hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管および腸管平滑筋の生理・生化学的差異に関する研究-平滑筋収縮の周期性の生理・生化学的機序-

刺激が継続するにも関わらず、細胞内Ca濃度の増加が一過性に終わる理由として、筋胃のCaチャネルが、電位依存性および細胞内Ca濃度依存性に不活化されるという特異な性格を持つチャネルであることが明かとなった。さらに、収縮蛋白系に関しては、他の多くの平滑筋でみられる受容体刺激による収縮蛋白系のCa感受性増大機構が観察されず、またサイクリックAMPやサイクリックGMP依存性キナーゼによるCa感受性低下もみられなかった。以上のように、phasic筋の典型例であると思われるニワトリ筋胃は、Caチャネルの性質、さらに収縮蛋白質のCa感受性の制御機構について他の筋とは大きく異なることが明かとなった。平滑筋はその収縮パターンからtonic筋およびphasic筋に分けられる。Tonic筋は刺激により持続性の収縮を発生するもので、多くの動脈がこれに当たる。Phasic筋は自発性の興奮性を持つ筋で、刺激により静止張力の上昇を伴わずに、自発性収縮の大きさのみが増強される筋である。消化管のある部分(胃、結腸の一部)がこれにあたる。混合型として、刺激により自発性収縮の大きさが増大するとともに、静止張力も増大するタイプの筋も存在する。この様な平滑筋は極めて多く、血管、消化管のある部分、末梢の動脈、静脈、生殖器系の平滑筋臓器などが挙げられる。この様な収縮パターンは、生体内でそれぞれの目的にかなった生理的役割を演じているものと解釈される。独特の収縮制御機構の存在が予想されるにもかかわらず、これに関する研究はほとんど行われていない。本年度は;1)tonic筋であるラット大動脈とphasic筋である門脈(静脈)の収縮パターンおよび細胞情報伝達系の差異を、最近注目されている新規平滑筋収縮物質であるエンドセリンをアゴニストとして選び比較した。その結果、両平滑筋において受容体サブタイプが異なること、また細胞内Ca濃度上昇機構や収縮蛋白質のCa感受性に差が見られることが明らかとなった。2)さらに、phasic筋である子宮平滑筋に注目し、妊娠の経過に伴う収縮性の変化を観察した。その結果、血小板活性化因子(PAF)の感受性が妊娠と共に著しく変化することを見いだし、PAFが妊娠維持あるいは分娩時の子宮の収縮性変化に大きく関与することが示された。その他、妊娠と共に収縮蛋白系の構成が変化することも明らかにされた。Phasic筋は自発性の興奮性を持つ消化管のある部分(胃、結腸の一部)がこれにあたる。この様な収縮パターンは、生体内でそれぞれの目的にかなった生理的役割を演じているものと解釈され、独特の収縮制御機構の存在が予想されるにもかかわらず、これに関する研究はほとんど行われていない。本研究は、各種平滑筋の収縮蛋白系の生化学的性格を比較し、機能との関連を明らかにすることを目的として計画されたが、本年度は以下の知見を得ることが出来た。1)子宮平滑筋は典型的なphasic筋であり分娩時に律動的に収縮を繰り返し、胎児を分出する。従来この律動性収縮の発現にはオキシトシンやプロスタグランジン類が関与されるとされてきたが、今回は血小板活性化因子(PAF)に注目し、妊娠後期の子宮筋がPAFに対して高い感受性を有することを発見し、新たな分娩誘発物質の候補として提唱した。
前立腺癌の骨転移巣形成を促進するTGFβをMMP13が活性化するメカニズムの解明

前立腺癌の骨転移巣では、腫瘍細胞と宿主の間質細胞である骨芽・破骨細胞が相互作用し骨転移巣が形成される。一方、MMPは腫瘍・間質相互作用で重要な役割を果たすことが知られている。本研究では、どのMMPがどのように骨微小環境での腫瘍間質相互作用に働くかを検討した。我々の開発した動物モデルを用い、ラット前立腺癌が溶骨・造骨性変化を伴い増殖する組織像が観察される骨浸潤先進部と対照として非浸潤部からRNAを抽出し、microarray解析した結果、浸潤先進部では、MMP7とMMP13が高発現していた。我々はMMP13に着目し、MMP13の免疫染色を行ったところ、ラットの骨芽細胞が陽性であった。さらにMMP13を抑制するONO4817をラットに経口投与したところ、骨浸潤先進部における活性型TGFβの濃度が減少し、破骨細胞の誘導と溶骨性変化の抑制が観察された。以上より、前立腺癌が増殖する骨微小環境では、潜在型TGFβが骨芽細胞由来のMMP13により活性化され、前立腺癌や破骨細胞にTGFβのシグナルが伝達された結果、前立腺癌の骨転移巣が進展することが考えられ、MMP13は骨微小環境での腫瘍・間質相互作用で重要な役割を果たすことが示唆された。我々はこれまでに、前立腺癌の骨転移巣では溶骨性変化に伴い骨基質から放出されるTGF-βが骨転移巣の進展を促進することを見いだした。本研究ではTGF-βがプロテアーゼにより活性化後にシグナルが細胞内へと伝達されることに着目し、rat collagenase 3(MMP13)が骨微小環境でのTGF-βの活性化すると仮説を立てて実験を行った。【方法と結果】我々の開発した動物モデルを用いて、ラット前立腺癌が溶骨・造骨性変化を伴い増殖する組織像が観察される骨浸潤先進部と、対照として非浸潤部から蛋白を抽出したところ、TGF-βの量は骨浸潤先進部で有意に上昇していた。MMP13免疫染色を行ったところ、骨芽細胞にMMP13陽性であった。また、MMP13に特異的な基質を用いて骨浸潤先進部および非浸潤部の酵素活性を測定したところ、骨浸潤先進部におけるMMP13の酵素活性は非浸潤部に比べて有意に上昇していた。さらに、MMP13の阻害作用をもつONO4817を投与した結果、骨浸潤先進部における活性型TGF-βの濃度が減少し、破骨細胞の誘導の抑制と、溶骨性変化の抑制が観察された。【結論】前立腺癌が増殖する骨微小環境では、骨芽細胞由来のMMP13が、骨基質から遊離した潜在型TGF-βを活性化し、破骨細胞にTGF-βシグナルが伝達され、溶骨性変化が進展することが示された。我々の開発した動物モデルを用い、ラット前立腺癌が溶骨・造骨性変化を伴い増殖する組織像が観察される骨浸潤先進部と対照として非浸潤部からRNAを抽出し、microarray解析した結果、浸潤先進部ではMMP7とMMP13が高発現していた。免疫染色の結果、MMP7は破骨細胞に陽性であり、MMP13は骨芽細胞に陽性であった。MMP7は、RANKLを切断して可溶型RANKLを生成し、これが破骨細胞を誘導・活性化した。さらにMMP7ノックアウトマウスを用いた実験により、MMP7の作用を減少させると可溶型RANKLの生成が抑制され、破骨細胞の誘導が減少し、溶骨性変化が有意に抑制された。一方、MMP13を抑制するONO4817をラットに経口投与したところ、骨浸潤先進部における活性型TGFβの濃度が減少し、破骨細胞の誘導と溶骨性変化の抑制が観察された。

