hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性型Ａｌｕ検出によるゲノム動的地図の作成

平成24年度に行った実験より、Aluのサブクラスを特異的に増幅することは難しいことが分かった。サブクラス同士が非常に似た配列であり、かつグアニン・シトシン塩基の割合が多いためと思われた。PCRプライマーの設定を繰り返した。アニーリング温度を高めに設定すること、プライマーの解離温度を高めにすることを試みたが、最適な条件はいまだ決まっていない。MAC-PCR法で見つかる新規Alu配列挿入の確認のために、Achレセプター遺伝子を含む染色体領域のPCR増幅を行い成功した。増幅断片は制限酵素にて切断を行い、レファレンス配列から予想される通りの断片長を得た。将来的に、新規挿入Aluが見つかった場合には、挿入の有無をこの方法で確認することができる。新規挿入Aluとその周辺塩基配列が決定された場合には、その配列の染色体上の座位を決定し、データベースのものと比較する必要がある。Alu配列はハプロイドあたり100万個と大量にあるため、検出されるAluも多種多量となる。このデータ処理のため、コンピュータを購入し基準となるゲノムデータをダウンロードした。また、クラウドソフトのGalaxy(https://main.g2.bx.psu.edu/)を用いてデータベースからのAlu等、繰り返し配列の全ゲノム情報をダウンロードできようにした。繰り返し配列の医学的な研究は世界的にも始まったばかりである。ゲノムの4割を占める繰り返し配列の進化的な意義が今後明らかになると、疾病と繰り返し配列の関連も分かってくる。繰り返し配列の挿入による遺伝子破壊だけでなく、ゲノム全体の制御を変化させる仕組みも疾病に関わることが明らかになるであろう。今回の研究は研究者の転勤に伴い一旦終了するが、ここで得られたノウハウを用いて新規挿入Aluと疾患の関連性に関して引き続き別施設で研究を継続する予定である。平成24年度は、活性型Alu検出のための基本的実験を行った。まず、Aluサブクラスの選別のためのMACPCR法の基礎実験を行った。MACPCR法はPNAの競合により、目標以外のAluのPCR増幅を抑えるものである。「PNAによるPCR阻害」の基本的データを得た。Aluのサブクラスは、わずか1塩基の違いで分類されるためこれを識別可能な塩基配列を決定した。進化学的に若いAluYa5に特異的な配列と、古いAlu(AluS, AluJ)に特異的な配列を認識できるPNAを購入した。また、上記PNAに相補となるAluYa5、AluS、AluYbの配列の一部をDNAで作成し、PNAとの結合温度の違いを検討し、PNA-DNAのMeltingTemperatureを求めるための解離曲線を作成した。PNAとDNA断片との結合は、DNA二重鎖形成を認識するLCGreenとSyberGreenを用いて検討した。蛍光強度変化の検出のために、ABI7900を用いた。この結果、DNAーDNAの相補鎖では解離曲線はシグモイドカーブを描き、この系がDNA結合の検出に使用可能であることを確認した。次に相補となるPNAとDNAでの解離曲線を作成した。しかし、PNA-DNAではDNA-DNAとは違い、検出される蛍光強度の変化は直線状であった。これは、PNA-DNAの結合が強く、DNA二重鎖が指数関数的に解離する温度に至っても、一斉に解離するものではない可能性が示唆された。もしくは、使用した蛍光色素が、PNA-DNAの相補鎖には十分取り込まれないため蛍光強度の変化が不十分な可能性が考えられた。以上の実験より、PNAーDNAの解離する温度の予測が難しいことが分かった。今後は、PCR反応液に直接PNAを混入し特定の配列に対してのクランピング効果があるか検討することとした。

現在行っているのは、PNAによるクランピング効果を確認する実験であり、特定のサブクラスのAluが検出できるかを検討する前の予備実験の段階である。PNAによるクランピング効果が確認できないと細胞検体での特定のAluフラグメント回収に進むことができないため、現在基礎実験を進めているところである。基準となるAluサブクラス(AluS、AluY、AluYa5、AluYb)をクローニングし、プラスミドに組み込み、今後の実験の標準品とする。この基準Aluを増幅するPCRを行い、PNAの混在の有無でPCR阻害が起こせるかを検討する。これにより、PNAによる阻害の至適温度を確認する。PNAによる阻害が確立すれば、Jurkat細胞ゲノムを用いてメチル化されたAluのフラグメントを収集する。このフラグメントの内で、進化的に若く、転移能力を持つAluYa5、AluYb8をさらに濃縮し、配列決定しゲノム上の位置を確定する。これにより、(転移)活性Aluのゲノム地図を作製する。ヒト疾患検体の収集に関しては、当大学の倫理委員会の承認を得た。Jurkat細胞で確立した技術により、当該疾患における末梢白血球のAlu挿入変異の検出を行う。引き続きMACPCR法を確立し、メチル化されたAluYa5、AluYbを持つDNA断片をゲノムより回収する。まずは、Jurkat細胞ゲノムを用いて実験を行う。Jurkatゲノムを物理的に断片化し、メチル化DNA結合蛋白を用いたカラムでメチル化のある断片のみを回収する。これら断片に対し、リンカーを結合する。リンカー配列とAlu特異的配列でPCRを行い、Aluを含む断片を増幅する。この時、前述のPNAを混在させ、目的以外のAlu(AluS、AluJ)が増幅しないようにする。得られた断片を、次世代シークエンサーにより配列決定を行う。フラグメントのユニーク配列より、ゲノム上の位置を同定し、回収されたAluの座位を決定する。得られた大量のデータは、コンピューターを用いたバイオインフォマティクスにより解析する。上記研究のために、メチル化DNA結合蛋白、カラム等の検査試薬を購入する。新たに、データ解析のためのコンピュータを購入する。
アセチル化による破骨細胞形成の新しいシグナル伝達の研究

