hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞膜表面抗原の免疫ラベルと誘電現象に基づく稀少細胞の分離回収

四重極電極を用いた誘電泳動により,細胞および微粒子の海島状パターンを作製した.標的の表面抗原に対する抗体を固定化した微粒子およびCD33陽性のHL-60細胞を,負の誘電泳動(n-DEP)により四重極電極の格子点に集積化した.この状態を3分間保持すると,免疫反応により細胞ー微粒子の複合体を形成できた.異なる抗体を微粒子に固定化した場合およびCD33陰性の細胞を用いた場合,電圧印加を停止すると集積化した細胞と微粒子は再分散状態に戻った.よって,迅速で簡便に細胞群に発現する抗原を識別できることが示せた.集積用電極および分離用電極から構成される流路デバイスを作製した.細胞分離用電極にはバンドアレイ電極および四重極電極を用いた.細胞集積用電極を用いて細胞を流路の片端側に流すことができた.さらに,分離用電極により細胞のサイズ別に流れる位置を制御して分離できた.サイズの大きな細胞はn-DEPの反発力により流路の側面側へと移動しながら下流へと流れ,サイズの小さな細胞は電極間ギャップを通過して下流へと流れた.また,分離時の電圧強度依存性を評価し最適化を行った.マイクロ電極をプローブとした電気化学顕微鏡を用いて細胞に発現する抗原量を測定した.細胞を酵素(グルコース酸化酵素)修飾微粒子でラベルし,誘電泳動により表面抗原発現細胞をマイクロウェルアレイ内に捕捉した.グルコース酸化酵素の基質であるグルコースの存在下において生成される過酸化水素の酸化電流をマイクロ電極で検出することができた.マイクロ電極を用いた誘電泳動により,単一細胞の捕捉,任意移動,再配置が可能な誘電泳動ピンセットを開発した.細胞群の中から目的細胞に電極を近接させ,正の誘電泳動により電極先端に捕捉した.また,n-DEPを用いると電極に捕捉された細胞をその位置に再配置できた.この操作を繰り返し細胞の配列体を作製できた.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。「四重極電極を組み込んだマイクロ流路デバイス」を用い,「誘電泳動による細胞および抗体固定化微粒子の迅速な集積による免疫ラベル化」と「細胞表面抗原の発現量に応じた分離・回収システムの構築」を行った.この技術を基盤として細胞膜表面に発現する抗原の表現型(フェノタイプ)を迅速で簡便に解析し,さらに,発現量に応じた分離・回収が可能なシステムの構築を行っている.誘電泳動による迅速な細胞配列化技術を,「印加電圧周波数を切り替える」だけで異なる細胞パターンを作製できる技術へと応用し,迅速で簡便な細胞表面抗原解析システムの構築を行った.さらに,この技術を細胞の分化に伴う表面抗原発現解析へと応用展開し,3種類の表面抗原の発現量増加および減少に伴う発現解析をラベルフリーで達成した.四重極電極を用いた細胞凝集塊形成では,細胞と微粒子を同じ位置に集積化し,免疫反応を利用して細胞ー微粒子複合体を形成することができた.複合体の形成からターゲットの表面抗原の発現を解析可能とした.このシステムは,簡便,迅速に均一サイズの細胞凝集塊(スフェロイド)を大量一括で作製するツールとして利用可能であることを実証した.また,誘電泳動による細胞操作技術をマイクロ流路デバイスによるフローシステムに適用し,細胞の表面抗原発現量に応じた超高速な分離・回収へと適用した.マイクロ流路内を流れる微粒子や細胞の流れ位置をサイズ別に制御できることを示した.マイクロ流路の上下面に微小電極構造を形成し,負の誘電泳動による反発力を利用して大きな反発力を受容する細胞を流路の壁面に誘導するシステムを作製した.また,血中循環腫瘍細胞(CTC)の分離・回収を達成するために,細胞懸濁液中にサイズの大きな細胞を極わずか(0.1ー1.0%)に混在させ,その分離に関する検討を開始した.四重極電極を用いた誘電泳動により,細胞および微粒子の海島状パターンを作製した.標的の表面抗原に対する抗体を固定化した微粒子およびCD33陽性のHL-60細胞を,負の誘電泳動(n-DEP)により四重極電極の格子点に集積化した.この状態を3分間保持すると,免疫反応により細胞ー微粒子の複合体を形成できた.異なる抗体を微粒子に固定化した場合およびCD33陰性の細胞を用いた場合,電圧印加を停止すると集積化した細胞と微粒子は再分散状態に戻った.よって,迅速で簡便に細胞群に発現する抗原を識別できることが示せた.集積用電極および分離用電極から構成される流路デバイスを作製した.細胞分離用電極にはバンドアレイ電極および四重極電極を用いた.細胞集積用電極を用いて細胞を流路の片端側に流すことができた.さらに,分離用電極により細胞のサイズ別に流れる位置を制御して分離できた.サイズの大きな細胞はn-DEPの反発力により流路の側面側へと移動しながら下流へと流れ,サイズの小さな細胞は電極間ギャップを通過して下流へと流れた.また,分離時の電圧強度依存性を評価し最適化を行った.マイクロ電極をプローブとした電気化学顕微鏡を用いて細胞に発現する抗原量を測定した.細胞を酵素(グルコース酸化酵素)修飾微粒子でラベルし,誘電泳動により表面抗原発現細胞をマイクロウェルアレイ内に捕捉した.グルコース酸化酵素の基質であるグルコースの存在下において生成される過酸化水素の酸化電流をマイクロ電極で検出することができた.

