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超対称性の破れと有効相互作用

当該研究計画では、超対称統一理論において超対称性が部分的に破れる際の有効相互作用について、その低エネルギーでの振る舞いに焦点を当て研究を遂行した。特に、N=2超共形対称牲が、N=1超共形対称性またはN=1超ポアンカレ対称性に自発的に破れる場合について非線形実現の方法を用いて有効相互作用を調べた。その結果、自発的破れに伴って現れる南部・ゴールドストン粒子がN=1のsupermultipletを形成し、それらの間の相互作用を記述する有効ラグランジアンが求められた。この研究成果は、学術論文として発表した(Phys.Lett.B420(1998)69-76)。また口頭では昨年9月に東京都立大学で開かれた物理学会と、11月に京都大学基礎物理学研究所での研究会「超対称性の新展開」で発表した。このようにして得られた有効理論に基づいて、標準模型を越える超対称標準理論(MSSM)に対する現象論的帰結や、超対称性のダイナミカルな破れと双対性との関係、さらにCP不変牲、コンフォーマル不変性等他の対称性に及ぼされる効果等の諸問題を今後包括的に検討したい。本計画の実施において、国内各地とりわけ、東大・広大・横浜国大、またドイツ・マックスプランク研究所の関連する分野の研究者との討論・研究交流が有益・不可欠であった。特に、来日中のB.ランペ氏とは、標準理論を越える超対称性理論に登場する新たな粒子に関する研究・討論を行った。尚、予算執行としては旅費の他、資料整理ための謝金、論文作成に必要なポストスクリプト対応のプリンターやパソコンの増設メモリおよびソフトを購入した。
分子シャペロンHSPはアポトーシスシグナルを制御する

本研究では、ヒト顎下腺由来腺癌細胞株(HSG)の抗Fas抗体(CH-11)誘導アポトーシスヘの熱ショックタンパク質90(HSP90)の関与をHSP90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン(GDM)を用いて検討するとともにHSP90のターゲットタンパク質を同定した。GDMは、HSG細胞に単独でアポトーシスを誘導するとおもに、CH-11誘導アポトーシスを増強した。また、GCM処理によるHSP90の発現量の増加がRT-PCR法とWB法により認められた、HSP90タンパクをHSG細胞に導入し細胞死誘導に対する影響を調べたところ、GDMならびにCH-11によるアポトーシス誘導はHSP90の導入による過剰発現で抑制された。このことから、HSP90はFas抗体誘導アポトーシスに対して抑制的に働いていることが示された。そこでつぎに、免疫沈降-WB法を用いてFasシグナル上でのHSP90のターゲットパンパクの検索を行った。その結果、RIP, Caspase 8と、Caspase 8のドミナントネガティブ作用を有するFADD-like ICE inhibitory protein (FLIP)がそれぞれGDM処理で有意に減少した。一方、GDMが熱ショック転写因子を介してHSP90発現を増加させるか否かをheat shock elementを上流に有するルシフェラーゼレポーターをHSG細胞に導入して検索した。導入細胞をGDMで処理したところ、熱ショック処理(42°C、2h)を行った場合と動揺にレポーター活性は上昇した。<結論>HSP90はそのシャペロン効果によりターゲットタンパク質であるFLIPを安定化し、Caspaseに対するそのドミナントネガテフィブ作用を介してFas誘導アポトーシスを負に制御していることが示された。本研究では、ヒト顎下腺由来腺癌細胞株(HSG)の抗Fas抗体誘導アポトーシスに熱ショックタンパク質90(HSP90)が関与するか否かを調べるために、HSP90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン(GDM)を用いて検討した。<方法と結果>細胞死誘導は、GDMと抗Fas抗体(CH-11)の単独、ならびに両者処理(GDM前処理)により行った。細胞死の割合(%)はトリパンブルー排除法により求めた。また、ウェスタンブロット(WB)法によるpoly(ADP-ribose)polymeraseの切断、形態学的観察やTUNEL染色法によりアポトーシスを判定した。その結果GDMは、HSG細胞に単独でアポトーシスを誘導するとともに、CH-11誘導アポトーシスを増強した。また、GDM処理によるHSP90の発現量の増加がRT-PCR法とWB法により認められた。つぎに、HSP90αタンパクをHSG細胞に導入し細胞死誘導に対する影響を調べたところ、GDMならびにCH-11によるアポトーシス誘導はHSP90の導入による過剰発現で抑制された。このことから、HSG細胞内(in vivo)においてHSP90は抗Fas抗体誘導アポトーシスに対して抑制的に働いていることが示唆された。そこでつぎに、免疫沈降-WB法を用いてHSP90のターゲットタンパクの検索を行った。その結果、Caspase 8と、Caspase 8の活性化を制御しているとされるFADD-1ike ICE inhibitory protein (FLIP)がそれぞれHSP90と結合していることが明らかになった。<結論>HSP90はFLIPやCaspase 8を介してFas誘導アポトーシスシグナルを負(anti-apoptotic)に制御していることが示された。

昨年度までに、ヒト顎下腺由来腺癌細胞株(HSG)の抗Fas抗体誘導アポトーシスへの熱ショックタンパク質90(HSP90)の関与の有無をHSP90の特異的阻害剤であるゲルダナマイシン(GDM)を用いて検討し、HSP90がFas誘導アポトーシスシグナル伝達系に対し、anti-apoptoticに関与していることを見い出した。また、Fasシグナル系におけるHSP90のターゲットタンパク質としてCaspase8のドミナントネガティブ作用を有するFADD-like ICE inhibitory protein(FLIP)の関与が示唆された。そこで、本年は、FLIPとHSP90の相互作用を詳細に検討するとともに、GDMがFLIPの発現に及ぼす影響を調べた。《方法、結果と考察》FLIPとHSP90との相互作用を免疫沈降-ウエスタンブロット(WB)法により検討した。HSG細胞より細胞可溶性画分を調製し、HSP90抗体による免疫沈降物を得、これを電気泳動後、FLIPに対する抗体でWBを行ったところ約56kDaの位置に特異的なFLIPのバンドを得た。また逆に、細胞可溶化物をFLIP抗体により免疫沈降し、電気泳動後にHSP90抗体でWBしたところ90kDaのHSP90の特異的バンドが得られた。これらの結果から、FLIPはHSP90と特異的に結合していることが明らかになった。つぎに、HSP90がFLIPの発現に対し影響を及ぼすか否かをRT-PCR法により検討した。GDM処理後6hのHSG細胞より全RNAを調製し、FLIPのmRNAレベルをRT-PCRにより調べたところ、非処理細胞に較べGDM処理で顕著に減少した。この結果から、HSP90はFLIPに結合することによりFLIPの安定化に寄与する事でFas誘導アポトーシスに対して、and-apoptoticに作用することが推測された。《結論》HSP90はそのシャペロン効果によりFLIPを安定化することでFLIPのカスパーゼ8のドミナントネガティブ作用を介しFas誘導アポトーシスを負に制御していることが示唆された。
副作用が懸念される薬物の腎尿細管分泌機序の解明と新規腎機能核医学画像測定法の開発

