hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軽い中性子過剰核の分子的構造

当年度においては、従来の分子軌道法を用いた軽い原子核のクラスター構造の研究をさらに発展させた計算を行った。まず9Be核のE1電磁遷移確率の分析を行った。この原子核のこの遷移確率は、超新星爆発後などにおこる爆発的元素合成(r-process)において、その最初の部分で決定的に重要な役割を担っており、宇宙における重い元素の生成メカニズムにかかわる問題である。ところが最近の実験により、その遷移確率はこれまで信じられていた値よりも2倍程度大きいことが示された。今回、我々は従来より開発してきたクラスター模型を用いた理論的枠組みを適用することによって、この実験的に新しく得られた遷移確率が正しいものであることを検証した。この結果については、Physical Review誌に詳細な分析を発表した。次に、軽い原子核の構造を計算する新たな枠組みの開発を行った。最近発展しつつある反対称化分子動力学(AMD)をさらに発展させ、AMD波動関数を何百も重ね合わせることによって核構造を精密に記述する方法を開発し、この手法をAMD-superposition of selected snapshotsと命名した。この方法により、従来のAMD法では不可能であった「中性子ハロー構造」など、中性子過剰核に現れる特徴的な物理現象がよい精度で記述されることが示された。また、Be同位体のクラスター構造や、さらにC同位体やO同位体など、幅広い質量領域が系統的に計算されうることも示された。さらに解析接続の手法と組み合わせることにより、束縛状態のみならず、共鳴状態の定量的な記述も可能であることがわかった。現在Physical Review誌に論文を投稿中である。本研究の目的は、一般に中心場的な構造を持つと信じられている「原子核」が、多中心的、分子的な構造を持つのかどうかを明らかにすることであり、そのような多様な構造が中性子過剰核などの不安定核でさらに重要性を増すのではないかという可能性をさぐることである。今年度は、その様な分子的構造の例として、軽い不安定原子核におけるクラスター構造をとりあげ、炭素同位体およびBe同位体の構造計算を主に行った。炭素同位体では、3つのαクラスター(^4He原子核)のまわりをバレンス中性子が運動するような状態が存在するのかどうかについての議論を行った。特に^14C原子核においては、3つのαクラスターが正三角形の配位を持ち、そのまわりに、ふたつの中性子がまるで分子における共有結合のような軌道を占有して運動する状態が存在する可能性を示した。この事は、原子核においては初めて、3回対称性という多様な存在形態が存在する可能性を示しており、現在論文の投稿を準備中である。また、さらにバレンス中性子の数を増やすことによって、3つのαクラスターが直線上に並ぶ状態も、励起状態に存在できるのではないかという示唆を与えた。^16C原子核がその候補であり、これについてはPhysical Review誌に発表した。さらに、今年度は^<10>Be原子核において、非軸対称変形の可能性を議論した。Be同位体においては2つのαクラスターが存在するという描像が成り立つことが古くから知られてきた。我々は以前からα+α+n+n・・という模型を用いてBe同位体を議論してきたが、今回この模型を用い、非軸対称変形を指摘した。電荷はαクラスターにのみ存在する。もし2つのαクラスターのみが存在すれば(^8Be)、電荷分布は軸対称である。この系のまわりにバレンス中性子が存在しても(他のBe同位体)、それらが軸対称な軌道を持てば、系の対称性は保存されるはずである。しかしながら、中性子過剰原子核のような弱結合系においては、バレンス中性子間の相関が重要になり、それによって中性子の軌道は軸対称からずれを生じる。また、この中性子のもたらす反跳によって、Be同位体の電荷分布は軸対称からずれを生じることが示された。これは中性子過剰核に特徴的な非軸対称変形をもたらすメカニズムを指摘したと言えるかもしれない。これについても、Physical Review誌に発表した。
脳血管性認知症の病態における脂肪酸シグナルの役割

脳血管性認知症の病態における脂肪酸シグナルの役割について検討するために、脳血管性認知症モデル動物におけるFabp7の発現解析を行ったが、脳梁および線条体におけるFabp7の発現量および発現細胞に有意な変化は認められなかった。また、脳血管性認知症の病態におけるFabp7の機能について検討したが、顕著な神経学的異常および体重変化は認められなかった。現在、これらの脳サンプルの免疫組織学的解析を進めている。アラキドン酸(ARA)は必須脂肪酸の1つであり、生体内では細胞膜構成因子として多く存在し、様々な生理活性を有することが知られている。脳血管性認知症ではARA代謝の異常が報告されていることから、正常なARAの代謝が認知機能の維持に重要であることが示唆されるが、その分子機序についてはほとんど明らかにされていない。本年度は、これまでの報告に基づいて、行動解析システム(新規物体認識テスト・放射状迷路テスト)および免疫組織解析システム(活性化グリア細胞GFAP,Iba-1,Musashi-1・軸索損傷APP・髄鞘染色MBP)を導入することにより、脳血管性認知症モデル動物を評価することが可能になった。さらに、脳血管性認知症の病態における脂肪酸結合タンパク質の役割を解明するために、脂肪酸結合蛋白質Fabp5,7の発現を免疫組織学的に評価することが可能になった。現在、野生型マウス(C57BL6/J,オス,12週齢)および脂肪酸結合タンパク質Fabp5,7ノックアウトマウス(Fabp5,7KO)に対して、偽手術もしくは右側総頸動脈永久結紮手術(以下、結紮手術)を施し、皮質下白質領域(線条体および脳梁)における脂肪酸結合タンパク質Fabp5,7の発現解析および炎症反応、白質病変等について免疫組織学的解析により検討する予定である。これまでに、野生型およびFabp5,7KOマウスにおいて、結紮手術による神経学的変化および体重変化を認めないことが確認されている。アラキドン酸は必須脂肪酸の1つであり、生体内では細胞膜構成因子として多く存在し、様々な生理活性を有することが知られている。本年度は、野生型マウスに対して偽手術ないし右側総頸動脈永久結紮手術(以下、結紮手術)を施し、結紮手術後1,2,4週間後のFabp7の発現を脳梁・線条体において検討した。その結果、いずれの領域においてもFabp7陽性細胞数およびその分布に関して、偽手術群と結紮手術群との間に顕著な変化は認められなかった。さらに、Fabp7陽性細胞のほとんどすべてがPDGFRα陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞であり、その割合も偽手術群と結紮手術群との間でほとんど変わらなかった。結紮手術後の時間経過に伴うFabp7陽性細胞数およびその分布に大きな違いは認められなかった。また、脳血管性認知症の病態におけるFabp7の機能を明らかにするために、野生型およびFabp7ノックアウトマウスに対して偽手術ないし結紮手術を施した。現在、これらのサンプルの組織学的解析を進めているところである。
間葉系幹細胞の造血支持能を利用した放射線造血障害の再生治療法の開発