以上より、前立腺癌が増殖する骨微小環境では、破骨細胞由来のMMP7は骨芽細胞のRANKLを可溶型にすることで溶骨性変化を促進すること、骨芽細胞由来のMMP13は骨基質から放出されたTGFβを潜在型から活性型へと変換し、前立腺癌や破骨細胞にTGFβのシグナルが伝達された結果、前立腺癌の骨転移巣が進展することが明らかとなった。このように、骨微小環境における腫瘍・間質相互作用においてMMP7とMMP13が重要な役割を果たしていることが明らかとなり、MMP7およびMMP13は前立腺癌骨転移の治療標的分子となり得ることが示唆された。
植物ＲＮＡｉに関わるＲＮＡポリメラーゼＲＤＲ６が異常ＲＮＡを識別する分子機構

今までの研究により外来遺伝子による転写後遺伝子抑制(PTGS)は外来遺伝子から生成されたpoly(A)鎖のないRNAがPTGSの引金になる事が明かとなった.しかしながら,植物には内在のpoly(A)鎖を持つRNAにもかかわらず, PTGSの標的になるRNAが存在する.このRNAは特殊なRISCによってターゲティングされることが知られている.その代表例であるTAS3 RNAはRISCの標的部位を二つ持っていて5'側標的部位はRISCと結合し, 3'側標的部位はRISCによって切断される. TAS3の二つの標的部位はTAS RNAから生成される二次的小分子RNA (phasiRNA)生合成に重要であることが知られている.しかしながら,なぜRISCによるTAS3のターゲティングがphasiRNA生成に重要なのかについては未だにわかっていない.上記の疑問を解決するために,私はphasiRNAの試験管内再現を試した.タバコ培養細胞抽出液にTAS3によるphasiRNA生成経路に必要である因子らを発現させてからTAS3 RNAを入れることでphasiRNAが生成が確認された.この結果により,私はTAS3 RNAによるphasiRNA生合成に成功した.次にRISCによる切断がPTGSの開始ステップである二本鎖RNA合成に影響を及ぼすのかを調てみた.その結果, RISCの標的部位どちらかに変異が入っている場合,合成された相補鎖RNAは検出されなかった.この結果から, RISCによる結合とRISCによる切断は二本鎖合成に必要であることが明らかとなった.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。植物には二次的小分子RNA増幅機構が存在する.この機構はRISCによって切断されたmRNA,ウイルスRNA,外来遺伝子由来のRNAといった「異常なRNA」に対して作動する.それらのRNAはRNA依存性RNAポリメラーゼ6(RDR6)によって相補鎖が合成され二本鎖化した後, Dicer様タンパク質によって21塩基および22塩基の小分子RNAに裁断される.これらの二次的小分子RNAは新たなAGOとRISCを形成することで,標的の遺伝子発現を強く抑制する.しかしながら,なぜ細胞内に存在する「正常なRNA」はRDR6の鋳型にならず「異常なRNA」のみ鋳型になるのかという重要問題は未だ解決されていない状況であった.ところで,リコンビナントRDR6を用いてRDR6の機能を解析した結果, RDR6はpoly(A)を持たないRNAのみを選択的に鋳型とし,相補鎖を合成することが明らかとなった.今年度は「RDR6の鋳型特異性」を生化学的手法を用いて詳細に解析した.解析により, RDR6は相補鎖合成の開始段階においてpoly(A)鎖を持つRNAを排除することが明らかとなった.そして, RDR6は8塩基以上のpoly(A)鎖を鋳型として認識しないことが明らかになった.ここまでの結果を纏めて科学雑誌に投稿し,公開された.本研究課題の最終目標は,「RDR6の鋳型選択機構を詳細に理解する」ことである.当初の計画通り生化学手法を用いた実験で, RDR6の酵素活性は詳細に解析できている.しかしながら, RDR6は細胞内において単独で働くわけではなく,様々な因子らと共に二次的小分子RNA増幅機構に関わっている.従って細胞実験でのRDR6働きを観察することは重要であるが,実験系の構築が非常に難しかった.植物細胞での実験は進めなかったが,生化学手法を用いて分かってきたRDR6の性質を論文として纏めたため,概ね順調であると評価した.今までの研究により外来遺伝子による転写後遺伝子抑制(PTGS)は外来遺伝子から生成されたpoly(A)鎖のないRNAがPTGSの引金になる事が明かとなった.しかしながら,植物には内在のpoly(A)鎖を持つRNAにもかかわらず, PTGSの標的になるRNAが存在する.このRNAは特殊なRISCによってターゲティングされることが知られている.その代表例であるTAS3 RNAはRISCの標的部位を二つ持っていて5'側標的部位はRISCと結合し, 3'側標的部位はRISCによって切断される. TAS3の二つの標的部位はTAS RNAから生成される二次的小分子RNA (phasiRNA)生合成に重要であることが知られている.しかしながら,なぜRISCによるTAS3のターゲティングがphasiRNA生成に重要なのかについては未だにわかっていない.上記の疑問を解決するために,私はphasiRNAの試験管内再現を試した.タバコ培養細胞抽出液にTAS3によるphasiRNA生成経路に必要である因子らを発現させてからTAS3 RNAを入れることでphasiRNAが生成が確認された.この結果により,私はTAS3 RNAによるphasiRNA生合成に成功した.次にRISCによる切断がPTGSの開始ステップである二本鎖RNA合成に影響を及ぼすのかを調てみた.その結果, RISCの標的部位どちらかに変異が入っている場合,合成された相補鎖RNAは検出されなかった.この結果から, RISCによる結合とRISCによる切断は二本鎖合成に必要であることが明らかとなった.平成29年度は,当初の計画通り,鋳型RNA選択に関わるRDR6の機能ドメインの同定する.具体的に, RNA認識モチーフを欠損したRDR6を用いてゲルシフト法及びフィルターバインディング法でRNAとの相互作用を調べる.そして,植物細胞抽出液を用いて二次的小分子RNA増幅メカニズムに関わる因子らをin vitro翻訳させ,「RISCによる切断→RDR6による相補鎖合成」という諸過程の産物を検出する実験系を構築する.

