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イオン液体を利用した熱化学法ISプロセス水素製造システムの熱効率向上に関する研究

イオン液体を利用して反応溶液中のヨウ素濃度を増加させることによって、ブンゼン反応でヨウ化水素濃度が高い生成物が得られれば、熱化学法ISプロセス水素製造システムの熱効率向上が期待できる。本研究では、ヨウ素系イオン液体がブンゼン反応の原料であるヨウ素及び二酸化硫黄の溶解性に優れていること、並びにイオン液体を利用することによって、通常のブンゼン反応を上回るヨウ化水素濃度が得られることを明らかにした。本研究は、熱化学法ISプロセスの熱効率向上における課題「ブンゼン反応(水、ヨウ素及び二酸化硫黄からヨウ化水素酸と硫酸を得る反応)の生成物からの効率的なヨウ化水素分離」を解決するため、イオン液体を利用して反応溶液中の原料ヨウ素の濃度を増加させることによって反応を促進し、ヨウ化水素濃度が高い生成物を得ることが目的である。本年度は、イオン液体のブンゼン反応に関連する物性データ取得を行った。先ず、ヨウ素イオンから構成されるイオン液体6種類を候補として、ヨウ素の溶解性を評価した。ここで、通常のブンゼン反応溶液中におけるヨウ素濃度は、ヨウ化水素に対するヨウ素溶解度に依存するため、この溶解度が一つの指標となる。試験の結果、1-エチル-3-メチルイミダゾリウムヨージド(C_6H_<11>N_2)、1-メチル-3-プロピルイミダゾリウムヨージド(C_7H_<13>IN_2)及び1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムヨージド(C_8H_<15>IN_2)の3種類がヨウ素を溶解でき、物質量あたりのヨウ素溶解度はヨウ化水素と比較して、各々、2.2倍、2.3倍及び2.4倍であり、これらのイオン液体の利用によって、反応溶液中のヨウ素濃度を増加できることを明らかにした。また、上記3種類のイオン液体において、硫酸との混合溶液中におけるヨウ素溶解度はイオン液体単体とほぼ同等であり、ヨウ素溶解性の観点から反応生成物である硫酸に対しての耐性を有していることが確認できた。さらに、反応生成物の液液相分離特性を把握するため、反応生成物濃度に相当するヨウ化水素酸及び硫酸にヨウ素及びイオン液体を混合・静置した。この結果、通常のブンゼン反応の生成物が硫酸相とヨウ化水素酸相の2液相に分離するのに対して、新たにイオン液体相が加わった3液相に分離することが確認でき、反応後のイオン液体の分離回収の観点から有利な特性を有していることを明らかにした。ヨウ素イオンを含むイオン液体の利用により反応溶液中のヨウ素濃度を増加させることができる。本年度は、昨年度の試験結果から、単位物質量あたりのヨウ素溶解度が最も高かった1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムヨージド(C_8H_<15>IN_2)を用いて、ブンゼン反応試験を実施した。反応実験に先立ち、分析すべき反応生成物中に新たにイオン液体が含まれるため、分析手法の確立を行った。従来の分析では滴定法によって、H+イオン及びI-イオンを定量し、これらの差を硫酸とし、残りのH+イオンをヨウ化水素としている。今回、イオン液体起源のI-イオンが新たに含まれるため、従来の滴定法に加えて、炭酸バリウムを用いて硫酸バリウム沈殿を生成させ、重量測定により硫酸を定量することにより、ヨウ化水素、硫酸、イオン液体を定量した。反応試験において、水、ヨウ素及びイオン液体(モル比1:1:0.24)を混合した原料に対して、二酸化硫黄ガス(総供給量モル比1)を供給しブンゼン反応を行った結果、反応生成物は液液相分離し、重液相におけるヨウ化水素濃度は、同条件下でイオン液体を用いない通常のブンゼン反応における57wt%を上回る60wt%が得られ、ブンゼン反応が促進していることが確認できた。
本態性高血圧の成因物質と考えられる内因性ジキタリス様物質の構造解析

正常血圧者と高血圧者の尿から数種のカラムを用い、本態性高血圧成因物質と考えられるNa,K-ATPase阻害物質をほば単離することができた。この物質がウアバインと極めて構造の類似したものであるとの報告が出されているため、相違点についてデータを取ったが、明らかに、種々の相違点が見出された。また、この物質が糖鎖を有している可能性が高いことより、高速液体クロマトグラフイ-の検出器に、糖を超高感度に分析できる電気化学検出器を用いて測定した。目的物質の安定性は極めて悪いことが知られている。このため、阻害活性も低下するものと思われる。検出の結果、特定の一つの分画のピーク面積が時間とともに減少し、阻害活性の低下と極めて高い相関性があった。このことより、この分画物質が高血圧成因物質であることが強く示唆された。なお、この物質の安定性が極めて悪く、半減期はおよそ5時間であった。このため、少しでも安定化を図るため、種々の試みを実施したが、尿素を固定化ウレアーゼによって処理すると、およそ3倍の時間安定化することができた。この物質は氷中保存により分解され、少なくとも4つのピークに分解された。電気化学検出器では糖の他、アミノ基を有する物質にも反応し、シグナルを呈する。このため、4つに分解された物質が全て糠であるかを知るため、アミノ基を有する物質を捕獲するアミノトラップカラムを付け、4つの物質を測定したところ、そのうち1つのピークは消失した。このことは、目的物質が少なくとも3種の糖および糖鎖とペプチドから構成された物質であることを強く示唆しているものと思われた。このように、成因物質をほぼ特定することに成功し、しかもこの物質を単一に精製する方法と、糖鎖の精製単離方法は確実に拾得することに成功した。このため、スケールアップにより、糖鎖の単離ができれば、構造決定まで後一歩のところまで到達することに成功した。本態性高血圧患者尿約200リットルから、超大型カラム(500φmm、1,000mm ODSカラム)を用いた高速液体クロマトグラフィと、分取型大型カラム(21.5φmm、300mmアミドカラム)を組み合わせ、短時間で高精度の目的物を得た。なお、最終的にはもう一段、エンドキャップ処理されたODSカラム(7.8φmm、300mm)にて精製した。精製されたこの分画が、(1)Na・K ATPaseの阻害活性(2)抗ジキタリス抗体との交差性(3)Na・K ATPaseに対する^3Hウアバインの置換活性(4)分画分子量10,000の透析膜を通過することの4点の性質を有していることを確認した。さらに、この分画物質をダイオネックス社製・糖分析用システムによって糖および糖関連物質であるかどうかの分析を行った。その結果、単糖ではなく、明らかに糖重合体と思われるピークを得ることができた。糖のみの重合体であるとすれば、何種類の糖の重合体であるのか。糖鎖を有するペプチドとの重合体であるかのを区別するため、酸水解後、もう一度糖分析システムにて測定を行うと、重合体のシグナルは消失し、単糖と思われるリテンションタイムに数種のシグナルを得ることができた。さらに、アミノ酸を吸着するイオン交換樹脂カラムを通過させた後にもう一度糖分析システムにて検出すると、1種を除いて全てのシグナルは消失した。このことは目的物質が糖鎖を有するペプチドであることを強く示唆しており、糖も、1種類の糖しか結合していない可能性を示しているものと思われる。現段階では、目的物質と考えられる様々な性質を有し、しかも糖鎖を有するペプチド画分をヒト尿中より精製し、この興味深い分画の精製を重ね、今後さらに詳細な化学的性質と、生理活性を調べる予定である。