アセチル化によるosteopontin発現がどのようなシグナル伝達介するのかを検討をおこなった。未分化間葉系細胞C3H10T1/2にアセチル化を誘導するトリコスタチンAを添加し細胞より経時的にRNAを採取しNorthern blotにてosteopontin,mRNAの発現の増強を確認した。RT-PCRにてc-Fos,c-Junの発現を調べたところ0,3,6時間後c-Fos,c-Junの発現では明らかな発現の増強は認められなかった。c-Fos,c-JunのEMSAではAP1のcompetiterを用いると明らかにバンドの減少が認められ、c-Fos抗体、リン酸化したc-Jun抗体によりスーパーシフトのバンドが認められた。これらの結果からosteopontinの発現にはc-Fos,リン酸化したc-Junが関与していることを明らかとしこれを報告した(Biochem Biophys Res Commun. 2004 Mar 19;315(4):959-63)。さらに破骨細胞形成において重要なシグナル伝達分子であるRANKLのmRNAはアセチル化において発現の亢進を認めた。またアセチル化により発現の亢進が認められる分子としてcdk inhibitorであるp21が報告されているが、c-Junのシグナル伝達の阻害剤を用いた実験ではこのおいて細胞増殖抑制の変化は認められずp21の発現シグナルはc-Junとは異なる独立した伝達経路において発現が認められることが明らかとした。c-Junのリン酸化に関与する酵素としてはJDPが報告されておりアセチル化のシグナル伝達にはJDPが関与していることが考えられた。今後の検討としてOsteopontinとRANKLがどのように関与するか調べる必要があると考えている。本年度はトリコスタチンAによるオステオポンチン発現がどのようなシグナル伝達介するのかを検討をおこなった。未分化間葉系細胞C3H10T1/2にトリコスタチンA(50ng/ml)を添加し細胞より経時的にRNAを採取しNorthern blotにてオステオポンチン,RT-PCRにてRANKL mRNAの発現の増強を確認した。RT-PCRにてc-Fos, c-Junの発現を調べたところ0,3,6時間後c-Fos, c-Junの発現では明らかな発現の増強は認められなかった。c-Fos, c-JunのEMSAではAP1のcompetiterを用いると明らかにバンドの減少が認められ、c-Fos抗体、リン酸化したc-Jun抗体によりスーパーシフトのバンドが認められた。これらの結果からオステオポンチンの発現にはc-Fos,リン酸化したc-Junが関与していることがわかった。さらに。またオステオポンチンは破骨細胞においても発現が認められること、今回RANKLの発現も認められており、c-Fosが過去の論文においては破骨細胞においての高進で認められることを考えると、我々が研究しているアセチル化に関するシグナル伝達は破骨細胞形成に関与すると考えており、今後破骨細胞形成過程においてRANK, RANKLなど他のサイトカインがどのように関与するか調べる必要があると考えている。
ロンドン五輪報道をめぐる国際ニュース・フレームの分析：北京五輪との比較から

本研究の目的は2つある。第1に、日本のテレビニュース番組がロンドン五輪開催期間にどのようにニュースを報道したのかを内容分析することである。第2に、その分析結果と北京五輪開催期間における同様の内容分析の結果を比較することである。ロンドン五輪開催期間のニュース報道の内容分析結果は、2014年度武蔵社会学会で報告した。また、『ソシオロジスト』No.17に論文として発表した。2つの五輪開催期間のニュース報道の内容分析結果の比較に関する考察は、EASM2015で報告した。これら2つの研究目的の達成を通じて、日本のテレビニュース番組における国際報道のニュース・フレームについての知見を得た。第2に、その分析結果と2008年に実施した北京五輪開催期間における内容分析の結果を比較することである。これらの2つの研究目的の達成を通じて、日本のキー局が提供する代表的なニュース番組に内在する国際報道のニュース・フレームを明らかにする。上記の目的達成のため、今年度はロンドン五輪開催期間に日本のキー局が提供する代表的なニュース番組が報道したニュースのコーディングに取り組んだ。分析の対象となるニュース番組は、「NHKニュース7(NHK)」「NEWS ZERO(日本テレビ)」「NEWS23X(TBS)」「NEWS Japan+すぽると!(フジテレビ)」「報道ステーション(テレビ朝日)」の5番組である。これら5番組が、五輪開会式4日前の2012年7月24日から五輪閉会式4日後の2012年8月16日までの計24日間に報道したすべてのニュースを対象としてコーディングを実施した。コーディングにあたっては、国際テレビニュース研究会がこれまで開発・改良を重ねてきたテレビニュースの内容分析の手法を用いた。具体的には、ニュース番組を視聴しつつ、ニュースをニュース項目ごとに分類し、ニュースの「映像内容」、「開始・終了時間」、「タイトルテロップ」「関係地域」、「分野」「英国(人)への言及・発言および映像」についてコーディングシートに記入していった。コーディングは共同研究者および十分に訓練を積んだコーダーが実施した。その結果、対象となるすべてのニュース番組、すべての対象期間のニュースのコーディングが完了した。以上が、平成25年度に実施した研究の成果である。上記の目的達成のため、今年度は昨年度にコーディングしたデータを元にして、量的および質的な分析を加えた。第1の目的である日本のテレビニュース番組がロンドン五輪開催期間にどのようにニュースを報道したのかについては、2014年度武蔵社会学会にて「ロンドンオリンピックのテレビニュース報道に関する内容分析」のタイトルで研究発表した(於武蔵大学、2014年7月19日)。また、研究論文「ロンドンオリンピック開催期間における日本のテレビニュース報道に関する内容分析」を執筆し、『ソシオロジスト』No.17に掲載された(2015年3月)。以上をもって、その目的は達成された。第2の目的である2008年に実施した北京五輪開催期間における内容分析の結果の比較については、第1の研究成果を含めて2015年4月に研究報告書というかたちで刊行される運びとなっている。また、EASM(European Association for Sport Management)の2015年度大会に発表申込が受理され、2015年9月に発表する予定である。以上が、2014年度の研究成果である。本研究の目的は2つあった。これらの2つの研究目的の達成を通じて、日本のキー局が提供する代表的なニュース番組に内在する国際報道のニュース・フレームを明らかにすることを試みた。第1の目的については、2014年度武蔵社会学会にて「ロンドンオリンピックのテレビニュース報道に関する内容分析」のタイトルで研究発表した(於武蔵大学、2014年7月19日)。また、研究論文「ロンドンオリンピック開催期間における日本のテレビニュース報道に関する内容分析」を執筆し、『ソシオロジスト』No.17にて発表した(2015年3月)。コーディングしたデータに対する内容分析は計画通りに実施され、必要十分の結果を得た。