マイクロ電極を用いた誘電泳動により,単一細胞の捕捉,任意移動,再配置が可能な誘電泳動ピンセットを開発した.細胞群の中から目的細胞に電極を近接させ,正の誘電泳動により電極先端に捕捉した.また,n-DEPを用いると電極に捕捉された細胞をその位置に再配置できた.この操作を繰り返し細胞の配列体を作製できた.初年度において,予定していた研究項目をすべて遂行し,当初予定以上の成果を得ることができた.よって,本研究は,当初予定以上に研究が遂行できていると判断できる.2枚の交互くし型(IDA)電極を上下に組み合わせた四重極電極を用いて,迅速に細胞および微粒子(直径500 nm)の海島状パターン作製技術を行った.標的の表面抗原に対する抗体を固定化した微粒子およびCD33を発現するHL-60細胞を,負の誘電泳動により四重極電極の格子点に集積化した.免疫反応により迅速で簡便に抗原発現細胞ー微粒子の複合体を形成することができ,ラベルフリーで細胞母集団の中から標的抗原発現を調査することができた.細胞集積用電極および発現量別細胞分離電極(分離器)から構成される流路デバイスに作製を行った.流れの方向に対し一定の角度を有するバンド電極対を作製し細胞集積用電極とした.流路中をランダムに流れる細胞を負の誘電泳動により流路中央部へと集積化できた.一部を絶縁被覆したバンド電極対から成る分離器およびギャップ幅の異なる交互くし型電極を上下で組み合わせた分離器を作製した.この分離器を用い,サイズの異なる赤血球および白血球の分離を行った.サイズの小さな赤血球は絶縁被覆部位を選択的に通過し,サイズの大きな白血球は強い反発力を受容するため絶縁被覆部位を通過できなかった.よって,この分離器を用いると,サイズの異なる赤血球と白血球を分離でき,下流にて流路を分岐させることにより異なるチャンバーに回収することができた.誘電泳動を利用して酵素(グルコース酸化酵素)修飾微粒子および表面抗原発現細胞をマイクロウェルアレイ内に捕捉した.SECMを用いて,この酵素活性を検出できた.酵素修飾微粒子で細胞表面抗原をラベル化し,単一細胞レベルでの表面抗原発現量の定量に着手した.27年度が最終年度であるため、記入しない。四重極電極を用いて細胞および微粒子の海島状パターンを作製する.標的の表面抗原に対する抗体を固定化した微粒子および細胞を,負の誘電泳動(n-DEP)により四重極電極の格子点に集積化する.これにより,迅速に免疫反応で抗原発現細胞ー微粒子の複合体を形成する.本年度は,比誘電率および比重の大きいチタン酸バリウム粒子(直径200 nm)を用いる.この細胞ー微粒子複合体の誘電泳動挙動を調査し,流体デバイスを用いた分離に応用する.細胞集積用電極および発現量別細胞分離電極(分離器)から構成される流路デバイスを作製する.前年度,集積用電極に負の誘電泳動の作用する交流電圧を印加し,流路の中央部に細胞および細胞ー微粒子複合体を集積化することができた.また,分離器によりサイズの異なる赤血球および白血球の分離が可能であった.本年度は,表面抗原発現細胞ー微粒子複合体と未修飾細胞の混合物を四重極電極流路デバイスに導入し,修飾量と流れ位置の関連について詳細に調査する.分離分解能の向上を目指し,細胞濃度,印加電圧,電極デザインの最適化を行う.サイズの異なる細胞を導入し,微粒子修飾なしでもサイズ別分離が可能であることを示す.ハイスループットな分離のため,送液速度と分離効率の関連について明らかにする.マイクロ電極をプローブとしたSECMで個々の細胞に発現する抗原量を定量する.誘電泳動を利用して表面抗原発現細胞をマイクロウェルアレイ内に捕捉する.
炎症急性期蛋白合成誘導の調節機構と、その生理的役割に関する研究

1.急性期蛋白合成誘導に対する、抑制系及び促進系の解析:ラット初代培養肝細胞を用いた実験により、その急性蛋白T-キニノ-ゲン(T-kgn)産生は活性化マクロファ-ジあるいは活性化Tリンパ球に由来する液性因子により刺激される。その刺激因子は、マクロファ-ジではインタ-ロイキン6(IL-6)とインタ-フェロンαの両者、Tリンパ球ではIL-6であることを明らかにした。またIL-6の作用が腫瘍壊死因子(TNF)あるいはIL-1により抑制されることを明らかにした。一方、長時間活性化を受けた脾臓細胞からは、肝細胞T-kgn産生をむしろ抑制する因子の分泌されることを認め、この因子がマクロファ-ジに由来するものであり、その抑制マクロファ-ジ誘導にTリンパ球の介在とプロスタグランジン産生が必要であることを明らかにした。2.急性期蛋白キニノ-ゲンの癌細胞増殖抑制機序の解析:マウス低分子キニノ-ゲン以外に、ラットT-キニノ-ゲンや卵白シスタチンにin vitroでの癌細胞増殖抑制作用を認め、その作用が癌細胞膜上のカテプシンL様プロテア-ゼ阻害による可能性を認めた。その細胞周期上の作用点が、G_0、G_1期からS期に移行する過程であることを認めた。3.急性期蛋白アンジオテンシノ-ゲンの機能分析:肝癌細胞培養系により炎症時にアンジオテンシノ-ゲン(AGN)産生を刺激する因子がIL-6であることを証明した。血漿AGNの炎症急性期での増加が、アンジオテンシンI産生を高めることを証明した。慢性炎症では、他の急性期蛋白と異なりAGNは一過性の血漿濃度増加反応しか示さず、その産生調節系の特異生につき今後の検討が必要である。肝細胞の炎症急性期蛋白合成に対する白血球の抑制系:脾細胞をLPS刺激することにより、通常T-キニノーゲン(Tkgn)のような炎症急性期蛋白の肝細胞での生合成を刺激する因子(IL-6とIFN)の分泌が見られるが、長時間LPS刺激条件によっては、逆にそれを抑制する因子の分泌が観察された。この因子産生はグルココルチコイド、IL-1、TNFによって促進された。また、この抑制性因子産生細胞の誘導は、インドメタシン存在下で抑制され、PGEやPGE添加により回復することから、抑制性因子産生細胞誘導過程に関与すると考えられた。抑制性因子産生細胞はマクロファージであることを証明し、この抑制性マクロファージ誘導に、アクセサリー細胞としてT-細胞の存在が必須であることを認めた。急性期蛋白キニノーゲンの癌細胞増殖抑制機序:in vitro実験において、担癌マウス腹水より単離したキニノーゲンに限らず、既知のシステインプロテアーゼ(CP)インヒビターである卵白シスタチンやTkgnにも、複数種癌細胞増殖抑制作用のあることを認めた。この作用は、細胞周期上のGO、G1期からS期への移行に見られ、癌細胞膜表面に検出されたある種のCPに対する阻害に基づくとの証拠を得た。急性期蛋白アンジオテンシノーゲン(Agn)の誘導機構と機能:肝癌細胞株を用いた培養実験により、肝細胞Agn産生はグルココルチコイド存在下、IL-6により刺激されることを見いだした。起炎刺激を与えたラットにおいて、血漿Agn濃度の増加に伴い、血漿のアンジオテンシンI産生速度が高まることを証明した。精製Agnには、セリンプロテアーゼ阻害活性、あるいはステロイドホルモン結合活性を検出し得なかった。

急性期蛋白アンジオテンシノ-ゲン(AGN)の誘導機構と機能:慢性炎症としてラットのアジュバント関節炎モデルを作成し、その血漿AGN濃度の変化を追ったところ、アジュバント処置後の急性期に血漿AGN濃度の増加が見られたが、その反応は一過性であり持続性の増加ではなかった。一方、ラットにおける急性期蛋白として知られるTーキニノ-ゲン及びα_2ーマクログロブリンについては、アジュバント処置後の急性から慢性炎症にいたる全過程でその血漿濃度は増加を示した。このようなAGNと他の急性期蛋白の相違が、それらの肝細胞での産生を調節する白血球由来サイトカイン種の相違に基づくかを明かにするため、現在血漿インタ-ロイキン6レベルの測定を行っている。一方、マウスに起炎刺激を与え、経時的に採取した血漿をラットの肝癌細胞株Hー4細胞培養系に添加すると、そのAGN産生の増加することを見いだした。このマウス血漿中のAGN産生刺激因子がインタ-ロイキン6であるかについて、現在検討中である。炎症急性期に血漿中に増加するAGNが、レニン-アンジオテンシン系にどのような影響を与えるかについてLPS急性炎症ラットについて検討した。その結果、LPS処置後4時間まで血漿レニン濃度の低下が観察され、同時に血漿アンジオテンシンI産生活性(レニン活性)の低下も見られたが、血漿レニン濃度が正常レベルに回復した16時間後では逆にアンジオテンシンI産生活性は亢進した。この急性炎症16時間のアンジオテンシンI産生増加は血漿AGN濃度増加と一致し、このことは炎症時の血漿AGN濃度増加がレニンーアンジオテンシン系に促進的に関与することを示す。
光応答性デンドリマーと生体関連物質との相互作用に関する研究

