hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大型生理活性糖タンパク質の精密半化学合成

標的糖タンパク質を半合成することとし、全長のポリペプチド鎖のうち糖鎖がない長鎖ペプチド領域は、大腸菌発現により調製し、その他糖鎖が結合したペプチド領域は、Boc-ペプチド固相合成法により、ペプチドチオエステルならびにペプチドヒドラジド体として調製した。糖鎖は、鶏卵からアスパラギン結合型2分枝アシアロ型糖鎖ならびハイマンノース型糖鎖を調製し利用した。その結果、IgG1-Fc部位に相当するドメインならびにアミノ酸318残基からなるシアル酸転移酵素(STase)の半化学合成に成功した。フォールディングしたSTaseは十分な酵素活性を示した。Ig GのFc部位の合成では、各ペプチドセグメント、糖ペプチドセグメントを一般的なFmoc法ではなく、大量合成が期待できるBoc法をFc部位の合成に活用したこと、ならびにヒドラジドライゲーション法を活用することで、原料供給の効率性が向上した。現在、IgG-Fcの量産をおこなっている。天然型のレクチンよりも糖鎖に高い親和力を示すものとしてシグレック誘導体の合成を検討している。化学合成したシグレックの糖鎖結合部位近傍に、人工的な環状ペプチドを追加付加せることで糖鎖への親和力を向上させる検討をした。また、この環状ペプチド5残基程度は、ライブラリー化したものを結合させ、最適なものを見つけられるストラテジーを検討しその目処をたてた。より糖鎖に結合する環状ペプチドの単離、そして配列決定には、環状ペプチドに故意に導入したメチオニンをCNBrで切断し直鎖状にし、そしてペプチドラダー法を利用することが最も簡便であるという結果に至った。現在、シグレックと環状ペプチドライブラリーの量産を検討している。複合型糖鎖をもつアミノ酸400残基程度であるヒトのシアル酸酵素の半化学合成は、構造が解かれ、構造維持に必要な308残基を全長とするものを対象とした。糖鎖の有無はこの酵素活性に重要な役割をしていると考えられ、その機能解明、酵素メカニズムの解明を目指す。全長の318残基を3つのセグメントにわけ、糖鎖を含む全ての各セグメントの合成が完了した。第一セグメント53残基のペプチドチオエステル、第2セグメント42残基は糖ペプチドチオエステルとしてBoc法による合成が完了した。また、第3セグメントは大腸菌発現により調製することに成功し、現在、連結を検討している。膜タンパク質の合成は、予想どおり、ペプチドの溶解性が問題であるため、糖を脱着させることで難溶ペプチドを加溶化させる新規な膜タンパク質合成法を考案した。現在、その手法を発展させる検討をしている。糖結合ドメインの近くに環状ペプチドを付加し糖鎖への親和力が向上した人工レクチンの合成を目指した。まず、シグレック7の基本骨格のN末端側の121残基を大腸菌で発現し、ペプチドチオエステルの合成に成功した。そして、シグレック7C末端側の16残基からなるペプチドを化学合成し、そしてnative chemical ligationにより連結し、現在、シグレック全長の大量調製を検討している。シアル酸転移酵素は、昨年までにC末端側の223残基は大腸菌発現により調製はできていたが、そのペプチドのN末端側にHistagを付加させ溶解性を向上させたペプチドをデザインした(histagはTEVプロテアーゼによる加水分解するように配列を調整した)ものを用いて条件検討をした。その結果、TEVプロテアーゼによる脱保護により目的とする223残基ペプチドを得ることに成功した。また、昨年までに、酵素のN末端側のペプチドチオエステル、糖ペプチドチオエステルの合成は成功していたので、その量産化等効率化し、現在、シアル酸転移酵素の触媒部位全長を調製するためNCLを検討中である。抗体のFC部位の半化学合成は、全長216残基のうち、C末端側の124残基を大腸菌で発現し、N末端側の92残基をBoc法で合成することで必要量が確保でき、順次NCLを実施し、純度のいいFC糖鎖ペプチドの全長合成に成功した。現在、そのフォールディングの検討に着手した。膜糖タンパクとしてロドプシンの半化学合成を検討しているが、そのN末端ペプチドにおいても疎水性が高く化学合成をすることが困難な状況となっている。そこで、固相合成で調製するペプチドに本来はついていないヒト複合型糖鎖を付加し、リポソームにペプチド部位の方向を制御しながら埋め込み、膜中でのNCLを繰り返すことで膜タンパク質の合成を検討している。現在、必要となるロドプシンのN末端糖ペプチド30残基の合成をおこない、膜中でのNCLの検討を開始した。シアル酸転移酵素、抗体のFc部位については順調に合成が進んでおり、半化学合成による合成が期待できる。膜タンパク質については、予測をしていただが、その疎水性が化学合成の問題となっている。これについては、膜のなかでペプチドを連結する手法にも取り組み新しい膜タンパク質合成の方法を検討している。本研究では、糖ペプチド固相合成法と大腸菌発現法を組み合わせて大型糖タンパク質の半化学合成を検討した。シアル酸転移酵素は、シアリル糖鎖の合成に必須な酵素であるが、哺乳類のシアル酸転移酵素は、大腸菌による発現では、ほとんど活性を示さないことが知られている。これは、糖タンパク質である哺乳類のシアル酸転移酵素の生合成に、小胞体内での糖タンパク質品質管理機構が必須であることを示唆している。そこで本研究では、ヒトβガラクトシドα2,6-シアル酸転移酵素について、糖タンパク質品質管理機構におけるフォールディングと酵素活性の関係、および糖鎖の役割を詳細に調べるため、ハイマンノース型糖鎖を1本もつシアル酸転移酵素の半化学合成を検討した。

シアル酸転移酵素の膜外ドメインはN結合型糖鎖をもつ、318残基のアミノ酸からなる糖タンパク質である。骨格となるシアル酸転移酵素の全長ポリペプチド鎖は、Boc固相合成により調製した53残基のペプチドチオエステル(セグメント1)、および、42残基の糖ペプチドヒドラジド体(セグメント2)と大腸菌発現により得られた223残基のペプチド(セグメント3)をNative Chemical Ligation (NCL)を用いて連結し調製した。次にラット肝臓細胞から単離した小胞体画分(超遠心で単離後界面活性剤で膜破壊したもの)に導入してリフォールディングを検討した。そして、この溶液を酵素源としてシアル酸転移活性を評価したところ、十分な酵素活性を得ることに成功した。これにより、複雑な構造の酵素においても半化学合成で得られることが確認できた。以上の結果、本プロジェクトでは、これまで合成が困難と思われていた大型糖タンパク質も半化学合成でできることが証明できた。標的糖タンパク質を半合成することとし、全長のポリペプチド鎖のうち糖鎖がない長鎖ペプチド領域は、大腸菌発現により調製し、その他糖鎖が結合したペプチド領域は、Boc-ペプチド固相合成法により、ペプチドチオエステルならびにペプチドヒドラジド体として調製した。糖鎖は、鶏卵からアスパラギン結合型2分枝アシアロ型糖鎖ならびハイマンノース型糖鎖を調製し利用した。その結果、IgG1-Fc部位に相当するドメインならびにアミノ酸318残基からなるシアル酸転移酵素(STase)の半化学合成に成功した。フォールディングしたSTaseは十分な酵素活性を示した。レクチン、抗体のIgFc、シアル酸転移酵素の半化学合成に必要な全てのペプチド、糖ペプチドセグメントの合成が完了した。27年度はその連結を検討することができる。これまでに調製したペプチド、糖ペプチドを量産しつつ、それらを連結し、抗体のFc部位、シアル酸転移酵素、人工レクチンの合成を引き続き進める。膜タンパク質合成については、新規な合成法も開発しつつ、引き続き検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。生体関連化学26年度で得られた全てのペプチドセグメント、糖ペプチドセグメントを更に量産化しながらそれらを連結し、標的タンパク質のフォールディングを検討していく。また、膜タンパク質合成としては、水に難溶なペプチドを効率よく溶解させてペプチド類を連結する手法を検討していく。
クライオ電子顕微鏡法とNMR分光法による筋収縮制御機構の研究

