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海外における日本情報の需要と供給に関する研究

日本情報に対する需要及び(各国内の供給)の態様と特性を、地域及び主題分野という二つの次元から解明を試み、とりわけ(次世代の)キーパーソンの要求パターンに着目した。また、日本情報の提供にともなう課題である「標準化」は、国内的な観点からのみならず、海外各国における観点からも検討する必要がある。海外における日本情報への要求・需要の様態と特性を把握・解明するとともに、供給の問題点を明らかにすることにより、わが国における学術活動の国際貢献の可能性向上に資することを目的としてきた。平成9年度は、延べ12名の派遣によって、各地における日本情報に対する需要と供給の現状、日本からの支援の方策ならびに用件などを調査分析した。また、延べ6名の招へいにより、各国における学術情報システムまたはこれに相当する国家的情報流通基盤の状況やマルチメディア開発の課題などについて報告を受け、意見・情報交換を行った。海外における日本研究の進展は、各国内における日本理解への要求と、これに応える各国内及び日本側からの情報提供に支えられている。日本内部における情報発信への要求は、学会活動の国際化とともに高まりつつあるが、発信された情報が、それにふさわしい各国内の要求の主体にまさしく伝達される必要がある。そのため、日本情報に対する需要及び(各国内の供給)の態様と特性を、地域及び主題分野という二つの次元から解明を試み、とりわけ(次世代の)キーパーソンの要求パターンに着目する調査分析を続けてきた。海外における日本情報への要求・需要の様態と特性を把握・解明するとともに、供給の問題点を明らかにすることにより、わが国における学術活動の国際貢献の可能性向上に資することを目的としている。そこで平成7年度には、9組13名の派遣による訪問調査を行ない、また、4組9名の招へいによる情報・意見の交換、研究計画に関わる討議を行った。訪問調査の重点は、欧米における日本研究拠点における情報・資料の蓄積・利用に関わる実施調査、現地専門家からの聞き取り、日本語を含む多言語処理技術、フルテキスト・データベース技術の進展および応用状況、日本研究をふくむ学術研究体制などとした。招へいによる共同研究としては、ネットワークの進展と技術応用における国際協調上の具体的課題をめぐって、米国、韓国などの専門家と討議した。「海外における日本情報の需要と供給に関する研究」は平成7,8,9年度の3か年計画であり、今年度は第二年次にあたる。本研究の主旨は次の通りである。すなわち、海外における日本研究の進展は、各国内における日本理解への要求と、これに応える各国内及び日本側からの情報提供に支えられている。そのため、日本情報に対する需要及び(各国内の供給)の態様と特性を、地域及び主題分野という二つの次元から解明を試み、とりわけ(次世代の)キーパーソンの要求パターンに着目する。海外における日本情報への要求・需要の様態と特性を把握・解明するとともに、供給の問題点を明らかにすることにより、わが国における学術活動の国際貢献の可能性向上に資することを目的とする。そこで、平成8年度には、11件の訪問調査のための派遣と3組7名の招へいを実施した。研究テーマが、大きく日本研究、日本情報、日本語文献などに関り、その故に、サブテーマとしては際限のない構造となっているが、今年度は、日本語資料の図書館、書誌情報のコンピュータ処理、そのための文字セット問題、データベースの国際交換の可能性と日本情報への応用などについて派遣調査した。招へいでは、インドネシア(1)、韓国(4)、米国(1)、ドイツ(1)などにおける学術情報流通に関わる機関・組織の実態と、それらの内部における日本情報、日本文献に関わる需要と供給の態様について、各国報告のかたちで報告し、これをもとに討議するかたちとなった。研究方法、研究対象などについての議論は、上記の訪問調査や招へい者との討議のなかで進めている。学術情報センターへは海外からの来訪者も多く、機会をとらえて本研究に関わる質疑・討議を進めている。

海外における日本情報への要求・需要の様態と特性を把握・解明するとともに、供給の問題点を明らかにすることにより、わが国における学術活動の国際貢献の可能性向上に資することを目的としてきた。平成9年度は、延ベ12名の派遣によって、各地における日本情報に対する需要と供給の現状、日本からの支援の方策ならびに要件などを調査分析した。また、延ベ6名の招へいにより、各国における学術情報システムまたはこれに相当する国家的情報流通基盤の状況やマルチメディア開発の課題などについて報告を受け、意見・情報交線を行った。
我が国の長寿社会に適した生活・生命支援技術の開発

本研究では、今後の急速な社会の高齢化に対して、ますます重要性が増すと考えられる高齢者や障害者に対する生活環境支援機器、コミュニケ-ション機器等の生活・生命支援機器の開発に関して、わが国の現状解析、諸外国との比較、将来の課題、問題点等について調査・研究を行った。調査・研究の結果、以下の点を明確にした。(1)この分野の機器は、社会制度と社会環境と密接な関係にある。(2)福祉先進諸国の基本的な考え方を参照しながら、我が国独自の立場で技術児開発する必要がある。(3)機器開発に必要な基本技術と生産技術に関する体型化は、我が国率先して行う必要があり、また期待されている。(4)在宅ケアに必要な日常生活に関する機器は、病院や施設用に比較して全く未熟な段階にある。(5)高齢者のQOLの意識に基づいて開発技術の体系化と開発方策の研究を行う必要がある。更に、実際に福祉機器の研究開発を通じて行って以下の点を明確にした。(1)ハ-ドウエアよりもソフトウエアの開発が重要となる。(2)看板技術と真に役立つ技術とを区別する必要がある。(3)多機能よりは、単機能のほうがより実用的である。(4)コミュニケ-ション機器は、高齢者のQOLに重要であり、また介護に携わる家族にとっても重要なものが多い。以上、我が国が今後重点的に取り組むべき問題点としては、高齢者のQOLに適した自立生活支援機器、在宅において介護する家族の負担を軽減する介助支援機器、および機器開発に必要な基本技術の開発である。また、我が国の現状解析と諸外国との比較・将来の課題についてまとめた結果、安価、小型、軽量、省エネルギ-、低雑音、高信頼性などの条件が重要であることが明かとなった。更にその結果に基き、高齢者用機器技術について、ソフトウエアとハ-ドウエアの両面から検討した結果、機器の実用化を左右するソフトウエアの開発は、ハ-ドウエア以上の重要であることを明確にした。
シアノバクテリアの形態的多様化と超緩進化

