hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼球運動の軌跡解析によるヒューマンエラー削減のための効果的な教育法の確立

しかしながら,現在の教育方法では臨床実習にあがるまでのスキルの獲得が十分になされておらず,臨床現場では歯科衛生士学生による器具の受け渡し時の器具刺しや器具の向き違いなどのエラー報告は少なくない.現行の教育では「見て確認しなさい」等と指導を行っているものの,実際はどのように歯科衛生士学生が視線を配っているかははっきりしておらず,我々が行っている教育が安全かつ迅速な診療を行うためのエラー削減に繋がっているかは疑問である.これを解決するにはエラーを科学的に分析し,見るポイントを具体的に指示するなどの対策をとることが必要であると考える.そこで,我々はヒューマンエラー削減に繋がる教育を確立することを目的として“見るポイント"を指導した学生(視線教育型)と指導していない学生(従来型)の器具渡しの一連の動作について眼球運動を測定し,エラーの発生率と視線の配り方の比較を行い,さらに臨床経験のある歯科衛生士の視線の配り方を加え分析を行った.その結果,視覚素材を用いた実技の伴わない講義のみによる教育ではエラー削減にまでは至らなかったが,視線の配り方に変化がみられることが明らかになった.視線教育型では,視線の動きに無駄が少なく課題に集中できるためエラー削減に繋がると考える.また,迷いや不安が視線に反映されることで,エラーを起こす可能性の高い学生を選別し指導することも可能である.以上から今回ではエラー削減までは至らなかったが,実習の教育効果を評価する方法の1つとして眼球運動の測定は有効であると結論される.歯科衛生士教育平成25年度に開発した動画解析ソフトを測定に導入することで,以前の2次元的なテスト画像の解析と比べて格段に素早く,且つ被験者が見ている実視野を再現して分析できるようになった。すでに臨床経験のある歯科衛生士の眼球運動のデータと従来型の教育を受けた学生の眼球運動のデータの測定は終了している。また,このデータから歯科衛生士と学生のエラーの発生率も分析済みである。歯科衛生士を対象として,臨床経験の有無で器具の受け渡しという動作において,どのような因子がエラーを引き起こす要因となるのか,ヒューマンエラーのパターンから発生に関与する因子を明らかにし,学生と比較するまでが平成24年度の予定であった。しかし,実際のエラーを引き起こす因子は単純なものではないことがわかった。そのため,テスト画像のVTRを制作し眼球運動を分析するのではなく,直接被験者がみている視野画像をFree Viewを用いて録画し,眼球運動を解析するシステムに変更することとなった。これにより,設定された架空の視野範囲だけでなく,より現実的な見方の解析ができると考える。そのため,あらかじめ設定された画像内の処理をする装置およびソフトではなく,受け渡しまでのあらゆる視線を解析する装置とソフトの解析が必要である。現時点で解析装置およびソフト(クランプ受け渡し動画解析装置一式)の制作は終了しており,調整段階に入っている。ラバーダム防湿を行う際のクランプの試適時の視線の配り方について,実視野から抽出した臨床経験のある歯科衛生士の眼球運動データと従来型の教育を受けた学生の眼球データを比較し,ヒューマンエラー発生率と影響を与える因子を分析した結果,以下のことがわかった。ヒューマンエラー発生率は歯科衛生士55.6%,学生60.0%とそれほど大きな差はみられなかった。しかし,エラーのパターンは歯科衛生士が「渡す」段階のエラーが大きな割合を示したのに対し,学生はクランプをクランプフォーセップスに取り付けるという準備段階も含む複合型のエラーが多く発生した。
痛みが中枢神経諸核のシナプス活性におよぼす影響

痛みの認知機構に対する中枢の役割については、現在全くといってよいほど解明されていない。そこで本研究では、知覚神経の末梢に加えた侵害刺激が、中枢のどの部分の神経活動に影響を与えるかということを究明するために行った。対象は体重500550gの雄のWistar系ラットである。サイアミラールの腹腔内投与下に、右側大腿静脈よりC-14デオキシグルコース50μCiを静脈内投与した。そして、ラットの三叉神経末梢で眼窩下神経支配領域の右側上唇部に電気的侵害刺激を45分間与えた。その後、断頭し凍結した後、-20°Cで前頭部より後頭部にかけて厚さ20μmの冠状切断を行った。凍結切片を乾燥後、オートラジオグラフを行った。その結果、非刺激側である左側大脳皮質体性感覚野のC-14デオキシグルコース濃度は、刺激側である右側に比べ高く、その濃度比は、1.091.29(1.17±0.08)であった。C-14デオキシグルコース濃度が高い部位は低い部位にくらべて神経活動が活発であったことを示しているので、非刺激側の大脳皮質体性感覚野がより侵害刺激を受容していることを体謝面より確認することができた。なお、電気的侵害刺激を加えなかった場合には、左右の大脳皮質体性感覚野のC-14デオキシグルコース濃度に差はみられなかった。ところで、今回の研究では大脳辺縁系でのC-14デオキシグルコース濃度については十分な分析ができなかったが、サイアミラール麻酔下にラットの三叉神経末梢の上唇部に電気的侵害刺激を加え大脳辺縁系より誘発電位の記録を試みた。その結果、非刺激側の海馬より誘発電位の記録が可能であった。大脳辺縁系は痛みに対する情動的反応の関与が推測されている部位である。今後は痛み刺激に対する大脳辺縁系の活動部位を分析する必要があり、C-14デオキシグルコース法ならびに誘発電位の記録によって研究を進めたいと考えている。本年度より3ヶ年計画で痛みが中枢神経諸核のシナプス活性におよぼす影響に関する研究を開始した。対象は体重送400gのウイスタ-系ラットである。痛み刺激としては三叉神経末梢部に電気的侵害刺激を与える方法を採用した。この刺激は一次中継核である三叉神経脊髄路核・二次中継核である視床,それに大脳皮質へと伝えられ,これは電気生理学的に誘発電位を記録することによって確認される。しかしながらこの刺激が最終的に中枢神経のどの部位において痛みとして認知されるかということは現在全くわかっていない。それにはまず,与えた痛み刺激が中枢神経のどの部位に伝えられるかということを解明することからはじめる必要がある。そのため本研究では脳の活動部位をマッピングする方法として考え出されたソコロフらのデオキシグルコ-ス法を用いることにした。そこで,ラットの腹腔内に麻酔薬を投与した後,〔^ ́ξ〕ーデオキシグルコ-スを静脈内に注入した。その後,三叉神経末梢部に電気刺激を40分間加えた。すると電気刺激が伝えられた部位においては,シナプス活性が高まりグルコ-ス利用率が増加する。その結果,グルコ-スは代謝により分解されるが,デオキシグルコ-スは分解されず局所にとどまる。

