hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語母語児童への国語教育と非母語児童への日本語教育を言語環境から再構築する試み

外国にルーツのある児童が2割を超えている、大阪のある公立小学校において、日本語と母語の両言語について、会話能力のテストと読書力(読解力、読書行動プラス読書習慣)の対話型評価を行った。また保護者には言語環境についてアンケート調査を行った。多くの中国ルーツの児童は、中国語が聞いてわかる「聴解型」か「会話型」、あるいは中国語の運用能力のほとんどない「日本語モノリンガル」になっており、2言語で読み書きもできるのは、非常に少数であった。1.目的本研究は、外国人児童の多い大阪府下の公立小学校において、これまでは別々に議論されてきた「国語教育(日本語母語児童)」と「日本語教育(非日本語母語児童)」を、日本で成育する全ての子どもにとって「学力」を伸ばす「よりよい言語環境」とは何かという視点から、再構築しようとするものである。2.実施状況(1)ある公立小学校において、前年度までに行った読書力テスト(DRA-J : Developmental Reading Assessment-Japanese)をもとにしたツールを用い、教員研修を行った上で、児童の言葉の力を見る調査を始めた。まず1年生の日本語の会話力と読書力を調査した。日本語母語児童(11名)と、中国ルーツの児童(6名)、それ以外の国際児(1名)の計18名である。さらに、そのうちの中国語を母語とする児童(6名)には、両言語の能力の差異を見るため、新しく開発中の中国語読書力テスト(DRA-C)を使って、パイロット的に中国語の言葉の力を見る調査を行い、現在結果を分析中である。(2) (1)の被調査者の保護者に、児童のテスト結果を個別にフィードバックして、言葉の力増進への提案を行うと共に、家庭での言語環境に関する調査を実施しているところである。(3)上記(1)と(2)を行った小学校とは別の小学校においても、日本語の非母語児童についての状況を把握しているところである。複数の公立小学校の外国人児童への言葉の指導(「取り出し」と、「入り込み」指導の現場)の実態を非参与観察し、教室環境や指導内容に関する提言を行い、変化を観察中である。異なる母語とニーズを持つ児童の指導に当たる教員にとっては、子どもの「学力」に密接に関連する言葉の力を把握することは喫緊の課題であり、本調査の意義が認められる。1.目的本研究は、外国人児童の多い大阪府下の公立小学校において、これまでは別々に議論されてきた「国語教育(日本語母語児童)」と「日本語教育(非日本語母語児童)1を、日本で成育する全ての子どもにとって「学力」を伸ばす「よりよい言語環境」とは何かという視点から、再構築しようとするものである。2.実施状況(1)ある公立小学校において、前年度に読書力テスト(DRA-J : Developmental Reading Assessment-Japanese)をもとにしたツールを用いて1年生の日本語の会話力と読書力を見る調査のデータ収集を行ったが、本年度はまずその分析を行った。日本語母語児童と、中国ルーツの児童とそれ以外の国際児に行ったものである。そのうち中国語を母語とする児童には両言語の能力を見るため、開発中の中国語読書力テスト(DRA-C)を使って、パイロット調査を行い、分析をした。(2) (1)の子どもたちの保護者に、家庭での言語環境に関する調査を行い、データを分析した。(3) (1)、(2)の結果に基づき、学会発表(言語政策学会でのパネル発表)を行っただけでなく、大阪府下の日本語指導に関わる教員のためのワークショップも2回行った。参加者は、50余名と30名であった。(4)前年度に引き続き、今年度は3年生と1年生について、特に中国ルーツの子どもたちを中心に、両言語の力を見る調査を行った。データを分析中である。(5) (4)の児童の保護者についても家庭の言語環境に関する調査を実施中である。(6)上記(1)-(5)を行った小学校とは別の小学校においても、日本語の非母語児童についての状況を把握しようとしているところである。本研究は、大阪府下の公立小学校において、増加する外国にルーツを持つ児童への二言語(母語と日本語)教育のあり方を考えることで、クラスメートとして同じ環境で学んでいる日本人児童(日本語母語児童)への国語教育をも視野に入れた、どの児童にもプラスになる教育を目指すための基礎的研究を行った。外国にルーツを持つ児童への教育が喫緊の課題となっている現場において、「教育現場の意向を尊重する」という立場を最優先にするために、日本語非母語話者児童の言語能力について、日本語と母語である中国語の能力を調べ、また保護者の意識調査と合わせて、言語教育環境を考察することを、中心的課題とした。全校児童の2割を中国ルーツの児童が占めているK小学校を中心的調査地として、中国ルーツの児童へは2言語の調査を行った。

実質的に2年余りの調査期間中に、16年生ののべ人数で日本語テスト77名、中国語テスト44名の児童が、対面型言語能力アセスメントの調査協力者となった。日本語テストはバイリンガル児のための基礎会話力、語彙力、認知力のアセスメントである「OBCテスト」と、読書力を評価する「対面型読書力テスト(DRA-J)」を使用した。中国ルーツの児童については、口頭能力は中国語による「OBCテスト」、読書力については、本研究の一環として開発した「中国語版読書力テスト(BーDRA-C)」を使用した。日本生まれまたは幼少期に来日した児童たちの言語能力は個人差が大きく、母語が獲得できていない「日本語モノリンガルに近い」児童、読み書きはできないが「OBCテスト」はできた「聴解型バイリンガル」がほとんどであり、「4技能バランス型バイリンガル」はごく少数であった。言語環境によるところが大きいが、保護者への働きかけが活発になりつつある現場なので、学校、家庭との協力を得て、今後の縦断的調査研究が必要であると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
固体の変形破壊と欠陥過程にともなう電子・イオン・光子の放射現象とその応用に関する研究

