hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポータブルラマン分光器による新規血痕検査法の確立

【目的】ラマン分光法は、非破壊・非接触で分析が可能で近年法医鑑識科学の分野で応用されている。研究代表者はこれまで、現場で使用可能なポータブルラマン分光器を用いた血痕の人獣鑑別法の確立を行ってきた[1]。更に、今回は乳児と成人の血痕の識別を顕微ラマン分光法を用いて行った[2]。【試料と方法】死後経過時間が2時間以内の解剖に付された乳児と成人各5サンプルの血液100μLをガーゼに滴下し、血痕を作成した。顕微ラマン分光器により血痕サンプルのラマンスペクトルを得た。【結果および考察】アルブミン、グルコース、ヘモグロビンに由来する754, 1002, 1127, 1248, 1340, 1368, 1560,および1611 cm-1にピークが観察された。これは以前研究代表者がポーラブルラマンで報告した結果[1]と同様であった。顕微ラマンは分解能が高いため、さらに674, 976, 1176, 1105, and 1390cm-1にピークが認められた。1105cm-1のピークは成人でのみ観察され、乳児では観察されなかった。ガーゼのみのスペクトルを取ったが該当のピークは確認されなかった。ピークのアサインを行ったところ、1105cm-1はhistidineであると考えられた。L-Histidine粉末のラマンスペクトルに該当するピークが観察された。成人ヘモグロビンの主成分であるHbAは2つのαchains (141 amino acids)と2つのβchains (146 amino acids)から成り、乳児ヘモグロビンの主成分であるHbFは、2つのαsubunits (141 amino acids)と2つのγchains (146 amino acids)から成る。HbAとHbFを比較するとHbFでは2か所His (His116Ile and His143Ser)が置換している。よって乳児ヘモグロビンで1105cm-1が観察されず、2か所のHis置換(His116Ile and His143Ser)によるものと考えられた。顕微ラマン分光法を用いた乳児と成人の血痕の識別に関する論文がJ ForensicSci (2018)に掲載された。ラマン分光法の血痕検査以外の法医鑑識科学への応用を目指したい。【目的】ラマン分光法は、非破壊・非接触で分析が可能である。ロイコマラカイトグリーンはDNAを分解するなど、従来の血痕検査法は破壊的方法であるため、非破壊の血痕検査法が望まれる。近年ポータブルラマン分光器の利用が可能となっている。本研究では、ポータブルラマン分光器を用いた現場における非破壊の血痕の人獣鑑法の確立を目的とした。【方法】ヒト、ウシ、ウマ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ニワトリ由来の血液をガーゼに滴下し、血痕を作成した。ポータブルラマン分光器(Enwave Optronics社製)により、血痕資料から直接ラマンスペクトルを測定した。得られたスペクトルデータについて主成分分析を行った。【結果および考察】従前の研究で、血液の主成分のヘモグロビンは1000, 1368, 1542, 1620cm-1に散乱ピークが観察されることが報告されている。今回ポータブルラマン分光器を用いて測定を行った各動物種の血液でも、これらの散乱ピークが観察され血液の識別が可能であった。これらのピーク強度を用いて主成分分析を行ったところ、各動物種に特有な特徴が観察され動物種の判別が可能であった。ヒトヘモグロビン鎖構造はα2β2、α2σ2であるが、ウシ、ウマ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ニワトリは、それぞれα1β1とα2β2、α1/2β1/2、α2β2、α2βA2とα2βC2、α2β2、αβA/B、α1/2β1、α1β1、αAβ2の鎖構造を持つ。ポータブルラマン分光器は現場でも使用が可能であり、DNA検査前のスクリーニング法として非破壊でDNA検査に影響を及ぼさず、法医鑑識活動に有用な装置であることが示唆された。

顕微ラマンは分解能が高いため、さらに674, 976, 1176, 1105, and 1390cm-1にピークが認められた。1105cm-1のピークは成人でのみ観察され、乳児では観察されなかった。ガーゼのみのスペクトルを取ったが該当のピークは確認されなかった。ピークのアサインを行ったところ、1105cm-1はhistidineであると考えられた。L-Histidine粉末のラマンスペクトルに該当するピークが観察された。成人ヘモグロビンの主成分であるHbAは2つのαchains (141 amino acids)と2つのβchains (146 amino acids)から成り、乳児ヘモグロビンの主成分であるHbFは、2つのαsubunits (141 amino acids)と2つのγchains (146 amino acids)から成る。HbAとHbFを比較するとHbFでは2か所His (His116Ile and His143Ser)が置換している。よって乳児ヘモグロビンで1105cm-1が観察されず、2か所のHis置換(His116Ile and His143Ser)によるものと考えられた。顕微ラマン分光法を用いた乳児と成人の血痕の識別に関する論文がJ ForensicSci (2018)に掲載された。乳児の血痕の同定は、嬰児殺などにおいて重要である。成人のヘモグロビンは(HbA)でα2β2の4量体から成る。一方、乳児ヘモグロビン(HbF)はα2γ2から成る。これらの識別する既存の方法は、破壊検査であり大量の試料を必要とする。そこでラマン分光法を用いた、破壊検査の確立を目指す。ラマン分光法の血痕検査以外の法医鑑識科学への応用を目指したい。研究計画に変更が生じ、翌年度分と合わせて備品を購入する。繰り越した予算と合わせて備品を購入する予定である。
貫通孔構造を有するかご状中空シリカ粒子を用いた細胞型バイオリアクターの開発