放射線非照射及び照射CD34陽性細胞(ヒト造血幹・前駆細胞)を、臍帯血由来間葉系幹細胞様ストローマ細胞と共培養することにより、サイトカイン単独での培養に比べ有意に高い細胞増殖及び未分化維持といった造血支持能が示された。サイトカインを共培養開始16時間後に添加すると、照射細胞はストローマ非存在下培養では著しく造血が低下したが、共培養では同時添加した場合と同等の造血が認められた。この時、共培養上清中のヒアルロン酸は顕著に増加し、一方硫酸化グリコサミノグリカンはストローマ非存在下放射線照射細胞単独培養で有意に増加した。同様に幾つかのサイトカイン産生も放射線照射細胞単独培養で増加した。以上の結果から、間葉系幹細胞様ストローマ細胞は放射線曝露ヒト造血幹・前駆細胞の造血再生に有用であることが明らかとなった。この時、造血幹/前駆細胞とストローマ細胞との接触刺激が重要であると共に、細胞外マトリックス成分産生が大きく関与している可能性が示唆された。また、本研究の関連成果が2件の特許出願に繋がった。間葉系幹細胞は、骨髄や臍帯血中にごくわずかに存在する未分化の細胞で、増殖能と共に骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞等への分化能を有している。さらに、造血幹細胞の造血を支持・促進し、造血幹細胞移植時に生着促進・生着不全防止を目的に間葉系幹細胞の同時移植が行われ効果を上げている。一方、造血・免疫システムは放射線や抗がん剤に対し極めて感受性が高いため、放射線や抗がん剤によるがん治療における副作用としてしばしば骨髄抑制が生じ、治療上のdose limiting factorとなっている。そこで、間葉系幹細胞の造血支持・促進能を利用することで、造血幹細胞を増幅して血球減少症回避が図れ、さらには血小板や好中球など特定の血球を特異的に増幅させることにも繋がる。本研究では、放射線曝露が予想される場合や、放射線造血障害状態に陥った個体自身の造血幹細胞から、造血幹・前駆細胞の再生を想定して、間葉系幹細胞を用いた新たな細胞治療方法を開発する事を目的として研究を開始した。平成18年度は、臍帯血より間葉系幹細胞を培養誘導して造血支持細胞層とし、幾つかのサイトカインも添加した条件下で2Gy曝露された臍帯血造血幹細胞の造血再生を検討した。その結果、赤血球及び白血球系前駆細胞の造血回復作用は低かったが、巨核球造血を促進する可能性が示された。当該年度はさらに造血幹細胞からの巨核球・血小板造血の特異的促進にも焦点をあて、幾つかの成果を得ることが出来た。1つは緑茶カテキン成分であるEGCGが巨核球・血小板造血ならびに放射線防護作用を示すこと、放射線曝露臍帯血造血幹細胞からの再生にはトロンボポエチンとインターロイキン-3のコンビネーションが効果的である事を明らかにした。さらに細胞外マトリックス成分であるグリコサミノグリカンやプロテオグリカンに巨核球・血小板造血促進作用を認めた。またこれら一連の成果から得られた培養技術について特許出願を行った。

平成19年度は、臍帯血より間葉系幹細胞を培養誘導して造血支持細胞層とし、IL-3,SCF及びTPO存在下で、2Gy曝露された臍帯血造血幹細胞の造血再生を検討した。その結果、間葉系幹細胞支持層存在で、総細胞数、造血幹細胞及び造血前駆細胞数は有意に増加し、間葉系幹細胞の有用性が示された。また、照射造血幹細胞からの増幅においては、サイトカイン刺激より間葉系幹細胞との接触刺激がより重要である事が明らかとなった。また本研究の関連成果から得られた技術について特許出願を行った。間葉系幹細胞は、骨髄や臍帯血中にごくわずかに存在する未分化の細胞で、増殖能と共に骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞等への分化能を有している。さらに、造血幹細胞の造血を支持・促進し、造血幹細胞移植時に生着促進・生着不全防止を目的に間葉系幹細胞の同時移植が行われ効果を上げている。一方、造血・免疫システムは放射線や抗がん剤に対し極めて感受性が高いため、放射線や抗がん剤によるがん治療における副作用としてしばしば骨髄抑制が生じ、治療上のdose limiting factorとなっている。本研究では、放射線曝露が予想される場合や、放射線造血障害状態に陥った個体自身の造血幹細胞から、造血幹・前駆細胞の再生を想定して、間葉系幹細胞を用いた新たな細胞治療方法の開発を目的として研究を開始した。放射線非照射及び照射ヒトCD34陽性細胞(造血幹・前駆細胞)を臍帯血由来間葉系幹細胞様ストローマ細胞と共培養することにより、サイトカイン単独での培養に比べ有意に高い細胞増殖及び未分化維持といった造血支持能が示された。サイトカインを共培養開始16時間後に添加すると、照射細胞はストローマ非存在下培養では著しく造血が低下したが、共培養では同時添加した場合と同等の造血が認められた。この時、共培養上清中のビアルロン酸は顕著に増加し、一方硫酸化グリコサミノグリカンはストローマ非存在下放射線照射細胞単独培養で有意に増加した。同様に幾つかのサイトカイン産生も放射線照射細胞単独培養で増加した。以上の結果から、間葉系幹細胞様ストローマ細胞は放射線曝露ヒト造血幹・前駆細胞の造血再生に有用であることが明らかとなった。この時、造血幹/前駆細胞とストローマ細胞との接触刺激が重要であると共に、細胞外マトリックス成分産生が大きく関与している可能性が示唆された。得られた成果の一部は生命科学の国際誌であるLife Sceincesに掲載された。
インターナライズ抗体を用いた骨髄腫細胞の特異的ターゲッティング法の開発

