hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PCR-クローニング法による新しい癌抑制遺伝子の単離・同定

細胞の分化および増殖の異常によって細胞が癌化することが知られているが,本研究では分化および増殖に関連した新規遺伝子を単離することを目的とした.方法としてはPCRを利用したdifferential display法を用いた.前立腺癌細胞株であるLNCapに細胞分化誘導因子であるPMAを添加したものと,無添加のものを用いて,differential display法により発現の差のあるバンドをひろいあげた.これらをゲルより切り出してサブクローニングを行い,シークエンス反応にて塩基配列を解読してデータベースに照会したところ,多数の新規遺伝子断片と思われるクローンが単離された.次に,これら遺伝子断片をプローブとして用いて各種癌細胞株での発現をノーザンブロットで確かめたところ,3つのクローンについては明らかな発現が認められた.まず,クローン9は大きさ約1.7kbと推定され,用いた全ての細胞株に強い発現を認めた。アミノ酸配列ではチロシン脱リン酸化酵素との間にホモロジーが認められた.クローン16-5の大きさは約3.7kbと推定され,これもすべての細胞株に非常に強い発現が認められた.これら2つのクローンは細胞の種類を問わず生存に不可欠な遺伝子である可能性が高いと思われた.クローン15-1は約3.8kbの大きさと推定され,PMA処理したLNCaP細胞でのみ発現が認められ,ほかの細胞株やPMA無処理のLNCaP細胞では全く発現が認められなかった.今後,これらのcDNAの全長を単離し,機能的な解析を行う予定である.細胞の分化および増殖の異常によって細胞が癌化することが知られているが,本研究では分化および増殖に関連した新規遺伝子を単離することを目的とした.方法としてはPCRを利用したdifferential display法を用いた.前立腺癌細胞株であるLNCapに細胞分化誘導因子であるPMAを添加したものと,無添加のものを用いて,differential display法により発現の差のあるバンドをひろいあげた.これらをゲルより切り出してサブクローニングを行い,シークエンス反応にて塩基配列を解読してデータベースに照会したところ,多数の新規遺伝子断片と思われるクローンが単離された.次に,これら遺伝子断片をプローブとして用いて各種癌細胞株での発現をノーザンブロットで確かめたところ,3つのクローンについては明らかな発現が認められた.まず,クローン9は大きさ約1.7kbと推定され,用いた全ての細胞株に強い発現を認めた。アミノ酸配列ではチロシン脱リン酸化酵素との間にホモロジーが認められた.クローン16-5の大きさは約3.7kbと推定され,これもすべての細胞株に非常に強い発現が認められた.これら2つのクローンは細胞の種類を問わず生存に不可欠な遺伝子である可能性が高いと思われた.クローン15-1は約3.8kbの大きさと推定され,PMA処理したLNCaP細胞でのみ発現が認められ,ほかの細胞株やPMA無処理のLNCaP細胞では全く発現が認められなかった.今後,これらのcDNAの全長を単離し,機能的な解析を行う予定である.PCR-cloning法による新たな遺伝子単離を目指して研究を進めてきたが,現在までにいくつかの新しい遺伝子断片が得られたので報告する.まずPCRのprimerを設定する際に,類似した機能をもつ遺伝子も増幅できるように重要なドメインに64256種類のdegenerate primerを合成し,いくつかの細胞から合成したcDNAを鋳型にPCRを行った.今回,対象としたのは細胞の分化,増殖に関与しているとされるカルシウム結合蛋白ファミリーで,これらでよく保存されているCa結合部位をprimerの設定場所として選択した.いくつかのprimerを組み合わせたPCRの結果,予想される以外の未知のバンドが出現した増幅産物をHPLCで精製した後,T-vectorにライゲーションして,シークエンスを行いopen reading frameの検索を行った.十分な長さのopenreading frameが得られた塩基配列をGene Bankにて照合した結果,いくつかの既知の遺伝子のほかに,未知の遺伝子と考えられるいくつかのクローンが得られた.これらのなかには既知の遺伝子とほとんど相同性がないものや,既にHuman sequence taqとして報告されている機能不明の未知の遺伝子群と一致するものが単離されている.今後,これらの遺伝子の各組織での発現を検索し,最終的にcDNAライブラリーからの全長の遺伝子の単離を行う予定である.癌における遺伝子異常を解明する目的で,我々はこれまで既知の遺伝子突然変異を検索してきた.今回,癌研究の新たな展開をひらくためにPCR-cloning法による新たな遺伝子単離を目指して研究を進めた.PCR-クローニング法においてprimerを設定する際に,新たな遺伝子単離の対象として細胞の分化,増殖に関与しているとされるカルシウム結合蛋白ファミリーを選択した.これら遺伝子間でよく保存されているCa結合部位をprimerの設定場所として選択した.いくつかのprimerを組み合わせてPCRを行い,予想される以外の未知のバンドが出現した増幅産物をHPLCで精製した後,T-Vectorにligationして,シークエンスを行いopen reading frameの検索を行った.十分な長さのopenreading frameが得られた塩基配列をgene bankにて照合した結果,calvasculin等いくつかの既知のCa結合蛋白遺伝子のほかに,未知の遺伝子と考えられるいくつかのクローンが得られた.これらの中には既知の遺伝子とほとんど相同性がないものや,既にHuman sequence taqとして報告されている未知の遺伝子群と一致するものが単離された.これらの遺伝子の中で現在B3と名付けたクローンのノーザンブロットでの発現を解析中であるが,白血病,乳癌,大腸癌などの各細胞株ではこのB3遺伝子の発現はみられなかった.現在ほかの組織での発現ならびに乳腺cDNAライブラリーからプラークハイブリダイゼーションを行っている.

また,これ以外のDNA断片についてもノーザンブロット解析により発現を検索していく予定である.細胞の分化および増殖の異常によって細胞が癌化することが知られているが,本研究では分化および増殖に関連した新規遺伝子を単離することを目的とした.方法としてはPCRを利用したdifferential display法を用いた.前立腺癌細胞株であるLNCaPに細胞分化誘導因子であるPMAを添加したものと,無添加のものを用いて,differential display法により発現の差のあるバンドをひろいあげた.これらをゲルより切り出してサブクローニングを行い,シークエンス反応にて塩基配列を解読してデータベースに照会したところ,多数の新規遺伝子断片と思われるクローンが単離された.次に,これら遺伝子断片をプローブとして用いて各種癌細胞株での発現をノーザンブロットで確かめたところ,3つのクローンについては明らかな発現が認められた.まず,クローン9は大きさが約1.7kbと推定され,用いた全ての細胞株に強い発現を認めた.アミノ酸配列ではチロシン脱リン酸化酵素との間にホモロジーが認められた.クローン16-5の大きさは約3.7kbと推定され,これもすべての細胞株に非常に強い発現が認められた.これら2つのクローンは細胞の種類を問わず生存に不可欠な遺伝子である可能性が高いと思われた.クローン15-1は約3.8kbの大きさと推定され,PMA処理したLNCaP細胞でのみ発現が認められ,ほかの細胞株やPMA無処理のLNCaP細胞では全く発現が認められなかった.今後,これらのcDNAの全長を単離し,機能的な解析を行う予定である.
新規ポリコーム複合体因子Zfp277による造血幹細胞制御機構の解明