したがって脳の局所のデオキシグルコ-ス濃度を測定することによって,痛み刺激によって活動のする部位を同定できるはずである。そこで電気刺激を加えた後,直ちに断頭し、ドライアイス,イソペンタンを用いて凍結後,凍結切片を作成し,オ-トラジオグラフィ-によって〔^ ́ξ〕ーデオキシグルコ-スの濃度の測定を行っている。なお,痛みをはじめとした体性感覚情報の統括部位としては頭頂連合野が考えられているので,特にこの部位について注目したいと考えられている。痛みの認知機構に対する中枢の役割については、現在全くといってよいほど解明されていない。そこで本研究では、知覚神経の末梢に加えた侵害刺激が、中枢のどの部位の神経活動に影響を与えるかということを究明するために行った。対象は体重500550gのウィスター系ラットである。麻酔はサイアミラールの腫腟内投与によって行い、自発呼吸下で維持した。次いで、14C-デオキシグルコースを125μci/kg静脈内投与した。侵害刺激を与えるため、三叉神経末梢の上唇部に双極電極を刺入し、電気刺激装置およびアイソレータを用いて電気的侵害刺激を45分間加えた。その後直ちに断頭し脳を摘出した。摘出した脳は、ドライアイスで冷却したイソペンタンにて急速冷凍した後、包埋した。そして、凍結切片作成装置を用いて、-20°Cの状態にて、前頭部より後頭部にかけて、厚さ20μmの凍結切片を、15枚に1枚の割合で連続的に採取した。24時間にわたって、-20°Cの状態にて乾燥し、ルミラー膜上に各切片をはりつけた。そして、X線フィルムに濃度のキャリブレーションのため、あらかじめ濃度が明らかなマイクロスケールとともに3週間密着した後現像を行った。現像したX線フィルムは、マイクロデンシトメータを用いて各脳組織の黒化度を測定し、14C-デオキシグルコース濃度に換算した。その結果、大脳皮質の体性感覚野においては、電気的浸害刺激を加えた側とは反対側の14C-デオキシグルコース濃度が同側にくらべて高い傾向がみられた。14C-デオキシグルコース濃度が高い部位は低い部位にくらべて神経活動が活発であることを示している。なお、電気的侵害刺激を加えなかった場合については現在研究中である。そして、これまでの研究で、サイアミラール麻酔下のラットの三叉神経末梢の上唇部に電気的侵害刺激を加えた場合、大脳皮質の体性感覚野においては、電気的侵害刺激を加えた側とは反対側のC-14デオキシグルコース濃度が同側にくらべて高いことが判明した。C-14デオキシグルコース濃度が高い部位は低い部位にくらべて神経活動が活発であったことを示しているので、侵害刺激を加えた側とは反対の体性感覚野がより侵害刺激を受容していることを代謝面より確認することができた。尚、電気的侵害刺激を加えなかった場合には左右の大脳皮質体性感覚野のC-14デオキシグルコース濃度に差はみられなかった。ところで今回の研究では大脳辺縁系でのC-14デオキシグルコース濃度については十分な分析ができなかったが、サイアミラール麻酔下のラットの三叉神経末梢の上唇部に電気的侵害刺激を加え大脳辺縁系より誘発電位の記録を試みた。その結果、侵害刺激を加えた側とは反対側の海馬より誘発電位の記録が可能であった。大脳辺縁系は痛みに対する情動的反応の関与が推測されている部位である。
疎水的環境中の水とイオンの相互作用

有機溶媒中でのイオンの選択的水和反応は,油水界面イオン移動を支配する重要な要素の一つであり,また,タンパク質内部の疎水的環境中の水の動態を理解する上でも重要である.本研究では,^1H-NMR法ならびに溶媒抽出法(+カールフィッシャー水分量測定)によって三種イオンのニトロベンゼン(NB)中の選択的水和反応を研究した.^1H-NMR法では,無機陰イオン(Cl^-,Br^-,I^-,ClO_4^-,NO_3^-,SCN^-)の重水素置換NB中での選択的水和反応を,水プロトンの化学シフトと縦緩和時間の測定によって検討した.化学ソフトからは,この選択的水和反応が逐次反応であることが明らかになり,さらに緩和時間からはイオンに水和した水分子の回転相関時間が,粘度の比較的高いNB中ではpsのオーダーであることが分かった.一方,溶媒抽出法からは第1,第2,第3級アルキルアンモニウムイオンのNB中の水和数が,それぞれ1.64,1.04,0.66であり,アルキル基の立体障害が重要であることが示された.さらに,同法を各種カルボン酸イオンに適用したところ,カルボン酸のNB中の水和数はその化学構造にあまり依存せず,約2.6であるという予備的結果が得られた.なお,上記の実験的研究に基づいて,親水性のイオンの溶媒間移行ギブス自由エネルギーには有機溶媒中の水が重要な役割を担うことが明確となった.そこで,従来のボルン型の静電理論とは違い,このような水の重要な役割を考慮に入れた新しいイオン移動エネルギーの理論を提案することができた.有機溶媒中でのイオンの選択的水和反応は,油水界面イオン移動を支配する重要な要素の一つであり,また,タンパク質内部の疎水的環境中の水の動態を理解する上でも重要である.本研究では,^1H-NMR法ならびに溶媒抽出法(+カールフィッシャー水分量測定)によって三種イオンのニトロベンゼン(NB)中の選択的水和反応を研究した.^1H-NMR法では,無機陰イオン(Cl^-,Br^-,I^-,ClO_4^-,NO_3^-,SCN^-)の重水素置換NB中での選択的水和反応を,水プロトンの化学シフトと縦緩和時間の測定によって検討した.化学ソフトからは,この選択的水和反応が逐次反応であることが明らかになり,さらに緩和時間からはイオンに水和した水分子の回転相関時間が,粘度の比較的高いNB中ではpsのオーダーであることが分かった.一方,溶媒抽出法からは第1,第2,第3級アルキルアンモニウムイオンのNB中の水和数が,それぞれ1.64,1.04,0.66であり,アルキル基の立体障害が重要であることが示された.さらに,同法を各種カルボン酸イオンに適用したところ,カルボン酸のNB中の水和数はその化学構造にあまり依存せず,約2.6であるという予備的結果が得られた.なお,上記の実験的研究に基づいて,親水性のイオンの溶媒間移行ギブス自由エネルギーには有機溶媒中の水が重要な役割を担うことが明確となった.そこで,従来のボルン型の静電理論とは違い,このような水の重要な役割を考慮に入れた新しいイオン移動エネルギーの理論を提案することができた.有機溶媒中でのイオンの選択的水和反応は,油水界面イオン移動を支配する重要な要素の一つであり,またタンパク質内部の疎水的環境中の水の動態を理解する上でも重要である.本研究では,^1H-NMR法を用いて重水素置換ニトロベンゼン(NB-d_5)中の各種無機陰イオン(Cl^-,Br^-,I^-,ClO_4^-,NO_3^-,SCN^-)の選択的水和反応について調べた.また,溶媒抽出(+カールフィッシャー水分量測定)に基づいて各種アルキルアンモニウムイオンのNB中の水和数を測定した.まず,NMR分光法によって測定した水分子の化学シフトの解析により,NB-d_5中の各種陰イオンの選択的水和が逐次反応によることが明らかになった.すなわち,従来カールフィッシャー法によって測定された水和数は統計的平均値である.また,縦緩和時間の測定から見積もったイオンに水和した水分子の回転緩和時間(150500fS)は,NB-d_5中のフリーな水分子(150fs)よりも大きくなり,水分子がある程度イオンに束縛されていることが示された.しかし,3次元的な水素結合ネットワークを形成しているバルク水中の水分子(2200fs)よりも小さく,かなりの運動の自由度が残されていることが分かった.なお,カールフィッシャー法により測定した第1,第2,第3級アルキルアンモニウムイオンのNB中の水和数はそれぞれ1.5,1.1,0.7であり,アルキル基の立体障害が重要であることが分かった.有機溶媒中でのイオンの選択的水和反応は,油水界面イオン移動を支配する重要な要素の一つであり,また,タンパク質内部の疎水的環境中の水の動態を理解する上でも重要である.

