hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝性脳症における神経伝達アミノ酸のシナプトソーム代謝異常

急性肝不全モデル(ラット)を用い、前脳,脳幹,小脳の脳各部位のアンモニア濃度ならびに神経終末シナプトソームの興奮性(Glu,Asp),抑制性(GABA,Gly)神経伝達アミノ酸濃度を測定し、GluとGABAの神経膜への結合能について検討した。また、アンモニア負荷や分枝鎖アミノ酸輸液による変化についても観察し、肝不全時の脳内アミノ酸代謝の異常をより動的に把握しようと試みた。1.急性肝不全ラットの脳各部位のアンモニア濃度はいづれも血清濃度より高く、とくに前脳と脳幹でそれぞれ対照の3.4倍,4.3倍と著るしい増加を示した。2.シナプトソームの回収率は、7.2-10.1mg蛋白/g脳で、急性肝不全ラットは対照と有意差はなかった。シナプトソーム分画のアミノ酸パターンでは、Glu,GABA,Aspが高く、Gln,Gly,Tauを除く他のアミノ酸はごく微量であった。急性肝不全ラットでは、前脳のGluと脳幹のGABA濃度が低下し、前脳のAsp濃度も低下傾向を示した。一方、Glnは低濃度ながらいづれの部位でも増加傾向を示し、Glu/Glnは低下した。しかし、Glu/GABAや(Glu+Asp)/(GABA+Gly)に有意の増減は観察されず、シナプトソームのGlu脱炭酸酵素活性にも変化はみられなかった。3.粗神経膜分画とのGluの最大結合数(Bmax)は、急性肝不全ラットの脳幹で低値を示したが、Gluの解離恒数(Kd)やGABAのKd,Bmaxには明らかな変化はみられなかった。4.酢酸アンモニウム負荷により、Glu/Glnは肝不全時と同様に低下し、BCAA輸液はこれを防止した。シナプトソームの興奮性、抑制性神経伝達アミノ酸濃度の変化は、機能別,選択的低下でなく、脳内アンモニア代謝の異常より惹起された二次的変化と考えられる。シナプトソームにおける高アンモニアイオン濃度のためglutaminase活性が阻害され、Glnからの神経伝達アミノ酸の供給が減少したためと考えられた。
ラット血管および肛門尾骨筋平滑筋のノルエピネフリン収縮におけるセカンドメッセンジャーの役割

平成4年度は,ラット肛門尾骨筋およびウサギ腸間膜動脈のβ-エスシン処理スキンドファイバーを用いた実験で、α_1作動薬の収縮機構への直接作用について検討し,両筋の性格を比較した。両筋におけるCa^<2+>収縮のEC50値は1.01.5×10^<-6>Mであり,Ca^<2+>感受性に差異は認められなかった。α_1作動薬のフェニレフリン(PE)(GTP存在下)の適用により,両筋のCa^<2+>(10^<-6>M)収縮はともに増強したが,収縮増強作用の程度は肛門尾骨筋で小さかった。両筋のPE処置によるCa^<2+>-張力曲線はともに左方へ移動して増強効果が認められた。GTPアナログのGTPrsあるいはホルボールエステルのDPBの処置により,両筋のCa^<2+>収縮は増強されたが,GTPrsによる収縮増強作用はウサギ腸間膜動脈に比べラット肛門尾骨筋で小さかった。両筋におけるGTPrsおよびDPBのCa^<2+>-張力曲線はともに左方へ移動して増強効果が認められた。両筋の作動薬によるCa^<2+>収縮の増強作用は受容体拮抗薬あるいはH-7処置で有意に抑制された。これらの結果により、α_1受容体作動薬によるラット肛門尾骨筋の収縮はG蛋白質を介した収縮要素のCa^<2+>感受性を増加している可能性が示唆され,肛門尾骨筋は血管平滑筋における受容体作動薬のCa^<2+>感受性増加に比べその程度が低いことが認められた。また,これらの受容体作動薬およびホルボールエステルはH-7感受性のプロテインキナーゼCを介してCa^<2+>感受性を増加させる可能性が考えられる。これらの成績は第114回日本獣医学会(於;北海道大学)にて発表した。平成2年度は,ラットの大動脈および肛門尾骨筋における選択的なα_1受容体作動薬のフェニレフリン収縮について検討した。正常栄養液にフェニレフリン(10^<ー6>M)を適用すると,両筋はともに収縮を発生し,これらの筋はいずれも最大収縮のレベルにおいて持続した。Ca^<2+>除去液中でフェニレフリンを添加すると,一過性収縮を生じ,その後Ca^<2+>(2.5mM)を添加すると,2相性の収縮(最初の相をTonicーI,後半の相をTonicーIIとする)が両筋で認められた。フェニレフリンを適用した時の肛門尾骨筋の一過性収縮は大動脈のそれに比べ極めて小さかったが,Ca^<2+>遊離阻害剤(プロカインおよびライアノジン)により大動脈におけると同様に抑制された。両筋のTonicーI収縮はイノシト-ルリン脂質代謝阻害剤(NCDC,ネオマイシン,キナクリンおよびHー7)でそれぞれ抑制された。また,TonicーII収縮は有機Ca^<2+>拮抗剤(ニフェジピンおよびニカルジピン)処置によりそれぞれ抑制された。さらにCa^<2+>促進作用をもつBay Kー8644により,両筋のTonicーII収縮は増強された。以上の結果から,ラット大動脈および肛門尾骨筋におけるフェニレフリンを適用して生ずる収縮は3つのコンポ-ネントから成り,種々の阻害剤の適用の効果から,両筋のフェニレフリン収縮が筋小胞体のCa^<2+>遊離,Ca^<2+>の流入および収縮蛋白系のCa^<2+>感受性の増加にそれぞれ関連すると思われる成績が得られた。このうちCa^<2+>感受性の増加は,セカンドメッセンジャ-であり,かつイノシト-ルリン脂質代謝によって産生されるジアシルブリセロ-ルがプロテインキナ-ゼCを活性化する機構の関与する可能性が示唆された。この点に関しては,ラット大動脈および肛門尾骨筋の成績に定性的な差異は認められなかったが,次年度にはさらに両筋のCa^<2+>感受性の定量的な差違を比較検討する予定である。ラット大動脈および肛門尾骨筋におけるα作動薬の収縮反応は,種々の阻害剤の適用の効果から,Ca^<2+>流入,Ca^<2+>遊離および収縮蛋白系のCa^<2+>感受性の増加に関連することが前年度の研究で示された。平成3年度は、大動脈および肛門尾骨筋におけるα_1作動薬のフェニレフリン収縮のCa^<2+>感受性の変化を中心に,収縮張力とfura2法による細胞内Ca^<2+>(〔Ca^<2+>〕i)レベルの変化を同時に測定し,両筋のCa^<2+>感受性の差違について比較検討した。大動脈と肛門尾骨筋はフェニレフリンおよび高濃変K^+を累積適用すると,収縮張力と〔Ca^<2+>〕iレベルはいずれも用量依存的に増加して正の相関関係を示した。しかし大動脈において,フェニレフリンは高濃度K^+と比較して同じ〔Ca^<2+>〕i量でより大きな収縮を生じたが,肛門尾骨筋においてその差は小さかった。両筋のフェニレフリン収縮時にCa^<2+>括抗薬およびEGTAをそれぞれ適用すること,〔Ca^<2+>〕iは静止レベルかそれ以下に減少するが,収縮張力は大動脈で一部残存した。Ca^<2+>除去液中で大動脈はフェニレフリンの適用により一過性の収縮と〔Ca^<2+>〕iレベルの増加がそれぞれ観察されたが,肛門尾骨筋はこれらに対して無影響であった。

