hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先端技術を駆使したＨＬＡ多型・進化・疾病に関する統合的研究

これらの研究をさらに深化させるとともに、HLA統合データベースのさらなる向上、成果の社会への発信、若手研究者育成に努め、HLA生成の進化学的謎、および予防・治療法のない難治性免疫疾患の解明とHLA分子標的治療法の開拓という二大課題の解明を目指す。研究分野の枠組みを越えた統合的HLA研究を展開し、総括班による調整・企画・広報・評価、研究支援活動のもと、平成26年度は以下の成果を得た。A01では、椎名がHLA領域リシークエンシングによる高解像度HLAタイピング法を開発し、今西がHLA統合データベース「The HLA Information Resource (HLA-IR)」を構築し公開した。また、山本はHLAのアレル間で異なるDNAメチル化状態を同定し、その生理学的意義の解明を進めている。A02では、横山がA04笹月と連携し、スギ花粉症抗原Cryj1由来ペプチドとHLA-DP5分子の複合体立体構造の解明に成功し、ペプチドN末端がHLA・ペプチド複合体の集合様式を制御することを発見した。宮寺はA04徳永と連携し、自己免疫疾患発症におけるHLA分子ヘテロダイマーの安定性の意義を解明した。また西村はヘルパーT細胞とキラーT細胞の両者を誘導するペプチドワクチンの樹立に成功した。A03では、颯田がHLA-DRB1系統間でペプチド結合部位の非同義置換の置換率に多様性があることを明らかにした。A04では、徳永がナルコレプシーの新規感受性遺伝子座を同定するとともに、SNPによる高精度のHLA-imputation法を開発した。森島は非血縁者間骨髄移植におけるHLA-C、-DPB1ミスマッチの白血病再発抑制効果を解明し、水木はベーチェット病発症におけるHLA-B51とERAP遺伝子多型の相互作用を解明した。笹月は臨床情報の詳細な解析からグレーブス病においてHLA-DP5が抗Tg抗体、抗TPO抗体産生を抑制するという知見を得、DP5を介したグレーブス病発症の新規分子機序の解明を進めている。今後、これらの研究をさらに深化させるとともに、HLA統合データベースのさらなる向上、成果の社会への発信を推進し、HLA生成の進化学的謎、および予防・治療法のない難治性免疫疾患の解明とHLA分子標的治療法の開拓という二大課題の解明を目指す。ヒトの主要組織適合遺伝子複合体であるHLAは、生体防御の最前線で、多様な病原体由来のペプチドを結合し、抗原特異的免疫応答を制御している。本領域研究では、「HLAの成り立ちの進化学的解明」および「免疫応答関連疾患発症におけるHLAの役割の解明とHLAを標的とした分子創薬のための免疫抑制分子の解明」を目的に掲げ、ゲノム科学とタンパク科学における革新的技術とヒト全タンパク配列データベース、病原体のゲノムデータベースなどの先端情報を活用して、研究分野の枠組みを越えた統合的HLA研究を展開する。総括班による調整・企画・広報・評価、研究支援活動のもと、平成24年度は以下の成果を得た。
ネパール基礎教育における公立・私立校格差 －エビデンスベースで見る教授・学習活動

教育分野における重点が「量」から「質」へと転換された今、多くの開発途上国では「質の高い教育」を求める動きが発生しており、私立校の在籍者数が急増している。この背景には、公立校と私立校の教育格差問題が存在し、公立校における教育の質的向上が喫緊の課題となっている。本研究はネパールを対象に、教育の質を左右する学校内プロセスに着目し、私立校等の高いパフォーマンスを支える要因を解明する。そして、高いパフォーマンスを実現できない学校にそれらの要因をどのように応用できるかについて包括的に検討する。
気腹圧が腎微小循環に与える影響

気腹圧による腎機能への影響について動物実験及び実臨床で検討した。動物実験(豚)にて気腹圧の上昇と共に赤血球速度の有意な減少を認めた。腹腔鏡下手術において12mmHg群(A群)と8mmHg群(B群)で腎表面酸素飽和度についてB群では変化がみられなかったが、A群において気腹開始3時間後で酸素飽和度の低下がみられた。腹腔鏡下donor腎摘での気腹圧が12mmHgで行った群(C群)と8mmHg(D群)での受腎者での術後1週間でのERPFはC群で229±71ml/minに対し、D群では252±52ml/minでありD群の方で腎機能は良好であった。気腹圧が高くなると、腎微小循環に影響を与え12mmHgを超える長時間の腹腔鏡手術になると腎機能にも影響を及ぼすことが示唆された。最近では腹腔鏡下の腎手術が増加し、術後の腎機能が大変重要な問題となるdonor腎摘除術、腎部分切除術も腹腔鏡下で行われるようになっている。しかし腹腔鏡手術での気腹圧の影響が腎機能に及ぼす影響については詳細には検討されていない。腎血流低下や腎阻血により大きく影響を受ける尿細管上皮周囲の毛細血管血圧は15mmHgといわれており、一般的に腹腔鏡手術で用いられる気腹圧10-15mmHgでの腎の微小循環に及ぼす影響について拡大内視鏡を用いて研究を行い、さらに臨床経過との関連について検討することとした。低侵襲性のため多くの分野で腹腔鏡手術の適応の拡大を認めるが、気腹圧下での腎機能へ及ぼす影響については明らかではない。気腹圧により影響を受ける腎微小循環を豚腎にて直視下に観察し、その影響を調査した。(方法)生後6ヶ月の豚6頭(雌)、左腎を対象とした。ケタミンを使用した全身麻酔下に手術を行った。術中の麻酔下管理は心電図、中心静脈圧(CVP)、尿量、輸液速度をモニタリングして行った。手術中は点滴液を静脈内に注射し、このstudyの間、輸液速度は40ml/hrに設定し、麻酔条件を一致させた。術中の体位は右側臥位として経腹的到達法にて腎周囲脂肪識を剥離し、腎実質表面を露出した。気腹圧を5mmHg→10mmHg→15mmHg→20mmHg→25mmHgと段階的に上げ、それぞれの気腹圧で5分間、維持し、腎尿細管周囲毛細血管赤血球速度を測定した。同じ気腹圧において同時に腎動脈本幹の血流を電磁流量計にて測定をした。その後、開腹をし、コントロールとして気腹圧なしでの腎尿細管周囲毛細血管赤血球速度(CPC)及び腎動脈血流を計測した。それぞれの対象において、多数箇所の微小循環の測定を行った。(結果)気腹圧を上げるとともに、腎尿細管周囲毛細血管赤血球速度の減少を認めた。0mmHg(開腹)と10mmHg、10mmHgと15mmHgでは有意差を認めた。気腹圧が25mmHgに達すると、そのほとんどの赤血球に動きが認められなかった。この際、vital-sign(arterial pressure、CVP、Heart rate)に大きな変調はきたさなかった。ここで気腹圧を10mmHgに戻すと、腎尿細管周囲毛細血管赤血球速度はすぐに回復した。一方、腎動脈の血流速度には気腹圧の上昇による変化を認めなかった。(結論)動物実験にて直視下で腎尿細管周囲毛細血管、赤血球を観察し、気腹圧が腎周囲毛細血管血流に与える影響、適切な腎微小循環に影響を与えない気腹圧を、明らかにした。最近では腹腔鏡下の腎手術が増加し、術後の腎機能が重要な問題となるdonor腎摘除術も腹腔鏡下で行われるようになっている。腎血流低下や腎阻血により大きく影響を受ける尿細管上皮周囲の毛細血管血圧は15mmHgといわれており、一般的に腹腔鏡手術で用いられる気腹圧8-15mmHgでの移植腎の腎機能に影響を及ぼす影響について研究を行った。

