hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スマート発酵工学によるバイオブタノールの生産

本発酵では転写解析の結果、CX混合糖でのCCR回避機構では、セロビオースの非PTS系輸送体であるパーミアーゼと菌体内β-グルコシダーゼを介したバイパス経路の利用、そしてCCRのキー酵素遺伝子hprKの発現抑制が重要な要因であった。2.発酵プロセス適応型イネの育種:独立の形質転換体の数が少なかった老化誘導プロモーターでendo-glucanaseを発現するイネを新たに作出し、採種した。また、cellobiohydrolaseとendo-glucanaseの融合タンパク質(ハイブリッドセルラーゼ)を発現するイネも作出した。ハイブリッドセルラーゼ発現イネの糖化性を調べたところ、糖化性の向上は見られず、両セルラーゼを融合させた結果、活性が大きく低下したことが考えられた。N末端とC末端を入れ替えたハイブリドセルラーゼ発現イネも作出しており、今後はこれらのイネの糖化性を測定していく。計画書の作成段階で、予想される問題点を明確にしていたことと、数値目標を定め多方面からの検討を柔軟に行ったことが順調に進展する結果となった。また、研究代表者と分担者が互いの専門領域で柔軟に対処したことも大きな要因と言える。しかし、本研究は3つの研究項目、1混合糖を用いたカタボライト抑制(CCR)がかからない高効率ブタノール発酵(発酵工学)、2CCR機構の解明および高収率・非CCR菌株の育種(分子微生物学)、3発酵プロセス適応型イネの育種(植物育種学)、に絞り、専門分野が異なる研究者が連携して並行複式型研究(分野をまたぐフィードフォワードとフィードバック)を行っているため、各研究項目ですれが生じている部分がある。その点を次年度の研究計画に反映したい(次項の「12.今後の研究の推進方策」を参照してほしい)。1.カタボライト抑制(CCR)を回避したブタノール発酵:グルコース(G)とキシロース(X)から成る混合糖(GX混合糖)を用いた場合、CCRが生じる。そこで、Gの代わりに二糖であるセロビオース(C)から成る混合糖(CX混合糖)を用いて回分培養を行った結果、CXが同時に消費され、CCRが回避された。回避機構について、転写解析の結果、Cの非PTS系輸送体であるpermeaseと菌体内β-glucosidase(βG)を介したバイパス経路の利用、そしてCCRのキー酵素遺伝子hprKの発現抑制が重要な要因であった。また、CX混合糖を用いてcell recyclingによる高密度菌体の連続発酵系の構築を検討した。その結果、約0.7 h-1の高希釈率でも混合糖の高い利用率とブタノール高生産性を達成した。実際に、稲わらを原料とした場合、そのSemi-hydrolysateはCCRを回避すると共に、稲わらの糖化に使用する酵素当たりのブタノール収率やブタノール生産性を高め、費用対効果の高い適応型発酵プロセスが構築できた。2.発酵プロセス適応型イネの育種:老化誘導プロモーターによりβG、cellobiohydrolase(CH)、endo-glucanase(EG)およびCHとEGの融合タンパク質(ハイブリッドセルラーゼ)をそれぞれ発現するイネを作出し、稲わらの酵素糖化性を調べた。その結果、老化前(出穂期)には糖化性の向上は見られなかったが、老化後(収穫期)には、CHおよびEGを導入したイネで糖化性の向上が見られた。
Ｔｏｂ蛋白質によるＣＣＲ４－ＮＯＴ脱アデニル化酵素複合体の形成と機能の制御

TobやCCR4-NOTの構造解析を進めた。(1)C端側を、43アミノ酸残基と53アミノ酸残基を欠失させた、野生型Tob蛋白質(それぞれTob301,Tob291)を調製した。Tob301に比べTob291は発現量が3倍程度よく、約4リッター培養から3 mgの精製蛋白質を得た。結晶化に成功したが解析に適した回折は得られなかったので会合蛋白質との共結晶構造解析の準備を開始した。(2)UV等によるDNA損傷依存的にTobをリン酸化し安定化させるキナーゼが、CGK733阻害剤感受性であることを見出していた。しかし、既知のCGK733感受性キナーゼである、ATRやATMにはそのような作用は見られなかった。一方で2D-DIGE法やin vitroリン酸化法を用いた研究から、Cdc7キナーゼがTobと会合しリン酸化しうることを示した。Cdc7によるTobのin vitroリン酸化実験から被リン酸化アミノ酸残基としてSer151, 153、205、並びにThr204を見出した。このうち、少なくともSer151のリン酸化は、in vivoでのTobの安定性増大に寄与することを示した。(3)CCR4-NOT複合体の活性サブユニット中、直接会合することが示されているCNOT6LとCNOT7について、それぞれ全長配列を調製し、in vitroで会合させて複合体を精製し、結晶を得た。CNOT2とCNOT3の会合に関わるNOT boxをGST融合蛋白質として調製したが、精製過程でNOT box配列がグルタチオンセファロースに特異的に吸着することがわかり、調製方法の改善を図った。(4)X線結晶解析用に昆虫細胞系でCNOT3を大量発現させたが、この配列も樹脂に吸着することが分かった。現在別法で調製するとともに、CNOT3をドメイン構造に基づいて3分割して結晶化解析に十分な量を調製した。24年度が最終年度であるため、記入しない。リン酸化による蛋白質の修飾に注目した、Tobとその相互作用分子の会合状態の構造生物学的解析を以下のように進めた。(1)全長Tob蛋白質は可溶化せず、C端側を十数アミノ酸欠失させたTob・Cは可溶化できた。MAPK依存的リン酸化Tobの構造解析のために、リン酸化模倣体Tob・C3SEと非リン酸化模倣体Tob・C3SAを作成した。十分量のこれら蛋白質を調製し、様々な条件で結晶化させようとしたができなかった。Pull-down実験では、Tob・C3SEもTob・C3SAも、in vitroで過剰量存在するとTobに会合できることが分かった。一方で非リン酸化TobとCNOT7とTri(dA)の3者の結晶構造を解いた。(2)Tobはproteasomeのよい標的であり、不安定であるが、UV等によるDNA損傷に依存してリン酸化されて安定化する。関与するキナーゼを同定するために様々な阻害剤を用いてUV刺激してTobの安定化を調べた。その結果、CGK733がTobの安定化を阻害することを見出した。現在CGK733で阻害されるキナーゼ候補を絞り込んでいる。(3)CCR4-NOT複合体の全体構造の解析を視野にいれ、複合体サブユニットすべてについて大腸菌、あるいは昆虫細胞を用いて大量に発現させることに成功した。CNOT2とCNOT3が全体構造の維持に重要であることを見出したのでCNOT2とCNOT3の会合を調べ、それらがそれぞれのC端側にあるNOT boxで会合することを見いだした。(4)HeLa細胞の増殖を同調させ、細胞周期依存的にM期でCNOT3がリン酸化されることを見出した。予備実験からはcdc2キナーゼ/cyclinBが責任キナーゼであると考えられた。一方でX線結晶解析用に昆虫細胞系でCNOT3を大量発現させたが、結晶を得るには至らなかった。