この系の構築により,細胞内でのRDR6の役割を詳細に理解できると考えられる.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
UAVを利用した熱帯季節林の減少・劣化量把握

本研究では無人航空機(UAV,ドローン)を利用した正確で安価な森林減少・劣化量の推定技術を開発し,その検出限界を明らかにすることを目指している。本研究の対象地は,ミャンマー・カタ地区の国有林である。今年度は昨年度に引き続きUAV由来データからの森林減少・劣化量の推定を試みた。昨年度時点では,50mグリッドのスケールの場合,決定係数で0.48程度の精度で森林の劣化量を推定することができていた。今年度は推定精度の向上を目指して,誤差要因の検討と新たな統計モデルの開発を実施した。その結果,決定係数は0.77まで向上した。誤差要因として,複数の画像を重ね合わせる際の位置合わせの精度が重要であることが示唆された。熱帯地域においては,高精度のGNSSを活用して測量を行うことが難しい場合も多いので,本誤差要因を低減するような高精度なサーフェスマッチング技術の開発が今後重要であるといえた。また,その他の誤差要因として,伐採木がグリッドの外にはみ出している場合には,伐採した木の周囲のグリッドでは減少量を過大評価する傾向が見られた。また,択伐の際に周囲の木や灌木をなぎ倒してしまった場合にも,過大評価となった。さらに,航空機レーザスキャナを用いて択伐の把握を目指した他地域での研究と比較した。その結果,本研究の結果は既往の結果に比べて精度が高いことがわかった。この理由として,まず考えられるのは,過去の研究では,伐採前と伐採後のデータを収集する期間が数年と長く,択伐以外の森林減少要因(例えば枯損)を誤差要因として含むことである。また,既往の研究では,伐採前と伐採後,それぞれでバイオマス推定モデルを構築し,両者の差分から減少量を推定している。本研究は,減少量を直接推定したため精度が高まったと考えられた。本研究では無人航空機(UAV,ドローン)を利用した正確で安価な森林減少・劣化量の推定技術を開発し,その検出限界を明らかにすることを目指している,今年度はUAV由来データの1)位置精度,2)林分構造の推定精度を明らかにすることを目的とした。本研究の対象地は,大分県長期育成循環施業モデル団地である。本対象地で実施された,UAVによる写真撮影のデータと地上測定のデータを入手し解析に利用した。UAVによる写真撮影データは,対空標識を10個程度設置したうえで撮影したものである。入手した写真データからStructure from Motion技術を利用して,林分の3次元データを作成した。地上測定データは,スギ・ヒノキ林それぞれ10ヵ所のプロットデータである。各データには,プロット内の樹木の直径と高さが記録されている。上記のデータを元にまずは位置精度の検証を行った。具体的には,作られた3次元データ内で示される対空標識の位置と実際の対空標識の座標の差を検証した。その結果,対空標識を10個程度置くことで,誤差を数m以内に抑えることが出来た。次に,UAVから求めた森林の3次元に関する指標から林分構造の推定を試み,その精度を検証した。推定を目指した項目は,地上計測の結果から求めた平均樹高,Lorey's平均樹高,最大樹高,林分材積量の4項目である。その結果,樹高の推定精度は総じて高く,決定係数はどれも0.9程度だった。林分材積量の推定精度は樹高の推定精度より若干低いものの,決定係数で0.7程度であった。以上のことから,UAVから樹高や林分材積量といった林分構造を推定できると結論づけた。昨年度の研究結果,UAVから林分構造を推定できることが示唆された。ここまでの研究結果は,おおむね予定通りであるといえる。今年度以降,ミャンマーでの森林計測やUAV撮影等を実施する予定であるが,これらの計画・打ち合わせについて,極めて順調に進んいる。研究計画当初は,伐採後,数ヶ月経過した後に撮影する予定であったが,この数ヶ月の無駄を省くべく,森林伐採の直前と直後にUAV撮影が可能となるように調整を進めている。以上の点から,当初の計画どおりおおむね順調に進展していると判断した。本研究では無人航空機(UAV,ドローン)を利用した正確で安価な森林減少・劣化量の推定技術を開発し,その検出限界を明らかにすることを目指している,今年度はUAV由来データからの森林減少・劣化量の推定を試みた。本対象地において,9haの方形プロットを2つ設置し,その内部でミャンマー択伐方式に基づくを森林伐採を実施した。この時,伐採した木の位置をGPSで記録し,また伐採した木のサイズに関する情報を伐採担当者より入手した。伐採の直前と直後にそれぞれUAVによるプロットの写真撮影を行った。撮影した写真にStructure from Motion技術を利用して,伐採前後の林分の3次元データを作成した。この前後の3次元データの差分から,森林の3次元構造の変化量マップを作製した。3次元構造変化量マップと,GPSで記録した伐倒木の位置図を比較し,UAVから森林の伐採が検出できるか検討した。その結果,3次元データの差分から作製した伐採地点と,GPS記録した伐倒木の位置はほぼ一致しており,3次元データの差分から森林の減少劣化を検出出来る可能性が示唆された。次に,林分レベルで森林劣化量を求める統計モデルの構築を行った。

50mグリッドのスケールで,伐採バイオマス量を集計し,伐採前後の3次元構造から推定できるか検証した。50mグリッドのスケールの場合,決定係数で0.48程度の精度で森林の劣化量を推定することが出来た。以上の結果から,UAVによる森林減少量の検出は有効であると結論づけた。これまでの研究経過はおおむね予定通りであるといえる。研究計画当初は,伐採後,数ヶ月経過した後に撮影する予定だったが,この数ヶ月の無駄を省くべく,森林伐採の直前と直後にUAV撮影を行った。その結果,時間を無駄にすること無く研究が進んだ。以上の点から,当初の計画どおりおおむね順調に進展していると判断した。本研究では無人航空機(UAV,ドローン)を利用した正確で安価な森林減少・劣化量の推定技術を開発し,その検出限界を明らかにすることを目指している。本研究の対象地は,ミャンマー・カタ地区の国有林である。今年度は昨年度に引き続きUAV由来データからの森林減少・劣化量の推定を試みた。昨年度時点では,50mグリッドのスケールの場合,決定係数で0.48程度の精度で森林の劣化量を推定することができていた。今年度は推定精度の向上を目指して,誤差要因の検討と新たな統計モデルの開発を実施した。その結果,決定係数は0.77まで向上した。誤差要因として,複数の画像を重ね合わせる際の位置合わせの精度が重要であることが示唆された。熱帯地域においては,高精度のGNSSを活用して測量を行うことが難しい場合も多いので,本誤差要因を低減するような高精度なサーフェスマッチング技術の開発が今後重要であるといえた。また,その他の誤差要因として,伐採木がグリッドの外にはみ出している場合には,伐採した木の周囲のグリッドでは減少量を過大評価する傾向が見られた。また,択伐の際に周囲の木や灌木をなぎ倒してしまった場合にも,過大評価となった。さらに,航空機レーザスキャナを用いて択伐の把握を目指した他地域での研究と比較した。その結果,本研究の結果は既往の結果に比べて精度が高いことがわかった。この理由として,まず考えられるのは,過去の研究では,伐採前と伐採後のデータを収集する期間が数年と長く,択伐以外の森林減少要因(例えば枯損)を誤差要因として含むことである。また,既往の研究では,伐採前と伐採後,それぞれでバイオマス推定モデルを構築し,両者の差分から減少量を推定している。本研究は,減少量を直接推定したため精度が高まったと考えられた。昨年度,森林の計測を行ったプロットの内,数カ所で計測後に森林の伐採が行われている。そこで,今年度は伐採地点でUAVによる写真撮影を再度行うことで,森林の減少・劣化が検出出来るか検証する。また,今年度から来年度にかけて,ミャンマーに滞在し,ミャンマーでの合法伐採の前後でUAVによる撮影を繰り返すことで,熱帯林での森林減少・劣化量の推定が可能か検証する予定である。昨年度,伐採前後の森林変化量の検出を試みた。今年度は,再度同じ対象でUAVの撮影を行うことで,時間経過に伴う森林変化量の検出可能性の変化を検証する予定である。当初,UAVを2機購入予定だったが,1台のみの購入としたこと,現地調査データについて,当初報告者自身が測定予定で予算を計上していた所,無償で入手できたため,現地調査に関する旅費支出が抑えられた事などが理由である。
植物の防御機構に対する植食性昆虫の対抗適応メカニズムの分子基盤の解明