骨格筋と心筋では,細胎内カルシウム濃度が1・Mを越えるとアクチンとミオシンとの相互作用が活性化され,二種類のフィラメントは滑りあって筋収縮が生じる。カルシウムの標的はアクチンと結合するトロポニンであり,カルシウムによるトロポュンの構造変化は収縮制御のトリガーとなる。トロポニンは3つのコンポーネントからなっている。TnTはトロポミオシンと結合し,TnCはカルシウムを結合し,TnIはアクチンと結合して収縮を阻害する。カルシウムを結合したTnCはTnIと強く結合し,Tnlの阻害活性を喪失させる。TnCとCa^<2+>の結合は結晶解析やNMR分光法で原子レペルで研究されてきたが,筋弛緩の分子機構を明らかにする上で重要なトロポュンとアクチンの結合の詳細は不明であった。アクチン・トロポミオシン・トロポニンの分子比は7:1:1であり,1分子のトロポニンが7分子のアクチンを制御しなければならない。トロポミオシンは長さが約400Åの棒状分子であり,7分子のアクチンと結合しているので,トロポェン今トロポミオシンヘ伝搬すると,長さ約400Åの範囲に広がり,7分子のアクチンが制御されると想定されてきたが,その詳細は不明であった。本研究では,クライオ電子顕微鏡法で得られた細いフィラメントの立体構造から明らかにされたトロポュンのアクチン結合ドメインの原子構造を,トロポニン三者複合体のNMR分光により決定し,これを電子顕微鏡マップに当て嵌め,アクチンとトロポニンが11個の塩橋を介して結合することを明らかにした。これに関与するアミノ酸の内,6個でその変異が家族性心筋症を引き起こすことが知られており,本研究はその病因を原子モデルのレベルで明らかにした。また,アクチンに結合したトロポニンはトロポミオシンを押すことによりトロポミオシンを移動させ,アクチン7分子へと制御を拡大していることを提唱した。生体運動は分子モーターが分子レールの上を滑ることによると考えられている。その際ATP分解が伴い、細胞内カルシウム・イオン濃度が制御に関わっている。分子モーターであるミオシンが分子レールであるアクチン・フィラメント上を滑る際には、まずCa^<2+>がトロポニンに結合して細いフィラメントを活性化し、活性化された細いフィラメントにミオシン・ADP・無機リン酸(Pi)複合体が相互作用する。このCaによる「細いフィラメント」の制御の分子機構を明らかにすることを目的とした。低Ca濃度ではトロポニンが分子構造変化しトロポニン・アームがトロポニン分子本体から突出してくることを、私たちはクライオ電子顕微鏡像を単粒子解析して初めて明らかにしたが、このトロポニン・アームの原子構造を安定同位体標識したトロポニン3者複合体(TnT2,TnC,TnI)のNMR分光法で明らかにすることを第一の目標とした。この目標はNMR分光法によって、2次構造を決定、NOEスペクトルにより3次構造決定を行い、トロポニン・アームがトロポニンに組み込ませている状態のままで原子構造の決定に成功した。トロポニン・アームは低Ca濃度アクチンに結合して収縮阻害をもたらす重要な領域であるが,高Ca濃度でのTnT2・TnC・TnI複合体の結晶解析の結果では、電子密度が観察できておらず,領域は結晶のなかでは揺れ動き、構造決定が困難だった。

今回のNMR分光法による原子構造決定により,トロポニン・アームはこの阻害領域を含めてX線結晶解析では可視化できない部分は、逆にNMRスペクトルが得られるとの予測が裏付けられた。また高Ca濃度ではトロポニン・アームがトロポニン頭部の本体とより密接に結合することも明らかとなった。生体運動は分子モーターが分子レールの上を滑ることによると考えられている。その際ATP分解が伴い、細胞内カルシウム・イオン濃度が制御に関わっている。分子モーターであるミオシンが分子レールであるアクチン・フィラメント上を滑る際には、まずCa^<2+>がトロポニンに結合して細いフィラメントを活性化し、活性化された細いフィラメントにミオシン・ADP・無機リン酸(Pi)複合体が相互作用する。このCaによる「細いフィラメント」の活性化の分子機構を明らかにしたい。とくに、低Ca濃度ではトロポニンが分子構造変化しトロポニン・アームがトロポニン分子本体から突出してくることを、私たちはクライオ電子顕微鏡像を単粒子解析して初めて明らかにしたので、このトロポニン・アームをアミノ酸レベルでその構造を明らかにし、分子スイッチのメカニズムを解明したい。この目的達成のため、「細いフィラメント」の三次元構造の高分解能化を図る。トロポニン・アームの原子構造をNMR分光法によって決定し、これを電子顕微鏡からの三次元像にドッキングした。これによって、アクチンとトロポニン・アームの結合様式をアミノ酸残基のレベルで明らかにすることに成功した。これに基づいてトロポニンのコア・ドメイン全体を電子顕微鏡からの三次元像にユニークにドッキングすることにも成功したので、弛緩状態の細いフィラメントの原子モデルを構築出来た。しかし、トロポニンの一部はまだ構造が決定できていないので、残りの部分の構造解析を行っている。骨格筋と心筋では,細胞内カルシウム濃度が1μMを越えるとアクチンとミオシンとの相互作用が活性化され,二種類のフィラメントは滑りあって筋収縮が生じる。カルシウムの標的はアクチンと結合するトロポニンであり,カルシウムによるトロポニンの構造変化は収縮制御のトリガーとなる。トロポニンは3つのコンポーネントからなっている。TnTはトロポミオシンと結合し,TnCはカルシウムを結合し,TnIはアクチンと結合して収縮を阻害する。カルシウムを結合したTnCはTnIと強く結合し,TnIの阻害活性を喪失させる。TnCとCa^<2+>の結合は結晶解析やNMR分光法で原子レベルで研究されてきたが,筋弛緩の分子機構を明らかにする上で重要なトロポニンとアクチンの結合の詳細は不明であった。アクチン・トロポミオシン・トロポニンの分子比は7:1:1であり,1分子のトロポニンが7分子のアクチンを制御しなければならない。トロポミオシンは長さが約400Åの棒状分子であり,7分子のアクチンと結合しているので,トロポニン→トロポミオシンへ伝搬すると,長さ約400Åの範囲に広がり,7分子のアクチンが制御されると想定されてきたが,その詳細は不明であった。本研究では,クライオ電子顕微鏡法で得られた細いフィラメントの立体構造から明らかにされたトロポニンのアクチン結合ドメインの原子構造を,トロポニン三者複合体のNMR分光により決定し,これを電子顕微鏡マップに当て嵌め,アクチンとトロポニンが11個の塩橋を介して結合することを明らかにした。これに関与するアミノ酸の内,6個でその変異が家族性心筋症を引き起こすことが知られており,本研究はその病因を原子モデルのレベルで明らかにした。
変性腰椎に対する人工髄核注入療法の開発

