hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
液相からの機能性錯体分子の薄膜単結晶の作製法に関する研究

ハロゲン架橋白金混合原子価錯体について、エチレンジアミン配位子を含む臭素架橋錯体の水溶液に、過塩素酸を加えて緑色微結晶を析出させ始めてから、1R,2R-ジアミノシクロヘキサン配位子を含む臭素架橋錯体を基板結晶として溶液中に浸し,ゆっくりエピタキシャル成長させて厚さ約0.05ミクロンの薄膜単結晶を作製した。また、置換基の異なるピリジンチオール配位子を含む同形の発光性多核銅(I)錯体と銀(I)錯体を基板結晶と膜結晶として、溶解度の小さい基板結晶を膜結晶を含む溶液中に浸して減圧濃縮し、赤色発光する基板表面上に黄緑色発光する銀(I)錯体の微小単結晶がエピタキシャル成長したのを確認した。本研究では、気相からの結晶成長が困難と思われる金属錯体結晶(電荷を持ち蒸気圧が低く熱的に不安定)を対象として、溶液からのエピタキシャル結晶成長法を利用して薄膜単結晶の作製を試みた。本研究では、エピタキシャル結晶作製にすでに成功している、ハロゲン架橋一次元白金(II,IV)混合原子価錯体を研究対象とした。有機配位子としてシクロヘキサンジアミンを用い、臭素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体(1)を基板結晶として、塩素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体(2)を膜結晶とした場合、良質なエピタキシャル薄膜結晶の作製にすでに成功している。基板結晶として(2)を用い、薄膜結晶として基板結晶(2)とは異なるエチレンジアミン配位子を用いた塩素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体(3)および臭素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体(4)を用いて、エピタキシャル成長を試みた。この結果、膜結晶として臭素架橋錯体(4)を用いた場合、(4)の青色の薄膜結晶が基板結晶表面上に島状に厚さ約0.5ミクロンほどに成長していることが確認された。偏光顕微鏡による直交ニコル観察から、島状結晶の配向はそろっており、また基板結晶とも配向が一致することが確認できた。基板結晶(2)と膜結晶(4)の結晶構造を比較すると、空間群はI222とIcmaと異なり、格子定数も2倍ほど異なる。これらのことより、結晶構造が異なる(2)と(4)についても、エピタキシュル成長することが強く示唆された。一方、基板結晶(2)と膜結晶(3)のエピタキシャル成長には成功していない。本研究では、気相からの結晶成長が困難な金属錯体(電荷を持ち蒸気圧が低く熱的に不安定)である、ハロゲン架橋一次元白金(II,IV)混合原子価錯体および発光性多核銅(I)、銀(I)錯体を対象として、溶液からのエピタキシャル結晶成長法を利用して、基板結晶上に薄膜単結晶を作製した。同じシクロヘキサンジアミン配位子を用いた臭素架橋白金(II,IV)錯体(1)を基板結晶、塩素架橋白金(II,IV)錯体(2)を膜結晶として水溶液からのエピタキシャル成長により薄膜単結晶の作製にすでに成功している。本研究では、エチレンジアミン配位子を含む臭素架橋白金(II,IV)錯体(3)を薄膜結晶試料として、金色の基板結晶(1)表面へのエピタキシャル成長を試みた。この結果、ゆっくりエピタキシャル成長させることにより緑色の厚さ約0.05ミクロンの薄膜単結晶(3)の作製に成功した。発光性多核金属錯体については、置換基の異なるピリジンチオール配位子を含むが同形の銅(I)錯体と銀(I)錯体をそれぞれ基板結晶と膜結晶として溶液からのエピタキシャル成長を行った。膜結晶のクロロホルム溶液中に溶解度の小さい基板結晶を入れ、ダイヤフラムポンプを使って12°Cで57日かけて減圧濃縮を行い、基板結晶表面への膜結晶のエピタキシャル成長に成功した。紫外光を照射して試料を顕微鏡観察したところ、赤色発光する銅(I)錯体の基板結晶表面に、黄緑色発光する銀(I)錯体の複数の微小単結晶が方向をそろえて付着しているのが分かった。X線回折法によりエピタキシャル成長面の面指数を決定したところ三方晶系の(10-11)面であることが分かった。これより、既知の結晶構造を考慮すると、結晶界面では金属錯体の有機配位子部分が重なる方向で結晶成長していると考えられる。研究室のホームページ化学結晶学、錯体化学有機配位子が異なり結晶構造も異なるハロゲン架橋白金(II,IV)混合原子価錯体を基板結晶と薄膜結晶に用いた場合について、基板結晶表面上に島状の薄膜結晶の作製に成功した。膜結晶と基板結晶の方位が一致することが確認され、基板結晶上にエピタキシャル成長していることが確認できた。

これは26年度に計画していたことであり、予定以上の成果である。しかし、架橋ハロゲンが基板結晶と膜結晶で異なる場合、目的とするエピタキシャル結晶が得られていない。膜結晶作製において、配位子交換反応が起こっていることが考えられ、溶液法によるエピタキシャル成長に関して重要な知見が得られた。一方、基板結晶表面の化学処理とエピタキシャル成長との関係については、十分な検討がまだ行えていない。また、膜結晶の構造の同定等に関して、検討課題がはっきりして来た。以上の通り、本研究は概ね順調に進展していると評価できる。1、25年度に作製に成功したと推測している、シクロヘキサン配位子を含む臭素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体を基板結晶としてエチレンジアミン配位子を含む臭素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体を膜結晶としたエピタキシャル薄膜結晶について、実際に予想される結晶構造を持つ薄膜単結晶が得られているか、表面X線回折実験や顕微赤外分光測定などを行って、結晶構造の決定を試みる。2、25年度の実験ではエピタキシャル結晶の作製に成功していない、膜結晶としてエチレンジアミン配位子を用いた塩素架橋白金(II,IV)混合原子価錯体を用いた場合について、短時間で膜結晶を作製するなどの方法を利用して、再度エピタキシャル結晶の作製を検討する。溶液からのエピタキシャル成長の障害となる、イオン交換等の溶液内平衡反応を抑制する方法を検討する。3、目的とする化合物が基板結晶上にエピタキシャル成長するか判別する方法として、目的化合物の溶液を基板結晶上にコートし、溶媒を真空蒸発させて結晶化させることが考えられる。単結晶薄膜の作成は難しいが、エピタキシャル成長が可能であれば、方向がそろった単結晶粒が基板結晶表面に成長することが予想される。エピタキシャル成長の可否を判定する有効な手段として、その可能性を探る。4、d10金属を含む多核金属錯体は、発光性錯体として知られ、また四核錯体と六核錯体の間で溶液内平衡を持つことが明らかになっている。基板結晶および薄膜結晶の発光色から薄膜結晶がエピタキシャル成長しているか判断できるとともに、膜結晶の構造を推測することができる。また、基板結晶を選択することにより膜結晶の構造を制御できる可能性があり、興味深い研究対象と考えられ、エピタキシャル薄膜結晶の作製を試みる。25年度の本研究に関係した実験等に用いたガラス器具の修理を、26年に入ってからガラス器具修理業者に依頼を出した。しかしながら、4月から消費税が上がる等の経済状況のため、ガラス修理業者に大量の修理依頼がすでにあり、私の修理依頼に対応する時間的な余裕が全くないとの回答を得た。このため、ガラス器具の修理に予定していた科研費の予算が余ってしまった。真空ライン等のガラス器具の修理は本研究をスムーズに遂行するためには是非とも実行する必要があり、この費用として未使用の予算を今年度に使う予定である。
生理活性物質の長期酸化防止を可能とする抗酸化剤高速再生サイクルの設計

