hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心不全の進展に伴うエピジェネティックな転写制御機構の解析

【目的】申請者はこれまでの研究により、心肥大期から心不全期にかけてヒストンのアセチル化修飾部位がテールドメイン(H3K9)から球状ドメイン(H3K122)へと変化すること、クロマチンリモデリング因子のBRG1とヒストンアセチル化酵素のp300との結合が心不全期に増加することを見出した。本年度では、心肥大期から心不全期にかけてヒストンのアセチル化修飾部位の変化がBRG1によるエピジェネティックな制御機構で制御しているか解明することを目的として検討を行った。【方法・結果】初めに、高血圧誘導性心不全モデルであるダールラットの心肥大期、心不全期の心臓を用いてin vivo reChIPアッセイを行った。その結果、心不全期での肥大反応因子プロモーター近辺においてH3K122のアセチル化の増加とともにBRG1がリクルートされていることを確認した。次に、初代培養心筋細胞にBRG1のノックダウンを行い、フェニレフリン刺激により心筋細胞肥大を誘導し、心筋核内のヒストンのアセチル化について検討した。フェニレフリン刺激によるH3K9のアセチル化の増加はBRG1のノックダウンで変化はなかったが、H3K122のアセチル化の増加はBRG1のノックダウンにより有意に減少した。【考察】p300とBRG1の結合が増強することでH3K122がアセチル化され、転写が大きく亢進し心不全に至る可能性が示唆された。p300とBRG1との複合体形成のメカニズムを解明することが出来ればヒストンの球状ドメインのアセチル化を制御することが可能になると考える。そのため、p300とBRG1の結合が直接的または他のタンパク質を介した結合なのかを検討していきたい。本研究により新たなエピジェネティックな制御機構としてp300とBRG1の複合体形成を介したヒストンのアセチル化修飾が心不全へのトリガーとなる可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、心肥大期から心不全期にかけてヒストンのアセチル化修飾部位がなぜ変化するのかというエピジェネティックな制御機構を解明することを目的とした。心肥大や心不全に関する報告が多かったクロマチンリモデリング因子のBRG1に着目し以下の方法で検討を行った。初めに、高血圧誘導性心不全モデルであるダールラットの心肥大期、心不全期の心臓を用いて免疫沈降-ウエスタンブロッティング法によりヒストンアセチル酵素であるp300とBRG1との結合を確認した結果、p300とBRG1との結合はコントロール並びに心肥大期と比べて心不全期で有意に増加していた。また、BRG1の肥大反応遺伝子(ANF,BNP)上のプロモーターへのリクルートをin vivoクロマチン免疫沈降法により検討した結果、p300との結合と同様に心不全期においてコントロール並びに心肥大期と比べて有意に上昇していた。さらに、BRG1で免疫沈降したのちヒストンの球状ドメインであるH3K122-Acで免疫沈降したreChIPを行った結果、肥大反応遺伝子上のプロモーターにおいて心不全期でコントロール並びに心肥大期と比べて心不全期で有意に増加していた。以上のことから、心肥大期から心不全期にかけてヒストンのアセチル化修飾部位が変化する理由としてp300とBRG1の結合の変化並びにBRG1の肥大反応遺伝子上のプロモーターへのリクルートの変化が関連していることが考えられる。そのため、今後とテールドメインのH3K9-AcとBRG1との関係をreChIPを用いて解明したい。今後、その結果が明らかになれば心肥大から心不全へのトリガーとなるエピジェネティックな制御機構の新たな発見につながり、新規心不全治療のターゲットとなる可能性があると考える。ヒストンのアセチル化修飾部位を変化させる因子の候補としてクロマチンリモデリング因子のBRG1を候補として絞り込んだ。さらに、高血圧誘導性心不全モデルのダールラットを用いた実験においてタンパク質について解析する実験系(ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法、クロマチン免疫沈降法)で心肥大期から心不全期にかけてBRG1とp300との結合が増加することやBRG1の肥大反応遺伝子上のプロモーターへのリクルートが増加することなどの結果が見出されたことから当初の計画以上に本研究は進展していると考える。【考察】

p300とBRG1の結合が増強することでH3K122がアセチル化され、転写が大きく亢進し心不全に至る可能性が示唆された。p300とBRG1との複合体形成のメカニズムを解明することが出来ればヒストンの球状ドメインのアセチル化を制御することが可能になると考える。そのため、p300とBRG1の結合が直接的または他のタンパク質を介した結合なのかを検討していきたい。本研究により新たなエピジェネティックな制御機構としてp300とBRG1の複合体形成を介したヒストンのアセチル化修飾が心不全へのトリガーとなる可能性が示唆された。今後の研究の推進策としては、高血圧誘導性心不全モデルのダールラットの心肥大期、心不全期の心臓を用いてBRG1とH3K9のアセチル化との関係を検討するためにreChIPを行う。また、培養心筋細胞にBRG1の過剰発現系によるGain of functionやsiRNAを用いたLoss of functionを用いてH3K9並びにH3K122のアセチル化修飾に対してどのような影響を与えるのかについて検討を行う。以上のことから、心肥大期から心不全期にかけて起こるヒストンのアセチル化修飾部位の変化を起こす制御因子がBRG1であるかどうか解明する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
高血圧性肥大心筋における脂肪酸代謝に関する研究

本研究は高血圧性肥大心における脂肪酸代謝につき、高血圧モデルとして高血圧自然発生ラット(SHR)、対照としてWister Kyoto Rat (WKY)を用いて以下の事柄を検討した。1.高血圧性心肥大においてその進展とともにどのように脂肪酸代謝が変化するのか。5週、12週、15週、18週、51週のSHR、WKYにおける心筋血流製剤T1-201と脂肪酸代謝用製剤I-125-BMIPPの集積比(I-125-BMIPP/T1-201)を測定し、血流にみあった脂肪酸代謝の程度を検討した。その結果、SHRの心臓体重重比は5週からWKYより高く、集積比はどの週令においてもSHRでWKYより低かった(p<0.001)。その比は12週で両群とも高く、15, 18週と低くなった(p<0.05)が、51週では逆に高くなった。その傾向は両群で差がなかった。また、その集積比を内膜、外膜で比較したが、その傾向はSHRとWKYで有意差がなかった。2.ACE阻害剤の治療前後で肥大心の退縮とともに脂肪酸代謝が回復するのか。SHRに12週から15週までACE阻害剤であるカプトリルを投与したところ、血圧の降下とともに肥大心はその心臓体重比がWKYと有意差がないまでに退縮した、また、T1-201/I-125-BMIPP集積比もWKYの15週令の値と有意差がなくなった。これに対し、カルシウム拮抗剤であるヒドララジンを投与したSHRでは血圧の降下はみられるものの肥大心の退縮なく、集積比の変化がみられなかった。これらの結果より、高血圧性肥大心では、血流に比し脂肪酸代謝が低下しており、ACE阻害剤で肥大が改善すると脂肪酸代謝も回復することがわかった。しかし、Dahi ratで証明されているような内膜と外膜の脂肪酸代謝の差はみられず、高血圧の発生機序などの違いがその原因かもしれないと思われた。
感染・炎症が加速する発がんスパイラルとその遮断に向けた制がんベクトル変換

