hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NS5A-ISDRアミノ酸変異がHCV複製と薬剤感受性へ与える影響の解明

本研究は、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造領域(NS) 5Aに存在するIFN感受性規定領域(ISDR)のアミノ酸置換が、HCVのライフサイクル及びIFN感受性に与える影響を解析することを目的とし研究を行った。その結果、ISDRにアミノ酸置換を有するウイルスで、ウイルス粒子産生において重要なNS5Aとcoreとの相互作用が減少することで感染性ウイルス粒子産生の効率が低下した。更に、IFN誘導遺伝子(ISGs)発現を評価した結果、ISDRにアミノ酸置換のないウイルスで、NS5AとSTAT1が結合することで、STAT1リン酸化の亢進が抑制され、ISGs発現が阻害された。本研究はC型慢性肝炎におけるインターフェロン(IFN)治療効果に関与するC型肝炎ウイルス(HCV)非構造領域(NS) 5Aに存在するIFN感受性規定領域(ISDR)のアミノ酸変異が、HCVのライフサイクルに与える影響及びその作用機序を解析するとともに、どのような機序でIFN感受性を規定しているかについて明らかにすることを目的としている。近年、JFH-1株の構造領域は他の遺伝子型の株とでも置換可能であることが報告されていることから、Con1株の構造領域とNS5A領域の両方を持ったキメラウイルスを作製し、それらの全長RNAを培養細胞に導入することで、細胞内外のコア抗原量と感染力価の評価を行い、NS5A領域のみCon1株を持つキメラウイルスで観察された感染性ウイルス粒子形成の阻害が保たれているかを検証した。その結果、ISDRに7つの変異を持つウイルスでは、培養上清中及び培養細胞内での感染力が著明に低下しており、NS5A領域のみがCon1株を持つキメラウイルスと同様に感染性ウイルス粒子形成が阻害されていた。本研究はC型慢性肝炎におけるインターフェロン(IFN)治療効果に関与するC型肝炎ウイルス(HCV)非構造領域(NS) 5Aに存在するIFN感受性規定領域(ISDR)のアミノ酸置換が、HCVのライフサイクルに与える影響及びその作用機序を解析するとともに、どのような機序でIFN感受性を規定しているかについて明らかにすることを目的としている。HCVのウイルス粒子産生には、NS5A及びHCV coreタンパク質の相互作用が重要であると報告されている。そこで、NS5A及びHCV coreタンパク質の相互作用を免疫沈降法と共焦点レーザー顕微鏡を用い検討したところ、ISDRにアミノ酸置換のないウイルスではNS5AとHCV coreが共局在し結合していたのに対し、ISDRにアミノ酸置換のあるウイルスではNS5AとHCV coreの局在は変化し結合も減弱していた。ISDRに置換を持つウイルスは感染性ウイルス粒子の産生効率が低下していたが、これはNS5Aとcoreの相互作用が低下する為であることが、明らかとなった。さらに、ISDR置換株を導入した細胞ではIFN添加によるISGsの発現が回復していた。これらの知見は、ISDRのアミノ酸変異によるHCVライフサイクルへの影響及びIFN感受性について説明できるものであり意義深いと考える。本年度の研究により、上記のような新しい知見が得られたことから、研究は順調に進展していると考えた。本研究はC型慢性肝炎におけるインターフェロン(IFN)治療効果に関与するC型肝炎ウイルス(HCV)非構造領域(NS) 5Aに存在するIFN感受性規定領域(ISDR)のアミノ酸置換が、HCVのライフサイクルに与える影響及びその作用機序を解析するとともに、どのような機序でIFN感受性を規定しているのかについて明らかにすることを目的としている。そこで、NS5Aアミノ酸置換によるJak-STAT経路への影響を検討した結果、JFH1/5ACon1/i-7mutではIFN-α添加によりSTAT1リン酸化が亢進したが、JFH1/5ACon1ではSTAT1リン酸化の亢進は起こらなかった。現在までに、ISDRのアミノ酸置換により、ウイルス粒子の生成効率に影響を与えること、更にこの変異株ではIFNによるISGsの誘導抑制効果が減弱していることを明らかにしてきた。一方で、IFNによるISGs誘導が宿主細胞により異なることが明らかとなり、より詳細な検討を行う必要が生じた為。培養細胞で効率良く複製が可能なHCV株は遺伝子型2aのJFH-1株のみであることから、JFH-1株のNS5Aを、遺伝子型1bであるCon1株由来のNS5Aに置換した組換えウイルス(JFH1/5ACon1)とJFH1/5ACon1株のNS5A内のISDRに7つのアミノ酸置換を持つJFH1/5ACon1/i-7mutを構築した。これらの株のHCV-RNAを細胞に導入した結果、HCVのウイルス粒子産生において重要であるNS5Aとcoreタンパク質との相互作用が、ISDRにアミノ酸置換を有するウイルスでは減少しており、その結果、感染性ウイルス粒子産生の効率を低下した。また、構築した組換えウイルスを導入した細胞で、IFN-αの添加によるインターフェロン誘導遺伝子(ISGs)発現を評価した結果、ISDRにアミノ酸置換のあるウイルスではIFN-αの添加によりISGsの発現が有意に上昇したが,ISDRにアミノ酸置換のないウイルスではISGs発現が抑制されていた。この現象について詳細に検討した結果、ISDRにアミノ酸置換のないウイルスでは、NS5AがSTAT1と結合することで、STAT

1リン酸化の亢進が抑制されたのに対して、ISDRにアミノ酸置換があるウイルスでは、この現象はほとんど見られなかった。本研究は、C型肝炎ウイルス(HCV)非構造領域(NS) 5Aに存在するIFN感受性規定領域(ISDR)のアミノ酸置換が、HCVのライフサイクル及びIFN感受性に与える影響を解析することを目的とし研究を行った。その結果、ISDRにアミノ酸置換を有するウイルスで、ウイルス粒子産生において重要なNS5Aとcoreとの相互作用が減少することで感染性ウイルス粒子産生の効率が低下した。更に、IFN誘導遺伝子(ISGs)発現を評価した結果、ISDRにアミノ酸置換のないウイルスで、NS5AとSTAT1が結合することで、STAT1リン酸化の亢進が抑制され、ISGs発現が阻害された。HCVのレセプター分子が発現していない細胞(Huh7-25細胞)を用い、ISDRの変異がHCVのライフサイクルに与える影響を詳細に評価した結果、ISDRに変異を持つウイルスは感染性ウイルス粒子の生成効率が低下していた。さらに、ISDR変異株を導入した細胞ではIFN添加によるISGsの発現が回復していた。これらの知見は、ISDRのアミノ酸変異によるHCVライフサイクルへの影響及びIFN感受性について説明できるものであり意義深いと考える。今後この得られた知見の作用機序について詳細に検討を行う。本年度の研究により、上記のような新しい知見が得られたことから、研究は順調に進展していると考えた。これまでに得られた知見から、ISDRのアミノ酸置換により、ISDRが含まれるNS5Aとcoreの相互作用が減弱することで、HCVの感染性ウイルス粒子産生の効率が低下することが明らかとなった。また、ISDRのアミノ酸置換はIFN添加によるISGs誘導に影響を与えることも確認され、Jak-STAT経路への関与が見られた。そこで、今後はISGs誘導に関与するJak-STAT経路関連タンパク質とISDRアミノ酸置換ウイルスの相互作用について詳細に検討を行う。これまでに得られた知見から、ISDRのアミノ酸置換により、ISDRが含まれるNS5Aとcoreの相互作用が減弱することで、HCVの感染性ウイルス粒子産生効率が低下すること、更にIFN添加によるSTAT1のリン酸化に関与することでISGs誘導に影響を与えることが明らかとなった。しかし、IFNによるISGs誘導が宿主細胞により異なることが明らかとなったことから、今後は複数の培養細胞を用い、詳細な検討を行う。ウイルス学これまでに得られた知見から、ISDRのアミノ酸変異はHCVの感染性ウイルス粒子生成の効率、さらにIFN添加によるISGs誘導に影響を与えることが明らかになった。そこで、今後はこれらの現象がどのように誘導されているのか、その機序を明らかにする。ISDR変異株導入細胞でNS5Aタンパク質を免疫染色することにより、ISDRに変異を持ったNS5Aタンパク質の局在を評価する。特に粒子形成の場として知られている細胞内脂肪滴及びISGs誘導に関与するJak-STAT
古代出羽における国制形成過程の研究

