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アイソトポマーの計測・解析技術開発による物質循環解析

水素から硫黄に至る生元素安定同位体の自然存在度は、物質循環追跡に有効である。本研究では単一同位体に限られていた環境分子中の同位体の組み合わせからなる多種同位体置換種、即ち「アイソトープの分子版」であるアイソトポマーの計測・解析法を開発した。これを地球温暖化関連物質とその前駆物質である生体分子に適用し、起源、生成・消滅過程の情報を読み解いた。未計測分子と観測不可能な短寿命反応中間体などの存在度予測には第一原理に基づく理論計算を行って補完した。また、地球規模3次元化学輸送モデルを窒素・硫黄酸化物に適用し、主要な地球温暖化ガスとエアロゾルの循環を解明した。本研究では、地球環境物質に着目したアイソトポマー計測法の確立および実試料への適用を行うとともに、アイソトポマー実測データ・理論計算によるアイソトポマー分別係数を用いた数値モデリングも行うことで、従来よりも高精度な地球環境物質の循環解析を行う。具体的な研究目的を以下の4点とし、並行して進めた。1.重要な生体分子のアイソトポマー計測法の開発および環境試料・微生物試料への適用:重要な生体分子の1つであるアラニンに着目し、化学分解法および熱分解法を組み合わせた分子内炭素同位体比計測法を開発した。バイオマーカー分子として重要な長鎖n-アルカン(C6C29)について、定量^<13>CNMR法を用いた分子内炭素同位体分布計測法を開発した。2.温暖化関連物質のアイソトポマー計測法の大気試料への適用:N_2Oについては、マイクロ波放電でN_2Oを分解し、得られるO_2の同位体比測定を行うことによる三種酸素同位体比計測法を開発した。従来の方法と比べ少ない試料量でほぼ同等の精度で分析が可能となり、妨害成分の除去などの煩雑な分析操作も省略できるようになった。この方法をエアロゾル、雨水中の硝酸の酸素同位体比測定に適用した。硫黄化学種については、COSをフッ化してSF_6に変換する方法を検討し、反応が定量的に進行することを確認した。3.アイソトポマー分別の理論計算・模擬実験:SOの光解離過程について電子状態問の非断熱遷移を考慮した量子緊密結合計算プログラムの開発と実施を行った。得られた同位体分別係数は,質量依存分別線からかけ離れた結果となった。4.アイソトポマーモデルの構築と物質循環解析:海洋N_20アイソトポマーモデリングについては、既存の観測値をもとに試作モデルを構築した。硫酸エアロゾルアイソトポマーモデリングについては、既存の観測値と理論計算、室内模擬実験から得られた分別係数をもとにδ^<34>Sを予報できるモデルを構築した。環境分子として重要であり、且つ生化学的にも重要な代謝物である炭素数2のエタノール、アセトアルデヒド、酢酸に着目し、その分子内炭素同位体分布を高精度に計測する方法を開発した。特にエタノールの分子内炭素同位体分布計測については、従来のようにエタノールを酢酸に変換することなく、また分子レベル計測を別に行うことなく、1回の計測で分子レベルおよび分子内炭素同位体比分布を計測できる方法を開発した。一酸化二窒素(N2O)については、三種酸素同位体比を測定する新たな方法の開発に成功した。この方法は、マイクロ波放電を利用して微量のN2Oを分解し、得られるO2の同位体比測定を行う。5-40 nmolのN2Oを含む試料であれば、N2Oの分離・精製、分解反応、O2の分離・精製と安定同位体質量分析計への導入をオンラインで行うことができ、△17O値が約0.3‰の精度で得られる。一酸化硫黄(SO)の光解離過程について行った厳密量子動力学計算により、質量依存分別(MDF)および質量非依存分別(MIF)現象を起こす基本的なメカニズムの解明につながった。この結果を基に仮説を立て多原子分子系への応用し,光反応におけるMDFおよびMIFを起こす可能性を,電子励起状態及び発生する可能性のある光の波長までをも予想することが可能になりつつある。今後,様々な分子に対し解明が進むきっかけを与える理論の構築に成功しつつある。大規模火山噴煙を模擬したプルームモデルを用いて成層圏での大気化学反応を再現し、二酸化硫黄(SO2)の光励起反応によって引き起こされるMIFによって極域の雪やアイスコア硫酸の硫黄安定同位体比が変化するメカニズムの解明に成功した。1.重要な生体分子のアイソトポマー計測法の開発および環境試料・微生物試料への適用:エタノール、アセトアルデヒド、酢酸のアイソトポマー計測法について、迅速・簡便化を行った。長鎖n-アルカンのアイソトポマー計測について、ガ熱分解法を構築し、定量13CNMR法との比較を行った。2.温暖化関連物質のアイソトポマー計測法の大気試料への適用:N2Oについては、前年度開発したマイクロ波放電法を用いたN2Oの三種酸素同位体比計測法の精度・確度を確認し、エアロゾル、雨水中の硝酸の酸素同位体比測定に適用した。硫黄化学種については、大気中の低濃度COSの濃縮等の前処理方法について検討を行った。

3.アイソトポマー分別の理論計算・模擬実験:SOの光解離過程について電子状態間の非断熱遷移を考慮した量子緊密結合計算プログラムの開発と実施を行った。得られた同位体分別係数は,質量依存分別線からかけ離れた結果となった。COSの大気中分解反応の同位体分別を理論計算及び実験から決定した。4.アイソトポマーモデルの構築と物質循環解析:海洋N2Oアイソトポマーモデリングについては、既存の観測値をもとにモデルを構築し、同モデルを用いて観測結果を定量的に解析した。硫酸エアロゾルアイソトポマーモデリングについては、既存の観測値と理論計算、室内模擬実験から得られた分別係数をもとにδ34Sを予報できるモデルを構築した。SO2の光励起反応によって引き起こされる質量非依存分別によって大規模噴火後の極域氷床記録を初めて再現した。13種類の試薬酢酸のアイソトポマー値を決定し、国際標準物質としての利用を提案した。C3化合物についてプロパンのアイソトポマー計測法を開発した。また、数種の試薬アセトンのアイソトポマーをオフライン法で計測し、オンライン法開発のために必要な標準物質の作成に成功した。N2Oの三種酸素同位体組成分析については、前年度までに開発した方法を改良・自動化し、脱窒細菌を用いてN2Oに変換した100 nmolの硝酸塩試料を簡便かつ高精度で測定するシステムを構築した。本法の高感度化を行えば、低濃度の成層圏試料に応用できる。世界初となるOCSの硫黄同位体比測定については、Analytical Chemistryに方法論の論文が掲載された。新たに硫酸の三酸素同位体測定システムを立ち上げ、その自動化を実施し成功した。SO2の32、33、34、36SO2の紫外線スペクトルを世界で初めて求めた。また、多自由度系からなる分子の紫外線領域における光吸収スペクトル(アインシュタインのB係数)を同位体の差異も含めて決定できる非断熱遷移を考慮した凍結ガウス波束発展法に基づくプログラムを開発した。硫化水素およびアンモニアとその同位体種について実施し、既存の厳密計算とのよい一致を得た。硫酸の光解離メカニズムを解明し、真空紫外領域波長領域で同位体異常が発現する可能性を理論的に予測した。H2SO4分子の光解離反応において新しい生成物を発見し、波長による期待される同位体効果の特徴を予測、新たな生成物を発生しうることを発見した。世界に先駆けて開発したOCSの測定法を微生物によるOCS消費過程の模擬実験試料に適用した。0次元海洋N2Oアイソトポマーモデルを用いて、西部北太平洋の亜熱帯と亜寒帯の2つの定点で観測されたN2O濃度とアイソトポマー値を再現し、同海域におけるN2O放出量とN2O生成要因を解明した。重要なC3化合物のアイソトポマー計測法を進展させた。プロパンのアイソトポマー計測法を実用化し、熱分解起源と非生物起源のプロパンを明確に区別できる可能性を見出した。生体代謝物として重要なピルビン酸のアイソトポマー計測法を開発した。アセトンのオフライン計測で得られた値を基準にオンラインアイソトポマー計測法を開発した。地球温暖化関連物質であるN2Oおよび硝酸塩の酸素非質量依存同位体分別を高感度で測定する方法を開発し自動化した。N2Oについては、15Nの分子内同位体分布計測法を自動化して対流圏大気中N2Oの変化傾向を明らかにし、国際共同研究によりアイソトポマー標準物質の較正、配布を行った。
高位中枢活動は運動筋受容器反射を修飾するか?-覚醒・睡眠サイクルの応用