シアノバクテリアは、約27億年前までに地球上に出現し、初期に形態的な多様性を獲得した後、現在まで大きな形態的な変化をせずに生き延びているという、いわゆる「生きた化石」として知られている。しかし、その進化の詳細はよくわかっていない。そこで、シアノバクテリアの形態的多様性を支える分子機構を解明するため、糸状性シアノバクテリアの細胞分化に着目し、特に研究の遅れているホルモゴニア形成の分子機構を調べた。これまで研究代表者は、糸状性シアノバクテリアのモデル生物Nostoc punctiformeのトランスポゾン変異体を作出・選別し、ホルモゴニア形成能を失った個体を複数ライン単離、各個体でトランスポゾンにより破壊されていた遺伝子の塩基配列を決定していた。H18年度には、前年度までに未解析だった個体について変異体を再構築し、ホルモゴニア形成能・窒素固定能・宿主のコケ植物との共生能それぞれを調査した。その結果、ある遺伝子を破壊すると、ホルモゴニア形成および植物への共生の能力が野生型に比べて著しく低下することが判明した。この遺伝子は、情報伝達に関与するタンパク質をコードしており、その特徴的なドメイン構造は、細胞分化能を示す糸状性シアノバクテリアにのみ存在することが、ゲノム情報の検索から示唆された。これまで、ホルモゴニア形成に関与する遺伝子としては、ホルモゴニアの分化を抑制する機能を持つと推測される遺伝子群hrmUAが同定されているが、ホルモゴニア分化・植物宿主への共生を正に制御する遺伝子は知られておらず、本研究で同定された遺伝子は、宿主植物への応答やホルモゴニア形成に関与する遺伝子として、またシアノバクテリアの形態進化を探る鍵の一つとして、今後の発展的研究が期待される。シアノバクテリアの形態的多様性を支える分子機構を解明するため、次の研究を行った。1.ホルモゴニア形成を制御する遺伝子の特定研究代表者は、ホルモゴニア形成能を失ったトランスポゾン変異体5個を単離し、原因と推測される遺伝子配列を決定していた。これらの遺伝子の機能を確認するため、変異体を再構築した。5個の候補遺伝子のうち、3個の再構築体が得られ、それぞれについてホルモゴニア形成能と窒素固定能の確認、宿主のコケ植物との共生実験を行った。しかし、再構築された変異体は、トランスポゾンにより破壊された遺伝子以外に原因があったことが推察された。引き続き、残る2個の候補遺伝子について変異体の再構築、表現型の確認を進めている。2.窒素固定に異常を来す変異体の解析ホルモゴニア形成に関わる変異体の探索中に、窒素欠乏下で生育しない変異体が選別された。現在、この変異体が、窒素固定能と異質細胞形成能のどちらに異常を来しているのかを調べるために、還元環境下での培養および窒素固定活性の測定のための準備を進めている。3.細胞分化を制御する遺伝子のシアノバクテリアにおける分布の調査シアノバクテリアを構成する5目のうち、4目22属29種について、アキネート形成を制御する遺伝子の存在を検出するため、PCRを行った。今後、残る1目についても解析を進めるとともに、異質細胞およびホルモゴニア形成を制御する遺伝子の存在について確認していく予定である。
膵癌抑制効果を有する特異的間質細胞の同定および新規膵癌治療法の開発

膵癌に対して抑制的に作用する特定の間質細胞集団を同定するために、ヒト膵癌切除組織から分離・培養した膵星細胞の表面抗原解析を行い、CD271に着目した。癌細胞との共培養実験において、膵星細胞のCD271遺伝子発現増加は一過性であった。また、癌細胞の方向に遊走する膵星細胞のCD271発現は、遊走しない細胞と比較してより少ないことが明らかになった。膵癌切除組織間質のCD271発現を免疫組織化学染色で検討すると、CD271の高発現群は予後良好であった。以上のことから、CD271陽性膵星細胞が膵発癌の早期において、癌間質相互作用によって膵癌に対して抑制的に作用することが示唆された膵癌に対して抑制的に作用する間質細胞を同定するためいに、膵癌間質の線維増生を制御する膵星細胞に着目し、その表面抗原の解析をフローサイトメトリーを用いて行った。本研究の契機の一つである膵癌抑制性の脂肪由来間質細胞の報告から、脂肪細胞にも分化しうる間葉系幹細胞に着目した。そして、その表面抗原であるCD271に着目するに至った。当研究室で樹立したヒト膵癌切除組織由来膵星細胞12種類を解析すると、CD271陽性細胞は0.0-2.1%の割合で認めた。インナーカップに膵星細胞、アウターカップに膵癌細胞を培養して行う遊走能実験では、癌細胞が存在するアウターカップの方向に遊走する膵星細胞集団が、遊走しない細胞集団よりもCD271の遺伝子発現量が少ないことが明らかになった。膵癌細胞との共培養実験では、CD271の遺伝子発現は一過性に増加した後に、減少することが明らかになった。CD271陽性細胞を、セル・ソーターで分取して機能実験を行うことを試みたが、CD271陽性細胞の割合が非常に少ないためか、安定的かつ高純度のCD271陽性細胞を十分量分取することはできなかった。次に、免疫組織化学染色法でヒト膵癌切除組織におけるCD271の発現を検討した。CD271は腫瘍の中心部分ではなく、腫瘍辺縁の間質に発現する傾向があることが明らかになった。また、臨床病理学的因子との解析も行い、CD271の発現量が高いほど予後良好であった。以上のことから、CD271は一過性のマーカーであり、発癌過程の早期に膵癌間質に発現することや、CD271陽性細胞が癌間質相互作用において癌細胞に対して抑制的に働くことが示唆された。以上のことから、CD271陽性膵星細胞が膵発癌の早期において、癌間質相互作用によって膵癌に対して抑制的に作用することが示唆された最近の癌研究の知見では、癌細胞だけでなく周囲の微小環境(ニッチ)の重要性、癌間質相互作用の重要性が注目されている。申請者らは膵間質に存在する膵星細胞(pancreatic stellate cell; PSC)とその成熟型である膵線維芽細胞に注目した。一部間質細胞に癌に対して抑制的に働くものが存在する可能性があることが明らかになってきた。そこで、本研究では膵癌の進展に対して抑制的に作用する特定の間質細胞集団およびその責任分子を同定し、それらを応用した新規膵癌治療法の開発を行うことを目指した。本年度は以前よりすすめてきたヒト膵癌組織からの膵星細胞の樹立をさらに進め、最終的に当研究室で50株以上を樹立し所有するに至った。それらに対し、膵癌細胞に影響を与えうる膵星細胞のマーカーとして期待されるCD10、CD29、CD44、CD90、CD105、CD117、CD271、CD280、Stro-1、VEGFR1などの多数の表面マーカーの発現解析を行い、CD271、Stro-1、VEGFR1を選出した。この中で申請者が判明させたものとして、CD271が癌細胞との共培養によって細胞内でメッセンジャーRNAが増加し、しかし共培養の一定時間を過ぎることによって急速に減少していくことが確認できた。さらに機能に特化した解析を行うため、Invasion assayを応用した当研究室独自の方法により浸潤細胞・非浸潤細胞での分取を行った。この実験の結果として非浸潤細胞においてCD271は高いという特筆すべき結果を得た。また予後調査によって当研究室での膵癌切除症例においてCD271高発現症例が予後良好であったことより、CD271が癌抑制に関与する因子として間違いないであろうことを確信している。膵星細胞の機能解析を現在進めており、また当研究室では膵星細胞のセルソーターおよびAutoMACsを用いた分取技術を確立している。しかし、今年度の目標であったマイクロアレイに関しては、同一個体からの正常膵由来膵星細胞と癌部分由来膵星細胞の機能解析において大きな差異がみられないことより至っていない。また、NOGマウスでなくさらに宿主免疫の影響