本研究はより高付加価値のある機能性デンドリマー化合物の開発を目指し研究を開始した。今日遺伝子治療との関係から安全面で有望である非ウイルスベクターの導入効率を向上させることが重要な問題となっており、我々はこの問題を解決する一つの方法として、生体物質との親和性を可逆的にコントロールできる光応答システムを塩基性デンドリマー化合物へ導入することにした。その結果、次のことが明らかとなった。1.基本骨格にアゾベンゼンを含む光応答性デンドリマー(ポリアゾベンゼンデンドリマー)を合成する事ができた。2.ポリアゾベンゼンデンドリマーのフォトクロミック特性はデンドリマーの世代の違いを反映する。3.ポリアゾベンゼンデンドリマーの分子サイズをアゾベンゼンのシス-トランス異性を利用して制御できる。4.水溶性に富む末端リシン修飾ポリアゾベンゼンデンドリマー(Lys-G2)は相互作用により安定な複合体を形成する。5.ポリアゾベンゼンデンドリマー(Lys-G2)は哺乳細胞にプラスミド遺伝子を効率よく導入する事ができる。6.ポリアゾベンゼンデンドリマーを用いたトランスフェクションは紫外光照射を利用して効率を増加できる。7.ポリアゾベンゼンデンドリマー(Lys-G2)と核酸分子の親和性は末端カチオン電荷に依存する。以上の知見は、デンドリマー化合物が生体分子と相互作用する上で有効な手段となることをあらためて明らかとしたことにとどまらず、フォトクロミック分子を用いて細胞内タンパク質発現というin vivoでの生物プロセスを光制御できることを証明した。今後さらなる改良を施すことにより、遺伝子治療現場で早急に求められている高効率非ウイルスベクターの開発につながっていくと期待される。生命を形成する組織体は核酸・蛋白質・糖質に代表されるように高分子である。これら高分子は合目的に情報が内蔵され特定の高次構造を取ることにより機能を発現する。天然高分子のように複雑でないもののシンプルな高分子として自由の分子設計し構造制御が可能なものとしてデンドリマ-化合物がある。そこで、本研究では、光応答性の塩基性デンドリマ-を合成し、それを用いてタンパク質やDNAとの相互作用やドラッグデリバリーシステムの開発を目指した。まず、デンドリマ-の末端表面にL-リジン基、骨格中にアゾベンゼン、また核としてパラ位にアミノメチル基を有するカリックス[4]アレーンの1、3-オルタネート体を配置したデンドリマ-を設計合成した。各段階とも収率よく、目的物が得られた。また、以前に合成した、同世代の末端が1級アミン基のみのデンドリマ-に比べて水溶性が高くなった。次に、アゾベンゼンのシス・トランス異性化におけるシス・トランス存在率、異性化到達時間等の基礎的物性、動的散乱法を用いて紫外光照射による粒径変化について検討し、シス異性化により枝構造が屈曲し粒径が収縮することを明らかにした。水中では、枝分子同志のスタッキングや疎水結合で異性化が妨げられることも分かった。更に、光応答性のドラッグデリバリーシステム構築のために、抗炎症薬グリチルリチン酸や様々な染料分子に対する包接能についても検討した。今後、外部刺激による作用を自在に制御出来る遺伝子や薬物輸送システムの構築、内部空孔を利用した新規反応場の構築について検討する。天然高分子のように複雑でないもののシンプルな高分子として自由に分子設計し構造制御が可能なものにデンドリマー化合物がある。前年度には、デンドリマーの末端表面にL-リジン基、骨格中にアゾベンゼン、また核としてパラ位にアミノメチル基を有するカリックス

[4]アレーンの1,3-オルタネート体を配置した光応答性でカチオン性のデンドリマー(2世代、3世代)を設計合成し、アゾベンゼンのシス・トランス異性化におけるシス・トランス存在率、異性化到達時間等の基礎的物性、動的散乱法を用いて紫外光照射による粒径変化等を検討し、シス異性化により枝構造が屈曲し粒径が収縮することを明らかにした。本年からは、その毒性が低いカチオン性光応答デンドリマーを用いてタンパク質やDNAとの相互作用やドラッグデリバリーシステムの開発を目指した。まず、光構造変化がどのように遺伝子導入に変化をもたらすかを検討した。細胞としてCOS-1細胞を、導入遺伝子としてlac-Z遺伝子を有するpCHl10プラスミドDNAを用いた。デンドリマー/DNA錯体の遺伝子導入効率は、3世代より2世代で、2世代においては遺伝子導入後の紫外光照射によって、高い導入効率が得られた。これは、デンドリマーの構造変化により細胞内に導入された錯体の安定性が減少し、より多くのプラスミドDNAが読み出されたことを示している。一方、細胞への遺伝子導入の最適条件を探るために、in vitro系で上記デンドリマーと核酸分子との相互作用の解明を行った。相互作用を調べるために、電荷比率による錯体の粒径変化を動的光散乱で、錯体形成度合いを電気泳動で調べた。その結果、デンドリマーの世代数の増加による柔軟性の増大によって静電相互作用が容易になりDNAとの結合が強くなることが明らかになった。生体高分子は合目的に情報が内臓され特定の高次構造を取ることにより機能を発現する。タンパク質と核酸の相互作用は遺伝情報の安定した蓄積や発現制御など多くの重要な役割を果たしている。デンドリマーをナノスケールの機能性組織体と考えると蛋白質類似の機能発現の可能性が考えられるが、本研究では、光応答性のカチオン性デンドリマーと核酸分子との相互作用及び光応答性デンドリマーを用いた動物細胞への遺伝子導入の光制御を目指し研究を展開してきた。昨年度までに、末端にリジン残基を導入したポリアゾベンゼンデンドリマーとDNAプラスミドの相互作用をin vitroで評価し、動物細胞へトランスフェクション関する実験を行ってきた。それらの研究により、リジン残基を持つ光応答性デンドリマーを用いてのトランスフェクションを光制御できることが明かとなった。本年度は、その作用機序の解明を目指し光照射前後でのデンドリマー粒子表面の電位(ゼータ電位)を電気泳動法により測定した。昨年までの研究より紫外光を照射することで粒子が収縮することが光散乱法より明らかにされているが、更にその際に分子の凝集状態が変化することも今回明らかとなった。更に紫外光照射時に粒子の正電荷が減少し、そのためにポリアニオンである核酸分子との親和性も低下する。実際に、プラスミド核酸分子と光応答性デンドリマーの複合体を動物細胞に導入後、細胞を紫外光照射することでタンパクの発現量が増加したことはデンドリマー粒子の表面電位の変化によるものと考えられる。また、核酸との親和性を向上するために末端により塩基性の強いグアニジウム基を導入した。リシンの代わりにアルギニン残基を用い、半分のアミノ基をグアニジウム基で置換したアルギニン修飾光応答性デンドロンはDNAとの親和性がリシン修飾体よりも高いことが明らかとなった。
超弦理論に基づく超対称統一理論の研究