中高年者の変性腰椎に対するre-stabilization(再安定化)が最終目的である.経皮的人工髄核注入療法の開発にあたり,当面は変性腰椎の物性の計測が本研究の目的であり,動作中の生体における椎間板内圧測定の解析を予定した.今年度は、高齢者新鮮屍体標本から採取した変性腰椎全体の手術前後の剛性変化について,圧縮剛性は手術前の正常腰椎と比べ,部分椎弓切除後最大71%に低下し,後屈については57%まで低下,さらに椎間孔解放術を追加すると,それぞれ68%,47%となり,手術操作による安定性の喪失の大きさを明らかにした.一方,骨粗鬆症が存在する高齢者においては,椎間板内圧が高い状態では,かえって椎体骨折の頻度が高まることを臨床的に示し,変性腰椎の再安定化を目的とする髄核注入療法では,椎間板内圧の至適な値についての配慮が必要であることが判明した.さらに,生体における椎間板内圧測定に当たり,変性した椎間板での内圧測定について過去に一定した結果が報告されていないこと,および測定方法の熟練が必要なため,新たな新鮮屍体標本を採取し,予備実験を行うこととした.科学研究費補助金により購入した圧トランスデューサーを椎間板の中に挿入し,Instron圧縮試験器により荷重を負荷,新鮮屍体標本の圧縮負荷時における椎間板内圧の変化とその椎間板内分布の計測を開始し、現在データの解析中である.今後、そのデータと方法を元に,10名前後の変性腰椎を有する患者ボランティアの手術前後の生体における椎間板内圧計測を行い,椎間板内圧とX線画像上の腰椎安定性に関する検討を進め、安定性確保に必要な剛性および椎間板内圧値の設定を予定している.中高年者の変性腰椎に対するre-stabilization(再安定化)が最終目的である.経皮的人工髄核注入療法の開発にあたり,当面は変性腰椎の物性の計測が本研究の目的であり,動作中の生体における椎間板内圧測定の解析を予定した.今年度は、高齢者新鮮屍体標本から採取した変性腰椎全体の手術前後の剛性変化について,圧縮剛性は手術前の正常腰椎と比べ,部分椎弓切除後最大71%に低下し,後屈については57%まで低下,さらに椎間孔解放術を追加すると,それぞれ68%,47%となり,手術操作による安定性の喪失の大きさを明らかにした.一方,骨粗鬆症が存在する高齢者においては,椎間板内圧が高い状態では,かえって椎体骨折の頻度が高まることを臨床的に示し,変性腰椎の再安定化を目的とする髄核注入療法では,椎間板内圧の至適な値についての配慮が必要であることが判明した.さらに,生体における椎間板内圧測定に当たり,変性した椎間板での内圧測定について過去に一定した結果が報告されていないこと,および測定方法の熟練が必要なため,新たな新鮮屍体標本を採取し,予備実験を行うこととした.科学研究費補助金により購入した圧トランスデューサーを椎間板の中に挿入し,Instron圧縮試験器により荷重を負荷,新鮮屍体標本の圧縮負荷時における椎間板内圧の変化とその椎間板内分布の計測を開始し、現在データの解析中である.今後、そのデータと方法を元に,10名前後の変性腰椎を有する患者ボランティアの手術前後の生体における椎間板内圧計測を行い,椎間板内圧とX線画像上の腰椎安定性に関する検討を進め、安定性確保に必要な剛性および椎間板内圧値の設定を予定している.
イネのセシウム吸収変異体の解析と原因遺伝子同定

