hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
欧米史上におけるマイノリティとその迫害・差別・救済の比較史的研究

研究分担者個人のレヴェルにおいてみるとき、如上の課題について、今年度はかなりの成果をあげることができたと考えている。とくに、前年度やや弱体であった中世史の分野で、2名の研究分担者をあらたに加えることができ、調査・分析の不足を補いえたのは、おおきな前進であった。しかしながら、さまざまな時代・地域に関する各自の事例研究を持ち寄り、つきあわせ、比較・検討の視点を確認し、問題の共通の構造や独自性・特殊性について認識を深めあうという、共同研究としての達成については、依然として所期の目的を充分はたしえていない。研究分担者の個別研究が進むにつれて、検討事項が予想を越えて増大したことが、最大の理由であるが、この点は早急に克服されねばならない。次年度は最終年度であるので、報告・討議を集中的に行って、総合的な考察をまとめるための論理を構築していきたい。各自の研究成果はあがってきていると思われるので、鋭意議論を重ねていけば、共同研究の実をあげることができるはずである。研究計画の最終年度は年度の前半に各研究班ごとに集中的に報告・討議を行ない、各分担者の成果を検証し、総合的な共通の認識の確立に努めた。共同研究の成果の集大成と公表にむけて討論を重ね、また相互の原稿のつきあわせをしながら報告書を完成させた。各分担者の報告テーマは以下の通り。中井義明「ギリシア人の異民族意識-リュディア人の場合-」大戸千之「古代ギリシアにおける身体障害の問題」小田内隆「12世紀ルネサンスとユダヤ人」芝井(山辺)規子「中世ボローニャにおける外国人学生の問題」石坂尚武「説教例話における悪魔の機能」今関恒夫「マイノリティとしてのロラード」谷口健治「近代ドイツの女性労働」松原広志「ロシアにおける仏教」山田史郎「アメリカ移民史研究とエスニシティ」中谷猛「フランス第三共和政のマイノリティ・ユダヤ人問題について」佐藤卓巳「ドイツ新聞学における反ユダヤ主義問題-ノエル・ノイマン論争の意味」米山裕「アメリカの日本移民社会」高橋秀寿「スキンヘッドヘッド-ドイツにおけるマジョリティのなかのマイノリティ」
密結合マルチプロセッサ上のElastic Barrierの性能評価

本研究は密結合マルチプロセッサ上での実用的な規模のアプリケーションに対するElastic Barrier機構の有効性を定量的に評価することを目的としていた。ElasticBarrierを効率的に使用する最適化コンパイラのプロトタイプの開発、アプリケーションに対するシミュレーションによる定量評価、Elastic Barrierを実装したマルチプロセッサプロトタイプの作製、の三通りのアプローチで研究を行った。最適化コンパイラのプロトタイプは初期バ-ジョンが完成し、その最適化コードを利用したElastic Barrierの効果について報告発表を行った。また、対象とするアプリケーションを増やして従来のシミュレーションによる評価も実施した。この結果、細粒度並列性を使用してスピードアップを達成するアプリケーションに関しては非常に効果が高いことが判明した。粗粒度並列性のみで十分なスピードアップが達成されるアプリケーションに対しては、めざましい効果は得られなかったが、Elastic Barrierの使用がスピードダウンにつながることはなかった。シミュレーションでは評価不可能な規模のアプリケーションに対する評価を可能にするために、Elastic Barrierを実装した密結合マルチプロセッサプロトタイプ「お茶の水1号」の研究開発も行った。「お茶の水1号」は4台のRISCプロセッサからなる密結合マルチプロセッサであり、完成時のピークパフォーマンスは600MIPS,400MFLOPSである。交付された予算の大半はこのプロトタイプ作製の部品となるField Programmable Gate Array(FPGA)の購入に使用された。このプロトタイプの設計並びに各機能の性能見積りについては報告発表を行った。しかし、現在デバッグ中であり、2CPU分の2枚の基板が動作しているが、並列処理動作を行う段階までは達していない。本プロトタイプ上でElastic Barrierの性能データが取れ次第、公表していく予定である。
一貫した情報教育の評価の客観化におけるファジィ分析の導入

本研究は,経験的把握による授業評価の分析を客観的に実施することを主眼とし,学習者側から見た授業評価と合わせて,教師の主観的情報を科学的に処理できるファジイ理論による授業分析法の確立を目的とした。これらは,生徒個人やグループあるいはクラス全体の学習定着度の検討や授業評価の分析,教授行動と学習定着度の関係,および情意面を含んだ評価の客観化をはかるものである。クラスター・因子の両分析と,ファジイ分析で,情報教育の学力向上に必要なこととして,特に前者では「興味・関心・意欲」が,後者では「態度」という「情意面」があげられ,その上で「知識・理解」という「知性面」が構成されていた。このことは,中学・高校・大学一貫して情報教育は,一般的・情意的信頼,教科指導力,すなわち「教科内容の段階化」「教科内容への目的意識・意欲」「専門内容の平易な教授と実習指導」が必要であることを示している。これは,すなわち問題として上げられた「カリキュラムの充実」をはかることがまず大切であることが言える。これらの調査から,生徒・学生の学力向上が人間的接触・実技指導・理論的指導という具体的な教科指導力に影響し,クラスター分析,因子分析で得られた結果を,さらにファジイ分析を用いることにより学力の定着と意欲,興味・関心という情意面が教師の指導力と共に深く関係していることが明確にされた。この2年間の研究では,「興味・関心」などの因子が各学習者に共通して,教師の人間としての接触が深く関わっていることがわかった。今後の研究方向としては,ファジイ分析の新たな展開,例えば従来のファジイ測度とメンバーシップ関数による分析に加えてファジイグラフやファジイ積分,時間の経過と実践後の様子を含めた3次元的分析を広く一般教育の中で行う必要があろう。本研究は,高校と大学の情報教育を対象として,情意領域の評価を中心に,クラスター分析で評価の妥当性を確認し因子分析による評価を比較検討した後,ファジイ分析(ファジイ測度とメンバーシップ関数)を用いた分析を行った。【情報教育の因子分析】S評価(生徒自身の評価)では,第1因子「技能熟練」,第2因子「技能の確認」,第3因子「学習の心構え」を示し,T_1評価(教師の教授行動の評価)では,第1因子「理論と実習の確認指導」,第2因子「学習の心構え」,第3因子「技能向上指導」を示し,T_2評価(教師の一般教授行動の評価)では,第1因子「意欲的取り組みの指導」,第2因子「信頼関係の育成」,第3因子「生徒の能力を考慮した実習指導」を示した。【情意領域のファジイ分析】ほとんどのメンバーシップ関数値は0.7以上で,各因子と比較すると,第1因子「知識・理解・技能」のメンバーシップ関数の平均は0.7,第2因子「態度」のメンバーシップ関数の平均は0.8,第3因子「興味・関心・意欲」のメンバーシップ関数の平均は0.9となり、第1因子,第2因子,第3因子の順にメンバーシップ関数値が高くなっている。【本年度のまとめ】ファジイ分析(メンバーシップ関数)による評価では,学力定着は,特に生徒の意欲と興味・関心という情意面が教師の熱意と指導力に,深く関係していることを示した。また,学力定着に必要な授業の要素とは,熱意と指導力(信頼)であり,具体的には,「教科内容の段階化」「教科内容への目的意識・意欲」「専門内容の平易な教授と指導」などである。つまり,ファジイ分析と従来のクラスター・因子分析では,情報技術教育の学力向上に必要なこととして,情意領域の中で特に前者では「態度」という「情意面」が,後者では「興味・関心・意欲」があげられ,その上で「知識・理解」という「知性面」が構成されていると考えられる。本中間報告は,生徒の学力向上は人間的接触・実技指導・理論的指導といった具体的な教科指導力に影響し,またファジイ分析と、クラスター分析,因子分析を比較するところによれば,学力の定着と意欲,興味・関心という情意面が教師の指導力と共に関係していることを明確にするものである。これらの調査から,生徒・学生の学力向上が人間的接触