したがって、おおむね順調に進展しているといえる。ジャーナリズム本研究の内容分析の結果をまとめた研究報告書を、2015年4月に刊行する予定である。また、EASM(European Association for Sport Management)の2015年度大会にて、2015年9月に発表する予定である。本件に関しては、2015年4月に発表申込が受理されている。さらに、共同研究者の専門領域にしたがってナショナリズム、エスニック、ジェンダーといった点から五輪報道にさらなる分析を加えて、各自がそれらに関する論文を執筆することを予定している。コーディングは計画通りに実施され、必要十分の結果を得た。研究が順調に進行したため、平成27年度に使用予定だった海外雑誌へ論文投稿するための英文校閲費を平成26年度中に使用する可能性が出てきた。その可能性に対処すべく、平成27年度分助成金から前倒し支払を請求して、英文校閲費分として準備した。しかし、英文校閲費を平成26年度中に使用することはなかったため、その分が次年度使用額として生じた。コーディングしたデータに統計的処理を施して、量的分析を行う。これを基本データとして、ロンドン五輪報道の傾向を抽出する。そして、量的分析で得られた結果を前提にして質的分析に取り組む。具体的には、共同研究者各自の専門領域にしたがってテレビ・ジャーナリズム、スポーツ・ジャーナリズム、ナショナリズム、エスニック、ジェンダー、客観報道、映像といった点から五輪報道に着目して質的分析を加える。これらの分析結果をもとに論文を執筆、または学会で発表する。平成27年度、当該助成金は当初の目的通り海外雑誌へ論文投稿するための英文校閲費として活用する予定である。昨年度の科学研究費補助金の主な使途は、平成25年度研究実施計画のうち「ニュース番組のコーディングの実施」に係る人件費であった。「コーディング」という作業は、統計処理を施して集計・分析する以前の、第一次的なデータ収集作業となり、本研究の基幹となる作業であるため、配分された研究費の予算の大部分は、人件費として計上されていた。そして、使用した研究費補助金は、予算配分に従い、全てを人件費として使用した。しかしながら、トレーニングを十分に受けた学生が、作業内容に習熟し、かつ内容をよく理解した上で効率的に作業を進めるなどしたため、計画よりも若干早い作業期間内でコーディングを終了できた。また、予算には郵送費などが若干、別途措置がなされていたが、定期的に研究会を開催するなど、研究協力者同士の会合も十分に行われており、こうした使途が発生しなかった。これが次年度使用額が生じた理由である。本科学研究費補助金の平成26年度研究実施計画では、過去の調査研究との量的・質的な比較検討や共同研究者の専門領域にしたがった検討・考察作業が中心となっている。
室内空気質分布と人体経気道暴露濃度の数値予測モデルの深化と汎化（国際共同研究強化）

室内環境中に存在する各種のガス状・粒子状汚染物質による経気道暴露の予測や制御,もしくは,鼻腔を含む人体呼吸器系を利用した薬物送達システムDDS(Drug Delivery System)の開発を推進するためには,鼻腔から気管・気管支内の速度場・温度場・湿度場・汚染物質輸送現象,即ち気道内の流体工学的な基礎情報の把握が重要な課題である.実人体を用いた被験者実験や動物実験は倫理的側面でその実施には非常に大きな制約があるため,その代替となる数値解析モデルの開発が強く求められている.本研究は,豪州RMIT大学のTu教授ならびにInthavong准教授と国際共同研究を推進することで,実人体を用いた試験(in vivo)に代替可能な数値気道モデル(in silico Airway)の開発を行った.ヒトを対象としたモデルとして,二種類のヒト数値気道モデルを作成した.また,経気道暴露試験で汎用的に使用される実験動物であるラット,イヌ,サルのほ乳類を対象とした数値気道モデルも作詞,動物実験や模擬実験(in vitro)の代替法となる普遍的な数値解析モデルの構築を目指して,生理的薬物動態モデルを統合した新たな数値気道モデルを作成した.また,本研究ではヒトとサルの気道を対象として,複雑形状の鼻腔を含む気道内の速度場・粒子拡散場を高空間・高時間分解能で3次元可視化計測する技術の開発にも取り組み,in vitro実験も併用することで,数値解析検証用となる高精度の流れ場データの整備も行った.内定年度:2015豪州RMIT大学への渡航は2018年2月から1年間を予定している.RMIT大学の共同研究者であるTu教授ならびにInthavong博士とは電子メール,Skype等を利用して,呼吸器系を再現した数値人体モデル開発,サロゲート動物の数値気道モデル開発に関する共同研究を着実に推進した.当初の計画通り,渡航は研究年度の3年目の一年間を予定している.電子メール,Skype等を利用した共同研究は滞りなく進めており,特に問題は無い.室内環境中に存在する各種のガス状・粒子状汚染物質による経気道暴露の予測や制御,もしくは,鼻腔を含む人体呼吸器系を利用した薬物送達システムDDS(Drug Delivery System)の開発を進める上で,鼻腔から気管・気管支内の速度場・温度場・湿度場・汚染物質輸送現象,即ち気道内の流体工学的な基礎情報の把握が重要な課題となっている.本研究は,実人体を用いた試験(in vivo)に代替可能な数値気道モデル(in silico Airway)の開発を目指すものである.特に経気道暴露試験で汎用的に使用される実験動物であるラット,イヌ,サル,人間の各数値気道モデルを開発することで,動物実験や模擬実験(in vitro)の代替法となりうる普遍的な数値解析モデルの構築を目指すものである.豪州RMIT大学の共同研究者であるProf. TuならびにDr InthavongとはWEB会議システムを用いて定期的な情報交換を行うと共に,ラット,イヌの気道モデルデータを共有することで数値解析のQuality Controlに関して合理的な共同研究実施の方法を議論している.また,アカゲザルモデルに関してはSTLデータの共有による三次元モデル構築精度の相互比較を行うと共に,PIVによるサル上気道内流れの高精度計測法に関して情報交換を行いながら,実験を推進している.平成29年度は,具体的に渡航による共同研究実施の第一弾として,2018年2月3日より2月14日に豪州メルボルンのRMIT大学に滞在し,共同研究者であるProf. TuならびにDr Inthavongと国際会議COBEE 2018を共同開催した.また,2018年4月からの本格的な渡航による共同研究推進のため,現地で実験設備の準備と計算モデルの整理を入念に行った.本格渡航は研究最終年度(3年目)に計画しており,その渡航に向けた入念な下準備を行うと共に,豪州RMIT大学の共同研究者と共に豪州で国際会議を共同開催した.当初の研究計画を大きく変更すること無く研究を進めている.室内環境中に存在する各種のガス状・粒子状汚染物質による経気道暴露の予測や制御,もしくは,鼻腔を含む人体呼吸器系を利用した薬物送達システムDDS(Drug Delivery System)の開発を推進するためには,鼻腔から気管・気管支内の速度場・温度場・湿度場・汚染物質輸送現象,即ち気道内の流体工学的な基礎情報の把握が重要な課題である.実人体を用いた被験者実験や動物実験は倫理的側面でその実施には非常に大きな制約があるため,その代替となる数値解析モデルの開発が強く求められている.本研究は,豪州RMIT大学のTu教授ならびにInthavong准教授と国際共同研究を推進することで,実人体を用いた試験(in vivo)に代替可能な数値気道モデル(in silico Airway)の開発を行った.ヒトを対象としたモデルとして,二種類のヒト数値気道モデルを作成した.また,経気道暴露試験で汎用的に使用される実験動物であるラット,イヌ,サルのほ乳類を対象とした数値気道モデルも作詞,動物実験や模擬実験(in vitro)の代替法となる普遍的な数値解析モデルの構築を目指して,生理的薬物動態モデルを統合した新たな数値気道モデルを作成した.