炭素イオンビーム照射由来のイネの変異集団から、水耕栽培によりセシウム吸収能力の異なる変異体を選抜した。選抜条件の最適化、後代でのガンマカメラによる放射性セシウム動態の撮像、ポット栽培した植物体の藁及び籾に含まれる非放射性セシウム量の評価を行った。No.312系統は野生型に比べてセシウム吸収量が低い可能性が示唆されたが、明確なデータを得るには至らなかった。本課題は、植物のセシウム吸収や動態への理解を深めるとともにセシウム低吸収性の遺伝資源を作出することを目指し、イオンビーム照射により選抜したイネのセシウム吸収変異体の解析ならびに原因遺伝子の同定を進めることを目的とする。炭素イオンビーム照射によって作成したM2系統(計462系統、約2,700個体)について、水耕栽培によって安定セシウムの吸収能力を評価し、10系統から低吸収候補個体、7系統から高吸収候補個体を一次選抜した。これらの個体から得たM3種子を育成し、一次選抜と同様に水耕栽培によって吸収能力を評価したが、これまでのところ、変異形質が固定されたと思われる系統を確認することができていない。一次選抜では、安定セシウムを含む水耕液で7日間育成した後の最新展開葉に含まれる新鮮重量あたりのセシウム量を評価したが、葉位別に測定した場合、最新展開葉の葉位が高いほど濃度が高い傾向があり、すなわち、第2葉より第3葉、第3葉より第4葉の方が、一定期間セシウムを吸収した際の濃度が高い傾向があり、適切に吸収能力を評価するためには同じ葉位の葉を採取する必要があると考えられた。この他に測定誤差を生む要因として、セシウム濃度の測定に使用している原子吸光分析装置のキュベットの劣化が考えられ、一定のサンプル数を測定する毎に標準試料を測定して補正する方法によって測定の精度を上げられることを確認した。また、来年度以降に予定していたガンマカメラを用いたイメージングに関する予備試験を行い、イメージング中の水耕液や温度・湿度の維持について検討するとともに、No.312系統では野生型に比べて根から基部への移行速度が2/3程度で遅いことが示唆された。昨年度までに462系統(約2,700個体)から選抜した低吸収及び高吸収候補個体の後代では、変異形質が固定されたと思われる系統は確認できなかったことから、新たに作成した820系統(約4,800個体)のM2種子を水耕栽培し、15系統から低吸収候補個体を、27系統から高吸収候補個体をそれぞれ選抜した。選抜にあたって採取する葉位によってセシウム濃度が異なることが昨年度の試験で示唆されたため、播種後の育成期間及び葉位と葉中セシウム濃度との関係を更に確認するために、播種後17日、21日または38日間育成(いずれも最後の3日間に50ppbのセシウムを添加した水耕液を使用)した野生型植物体を測定した。いずれの育成期間においても葉位によって葉の重量とセシウム濃度の関係は異なり、最新葉へ優先的に蓄積される傾向が認められた。第2葉は発達期間が第3葉以降に比べて短いため、濃度測定の個体間差が出やすかった。できるだけ早期にセシウム吸収能力の異なる個体を選抜するためには、計21日間育成して第3葉を採取する方法が望ましいと考えられ、また、採取時に第4葉が出現していない個体については相対的に濃度が上がることに注意する必要があることがわかった。昨年度の試験から、No.312系統はセシウムの移行速度が遅いことが示唆された。一般に、低カリウム濃度条件ではセシウムの吸収が促進されるため、低吸収の特性をより顕著に確認できると考えられる。通常に比べて1/2及び1/4のカリウム濃度条件でNo.312系統を水耕栽培し、部位毎のセシウム濃度を測定した。基部及び第2葉では、No.312系統と野生型の差は明確では無かったが、第3葉及び第4葉については、特に1/4濃度条件で低い傾向が認められた。一次選抜した変異候補個体の次世代で変異形質が明確に確認されなかったため、当初予定していた原因遺伝子同定に関する試験が進められていない。昨年度、新たに作成した炭素イオン照射由来の計820のM2系統(約4,800個体)から、水耕栽培によりセシウム吸収能力が異なる変異候補個体を一次選抜した。これらの個体の自殖により得たM3世代の種子を育成し、今年度までに最適化した水耕栽培方法で評価した。ストライプまたは黄緑色の葉色を示す個体がM2世代の4系統で確認されたが、これらの個体に由来するM3個体は全て同様の葉色を示し、セシウム吸収量も少ないことから形質が遺伝的に固定していることが確認された。また、昨年度までの試験でセシウム吸収能力が低いと考えられるNo.312-4の後代及びNo.312-8の後代をさらに評価するため、ワグネルポットで栽培した個体のわら及びもみに含まれる非放射性セシウムの含量を調査した。各系統6個体をビニルハウス内で栽培し、地上部を収穫後、乾燥させた植物体を粉砕した。粉砕した各個体のわら100mg及びもみ50mgを濃硝酸で分解した後、それぞれ1 ml及び0.5 mlの0.1N硝酸に再溶解した溶液を原子吸光分析装置で測定した。

コシヒカリに比べてNo.312系統は同等あるいはやや低い濃度を示したが、統計的に有意な差とは言えなかった。以上の結果から、当初の一次選抜方法には測定誤差を生む要因が多く含まれていたが、最適化することにより、セシウム吸収能力の異なる個体を幼苗の段階で選抜できることが示された。また、No.312系統はコシヒカリと同等の生育を示し、セシウム吸収量が低い可能性があるが、明確なデータを得るには至らなかった。炭素イオンビーム照射由来のイネの変異集団から、水耕栽培によりセシウム吸収能力の異なる変異体を選抜した。選抜条件の最適化、後代でのガンマカメラによる放射性セシウム動態の撮像、ポット栽培した植物体の藁及び籾に含まれる非放射性セシウム量の評価を行った。No.312系統は野生型に比べてセシウム吸収量が低い可能性が示唆されたが、明確なデータを得るには至らなかった。一次選抜した変異候補個体の次世代で変異形質が明確に確認されなかったため、当初予定していた原因遺伝子同定に関する試験が進められていない。新たに選抜した低吸収及び高吸収候補個体を自殖して得た後代個体のセシウム吸収能力を評価する。変異形質の固定が確認された系統について、イメージング試験及び次世代シークエンサーを利用して原因遺伝子の同定を進める。放射線遺伝育種学植物材料の栽培及び測定条件を最適化して、一次選抜した変異体候補系統のセシウム吸収能力を再評価する。また、H26年度に新たに炭素イオンビーム照射によって数百系統以上のM2種子を作成しており、これらを使った変異体の選抜を進める。変異形質の固定が確認され次第、イメージング試験を行う。原因遺伝子を迅速に同定するため、次世代シークエンサーによる塩基配列解析を利用する。塩基配列解析作業に使用する予定であったが、業者側から平成26年度内の納入が難しいとの回答があったため次年度使用額が生じた。平成27年度初頭に塩基配列解析作業を実施するために使用する。
博覧会の時代と泉鏡花