1.本総合研究は,平成5年7月24日大阪科学技術センター,同年11月20日茨城大学共同研究開発センター及び平成6年2月4,5日奈良教育大学教育実践研究指導センターにおいて合計3回の研究集会を開き,標記課題について以下の成果をあげた.2.固体の変形破壊にともなうフラクト放射に関しては,低温における水晶からのフラクト放射,MgO単結晶からの破壊放射の真空度依存性,SiO_2系固体のフラクト熱放射パルスの分光法およびこれによる瞬間温度測定等を明かにした.3.固体の欠陥過程によるエキソ放射研究では,KCl等の変形発光とTLへの加圧効果,MgO単結晶のエキソ電子エネルギースペクトルの特徴,未照射非晶質合金の加熱に伴うエキソ電子放出,岩石からのTSEE像の観察法,Alチップからの電界刺激エキソ電子放射の起原,インコネル合金からのエキソ電子放射の特徴,LiNbO_3単結晶やCa_5(PO_4)_3OH:Cuの熱刺激によるエキソ電子放射特性,ルンゲ-クッタ-ギル法によるTSEEグロー曲線解析法等が明かにされた.4.気体の吸着脱離とエキソ・フラクト放射の関連についてはニッケル酸化膜の性状との関係及びトライボ化学反応との関係が明かにされた.5.摩耗・破壊の解析への応用は各種材料の潤滑面,切削面等について試みられた.1.本総合研究は,平成5年7月24日大阪科学技術センター,同年11月20日茨城大学共同研究開発センター及び平成6年2月4,5日奈良教育大学教育実践研究指導センターにおいて合計3回の研究集会を開き,標記課題について以下の成果をあげた.2.固体の変形破壊にともなうフラクト放射に関しては,低温における水晶からのフラクト放射,MgO単結晶からの破壊放射の真空度依存性,SiO_2系固体のフラクト熱放射パルスの分光法およびこれによる瞬間温度測定等を明かにした.3.固体の欠陥過程によるエキソ放射研究では,KCl等の変形発光とTLへの加圧効果,MgO単結晶のエキソ電子エネルギースペクトルの特徴,未照射非晶質合金の加熱に伴うエキソ電子放出,岩石からのTSEE像の観察法,Alチップからの電界刺激エキソ電子放射の起原,インコネル合金からのエキソ電子放射の特徴,LiNbO_3単結晶やCa_5(PO_4)_3OH:Cuの熱刺激によるエキソ電子放射特性,ルンゲ-クッタ-ギル法によるTSEEグロー曲線解析法等が明かにされた.4.気体の吸着脱離とエキソ・フラクト放射の関連についてはニッケル酸化膜の性状との関係及びトライボ化学反応との関係が明かにされた.5.摩耗・破壊の解析への応用は各種材料の潤滑面,切削面等について試みられた.
紡錘体チェックポイント終了に働くＳＩＲＴ２分子がオートファジーを抑制する意義

紡錘体チェックポイント(以下SAC)は、染色体が微小管と正しく結合するまで分配されないよう分裂期に停止させる監視機構であり、その破綻は発がんに直結する。SAC-Onの機序の理解が進み、最終的にCyclin B/Cdk1活性を維持し分裂期停止に導くことが分かっている。一方、SAC-On細胞をSAC-Offに移行させ細胞周期を再開させる機構は不明であった。この機構として、SIRT2によるオートファジー制御が重要であること、その仲介経路としては当初予想していた中心体ではなく、オートファジー配下のある経路の活性が変化していることを突き止めた。今後この経路をSAC-Offの制御候補経路とし解析を進める。脱アセチル化酵素SIRT2は紡錘体チェックポイントからの細胞死を誘導する。この機構としてオートファジーを抑制していることが、オートファジー実行因子の共ノックダウンから明らかになった。紡錘体チェックポイントからの細胞死を誘導には活性化された紡錘体チェックポイントを適切なタイミングで終了させ、Pseudo G1期に移行させることが必要であることが分かっているが、紡錘体チェックポイントが活性化されている際にオートファジーが活性化されていると紡錘体チェックポイントを不活性化するタイミングが遅れ、Pseudo G1期への移行も阻害されることがわかった。オートファジーはミトコンドリアのような巨大構造物を分解の標的とすることから、当初、オートファジーの標的として中心体断片化を候補としていたが、中心体断片化はオートファジーを抑制しても大きな変化は認められず現時点では標的となるかどうか不明である。しかし新たな標的として核分裂の異常形態のひとつである微小核形成が浮上した。それはオートファジー亢進時においては微小核形成が阻害されていたことに基づき。ひとつの可能性として紡錘体チェックポイント活性化されている際のオートファジー亢進は微小核形成を標的としている可能性があると考えている。微小核形成が異常核型を示す細胞の細胞死誘導の引き金であるという報告があり、この仮説とも合う。微小核はM期-Pseudo G1期移行に伴い形成されるが、オートファジー亢進により微小核形成が阻害されることがこの移行を阻害していることを示唆する。更に興味深いことに、SIRT2ノックダウンだけではなく、薬剤処理によりオートファジー活性化を誘導すると全く同じ現象が見られることから、紡錘体チェックポイント活性化時におけるオートファジー抑制の意義は普遍的なものであると考えられる。脱アセチル化酵素SIRT2は紡錘体チェックポイントからの細胞死の一つ、Post-slippagecell deathを誘導する。これは4倍体化した細胞で起こるゆっくりとした細胞死であり、紡錘体チェックポイントからのもう一つの細胞死であるmitoticcell deathと比べ不明の点が多い。この二つの細胞死は微小管阻害剤の抗癌剤として作用基盤となっており、とくにPost-slippage cell deathの理解が制癌上重要である。本研究では、Post-slippage cell deathが起こるためには、SIRT2のどのような機能が重要であるのかを調べ、SIRT2によるオートファジー抑制が必須であることを明らかにした。SIRT2によるオートファジー抑制がなぜこの細胞死を誘導するのか、その機序を探った結果、オートファジーの標的として4倍体細胞での微小核形成が起こることが重要であると考えられた。実際、微小管阻害剤処理により紡錘体チェックポイントを長期活性化誘導すると、SIRT2ノックダウン細胞では対象細胞と比べ微小核形成のタイミングが遅れる。以上の現象は、オートファジーを薬剤処理で誘導した際にもSIRT2ノックダウンと同様に観察されたことから、SIRT2の分子機能を超え、オートファジー制御、微小核形成、Post-slippage cell deathの関係はより普遍的な関係であると結論した。この三者の関係についてさらに検討を加えた。オートファジーはその配下にさまざまな標的経路を持つが、そのうちのある経路AについてSIRT2ノックダウン細胞で活性化していることを見いだした。他の経路も検討するとともに、この経路が後に起こる微小核形成、Post-slippagecell deathに重要なのかどうかを検討している。紡錘体チェックポイント(SAC)を誘導した場合(SAC-On)、SIRT2ノックダウン細胞でオートファジーが亢進していることは、GFP融合LC3(オートファゴソームのマーカー)のドット形成の観察による。この点をより確かなものとするために、生化学的にLC3、p62を評価系のイムノブロットで追認した。今後オートファジーレベルの定量的評価にはこれらを併用することとした。