新学術領域研究「発がんスパイラル」は、単一の微生物感染による発がんを中心に、がんの発症・進展に関わる微生物側因子の役割を明らかにするとともに、発がん微生物感染が局所に誘起する炎症・免疫応答が発がんを加速する機構の本態を解明し、革新的ながん予防・がん治療法開発への道を拓くべく平成22年度に開始された。本取り纏めでは、新学術領域研究「発がんスパイラル」の研究成果を以下のように取りまとめた。1.領域研究報告書の作成研究代表者ならびに連携研究者による会合を2回行い、過去4回にわたり発刊したNews Letterの集大成として、5年間の成果をまとめた領域研究報告書を発行した。報告書では、発がん微生物が保有するがんタンパク質の作用機構、微生物がんタンパク質と宿主生体応答系の相互作用ネットワーク、「発がんスパイラル」場形成を担う免疫系細胞の同定とゲノム不安定性を増強するエフェクター分子の作用機構、自然免疫系細胞のがん細胞認識とがん細胞破壊を促進する分子群の同定、など本領域研究から得られた多くの新たながん生物学的知見を記述するとともに、新規ナノゲルやDNAワクチンの開発を通して拓かれつつある「向がん」から「制がん」への宿主応答ベクトル変換を誘導する次世代のがん予防・治療法開発へのプロセスを記載した。インパクトの高い国際一流誌に報告された研究成果も報告書内に別刷として収集した。2.領域公式ウェブサイトの運営:ウェブサイトを通じ、社会・国民に向けた積極的な情報公開を維持した。これまでに公開してきた情報に加え、新たに「研究成果」として過去5年間に進めてきた基礎研究の成果の社会への還元状況を発信した。さらに領域公式ウェブサイトから、各研究者個別のウェブサイトへ相互リンクを図り、利用者はリンク先からさらに詳細な情報を得ることが出来るように工夫した。27年度が最終年度であるため、記入しない。新学術領域「発がんスパイラル」では、がんの発症における微生物感染、炎症ならびに自然免疫・獲得免疫が担う役割を、原子・分子レベルから個体に至る階層横断的な研究を通して明らかにした。本領域ではさらに、臨床応用に向け「発がん性の負のスパイラル」遮断を可能にする革新的な免疫アジュバントの作製や次世代ドラッグデリバリーシステム(DDS)の開発に成功した。総括班では、ホームページによる情報発信に加え、例年の国際シンポジウム開催ならびにニュースレター発行を通し、領域内外における共同研究の積極的な推進を促した。新学術領域研究「発がんスパイラル」総括班は、平成22年度、研究代表者の畠山に加え、連携研究者である総括班員が各研究班を統括し、「感染・炎症が加速する発がんスパイラルとその遮断に向けた制がんベクトル変換」研究の目的達成に向け発足初年度円滑な領域運営を進めた。実際の領域運営は、各総括班員が分担・協力して各々の研究班を有機的に組織し、同時に領域全体の研究方針の策定や企画調整を行った。代表者は各連携研究者と研究の効果的推進方策を検討し、総括班会議を開催して運営方針を検討した。第一回の総括班会議は平成22年8月2日に東京大学医学部で開催され、総括班の予算執行に関する討議が行なわれた。また、当該研究領域・分野の学問的水準を常に世界の最高レベルに維持すべく、感染がんに関連した研究分野において国際的な研究を展開している研究者を招聘する国際シンポジウムを平成23年2月1日-3日の間、東京大学鉄門講堂にて開催した。今回は、炎症・発がん・免疫とチロシンリン酸化/脱リン酸化との接点をテーマに、国外から10名の世界的研究者を招待するとともに、7名の計画研究者全員、17名の国外研究者が最先端の成果を発表し、100名を越す参加者から活発な質疑応答が行なわれた。この会を通して、新たな共同研究につながる多くの国際的な交流が生まれ、シンポジウムはきわめて成功裏に終了した。また、本研究領域のホームページを日本語・英語で開設し、その内容は逐次更新されている。さらに、がん支援研究(新学術領域)を通して、「発がんスパイラルの研究を積極的に公開している。本年度の研究成果の複数は全国紙に掲載され、社会に広く知らされた。総括班としての活動の目的は、本「発がんスパイラル」領域研究が掲げる目標を5年の研究期間内に滞りなく達成するため、各研究班の活動のスムーズな研究活動計画遂行を支援するともに、研究領域全体の進捗度を俯瞰的に評価し、領域研究の健全な進展を促すことにある。平成23年度は6月20日に計画研究班員7名による総括班会議を東京大学医学部にて開催した。この会議で外部審査委員として3名の外部評価委員を委嘱するとともに、平成24年度の国際シンポジウムを金沢大学がん研究所(大島正伸教授主催)にて開催することを決定した。同20日の午後には、公募研究班として23年度から参加となった12班の研究代表者によるこれまでの研究概要と今後の計画に関する発表会が開催された。9月には計画研究班の研究内容を掲載したニュースレターを発行し、全国の関連の研究者に配布した。平成24年1月16日、17日の両日、京都大学医学部芝蘭会館において第二回発がんスパイラル国際シンポジウムを開催した(京都大学ウイルス研究所との共催事業)。2日間の開催でのべ200名近くの参加者があり、回は成功裏に終了した。計画班領域内での共同研究も順調に進行しており、瀬谷班-秋吉班、大島班-秋吉班、畠山班-谷口班-大島班、瀬谷班-下遠野班間での共同研究が進展している。