(方法)2002年から2010年2月までに名古屋大学泌尿器科で腹腔鏡下Donor腎摘出術を行った例である。全例移植後腎機能は発現し、術後2週間までに拒絶反応を合併した症例は見られなかった。2006年までは気腹圧を12mmHgで行い(Ag群)、2007年以降は8mmHg(B群)で行っている。両群でのrecipientでの術後1週間までの血清クレアチニン値と、recipientでの術後1週間でのMAG3を用いた腎シンチグラムでのERPFについて比較検討した。(結果)術後1週間でのrecipientのERPFはA群(12mmHg)で229±71ml/minでB群(8mmHg)で252±52でありB群の方良好であった。手術翌日の血中CrはA群4.8±2.3mg/dlB群4.7±2.7mg/dlと差はみられなかったが、術後1週間目ではA群1.65±1.5mg/dlB群1.26±0.7mg/dlとB群の方で良好な腎機能を示した。(結論)気腹圧が12mmHとわずか高いだけでもレシピエントの腎機能に移植後1週間目と移植後のERPFに影響を及ぼすことが示唆された。低侵襲性のため多くの分野で腹腔鏡手術の適応の拡大を認めるが、気腹圧下での腎機能へ及ぼす影響については明らかではない。昨年の本研究では、腹腔鏡下donor腎採取術では気腹圧が12mmHgで行った群の方が8mmHgで行った群より移植早期の腎機能に影響を受けることを報告した。今回は、気腹圧12mmHgで行なわれた腹腔鏡手術中に酸素飽和度測定器を用いて気腹時間とともに腎臓の酸素飽和度が、どの程度変化するかを検討した。手術中に腎被膜が露出する腎盂形成術、Donor腎採取術、腎部分切除術が対象となるが、Donor腎採取術、腎部分切除術では腎を前後に動かすことにより腎の酸素飽和度が変化するため、今回は、基本的には腎を移動させることのない腹腔鏡下腎盂形成術症例を対象とした。(方法)気腹圧12mmHgで腹腔鏡下腎盂形成術をおこなった9例である。気腹開始後1時間、2時間、3時間で腎被膜に直接接触させて酸素飽和度を測定した。(結果および考察)気腹開始1時間での酸素飽和度に対し2時間ではほぼ100%であったが、3時間では95%と有意差はみられないがやや低下がみられた。これは、気腹圧12mmHgで4時間を超える手術では、症例によっては腎機能が低下することがありうることを示唆した。(目的)低侵襲性のため多くの分野で腹腔鏡手術の適応の拡大を認め、泌尿器科分野でも腹腔鏡手術が広く行われるようになっている。気腹圧下での腎機能へ及ぼす影響については明らかではないが私たちは今まで生体拡大内視鏡を用いて腎表面の赤血球速度の測定を行い気腹圧と腎表面血流について検討してきた。その結果気腹圧の増大とともに腎表面赤血球速度の低下がみられ20mmHgでは腎表面での血流が停止することを確認した。生体拡大内視鏡は器具の設定などが煩雑であるため、簡易に腎血流を測定する方法として酸素飽和度測定器に着目した。今回は、気腹圧15mmHg,12mmHg,8mmHgで行なわれた腹腔鏡手術中に酸素飽和度測定器を用いて気腹時間とともに腎臓の酸素飽和度が、どの程度変化するかを検討した。手術中に腎被膜が露出する腎孟形成術、Donor腎採取術、腎部分切除術を対象とした。(方法)気腹圧15mmHg(n=5),12mmHg(n=7),8mmHg(n=7)で腹腔鏡手術を行った症例について帰福開始後から経時的に腎表面酸素濃度を測定した。(結果および考察)気腹開始
ダイオキシンの発生毒性発現機序の分子生物学的・細胞化学的解析

ダイオキシン類の毒性発現にはアリル炭化水素受容体(aryl hydrocarbon receptor,以下AhRと略)を介するものと介さないものがあるといわれる。発生毒性発現の分子的機構を解析するため,AhR遺伝子ノックアウトマウスを入手した。野生型(Ahr^<+/+>)対照にはC57BL/6系マウスを用い,AhRノックアウト・ホモ(Ahr^<-/->)個体,ヘテロ個体(Ahr^<+/->)とのTCDDの発生毒性に対する感受性の差を調べた。マウスの妊娠12.5日(腟栓発見日=妊娠0日)にTCDD0.625-80μg/kg体重を1回強制経口投与し,妊娠18.5日に母体を屠殺して胎仔の口蓋裂,水腎症の発現頻度を調べた。予想されたとおり,野生型胎児ではほぼ全例に口蓋裂,水腎症をおこす条件でTCDDを投与しても,ホモ胎児では全く奇形は生じなかった。この結果はTCDDによる奇形誘発にAhRが介在することを明確に示したものである。ヘテロ胎児では口蓋裂の頻度が野生型よりかなり低く,AhR遺伝子の量が正常の半分であるとTCDDの効果が十分に発揮されない単数機能不全(haplo-insufficiency)が観察された。水腎症はヘテロ胎児でも全例にみられたが,これは水腎症の誘発閾値が口蓋裂のそれよりも低いためと思われる。また,AhR遺伝子の破壊に用いたLacZ遺伝子産物をレポーターとして,発生途上のAhRノックアウト・ヘテロ個体を材料に,β-ガラクトシダーゼの組織化学により,AhRの組織での分布を調べた。その結果は野生型マウスでインシツハイブリダイゼーション法により調べられたAhRメッセンジャーRNAの発現領域とほとんど一致していた。発生途上の二次口蓋突起,尿管,中腎管,中腎傍管,脊髄神経節,末梢神経系などにAhRが存在することが確認された。AhRは口蓋裂,水腎症の誘発には必須であるが,その有無がダイオキシンの毒性標的器官となるか否かを直接決定するのではないことが示唆された。
持続可能な社会のための科学教育を具現化する教師教育プログラムの開発