多発性骨髄腫は現在も難治性の造血器腫瘍であり,新しい治療戦略の開発が求められている。そこで,本研究では骨髄腫細胞に特異的に高発現しているHM1.24/BST2(CD317)に着目し,本分子に対する新規モノクローナル抗体(b-76-8)の治療への応用の可能性について研究を進めた。まず,本抗体の細胞内分布について検討を行ったところ,細胞表面に結合した後,receptor-mediated endocytosisにより,60分後には約80%が骨髄腫細胞内ヘインターナライズされることが明らかとなった。また,b-76-8抗体は細胞質のトランスゴルジ網に集積することが明らかとなった。次に,細胞毒であるメイタンシン(DM1)を結合させたb-76-8-DM1抗体を作製し,in vitroやin vivoにおける細胞傷害活性について検討した。b-76-8-DM1はb-76-8やDM1単独と比較し,骨髄腫細胞の細胞周期を著明に抑制し,高率にアポトーシスを誘導した。さらに,b-76-8-DM1はマウス骨髄腫モデルにおいて,b-76-8抗体単独やDM1より優れた抗腫瘍効果を発揮した。このような細胞傷害活性は骨髄腫細胞に特異的に認められた。以上の結果より,b-76-8抗体は結合物質を特異的に骨髄腫細胞内に伝達させる機能を有しているものと考えられ,HM1.24/BST2(CD317)は多発性骨髄腫に対する新しいターゲティング療法の標的分子として重要である可能性が示唆された。Type II膜蛋白であるHM1.24/BST2(CD317)は骨髄腫細胞に特異的に高発現していることから,新しい治療標的分子として注目されている。我々はヒト抗体産生マウス(KM mouse)を用い,HM1.24に特異的な新規モノクローナル抗体b-76-8を作製した。本年度においては,b-76-8抗体の骨髄腫細胞に対する抗腫瘍活性について検討した。b-76-8抗体のADCC活性およびCDC活性についてCr遊離試験にて測定したところ,比較的弱い活性を有することが明らかとなった。しかしながら,b-76-8抗体のインターナライズ活性をフローサイトメトリーにて測定したところ,細胞表面に結合した抗体は60分後には約80%が細胞内へインターナライズされることが明らかとなった。b-76-8抗体の細胞内局在について免疫細胞化学を行い共焦点レーザー顕微鏡にて検討したところ,トランスゴルジ網に集積することが明らかとなった。また,このインターナライズ活性はHM1.24を高発現している骨髄腫細胞に特異的に認められた。そこで,細胞毒であるメイタンシン(DM1)を結合させたb-76-8-DM1抗体を作製し,in vitroやin vivoにおける細胞傷害活性について検討した。以上の結果より,インターナライズ抗体b-76-8は結合毒素を効率よく骨髄腫細胞に伝達させることから,多発性骨髄腫に対する新しいターゲティング療法として有用である可能性が示唆された。多発性骨髄腫は現在も難治性の造血器腫瘍であり、新しい治療戦略の開発が求められている。本研究では、骨髄腫細胞に特異的に高発現しているHM1.24/BST2(CD317)に着目し、本分子に対する新規モノクローナル抗体(b-76-8)の治療への応用の可能性について研究を進めた。平成18年度においては、b-76-8抗体が骨髄腫細胞に特異的に結合し、インターナライズ活性を有することを明らかにした。

さらに、細胞毒であるメイタンシン(DM1)を結合させたb-76-8-DM1抗体を作製し、本イムノトキシンがin vitroとin vivoにおいて優れた抗腫瘍効果を発揮することを明らかにした。本年度は、b-76-8抗体のインターナライズ活性の作用機構について解析を加えた。蛍光標識したb-76-8抗体の細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、b-76-8抗体は細胞内に取り込まれた後、速やかにトランスゴルジ網に集積することを見出した。また、このb-76-8抗体の細胞内局在パターンはtransferrinの局在パターンと一致したことから、receptor-mediated endocytosisにより骨髄腫細胞内に取り込まれることが明らかとなった。以上の結果より、b-76-8抗体は結合物質を特異的に骨髄腫細胞内に伝達させる機能を有しているものと考えられ、HM1.24/BST2(CD317)は多発性骨髄腫に対する新しいターゲティング療法の標的分子として重要である可能性が示唆された。
1998年投入産出表とCGEモデルに基づくスロヴァキア共和国のマクロ経済政策分析

1.本年度の研究は2000年の標準レオンチェフ型産業連関表をSNA(国民経済計算体系)データから導出・推定し、通常の産業連関分析を試みることを実施した。計画した47×47産業の1998年の産業連関表を60×60産業の2000年のデータに修正する事が出来た。ただし、2000年の公式なデータはまだ作成中のため、分析に必要な欠落データは1996年の業連関表から使用されている。2.研究の目的、動学的な計算可能一般均衡(CGE)モデル、そしてそれに基づく計量的な分析には、データを収集し統合的なSAM(Social Accounting Matrix:社会会計マトリクス)によるデータベースを作成する事が必要である。本年度は集計SAMの作成を実施した。産業連関表以外にSAMの作成に必要な、供給と需要表データ、投入産出データ、詳しい国民経済計算データ、固定資産在庫データ、雇用統計データなどをスロヴァキア共和国財務省、統計管理局、マテイベル大学経済学部、第一衛生銀行等で収集した。日本とは背景を大いに異にするスロヴァキアのマクロ・データが産業連関表の形で整理されている。産業連関表の作成自体は、日本や東アジアの多くの地域ですでにかなりの経験が積まれている。工業国では、すでにその応用技術の開発やそれに関連する理論的な検討が大幅に進んでいる。しかし、かつての社会主義国から現代的な市場経済への移行を目指す社会においては、基礎的なデータの不足に加えて、統計データ収録における基準の違いから、欧米型の基準に従ったものに組み替える場合に、予想困難な障害に出会うことが少なくない。本年度の研究の整理に当って、そのような状況下でもかなりに纏まった集計データを整理することが不可能ではないことが証明されている。産業連関表と上記の他の5グループのデータの根源は様々なので、錯綜している可能性がある。そのため、産業と産物を60の同種的な部門に分けなければならない。これまでにスロヴァキア共和国に関するSAMを作成した例はないため、収集したデータに基づいて2000年のSAMを作成する。来年度はデータベースを作成する作業の最終的な段階に入り、CGEモデルを造る予定である。
吸収端を大きく長波長シフトさせた高CT性ポリイミドの分子設計と光物性

