hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分裂酵母の胞子形成におけるオルガネラ再構成の解析

また、以前取得した245株も含め、過去の研究で取得された数多くの胞子形成欠損変異株の中には、オルガネラの再構成に異常なものがみられている。本研究はこのオルガネラの再構成が、胞子形成にどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的とする。前年度の結果から、エキソサイトーシス経路と中心体に相当する構造であるSPBの相互作用が前胞子膜形成の開始に重要な役割を担っていることが分かった。そこでまず、エキソサイトーシス経路におけるRab-GEFカスケードの因子に着目し、胞子形成時の発現について調べた。その結果、下流のRabであるYpt2のGEFとして機能するSec2の発現が低下している可能性が示唆された。また、このRab-GEFカスケードの因子と、胞子形成特異的なSPB構成因子との結合の有無について検討したところ、胞子形成特異的なYpt2のGEFであるSpo13はSec2と同様に上流のRabであるYpt3のエフェクターとして機能しうること、加えて、Sec2が、前胞子膜形成の開始に必須であるSpo7と強固に結合することが分かった。Ypt3とSec2の相互作用にSpo7が影響を与えるのかどうかを検討した結果、Spo7を加えたとき、GTP結合型のYpt3とSec2の結合が弱まることが示唆された。以上の結果から、胞子形成時には、Sec2の発現量が低下するとともに、胞子形成特異的なSPB構成因子であるSpo7によってSec2の機能が抑制され、Sec2を介したYpt3からYpt2へのRab-GEFカスケードが抑制されている、というモデルを構築した。胞子形成は細胞質中に新たな細胞膜である前胞子膜が新生するという、ダイナミックなイベントである。これまでに、前胞子膜の伸展には、小胞体、ゴルジ体、細胞膜といったオルガネラからの膜小胞輸送が必須であり、胞子形成時にはオルガネラの大規模な再構成が起こることが明らかになっている。また、以前取得した245株や、過去の研究で取得された数多くの胞子形成欠損変異株の中には、オルガネラ再構成が異常なものがみられている。本研究はこのオルガネラ再構成が、胞子形成にどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的とする。前年度までの結果から、前胞子膜形成の開始欠損株において、Rab GTPaseであるYpt2がSPBに局在が変わることが分かっている。その局在がSPB構成因子であるSpo13依存的であったことから、Ypt2の局在時期を詳細に調べた。その結果、第一減数分裂の後期、Spo13にやや遅れてSPBに局在することが分かった。第一減数分裂時には未だ前胞子膜が形成されていないことが確認されている。これまでの結果と合わせて、Ypt2のSPB局在は前胞子膜には依存しておらず、Spo13に依存することが明らかとなった。Ypt2の上流のRabであるYpt3がこの局在を調節している可能性を検証するため、ypt3-変異株において、減数分裂時のSpo13およびYpt2の局在観察を行った。その結果、Spo13もYpt2もSPBへの局在が確認され、Spo13およびYpt2のSPB局在はYpt3依存的ではないことが示された。すなわち、出芽酵母等で知られているようなRab GEFカスケードとは異なる局在の依存性を持つ可能性が示唆された。Spo13はYpt2のGEFであるSec2と類似の配列をもつことから、Sec2がspo13欠失による胞子形成欠損を抑圧できるかどうかについて検討した。
FISH法を用いたPTEN遺伝子異常による子宮内膜癌早期診断の検討

LBC法を用いた子宮内膜細胞診に遺伝子解析を併用することでより精度の高い子宮内膜癌の診断が可能かを検討することを目的とし、PTEN遺伝子の欠失および蛋白発現を子宮内膜細胞診材料にて解析した。子宮内膜癌症例においては正常子宮内膜や子宮内膜増殖症に比べPTEN蛋白が減少していた。LBC標本でのPTEN遺伝子異常の検出においては、現在は前処理法などを追加し安定したシグナルを検出するプロトコルを検討中である。本研究では、近年著しい増加がみられる子宮内膜癌の検出率の高い検査法の開発を目指し、PTEN(phosphatase and tensin homolog)遺伝子の欠失および蛋白発現を子宮内膜細胞診材料にて解析し、従来から行われている形態学的解析にこれらの遺伝子解析を併用することでより精度の高い子宮内膜癌の診断が可能かを検討することを目的としている。平成25年度は、Liquid-based cytology(LBC)法により作製した子宮内膜細胞診標本上にてPTENの免疫細胞化学染色を行い蛋白発現を解析することを研究計画とした。SurePath法を用いてLBC標本を作製し、正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌を対象にPTEN蛋白の発現を免疫細胞化学的に解析した。PTEN蛋白はその遺伝子異常により蛋白発現が消失することが報告されているが、今回解析した症例におけるPTEN蛋白の消失の頻度は正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌の順に高くなっていた。本研究では近年著しい増加がみられる子宮内膜癌の検出率の高い検査法の開発を目指し、PTEN遺伝子の欠失および蛋白発現を子宮内膜細胞診材料にて解析し、従来から行われている形態学的解析にこれらの遺伝子解析を併用することでより精度の高い子宮内膜癌の診断が可能かを検討することを目的とした。平成25年度は新しい細胞診標本作製法であるliquid-based cytology (LBC)法を用いて作製した子宮内膜細胞診標本上にてPTENの免疫細胞化学染色を行い蛋白発現を解析した。LBC法には数種の手法があるが本検討はSurePath法を用いて複数枚の標本を作製し、対象症例として正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌を用いた。PTEN蛋白発現の消失の頻度は正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌の順に高くなっており、子宮内膜の癌化に伴いPTENの蛋白発現が消失している可能性が示唆された。平成26年度はLBC標本においてfluorescence in situ hybridization (FISH)を用いたPTEN遺伝子の欠失について検討した。LBC標本におけるFISHの検討については、従来の細胞診標本や組織標本と固定法が異なるため、通常の実験方法では明瞭なシグナルが観察しにくいことが分かった。また、標本作製後の保存期間による影響も考えられた。現在は前処理法などを追加し、安定したシグナルを検出できる実験手順を検討中である。今後は、LBC標本におけるPTEN遺伝子欠失の結果と蛋白消失の結果をもとに、子宮内膜癌の検出率の差異について検討する予定である。細胞診断学平成25年度の研究計画である正常子宮内膜、子宮内膜増殖症、子宮内膜癌のLBC標本を用いた免疫細胞化学染色は検討できている。平成25年度に得られた免疫細胞化学染色にて得られたデータに加え、平成26年度はFISH法を用いた遺伝子欠失の有無を検討する。得られたデータは、日本臨床細胞学会にて発表予定である。最終的な解析結果が終了したのち、成果を論文にまとめて国際専門誌に投稿する。
雰囲気制御型走査プローブ法によるダイヤモンド表面のナノ化学修飾