泉鏡花のバックグラウンドとして彫金師の父泉清次がいかに関与し、影響を与えているかを解明した。まず、清次がウイーン万博に和泉政久の名前で「花器」を出品している可能性の高さと、ニュルンベルク金工博覧会に「香炉」などを出品していたことをつきとめた。ウイーン万博の「花器」は、謡曲で名高い「海士ノ玉採リ」を象嵌したものである。清次が輸出工芸時代に制作したものは、たしかな技術とジャポニスムが直結したものである。同時に、鏡花と能の結びつきは母方のみならず、父からの摂取もある。鏡花作品に父を源流とした職人や工芸品が多く登場しており、「模様」「デザイン」の面からの父の影響は大きい。まさに博覧会時代の所産である。泉鏡花の父、泉清次が、彫金師であったことに注目し、彼が残した数少ない作品と、博覧会への出品状況を精査することで、鏡花の想像力への関わりを解明することが課題であった。まずは、明治18年にニュルンベルクで開催された金工万博博覧会に、清次が何を出品したのかを特定することと、その金工博覧会がいかなるものであったかを明確にする必要があった。この博覧会についての資料が不足しているなかで、美術史研究家のシビル・ギルモント氏が2002年から2003年にかけて発表した、3本の論文が見つかり、その翻訳を専門家に依頼したことでこの博覧会のほぼ全容が把握できた。あわせてバイエルン州立図書館および、ゲルマニッシュナショナルミュウジアム付属図書館とのやりとりによって、当時ミュンヘンで出版された、「日本の展示に関する特別目録」を入手した。それによって、泉清次は、「香炉、四分一、を素材として浮き彫りを施した彫金作品」を出品してることが判明した。当時事務官だった山本五郎の「金工万国博覧会報告」にも清次が「金属器一点」を出したことは申請時点で確認していたが、作品が香炉であることが特定できたことはかなりの進歩である。なお、この「特別目録」には、金沢銅器会社、村沢国則、水野源六らの出品作品も詳しく記述されており、彼らは山本五郎の報告や一般的な目録には記述されていない製品を作っていることがわかり、この記載のずれについては、仔細に検討すべき問題として残る。これに関連してミュンヘン、ニュルンベルクに行き、資料を入手してきた。さらに、この博覧会への出品者や会社は、明治6年のウイーン万博に関与しており、とくに清次は、「和泉政久」として「海士ノ玉取之図」を象嵌した鉢を出品していることを、ウイーン万博の出品目録とつきあわせて確認した。文献上での発見ではあるが、泉清次が政光以外の工名をもつことは注目したいし、今後も追究したい。泉清次の博覧会に関する仕事の背景をさぐることと、鏡花作品との関係は「物語る紋様」という小論文にまとめ、「アナホリッシュ国文学」(2014年5月、泉鏡花特集)に発表した。その後、「図案」(模様)とは何か、また、それがいかなる問題を投げかけるかという根本的な問いに立ち返り、その点に絞って、調査研究をすすめてきた。昨年は、泉清次とウイーン万博の関係を手がかりとなる図版をもとに「金沢銅器製造元記」の記述と対照させ、清次が「海人ノ玉採リ図」が象嵌された石菖鉢を作ったことが確定できた。また、よく引用されてきた「米沢文書」には、清次の師匠といわれる水野源六、山尾次六についての記述があるが、これは、米沢清左衛左門の最晩年の記憶によるもので、この文書に絶大の信頼をおくには疑問が生じる箇所が多々ある。この文書に書かれたとおり清次が7代水野源六、のち山尾次六に師事したという記述それ自体を再考すべきであるということになる。以上のことは、2度にわたる金沢市立図書館での調査による。なお、昨年はウイーン万博140年記念の展示がウイーンミュウジアムであり、現地にての見学を行い、図録なども役立てている。2013年にニュルンベルクのゲルマンナショナルミュウジアム付属図書館で調査し資料を収集したが、それらドイツ語の資料の翻訳はほぼ完成し、その資料を丹念に読みこむ段階に入っている。その結果、とくにこの博覧会で注目された「竜神」像は、謡曲「竹生島」の「竜神」をふまえており、謡曲の「絵画的応用」という観点が浮上した。これはウイーン万博における「海人」の紋様の問題と直結しており、考察をすすめている。「博覧会の時代と泉鏡花」という課題のもとに、彫金師であった父泉清次がいかに鏡花に影響を与え、鏡花作品にひきつがれたかを解明した。まずは、清次が明治6年のウイーン万博に「海女の玉取りの段」を象嵌した「花器」を出品した可能性の高いこと、明治18年のニュルンベルク金工万国博覧会に「香炉」や「赤銅の鉢」を出品したことをニュルンベルクのゲルマンナショナルミュウジアム附属図書館所蔵のカタログによって確認した。輸出工芸時代の特色をはっきり示す柴山象嵌の盆や、「鶴亀図大盃」など外国からもどってきた作品によって、鏡花の初期作品「聾の一心」(明治28年)と「鶴亀図大盃」の内容的な連関や、下図の構想が遺品のみならず「増補頭書訓蒙図彙」に酷似していることなどがわかった。

ウイーン万博に出品されたと思われる「花器」は、鏡花の「歌行燈」(明治43年)に直結するもので、鏡花が意識していたと断定はできないが、この線からの「歌行燈」の構想を押し量る方向性が切り開かれた。またニュルンベルク金工博について鏡花は特別に書いたものはないが、最初で最後の訳業であるハウプトマンの「沈鐘」(戸張竹風との共訳、明治41年春陽堂)における主人公ハインリヒの室内装飾には、ニュルンベルク出身の親方らの「金彫の名作」が飾られているとあり、管見によれば、もっとも正確な翻訳である。「沈鐘」はハインリヒという西洋文学に描かれた職人が主人公であり、「鐘」のテーマは「草迷宮」や大正期の戯曲にも浮上することを考慮すれば、鏡花の本領というべきロマンチシズムは、ハウプトマンーニュルンベルクを結ぶ線の延長上に考えうる。鏡花の初期から晩年までつづく職人小説の背景に父親の営みを介在させることで、比較文学、比較文化の方向性がみえてきた。鏡花の評伝、博覧会史、鏡花文学の新たな地平が融合してくるところまでを研究した。泉鏡花のバックグラウンドとして彫金師の父泉清次がいかに関与し、影響を与えているかを解明した。まず、清次がウイーン万博に和泉政久の名前で「花器」を出品している可能性の高さと、ニュルンベルク金工博覧会に「香炉」などを出品していたことをつきとめた。ウイーン万博の「花器」は、謡曲で名高い「海士ノ玉採リ」を象嵌したものである。清次が輸出工芸時代に制作したものは、たしかな技術とジャポニスムが直結したものである。同時に、鏡花と能の結びつきは母方のみならず、父からの摂取もある。鏡花作品に父を源流とした職人や工芸品が多く登場しており、「模様」「デザイン」の面からの父の影響は大きい。まさに博覧会時代の所産である。ニュルンベルク金工博において、泉清次の出展品や金沢の金工家の出展品は文献上は特定できた。ただし、1885年当時のニュルンベルク工業美術館が現存していないため、現物の特定は困難である。この点はさらに探究することにして、金沢の「泉鏡花記念館」の協力のもとに、清次の作品をさがすことにし、昨年1月1日発行の「北國新聞」を通じて市民に呼びかけた。それと連動して、清次と鏡花の関係を「紋様」への志向というところにみる、という一文を同新聞に寄稿した。また、ウイーン万博やニュルンベルク金工博を「謡曲」の意匠という観点からみることの意義を見出せたことは、予想外の収穫である。つまり、鏡花の「能」への深い理解は母親の側からの影響はよく論じられるが、父親=職人の側からの影響も濃厚であることは、鏡花作品を読むうえでも重要であり、作品読解の方向がさらに開かれたことを特に強調したい。日本文学きたる6月14日、日本比較文学会の大会において、「明治初期の金工作品への謡曲の絵画的応用ーウイーン万博とニュルンベク金工万国博覧会」と題して、口頭発表を行う予定であり、これまで蓄積してきた金工と紋様の問題を花器の象嵌の意匠や「竜神」像の具体的な分析を通じて深める。枠組みとしてはジャポニスム研究となり、どちらかといえば、陶磁器や七宝に偏った分析から金工へと目を移すという点で意義あるものと考える。また、7月には泉鏡花研究会にて、泉清次について本研究課題で明らかになったこと、それが、鏡花研究にいかにかかわるかについて、発表する。そのうえで、これらを論文としてまとめる予定である。その際フィラデルフィア万博のコレクションを多く所蔵するウヲルターズ・アートギャラリー(ボリチモア)のコレクションも大いに必要となるので渡米計画をたてている。
培養rat中皮細胞のinducible NOSと各種cytokinesの発現