今年度は、昨年度に行ったモデル化合物と量子化学計算による分子設計指針に従い、全フッ素化酸無水物から合成したポリイミド(Pl)の光学物性の検討を行った。酸無水物の全フッ素化により最低非占軌道エネルギーが減少することから,電荷移動相互作用(CT)がより強く起こるとの予想通り、ジフルオロピロメリット酸無水物(P2FDA)を用いて合成したPlは、既存のPlに比べて吸収端、励起波長、蛍光波長が100150nmも長波長シフトするとともに、500nm付近に新たな吸収ピークが出現し、分子設計の正しさを証明できた。この酸無水物に2つの電子供与性メトキシ基を有する剛直性ジアミンを組み合わせることにより、最高占有軌道エネルギーが上昇して分子内CTがさらに起こりやすくなったため、吸収端、励起波長、蛍光波長がさらに100150nmも長波長シフトした。結果として、有機高分子では非常に例の少ない可視長波長近赤外域(700850nm)に蛍光発光を有する『高CT性含フッ素ポリイミド』が合成できた。このPlでは、モデル化合物で見られた局所的な分子内CTに加え、周期構造による分子内CTや分子間CTがより強く起こることから、CT性がさらに強められたものと考えられる。ついで、より立体的な構造を有する全フッ素化酸無水物:1,4-ビス(3,4-ジカルボキシトリフルオロフェノキシ)テトラフルオロベンゼン二無水物(10FEDA)を用いて各種Plを合成し、光学特性の検討を行った。この酸無水物を用いた場合も、450nm付近に新たな吸収ピークが出現するとともに、既存のPlに比べて吸収端、励起波長、蛍光波長が150200nm長波長シフトした。さらに予想に反して、これらのPlが既存のPlに比べて10倍程度の強い蛍光発光を示すことを見出した。通常、CT性の同上は無輻射遷移の確率を高め蛍光発光を弱めるとされているが、3次元的な立体構造のために分子間凝集に墓づく濃度消光効果が弱められ、全フッ素化酸無水物部分に局所的な蛍光発光が現れたものと考えられる。今後、原料ジアミンの化学構造と電子状態を制御することによって、さらに強い蛍光発光を示す『高蛍光性含フッ素ポリイミド』の開発に注力していきたい。今年度は、ポリイミドの分子内・分子間電荷移動を増大させ、しかもそれも制御するための基礎的知見を得ることを目的として,電荷移動(CT)が強く起こるようなイミドのモデル化合物の分子設計を行い,紫外・可視吸収スペクトルと分子軌道法計算により分子内電荷移動の様子を調べた。特に、(1)酸無水物部分に複数のフッ素原子を導入した場合の効果(酸無水物部分の電子吸引性を強化)、(2)アミン部分にメトキシ基を導入した場合の効果(アミン部分の電子供与性を強化)について検討した。酸無水物の全フッ素化により電子親和力が増加し、最低励起エネルギーが減少することから,CTがより強く起こることが予想されるが、モデル化合物吸収端の比較からフッ素化によりCT吸収帯の吸収強度が強まり,吸収端が長波長シフトすることが確認された。一方、アミン部分ヘメトキシ基を導入すると、イオン化ポテンシャルが減少し最低励起エネルギーが低下することから,イミド化合物において分子内CTがより強く起こり、長波長側の吸収帯が置換基のないものに比べさらに長波長側にシフトすると予想されるが、メトキシ基の置換位置がオルト位<メタ位<パラ位の順に吸収端が長波長へシフトし、電子供与性が最も顕著となるパラ位で分子内CTが強くなることが確認された。以上の検討により、イミド化合物の酸無水物部分に電子吸引性のフッ素を、またアミン部分に電子供与性のメトキシ基を導入することで、分子内CT吸収帯に帰属される最低励起エネルギー付近の吸収帯は長波長側へ大きくシフトするとともに、その吸収強度が増大することが確認できた。これらの結果は、われわれが提案した分子設計指針が正しいことを支持している。高分子である芳香族ポリイミドでは、低分子化合物に見られる局所的な分子内CTに加え、周期的な分子内CTや分子間のCTが強く起こることが予想されることから、来年度は同様の検討を全フッ素化酸無水物(2種)と2つのメトキン基を有する剛直性ジアミンを用いた高分子系へ展開する。

このPlでは、モデル化合物で見られた局所的な分子内CTに加え、周期構造による分子内CTや分子間CTがより強く起こることから、CT性がさらに強められたものと考えられる。ついで、より立体的な構造を有する全フッ素化酸無水物:1,4-ビス(3,4-ジカルボキシトリフルオロフェノキシ)テトラフルオロベンゼン二無水物(10FEDA)を用いて各種Plを合成し、光学特性の検討を行った。この酸無水物を用いた場合も、450nm付近に新たな吸収ピークが出現するとともに、既存のPlに比べて吸収端、励起波長、蛍光波長が150200nm長波長シフトした。さらに予想に反して、これらのPlが既存のPlに比べて10倍程度の強い蛍光発光を示すことを見出した。通常、CT性の同上は無輻射遷移の確率を高め蛍光発光を弱めるとされているが、3次元的な立体構造のために分子間凝集に墓づく濃度消光効果が弱められ、全フッ素化酸無水物部分に局所的な蛍光発光が現れたものと考えられる。今後、原料ジアミンの化学構造と電子状態を制御することによって、さらに強い蛍光発光を示す『高蛍光性含フッ素ポリイミド』の開発に注力していきたい。
脊椎の発生・維持・変性の分子機序解明を目指した統合的研究

変形性腰椎症は変形性膝関節症を上回る膨大な患者数がいるものの、人工膝関節置換術のような長期に安定した治療法はない。分子病態解明、さらには発生学的研究においても、脊椎は四肢関節と比べて大きく立ち遅れている。東京大学医学部整形外科ではこれまでに開発したマウス変形性腰椎症モデルをベースに、脊椎の各組織の発現解析を行い、組織特異的Creマウスや初代細胞培養法など脊椎基礎研究に必要な基盤技術を開発し、脊椎の形成、維持、変性を一元的に理解するための統合的研究を計画した。まずレーザーマイクロダイセクションなどを用いた脊椎の発現解析を行い、正常マウス成体の椎間板、および変性モデルの各段階の線維輪、髄核、周囲靭帯を切り取ってmRNAを回収し、RNAシーケンスを行った。得られた発現遺伝子群についてパスウェイ解析を行い、それぞれの組織で重要な役割を果たすであろうシグナル経路の候補を複数得た。そのうちの一つ、椎間板線維輪の内側に特異的に発現する遺伝子についてはタモキシフェン誘導性のCreマウスを樹立し、Rosa26-tdTomatoと交配させてトラッキングを行ったところ、椎間板線維輪周辺のprogenitorと思われる細胞群を標識することができた。現在そのCreマウスを様々なfloxマウスと交配させ解析を進めている。またこの候補遺伝子については、椎間板摘出術で得られたヒト椎間板サンプルにおいても発現していることが確認された。計画通り候補遺伝子のCreマウスも作出し、セルトラッキングでCreが適切に作動していることも確認できた。進捗はほぼ計画通りである。今後は以下の3つのサブテーマについて実施する。・ミニブタ線維輪、髄核の初代培養技術の確立:ミニブタは皮膚や骨格、軟骨の構造などがヒトに酷似しており、さらに国内のブリーダーによってクローズドコロニーが複数確立されている。1頭から十分な量の組織が得られ、肉眼でも十分に組織を識別できることから、ミニブタの線維輪細胞、髄核細胞の初代培養法の確立を目指す。昨年までに得られたマーカー遺伝子の発現を確認し、初代培養細胞としての性質を検討する。・脊椎の形成・維持・変性を制御する候補遺伝子の機能解析:前年度までの発現解析、およびゲノムワイド関連解析の結果から、脊椎の形成・維持・変性を制御する候補遺伝子として2つを選定し、in vitro, in vivoで解析を行う。・セルトラッキングによる脊椎組織の細胞ターンオーバーの解析:線維輪マーカー遺伝子として同定したものの一つは既にCreマウスを作出済みであり、これとRosa26tdTomatoを交配させてセルトラッキングを行う。東京大学医学部整形外科ではマウス変形性腰椎症モデルの開発をおこなってきた。申請者らは、これまで四肢骨格形成や変形性膝関節症の研究で培ってきた技術と経験を基に、脊椎の各組織の発現解析を行い、組織特異的Creマウスや初代細胞培養法など脊椎基礎研究に必要な基盤技術を開発した上で、脊椎の形成、維持、変性を一元的に理解するための統合的研究を計画した。まずレーザーマイクロダイセクションなどを用いた脊椎の発現解析として、硬組織からLMDにて微小組織サンプルを回収し、mRNAを逆転写、増幅してRNAシーケンスを行う手法を転用した(Biomed Res. 35:263-70, 2014)。まず切片作成に十分な大きさとなるE10.5-11.5から、骨格成長が落ち着く生後8wまでのマウスサンプルを時系列に採取し、固定なしに専用コンパウンドに包埋して液体窒素内で急速凍結させ、川本法に準じて凍結切片を作成したのち、LMDによって各段階の線維輪、髄核、周囲靭帯を切り取った。回収されたサンプルからmRNAを回収し、逆転写、増幅を行ったのちにRNAシーケンスを行い、遺伝子群の発現量とその変化を詳細に解析した。発現遺伝子についてパスウェイ解析を行い、それぞれの組織で重要な役割を果たすであろうシグナル経路の候補を複数得た。発現解析などほぼ計画通りに進められている。

