hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気管いびき音モニターによる小児の睡眠呼吸障害スクリーニング法の開発と検証

しかし、新装置の開発が遅れ、それが実施できなかった。しかしながら、我々は人工知能(深層学習)を用いることで、気管音画像から睡眠・覚醒は92%の精度で判別できること、会話、体動、閉塞性無呼吸、低呼吸、いびきなども同等の精度で判別できることが明らかになった。現在、この方法を小児例へ適応することで、気管音測定による小児の在宅無呼吸診断が可能になるものと考える。本研究の目的は、本人も家族も気づかない睡眠呼吸障害が原因で起こる衝動性、注意力不足、学習障害、発育不良、夜尿症等の症状を呈する小児の睡眠呼吸障害を発見・治療することにより、心身の健康を取り戻し、親子関係を明るいものに変え、学校教育における指導上の困難を軽減することで、それらの小児と家族が生き生きと生活ができる明るい未来と幸せの実現を目指す。本目的のため、小児への負担を軽減した精度の高い睡眠呼吸障害判定検査機器(気管いびき音モニター)を準備し、本研究では、小児の集団レベルでの睡眠呼吸障害の有病率を明らかにし、見過ごされている睡眠呼吸障害に対して適切な治療を進めることで、これまで世界的に把握できていなかった一般集団(保育所、幼稚園、小学校)における小児の睡眠呼吸障害の実態を解明し、睡眠呼吸障害が原因で起こる健康障害、学習障害、問題行動等を改善することを目標とする。治療を要するにもかかわらず見過ごされている小児の睡眠呼吸障害が早期発見・治療へとつながり、睡眠呼吸障害に起因する学習障害や問題行動が改善することで、それらの子ども達と家族をはじめ周囲の人々の未来が好転すると確信する。そこで、簡易に睡眠呼吸障害を検出する機器を作成・準備した。某小学校小学1年生と2年生全員を対象に本機器および質問票を用いて睡眠呼吸障害を検出し、近隣の医療機関へ受診勧奨を行う体制を構築した。平成30年度中には、82名の小学生が登録され、これまでの調査結果を集計し、フィードバックを行っている。また、現在、順天堂学耳鼻科をはじめとする専門医療機関にて診察を受けるように勧奨中である。平成30年度までに、研究倫理審査を受け承認を得た。また、小児の睡眠呼吸障害を検出する機器を準備し、予備的測定を行った。以上の経過より小児の家庭で行うに際しての問題点の抽出と対応手法を策定した。その際、安全かつ精確な機器の使用と測定を目的として説明文書を作成した。また、対象となる小学校と協力関係を構築し、教員および保護者に対して本調査に関する情報提供を行った。某小学校小学1年生と2年生全員を対象に本機器および質問票を用いて睡眠呼吸障害を検出した。平成30年度中には、82名の小学生が登録され、これまでの調査結果を集計した。現在、フィードバックを行っている。また、現在、順天堂学耳鼻科をはじめとする専門医療機関にて診察を受けるように勧奨中で、必要に応じて、PSG検査等の精密検査を実施し、適切な治療を行う予定である。平成30年度は、平成29年度に開発した気管いびき音モニターを用いて、文京区内の小学生約130名を対象に、睡眠時無呼吸症候群の健診を実施する予定である。また、健診結果で要精密検査と判定された小児については、順天堂大学耳鼻科にて診察を受けるように勧奨し、PSG検査などの精密検査を実施する。また、万一、文京区で研究が進まない場合は、すでに小児の睡眠問題について申請者らと共に取り組んでいる愛媛県松山市、兵庫県洲本市において同様の研究を実施する。
母親の健康チェックシートの開発と評価ー育児相談への活用と縦断調査の試みー

「母親の心の健康チェックシート(以下チェックシートとする)」を用いて、育児相談を行い、その評価を行った。育児相談者は7名であり、2-3名の母親を受け持ち継続的に関わった。育児相談により有意に夫への感謝が上昇し、心身の疲労が低下した。母親は自分や子育てへの気づきや育児相談への満足感があった。母親の語りは、【自分に対する思い】が最も多く、次いで、【夫や周囲の人に対する思い】【子どもに対する思い】であった。相談員は母親に多くの語りを引き出すことができた。また、母親に語らせることによって母親が気持ちに気づき、受け止められる、認められる、安心するなどの有効な支援に支えられていることが示唆された。母親の心理的な健康状態を知るために作成した「母親の心の健康チェックシート」を用いて、縦断的な家庭訪問により育児相談を行った。実施群は3回の家庭訪問を6か月毎に行い参加した母親は20名である。相談者は大学の教員7名であり、1人2-3人の母親を受け持ち継続的に関わった。毎回育児チェックシートの項目以外の質問を受けると共に、育児幸福感を高める質問を用意した。最終回の時点で、チェックシートによる相談に対する質問紙調査を実施した。相談時は許可を得て録音し逐語録を起こした。コントロール群では、実施群と同じ20名をめざし現在追跡中とし、同時期に育児チェックシート項目で構成される質問紙調査を行っている。分析は、反復測定による一元配置分析と質的分析を行った。結果は、実施群、コントロール群の属性に有意な差はなかった。4時点のチェックシート項目の変化では、実施群に於いて子どもとの絆が上昇し、心身の疲労が低下した。夫の支援のなさは、上昇していた。本結果は、子どもの成長に伴う母親の変化であると考えることもできる。しかし、チェックシートを用いることで、母親は多くの気持ちを語ることができ、相談者は様々な関わりを持つことができていた。そこでさらに、20名の家庭訪問による語りを質的に相談者の関わりと母親の語りの2側面から3回の育児相談の場面を分析している。今後相談者と関わりと母親の思いの視点から、分析した結果を論文にまとめたいと考えている。1.MWCSを作成し、その結果を判断していくための標準値を設定する。すでに開発を行ったCHS短縮版13項目(3下位項目)とCSS短縮版16項目(3下位項目)、計29項目で構成されている。このMWCSの標準値を作成するため3000件程度のデータの収集と分析が課題である。その際可能であれば過去の調査データも活用する。・・・現在のところ過去のデータによる標準化の分析は行われていない。今後の課題となる。標準化する以前のチェックシートは作成し論文にした。2.MWCSを育児相談に活用する。その活用の実際と継続的な相談時の活用介入を試みその有効性を検討する。評価は活用介入前と継続的な活用介入の後に行う。さらに保健センター育児相談事業においてMWCSを試験的に導入しその評価を行う。・・・家庭訪問によるチェックシートを用いた相談介入はすでに実施しており、現場での活用が課題となっている。3. MWCS、CFSI項目を選択的に用いた54項目による母親の蓄積的疲労インデックス、母親の育児に対する自信についてのエピソードについて子どもが3歳(5歳)になるまで縦断的に追跡調査し、それらの変化や関係性について解明する。このことから育児支援への提言を試みる。・・・3か月のデータは黄疸としてのデータはまとめ論文にした。縦断調査は1歳6か月がまとまったところでデータ分析を行う予定である。平成23年度は5年間にわたる調査研究の初年度に当たり、以下の内容で取り組んだ。すでに継続的に取り組んでいる内容の成果のまとめにも力を入れている。1質問紙による縦断調査質問紙による縦断研究を進めている。生後3か月の健診で来所した対象者に配布している。700名を予定している。2チェックシートの開発1)チェックシートの母親の育児心理状態を査定するため、育児ストレス短縮版尺度8)(Child-care StressScale、CSSSとする)および育児幸福感短縮版尺度9)(Child-care Happiness Scale、以下CHSSとする)のデータの基本統計量とα係数を確認し、各下位尺度得点を、パーセンタイルに変換するための個人プロフィール表を作成した。各下位尺度得点のパーセンタイルを算出した。2)チェックシートの構成チェックシートは回答後、採点を簡易にできるように構成された。また、CHSS得点とCSSS得点の個人プロフィール表の中には、各下位尺度得点の値が、どれ位のパーセンタイル値に相当するか分かるように配列した。なお、得点の高さの意味的理由より、個人プロフィール表の値は、CHSSは最大値から始まり、CSSSは最小値から始まるようになっている。つまり、上部に個人の得点がプロットされているほど健康的であると解釈できるよう作成した。これらの研究経過については、第13回日赤看護学会で発表予定です。本研究は4年目に入る。25年度は、母親の心理的な健康状態を知るために作成した「母親の心の健康チェックシート」を用いて、縦断的な家庭訪問により育児相談を行った。