以上の結果から,ラット大動脈および肛門尾骨筋におけるフェニレフリン収縮はともに受容体を介するCa^<2+>流入に依存しているが,細胞内蓄臓部位からのCa^<2+>遊離作用との関連は肛門尾骨筋で極めて少しいことが認められた。さらに,大動脈において見られるCa^<2+>感受性の増加作用は,肛門尾骨筋では小さく,またCa^<2+>非依存性の収縮機構は存在しないと思われる成績が得られた。これらの成績により,ラット肛門尾骨筋は大動脈において見られるセカンドメッセンジャ-,特にイノシト-ルリン脂質の代謝回転による代謝物との関連性が少い特徴を有する筋である可能性が示唆された。現在、これらの点についてさらにスキンドファイバ-を用いた実験で検討中である。平成4年度は,ラット肛門尾骨筋およびウサギ腸間膜動脈のβ-エスシン処理スキンドファイバーを用いた実験で、α_1作動薬の収縮機構への直接作用について検討し,両筋の性格を比較した。両筋におけるCa^<2+>収縮のEC50値は1.01.5×10^<-6>Mであり,Ca^<2+>感受性に差異は認められなかった。α_1作動薬のフェニレフリン(PE)(GTP存在下)の適用により,両筋のCa^<2+>(10^<-6>M)収縮はともに増強したが,収縮増強作用の程度は肛門尾骨筋で小さかった。両筋のPE処置によるCa^<2+>-張力曲線はともに左方へ移動して増強効果が認められた。GTPアナログのGTPrsあるいはホルボールエステルのDPBの処置により,両筋のCa^<2+>収縮は増強されたが,GTPrsによる収縮増強作用はウサギ腸間膜動脈に比べラット肛門尾骨筋で小さかった。両筋におけるGTPrsおよびDPBのCa^<2+>-張力曲線はともに左方へ移動して増強効果が認められた。両筋の作動薬によるCa^<2+>収縮の増強作用は受容体拮抗薬あるいはH-7処置で有意に抑制された。これらの結果により、α_1受容体作動薬によるラット肛門尾骨筋の収縮はG蛋白質を介した収縮要素のCa^<2+>感受性を増加している可能性が示唆され,肛門尾骨筋は血管平滑筋における受容体作動薬のCa^<2+>感受性増加に比べその程度が低いことが認められた。また,これらの受容体作動薬およびホルボールエステルはH-7感受性のプロテインキナーゼCを介してCa^<2+>感受性を増加させる可能性が考えられる。これらの成績は第114回日本獣医学会(於;北海道大学)にて発表した。
在宅痴呆性老人家族介護者の自己強化のプロセスとその促進要因の仮説化と検証

在宅痴呆性老人家族介護者の自己強化のプロセスおよびその促進要因を明らかにするため、16名の家族介護者に対するインタビュー調査および872名の家族介護者に対する質問紙調査を行った。その結果、以下の点が明らかになった。1.インタビュー調査により家族介護者の自己強化とは、介護者が困難な介護体験を乗り越え、自己を強化するプロセスであり、そのプロセスには、(1)確かさ(2)変更(3)受容(4)広がりの4段階が仮定された2.インタビューデータを基に自己強化項目・促進要因項目・ストレス項目を作成し、質問紙調査を行った。504名(57.8%)の有効回答データの因子分析により、自己強化の4因子構造が確認され、(1)確かさ(α=0.94)(2変更(α=0.90)(3)受容(α=0.83)(4)広がり(α=0.76)を見出すことができた(全体のα=0.88)。その寄与率は69.5%(累積寄与率:69.545)であった3.自己強化合計点は、ストレス得点と弱い負の相関があった(r=-0.09)4.重回帰分析により、自己強化の各段階への規定要因として次の要因が統計的に有意であった。(1)確かさへの規定要因:受け止め、理解、病気認識(2)変更への規定要因:受け止め、心身余裕(3)受容への規定要因:受け止め、理解、限界認識、痴呆の人との関係安定(4)広がりへの規定要因:受け止め、理解、心身余裕。以上の結果から、家族介護者の自己強化のプロセスの各段階に応じた支援の必要性が示唆された。在宅痴呆性老人家族介護者が、困難な在宅介護を乗り越え、介護を自己の人生に肯定的に意味づけていくプロセスとその促進要因を明らかにする目的で、6名の在宅痴呆性老人家族介護者にインタビューを行い、分析を行った。分析の枠組みは、文献検討に基づき、Masteryの概念を用いた。その結果、在宅痴呆性老人家族介護者は、【確かさ】【変更】【受容】【拡がり】といったプロセスを経て、自己を広げ、介護を自己の人生に肯定的に意味づけていっていた。また、その各プロセスを促進する要素として、<介護負担観からの脱却の願い><他の介護者との比較による自己の介護状況の客観化><痴呆という病気の受け入れ><痴呆性老人との関係性の変化><家族の会の仲間の支え><自分だから介護できたという確信><家族内の関係性の変化>等が抽出できた。今後の課題は、対象者を更に増やし、詳細な事例分析を行っていくことである。在宅痴呆性老人家族介護者12名に対し、介護を乗り越えて自己を強化して行くプロセスとその促進要因を明らかにするために、インタビューを行なった。その結果、介護を乗り越えて自己を強化して行くプロセスとして、1.確かさ:自己を保持しながら、介護をめぐる自己状況を客観視し、介護の葛藤を調整して自己の確かさを信じようとする2.変更:介護をめぐる人や施設に働きかけて介護のストレッサーを減らそうとする3.受容:変えられないものを変えようとするのではなく、介護の現状を受け入れたり、気持ちを切り替えて、前進しようとし、また他者への思い遣りを育む4.広がり:痴呆の介護という体験によって、自己の新たな能力や見方・自己効力に気づくとともに、他者との新たな関係の構築が生じる。そして、介護を新たな人生の意味の獲得に転換しようとする、の4段階が見出された。また、各段階の促進要因としては、確かさに対して<気持ちの吐き出し><気持ちの共感><介護仲間による自己肯定>、変更に対して<ケアマネージャーによる自己肯定><介護仲間による気持ちの理解