本研究者はナノオーダーの貫通孔構造を有する無機中空粒子(CHS)の特異な構造を利用した微小反応場システム(細胞型バイオリアクター)の開発を目指し、より精密な形態制御が可能なCHS合成方法の検討を進めた。まずリゾチーム-シリカハイブリッド粒子をスタート物質とした水熱処理によるCHS合成プロセスにおいて、水熱処理条件やスタート物質であるハイブリッド粒子の組成によるCHSの形態制御を試みたところ、ハイブリッド粒子の組成によって異なる形態の貫通孔構造が形成されることを見出した。一方ハイブリッド粒子の外形は水熱処理前後において変化しないことから、貫通孔構造のみの形態を自在にコントロールできることが示唆された。またCHS構造の形成条件として、ハイブリッド粒子表面のシリカ層の存在が必要であることを明らかとし、その形成メカニズムを明らかにすることができた。しかしながら、ハイブリッド粒子の粒子径が最大でも1-3umであったため、細胞型バイオリアクターとして用いるにはより幅広い粒子径にコントロール可能なCHSの合成方法が望まれた。そこで、SPGグラスを用いて均一な粒子径のエマルジョンを作成し、その表面においてハイブリッドシェル構造を作成することでCHSが合成できるのではないかと考え、検討した。その結果、中空構造は得られたものの、シェル構造の強度が足りず、リゾチームの除去プロセスにおいてシェル構造が破壊されてしまう結果となった。本研究者は、細胞型バイオリアクター構築に向け、貫通孔構造を有する無機中空粒子を新規に合成し、貫通孔を分子輸送チャネルとして利用した粒子内部への生体高分子の内包化を試みた。当初リゾチーム分子を用いたシリカバイオミネラリゼーションと超音波処理を組み合わせた手法により貫通孔構造を有する中空シリカ粒子を合成したが、検討を進めた結果、超音波処理によって、(1)貫通孔の形状や膜厚にばらつきが生じる、(2)殻構造の機械的強度が弱く合成時に破壊してしまう、等の問題点が生じることが明らかとなった。そこで超音波処理を必要としない合成方法の検討を行った結果、非中空リゾチームーシリカハイブリッド粒子をアルカリ溶液で水熱処理することによって、上記中空粒子と同様な貫通孔構造を有するアルミノシリケート中空粒子を合成することに成功した。新たに得られた中空粒子は、貫通孔形状のバラつきが少なく、合成時の破壊を抑えることが可能できたため、この中空粒子を用いて赤色蛍光タンパク質(DsRED)のシップインボトルによる内包化を試みた。中空粒子をDsRED溶液に分散させた後、タンパク質架橋剤を添加してDsRED同士を架橋した結果、中空粒子内に内包化されたDsREDを蛍光顕微鏡にて確認する事ができた。架橋・内包化されたDsREDの外形は中空粒子の殻構造よりやや小さく、殻構造によって粒子内部での重合が制限されている事が示唆された。貫通孔を自由に通過できる単体のDsRED分子は粒子内外へ移動できるが、粒子内部にて架橋化されたDsRED重合体はその大きさが貫通孔の径を上回ると、粒子外部へ移動することができなくなる。このようなシップインボトル形式の生体高分子の内包化は、無機中空粒子の形態を活かしたバイオリアクター構築のモデルになるものと期待され、本研究成果は、今後より複雑な機能性構築や内包化分子の挙動解析などに展開するものと思われる。
児童虐待予防のための地域ペアレンティング・プログラムの評価に関する研究

虐待予防の観点から、子育て支援の家族介入プログラムであるトリプルPの有用性を検討した。和歌山(15名)、大阪(20名)、摂津(25名)に在住する2歳から5歳の子どもをもつ母親を対象にグループ・トリプルPを実施した。親が報告する子どもの困難な行動(SDQ)、親の子育てスタイル(PS)、親の抑うつ、不安、ストレスなどの精神状態(DASS)、親の子育ての自信(PSBC)、夫婦間の関係の質と満足度(RQI)、夫婦間の意見の衝突の程度(PPC)、親の子どもへの不適切な行為(JM)の7種類の質問票を用いて、介入前後、介入前と介入3か月後、および待機後の変化を比較した。結果、介入群(n=60)で5つの質問票(SDQ、PS、DASS、RQI、JM)で有意な介入効果が得られ、介入3か月群(n=37)で4つの質問票(SDQ、PS、RQI、JM)で有意な持続効果を認めた。【目的】(1)幼児期にある子どもの親を対象に、子育てに対する親の意識や精神状態、子どもの問題行動への対処方法、親自身のセルフケア等に関する調査を実施し、わが国の子育ての実態を明らかにする。(2)育児支援プログラムによる教育的介入を行い、プログラムの有用性を検証する。(3)地域に育児支援プログラムを普及するための基盤づくりを行う。【研究方法】研究内容は、以下の3点りである。なお、対象地域は和歌山、大阪(2カ所)、神奈川県の計4ケ所である。(1)子育てに関する質問紙による地域実態調査(2)トリプルP啓発の講演会の実施(3)トリプルPによる介入【結果】(1)母親の12.5%で子育ての困難さを感じ、子育て中に抑うつ気分、不安、ストレスを感じる母親が、それぞれ8.7%、8.0%、12.3%であった。また自己評価として子どもに虐待をしていると感じる母親も13%に認められた。(2)啓発運動の一環として、トリプルPの開発者であるマット・サンダース教授の講演会を和歌山市、田辺市において開催し、母親、子どもの専門家など、計200人が参加した。(3)介入前後の比較において、多くの子育てスキルの有用性が示され、プログラムに対する満足度も高いという結果が得られた。またプログラム参加を機会に母親同士の仲間作りも促進された。【考察】子度立ての困難さ、抑うつ気分、不安、ストレスを感じている母親あるいは、わが子を虐待しているのではと感じる母親が少なからず存在することが判明した。トリプルPという子育て支援プログラムの実施により、子育てスキルにおいて有用性が示され、さらに子どもへの養育態度や子どもの行動等に関して効果がみられた。【背景】和歌山県における研究調査から、12.5%の母親が子育ての困難さを感じ、さらに子育て中に抑うつ気分、不安、ストレスを感じる母親がそれぞれ8.7%、8.0%、12.3%に認められ、母親の育児支援の具体的な方法が求められている。【目的】オーストラリア・クイーンズランド大学のマット・サンダース教授らにより開発された育児支援プログラム(トリプルP)による教育的介入を行い、日本におけるプログラムの有用性を検証することである。【対象と方法】対象地域は和歌山県、大阪府(2カ所)、神奈川県の計4地域とした。母親の自己記入による複数の質問紙を用い、(1)介入なしの場合の経時的変化(2ケ月間)、(2)介入前後の比較、(3)介入後の持続効果(3カ月後)について調査分析した。調査内容は、子どもの行動、母親の子育てスタイル、子育ての自信、精神状態およびパートナーとの関係である。【結果】トリプルPという子育て支援プログラムの実施により、子育てスキルにおいて有用性が示され、さらに子どもへの養育態度や子どもの行動等に関して効果がみられた。介入直後の効果だけでなく、プログラム終了3カ月後も有用性の持続が認められた。【平成20年度研究に向けて】日本におけるトリプルPの普及とともに、エビデンスに基づいた有用性の検証を継続する。しかし、現時点では複数の質問表によるアセスメント方法が煩雑であるという母親の意見もあり、アセスメント方法を工夫し、日本におけるプログラム実施方法の確立を目指す。さらに現在20数力国で実施されている状況から他国との積極的な意見交換を行う予定である。