最初、前段階としてRat腹くう内マクロファージを採取し、lipopolysaccharide (LPS,10mcg/ml)刺激にて、培養マクロファージ上清からのnitric oxide (NO)の代謝産物であるNO_2^-/NO_3^-(NOX)が測定可能であることを確認した。また、そのマクロファージからRNAを取り出し、reversed transcribed PCR (RT-PCR)にてinducible NO synthase (iNOS)のmRNAの発現が認められた。また、腹膜透析液内に含まれるブドウ糖に焦点を当てて、高濃度ブドウ糖(1000mg/dl)でマクロファージを刺激したところ、低濃度ブドウ糖刺激よりTGFβのmRNAの発現が多いことも確認した。培養中皮細胞を用いては、LPS刺激にて培養上清にNOXが定量可能であることが認められ、現在そのtime courseを検討している。また、RT-PCRにてiNOSのmRNAの発現、定量化、さらにtime courseについても検討中である。また、高濃度ブドウ糖液にて培養すると100mMまで濃度依存性にTGFβのRT-PCRでの発現が増加し、培養のtime courseとしては、48時間が最高であった。他の組織修復に働くと考えられるPDGFやpoluamine(産生酵素であるODS)の発現については、現在検討中である。今まで、高濃度ブドウ糖は、腹くう内マクロファージや中皮細胞においてもTGFβの産生増加に関与しており、腹膜線維化の一つの原因であることが推測される。この点においても検討実験数を増やし、再確認していきたい。
少年院及び刑務所における矯正教育の構造と過程に関する教育学的研究

本研究では、教育学の観点から、少年院および刑務所における矯正教育の構造と過程に関する経験的分析が実施された。量的質問紙調査と質的フィールドワークに基づき、矯正教育のマクロな構造的特徴と、ミクロな処遇過程の一端を明らかにすることができた。本年度は、「少年院、刑務所等の矯正施設における教育的諸処遇(以下、「矯正教育」とする)」に関して、教育学的観点から、その構造と過程を明らかにするために、次のような研究を行った。まず、質問紙プロジェクトでは、会合を重ねて、質問紙の内容を洗練させて、研究目的を明らかにするために効果的な質問紙を作成した。質問紙を準備する過程でいくつかの課題が浮上したため、調査と分析は、来年度行うことになった。続いて、フィールドプロジェクトでは、榛名女子学園の施設、教育活動の参観を行ったほか、浪速少年院、大阪刑務所、交野女子学園の施設、教育活動の参観を行うことにより、これまで集中的にフィールドワークを行ってきた東北少年院、青葉女子学園、福島刑務所での矯正教育の取り組みを、日本における矯正教育の全体構図のなかに位置づけることを試みた。とりわけ、大阪刑務所では、福島刑務所の研究グループが行ってきた効果的な薬物離脱教育について、集約的な議論とインタビューを行うことができ、今後の研究の方向性が示された。そして、ネットワークプロジェクトでは、少年院、刑務所等のフィールドワークをライフワークをされ、それぞれの少年院、刑務所等の特色、風土に詳しい、緑川徹氏を招聘し、研究会を開催した。この研究会では、日本全国の少年院、刑務所の特徴が詳細に議論され、前項のフィールドワークプロジェクト同様、これまで集中的に研究をしてきた個別の事例を全体構図のなかに位置づける大きな手がかりを得た。これらの研究とアウトプットにより、来年度以降の個別、具体的な研究の土台ができたといえる。本年度は、「少年院、刑務所等の矯正施設における教育的諸処遇(以下、「矯正教育」とする)」に関して、教育学的観点から、その構造と過程を明らかにするために、次のような調査、研究、プロジェクトを行った。まず、質問紙プロジェクトでは、全国の47少年院を対象とした質問紙調査を実施した。この質問紙調査は「矯正教育の実際と職員の意識に関する調査」(法務教官対象)および「生活と意識に関する調査」(在院少年対象)からなっている。これらの調査を通して、在院の少年たちの属性ならびに意識が明らかになった。同時に、例えば、非行の原因について、法務教官が少年の親子関係にあると見なしているのに対して、在院少年は自らの生まれつきの性格にあると考える傾向にあるなど、両者の意識のズレも明らかになり、今後の矯正教育に寄与する貴重な知見が得られた。この調査から得られた知見については、諸学会で発表を行っている。また、フィールドワークプロジェクトでは、岡山少年院のほか、筑紫少女苑、有明高原寮において施設、教育活動の参観を行った。とりわけ、有明高原寮での参観は、矯正教育における地域の果たす役割を認識させられるものであり、今後の研究の指針を与えられた。さらには、ネットワークプロジェクトでは、法務省矯正局の木村敦氏を招いて、研究会を行うことにより、内側から見た矯正教育についての理解を深めることができた。これらの研究とアウトプットにより、本研究の研究目的の実現に向けて、大きく前進するとともに、来年度のさらなる研究進展の展望が開けたといえる。最終年度にあたる本年度は、「少年院、刑務所等の矯正施設における教育的諸処遇(以下、「矯正教育」とする)」に関して、教育学的観点から、その構造と過程を明らかにするために、次のような調査、研究、プロジェクト、アウトプットを行った。まず、質問紙プロジェクトにおける、全国の47少年院を対象とした二つの質問紙調査-「矯正教育の実際と職員の意識に関する調査」(法務教官対象)および「生活と意識に関する調査」(在院少年対象)-の分析、考察を行い、法務教官の指導観を実証的に明らかにするとともに、非行少年の少年院への適応の過程を探究した。さらに、「生活と意識に関する調査」については、当時長期処遇施設の新入期にあった男子少年に対し、中間期と出院準備にフォローアップの質問調査を行い、施設内処遇の過程における男子在院少年の諸特徴と意識についての考察を行った。また、アウトプットプロジェクトとして、この3年間のフィールドワークを中心とした研究成果を本研究のメンバーが論文としてまとめ、これらの論文集を矯正教育についての本格的な研究書として出版する計画を立てて、執筆を行った。このプロジェクトでは、すでにすべての原稿が出版社に入稿されている。さらには、ネットワークプロジェクトでは、矯正教育の実務家と本研究プロジェクトの研究者との特別研究会を行い、お互いに矯正教育の課題と矯正研究の展望についての理解を深めるなど、この3年間の研究の成果を踏まえて、次の研究に向けての新たな体制づくりにいそしんでいる。
家族構成の周期的変化に関する社会学的研究-宗門人別帳をもちいた分析-