またこの候補遺伝子については、椎間板摘出術で得られたヒト椎間板サンプルにおいても発現していることが確認された。計画通り候補遺伝子のCreマウスも作出し、セルトラッキングでCreが適切に作動していることも確認できた。進捗はほぼ計画通りである。前年度実施した正常脊椎の微小発現解析に続き、今年度以降はモデルマウスの変性過程での解析を行い、変性が生じるメカニズムにも迫る。平行して脊椎手術で得られる椎間板や椎体についても発現解析を行う。今後は以下の3つのサブテーマについて実施する。・ミニブタ線維輪、髄核の初代培養技術の確立:ミニブタは皮膚や骨格、軟骨の構造などがヒトに酷似しており、さらに国内のブリーダーによってクローズドコロニーが複数確立されている。1頭から十分な量の組織が得られ、肉眼でも十分に組織を識別できることから、ミニブタの線維輪細胞、髄核細胞の初代培養法の確立を目指す。昨年までに得られたマーカー遺伝子の発現を確認し、初代培養細胞としての性質を検討する。・脊椎の形成・維持・変性を制御する候補遺伝子の機能解析:前年度までの発現解析、およびゲノムワイド関連解析の結果から、脊椎の形成・維持・変性を制御する候補遺伝子として2つを選定し、in vitro, in vivoで解析を行う。・セルトラッキングによる脊椎組織の細胞ターンオーバーの解析:線維輪マーカー遺伝子として同定したものの一つは既にCreマウスを作出済みであり、これとRosa26tdTomatoを交配させてセルトラッキングを行う。
口腔領域における活性酸素ラジカル発生の消長とそのin vivo画像化

電子磁気共鳴(ESR)法は,ラジカル種を非侵襲,非破壊的に直接測定できる方法である。とくにin vivo ESR法は生体内に存在するラジカル種の非侵襲測定を可能とし,ラジカル動態のモニタリングに対し有効な手段である。現在磁場掃引速度の高速化及び画像処理技術の向上により2次元ESR imagingが可能となっているが,3次元ESR imagingではラジカルの空間的分布を明瞭にすることは困難である。我々の教室では三次元磁場勾配コイルを備えた3次元ESR-CT imaging装置を開発し,ラジカルスピンプローブを投与したマウス頭部およびラット摘出脳の2次元投影ESR測定および3次元ESR-CT imaging測定に成功した。またこの方法で得られたデータをもとにX,Y,Z3方向からの断層画像,そして立体画像構築を試みた。本実験で我々は,血液脳関門(Blood Brain Barrier; BBB)透過性の異なる2種類のニトロキシドラジカルスピンプローブ(carbamoy-PROXYL, MC-PROXYL)を用いた。ESR imaging測定は,我々の開発したESR imaging systemを用いて行った。本systemは,生体計測用L-band ESR分光計にイメージング用高速掃引コイル,3次元磁場勾配コイル,バイポール型定電流増幅器を備えており,磁場勾配制御,データ収集及び画像再構成演算はパーソナルコンピュータにて処理される。また、3次元データをもとにして立体視覚化処理も可能である。ESR imaging実験は,スピンプローブ投与ラット摘出脳のESR imaging測定を行った。MC-PROXYL投与ラット摘出脳からニトロキシドESRシグナルが検出され、輪郭のはっきりとした二次元画像が得られた。これに対し,carbamoyl-PROXYL投与ラット摘出脳からはESRシグナルはほとんんど検出されず,carbamoyl-PROXYLが脳へ移行していないことが確認された。また,総頚動脈からの片側投与実験では,MC-PROXYL投与側の脳半球からラジカル分布画像が得られ,ESR imaging測定によりスピンプローブ分布の位置情報を三次元画像として明確に峻別可能となった。摘出臓器でのimaging測定後,in vivo ESR測定を行った。マウス尾静脈よりcarbamoyl-PROXYL,MC-PROXYLを投与後、マウス頭部から3本線ESRシグナルが検出され,頭部領域にスピンプローブが到達していることが確認された。しかし磁場勾配を与えて測定した3次元ESRスライス画像は,頭部領域へのラジカル分布を示していたが,carbamoyl-PROXYLは脳に移行していないことが確認された。また,このデータをもとに立体視覚化処理を行った立体画像でもcarbamoyl-PROXYLは脳に移行していないことが確認された。しかし,得られる画像からin vivoスピンプローブ分析の詳細を判別することは現段階では難しいと思われる。これは、用いたスピンプローブの線幅がESR imagingには広いこと,また現在使用しているソフトの画像処理能力が不十分であることなどが挙げられる。従って,より詳細なラジカル分布の位置情報をえるために,スピンプローブの開発と本システムのさらなる改良・開発を進めていきたい。しかし磁場勾配を与えて測定した3次元ESRスライス画像は,頭部領域へのラジカル分布を示していたが,