電顕観察でのオートファゴソーム形成の亢進での確認を進めている.H23年度では、SIRT2によるオートファジー抑制がSAC-Offへの移行に必要なことをオートファジー実行に必要な分子のノックダウンにより明確に示すことができた。またSIRT2によるオートファジー抑制にはHDAC6が関与し、HDAC6はSIRT2と同じ経路上でオートファジーのレベルの制御を行なっていることを明らかにした。このようにSIRT2によるSACからの細胞死誘導にはオートファジーの抑制が関与していること、そしてここに関わる分子としてHDAC6を提示するに至った。HSP70.2はHDAC6と同様にSIRT2と結合する蛋白として同定し、HDAC6と同様にSIRT2と同じ経路で働くことを予想していたが、HSP70.2に対する複数のsiRNAを用いて検討したところ、HSP70.2をノックダウンできるにも関わらず、SIRT2 siRNAによるオートファジー亢進を抑制できないものがあり、単にsiRNAのサイドエフェクトの可能性が排除できない。HSP70.2についての解析はペンディングにしている上記の解析においては、SIRT2ノックダウン時に見られるSAC時の中心体の断片化についても解析した。その結果SAC-Onからの細胞死誘導と中心体の断片化もレベルの相関することも確認でき、オートファジーとSACからの細胞死誘導、中心体の断片化がよく関連することが分かった。微小管阻害剤など紡錘体チェックポイントを発動させる薬剤の抗癌作用は、M期停止中の細胞死、加えてM期完了せぬままG1期にスリップした四倍体細胞での細胞死(PSCD)誘導にある。本研究ではPSCDを標的とした制癌法開発をめざし、我々は効率的なPSCDに必要な分子としてSIRT2に着目し解析を進め、そのオートファジー制御機能がPSCDのレベルを制御することが分かった。そこで平成26年度は、オートファジーとの関連が知られる転写因子活性化のシグナル経路についてその関与を探った。その結果、SIRT2をノックダウンした細胞(PSCDが不全になった細胞)で、ある経路についてその活性化が起こっていることが、これに深く関わるタンパク分子の局在変化から分かった。この経路の活性化が実際PSCDのレベルを制御するかどうかを検討している。さらにある細胞周期制御分子の高発現がPSCDのレベルとよく相関すること、そしてこの分子の発現レベルを人為的に変えることでSIRT2ノックダウンの表現型がrescueされることが新たに分かった。この細胞周期制御分子の発現制御、オートファジー制御、先述のオートファジーとの関連が知られる転写因子活性化経路の三つの相互関連を解明していくことでPSCDの詳細な機序に今後迫ることができる。染色体医工学SIRT2が紡錘体チェックポイントからの細胞死を誘導する機序としてオートファジー関与を明確に提示できた。そして細胞死誘導を微小核形成を、オートファジーによる分解の新たな標的として提示できた。さらにこの現象がSIRT2分子だけでなくオートファジーという現象について敷衍できた点は満足できる。ただし予定より進行が遅れている。
唾液腺組織幹細胞の同定と唾液分泌細胞への分化遺伝子の解明

ラット耳下腺主導管結紮による損傷からの再生過程において、幹細胞を検出するための免疫組織化学染色に陽性を示す細胞が、導管様構造物中に一過性に多数出現した。唾液腺組織幹細胞は、唾液腺再生過程の初期に出現し、導管様構造物を形成することが明らかとなった。また、組織幹細胞で構成された導管様構造物の周囲には、多数の交感神経の出現が一過性に認められたことから、組織幹細胞による耳下腺組織再生の初期には、交感神経が関与することが示唆された。唾液は消化、口腔衛生状態の保持、口腔粘膜の保護および口腔疾患の予防など、健康な生活を営む上で極めて重要な役割を担っている。近年、唾液分泌量が減少する口腔乾燥症罹患者が増加しているが、根本的な治療法はいまだに確立されていない。唾液腺組織幹細胞の同定と細胞分化遺伝子の解明を目的として、本研究を実施している。幹細胞を同定し、さらに幹細胞から腺房細胞へと分化する遺伝子を特定することができれば、唾液分泌機能を有する腺房細胞を確保することが可能となり、口腔乾燥症の治療法の確立の一助になるとともに、将来の遺伝子治療や再生医療実現の基盤を築き、国民の口腔の健康増進に多大な貢献ができるものと考えている。平成22年度では、生後10週齢のWistar系雄性ラットより耳下腺を摘出し、光学顕微鏡と電子顕微鏡の試料作製を行った。得られた試料に対して、漿液性腺房細胞の特異的マーカーである抗Amylase抗体と幹細胞の特異的マーカーである抗Musashi-1抗体を用いて免疫染色を施した。Amylase抗体陽性細胞は、腺房に局在してみられた。Musashi-1抗体陽性細胞の数は極めて少なく、腺房付近に認められた。これらの結果から、唾液腺を構成する各細胞の局在部位を検討した。平成23年度は、DNA合成期の細胞に特異的に取り込まれるbromodeoxyuridine (BrdU)を長期間保持する細胞:label-retaining cell (LRC)を検出する手法を用いて、ラット耳下腺の組織幹細胞を同定する。さらに、ラット耳下腺の腺房と組織幹細胞局在部位よりRNAの抽出を行う予定である。平成23年度は、平成22年度に採取し光学顕微鏡試料を作製した生後10週齢のWistar系雄性ラットの耳下腺を用いて実験を行った。DNA合成期の細胞に特異的に取り込まれるbromodeoxyuridine(BrdU)を長期間保持する細胞:label-retaining cell(LRC)を検出する手法を用いて、ラット耳下腺の組織幹細胞の同定を試みたが、BrdUを長期間保持する細胞は極めて少なく、幹細胞の同定に十分な結果が得られなかった。酵素標識ポリマー法を用いることで免疫組織化学染色の感度の向上を図り、平成24年度に追加実験を行う予定である。また、生後10週齢のラット耳下腺を採取し、ラット耳下腺の腺房と.組織幹細胞局在部位よりRNAの抽出と解析を行う予定である。唾石症などの排泄管閉塞性疾患、炎症、腫瘍および放射線療法などにより障害が生じた唾液腺には、唾液分泌障害が起こることは良く知られている。また近年、加齢、全身性疾患、ストレスなどの影響により唾液分泌量が減少する口腔乾燥症罹患者が増加しているが、根本的な治療法はいまだに確立されていない。唾液腺の修復過程において重要な役割を果たすとされている、唾液腺組織幹細胞の同定と細胞分化遺伝子の解明を目的として、本研究を実施した。幹細胞を同定し、幹細胞から腺房細胞への分化機序を明らかにすることができれば、唾液分泌機能を有する腺房細胞を確保することが可能となり、口腔乾燥症の治療法の確立の一助になるとともに、国民の口腔の健康増進に貢献ができるものと考えている。平成23年度は、bromodeoxyuridine (BrdU)を長期間保持する細胞:label-retaining cellを検出する手法を用いて、ラット耳下腺の組織幹細胞の同定を試みたが、BrdUを長期間保持する細胞は極めて少なく、幹細胞の同定のために十分な結果を得ることができなかった。

そこで平成24年度は、耳下腺主導管を結紮し耳下腺に損傷を与えることにより、耳下腺に多数の組織幹細胞を出現させることに成功した。導管結紮解除直後から、幹細胞を検出するための抗Musashi-1抗体に陽性を示す細胞が、導管様構造物に一過性に多数出現したことから、唾液腺組織幹細胞は、唾液腺再生過程の初期に出現し、導管様構造物を形成することが明らかとなった。また、組織幹細胞で構成された導管様構造物の周囲には、多数の交感神経の出現が認められたことから、組織幹細胞による耳下腺組織の再生に交感神経が関与する可能性が示唆された。平成23年度に抗bromodeoxyuridine(BrdU)抗体を用いた免疫組織化学染色を実施したが、先行研究から予測された結果とは異なり、幹細胞の同定に十分な反応陽性細胞が認められなかったため、追加実験が必要となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。免疫組織化学染色の感度を改善するために、酵素標識ポリマー法を用いて抗原抗体反応の発色感度を向上させる。また、平成23年度に引き続きラット耳下腺の腺房と幹細胞局在部位よりRNAの抽出を行い、耳下腺の実質性細胞に特異的に発現する遺伝子を検出する。
膵癌肝転移に対する腫瘍細胞特異的結合性リポソームを用いた新たな治療法の開発