・実技指導・理論的指導という具体的な教科指導力に影響し,クラスター分析,因子分析で得られた結果を,さらにファジイ分析を用いることにより学力の定着と意欲,興味・関心という情意面が教師の指導力と共に深く関係していることが明確にされた。この2年間の研究では,「興味・関心」などの因子が各学習者に共通して,教師の人間としての接触が深く関わっていることがわかった。今後の研究方向としては,ファジイ分析の新たな展開,例えば従来のファジイ測度とメンバーシップ関数による分析に加えてファジイグラフやファジイ積分,時間の経過と実践後の様子を含めた3次元的分析を広く一般教育の中で行う必要があろう。
多様な解消原因（解除、撤回、無効・取消し）にもとづく原状回復義務の総合的研究

契約解消原因、契約類型、当事者属性などの多様性を踏まえた、原状回復義務の内容の理論的明確化、異同の有無の検討をする。とりわけ、明文規定が置かれることになる、無効・取消しの場合、若干の改正が施される解除、これも新規定が置かれる消費者撤回権の諸場合の検討が中心となる。各解消原因に対応する清算義務の内容の異同の現状分析、その正当性の検討、原状回復義務統合論の検討、原状回復義務の個別内容(収益返還、費用償還)の検討、消費者契約清算の場合の特殊性の検討が個別の課題である。具体的論点としては、とりわけ、従来議論も多く、重要な、契約目的物の滅失損傷の場合のあるべき処理に関する提案を目標とする。
骨吸収抑制剤の開発を目指した破骨細胞形成シグナルの解明

骨吸収を担う破骨細胞の過度な活性化や分化は骨粗鬆症やリウマチ等の疾患を悪化させる。そこで骨吸収抑制剤の開発を目指し破骨細胞分化シグナルについて解析し受容体RANKのHCRと呼ぶ部分が分化に必須であることを見出し、さらにHCRに結合してHCRとともに破骨細胞分化に関与するタンパク質候補を同定した。また、化合物ライブラリーを用いて、これらのタンパク質の機能を阻害することにより骨吸収抑制剤として働く可能性のある薬剤の探索を開始した。破骨細胞形成特異的シグナル同定のためHCR結合タンパク質の探索を計画した。はじめに酵母ツーハイブリット法や免疫沈降法を実施する際のベイトの検討を行った。当研究室田口ら(Genes Cells,2009)が決定したHCRにFLAGタグを結合させたペプチドをレトロウイルスにより破骨前駆細胞に発現させたところ、RANKL刺激による破骨細胞誘導が顕著に抑制されるとともにNF-kBやNF-ATc1等RANKL刺激依存的な活性化も抑制された。これらの結果は、用いた長さのHCRペプチドにシグナル伝達に必要なタンパク質が結合している可能性を強く示唆している。この結果に基づいて、現在酵母ツーハイブリット法、免疫沈降法によるHCR結合タンパク質の探索に加えて、大腸菌で調整したリコンビナントHCRペプチドを用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによる結合タンパク質精製を実施している。一方、RANK受容体の細胞内局在については、RANKの細胞質内領域に蛍光タンパク質Venusを融合させたキメラタンパク質を破骨前駆細胞に発現させ、RANKL刺激することによりRANKが刺激依存的にエンドゾームへ移動することが明らかとなった。現在、HCRを欠損させたキメラタンパク質を同様な実験系を用いてその刺激依存的な挙動を解析している。また、Raw細胞における遺伝子発現抑制については、shRNAの標的配列に依存するものの成功しつつあり、今後さらに条件検討を進める。骨吸収抑制剤のスクリーニング系についてはNF-kBの制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーターをRaw細胞に発現させ、条件検討を行っている。研究計画を遂行し以下の結果を得た。1)酵母ツーハイブリッド法の条件設定が難しいので、HCR複合体を精製し、この構成因子を質量分析計により解析するため、TAPタグ付きHCRを恒常的に発現するRaw細胞を作成した。2)HCRのN末端側21残基とC末端側41残基に相当するオリゴペプチド(Nペプチド、Cペプチド)をそれぞれ発現させて同様に検討したところ、どちらを発現させてもNF-κB/MAPKsの活性化とNFATc1の発現誘導が顕著に抑制され、形成される破骨細胞数が減少したため、両方のオリゴペプチドに分化抑制能が有ることが示唆された3)平成21年12月.RANK受容体が刺激後24時間以降に細胞内へ移行し破骨細胞誘導シグナルを誘起する可能性が判明したので、それを検証するため免疫染色法等を用いて再評価する必要が生じた。この発見は受容体が細胞内局在を変化させることで新たな細胞分化シグナルを誘起することを示す点で破骨細胞形成特異的シグナルの分子機構の解明を目的とする本研究の成果を飛躍的に発展させる可能性があるので本科研費の一部を繰越した。その結果、免疫染色方および蛍光標識した受容体を用いて刺激後24時間でRANK受容体がエンドゾームに移行することが明らかになり、細胞内取り込み後の複合体形成に解析系の確立が進んだ。4)骨吸収抑制剤のスクリーニング系についてはNF-kBの制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーターをRaw細胞に発現させ、条件検討を継続している研究計画を遂行し以下の結果を得た。1)TAPタグ付きHCRを恒常的に発現するRaw細胞を作成し、RANKL刺激後のHCR複合体を精製し、この構成因子を質量分析計により解析した。複数に候補因子が同定されたので、それらの破骨細胞形成における役割を現在RNAi法等により解析している。2)これまでの成果からHCR領域は、受容体の細胞内への取り込みを促進することにより、破骨細胞形成に必須は長期継続シグナルを伝達すると考えていた。ところが受容体自身の挙動を解析したところ、HCR領域を持たない受容体は刺激後迅速に分解されるのに対してHCR領域を有する受容体は安定に存在することを強く示唆するデータを得た。これらの成果はHCR領域が受容体のリソゾームによる細胞内分解を制御する機能を有する可能性を示唆しており非常に興味深い。3)NFATc1により発現誘導するCathepsin-Kプロモーターの制御下にディフテリア毒素を発現するレポーターを組み込んだRaw細胞を作成した。この細胞はRANKL刺激で通常のシグナルが伝わるとディフテリア毒素が発現して細胞が死滅する。この細胞に遺伝子の不活化を起こすレンチウイルスを感染させたところRANKL刺激で死滅しない細胞が複数出現した。これはレンチゥイルスがRANKLシグナル伝達に必須な因子を不活化したと考えられ、新たな破骨細胞形成因子の同定へと進む可能性がある。