本研究は古代出羽の国制形成過程について,出羽国を構成する地域のなかの秋田に焦点をあわせて考察したものである。出羽国は和銅5年に新置,山形県庄内に国府を設け,同地方に置かれた出羽柵の機能の充実・強化が図られた。この時期の秋田に関する資史料は文献・考古とも非常に少なく,たとえば養老4年の渡嶋津軽津司の設置場所としての可能性が高いということや,天平5年頃の出羽国府の秋田移転の前提となる状況について,十分に推測はできるものの,実証することは容易ではなかった。ところが,7世紀後半から8世紀前半の本州北部日本海沿岸地域における海上交通路の利用という観点から,『日本書紀』・『続日本紀』・『扶桑略記』等の文献史料を手掛かりに,日本列島全体のなかで秋田を位置づけてみると,秋田は律令国家の北方政策および対東北アジア外交政策上,重要な拠点となっていたことが明らかになった。また,秋田市金足の大清水台II遺跡の発掘調査の結果,刀子と砥石が出土したが,これらの年代は8世紀第1四半期までさかのぼるものとみられること,当時,刀子の使用者としては官人があげられることから,この段階で秋田に中央政府の官人が駐在していたものと考えられる。以上のことから,8世紀第1四半期の秋田には天平5年頃に出羽国府が移転するに足る条件が整っていた可能性が大きかったことが明らかになった。
食品機能成分の腸送達システムを指向したＷ／Ｏ／Ｗエマルションの冷凍保存技術の開発

本研究では,水溶性の機能性食品成分を人の小腸に送達するシステムの構築を指向し,温度およびpHの変化が,Water-in-Oil-in-Water(W/O/W)エマルションおよび内包される機能性成分の安定性に及ぼす影響の評価に取り組む.本年度は,W/O/WおよびO/W(Oil-in-Water)エマルションの形態をとる市販の食品を対象とし,冷凍時の凍結挙動および冷解凍に伴う油水の分離挙動を比較した.検討対象の試料は大きく3つに分類される.すなわち,W/O/W型のマヨネーズ風ドレッシング(以下,W/O/Wエマルション),O/W型のマヨネーズ風ドレッシング(以下,O/Wエマルション)およびマヨネーズである.マヨネーズ風ドレッシングは,マヨネーズより含油量が少なく増粘剤等を含む.マヨネーズを冷凍すると,油相が結晶化し,それに伴い油水が完全に分離した.油相の結晶化がエマルションを不安定化させるという既往の研究と同様の結果を得た.一方,W/O/WおよびO/Wエマルションでは,油相は結晶化したが,著しい油水の分離は目視では観察されなかった.しかしながら,油相が結晶化した試料を遠心分離したところ,油水の分離が観察され,ほぼすべての油相が分離したことが推測された.これらの結果より,W/O/Wエマルションは,O/Wエマルションと同様に,油相の結晶化により不安定化することが示唆された.この知見は,油脂の結晶化の抑制が,分散安定性を維持する上で重要であることを示し,学術的に有意義である.また,W/O/Wエマルションは,冷解凍を経ると実際には不安定化が進行するが,外見上の安定性はある程度維持されることを示した.この知見は,常温で分散安定性の高いW/O/Wエマルションは,冷凍流通を想定した場合においても,外見上の品質を維持できる可能性を示し,本研究をさらに進展させていく上で有益である.平成30年度では,W/O/Wエマルションの調製条件の決定および分散安定性の評価手法について検討する予定であったが,エマルションの調製および油滴径の測定に必須である,乳化機器および粒度分布計の使用が困難であった.そこで予定を変更し,市場で流通している分散安定性の高いW/O/Wエマルションを用い,冷解凍時における水相および油相の結晶状態を検討するとともに,結晶化が分散安定性に及ぼす影響を評価した.その結果,冷解凍操作に対して安定なW/O/Wエマルションは,常温における安定性が十分高く,かつ油相が結晶化し難い特性を有する必要があることが示唆された.研究計画の順序を変更したが,冷解凍操作に対して安定なW/O/Wエマルションを調製する因子を明らかにした.これらを踏まえ,現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると評価した.さらに追加して,常温における分散安定性の高いW/O/Wエマルションを調製する条件について検討することとした.一般に,W/O/Wエマルションの不安定化の主因は,内水相の水分子の外水相への移動(油相透過)である.機能性食品成分のモデル物質としてベタニンを使用し,その安定性の変化から,油相透過の影響を評価することとした.ベタニンは実験系で汎用される色素であるため,化学的特性が明らかである.しかしながら,pHや温度がベタニンの分解速度に及ぼす影響については詳細が明らかでない.そこで,ベタニンの分解速度に関する基礎的なデータの収集に着手した.本研究では,W/O/Wエマルションの組成と冷凍保存温度が,エマルションと封入した機能性食品成分のモデル物質の安定性に及ぼす影響を実験的に明らかにする.平成30年度では,市販W/O/WのおよびO/Wエマルションの冷解凍操作に対する分散安定性の変化について検討した.この検討の結果,常温で分散安定性の高いW/O/Wエマルションを調製することが,W/O/Wエマルションを冷凍流通させる上でも重要であることが示唆された.令和元年度では,W/O/Wエマルションの分散安定性を評価するために,内包する機能性成分のモデル物質の安定性を評価する予定である.そこでまず,pHや温度が機能性食品成分のモデル物質(ベタニン)の安定性に及ぼす影響について評価する.この検討により得られた知見に基づき,常温におけるW/O/Wエマルションの不安定化の主因である,プロトン移動(油相透過)とベタニンの安定性の関係性について検討する.W/O/Wエマルション中におけるベタニンの安定性を評価する汎用的な方法は確立されておらず,技術的な困難が予測されるため,まず,W/O/Wエマルションの,内水相ー油相ー水相の構造を模倣した系におけるベタニンの安定性を評価する.この検討により,研究計画当初より予定していた,常温およびヒトの消化過程におけるW/O/Wエマルション安定性に関する知見を得る.

