hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん関連転写因子Runx1/CBFβを標的とした活性制御薬物の研究

がんの原因分子を標的とする薬剤を用いたがん分子標的治療は、白血病や肺がん等の様々ながんに対して延命効果を示している。しかしその標的分子としては、がんの原因の一部であるリン酸化酵素が主で、最大の原因分子である転写因子の多くはいまだがん分子標的の対象となっていない。そこで本研究では、転写因子を標的分子とした治療法の開発を目指した。転写因子を標的とした分子標的治療は、リン酸化酵素との複合変異のある症例にもリン酸化酵素阻害薬と併用することで治療効果を飛躍的に高めることが期待できる。具体的には、急性白血病において、高頻度に遺伝子変異が認められ、発病・進展に関与する転写因子Runx1/CBFβを対象とし、低分子阻害薬の開発を試みた。本研究では、まず表面プラズモン共鳴法やゲルシフトアッセイを用いて、複数種の低分子化合物がRunx1のDNA結合活性阻害を持つことを示した。さらに、Microscale thermophoresis (MST)を用いて、Runx1と低分子化合物との結合親和性の測定を行い、解離定数を算出した。一方、細胞レベルでの低分子化合物の活性評価として、Jurkat(T lymphoblast-like)細胞やRunx1に変異を有する白血病細胞であるKasumi細胞を用いて、培養細胞におけるRunx1の転写活性化能に与える低分子化合物の影響を解析した。さらに、低分子化合物によるRunx1のDNA結合阻害活性のメカニズムを明らかにするため、結晶系の異なるRunx1単体の結晶構造を複数明らかにし、Runx1と低分子化合物との複合体の結晶化を試みた。今後、低分子化合物の結晶への浸漬条件を検討する等して、Runx1と低分子化合物の相互作用を分子構造レベルで明らかにし、共同研究を行っているインタープロテイン(株)の協力のもと、化合物の分子構造をさらに最適化することを計画している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。がんの原因分子を標的とする薬剤による分子標的治療は、白血病や肺がんなどでめざましい効果を上げている。しかし、その標的分子は、がんの原因の一部としてのリン酸化酵素が主で、最大の原因分子である転写因子の多くはいまだ分子標的の対象となっていない。そこで本研究では、転写因子を標的分子とした治療法の開発を目指す。具体的には、急性白血病において、高頻度に遺伝子変異が認められ、発病・進展に関与する転写因子Runx1/CBFβを標的とした低分子活性阻害薬を開発し、がん治療における新たな選択肢として提案したい。転写因子を標的とした分子標的治療は、リン酸化酵素との複合変異のある症例にリン酸化酵素阻害薬と併用することで治療効果を飛躍的に高めることが期待できる。本研究では、まず表面プラズモン共鳴法を用いて、複数種の低分子化合物がRunx1のDNA結合活性阻害およびCBFβ結合活性阻害効果を持つことを示した。一方、細胞レベルでの低分子化合物の活性評価として、Jurkat (human T lymphoblast-like)細胞を用いて、培養細胞におけるRunx1の転写活性化能に与える低分子化合物の影響を解析した。今後、低分子化合物の構造をさらに最適化するために、Runx1と低分子化合物との相互作用について分子構造レベルで解析し、インタープロテイン(株)の協力のもとに阻害活性のさらに高い化合物の同定を目指す。現在までに以下の研究を行った。1)生化学的手法を用いた薬効の評価:表面プラズモン共鳴法に用いて、Runx1-DNAおよびRunx1-CBFβ結合阻害薬によるDNA結合阻害活性を測定した。現有するビアコア2000を用いて、センサーチップCM4にRunx1の結合配列を含む顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)のエンハンサーDNAを結合させ、Runx1を含む水溶液を添加することでDNAへの結合をセンサーグラムとしてリアルタイムにモニターした。その結果、複数種の低分子化合物にRunx1のDNA結合活性阻害およびCBFβ結合活性阻害効果があることがわかった。2)Runx1と低分子化合物との結合親和性の測定:Microscale thermophoresis (MST)を用いて、Runx1と低分子化合物との結合親和性を測定した。その結果、複数種の低分子化合物がRunx1と1:1のモル比で結合することが示され、解離定数を算出した。(今後、必要に応じて再現性の確認実験を行う)3)細胞レベルでの低分子化合物の活性評価:Jurkat (human T lymphoblast-like)cell lineを用いて、培養細胞におけるRunx1の転写活性化能に与える低分子化合物の影響を解析した。進捗状況がやや遅れている理由:昨年度、Runx1を標的とする化合物の活性評価の結果、当初の予想に反し、Runx1を標的とする化合物が他の転写因子Ets1にも作用することが明らかとなった。この現象の本質を見極めることが不可欠であることから、Ets1に対する化合物の活性評価を追加で実施する必要が生じた。さらに、候補低分子化合物とRunx1との共結晶化実験において、結晶化の再現性が乏しいなど、結晶化条件のスクリーニングに時間を要している。

しかしその標的分子としては、がんの原因の一部であるリン酸化酵素が主で、最大の原因分子である転写因子の多くはいまだがん分子標的の対象となっていない。そこで本研究では、転写因子を標的分子とした治療法の開発を目指した。転写因子を標的とした分子標的治療は、リン酸化酵素との複合変異のある症例にもリン酸化酵素阻害薬と併用することで治療効果を飛躍的に高めることが期待できる。具体的には、急性白血病において、高頻度に遺伝子変異が認められ、発病・進展に関与する転写因子Runx1/CBFβを対象とし、低分子阻害薬の開発を試みた。本研究では、まず表面プラズモン共鳴法やゲルシフトアッセイを用いて、複数種の低分子化合物がRunx1のDNA結合活性阻害を持つことを示した。さらに、Microscale thermophoresis (MST)を用いて、Runx1と低分子化合物との結合親和性の測定を行い、解離定数を算出した。一方、細胞レベルでの低分子化合物の活性評価として、Jurkat(T lymphoblast-like)細胞やRunx1に変異を有する白血病細胞であるKasumi細胞を用いて、培養細胞におけるRunx1の転写活性化能に与える低分子化合物の影響を解析した。さらに、低分子化合物によるRunx1のDNA結合阻害活性のメカニズムを明らかにするため、結晶系の異なるRunx1単体の結晶構造を複数明らかにし、Runx1と低分子化合物との複合体の結晶化を試みた。今後、低分子化合物の結晶への浸漬条件を検討する等して、Runx1と低分子化合物の相互作用を分子構造レベルで明らかにし、共同研究を行っているインタープロテイン(株)の協力のもと、化合物の分子構造をさらに最適化することを計画している。がんの原因分子を標的とする薬剤を用いたがん分子標的治療は、白血病や肺がん等の様々ながんに対して延命効果を示している。さらに、低分子化合物によるRunx
エストロジェン受容体発現量による予後・治療効果予測法の開発