4)HCRを大腸菌で大量に発現することに成功したので、化合物ライブラリーを用いて結合する化合物を質量効果を利用した表面プラズモン共鳴(SPR)で検出する。
熱加工シミュレーション支援ナレッジシステムの構築

本研究で開発を目的としている熱加工シミュレーション支援ナレッジシステムは、研究代表者が開発したシミュレーションソフトおよび既存商用ソフト(ABAQUS, MSC. Marc, SYSWELD, ANSYS, FINAS)を対象とし、これらを高度に利用するためのノウハウをインターネットを通して研究者、技術者に提供するものである。その構成要素は、各種要素モデル(物理モデル、幾何モデル、材料モデル、熱源モデル、積層モデル、境界条件モデル、評価モデル)と熱加工シミュレーション支援ナレッジを格納および発信するコンピュータシステムに大別され、これらについて平成14年度では、以下の研究を実施した。(1)ナレッジベースのシステムの調査として、構造設計ならびにシステム設計分野で実績のある大学・企業の研究者と研究会を開催し、熱加工シミュレーション支援システムへの適用性を調査した。また、この調査結果に基づき、平成13年度において概念設計を行ったコンピュータシステムに対して、新たに、最新のインターネット技術である、ディレクトリ・サーバを導入したシステムの概念設計ならびに基本システムの構築を行った。(2)対象を、TIG溶接による多層板継溶接に絞り、幾何、熱源、積層、境界条件、評価モデルを作成するために一連の数値シミュレーションを実施した。また、Inconel690合金を対象とした多層板継溶接時において問題となる、延性低下割れの問題について、本ナレッジシステムの適用性の検討を行った。(3)曲面薄板構造物の溶接組立に対象として、これまで組立時のノウハウとして用いられてきた、ギャップや目違いを統一的に取り扱えるシミュレーションソフトを開発し、その適用性の検討を行った。本研究で開発を目的としている熱加工シミュレーション支援ナレッジシステムは、研究代表者が開発したシミュレーションソフトおよび既存商用ソフト(ABAQUS, MARC, SYSWELD, ANSYS, FINAS)を対象とし、これらを高度に利用するためのノウハウをインターネットを通して研究者、技術者に提供するものである。その構成要素は、各種要素モデル(物理モデル、幾何モデル、材料モデル、熱源モデル、積層モデル、境界条件モデル、評価モデル)と熱加工シミュレーション支援ナレッジを格納および発信するコンピュータシステムに大別され、これらについて平成13年度では、以下の研究を実施した。(1)ナレッジエンジニアリングの現状に関する調査を実施し、知識の蓄積および有効活用のための具体的方法について検討を行った。(2)コンピュータシステムの構築に関しては、インターネットを通じて自由にアクセス可能なデータベースに関する調査を実施し、概念設計を行った。(3)物理モデルに関連しては、商用ソフトの調査を目的として、ソフトの供給企業、利用企業、大学の研究者をメンバーとする熱加工シミュレーション研究会を開催し、解決すべき問題点について検討した。(4)材料モデルに関して、溶接構造用の各種材料の材料定数の温度依存性を文献調査しデータベース化のためのデータ収集を行った。(5)対象を、アーク溶接による1パスの板継溶接と隅肉溶接に絞り、幾何、熱源、積層、境界条件、評価モデルを作成するために一連の数値シミュレーションを実施した。
ミクログレナ属藻類（緑藻綱）の分類学的見直しと好塩性・好冷性の系統進化

水中には多数の微細藻類が生息しているが,多様な微細藻類の棲み分けや,進化過程はほとんどわかっていない。そこで本研究では淡水・汽水・海水などに幅広く分布するミクログレナ属(Microglena;緑藻類)に着目し,その分類を進めると共に,それぞれの種の生育・生存可能な塩分濃度や温度,類縁関係について調べ,形態および増殖特性の進化を明らかにすることを目指す。
γ-セクレターゼの阻害剤の探索と光アフィニティーラベル法による構造解析

アルツハイマー病の発症の要因であるβ-アミロイド(amyloid β-protein, Aβ)は、前駆体タンパク(amyloid precursor protein, APP)のβ-セクレターゼ及びγ-セクレターゼによる2段階の切断を受けて生成することが知られている。これらセクレターゼに対する強力な阻害剤はアルツハイマー病治療薬として期待される。本研究は、多様なγ-セクレターゼ阻害剤の合成とその合成化合物を用いた機能の解明を目指している。強力なγ-セクレターゼ阻害剤として知られるDAPTをリード化合物として選択し、部分構造を可変した化合物を検討したところ、C端のブチルエステル部分をアミドにしたものには活性が保持されることがわかった。その結果を基にして、我々が独自に開発した固相を活用したコンビナトリアル合成へと展開した。合成ライブラリーの活性評価の結果、ベンゾフェノンアミドとした化合物は活性がDAPTの10100倍程度増強されることが明らかとなった。この結果により光アフィニティーラベル研究への展開も可能となった。すなわち、ベンゾフェノン基は光照射により近傍の官能基とクロスリンクが容易なため、光アフィニティーラベルの親和性基としても多用されている。さらに、我々はリガンド分子に光親和性基とビオチンタグを簡便に導入する新規合成方法論を独自に開発することで、DAPT誘導体の光アフィニティープローブ合成に成功した。現在、膜蛋白各分(γ-セクレターゼ)とのクロスリンク実験の結果、22Kdaの蛋白の検出を達成している。
電気二重層の異常誘電応答を利用した高密度電荷貯蔵