ダイヤモンドの最表面を終端する元素を制御するため、走査プローブ顕微鏡による電流印加法を試みた。まず、基礎的なデータとなる水素及び酸素終端の熱力学的安定性を超高真空において分析した。さらにダイヤモンドの核形成や水素終端状態の形成で重要となるバイアス印加条件を、マイクロ波プラズマCVD法における"その場"計測結果から議論した。トンネル電流が生じる環境において、伝導領域を絶縁領域に改質可能であることが示された。ダイヤモンドが共有結合体であるため、表面を終端するダングリングボンドが表面物性に大きな影響を及ぼすことが明らかになってきた。終端元素が水素の場合には負の電子親和力・p型伝導性・撥水性を示すのに対して、酸素の場合には正の電子親和力・縁性・親水性を示す。これらの表面電気伝導特性を利用して、電界効果型トランジスタなどの電子デバイスが実験室レベルで作製されているが、表面構造をナノレベルで改変する手法は未だ確立されておらず、終端構造の制御プロセス開発が求められている。一方、電子線衝撃による表面吸着物が脱離する現象を用いて、電子線リソグラフィーと同様に、パターン化した脱離を行うことが可能であると予想される。この際に、雰囲気制御した電子線解離反応によりナノレベルでの吸着制御が可能であると考えられるが、これらに関する先行研究はない。以上から、本研究では、ダイヤモンド表面の電気伝導性を変化させる終端原子(水素・酸素)に着目し、超高真空雰囲気における表面解析情報を基に、走査型プローブ顕微鏡を利用した電子衝撃反応を用いて、ダイヤモンド表面の原子の吸着・脱離過程のin-situ測定と制御を目的とする。共有結合性結晶であるダイヤモンドでは,表面のダングリグボンドが表面物性に大きな影響を及ぼす.このダングリグボンドを終端する元素が水素の場合には,負の電子親和力・優れたp型半導体特性・撥水性を示すのに対して,酸素の場合には,正の電子親和力・高い絶縁性・親水性を示す.この表面電気伝導を利用して,電界効果型トランジスターなどの電子デバイスが試験的に作製されているが,表面構造をナノレベルで制御する方法は未だ確立されていない.一方,電子線衝撃による表面吸着物が脱離する現象を用いることで,Si半導体プロセスによるパターンの電子線描画と同様に,パターン化した脱離を行うことも原理的には可能である.この際に,雰囲気制御した電子線解離反応によりナノレベルでの吸着が可能となるとも考えられるが,これらの点について研究した前例はない.以上から,本研究では,ダイヤモンド表面の電気伝導特性を変化させる終端原子(水素・酸素)に着目し,走査型プローブ顕微鏡を利用した電子衝撃反応を用いて,ダイヤモンド表面への原子の吸着・脱離過程について動的に測定することを目的とする.本年度は,雰囲気制御走査型プローブ顕微鏡内でダイヤモンド表面を水素終端,酸素終端処理を行うための基礎的な処理条件について検討を行った.CVDにより合成された多結晶ダイヤモンド試料を超高真空反応層に設置した後,試料温度を設定値に保った状態下で,水素または酸素分子をドースすることにより,試料表面での気体分子の熱解離反応を利用した終端構造の作製を行った.試料表面をオージェ電子分光法および熱脱離測定法を用いて調べ,試料表面の全てのダングリングボンドが終端される条件を明らかとした.このようにして求めた条件により水素終端した単結晶ダイヤモンドを環境制御形走査プローブ顕微鏡内に導入し、終端表面の電子線衝撃による脱離について検討を行った.ある条件の下で複数回の探針走査を行った後電流像を観察したところ,電気伝導性を示す水素終端表面とは異なる状況が観察されたことから,探針走査により脱離が起きていることを確認した.ダイヤモンド表面のダングリグボンドを水素終端した場合には,負の電子親和力,優れたp型半導体特性,撥水性を示すのに対して,酸素終端の場合には,正の電子親和力,高い絶縁性,親水性を示す。このため,表面電気伝導を利用して,電界効果型トランジスターなどの電子デバイスが試験的に作製されている。しかし,表面構造をナノレベルで制御する方法は未だ確立されておらず,デバイス作製プロセスとして表面終端構造の制御プロセスの開発が必要不可欠ある。本研究では,ダイヤモンド表面の電気伝導特性を変化させる終端原子(水素,酸素)に着目し,走査型プローブ顕微鏡を利用した電子衝撃反応を用いて,ダイヤモンド表面への原子の吸着,脱離過程について動的に測定することを目的とする。本年度は,高圧合成単結晶およびCVD合成多結晶ダイヤモンドの表面を用いて,雰囲気制御走査型プローブ顕微鏡内において水素終端表面の電気伝導特性を導電AFMモードおよびSTMモードを用いて測定した。この結果,水素終端構造であっても欠陥のより少ない高圧合成単結晶では,表面電気伝導性に劣るため終端構造を変化させる前に充分な前処理が重要であることが明らかとなった。現在,前処理の詳細な検討を行っている。本研究では,ダイヤモンド表面の電気伝導性を変化させる終端原子(水素・酸素)に着目し,超高真空雰囲気における表面解析を通じて熱力学情報を得る。

それを元に、走査型プローブ顕微鏡を利用した電子衝撃反応を用いて、ダイヤモンド表面の原子の吸着・脱離過程のin-situ測定と制御を目的としている。こうした研究は表面伝導を用いた新規のデバイスの作成に加え、プラズマ中でのダイヤモンドの成長機構の解明にも極めて重要な課題であると言える。本年度においては、水素終端されたダイヤモンド表面に対して、大気環境下での表面改質実験を行った。SPMプローブの電流像からは伝導性を有する領域と絶縁領域が明瞭に区別できることが見出された。電界研磨によって得られたタングステンプローブによる±10Vの電圧印加領域において、伝導領域の変化は生じていなかった。これより、表面C-H結合の解離に必要な実質のエネルギー、フラックスが少なくともそれぞれ10eV、1nA/φ1μm≒1kA/m2程度であることが見積もられた。このことは超高真空中でφ10nm以下のスポットサイズに10-100nAの電子を照射可能なAESなどを用いた置換反応実験の必要性を示唆している。最終年度において高真空中での電子線照射による終端元素の変化を観察することを試みある。他方、硫黄ドープされたダイヤモンドを対象にバルク/表面伝導を測定した。堆積されたままの薄膜においては、硫黄濃度に依存しない高い伝導度が得られた。これは水素終端された表面伝導に起因するものと推測された。他方、大気圧環境において800°Cの熱処理を行うことで表面伝導性は消失し、硫黄ドーパントに比例する電気伝導度が観測された。ダイヤモンドの表面構造(終端元素やダングリングボンド)が物性に大きな影響を及ぼすことが明らかになりつつある。さらに、これらの表面構造の熱力学的安定性は、未だ結論の出ていないダイヤモンドの核形成や成長の物理モデルを構築する上で欠かすことのできない情報を与える。本課題では走査プローブ(SPM)法やオージェ電子分光(AES)法を用いることで、表面終端構造の安定性やその制御法を明らかにする実験及び理論的研究を行った。昨年度までの雰囲気制御型SPM法による実験においてC-H結合の解離に必要な電子線衝撃が見積もられた、そのエネルギーは10eV以上フラックスは1nA/φ1μm≒1kA/m^2程度以上と推測されていた。これに基づき、超高真空中で15kV,1nA/φ10nmの電子線照射環境におけるAES法により、マイクロ波プラズマCVD法で作製した多結晶ダイヤモンド薄膜の粒表面、粒界部のオージェ電子スペクトルの測定を行った。これらの実験により、30分以上の電子線照射においても、250eV付近の炭素原子ピークは安定に確認可能であり、高エネルギー電子線照射による化学結合状態の変化は生じないことが明らかとなった。電子線照射位置を粒界部へと変化させた場合においては、炭素原子ピークは1.5eV程度低エネルギー側にシフトしており、粒界部のみ水素終端割合が高い(水素終端によるエネルギー安定度が高い)ことが示唆された。これらの結果はエネルギー的に不安定な面や稜ほど、水素終端による安定化度が高いことを予想させた。
放射光と超高圧技術による地球深部物質の探査

