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ゲノム民俗植物学による古典園芸植物の文化財的意義の検証とその保全方策の確立

わが国の野生集団から江戸時代に育成された古典園芸植物であるサクラソウ、ツツジ、ハナショウブの民俗文化財としての価値を検証するために、花形質の多様性のゲノム情報と園芸の歴史・文化的背景とを併せた解析を試みた。その結果、サクラソウでは、野生種から園芸種への変遷を花器形態の量的変異とDNA多型から明らかにできた。ハナショウブでは、野生のノハナショウブの自生地探索、形質調査、収集・維持活動を行うとともに、様々な花卉形質がノハナショウブから取り入れられていたことを明らかにできた。ツツジでは、花器形態変異を遺伝子レベルで明らかにできた。今後のナショナルコレクション作成へ基本情報を提供できた。サクラソウでは、ゲノムリソース充実のため20個のSSRマーカーと40個の一塩基多型マーカーを開発し、園芸品種と野生種の多様性解析を行ったところ園芸品種の多様度が低いことが分かった。さらに、分離集団を用いて、異型花柱性に関するQTL解析を行い、異型花柱性が1つの主導遺伝子と多数のQTLによって構成されていることを明らかにした。ツツジでは、采咲き・蕊咲き品種を材料として,形態的分析とその形態形成関連遺伝子を解析し,花冠の蕊化変異と多面的狭細化変異に分類し,それらの原因遺伝子MADS-boxCクラス遺伝子の関与について考察した.また,花芽形成と開花関連遺伝子について,品種'大紫'から単離したRpFTなど5種の遺伝子発現時期を解析し,各花器器官の分化との関連性を明らかにした.また、ツツジ園芸品種群の一つであるオオヤマツツジの成立起源について、形態調査とSSR解析ににつく調査を行い、オオヤマツツジは、ヤマツツジとケラマツツジ亜節園芸品種群との間の雑種起源である可能性が高く、種としての分類学的位置づけを見直す必要性があると結論した。ハナショウブでは、9種のSSRマーカーを開発し、野生集団間の遺伝的多様性および遺伝的分化の把握を試みた結果、ノハナショウブ野生集団内の遺伝的多様性は現在高いレベルで維持されていることが分かったが、近交係数が高い値を示し、今後、ノハナショウブの遺伝的多様性が失われていく可能性があることが示唆された。また、本マーカーは他のアヤメ属植物14種に対して適用可能である。日本各地のノハナショウブの自生地において、形質調査を行い、栽培品種のハナショウブの起源は、日本各地に自生するノハナショウブであることが強く支持される結果を得た。また、玉川大学で所有している江戸時代に育成された栽培品種のハナショウブについて品種分類図鑑を作成した。サクラソウでは画像解析による花型解析を試み、円形度およびすぼみ度がサクラソウの花形を示す形質のひとつである花容を定量的に表せることを明らかにし、定量値を用いて野生からの園芸化、園芸品種の多様化の時代変遷を明らかにし、江戸後期に花容が爆発的に多様な方向へ変異したことを明らかにした。ツツジでは、昨年度出版した江戸時代の彩色図版「津ゝし絵本」解説資料の情報をもとに、他の資料と比較した古典品種のデータベースを作成した。また、花器変異形質に関連するMADS-box遺伝子を解析し、花冠持続(見染性)、おしべ咲きおよび八重咲き形質は、Bクラス遺伝子;AP3、AGの各品種固有の変異によることを明らかにし、形質の遺伝性に対応するDNAマーカーを作成した。また、ツツジ園芸品種群の成立起源について野生種と園芸品種のSSRマーカーを用いたDNA分析を進め、前年度の結果で園芸品種群のサツキの関与が推察されたハンノウツツジとは異なり、アシタカツツジはサツキ亜節ヤマツツジ列内で独自に分化した可能性の高い野生種であることを明らかにした。さらに、霧島山系のミヤマキリシマ、ヤマツツジおよびこれらの自然雑種個体の花冠を用いて色素構成と色素合成遺伝子の発現を比較したところ、デルフィニジン系色素の蓄積にはF3′5′H遺伝子の発現の多様化が霧島山系の野生集団における花色の多様性を生み出していることが示唆された。ハナショウブでは、野生種の自生地においてピンク色の花色を呈するノハナショウブを発見した。この花色は栽培種では伊勢系品種に多くみられる形質であり、園芸植物としては観賞価値の高い重要な形質である。また、青森県の野生ノハナショウブからハナショウブのアイの部分が黄色い理由を明らかにするために極めて重要な素材を見出した。古典品種の新規収集に努め、品種分類図鑑の改定を行った。サクラソウでは、次世代シーケンサーによるmRNAの網羅的解析を行い、花器官由来の約76万リードの塩基配列を獲得した。園芸品種花色変異の機構解明のため、花弁色素の定性・定量解析を行った。

