hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
象牙質知覚過敏処置後の象牙細管構造の変化-イオン導入法とシュウ酸カリウム溶液の効果-

象牙質知覚過敏症の治療法のうち、イオン導入法またはシュウ酸カリウム溶液の塗布法の施した際の象牙細管内部の微細構造変化を調べる目的で、あえて比較的に象牙細管の開口の大きい幼若永久歯を対象に以下の実験を行った。すなわち、根未完成または根完成菌の幼若永久歯を有するカニクイザル2頭を実験動物として用いた。全身麻酔後、実験動物を手術台に固定し、前歯唇面、臼歯咬合面にそれぞれ2ケの独立した象牙質窩洞(深さ約2mm,直径約2mm)を形成し、窩底部に存在するスメア層の除去を超音波スケーラーにて行った。実験群は〔A群〕2窩洞のうち1つには8%塩化亜鉛液のイオン導入0.3mmA5分、他の1つには生理食塩液の塗布、〔B群〕2窩洞のうち1つには25%シュウ酸カリウム溶液2分間塗布、他の1つには2%フッ化ナトリウム溶液を3分間用、の2群とした。各実験群の窩洞から直径約1mm前後の象牙質試料を取り出し、1.樹脂包理後、厚さ約1020mumの切片を作製し、各種染色を施し、応用直下の歯髄と硬組織の光学顕微鏡観察、2.通法に従い脱水、臨界点乾燥を行い、走査型電子顕微鏡(SEM)観察、3.一部の試料はエポン樹脂包理後、ダイヤモンドナイフにて超薄切片を作製し、透過型電子顕微鏡観察を行った。その結果、光顕的観察では、塗布面に一致する歯髄腔の表層には特に変化はみられなかったが、残存窩底象牙質の厚さが比較的菲薄な例では、イオン導入例に若干の象牙芽細胞の変化を生じた。SEM観察では、細管の封鎖や狭窄がシュウ酸カリウム応用例にみられたが、同部象牙質直下の歯髄面における変化は現在標本作製中であり、今後、さらに詳細に関して検索していく予定である。
高分子と水との相互作用に対する立体規則性の影響を分子レベルで解明する試み

アクリルアミド系高分子と水の相互作用に高分子の立体規則度が与える影響を,赤外分光法・水晶振動子マイクロバランス(QCM)法・分子力学法を用いて調べた.赤外分光法とQCM法からは,立体規則度の変化によってアミド基まわりの水の水素結合状態が異なっていることがわかり,分子力学法からはその変化が隣接基間相互作用と水和とのバランスの変化によって引き起こされていることが示唆されたアクリルアミド系高分子と水の相互作用に高分子の立体規則度が与える影響を,赤外分光法・水晶振動子マイクロバランス(QCM)法・分子力学法を用いて調べた.赤外分光法とQCM法からは,立体規則度の変化によってアミド基まわりの水の水素結合状態が異なっていることがわかり,分子力学法からはその変化が隣接基間相互作用と水和とのバランスの変化によって引き起こされていることが示唆された平成21年度は,(1)高分子試料の調整,(2)測定チャンバー・セルの設計と製作,(3)分子力学によるシミュレーションの準備の3点を行った.(1)では,poly (N-isopropylacrylamide)およびpoly (N,N-diethylacrylamide)の立体特異性ラジカル重合を行い,m比が5090%の間で立体規則性の異なる試料を数種類用意することができた.(2)では,赤外線透過窓を有する高真空チャンバーを赤外装置の測定室内に配置するための治具の設計・製作,水蒸気を導入するための配管や圧力測定装置の設置を行った.チャンバー内の真空度は10^<-3>Pa以下にすることができた.また,作成した高分子試料を,本予算によって購入したスピンコーターによって赤外測定にとって最適な状態で薄膜化するための条件を探索した.この結果,上述の試料では10wt%のAcetone溶液を,3000rpm程度で回転する3mm厚のCaF_2円形窓板上に滴下すると良いことがわかった.このサンプルの赤外スペクトルを真空チャンバー内にて測定すると,ほとんど水の含まれていない薄膜の測定ができた.また,ここに蒸気圧を変化させながら水蒸気を吸着させると,水分子の吸着による赤外スペクトルの変化を明確に検出できることが明らかとなった.吸着された水のスペクトルは,高分子の種類によっても立体規則性によっても変化する.さらに得られるデータには,非常に高い再現性があることも分かった.(3)では,現有する計算機システムにTinkerや分子力学法を用いた配座探索パッケージCONFLEXを組み込み,計算を行えるような環境を整えた.モデル化合物について,TinkerではMM2やMM3を用いた構造最適化ができ,CONFLEXでは各種力場を用いた配座探索ができることを確認した.平成22年度は,立体制御されたアクリルアミド系高分子への水の収着挙動を,(1)赤外分光法と(2)QCM法によって調べた.また,(3)CONFLEXを用いた分子力場計算をダイマーモデルについて行った.(1)では,立体制御されたpoly (acrylamide), poly (N-isopropylacrylamide), poly (N,N-diethylacrylamide), poly (N-ethylacrylamide)の薄膜試料を作成し,様々な水蒸気圧下で水を収着させて赤外スペクトルを測定した.乾燥状態における高分子のC=O伸縮振動に関連するアミドIバンドは,立体規則性によって大きく変化することは無かった.一方,水蒸気の収着後には,アミドIバンドに明確な変化が観測されたため,アミド基まわりの水分子の配向は立体規則性に依存すると考えられる.(2)では,アニーリング前後における薄膜試料に対する水蒸気の収着量をQCMによって測定した.アニーリング前では,水蒸気収着に対する立体規則性の影響が顕著に現れたが,アニーリング後にはその差は小さくなった.また,立体制御していない高分子の水蒸気収着量は,アニーリング前後で大きく変化しなかった.これらの結果から,高分子薄膜に対する水蒸気収着量は,キャスト溶媒中の高分子鎖の状態に大きく依存していることが示唆された.立体規則性は,溶媒中での高分子の拡がりに影響を与えている可能性があり,これが薄膜化したときの水蒸気収着量に間接的に影響すると考えられる.(3)については,分子力場計算によってpoly (N-isopropylacrylamide) (PNiPAM)の親水性が立体規則性によって変化する原因を分子論的に解明する試みを行った.この結果については,すでに論文化した.