放射光と超高圧発生技術の組み合わせによる地球深部の物質学の新たな展開を目指し、(1)焼結晶ダイヤモンドアンビルを利用したマルチアンビル装置による70万気圧領域の高圧発生技術、(2)超音波測定法による20万気圧領域での弾性波速度精密測定技術の開発をおこなった。この結果(1)に関しては当初の目標を上回る80万気圧領域の超高圧発生に成功し、下部マントル上部中部領域に相当する圧力・温度条件下でのマントル物質の新たな相転移の発見や、精密な状態方程式の決定をおこなった。また、(2)に関しても当初の目標を達成し、20万気圧・1700Kというマントル遷移層中部に対応する高温高圧下で、マントルおよび沈み込むスラブ関連物質の弾性波速度を決定した。特にマントル遷移層で重要な高圧相であるリングウッダイトとメージャライトの弾性波速度を精密に決定し、得られたデータを基にしてマントル遷移層の化学組成に重要な制約を与えた。また、同様の手法を用いてMgOの弾性波速度と格子体積の同時測定をおこない、これらの実験データから新たな状態方程式を構築し、絶対圧力スケールを提案した。一方で、申請者らが開発した世界最硬ナノ多結晶ダイヤモンド(ヒメダイヤ)を高圧装置に応用し、放射光実験により発生圧力の評価をおこなった。ヒメダイヤはマルチアンビル装置とダイヤモンドアンビル装置の各々に対して、アンビル材料として利用を試みた。この結果、それぞれ110GPaおよび220GPa程度の圧力発生が確認され、今後の本格的利用におけるこの新しい材料のポテンシャルの高さを示した。本研究の主要な目標は1)マルチアンビル装置を用いた70GPa領域でのX線その場観察、および2)超音波技術と放射光実験を組み合わせた精密弾性波速度測定の2つの技術開発をすすめ、これに基づきマントル遷移層下部マントル領域の物質構成の解明をおこなうことである。研究初年度の平成15年度においては1)に関しては一辺14mmの焼結ダイヤモンドアンビルを用いた新しい試料部構成の開発をおこない、SPring-8において圧力発生試験をおこなった。この結果、従来45GPa程度にとどまっていた発生圧力限界を大幅に更新し、常温ながら60GPaの発生に成功した。更に、新しい加圧方式として、単結晶ダイヤモンドとマルチアンビル装置を組み合わせた高圧セルを開発し、50GPa程度の圧力発生が可能になった。一方、2)に関しては愛媛大学地球深部研究センターにおいて新たに弾性波測定システムを立ち上げるとともに、弾性波測定に適した高圧相焼結体合成をおこなった。得られたMg_2SiO_4スピネルに対して、GRCの超高圧発生装置と弾性波測定システムを用いて、15GPaまでの弾性波速度の決定に成功した。更にSPring-8において、透過X線像による試料部観察と解像度に関する基礎的な予備実験をおこなった。このように、本年度は当初の目標どおり研究が進展しており、来年度以降より高い圧力発生への挑戦とともに、SPring-8における弾性波測定をめざし、新たな技術開発に基盤をおいた放射光地球科学研究の展開を計る予定である。本研究の中心的課題である(1)焼結ダイヤモンドアンビルを用いた超高圧発生と(2)高温高圧下での超音波測定の両者において、技術的に大きな前進がみられた。前者(1)においては、45GPa、2500Kという従来にない高温高圧条件下での放射光X線回折技術が確立された。また、50GPa、1200K領域での実験も可能になるとともに、常温ではあるが60GPa領域の発生も達成された。このように本年度の研究の前進により、本研究の目標であるマルチアンビル装置による70GPa領域圧力発生の達成も目前になっている。このような技術開発を基礎に、下部マントル中での新しい高圧相の発見など、新たな知見が得られつつある。

一方(2)においては、SPring-8の放射光と本研究の超音波測定を組み合わせることにより、18GPa、1700Kという高温高圧下での弾性波速度とX線回折同時測定が可能になった。また、同時にCCDカメラを用いた試料長さの直接測定をおこない、これらのデータを用いて従来困難であった、マントル遷移層に対応する圧力温度領域内での弾性波速度精密決定が可能になった。この結果、マントル中において最も重要な高圧相であるリングウッダイトについて、広範な温度圧力の関数として弾性波速度測定がおこわれ、地震学的に得られている速度構造と直接対比可能な実験データが得られつつある。本研究では、これらの研究により得られつつある相転移、密度、弾性波速度の実験データと地震波トモグラフィーなどによるマントル微細構造モデルを対比させることにより、新しい地球深部の物質科学的モデルを構築する予定である。そのための全マントル地震学的モデルとして、新しい3次元的高分解能地震波トモグラフィー「EHIME-2004」が構築された。1.焼結ダイヤモンドアンビル(SD)を用いた圧力発生放射光とマルチアンビル装置の第2段アンビルにSDを用いた高圧発生実験では、この手法をもちいた高温下では世界で最高圧力である56GPaの発生に成功した。この技術を用いて、MnGeO_3のペロフスカイト-ポストペロフスカイト転移の研究をおこなった。この結果、温度1000°Cの高温下で、この圧力まではこの相転移は検出されなかった。一方で、新しい加圧方式である6-8-2加圧方式において、第3段アンビルにSDを用いた圧力発生試験をおこなった。この結果、常温ではあるが90GPaを越える圧力発生に成功し、今後の新しい展開が見込まれる。2.高温高圧下での弾性波速度測定放射光と超音波測定およびX線その場観察を組み合わせて、高温高圧下での鉱物弾性波速度精密決定技術の開発をおこない、19GPa、1400°C程度の圧力温度条件下での測定をほぼルーチン化した。このような高温高圧条件下での超音波法による弾性波速度測定例は世界で初めてであり、今後この手法を用いた様々な高圧相の弾性波速度測定をおこなう予定である。当面マントル遷移層で重要であるringwooditeおよびmajoriteについての測定をおこなうとともに、単結晶MgOを試料として用いた測定も試みた。しかしながら後者については、壁開の影響で試料の破壊や塑性変形が顕著に起こり、精度の高い測定には至っていない。今後静水圧性の高いセルの開発が必要であると考えられる。以上の重点的課題の他にも関連して、3.鉱物高圧相の相転移や状態方程式に関する研究、4.下部マントル深部領域における高圧相転移と物性予測、5.全マントルの地震波速度分布モデルの精密化、等に関して重要な成果が得られており、論文として発表済みあるいは投稿中である。焼結ダイヤモンドアンビル(SD)を用いて、常温下ではあるが当初の目標であった70万気圧の発生に成功した。また、1300K付近の高温下でも60万気圧程度の圧力発生が可能になり、この技術を用いて下部マントル関連物質であるMgAl_2O_4やPhase D、またMgSiO_3ポストペロフスカイト相のアナログ物質であるMnGeO_3の相変化をX線その場観察実験によりおこなった。
腎障害時の臓器間臓器内恒常性機構と幹細胞分化誘導タイミングにおける分子時計の役割