>、受容に対して<心身のゆとり><同じ境遇で頑張る介護者の存在><介護仲間による苛立ちの容認>、広がりに対して<新しい人との出会い><夫の無理解><自分だから介護できたという友人からの言葉><他の痴呆老人に上手く対応できた実感><介護仲間からの自分の強さの評価>があった。在宅痴呆性老人家族介護者が困難な介護を乗り切るためにどのような自己強化のプロセスがあり、またその促進要因は何かを分析するため、前年度までの研究成果にもとづく仮説から質問項目を作成し、504名の介護体験者の回答に対し因子分析および重回帰分析・共分散分析等を行った。その結果、(1)因子分析により自己強化の4因子構造が抽出され、その内容から(1)確かさ(α=0.94)(2)変更(α=0.90)(3)受容0.83(α=0.83)(4)広がり(α=0.76)を見出すことができた(全体のα=0.88)。これらの4要素と自己強化合計点とは、中程度の相関が見られた。確かさ(0.421、p<0.01)・変更(0.698、p<0.01)、受容(0.391、p<0.01)、広がり(0.432、p<0.01)。また、4要素の自己強化合計点への説明力は、64%であった(調整済みR2乗値=0.639)。これらのことから、自己強化のプロセスの4段階が存在する可能性が示唆された。(2)自己強化のプロセスの各段階を促進する要素として1)確かさの促進要因:(1)受け止め(2)理解(3)病気認識2)変更の促進要因:(1)受け止め(2)心身余裕3)受容の促進要因:(1)受け止め(2)心身余裕(3)理解(4)関係安定4)広がりの促進要因:(1)受け止め(2)理解(3)心身余裕が統計的に有意であった。
肥満による脂肪組織の慢性炎症に対する運動効果:その分子機構とマクロファージの役割

運動トレーニングは、内臓脂肪の酸化ストレスと、マクロファージ関連の炎症性アディポカインの発現を減少させた。酸化ストレスの低下は、抗酸化酵素の上昇によっていた。さらに、運動トレーニングはマクロファージによる細胞性免疫反応を増強し、一酸化窒素産生能を亢進して、感染防御能を高めることが示唆された。脂肪組織に対する効果は、皮下脂肪よりも内臓脂肪に強く現れる事実は、運動トレーニングが生活習慣病の予防・治療に有用であることを示唆する。平成19年度は、次の基礎実験を行った。1.脂肪組織の酸化ストレスに対する運動トレーニングの影響を検討した。ラットをコントロール(C)群とトレーニング(T)群(週5日、9週間のトレッドミル走)に分けた。T群の皮下組織には差がみられなかったが、副睾丸、後腹膜周囲の脂肪組織の活性酸素量はC群と比較して有意な低値を示した。また、T群の脂肪組織のmonocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)、TNF-αのタンパク量が減少し、MCP-1は血中濃度も低下した。さらに、MCP-1の発現に重要であり、酸化ストレスによって制御されるextracellular signal-regulated kinase(ERK)のリン酸化と転写因子c-fosのタンパク量もT群で減少した。以上のことから、運動トレーニングは酸化ストレスを軽減することにより、炎症性アディポカインによる脂肪組織の炎症反応を抑え、生活習慣病を予防・改善する可能性が示唆された。2.経口血糖降下薬・グリクラジドは、成熟脂肪細胞の核抽出物におけるproxisome proliferator-activated receotor γ(PPARγ)のDNA結合能を低下させ、転写活性にも作用することを明らかにした。こうして、グリクラジドは、細胞内情報伝達系を制御することによって肥満の予防.治療にも寄与することが示唆された。3.ライチ由来新規低分子ポリフェノールは、高脂肪食による肥満マウス・脂肪組織において抗酸化作用を示し、炎症性サイトカイン遺伝子の発現抑制作用もみられ、肥満の予防・改善に有効なツールになることが示唆された。平成20年度は、これらの成果をベースにして、肥満による脂肪組織とマクロファージの慢性炎症に対する運動効果を追求したい。平成20年度は、19年度の実績をベースに次の実験を実施した。1.脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の脂肪及び血管内皮細胞への分化に対する運動トレーニングの影響を検討した。運動トレーニングは、ラットに週5日、9週間のトレッドミル走を行った。その結果、運動トレーニングは、ADSCの脂肪細胞への分化を抑制し、血管内皮細胞への分化を促進させることによって、脂肪組織当たりの脂肪細胞数の減少と血管内皮細胞数の増加を引き起こすことが示唆された。2.急性運動による脂肪細胞の脂肪分解反応のメカニズムをラットのトレッドミル走により検討した。その結果、運動直後、3時間後に観察された脂肪分解反応の亢進は、ホルモン感受性リパーゼタンパク質のリン酸化の増加と、その後の細胞内局在変化により調節されることが示唆された。一方、24時間後のアゴニストによる脂肪分解反応の有意な低下は、この時間にみられるβ_2-アドレナリン受容体(β_2AR)発現の低下に起因すると考えられた。3.トレッドミルを用いた運動トレーニング(週5日、3週間)による自然免疫系におけるマウス・マクロファージ機能の修飾を検討した。その結果、運動トレーニングによるマクロファージβ_2ARの発現量の低下は、誘導型一酸化窒素合成酵素の発現を増強し自然免疫系での殺菌能を亢進した。加えて、細胞性免疫を司る1型Th(Th1)反応は細胞内感染防御に重要な反応であることから、運動トレーニング群のマクロファージに認められたTh1反応誘導性サイトカイン(TNF-_α、IL-12、IFN-_Y)産生能の上昇は、細胞性免疫応答における感染防御能の増強を示唆した。4.ライチ由来新規低分子ポリフェノールは、マウスの強制水泳による疲労を酸化ストレスの増加を抑制することによって軽減した。こうして、運動と脂肪組織とマクロファージの有機的なトライアングル関係を提案し、ある程度実証することができた。
2003年7月九州豪雨災害に関する都市-環境社会学的研究