除外のためSCIDマウスを用いたが、腫瘍樹立の後にprimary cultureを試みるも早期の段階でヒト由来膵星細胞が消失してしまうため手技の確立に至っていない。本研究の今後は癌細胞抑制PSCの純化が必要と考えられる。それにあたり問題点は膵星細胞のPhenotypeに応じた分取後に早期にもとの発現率へ戻ってしまうこと。またマウスにおいて癌細胞との共移植後に再純化を試みるも、癌細胞の増加速度が強いためか膵星細胞が残らないことによる。対応としては分取後早期の実験使用や、shRNAによる導入、およびマウスより摘出時に迅速に破砕、細胞分取を行うことでの純化培養を目指す。次年度は当初より予定していたマイクロアレイによる癌促進的あるいは抑制的に働く特定のPSC・線維芽細胞に対して、遺伝子発現の違いを解析し責任遺伝子を明らかにすることを目標とする。また、膵星細胞へのshRNAによる導入、そしてマウスへの移植の上で純化培養を目指す。
炎症性副作用を軽減したプロドラッグ型siRNAの開発

核酸医薬品は遺伝病に有効である反面、欠点として血液中での不安定性や免疫反応によるの臓器への傷害性が挙げられる。これらの欠点を克服するには天然型の核酸に化学修飾を施した人工核酸を使用することで可能である一方、人工核酸では十分な効果が得られないことが問題とされてきた。これまでに我々は2'-O-メチルジチオメチル(MDTM)修飾核酸を開発し、血液中での安定性と試験管レベルでの十分な効果を確認した。そこで、本研究ではMDTM修飾核酸の効率的な合成法を探索し、得られた修飾核酸を病気を模した実験動物を用いて既存の人工核酸と比較して、高い効果と少ない副作用を併せ持つ修飾核酸の決定を目的とする。本研究の目的は、生体内での十分な活性と核酸投与による炎症性副作用(サイトカイン産生)の回避の両立を目的とした2'-O-メチルジチオメチル修飾siRNA(MDTM-siRNA)を開発することであり、平成30年度はオリゴ核酸合成後修飾法によるMDTM-siRNAの合成に取り組んだ。これまでに、ウリジンにおいてのみ2'-O-MDTM基へ変換可能な2'-O-トリメトキシベンジルチオメチル基(TMBTM基)を有するオリゴ核酸合成前駆体(ホスホロアミダイト体)の合成、そのオリゴ核酸の合成およびMDTM修飾核酸への変換を既に達成している。標的配列の拡張にはアデノシン、グアノシン、シチジンへの修飾も必要となるが、これら3種のTMBTM修飾ホスホロアミダイト体の合成収率は満足の得られるものではなかった。まず、アデノシン、グアノシン、シチジンの修飾ホスホロアミダイト体の合成収率の改善に着手した。アデノシン、グアノシンおよびシチジンの修飾ホスホロアミダイト体の合成において、中間体であるTMBTM修飾ヌクレオシド誘導体の合成収率の改善が求められた。ウリジン誘導体の合成方法を参考に合成を試みたが、TMBTM基の導入反応の段階で大幅に収率が低下した。そこで、TMBTM基の導入における反応条件の種々検討を行った結果、グアノシンを除いて収率を改善することに成功した。得られたTMBTM修飾ヌクレオシド誘導体から3工程で目的の修飾ホスホロアミダイト体を合成した。グアノシン誘導体の合成収率の改善が必要と考えられるが、前倒しで合成した修飾ホスホロアミダイト体をApoB mRNAを標的としたRNA配列に組み込んだ後、MDTM修飾核酸への変換反応を行った。TMBTM-ウリジンを組み込んだオリゴ核酸と同様にアデノシン、グアノシンまたはシチジンを修飾したオリゴ核酸においてもMDTM修飾核酸への変換を確認している。研究実施計画に基づき、本年度は標的遺伝子配列拡張を目指した2'-O-メチルジチオメチル(MDTM)-核酸の合成に必要な3塩基種(アデノシン、グアノシン、シチジン)の2'-O-トリメトキシベンジルチオメチル(TMBTM)修飾ホスホロアミダイト体の合成収率の改善を実施した。本課題については種々の反応条件を検討し、アデノシンおよびシチジンにおいて合成収率を改善した。一方で、グアノシン誘導体の収率を改善する余地がある。またオリゴヌクレオチド合成前駆体であTMBTM修飾ホスホロアミダイト体を使用し、アデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンのいずれかを組み込んだTMBTM修飾RNAを合成した。得られた4種のTMBTM修飾RNAをそれぞれの対応するMDTM-RNAへ変換することに成功した。以上、本年度は当初の実施計画をおおむね満足する成果が得られ、次年度の研究計画を実施できるものと考えられる。今後は当初の予定どおり、病態モデル動物を使用したin vivo実験にさきがげけて、MDTM修飾siRNAと既存の修飾siRNA(2'-O-メチル修飾)の培養細胞におけるノックダウン活性の比較を行い、それらの血清中における化学的性質等に関する評価を行う予定である。これらの検討により得られた知見から、in vivo実験に使用するMDTM修飾siRNAを選定し、in vivoでのノックダウン活性および炎症性副作用について評価していく。これまでに、ウリジンにおいてのみ2'-O-MDTM