慢性腎臓病(CKD)の合併症を発症させる機構は未だ明らかにされていない。本研究では、CKD時に上昇したTGF-βが、分子時計を変容させ、腎線維化促進に加え、肝障害を併発させることを突き止めた。また肝代謝異常で上昇したレチノールが、腎障害を増強させることを明らかにした。さらに細胞分化に関わりリズミカルに振動する細胞周期制御因子が腎臓の炎症に関与していることを明らかにした。それを標的とした化合物を探索し、創薬の可能性が示唆された。慢性腎不全モデルマウスは、5/6腎摘出により作成した。腎摘出後、初期に一過性の炎症症状の後、数週後から慢性的な炎症症状を呈し、腎機能障害が確認された。慢性腎不全モデルマウスにおいて、各種臓器の時計遺伝子および代謝関連遺伝子の発現リズムを解析した。慢性腎不全モデルマウスの肝臓において、転写因子DBPの発現量が低下していることを明らかにした。時計遺伝子DBPは、全身で多くの遺伝子発現リズムを制御している転写促進因子である。また慢性腎不全モデルマウスにおいて、肝CYP3A11発現量が低下していることを明らかにした。次に、サイトカイン血清中濃度を網羅的に測定したところ、Transforming Growth Factor β(TGF-β)の濃度が有意に上昇していることを明らかにした。また腎不全モデルマウスの肝臓及び他臓器を対象に、TGF-βのシグナル活性を測定したところ、TGF-βシグナル活性が肝臓において亢進していることを明らかにした。次に、慢性腎不全モデルマウスにおいて、肝臓DBP制御下の遺伝子発現に及ぼすアンジオテンシンII(ATII)受容体の影響について検討した。腎臓の機能不全に起因する高血圧の原因因子であるATIIに着目して、ATIIの1α型受容体を特異的に欠損したATIIR1α(-/-)マウスにおいて腎不全モデルを作成し、肝臓における遺伝子発現量を測定した。その結果、ATIIR1α(-/-)の腎不全群では時計遺伝子DBPの発現量低下が抑えられることを明らかにした。現在は、腎不全モデルマウスを対象に、転写因子DBP活性変容の機序について詳細に検討している。またこれまでに得られた成果の論文投稿を予定している。慢性腎不全モデルマウスは、5/6腎摘出により作成し、慢性腎不全モデルマウスの肝臓において、転写因子DBPの発現量および肝CYP3A11発現量が低下していること、Transforming Growth Factor β(TGF-β)の血中濃度が有意に上昇していること、TGF-βシグナル活性が肝臓において亢進していることを明らかにした。そこで、今回、腎不全モデルマウスに抗TGF-β抗体を投与し、TGF-β活性を阻害したところ、肝臓DBPの発現量が基底レベルに回復することを明らかにした。またDBPが制御している遺伝子である肝臓CYP3A11の発現低下も抑えられることを明らかにした。これまでに、腎不全モデルマウスにおいて、肝臓DBP制御下の遺伝子発現に及ぼすアンジオテンシンII受容体の影響について検討した。腎臓の機能不全に起因する高血圧の原因因子であるアンジオテンシンII(ATII)に着目して、ATIIの1α型受容体を特異的に欠損した、ATIIR1α(-/-)マウスにおいて腎不全モデルを作成し、肝臓における遺伝子発現量を測定した。そこで、今回、腎不全モデルマウスにおいて、肝臓DBP制御下の遺伝子発現に及ぼすアンジオテンシンII受容体特異的阻害剤(ARBs)の影響について検討した。ARBs投与により肝臓DBPの発現量が基底レベルに回復することを明らかにした。つまり、腎不全患者において血圧を下げる目的で臨床上広く使用されている降圧薬(ARBs)は、腎不全時において肝臓DBP制御下にある遺伝子発現量の低下を抑える新規作用があることを明らかにした。現在は、腎不全の治療薬として、TGF-βおよびアンジオテンシンII受容体を標的としたsiRNAおよび化合物の探索を進めている。これまでの研究で、5/6腎摘出(5/6Nx)により作成した慢性腎不全モデルマウスの肝臓において、転写因子Albumin D-site binding protein (DBP)発現量の低下およびTGF-βシグナル活性の亢進を明らかにした。これらの機序および生理学的意義を詳細に検討する目的で、慢性腎不全モデルマウスの肝臓で、遺伝子発現変化の網羅的解析をマイクロアレイ法で行った。その結果、慢性腎不全モデルマウスの肝臓で、薬物代謝に関わる多くの遺伝子の発現量が低下することを明らかにした。その中でも、レチノール代謝の変容に着目し、発現が低下したレチノール代謝関連遺伝子の詳細を調べると、全てCYPsであることが明らかとなった。それらの中で、CYP3A11およびCYP26A1はレチノール代謝の重要な酵素群であることから、以降ではこの2つに着目して検討を行った。慢性腎不全モデルマウスのDBP、CYP3A11およびCYP26A1の発現低下は、TGF-β1抗体投与により抑制されたため、原因因子の一つとしてTGF-βの関与が示唆された。