平成23年度は,(1)立体制御されたPoly(N-ethylacrylamide)(PNEA)およびPoly(acrylamide)(PAA)薄膜への水蒸気収着過程における赤外スペクトル測定とその解析,(2)QCM法によるPNEAおよびPAA薄膜への水蒸気収着量の測定,(3)PNEA三量体モデル化合物についての分子力学シュミレーション,(4)立体制御されたPoly(N-ethylacrylamide)(PNiPA)に対するタンパク質収着実験,の4点を行った,(1)(2)では,平成2122年度に確立した装置および方法を用いて立体制御されたPNEAおよびPAAの薄膜を作成し,水蒸気収着過程におけるる赤外スペクトルを観測した.PNEAの赤外スペクトルの水収着による変化およびその立体規則度依存性はPNiPAと類似の結果を示したが,PAAは全く異なる挙動を示すことがわかった.QCM法による水蒸気収着量と赤外スペクトルの測定結果から,PNiPAとPNEAの水収着様式はアミド基への直接的水素結合であることが推定されるが,PAAの場合にはその実験的証拠はない.これは側鎖の構造が一級アミドか二級アミドかによって水収着挙動が異なることを示している.(3)については,平成22年度に確立された分子力学法による二量体モデルの自由エネルギー計算法を三量体モデルに応用し,三連子の立体構造が高分子の溶解性にどのような影響を与えるのかを調べた.(4)では,meso比が82%および76%のPNiPA(水に不溶)の薄膜を作成し,QCM法を用いて水溶液中でのタンパク質(ウシ血清アルブミン)収着量を測った.meso比が6%の差でもタンパク質収着量は4倍以上異なり,立体規則度のわずかな違いがタンパク質とPNiPAの相互作用に大きな影響を与えることが分かった.
dmit系金属錯体の微視的研究:磁気構造と電荷局在状態

我々はdmi t系導電性金属錯体に着目し、その低温電子状態を明らかにするため微視的な観点から研究を行っている。とくに、固体広幅NMRは非常に有力な実験手法であり、分子生物においては、これまで^1H核に対する測定が為されてきた。しかし、dmi t系では伝導電子密度大きいアニオン分子上には^1H核は存在せず、常磁性相の知見を得るには至らなかった。本研究課題では、今回その限界を克服するため、NMR測定にかかる^<13>C同位体置換試料を作成し、^<13>C-NMR測定から伝導電子に関する直接的な情報を得ることを試みた。dmit系金属錯体の代表的な塩の^<13>C同位体置換試料についてNMRスピン格子緩和率測定を行った。我々の非置換試料に対する結果を確認するとともに、分光器の向上によりさらに高温部まで測定することができた。^1H-NMRでは、50K以上でスピン格子緩和率が大きく増大し130K近傍でピークをとる。これはメチル基の運動の効果によるもので、電子状態に関する情報がマスクされている。一方、^<13>C-NMRでは、スピン格子緩和率は100K以上でも分子運動による影響は見られず、伝導電子に関する直接的な情報が得られた。さらに、今回、80K以下で急激に反強磁性揺らぎが発達していることを見いだした。これは、80K近傍で電子状態に何かしらの変化が生じていることを示唆しているおり、^<13>C-NMRによって初めて明らかとされた結果である。^<13>C-NMR測定により、これまで有意義な情報の得られなかった常磁性相・超伝導相に関する研究の展望が開けた。さらに、圧力下における金属安定化の機構、超伝導発現機構、第二絶縁相の電子状態を調べるとともに、単結晶資料による反強磁性磁気構造の決定を試みている。
ハイパー核ガンマ線分光で解明するΛN相互作用の荷電対称性

Λハイパー核の荷電対称性の破れを調べるため、J-PARC K1.1ラインにて、7Li(K-,π-)7ΛLi*, 7ΛLi*→4ΛH*+3He反応により4ΛHの励起状態を生成し、ゲルマニウム検出器群Hyperball-Jで4ΛHの1+→0+遷移のγ線を同時計測する実験(J-PARC E63)の準備を以下のように進めた。(1)4ΛHの弱崩壊からのπ-を検出して4ΛHの生成を同定するためのプラスチックカウンターシステムについて、さらなる詳細なシミュレーションを行い、3ΛHなど他のハイパー核フラグメントと分離可能なことを確かめた。(2)これらのシミュレーションをもとに検出器の試作機を製作して詳細なテスト実験を行った結果、シンチレータへのファイバーの接合位置等に改良の余地があることがわかり、これをもとに再度実機の設計を行った。(3)同様の検出器を用いて同じK1.1ラインで別の実験((π-,K0)反応による3ΛHハイパー核の寿命測定)を計画しているイタリア・トリノのグループと共同で検出器開発を進めることとし、打ち合わせを行った。(4)前年度に完成したK1.1ライン用ビームファイバートラッカー(BFT)については、宇宙線を用いてテストを行い、十分な検出効率と時間分解能を確認した。(5)DRS4チップを用いた新しい読出し回路(ADC)のテストを開始した。上記(3)の(π-,K0)反応を利用すると、4ΛHe,4ΛHよりも重いハイパー核について荷電対称性の破れの測定実験ができるので、その具体的可能性を検討した。関連実験としてH27年度に4ΛHeのγ線分光実験とともに実施した19ΛFのγ線分光実験のデータ解析を進め、発見した19ΛFの4つのγ線をもとに、19ΛFのレベル構造を確定し、結果をPRLに発表した。4ΛHのγ線分光実験で必要となるπ-弱崩壊測定用のカウンター製作については、試作機の詳細なテスト実験の結果、改良の余地があることがわかり、実機の設計をやり直すなどしたため予定より遅れているが、他の検出器や回路系の準備は順調に進んだ。4ΛHのγ線分光実験(J-PARC E63実験)については、実験を実施するJ-PARCのK1.1ラインの建設が大幅に遅れ、2021年の予定となってしまったため、本科研費の研究期間内に行うこととしては、本実験用の検出器の性能向上に努めつつ実験準備を整えておくことと、同型の検出器を用いて、より重いハイパー核の荷電対称性の破れを測定するための次期γ線分光実験の準備を進めておくこと、を目標とした。これまでにπ-弱崩壊測定用カウンターの製作に遅れが出ているものの、本実験への影響はまったくない。また、すでに完了した4ΛHeのγ線分光実験、および、4ΛHeの実験と同時に行った関連実験である19ΛFのγ線分光実験についても、すでに結果を論文発表済みではあるもののさらなるデータ解析を進めて荷電対称性の破れに関係するΛ核子相互作用の情報を引き出すこととした。2015年度前半には、J-PARC K1.8ラインにγ線検出器群Hyperball-Jを設置して、Λハイパー核の荷電対称性の破れの有無を確定するための実験である4ΛHeのγ線分光実験(J-PARC E13)を実施した。その後データ解析を行い、1406±2±2 keVの明確なγ線ピークを発見し、これを4ΛHe(1+->0+)のγ遷移と同定した。この結果は、昔の統計量の少ないデータから言われていた値(1.15 MeV)と大きく異なっていた。鏡像核の4ΛH(1+->0+)遷移エネルギーが1.09±0.02MeVであることがわかっているので、鏡像核の間でレベル間隔が0.3 MeV異なることがわかった。この結果は、通常核で荷電対称性の破れによる鏡像核のエネルギー差が60keV程度であるという事実と大きく異なる。また、昔のエマルジョンの4ΛH, 4ΛHeの基底状態の束縛エネルギーのデータ、および最近マインツ大で測定された4ΛH基底状態の束縛エネルギーのデータと組み合わせると、基底状態0+に荷電対称性の大きな破れがあるが励起状態1+にはほとんど破れがないことが分かり、Λ核子間の荷電対称性の破れがスピンに依存することが明らかになった。これらの結果は、この大きな荷電対称性の破れの起源を解明する上で重要な情報となる。この結果は、東北大・KEK・JAEA・J-PARC共同でプレス発表し、PRLに論文発表、いくつかの国際会議等で報告した。一方の4ΛH(1+->0+)のγ遷移エネルギーをHyperball-J検出器によって高精度で測る実験を検討・デザインし、J-PARC PACに実験提案を行った。この際、上記の結果を受けて、当初の方法から実験方法を見直し、ヘリウムでなくリチウム標的を用いて4ΛHの励起状態を生成することにした。必要となるエアロゲル検出器を製作し、テストを行って良好な結果を得た。4ΛHeのガンマ線分光実験は、当初の予定通り行われ、分解能・統計量ともに質の高いデータが得られた。