申請者の開発したWestern ligand blot(WLB)法により、リガンドを用いてエストロジェン受容体(ER)の発現量を再現性良く、安価に解析する方法を開発し、予後予測および治療効果予測診断法へ応用することを目的に研究を行った。昨年度はリガンドとしてエストラジオール誘導体を用いたが、受容体への結合能が低いことが分かった。そこで本年度はリガンドを変更し、タモキシフェン誘導体を用いることとした。タモキシフェン誘導体にタグとなるFITC修飾を行い、目的とする検出薬剤の合成に成功した。ERとの結合性を評価する目的で、ER発現細胞であるMCF7細胞を用い、蛍光顕微鏡により観察を行った結果、MCF7細胞への結合を認めた。このことからタグ標識したタモキシフェン誘導体が結合能を有することを明らかにした。次に、MCF7細胞から細胞溶解液を調製し、SDS-PAGEに供し、PVDF膜に転写後、その膜上のER検出を試みた。その結果、タモキシフェン誘導体を用いてERの検出に成功した。以上のことから、タモキシフェン誘導体を用い、WLBによりERが検出できることを明らかにした。さらに詳細な結合能を明らかにするため、ELISA法を用いERとタモキシフェン誘導体との結合親和性を評価した。その結果、11nMという高い親和性を有することを明らかにした。次年度はこのタモキシフェン誘導体を用いてリガンド誘導体染色法により乳がんおよぼ肺がんの病理検体の染色を行う予定である。また臨床情報と合わせて予後予測の検討を行う。1年目に検出薬剤の合成を終える予定であったが、1年目に合成した検出薬剤を評価した結果、低い親和性を有する薬剤しか合成できなかった。そこで2年目に新たな薬剤を合成することで高い親和性を有する検出薬剤の合成に成功し、1年目の目標を達成することができた。しかし、そこで時間を要し、進捗は当初の想定よりやや遅れている。昨年度に構築したELISAの評価法を駆使し、高い親和性を有する検出薬剤を見出すことに成功した。またWestern ligand blotによって標的とするエストロジェン受容体の検出に成功した。よって本年度は、この検出薬剤を用いて乳がんおよび肺がん検体を用いてリガンド誘導体染色を行う予定である。申請者の開発したWestern ligand blot(WLB)法によりリガンドを用いてエストロジェン受容体(ER)の発現量を再現性良く、安価に解析する方法を開発し、予後予測および治療効果予測診断法へ応用することを目的に研究を行った。本年は検出のためのリガンド薬剤合成を行い、その検出能の評価を行った。ERのリガンドとしてはエストラジオール誘導体を選び、出発原料としてエチニルエストラジオールを用いた。クリック反応により、ポリエチレングリコール(PEG)をリンカーとして導入し、その後にタグとなるFITC修飾を行い、目的とする検出薬剤の合成に成功した。ERとの結合性を評価する目的で、ER発現細胞となるMCF7を用い、共焦点顕微鏡により観察を行った結果、MCF7細胞への薬剤集積を認めた。このことからタグ標識したエストラジオール誘導体が結合親和性を失っていないことが判った。次に、MCF7細胞から細胞溶解液を調製し、SDS-PAGEに供し、PVDF膜に転写後、その膜上のERを検出できるかを確認した。その結果、エストラジオール誘導体を用いてERの検出に成功した。以上のことから、エストラジオール誘導体を用いてWLBによりERが検出できることを明らかにした。しかし、ERを検出するためにはエストラジオール誘導体をμM程度の高濃度で反応させる必要があり、その結合親和性が低いことが判った。そこで現在、エストラジオール誘導体のタグ修飾位置を検討し、結合親和性の高い誘導体合成を進めている。同時に結合親和性を定量評価するためのELISAを立ち上げている。次年度はELISAを用いて結合親和性の高い誘導体を見出し、WLB法およびリガンド誘導体染色法により乳がんおよぼ肺がんの病理検体の染色を粉う予定である。本年度の目的は検出薬剤の合成である。その点において、開発したエストラジオール誘導体によりWestern ligand blot法でエストロジェン受容体検出に成功したことから、当初目的は達成できたと考える。

次年度はこのタモキシフェン誘導体を用いてリガンド誘導体染色法により乳がんおよぼ肺がんの病理検体の染色を行う予定である。また臨床情報と合わせて予後予測の検討を行う。1年目に検出薬剤の合成を終える予定であったが、1年目に合成した検出薬剤を評価した結果、低い親和性を有する薬剤しか合成できなかった。そこで2年目に新たな薬剤を合成することで高い親和性を有する検出薬剤の合成に成功し、1年目の目標を達成することができた。しかし、そこで時間を要し、進捗は当初の想定よりやや遅れている。本年度開発した検出薬剤によりWestern ligand blot法でエストロジェン受容体検出に成功した。しかし、その際の反応濃度としてμM程度の高濃度が必要であることが判った。次年度はリガンド誘導体染色法で病理切片中のエストロジェン受容体検出を行う予定である。その際にはさらに結合親和性の高い検出薬剤の方が感度良く検出できると予想される。そのためには今後、高い結合親和性を有する誘導体の開発が必要と考えられる。また結合親和性を定性的に評価する系の構築も必要である。そこで今後の推進方策としてはELISAの構築と、高い結合親和性を有する薬剤を見出すことした。昨年度に構築したELISAの評価法を駆使し、高い親和性を有する検出薬剤を見出すことに成功した。またWestern ligand blotによって標的とするエストロジェン受容体の検出に成功した。よって本年度は、この検出薬剤を用いて乳がんおよび肺がん検体を用いてリガンド誘導体染色を行う予定である。本年度にwestern blot検出システムを購入する予定であった。しかし実験を進めた結果、次年度にELISAを立ち上げる必要性が生じ、そのためにマイクロプレートリーダーが必要になった。western blot検出システムに関しては、学内の共同利用施設により借りることが可能なので、次年度にマイクロプレートリーダーを購入することにし、そのために物品費を繰り越した。1,801円の次年度使用額が発生した。残額が少額すぎて研究に必要な物品購入には足りず、次年度に繰り越すことにした。
収束電子回折法による電荷・軌道秩序状態の観察