日常生活で行う軽度中程度の随意運動でみられる心循環調節にとって,運動筋受容器反射よりも高次中枢から発するセントラルコマンド(central command)によるfeedforward制御が重要である。特に,屈曲運動において,このcentral commandによる心循環調節は強く現れる。一方,覚醒状態のヒトや動物では,筋機械受容器反射および筋代謝受容器反射は抑制されている。睡眠あるいは麻酔に伴って生じる高次中枢活動の低下は筋機械受容器反射および筋代謝受容器反射を促通し,この筋機械受容器反射の修飾には脳内5-HT1A受容体が関わる。[1]随意運動時にみられる心循環応答に及ぼす運動筋受容器反射の役割を解明するために、1)能動的static筋収縮、2)筋電気刺激による誘発static収縮および3)受動的な肢回転運動に対する心循環応答を比較した。仰臥位において被験者の両足を特注型自転車エルゴメーターのペダルに固定した。それぞれの実験操作(0.5-3分間)に対する心電図、動脈血圧、心拍数、毎分心拍出量、末梢血管抵抗ならびに筋電図の応答を同時記録した。誘発収縮は筋機械受容器および代謝受容器を刺激するが、受動的肢運動は専ら筋機械受容器のみを刺激する。能動的筋収縮では、運動筋受容器反射に付加して、高位中枢から発するセントラルコマンドが心循環応答を制御する。特に、誘発筋収縮を実施する場合には臨床用低周波刺激装置を用いて、皮膚受容器にあまり痛みを与えずに骨格筋へ有効刺激を与えるように配慮した。その結果、受動的肢運動は有意な心循環応答を引き起さず、また誘発筋収縮に対する反射性応答は能動的筋収縮に対する応答の約50%以下であった。この所見は、随意運動時にみられる心循環応答がセントラルコマンドと筋代謝受容器反射による制御を主に受けるが、筋機械受容器反射は心循環応答の調節に関与しないことを示唆した。[2]次に、筋機械受容器反射が覚醒-睡眠サイクルにより修飾されるか否かを解明するために、予備的実験を実施した。前述のような仰臥位における受動的な肢回転運動に対する心循環応答を覚醒状態と睡眠状態(昼寝)で比較した。その結果、受動的肢運動は覚醒状態では心循環応答を誘発しなかったが、睡眠状態では心拍数や動脈血圧を有意に増加させた。以上の実験成績は、筋機械受容器反射が覚醒-睡眠サイクルによる影響を受ける、すなわち高位中枢活動による修飾を受けることを明らかにした。本年度は、高位中枢活動が筋受容器反射をどのように修飾するかを解明する目的で、1)ヒト下肢の他動運動時にみられる循環調節機構とそれに及ぼす睡眠の影響、そして2)覚醒動物後肢の他動的ストレッチに対する循環反応とそれに及ぼすPropofol麻酔ならびにセロトニン作動薬・拮抗薬の影響を調べた。1.心電図、動脈血圧、心拍数、毎分心拍出量、一回心拍出量、末梢血管抵抗および脳波を記録しながら、両足を自転車エルゴメーターのペダルに固定しモーター駆動により下肢に他動的回転運動を与えた。この他動的回転運動は主に筋機械受容器のみを刺激すると考えられる。覚醒時に実施したこの運動は心拍数、一回心拍出量、毎分心拍出量ならびに動脈血圧を軽度増加させ、末梢血管抵抗を軽度減少させた。超音波エコードップラー法を用いた上肢筋血管抵抗の計測から、他動的運動は筋血管抵抗を減少させることを明らかにした。対照的に、睡眠時に実施した他動的運動は心拍数ならびに動脈血圧を大きく増加させたので、覚醒-睡眠サイクルで変化する高位中枢活動が筋機械受容器反射を修飾することが示唆された。2.ヒトの実験結果と同様に、覚醒ネコ後肢の他動的ストレッチは心拍数および動脈血圧を軽度増加させた。続いてPropofol麻酔薬を静脈内投与したところ、Propofol麻酔は他動的ストレッチに対する心拍数や動脈血圧の応答を亢進した。覚醒状態で投与したセロトニン拮抗薬も他動的ストレッチに対する心拍数や動脈血圧の応答を亢進させたが、逆にセロトニン拮抗薬は心循環反応を低下させた。以上の所見は、麻酔薬の影響を受ける高位中枢活動が筋機械受容器反射を修飾し、このような中枢活動に脳内セロトニン系が関係することと思われる。本年度は,覚醒-睡眠サイクルに伴う高位中枢活動の変化が筋受容器の賦活に伴う反射性循環応答を修飾するか否かを同定した。更に,覚醒-睡眠状態で変化する神経伝達物質であるセロトニン(5-HT)に着目し,実験動物を用いて5-HTが筋受容器反射の修飾と関係するか否かを調べた。【ヒトを用いた研究】1.被験者6名の右下腿三頭筋に刺激電極を,胸部に心電図電極を,非利き手に指尖連続血圧計を,そして前額部に脳波電極を装着した。実験操作として下腿三頭筋の他動的ストレッチ

および電気刺激による等尺性筋収縮(最大弾度の20%レベル)を1-2分間実施し,心拍数,動脈血圧,毎分心拍出量および末梢血管抵抗の応答を計測した。筋ストレッチは機械受容器を主に刺激し,筋収縮は機械受容器のみならず代謝受容器も刺激した。2.覚醒時に実施した他動的ストレッチや誘発筋収縮は筋機械受容器反射や筋代謝受容器反射を賦活しなかったが,睡眠時に実施した同一の実験操作は心拍数や毎分心拍出量を有意に増加させ動脈血圧を上昇させた。これら心循環応答の時間経過が他動的ストレッチや誘発筋収縮間で異なったので,筋機械受容器そして代謝受容器反射力睡眠時に増強すると考えられた。これらの所見は覚醒-睡眠サイクルに伴う高位中枢活動の変化が筋機械受容および筋代謝受容器反射を変調することを初めて示唆した。【実験動物を用いた研究】5-HT_<IA>受容体の作動薬あるいは拮抗薬を静脈内に投与し,5-HT_<IA>が筋機械受容器反射に及ぼす作用を調べた。その結果、5-HT_<IA>受容体の作動薬は一貫した影響を示さなかったが,5-HT_<IA>受容体の拮抗薬は覚醒下あるいは麻酔下で実施した後肢ストレッチに対する反射性心拍数および動脈血圧応答を増加させた。ヒトで観察された覚醒-睡眠状態による筋受容器反射の修飾にセロトニンが関係することが示唆された。
イトマキヒトデ卵母細胞の核ならびに細胞表層の成熟におけるGTP