本研究の目的は,「サステナビリティ学」や「持続可能な開発のための教育(Education for Sustainable Development :略称ESD)」の射程から構想した新しいタイプの理科教師教育プログラムを開発し,評価することであった。そのために,神戸大学を拠点として,長崎大学,宮崎大学,大分大学,県立広島大学,愛知教育大学等の大学・大学院の科学教育・理科教育学と自然科学の研究者,国立科学博物館の研究者等が協同,連携し,学部レベル,大学院レベル,専門職大学院レベルの教師教育プログラム,さらには,現職教師を対象にした現職教育プログラムや博学連携プログラムの開発と評価に取り組んだ。その結果, ESDの観点から求められる教師教育プログラムのデザイン指針の策定,具体的なプログラム試案及び事例の提案をすることができた。本研究では,「サステナビリティ学」や「持続可能な開発のための教育(Education for Sustainable Development:略称ESD)」の射程から構想した新しいタイプの理科教師教育プログラムを開発し,評価することを目的としている。そのために,神戸大学を拠点として,長崎大学,宮崎大学,大分大学,県立広島大学,愛知教育大学等の大学・大学院の科学教育・理科教育学と自然科学の研究者,国立科学博物館の研究者等が協同,連携し,学部レベル,大学院レベル,,専門職大学院レベルの教師教育プログラム,さらには,現職教師を対象にした現職教育プログラムや博学連携プログラムの開発と評価に取り組むものである。具体的には,ESDの観点から求められる教師教育プログラムの目標論,方法論,内容論,評価論を文献調査や海外調査に基づいて理論的に検討し,仮説的なフレームワークを提案するとともに,具体的なプログラム試案を策定するものである。初年度は,「持続可能な開発のための教育(ESD)」を射程に入れた新しいタイプの理科教師教育プログラムの開発と評価のための準備段階の研究を行った。(1)研究枠組みの明確化,プログラムの基本原則の検討教師教育プログラムにおける目的論,方法論,内容論,評価論に関するフレームワークについて,海外調査(オスロ大学,ベルリン自由大学,コロンビア大学ティーチャーズカレッジ,アメリカ自然史博物館,フランス自然史博物館等)や文献調査及び国内の大学等の実態調査に基づいて,科学教育,博学連携,自然科学的基礎,教育方法等の視点から,研究全体の方向性の明確化に務めた。(2)プログラム試案の作成と試行学部(宮崎大学,大分大学),大学院(宇都宮大学),現職教師教育(県立広島大学)のそれぞれのレベルについてプログラムを開発するとともに,小規模で試行し,その評価と改善案の策定を行った。(3)授業実践事例の開発教師教育プログラムに必要不可欠となる小・中学校の授業実践を研究協力者の神戸大学発達科学部附属校と共同で開発,実施した。小学校では,食育に関係する単元の開発を行った。中学校では,教育方法の開発の観点から,理科をベースに協同学習に関する単元を開発した。(4)研究成果の予備的公表本研究の平成20年度の成果は,日本科学教育学会第32回年会(岡山大会),日本理科教育学会第58回全国大会(福井大会),日本理科教育学会近畿支部大会(神戸大会)等において発表された。また,海外においても,PCST2008(デンマーク),WBE2009(タイ),NARST2009(アメリカ)等で発表された。本年度は,初年度に引き続き,「持統可能な開発のための教育(ESD)」を射程に入れた新しいタイプの理科教師教育プログラムの開発と評価の準備・試行段階として位置づけ,研究を実施した。(1)研究枠組みの精緻化,プログラムの基本原則の明確化教師教育プログラムにおける目的論,方法論,内容論,評価論に関するフレームワークについて,教授学的内容知識(PCK),科学的リテラシー,博学連携等の観点から検討を行った。文献等による理論的な研究とともに,教師等を対象とした実態調査,外国における先進事例の調査等も実施した。成果の一部は,ロンドン大学の研究協力者にレビューを受け,国際的な視点からの精緻化に取り組んだ。(2)プログラムの試行的開発と評価大学院及び現職教育レベルを対象として,ESD意識を高めるための教育プログラムの試行的開発と実践・評価を行った。大学院生を対象としたものはESDの導入部分の事例開発,現職教育では更新制の講習において植物園との連携による実習の事例開発を行った。いずれも試行としての事例研究であったが,本格的なプログラム開発のための重要な知見を得ることができた。(3)成果発表

本年度は「持続可能な開発のための教育(ESD)」を射程に入れた新しいタイプの理科教師教育プログラムの本格的な開発と評価の第2段階として位置づけ,研究を実施した(1)研究枠組みの精緻化,プログラムの基本原則の明確化教師教育プログラムにおける目的論,方法論,内容論,評価論に関する理論的フレームワークについて,昨年度に引き続き検討を加えるとともに,プログラム開発のための基本原則をブラッシュアップし,具体化可能なものとして策定した.そのために,海外調査(イギリス,韓国,フィリピン等)と文献調査を継続的に実施した(2)プログラム開発と評価学部,大学院,専門職大学院,現職教師教育,博学連携のそれぞれのレベルについて,各担当が開発したプログラムを平成22年度の講義・演習等として本格的に実施し,その評価と改善案の策定を目指した.また,それらについて,分担研究者・連携研究者の所属機関において相互利用をすることで,プログラムの汎用可能性,普遍性についても予備的な検討を行った(3)研究成果の公表とシンポジウムの開催本研究の平成22年度までの途中経過は,日本科学教育学会,日本理科教育学会などの学術論文として公表した.国際会議では,XIV International Organization for Science and Technology Education (10STE) symposiumで4件の発表を行った.このほか,各分担研究者・連携研究者が共同で,日本科学教育学会第34回年会,日本理科教育学会第60回全国大会において自主課題研究を組織するなどして発表した本年度は,「持続可能な開発のための教育(ESD)」を射程に入れた新しいタイプの理科教師教育プログラムの本格的な開発と評価の最終段階として位置づけ,研究を実施した。(1)研究枠組みの精緻化,プログラムの基本原則の確定教師教育プログラムにおける目的論,方法論,内容論,評価論に関する理論的フレームワークについて,昨年度に引き続き検討を加えるとともに,プログラム開発のための基本原則を確定し,具体化可能なものとして策定した。そのために文献調査は継続的に実施した。(2)プログラム開発と評価学部,大学院,専門職大学院,現職教師教育,博学連携のそれぞれのレベルについて,各担当が開発したプログラムを平成23年度の講義・演習として本格的に実施し,その評価を実施した。また,それらについて,分担研究者・連携研究者の所属機関において相互利用をすることで,プログラムの汎用可能性,普遍性についても検討を行った。(3)研究成果の公表とシンポジウムの開催
被嚢構成タンパク質分子の解析