1.収束電子回折法による電子密度分布解析法について、継続して改良を加えた。これまでわれわれが独自に開発してきた解析ソフトウェア(MBFIT)に、より自由な束縛条件を導入できるようにソースコードの変更を追加した。2.LaCrO_3の菱面体晶相について、われわれが開発してきた収束電子回折法による電子密度分布解析を適用した。前年度すでに[11-1]方向からの投影電子密度分布を得ているが、今年度は複数の入射データを複合的に解析を行うことで3次元的な変形電子密度分布を得ることに成功した。Cr原子からO原子への明瞭な電荷移動が確認された。3.前年度から引き続いてLaMnO_3の軌道秩序相の電子密度分布解析を行った。この相では、Mn^<3+>の3d電子のうちe_g(3z^2-r^2)軌道に属する電子がMnまわりの酸素八面体のヤーンテラー歪みを伴って秩序配列することが、共鳴X線散乱等により報告されている。収束電子回折強度データを用いて価電子分布に特に敏感な低散乱角領域(sinθ/λ<0.3)の反射の結晶構造因子を精密化し、原子の球状電子密度分布を仮定した計算値から大きく値がずれる反射を見出した。この結果から変形電子密度分布を得て、Mn原子の3d電子の軌道秩序に直接対応する異方的な電子密度を観察することに世界で初めて成功した。1.収束電子回折法を用いて電子密度分布を得るための解析手法について検討した。これまでわれわれが独自に開発してきた収束電子回折強度解析のための汎用ソフトウェア(MBFIT)に、精密化した結晶構造パラメーターおよび低次結晶構造因子からポアッソン方程式を用いて電子密度分布を求める機能等を追加・拡張した。また、低次結晶構造因子をより高い精度で精密化するための実験条件について、動力学回折理論によるシミュレーションを行って調べた。2.電子密度分布解析の最初のテストとしてLaCrO_3の高温菱面体相を取り上げた。実験で得たエネルギーフィルター収束電子回折強度と動力学回折理論による強度計算をフィッティングすることにより、原子位置、等方性および異方性熱振動パラメーター(デバイ・ワーラー因子)の精密化および低次結晶構造因子の精密化を行った。解析結果は八面体頂点位置の酸素原子の異方的な熱振動を明瞭に示していた。さらに、この結果から、上で述べた改良を加えた解析ソフトウェアを用いて電子密度分布を求め、LaおよびCr原子からO原子への電荷移動を可視化することに成功した。3.軌道秩序を起こすLaMnO_3の電子密度分布解析に着手した。われわれの開発したエネルギーフィルター透過電子顕微鏡JEM-2010FEFを用いて、試料のナノメーター領域からエネルギーフィルター収束電子回折図形を撮影した。現在このデータを用いた解析が進行中である。
運動遂行時の注意喚起に伴う体性感覚野ニューロン活動

運動遂行中のサル大脳皮質体性感覚野には、運動遂行に伴う受容野の機械的刺激に先行して活動を開始するニューロンや、受容野が存在しないのに運動遂行に伴って活動するニューロンなど、その受容野が刺激されていないにも拘わらず活動が誘発されるようなニューロンが存在する。この活動が、運動に先立つ動物の注意や期待などの心的要因によって引き起こされた可能性を検討するために、心理学的にヒトの心活動をよく反映することが知られている瞳孔面積の変化と、運動遂行時や受動的刺激時のサル体性感覚野手指(II/III指)領域ニューロンの活動との関係を解析した。LEDのインストラクションによる指運動課題遂行中、手指運動に先行してほぼ常時瞳孔面積の増大が引き起こされた。散瞳の程度は、報酬獲得率の高い時期には大きく、実験終了近くで十分な報酬を得た後には小さかった。このことから、瞳孔面積の変化はサルにおいても運動に伴う心活動の良い指標となることが示唆された。解析を行った212個のうち、27個のニューロンで、運動に伴う受容野刺激に先行する散瞳の開始と同時に発火頻度が著名に増加した。課題遂行中LEDの点灯に伴って散瞳は引き起こされたが手指運動は行わなかった試行中では、散瞳の大きさと、誘発された活動電位(これはサルの注意のみによって引き起こされたと考えられる)の数との間には有意の相関が見られた。一方、指運動をさせる代わりに受動的刺激を行い、LEDが点灯中に刺激と同時に報酬を与えると、LEDの点灯に前後して散瞳が誘発された。受動的刺激に対する応答を解析した115個のニューロンのうち、14個のニューロンで散瞳している最中に与えられた刺激に対する反応のほうが安静時よりも大きく、12個のニューロンでは小さかった。これらの結果から、体性感覚系にトップダウンの情報処理があることが示された。
地震の表面波による歪の伝播・励起に伴う地下水変化

平成8年8月から湯谷温泉において,水温2チャンネル(深さ2.1mと低温の帯水層直上の深さ24m)と湧水量2チャンネル(低感度と高感度)の計4チャンネルのデータを,5Hzのサンプリングレートで(科学研究費で購入した)ディジタルデータレコーダに収録し始めた.収録チャンネルが増えたので,当初予定していた10Hzのサンプリングレートを5Hzに落として収録している.1996年10月19日の23時44分48秒頃に発生した日向灘の地震(M6.6)の際,従来の1時間値で見る限りでは,深さ2.1mと24mの所の水温が地震後に5070m°C上昇したということが分かるにすぎなかった.しかし,5Hzサンプリング値で見ると,深さ2.1mの水温で23時47分7秒頃から23時47分22秒頃から23時47分48秒頃の間に3m°Cの低下、深さ24mの水温で23時47分29秒頃の間に56m°Cの低下があり,その後上昇に転じていることが判明した.他方,京都大学鳥取観測所の超高性能地震計の記録によれば,P波立ち上がりが23時45分50秒前後、表面波の立ち上がりは23時46分45秒前後、表面波の大きなピークは23時47分前後である.現状では変化の全体を説明することはできないが,変化の開始時間のみに着目すると,表面波によって低温の帯水層の湧水量が変化し,それが水温の変化となって井戸上部に伝わっているように見える.これが事実とすれば,地震時の水温の変化が,地震の表面波によってもたらされるケースがあることを観測によって示した最初の事例となる.平成8年8月から湯谷温泉において,水温2チャンネル(深さ2.1mと低温の帯水層直上の深さ24m)と湧水量2チャンネル(低感度と高感度)の計4チャンネルのデータを,5Hzのサンプリングレートで(科学研究費で購入した)ディジタルデータレコーダに収録し始めた.収録チャンネルが増えたので,当初予定していた10Hzのサンプリングレートを5Hzに落として収録している.1996年10月19日の23時44分48秒頃に発生した日向灘の地震(M6.6)の際,従来の1時間値で見る限りでは,深さ2.1mと24mの所の水温が地震後に5070m°C上昇したということが分かるにすぎなかった.しかし,5Hzサンプリング値で見ると,深さ2.1mの水温で23時47分7秒頃から23時47分22秒頃から23時47分48秒頃の間に3m°Cの低下、深さ24mの水温で23時47分29秒頃の間に56m°Cの低下があり,その後上昇に転じていることが判明した.他方,京都大学鳥取観測所の超高性能地震計の記録によれば,P波立ち上がりが23時45分50秒前後、表面波の立ち上がりは23時46分45秒前後、表面波の大きなピークは23時47分前後である.現状では変化の全体を説明することはできないが,変化の開始時間のみに着目すると,表面波によって低温の帯水層の湧水量が変化し,それが水温の変化となって井戸上部に伝わっているように見える.これが事実とすれば,地震時の水温の変化が,地震の表面波によってもたらされるケースがあることを観測によって示した最初の事例となる.
生活場面における健康関連行動と心理生物学的ストレス反応との関連性