本研究は、キャパシタの高エネルギー密度化を目指し、キャパシタンスを増大させる新指針として「電気二重層の誘電率制御」を提案する。対象として、MXene(マキシン)と総称される層状化合物に着目する。MXeneは、層間に挿入された溶媒和イオンが電気二重層を形成し、キャパシタ電極として機能する。平成30年度において、Ti2CTx、Ti3C2Tx、Mo2CTxなど様々な組成を持つMXeneについて水系電解液での充電放電反応機構を調べたところ、ルイス酸性が強いカチオン種が水和された状態でMXene層間に閉じ込められ、電荷貯蔵を行うことが明らかとなった。更に、カチオン種のルイス酸性が強くなるほど水和水は強くナノ層間に閉じ込められ、電子とイオンが形成する電場は水の双極子分極と共鳴して過剰遮蔽を示すことが理論と実験の協業から明らかとなった。過剰遮蔽の結果、水分子は外部電場に対して負の誘電率を持つこととなり、高密度な電荷貯蔵を実現することに成功した。この結果はNature Communications誌に掲載され、プレスリリースを行った結果、化学工業日報1面に掲載された。ルイス酸性が強いカチオンと共に閉じ込められた水分子の負の誘電応答を利用した高密度電荷貯蔵を更に拡張するために、電位窓が拡大する高濃度水系電解液とMXeneの組み合わせを行った。その結果、従来型の電解液と比較し、3倍のカチオンを充電することに成功し、大幅なエネルギー密度の増加を実現した。この特異的な高密度イオン貯蔵は、理論計算の結果でも証明された。特に、水和イオンはナノ空間に超高密度で閉じ込められており、更なる水和水の異常誘電応答が期待される。MXene層間に閉じ込められた水分子が負の誘電率を持ち、その異常誘電応答を利用することで1.7倍の電荷貯蔵を実現することに成功した。更に、高濃度水系電解液とMXeneを組み合わせることで電荷貯蔵を更に3倍することにも成功しており、当初の計画を超える成果が得られている。MXene層間のイオン貯蔵について、水和水を用いた大幅な高密度化、高濃度水系電解液を用いた高密度化に成功しているが、一方で、高濃度電解液におけるカチオンーアニオン相関によるイオン易動度の低下が問題となっている。今後は、カチオンーアニオン相関を低減する方策を検討するとともに、MXene-高濃度電解液における律速段階を実験と理論の両面から追求し、その課題解決を図る。
トロンビン受容体の活性制御異常の分子機構解明と新たな動脈硬化治療戦略の開発

動脈硬化の発症・進展に関わるトロンビン受容体の機能について以下の成果を得た。1.トロンビンはトロンビン受容体PAR1を介してミオシン軽鎖のリン酸化を引き起こし、内皮細胞透過性を亢進させる。2.細胞辺縁部におけるミオシン軽鎖2リン酸化とアクチン線維束形成が内皮透過性亢進に重要な役割を果たす。3.血管病の形成に重要な役割を示すトロンビン受容体の脱感作障害(反応の持続性・反復性・不可逆性)モデル細胞を確立した。4.酸化ストレスと細胞外シグナル調節キナーゼERKが脱感作障害に関わることを明らかにした。1.脱感作障害の分子機構を明らかにする。脱感作モデル細胞として確立したラット大動脈平滑筋細胞A7r5は、トロンビン反応の持続や、PAR1活性化ペプチドによる反応性の繰返しを有した。この反応に対してRho kinase阻害剤は効果がなく、トロンビン受容体の脱感作障害にRhoキナーゼは関与しないことが明らかとなった。一方、NADPHオキダーゼ阻害剤およびERK阻害剤は、PAR1活性化によるCa2+反応を、一過性、非反復性、可逆性の反応に転換した。以上の結果から、PAR1の脱感作障害には酸化ストレスとERKが重要な役割を果たすことが示唆された。2.動脈硬化症の初期病変形成から進展に亘るトロンビン受容体の役割を明らかにする。トロンビン刺激は、内皮細胞の血管透過性亢進(バリアー機能破綻)や平滑筋細胞の増殖を惹起して動脈硬化初期病変形成に重要な役割を果たす。内皮細胞をトロンビン刺激すると、ミオシン軽鎖1リン酸化と2リン酸化が増加し、2リン酸化とアクチン繊維束形成が細胞膜直下に生じることを見出した。本年度はアデノウイルス発現系を用いて内皮細胞の透過性亢進におけるミオシン軽鎖1リン酸化と2リン酸化の役割を明らかにした。透過性亢進には、細胞膜直下における1リン酸化とアクチン繊維束形成だけで十分であること。しかしながらトロンビンによる透過性亢進は、2リン酸化を抑制した場合にのみ改善できることを明らかにした。各種培養細胞を用いてトロンビン刺激を行いFura-2蛍光測定により細胞質Ca2+濃度([Ca2+]i)変化を測定し、反応の持続性、反復性、可逆性を指標に脱感作機構の障害を評価した。ラット大動脈平滑筋細胞A7r5は、トロンビン反応の持続や、PAR1活性化ペプチドによる反応性の繰返しを有し脱感作モデル細胞として脱感作障害の実験系を確立した。このモデル細胞を用いて、Rhoキナーゼ阻害剤の効果を検討した結果、トロンビン受容体の脱感作障害にRhoキナーゼは関与しないことが明らかとなった。本年度は、内皮細胞のバリアー機能崩壊の機序について以下の研究成果をあげた。1トロンビン刺激により、内皮細胞膜直下にミオシン軽鎖2リン酸化とアクチン束の形成が生じる。この収縮タンパク質の細胞辺縁部への局在が内皮バリアー機能破綻に重要な役割を果たすという知見を得た。2ミオシン軽鎖の1リン酸はカルシウム依存性に生じ、2リン酸はカルシウム非依存性、Rhoキナーゼ依存性に生じることから、内皮細胞においては、ミオシン軽鎖の1リン酸と2リン酸が異なる制御を受けていることを初めて明らかにした。最終年度、以下の点を明らかにした。1トロンビン受容体の脱感作機構障害のモデル細胞A7r5では、トロンビン刺激が持続的なミオシン軽鎖2リン酸化(MLC-2P)を引き起こす。2内皮細胞において、トロンビン刺激3分後には細胞辺縁部にMLC-2Pとアクチンの局在が認められ、刺激20分後にはMLC-2Pは消失しアクチン線維はストレスファイバーを形成する。全研究期間、以下のことを明らかにした。トロンビン受容体脱感作障害の研究: 1A7r5細胞はトロンビンによるCa濃度上昇反応の持続性、非反復性、不可逆性などを示し、トロンビン受容体の脱感作機構が障害されている。2A7r5細胞のMLCのリン酸化は、定常状態でも高く、またトロンビン刺激によりMLC-2Pの上昇が持続する。3A7r5細胞でのトロンビン受容体の脱感作障害には活性酸素と蛋白質リン酸化反応が関与する。