超弦理論の低エネルギー領域の有効理論として得られる超重力模型の構造、性質について様々な側面から検討を行った。本研究において得られた主たる成果の概要は、以下の通りである。1.有効超重力模型において期待される超対称性の軟らかい破れのパラメータの持つ一般的な性質の解明と、そこで現れる破れの非普遍性の引き起こす様々な現象論的効果についての考察を行なった。その中で、超対称スカラー粒子が階層的質量スペクトルを持ち得ることを指摘するとともに、そのことがゲージ結合定数の統一や軟らかい超対称性の破れに伴うCP位相と中性子の電気双極子能率の関係にもたらす影響について調べ、従来の普遍的な超対称性の軟らかい破れの場合には見られなかった現象を引き起こす可能性が存在し得ることを見出した。また、超対称性の軟らかい破れのパラメータのフレーバー構造についても調べ、それらに関して和則を与えた。2.超弦理論の有効理論にしばしば現れる余分なU(1)対称性とゲージ-重項の存在する模型について、小さなニュートリノ質量の実現可能性を指針とし、そのような模型の様々な物理的性質について検討した。繰り込み群に基づく輻射補正による対称性の破れとZ'の質量との間の関係の解明、余分なU(1)の存在に付随する平坦なD項ポテンシャルがインフレーション宇宙論へ与える影響の指摘、陽子の安定性を自然な形で保証する模型の構成、太陽ニュートリノ問題と大気ニュートリノ問題および暗黒物質の3つの同時に説明するために必要とされる階層的なニュートリノ質量の導出を可能とする模型の構成等を行った。以上の成果は当初その解明を目標とした研究課題の重要な部分である。これらの研究成果はすでに口頭発表、研究論文の形で公表してある。今年度の研究では、以下の項目を中心に研究を進めた。1.超弦理論から期待される軟らかい超対称性の破れの持つ一般的な性質の解明、及びそれから予想されるフレーバーの変化を伴う中性カレントやCP対称性を破る位相との関連の検討。この研究から、ゲージシングレット粒子の導入による超対称標準模型の拡張は非常に興味深い性質を持つことが明らかになりつつある。また、超弦理論に特有な軟らかい超対称性の破れに基づき、ゲージ結合常数の統一について調べ、統一についての新たな可能性が存在することが分かった。2.軟らかい超対称性の破れを種とする弱い相互作用のエネルギー領域に於ける輻射補正によるゲージ対称性の破れの繰り込み群を使った解析、特に余分なゲージ対称性のある場合のゲージ粒子とトップクォークの質量の検討。この解析により、余分なU(1)対称性のある模型に於いては、余分なゲージ粒子の質量とトップクォークの質量の間に興味深い関係が存在することが分かってきた。3.超弦理論において、太陽ニュートリノ問題を説明できる程度の小さなニュートリノ質量の実現は残された大きな現象論的課題のひとつである。この問題を検討し、非常に有望と思われる模型を提案するとともに、太陽及び大気ニュートリノ問題を共に解決できる可能性を関連した枠組みの中で調べ、同時説明を可能にする機構を提案した。以上の課題は当初の研究目的の重要な部分である。上記の項目に関する研究成果の一部をすでに口頭発表、研究論文で公表した。現在新たな成果を論文として準備しつつある。今年度の研究において得られた主たる成果の概略は、以下の通りである。1.超弦理論において期待される超対称性の軟らかい破れの持つ一般的な性質の解明と、そこで現れる破れの非普遍性の引き起こす様々な現象論的効果について考察を行った。まず、ゲージ結合常数の統一が起こるエネルギースケールについて調べ、超対称性の破れにある種の非普遍性が存在する場合には通常よりも大きなスケールで結合定数の統一が起こることを示した。

次に、ゲージ結合定数の統一スケールについてこの様な現象を引き起こし得る超対称性の軟らかい破れが実際に超弦理論において導かれ得ることを具体的に超弦理論において示した。さらに、軟らかい超対称性の破れと中性子の電気双極子能率の関係について、特にCP対称性を破る位相との関連に着目し検討を行い、CP対称性を破る位相について従来許されないと考えられていた大きな位相が実験的に知られた中性子の電気双極子能率の上限値に矛盾しないことも有り得ることを指摘した。超弦理論において、太陽ニュートリノ問題を説明できる程度の小さなニュートリノ質量の実現は残された大きな現象論的課題のひとつである。この問題を超弦理論の有効理論として得られる余分なU(1)対称性とゲージシングレット粒子を含む模型において考察し、小さなニュートリノ質量の実現可能性を指摘した。同時にこの模型において、輻射補正によるゲージ対称性の破れの繰り込み群に基づく数値計算による検討、およびトップクォークと余分なU(1)ゲージ場の質量の評価を行った。以上の課題は当初の研究目的の重要な部分である。上記の項目に関する研究成果の一部をすでに口頭発表、研究論文で公表した。現在新たな成果を論文として準備しつつある。今年度の研究において得られた主たる成果の概略は、以下の通りである。末松は、超弦理論において期待される超対称性の柔らかい破れの持つ一般的な性質の解明と、そこで現れる破れの非普遍性の引き起こす様々な現象論的効果についての考察を行った。特に柔らかい超対称性の破れのCPを破る位相と中性子の電気双極子能率の関係の検討から、従来許されないと考えられていた大きな位相が中性子の電気双極子能率の実験の上限値に矛盾しないことが起こり得ることを指摘し、更にこのCP位相と宇宙のバリオン数の起源との関係について検討を進めた。太陽ニュートリノ問題を説明できる程度の小さなニュートリノ質量の実現は超弦理論の大きな現象論的課題のひとつである。この問題を超弦理論の有効理論として得られる余分なU(1)対称性とゲージングレット粒子を含む模型において考察し、小さなニュートリノ質量の実現可能性を指摘するとともに、その様な模型の宇宙論的特性の検討を行った。久保は、ゲージ結合定数と湯川結合定数の統一のもたらす様々な現象論的特性の解明を系統的に実行した。この様な結合定数の統一を仮定した場合に高次補正の入った繰り込み群方程式を用いることにより、低エネルギー領域における多数の物理量について極めて良い精度で実験値を再現できることを示すとともにこれまで予言出来なかった物理量の予言を行うこともできることを示した。以上の項目は当初の研究目的の重要な部分である。
嫌気性アンモニア酸化細菌のバイオフィルム形成機構の解明