平成18年度及び19年度の2年間において、幼児期にある子どもの親を対象に、子育てに対する親の意識や精神状態、子どもの問題行動への対処方法、親自身のセルフケア等に関する調査を実施し、わが国の子育ての実態を明らかにし、育児支援プログラム(トリプルP)による教育的介入を行い、プログラムの有用性を検証した。平成20年度は、地域にトリプルPを普及するための基盤づくりを行うことを目的とする地域にトリプルPを普及するための基盤づくりを行うことを目的とした。結果として、以下の活動を行った。1.実施プログラムの成果のまとめと課題を抽出し、今後のプログラムのあり方について、研究者問で検討を行った。検討会議は4回開催した。(1)平成20年5月ll日(東京:出席者6名)、(2)平成20年11月5H(福岡:出席者5名)(3)平成20年12月13日(広島:出席者5名)、(4)平成21年2月21日(東京:出席者4名)2.プログラムの成果にっいて、日本小児科学会(20G8年4月)、日本小児保健学会(2008年9月)、日本公衆衛生学会(11月)日本子ども虐待防止学会(2008年12月)等の国内学会で発表を行い、プログラム普及を図った。なお、日本公衆衛生学会では自由集会を企画し、「前向き子育てプログラム-その理論と実践-」を紹介し、日本子どもの虐待防止学会では「前向き子育てプログラムの日本における展開」をポスター展示し、ブースを設けプログラムの紹介を行った。3.日本におけるプログラムについて、トリプルP国際会議(2009年4月15日、カナダ・トロント)で「児童虐待予防のための地域ペアレンティング・プログラムの評価に関する研究-前向き子育てプログラム(トリプルP)の有用性の検討-」の発表し、意見交換を行った。
乳癌におけるKLK3(PSA)の腫瘍マーカーとしての検討および治療標的の探索

乳癌のサブタイプのうちホルモン受容体陽性のルミナルタイプの患者に対してはホルモン療法が効果的でありHER2陽性タイプは抗HER2療法が生存予後を改善することが知られている。しかしこれらの受容体を発現しないトリプルネガティブタイプ乳癌(TNBC)に対しては、治療法は化学療法のみと限られており、他のサブタイプに比べて悪性度が高く予後不良である。そのため、TNBCの早期診断と治療標的分子の同定が必要とされている。本研究ではおよそ2000名の乳癌患者の遺伝子発現データから294名のTNBC患者を抽出し解析を行った結果、TNBC患者ではKLK3高発現群は予後不良であることが明らかになった。KallikreinやKallikrein-related peptidase (KLK)ファミリータンパク質はセリンプロテアーゼの一種であり、がんの病態においても、その機能や発現が注目されている。特にKLK3はProstate specific antigen (PSA)と呼ばれており、前立腺がんの腫瘍マーカーとして臨床ですでに実用化われている。しかしながら、乳癌患者のサブタイプによるKLK3の発現の違いや、特にトリプルネガティブタイプにおけるKLK3の発現と予後の関連に関しては未だ解析されていない。本研究では、およそ2000名の乳癌患者のマイクロアレイデータから294人のトリプルネガティブタイプ患者を抽出し、KLK3の発現と生存日数でカプランマイヤー曲線および多変量解析を行った。トリプルネガティブタイプ患者ではKLK3高発現群は予後不良であることが明らかになった。この結果からKLK3はトリプルネガティブタイプ乳癌の予後予測可能な腫瘍マーカーとして用いることができる可能性が示唆された。さらに、乳がんの悪性化にたいするKLK3のIn vitroにおける機能を検証するために、乳癌細胞株におけるKLK3の発現量を調べた。その結果、MCF7,BT20, MDA-MB231, MDA-MB-436における内在性KLK3のかなり発現量が低かった。患者組織mRNAを用いたマイクロアレイ解析の結果から、乳癌細胞株(特にトリプルネガティブ乳癌)においては内在性にKLK3が高発現していることが予想され、これらの細胞株においてKLK3を発現抑制することで機能変化を調べる予定であったが、研究室に所持している乳癌細胞株では発現がほとんど見られなった。現在、他の乳癌細胞株を入手する準備を行っている。乳癌は女性において最も発生頻度の高い癌であり、死亡数は肺癌についで2番目に死亡数の多い癌である。ホルモン受容体(ER and/or PgR陽性の患者に対しては、アロマターゼ阻害剤やタモキシフェンなどのホルモン療法が効果的である。HER2陽性タイプは予後不良であるが、HER2陽性の患者に対してはトラスツズマブ(ハーセプチン)やペルツズマブ(パージェタ)など抗HER2療法が生存予後を改善することが知られている。しかしながらトリプルネガティブ乳癌はこれらの受容体を発現しないため、治療法は化学療法のみと限られている。トリプルネガティブタイプは全乳癌患者の1015%と報告されており、他のサブタイプに比べて悪性度が高く予後不良であるトリプルネガティブ乳癌の早期診断と治療標的分子の同定が着実に予後の改善につながる。本研究では、およそ2000名の乳癌患者のマイクロアレイデータから294人のトリプルネガティブタイプ患者を抽出しKLK3の発現と生存日数でカプランマイヤー曲線および多変量解析を行い、トリプルネガティブタイプ患者ではKLK3高発現群は予後不良であることが明らかになった。本研究で着目したKLK3(PSA)はすでに前立腺がんで臨床応用されている腫瘍マーカーであることから、前立腺がんの腫瘍マーカーとして使用されてきた際に得られた知識や情報を最大限に利用することで、乳癌のトリプルネガティブタイプでの腫瘍マーカーとして応用で応用可能であることが期待される。乳癌における内在性KLK3の機能を検討するために、KLK3の高発現する乳癌細胞株を引き続き探索する。さらに、培養条件によってKLK3の発現が変化することを期待して、癌幹細胞が濃縮できるsphere assayの培養条件でKLK3の発現上昇がみられるか検討行う。またFACSによりCD24lowCD44highの画分でのKLK3の発現も検討する。さらにKLKファミリーには他の分子に関しては、乳癌細胞株での発現が報告されているので、それらファミリー分子に関しても検討を広げる。腫瘍生物学KLK3を高発現する乳癌細胞株が手に入らず、この細胞を用いて実施を予定していたInvasion assayやFACSなど実験が平成27年度中に実施できなかったため。新たに乳癌細胞株を入手し、KLK3を高発現する乳癌細胞株を同定した後、平成27年度に予定していた実験を行う。
小児期粘膜免疫システム構築のメカニズムの解明と疾患関連腸内細菌の同定