平成17年度からの調査研究の成果を研究成果報告書にまとめた。調査対象地である大宰府市国分区は新興住宅地、飯塚市飯塚地区は中心市街地であるため、そのような地域特性との関わりを重視した観点から、各々の地域に固有の災害に対する脆弱性や災害後の社会過程を実証的に分析し、災害現象の地域類型論的な考察を行った。眼目は以下の通りである。第1は、平時の生活構造と災害時の社会的対応の関連性についてである。この点について、主に質問紙調査のデータに依拠して分析を行い、コミュニティ的な基盤が豊かな地域・社会層ほど緊急時の社会的対応に関して良好なパフォーマンスがみられたことを明らかにした。第2は、防災上の課題についてである。この点について、国分に関しては、同地が都市化する過程で生じた土地利用のあり方(山林、ため池、用水路の共同管理様式)の変化や、住民構成の混住化に伴う地域社会統合の弛緩といった事態に注目し、それらのことが災害の発生機構、緊急時の社会的対応ご災害後の防災まちづくり活動にどのような影響を及ぼしたのかについて分析を行った。飯塚については、ここ2030年間に進んだ中心市街地における商店街組織と町内会の分離(それに対応した地域の担い手層の分化)、そして近年になって深刻化しつつある中心商店街の衰退といった事態に注目し、それらが災害後の防災まちづくり活動に及ぼした影響について分析を行った。また、両地域に共通する防災行政の課題として、防災施策をまちづくり施策の乖離、基礎自治体の自主裁量権の少なさ、「開発」をめぐる施政方針と住民意識の齟齬、といった問題を取り上げた。最後に、災害調査から得られた上述のような諸知見が、都市社会学的研究や環境社会学的研究とのかかわりでどのような意義をもちうるかについて検討した。1.福岡県太宰府市国分区と飯塚市飯塚地区を対象にヒアリングを中心とした実地調査を行い(各4回)、両地区の被害と対応に関する情報収集につとめた(熊本県水俣市については、1度現地視察を行ったが、諸般の事情から調査対象地に加えることは断念した)。新興住宅地(国分)と中心市街地(飯塚)という地域性の差異に対応して、被害や対応のあり方、復興のための社会経済的条件に関して顕著な差異を見出すことができた(近々、報告書にまとめる予定)。2.災害復興や防災の問題は、狭義の災害復旧・防災事業だけでなく、当該地域の既存の地域課題と関連づけて幅広い視点から捉える必要があると考え、国分区については「混住地域におけるコミュニティ形成」、飯塚地区については「中心市街地の空洞化と活性化」といった地域課題に注目することにした。この点に関する情報収集に努め、太宰府市(国分)については「2003年九州水害の社会学的研究(1)-太宰府市における開発とコミュニティ-」と題する報告書にまとめた。3.災害社会学、都市社会学、環境社会学の関係について文献的研究を行い、その一応の成果を「災害の都市社会学と環境社会学」と題する論文にまとめた。4.来年度は、コミュニティ調査と災害調査を一体化したような内容の質問紙調査(「防災とコミュニティに関する意識調査」)を実施し、防災の地域的条件に関する理解をさらに深めていく予定である。そのため、調査経験の豊富な都市社会学者と災害社会学者から専門的知見の提供を受けて調査票の作成に取り組み、完成させた。また、調査対象者のサンプリングに必要な選挙人名簿の閲覧について、両市の選挙管理事務局に申請を行い、許可を得ることが出来た。1、2006年7月に、福岡県太宰府市国分区、飯塚地区を対象に「防災とコミュニティに関する意識調査」を実施した。調査対象者は選挙人名簿で無作為抽出し、郵送法で調査票を各500票配布し、国分区174票、飯塚地区157票、計331票の回収を得た。住所不明・対象者不在票が27票あったため、有効回収率34.9%(331/973)であった。単純集計結果を冊子にまとめ、調査結果の返送希望者91名に返送した。現在、データの分析中である。2、大宰府市における今回の土砂災害と高度成長期以降の開発政策との関連性について調査研究を行い、その成果を「2003年九州水害の社会学的研究(1)-大宰府市の開発とコミュニティ-」と題する調査論文にまとめた。また、その要点を地域社会学会第31回大会で報告した。3、太宰府市と飯塚市の災害による被害状況、災害後の社会的対応過程、現在の復興状況や直面している課題について比較分析を行い、その成果を「2003年九州水害の社会学的研究(2)-被害と対応の地域間比較-」と題する調査論文にまとめた。また、その要点を日本都市社会学会第24回大会で報告した。4、研究成果報告書の全体的な枠組を明確化する目的から、災害社会学の代表的な先行研究をレビューし、その到達点と課題について検討し、その成果を「災害の都市社会学-学史的整理と課題-」と題する論文にまとめた。近々、大学紀要に投稿する予定である。

第1は、平時の生活構造と災害時の社会的対応の関連性についてである。この点について、主に質問紙調査のデータに依拠して分析を行い、コミュニティ的な基盤が豊かな地域・社会層ほど緊急時の社会的対応に関して良好なパフォーマンスがみられたことを明らかにした。第2は、防災上の課題についてである。この点について、国分に関しては、同地が都市化する過程で生じた土地利用のあり方(山林、ため池、用水路の共同管理様式)の変化や、住民構成の混住化に伴う地域社会統合の弛緩といった事態に注目し、それらのことが災害の発生機構、緊急時の社会的対応ご災害後の防災まちづくり活動にどのような影響を及ぼしたのかについて分析を行った。飯塚については、ここ2030年間に進んだ中心市街地における商店街組織と町内会の分離(それに対応した地域の担い手層の分化)、そして近年になって深刻化しつつある中心商店街の衰退といった事態に注目し、それらが災害後の防災まちづくり活動に及ぼした影響について分析を行った。また、両地域に共通する防災行政の課題として、防災施策をまちづくり施策の乖離、基礎自治体の自主裁量権の少なさ、「開発」をめぐる施政方針と住民意識の齟齬、といった問題を取り上げた。最後に、災害調査から得られた上述のような諸知見が、都市社会学的研究や環境社会学的研究とのかかわりでどのような意義をもちうるかについて検討した。
メディアの協調性に関する実験的研究-メッセージの認知バイアスの検討-