本研究では,実験的-フィールド研究モデルに基づいて,日常生活場面の健康関連行動や健康状態が実験室場面でのストレス反応性との関連性を明らかにした.大学生を対象に健康関連行動調査を実施し,望ましい健康行動を実施している個人と実施していない個人を抽出し,実験室でのストレス実験を行った.望ましい健康行動を実施している個人は,日常生活場面でのストレス状況下でも,上手く対処し,ストレス反応を低減している研究成果を得られた.本研究では,実験的-フィールド研究モデルに基づいて,日常生活場面の健康関連行動や健康状態が実験室場面でのストレス反応性との関連性を明らかにした.大学生を対象に健康関連行動調査を実施し,望ましい健康行動を実施している個人と実施していない個人を抽出し,実験室でのストレス実験を行った.望ましい健康行動を実施している個人は,日常生活場面でのストレス状況下でも,上手く対処し,ストレス反応を低減している研究成果を得られた.本研究は,日常生活場面での個人の健康関連行動や健康状態がストレス場面にどのような影響を及ぼすかについて明らかにすることを目的とした.本年度は,望ましい健康行動の基準の妥当性の検証するために,フィールド場面で日本版健康関連行動調査を実施した.更に,メンタルストレステストに対する心理生物学的ストレス反応性の予備調査を検証し,次年度以降の実験システムを構築した.その結果,以下のような知見を得ることができた。1:望ましい健康行動の基準の妥当性の検証大学生を対象者に集団法にて日本版健康関連行動調査,GHQ-28及びBDIを実施した.健康行動,健康信念,健康知識及び健康のコントロール感を独立変数として,GHQ-28,BDIを従属変数として基準関連妥当性を検証した.うつ傾向や慢性ストレス状態の強い個人は,望ましくない健康行動をしており,健康信念や健康知識が低い傾向であった.一方,それらの傾向が低い個人は,望ましい健康行動を実施しており本調査用紙の妥当性を明確にできた.2:メンタルストレステストに対する心理生物学的ストレス反応性の予備調査大学生100名を対象にメンタルストレステストを実施し,その前後の唾液を採取しPNEI指標,DSSQ・III(主観的ストレス状態)及び心拍の変化を調べた.なお,同一の対象者にストレステストを負荷しない統制条件にて同様のプロトコールにて実験を行った.統制条件と比較して,実験条件のPNEI指標,気分及び心拍等が著明に上昇した.これらの結果から,スピーチ課題をメンタルストレステストとして採用し,実験モデルの妥当性を検証できた.3:認知的混乱課題によるストレス反応の変化2と同様の実験モデルにて,メンタルストレステストをスピーチ課題と認知的混乱課題(市販されているソフト)の二つを実施した.スピーチ課題に比べ認知的混乱課題のストレス反応は低かった.次年度以降にメンタルストレステストの種類を増やすことが検討課題である.本研究は、実験的-フィールド研究モデルに基づいて、日常生活場面での個人の健康関連行動や健康状態がストレス場面にどのような影響を及ぼすかについて明らかにすることを目的とした。本年度は、大学生を対象にBDIを実施し、健康状態の良い個人と良くない個人を抽出し、実験室でのストレス実験を行った。また、主観的幸福感についても同様の研究を実施し、以下のような知見を得た。1 :実験的-フィールド研究の実施(健康状状態の影響)健康な大学生を対象にBDIを実施し、高抑うつ群と健常群を被験者として選抜した。実験は、10分間の順応期後、9分間のメンタルストレステストを施行し、10分間の回復期にて実施した。free-MHPGでは、高抑うつ群は課題期に上昇し回復期で基準値に戻ったが、健常群では有意な変化が認められなかった。s-IgAでは、健常群に比較して高抑うつ群は常に低値を示した。以上の結果から、抑うつ者は、日常生活場面でのストレス状況下でも、強い心理的負荷を感じ、脳内の中枢神経に強く影響することが示唆される。2 :実験的-フィールド研究の実施(主観的幸福感の影響)大学生を対象にWHO-SUBIを実施し、心の健康度のカットオフを基準として、同意の得られた主観的幸福感の高い個人と低い個人を実験の対象者として選抜し、研究1と同様の手続きで実験を行った。コルチゾールでは、主観的幸福感の高い個人は低い個人に比較して、セッション中常に低かった。これら知見から、主観的幸福感の低い個人に比較して高い個人は、スピーチ課題を強いストレスと認知していない可能性が考えられる。コルチゾールを従属変数とした重回帰分析を行ったところ、緊張覚醒との関連性が認められた。つまり、コルチゾール反応と主観的ストレス反応との生態学的妥当性が検証された。本研究は,実験的-フィールド研究モデルに基づいて,日常生活場面での個人の健康関連行動や健康状態がストレス場面にどのような影響を及ぼすかについて明らかにすることを目的とした.本年度は,大学生を対象に健康関連行動調査を実施し,望ましい健康行動を実施している個人と実施していない個人を抽出し,実験室でのストレス実験を行った.また,GHQ-28,CES-D,主観的幸福感を基準に健康状態についても同様の研究を実施し,以下のような知見を得た.1:実験的-フイールド研究の実験(健康行動の影響)