植物は植食性昆虫に食べられないよう様々な防御機構を持つが、昆虫は植物の防御機構に対し適応するためのメカニズムを発達させている。したがって植物が本来持つ防御機構を植物保護・害虫管理の手法に効果的に応用するためには昆虫の機構メカニズムの解明が必要である。鱗翅目幼虫の吐き出し液や腸内に含まれるvolicitin [N-(17-hydorxylinolenoyl)-L-glutamine]は植物に揮発成分の放出を介した間接液防御反応を誘導する昆虫由来エリシターであり、その構造は17位に水酸基を持つlinolenic acidとglutamineがアミド結合した縮合物である。17位の水酸基の有無はエリシター活性に大きく影響するが、幼虫の組織や糞からは17位が酸化された脂質がほとんど検出されず、その動態が不明であった。そこで鱗翅目ヤガ科ハスモンヨトウ幼虫体内におけるヒドロキシ脂肪酸、およびその代謝物を探索した。幼虫の腸および糞をchitinaseで処理し、脱脂後の残渣をsodium methoxideで処理した後のmethanol可溶成分からmethyl 17-hydroxylinolenateを検出した。腸を除いた虫体や幼虫の人工飼料に同様の操作を行ってもmethyl 17-hydroxylinolenateは検出されず、volicitin類とは異なる17-hydroxylinolenicacidの縮合物が幼虫腸内で生合成されている可能性が示唆された。本研究で示唆された17-hydroxylinolenic acidの縮合物の存在についてば解析中であるが、本成果は鱗翅目幼虫の脂肪酸代謝の解析において新たな手がかりとなりうる。(1)幼虫腸管内のlysoPCは,植物の防御物質タンニンによる幼虫の消化酵素の変性を防ぐ.[U-13C]linolenicacidをハスモンヨトウ幼虫に摂食させたところ,腸管内腔から13C標識のlysoPCが検出された.これは食餌リン脂質の分解以外にも腸管内腔のlysoPCの供給経路の存在を示唆している.その経路として,i脂肪酸+lysoPC→PC,iiPC→lysoPCの2段階経路が考えられた.腸管組織と内腔の粗酵素液を用いたインキュベーション実験から,iは腸管組織,iiは内腔で起きると示唆された.iの反応は幼虫をタンニン添加飼料で飼育すると活性化した.幼虫は腸管組織でPCを生合成後,腸管内腔に放出し,さらにlysoPCに分解されると示唆された.腸管内腔のlysoPCは腸管組織に吸収されるので,幼虫は腸管内腔と組織間でリン脂質を循環させている可能性がある.(2)カイコ幼虫を解剖し,様々な組織のリン脂質をLCMS-IT-TOFを用いて分析した.その結果,腸管組織及び囲食膜において,他の組織では微量成分のPPEの割合が高かった.幼虫の飼料からはPPEが検出されず,PPEは幼虫体内で生合成されたと考えられる.また,ラジカル開始剤AAPH(2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride)を用いて,PCに対する抗酸化能を確認した.植食性昆虫が植物を食害すると腸内の活性酸素種が増加するので,腸管のPPEはこれらの酸化ストレスから腸管リン脂質を守っている可能性がある.生態系に配慮した植物保護のために,植物と昆虫の複雑な相互作用を分子レベルで解明が必要である.本研究では昆虫が植物の化学的障壁を如何に乗り越えているのか,昆虫の対抗適応戦略を脂質分子に注目し展開している.これまでの研究でカイコ幼虫腸管組織にエーテル型リン脂質plasmalogen phosphatidyethanolamine(PPE)が特異的かつ多量に存在することが分っている.PPEは幼虫の餌である人工飼料及び桑からは検出されないため,幼虫体内で生合成されている可能性がある。また,dilinolenoylphosphatidylcholineと2,2'-azobis(2-aminopropane)dichlorideとのインキュベーションからPPEがラジカルを介した脂質の過酸化反応を抑制することを確認した.鱗翅目幼虫の腸管内では植物の摂食によりヒドロペルオキシドが増加するなど酸化ストレスが高いため,PPEは腸管組織で抗酸化物質として機能している可能性がある.次にPPEと同様脂溶性抗酸化物質のトコフェロールとの比較をした.トコフェロールはPPEの20倍程度の抗酸化活性を持つ外因性の抗酸化物質であることが分っている.LC-APCI-MSを用いて分析したところ,トコフェロールは腸管内腔,腸管組織,腸管以外の組織の全てから検出されPPEとは対照的であった.PPEはトコフェロールとは異なる役割を持つことが示唆された.他には,ケルセチンの配糖体化とフェノールオキシダーゼの阻害,植物に間接的防御を誘導する昆虫由来エリシターvolicitinの水酸基が酸素由来であることを見出した.植物は植食性昆虫に食べられないよう様々な防御機構を持つが、昆虫は植物の防御機構に対し適応するためのメカニズムを発達させている。

17位の水酸基の有無はエリシター活性に大きく影響するが、幼虫の組織や糞からは17位が酸化された脂質がほとんど検出されず、その動態が不明であった。そこで鱗翅目ヤガ科ハスモンヨトウ幼虫体内におけるヒドロキシ脂肪酸、およびその代謝物を探索した。幼虫の腸および糞をchitinaseで処理し、脱脂後の残渣をsodium methoxideで処理した後のmethanol可溶成分からmethyl 17-hydroxylinolenateを検出した。腸を除いた虫体や幼虫の人工飼料に同様の操作を行ってもmethyl 17-hydroxylinolenateは検出されず、volicitin類とは異なる17-hydroxylinolenicacidの縮合物が幼虫腸内で生合成されている可能性が示唆された。本研究で示唆された17-hydroxylinolenic acidの縮合物の存在についてば解析中であるが、本成果は鱗翅目幼虫の脂肪酸代謝の解析において新たな手がかりとなりうる。
レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた超精密・微細・複雑形状部品の微小表面改質加工