また、公募研究班を含めた班員間の研究交流を推進すべく、共同研究に必要な情報ならびに遺伝子改変マウスなどの研究マテリアル交換、共通試薬等の供給も積極的に仲介し、各研究班の一層の研究発展をサポートした。平成25年度は研究代表者に加え連携研究者である総括班員(7名)が下記の活動を通して、「感染・炎症が加速する発がんスパイラルとその遮断に向けた制がんベクトル変換」研究の目的達成に向けた領域運営を進めた。まず、平成25年6月に東京大学において総括班会議を開催した。同時に、計画研究班ならびに新規公募研究班の代表者による研究進捗発表会を開催し、新学術領域としての今後の研究の進め方や現在進行中の共同研究あるいは新たな共同研究の可能性に関する討議を行った。本領域研究においてこれまでに得られた研究原理ならびに技術資源を、治療を含めた応用研究に進めることを念頭においた共同研究はおおむね順調に進んでいると評価できた。また本領域では、当該研究分野の学問的水準を常に世界の最高レベルに維持すべく、感染・炎症がんに関連した研究分野において指導的立場にある、あるいはきわめて活発な研究を進める国内外研究者を招聘する国際シンポジウムを毎年開催し、海外との積極的な共同研究を推し進めている。平成25年度は札幌(オーガナイザー:北海道大学医学系研究科瀬谷司教授)において第4回目の国際シンポジウムが開催され、海外から3名の講演者を招き成功裏に終了した。平成26年度の国際シンポジウムは神戸での開催を予定している。個々の班員は、がん研究の社会還元のため市民公開講座を積極的に進めるとともに、新聞報道などにより具体的な研究成果の発信に努めた。また、「発がんスパイラル」ホームページの内容の随時更新と一層の充実化に努めるとともに、10月に計画ならびに公募研究の進捗報告を中心とした3報目の「発がんスパイラル」会報を発行し、班員間の情報交換を進める中での連携強化を図った。最終年度となった平成26年度は、以下のような項目を重点に研究領域の推進とまとめを図った。まず、発がん性微生物感染を基盤に引き起こされる感染発がん化機構のさらなる解明を目指した。とりわけ、炎症が発がんを促進するばかりでなく、発がんシグナルが炎症を加速する結果、両者間にがんの発症・進展を促進する負のスパイラルが作動するという発見は重要であり、その機構解析を進めた。また、感染、炎症とがんの発生・進展をつなぐ細胞・分子の解明に向けた研究の学問的インパクトをより一層高めるため、共同研究を含めた多くのマウス遺伝学研究を押し進めた。とくに、発がんとがん微小環境形成におけるマクロファージや炎症性サイトカインの役割とその抑制法、がん細胞の悪性化を加速する遺伝子編集酵素を中心としたゲノム不安定性の獲得機構とその阻止法、がん細胞を駆逐するための「制がんベクトル変換」を担う生体応答としての免疫システムの作動システム解明等の研究を、臨床応用にトランスレートできるレベルにまで高めるべく展開させた。
放射光微小ビームを利用した粒子間干渉効果低減化による孤立粒子構造評価法の開発

Si単結晶を用いた寄生散乱除去法を開発し、マイクロビーム極小角X線散乱を行うための装置を製作した。この装置を利用することにより、従来観測できなかった数マイクロメートル領域における数百ナノメートルの構造を散乱法により評価できるようになった。また、SPring-8 BL03XUにて共用装置として一般に利用された。企業ユーザーによってゴム材料の不均一性評価、動的構造評価などに利用された。試料中における粒子の形状とそれらの分散状態を評価するためには、数μmの微小領域における数百nmの構造を観測する手法開発及び装置の構築が必要である。26年度は測定システム構築のための装置設計及び検証実験を行った。試料の上流300mmの位置に直径5μmのピンホールを配置し、X線を整形することで微小ビームを得た。ピンホールと試料との間にSi(220)チャンネルカット結晶を配置し、結晶角度をダイレクトビームの回折角に一致させた。微弱なX線散乱光を取得するために、試料と検出器の間には8mの真空パイプを配置し、検出器を用いて散乱像を取得した。0.15nmのX線を用いてX線CCDにより小角散乱像を測定した。チャンネルカット結晶を配置しない場合には、ピンホールから発生するストリーク状の寄生散乱が強く観測されたのに対し、チャンネルカット結晶を配置した場合には、結晶面と平行な方向以外の寄生散乱が効率良く取り除かれることが確認出来た。また、結晶面の平滑性に依存し、寄生散乱除去の状況が異なることが確認でき、結晶面の平滑性が非常に重要であることを認識した。結晶面の平滑性はその製作行程に大きく依存する。チャンネルカット結晶の製作では、面を平滑にすることが非常に難しい。そこで、結晶面が平滑な平板結晶を二組用いて、それらの並行性を調整することのできる小型チャンネルカット結晶装置の製作を検討した。現在、小型チャンネルカット結晶装置の製作を行っているところである。27年度は小角X線散乱法を用いて数μmの微小領域における数百nmの構造を観測する手法・装置を開発した。φ数μmのX線は微小ピンホールを光軸に挿入することにより生成し、小角散乱測定に要求される寄生散乱の除去は、結晶コリメート型寄生散乱除去装置を開発することで対応した。開発した装置を用いて実証実験を行い、それに成功したので詳細を下記に示す。直径8μmのピンホールを用いてX線を成形し、試料位置で5.0 x 6.9 μm xμm (V x H, FWHM)の光を得た。X線の波長は0.1 nmである。水平方向及び垂直方向に二組のSi単結晶を有するコリメート装置をピンホールの直下流に設置した。コリメートシステムを用いてピンホールエッジから発せられる寄生散乱除去を試みた。Si(111)結晶の回折幅は20μrad程度であるため、光軸に対して20μrad以上異なる角度の寄生散乱はSi結晶により除去される。結晶を水平と垂直方向に配置することで、全方位の寄生散乱を除去することに成功した。ピンホールの直下にスリットを配置する方法では、寄生散乱の除去を行うことが不可能であるが、この手法を用いることで極小角領域の寄生散乱除去も可能となった。300 nm周期の回折格子及び空気散乱測定を行った結果、300 nmの空間分解能があり散乱測定を阻害する寄生散乱を除去できていることが確認できた。研究計画通り、27年度中にマイクロビーム極小角散乱測定装置構築及び検証を実施が出来ており、計画は順調に進んでいる。最終年度にμBeam X線極小角散乱(μUSAXS)装置を利用して材料中のボイド構造評価を目指したが、試料から得られた散乱像はスペックル像となったため解析が困難であった。そこで、スペックル像を利用した解析手法の一つであるX線光子分光(XPCS)測定を行い、μUSAXS装置を用いた全方位スペックル像の取得の有用性を評価した。直径30μmのピンホールを用いてX線を成形し、水平方向及び垂直方向に2組のSi単結晶を有するコリメート装置(本研究にて27年度に構築)を用いてピンホールエッジから発せられる寄生散乱を除去した。試料としてポリプロピレングリコールに分散させたポリスチレン微粒子を用いた。7.7 m下流に設置したピクセル分解能が30 x 30 μm^2の2次元検出器で試料からのスペックルパターンを30 Hzのフレームレートで取得した。8x10^-3 8x10^-2 nm^-1の波数領域のスペックルパターンを全方位で取得した。得られたスペックル像の時間相関を計算することで自己相関関数を得た。得られた自己相関関数を解析した結果、微粒子のブラウン運動による緩和を観測することができた。φ数μm領域における数百nmの構造をX線散乱法により評価するために、μUSAXS装置を開発・製作した。結晶コリメート法を開発し全方位の寄生散乱を除去することにより、全方位の散乱測定を行うことが可能となった。この装置を利用することで試料の構造に由来するスペックル像の取得が容易となり、コヒーレントX線を利用した構造相関評価ができるようになった。