その結果、petunidin配糖体1成分(A1)、malvidin配糖体1成分(A2)、kaempferol配糖体2成分、caffeoylglucoseが特定された。これらの成分について野生種と園芸種を比較したところ、A1とA2の量的変異が園芸化に伴って拡大していることが明らかとなった。ツツジでは、江戸時代の彩色図版「津ゝし絵本」(国会図書館所蔵)に現代語訳を加えて復刻した解説資料を出版した。また、見染性品種を材料として、形態的分析と花器の形態形成に関与するMADS-box遺伝子の解析を行い、花冠の持続性は花冠のがく化による可能性が高いことを明らかにした。また、ツツジ園芸品種群の一つであるハンノウツツジの成立起源について、形態調査とSSR解析に基づく調査を行い、ハンノウツツジは、ヤマツツジとサツキ野生種あるいは園芸品種との間の雑種起源である可能性が高く、その場合は花粉親がサツキ、種子親がヤマツツジとして成立した可能性が示唆された。ハナショウブでは、東日本大震災で被災した青森県種差海岸において他植物が絶えているにも関わらずノハナショウブのみが生存し開花していたこと、これらの個体における耐塩性を根、葉について調べた結果、内陸他個体と比べ塩類を排除するATPase活性が高いこと、その場は液胞であり、塩類を処理すると液胞にNaイオンが蓄積することを組織化学的に証明できた。同時に、被災地においては「復興のシンボル」としてこれらのノハナショウブを保存していくこととなった。さらに、ノハナショウブは花器官などの観賞対象とする形質のみならず、環境適応性において地域的多様性を持っていることが明らかになった。サクラソウでは、園芸品種の系統関係を解析するために連鎖群ごとに2ー3個のDNAマーカーを用いて園芸品種と野生種300個体のstructure解析及び系統解析を行った。その結果、品種は野生型に近い群(W)とそれ以外(C)の2群に分かれた。C群はW群に比べ多様な花弁形態変異を示し、大型の花弁を付ける品種が多く、品種育成の方向性の検討の鍵になるような知見が得られた。花型変異のひとつとして八重咲きサクラソウを一重咲きと比較したところ、5つある雄蕊が弁化していた。また、花器官形成に関わるCクラス遺伝子は、一部の例外を除き八重および一重咲きの雌蕊と花筒で共通して発現していることが明らかになった。サクラソウの園芸品種の南京小桜の花組織(蕾から開花後)のトランスクリプトームの解析を行った。ツツジでは、石川県能登地方の江戸キリシマに関するこれまでの調査・研究成果を「のとキリシマツツジガイドブック」として取り纏めた。貴重な地域遺伝資源の啓蒙普及、保護育成ならびに地域活性化のための資料としての活用が期待される。また、花器変異形質に関連するMADS-box遺伝子を解析し、二重咲き形質は、Bクラス遺伝子;PIにおける挿入変異によることを明らかにした。ミカワヤマツツジを対象にSSR解析をした結果、本種はヤマツツジ変異種であることが示唆された。また、本年度までに得られた全SSRデータを解析した結果、ツツジ属の種と園芸品種の成立過程には、野生種の変異として成立したもの、種間交雑で成立したもの、栽培種が関与して成立したもの、といくつかのパターンがあることが明らかになった。ハナショウブでは、野生のノハナショウブについて、東北地域において収集を強化した。また、東日本大震災で津波の被害にあったにも関わらず生育・開花した株の耐塩性のメカニズムなどの機能性についての知見を得た。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物育種学
自己スプライシングにより生成する酵母VMA1エンドヌクレアーゼの結晶解析

酵母VMAl遺伝子がコードする一本鎖蛋白質は、液胞性ATPase触媒サブユニットを切り出し、中央部のDNAエンドヌクレアーゼ(Vmal derived endonuclease、以下VDE)を生成する。ポリペプチド鎖の切り出しと接続によるこの現象は、プロテインスプライシングと呼ばれており、自己触媒的に進行する。スプライシング反応の機構を三次元構造に基づいて明らかにすることを目的として、両端にスプライシングペプチド部分を付加したVDE(XA-VDE)のX線結晶構造解析を行った。大腸菌発現系によりXA-VDEを調製し、結晶化した。2人分解能までのX線回折強度データ(completeness97%)を測定し、分子置換法により得た初期モデルを結晶学的に精密化した。102Å分解能においてR因子が0.203(R_<free>は0.264)まで精密化した。XA-VDE結晶は野生型VDEの構造と同型であり、スプライシング活性を有するドメインIについては、そのrmsdが0.35人、エンドヌクレアーゼ活性に重要なドメインIIでは0.62人であった。N末端には付加したペプチド鎖に相当する電子密度が観察された。スプライシング反応に必須なHis362の側鎖が、切断されるペプチド結合の近傍に存在し、その反対側には変異を導入したAla284側鎖が位置している。C末端側4残基については相当する電子密度が得られず、MALDI-TOF質量分析によっても、Ala738以下を欠落していることを確認した。これは、スプライシング反応のステップでもあるAsn737の後での切断反応が進行した結果である。酵母VMA1遺伝子産物(VMA1プロトザイム)のプロテインスプライシング反応は、介在配列であるエンドヌクレアーゼ部分(VMA1 derived endonuclease ; VDE)と、その外側の数アミノ酸残基があれば、自己触媒的に進行する。このスプライシング反応の機構を、三次元構造に基づいて明らかにするため、VDEの結晶学的研究を行った。結晶化にはポリペプチド鎖の両端を伸長した長鎖化体VDE(XA-VDE)を用いた。これを大腸菌内で発現させ、溶菌、硫安沈殿の後、陽イオン交換および陰イオン交換のカラムクロマトグラフィにより、VDE画分を調製した。さらに、クロマトフォーカシングにより、等電点の異なる複数の画分を得た。このうち、N末端配列の均一な画分を、さらにゲルろ過クロマトグラフィにより精製した。結晶化は、ポリエチレングリコールを用いて、Cd^<2+>共存下で行った。得られた結晶の空間群はP2_1であり、格子定数はa=59.1Å、b=102.5Å、c=87.0Å、β=93.9°で、2Å分解能までの回折斑点を与えた。非対称単位にVDE2分子が存在すると、V_Mは2.58Å^3/Da、溶媒占有率は52%である。この結晶を、25%グリセロールを含む母液に浸漬した後、100Kに冷却し、CuKα線を用いて回折強度データを収集した。2.15Åまでの総反射数120,673個、独立な反射51,196個(コンプリ-トネス90%)を測定できた。水銀および白金化合物溶液に浸漬した結晶についても回折強度データを収集し、現在その解析を進めている。
下垂体後葉ホルモン産生神経系における神経とグリアの相互作用