被嚢(ひのう)はホヤの仲間に特有の外皮組織であり、自然界で唯一の動物セルロースを含む組織である。カタユウレイボヤ(Ciona intestinalis)の被嚢の大半はタンパク質によって構成されているが、その分子的な実体は全くの不明であった。本研究では、最新のプロテオミクスの手法を導入して(LCタンデムマス法)、被嚢を構成するタンパク質分子50種を初めて明らかにした。交付申請書に記載した研究実施計画に従い、以下の工程を進めた。<工程1.タンパク質試料の調製>結論)再現性よくタンパク質試料を調製する方法を確立した。内容)作業は全て4°Cで行った。成体を解剖して被嚢を採取した。被嚢試料と等量の50mM酢酸バッファー(pH5.5)を加え、生物試料用ミキサーを用いて破砕した。9000g×30分の遠心分離処理を行い、上清を画分1として回収した。沈澱に3倍量の同バッファーを加え、同条件で遠心分離し、上清を除いた(洗い作業)。洗い作業を計3回繰り返した。沈澱に3倍量の1%SDS水溶液を加え、よく,撹拌した後、90°C30分処理した。同条件で遠心分離を行い、上清を画分2として回収した。1%SDS水溶液を用いた洗い作業を2度行った。沈澱に、1%SDS・0.1%メルカプトエタノール水溶液を加え、よく撹拌した後、90°C1時間処理した。同条件で遠心分離を行い、上清を画分3として回収した。各画分をSDS-PAGE電気泳動に供し、それぞれが異なるバンドパターンを示すこと(画分化の成功を意味する。)、および複数回の作業を通じて画分ごとにほぼ同様のバンドパターンを示すこと(再現性があることを意味する。)を確認した。<工程2.成分の同定>結論)同定法の変更を余儀なくされた。内容)各画分に含まれるタンパク質成分を、SDS-PAGE電気泳動法により分離し、プロッティング法によりPVDF膜上に転写した。転写バンドを切り出し、エドマン法を用いてN末端アミノ酸配列を決定したが、有効な配列データを得るに到らなかった。バンドに含まれるタンパク質量が検出限界を下回ったこととN末端がブロックされていたことが原因であると推察された。解決策として、液体クロマトグラフィーによる分離とタンデム質量分析をくみあわせたシステムを採用した。微量の試料を十分に評価できることが分かったからである。現在、同定作業を始めたところである。「研究成果の具体的内容」交付申請書に記載した研究実施計画に従い、以下の工程を進めた。工程1.成分の同定新たに、トリクロロ酢酸を用いた濃縮法を導入したことによって、被嚢抽出タンパク成分の粗精製作業の精度を上げることができた。抽出したタンパク成分は、タンパク分解酵素処理後、液体クロマトグラフィーおよび質量分析器に連続的にかけ、予定通り、ペプチド試料データを得た。得られたペプチドデータを、カタユウレイボヤ・ゲノムおよびEST情報に基づいたデータベースを利用して、予想遺伝子およびESTクローンに対応させた。工程2.遺伝子発現解析工程1で同定した成分のRNAプローブを作成し、in situハイブリダイゼーション法により、遺伝子発現解析を行った。この際、被嚢に非特異的なシグナルが大量に現れ、プローブ特異的なシグナルの読み取りを邪魔することが、新たな問題として浮上した。そこで、(1)ホヤのアセトンパウダーを作成し、プローブの精製前処理を行い、(2)セルロース分解酵素を利用して、非特異的なシグナルを有した被嚢を除去する方法を開発することにより、問題を解決した。「研究成果の意義」従来不明であった被嚢構成タンパク質分子を同定したことは、今後の被嚢研究に必要不可欠な基礎データとして研究上の意義がある。また、研究実施計画通り、成分同定を行う実験系を立ち上げたことに科研費研究としての意義がある。「研究成果の重要性」非特異的なシグナルを被嚢ごと除去する方法は、in situハイブリダイゼーション法の適用範囲を拡げた点、特に、従来は適用不可能であった発生後期のホヤ試料に対して適用可能とした点が重要である。交付申請書に記載した研究実施計画に沿って、(1)カタユウレイボヤの被嚢基質を構成するタンパク質分子の同定と(2)その遺伝子発現解析を行った。(1)新たに導入した液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析機システムにより、被嚢基質を構成するタンパク質分子50を決定することに成功した。詳細なドメイン構造解析を行った結果、これらの分子は大まかに細胞外マトリックスを構成する糖タンパク質群と補体系免疫タンパク質群に二分された。前者の糖タンパク質には、脊椎動物の外皮組織を構成するフィブリリンやマトリリンが含まれる一方、既知のタンパク質に類似しない新規の糖タンパク質が多数含まれており、それぞれ、脊索動物の外皮組織に共通な分子と、被嚢というホヤの仲間に特異な外皮組織を特徴付ける分子の候補であると考えている。

また、後者の免疫タンパク質群は、固着生活をおくるホヤの仲間が外界に接する場である被嚢において、免疫作用が営まれていることを裏付けるものと理解している。(2)同定した分子のESTクローン全長配列を決定した後、ジゴキシゲニンで修飾したRNAプローブを作成し、in situハイブリダイゼーション法により、遺伝子発現解析を行った。被嚢を裏打ちする表皮細胞や、被嚢内に存在する自由移動性の細胞に発現シグナルが認められたが、被嚢そのものに非常に強いバックグラウンドが現れるため、結果の解釈が困難であった。そこで、バックグラウンドが現れない条件および現れたバックグラウンドを除去する条件を検討し、大幅に改善することに成功した.これらの成果は、従来不明であった被嚢の構造および被嚢に認められる免疫現象の分子的実体に関する初めてのデータであり、今後の研究発展の基盤になると考えている。
高発光性と高移動度を両立させた発光デバイス材料の創製

