hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外交・安全保障政策の日独比較研究-「防衛構想」と対米関係を中心として-

研究実施計画に基づいた今年度の作業および実績にかんしては、以下のとおりである。佐藤内閣期における日米関係の展開過程について、第3次佐藤内閣期(1970年1月以降)の安全保障問題をめぐる日米の協議過程を中心に明らかにした。具体的には、当時日米間において協議事案となっていた、在日来軍基地の問題、沖縄返還などの問題をめぐる日米の協議過程を考察した。資料として、昨年度および一昨年度に調査・収集した外交資料を用いて、事実の解明作業をすすめていった。また、独米関係の展開過程について、1969年以降(SPD・FDP連合政権期)の事実の解明作業をおこなった。くわえてアメリカの対独政策にかんして、ニクソン政権期のアメリカの対日政策および対独政策について、国務省文書を中心に整理作業をすすめた。資料として、おなじくこれまでに調査・収集した外交資料を用いた。以上にかんして、未整理部分の史資料の調査・収集を目的として、2003(平成15)年9月に「外国旅費」を使用して、アメリカ国立公文書館(メリーランド州カレッジパーク)において約10日間資料調査・収集作業をおこなった。昨年度に引きつづいて、ニクソン政権期の対日政策および対独政策にかんする外交資料について、1966年から1973年にかけての国務省文書(Subject Numeric Files)および大統領文書などを中心にあたった。これらの史資料から、ニクソン政権期のアメリカの対日政策、対独政策の展開過程にかんする考察をすすめた。以上の作業から、「デタント」期の日米関係・独米関係の展開過程を実証的に検証した。研究実施計画に基づいた今年度の作業および実績に関しては、以下のとおりである。前年2001(平成13)年度に科学研究費補助金を使用して収集した1次資料を中心にして、2002(平成14)年9月に、拙稿「中曽根康弘防衛庁長官の安全保障構想-自主防衛と日米安全保障体制の関係を中心に-」を『九大法学』第84号に発表した。本稿では、デタント期の日米安全保障体制をめぐる政治過程に関する考察の一環として、中曽根康弘防衛庁長官期(1970年1月1971年7月)の日本の安全保障政策、および日米協議の過程を中心に明らかにした。1970年1月に、対同盟諸国への防衛上の役割分担要求としてニクソン政権によって「ニクソン・ドクトリン」が提示されるが、これに対する日本側の政策決定者の対応の側面を示した。また2003(平成15)年1月に、国内旅費を使用して外務省外交史料館において外交資料を調査・収集した。外交資料は、2002(平成14)年12月に公開された第17回外交記録公開分を中心にあたった。そのほか、デタント期のアメリカ対外政策に関して、"Japan and the United States : Diplomatic, Security and Economic Relations, 1960-1976"に所収分の外交文書を読み進める機会をえた。また3月にアメリカ国立公文書館にて、ニクソン政権期の対日政策および対独政策に関する公文書を調査・収集した。以上について踏まえたうえで、今後はこれらの史資料を読み進めて整理していくと同時に、中曽根長官期(1971年7月)以後のアメリカの対外政策、および対同盟諸国政策の展開、および日米関係・独米関係の展開について考察を進めていく予定である。それらの成果に関しては、来年度以降活字論文において公表する予定である。
異方的超流動ヘリウム3A相における量子渦の可視化

今年度は、昨年度に引き続き、MRIの分解能の向上を図った。特に低温高磁場下で生じる非線形現象とMRIとの関係について調べた。低温高磁場下においては磁化が増大するため、MRIの分解能が向上する。しかし、大きな磁化による双極子相互作用が多重エコー(MSE)やスピン流などの非線形効果を生む。MSEに関しては、180度パルスが均一に照射されればその発生を抑制できる。そのため昨年度に送信RFコイルの大型化による実空間均一度の向上と、共鳴回路の小型化によるQ値の向上を図ることによる送信パルスの周波数空間での均一度の向上を図った。しかし、大きなMSEらしきものが発生したために、その発生メカニズムを調べた。発生していたMSEには低温になるほど大きくなるという温度依存性があった。これは、MSEの大きさが磁化の増大に比例するという事実と合う。しかし、MRI画像作成時の磁場勾配の方向依存性を解析してみると、MSEの大きさに比例するb値と呼ばれる値が、0から負の領域で、MSEの大きさが大きくなるという結果となっていた。そのため、単純にMSEが生じていためにMRIの画像の歪みが生じたと結論づけることができていない。また、低温領域では、スピン拡散の影響が顕著となり、上記であげた単純なMSEのメカニズムが機能していないと考えられる。また、70年代にコーネル大のグループが、低温高磁場領域において出現するスピン流を観測している。これは、NMRによって作られた磁化の勾配によって生み出されたとされている。このコーネル大での状況に近い形のものが、今回の実験においても生み出されていた可能性がある。そこで、現在においても、数値計算を含め解析を行なっている。非線形現象とMRIとの関係の解析に平行して、回転する核断熱希釈冷凍機の建設を進めた。回転部をくみ上げ、回転のテストを行なった。また、低温部の部品を作製した。今年度は,主にMRIの分解能の向上を行った。分解能の向上には,磁場勾配の増加が必要であるが,帯域が広がるため,測定感度の向上が必要であり,それらの改善を行い,測定を行った。磁場勾配はx, y, zの各方向とも1.7T/mを実現している。磁場勾配を増やしたためにそれに付随して,周波数帯域を制限するために試料の大きさを小さくする必要や,励起コイルの均一度の向上,励起電力の増大などが必要であった。また,パルス法を用いているために2つの異なる位相を持つ信号間のタイミング等の問題があり,それが分解能の低下の原因となっていた。さらに,低温において磁化の拡散が顕著となるため,それらの影響を調べた。大きな拡散係数のために短いパルス間間隔にしたり, 90度180度パルスの影響を減らすために位相を変えて励起したデータを用いて解析するなどの方策を用いて,データの精度を向上させるなどを行い,現時点で1μmのピクセルサイズを実現しているが,画像に様々な影があり,それらの原因を特定する必要がある。
統合失調症死後脳におけるオリゴデンドロサイト/ミエリンの神経病理学的研究