本研究では,^1H-NMR法ならびに溶媒抽出法(+カールフィッシャー水分量測定)によって各種イオンのニトロベンゼン(NB)中の選択的水和反応を研究した.^1H-NMR法では,無機陰イオン(Cl^-,Br^-,I^-,ClO_4^-,NO_3^-,SCN^-)の重水素置換NB中での選択的水和反応を,水プロトンの化学シフトと縦緩和時間の測定によって検討した.化学シフトからは,この選択的水和反応が逐次反応であることが明らかになり,さらに緩和時間からはイオンに水和した水分子の回転相関時間が,粘度の比較的高いNB中ではpsのオーダーであることが分かった.一方,溶媒抽出法からは第1,第2,第3級アルキルアンモニウムイオンのNB中の水和数が,それぞれ1.64,1.04,0.66であり,アルキル基の立体障害が重要であることが示された.さらに,同法を各種カルボン酸イオンに適用したところ,カルボン酸のNB中の水和数はその化学構造にあまり依存せず,約2.6であるという予備的結果が得られた.なお,上記の実験的研究に基づいて,親水性のイオンの溶媒間移行ギブス自由エネルギーには有機溶媒中の水が重要な役割を担うことが明確となった.そこで,従来のボルン型の静電理論とは違い,このような水の重要な役割を考慮に入れた新しいイオン移動エネルギーの理論を提案することができた.
屈折矯正角膜手術後の白内障手術における眼内レンズパワーの計算式の開発

1屈折矯正手術Summit社製エキシマレーザーUV-200を用いて、,Photorefractive Keratectomy(PRK)を施行した。対象は、屈折度-3.50D-18.75Dの近視者63名112眼(平均年齢34.8歳)。これらに矯正量-3.50-10D(平均-6.31D)のPRKを施行した。最終観察時の屈折度は、+1.50-12.5D(平均-3.48D)であった。術後一年での矯正精度は、目標屈折度の±0.5D以内が29.3%、±1.OD以内が46.7%、±2.OD以内が72.0%であった。これらの症例のうち、加齢とともに白内障が進行して矯正視力が低下したために、手術が必要となった症例は1名1眼のみであった。2白内障手術症例は47歳女性、PRK術前屈折度は-15.OD。平成5年に矯正量8.ODのPRKを施行、平成6年に6.ODの追加矯正を施行した。術後屈折度-5.5Dと安定していたが、白内障が進行し矯正視力が0.4まで低下したために、平成9年8月に、水晶体超音波乳化吸引術及び人工レンズ挿入術を施行した。人工レンズの度数の選択に際しては、再矯正後にビデオケラトスコープで測定した角膜曲率半径のうち、瞳孔中心から6本目までの平均値を使用、術後目標屈折値は±ODとして計算して、眼内レンズの度数を決定した。術後屈折値は目標より3.75D遠視側にずれが生じたため、術後2週間目に眼内レンズを交換してほぼ目的の屈折値となった。白内障手術の適応となった症例数が少ないため、統計処理はできなかったが、近年の文献では眼内レンズ度数の計算にSRK/T式を使用するのがよいという報告があり、今後症例数を増やしての検討が必要であると思われた。【目的】屈折矯正角膜切除術後の白内障手術における眼内レンズパワーの計算に必要な因子を検討する。【対象・方法】白色家兎6羽を対象とし、SUMMIT社製エキシマレーザーUV-200を用いて両眼に屈折矯正角膜切除術を施行した。切除量は右眼10D、左眼5Dとした。そして3か月経過した時点で両眼に水晶体摘出及び人工レンズ(二デック社製+26.0D)挿入術を施行し、さらに2か月間経過観察した。水晶体摘出及び人工レンズ挿入術前に屈折値・角膜屈折力(直径2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm)・眼軸長を測定し、それらの値をSRK-II式に代入して得られた術後の予想屈折値と、術後2か月における実際の屈折値との相関を各角膜曲率半径ごとに求め、比較・検討した。【結果】水晶体摘出及び人工レンズ挿入術前の屈折値・角膜屈折力(直径2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm)・眼軸長の平均はそれぞれ、+4.10D、41.66D、42.03D、41.89D、42.33D、42.29D、15.37mmであった。そして術後2か月における予想屈折値と実際の屈折値との相関係数は、各直径に対してそれぞれ、0.900、0.903、0.891、0.892、0.900であり、直径2.5mmにおいて最も強い相関がみられた。【考察】白色家兎に対する屈折矯正角膜切除術後の白内障手術における眼内レンズパワーの計算には直径2.5mmにおける角膜曲率半径の計測が必要である。また、人眼においても屈折矯正角膜切除術の切除量に応じて計測すべき角膜曲率半径の直径が異なることが予想され、また、これら以外にも前房深度、角膜厚などを今後検討する必要があるものと思われた。