腎臓は、投与薬物の排泄臓器として重要な役割を果たしており、正確な腎排泄機能の測定は臨床上重要である。MRI・CT造影剤や白金系抗がん剤等のように比較的分子量が大きく、高い投与濃度の場合、投与薬物が糸球体濾過と近位尿細管から分泌されるが、尿細管分泌機序や尿細管上皮細胞集積性が十分に解明されていない。本研究では、臨床で副作用が問題となっている薬物の近位尿細管分泌機序と尿細管上皮細胞集積性を解明する。さらに、臨床では投与薬物の副作用発生を回避するため、薬物投与前に糸球体濾過量を主に反映している血清クレアチニン測定を行っているが、糸球体濾過量が正常であっても、近位尿細管膜上の薬物トランスポータの発現量や活性が低く、尿細管分泌量が低下している高齢健常者や患者では副作用が生じやすい。そこで、現状の腎機能測定法では、測定困難な近位尿細管分泌量を正確かつ特異的に定量測定可能な核医学画像測定法の開発を目指す。申請者は、初めに現在臨床使用されている放射性医薬品とMRI・CT造影剤の腎排泄機序を解明することから研究を開始した。腎臓において代表的な管腔側薬物トランスポータ単一強制発現ベシクルを用いて、腎機能測定用核医学画像診断薬[99mTc]MAG3における薬物トランスポータの親和性を検討したところ、様々存在する薬物トランスポータの中でmultidrug resistance-associated protein(MRP)2とMRP4の親和性が確認できた。つまり、[99mTc]MAG3はMRP2とMRP4を介して尿細管分泌されていることを解明した。今後、実験動物等において、[99mTc]MAG3とMRP2とMRP4の関係性を調査する予定である。今後は、他の核医学画像診断薬やMRI・CT造影剤の腎排泄機序を検討する予定である。腎機能測定用核医学画像診断薬[99mTc]MAG3の尿細管分泌機序を検討した結果、様々存在する薬物トランスポータの中でMRP2とMRP4の関与を発見したが、本研究を開始するための準備に時間がかかったため、本研究の進展はやや遅れている。本研究では、副作用が懸念されるMRI・CT造影剤や抗がん剤等の薬物の近位尿細管分泌機序及び尿細管上皮細胞集積性の解明と、現状の臨床用核医学画像診断薬では評価困難な尿細管膜上の薬物トランスポータ機能の測定が必要な場合には、当該腎機能を正確かつ直接的に測定可能な新規放射性薬剤の開発を行う。平成30年度には、腎機能測定用核医学画像診断薬[99mTc]MAG3の尿細管分泌機序を検討した結果、[99mTc]MAG3はMRP2とMRP4を通じて分泌されることを発見した。今後も、現状の臨床用核医学画像診断薬、MRI・CT造影剤や抗がん剤等の尿細管分泌機序と細胞集積性を解明する。これらの結果から、当該薬物の副作用発生の一因となっている主要な尿細管分泌機序を見出し、臨床用核医学画像診断薬を用いて、副作用が懸念されるMRI・CT造影剤や抗がん剤等の薬物の近位尿細管分泌機序及び尿細管上皮細胞集積性を評価困難な場合には、米国のテキサス大学MDアンダーソンがんセンター、National Institutes of Healthとスタンフォード大学の協力の下、新規放射性薬剤を開発する予定である。腎機能測定用核医学画像診断薬[99mTc]

MAG3の尿細管分泌機序を検討した結果、様々存在する薬物トランスポータの中でMRP2とMRP4の関与を発見したが、本研究を開始するための準備に時間がかかったため、本研究の進展はやや遅れている。本研究では、副作用が懸念されるMRI・CT造影剤や抗がん剤等の薬物の近位尿細管分泌機序及び尿細管上皮細胞集積性の解明と、現状の臨床用核医学画像診断薬では評価困難な尿細管膜上の薬物トランスポータ機能の測定が必要な場合には、当該腎機能を正確かつ直接的に測定可能な新規放射性薬剤の開発を行う。平成30年度には、腎機能測定用核医学画像診断薬[99mTc]MAG3の尿細管分泌機序を検討した結果、[99mTc]MAG3はMRP2とMRP4を通じて分泌されることを発見した。今後も、現状の臨床用核医学画像診断薬、MRI・CT造影剤や抗がん剤等の尿細管分泌機序と細胞集積性を解明する。これらの結果から、当該薬物の副作用発生の一因となっている主要な尿細管分泌機序を見出し、臨床用核医学画像診断薬を用いて、副作用が懸念されるMRI・CT造影剤や抗がん剤等の薬物の近位尿細管分泌機序及び尿細管上皮細胞集積性を評価困難な場合には、米国のテキサス大学MDアンダーソンがんセンター、National Institutes of Healthとスタンフォード大学の協力の下、新規放射性薬剤を開発する予定である。次年度使用額が生じた理由として、本研究に使用する一部の管腔側薬物トランスポータ単一強制発現ベシクルに関して、平成30年度に購入予定であったが、平成31年度に購入するように変更したためである。したがって、平成31年度の研究費の使用計画として、平成30年度未使用額と平成31年度の配分額を合算し、物品費として、薬物トランスポータ単一強制発現ベシクルと溶液、試薬、放射性薬剤、CT・MRI造影剤及び実験器具等を購入する。また、国内・国外の共同研究施設への出張、英語論文校正や論文投稿料等にも使用する予定である。
遺伝子導入ES細胞からの腎臓発生分化に関する基礎的研究