CNOT2とCNOT3の会合に関わるNOT boxをGST融合蛋白質として調製したが、精製過程でNOT box配列がグルタチオンセファロースに特異的に吸着することがわかり、調製方法の改善を図った。(4)X線結晶解析用に昆虫細胞系でCNOT3を大量発現させたが、この配列も樹脂に吸着することが分かった。現在別法で調製するとともに、CNOT3をドメイン構造に基づいて3分割して結晶化解析に十分な量を調製した。24年度が最終年度であるため、記入しない。結晶構造に向けた蛋白質の大量精製、精製蛋白質同士の会合、DNA損傷依存的なTobリン酸化の解析、非リン酸化TobのとCNOT7とpoly(A)模倣体Tri(dA)の3者複合体の結晶構造解明など、全体としておおむね順調に進展しているといえる。ただ、リン酸化模倣Tobや非リン酸化模倣Tobの構造解析と大量調製したCNOT3の構造解析が、結晶化条件を多々検討したにも関わらず結晶化に至らず、見かけ上やや遅れている感があるかもしれない。しかしどちらの場合も、会合蛋白質と共結晶を解く方向で準備が進んでおり、研究期間中に解決できると予測している。(1)上記のように、Tobリン酸化部位変異体やCNOT3は大量に蛋白質を精製しても結晶化しなかったので、それぞれ会合することが分かっている、CNOT7やCNOT2との共結晶構造を解く。またTobについては、C端側を約100アミノ酸欠失し、かつMAPKによるリン酸化部位を保持する蛋白質を調製することによっても結晶化条件を改善する。(2)TobとPABPの共結晶構造解析を進める。(3)CNOT3のリン酸化部位を決め、リン酸化模倣体や非リン酸化模倣体がCCR4-NOT複合体本体を標的mRNAにリクルートするかどうか、luc assayにより検討する。
非対称細胞分裂においてSWI/SNFクロマチン構造変換複合体の果たす役割

申請者らはこれまでに、線虫におけるSWI/SNF構成因子の相同分子としてPSA-1,PSA-4,PSA-10,PSA-13を同定しているが、これらが他の生物と同様に複合体を形成して機能するかどうかは明らかになっていない。そこで、PSA-1及びPSA-4に対する抗体を作成し、各因子の遺伝子導入体を用いて免疫沈降を行った。その結果、少なくともこれら四つは複合体を形成しうることが明らかになり、これらが線虫においてもSWI/SNF複合体として機能することを示した。さらにこの結果は、SWI/SNFをターゲットとした免疫沈降実験系の確立を意味する。現在、WRM-1/β-catenin、LIT-1/NLK及びPOP-1/TCF等のWntシグナル下流因子とSWI/SNFとの相互作用の解析が進行中である。また、線虫固体を用いたTwo-Hybrid Systemについては、コントロール用の各発現ベクターの構築が終了しており、今後、遺伝子導入体の作成により実験系の確立に取り組む。さらに、非対称分裂に異常を示す別の新たな変異体を単利し、その解析により非対称分裂に関与する新規遺伝子psa-16を同定した。psa-16変異体では、LIT-1の極在の非対称性は変化しないが、WRM-1の極在の非対称性がなくなるあるいは反転していた。さらに、PSA-16をBaitとしたYeast Two-Hybridスクリーニングにより、PSA-16がWntシグナル伝達因子であるMIG-5/Dishevelledと相互作用しうることが明らかになった。これらの事からPSA-16は、Wntシグナル依存的にWRM-1とLIT-1の姉妹細胞間における非対称な相互作用を制御することにより、非対称分裂を制御する新規因子である事が期待される。現在、psa-16変異体およびPSA-16タンパク質について、詳細な解析を進めている。
攻撃行動の生起過程における社会的情報処理と感情処理能力の役割

本年度は,攻撃性の3タイプ(反応的表出性攻撃,反応的不表出性攻撃,道具的関係性攻撃)と社会的情報処理過程との関連についてさらなる検討を重ねた.社会的情報処理過程のうち反応評価過程を中心にその特徴を明らかにした研究の成果が,「小学生における3タイプの攻撃性が攻撃反応の評価および結果予期に及ぼす影響(教育心理学研究,52,298-309)」としてまとめられた.また,反応評価過程に感情処理過程を盛り込み,その詳細な特徴を検討するための調査について分析を進めた.この調査は小学児童(46年生)を対象にし,児童用P-R攻撃性質問紙(「小学生用P-R攻撃性質問紙の作成と信頼性,妥当性の検討(心理学研究,75,254-261.)」で標準化を完了)と共に,本研究のために作成した質問紙を使用した.表出性攻撃・関係性攻撃の各攻撃性が高い児童は低攻撃児に比べ,攻撃行動喚起事態での攻撃行動の社会的情報処理(反応評価)に歪みを示したが,特に高関係性攻撃児の社会的情報処理の歪みは多岐にわたり,彼らが学校現場での問題となる可能性を示唆した.さらに,高関係性攻撃児は相手から実際に被害を受けるという,攻撃行動喚起事態の程度が高い場合に相手に対する共感を低下させており,それが彼らが関係性攻撃行動を実際にとる一因である可能性が示された,さらに,内外の研究の文献的検討をおこない,成人の研究で問題とされている健康状態や児童のその後の発達との関連が重要視されている適応について論じた.その成果は「児童の攻撃性と適応および健康(美作大学・美作大学短期大学部紀要,50,1-6.)」としてまとめられた.本年度は,内外の研究の詳細な文献的検討に加え,攻撃性の3タイプ(反応的表出性攻撃,反応的不表出性攻撃,道具的関係性攻撃)と社会的情報処理過程のうち反応評価過程を中心にその特徴を明らかにし,また合わせて,反応評価過程に感情処理過程を盛り込み,その詳細な特徴を検討するための調査を実施した.内外の研究の文献的検討については「攻撃性概念の細分化と形成過程(美作大学紀要論文)」としてまとめられた.調査については小学児童を対象に児童用P-R攻撃性質問紙と共に,本研究のために作成した質問紙を実施した.この質問紙は疑似事態において,攻撃行動喚起事態を設定し,攻撃行動の与え手と受け手の反応を規定する質問紙(攻撃事態評価紙)である.反応の正当性や結果の予想評価を含む反応評価を測定した.また,感情についても攻撃の受け手への共感感情の有無,また攻撃行動の受け手の感情状態の推測など,多面にわたる感情処理過程を測定した.表出性攻撃・関係性攻撃の各攻撃性が高い児童は低攻撃児に比べ,攻撃行動喚起事態での攻撃行動の社会的情報処理(反応評価)に歪みを示したが,特に高関係性攻撃児の社会的情報処理の歪みは多岐にわたり,彼らが学校現場での問題となる可能性を示唆した.さらに,高関係性攻撃児は相手から実際に被害を受けるという,攻撃行動喚起事態の程度が高い場合に相手に対する共感を低下させており,それが彼らが関係性攻撃行動を実際にとる一因である可能性が示された.本年度は,攻撃性の3タイプ(反応的表出性攻撃,反応的不表出性攻撃,道具的関係性攻撃)と社会的情報処理過程との関連についてさらなる検討を重ねた.社会的情報処理過程のうち反応評価過程を中心にその特徴を明らかにした研究の成果が,「小学生における3タイプの攻撃性が攻撃反応の評価および結果予期に及ぼす影響(教育心理学研究,52,298-309)」としてまとめられた.また,反応評価過程に感情処理過程を盛り込み,その詳細な特徴を検討するための調査について分析を進めた.この調査は小学児童(46年生)を対象にし,児童用P-R攻撃性質問紙(「小学生用P-R攻撃性質問紙の作成と信頼性,妥当性の検討(心理学研究,75,254-261.)」で標準化を完了)と共に,本研究のために作成した質問紙を使用した.表出性攻撃・関係性攻撃の各攻撃性が高い児童は低攻撃児に比べ,攻撃行動喚起事態での攻撃行動の社会的情報処理(反応評価)に歪みを示したが,特に高関係性攻撃児の社会的情報処理の歪みは多岐にわたり,彼らが学校現場での問題となる可能性を示唆した.さらに,高関係性攻撃児は相手から実際に被害を受けるという,攻撃行動喚起事態の程度が高い場合に相手に対する共感を低下させており,それが彼らが関係性攻撃行動を実際にとる一因である可能性が示された,さらに,内外の研究の文献的検討をおこない,成人の研究で問題とされている健康状態や児童のその後の発達との関連が重要視されている適応について論じた.その成果は「児童の攻撃性と適応および健康(美作大学・美作大学短期大学部紀要,50,1-6.)」としてまとめられた.
教師なし特徴学習による高精度多細胞種セグメンテーションアルゴリズムの開発