トロンビンによる内皮バリアー障害の研究: 1内皮細胞のMLC-1Pはカルシウム依存性で、トロンビンによるMLC-2Pの上昇はカルシウム非依存性、Rho kinase依存性で、MLC-1PとMLC-2Pは異なる制御受けている。2トロンビン刺激3分後の内皮透過性亢進初期には、アクチンとMLC-2Pは細胞辺縁部に局在する。3トロンビン刺激15分以降の透過性亢進の持続相では細胞辺縁部のMLC-2Pは消失し、アクチン線維はストレスファイバーを再編成する。4細胞間接着が未熟な細胞や細胞間接着を障害させた細胞では、刺激3分後でもアクチンとMLC-2Pはストレスファイバーを形成する。以上の結果から、密な細胞間接着を形成した内皮細胞において、トロンビン受容体刺激は細胞辺縁部のMLC-2Pとアクチン線維束形成と、その結果としての求心性細胞収縮力を引き起こし、これが透過性亢進の初期事象として重要な役割を果たすことが明らかとなった。医歯薬学・内科系臨床医学・循環器内科学・分子血管病態学1.トロンビン受容体の活性制御異常の分子機構の解明H24年度に確立した脱感作障害モデル細胞を用いて、H25年度は脱感作障害と酸化トレスとの関与および脱感作に関わる因子の同定を行った。その結果、トロンビン受容体PAR1の脱感作障害には酸化ストレスとERKが重要な役割を果たすことが示唆され、脱感作障害の機序にかかわる詳細を明らかにできる見通しを立てることができた。2.動脈硬化症の初期病変形成から進展に亘るトロンビン受容体の役割解明H24年度に確立したミオシン軽鎖リン酸化部位変異ミュータントのアデノウイルス発現系などを用いて、トロンビンによる血管透過性亢進における内皮細胞のミオシン軽鎖のリン酸化の役割を明らかにすることができた。さらにトロンビン受容体活性化から内皮細胞の収縮、透過性亢進に至る機序の詳細を明らかにできる見通しを立てることができた。1.トロンビン受容体の活性制御異常の分子機構の解明H24年度において、トロンビンに対する「反応の持続性」「反復性」「可逆性」を有する脱感作障害モデル細胞を確立した。この細胞を用いて脱感作障害と酸化ストレスとの関与および脱感作に関わる因子の同定を行う研究に着手した。2.動脈硬化症の初期病変形成から進展に亘るトロンビン受容体の役割解明トロンビンによる血管透過性亢進については内皮細胞のミオシン軽鎖の2リン酸化が重要であることを明らかにした。次年度からは、各種阻害剤やすでに確立しているタンパク質導入法、さらに24年度に確立したミオシン軽鎖のリン酸化解析に有効なミオシン軽鎖リン酸化部位変異ミュータントのアデノウィルス発現系などを用いてトロンビン受容体活性化から透過性亢進に至る機序の詳細を明らかにできる見通しを立てることができた。1.トロンビン受容体活性制御異常の分子機構の解明H25年度にERKの阻害により脱感作機構が回復することを明らかにした。脱感作障害モデル細胞のトロンビン受容体のリン酸化にかかわる酵素を同定する。また、GRKやβアレスチンの発現、受容体の脱リン酸化酵素の発現や活性変化などをタンパク質の阻害剤やRNA干渉法などの手法を用いて解析し、トロンビン受容体のリン酸化、脱感作に関わる分子を明らかにする。動脈硬化モデル動物などのトロンビン受容体の発現を解析し、病変形成や進展とのかかわりを明らかにする。2.動脈硬化症の初期病変形成から進展に亘るトロンビン受容体の役割を明らかにする。トロンビンによる内皮バリアー機能障害におけるミオシン軽鎖リン酸化の役割を明らかにした。
膠原病性肺高血圧症における新規治療法開発の分子基盤の構築

膠原病の難治性合併症の一つである肺高血圧症(PH)は致死性の右心肥大/右心不全を発症する。本研究では、右心肥大制御に基づいた新規膠原病性PH治療法開発の分子基盤を構築することを目的とした。転写伸長反応促進因子P-TEFbの活性を抑制するHEXIM1の心筋細胞での過剰発現は、低酸素誘導性PHマウス、ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHマウスにおいて、心筋細胞における細胞肥大抑制、心肥大関連遺伝子発現抑制、低酸素誘導因子HIF-1αの蛋白発現とその標的遺伝子発現の抑制、心室壁血管新生抑制、により右心肥大発症を抑制した。従って、HEXIM1は膠原病性PHの新規治療標的となりうると考えられた。膠原病性肺高血圧症(膠原病性PH)は、非可逆的右心肥大に引き続く致死性の右心不全を発症するいまなお予後不良の疾患である。現行治療の中心である免疫抑制療法や肺血管拡張療法では効果が不十分であり新規治療法の開発が強く望まれている。核蛋白質HEXIM1は転写伸長反応促進因子P-TEFbの活性化を抑制する分子であり、心肥大を抑制性に制御する可能性が示唆されている。申請者らは、HEXIM1は培養心筋細胞における、エンドセリン1誘導性の心肥大関連遺伝子の発現や細胞肥大を抑制することを明らかにし、さらに、心筋選択的HEXIM1-Tg(HEX-CTg)マウスは、低酸素飼育によるPHー右心肥大形成を抑制することをも明らかにした。そこで、膠原病性PH-右心肥大-右心不全病態におけるHEXIM1の意義を詳細に解明し、HEXIM1を標的とした右心肥大制御に基づいた新規膠原病性PH治療法開発の分子基盤を構築することを目的とした。既に確立した「低酸素誘導性PHモデルマウス」における右心肥大誘導に対するHEXIM1の影響を詳細に解析するため、野生型、HEX-CTgに加え、HEXIM1のP-TEFb抑制活性を消失したHEXdNLS-CTgマウスを作製・飼育し、解析を進めた。いずれのマウスおいてもPHは誘導されたが、おのおのの生存期間には有意な差は認められなかった。野生型では右心肥大、右心不全傾向が誘導されたが、HEX-CTgでは誘導されず、HEXdNLS-CTgでは誘導された。これらの結果はHEXIM1によるPHに伴う右心肥大誘導抑制作用がP-TEFb抑制作用に依存していることを示唆するものと考えられた。膠原病患者における主な死因の一つとして重要である肺高血圧症(PH)は、非可逆的右心肥大に引き続く致死性の右心不全を発症するいまなお予後不良の疾患であり、その克服が課題となっている。ここで、核蛋白質HEXIM1は転写伸長反応促進因子P-TEFbの活性化を抑制する分子であり、心肥大を抑制性に制御する可能性が示唆されている。申請者らは、HEXIM1の過剰発現は培養心筋細胞における、エンドセリン1誘導性の心肥大関連遺伝子の発現や細胞肥大を抑制し、低酸素飼育によるPHマウスモデルにおける右心肥大を抑制することを明らかにした。今回、既に確立した「低酸素誘導性PHモデルマウス」を用い、「HEXIM1は、低酸素条件下で誘導される低酸素誘導因子HIF-1αの蛋白発現量やその標的遺伝子であるVEGFなどの遺伝子発現を抑制し、右室心筋の血管新生を抑制することで右心肥大を抑制する」、ことを新たに明らかにした(Yoshikawa, Biochem Biophys Res Commun, 2014)。現在、HEXIM1のP-TEFb抑制活性を消失したHEXdNLSの心筋特異的Tgマウスを加え、ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHモデルも構築し、HEXIM1誘導薬の網羅的探索も進めている。申請者らは、HEXIM1の過剰発現は培養心筋細胞における、エンドセリン1誘導性の心肥大関連遺伝子の発現や細胞肥大を抑制し、低酸素飼育によるPHマウスモデルにおける右心肥大発症を抑制することを明らかにした。これまでに、「低酸素誘導性PHモデルマウス」を用い、「HEXIM1は、低酸素条件下で誘導される低酸素誘導因子HIF-1αの蛋白発現量やその標的遺伝子であるVEGFなどの遺伝子発現を抑制し、右室心筋の血管新生を抑制することで右心肥大を抑制する」、ことを明らかにした(Yoshikawa et al., Biochem Biophys Res Commun, 2014)。さらに、「ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHモデル」を用い、HEXIM1による膠原病性PHー右心肥大発症の抑制効果を明確にした(投稿中)。HEXIM

