hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ADHD同胞多発家系のリスク遺伝子の同定と機能解析；発達特性の多次元評価

注意欠如・多動症attention-deficithyperactivitydisorder(ADHD)は、不注意と多動性・衝動性を主症状とする発達障害である。今回我々は、ADHD家系から次世代シーケンサーを用いて、候補遺伝子を同定することを研究の目的としている。ADHD家系では、家系内に複数の発達障害が混在しており、診断閾値以下の家系構成員もいるため、発達障害の特性を多次元的に評価する「発達障害の特性別評価法Multi-dimensional Scale for PDD and ADHD(MSPA)」を用いて、家系の構成員全体を評価し、発達障害特性の伝達形式を想定した。平成30年度は、ADHD多発大家系2家系から検体を採取し、次世代型シーケンサーにて遺伝子解析(全エクソンシークエンス)を行うことにより原因遺伝子の同定を試みた。MSPAを用いて、家系の構成員全体を評価し、不注意、衝動性などのADHD傾向だけではなく、共感性などの自閉スペクトラム症の特徴も併存していることがわかった。2家系のうち1家系(家系1)では、これまでに発達障害との関連が報告されている遺伝子において1塩基置換変異が同定された。また、もう一つの家系(家系2)においては家系内の全患者に共通する候補変異が複数同定されたため、病的変異の絞り込みが必要であった。今後はADHDの多検体を用いて候補遺伝子のassociation studyを行う予定である。また、遺伝子編集技術を用いて候補遺伝子編集モデルマウスを作成し、行動解析を行う予定である。平成30年度は、ADHD多発大家系2家系から血液を採取した。家系情報から疾患発症に大きな影響を与えうるrarerisk variantsの存在が推測されたため、採取した血液からDNAを抽出し、次世代型シーケンサーにて遺伝子解析(全エクソンシークエンス)を行うことにより原因遺伝子の同定を試みた。2家系のうち1家系(家系1)では、これまでに発達障害との関連が報告されている遺伝子において、家系内の全患者に共通する1塩基置換変異が同定された。また、もう一つの家系(家系2)においては家系内の全患者に共通する候補変異が複数同定されたため、病的変異の絞り込みが必要な状況である。上記の遺伝子解析にて同定された候補変異の病的意義を考察するため、家系1・2の臨床情報をより詳細に蓄積している状況である。遺伝子解析にて同定された候補変異の病的意義を考察するため、引き続き家系1・2の臨床情報を収集していく予定である。また、家系1・2で同定された候補遺伝子と発達障害との関連を解析するため、ADHD散発例の検体を多数収集し、association studyを行う予定である。合わせて、上記変異の生物学的意義を解析するため、遺伝子編集技術を用いて遺伝子編集モデルマウスを作成し、マウスの行動にどのような変化が起こるか解析を行う予定である。注意欠如・多動症attention-deficithyperactivity disorder(ADHD)は,不注意と多動性・衝動性を主症状とする発達障害である。今回我々は、ADHD家系から次世代シーケンサーを用いて、遺伝子頻度が1%未満でイフェクトサイズが比較的高い「頻度が稀な変異(rare variant)」を同定することを研究の目的としている。ADHD家系では、家系内に複数の発達障害が混在しており、診断閾値以下の家系構成員もいるため、発達障害の特性を多次元的に評価する「発達障害の特性別評価法Multi-dimensional Scale for PDD and ADHD(MSPA)」を用いて、家系の構成員全体を評価し、発達障害特性の伝達形式を想定する予定である。平成29年度は、長崎大学病院に通院している患者で、主診断がADHDである患者を発端者とし、3名の同胞すべてがADHDの診断を満たす家系のうち、2家系から研究の同意が得られた。家系の対象者について、米国精神医学会の診断基準DSM-5を用いて臨床診断を行った。またMSPAを使って14項目の評価を行った。MSPAは14項目の発達障害に関係する症状を5段階で評価するものである。今回の調査では14項目それぞれの数値を2以下と3以上にわけ,それぞれ「低得点」「高得点」として解析を行う。今後検体(血液、唾液)を採取する予定である。我々は当院児童思春期外来の疫学調査で3名のADHD罹患同胞を有する4家系を発見したが、遺伝子を対象とした研究について家族の抵抗が強く、またそれぞれがばらばらに暮らしている家族もあり、同意の取得や検体の収集に時間がかかっている状況である。注意欠如・多動症attention-deficithyperactivity disorder(ADHD)は、不注意と多動性・衝動性を主症状とする発達障害である。