本研究は、脂溶性抗酸化剤ビタミンEと水溶性抗酸化剤ビタミンCの共存系にさらに両親媒性抗酸化剤カテキンを複合させた新規な酸化防止法を確立することを目的としている。これまでに、界面積既知の油水二相系においてビタミンEとC共存下で生理活性物質β-カロチンの酸化実験を行い、酸化防止期間が最大となる抗酸化剤添加条件を実験的に明らかにした。また、各抗酸化剤単独存在下におけるカロチンの酸化モデルを構築した。本年度は、これらの酸化モデルを組み合わせ、さらに、ビタミンEとCの間で生じる反応を考慮することによって、両抗酸化剤共存下でのカロチン酸化モデルを構築した。昨年度までの研究により、両抗酸化剤共存下では、ビタミンC初濃度が低い場合にはビタミンE消費が促進されてカロチン酸化の抑制期間が短くなるが、ビタミンC初濃度が高くなると逆にビタミンE消費が抑制されて酸化抑制期間が飛躍的に長くなるという実験結果を得ている。そこで、ビタミンE消費を促進する反応として、水相でのビタミンC自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルが油水界面でビタミンEを消費する反応を、ビタミンE消費を抑制する反応として、ビタミンCがラジカル化したビタミンEに水素を供与し再生する反応を、それぞれ考慮した。また、再生反応は油相に溶解したビタミンCとビタミンEの間で生じるとした。これらの反応および物質移動を考慮した酸化モデルは、前述したビタミンC初濃度に応じてカロチンの酸化が促進されたり抑制されたりという、相反する現象を良好に表現した。また、このモデルを用いてカロチン酸化に及ぼすビタミンE初濃度や油水界面積の影響を検討することにより、酸化抑制期間を増大させるための適切な条件を明らかにした。本研究は、脂溶性抗酸化剤ビタミンEと水溶性抗酸化剤ビタミンCの共存系にさらに両親媒性抗酸化剤カテキンを複合させた生理活性物質の新規な酸化防止法を確立することを目的としている。本年度は、ビタミンEとC共存下での抗酸化機構の解明を目指し、油水界面積既知の単純な二相系において、ビタミンEとC共存下での生理活性物質カロチンの酸化実験を行い、各抗酸化剤を単独添加した条件での実験結果と比較した。ビタミンEのみを添加した場合、系内にビタミンEが存在する限りカロチン酸化の進行が緩やかとなる期間(酸化抑制期間)が観察され、この酸化抑制期間はデカンのみの均相系よりも水相が存在する二相系の方が長くなった。一方、ビタミンCのみを添加した場合、カロチンの酸化挙動は何も添加しない場合とほとんど変わらなかった。また、両抗酸化剤共存下では、高濃度のビタミンCと共にビタミンEを添加した場合、ビタミンEの消費抑制反応が生じてカロチンの酸化抑制期間が長くなるが、低濃度のビタミンCと共にビタミンEを添加した場合、ビタミンEの消費促進反応が生じてカロチンの酸化抑制期間が短くなることが分かった。これより、水相に存在するビタミンCは、カロチンと同じ油相に存在するビタミンEに対して、E自身の酸化を抑制する抗酸化反応、あるいはラジカル化したEを再生する反応を生じ、間接的にカロチン酸化を抑制していると考えられる。その一方で、ビタミンC自身も酸化して反応性の高いラジカルとなり、ビタミンEとの交差反応によりEの消費を促進していると考えられる。そこで、ビタミンEの消費抑制反応が優先的に生じる条件で長期間のカロチン酸化実験を行ったところ、室温・大気圧下においても数ヶ月の酸化防止が可能であった。昨年度は、界面積既知の油水二相系においてビタミンEとC共存下で生理活性物質β-カロチンの酸化実験を行い、酸化防止期間が最大となる抗酸化剤添加条件を明らかにした。本年度は、まず、油水二相系における各抗酸化剤単独添加条件でのカロチンの酸化モデルを構築した。ビタミンE単独添加時では、水相の存在によってビタミンEの消費が抑制され、その結果、カロチン酸化の抑制期間が油相のみの系よりも長くなることから、ビタミンE自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルが油相から水相に移動し除去されることを考えたモデルを構築した。このモデルは、種々の抗酸化剤濃度および油水界面積条件でのカロチンの酸化挙動を表現できた。一方、ビタミンC単独添加時では、ビタミンCの有無にかかわらずカロチンの酸化挙動が変わらないことから、油相でのカロチン酸化と水相でのビタミンC酸化が独立して起こっていると考え、水相への酸素の物質移動を考慮したモデルを構築した。このモデルは、種々の抗酸化剤濃度でのカロチンの酸化、およびビタミンC自身の濃度変化を表現した。次に、カロチンが存在しない油水二相系において、ビタミンEとC間で生じる反応に着目するため、同様の酸化実験を行った。そして、水相のビタミンCの存在によって、油相のビタミンEの消費が抑制されていることから、油水界面においてビタミンE酸化の連鎖成長ラジカルとビタミンCとの抗酸化反応が生じていると考えたモデルを構築した。このモデルは、種々のビタミンC濃度条件下でのビタミンEおよびC濃度の経時変化を良好に表現できた。