観測されたガンマ線から、Λ核子間にきわめて大きな荷電対称性の破れがあることが確定したが、これは我々も予想外の結果であり、世界の理論家に驚きを与えるとともに、理論・実験両面での研究を加速させた。また、今後行う4ΛHのガンマ線分光実験については、実験方法を見直したことで、当初の見積もりよりもハイパー核の生成量が増えてエネルギーの測定精度が上がると期待している。Λハイパー核の荷電対称性の破れを調べるため、J-PARC K1.1ラインにおいて、7Li(K-,π-)7ΛLi*, 7ΛLi*→4ΛH*+3He反応によって、4ΛHの励起状態を生成して、ゲルマニウム検出器群Hyperball-Jで4ΛHの1+→0+遷移のγ線を同時計測する実験(J-PARC E63)の準備を以下のように進めた。・実験の詳細をシミュレーションをもとにデザインし、技術提案書にまとめ、J-PARCに提出した。それをもとに実験審査委員会で議論が行われ、最終採択(stage-2採択)を受けた。・4ΛHの弱崩壊からのπ-を検出して4ΛHの生成を同定するためのプラスチックカウンターシステムについて、シミュレーションに基づき最適な厚さや形状を決定し、検出器の設計を行った。・K1.1ビームラインのビームスペクトロメータの上流に設置してビーム粒子の軌跡測定を行うための検出器として、多数のシンチレーションファイバーからなるビームファイバートラッカー(BFT)を製作し、読出し回路系(ESIROC)を接続して性能テストを行って良好な結果を得た。・K1.1ビームラインの標的前後に設置してビーム粒子の種類の同定を行うためのエアロゲルチェレンコフ検出器を製作した。これをJ-PARC K1.8ラインに設置してK中間子、π中間子のビームを用いてその性能を詳しくテストした。さらに、その性能をもとにトリガーレートを見積もり、本実験において問題が生じないことを確認した。・すでにPhys. Rev. Lett.に論文発表した4ΛHeのガンマ線測定成果とそれから得られた荷電対称性の大きな破れについて、さまざまな国際会議で報告した。本研究では、互いに鏡像核である4ΛHeと4ΛHの構造をガンマ線分光によって精密に調べることとしている。前者の測定はすでに完了しており、H28年度は後者の測定の準備を進めた。とくに、・4ΛHの構造を調べる実験の提案書をJ-PARCに申請し、最終採択された。・4ΛHの実験に必要なさまざまな検出器の作成とテスト実験を行い、本実験のための準備が大きく進展した。・すでにデータを取得した4ΛHeのガンマ線については、その測定結果をすでにPRLに発表し注目されたが、その後も詳細なデータ解析を行う予定であったがあまり進まなかった。Λハイパー核の荷電対称性の破れを調べるため、J-PARC K1.1ラインにて、7Li(K-,π-)7ΛLi*, 7ΛLi*→4ΛH*+3He反応により4ΛHの励起状態を生成し、ゲルマニウム検出器群Hyperball-Jで4ΛHの1+→0+遷移のγ線を同時計測する実験(J-PARC E63)の準備を以下のように進めた。(1)4ΛHの弱崩壊からのπ-を検出して4ΛHの生成を同定するためのプラスチックカウンターシステムについて、さらなる詳細なシミュレーションを行い、3ΛHなど他のハイパー核フラグメントと分離可能なことを確かめた。(2)これらのシミュレーションをもとに検出器の試作機を製作して詳細なテスト実験を行った結果、シンチレータへのファイバーの接合位置等に改良の余地があることがわかり、これをもとに再度実機の設計を行った。(3)同様の検出器を用いて同じK1.1ラインで別の実験((π-,K0)反応による3ΛHハイパー核の寿命測定)を計画しているイタリア・トリノのグループと共同で検出器開発を進めることとし、打ち合わせを行った。
小惑星の遷移メカニズム解明とその応用による新たな深宇宙探査軌道の設計