イトマキヒトデ卵母細胞は、その周りの濾胞細胞から分泌された1-メチルアデニン(1-MA)に、トランスメンブランコントロール系を介して反応し、中断していた減数分裂を再開(卵成熟)する。GTP-γ-S、GDP-β-S、百日ゼキ毒素(PTX)、コレラ毒素等を細胞内注射した卵母細胞が、1-MAに反応して減数分裂を再開するか否かを卵核胞崩壊の有無により、また、このような卵母細胞が受精したときに表層粒の開口分泌が起るか否かを受精膜形成の有無によりそれぞれ調べ、まず次の結論を得た。1.1-MAの受容から卵核胞崩壊にいたる情報伝達系にPTX感受性のGTP結合タンパク質が関与している。2.表層粒の開口分泌にもGTP結合タンパク質が関与している。3.前者に関与するGTP結合タンパク質は、おそらくGi型のものであり、後者に関与するものとは異なっている。ついで、1-MAの情報伝達系に関わるGTP結合タンパク質が作用するのは、MPF(Maturation Promoting Factor)形成の前であるか否かを検討した。PTXを注射して1-MAによる卵核胞崩壊を抑えた卵母細胞に、さらにMPF(成熟中の卵母細胞の細胞質)を注射したところ、卵核胞が崩壊したので、次のように結論された。4.PTX感受性のGTP結合タンパク質は、1-MAの受容からMPFの形成にいたる過程に関与している。さらに、卵母細胞の表層を単離し、PTXによってADPリボシル化されるタンパク質が存在するか否かを検索し、次の結論が得られた。5.卵母細胞表層には、分子量約39KDaのPTX感受性GTP結合タンパク質が存在する。以上より、1-MAの受容からMPF形成にいたる情報伝達系には、PTX感受性、分子量約39KDaのGTP結合タンパク質が関与していると結論された。
シナプス安定性に関する微細形態解析

神経回路が長期に亘り記憶を保持するためには、シナプスが長期に亘り安定的に維持される必要がある。一方、新しいことを学習したり外界の変化に応じて柔軟に対応する上でシナプスの可塑性は重要である。本研究課題は、シナプスの安定化をもたらす分子的基盤の解明を目的とし、大脳皮質スパインの安定性と形態との関連について解析する。具体的には二光子励起レーザー顕微鏡を用い、マウス大脳皮質体性感覚野の神経細胞の同一の樹状突起を長期間にわたって観察した後、同じ部位を電子顕微鏡で同定し、電子顕微鏡による立体構築像を得る。これにより長期間にわたって安定なスパインと新たに生成されたスパインに特徴的な形態学的パラメーターについて解析する。これまでにin vivoイメージングを行った箇所を効率的に電子顕微鏡で同定し、三次元再構築する手法を確立した。具体的には頭蓋骨を薄く削ったマウスを用い、いわゆるthinned skull法によりスパインを長期観察した後、マウスを還流固定し、脳をスライス化した後で、二光子顕微鏡のレーザーによる焼灼痕を用いて標的となる樹状突起をマークし、この焼灼痕を指標としてFIB-SEMと呼ばれる走査型電子顕微鏡を用いることで樹状突起の三次元再構築を行った。これによりスパインの時系列的な変化の追跡と、スパインの微細構造とを対応づけることが可能となった。この手法を推し進めることにより、安定スパインと新生スパインの三次元再構築像を蓄積することが可能となり、スパインの安定性と微細構造の関連について定量的な解析を行うための基盤が確立された。これまでは頭蓋骨を薄く削ったマウス脳を二光子顕微鏡により経時的に観察し、目的となる樹状突起を電子顕微鏡で効率的に同定する手法について確立し、安定スパインと新生スパインの立体構築像を取得することが可能となった。ただしこの手法では、長期間に亘るin vivoイメージングが必要であることや、FIB-SEM顕微鏡による三次元再構築可能な体積に限りがあることから、定量的な解析のために充分な量のデータを蓄積するためには長い時間を要する。そこで、複数回にわたる継続的なin vivoイメージングが可能となるopen skull法による二光子顕微鏡観察について確立するとともに、電子顕微鏡観察のための効率的な試料加工法についても改良を重ねた。依然としてデータ取得までに要する時間は比較的長期間であるが、効率的にデータを取得することが可能となり、定量的解析を可能とする手法を確立することができた。これまでに大脳皮質神経細胞の樹状突起を経時的に観察し、樹状突起スパインの微細構造を効率的に三次元再構築する手法を確立することができた。しかし研究代表者は2018年12月に群馬大学医学部に異動した。これにより、二光子顕微鏡およびFIB-SEMの利用が困難となった。また群馬大学の動物実験施設の方針により、マウス大脳皮質の長期間に亘るスパインの動態観察が困難となった。そこで今後はシナプス安定性の分子機構の解明という本来の目的に立ち返りつつ、新たな系の導入を試みる予定である。

これまでに大脳皮質神経細胞の樹状突起を経時的に観察し、樹状突起スパインの微細構造を効率的に三次元再構築する手法を確立することができた。しかし研究代表者は2018年12月に群馬大学医学部に異動した。これにより、二光子顕微鏡およびFIB-SEMの利用が困難となった。また群馬大学の動物実験施設の方針により、マウス大脳皮質の長期間に亘るスパインの動態観察が困難となった。そこで今後はシナプス安定性の分子機構の解明という本来の目的に立ち返りつつ、新たな系の導入を試みる予定である。研究代表者は2018年12月に群馬大学に異動した。これに伴い、その前後での実験計画や研究費の使用計画等に一部変更が生じたことから次年度使用額が生じた。研究計画の具体的な実施状況には当初の予定に対して若干の変更は生じるが、当初明らかにしようとしていた研究計画そのものには支障は生じない。
野菜及び漬物中に存在し,亜硝酸処理により生ずる癌原物質の構造と癌原性