毎回育児チェックシートの項目以外の質問を受けると共に、育児幸福感を高める質問を用意した。最終回の時点で、チェックシートによる相談に対する質問紙調査を実施した。相談時は許可を得て録音し逐語録を起こした。コントロール群では、実施群と同じ20名に、同時期に育児チェックシート項目で構成される質問紙調査を行った。分析は、反復測定による一元配置分析と質的分析を行った。結果は、実施群、コントロール群の属性に有意な差はなかった。4時点のチェックシート項目の変化では、実施群に於いて子どもとの絆が上昇し、心身の疲労が低下した。夫の支援のなさは、上昇していた。本結果は、子どもの成長に伴う母親の変化であると考えることもできる。しかし、チェックシートを用いることで、母親は多くの気持ちを語ることができ、相談者は様々な関わりを持つことができていた。そこでさらに、20名の家庭訪問による語りを質的に相談者の関わりと母親の語りの2側面から育児相談の場面を分析している。相談者と関わりと母親の思いの視点から、分析した結果を論文にまとめた。また、縦断調査研究は継続して進行しており、現段階で、1歳6か月児を持つ母親の育児に対する自信と題して、論文にまとめた。また、母親の心の健康チェックシートについての論文をまとめた。1.最終年度の活動最終年度の研究活動は、母親の心のチェックシートを含めた質問紙による縦断調査を継続した。子どもが5歳になるまでを縦断的に追いかけています。28年度も引き続き継続していく予定である。さらに論文を作成した1歳6か月並びに3歳の子どもをもつ母親の育児への自信の2編の論文を作成しました。1編はすでに学会誌に掲載されているが、残り1篇は査読中となっています。また、今までの研究成果を著書にしてまとめ出版しました。2.4年間の成果として母親の心理的な健康状態を知るためのチェックシートを作成しました.これは,先行して行われた研究で開発した育児ストレス短縮版尺度とCHS短縮版尺度に基づいた29項目によって構成されています.700名のデータから基準となる値を作成し,1年半にわたる家庭訪問による継続的な相談活動に活用した後に評価をします.育児相談時に相談者(相談を受ける専門職者)が聞き取りながら回答を求めていきます評価得点の高い項目や低い項目に着目しながら母親の気持ちを引き出していきます.最終的には,母親と相談者が各下位項目得点を個人プロフィール表に基づいて確認し,改めて相談を進めていきます.特に基準となる値との比較により評価レベルが下方に位置している場合は,過度な不安とならないよう留意します.研究協力の依頼をして20名の母親から協力が得られました.7名の助産師(保健師の資格を併せ持つ者3名)の資格を有する母性・助産看護学教員が,6か月に1回程度の家庭訪問を3回実施します.その活用の実際や継続的な活用を試みることでの有効性を検討します.評価は活用前と継続的な活用の後に行います.その結果,母親が語っていたこと,相談者が対応したこと,継続的な育児相談の効果について明らかにしました.
天然物を利用したヒストン化学修飾剤によるエピジェネティックス制御

DNAビスインターカレーター能を有する環状ペプチド系天然物を母骨格とした誘導体を合成し、そのDNA結合能とin vitroヒトがん細胞増殖抑制活性を評価した。その中で、天然物と同等の活性を有する誘導体を見出す事ができた。さらに類縁天然物であるトリオスチンAとエチノマイシンの合成にも着手し、6個の誘導体を合成した。各種ヒトがん細胞に対する増殖抑制活性を評価したところ、nMオーダーのIC50値を示す化合物を見出す事ができた。さらに、ヒト腎臓がん細胞皮下移植マウスモデルを用いたin vivo抗がん活性を示す誘導体を見出した。新規抗がん剤のシーズを見出す事が出来たと言える。本研究は、ヒストンメのエピジェネティックス研究における有用な新規ケミカルツールと新規抗がん剤シードの開発を目指し、低分子エピジェネティックス制御化合物を創製するものである。本年度は優れた細胞透過能とDNAビスインターカレーター能を有する環状ペプチド系天然物であるキナルドペプチンを母骨格とした誘導体の合成を行った。まず、Ugi多成分反応のメリットを最大限に利用したキナルドペプチンの全合成経路の検討を行った。グリシルサルコシンと、3位に不斉中心を有する5員環状イミン、ジアミノブタン酸から調製したイソニトリルによるジアステレオ選択的なUgi多成分反応(3成分3分子反応)を行いテトラペプチドを得た。これをイソシアノカルボン酸に変換した後、2度目のUgi多成分反応(2成分4分子反応)により、2量化とマクロ環化反応を検討した。その結果痕跡量ではあるが、目的とする環状デカペプチドを得ることができた。併行して、固相合成法によるキナルドペプチン誘導体の合成も行った。環状ペプチド部のアミノ酸残基を変換した誘導体16個を合成し、そのDNA結合能とヒトがん細胞増殖抑制活性を評価した。さらに類縁天然物であるトリオスチンAとエチノマイシンの全合成にも着手し、双方向型の伸張経路により、短行程でトリオスチンAの全合成を達成した。本経路は、多彩な誘導体合成に適した合成法である。本合成法をエチノマイシンの全合成に適用すべく、種々条件検討を行った。キナルドペプチンに関しては、Ugi多成分反応による液相法と併行して、固相法による合成を展開する事で、母骨格を変換した誘導体の合成と生物活性評価を行う事が出来たため。得られた構造活性相関に関する情報は、今後の誘導体合成に有用な情報となる。また、環サイズの異なるトリオスチンAの誘導体合成に適した全合成も達成出来た事から、キナルドペプチンとあわせて、環状ペプチドライブラリー構築へ向けて大きく前進したと言えるため。まず優れた細胞透過能とDNAビスインターカレーター能を有する環状ペプチド系天然物であるキナルドペプチンを母骨格とした誘導体の合成を行った。固相合成法によるキナルドペプチン誘導体の合成も行い、環状ペプチド部のアミノ酸残基を変換した誘導体16個を合成し、そのDNA結合能とヒトがん細胞増殖抑制活性を評価した。平成28年度は、本経路を用いる事で、6個の誘導体を合成した。更にこの化合物の、ヒト腎臓がん細胞(MiaPaca)皮下移植マウスモデルを用いたin vivo抗がん活性を評価したところ、200 ng/kgの低用量でも薬効を示すことが明らかとなった。本化合物のエピジェネティックス調節能は現在評価中である。Ugi多成分反応によるキナルドペプチンの効率的合成を更に進める。活性を保持または増強したキナルドペプチン誘導体・トリオスチンA誘導体に対して、メチル基やアセチル基の供与官能基を導入して、ヒストン修飾能を検討する。更にヒトがん細胞増殖抑制活性とエピジェネティックス変化を検討する。創薬化学平成27年度中に全額使用済みであるが、年度末に購入した物品の支払いが本報告書の作成時点で反映されていないため。上記のとおり、平成27年度中に全て使用済みである。