テトラサイクリンオフシステムで導入遺伝子を調節できるES細胞でPax2遺伝子を導入したものを確立し、それらを分化させて胚様体を形成させることで腎臓の発生において重要な因子のintegrin α8やaquaporin 1の発現を増加させることができた。この実験の成果により、ES細胞から腎臓をはじめとした様々分野の初期発生において、遺伝子の発現の状況、目的とした細胞種の獲得など細胞を用いた再生医療に応用できることが期待される。末期慢性腎不全に陥った場合の主な治療は人工透析だが、医療経済の面では国の財政を圧迫し、患者の生活の質を著しく低下させる。一方でそれに変わる腎移植治療も確立された治療法ではあるものの、ドナー不足の面で透析の代替治療にはなり得ていない。そこで私たちは、すべての胚葉に分化可能な胚性幹細胞(Embryonic stem : ES細胞)に着目し、腎・尿管発生に重要な働きのPax2を遺伝子導入したES細胞から腎尿細管への分化が可能であるかを検討し、腎再生分化機構の解明と腎臓再生への応用を目指すことを目的とした。マウスより確立されたES細胞の一つであるMGZRTcH2を用いた。培養したES細胞と導入する遺伝子を用意し、electropolation用キュベット内に混ぜ入れて、960μF、250mVの条件でelectropolation法を行い、遺伝子を導入する。最終的にはサザンブロッティング法にて遺伝子が導入されたことを確認した。導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認するため、ES細胞からmRNAを抽出し、SuperScript II^Rキットにて逆転写反応を行い、得たcDNAを鋳型にして導入遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーでPCR反応を行った。また同時に、ウエスタンブロッティング法も行いタンパクレベルでの評価をした。遺伝子導入ES細胞が導入遺伝子が発現した状態で他の尿路発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認したところ、AQP1遺伝子の増加を認め、近位尿細管が分化していることが示唆された。ES細胞から腎臓への分化誘導系を確立することを最終目的に、Pax2遺伝子をES細胞に遺伝子導入をし、目的の細胞に分化する可能性のある遺伝子導入ES細胞を確立した。1.遺伝子導入ES細胞の確立と培養マウスより確立されたES細胞の一つであるMGZRTcH2細胞を用いた。培養条件は5%CO2、37°Cで、培養液はGlasgow MEMに10%FCS、10-4M2-メルカプトエタノール、non-essential aminoacid、1mMsodium pyruvate、1000U/ml LIFを加えたもの使用する。ES細胞を回収し、Pax2遺伝子を組み込んであるプラスミドDNAを用意し、960μF、250mVの条件でelectropolation法を行い、遺伝子を導入した。2.遺伝子導入ES細胞の分化実験Pax2遺伝子導入ES細胞をLIFを除いた培養液中でhanging drop法を用いembryoidbody(胚様体:EB)を形成させ、分化させた。5日後にEBを再度ディッシュに付着させ、分化を進めて、時間の経過とともに細胞を回収し、発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認した。また細胞の形態変化なども評価した。3. Pax2遺伝子導入ES細胞およびEBの遺伝子発現の確認回収したPax2遺伝子導入ES細胞、細胞塊をまず導入遺伝子自体が発現しているかどうかをRT-PCR法を用い確認する。ディッシュに平面培養したES細胞を回収し、mRNAを抽出し、SuperScript IIIキットにて逆転写反応を行った。得たcDNAでPCR反応を行った。この時、遺伝子未導入ES細胞を対照とし、増幅DNAバンドの有無などで判断した。他の腎発生の各段階で発現してくる遺伝子に変化がないかどうかをRT-PCR法を用い確認し、AQP1、Integrin α8の上昇を認めた。
イギリスにおける秘密保護に関する基礎的研究

本研究では、イギリスにおける医師の守秘義務に関する法的規制の現状について、(1)法源と法的効果、(2)保護対象となる秘密の意義・内容、(3)守秘義務の射程範囲と限界を中心に調査・分析を行った。(1)について、守秘義務の法源は、医師と患者との信頼関係(義務論)と当該義務の履行による重要な公共利益の実現(帰結主義)という2つの倫理的基盤のもと、1エクイティ上の義務違反、2コモン・ロー上の不法行為(tort)、3契約違反、41998年情報保護法(2018年データ保護法)に大別され、義務違反に対する事案の大多数が損害賠償(民事裁判)であり、医師の義務違反を処罰した例は確認されなかった。他方、1998年人権法、患者の権利に関する法のほか、British Medical Councilによる指針が医師の重要な行動規範となっていることも確認された。(2)について、保護対象となる秘密とは、裁判例の動向を追った限りでは、日常生活に関する些細な事情を除くほか、利用価値のある個人的情報を幅広く含むものと解されている。(3)について、守秘義務は、患者の同意がある場合や機密性が失われた場合のほか、制定法上の許容規定がある場合(犯罪捜査(1984年警察及び刑事証拠法、1973年薬物乱用法)、研究(2006年国家健康法)など)にも第三者提供が許容されている。第三者提供の限界については、民事判例において、私生活尊重の利益(1998年人権法8条)と報道の自由(同法10条)とを公共の利益の観点から比較衡量する中で考慮要素が示される一方、測定が困難であることや提供可能な相手方の範囲がなお明らかでないといった課題があることも確認された。本研究により、イギリスにおける法的規制の現状が明らかになるとともに、実例に乏しい日本法の解釈論の方向性や望ましい法的規制の在り方に関する比較法的示唆を獲得することができた。本研究の計画では、平成28年4月から平成29年6月の15か月間を第1期研究として、イギリスにおける医師の守秘義務に係る法制度、法状況の調査に充てることとしていた。また、「患者の嗜好」や「医療機関受診の事実」が保護すべき秘密に当たるかなどが争われた事案(Campbell v MGN[2004]UKHL 22)、「秘密の公表」と「表現の自由」との衝突が争われた事案(Mosley v News Group Newspapers[2008]EWHC 687)、機密情報が欧州人権条約8条にいう「私生活を尊重される権利」に含まれるとの理解を示した事案(Z v Finland(1988)EHRR 371)など、上記各法領域における諸判例についても調査を行った。平成29年3月末日時点ではなお第1期研究を継続中であるが、イギリスの法制度、及び医師の守秘義務違反が問題となった多数の事案を俯瞰する限り、大部分は刑事法以外の法領域に係るものであることが把握された。この点、今後の研究において秘密保護に関する刑事法の意義と限界を考えていく上で、一定の視点、示唆が得られた。平成28年4月14日、16日に発生した一連の熊本地震の影響により、同年8月頃まで十分な研究時間を確保することができなかったため、第1期研究の進捗が予定よりかなり遅れている。本研究の計画では、平成29年の6月までを第1期研究、平成29年7月から平成29年12月の6か月間を第2期研究、平成30年1月以降を第3期研究として、それぞれイギリスにおける医師の守秘義務に係る法制度の調査、守秘義務解除の諸事由(正当化事由)の研究、ならびに日本法への示唆の探究に充てることとしていた。かかる研究計画に基づき、平成29年度は、医師の守秘義務に関する多様な法源(エクイティ上の義務を起源とし、1988年人権法8条によるプライバシー権が部分的に影響、その他、GMC指針などのソフトローも存在)と法的効果(インジャンクション、損害賠償、医業停止)を擁する法制度の調査(第1期研究)を終え、医師による守秘義務解除、とりわけ刑事手続における取扱いについて、1969年のParry-Jones対The Law Society事件以降、現在に至る判例の動向を調査した(第2期研究)。第2期研究は現在も調査継続中であるが、イギリス法においては、「司法の利益の優越」という観点のもと、刑事手続、とりわけ公判段階における医師の特権(医療情報に関する証言拒否権)は存在しないものとされる一方、捜査段階においては1984年警察及び刑事証拠法の適用により、医療情報が幅広く保護されていること、そこでは衡量要素となる諸利益が相当に異なって解されていること、他方、医師による任意の情報提供については、捜査・公判段階を問わず広く適法であり、守秘義務違反を構成しないと解されていることなどが確認された。守秘義務解除の一般的な許容基準について、平成30年度初頭に検討を行い、第2期研究から速やかに第3期研究に移行する計画である。平成28年4月14日、16日に発生した一連の熊本地震の影響により平成28年度第1期研究に遅れが生じ、第1期研究期間を平成29年9月まで3か月延長したことにより、第2期研究の着手が平成29年10月にずれ込んだ上、平成30年3月に完了予定の第2期研究にも若干の遅れが生じているため。