carbamoyl-PROXYLは脳に移行していないことが確認された。また,このデータをもとに立体視覚化処理を行った立体画像でもcarbamoyl-PROXYLは脳に移行していないことが確認された。しかし,得られる画像からin vivoスピンプローブ分析の詳細を判別することは現段階では難しいと思われる。これは、用いたスピンプローブの線幅がESR imagingには広いこと,また現在使用しているソフトの画像処理能力が不十分であることなどが挙げられる。従って,より詳細なラジカル分布の位置情報をえるために,スピンプローブの開発と本システムのさらなる改良・開発を進めていきたい。概要従来からの研究で,生体内で生成される活性酸素ラジカル種(一重項酸素,一酸化窒素ラジカル,過酸化水素,スーパーオキシドラジカル,ヒドロキシルラジカル)をin vitroで,しかもマイクロモルオーダーで検出する技術を確立した。本研究プロジェクトの初年度の到達目標は,生体内で酸素ラジカル分子を検出し,画像化するための基礎実験手法を構築することである。病態を反映して生体内で生成する活性酸素は超短寿命であり,ESR検出するためにはスピントラップ剤を使用しなければならない。不幸なことに,生体内分布が詳細に知られている毒性の低いスピントラップ剤は現存しない。予備的研究として安定化スピンラベル剤をマウスに全身適用し,その生体内分布を三次元で画像化することを試みた。スピンラベル剤pyrrolidine-1 oxyl(3-carbamoyl-PROXYL)を腹腔内に投与し,腹部の画像解析を行った。得られたESRシグナル(3本線)を微分スペクトル化し,積分処理後,微細構造相互作用により不要スペクトルを消去,スムージングとフーリエ変換した。Window・空間フィルターを介し逆フーリエ変換することで画像再構成処理し,二次元画像を得た。また,三次元測定により立体画像化することに成功した。今後の課題は,大型動物(ウサギ程度)に応用できるまで装備を拡張することと,新しいスピンラベル剤の開発に力を注ぎ,酸素由来ラジカルの画像化を実現できる素地を作ることを到達目標とする。電子磁気共鳴(ESR)法は,ラジカル種を非浸襲,非破壊的に直接測定できる方法である。とくにin vivo ESR法は生体内に存在するラジカル種の非浸襲測定を可能とし,ラジカル動態のモニタリングに対し有効な手段である。
眼の免疫特権機構の解明と角膜移植後拒絶反応の制御

眼は、臓器内の炎症を自動制御する「免疫特権:immune privilege」という性質をもつ臓器である。免疫特権は、自己免疫疾患や臓器移植後拒絶反応の自動制御に深く関与している。我々は、眼の免疫特権の分子機構を解析し、眼組織移植後の拒絶反応のあらたな制御法を確立することを最終目標としている。本研究において、移植後の眼内免疫抑制性微少環境の維持に関与すると思われる新しい候補因子として、免疫補助シグナル分子であるProgrammed death-1とそのリガンドB7-H1(PD-L1)に注目し、以下のことを明らかにした。B7-H1は、角膜内皮細胞に恒性発現し、角膜移植後に眼局所に浸潤するPD-1陽性T細胞にアポトーシスを誘導し、角膜内でエフェクター細胞を除去することにより、拒絶反応の効果相(effector phase)における抑制効果を発揮する。一方、PD-1/B7-H1経路は、角膜移植後に眼由来の抗原提示細胞と脾臓のB細胞やナチュラルキラーT細胞により誘導される制御性T細胞に依存する免疫寛容現象には、関与しない。角膜細胞に発現するB7-H1は、抗原特異的な反応性T細胞による障害を抑制するのみでなく、抗原非特異的な活性化T細胞によるbystanderな障害も抑制する。また、炎症性サイトカインであるインターフェロン-γの存在下では、角膜細胞におけるB7-H1の発現はさらに増強して、T細胞のアポトーシスをさらに強く誘導する。T細胞表面のPD-1発現は角膜細胞との接触により増強し、アポトーシスに至りやすくなる。以上のように、角膜移植におけるPD-1/B7-H1経路の役割は、2次リンパ器官における免疫応答というよりも、末梢におけるエフェクター免疫細胞と角膜細胞における細胞相互作用に関与し、局所における免疫抑制性微少環境の維持に貢献する分子であることを明らかにした。我々は角膜移植の免疫応答におけるPD-L1の発現と役割を解析したところ、マウスの正常角膜の内皮細胞と実質細胞はPD-L1を恒常的に発現しており、一方、角膜アログラフト移植後の拒絶反応においては浸潤T細胞がPD-1を発現していた。マウスの角膜移植宿主に抗PD-L1抗体を腹腔内投与したところ、対照のrat IgG投与群と比較して有意に生着が短縮し(p<0.006)全例拒絶された。このことから、角膜のPD-L1発現が角膜の免疫特権を維持する一つの因子であることが示唆された。さらに、アログラフト角膜内の浸潤細胞表面のT細胞マーカーとPD-1の発現を免疫組織化学で解析し、アポトーシスをTUNEL法で解析した結果、対照アログラフトは、術後2週にグラフト接合部実質と内皮面の浸潤細胞がアポトーシスになっており、4週には浸潤細胞はほとんど消失して、アログラフトは透明生着したのに対し、抗PD-L1抗体を投与された宿主のアログラフト角膜では、実質内と内皮面に浸潤したPD-1陽性CD4T細胞はアポトーシスにならず、4週には多数のT細胞が浸潤して角膜は混濁した。こうした結果から、角膜に発現するPD-L1は、アログラフト局所の浸潤T細胞にPD-1を介してアポトーシスを誘導し、攻撃細胞のperipheral deletionという機序で角膜局所において拒絶反応を制御していることが明確になった。【目的】T細胞表面の抑制性シグナル分子Programmed Death(PD)1のリガンドB7-

H1は、角膜の内皮細胞に恒性発現し、浸潤細胞に細胞死を誘導して角膜移植後の拒絶反応を抑制することを昨年度に報告した。今年度は、角膜拒絶反応のin vitroモデルを作成し、B7-H1による免疫特権機構を解析し、炎症時における角膜表面のB7-H1およびT細胞表面PD-1の発現誘導を解析した。【方法】マウス角膜を抗B7-H1抗体または対照IgGで前処理してからT細胞と共培養し、T細胞による角膜内皮細胞の障害をpropidium iodide染色で解析した。T細胞は同系、アロ、third partyの正常マウスと、同系やthird partyの抗原で免疫したアロマウスの脾臓から精製した。角膜と共培養後のT細胞のPD-1発現変化を解析した。また、インターフェロン(IFN)γ刺激後のヒトまたはマウス角膜と、角膜移植後の炎症時における角膜におけるB7-H1の発現変化を解析した。【結果】B7-H1阻害されたマウス角膜は、抗原特異的T細胞およびthird party反応性T細胞による角膜内皮障害が対照角膜よりも有意に強く、アロやthird partyのnaive T細胞との共培養後の障害も対照より強かった。B7-H1はヒト角膜の全層およびマウス角膜の実質と内皮に発現し、IFNγ刺激により増強し、移植後にも増強した。正常角膜の上皮にB7-H1は未発現であるが、IFNγ刺激により発現が誘導された。T細胞表面のPD-1発現は角膜と共培養後に増強した。【結論】角膜に発現するB7-H1は、抗原特異的な反応性T細胞のみならず活性化T細胞によるbystanderな障害も抑制し、さらには角膜局所でのnaiveT細胞への感作を抑制する。炎症時には角膜のB7-H1発現はさらに増強して組織障害を抑制する役割をもつ。
非同期仮想ハードウェア技術を用いた低電力メディア処理プロセッサの試作