増殖速度が極めて遅く、平板培養例や純粋培養例は報告されていない嫌気性アンモニア酸化細菌(Anammox細菌)に関し、アンモニア代謝に必要であることが示唆されるバイオフィルム形成機構を解明した。Anammox Planctomycete Candidatus `Brocadiasinica'の断片化ゲノムDNAを用いたバイオフィルム形成に寄与する遺伝子の探索に続き,`Brocadia sinica'の膜タンパク質解析を行った。マルチビーズショッカーによる菌体破砕後、膜画分を調製しSDS-PAGEによる膜タンパク質解析を行った。その結果、Brocadia sinicaは35kDa,45kDa,90kDaを分子量とする3種の膜タンパク質(P35,P45,P90)を産生・分泌していることを見出した。N末端アミノ酸解析により、3種全てのタンパク質は、アナモックス反応における重要な酵素であるヒドラジン加水分解に関与していることが示唆された。P35,P45,P90をコードしている遺伝子は、窒素飢餓に応答するシグマ54特異的二成分制御タンパク質をコードする遺伝子の下流に位置していた。3種類のタンパク質ならびに各タンパク質由来のシグナル配列をコードするORFを、それぞれpETベクターを用いて大腸菌DH5α(DE3)に導入し、遺伝子導入大腸菌のバイオフィルム形成量を測定した結果、明らかに組み換え大腸菌のバイオフィルム形成量が増加した。よって、大腸菌に産生されたBrocadia sinica由来の膜タンパク質は、大腸菌の膜表面に移行し、細胞の接着力を高めるように細胞膜構造を修飾していること、Brocadia sinica目身のバイオフィルム形成にも3種の膜タンパク質が大きく関与していることが強く示唆された。Anammox Planctomycete Candidatus 'Brocadia sinica'の断片化ゲノムDNAを用いたバイオフィルム形成に寄与する遺伝子の探索に続き、'Brocadia sinica'の膜タンパク質解析を行った。3種類のタンパク質ならびに各タンパク質由来のシグナル配列をコードするORFを、それぞれpETベクターを用いて大腸菌DH5・(DE3)に導入し、遺伝子導入大腸菌のバイオフィルム形成量を測定した結果、明らかに組み換え大腸菌のバイオフィルム形成量が増加した。よって、大腸菌に産生されたBrocadia sinica由来の膜タンパク質は、大腸菌の膜表面に移行し、細胞の接着力を高めるように細胞膜構造を修飾していること、Brocadia sinica自身のバイオフィルム形成にも3種の膜タンパク質が大きく関与していることが強く示唆された。
NPO法人における看護サービスの経済的特性に関する研究

NPO法人における看護サービスの経済的特性を明らかにする目的で、NPO法人において看護・介護サービスを実際に提供している施設およびその企画・準備段階にある事業所の代表・施設長らに面談し、収集した情報・資料について分析した。そして政府・NPO・企業の3経済主体で提供されるサービスの経済的特性について明らかにした。NPOは、政府ができない隙間産業や低所得者の存在や情報の不完全性等の市場の失敗を民間で補填するという活動から、政策提言力を担うまでの幅広い活動をしている。NPO法人理事長の惣万佳代子氏が先駆的に取り組んだ富山型デイサービス推進特区から制度化への歩みは、まさに後者の活動に該当する。NPOでは、ミッションを実現すべく地域の人々と交流し、互いに開かれた関係性の中で自由に生き生きと暮らせる、人と人との基本的信頼に基づいた看護サービスを提供している。収益を直接の目的とするのではなく、地域で暮らす人々の個別のニーズに応え、住民自らが互いに助け合うというミッションの下、柔軟に創造的に取り組むという経済的特性を持つ。今回、面談したNPOの施設長らはいずれも目的・使命感を熱く語り、志を同じくするメンバーと継続的に活動するという共通点があった。その成果の一部を「NPOにおける看護サービスの経済的特性」と題して発表した。NPOの看護職による先駆的な小規模多機能サービス活動を契機に、今後、社会的共通資本の1つとして、NPOによる看護サービスの需要が高まり、地域密着型の看護・介護活動が広がることを予測した。NPO法人における看護サービスの意味とその経済的特性を明らかにする目的で、本年度に取り組んだ研究実績の概要は、大きく以下の2点である。その1は、経済政策、公共経済学、医療経済学、看護経済学、介護保険および福祉関係等の文献、インターネット検索から「NPO、NPO法人、介護保険、非営利組織、経営、フィランソロピー、ボランティア、看護・介護サービス」等をキーワードに収集した知見について分析した。結果、現経済体制下、行政(政府)・企業(民間)・NPOという3つの経済主体でこれからの長寿社会における看護・介護サービスを供給していく意味とNPO法人による看護・介護サービスの経済的特性、特にNPOは非営利組織なので無償で対価をとってはならない・利益を上げてはならない組織という思い込みを解くNPOにおける営利性についてまとめ、考察した。その2は、NPO法人として看護・介護サービスを実際に提供している施設およびNPO法人への準備段階にある施設の現状を把握するために、相手方の人権およびプライバシーに十分配慮し、同意を得たうえで、NPO法人・NPOの施設長に訪問面接を行った。結果、現在の経営状況に至った経緯・背景、サービス利用者および事業者の特性、地域特性、経営状況、情報ネットワーク、現状と課題等について把握した。収集した情報・データを分析し、NPO・NPO法人における看護・介護サービス提供の実態的解明を図り、これからの課題を明らかにしているところである。
効果的なＭｅｄｉａｌ　Ｔｉｂｉａｌ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ予防手段の開発

ベアフットランニングはランニング中の下肢のダイナミクスを変化させ、習慣的なベアフットランニングトレーニングを行うことでランニングパフォーマンスが向上することが報告されている。しかしながら、ベアフットランナーではノーマルシューズ着用ランナーと比較して下腿および足部の障害が多いと報告されており、ベアフットランナーに対する障害予防が必要である。また、ベアフットランナーにおけるランニング障害の中にはMedial Tibial Stress Syndromeをはじめとする下肢の筋損傷や腱炎が多く含まれており、的確な障害予防方法の立案のためには、ランニングによってどの筋がストレスを受けるかを明らかにすることが必要である。そこで、shearwave elastographyを用いてシューズ着用の有無がランニングによる下肢筋群へのストレスに与える影響を検討した。健常成人男性を対象とした。対象はシューズ着用もしくは非着用の条件でトレッドミルランニングを45分間、最大下の運動強度で行い、ランニング前後に下肢筋のせん断波伝播速度(SWV)を測定した。測定対象筋は、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、外側腓腹筋、内側腓腹筋、ヒラメ筋、腓骨筋浅層、腓骨筋深層、長母趾屈筋、長趾屈筋および後脛骨筋とした。二元配置分散分析の結果、後脛骨筋のSWVは両群ともにランニング後に有意に高値を示した。外側広筋のSWVはシューズ着用群においてランニング後に有意に高値を示した。腓骨筋群のSWVはシューズ非着用群においてランニング後に有意に高値を示した。本結果より、シューズ着用の有無にかかわらず、ランニングによって後脛骨筋がストレスを受け、シューズ着用によって外側広筋、非着用によって腓骨筋群がストレスを受けることが示唆された。当初の計画から変更があったが、1編の論文が学術誌に掲載された。Medial Tibial Stress Syndrome既往者は長趾屈筋および後脛骨筋が硬いことが報告されており、効果的なMedial Tibial Stress Syndrome予防手段の開発のためにはランニング中の後脛骨筋および長趾屈筋への負荷を減らす方法を明らかにすることが必要である。今後の研究では、ランニング課題における後脛骨筋および長趾屈筋の共同筋を明らかにし、後脛骨筋および長趾屈筋への負荷を減らす方法を検討する。
非アルコール性脂肪肝発症におけるＰＥＸ１１ａｌｐｈａ遺伝子の機能解析