モノクローナル抗体を研究基盤とした甘草機能性フラボノイドの作用機序の徹底的究明

モノクローナル抗体(mAb)を研究基盤として、甘草含有化合物が有する機能性解析を試みた。種々の甘草フラボノイドを用いて、前駆脂肪細胞3T3-L1の分化抑制作用についてスクリーニングを行い、さらに、甘草の主要成分であるグリチルリチン(GL)や、その代謝物であるグリチルレチン酸(GA)との相乗効果についても検討した。また、GAに対するmAbの作成に成功し、抗GA mAbを用いたenzyme-linked immunosorbent assayを確立し、GAの定量分析を可能とした。また、GLと甘草の主要フラボノイドであるリクイリチンの視覚的な検出が可能なイースタンブロッティングの開発を達成した。本研究は、甘草に含まれる機能性フラボノイドが前駆脂肪細胞3T3-L1細胞に及ぼす抗肥満作用(中性脂肪蓄積抑制作用)の作用機序を、天然化合物特異的モノクローナル抗体を用いて解明することを目的としている。本年度の研究実施計画では、1甘草主要フラボノイドリクイリチンで処理した3T3-L1細胞の分化初期および、分化後期における分化マーカーの変動を指標とした中性脂肪蓄積抑制作用の解析【平成27年度】および、2リクイリチンに対する特異的モノクローナル抗体を用いた、競合的ELISA法による3T3-L1細胞へのリクイリチンの取り込み量の解析、細胞内挙動解析【平成27、28年度】を行うこととなっていた。項目1に関しては、3T3-L1細胞の安定した培養法の確立に多くの時間を要してしまったため、詳細な分化マーカーの解析にまで至ることができなかったが、リクイリチンに対する特異的モノクローナル抗体を用いた、配糖体等の低分子化合物の免疫染色手法であるイースタンブロティングの確立に成功した。さらに、我々は、甘草の主要成分であるグリチルリチンに対する特異的モノクローナル抗体も有しているため、グリチルリチンとリクイリチンに対するモノクローナル抗体をそれぞれ用いる事で、両成分を特異的にかつ、視覚的に検出が可能なダブルイースタンブロティングの開発に成功した。イースタンブロティングおよび、ダブルイースタンブロティングを確立したことは、今後の機能性解析において強力な解析ツールとなり得ることを示しており、今後の研究遂行にあたって、重要な研究成果であった。平成27年度の研究実施計画としていた、3T3-L1細胞の中性脂肪蓄積抑制作用の各種分化マーカーを用いた解析に関しては、3T3-L1細胞の安定した培養条件検討のため、詳細な検討にまでは至ることができなかったが、リクイリチンに対する特異的モノクローナル抗体を用いた免疫染色手法である、イースタンブロティングおよび、ダブルイースタンブロティングの開発に成功したことは、今後の研究遂行において重要な成果であると考えられる。本研究では、甘草の機能性フラボノイドが前駆脂肪細胞3T3-L1細胞の分化抑制、中性脂肪蓄積抑制作用(抗肥満作用)の作用機序を、我々の研究室が有する天然化合物特異的モノクローナル抗体を用いて解析することを目的としている。本年度は、甘草に含まれる様々なフラボノイド成分で、スクリーニング的に3T3-L1細胞を処理し、各種フラボノイドが有する抗肥満作用(3T3-L1細胞分化抑制能)について検討を行った。その結果、フラボノイド成分のみで3T3-L1細胞を処理した場合において、顕著な抗肥満作用を発揮するフラボノイド成分の同定に至らなかった。しかしながら、甘草に含まれるフラボノイド成分と、他の成分の2成分又は3成分間での相乗効果なども考えられるため、甘草のフラボノイド成分と甘草の主要成分であるグリチルリチン及び、そのアグリコンであるグリチルレチン酸との相乗効果の有無について精査を実施している。また、複数成分間における3T3-L1細胞分化抑制作用の作用機序解明の為に、すでに作製に成功している甘草主要成分グリチルリチン及び、甘草主要フラボノイド成分であるリクイリチンに対する特異的モノクローナル抗体に加え、グリチルリチンの生体内代謝物であるグリチルレチン酸に対する特異的モノクローナル抗体の作製に関しても併せて着手し、これらの特異的モノクローナル抗体を用いた免疫化学的手法による解析を実施する予定である。予想に反して、フラボノイド成分のみの処理では前駆脂肪細胞3T3-L1細胞における顕著な抗肥満作用を示すフラボノイド成分が同定できなかったことから、実験動物などの生体を使用した作用機序の解明には至っていない。しかしながら、我々は甘草の主薬効成分であるグリチルリチンや甘草主要フラボノイドであるリクイリチンに対するモノクローナル抗体を既に作製済みであるため、フラボノイド成分とその他の成分間での相乗効果の解析を行うにあたっては、大きな問題は無いと考えている。本研究の目的は、甘草エキスや甘草に含まれるリクイリチンをはじめとした甘草フラボノイドが有する多彩な機能性の解明を遂行することである。すなわち、本研究の究極的な目的は、甘草フラボノイドが前駆脂肪細胞3T3-L1細胞にもたらす中性脂肪蓄積抑制作用(抗肥満作用)の標的分子(タンパク質)をモノクローナル抗体を研究基盤として用いて同定し、その作用機序の究明を行うことである。これまでの研究の結果、種々の甘草フラボノイド成分を用いてスクリーニング的に3T3-L1細胞を処理したところ、顕著な中性脂肪蓄積抑制作用を有する成分の同定に至らなかった。

そこで、甘草に含まれる他成分との相乗効果なども考えられたため、本年度は甘草の主要成分であるグリチルリチンの生体内代謝物であるグリチルレチン酸と、甘草フラボノイドとの相乗効果の有無について精査し、さらに、グリチルレチン酸の生体内挙動や局在、分布解析のツールとすべく、グリチルレチン酸に対するモノクローナル抗体の作製に着手した。これまでにグリチルレチン酸に対するモノクローナル抗体の作製例は報告されていたが、煩雑な免疫原の調製が必要であった。我々はEDCをリンカーとして採用することで、簡便に免疫原を調製することに成功し、グリチルレチン酸に対して特異的なモノクローナル抗体を得るに至った。さらに、本坑体の詳細な特徴付けを実施し、本坑体を用いたindirect competitive ELISAを確立した。モノクローナル抗体(mAb)を研究基盤として、甘草含有化合物が有する機能性解析を試みた。種々の甘草フラボノイドを用いて、前駆脂肪細胞3T3-L1の分化抑制作用についてスクリーニングを行い、さらに、甘草の主要成分であるグリチルリチン(GL)や、その代謝物であるグリチルレチン酸(GA)との相乗効果についても検討した。また、GAに対するmAbの作成に成功し、抗GA mAbを用いたenzyme-linked immunosorbent assayを確立し、GAの定量分析を可能とした。また、GLと甘草の主要フラボノイドであるリクイリチンの視覚的な検出が可能なイースタンブロッティングの開発を達成した。今後の研究遂行計画としては、平成27年度に確立した培養条件を用いて、3T3-L1細胞の分化、中性脂肪蓄積抑制作用に関して、より詳細な解析を実施していく予定である。また、リクイリチンに対する特異的モノクローナル抗体を用いた競合的ELISAを用いて、リクイリチンの経時的な取り込み等についても解析を遂行していく。今後は、甘草主要成分であるグリチルリチンとフラボノイド成分間の相乗効果等に着目し研究を遂行する。また、甘草のフラボノイド成分とグリチルリチンとの相乗効果解析と並行し、グリチルレチン酸に対するモノクローナル抗体の作製も実施し、機能性解析を行う予定である。食品化学、天然物化学脂肪蓄積抑制作用解析のためのキットや試薬類の購入を考えていたが、培養条件の決定に多くの時間を要してしまったため、予定していた試薬類の購入に至らなかった。平成28年度以降は、平成27年度実施計画の分も含め研究を遂行していくため、平成27年度の研究計画で使用予定であった試薬、キット等の購入を行う予定である。