基へ変換可能な2'-O-トリメトキシベンジルチオメチル基(TMBTM基)を有するオリゴ核酸合成前駆体(ホスホロアミダイト体)の合成、そのオリゴ核酸の合成およびMDTM修飾核酸への変換を既に達成している。標的配列の拡張にはアデノシン、グアノシン、シチジンへの修飾も必要となるが、これら3種のTMBTM修飾ホスホロアミダイト体の合成収率は満足の得られるものではなかった。まず、アデノシン、グアノシン、シチジンの修飾ホスホロアミダイト体の合成収率の改善に着手した。アデノシン、グアノシンおよびシチジンの修飾ホスホロアミダイト体の合成において、中間体であるTMBTM修飾ヌクレオシド誘導体の合成収率の改善が求められた。ウリジン誘導体の合成方法を参考に合成を試みたが、TMBTM基の導入反応の段階で大幅に収率が低下した。そこで、TMBTM基の導入における反応条件の種々検討を行った結果、グアノシンを除いて収率を改善することに成功した。得られたTMBTM修飾ヌクレオシド誘導体から3工程で目的の修飾ホスホロアミダイト体を合成した。グアノシン誘導体の合成収率の改善が必要と考えられるが、前倒しで合成した修飾ホスホロアミダイト体をApoB mRNAを標的としたRNA配列に組み込んだ後、MDTM修飾核酸への変換反応を行った。TMBTM-ウリジンを組み込んだオリゴ核酸と同様にアデノシン、グアノシンまたはシチジンを修飾したオリゴ核酸においてもMDTM修飾核酸への変換を確認している。研究実施計画に基づき、本年度は標的遺伝子配列拡張を目指した2'-O-メチルジチオメチル(MDTM)-核酸の合成に必要な3塩基種(アデノシン、グアノシン、シチジン)の2'-O-トリメトキシベンジルチオメチル(TMBTM)修飾ホスホロアミダイト体の合成収率の改善を実施した。本課題については種々の反応条件を検討し、アデノシンおよびシチジンにおいて合成収率を改善した。一方で、グアノシン誘導体の収率を改善する余地がある。またオリゴヌクレオチド合成前駆体であTMBTM修飾ホスホロアミダイト体を使用し、アデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンのいずれかを組み込んだTMBTM修飾RNAを合成した。得られた4種のTMBTM修飾RNAをそれぞれの対応するMDTM-RNAへ変換することに成功した。以上、本年度は当初の実施計画をおおむね満足する成果が得られ、次年度の研究計画を実施できるものと考えられる。今後は当初の予定どおり、病態モデル動物を使用したin vivo実験にさきがげけて、MDTM修飾siRNAと既存の修飾siRNA(2'-O-メチル修飾)の培養細胞におけるノックダウン活性の比較を行い、それらの血清中における化学的性質等に関する評価を行う予定である。これらの検討により得られた知見から、in vivo実験に使用するMDTM修飾siRNAを選定し、in vivoでのノックダウン活性および炎症性副作用について評価していく。
理論と観測で相補的に迫る原始惑星系円盤構造形成から惑星形成に至る新たな描像

地球等の惑星がどのように形成されたのかを解明することは、現在の天文学の最も重要な課題の一つである。近年、惑星形成の現場である原始惑星系円盤の詳細な観測が進んでおり、多重リングなどの構造が観測され注目を集めている。このような構造は、従来の惑星形成モデルでは想定されてこなかったため、全く新しい惑星形成シナリオが必要とされている。本研究では、理論と観測の両面から、原始惑星系円盤の形成進化に伴う構造形成と、その後の惑星形成について研究を行う。理論モデルを用いた円盤形成・進化の計算と、観測による円盤構造の統計的な理解から「多様な円盤構造を経て惑星形成に至る」という新たな惑星形成シナリオを構築する。
トマトモザイクウイルスＲＮＡ複製複合体形成におけるジスルフィド結合の役割の解明

トバモウイルスの130K複製タンパク質が、ゲノムRNAの5'末端近傍の約70ヌクレオチドの領域に結合して複合体PMTCを形成し、翻訳を阻害するとともに当該RNAを複製に導くことを見出した。PMTCには複数の複製タンパク質が含まれた。遊離130Kタンパク質はゲノムRNAへの結合能を示さなかったが、そのN末端側2/3に相当するMet-IR断片は結合能を有していた。このことから、130Kタンパク質は合成の途上でゲノムRNAを認識すると考えられた。我々は先行研究で、トマトモザイクウイルス(ToMV)の膜結合複製複合体の主な構成因子130K複製タンパク質が、ジスルフィド結合を介した高分子量複合体を形成すること、その高分子量複合体に含まれる130Kタンパク質のみがRNA複製に関連した酵素活性を獲得していることを見いだした。本研究の目的は、130Kタンパク質の高分子量化をもたらすジスルフィド結合の実体を解明し、それが複製複合体形成のどの段階で形成されるのか、さらに、ジスルフィド結合形成のToMVRNA複製複合体形成における役割は何かを明らかにすることである。平成24年度は、ToMVの1301(複製タンパク質中に存在する19個のシステイン残基のそれぞれをセリン残基に置換する変異を完全長ToMV cDNAに導入し、19種類の変異ウイルスRNAを作製した。これらの性質を試験管内ウイルスRNA翻訳・複製系を用いて解析し、3つの変異(C179S, C186S, C581S)がジスルフィド結合を介した複製タンパク質の高分子量化のみならず、pre-membrane-targetingcomplex(PMTC)形成能、複製タンパク質の膜結合能、グアニリルトランスフェラーゼ活性およびRNA合成活性を喪失させることを明らかにした。一方、二本鎖small interfering RNA結合能はこれらの変異により影響を受けなかった。このことから、これらのシステイン残基がジスルフィド結合にかかわるとともに、複製複合体形成のごく初期に位置するPMTC形成において重要な役割を果たす可能性が示唆された。PMTC形成は還元剤存在下でも起きるので、当該システイン残基のPMTC形成段階における役割は、ジスルフィド結合形成ではなく、当該残基を介した相互作用を成立させることにあると考えられた。本研究は、プラス鎖RNAウイルスであるトバモウイルスの複製複合体形成機構の解明を目的とする。本研究開始時点で、複製複合体の主な構成因子である130K複製タンパク質がジスルフィド結合を介した高分子量複合体を形成すること、その高分子量複合体に含まれる130Kタンパク質のみがRNA複製に関連した酵素活性をもつことが明らかになっていた。その後の研究で、ジスルフィド結合形成にかかわるシステイン残基間の相互作用が、複製複合体前駆体であるpre-membrane-targeting complex (PMTC)の形成の鍵となっていることを示唆する結果を得た。そこで平成25年度は、PMTCの形成機構および性状を、当該システイン残基の役割に注目しつつ解析し、以下のことを明らかにした。(i)タバコモザイクウイルス(TMV)の130K複製タンパク質は、翻訳に共役してゲノムRNA 5'非翻訳領域の約70ヌクレオチドの領域に結合し、PMTCを形成する。(ii)TMV RNAの5'非翻訳領域の配列はPMTC形成とマイナス鎖RNA合成に重要である。(iii)TMV 130Kタンパク質のC末端側に存在するヘリカーゼドメインを欠失させたMet-IR断片は全長130Kタンパク質と異なり、翻訳が完了してからも5'非翻訳領域に結合できる。(iv)130Kタンパク質の179,186あるいは581番目のシステイン残基をセリン残基に置換したトマトモザイクウイルス(ToMV)変異体は5'非翻訳領域結合能、膜結合能、多量体形成能を全て喪失している。これらの結果を踏まえ、合成途上の複製タンパク質が複製鋳型を配列特異的に認識するモデルを提案し、Proc. Natl. Acad. Sci. USA誌に発表した。本研究は、当初、タバコモザイクウイルス(TMV)の複製機構の理解に向け、130K複製タンパク質のジスルフィド結合を介した高分子量複合体形成の意義の解明を目的とした。その後の解析で、ジスルフィド結合を形成できなくなった変異130Kタンパク質が複製複合体前駆体PMTCも形成できないことが明らかとなった。これを受けて、PMTCの形成機構の解析に重点を移し、130Kタンパク質は翻訳と共役してTMV RNA 5'末端から100ヌクレオチド(nt)の領域に結合し、PMTCを形成すること; 130Kタンパク質のヘリカーゼドメインを欠失させたMet-IR断片は、翻訳完了後もTMV RNA結合能を維持することを明らかにした。本年度は、Met-IRが結合するために必要な標的RNAの要件を調べた。TMV RNA 5'末端100 ntに相当するRNA (RNA1-100)とMet-