亜硝酸処理により直接変異原性を示す食品は、胃癌の発生に関与している可能性がある。各種野菜及び漬物を亜硝酸処理すると、サルモネラ菌TA100に対する直接変異原性が生ずる。そこで、日本人が頻繁に摂取している白菜に含まれる、亜硝酸処理により変異原性を示す変異原前駆体の分離精製を行った。その結果、4-メトキシインドール-3-アルデヒド(【I】)及び4-メトキシインドール-3-アセトニトリル(【II】)を変異原前駆体として単離した。(【I】)及び(【II】)の亜硝酸処理により生ずる変異原性は、変異原前駆体1mg当たりTA100に対して、-S9uixで、各々156,900及び31,800復帰コロニーであった。(【I】)及び(【II】)は、白菜300gより、各々700μg及び60μg得られ、白菜全体の変異原性の16%及び0.3%を説明することができた。尚白菜中の変異原前駆体として既に報告されているインドール-3-アセトニトリルも、白菜300gより80μg得られた。白菜塩漬け醸成期間中の、亜硝酸処理により生ずる変異原性の経時変化を調べた。その結果、変異原性は生の白菜に最も強く認められ、10日目の塩漬け及び漬け汁には生の白菜の変異原性の33%及び31%に相当する活性が認められた。よって、亜硝酸処理により生ずる白菜塩漬けの変異原性は、醸成期間中に変異原前駆体が生成するためではなく、生の白菜に存在するインドール化合物等の変異原前駆体によるものと考えられる。インドール化合物は環境中に普遍的に存在しており、そのニトロリ化の反応は速い。した員って、亜硝酸存在下におけるインドール化合物の発癌性、特に胃癌誘発の有無を調べることは重要である。
微生物還元性鉄・マンガンの化学的定量法の確立と環境動態解析への応用

昨年度までに確立した、EDTAによる微生物還元性鉄・マンガンの化学的抽出・定量法を、性質の異なる5種の水田土壌(黒ボク土、灰色低地土、黄色土、グライ土)および琵琶湖全域から採取した湖底堆積物の分析に適用した。黒ボク土壌以外の水田土壌では、上記の方法で抽出した鉄・マンガンがいずれも微生物還元性鉄・マンガンと非常に近似した値(鉄:70-120%、マンガン:90-110%)を示しており、本法が多くの土壌に適用可能であることが示された。また、従来の化学的定量法によれば、鉄では過大評価、マンガンでは過小評価していることが示され、土壌中の酸化還元反応におけるマンガンの重要性が指摘された。一方、黒ボク土壌では、両元素とも低く見積もられる(鉄:10%、マンガン:20%)傾向にあり、抽出にさらに検討が必要であると考えられた。琵琶湖表層堆積物(0-2cm)の微生物還元性鉄は、空間的な差異はそれほど大きくなかったが、マンガンについては試料採取地点の水深との間に明瞭な正の相関が認められた。特に水深40m以上で、急激に微生物還元性マンガンの濃度が上昇していた。深度分布より微生物還元性マンガンは極表層に集積していることが明らかとなったことから、水温躍層形成期に湖底の酸素濃度が低下することにより、堆積物中のMn^<2+>が湖水へ溶出・再酸化を受けて湖底表層に堆積したものと推察された。このことから、微生物還元性マンガンが湖底の酸化還元環境の動態を測る1つの指標となることが示唆された。湛水土壌や湖沼堆積物などの嫌気的環境では、鉄・マンガンが電子受容体として物質動態に重要な役割を果たしている。鉄・マンガンは様々な形態で存在しているが、実際に電子受容体として機能しているのは嫌気微生物代謝によって直接的・間接的に還元作用をうける画分、微生物還元性鉄・マンガンであると考えられる。本年度は、微生物還元性鉄・マンガンを同時に抽出できる化学的定量法を確立した。水田土壌あるいは琵琶湖堆積物を嫌気条件で培養して生成した2価鉄およびマンガンを測定し、異なる還元剤および抽出剤の組み合わせで抽出した鉄・マンガン量との比較を行った。塩酸ヒドロキシルアミン-硝酸法、塩酸ヒドロキシルアミン-塩酸法ではマンガンは培養法にほぼ匹敵していたが、鉄は過少評価される傾向にあった。また、非晶質鉄・遊離酸化鉄が定量できるとされるシュウ酸Buffer法、ハイドロサルファイト-EDTA法では培養法で得られた鉄を上回ることが明らかとなった。また、これらの傾向は特に水田土壌で顕著であった。ハイドロサルファイト-EDTA法について詳細に検討した結果、黒ボク土壌を除いた水田土壌や琵琶湖堆積物ではEDTAだけでも微生物還元性鉄・マンガンに近い量が抽出されることが明らかになった。抽出時間や抽出温度をさらに検討し、堆積物試料0.25gに対し0.04MEDTA100mlを加えて90°Cで60min加熱抽出したときにマンガンでは培養法の93%、鉄ではほぼ100%抽出できることを明らかにした。培養法との組み合わせ実験により、本法で抽出された鉄・マンガンの大半が実際に微生物還元を受けることが示された。
材線虫病の病徴発現を決定する原因物質の解明

本研究は,材線虫病の病徴が進展していく過程で引き起こされるマツ樹体の全身的な水分通道の低下過程を,物質レペルから追究することを目的とした。まず,病徴進展の過程て引き起こされる通道阻害はモノテルペン類によらないことが明らかにされた。そこで,キャピテーションの発生原因を木部樹液の表面張力に着目した。その結果,材線虫接種後に著しく表面張力が低下した樹種では,病徴の進展が速やかで枯死率が高かった。これに対して,表面張力の低下が遅い樹種では病徴の進展は遅く枯死率が低かった。この結果から,材線虫感染後の表面張力の低下が病徴の発現と密接な関係にあることが明らかにされた。従って,材線虫の感染に対する表面張力の変化が病徴の発現を制御する要因であり,また材線虫病低抗性と密接な関連を持つことが示唆された。そこで,木部樹液の表面張力を低下させる原因物質について,材線虫代謝産物の閉与について検討を行った。その結果,材線虫を増殖させた培地の抽出液には表面張力の低下を引き起こす物質が認められなかったことから,表面張力低下の原因物質は材線虫の感染に伴ってマツが産生する異常代謝産物であると考えられた。キャピテーションの発生を促進する蓚酸が材線病の病徴の進展に関与するか否かを知る目的で,材線虫を増殖させた培地抽出液のガスクロマトグラフィーによる分析を行った。その結果,材線虫は蓚酸を産生し,近縁種で非病原性のニセマツノザイセンチュウは蓚酸を産生しないことが明らかにされた。これらのことから,材線虫の産生する蓚酸がキャビテーション発生の原因物質の一つであることが推測され,蓚酸産生能の違いが病原性と関連する可能性が示唆された。材線虫病の病徴の進展過程で顕著な影響の表れる樹脂滲出に着目して、樹脂生産を促進することが知られるパラコートをクロマツ苗に投与し、木部における通道性について材線虫接種苗と比較して検討した。パラコート処理苗では、モノテルペン類および樹脂量に顕著な増加が認められ、広範な木部における水分通道阻害が観察された。一方、材線虫接種苗では前面に散在するパッチ状の通道阻害が観察されたものの、モルテルペン量の増加は認められなかった。これらのことから、モノテルペン類生成が材線虫病における通道阻害の直接の原因ではないと考えられた。また、パラコート処理苗に材線虫を接種したところ、病徴進展が促進された。同時に、通道阻害の拡大が材線虫の増殖などに先行する現象として認められた。従って、木部通道抵抗の増大が材線虫病の進展に重要な役割を果たすことが示唆された。一方、苗畑に植栽されたクロマツ苗を用い、材線虫接種後の安息香酸やカテコールなどを含む芳香族化合物の動態について調べた。今回は、材線虫接種苗と対照苗との間に、これら芳香族化合物の生成に明瞭な差違は認められなかった。マツ材線虫病の萎凋原因について、通道阻害を引き起こすキャビテーションの発生と拡大が,病徴進展の重要な鍵であると考えられる。前年度の研究成果から、モノテルペン類生成は通道阻害の原因物質ではないことが明らかにされた。そこで、病徴進展の過程で生ずるキャビテーションの発生原因について,密接な関係にあるとされる蒸散流の表面張力に着目し,病徴の進展とキャビテーションの発生について検討を加えた。