また,本研究ではヒトとサルの気道を対象として,複雑形状の鼻腔を含む気道内の速度場・粒子拡散場を高空間・高時間分解能で3次元可視化計測する技術の開発にも取り組み,in vitro実験も併用することで,数値解析検証用となる高精度の流れ場データの整備も行った.研究計画に従い,着実に研究を推進する.研究の最終年度であるH30年度は,一年間のRMIT大学滞在によりJiyuan Tu教授,Kiao Inthavong博士の研究グループと数値気道モデル開発で共同研究を推進する.具体的課題は下の3点である.課題(1):実人体のCT (コンピュータ断層撮影)データを用いた数値気道モデルの作成課題(2):ラット,ビーグル犬,カニクイザルのCTデータを用いた数値気道モデルの作成課題(3):数値気道モデル内の流れ場・汚染物質拡散場解析結果の検証用高精度実験データの計測上記課題(1)では,性別や年齢別に複数の実人体CTデータを用意し,複数の数値気道モデルを作製し,作成した数値気道モデルと計算流体力学CFD (Computational Fluid Dynamics)を連成させて気道モデル内の速度場・温度場・湿度場・汚染物質濃度場の詳細解析を行う.課題(2)では,経気道暴露試験に利用される実験動物を対象として数値気道モデルを作製する.ラット,ビーグル犬,カニクイザルを対象として数値気道モデルを作製し,その流体工学的特徴を定量的に明らかにした上で,人体の気道モデルとの相対的差違を整理する.ラットから人間まで,経気道暴露試験で対象となりうる哺乳類を全てカバーすることで,in vivo試験の代用となりうる数値気道モデル(in silicoサロゲートモデル)を整備する.課題(3)ではラット,イヌ,サル,人間の4種の数値気道モデル幾何形状データを基に3Dプリンタにて透明アクリル製の気道モデルを作製する.その上で,粒子画像流速計測法PIV (Particle Image Velocimetry),粒子像追跡流速計PTV (Particle Tracking Velocimetry)を併用して複雑幾何形状である気道モデル内の流れ場,微粒子拡散性状を定量的に計測する手法を確立する.
有明海の環境変化が漁業資源に及ぼす影響に関する総合研究

17年度には分担課題相互の連携を強化し、これまでの研究成果の総合的なとりまとめを行った。研究期間に得られた成果の大要は以下の通りである。(1)潮流のシミュレーションにより、有明海奥部の干潟干拓に伴う地形変化が潮流速を減少させ1970年代に富栄養化を急速に進行させた可能性が高いことを明らかにした。また、最近年の透明度の上昇は主に海底泥の巻き上げ量の減少に起因し、それが赤潮の発生頻度を増加させる要因となっていることを指摘した。(2)魚類の漁獲量は1990年代とくにその後半に減少が著しいこと、それは幼稚仔期の生息場の減少に加えて貧酸素化の拡大など底層環境悪化の影響を受けている可能性が高いことを指摘した。また、最近のエイ類の増加は二枚貝に対する捕食圧を増加させ、底棲魚類との餌をめぐる競合関係を強めていることが分かった。(3)炭素・窒素安定同位体比の分析により、白川河口干潟では二枚貝を含む干潟動物が主に海洋起源の植物プランクトンを栄養源としていることなど干潟生態系の栄養構造について新たな知見を得た。また、砂泥の堆積・浸食の季節的な動態が二枚貝個体群の生息基盤を不安定化しその変動に関与していることを指摘した。(4)鉛直成層の時空間的な変動が生物生産に大きな影響を及ぼしていること、人工衛星の海色画像が赤潮や浮泥のモニタリングに有効であること、環境ホルモン物質による干潟底泥の汚染が一部で進行し始めていることを明らかにした。(5)物質循環システムの変化として以上を総合し、1960年頃までの有明海は浮遊系と干潟を含む底棲系の物質循環が適度なバランスを保っていたのに対して、最近年は「干潟の減少による底棲系の衰退」とそれに伴う「浮遊系の物質循環を阻害する有害プランクトン種の優占化」が急速に進行していることを指摘した。成果を関連学会等で公表するとともに、干潟の環境変化や環境ホルモン汚染について有明海と共通する問題をかかえる韓国等と共同シンポジウムを開催し、研究の国際展開をはかる基盤を築いた。有明海の環境や低次生産、漁業資源生産などの時系列変化とその要因に関する資料解析と現場調査を分担して進めた。研究実績の大要は以下の通りである。(1)1990年代(とくにその後半)に透明度が上昇傾向にあること、高塩分水の分布パターンや外海水との交換の大きさにはそれに対応する傾向的な変化はみられず、それは有明海内の環境変化に起因する可能性が高いことが分かった。(2)堆積物コアに含まれる渦鞭毛藻シスト群集の組成変化について分析した結果、1980年代半ばから富栄養化が急速に進行し始め、1990年代後半にそれがさらに顕著になったことが示唆された。(3)2001年3月から毎月1回継続しているプランクトン調査と海色人工衛星画像の解析により、クロロフィルa濃度の季節変動パターンや2000年12月2001年3月にノリ養殖に大きな被害を与えた赤潮の発生から消滅に至る一連の過程を明らかにした。(4)二枚貝を著しく減少させた要因の一つとして、スナモグリ類など埋在性の大型ベントスについてバイオマスの推定を試み、干潟面にできる巣穴の中に稚貝がトラップされ死亡する可能性について現場調査と実験を開始した。(5)漁業生物の組成と数量変動の実態を海域別に検討した。