我々は腫瘍細胞表面に発現するコンドロイチン硫酸(CS)と高い結合性を有する新規脂質TRX-20を結合させたポリエチレングリコール・リポソーム(TRX-20リポソーム)を開発し、これにシスプラチンを封入してDrug Delivery System (DDS)としての有用性を報告した。本研究ではこのTRX-20リポソームを臨床応用し、膵癌特に肝転移に対する新たな治療法を開発することを目的としている。臨床検体におけるCS発現の検討:1992年から2000年にかけて当科にて手術施行された膵癌症例15例、胃癌症例7例のホルマリン固定標本の免疫組織染色において、その染色強度を5段階で判定すると、膵癌では正常膵組織に比べ有意にCS発現は上昇しており(p<0.05)、ほとんどの症例で著明なCS発現を認めた。一方胃癌、正常胃組織、正常膵組織問で差を認めなかった。以上より、膵癌に対するCSを標的とした新たな分子標的治療への応用の可能性が示唆された。ヒト膵癌細胞株を用いた検討:ゲムシタビン封入TRX-20リポソーム(TRX-20L-Gem)のCS高発現ヒト膵癌細胞株CFPAC-1とCS低発現ヒト大腸癌細胞株HT-29に対する抗腫瘍効果を検討したところ、薬剤を90分接触させる条件では、TRX-20L-Gem(0.3uM)はCFPAC-1に対して、TRX(-)-Gemやfreeゲムシタビンに比べ有意な抗腫瘍効果を示した。一方HT-29に対しては、freeゲムシタビン(2.55.0uM)はTRX-20L-GemやTRX(-)-Gemに比べ有意な抗腫瘍効果を示したが、TRX-20L-Gem(0.155.0uM)は抗腫瘍効果を示さなかった。以上より現在CFPAC-1肝転移マウスを用いたTRX-20L-Gemの抗腫瘍効果を検討中である。ヒト膵癌細胞株担癌マウスを用いた検討:CFPAC-1ならびにHT-29皮下腫瘍担癌マウスに対して1.5mg/kの各ゲムシタビン製剤を腫瘍細胞摂取後第7日目と14日目に静脈内投与し、腫瘍体積を観察すると28、35日目においてTRX-20L-Gem投与群は他の群に比べ有意に腫瘍の増殖を抑制した。またCFPAC-1の実験肝転移モデルにおいて腫瘍摂取後3日目に1.5mg/kの各ゲムシタビン製剤を投与し、30日目に肝臓を観察するとTRX-20L-Gem投与群以外では肝転移を形成していたが、TRX-20L-Gem投与群では肉眼的に肝転移を認めなかった。生体内分布の検討などからも肝転移に対するTRX-20L-Gemの有効性が確認された。

またCFPAC-1の実験肝転移モデルにおいて腫瘍摂取後3日目に1.5mg/kの各ゲムシタビン製剤を投与し、30日目に肝臓を観察するとTRX-20L-Gem投与群以外では肝転移を形成していたが、TRX-20L-Gem投与群では肉眼的に肝転移を認めなかった。生体内分布の検討などからも肝転移に対するTRX-20L-Gemの有効性が確認された。我々は腫瘍細胞表面に発現するコンドロイチン硫酸(CS)、と高い結合性を有する新規脂質TRX-20を結合させたポリエチレングリコール・リポソーム(TRX-20リポソーム)を開発し、これにシスプラチンを封入してDrug Delivery System (DDS)としての有用性を報告した。本研究ではこのTRX-20リポソームを臨床応用し、膵癌特に肝転移に対する新たな治療法を開発することを目的としている。臨床検体におけるCS発現の検討:1992年から2000年にかけて当科にて手術施行された膵癌症例15例、胃癌症例7例のホルマリン固定標本に、免疫組織染色を行い、染色強度を画像解析により5段階で判定した。膵癌(2.76±0.24)では膵正常組織(0.5±0.5)に比べ有意にCS発現は上昇しており(p<0.05)、ほとんどの症例で著明なCS発現を認めた。一方胃癌(1.11±0.31)と正常胃組織(0.5±0.29)とでは差を認めなかった。これらのことより、膵癌に対するCSを標的とした新たな分子標的治療への応用の可能性が示唆された。ヒト膵癌細胞株を用いた検討:ゲムシタビン封入TRX-20リポソームのCS高発現ヒト膵癌細胞株CFPAC-1とCS低発現ヒト大腸癌細胞株HT-29に対する抗腫瘍効果を検討したところ、薬剤を90分接触させる条件では、ゲムシタビン封入TRX-20リポソーム(0.3uM)はCFPAC-1に対して、ゲムシタビン封入TRX-20(-)リポソームやfreeゲムシタビンに比べ有意な抗腫瘍効果を示した。一方HT-29に対しては、freeゲムシタビン(2.55.0uM)はゲムシタビン封入TRX-20リポソームやゲムシタビン封入TRX-20(-)リポソームに比べ有意な抗腫瘍効果を示したが、ゲムシタビン封入TRX-20リポソーム(0.155.0uM)は抗腫瘍効果を示さなかった。以上より現在CFPAC-1肝転移マウスを用いたゲムシタビン封入TRX-20リポソームの抗腫瘍効果を検討中である。我々はコンドロイチン硫酸(CS)と高い結合性を示す新規脂質TRX-20を結合させたポリエチレングリコール・リポソーム(TRX-20Lip.)を開発し、これにシスプラチンを封入してDrug Delivery Systemとしての有用性を報告した。今回、これを利用して膵癌の予後改善のため、膵癌肝転移に対する新たな治療法を開発することを目的とした。膵癌におけるCSの発現:1992年より2000年までに手術施行された膵癌、大腸癌、胃癌の切除組織でのCS発現を免疫組織染色法にて検討すると、膵癌ならびに大腸癌でのCS発現は、正常組織や胃癌に比べ有意に高かった。また、臨床病理学的因子とCS発現との間に相関は認めなかった。ゲムシタビン封入TRX-20リポソームに関する検討:ゲムシタビン(GEM)を封入したTRX-20Lip.(GEM-TRX-20Lip.)は、GEMの封入量が1250μMまでは漏出も認めず安定であった。膵癌腫瘍細胞株を用いた検討:TRX-20Lip.とヒト膵癌細胞株との結合性は、CFPAC-1やPK-45のようなCS高発現株(cell ELISA法にて判定)と有意に高く結合し、一方CS低発現株MIAPaCa-IIやHPACとはほとんど結合しなかった。CFPAC-1ならびにCS低発現
細胞場におけるｍＲＮＡ代謝とタンパク質分解とを統合する環境刺激応答制御機構