このように、成因物質をほぼ特定することに成功し、しかもこの物質を単一に精製する方法と、糖鎖の精製単離方法は確実に拾得することに成功した。このため、スケールアップにより、糖鎖の単離ができれば、構造決定まで後一歩のところまで到達することに成功した。本態性高血圧患者尿約200リットルから、超大型カラム(500φmm、1,000mm ODSカラム)を用いた高速液体クロマトグラフィーと、分取型大型カラム(21.5φmm、300mmアミドカラム)を用いた高速液体クロマトグラフィーを組み合わせ、短時間で高純度の目的物を精製した。得られた分画はさらに、エンドキャップ処理されたODSカラム(7.8φmm、300mm)を用いて精製した。精製された分画は(1)Na^+,K^+ATPaseの阻害活性、(2)抗ジキタリス抗体との交差性、(3)Na^+,K^+ATPaseに対する^3Hウアバインの置換活性、(4)分画分子量10,000の透析膜を通過することの4点を確認し、更に糖を超高感度に分析する検出計により目的物質を測定した。また、精製各ステップにおいて糖鎖分析を実施し、同一物質を追跡しているかどうかを確認した。その結果、精製の早い時期から物質の変化が認められ、目的物質を入手することはできなかった。目的物質の変性は予想を上回る速度で進行しており、これを安定化させる何らかの手段を検討中で、2次速度定数に従う分解であることを手がかりに検索中である。正常血圧者と高血圧者の尿から数種のカラムを用い、本態性高血圧成因物質と考えられるNa,K-ATPase阻害物質をほぼ単離することができた。この物質がウアバインと極めて構造の類似したものであるとの報告が出されているため、相違点についてデータを取ったが、明らかに、種々の相違点が見出された。また、この物質が糖鎖を有している可能性が高いことより、高速液体クロマトグラフィーの検出器に、糖を超高感度に分析できる電気化学検出器を用いて測定した。目的物質の安定性は極めて悪いことが知られている。このため、阻害活性も低下するものと思われる。検出の結果、特定の一つの分画のピーク面積が時間とともに減少し、阻害活性の低下と極めて高い相関性があった。このことより、この分画物質が高血圧成因物質であることが強く示唆された。なお、この物質の安定性が極めて悪く、半減期はおよそ5時間であった。このため、少しでも安定化を図るため、種々の試みを実施したが、尿素を固定化ウレアーゼによって処理すると、およそ3倍の時間安定化することができた。この物質は氷中保存により分解され、少なくとも4つのピークに分解された。電気化学検出器では糖の他、アミノ基を有する物質にも反応し、シグナルを呈する。このため、4つに分解された物質が全て糖であるかを知るため、アミノ基を有する物質を捕獲するアミノトラップカラムを付け、4つの物質を測定したところ、そのうち1つのピークは消失した。このことは、目的物質が少なくとも3種の糖および糖鎖とペプチドから構成された物質であることを強く示唆しているものと思われた。
小児インスリン非依存性糖尿病の遺伝的糖新生調節障害に関する培養単球での検討

1:ヒトFBPase遺伝子の転写制御領域のクローニングとその塩基配列の決定ヒト胎盤からのgenomicDNA libraryより、human FBPase遺伝子プロモーター領域の合成オリゴヌクレオチドをプローブにして、約4kbの転写制御領域をクローニングした。これをpUC118vectorにサブクローニング後、その塩基配列を決定した。2:この転写制御領域の0.5kbフラグメントにatRA,.9cRAおよびVD3に応答するシスエレメント配列が存在することを、レポーター遺伝子アッセイシステム(Luciferaseベクター系)にて示した。3:本領域に存在する一つの応答領域fbp-RARE/VDRE(-340 to -326)が、RARおよびVDR両核内レセプター蛋白による転写誘導に機能する、という非常に興味深い結果をレポーターアッセイにより明かにすることができた。4:これらの結果はビタミンD3や活性型レチノイン酸(atRA,9cRA)の脂溶性リガンドが単球系血液細胞におけるヒトFBPase遺伝子発現の重要なモジュレーターであることを示している。5:FBPase遺伝子の調節領域において、インスリン反応性塩基配列と想定される塩基配列を、atRA,9cRAおよびVD3に応答する塩基配列の近辺に見いだした。レポーター遺伝子アッセイシステムを用いて、現在さらに検討中である。1:正常人の培養単球を用いて、インスリンのFBPase活性抑制効果について検討した。3日および7日の培養で、各種濃度の薬物(インスリン、Dexamethasone,cyclic-AMP,8-Bromo-cyclic-AMP,Dibutyryl-cyclic-AMP)の添加組み合わにて行った。しかしながら、この様な条件下ではインスリンのFBPase活性抑制効果の判定についての再現が困難と判明した。2:インスリンのFBPase活性抑制効果を判定する時間に問題がある可能性が考えれれた。FBPaseの転写調節領域にインスリン反応性の塩基配列の存在を想定した。この可能性を検討するために、2.6kbp長のFBPaseの転写調節領域をヒトゲノムDNAライブラリーよりクローニングした。3: FBPaseの転写調節領域をpTK-Lucに組み込んだレポータージーンを作成した。現在、各種のポストインスリンレセプター情報伝達物質を加えて、レポータージーンによりFBPaseの発現抑制効果を検討中である。これをpUC118 vectorにサブクローニング後、その塩基配列を決定した。2:この転写制御領域の0.5kbフラグメントにatRA.,9cRAおよびVD3に応答するシスエレメント配列が存在することを、レポーター遺伝子アッセイシステム(Luciferaseベクター系)にて示した。
I-131標識モノクロナル抗体による悪性黒色腫の診断と治療に関する基礎的検討