苗畑に植栽された6年生クロマツ苗を用い,強病原性S6-1系統材線虫2万頭を接種した結果、病徴前期に蒸散流の表面張力が低下し,引き続き低下する苗は枯死し、低下が回復した苗ではその後病徴は進展しなかった。このことは、蒸散流の表面張力の低下がキャビテーションの発生を促すことから,材線虫病におけるキャビテーションは蒸散流の表面張力の低下によって引き起こされるものと考えられた。つまり,表面張力の低下によるキャビテーションの発生がある閾値を超えて生じた場合に初めて病徴進展が引き起こされるものと推察された。以上の結果から、蒸散流の表面張力の低下が材線虫病の病徴進展因子として作用していることが明らかにされた。1.キャビテーションの発生要因として考えられる木部樹液の表面張力と,樹種間の材線虫病抵抗性との関連について検討した。その結果,マツノザイセンチュウ(材線虫)接種後に著しく表面張力が低下した樹種では,病徴の進展が速やかで枯死率が高かった。これに対して,表面張力の低下が遅い樹種では病徴の進展は遅く枯死率が低かった。この結果から,材線虫感染後の表面張力の低下が大きいほど病徴の発現が顕著であることが明らかにされた。従って,材線虫の感染に対する表面張力の変化が病徴の発現を抑制する要因であり,また材線虫病抵抗性と密接な関連を持つことが明かにされた。2.木部樹液の表面張力を低下させる原因物質について,材線虫代謝産物の関与について検討を行った。その結果,材線虫を増殖させた培地の抽出液には表面張力の低下が認められなかったことから,表面張力低下の原因物質は材線虫の感染に伴ってマツが産生する異常代謝産物であるものと考えられた。3.キャビテーションの発生を促進する蓚酸が材線病の病徴の進展に関与するか否かを知る目的で,材線虫を増殖させた培地抽出液のガスクロマトグラフ分析を行った。その結果,材線虫は蓚酸を産生し、近縁種で非病原性のニセマツノザイセンチュウは蓚酸を産生しないことが明かにされた。これらのことから,材線虫の産生する蓚酸がキャビテーション発生の原因物質の一つであると推測され,蓚酸産生能の違いが病原性と関連する可能性が示唆された。
温泉特有種の藍藻に含有される生物活性物質の探索

温泉特有種微細藻で強酸性下に生息するCyanidium cardariumを群馬県草津温泉湯畑及び西の河原で採集した。その懸濁液を寒天培地上に培養後,コロニーを採取,それを液体培地で培養後もう一度同様の操作を繰り返して,単藻化したCyanidium cardariumを得ることに成功した。単藻化した藻体を,光照射下に通気しながら培養すると成長が早いことが確認できたことから,温泉の環境に近づけるため約40°Cに温度を保ちながらpH3という環境下,これまで一般の藍藻類を培養してきた場合と同様に5L三角フラスコ中で6週間の大量培養(全部で72Lの培養液)を行い,約20gの凍結乾燥藻体を得ることができた。さらに能率よく藻体を得るため,培養容器を20Lのタンクに変更し,5L三角フラスコに用いた場合と同量の前培養藻体で160Lの培地を用いて8週間培養することにより,約50gの凍結乾燥藻体を得ることができた。これを3回繰り返し現在約170gの凍結乾燥藻体を得,これらを用いて成分の検索を始めた。なおCyanidium属は以前藍藻に分類されていたが,現在は紅藻類に分類されている。温泉特有種に数えられる藍藻の一つとして,Mastigocladus属がある。これを和歌山県湯の峰温泉で採取し,単藻化の操作を行った。しかしながらこの藻体は液体培地では発育しなかったため,大量培養する場合の培養方法を検討中である。
凍結破壊腫瘍細胞によるマクロファージの活性化に関する研究

悪性腫瘍凍結療法によって誘導される免疫応答を調べるためのモデル実験として、凍結破壊したMeth A細胞(Cryo-MA)を接種した同系BALB/cマウスにみられる免疫応答をマクロファージ(Mφ)を中心に調べた。対照としてマイトマイシンCで処理して増殖能を失わせた生細胞(MMC-MA)を用い比較した。Cryo-MAまたはMMC-MAを接種したマウスから14日目に脾細胞を採取し、Winn中和試験を行ったところMMC-MA群では約50%、Cryo-MA群では約20%の腫瘍増殖の抑制が認められた。脾細胞中のMφのcytostaticactivityの経日的変化をみるとCryo-MA群ではその発現が遅延していた。また、各種サイトカインの産生能をみると、MMC-MA群のMφは腫瘍壊死因子(TNF)の産生能が高いのに対し、Cryo-MA群ではインターフェロン、インターロイキン1およびプロスタグランディンE2の産生能が有意に高かった。Mφの貪食能をラテックスビーズを用いて調べたところ、MMC-MA群のMφは常に高い貪食能を示したが、Cryo-MA群では14日目に初めて貪食能の亢進が認められた。次に、Mφの抗原提示能をla抗原の陽性率により測定した。接種後14日間を通じてMMC-MA群がCryo-MA群を上回るla抗原陽性率を示した。すなわち抗原提示能ではMMC-MAの方がCryo-MAより優れており、CTLの誘導にはMMC-MAの方が有利であると考えられた。事実、MMC-MAはCTLを誘導できるのに対し、Cryo-MAはCTLをほとんど誘導できなかった。一方、NK活性についてはCryo-MA接種群に高活性が出現しており、またこれはMφによるIFNの産生能と相関することが判明した。すなわち、Cryo-MAはMφにα-IFNの産生を促し、それがMφのcytostatic activityとNK活性の出現を促すが、それは逆にla抗原の発現を抑制し、結果としてCTLの出現を抑制する作用をもつことが示唆された。MMC-MAおよびCryo-MA接種マウスのCTLとNK活性は、マクロファージとその産生するcytokineにより制御されていることが示唆された。悪性腫瘍凍結療法によって誘導される免疫応答を調ベるためのモデル実験として、凍結破壊したMeth A細胞(Cryo-MA)を接種した同系BALB/cマウスにみられる免疫応答を、マクロファージ(Mφ)を対象として調べた。対照としてマイトマイシンCで処理して増殖能を失わせた生細胞(MMC-MA)を用い、比較した。Cryo-MAまたはMMC-MAをマウスに接種し、14日目に脾細胞を採取し、Winn中和試験を行ったところ、MMC-MAにより免疫したマウスの脾細胞は、約50%の腫瘍増殖の抑制が認められた。一方、Cryo-MAの場合も約20%の増殖抑制をみた。MMC-またはCryo-MAを腹腔内に接種したマウスの脾臓よりMφを採取し、Meth Aを標的細胞としてcytostatic activityを調べた。