申請者はC2H2型Zinc finger domainをもつZfp277の機能を明らかにする目的で、Zfp277ノックアウトマウスを樹立しマウス繊維芽細胞の細胞増殖を観察した。その結果、この分子が新規のがん抑制遺伝子Ink4a/Arfの制御分子として細胞老化を制御することを見出した。Zfp277欠損による細胞老化の誘導はBmilの強制発現によっても遅らせることができない。そこで、この分子機構を明らかにする目的でクロマチン免疫沈降(ChIP)を行い、ポリコーム複合体因子のInk4a/Arf遺伝子座での局在を解析した。その結果、Zfp277はポリコーム遺伝子複合体のInk4a/Arf遺伝子座へのリクルートに必須であることが明らかになった。また、この解析の過程で細胞老化を制御する上流経路である酸化ストレス経路(JNKおよびp38MAPK経路)の活性化が、Zfp277およびポリコーム複合体タンパクの発現量を制御することも見出した。これらの知見は、ポリコーム遺伝子の遺伝学的解析から示唆されている細胞老化と個体レベルのagingおよび幹細胞維持に共通する分子機構の一端を明らかにするものであることから、これらの知見を学術誌に成果として報告した(M.Negishi et al. PLosONE5 : e12373 (2010))。現在、ChIP sequenceを用いてポリコーム遺伝子およびZfp277の網羅的ゲノム解析を行い、細胞運命を決定するポリコーム複合体の遺伝子発現機構におけるZfp277の重要性を解析している。同時に、Zfp277の造血幹細胞の機能を明らかにする目的で、Zfp277ノックアウトマウスの骨髄細胞から造血幹細胞を純化し、多分化能および長期骨髄再構築能の評価を進めている。
光機能電極構築のための疎水場界面・ポルフィリン化合物分子膜

1.目的生体系での効率良い光電変換の電子・エネルギー輸送の人工モデルとして,タンパクならびに脂質2分子膜からなる疎水場層内に配列された金属ポルフィリン誘導体分子が働いている。本研究ではモデル疎水場として,リン脂質2分子膜ならびに疎水性ポリペプチド膜を用い,水溶液環境下での電極表面疎水場に置かれた金属ポルフィリンの酸化還元ならびに光電気化学反応の光電変換を調べる。疎水場界面層を利用した研究は今までにほとんど報告されてなく,生体系,特に生体膜内での光電変換や電子・エネルギー輸送が膜タンパク質で囲まれた疎水場で起きていることを考えると,新たな光電変換素子の開発が可能となる。2.結果(1)単分子層Mnポルフィリンの電子伝達速度:中心金属であるMnの2価/3価の酸化還元を利用して,電極と自己組織化単分子Mnポルフィリン間の電子伝達速度をボルムメトリーと電位変調反射から調べた。両者間の距離とともに速度が指数関数的に減少する。また,Mnポルフィリンを疎水性ポリペプチドで囲み,水溶液の影響を減らすと速度は増加する。(2)MgならびにZnポルフィリンの光電気化学:Mg, Znポルフィリンを含むリン脂質膜被覆電極を作製し,光応答電流を調べた。光応答電流のアクションスペクトルは,膜被覆電極の吸収スペクトルの類似な応答を示す。光電変換効率は0.1%程度の低い値であった。Mg, Zn以外のMn, Ni, Co,フリーベースのポルフィリンに関しても調べたが,その変換効率はさらに低い値であった。
希土類添加半導体を用いたテラヘルツ波発生/検出素子の開発

本研究では、我々により超高速(サブピコ秒)のキャリア緩和を示すことが見いだされたEr,O共添加GaAs (GaAs:Er,O)を新しいテラヘルツ波発生/検出用材料として位置づけ、そのデバイス応用可能性を明らかにすることを目的とした。GaAs:Er,Oを用いたテラヘルツ波発生素子を作製し、フェムト秒レーザの照射を行ったところ、テラヘルツ波の発生が観測された。そのテラヘルツ波強度は照射パワーとともに増大するものの、飽和傾向を示した。また、多層構造素子において、ヘラヘルツ発生性能を評価した結果、テラヘルツ波放射強度の増大を観測した。一方、試作されたGaAs:Er,Oテラヘルツ波検出素子の性能を評価し、テラヘルツ波の検出に世界で初めて成功した。本研究では、我々により超高速(サブピコ秒)のキャリア緩和を示すことが見いだされたEr,O共添加GaAs (GaAs:Er,O)を新しいテラヘルツ波発生/検出用材料として位置づけ、そのデバイス応用可能性を明らかにすることを目的とする。具体的には、GaAs:Er,Oの成長条件や素子構造の最適化を通じて、テラヘルツ波発生/検出素子を試作し、その究極性能を明らかにすることを目指す。平成24年度は平成23年度の研究課題を継続的に発展させながら、テラヘルツ波検出素子の作製・特性評価および、素子性能の向上に取り組んだ。【課題3】テラヘルツ波検出素子の試作・特性評価:テラヘルツ波発生素子として用いたものと同様の構造を有する光伝導アンテナのテラヘルツ波検出性能を室温で評価した。テラヘルツ波の発生にはLT-GaAs光伝導アンテナを用いた。照射するフェムト秒レーザの照射パワーと印加電圧をパラメータとして、試作したGaAs:Er,O素子の性能を評価した結果、テラヘルツ波の検出に、世界で初めて成功した。しかしながら、LT-GaAsと比較するとS/N比が低く、信号強度自体も1/100程度であった。性能向上に向けて、素子構造やデバイス加工プロセスの最適化が今後の課題である。【課題4】多層構造素子の検討:これまでのGaAs:Er,Oテラヘルツ波発生/検出素子はGaAs基板上に成長したGaAs:Er,O単層膜を用いてきた。様々な層構造試料から光伝導アンテナを作製し、そのテラヘルツ波発生性能を評価した結果、n+-GaAs基板上に無添加GaAs、GaAs:Er,Oを順次、積層した構造において、テラヘルツ波放射強度の増大を観測した。この結果はテラヘルツ波放射強度の増大に向けて、素子に用いる層構造設計の重要性を示唆している。【課題1】Er添加条件の最適化: GaAs:Er,Oは現有のOMVPE装置により作製した。低温成長GaAs (LT-GaAs)を凌ぐ超高速なキャリア緩和を実現するために、添加するEr濃度をパラメータとした。得られた試料のキャリア緩和時間は現有のフェムト秒レーザを用いたポンプ・プローブ光反射率測定により評価した。Er濃度の増加とともにキャリア緩和時間が短くなり、高Er添加試料ではLT-GaAsを凌ぐキャリア緩和が得られることが明らかになった。不純物添加によるキャリア緩和時間制御については世界で初めての結果である。【課題2】テラヘルツ波発生素子の試作・特性評価:テラヘルツ波発生特性の精密評価とデバイス応用を目的にダイポール型光伝導アンテナを作製した。得られた光伝導アンテナのテラヘルツ波発生特性は室温において、LT-GaAs光伝導アンテナを検出器とした現有の評価システムにより調べた。フェムト秒レーザの照射によりテラヘルツ波の発生が観測され、そのテラヘルツ波強度は照射パワーとともに増大するものの、飽和傾向を示した。この現象は光励起キャリア密度の増大によって発生するスクリーニング効果に起因している。無添加GaAsにおけるテラヘルツ波発生の場合と比較して、GaAs:Er,Oでは照射パワーに対する飽和傾向が小さく、Er濃度の増加とともに、飽和傾向の抑制が顕著に生じることが明らかになった。Er濃度によりキャリア緩和時間が系統的に制御できること、サブピコ秒のキャリア緩和によりスクリーニング効果が効果的に抑制できること等、今後の研究展開の鍵を握る重要な知見が着実に得られており、当初、設定した課題に対して順調に研究が進展している。