これまでに、界面積既知の油水二相系においてビタミンEとC共存下で生理活性物質β-カロチンの酸化実験を行い、酸化防止期間が最大となる抗酸化剤添加条件を実験的に明らかにした。また、各抗酸化剤単独存在下におけるカロチンの酸化モデルを構築した。本年度は、これらの酸化モデルを組み合わせ、さらに、ビタミンEとCの間で生じる反応を考慮することによって、両抗酸化剤共存下でのカロチン酸化モデルを構築した。昨年度までの研究により、両抗酸化剤共存下では、ビタミンC初濃度が低い場合にはビタミンE消費が促進されてカロチン酸化の抑制期間が短くなるが、ビタミンC初濃度が高くなると逆にビタミンE消費が抑制されて酸化抑制期間が飛躍的に長くなるという実験結果を得ている。そこで、ビタミンE消費を促進する反応として、水相でのビタミンC自身の酸化によって生じた極性の高い連鎖成長ラジカルが油水界面でビタミンEを消費する反応を、ビタミンE消費を抑制する反応として、ビタミンCがラジカル化したビタミンEに水素を供与し再生する反応を、それぞれ考慮した。また、再生反応は油相に溶解したビタミンCとビタミンEの間で生じるとした。これらの反応および物質移動を考慮した酸化モデルは、前述したビタミンC初濃度に応じてカロチンの酸化が促進されたり抑制されたりという、相反する現象を良好に表現した。また、このモデルを用いてカロチン酸化に及ぼすビタミンE初濃度や油水界面積の影響を検討することにより、酸化抑制期間を増大させるための適切な条件を明らかにした。
新規二官能性キラル相間移動触媒の創製と環境調和型不斉合成反応への応用

キラル相間移動触媒を用いた不斉合成反応は、医薬品中間体を効率的に合成するための強力な手法として注目を集めているが、本反応を実施するための有効なキラル相間移動触媒の例は未だ限られている。本研究では、二官能性触媒デザインという新たな触媒設計のコンセプトを基に新規触媒を開発し、本触媒を利用することで、医薬品中間体などの有用化合物の効率的合成法を確立した。ビナフチル骨格を有する第四級アンモニウム塩型キラル相間移動触媒に、基質認識部位として水酸基を導入した新規二官能性キラル相間移動触媒を新たに創成し、これを触媒とした環境調和型不斉合成反応の開発を行った。通常、第四級アンモニウム塩を相間移動触媒とした反応では、反応促進のために外部塩基の添加が必須であると考えられてきた。ところが、本研究過程においてある種の反応では塩基を一切添加せずとも非常に効率的に反応が進行することを見いだした。本反応系において、新規二官能性キラル相間移動触媒が非常に有効な触媒として機能することを見いだし、これを用いたニトロオレフィンの不斉アミノ化反応について検討したところ、触媒量わずか0.05mol%で、反応は円滑に進行し高い不斉収率で目的生成物を与えることを見いだした。本反応は、塩基を一切用いず、極少量の有機溶媒存在下、水を主とする溶媒系で実施でき、原子効率の高い環境調和型の効率的有機合成反応を開発することが出来た。さらに、本反応における遷移状態についての考察を行うべく、触媒のX線結晶構造解析を行った。その結果、本研究で開発した二官能性触媒デザインが反応を効率的に行う上で非常に重要であることが示唆され、触媒デザインの新たな可能性を示すことが出来た。また、本研究で開発した二官能性キラル相間移動触媒を用い、生理活性化合物の合成において有用なツールとなりうる不斉フッ素化反応の開発を行った。本触媒を用いることで、高立体選択的なβ-ケトエステルの不斉フッ素化反応を実現した。昨年度開発した二官能性キラル相間移動触媒を利用し、医薬品開発などにおける重要な中間体であるα,α-二置換α-アミノ酸類の効率的合成法の開発を行った。最近見出した塩基を用いない中性条件下で進行する環境調和型反応系を利用し、α-アミノ酸等価体としてのα-ニトロエステルのマレイミドへの不斉共役付加反応について検討した。二官能性キラル相間移動触媒の構造を精密に最適化することで、高立体選択的に生成物を与える反応系を構築し、様々なα,α-二置換α-アミノ酸誘導体を立体選択的に得る方法を確立した。ここで得られた生成物は、生理活性天然物に見られる構造と類似の構造を有しており、生理活性化合物探索における有用な手法が確立できたといえる。また、反応中間体のX線結晶構造解析により、二官能性キラル相間移動触媒の機能を明らかにし、更なる展開の足がかりとなる有用な情報を得る事が出来た。ここで得た知見を活かし、次にα-ニトロエステルとホルムアルデヒドの直截的アルドール反応による、α-アルキルセリン誘導体合成法の開発に着手した。塩基を用いる従来の相間移動反応系では、塩基の作用によるレトロアルドール反応が問題となり、相間移動条件下で高エナンチオ選択的直截的アルドール反応を達成する事は困難であると考えられてきた。そこで、塩基を用いない中性条件下での反応系を適用する事でこれまでの問題を克服し、高エナンチオ選択的アルドール反応が実現できると考え、本反応開発に取り組んだ。ここでも、二官能性キラル相間移動触媒が有効に機能し、様々なα-アルキルセリン誘導体を高エナンチオ選択的に得る方法を確立することが出来た。本反応は、わずか0.1mol%の二官能性キラル相間移動触媒存在下、取り扱いの容易な市販のホルムアルデヒド水溶液を用い反応を行うことが可能であり、環境調和型の理想的な反応系を構築することが出来た。
リソソーム糖蛋白質の基質複合体のX線結晶構造解析

ヒトのリソソーム糖タンパク質のα-ガラクトシダーゼとその基質類似体との複合体のX線結晶構造解析を行い,本酵素そしてこれに高い相同性を示すα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの機能と疾患との関わりを三次元構造に基づいて解明することを研究の目的とした。α-ガラクトシダーゼの遺伝子変異は,糖セラミドからガラクトースを水解脱離させる本酵素の活性の低下をもたらし,ファブリー病を惹起する。ファブリー病は,早期発症で酵素活性が認められず,血管系の内皮細胞,腎臓,心筋や神経節細胞に糖脂質が蓄積して致命的な経過をとる古典型と,晩期発症で低い酵素活性が認められ,心臓肥大などの症状を示す亜型に大別される。α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの遺伝子変異は神崎.シンドラー病の代謝異常症を惹起する。両酵素について,メタノール資化酵母によりタンパク質を大量に発現させ,アスパラギン結合型糖鎖の短糖鎖化とHPLC精製を行い,結晶を析出させた。分子量約9万のホモダイマーであるα-ガラクトシダーゼについては,基質類似体N-(N-benzyloxycarbonyl-6-aminohexyl)-α-D-galactopyranosylamine,BAGをネーティブ結晶に導入した。得られたα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの結晶は微小のため,試料の高純度精製法の改良を進めた。α-ガラクトシダーゼの斜方晶系結晶についてまず分解能2.6Aで構造を得たのち,阻害剤BAGとの複合体の結晶について分解能2.5Aの構造を得た。その結果,本酵素では,糖鎖がAsn139,Asn192とAsn215に結合していること,活性の触媒作用にはAsp231とAsp170のカルボキシル側鎖が関わること,さらに,これら酵素での基質特異性と活性低下の構造基盤を明らかにできた。
線虫感染に伴うマスト細胞の遊走と接着分子に関する研究