損傷部位である腎臓における過剰なTGF-βの発現亢進が血液循環を介し肝臓に移行し、DBPの発現量が減少し、CYP3A11、及びCYP26A1が減少することで、レチノールが代謝不全により過剰に蓄積することを明らかにした。肝臓の代謝機能の低下により上昇したレチノールが腎臓において、繊維化および炎症に関与することを明らかにした。これらの過程で、慢性腎不全時の炎症進行過程において、細胞周期を制御する因子が重要であることを明らかにした。そこで、慢性腎不全の治療薬として、細胞周期を制御する因子を標的としたsiRNAおよび化合物の影響について検討したところ、種々の炎症症状が抑えられることを明らかにした。慢性腎臓病(CKD)の合併症を発症させる機構は未だ明らかにされていない。本研究では、CKD時に上昇したTGF-βが、分子時計を変容させ、腎線維化促進に加え、肝障害を併発させることを突き止めた。また肝代謝異常で上昇したレチノールが、腎障害を増強させることを明らかにした。さらに細胞分化に関わりリズミカルに振動する細胞周期制御因子が腎臓の炎症に関与していることを明らかにした。それを標的とした化合物を探索し、創薬の可能性が示唆された。腎不全モデルマウスに抗TGF-β抗体を投与し、TGF-β活性を阻害したところ、肝臓DBPの発現量が基底レベルに回復すること、そしてDBPが制御している遺伝子である肝臓CYP3A11の発現低下も抑えられることを明らかにした。次に、腎不全モデルマウスにおいて、肝臓DBP制御下の遺伝子発現に及ぼすアンジオテンシンII受容体特異的阻害剤(ARBs)の影響について検討したところ、ARBs投与により肝臓DBPの発現量が基底レベルに回復すること、そしてDBPが制御している遺伝子である肝臓CYP3A11の発現低下も抑えられることを明らかにした。以上のことから、おおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学これまでに実施した課題15に加えて、課題6について検討する。またこれまでに得られた成果の論文投稿を予定している。課題1:腎障害時の臓器障害過程で時計遺伝子発現リズムの変容タイミングを時系列で解析する。課題2:腎障害時の網羅的遺伝子発現解析により時計遺伝子発現リズム変容に係る遺伝子を抽出する。課題3:腎障害時の網羅的タンパク発現解析により時計遺伝子発現リズム変容に係る臓器間シグナル分子を抽出する。課題4:腎障害時に臓器間シグナル分子の阻害剤、抗体を用い時計遺伝子発現リズム変容に係る臓器間シグナル分子を確定する。課題5:腎障害時の臓器間シグナル分子を起点に、時計遺伝子の上流・下流の発現制御機構を解明する。課題6創薬シーズ化合物の探索とDDSの開発を行う。慢性腎不全モデルマウスの肝臓において、転写因子DBPの発現量およびCYP3A11発現量が低下していることを明らかにした。その機序として、TGF-βシグナル活性およびアンジオテンシンII受容体が関与していることを明らかにした。昨年実施した課題13に加えて、課題
地域貿易協定によるビジネストラベル費用の低下が貿易・直接投資に与える影響の考察

貿易自由化だけでなく人の移動の円滑化も併用することにより,2国間地域貿易協定の両参加国がともに経済厚生を改善できることを理論的に示した。また2つの国の政府による政策決定ゲームを用いて,実質的な貿易自由化と人の移動の円滑化が同時に実現する可能性も理論的に示した。これらの結果はどの水準までの自由化・協力を経済連携協定に含めるかを検討する際の1つの学術的サポートとなる。実証分析は完遂できなかったが,APECにおける商用渡航カード・プログラムの導入とその拡大,米国の専門技能者ビザ発行プロセスの変化に注目すれば,人の移動の円滑化が貿易・直接投資に与える影響を実証的に分析可能であるとの結論に至った。日本の経済連携協定に代表されるように,現在の多くの地域貿易協定は貿易以外の分野として人の移動や投資を含み,「ヒト,モノ,カネ」の流れを円滑にするものである。これに関連して,人の移動の円滑化が貿易・直接投資をどのように変化させるのか,また貿易だけでなく人の移動の円滑化をも考慮することで,経済政策としての地域貿易協定をどのように再評価できるのか,これらを明らかにすることが本研究の目的である。本研究では地域貿易協定における商用目的の人の移動(短期の商用訪問者や企業内転勤者)の円滑化によってもたらされるビジネストラベル費用の低下に着目している。平成25年度は,商用目的の人の移動の円滑化による直接投資の量的変化,経済厚生への影響について理論分析を行った。そこでは人の移動の円滑化が地域貿易協定の締結,貿易自由化の促進に果たす補助的な役割を示し議論も行った。この結果は貿易以外の幅広い分野を含む経済連携協定の締結を積極的に推進している日本にとっては,今後の新たなる経済連携協定の締結あるいは既存の協定の更新の際に,どの水準までの自由化・協力を協定に含めるかを検討するための1つの学術的サポートとなりうる。研究実施計画では平成25年度は既存データ,ヒアリング調査(海外2回,国内1回)を行い,理論分析の準備に着手する予定であったが,実際にはヒアリング調査を行うことはできなかった。しかし本研究はヒアリング調査,理論分析,そして実証分析を行うことにより,地域貿易協定による人の移動の円滑化,貿易費用,ビジネストラベル費用の低下の影響を多面的に分析することを特色としているので,本年度に行った分析はその1つの中心に十分なりうるものである。ただし言うまでもなく,理論分析に対する現実からの裏付けおよび同分析の改善のために,次年度以降に既存データの整理,ヒアリング調査を行う。平成26年度は,前年度に行った商用目的の人の移動の円滑化による直接投資の量的変化,経済厚生への影響に関する理論分析を更に発展させた。前年度の研究では貿易自由化だけでなく人の移動の円滑化も併せて用いることにより,2国間地域貿易協定の参加国がともに経済厚生を改善できる状況が存在することを示したが,人の移動の円滑化を含む地域貿易協定の締結可能性そのものは分析されていなかった。そこで平成26年度は,2つの国の政府による政策決定ゲームを用いて更なる分析を試みたが,そこでは実質的な貿易自由化と人の移動の円滑化が同時に実現する可能性が理論的に示された。前年度と同様,この結果は貿易以外の幅広い分野を含む経済連携協定の締結を積極的に促進している日本にとっては,今後の新たなる経済連携協定の締結あるいは既存の協定の更新の際に,どの水準までの自由化・協力を協定に含めるかを検討するための1つの学術的サポートとなりうるものである。研究実施3年目である平成27年度は,まず平成25年度より持ち越していたビジネストラベルとビジネストラベル費用の低下に関してデータを用いた検証を終えた上で,本来の平成27年度の研究実施計画を遂行していくはずであった。また在外研究の延長に伴い依然としてヒアリング調査には困難が伴うが,デンマークを主とした北欧地域を対象にすることで未実施のヒアリング調査を行うこととしていた。しかしながら在外研究と年度後半に生じた研究代表者の予期せぬ健康問題により本研究実施がほぼできず,唯一平成25年度および平成26年度の2年間で行った理論研究の仕上げを行えたことを除いて,特段の研究実績を残せずに終わった。