原発性免疫不全症患者および健常者において、末梢血免疫担当細胞におけるTGF-βシグナル応答を解析し、TGF-βによる免疫抑制作用や、TGF-βのシグナル下流にあるSmadシグナルが一部の原発性免疫不全症患者で低下していることを見出した。本研究によりTGF-β/Smadシグナル伝達系が原発性免疫不全症の病態形成に関与していることを示唆し、新たな免疫不全症の同定への可能性が考えられる。また、本経路を調整することにより、新たな治療方法の開発につながる可能性がある。ヒト小児期特有(特に日本人)の腸内細菌叢を解析し、更に、胎児期や新生児期等の小児期の免疫システム構築における腸内細菌叢や腸管粘膜免疫の関与・役割を検証することが本研究の目的である。腸内細菌叢は近年の多くの報告から、腸管粘膜免疫だけでなく、全身の免疫応答に寄与していることが明らかとなりつつある。このことは、無菌状態の個体である胎児から新たに腸内細菌叢を形成する小児期が、各個体の生理的・病的免疫系の構築に大きな影響を有する可能性があることを示唆する。TGF-βは母乳や腸管組織に豊富に存在するサイトカインであり、腸内細菌叢の形成に大きな影響を有すリンパ球や単球等の免疫細胞に対し様々な機能を有す。このことから、腸内細菌叢形成や腸管粘膜免疫に果たすTGF-βの役割を明らかにすることは、小児期の免疫系構築と腸内細菌叢形成の関連性を理解する上で重要と考えられる。現在までに申請者らは、同年代の健常児と原発性免疫不全症患者の末梢血免疫細胞におけるTGF-βシグナル応答性を検討し、TGF-βによる免疫抑制作用やTGF-βの下流シグナルであるSmadシグナルが一部の原発性免疫不全症患者由来のリンパ球や単球で低下していることを見出した。本知見は、TGF-βシグナルにおける上記原発性免疫不全症の原因遺伝子の関与を示唆しており、更なる検討によって新規パスウェイを同定出来ることが期待される。また、上述のTGF-βシグナル異常が、本疾患の一部表現型の病態である可能性が示唆されることから、病態解明や新たな治療法の開発に繋がることも期待される。申請者らは、既に一部の免疫疾患におけるTGF-βの応答異常を見出しており、患者免疫細胞のTGF-βシグナル異常も明らかにしている。これらの知見は新たなTGF-βシグナル・パスウェイの同定や上記免疫疾患の病態解明に繋がると期待される。更に、同疾患は腸管粘膜免疫異常を合併することが明らかとなっており、本疾患患者の腸内細菌叢を解析することで、腸管粘膜免疫・腸内細菌叢構築におけるTGF-βの機能的役割を検証することが可能となる。但し、平成25年度中に行う予定であった健常児及び免疫疾患患者の腸内細菌叢解析についてはまだ実施に至っておらず、次年度早々に行う予定である。今回TGF-βシグナル異常を見出した原発性免疫不全症患者を含めた種々の免疫疾患患者及び同年代の健常児の腸内細菌叢を解析し、それぞれの免疫学的特徴と腸内細菌叢の組成との関連性について検討する。また、本研究で明らかとなった同疾患で観察されるTGF-βシグナル異常の更なる分子生物学的検討を行い、未知の新規TGF-βシグナル経路を明らかににする平成25年度中に行う予定であった健常児及び免疫疾患患者の腸内細菌叢解析が、サンプル数が揃わず実施に至っていないため、同実験に使用予定であった研究費が繰り越しとなった。サンプル数が揃い次第、上述の健常児及び免疫疾患患者の腸内細菌叢解析(16sリボソーム解析、メタゲノム解析など)を行うための試薬・器具などの物品購入費や解析費用として使用する予定である。
低悪性度神経膠腫の術中迅速可視化を実現する蛍光プローブの開発と機能検証

腫瘍選択的な蛍光イメージングを実現するための戦略として、腫瘍細胞において発現や活性が亢進していることが知られているプロテアーゼを利用する手法が挙げられる。今年度は、前立腺がん細胞や乳がん・脳腫瘍などの新生血管において高発現することが報告されているProstate specific membrane antigen (PSMA)を標的とした、がんイメージングプローブ開発を行った。PSMAはペプチドC末端のグルタミン酸を切断するカルボキシペプチダーゼとして働くことから、当研究室ではその活性を検出するactivatable型蛍光プローブとして5GluAF-Fluoresceinを開発していた。5GluAF-Fluoresceinは、分子内のアゾホルミル基の強い電子求引性により光誘起電子移動(PeT)が起こり消光しているが、PSMAによりグルタミン酸が切断されると強蛍光性のフルオレセインが放出される設計となっている。しかし、フルオレセインは水溶性が高く、細胞膜を透過しないことが課題として挙げられていた。そこで、私は色素骨格の変更により、細胞膜透過型のPSMA活性検出プローブの開発に取り組んだ。具体的には、色素骨格をより脂溶性の高い構造へ変換したプローブを3種類設計・合成し、PSMA精製酵素や前立腺がん由来細胞を用いて反応速度や細胞膜透過性の評価を行った。その結果、2Me-TokyoGreen (2MeTG)を骨格とする5GluAF-2MeTGはPSMAに対して最も速い応答を示し、かつPSMA発現細胞の細胞内を蛍光染色することが可能であることが示された。また、5GluAF-2MeTGを用いてヒト前立腺がん手術検体のイメージングを行ったところ、蛍光を示す部位とPSMAを発現するがん部位とが概ね一致し、世界で初めて前立腺がん臨床検体内のがん部位のライブイメージングに成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1) IDH1の変異を標的とした蛍光プローブの開発イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)1は,低悪性度神経膠腫の多くで変異していることが知られており,変異体はNADPH存在下でα-ケトグルタル酸(α-KG)を2-ヒドロキシグルタル酸(2-HG)へと変換する活性を持つ.低悪性度神経膠腫を検出する蛍光プローブの開発のため,変異体に特徴的なジケトン構造の還元反応を利用することを考え,研究を行った.IDH1変異体検出蛍光プローブの開発にあたり,大腸菌から精製したIDH1タンパク質について,α-KGを基質とした活性評価を行い,変異体であるIDH1 R132HがNADPH存在下でα-KGを還元する活性を持つことを確認した.続いて,IDH1 wt/R132Hの基質選択性を調べるため,ジケトン構造を持つα-KG誘導体5種類を用いて,NADPH存在下で各誘導体を基質として還元反応が起こるかを検討した.今回用いた5種類の誘導体は全てIDH1 wt/R132Hの基質にはならず,また,IDH1 R132Hとα-KGの反応を阻害することもなかったことから,タンパク質の基質認識ポケットに入らないことが示唆された.この結果から,IDH1 R132Hの基質認識は非常に厳密であり,酵素反応を蛍光制御に利用することは難しいと判断し,IDH1変異体検出蛍光プローブの開発は断念することとした.(2)脳腫瘍細胞で亢進しているプロテアーゼ活性を標的とした蛍光プローブの開発脳腫瘍特異的なプロテアーゼ活性をターゲットとした蛍光プローブの開発を目的とし,計260種類のプローブライブラリーのスクリーニングを行い,30種類の候補プローブを見出した.これらの候補プローブの一部を脳腫瘍手術検体のイメージングに適用し,約半数の症例で腫瘍部と正常部の蛍光強度に差がつく2種類のプローブを見出した.脳腫瘍特異的なプロテアーゼ活性をターゲットとした蛍光プローブ開発において,プローブライブラリーのスクリーニングにより見出された2種類のプローブは,脳腫瘍手術検体を用いたイメージング実験においても約半数の症例で腫瘍部と正常部の蛍光上昇に差がみられる有望な候補プローブであり,この一年間でプローブの探索研究が進展したと言える.(1)脳腫瘍細胞で亢進しているプロテアーゼ活性を標的とした蛍光プローブの開発昨年度に引き続き、スクリーニングの結果見出された候補プローブを、新鮮手術検体のex vivoイメージングに適用した。これまでの検討から、PR-HMRGは11例中6例で腫瘍部における強い蛍光上昇を示し、AcGP-HMRGは20例中11例で正常部における強い蛍光上昇を示した。(2)グルコーストランスポーターGLUT1を標的とした蛍光プローブの開発一般的に腫瘍細胞においては、その急速な細胞増殖や亢進した細胞内代謝を維持するため、糖やアミノ酸などに対する種々のトランスポーターが高発現していることが知られている。その中でもグルコーストランスポーター1(GLUT1)は、脳腫瘍を含む様々ながんで発現が亢進していることが報告されており、イメージングや治療の標的として注目されており、私はGLUT1を標的としたactivatable型蛍光イメージング手法の開発に取り組んだ。具体的には、アルキン(またはアジド)を導入したグルコース誘導体をGLUT1を介して細胞内に取り込ませ、その後アジド(またはアルキン)を導入した蛍光プローブを適用し、細胞内でのclick反応によりグルコース誘導体と蛍光プローブがラベル化されることで蛍光特性が変化することでイメージングを行う手法を考えた。