人工レンズの度数の選択に際しては、再矯正後にビデオケラトスコープで測定した角膜曲率半径のうち、瞳孔中心から6本目までの平均値を使用、術後目標屈折値は±ODとして計算して、眼内レンズの度数を決定した。術後屈折値は目標より3.75D遠視側にずれが生じたため、術後2週間目に眼内レンズを交換してほぼ目的の屈折値となった。白内障手術の適応となった症例数が少ないため、統計処理はできなかったが、近年の文献では眼内レンズ度数の計算にSRK/T式を使用するのがよいという報告があり、今後症例数を増やしての検討が必要であると思われた。
界面活性能を持つ新規蛍光試薬を用いる環境中でのアルミニウム動態解析法の高感度化

1緒言環境中の微量のアルミニウムが、水棲生物の死滅や森林衰退、さらには痴呆などの神経障害に関連することが明らかになっており、またその毒性はアルミニウムの化学種に依存することがわかっている。本研究では、アルミニウムを選択的に濃縮するカラムの開発を行い、河川水中アルミニウムの化学種別定量法に応用した。2実験アルミニウムと選択的に錯形成するo, p, o'-Trihydroxyazobenzen骨格を持つ両親媒性錯形成試薬5'-Chloro-5-dodecyl-2,4,2'-trihydroxyazobenzen(CDTA)を合成し、疎水多孔性樹脂であるアンバーライトXAD-4に担持させた。このCDTA担持樹脂をカラムに充填し、アルミニウムの濃縮に用いた。濃縮操作は、カラム本体を60°Cの恒温槽中に設置し、1000mlの試料水を3.0ml/minで通過させた。吸着されたアルミニウムを溶出させるために10mlの2M塩酸を0.3ml/minで試料水とは逆方向に流し、溶出させた。この10mlの濃縮液を中和し、pH3.0,25mlとした。得られた25mlの濃縮液を既に開発したルモガリオンを用いた蛍光検出FIA法でアルミニウム濃度を定量した。また、既に開発したイオン交換体を用いたアルミニウムの化学種別定量法に適用する場合は、1000mlの試料水をイオン交換体に通し、その交換水の濃縮を行った。3結果と考察各使用試薬のブランク値を正確に見積もることで100pptで標準偏差7.3%(n=5)とよい再現性を示し、主な妨害金属イオンである鉄イオンを共存させたとき[Al^<3+>]:[Fe^<3+>]=1:200までアルミニウムのカラム吸着に影響がなかった。また、アルミニウムの化学種別定量法に適応した結果、標準溶液を用いた場合には、アルミニウム化学種の平衡計算から得られた値と良い一致を示し、河川水試料を用いた場合にも十分な感度で化学種別に定量することができた。本研究では、高感度な新規蛍光試薬の開発を研究目的とした。アルミニウム定量でよく用いられるルモガリオンの基本骨格であるo,p,o′-Trihydroxyazobenzeneに界面活性剤構造を組み込んだ蛍光試薬を合成し、本試薬とアルミニウム蛍光錯体の物性評価を行った。2実験Ethanol/水混合溶媒中で長鎖アルキル基を持つレゾルシンと2-Amino-4-chlorophenol-6-sulfonic acid等のAminophend類のカップリング反応を行い、好収率で種々の界面活性蛍光試薬を得た。得られた蛍光試薬の親水基は、スルホン酸とアンモニウム塩の2種であり、スルホン酸型の蛍光試薬についてはアルキル鎖長が炭素数412のものを合成した。Triton X-100及び疎水鎖の鎖長が炭素数612のAlkyltrimethylammonium bromide共存下アルミニウム錯体の蛍光強度を測定し、界面活性剤添加による蛍光増感効果を検討した。
マウス発癌モデルを用いた口腔癌早期病変の生物学的解析と病態解明

口腔癌は、その早期病変である口腔粘膜の上皮内病変(前癌病変から非浸潤癌)を経て浸潤癌へと進展する。上皮内病変の病態解明は、浸潤癌への進行過程を明らかにし、浸潤癌への進行を防ぐための重要な基礎的研究である。本研究では化学発癌剤である4NQOによるマウス化学発癌モデルを用いて、浸潤癌が形成される前に生じる舌の上皮内病変を採取し、早期病変の病態解明、浸潤癌への進展に関わる因子を明らかにすることを目的とする。平成30年度は、前年度より引き続き、化学発癌剤である4NQOの飲用により引き起こされる発癌過程における血管構造の変化について野生型マウスを用いた解析を行った。前年度に得られていた発癌過程における血管密度の上昇に加え、組織透明化技術を用いた血管の観察を行ったところ、前癌病変において既に血管の走行異常が見られており、浸潤癌においては血管径の不整、異常分岐、異常湾曲といった構造の異常が見られることが明らかとなった。微細構造的には周皮細胞の欠落や管腔構造をなさない血管内皮細胞の増生が癌組織では明らかとなった。免疫組織学的に血管増生因子の発現や、低酸素トレーサーを用いた組織学的解析では、前癌病変から非浸潤性の超早期病変では病変が低酸素状態であり、血管新生が活発化された状態であるが、浸潤癌では低酸素状態が解消されていると考えられた。また本年度は、昨年度より維持してきた上皮細胞特異的に緑色蛍光(ZsGreen)を発する遺伝子組換えマウスであるK14Cre;ZsGreenマウスに対して発癌実験を行った。野生型マウスと同様のプロトコールで発癌が可能であった。さらに、前癌病変および浸潤癌組織より緑色蛍光を発現する前癌病変細胞、癌細胞が採取され、培養可能であった。今後、正常粘膜上皮、前癌病変上皮、浸潤癌上皮細胞の初代培養により、それぞれの細胞学的特徴を解析する。初代培養まで行えた点は、研究計画と照らし合わせ順調に遂行しているが、他施設を使用する必要があるため、新鮮採取組織からの遺伝子抽出と解析に遅れが生じている。今後、発癌過程にある組織より、新鮮凍結組織を採取し、遺伝子解析を行う予定である。また前癌病変細胞を正常細胞、癌細胞と比較することで、前癌病変細胞の細胞学的特徴を明らかにする。口腔癌は、その早期病変である口腔粘膜の上皮内病変を経て浸潤癌へと進展する。その上皮内病変の病態解明は、浸潤癌への進行過程を明らかにし、浸潤癌への進行を防ぐための重要な基礎的研究である。本研究ではマウス化学発癌モデルを用いて、浸潤癌が形成される前に生じる舌の上皮内病変を採取し、細胞生物学的・分子生物学的解析により早期病変の病態解明、浸潤癌への進展に関わる因子を明らかにすることを目的とする。平成29年度は、発癌過程の舌上皮細胞を選択して採取することを目的に、上皮細胞特異的に緑色蛍光(ZsGreen)を発する遺伝子組換えマウスであるK14Cre;ZsGreenマウスの作製を行った。米国ジャクソン社より購入したK14CreマウスとZsGreenマウスを交配し、口腔粘膜上皮に永続的に緑色蛍光を有するK14Cre;ZsGreenマウスを作製した。実際に蛍光が発現されている事を確認したのち、化学発癌を開始している。また遺伝子組換えマウスの作製期間を利用し、野生型マウスに対し化学発癌を行ったところ、これまでの報告と同様、超早期病変と思われる過形成、上皮内病変である舌上皮異形成および舌早期癌(非浸潤癌)、進行した浸潤癌組織を得た。浸潤癌の特徴のひとつである異常血管増生に着目し、それぞれの病変における毛細血管を解析したところ、病態の進行に伴い、血管密度が上昇している事が明らかとなった。これまで、他の研究者らにより異常上皮細胞の低酸素状態が血管密度の上昇につながっていると報告されている。そこで低酸素トレーサーおよび免疫組織学的解析にて早期病変における低酸素状態を解析したところ、低酸素状態は証明されなかった。この事は、これまで想定されてきた上皮細胞の因子ではなく、他の因子が血管増生に関わっている可能性が示唆する。今後、早期病変の組織より細胞を抽出、採取し、より詳細な解析を行う予定である。平成29年度は、遺伝子組換えマウスであるK14Cre;ZsGreenマウスを作製を行い、平成30年度にK14Cre;ZsGreenマウスに対して化学発癌を開始する予定であったが、米国ジャクソン社からの購入が順調であったこと、また交配が効率よく行われたことから想定したより早く化学発癌を開始することが出来た。今後、持続的に化学発癌に供する遺伝子組み換えマウスの維持に努める必要がある。また、遺伝子組み換えマウスの作製期間を利用して、研究開始と同時に、野生型マウスにおける化学発癌を開始したことで、これまでの報告と同様、超早期病変と思われる過形成、上皮内病変である舌上皮異形成および舌早期癌(非浸潤癌)、進行した浸潤癌の組織を得る事が出来た。それにより、研究期間の早期より、研究対象の一つとして血管新生・異常血管の増生に着目することが出来た、低酸素トレーサーの使用といった発癌中のマウスに薬剤を投与して解析するという実験にも着手することが出来た。