本研究はヒアリング調査,理論分析,そして実証分析を行うことにより,地域貿易協定による人の移動の円滑化,貿易費用,ビジネストラベル費用の低下の影響を多面的に分析することを特色としているので,理論研究は当然ながら本研究の重要な貢献となりうるものである。しかし,その特色は既存データの整理,ヒアリング調査抜きでは本研究が完成しないことも同時に示しているので,未だ理論研究以外が進呈していないことには猛省するばかりである。当初の研究実施計画では研究3年目である平成27年度末までに,日本の経済連携協定あるいは他の国々の地域貿易協定のビジネストラベルやビジネストラベル費用への影響を既存データで検証し,すべてのヒアリング調査(海外3回と国内2回)を行い,理論研究を終え,実証研究に取り組んでいる予定であった。しかしながら実際には平成25年度に実施できなかったヒアリング調査をその後の2年間にも在外研究の取得(2年目は延長)により実施できていない。また平成27年後半に発生した研究代表者の健康問題により既存データの整理を終えること,実証研究に取り掛かることもできなかった。したがって現時点において十分進んでいるのは理論研究のみとなっている。この点から現在までの達成度は「遅れている」と自己評価するほかない。予期せぬ健康問題ではあったが,年度前半に在外研究課題との間で適切な時間配分を行っていれば,ある程度の研究を実施できていたはずである。この点に関しては研究代表者の判断ミス以外の何物でもない。日本の経済連携協定に代表されるように,現在の多くの地域貿易協定は貿易以外の分野としての人の移動や投資を含み,「ヒト,モノ,カネ」の流れを円滑にするものである。これに関連して,人の移動の円滑化が貿易・直接投資をどのように変化させるのか,また貿易だけでなく人の移動の円滑化をも考慮することで,経済政策としての地域貿易協定をどのように再評価できるのか,これらを明らかにすることが本研究の目的である。本研究では地域貿易協定における商用目的の人の移動(短期の商用訪問者や企業内転勤者)の円滑化によってもたらされるビジネストラベル費用の低下に着目している。研究実施4年目である平成28年度は元々本研究の最終年度であったが,1年間の補助事業期間延長を申請することを見据えて,ビジネストラベルとビジネストラベル費用の低下に関する検証を終え,未実施のヒアリング調査を行うことを最初の課題としていた。そして次に当初計画で平成27年度に行うはずであった実証研究とヒアリング調査の後半を遂行していく予定であった。しかしながら平成27年度後半に生じた研究代表者の健康問題の余波と,学内業務による多忙により,年度末に行ったオーストラリアにおける現地研究者との意見交換以外,本研究実施がほぼできず終わった。もともと本研究はヒアリング調査,理論分析,そして実証分析を行うことにより,地域貿易協定による人の移動の円滑化,貿易費用,ビジネストラベル費用の低下の影響を多面的に分析することを特色としていた。しかし研究期間の制約上実証研究はあきらめ,現在ほぼ仕上がっている理論研究にヒアリング調査のみを加えることで本研究をまとめていくこととする。
2元系ネプツニウム化合物NpX_3の単結晶育成とその基礎物性

NpTGa_5はいずれも基底状態で磁気秩序を示しが、これら計測より遍歴5f電子の磁性への関与が明らかになった。ドハース・ファンアルフェン測定より、超ウラン化合物としては初めてフェルミ面観測に成功した。このうち、NpRhGa_5では4つの円柱状フェルミ面を観測し、5f電子を遍歴としたバンド計算ときわめて良い一致を示した。5f電子が磁性のみならず伝導も担っていることが、バンド計算との対応から実証された。さらにNpFeGa_5に対するメスバウアー分光より、FeサイトならびにNpサイトの内部磁場を観測し、両サイトが磁気モーメントを担うことを明らかにした。磁気異方性が強く、磁場をc軸に掛けた場合4Tでメタ磁性転移を起すがa軸では反強磁性状態のままである反強磁性体NpCoGa_5(T_N【approximately equal】47K)に対してNMR測定を行った。スピン格子緩和率(1/T_1)の温度依存を見ると、磁場をa軸に掛けた場合は反強磁性転移点での揺らぎ増大によるピークが見られるがc軸に掛けた場合ピークは現れない。つまり反強磁性転移が消失しても揺らぎが高磁場下まで抑えられていくことが判明した。本研究費補助金はわが国における初の超ウラン物性研究の萌芽を促した。超ウラン元素固体物質に関して、その固体電子物性の系統的な研究はこれまで我が国では皆無であった。それは超ウラン元素が強い放射性を帯びており、試料の取り扱いは放射線管理された専用設備を有する施設でしか行えないためである。独・カールスルーエ超ウラン研究所ならびに米・ロスアラモス国立研究所でのみ系統的に行われてきた超ウラン元素固体物性の研究を金属材料研究所・附属材料試験炉利用施設で開始するための準備を行った。初年度において、原料であるネプツニウム金属を調製するためのグローブボックス、ネプツニウム水溶液の電気分解用セル、ネプツニウムアマルガム熱分解用電気炉・結晶育成用電気炉、多結晶溶解用アーク炉、ドハース・ファンアルフェン効果測定装置、核磁気共鳴分光器、抵抗測定用クライオスタット、比熱測定用クライオスタットを準備した。初年度内に実際にネプツニウムを扱った実験までには到達できなかったが、ウランや希土類を用いた模擬実験を繰り返し、次年度以降安全に実験に着手できる態勢が整った。水溶液の電気分解用セルではウラン塩酸水溶液を用いてウランアマルガムの調製技術の習得に努めた。また、アーク炉ではURh_3,CeRu_2,CeAl_2等の多結晶試料の作成を試みた。さらに単結晶育成用電気炉(マツフル炉)ではUGa_3,USn_3等の単結晶試料の作成を試みた。また、抵抗測定用クライオスタット、比熱測定用クライオスタットでは標準試料ならびに幾つかのウラン化合物を測定し、温度計の校正、計測プログラムの改良等を行った。以上のように初年度において実験環境の整備はほぼ完了したが、本研究課題に直接関係する成果は次年度以降に持ち越しになった.東北大学・金属材料研究所と日本原子力研究所・先端基礎研究センターの協力により、我が国初の本格的な超ウラン化合物の電子物性研究が開始された。本研究課題はその一翼を担うものである。当初、2元化合物NpX_3に限定して展開する予定であったが、f子系化合物としては驚異的に高い転移温度の超伝導体PuCoGa_5(T_c=18K)が米・ロスアラモス研究所で発見されたことに触発されて、NpTGa_5(T=Transition metal)も対象物質とすることにした。さらに、八重極秩序の可能性が示唆されている唯一の物質である2元系酸化物NpO_2も研究対象に加えた。給排気管理された鉄セル内に電気炉を設置してフラックス法により単結晶NpTGa_5(T=Fe, Co, Ni)を育成した。NpFeGa_5は118Kで、NpCoGa_5は50Kで、NpNiGa_5は34Kと18Kで反強磁性転移を示した。特にNpFeGa_5とPuCoGa_5は同数の価電子(n=30)を有するため、共に大きな2次元的なフェルミ面を持つことがバンド計算から推察されており、両者の比較は興味深い。NpFeGa_5の電気抵抗は、0.5Kまで超伝導を示さなかったが、118Kで抵抗が急激に増加し、85Kで極大を示した。磁気秩序に伴ってギャップが開き、フェルミ面の再構築が起こっているものと推測される。そこで、我々はGa-NMRの測定を開始し、ネール点以上(T>120K)でのみシグナルの観測に成功した。ナイトシフトKは260Kから120Kへ温度が下がるにつれて上昇をした。また、超微細パラメータν_Qとηおよび結合定数Aは、ウラン系で詳しく研究されているUPtGa_5と同程度の値となり、重い電子状態になっていると考えられる。微視的測定としてNMRに加え、メスバウアー測定も開始した、その参照物質としてない微磁場が比較的小さいNpSn_3の作製に着手した。