メッセージから好意が知覚されると受信者の協調的反応が促進されるが、特に非言語メッセージの意図短資にはネガティビティ・バイアスが生じやすいことが示されている(佐々木・大渕、2002)。本研究では、メディア・コミュニケーションの協調性を検討やるため、メディアを介して伝達されるメッセージの認知バイアスのメカニズムを探った。好色的意図が知見されにくいという認知バイアスは、電話型会話とTV電話型会話のように言語・非言語メッセージが連合処理されるメディアにおいて生じ、映像を伴うメールのように言語・非言語メッセージが非連合に処理されるメディアにおいては生じないことが示されている(佐々木、2005a)。連合処理型のメディアでは、言語情報の処理能力が低い方が、非言語メッセージをネガティブに知見しやすいことからも佐々木、2005b)、情報処理システム漣胎a理型・搦吏胎便R型)と受信者の間轍回Hの能力がメッセージの認知バイアスに影響することが予想された。本研究の実験では、情報処理システム要因として、連合処理型メディア音声、音声+映像)と非連合処理型メディア(メール+映像)の3水準、被験者の言語処理能力として日本語版RSTが測定され(苧阪、2002)、高RST、低RSTの2水準が設定された。これら2要因と非言語メッセージの認知バイアスの関連を検討するため、非言語メッセージの好意性(ポジティブ、ネガティフ)を要因とし、意図の好意性知見を従属測度として実験を行った。その結果、連合処理型のメディアでは言語処理能力によって非言語メッセージの好意性知覚にバイアスが生じることが示さ、非連合処理型のメディアではこのバイアスが見られなかった。これらの結果から、非言語メッセージによってメディア・コミュニケーションの協調性を促進するためには、受信者の言語処理の認知的負荷を低くすることが必要だと結倫づけられた。本研究では、メッセージの認知バイアスが生じる条件を実験的に明らかにし、どのような伝達機能を備えたメディアが協調的相互作用を生じやすいのかを検討するものである。本年度は、これまでの研究では葛藤のある状況での相互作用において非言語メッセージの好意性認知バイアスが見出されたが、非言語メッセージの認知バイアスがどのような状況でも生じるのかどうかを再検討した。まず、メディアにおいて行う相互作用のシナリオを作成した。佐々木・大渕(2002)の実験では、被験者は会話相手である実験協力者から援助を求められるが、援助を行うと被験者は不利益をこうむるという葛藤のあるシナリオであった。本研究では、こうした利害が不一致である状況と、被験者と実験協力者が共同作業を行う利害が一致する状況のシナリオを設定した。予備調査を行った上でシナリオを作成し、予備実験を行ってこれら二つのシナリオを評定した。評定値を分析して両者ともに同程度のリアリティと両者の間で利害の一致度に有意差が見られることを確認する。更に、音声チャネルにおいても映像チャネルにおいても非言語メッセージの協調性の水準を保てるように実験協力者を訓練した。本年度は、高性能のマイクとオーディオミキサー、音声分配器、デジタルデッキを備えて被験者の音声会話の反応を測定した。実験協力者(被験者の会話相手)の非言語メッセージの好意性を実験要因とし、被験者は敵意非言語条件あるいは好意非言語条件において実験協力者と会話を行った。その結果、実験協力者が異なる場合であっても、これまで見出されたものと同様に非言語メッセージの意図帰属においてネガティビティ・バイアスが生じていることが示された。また、意図帰属が好意的であるほど被験者の経験する感情は強調的であった。本年度で確認されだ結果をもとに、来年度以降は音声会話だけでなくTV電話会話を行い、どのような条件で非言語メッセージの認知バイアスが生じるのかを明らかにする。本年度は、昨年度の予備実験によって新たに作成されたシナリオを用いて実験を行った。本年度の実験では、協力場面においても非言語メッセージの認知バイアスが生じるかどうか、そのバイアスは用いられるメディアによって違いがあるかどうかを実験的に検討した。実験要因は、非言語メッセージの好意性(好意、敵意)とメディア(音声、TV電話)および被験者のワーキングメモリ(高、低)であった。音声会話は、高性能のマイクとオーディオミキサー、音声分配器、デジタルデッキを備えて被験者の会話の反応を測定した。TV電話会話は、音声会話装置に加えて映像分配器、モニター、カメラを設置して音声と表情が伝達される会話を行なった。その結果、協力場面であっても、これまで見出されたものと同様に非言語メッセージの意図帰属においてネガティビティ・バイアスが生じていることが示された。非言語メッセージが好意的であるほど被験者の経験する感情は協調的であった。また、メディアの要因では、TV電話の方が敵意帰属や怒り感情の経験が強く見られる傾向があった。ワーキングメモリに関しては、ワーキングメモリが高群の被験者の方がワーキングメモリ低群の被験者よりも好意的な意図帰属を行なうことが示唆された。これはワーキングメモリの必要量が異なるメディア間では、相互作用の協調性に違いが生じることをうかがわせる。本研究では、メディアとワーキングメモリの交互作用は見られなかった。これは、本研究のメディア要因では、TV電話と電話であったため、両者のあいだで必要なワーキングメモリの量がそれほど顕著ではなかったからであろう。

来年度以降は、e-mailの交換システムを導入し、新たなメディア・コミュニケーションとの比較研究を行なう。本研究において明らかにされた会話中のワーキングメモリと相互作用の協調性との関連について来年度はさらに検討を進める予定である。メッセージから好意が知覚されると受信者の協調的反応が促進されるが、特に非言語メッセージの意図短資にはネガティビティ・バイアスが生じやすいことが示されている(佐々木・大渕、2002)。本研究では、メディア・コミュニケーションの協調性を検討やるため、メディアを介して伝達されるメッセージの認知バイアスのメカニズムを探った。好色的意図が知見されにくいという認知バイアスは、電話型会話とTV電話型会話のように言語・非言語メッセージが連合処理されるメディアにおいて生じ、映像を伴うメールのように言語・非言語メッセージが非連合に処理されるメディアにおいては生じないことが示されている(佐々木、2005a)。連合処理型のメディアでは、言語情報の処理能力が低い方が、非言語メッセージをネガティブに知見しやすいことからも佐々木、2005b)、情報処理システム漣胎a理型・搦吏胎便R型)と受信者の間轍回Hの能力がメッセージの認知バイアスに影響することが予想された。本研究の実験では、情報処理システム要因として、連合処理型メディア音声、音声+映像)と非連合処理型メディア(メール+映像)の3水準、被験者の言語処理能力として日本語版RSTが測定され(苧阪、2002)、高RST、低RSTの2水準が設定された。これら2要因と非言語メッセージの認知バイアスの関連を検討するため、非言語メッセージの好意性(ポジティブ、ネガティフ)を要因とし、意図の好意性知見を従属測度として実験を行った。その結果、連合処理型のメディアでは言語処理能力によって非言語メッセージの好意性知覚にバイアスが生じることが示さ、非連合処理型のメディアではこのバイアスが見られなかった。これらの結果から、非言語メッセージによってメディア・コミュニケーションの協調性を促進するためには、受信者の言語処理の認知的負荷を低くすることが必要だと結倫づけられた。
モモにおけるオーキシン生合成機構の解明と軟化制御への応用