本研究では、植物の環境感覚においてCOP9シグナロソーム(CSN)が「mRNA代謝とタンパク質分解とを統合的に制御する鍵因子である」と考え、細胞の場におけるCSNの刺激応答機構を解明することを目的としている。当該年度はCSNとmRNA代謝制御関連因子の相互作用が、植物の環境刺激応答に担う機能を理解することを目指した。CSNと直接結合するSAP130の機能解析を進めた結果、その転写産物は多くの器官で認められたが、その発現抑制植物は花粉の形態形成異常を示した。SAP130発現抑制植物では花粉形成期に発現するQRT1とQRT3のmRNA量が減少することから、「スプライシングの標的や効率の制御機構にSAP130が関与する」と仮説を立てて候補遺伝子群の発現解析を進めた。加えてSAP130発現抑制植物では、アントシアニンの蓄積が上昇し、光感受性が亢進することを示し、原因となる標的遺伝子の同定を進めた。また、SAP130に加えてAt3g11960類似遺伝子が存在することを見出し、その機能欠損植物ラインを確立したので解析を進めた。一方、csn1部分相補植物fus6/CSN1-3-4もSAP130発現抑制植物と類似した低い稔性を示し、花粉の形成過程に異常があったことから、CSNとSAP130とが協調して花粉形成に必須の機能を担うと考えている。SAP130が構成するSF3bはヒトでは7因子で構成されているが、植物では未知である。シロイヌナズナにもそれらの遺伝子が保存されており、SAP155を除く6因子については2コピーずつ同定した。手始めにSAP49を解析した結果、SAP49は植物発生初期の形態形成に重要であることが判明し、他についても順次機能解析を進めている。また、スプライシングに関わるPrp43も2コピー存在し、CSNと結合することからその機能解析を進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、植物の環境感覚においてCOP9シグナロソーム(CSN)が「mRNA代謝とタンパク質分解とを統合的に制御する鍵因子である」と考え、細胞の場におけるCSNの刺激応答機構を解明することを目指す。これまでCSNがタンパク質分解系を調節し、植物では光情報伝達下流の形態形成の制御、動物では情報伝達や細胞周期の制御に関与することを報告した。ここではシロイヌナズナを用いてCSNと相互作用するRNA代謝関連因子に注目し、CSNが光をはじめとする環境刺激に応答して情報伝達を制御する分子機構を解明する。該当年度の実績後概要を列記する。まず、個体におけるSAP130の分子機能を明らかにするために、シロイヌナズナを用いて解析した結果、SAP130は2つの遺伝子にコードされ、これら遺伝子は器官ごとに類似した遺伝子発現様式を示し、プロモーター活性は共に特定時期の葯で高かった。両遺伝子を標的とするRNAi発現抑制植物では、花粉形成過程のmicrospore stageからbicellular stageへの移行期に形態形成異常を示した。この時期は花粉がmRNAを大量に蓄積する時期にあたり、成熟花粉はそのpre-synthesized mRNAを用いて受粉の場で転写を伴わない翻訳を効率的に行なう。また花粉形成異常の原因となる遺伝子ターゲットを探索し、花粉形成期に特異的なQRT1とQRT3の発現がSAP130発現抑制植物で減少することを見出した。一方、CSN1のN末端領域は重要な機能を担い、シロイヌナズナでは欠損すると致死、動物ではAP-1の転写活性を抑制し、紫外線や飢餓回復の刺激に応答するc-fosの活性化を抑制する。今回、動物培養細胞をモデルに用いて、CSN1Nが紫外線や飢餓回復の刺激に応答するc-Junのリン酸化を抑制し、その上位にあるJNK1の発現を抑制することを解明した。

シロイヌナズナにもそれらの遺伝子が保存されており、SAP155を除く6因子については2コピーずつ同定した。手始めにSAP49を解析した結果、SAP49は植物発生初期の形態形成に重要であることが判明し、他についても順次機能解析を進めている。また、スプライシングに関わるPrp43も2コピー存在し、CSNと結合することからその機能解析を進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。「CSNと結合するスプライソソーム構成因子の機能」:SAP130はスプライソソーム形成やスプライシングに不可欠だが、その詳細な分子機能は不明である。シロイヌナズナのSAP130は2つの遺伝子にコードされていた。これら遺伝子は器官ごとに類似した遺伝子発現様式を示し、そのプロモーター活性は共に特定時期の葯で高かった。両SAP130の機能重複が示唆されたので、RNAi法を用いて両遺伝子を標的とする発現抑制植物を作製して解析を行なった。その結果SAP130発現抑制植物では、花粉形成過程のmicrospore stageからbicellular stageへの移行期に形態形成異常を示した。この時期は花粉がmRNAを大量に蓄積する時期にあたり、成熟花粉はそのpre-synthesized mRNAを用いて受粉の場で転写を伴わない翻訳を効率的に行なうと考えられている。つぎに花粉形成異常の原因となる遺伝子ターゲットを探索し、花粉形成期に特異的なQRT1とQRT3の発現がSAP130発現抑制植物で減少することを見出した。この成果は原著論文[Plant Cell Physiol, 52: 1330-9 (2011)]に報告した。「CSNが内包するCSN1の遺伝子転写抑制機能」: CSN1のアミノ末端領域(CSN1N)は重要な機能を担っており、シロイヌナズナにおいてCSN1Nが欠損すると致死となり、動物においてはCSN1NがAP-1の転写活性を抑制し、紫外線や飢餓回復の刺激に応答するc-fosの活性化を抑制することが先行研究より判明している。今回、動物培養細胞をモデルに用いて、CSN1Nが紫外線や飢餓回復の刺激に応答するc-Junのリン酸化を抑制し、その上位にあるJNK1の発現を抑制することを解明した。この成果は原著論文[Protein Cell, 2: 423-32 (2011)]に報告した。今後は、CSNとSAP130との相互作用が植物の環境刺激応答に担う機能の解明を目指す。まずcsn1機能欠損変異体にCSN1を発現した部分相補植物が、SAP130機能抑制植物同様に低い稔性を示すことに注目し、花粉形成に着目した詳細な解析を行なう。また、CSNとSAP130の機能抑制植物がともに多量のアントシアニンを蓄積する形質を示すことに着目し、光刺激応答時のCSNとSAP130の機能解析を行なう。さらに、CSN1やSAP130の発現様式を改変した植物を用いて、SAP130とその類似遺伝子群の機能解析、CSN1やSAP130の標的因子解析を行ない、環境刺激に応答する植物細胞の分子機構を解明する。
禁煙補助薬バレニクリンによるα７ニコチン受容体を介した心血管イベント発症機序