1)OBCAM, Kilonは、視床下部バソプレッシンニューロンの樹状突起に特異的に発現している事がわかった。この発見は、樹状突起特異的接着因子の初めての報告である。2)Thy-1,F3等の接着因子慢性浸透圧刺激した下垂体後葉でdownregulationされることを見出した。これらの接着因子の低下は細胞間結合を弱め、可塑的変化を可能にしているものと推測される。3)慢性浸透圧刺激を与えた場合、大型のものが血管系へ、小型のものがグリア系へ残るという結果を得た。このことは、終末部の肥大化がSproutingではなく、グリア細胞の形態変化と終末部の再構築(配置)により生じたことを示している。4)神経活動の増加に伴う終末部へのCa2+流入増大は、カルシウム結合タンパクであるカルレチニンのupregulationを引き起こし、流入したカルシウムを緩衝しているものと考えられる。5)慢性浸透圧刺激を与えたラットにおいては、グリア細胞の細胞質突起が著しく短くなることをin vivoレベルで初めて証明した。6)培養した下垂体後葉グリア細胞における解析では、グリア細胞の形態変化に、微小管配列変化やアクチン繊維の重合、脱重合が生じることがわかった。実際、下垂体後葉のグリア細胞は、他の脳部位のグリア細胞とは異なり数多くの微小管を持っていることがわかった。さらに、微小管を制御するタンパクとしてMAP2のアイソフォームで低分子型D体が多く発現していることも判明した。7)培養したグリア細胞の形態変化は、神経あるいはホルモン受容体を介して起こしていることも判明した。8)グリア細胞は、Ca^<2+>動因にかかわる受容体も数多く発現していることがCa^<2+>-Fura-2を用いた測光により判明した。このことは、神経-グリア相互作用があることを示している。9)c-fos遺伝子は、一般に神経活動後一時的にしか発現しないと考えられてきたが、慢性浸透圧刺激は、c-fos遺伝子の持続的発現を引き起こす事がわかった。このことは、生体内においては、転写調節因子の発現がより複雑化していることを示している。オキシトシンやバソプレッシンを合成する、視床下部-下垂体後葉系は、神経とグリア細胞の形態変化による組織再構築が再現性良く観察される。このような、可塑的な性質については不明点で、そのメカニズムについては良くわかっていない。昨年度の研究においては、下垂体後葉におけるグリア細胞の可塑性のメカニズムとして、MAP2の特異的局在をウエスタン解析および蛍光2重染色で確認している。特に、このMAP2タイプが、神経の樹状突起にある高分子型MAP2とは違い、胎児脳に豊富な、低分子型MAP2であることが解った。さらに、このMAP2を用いてグリア細胞の劇的な形態変化を、形態定量的に解析し、慢性刺激により、著しい退縮があることを報告した。また、グリア細胞には、エンドセリン、5-HT、PGE2、などの幾種類もの神経伝達物質受容体が存在することも報告している。よって、グリア細胞は、神経からの情報を受け取り、相互コミュニケーションを持つことが解った。神経終末部の変化としては、カルシウム結合蛋白である、カルレチニンやカルビンジンの、慢性刺激によるUp regulationがあることも観察、報告している。カルシウム結合蛋白は特に、microvesicleの多く集まる、活性体周辺に高密度で存在していることも、判明した。さらに、新規な接着因子Kilonを発見して、この蛋白がバソプレッシン神経の樹状突起に極めて特異的に存在することも判明している。以上のように、可塑性のメカニズムの分子レベルの背景として、細胞骨格や接着因子の幾つかの蛋白が関与することを解明した。8)グリア細胞は、Ca^<2+>動因にかかわる受容体も数多く発現していることがCa^

<2+>-Fura-2を用いた測光により判明した。このことは、神経-グリア相互作用があることを示している。9)c-fos遺伝子は、一般に神経活動後一時的にしか発現しないと考えられてきたが、慢性浸透圧刺激は、c-fos遺伝子の持続的発現を引き起こす事がわかった。このことは、生体内においては、転写調節因子の発現がより複雑化していることを示している。オキシトシンやバソプレッシンを合成、放出する視床下部-下垂体後葉系は、慢性刺激により、神経とグリア細胞の形態変化による組織再構築が再現性良く観察される。しかし、この系にける形態学的可塑性の生理学的意義や分子メカニズムについては、不明なところが多い。本年度の研究においては、1)慢性刺激により、グリア細胞の形態変化とともに、神経終末部が選択的に血管系へ移動することが判った、2)F3やThy-1などの免疫グロブリンスーパーファミリー蛋白が、下垂体後葉の神経終末部に存在し、刺激によりdownregulationされることが判明した、3)他の脳組織に比べ、下垂体後葉のグリア細胞は、微小管を高レベルで発現している、4)微小管の調節因子として、MAP2Dもグリア細胞に発現しており、形態調節に関与することが証明された、5)慢性刺激により、カルシウム結合蛋白である、カルレチニンの発現が増大することが判った、6)慢性刺激により、視床下部の視索上核で、持続的なFos発現が観察された、7)視床下部の大細胞性ニューロンの樹状突起、特に、バソプレッシン神経に特異的に発現する接着因子、免疫グロブリンスーパーファミリーに属すOBCAMを発見した、8)LPS投与により、視庄下部の神経核だけでなく、下垂体後葉のグリア細胞にも、Fosが発現することが判明した。以上の結果は、視床下部-下垂体後葉系の組織構築メカニズムだけでなく、その分子レベルでの機構の解明に大きく貢献した。本研究費による本年度の研究成果として1)下垂体後葉神経終末部における微細構造レベルの変化が、終末部のsproutingではなく終末部とグリア細胞の相互配置変化により生じることがわかった。つまり、グリア細胞の細胞質突起が退縮する一方、神経終末部で大型のものが血管系へ接触し、逆に小型のものがグリア細胞に覆われるようになる。このときの分子レベルの背景として、Thy-1,F3などのGPI-アンカー型接着因子のdown regulationが生じる事もわかった。2)一般に、成熟した脳のグリア細胞は微小管をあまり含んでいない。しかし、下垂体後葉のグリア細胞には、多くの微小管が存在していることが判明した。このことは、下垂体後葉グリア細胞の形態変化の分子メカニズムの一因と考えられる。さらに、微小管を調節する因子として微小管関連タンパクMAP2Dの発現があるこをRT-PCR, Western blottingにて証明した。3)慢性刺激を与えて、可塑性が生じている神経においては、転写調節タンパクであるFosが、持続的に発現していることがわかった。4)通常Fosの発現が認められないグリア細胞において、LPS投与では発現することが確認された。以上の結果は、下垂体後葉神経系における神経-グリア細胞相互作用のメカニズムの解明に著しく貢献した。
複雑合金相の構造安定化と原子振動　-透過電子顕微鏡による挑戦-