接着分子の発現(1)カドヘリン骨髄由来培養マスト細胞(BMMC)、腹腔マスト細胞(PMC)、メチルセルロースコロニー培養小腸上皮(M-IE)、腸管膜リンパ節細胞由来(M-MLN)マスト細胞をRT-PCR、FACS、免疫染色、ウエスタンブロット法で解析した結果すべてのマスト細胞においてE-カドヘリンの発現を確認した。しかしながらN-カドヘリンの発現は腹腔マスト細胞には認められなかった。また、P-カドヘリンの発現はすべてのマスト細胞において認められなかった。(2)CD103(αIEL)/β7インテグリンE-カドヘリンのリガンドの一つであるCD103(αIEL)/β7インテグリンのβ7発現はBMMC,PMC,M-IE,M-MLN由来マスト細胞すべてにおいて発現を確認した。CD103は通常のBMMCにおいて発現が認められないが、TGF-β1,PMA刺激により発現する。我々はこれらの刺激の他にIgE刺激によっても発現することを見出した。E-カドヘリンの機能(3)分化・増殖マスト細胞前駆細胞からマスト細胞に分化・増殖する過程でE-カドヘリンの関与を明らかにするため、小腸上皮単核球をメチルセルロースコロニー培養法で、形成するマスト細胞コロニーの数を解析した。E-カドヘリン抗体・ペプチドを添加した群では形成するコロニー数がコントロール抗体・ペプチド群と比較し有意に減少した。マスト細胞に分化した後の増殖にE-カドヘリンが関与しているかBMMCを用い、抗体・ペプチドをメチルセルロース培養に添加し、形成するマスト細胞コロニー数を解析した。E-カドヘリン抗体・ペプチドを添加した群はコントロール抗体・ペプチド群と比較し有意にコロニー数が減少した。(4)細胞接着E-カドヘリンを発現する上皮細胞株F-9とBMMCの細胞間接着をbinding assayで調べた結果、E-カドヘリンを介した細胞間接着を確認した。TGF-β1刺激によりCD103を発現させたBMMCではインテグリンの活性化(マンガンの添加)によりF-9細胞とBMMCの接着割合が増加した。I)マスト細胞前駆細胞からマスト細胞に分化・増殖する過程でE-カドヘリンの関与を明らかにするため、(1)マウス骨髄細胞、(2)小腸上皮単核球をマスト細胞増殖因子を含むメチルセルロースコロニー培養法で、形成するマスト細胞コロニーの数を調べた.骨髄細胞のコロニーアッセイではマスト細胞の他、マクロファージ、顆粒球等のコロニーを形成する.小腸上皮単核球のコロニーアッセイでは出現するコロニーはすべてマスト細胞から成るコロニーである.(1) E-カドヘリン抗体を添加した群では形成するコロニー数がアイソタイプマッチコントロール抗体群と比較し有意に減少(コロニー抑制率約25%)し、現在出現したコロニーの細胞同定を行っている.(2) E-カドヘリン抗体を添加した群では形成するコロニー数がアイソタイプマッチコントロール抗体群と比較し有意に減少(マスト細胞コロニー抑制率約5080%)した.II)マスト細胞に分化した後の増殖にE・カドヘリンが関与しているか、骨髄由来培養マスト細胞を用い、抗体を(3)液体培養と(4)メチルセルロース培養に添加し、マスト細胞数と形成するマスト細胞コロニー数を解析した.骨髄由来マスト細胞はマウス大腿骨より骨髄細胞を回収し、IL-3,IL-4を含む増殖培地で4週間以上継代培養した純化率95%以上のマスト細胞を用いた.(3)骨髄由来培養マスト細胞にE-カドヘリン抗体を添加し3,5日間液体培養した結果、3日間ではアイソタイプマッチコントロール抗体群と比較し有意に細胞数の抑制が観察されたが、5日間では認められなかった.(4)骨髄由来培養マスト細胞にE-カドヘリン抗体を添加しメチルセルロース培養法で10日間培養した結果、アイソタイプマッチコントロール抗体群と比較し有意にコロニー数が減少(コロニー抑制率約25%)していた.接着分子の発現(1)カドヘリン骨髄由来培養マスト細胞(BMMC)、腹腔マスト細胞(PMC)、メチルセルロースコロニー培養小腸上皮(M-IE)、腸管膜リンパ節細胞由来(M-MLN)マスト細胞をRT-PCR、FACS、免疫染色、ウエスタンブロット法で解析した結果すべてのマスト細胞においてE-カドヘリンの発現を確認した。E-

カドヘリン抗体・ペプチドを添加した群はコントロール抗体・ペプチド群と比較し有意にコロニー数が減少した。(4)細胞接着E-カドヘリンを発現する上皮細胞株F-9とBMMCの細胞間接着をbinding assayで調べた結果、E-カドヘリンを介した細胞間接着を確認した。TGF-β1刺激によりCD103を発現させたBMMCではインテグリンの活性化(マンガンの添加)によりF-9細胞とBMMCの接着割合が増加した。
『竹枝詞』1000年の歴史

竹枝詞は1000年に渡る歴史があるが、時代ごとにその様相を変化させている。例えば唐代では旅情を詠う叙情詩の色彩が強い。その中で劉禹錫の竹枝詞は土地の風物を描くことに重点がおかれており、特異な作品であることが分かった。また南宋から次第に詠う土地の限定が緩やかになり、様々な土地が対象となった。その趨勢を加速させたのが元末の「西湖竹枝」と考えられる。この西湖竹枝の詠いぶりは日本の竹枝詞にも影響を与えたと考えられる。清代になると竹枝詞は更に広がりを見せる。「竹枝」という題名でなくても竹枝詞と見なされている作品が多く現れる。また竹枝詞にルポルタージュ的な役割を付すようになり、地方誌の中に多く見られるようになる。日本の竹枝詞にも記録的な性格を帯びるものがあるが、「西湖竹枝詞」的作品も多く見られ、日本詩話の中でも西湖竹枝の影響が大きいことが分かる。日本の竹枝詞は中国のものと比べるとその流行が江戸時代にまで下るが、その要因等は目下考察中である。
変異p51/p63,calpastatin導入bcr/abl-Tgマウス病態解析