普通モモの果実は成熟期になるとオーキシン含量が増加し、エチレン生合成経路の酵素遺伝子(PpACS1)の発現を誘導する。PpACS1によって生成されたエチレンは、細胞壁修飾等に関わる酵素遺伝子発現を誘導し、これらの酵素の働きによって果肉硬度が低下する。本研究では、普通モモにオーキシン生合成阻害剤処理を行うことで、エチレン生合成と軟化の抑制が起こることを明らかにした。また、モモ軟化時の肉質に影響を与えると推測された酵素のアイソジーンについて発現様式を解析した結果、酵素のアイソザイム3がモモのメルティング質に深く関与する可能性が示唆された。モモ果実には、成熟期にエチレン生成量が増加し軟化する溶質モモと、エチレン生成量が増加せず軟化しない硬肉モモがある。これまでに申請者らは、硬肉モモ果実では、成熟後期にIAA内生量が増加しないため、エチレン生成量が増加せず軟化しないことを明らかにした。本年度は硬肉モモ果実成熟後期におけるIAA生合成経路における変異箇所を明らかにすると共に、溶質モモ果実においてIAA生合成阻害剤処理による軟化抑制効果を明らかにした。これまでの解析により、硬肉モモ果肉におけるIAA内生量の低下は、IAA生合成経路に問題が生じている可能性が高いと考えられる。そこでIAA生合成経路における欠損箇所を明らかにするために、IAA生合成主経路の中間体であるIPA(インドール-3-ピルビン酸)等の内生量について調べた。その結果、モモにおけるオーキシン生合成はシロイヌナズナで報告されているものと同じ経路であることが明らかとなった。また、その経路において硬肉モモではIAAの前駆体であるインドール-3-ピルビン酸(IPA)が蓄積していたことから、IPAからIAAを合成する酵素YUCCAに変異が生じている可能性が示唆された。溶質モモの軟化制御のために、オーキシン生合成阻害剤を処理した。過去に効果の認められた剤を用いて年次変化について調べたところ、前回と同様にエチレン生成および軟化抑制の効果は認められた。一方、新たに開発された剤を用いたところ、抑制の傾向は見られるものの有意な差ではなかった。これまでに、一般的なモモでは軟化初期にオーキシンの生合成量の増加が始まり、増加したオーキシンによってエチレンの生成が誘導され、エチレンによって誘導されたポリガラクチュロナーゼなどの細胞壁修飾酵素の作用によってモモの軟化が起こることを明らかにした。硬肉モモとよばれるモモは一般的なモモとは異なり、成熟果実におけるオーキシン生成が起こらないため、エチレンの生成が起こらず軟化しない。硬肉モモはエチレンを外的に処理をすることによって、果肉硬度は低下するものの、粉質化が起こり肉質が悪いため商品価値は低いと考えられてきた。モモの軟化にはオーキシンが関与していることが明らかになったことから、モモの肉質にも影響を及ぼしている可能性が考えられた。そこで、本年度はモモの肉質に及ぼすオーキシンの影響を明らかにするために、硬肉モモにオーキシン処理またはエチレン処理を行い、肉質の違いや貯蔵中の変化、細胞壁修飾酵素遺伝子発現について解析した。モモ軟化時の肉質に影響を与えると推測された細胞壁修飾酵素のアイソザイムを3種類単離して遺伝子発現変動について調べた。1および2の発現様式は、一般的なモモと硬肉モモの果実生育過程において違いは認められなかった。一方、3は溶質モモの果実成熟後期(軟化期)に発現量が増加したが、硬肉モモでは増加しなかった。しかし、硬肉モモにオーキシン処理をすると発現量が増加した。これらの結果からオーキシンは果実軟化時のメルティングと呼ばれる肉質に関与していると考えられ、それには細胞壁修飾酵素が直接関与していることが推測された。普通モモの軟化初期にはオーキシン生合成量が増加することでエチレンが誘導され、果肉硬度が低下することを明らかにしてきた。硬肉と呼ばれるタイプのモモは成熟期において果肉でオーキシン生合成量が増加しないため、エチレンが誘導されず、硬いままである。硬肉モモにエチレン処理をすると細胞壁修飾酵素が誘導され、果肉硬度は低下するものの粉質化する。昨年度までに、モモの軟化に影響を与えると考えられる細胞壁修飾酵素を単離し、これらの遺伝子発現が硬肉モモにオーキシン処理をした時の違いを解析したところ、酵素3がメルティングと呼ばれる肉質に関与していることを明らかにした。今年度は普通モモの粉質化とこれらの酵素の発現に関わる影響について解析をした。普通モモは低温貯蔵した後に、常温へ戻すことで粉質化が起こる。粉質化を軽減する処理を行った区ではオーキシン生合成に関わる酵素の発現量が高い傾向を示した。しかし、粉質化に関わる2種類の細胞壁修飾酵素の発現様式は硬肉モモを人為的に粉質化させた時とは異なる傾向を示した。

また、モモ軟化時の肉質に影響を与えると推測された酵素のアイソジーンについて発現様式を解析した結果、酵素のアイソザイム3がモモのメルティング質に深く関与する可能性が示唆された。モモの硬さにオーキシンが関与していることは既に明らかにしていたが、肉質にも直接影響を及ぼしていることを明らかしたことから、おおむね順調に進展していると評価した。園芸科学肉質に関わる遺伝子の一端は明らかになったが、網羅的解析はできていない。従って、今後、これまでに確認した以外の細胞壁修飾酵素についても発現変化を明らかにする。モモのオーキシン生合成経路等については、これまでに全く知見がなかったが、本研究では生合成経路の中間体を測定することによって、アラビドプシス等で報告されている経路が主要経路であることが明らかとなった。更に硬肉モモはIAAの前駆体であるIPAの蓄積が認められたことから、YUCCAの変異体であることが明らかとなった。YUCCAの変異体モデル植物等で解析されているだけで、モモ果実において発見したことは世界で初めてである。このように、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。平成25年度に予定していたRNAseq解析を行わずして軟化に関わるオーキシン生合成の一端を明らかにすることができたために、平成26年度は予定よりも予算が多くなっていた。平成26年度はモモの肉質との関係を明らかにするために、遺伝子単離、シークエンス解析等の高額な試薬を購入したが、マイクロアレイの網羅的解析やモモ肉質変化の生化学的な解析に至らなかったため残額が生じた。硬肉モモのでは、オーキシン生合成の欠陥により果肉硬度が高く保たれることが明らかとなったが、オーキシンは果肉硬度だけでなく、肉質にも影響を及ぼす可能性が示唆されている。従って、今後はオーキシンがモモ肉質に与える影響について、分子生物学的手法を用いて、特に重点的に解析する予定である。平成26年度に行えなかったマイクロアレイによる細胞壁修飾酵素の網羅的解析、モモ肉質変化の生化学的な解析に用いる予定。当初の計画では、オーキシン生合成中間代謝産物を測定による変異箇所の推定と平行して、次世代シークエンサーによる発現mRNAの全塩基配列の決定をすることで、硬肉モモIAA生合成に関与する因子を特定する手法を想定していた。しかし、オーキシン生合成中間代謝産物の測定に成功したために、原因箇所を特定することができたため、次世代シークエンサーによる発現mRNAの全塩基配列の決定を行う必要がなくなった。従って次年度使用額が生じた。オーキシンがモモ肉質に及ぼす影響を明らかにするために、肉質に関与する細胞壁軟化関連酵素の網羅的な解析をする予定で、マイクロアレイ解析およびシークエンサーによる塩基配列の決定に使用する予定である。
外科領域における再生医学に関する基盤的研究

単離した肝および膵細胞集団の中から多能性を持つ幹細胞を、FACS(fluorescence activated cell sorter)とモノクローナル抗体を用いた精度の高い細胞分離法により純化・回収し、それらの分化・増殖機構を解析するとともに操作技術を開発することを目的として研究を行った。肝再生誘導法の確立に関しては、既に確立していた肝幹/前細胞画分であるc-Kit-CD49f+CD29+CD45-TER119-細胞の分離技術をさらに進展させ、自己複製能をも有する多能性肝幹細胞であるc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞の純化法を確立した。このc-Met+c-Kit-CD49f+/lowCD29+CD45-TER119-細胞が、肝細胞や胆管細胞だけではなく膵細胞や腸管上皮細胞への分化の可塑性をも有していることも明らかにした。今後、糖尿病治療への応用などの可能性を検討する。膵再生誘導法に関しては、膵前駆細胞のクローナルな培養系を検討し、今後膵幹細胞の同定・分離に用いることの可能な解析系を確立した。ES細胞の分化誘導に関しては、胚様体を介した肝細胞への分化誘導が可能であることを確認した。今後、肝臓へ内胚葉へ分化決定されたES細胞由来の細胞の分離を試みる。
新規スクリーニング法が築くC.elegans microRNA標的遺伝子の全体像