その結果、湾奥部は稚魚主体の魚種が多く生息し成育場として重要であること、豊富な餌生物量がその要因であること、湾奥で産卵するコイチなど一部の魚種で再生産のパターンに大きな変化が生じていることが分かった。また、タイラギの大量斃死の原因に関連して、その着底稚貝の低酸素耐性に地域差があることを実験的に明らかにした。(6)海藻の分布と現存量について過去との比較を行い、局所的なものを除けば目立った変化はないことを確認した。また、ノリ・ワカメ養殖生産の実況を分析した。(7)環境ホルモン物質(とくに環境エストロジェン)と重金属による汚染状況を把握するため、その測定の準備を進め、湾奥の河口域で分析用のボラと底泥を採取した。有明海の環境や低次生産の短期変動について現場調査を継続するとともに、漁業資源生物を含めた中長期の変動実態について解析を進めた。主要な研究実績は以下の通りである。(1)最近年の透明度の上昇について、その場所や季節による変動特性を分析し、懸濁物の供給量や底泥の巻き上げ量の減少が関係していることを指摘した。(2)継続的な海洋構造とプランクトンの調査、水温・流速・濁度・クロロフィル濃度の連続測定により、降水量の変化(河川水量の変化)や大潮・小潮周期の鉛直成層の変化が一次生産に大きな影響を及ぼすことが分かった。(3)諌早湾の潮受け堤防完成後に渦鞭毛藻やラフィド藻の赤潮発生頻度が増加していること、それは流速低下と底層の貧酸素化に起因することを指摘した。(4)複数の堆積物柱状試料について渦鞭毛藻シストの数と組成を分析し、諌早湾では1970年代に富栄養化が始まり、1980年代にそれが急速に進行したことを明らかにした。(5)河口干潟におけるアサリの分布はニホンスナモグリの加害作用の影響を受け低潮帯に限定されること、その一方でシオフキガイにはそのような対応が見られず、それはスナモグリ類の巣穴に捕捉された稚貝の浮力や干潟表面への復帰速度の違いに由来する可能性があることを指摘した。(6)過去に比べて紅藻と緑藻の種類数やアマモの分布量が増加傾向にあること、ノリの生長はアオサに比べて高濃度の栄養塩を必要とすることが分かった。(7)トビハゼの飼育実験やボラの生殖腺の分析結果から、大牟田川河口の底泥に環境ホルモン作用を示す物質が相当量含まれている可能性があることが分かった。(8)魚類相や定置網漁獲物組成の時系列変化などについてもデータ収集と解析を進め、優占するいくつかの魚種について、年齢・成長・再生産・生活史を明らかにした。なお、平成14年9月にこれまでの研究成果を中間報告するためシンポジウムを開催し、その内容を月刊海洋の特集号として刊行した。有明海の環境や低次生産について現場調査を継続するとともに、漁業資源生物を含めた中・長期的な変動とその要因について検討を進めた。主な研究実績は以下の通りである。(1)これまでデータが少ない小潮期の海洋構造の大潮期との違いを明らかにした。また、連続測定の結果から、クロロフィル蛍光の変動に冬季には潮汐周期、夏季には降雨による数日周期と生理活性による日周変動が卓越することを示した。(2)貝類が生息する海底直上の溶存酸素濃度(DO)を実測し、海底上50cm1mよりもさらに夏季のDO低下が顕著であることを示した。(3)プランクトン調査(20012003年)により、年間を通して最も重要な基礎生産者は中心目珪藻であること、微小プランクトン生物量のネット動物プランクトンに対する比率が大きくなる場合がしばしば見られ、それは資源生産の低下や海底付近の低酸素化と関連する可能性があることを指摘した。
環境保全と生産性に優れた有機メッキ処理金属とゴムの直接接着技術の実用化

本研究では,トリアジンチオール化合物(RTDN)による有機めっき処理金属とゴムとの直接架橋接着技術を提案し,ゴム架橋系に影響されず,しかも,金属上に黄銅や亜鉛めっき処理の必要がない新規な直接架橋接着技術を研究することを目的としている。まず,6-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールモノナトリウム塩(DAN)により有機めっき処理をした金属(スチール・マグネシウム合金)とアクリルゴム(ACM)・過酸化物架橋系(EPDM)・硫黄架橋(NBR)の直接架橋接着性を検討した結果,以下のことが明らかになった。(1)有機めっき処理により,金属表面上に三次元構造を持つトリアジンチオール被膜を形成させることができる。(2)接着物のはく離強度は、被膜の厚さ・処理溶液成分・成分量・有機めっき処理条件に依存される。(3)ゴム架橋剤の配合(ゴム補強剤・軟化剤・架橋剤)が・接着物のはく離強度に影響し、架橋剤の配合量はお互いに強い相関関係を示し、良好な接着性を得るためには、それぞれ最適な配合量が必要である。(4)接着物の耐熱性・耐油性・耐水性・耐湿性は非常に優れている。良好な直接架橋接着性を得るための有機めっき被膜の構造としては,(1)有機めっき被膜と金属基板が界面化学結合していること,(2)有機めっき被膜とゴムが界面化学結合していること(3)十分な被膜凝集強度を保持していることの3条件が必要であることが明らかになった。ゴムと金属の接着において、接着剤を使用しない直接接着は地球温暖化、作業者の健康衛生及び作業環境等の観点から重要である。さらに本法はコストパーホーマンスに優れており、高い競争力を持つ技術である。平成12年度(初年度)はリサイクルの観点から鋳鉄とマグネシウム合金を、また不腐食金属であるスレンレスを選び、SBR,アクリルゴム、及びEPDMとの接着を試みた。6-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールを鋳鉄に有機メッキし、これにSBR配合物を接触させて、加熱プレス化すると容易に高い接着力を有する鋳鉄-SBR接着物が得られた。これは現在、自動車エンジンのマウントに応用すべく、関連会社に紹介して評価を依頼している。1,3,5-トリアジン-2,4,6-トリチオールにより有機メッキしたステンレスとアクリルゴム配合物を160°C、6分間直接架橋接着し、高い接着強度の接着物を得た。これはバイクの防振ゴムへの展開を地元企業に依頼し評価をしている。6-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールによるマグネシウム合金の有機メッキ条件を詳細に検討し、マグネシウム合金が腐食しないで有機メッキできる条件を精査を行い、マグネシウム合金の有機メッキが可能になった。6-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールによる有機メッキ処理マグネシウム合金とEPDMの直接架橋接着を行い高い接着強度を有する接着物を得た。この接着物の用途については関連企業を通じて紹介している。まず,6-ジアリルアミノ-1,3,5-トリアジン-2,4-ジチオールモノナトリウム塩(DAN)により有機めっき処理をした金属(スチール・マグネシウム合金)とアクリルゴム(ACM)・過酸化物架橋系(EPDM)