本研究では、イギリスにおける医師の守秘義務に関する法的規制の現状について、(1)法源と法的効果、(2)保護対象となる秘密の意義・内容、(3)守秘義務の射程範囲と限界を中心に調査・分析を行った。(1)について、守秘義務の法源は、医師と患者との信頼関係(義務論)と当該義務の履行による重要な公共利益の実現(帰結主義)という2つの倫理的基盤のもと、1エクイティ上の義務違反、2コモン・ロー上の不法行為(tort)、3契約違反、41998年情報保護法(2018年データ保護法)に大別され、義務違反に対する事案の大多数が損害賠償(民事裁判)であり、医師の義務違反を処罰した例は確認されなかった。他方、1998年人権法、患者の権利に関する法のほか、British Medical Councilによる指針が医師の重要な行動規範となっていることも確認された。(2)について、保護対象となる秘密とは、裁判例の動向を追った限りでは、日常生活に関する些細な事情を除くほか、利用価値のある個人的情報を幅広く含むものと解されている。(3)について、守秘義務は、患者の同意がある場合や機密性が失われた場合のほか、制定法上の許容規定がある場合(犯罪捜査(1984年警察及び刑事証拠法、1973年薬物乱用法)、研究(2006年国家健康法)など)にも第三者提供が許容されている。第三者提供の限界については、民事判例において、私生活尊重の利益(1998年人権法8条)と報道の自由(同法10条)とを公共の利益の観点から比較衡量する中で考慮要素が示される一方、測定が困難であることや提供可能な相手方の範囲がなお明らかでないといった課題があることも確認された。本研究により、イギリスにおける法的規制の現状が明らかになるとともに、実例に乏しい日本法の解釈論の方向性や望ましい法的規制の在り方に関する比較法的示唆を獲得することができた。当初、第1期研究期間を平成28年4月から平成29年6月までの15か月としていたが、5か月間の遅れが生じたことから、第1期研究期間を平成29年9月まで3か月間延長した上で、調査対象としていた図書、文献、判例等をより精選して研究の遅れを取り戻したい。調査対象となる図書、文献、判例等を精選し、第2期研究を平成30年6月頃をめどに完了し、第3期研究期間(当初予定8か月間)を同年12月までとし、第4期研究(総括総括・論文執筆)を平成31年3月までと修正することで、当初期間での研究の完了を目指したい。平成28年4月14日及び16日に発生した一連の熊本地震の影響により、第1期研究の開始が大幅に遅れ、当初予定していた図書・文献調査が進まなかったことから、物品費を十分に執行することができなかった。第1期研究終了後に海外調査1を予定していたが、訪問予定であった現地研究者との日程調整がうまくいかず、実現できなかったため、旅費の執行でかなり余剰が生じた。平成30年度中、夏と春の2回、海外調査に出ることで、当初の計画通り、研究内容の確実なフォローを図る予定である。平成29年度は、第1期研究期間を3か月間延長し、同年9月まで図書・文献調査を継続することとしたため、必要な図書・文献の購入、資料収集のための出張など、平成28年度から繰り越した助成金を適切に執行することが可能である上、海外調査1を予定通り実施する予定であるため、平成29年度分として請求した助成金も同様に適切に執行することができると見込んでいる。
フレ-ム・ジェット溶射法による酸素センサ-の試作

大気中の酸素分圧及び溶融金属中の酸素濃度を電気化学的に直接測定する方法としてジルコニア固体電解質を用いることが広く知られている。この場合,酸素センサ-の測定部は(1)の酸素濃淡電池図によって示される。この電池は参照極の酸素ポテンシャル(Po_2)、安定化ジルコニア固体電解質部、並びに測定する酸素ポテンシャル(Po_2')によって構成される。測定する酸素分圧(Po_2')は(2)式に基づいて起電力(E)として表示される。現状の酸素センサ-は安価で簡便に作ることが困難である。このため本研究では、溶射法を適用して小型で多量生産できる新しい酸素センサ-の開発を行った。試作した酸素センサ-ではFe/FeO溶射皮膜を参照極に、また安定化ジルコニア溶射皮膜を固体電解質に適用した。本研究の成果をまとめると次の通りである。被溶射体の形状及び皮膜厚さを改善することにより熱衝撃性に優れた、酸素ガスの漏れのない酸素センサ-が得られた。参照極部のFe/FeO皮膜厚さはセンサ-の特性を決定する重要な要因である。なお、参照極部の溶射皮膜厚さを増加することにより測定可能時間が増加する傾向となり、400μmの溶射皮膜厚さで、約3hrの測定が可能となった。フレ-ムジェット溶射法により作製した酸素センサ-について、8001000°C温度において性能実験した結果、従来の一端閉管型のジルコニア固体電解質を用いた酸素センサ-に匹敵する性能を示した。本年度は、酸素センサ-の試作を主体として実験を行い、センサ-の実用性については起電力の測定により求めた。研究の概要は下記のとおりである。○フレ-ム・ジェット溶射法およびプラズマ溶射法による安定化ジルコニア酸素センサ-の作製実験上記の溶射方式によりジルコニア溶射皮膜をNi-Cr合金、鉄-酸化鉄の参照極(溶射皮膜部)の表面部に作製する。本実験では溶射距離などの条件を変化させて、適正条件を求めた。その結果、被溶射体はMo材が電導度からも適正であり、ジルコニア皮膜の作製法としては、プラズマ溶射法が優れていることが得られた。高温強度試験では、ジルコニア皮膜厚さを300μm以上にすると、熱衝撃などによりクラックの発生が認められる。緻密性などの関連からも300μm付近の皮膜厚さが有効であった。また、参照極の溶射材料としては鉄-酸化鉄が良好であり、ジルコニア皮膜との結合力も優れていた。○溶射法により作製した酸素センサ-の性能実験作製した酸素センサ-について大気雰囲気中で8001000°Cに加熱し、起電力の経時変化を測定した。この場合も、起電力の発生は鉄-酸化鉄を参照極としたものにおいて大きく表われた。しかし、Ni-Cr合金の参照極では、起電力の発生も小さくなっており、温度変化との対応が明確に得られなかった。溶射皮膜の厚さの影響についても、関連性が明確に得られており、200μm以下では気孔(貫通気孔)が多くなり、起電力を測定することができなかった。従来の焼結体ジルコニアの酸素センサ-に比較しても再現性の点では劣っており、信頼性の高い酸素センサ-を作るためには溶射条件の確立が必要である。来年度は、溶射材料の選定並びに耐久性などを中心として研究を行う。併せて溶融金属中の酸素濃度の測定を試みる予定である。本年度は,溶射法により酸素センサ-の固体電解質部並びに参照極部を作製して,主として,大気雰囲気(0.21atm)において試作したセンサ-の性能実験を行った。フレ-ムジェット溶射法およびプラズマ溶射法による酸素センサ-の作製実験