本年度は、click反応によって蛍光特性が変化する蛍光プローブ骨格の開発に取り組んだ。ローダミンにアジドを導入した誘導体を2種類、Siピロニンの9位にアルキンを導入した誘導体を1種類合成し、光学特性を調べたところ、ローダミン誘導体はclick反応の前後で蛍光特性はほとんど変化しなかった。一方、Siピロニン誘導体はclick反応の前後でpKaが2程度変化し、click activatableな蛍光プローブとして利用できる可能性が示唆された。脳腫瘍特異的なプロテアーゼ活性を標的としたプローブ開発において、スクリーニングで見出された候補プローブのうち、2種類のプローブは症例数を増やした検討においても約半数の検体で腫瘍部または正常部における選択的な蛍光上昇を示した。また、グルコーストランスポーター1を標的としたプローブ開発において、click反応の前後で蛍光特性の変化するプローブ骨格の開発に成功し、この一年間で研究が進展したと言える。腫瘍選択的な蛍光イメージングを実現するための戦略として、腫瘍細胞において発現や活性が亢進していることが知られているプロテアーゼを利用する手法が挙げられる。今年度は、前立腺がん細胞や乳がん・脳腫瘍などの新生血管において高発現することが報告されているProstate specific membrane antigen (PSMA)を標的とした、がんイメージングプローブ開発を行った。PSMAはペプチドC末端のグルタミン酸を切断するカルボキシペプチダーゼとして働くことから、当研究室ではその活性を検出するactivatable型蛍光プローブとして5GluAF-Fluoresceinを開発していた。5GluAF-Fluoresceinは、分子内のアゾホルミル基の強い電子求引性により光誘起電子移動(PeT)が起こり消光しているが、PSMAによりグルタミン酸が切断されると強蛍光性のフルオレセインが放出される設計となっている。しかし、フルオレセインは水溶性が高く、細胞膜を透過しないことが課題として挙げられていた。そこで、私は色素骨格の変更により、細胞膜透過型のPSMA活性検出プローブの開発に取り組んだ。具体的には、色素骨格をより脂溶性の高い構造へ変換したプローブを3種類設計・合成し、PSMA精製酵素や前立腺がん由来細胞を用いて反応速度や細胞膜透過性の評価を行った。その結果、2Me-TokyoGreen (2MeTG)を骨格とする5GluAF-2MeTGはPSMAに対して最も速い応答を示し、かつPSMA発現細胞の細胞内を蛍光染色することが可能であることが示された。また、5GluAF-2MeTGを用いてヒト前立腺がん手術検体のイメージングを行ったところ、蛍光を示す部位とPSMAを発現するがん部位とが概ね一致し、世界で初めて前立腺がん臨床検体内のがん部位のライブイメージングに成功した。今年度の研究で見出された,脳腫瘍特異的なプロテアーゼ活性を検出する蛍光プローブとして有望な2種類のプローブについて,更なる検討を行う.
自然エネルギーの複合利用に関する研究

木村は、山梨県の藁葺鉄板屋根の民家で夏季の熱環境実測を行い、気温、室内表面温度、方向別ふく射熱量、湿度風速などの経時変化の計測結果を分析することにより、冷ふく射効果、吸放湿効果、通風効果などの自然エネルギー複合利用効果を認めた。夏季の蒸暑条件を環境試験室に再現し、男女大学生172名の体感の不満足度を求めた。片山は、中高層市街地と水面のある公園で、係畄気球により夏季の風速、気温の垂直分布を観測し、日射による気温上昇と水面による気温低下を認め、夏季日中の住棟間の地表面熱収支を求めた。新有効温度は日向で32-38°Cのとき日蔭では30°C以下となり、夏季の通風室内での体感申告から快適となる風速の中央値は1.4m/sとなった。中村は、キャビティ室間の夏季の熱環境測定の結果、放射温度は裸地、コンクリート面ともに夜間も高く、開けた芝地では気温より低いことを確認し、理論計算と併せて、室間形状と地面材料の選択により市街地の熱環境調整の計画ができることを示唆した。測定気象データに基き人体熱収支計算を行い、直達日射と風速の強い影響が現われた。高野は、海洋エネルギーの複合利用の基礎研究として、多レベル海流・水温・塩分予報モデルにより格子点法を用いてシミュレーションを行い、道筋が狹く安定した赤道潜流が利用し易いこと、水温差は西太平洋赤道海域が大きいことを示した。冷排水の拡がりを予測するモデルをジブラルタル海狭から流出する地中海高塩分水に適用した。福岡は、斜面の温暖帯にある瀬戸内地方の高地性集落の気候学的特長について、放射エネルギー収支の実測、数値計算、気温の逆転観測の結果から確認した。広島県全域の標高、起伏度のメッシュデータに基き、傾斜地の角度と向き、起伏度の分布を求め、太陽熱・風力の局地的有効利用の可能性を示唆する基礎的資料を得た。以上5名の研究分担者は相互に成果を評価しつつ研究を進めた。
安全かつ効果的な同種骨移植骨を可能にするプラズマ処理