統合失調症のオリゴデンドロサイト/ミエリン病態を明確化するために、死後脳を対象とした神経病理学的な検討を行い、統合失調症の長期罹患例の上側頭回では、myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)の発現やMOG陽性線維状構造物の厚みが減少していることを明らかとした。上側頭回は神経画像研究で、進行性の形態変化が報告されており、これらは疾患病態を反映する観察所見と考えられた。海馬CA3においても、同様の所見が認められた。さらに、分子生物学的な背景との関連性をより明確にするために、稀なゲノム変異を伴う統合失調症死後脳で検討を行った。22q11.2欠失を伴う統合失調症においてもMOGの発現・構造物の厚みの減少が観察された。また、白質Nogo-A陽性オリゴデンドロサイト(OLG)密度が、稀なゲノム変異のない統合失調症と比較して、より減少していた。22q11.2欠失領域はNogo-Aの受容体を包含しており、欠失領域との関連が強く推量された。カルボニルストレス系ゲノム変異を伴う統合失調症では、KB染色でミエリンの密度が低下し、白質のNogo-A陽性OLG密度が減少していた。白質には終末糖化産物が豊富に蓄積し、カルボニルストレス亢進とオリゴデンドロサイト/ミエリン病態との関連が推量された。いずれの稀な変異を伴う死後脳も、モデル動物で確認していたカテコラミン神経系、GABA神経系の形態変化が観察された。統合失調症死後脳においてオリゴデンドロサイト/ミエリンの変化を実際に観察し、さらに稀なゲノム変異を伴う死後脳でも、オリゴデンドロサイト/ミエリンに加え、カテコラミン神経系、GABA神経系の変化を共通所見として観察することで、オリゴデンドロサイト/ミエリンが統合失調症の病態に関連することを神経病理学的に確認した。1.症例数を増やすために、引き続き死後脳の収集を行った。その上で、統合失調症死後脳の上側頭回において、正常脳とのmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)の形態学的差異を神経病理学的に検討した。罹病期間、薬剤などの臨床情報も収集・解析し、その結果、罹病期間が長期に及ぶ統合失調症の上側頭回皮質中間層において、MOGの分布が低下していること、さらに、皮質第III層で、神経線維ごとのMOGの発現が減少していることを明らかとした。これらの所見は、抗精神病薬の薬剤量やpost-mortem intervalと関連はなく、統合失調症の進行性の脳病態(長期罹患)と関係している可能性が示唆された。海馬CA3においても同様の所見を認めたが、下頭頂小葉では認められず、この変化の部位特異性が示唆された。上側頭回に関してはこの領域が精神症状に関連することを、器質的な要因を基盤に精神症状を生じた症例で検討し、症例報告として報告した。2.MOGの分布の神経病理学的検討を、発症に強く関与する稀なゲノム変異を同定したヒト死後脳(カルボニルストレス系ゲノム変異、22q11.2欠失、MBD5欠失を伴う統合失調症死後脳)及びDISC1KOマウスにおいても実施した。その結果、22q11.2欠失統合失調症死後脳の上側頭回、海馬CA3において、他の統合失調症と同様のMOG分布所見、神経線維ごとのMOGの発現が減少している所見を観察した。このことにより、22q11.2欠失が関与する病因・病態が統合失調症の同部位のオリゴデンドロサイト/ミエリン病態に関連している可能性が推量された。また、DISC1KOマウスに関しては、統合失調症の病態とDISC1との関連をより明確にするために、カテコラミン神経系、GABA神経系等も検討し、報告した。本研究の目的は、オリゴデンドロサイト/ミエリンの異常が統合失調症の病態に関与していることを、オリゴデンドロサイト/ミエリンの形態学的所見を免疫組織学的、神経病理学的に観察することによって、明らかにすることにある。また、そのために、一般的な統合失調症死後脳で検討を行うだけでなく、発症に強く関与するゲノム変異を同定したヒト死後脳や遺伝子改変モデル動物でも、統合失調症死後脳と同様の所見が観察されるか適時参照することを方法論の一つとしている。平成28年度は、myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)の形態学的変化を統合失調症死後脳で免疫組織学的、神経病理学的に検討し、さらにこれを統合失調症に強く関与するゲノム変異を同定したヒト死後脳や遺伝子改変モデル動物でも、検討することを計画していた。実際に、一般的な統合失調症死後脳、すなわち、稀なゲノム変異のない統合失調症死後脳において、正常対照死後脳とは異なったMOGの形態学的所見(上側頭回、海馬CA3におけるMOGの分布・発現の変化)を得て、さらに、その部位特異性、疾患との関係性(長期罹患との関係)を確認し、この所見が統合失調症の病因・病態を反映している可能性を明らかにした。

また、統合失調症に強く関与するゲノム変異を同定したヒト死後脳や遺伝子改変モデル動物でも、同様の検討を行い、22q.11.2統合失調症死後脳において、同様のMOGの分布・発現の変化を確認し、22q11.2欠失が関与する病因・病態が統合失調症の同部位のオリゴデンドロサイト/ミエリン病態に関連している可能性を明らかにした。症例数増加のための死後脳収集および収集脳の一般病理学的所見の検討も適宜行っており、これらのことから、概ね順調に進展していると考えられる。前年度までに、統合失調症の長期罹患例にて、上側頭回、海馬CA3におけるmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)の分布の変化、神経線維ごとのMOGの発現の減少を明らかとし、同様の所見を稀なゲノム変異を同定した死後脳(カルボニルストレス系ゲノム変異、22q11.2欠失、MBD5欠失を伴う統合失調症死後脳等)のなかでも、22q11.2欠失統合失調症死後脳において認められることを確認していた。平成29年度は、MOG以外のオリゴデンドロサイト/ミエリン関連タンパクのうち、Nogo-Aに着目し、統合失調症死後脳および稀なゲノム変異を同定したヒト死後脳(平成28年度の結果から特に22q11.2欠失統合失調症死後脳)にて、形態学的所見の検討を行った。22q11.2欠失の欠失領域はNogo-Aの受容体を包含している。結果、22q11.2欠失統合失調症の剖検脳における上側頭回の白質では、稀な遺伝子変異のない統合失調症と比較して、Nogo-A陽性オリゴデンドロサイトの密度が減少し、22q11.2欠失が、統合失調症患者の剖検脳において上側頭回のオリゴデンドロサイト/ミエリンの変化に関連していることが示唆された。Nogo-A陽性神経細胞は、22q11.2欠失統合失調症死後脳の上側頭回皮質第III層において、稀な遺伝子変異のない統合失調症と比較して、増加していたが、病態との関連はさらなる検討を必要とする。DISC1KOマウスに関しては、統合失調症の病態とDISC1との関連をより明確にするために、Neuropeptide Yについて検討した。症例数増加のために、引き続き死後脳の収集をおこない、稀な遺伝子変異を持つ統合失調症(X染色体に5.1Mbのサイズの重複。重複領域には、HTR2C、PAK3などの重要な遺伝子を有する)の死後脳を見出した。平成29年度は、myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)以外のオリゴデンドロサイト/ミエリン関連タンパクの形態学的変化を、統合失調症死後脳及び統合失調症に強く関与するゲノム変異を同定したヒト死後脳で免疫組織学的、神経病理学的に検討することを計画していた。平成28年度までに行った研究をもとに、22q11.2欠失における欠失領域が関連しうるオリゴデンドロサイト/ミエリンの病態に着目し、抗Nogo-A抗体を用いた免疫組織学的、神経病理学的検討により、22q11.2欠失統合失調症死後脳と稀な変異のない統合失調症との比較から、22q11.2欠失が、統合失調症患者の剖検脳において上側頭回のオリゴデンドロサイト/ミエリンの変化に関連していることを示唆する観察所見を見出した。今回観察した所見は神経画像や分子生物学的研究結果の実際の組織上の変化を捉えていると考えられる。本研究では、一般的な統合失調症死後脳で検討を行うだけでなく、発症に強く関与するゲノム変異を同定したヒト死後脳や遺伝子改変モデル動物でも、統合失調症死後脳と同様の所見が観察されるか適時参照することを方法論の一つとしているが、前年度までの結果から、観察領域、主に観察すべき対象・背景に想定しうる病態、観察候補となるオリゴデンドロサイト/ミエリン関連タンパクを絞り込み、実際の統合失調症死後脳において、疾患病態に関連しうると考えられるオリゴデンドロサイト/ミエリンの変化を観察することが出来た。
発生工学を用いたNIDDMの病態モデル作成によるNIDDMの発症機構の解明