禁煙補助薬バレニクリンは、α4β2 nAChR部分作動、α7 nAChR完全作動薬であり、画期的で禁煙成功率が高い。しかし、心血管イベントのリスクを増大させると報告された。そこでバレニクリンによる心血管イベントの発症機序を明らかにするため、動脈硬化モデルマウスにバレニクリンを投与し、動脈硬化巣の形成を評価した。その結果、バレニクリンは動脈硬化巣の形成を促進させた。またα7 nAChRの阻害薬の併用により、その動脈硬化巣形成は抑制された。以上のことから、バレニクリンはα7nAChRを介して動脈硬化巣の形成を促進し、心血管イベントの発症リスクを増大させる可能性が示唆された。経口禁煙補助薬バレニクリンは、禁煙治療において画期的で有効性の高い薬であるが、心血管イベントの重篤な副作用が発現することがある。しかし、この発症機序に関する基礎研究は殆どない。そこで、バレニクリンの心血管イベント発症の機序を解明し、この有害作用の予防・軽減・回避対策の構築、また新たな経口禁煙補助薬の開発へと連結することを目的として本研究を企てた。具体的には、動脈硬化モデルマウスを用いて「バレニクリンが、炎症性細胞のα7 nAChRを介して動脈硬化症の発症・進展、不安定化を惹起し、心血管イベントを発症させる。」という仮説を検証し、その発症機序を追究するものである。バレニクリン投与により、動脈硬化巣の形成を促進することを平成25年度に明らかにした。平成26年度は、動脈硬化症の発症・進展、不安定化をα7 nAChRを介して惹起するかを動物実験、細胞実験で明らかにする。バレニクリンをApoE KOマウスに3週間投与したところ、0.05mg/kg/日の低用量の濃度では、動脈硬化層の形成を促進しなかった。その一方、0.5mg/kg/日の高用量の濃度で投与したところ、動脈硬化巣の形成を有意に促進させたことを平成25年度は明らかにした。また、ApoE KOマウスの動脈硬化巣内におけるα7 nAChR発現を確認するために、血管内皮細胞、マクロファージとα7 nAChRで蛍光二重染色を施行し確認した。動脈硬化巣内においてα7 nAChRが血管内皮細胞、マクロファージに発現していることが明らかとなった。以上、平成25年度はApoE KOマウスに0.5mg/kg/日の高用量のバレニクリンを投与することで、動脈硬化巣の形成を促進したことを明らかにし、α7 nAChRを介したバレニクリンの作用が心血管イベントを惹き起こす可能性を提起した。循環器系疾患における禁煙治療の重要性は、十分に認知されているにもかかわらず、その効果的治療法の選択は狭い。喫煙による心血管イベント発症のリスクを回避するためにバレニクリンの禁煙治療を行うにもかかわらず、逆にそのリスクを増大させるのは問題である。平成25年度には、ApoE KOマウスにバレニクリンを3週間投与したところ、バレニクリンにより、動脈硬化巣の形成が促進したことを明らかにした。平成26年度では、動脈硬化巣におけるα7 nAChR(ニコチン性アセチルコリン受容体)を介するバレニクリンの作用を検討した。ApoE KOマウスにバレニクリンとα7 nAChRのアンタゴニストであるメチルリカコニチン(MLA)を併用し、動脈硬化巣の面積を評価した。MLAを5mg/kgを併用したところ、バレニクリンによるその動脈硬化巣の形成は抑制された。このことから、バレニクリンはα7 nAChRを介することで、動脈硬化巣の形成を促進し、心血管イベントのリスクを増大させることが示唆された。薬理学経口禁煙補助薬バレニクリンは、禁煙治療において画期的で有効性の高い薬であるが、心血管イベントの重篤な副作用が発現することが報告されている。そこで本研究は、バレニクリンのこの有害作用の予測・軽減・回避対策の構築、さらに有害作用の低減化とともに優れた禁煙効果を有する新薬の開発へと繋げるために、バレニクリンによる心血管イベント発症のメカニズムを明らかにすることである。このメカニズムを明らかにするため、ApoE KOマウスにバレニクリンを投与し、バレニクリンによる動脈硬化巣の形成を検討・評価した。

本年度は、1高用量のバレニクリンにより動脈硬化形成を促進させること、2バレニクリンによる動脈硬化巣形成にα7 nAChRを介する可能性を示した点を考慮すれば、研究の進捗状況としておおむね順調と評価できる。平成25年度に得られた結果をもとにして、平成26年度では動脈硬化巣におけるα7 nAChRを介するバレニクリンの作用を検討する。まずApoE KOマウスにバレニクリン、α7 nAChRアンタゴニストであるメチルリカコニチン(MLA: methyllycaconitine)を併用する。動脈硬化巣の面積を評価し、動脈硬化巣におけるα7 nAChRを介するバレニクリンの作用を精査する。また動脈硬化巣内でα7 nAChRが、血管内皮細胞、マクロファージに発現していたことから、培養したマクロファージ、血管内皮細胞にバレニクリン、MLAを処置し、これらの細胞におけるα7 nAChRを介したバレニクリンの作用を明らかにする。これらの成果は、バレニクリンによる心血管イベント発症における有害作用の予防・軽減・回避対策の構築、また新たな経口禁煙補助薬の開発へと連結する。3月末の学会発表の目的で、旅費を見積もり分で使用予定であったが、実際の支払いでは9830円の差額が生じ、その分次年度に繰り越すことになった。平成26年度も、学会発表・参加予定であるため、今回の繰り越した分をそのまま旅費に追加して使用する予定である。
エリスロポエチンの中枢神経系における新機能の解明