I-131標識モノクローナル抗体による悪性黒色腫の画像診断(Radio-immunodetection)および治療(Radioimmunotherapy)の有用性と問題点を中心に、メラノーマ移植マウスを用いてin vivoの実験を行った。モノクローナル抗メラノーマ抗体(M2590)をI-131で標識し、画像診断には20μci前後を投与し、そして治療には30150μciを投与した。I-131標識M2590は、血中消失率は比較的速く、静注後3日で血中放射能は無視できる程度となった。メラノーマへのI-131 M2590の集積程度は血液の210倍となり個体差が大きかった。オートラジオグラムで腫瘍内分布を観察すると、I-131 M2590の分布は不均一で、これが発育速度の速いメラノーマでは、個体差が大きくなる一因と考えられた。治療量のI-131 M2590を投与したメラノーマ移植マウスの生存日数は35.5日(n=30)とI-131抗体非投与群(n=21)の25.5日に比し延長する傾向がみられたが、治療には至らなかった。M2590のメラノーマの有効半減期は1.3日と短かく、腫瘍の集積量はMIRD法による累積放射能の測定で2000rad以上は得難かった。そこで我々は二種のモノクローナル抗体(M2590およびM562)を同時に投与し、これらの腫瘍内分布に差が無いか検討した。方法は二種の放射性ヨード(I-131およびI-125)を各々M2590およびM562に標識して同時投与し、物理的半減期の差を利用してM2590とM562の腫瘍内分布をオートラジオグラムで得た。その結果、M2590とM562は異った腫瘍内分布を呈し、これらを同時に投与すると画像診断における検出感度および治療における効果を高め得ると推定された。今後、組織化学的にM2590とM562の認識する抗原の差を同定していく予定である。
工業高等専門学校低学年における青銅鏡作りの改善

1、研究目的:一年生を対象に環境材料工学入門として、行っている青銅鏡作りの方法を改善する。(1)、錫の溶融時における酸化および、青銅鏡の結晶粒粗大化を予防する。(2)、入学したばかりの学生たちに、「合金とは何か」、「青銅鏡は、何故、銅と錫の混合比が3:1なのか」等を、視覚的に分かりやすく説明できるように工夫をする。2、研究方法:坩堝の種類を変え、鋳物砂を入れた冷却専用ステンレスパット上に数個の坩堝を配置し青銅鏡を作製する。6種類の混合比率で銅錫合金を作製し、硬さ試験及びEPMAによるX線面分析等を行う。6種類の銅錫合金は、それぞれ鏡面仕上げをして組成の違いによる色見本とする。3、研究成果(1)、黒鉛坩堝を3個、鋳物砂を入れた冷却専用ステンレスパット上に配置し3回に分けて作製することで錫の溶融時における酸化および、青銅鏡の結晶粒粗大化をほぼ予防することができた。(2)、6種類の銅錫合金の組成と硬さのグラフ及びEPMAの面分析写真(銅、錫のX線像とSEM像)を対比させたテキストを作成した。これにより、硬さは錫30%あたりが最高であるがその表面は均一ではなく、錫25%が強度と表面の美しさから青銅鏡に適しているのが分かる。また、6種類の銅錫合金のX線像(銅、錫)とSEM像から、合金は、銅と錫がすべて均一に混ざり合っているのではなく、銅の多いところと錫の多いところが混在しているのが分かる。ここでも、青銅鏡(錫25%)が最も均一に混ざり合っているため表面が比較的きれいである。これらにより、低学年の学生に、銅と錫の混合比率によって、銅錫合金の硬さや色がどの様に変化するか青銅鏡は何故、錫25%なのか実際に、目で見て理解してもらえるようになった。銅錫合金に含まれる銅や錫が、その混合比率の違いによってどのように溶け合っているか、分布状態を視覚的に見てもらうことにより「合金とは何か」分かりやすく説明できるようになった。青銅鏡(錫25%)の銅と錫が、他の銅錫合金と比較して均一に分布している状態を写真(X線像)で示すことができた。
合唱の基礎的な音楽能力を育成するアプローチ学習の開発(2)

2011年度から芸術教科の授業時数が減る。音楽科の学習内容を保障しながら,しかも合唱でも他声部に影響されない正確な音高感を子どもたちに育むために,Song approachとExercise approarchを融合させた新しいアプローチ学習を導入することが有効ではないかと考えた。2005年度の奨励研究では,ハハまでの1オクターブの音域の音高を弁別し,再生する能力は高まり,この音域に有効なカリキュラムが作成できたが,実際の教科書にある合唱曲には,ハより下のイやハより上のトの音が多く出てくるので,音域を上下3度ずつ広げた。研究に入る前後で,歌唱に対する意識調査と歌唱実態調査(を実施し比較した結果,「歌が好き」「みんなで歌うのが好き」と答える児童に変化はなかったが,「1人で歌うのが好き」な児童が,14.7%から50%に増えた。また,正確に音を再生する能力も,52.9%から61.8%と8.9ポイント上昇した。このことから,中学年期に入ってくると,いくら音が正確に再生できても,「1人で歌う」ことに抵抗を示す児童がやや増えてくる。また,なかなか音を正確に再生できない児童は,「みんなで歌う」ことで合唱に安心感があり,歌うことへの意欲は高い。しかし,合唱の初期にある中学年期の子どもたちは,音高感と歌う人数が必ずしも比例していない。
新規なオリゴチオフェン誘導体の合成,物性および光・電子機能材料への応用

本研究は、重合度・重合位置など構造を制御した新規オリゴチオフェンおよびそれらを側鎖に有する新規高分子を設計・合成し、それらの光電物性、電気化学的特性ならびに導電性をπ電子共役系の長さと相関させて解明し、光電変換材料、エレクトロクロミック材料へ応用することを目的としている。本年度は、オリゴチオフェンの共役鎖長と電導度との相関を明らかにすることを目指して、これまで研究の行われていなかった電気化学的手法に基づく塩の調製とそれらの導電性を検討した。鎖長の異なるオリゴチオフェンとしてチオフェン47量体および12量体について検討を行った。各種スペクトルおよび元素分析より、チオフェン4、6、7量体を電解酸化して得られた塩は、ラジカルカチオンのsimple salt(オリゴチオフェンと対アニオンの組成比が1:1)、チオフェン5量体の塩は、ラジカルカチオンのcomplex salt(組成比が2:l)であり、チオフェン12量体の塩は、オリゴチオフェンと対アニオンの組成比が1:2であることを同定した。チオフェン12量体の塩の電導度は、約10Scm^<-1>であり、本研究で検討したオリゴチオフェンの中で最も高い値を示した。チオフェン4、5、6、7量体から12量体へ鎖長が伸びることにより、その塩がラジカルカチオン塩から2電子酸化された塩に変わること、および電導度が38桁も高くなるという興味深い結果が得られた。本研究では、重合度・重合位置を制御したオリゴチオフェンおよびそれらを側鎖に有する新規高分子を研究対象として、それらの光・電子物性の解明と機能性材料への応用を検討した。(1)オリゴチオフェンのヨウ素酸化によって得られる塩の導電性オリゴチオフェンの分子構造と導電性との相関を明らかにすることを目的として、末端チオフェン環のα位をエチル基でキャップしたチオフェン3,4,および5量体のヨウ素蒸気による化学酸化を行い、得られる粉末の構造、電導度を検討した。得られた暗褐色粉末は、各種スペクトルより、I_3^-およびI_5^-を含むオリゴチオフェンのラジカルカチオン塩であることを同定した。その結果、オリゴチオフェンの鎖長の増加に従って、得られた塩の電導度は高くなり、チオフェン5量体の室温電導度は、4x10^<-4>Scm^<-1>であることがわかった。(2)オリゴチオフェンを側鎖に有する新規高分子の合成とエレクトロクロミック特性の検討われわれは、これまでに、チオフェン3量体および4量体を側鎖に有する新規ビニル高分子を設計・合成し、これらが優れたエレクトロクロミック材料として機能することを見いだしている。本研究では、さらに鎖長の長いオリゴチオフェン(5量体、6量体)を側鎖に有する新規ビニル高分子およびチオフェン3量体を有する新規メタクリレート高分子を合成し、それらのエレクトロクロミック特性を検討した。その結果、合成した新規高分子は、電気化学的ド-ピング・脱ド-ピングにより鮮明な色彩変化を示すことを見いだした。また、極性部位を有するメタクリレート高分子のほうが、ビニル高分子に比べ、色彩変化の応答時間が向上していることを明らかにした。
口腔粘膜癌の頸部リンパ節転移に関する細胞接着分子の免疫組織学的研究