口腔癌は、その早期病変である口腔粘膜の上皮内病変(前癌病変から非浸潤癌)を経て浸潤癌へと進展する。上皮内病変の病態解明は、浸潤癌への進行過程を明らかにし、浸潤癌への進行を防ぐための重要な基礎的研究である。本研究では化学発癌剤である4NQOによるマウス化学発癌モデルを用いて、浸潤癌が形成される前に生じる舌の上皮内病変を採取し、早期病変の病態解明、浸潤癌への進展に関わる因子を明らかにすることを目的とする。平成30年度は、前年度より引き続き、化学発癌剤である4NQOの飲用により引き起こされる発癌過程における血管構造の変化について野生型マウスを用いた解析を行った。前年度に得られていた発癌過程における血管密度の上昇に加え、組織透明化技術を用いた血管の観察を行ったところ、前癌病変において既に血管の走行異常が見られており、浸潤癌においては血管径の不整、異常分岐、異常湾曲といった構造の異常が見られることが明らかとなった。微細構造的には周皮細胞の欠落や管腔構造をなさない血管内皮細胞の増生が癌組織では明らかとなった。免疫組織学的に血管増生因子の発現や、低酸素トレーサーを用いた組織学的解析では、前癌病変から非浸潤性の超早期病変では病変が低酸素状態であり、血管新生が活発化された状態であるが、浸潤癌では低酸素状態が解消されていると考えられた。また本年度は、昨年度より維持してきた上皮細胞特異的に緑色蛍光(ZsGreen)を発する遺伝子組換えマウスであるK14Cre;ZsGreenマウスに対して発癌実験を行った。野生型マウスと同様のプロトコールで発癌が可能であった。さらに、前癌病変および浸潤癌組織より緑色蛍光を発現する前癌病変細胞、癌細胞が採取され、培養可能であった。今後、正常粘膜上皮、前癌病変上皮、浸潤癌上皮細胞の初代培養により、それぞれの細胞学的特徴を解析する。初代培養まで行えた点は、研究計画と照らし合わせ順調に遂行しているが、他施設を使用する必要があるため、新鮮採取組織からの遺伝子抽出と解析に遅れが生じている。平成29年度に開始したK14Cre;ZsGreen遺伝子組み換えマウスに対する化学発癌により得られた組織における上皮細胞に限局した緑色蛍光の発現を、超早期病変と思われる過形成、上皮内病変である舌上皮異形成および舌早期癌(非浸潤癌)、進行した浸潤癌にて確認する。なお、本研究で使用するK14Cre;ZsGreen遺伝子組み換えマウスはCre-LoxPシステムを利用しており目的細胞が既存の扁平上皮を由来としている限り緑色蛍光を発現していると考えられる。病変における上皮細胞の発する緑色蛍光を確認した後、生体より組織を採取し、酵素的に舌粘膜を分解し、舌扁平上皮細胞の初代培養を行う。各病変より採取・培養された初代培養細胞よりタンパク質、mRNAを抽出し、血管増生因子の発現を比較・解析する。また網羅的遺伝子解析法を用いて、早期病変から浸潤癌に至る過程の網羅的な遺伝子発現プロファイルを作製する可能性についても検討する。なお、初代培養が困難であった場合は組織全体での解析を検討する。早期病変から浸潤癌に至る過程での血管新生を明らかにする目的で、新生血管を追跡可能なVE-cadherin-CreERT2マウスを購入し、初代早期病変細胞と浸潤癌細胞の同所移植による血管新生能の比較を行う。同マウスにおける化学発癌と新生血管の追跡実験の可能性についても検討する。今後、発癌過程にある組織より、新鮮凍結組織を採取し、遺伝子解析を行う予定である。また前癌病変細胞を正常細胞、癌細胞と比較することで、前癌病変細胞の細胞学的特徴を明らかにする。
本態性高血圧症の発症、進展に関与する遺伝因子の解明