平成23年度の研究課題を継続的に発展させながら、テラヘルツ波検出素子の作製・特性評価および、テラヘルツ波発生・検出素子の性能向上に取り組む。【課題3】テラヘルツ波検出素子の試作・特性評価:テラヘルツ波発生素子として用いたものと同様の構造を有する光伝導アンテナのテラヘルツ検出性能を前述のシステム(この場合、試料はディテクター位置にセットする)により評価する。テラヘルツの発生にはLT-GaAs光伝導アンテナを用いる。測定温度は室温とする。照射するフェムト秒レーザの照射パワーと印加電圧をパラメータとして、試作したGaAs:Er,O素子の性能を評価する。【課題4】層構造素子の検討:これまでのGaAs:Er,Oテラヘルツ波発生/検出素子はGaAs基板上に成長したGaAs:Er,O単層膜を用いてきた。そのために電極ギャップ間に光励起されたキャリアは多方面へ拡散する。GaAs:Er,O層に印加される電界を制御することを目的に、層構造試料を作製する。作製された層構造試料から光伝導アンテナを作製し、そのテラヘルツ波発生/検出性能を評価する。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。
テンソル分解法を用いた高精度第一原理計算手法の開発

第一原理計算とは、量子力学の原理をもとに、コンピュータ上で物質の振る舞いを再現するための計算手法の総称である。第一原理計算による「コンピュータ実験」を利用することで、物質・材料開発を加速することができると期待されている。実際には、量子力学の原理をそのまま用いようとすると計算量が世界最速のスーパーコンピュータ上でも扱えないほどに大きくなってしまうので、様々な近似手法が用いられるが、多くの場合で十分な精度で計算できていないのが現状である。そこで本研究では、データ解析の分野で着目されている「テンソル分解」を援用することで、高精度かつ適用範囲の広い第一原理計算手法を目指した開発を行った。今年度は主に、対称テンソル分解配置間相互作用(STD-CI)法のプログラムの整備、及び、高速化を行った。STD-CI法で分子などのエネルギーを求める際は、エネルギー関数を変分原理に則って最適化するが、その変分アルゴリズムについて検討を行い、ある程度安定的に解を求めることができるようになった。また、変分にはエネルギーの微分を要するが、この微分の精度を維持するために多倍長精度の実数が必要になることが分かった。さらに、OpenMPによる並列化を進め、計算時間を6倍程度短縮することができた。以上のようにして整備を進めてきたプログラムを、高精度量子科学計算のベンチマークとして従来から用いられてきている、BeをH2に挿入する経路上のエネルギー計算に応用し、STD-CI法の性能を調べた。テンソル分解の階数を2としたとき、もっとも精密な方法である完全CI法とくらべて約10 mHartree異なるエネルギーを得た。これは、同じ挿入経路上で最大で100 mHartreeの誤差を生じるハートリー・フォック法にくらべると大きな改善であるが、CAS-CCSD法などでは1 mHartree程度の誤差であり、さらなる改善が望まれる。テンソル分解の階数を増やすことでより精度が上がると考えられるが、現状のプログラムでは安定に解を求めることができていない。また、STD-CI法では、特に遷移状態の構造において、エネルギーを完全CI法にくらべて過小評価することがあり、これは変分原理に反する。その理由として、スピンの対称性を考慮していないことが考えられる。スピン対称性の考慮は収束性の改善にも役立つと考えられるため、来年度の重要課題とする。今年度も引き続き、対称テンソル分解CI (STD-CI)法の変分アルゴリズムの検討を行った。特に、テンソル分解の階数を増やしてもエネルギーの改善が見られない問題に取り組んだ。この問題が生じている計算について変分計算の進み方を調べたところ、1つのテンソル分解階数が寄与する波動関数の成分のみが相対的に大きくなってしまい、他の成分が実質ゼロになっていることが分かった。このことから、各テンソル分解階数が寄与する波動関数のノルムの制御が重要であることが示唆される。これは、機械学習の分野において、関数に対して単なる直接フィッティングを行うのではなく、ノルムなどに対する罰則項を付加する、いわゆる正則化の必要性に関連していると考える。一方、共同研究者の植村、杉野と共に、STD-CI波動関数の変分空間を拡張した拡張STD-CI (ESTD)法を開発した。本手法でも上記のような問題が生じたが、各テンソル分解階数ごとに波動関数のノルムが1となるような制約を変分パラメータに加えたところ、安定的に計算出来るようになった。これにより、水分子に対して完全CI計算のエネルギーと倍精度浮動小数点数の数値精度の範囲内で完全に一致する計算を行うことができた。本成果については、原著論文を投稿中である。昨年からの課題であるスピンや分子構造の対称性の考慮については、文献調査の結果、原子核物理の分野で古くから用いられているgenerator coordinate法がSTD-CI波動関数に対しても有用であると考えるに至った。プログラムへの実装については今後の課題である。26年度が最終年度であるため、記入しない。計算材料学26年度が最終年度であるため、記入しない。プログラムの整備は進んできており、当初想定したとおり、一般的な分子に適用し、方法論そのものの評価を進めることができている。また、これによって新たな課題もあきらかになっており、ある部分では予想以上に研究が進展していると言える。一方、当初予定した原子間力の計算については十分には進んでおらず、今後取り組んでいく予定である。上記で述べたとおり、スピン対称性を考慮したSTD-CI法を検討する。これによってエネルギーの精度向上と同時に、収束性の改善も行う。これに加えて、当初の計画どおり、1)原子間力の計算手法の確立、2)励起状態の計算手法の開発、3)より大規模な系へのSTD-CI法の適用を目指して、アルゴリズムの検討とプログラムの整備、高並列化を進める。並列化については、MPI並列や、アクセラレータの併用も検討する。
魔術的リアリズムの表象研究-ポストモダニズム、ポスト植民地主義、アメリカニズム