巨大構造物を代表とする構造材料などに用いられている金属材料は一般に社会基盤材料と呼ばれている。そのような合金の組成は酸化物などと異なり、不定比であり、様々な組み合わせが可能である。このような合金は一般に不定比化合物と呼ばれており、本研究はその構造安定性がどのようにもたらされているかを知ることを目的に行われた。具体的には研究者らは複雑な構造を呈するステンレス鋼中の介在物、軽量高強度金属であるマグネシウム合金中に出現する特異的な周期構造、また触媒等への利用が考えられる金属微粒子に着目し、特に最新型の収差補正型透過電子顕微鏡を用いてこれらの材料に出現する複雑相の構造安定化に対しその起源を解明した。本研究の目的は電子間化合物(ヒュームロザリー相、HR相)の安定性の起源として、電子状態によるエネルギー論だけではなく、振動エントロピーによる特に高温における相安定化機構を解明することにある。そのため、原子振動や短範囲規則を電子線回折において現れる散漫散乱を格子ダイナミクスと結びつけることにより定量化するとともに、第一原理計算に基づいたポテンシャル内での振動をエントロピーとして抽出し、理論と実験の両面から振動の効果を評価することが研究計画の骨子である。さらに短範囲規則を定量的に評価するためにMg合金に対しても同様の手法を適用することを試みる。当該年度はまず典型的なHR合金である銅-錫合金を作成し種々の熱処理を行い電子線回折パターンを得た。逆格子空間内のいくつかの方向にストリークが観察され、振動あるいは歪の存在が実験的に確認できた。この過程で従来単相と考えられていた組成と温度において、実は準安定な複数の相が存在していることを新たに見出した。また、実空間における観察という観点からは短範囲に規則化している領域からの高分解能電子顕微鏡像を得ることに成功した。一方、振動エントロピーを計算するためにはまず電子状態を理解し、原子が閉じ込められた空間のエネルギー状態を評価しなくてはならない。このため当該年度は第一原理計算ソフトウェアを導入し、HR相内部のポテンシャル計算を開始した。銅基合金において不定比性を考慮し、いくつかの熱力学的要因下において相安定化に必要なエネルギーを得た。合金の作製、透過電子顕微鏡による観察が順調に進み、また第一原理計算ソフトウェアの導入も予定通り進行している。特に高角まで試料を回転可能日本電子製JEM-2000EX、高分解能STEMを行うためのJEM-ARM200Fが問題なく稼働しており、本研究における骨格をなす逆空間における振動の定量化に関する実験を進めることができた。また、フォノン分散を求めるための第一原理計算による研究環境も、その第一段階としてのポテンシャルの計算環境立ち上げが終了し、複数の銅基合金系について計算を開始できた。さらに軽金属を主体とする合金系でもマグネシウム合金における規則化の前駆現象として、変態の極めて初期の段階でのゆらぎの検出を実空間における高分解能観察という形で進め、析出初期過程における合金元素の化学ポテンシャル依存性を明らかにした。今後、この初期の規則化を局所的なフォノンモードの安定化という観点から解釈するために、やはり振動モードの計算が必要である。この観点はこの合金系においては従来にない考え方であり、本研究の新たな骨子として進めていく予定である。一方、当初予定していなかった単相領域における複数の準安定相の出現の起源に関しては、まず構造を確認したうえで収束電子線回折などの局所領域からの情報抽出が必要であることが判明し、この系に関しては界面エネルギーの効果も加味したうえで、相安定化機構を説明する必要がある。すでに電子線回折による方位関係の精査は済んでおり、全体として問題なく研究は進捗している。本研究では社会基盤材料として重要なHR相や後述するTCP(topologically complex phase)相などの複雑な結晶構造を有する相における高温の安定性の原因を追求し、(1)実験的にはTEMにおける加熱実験により、散漫散乱ならびに高分解能観察を行い、(2)第一原理計算により得られるフォノン分散と対比することによりデータを検証し、(3)最終的に振動エントロピーを定量化することにより、これらの相の安定性の原因を解明することを目的としている。実験的な観点からは本年度はステンレス鋼中のTCP相の構造解明に注力した。すなわち原子力格納容器等に用いられるモリブデンを含有する二相ステンレスにおいて、そのフェライト相に析出するG相として知られるTCP相は脆性をもたらす析出相であるが、その構造ならびに発生の起源が不明であった。今回、種々の析出条件において構造変化の様子を透過電子顕微鏡を用いて追跡した。その結果、ナノメートルオーダーの領域(ドメイン)が生成し、その領域にモリブデンが濃化することを見出した。さらに一部の領域では擬似5回対称性を呈する回折パターンが検出され、この相がχ相と極めて類似しており、複合析出的な形態をしていることを見出した。また実用材料としてはアルミニウム合金に着目し、θ相にいたる析出シーケンスを解明している。一方、計算という観点から、本年度は第一原理計算によるポテンシャルの計算に加え、そのポテンシャルに基づくフォノン計算を開始した。現在は単純な合金系についてフォノン状態密度を求めることに成功しており、次年度はフォノンによる電子線回折パターン中の散漫散乱の定量化につなげる予定である。まず、計算および理論という観点からは、今年度はVASPに基づく第一原理計算によって得られたポテンシャル中の原子の振動を求め、振動の状態密度を明らかにする体制を整えることができた。

本研究で用いている格子振動特性を求める計算ツールでは、位相空間上で積分を行うことにより振動エントロピーを評価することが可能あるが、非化学量論性が大きい領域では配置エントロピーの項も全体の自由エネルギーに対して大きな寄与を有する。したがって、相の安定性を最終的に検討するにあたってはこの二つのエントロピーを考慮する必要があり、この点においては次年度の課題とした。実験的にはステンレス合金系およびアルミニウム合金系中に発生する複雑な構造を有する析出相の安定性を収差補正電子顕微鏡を用いて解明しており、この分野での新しい成果となっている。特にG相の安定性に5回対称性を内包するχ相の存在を見出したことは大きい。すなわち組成揺らぎにより並進対称性を有する結晶構造が担保されない場合でも局所的には同様の点対称性を有するクラスターが構造単位として存在することを示し、具体的にはモリブデンがこのクラスターの安定性に関与していることを明らかにしている。これは当初予想されなかった現象であるが、析出相という母相と平衡状態にある相の安定性という意味では重要な成果といえる。この系に関しては加熱実験等により、さらにこのクラスターの安定性を立証することも必要と考える。複雑な結晶構造を有する合金相であるヒュームロザリー相(Hume-Rothery相、HR相)やフランクカスパー相などの構造は、第一原理計算などから得られる絶対零度におけるエネルギー論という観点からだけでなく、原子振動などに起因するエントロピー効果によって安定化が重要であることが経験的に知られている。しかしながら、この振動による相の安定化効果は熱分析等による定性的な理解にとどまっているのが現状である。そのため本研究では、透過型電子顕微鏡を用いることにより合金中の相安定性を上記の観点から解明することを目的としている。研究成果はバルク系合金中の析出挙動における相安定と規則合金のサイズ効果における相安定性とに大きく区分することができる。前者のバルク系では、まずフェライト系ステンレスに出現する複雑相であるG相の安定性を詳細に調べ、Moの添加によりこの構造が安定化されていることを明らかにした。さらに局所的に5回対称性が存在していることをナノビーム回折法を用いて実験的に示し、χ相の存在と関連してその安定性を説明した。次にマグネシウム合金において出現する長周期積層構造の安定性を詳細に調べ、特に構造が安定化する前駆段階としてのGPゾーンの出現をSTEM観察の深さ方向の焦点距離依存性という技術を用いることにより精密に調べ、この系におけるリアクションシークエンスを明らかにした。さらに三次元トモグラフィー法を用いてMg97Zn1Gd2系における一方、微粒子における構造の安定性という観点からはAu/Co系におけるシェル構造に着目し、サイズ依存性とシェル構造による界面エネルギーが相の安定性に及ぼす効果を特に収差補正型電顕を駆使することにより解明した。具体的には表面への析出とエピタキシャル歪の効果が相互に影響しあい、この系の構造を制御することが可能であることを示した。巨大構造物を代表とする構造材料などに用いられている金属材料は一般に社会基盤材料と呼ばれている。
ゲート変調を利用したアモルファス酸化物半導体の薄膜成長：新規欠陥制御法の確立