我が国には約3000万人の本態性高血圧症患者が存在するが、原因不明の本疾患に対しては、血圧値のみを指標とした対症療法が行われているに過ぎず、降圧療法による合併症予防効果は既に限界に達している。本研究では、遺伝型と表現型の関連を検討するassociation studyの手法を用いて、SNPsの意義を多角的に検討する試みを行った。対象者として、大阪大学医学部附属病院の老年・高血圧内科に通院あるいは入院中の患者と、I県0町で実施されている農村部大規模コホート研究(0研究)のMRI検診参加者の中で、遺伝子解析に同意した者を選んだ。研究計画書は大阪大学倫理委員会、東北大学倫理委員会の承認を得た。大阪大学での検討(阪大研究)では、重症高血圧患者の降圧薬治療効果に及ぼすレニンーアンジオテンシン系遺伝子多型の影響を、後ろ向きに検討した。0研究では、MRIによるラクナ梗塞とPVHの定量的評価と、循環器合併症のリスクとして注目されるMTHFRのC677T遺伝子多型の関連を検討した。阪大研究では、一切の介入を排除した条件下で実施されている長期降圧療法への遺伝子多型の影響を検討した結果、ACE遺伝子のDD型で降圧度が低い(p<0.05,DD vs ID+II)ことが示された。有意差は認められなかったが、ACE/DD型の本態性高血圧症患者ではβ-blocker使用頻度が高く、α-blocker,利尿薬の使用が少ない傾向が認められた。0研究では、MTHFR/TT型をもつ者の拡張期血圧は有意に高く、大脳基底核におけるラクナスコアも高い傾向が認められた(p<0.02)。今回の小規模な検討では、疾患を規定するような強いリスク遺伝子多型は存在しなかったが、高血圧から合併症に至る過程、降圧薬の選択にもSNPsの情報が役立つ可能性が示唆された。今後は、日本人におけるSNPsの意義を確立するために、より多くの検体の収集と、多角的な表現型の収集が望まれる。
大学体育教員の授業力量を高める授業改善動画システムの開発

本研究は、研究代表者がこれまで行なってきた暗黙知研究を拠所として,【課題1】大学体育教員が自らの授業を他の教員と協調しながら自覚化して課題確定できる授業改善動画システムを開発するとともに,【課題2】汎用性を高める改良を行なってアクションリサーチを機能させることで,日常的に授業改善に取り組む環境の整備と,大学体育教員の授業改善に向けた組織風土を醸成することを目的としている.1年目は,大学体育教員向けの授業改善動画システムを導入した【課題1】.システムの開発は、1)動画を投稿する授業者が簡易に投稿できるようにする、2)どのVTR画像(教師の視点、授業空間全体、あるいは両方の組み合わせ)が授業の課題箇所・改善案を明確化できるのか、3)どのような発言フレームの設計が授業の課題箇所・改善案を明確化できるか、という3点に着目して開発を試みた.2年目は、授業改善動画システムを使った協調的授業改善に参加する教員の属性を拡げることで、システムの汎用可能性と限界を明らかにした【課題1から2へ】.授業を観る眼を持った体育教員・若手の体育教員・物理的に会うことが不可能な遠方の大学間での教員など,様々な教員の属性で授業改善動画システムによる授業改善がどのように機能するかを明らかにすることを試みた.3年目である今年度は、複数の大学で授業改善動画システムを導入して、対象となる大学の体育教員の組織文化の変容を明らかにする【課題2】ことを試みている.アクションリサーチとしての効果測定は、学生の変容(形成的授業評価)、教員の意識の変容、協調的授業改善が日常化したか否か、部分適合から全体適合(一部の教員の取り組みから複数の大学の取り組みになったか否か)で明らかにすることを試みている.3年目である今年度は、複数の大学で授業改善動画システムを導入して、対象となる大学の体育教員の組織文化の変容を明らかにする【課題2】ことを試みる計画としている.しかしながら,複数大学におけるアクションリサーチとしての効果測定が、対象校の都合などにより遅れており,十分なデータを取得するに至っていない.特に評価に関しては,学生の変容(形成的授業評価)、教員の意識の変容、協調的授業改善が日常化したか否か、部分適合から全体適合(一部の教員の取り組みから複数の大学の取り組みになったか否か)を明らかにすることが必要であるが,授業改善動画システムによる試験的なデータ収集を行ない,効果測定を一部の対象大学において収集している状況でとどまっている.対象大学の対象者(教員)の授業スケジュール等の調整がつかないことが理由としてあげられるため,次年度は早めにスケジュール管理を行なうことで,データを収集していく.3年目となる今年度は,複数の大学のアクションリサーチに定着させる検証を行なうことになっていたが,大学体育授業研究会参加教員のいる大学間の組織としてアクションリサーチに至っていない,そのため,現在までの進捗状況にも記載したとおり,次年度は早めにスケジュール管理を行なうことで,対象大学の対象者(教員)の授業調整を行なってデータを収集していく.とくにアクションリサーチとして定着させるためには,学生の変容,教員の意識の変容,協調的授業改善の日常化,部分適合から全体適合の4つの視点で評価することが必要であることから,年度初めに関係する教員組織で打ち合わせを行ない,運用の定着化に向けたスタートを切る.また,最終年度になることから,月1回程度のミーティングを行なって,成果発表及び論文の執筆を進めていく.本研究は、研究代表者が行なってきた暗黙知研究を拠所として、【課題1】大学体育教員が自らの授業を他の教員と協調しながら自覚化して課題確定できる授業改善動画システムを開発するとともに,【課題2】汎用性を高める改良を行なってアクションリサーチを機能させることで、日常的に授業改善に取り組む環境の整備と、大学体育教員の授業改善に向けた組織風土を醸成することを目的としている.体育授業は、教員の暗黙知が内包されているため、言語データ(教員が発した言葉や指導案)あるいは授業者と授業観察者の記憶だけを拠所にして振り返る(検討する)ことに限界がある。そのため、授業時の動画を用いて「この場面」を振り返り、「あの場面」にジャンプして振り返ることで暗黙知が浮き彫りになるとともに、教員同士がその知を共有できると考えた.また,「曖昧模糊とした授業改善の課題」あるいは「やりっぱなしの授業」ではなく、動画に映る授業時の学生の具体的な姿を通して、授業の何が課題なのかを明確にして、着実に実践の成果を蓄積できる(暗黙知を教員の力にしていく)ことができると考えた。さらに,従来のアクションリサーチと違い、協調的授業改善に参加する教員がパソコンでいつでも検討ができるシステムの構築を企てた.このことにより,1大学の体育教員だけでなく他大学の教員と組織的に授業改善ができると仮定している.1年目の本年は,大学体育教員向けの授業改善動画システムのソフトを開発した【課題1】.システムの開発は、1)動画を投稿する授業者が簡易に投稿できるようにする、2)どのVTR画像(教師の視点、授業空間全体、あるいは両方の組み合わせ)が授業の課題箇所・改善案を明確化できるのか、3)どのような発言フレームやボタンの設計が授業の課題箇所・改善案を明確化できるか、という3点に着目して開発を行なった。1年目は、課題1をクリアするため,大学体育教員向けの授業改善動画システムのソフトを開発した。システムの開発は、1)動画を投稿する授業者が簡易に投稿できるようにする、2)どのVTR画像(教師の視点、授業空間全体、あるいは両方の組み合わせ)が授業の課題箇所・改善案を明確化できるのか、3)どのような発言フレームやボタンの設計が授業の課題