1 NECおよびNECエレクトロニクスによる動的リコンフィギャラブルプロセッサDRPを用いて仮想ハードウェアのメカニズムを評価した.この結果,単一系統の状態遷移によりハードウェアを動的に再構成する仮想ハードウェアのメカニズムでは,単純な状態遷移によってなるべく多くの演算を並列化することが性能向上の鍵となることを明らかにした.特にメディア処理に多く用いられる固定小数点演算のマルチサイクル性に着目した最適化手法を提案し,その有効性を示した.2東京大学のVDEC(大規模集積回路設計教育センター)の協力を得て,非同期回路チップの設計を行った.特に消費電力を抑えつつ回路を高速に動作させるために,非同期マイクロパイプラインの基本要素となるMullerのC素子とフリップフロップからなる回路モジュールをレイアウトレベルで設計した.この結果,既存のものに比べて高速かつ小面積でマイクロパイプラインを実現することのできる非同期回路セルを構築した.3動的に再構成しながら仮想ハードウェアを実現するためには,OSがメモリの空き領域管理を行うように,ハードウェアの空き領域管理がなされなければならない.これをハードウェアで集中的に行うと管理する領域が増えるにつれ性能上の問題が生じる.しかし,領域管理を分散的に行うための良い方法は知られていなかった。そこで,「圧力」の概念を導入し,ハードウェアモジュール同士が信号をやりとりしながら分散的に領域管理を行うメカニズムを提案しその有効性を示した.本研究で設計するメディアプロセッサのターゲットアプリケーションとして、楕円暗号処理と画像処理を取り上げ、その特性から演算器の構成について検討した。楕円暗号処理においては、その安全性を確保するためには従来のプロセッサで扱ってきたビット数よりも、はるかに大きな整数演算が支配的となる。これを低電力で実現する方法として、並列型、非同期ビットシリアル型、中国剰余定理に基づく剰余表現を用いたディジットシリアル型の演算を試実装しその得失を比較した。並列型については、非同期回路技術を適用しオペランドの値にしたがってクリティカルパスの変動を許すことで、演算性能を2割程度向上できることを明らかにした。非同期ビットシリアル型については、除算以外の演算器については効率的な構造を見いだすことができたが、除算器については他の演算器に比べると複雑になり、特にLSB側からオペランドを転送する方式は非効率であることが分かった。剰余表現を用いるアプローチは、加算および乗算は効率よく演算することができるが、除算や値の比較を行うためには表現を変換しなければならず、楕円暗号処理をそのまま行うには難しい面があることが分かった。一方、本研究で想定しているような組み込み用途では、複雑構成を持つ高性能の浮動小数演算器を持つことは難しいと考えられる。そこで、画像処理の例としてレイトレーシングによるCG処理を取り上げ、処理に必要な演算精度に関して実験を行い検討した、この結果、肉眼ではほぼ見分けのつかないとされるピーク信号対雑音比40dBを満足させるためには、30ビット以上の整数演算で十分であることが分かった。これらの結果をふまえ、来年度は除算器の構成に検討を加えた上でシリアル型整数演算を軸としたプロセッサアーキテクチャを実装していく予定である。本年度はFPGAボードを用いた演算器動作の検証と並行しながら,試作チップの設計をすすめた.現在の所,非同期チップの設計を支援するツールが存在しないことから,非同期回路を一種のペトリネットとしてモデル化し,ユーザがペトリネットとして入力したモデルを非同期回路に自動で変換する設計ツールの実装を行った.そして,本ツールを用いてさまざまなアプリケーションを非同期回路として設計することにより,効率的な論理ユニットの粒度について検討を行った.また,今回設計するメディア処理プロセッサでは消費電力を抑えるために浮動小数点ユニットを実装しないが,レイトレーシングなどの画像レンダリング処理やIMBEなどの音声符合化処理などを固定小数演算だけを用いて実装し,30ビット程度の精度を持てば実装方法を工夫することで必要な処理結果を得られることを示した.さらに,メディア処理プロセッサにおいて今後重要となると考えられる楕円曲線暗号処理に関して効率の良い演算器の構成方法について検討を行ない,素体に基づくモンゴメリ乗算方法の有効性を示した.試作チップの設計は現在一般的なRISCプロセッサと同等の処理を行うマイクロプロセッサ部の動作テストが完了しており,来年度にはテープアウトする予定である.なお,これらの研究成果は電子情報通信学会論文誌やInternational Conference on Field Programmable Logic and Applications等で公表を行っている.1 NECおよびNECエレクトロニクスによる動的リコンフィギャラブルプロセッサDRPを用いて仮想ハードウェアのメカニズムを評価した.この結果,単一系統の状態遷移によりハードウェアを動的に再構成する仮想ハードウェアのメカニズムでは,単純な状態遷移によってなるべく多くの演算を並列化することが性能向上の鍵となることを明らかにした.特にメディア処理に多く用いられる固定小数点演算のマルチサイクル性に着目した最適化手法を提案し,その有効性を示した.2東京大学のVDEC(大規模集積回路設計教育センター)の協力を得て,非同期回路チップの設計を行った.特に消費電力を抑えつつ回路を高速に動作させるために,非同期マイクロパイプラインの基本要素となるMullerのC素子とフリップフロップからなる回路モジュールをレイアウトレベルで設計した.この結果,既存のものに比べて高速かつ小面積でマイクロパイプラインを実現することのできる非同期回路セルを構築した.3動的に再構成しながら仮想ハードウェアを実現するためには,OSがメモリの空き領域管理を行うように,ハードウェアの空き領域管理がなされなければならない.これをハードウェアで集中的に行うと管理する領域が増えるにつれ性能上の問題が生じる.しかし,領域管理を分散的に行うための良い方法は知られていなかった。

そこで,「圧力」の概念を導入し,ハードウェアモジュール同士が信号をやりとりしながら分散的に領域管理を行うメカニズムを提案しその有効性を示した.
単一細胞解析から解き明かす加齢造血幹細胞の自己複製プログラムの亢進