本研究は既存の画像解析・機械学習アルゴリズムでは実現されていない、細胞種に依らない汎化性が高い高精度細胞セグメンテーションアルゴリズムの構築をAutoencoder(自己符号化器)を用いることで実現することを目的としている。平成30年度は多層ニューラルネットワークの構造、学習アルゴリズムの適否について詳細に検討し、検討を行ったアルゴリズムから順次実装を進めた。当研究課題において開発を行うセグメンテーションアルゴリズムの中核をなすのは多層ニューラルネットワークと自己符号化器となる。当該年度では多層ニューラルネットワークの一種であるU-Netをベースとしたアルゴリズムの検討を行った。U-Netは大局的な特徴を抽象化して学習するとともに、局所的な特徴も合わせて学習することが可能なアーキテクチャであり、その独自なネットワーク構造により高い性能を示すが、機械学習が本質的に持っている問題点である「学習効果は与える学習データに強く依存する」という点は未解決である。当該年度はU-Netの構造を保ちつつ、自己符号化が可能なネットワークの検討を行い、Pythonによる深層学習フレームワークであるChainerを用いて実装を行った。学習データに関しては、HeLa細胞の顕微鏡画像を撮像しセグメンテーションの正解データを用意し、セグメンテーションの学習を行った。また他の細胞種(NIH3T3, SH-SY5Y等)の顕微鏡画像を撮像し、自己符号化器にて教師なし学習を行い、精度評価を行った。畳み込みニューラルネットワークを用いた細胞セグメンテーションアルゴリズムであるU-Netと自己符号化器を結合した学習モデルの構築を行った。モデル前半部は自己符号化器として正解ラベルを用いずにNIH-3T3細胞画像を学習させ、モデル後半部はNIH-3T3の自己符号化器で得られた特徴を基にHeLa細胞画像の正解ラベルを用いて学習を行った。得られた三つの学習済みモデルでNIH-3T3のセグメンテーションを行い精度を評価した。セグメンテーションの評価指標であるIoUを用いてセグメンテーション精度を評価した。HeLaを学習させたU-NetモデルのIoUが0.609であったのに対し、本研究のモデルは0.496であり、先行研究を上回らなかった。本研究のモデルが高精度にセグメンテーションを行えなかった理由を明らかにするべく、学習済みモデルの解析を行ったところ、モデル前半部の自己符号化器の学習が適切に行われなかったことが明らかとなった。本研究で提案したアルゴリズムは、先行研究のU-NetモデルにHeLaを学習させ、NIH-3T3をセグメンテーションした場合の精度を上回らなかった。今年度は、自己符号化器モデルの構造の再検討や入力画像へのノイズ付加によって、自己符号化器がセグメンテーションに有効な特徴を抽出するような改良を計画している。具体的には、まずNIH/3T3の顕微鏡画像で自己符号化器モデルを学習させ、NIH/3T3の特徴を抽出した後、自己符号化器で抽出した特徴を各層ごとに連結したモデルを作成することを計画している。続いて、作成したモデル内の自己符号化器で抽出した特徴を利用しつつHeLaの正解ラベルを用いて学習させることで自己符号化器で抽出した特徴を利用して細胞画像をセグメンテーション可能なモデルの構築を計画している。

本研究で提案したアルゴリズムは、先行研究のU-NetモデルにHeLaを学習させ、NIH-3T3をセグメンテーションした場合の精度を上回らなかった。今年度は、自己符号化器モデルの構造の再検討や入力画像へのノイズ付加によって、自己符号化器がセグメンテーションに有効な特徴を抽出するような改良を計画している。具体的には、まずNIH/3T3の顕微鏡画像で自己符号化器モデルを学習させ、NIH/3T3の特徴を抽出した後、自己符号化器で抽出した特徴を各層ごとに連結したモデルを作成することを計画している。続いて、作成したモデル内の自己符号化器で抽出した特徴を利用しつつHeLaの正解ラベルを用いて学習させることで自己符号化器で抽出した特徴を利用して細胞画像をセグメンテーション可能なモデルの構築を計画している。
臨床データ解析による臍帯血移植成績向上のための国際標準アルゴリズム確立