主観的ストレス反応については,望ましい健康行動を実施している個人に比べ実施していない個人は強い心理的負担を示し,free-MHPGでも同様パターンを示した.作業成績については,望ましい健康行動を実施している個人の方が概ね良かった.以上の結果から、望ましい健康行動を実施している者は,日常生活場面でのストレス状況下でも,上手く対処し,ストレス反応を低減している示唆される。2:実験的-フィールド研究の実施(健康状態の影響)健康状態の良い個人は,スピーチ課題に,s-IgA,コルチゾール,心拍,LF/HF波が上昇し主観的ストレス反応も認められたが,健康状態の良くない個人では,s-IgAやコルチゾールなどで上昇しなかった.健康状態の良い個人は,スピーチ課題時に,HF波と緊張覚醒,時間的プレッシャー及びフラストレーションとの間に負の相関が認められた.すなわち,健康状態のよい者は、ストレスに対し生態が正常に反応しているのに対して、良くない者は、正常に反応しないアロスタティク負荷状態に陥っている可能性が示唆される。3: 3年間の研究成果の報告本研究にて得られた知見を,日本心理学会第73回大会のワークショップにて研究の一部を発表するとともに,日本ストレス学会,日本健康心理学会において一般発表を行った.
酵素分解可能なデンドリティック高分子の合成

リシンデンドリマーは三次元的構造が制御された生体分子由来のデンドリマーとして医療分野への応用が期待されているが、合成時にリシンの側鎖アミノ基をすべて反応に使うため、酵素分解性、代謝性が低い。側鎖アミノ基は酵素による分子認識に重要な役割を果たしているだけでなく、ユビキチン系代謝経路においても重要な役割を果たすことが知られている。本研究では側鎖アミノ基を残したペプチドオリゴマーを合成し、これを繰り返しカップリングすることにより酵素分解可能な新規デンドリマーを合成し、酵素分解活性を評価することが目的である。酵素分解可能なデンドリマーのビルディングブロックとして、グリシン(G)とリシン(K)からなるペプチドオリゴマーの合成を行った。Type I(ABB'型(Fmoc保護)とType II(AB_2型(Fmoc保護)のペプチドオリゴマーをトリチル樹脂を用いた固相合成法により合成した。このペプチドオリゴマーをビルディングブロックとし、Wang樹脂を用いてデンドリマー合成を行った。HPLC分画実験により精製された第一世代、第二世代デンドロンはともにHPLCで単一ピークを示し、目的の質量数をもつことをMALDI-TOF MSスペクトルにて確認した。反応条件最適化過程において、これらデンドロンに含まれるBoc保護基は通常より切断されにくく、数倍の反応時間が必要であることが明らかとなった。ビルディングブロック合成の条件最適化に時間がかかったため、高世代デンドリマーの合成までは期間内に行うことができなかった。高世代デンドリマーの合成と酵素分解反応については継続して検討していく予定である。本研究では側鎖アミノ基を残したペプチドオリゴマーを合成し、これを繰り返しカップリングすることにより酵素分解可能な新規デンドリマーを合成し、酵素分解活性を評価する。平成18年度はリシンのα位と側鎖アミノ基の両方を反応させるTypeI(ABB'型(Fmoc保護))に絞り、液相、固相法による合成条件の最適化を行った。液相法では、カルボキシル基末端をフェナシル基で保護する方法、可溶性高分子担持体としてポリエチレンオキシドを用いる方法などを試みた。いずれの方法でもカップリング反応自体は十分進行したものの、カルボキシル基末端を脱保護した後の精製段階に問題があり、目的とするペプチドオリゴマーを高純度、高収率で得ることはできなかった。一方、弱酸で切断可能なトリチル樹脂を用いた固相法で高純度のペプチドオリゴマーが容易に合成できることがわかった。現在、トリチル樹脂を用いた固相法によりペプチドオリゴマーを量産している。このペプチドオリゴマーをビルディングブロックとし、トリチル樹脂、Wang樹脂を用いたデンドリマー合成を行うことで、同一構造で側鎖アミノ基の有無だけが異なるデンドリマーを合成し、酵素分解試験を行う予定である。

酵素分解可能なデンドリマーのビルディングブロックとして、グリシン(G)とリシン(K)からなるペプチドオリゴマーの合成を行った。Type I (ABB'型(Fmoc保護))とType II (AB_2型(Fmoc保護))のペプチドオリゴマーをトリチル樹脂を用いた固相合成法により合成した。このペプチドオリゴマーをビルディングブロックとし、Wang樹脂を用いてデンドリマー合成を行った。HPLC分画実験により精製された第一世代、第二世代デンドロンはともにHPLCで単一ピークを示し、目的の質量数をもつことをMALDI-TOF MSスペクトルにて確認した。反応条件最適化過程において、これらデンドロンに含まれるBoc保護基は通常より切断されにくく、数倍の反応時間が必要であることが明らかとなった。ビルディングブロック合成の条件最適化に時間がかかったため、高世代デンドリマーの合成までは期間内に行うことができなかった。高世代デンドリマーの合成と酵素分解反応については継続して検討していく予定である。
適応アルゴリズムによる周波数分析法を用いた時変同期信号の分析・同定