同種骨に対する高温加圧滅菌が骨癒合能に与える影響を定量評価し、同滅菌骨に対するプラズマ表面処理が低下した癒合能を回復するかどうか調査した。結果、ガス滅菌に比較し、高温高圧滅菌では骨癒合能が約25%低下することが判明した。その差は酸素プラズマ1分の曝露により回復する可能性があるものの、低温で十分なラジカルを生成するプラズマ条件で安定性した効果を示すには至らず、更なる調査を要するものと考える。平成24年度の結果から、骨釘に対する加圧滅菌は低温滅菌に比較し骨癒合能を約25%減じることがわかった。本年度は、滅菌操作で失われた骨癒合能を回復する手段して、プラズマ表面処理が有効か否か検証を行った。実験系は昨年度とほぼ同様の手法を採用し、骨釘を作製し加圧滅菌プラズマ処理群(AP群)および低温滅菌非プラズマ処理群(EN群)を設け、日本白色家兎大腿骨顆部へ移植した。屠殺時期を術後10日へ変更し固定強度を調査した。プラズマ処理では、無駄を省くため過去の研究から絞り込んだ条件を採用し、電力150W,carrier gas;He(流量4L /min),reactive gas;O2 (流量2.3/min),照射時間;30分および60分という条件で処理を行った。結果、EN群の固定強度は325±62N(範囲:205-441N)に対し、AP群では30分処理で279±72N(範囲:180-360N),60分処理で312±75N(範囲:190-432N)であり、両群間に有意差は認めなった(p=0.12, p=0.40)。処理時間について、AP群の30分処理と60分処理の比較では有意差は認めない(p=0.38)ものの、60分処理で高い強度を示す傾向を認めた。以上の結果から滅菌処理法の違いにより生じた癒合能の差が、プラズマ処理を加えることで是正させる可能性があることが示唆された。一方でサンプル間の個体差が大きく、結論づけるには時期尚早と考える。加えて処理時間について、より短時間での処理が有効である可能性があることが予備実験から判明した。条件を再検討しさらに検証を勧める必要があると考える。本年度は滅菌法の違いによる骨癒合能の変化を正確に確認するため、牛骨から精密加工機で作製した骨釘を2群に分け、一方に加圧滅菌を施行(A群)し、他方に低温滅菌を施行(E群)した。対象群として生体吸収材として汎用されるポリ乳酸材(PLLA)を同様の形状に加工したPLLA釘を用意し、同様の条件で低温滅菌を施行(P群)した。これら3群を家兎大腿骨顆部へ移植し、術後10日および14日時点での目での固定力を評価した。またマイクロCT(μCT)を用い骨癒合部の微細構造を評価した。その結果、移植直後の固定力は3群間に差を認めなかった(A群0.30±0.09N, E群0.25±0.05N, P群0.33±0.08N)が、術後14日ではA群312±20N, E群400±56N, P群21±8Nといずれも各群間に有意差を認めた(p以上の結果から、加圧滅菌では低温滅菌に比較し骨癒合能が約25%低下することが判明した。一方で加圧滅菌した骨釘でもPLLA釘に比較し術後14日で10倍以上の固定強度を得ることも判明した。この事実は、骨が持つ骨形成タンパク質(BMP)が滅菌による熱変性で失活しても、骨釘はPLLA釘より固定材として優れていることを示唆していると考える。平成25年までの結果から、骨表面へのプラズマ処理が骨癒合能を向上させる可能性が示唆された。本年度は至適な条件を検索するため、主としてreactive gas種の調整と処理時間の調整を行った。ガス種選択実験では実験系およびプラズマ生成条件は前年度までの仕様を踏襲し、骨釘の滅菌は加圧滅菌とした。プラズマ処理はcarrier gasにHeを4L/minで用い、reacrtive gasにO2およびN2をそれぞれ流量2.3L/minで加えた。コントロールをractive gasを混入しないHe単独プラズマ処理とした。処理時間は30分を選択した。プラズマ処理した骨釘を家兎に移植し、術後10日目の骨癒合強度を測定した。結果、O2群は279±23N、N2群は232±27N、He群は247±33Nとなり、群間に統計学的有意差は認めなかった。処理時間実験では昨年度までの実験から長時間の処理が有利と考えていたが、細胞活性には数秒から数分というより短時間の処理が有効である可能性が報告された(Haertel B et al. Biomol Ther, 2014)ことから、処理時間1分郡を追加し30分および60分と比較した。

結果、1分群は340±23N、30分群は279±23N、60分群は312±24Nとなり、群間に統計学的有意差は認めなかった。結果的に、ガス種、処理時間ともに有意な差を検出できなかったが、O2プラズマで1分の処理が癒合強度増強に有利である可能性があると考える。一方、これまでラジカルの有無に関する検討は不可能であったが、2015年に特願申請され試薬を用い検討した結果、同試薬の検出値に達していないことが判明した。結果にばらつきがあり、かつ有意差を検出できなかった要因の一つと考えている。十分量のラジカルを生成しうる条件に再設定し、骨癒合促進効果に関する実験を継続する必要がある。医学整形外科加圧滅菌骨に対するプラズマ処理の効果を検証し、その有効性を検証するところまでは予定通り遂行できた。一方で、同種骨移植モデルの実験は先送りとした。その理由は、小動物実験の結果から絶対的な結論を導き出せないと判断したこと、およびプラズマ処理時間など設定条件について追加調査が必要になったためである。現状況下において、大動物事件を遂行するとこは意味がないと判断し、したがって当初の予定が一部未完遂となった。上記の通り、申請書の計画に従って研究を行っている。結果も概ね仮説の通りであり、継続して研究する必要がある。上述の如く新たな課題が見つかった。当面は設定条件を模索するため、処理時間を変え生体外で表面処理効果を検証(X線光電子分光法)していく。可能ならば新たなガス種も検証する。再設定ののち、小動物実験を施行し、骨癒合に対するプラズマ表面処理の効果を検証していく予定である。確信のある効果が実証できれば、大動物実験へ移行し、臨床応用へ向けての計画を立案する。来年度はBMPの失活によって失われた骨癒合能を補填する技術としてプラズマ表面処理が利用可能かどうか検証する。実験系は本年同様とし、加圧滅菌した骨釘にプラズマ表面処理を行う。条件は電力150W,carrier gas;He(流量4L /min),reactive gas;O2 (流量2.3/min)またはN2(流量2.3L/min),照射時間;30分または1時間とすることを予定しているが、最適な条件は不明であるため適宜修正するものとする。プラズマ表面処理が骨癒合へ与える効果を検証しているが、骨への画黒時間に関する研究に時間を要したため、予定通り実験が進まず、したがって予算に残が生じた。プラズマ処理工程における時間やガス種など再度検証しより有効な条件を模索する。家兎を用いた実験で生体内での効果を検証し、状況に応じ豚など大動物実験を予定する。本年度生じた残金はその費用に充てる。本年度予算の内2218円の残金を生じたが、必要物品を購入した結果の残金であり、大幅に研究費が余ったわけではない。本残金は次年度研究費130万円に組み込み、研究に必要な物品の購入費に充てる予定である。
元素相乗的な連続結合活性化に基づくホウ素・ケイ素・遷移金属複合系の新触媒プロセス