microRNA(miRNA)は22塩基程度のRNAであり、mRNAの3'側非翻訳領域(3'UTR)と塩基対合し、標的となる遺伝子の発現を抑制する。miRNA研究は様々な生物にて行われており、線虫C.elegansでも150種以上のmiRNAが発見されているが、ほとんどのmiRNAについて機能は明らかになっていない。miRNA機能の理解には標的遺伝子を知ることが重要であり、C.elegansにおけるmiRNA標的遺伝子全体像の解明を目標に、新たに考案したスクリーニング法の開発を進めた。この方法は、標的mRNAに結合した内在性miRNAをプライマーとする逆転写反応によりcDNAを合成し、対象とするmiRNAの配列を用いたPCRを組み合わせることで、対象miRNAの標的遺伝子に由来するcDNAをクローン化するものである。C.elegans lin-4 miRNAを対象に行ったところ、既存の標的遺伝子であるlin-14の3'UTR配列からなるクローンを多数得ることができた。未知標的遺伝子の同定も試み、C.elegans let-7 miRNA変異体が示す致死表現型に関わる標的遺伝子を探したところ、得られたクローンの中からK10C3.4遺伝子を以下の結果より同定した。まず、K10C3.4プロモーターによりレポーター遺伝子が発現する組織の一部は、let-7遺伝子の発現組織と重なる。この発現は3'UTRをK10C3.4のものに置き換えると抑制されるが、この抑制はlet-7変異体では部分的に解除される。let-7変異による致死は、標的遺伝子発現抑制の欠如による標的遺伝子タンパク質の異所産生によると考えられるが、K10C3.4遺伝子に対するRNAiによりタンパク質産物を枯渇させると、少数の個体が致死表現型を示さず生き延びた。逆にK10C3.4遺伝子の導入株にてこの遺伝子産物を強制産生させると、少数個体がlet-7変異体様の致死表現型を示し、K10C3.43'UTRまで含む遺伝子の導入株では、この表現型を示す個体の割合は低下した。
哺乳類繊毛・鞭毛の機能多様性に基づく最先端構造解析

ほとんどの真核細胞は繊毛・鞭毛と呼ばれる細胞小器官を持っている。近年の研究によって、繊毛・鞭毛を構成する全蛋白質が報告されたが、繊毛の機能や構造は存在する組織によって多様であり、その構造学的な違いは良く分かっていない。本研究課題では特に、マウスの様々な組織・器官に存在する繊毛・鞭毛に着目し、電子顕微鏡を用いた3次元構造解析を行った。その結果、気管繊毛と精子の鞭毛の3次元構造が明らかとなり、機能の違いと構造の関連性が解明されると期待している。また、繊毛構造の異常は様々な病気に関与しており、繊毛疾患(Ciliopathy)の原因解明や治療法の開発などに向けた基礎的な研究となる事が期待される。真核生物の繊毛・鞭毛は様々な組織・器官に存在し、各組織の機能に応じて運動性や構造が異なっている事が知られている。また、原発性繊毛機能不全症と呼ばれる様々な疾患にも関わるため、医学・生理学的にも重要な細胞小器官の1つである。本研究課題では、哺乳類マウスの様々な組織に存在している繊毛・鞭毛に着目し、その3次元構造をクライオ電子線トモグラフィー法によって明らかにすると同時に、それぞれの構造を比較することである。今年度は、九州大学・生体防御医学研究所のFEI製Tecnai Polara、及び名古屋大学の同機種を用い、加速電圧300kVで複数の繊毛・鞭毛の傾斜画像シリーズを得ることに成功した。撮影の際、傾斜角度やフォーカスのずれを緻密に調整することによって、より詳細な3次元構造を得ることに成功した。マウス精子鞭毛に関しては昨年度得られたものよりもさらに詳細な3次元構造を得ることができた。その結果、基本的な内部構造は気管の繊毛とそれほど変化はないものの、細かな構造に違いがあることが分かった。また、精子鞭毛には軸糸構造の周辺部に存在するOuter Dense FiberやFibrous Sheathと呼ばれる精子鞭毛の持っている特有な構造もさらに詳細に確認することが出来た。精子鞭毛のラジアルスポークは気管繊毛で観察されたものと同様、96nm周期中に3本あることが分かり、その一部の構造の中には気管繊毛と異なる構造があることが観察された。一次繊毛に関しては、NIH3T3細胞を培養し、一次繊毛の存在を確認し、単離方法や回収方法を改善した。今後の3次元構造解析によって気管繊毛や精子鞭毛との違いが解明されるものと期待される。近年、真核生物の「繊毛・鞭毛」と呼ばれる細胞小器官が、外部流体を形成するために周期的に運動し、目的の場所に移動するための駆動力(エンジン)としてだけでなく、外部からの化学・力学的な環境変化を感知するための「細胞のセンサー」でもある事が分かってきている。また、原発性繊毛機能不全症と呼ばれる様々な疾患にも関わるため、医学・生理学的にも重要である。本研究課題では、主に哺乳類マウスを用いて、気管繊毛、精子鞭毛、一次繊毛の3つの繊毛・鞭毛に着目し、その3次元構造をクライオ電子線トモグラフィー法によって解析すると同時に、その構造と運動性の違いの関連性を検証したいと考えている。現在まで、東北大学でマウスの精巣上体尾部から運動性を持つ精子を単離し、光学顕微鏡観察で運動性を確認後、膜処理を行い軸糸構造を単離出来た。この精子の除膜サンプルを九州大学生体防御医学研究所でクライオ電顕サンプルを作成し、加速電圧300kVのFEI製Tecnai Polaraを用いて電子顕微鏡観察と3次元構造解析のための傾斜情報の取得を試みた。その結果、複数の傾斜情報サンプルを得ることに成功し、3次元再構成を行うことによって軸糸構造やその周辺にあるOuter Dense Fiber (ODF)の3次元構造を確認することが出来た。軸糸構造内には外腕ダイニンや内腕ダイニンの他、ラジアルスポークや中心対微小管構造も確認することが出来たが、今後さらに詳細な構造解析を行う予定である。一次繊毛に関しては、現在までNIH3T3細胞の培養システムを構築出来、効率的に継続して培養する研究環境を整えることが出来た。今後は精子鞭毛の画像解析を行いより詳細な構造解析を行うと同時に、一次繊毛の3次元構造解析を行う予定である。応募時の研究目的に沿った研究計画の通りに、概ね順調に研究が進行している。平成24年度の当初の目標にあるように、クライオ電子線トモグラフィー法によるマウス精子鞭毛の傾斜情報を得ることに成功し、その傾斜情報から画像解析によって3次元再構成を行い、3次元構造を得ることに成功した。