申請者は2017-2018年度の研究課題「単一細胞解析から解き明かす加齢造血幹細胞の自己複製プログラムの亢進」において、加齢造血幹細胞の単一細胞レベルの遺伝子発現解析を通じた検討を行い、FluidigmC1システムおよびIlluminaHiSeq2000を用いて様々な月齢段階の造血幹細胞(CD150+CD48-CD34- LSK細胞)の単一細胞RNAsequence解析を実施し、各群50-90細胞分のトランスクリプトームを取得した。若齢の造血幹細胞と加齢した造血幹細胞は遺伝子発現では明確に異なるクラスターを形成するがそれぞれのグループ内では均一な細胞集団であった。すなわち造血幹細胞は加齢に伴って集団の各細胞が一様な質的変化を起こすことが見出され、その分子メカニズムとしては造血幹細胞の自己複製を制御する遺伝子プログラムの発現亢進が示唆された(投稿準備中)。加齢に伴い発現の亢進する遺伝子と造血幹細胞を体外培養した際に発現亢進する遺伝子のうち、TPOシグナル下流遺伝子(巨核球関連遺伝子)が共通しており、造血幹細胞の加齢変化と培養ストレスは密接な関係があると考えられた。培養ストレスと造血幹細胞の加齢変化との共通点を探るため、培養条件(栄養条件、サイトカイン、酸素濃度など)を網羅的に再検討し、高脂質濃度、低サイトカイン、低酸素の条件が造血幹細胞を静止期に維持する必要最低限の要素であることを見出した。しかし現時点では培養後いくつかの未分化マーカーの減少、加齢マーカーの増加、移植生着能の低下が認められる。加齢マーカーの増減は、栄養条件およびサイトカインシグナルと密接に関係していることを明らかにしつつあり、静止期維持培養条件を明らかにすることは、造血幹細胞の未分化維持機構の理解のみならず、その加齢変化の理解にもつながると考えられる。造血幹細胞の加齢変化は高齢者の易感染性や難治性免疫疾患、造血器悪性腫瘍の罹患率の増加の背景となるが、そのメカニズムは不明である。本研究では様々な時期のマウスとヒトの造血幹細胞の単一細胞RNA-sequence解析を実施して、加齢造血幹細胞特有の遺伝子発現ネットワークを明らかにしてきた。加えて、加齢造血幹細胞で新規に見出した特徴である自己複製能亢進と分化障害を解除する薬剤を探索し、その改善効果の検証と分子機構の解明を図っている。10週齢と2年齢の個体に加え、中間年齢段階の個体でのscRNA-seq解析を実施した。この結果、造血幹細胞集団の加齢変化は予想よりも早く加齢形質(2年齢の造血幹細胞の発現プロファイル)へと遷移することが明らかになった。さらに、そのような性質は全ての細胞が一様に変化を示しており、加齢に伴い造血幹細胞の一様な性質の変化を示唆した。また、加齢造血幹細胞同様、造血幹細胞特異的遺伝子の発現上昇が7ヶ月齢より認められ、造血幹細胞の機能上の変化に先行して遺伝子発現の変化を認めることが示唆された。転写因子の相互依存関係については、各転写因子を過剰発現させた上で、他の転写因子の発現変化を定量的PCRによって確認した。加齢に伴って発現が上昇する造血幹細胞の転写因子はいずれも分化と未分化性の両方を制御していることを意味しており、加齢造血幹細胞の自己複製能の亢進は、これら転写因子の分化抑制のバランスの異常によって引き起こされることを示唆している。これらの遺伝子発現解析に加えて、加齢造血幹細胞のよりよい(造血幹細胞移植に頼らない)機能評価系を確立するために、造血幹細胞をより生体に近い環境で維持する培養法を開発した。本培養法を用いると加齢造血幹細胞は若齢造血幹細胞に比べてより広いダイナミックレンジの環境変化に対して生存しかつ未分化性を維持することが明らかになった。初年度に実施する予定であった本研究期間中に中間年齢段階(7ヶ月、1年齢、1.5年齢)の個体でのscRNA-seq解析を実施した。その結果、Pbx1,Gata2はGata1を介した赤芽球系プログラムを抑制する一方で顆粒球・リンパ球系分化プログラムを駆動していることを示していた。逆にGata2は顆粒球系分化プログラムを抑制する一方、Gata1を介した赤芽球・巨核球系プログラムを駆動していた。

本培養法を用いると加齢造血幹細胞は若齢造血幹細胞に比べてより広いダイナミックレンジの環境変化に対して生存しかつ未分化性を維持することが明らかになった。今後は同培養条件下において薬剤探索スクリーニングや遺伝子発現解析を組み合わせ、加齢造血幹細胞の機能解析を進めていく。申請者は2017-2018年度の研究課題「単一細胞解析から解き明かす加齢造血幹細胞の自己複製プログラムの亢進」において、加齢造血幹細胞の単一細胞レベルの遺伝子発現解析を通じた検討を行い、FluidigmC1システムおよびIlluminaHiSeq2000を用いて様々な月齢段階の造血幹細胞(CD150+CD48-CD34- LSK細胞)の単一細胞RNAsequence解析を実施し、各群50-90細胞分のトランスクリプトームを取得した。若齢の造血幹細胞と加齢した造血幹細胞は遺伝子発現では明確に異なるクラスターを形成するがそれぞれのグループ内では均一な細胞集団であった。すなわち造血幹細胞は加齢に伴って集団の各細胞が一様な質的変化を起こすことが見出され、その分子メカニズムとしては造血幹細胞の自己複製を制御する遺伝子プログラムの発現亢進が示唆された(投稿準備中)。加齢に伴い発現の亢進する遺伝子と造血幹細胞を体外培養した際に発現亢進する遺伝子のうち、TPOシグナル下流遺伝子(巨核球関連遺伝子)が共通しており、造血幹細胞の加齢変化と培養ストレスは密接な関係があると考えられた。培養ストレスと造血幹細胞の加齢変化との共通点を探るため、培養条件(栄養条件、サイトカイン、酸素濃度など)を網羅的に再検討し、高脂質濃度、低サイトカイン、低酸素の条件が造血幹細胞を静止期に維持する必要最低限の要素であることを見出した。しかし現時点では培養後いくつかの未分化マーカーの減少、加齢マーカーの増加、移植生着能の低下が認められる。加齢マーカーの増減は、栄養条件およびサイトカインシグナルと密接に関係していることを明らかにしつつあり、静止期維持培養条件を明らかにすることは、造血幹細胞の未分化維持機構の理解のみならず、その加齢変化の理解にもつながると考えられる。1年度目に開発した、造血幹細胞を静止期に誘導する培養条件と、既に同定している加齢造血幹細胞関連マーカーによる加齢評価を組み合わせることで、下記2の薬剤探索のスクリーニングの効率化を図る。また、薬剤のみならず、培養環境の自体の操作による加齢変化のコントロールも試みる。Scl-tTA:H2B-GFPマウスはドキシサイクリン(Dox)投与によって造血幹細胞が分裂するたびに幹細胞のGFPの蛍光が低下するマウス系統であり、GFP蛍光で造血幹細胞の分裂履歴を評価可能である。1年齢の本マウスにDoxを投与し10週継続したうえで造血幹細胞集団をGFPhigh (分裂回数が少ない、あるいは無し)およびGFPlow(分裂回数が多い)に分ける。それぞれの造血幹細胞集団を単離し、単一細胞cDNAライブラリーを調整し、index付加後scRNA-seqを行う。造血幹細胞の加齢特徴的な遺伝子プログラムが分裂履歴に影響するのか否かを評価する。また、加齢と造血幹細胞の分裂頻度の関係を調べるため、若齢から2年齢に至るまで同マウスをDox投与後継時的に造血幹細胞分画のGFP陽性細胞の割合を解析していく。2造血幹細胞の加齢形質を若返らせる薬剤の探索赤芽球分化およびリンパ球分化能の回復を最適化するための条件を、Bリンパ球系、骨髄球系、赤芽球系の分化能を同時に評価することのできる胸腺間葉系細胞株TSt-4と造血幹細胞の共