上記の両溶射方式によりジルコニア溶射皮膜が固体電解質となる酸素センサ-の作製を行うと共に、参照極部に対してもフレ-ムジェット溶射法を適用して、FeーFeO系皮膜を作製した。固体電解質をジルコニア溶射皮膜とするセンサ-では参照部材としては炭素鋼棒(SS41)、モリブデン棒を用いた。その結果、ジルコニア溶射皮膜と母材の密着性も良好であり、耐熱衝撃性に優れているセンサ-を作製するための溶射条件を確立できた。FeーFeO参照極部の作製に関しては、焼結体のジルコニア板に対してFe粉末を溶射することにより行った。この場合、厚膜の溶射皮膜の作ることが、センサ-の耐久性を向上するために重要であり、剥離などを発生しない、適正な積層条件を得るため、溶射温度,溶射距離などの諸条件について実験を行い、600μm皮膜厚さまで作製することを可能とした。溶射法により作製した酸素センサ-の性能実験作製した酸素センサ-について8001000°C温度の大気雰囲気中(0.21atm)での酸素濃度測定を行った。この場合、酸素濃度の測定は起電力の経時変化から求めた。参照極部材をモリブデン棒、炭素鋼棒としたジルコニア溶射皮膜の固体電解質酸素センサ-では800900°Cの温度において数10mVの起電力の発生が認められた。しかし、この数値は大気中の酸素分圧に対応しておらず、本方式による酸素センサ-からは酸素濃度に対応した有用な結果を求めることはできなかった。Fe溶射皮膜により、参照極部を作製した酸素センサ-では、前者のセンサ-に比較して大きな起電力値が得られており、1000°Cの温度では平均780mVを示した。この値は、参照極皮膜部がFe,Fe_3O_4により構成されていると想定すると、大気中の酸素分圧(0.21atm)に対応した数値を示していると言える。なお、参照極部のFe溶射皮膜厚さを増すと共に測定時間が増加する傾向となり、400μmの皮膜厚さで、約3hrの測定が可能となった。
妊娠子宮の脱落膜化に伴う形態学的リモデリングの分子機構

我々がクローニングした細胞外セリンプロテアーゼ・ニューロプシンは子宮において妊娠時にのみ脱落膜細胞においてその遺伝子発現が認められる。平成11年度の研究で、ニューロプシンの遺伝子発現誘導は子宮内膜細胞の脱落膜化により誘導され、胎仔の存在は必要でないことを明らかにした。しかしながら、本プロテアーゼがその機能を発揮するためには、遺伝子発現が誘導されるだけでは不十分で、前駆体型蛋白として翻訳・分泌された後、N末端の4アミノ酸のプロセシングによって活性型ニューロプシンに変換される必要がある。そこで平成12年度の研究では、子宮内膜細胞の脱落膜化により活性型ニューロプシンが出現するか否かを本研究室で構築したニューロプシン特異的酵素活性測定法を用いて検討した。その結果、活性型ニューロプシンは非妊娠時の子宮やホルモンの変化のみを誘導した偽妊娠マウス子宮では存在しないものの、オイル注入によって脱落膜化を引き起こした子宮では有意に活性型ニューロプシンの含有量が上昇することを示した。このときの活性型ニューロプシン量は正常妊娠時8日目の子宮内での量とほぼ同じで、ほぼ全てのニューロプシン蛋白が活性型に変換されていることが明らかとなった。この結果から、子宮内膜細胞の脱落膜化はニューロプシンの遺伝子発現を誘導するのみならず、活性型蛋白への変換も誘導することが示された。次に、本研究室で作成したニューロプシン遺伝子欠損マウスの妊娠子宮の組織像を観察することにより、ニューロプシンの妊娠子宮における役割を検討した。ニューロプシン遺伝子欠損マウスは正常に妊娠、出産することができ、その組織像もマクロのレベルでは野生型マウスと比較して顕著な差は見られなかった。このことから、ニューロプシンは子宮内膜細胞の脱落膜化に伴って生じることが知られている細胞外環境の変化を極めて微細なレベルで調節していることが示唆された。我々がクローニングしたセリンプロテアーゼ・ニューロプシンの妊娠子宮脱落膜化に伴う形態学的リモデリングにおける生理的機能を明らかにする目的で、平成11年度は妊娠子宮におけるニューロプシン発現誘導機構に関する解析を行った。ニューロプシン遺伝子は妊娠時においてのみ脱落膜化した子宮内膜細胞に発現することから、その発現は、(1)ホルモンの変化、(2)内膜細胞の脱落膜化、(3)胎仔の着床、のいずれかが引き金となって引き起こされるものと考えられる。そこで私は、ホルモンのみ妊娠状態へ移行する偽妊娠マウス、及びホルモンの変化に加えて内膜細胞の脱落膜化も生じるが胎仔の存在しない脱落膜腫形成マウス、という2種類のモデルマウス子宮におけるニューロプシン発現を検討した。その結果、ニューロプシン遺伝子発現は偽妊娠マウス子宮では認められないものの、脱落膜腫形成マウスでは認められることをRT-PCR法及びin situハイブリダイゼーション法により確認した。また、その発現は脱落膜化した子宮内膜細胞に限局しており、発現の程度は脱落膜化の程度と一致することも明らかとした。更に、蛋白発現の指標であるニューロプシン酵素活性についても脱落膜腫形成マウス子宮にのみ認められ、脱落膜化が激しいほどニューロプシン活性が高いことを確認した。以上の結果から、妊娠子宮におけるニューロプシン発現誘導はホルモンの変化のみでは生じず脱落膜化を必要とすること、また、胎仔の存在は必要ではないことが示された。ニューロプシン発現は脱落膜化が引き金となって引き起こされるという今回の結果を踏まえ、平成12年度はニューロプシン遺伝子欠損マウス子宮における脱落膜化を検討することで、妊娠子宮におけるニューロプシンの機能をより詳細に検討する予定である。
基盤岩石の異なる丘陵地における谷の形成条件の定量的評価