本研究では高精度・微細・複雑形状部品の表面品質・性状改善(鏡面・粗面,内部応力除去・付与,洗浄等)を行うことを想定して,レーザー誘起水中衝撃波に着目し,光ファイバーの一方端に金属膜を成膜し,その金属膜部を液中に浸漬し,レーザー光はその反対端から入射することにより局所的に衝撃波を発生されるレーザ誘起液中マイクロ衝撃波発生装置の試作を行った.その結果,約3.3MPaの衝撃波が得られるとともに,その強度はファイバー端面や金属薄膜の性状に影響することが分かった.近年,マイクロ・ナノオーダーの形状精度を有する超精密・微細・複雑形状部品は理化学機器や医療機器のみならず,デジタルカメラ,スマートフォン,自動車など,民生品の性能を左右する核になっている.今後,これら部品には更なる高機能化・高性能化が求められ,高精度化・微細化・複雑形状化だけでなく,表面品質・性状改善(鏡面・粗面,内部応力除去・付与,洗浄等)も要求される.しかしながら,機械研磨では工具の微小化が困難であり,微細・複雑形状の奥深くまで加工出来ない,エッチングでは全面均等加工あるいは局所選択加工が生じて形状精度が劣化する,ブラスト加工では噴射可能な粒子系が数十μmと大きく,局所加工にはマスクが必要である等といった問題がある.上記問題を解決する方法として,本研究ではレーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工を提案している.レーザ誘起マイクロ衝撃波の発生原理は以下の通りである.光ファイバの一方端に金属膜を成膜し,その金属膜部を液中に浸漬し,低強度のパルスレーザ光をその反対端から入射する.入射したレーザ光を吸収した金属膜が熱によって弾性膨張し,これによって液中で衝撃波が発生する.本研究では,レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工装置を試作するとともに,試作装置による各種微細・複雑形状に対する微小表面品質・性状改善加工へ適応することを試みる.本年度は,レーザ誘起マイクロ衝撃波発生装置および衝撃波によって水中に生じる圧力を測定する装置を試作し,それを用いて試作装置の衝撃波発生特性を調査した.近年,マイクロ・ナノオーダーの形状精度を有する超精密・微細・複雑形状部品は理化学機器や医療機器のみならず,デジタルカメラ,スマートフォン,自動車など,民生品の性能を左右する核になっている.今後,これら部品には更なる高機能化・高性能化が求められ,高精度化・微細化・複雑形状化だけでなく,表面品質・性状改善(鏡面・粗面,内部応力除去・付与,洗浄等)も要求される.しかしながら,機械研磨では,工具の微小化が困難であり,微細・複雑形状の奥深くまで加工出来ない,エッチングでは,全面均等加工あるいは局所選択加工が生じて形状精度が劣化する,ブラスト加工では,噴射可能な粒子系が数十μmと大きく,局所加工にはマスクが必要である等といった問題がある.本研究では上記問題を解決する方法として,レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工を提案し,「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工装置の試作」,「試作装置による各種微細・複雑形状に対する微小表面品質・性状改善加工の適応」を明らかにする.本年度は,主に「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波」を用いた新たな微小表面改質加工」を試みた.これまで衝撃波を利用した加工としては脆性材料の破砕・粉体化,粉体材料の衝撃固化,金属材料の表面硬化,接合,成形などが行われているが,これらは大面積に均一に加工する方法である.また衝撃波を用いた局所加工としてはレーザピーニングなどが行われているが,集光レーザによる加工対象物表面のアブレーション加工や熱影響が生じる可能性がある.そのため,これらを超精密・微細・複雑形状部品の微小表面改質加工へ適応することは困難である.一方,本研究で提案する「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波」では,光ファイバを用いることにより微小領域に衝撃波を照射することが可能であった.本研究で提案している「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波」では,光ファイバを用いることにより微小領域に衝撃波を照射することが可能であるが,それにより表面改質された領域も非常に小さいため,その効果を定量的に評価することが困難であった.そのため,再現性に十分優れた実験データが得られていない.近年,マイクロ・ナノオーダーの形状精度を有する超精密・微細・複雑形状部品は理化学機器や医療機器のみならず,デジタルカメラ,スマートフォン,自動車など,民生品の性能を左右する核になっている.今後,これら部品には更なる高機能化・高性能化が求められ,高精度化・微細化・複雑形状化だけでなく,表面品質・性状改善(鏡面・粗面,内部応力除去・付与,洗浄等)も要求される.しかしながら,機械研磨では,工具の微小化が困難であり,微細・複雑形状の奥深くまで加工出来ない,エッチングでは,全面均等加工あるいは局所選択加工が生じて形状精度が劣化する,ブラスト加工では,噴射可能な粒子系が数十μmと大きく,局所加工にはマスクが必要である.等といった問題がある.本研究では上記問題を解決する方法として,レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工を提案し,「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工装置の試作」,「試作装置による各種微細・複雑形状に対する微小表面品質・性状改善加工の適応」を明らかにする.

