK2、B細胞は、DOK1およびDOK3、顆粒球はすべて発現していることがわかっている。牛も本研究にて同様であることは推察されたが、DOK3に関しては発現が弱く、技術的なものであるのか、実際にそうなのかは明らかではない。そこでFACS法あるいはMACS法を用いてT、Bおよび顆粒球を分離しDOK1、2および3の発現を解析する必要がある。また、タンパクレベルの解析には牛のDOKタンパクを良好に認識する抗体が必要であり、その作製を検討している。

また、タンパクレベルの解析には牛のDOKタンパクを良好に認識する抗体が必要であり、その作製を検討している。牛におけるDOKの発現がヒトあるいはマウスと同様と想定していたが、健康な牛でのDOK発現をとくにDOK3で検討する必要がでてきた。次年度に、市販されている数社の牛を認識するDOK3抗体の検討と、交差しない場合はペプチド抗体を作製する必要があるため、次年度分の助成金と合わせて使用する予定である。
RNF43による恒常性の維持とその破綻によるがん化メカニズムの解明

最近、幹細胞特異的ユビキチンリガーゼであるring finger protein 43 (RNF43)がWnt受容体のFrizzled (Fzd)を分解するユビキチンリガーゼであること、RNF43がFzdをユビキチン化しリソソームで分解することが複数の海外のグループから報告された。これまでの研究において我々は、幹細胞特異的ユビキチンリガーゼであるRNF43がp53経路を抑制すること、Fzdを細胞外ドメインで認識し分解すること、正常型RNF43はがん抑制遺伝子として機能していること、その遺伝子変異によってRNF43の細胞内局在異常が引き起こされた結果、RNF43が形成するWntシグナルのフードバック機構が負から正へと転換することでWntシグナルの暴走に起因する発がんが引き起こされることを報告してきた。しかしRNF43は比較的最近発見された分子であり、その正常組織と発がん過程における機能とその調節にはまだ不明な点が多かった。本研究では世界に先駆け、多くの生物種において同じRNF43タンパク質上で、またヒトにおいてはRNF43とそのホモログのZNRF3の間で高度に保存されている4つのセリン残基がリン酸化を受けることにより、RNF43のユビキチン化活性が調節されていることを世界に先駆け明らかにした。また発がん型変異を持ったRNF43はWntシグナルを異常活性化するにもかかわらず、p53を抑制する機能は維持していることも明らかにした。この結果は、以前の報告で膵臓がんにおいてRNF43と活性型Ras変異が高頻度にリンクしている理由を明確にした。1. Wnt活性化>2. Ras活性化>3. p53不活性化と進行していく多段階発がんモデルにおいて、RNF43の変異が1段階目と3段階目の両方に関与することで、RasとRNF43の2つの遺伝子変異だけで発がんを達成することを実験的にも証明した。研究自体のデータ取得や論文作成、投稿まではすべて当初の計画通り、順調に進行した。しかし論文投稿後に投稿誌編集部での処理に遅れが出たため当初予定していた2018年度中には投稿論文は受理されず、想定していたよりも半年ほどの遅れが出ている。現在ようやく投稿雑誌の編集部より修正投稿を受け付けるとの連絡を受け、そのためのデータ取得と原稿修正に入ったところである。本研究を論文発表により完了させるため、2019年度まで1年間の研究期間延長の申請を行った。その際に、2018年度予算の一部を論文投稿料として2019年度へ繰り越しを行った。すでに論文投稿、審査は完了し、現在は修正投稿のデータと原稿の改訂を行っているところであり、2019年度中での論文受理を目指している。幹細胞特異的に発現するユビキチンリガーゼであるRNF43は、大腸がん、膵臓がん、胆管がんなど多岐にわたるがんで高発現していることが報告され、また高頻度で突然変異が同定されてきた。しかし、長らくそのがん化に関与する分子メカニズムは不明であったが、ここ我々を含む複数のグループによってその分子メカニズムが明らかになりつつある。我々は以前、RNF43ががん抑制遺伝子p53による下流遺伝子の転写活性化を抑制し、またその結果細胞死を抑制することにより発がんに関わること、Wnt受容体であるFrizzled (Fzd)タンパク質の発現を低下させることで、その破綻が発がんに関与することが有名なWntシグナルの抑制を行っていることを報告してきた。その中で、がん患者さんから同定されたRNF43の点突然変異はRNF43自身の細胞内局在異常を引き起こし、Fzdの分解不全による蓄積がWntシグナルの異常活性化、そしてシグナルを負に制御するフィードバックループの崩壊と暴走が発がんの一因となっている分子メカニズムを提唱してきた。そこで次に我々は、RNF43による恒常性の維持メカニズムへの更なる理解を求め、RNF43の翻訳後修飾によるWntシグナル・発がんの制御機構の解明にアプローチした。その結果、RNF43のリン酸化と細胞ストレスにより引き起こされるプロセッシングによってWntシグナルが調節されていることを見出した。