本研究課題では、電界効果や光照射によるフェルミレベルの外部制御により、酸素欠損や過剰酸素、不純物水素などの欠陥形成を制御することを目的とし、最終的には欠陥の制御された高移動度アモルファス酸化物を実証することを目標としている。初年度の目標は、デバイスシミュレータによる実験条件の見積もり及び硬X線光電子分光法による欠陥解析を行い、その結果を踏まえ本手法の効果を予備的に確かめることを目標としていた。スパッタリングおよびパルスレーザー堆積法によって、不純物を添加したアモルファス酸化物薄膜トランジスタを作成し、シルバコ社のアトラス(デバイスシミュレータ)により欠陥解析を試みた。アモルファスGaOおよびアモルファスInGaZnOについて薄膜トランジスタを作成し、伝達特性および出力特性を測定した。デバイスシミュレータの欠陥パラメータを最適化することで実験結果をよく再現することができ、添加された不純物についても欠陥準位を抽出することができた。また、硬X線光電子分光法によって、酸素欠損の評価を行った。後処理と差分法を組み合わせることによって、酸素欠損が深い欠陥準位を形成するという結論が得られ論文の執筆を行っている。これらの予備的な実験の結果は本研究内容に重要であり、慎重にまとめを行っている段階である。これらを踏まえ、本年度には電界効果等によるフェルミレベル変調を行い、本手法の有効性を実証する予定である。初年度の目標は実際に電界効果によるフェルミレベル変調の影響を確かめることであった。しかし、その実験の過程で、深い欠陥準位の起源を同定することに成功し、本成果を慎重にまとめている段階である。この結果は本プロジェクトを遂行する上でも極めて重要な結果であり、来年度は、それを踏まえ実験を行う予定である。計画書に書いた方法に加えて以下の方策を加える。・熱処理時のEF制御の影響を調査する。・光照射による非平衡プロセスの検証を行う。・デバイス構造の最適化を行う。前年度の実験で硬X線光電子分光による欠陥解析に時間が取られてしまったため、装置購入による実験が遅れたため。本年度はサンプル作製に用いる物品を導入する予定である。
仮想将来世代による新しい市民討議手法の開発と効果測定－将来人の思考プロセスは何か

本研究は、「仮想将来世代」を政策形成・合意過程に導入する(=フューチャー・デザイン,以下FD)ことで、未来を視野に入れた長期的かつ俯瞰的な視点に基づく合意形成の具体的手法を領域横断的に開発し、その効果を科学的に検証することを目的とする。持続可能性に関わる地域課題の特徴は,個人(短期)と社会(長期)が利益相反するため政策合意形成に至らず停滞することが多い。その問題に、市民参加型討議に焦点を合わせ、解決の突破口を提供する。本研究では,(1)市民参加型討議における提供情報の種類と質の検討や合意形成プロセスの効果の分野横断的検討を通じてFD討議手法を見直しし,「仮想将来世代」に誘うための将来情報の提示方法や,効果的に誘うための討議中に行う複数種類のワーク内容と実施手法,及び変容した市民が構造的に意思決定することを可能にするための討議言語の開発に着手し,一定の成果を見た。(2)また,新FD手法を用いた市民参加型討議を開催し,そこから導出された政策含意が,これまでのFDを伴わない手法から導かれた同質の政策に対する含意との比較を実施し,両者に顕示化するのに十分な差異を検出した。(3)現世代の利害を超える時間的俯瞰思考が、人々の意思決定プロセスにもたらす影響や、自他の利害相反を克服する社会的俯瞰思考と時間的俯瞰思考との相関について、データに基づき統計的に検証し有意な差異を特定した。その結果,仮想将来世代を用いるFD手法の効果を定量化した。(1)本研究には自治体と研究者との協働が欠かせないが,松本市との継続的関係は,信州大学と松本市間における連携協定のメインテーマに本研究が位置づけられるようになった。また松本市地域づくり課と代表者所属の学部とが,本研究をテーマに連携協定を結び継続している。さらにH30年度中に長野県佐久穂町と代表者所属学部とが本研究をテーマに連携協定を結び,協働作業の土壌づくりを開始した。(2)松本市において,新たに開発した市民討議手法を用いた政策形成のための市民討議を実施した。(3)市民討議中に参加者による意思決定に関するアンケート調査を行い,データ解析を行って,仮想将来世代による思考の特徴を定量的に特定した。今後は以下の3点を中心に研究を展開する。(1)佐久穂町における市民参加型討議を実施し,松本市での実施体制とは異なる行政・町民・研究者の協働体制を試みる。(2)松本市でのこれまで2回に渡る市民討議の実施を踏まえ,仮想将来世代を導入した政策選定と対応する市民討議デザインのためマニュアルを作成し,行政が自律的に実施できる体制を構築する。(3)松本市におけるこれまでの実施実績に基づき,政策立案から政策形成までのプロセスをFDの視点から抜本的に見直し,本質的な課題解決の突破口に踏み込む。

(2)松本市でのこれまで2回に渡る市民討議の実施を踏まえ,仮想将来世代を導入した政策選定と対応する市民討議デザインのためマニュアルを作成し,行政が自律的に実施できる体制を構築する。(3)松本市におけるこれまでの実施実績に基づき,政策立案から政策形成までのプロセスをFDの視点から抜本的に見直し,本質的な課題解決の突破口に踏み込む。研究費の大部分は,市民討議実施に関わる諸経費及び研究会や報告会等への参加のための旅費に充当されるが,市民討議実施には自治体や市民など多くの関係方面との調整が必要であり,長い期間を経て準備して初めて実施が可能となる。そのため,助成金支給後から年度内に実施できる討議規模は限定されてしまった。次年度使用額については,2019年度請求額とあわせて,市民討議の実施や研究会等への参加に使用する計画である。
高感度生細胞イメージングに基づくRho-mDiaシグナルの細胞内作用点特定