本研究で提案している「レーザ誘起液中マイクロ衝撃波」では,光ファイバを用いることにより微小領域に衝撃波を照射することが可能であることを明らかにしている.しかしながら,これにより試料の表面改質される領域も非常に小さいため,その効果を定量的に評価することは困難であった.そこで,コンピュータ制御のステージを用いて,試料を一定ピッチで移動させながら衝撃波を照射できるよう装置の改良を行った.本研究では高精度・微細・複雑形状部品の表面品質・性状改善(鏡面・粗面,内部応力除去・付与,洗浄等)を行うことを想定して,レーザー誘起水中衝撃波に着目し,光ファイバーの一方端に金属膜を成膜し,その金属膜部を液中に浸漬し,レーザー光はその反対端から入射することにより局所的に衝撃波を発生されるレーザ誘起液中マイクロ衝撃波発生装置の試作を行った.その結果,約3.3MPaの衝撃波が得られるとともに,その強度はファイバー端面や金属薄膜の性状に影響することが分かった.試作したレーザ誘起マイクロ衝撃波発生装置では,光ファイバの一方端に金属膜を成膜し,その金属膜部を液中に浸漬し,低強度のパルスレーザ光をその反対端から入射する.入射したレーザ光を吸収した金属膜が熱によって弾性膨張し,これによって液中で衝撃波が発生する.本装置は大きく分けて,パルスレーザ発信器,金属膜を成膜した光ファイバ,光ファイバにレーザ光を入射する光学系,衝撃波の照射位置を制御するステージの4つに分かれており,本研究では光ファイバ端面の研磨加工と金属膜成膜および入射光学系を作製し,レーザ誘起マイクロ衝撃波発生装置を試作した.光ファイバから照射される衝撃波の評価をする方法として,水中に浸漬した光ファイバ金属膜部下部に圧力センサを設置し,照射された衝撃波の圧力を測定する装置を作製した.試作装置の光ファイバ金属膜より照射される衝撃波は使用する光ファイバの材質,端面形状,端面粗さ,成膜する金属膜の材質や膜厚,照射するレーザ光の波長,出力,発振周波数などに大きく影響すると考えられる.そこで,光ファイバはプラスチックとガラスの2種類,端面粗さは粗面・鏡面仕上げとし,金属膜の膜厚,照射するレーザ光の出力を変化させて,発生する衝撃波の圧力を評価した.これらの結果,水中に浸漬した光ファイバ金属膜部下部に設置した力センサから衝撃波に起因する信号を確認することはできなかった.この原因としては,光ファイバに入射するレーザのエネルギー不足が考えられる.試作したレーザ誘起マイクロ衝撃波発生装置では用いたレーザ発振器の内部トラブルにより,スペックどおりのレーザ出力を安定して得ることができていなかった.このため,圧力センサの検出限界以下の衝撃波しか出ていなかった,あるいは衝撃波が発生していなかったと考えられる.今年度は実験データの再現性向上を目的として,パソコン制御された精密ステージを用いて衝撃波照射位置を厳密に制御するなどして,各種微小表面改質加工の基本特性を明らかにしていくとともに,これらの結果を基に,実際の超精密・微細・複雑形状部品に対してレーザ誘起液中マイクロ衝撃波を用いた微小表面改質加工を適応し,その可能性を検討する.精密加工現時点では試作したレーザ誘起マイクロ衝撃波発生装置から衝撃波の発生が確認できていない.この対策として,早急に試作装置に用いたレーザ発信器を所定の出力が得られるものと交換するとともに,光ファイバの代わりに片端面に金属膜を真空蒸着した平面ガラスを水中に浸漬し,レンズで集光したエネルギー密度の高いレーザ光を入射できるよう装置を改造して下記の実験を行う.
検出能を改良したフィッシュ法による放射線抵抗性癌の染色体解析と治療法選択への応用

従来の遺伝子解析では、M期に細胞を同調して解析してきたが、効率が極めて悪く十分な成果が期待できなかった。また、染色体の形態変化を指標とした場合、変異遺伝子の検出も感度が低く、これも遺伝子解析の妨げとなっていた。本研究はカリクレインAを用いて遺伝子を濃縮し、M期以外の細胞からも染色体を解析でする手技と、特定の染色体を抗体を用いて蛍光染色する手技により、遺伝子変異を解析する方法を確立することを第一の目的とした。平成11年度は膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌より確立された培養細胞の放射線感受性をColony法により検討し、細胞の放射線感受性と染色体異常の基礎資料を作成した。培養細胞の放射線感受性がDo値で約2倍異なる細胞株を明らかにした。平成12年度は平成11年度に引き続き、正常リンパ球を照射した場合、出現する染色体異常を検討した。全身照射を行った患者から、照射前と照射線量毎にリンパ球を採取し、照射線量と染色体変異の関係を、FISHによる染色体1,2における変異発現と染色体の異常から検討した。その結果、染色体の変異の発現は線量と良好な相関を示した。また、同一患者から採取したリンパ球をin vitroで照射し、同様な染色体の解析を行った。その結果、照射線量毎に採取した患者のリンパ球における染色体変異と、in vitroで照射した染色体変異は極めて良好な相関を示した。このことは、染色体変異が12Gyまでの大線量でも変異を放射線照射の指標にできることが明らかになった。腫瘍細胞での検討では、照射前にも変異が多く、照射の影響を判定しにくく今後も引き続き行っていく予定である。また、形態の変化を指標とした場合、変異遺伝子の検出も感度が低く、これも遺伝子解析の妨げとなっていた。第二は、放射線照射が行われた正常細胞と癌細胞にこの方法を適応し、放射線照射前後の染色体変異を比較検討して、放射線感受性に関連する染色体変異を解明し、放射線低抗性癌の解析に役立たせることを目的とした。本年度は膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、食道癌より確立された培養細胞の放射線感受性をColony法により検討し、細胞の放射線感受性と染色体異常の基礎資料を作成した。Do値で約2倍放射線感受性の異なる培養細胞を明らかにした。染色体解析の基礎的検討として、正常なヒトと放射線治療の行われたヒトの末梢血からリンパ球を採取して、リンパ球を分離後培養し、上記の方法で放射線照射後のリンパ球における染色体変異を検討した。抗体を用いて蛍光染色で検討したのは、染色体はNo.1と2である。その結果、染色体1,2における変異の発現は、ほぼ線量依存性に増加することを確認した。また、No.1,2染色体の一部が他の染色体に組み込まれる確立は、正常人における発現と比較した場合、2Gyあたり約10倍になっていた。従来の遺伝子解析では、細胞をM期に同調して解析してきたが、効率が極めて悪く十分な成果が期待できなかった。本研究はカリクレインAを用いて遺伝子を濃縮し、M期以外の細胞からも染色体を解析する手技の確立を第一の目的とした。ついで、特定の染色体を抗体を用いて蛍光染色する手技により、遺伝子変異を解析する方法を確立することを第二の目的とした。

本年度は昨年度に引き続き、正常リンパ球を照射した場合、出現する染色体異常を検討した。全身照射を行った患者から、照射前と照射線量毎にリンパ球を採取し、照射線量と染色体変異の関係を、FISHによる染色体1,2における変異発現と染色体の異常から検討した。その結果、染色体の変異の発現は線量と良好な相関を示した。また、同一患者から採取したリンパ球をin vitroで照射し、同様な染色体の解析を行った。その結果、照射線量毎に採取した患者のリンパ球における染色体変異と、in vitroで照射した染色体変異は極めて良好な相関を示した。このことは染色体変異が12Gyまでの大線量でも、変異を放射線照射の指標にできることが明らかになった。腫瘍細胞での検討では、腫瘍細胞は正常細胞と異なり照射前にも染色体変異が多く出現しており、照射の影響を判定しにくく、現在まで明らかな結果を得られなかった。今後も引き続き検討を行っていく予定である。
ヒト歯髄における骨形成蛋白の遺伝子発現に関する基礎的研究。