1誘導薬の候補薬剤も同定しており、現在、膠原病性PH-右心肥大-右心不全発症抑制効果について解析を進めている。膠原病の難治性合併症の一つである肺高血圧症(PH)は致死性の右心肥大/右心不全を発症する。本研究では、右心肥大制御に基づいた新規膠原病性PH治療法開発の分子基盤を構築することを目的とした。転写伸長反応促進因子P-TEFbの活性を抑制するHEXIM1の心筋細胞での過剰発現は、低酸素誘導性PHマウス、ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHマウスにおいて、心筋細胞における細胞肥大抑制、心肥大関連遺伝子発現抑制、低酸素誘導因子HIF-1αの蛋白発現とその標的遺伝子発現の抑制、心室壁血管新生抑制、により右心肥大発症を抑制した。従って、HEXIM1は膠原病性PHの新規治療標的となりうると考えられた。肺高血圧症モデルマウスにおけるHEXIM1の右心肥大誘導抑制作用のメカニズムに関し、新たな機構を発見し、論文として報告した。医歯薬学、内科系臨床医学・膠原病学、内分泌・代謝学、分子生物学低酸素誘導性PHモデルに加え、ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHモデルも構築した。これらのモデルを利用し、心筋細胞特異的HEXIM1トランスジェニックマウス、HEXIM1のP-TEFb抑制活性を消失したHEXdNLSの心筋特異的トランスジェニックマウスを加え、膠原病性肺高血圧症ー右心肥大ー右心不全におけるHEXIM1の意義についてさらに詳細に解析を進める。また、HEXIM1誘導薬の網羅的探索も進めている。低酸素誘導性PHモデルにおける右心肥大誘導が不十分な個体が多い。このため、野生型マウスと遺伝子改変マウスとの対比データの信頼度が低く、再実験中である。当初計画よりも進展があったため、各種消耗品の消費が早く、平成27年度に予定していた消耗品購入を前倒して実施する必要があった。そこで前倒し請求をしたが、当初の想定よりも消耗品消費を抑制することが出来、研究にも支障を来さなかったため、未使用額が生じた。低酸素誘導性PHモデルを用いたHEXIM1の役割の詳細な解析を進めるとともに、in vitro実験や他のマウスモデルである「ブレオマイシン誘導性肺線維症-PHモデル」の確立をすすめる。当初計画の平成27年度予算とほぼ同額であり、当初計画通りの使用予定とする。
突発Ｘ線・ガンマ天体の検出に特化した新しい光学系の開発

ホール・マスクとX線CCDカメラを用いる、突発X線天体検出に特化した広視野カメラのプロトタイプを製作し、銅箔マスクについて性能評価実験を行なった。厚さ25 μmの銅箔にピコ秒レーザなどを用いて最小35 μmのホール・パターンを加工し、銅箔マスクを製作した。プロトタイプ・カメラを真空チェンバー内に設置し、X線を照射し、性能評価実験を行なった。撮像データをFITS形式で取得するシステムを構築し、ホール像を再現した。また実体顕微鏡システムを用いる、マスクの検査とアライメントのための設備を設置した。成果を国内学会・国際学会で発表し、科学成果を広く知らしめる一般向け科学解説書を執筆・発行した。本研究では、X線/γ線突発現象の検出に特化した、ランダム・ホールとコリメータを組み合わせた新しい光学系を開発している。この光学系は、現在用いられている符合化マスク方式とちがって高いアライメント精度を必要としないため、カメラの大量生産と大面積化が可能である。また国際宇宙ステーションに搭載予定のγ線バースト観測装置CALET-GBMは、この研究で開発するボアサイト・カメラとγ線バースト検出アルゴリズムが共通である。共通の環境を開発・利用して両者の開発を行なっている。初年度には研究の立ち上げを行ない、マスクされたイメージを撮像するX線CCDカメラを選定し、アンドール社製裏面照射型CCD DX434BN(ピクセル・サイズ13μm、画素数1024×1024)を入手した。CCD駆動信号発生とADCには、同じくアンドール社製の提供する製品を採用し、これらはPCIカードでPCに接続可能である。制御ライブラリはLinux上で動作可能なものを用いる。青山学院大の真空槽、X線発生装置を用いて性能評価を行なう段階である。また、本光学系の観測対象である、X線連星系の変動現象の研究を行ない、特にマイクロクエイザーCyg X-3のγ線を伴うフレア現象の観測に成功した。観測結果について、天文学会などで発表した。またX線連星系の変動現象の研究結果を3篇の英文論文として発表した。さらに、科学成果の一般向けの還元・教育活動の一環として、科学解説書を2冊執筆し、発表した。ホール・マスクとX線CCDカメラを用いる、突発X線天体検出に特化した広視野カメラのプロトタイプを製作し、複数の銅箔マスクについて性能評価実験を行なった。加工はコバヤシ精密工業と協力して行なった。銅箔マスクのテスト・パターンを複数製作し、X線CCDカメラにマウントして広視野カメラのプロトタイプとした。真空チェンバー内に設置し、-40°CまでCCDを冷却し、55Fe等の密封放射線源を真空チェンバーのベリリウム窓の外、プロトタイプ・カメラの視野内に設置して、X線を照射し、性能評価実験を行なった。成果を国内学会・国際学会で発表し、科学的成果を広く知らしめる一般向け科学解説書を3冊、執筆・発行した。現在稼働中の広視野X線天体モニタ・ミッションであるMAXIによって検出された新型ノバの発見論文を発表した。本研究では、X線/γ線突発現象の検出に特化した新しい光学系を開発している。初年度の計画である、シミュレーションを用いる基本デザインからカメラの基本構造を決めた。現在、X線イメージ撮像用のCCDカメラの試験に入っている。