Ph^1陽性慢性骨髄性白血病(Ph+CML)の発症進展にp51/p63(p53ファミリー)変異や新規calpastatin(プロテアーゼインヒビター)類似遺伝子変異が関与していることを分子生物学的手法により細胞レベルで解析・解明することを目的とした。3種類のmajor bcr-abl(b2-a2,b3-a2,そしてμtype)を用いてCML発症のモデルマウスを作成するのに成功し、一部継続中である。μtype Tgマウス,b3-a2 Tgマウスの作成に成功した。μtype Tgマウスは脾臓、骨髄で顆粒球系、巨核球系の腫瘍性増殖が著しく多臓器にも浸潤を認め、末梢で顆粒球、血小板数の増加を認め発症に潜伏期間が長いのが特徴で、μtype Tgマウス特有のフェノタイプを示した。正常脾臓のCD117、CD61、CD11b、TER119細胞集団は単核領域で22.0%,26.9%,63.6%,23.5%でありTgマウスでは62.2%,88.8%,48.9%,46.0%とすべて増加を示し、Tgマウスでは多核領域細胞の増加(1.1%→9.1%)を認め、そのCD117、CD61、CD11b、TER119もその集団内で57.9%,99.2%,99.2%,71.2%と血小板産生細胞や顆粒球産生細胞など髄外造血の亢進が観察された。b2-a2Tgマウスの作成を現在試みており、すでに成功した上記2種類のTgCMLモデルマウスCMLフェノタイプを現在詳細に検討・解析中である。p51/p63遺伝子はCML病期進展に関与し、異常となることを明らかにした。p51/p63導入Tgマウスの作成も現在試みており、Tgマウスのフェノタイプを現在詳細に検討・解析中である。変異calpastatin類似遺伝子cDNAをRT-PCR後クローニングし塩基配列を検討し発現ベクターにサブクローニングしている。Ph^1陽性慢性骨髄性白血病(Ph+CML)の発症進展にp51/p63(p53ファミリー)変異や新規calpastatin(プロテアーゼインヒビター)類似遺伝子変異が関与ていることを分子生物学的手法により細胞レベルで解析・解明することを目的とした。major bcr-abl融合遺伝子が大半のCMLで発現されているが、このCML発症のモデルマウスを作成するのに成功した。p51/p63遺伝子はCML病期進展に関与し、異常となってくることを明らかにした。mRNAのisoformもp51-α,-β,-γが存在し、白血病細胞ではp51αの発現がほとんどであり現在機能解析中である。遺伝子変異解析では病期進展にDNA結合領域に点突然変異が集中していた。変異calpastatin類似遺伝子cDNAをRT-PCR後クローニングし塩基配列を検討し発現ベクターにサブクローニングした。

3種類のmajor bcr-abl(b2-a2, b3-a2,そしてμtype)を用いてCML発症のモデルマウスを作成するのに成功し、一部継続中である。μtype Tgマウス、b3-a2 Tgマウスの作成に成功した。μtype Tgマウスは脾臓、骨髄で顆粒球系、巨核球系の腫瘍性増殖が著しく多臓器にも浸潤を認め、末梢で顆粒球、血小板数の増加を認め発症に潜伏期間が長いのが特徴で、μtype Tgマウス特有のフェノタイプを示した。正常脾臓のCD117、CD61、CD11b、TER119細胞集団は単核領域で22.0%, 26.9%, 63.6%, 23.5%でありTgマウスでは62.2%, 88.8%, 48.9%, 46.0%とすべて増加を示し、Tgマウスでは多核領域細胞の増加(1.1%→9.1%)を認め、そのCD117、CD61、CD11b、TER119もその集団内で57.9%, 99.2%, 99.2%, 71.2%と血小板産生細胞や顆粒球産生細胞など髄外造血の亢進が観察された。b2-a2Tgマウスの作成を現在試みており、すでに成功した上記2種類のTg CMLモデルマウスCMLフェノタイプを現在詳細に検討・解析中である。p51/p63遺伝子はCML病期進展に関与し、異常となることを明らかにした。p51/63導入Tgマウスの作成も現在試みており、Tgマウスのフェノタイプを現在詳細に検討・解析中である。変異calpastatin類似遺伝子cDNAをRT-PCR後クローニングし塩基配列を検討し発現ベクターにサブクローニングしている。
多点探索法に基づく強化学習と複雑なシステム制御への適用

複雑なシステム制御を達成する強化学習手法の確立を目指し,政策勾配法に関する研究を行った.複雑なシステムではその制御則の設計が困難であるため,強化学習により学習主体であるエージェントが自律的に目的の制御則を獲得することが好ましい.政策勾配法は制御則をモデルで表現して,そのパラメータを勾配法により最適化する強化学習手法の総称であり,制御問題への適用が容易であるなどの利点がある.しかし,従来の政策勾配法は局所探索に基づいているため複数の局所解がある場合に実用的な制御則を獲得できない.そこで,本研究では,既存の手法では実用的な制御則の獲得が困難なタスクに対する強化学習手法を確立することを目的としている.局所解を乗り越えるために多点探索手法の開発を行った.多点探索手法では多点であるがための探索効率の低下が問題となる.そこで,(i)政策勾配法そのものの探索効率の向上,(ii)同じサンプルから複数の制御則を同時に改善する政策勾配法の構築を行った.まず,探索効率の向上に関しては,自然勾配を導入した政策勾配法は探索効率が高いが,自然勾配を推定するための計算量が多いため高次元のパラメータを持つ制御則には適用が困難である.そこで,制御則のパラメータの取り方を工夫することで計算量の削減を行った.次に,政策勾配法により同じサンプルから複数の制御則を同時に改善するために重点サンプリングを用いた.重点サンプリングは異なる分布によりサンプリングされたサンプルから分布の評価値の期待値を推定するための統計学的な手法である.集団で解探索を行う政策勾配法の枠組みを構築し,政策勾配法に基づく効率的な多点探索手法を,重点サンプリングを用いる政策勾配法により構築した.構築した手法をベンチマーク問題へ適用し,単点探索では初期値により最適解が学習できないような多峰性の問題において構築した手法の有効性を実験的に示した.複雑なシステム制御を達成する強化学習手法の確立を目指し,政策勾配法に関する研究を行った.複雑なシステムではその制御則の設計が困難であるため,強化学習により学習主体であるエージェントが自律的に目的の制御則を獲得することが好ましい.政策勾配法は制御則をモデルで表現して,そのパラメータを勾配法により最適化する強化学習手法の総称であり,制御問題への適用が容易であるなどの利点がある.しかし,従来の政策勾配法は局所探索に基づいているため複数の局所解がある場合に実用的な制御則を獲得できない.そこで,本研究では,既存の手法では実用的な制御則の獲得が困難なタスクに対する強化学習手法を確立することを目的としている.局所解を乗り越えるために多点探索手法の開発を行った.多点探索手法では多点であるがための探索効率の低下が問題となる.そこで,(i)政策勾配法そのものの探索効率の向上,(ii)同じサンプルから複数の制御則を同時に改善する政策勾配法の構築を行った.まず,探索効率の向上に関しては,自然勾配を導入した政策勾配法は探索効率が高いが,自然勾配を推定するための計算量が多いため高次元のパラメータを持つ制御則には適用が困難である.そこで,制御則のパラメータの取り方を工夫することで計算量の削減を行った.次に,政策勾配法により同じサンプルから複数の制御則を同時に改善するために重点サンプリングを用いた.重点サンプリングは異なる分布によりサンプリングされたサンプルから分布の評価値の期待値を推定するための統計学的な手法である.集団で解探索を行う政策勾配法の枠組みを構築し,政策勾配法に基づく効率的な多点探索手法を,重点サンプリングを用いる政策勾配法により構築した.構築した手法をベンチマーク問題へ適用し,単点探索では初期値により最適解が学習できないような多峰性の問題において構築した手法の有効性を実験的に示した.
「色葉字類抄」を中心とする国語辞書の語彙・系譜の研究