本年度は,足尾山地東部のチャート山地,砂岩山地,房総半島鹿野山の砂岩地域,泥岩地域,および阿武隈山地・花岡閃緑岩地域における降雨流出観測を継続した.また,上記の5地域それぞれにおいて10-30個の河道発生点における勾配,集水面積,標高を測定した.水文観測データをもとに統計解析を行った結果,5つの調査地域で降雨流出特性が大きく異なっていた.これら地域における降雨流出特性の差異は,基盤岩の透水性の違いに起因するものと考えられる.また河道発生条件は降雨流出特性と大きく関係していることが明らかとなった.例えば,足尾山地東部のチャート山地では5地域の中で最も降雨ピークに対する流出応答が明瞭であり,河道発生点における集水面積と勾配との間では最も明瞭な負の相関関係が得られた.このことは土層中における地中水流出が集水面積に依存した河道発生プロセスをもたらしていることを示唆している.逆に房総半島の砂岩流域では,降雨ピークに対する流出応答は不明瞭であり,年間を通して安定した地下水流出が湧水を涵養していることが明らかとなった.一方,河道発生点における集水面積と勾配との関係は5地域の中で最も不明瞭であった.その他の3地域の観測結果を総合すると,地下水の影響が大きくなり,流出が安定するにつれて,河道発生における集水面積の効果が弱くなるという傾向が見られた.さらに,地下水の影響が大きくなるにつれて,河道発生は標高の影響を強く受けることが示唆された.本研究成果により得られた足尾山地東部チャート地域の河道発生モデルについては,現在国際学術雑誌において査読中である.また,本報告に記載した内容に関する論文を執筆している.本年度は,2000年に開始された足尾山地東部のチャート地域,砂岩・頁岩地域における降雨流出観測,土砂流出観測を継続した.足尾山地チャート地域の観測データから降雨流出条件式と土砂移動の発生限界式を導き,両者を組み合わせることにより河道発生条件を定式化した.この条件式により3年に一度程度の強い降雨条件下での土砂流出発生地点が,実際に観測される河道発生地点に対応することが明らかとなった.一方,房総半島鹿野山の砂岩地域,泥岩地域,および阿武隈山地・花崗閃緑岩地域の谷頭部に新たに試験流域を設けた.房総半島の砂岩流域では,降雨に対する応答がほとんどみられず,年間を通して安定した地下水流出と一定の土砂流出が継続していることが明らかとなった.泥岩流域では,降雨に対する応答が極めてよく,降雨イベントの発生に対応して土砂流出が発生した.花崗閃緑岩流域は,降雨に対して小規模な応答が観測され,顕著な土砂流出は発生しなかった.なお,これら3流域に関しては,次年度のデータも含めてさらに詳細な解析を行う予定である.房総半島の砂岩地域,阿武隈山地・花崗閃緑岩地域では谷頭部の集水面積,勾配の測定,湧水流量の観測を行った.砂岩地域では,谷頭部の斜面勾配が45度程度でほぼ一定であり集水面積に依存しない傾向が見られた.さらに,湧水流量は地形的集水面積とは無関係であり,湧水の位置は標高によって規制されていることが明らかとなった.花崗閃緑岩地域では,斜面勾配と集水面積との間に負の相関関係が見られること,湧水流量と集水面積との間に正の相関関係が見られることが明らかとなった.今後,房総半島,泥岩地域でも,谷頭部の地形測定と湧水流量の観測を行い,足尾山地2地域,阿武隈山地1地域,房総半島2地域の計5地域での比較・検討を進める予定である.本年度は,足尾山地東部のチャート山地,砂岩山地,房総半島鹿野山の砂岩地域,泥岩地域,および阿武隈山地・花岡閃緑岩地域における降雨流出観測を継続した.また,上記の5地域それぞれにおいて10-30個の河道発生点における勾配,集水面積,標高を測定した.水文観測データをもとに統計解析を行った結果,5つの調査地域で降雨流出特性が大きく異なっていた.これら地域における降雨流出特性の差異は,基盤岩の透水性の違いに起因するものと考えられる.また河道発生条件は降雨流出特性と大きく関係していることが明らかとなった.例えば,足尾山地東部のチャート山地では5地域の中で最も降雨ピークに対する流出応答が明瞭であり,河道発生点における集水面積と勾配との間では最も明瞭な負の相関関係が得られた.このことは土層中における地中水流出が集水面積に依存した河道発生プロセスをもたらしていることを示唆している.逆に房総半島の砂岩流域では,降雨ピークに対する流出応答は不明瞭であり,年間を通して安定した地下水流出が湧水を涵養していることが明らかとなった.一方,河道発生点における集水面積と勾配との関係は5地域の中で最も不明瞭であった.その他の3地域の観測結果を総合すると,地下水の影響が大きくなり,流出が安定するにつれて,河道発生における集水面積の効果が弱くなるという傾向が見られた.さらに,地下水の影響が大きくなるにつれて,河道発生は標高の影響を強く受けることが示唆された.本研究成果により得られた足尾山地東部チャート地域の河道発生モデルについては,現在国際学術雑誌において査読中である.また,本報告に記載した内容に関する論文を執筆している.
4次元レフシェツファイバー空間

4次元多様体の特別なクラスとして,Lefschetzファイバー空間があり,4次元多様体,代数曲面,閉曲面の写像類群,組み合わせ群論等のいろいろな分野に関係する興味深い研究対象である.現在,力を入れているのは楕円曲面の拡張として,ファイバーの種数が2の場合である.M_2を種数2の写像類群とし,ζ_i,i=1,2,...,5を標準生成元とする.(ζ_1ζ_2ζ_3ζ_4ζ^2_5ζ_4ζ_3ζ_2ζ_1)^4=1という関係と(ζ_1ζ_2ζ_3ζ_4)^<10>=1という関係は,それぞれS^2上の種数2のLefschetzファイバー空間に対応している。これらの全空間は同相であるが、Lefschetzファイバー空間としてはC^∞同型でない.研究代表者が昨年度に発見したこの例について,これらの全空間が微分同相かどうかが興味ある問題であり,研究を続けていたが,Texas大学の若い数学者T.Fullerが博士論文提出後に,その応用として,互いに微分同相でないことを証明してしまった.自分で解けなかったのは残念であるが,これは多重ファイバーのないファイバー空間でエキゾチックな微分構造をもつ最初の例であると思われる.研究年度の後半で,種数2のLefschetzファイバー空間の大域的モノドロミ-の研究に重要と見られる自由群上のある対応I:F_n→F_n(「量子逆元」)を見いだした.これは,逆元をとる操作に高次の非可換性を組込んだようなもので,現在,これについて研究中である.4次元多様体の特別なクラスとして,Lefschetzファイバー空間があり,4次元多様体,代数曲面,閉曲面の写像類群,組み合わせ群論等のいろいろな分野に関係する興味深い研究対象である.現在,力を入れているのは楕円曲面の拡張として,ファイバーの種数が2の場合である.M_2を種数2の写像類群とし,ζ_i,i=1,2,...,5を標準生成元とする.(ζ_1ζ_2ζ_3ζ_4ζ^2_5ζ_4ζ_3ζ_2ζ_1)^4=1という関係と(ζ_1ζ_2ζ_3ζ_4)^<10>=1という関係は,それぞれS^2上の種数2のLefschetzファイバー空間に対応している。これらの全空間は同相であるが、Lefschetzファイバー空間としてはC^∞同型でない.研究代表者が昨年度に発見したこの例について,これらの全空間が微分同相かどうかが興味ある問題であり,研究を続けていたが,Texas大学の若い数学者T.Fullerが博士論文提出後に,その応用として,互いに微分同相でないことを証明してしまった.自分で解けなかったのは残念であるが,これは多重ファイバーのないファイバー空間でエキゾチックな微分構造をもつ最初の例であると思われる.研究年度の後半で,種数2のLefschetzファイバー空間の大域的モノドロミ-の研究に重要と見られる自由群上のある対応I:F_n→F_n(「量子逆元」)を見いだした.これは,逆元をとる操作に高次の非可換性を組込んだようなもので,現在,これについて研究中である.
フィブリンを担体にした生物学的修飾物質の腫瘍内投与の効果とその作用機序の解析