IRS-1欠損マウス(Nature372:182-186,1994;J.Clin.Invest.99:861-866,1997)が骨格筋や脂肪細胞でのインスリン抵抗性を有するが膵β細胞過形成を呈するするため,正常耐糖能が保持されるのと対照的である。一方、IRS-2欠損マウスは肝臓でインスリン抵抗性を有するうえに,膵β細胞形成障害が存在するためNIDDMを発症した(Diabetes,in press)。このようにIRS-1とIRS-2は類似した構造をもつものの,インスリン標的組織におけるインスリン作用や膵β細胞分化・増殖シグナルにおいて異なる役割を担っていることが示唆された。また、膵β細胞のグルコース応答性インスリン分泌におけるNADHシャトル(グリセロールリン酸(GP)シャトルとリンゴ酸・アスパラギン酸(MA)シャトルから構成される)の役割解明のため、GPシャトルの律速酵素であるミトコンドリア・グリセロール3リン酸脱水素酵素(mGDPH)欠損マウスを作製し,NADHシャトルがミトコンドリアエネルギー代謝の活性化を介して,グルコース応答性インスリン分泌の主要経路であることを初めて明らかにした(Science 283:981-985,1999;J.Biol.Chem.274:25386-25392,1999)。さらに個々の糖尿病候補遺伝子の欠損マウスのそのかけ合わせにより多因子病としてのヒト糖尿病を再構成し,糖尿病の発症進展にはインスリン分泌不全とインスリン抵抗性の両者の存在が重要であることを個体レペルで直接証明した(J.Clin.Invest.99:861-866,1997)。このように発生工学を用いて個体レペルでの糖尿病発症機構の解析を精力的に進めてきた。ヒトNIDDM遺伝子マッピング・同定が急速に進んでいる現状を鑑みると,発生工学的手法によりヒト遺伝子異常をマウスにおいて再構成することがヒトNIDDMの分子機構の解明にも重要な役割を果たすことが期待される。【目的】日本人NIDDMは、病初期よりの膵b細胞におけるグルコース応答性インスリン分泌低下を特徴とするが、その成因にグリセロールリン酸(GP)シャトルおよびリンゴ酸・アスパラギン酸(MA)シャトルからなるNADHシヤトルの機能不全が関与する可能性が指摘される。グルコース応答性インスリン分泌におけるNADHシャトルの意義を、GPシャトルの律速酵素であるmitochondrialglycerol-3 phosphate dehydrogenase (mGPDH)遺伝子欠損マウスを作製して解析した。【結果】mGPDH欠損マウスは正常耐糖能であり、膵島のグルコース応答性インスリン分泌も正常であった。MAシャトルの阻害剤であるアミノオキシ酢酸(AOA)存在下での野生型マウス膵島のインスリン分泌も障害されなかった。しかし、mGPDD欠損マウス膵島にAOAを作用させ、両シャトル活性を停止させると、インスリン分泌はほぼ廃絶した。この際、グルコースの解糖系での利用およびミトコンドリア内での酸化には有意な障害は認められなかったが、TCAサイクルでのグルコース酸化は42%に低下していた。また、グルコ一ス応答性のNAD(PH)Hの産生およびミトコンドリア内膜過分極の形成は約2530%に低下しており、ミトコンドリア内へのCa^<2+>流入ほはとんど消失していた。膵島ATP含量の増加も、約40%に低下していた。【考察】