また、これらRNF43の翻訳後修飾はがん患者より同定された遺伝子変異によって大きく影響を受けることも明らかにした。これらの結果からRNF43の機能異常によりWntシグナル調節機構の破綻と発がんの分子メカニズムの理解は大きく前進したので、今後はRNF43-p53の発がん経路についても明らかにし、RNF43の機能異常による発がんプロセスを統合的に理解していきたいと考えている。現在までに、RNF43がWntシグナルを介して個体の恒常性を維持するメカニズムと、その破綻によるがん化メカニズムの統合的な解明を目指した。その結果、RNF43の機能調節に関与するリン酸化メカニズムの解明では、RNF43の活性化(Wntシグナルの抑制)には、細胞内ドメインの4つのセリン残基が決定的な役割を担っていることを明らかにした。また、このセリン残基は細胞内で恒常的にリン酸化されており、セリンリン酸化がRNF43の機能を調節する分子スイッチの役割を果たしていることを解明した。しかしながら、当初予定していたRNF43のセリンリン酸化を支配する上流のシグナル・リン酸化酵素の同定は難航しており、現在までに決定的な候補は得られていないのが現状である。RNF43の切断機構の解明では、RNF43ががん細胞特有のストレス刺激依存的に切断を受けることが、Wntシグナル調節に重要な役割を果たしていることを明らかにした。

その際に、がん患者から同定された機能不全型(発がん型)の点突然変異をもつRNF43は、プロセッシングを受けないことを見出した。この結果から、プロセッシングに耐性となる変異がRNF43によるがん化メカニズムの一端を担う可能性も示唆された。RNF43による幹細胞の分化調節機構の解明では、RNF43の発現が幹細胞の適切な自己複製や分化制御による幹細胞の維持機構についてのアプローチを行った。その結果、RNF43は幹細胞が分化するに伴い発現が低下することを見出した。そこでRNF43の発現調節機構を明らかにするためプロモーターを解析した結果、幹細胞特異的に発現する転写因子の結合部位を複数同定した。幹細胞特異的に発現するユビキチンリガーゼであるRNF43は、さまざまながんで高発現していることが報告されている。またがん患者由来のサンプルを使った遺伝子発現解析から、RNF43遺伝子に高頻度で突然変異が同定されること、またこれらの変異は活性型Ras変異と高頻度にリンクしていることが明らかにされてきた。我々は以前、RNF43がp53による下流遺伝子の転写活性化を抑制すること、細胞死を抑制することにより発がんに関わることを報告した。またWnt受容体であるFzdタンパク質の発現を低下させること、この発現調節機構負に基づく負のフィードバックループの崩壊とWntシグナルの暴走が発がんの一因であることを報告してきた。そこで今年度はこの一連の分子メカニズムがどのようにWntシグナル調節と発がん調節に関与しているかを、総説として発表した。さらに我々は、RNF43の翻訳後修飾によるWntシグナルの調節に注目して研究を進めている。そこで、受精してから生まれてくるまでの形態形成過程、出生し成長した後に成体での恒常性維持に、さらにその恒常性が破綻し死に至るまでの過程でどのようにRNF43が関与し、またそのRNF43のリン酸化によるWntシグナル調節機構が重要な役割を果たしているか検討を行った。その結果、RNF43のリン酸化は上記全ての過程に密接に関与していることを明らかにし、論文として投稿中である。この研究成果は日本癌学会、日本分子生物学会、Wnt研究会等で発表された。さらに現在はこのリン酸化の上流シグナルを同定するべく研究を進めている。これまでに、生体の形成と恒常性維持を司るWntシグナルの調節に、どのようにRNF43が関与しているか、またその機能調節にどのようなメカニズムが存在しているかについて、RNF43の翻訳後修飾に焦点をあてて研究をおこなってきた。その結果、RNF43の細胞内ドメインで、ZNRF3との間で保存されているセリンがリン酸化されていること、このリン酸化が起こらないようにするとタンパク質量が変化しないにも関わらずRNF43の機能が失われる事、また恒常的にリン酸化している状態ではその機能が増強していることを見出した。このリン酸化は、RNF43の機能に対してスイッチとして機能して、形態形成、幹細胞の自己複製による恒常性の維持、恒常性の破綻による発がんの全ての過程に関与していることを明らかにし、複数の学会において発表してきた。さらに最近、がん患者で同定された細胞外ドメインにミスセンス変異を持つ発がん型RNF43は、実際に活性型のRas変異と協働して発がんに関与していることを動物実験により確認した。
関節リウマチ滑膜細胞におけるリゾリン脂質受容体応答が病態形成で果たす役割の解明