Pex11a遺伝子は脂肪酸代謝を行う細胞内の小器官であるペルオキシソームの増殖に関与することが知られている。本研究では、Pex11a欠損マウスを用いて、Pex11a遺伝子の機能を解析した。欠損マウスは肥満や脂肪肝になりやすく、その背景には肝臓のペルオキシソームの減少、脂肪酸代謝関連遺伝子の発現の低下、小さくて丸い、機能を持たないペルオキシソームの増加がある。フェノフィブレートの投与により、ペルオキシソームの数及び代謝関連遺伝子が増加し、体重が減少した。以上の結果から、Pex11a遺伝子はペルオキシソーム増殖及び脂肪酸代謝に関与し、肥満や脂肪肝の治療ターゲットとなる可能性があると示唆された。ペルオキシソームは脂肪酸代謝を行う細胞内の小器官である。ペルオキシソームは前ペルオキシソームの伸長分裂及び小胞体起源の2つのルートを介して増殖することが知られており、培養細胞実験でPex11a遺伝子がペルオキシソームの伸長分裂に関与することが報告されている。そこで本研究では、動物でのペルオキシソーム機能を調べるため、Pex11a欠損マウスを用いて、Pex11a遺伝子が肝臓のペルオキシソームの増殖や脂肪酸代謝に関与し、肝臓での中性脂肪蓄積が増悪するかを検討した。前年度の研究において、Pex11a欠損マウスは肥満や脂肪肝になりやすく、その背景には肝臓のペルオキシソームの減少、脂肪酸代謝関連遺伝子の発現レベルの低下があることが分かった。今年度は、免疫電子顕微鏡法を用いて、ペルオキシソームの形態を分析した結果、Pex11a欠損マウスでは小さくて丸いペルオキシソームが多いことが明らかとなった。これはPex11aの欠損により、ペルオキシソームの伸長機能が低下し、代償的に小胞体起源のペルオキシソームが主体となることが原因であると考えられる。この時、Pex11a欠損マウスでは、ペルオキシソームの表面たんぱく質の発現量に対するペルオキシソーム内の脂肪酸代謝酵素の発現量が低下していたことから、機能を持たないペルオキシソームが増加していると考えられた。また、ペルオキシソーム生成促進物質であるフェノフィブレートの投与により、Pex11a欠損マウスは野生型マウスとともに体重増加が抑制され、ペルオキシソームの数及び脂肪酸代謝関連酵素が増加した。以上の結果から、Pex11a遺伝子は肝臓のペルオキシソームの伸長分裂機能及び脂肪酸のベータ酸化に関与することが明らかとなり、Pex11a及びペルオキシソームをターゲットとして、肥満や脂肪肝に対する新しい候補薬となる可能性があると示唆された。Pex11a欠損(KO)マウスは肥満や脂肪肝になりやすいことを予備実験で確認した。そこで、この発症におけるペルオキシソームの脂肪酸代謝及び増殖能におけるPex11a遺伝子の役割を明らかにし、非アルコール性脂肪肝の治療ターゲットとしてのペルオキシソームの可能性を分子レベルで探索することを目的とし、以下の検討を行った。1.Pex11aKOマウスの肥満や脂肪肝の発症:5週齢の野生型(WT)とKOマウスに普通食と高脂肪食を12週間与えたところ、KOマウスの体重はWTマウスより高いことが分かった。Oil Red O染色及び生化学的手法で調べた、KOマウスの肝臓の中性脂肪量は、WTマウスより高かった。また、KOマウスの肝臓トリグリセリドの排出能はWTマウスより低かった。2.インスリン抵抗性:8週齢のWTとKOマウスを18時間絶食後、グルコースを腹腔内に投与し、血糖値を測定した。インスリン抵抗性には差が認められなかった。また、絶食後の血糖値の差も認められなかった。3.ペルオキシソーム増殖能:ペルオキシソームの表面タンパク質(PMP70)及び内在性タンパク質(Catalase)抗体を用いて肝臓のペルオキシソームを免疫染色し、ペルオキシソームの数や形状を評価した。KOマウスのペルオキシソーム数はWTマウスより少なかった。また、KOマウスでは、小さくて真丸いペルオキシソームがWTマウスより多いことが分かった。4.ペルオキシソームの脂肪酸代謝関連遺伝子の解析:KOマウスのペルオキシソームのAbcd2とAcot3のmRNAの発現量がWTマウスより低かった。以上の結果から、Pex11a欠損により、ペルオキシソーム増殖能及び脂肪酸代謝関連遺伝子の発現が低下し、脂肪酸代謝能の低下によって肝臓に中性脂肪が蓄積しやすくなると考えられた。・肝臓のペルオキシソームの免疫染色は、4%ホルマリンで固定切片では鮮明に染色することができなかったが、4%ホルマリンの代わりにブアン固定液を用いることにより染色可能となった。・共焦点顕微鏡及び免疫電子顕微鏡を用いることによってペルオキシソームの数と形状を正確に評価できることを確認した。・ペルオキシソームの脂肪酸代謝

関連酵素を測定したが、有意差が認められなかった。この原因となる可能性の一つは、KOマウスのペルオキシソームの脂肪酸代謝関連酵素が細胞質に大量に存在するが、うまくペルオキシソーム内に取り込まれなかったのかどうか調べることが今後の課題である。実験では、肝臓からペルオキシソームを分離し、ペルオキシソーム内の脂肪酸代謝関連酵素を測定する予定である。・日本には非アルコール性脂肪肝疾患は推定1000万人以上いるとされ、効果的な治療法の開発は急務である。Pex11aをターゲットとして非アルコール性脂肪肝の候補治療薬を見出すことが次年度の目標である。ペルオキシソーム生成促進物質にはフィブレート系薬物と酪酸が存在するが、前者の腎臓に対する有効性は、ラットでは確認されたが、ヒトでは効果が弱いということが明らかになっている。従って、本研究では後者の酪酸またはそのプロドラッグのトリブチリンを用いて検討する予定である。端数として生じた残額と合わせ、次年度の研究費として使用する。動物、抗体、試薬などの購入費は60万程度となる。研究成果を国内外に広く発信するため、2013年のイギリス・バミンガームに開催する予定の国際生理学会及び日本分子生物学会へ参加する費用は約40万である。その他は20万程度となる。
マトリプターゼの分解抑制に基づくがん診断法の確立