NADHシャトルは、TCA回路および酸化的リン酸化を含むミトコンドリア・エネルギー代謝の活性化を介して、膵島グルコース応答性インスリン分泌に必須であることが初めて示された。膵b細胞に流入したグルコース濃度情報は、古典的に考えられていたようにピルビン酸としてではなく、主としてNADHとしてミトコンドリアに伝達されて、代謝性シグナルであるATPを産生すると考えられた。本研究では発生工学を用いてインスリン作用やインスリン分泌に関する遺伝子を操作した動物モデルを作製し、糖尿病の成因や病態を個体レベルで解析した。IRS-2(Insulin receptor substrate-2)欠損マウスの作成:IRS-1とIRS-2はインスリン受容体チロシンキナーゼの主要な基質であり、受容体以後のシグナル伝達の最初のステップとして重要と考えられている。IRS-1欠損マウスは、インスリン抵抗性が存在するものの、耐糖能は正常に保たれていた。これは膵β細胞過形成によりインスリン分泌が十分に保たれているからであった。一方、本年度IRS-2欠損マウスの作成に成功した。ヘテロIRS-2欠損マウスは特に明らかな表現型を認めない。ホモIRS-2欠損マウスは現在3週令であり今後詳細に解析を行う。グリセロールリン酸シャトル欠損マウス:mGPDH欠損、すなわちGP(グリセロールリン酸)シャトル欠損マウスを、ジーンターゲティングの手法を用いて作製した。GPシャトル欠損マウスにMA(リンゴ酸-アスパラギン酸)シャトルの阻害薬であるアミノオキシ酢酸(AOA)を併用することにより、膵島で両方のNADHシャトル機能を停止させると、グルコース応答性インスリン分泌はほぼ完全に廃絶した。このようにNADHシャトル機構は、グルコース応答性インスリン分泌に必須であることがはじめて明らかにされた(Science 283:981-985,1999)。PI3キナーゼp85α調節サブユニット欠損マウス:PI3キナーゼp85α調節サブユニット欠損マウスは正常に生まれ、成長や行動に異常を認めなかったが、インスリン感受性亢進と低血糖を認めた。骨格筋や脂肪細胞でのインスリン依存的糖取り込み能が亢進していたが、これは脂肪細胞内でのGLUT4 translocationのexocytosis経路が亢進しているためであった。インスリン依存的にIRS-1と結合する調節サブユニットは野生型ではp85αであったのに対し、欠損マウスではp85αのaltemativesplicing isoformであるp50αであった。欠損マウスではPI3キナーゼ産物であるPI(3,4,5)P_3の産生が増加しており、この結果、GLUT4 translocationが亢進したと推測された。PI3キナーゼ活性化が個体レベルでのglucose homeostasisやインスリン依存的糖輸送に強く関与していることが証明された(Nature Gcnetics21:230-235,1999)。IRS-1欠損マウス(Nature372:182-186,1994;J.Clin.Invest.99:861-866,1997)が骨格筋や脂肪細胞でのインスリン抵抗性を有するが膵β細胞過形成を呈するするため,正常耐糖能が保持されるのと対照的である。
NOによる肝細胞死制御とその機構解明に関する研究

本研究のin vitroにおいて、TNF-a+actinomycin Dにより誘導されるapoptosis発生はNO誘導物質であるSNAPにより、mitochondria呼吸鎖で産生されるROI発生の抑制を介して抑制された。このapoptosis抑制はNOによる直接的なROIのscavenge作用ではなく、cytochrome oxidase活性の抑制によると考えられた。TNF-a+actinomycin D投与後のdihydrorhodamine123やhydroethidineの酸化がNOにより抑制される機序に関してはNOが直接的にTNF-a+actinomycin Dにより産生されたROIと結合してROIを中和する、NOが酸素と競合することによりcytochrome oxidaseによる呼吸を抑制するなどが考えられた。しかも、ONOO^-の障害作用が何らかの形で抑制されたことが考えられるが、その作用機序に関しては不明である。いずれにしても、NOがmitochondriaにおける呼吸鎖のcomplexI,II,IIIの抑制を制御したことから、NOによるapoptosis発生の抑制がmitochondriaにおける呼吸鎖でのROI抑制によると推察できる。In vivoにおいても、LPS誘発apoptosisを確認した。DNA fragmentationは肝細胞死の数時間前にALTの上昇と同じように出現したことから、LPSによる肝障害の初期はapoptosisが主体である可能性が考えられる。Fas/CD95は正常の肝細胞でも誘導され、apoptosis発生の必要性に応じてapoptosisを誘導することが知られている。しかし本研究において、Fas/CD95の誘導とは無関係にapoptosisが発生した。本研究においてTNF-a,LPSにてmitochondria内膜障害、NAD^1の減少、ATP減少などに続くpoly(ADP-ribose)polymerase活性の賦活などを認めた。NOの障害性に関して、peroxynitriteはDNAの断片化、poly(ADP-ribose)polymerase活性化を促進し、細胞内エネルギー量の低下をもたらすが、NO自体にはその作用が極めて低いと考えられている。DNAはあらゆる障害物質にてたやすく傷害され、poly(ADP-ribose)polymeraseが活性化される。poly(AP-ribose)polymeraseの活性化は細胞内エネルギーを消費し、NAD^+の低下などが発生するため、その程度が高じると細胞障害を増長すると考えれる。LPSにより惹起される肝細胞死に対するNOによる防御機構の解明に関して検討した。1)250g Wistar系ラットにLPS100μg/kg,LPS+actinomycin D800μg/kg,LPS+act D+100μSNAPを投与して、4、6、8時間後のミトコンドリア機能を酸素消費量にて検討したところ、LPS単独では4時間目に0%、6時間目に2%、8時間目2%とミトコンドリア機能には異常を認めなかった。LPS+act Dでは4時間目に13%、6時間目に19%、8時間目37%のミトコンドリア機能抑制を認めた。LPS+act D+SNAPでは4時間目に4%、6時間目に11%、8時間目に14%と有意にミトコンドリア機能低下の抑制を認めた。2)遊離肝細胞を用いてミトコンドリア産生活性酸素種による細胞障害性とNOによる抑制、poly(ADP-ribose)polymeraseとの関係について検討した。

LPSにて発生する細胞障害はNOにより抑制され、それと平行してpoly(ADP-ribose)polymerase活性が増加した。LPSおびNO添加量を増量して行くと、それと平行してpoly(ADP-ribose)polymerase活性もより増加したが、細胞障害性もより強くなった。その際の細胞内ATP含有量、NAD量は著明に低下していた。したがって、活性酸素産生量が増加し、NO量を増加すれば、かえってADP-ribosylationにともなうNADの枯渇を惹起して、細胞障害性が強くなるものと解された。3)ミトコンドリア膜電位の低下が細胞障害性の誘因ではないかとして膜電位を検討したが、膜電位が十分維持されている状態下においても細胞障害性を認めたことから、その障害は他の原因によるものと解された。4)細胞内活性酸素産生量とミトコンドリア障害とはほぼ平行していた。5)LPS+act DによるDNA-fragmentationは4時間目から認め、6時間目に48%となった。そのDNA-fragmentationはSNAP添加により21%に有意に抑制された。LPSにより惹起される肝細胞死に対するNOによる防御機構の解明に関して検討した。2)iNOS阻害剤SMT 10mg/kgを腹腔内投与した後、LPS+Act Dを投与したところ、ミトコンドリア呼吸能は極めて悪化した。3)遊離肝細胞を用いてミトコンドリア産生活性酸素種による細胞障害性とNOによる抑制、poly(ADP-ribose)polymeraseとの関係について検討した。しかも、SMT添加によりその活性はさらに増加し、細胞障害性もより強くなり、その際の細胞内ATP含有量、NAD量も著明に低下した。しかし、その活性の増加はSMAP投与にて有意に抑制された。4)ミトコンドリア膜電位はiNOS阻害剤を投与しない状態ではある程度維持されていたが、iNOS阻害剤投与にて極めて悪化した。4)細胞内活性酸素産生量はNO産生、抑制においても有意差を認めなかった。5)LPS+act DによるDNA-fragmentationは4時間目から認め、SNAP添加により有意に抑制され、SMT添加により増強した。本研究のin vitroにおいて、TNF-α+actinomycin Dにより誘導されるapoptosis発生はNO誘導物質であるSNAPにより、mitochondria呼吸鎖で産生されるROI発生の抑制を介して抑制された。
ラン藻におけるクロロフィルbの発現