関節リウマチ(RA)では、炎症細胞が滑膜組織に浸潤し、種々の炎症メディエーターを放出して滑膜炎や関節破壊を起こす。炎症メディエーターのうち、リゾホスファチジン酸(LPA)とRAの関係については不明の点が多い。また、関節滑液の酸性化がRAの病態形成に重要である可能性も考えられた。そこで、LPAや酸性で誘発されるRA滑膜細胞の炎症応答を調べ、RA関節滑液中のLPAや滑液の酸性化がRA病態形成に重要であることを見出した。リゾホスファチジン酸(LPA)などのリゾリン脂質は、Gタンパク共役型受容体を介して多彩な細胞機能を調節し、血管新生の関わる様々な疾患の病態形成と関連している。関節リウマチ(RA)では、炎症刺激を受けた滑膜細胞(SC)の著しい増殖、COX-2発現の増大と作られたプロスタグランジンE_2による血管透過性の増大や関節痛の強烈な増幅と関節破壊の促進などがみられる。我々は、RA患者のSCでのCOX-2発現が、RA患者の関節滑液中のLPAとIL-1によって相乗的に増大することを見出した.本研究ではRASCのLPA受容体を介する応答とRAの病態形成との関連を明らかにする目的で、(1)RASC上のLPA受容体の性質(2)LPA刺激後のRASCの増殖、(3)LPA受容体に対するモノクローナル抗体(mAb)の作製について検討した。その結果、RASCの主要なLPA受容体はLPA_1であり、LPA_2とLPA_3は殆ど発現しないが、siRNAを用いてLPA_1 mRNAの発現を90%以上阻害してもLPA刺激後のCOX-2発現の低下は部分的であることから、LPA_1の代謝回転が遅く、細胞上に残存するLPA_1が機能する可能性が示唆された。この点について、現在作成中のLPA_1に対するmAbを用いて、LPA_1の局在性と併せて検討する。また、RASCの細胞増殖はIL-1で亢進するがLPAでは有意な効果が認められなかった。正常線維芽細胞の増殖に対して、IL-1もLPAも有意な効果を示さなかった.この結果とCOX-2誘導の結果から、LPAに対して応答するには、細胞が予め何らかの刺激を受けている必要性を示唆しており、現在、RAでのSCの細胞外環境を考慮し、候補となるプライミング因子とLPA_1を介するシグナリングを解析しているリゾホスファチジン酸(LPA)は、Gタンパク共役型受容体を介して多彩な細胞機能を調節する。関節リウマチ(RA)では、炎症刺激を受けた滑膜細胞(SC)が著しく増殖し、COX-2発現が増大し、生じたプロスタグランジンE_2(PGE_2)により血管透過性が増大すると共に、強烈な関節痛と関節破壊が亢進する。しかも、RASCでのCOX-2発現は、LPAとIL-1によって相乗的に増大するが、詳細なしくみは明らかでない。本研究ではRASCのLPA受容体を介する炎症応答とRAの病態形成との関連を解明する目的で、(1)RASC上のLPA受容体の性質、(2)LPA刺激後の細胞内シグナリング、(3)LPA刺激とRASCの増殖、(4)LPA受容体に対するモノクローナル抗体の作製について検討している。その結果、RASCの主要なLPA受容体はLPA1であり、LPA2やLPA3の発現は著しく少ないが、3種のLPA受容体サブタイプのsiRNAを用いた結果、COX-2発現にはLPAIが関与すること、LPA1をノックダウンするとLPA3発現が有意に増大し、特定の条件下ではCOX-2発現も増加することを見出した。また、RASCをLPA刺激すると、関節炎や関節破壊に関わるCOX-2やMMP-1、MMP-3及びADAMTS4が発現するが、これらはGi及びG12/13とMAPkinaseやNFkBを介して誘導されることを明らかにした。また、RASCをLPA刺激しても細胞の増殖には影響しないが、RASCのLPA1をノックダウンするとウシ胎児血清存在下での増殖が低下すること、LPA2やLPA3をノックダウンしても増殖低下は認められず、LPA1と他の因子の受容体の間で増殖に関するクロストークのある可能性が示唆された。これらの点を踏まえ、新規のモノクローナル抗LPA1抗体を用いて、LPA1を介する細胞内シグナリングの解析を進めている。リゾホスファチジン酸(LPA)は、Gタンパク質共役型受容体を介して多彩な細胞の機能を調節すると共に、炎症性疾患の病態形成とも密接に関連するシグナル分子の一つである。関節リウマチ(RA)では、炎症性刺激を受けた滑膜細胞(SC)でCOX-2の発現が亢進して、滑膜組織での血管透過性や関節痛が増大し、関節破壊が進行する。血液や関節滑液に含まれるLPAは、IL-1などの炎症性サイトカインと共に、この一連の反応を相乗的に増幅することを我々は見出している。