本研究は江戸時代後期における農民家族について播州赤穂の二つの村の宗門人別帳をもちいて, (1)家族構成の変化を通時的に分析し,日本における伝統的家族のライフサイクルの型を提示すること, (2)平均余命,結婚年令,出生児数,出生間隔,死亡秩序などのライフサイクルにおける人口学的,基本的出来事を追跡することによって家族周期のモデルを再構成することを目的とするものである.分析にもちいたデータは,二つの村の宗門人別帳であり,一つは楢原村の1799年から1871年の73年間,他の一つは1832年から1870年の39年間のものである.以下に研究成果の一部を要約しておく.家族構成の周期的変化は, 1)父母と子からなる核家族は→2)やがて子の結婚によって父母と子供夫婦の直系家族となるが,弟妹は同居する→3)その後戸主の交代が行われるが,弟妹は兄の世話になる→4)やがて弟妹の独立によって父母と子夫婦の直系家族となる→5)親の死亡によって再び父母と子からなる核家族となる.この1周期の長さはおよそ26年である.なお原村においては2)の段階で継嗣の結婚以前に弟妹が離家しているという現象がみられ,この場合の1周期の長さはおよそ25年となっている.分析のプロセスで得たデータをもとにして家族の周期モデルを作成した.直系家族の周期的変化は, (1)第1年目(継嗣結婚)から3年目(孫出生), (2)4年目(戸主交代)から9年目(弟妹離家), (3)10年目(父死亡)から26年目,第27年目以降次の周期に入るがその場合には全く同じパターンを繰り返すわけである.原村の場合には継嗣の結婚以前に弟妹が離家しているわけであり,継嗣の結婚年令がかなり高くなると考えられ,結婚年令の再検討をしてモデルを作成してみるつもりである.今後は個人の生涯の軌跡,ライフコース分析を試みる.本研究は江戸時代後期における農民家族について播州赤穂の二つの村の宗門人別帳をもちいて, (1)家族構成の変化を通時的に分析し,日本における伝統的家族のライフサイクルの型を提示すること, (2)平均余命,結婚年令,出生児数,出生間隔,死亡秩序などのライフサイクルにおける人口学的,基本的出来事を追跡することによって家族周期のモデルを再構成することを目的とするものである.分析にもちいたデータは,二つの村の宗門人別帳であり,一つは楢原村の1799年から1871年の73年間,他の一つは1832年から1870年の39年間のものである.以下に研究成果の一部を要約しておく.家族構成の周期的変化は, 1)父母と子からなる核家族は→2)やがて子の結婚によって父母と子供夫婦の直系家族となるが,弟妹は同居する→3)その後戸主の交代が行われるが,弟妹は兄の世話になる→4)やがて弟妹の独立によって父母と子夫婦の直系家族となる→5)親の死亡によって再び父母と子からなる核家族となる.この1周期の長さはおよそ26年である.なお原村においては2)の段階で継嗣の結婚以前に弟妹が離家しているという現象がみられ,この場合の1周期の長さはおよそ25年となっている.分析のプロセスで得たデータをもとにして家族の周期モデルを作成した.直系家族の周期的変化は, (1)第1年目(継嗣結婚)から3年目(孫出生), (2)4年目(戸主交代)から9年目(弟妹離家), (3)10年目(父死亡)から26年目,第27年目以降次の周期に入るがその場合には全く同じパターンを繰り返すわけである.原村の場合には継嗣の結婚以前に弟妹が離家しているわけであり,継嗣の結婚年令がかなり高くなると考えられ,結婚年令の再検討をしてモデルを作成してみるつもりである.今後は個人の生涯の軌跡,ライフコース分析を試みる.1.兵庫県赤穂市の「松岡家文書」のなかにある原村の宗門人別帳をもちいて幕末期の約80年間にわたる家族構成の周期的変化をつきとめた。今回の研究で得られた知見を要約すれば次のようになる。(1)約80年間の家族構成の周期的変化は「無配偶子女を含む世帯」→「有配偶子女を含む世帯」→「傍系親族を含む世帯」→「直系尊卑族を含む世帯」を主要回路として変化する。(2)主要回路の周期の長さはおよそ28年である。(3)家族形態の周期的変化を決定する条件は隠居、相続、分家などの慣行を含めた家族制度である。原村の場合には長子相続であり、圧倒的に死に譲りが生き譲りよりも多いことおよび村内での分家を家株によって制限していることなどが明らかとなった。このことは家族構成の周期的変化を明確にしている一因として考えられる。現在家族形態の周期的変化の契機(理由)を詳細に検討していることである。(4)家族周期の長さ(1周期)や、出現する形態とその持続期間を決定するのは初婚年齢、有配偶率、出産率、平均余命などである。これも現在分析中である。

2.今後の研究の展開に関する計画としては、原村における家族形態の周期的変化を決定する要因を解明すること、初婚年齢、有配偶率、出産率、平均余命などのライフサイクルにおける人口学的、基本的出来事(evemts)を追跡することによって家族周期のモデルを再構成すること、さらに分析の単位を宗門人別帳の集合的構成単位に置くのではなく、個人単位に措定し、個人の生涯の軌跡、すなわちライフコース的視点による分析などを試みる予定である。
消化器癌におけるgenetic instabilityの解析と臨床応用

平成8年度は次の2つのサブテーマについて検討を行う予定であったが、以下のような結果が得られた。(1)胃癌症例に関しては、genetic instabilityは88症例中、18例(20.4%)に認められた。臨床病理学的因子とgenetic instabilityの相関を調べると、genetic instabilityは高齢者に有意に多く(P<0.005)、リンパ節転移陰性症例に多い傾向(P=0.07)が認められた。(2)大腸癌では全54症例中13例(24.%)にgenetic instabilityが認められ、臨床病理学的因子とgenetic instabilityの相関では、genetic instabilityはリンパ節転移陰性症例に有意に多く(P<0.05)、中枢側大腸癌に多い傾向(P=0.051)が認められた。以上のように、genetic instabilityはリンパ節転移陰性例に多く、予後良好の指標となり得る可能性が示唆された。2.多発消化器癌・重複消化器癌におけるgenetic instabilityの検出:同時性多発胃癌17症例と食道癌術後に胃癌を発症した4症例を集積した。多発胃癌に関しては14症例、30癌病巣についてgenetic instabilityの検索が進んでおり、現時点では14症例中11症例(78.5%)に、個々の腫瘍別では30腫瘍中16腫瘍(53.3%)にgenetic instabilityを認めている。いずれも単発胃癌のgenetic instability陽性率より高く、genetic instabilityが多発胃癌患者のスクリーニング法となりうる可能性が示唆された。
穿刺吸引細胞診を利用した甲状腺分化癌における癌遺伝子、癌抑制遺伝子の臨床的検討

背景:甲状腺腫瘍のなかには濾胞癌のように術前診断が非常に困難なものや、ある種の乳頭癌のように予後に大きな差がでるものなどがあり、手術適応や手術範囲などの治療方針を決定するうえで、これらの鑑別に有用な情報が術前に得られることは、非常に臨床的意義が高いと考える。穿刺吸引細胞診より得た腫瘍細胞より抽出したDNA,RNAを用いて、遺伝子的検索を行い、術前の治療方針に役立てえるかを検討した。対象:甲状腺腫瘍(甲状腺乳頭癌2例、濾胞腺腫5例、甲状様甲状腺腫8例、橋本病1例)をもつ患者16名より得た22検体を対象とした。方法:甲状腺腫瘍を持つ患者に対し、従来の経皮的穿刺吸引細胞診(22G針使用)の際、診断用にスライドグラスに塗沫後、針内やシリンジ内に残った細胞を0.5mlの生食で回収、EDTAいりチューブにて-20度で保存した。対象のため、手術摘出標本に直接穿刺し同様の採取をおこなっ。結果:回収した22検体すべてよりDNAは抽出しえた。また、各々のprimmerにおいてPCRの増幅も施行可能であった。検索したK-ras,p16,p53については16症例、22検体いずれにも点変異をみとめなかった。RNA抽出は現在試行中である。考察:今回の検討で穿刺吸引細胞診からの細胞で充分に遺伝子的検索を行えることが判明した。今回検索した遺伝子では直接組織型などとの検討は行えなかったが、症例を増やし、また新たな遺伝子にも検討を加えたい。さらにこの手技にてprospective studyも行っていきたい。
糖尿病性慢性合併症の発症とヒトアルドース還元酵素の分子機構に関する研究