本年度は、クロロフィルb含量の高い光化学系Iの吸収スペクトル解析を行うために、クロロフィルb合成活性の高い形質転換株の作製を行なった。ラン藻の1種である原核緑藻Prochlorothrix Hollandicaのクロロフィリドaオキシゲナーゼ(CAO)遺伝子は、シロイヌナズナのCAOに比べて非常に短いことが知られている。このProchlorothrixとシロイヌナズナのCAOの配列比較より、シロイヌナズナのCAOの活性中心は、CAOのC末端側に存在していることが予想された。また、N末端側には未知の機能を有していると考えられた。そこで、シロイヌナズナのCAOのN末端領域を短く改変したものと、Prochlothrix HollandicaのCAOを導入した形質転換株を作製した。ProchlorothrixのCAO、並びにN末端を削除したシロイヌナズナのCAOは、今まで用いてきた形質転換株に導入されているCAOの約6割の長さを持つ。このように、配列を短くすることで、CAOの発現効率が上昇することが期待された。これらの形質転換株のクロロフィルb合成活性を比較したところ、ProchlorothrixのCAO、ならびにN末端を除去したシロイヌナズナのCAOを導入した株も、以前の形質転換株より高いクロロフィルb合成活性を示さなかった。これらの改変したCAOは、シロイヌナズナ中では非常に高いクロロフィルb合成活性を示すことから、シロイヌナズナのCAOのN末端側の領域は高等植物内でのみ機能すると考えられた。ラン藻のクロロフィルb合成形質転換株を用いて、クロロフィルbの作用スペクトルや集光装置内におけるクロロフィルb結合部位の解析を行ってきた。そして、さらに詳細な解析を行うために、クロロフィルb含量の高いラン藻を作製しようという試みを行ってきた。昨年度までは、クロロフィルa/b結合タンパク質であるlhcb1遺伝子の一部とCAOを導入した形質転換株が、最大でクロロフィルa量の約5分の1のクロロフィルbを合成することを明らかにした。この結果は、ラン藻に導入したCAOの活性がLHCタンパク質との相互作用によって上昇したことを示唆するものであった。そこで今年度は、さらにCAOの活性の高い形質転換株を作製するために、lhcb1遺伝子の全長、または、他のlhcb1断片をクロロフィルb合成株に導入した新たな形質転換株を作製した。また、以前ラン藻に導入したCAO遺伝子の発現には、psbA2遺伝子のプロモーターを使用していた。このpsbA2遺伝子にコードされているD1タンパク質は、非常にその合成が活発であることが知られている。そこで、今回は転写のみならず、翻訳系もpsbA2のものを利用しようと考え、ラン藻中のpsbA2遺伝子のORFをCAOのORFに置き換えた形質転換株を作製した。そしてこれらの遺伝子を導入した形質転換株のクロロフィルb合成量を測定した。しかし、今回作成した全ての形質転換株において、クロロフィルaの5分の1以上のクロロフィルbを合成することはできず、以前作製したCAOのみを含む株と同程度のクロロフィルb合成量を示した。以上のことから、ラン藻の形質転換株におけるクロロフィルbの蓄積量は、CAOタンパク質の合成や、LHCタンパク質との相互作用以外の、何か未知の因子の制御を受けていることが考えられた。
生体マイクロチューブの重合ダイナミクスの可逆的光制御と擬似細胞マシン創製への応用

本研究は、フォトクロミック分子の一つであるアゾベンゼンの光異性化反応で、微小管の重合・脱重合ダイナミクスを光可逆的にコントロールできるアゾベンゼンを開発し、それを擬似細胞マシンの創製へと応用することを目的としている。置換基の種類や置換位置の異なる種々のアゾベンゼン誘導体を合成し、微小管の重合阻害作用に及ぼす影響を徹底的に検討した結果、微小管に相互作用できる親水性のアミノ酸と、疎水性のアルキル鎖をパラ位に有することが可逆的な微小管の重合ダイナミクスには必要であることが明らかとなった。本研究は我々が最近偶然にも見出したアルキル鎖とアミノ酸の一つであるリジン基を両端に有する両親媒性のアゾベンゼン誘導体が、トランス体の状態では微小管を著しく不安定化し、光異性化したシス体では重合を阻害せず微小管が形成されるという現象をさらに発展させ、そのメカニズムの解明および光で駆動する擬似細胞マシンの創製へと繋げていくことを目的としている。本年度の研究では、置換基の種類や置換位置が異なる種々のアゾベンゼン誘導体を合成し、微小管タンパク質の重合ー脱重合挙動の光スイッチング能に及ぼす分子構造の影響をin-vitroで検討し、光スイッチング挙動に対するメカニズムに対する考察を行った。その結果、アゾベンゼンの一つのパラ位にリジン基のようなカチオン性のアミノ酸を有し、反対のパラ位に疎水性の置換基を有するときに、トランス体の状態における微小管の不安定化、および光異性化に伴う可逆的な微小管重合ダイナミクスの光制御が達成できることを明らかとした。これにより、光スイッチング機能を有する微小管重合阻害剤を設計する上での明確な分子指針が得られた。さらに開発したアゾベンゼン誘導体が生細胞中の微小管にどのような影響を与えるのかを検討した結果、in-vitroにおいて顕著な微小管の脱重合挙動が観測されるアゾベンゼンを投与した生細胞は投与後15分程度で内部の微小管の構造が完全に確認されなくなり、細胞骨格の形態も大きく変形することが認められた。一方、in-vitroで微小管の脱重合挙動が観測されないアゾベンゼン誘導体を投与した場合、投与後1時間経過しても細胞内部の微小管や細胞骨格の形態に変化は認められなかった。このことから、in-vivoにおいてもin-vitroと同様のメカニズムで微小管の脱重合が誘起されている可能性が示唆され、擬似細胞マシン創製への足がかりとなるデータが得られた。本研究は、フォトクロミック分子の一つであるアゾベンゼンの光異性化反応で、微小管タンパク質の重合・脱重合ダイナミクスを光可逆的にコントロールできるアゾベンゼンを開発し、それを利用した擬似細胞マシンを創製することを目的としている。本年度は、置換基の種類や置換位置の異なる種々のアゾベンゼン誘導体を合成し、微小管との相互作用や重合阻害作用に及ぼす置換基の種類や結合位置の影響を徹底的に検討することを目指して研究を進めた。その結果、分子内に微小管に相互作用できる親水性のアミノ酸と、ある程度の長さの疎水性のアルキル鎖をパラ位に有することが脱重合の誘起には必要であり、両親媒性の構造が微小管の脱重合に大きく寄与していることを明らかとした。また、アゾベンゼン骨格の光異性化反応に伴い分子の形が大きく変化することが、脱重合ー重合挙動の光スイッチングを可能にしていることが示唆された。これにより微小管の脱重合ダイナミクスを光スイッチングするために必要な分子設計指針を明らかとすることができた。この結果を応用して、可視光のみで機能する光スイッチング能を有する微小管重合阻害剤の開発にも取り組んだ。生細胞系にこの研究を発展させていく上では、紫外光照射による光異性化反応は大きな弊害となってくるため、より長波長の可視光で光異性化反応を行えることは必要不可欠となる。アゾベンゼンのオルト位に4つアルコキシ基を導入したアゾベンゼン骨格の両側にリジン基とヘキシル基を有する分子を合成し、可視光のみで機能する光スイッチング機能を有する微小管重合阻害剤を開発することにも成功した。これまでに置換基の種類や置換位置の異なる種々のアゾベンゼン誘導体を合成し、分子内に微小管に相互作用できる親水性のアミノ酸と、ある程度の長さの疎水性のアルキル鎖をパラ位に有することが脱重合の誘起には必要であり、両親媒性の構造が微小管の脱重合に大きく寄与していることを明らかとしている。さらに、その結果を応用することで可視光のみで機能する光スイッチング能を有する微小管重合阻害剤の開発にも成功している。この結果は当初予定していた研究計画よりも幾分か早く研究が進行していることから、達成度としてはおおむね順調であるものと判断している。