本研究では、近年アクチン線維の重合核形成促進分子として脚光をあびつつあるForminファミリー蛋白質の1つ、mDialを単分子スペックル解析することで、以下に示す新規のアクチン重合に駆動される分子移動装置の発見につながる大きな成果が得られた。まず、蛍光単分子イメージングにFormin蛋白質の1つ、mDialを分子ごとに可視化したところ、mDialのFH1-FH2が毎秒2.0μmもの高速で細胞内を分子移動することを発見した。この移動は微小管を壊しても変化なく、アクチン線維に作用する3種の薬剤によって完全に停止した。次に細胞において、アクチン作用薬投与時のmDialの速度変化を解析したところ、アクチン単量体の濃度を減少させる薬剤処理ではmDialの動きが徐々に同調して減速し停止したが、直接アクチン伸長を阻害する薬剤では、個々のmDialの動きは即座に、しかも様々なタイミングで停止した。アクチン線維の重合速度はアクチン単量体の濃度に比例するので、mDialの運動はアクチン重合端に沿った移動と考えられる。更にミオシン非依存性を確証すべく、我々は精製アクチン、プロフィリン、リコンビナントmDialを用い、蛍光顕微鏡下でアクチン線維伸長を観察した。アクチン線維は、ガラス面に固相化されたmDialに接した部位で伸長し、その伸長速度から、mDialが重合を続ける反矢じり端に連続的に会合することが実証された。以上の結果から、Forminファミリーはアクチン重合の力を利用した分子移動装置として、細胞内で働いていることが予想される(Science 303:2007)。引き続き、その分子移動が細胞内でどのように利用されるかについて、野生型のmDailの分子イメージングを中心に解析を現在つづけている。mDia1はN末端に低分子量G蛋白質Rho結合ドメインをもち、Rhoが結合するとそのC末端との結合が外れ、FH1-FH2ユニット構造が活性化し、細胞内に著明なアクチンファイバーを誘導する(Watanabe N.et al.Nat.Cell Biol.,1999)。最近、FH1-FH2ユニットが試験管内でアクチン核化を加速し、アクチン線維の伸長端に結合することが報告された。我々はEGFP-mDia1を単分子スペックル法によって生細胞内で観察したところ、FH1-FH2変異体が、数十マイクロンの距離を移動するのを見い出した。その平均速度は毎秒2.0マイクロメーターで、アクチン流動より2桁速い。その移動はNocodazoleで微小管を壊しても影響を受けず、アクチン重合、脱重合を阻害する3種の薬では完全に停止した。更に、アクチン単量体不活化や脱重合阻害では、徐々に速度が減速するが、アクチン線維の伸長端に結合し、伸長を阻害するサイトカラシンを用いると個々のmDia1の分子運動が瞬時に、しかも数秒間にわたって次々にランダムに停止した。この停止様式は3種の薬剤によって引き起こされるであろうアクチン線維の伸長速度の変化と一致する。また、これらの薬剤処理中でもアクチン線維が残存し、アクチン収縮が起きることからミオシンモーターを介した分子移動ではないと考えられる。顕微鏡下で、精製されたアクチン、プロフィリン、mDia1を用い、mDia1が重合をつづけるアクチン伸長端に会合する結果を見い出した。これらのデータは、mDia1は重合するアクチンの反矢じり端にプロセッシヴに結合しながら移動することを示す。今回の発見はモーター蛋白質以外ではじめて長距離を移動できる分子機構が存在することを、しかもそれを生細胞内で直接明らかにした(Science印刷中)。

本研究では、近年アクチン線維の重合核形成促進分子として脚光をあびつつあるForminファミリー蛋白質の1つ、mDialを単分子スペックル解析することで、以下に示す新規のアクチン重合に駆動される分子移動装置の発見につながる大きな成果が得られた。まず、蛍光単分子イメージングにFormin蛋白質の1つ、mDialを分子ごとに可視化したところ、mDialのFH1-FH2が毎秒2.0μmもの高速で細胞内を分子移動することを発見した。この移動は微小管を壊しても変化なく、アクチン線維に作用する3種の薬剤によって完全に停止した。次に細胞において、アクチン作用薬投与時のmDialの速度変化を解析したところ、アクチン単量体の濃度を減少させる薬剤処理ではmDialの動きが徐々に同調して減速し停止したが、直接アクチン伸長を阻害する薬剤では、個々のmDialの動きは即座に、しかも様々なタイミングで停止した。アクチン線維の重合速度はアクチン単量体の濃度に比例するので、mDiaiの運動はアクチン重合端に沿った移動と考えられる。更にミオシン非依存性を確証すべく、我々は精製アクチン、プロフィリン、リコンビナントDmialを用い、蛍光顕微鏡下でアクチン線維伸長を観察した。アクチン線維は、ガラス面に固相化されたmDialに接した部位で伸長し、その伸長速度から、mDialが重合を続ける反矢じり端に連続的に会合することが実証された。以上の結果から、Forminファミリーはアクチン重合の力を利用した分子移動装置として、細胞内で働いていることが予想される(Science303:2007)。引き続き、その分子移動が細胞内でどのように利用されるかについて、野生型のmDailの分子イメージングを中心に解析を現在つづけている。
分析考古学による西アジア先史時代石器利用の研究