・硫黄架橋(NBR)の直接架橋接着性を検討した結果,以下のことが明らかになった。(1)有機めっき処理により,金属表面上に三次元構造を持つトリアジンチオール被膜を形成させることができる。(2)接着物のはく離強度は、被膜の厚さ・処理溶液成分・成分量・有機めっき処理条件に依存される。(3)ゴム架橋剤の配合(ゴム補強剤・軟化剤・架橋剤)が、接着物のはく離強度に影響し、架橋剤の配合量はお互いに強い相関関係を示し、良好な接着性を得るためには、それぞれ最適な配合量が必要である。(4)接着物の耐熱性・耐油性・耐水性・耐湿性は非常に優れている。良好な直接架橋接着性を得るための有機めっき被膜の構造としては,(1)有機めっき被膜と金属基板が界面化学結合していること,(2)有機めっき被膜とゴムが界面化学結合していること(3)十分な被膜凝集強度を保持していることの3条件が必要であることが明らかになった。
水産物由来カロテノイドの酵素的非対称解裂とその産物の生体調整機能発現作用機構

水産物由来カロテノイドがβ-カロテン-9', 10'-モノオキシゲナーゼ(CMO2)よって代謝されるのではないかと考え、これを検証するため、(1)マウスの肝臓ホモジネートを用いた検討、(2)組み換えCMO2を用いた検討、(3)CMO2発現細胞を用いた検討を行った。しかし、マウス肝臓ホモジネート中に活性を見出すことはできなかった。酵素活性を有するCMO2リコンビナントタンパク質を作成することができなかった。またヒト乳癌細胞株であるMDA-MB-231はCMO2を発現していることが知られていたため、in situでの酵素活性の測定を試みたが、CMO2代謝産物の細胞内での蓄積は認められなかった。食品機能性成分として水産物由来カロテノイドが注目され、その生理機能と機能性発現メカニズムが精力的に研究されている。しかし、カロテノイド分子の直接の作用点については、まだ明らかになっていない。そこで、β-カロテン-9', 10'-モノオキシゲナーゼ(CMO2)に注目し、CMO2によるカロテノイドの代謝産物が、各種核内レセプターを介して遺伝子発現に影響を与えるという仮説を立て、これを証明することを目的とした。前年度、各種培養細胞におけるCMO2のmRNA発現量をRT-PCR法を用いて調べたところ、ヒト乳癌由来細胞株MDA-MB-231細胞など、いくつかのガン細胞において発現が確認できた。そこで今年度は、MDA-MB-231細胞をカロテノイド含有培地中で培養し、細胞内カロテノイド組成をLC-MSを用いて解析した。しかしながらCMO2による代謝産物は見出されず、MDA-MB-231細胞内ではCMO2はカロテノイドの開裂酵素としての機能を発現しない可能性が考えられた。本研究では、水産物由来カロテノイドの代謝産物を得ることは難しく、カロテノイドの機能性発現に対するCMO2の寄与を調べるためには、RNAiの手法を用いたCMO2のノックダウン実験などを行う必要があると考えられる。水産物由来のカロテノイドがヒトにおける生理機能性成分として大きな注目を浴びている。カロテノイドの機能性発現機構として、遺伝子発現やシグナル伝達への影響が報告されているが、生体におけるカロテノイド分子の直接の作用点は全く不明である。水産カロテノイドの機能を広く安全に利用していくためには、本作用点の解明が喫緊の課題である。本研究では、最近発見されたβーカロテン-9',10'-モノオキシゲナーゼ(CMO2)が水産カロテノイドを分解し、その産物が各種核内レセプターのリガンドになり、遺伝子発現に影響を与えるという仮説をたて、それを証明することを目的とした。本年度はCMO2の酵素源となる生体試料を探索した。マウスの肝臓ホモジネートおよびそのミトコンドリア画分からはCMO2活性を見出すことは出来なかった。そこで、リコンビナントタンパク質の作成を試みた。カイコ杯由来Ke17細胞に、バキュロウイルス由来発現ベクターを用いて遺伝子導入したところ、CMO2タンパク質の発現が確認できた。しかしながら発現量が微量であるため、活性を確認することができなかった。また、培養細胞株におけるCMO2発現をRT-PCR法によって調べたところ、結腸がん由来DLD-1細胞に発現していることを確認し、さらに過酸化水素処理により、約二倍に発現量が上昇することが分かった。その他の培養細胞株として、乳がん由来MDA-MB-231細胞でも比較的発現量が高いことを確認した。今後、これらの培養細胞およびリコンビナントタンパク質を用いて検討を進める。βーカロテン-9',10'-モノオキシゲナーゼ(CMO2)の調製源として、当初マウス肝臓ホモジネートを用いていた。しかし、調製は不首尾に終わり、調製源を変更した。このため、やや遅れている。βーカロテン-9',10'-モノオキシゲナーゼ(CMO2)の酵素源として、マウスの肝臓ホモジネートが適切と考えていたが、調製できなかった。そのため、他の手法を検討した。その結果、リコンビナントタンパク質およびいくつかの培養細胞での発現を確認した。発現を高める条件も見いだした。一方、計画進行に必要な各種カロテノイドについては、シフォナキサンチン、ネオキサンチン、ビオラキサンチンをはじめ、市販されていない特殊なカロテノイドを含めて、実験に必要な量の調製はできている。したがって、今後はこれらの酵素源を使用して当初の計画を遂行する予定である。すなわち、各種水産カロテノイドに対するCMO2の基質特異性、反応生成物の解析をまず尾来なう。ついで、反応生成物の核内受容体に対するアゴニストあるいはアンタゴニスト活性を調べる。さらに、生成物の各種機能性を調べる。

特にアポトーシスに関与する因子やシグナル伝達経路、血管新生、脂肪細胞分化に対する影響をターゲットとする。現時点では動物実験も予定しているが、当初予定よりやや遅れ気味であるので、今後の進展状況により判断したい。次年度は細胞実験を多数行うため、培養に必要な培地類、また遺伝子発現の解析のために必要な分析試薬等の購入に比較的高額の研究費が必要である。また、機能性解析のためには、IL-8などの炎症性因子やVEGFなどの血管新生促進因子、SP-1などの血管新生抑制因子等々、各種サイトカイン類などもきわめて高額であり、これらの購入に本研究費を当てる必要がある。
オピオイド受容体による血液脳関門透過性の調節に関する研究