癌の転移は、1)癌細胞の原発巣からの離脱・解離、2)間質への浸潤、3)血管内皮細胞への接着と血管内遊走、4)血管外脱出、5)転移臓器での着床・増殖といった、複雑な過程を経て成立する。本研究では、口腔扁平上皮癌42例の治療前生検組織を研究材料として、転移機構の各段階に直接関与するとされている接着分子、即ち1)E型カドヘリン、2)I型コラーゲン、3)ICAM-1およびLFA-1の発現様式を免疫組織学的に検索し、頸部リンパ節転移との関連について検討し以下の結果を得た。1.各種接着分子の発現様式;E型カドヘリンは癌細胞間に膜状の陽性反応として観察され、症例によって強い陽性反応がみられる非減弱型や反応が弱いか欠失している減弱型など違いが認められた。T3,T4の進展例では発育先進部における発現が減弱する傾向であった。I型コラーゲンは間質にび慢性に分布し、間質結合組織の増生の程度により染色程度に違いがみられた。高度浸潤癌(4C,4D)あるいは低分子癌では染色程度が弱い傾向であった。ICAM-1は間質の微小血管内皮細胞に強い陽性反応として観察され、癌細胞間に膜状に染色される症例が散見された。LFA-1は癌胞巣や血管周囲に浸潤するリンパ球に膜状の陽性反応として観察され、癌細胞間に膜状に観察される症例も散見された。2.接着分子の発現様式と頸部転移との関連;対象42例のうち、原発巣と同時に頸部廓清術を行い組織学的に転移が認められた症例は13例、後発転移をきたした症例が3例で、42例中16例がpN+(転移陽性例)であった。転移の有無と各種接着分子の発現様式との関連をみると転移陽性例16例のうちE型カドヘリンの非減弱型は2例のみであり、14例(87.5%)は減弱型であり、E型カドヘリンの減弱症例では頸部転移をきたす症例が多いことが示唆された(p<0.05)。転移陽性例ではI型コラーゲンの染色程度が有意に弱い傾向であり(p<0.05)、LFA-1やICAM-1も癌細胞に陽性所見が観察された。
超低比重リポ蛋白受容体発現と妊娠中毒症および子宮内胎児発育遅延の病態について

正常妊娠における胎盤でのリポ蛋白受容体の発現と比較し,妊娠中毒症(中毒症)及び妊娠糖尿病(GDM)症例における胎盤での発現は著しく変動を示す症例が多い.中毒症及びGDMにおける血中脂質の特徴並びに胎児胎盤系における脂質代謝について検討した.特に胎盤における超低比重リポ蛋白(VLDL)受容体mRNA及び低比重リポ蛋白(LDL)受容体mRNAの発現を測定し,それらの病態との関連について検討することを本研究の目的とした.同意を得て採取したヒト胎盤の絨毛組織を試料とした.AGPC法によりRNAを抽出し,ノザンブロット法を行った.血清脂質濃度については,従来の報告どおり,非妊娠群と比較して妊娠している症例では,血清脂質は高値であった.なかでも中毒症及びGDMでは,コレステロールの上昇と比較して,トリグリセライドの上昇が著しかった.VLDL受容体mRNAは,正常妊婦に比し,中毒症で低値,GDMで高値であった.LDL受容体mRNAは,正常妊婦,中毒症及びGDMとの間に差は認められなかった.VLDL受容体mRNAと臍帯血中TG及びVLDL濃度の間に,正常妊婦,GDMの両群において正の相関を認め,特にGDMで高い相関があった.GDMの中で児体重が3500g以上の症例では,臍帯血中TG及びVLDL濃度が高値であった.産褥1ヵ月において一部の中毒症及びGDMでは血糖値が正常化してからも,血清TG及びVLDLが高値,HDL-Cが低値であった.これらのことから,胎盤におけるVLDL受容体は児へのエネルギー源となるTGの供給という点で,重要な役割を果たしているものと考えられる.また,中毒症とGDMにおいて高脂血症が異なる機序によってもたらされている可能性がある.中毒症では,胎盤でのVLDL受容体の発現の減弱による輸送障害としての母体血清中の脂質の蓄積,GDMではインスリン抵抗性による細胞でのグルコース利用障害の代償としてTGが必要とされ,その輸送のためにVLDL代謝が亢進することによる,と考えられる.正常妊娠における胎盤でのリポ蛋白受容体の発現と比較し,妊娠中毒症(中毒症)及び妊娠糖尿病(GDM)症例における胎盤での発現は著しく変動を示す症例が多い.中毒症及びGDMにおける血中脂質の特徴並びに胎児胎盤系における脂質代謝について検討した.特に胎盤における超低比重リポ蛋白(VLDL)受容体mRNA及び低比重リポ蛋白(LDL)受容体mRNAの発現を測定し,それらの病態との関連について検討することを本研究の目的とした.同意を得て採取したヒト胎盤の絨毛組織を試料とした.AGPC法によりRNAを抽出し,ノザンブロット法を行った.血清脂質濃度については,従来の報告どおり,非妊娠群と比較して妊娠している症例では,血清脂質は高値であった.なかでも中毒症及びGDMでは,コレステロールの上昇と比較して,トリグリセライドの上昇が著しかった.VLDL受容体mRNAは,正常妊婦に比し,中毒症で低値,GDMで高値であった.LDL受容体mRNAは,正常妊婦,中毒症及びGDMとの間に差は認められなかった.VLDL受容体mRNAと臍帯血中TG及びVLDL濃度の間に,正常妊婦,GDMの両群において正の相関を認め,特にGDMで高い相関があった.GDMの中で児体重が3500g以上の症例では,臍帯血中TG及びVLDL濃度が高値であった.産褥1ヵ月において一部の中毒症及びGDMでは血糖値が正常化してからも,血清TG及びVLDLが高値,HDL-Cが低値であった.これらのことから,胎盤におけるVLDL受容体は児へのエネルギー源となるTGの供給という点で,重要な役割を果たしているものと考えられる.また,中毒症とGDMにおいて高脂血症が異なる機序によってもたらされている可能性がある.中毒症では,胎盤でのVLDL受容体の発現の減弱による輸送障害としての母体血清中の脂質の蓄積,GDMではインスリン抵抗性による細胞でのグルコース利用障害の代償としてTGが必要とされ,その輸送のためにVLDL代謝が亢進することによる,と考えられる.正常妊娠症例の胎盤、妊娠中毒症症例を重症、軽症および高血圧の有無等に分類した胎盤を当大学病院および秋田県内の各施設より採取している。各胎盤よりAGPC法によりRNAを抽出し、超低比重リポ蛋白(VLDL)受容体mRNA発現をVLDL受容体cDNA probeでNorthern HybridizationまたはRT-PCR法で検討中である。正常妊娠症例と比較し、妊娠中毒症症例ではVLDL受容体mRNA発現が減弱している傾向を認めた。妊娠中毒症症例の詳細な分類における、リポ蛋白受容体発現の増減については、現在、該当症例の検体数を増やし検討中である。また、子宮内胎児発育遅延(IUGR)症例の胎盤を採取し、妊娠中毒症および糖尿病等の合併症の有無を考慮して分類を進めている。各胎盤よりAGPC法によりRNAを抽出し、VLDL受容体等のリポ蛋白受容体発現について、Northern HybridizationまたはRT-PCR法で検討中である。asymmetricalIUGRの胎盤でVLDL受容体mRNA発現が減弱している傾向を認めた。【目的】