IRを混合し、マイクロコッカルヌクレアーゼで処理すると、約70 ntのRNA断片が保護された。RNA1-100に5'末端側から22 ntあるいは3'末端側から25 ntの欠失を導入しても約70 ntの断片が保護されたが、それ以上欠失を大きくすると保護は見られなくなった。興味深いことに、保護が観察された5'あるいは3'欠失体の共通部分を含むRNA16-80では保護は全く観察されなかった。複製タンパク質の結合領域にはACA配列が繰り返し現れ、そのいくつかを他の配列に置換すると結合は観察されなくなった。また、ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動解析により、RNA1-100とMet-IRの複合体の大きさはおよそ100万Daと見積もられた。以上を総合して、ある決まった数のMet-IR分子が70 ntにわたるACA配列に富むRNA領域に結合したときに限って安定な複合体が形成される可能性が考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。複製タンパク質中のシステイン残基をセリン残基に置換したToMV変異株19株の性質を明らかにし,ToMVRNA複製における複製タンパク質のジスルフィド結合形成による高分子量化の重要性を示す論文をまとめることができた。これは、概ね当初の予定通りの進展である。トバモウイルスRNAの複製における複製タンパク質間ジスルフィド結合に関する解析から始まった研究が、想定とはやや異なる方向に進展したが、結果として、これまで未知であった当該ウイルスの複製タンパク質による鋳型認識機構の一端を明らかにできたため。ToMV複製タンパク質中のシステイン残基がジスルフィド結合にかかわるとともに、複製複合体形成のごく初期に位置するPMTC形成において役割を果たす可能性が示唆された。PMTC形成は還元剤存在下でも起きるので、当該システイン残基のPMTC形成段階における役割は、ジスルフィド結合形成ではなく当該残基を介した相互作用を成立させることにあると考えられた。このため、平成25年度はPMTC形成におけるシステイン残基の機能の解析に重点を置く。以上の結果を受けて、5'非翻訳領域を認識できる複製タンパク質内の最小領域を明らかにするとともに、PMTC形成に必須な5'非翻訳領域の領域を同定する。さらに、当該複製タンパク質最小領域の大腸菌での大量発現系を構築し、PMTC形成におけるジスルフィド結合形成の詳細を解析する。独立行政法人農業生物資源研究所・石橋和大氏に連携研究者として、変異RNAおよびタンパク質の作製においてご協力いただく予定である。平成24年度は、消耗品の節約等により次年度使用可能な予算を生じた。さらに、方針の若干の変更により、平成25年度に予定していた受託解析をペンディングにする可能性が出てきた。そこで、平成25年度には、より効率よく実験を進めるためのキット類の購入や、研究支援者の雇用の可能性も考慮したい。
ヒト乳頭腫ウイルスの型特異的造腫瘍効果および細胞変性効果に関する研究

2.多発性足底表皮様嚢腫の一例では全ての嚢腫にエックリン汗管とHPV 60ゲノムが検出され,HPVのみならず発症病理機構におけるエックリン汗管の重要性が示唆された(J Am Acad Dermatol 30:494-496,1994)。これを受けて119例の手掌足底表皮様嚢腫について病理組織・免疫病理組織学的検討および関連HPV型に関する分子生物学的検討を行った結果,エックリン汗管が高率に検出されること,Hg型封入体を有する嚢腫に相関して検出されるHPV 60とunknown HPV型を含む複数のHPV型が検出されることを明らかにした。以上の研究結果に基づき,長く病因の不明であった足底表皮様嚢腫発症機構について,HPV感染によるエックリン汗管由来の角化性嚢腫という新しい機構を提唱した(Br J Dermatol 132:533-542,1995)。1.ヒトパピローマウイルス(human papillomavirus、以下HPVと略)の型特異的細胞変性効果のうち、細胞質内に出現する特異な顆粒(細胞質内封入体)をgranular(Gr)型、filamenfous(Fl)型、homogeneous(Hg)型に分類、各々が、HPV1型、HPV63型、HPV65型の感染と特異的に相関することを明らかにし、臨床的特徴とも併せて封入体の出現するウイルス性疾質(封入体疾質の新しい分類を提唱した。研究の途中でHPV1とHPV63の重感染例を経験、二種の異なるHPVの初めての重感染例の発見となった。この時、感染細胞の細胞質内にはHPV63のFl型封入体のみしか発現しておらず、HPV63によるHPV1の細胞変性効果の抑制が推論された。2.足底粉瘤の多発例を検討した結果、すべての粉瘤にHPV60DNAとエックリン汗管の存在が認められた。このことはHPVのエックリン汗管への感染が足底粉部(表皮様嚢腫)の発症メカニズムである可能性を示唆した。次いで、足底粉痛の多数例について、HPV感染、およびエックリン汗管の関与の普遍性が検討され、検討例の約30%にHPV感染が、また約70%にエックリン汗管が認められた。永く病因の不明であった足底粉瘤の新しい発症メカニズムとしてのエックリン由来嚢腫を提唱した(論文投稿中)1)ヒトパピローマウイルス(human papillomavirus;HPV)の型特異的変性効果の一つである細胞質内封入体(疣贅)について、臨床像、組織像、原因HPVの型の違いによる新分類の提唱をBr.J.Dermatol.(1994;130:158-166)誌上に発表した。これらはHPV1関連granular型封入体,HPV4,60,65関連homogeneous型封入体、およびHPV63関連filamentous型封入体であり、現在関連各HPV型のE4遺伝子蛋白に対する特異抗体を作成中であり、同遺伝子の封入体形成への関与を検討する予定である。2)従来、病因の不明であった(手掌)足底表皮様嚢腫119例についての検討結果、強いエックリン汗管との関連、及び特定HPV型(現在のところHPV60のみが検出されている)の感染を明らかにし、本腫瘍の新発症メカニズムを提唱した(Br.J.Dermatol.1995.in press).すなわち、手掌、足底発症の表皮様嚢腫については、HPV60の汗管上皮への特異的親和性に基づく感染により引き起こされている可能性について述べた。3)表皮様嚢腫とエックリン汗管、及びHPV感染との関連の可能性について研究範囲を手掌、足底以外の発症例まで拡大した結果、躯幹発症の表皮様嚢腫についてもエックリン汗管あるいはHPV感染との関与が示唆される知見がえられた(Am.J.Dermatopathol.1995;17:71-74).表皮様嚢腫の真の発症メカニズムについては、今後新HPV型の関与の可能性も含めた多方面からの、また多数例についての検討が重要であることを述べた。1.ヒトパピローマウイルス(human papillomavirus:HPV)の型特異的細胞変性効果の一つである細胞質内封入体を有する疣贅は封入体疣贅と呼ばれ、従来HPV1型によるものが知られていた。封入体疣贅は型特異的細胞変性効果の意義および発現メカニズムを研究する最良モデルである。