種々の硬組織の形成に対し骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)が重要な役割を果たしていることは良く知られており、齲蝕罹患歯牙における修復象牙質の添加に際して歯髄組織中の細胞の硬組織形成能を有する細胞(象牙芽細胞)への分化過程においてBMPsが何らかの関係を有していることが充分に予想し得る。本研究は齲蝕罹患歯牙の歯髄組織におけるBMPs蛋白の局在および遺伝子の発言を検索し、BMPsの修復象牙質形成に対する機能的役割を解明しようとするものである。免疫組織化学染色およびin situ hybridization法に必要な歯髄組織は現在十分な数の試料を齲蝕あるいは歯冠周囲炎により抜去されたヒト顎第3臼歯より得ており、固定後-80°Cのdeep freezer内に凍結保存している。これらの試料より凍結切片を作成し、米国Genetic Institute社より供与された抗BMps-2 and -4モノクローン抗体による免疫組織化学染色を施した。その結果、歯髄組織中の象牙芽細胞や歯髄細胞に陽性所見を認め、象牙芽細胞にやや強い反応を認めたものの、本抗体は同時に非特異的な反応もみられ、齲蝕の進行度による、陽性細胞の変動を明らかにすることが困難であった。したがって現在はin situ hybridization法によるmessengerRNAの検出を試みている。BMPs-2および-4に対するDNA塩基配列に相補的なアンチセンスoligonucleotideをDNA合成機を用いて作成し、T-Tダイマー化ののち、すでにBMPs-2および-4の遺伝子の発言が認められている骨肉腫を対照として反応を行なった結果、oligonucleotideの特異性が確認された。今後はこのoligonucleotideを用いて歯髄組織中における、BMPs-2および-4遺伝子の発現状況を検索する。
セルトリ細胞における一酸化窒素(NO)の産生とその影響

培養幼若ラットセルトリ細胞(SC)の実験系を用い,セルトリ細胞におけるNOSの局在性とNO産生の動態,そして,セルトリ細胞の形態や機能に対するNOの影響を細胞生物学的,免疫組織化学的,生化学的観点から検討し,以下の研究成果を得た.1.SCは自発的にNO産生をしている事(多分,cNOSに依存する事),2.リポ多糖(LPS)の添加によってNO産生は亢進されない事(実験条件下ではiNOS誘導が起こらない事),3.外因性NO(NOC18/100μM)を添加した時,SC単層の電気抵抗値は変動しない事,4.外因性NOによって,SC分泌タンパク質の総分泌量に変化は観られないが,トランスフェリン分泌の方向性(極性分泌)は基底方向へと有意に亢進される事,5.SCの細胞間接着装置を構成するタンパク質(occludin, Zo-1)の局在は,細胞質外周接着部にハチの巣模様状に認められ,また,actinの局在もこれらに類似している事,6.NOC18(200μM)の添加後24時間目には,occludin, Z0-1のハチの巣模様の整然とした局在は部分的に,あるいは完全に崩れる事,7.NOC18(400μM)の添加後48時間目で,SCにおけるoccludin, ZO-1の発現量はそれぞれ,未処理対照群(100%)の81%,49%にまで減少していた事,などを明らかにし,精巣における過剰のNOは,精子形成過程に少なからず病態生理学的影響を与える可能性を示した.この事は,SCの細胞間接着装置を構成するタンパク質が,過剰のNOによって局在性ばかりではなく,その発現量にも変調を来す事を示している.以上の結果を総括すると,精巣における急性,あるいは慢性の病態時に精巣内で産生されるであろう過剰のNOは,精巣上皮細胞のタンパク質分泌極性の変調や,細胞密着帯関連タンパク質の脱制御をもたらし,血液-精巣関門の崩壊を惹き起こすと共に,以後の正常な精子形成過程に重篤な影響をもたらす可能性が示唆された.培養幼若ラットセルトリ細胞(SC)の実験系を用い,セルトリ細胞におけるNOSの局在性とNO産生の動態,そして,セルトリ細胞の形態や機能に対するNOの影響を細胞生物学的,免疫組織化学的,生化学的観点から検討し,以下の研究成果を得た.1.SCは自発的にNO産生をしている事(多分,cNOSに依存する事),2.リポ多糖(LPS)の添加によってNO産生は亢進されない事(実験条件下ではiNOS誘導が起こらない事),3.外因性NO(NOC18/100μM)を添加した時,SC単層の電気抵抗値は変動しない事,4.外因性NOによって,SC分泌タンパク質の総分泌量に変化は観られないが,トランスフェリン分泌の方向性(極性分泌)は基底方向へと有意に亢進される事,5.SCの細胞間接着装置を構成するタンパク質(occludin, Zo-1)の局在は,細胞質外周接着部にハチの巣模様状に認められ,また,actinの局在もこれらに類似している事,6.NOC18(200μM)の添加後24時間目には,occludin, Z0-1のハチの巣模様の整然とした局在は部分的に,あるいは完全に崩れる事,7.NOC18(400μM)の添加後48時間目で,SCにおけるoccludin, ZO-1の発現量はそれぞれ,未処理対照群(100%)の81%,49%にまで減少していた事,などを明らかにし,精巣における過剰のNOは,精子形成過程に少なからず病態生理学的影響を与える可能性を示した.この事は,SCの細胞間接着装置を構成するタンパク質が,過剰のNOによって局在性ばかりではなく,その発現量にも変調を来す事を示している.以上の結果を総括すると,精巣における急性,あるいは慢性の病態時に精巣内で産生されるであろう過剰のNOは,精巣上皮細胞のタンパク質分泌極性の変調や,細胞密着帯関連タンパク質の脱制御をもたらし,血液-精巣関門の崩壊を惹き起こすと共に,以後の正常な精子形成過程に重篤な影響をもたらす可能性が示唆された.培養ラットセルトリ細胞(SC)におけるNOS発現とNO産生に関する実験では,幼若ラットの精巣からSCを分離し,二槽培養系において無血清培養した.未処理のSCが産生する自発的NO量は2日間で16.9±0.7nmol/ml/well程度で,上槽(8.0±0.3nmol/0.5ml/well)と下槽(8.9±0.5nmol/0.5ml/well)へほぼ同程度(上層/下層比=0.92±0.03)に産生/放出されていた.これは,SCが定常的にcNOSを発現して生理的NOを産生している事を示すもので,現在,SC中のNOSアイソフォーム(bNOSあるいはeNOS)について検討中である.これに対して,リポ多糖(LPS:1μg/ml)を添加してSCにおけるiNOSの誘導を介したNOの過剰産生を試みたが,未処理SCとの間に有意な差を認めなかった(16.3±0.8nmol/ml/well,上層/下層比=0.93±0.03).このことから,精製SCにおけるiNOSの誘導にはLPS単独刺激では不十分である事が理解でき,他のサイトカイン類(TNFα,IL-1,IFNγなど)によるiNOS誘導の検討が必要である.