妊娠中毒症症例の重症度(軽症・重症),分類別(高血圧の有無など),耐糖能異常症例の胎盤ならびに子宮内胎児発育遅延症例での超低比重リポ蛋白(very low density.lipoprotein:VLDL)受容体mRNAおよび低比重リポ蛋白(low density lipoprotein:LDL)受容体mRNAの発現を詳細に検討し,病態との関連を明らかにする.妊娠週数,疾患でその発現に変動を示す胎盤のVLDL受容体の体系的研究は希であり,周産期領域での中性脂肪などの脂質代謝の新しい側面が開けることになる.【方法】ヒト胎盤のVLDLレセプター(R)mRNAおよびLDL-R mRNAの発現の定量化を行い検討した.【結果】ヒト胎盤で,VLDL-R mRNA(3.6kbおよび5.8kbの2本のバンド)およびLDL-R mRNA(5.1kbのバンド)の発現を認めた.VLDL-R mRNA/G3PDH mRNA値は,正常妊娠例と比較して妊娠糖尿病,妊娠中毒症症例では高値を示した.LDL-R mRNA/G3PDH mRNA値は,正常妊娠例と比較して妊娠糖尿病,妊娠中毒症症例では低値を示した.これらの結果より,VLDL-RおよびLDL-Rの発現が,妊娠中の脂質代謝と密接に関連し,妊娠中毒症ならびに妊娠糖尿病の病態に関与する可能性が示唆された.また,胎盤においてTGはエネルギー源として,コレステロールはステロイドホルモン産生源として利用され,これらの変化は,合目的な変化として捉えていく必要がある.現在対症療法が中心のこれらの症例に対し,脂質代謝改善薬の利用などにより,積極的な対応が可能になり得る.
磁場制御可能な形状記憶合金の系統的探索

平成15年度から平成17年度の研究期間に以下のような新しい磁場制御可能な形状記憶合金の探索を行った。上記化合物の熱及び磁気測定と結晶構造解析により、組成xが0.06と0.08の狭い組成領域の試料が熱弾性型のマルテンサイト変態を起こすことを明らかにした。従って、上記化合物は強磁性形状記憶合金の可能性がある。2.室温以上にマルテンサイト変態温度(T_M)を持ち、且つ展性に優れた強磁性形状記憶合金の探索強磁性形状記憶合金Ni-Mn-Ga合金は磁場による巨大歪特性を示す。展性の優れたNi-Mn-Ga合金を開発するため、Ni_<50+x>Mn_<12.5>Fe_<12.5>Ga_<25-x>合金の特性を調べた。Fe添加により、著しく展性が改善され、90°CにT_Mを持つ磁場制御可能な強磁性形状記憶合金を開発した。従来の強磁性形状記憶合金はマルテンサイト相、母相共に強磁性を示す。上記合金のマルテンサイト相では反強磁性あるいはフェリ磁性が現れることを明らかにした。両相の磁化の差が大きいため、マルテンサイト相において磁場を作用すると容易に母相に転移することがわかった。従って、上記合金は磁場制御可能な形状記憶合金になりうる。室温で斜方晶NiTiSi型の結晶構造を持つ3元金属間化合物MnCoGeは340Kにキュリー温度(Tc)を持つ強磁性体であるが、温度を上昇させると6方晶Ni_2In型構造に相転移を起こす。研究代表者等はこの構造相転移が無拡散型熱弾性マルテンサイト変態であることを以前に明らかにした。更に研究代表者等はMnCoGoのCoサイトに一部空孔を注入した化合物MnCo_<1-x>Ge(x〓0.08)では、Tcとマルテンサイト変態温度T_Mが逆転し、MnCo_<1-x>Ge化合物が強磁性形状記憶物質になる可能性を指摘してきた。今年度は上記化合物においてCoサイトの空孔濃度xを0.08に固定したMn_<1+δ>CO_<0.92>Geの結晶学的、磁気的特性を詳細に調べ以下の様な新たな知見を得た。1、3元化合物Mn_<1+δ>CO_<0.92>Geにおいて、δ≦0.09の組成領域の試料は強磁性状態で形状記憶効果を持つことを明らかにした。特にMn組成δの増加に伴ない、マルテンサイト変態温度が室温に接近することが分かった。2、上記化合物の精密磁化測定を行い、マルテンサイト相の磁気モーメントがオーステナイト相の磁気モーメントに比べ非常に大きいことを明らかにした。例をあげればMn_<1.07>CO_<0.92>Geのマルテンサイト相の磁気モーメントは約20%オーステナイト相の磁気モーメントより大きい。3、Mn_<1.07>CO_<0.92>Geの強磁場中X線回折実験を行ない、マルテンサイト変態温度直上で磁場誘起マルテンサイト変態を観測した。平成16年度は磁場制御可能な形状記憶合金の探索をMn-Co-Ge系以外の物質群に拡大する。更に平成15年度の実験成果を基にしてこれら化合物のマルテンサイト変態機構を理論的に解明する予定である。室温で斜方晶TiNiSi型の結晶構造を持つ3元金属間化合物MnCoGeは340Kにキュリー温度(T_c)を持つ強磁性体であるが、温度の上昇に伴いT_c以上で六方晶Ni_2In型構造に転移する。研究代表者等はこの構造相転移が無拡散型熱弾性マルテンサイト変態であることを明らかにした。