またHPVに担われる遺伝子の一つE4の働きを知る上でも重要である。我々は新しい2種の封入体疣贅を発見、記載した。これらから2種の新HPVをクローニングし、これらはHPV63とHPV65と命名された。2.HPV1,HPV4,HPV60,HPV63およびHPV65のE4蛋白に対する特異抗体を作製した。これらを用いた免疫酵素抗体法により、各HPV型のE4蛋白の組織切片上での分布を検討した。この結果E4蛋白は、それぞれ対応するHPV型感染による疣贅の、封入体を有する細胞に概ね一致して細胞質内および封入体に関連して分布することが解った。このことはHPVの型に拘わらずE4蛋白が封入体の生成に関与することを示すものと考えられた。3.足底の粉瘤(表皮様嚢腫)については、長く外傷などによる表皮の真皮内迷入説が信じられて来たが、我々はこれとは全く異なる、新しい発症病理機構を示唆する結果を得た。すなはち、我々は手掌足底表皮様嚢腫に高頻度にエクリン汗管が検出されることを、病理組織学的および免疫組織学的に証明した。続いて、新しく経験した10数例の連続切片を用いた検討では全例がエクリン汗管由来である確証を得た。主として我々が問題提起して来た足底表皮様嚢腫発症機構におけるHPVの役割について、HPV60およびその他の新HPV型を含む複数種のHPVが関与する可能性を明らかにした。また平行して明らかにしたエクリン汗管との関連は、あるHPV型(HPV60を含む)がエックリン汗管上皮を標的細胞とする可能性を示唆した。
細菌間で伝達されるRNAを記憶するDNAメモリの開発

本研究の主な目的は、細菌におけるRNAの伝達能を安定に記憶するメモリを開発することである。この系では、特定の低分子RNAが存在する場合に限って部位特異的組換え酵素TnpRの発現が活性化され、産生されたTnpRが標的遺伝子カセットの切り出しを触媒する。切り出し反応に伴い、クロラムフェニコール感受性・スクロース耐性の表現型にロックされる。コレラ菌のDNAコンピテンスを活性化を担う低分子RNAであるTfoRの検出系を構築し、性能評価を行った。その結果、いかに検出感度・特異性を高めることができるかが課題となった。細菌における調節性ノンコーディングRNA(regulatory non-coding RNA: rncRNA)は,標的mRNAの翻訳を抑制するタイプ(OFF型)と活性化するタイプ(ON型)に分けられる。当該年度はコレラ菌ON型rncRNAを検出する系の開発を試みた。この系はRIVET(Recombination-based in vivo expression technology)を応用したものであり,以下の二つの因子から構成される。一つは特異的なrncRNAを検出するセンサーである。これには任意rncRNAの標的部位をリゾルベース遺伝子tnpRに翻訳融合したものを用いる。二つ目は検出情報を記憶するメモリであるが,これにはTnpRによる不可逆的なDNA切り出し反応を利用する。つまり,特異的なrncRNAが存在する場合に限ってtnpRの翻訳が活性化され,産生されたリゾルベースがDNAの切り出し反応を触媒する系である。1)センサープラスミドの構築:アラビノース誘導型ベクターpBAD30にtnpRの開始コドンを除いた部分をクローニングした。さらにON型rncRNAの標的部位をtnpRとフレームが合うように挿入し,様々なセンサープラスミドを構築した。2)メモリ株の構築:同じ向きに並んだ二つのTnpR認識部位とそれらの間にクロラムフェニコール耐性遺伝子catおよびレバンスクラーゼ遺伝子sacBを組み込んだカセットをコレラ菌の染色体上に導入した。さらにこの株から各ON型rncRNA遺伝子を欠失させ,様々なメモリ株を構築した。センサープラスミドとメモリ株を適切に組み合わせた場合,菌体外から特異的なrncRNAが供給された時のみTnpRの発現が活性化し,cat-sacBカセットが切り出される。これにより最終的にはクロラムフェニコール感受性・スクロース耐性の表現型が付与される。本研究の主な目的は,細菌におけるRNAの伝達性を安定に記憶するメモリを開発することである。本年度はコレラ菌のON型rncRNAの一つであるTfoRを指標として,昨年度構築した検出系を評価した。この系はRIVET(Recombination-based in vivo expression technology)をベースにしたものであり,以下の二つの要素から構成される。これにはTfoRの標的遺伝子tfoXをリゾルベース遺伝子tnpRに翻訳融合したプラスミドを用いる。つまり,TfoRが存在する場合に限ってtfoX::tnpRの翻訳が活性化され,産生されたTnpRが染色体上のres-cat-sacB-res遺伝子カセットの切り出しを触媒する。これにより最終的にはクロラムフェニコール感受性・スクロース耐性(CmS/SucR)の表現型が付与される。メモリ株をセンサープラスミドで形質転換させ,TfoRの発現が活性化するキチンオリゴ糖存在下で培養したところ,CmS/SucRコロニーの出現率が著しく不安定であった。そこでtfoX::tnpR翻訳融合をメモリ株の染色体に導入し,同様の解析を行ったところ,CmS/SucRコロニーの出現率は安定なものの,TfoRが発現誘導されない条件下でのバックグラウンドが高かった。今後はいかに検出系のバックグラウンドを低下させるかが課題である。当該年度の目標は,1)ON型rncRNA検出系の感度評価,2)伝達性を有するON型rncRNAのスクリーニング,3)OFF型rncRNA検出系の構築と感度評価,4)伝達性を有するOFF型rncRNAのスクリーニング,5)スクリーニングされた候補RNAの可視化,というものであった。このうち,1)の実験を集中的に行ったが,検出系のバックグラウンドが予想以上に高く,年度内に評価を行うことが困難になった。これに伴い,残りの解析を十分に行うことができなかった。したがって,「遅れている」と自己評価する。本年度はコレラ菌の制御性低分子RNAの1つであるTfoRを検出する系の改良を試みた。この系はRIVET(Recombination-based in vivo expression technology)をベースにしたものであり、以下の2つの要素から構成される。1つは特異的な低分子RNAを検出するセンサーである。これにはTfoRの標的遺伝子tfoXとリゾルベース遺伝子tnpRの翻訳融合を運ぶプラスミドを用いる。2つ目は検出情報を記憶するメモリであるが、これはTnpRによる不可逆的なDNA切り出し系を染色体上に導入したものである。つまり、TfoRが存在する場合に限ってtfoX::tnpRの発現が活性化され、産生されたTnpRが染色体上のres::cat::sacB::res遺伝子カセットの切り出しを触媒する。