血液脳関門(BBB)透過性を調べるために,マウスにフルオレセインナトリウム(NaFl)40mg/kgを静注し, 30分後に脳潅流を行い,脳内NaFl濃度を測定した.これに対するモルヒネおよび他のオピオイド化合物の効果を調べた.〔結果〕1.塩酸モルヒネ(0.3-10mg/kg, SC)をNaFl静注20分前に投与すると用量依存的に脳内NaFl量が増加した.この作用はモルヒネ投与20分後で最高となり, 4時間後まで続いた.また,血中NaFl濃度は変化しなかった.2.このモルヒネのBBB透過性亢進作用はナロキソンの少量によって有意に抑制された.3.ブプレノルフィン0.5mg/kg.S.C.はモルヒネ5mg/kg.S.C.に匹敵する効果を示したが,ペンタゾシンは50mg/kgの大量においても有意な効果を示さなかった.血液のpHは,モルヒネ10mg/kgおよびペンタゾシン50mg/kgの投与により有意に低下したが,ブプレノルフェン0.5mg/kgは有意な影響を及ぼさなかった.4.μアゴニスの〔D-Ala^2-MePhe^4-Gly(ol)^5〕enkephalin 0.1μg,脳室内投与(i.c.v.)はモルヒネ10mg/kgと同程度にBBB透過性を亢進したが, KアゴニストのエチルケタゾシンおよびU-50488H, Sアゴニストの〔D-Thr^2-Leu^5〕enkephalin-Thr σアゴニストのSKF-10047は有意な効果を示さなかった.〔D-Ala^2, D-Leu^5〕enkephalin 0.5μg i.c.v.は著明なBBB透過性亢進を示したが,この作用はδアンタブニストのTCT-174864では拮抗されず,ナロキソンで拮抗された.〔結論〕以上の結果より,モルヒネ,ブプレノルフィン, (D-Ala^2-MaPlie^4-Gy(ol)^5)enkephalinは脳内μオピオイド受容体を刺激して, NaFlに対するBBB透過性を亢進することが明らかである.血液脳関門(BBB)透過性を調べるために,マウスにフルオレセインナトリウム(NaFl)40mg/kgを静注し, 30分後に脳潅流を行い,脳内NaFl濃度を測定した.これに対するモルヒネおよび他のオピオイド化合物の効果を調べた.〔結果〕1.塩酸モルヒネ(0.3-10mg/kg, SC)をNaFl静注20分前に投与すると用量依存的に脳内NaFl量が増加した.この作用はモルヒネ投与20分後で最高となり, 4時間後まで続いた.また,血中NaFl濃度は変化しなかった.2.このモルヒネのBBB透過性亢進作用はナロキソンの少量によって有意に抑制された.3.ブプレノルフィン0.5mg/kg.S.C.はモルヒネ5mg/kg.S.C.に匹敵する効果を示したが,ペンタゾシンは50mg/kgの大量においても有意な効果を示さなかった.血液のpHは,モルヒネ10mg/kgおよびペンタゾシン50mg/kgの投与により有意に低下したが,ブプレノルフェン0.5mg/kgは有意な影響を及ぼさなかった.4.μアゴニスの〔D-Ala^2-MePhe^4-Gly(ol)^5〕enkephalin 0.1μg,脳室内投与(i.c.v.)はモルヒネ10mg/kgと同程度にBBB透過性を亢進したが, KアゴニストのエチルケタゾシンおよびU-50488H, Sアゴニストの〔D-Thr^2-Leu^5〕enkephalin-Thr σアゴニストのSKF-10047は有意な効果を示さなかった.〔D-Ala^2, D-Leu^5〕enkephalin 0.5μg i.c.v.は著明なBBB透過性亢進を示したが,この作用はδアンタブニストのTCT-174864では拮抗されず,ナロキソンで拮抗された.〔結論〕以上の結果より,モルヒネ,ブプレノルフィン, (D-Ala^2-MaPlie^4-Gy(ol)^5)enkephalinは脳内μオピオイド受容体を刺激して, NaFlに対するBBB透過性を亢進することが明らかである.
小学校における読解力を育成する国語科説明文指導の実践的研究-読解過程に〈鉛筆対話〉を取り入れた低学年の授業実践-

「研究の目的」4年生の説明文の読解学習に、学習者が自らの学びをメタ認知し、<鉛筆対話>を取り入れ学習者同士が学び合う授業を行った。そのことにより、学習者は教材に向き合い筆者とかたり合うことで批判的な読みを行い読解力が育成されることがわかった。そこで、低学年においても読解活動に<鉛筆対話>を取り入れることの有効性について実践研究を行う。「研究の方法」「書く」ことに抵抗がなくなってきたと思われる2年生を対象に研究を行った。5月の初期段階と2月に自身の担当学級と大阪とで行い比較検討を行った。その間も説明文学習においては、<鉛筆対話>を取り入れた実践を継続する。また、<鉛筆対話>を取り入れない指導も行い比較検討する。「研究の成果」2学年においても、「思い」を交流し合うことはできる。単に(わかったこと)を交流し合うのではなく、(わからないこと)も出し合うようにした。友だちとの考えの違いに気付かせるための方法としては有効である。また、説明文の読み取りの手順を意識化させることにより「説明文の書き方」に目が向くようになってきた。学年末には、「筆者の書き方の上手なところ」を発見し、自分の書き方に取り入れようとする様子も見られた。(こんなことも書いてほしいなあ・なんで書いていないのかなあ)などという教材文に対して積極的に関わるようになってきた。しかし、低学年の場合は「思考」が拡散する傾向があるため時間を制限し、指導者として学習者同士が話し合う論点を明確に示す必要がある。私立と公立の児童に大きな違いはないが、「書きなれている」という点では、私立の児童の方が量的に多く書ける傾向がある。今回茨城の指導者に説明文指導についてのアンケートを行った。前回の大阪・秋国と比較しても「説明文の指導法」に変化がなく、指導者として「力のつく」指導法を模索する姿が見えた。学年の発達段階にそった<鉛筆対話>を取り入れた実践を開発していきたい。
両性膜による塩輸送の基礎的研究

圧透析は,電気透析あるいは逆浸透のような通常の膜分離に代わるカン水からの純水製造や海水濃縮に対する新しい技術として期待されている。本研究では,まず陽イオン交換基としてスルホン酸,陰イオン交換基としてトリメチルアミンをほぼ同数(0.11meq./g)保持した両性膜を作製し,加圧下における塩輸送の可能性を調べた。基礎実験として機械的圧力を加える代わりに,サッカロースの添加による浸透圧下での膜・KCl水溶液系における体積流束と塩流束を測定した。さらにこれらの流束値の結果について,非平衡熱力学に基づいた塩輸送現象の基礎的な解析を行ない,膜特性を表すパラメータである濾過係数,反射係数および塩透過率を見積り,単一型イオン交換膜から得られたものと比較検討した。両性膜の濾過係数は単一型のイオン交換膜に比べ約2030倍大きな値を示し,塩水をより通しやすい性質をもつことがわかった。また,反射係数の値は,0.47と小さく,塩は膜に引きつけられ膜内に取り込まれ易いことがわかった。さらに塩の通り易いさを表す膜透過率は,単一型イオン交換膜と比較すると,約500倍という大きな値を示した。このことは作製した両性膜が,体積流束よりも塩流束の方が大きく,水よりも塩を通しやすいことを示している。以上の結果より,この両性膜は塩水溶液系において塩を優先的に輸送し,海水濃縮やカン水の脱塩の可能性を有することがわかった。本研究により,作製した両性膜は浸透圧下において塩輸送を促進することが示されたが,今後は機械的な高圧力に伴う塩輸送についての研究を計画している。
担子菌のセルロース分解様式の多様性を制御する因子の解析