臍帯血移植は、骨髄移植や末梢血幹細胞移植と比較し、移植片に含まれるCD34陽性細胞数は1/10程度と少数であるのにも関わらず、生着が得られる。また、HLA不適合抗原が3座6抗原のうち2抗原以内であれば、重症GVHDの発症リスクを増加させることなく実施可能であり、HLA適合ドナーが見出せない場合の、代替移植ドナーとして非常に有用である。しかし、臍帯血移植は他の移植ソースと比較し、感染症などの移植後早期の合併症の頻度が高いという問題点があり、その克服が必要である。各国において予後予測因子の解析が行われているが、欧米と日本では臍帯血移植の成績は異なるため、その結果の外挿性が障壁となっている。外挿性に関する問題点を解決するため、まず、欧州骨髄移植学会および欧州臍帯血研究施設であるユーロコードと日本造血細胞移植学会・日本造血細胞移植データセンターとの共同研究基盤を確立した。そして、欧州および日本のレジストリーデータに収集されている臨床データの各項目を詳細に検討し、会議を通じて、各レジストリーデータの変数および統合用変数のdictionaryを作成した。そのdictionaryに従い、両レジストリーの急性白血病に対する臍帯血移植の統合データセットを作成した。統合した造血幹細胞移植のデータセットにおいて、患者と臍帯血のHLA適合度、臍帯血有核細胞数、各施設の移植経験数、性別、移植年代、GVHD予防法、その他、様々な背景因子が移植成績に及ぼす影響に関して解析を行い、両レジストリーデータの移植成績に影響を及ぼす因子の類似点、相違点を明らかにした。その結果に関して、欧州骨髄移植学会や日本血液学会にて口頭発表を行った。最も大きな課題であった、欧州骨髄移植学会・ユーロコードと日本造血細胞移植学会の急性白血病に対する臍帯血移植データの統合が行えたことは非常に大きな第一歩である。またその統合データを用いて、各レジストリーデータ内で臍帯血移植成績に影響を及ぼす因子の比較を行い、HLA適合度や臍帯血有核細胞数が移植成績に与える影響に関して検討できたことは評価に値する。レジストリーデータ統合解析の次は、保存サンプルの統合解析を目指しており、今後は、利用可能な検体を用いて、HLA-A,-B,-DRB1座のみならずHLA-C,-DPB1,-DQB1座のタイピングを行うことや、HLA抗体が生着に及ぼす影響などの検討を予定している。またKIR不一致が移植成績に及ぼす影響を明らかとするためKIR typingの検討も課題である。その他、HLAハプロタイプの推定およびハプロタイプの種類が移植成績に及ぼす影響を明らかとすることも重要である。また、各レジストリーデータにおいて、急性および慢性GVHDが移植成績に及ぼす影響を詳細に解析することも予定している。
細胞シート工学を応用した関節軟骨部分損傷の修復・再生に関する研究

【目的】我々は角膜、心筋等の分野で臨床応用されている細胞シートの軟骨損傷治療への適用を検討している。本研究の目的は温度応答性培養皿を用いて作製したヒト軟骨細胞シートの特性を明らかにすることである。【方法】患者10人の承諾を得て膝前十字靭帯再建術の顆間形成の際に採取した軟骨を酵素的に処理して細胞を単離した。実験に際し、以下の3群を作製した。1.従来の培養皿での単層培養群、2.温度応答性培養皿を用いて作製した細胞シート群、3.3層に積層化して更に1週培養した積層化シート群である。形質発現や接着因子等の遺伝子発現状況を網羅的に確認するためcDNAマイクロアレイを実施し、その後、有意差を認めた遺伝子群に関してアルタイムPCRを実施し群間比較を行った。【結果および考察】軟骨細胞シートは、積層化することでII型コラーゲンとアグリカンの1.5倍以上、SOX9の2倍以上の統計学的有意な発現増加が確認され、形質発現を維持し得ることがわかった。またFibronectinとGap43の2倍以上の有意な発現増加も認め、十分な接着性とバリア機能も保持していることが推察された。さらに、マトリックス変性助長に関与し、変形性関節症発症にも関与が指摘されているMMP-3、MMP-13、ADAMTS5等の発現が積層化シートでは一様に有意に抑制されることを確認した。以上より、積層化シートは形質発現を維持しながら、軟骨損傷部からのプロテオグリカン流出を阻止し、Catabolic factorから損傷部を保護することで軟骨修復に寄与するものと考えられた。【結論】ヒト軟骨細胞シートの特性をmRNA発現レベルで明らかにした。軟骨細胞シートは優れた接着性と軟骨保護作用を有し、関節軟骨修復に寄与すると考えられた。<目的>温度応答性培養皿の性質を利用し、培養軟骨細胞を細胞外マトリックスを温存したままシート状に回収し、さらに積層化させたシートを関節軟骨損傷部へ移植することで、軟骨修復に寄与するかどうかを検討した。<方法>膝前十字靭帯再建術時に患者同意のもと、得られたヒト関節軟骨、滑膜(n=25)から細胞を単離し、温度応答性培養皿に播種した。コンフルエントになった時点で低温処理を行うと、培養関節軟骨細胞並びに滑膜細胞は細胞外マトリックスを温存したままシート状に回収可能であった。軟骨細胞は単層培養では脱分化し、その形質維持が困難であるため、軟骨細胞シートを3層まで積層化し、単層培養時との遺伝子発現をreal-time PCR法にて比較し評価した。次に、軟骨細胞シートの接着性、軟骨修復効果を評価するため日本白色家兎を用いたin vivoの実験を行った。日本白色家兎の膝関節軟骨を約1mm部分欠損させ、幼弱家兎軟骨から作製した積層化軟骨細胞シートを移植した群と非移植群をそれぞれ作製した(n=8)。4週間後の組織切片を作製し、サフラニン-0染色にて評価した。<結果>軟骨細胞シートは細胞外マトリックス内の接着因子も温存されているため積層化が可能でScaffoldを用いずに3次元構造体を作製することができた。また軟骨細胞シートと滑膜細胞シートの組み合わせでも積層化可能であった。Real time PCR法で評価すると接着因子であるファイブロネクチンの発現が上昇しており、軟骨細胞の形質維持を示唆するtype IIコラーゲン、アグリカンの発現も上昇していた。