本研究では,水溶性の機能性食品成分を人の小腸に送達するシステムの構築を指向し,温度およびpHの変化が,Water-in-Oil-in-Water(W/O/W)エマルションおよび内包される機能性成分の安定性に及ぼす影響の評価に取り組む.本年度は,W/O/WおよびO/W(Oil-in-Water)エマルションの形態をとる市販の食品を対象とし,冷凍時の凍結挙動および冷解凍に伴う油水の分離挙動を比較した.検討対象の試料は大きく3つに分類される.すなわち,W/O/W型のマヨネーズ風ドレッシング(以下,W/O/Wエマルション),O/W型のマヨネーズ風ドレッシング(以下,O/Wエマルション)およびマヨネーズである.マヨネーズ風ドレッシングは,マヨネーズより含油量が少なく増粘剤等を含む.マヨネーズを冷凍すると,油相が結晶化し,それに伴い油水が完全に分離した.油相の結晶化がエマルションを不安定化させるという既往の研究と同様の結果を得た.一方,W/O/WおよびO/Wエマルションでは,油相は結晶化したが,著しい油水の分離は目視では観察されなかった.しかしながら,油相が結晶化した試料を遠心分離したところ,油水の分離が観察され,ほぼすべての油相が分離したことが推測された.これらの結果より,W/O/Wエマルションは,O/Wエマルションと同様に,油相の結晶化により不安定化することが示唆された.この知見は,油脂の結晶化の抑制が,分散安定性を維持する上で重要であることを示し,学術的に有意義である.また,W/O/Wエマルションは,冷解凍を経ると実際には不安定化が進行するが,外見上の安定性はある程度維持されることを示した.この知見は,常温で分散安定性の高いW/O/Wエマルションは,冷凍流通を想定した場合においても,外見上の品質を維持できる可能性を示し,本研究をさらに進展させていく上で有益である.平成30年度では,W/O/Wエマルションの調製条件の決定および分散安定性の評価手法について検討する予定であったが,エマルションの調製および油滴径の測定に必須である,乳化機器および粒度分布計の使用が困難であった.そこで予定を変更し,市場で流通している分散安定性の高いW/O/Wエマルションを用い,冷解凍時における水相および油相の結晶状態を検討するとともに,結晶化が分散安定性に及ぼす影響を評価した.その結果,冷解凍操作に対して安定なW/O/Wエマルションは,常温における安定性が十分高く,かつ油相が結晶化し難い特性を有する必要があることが示唆された.研究計画の順序を変更したが,冷解凍操作に対して安定なW/O/Wエマルションを調製する因子を明らかにした.これらを踏まえ,現在までの進捗状況はおおむね順調に進展していると評価した.さらに追加して,常温における分散安定性の高いW/O/Wエマルションを調製する条件について検討することとした.一般に,W/O/Wエマルションの不安定化の主因は,内水相の水分子の外水相への移動(油相透過)である.機能性食品成分のモデル物質としてベタニンを使用し,その安定性の変化から,油相透過の影響を評価することとした.ベタニンは実験系で汎用される色素であるため,化学的特性が明らかである.しかしながら,pHや温度がベタニンの分解速度に及ぼす影響については詳細が明らかでない.そこで,ベタニンの分解速度に関する基礎的なデータの収集に着手した.本研究では,W/O/Wエマルションの組成と冷凍保存温度が,エマルションと封入した機能性食品成分のモデル物質の安定性に及ぼす影響を実験的に明らかにする.平成30年度では,市販W/O/WのおよびO/Wエマルションの冷解凍操作に対する分散安定性の変化について検討した.この検討の結果,常温で分散安定性の高いW/O/Wエマルションを調製することが,W/O/Wエマルションを冷凍流通させる上でも重要であることが示唆された.令和元年度では,W/O/Wエマルションの分散安定性を評価するために,内包する機能性成分のモデル物質の安定性を評価する予定である.そこでまず,pHや温度が機能性食品成分のモデル物質(ベタニン)の安定性に及ぼす影響について評価する.
一般マルコフ決定過程と適応制御への応用

本研究は、ボレル可測集合を状態及び行動空間にもつ一般マルコフ決定過程とその適応制御への応用の研究を目的としている。主な研究成果は次の通りである。1.1つの政策に対して定義されていたoccupation measureの概念を政策の系列に対してまで拡張し、その最適化への応用範囲を拡大した。これによって最適解の存在やその構成法の証明が見通しよくかつボレル可測性のもとで考察できるようになった。割り引きされた総コスト基準の場合におけるこれらの成果はComputers&Mathematical Applications(1994)に掲載予定である。平均コスト基準の場合についても結果を得ており近々論文にまとめて発表する予定である。上記の解析法は多目的な場合や確率ゲームの解析にも適用可能であり、今後の研究課題である。2.適応制御モデルへの応用として、fuzzy dynamic systemの研究に取り組んだ。fuzzy関係に対するPotentialを定義し、縮小性の仮定のもとでその存在を証明した。また、線形性を導入してPotentialに対するfuzzy関係方程式による特徴付けを行った。これらの成果はFuzzy Sets and Systems(Vol.60,1993,PP.283-294)に掲載されている。Potentialに関するこの成果は、Markov性をもつfuzzydecision processの研究への展望を開くものと期待される。その他にも、本研究に参加した研究者は、本研究の研究実施計画にもとづき、精力的に研究を行い、それぞれ一定の成果をおさめ、研究論文として発表されている。
機能化生体吸収性高分子と生体物質・細胞との複合化