この3次元構造は今後画像解析を工夫することによって、当初考えていたよりも、さらに分解能の高い構造を得ることができるのではないかと期待している。申請者は、マウスの精巣上体尾部の摘出や精子の単離、精子の運動の光学顕微鏡解析などは初めての経験であったが、問題なく達成することができた。哺乳類の精子鞭毛の3次元構造は、今までに全く報告がなく、本研究で世界で初めての新たな知見が得られるものと期待される。また、当初の計画にはなかった、鞭毛の外側の構造であるOuter Dense Fiber(ODF)の構造も観察することができ、新しい研究の道筋も得ることが出来た。一次繊毛に関しては、当初の予定通り、一次繊毛収集、サンプル調整のための研究設備の構築や培養技術の習得など、こちらも申請者には初めての経験であったが、問題なく達成することができた。よって、本研究の達成度合いは、おおむね順調に進んでいると言って良い。平成25年度は昨年構築した培養システムと培養技術を駆使し、NIH3T3細胞から一次繊毛の単離と収集を行う。NIH3T3は比較的増殖速度が速く、早い周期で一次繊毛の回収を行うことができるはずである。先ずは、培養シャーレ、510個分からどの程度の効率で一次繊毛が単離できるのかを試みる。単離方法は2通り考えており、1つはポリエルリジンを塗ったガラス板を細胞表層(一次繊毛のある面)に軽く押し当て、ガラス表面に吸着させ単利する方法と、もう一つは、Caショック法により単離する方法を試みる。どちらか効率の良い方法で、その後の研究を進める予定である。ある程度一次繊毛が回収でき次第、昨年と同じく、九州大学の生体防御医学研究所にサンプルを持っていき、クライオ電子顕微鏡のための凍結サンプルを作る。凍結サンプルは、やはりFEI製Tecnai Polaraを用いて傾斜情報の取得を試みる。細かな作業は精子の場合と全く同じやり方で行えるものと予想している。傾斜情報が得られたら、当研究室の画像解析システムで3次元再構成を行い、3次元構造を得る。得られた構造は、気管繊毛、精子鞭毛と比較し、その詳細な構造の違いについて調べる。このことにより、繊毛・鞭毛の多様な運動様式の一端が解明されるものと期待している。次年度の研究費については、主にサンプル調整のための試薬代、プラスチック消耗品代、電子顕微鏡観察のためのピンセット、観察用グリッドなどの消耗品類、細胞培養のための培地の費用、電子顕微鏡観察のための九州大学への出張費などに当てる予定である。また、研究成果を広くアピールするために学会発表のための出張費用や関連する研究者に意見や議論をするための出張費用などにも使用する。また、投稿論文や関連書籍への掲載料など、研究成果発表のための費用として使用する予定である。
種子貯蔵タンパク質液胞輸送機構の迅速解析システムの構築

昨年度、ボンバードメント法による遺伝子導入と落射型蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡観察を組み合わせることにより、GFPを用いたトランジェントアッセイシステムを開発した。そして、本方法によりダイズβ-コングリシニンα'サブユニットのC末端24残基が液胞輸送に重要な働きをしていることを示した。本年度は、さらに詳細な解析を進め、α'サブユニットのC末端10残基が液胞中の区画であるマトリックスへのシグナルとなっていることを明らかにした(Nishizawa et al.,Plant J.,2003,in press)。GFPを用いたアッセイ系に加えて、各種貯蔵タンパク質欠失ダイズに、ダイズ貯蔵タンパク質の遺伝子を導入し、間接蛍光抗体法によって輸送部位を同定するアッセイ系の構築を試みた。この方法を確立することにより、ダイズ種子貯蔵タンパク質の輸送機構をダイズ種子中で詳細に解析することが可能となる。まず、一般的な品種を用いて、内在性のダイズ種子貯蔵タンパク質(グリシニン及びβ-コングリシニン)を間接蛍光抗体法によって検出するための条件(固定時間、固定試薬、グリシニン及びβ-コングリシニンの抗体濃度、蛍光ラベルした二次抗体の濃度、抗体反応時間など)を検討した。その結果、グリシニン及びβ-コングリシニンの両抗体により、両タンパク質の液胞への局在を特異的に検出する条件を確立した。この条件をもとに、グリシニンを欠失しているダイズ種子に、グリシニンの遺伝子をボンバードメント法により導入し、発現タンパク質の検出を試みた。しかし、グリシニンを欠失しているダイズ種子の内在性タンパク質とグリシニン抗体とが非特異的に反応したため、導入したグリシニンの発現を検出できなかった。今後、使用する抗体の最適化を行うことにより、本アッセイ系を完成できるものと考えている。本研究では、種子細胞特異的に制御されている種子貯蔵タンパク質の液胞輸送シグナル及びその機構を迅速かつ簡便に解析するシステムの構築を目的とする。本年度は、まずボンバードメント法により、緑色蛍光タンパク質(GFP)をレポータータンパク質として用い、遺伝子が導入された細胞の特定法を検討した。まず、N末端にダイズβ-コングリシニンのシグナルペプチド、そしてC末端に小胞体局在化シグナルあるいはレクチンの液胞輸送シグナルを融合させたGFPの遺伝子を、ダイズβ-コングリシニンのプロモーター下流に挿入したプラスミドを構築した。そして、それらの遺伝子をボンバードメント法により、登熟期ダイズ種子に導入した。導入後、暗所において、25°C、24-48時間インキュベートしたのち、両刃剃刀を用いて切片を調製した。広範囲で遺伝子が導入された細胞を特定するために、共焦点レーザー顕微鏡観察を行う前に、落射型蛍光顕微鏡により遺伝子導入された細胞をスクリーニングした。20-50個の細胞に1つくらいの割合で、遺伝子が導入された細胞を特定できた。さらに、GFPが観察された細胞について共焦点レーザー顕微鏡観察を行った結果、C末端に小胞体局在化シグナルあるいはレクチンの液胞輸送シグナルを融合させたGFPはそれぞれER及び液胞への局在が観察された。また、コントロールとして行ったC末端に両シグナル共に融合させていないGFPは、細胞間壁まで運ばれていた。これらの結果は本方法により、種子貯蔵タンパク質の液胞輸送シグナルを登熟期種子細胞を用いて解析することが可能であることを示している。そこで、本方法によりダイズβ-コングリシニンα'サブユニットのC末端24残基をGFPに融合させた遺伝子を登熟期ダイズ種子に導入し、その細胞内局在性を解析したところ、液胞への局在が観察された。このことから、α'サブユニットのC末端領域が液胞輸送に重要な働きをしていることが明らかとなった。来年度は、各種貯蔵タンパク質欠失ダイズを用いた間接蛍光抗体法を確立し、種子貯蔵タンパク質液胞輸送機構の迅速解析システムを完成させる予定である。

しかし、グリシニンを欠失しているダイズ種子の内在性タンパク質とグリシニン抗体とが非特異的に反応したため、導入したグリシニンの発現を検出できなかった。今後、使用する抗体の最適化を行うことにより、本アッセイ系を完成できるものと考えている。