また、軟骨破壊を助長する因子であるMMP-3,13、ADAMTS-5の発現が積層化することで有意に減少しているのに対し、MMP-3の拮抗因子であるTIMP-1の発現は上昇していた。日本白色家兎を用いたin vivoの実験では、膝関節軟骨部分欠損部に積層化軟骨細胞シートを移植すると、細胞シートは直接的に生体内の軟骨組織に強固に接着しており、非移植群と比較し、組織学的に変性抑制効果が認められた。【目的】我々は角膜、心筋等の分野で臨床応用されている細胞シートの軟骨損傷治療への適用を検討している。本研究の目的は温度応答性培養皿を用いて作製したヒト軟骨細胞シートの特性を明らかにすることである。【方法】患者10人の承諾を得て膝前十字靭帯再建術の顆間形成の際に採取した軟骨を酵素的に処理して細胞を単離した。実験に際し、以下の3群を作製した。1.従来の培養皿での単層培養群、2.温度応答性培養皿を用いて作製した細胞シート群、3.3層に積層化して更に1週培養した積層化シート群である。形質発現や接着因子等の遺伝子発現状況を網羅的に確認するためcDNAマイクロアレイを実施し、その後、有意差を認めた遺伝子群に関してアルタイムPCRを実施し群間比較を行った。【結果および考察】軟骨細胞シートは、積層化することでII型コラーゲンとアグリカンの1.5倍以上、SOX9の2倍以上の統計学的有意な発現増加が確認され、形質発現を維持し得ることがわかった。またFibronectinとGap43の2倍以上の有意な発現増加も認め、十分な接着性とバリア機能も保持していることが推察された。さらに、マトリックス変性助長に関与し、変形性関節症発症にも関与が指摘されているMMP-3,MMP-13,ADAMTS5等の発現が積層化シートでは一様に有意に抑制されることを確認した。以上より、積層化シートは形質発現を維持しながら、軟骨損傷部からのプロテオグリカン流出を阻止し、Catabolic factorから損傷部を保護することで軟骨修復に寄与するものと考えられた。【結論】ヒト軟骨細胞シートの特性をmRNA発現レベルで明らかにした。軟骨細胞シートは優れた接着性と軟骨保護作用を有し、関節軟骨修復に寄与すると考えられた。
1950年代フランスの統合政策と仏独経済関係

平成18年度は、16年度および17年度の研究成果を発展させ、これまで収集した一次史料をもとに博士論文「フランスのヨーロッパ統合政策と経済近代化-1950年代における国内農工関係と仏独経済関係-」を執筆・提出した(現在審査中)。本論文は、従来の統合史研究において看過されてきた農業問題にも着目し、フランスのヨーロッパ統合政策を工業のみならず農業をも含めた経済政策全体と関連付けて再検討することを試みるものである。具体的には、第1章において、1950年代前半までの経済近代化政策遂行の過程でフランス国内の農工関係がいかに規定され、その結果が統合政策にどのように影響したかを明らかにした。第2章では、ローマ条約交渉期における共同市場構想へのフランスの対応を「社会的負担の調和」要求の視点から検討し、ドイツ企業との競争の脅威を解消する試みがいかになされたかを明らかにした。第3章では、共同市場受諾を国内の農業政策との関連において検討することで、共同市場への農業包含の意義を明らかにした。第4章では、自由貿易圏構想の動向とフランスの統合政策の関連について検討し、フランスが最終的に同構想を拒否した理由を明らかにした。これにより、本論文は、農業国かつ工業国であるという特殊性を持つフランスにとって、EECが農業と工業双方の近代化と、その並行的発展を可能にする枠組みであったことを明らかにしており、フランスのEEC受諾理由を工業近代化の課題に求める従来の研究に対して、新たな統合像を提供するものと思われる。一般的にEECの設立はフランス農業にとって大きな利点があったと理解されているが、これまでの統合史研究はもっぱら工業部門の検討に重点をおき、フランスがEECの共同市場創設を受け入れるにあたって、農業問題をどのように検討したかについては明らかにしていない。したがって本年度は、1950年代初頭のヨーロッパ農業共同体構想から、EECの共通農業政策の基本ラインを定めたストレーザ会議の時期におけるフランスの統合政策と国内の農業政策の関連を探ることを課題とした。とりわけこの期間が第二次近代化計画の策定および実施期間、さらに第三次近代化計画の策定期間に一致することから、両計画における農業近代化政策がヨーロッパ統合の進展におけるフランスの態度決定にいかに繁栄されたかを検討することを主眼とした。このため、まずヨーロッパ農業共同体構想および近代化計画に関する先行研究の整理を行った上で、以下の3ヶ所の文書館において一次史料の収集を行った。(1)フランス外務省(経済金融局文書)、(2)パリ国立文書館(計画庁文書および「ヨーロッパ経済協力関係問題省間会議事務局」文書)、(3)現代史料センター(農業省文書、「ヨーロッパ経済協力関係問題省間会議事務局」文書)。本年度の研究成果については、来年度発行の『現代ヨーロッパ社会経済政策の課題と展開(仮題)』(廣田功編、2005年10月発行予定)において発表予定である。また、本年度は、『ヨーロッパ統合と国際関係』(木畑洋一編、2005年4月末発行予定)に収録されるパトリック・フリダンソン執筆論文、「ヨーロッパ統合とフランス(1920-1990年)-政治家のヨーロッパか、企業のヨーロッパか-」の翻訳を行った。フランスはEUの共通農業政策の受益国であるにもかかわらず、従来の研究はフランスの統合政策と工業近代化の問題を重視し、農業問題との関連は看過されてきた。本年度の研究は、主として計画庁文書を用い、戦後フランスの農業政策の視点から統合政策を検討することを主眼とした。この成果は、論文「戦後フランスの農業政策とヨーロッパ統合(1945-57年)」(『現代ヨーロッパの社会経済政策-形成と展開』)において発表した。これにより、ローマ条約交渉の過程でフランスが要求した農業に関する要求は、従来指摘されているような貿易収支改善のための輸出利害にとどまらず、国内における経済近代化計画の推進と密接に関係していることが明らかとなった。戦後の近代化計画推進の過程において、工業と農業の発展の要素が緊密に結びついた結果、フランス政府にとって、工業か農業の一方を犠牲にした政策の実施は不可能となった。したがってローマ条約によって設立された共同市場は、次の二つの意味において近代化実施の最適な枠組みであったのである。それは、一方で、価格競争力が低い農産物に市場と保護を提供する枠組みであり、他方で、工業製品の価格低下と離農者の受け皿の拡大をもたらす工業近代化の達成に適した枠組みであった。さらに、この研究内容を発展させ、次に工業利害の観点から見た農業近代化の意義について詳細に検討するため、国立文書館(パリ)、産業界史料センター(ルーベ)において一次史料収集を行った。

第3章では、共同市場受諾を国内の農業政策との関連において検討することで、共同市場への農業包含の意義を明らかにした。第4章では、自由貿易圏構想の動向とフランスの統合政策の関連について検討し、フランスが最終的に同構想を拒否した理由を明らかにした。これにより、本論文は、農業国かつ工業国であるという特殊性を持つフランスにとって、EECが農業と工業双方の近代化と、その並行的発展を可能にする枠組みであったことを明らかにしており、フランスのEEC受諾理由を工業近代化の課題に求める従来の研究に対して、新たな統合像を提供するものと思われる。
膠原病抑制遺伝子に関する病態機能解析ならびに治療展開研究