本研究では1)高ホール移動度,2)固体での高発光性を併せ持つ酸素架橋V字型およびN字型パイ電子系コアを基本骨格とする。これらについて伝導や光物性に関連する置換基と印刷プロセスに関連する置換基の両軸からの構造有機化学的アプローチにより有機発光デバイス向けの有機半導体材料の創製を行い、有機発光トランジスタ向けの有機半導体材料の分子設計指針を確立する。今年度は、非対称のパイ系を有する誘導体(DNF-L, DNT-L)の結果を取りまとめ学術論文として発表した。これらの分子はアモルファスシリコンに匹敵する移動度、非常に低い閾値電圧を持つ塗布型有機トランジスタ材料の分子設計が示された。このふたつの分子の検討で、アルキル基を全く持たない縮環パイ系化合物であっても、パイ系のつながり方を適切に設計すれば、塗布型有機トランジスタ材料に求められる溶解度の条件を十分に満たせることが明らかになった。我々は既に、DNF-V誘導体(Ph-DNF-VW)を設計し、300°C以上の非常に高い耐熱性、固体状態で非常に高い量子発光効率(ΦF=80%)を示し、単結晶貼り付けデバイスはアモルファスシリコンに匹敵する移動度最大(0.70cm2/Vs)を示し、さらに劇的な閾値電圧の減少を明らかにしている。しかしながら、Ph-DNF-VWは非常に低い溶解度しか示さないため、外側のアリール置換基を変化させることによって、優れた基礎物性を保ちつつ、溶解度を向上させる分子設計方針の探索に着手した。昨年度、グラムスケールで合成した臭素原子を有するDNF-V誘導体(Br-DNF-VVおよびBr-DNF-VV)に種々のアリール基を高い収率で導入できる条件を検討している。従来、必要不可欠と考えられていた柔軟なアルキル基を持たなくても、高移動度を保ちつつ、高い溶解度を有機半導体分子に担保させることがわかったことは大きな成果である。アルキル基などのフレキシブルな置換基導入によって溶解度を担保させていた従来の分子設計方針とは全く異なるアプローチに基づいており塗布型有機半導体材料の分子設計指針の確立に大きく寄与する。当初の予定通り、臭素原子を有するDNF-V誘導体を前駆体として、種々のアリール基をもつ化合物の合成研究に着手できた。今後、これらの基礎物性、デバイス物性を検討するためには、非常に純度の高いサンプルを得る必要がある補助事業期間内に目的を達成するために、平成30年度はグラムスケールで得た前駆体分子に種々のアリール基を導入する検討を重点的に行なった。この結果、平成31年度はこれらの化合物の性質の解明に集中して取り組むことができるようになった。平成30年度、化合物の性質を明らかにするために用いる予定だった経費は平成31年度以降に執行する予定である。今年度は、非対称のパイ系を有する誘導体(DNF-L, DNT-L)の基礎物性、デバイス特性を詳細に検討した。これらの単結晶構造解析を行い、パッキング構造を明らかにした。この結果を元にして計算を行うことで集合体構造中の電子の伝搬を明らかにした。さらにこれらを用いたデバイスを検討し、アモルファスシリコンに匹敵する移動度が得られた。この材料を用いたデバイスは閾値電圧が非常に低く、アルキル基を全く持たず、塗布型有機トランジスタに適用可能な材料のポテンシャルが示された。我々は近年、フェニル基を持つDNF-V誘導体(Ph-DNF-VW)を設計し、グラムスケールでこれを得る効率的合法を確立した。Ph-DNF-VWは300°C以上の非常に高い耐熱性、固体状態で非常に高い量子発光効率(ΦF=80%)を示す。Ph-DNF-VWの単結晶貼り付けデバイスはアモルファスシリコンに匹敵する移動度最大(0.70cm2/Vs)を示し、さらに劇的な閾値電圧の減少が明らかになった。Ar-DNF-VWの集合体構造の制御およびそれに起因する物性の向上を目的として種々のピリジル基を有するDNF-V誘導体を効率的に合成した。臭素原子を有するDNF-V誘導体(Br-DNF-VVおよびBr-DNF-VV)を設計し、グラムスケールで合成・単離・精製することに成功した。対称性を崩し、溶解度を高めたDNF-L, DNT-L誘導体でもアモルファスシリコンに匹敵する移動度および低い閾値電圧を実現できたことは大きな成果である。これはアルキル基などのフレキシブルな置換基導入によって溶解度を担保させていた従来の分子設計方針とは全く異なるアプローチに基づいており、より高性能な塗布型有機半導体材料の分子設計指針の確立に大きく寄与する、当初の予定通り、今年度に種々のピリジル基を有する化合物を合成できた。この方法はピリジル基のようなヘテロ環をもつDNF-V誘導体の合成にも、グラムスケールで適用できることがわかった。今後、これらの基礎物性、デバイス物性を検討するためには、非常に純度の高いサンプルを得る必要がある本研究では1)高ホール移動度,2)固体での高発光性を併せ持つ酸素架橋V字型およびN字型パイ電子系コアを基本骨格とする。

これらについて伝導や光物性に関連する置換基と印刷プロセスに関連する置換基の両軸からの構造有機化学的アプローチにより有機発光デバイス向けの有機半導体材料の創製を行い、有機発光トランジスタ向けの有機半導体材料の分子設計指針を確立する。今年度は、非対称のパイ系を有する誘導体(DNF-L, DNT-L)の結果を取りまとめ学術論文として発表した。これらの分子はアモルファスシリコンに匹敵する移動度、非常に低い閾値電圧を持つ塗布型有機トランジスタ材料の分子設計が示された。このふたつの分子の検討で、アルキル基を全く持たない縮環パイ系化合物であっても、パイ系のつながり方を適切に設計すれば、塗布型有機トランジスタ材料に求められる溶解度の条件を十分に満たせることが明らかになった。我々は既に、DNF-V誘導体(Ph-DNF-VW)を設計し、300°C以上の非常に高い耐熱性、固体状態で非常に高い量子発光効率(ΦF=80%)を示し、単結晶貼り付けデバイスはアモルファスシリコンに匹敵する移動度最大(0.70cm2/Vs)を示し、さらに劇的な閾値電圧の減少を明らかにしている。しかしながら、Ph-DNF-VWは非常に低い溶解度しか示さないため、外側のアリール置換基を変化させることによって、優れた基礎物性を保ちつつ、溶解度を向上させる分子設計方針の探索に着手した。昨年度、グラムスケールで合成した臭素原子を有するDNF-V誘導体(Br-DNF-VVおよびBr-DNF-VV)に種々のアリール基を高い収率で導入できる条件を検討している。従来、必要不可欠と考えられていた柔軟なアルキル基を持たなくても、高移動度を保ちつつ、高い溶解度を有機半導体分子に担保させることがわかったことは大きな成果である。アルキル基などのフレキシブルな置換基導入によって溶解度を担保させていた従来の分子設計方針とは全く異なるアプローチに基づいており塗布型有機半導体材料の分子設計指針の確立に大きく寄与する。当初の予定通り、臭素原子を有するDNF-V誘導体を前駆体として、種々のアリール基をもつ化合物の合成研究に着手できた。今後、これらの基礎物性、デバイス物性を検討するためには、非常に純度の高いサンプルを得る必要がある補助事業期間内に目的を達成するために、平成29年度は目的化合物をより容易に、グラムスケールで得る方法を模索し、より洗練された分子設計方針に基づいた目的化合物の確保を重点的に行なった。この結果、平成29年度はこれらの化合物の性質の解明に集中して取り組むことができるようになった。今年度、化合物の性質を明らかにするために用いる予定だった経費は来年度以降に執行する予定である。補助事業期間内に目的を達成するために、平成30年度はグラムスケールで得た前駆体分子に種々のアリール基を導入する検討を重点的に行なった。この結果、平成31年度はこれらの化合物の性質の解明に集中して取り組むことができるようになった。平成30年度、化合物の性質を明らかにするために用いる予定だった経費は平成31年度以降に執行する予定である。平成29年度の研究を通して、基礎物性を明らかにするための研究方針、研究体制が確立できた。平成29年度に使用しなかった807800円および平成30年度の配分の一部は、今年度に合成した化合物の性質を明らかにするための消耗品購入に用いる。平成30年度の研究を通して、基礎物性を明らかにするための研究方針、研究体制が確立できた。
高圧高温下におけるマントル物質の変形実験と粘性率の決定