MMC群では7日目より活性が出現したが、Cryo群では14日目になって初めて活性が出現し、MMC群に比べ、発現時期が遅れることが判明した。これは標的細胞にP815を用いた場合も同様であった。次にMφによる各種サイトカインの産生能を調べた。MMC-あるいはCryo-MAを腹腔内に接種し、3、7および14日目にMφを採取し、24時間培養し、その上清中のインターフエロン(IFN)、腫瘍壊死因子(TNF)およびインターロイキン1(IL-1)の量を測定した。IFNはCryo群において7日目より上昇がみられたが、MMC群や無処置対照群ではほとんど産生されなかった。IL-1においても同様に結果を得た。一方、TNFの産生に関しては、MMC群が高い値を示したのに対し、Cryo群や無処置対照群ではほとんど産生はみられなかった。このように凍結処理Meth AはMMC処理Meth Aとはかなり異なった性質のMφを誘導することが判明した。今後はこれらの事実をふまえ、このMφが他の免疫細胞に与える影響を検討し、凍結療法後の免疫応答におけるMφの役割を明らかにしたい。昨年度の結果から凍結破壊したMeth A細胞(Cryo-MA)は、腫瘍の増殖に対し抑制効果を持つことが示された。しかし、これはマイトマイシンCで処理して増殖能を失わせた生細胞(MMC-MA)に比べ弱いものであった。MMC-MAまたはCryo-MAを腹腔内に接種したマウスの脾臓よりマクロファージ(Mφ)を採取し、Meth Aを標的細胞としてcytostatic activityを調べたところ、その活性の出現はMMC-MA群では接種取後7日目より認められたのに対し、Cryo-MA群では14日目に出現し、発現時期の遅延が認められた。また、cytotoxic activityは両群とも十分に発現しなかった。Mφの貪食能をラッテックスビーズを用いて調べたところ、MMC-MA接種マウスのMφは常に高い貪食能を示したが、Cryo-MA接種マウスでは14日目に初めて貪食能の亢進が認められた。次に、Mφの抗原提示能をIa抗原の陽性率により測定した。接種後14日間を通じてMMC-MA群がCryo-MA群を上回るIa抗原陽性率を示した。すなわち抗原提示能ではMMC-MAの方がCryo-MAより優れており、CTLの誘導にはMMC-MAの方が有利であると考えられた。事実、MMC-MAはCTLを誘導できるのに対し、Cryo-MAはCTLをほとんど誘導できなかった。一方、NK活性についてはCryo-MA接種マウスに高活性が出現しており、またこれはMφによるIFNの産生能と相関することが判明した。すなわち、Cryo-MAはMφにα-IFNの産生を促し、それがMφのcytostatic activityとNK活性の出現を促すが、それは逆にIa抗原の発現を抑制し、結果としてCTLの出現を抑制する作用も併せもつことが示唆された。MMC-MAおよびCryo-MA接種マウスのCTLとNK活性は、マクロファージとその産生するcytokineにより制御されていることが示唆された。なお、凍結処理細胞の分画化とその免疫学的な効果については、現在実験中である。
滲出性中耳炎後遺症の治療に関する実験的および臨床的研究

難治性滲出性中耳炎のうち、遷延する鼻副鼻腔炎を伴うものにマクロライド系抗生剤の少量長期投与(通常使用量の1/3量を3カ月投与)を行い、聴力改善では現在最も滲出性中耳炎の治療として確立されている鼓膜チューブ留置と同等の結果がみられ、長期的には鼓膜チューブ留置より再発が少ないという良好な結果が得られ、この群の滲出性中耳炎に本治療法が有効であることがわかった。中耳コレステリン肉芽腫に対して、ステロイド剤内服(プレドニソロン0.5-1mg/kgを初回量として10-14日で漸減)後に鼓膜チューブ留置を行い、6例、7耳すべてで耳漏停止、聴力回復をみ、重篤な副作用もみられなかったことから、本治療法がコレステリン肉芽腫に対して有効な治療法であることがわかった。器質的に閉塞した耳管に対する耳管再建は、予想以上に困難であることがわかったが、これを未然に防ぐために耳管通気が有効であることがわかった。また過度の通過性を持つ耳管に対しては、軽度のものでは耳管内ベゾルド末の噴霧が有効であり、重度のものにはアテロコラーゲンの耳管粘膜下注入が有効であることがわかった。その他、耳管機能障害のメカニズムとして、炎症による耳管粘膜の表面張力が上昇すること、また粘膜の浮腫などにより嚥下時に耳管の絞扼が起こることが新たにわかった。さらに中耳の換気には、耳管の他に内耳粘膜のガス交換が重要な役割を持ち、ちゅうじの換気不全により起こる疾患では、耳管とともにこの粘膜ガス交換も障害されていることがわかった。難治性滲出性中耳炎のうち、遷延する鼻副鼻腔炎を伴うものにマクロライド系抗生剤の少量長期投与(クラリスロマイシン、一日通常量の1/3量を3カ月分投与)を行ったところ、聴力改善では現在最も滲出性中耳炎の治療として確立されている鼓膜チューブ留置と同等の効果がみられ、長期的には鼓膜チューブ留置より再発が少ないという結果を得た。またこれらの症例では副鼻腔炎も改善する傾向がみられた。この結果からこの群の難治性滲出性中耳炎に本治療法が有効であることがわかった。中耳コレステリン肉芽腫に対して、ステロイド剤内服(プレドニソロン0.5-1mg/kgを初回量として10-14日で漸減)後に鼓膜チューブ留置を行ったところ、5例、6耳すべてで耳漏停止し、聴力も正常に回復した。また副作用も重篤なものはみられなかった。今後も引き続き経過観察し、長期成績をみる予定であるが、本治療法は侵襲が少なく、効果が予想以上に良いため、中耳コレステリン肉芽腫の第一選択の治療法となりうると考えられた。耳管の器質的閉塞を伴う難治性滲出性中耳炎に対しては、現在実験的にネコでこれを作製し、耳管を再建する目的で耳管内にシリコン性のステントを挿入して3カ月後の組織を1耳で調べたが、耳管粘膜上皮の再生は完全ではなく、より長期のステントの留置が必要である可能性が示唆されている現状である。過度の通過性をもつ耳管に対しては、それを修正するために耳管粘膜下に注入する生体材料を主に持続性の点から実験的、臨床的に検討してきた。その結果、通常のアテロコラーゲン(ザイダームコラーゲン)が優れていることがわかった。今後実験的にも臨床的にも症例を増やす予定である。難治性浸出性中耳炎のうち、遷延する鼻副鼻腔

炎を伴うものにマクロライド系抗生剤の少量長期投与(通常使用量の1/3量を3カ月投与)を行い、聴力改善では現在最も浸出性中耳炎の治療として確立されている鼓膜チューブ留置と同等の結果がみられ、長期的には鼓膜チューブ留置より再発が少ないという良好な結果が得られ、この群の浸出性中耳炎に本治療法が有効であることがわかった。中耳コレステリン肉芽腫に対して、ステロイド剤内服(プレドニソロン0.5-1mg/kgを初回量として10-14日で漸減)後に鼓膜チューブ留置を行い、6例、7耳すべてで耳漏停止、聴力回復をみ、重篤な副作用もみられなかったことから、本治療法がコレステリン肉芽腫に対して有効な治療法であることがわかった。器質的に閉塞した耳管に対する耳管再建は、予想以上に困難であることがわかったが、これを未然に防ぐために耳管通気が有効であることがわかった。また過度の通過性を持つ耳管に対しては、軽度のものでは耳管内ベゾルド末の噴霧が有効であり、重度のものにはアテロコラーゲンの耳管粘膜下注入が有効であることがわかった。その他、耳管機能障害のメカニズムとして、炎症による耳管粘膜の表面張力が上昇すること、また粘膜の浮腫などにより嚥下時に耳管の絞扼が起こることが新たにわかった。さらに中耳の換気には、耳管の他に中耳粘膜のガス交換が重要な役割を持ち、ちゅうじの換気不全により起こる疾患では、耳管とともにこの粘膜ガス交換も障害されていることがわかった。
骨吸収因子RANKLと骨形成因子BMPの発現に及ぼす歯周病原性細菌の関与の解明