箇所・改善案を明確化できるか、という3点に着目して行なった。体育授業は、教員の暗黙知が内包されているため、言語データ(教員が発した言葉や指導案)あるいは授業者と授業観察者の記憶だけを拠所にして振り返る(検討する)ことに限界がある。そのため、授業時の動画を用いて「この場面」を振り返り、「あの場面」にジャンプして振り返ることで暗黙知が浮き彫りになるとともに、教員同士がその知を共有できるような設計が必要である.また,「曖昧模糊とした授業改善の課題」あるいは「やりっぱなしの授業」ではなく、動画に映る授業時の学生の具体的な姿を通して、授業の何が課題なのかを明確にして、着実に実践の成果を蓄積できる(暗黙知を教員の力にしていく)ことが必要となる.以上の課題が1年目の研究検討によって抽出されたことから,課題をクリアできる授業改善システムの構築を行なった.本研究は、研究代表者がこれまで行なってきた暗黙知研究を拠所として、【課題1】大学体育教員が自らの授業を他の教員と協調しながら自覚化して課題確定できる授業改善動画システムを開発するとともに、【課題2】汎用性を高める改良を行なってアクションリサーチを機能させることで、日常的に授業改善に取り組む環境の整備と、大学体育教員の授業改善に向けた組織風土を醸成することを目的としている。1年目は、大学体育教員向けの授業改善動画システムのソフトを開発してきた【課題1】。システムの開発は、1)動画を投稿する授業者が簡易に投稿できるようにする、2)どのVTR画像(教師の視点、授業空間全体、あるいは両方の組み合わせ)が授業の課題箇所・改善案を明確化できるのか、3)どのような発言フレームやボタンの設計が授業の課題箇所・改善案を明確化できるか、という3点に着目して行なってきた。2年目である本年度は、授業改善動画システムを使った協調的授業改善に参加する教員の属性を拡げることで、システムの汎用可能性と限界を明らかにしてきた【課題1から2へ】。授業を観る眼を持った体育教員・若手の体育教員・物理的に会うことが不可能な遠方の大学間での教員など、様々な教員の属性で授業改善動画システムによる授業改善がどのように機能するかを明らかにしてきている。そのため、授業時の動画を用いて「この場面」を振り返り、「あの場面」にジャンプして振り返ることで暗黙知が浮き彫りになるとともに、教員同士がその知を共有できることが重要であり、本研究でここまで一定の成果がでている。
微生物の適応変異誘発メカニズムと潜在能力活用に関する研究

Comamonas testosteroni TA441はフェノールを唯一炭素源として23週間馴養することにより不可逆的にフェノール資化能を獲得する。これは、本菌は完全なフェノール分解酵素とフェノール応答転写活性化因子の遺伝子群(aph遺伝子群)を持つが、野生株では転写抑制因子AphSによりaph遺伝子群が発現抑制されており、馴養中にaphS遺伝子に突然変異が起こることで抑制が解除されるためである。昨年度の結果から、TA441のフェノール分解系は実験室環境の高フェノール濃度、高通気条件での増殖には不向きであり、自然生態系の低フェノール濃度、微好気条件での生存に適していることが示された。本年度はaph遺伝子が生理的に機能していることを検証するために、野生株と各種変異株の共培養を行い、培養後の占有率からCompetitive index (競争力指数)を求め、aph遺伝子の生存への寄与を調べた。栄養培地では、フェノール分解酵素を欠失したaph遺伝子欠損株の生育が不利になり、aph遺伝子が確かに生存に有利に働いていることが示された。逆に、aph遺伝子を高発現するaphs(リプレッサー)変異株では高濃度(5mM)のフェノール存在時に生育が不利になった。この原因は、高濃度のフェノールとフェノール酸化酵素の存在が酸化ストレスを引き起こすためと予想された。これらの結果は、実験室レペルでの増殖を指標とした場合には機能が見えずクリプティックと思われた遺伝子でも、Active but not culturable (ANC)のような形での生存に寄与していることを示唆するものであった。本年度はaph遺伝子群の生理的役割を解明するため、野生株とaphS変異株を用い、種々の培養条件での生育とフェノール分解活性を比較した。その結果、野生株は高濃度のフェノールは分解しないが、低濃度では増殖はしないもののフェノールを分解した。aphS変異株は通常の培養条件ではフェノールで生育するが、ジャーファーメンターを用いた高通気培養では、フェノールを分解するものの増殖することができなかった。また、野生株では低濃度でaph遺伝子の転写活性のわずかな上昇が認められた。以上の結果から、TA441のフェノール分解系は、実験室環境の高フェノール濃度、高通気条件での増殖には不向きであり、自然生態系の低フェノール濃度、微好気条件での生存に適していると示唆された。このことは、TA441のフェノールヒドロキシラーゼが高い基質親和性を持つことからも裏付けられた。つまり、TA441のフェノール適応現象は、「自然界での生存に適した状態」から「実験室での増殖に適した状態」への変化であると考えられる。これらの結果は、実験室内で示す微生物の能力が、必ずしも自然界で有効とは限らないことを示しており、有用微生物を環境浄化等へ利用する際に考慮すべき新たな要素を提供した点で意義深いと考える。本年度はさらに、DNA変異修復系のMutSやDinBのフェノール適応への関与を調べるため、それらの欠損株を作製し、馴養期間の変化を調べた結果、mutS変異により適応速度が倍以上に速くなることが分かった。
霊長類脊髄損傷モデルにおける運動関連領野の神経可塑的変化の解明

随意運動を制御する皮質脊髄路が脊髄損傷などにより傷害されると損傷部位以下で著しい運動機能の低下が生じる。これまでに先行研究において、脊髄損傷後の運動機能回復には、皮質脊髄路の神経回路再構築が重要であることが報告されている。しかし、脊髄損傷後の神経回路再構築の機構については、未だ不明な点が多くある。そこで、本研究ではサル脊髄損傷モデルを用いて、皮質脊髄路を形成する神経細胞が分布する運動関連領野(一次運動野、運動前野、補足運動野)における神経可塑性と機能回復の関係について解明するために、手指の運動機能の変化と神経細胞(巨大錐体細胞)の樹状突起および樹状突起スパインの形態変化に着目して解析を行う。
RNA干渉を用いた骨芽細胞、脂肪細胞分化調節因子の新規同定とその機能解析