「魔術的リアリズム」の言説をポストモダニズム、ポスト植民地主義、アメリカニズムとの関連で歴史化した。そうすることで、「魔術的リアリズム」が地理的・存在論的・政治的・文化的境界を、探求し、侵犯するのに適した語りの様式であること、ひいては近代化の過程を振り返り、(西洋)近代という準拠枠より大きな世界を指向する様式であること、魔術的リアリズム小説がさまざまな語りの様式と多様に関連する発展的なジャンルであることを示した。本研究の大枠は、文学・美術・映画分野をはじめとする文芸諸ジャンルにまたがる表現様式である「魔術的リアリズム」を、「ポストモダニズム」「ポスト植民地主義」「アメリカニズム」および「グローバリズム」との関連において考察することであるが、H21年度は、とりわけ関連資料を広範に入手すること、さらには中間的成果として、国内学会での口頭発表、および大学紀要論文として発表することを目標とした。前者に関しては、日本アメリア文学会全国(於秋田大学)における研究発表「Robert CooverのThe Public Burningにおける戯画的想像力」として結実した。これはRobert Cooverのブラック・ユーモア小説における主人公Richard Nixonが、冷戦期のアメリカニズムとの関連においてどのように(リアリズムに依拠せずに)表象されているのかを明らかにしたものである。後者に関しては、東京学芸大英語科の紀要『英学論考』の論文「Herblock×Nixon」として一応の形を見たが、政治風刺漫画家Herblock (Herbert Block)によるNixon表象を概観する本稿は、前者の準備的論考といった体裁のものである。海外での資料収集に関しては、米国のペンシルヴァニア州立大学を中心に行い、あわせてカリフォルニアのRichard Nixon Presidential Library and MuseumとワシントンDCの国会議会図書館における調査、Herblock Foundationにおける図版版権取得を行った。また、次年度に行われる米国比較文学会における研究発表(村上春樹の小説について)のための準備を行った(受託済)。本研究の大枠は、文学・美術・映画分野をはじめとする文芸諸ジャンルにまたがる表現様式である「魔術的リアリズム」を、「ポストモダニズム」「ポスト植民地主義」「アメリカニズム」および「グローバリズム」との関連において考察することである。H22年度は、H21年度に引き続き、関連資料を広範に入手すること、さらには中間的成果として、学会での口頭発表、および学術論文として発表することを目標とした。前者については、文学関係にとどまらず、美術関係の資料や映像資料を幅広く収集した。後者に関しては、前年度より準備を進めた米国比較文学会における研究発表「Confronting the National History in the Post-Cold War Context:"Heterogeneous Space" in Haruki Murakami's Fiction」として結実した。これは村上春樹の小説における暴力と倫理的主体の表象の問題を、グローバリズムやポスト植民地主義的見地から考察したものである。"Nations are notions":Literary Materiality and the 20^<th> Century Nation Stateというセッションに組み入れられ、多くの研究者と活発な議論を交わすことができた。また、魔術的リアリズムと密接に関連するファンタジーや反リアリズム的モードについてのシンポジウム「アメリカン・ロマンスの系譜」を所属するサウンディングズ英語英米文学会において企画立案し、翌年度に開催することとなった。サウンディングズ英語英米文学会(於上智大学)におけるシンポジウム「アメリカンロマンスの系譜」(司会・講師)における研究発表(ジョン・バースの小説について)を行った。魔術的リアリズムだけでなく、アメリカ小説におけるファンタジーや反リアリズムについて扱った本シンポジウムを通して、魔術的リアリズム(およびファンタジー)の裏返し(あるいは共犯関係)としてのアメリカ小説の伝統という観点から、アメリカ文学史における位置づけについて考察することができた。平成24年12月には、本シンポジウムをもとにした論集(共著)が刊行予定である。また、前年度に行った米国比較文学会における研究発表「Confronting the National History in the Post Cold War Context: "Heterogeneous Space" in Haruki Murakami's Fiction」(村上春樹の魔術的リアリズム小説における暴力と倫理的主体の表象の問題を、グローバリズムやポスト植民地主義的見地から考察したもの)の議論を発展させ、大学紀要(『東京学芸大学紀要』人文社会科学系I)に発表した。当該論文では、「空間」「暴力」「生-権力」といった観点から、村上春樹の小説における魔術的リアリズムの語りの戦略には近代国民国家の孕む諸矛盾と交渉しつづけようとする著者の倫理的姿勢が表明されていることを明らかにした。
酵素一補酵素結合を用いる酵素リアクタ-