キャビティ型配位子を活用した効率的な二酸化炭素固定化反応の開発

二酸化炭素取り込み反応で生成したキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)ペルオキソカルボナート錯体が、ホスフィンに対して酸素原子移動反応を起こし、対応するPd(II)カルボナート錯体とホスフィンオキシドを与えることを見出した。また、ホスフィンへの酸素移動反応は塩化リチウムにより劇的に加速されることがわかった。塩化リチウムは、錯体からペルオキソカルボナート部位を遊離する役割を担っている。さらに、ペルオキソカルボナート錯体はスルホキシドに対しても酸素原子移動反応を起こし、Pd(II)カルボナートとスルホンを与えることを示した。既に報告しているメタフェニレンデンドリマー骨格を基盤としたキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)ペルオキソカルボナート錯体と種々のアルケンとの量論反応について検討した。エチレン、スチレン、ノルボルネン、ビニルエーテルなどとの反応を検討したが、いずれの場合も反応は進行せず、塩化リチウムなどのルイス酸を添加した場合も同様であった。その一方で、マレイン酸ジメチルを用いた場合にシスートランス異性化反応が進行することが分かった。今後、反応機構について解明する予定である。Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体の酸化能について知見を得るべく、酸素原子アクセプターとの反応についても検討した。ホスフィンとの反応では酸素転移反応がゆっくりと進行し、対応するホスフィンオキシドとPd(II)カルボナート錯体が得られた。その構造はX線結晶構造解析により決定した。また、この酸素転移反応が塩化リチウム存在下で劇的に加速されることを見出した。この場合、ホスフィンオキシドとともにジクロロPd(II)錯体が生成していたことから、塩化物イオンはPd上を攻撃することでペルオキソカルボナート部位の脱離させる役割を担っており、それに伴い遊離したペルオキソカルボナートがホスフィンと速やかに反応し、ホスフィンオキシドが得られたものと考えられる。また興味深いことに、ジメチルスルホキシドが酸素原子アクセプターとして振る舞うことを見出した。これは、遷移金属ーペルオキソカルボナート錯体からスルホキシドへの酸素転移反応が進行することを示した初めての例である。メタフェニレンドンドリマー骨格を基盤としたキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)ペルオキソカルボナート錯体と種々の試剤との反応について検討した。まず、電子不足なアルケン、アルキン類との反応を行った。Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体とテトラシアノエチレン(TCNE)との反応を検討したところ、ペルオキソカルボナート錯体から二酸化炭素が脱離し、TCNEが挿入した5員環メタラサイクルが得られることがわかった。また、アセチレンジカルボン酸ジメチル(DMAD)との反応でも同様に、二酸化炭素が脱離し、DMADが挿入した5員環メタラサイクルが得られた。以上のように、電子不足な炭素ー炭素不飽和化合物との反応では、目的とする二酸化炭素の固定化よりも、脱離の方が優先して起こることが明らかとなった。なお、Pd(II)ペルオキソ錯体は、TCNE、DMADとの反応で同様の5員環メタラサイクルを与えることが報告されており、これら試剤に対する反応性はペルオキソ錯体とペルオキソカルボナート錯体とで類似しているといえる。次に、ホウ素化合物との反応について検討した。まだ予備的な段階ではあるが、Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体とフェニルボロン酸との反応を行ったところ、C-B結合が酸化されたフェノールが中程度の収率にて得られることが分かった。なお、アミン、アルコールとの反応についても検討したが、反応は進行しなかった。これらの結果は、Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体が、求核的な酸化剤として振る舞うことを示唆している。本年度は、Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体と、電子不足なアルケン・アルキン類との反応、およびホウ素化合物との反応について検討を行った。前者の炭素-炭素不飽和化合物との反応は、二酸化炭素部位の固定化を目的として行ったが、予期せず二酸化炭素部位の脱離が速やかにおこることが明らかとなった。現時点で、本研究の目的である環状カルボナートの生成は確認できていないため、当初の予定からは遅れていると考えられる。その一方で、Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体が、C-B結合を酸化する程度の酸化能を有することが明らかとなった。これは、昨年度に明らかにしたスルホキシドの酸化反応と関連して、ペルオキソカルボナート錯体の酸化剤としての機能の一端を見出したものと言える。メタフェニレンドンドリマー骨格を基盤としたキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)ペルオキソカルボナート錯体と種々の試剤との反応、および他の遷移金属錯体の合成について検討した。前年度までに、電子不足なアルケン・アルキンとPd(0)ペルオキソカルボナート錯体を反応させると、二酸化炭素が脱離するとともに、炭素ー炭素結合が挿入し5員環メタラサイクルが生成することを見出している。そこで、電子不足な不飽和化合物としてニトリルを選択し、種々の条件下反応を検討したが、反応は進行しなかった。また、種々のアルケンとの反応についても検討したが望みの挿入反応は進行しなかった。一方、還元剤であるシランとの反応を検討したところ、室温で速やかに還元が進行し、ビスカルベンPd(0)錯体が中程度の収率で得られた。