平成24年度は本年度に得られた結果をもとに、まずは重合阻害作用を示す異性体を逆転させた(すなわちトランス体では重合阻害作用を示さず、シス体で重合阻害作用を示す)分子の開発に取り組む。その後、光スイッチング機能を有する微小管上号阻害剤として最適構造を持つアゾベンゼン誘導体をスクシイミドエステル化もしくはマレイミド化し、チューブリンのアミノ残基やシステイン残基に共有結合させる方法を検討することで、微小管ダイナミクスを光制御可能な分子を微小管の基本単位となるチューブリンに直接組み込んだ光応答性チューブリンの開発を試みる。生化学的あるいは分光学的手法を用いて、反応させたチューブリンに対するアゾベンゼン誘導体の修飾率と重合能を評価し、最適条件を明らかとする。最終的には、それらを人工脂質膜等の微小空間に閉じ込め、光照射することでその形態を変化させる人工マイクロマシンを作ることを目標とする。平成23年度末に発注した実験器具および試薬類が年度内に納品は完了したものの、年度内の手続き処理に間に合わずに未使用額が発生した。この平成23年度未使用額については、既に納品が完了し、支払が次年度になった実験器具および試薬類の支払に使用する。
ファジィ理論を用いた建築構造骨組及び部材の満足度指定設計

昨年度までに本研究テーマに関して「ファジィ理論を用いた満足度指定設計」の考え方を提示するとともに,「せん断型一次固有周期制約条件下のファジィ閉形解」「保有水平耐力を指標とした満足度指定設計法」を提示した。これらは,クリスプ最適設計問題の閉形解を利用したり,線形な制約条件及び目的関数を扱った問題であり,ファジィ理論の満足度を定義するα-レベル集合の概念の導入が比較的容易であった。本年度は非線形制約条件もしくは非線形目的関数によって定式化されるクリスプ最適設計問題に対して,満足度指定設計問題を定式化する。ここで,近似解法として感度解析手法を用いて,クリスプ最適設計解における感度係数を得ることで,目的関数と制約条件の線形化を行い,ファジィ制約条件及びファジィ目的関数を設定する線形化手法を提示した。また,これまでの例題ではファジィ設計解領域においてファジィ設計解を得る場合,各々のファジィ設計解の幅の比率を一定としていた。本年度はファジィ設計解領域より互いに独立なファジィ設計解によって得られる領域が,ファジィ設計解領域の中で最大となるファジィ設計解をファジィ閉形解として得ることができる最大化法を示した。これらを5層3スパン建築骨組を例として,その満足度指定設計問題の定式化及び解法を示し,線形化法によるファジィ設計解と最大化法によるファジィ設計解を例示した。これまでに本研究テーマに関して「ファジィ理論を用いた満足度指定設計」の考え方を提示するとともに,「せん断型一次固有周期制約条件下のファジィ閉形解」の提示をも行って来た。この考え方を基に,本年度は梁と柱で構成された建築ラーメンを対象とした「保有水平耐力を指標とした満足度指定設計法」を提示した.建築骨組の設計時に採用する制約条件については,設計者がその時々に決定するため,いろいろな条件下での満足度指定設計法の誘導が今後必要である.ここでは,設計問題の定式化と設計解の誘導が容易な,線形計画問題として取り扱える「保有水平耐力を指標とした満足度指定設計法」をまず提示する.これは,梁や柱などの個々の部材レベルでの寸法までをも直接的に求める設計法の展開の基礎理論となる.低層の建築構造物の必要保有水平耐力を指定した骨組部材を容易に見い出すことができれば,これを初期設計に他の制約条件も満足する骨組を設計するという有用な使い方もできる.梁と柱で構成された平面建築骨組を対象として,保有水平耐力と構造重量の満足度を制約した満足度指定設計問題の定式化を行った.この定式化は,ファジィ理論のメンバシッブ関数の考え方を利用した定式化で,ファジィ最適設計問題と見なすこともできる.この設計問題では,部材(設計変数)ごとに独立な断面性能(全塑性モーメント)の可能領域を求めることになる.すなわち,部材ごとに断面性能の上限値と下限値の中に入る断面性能を一個づつ選定すれば,指定した満足度以上の骨組が設計できる.この最適設計問題の解を求める手法として,それに直接対応するクリスプな設計問題の解を利用して元問題であるファジィ最適設計問題の解を求める方法を提示した.これにより,満足度が指定値以上となる骨組の設計解(部材全塑性モーメント)の上限値と下限値を陽な閉形表現で求めた.昨年度までに本研究テーマに関して「ファジィ理論を用いた満足度指定設計」の考え方を提示するとともに,「せん断型一次固有周期制約条件下のファジィ閉形解」「保有水平耐力を指標とした満足度指定設計法」を提示した。
低酸素再酸素化ストレスが血管内皮細胞機能に及ぼす影響