このうち、NpRhGa_5では4つの円柱状フェルミ面を観測し、5f電子を遍歴としたバンド計算ときわめて良い一致を示した。5f電子が磁性のみならず伝導も担っていることが、バンド計算との対応から実証された。さらにNpFeGa_5に対するメスバウアー分光より、FeサイトならびにNpサイトの内部磁場を観測し、両サイトが磁気モーメントを担うことを明らかにした。磁気異方性が強く、磁場をc軸に掛けた場合4Tでメタ磁性転移を起すがa軸では反強磁性状態のままである反強磁性体NpCoGa_5(T_N【approximately equal】47K)に対してNMR測定を行った。スピン格子緩和率(1/T_1)の温度依存を見ると、磁場をa軸に掛けた場合は反強磁性転移点での揺らぎ増大によるピークが見られるがc軸に掛けた場合ピークは現れない。つまり反強磁性転移が消失しても揺らぎが高磁場下まで抑えられていくことが判明した。本研究費補助金はわが国における初の超ウラン物性研究の萌芽を促した。
抗てんかん薬の発生毒性の再評価

胎生期バルプロ酸(VPA)曝露に起因する脊髄神経形成異常(SNDs)について、神経管閉鎖不全(NTDs)と比較して検討した。ICRマウスの妊娠6,7,8,又は9日にVPA100-400 mg/kgを投与し、妊娠10日に胚を採取した。抗ニューロフィラメント抗体を用いたホールマウント免疫染色を行い、脊髄神経の走行とNTDsの有無を観察したところ、VPAが誘発するSNDs発症は、NTDsの場合と同様に感受期が妊娠8日で、発症頻度が用量相関性を示したが、NTDs発症抑制に有効な葉酸投与でもSNDs発症は抑制されなかった。よってSNDsとNTDsは異なるメカニズムにより誘発される可能性が示唆された。本研究は、妊娠中の抗てんかん薬服用に起因する胎児の発達障害を予防するための知見を得ることを目的としている。平成26年度は、埋め込み式infusion pumpを用いたバルプロ酸(VPA)投与法でてんかん治療域レベル(50100μg/ml)の血中濃度を保つための投与条件の検討、および胎生期VPA曝露に起因した脊髄神経形成異常について、投与量や投与時期による発生率の変動を検討した。非妊娠SDラットの背部皮下に小型infusion pump(iPRECIO,プライムテック)を留置し、種々の濃度や流速でVPA投与を行い、血中VPA濃度を測定した。その結果、濃度500 mg/ml,流速20μl/hの投与は、投与後124hの血中VPA濃度が63.388.0μg/mlとなり、安定的に治療域VPA濃度を保つために適当であると考えられた。また、VAP投与時期による脊髄神経形成異常の出現頻度等の変化を検討するため、ICRマウスのGD 6, 7, 8,又は9にVPA (400 mg/kg)を皮下投与した。GD10で胎仔を採取し、抗neurofilament抗体を用いたwhole-mount免疫染色を行い脊髄神経の走行を観察した。VPA曝露胎仔では、神経束の消失、隣接する分節との合流や分節の二分化などの分節性走行の乱れが認められた。これらの脊髄神経形成異常の発生頻度はGD8に投与した群で最も高かった(36.8%)。次に、VAP投与量による脊髄神経形成異常の出現頻度等の変化を検討するため、前述の検討で脊髄神経異常の頻度が最も高かったGD8に、200, 400,又は700 mg/kgのVPAを皮下投与し、同様に胚仔の脊髄神経を観察した。その結果、脊髄神経束の消失や隣接する分節への合流などの主要な脊髄神経形成異常は、VAP投与量に依存して発生頻度が変化した。分節の二分化など比較的発生頻度が低い形成異常は投与量の影響を受けなかった。以上より、胎生期VPA曝露による脊髄神経形成異常の発生頻度は、VPAの曝露時期や曝露量の影響を受けることが明らかとなった。本研究は、主に胎生期バルプロ酸曝露によって生じる脊髄神経形成障害について、その感受期、閾値、分子基盤について明らかにし、さらに多剤曝露の影響や葉酸の効果についても評価することで、抗てんかん薬の発生毒性をこれまでとは異なる見地から再評価することを目的としている。平成26年度に胎生期バルプロ酸(VPA)曝露マウスで生じる脊髄神経の形成障害において、VPA投与の量または時期の違いによる脊髄神経形成異常の有病率の変化を検討した。平成27年度は、胎生期VPA曝露による脊髄神経形成異常に対する葉酸(FA)の効果を検討し、神経管閉鎖不全(NTDs)に対する効果と比較した。その結果、VPA+FA(3mg/kg)群ではこれまでの報告と同様にNTDsの発生率は有意に低下したが、脊髄神経異常の発生率に有意な差は、認められなかった。また、本研究では葉酸の溶媒をDWからPBSに替えることで、葉酸の吸収効率が高まることを確認した。そこで同様量の葉酸をPBSを溶媒として投与し、VPAによるNTDs及び脊髄神経形成異常に対する効果を検討したところ、NTDsの発現が有意に上昇した。よってVPAが引き起こすNTDsやせき髄神経形成異常に対しての葉酸の予防効果は、母体の血中葉酸濃度によって異なる可能性が示唆された。本研究は、当初の研究計画書に基づき平成26年度には胎生期バルプロ酸(VPA)曝露マウスで生じる脊髄神経の形成障害において、VPA投与の量または時期の違いによる脊髄神経形成異常の有病率の変化を検討した。その結果、VPA+FA(3mg/kg)群ではこれまでの報告と同様にNTDsの発生率は有意に低下したが、脊髄神経異常の発生率に有意な差は認められなかった。また、本研究では葉酸の溶媒をDWからPBSに替えることで、葉酸の吸収効率が高まり、同量の葉酸を投与しても母獣の血中葉酸濃度が上昇することを確認した。そこで同量の葉酸をPBSを溶媒として投与し、VPAによる脊髄神経形成異常及びNTDsに対する効果を検討したところ、脊髄神経形成異常の有病率は変化しなかったが、NTDsの有病率が有意に上昇した。また、DWに溶解した葉酸を二倍量(6mg/kg)投与することで母獣の血中葉酸濃度を上昇させると、脊髄神経形成異常がやや増加傾向を示した。