この装置を利用することにより、従来観測できなかった数マイクロメートル領域における数百ナノメートルの構造を散乱法により評価できるようになった。また、SPring-8 BL03XUにて共用装置として一般に利用された。企業ユーザーによってゴム材料の不均一性評価、動的構造評価などに利用された。研究計画では、マイクロビーム極小角X線散乱法の構築に関し、27年度中にシステム構築及び検証を実施する計画としている。チャンネルカット結晶を用いた寄生散乱除去の検証は達成できており、現在制作している小型チャンネルカット結晶装置が完成により、測定・評価が可能となる。小型チャンネルカット結晶装置は27年度の秋に完成を予定している。マイクロビーム極小角散乱測定システムについて成果報告を行うとともに、このシステムを用いて、繊維試料の紡糸過程におけるボイド生成過程を追跡する研究を共同研究者と推進する。放射光科学チャンネルカット結晶を用いて寄生散乱を除去する手法について、先に成果報告を考えている。また、マイクロビーム極小角X線散乱法については、散乱理論等の検証を十分に行った上で、実試料測定を実施する。成果報告の回数が少なかったために、次年度使用額が生じた。チャンネルカット結晶を購入する予定であったが、平板結晶を用いた二結晶分光装置の製作が必要と判断されたために、27年度の執行計画とした。成果報告を行うために使用する。27年度に結晶角調整機構の製作を行い、小型チャンネルカット結晶装置を導入する。
P2Pシステムのための消費電力低減を考慮したピアの発見と選定プロトコルの研究

本研究では,システム内で実行されるアプリケーションを計算資源(CPU),通信資源,および計算資源と通信資源の両方を使用する3種類に分類し,これらのアプリケーションプロセスを実行した場合のコンピュータ(ピア)の計算モデル,ファイル転送モデル,および,消費電力モデルの定式化を行った.また,定義した計算およびファイル転送モデルと消費電力モデルからシステム内で各アプリケーションプロセスが実行された場合にシステム全体の消費電力を低減し,かつアプリケーションプロセスの要求するサービス品質(QoS)を満足するピアの選定アルゴリズムを提案した.本研究では,システム内で実行されるアプリケーションを計算資源(CPU),通信資源,および計算資源と通信資源の両方を使用する3種類に分類し,これらのアプリケーションプロセスを実行した場合のコンピュータ(ピア)の計算モデル,ファイル転送モデル,および,消費電力モデルの定式化を行った.また,定義した計算およびファイル転送モデルと消費電力モデルからシステム内で各アプリケーションプロセスが実行された場合にシステム全体の消費電力を低減し,かつアプリケーションプロセスの要求するサービス品質(QoS)を満足するピアの選定アルゴリズムを提案した.本研究では,コンピュータ(ピア)をCPU数等のマクロレベルで分類し,各ピア上で応用プログラムを実行した場合の計算モデルと消費電力特性の関係を明確にする.この結果をもとにP2Pシステムで応用プログラムを実行する場合にシステム全体の消費電力を低減し,かつ応用プログラムの要求するサービス品質(QoS)を満足するピアの発見プロトコルと選定アルゴリズムを提案することを目的としている.平成22年度は,ピアの計算モデルと消費電力特性の定式化を行い,P2Pシステム全体の消費電力を低減するためのピアの発見プロトコルと選定アルゴリズムの設計を実施した.本研究では,対象とするアプリケーションをファイル転送およびトランザクション処理が主な処理となる2種類のアプリケーションを想定し,それぞれのアプリケーションに対して,ハードウェア構成の異なるピアで同時実行されるプログラム数と消費電力量の関係を測定した.この結果から,本研究では,CPU数およびコア数でピアを分類することとし,アプリケーションと分類したピア毎に計算モデルと消費電力モデルを定義した.この計算モデルと消費電力モデルを使用することにより,各ピアの持つ分類項目,実行中の応用プログラム数,最小・最大消費電力値がわかれば,各ピアに新たな要求を割当てた場合の消費電力量を推定できる.よって,この推定結果をもとに新たな要求の処理に掛かる消費電力が最小となるようなピアを選定するアルゴリズムの設計,実装およびシミュレーションを用いた動作検証を行った.次年度は,具体的なアプリケーションを想定したシミュレーションを実施し,提案手法の評価および改善を実施する予定である.本研究では,コンピュータ(ピア)をCPU数等のマクロレベルで分類し,各ピア上で応用プログラムを実行した場合の計算モデルと消費電力特性の関係を明確にする.この結果をもとにP2Pシステムで応用プログラムを実行する場合にシステム全体の消費電力を低減し,かつ応用プログラムの要求するサービス品質(QoS)を満足するピアの発見プロトコルと選定アルゴリズムを提案することを目的としている.平成22年度中にトランザクション処理およびファイル転送が主な処理となる2種類のアプリケーションに対して,それぞれピアの計算モデルおよび消費電力モデルの定式化を実施した.また,これらのモデルをもとに新たな要求がピアに割当てられた場合の消費電力を推定するアルゴリズムの実装を行っている.平成23年度は,2種類のアプリケーションを対象として,プロトタイプを用いたアルゴリズムの動作検証を実施した,動作検証では,プロトタイプを用いたシミュレーションで選定アルゴリズムが机上での結果と同様に動作することを確認した.さらに,トランザクションおよびファイル転送が主な処理となる2種類のアプリケーションに対して,シミュレーション環境での提案手法の評価を実施した.各アプリケーションに対して,システムの規模(システム内のピア数,発行される要求数等)を変更し,システム全体で消費された電力量とサービス品質(応答時間等)の評価を行った.ここで,従来提案されているピアの選定手法を用いた場合と提案手法を用いた場合での総消費電力量とサービス品質を比較し,提案手法の妥当性を検証した。最後に,前述の研究結果をもとにトランザクションおよびファイル転送の両方を実施する一般的なアプリケーションを想定し,計算モデルと消費電力モデルを統合した.次年度は,この結果を用いて一般的なアプリケーションのためのピアの選定アルゴリズ設計・実装,および評価を実施する.平成23年度までにトランザクション処理およびファイル転送が主な処理となる2種類のアプリケーションを想定し,各アプリケーションに対して,ピアの計算モデル,消費電力モデルの定式化,およびシステム全体の消費電力を低減するためのピアの選定アルゴリズムの実装よびシミュレーションでの評価を実施した.さらに,平成23年度中にトランザクションおよびファイル転送の両方を処理する一般的なアプリケーションに対して,統合された計算モデルと消費電力モデルを定義した.平成24年度は,トランザクションおよびファイル転送の両方を処理する一般的なアプリケーションを対象として,平成23年度に統合した計算モデルと消費電力モデルを用いたピアの選定アルゴリズムの設計,実装,および評価を実施した.シミュレーション環境での提案手法の評価を実施した.シミュレーション環境において,システムの規模(ピア数,発行される要求数,要求の種別等)を変更し,システム全体で消費された電力量とサービス品質(応答時間等)の評価を行った.ここで,従来手法と提案手法の比較を行い,提案手法が従来手法に比べて,消費電力を削減できること,また,応答時間を短縮できることを示した.さらに,平成23年度中の実験を通して,ピアの消費電力モデルが,当該ピアの持つ冷却装置の制御方式に大きく依存することが確認されたため,ピアの持つ冷却装置の制御方式を考慮した消費電力モデルを新たに定式化し,各ピアの持つ電力特性を考慮して最適なピアを選定するようアルゴリズムを改良した.以上の研究結果を国際会議,国際論文誌で発表した.