血管内皮は炎症や虚血再灌流障害の際に臓器と同様に重要な役割を果たし、メディエータとして働いていることがわかっている。ブタ下行大動脈血管内皮を用いエネルギー枯渇状態を作り、細胞機能評価として細胞内カルシウム濃度を測定した。シアン化カリウムと2ーデオキシ-D-グルコースを用いて細胞をエネルギー枯渇状態にし、再度エネルギー供給すると、ブラジキニン、サプシガーゲンによる細胞刺激で細胞内カルシウム反応が通常時より小さくなることがわかった。これらから細胞の機能の一部が変化することがわかり、臨床上の低酸素再灌流時においても、血管内皮細胞が何らかの変化を起こしていることが示唆された。血管内皮は炎症や虚血再灌流障害の際に臓器と同様に重要な役割を果たし、様々なシグナル伝達を介してメディエータとして働いていることがわかっている。生体内では血管内に血液が流れることによってシェアーストレスがかかり血管内皮が様々な反応を起こしている。このため灌流を行った状態での各種の反応を捉えることを最終的な目標としているが、実験設備を整えることに費用がかかり困難である。当初の計画では血管内皮を低酸素、灌流状態に置いた後で再灌流し、その際の血管内皮の細胞機能や活性酸素種の定量、細胞内シグナルの変化を測定する予定であった。しかし我々の施設に現在ある装置では完全な低酸素を実現するのが困難であり、現在模擬的(化学的)虚血状態を作り、静止モデルで細胞機能を測定している。現在までに、化学的な虚血再灌流後のブラジキニンによる細胞刺激で細胞内カルシウム濃度の変化を測定しているが、この点については機能が完全に失われるわけではないことがわかった。虚血再灌流障害の際にカルシウムが重要な役割を果たすことが予想されるが、詳細は不明である。またその他の細胞からの産生物質(Nitric Oxide、PGI2)については現在測定開始したところであり、こちらについてはまだ結果を報告するに至らない。来年度は引き続きこれらを測定しまだ開始していない活性酸素の定量、更に当初の予定にあるミトコンドリア機能についても評価する予定である。またその他の細胞からの産生物質(Nitric Oxide、PGI2)については現在測定中であり、こちらについてはまだ結果を報告するに至らない。現在は実際の低酸素、灌流状態を実現するのが困難であるため模擬的(化学的)虚血での静止モデルでの研究となっているが今後可能であれば当初の目標の実際の低酸素、灌流モデルとしたいが、費用、時間的には困難が予想される。このため灌流を行った状態での各種の反応を捉えることを最終的な目標としているが実験設備を整えることに多額の費用がかかり現時点では困難である。当初の計画では血管内皮を低酸素、灌流状態に置いた後で再灌流し、その際の血管内皮の細胞機能や活性酸素の定量、細胞内シグナルの変化を測定する予定であった。しかし我々の施設に現在ある装置では完全な低酸素を実現するのが困難であり現在模擬的(化学的)虚血状態(エネルギー枯渇状態)を作り、静止モデルで細胞機能を測定している。現在までに科学的な虚血再灌流後のブラジキニンによる細胞刺激で細胞内カルシウム濃度の変化を測定しているが、この点については機能が完全に失われるわけではなく、反応の程度が小さくなる傾向があることが観察されている。小胞体のCa2+ATPase阻害薬であるサプシガーゲンでの刺激でも同様の結果が得られている。虚血再灌流障害の際にカルシウムが重要な役割を果たすことが予想されるが、詳細は未だ不明である。また、その他の細胞から産生される物質(Nitric Oxide、PGI2)については現在測定中であり、これらについてはまだ結果を報告するに至らない。来年度は引き続きこれらを測定し、まだ開始していない活性酸素の定量、更に当初の予定であるミトコンドリア機能についても評価する予定である。

現在は実際の低酸素、灌流状態を実現するのが困難であるため模擬的(化学的)虚血を用い静止モデルでの研究となっているが今後可能であれば当初の目標の実際の低酸素、灌流モデルを実現したいが費用、時間的には困難が予想される。低酸素モデルを作るのに様々な方法を試みているが十分な低酸素が実現できずにいる。このためまず模擬的な虚血状態(化学的なエネルギー枯渇状態)を作り上げることで細胞機能を測定することとなった。低酸素の実現するために時間を要したため本実験開始までがやや遅れてしまった。また、実験開始後に蛍光強度測定機器、ソフトの新しいバージョンへの交換があったため、実験結果が安定せず、原因を検索中である。これらから多数回の実験が必要であり、時間を要している。血管内皮は炎症や虚血再灌流傷害の際に臓器と同様に重要な役割を果たし、様々なシグナル伝達を介してメディエータとして働いていることがわかっている。生体内では血管内に血液が流れることによってシェアーストレスがかかり血管内皮が様々は反応を起こしている。このため灌流を行った状態での各種の反応を捉えることが目標としていた。当初の計画では血管内皮を低酸素、灌流状態に置いた後で再灌流し、その際の血管内皮の細胞機能や活性酸素の定量、細胞内のシグナルの変化を測定する予定であった。しかし我々の施設にある装置では完全な低酸素を実現することが困難であったので、やむを得ず模擬的(化学的)虚血状態(エネルギー枯渇状態)を作り、静止モデルで細胞内カルシウム濃度を測定した。ブタ下行大動脈を培養し、第一世代を用いた。大動脈シアン化カリウムと2ーデオキシ-D-グルコースを用いて化学的エネルギー枯渇状態に曝された細胞をその後、再度細胞培養液を用いてエネルギー供給できる状態で培養し、細胞機能の変化について観察した。蛍光顕微鏡を用い、fura-2/AMを用いて細胞内カルシム濃度比の変化を比較した。コントロール群との比較ではブラジキニンによる細胞刺激での細胞内カルシウム反応が小さくなるが、完全に抑制されるわけではないことがわかった。また、小胞体のCa2+ATPase阻害薬であるサプシガーゲンでの刺激でも同様に、細胞内カルシウム反応が小さくなることがわかった。これらから、エネルギー枯渇状態の後に再度通常状態に戻して培養した血管内皮では細胞の機能の一部が変化することがわかった。血管内皮からのPGI2産生についても検討したが、これについては明確な結果が得られなかった。血管内皮は炎症や虚血再灌流障害の際に臓器と同様に重要な役割を果たし、メディエータとして働いていることがわかっている。ブタ下行大動脈血管内皮を用いエネルギー枯渇状態を作り、細胞機能評価として細胞内カルシウム濃度を測定した。シアン化カリウムと2ーデオキシ-D-グルコースを用いて細胞をエネルギー枯渇状態にし、再度エネルギー供給すると、ブラジキニン、サプシガーゲンによる細胞刺激で細胞内カルシウム反応が通常時より小さくなることがわかった。これらから細胞の機能の一部が変化することがわかり、臨床上の低酸素再灌流時においても、血管内皮細胞が何らかの変化を起こしていることが示唆された。低酸素を成功させるためにさまざまな方法を試みてみたが、不十分であり、まず模擬的な虚血状態(化学的虚血状態)を作りあげることで、細胞機能などを測定することとなった。
ブラジル料理中ヘテロサイクリックアミン含有量測定と摂取量把握のための質問票の開発