以上より、母体の血中葉酸濃度によってVPAが引き起こす脊髄神経形成異常やNTDsに対する葉酸の効果が異なる可能性が示唆された。これらの研究は当初の実施計画に基づいて行われており、よって本研究は概ね計画通りに進められていると判断できる。本研究は、妊娠中の抗てんかん薬服用に起因する胎児の発達障害を予防するための知見を得ることを目的に行われた。ICRマウスの妊娠6、7、8、又は9日のいずれかにバルプロ酸(VPA)400 mg/kgを投与し、妊娠10日に胚を採取した。神経管閉鎖不全(NTDs)の有無および抗ニューロフィラメント抗体を用いたホールマウント免疫染色を行い脊髄神経形成異常(SNDs)の有無を調べた。VPA曝露マウス胚では、主に胸神経と腰神経において神経束の欠損や隣接する神経束との吻合などの脊髄神経走行異常が認められた。また、後根神経節の分節化の異常も多数認められたが、その一部は脊髄神経走行異常を伴っていた。VPA投与日毎のSNDsの発症頻度を解析したところ、妊娠8日でのVPA曝露は有意にSNDsの発症頻度を増加させた(60.0%)。一方、NTDsの発症頻度は妊娠7日(26.4%)または8日(27.7%)のVPA投与で有意に増加した。また、妊娠8日に100, 200, 400,又は600 mg/kgのVPAを投与し、同様の観察を行ったところ、SNDsとNTDsの発症頻度にはそれぞれ用量相関性が認められた。さらに妊娠68日の葉酸投与は,VPAにより誘発されるNTDsの発症を有意に抑制したが,SNDsに対しては効果を示さなかった。以上より、胎生期バルプロ酸曝露によるSNDsの感受期は妊娠8日であること、およびSNDsの発症頻度はバルプロ酸投与量と用量相関性があることが明らかになった。また、胎生期バルプロ酸曝露によるSNDsとNTDsは、臨界期は類似するものの、葉酸による抑制効果の違いから、異なるメカニズムにより誘発される可能性が示唆された。胎生期バルプロ酸(VPA)曝露に起因する脊髄神経形成異常(SNDs)について、神経管閉鎖不全(NTDs)と比較して検討した。ICRマウスの妊娠6,7,8,又は9日にVPA100-400 mg/kgを投与し、妊娠10日に胚を採取した。抗ニューロフィラメント抗体を用いたホールマウント免疫染色を行い、脊髄神経の走行とNTDsの有無を観察したところ、VPAが誘発するSNDs発症は、NTDsの場合と同様に感受期が妊娠8日で、発症頻度が用量相関性を示したが、NTDs発症抑制に有効な葉酸投与でもSNDs発症は抑制されなかった。よってSNDsとNTDsは異なるメカニズムにより誘発される可能性が示唆された。平成26年度は実験計画書に従って、まず、埋込式小型infusion pumpを用いて、ラットの血中バルプロ酸濃度をヒト治療域である50100μg/mlの範囲内に保投与条件について検討し、至適条件を見いだす事に成功した。次のステップとしては、infusion pumpを留置した雌ラットを交配させてバルプロ投与を行い、その仔を用いた解析を行うことであるが、妊娠日に合わせてバルプロ酸投与にはpumpを留置した後でも投与条件のプログラム変更が可能な新型のinfusion pumpの使用が必要となる。本年度の予算でこのpumpとマネージメントシステムを購入したが、初期不良のため本年度前半は使用することができなかった。現在は既にアプデートが完了しており、妊娠動物への投与実験についての計画を進めているところである。
潜在(偶発)並びに臨床前立腺癌における染色体領域欠失の比較検討

臨床的に意義のない前立腺癌と考えられる、75歳以上の微小高分化型潜在癌32例、並びに臨床前立腺癌62例(限局癌42例、転移癌20例)についてmicrosatellite領域PCR法を用いて第7、8、10染色体における欠失(allelic imbalance:以下、AI)、並びにmicrosatellite instability(以下、MI)を解析した。解析した7q31領域の4つのsymbollociのうち、少なくとも1つがAIを示した症例は、潜在癌で16%であるのに対して、限局臨床癌では45%と有意に多かった(p<0.01)。さらに転移癌では65%で潜在癌、限局臨床癌と比較して多かった(それぞれ、p<0.001.p<0.05)。一方、8p22-21でAIを示した症例は潜在癌で32%、限局臨床癌で43%と多くなる傾向を認めたが、有意差を認めなかった。また転移癌では60%と潜在癌と比較すると有意に多かった(p<0.05)が、限局臨床癌とは有意差を認めなかった。PTEN/MMAC1遺伝子が位置する10q23領域でAIを示した症例は他の2領域に比べ少なく、潜在癌で9%、限局臨床癌で12%であった。一方、転移癌では35%と潜在癌、限局臨床癌に比べ多かった(共にp<0.01)。MIの頻度は、3領域すべてで潜在癌、臨床癌ともに20%を越えるlocusはなかった。以下に成果をまとめる。(1)臨床的に意義のない癌は、意義のある癌と比較して染色体欠失(AI)が少ないと考えられた。(2) 8p22に存在する癌抑制遺伝子の欠失は、臨床的に意義にない癌においても頻繁に認められたことから、前立腺発癌の早期に生じている可能性が示唆された。(3) 7q31の欠失、並びにPTEN/MMAC1遺伝子が位置する10q23の欠失は、臨床癌の成立、転移能の獲得との関連が示唆され、臨床的に意義のある前立腺癌の新しいbiomarkersとしての有用性が期待された。潜在前立腺癌は高頻度に発生するが、臨床癌に発達するものはごく一部であり、両者の生物学的特性に関与する遺伝子変異が異なる可能性が示唆される。我々はmicrosatellite領域PCR法を用いて潜在並びに臨床前立腺癌における染色体上領域の欠失(ヘテロ接合性消失)の特徴を比較検討することを初年度の目標とした。剖検時に発見された高齢者微小潜在前立腺癌(75歳以上、腫瘍径10mm以下)並びに前立腺全摘除術施行時に得られた臨床前立腺癌(pT2,3)のパラフィン包埋標本からmicrodissection法を用いて癌細胞DNAを抽出した。同様に正常組織標本(剖検例では腎臓のパラフィン包埋標本、全摘例では転移のないことを確認した所属リンパ節)から得たDNAをコントロールとした。染色体7q31,8p22-p21,16q23-qter,18q21-q22のmicrosatellite領域primers各々4組を用いてPCRを施行し、蛍光式オートシーケンサーでそれぞれの染色体上領域のヘテロ接合性消失を解析した。