本年度は,様々な小惑星が捕捉されており,また複数の宇宙ミッションにおいて利用が検討されている,quasi-satellite orbit(QSO)の様々な種類(ファミリー)を明らかにし,得られたQSOの工学的応用を提案した.特に,地球-月系および火星-フォボス系の円制限三体問題において,2D不安定周期QSOを分岐解析することで新たに分岐解として3D不安定周期QSOの様々なファミリーを明らかにした.得られたQSOの一つ目の応用として,3D不安定周期QSOに付随する不変多様体の相空間構造の近傍に,長期安定な3D準周期QSOが存在することを示した.すなわち,3D不安定周期QSOの不変多様体を目印に,長期安定な3D準周期QSOを効率的に探索できることを示した.長期安定な3D準周期QSOは,月やフォボス等の天体の高緯度領域の長期間の観測や探査に有用と考えられる.得られたQSOの二つ目の応用として,不安定性の弱い3D不安定周期QSOの不安定多様体によるフォボスへの着陸を提案し,その初期解析を行うことでミッションへの有用性を示唆した.従来提案されていたラグランジュ点周りの不安定性の強い周期軌道から生じる不安定多様体を用いるフォボス着陸軌道と比較して,着陸前の軌道保持が容易となる利点が考えられる.得られたQSOの三つ目の応用として,太陽の摂動を含めた空間円制限四体問題において,地球低軌道から太陽重力の摂動や月フライバイを利用して月周りの長期安定な3D準周期QSOに,1m/s以下の小さい投入マヌーバによって遷移する軌道の設計手法を提案した.投入マヌーバはミッション成功に関わるクリティカルなイベントであるため,小さい投入マヌーバによって長期安定な軌道に遷移可能な提案軌道は,燃料消費量のみならずロバスト性の観点からも有利であると考えられる.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,複数の天体の影響を考慮した多体ダイナミクスに潜む自然現象を解析・応用することで,新しいミッション軌道を創出することを目的としている.本年度は,特に以下の研究内容を遂行した.(1)最適化理論に基づき,月への低推力最適軌道を求める際に必要となる設計変数の数を減少させる手法を提案した.本手法により計算量を低減することで,先行研究において十分に調べられていなかった燃料消費量が少ない月遷移軌道を求めることができた.その結果,過去のミッションとは異なる軌道共鳴による月重力アシストを利用することで,燃料消費量をより節約できる可能性を示した.以上の成果に基づいて,国内発表を2件,国外発表を1件行った.なお,本研究はJAXA所属のStefano Campagnola氏の協力を得て遂行した.(2)近年発見された月への中エネルギー型遷移軌道を解析するため,中エネルギー領域においては,月に衝突する特異的な軌道がチューブ構造を持つことを数値計算によって明らかにし,衝突軌道のチューブ構造に基づく中エネルギー型月遷移軌道の効率的な設計手法を提案した.以上の成果に基づいて国外発表を1件行い,国際学術誌雑誌へ投稿中である.なお,本特別研究員はミラノ工科大学において一時期本研究を遂行し,またミラノ工科大学所属のFrancesco Topputo氏およびJAXA所属のStefano Campagnola氏の協力を得た.(3)木星と1:1の軌道共鳴状態にある小惑星の様々な遷移現象を支配する力学的な骨格構造を,高次元モデルである空間円制限三体問題においてLagrangian coherent structuresの手法を用いることで明らかにした.さらに,地球-月系においても小惑星の遷移現象を模倣する軌道を求め,ミッション軌道としての有用性を検討した.以上の成果に基づいて国内発表を1件行った.様々な小惑星の遷移現象を司る力学的な骨格構造を明らかにすることができ,また本研究の目的である小惑星の遷移現象を模倣するミッション軌道の設計に有用となり得る,力学系理論および最適化理論に基づいた新しい軌道探索手法を提案できたため.本年度は,以下の研究内容を実施した.1.インパルス推進を用いた低エネルギー型月遷移軌道の設計本研究では,格子探索による初期予想の探索,multiple shooting法による最適化(燃料消費量を最小化),continuation法による同一ファミリーの解の探索を行うことで,遷移時間が200日以下の低エネルギー型月遷移軌道を大域的に探索し,解構造を明らかにした.さらに,遷移時間-燃料消費量に関するパレート最適解を解析し,太陽,地球,月の摂動を利用して燃料消費量を低減するメカニズムを示した.以上の成果に基づいて国外発表を1件,国内発表を2件行い,国際学術誌雑誌へ投稿準備中である.2.太陽重力摂動下における連続月スイングバイ軌道の設計近年JAXAと東京大学によって提案され、開発されている超小型衛星EQUULEUSは,地球-月系のラグランジュ点L2周りの低エネルギーな準周期軌道(準ハロー軌道)に遷移して月の裏側を観測することを目指している.本特別研究員は,上述の低エネルギー型月遷移軌道に関する研究において培った経験を活かし,EQUULEUSミッションの軌道設計に協力した.EQUULEUSは太陽,地球,月の摂動を利用するため,カオス的な軌道となり,そのような軌道の系統的な設計手法は確立されていない.また,EQUULEUSは超小型衛星であるため,使用可能な燃料消費量の大きさは限られており,また相乗り衛星であるため打ち上げ条件を決定することができない.

したがって,十分小さな燃料消費量の遷移軌道を色々な打ち上げ条件に対して柔軟に設計する必要がある.これらの困難を克服するため,他の研究者と協力して軌道設計ツールを作成した.これにより,複数の打ち上げ条件に対して燃料消費量が許容値以下の遷移軌道を求めることが可能となった.以上の成果に基づいて,国内発表を行う予定(採択済)である.本年度の研究成果として,ミラノ工科大学にて国際共同研究を実施し,インパルス推進を用いた低エネルギー型月遷移軌道の大域的解構造を明らかにすることができた.その成果を米国での国際会議や国内学会にて発表し,また現在査読付き論文として国際学術雑誌に投稿を準備している.研究に付随して開発した手法およびツールは,小惑星への遷移軌道等,今後色々な応用が見込まれる.さらに,JAXA宇宙科学研究所と東京大学の共同研究開発チームに所属して,専門分野を活かして超小型衛星ミッションの軌道設計を行った.この成果は,平成29年度に開催予定の国際シンポジウムでの発表に採択されている.また,所属研究室の修士課程の学生達と協力して,低エネルギー型月遷移軌道の設計手法に関する新たな研究成果を挙げ,国内学会にて発表した.以上のことから,本年度の研究はおおむね順調に進展していると考えている.本年度は,様々な小惑星が捕捉されており,また複数の宇宙ミッションにおいて利用が検討されている,quasi-satellite orbit(QSO)の様々な種類(ファミリー)を明らかにし,得られたQSOの工学的応用を提案した.特に,地球-月系および火星-フォボス系の円制限三体問題において,2D不安定周期QSOを分岐解析することで新たに分岐解として3D不安定周期QSOの様々なファミリーを明らかにした.得られたQSOの一つ目の応用として,3D不安定周期QSOに付随する不変多様体の相空間構造の近傍に,長期安定な3D準周期QSOが存在することを示した.すなわち,3D不安定周期QSOの不変多様体を目印に,長期安定な3D準周期QSOを効率的に探索できることを示した.長期安定な3D準周期QSOは,月やフォボス等の天体の高緯度領域の長期間の観測や探査に有用と考えられる.得られたQSOの二つ目の応用として,不安定性の弱い3D不安定周期QSOの不安定多様体によるフォボスへの着陸を提案し,その初期解析を行うことでミッションへの有用性を示唆した.従来提案されていたラグランジュ点周りの不安定性の強い周期軌道から生じる不安定多様体を用いるフォボス着陸軌道と比較して,着陸前の軌道保持が容易となる利点が考えられる.得られたQSOの三つ目の応用として,太陽の摂動を含めた空間円制限四体問題において,地球低軌道から太陽重力の摂動や月フライバイを利用して月周りの長期安定な3D準周期QSOに,1m/s以下の小さい投入マヌーバによって遷移する軌道の設計手法を提案した.投入
神経網形成を促す神経栄養因子が消化管粘膜の恒常性維持及び損傷修復に果す役割の追究