さらに研究代表者等はMnCoGeのCoサイトに一部空孔を注入したMnCo_<1-x>Ge(x〓0.08)では、T_cとマルテンサイト変態温度T_Mが逆転し、MnCo_<1-x>Ge化合物が強磁性形状記憶物質になる可能性を指摘してきた。今年度はMn_<1.07>Co_<0.92>Geに焦点を絞り、磁場誘起マルテンサイト変態の実験を行った。さらに強磁性形状記憶合金として有名なNi_2MnGaのT_cとT_Mを上昇させる目的でFe添加Ni_2MnGaの磁気および結晶学的研究も行った。研究成果は以下のとおりである。平成17年度は平成15年度、平成16年度の研究を継続しつつ、新しい磁場制御可能な形状記憶合金の系統的探索を行った。以下1、2、3は平成17年度の研究実績の概要であるが、1と2は平成15年度、16年度からの継続研究の概要であり、3は平成17年度から実施した研究実績の概要である。1.新強磁性形状記憶合金MnCO_<1-x>Geの研究上記化合物の磁気測定を行った。上記化合物に現れるマルテンサイト変態は磁性と格子歪が強く結合していることに起因し、ランダウ型の熱力学ポテンシャルを使って相転移の定性的議論を行った。2.室温以上にマルテンサイト変態温度(T_M)を持ち、且つ展性に優れた新形状記憶合金の探索従来の強磁性形状記憶合金はマルテンサイト相、母相共に強磁性を示す。上記合金のマルテンサイト相では反強磁性、フェリ磁性が現れることを磁化測定、中性子回折実験で明らかにした。両相の磁化の差が大きいため、マルテンサイト相において磁場を作用すると容易に母相に転移することがわかった。従って、上記合金は磁場制御可能な形状記憶合金になり得る。
光ファイバースコープによる水蒸気チャンバー界面のミクロ採油挙動の可視化

重質油層およびオイルサンド層からの採油増進による原油生産は,21世紀の石油資源として重要であり,熱回収法であるSAGD法は,重要な新技術と位置付けられている。本研究は,従来のSAGD法の理論を適用した数値解析結果とフィールド試験結果の相違に関して,水蒸気が凝縮するチャンバー界面部分のミクロ的な熱・物質移動現象にその原因があるものと推測し,物理実験モデルと数値解析モデルによって生産流体中に観察されるエマルションの生成メカニズムを解明し,生産特性との関連を明らかにすることを目的としたものである。光ファイバースコープを用いた油層内の水蒸気チャンバー界面での水蒸気による油の置換とエマルション生成挙動などのミクロ採油挙動の可視化を実施した結果,水蒸気チャンバー界面において水蒸気が直径0.01mm程度の微細な凝縮水滴となって凝縮し,その後に油相中へ取込まれて混合する複雑なエマルション生成現象が観察された。また,水蒸気チャンバーの段階的成長過程において,チャンバー界面においてエマルションが生成されることを,光ファイバースコープ画像と人工的なエマルション生成実験との対応から裏付けた。さらに,生産流体におけるエマルション特性を調べた結果,両坑井間のブレークスルー以後は水/油比がほぼ一定の状態で生産が継続され,水蒸気チャンバー界面におけるエマルション生成がSAGD法の水蒸気チャンバー固有の構造から生ずることを明らかにした。この実験結果に基づいて数値シミュレータSTARS用の数値モデルをintermediate3 stone1の濡れモデルを用いて構築したところ,実験結果と同様の水蒸気チャンバー界面の上方への拡大は抑制され,横方向への拡大は加速されることが確認され,油生産特性を含めた良好な数値予測結果となることがわかった。SAGD法は,重質油層およびオイルサンド層に水蒸気を圧入し,その加熱で流動しやすくなった原油を重力の作用で採収する商業生産法であるが,従来のSAGD法の理論を適用した数値解析結果とフィールド試験結果に相違があることも指摘されている。とくに水蒸気が凝縮するチャンバー界面部分のミクロ的な熱・物質移動現象と生産レートとの関係についてはまだ多くの点で未解明な部分が多い。本研究では,SAGD法の生産流体中で生成が確認されているエマルションの生成メカニズムを実験的に明確にするため、油層内部に挿入する光ファイバースコープおよび油層モデルへの取り付け機構,とくに光ファイバの耐熱性試験,水蒸気のシーリングに関する設計および油層モデルの製作および既存生産装置の改良を実施した。これを油層モデルに適用し,チャンバー界面での水蒸気の凝縮機構と油の挙動に関するデジタル画像2種の取得に成功した。さらに,油層シミュレータSTARSを用いて本実験モデルの測定結果に関するヒストリーマッチを実施し,チャンバー界面でのミクロ的現象を近似的に再現するために,3相を考慮したストーンモデルと呼ばれる濡れモデルが有効であることがわかった。なお,アサバスカオイルサンドのフィールド試験で生産されたビチューメンのエマルションの特性とくに微小水滴に対する水分量を自動水分測定装置で測定した結果数ミクロンオーダーの油中水滴型のエマルションが形成されていること,および実験で得られたエマルションと類似した特徴を有することが明らかになった。重質油層およびオイノレサンド層からの採油増進による原油生産は,21世紀の石油資源として重要である。とくに,熱回収法であるSAGD法は,水蒸気を油層に圧入加熱することで流動し易くなった原油を重力作用で採収する経済的な生産法であり,重要な新技術と位置付けられている。本研究では,従来のSAGD法の理論を適用した数値解析結果とフィールド試験結果の相違に関して,水蒸気が凝縮するチャンバー界面部分のミクロ的な熱・物質移動現象にその原因があるものと推測し,物理モデル実験と数値解析モデルによって調べた。