NADのような担体型の補酵素を必要とする酵素反応を酵素リアクタ-中で連続化するための触媒素子として、酵素ー補酵素結合体を作製した。補酵素としてNADを用い、酵素としてのグルコ-ス脱水素酵素(GlcDH)や乳酸脱水素酵素などの脱水素酵素類、さらには、フェナジン誘導体(EP)のような人工の触媒基を組み合わせることにより、種々のタイプの結合体を得、それらを用いた酵素アクタ-の特性を明らかにしようとした。まず、GlcDHとポリエチレングリコ-ル結合NAD(PEGーNAD)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GlcDHーPEGーNADを作製した。乳酸脱水素酵素との共役反応におけるGlcDHーPEGーNADのNADH再生素子としての活性を調べ、本共役反応系を限外濾過膜(PM10)を用いたリアクタ-内に保持し、ピルビン酸からLー乳酸への変換反応が連続的に行えることが明らかとなった。次に、グルタミン酸脱水素酵素(GltDH)とポリエチレングリコ-ル結合5ーエチルフェナジン(EPーPEG)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GltDHーPEGーEPを作製した。この結合体は、NADH酸化酵素としての活性を示した。さらに、GlcDHをPEGーNADおよびポリエチレングリコ-ルの結合したEP(EPーPEG)と結合した三重結合体(EPーGlcDHーNAD)を作製した。得られた結合体は、グルコ-ス酸化酵素の活性を持つ新しい触媒素子であることが明らかとなった。このことは、EPとNADをともに結合することにより、脱水素酵素が酸化酵素に機能変換されることを示すものであり、またNADを分子内でリサイクルするシステムが設計可能であることも示している。NADのような担体型の補酵素を必要とする酵素反応を酵素リアクター中で連続化するための触媒素子として、まず、グルコース脱水素酵素(GlcDH)とポリエチレングリコール結合NAD(PEGーNAD)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GlcDHーPEGーNADを作成した。得られた結合体は、1分子中(4量体)に約2分子の活性なNADを結合していた。結合体のpH安定性は元の酵素と同じであった。外部NADに対する酵素部分の比活性は元の酵素の77%であり、結合したNADに対するその結合体の酵素部分の活性は、サブユニットあたり0.26s^<-1>であった。他のデヒドロゲナーゼ反応に対する結合体のNAD部分の補酵素活性は、PEGーNADとほぼ同じであった。乳酸脱水素酵素との共役反応におけるGlcDH-PEG-NADのNADH再生素子としての活性を調べたところ、複合体の比活性は4量子あたり1.1s^<-1>、グルコースに対するKm値は24mMであった。さらに、本共役反応系を限外濾過膜(PM10)を用いたリアクター内に保持し、ピルビン酸からLー乳酸への変換反応が連続的に行えることが明らかとなった。次に、グルタミン酸脱水素酵素(GltDH)とポリエチレングリコール結合5ーエチルフェナジン(EPーPEG)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GltDHーPEGーEPを作成した。得られた結合体は1分子中(6量体)に約4分子のEPを結合していた。EPの近位にNADH結合部位が存在するため、NADHの有効濃度が0.33mM上昇することがわかった。また、EPとNADHとの分子内反応速度定数は、0.38s^<-1>であった。

NADの様な担体型の補酵素を必要とする酵素反応を酵素リアクタ-内で連続化するための触媒素子として、昨年度は、グルコ-ス脱水素酵素(GlcDH)とポリエチレングリコ-ル結合NAD(PEGーNAD)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GlcDHーPEGーNADを作成した。本年度は、さらに高度に組織化された酵素ー補酵素結合体を作成するために、この様な結合体中で人工の触媒基としてはたらく、新しいフェナジン誘導体(EP)を合成した。EPは、従来の誘導体とは異なりすぐれた安定性を有するとともに、酵素やPEGーNADと結合しうる官能基を持っている。実際、EPとPEGーNADとの結合体、EPーPEGーNADは、一種の人工酵素的な特徴を持つ、NAD再生素子として機能することがわかった。次に、GlcDHをPEGーNADおよびポリエチレングリコ-ルの結合したEP(EPーPEG)と結合した三重結合体、EPーGlcDHーNADを作成した。得られた結合体は、1分子中(4量体)に約3分子のEPと約5分子のNADとを結合しており、グルコ-ス酸化酵素の活性を持つ新しい触媒素子であることが明らかとなった。このことは、EPとNADとを共に結合することにより、脱水素酵素が酸化酵素に機能変換されることを示すものであり、またNADを分子内でリサイクルするシステムが設計可能であることも示している。なお、本酸化酵素の反応性を定量的に評価するため、酵素法による溶存酸素濃度の測定法も新たに開発した。NADのような担体型の補酵素を必要とする酵素反応を酵素リアクタ-中で連続化するための触媒素子として、酵素ー補酵素結合体を作製した。補酵素としてNADを用い、酵素としてグルコ-ス脱水酵素(GlcDH)や乳酸脱水素酵素などの脱水素酵素類、さらには、フェナジン誘導体(EP)のような人工の触媒基を組み合わせることにより、種々のタイプの結合体を得、それらを用いた酵素リアクタ-の特性を明らかにしようとした。これまで、GlcDHとポリエチレングリコ-ル結合NAD(PEGーNAD)とを結合した酵素ー補酵素結合体、GlcDHーPEGーNADを作製した。そして、さらに高度に組織化された酵素ー補酵素結合体を作成するために、このような結合体中で人工の触媒基として働く、新しいEPを合成した。EPは、従来の誘導体とは異なり、優れた安定性を有するとともに、酵素やPEGーNADと結合しうる官能基を持っている。さらに、GlcDHをPEGーNADおよびポリエチレングリコ-ルの結合したEP(EPーPEG)と結合した三重結合体、EPーGlcDHーNADを作製した。得られた結合体は、グルコ-ス酵化酵素の活性を持つ新しい触媒素子であることが明らかになった。本年度は、乳酵脱水素酵素、PEGーNAD、ポリエチレングリコ-ル結合5ーEEP(EPーPEG)を結合した三重結合体を作製し、その乳酸酸化酵素としての性質を明らかにした。以上の結果は、EPとNADとをともに結合することにより、脱水素酵素が酸化酵素に機能変換されることを示すものであり、またNADを分子内でリサイクルするシステムが設計可能であることも示している。
ビタミンD水酸化体の新規生産法の開発