従来造血ホルモンとして知られていたエリスロポエチン(EPO)の脳・神経系における作用を明らかにすることを目的とした。神経伝達物質としてグルタミン酸は必須の因子である。しかし脳虚血の際には過剰のグルタミン酸が放出される結果、ある種のニューロンはグルタミン酸の興奮毒性により死滅する。これまでにEPOは中枢神経系ではアストロサイトが生産すること、EPOはin vtroにおいてグルタミン酸の毒性によるニューロン死を効果的に防止することを明らかにしてきた。本研究では砂ネズミを用いてin vivoにおいてもEPOがニューロン死を防止するかについて検討した。EPO又はEPO可溶型受容体を砂ネズミの脳内に投与し、脳虚血に伴うニューロン死への影響を精査した。砂ネズミは、虚血による神経細胞死を解析するのに最適の動物である。砂ネズミに一定の虚血を施すと、1週間後には海馬CA1領域のニューロンの半分は遅発性神経細胞死を起こし選択的に死ぬ。海馬は学習および記憶に重要な組織であり、虚血により海馬の神経細胞が死んだ動物の学習記憶能力は著しく低下する。砂ネズミの学習記憶能力はステップダウン型回避学習実験により判定し、その後海馬領域の神経細胞密度を測定することによりニューロン死保護効果の総合評価を行った。EPOの投与はニューロン死を低滅し、逆に可溶型EPO受容体の投与は内因性のEPOの作用を阻害することによりニューロン死を促進した。これよりアストログリアの生産する内因性のEPO自体が中枢神経系に生理作用を持つことを証明した。エリスロポエチン(EPO)は赤血球前駆細胞に作用し、その分化と増殖を促進するサイトカインであり、赤血球量の調節に最も重要な働きを持つ糖蛋白質である。EPOは造血系にのみ作用すると信じられてきたが、中請者らのグループはEPOが脳神経系において新しい機能を持つ可能性を示した。本研究は、in vivoにおいて腎一造血組織というエンドクラインシステムとは全く独立して、中枢神経系ではニューロン-アストログリア細胞というパラクラインシステムでEPOが生理的意義をもって作用することを証明することを目的とした。1.EPOの虚血によるニューロン死阻止効果-砂ネズミを用いた学習記憶実験-砂ネズミに短時間の虚血を施すと、1週間後には海馬CA1領域のニューロンの半分は遅発性神経細胞死を起こし死ぬ。脳内に小型ポンプを埋め込み、連続的にEPOあるいはEPO可溶型受容体を脳室内に投与した。その結果、EPOの投与はニューロン死を低減し、可溶型受容体はニューロン死を促進した。これよりEPOはin vivoにおいても海馬CA1ニューロンの虚血による細胞死をin vitroと同様に効果的に阻止できるだけでなくアストログリアの生産する内因性のEPO自体が中枢神経系に生理作用を持つことを証明した。2.神経特異的EPO可溶型受容体発現トランスジェニックマウスによるEPOの生理的意義の解析EPO可溶型受容体を中枢神経系で特異的に発現させるマウスを作製した。可溶型EPO受容体はアストログリア細胞で産生されたEPOの作用を阻害する。可溶型EPO受容体発現マウスとノーマルマウスの虚血に対する耐性を測定する。学習記憶実験はまとまった動物の数が必要であり、F1,F2マウスを得ているところである。
子宮頚癌の分子標的温熱放射線療法の基礎的検討

温熱療法によって惹起されるアポトーシス関連蛋白の発現の変化を検討した結果、Ku70とBaxの結合が増加し、Ku70とKu80との結合は減少していた。Ku70がDNA障害修復作用を有していることから、温熱療法後のKu70とBaxの結合増加が温熱療法の熱ストレスによる細胞障害を回避する機構であるか否かについて検討した。すなわち、Ku70の発現をsi-RNAを用いて低下させた状況で温熱療法を行ったところ、対照に比べて温熱療法によるアポトーシス誘導が促進されることが示された。さらに、Ku70発現低下細胞においてはBax活性化が誘導され、ミトコンドリアに局在するアポトーシス促進機構に関与するチトクロームCの増加がみられ、Ku70を標的とした薬剤の併用によって温熱療法の感受性を増加させうることが示された。また、Ku70のアポトーシス抑制作用がKu70のC末端のリジン残基のアセチル化によって完全にブロックされることが知られていることから、アセチル化リジン残基を認識する抗体を用いた解析を行った結果、温熱療法によってKu70の脱アセチル化が促進されていることが示され、脱アセチル化酵素(HDAC)の一つであるSirT-1の発現が亢進していた。そのため、温熱療法の細胞障害回避メカニズムの一つとしてHDACの活性化(SirT-1の増加)によるKu70の脱アセチル化の促進によりBaxとKu70の結合が増加するという機構が存在する可能性が考えられた。最後に、HDAC阻害剤を用いて温熱療法の効果を増強できる可能性を考え、SirT-1の阻害剤であるニコチンアミドを温熱療法とともに子宮頸癌細胞株(SiHa)に作用させたところ、対照に比べて有意に温熱療法によるアポトーシスが促進されることが示され、HDAC阻害剤を組み合わせることで温熱療法の治療効果を増強しうる可能性が示された。今後の臨床応用を目指してさらなる検討が必要であると考えられる。Bcl-2ファミリーはアポトーシス経路を構成する代表的なものである。Baxはアポトーシス誘導に働き、Bcl-2はBaxとヘテロダイマーを形成することにより、そのアポトーシス誘導能を阻害する。今回は肺癌細胞を用いて実験を行った。調べた全ての培養肺癌細胞において多量の野生型Baxが発現していた。Bcl-2は細胞質内に、Baxは核内および/あるいは細胞質に局在を認めた。42.5度に加熱したところ、肺癌細胞ではBaxが核内へ移行し、細胞はアポトーシスを回避した。この局在変化は加熱後30分から始まり、3時間以内に完了した。Bcl-2はリン酸化されなかった。免疫共沈法とFar Westernプロット解析を行い、加熱によりBaxとBcl-2が解離し、Ku70とBaxの結合が増加していることを確認した。共焦点レーザー顕微鏡で観察したところBax/Ku70複合体が核内へ移行し、結果として細胞質内のBax量が減少していた。そのために肺癌細胞が加熱によるアポトーシスから回避していると考えられた。さらに、Ku70に対するSiRNAの細胞内導入により、Baxは細胞質内にとどまり、導入細胞ではコントロール細胞の2-3倍のカスペース依存性のアポトーシスが加熱後1-6時間の短時間におこることが確認された。Annexin V染色により、細胞死の増加がネクローシスではなくアポトーシスであることを確認した。すなわち、Baxが細胞質内のミトコンドリアにとどまるか、あるいはKu70と結合しているかが、癌細胞の細胞死決定に重要な役割を果たしているのではないかと考えられた。これらの結果により、癌細胞の死はアポトーシス経路を構成する蛋白以外にアポトーシスを回避するメカニズムに関与する因子によって制御されており、これらの因子を標的とした新しい治療法により癌細胞のアポトーシスを誘導できる可能性が示された。

最後に、HDAC阻害剤を用いて温熱療法の効果を増強できる可能性を考え、SirT-1の阻害剤であるニコチンアミドを温熱療法とともに子宮頸癌細胞株(SiHa)に作用させたところ、対照に比べて有意に温熱療法によるアポトーシスが促進されることが示され、HDAC阻害剤を組み合わせることで温熱療法の治療効果を増強しうる可能性が示された。今後の臨床応用を目指してさらなる検討が必要であると考えられる。
バイオマーカーに基づく無作為割付比較試験による混合性うつ病の治療アルゴリズム構築