マトリプターゼは膜結合型のセリンプロテアーゼで、癌の浸潤/転移に深く関与する。私達はマトリプターゼに存在する糖鎖構造を糖転移酵素GnT-Vの遺伝子導入により改変させると、マトリプターゼの分解が著しく抑制されることを見い出した(JBC277,16960-16967,2002)。本研究では、精製したマトリプターゼを用いて、糖鎖修飾によるマトリプターゼ安定性の分子機構を解明し、マトリプターゼに存在する4カ所のN型糖鎖の中で772番目のAsnに存在する糖鎖がプロテアーゼに対する分解抑制に最も重要であることを見いだした。すなわち、GnT-Vを過剰発現した胃癌細胞からマトリプターゼを精製すると、2002年の論文と同様GnT-Vによって糖鎖修飾をうけたマトリプターゼはトリプシン処理に対して、分解耐性となった。さらにsitedirected mutagenesis法によりマトリプターゼの糖鎖のmutantを作製し、GnT-Vを高発現するCOS細胞に発現させトリプシン処理したところ、Asn772番目の糖鎖欠損株では容易に分解された。またGnT-Vは古くから癌の転移に関係が深い糖転移酵素として注目されてきたが、癌の種類によって予後因子としての重要性が異なる。つまりGnT-Vが糖鎖修飾し、その機能を変化させる標的分子の存在が意味を持つのではないかと考えられる。マトリプターゼは、GnT-Vの標的分子の1つで、甲状腺癌組織における両者の発現を検討したところ、非常に強い正の相関関係を認めた。さらに、マトリプターゼの糖鎖の違いを生かした新しい臨床診断の開発を目指して、マトリプターゼのELISA系を確立した。
子どものコミュニケ-ション行動を促す大人の援助〜子どもと大人のコミュニケ-ションをスム-ズにする要因の検討

幼児期の子どものコミュニケ-ション行動、特にことばで意志伝達をしようとするときに、どういう大人が関わるかによって、子どものコミュニケ-ション行動がスム-ズにいく場合とそうでない場合とがある。コミュニケ-ションをスム-ズにする要因を明らかにするために、4歳児、5歳児の幼児を対象にして、身近な題材の説明の事態と矛盾の含まれた難しい物語を産出する事態で、幼児の実験に熟達した実験者と幼児の実験が初めての実験者が相手をする場合を比較し、子どもと大人との相互交渉がどのように変わるかをビデオ分析を行うことにより詳細に検討した。その結果、第1に、子どもにとって難しい題材の物語であるほど、相手をする大人の言語・非言語行動が子どもの反応に影響を与えることがわかった。第2に、年齢が小さいほど、熟達した実験者によって多くの言語反応が引き出されることがわかった。第3に、産出された物語の内容分析を行うと、幼児の実験に慣れた実験者ほど子どもの言語反応が豊かになり、まとまりのよいディスコ-スが産出されることが確認された。第4に、子どもの側の説明技能やディスコ-スの成立を支える認知機能の発達の度合が異なることもこのような幼児期中期と後期で子どものコミュニケ-ションの違いをもたらすことが示唆された。すなわち、後期になるほど、大人の意図を理解して行動を制御できるようになるために、コミュニケ-ションがうまくいくようになるものと推測される。以上のように子どもの反応は相手をする大人の働きかけによって異なるが、熟達した実験者と素人の実験者の働きかけにおいて顕著な差が認められたのは、単に支持的言語反応や誘導的質問などの言語反応が適切であるだけでなく、〈うなずき〉や子どもがリラックスできるような〈表情〉、教示を与える〈タイミング〉や子どもの反応に対する〈容認的うなずき〉などの非言語的応答においてであることが見いだされた。
フェムト秒時間分解光電子画像観測法による水和電子の研究

今年度は,昨年度開発を行った液体分子線源を用いて,液体からの光電子放出について半球型電子エネルギー分析器を用いて,検討をおこなった.電子の運動エネルギーを測定する光電子分光においては,光電子の運動エネルギーを変化させてしまう光電子・気体分子間の衝突がないことが要求される.また,電子エネルギー分析器内部の電子検出器であるマイクロチャンネルプレート付近ではより良い真空度が要求される.一方,液体分子線の周辺では,液体からの分子の蒸発により,気体分子の密度が高く,真空度は光電子分光において要求されるレベルに比べはるかに悪い.そのため,液体分子線から電子検出器までの光電子飛行領域に多段の差動排気システムを持つ光電子分光装置を用いた.液体分子線と垂直に1ミリ離れた位置に差動排気のための初段のアパーチャーを設置することにより,光電子と蒸発分子との衝突が無視できる状況が実現できることがわかった。この光電子分光装置内で,電解質水溶液の液体分子線を真空チャンバー内に噴出させ,液体分子線源から下流数ミリの位置で波長30.38nmのHe(II)真空紫外光を照射することにより,液体からの光電子放出を観測することに成功した.電解質を用いたのは,液体分子線源のオリフィス部での電気二重層形成に由来する流動帯電の影響を低減するためである。観測された光電子スペクトルには,液体分子線から蒸発した水分子からのスペクトル線が極めて強く観測されたため,液体からの光電子スペクトルの線型の判別は困難であった.液体からのスペクトルにおける線型の評価においては,真空紫外光のビームサイズ,電子エネルギー分析器の見込角等について検討を重ねる必要があることが分かった.真空中に噴出した水の液滴中に捕捉された水和電子の励起状態における超高速緩和過程の機構解明を目的として研究を行った.今年度は,真空中において液滴を生成するための液体分子線源の開発・設計・評価を行った.液体分子線は,極めて微小な穴(オリフィス)から液体を高圧で押し出すことによって得ることが出来る.本研究では,直径10ミクロンの穴を持つ,電子顕微鏡用の絞りをオリフィスとして用いた.また,液体を高圧で押し出すポンプとしては,高速液体クロマトグラフィー用の送液ポンプを用いた.約8MPaの圧力で液体をオリフィスから押し出すことにより,液体分子線を得ることができた.分子線の下流では,流体力学的な不安定性の作用により連続した分子線流は寸断され,液滴を得ることができる.ところが,この方法で得られる液体分子線および液滴は,外部から電荷を供給していないにも関わらず,帯電していることがわかった.これは,液中で電離平衡を形成しているイオンの一方が,オリフィス部位において電気二重層の形成に利用された結果現れる界面動電現象(流動電位)によるものである.この帯電による流動電流値は,液体の流速の平方根に比例するので,流動電流値測定から液体流の速度の安定性,つまりはポンプの高圧下での送液安定性について評価することができた.一方,この電気化学的過程による液体の帯電は,液滴への電子付着・水和電子生成過程においてクーロン力による影響を与えるため,この帯電を除く必要がある.現在,オリフィスに外部から電位を与えることで,この電気化学的帯電を除き,電気的に中性の液滴が生成できるか検討中である.今年度は,昨年度開発を行った液体分子線源を用いて,液体からの光電子放出について半球型電子エネルギー分析器を用いて,検討をおこなった.電子の運動エネルギーを測定する光電子分光においては,光電子の運動エネルギーを変化させてしまう光電子・気体分子間の衝突がないことが要求される.また,電子エネルギー分析器内部の電子検出器であるマイクロチャンネルプレート付近ではより良い真空度が要求される.一方,液体分子線の周辺では,液体からの分子の蒸発により,気体分子の密度が高く,真空度は光電子分光において要求されるレベルに比べはるかに悪い.そのため,液体分子線から電子検出器までの光電子飛行領域に多段の差動排気システムを持つ光電子分光装置を用いた.液体分子線と垂直に1ミリ離れた位置に差動排気のための初段のアパーチャーを設置することにより,光電子と蒸発分子との衝突が無視できる状況が実現できることがわかった。観測された光電子スペクトルには,液体分子線から蒸発した水分子からのスペクトル線が極めて強く観測されたため,液体からの光電子スペクトルの線型の判別は困難であった.液体からのスペクトルにおける線型の評価においては,真空紫外光のビームサイズ,電子エネルギー分析器の見込角等について検討を重ねる必要があることが分かった.
有機典型元素化合物の異常原子価に関する総合研究