なお、ラジカル的な水素供与体である1,4-シクロヘキサジエンとの反応は進行しなかった。キャビティ型カルベンAg(I)錯体をカルベン供与体として活用することで、種々の遷移金属錯体との金属交換反応を検討した。カルベンーAg(I)錯体は、対応するイミダゾリウム塩と酸化銀との反応により容易に合成できた。Ag(I)錯体とPd(II), Au(I), Ir(I), Ir(III)錯体との反応を行ったところ、いずれの場合も金属にカルベンが一つ配位した錯体が得られた。Ir(III)の錯体はX線構造解析によりその構造を明らかにした。種々検討した結果、カルベン窒素上の置換基として、これまで主に用いてきたメチル基を有するものよりも、イソプロピル基を有するものの方が格段に錯体の安定性が高かった。本年度は、Pd(II)ペルオキソカルボナート錯体と種々の反応剤との反応について検討した。種々の不飽和化合物との反応を検討したところ、電子不足な化合物とは速やかに反応するものの、それ以外のものに対するペルオキソカルボナートの反応性は予想に反して低く、適切な活性化剤を探索する必要がある。一方、シランとの反応で速やかに対応するPd(0)錯体が生成したことは、ペルオキソカルボナート錯体が酸化剤としての機能の一端を見出したものと言える。以前の検討で、メタフェニレンデンドリマー骨格を基盤としたキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)ペルオキソカルボナートが、ホスフィンに対し酸素転移反応を起こして対応するホスフィンオキシドを与えること、および塩化リチウムを添加すると反応が著しく加速されることを見出している。そこで、ペルオキソカルボナート錯体が引き起こす酸素転移反応について更なる知見を得るべく、有機硫黄化合物との反応について検討を行った。Pd(II)ペルオキソカルボナートに対しスルフィドPhSMeを作用させたところ、Pd(II)ペルオキソカルボナートは消失したもののカルベン配位子を有する化合物は複雑化し、生成物の同定には至らなかった。同反応を塩化リチウム存在下でも行ったところ、Pd(II)ペルオキソカルボナートが収率良くPd(II)ジクロリド錯体へと変換されたが、スルフィドの酸化体は観測されなかった。ペルオキソカルボナートのジクロリドへの変換は既に報告している。その一方で、硫黄化合物としてジメチルスルホキシドを溶媒量用いた場合には、酸素原子が一つ失われたPd(II)カルボナート錯体が定量的に得られることがわかった。同時にジメチルスルホンが生成していたことから、Pd(II)ペルオキソカルボナートからスルホキシドに酸素移動が起こったことが明らかとなった。以前の検討で、ホスフィンとの反応は、塩化リチウムを添加しないと反応が著しく遅いことを見出しているが、ジメチルスルホキシドとの反応は添加剤を加えなくとも効率良く進行する点は興味深い。なお、立体的によりかさ高いジフェニルスルホキシドとの反応は同条件下では進行しなかったことから、本酸素移動反応はスルホキシド置換基の立体的特性に大きく依存することが示唆される。二酸化炭素取り込み反応で生成したキャビティ型カルベン配位子を有するPd(II)
地質情報の3Dプリンタ造形による教育・展示技術の高度化

本課題の目的は,3Dプリンタによって地質情報の立体模型を造型するノウハウの構築,その模型を研究素材として利用することによる研究進展への貢献,模型を教材として教育や人材育成に利用したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いてその高度化を図ることである.本研究課題においては,地質構造や化石標本等,様々な地質情報の3次元形状デジタルデータの取得や加工処理,そのデータから3Dプリンタによる精密かつ客観的な立体模型を出力する一連の技術を開発し一般化する.こうして作成された精密な模型は研究材料として有用であり,研究分野の発展に貢献することが期待される.さらに,それらの立体模型を教材として教育や人材育成に利用したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いてその高度化を図る.研究初年度においては高詳細な光造形3Dプリンタを導入して,実物の500倍に相当する放散虫化石模型を造形し,産業技術総合研究所地質標本館の展示改修の際,実際にこの模型を用いて展示を行った.このように,3Dプリンタによる地質情報の模型は,自在な拡大縮小とデータ処理により,地球の大構造や地形等の縮小,微化石の拡大,変形した化石の形状復元,貴重標本や脆弱標本の複製等の造型を行うことで,地質情報の可触化・可視化を実現を示すことができた.このノウハウを広く適用して作成した立体模型を教育・研究に供したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いることでもたらされる教育・展示技術の高度化を実現した.当該年度は,6月から所内異動により研究関連部門に本務が移った.この人事は研究課題提案時には予想されなかったことであり,研究部門にも兼務がかかり研究を進めることができたものの,当初計画を全て実行するには至らなかった.論文や学会発表の機会も得らなかったため,初年度の進捗状況は遅れていると評価せざるを得ない.第2年度は,6月以降に研究部門に本務が移るため,遅れている研究をより推進することが可能となる.初年度に実現できなかったマイクロX線CT装置を用いた微化石の3次元データ取得を実施し,系統的な指標化石模型のセットを製作する.化石に留まらず,地質構造や地形などの地質情報の立体模型製作にも取り組み,研究課題の核心部分を掘り下げることとする.このようにして製作した模型を地質標本館などにおいて実際に展示に用いたり,学生実習などに提供することで,教育・展示技術の高度化を推し進める.本課題の目的は,3Dプリンタによって地質情報の立体模型を造型するノウハウの構築,その模型を研究素材として利用することによる研究進展への貢献,模型を教材として教育や人材育成に利用したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いてその高度化を図ることである.本研究課題においては,地質構造や化石標本等,様々な地質情報の3次元形状デジタルデータの取得や加工処理,そのデータから3Dプリンタによる精密かつ客観的な立体模型を出力する一連の技術を開発し一般化する.こうして作成された精密な模型は研究材料として有用であり,研究分野の発展に貢献することが期待される.さらに,それらの立体模型を教材として教育や人材育成に利用したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いてその高度化を図る.研究初年度においては高詳細な光造形3Dプリンタを導入して,実物の500倍に相当する放散虫化石模型を造形し,産業技術総合研究所地質標本館の展示改修の際,実際にこの模型を用いて展示を行った.このように,3Dプリンタによる地質情報の模型は,自在な拡大縮小とデータ処理により,地球の大構造や地形等の縮小,微化石の拡大,変形した化石の形状復元,貴重標本や脆弱標本の複製等の造型を行うことで,地質情報の可触化・可視化を実現を示すことができた.このノウハウを広く適用して作成した立体模型を教育・研究に供したり,研究成果発信のための展示・説明等に用いることでもたらされる教育・展示技術の高度化を実現した.当該年度は,6月から所内異動により研究関連部門に本務が移った.この人事は研究課題提案時には予想されなかったことであり,研究部門にも兼務がかかり研究を進めることができたものの,当初計画を全て実行するには至らなかった.論文や学会発表の機会も得らなかったため,初年度の進捗状況は遅れていると評価せざるを得ない.第2年度は,6月以降に研究部門に本務が移るため,遅れている研究をより推進することが可能となる.初年度に実現できなかったマイクロX線CT装置を用いた微化石の3次元データ取得を実施し,系統的な指標化石模型のセットを製作する.化石に留まらず,地質構造や地形などの地質情報の立体模型製作にも取り組み,研究課題の核心部分を掘り下げることとする.このようにして製作した模型を地質標本館などにおいて実際に展示に用いたり,学生実習などに提供することで,教育・展示技術の高度化を推し進める.「現在までの進捗状況」にも述べたとおり,当該年度は所内異動により十分に研究活動に時間をかけることができず,計画を実行しきれなかった.本年度は,研究部門に戻るため研究を計画に沿って進める予定である.本年度は,主として外部機関が所有するマイクロX線CT装置による微化石の三次元データ取得のための旅費や機器使用料,ハンディタイプのレーザースキャナの導入費用として予算を使用する予定である.