1.SAPを介した自己免疫現象の発現機序(古川、小野、石井)自己免疫性肝炎の疾患モデルとされるConAレクチン誘導肝炎(ConA肝炎)をSAP欠損マウスなどに誘導し、その機序に関して次の新たな知見を得た。・ConA肝炎には、SAPが抑制的に作用している。・SAFの抑制は、Fasリガンドに依存しない肝細胞傷害エフェクター細胞に作用している。2.自己免疫疾患に関わるSALMファミリー受容体の同定(古川、小野)各種SLAMファミリー受容体遺伝子の細胞外領域のみを可溶性タンパク質として発現するDNA構築を作製した。また、作製したDNA構築を生体内で発現させる系として利用する急速静脈注入法条件の至適化を行った。3.アレルギーと血小板機能(小野)cinn遺伝子をC57BL/6J(B6)に退交配で導入したコンジェニック系統(B6^<sinn/sinn>)に、IgE依存性アナフィラキシー反応を誘導し、この生体反応系における血小板の機能を評価した。その結果、血小板はアナフィラキシー反応の遅発相に抑制的に作用することが分かった。4.関節炎と血小板機能(小野)血小板の関節炎促進効果を確認1.SAPを介した自己免疫現象の発現機序(古川、小野、石井)自己免疫性肝炎の疾患モデルとされるConAレクチン誘導肝炎(ConA肝炎)をSAP欠損マウスなどに誘導し、その機序に関して次の新たな知見を得た。4.関節炎と血小板機能(小野)血小板の関節炎促進効果を確認私たちは、膠原病疾患モデルマウスの中から正常化マウスを分離し、そこに「正常化」の原因となった突然変異、すなわち膠原病抑制変異の同定を試みてきた。実際これまでに、ポストゲノムの遺伝子情報を活用することにより、2種の膠原病抑制変異の同定に成功している。さらに、これらの変異マウスの詳細な解析から、膠原病の病態に関わる新たな分子や組織傷害のエフェクター細胞が想定されており、現在、この新しい着想を基に新たな疾患制御法を想起するに至っている。本研究は、上記2変異の正常の遺伝子機能が、どのように病的カスケードに作用して膠原病発症に導いているのかを明らかにし、その理解の上に、免疫・炎症性疾患の新治療法を提案し、動物実験でその有効性を検証することを目的とした。平成16年度は、研究計画2-1.SAPを介した自己免疫現象の発症機序、ならびに2-2.自己免疫現象に関わるSAPの上流分子の同定、に関する研究を重点的に行った。結果は次にまとめられる。1.MRL/lprマウスより調整した脾細胞分画(CD4,CD8,CD4/CD8-DNなど)をSAP欠損マウスに移入した。自己免疫現象の再構築性に関して現在解析中。2.SAP上流にあるSALMファミリー受容体の1つである2B4受容体の単クローン抗体を作製した。本受容体が自己免疫に関わる可能性を調べるため、抗2B4抗体を精製してMRL/lprマウスに投与した。抗体投与がもたらす自己免疫現象の変化に関して現在解析中。3.SAPに関連する各受容体の可溶型分子をデザインし、アデノウイルスベクターに導入した。これらの可溶性受容体をMRL/lprに発現させて、自己免疫病に最も関わるSALMファミリー受容体の同定を進めている。膠原病疾患モデルマウスの中から正常化マウスを分離し、そこから「正常化」の原因となる突然変異の同定を試み、2つの変異遺伝子の同定に成功した(Komori H, et al.J Immunol 2006)。これらの変異マウスの解析から、膠原病の病態に関わる新たな分子や組織傷害のエフェクター細胞の同定(16年度計画の継続課題)に取り組む一方で17年度計画の課題に着手し、次の成果を得ている。1.16年度の計画の継続課題SAP分子の上流にあるリンパ球受容体4種(2B4,SLAM, Ly108,CD89)の可溶型遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクター、また、細胞株を構築中である。2.血小板分泌機能を利用したドラッグ・デリバリーシステムの開発血小板機能不全マウスより、急速進行性糸球体腎炎(RPGN)に血小板が重要な役割を果たすことを示した。様々なRPGN発症モデルで血小板の重要性を検討した結果、RPGNにも血小板依存性と非依存性の病態が存在することを突き止めた。血小板機能のターゲット治療は、前者の場合にしか望めないことになる。したがって現在、ヒトのRPGNにおいて、そのような2群が存在するかどうかを検討している。

今年度は、動物実験レベルで、骨髄移植の急性GVHDやRPGNの抑制に著効を示す新規経口免疫抑制剤の開発に成功した(Saiga K, et al.Bone Marrow Transplant 2005)。現在、日本化薬株式会社と共同で、本免疫抑制剤に関する血小板分泌機能を利用したドラッグ・デリバリーシステムを開発中である。生体内に導入するベクターを作製中である。4.アレルギー反応(マスト細胞の脱顆粒)ならびにアレルギー性炎症の抑制の試みSAP変異の骨髄マスト細胞では、IgEと抗原刺激による脱顆粒反応、TNF, IL-6などのサイトカイン産生に異常がないことを確認した。1.SAPを介した自己免疫王象の発現機序(古川、小野、石井)自己免疫性肝炎の疾患モデルとされるConAレクチン誘導肝炎(ConA肝炎)をSAP欠損マウスなどに誘導し、その機序に関して次の新たな知見を得た。(1)ConA肝炎には、SAPが抑制的に作用している。(2)SAPの抑制は、Fasリガンドに依存しない肝細胞傷害エフェクター細胞に作用している。2.自己免疫疾患に関わるSALMファミリー受容体の同定(古川、小野)各種SLAMファミリー受容体遺伝子の細胞外領域のみを可溶性タンパク質として発現するDNA構築を作製した。また、作製したDNA構築を生体内で発現させる系として利用する急速静脈注入法条件の至適化を行った。可溶性タンパク質の導入は現在実施中。3.アレルギーと血小板機能(小野)cinn遺伝子をC57BL/6J (B6)に退交配で導入したコンジェニック系統(B63^<sinn/sinn>)に、IgE依存性アナフィラキシー反応を誘導し、この生体反応系における血小板の機能を評価した。その結果、血小板はアナフィラキシー反応の遅発相に抑制的に作用することが分かった。4.関節炎と血小板機能(小野)血小板の関節炎促進効果を確認中。
心理的要因を考慮したリスク設計工学のための基礎的研究