パソコンベースでの採譜処理目的に本年度の研究を行った.特に,採譜を行う上で重要な音楽を構成している各音の音階を同定する研究を行い,下記のような結果を得た.(1)音階を同定するアルゴリズムに関する研究a.適応アルゴリズムをもとにした再帰型短時間スペクトル分析法LMSアルゴリズムを応用した周波数分析法を拡張して,定Qフィルタバンクを構成する方法を提案し,その安定条件や分解能などの特性を数学的に解析するとともに,シミュレーションなどによって分析精度が向上することを確認した.b.複素1次系をもとにした再帰型短時間スペクトル分析法複素1次系をもとにした再帰型短時間スペクトル分析法の数学的な解析を行い.分析を行っている周波数成分以外の周波数成分が周波数分析に及ぼす影響を求めて,実験で明らかにした.(2)音階の決定に関する研究楽器が奏でる音は基本波成分と高調波成分からなる.この楽器が奏でる音の基本波成分と高調波成分のパワーの比は楽器の種類や基本周波数によって異なる.楽器の音の分析をに行い,分析結果のデータベース化することができた.(3)音の持続時間の決定に関する研究一般的に音の終了時点というのは認識が困難であるので,音の立ち土がり,時点から次の音の立ち上がり時点までを各音素の持続時間と考え,振幅の変化を調べるのに有利な表現である短時間エネルギの差分データが用いて音の持続時間を決定していた.しかし,音の立ち上がりが小さい場合には抽出できないという問題点があった.そこで,音に持続時間の基準となる基準拍と周波数分析によって得られた各音階のパワーデータを用いることによってこのような問題が解決できた.パソコンベースでの採譜処理目的に本年度の研究を行った.特に,採譜を行う上で重要な音楽を構成している各音の持続時間を決める研究とその音の音階を決める研究を行い,下記のような結果を得た.(1)音階の決定に関する研究楽器が奏でる音は基本波成分と高調波成分からなる.この楽器が奏でる音の基本波成分と高調波成分のパワーの比は楽器の種類や基本周波数によって異なる.このことから基本波成分と高調波成分のパワーの比のテーブルを用意する必要があるので,楽器の音の分析を複素1次系をもとにした再帰型短時間スペクトル分析法に行い,分析結果のデータベース化することができた.(2)音の持続時間の決定に関する研究一般的に音の終了時点というのは確認が困難であるので,音に立ち上がり時点から次の音の立ち上がり時点までを各音素の持続時間と考え,振幅の変化を調べるのに有利な表現である短時間エネルギの差分データを用いて音の持続時間を決定していた.しかし,音に立ち上がりが小さい場合には抽出できないという問題点があった.そこで,音に持続時間の基準となる基準拍と周波数分析によって得られた各音階のパワーデータを用いることによってこのような問題が解決できた.(3)採譜処理に関するその他の研究拍子については,従来のような音響パワーの変化パターンを用いて,2拍子系か3拍子系か判断する方法ではなく,メロディーの周期性から求められることがわかった.また,音階データの転調の有無に関わらず,調子を決定することが可能な方法を提案することもできた.(4)その他の研究LMSアルゴリズムを用いた周波数分析法の実時間処理の可能性を確かめるために,このシステム同定法の1つである周波数応答法に応用し,その可能性を確かめることができた.パソコンベースでの採譜処理目的に本年度の研究を行った.特に,採譜を行う上で重要な音楽を構成している各音の音階を同定する研究を行い,下記のような結果を得た.(1)音階を同定するアルゴリズムに関する研究a.適応アルゴリズムをもとにした再帰型短時間スペクトル分析法LMSアルゴリズムを応用した周波数分析法を拡張して,定Qフィルタバンクを構成する方法を提案し,その安定条件や分解能などの特性を数学的に解析するとともに,シミュレーションなどによって分析精度が向上することを確認した.b.複素1次系をもとにした再帰型短時間スペクトル分析法複素1次系をもとにした再帰型短時間スペクトル分析法の数学的な解析を行い.分析を行っている周波数成分以外の周波数成分が周波数分析に及ぼす影響を求めて,実験で明らかにした.(2)音階の決定に関する研究楽器が奏でる音は基本波成分と高調波成分からなる.この楽器が奏でる音の基本波成分と高調波成分のパワーの比は楽器の種類や基本周波数によって異なる.楽器の音の分析をに行い,分析結果のデータベース化することができた.(3)音の持続時間の決定に関する研究一般的に音の終了時点というのは認識が困難であるので,音の立ち土がり,時点から次の音の立ち上がり時点までを各音素の持続時間と考え,振幅の変化を調べるのに有利な表現である短時間エネルギの差分データが用いて音の持続時間を決定していた.しかし,音の立ち上がりが小さい場合には抽出できないという問題点があった.そこで,音に持続時間の基準となる基準拍と周波数分析によって得られた各音階のパワーデータを用いることによってこのような問題が解決できた.
アコースティクエミッションの文化財への応用-水浸出土木材の保存処理における異常の検知-

水浸出土木材の最大の課題は、如何に収縮による変形や亀裂を起こさず、発掘時の形状を保ったまま、乾燥し強化できるかである。従来、実際の処理にあたっては、そのほとんどが処理中の遺物を処理装置から取り出し直接肉眼観察するか、ひずみセンサーを取り付けるなどして外部から確認する状況であった。そこで、本実験では、ひずみや亀裂を生じる際に発する弾性波を2カ所から計測することにより、遺物内で生じる異常の場所が2次元的にどの位置に発生するか、異常の種類と弾性波の種類の関係、異常を事前に知ることを目的としてアコースティクエミッション(A.E,)の適用性を探る第1歩とした。特に過乾燥による亀裂やひずみを発生しやすい真空凍結乾燥法と、最も汎用に利用されているPEG含浸法への応用を試みた。凍結乾燥法については、非試験体のA.E.のみならず、真空ポンプや冷凍機からのノイズの発生とその遮断、ならびに-40°Cの真空装置内の計測が可能かどうかを検討し、-20°Cの耐寒ラバーによりノイズを押さえ、かつジグの取り付け法を解決した。PEG含浸処理中の計測には耐熱性があり、溶液中で測定可能なセンサーを用意した。その結果A.E.の測定の可能性が得られ。それを持ってモミノキとカシについて真空凍結乾燥時の測定を行ったなお、亀裂の発生や変形を掴むため、X線透過試験とビン埋め込みによる試験片の直線的な形状変化を追った。三次元による位置確認は本計測器では困難であったが、二次元による異常の場所の特定と亀裂や、変形の現象の違いをオッシログラフにより推定出来ることが判明した。なおPEG含浸処理液中では水浸出土木材が軟らかく、最終的にはPEGによる固化の過程がありA.E.の測定方法の検討と解析法を更に検討して行く必要があることが判明した。
被嚢性腹膜硬化症におけるTヘルパー細胞の役割の解明と新規治療法の開発