平成30年度は、「色葉字類抄」所収語彙の研究、古辞書データベース構築、共同研究、学会発表を行った。具体的には以下の通りである。【「色葉字類抄」所収語彙の研究】「色葉字類抄」の語彙と「明月記」の語彙の比較検討を行い、学会にて研究発表を行った(「古辞書の意義分類と古記録ー『色葉字類抄』と『明月記』を例としてー」、第118回訓点語学会研究発表会、2018年5月13日)。また学振外国人特別研究員(京都大学所属)の李媛氏と日本の古辞書「篆隷万象名義」「類聚名義抄」「色葉字類抄」における義注と訓注の関係についての共同研究を行い、学会にて研究発表を行った(「平安時代の字書・辞書間における義注・訓注の重なりについて、日本語学会2018年度秋季大会、2018年10月13日)。【古辞書データベース構築】「色葉字類抄」と他の辞書のデータベースを連携する上での課題について検討し、「平安時代漢字字書総合データベースによる研究基盤の確立」(基盤研究(B)、代表者:池田証壽)の連携研究者として、国際シンポジウム「古辞書研究の射程」に参加し、研究発表を行った。(「国語辞書系古辞書データベースの展開ー字類抄における音訓表記の検討を中心としてー」)以上は、交付申請書の「研究の目的」に記した(A)「平安時代の国語辞書『色葉字類抄』の研究1収録語彙に関する研究」および(C)「古辞書のデータベース化とその活用」についての研究を、計画通り遂行したものである。研究は予定通り進んでおり、順調である。平成30年度の口頭発表を元に、論文執筆および投稿を行うとともに、平成31年度は、研究計画に記した【(A)平安時代の国語辞書『色葉字類抄』の研究2伝本に関する研究】【(B)平安時代明治時代における本邦国語辞書収録語彙の変遷の研究】についても調査・研究を行い、学会発表ないし論文執筆を行う予定である。また並行して、「色葉字類抄」データベースの構築を進める予定である。次年度使用額は、データベース構築のための人件費として次年度分に計上することとしたものである。
リボソーム28SRNAのもつGTPaseドメインの機能構造(高次構造を認識するRNA抗体のエピトープ解析)

リボソームRNAは系統的に大変良く保存されており、タンパク質合成において中心的役割を演じていることが示されている。1991年に我々は動物リボソームの活性を抑制する抗RNA抗体(抗28S)をSLE患者の血清より発見した。1992年から3年間にわたる本研究では、抗28S抗体が認識するRNA部位の構造と機能の解析が中心になされ、rRNAのGTP水解反応に関わる実体を明らかにした。また、本抗体のエピトープの解析および膠原病患者における出現頻度も合わせて検討し、以下のような新たな知見が得られた。(1)抗28S抗体はGTPアーゼドメインと呼ばれる機能ドメインに特異的に結合する。その際、G・1959を含む4塩基が抗体との結合に関与し、これらの塩基がエピトープを形成することが示唆された。(3)抗28Sは真核生物リボソームに特異的であるが、大腸菌のGTPアーゼドメイン中のA・1067(ヒトG・1959と等価の位置)をGに置換するだけで抗28S抗体と大腸菌リボソームとの強い結合性が生じ、この位置の塩基Gが抗体の認識に重要であることが示された。(4)ペプチド鎖伸長因子EF・2は抗体の結合部位でもあるG・1959と相互作用することが判明し、抗28Sがその相互作用を直接阻害することが明らかになった。(5)17%のSLE患者に抗28Sタイプの抗体活性が検出されるが、他の膠原病患者からは検出されない。また、本抗体はリボソームタンパク質L12、P1、P2、P0に対する自己抗体の出現と強く相関し、RNAドメインへの自己免疫応答にこのRNA・タンパク質複合体構造が関係することが示唆された。タンパク質生合成におけるリボソームRNA(rRNA)の役割が注目されており、その機能構造の解明が待たれている。通常、rRNAの高次構造はリボソームタンパク質との結合によって調整を受け安定化していると考えられ、各結合タンパク質のRNA結合機構およびそれによって誘発されるRNAの高次構造が重要な問題になっている。我々は、翻訳過程のGTP水解反応に関与すると考えられている28S rRNA中の"GTPaseドメイン"(ラット28S rRNAでは塩基1841-1936部位)に注目し、RNAータンパク質相互作用および高次構造の解析を行なっている。これまでの研究で、このドメインにリボソームタンパク質L12およびPタンパク質複合体が結合すること、また、この部位が抗RNA自己抗体(抗28S)の標的になっており、この抗体の結合によってリボソームの活性が完全に抑待されることを証明してきた。本年度は主にRNAの化学修飾による分析を行ない、以下に示すようにGTPaseドメインの二次構造、および抗28S RNA自己抗体のエピトープ、さらにリボソームタンパク質や伸長因子EF-2との相互作用など、このRNAドメインの構造と機能に関する新しい知見を得た。2.抗28SはGTPaseドメイン中のG-1878を含むループ部分の化学修飾を保護し、本抗体のRNA上のエピトープが明らかになった。3.1.の試薬およびRNA骨格のリン酸基の修飾試薬であるethylnitrosoureaを用いたフットプリント法による解析からリボソームPタンパク質はA-1859周辺のinternal loopに、またL12タンパク質はU-1871バルジ部分を中心としたステムの骨格構造を認識することが判明した。4.EF-2はGTPaseドメイン中でG-1878の一か所を保護し、この部位がEF-2の作用部位であることが示された。