本研究では、LPA受容体を介する細胞応答がRAの病態形成に及ぼす影響を明らかにする目的で、RASCと正常SCを用いて、(1)RASCの炎症応答に関与するLPA受容体の性質、(2)LPA受容体を介する細胞内シグナル伝達機構の解析、(3)LPA受容体サブタイプに対するモノクローナル抗体(MAb)の作製、について検討した。その結果、非炎症性の正常SCは、RASCの場合とは異なり、LPAで刺激してもCOX-2発現は誘導されず、両細胞間での応答に相違が見られた。また、炎症反応が進行する酸性条件下では、LPA受容体サブタイプのLPA2とプロトン感知性受容体OGR1がクロストークし、MAPキナーゼ系を介する経路でCOX-2やアグリカナーゼの発現が誘導されることを見出した。生理的条件下でこの反応に関与するLPA受容体サブタイプはLPA1であるが、LPA1をノックダウンしたRASCでLPA3の発現が増大する場合にはLPA3を介して起きることから、細胞の環境の変化によって関与するLPA受容体のサブタイプとシグナル伝達経路が変化する可能性が示された。この点については、これまでに作製したLPA1ペプチドに特異的なMAbや、今回新たに作製したLPA3ペプチドに特異的なMAbを用いて、LPA受容体の局在性と併せてさらに解析中である。RASCに発現しているLPA受容体を介してCOX-2やマトリックスメタロプロテアーゼの発現に至るシグナリング経路についての解析が進み、RASCの細胞外環境が病態形成において重要な役割を果たしていることを示唆する結果も得られている。そして、LPA1に対するモノクローナル抗体も作製できたので、今後の研究の進展に役立てることができると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。RAの病態形成におけるLPA受容体の役割を解析する過程で、LPA受容体サブタイプ間、あるいはLPA1と他の細胞外因子に対する受容体などのクロストークの重要性が示唆される結果が得られたので、RASCの細胞外環境を変化させた場合のLPA受容体応答についても研究を進める。LPA受容体に対する新規のモノクローナル抗体も今後の研究の有力な武器になると考えている。モノクローナル抗体を活用してLPA受容体の性質や細胞内シグナリングについての解析を進め、RAの病態形成のしくみの解明とRA患者のQOLの改善に役立つ知見を得るようにしたい。
社会的意思決定の意図せざる結果に関する数理社会学的研究

集団の目標の実現という「公共財」の供給をめざす集合行為の失敗(社会運動組織の失敗、「オルソン問題」)という社会現象を念頭において、社会的意思決定の「意図せざる結果」に関する数理モデルや理論的研究のレビューを行った。その結果、ゲーム理論など合理的行為者モデル・合理的選択理論に依拠した研究においては集団内の要因が重視されているのに対し、資源動員論アプローチによる社会運動の成功/失敗に関する研究においては集団間の対立や協力などの要因が重視されていることが明らかになった。このレビューに関しては、既に論文としてまとめており、公表の予定である。資源動員論が重視しているような集団間の異質性や集団間関係を考慮にいれた数理モデルとしては、James .Colemanの集合行為モデルがある。このモデルを意識しながら、新たな数理モデルの構築をめざした。この過程で、モデルの挙動を理解するために、コンピュータ・シミュレーションを試みた。現在のところ、数理モデルの解析とシミュレーションの途中の段階であり、いまだ明確な結論を得ることができていない。今後も解析とシミュレーションを継続し、集団間関係と集団内の行為者の意思決定プロセスとが「意図せざる結果」の発生にどのようにかかわっているのかを明らかにしていく予定である。
多孔質セラミックスにおける骨芽細胞の骨形成分子メカニズムの解析

連通気孔を有する多孔体HAセラミックス骨補填材IP-CHAがヒト骨芽細胞に及ぼす影響を細胞生物学的に検討し,骨芽細胞の増殖,分化を支持し,骨芽細胞の足場の担体として有効に機能することを明らかにした。また,IP-CHA/骨芽細胞複合体は生体親和性および骨伝導能を有し,早期の骨組織再生を促進すること,さらに異所性骨形成能を確認し,またIP-CHA/骨芽細胞/TGF-・1複合体では早期に新生骨形成を認めることを報告してきた。バイオマテリアルと骨芽細胞複合体による骨形成分子機構を明らかにすることにより,理想的な骨再建材料の開発と臨床応用へと発展する可能性が示唆された。自家骨移植に代わる骨再建・再生法として,これまで我々は多孔質セラミックス(IP-CHA)と骨芽細胞のハイブリッド人工骨が有用であることを報告してきた。本研究においては,IP-CHAにおけるヒト骨芽細胞増殖・分化促進メカニズムを遺伝子レベルで解明し,特異的かつ普遍的に作用するシグナル伝達物質を含めた因子の発見・解析により,IP-CHAにおけるヒト骨芽細胞による骨形成課程における細胞動態の詳細を明らかにすることを目的としている。IP-CHAにおけるヒト骨芽細胞の骨形成メカニズムの解析を行うため,IP-CHAに当科にて継代培養を行っているヒト顎骨骨芽細胞を播種し,デキサメタゾンを含む石灰化誘導培地で培養後,骨芽細胞からmRNAを抽出し,Runx2,Osteorixなどの転写因子の発現をreal-time PCR法,ELIZA法にて検討し,多孔質セラミックス(IP-CHA)における骨芽細胞の骨形成・分化マーカー(ALP,Type I collagen,OCN,OPN)の遺伝子発現に対する相乗効果,あるいは抑制効果を経時的に検討したところ,細胞内分子と細胞内シグナル伝達系が,ALP,Type I collagen,OCN,OPN mRNAの発現に特異的な作用をきたして骨芽細胞の分化を促進し、制御している可能性が示唆された。