消化管粘膜防御能調節機構の解明を目指して、神経栄養因子の消化管における分布と機能を調べ以下のような結果を得た。1.神経栄養因子及びその受容体の消化管における分布神経栄養因子であるNGF, BDNF, NT-3のmRNAの発現は、成熟ラット及びマウスの胃・小腸・大腸で確認された。一方、その受容体は、mRNAレベルでTrk Cが検出されるのみであり、免疫組織化学的検討では受容体は確認されなかった。2.消化管粘膜上皮内の神経分布週齢数の異なるラット消化管粘膜の神経分布の比較で、CGRP含有神経線維の割合が加齢により変化することを見出した。また、7週齢ラット胃組織ではCGRP受容体を介した特徴的なムチン生合成活性亢進が確認されたのに対して、52週齢ではそのような作用は示されなかった。3.実験潰瘍治癒過程における検討塩酸アスピリン投与による潰瘍モデルの検討に、我々が開発した抗ムチンモノクローナル抗体(RGM21, PGM34, RGM26)を使用することにより、より鮮明なる表層粘膜の損傷を評価できることが示された。ラット胃粘膜に酢酸を直接注入し作成した慢性潰瘍モデルでは、その治癒過程で一過性に特徴的な粘液細胞の出現が確認された。4.ムチン代謝へ及ぼす影響成熟ラットの胃粘膜組織を用いて、培地内に各種神経栄養因子(NGF, BDNF, NT-3, EGF, HGF)を添加したときのムチン生合成活性を比較したところ、EGF, HGFでは亢進作用が確認されたが、NGF, BDNF, NT-3では明らかな変化が認められなかった。以上の結果から、消化管粘膜の恒常性を維持する上で神経の果たす役割は重要であるが、脳において作用が解明されているNGF, BDNF, NT-3が粘液細胞へ直接的に作用する可能性は少ないことが明らかとなった。複雑なネットワークが想定される粘膜防御能調節機構の解明をめざして、神経網形成を促す因子である神経栄養因子の消化管における存在の可能性について調べ、以下のような結果を得た。1)成熟ラットから、胃、小腸、大腸の各組織を採取し、各部位におけるNGF(nerve growth factor)の発現を調べたところ、いずれの部位でもそのmRNAの発現が確認された。シークエンスを検討したところ、胃から検出されたNGFは脳におけるものと一致した。2)同様に、ラット消化管各部位におけるBDNF (brain-derived neurotrophic factor)の発現を検討したところ、NGFと同じように、胃、小腸、大腸ともに確認された。シークエンス結果も、脳のBDNFと同じであった。3)脳神経科学領域における既存の増殖因子であるNT-3(neurotrophin-3)についても胃、小腸、大腸のラット消化管各部位でともに同一と考えられるものが確認されたが、新規のものは現在までのところ検出できていない。4)成熟マウスを用いて同様の検討を行ったが、結果はラットの場合と同様であった。5)以上の結果は、脳科学や神経科学の研究領域で多彩な機能を有することが明らかとなっている神経栄養因子が消化管にも存在することを示したものであり、脳腸ホルモンでその関連性を指摘されている「消化管」と「神経」の綿密な連関の新たなる一面を見いだす端緒となりうると考えられた。

複雑なネットワークが想定される粘膜防御能調節機構の解明を目指して、神経網形成を促す因子である神経栄養因子の消化管における機能発現の可能性について調べ、以下のような結果を得た。1)成熟ラットから、胃、小腸、大腸の各組織を採取し、各部位におけるNGF(nerve growth factor)の特異的受容体であるTrk Aの発現を調べたところ、いずれの部位においても明確な発現は確認できなかった。3)上記高親和性神経栄養因子受容体(Trk family)の存在の有無をさらに確認するため、各組織で免疫組織化学的検討を行ったが、いずれも確認されなかった。5)以上の結果は、絶えず細胞の増殖・分化・脱落が繰り返される消化管粘膜上皮の中でその恒常性維持に神経栄養因子が関与しているとすると、その機序を考える上で他の調節因子との関連で広く検索を進めていく必要があることを示したものであると考える。複雑なネットワークが想定される粘膜防御能調節機構の解明を目指し、神経網形成を促す因子の消化管における分布と機能について形態学的および生化学的検討を行い、以下のような結果を得た。1)7週齢と52週齢のWistar系雄性ラットの消化管粘膜における神経分布を比較したところ、特に胃粘膜における粘膜固有層で、calcitonin-gene related peptide (CGRP)含有神経線維の有意な減少を認めた。全神経線維の分布を確認するため用いたprotein G product9.5に対する染色性には、2群間で大きな差異はなかった。このことより、ある種の神経線維の割合は加齢により変化することが明らかとなった。2)週齢数の異なるラットより作成した胃組織で粘液代謝に及ぼすCGRPの作用を比較したところ、7週齢ではCGRP受容体を介した特徴的なムチン生合成活性亢進作用が確認されたのに対して、52週齢ではそのような変化は示されなかった。3)同時に、胃粘膜内の一酸化窒素合成酵素(NOS)活性を7週齢と52週齢ラットで比較したところ、後者では著しく活性が低いという結果が得られた。4)以上の結果は、加齢に伴う胃粘膜防御機能の脆弱化を示唆する報告と考え合わせると、週齢による生体内生理活性物質の量的変化に注意する必要性はあるものの、胃粘膜の恒常性を保つという観点からみた場合、神経機能の果たす役割が大きいことを示す重要な所見であると考える。複雑なネットワークが想定される粘膜防御能調節機構の解明を目指して、各種調節因子の実験潰瘍治癒過程における関与及び粘膜防御能に深く関わるムチン代謝への影響について調べ、以下のような結果を得た。1.成熟ラットに塩酸アスピリンを投与し、5時間経過した後、胃を採取。カルノア固定後、我々が開発した抗ムチンモノクローナル抗体:RGM21,PGM34(胃体部表層粘液細胞由来ムチンと反応),RGM26(胃前庭部表層粘液細胞由来ムチンと反応)を用いた免疫組織化学的染色を行ったところ、RGM21とPGM34に対する染色範囲が縮小していることが観察された。とりわけRGM21では、表層粘液細胞にほとんど染色性がみられず、粘液ゲル層を含む胃粘膜表層細胞の脱落による損傷を受けていることが観察され、これらの抗体による免疫組織化学的検討で、より鮮明なる表層粘膜の損傷を評価できることが示された。2.ラット胃粘膜に酢酸を直接注入し作成した慢性実験潰瘍モデルで、経時的に胃粘膜固定標本を作り、その治癒過程を上記抗体で調べたところ、24時間後の胃体部で正常粘膜では染色性を認めないはずのRGM26に反応する粘液細胞が確認された。
複合系の反応設計