本研究の目的は、『(死亡)リスクの許容限界を、リスクが経時変化した後一定に落ち着いたところに求める』とするC.Starrの先駆的研究をはじめとした内外の数多くのリスク認知研究の成果を踏まえながら、社会生活上の種々の人命リスクおよびその変動を定量的に同定し、それらのリスク値・リスク変動が市民にどのように認知されているかを明らかにするとことである。環境刺激の認知に関しては、例えはいくつかの環境科学の研究において、人間の温冷感は環境温度の絶対値よりも温度変化に強く影響されている領域のあることが見いだされており、本研究ではリスク認知がある時点でのリスクの絶対値ではなくリスクの経時変化に強く影響を受けるとの仮説をもって分析を行った。具体的には、疾病、事故・災害による死亡リスクを生活上関わった時間当たりの死亡率という形で各種公的統計資料に基づいて同定し、さらにその経時変動を明らかにした。一方それらのリスクに対する心理評価を、死亡者数および危険度を解答するアンケート調査により求めた。このアンケート調査は1988年と1995年の2度にわたって行ったものであり、これらの結果の比較により心理評価の経時変動も併せて分析できるよう計画されたものである。死亡リスクと心理評価を重ね合わせることで以下の点が明らかとなった。・各死因に対する死者数の推定と危険性の評価は疾病、事故・災害を問わず強い相関関係をもち、さらに、死者数を小さく推定する死因は安全であり、大きく推定する死因は危険だと評価している、・死亡リスクの経時変動に対して、疾病の場合はリスクが減少している死因を安全と評価している一方、事故・災害ではリスクが減少している死因を危険と評価しており、疾病と事故・災害では危険性の心理評価が異なる傾向にある、・過去25年間の死亡リスクの経時変動が全体的に小さくなりつつある中で、2回のアンケート調査より得られた心理評価は、各死因の危険性を高く判断するよう変化してきている。平成7年度の研究において対象とした死因は疾病19項目、事故・災害14項目であり、各死因に対して、各種公的統計資料より得られる客観的統計値として、1969年1993年の各年の(1)[死者数]、同期間における(2)[死亡率]、報告者が提案している(3)[死亡率の年変動指標α]、および死亡リスクに対する心理的・主観的評価値として1995年実施のアンケート調査より得られる、(4)[死者推定値]、(5)[死亡危険度評定値]、の諸量を求め、さらに、1988年に実施した同様のアンケート調査結果を比較対照データとして併せて考察した結果、本年度の研究により以下の点が明らかとなった。(1)各死因における1969年1993年の25年間にわたる死亡率の変動が、報告者の提案する指数関数によくあてはまり、ここで得られるパラメータαが死亡リスクの変化を表現する指標として適切であることが確認された。(2)変動指標αと1995年の死者数統計値との関係から、疾病、事故・災害とも、死者数の多い死因ほど死亡率が増加している、あるいは死亡率が減少しにくい傾向にあることが明らかとなった。(3)1969年1986年の18年間におけるαと、1976年1993年の18年間におけるαの比較より、「腎炎」「肺炎」を除いた全ての死因項目でαの値がゼロに漸近していることが明らかとなり、死亡危険に関して、死亡率の変化が穏やかになってきている、あるいは死亡率が変化しにくくなってきている現状が示された。

(4)死亡リスクに対する心理評価の一側面と考えている死者推定値に関して、1995年アンケートの結果は、1988年アンケートの結果に対して、疾病では[栄養失調]を除いた全ての死因項目で、事故・災害では「全ての自然災害」を除いて、より低く推定する傾向にあり、一方、心理評価の他の側面と考えている危険度評定では、「肺炎」を除いた全死因項目で1995年の方がより危険だと判断していることが明らかとなった。以上明らかになった点に加えて、既往の研究で報告者が示した結果の一つであるαと危険度評定値との関係、すなわち疾病においては死亡率が変化しない死因ほど危険とみなし、事故・災害においては死亡率が減少している死因ほど危険とみなしていること、を考慮しながら特に上述(3)、(4)を併せ見ると、死亡率が変化しない死因を危険とみなす傾向が、今日の死亡リスクに対する社会的評価の現状を示しているものと推測される。本研究の目的は,『(死亡)リスクの許容限界を、リスクが経時変化した後一定に落ち着いたところに求める』とするC.Starrの先駆的研究をはじめとした内外の数多くのリスク認知研究の成果を踏まえながら、社会生活上の種々の人命リスクおよびその変動を定量的に同定し、それらのリスク値・リスク変動が市民にどのように認知されているかを明らかにすることである。環境刺激の認知に関しては、例えばいくつかの環境科学の研究において、人間の温冷感は環境温度の絶対値よりも温度変化に強く影響されている領域のあることが見いだされており、本研究ではリスク認知がある時点でのリスクの絶対値ではなくリスクの経時変化に強く影響を受けるとの仮説をもって分析を行った。具体的には、疾病、事故・災害による死亡リスクを生活上関わった時間当たりの死亡率という形で各種公的統計資料に基づいて同定し、さらにその経時変動を明らかにした。一方それらのリスクに対する心理評価を、死亡者数および危険度を回答するアンケート調査により求めた。このアンケート調査は1988年と1995年の2度のわたって行ったものであり、これらの結果の比較により心理評価の経時変動も併せて分析できるよう計画されたものである。死亡リスクと心理評価を重ね合わせることで以下の点が明らかとなった.・各死因に対する死者数の推定と危険性の評価は疾病、事故・災害を問わず強い相関関係をもち、さらに、死者数を小さく推定する死因は安全であり、大きく推定する死因は危険だと評価している、・死亡リスクの経時変動に対して、疾病の場合はリスクが減少している死因を安全と評価している一方、事故・災害ではリスクが減少している死因を危険と評価しており、疾病と事故・災害では危険性の心理評価が異なる傾向にある、・過去25年間の死亡リスクの経時変動が全体的に小さくなりつつある中で、2回のアンケート調査より得られた心理評価は、各死因の危険性をより高く判断するよう変化してきている。
口腔内マイクロバイオーム形成機序および宿主免疫に及ぼす影響の解明