平成12年度においても光ファイバースコープによって生産流体中でのエマルション生成を確認したが,その解像度に問題点を残したことから,本年度導入した新たに導入した改良型光ファイバースコープを油層内部に挿入し,チャンバー界面での水蒸気の凝縮機構と油の挙動に関するデジタル画像とを取得し,サーモトレーサ画像との比較研究によってエマルションの生成メカニズムを実験的に明確した。さらに,水蒸気チャンバー界面での油生産機構を加速するため,MSSと呼ばれる界面活性剤を初期的に使用するプロセスについての実験的な検証を実施した。一方,油層シミュレータSTARSを用いて界面活性剤の流動特性に与える効果をモデル化する場合において,ストロングフォームと呼ばれる数値モデルが有効であることを明らかにした。平成12年度の研究成果は,米国石油学会発行のSPEJoumalに掲載された。また,平成13年度の研究成果は石油技術協会で発表したのほか,米国タルサ市で2002年4月に開催される採油増進に関わる国際会議IOR2002で発表予定であり,SPE JournalへもSPE75241として論文投稿された。重質油層およびオイルサンド層からの採油増進による原油生産は,21世紀の石油資源として重要であり,熱回収法であるSAGD法,とくに地表から水平坑井を掘削するサーフェイスSAGD法は重要な新技術と位置付けられている。本研究では,平成12年度および13年度において得られたファイバースコープを用いたミクロ採油挙動の可視化実験結果のまとめを行い,物理モデルを用いたエマルジョン生成の定性的把握と,生成されたエマルジョンの性状に及ぼす水蒸気圧入条件の影響及びエマルジョンの水/油比,レオロジー特性について測定し,油層の性状(特に粘性)と水蒸気圧入条件(温度、圧力、流量)間との関連性について明らかにした。また,最終的なエマルジョン生成を含めた数値シミュレーション手法に関し,粘性流の相対浸透率などのエマルジョンの特性を数値的に決定する4種の濡れモデルを数値シミュレータ「STARS」に組み込むことで数値シミュレーション結果の比較検討を実施した。この結果,従来から問題とされてきた水蒸気チャンバーの上方人の成長速度の相違に関してintermediate3 stone 1を用いることで改良できることが明らかになった。この改良した数値モデルを用いて、これまでのSAGD法に関する縮小モデルを用いた実験結果とのヒストリマッチングを実施し,改良前との比較検討を実施した。また,SAGD法の改良生産プロセスであるSAGD-ISSLW法に関する解析を実施し,その増産メカニズムに関し,ミクロ的視点から説明できることがわかった。本,研究成果は石油技術協会および米国タルサ市において開催された第13回採油増進に関わる国際会議などにおいて公表し,その内容を内外の研究者と議論した。
現代日本語の「とりたて」の範囲と成立条件に関する研究

本研究は、とりたて副詞について、「選択指定」「おもだて」「比較選択」に分類されるとりたて副詞を中心として分析・考察を行い、それぞれの表現形式がとりたて表現と解釈される条件を明らかにした。また、とりたて副詞に分類される表現形式それぞれの分類の妥当性についても指摘を行った。本研究によって、これまでとりたて助詞に比べて立ち後れていたとりたて副詞研究に一定の成果を得ることができた。本年度は、とりたて副詞に分類される形式のうち「マサニ」を中心として分析・考察を行った。マサニを類似した意味を持つと考えられるマチガイナク・タシカニ・ホントウニと比較した結果、以下の2点の特徴を明らかにした。(1)「AマサニBダ」におけるマサニは、話し手がAにあてはまるものとしてBを評価的に捉えていることを示す。(2)「AハBダ」と判断する際、タシカニ・ホントウニは、先行する文脈等に示される話し手(読み手)以外の判断内容に照らし合わせて判断しているのに対し、マサニではそのような先駆文脈は問題とされていない。また、マチガイナクには「話し手が当該の内容を評価的に捉えていることを示す」という制限はないこと、タシカニとホントウニとの違いには、後者が「AハBダ」と考える度合いが強いことが挙げられることを、併せて指摘した。さらに、マサニと総記のガ、とりたて助詞のコソとの関連についても指摘を行った。以上の成果をもとに、次年度も継続してとりたて副詞の用例の収集とその分析を行い、とりたて副詞の範囲と成立条件について明らかにしていく。本年度は、とりたて副詞に分類される形式のうち「オモニ」を中心として分析・考察を行った。まず、オモニと、同じくとりたて副詞に分類されるトクニ・コトニ・トリワケとを、とりたてられる要素である「当該要素」、それと対比される「他の要素」、それらを要素とする「前提集合」の3者の関係に注目して比較分析した結果、トクニ・コトニ・トリワケは、「当該要素も他の要素も、ともに前提を満たす(肯定される)要素として肯定的に捉えられている」ことを前提として、「当該要素が前提を満たすものとして顕著である」と捉えられているのに対して、オモニでは、他の要素も当該要素とともに「前提を満たす(肯定される)要」として捉えられているものの、「他の要素は肯定されてはいるが否定されるに等しいもの」と捉えられている点を指摘した。また、トクニの「特別に」用法とオモニの違いとして、トクニの「特別に」用法では、当該要素以外の他の要素が否定されるのに対し、オモニは「他の要素がないに等しい」が、全く否定されるわけではない点を挙げた。さらに、「概略・概括的な程度量の副詞」とオモニーとの違いについて、前者が程度量を示すものであるのに対し、後者はとりたての特徴である「当該要素と他の要素との関係」によって捉えられるものであることを指摘した。本年度は、「比較選択」のとりたて副詞及び「比較選択」のとりたて副詞に意味的に類似する表現形式について考察を行った。具体的には、ムシロとドチラカトイエバ、さらに、ムシロと類似する用法を有するとされる表現形式であるカエッテについて、それぞれの用法を比較・考察した結果、以下の点を明らかにした。(1)ムシロとドチラカトイエバを比較し、ムシロは<前提集合>の要素が「前提を満たす要素として想定されやすいか否か」という価値判断を有する要素として設定されるのに対し、ドチラカトイエバは<前提集合>の要素がニュートラルな関係で提示されるものであること、また、先行研究において「述べられる行為や状態の実現についての蓋然性に関する判断を担う」とされる「絶対」等の副詞類と意味的に近い関係を有する点を指摘した。(2)カエッテは「予想される結果-それとは逆の事態」という関連が読み取れる文脈が必要であることを確認した。これは、何らかの設定において想定され得る結果・結論のうち、「その設定から最も妥当なものとして導かれるか否か」という価値判断を含む<前提集合>であると記述できることから、カエッテがとりたて用法を有する、具体的には、何らかの設定において想定され得る結果,、結論のうち、「その設定から最も妥当なものとして導かれる結果・結論」と「その設定からは導かれないと考えられる結果・結論」から成る<前提集合>の中から、「その設定からは導かれないと考えられる結果・結論」を<当該要素>としてとりたてるものとする記述が可能であることを指摘した。以上の考察により、「比較選択」のとりたて副詞の意味とそれらと意味的に類似する表現形式との関係について一定の研究成果が得られたと考えられる。
昆虫細胞における新規遺伝子導入技術の確立