Tumor Necrosis Facotr-α(TNF)の抗腫瘍効果の増強および副作用の軽減を目的にTNFとfibrin gelの混合製剤を作製し、TNFの徐放性と腫瘍内投与による抗腫瘍効果を検討した。TNFの徐放性の検討では、in vitroではTNFとfibrin gelの混合製剤は、燐酸緩衝液中で約7日間にわたってTNFを放出することがELISA法による解析で明かとなり、in vivoでは抗TNFポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色上、投与した腫瘍局所にTNFが約7日間停滞することが確認され、fibrin gelも同様に約7日間、停滞することが確認された。また、抗腫瘍果の検討では、マウス皮下移植腫瘍内(大腸癌細胞株colon 26)に投与することで強い腫瘍増殖抑制効果を示し、移植腫瘍全体の57%(n=7)で腫瘍は完全に消失し、その後の再発も認められなかった。また、薬剤投与後14日目において残存した腫瘍重量も生理食塩水のみを投与した対照群に比較して有意に減少し、TNFのみを単独で投与した場合と比較しても減少傾向が認められた。病理組織学的検討でも、全例で腫瘍組織の広汎な変性・壊死と多数の単核球の浸潤を認めた。副作用の指標として薬剤投与後のマウス体重を経日的に計測したところ、生理食塩水あるいはTNFを単独で投与したものに比較してTNFとfibrin gelの混合投与では明かな減少を認めなかった。以上からTNFとfibrin gelの混合製剤のin vitroにおけるTNF徐放性、in vivoでの局所停滞性、抗腫瘍効果が確認された。
高分散冷却エシェル分光器ProtoIRHSを用いたPAHの赤外発光分光

高分散冷却エシェルグレーティング分光器ProtoIRHSの製作と光学調整、真空排気系や冷却系の整備、および多環芳香族炭化水素(PAH)の超音速自由噴流ガス中でのレーザー誘起発光スペクトルの測定を行うための高真空チャンバーの設計・製作を行った。分光光学系の製作とエシェルフォーマットの撮像のためのSi : AsIBC 512 x 412素子2次元アレイ検出器の動作確認に成功した。炭酸ガスレーザーの波長10.6μm単色光を用い、ProtoIRHSの波長分解能λ/Δλ=46,000と測定し、世界初のGe単結晶イマージョングレーティングが当初目標をほぼ満たす性能を有していることを確認した。次に、PAHが生成されるパルスノズルからの赤外発光を分光器に導入させるために必要な前置光学系の製作と光学調整、撮像用のInSb 256 x 256素子2次元アレイ検出器の設置と動作試験を行い、試験光源による結像性能および検出器雑音において良好な結果を得た。また、光入射窓や電気制御系からの熱放射の侵入を抑えるための冷却フィールドストップの製作や、断熱シールドの設置、迷光対策のためのバッフルの設置を行った。さらに、真空チャンバー内でパルス放電ノズルの直下にエキシマーレーザーからの励起紫外光を集光する光学系を構築した。この紫外光により励起したPAH種からの微弱な赤外発光を捉えるために、チャンバー内の集光鏡を液体窒素冷媒により冷却し、熱輻射を抑える構造を設計・製作し、これを完成させた。
アンチセンスＲＮＡの機能解析と血液を用いた消化器癌の新規診断法の開発

アンチセンスRNAの機能解析と末梢血中のRNAの網羅的解析を行い、消化器癌の層別化・テーラーメード治療のマーカーとすることを目的とする。大腸癌患者の血液中で健常人と変化しているアンチセンスRNAを20種同定し,これらのRNAが大腸癌患者と健常人を明確に区別することを確認した。また大腸癌患者、膵癌患者の血液中エクソソーム内で健常人と変化しているRNAをそれぞれ15種、17種同定した。これらのRNAは大腸癌患者と健常人を明確に区別することが可能であった。今後は癌種を増やし同様の解析を行いつつ,低コストで迅速診断が可能な新しい癌診断カスタムマイクロアレイの開発などを行っていく予定である。我々はヒト大腸癌および肝癌組織に関して、独自に設計したカスタムマイクロアレイを用いて4万種類を超える遺伝子の発現を測定し、個別のアンチセンスRNAが癌の発生・進行に特異的に増加又は減少していることを確認した。本研究では大腸癌・膵癌患者および健常人の末梢血中のRNAを抽出して独自に作製した網羅的解析を行い、最終的には早期発見が困難な消化器癌の層別化ならびにテーラーメード治療のマーカーとすることを目的とした。これまでに、大腸癌患者28例と健常者6例を対象として、末梢血中のアンチセンスRNAの網羅的解析を行った。大腸癌患者の血液中で健常人と変化しているアンチセンスRNAを20種同定した。末梢血液中のアンチセンスRNAの測定が大腸癌の診断に有用である可能性が示唆された。(論文投稿準備中)さらに、近年miRNAを中心に、エクソソーム由来分泌型non-coding RNAはさまざまな癌種のバイオマーカーとして注目を集めている。そこで我々は末梢血中エクソソームのmiRNAの解析を行った。これまでに、大腸癌患者10例と膵癌患者10例と健常人4例を対象として、エクソソーム内miRNAの網羅的解析を行った。大腸癌患者、膵癌患者の血中エクソソーム内で健常人と比較して、発現が変化しているmiRNAをそれぞれ大腸癌15種、膵癌17種同定した。クラスター解析を行うと、これらのエクソソーム内miRNAは大腸癌患者と健常人を明確に区別することが可能であった。末梢血液中エクソソーム内miRNAの測定が大腸癌の診断に有用である可能性が示唆された。膵癌に関しては明確に区別することができなかった。アンチセンスRNAおよびエクソソーム内miRNAは末梢血を用いた大腸癌・膵癌の新規バイオマーカーとなる可能性が期待される。本研究では、大腸癌・膵癌・胆道癌患者および健常人の末梢血からRNAを抽出し、独自に作製した約4万種のセンス/アンチセンスRNAの検出が可能なカスタムマイクロアレイで発現変化を網羅的に解析、リアルタイムRT-PCR及びin situ hybridization(ISH)で発現の確認を行う。ヒト大腸癌組織で我々が同定した特定のアンチセンスRNA(Kohno et al, Int J Oncol 2010)と末梢血中で共通に発現異常を示すセンス/アンチセンスRNAのプロファイリングを比較検討する。膵癌・胆道癌組織でも同様に検討を行う。それをもとに、新たに癌スクリーニング検査に有用な遺伝子の組み合わせを30個から50個に絞り込み、末梢血サンプルから診断可能な癌の新規バイオマーカーを同定する。また、ヒト大腸癌細胞株における特定のアンチセンスRNAをsiRNAでknock down, transductionして機能解析を行い、最終的にはアンチセンスRNAの発現と癌の予後、各種治療効果との相関を明らかにする。平成24年度は研究をスタートさせるための準備と予備実験を中心に活動した。大腸癌に関しては、これまでに大腸癌患者28例、健常人6例のカスタムマイクロアレイによる網羅的解析を行った。術後1週間、3ヶ月の末梢血も解析している。解析の結果、有意差を認めるアンチセンスRNAを同定した。これらのアンチセンスRNAは大腸癌の新たな血中バイオマーカーとなる可能性がある。膵癌および胆道癌に関しては、患者の術前の血液および手術標本より癌組織のサンプリングを行い、現在も検体を収集中である。検体が集まり次第、マイクロアレイを行い解析する予定である。本年度で、大腸癌の検体に関しては、カスタムマイクロアレイを用いた網羅的解析まで進んでおりおおむね順調に進んでいる。膵癌・胆道癌に関しては症例がなかなか集まらない点があるが、今年度中には検体が集まり、マイクロアレイによる網羅的解析が行える予定である。今年度は、検体が集まり次第、膵癌・胆道癌の末梢血を用いたマイクロアレイ解析を行い、膵癌・胆道癌の早期診断に有用なアンチセンスRNAの特定を最大の目標とする。