担子菌のセルロース分解様式は、菌によって多様性があることがわかっている。これまで白色腐朽型のセルロース分解様式についての研究は盛んに行われてきたが、褐色腐朽型のセルロース分解様式についての研究は限られている。そこで、褐色腐朽菌のセルロース分解機構について研究を進めていくことで、担子菌のセルロース分解様式の多様性を決める酵素は何か、またその酵素の構造と機能にどのような差異があるのかを分子レベルにおいて明らかにすることを研究の目的とした。まず、これまでの研究の結果から、糖質加水分解酵素ファミリー7に属する酵素(Cel7)に着目した。褐色腐朽菌Coniophora puteanaはCel7をセルロースを炭素源とした培養系において主な菌体外酵素として生産するが、精製したC. puteana由来Cel7は結晶性セルロースを分解することができなかった。その理由として、糸状菌、白色腐朽菌由来の結晶性セルロースを効率よく分解できるCel7との最も大きな差異は固体のセルロースに吸着する機能を持つ、糖結合性ドメインがC. puteanaには欠如していることが明らかとなった。また、12種類の担子菌よりCel7遺伝子のスクリーニングを試みたところ、白色腐朽菌においては全ての菌よりCel7遺伝子をスクリーニングすることに成功したが、C. puteanaを除き、全ての褐色腐朽菌においてCel7遺伝子の存在を確認することはできなかった。このことから担子菌のセルロース分解様式の多様性を決める因子の一つとして、担子菌にはCel7の有無、特性にバリエーションが存在する可能性が示唆された。様々な担子菌からのCel7遺伝子のスクリーニングに際し、新しくCODEHOPプログラムというツールを利用して、高確率にスクリーニングしてくることに成功した。さらにCODEHOPを利用して、様々な担子菌より、他の糖質加水分解酵素ファミリー遺伝子や、リグニン分解関連酵素、セロビオース脱水素酵素といった、担子菌のセルロース分解や木材分解様式に多様性を与えると考えられる酵素遺伝子を取得することに成功した。また、担子菌のセルロース分解様式に差異を与える因子に関する情報を取得する一方で、後に表現系によってその因子の影響を調べるために、担子菌の遺伝子組換え系の構築に着手した。その結果、アグロバクテリウムを用いて、担子菌Phanerochaetechrysosporiumの薬剤耐性株を得ることに成功した。そこで、褐色腐朽菌のセルロース分解機構について研究を進めていくことで、担子菌のセルロース分解様式の多様性を決める酵素は何か、またその酵素の構造と機能にどのような差異があるのかを明らかにすることを本年度の研究の目的とした。我々は糖質加水分解酵素ファミリー7に属する酵素(Cel7)に着目した。褐色腐朽菌Coniophora puteanaはCel7をセルロースを炭素源とした培養系において主な菌体外酵素として生産するが、精製したC.puteana由来Cel7は結晶性セルロースを分解することができなかった。さらに酵素学的、分子生物学的の両面から解析することによって他の結晶性セルロースを分解することのできる白色腐朽菌、または糸状菌由来Cel7と比較した。その結果、糸状菌、白色腐朽菌由来の結晶性セルロースを効率よく分解できるCel7との最も大きな差異は固体のセルロースに吸着する機能を持つ、糖結合性ドメインがC.puteanaには欠如していることが明らかとなった。さらにC.puteana由来Cel7はこれまでに単離されたCel7とは異なり、キシランやグルコマンナンといったヘミセルロースに対して高い活性を示すことを明らかにした。ヘミセルロースに高い活性を示すCel7はこれまでに報告されていない。また、12種類の担子菌よりCel7遺伝子のスクリーニングを試みたところ、白色腐朽菌においては全ての菌よりCel7遺伝子をスクリーニングすることに成功したが、C.puteanaを除き、全ての褐色腐朽菌においてCel7遺伝子の存在を確認することはできなかった。

また、12種類の担子菌よりCel7遺伝子のスクリーニングを試みたところ、白色腐朽菌においては全ての菌よりCel7遺伝子をスクリーニングすることに成功したが、C. puteanaを除き、全ての褐色腐朽菌においてCel7遺伝子の存在を確認することはできなかった。このことから担子菌のセルロース分解様式の多様性を決める因子の一つとして、担子菌にはCel7の有無、特性にバリエーションが存在する可能性が示唆された。様々な担子菌からのCel7遺伝子のスクリーニングに際し、新しくCODEHOPプログラムというツールを利用して、高確率にスクリーニングしてくることに成功した。さらにCODEHOPを利用して、様々な担子菌より、他の糖質加水分解酵素ファミリー遺伝子や、リグニン分解関連酵素、セロビオース脱水素酵素といった、担子菌のセルロース分解や木材分解様式に多様性を与えると考えられる酵素遺伝子を取得することに成功した。また、担子菌のセルロース分解様式に差異を与える因子に関する情報を取得する一方で、後に表現系によってその因子の影響を調べるために、担子菌の遺伝子組換え系の構築に着手した。その結果、アグロバクテリウムを用いて、担子菌Phanerochaetechrysosporiumの薬剤耐性株を得ることに成功した。担子菌のセルロース分解様式は、菌によって多様性があることがわかっている。これまで白色腐朽型のセルロース分解様式についての研究は盛んに行われてきたが、褐色腐朽型のセルロース分解様式についての研究は限られている。そこで、褐色腐朽菌のセルロース分解機構について研究を進めていくことで、担子菌のセルロース分解様式の多様性を決める酵素は何か、またその酵素の構造と機能にどのような差異があるのかを分子レベルにおいて明らかにすることを研究の目的とした。まず、これまでの研究の結果から、糖質加水分解酵素ファミリー7に属する酵素(Cel7)に着目した。褐色腐朽菌Coniophora puteanaはCel7をセルロースを炭素源とした培養系において主な菌体外酵素として生産するが、精製したC. puteana由来Cel7は結晶性セルロースを分解することができなかった。その理由として、糸状菌、白色腐朽菌由来の結晶性セルロースを効率よく分解できるCel7との最も大きな差異は固体のセルロースに吸着する機能を持つ、糖結合性ドメインがC. puteanaには欠如していることが明らかとなった。