本研究では、生体吸収性高分子の化学修飾ならびに生理活性物質の固定化を行い、新たな生体機能性を付与した吸収材料の開発を行い、その生理活性を検討するとともに細胞との複合化を試みて生体組織、器宮の再構成を行うことを目的としている。これまでに、著者は、α-リンゴ酸エステルとグリコール酸の複合単位からなる環状ジエステルモノマーである3-(S)-[(alkoxycarbonyl)methyl]-1,4-dioxane-2,5-dioneの合成を行い、その単独重合ならびにラクチドとの共重合によりリンゴ酸単位を含むポリ(α-ヒドロキシ酸)が容易に得られることを見い出した。そしてラクチドとの共重合比を変化させることにより、ポリ乳酸の加水分解性を制御できることを示した。特に、側鎖カルボキシル基をベンジル基で保護した3-(S)-[(benzyloxycarbonyl)methyl]-1,4-dioxane-2,5-dione(BMD)を用いた共重合体は、重合後の側鎖の脱保護が容易であり、このカルボキシル基に対して様々な化学修飾を行うことにより高次の機能性を有する吸収性材料の開発が示唆された。そこで、著者は、その一例として、BMDとL-ラクチドの共重合体を脱保護して得られる乳酸-グリコール酸-リンゴ酸共重合体(PMLA)の側鎖カルボキシル基に細胞接着因子であるRGD(Arg-Gly-Asp)トリペプチドを固定化し、細胞接着性の制御ならびに細胞との複合化による生体組織、器官の再構成(Guided Tissue Regeneration)を検討した。その結果、PMLAのフィルムにRGDペプチドを容易に固定化できること、固定化により細胞接着性の制御が可能なことが見いだされ、このようなポリエステル-ペプチド複合体が吸収性の細胞接着マトリックスとして有効であり、ハイブリッド型医用材料として応用も可能であることが示された。今後の展開に興味がもたれるものと確信する。本研究では、生体吸収性高分子の化学修飾ならびに生理活性物質の固定により、新たな機能を付与した吸収性材料の開発を行ない、その生理活性を検討するとともに細胞との複合化を試みて生体組織、器官の再構成を行なうことを目的としている。本年度は、Lーラクチドと3ー(S)ー〔(benzyloxycarbonyl)methgl〕ー1,3ーdioxanー2,5ーdione〔BMD〕の共重合ならびにその水素化分解を行ない、乳酸ーグリコ-ル酸ーαーリンゴ酸共重合体を合成した。そしてこの共重合体の側鎖カルボキシル基に、接着性リガンドペプチドであるRGDC(ArgーGlyーAsp)を固定し、細胞接着性を有する吸収性ポリエステルを合成した。固定化はDCCによるカップリング反応によって行ない、固定化が側鎖カルボキシル基に対して定量的に進行したことを確認した。現在、このポリエステルーペプチド複合体のフィルム化を行ない、それをマトリックスにして細胞培養を検討している。また、固定化率の高いものについては、その制ガン性の評価を行なっている。また、ポリーLー乳酸のフィルム表面に、アリル化ゼラチン(アリルアルコ-ルをゼラチンの側鎖カルボキシル基にエステル化したもの)をラジカル的に反応させることにより、ポリーLー乳酸ーゼラチン複合体を得ることに成功した。表面グラフト修飾率をかえて、この複合体と細胞との相互作用の違いについて検討を行なっている。さらに、ポリーLー乳酸の中空系を作製し、ゼラチンとの複合化を行ない管状組織細胞との接着性、神経細胞との相互作用について検討を行なっている。

本研究では、生体吸収高分子の化学修飾ならびに生理活性物質の固定化を行い、新たな生体機能性を付与した吸収材料の開発を行い、その生理活性を検討するとともに細胞との複合化を試みて生体組織、器官の再構成を行うことを目的としている。L-ラクチドと3-(S)-[(benzyloxycarbonyl)methyl]-1,4-dioxane-2,5-dione[BMD]の共重合ならびに共重合体の水素化分解を行い、乳酸-グリコール酸-α-リンゴ酸共重合体(PMLA)を合成した。そしてこの共重合体の側鎖カルボキシル基に、接着性リガンドペプチドであるRGD(Arg-Gly-Asp)を固定化し、細胞接着性を評価した。固定化をピリジン溶液中、クロルギ酸エチル(ECF)をカップリング剤に用いて行った場合、PMLA(90/10)に対するRGD固定化量は6μg/mgで側鎖カルボキシル基に対して8.8%の導入率となった。また、PMLAをフィルム化してその表面に対するRGD(S)の固定化をDDC法で行い、78μg/cm^2程度のRGD固定化フィルムを得た。溶液系で得たRGD固定化PMLAをポリ-L-乳酸(PLLA)フィルムにコーティングして細胞接着実験を行った結果、RGD単位がフィルム内部に埋め込まれ、固定化されたRGD量から推定されるほどの接着効果が得られなかった。それに対してRGDを表面固定したフイルムでは、細胞接着性が著しく向上することがわかった。また、PMLAの共重合組成比の変化やジアゾメタン処理、熱処理による細胞接着性への影響についても検討を行い、RGD固定化による接着効果を保持しつつ、フィルムの分解速度の制御ができることを見いだした。以上の結果から、PMLAフィルムに細胞接着性ペプチドを容易に固定化できること、固定化により細胞接着性が著しく向上することが確認された。従って、このポリエステル-ペプチド複合体は細胞接着性マトリックスとして働くことから、ハイブリッド型医用材料として応用することができる。
ゲノム編集技術を用いた免疫不全マイクロミニブタの創出

ブタは生理学的および解剖学にヒトに類似していることから、モデル動物として臓器移植、再生医療、医学的トレーニング、医療機器・医薬品開発など広く使用されている。ただし成豚時体重が100kgを超えるため、多くの研究機関における実験動物施設での取扱には高いハードルがある。本研究は、各研究機関に導入可能なマイクロミニサイズの免疫不全ブタの創出により、ブタを利用した幹細胞の治療効果評価系の導入を可能にすることを目指す。方法として、マイクロミニブタ由来の精子を体外受精に用い、さらにその体外受精卵においてゲノム編集によりのインターロイキン2受容体γ鎖(IL2RG)のノックアウトによる免疫不全化と、成長ホルモン受容体(GHR)をダブルノックアウトすることで超小型化免疫不全ブタを作出する。本年度は、in vitroにおいて2種類の標的遺伝子をブタ体外受精胚において同時にノックアウトする技術の確立を目指した。実際には、まず標的遺伝子であるIL2RGおよびGHRに対するgRNAをそれぞれ5種類設計した。エレクトロポレーションによりCas9タンパクとともに計10種類のgRNAをブタ体外受精胚導入し、7日間培養後に得られた胚盤胞における各標的遺伝子に対する変異導入率およびその効率について検討した。その結果、IL2RG、GHRそれぞれについて高い編集効率を示すgRNAを2種類ずつ得ることができた。次に、IL2RG/GHRダブルノックアウトにむけ、編集効率の高かったgRNAを同時に導入した場合に最も効率よくダブルノックアウトが得られる組み合わせおよびその条件についても解析を行った。その結果、IL2RG/GHR両遺伝子を同時に欠損する胚盤胞が得られることが確認できた。以上の技術に関する結果の一部について、第6回日本先進医工学ブタ研究会および日本ゲノム編集学会第3回大会において発表を行った。これまでに2種類の標的遺伝子のそれぞれについて5種類のgRNAを作製し、ブタ体外受精胚にCas9タンパクと導入した場合の変異導入率を検討した結果、双方の標的遺伝子について非常に高い効率で変異を導入可能なgRNAを2種類ずつ得ることができた。また、それらのgRNAを組み合わせ、2種類のgRNAを同時に導入することで2つの標的遺伝子がブタ体外受精胚において同時にノックアウト可能であることについても確認できた。超小型化免疫不全ブタ作出にむけ、体外受精にはマイクロミニブタ由来の精子を使用予定である。そのため、雄のマイクロミニブタより精液を採取後に体外受精を行い、その後の胚発生について検証し、最適な体外受精条件を確立する。また、IL2RG/GHRダブルノックアウトブタ作製に向け、より高い効率で2つの標的遺伝子を同時にノックアウト可能な導入条件等について検討を行う。さらに、マイクロミニブタ精子を用いて得た体外受精胚に対し、エレクトロポレーション法によりIL2RG/ GHR両ゲノム編集を行う。得られた胚を受胚メスに移植し、免疫不全マイクロミニブタ作出を目指す。