本研究では、被嚢性腹膜硬化症の病態におけるTヘルパー(Th)細胞の役割解明を目的としている。研究代表者が開発したTh1/Th2/Th17細胞優位発現マウスに実験的腹膜硬化症モデルを誘導し、解析した。その結果、Th2細胞優位マウスは、腹膜の線維化がもっとも重度であった。一方、Th1細胞優位マウスはもっとも軽微であった。次に、Th1細胞優位発現マウスの腹水にて上昇が認められたIFN-γを、腹膜の線維化を誘導した野生型マウスに投与したところ、線維化の緩和を確認した。本研究結果により、被嚢性腹膜硬化症に対し、新たにTh細胞およびサイトカインの制御による治療法の有効性が示唆された。本研究では、これまで不明だった被嚢性腹膜硬化症の病態におけるTヘルパー(Th)細胞の役割を解明し、新たにTh細胞制御による治療法を開発することが目的である。研究代表者はTh1/Th2/Th17細胞優位発現マウスを独自に開発ずみで、本研究では、これらのマウスを用いて、1被嚢性腹膜硬化症を誘導し、Th細胞の特異性と病態進展の関係を明確にする。2Th細胞制御による被嚢性腹膜硬化症の新たな治療法を開発し、腹膜透析普及の障害である被嚢性腹膜硬化症の病態改善に寄与することの2点を目的とする。平成25年度では、研究代表者が作製したTh1細胞優位発現マウス(T-betトランスジェニック(Tg)マウス)、Th2細胞優位発現マウス(GATA-3 Tgマウス)、Th17細胞優位発現マウス(RORγt Tgマウス)、および野生型マウスにクロールヘキシジングルコネート(chlorhexidine gluconate, CG)を週3回腹腔内投与し,実験的被嚢性腹膜硬化症を誘導し、3週間後に腹膜硬化症の検討を行った。CG投与3週間後にマウスを解析したところ、体重減少率、肉眼的炎症所見、腹膜肥厚の検討で、いずれもGATA-3 Tgマウスがもっとも重篤であった。4群の病変比較ではGATA-3 Tgマウス>野生型マウス>RORγt Tgマウス>T-bet Tgマウスの順であった。また、腹膜組織でのα-SMA陽性およびcollagen III陽性範囲の評価、マクロファージ細胞数の評価では、いずれもGATA-3 Tgマウスでもっとも認められた。以上の結果より、本年の実験結果では、実験的被嚢性腹膜硬化症では、Th2細胞優位発現マウスであるGATA-3 Tgマウスがもっとも重篤化が認められ、病態進行にTh2細胞の関与が強く示唆された。平成25年度では、研究代表者が作製したTh1細胞優位発現マウス(T-betトランスジェニック(Tg)マウス)、Th2細胞優位発現マウス(GATA-3 Tgマウス)、Th17細胞優位発現マウス(RORγt Tgマウス)、および野生型マウスにクロールヘキシジングルコネート(chlorhexidine gluconate, CG)を週3回腹腔内投与し,実験的被嚢性腹膜硬化症を誘導し、3週間後に腹膜硬化症の検討を行ったところ、GATA-3 Tgマウス>野生型マウス>RORγt Tgマウス>T-bet Tgマウスの順に病態の重症度を確認した。平成26年度では、Th1/Th2/Th17に関連する病態増悪因子特定のため、CG投与下の腹水サイトカイン産生状況を確認した。その結果、GATA-3 TgマウスではIL-13の著しい産生、T-bet TgではIFN-γの上昇が確認された。病態の進展にこれらのサイトカインの関与が疑われるため、今後はこれらサイトカインの投与または抗体投与による病態の進展への影響の有無を検討する予定である。腹膜透析の重症合併症である被嚢性腹膜硬化症の病態形成では、さまざまな要因が報告されているが、Tヘルパー(Th)細胞の関与は不明な点がまだ多い。本研究では、被嚢性腹膜硬化症におけるTh1/Th2/Th17細胞の役割解明を目的としている。研究代表者はTh1、Th2、Th17細胞優位発現マウスを独自に開発し、本研究ではこれらのマウスを用いて、Th細胞の分化制御と被嚢性腹膜硬化症の関係の解明を試みた。クロールヘキシジングルコネート投与による実験的腹膜硬化症モデルをそれぞれのマウスに誘導し、腹膜線維症の病態を解析した。Th1、Th2、Th17細胞が優位発現するT-bet過剰発現マウス(Th1優位)、GATA-3過剰発現マウス(Th2優位)、RORγt過剰発現(Th17優位)マウス、および野生型マウスに実験的腹膜硬化症を誘導した。

その結果、GATA-3過剰発現マウスは、ほかのマウスと比較し、腹壁腹膜の肥厚、腹膜組織におけるα-SMAの発現、マクロファージの浸潤、III型コラーゲンの発現でいずれももっとも強い結果であった。一方、T-bet過剰発現マウスの病変はもっとも軽微であった。T-bet過剰発現マウスの腹水を検討したところ、IFN-γの高値を認めたため、野生型マウスにクロールヘキシジングルコネートとともにIFN-γを腹腔内に投与したところ、腹膜線維化の緩和を有意に確認できた。本研究の結果から、腹膜線維化の病態制御には、Th細胞およびそのサイトカインが関与していることが考えられ、またこれらを制御することにより、病態制御の可能性が示唆された。本研究結果により、有効な治療法のない被嚢性腹膜硬化症に対し、新たにTh細胞およびサイトカインの制御による治療法の有効性が示唆された。本研究では、被嚢性腹膜硬化症の病態におけるTヘルパー(Th)細胞の役割解明を目的としている。研究代表者が開発したTh1/Th2/Th17細胞優位発現マウスに実験的腹膜硬化症モデルを誘導し、解析した。その結果、Th2細胞優位マウスは、腹膜の線維化がもっとも重度であった。一方、Th1細胞優位マウスはもっとも軽微であった。次に、Th1細胞優位発現マウスの腹水にて上昇が認められたIFN-γを、腹膜の線維化を誘導した野生型マウスに投与したところ、線維化の緩和を確認した。本研究結果により、被嚢性腹膜硬化症に対し、新たにTh細胞およびサイトカインの制御による治療法の有効性が示唆された。平成26年度では、実験的被嚢性腹膜硬化症に関与するサイトカインの特定したことにより、今後はこの結果をもとに、治療法の開発を行うことが可能と考える。当初の予定に照らし合わせ、おおむね順調に進展していると考えられる腎臓内科学本研究課題の今後の推進方策として、まず、被嚢性腹膜硬化症の増悪因子となるサイトカインの抗体投与などによる治療法開発を検討する。また、クロールヘキシジングルコネート投与による実験的被嚢性腹膜硬化症のほか、他の実験的被嚢性腹膜硬化症モデル(ブドウ糖分化産物投与によるなど)の誘導にても同様にTh2細胞の関与しているかどうかを確認する。平成25年度では、Th1、Th2、Th17細胞優位発現マウス間での差異を検討し、Th2細胞の関与がもっとも強く示唆されることを確認した。当初の予定に照らし合わせ、おおむね順調に進展していると考えられる。本研究課題の今後の推進方策として、クロールヘキシジングルコネート投与による実験的被嚢性腹膜硬化症のほか、ブドウ糖分化産物投与による実験的被嚢性腹膜硬化症の誘導にても同様にTh2細胞の関与しているかどうかを確認する。そして、同様にTh2細胞による関与を確認したのち、Th2細胞抑制による実験的被嚢性腹膜硬化症治療を試みる。
「時間」表現の「空間」構造-絵画における視覚要因の分析を通して-