平成23年度の交付申請書に記載した研究実施計画通り,トランザクション処理およびファイル転送が主な処理となる2種類のアプリケーションに対して,提案アルゴリズムの動作検証,シミュレーション環境での評価を実施できている.さらに,一般的なアプリケーションを想定し,計算モデルおよび消費電力モデルを統合することができている.以上のことから,研究計画通りに進展していると判断する.24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は,平成23年度の結果を用いて,一般的なアプリケーションがピア上で実行された場合の消費電力推定アルゴリズムとピアの選定アルゴリズムの実装,動作検証,およびシミュレーション環境での評価を実施する予定である.さらに,平成23年度の実験結果からピアの消費電力モデルが,当該ピアの持つ冷却装置の制御方式に大きく依存することが確認された.よって,ピアの持つ冷却装置の制御方式を考慮するよう現状の計算モデルおよび消費電力モデルを改良する.このモデルを用いて提案アルゴリズムを拡張することを研究課題として追加する。さらに,これらの研究結果を国際会議,国際論文誌に投稿する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
新規植物細胞融合現象の必須因子の同定と分子メカニズムの解析

植物細胞の周辺は厚い細胞壁に覆われていることから,細胞同士が接触を必要とする細胞融合現象は起こらないと考えられていた.ただ,雌側組織である胚珠の内部に存在する2つの雌性配偶子,卵細胞と中央細胞の受精のみが被子植物の発生において例外的に起こる細胞融合として知られていた.近年,われわれのグループは,受精した中央細胞,すなわち胚乳が隣に位置する助細胞を融合・吸収することを明らかにした.本研究ではこの助細胞胚乳融合と命名した新規の植物細胞融合現象の分子メカニズム解明とその生理学的役割の解明を計画していた.30年度では,助細胞胚乳融合についてわれわれが注目している新機能,すなわち,受精後の胚珠が過って後発の花粉管を受容したとき,不要な精細胞を受精の場へと送るかわりに胚乳へと廃棄する最終的な精細胞の経路選択機能を明らかにした.この成果については6月に開催された国際植物生殖学会(ICSPR2018)報告した.助細胞胚乳融合の分子メカニズム解明に向けた順遺伝学的アプローチでは,スクリーニングの規模を拡大し,高頻度に助細胞胚乳融合の欠損を示す変異体の系統を合計8つ得た.そのうち,系統#17については5回目の戻し交配が完了しており,受精後の種子の表現型解析を行った.その結果,助細胞胚乳融合を欠損する胚珠が助細胞核の崩壊のタイミングが遅くなることが示唆された.花粉管の誘引活性をもつ助細胞の細胞核崩壊は,受精後の胚珠の速やかな花粉管誘引停止において重要な役割をはたしていると予測されてきた.系統#17は受精後の助細胞の不活性化メカニズムを解析するツールとして期待される.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。助細胞胚乳融合は,発達する胚乳が残存助細胞を融合・吸収する現象として発見されてきた.受精に依存せずに自律的に胚乳が発達するポリコーム抑制複合体2 (FIS-PRC2)の変異体であるmsi1変異体を解析したところ,自律的に胚乳が発達した胚珠においても助細胞胚乳融合が誘導することがわかった.これにより,FIS-PRC2の下流で制御される胚乳発達因子の中に助細胞胚乳融合に必須の因子が存在することが示唆された.一方,受精直後の胚珠を取り出してin vitroで培養し,様々な阻害剤で処理したときの助細胞胚乳融合への影響を解析したところ,受精後に起こる新規遺伝子発現や胚乳核分裂を制御するサイクリン依存性キナーゼ(CDK)活性が助細胞胚乳融合の制御に重要な役割をはたすことが示唆された.また,順遺伝学的なアプローチとして,最初に助細胞胚乳融合をきっかけにして種子の致死を引き起こすような植物体の作出を目指していたが,細胞融合後も遺伝子発現のスイッチとなるはずのGAL4-tagRFPが小胞体膜上から核内へと移行する様子は見られず,遺伝学の材料としては適さないことが明らかとなった.一方で,逆遺伝学的アプローチの手がかりを得るために,受精直後の胚乳で特異的に発現する遺伝子の解析を目指している.胚乳特異的に発現をするFWAのプロモーター領域を用いて,核膜をビオチンラベルする形質転換体を作出しているところである.これにより,INTACT法とよばれる細胞核回収手法で初期胚乳の核を単離する準備を進めているところである.被子植物の花粉管誘引は受精後間もなく起こる助細胞胚乳融合によって急速に停止することが知られている.助細胞胚乳融合は重複受精によって強く誘導されるが,受精非依存的な自律的胚乳発達によっても起こるかどうか明らかではなかった.そこで,種子発達を負に制御するポリコーム抑制複合体2 (FIS-PRC2)の変異体を解析した.msi1変異体の雌しべを除雄して2日後の胚珠を蛍光観察したところ,助細胞をラベルしていた緑色蛍光蛋白質GFPの蛍光が自律的に発達する胚乳へと移動することがわかった.これにより,FIS-PRC2の下流で制御される胚乳発達因子の中に助細胞胚乳融合に必須の因子が存在することが示唆された(Motomura et al.; Cell Struc. Funct. ;2017).一方,受精直後の胚珠を取り出してin vitroで培養し,様々な阻害剤で処理したときの助細胞胚乳融合への影響を解析したところ,タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドや転写阻害剤であるコルジセピンで処理をすると,受精後の胚珠における助細胞胚乳融合は顕著に阻害された.同様の阻害作用はCDKの阻害剤のロスコビチンでも確認されたことから,受精後の新規の遺伝子発現や胚乳核分裂自体が助細胞胚乳融合において重要な役割をはたすことが明らかとなった(論文投稿中).研究代表者が名古屋大学から横浜市立大学へと異動した関連で,名古屋大学のITbMとのケミカルライブラリーの使用契約の締結に時間がかかっていたが,年度内に契約を完了することができた.上記の薬理学的解析でも示唆されたように,助細胞胚乳融合において必要とされる遺伝子の一部は受精後に発現を開始する.初期胚乳で特異的に発現する遺伝子の同定にむけて,胚乳特異的に発現をするFWAのプロモーター領域を用いて,核膜をビオチンラベルする形質転換体を作出しているところである.植物細胞の周辺は厚い細胞壁に覆われていることから,細胞同士が接触を必要とする細胞融合現象は起こらないと考えられていた.