DNA複製におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用の構造生物学

DNAクランプは複製・修復・組み換えなど, DNA上で起こる様々なイベントの足場となるタンパク質で,必要なタンパク質を適切な場所に集合させる.真核生物は2種類のDNAクランプ, PCNAとRAD9/HUS1/RAD1(9-1-1)を持つ.本研究では, 9-1-1の最も重要な部分であるRAD9のC末端領域(270-391)(RAD9CTD)の構造解析を行った.CDスペクトルによって溶液構造を調べたところ,明確な2次構造を示すスペクトルは示さなかった.そこで, X線溶液散乱(SAXS)実験を行い,得られた散乱データからクラツキープロットを計算したところ, RAD9CTDは天然変性構造であることがわかった.RAD9CTDはDNA損傷シグナルによって高度にリン酸化されることが知られている.したがって, RAD9CTDが天然変性構造であることは,この領域が翻訳後修飾を受けるには適した構造であり,リン酸化によってその構造が変化することが予想される.いくつかの古細菌はへテロ三量体DANクランプ(PCNA1-PCNA2-PCNA3)を持つ.我々はSulfolobus tokodaii由来PCNA2-PCNA3のSAXS実験を行い, PCNA2-PCNA3が2 : 2の4量体リング構造を形成することを明らかにした.DNAクランプは複製・修復・組み換えなど, DNA上で起こる様々なイベントの足場となるタンパク質で,必要なタンパク質を適切な場所に集合させる.真核生物は2種類のDNAクランプ, PCNAとRAD9/HUS1/RAD1(9-1-1)を持つ.本研究では, 9-1-1の最も重要な部分であるRAD9のC末端領域(270-391)(RAD9CTD)の構造解析を行った.CDスペクトルによって溶液構造を調べたところ,明確な2次構造を示すスペクトルは示さなかった.そこで, X線溶液散乱(SAXS)実験を行い,得られた散乱データからクラツキープロットを計算したところ, RAD9CTDは天然変性構造であることがわかった.RAD9CTDはDNA損傷シグナルによって高度にリン酸化されることが知られている.したがって, RAD9CTDが天然変性構造であることは,この領域が翻訳後修飾を受けるには適した構造であり,リン酸化によってその構造が変化することが予想される.いくつかの古細菌はへテロ三量体DANクランプ(PCNA1-PCNA2-PCNA3)を持つ.我々はSulfolobus tokodaii由来PCNA2-PCNA3のSAXS実験を行い, PCNA2-PCNA3が2 : 2の4量体リング構造を形成することを明らかにした.DNAクランプのユビキチン化は,損傷乗り越えDNA合成(TLS)やチェックポイントの活性化など,DNA損傷に対する細胞機能を発動させる重要なトリガーである.本研究では2つのDNAクランプ,PCNA及び9-1-1に注目し,DNA損傷応答におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用を構造生物学的に明らかにすることを目指す.平成21年度は,1)ユビキチン化PCNAの調製,2)PCNAの脱ユビキチン化酵素USP1の調製,3)PCNA変異体の機能解析と構造解析を行った.1)ユビキチン化PCNAを大量に調製し,ナノフローESI法による質量分析(NanoESI MS)を行った.その結果,3量体PCNAの1箇所あるいは2箇所がユビキチン化されていることを確認した.これは,生体内では必ずしも3箇所がユビキチン化される必要がないことを示唆する結果である.また,未修飾の3量体も存在していることがわかり,純度を上げるために発現系及び精製条件のさらなる検討が必要である.2)USP1はモノユビキチン化されたPCNAを脱ユビキチン化する酵素である.様々な発現ベクターを試した結果,ヒトUSP1を大腸菌を用いて発現させることに成功した.3)TLSを阻害する酵母PCNA変異体G178S(REV6-1)を調製し,様々な手法により3量体の安定性を調べた.その結果,REV6-1は野生型PCNAに比べて,3量体の安定性が著しく低下していることがわかった.また,結晶構造解析を行ったところ,酵母REV6-1は3量体リングを形成していなかった.ヒトREV6-1のユビキチン化をin vitroで行ったところ,野生型とほぼ同程度にユビキチン化されることがわかった.以上のことから,REV6-1のTLS阻害は,3量体形成の破綻に起因すると考えられる.DNAクランプは,DNA複製や修復において様々なタンパク質をDNA上にリクルートする足場タンパク質である.DNAに損傷が生じると,DNAクランプはユビキチン化を受ける.これが,損傷乗り越えDNA合成(TLS)やテンプレートスイッチ(TS)などのDNA損傷トレレランス機構を発動させるシグナルであると考えられている.本研究では2つのDNAクランプ,PCNA及び9-1-1に注目し,DNA損傷応答におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用を構造生物学的に明らかにすることを目指す.平成22年度に行った研究をいかに記す.1)ユビキチン化PCNAの調製系の検討を行った.しかしながら,未だ未修飾の3量体も存在しており,純度を上げるために発現系及び精製条件のさらなる検討が必要である.2)USP1はモノユビキチン化されたPCNAを脱ユビキチン化する酵素である.ヒトUSP1を大腸菌を用いて発現させることに成功したが,発現量が少ないため,結晶化には至っていない.今後,試料調製の条件検討を進めていく.