桑嶋は、制癌剤として最も有望視されているタキソ-ルの全合成について検討を加え、類縁体であるCーarータキシニンの合成に成功した。また、2ー(アルキルチオ)アリルシリルエ-テルを用いるエン反応の立体選択性及び不斉転写等を明らかにし、その成果に基づいて、極めて効率的なアンスラサイクリンのエナンチオ選択的合成法を開発した。中井は、光学活性ビナフト-ル由来の配位子を持つチタン系触媒を用いて、エン反応、DielsーAlder反応、及びアリル金属種の付加反応等の不斉触媒化(触媒的エナンチオ制御)に成功した。また、ランタニド錯体を用いて、光学活性αーアリコキシアルデヒドとケテンアセタ-ルの不斉アルド-ル反応の触媒的ジアステレオ制御法を開発した。藤本は、化学反応の局所的特性を解析し、反応中心や官能基の電子供与能あるいは電子受容能の周辺構造への影響を明らかにすることによって、反応の予測を可能にする新しい尺度を導いた。また、クラウンエ-テル等の包接化合物の金属カチオン補足能を評価し、多中心的相互作用の様式を明らかにした。村井は、通常、有機合成には利用不可能な不安定活性中間体であるアザトリメチレンメタン種をパラジウム錯体として発生させることに成功し、これを用いた〔2+1〕、〔3+2〕、及び〔3+2+1〕型の新規触媒的環化反応を開発した。山本は、分子内にアルデヒド基を持つγーオキシアリルスズを各種のルイス酸と複合化することにより、分子内環化反応が高選択的に進行することを明らかにし、この手法を用いて海産生理活性物質であるブレベトキシンの6.7.7.6縮環系の立体選択的構築法を開発した。
周産期における麻疹ウイルス胎盤感染がもたらす胎児への影響に関する研究

麻疹ウイルス(MeV)はワクチンで予防できる病気である。近年ワクチン接種率の上昇に伴い日本国内での患者数は減少し、2015年には国内からの排除が認められたが、国内では輸入麻疹による成人麻疹の散発事例が相次いでいる。MeVは妊婦に感染すると早産や流産を起こすことが知られているが、その機序については不明であった。本研究では、ヒト胎盤由来の培養細胞を用いてMeVの胎盤感染モデルを作成し、感染が胎盤にもたらす影響を検討した。その結果、MeVは胎盤細胞へ持続的に感染し、代謝の障害、局所でのホルモンの分泌増加、インターフェロンの産生を引き起こし、胎盤の機能を障害することが明らかになった。麻疹ウイルス(MV)の胎盤由来細胞への感染性の検討では、MVをヒト胎盤由来絨毛膜細胞(JAR, JEG3, Bewo)に暴露し、ウイルス感染の有無を免疫染色、ウエスタン法、細胞から抽出されたRNAを用いウイルスゲノムを標的にしたリアルタイムPCR法により確認した。免疫染色およびウエスタン方法では、経時的なウイルス抗原量の増加、リアルタイムPCR法ではウイルスゲノムコピー数の増加がみられ、ウイルスの感染・増殖が確認された。感染細胞の観察では明瞭な細胞変性効果はみられなかったが、細胞内在性ATPは経時的に減少する一方で、胎盤性ホルモン量は増加した。感染細胞の培養上清を使ったタイトレーションの結果、培養上清中での感染性ウイルス量が低いことが確認された。ヒト胎盤由来絨毛細胞のMV感受性を規定する因子の検討においては、既知のMV受容体(CD46, CD150, DC-SIGN, Nection4)に関する発現プロファイリングをRT-PCRおよびフローサイトメトリー法を用いて行った。その結果、細胞にはCD150の発現はみられず、CD46およびNectin4が発現していることが明らかになった。昨年度までに得られたデータでは、麻疹ウイルス(MV)の胎盤由来絨毛膜細胞(JAR)感染はウイルス増殖が遅く細胞障害性が低いことが明らかになった。本年度はこれらの事象に着目し、胎盤由来細胞でのMV持続感染株の樹立を試みた。JAR細胞に野生株およびワクチン株MVを感染させて20代以上継代を行った。細胞中のMVをリアルタイムPCR法、ウエスタンブロッティング法および間接蛍光抗体法(IF)で確認し、ワクチン株、野生株ともにMV持続感染細胞を樹立した。樹立した細胞のIFでは、100%の細胞でウイルス抗原が確認された。持続感染細胞の培養上清および凍結融解細胞を用いたタイトレーションでは、上清中および細胞中いずれも感染性のウイルスが見られたが、細胞中の方が感染性ウイルス量は多かった。MV持続感染細胞の生理学的な変化は、細胞内在性ATP量の減少と胎盤性ホルモン分泌量の増加、IFN産生が確認された。IFN産生は野生株よりもワクチン株で高かった。今年度はより実際の臨床症例を反映していると考えられる「胎盤由来細胞へのMV持続感染」を明らかにできた。本研究課題の進捗状況は順調であると考えている。昨年度までに得られたデータから、麻疹ウイルス(MV)は胎盤由来絨毛膜細胞(JAR)へ持続的に感染できることを確認した。今年度は持続感染に関与する因子を遺伝子発現レベルで同定するために、MV CAM-70株(CAM)及び野生株(FI)が持続感染した胎盤由来細胞及び非感染細胞のマイクロアレイを行った。対象とした全2万遺伝子中、10倍以上の変動を示す遺伝子はCAMが84、FIが73種類で、共通した遺伝子変動は25種類であった。CAMが野生株より10倍以上発現を変動させた遺伝子は17種類、その反対は28種類であった。抗ウイルス因子はIFNbeta、IFNlambda2/IL28A、IFNlambda1/IL29、BST-2、IFITM1/3、TNFalpha等が同定された一方、IFNalpha, gammaは有意な転写増が認められず、ELISAデータともよく一致した。hCGの産生に関わる酵素CGAは5-11倍、CGBは0.5-3倍の転写増が認められ、MV感染JARにおけるhCG分泌増はおもにCGAの転写増強によるものと考えられた。progesteron分泌増の明確な責任因子は同定できなかった。転写活性が上昇した因子のうちIFITM1/3及びBST-2について、それぞれ293FT細胞へ遺伝子導入を行い、麻疹ウイルス(CAM)の感染及び増殖に変動が見られるかを検討を行った。ウイルスの増殖は培養上清のタイトレーションによって決定したが、いずれの遺伝子を導入しても増殖性に変化は見られなかった。今後はCAMおよびFI感染細胞に共通して大きな変動を示した因子の中から上記以外の候補について機能的な検討が必要であると考えられた。

当初の研究計画に沿って課題に取り組み、MVの胎盤由来細胞感染と細胞に及ぼす影響を評価できた。MVの培養上清へのウイルスの放出が細胞内のウイルス抗原量に比して低かった点については、なお詳細な解析を要する。本研究課題の進捗状況はおおむね順調と考えている。今後は、胎盤由来細胞におけるMV持続感染が及ぼす影響について、mRNAプロファイリングを中心に検討する。持続感染で転写活性が上昇する因子を選抜し、個別にJAR細胞および293T細胞等に導入して感染動態に及ぼす影響を検討する。ウイルス学研究計画に沿ってMV感染により生じる胎盤ホルモン産生に関わる因子の解析と絨毛細胞感染に与えるワクチン誘導免疫の効果について検討を行う。また、MVの胎盤由来細胞感染時に、培養上清へのウイルス放出が少なかった点に着目し、MV感染による細胞内でのウイルスの複製動態についてさらに踏み込んだ検討を行う。予算の99%以上は使用されており、ほぼ計画通りであった。予算の94.8%は年度内に執行されており、ほぼ計画通りであった。次年度への繰り越しが発生した理由としては、物品の購入予定金額と実際の購入金額の差額であったと考えられた。次年度も当初の予算通り執行予定である。次年度以降も前年度の繰り越し分と合わせて、当初の予想通り執行予定である。
平滑筋細胞に起因する新たな動脈硬化進展メカニズムの解析とその抑制方法の構築