2018年度、in ivtroにおいて非常に順調に効率のよいgRNAがえられたため、想定よりも使用額を抑えることができた。2019年度においては胚移植を予定しており、母豚の購入および飼育・維持に使用する予定である。
葉緑体と大腸菌の双方で自律複製可能なシャトルベクターの開発

我々の研究グループでは、以前作出した斑入りを示す葉緑体の遺伝子組換えタバコに、著しくコピー数が増加した「ミニサークル」(組換え型の葉緑体ゲノムからループアウトしてできた22kbの環状DNA分子)を見いだしている。本研究の目的は、このミニサークルを利用して、葉緑体と大腸菌の双方で自律的に複製可能なシャトルベクターを初めて開発することにある。本研究では、このミニサークルに由来する3つの葉緑体DNA断片を、大腸菌の汎用プラスミドベクターにそれぞれクローニングし、抗生物質耐性マーカーであるaadAカセットを連結した後、パーティクルガン法によりタバコの葉へ撃ち込んだ。その結果、全てのプラスミドで形質転換体が得られ、さらに形質転換体から調製したDNAの解析から、撃ち込んだプラスミドが形質転換体の葉緑体内で複製、維持されていることが示された。このことは、タバコの葉緑体と大腸菌の双方で自律的に複製可能な3種類のシャトルベクターを構築することが可能であることを示す。現在まで、これらのベクターによりタバコへ導入された遺伝子は、選抜マーカーのaadAのみであるが、理論上、このシャトルベクターは任意の遺伝子をタバコの葉緑体へ導入できると考えられるので、今後、aadA以外の遺伝子の導入を試みる。一方、この研究で用いた、葉緑体DNA断片を、大腸菌のプラスミドベクターに単に連結して葉緑体へ導入する手法は、葉緑体における複製起点を同定するためにも応用可能であり、この方面へも研究を展開する。葉緑体と大腸菌のシャトルベクターに利用可能な複製起点が、タバコの葉緑体ゲノムのミニサークル以外の領域にも存在するかを探るため、今年度は以下の実験を行った。タバコの葉から葉緑体DNAを単離し、制限酵素SacI及びXhoIで二重消化し、大腸菌のプラスミドベクターに挿入した。その結果、これまでに計14種類の異なる葉緑体DNA断片をクローニングすることができた。得られたプラスミドを、3種類ずつ混合し、パーティクルガン法によりタバコの葉へ撃ち込んだところ、形質転換体が得られたプラスミドのセットが存在した。具体的に、各セットを36回ずつタバコの葉に撃ち込んだところ、a,k,mと名付けた葉緑体DNA断片を持つプラスミドのセットから6個体、d,e,m、f,j,l、b,c,gの各セットからそれぞれ1個体ずつ形質転換体を得ることができた。各形質転換体の葉から全DNAを抽出し、大腸菌へトランスフォームしたところ、9個体の全DNAのうち7個体のDNAで、多数のアンピシリン耐性コロニーを観察することができた。得られたコロニーについて、コロニーPCR及びシークエンシングにより、プラスミドが持つ葉緑体DNA断片の特定を行った。その結果、断片mを持つもの、jを持つもの、eあるいはmを持つもの、kあるいはmを持つものの4種類が存在することがわかった。これら形質転換体に維持されていた葉緑体DNA断片をシークエンシングにより解析したところ、断片jとkはミニサークルに含まれる配列であったが、断片eとmはミニサークルには含まれていない配列であった。これらの結果から、葉緑体ゲノムには、複製起点として働く配列が複数存在していることが示唆された。以上、シャトルベクターを構築することができたこと、葉緑体の複製起点に関する新知見が得られたことから、本研究は順調に進展していると考えられる。これまでに開発した葉緑体と大腸菌のシャトルベクターへ有用遺伝子を導入し、新たな形質転換体を作出する。また、形質転換体を開花・結実するまで育成し、このベクターが後代へ伝達するか調査する。葉緑体DNAの複製起点の同定に関する実験を、タバコのゲノム全領域について行う。また、この実験の対象をレタス、トマトおよびコムギなど他の植物へも拡張し、この実験方法と得られる結果の一般性を検証する。さらに、このベクターから目的遺伝子のみを葉緑体ゲノムへ移行させることで、抗生物質耐性遺伝子を持たない、マーカーフリー組換え体を作出する方法を確立する。葉緑体の遺伝子組換えを利用して、強光などのストレスに強い植物を作出する目的で、モデル植物であるタバコの葉緑体ゲノムに活性酸素分子種の消去に関わる酵素APXの遺伝子を導入した。その結果、APXを強発現する組換えタバコが得られたが、一部の系統に斑入りが観察された。その原因を探るため、斑入りのタバコの葉緑体ゲノムを調べたところ、著しくコピー数が増加したミニサークル(組換え型の葉緑体ゲノムからループアウトしてできた22kbの環状DNA分子)を葉緑体中に見いだした。この結果はミニサークルに葉緑体の複製起点が含まれることを示唆する。そこで本研究は、このミニサークルを利用して、葉緑体と大腸菌の双方で自律的に複製可能なシャトルベクターを初めて開発することを目的とした。この研究では、目的遺伝子を、相同組換えで葉緑体ゲノムに導入するのではなく、自律複製可能なベクターにクローニングして葉緑体へ導入する。また、タバコで得た葉緑体DNA複製の知見を、レタス、トマトおよびコムギへ応用し、この方法の汎用性を検討する。さらに、このベクターから目的遺伝子のみを葉緑体ゲノムへ移行させることで、抗生物質耐性遺伝子のマーカーフリー組換え体を作出する。平成29年度は、ミニサークルを分割して得た3種類の葉緑体DNA断片を、それぞれ大腸菌のプラスミドベクターpBluescriptIISK+にクローニングし、さらに抗生物質耐性マーカー遺伝子(aadA)を結合した3種類のシャトルベクターを構築し、タバコの葉へボンバードメント法により撃ち込んだ。