我々はタンパク質をコードしない小分子RNAに着目し、骨芽細胞分化における機能を検討した。その結果、mir-206が骨芽細胞分化を抑制すること、mir-206を過剰に発現するトランスジェニックマウスの骨量が低下することを明らかにし、マイクロRNAが骨芽細胞分化の生理的調節因子であることを世界で初めて報告した。1成熟細胞特異的遺伝子プロモーター制御下にチミジンキナーゼを恒常的に発現する細胞株の確立:オステオカルシンプロモーターを用いて成熟骨芽細胞特異的にチミジンキナーゼを発現する(OSC-TK)C2C12細胞株を樹立した。また、脂肪細胞分化に伴いチミジンキナーゼを発現する(AP2-TK)3T3-L1細胞株も樹立した。それぞれ分化促進因子であるBMP-2あるいはインスリン等の添加により分化が誘導されること、ノザンブロットにてチミジンキナーゼの発現が誘導されることを確認した。さらに、ガンシクロビルの投与によりいずれの細胞も死滅した。こうしてスクリーニングの系を構築した。2未分化間葉系細胞由来siRNAライブラリーの構築:未分化C2C12細胞および骨芽細胞へと分化したC2C12細胞より常法によりRNAを採取し、さらにcDNAライブラリーを調整し、レンチウィルスによるsiRNAライブラリーを構築した。またマウスゲノムを用いた別のsiRNAライブラリーを共同研究者とともに開発した。3 siRNAライブラリーを用いたスクリーニング:1で確立した細胞株に、2のライブラリーを感染させ、分化を誘導する条件の下で培養した。分化誘導によっても死滅しない細胞群、すなわちsiRNAにより分化誘導が障害された細胞をこれまでに数クローン単離した。現在、これらの細胞群よりDNAを得て、発現しているsiRNAの遺伝子同定を進めている。1成熟細胞特異的遺伝子プロモーター制御下にチミジンキナーゼを恒常的に発現する細胞株の確立:脂肪細胞分化に伴いチミジンキナーゼを発現する(AP2-TK)3T3-L1細胞株を樹立したが、その後の検討で、ガンシクロビルによる細胞死の特異性が低く、チミジンキナーゼを発現しない細胞とともに培養した場合それらの細胞にも細胞死を誘導することが明らかになった。そのため、イメージング手法を用いた細胞分化度の測定系の再構築を行っている。2μRNAの骨芽細胞分化に関する研究siRNAと同様に低分子RNAであるμRNAを用いて骨芽細胞分化の新規調節因子の同定を試みた。マウス筋芽細胞C2C12にBMP2を投与し、骨芽細胞への分化誘導前後において発現に変動の認められるマイクロRNAを網羅的に検索した。続いて骨芽細胞においてそれらのマイクロRNAを過剰発現あるいはノックダウンし、その分化に及ぼす影響を定量的PCR法などで解析を加えた。さらにそれらマイクロRNAの骨芽細胞における標的について検討した。C2C12では多数のマイクロRNAの発現が認められ、BMPの投与により発現量が変化したが、その中でBMPにより発現が減少するマイクロRNAxに注目した。初代培養骨芽細胞において、マイクロRNAxの発現は分化の進行に伴って次第に減少した。また、C2C12および初代培養骨芽細胞を用いた検討で、マイクロRNAxの過剰発現により骨芽細胞分化が抑制された。さらに、データベースを用いた検索によりin silicoでのマイクロRNAxの標的遺伝子候補を見出し、実際に骨芽細胞を用いてin vitroでもマイクロRNAxの過剰発現により標的遺伝子の発現が減少することを確認した。siRNAと同様に低分子RNAであるマイクロRNAを用いて骨芽細胞分化の新規調節因子の同定を試みた。一方、マイクロRNAxのノックダウンにより骨芽細胞の分化は促進された。さらにマイクロRNAxを発現するトランスジェニックマウスを作成したとおころ、その骨量は減少し、骨芽細胞の分化が抑制されることを見出した。
Study on a physical layer security framework for establishing trustworthy IoT systems

平成30年度(半年間)は主に、下記研究課題について実施した。平成31年度は、下記研究課題について実施する。
脊椎動物細胞におけるミオシンIおよびミオシンI様蛋白質の存在と機能の解析

脊椎動物におけるミオシンIおよびミオシンI様蛋白質の存在と機能について解析することを目的として、本年度はヒト、ブタおよびモルモットの好中球を材料として以下のことを行った。ミオシンIは低イオン強度で可溶性であるが、細胞の機能発現時には不溶性の膜分画に移行する可能性が高い。そこで、細胞機能静止時と機能時(遊走時、活性酸素生成時)の好中球を生理的イオン強度で破砕し、可溶性分画と不溶性分画に分けてミオシン分子種とその動態について電気泳動およびイムノブロットを用いて検討した。細胞破砕は機能静止時の細胞に活性酸素生成を起こさせないような短時間の超音波処理により行った。各分画と、抗DictyosteliumミオシンI重鎖抗体、抗ラット子宮平滑筋および抗砂嚢平滑筋ミオシンII重鎖抗体の反応性をイムノブロットで調べた。抗ミオシンI抗体は、機能静止時の好中球の可溶性分画の約230Kdペプチドと反応したが、これは不溶性分画にほとんど存在せず、細胞機能時に局在の変化は見られなかった。報告されているミオシンI重鎖は120Kd付近であること、含量が比較的多いこと、ミオシンを非変性状態で特異的に電気泳動するピロリン酸ゲル電気泳動(PPi PAGE)でミオシン(ミオシンIも解析可能である)の挙動を示さないことなどから、このペプチドがミオシンIである可能性は低い。また、2種の抗ミオシンII重鎖抗体による解析で、細胞機能静止時にはミオシンIIは可溶性分画に70%以上存在するが遊走により可溶性分画から不溶性分画に移行し、存在比は1:1に変化することが明らかになった。これはミオシンIIの遊走への関与を支持するデ-タである。このようなミオシンIIと同様な挙動を示す分子量約140KdのペプチドをPPi PAGEで検出しており、報告されているミオシンIより分子量は大きいがミオシン分子種であることを示唆するデ-タを得ており、さらに解析を進めるためこのペプチドを精製中である。