ただ,雌側組織である胚珠の内部に存在する2つの雌性配偶子,卵細胞と中央細胞の受精のみが被子植物の発生において例外的に起こる細胞融合として知られていた.近年,われわれのグループは,受精した中央細胞,すなわち胚乳が隣に位置する助細胞を融合・吸収することを明らかにした.29年度,われわれはこの助細胞胚乳融合現象が,受精後の新規遺伝子発現や胚乳核分裂を制御するサイクリン依存性キナーゼ(CDK)活性に依存することを原著論文として報告した.また,シロイヌナズナの胚珠の助細胞や胚乳において,助細胞胚乳融合が起こる前後のカルシウム動態を解析した研究を展開した.さらに,助細胞胚乳融合が起こった後に残存助細胞由来のミトコンドリアが胚乳由来のミトコンドリアと融合していく過程のライブイメージングを行った.これらの成果については現在論文を執筆中である.順遺伝学的アプローチでは,自家受精後の胚珠の約25%が助細胞胚乳融合をしない変異体(#17)が得られた.この変異体を親株と相互に交配したところ,助細胞胚乳融合欠損を示す胚珠の頻度が25%よりも低かったことから,この表現型が潜性であることが示唆された.驚いたことに,変異体の雌しべにおける花粉管の伸長パターン解析から,助細胞胚乳融合が欠損していても残存助細胞の不活性化への影響が限定的であることが示唆された.原因遺伝子のマッピングに向け,変異体#17と親株との戻し交配が完了した.これまでわれわれは,助細胞特異的にミコトンドリア局在シグナルを付加したmTFP1を発現する植物が,発生が進んだ種子においても助細胞胚乳融合が起きたかどうかを明瞭に判断することができるマーカーラインとして適していることを見出していた.この株に対して,EMSによる変異誘導を行い,2213個体のM1世代を生育させ,自家受粉した雌しべを解剖して蛍光顕微鏡観察を行った.通常,胚乳核が432個になった胚珠ではmTFP1でラベルされた助細胞のミトコンドリアが助細胞胚乳融合によって胚乳へと流出する.これに対し,胚乳核の分裂がみられるものの,助細胞のミトコンドリアが胚乳へと流出しない胚珠の頻度が10%を上回る変異体候補を41個体選抜した.さらにそのM2世代まで表現型が伝達されるかどうか調べる二次スクリーニングの結果,自家受精後の胚珠の約25%が助細胞胚乳融合をしない変異体が1つだけ(#17)得られた.また,変異体を親株と相互をしたときに助細胞胚乳融合の欠損が生じる頻度は,自家受精の場合よりも低かった.これは受精後の胚乳において父側か母側のどちらかが野生型であれば他方の機能欠損を補うことができることを示唆する.現時点で変異体#17と親株との戻し交配が完了しており,原因遺伝子のマッピングに向けた準備が完了した.植物細胞の周辺は厚い細胞壁に覆われていることから,細胞同士が接触を必要とする細胞融合現象は起こらないと考えられていた.ただ,雌側組織である胚珠の内部に存在する2つの雌性配偶子,卵細胞と中央細胞の受精のみが被子植物の発生において例外的に起こる細胞融合として知られていた.近年,われわれのグループは,受精した中央細胞,すなわち胚乳が隣に位置する助細胞を融合・吸収することを明らかにした.本研究ではこの助細胞胚乳融合と命名した新規の植物細胞融合現象の分子メカニズム解明とその生理学的役割の解明を計画していた.30年度では,助細胞胚乳融合についてわれわれが注目している新機能,すなわち,受精後の胚珠が過って後発の花粉管を受容したとき,不要な精細胞を受精の場へと送るかわりに胚乳へと廃棄する最終的な精細胞の経路選択機能を明らかにした.
日中両言語における人をさし示す言葉の対照研究-琉球方言、中国南方方言との比較研究も含めて-

琉球方言に属する奄美諸島方言の親族名称やヒト代名詞は本土日本語と、いくつかの点で異なっている。親族名称の中でも大きな違いとして、「男称」male speaking-「女称」female speakingという、標準語ほかにみられない軸にそった対立の存在が挙げられる。この対立は、古代日本語にその存在が指摘されることがある。昨夏の調査でも、奄美大島方言で基本的にこの軸を保持していることが確認できた。同島大和浜方言に関しては、この軸にかかわる親族名称に、語構成の点で複合名詞として現れる二次的な単位が指摘されている。そして、奄美大島方言に見られる、親族名称の意味内容の変動も、本土日本語と一致していない。ははおやを指し示す単語に時代差があって、同じ単語が母親をさしたり、祖母をさしたりすることがある。この現象も確認できた。一方、奄美諸島方言のヒト代名詞に関しては、標準語や本土方言の多くとは違って、一般言語学的にみて、むしろふつうのヒト代名詞体系と異ならない、と松本はみている。奄美大島方言では、1人称複数にミウチ形exclusiveとミウチ-アイテ形inclusiveの対立が今回の調査で見られなかった。陳露は中国語における人を指し示すコトバについで調査した。共通語の指示代名詞の核となる「〓」「那」に指示対象と話し手の間における「モノとヒト」の関係のみを反映しているので、指示詞運用においては、話し手と他者の間における「ヒトとヒト」の関係は指示詞選択に殆ど反映されずにその人称代名詞の意図的な使用または回避によって反映されると考えられる。一方、粤方言に一人称代名詞に排除式と包括式の区別がないとされているが、粤方言の下位区分にある広西の博白方言「地老話」では一人称代名詞に排除式と包括式の使い分けが見られた。また、同地域における親族語彙の使用も、自分の両親を「オジサン」「オバサン」または「オニーサン」「アニヨメサン」と呼ぶ人がいるなどその多様性が見られた。
骨形成促進の分子基盤解明