動脈硬化の進展過程において、動脈硬化巣からの刺激に応じて平滑筋細胞は形質変化し、病態進展に関与すると考えられてきた。我々は、動脈硬化巣が新たに形成される直前に平滑筋細胞は分化型から脱分化型へ形質変化し、病巣形成に関与する可能性を示してきた。apoEノックアウトマウスの大動脈凍結切片の平滑筋細胞分化マーカーα-smooth muscle actin(SMA)とSM22を蛍光抗体法により二重染色し、共焦点顕微鏡により観察した。正常大動脈平滑筋層は、α-SMAとSM22が共局在していた。動脈硬化の初期病変が形成された近傍は、病巣に隣接しない領域の平滑筋細胞層のα-SMAとSM22発現が共に低下していた。平滑筋細胞は、動脈硬化巣形成前より脱分化型への形質変化が進行していた。平滑筋細胞は、脱分化の進行と共に過酸化水素を消去する抗酸化タンパク質であるPeroxiredoxin2(Prx2)の発現が低下する。PrxのアイソフォームやPrxと共役して過酸化水素消去に寄与するThioredoxin(Trx)の分布を解析した。正常大動脈平滑筋層は、分泌型のPrx4、Trxが発現しているが、病巣形成初期はその発現が低下していた。予備的検討からPrx2発現低下への転写因子の関与が示唆され、更なる解析が必要と考えている。初代培養ヒト平滑筋細胞のPrx2のノックダウンが、形質に及ぼす影響を検討した。Prx2 siRNAにより平滑筋細胞のPrx2タンパク質量がコントロールの約40%に低下したとき、α-SMAが72%に低下し、脱分化マーカーSMembは357%に上昇した。平滑筋細胞のPrx2低下は、分化型から脱分化型への形質変化を促す可能性が示唆された。平滑筋細胞は、Prx2等の低下に伴う酸化ストレス亢進により分化型から脱分化型へ形質変化し、動脈硬化の進展に重要な役割を担う可能性が示唆された。
生体内発癌におけるがん遺伝子相互の機能的連鎖に関する研究

すでに作製したcーfosトランスジェニックマウス(Cell53,1988)のリンパ球分化成熟度をそれらの機能の面からの検討した。その結果、ヘルパ-T細胞や抗原提示細胞の機能は正常であった。しかし、B細胞の分化異常があり、成熟B細胞からIgGメモリ-B細胞への分化過程が強く障害されていた。また、キラ-T細胞やNK細胞活性は軽度(対照の50%)低下していた。以上の成果をInt.Immunol.(印刷中)に発表した。cーfosマウス脾臓由来のB細胞の分化実験系において、cーfos B細胞は抗Ig抗体の刺激では全々細胞分裂を起こさなかった。しかし、LPS刺激に対してはその感受性が増強していた。このことからB細胞における抗Ig抗体やLPSによる刺激伝達系にcーfosが関与していることを明らかにした。以上の成果を日本免疫学会(1990年)に発表している。また、生体内発癌におけるcーfos遺伝子産物の関与を検討する目的でcーfosマウスの皮膚にDMBAを塗布したところ11週で扁平上皮癌が出現した。また、DMBAを8週間塗布したのちの皮膚をNudeマウスへ移植するとpapillomaが出現することを明らかにした(Sakai et al準備中)。さらに、リンパ球腫瘍化におけるがん遺伝子相互の機能的連鎖に関してcーmycやvーjunトランスジェニックスマウスを用いて検討した。cーfosマウスとcーmycマウスを交配させたところpreB細胞リンフォ-マの出現頻度が上昇した(Takaoら投稿中)。得られたリンフォ-マではいずれも外因性cーmycの発現が著しく多かった。また、vーjunマウスを作製したところ、B細胞の初期分化に異常が見られた。また、抗体産生の異常も見られた。このvーjunマウスとcーfosを交配させたところ生後5週以内に全例が死亡した(日本免疫学会1990年)。現在その原因について免疫学的検討を加えている。
環境汚染と紫外線の複合影響が近年の皮膚発癌増加に及ぼす影響-ヒストン修飾との関連性

環境汚染物質と太陽光(紫外線)の複合作用後の皮膚培養細胞中のヒストン修飾変化について検討した。その結果、環境汚染物質への光照射により、光酸化物質が産生し、それがヒストンH2AXおよびヒストンH3のリン酸化を引き起こすことを明らかにした。また、光酸化物質がアポトーシスを阻害し細胞をがん化させることを示した。ヒストンH3のリン酸化は発がんに関与していることが報告されていることから、本成果は環境汚染物質への太陽光照射が、ヒストンの修飾変化をもたらす発がん性物質を生成しうることを示唆したものである。環境汚染物質と太陽光(紫外線)の複合作用による発がん誘導の可能性の有無を、培養皮膚細胞を用いてヒストン修飾という観点から検討した。今年度は代表的な汚染物質である多環芳香族炭化水素(PAHs)を環境汚染物質として選択した。光(擬似太陽光、紫外線)存在下のPAHs作用または、光照射されたPAHsにより、これまで明らかにしているヒストンH2AXのリン酸化以外に、ヒストンH3のリン酸化が引き起されることを見出した。ヒストンH2AXのリン酸化とともに、ヒストンH3のリン酸化も、生存率に影響を示さない程度の低濃度のPAHsで誘導されることが判明し、H2AXのリン酸化と合わせて高感度リスク評価系の一項目となり得ることが示された。最近の報告によればヒストンH3のリン酸化は、プロモーション活性を担うproto-oncogeneであるc-fosやc-junの誘導に関連していることが明らかにされており、複合作用による発がん誘導への関与を現在検討中である。さらに、光照射されたPAHsをLC/MS、GC/MSにより分析した結果、PAHs分解過程の酸化物(例えば、benzo[a]pyreneの酸化物である2-hydroxy-BaP-1,6-dioneなど)がこれらヒストンの修飾を誘導していること、それら酸化物から産生される活性酸素種が関与していることが明らかになった。また、PAHsの光分解には、紫外線B領域の波長が特に重要であることが判明した。1.多環芳香族炭化水素(PAHs)の光分解物によるヒストンH2AXのリン酸化PAHsに擬似太陽光を照射した。その中で数種のPAHsの光産物がDNA二本鎖切断に伴うヒストンH2AXのリン酸化を誘導した。UVB領域に吸収をもつPAHs(phenanthrene等)はその光産物がH2AXのリン酸化を誘導するが、UVB領域に吸収をもたないPAHs(pyrene等)は誘導を示さなかったことから、太陽光中のUVB領域の光がヒストンりん酸化を誘導する化合物の生成に重要であることが明らかとなった。2.PAHsの光分解物によるヒストンH3のリン酸化1と同様のPAHsの光分解物は、ヒストンH3のリン酸化を誘導した。ヒストンH3のリン酸化はプロモーション活性を担うproto-oncogeneであるc-fosやc-junの誘導に関連しているので、PAHsの光分解物による発がん誘導の可能性を示唆していた。3.PAHsの光分解物によるアポトーシスの阻害と発がんPAHsの光分解物はアポトーシスの誘導の阻害効果も有していた。アポトーシスは変異した細胞の除去機構として重要であるが、光分解物によりそれは阻害され、生存した細胞はがん化し、マウスにおいて腫瘍を形成した。これまで、benzo[a]pyrene等のPAHsは代表的な発がん性物質とされてきたが、その発がんメカニズムは代謝体によるDNA付加体形成と考えられてきた。本研究結果は、太陽光(紫外線)は環境汚染物質を修飾、酸化することにより、より高い毒性、発がん性を有する化合物に変化する可能性があること、ヒストンの修飾変化、アポトーシスの阻害など、DNA付加体形成とは別のがん化を亢進する機構があることを示した。
環境ストレスで生じた遺伝子変異による難治疾患の発症解明-網羅的解析とゲノム編集-