本研究の目的は,細菌感染により誘導されたラットの実験的根尖性歯周炎において根尖部歯周組織の創傷治癒におけるRANKLおよびBMPの発現と創傷治癒に及ぼすEmdogain^<(R)>gelの効果について解析することであった.感染により誘導された根尖病変部にEMDを貼薬した際の治癒においては,根尖病変周辺で骨形成が活性化され,TGF-β1やBMP-2が陽性の修復性マクロファージが重要な役割を果たしている可能性が示唆された.本研究の目的は,細菌感染により誘導されたラットの実験的根尖性歯周炎において根尖部歯周組織の創傷治癒におけるRANKLおよびBMPの発現と創傷治癒に及ぼすEmdogain^<(R)>gelの効果について解析することであった.感染により誘導された根尖病変部にEMDを貼薬した際の治癒においては,根尖病変周辺で骨形成が活性化され,TGF-β1やBMP-2が陽性の修復性マクロファージが重要な役割を果たしている可能性が示唆された.本研究では歯周病原性細菌P.gおよびA.aにより誘導された実験的根尖性歯周炎根尖歯周組織における樹状細胞。マクロファージ、T細胞、骨芽細胞、破骨細胞とその関連分子の動態について免疫組織学・分子生物学的に解析することを目的としている。一方。近年、EMDの慢性辺縁性歯周炎の骨吸収の改善の有効性が認められ、実験的な作用機序の解明が行われている。しかしながら、根尖病巣周囲組織における樹状細胞、マクロファージ、T細胞、骨芽細胞、破骨細胞の動態にEMDがどのような影響を与えるかは、未だ明らかになっていない。本研究期間では、EMDが根尖歯周組織の創傷治癒に及ぼす効果の解析を日的として、根尖病変周囲硬組織のリモデリングに関与すると考えられるIL-1βおよびRANKLなどの骨吸収活性化因子と、BMP-2およびTGF-β1などの骨形成促進因子の発現について免疫組織学的に検討を行ったところ、以下の結果を得た。・5週令ラットに根尖病変を成立させたところ、ED1, IL-β、RANKL発現細胞は術後0日後目で多く認められ、その後は減少傾向を示し、BMP-2, TGFβ1発現細胞は7日後をピークとした増減を示した。この現象は特にEMD群で著明であった。・EMD群では骨芽細胞に経時的に高いALP活性が認められ、その近傍には泡沫型のBMP-2発現細胞が観察された。これらはED1発現細胞と局在が類似しており、マクロファージである可能性が示唆された。以上の結果より、根尖病変周囲組織へのEMDの貼薬によって、根尖病変周辺で骨形成が活性化されることが示唆された。本研究では歯周病原性細菌P.gおよびA.aにより誘導された実験的根尖性歯周炎根尖歯周組織における樹状細胞、マクロファージ、T細胞、骨芽細胞、破骨細胞とその関連分子の動態について免疫組織学・分子生物学的に解析することを目的としている。一方、近年、EMDの慢性辺縁性歯周炎の骨吸収の改善の有効性が認められ、実験的な作用機序の解明が行われている。本研究期間では、EMDが根尖歯周組織の創傷治癒に及ぼす効果の解析を目的として、根尖病変周囲硬組織のリモデリングに関与すると考えられるIL-1βおよびRANKLなどの骨吸収活性化因子と、BMP-2およびTGF-β1などの骨形成促進因子の発現について免疫組織学的に検討を行ったところ、以下の結果を得た。・5週令ラットに根尖病変を成立させEMDを作用させたところ、EMD群では術後7日目に,TGF-β1またはBMP-2陽性を示すマクロファージの急激な増加が観察され,術後14日目にはセメント質および骨組織の著しい形成が認められた.・一方,PGA群では実験期間を通じてTGF-β1またはBMP-2が陽性のマクロファージは少数であり,根尖病変周辺の歯周組織の回復はほとんど認められなかった.これらはED1発現細胞と局在が類似しており、マクロファージである可能性が示唆された。以上の結果より、EMDの応用により誘導された根尖病変部の治癒においては,TGF-β1やBMP-2が陽性の修復性マクロファージガ,重要な役割を果たしている可能性が示唆された
腫瘍細胞破壊のキラ-メカニズム

宿主細胞によるがん細胞破壊のキラ-メカニズムの本態を明らかにすること,また得られた知見を生かして,キラ-細胞を利用した論理的ながん治療法の確立へもアプロ-チすることを目的として研究を行ない以下の成績を得た.1)活性化マクロファ-ジの腫瘍細胞認識に関わるレクチンの構造と遺伝子が決定された.2)キラ-T細胞の抗原特異性を支配するT細胞受容体の可変部領域の遺伝子構造が解明された.3)クラスII拘束性可溶性蛋白特異CTLが免疫反応を特異的に抑制する能力を持つことが明らかになり,この細胞はまた,サプレッサ-T細胞の機能を発揮することが判明した.4)キラ-因子としてのパ-フォリンの役割について複数の系での検討が行なわれた.その結果,パ-フォリンのみによる標的細胞破壊はADCCなどの限定された系でのみ起こることが判明し,他の系での標的細胞破壊にはその他のキラ-因子が関与することが示唆された.5)キラ-細胞による標的細胞破壊における情報伝達系の解明のために紫外レ-ザ-を光源とした共焦点レ-ザ-顕微鏡の開発され,キラ-細胞の機能解析が高感度,かつ,定量的に行えるようになった.このシステムの使用によりキラ-細胞のカルシウムシグナルが細胞質だけでなく核にまで伝達されることが解明された.6)ヘルパ-/キラ-活性を持つヒトCD4^+T細胞のin vitro大量培養が可能となった.この方法により作成したキラ-細胞を用いたがんの養子免疫療法が検討され,有為な成績が得られた.宿主細胞によるがん細胞破壊のキラ-メカニズムの本態を明らかにすること,また得られた知見を生かして,キラ-細胞を利用した論理的ながん治療法の確立へもアプロ-チすることを目的として研究を行ない以下の成績を得た.1)活性化マクロファ-ジの腫瘍細胞認識に関わるレクチンの構造と遺伝子が決定された.2)キラ-T細胞の抗原特異性を支配するT細胞受容体の可変部領域の遺伝子構造が解明された.3)クラスII拘束性可溶性蛋白特異CTLが免疫反応を特異的に抑制する能力を持つことが明らかになり,この細胞はまた,サプレッサ-T細胞の機能を発揮することが判明した.4)キラ-因子としてのパ-フォリンの役割について複数の系での検討が行なわれた.その結果,パ-フォリンのみによる標的細胞破壊はADCCなどの限定された系でのみ起こることが判明し,他の系での標的細胞破壊にはその他のキラ-因子が関与することが示唆された.5)キラ-細胞による標的細胞破壊における情報伝達系の解明のために紫外レ-ザ-を光源とした共焦点レ-ザ-顕微鏡の開発され,キラ-細胞の機能解析が高感度,かつ,定量的に行えるようになった.このシステムの使用によりキラ-細胞のカルシウムシグナルが細胞質だけでなく核にまで伝達されることが解明された.6)ヘルパ-/キラ-活性を持つヒトCD4^+T細胞のin vitro大量培養が可能となった.この方法により作成したキラ-細胞を用いたがんの養子免疫療法が検討され,有為な成績が得られた.
楕円曲線の算術的理論の研究