多数存在するビタミンD水酸化体の中には、有用なものが多数存在する。本研究では、活性型ビタミンD2など、これまでバイオコンバージョン法による生産報告例のなかったビタミンD水酸化体を簡便に提供することを目的とした。これまでに我々は、放線菌由来CYP105A1の二重変異体R73A/R84Aを利用した活性型ビタミンD3生産を報告してきたが、今回、新たに活性型ビタミンD2生産を可能とする三重変異体R73A/R84A/M239Aを取得した。また、ヒト体内に存在するビタミンD2代謝物25,26-ジヒドロキシビタミンD2生産にR73A/R84Aが有用であることを明らかにした。ビタミンD水酸化体は、すでに医薬品となっている天然の活性型ビタミンD3(1α,25-ジヒドロキシビタミンD3)やその誘導体を含め、骨粗鬆症やがん等の予防・治療が期待される有用な化合物である。しかしながら、化学合成が困難なことから高価な化合物となっており、安価な製造法が求められている。活性型ビタミンD3については、近年バイオコンバージョン法による安価な生産が実用化されたが、他のビタミンD水酸化体についてはそのような生産報告はない。本研究では、種々のビタミンD水酸化酵素を利用し、多岐にわたるビタミンD水酸化体について簡便に取得することを目的としたものである。本年度は、活性型ビタミンD2の効率的な生産法の確立を中心に行った。我々は、これまでに、放線菌由来CYP105A1の二重変異体(R73A/R84A)が、ビタミンD3を基質に高い活性型ビタミンD3生産能を有することを報告してきた。しかしながら、本変異体とビタミンD2を反応させた場合、活性型ビタミンD2の生成はほとんどみられなかった。前駆体である25-ヒドロキシビタミンD2は生成されており、25-ヒドロキシビタミンD2に対する1α位水酸化活性が極めて低いことが原因であると考えられた。この可能性を、R73A/R84Aの立体構造をもとにした分子モデリングにより調べたところ、ビタミンD2側鎖の自由度が低くMet239が障害になっている可能性が示唆された。この立体障害を除くために、3重変異体R73A/R84A/M239Aを作製したところ、25-ヒドロキシビタミンD2に対する1α位水酸化活性が付与されることがわかった。現在、他の水酸化体についても効率的な生産法を検討している。上述したとおり、活性型ビタミンDを含めたビタミンD水酸化体の安価な生産が求められている。我々は、長年、種々のビタミンD水酸化酵素の機能解析を行っており、当初、それらを用いた活性型ビタミンD3生産を最重要課題と考えていた。しかしながら、活性型ビタミンD3については、近年バイオコンバージョン方による安価な生産法が実用化されたことから、活性型ビタミンD3と側鎖構造が異なる活性型ビタミンD2生産を最重要課題とした。活性型ビタミンD2は、活性型ビタミンD3と同様に生理活性の高い有用な化合物であるが、バイオコンバージョン法による生産報告が皆無である。これまでに我々は放線菌由来CYP105A1二重変異体(R73A/R84A)がビタミンD3を基質として高い活性型ビタミンD3生産能を有することを明らかにしていたが、本変異体を用いてビタミンD2を代謝させても、活性型ビタミンD2を得ることができなかった。R73A/R84Aと25-ヒドロキシビタミンDのドッキングモデリングを参考に、R73A/R84Aにさらに変異を重ね、R73A/R84A/M239Aが、25-ヒドロキシビタミンD2に対する1α位水酸化活性を有することを明らかにした。すなわち、この変異体を利用して、25-ヒドロキシビタミンD2を基質に活性型ビタミンD2が生産可能となる。一方で、本変異体はビタミンD2から、25-ヒドロキシビタミンD2を生成する能力は低下しており、安価な生産を実現するためには、別途、25-ヒドロキシビタミンD2生成系と組み合わせる必要がある。我々はすでに、25-ヒドロキシビタミンD2生成系を確立しており、安価な活性型ビタミンD2生産の実現が期待できる。本研究では、活性型ビタミンD2(1α,25-ジヒドロキシビタミンD2, 1α,25D2)など、これまでバイオコンバージョン法による生産報告例のなかったビタミンD水酸化体を簡便に提供することを目的とした。

前駆体である25-ヒドロキシビタミンD2(25D2)は生成されたが、25D2に対する1α位水酸化活性が極めて低いことがわかった。VD2を基質に25D2を経て1α,25D2を生成する酵素の取得を目的とし、R73V/R84Aと25D2とのドッキングモデルを作製した。Met239がVD2と立体障害を起こしている可能性が示唆されたため、Met239をアラニンに置換したCYP105A1三重変異体(R73A/R84A/M239A)を作製し、25D2に対する1α位水酸化活性を測定した。その結果、変異導入前の二重変異体(R73A/R84A)と比較し、20倍の1α位水酸化活性を有することがわかった。他に、R73A/R84Aを利用した25,26-ジヒドロキシビタミンD2生成にも成功した。多数存在するビタミンD水酸化体の中には、有用なものが多数存在する。本研究では、活性型ビタミンD2など、これまでバイオコンバージョン法による生産報告例のなかったビタミンD水酸化体を簡便に提供することを目的とした。これまでに我々は、放線菌由来CYP105A1の二重変異体R73A/R84Aを利用した活性型ビタミンD3生産を報告してきたが、今回、新たに活性型ビタミンD2生産を可能とする三重変異体R73A/R84A/M239Aを取得した。また、ヒト体内に存在するビタミンD2代謝物25,26-ジヒドロキシビタミンD2生産にR73A/R84Aが有用であることを明らかにした。1年目に取得したCYP105A1三重変異体(R73A/R84A/M239A)は、25-ヒドロキシビタミンD2の1α位水酸化活性を有していたことから、25-ヒドロキシビタミンD2を基質に活性型ビタミンD2が生産可能な酵素である。2年目は、取得した変異体を放線菌もしくは大腸菌内で発現させてバイオコンバージョン法による生産を目指す。本酵素を用いた場合、安価なビタミンD2を基質とした場合には、活性型ビタミンD2の生産性が低いことが予測されることから、別途、25-ヒドロキシビタミンD2を提供する系と組み合わせる。25-ヒドロキシビタミンD2を提供する系として、紫外線を照射した組換え酵母を利用する。これは、酵母内在性のエルゴステロールが紫外線によりビタミンD2へと変換されることを利用したものであり、これまでに、CYP2R1発現酵母を利用して、基質を全く添加することなく、25-ヒドロキシビタミンD2が生成可能であることを報告している。CYP105A1三重変異体と紫外線照射CYP2R1発現酵母を組み合わせて、活性型ビタミンD2の安価な生産を目指す。また、現在、他のビタミンD水酸化酵素(CYP24A1、CYP27A1、CYP27B1)の放線菌を宿主とした発現系も構築中であり、種々の水酸化酵素系を組み合わせることで、多数存在するビタミンD水酸化体生成の取得および、生理活性の知られていない化合物については生理活性評価を行う。農学・農芸化学・応用生物化学安価なビタミンD2から活性型ビタミンD2を得るには、1位と25位の両方の水酸化能が必要である。使用した酵素は、1位水酸化活性が低かったことから、1位水酸化活性を上昇させた変異体探索を行ったが、予想していたよりも少ない変異体の構築で、目的の性質を有する酵素を取得することができた。これにより、1年目の予算が少なく研究を執行することができた。
軟骨魚類研究への逆遺伝学的解析の導入

軟骨魚類は、適応・繁殖・進化・海洋生態系・資源など基礎生物学的にも社会的にも重要な生物群である。しかし軟骨魚類研究には、遺伝子操作・逆遺伝学的解析が不可能という手法的制約がある。多数の受精卵を使用できることや、エコー検査により初期卵を得られるメリットを活かし、卵割初期卵や発生中の胚へのインジェクション、ウイルスをキャリアに用いる遺伝子導入により、世界でも初めてとなる軟骨魚への遺伝子改変・逆遺伝学的解析に挑戦する。トラザメをモデルに遺伝子改変技術一般を開発することが目的であり、その成果は生理・形態・発生・遺伝など様々な現象解明につながることが期待される。
経年および熱処理による木材の材質変化メカニズム