IP-CHAは既に臨床応用されており,本材料と骨原性細胞複合体に関する研究は活発に行われているが,多孔質セラミックスにおける細胞挙動や骨芽細胞分化を制御するシグナル因子群に関する詳細については未だ明らかになっていない。骨形成に関わるシグナル伝達系として,MAPKカスケード,Smadシグナリング,Wntシグナリングが関係することが明らかとなっている。これらの伝達系はストロークしており,骨形成は複雑なネットウークで制御されている。引き続き,IP-CHAにおける骨芽細胞に特異的かつ普遍的に作用するシグナル伝達物質を含めた因子の発見・解析を行う予定である。また,バイオマテリアルと骨芽細胞複合体による骨形成分子機構を明らかにすることにより,多孔質セラミックス/骨芽細胞複合体の臨床応用に基礎的な裏付けを行うとともに,より理想的な骨再建材料の開発と臨床応用を検討する。本研究においては,IP-CHAにおけるヒト骨芽細胞増殖・分化促進メカニズムを遺伝子レベルで解明し,特異的かつ普遍的に作用するシグナル伝達物質を含めた因子の発見・解析により,IP-CHAにおけるヒト骨芽細胞による骨形成課程における細胞動態の詳細を明らかにすることを目的とした。IP-CHAは既に臨床応用されており,本材料と骨原性細胞複合体に関する研究は活発に行われているが,多孔質セラミックスにおける細胞挙動や骨芽細胞分化を制御するシグナル因子群に関する詳細については未だ明らかになっていない部分がある。本研究により,多孔質セラミックス/骨芽細胞複合体の臨床応用に基礎的な裏付けを行うとともに,より理想的な骨再建材料の開発と臨床応用の基礎的研究になったと考える。H22年度にIP-CHAにおけるヒト骨芽細胞の骨形成メカニズムの解析を行っていたが、年度途中で産休のため一時中断。H23年度研究を再開した際に、再度それまでのデータを解析し直したため、当初の計画よりやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。

22年23年度に予定していた細胞レベルでの骨形成メカニズムの解析をさらに進めると同時に、IP-CHA/骨芽細胞複合体を生体内へ移植し、局所的骨形成メカニズムの検討および複合体の基本物性の検討を行う。大学院生に補助的に参加していただき、in vitroおよびin vivo同時に解析を行うようにする。24年度が最終年度であるため、記入しない。
亜鉛及び銅イオン動態がステロイドホルモン・レセプター動態に及ぼす影響

卵胞内の顆粒膜細胞を、卵丘細胞群(C)と壁側の顆粒膜細胞群(M)の2群に分け、それぞれの機能分化についてsteroidgenesisの面から検討した。1.単層培養法にてestrogen(E)、progesterone(P)分泌の違いを検討した。2日毎に培養液を交換し、それぞれの濃度変化を検討した。C、M群共に14日目まで減衰しながらE、Pを分泌した。2日目のE濃度は両群に差は認めず、P濃度はM群が有意に高かった(p<0.05)。14日目までの両群のE/Pの動きをみると、両群共上昇傾向を示していたが、C群の方の上昇がより高い傾向にあった。これはC群においてE分泌の減少よりもPの減少傾向が強いことによるものと考えられた。2.培養14日目のFSH刺激(1IU/ml)に対する16日目の両群のE、P分泌をみるとP分泌については両群共に反応が低く差がなかったが、E分泌については両群共に反応し、C群の方が分泌が高い傾向にあった。10日間を越える長期培養法では培養細胞のdoubling timeやqualityが問題となるため、このあと短期培養法にて検討した。3.培養4日目の各種刺激に対するM群とC群のE分泌反応を検討したところ、FSH製剤(fertinom P、humegon)に対する反応はcontrolに比べ有意差はなかったが、NO阻害剤であるL-NMMAに対するC群のE分泌およびgrowth hormone(GH)に対する両群のE分泌はcontrolに比べ、有意に上昇した。培養8日目の各種刺激に対する両群のE分泌を検討したが、GHに対するE分泌のみが有意に上昇した。最近、卵胞におけるsteroidgenesisにfree radicalが関与していることを示唆する報告が増えているが、我々の結果も同様であった。GH刺激に対するE分泌の有意な上昇については今後検討していきたいと思います。以上の結果から、ホルモン産生については、両群間に何らかの機能的差がある可能性が示唆された。今後growth factorも含めて検討して行きたい。
単語認知過程における正書法的・音韻的類似語数の効果