我々はポストスピネル転移により下部マントル最上部の条件(24GPa,1600°C)で生成された非常に細粒な(3μm以下)分解生成物が、超塑性的となる可能性を示し、これによって670kmの深さにおける急激な地震活動の減少と、700km以深でのアサイスミシティーなどを説明した。また分解生成物の流動特性を調べるため、アナログ物質としてMn_2TiO_4の分解を用い、0.9-1.6GPa、1000-1320°Cの条件で時間を8分から256時間変化させ結晶粒成長実験を行った。長時間おいたものでも粒径は高々10μm程度であり、下部マントルへ沈み込むスラブについても粒成長速度は遅く、5cm/年の沈み込み速度について、少なくとも数十km以上の領域が超塑性的となる事を見積った。更にピストンシリンダー装置を用い、円柱状の試料の上下に圧力媒体より硬いアルミナを、周囲に塩化ナトリウムなどの柔らかいものを詰め、硬いものと柔らかいものの圧縮特性の差を利用してMn_2TiO_4の分解生成物に高圧高温下で変形を加え、変形を加えないものの反射電子像と比較した。その結果、変形を加えたものは分解生成物の一部が非常に細長く延び、超塑性に特徴的なテクスチャーをもつ事が解った。また、上部マントル物質について高圧高温下で決定されたクリープ法則と地震のQ値のデータに基づき、我々は粘性率とQ値の関係式を求めた。その結果を上部マントルの地震のQ値構造と比較しマントルの粘性率を見積った。東北日本の上部マントルでは火山フロントより背弧側で粘性率は低く(約10^<20>Pa・s)、マントルウェッジの先端部で10^<23>Pa・s程度であり、沈み込むスラブは10^<23>Pa・sより高い。太平洋下ではリソスフェア下部から300kmまでの深さで3x10^<18>-3x10^<22>Pa・sの範囲の粘性率が得られ、リソスフェア・アセノスフェア境界で10^<20>-10^<21>Pa・sの範囲にあり、リソスフェアの粘性は10^<21>Pa・sより高い。アイスランドプラトー下のアセノスフェアでは、Qs=7(0-5Ma)と50(5-10Ma)に対し10^<16>と10^<18>Pa・sが得られた。0-5Maの領域では部分容融(3-7%)が、5-10Maの領域ではソリダス温度の90%くらいの高温が期待され、求められた粘性率はこのような温度構造とも調和的である。

我々はポストスピネル転移により下部マントル最上部の条件(24GPa,1600°C)で生成された非常に細粒な(大部分3μm以下)分解生成物が、超塑性的となる可能性を示してきた。反射電子像の観察からペロフスカイトとマグネシオヴスタイトは、両者が交互に入り組んだ細粒の集合体となり、高温で長時間アニ-ルしても粒径がほとんで変化しないという実験結果が、金属やセラミクスについて報告されている。そこでスピネル分解反応によって、670ー700kmの深さで剛体的でサイスミックなスラブから、流動的でアサイスミックなスラプに変化することが可能である。このことは670ー700kmの深さでの急激な地震活動の減少と、700km以深でのアサイスミシティ-などを良く説明することを我々は示してきた。そこで分解生成物の流動特性を調べるためアナログ物質としてβーMn_2TiO_4を用い、分解反応Mn_2TiO_4→MnTiO_3+MnOの相平衡図を作成し、MnTiO_3とMnOの混合物はポストスピネル相と全く同様に、非常に細粒で相互に入り組んだ配列をとることが反射電子像によって確認された。この観察結果からβーMn_2TiO_4がポストスピネル転移をシミュレ-トするために適切なアナログ物質であることを確かめた。また結晶粒成長を調べるため30分から3時間ほど試料を高圧高温下でアニ-ルし粒径変化を調べた。この様な短時間では粒径はほとんど変化しないことが解った。また高圧高温下における変形実験を行うため,円柱状の試料を用いその上下に圧力媒体より硬いもの(アルミナなど)を周囲に塩化ナトリウムなどの柔かいものをつめ、圧力温度を安定させわずかに加圧した。この加圧過程において硬いものと柔かいものの圧縮特性の差を利用してβーMn_2TiO_4の分解生成物に変形を加え、変形を加えないものの反射電子像と比べた。その結果変形を加えたものは分解生成物の一部が非常に細長くのび、超塑性に特徴的なテクスチャ-をもつことが解った。昨年度の仕事に引き続き、我々は分解生成物の流動特性を調べる基礎実験を本年度も行なった。ポストスピネル転移により、下部マントル最上部の条件で生成された、非常に細粒な分解生成物が超塑性的となり、下部マントルへ沈み込むスラブが、剛体的でサイスミックなものから、流動的でアサイスミックなものへと変化する可能性を示してきた。ポストスピネル相と酸似の分解生成物テクスチャーを示すアナログ物質β-M_<n2>TiO_4を用い、圧力0.9GPa-1.6GPa_1温度1000°C-1320°Cの条件下で、時間を0.5時間から288時間変化させ、結晶粒成長実験を行なった。長時間おいたものでも粒成長は高々15um程度であり、粒成長速度の非常に遅いことが定量的に確認された。実験結果は、Kinetic Grain Growth Equationによって良く表わされ、粒成長の活性化エネルギー、活性化体積及び粒成長指数が決定された。本研究結果を地球内部に外挿することにより、下部マントルへ沈み込むスラブについても粒成長速度は遅く、スラブの沈み込み速度を毎年10cmとして、少なくとも数十km以上の領域に渡って超塑性的となることが見積られた。更に我々はかんらん石を主要構成鉱物とする上部マントル物質について決定されたクリープ法則と地震の非弾性的性質を表わすQ値の両者が、ソリダス温度と密接な関係にあることを利用して、クリープ則とQ値の関係、すなわち粘性率とQ値の関係を調べその関係式を求めた。その結果を上部マントルについて求められているQ値構造と比較し、東北日本島弧下マントルの粘性率を推定した。その結果、火山フロントより背弧側で粘性率は低く(10^<20>P_<a-s>)、マントルウェッジの先端部で約10^<23>P_<a-s>程度であり、沈み込むスラブは10^<23>P_<a-s>よりも高い値を示した。これらの値は地表の変形から求められた粘性率構造とも良く一致し、また日本列島における火山と沈み込むスラブの分布とも調和的であることが示された。
「参加コミュニケーション型従業員代表制」の組織と機能に関する研究