遷移金属錯体による元素間結合の活性化をきっかけとして複数の結合活性化を連続的に引き起こす素反応過程に基づいた高反応性触媒中間体の効率的形成と、これを利用する触媒的結合形成反応の開発を目的として研究を行った。平成20年度に実施した「研究項目2.メタル-シリレンを経由する他の不飽和炭化水素との触媒的結合形成反応の開発」において、炭素-炭素二重結合化合物との反応を検討した際に得られた知見に注目し、エチレンおよび末端アルケンとの反応についてさらなる検討を行った。その結果、ケイ素上にジエチルアミノ基を有するシリルボランを用いトリフェニルボスフィンを配位子に有するパラジウム触媒存在下反応を行うと、エチレン2分子とシリレン3分子が関与する炭素-ケイ素およびケイ素-ケイ素結合形成が進行し、7員環含ケイ素化合物である1,2,5-トリシラシクロヘプタンが良好な収率で生成することが明らかとなった。一方、スチレンや脂肪族末端アルケンの反応においては、アルケン2分子とシリレン2分子による6員環生成物が主として生成した。このような結合形成は本手法に特徴的な反応様式であり、メタルーシリレンを経由することにより初めて実現したことから、触媒反応設計の新指針となる重要な成果であると考えられる。これまでの検討で得られた知見を基にして、交付申請書に記載の「研究項目3.メタルーボリレンの効率的発生法開発」に取り組んだ。ボリレン前駆体としてホウ素上にジメチルアミノ基およびクロロ基を有するジボロンを複数種調製し、遷移金属触媒存在下不飽和炭化水素との結合形成を検討するとともに、生成が予想される有機ホウ素化合物を別法により調製しその物性について調査した。その結果、メタルーボリレンの効率的形成手法確立には至らなかったものの、今後の反応開発の鍵となる基礎的事項について十分な知見を得ることができた。交付申請書に記載した「研究項目1.メタル-シリレンを経由する1,3-ジエンとの触媒的結合形成反応の開発」において、シリルボランのケイ素上に置換した脱離基の種類、および触媒上の配位子の電子的・立体的効果について検討を行ったところ、ジエチルアミノ基が置換したシリルボランを用い適切なリン配位子を有するパラジウム触媒の存在下反応を行うことで、シリレン等価体の形成と炭素一ケイ素結合の形成が効率よく進行し、5員環環状ケイ素化合物が収率よく生成することを見出した。様々な置換様式の1,3-ジエンに対し反応を検討した結果、本反応が高い基質一般性を示すことに加え、官能基選択的かつ立体特異的に進行することが明らかとなった。これらは、従来の熱分解や光反応により発生させたフリーシリレンでは達成できないことから、メタル-シリレンを経由する本反応の有機合成的有用性が明らかとなった。ここで得られた知見を基にして、交付申請書に記載した「研究項目2.メタルーシリレンを経由する他の不飽和炭化水素との触媒的結合形成反応の開発」に関して末端アレンおよび非共役エンインとの反応を検討した。その結果、期待した環状ケイ素化合物の形成反応は進行しなかったものの、生成した化合物の構造から反応機構に関する有用な知見を得ることができた。これらの知見は、メタルーシリレンを活用する触媒的結合形成反応開発に資すると考えられる。
虚血性急性腎不全の発症・修復におけるエンドセリン,成長因子の役割の検討

虚血性急性腎不全におけるエンドセリン(ET)、トロンボキサン(Tx)の役割検討した。急性腎不全はSDラットの左腎動脈を60分間閉塞し作成した。閉塞解除48時間後に腎のイヌリンクリアランス(Cin)、腎内ET,Tx濃度を測定した。腎内ET、TxB2濃度の測定及びET抗体(AwETN_<40>3.3nmol/kg)、ET-A受容体拮抗薬(FR139317、50mg/kg/day、3日間皮下注)、TxB2の合成阻害薬(OKY046、100mg/kg/day)の腎機能に及ぼす影響を検討した。この際右腎を摘出した群、偽右腎摘出手術群と非虚血対照群で比較した。Cinは虚血により右腎摘群で対照群の24.2%へ低下したが、偽手術群ではその低下はさらに強く5.1%であった(p<0.05)。組織学的にも偽手術群で右腎摘群に比し尿細管壊死が著しかった。腎皮質内ET,Tx濃度は共に虚血により対照群に比し有意に上昇したが、右腎摘群では偽手術群に比し有意に低値であった。左腎からの尿中ET、Tx排泄量は右腎摘出群では偽手術群に比し有意に大であった。ET抗体、ET-A受容体拮抗薬(今回の量のFR139317は0.08-0.4nmol/kgのET1静脈内投与による昇圧を抑制した)は、右腎摘群、偽腎摘群とも虚血48時間後のCinを改善させなかった。一方、TxB2合成阻害薬は偽手術群において虚血後の尿量、腎血流量、糸球体濾過値を増加させた、右腎摘出群とほぼ同じ値となった。一方、右腎摘出群ではTxB2合成阻害薬投与によって腎血流量、Cinは変化しなかった。以上の結果から、左腎の虚血性腎障害が右腎摘出によって軽減される機序に腎内のTx作用が重要な役割を果していること、また腎内ET-A受容体を介するETの関与は少ないこと、が明らかとなった。虚血性急性腎不全におけるエンドセリン(ET)の役割をみる目的で急性腎不全での腎内ETの測定及びET抗体、ET拮抗薬の腎機能に及ぼす影響を検討した。閉塞解除48時間後に腎のイヌリンクリアランス(Cin)、腎内ET濃度を測定した。腎皮質内ET濃度は虚血により対照群に比し有意に上昇したが、偽手術群(924±241pg/g tissue)では右腎摘群(420±38pg/g tissue)に比し有意に高値であった。(p<0.05)。尿中ET排泄量は右腎摘出群では偽手術群に比し有意に大であった。腎内ET濃度の差がCinの差の原因になっている可能性を検討するため、ET抗体(AwETN_<40> 3.3nmol/kg)を虚血前、血流再開5分前、再潅流1時間後および5時間後の計4回投与したが虚血48時間後のCinに影響を及ぼさなかった。さらにET-A受容体拮抗薬であるFR139317を虚血24時間前よりosmotic minipumpを用いて50mg/kg/day、3日間皮下投与した(別の実験で、この量のFR139317が0.08-0.4nmol/kgのET1静脈内投与による昇圧を抑制することを確認してある)が、右腎摘群、偽腎摘群とも虚血48時間後のCinの改善をみかなった。以上の結果は、虚血性腎不全のCinの低下にET-A受容体を介するETの関与は少ないと考えられる。