本研究では、西アジア先史時代社会を理解する一手段として、石器利用に関する徹底した基礎研究を実施した。蛍光X線分析による黒曜石石材の産地同定分析、電気炉および野火を用いたフリントの加熱処理実験、顕微鏡観察による石器の使用痕分析を3つの柱として実施し、実用性の高い基礎データを大量に取得することに成功した。同時に、石材の獲得から石器の廃棄まで、石器利用を1つの流れとして捉える視点から得られたデータを総合し、石器利用における機能的側面と社会的側面を包括的に捉えた新しい石器研究法を提示した。初年度にあたる平成25年度は、8月から9月にかけて、トルコ南東部バトマン県のハッサンケイフ・ホユック遺跡の発掘調査(筑波大学アナトリア調査団:代表三宅裕筑波大学教授)に参加し、本研究で用いる一次資料となるフリント製および黒曜石製の石器資料を獲得した。これらの資料を用いて、石器製作技術および石器のスタイルに見られるパターンを分析し、基礎データの収集に努めた。また、本研究における、石材産地の同定、石器使用痕分析、石器の加熱処理実験の3つの柱の1つである石材産地分析において、主要石材の1つである黒曜石の交易を探るため、同遺跡および近隣のサラット・ジャーミー・ヤヌ遺跡出土黒曜石の理化学分析をおこなった。研究協力者であるカナダ・マクマスター大学のトリスタン・カーター准教授との共同で、エネルギー分散型蛍光X線分析法を用いて約800点の黒曜石の成分組成分析を実施し、東アナトリア産の黒曜石が中心的に利用されていたことが明らかになった。さらに、加熱処理実験に関して、実験用の資料を獲得するべく、ハッサンケイフ・ホユック遺跡周辺でフリント産地の調査を実施した。ティグリス河沿い、その支流のワディ沿いを踏査し、フリントのノジュールおよび転礫を複数の地点から採取した。加熱実験として、採取したフリントを熾火で30分から1時間加熱し、石質の変化を観察する実験をおこなった。これは本格的な温度管理を伴う本実験に入る前の予備実験として実施したものであるが、加熱処理に必要な温度、加熱時間についての予見を得ることができた。研究年度2年目の今年度は、当初の研究計画の予定通り、石器の加熱処理実験を中心に研究を進めた。本研究課題の3つの柱としている、石材の産地同定分析、加熱処理実験、使用痕分析のなかの1つにあたる。前年度に実施した予備実験の結果を踏まえ、年度当初に加熱用の電気実験炉を購入し、それを用いてトルコ共和国で採取したフリント石材の加熱実験をおこなった。加熱温度、加熱時間の設定を変えながら実験を繰り返し、遺跡から出土する先史時代の石器と同様の加熱変化を引き起こす条件としては、250から350°Cで2時間以上の加熱が必要であることを明らかにした。さらに、先史時代と同様の条件で石材を加熱するために、野外での焚き火によってフリントを加熱する実験をおこなった。熱電対温度計で加熱温度を計測し、やはり室内実験の結果と同様の加熱温度・時間が最適であることを確かめるとともに、野火の温度管理は予想以上に難しく、先史時代の石材加熱においても失敗例が多数あることを確認することができた。同時におこなった考古学資料の研究からは、当時の人々がこのような失敗を気にせずに加熱処理を実施していたことが予想され、先史時代の技術が不安定であった反面、技術の運用においては必ずしも効率化が求められていたわけではないことが明らかになった。石器利用の側面から当時の社会の性格を知る上での貴重な見解が得られたといえる。また、加熱実験と併行し、8-9月にはトルコにおいてハッサンケイフ・ホユック遺跡の発掘調査(筑波大学アナトリア調査団)に参加し石器の基礎データを収集するとともに、昨年度に引き続き黒曜石の産地同定分析を継続しておこない、サラット・ジャーミー・ヤヌ遺跡出土の黒曜石資料に関しては、全点の分析を終了することができた。最終年度に当たる平成27年度には、石器の使用痕研究を進めるとともに、これまでに取得した分析データを統合し、西アジア先史時代における石器利用の性格を理解することに主眼をおいた。使用痕分析では、狩猟具であった石鏃の使用状況をあきらかにするとともに、植物の収穫具であった鎌刃石器の利用頻度が時代と共に増加する様相をあきらかにしたうえで、当時の人々が狩猟採集の時代から続く伝統的な石器利用を数千年間維持し続けていたことを提示した。これにより、3年間の研究期間において当初の計画通り実施した3つの分析、蛍光X線分析による黒曜石石材の産地同定分析、電気炉および野火を用いたフリントの加熱処理実験、顕微鏡観察による石器の使用痕分析の結果が出揃い、実用的な石器研究の基礎データベースを提示することができた。さらに、最終的な研究成果として、これらのデータを統合し、石材の獲得から石器の廃棄までの石器利用を1つの流れとして捉える視点から研究を進め、西アジア先史時代の石器利用の在り方を左右した要因の多くが、個々の工程における作業効率や機能的優位性ではなく、石器利用全体に通底する文化的嗜好性であることをあきらかにした。その結果、「先史時代社会を理解する手段として石器利用に関する徹底した基礎研究を実施し、石器利用における機能的側面と社会的側面を包括的に捉えた新しい石器研究法を提示する」という当初の研究目的を達成することができた。研究成果については、イギリス、オーストリア、ポルトガルで開催された学会発表によって公表するとともに、学術論文としてまとめ、国際誌に投稿した。

蛍光X線分析による黒曜石石材の産地同定分析、電気炉および野火を用いたフリントの加熱処理実験、顕微鏡観察による石器の使用痕分析を3つの柱として実施し、実用性の高い基礎データを大量に取得することに成功した。同時に、石材の獲得から石器の廃棄まで、石器利用を1つの流れとして捉える視点から得られたデータを総合し、石器利用における機能的側面と社会的側面を包括的に捉えた新しい石器研究法を提示した。当初の研究計画どおり、初年度と今年度において、石材の産地同定、加熱実験が順調に進んでいる。次年度に予定している石器の使用痕研究に関しても、研究協力者との研究打ち合わせ、研究資料の受け渡しはすでに済んでおり、準備は順調に進んでいるといえる。また、今年度におこなった新たな発掘調査によって、さらに本研究で扱うことができる石器資料が増えており、次年度におこなう研究の資料も十分に確保できている。西アジア考古学最終年度にあたる次年度には、石器の使用痕研究を中心的におこなうとともに、これまでの研究成果を総括し、研究成果を発表することに重きを置く。黒曜石の産地同定分析に関してはすでに分析データが得られており、現在研究論文の発表について研究協力者と話を進めている段階である。次年度中には雑誌論文として研究成果を発表する予定である。また、今年度におこなった石材の加熱実験の補完研究として、遺跡から出土する石器を熱ルミネッセンス法などで分析し、先史時代の石材加熱温度にはかなり幅があったこと、加熱不足や過加熱の例が多数あったことを明らかにしたいと考えている。石器の基礎分析の3つの柱としている、1)石材産地の同定、2)石器使用痕分析、3)石器の加熱処理実験のうち、1)の調査として黒曜石産地同定分析結果を予定通り得ることができた。また、遺跡周辺でのフリント産地の踏査を実施し、石灰岩盤中にフリントのノジュールを産出する地点を確認することができた。これらは25年度の研究実施計画として予定していた研究が順調に進んだ結果である。さらに次年度に予定している3)の加熱処理実験についても、今年度に予定を早めて予備実験をおこない、本実験への準備を進めることができた。次年度は、計画研究通り石器の加熱処理実験を進める。すでに実験に用いるフリント石材は確保しており、実験用のオーブンおよび高温計を準備でき次第、本格的な実験に入る予定である。また、引き続きフィールドでの調査を実施し、加熱処理の施された石器標本を獲得するとともに、実験結果との対照をおこなう。
両親媒性含遷移金属ロタキサンを用いる分散系の制御-温度可逆ゾルゲル相転移