昨年度までに構築した系では、TfoR非発現時のバックグラウンドが高いことが判明した。本年度は、1)染色体上でのtfoX::tnpR翻訳融合遺伝子の構築、2)切り出し反応を低下させる変異型res部位の導入、の2つのアプローチによってバックグラウンドを低下させる試みを行ったものの、今度はTfoRを発現させた場合でも切り出し反応が起こらなくなった。以上のことから、さらなるバックグラウンドのコントロールが課題となった。本研究の主な目的は、細菌におけるRNAの伝達能を安定に記憶するメモリを開発することである。この系では、特定の低分子RNAが存在する場合に限って部位特異的組換え酵素TnpRの発現が活性化され、産生されたTnpRが標的遺伝子カセットの切り出しを触媒する。切り出し反応に伴い、クロラムフェニコール感受性・スクロース耐性の表現型にロックされる。コレラ菌のDNAコンピテンスを活性化を担う低分子RNAであるTfoRの検出系を構築し、性能評価を行った。その結果、いかに検出感度・特異性を高めることができるかが課題となった。当該年度の目標は,1)ON型rncRNA検出系の構築,2)OFF型rncRNA検出系の構築および3)両検出系の感度評価をコレラ菌,大腸菌,サルモネラ菌で行い,4)コレラ菌において伝達性rncRNAのスクリーニングする,というものであった。以上の目標のうち,コレラ菌において1)は達成したが,残りはほぼ手付かずであった。理由としてセンサープラスミドのベースとなる組換え酵素遺伝子の選定とそれにともなうメモリ株の構築に時間を費やしたことが挙げられる。最終年度であるため今後はON型rncRNAの解析に焦点を当てる。まず,検出系に用いられるリゾルベースTnpRの認識部位resを変異型にすることでバックグラウンドを低下させ,理想的な評価基盤を構築する。評価項目としては,1)TfoRを発現させない場合,2)菌体内でTfoRを発現させた場合,3)菌体外からエレクトロポレーションでTfoRを導入した場合,4)菌体外からTfoRを加えた場合に,CmS/SucRコロニーの出現率を調べる。特に,1)と2)で検出感度を詳細に解析する。また,この系をベースにして様々なON型rncRNA検出系を再構築し,菌体間での伝達性を有するものをスクリーニングする。最終的にはスクリーニングされたRNAに蛍光アプタマーを融合し,蛍光顕微鏡での可視化を試みる。細菌学今後は対象をコレラ菌に絞り,以下の解析を行う。1)ON型rncRNA検出系の感度評価,2)伝達性を有するON型rncRNAのスクリーニング,3)OFF型rncRNA検出系の構築と感度評価,4)伝達性を有するOFF型rncRNAのスクリーニング,5)スクリーニングされた候補RNAの可視化前年度はコレラ菌におけるRNAの検出系を構築し,本年度はその細菌間伝達性の評価を行う予定であった。しかしながら,検出系のバックグラウンドが予想以上に高く,年度内に評価を行うことが困難となった。そこで検出系を再構築し,理想的な評価を行う上で期間延長を申請したため。
細胞極性決定因子aPKC/ASIPの哺乳類初期発生及び器官形成における役割の解析

a)哺乳類初期発生におけるaPKC/ASIPの役割の解析1)免疫組織学的な解析の結果、胎生7.5日ΔaPKCマウスの異常な胚性外胚葉を構成する上皮様細胞で一部の細胞接着分子マーカーの挙動が異常であった。更に、電子顕微鏡解析により、この異常な細胞で実際に細胞間接着構造が異常となっていることが確かめられた。2)この異常な胚性外胚葉を構成する上皮様細胞ではaPKC結合蛋白であり、かつ細胞極性マーカーであるASIPとPar6の細胞内局在が異常であった。3)この異常な上皮様細胞では細胞の分裂軸が異常であった。つまり、ΔaPKCマウスの異常な胚性外胚葉を構成する上皮様細胞においては細胞極性が異常となっていた。以上から、aPKCは哺乳類初期発生過程において、胚性外胚葉を構成する上皮細胞の細胞極性制御に必須であり、この極性制御を介して胚性外胚葉の組織構築に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。このことは、不明な点の多い哺乳類初期胚の胚性外胚葉の発生メカニズムの一端に新たなメスを入れるものである。更に、線虫やショウジョウバエばかりではなく哺乳類の初期発生においても保存された多細胞生物共通のaPKCを介した細胞極性制御メカニズムの存在が本研究により明らかとなった。b)中枢神経形成aPKC/ASIPは脳室帯の神経幹細胞において脳室に面した頂端側に極性を持って局在しており、aPKC/ASIPは哺乳類における中枢神経発生に重要な役割を果たしていることが期待された。そこで、発生過程において脳室帯の神経幹細胞でcreを特異的に発現するNestin-creTgマウスとaPKC-loxPマウスとを交配し、発生過程で中枢神経特異的にaPKC遺伝子を欠失し、中枢神経発生におけるaPKCの役割を主に細胞極性という観点で組織学的解析により明らかとすることを試みた。現在までに、解析用のマウスの交配作製までが終了している。
巨大モーター蛋白質ダイニンのＸ線結晶構造解析による作動機構の解明