左腎からの尿中ET、Tx排泄量は右腎摘出群では偽手術群に比し有意に大であった。ET抗体、ET-A受容体拮抗薬(今回の量のFR139317は0.08-0.4nmol/kgのET1静脈内投与による昇圧を抑制した)は、右腎摘群、偽腎摘群とも虚血48時間後のCinを改善させなかった。一方、TxB2合成阻害薬は偽手術群において虚血後の尿量、腎血流量、糸球体濾過値を増加させた、右腎摘出群とほぼ同じ値となった。一方、右腎摘出群ではTxB2合成阻害薬投与によって腎血流量、Cinは変化しなかった。以上の結果から、左腎の虚血性腎障害が右腎摘出によって軽減される機序に腎内のTx作用が重要な役割を果していること、また腎内ET-A受容体を介するETの関与は少ないこと、が明らかとなった。本研究は急性腎不全の発症に対する血管作動性物質の関与と、回復過程への成長因子の関与を検討するものである。平成4年度において、エンドセリンが虚血性急性腎不全の発症に中心的役割を果たしているとは考えにくいという結果を示したが、本年度はトロンボキサンの関与について検討した。平成4年度研究計画書に述べたように、左腎動脈の60分完全閉塞による急性腎不全は右腎を摘出しておいた場合に軽減されること、その際虚血後の左腎内のトロンボキサンB2の増加が軽減されることを我々は既に報告している。今回トロンボキサンB2の合成阻害薬であるOKY046(100mg/kg/day)を用い、虚血性急性腎不全が軽減されるか否か検討した。その結果、トロンボキサンB2合成阻害薬の投与により、尿量、腎血流量、糸球体濾過値の増加を認め、虚血性急性腎不全の発症にトロンボキサンが関与する可能性があることが示された。また、回復過程に対する成長因子の関与を検討する目的で、右腎摘出をした場合としなかった場合とで虚血後の細胞増殖の程度が異なるか否かを検討した。左腎を60分間閉塞し、閉塞解除後30分5、24、48、96時間の時点で左腎を摘出しホルマリン固定後、proliferating cell nuclear antigen(PCNA)の発現を免疫染色を用いて検討した。その結果、虚血後24時間の時点でのPCNA発現は右腎摘出群で大であり、右腎摘出群で細胞増殖が促進されていることが示唆された。現在、動物の数を増加させ、この結果の確認を行っている。細胞増殖にIGF-1,EGF,TGF-βなどが関与するかを検討する目的でジゴキシゲニンをラベルしたプローベを用いてmRNAMの検出を行っているが、従来のアイソトープをラベルしたプローベと異なり、条件設定が困難であり、現在その条件設定を急いでいる段階である。
クロバザム及び活性代謝物の薬物動態/臨床効果とCYP2C19遺伝子多型の関連

【背景・目的】クロバザム(CLB)は、既存のベンゾジアゼピン系薬剤に比べ、広い抗てんかん作用をもつことから難治てんかん患者を中心に様々な発作型の薬物治療に用いられている。我々は、成人難治性てんかん患者におけるN-CLBとCLBの血中濃度比の個体間変動がCYP2C19遺伝子多型と関連していることを報告しているが、治療域を含めた体内動態に関する詳細な報告やCYP2C19遺伝子多型と臨床効果および副作用などの薬物治療についての報告はほとんどない。そこで、CLB服用患者におけるCLB体内動態とCYP2C19遺伝子多型による臨床効果の関係について検討し、評価することを目的とした。【研究方法】京大病院でCLBを服用している患者23名を対象に、CLBおよびN-CLB血中濃度測定値を収集した。また、PCR-RFLP法によりCYP2C19の遺伝子解析を行い、CLBの体内動態や臨床効果との関係について検討した。【研究成果】CYP2C19遺伝子多型においてホモ変異型の場合、野生型の場合と比べ、CLB投与量は約半分、N-CLB血中濃度は約2倍、N-CLB/CLB血中濃度比は約3倍と遺伝子型により大きく異なった。また、野生型を有する患者の発作消失が0名だったのに対し、ホモ変異型を有する患者では発作消失が4名と有意な発作の抑制効果がみられたことから、ホモ変異型を有する場合、低用量で有効な治療効果を得られることが示された。以上の結果より、成人難治性てんかん患者においてCYP2C19遺伝子多型が低用量CLB治療におけるN-CLB血中濃度および有効性と関連していることを明らかとした。現在、CLB導入前の患者を対象に遺伝子解析を行い、低用量で効果の期待できる患者にCLB治療を選択するといった個別化医療への応用へむけた前方視的な検討を行っている。
高血圧予防食品設計のための新戦略提案

レニン-アンジオテンシン(RA)系は血圧上昇を担う代謝系であり、アンジオテンシンI変換酵素(ACE)阻害が降圧作用の本体である」との従来説を覆し、血圧調節系としてのRA系の実証とAng代謝の正常化を指標とする新たな高血圧および関連疾患予防食品研究の創製を提唱するものである。そこで、本年度では、RA系代謝物相関を最終目標とする上で重要となるRA系代謝物の一斉分析法の設定を試みた。まず、Sprague-Dawley(SD)ラットを用いて、血漿1 mLからアンジオテンシン(Ang) I, Ang II, Ang-(1-7)をfmol/mLレベルにおいて検出することを目的として、各種MS分析法を検討した。より高い検出感度を得るために、ペプチド誘導体化法を検討し、カルボキシル基誘導体化剤として2-picolylamine、1-(2-pyrimidyl)piperazine、アミノ基誘導体化剤としてTNBS、NDA、アセチル化剤として無水酢酸を用いて、対象アンジオテンシン(Ang)代謝物に対しそれぞれ誘導体化反応を行い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)-MS法による誘導体化代謝物の合成確認とLC-IT-MS/MS法による分析を試みた。その結果、一斉解析のための逆相カラム分離条件、MS解析のためのMRMトランジット条件等を設定することができた。各種誘導体化法のうち、カルボキシル基誘導体化およびアセチル化を同時に行うことによって、対象Ang代謝物はサブpmolレベルにおいて一斉検出が可能であることが示唆された。高血圧自然発症ラットでの加齢に伴う血圧亢進とRA系賦活の相関を得ることが本研究の課題であるが、同一固体をと殺することなく長期に観察(血液試料採取)し、代謝物療を一斉解析するには微量血液での高感度分析法の設定が必要である。現時点では血液1mLレベルでのfmol検出が可能な分析法を設定することができたが、上記観察を達成するにはさらに10倍以上の感度を示す方法が必要であり、これを現在検討している段階であるため。正電荷を保有する誘導体化剤を用いて、LC-TOF-MSあるいはMS/MS測定法の構築を図り、更なる高感度検出系の設定を試みる。本研究は、「レニン-アンジオテンシン(RA)系は血圧上昇を担う代謝系であり、アンジオテンシンI変換酵素(ACE)阻害が降圧作用の本体である」との従来説を覆し、血圧調節系としてのRA系の実証とAng代謝の正常化を指標とする新たな高血圧および関連疾患予防食品研究の創製を提唱するものである。そこで、当該年度では、高血圧発症に関わるRA系代謝物相関を最終目標とする上で重要となるRA系代謝物の一斉解析法の設定を試みた。対象とする7種類のAng代謝物について一斉に解析可能なLC-IT-MS/MS-MRM法を構築することができた。本法の設定により、循環血液中の代謝物動態を把握するための分析条件を設定し得たことになる。ただし、得られたLODがpmol/mLレベルであったことは、経時的な血圧-代謝物相関に関する解析をする上で重要となる尾静脈採血において、その採血量から推定して、さらに高感度な分析法の設定が要求されるところである。すなわち、血漿100micro-Lでfmol/mLレベルでの定量が今後の課題といえる。