低分子ゲル化剤は溶媒中で分子が自己集合して非共有結合性の超分子ポリマーを形成し,これによって溶液のゾルーゲル転移が誘起される。環状分子は形状に異方性をもつため、特徴ある分子間相互作用をもつことが期待される。π共役系の剛直性をもった類似骨格を有する菱形環状分子を2種類合成した。菱形骨格部分は平面性を保つ一方、稜のフェナンスレン部分は骨格平面にほぼ垂直に配向している分子で、環状平面骨格部分同士はアルキンと芳香環との相互作用などによって階段状に集積することを明らかにした。フェナンスレン部分は階段状集積体同士の相互作用にも寄与している。結果として、これらの階段状集積体が結晶中で同じ方向に配列して、全体として一次元の組織体を形成していることが明らかになった。一方類似骨格でフェナンスレンのかわりにジイミン部分をもつ大環状分子は、有機溶媒の懸濁液を超音波照射することによって、ゲルを形成した。ゲル形成には超音波照射が必須であり、加熱等の操作では、形状の変化はみられなかった。塩化メチレン懸濁液から生じたゲルを直接顕微鏡観察すると、明確な繊維状組織を見ることができ、異方性をもつ自己集合を行っていることがわかる。キセロゲルのSEM像とX線回折結果を比較するとキセロゲルでは集合体に方向性があり、生成後の状態に比べて明らかに結晶性が向上している。この系では超音波照射によって、分子間相互作用による配列がうながされ、集合構造が制御されたものと理解される。今回、配位能を有するアルキルビピリジニウムに対してパラジウム前駆体錯体を反応させて二鎖型の両親媒性錯体を合成した。この錯体とシクロデキストリンからヒドロゲルが生成した。これまで水中でゲル化する金属錯体の例は極めて少なく,今後金属錯体に由来する機能性集合体の生成が期待できる。本研究では、アルキルピリジニウム配位子を有するパラジウム錯体を軸成分、α-シクロデキストリンを環成分としてロタキサンを新たに開発し、その水溶液からゲルへの相転移を検討する。特に、本年度は、各成分分子及びロタキサンの合成に重点を置いて研究をおこなった。汎用性有機化合物として知られる各種のアルキルピリジニウムおよびアルキルビピリジニウムを合成し、そのα-シクロデキストリンとのロタキサン形成を各種スペクトル解析を中心に研究した。アルキル基の長さに応じてα-シクロデキストリンを1個-3個まで含む24擬ロタキサンを得ることができた。擬ロタキサン水溶液のROESYパルステクニックを用いたNMR測定を行ったところ、これらの擬ロタキサンは、その軸成分の末端同士がスタッキングにより相互作用したオリゴマーを形成していることがわかった。この溶液の温度を下げると、成分分子化合物濃度および溶液温度に応じてヒドロゲルが生成する。このゾルゲル相転移温度は溶液調整条件を変えることによって、7°Cから63°Cまで自在に変化することができた。ゲル生成のための条件を溶液スペクトルから検討した。その結果、溶液内に2-ロタキサンのみが存在する場合にはゲルは生成することなく、少量でも3-ロタキサンが生成するとゲル化することがわかった。すなわち、これらロタキサンは溶液内では軸分子の相互作用によってオリゴマーを形成しているが、環状分子が2個並列した3-ロタキサン構造が一部に生じるとオリゴマー間に親水的な相互作用が生じ、これによって三次元ネットワークが構築されること、ネットワーク間に溶媒分子が包接されて、ヒドロゲルが生成すること、がわかった。本研究計画によって、溶液のゲル化とゾル化を、錯体化学的に厳密に制御できる配位結合と関連付けることが可能になったとともに、これまで困難であったゲル化の精密な制御を達成できた。
フサシダ科植物における造精器誘導物質の生合成とその誘導遺伝子の機能の解析

フサシダ科Lygodium属のシダの主要造精器誘導物質であるGA_<73> methylester(GA_<73>-Me)の生合成経路を追究した。カニクサ(L.japonicum)など3種のLygodium属のシダのうち、GA_<73>-Meの生合成量がもっとも多かったL.circinnatumを用いてGA_<73>-Meの生合成経路の追究を行った。前葉体中のGA分析結果に基づいてC-7カルボン酸のメチルエステル化はGA_<73>への変換後起こると推定した。GA_<73>の生合成については、9,15-cyclo-GA_9が前駆体である可能性、及び他のGAと同様の経路で生合成されている可能性が考えられる。そこで、L.circinnatum前葉体に9,15-cyclo-GA_9,GA_<24>、及びGA_9の重水素標識体を投与し、その代謝物の同定を試みた。その結果、GA_<73>-Meは9,15-cyclo-GA_9由来ではなく、GA_<24>を経て生合成されること、GA_<24>からGA_<73>への変換はGA_9を経由しないことが示された。一方、造精器誘導物質の作用発現機構追究の一環として、A.phyllitidis配偶体において、その主要造精器誘導物質であるantheridic acid処理により発現が誘導、あるいは抑制される遺伝子の単離を試みた。造精器誘導物質に対する反応性が高い暗黒下培養した原糸体を試料とした。Antheridic acid処理した試料のpoly(A)^+RNAからcDNA libraryを作成し、処理・未処理各々のpoly(A)^+RNAより調製したプローブを用いてディファレンシャルスクリーニングを行ったが、antheridic acid処理により発現量が変化すると考えられるクローンは得られなかった。そこで、処理・未処理のcDNAを用いWang&Brown(1991)により報告されたサブトラクション法を試みることとした。現在、6回のサブトラクションを行い、誘導、抑制遺伝子が分離濃縮されたと考えられるcDNAプールを得た。これらをプローブとして誘導・抑制遺伝子のスクリーニングを継続中である。