リボソームRNAは系統的に大変良く保存されており、タンパク質合成におけるその直接的役割を探ることは、生命の起源の問題に対するヒントを提供するものとして最近注目をうけている。我々はこれまで動物リボソームの28SrRNAの一つの機能ドメインを認識する自己抗体(抗28S)をSLE患者の血清より発見し、これをプローブとしてこの抗原RNAドメインの構造と機能の解析を行ってきた。これまでの研究で、このドメインがタンパク質合成にカップルしたGTP水解反応に直接関与することを明らかにしてきた。平成5年度は、このドメイン(GTPaseドメイン)の構造とエピトープの解析を主に行い、以下に示すような成果が得られた。1.各種deletion mutantを作製することにより、抗体が認識できる高次構造を保持する最小のRNA断片を検索した。その結果、ヒト28SrRNAの塩基1943-2000部位を含む断片がその最小ユニットであり、それ以上削除すると抗体の結合能は失われた。2.1)で決められた最小RNA断片をT7 RNAポリメラーゼを用いた転写系により大量に合成し、NMRによる高次構造解析をおこなった(東京大学理学部横山研究室との共同研究で、目下部分的なデータが得られている)。3.抗体によるfoot-printingの解析により、GTPaseドメイン中の塩基G-1878を含む4塩基が抗体との結合に関与することが判明した。4.抗28Sは真核生物のRNAに特異的であるが、mutagenesisによる解析によって、3)で同定された塩基のうちG-1878がこの特異性の原因となっていることが判明した。リボソームRNAは系統的に大変良く保存されており、タンパク質合成において中心的役割を演じていることが示されている。平成5年度までの研究で、抗28S抗体は真核生物のGTPaseドメインと特異的に結合し、リボソームとペプチド鎖伸長因子との相互作用、およびそれとカップルしたGTP水解反応を阻害することを示し、このドメインが伸長因子の作用部位であると考えてきた。平成6年度は、このドメイン中のペプチド鎖伸長因子EF-2の作用部位、およびこのドメインを認識する抗28S抗体の結合特異性に関与するRNAエレメントをそれぞれ解析し、以下に示すように自己抗原エピトープと伸長因子の作用部位ば一致することをつきとめた。また、多くの自己免疫病患者の血清から抗28S抗体活性の検出を試み、その出現頻度を明らかにした。1.Footpritingの解析により、ペプチド鎖伸長因子EF-2が作用するとヒト28SrRNAの塩基としてGTPaseドメイン中のG-1959が同定された。2.抗体によるfoot-printingの解析により、GTPaseドメイン中の塩基G-1959を含む4塩基が抗体との結合に関与することが判明した。3.大腸菌のGTPaseドメイン中のA-1067(ヒトG-1959と等価の位置にある)をAに置換するだけで抗28S抗体と大腸菌23SrRNAおよび50Sリボソームサブユニットとの強い結合性が生じ、この位置の塩基Gが抗体の認識に重要であることが示された。4.17%のSLE患者に抗28Sタイプの抗体活性が検出されたが、他の膠原病患者からは検出されず、本抗体の活性がSLE診断のマーカーとして利用できることが明らかになった。
若年運転者の運転態度尺度構成に関する研究

交通事故統計の分析及び文献研究をもとに、若年運転者の特徴的な運転態度を明確にし、大学生448名を調査対象として若年運転者の運転態度尺度の構成を図った。尺度の一般性を高めるために、25歳未満の若年運転者516名を含む一般運転者2,256名を対象に再度調査し、若年運転者はもちろん全運転者に適用可能な運転態度尺度を構成することができた。尺度は7個で、それぞれ、(1)運転における攻撃性尺度、(2)取締りや交通ルールに対する否定的態度尺度、(3)享楽的運転志向尺度、(4)運転における不安と集中欠如尺度、(5)「駐車禁止」の無視尺度、(6)シートベルト着用に対する否定的態度尺度、(7)遵法的態度尺度、と命名した。これら7尺度はまた、〔I〕ルールを無視した運転傾向(遵法的態度のなさ、「駐車禁止」の無視、取締りや交通ルールに対する否定的態度、シートベルト着用に対する否定的態度)、〔II〕危険敢行的な運転傾向(享楽的運転志向、運転における攻撃性)、〔III〕運転における不安(運転における不安と集中欠如)の3因子構造となることが明らかになった。さらに、悪質運転者(745名)、普通運転者(1,459名)、優良運転者(52名)の3群の正準判別分析を行った結果、3群の運転態度の明確な差異を明らかにすることができた。悪質運転者はシートベルトを着用せず、駐車禁止場所に駐車し、攻撃的な運転をし、取締りや交通ルールに対して否定的である傾向が強く、優良運転者は遵法的かつ攻撃的でない運転傾向が強く示された。本研究において、基準関連妥当性かつ信頼性いずれも高い運転態度尺度を構成することができた。交通事故統計の分析及び文献研究を通じて、若年運転者の特徴的な運転態度として、スピード志向性が強い、ルール意識が希薄である、攻撃的な運転態度が強い、事故や違反を軽くみる態度が強い、自己中心的な運転態度が強い、運転技能への過信、運転への集中の欠如が明らかになった。運転態度の尺度構成は、これらの運転態度を中心に行うこととし、これらの運転態度を適切にとらえることのできるであろう質問を111項目精選し、調査対象者の人口学的特性をとらえる質問項目を加え、「自動車の運転についてのアンケート」を作成し、大学生を中心とする若年運転者341名に調査を実施した。因子分析の結果から、攻撃的な運転態度、レクリエーションとしての車、交通取締りに対するマイナス感情、交通ルールの絶対視、運転に対する不安、シートベルトの非好意、標識・標示などへの注意、運転中の集中力の欠如などの因子に質問が分かれてきた。現在調査対象者数を増してさらなる分析を行っている。これらの予備的分析をもとに、尺度構成を目指す運転態度の側面にしぼり込み、各側面を代表する質問項目の数を増やすことで、本研究の目的である若年運転者の運転態度尺度構成の見通しがえられ、現在本調査への準備にとりかかっているところである。尺度1=運転における攻撃性(16項目)、尺度2=取り締まりや交通ルールに対する否定的態度(14項目)、尺度3=享楽的運動志向(14項目)、尺度4=シートベルト着用に対する否定的態度(5項目)、尺度5=「駐車禁止」の無視(5項目)、尺度6=自己顕示・衝動的態度(8項目)、尺度7=取り締まり効果の肯定と交通ルール遵守の態度(7項目)、尺度8=几帳面さ(8項目)、尺度9=運転における不安と集中欠如(6項目)、以上の9尺度について基準関連妥当性の高い尺度構成を行うことができた。