前年度に引き続きサンプルを収集し、解析可能な症例数に達したため遺伝統計解析を外部委託した。その結果が不正確と判明し、委託ではなく我々が遺伝統計解析を行うことになった。本研究の一部を使用した結果が共同研究施設から、2つの論文として公表された。遺伝統計を外部委託していたが、その結果が不正確と判明し、委託ではなく我々が自ら遺伝統計解析を行うことになった。遺伝統計のエキスパート関西医科大学日笠教授のご指導の元、遺伝統計を順調に行えているが、当初の予定にない行いであったため、進捗が遅れることとなった。また、治療抵抗性うつ病を対象としているため、最初の抗うつ薬で反応してしまう患者は試験にエントリーできず、サンプルのリクルートがやや遅れていた。1年間の研究機関の延長が認められたため、サンプルをできるだけ増やし、解析を行っていく。治療抵抗性うつ病、混合性の特徴を伴ううつ病の最新のエビデンスにもとづき、結果が臨床により貢献できるように、研究プロトコルをより質が高く、より意義ある結果が得られる可能性高いものにするために詳細な設定を行った。特に介入の種類と統計学的なパワー、遺伝子以外のバイオマーカーの選定、認知機能検査の選定において、責任医師、分担医師とで会議を行い、詳細を決定しました。完成したプロトコールを倫理委員会に申請し、UMINに登録完了しました。研究で使用する、臨床経過、患者背景、検査結果を記入するケースカードを作成し、予備的に使用することで不備を改善し、完成させました。実際の患者エントリーをおこなう部署で、認知機能検査や血液のサンプリングやその後の処置の流れを確認しました。関西医科大学の研究分担者と兵庫医療大学の連携研究者とで、月1回の研究会議を行い、上記案件について話し合った。関西医科大学の研究分担者と産業医科大学の研究分担者および兵庫医療大学の連携研究者で4回/年の研究会議を行い、上記案件について話しあった。概ね予定通り進展しているが、uminと倫理委員会申請後、倫理委員会での承認までに時間を要したことで、少し遅れている。承認までの待ち時間の間は、能率を良くするケースカードを作成したり、臨床でのサンプリング手順の再確認をしたり、カルテ調査にて候補患者を検索するなど、今後のよりスムーズな進行の工夫をしている。関西医科大学総合医療センター、産業医科大学病院、セフィロト病院にて、倫理委員会の承認後速やかに、サンプルのリクルートを開始、約10名の治療抵抗性うつ病患者がエントリーし、経時的なDNA、miRNA用の血液、メチル化解析、蛋白解析用の血漿、社会・認知機能、うつ病の重症度、副作用の評価と、気質、虐待歴の評価が終了している。臨床症状の評価は、評価者ブラインドで行い、治療者用と評価者用のケースカードに記録し、終了したものをまとめ匿名化しPCに保存。昨年に引き続き、関西医科大学の研究分担者と兵庫医療大学の連携研究者とで、月1回の研究会議を行った。また、全体の研究分担者で4回会議を行った。サンプルのリクルートスピードがやや遅いものの、概ね順調に進展している。前年度に引き続きサンプルを収集した。順調に収集出来ているが、予定よりもサンプルの数が少ないため、これまでに収集したサンプルと併せてゲノム統計解析を行い、現在、解析進行中である。上半期に8月と10月に共同研究施設と研究会議を開催した。現在までに、混合サンプルにて解析したバイオマーカーは網羅的miRNA解析、候補遺伝子、候補蛋白、網羅的メチレーションのデータが解析されており、今後も追加サンプルに同等の解析を行うとともに、遺伝子に関しても網羅的か解析を行う予定である。オーランドの世界精神遺伝学会、Pharmacogenetic in Psyhicatry学会に参加し、ゲノム解析のアップデートを行い、海外共同研究施設と会議を行った。4月の第113回精神神経学会総会において、治療抵抗性うつ病について、これまでの研究結果と本研究の紹介を含めた内容"治療抵抗性抑うつに対し外来診療で出来る薬物療法"をシンポジストとして講演した。第39回日本生物学的精神医学会・第47回日本神経精神薬理学会合同年会でシンポジストとして登壇、本研究の紹介を含めた内容を"うつ病における遺伝薬理学の現状"として講演。治療抵抗性うつ病を対象としているため、最初の抗うつ薬で反応してしまう患者は試験にエントリーできず、サンプルのリクルートがやや遅れている。現在、能率を良くするケースカードを作成したり、臨床でのサンプリング手順の再確認をしたり、カルテ調査にて候補患者を検索するなど、今後のよりスムーズな進行の工夫をしている。最初に想定した計画通りにH28年度も患者のリクルートを継続して行っていく。また、全体での研究会議もを4回/年、兵庫医療大学とは12回/年の会議を実施し、研究の能率を上げていく。今後も継続しサンプルをリクルートする。

サンプルリクルートの進捗具合に応じて、遺伝子解析、プロテオーム解析、メチレーション解析、miRNA解析を実施する。上記解析は、これまですでにリクルート済みの治療抵抗性うつ病サンプルと併せて行う。これまでのサンプルはすでに150例以上のリクルートが終了しており、それと併せて解析することで、新たなRCTの進捗が送れても、本研究の主旨に適した結果を高い実現確実性で得られることが可能である。得られた臨床データと、上記解析結果の統計解析を行う。得られた結果を国内、国際学会の場で公表し、論文化をすすめる。サンプルのリクルートを進めるとともに、サンプルリクリルートがうまくいかない時に、考えていた方策として、これまでに収集した治療抵抗性のサンプルのゲノムやバイオマーカー併せて運用し、プレシジョンメディシンを目指した遺伝統計解析を行い、逐次論文として公表していく。サンプルのリクルートにもう少し時間をかけたほうがいいと判断した場合は、研究期間を延長することも考える。1年間の研究機関の延長が認められたため、サンプルをできるだけ増やし、解析を行っていく。本年度は、消耗品の使用頻度が想定よりも少なかったため、若干の余剰金が発生しましたサンプルのリクルートが中心の作業であり、消耗品、人件費が想定よりも少し少なかった。会議を開催する際に、学会開催中など、他の会と同時に会議を開催することで、旅費の支出が少なくすんだため、若干の余剰金となった。全てのサンプルリクルートが終了した時点で、網羅的遺伝子解析や統計解析を行う予定であるが、研究の進行が若干遅れており、まだサンプルリクルートを継続しているため、それら解析にかかる費用を今年度は使用せず次年度に使用する予定である。遺伝統計解析を外部委託しておりましたが、慎重な精査の結果、外部委託の統計解析が不正確と判明し、委託を予定した解析を、自ら行うことになりました。関西医科大学のゲノム解析部門教授のご指導の元、遺伝解析を行い、ようやく結果が出始めております。当初予定していなかった、外部委託会社関連のトラブルにて、進捗が遅れてしまいました。また、同時に、サンプルのリクルートにも時間を要しました。治療困難例が当初の予定よりも少なく、想定していたエントリー期間の延長が必要でした。上記2つの理由により、研究期間を延長したため、最終的な遺伝子解析費用は十分なサンプル数が確保できる次年度に使用することといたしました。若干の余剰金は来年度の消耗品に充てる予定です次年度は、遺伝子解析などの解析、学会発表など、消耗品、解析費用、解析用のPCやソフト、出張費用などが必要となるため、そこに充てる予定です。