木材の経年にともなう材質変化を明らかにすることを目的として、1.ケヤキ材およびスギ材の熱処理による材質変化、2.経年にともなうケヤキ材の材質変化を評価した。その結果、材質変化には温度依存性があり速度論的に解析が可能であることがわかった。また、比強度および破壊に要するエネルギーが経年により有意に減少していた。さらに、3.木材中に存在する水分の影響を考察するため、温度・湿度を制御した湿熱処理を行い、温度と湿度の両方を考慮した材質変化のモデリングに成功した。本研究の目的は、経年および熱処理による木材の材質変化メカニズムの全容を解明することである.そのために,常温で経年した木材(歴史的建造物由来古材)と高温で熱処理した木材を試料として用い,物理的・化学的・組織学的手法により両者を評価・比較することによってメカニズムの解明を試みる.本年度は,放射性炭素年代測定を行い材形成年を明らかにした歴史的建造物由来のケヤキ古材に関して,各種材質の測定を行った.年代測定の結果,材形成後200年から500年経年した材であることがわかった.経年に伴い,比強度,破壊に要するエネルギー,明度などが有意に減少し,平衡含水率は増加する傾向にあった.密度,結晶化度,比ヤング率は変化の傾向が見られなかった.熱処理に伴う材質変化と比較すると,色,比強度および破壊に要するエネルギーの変化について同様の傾向であった.今後,試料数を増やすとともに,各材質についての反応速度論的解析および微細構造変化,化学成分変化を調べる予定である.本研究の目的は,経年および熱処理による木材の材質変化メカニズムの全容を解明することである.そのために,常温で経年した木材(歴史的建造物由来古材)と高温で熱処理した木材を試料として用い,物理的・化学的・組織学的手法により両者を評価・比較することによってメカニズムの解明を試みる.古材について:前年度に引き続き放射性炭素年代法による材形成年代のデータを充実させた結果,6点のケヤキ古材に関して,材形成後約200年から600年経年したものであることが明らかになった.これにより年代を微修正したが,それでも,経年にともなう物性変化の傾向に変わりはなかった.X線回折法により,相対結晶化度,結晶幅,ミクロフィブリル傾角を測定したが,算出法により相対結晶化度が異なるなど,特に赤道反射測定において,試料調整と回折チャートの解析にさらなる検討が必要であることがわかった.これについては,粉末試料あるいはセルロースのみを測定することによって解決をはかる予定である.熱処理材について:先んじて発表した色変化の速度論的解析をプロトタイプとして,他の物性(重量,寸法,力学特性,含水率)の変化についても解析を行い,活性化エネルギーを算出した(投稿準備中).ただし,含水率について,試料重量の少なさから精度が不十分なデータが一部存在したため,吸着等温線の測定を兼ねて再測定する予定である.湿熱処理について:これまで用いてきた熱処理材は水分が存在しない状況で行う乾熱処理により作成したものであった.しかしながら,実際の経年変化は含水率が数%数十%の常態で起こることから,水分の影響を考察するために湿熱処理を行った.湿熱処理による色変化から,温度と水分の両方を加味して経年変化をモデリングし,ケヤキ古材の色変化と比較したところ,例えば平均気温15度の場合,平均相対湿度50%で経年したことになるとの結果を得た.おおむね計画通り進んでいる.ただし,計画では放射方向の曲げ試験を行う予定であったが,試験片のサイズが大変小さいため,現在保有している装置では正しく測定することが不可能であった.本研究課題で用いる試験片サイズに適した力学試験法を,既存の熱機械分析装置を工夫することで検討中である.また,上述の試験後の試験片を使って行う予定であった電子顕微鏡観察についても,上述の試験が終了していないため行っていない.25年度が最終年度であるため、記入しない。小さな試験片での曲げ試験法の解決およびその後の電子顕微鏡観察を早急に行い,当初の研究計画通り進めたい.25年度が最終年度であるため、記入しない。
胚中心細胞のRAG1&RAG2発現調節と濾胞樹状細胞

我々は科研費の助成を受けて、濾胞樹状細胞(FDC)の新規機能的マーカー:胚中心Bリンパ球(GCB)のEmperipolesis能を発見し、FDCはこの密接な細胞相互作用を介してGCBのアポトーシス感受性を変動させ、そのセレクションにも積極的に関与していると報告してきた。今回はこの研究をさらに発展させ、FDCはに再発現するRAG-1&RAG-2も制御している可能性を検索した。ただ、研究を始めてまもなく、改めてRAG-1&RAG-2が成熟Bリンパ球に特異的に再発現する事自体が疑問視されるようになり、我々の研究も依然として推敲を重ねている途中であるが、これまでの成績からいえることは、(1)ヒト扁桃の成熟Bリンパ球に明瞭なRAG-1&RAG-2の発現はない。(2)それをrIL-4/CD40で活性化させるとRAG-1&RA6-2の発現がで時折観察される。(3)しかし、FDCに包み込まれた分画Bリンパ球に発現の有意義な変動はなかった。以上のことから、FDCは胚中心のRAG-1&RAG-2発現現象に積極的に関与していないらしい。ただ、B細胞腫瘍株での検索ではRAG-1&RAG-2発現が胚中心成熟段階と関連深いことを改めて示唆しているので、意義についてはさらに現在の検出実験系の感度を上げたり、その他の遺伝子発現との総合的な検討をくわえた研究を続け、将来に成果を発表したい。今年度は胚中心Bリンパ球のRAG1 & RAG2発現調節に対して瀘胞樹状細胞が修飾作用を有している現象を見つけることに集中された。実験系が確立しやすいマウスでの瀘胞樹状細胞の分離は、それらの末梢リンパ組織であるリンパ節や牌臓が小さなことより現在極めて困難であるので、人肥大扁挑の手術材料より瀘胞樹状細胞を分離精製した。このことは同時に我々の実験が症例の状態に左右されやすく、今年度の実験結果にまだ明確な結論が出ない原因の一つである。すなわちin vitroに回収した人瀘胞樹状細胞は静止期の(IgD+)Bリンパ球を包み込み、12時間のナース時間内に、静止期の(IgD+)Bリンパ球をCD40とIL-7で刺激しRAG1&RAG2のmRNA発現を誘発させた程の明確さはかけるものの、症例によっては擬陽性と解釈できるものも確認できた。次年度には瀘胞樹状細胞とBリンパ球との反応時間の延長やSouthern blottingによる感度を上げた実験から再開して、瀘胞樹状細胞が瀘胞Bリンパ球のRAG1&RAG2の発現に影響を及ぼしている現象を明確につかみ、報告し、その後、瀘胞樹状細胞の細胞表面のどのような分子がその反応系を刺激しているのか研究を進める予定である。今年度もこの研究の基礎となる胚中心Bリンパ球のRAG1&RAG2発現調節に対して濾胞樹状細胞が修飾作用を有している現象を見つけることに集中された。しかし複数のPrimerやRT-PCRの条件等を試みたが、centrocyteに特異的な発現や、これを修飾する濾胞樹状細胞の作用を言い切るデータは結局でなかった。ところが最近のGFPをreporterとしてRAG遺伝子に組み込んでRAG発現を可視化した実験(Nature,1999)では,RAG-positive細胞は胚中心細胞の性状を保有しないといわれ、胚中心細胞のRAG発現の特異性があらためて問題になってきた。とすれば我々がこれまでCentrocyteにRAGの発現が証明できなかったのはむしろ正しかったことにもなる。一方、正常像を凍結しているリンパ腫のなかにRAG1&RAG2が特異的に発現している症例の検索を続けてきた。こちらはRAG-1がFollicular Iymphomaの全症例とDiffuse large B-cell lymphoma,T-cell or histiocyte-richの全症例に確認されており、RAGがある種の発癌に密接に関わっている新事実を示唆している。
新規カルシウム結合蛋白質peflinの性状解析と生理機能の解明