近年,視覚呈示された単語の認知に際して,それと類似した他の単語の存在が如何なる影響を及ぼすのかが検討されている.特に欧米諸言語においては,「当該文字列を構成する文字を一文字だけ別の文字に置き換えることによって作成可能である単語」と定義されるneighbors(以下類似語)が,当該単語の認知過程に及ぼす影響について議論がされてきている.本研究では,NTT日本語データベースシリーズ「日本語の語彙特性」及びMacintosh版岩波広辞苑第四版に基づき,カタカナ表記語の正書法的類似語数,音韻的類似語数を報告した.これらは川上(2000a,2000b)として報告されている.次にこうした資料に基づく類似語数と,カタカナ2文字組を手がかりとして被験者が産出可能なカタカナ3文字表記語の数とが対応しているのか否かが質問紙調査によって吟味された.被験者は補充すべき文字の位置に応じて3つの群のいずれかにランダムに割り当てられた.UFF条件の被験者は,最後の2文字を手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.FUF条件の被験者は,最初と最後の1文字ずつを手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.FFU条件の被験者は,最初の2文字を手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.実験の結果,類似語数と被験者が産出した単語数との間に有意な相関が認められた.この相関は,実在の辞書である岩波広辞苑第四版と被験者が有する心的辞書との間に対応があることを示していると解釈された.またこうした類似語数がカタカナ表記語の語彙判断過程に及ぼす影響について実験的に吟味された.実験の結果,カタカナ表記語の類似語数は,その認知過程に抑制的な効果を持つことが示された.以上の2つの研究結果は現在投稿中である.本研究では,視覚的に呈示されるカタカナ表記語の認知過程において,正書法的類似語が及ぼす効果と音韻的類似語が及ぼす効果とを分離した上で解明することを目的としている.正書法的類似語とは,同一の表記形態を親近性の高いものとする単語のうち,当該単語を構成する一文字を他の文字に変更することによって作成可能な単語を指す.これに対して音韻的類似語とは,表記の親近性に関わらず同一の拍数からなる単語で当該単語を構成する一拍を他の拍に変更することによって作成可能な単語を指す.さらにこれらの類似語の定義の際の基準として,音素,すなわち母音あるいは子音のいずれかのみを提案し,こうした類似語が当該単語の認知過程に及ぼす影響を検討する.こうした検討を行うために,NTT日本語データベースに基づいて,カタカナ表記語を選定する作業を進行中であり,現時点では完成していないが,来年度には資料として発表する予定である.この一方で,こうした客観的な基準に基づいたカタカナ表記語の類似語数の多寡が,実際にヒトが想起可能な類似語数の多寡と対応しているのか否かを質問紙によって検討を行った.カタカナ3文字語を構成する一文字を空欄(□)にすることによって,カタカナ3文字語を産出するための手がかり刺激を作成し,これらの空欄に当てはまる文字を制限時間内にできるだけ多く想起するという課題を被験者に課した.空欄とする文字位置として,最初の一文字,真ん中の一文字,最後の一文字の3条件が設定された.広辞苑第四版に基づくカタカナ表記語の調査から類似語数を算出した川上(1998)の資料に基づき,実在するカタカナ表記語の数と被験者が想起するカタカナ表記語との対応が検討された.両者の間には,いずれの空欄位置条件においても有意な相関が認められた.近年,視覚呈示された単語の認知に際して,それと類似した他の単語の存在が如何なる影響を及ぼすのかが検討されている.特に欧米諸言語においては,「当該文字列を構成する文字を一文字だけ別の文字に置き換えることによって作成可能である単語」と定義されるneighbors(以下類似語)が,当該単語の認知過程に及ぼす影響について議論がされてきている.本研究では,NTT日本語データベースシリーズ「日本語の語彙特性」及びMacintosh版岩波広辞苑第四版に基づき,カタカナ表記語の正書法的類似語数,音韻的類似語数を報告した.これらは川上(2000a,2000b)として報告されている.次にこうした資料に基づく類似語数と,カタカナ2文字組を手がかりとして被験者が産出可能なカタカナ3文字表記語の数とが対応しているのか否かが質問紙調査によって吟味された.被験者は補充すべき文字の位置に応じて3つの群のいずれかにランダムに割り当てられた.UFF条件の被験者は,最後の2文字を手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.FUF条件の被験者は,最初と最後の1文字ずつを手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.FFU条件の被験者は,最初の2文字を手がかりとしてカタカナ3文字表記語を産出することを求められた.実験の結果,類似語数と被験者が産出した単語数との間に有意な相関が認められた.この相関は,実在の辞書である岩波広辞苑第四版と被験者が有する心的辞書との間に対応があることを示していると解釈された.またこうした類似語数がカタカナ表記語の語彙判断過程に及ぼす影響について実験的に吟味された.実験の結果,カタカナ表記語の類似語数は,その認知過程に抑制的な効果を持つことが示された.以上の2つの研究結果は現在投稿中である.