本研究期間内に、1口腔マイクロバイオームの形成機構の解明、2口腔内感染防御機構としての口腔マイクロバイオームの検証を行うことを目的としている。平成28, 29年度に分離したレンサ球菌を中心に、バクテリオシンが細菌叢形成に与える影響について検証した。(1)口腔細菌の性状解析:口腔から分離したS. mutans菌134株について、平成29年度に明らかにしたバクテリオシン遺伝子保有状況をもとに、バクテリオシン遺伝子破壊株を作成を試み、MutacinIおよびIVの破壊株を得た。得られた遺伝子破壊株を用いて、他種レンサ球菌との共培養試験を行った結果、他のレンサ球菌種の割合が欠損株との共培養の際に増加する傾向が認められた。(2)細菌叢解析:約200サンプルの唾液のメタゲノム解析を用いて、S. mutansの産生するバクテリオシンの種類と産生性との関連性について、検証したが、相関性は認められなかった。また、メタゲノム解析で同定された菌種について、菌種間での相関性について検証した結果、一部の菌種間で相関が認められた。(3)分離S.mutansのゲノム解読:分離したS. mutans全株について、国立感染症研究所薬剤耐性研究センターの菅井基行センター長との共同研究でゲノム解読を行ったが、DNAの抽出の問題で十分な結果が得られず、再度、全株のDNA抽出を行った。現在、ゲノム解読を再度実施中である。(4)鼻腔及び口腔からの黄色ブドウ球菌の分離:約300人の鼻腔及び口腔から黄色ブドウ球菌の分離を試み、115人から口腔・鼻腔のいずれかで分離できた。口腔の黄色ブドウ球菌の分離の有無と唾液細菌叢との関連性を検討したが、関連性は認められなかった。国立感染症研究所との共同研究で分離菌のゲノム解析を行った結果、同一人物の鼻腔と口腔由来の黄色ブドウ球菌では数塩基から数十塩基が異なっていることが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、口腔マイクロバイオームの多様性および形成機序を証明するための基盤研究および口腔マイクロバイオームによる生体に及ぼす影響を検証することである。そのため、本研究期間内に、1100名の口腔から各種口腔細菌の分離同定によるマイクロバイオームライブラリーの確立、2各種口腔分離細菌の性状解析、3各マイクロバイオームの生体への影響の検証を検証する予定であるが、平成28年度は口腔細菌の分離及び分離菌の性状解析を中心に行った。主な研究実績は以下の通りである。2)唾液サンプルの採取:200名からの刺激唾液を回収し、保存した。一部、予備実験として唾液からDNAの抽出を行い、定量性PCRで口腔レンサ球菌の同定、構成比率を算出した。3)分離菌の性状解析:分離したS. mutansについてバクテリオシンをコードする13の遺伝子の保有状況について検討した。また、S. mutansの産生するバクテリオシンの他細菌種に対する抗菌効果をdirect assay法により検討した。S. aureusについてもバクテリオシン感受性、過酸化水素感受性について検討した。4)共培養試験:数種の口腔レンサ球菌を用いて共培養試験の検討を開始した。本年度ではスクロース存在下での複数種の口腔レンサ球菌培養時の構成比率を検討した。当初の研究計画通りに、本年度は口腔細菌の分離・性状解析を順調に行っている。本年度はレンサ球菌、ブドウ球菌を中心に分離をしており、当初、100名からの分離を予定していたが、分離率の問題もあり、現時点で270名からの分離を行っている。分離した細菌の性状解析も遺伝子解析、抗菌活性の検討など順調に進んでいる。メタゲノム解析用の唾液の収集も順調であり200名からすでに回収しており、現在DNA抽出を開始している。本研究目的である口腔マイクロバイオームの多様性及び形成機序を明らかにするために、本年度は下記の研究成果を得た。1)唾液を用いたメタゲノム解析:昨年度に収集した刺激唾液サンプル191検体のメタゲノム解析をT-RFLP法を用いて解析を行った結果、細菌の種類、構成比率は個体差が大きかった。今後、分離した菌の性状解析の結果をもとに、関連性を検討していく。口腔の黄色ブドウ球菌の分離の有無との相関性の認められる菌種などを検討したが、現時点では明らかにできなかった。2)分離したS. mutansの解析:分離したS.mutans134株について、昨年度にバクテリオシン遺伝子保有状況を確認したが、さらにその発現性について検討を行った。当初、液体培地で培養し、発現解析を行ったが、多くのバクテリオシン遺伝子発現性が認められなかった。発現条件の検討した結果、寒天培地上での発現性が強く認められたため、全株の発現性を検討している。全ての解析が終了していないが、遺伝子を保有しているにもかかわらず、発現性を示さない株の存在があることが認められた。また、分離した菌株の全ゲノム配列の決定を行っており、次年度初めには解析が終了する。得られたゲノム情報から、各菌株の性状解析、バクテリオシン遺伝子の多型性等の解析を進める。3)レンサ球菌種の共培養試験:分離したS.mutansのバクテリオシン産生株を用いた、他種レンサ球菌との共

培養試験を行った結果、バクテリオシン産生菌の種類により、構成する比率が変化することが明らかとなった。本年度は、メタゲノム解析、分離菌の全ゲノム配列決定などに重点を置き、マイクロバイオーム形成と抗菌性因子との関連性を検討した。当初予定していたメタゲノム解析は本年度終了し、口腔細菌の分離もS. mutansについては十分に行えた。他レンサ球菌種や他属菌の分離も当初は同時に行う予定であったが、それぞれに操作が煩雑であるため、S. mutansを中心に行った。一部、同一口腔内から複数のレンサ球菌種、歯周病原因菌を分離しており、今後も必要に応じてさらに分離する。また、バクテリオシン遺伝子の発現性検証の結果から、株間での遺伝子発現性に多様性があるため、バクテリオシン遺伝子領域の多型性の可能性が認められたため、S. mutans134株について全ゲノム配列の決定を試みた。これまで、多検体でのS.mutansゲノム配列の比較はなく、今後の解析により有益な情報が得られることが予想される。共培養実験については、当初考えていたよりも、条件設定が難しかったが、寒天培地上で行うことで安定した結果が得られるようになってきており、今後さらに検討を行い、複数の菌種を用いた共培養系の確立ができると思われる。すでに、予備実験的にはバクテリオシン産生菌の種類や発現性により、in vitroでの口腔レンサ球菌種の構成比率は変化することを明らかにしている。宿主免疫に及ぼす影響の検討がやや遅れているが、これはゲノム解析などの実験が多く入ったためであるが、ゲノム解析からは有益な情報が得られることが期待されるため、全体的には順調に進んでいると判断できる。本研究期間内に、1口腔マイクロバイオームの形成機構の解明、2口腔内感染防御機構としての口腔マイクロバイオームの検証を行うことを目的としている。平成28, 29年度に分離したレンサ球菌を中心に、バクテリオシンが細菌叢形成に与える影響について検証した。(1)口腔細菌の性状解析:口腔から分離したS. mutans菌134株について、平成29年度に明らかにしたバクテリオシン遺伝子保有状況をもとに、バクテリオシン遺伝子破壊株を作成を試み、MutacinIおよびIVの破壊株を得た。得られた遺伝子破壊株を用いて、他種レンサ球菌との共培養試験を行った結果、他のレンサ球菌種の割合が欠損株との共培養の際に増加する傾向が認められた。(2)細菌叢解析:約200サンプルの唾液のメタゲノム解析を用いて、S. mutansの産生するバクテリオシンの種類と産生性との関連性について、検証したが、相関性は認められなかった。また、メタゲノム解析で同定された菌種について、菌種間での相関性について検証した結果、一部の菌種間で相関が認められた。(3)分離S.mutansのゲノム解読:分離したS. mutans全株について、国立感染症研究所薬剤耐性研究センターの菅井基行センター長との共同研究でゲノム解読を行ったが、DNAの抽出の問題で十分な結果が得られず、再度、全株のDNA抽出を行った。現在、ゲノム解読を再度実施中である。(4)鼻腔及び口腔からの黄色ブドウ球菌の分離:約300人の鼻腔及び口腔から黄色ブドウ球菌の分離を試み、115人から口腔・鼻腔のいずれかで分離できた。口腔の黄色ブドウ球菌の分離の有無と唾液細菌叢との関連性を検討したが、関連性は認められなかった。