骨細胞への分化におけるエピゲノムに着目し、分化培地で4週間以上培養したMC3T3E1細胞では、骨細胞マーカーの十分な発現を認めなかった。このことから、骨細胞マーカー遺伝子の転写開始点におけるヒストンH3のK4およびK27のメチル化修飾を評価したところ、ともに修飾されたbivalentな状態であった。そこで、転写抑制性修飾であるK27の脱メチル化酵素の一つであるKdm6Aに着目し、Kdm6A遺伝子座にloxP配列を挿入したKdm6Afloxマウスを作出した。骨芽細胞から骨細胞への分化におけるエピゲノム修飾変化ならびにその制御因子を同定することができれば、新たな骨粗鬆症疾患病態を紐解くことが可能になり、様々な新規治療技術への応用が期待できると考え、本研究の着想に至った。骨芽細胞から骨細胞への分化過程の詳細は全く不明であり、一般的な培養細胞を用いた分化系では骨芽細胞から骨細胞への分化は認められない。そこで、骨芽細胞系細胞株MC3T3E1細胞を分化培地(アスコルビン酸、βグリセロリン酸含有)にて3週間の培養を行い、経時的に細胞を回収した。まずRNAを抽出し骨芽細胞および骨細胞マーカー遺伝子の発現を定量的RT-PCR法にて評価した。同時に、各遺伝子の転写開始点(TSS)近傍のヒストン修飾変動を観察するため、代表的転写活性化および不活性化修飾であるH3K4me3およびH3K27me3のクロマチン免疫沈降反応(ChIP)を行った。その結果、RT-PCRで転写亢進が確認された骨芽細胞マーカー遺伝子のTSSでは、H3K4me3のみが上昇しているのに対し、3週間の培養でも転写亢進が認められなかった骨細胞マーカー遺伝子のTSSでは、H3K4me3およびH3K27me3の両方の修飾が亢進しているbivalentな状態であった。このことから、骨芽細胞から骨細胞への分化には、転写不活性化を制御するH3K27me3修飾の脱メチル化が必須であると考えられた。H3K27の脱メチル化酵素としてJmjd3およびUtxが同定されている。我々は、このうち、骨粗鬆症患者数には性差があることから、X染色体上に座位するUtxに着目し、現在、floxマウスを作出中である。今後、骨(芽)細胞特異的Utx遺伝子欠損マウスを作出、解析する事で、骨細胞分化におけるエピゲノム制御機構の意義が明らかとなり、新たな骨形成促進薬開発へと繋がることが期待される。複数の骨芽細胞系細胞株をアスコルビン酸およびβグリセロリン酸含有骨芽細胞分化培地にて培養し、経時的に細胞を回収。マーカー遺伝子の発現にて、後期骨芽細胞分化が進んでいるものの骨細胞特異的遺伝子の発現が認められない事を確認した。このように後期骨芽細胞分化させた状態で、骨細胞特異的遺伝子の転写開始点(Transcriptional Start Site:TSS)領域における転写活性化および抑制化の指標であるヒストン修飾(H3K4me3およびH3K27me3)のクロマチン免疫沈降反応(ChIP)を行い、骨細胞特異的遺伝子であるSost (Sclerostin)のTSSにおけるヒストンメチル化修飾を評価したところ、転写活性化および抑制化の両方の修飾が認められ、Bivalentな修飾状態であることを確認した。この結果から、後期骨芽細胞から骨細胞への分化には、抑制的ヒストン修飾であるH3K27の脱メチル化が重要である事が考えられた。骨芽細胞系細胞株を分化培地で培養し分化させた状態で、骨細胞特異的遺伝子の転写開始点領域におけるヒストン修飾(H3K4me3およびH3K27me3)のChIPを行い、Bivalentな修飾状態であることを確認した。骨細胞マーカー遺伝子の発現が転写開始点においてBivalentな修飾状態で抑制されていることから、発現抑制の指標であるH3K27me3修飾が問題となる。H3K27me3の脱メチル化酵素であるJMJD3およびUTXの強制発現系により脱メチル化を確認し、骨細胞分化が進むか否かを評価する。その上で、各脱メチル化酵素の遺伝子欠損マウスを作出し、生体内における骨細胞分化を評価する。上記の推進方策に則り、培養細胞レベルおよびマウスを用いた解析を遂行する目的で、主に試薬やマウスなどの物品購入費に使用する予定である。
犬の自然発生腫瘍を用いた血管新生阻害剤と分化誘導剤による腫瘍休眠療法の検討

悪性腫瘍が自然発生した犬に、開発研究段階の抗腫瘍薬である血管新生阻害剤TNP-470および/あるいは分化誘導剤OCTを投与し、これらの薬剤の副作用をおもに調べ、さらに可能な範囲で抗腫瘍効果について調べた。これらの研究薬による致死的な副作用を避けるために、低用量から開始し、副作用を認めなければ、主に24週毎に投与量を増加した。TNP-470は、1回あたり12.5223mg/m^2の量で、皮下あるいは静脈内に週13回の割合で投与した。この研究薬は42症例に使用し、副作用と考えられる徴候として、ふらつきあるいは震えが7症例に認められ、次いでけいれん発作が3症例に、出血、食欲低下および嘔吐がそれぞれ1症例に認められた。これらの臨床徴候と投与量には有意な関係は認められなかった。血液検査においては、赤血球数の減少、白血球数の増加、クレアチニン値の上昇およびアルカリフォスファターゼ値の上昇を認めたが、重篤なものはなかった。OCTは、1回あたり0.030.12μg/kgの量で毎日経口投与した.この研究薬は、26症例に投与されたが、2週以上にわたり投与された21症例中7症例に高Ca血症が認められた。このうち5症例は0.03μg/kgの投与量によって6週以内に生じたが、残りの2症例は0.12μg/kgまで増量した半年後に生じた。高Ca血症は休薬によって1週以内に正常に復した。他の血液生化学検査においては白血球数の増加を認めたが、重篤なものではなかった。抗腫瘍効果に関しては、比較対照がないため腫瘍の成長速度や遠隔転移率を抑制しているかを明らかにすることは難しかったが、原発巣あるいは転移巣に縮小が認められた。また、高率に転移が生じる骨肉腫などの症例においては、長期にわたって転移が生じない症例も認められた。以上のことから、今回用いた新規血管新生阻害剤と分化誘導剤は、従来の抗癌剤と比較して重篤な副作用は極めて少なく、また腫瘍が縮小する症例を認めたことから、腫瘍休眠療法を目指す治療薬としてさらに検討する価値が大きいと思われた。悪性腫瘍はいまだ致死率の高い難病であり、種々の抗癌剤の開発・研究が進められているが、そのほとんどが細胞毒性薬であるため、重篤な副作用により患者のQOLが損なわれることが多い。このため、腫瘍を根治するのではなく沈静化させることによって腫瘍と共存しQOLを維持しようとするTumor Dormancy Therapyが注目されてきている。そこで本研究においては、ともに生体への毒性が小さい血管新生阻害剤と分化誘導剤を併用することによってより確実かつ強力に腫瘍のDormancyを誘導できないかどうかを、犬の腫瘍症例を用いて評価を開始した。対象症例は、北海道大学獣医学部附属動物病院で治療中の腫瘍罹患犬のうち、飼い主と十分なインフォームドコンセントの上で治験の了解が得られた犬とした。平成12年度は20症例ほどに開発段階にある血管新生阻害剤であるTNP-470あるいは分化誘導剤であるOCTを試験的に投与することができた。