その結果、いずれのベクターからも抗生物質耐性を示すタバコのシュートやカルスを得ることができた。また、これらの個体を閉鎖系温室で育てて自殖種子を得て、次世代に抗生物質耐性が伝達するか調査した。その結果、一部の系統には耐性個体が出現し、このシャトルベクターが次世代へ伝わることが示された。本研究はおおむね順調に進展していると考える。その理由は、まず、パーティクルガン法を用いて上記3種類のプラスミドをタバコの葉へ撃ち込んだところ、実際に抗生物質耐性を示す複数のシュートやカルスが得られたことである。これらのプラスミドは、葉緑体内で自律複製しているミニサークルの断片を持つので、3種類のうち少なくとも1種類は、このような結果を示すであろうと予測していたが、すべてのプラスミドで耐性個体が得られたのは予想外であった。この結果は、用いたプラスミドがいずれも葉緑体の形質転換に利用できることを示している。また、次の理由は以下の実験結果による。耐性個体のシュートから、全DNAを抽出し、そのDNAを大腸菌へトランスフォームしたところ、#2Aと呼ぶ耐性系統からは、撃ち込んだプラスミドである#2Aがそのままの形でレスキューされた。このことは導入されたプラスミドが葉緑体中で自律複製可能であることを示しており、大腸菌と葉緑体の双方で複製可能なシャトルベクターを構築するという、当初の目的の本筋は#2Aにより達成されている。また#1および#3と呼ぶ耐性系統からは、撃ち込んだプラスミドよりもサイズの大きなプラスミド(プラスミド#1ins、#3ins)がレスキューされた。部分的シークエンンシングなどによる解析の結果、プラスミド#1insおよび#3insには、新たな葉緑体DNA断片が相同組換えによって移行していることも新たにわかった。撃ち込んだプラスミドが、植物内でどれだけ増加しているのかを調べるために、耐性個体の全DNAを鋳型に、TaqManプローブによるリアルタイムPCRを行った。その結果、プラスミドは葉緑体ゲノムに対して#1で7.9倍、#2Aで平均1.9倍、#3で平均6.2倍多くなっており、それが持つ断片によってコピー数に差が見られたものの、いずれも葉緑体内で増幅可能であることが示された。我々の研究グループでは、以前作出した斑入りを示す葉緑体の遺伝子組換えタバコに、著しくコピー数が増加した「ミニサークル」(組換え型の葉緑体ゲノムからループアウトしてできた22kbの環状DNA分子)を見いだしている。本研究の目的は、このミニサークルを利用して、葉緑体と大腸菌の双方で自律的に複製可能なシャトルベクターを初めて開発することにある。本研究では、このミニサークルに由来する3つの葉緑体DNA断片を、大腸菌の汎用プラスミドベクターにそれぞれクローニングし、抗生物質耐性マーカーであるaadAカセットを連結した後、パーティクルガン法によりタバコの葉へ撃ち込んだ。その結果、全てのプラスミドで形質転換体が得られ、さらに形質転換体から調製したDNAの解析から、撃ち込んだプラスミドが形質転換体の葉緑体内で複製、維持されていることが示された。このことは、タバコの葉緑体と大腸菌の双方で自律的に複製可能な3種類のシャトルベクターを構築することが可能であることを示す。
塩分過剰摂取が視床下部炎症を介して肥満を助長する機序の解明

塩分過剰摂取が肥満症を増悪させるかを検証する目的で、高脂肪食摂餌による肥満マウスモデルを基に、給餌に塩分を負荷して塩分を過剰摂取させるモデルを用いて、体重の推移や臓器障害を比較検討した。C57BL6雄マウスに高脂肪食(食塩濃度0.38%)、あるいは高脂肪高塩分食(食塩濃度2.0%または4.0%)を負荷した体重の推移を比較したところ、高脂肪高塩分食群(食塩濃度2.0%)においては体重が緩徐に増加し、給餌開始後30週付近で体重差は消失するが、高脂肪高塩分食群(食塩濃度4.0%)においては体重増加が抑制されたまま給餌開始後30週においても体重差は消失しなかった。視床下部炎症の程度を比較するため視床下部弓状核における炎症性サイトカインの発現を比較したが有意な差異を認めなかった。体組成を検討したところ、高脂肪高塩分食群においては食塩濃度2.0%、4.0%ともに精巣周囲脂肪量が有意に増加していた。以上の結果から、塩分過剰摂取は体重増加を抑制するにも関わらず、内臓脂肪を含めた体組成変化を惹起することが確認できた。高脂肪食群と比較して、高脂肪高塩分食群では、耐糖能が悪化し、インスリン分泌の低下を示唆する所見が得られた。組織学的検討の結果、高脂肪高塩分食群においては、膵島の数やサイズが低下する結果が得られた。膵における遺伝子発現を比較したところ、TGF-β、1型および4型コラーゲンの遺伝子発現が有意に増加しており、高脂肪高塩分食は、膵島において線維化を含む器質的変化やβ細胞の増殖、細胞死などに関与する可能性が示唆された。本研究により、脂質の過剰摂取に塩分過剰摂取が加わると、体重増加促進作用はないものの、体組成変化を来たすとともにインスリン分泌不全による耐糖能悪化を促進するという病態形成機序が想定された。本研究においては、塩分の過剰摂取がミクログリアの自然免疫応答機構を過剰活性化し、視床下部炎症の増悪を介して肥満を助長し、メタボリック症候群の病態を形成するという仮説を設定して検討を進めた。マウスを普通食群、高脂肪食群、高脂肪+高塩分食群に群分けして体重の推移を比較した結果、高脂肪+高塩分食群は、高脂肪食群に比較して摂餌量が同等であるものの体重増加が抑制された。解剖の結果、高脂肪+高塩分食群において精巣上体周囲脂肪量は有意に増加した。このことから高脂肪+高塩分食群は高脂肪食群に比較して、内臓脂肪量増加、除脂肪体重減少を来たすことが示唆された。近年、塩分過剰摂取によって筋肉量が低下することが報告されている。今回認められた高脂肪+高塩分食群における除脂肪体重減少についても、筋肉量の減少を介している可能性が推察された。マウスの脂肪量、筋肉量についてはCTによる解析を進めている。肥満に筋肉量低下を合併する病態は、サルコペニア肥満と提唱され高齢社会における病態として注目されている。今後は、塩分の過剰摂取が内臓脂肪増加、筋肉量低下といった体組成の変化を介してメタボリック症候群の病態を増悪させる可能性についても検討を進める方針である。また、今回のモデルにおいて、ミクログリアを介した視床下部炎症の関与について、視床下部弓状核の遺伝子発現を検討した結果、炎症性サイトカイン発現に有意な差は認めなかった。塩分をより高用量負荷したモデルを新たに用いて検討した結果、高脂肪食群に比較して炎症性サイトカインの発現が増加する結果が得られた。今後、塩分過剰が肥満の助長や体組成変化を引き起こす機序として中枢神経系を介した作用があるかについても解析を進める方針である。マウスに高脂肪+高塩分食を負荷した群は、高脂肪食群に比較して、内臓脂肪量増加と除脂肪体重減少を認めた。一方で、ミクログリアの免疫応答過剰を介して視床下部炎症が増悪するという仮説に対しては、それを裏付ける十分な結果は得られていない。この原因の一つとして、今回解析に用いた高脂肪+高塩分食モデルは、既存の高塩分負荷による免疫応答過剰を報告したモデルと比較して、塩分負荷量が低いためと考えられた。我々は当初、ヒトの日常診療への応用を勘案して、食事からの塩分摂取に近い塩分量を負荷したモデルを用いて検討を開始した。このモデルでは体重差と内臓脂肪増加が観察されるまで期間を要した。塩分負荷量が低いことが、体組成の変化は観察できたものの炎症反応の増加を検出し難かった原因と考えた。今回の結果を受けて、より高濃度の塩分を負荷したモデルについても解析を進めている。その予備的検討においては、視床下部弓状核において、高塩分+高脂肪食群で炎症性サイトカインのmRNA発現が増加する結果が得られた。また、体重増加抑制作用も増強されたため、内臓脂肪量増加、除脂肪体重減少につながるかについて解析を進めていく。今後、両者の塩分負荷モデルを用いて解析することによって、過剰な塩分摂取が中枢に影響する機序や視床下部炎症の増悪、中枢におけるエネルギーバランス調整に対する影響が引き起こされるかについても解析する方針である。耐糖能に対する影響についてはブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験を用いて解析している。筋肉、肝臓に対する影響については、遺伝子発現の変化や組織学的解析を進めている。