3)TLSを阻害する酵母PCNA変異体G178S(REV6-1)を調製し,その構造安定性を円偏光二色性スペクトルを用いて評価した.野生型PCNAおよびREV6-1それぞれに対し,測定セルを20度から95度まで昇温しながら三次構造の変化を見るために近紫外スペクトルを測定した.その結果,野生型の変性温度は67.7度,REV6-1の変性温度は61.8度であり,REV6-1は野生型PCNAよりも構造が不安定であることが明らかとなった.4)全長ヒト9-1-1を調製するために発現ベクターの再構築を行ったが,発現量は改善されなかった.今後は大腸菌コドンに最適化した遺伝子を合成し,全長ヒト9-1-1の大量調製を進めるDNAクランプは,DNA複製や修復において様々なタンパク質をDNA上にリクルートする足場タンパク質である.DNAに損傷が生じると,DNAクランプはコビキチン化を受ける.これが損傷乗り越えDNA合成やテンプレートスイッチなどの損傷トレランス機構を発動させるシグナルであると考えられている.本研究では2つのDNAクランプ(PCNA及び9-1-1)に注目し,DNA複製におけるユビキチン化シグナルと分子間相互作用を構造生物学的に明らかにすることを目指す.本年度に行った研究を以下に示す.【UAF1】PCNAの脱ユビキチン化酵素USP1の制御因子であるヒトUAF1の調製を行った.大腸菌を用いて様々な発現条件を検討した結果,UAF1をヒスタグ融合タンパク質として発現させることに成功した。UAF1は,アフィニティーカラム,イオン交換カラム,ゲル濾過カラムで精製した.さらに結晶化スクリーニングを行ったところ,PEGを沈殿剤とした条件でUAF1の結晶化に成功した.【RAD9】9-1-1のサブユニットの1つであるRAD9のC末端ドメイン270-391残基(RAD9CTD)の構造生物学的研究を行った.大腸菌のコドンに最適化したRAD9CTDをGST融合タンパク質として発現させ,アフィニティーカラム,イオン交換カラム,ゲル濾過カラムで精製を行った.得られた試料を用い,X線小角散乱実験を行い,散乱曲線からクラツキープロットを計算した.また,遠紫外CDスペクトルを測定した.それらの結果から,RAD9CTDは100残基を超える大きさを持つが,一定の構造をとらない天然変性タンパク質であることが明らかになった.RAD9CTDは高度にリン酸化修飾を受ける.したがって,RAD9CTDが天然変性状態であることは,リン酸化修飾には都合がよい構造であるといえる.
確率幾何モデルに対するくりこみ群のアプローチ

水を熱すると水蒸気になるが,このように外部パラメーター(この場合は温度)の変化に応じて物質の状態が変わることを相転移という,相転移に際しては,様々な物理量が発散し,これを臨界現象という.臨界現象の解析に有効な手法として,くりこみ群の方法がある.本研究では,くりこみ群の解析手法を,自己回避ランダムウォーク(溶液中の一次元高分子のモデル)などの確率幾何モデルやイジングモデル(磁石のモデル)の低温相に対しても有効になるように厳密に拡張することを目的とし,証明の大筋を得た.水を熱すると水蒸気になるが,このように外部パラメーター(この場合は温度)の変化に応じて物質の状態が変わることを相転移という,相転移に際しては,様々な物理量が発散し,これを臨界現象という.臨界現象の解析に有効な手法として,くりこみ群の方法がある.本研究では,くりこみ群の解析手法を,自己回避ランダムウォーク(溶液中の一次元高分子のモデル)などの確率幾何モデルやイジングモデル(磁石のモデル)の低温相に対しても有効になるように厳密に拡張することを目的とし,証明の大筋を得た.「くりこみ群」は統計力学および場の理論の解明には欠かせない解析手法である.しかし,ランダムウォーク,パーコレーションなどの確率幾何モデルに対するくりこみ群の適用例の殆どすべては,(a)その臨界現象を解析できるほど強力ではないか,(b)確率幾何モデルを一旦,場の理論の系に書き直した上でくりこみ群の手法を適用したものか,のどちらかである.本研究では,これらの欠点を克服するため,確率幾何モデルに対して,その確率幾何モデルとしての特徴を生かす形での,新しいくりこみ群による解析を行うことを目的とする.今年度は特に,「4次元正方格子における自己回避ランダムウオーク」のくりこみ群解析を研究し,以下のような進展を見た.1.上記モデルに対して,ランダムウォークであること(確率幾何モデルであること)を十分に利用した自然なくりこみ群の方法を定式化した.2.この定式化において,くりこみ群の主要項を詳しく解析し,この項以外の効果をすべて無視すれば,この項が実際に予想される臨界現象に導くことを確かめた.3.厳密なくりこみ群解析においては,当然,主要項以外の項がどのように寄与するかをコントロールすることが本質的に重要である.このコントロールは非常に難しく,一般論を一気に作るのは困難なため,今年度は主要項以外の項のいくつかを具体的に表現し,これらがコントロールできることを確認した.これらの成果は,次年度に主要項以外の項をコントロールする一般論を構成するための重要な布石になるものである.「くりこみ群」は統計力学および場の理論の解明には欠かせない解析手法である.しかし,ランダムウォーク,パーコレーションなどの確率幾何モデルに対するくりこみ群の適用例の殆どすべては,(a)その臨界現象を解析できるほど強力ではないか,(b)確率幾何モデルを一旦,場の理論の系に書き直した上でくりこみ群の手法を適用したものか,のどちらかである.本研究では,これらの欠点を克服するため,確率幾何モデルに対して,その確率幾何モデルとしての特徴を生かす形での,新しいくりこみ群による解析を行うことを目的としている.今年度の成果は以下の通りである.1.昨年に引き続き,「4次元正方格子における自己回避ランダムウォーク」のくりこみ群解析を研究し,主要項以外の項がどのようにふるまうかを調べた(主要項が期待通りにふるまうことは昨年度に確かめてある).結果として,摂動論の範囲では期待されたようになっている,つまり非主要項はくりこみ変換によってドンドン小さくなることを摂動領域では確かめた.2.しかし,非摂動領域での解析が完成していないので,この部分を更に解析した.この領域からの寄与は無視できるくらい小さいはずなのだが,それを数学的に証明するのがなかなか困難である.この問題を解決するためにいろいろな表現を使って試行錯誤をした.まだ完全な解決には到っていないが,どのような方向が良さそうか,だんだんと様子が見えて来ているところである.「くりこみ群」は統計力学および場の理論の理解には欠かせない解析手法である.しかし,ランダムウォークやパーコレーションなどの確率幾何モデルの対するくりこみ群の適用例は,(a)その臨界現象を解析できるほど強力でないか,(b)確率幾何モデルを一旦,場の理論(スピン系)のモデルに書き直した上でくりこみ群の手法を適用したものがほとんどであった.また,スピン系のモデルに対しても,その高温側の解析はかなりなされているものの,低温相の解析はほとんど行われていない.本研究ではこれらの欠点の克服を目指した.今年度の結果は以下の通りである.1.ランダムウォークに対するくりこみ群解析の困難を浮き彫りにし,その解決を図るため,類似の問題である「4次元スピン系の,磁場の存在下での臨界現象」「同モデルの低温相での臨界現象」の解析を行った.その結果,このモデルに対して,十分にくりこみ群解析が可能である事が判明した.これらはこれまでに世界の誰もが成功していなかった課題であり,その価値は非常に大きい.現在,「磁場の下での臨界現象」については研究がほぼ完成し,論文執筆中である.また,「低温相の臨界現象」についても大きな困難は解決済みで,時間の問題で研究を完成できると信じている.2.上記の4次元スピン系の研究が非常に進展したので「4次元正方格子上の自己回避ランダムウォーク」のくりこみ群の解析を続行した.最終解決に向けて,非常に有望な取り組み方が見えて来ている.