ダイニンは,多種多様な細胞運動のエンジンとしてはたらく巨大モータータンパク質複合体である.しかし,このエンジン自身がどのような仕組みで動いているのかという根本的な問いについては,半世紀近い研究にもかかわらず,多くの未解明問題が残されている.研究代表者らは,ダイニンモータードメインの2.8Å分解能でのX線結晶構造解析を達成し,長年待ち望まれてきたダイニン中核領域の原子構造を明らかにすることに成功した.得られた結晶構造は,今後のダイニンメカニズム研究における重要基盤となるだろう.ダイニンは,多種多様な細胞運動のエンジンとしてはたらく巨大モータータンパク質複合体である.しかし,このエンジン自身がどのような仕組みで動いているのかという根本的な問いについては,半世紀近い研究にもかかわらず,多くの未解明問題が残されている.研究代表者らは,ダイニンモータードメインの2.8Å分解能でのX線結晶構造解析を達成し,長年待ち望まれてきたダイニン中核領域の原子構造を明らかにすることに成功した.得られた結晶構造は,今後のダイニンメカニズム研究における重要基盤となるだろう.「ダイニン」は,ATP加水分解で得られたエネルギーを利用して微小管上を滑り運動する巨大なモーター蛋白質複合体である.私たちの細胞内では,細胞内物質輸送,細胞分裂,細胞移動,鞭毛・繊毛運動などに駆動力を供給することで,きわめて重要な生理的機能を果たすことが明らかにされている.しかし,ダイニン自身がどのような分子メカニズムで動いているのかという根本的な問いについては,半世紀近い研究にもかかわらず,多くの未解決問題が残されており,その解明は生物物理学・細胞生物学分野の重要な研究課題のひとつである.本研究では,ダイニンの機能面での解析を進めるとともに,構造面での研究を強力に推進することで,その運動メカニズムの全貌を明らかにすることが最終目標である.特に,X線構造解析を中心とした構造生物学的アプローチによりダイニン分子の構造を原子分解能(3.5A分解能)で決定し,運動メカニズムの構造的基盤を明らかにすることを重点目標としている.本年度は,モーター活性を維持した完全長のダイニンモータードメインについて,中空間分解能(4.5A分解能)での構造解析を完了し,2次構造レベルの分子構造を明らかにした。この研究成果は,Nature Structural & Molecular Biology誌に掲載され,同誌のNews & Viewsに取り上げられるなど一定の評価を得た.また,原子分解能(3.5A分解能)で構造を決定するために必要な技術要素検討についても研究を順調に進展させることができた.具体的には,コンストラクト,結晶化,結晶化後処理,回折データ取得などについて網羅的な検討を行った結果,2.8A分解能のX線回折データを安定して取得する条件を確立した.また,位相決定の鍵となるセレノメチオニン導入ダイニン分子の発現系確立にも成功した.「ダイニン」は,ATP加水分解で得られたエネルギーを利用して微小管上を滑り運動する巨大モーター蛋白質複合体である.私たちの細胞内では,細胞内物質輸送,細胞分裂,細胞移動,鞭毛・繊毛運動など生命活動に必須な細胞運動を駆動しているが,その運動のしくみはいまだ謎に包まれている.本研究では,X線単結晶構造解析を中心とした構造生物学的アプローチによりダイニン分子の構造を原子分解能(3.5Å分解能)で決定し,運動メカニズムの構造的基盤を明らかにすることを重点目標としている.ダイニン分子の最初の原子構造については,昨年度の研究により,「力発生後」状態の構造解析を達成し,各アミノ酸残基レベルでその構造を決定することに成功している.本年度の研究では,次の重要課題である,ダイニン力発生過程の他の中間状態の構造解析に取り組んだ.特に「力発生前」の構造を明らかにすることが重要であるため,この中間状態を安定にトラップできる条件を集中的に検討した.その結果,力発生前状態をトラップするために過去30年以上にわたって用いられてきた方法は,結晶化のような蛋白質高濃度かつ長時間トラップを要する条件には適用できないことが明らかになった.今後は,変異体とヌクレオチドアナログを組み合わせるなど新たなトラッピング法を開発し,「力発生前」状態を確実に捉える条件を見出すことが必要であろう.また,ダイニンの力を生み出す構造変化を捉えるもう一つのアプローチとして,分子動力学シミュレーションによる初期検討を行った.本アプローチは,本研究で決定したダイニンの結晶構造に基づき,中村研究室(大阪大学蛋白質研究所)との共同研究により遂行したものである.その結果,ダイニンの力発生に重要だと考えられるサブドメインの構造変化について予備的な知見が得られた(International workshop Dynein2013発表).「ダイニン」は,ATP加水分解で得られたエネルギーを利用して微小管上を滑り運動する巨大なモーター蛋白質複合体である.私たちの細胞内では,細胞内物質輸送,細胞分裂,細胞移動,鞭毛・繊毛運動などの生命活動の基盤となる様々な細胞運動を駆動している.しかし,ダイニン自身がどのような分子メカニズムで動いているのかという根本的な問いについては,半世紀近い研究にもかかわらず,多くの未解決問題が残されており,その解明は生物物理学・細胞生物学分野の重要な研究課題のひとつである.本研究では,ダイニンの機能面での解析を進めるとともに,構造面での研究を強力に推進することで,その運動メカニズムの全貌を明らかにすることが最終目標である.

特に,X線構造解析を中心とした構造生物学的アプローチによりダイニン分子の構造を原子分解能(3.5Å分解能)で決定し,運動メカニズムの構造的基盤を明らかにすることを重点目標としている.本年度の研究では,ダイニンの心臓部であるモータードメインについて,2.8Å分解能での結晶構造解析を完了し,長年にわたり待ち望まれてきたアミノ酸残基レベルで運動メカニズムを議論することが可能な原子モデルを得ることに遂に成功した.この研究成果は,Nature誌に掲載され,Nature Structural & Molecular Biology誌のNews & Viewsに取り上げられるなど一定の評価を得た.また,ダイニン分子の力を生み出す構造変化を明らかにするためにクライオ電子顕微鏡像解析を行い,力発生前・後の二つの反応中間状態の低分解能三次元構造情報を得ることにも成功した.本年度は、従来を超える高空間分解能の回折データ取得とより正確な位相情報を得ることを目標として研究を遂行し、ほぼ予定通り研究を進展させることができたことから、上記評価とした。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では,ダイニンモータードメインの原子構造を決定することが第一目標であった.本年度の研究により,ADP結合状態のダイニンモータードメインについて2.8 Å分解能での結晶構造解析を行うことに成功し,この目標を遂に達成したため,上記評価とした.本年度の研究により,空間分解能2.8Aの回折データを取得することが可能となり,また上述のように位相決定に重要となるセレノメチオニン導入ダイニン分子の発現系確立にも成功した.今後の最重要課題は,これらの系を活用して実際にダイニン分子の原子構造を決定することである.25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究における今後の重要課題は次の2点である.(1)ダイニンモータードメインのATP加水分解サイクル過程に伴う構造変化をX線構造解析で捉える(2)微小管に結合したダイニンの構造をクライオ電子顕微鏡像再構成法で捉える本年度の研究により決定したダイニンモータードメインの原子構造を基盤として,次年度の研究では上記課題達成を目指す.
アルケニルボロン酸エステルの精密ラジカル重合が拓く新規機能性ビニルポリマー創製

本研究ではホウ素の特異な元素特性の活用により、新しい重合システムの開発・機能性高分子の創出を行う。具体的には、アルケニルボロン酸エステルをラジカル重合のモノマーとして用いることにより、主鎖上にボロニル基が直接置換したビニルポリマーを合成する。これを合成中間体として利用することで従来合成困難とされてきた様々なビニルポリマーの合成に繋げるほか、ルイス酸性を有するホウ素が主鎖上に高度に集積されている点を利用した分子認識材料を開発する。