大腸癌に関しては、さらに症例を増やして解析を行い新規バイオマーカーの同定を目標とする。4種類の大腸癌細胞株における癌スクリーニング診断に有用と思われる候補アンチセンスRNAの発現をリアルタイムRT-PCRで検討する。候補アンチセンスRNAのシークエンスを行い、センスRNAとオーバーラップする領域にsiRNAを設計する。癌特異的糖鎖抗体を表面に持つマイクロカプセルに封入して培養大腸癌細胞株に添加し、アンチセンスRNAを選択的にsiRNAでknock downもしくは、transductionさせ、細胞増殖速度の変化やアポトーシスの程度を検討し、サイレンシング療法に使える遺伝子の候補を絞る。該当なし
microRNAが関与する歯周病の発症と進行メカニズムの解明

miRNAマイクロアレイの結果、炎症歯肉でmiR-223の発現が増加したため、miR-223発現プラスミドをヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に導入後、IL-1βとTNFαで刺激し、IKKαの発現を検索した。TNFαmRNA量は、IL-1β、TNFα刺激で約20倍増加し、miR-223発現下で両者で刺激すると、さらに増加した。IL-1βmRNA量は、IL-1β、TNFα刺激で約400または90倍増加し、miR-223発現下でIL-1β刺激で約2倍増加し、TNFα刺激で減少した。miR-223発現で、IKKα発現は減少したため、miR-223はIKKαを阻害し、NFκB活性を促進すると考えられる。中等度重度慢性歯周炎患者のフラップ手術時に切除する炎症性歯肉と、デンタルインプラント手術時に切除する非炎症性歯肉から全RNAを抽出し、両歯肉組織でのmicroRNA(miRNA)発現の違いをmiRNAマイクロアレイで、遺伝子発現の違いをDNAマイクロアレイで解析し、炎症部位で増減するmiRNAと遺伝子の発現に関して解析を行い、さらに、炎症部位で増減するmiRNAと遺伝子の相互作用についての解析を行う予定である。両マイクロアレイの結果は、リアルタイムPCRを用いて遺伝子発現レベルの変化を再解析を行う。遺伝子ネットワーク、情報伝達系のデーターベースであるIngenuity Pathways Analysis(IPA)を用いて、歯周炎との関連、遺伝子ネットワーク、情報伝達系について解析を行う予定である。初年度は、炎症性歯肉と非炎症性歯肉から抽出した全RNAを使用して、両歯肉組織でのmiRNA発現の違いをmiRNAマイクロアレイで解析し、炎症性歯肉で発現が上昇した17種類のmiRNAおよび発現が減少した22種類のmiRNAを同定した。発現が上昇した上位3位のmiRNAは、hsa-miR-150、hsa-miR-200bおよびhsa-miR-223であり、発現が低下した上位3位のmiRNAは、hsa-miR-379、hsa-miR-199a-5pおよびhsa-miR-214であった。また、miRNAマイクロアレイの結果は、GeneSpring GXソフトウエアおよびIPAを用いてデーター解析を行った。次年度には、培養歯肉線維芽細胞または歯肉上皮細胞に、解析結果から同定した数種類のmiRNAの発現ベクターを導入後、炎症性サイトカインで刺激し、その解析結果から、歯周炎の発症および進行に深く関与するmiRNAおよび遺伝子を同定したい。MicroRNA(miRNA)は、長さ約22塩基の一本鎖ノンコーディングRNAで、標的mRNAの3末端非翻訳領域(3'-UTR)に結合して翻訳抑制を引き起こし、遺伝子発現を調節することで、様々な疾患の発症に関与することが報告されている。我々のグループは、TLR4遺伝子の3'-UTRにある1塩基多型(rs11536889)がmiR-1236とmiR-642aとの結合を介してTLR4の発現量および歯周炎の発症と関連することを報告した(J Biol Chem. 2012, 287; 25163-25172)。このTLR4遺伝子多型rs11536889におけるC/C遺伝子型は、歯周炎等のTRL4活性化を誘因とする炎症性疾患のリスク因子になると予想され、疾患関連遺伝子として診断や新たな治療法の開発に応用される可能性が期待される。H26年度には、歯周病の発症と進行へのmicroRNAの役割を解明するために、重度慢性歯周炎患者の歯周外科手術時に切除する炎症性歯肉と、インプラント手術時に切除除去する非炎症性歯肉から低分子RNAを含む全RNAを抽出し、miRNAマイクロアレイにてmiRNA発現量の違いを比較検討した。その結果、炎症性歯肉ではmiR-150、miR-223およびmiR-200bの発現量が増加し、歯周炎の発症にこれらのmicroRNAが関与する可能性を示した(J Oral Sci. 2014, 56;253-260)。HGFをIL-1βまたはTNF-αで刺激すると、IL-1βとIL-6のmRNA量は増加し、miR-223を過剰発現で、IL-1βとIL-6のmRNA量はさらに増加した。HGFでのIL-1βとIL-6のmRNA量は、IL-1βまたはTNF-α刺激で増加し、miR-223インヒビターを導入すると、減少した。HGFをIL-1β刺激しmiR-223を過剰発現させると、IL-1βおよびIL-6タンパク質の顕著な増加が認められた。miR-223の標的遺伝子であるMKP-5のmRNA量は、miR-223を過剰発現させると減少したが、IKKαのmRNA量は、miR-223を過剰発現しても変化しなかった。しかし、miR-223を過剰発現させるとIKKαのタンパク質量は減少した。一方、miR-223を過剰発現させるとリン酸化p38 MAPKのタンパク質量は増加した。以上の結果から、miR-223はIKKαの発現を、mRNAの分解ではなく、翻訳阻害のプロセスで発現を抑制すると考えられた。