昆虫細胞における効率的な遺伝子導入法の確立を目的として、多様な昆虫由来培養細胞に線虫SID1遺伝子を導入し解析した結果、カイコPS140-SID1細胞が最も高いdsDNA取込み能を示すことを明らかにした。また、二価の金属イオンの添加については、若干の取込み能の向上が認められたが、DNAとRNAのヘテロ2重鎖やヘテロ3重鎖については、いずれも取込み能を低下させることが明らかになった。次に、dsRNA依存的なdsDNAの導入を行った所、0.05 mM以上の融合タンパク質を加えた場合に効果が認められた。また、N末端部分を加工したSID1発現細胞においてもDNAの取り込み能が上昇していた。我々は、これまで、線虫SID1遺伝子を導入したカイコ培養細胞BmN4-SID1がdsRNAのみならず、dsDNAを取込むことを報告している。そこで、昆虫細胞における効率的な遺伝子導入法の確立を目的として、多様な昆虫由来培養細胞に線虫SID1遺伝子を導入し解析した。その結果、カイコPS140-SID1細胞がBmN4よりも良好なdsDNA取込み能を示したが、カイコBm5-SID1細胞、ヨトウガSf9-SID1細胞のdsDNA取込み能は、BmN4-SID1より低く、細胞種により大きな相違があることが明らかになった。そこで、SID1遺伝子と協調して働いているSID2, 3, 4, 5遺伝子をBmN4-SID1細胞に追加導入したが、dsDNA取込み能は向上しなかった。また、核酸の取り込みに対する二価の金属イオンの影響を解析したところ、カドミウムを除く重金属は、dsRNAの取込みには影響を与えなかったが、コバルト、マグネシウム、亜鉛は、dsDNA取込み能を向上させることが明らかとなった。DNAとRNAのヘテロ2重鎖やヘテロ3重鎖については、いずれも取込み能を低下させることが明らかになったが、その過程でPCR産物がプラスミドDNAよりも高い取込みを示すことを見出した。また、BmN4-SID1において、内在の糖鎖修飾酵素FDLを阻害した場合、dsDNA取込み能が低下することを見出した。そこで、細胞の表面糖鎖を切断する酵素で処理することにより、dsDNA取込み能を向上できる可能性がある。そのために必要なPNGaseFとEndoHについてバキュロウイルスを用いたカイコ発現系を構築した。本年度は、カイコBmN4-SID1細胞をベースに効率的なDNA導入法の確立を目指して研究を進めた。主として2つのアプローチを用いたが、まず、dsRNAとdsDNAを結合できる親和性の融合タンパク質を作製し、dsRNAとdsDNAをこのタンパク質を介して結合させることにより、dsDNA取込み能の向上を試みた。RNAを結合するタンパク質としては、ラムダNタンパク質、dsDNA結合タンパク質としては古細菌由来のsso7dを用い、BoxB配列を有するdsRNAとルシフェラーゼ発現ベクターを作製した融合タンパク質を用いて結合し、BmN4-SID1細胞への導入を行った。0.05 mM以上の融合タンパク質を加えた場合に効果が認められたが、低濃度では効果が低かった。また、sso7d単独やプロタミンなどDNAを部分的に凝集させる効果を持つタンパク質についても遺伝子導入効率に与える影響を検討したが、効果は認められなかった。ついで、膜タンパク質であるSID1のN末端部分にDNA結合能を持つ短いペプチド、sso7d及びヒトLAMP2C領域を付加することによる影響を解析した。これらの融合配列を有する組換えタンパク質を発現する形質転換細胞を樹立し、ルシフェラーゼ発現プラスミドの導入を試みたところ、sso7dーSID1及び逆向きLAMP2CーSID1発現細胞においてDNAの取り込み能が上昇していた。また、これらのペプチドの付加によるdsDNA取込み能の顕著な低下は認められなかった。また、これらの細胞を用いて、長鎖DNAの取り込みについても検討した。バキュロウイルスゲノムを有する120 kbpのBacmidの導入を試みたところ、通常の方法では導入効率はかなり低かったが、細胞を培地ごとゆっくり振盪することにより、導入効率が上昇し、ウイルス粒子の産生が起こることを見出した。これまでのところ、研究は概ね順調に進行している。SID2, 3, 4, 5遺伝子の共発現やRNA/DNAヘテロ2重鎖については、遺伝子導入効率の向上効果が期待されたが、当初想定した結果は得られなかった。しかし、これらの結果から今後の研究の方向性を絞り込むことができた。また、副産物としてPCR産物が効率良く取込まれることを発見し、これが、構造に依存しているのか、DNA上の科学修飾に依存しているのか等、プラスミドDNAとの相違の原因解明に興味が持たれる。

いくつかの二価の金属イオンについては、遺伝子導入効率の向上に効果が認められたこと、また培地に添加するだけで容易であることから、他の方法との併用も考えられる。さらに、細胞表層の膜タンパク質であるSID1の機能にN-結合型糖鎖がどのように関与しているのかを解析することは興味深い。生きた細胞の表面糖鎖を改変するためには大量の酵素が必要であると予想されるが、PNGaseFとEndoHについて、カイコ発現系を構築できた。本酵素は、組換えタンパク質としての大量発現が難しい高価な酵素であることから、本研究での用途に加えて、他の利用価値も高い。昆虫分子生物学本年度は、昨年度までの研究を継続するとともに、DNAを部分的に凝集させる効果を持つタンパク質や低分子化合物について、遺伝子導入効率に与える影響を検討する。また、dsRNAとdsDNAを結合できる親和性の融合タンパク質を作製し、dsRNAとdsDNAをこのタンパク質を介して結合させることにより、dsDNA取込み能の向上を目指す。dsRNAを結合するタンパク質としては、ラムダNタンパク質、dsDNA結合タンパク質としてはsso7dを用いる予定であるが、dsRNA結合タンパク質については、新規カイコ由来タンパク質の同定を試みる。同時に、多数のカイコ糖鎖関連酵素について、それらの機能阻害細胞における遺伝子導入効率を解析する。
精子および卵子の標識による効率的な複数遺伝子変異マウスの作成法の開発

多因子疾患の病態解明や疾患関連遺伝子の相互作用を解明するために、複数の遺伝子改変マウスの交配により複数遺伝子変異マウスを作製し、複数の遺伝子間の相互作用を解析する方法が急激に普及している。ヘテロ変異マウスより、変異遺伝子を持つ精子や卵子をFACS(fluorescein activated cell sorter)および顕微鏡で選別し、体外受精あるいは顕微受精で受精させることにより、短期間に複数遺伝子ホモ変異マウスを作製する方法を確立することを目的とし、以下のことを実施した。1)FACSによる精子選別方法を検討するため、精子で特異的に発現するアクロシン結合タンパク遺伝子制御領域とGFP遺伝子の融合遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製し、ヘテロ変異マウスの精子をFACSによるソーティングを実施した。GFPの発現の有無によりソーティングは可能であったが、得られた精子の運動性や受精能力の低下が認められた。2)ソーティングの条件(希釈液、温度等)を変えることにより、体外受精と胚移植による産仔を得ること、産仔の遺伝子解析により、変異遺伝子をもつ精子がソーティングにより選別可能なことが確認された。しかし、出生率は低く、ソーティング条件の更なる改善が必要である。3)体外受精率の悪い選別精子の受精能を高めるため、顕微受精法を適用し、産仔が得られることを確認した。以上より、あらかじめ、導入遺伝子をGFPで標識することにより、変異遺伝子を持つ精子を選別することが可能であると考えられる。