本研究では、代数体上定義された、虚数乗法を持つアーベル多様体の数論的性質を研究した。まず第一に、定義体が有理数体で虚数乗法の体が円分体であるものを考察した。この場合、具体的に知られている例として、フェルマ-曲線のヤコビ多様体が挙げられるが、そのハッセ=ヴェイユL関数は、ある特別なヤコビ和から得られるヘッケ量指標のL関数で表わされる。そこで、より一般のヤコビ和そのものの数論的性質を調べることが重要になってくる。論文"Abelian fields generated by a Jacobi sum"において、ひとつのヤコビ和の生成されるアーベル体の特徴づけを行ない、いくつかの場合においてそのアーベル体を決定することに成功した。それらの結果は、この問題を最初に提起した小野の論文の結果の拡張を与えるものである。次に、論文"Tosion points on abelian fields with complex multiplication"において、虚数乗法を持つアーベル多様体のモ-デル=ヴェイユ群の有限部分の大きさを調べた。この方向では、シルヴァーバーグの評価式があるが、それは一般の場合に適用可能だが最良のものではないことがわかっていた。そこで、考えているアーベル多様体の定義体が虚数乗法の体の反射体を含まないという仮定の下で考えてみた。この場合モ-デル=ヴェイユ群の有限部分の大きさは、定義体と虚数乗法の体の反射体の合成体に含まれる1の巾根の数を用いたある定数でおさえることができることが判った。特に、有理数体上の楕円曲線の場合にその結果を適用すると、古典的な結果であるオルソンの評価式を得る。更に、これはいくつかの例においては最良のものであることも確かめられた。
網羅的遺伝子発現解析に基づいた甲状腺未分化癌の分子機構の解明と新規治療戦略の開発

臨床甲状腺癌組織を用いた網羅的遺伝子発現解析の結果、転写因子PATZ1に着目し、下記の結果を得た。1ヒト臨床検体を用いた免疫組織染色での解析で、正常濾胞上皮細胞と過形成では、全例でPATZ1は核に発現していたが、甲状腺癌の分化度が低下すると、核での発現頻度は有意に減少していた。2不死化甲状腺濾胞上皮細胞(Nthy-ori-3.1細胞)でPATZ1をノックダウンすると、細胞の増殖、遊走、浸潤能の増加が認められた。3Nthy-ori-3.1でPATZ1をノックダウンすると、細胞の浸潤や遊走に関与する、uPAやMMPsの発現と活性の上昇が認められた。4もともとPATZ1発現の少ない甲状腺未分化癌細胞株(ACT-1、FRO)で、PATZ1を強制発現させると、増殖、遊走、浸潤能の低下と、uPAやMMPsの低下が認められた。5臨床検体での免疫組織染色での解析で、PATZ1とuPA、MMPsの発現に有意な逆相関が認められた。当初の目的通り、臨床甲状腺癌組織を用いた網羅的遺伝子発現解析の結果から候補遺伝子を複数抽出し、そのうちの一つである転写因子PATZ1に着目し、in vitroおよび臨床検体での解析を行い、得られた成果の一部を論文発表することができた。これまでのところ、概ね順調に経過していると考えている。in vitroとin vivoで興味深い結果が認められたPATZ1の機能解析をさらに進めると同時に、他の候補遺伝子についても解析を進めていく予定である。一時成果報告(論文作成)に時間を要したため、実験を縮小したが、論文発表が一段落したので、今後物品購入も増加する予定で、次年度に使用する計画である。
歯周病原性菌の病原性因子に関する研究

Porphyromonas gingivalisなどの黒色色素生産性嫌気性桿菌を歯周局所から分離する際、選択培地としてカナマイシンが加えられたものがよく用いられる。P. gingivalis菌体破砕上清中のカナマイシン不活化能を検討した結果、カナマイシン不活化因子が存在することが解ったので、P. gingivalisからその不活化に関わる遺伝子のクローニングを試みた。P. gingivalis 16-1株からの染色体DNAを用いて組換えDNA実験を行いカナマイシン耐性の大腸菌形質転換体を得た。本カナマイシン不活化活性はアセチルコエンザイムAによって促進されることがわかり、カナマイシンをアセチル化することによって不活化していることが示唆された。歯周病局所からよく分離されるCapnocytophaga菌種の内毒素活性について検討した。その結果C. sputigena LPSは比較的強い免疫生物学的活性を示したが、C. ochraceaおよびC. gingivalisのLPSの活性は弱かった。このことよりCapnocytophaga菌種のうち特にC. sputigenaが歯周病に関与している可能性が示唆された。Actinobacillus actinomycetemcomitansは、歯周病に深く関わっているグラム陰性通性嫌気性桿菌である。本研究ではA. actinomycetemcomitansから溶血活性にかかわる遺伝子のクローニングを試みた。A. actinomycetemcomitans ATCC 43718株からの染色体DNA断片をpTZ18Rに組換えてウマ血液寒天培地上で溶血を示す大腸菌形質転換体を選択した。得られたクローンpTZAa1は、A. actinomycetemcomitans由来の約1.7-kbpの挿入断片を有していた。その大腸菌クローン菌体の超音波破砕上清をSDS-PAGEで調べたところ分子量約1万にバンドが確認された。今後この遺伝子の塩基配列を決定するなど更に解析を進めるとともに、今回クローニングされた以外の溶血因子のクローニングを試み、それらの歯周病との関わりについて検討する予定である。Porphyromonas gingivalisなどの黒色色素産生性嫌気性桿菌を歯周局所から分離する際、選択培地としてカナマイシンが加えられたものがよく用いられる。しかしこのカナマイシン耐性機構については、詳しく検討されていない。そこでP.gingivalis菌体破砕上清中のカナマイシン不活化能を検討した結果、カナマイシン不活化因子が存在することが解ったので、P.gingivalisからその不活化に関わる遺伝子のクローニングを試みた。P.gingivalis16-1株からの染色体DNAを用いて組換えDNA実験を行いカナマイシン耐性の大腸菌形質転換体を得た。得られたクローンpPG16は、約2-kbの挿入断片を有しており、Southern blotの結果その挿入断片は供試した全てのP.gingivalis染色体DNAと反応した。また、P.gingivalis16-1株の全菌体で免疫して得られたウサギ抗血清とクローンpPG16菌体破砕上清を用いてWestern blot解析を行ったところ約35kDaに反応バンドが得られた。