また、光学系の観測対象であるX線変動天体を観測し、論文、学会発表などを行なった。以上より、研究の目的の達成度は、おおむね順調であると評価される。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度分の研究目的の達成度から判断して、平成24年度分の研究目的はおおむね順調に進展していたと考えられる。次年度では、CCD撮像素子の性能評価を行ない、マスクパターンと組み合わせた位置決定能力の検証を行なう予定である。予定どおり推進する。
二次元近藤格子系の量子臨界状態と電子構造

磁気秩序が抑制された近藤格子系層状オキシプニクタイドCeFePOの磁性に対するCr置換効果を探求し、Cr5%とCr45%の近傍組成で2つの強磁性量子臨界点を確認した。CeFePOの電子比熱の増大から近藤温度12 K以下において、Kondo一重項の存在が確認された。一方、Cr20%では、6 K以下で強磁性転移の出現と電子熱容量の著しい減少が観測され、Kondoブレイクダウンが起きている。また、磁場印加により磁気相転移点の増大が確認され、強磁性相における強磁性揺らぎの存在が示唆される。また、Cr50%では、25K付近において、Feの磁気状態がスピン密度波状態に相転移していることが予想される。鉄系高温超伝導関連物質CeFePOは極低温でも磁気転移を示さないが、Ce(Fe,Ru)POでは強磁性量子臨界現象が観測される。CeRuPOの強磁性相はFe濃度の増加とともに強磁性転移温度TCが減少し、Fe濃度が85 %付近で量子臨界点(QCP)を迎える。本研究では、CeFePOのFeをRu, Cr等で部分置換した結晶を作製し、低温高磁場下における物性測定により、抑制されていた強磁性転移が発現しかかったQCP近傍物質の電子物性の本性を明らかにする。そのためには、化学組成が制御された良質結晶の作製と低温輸送現象測定が必要不可欠である。よって、初年度には3He冷凍装置による高磁場下輸送現象測定装置の立ち上げを行いながら、強磁性QCP未確認物質Ce(Fe,Cr)POを注意深く合成・同定するとともに、強磁性QCPの探索・実証を行った。注意深く合成したCe(Fe,Cr)PO(Cr置換量x≦0.75)は全て常伝導を示し、x≧0.20試料は電気抵抗極小現象を示した。x=0.07-0.38の試料は強磁性を示し、最高のTCはx=0.30で10.8 Kであった。Cr置換に伴う格子定数a, cの増大によりCeO層と(Fe, Cr)P層の層間距離が増加し、伝導電子と局在した4f電子間の混成による近藤カップリングが抑制されている。57Feメスバウアー分光の結果、x=0.10, 0.20の試料は4.2 Kまで四重極分裂のダブレットのみを示し、Ce(Fe,Cr)POに発現する強磁性はCe由来によるものである。一方でx≧0.50の試料ではTCが2 Kまで観測されず、RKKY相互作用の符号反転によりCe原子の基底状態が強磁性から反強磁性に変化している。したがって、Ce(Fe,Cr)POでは、Cr置換量0.05≦x≦0.07および0.38≦x≦0.50に強磁性QCPが存在していると考えられる。二次元近藤格子系CeFePOを母物質としたCe(Fe,Cr)POは、二次元近藤格子系の中でも希少な強磁性量子臨界点(QCP)を示すことが確認されており、強磁性QCP近傍における電子状態の探求に興味が持たれる。そこで、2年目は、強磁性QCP近傍物質Ce(Fe,Cr)POの単結晶を自己フラックス法で作製するための条件出しを行うとともに、57Feメスバウアー分光測定及び高磁場極低温比熱測定により、Fe原子核における局所微細構造、磁気相転移の存在及びKondo一重項の形成の有無を明らかにすることを目的とした。CeFe0.5Cr0.5POのメスバウアー分光測定において、20-50Kの間でスペクトル線の幅の増大が確認されるが、sextetは出現しない。そこで、内部磁場分布の存在を仮定したスペクトル解析を行ったところ、25K付近においてFeの磁気状態がSpin Density Wave (SDW)状態に相転移していることが示唆された。CeFePOの比熱測定において、Ce4fの寄与を見積もると、ゾンマーフェルト係数は約780mJ/K2/molであり、LaFePOと比較して約80倍の電子比熱の増大が確認された。これは低温領域においてKondo一重項が形成され、これが電子熱容量を増大させたと考えられる。一方、CeFe0.8Cr0.2POでは、Crドープによる強磁性転移(Tc=6K)の出現と電子熱容量の著しい減少が観測され、低温領域で形成されていたKondo一重項のRKKY相互作用出現による消滅(Kondo breakdown)現象が生じたと考えることができる。また、磁場印加により磁気相転移温度の増大が確認され、強磁性相における強磁性揺らぎの存在を示唆している。CeFe0.5Cr0.5POの比熱測定結果からは14K付近での磁気相転移の存在が確認された。二次元近藤格子系常磁性体CeFePOは、抑制されていた強磁性転移が発現しかかった(磁気秩序発現寸前の磁気ゆらぎが発達した)量子臨界点(QCP)近傍物質の母物質である。本研究では、その電子物性の本性やその物性制御要因を探求し、二次元強磁性近藤格子における量子臨界状態を明らかにしながら、元素選択的な電子磁気状態相図を作製するとともに、二次元近藤格子系における量子機能の開拓指針を提案することである。鉄系超伝導体関連物質である二