日本の大学における利益相反マネジメントの体制とその運用の実態に関する調査研究

大学における利益相反問題は産学連携活動において最も生じやすい。近年、臨床研究の分野では、産学連携活動において高血圧症治療薬にかかる臨床研究データの人為的操作が行われた事件を受けて、臨床研究法(平成29年法律第16号)の成立やこれに伴う厚労省の「臨床研究法における利益相反管理ガイダンス」の周知がなされたが、臨床研究以外の産学連携活動等における利益相反マネジメントについては、産学連携活動の著しい活発化に比して対応の遅れが懸念された。このため、主に臨床研究以外の活動における各大学の利益相反マネジメントの体制や運用に関する実態を把握し、利益相反マネジメントの課題を明らかにすることを目的として、2015年度に民間企業との共同研究を実施した実績のある345の国公私立大学を対象としたアンケート調査を実施した。調査実施日は2018年6月25日、締切日は2018年7月31日である。なお、本研究グループは同様の実態調査を2012年にも実施しており、当該調査と比較のできる項目については約6年経過後の現在との比較を行い、状況の変化などについても検討した。調査の結果、臨床研究に関するもの以外の大学における産学連携に伴う利益相反マネジメントは、利益相反ポリシーの制定や利益相反委員会、利益相反担当部署の設置など体制が相当程度整備されてきたものの、その実質が殆ど備わっていないことが明らかとなった。明らかになった課題の対策のために、次のような提言を行った(論文等発表)。1国等の研究助成金の交付申請時における利益相反に関する審査の義務付け(例えば文部科学省科学研究費補助金における審査義務)、2定期的自己申告制度の導入の促進(現状では50%の実施率)、3利益相反アドバイザーの人材育成(現状では27%の設置率)、4学外有識者によって構成される利益相反アドバイザリーボードの設置(現状では5%の設置率)。2018年度は、大学における利益相反マネジメントの体制と運用に関するアンケート調査票を検討・作成し、67月にかけて調査を実施し、11月には調査結果を成果報告書「大学における利益相反マネジメントの体制と運用に関する調査研究」(全125頁)にまとめ、180部印刷して関係大学等に配付するとともに、所属大学のリポジトリや所属部局のホームページに掲載して普及に努めた。また、調査結果を論文にまとめ、2019年4月に学会誌で査読論文として掲載予定である。さらに、2019年6月には学会での発表も予定している。当初計画では、2018年度はアンケート調査の実施までで、調査結果の報告書の作成及び配付は2019年度の実施を予定していた。速やかに研究が進行し、研究計画は当初の計画以上に進展している。2019年度は、企業との共同研究が多い大学50大学を選定し、所属教員1,000名を無作為抽出し、研究活動における利益相反の経験の有無、有の場合の対応の実態、利益相反マネジメントの在り方に対する意見などについてアンケート調査を行う。ここでは、利益相反マネジメントにおいて制約を受ける可能性のある教員の立場から見た場合の、日本の大学における利益相反マネジメントの実態と課題を明らかにする。

当初計画では、2018年度はアンケート調査の実施までで、調査結果の報告書の作成及び配付は2019年度の実施を予定していた。速やかに研究が進行し、研究計画は当初の計画以上に進展している。2019年度は、企業との共同研究が多い大学50大学を選定し、所属教員1,000名を無作為抽出し、研究活動における利益相反の経験の有無、有の場合の対応の実態、利益相反マネジメントの在り方に対する意見などについてアンケート調査を行う。ここでは、利益相反マネジメントにおいて制約を受ける可能性のある教員の立場から見た場合の、日本の大学における利益相反マネジメントの実態と課題を明らかにする。
磁性細菌粒子膜への膜貫通タンパク質の発現に向けた粒子膜改変に関する研究