慢性炎症・線維化に着目した肺癌悪性度獲得メカニズムの解明と新規治療への応用

【対象】2006年1月から2016年3月において当科にて切除された間質性肺炎合併33症例および間質性肺炎非合併症例784症例を対象とした、この中からマッチドペア解析を用いて、間質性肺炎合併肺癌:非合併肺癌=1:2になるようにサンプルを抽出し間質性肺炎合併肺癌33例および間質性肺炎非合併65症例を同時に解析した。【蛋白抽出】1凍結標本から組織(癌部、癌隣接部、非癌部)を採取した(15-25mg程度)。2RIPA bufferを加えて、Tissue Lyserで組織をhomogenizeした。3遠心(4°C, 104G, 10min)施行。4上清を回収。-80°Cで保存。【蛋白定量】Bradford法:Quick Start Protein Assayを使用、タンパク定量後、-80°Cで保存した。【サイトカイン測定】ストックした上清をCytometric Bead Arrayを用いて多項目サイトカイン同時定量解析を行った。測定サイトカイン:TGF-β,VEGF, FGF, Fibronectin, HGF, IL-1β,IL-2, IL-6, IL-10, IL12p70, IL-17,IFN-γ, Fibronectin, HGFを測定した。【結果】1IL-6は間質性肺炎非合併肺癌の非癌部での発現量が高く、VEGFは癌部での発現が高かった。2IL-6は非癌部での発現量が高く、IL-1β,VEGF,FGFは腫瘍部での発現が高かった。3IL-10, TNF, IL-12p, IFN-γは検出範囲以下であった。4FGFは間質性肺炎非合併肺癌症例の非癌部、癌部いずれにおいても高値であった。【進捗状況】現在、得られたサイトカインプロファイルと臨床病理学的因子との関連性を解析中である。症例の抽出及びデータの集積も順調に行えている。現在、統計学的解析を行っており、英文論文を作成の上、投稿予定である。【対象】2006年1月から2016年3月において当科にて切除された間質性肺炎合併41症例。間質性肺炎非合併症例784症例の中からマッチドペア解析を用いて、間質性肺炎合併肺癌:非合併肺癌=1:2になるようにサンプルを抽出し、間質性肺炎非合併82症例も同時に解析する。【蛋白抽出】1凍結標本から組織(癌部、癌隣接部、非癌部)を採取(15-25mg程度)。2RIPA bufferを加えて、Tissue Lyserで組織をhomogenize。3遠心(4°C, 104G, 10min)。4上清を回収。-80°Cで保存。【蛋白定量】Bradford法:Quick Start Protein Assayを使用、タンパク定量後、-80°Cで保存。【サイトカイン測定】ストックした上清をCytometric Bead Arrayを用いて多項目サイトカイン同時定量解析を行う。測定サイトカイン:TGF-β,VEGF, FGF, Fibronectin, HGF, IL-1β,IL-2, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-17,IFN-γ, Fibronectin, HGF。【進捗状況】サンプルの抽出が終了し、各々のサンプルにおいて蛋白を抽出しているところである。対象となるサンプルを抽出し、各組織標本から蛋白を抽出している段階である。蛋白抽出終了後はサイトカイン測定に取り掛かることができる予定であり、おおむね順調に進展しているものと考えられる。4上清を回収。-80°Cで保存。

4FGFは間質性肺炎非合併肺癌症例の非癌部、癌部いずれにおいても高値であった。【進捗状況】現在、得られたサイトカインプロファイルと臨床病理学的因子との関連性を解析中である。症例の抽出及びデータの集積も順調に行えている。◎非小細胞肺癌株を用いた炎症性サイトカイン、線維化促進サイトカインによる悪性度誘導実験:サイトカインを導入後、in vitro下における悪性度(増殖能、転移能)誘導実験を行う。非小細胞肺癌株(A549, H157, H2122, H358, H1299, H23,PC9)を培養し、培養上清中にKeyサイトカインを投与し細胞接着性試験、ゼラチンザイモグラフィー、ケモインベージョンアッセイ等にて浸潤・転移能を測定する。◎非小細胞肺癌株を用いた抗炎症薬あるいは抗線維薬による炎症性サイトカイン及び線維化促進サイトカイン抑制実験:逆に抗炎症薬あるいは抗線維薬(Pirfenidone他)を用いて腫瘍細胞の悪性度(増殖、転移能)抑制実験を行う。PirfenidoneはPirfenidone(5-methyl-1-phenyl-2[1H]-pyridone)は抗線維化薬であり、間質性肺炎患者において一秒量の低下抑制、PFSの延長効果がある(Taniguchi H et al.Eur Resp J. 2010; 35: 821-829. )。PirfenidoneはTGF-βやTNF-αの抑制、線維芽細胞の増殖、コラーゲン生成を抑制することにより、組織の炎症、線維化を抑制する(Noble W et al.Lancet. 2011; 377: 1760-1769.)。日本では2008年より特発性肺線維症を適応とし、臨床に用いられている。その際、培養液中のサイトカイン濃度の推移を経時的に観察する。◎動物実験モデルによる腫瘍制御実験:マウスあるいはラット肺癌モデルによるin vivo下での抗炎症薬あるいは抗線維薬(Pirfenidone他)を用いた腫瘍制御実験を行い、至適投与濃度、経路、時期を決定し、その腫瘍抑制効果(腫瘍局所増大抑制、腫瘍浸潤・転移能抑制、生存率等)を解析する。現在、統計学的解析を行っており、英文論文を作成の上、投稿予定である。研究遂行のために必要な物品および情報収集のために使用した。