次元近藤格子系常磁性体CeFePOのFeサイトをCrで部分置換することにより、抑制されていた強磁性転移を発現させ強磁性QCP(Cr濃度約40%)が本質的に存在することを明らかにするとともに、二次元近藤格子系Ce(Fe,Cr)POの強磁性量子臨界相図を作成し、従来の強磁性量子臨界相図と大きく異なる新奇な特徴をもつことを明らかにした。Ce(Fe,Ru)Pでは、強磁性QCPがx0.14で出現するのに対して、Ce(Fe,Cr)Pでは、強磁性QCPがx0.4で出現することから、現在、強磁性QCPの物性制御指針を検討中である。また、2015年度から、当初計画になかったCe(Fe,Cr)POの低温高磁場下比熱測定を新たに行うことで、CeFePOのゾンマーフェルト係数は、LaFePOと比較して約80倍程度、電子比熱が増大し、低温領域においてKondo一重項が形成されていることを明らかにした。興味深いことに、Crを20%部分置換すると、強磁性(Tc=6K)が出現し、Kondo breakdownにより電子熱容量は著しく減少する。また、磁場印加により磁気相転移温度の増大が確認され、強磁性相における強磁性揺らぎの存在を示唆している。重い電子系には、磁気秩序を抑制させる近藤効果と磁気秩序を安定化させるRKKY相互作用の拮抗により、温度-化学組成相図上で、磁気秩序相と常磁性相の相境界が0 K付近で消失する磁気量子臨界点(QCP)が存在する。Ce2O2層とFe2P2層からなる層状構造を持つ二次元近藤格子系Ce(Fe,Cr)POは二次元近藤格子系の中でも希少な強磁性QCPを示すことが確認されており、強磁性QCP近傍における新たな磁気秩序相や電子状態の解明が重要である。そこで、本研究では、注意深く合成した良質試料(Crの固溶限界:70%)の57Feメスバウアー分光測定及び高磁場極低温比熱測定により、Fe原子核における局所微細構造、磁気相転移の存在及びKondo一重項の形成の有無を明らかにすることを目的とする。磁場中比熱測定からCeFePOの電子比熱の増大から近藤温度TK=12 K以下においてKondo一重項の存在が確認された。CeFe0.9Cr0.1POでは比熱の増大と強磁性転移が確認されたことから磁気相分離が起きていると考えられ、一方、CeFe0.8Cr0.2POでは、強磁性転移(TC=6 K)の出現と電子熱容量の著しい減少が観測され、低温領域で形成されていたKondo一重項のRKKY相互作用出現による消滅(Kondo breakdown)現象が生じたと考えることができる。CeFe0.5Cr0.5POでは、57Feメスバウアー分光スペクトルに、20-50Kの間でスペクトル線の幅の増大が確認されるが、sextetは出現しない。そこで、内部磁場分布の存在を仮定したスペクトル解析を行ったところ、25K付近においてFeの磁気状態がSDW状態に相転移していることを示唆している。磁気秩序が抑制された近藤格子系層状オキシプニクタイドCeFePOの磁性に対するCr置換効果を探求し、Cr5%とCr45%の近傍組成で2つの強磁性量子臨界点を確認した。CeFePOの電子比熱の増大から近藤温度12 K以下において、Kondo一重項の存在が確認された。一方、Cr20%では、6 K以下で強磁性転移の出現と電子熱容量の著しい減少が観測され、Kondoブレイクダウンが起きている。また、磁場印加により磁気相転移点の増大が確認され、強磁性相における強磁性揺らぎの存在が示唆される。また、Cr50%では、25K付近において、Feの磁気状態がスピン密度波状態に相転移していることが予想される。強磁性量子臨界点(QCP)未確認物質Ce(Fe,Cr)POを注意
ジアシルグリセロールキナーゼγを介するがん抑制機構の解明

大腸がんにおいてジアシルグリセロールキナーゼγ(DGKG)がエピジェネティックに発現抑制されている事実を明らかにした。すなわち、DGKGのプロモーター領域が高度にメチル化されていること、およびDGKGのmRNA発現量も極めて低レベルであることを、大腸がん細胞株と正常大腸細胞、あるいは大腸がん検体のがん部と背景粘膜部位との比較により明らかにした。DGKGを発現していない大腸がん細胞株HCT116にDGKγ(野生型)を過剰発現させてフェノタイプの変化を観察したところ、増殖速度に影響は見られなかったが、浸潤能や遊走性が有意に減少した。DGKの発現抑制と大腸がんの悪性化との間の関連が示唆された。前年度の研究ではDGKG発現抑制細胞株にDGKγを過剰発現させるとコントロールと比較して細胞の増殖速度が約80%に減少すると報告したが、幾つかの細胞株を用いてさらに詳細に検討を進めた。前年度同様に、アデノウイルスを用いてDGKG発現ベクターを細胞に導入するが今回は調製が遅れていたDGKG野生型のアデノウイルスも揃ったので、コントロール(LacZ)、DGKG野生型(WT)、DGKG不活性型ミュータント(KD)、DGKG常時活性化型ミュータント(CA)の4ベクターで結果を比較した。使用細胞株もDLD1、RKO、HCT116と大腸がん由来の3種を用いてMTTアッセイ法により検討した。すると、WT発現細胞の増殖速度はLacZ発現細胞とほとんど変わらないことが明らかにされた。しかも驚くべきことにKD、CA発現細胞はともに増殖速度が大きく減少した(コントロールの約70%)。DLD1細胞を用いて細胞運動能を調べたところ、コントロールとWT発現では差が見らないものの、KDとCA発現ではそれぞれコントロールの約50%に細胞運動能が減少しており、細胞増殖能への影響と同じ傾向を示した。一方HCT116細胞を用いた実験では、WTおよびKDの発現がコントロールの約60%に細胞運動能および細胞浸潤能を減少させた。さらにCAの発現により両能力はさらに大きく減少した(コントロールの約20%)。この複雑な結果は、DGKGが細胞内で精緻な制御を受けている可能性を示す。現在より詳細な検討を進めている。DGKGの発現により発現量が変動する遺伝子を網羅的に調べるために発現マイクロアレイ実験を行ったが、有意に変化する遺伝子の中に興味を引くようなものは見つかっていない。また、DGKG発現によるRac1、RhoAの活性化は検出できなかった。予備的実験によって推測されていた通り、DGKγ遺伝子DGKGがDNAメチル化により発現抑制されていることを確認した。具体的な結果を以下に詳述する。まずRT-PCR解析法により、正常大腸上皮細胞に比べて大腸がん由来細胞株ではDGKGの発現が著しく減少していることを示した。Bisulfite Pyrosequencing法を用いてDGKGのプロモーター領域内CpGアイランドのメチル化を定量したところ、正常細胞では10%程度の低いDNAメチル化率であったが、多くの大腸がん細胞株では極めて高いDNAメチル化率を示した(9株中6株で60%を超える)。さらに大腸がん検体中のDNAを用いてDGKGのメチル化率を定量すると、メチル化率20%を超える検体が半数を超えた一方、非がん部検体のDNAは全てメチル化率10%以下であった。以上の結果より、DGKGは大腸がんにおいてDNAメチル化により発現抑制されていることが明らかとなった。次に大腸がん細胞におけるDGKγの役割を明らかにするために、DGKG発現抑制細胞株(HCT116、DLD1など)にDGKγを過剰発現させて細胞のフェノタイプの変化を観察した。遺伝子導入効率の影響を無視できるようにDGKγの過剰発現にはアデノウイルスを使用した。MTTアッセイ法ではDGKγの発現が細胞増殖速度を有意に減少させた(コントロールの約80%)。また細胞浸潤能、細胞運動能もDGKγ発現によりコントロールの約50%に減少した。興味深いことに、これら全てのフェノタイプ変化はDGK活性を失った変異体の発現によっても観察されており、DGKγの酵素活性によらないことが示唆されている。次年度は大腸がんとDGKG発現抑制の関係についてさらに詳細に検討したい。我々は前年度までの研究において、大腸がんにおいて脂質代謝酵素DGKGの発現が有意に抑制されていること、そしてこの抑制がDGKG遺伝子のDNAメチル化によるものであることを明らかにした。DGKGの発現抑制と大腸がん細胞のフェノタイプに関連があるかどうかを調べるために、DGKG発現が抑制されている大腸がん由来細胞株HCT116およびDLD1細胞にDGKGを過剰発現させて、細胞のフェノタイプが変化するかどうかを調べた。