平成8年度は先行研究の調査と理論仮説の形成に取り組み、以下のような成果を得た。1910年代後半から1930年代にかけての従業員代表制についての同時代の観察者の分析・評価の見直し:当時の有力な経営者団体(NICB、NAM、AMA)、労働組合(AFL)による調査や声明、そして有力な労使関係研究者の業績を見直し、「参加・コミュニケーション型従業員代表制」の輪郭より鮮明にするとともに、General Electric社の従業員代表制(Works Council)の位置を確定した。平成9年度は、対象をGeneral Electric社のSchenectady事業所に限定して、ミクロ的な観察に基づく、実証的な研究を行い、「参加・コミュニケーション型従業員代表制」の組織構造と機能を解明した。以下がその概要である。(1)General Electric社における従業員代表制Works Councilの形成にあたって、第一次大戦期までの工場の管理者側と実質的な団体交渉を行っていた、労働組合の存在がかなり大きな影響を与えた。特に、この組合の実質的な反対によって頓挫した最初の従業員代表制Industrial Representationの経験(1992年)がWorks Councilの構造に決定的な影響を及ぼした。(2)1924年に形成されたWorks Councilは、変則的な合同協議会型従業員代表制で、その最大の特徴は、きわめてシンプルな組織構造、職場における個々の従業員の苦情やローカルな問題の処理をWorks Councilにおける事業所全体の共通問題の協議と分離したこと、従業員代表たるWorks Councilmenの職場活動を公認し、Foremenとの関係を明確にしたことなどであった。(3)Works Councilmenの定例会議における協議は、(1)従業員の雇用と配置などに関する問題、(2)職務と報酬に関する問題、(3)従業員の金銭的福利厚生制度の改正や受給者の範囲や受給の条件などの付加給付に関する問題、(4)その他の福利厚生や環境に関する問題、など従業員の雇用と仕事にかかわる問題を広く網羅していた。(4)Works Councilmenは当初より、職場における事実上のショップ・スチュワードとして活動し、職場における上下両方向の情報の流れを媒介し、また、特に一般従業員と第一線監督者との間の利害調整に大きな役割を果たした。(5)こうしたWorks Councilmenの活動の結果、事業所内のコミュニケーションは活発化し、労使双方の相手方に対する理解が深まり、事業所コミュニティーの一体感を醸成した。加えて、Works Councilの協議を通じて、雇用や賃金などにかかわる暗黙の慣行の多くが明示的なルールに転化し、こうした慣行の適用を巡るトラブルを減少させた。さらに、Works Councilmenの職場活動の公式化は、Foremanの権限を限定し、職場の労使関係の近代化に貢献した。今年度の研究の重点を、(1)史料の収集整理、(2)より広範な先行・関連研究の調査と理論仮説整備においた。(1)の史料収集に関しては、以下のような課題を遂行した。

(2)史料の整理:コンピュータへの入力とデータベース化(1)の資料を中心にデータ入力と整理、データベース化を行った。現在、このデータをこれまでの予備作業で構築されたデータベースに統合する準備を行っている。(2)の先行研究の調査と理論仮説の整備については、次のよう課題を中心に取り組んだ。(1)1910年代後半から1930年代にかけての従業員代表制についての同時代の観察者の分析・評価の見直し:当時の有力な経営者団体(NICB、NAM、AMA)、労働組合(AFL)による調査や声明、そして有力な労使関係研究者の業績を見直し「参加・コミュニケーション型従業員代表制」の輪郭より鮮明にするとともに、General Electric社の従業員代表制(Works Council)の位置を確定した。(2)現在アメリカで進行している労使関係システムの再検討の議論の中での従業員代表制に関する研究のサ-ヴェイを行う:主として労働組合に依存しない従業員参加・集団的労使関係の可能性と限界に関する議論を検討し、本研究の理論仮説と分析枠組みの改善に取り組んだ。この取り組の一端は、「「参加・コミュニケーション型従業員代表制」の系譜と労使関係ネットワーク」という論文に取りまとめた(経営史学会誌『経営史学』に掲載予定)。標記研究課題に関して、以下のような取り組みを行い、後述の研究成果を得た。本年度は、昨年度行った、(1)史料収集とデータベース化、(2)先行研究の調査と理論仮説の整備に基づいて、対象をGeneral Electric社のSchenectady事業所に限定して、ミクロ的な観察に基づく、実証的な研究を行い、「参加・コミュニケーション型従業員代表制」の組織構造と機能を解明した。本年度の研究の結果明らかになったのは、以下の点である。(1)General Electric社における従業員代表制Works Councilの形成にあたって、第一次大戦機まで工場の管理者側と実質的な団体交渉を行っていた、労働組合の存在がかなり大きな影響を与えた。とくに、この組合の実質的な反対によって頓挫した最初の従業員代表制Industrial Representationの経験(1992年)がWorks Councilの構造に決定的な影響を及ぼした。(2)1924年に形成されたWorks Councilは、変則的な合同協議会型従業員代表制で、その最大の特徴は、きわめてシンプルな組織構造、職場における個々の従業員の苦情やローカルな問題の処理をWorks Councilにおける事業所全体の共通問題の協議と分離したこと、従業員代表たるWorks Councilmenの職場活動を公認し、Foremanとの関係を明確にしたことなどであった。
MLL再構成陽性急性リンパ性白血病の病態解明と治療法の開発