一方,このSC二槽培養系にNOドナー(NOC18:100μg/ml)を添加し,外因性NOの影響を検討したが,発生したNOはSC層の電気抵抗値(未処理SC:25.5±2.0Ω/0.64cm^2,NOC18処理SC:25.7±1.4Ω/0.64cm^2)に有意な変動を与えず,また,SCによる総トランスフェリン(TF)分泌量(未処理:512±34ng/ml,NOC18処理:544±31ng/ml)にも影響しなかった.しかし,TFの分泌量は下槽側へ有意に亢進し,上下槽のTF濃度比の低下(未処理SC:1.86±0.22,NOC18処理SC:1.47±0.08)が認められた.これらの事から,精巣において,過剰のNOは精巣上皮細胞のある種のタンパク質の極性分泌機能の変調を惹き起こし,以後の正常な精子形成過程に少なからず病態生理学的影響を与える可能性が示唆された.昨年度までに,培養ラットセルトリ細胞(SC)を用いた実験から,SCの自発的NO産生が認められたが,前炎症反応誘導物質であるリポ多糖(LPS)によってNO産生の亢進は惹起されない事を確認した.また,培養SCに対してNOドナー(外因性NO)を添加した時,SC単層の電気抵抗値やSC分泌タンパク質であるトランスフェリン(TF)の総分泌量に変化は観られなかったが,TF分泌の方向性(極性分泌)は基底方向へと有意に亢進される事が分かった.これらの事から,精巣において,過剰のNOは精巣上皮細胞のある種のタンパク質の極性分泌機能の変調を惹き起こし,精子形成過程に少なからず病態生理学的影響を与える可能性が示された.本年度は,SC層の透過性を司る密着帯結合(tight junction : TJ,血液-精巣関門)に関連した分子群がNOによってどのような動態を示すのかを,特異的抗体や化学反応物質を用いて免疫細胞化学的/細胞化学的手法によって検討した.その結果,正常SCにおけるoccludinとZO-1の局在は,細胞質外周の細胞間接着部にハチの巣模様状に認められ,また、actinの局在もこれらに類似していた.これに対して,NOドナー(NOC18/200μM)添加後24時間目には,occludin, ZO-1のハチの巣模様の整然とした局在は部分的に,あるいは完全に崩れていた.その一方で,actinの局在自身には顕著な差を見出せなかった.以上の結果から,精巣における急性,あるいは慢性の病態時にセルトリ細胞以外の細胞(例えばライディッヒ細胞など)によって産生されるであろう過剰のNOは精巣上皮細胞のTJ関連タンパク質の崩壊をもたらし,血液-精巣関門の変調を惹き起こすと共に,以後の正常な精子形成過程に重篤な影響をもたらすものと考えられる.昨年度までに、培養幼若ラットセルトリ細胞(SC)の実験系を用い,(1)SCは自発的にNO産生をしている事(多分、cNOSに依存する事),(2)リポ多糖(LPS)の添加によってNO産生は亢進されない事(実験条件下ではiNOS誘導が起こらない事),(3)外因性NO(NOC18/100μM)を添加した時,SC単層の電気抵抗値は変動しない事,(4)外因性NOによって、SC分泌タンパク質の総分泌量に変化は観られないが,トランスフェリン分泌の方向性(極性分泌)は基底方向へと有意に亢進される事,(5)SCの細胞間接着装置を構成するタンパク質(occludin, ZO-1)の局在は,細胞質外周接着部にハチの巣模様状に認められ,また,actinの局在もこれらに類似している事,(6)NOC18(200μM)の添加後24時間目には,occludin, ZO-1のハチの巣模様の整然とした局在は部分的に,あるいは完全に崩れる事,などを明らかにし,精巣における過剰のNOは,精子形成過程に少なからず病態生理学的影響を与える可能性を示した.本年度は,SCにおけるoccludin, ZO-1の発現に対するNOの影響について検討を加えた.
マルチスケールコネクトームの展開

本プロジェクトの目標は、脳神経系において、(1)データにもとづいてモデル形成をし、(2)モデル形成に有効なデータを蓄積する事である。脳マクロでの理論研究(データ解析+モデル分析)において、我々の伝達速度を推定し、脳構造配線とミリ秒スケールでの早い脳内ダイナミクスを比較した研究成果が論文として発刊された[Shimono, Hatano, 2018]。申請者は、H29年度の終盤より京都大学医学部への異動をし、自身のラボ-実験スペースを保有し、生理実験を極めて円滑に行える様になった。それと同時に卓越研究者としての採択が決まり(https://www.hakubi.kyoto-u.ac.jp/jpn/02_mem/08shimono.shtml)、その研究予算で高額な世界最高数の計測点数をほこる多電極計測装置を購入できた。そのため本プロジェクトでも、卓越プロジェクトとの相乗効果が期待されるさらに効果的な予算使用を志向した。たとえば、神経活動を蛍光計測でも多電極計測でも活用できて意義深いため、両方の計測で用いられる高性能の国産スライサーを本予算から購入した。多電極システムでの実験はすでに始まっており、rodentのacute sliceの新皮質から電気活動を安定して計測できる化学プロトコルを見出した(意外と世界的に稀な到達点である)。これにより、この萌芽の期間中で、新規な実験パラダイムの発表に続いて、詳細なモデリングを可能とするビックデータを着実に蓄積して、大局的ルールの発見的研究へと続く道筋が敷かれた。また、本年度中で招待講演を約5件,対談1件を含む講演,学術発表を行った。その内の一件はYoutubeにてシェアされている様である(https://www.youtube.com/watch?v=9a-dczDZsAk&t=2s)。本年度では、新しいラボの立ち上げが中心的なissueとなってきた。その立ち上げは、思った以上に順調に進んでおり、本プロジェクトの残りの2年中での成果へと結実できる機運が高まっている。モデリングは現実を反映する形で構築されなくては意味がなく、data drivenなアプローチは必須である。今年度に用意できた実験基盤は、そのアプローチを力強く進めるものとなるものである。また、異動の多忙な中でも、複数の講演を行う事もできている事から、プロジェクトは順調に進んでいると言える。前述の通り、世界最高数の計測点を有する計測機を含む実験系の確立をほぼできた事は意義深い。まだ公開はできないが、実験系に新規性を盛り込むポイントをいくつか用意している。相対的な優劣はつけがたいが、インフォマティクス的に外に存在するデータを解析する事よりも、これから二年においては、モデリングを志向しつつも、自らそれに必要なデータ蓄積に力を注ぐ事が、より有望な展開が期待されると思われる。それらの成果を論文などでまとめてゆくとともに、その先に、データ公開用にデータベースの構築などを視野に入れてゆく事となるだろう。

相対的な優劣はつけがたいが、インフォマティクス的に外に存在するデータを解析する事よりも、これから二年においては、モデリングを志向しつつも、自らそれに必要なデータ蓄積に力を注ぐ事が、より有望な展開が期待されると思われる。それらの成果を論文などでまとめてゆくとともに、その先に、データ公開用にデータベースの構築などを視野に入れてゆく事となるだろう。本萌芽研究プロジェクトの進行途中で、京都大学への異動と、自らがラボの主催者となる大きな転機があった。そのため、京都大学内部での交流や、ラボの立ち上げに比重が高まり、海外の共同研究者らとの交流の重みが比較的に軽くなり、交通費が予想より減少した。ただし、本年度のしわ寄せにより、国際交流は来年度以降に増えると予想されるため、来年度への移行する事とした。