peflinは、5つのEF-handをもつpenta-EF-hand(PEF)カルシウム結合蛋白質であり、アポトーシス誘導に関与するカルシウム結合蛋白質ALG-2と同じファミリーに属す。peflinの特異的モノクローナル抗体を作製することにより、peflinは、アポトーシス誘導に関わるCa^<2+>結合蛋白質ALG-2とヘテロダイマーを形成すること、また、細胞内局在性解析の過程で、peflinが細胞質に存在するのに対して、ALG-2は細胞質と核にも存在することをすでに明らかにしていたが、本研究では、peflinとALG-2の相互作用部位を明らかにする目的で、各種欠損変異体を作製し、酵母two-hybrid法による解析をおこなった。その結果、peflin、ALG-2ともにEF-5を含むC末端領域が相互作用に必要であることが判明した。これは、EF-5はカルパインの結晶解析によりダイマー形成部位であることが分かっているが、このことはpeflinとALG-2のヘテロダイマー形成についても当てはまる一般的原理であると思われる。peflinの主な機能として、ALG-2とヘテロダイマーを形成することにより、ALG-2の安定性、局在性や機能を制御している可能性が考えられる。Peflinの相互作用因子探索のため酵母two-hybrid法によるスクリーニングを行ったが、ALG-2が陽性クローンとして得られたが、他のクローンは、擬陽性と判断された。一方、ALG-2の相互作用因子を探索した結果、peflinとともに、Alixが陽性クローンとして得られた。さらに新規相互作用因子としてアネキシンXIが見出された。欠損変異体解析よりアネキシンXIのN末端領域と結合すること、in vitroでの解析によりカルシウム依存的に結合することが明らかになった。また、アネキシンXIのN末端領域とAlixのC末端領域はアミノ酸配列に類似が見られ、共通の結合モチーフを有していることが推察された。
近世中後期における油・種物の流通構造

本研究の目的は、畿内諸都市を拠点に、畿内周辺と西日本諸国に広がる油・種物の流通構造を、生産・流通の担い手の視座から復元すること、その際に、幕府の統制政策や個別領主支配との関係も含めて総合的に描くことである。そのためには、(A)畿内諸都市における油・種物の取引構造を復元し、(B)畿内近国・西日本諸国の生産・流通構造を、i大坂等の公認の商人仲間との関係、iiその背景にある幕府の統制政策の性格、iii個別領主支配の特質、に留意して分析することが有効である。初年度にあたる2018年度は、1油の生産・流通に即して、幕府が制定した油方仕法の枠組みと、油の産地における取引の実態を突き合わせた総体的把握を目指し、219世紀における村落社会が、絞油業を組み込みつつ、どのような変化を遂げるのかを検討した((B)のうち畿内の分析)。1泉州北部から大坂に油を出荷する際、油方仕法では荷の継ぎ立てのみ許された堺の荷次が、樽の詰め替えに伴う決済も担う商慣行があったことを指摘し、法的位置づけとは関係なく、産地と大坂の取引において重要な役割を果たし続けたことを明らかにした。また、天保5(1834)年に認可された堺油市場の設立過程に注目し、実現を図った幕府官僚の動向だけでなく、取引を担う生産者や商人の利潤追求も含めて、その実現過程や、設立後に生まれた新たな矛盾を明らかにした。219世紀の村掟を分析し、地域の若者と奉公人、絞油業の出稼ぎ人がもたらす問題を検討したほか、共通する関心から、弘化3(1846)年の和泉における若者の密通と堕胎の取締りにも注目した。なお、2018年3月より2019年1月まで国際的な活躍が期待できる研究者の育成事業「周縁的社会集団と近代-日本と欧米におけるアジア史研究の架橋」(代表:大阪市立大学・塚田孝)で海外派遣されており、明治維新150年をテーマにした国際シンポジウムで口頭発表も行った。従来の油生産・流通に関する研究では、幕府による油方仕法や政策議論を中心に取り上げてきたが、今年度の研究では、とくに仕法と取引慣行との相剋や矛盾を、実際の油生産・流通の担い手に即して解明し、論文発表できた。また、新たに今年度は、絞油業に不可欠な労働者層に着目した。都市大坂と比較して、村方では出稼ぎ労働者より地域の部屋住み層の需要が高く、部屋住み層も雇用機会を独占しようとするなど、地域における労使関係の一端がみえてきた。とくに絞油業の拠点である一つの村に即して19世紀の若者問題を検討し、当時の地域社会の抱えた課題や矛盾を、村政はもちろん、村落下層の実態を含めて捉えることが可能となった。ここでは若者問題や堕胎取締を介して、絞油業という〈生産・労働〉の側面だけでなく、人口・婚姻・出産といった〈生活〉の側面へも視野を広げ、当該地域の社会構造を全体史的に把握することも目指している。絞油業には留まらない、19世紀の地域社会論を展開する可能性もみえてきた。さらに今年度中には、イエール大学やシンガポール国立大学に派遣され、一次史料の読解と英訳を行う共同研究に参加し、国際学会・シンポジウムで発表できた。またそれらの成果を基に2本の英語論文を執筆した。アメリカの歴史研究から刺激をうけ研究の視野を広げると共に、今後アメリカの若手研究者と交流を重ねる土台づくりができたことを、今後の共同研究と成果の発信に活かしていきたい。1)基礎史料調査(A)と(B)の研究計画の推進に必要な史料調査と分析を引き続き実施する。具体的には、(A)企業所蔵の大坂油問屋の文書、(B)畿内の在郷町である平野郷町、播磨国の大庄屋の家文書などの調査を予定している。2)西国諸国の先行研究収集(B)西国諸地域での油の生産・流通構造の解明を進めるにあたって、各自治体史から関係史料の収集をすすめる。3)和泉における19世紀の地域社会論初年度の成果である「史料紹介:泉州泉郡池田下村慶応3年正月村中規定連印帳」を継続し、村掟の各箇条で言及されるテーマについて池田下村の庄屋家文書である高橋家文書や森内家文書と掛け合わせた分析を進め、学会発表および論文として発表する準備を進める。