ブラジル在住日系人のヘテロサイクリックアミン摂取量を把握するための質問票を開発し、加熱食品中のヘテロサイクリックアミン含有量データベースを作成するために、ブラジルでよく用いられる調理法を用いて肉・魚類を調理しヘテロサイクリックアミンの分析を行った。その結果、食材、調理法、焼き具合(3-4段階)、マリネの有無、皮の有無などの条件別のデータベースが整備され、質問票により摂取量推定が可能となった。ブラジルに居住する日系人を対象に,面接法により対象者個人の習慣的な食品・栄養素摂取量が把握できるように開発された食物摂取頻度調査票をもとに,ヘテロサイクリックアミン摂取量推定のための質問票の開発し,摂取量推定に必要な加熱食品中のヘテロサイクリックアミン含有量データベースの作成を行っている。今年度は,食物摂取頻度調査票に掲載されている食品,料理名からヘテロサイクリックアミンが生成される可能性がある項目について,3-4段階の焼き具合(レア,標準,よく焼く,非常によく焼く)とマリネ(加熱調理前に酢,油,にんにく,たまねぎなどに漬けること)ありとなしの場合に分けて調理し,分析用サンプルを収集した。また焼き具合を尋ねる質問には写真を見ながら回答できるように,焼き具合ごとに出来上がりの写真を撮影した。分析はKataoka H, et. al.(Bull Environ Contam Toxicol.2002;69:682-9)の方法に従い,サンプルをブルーレイヨン吸着法により前処理し,窒素選択検出ガスクロマトグラフィーにより分析した。分析項目はPhIP,IQ,MeIQx,MeIQ,4,8-DiMeIQx,7,8-DiMeIQx,Trp-P-1とし,予備検討の後にサンプル分析を開始した。1調理あたり3サンプル,合計で387サンプルの分析を予定していたが,1サンプルあたりの分析時間が長くかかるため(特にブルーレイヨン吸着法による前処理),実際に平成20年4月の時点で分析が終了したサンプルは全体の約3/4である。引き続き分析を継続し,分析終了後,加熱食品中のヘテロサイクリックアミン含有量データベースを完成させ,1.焼き具合による違い,2.マリネの有無による違い,3.調理方法(特にシュラスコとグリル)による違いを検討する予定である。ブラジルに居住する日系人を対象に、面接法により対象者個人の習慣的な食品・栄養素摂取量が把握できるように開発された食物摂取頻度調査票をもとに、ヘテロサイクリックアミン摂取量推定のための質問票の開発し、摂取量推定に必要な加熱食品中のヘテロサイクリックアミン含有量データベースの作成が目的である。ブラジルでよく用いられる調理法を用いて(パンフライ、グリル、シュラスコ)、3-4段階の焼き具合、マリネの有無、皮の有無などの条件別に、牛肉、豚肉、鶏肉、ハンバーグ、ソーセージ、イワシ、サケを調理し、1調理あたり3サンプルを分析に用いた。今年度は引き続き分析を行い、予定したサンプルの分析を終え、データベースを作成した。PhIP、IQ、MeIQx、MeIQ、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、Trp-P-1の7項目を分析対象としたが、実際に検出されたのは、PhIP、MeIQx、4,8-DiMeIQxの3つであった。焼き具合別ではvery well-doneのサンプルのうち87-100%から検出され、mediumでは17-33%であった。どの値もよく焼くほど高くなり、特にvery well-doneで顕著に高かった。ヘテロサイクリックアミンの中ではMeIQx、4,8-DiMeIQxに比べてPhIPの値が高い傾向であった(最高値はマリネなしの鶏肉をシュラスコでvery well-doneに焼いたもので47.3ng/g)。調理法別ではパンフライ、グリルに比べシュラスコの値が高い傾向であった。また食材別に見ると、牛肉、豚肉、イワシ、サケに比べ鶏肉の値が高い傾向であった。さらに、焼き具合、調理法、食材によらず、マリネ無しに比べて有りでは値が顕著に低かった。本研究により、加熱食品中のヘテロサイクリックアミン含有量データベースが整備され、質問票により摂取量推定が可能となった。
核内受容体による転写制御機構の解析

核内受容体による転写制御を分子レベルで明らかにする目的で以下の2点に絞り研究を進めた。1.核内受容体標的エンハンサー配列認識の特異性と非特異性我々はすでに従来より知られてきたコンセンサスエストロゲン応答配列(ERE)とは全く異なるタイプのERE(OV-ERE)が、主要卵白タンパクであるオバルブミン遺伝子プロモーターに存在することを証明した。OV-EREでは多くの核内受容体の標的結合部位であるAGGTCAモチーフが計4個互いに100bp以上も離れて存在していた。そこで、ERのOV-ERE認識の特異性を検討する目的で、2個のAGGTCAモチーフ間のスペースが離れた配列への各核内受容体(VDR,TR,RAR,RXR)の標的特異性を調べた。その結果、2つのモチーフ間のスペースが狭い場合には標的特異性が現れるのに対し、スペースが広い(10bp)場合には、特異性が消失することを見出した。また、この際、DNAに高次構造の変化が生じることも見出している。2.核内受容体群の発現調節レチノイド受容体(RAR,RXR)遺伝子群の発現に及ぼすビタミンA、ビタミンD、甲状腺ホルモンの効果を調べた結果、RXRbetaは正、RXRgammaは負に甲状腺ホルモンによって制御されることを見出した。このことは、核内受容体遺伝子自身の発現が関連するリガンドによって制御される複雑なネットワークが存在することを示したものである。