塩分過剰摂取が肥満症を増悪させるかを検証する目的で、高脂肪食摂餌による肥満マウスモデルを基に、給餌に塩分を負荷して塩分を過剰摂取させるモデルを用いて、体重の推移や臓器障害を比較検討した。C57BL6雄マウスに高脂肪食(食塩濃度0.38%)、あるいは高脂肪高塩分食(食塩濃度2.0%または4.0%)を負荷した体重の推移を比較したところ、高脂肪高塩分食群(食塩濃度2.0%)においては体重が緩徐に増加し、給餌開始後30週付近で体重差は消失するが、高脂肪高塩分食群(食塩濃度4.0%)においては体重増加が抑制されたまま給餌開始後30週においても体重差は消失しなかった。視床下部炎症の程度を比較するため視床下部弓状核における炎症性サイトカインの発現を比較したが有意な差異を認めなかった。体組成を検討したところ、高脂肪高塩分食群においては食塩濃度2.0%、4.0%ともに精巣周囲脂肪量が有意に増加していた。以上の結果から、塩分過剰摂取は体重増加を抑制するにも関わらず、内臓脂肪を含めた体組成変化を惹起することが確認できた。高脂肪食群と比較して、高脂肪高塩分食群では、耐糖能が悪化し、インスリン分泌の低下を示唆する所見が得られた。組織学的検討の結果、高脂肪高塩分食群においては、膵島の数やサイズが低下する結果が得られた。膵における遺伝子発現を比較したところ、TGF-β、1型および4型コラーゲンの遺伝子発現が有意に増加しており、高脂肪高塩分食は、膵島において線維化を含む器質的変化やβ細胞の増殖、細胞死などに関与する可能性が示唆された。本研究により、脂質の過剰摂取に塩分過剰摂取が加わると、体重増加促進作用はないものの、体組成変化を来たすとともにインスリン分泌不全による耐糖能悪化を促進するという病態形成機序が想定された。これまでの検討により、高塩分+高脂肪食の摂取によって内臓脂肪量増加、筋肉量低下が引き起こされる可能性が示された。肥満に筋肉量の低下を主体とするサルコペニアを合併するとインスリン抵抗性が増悪したり、生命予後が悪化することが報告されている。内臓脂肪量増加、筋肉量低下についてCTや解剖による組織重量などを用いてより定量的に比較する。また、内臓脂肪量増加や筋肉量低下によって、インスリン抵抗性、脂肪肝が進展増悪することが想定されるため、耐糖能評価や肝臓の組織学的解析に着手している。また、筋萎縮を来たす機序についてより詳細に解析することで、病態の解明、治療法の開発を目指す。塩分負荷を増強することで、視床下部炎症が検出される結果が認められたため、塩分過剰摂取がどのようなメカニズムで中枢に感知されて視床下部炎症やエネルギーバランスの調整異常を来たすかについても研究を展開する。塩分過剰摂取はメタボリック症候群の危険因子であるが、その意義については未解明な課題が多い。炎症を介さない体組成の変化についても、肥満症の質的な病態解明、治療法の開発に有用であると考えられるため解析を継続する方針である。
自然突然変異の原因としてのヌクレオチド除去修復の修復DNA合成エラー

研究代表者らの最近の研究から、ヌクレオチド除去修復能を欠損した大腸菌株では自然突然変異の発生頻度が顕著に低下することが明らかになった。この誰もが予期しなかった発見から、細胞内で無傷の染色体DNAあるいは未知の自然DNA損傷にヌクレオチド除去修復(NER)が作用する際に生じる修復DNA合成エラーが自然突然変異の重要な発生原因である可能性が浮かび上がってきた。修復DNA合成を行うDNAポリメラーゼIの校正機能欠損変異株でも自然突然変異頻度が大きく上昇すること、その上昇した変異頻度はNER欠損変異により抑制されることなどから、このモデルの妥当性はほぼ間違いないことと考えられる。このモデルの正否を最終的に確定し、NERに依存する自然突然変異の発生機構を解明することを目的として、NERに関与する遺伝子の過剰発現を利用して細胞内でのNER活性を上昇させた場合に自然突然変異頻度が上昇するかどうかを検討した。その結果、UvrAおよびUvrBタンパク質を過剰発現させた場合には10倍程度、さらにUvrCタンパク質も発現させた場合には数百倍の自然突然変異頻度の上昇を観察した。この結果、NERがDNA損傷が存在しないときにもDNA修復反応を引き起こし、その修復合成の過程で突然変異が誘発されることが強く示唆された。
シンクロナイズドスイミングのスラスト動作の技術特性