糖尿病性慢性合併症の予防と治療は極めて重要な課題であり,本研究でその発症機序におけるポリオール経路の意義,特にヒトアルドース還元酵素の分子機構とその関連におけるミオイノシトール代謝,培養血管内皮細胞における高血糖による遺伝子レベルの変異を中心に検討した。1.ヒトアルドース還元酵素(AR)と近縁酵素とのアミノ酸配列との相同性から推測される基質結合部位,触媒部位の中心的役割を担うアミノ酸を他のアミノ酸に置換した。変異の導入はmutagenic oligonucleotide methodにより行った。作成した変異遺伝子の塩基配列を確認し,バキュロウィルス-昆虫細胞系を用いて変異ARを発現させ精製した後,酵素活性,基質,阻害剤に対する親和性の変化を検討した。その結果,Lys-263が基質や阻害剤との結合に重要な役割を果たすアミノ酸残基であることが示された。2.ヒトARcDNAを導入したトランスジェニックマウスの解析を行ない,腎や肝などの多くの臓器にヒトARmRNAと蛋白の発現を認めた。病理組織学的には6週齢の腎血管に血栓形成,糸球体にcapsular drop様の変化を認めた。従って,糖尿病性合併症の標的臓器はAR活性の亢進によって障害を受けやすいことが示唆された。3.糖尿病性血管障害の発症機序の1つして,高血糖あるいはその代謝物質(ソルビトールなど)による機序が考えられる。培養ヒト血管内皮細胞を用いて検討した結果,高グルコース濃度下において血小板由来成長因子(PDGF)産生能はmRNAレベル,蛋白合成レベルともに有意に亢進した。また,イコサペント酸はこのPDGF産生を抑制した。4.以上より,ヒトARの性状と糖尿病性合併症発現におけるその意義の一面を明らかにし,更に高血糖による遺伝子レベルでの変異の知見を得た。1.バキュロウィルスー昆虫細胞系を用いて発現させた組換えヒトアルドース還元酵素(hAR)の蛋白修飾に関する研究:態尿病性慢性合併症の研究、および新しいhAR阻害剤(ARI)の開発に役立つように、hARcDNAを導入したバキュロウィルスを用いて純度の高いhARを大量に供給するシステムを確立し、その分子量、等電点、酵素学的特性、既存のARIの効果、アミノ酸配列、蛋白修飾などがヒト組織中から精製されたARと同一であることを確認した。2.hARの活性中心に関する研究:より効果が高く、副作用の少ないARIの開発のためには、hARの活性中心の構造を明らかにする必要がある。そこで部位特異的変異誘発法を用いて、さまざまな変異hARを作成し、Lys-263の残基が基質やARIとの結合に重要な役割をになっていることを明らかにした。3.hARcDNAを導入したトランスジェニックマウス(hAR-Tg)の作成:糖尿病性慢性合併症におけるhARの関与を固体レベルで明らかにするために、ハウスMHCクラスI抗原のプロモーターにhARcDNAをつないだベクターを妊娠マウスの受精卵の雄性前核にマイクロインジェクション法を用いて導入し、hAR-Tgを確立した。4.hAR-Tgの解析:各組織のmRNA、蛋白を用いて、それぞれ、ノザン、ウェスタンブロッティングを行ない、検索した全ての組織においてhARが発現していることを確認した。また、hARに対するモノクローナル抗体を用いて確立したELISAによる測定でも、litter mateでは発現していないhARの発現を確認し、組織中のAR活性もlitter mateと比較して、約5倍、高値であった。平成5年度は主に、ヒトアルドース還元酵素cDNAを導入したトランスジェニックマウス(hAR-Tg)を用いて研究を進めた。

まず、hAR-Tgの筋組織のホモジェネート上清から硫安沈殿、Sephadex G-100,Blue-Sepharose CL-6B,DEAE-Sephacelを経て、ARを精製し、NADPHの消費を吸光度の減少で測定する方法を用いてARの活性を測定した。マウスARとヒトARとを分画することは困難であったが、hAR-Tgの筋組織から精製されたARの蛋白量と活性はlitter mateから得られたARと比較して約56倍であった。次に、hAR-Tgの肝、腎組織のホモジェネート上清を1M過塩素酸で除蛋白し、水酸化カリウムで中和した後、ソルビトール脱水素酵素を用いたアッセイ系によってソルビトール濃度を測定した。通常食投与下においてはhAR-Tgの肝、腎組織中のソルビトール濃度はlitter mateの値と有意差がなかったが、30%グルコース食投与によってhAR-Tgでのみ肝、腎組織中のソルビトール濃度が上昇し、この上昇はARI(Ono-2235)の同時投与によって抑制された。一方、弘前大学医学部病理教室の協力を得て、hAR-Tgの神経伝達速度を腓腹神経を用いて測定したところ20%ガラクトース食を投与するとhAR-Tgの神経伝達速度が有意に低下し、この低下はARIの同時投与によって抑制された。糖尿病性慢性合併症の発症において,高血糖および細胞内ソルビトールの蓄積によりミオイノシトール代謝障害が引き起こされることを明らかにしてきたが,本研究において培養ヒト大動脈平滑筋細胞を用いて検討した。その結果,ミオイノシトールのとり込みは高血糖あるいは高浸透圧により有意に減少した。一方,イコサペント酸の添加によりミオイノシトールのとり込みは対照群のレベルまで回復した。また,ミオイノシトール代謝はNa^+,K^+-ATPaseに依存していることが示された。従って,細胞内ソルビトールの増加は浸透圧の上昇とともに間接的にはミオイノシトール代謝異常を引き起こすことが示され,糖尿病性合併症の発症に関与することが示唆された。糖尿病性網膜症の発症に網膜血管新生因子の関与が考えられる。本研究で網膜血管新生動脈モデルを用い,TGF-β,IGF-1,PDGF-b,bFGF,VEGFの各遺伝子発現を網膜組織で経時的に検討し,各因子の血管新生に関与する時期を明らかにした。即ち,新生仔ラットを高酸素下で飼育すると短期間で網膜新生血管が形成された。経時的に麻酔下で網膜組織を採取し,抽出RNAより各遺伝子発現を検討した。その結果,TGF-β遺伝子の発現減少,IGF-1,PDGF-b,bFGF,VEGF遺伝子の発現は他の遺伝子の変化,組織変化に先行して増加したことから,血管新生の初期に強く関与していることが示唆された。以上の研究から,糖尿病性慢性合併症にみられる組織ソルビトールの蓄積は組織内ミオイノシトールの低下を引き起こすこと,網膜病変に各種成長因子の関与が示され,これらの代謝異常と遺伝子異常の関与が強く示唆された。