乳児期発症のMLL再構成陽性の急性リンパ性白血病(ALL)は予後不良の疾患であり、新規治療法の確立が望まれる。ヒト細胞が移植可能なNSG免疫不全マウスへの白血病移植モデルを用いてin vivoでの薬剤投与による治療法の開発を行った。ALL由来細胞(HAL-01)NSGマウスに移植し、DNA損傷を誘導するアントラサイクリン系抗がん剤ドキソルビシンを治療量投与すると、NSGマウスはPrkdcが欠損し非相同組み換え末端結合(NHEJ)が障害されているため毒性によりすぐに死亡した。そこで薬剤輸送ポンプ(p-gp)阻害剤であるシクロスポリンを併用したところ、白血病移植マウスの生存率が延長した。近年、化学療法の進歩により小児の急性白血病の予後は著しく改善したが、乳児期発症のMLL再構成陽性の急性リンパ性白血病(ALL)は依然として予後不良の疾患であり、白血病発症の機構を明らかにし、新規治療法の確立が望まれる。今年度は免疫不全マウスへの白血病移植モデルを用いてin vivoの薬剤投与の系の確立を試みた。乳児白血病細胞を用いる前に、まず別のヒト白血病由来細胞(HAL-01)を免疫不全マウスであるNSG mouseに移植し、白血病発症及び化学療法の有効性を検討した。ヒトHAL-01由来の急性リンパ性白血病を発症したマウスを用いて薬剤投与実験を行った。アントラサイクリン系抗がん剤であるドキソルビシンを投与した群は化学療法に伴う毒性によりすぐに死亡したため、2mg/kgから用量を振ってドキソルビシンの至適用量を確立した。今後は乳児白血病由来細胞を異種移植したマウスで既知の抗がん剤に加えてMLL再構成陽性ALLに有効とされる分子標的薬を用いて薬剤投与実験を検討する。今年度は免疫不全マウスへの白血病移植モデルを用いたin vivoでの薬剤投与の系が概ね確立し、順調に進展している。次年度はMLL再構成陽性急性リンパ性白血病に有用な分子のスクリーニングを行い、新規標的分子を抽出し、その分子のin vitroや白血病モデルマウスにおける細胞死誘導効果の検証にも着手する予定である。乳児期発症のMLL再構成陽性の急性リンパ性白血病(ALL)は依然として予後不良の疾患であり、白血病発症の機構を明らかにし、新規治療法の確立が望まれる。NSGマウスはPrkdcが欠損しているため非相同組み換え組み換え末端結合NHEJが障害されており、DNA損傷を誘導する薬剤により、移植した細胞に細胞死を誘導する濃度で、個体死が起こってしまう。そこで個体死を起こさないで白血病細胞に細胞死を誘導する工夫が必要となる。急性リンパ性白血病由来細胞(HAL-01)NSGマウスに移植し、アントラサイクリン系抗がん剤であるドキソルビシンを投与したところ、NSGマウスはPrkdcが欠損し非相同組み換え組み換え末端結合(NHEJ)が障害されているため、治療必要量のドキソルビシンに伴う毒性によりすぐに死亡することが明らかになった。そこで低用量のドキソルビシンでの治療を試みたが、生存に有意な条件は得られなかった。そこで薬剤輸送ポンプ(p-gp)阻害剤であるシクロスポリンを併用した治療を試みたところ、白血病移植マウスの生存率が延長することが明らかとなった。次に、その他のDNA損傷修復経路である、塩基除去修復の阻害剤であるPARP阻害剤の投与をNSGマウスで行った。PARP阻害剤により修復されなかったDNA一本鎖損傷はDNA複製に伴いDNA2重鎖切断に移行する。細胞周期S期からG2/M期ではDNA損傷修復は主に相同組み換え修復によって行われるため、NSGマウスはPARP阻害剤に高感受性を示さなかった。NSGマウスは塩基除去修復を利用するアルキル化剤や相同組み換え修復に関連する薬剤のスクリーニングには有用であることが明らかとなった。さらに分子化合物ライブラリーを用いて、MLL再構成陽性白血病に特異的に細胞死を誘導する化合物や分子を抽出し、新規の標的治療薬の候補となりうるかを以下の方法で検討する。1)標的分子が含まれる経路を標的とした化合物によって、MLL再構成陽性白血病に特異的な細胞死誘導するかを検討する。2)MLL再構成陽性白血病を含む他の白血病細胞株約30株を用いて、in vitroで候補分子の有効性の評価及び効果がMLL再構成陽性白血病に特異性があるかを確認する。3)白血病モデルマウスを用いたin vivoで候補分子の有効性及び毒性を評価する。

小児血液・腫瘍次年度は今年確立されたマウスへの異種移植実験系を用いて、より多くのマウスや薬品、抗体薬を使用することが予想され、次年度使用額に繰り越した。物品費38万、人件費20万、その他10万
発生工学的手法による原虫病感染防御機構の分子免疫学的解析

原虫感染による動物の被害は、世界的規模に及び、動物産業界に甚大な被害を与えているのみならず、人畜共通感染症として公衆衛生上の重要問題となっているが、完全な予防・治療法は確立されていない。本研究の目的は、発生工学的手法を用いて作り出された遺伝子改変マウスを用いて、個体レベルで原虫感染防御機構を解明することである。そこで、トキソプラズマ、バベシア、トリパノソーマ、ネオスポーラ、クリプトスポリジウムの各種原虫から免疫原性の高い蛋白質を特定し、塩基配列の同定をおこなった。また、モノクローナル抗体を用いて原虫抗原蛋白質の局在を、間接蛍光抗体法、共焦点レーザー顕微鏡、透過型電子顕微鏡により明らかにすると共に、機能解析として各蛋白質の原虫分化・増殖、細胞内侵入性、感染マウスに対する生存率等に及ぼす影響を検討し、感染防御機構への関与を解析した。更に、既に本センターで保有している遺伝子改変マウス(トキソプラズマP30トランスジェニックマウス、IFN-γノックアウトマウス、スカベンジャーレセプターノツクアウトマウス、TNF-αノックアウトマウス)に各種原虫を接種し、感染経過を野生型マウスと比較検討することにより、感染防御機構の解明をおこなった。その結果、感染防御免疫における抗原提示細胞の重要性、特にT細胞と樹状細胞との相互作用において、細胞表面抗原の発現が防御効果を左右する重要な要素となる可能性が強く示唆された。すなわち、T細胞に存在するCD28の発現は感染防御を誘導する免疫処置により変化しないのに対して、抗原提示細胞上のclass II、CD80及びCD86分子の発現は上昇し、T細胞活性化を誘導する事実が明らかとなった。また、細胞内寄生原虫に関しては、感染宿主細胞のアポトーシスが防御機構に重要であり、原虫側から積極的に働きかけるアポトーシスの抑制が、原虫の病原性を高める要因となることを明らかにした。1.原虫検出感染防御機構に関与する遺伝子の決定(1)各原虫に対するモノクローナル抗体の作製トリパノソーマ、ネオスポーラ原虫に関して、培養あるいは実験動物を用いて抗原を採集し、原虫特異抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。(2)免疫原生蛋白質の同定と機能解析モノクローナル抗体により認識される抗原蛋白質をWestern blot法,間接蛍光抗体法、共焦点レーザー顕微鏡により同定するとともに、それぞれの抗体の中和活性を調べることにより、各蛋白質の原虫分化・増殖、細胞内侵入性、生存率に及ぼす影響を検討し、感染防御能機構への関与を解析した。(3)免疫原生蛋白質をコードする遺伝子のクローニングと塩基配列の解読モノクローナル抗体をプローブとして、cDNAライブラリーを作製し、特異抗原をコードする遺伝子クローンを選択し、クローニング後、トリパノソーマのP0蛋白をコードする遺伝子の塩基配列を決定する。2.遺伝子改変マウスを用いた原虫感染実験既に保有しているトキソプラズマP30トランスジェニックマウス、IL-1ノックアウトマウス、IFNγノックアウトマウス、スカベンジャーレセプターノックアウトマウス、TNFαレセプターノックアウトマウスに各種原虫を接種し、感染経過を野生型および免疫不全マウス(ヌードおよびスキットマウス)と比較検討した。(1)トキソプラズマ原虫の感染実験P30トランスジェニックマウスにBeverley株bradyzoiteを腹腔内接種し、感染抵抗性の減弱がサイトカインパターンの違いに起因する事実を明らかにした。(2)クリプトスポリジウム原虫の感染実験クリプトスポリジウム(Cryptosporidium paruvum)のオーシストをスキットマウスに経口接種し、感染量とオーシストの排泄数および生存率との関連性を検討した。(3)ネオスポーラ