投与にあたっては、致命的な副作用を避けるために、安全な低用量から開始し、2週間投与後副作用を認めなければ投与量を漸増する方法を採り、また対象腫瘍症例は現状の一般療法(外科療法、化学療法、放射線療法)では改善が見込めない末期症例とした。このため、薬剤の投与量が十分に増加でき、かつ長期観察可能な症例はごく一部の症例のみであった。しかしながら、腫瘍が脱落した症例、転移が長期抑制された症例、転移巣がわずかに縮小した症例を認め、これらの薬剤の有用性が示唆されている。平成13年度は、さらに症例を重ね、これらの薬剤の有用性を明らかにする計画である。悪性腫瘍はいまだ致死率の高い難病であり、種々の抗癌剤の開発・研究が進められているが、そのほとんどが細胞毒性薬であるため、重篤な副作用により患者のQOLが損なわれることが多い。このため、腫瘍を根治するのではなく沈静化させることによって腫瘍と共存しQOLを維持しようとするTumor Dormancy Therapyが注目されてきている。そこで本研究においては、ともに生体への毒性が小さい血管新生阻害剤と分化誘導剤を併用することによってより確実かつ強力に腫瘍のDormancyを誘導できないかどうかを、犬の腫瘍症例を用いて評価を開始した。対象症例は、北海道大学獣医学部附属動物病院で治療中の腫瘍罹患犬のうち、飼い主と十分なインフォームドコンセントの上で治験の了解が得られた犬とした。投与にあたっては、致命的な副作用を避けるために、安全な低用量から開始し、24週間投与後副作用を認めなければ投与量を漸増する方法を採り、また対象腫瘍症例は現状の一般療法(外科療法、化学療法、放射線療法)では改善が見込めない末期症例とした。平成13年度は、前年度に引き続き、治験症例数を増やし、各薬剤による副作用と抗腫瘍効果について観察した。治験症例数は血管新生阻害剤であるTNP-470単独で26症例、分化誘導剤であるOCT単独で10症例、および両者の併用で16症例となった。薬剤の投与量が十分に増加でき、かつ長期観察可能な症例は少数であったが、重篤な副作用は認められなかった。また、腫瘍が脱落した症例、転移が長期抑制された症例、転移巣がわずかに縮小した症例を認め、これらの薬剤の有用性が示唆されている。
マイクロマニピュレータによる細胞レベルでの果実への糖蓄積機構の解析

マイクロマニピュレータを用いて、数種果樹の果実から単一細胞の液胞液を採取し、その糖含量及び組成を分析することで、果実内での糖蓄積機構をインタクトな単一細胞レベルで解析することを目的として、以下の実験を行った。1.果実の単一細胞からマイクロマニピュレータにより採取した液胞液を用いて、その糖含量と糖代謝を測定する分析法を検討した。その結果、カバーガラス上のパラフィンオイルで覆った酵素液ドロップ中で糖特異的な酵素反応を促し、生じるNADPH量を倒立顕微鏡に装着した顕微測光装置で測定することにより、ブドウ糖・果糖・ショ糖・ソルビトール含量およびインベルターゼ活性をそれぞれ高精度で測定することが可能であることが確かめられ、単一細胞中の糖含量・代謝の測定法を確立することが出来た。2.果実の単一細胞中の浸透圧調節機能を解析するため、浸透圧、無機イオン(カリウム)含量をマイクロマニピュレータにより採取した単一細胞の液胞液によって測定する方法を検討した。その結果、ピコリッターオズモメーターにより浸透圧を、X線マイクロアナライザーを装着した走査型電子顕微鏡によりカリウム含量を定量する方法を確立した。3.上記の方法により、カキ・ブドウ・モモ・ナシ・リンゴについてそれぞれの果実の1つの柔細胞における糖組成、浸透圧、カリウムイオン濃度を成熟期前後に測定し、樹種間での糖蓄積過程の差異とともに同一果実内での部位別による糖蓄積過程の差異を細胞レベルで解析した。その結果、何れの樹種でも果実全体を用いて測定した糖組成と単一細胞中の糖組成はパラレルであること、および成熟に伴う細胞の浸透圧上昇が糖含量の上昇に起因することが細胞レベルで確かめられた。また、樹種によって、果実の部位により細胞の糖組成に差異がみられる場合とそうでない場合があり、樹種によって糖蓄積機構に違いがあることが示唆された。マイクロマニピュレータを用いて、数種果樹の果実から単一細胞の液胞液を採取し、その糖含量及び組成を分析することで、個々の細胞での糖蓄積パターンを再評価し、果実内での糖蓄積機構をインタクトな単一細胞レベルで解析することを目的として以下の実験を行った。1.まず、ブドウ'ピオーネ'、'ネオマスカット'、'マスカットベリーA'の3品種を用い、単一細胞からマイクロマニピュレータにより採取した液胞液を用いて、その糖含量を測定する分析法を検討した。その結果、カバーガラス上のパラフィンオイルで覆った酵素液ドロップ中で糖特異的な酵素反応を促し、生じるNADPH量を倒立顕微鏡に装着した顕微測光装置で測定することにより、ブドウ糖・果糖・ショ糖の含量をそれぞれ高精度で測定することが可能であることが確かめられ、単一細胞中の糖組成・含量の測定法を確立することが出来た。2.次に、カキ果実において、これまでの果実全体を用いた糖分析の結果より、ショ糖を高い割合で蓄積するとされる品種とブドウ糖・果糖の還元糖を高い割合で蓄積するとされる品種を用い、その果肉の単一柔細胞からマイクロマニピュレータによって液胞液を採取し、先に確立した方法で各糖組成・含量を計測した。その結果、これまでの果実全体での測定と同じ結果が得られ、単一細胞中で糖蓄積の差異が品種間でみられることが確認できた。さらに、この糖組成の差異をもたらす原因と考えられているインベルターゼ活性を単一細胞の液胞液を用いて測定したところ、その活性と液胞中の糖組成に明かな相関が認められ、単一細胞中での糖代謝解析の可能性が示された。さらに、ナノリッターオズモメーターを用いて、液胞液を用いたナノリッターレベルでの浸透圧の測定方法を検討し、糖蓄積との関係を考察した。

マイクロマニピュレータを用いて、数種果樹の果実から単一細胞の液胞液を採取し、その糖含量及び組成を分析することで、果実内での糖蓄積機構をインタクトな単一細胞レベルで解析することを目的として、本年度は以下の実験を行った。1.まず、様々な果樹の樹種において、昨年度カキ、ブドウ果実で確立した糖蓄積過程の解析が可能かどうかを調査する目的で、モモ'あかつき'・'清水白桃'、ナシ'二十世紀'、リンゴ'ふじ'を用い、単一細胞からマイクロマニピュレータにより液胞液を採取した。ここで、バラ科果樹ではこれまで測定法を確立したショ糖、ブドウ糖、果糖に加え、ソルビトールを果実内に蓄積するため、その測定法についてまず検討した。その結果、これまでと同様の方法で、ソルビトール脱水素酵素を用いた酵素反応によって生じるNADPH量を顕微測光装置で測定することにより、ソルビトールを細胞レベルで定量することが可能であることが確かめられた。そこで、これらの樹種について成熟期に単一細胞中の糖組成・含量、浸透圧、カリウム含量を測定したところ、特にリンゴ'ふじ'では糖組成・含量が採取した細胞間でかなり変異のあることが明らかとなった。2.次に、ブドウ'ネオマスカット'果粒において、果粒維管束からの距離が異なる単一柔細胞からそれぞれ液胞液を採取し、部位別での糖蓄積過程に差異があるかどうかをマイクロマニピュレータを用いて解析した。その結果、ショ糖含量は成熟期まで低い濃度で推移し、ブドウ糖及び果糖はベレゾーン以降急激に増加したが、採取した何れの部位の細胞においても同様の傾向を示し、部位による差異はなかった。また、浸透圧、カリウム含量についても部位別の差異は認めらなかった。ブドウ'ネオマスカット'は、糖蓄積に関して果粒内のどの細胞も均質な機構をもっていると考えられた。