本研究では、創薬分野において注目を集めている膜貫通タンパク質を、磁性細菌から得られる脂質二重膜で覆われた磁性粒子(磁性細菌粒子)上に機能を保持した状態でアセンブルすることを目指している。本目標を達成するために、膜貫通タンパク質を磁性細菌粒子上に局在させるためのアンカーの検討、また膜貫通タンパク質を局在させた粒子表面の脂質・タンパク質のリアレンジによるターゲット膜貫通タンパク質の機能化を行うことを目的とした。前年度に検討した発現法により膜4回貫通型のテトラスパニンファミリーに属するCD81の磁性細菌粒子上への発現を試みた。粒子膜に強固に結合しでいる磁性細菌粒子膜由来のMms13タンパク質のC末端にCD81の全長または細治外領域(ED1)を融合し、融合タンパク質を磁性細菌に導入した。ED1をディスプレイした粒子においては、磁性細菌粒子膜に高発現していることが確認できた。次に粒子膜にアセンブルされた膜貫通タンパク質の機能性の向上を目的として、粒子膜の改変を行った。磁性細菌粒子上の膜表面には粒子合成に関わるタンパク質など、表在または貫通タンパク質が多く存在する。これらのたんぱく質は目的の膜貫通たんぱく質の解析において、擬陽又は擬陰的な反応性を示す可能性がある。そこで磁性細菌粒子に対し、様々な界面活性剤処理を施し、たんぱく質の除去を行った。界面活性剤にCTABを用いることにより、粒子膜に強固に結合しているMms13アンカー分子と融合した目的タンパク質は特異的に粒子に残り、また他のタンパク質は除去されていることが示された。さらに、界面活性剤により除かれた脂質を補うために、ホスファチジルコリンを添加した。その結果、分散性が回復し目的タンパク質の機能も保持されていることが示された。本研究は、膜貫通タンパク質を、磁性細菌から得られる脂質二重膜で覆われた磁性粒子(磁性細菌粒子)上にアセンブルするために、遺伝子工学的手法による効率的発現、および粒子膜の脂質・タンパク質のリアレンジによるターゲットタンパク質の機能化を行い、磁性粒子-膜タンパク質複合体を新たに作製することを目的とした。磁性細菌粒子膜プロテオーム解析により単離されたタンパク質Mms13を粒子膜局在用のアンカー分子とし、膜7回貫通型であるドーパミンレセプターの17回貫通領域をそれぞれ融合した。このときドーパミンレセプターのN末及びC末にFLAGタグ(DYKDDDDK)及びHisタグ(HHHHHHH)を設計し、膜貫通タンパク質の配向性を評価するためのタグを導入した。これらの融合タンパク質をコードするDNA断片を磁性細菌で複製可能なプラスミドに導入し、このプラスミドを用いて磁性細菌を形質転換した。その結果、膜2回貫通タンパク質であるMms13にドーパミンレセプターの14回貫通タンパク質を融合した遺伝子を保持した形質転換体においては、抗生物質下で生育が観察された。一方で6,7回貫通タンパク質を融合した遺伝子を保持した形質転換体は得られなかった。また1回貫通タンパク質を融合した遺伝子を持つ形質転換体から磁性粒子を抽出し、アルカリフォスファターゼ(ALP)標識の抗FLAGタグ抗体、および抗Hisタグ抗体を用いて粒子上における膜貫通ドメインの発現を確認した。その結果、Mms13に融合した1回貫通領域のNおよびC末端が共に粒子表面に局在していることが示された。本手法を用いることにより、各膜貫通ドメインの配向を評価することが可能であると考えられた。
数論における指数和の応用の新展開

数論においては種々の数え上げが重要な役割を果たす.そこで困難なのは離散的現象を連続的対象で近似する際の誤差の評価である.この誤差は多くの場合、調和解析により指数和で表すことができる.従って、指数和の評価は多くの数論の問題において要となる.本研究は,数論の広く利用可能な新基礎技術の開発を目指し,指数和の技法の新しい応用とその深化を行う.特に次の2つを試みる:(研究A)素数の加法的問題の短区間中の挙動における指数和の新しい応用の開発,(研究B)Euler関数のcorrelationの誤差項評価の改善.数論においては種々の数え上げが重要な役割を果たす.そこで困難なのは離散的現象を連続的対象で近似する際の誤差の評価である.この誤差は多くの場合、調和解析により指数和で表すことができる.従って、指数和の評価は多くの数論の問題において要となる.本研究は,数論の広く利用可能な新基礎技術の開発を目指し,指数和の技法の新しい応用とその深化を行う.特に次の2つを試みる:(研究A)素数の加法的問題の短区間中の挙動における指数和の新しい応用の開発,(研究B)Euler関数のcorrelationの誤差項評価の改善.