静止した「空間」表現の中に「時間」印象を感じることがある。例えば、絵画や写真の中に、"一瞬"や"過去"、"持続する時間"等を感じることがある。この場合、いったいどのような「空間」要因が「時間」印象の生起に関与しているのであろうか。本研究は、芸術作品を刺激として、画面から感じられる時間印象の構造を探るとともに、それを規定する空間要因(視覚要因)の分析を通して、感性情報処理の一端を考察するものである。刺激には近代から現代に制作された芸術作品(絵画または写真)を採用し、現代における時間のあり方を併せて検討することとした。自由記述による予備実験を経て、32の刺激および60の形容語を選び出し、各刺激に当てはまる形容語を、132名の被験者に選択させた(記述選択法)。単純集計の結果から点相関係数を算出し、因子分析およびクラスター分析を行った。画面に感じられる時間印象については、「過去-現在-未来に渡る時間軸でのある時点」、その間を穏やかに流れる「持続する時間」、「時間の停止」、そして時間そのものではないが時間と深く関わる「動き(変化、速度)」が抽出された。表現法の観点から概観すると、「過去-現在-未来」の時間軸には色彩の影響が、「持続する時間」には安定した構図が、「停止した時間」には比較的単純な構図と余白による心理的な投映効果の余地が示され、一方、「動き」には細かな画面分割や激しい筆遣いが見られた。今後は、作品の選択を再考し、視覚的要因との関係づけを充実させるとともに、鑑賞のみならず制作の方向からの検討も行う計画である。
小胞体局在PDIファミリー蛋白質のBPTI refolding活性に与える影響

平成1011年におこなった研究より、ERp61とERp72は、PDIと同様にBPTIのrefolding反応を促進させること、ERp61とERp72はPDIよりも早く一部の還元型BPTIを成熟型へとrefo1dingさせるにも関わらず・反応720分後でもrefolding中間体が残存していることが判った。この原因を探るべく、二つのrefolding中間体N'(Cys30-Cys51、Cys14-Cys38に二つのジスルフィド結合を持つ)とN^*(Cys5-Cys55、Cys14-Cys38に二つのジスルフィド結合を持つ)を用いて解析したところ、ERp61とERp72は、N'から成熟型への反応は促進できるが、N^*から成熟型への反応は、ほとんど促進できないことがわかった。BPTIrefoldingにおける各PDIファミリー蛋白質のチオレドキシン領域の作用の違いを解析するため、PDI、ERp72、ERp61の各チオレドキシン領域のシステイン残基のセリン残基への置換を試みた。ERp72はPDIやERp61と異なり3箇所のチオレドキシン領域を持つが、各領域が蛋白質のS-S結合形成/異性化にどのように関与しているかについては不明である。正常型と3箇所のアミノ酸置換と組み合わせによる変異型の計8種類のERp72にヒスチジンタッグを付加し大腸菌で発現させた。Ni-NTAカラムでのアフィニティー精製、resource Qカラムでのリクロマトグラフィーをおこない、SDS-PAGE・CBB染色で確認したところ、ほぼ単一バンドとして精製することができた。3箇所すべてのチオレドキシン領域のシステイン残基を置換した変異体では、インスリン還元活性はバックグラウンドレベルにまで活性が低下した。次に、N末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン1)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性にまで低下した。さらに中央のチオレドキシン領域(ドメイン2)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性に低下した。しかしC末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン3)を置換した変異体ではほとんどVmaxには影響がなかった。以上の結果より、インスリン還元反応にはERp72に存在する3カ所のチオレドキシン領域のうち、ドメイン1とドメイン2S-S結合形成/異性化に寄与しているが、ドメイン3はほとんど作用していないことが判った。平成10年度の計画に従い、ラット肝臓から小胞体局在PDIファミリー蛋白質PDI、ERp61、ERp72の大量精製をおこない、各PDIファミリー蛋白質存在下でin vitro BPTIrefoldingアッセイをおこない、その影響を解析した。これまでに得られた結果は、a)還元型BPTIから成熟型への生成速度を比較したところ、PDI存在下では、反応後2.5分後には成熟型が形成されていることが確認でき、300分後には添加した還元型BPTIはほぼすべて成熟型にrefoldingされていた。ERp61もしくはERp72存在下では、PDIと同様に反応後2.5分後に成熟型の形成が確認でき、BPTIのrefolding反応を促進する能力を持つことが判ったが、PDIと異なり、反応後300分から720分後においても、refolding中間体が残存していた。b)refolding中間体に対するERp61とERp72の作用を直接解析するため、二つのrefo1ding中間体N'(Cys^<30>-Cys^<51>、Cys^<14>-Cys^<38>に二つのジスルフィド結合を持つ)とN^*(Cys-{ys.Cys-Cysに二つのジスルフイド結合を持つ)を精製し、アッセイに用いた。上記と同様に解析したところ、PDI存在下では、refolding反応の律速段階であるN'から成熟型、N^*から成熟型への反応を著しく促進することを確かめた。ERp61あるいはERp72存在下では、PDI存在下に比べ促進活性は弱いがN'から成熟型への反応は有意に促進していた。一方、N^*から成熟型への反応は、ほとんど促進していないことが判った。以上より、PDIはN'およびN^*の両方に作用し成熟型への反応を促進させるが、ERp61およびERp72はN'のみ反応に作用し成熟型への反応を促進させることが判った。BPTI

refoldingにおける各PDIファミリー蛋白質のチオレドキシン領域の作用の違いを解析するため、PDI、ERp72、ERp61の各チオレドキシン領域のシステイン残基のセリン残基への置換を試みた。ERp72はPDIやERp61と異なり3箇所のチオレドキシン領域を持つが、各領域が蛋白質のS-S結合形成/異性化にどのように関与しているかについては不明である。正常型と3箇所のアミノ酸置換と組み合わせによる変異型の計8種類のERp72にヒスチジンタッグを付加し大腸菌で発現させた。Ni-NTAカラムでのアフィニティー精製、resource Qカラムでのリクロマトグラフィーをおこない、SDS-PAGE・CBB染色で確認したところ、ほぼ単一バンドとして精製することができた。3箇所すべてのチオレドキシン領域のシステイン残基を置換した変異体では、インスリン還元活性はバックグラウンドレベルにまで活性が低下した。次に、N末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン1)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性にまで低下した。さらに中央のチオレドキシン領域(ドメイン2)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性に低下した。しかしC末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン3)を置換した変異体ではほとんどVmaxには影響がなかった。以上の結果より、インスリン還元反応にはERp72に存在する3カ所のチオレドキシン領域のうち、ドメイン1とドメイン2S-S結合形成/異性化に寄与しているが、ドメイン3はほとんど作用していないことが判った。