しかし、これらは大学生を中心とする若年運転者のデータをもとに得られたもので、その汎用性については問題性が指摘される。そこで平成7年度の後半は、各年令層の一般運転者(警察の処分者講習受講者、簡素講習受講者の優良運転者、一般企業の運転者等1,500名;尺度の汎用性を高めるために、現在も調査対象者を漸次追加している)について分析を加え、性別、年齢別、運転歴別、運転頻度別、事故の有無別、違反の有無別などの分析を通して、尺度の基準関連妥当性をさらに高めるために、質問項目のさらなる精選、質問項目のカテゴリーウェイト付けの再検討などを重ねてきた。最終的には約2,000名のデータ数をもとに、平成8年度前半において、若年運転者の運転態度の尺度構成を確定する予定である。交通事故統計の分析及び文献研究をもとに、若年運転者の特徴的な運転態度を明確にし、大学生448名を調査対象として若年運転者の運転態度尺度の構成を図った。尺度の一般性を高めるために、25歳未満の若年運転者516名を含む一般運転者2,256名を対象に再度調査し、若年運転者はもちろん全運転者に適用可能な運転態度尺度を構成することができた。尺度は7個で、それぞれ、(1)運転における攻撃性尺度、(2)取締りや交通ルールに対する否定的態度尺度、(3)享楽的運転志向尺度、(4)運転における不安と集中如尺度、(5)「駐車禁止」の無視尺度、(6)シートベルト着用に対する否定的態度尺度、(7)遵法的態度尺度、と命名した。これら7尺度はまた、〔I〕ルールを無視した運転傾向(遵法的態度のなさ、「駐車禁止」の無視、取締りや交通ルールに対する否定的態度、シートベルト着用に対する否定的態度)、〔II〕危険敢行的な運転傾向(享楽的運転志向、運転における攻撃性)、〔III〕運転における不安(運転における不安と集中欠如)の3因子構造となることが明らかになった。さらに、悪質運転者(745名)、普通運転者(1,459名)、優良運転者(52名)の3群の正準判別分析を行った結果、3群の運転態度の明確な差異を明らかにすることができた。悪質運転者はシートベルトを着用せず、駐車禁止場所に駐車し、攻撃的な運転をし、取締りや交通ルールに対して否定的である傾向が強く、優良運転者は遵法的かつ攻撃的でない運転傾向が強く示された。本研究において、基準関連妥当性かつ信頼性いずれも高い運転態度尺度を構成することができた。
ウイルス性脳疾患の克服:パターン認識受容体RAGEの機能に基づく新戦略の構築

ウイルス性脳疾患の発症には中枢神経系(CNS)でのウイルス持続感染と過剰な脳炎反応が深く関わっている。これまでの研究により、CNSでの持続感染の成立には、ウイルス側の複製調節に加え、宿主脳内のさまざまな因子が重要な役割を果たしていることが示されている。研究代表者は、ボルナ病ウイルス(BDV)感染をモデルに、ウイルス持続感染の成立に関わる脳内因子と脳内免疫の活動を総合的に解析してきた。その結果、BDVが感染した脳内では、持続感染の成立に伴い炎症増幅因子であるS100Bの発現低下と糖化最終産物受容体(RAGE)の脱活性化が誘導されることを明らかにした。パターン認識受容体であるRAGEは、自然免疫活動の長期化や炎症反応の増幅にも関与しており、BDVはRAGEの活性化を抑制することで、宿主免疫の攻撃から逃れると同時に、持続感染の成立を図っていると示唆された。本研究は、CNSにおけるS100BとRAGEの機能を詳細に解析し、その制御に基づいてCNSから排除する新戦略を構築することを目的として進められた。解析の結果、BDVの持続感染に伴いラット脳ではS100Bの発現抑制が観察され、S100Bの機能が恒常的に抑制されていることが示唆された。S100Bの発現低下が認められた脳では、自己免疫性脳炎が誘導されないことも明らかとなり、BDVの持続感染はRAGEとS100Bの働きを抑制することで、免疫応答を制御していると考えられた。さらに、BDV持続感染ラットへ可溶化RAGE(sRAGE)の投与を行ったところ、BDV持続感染ラット脳における炎症細胞浸潤が顕著に抑制されることが示された。これらの成果は、脳内でのRAGEあるいはS100Bの制御により、ウイルス感染に伴う過剰な脳炎反応を抑制できる可能性を示している。ウイルス性脳疾患の発症には中枢神経系(CNS)でのウイルスの持続感染が深く関わっていると考えられる。その結果、BDVが感染した脳内では、持続感染の成立に伴い、糖化最終産物受容体(RAGE)の脱活性化が誘導されることを明らかにした。そこで、本研究では、CNSにおけるRAGEの機能を詳細に解析し、その制御に基づいた神経ウイルス感染症の克服、ウイルス性脳炎とウイルス増殖の抑制を目指すものである。本年度は、RAGEのリガンドであり、炎症反応の増幅に関与しているS100B動態について、BDV感染ラットを用いて解析を行った。その結果、BDV接種後5週目のラット脳ではS100Bの発現抑制が観察された。また、LPSの接種によっても、S100BとRAGEの発現上昇は認められず、BDV持続感染脳ではS100Bの機能が恒常的に抑制されていることが示唆された。S100Bの発現低下が認められた脳では、ミエリン蛋白質の接種によっても実験的自己免疫脳炎は誘導されないことが明らかとなった。

これらの結果より、BDV感染は脳内でのS100Bの発現とその活性化を抑制して、細胞浸潤を伴う過剰な脳炎反応を制御することで、宿主免疫の攻撃から逃れているとともに、持続感染を成立させていると考えられた。ウイルス性脳疾患の発症には中枢神経系(CNS)でのウイルスの持続感染と過剰な脳炎反応が深く関わっている。本研究は、ウイルス性脳疾患、特に免疫応答による脳神経細胞の破壊を回避するとともに、ウイルスをCNSから排除する新戦略を構築することを目的として進められた。研究代表者は、ボルナ病ウイルス(BDV)感染をモデルに、ウイルス持続感染の成立に関わる脳内因子と脳内免疫の活動を総合的に解析してきた。その結果、BDVが感染した脳内では、持続感染の成立に伴い糖化最終産物受容体(RAGE)の脱活性化が誘導されることを明らかにした。パターン認識受容体であるRAGEは、自然免疫活動の長期化や炎症反応の増幅にも関与している。すなわち、BDVはRAGEの活性化を抑制することで、宿主免疫の攻撃から逃れるとともに、持続感染の長期化を図っていると示唆された。本年度では、RAGEの活性化制御によるウイルス増殖抑制と脳炎の抑制について、実験動物を用いて解析を行った。BDVが持続感染したラットを用いて、組換えBDVN蛋白質(rN)の接種による脳内RAGE活性化を誘導した。同時に、RAGEの活性化を制御するために、可溶化RAGE(sRAGE)の頭蓋内接種を行った。その結果、sRAGEの投与により、BDV持続感染ラット脳内では炎症細胞浸潤が顕著に抑制されることが明らかとなった。一方、IL-1β、TNF、MCP-1、MIP-1などの炎症性サイトカインの発現には変化が認められなかった。以上のことより、sRAGE投与によるRAGE活性化の抑制により、細胞浸潤を伴う過剰な脳炎反応を制御できることが示された。一方、脳内のウイルス量に関しては変化が認められず、脳内で持続感染を成立させたウイルスの排除に関しては異なるアプローチが必要であると考えられた。