1.平成2年度に発足するべく採択された重点領域研究「有機典型元素化合物の異常原子価」(略称:有機異常原子価)を実行するために、研究計画・計画班員等を見なし、再検討・確認するための研究連絡会を研究代表者を中心に班長予定者である石川満夫(広島大工)・中村晃(阪大理)・古川尚道(筑波大化)の4人が広島・東京・大阪で行った。その結果、研究計画の骨子は申請計画通りに行うのが適当であるとし、計画班員について多少の手直しをして原案を作製した。総括班の評価グル-プの先生方にも御意見を伺いさらに改良を重ねた。その結果以下の研究組織案を作製した:総括班(i)評価グル-プ7名(ii)実施グル-プ5名、第1班高配位有機典型金属化合物の異常原子価7名、第2班高配位有機ヘテロ元素化合物と異常原子価8名、第3班低配位および高歪有機典型元素化合物の特徴と異常性7名、第4班有機典型元素化合物および遷移金属化合物の接点8名。さらに、上記計画研究を補うと同時に新規な研究課題として、どのような傾向・内容の研究を必要とするかについても検討した。2.平成2年1月6・7・8日に広島において本班の全体会議を行い、上記にて作製した「有機異常原子価」の計画案を説明し、詳細にわたり検討した。班員の意見をふまえて原案を多少改良し、第2年度・第3年度の発展方向および公募研究の内容に期待する点などについても種々討論した。さらに広報のやり方・担当者をきめ、本重点領域研究の盛り上げ方についても意見の交換をした。
ミトコンドリアゲノム変異のマウス逆遺伝学

本研究では、変異型mtDNA分子種を導入したマウス群を活用して、変異型mtDNA分子種による多様な病型形成機構を、項目1)変異型mtDNA分子種間の差異による制御(変異分子種の階層)、項目2)組織特異的な変異型mtDNA分子種の蓄積動態の差異による制御(組織・細胞種の階層)、項目3)核ゲノム背景やストレス環境下での高次病原性制御(核ーミトコンドリアの協調階層)という多階層病理として捉え、ミトコンドリアセントラルドグマの破綻病理の解明を目指した。項目1)については、昨年度までにミトコンドリアtRNA-Lue (UUR)遺伝子に病原性点突然変異(A3302G)を有するキメラマウスの作製に至っていた。今年度は、このキメラマウスから全身性にこの変異型mtDNA分子種を含有するミトマウスの作出に成功した。現在、このミトマウスの系統維持と病態解析を実施している。項目2)については、糖尿病の核ゲノム背景(db /db)のミトマウスでは、肝臓や膵臓における変異型mtDNAのさらなる蓄積が誘導されることを見出した。これらの結果は、組織特異的な変異型mtDNAの蓄積動態に核ゲノム背景や生体環境が重要な役割を果たすことを示唆している。また、この蓄積動態を変化させる分子基盤として、ミトコンドリアの分裂・融合が寄与する可能性を検証した。項目3)については、糖尿病の核ゲノム背景(db /db)のミトマウスでは、野生型の核ゲノム背景のミトマウスでは観察されなかった肝機能障害の発症が観察された。この結果は、核ゲノムとmtDNAの相互作用によって、多様な病態が発症することを実験的に示唆している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、変異型mtDNA分子種を導入したマウス群を活用して、変異型mtDNA分子種による多様な病型形成機構を多階層病理として捉え、ミトコンドリアセントラルドグマの破綻病理の解明を目指している。今年度の研究実績は以下の通りである。1.変異型mtDNA分子種間の差異による制御(変異分子種の階層):本項目の解析には、変異型mtDNAを導入した多様なモデルマウスの作出と活用が必須である。そこで、既存の3種の変異型mtDNA導入マウスに加え、新たにtRNA-Lue(UUR)に病原性点突然変異を有するmtDNAを含有するマウスの作製を行っている。現状、tRNA-Lue(UUR)に病原性点突然変異を有するmtDNAを導入したマウスES細胞の樹立に成功し、このES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。2.組織特異的な変異型mtDNA分子種の蓄積動態の差異による制御(組織・細胞種の階層):欠失型mtDNAを含有するマウスと組織特異的にミトコンドリア分裂因子(Drp1)を破壊したマウスを交配させ、肝臓特異的にミトコンドリア分裂を抑制し、かつ、欠失型mtDNAを含有する新たなモデルマウスを作製した。このマウスでは、肝臓特異的に、欠失型mtDNAの病原性の増強と不良ミトコンドリアの蓄積、ならびに、導入されている欠失型mtDNAのさらなる蓄積が観察された。3.核ゲノム背景やストレス環境下での高次病原性制御(核ーミトコンドリアの協調階層):既存の変異型mtDNAを含有するマウスと糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)を交配させ、糖尿病を発症する変異型mtDNAを含有するマウス群を樹立した。その結果、糖尿病が変異型mtDNAの病原性を増強することが分かった。また、糖尿病環境は導入されている変異型mtDNAの蓄積動態に景況を及ぼす可能性があることも分かった。以下の進捗により、おおむね順調に進展していると自己評価した。1.変異型mtDNA分子種間の差異による制御(変異分子種の階層):モデルマウスの樹立には至っていないものの、tRNA-Lue(UUR)に病原性点突然変異を有するmtDNAを導入したマウスES細胞の樹立とキメラマウスの作製に至っている。2.組織特異的な変異型mtDNA分子種の蓄積動態の差異による制御(組織・細胞種の階層):ミトコンドリアの分裂が変異型mtDNAの病原性発揮やそれ自身の蓄積に影響を及ぼす可能性を個体の臓器を用いて示唆することができている。3.核ゲノム背景やストレス環境下での高次病原性制御(核ーミトコンドリアの協調階層):糖尿病環境による変異型mtDNAの病原性制御を解明するための新たなモデルマウス(既存の3種の変異型mtDNA含有マウスの核背景をdb/dbに置換したマウス群)の作製に至り、一定の成果を得ている。そこで、既存の3種の変異型mtDNA導入マウスに加え、ミトコンドリアtRNA遺伝子に病原性の突然変異を含有する新たなモデウマウスの作製に注力した。今年度は、tRNA-Lue (UUR)遺伝子に病原性点突然変異を有するmtDNA分子種を導入したキメラマウスの作製に成功した。作製したキメラマウスの臓器の詳細