本研究は,トップレベルのシンクロナイズドスイマーの水上・水中のスラスト動作を3D DLT法を用いて分析し,スラスト動作の高さの獲得に関連する技術特性を明らかにした.水面下と水上の両方を用いる動作を同時に分析した初めての研究である.研究結果から,スラストの最大到達高を高めるための重要なテクニックは,短時間でアンロールすること,およびスラスト前半に腕をかき下げず,腕をターンする際に水面近くの水をキャッチすることであると結論づけられた.スラスト動作のスカーリングと身体動作の技術特性を明らかにし,スキル向上に役立てることが本研究の目的である。スラスト動作の優劣は水上高によって評価されるため,平成26年度はスラスト動作を含めたシンクロナイズドスイミング演技中の水上到達高の測定方法について,即時的に評価できる方法がないか検討した。従来の1.映像分析に加えて,2.加速時計Myotestを用いた分析,3.レーザー・レーダーを用いた分析の3つの方法で予備実験を行った。その結果,2.加速時計Myotestを用いた分析は水中では使用できないため,スラスト動作の測定はできないが,陸上での類似動作,つまりスラスト動作の陸上トレーニングのひとつであるアンロール動作(バレーレッグダブル姿勢から両脚を鉛直方向に突き上げる動作)の速度測定は可能であり,トレーニング指標として有効であることがわかった。3.レーザー・レーダーは動く選手をリアルタイムに検知し可視化でき,位置,動き(移動方向・速度),軌跡を把握可能である。日立製作所,国立スポーツ科学センター研究員の伊藤浩志氏,およびシンクロナイズドスイミング日本代表チームの協力を得て,レーザー・レーダーが水中動作を対象に検知・可視化できるかどうかの予備実験を行った。シンクロナイズドスイミング演技は,水中環境であることに加えて移動範囲が広いため,3次元で分析しなければ精度の高いデータが得られないことが明らかとなり,現時点での予算では限界があることがわかった。レーザー・レーダーについては継続して使用可否を検討したい。また,研究に関する情報収集のため,オーストラリアで開催された水泳バイオメカニクス国際学会へ参加,世界上位国のスラスト動作の映像収集のため国際大会を視察,また本研究課題につながる研究成果を日本体育学会にて発表した。本研究の目的は,テクニカルルーティンの規定要素に含まれる重要な基本動作であるスラスト動作を,水上および水中を同期させた3次元画像分析によってスラスト動作のスカーリングと身体動作の技術特性を明らかにし,スキル向上に役立てることであった。平成27年度は,前年度に試行したレーザー・レーダー分析が予算的に叶わなかったことから,従来用いていた三次元画像分析を用いて動作分析を行った。国内トップレベルの女子シンクロナイズドスイミング選手を対象者とし,スラスト動作の三次元映像分析を行った。画像分析に必要なキャリブレーション較正器を制作し,水上撮影用カメラ2台と水中撮影用カメラ2台の計4台を同期させ,スラスト動作を撮影した。4台のカメラによって得られた画像それぞれから,較正点および被験者の身体各部位の座標を,動作解析システム(DKH,Frame-DIAS)を用いて読み取った。3次元座標は,3D-DLT法を用いて算出した。分析のパラメータ変量を,最大到達高,肩・肘・手首の対水面高,アンロール時間,スカーリング時間,スラスト動作時間,最大重心鉛直速度とした。得られた研究成果は,シンクロナイズドスイミング上級コーチ養成講習会(H27年10月25日)およびシンクロナイズドスイミングコーチ養成講習会(H27年11月28日)にて発表し,結果の解釈について現場指導者らとディスカッションを行った。競技レベルの異なる選手を対象にスラスト動作の映像を収集し,水中と水上動作を同期させた3次元画像分析を実施できた。分析で得られた結果からスラスト動作の指導ポイントや重心ー浮心関係の変化などについてまとめ,「コーチ養成講習会」「上級コーチ養成講習会」「全国コーチキャンプ」などの指導者講習会・研修会で解説した。また,日本代表合宿時にコーチらと指導ポイントについてディスカッションを行い,研究結果の解釈の考察に役立てることができた。近年,シンクロナイズドスイミングの技術進歩はめざましく,リスクの高いダイナミックな動作を次々に展開していく演技傾向が強まっている.現在,自力で行う動作の中で,もっとも高さを得られる技はスラスト動作である.シンクロナイズドスイミングは水面下と水面上の両方を用いて実施される三次元の動作であることから,これまでキネマティック研究はほとんどなされてこなかった.本研究の目的は,水上および水中の3次元映像分析を用いて,一流シンクロナイズドスイミング選手におけるスラスト動作の高さの獲得に関連する技術特性を明らかにすることである.トップレベルのシンクロナイズドスイマーの水上・水中のスラスト動作を3D DLT法を用いて分析した.その結果,以下の結論が得られた.最大到達高指数と最大重心鉛直速度に有意な関連があったことから,最大到達高を大きくするためには,重心鉛直速度を高める必要がある.最大到達高指数の高い選手は,腕ターンの局面において,素早い腰の伸展によってアンロールを短時間で行っていた.また,腕プル時に手首を水面近くに保ってかきおろさないで,腕ターン時に高い手首の鉛直速度を示し,腕を水面近くへ上昇させていた.このことから,スラストの最大到達高を高めるための重要なテクニックは,短時間でアンロールすること,およびスラスト前半に腕をかき下げず,腕をターンする際に水面近くの水をキャッチすることである.

本研究はシンクロナイズドスイミングの動作を水上と水中の両方を同時に分析した初めての研究である.一連の技術を身体全体を捉えて分析できた結果,水中での腕のかきと身体の動きのタイミングを明らかにすることができた.研究結果は,国際学会で発表しプロシーディングに論文投稿した.また,日本水泳連盟主催の公認コーチ研修会,講習会において講義を行い,指導者らに対して実践への応用をフィードバックした.本研究は,トップレベルのシンクロナイズドスイマーの水上・水中のスラスト動作を3D DLT法を用いて分析し,スラスト動作の高さの獲得に関連する技術特性を明らかにした.水面下と水上の両方を用いる動作を同時に分析した初めての研究である.研究結果から,スラストの最大到達高を高めるための重要なテクニックは,短時間でアンロールすること,およびスラスト前半に腕をかき下げず,腕をターンする際に水面近くの水をキャッチすることであると結論づけられた.シンクロナイズドスイミング演技中の水上到達高の測定方法について,加速時計Myotestを用いた分析およびレーザーを用いた分析の予備実験を行った。研究計画にもとづくと,レーザー・レーダーにて動作を撮影し,実際の競技会で水上高等のデータ収集を試みることにしていたが,予算の関係上難しいことが判明し,運用できなかった。しかしながら,従来の3次元画像分析に加えて,陸上トレーニングでのMyotestを併用すると,スラスト動作の評価をこれまでよりも効果的に行えることが示唆されたことは収穫である。また,研究に関する情報収集のため,国際学会へ参加,また本研究課題につながる研究成果を国内学会にて発表できた。よって,総合的には「おおむね順調に進展している」と判定した。平成28年度は研究論文にまとめ,国内・国際学会等で発表,学会誌への投稿を行う。シンクロナイズドスイミング技術指導マニュアル等に,本研究の成果から得た実践的知見を記述するとともに,指導者講習会等でデータを活用し,シンクロナイズドスイミングの競技力向上に役立てる。水泳競技コーチング論レーザー・レーダーにて動作を撮影し,実際の競技会で水上高等のデータ収集を試みることにしていたが,精度の高いデータを得て解析するには3次元分析システムが必要であることが予備実験で判明した。3次元でのレーザー・レーダー分析システムの開発は本研究課題の予算では難しいことから,従来の3次元画像分析と加速時計を用いて陸上でのスラスト動作の分析を行うことで,スラスト動作の評価指標を得ることとする。平成26年度にレーザー・レーダー分析機器の制作・購入を計画していたが,試験実験をした結果,本研究の分析には3次元レーザー・レーダーでなければ精度の高いデータが得られないことがわかった。3次元の分析機器は本予算では賄えないことから機器購入を断念し,平成27年度に現有の分析機器で分析を行ったため,使用予定額に差額が生じた。レーザー・レーダー分析システムを購入する予定であったが,予備実験の結果,当初購入予定の2次元分析システムでは精度の高いデータ収集ができないことが判明した。