様々な環境ストレスは臓器に遺伝子変異を誘発し、心筋症や癌など致死的な疾患に関与しているが、解析が困難であり、遺伝病以外ほとんど解明されていない。申請者は、組織特異的なストレス誘発変異を解明するため、疾患微量組織から高純度DNAを抽出し、次世代シーケンサーで点突然変異を正確に解析する手法を確立した。組織が微量であることから、2000箇所の既知の心筋症の報告がある変異領域をカスタムパネルで1本のチューブで増幅し、次世代シーケンス解析を行った。この技術を家族歴のない致死性拡張型心筋症の微量心筋に応用し、原因遺伝子を同定した。その結果、心筋のカルシウムを制御する遺伝子で1塩基の欠失した変異が見つかり、この変異は、タンパク質の欠損を誘発していた。この遺伝子の領域を含め全エクソン領域の次世代シーケンス解析を追加解析し、この変異を確認することができた。また、この変異箇所の1塩基手前の変異で家族性心筋症発症が報告されており、申請者が検出した変異が心筋症を誘発している可能性が高いことを示唆している。この変異遺伝子を細胞に導入した結果、細胞内での局在は変化しなかった。そこで、この変異遺伝子を発現するゲノム編集マウスの作製に取り組んだ。ゲノム編集マウスでは、卵管に直接ゲノム編集のためのガイドRNAなどを導入し電気穿孔法で卵管内の受精卵のゲノム編集を行った。その結果、10%前後の成功率で変異マウスの作出に成功したが、いずれも出生直後に死亡し解析まで進んでいない。さらに改良を重ね、疾患変異を再現する染色体相同組換えマウスを作製し拡張型心筋症治療の糸口を見いだす。染色体DNAは、酸化ストレスや放射線などの環境ストレスによって損傷し、一部で変異が挿入され、アミノ酸配列が変化する。これらの遺伝子変異が生殖細胞に伝わる場合には遺伝病となり、出生後の環境ストレスによる体細胞変異では、特定の臓器不全などの疾患になる。癌や心筋症は、これらの体細胞変異によって引き起こされているが、疾患部位の採取が困難なことや血管など正常組織混入の問題があり十分解明されてはいない。遺伝子変異のモデル疾患として孤発性(家族歴のない)拡張型心筋症の原因変異の同定を次世代シーケンサーで行った。凍結サンプルをビーズ破砕で抽出することで高純度DNAの精製に成功し、微量組織から次世代シーケンス解析を可能にした。さらに既知の遺伝子変異を高速に解析する方法としてアンプリコンシーケンス法を開発し、10ngのゲノムDNAを1本のチューブで2986遺伝子を同時に増幅できる手法を開発した。次世代シーケンスの最適なDNA抽出を行うため組織の破砕方法を検討し、この家族歴のない拡張型心筋症からの組織および正常血液からDNAの精製を行った。既知の心筋症原因遺伝子に対するパーソナル型次世代シーケンス解析:これまでに心筋症や不整脈など心臓疾患を発症することが報告されている57遺伝子(Elizabeth M. JCI, 2013)の2987領域に対するプライマー設計を行い、独自のカスタムパネルを作製した。このマルチプレックスPCRで57遺伝子全領域(2987産物)の98.3%をカバーし、平均カバレッジ200以上の良好な結果が得られた。7例のサンプルを次世代シーケンサーで解析し、世界で初めて生存時の拡張型心筋症の患者さんに存在する3箇所のアミノ酸配列に変化を起こす新規変異を発見した。癌や心筋症は、特定の体細胞変異によって引き起こされているが、疾患部位の採取が困難なことや血管など正常組織混入の問題があり十分解明されてはいない。申請者は、次世代シーケンス技術を使い、体細胞変異のモデル疾患として孤発性(家族歴のない)拡張型心筋症の原因変異の同定を行った。既知の遺伝子変異を網羅的に解析するアンプリコンシーケンス法を開発し、2987遺伝子から世界で初めて生存時の孤発性拡張型心筋症の患者さんに存在する3箇所の新規アミノ酸変異を発見した。これらの変異を挿入したノックインゲノム編集マウスを作製した。このマウスで心筋の機能解析を行ったが、わずかに心筋収縮能力の低下を認める程度であり直接的な心筋症発症の原因遺伝子ではないと判断した。そこで、また、大規模ゲノム変異を解析するため、全遺伝子のエクソン領域を増幅する実験条件を検討しているが、機器のトラブルが発生し、次世代シーケンサーの交換・点検などに時間がかかっている。微量組織からゲノムDNAの精製に成功し、高純度のゲノムが分離できている。また、全ゲノムエクソン領域にマルチプレックスPCRでもきれいな増幅が確認され、解析データが取得できた。現在、大量のシーケンスデータを解析している。新規変異以外に既知の変異遺伝子を発現ノックインマウスを作製し、拡張型心筋症発症マウスおよび肥大型心筋症発症マウスを作製した。このマウスの心臓の領域毎の全遺伝子発現の解析を行っている。微量組織から全ゲノム遺伝子を抽出し、全エクソン領域を増幅する手技を確立した。この手法で原因不明の拡張型心筋症の発症機構の解明を行っている。