2家系のうち1家系(家系1)では、これまでに発達障害との関連が報告されている遺伝子において1塩基置換変異が同定された。また、もう一つの家系(家系2)においては家系内の全患者に共通する候補変異が複数同定されたため、病的変異の絞り込みが必要であった。今後はADHDの多検体を用いて候補遺伝子のassociation studyを行う予定である。また、遺伝子編集技術を用いて候補遺伝子編集モデルマウスを作成し、行動解析を行う予定である。平成30年度は、ADHD多発大家系2家系から血液を採取した。家系情報から疾患発症に大きな影響を与えうるrarerisk variantsの存在が推測されたため、採取した血液からDNAを抽出し、次世代型シーケンサーにて遺伝子解析(全エクソンシークエンス)を行うことにより原因遺伝子の同定を試みた。2家系のうち1家系(家系1)では、これまでに発達障害との関連が報告されている遺伝子において、家系内の全患者に共通する1塩基置換変異が同定された。また、もう一つの家系(家系2)においては家系内の全患者に共通する候補変異が複数同定されたため、病的変異の絞り込みが必要な状況である。上記の遺伝子解析にて同定された候補変異の病的意義を考察するため、家系1・2の臨床情報をより詳細に蓄積している状況である。対象者の同意が思うように得られない場合など、検体の収集が思うように進まない場合は、長崎市障害福祉センター診療所などの共同研究機関に協力を呼びかけ、対象となる家系を増やしていく予定である。遺伝子解析にて同定された候補変異の病的意義を考察するため、引き続き家系1・2の臨床情報を収集していく予定である。また、家系1・2で同定された候補遺伝子と発達障害との関連を解析するため、ADHD散発例の検体を多数収集し、association studyを行う予定である。合わせて、上記変異の生物学的意義を解析するため、遺伝子編集技術を用いて遺伝子編集モデルマウスを作成し、マウスの行動にどのような変化が起こるか解析を行う予定である。通信費などで予定していた予算が若干余ったため、次年度使用額が生じた。次年度に有効に活用する予定である。マウスの出産が予想外にうまくいかず、当初予定していたDNA解析用の試薬の購入を見送った。令和元年度には、平成30年度の残額をDNA解析用の試薬を購入するために使用する予定である。
転移性腫瘍におけるトリプトファン代謝酵素制御による新規免疫療法の確立と病態解析

1.B16F10腫瘍細胞をマウスに尾静脈投与し、肺転移モデルを作製した。前実験の結果より、IDO1KOマウスおよびIDO1阻害剤投与マウスでは、野生型マウスと比較して有意に肺/体重比が減少することを明らかにした。一方で、IDO2KOマウスおよび阻害剤の投与において抗腫瘍効果はみとめなかった。従って、B16F10細胞投与による肺微小環境ではIDO2を介さないトリプトファン代謝が重要であることが明らかになった。2.前年度にキヌレニンを3ーヒドロキシキヌレニンに代謝する律速酵素であるKMOKOマウスにB16F10腫瘍細胞を尾静脈投与し、肺転移モデルを作製したところ、野生型マウスと比較して有意に肺/体重比が減少していることを明らかにした。そこで、KMOKOマウスと野生型マウスの肺臓中トリプトファン代謝産物を測定したところ、。KMOKOマウスでは、野生型マウスと比較して、有意にキヌレニン、キヌレン酸およびアントラニール酸が増加していた。一方で、3ーヒドロキシキヌレニン、3ーヒドロキシアントラニール酸が有意に減少していた。すなわち、高キヌレニン血症のマウスであっても、抗腫瘍効果を失うことはなかった。従来、キヌレニンは細胞障害性T細胞の抑制や制御性T細胞の誘導を介した腫瘍免疫を制御していると考えられていたが、本研究において、少なくともがん微小環境のキヌレニンレベルの増加は腫瘍免疫の制御に関与しないと考えられた。3.ヒト肺癌病理標本におけるトリプトファン代謝関連酵素の発現検討を進めている。特に肺腺癌の検体を中心に、IDO1、IDO2、KMO、KAT等の免疫染色の最適化を実施した。今後は予後や治療効果との関連性を調査していく。本年度の研究計画として、1)各種KOマウスにおけるトリプトファン代謝産物の有無によるNKT細胞及びCTL誘導効率の比較、2)トリプトファン代謝産物による腫瘍細胞増殖シグナル経路の制御機構の解析、3)副作用が少なく特異性の高い阻害剤の選択及び投与量、投与法の検討を予定していた。しかし、研究遂行に伴った新たな制御機構を同定したため、そちらの研究を優先し、おおむね順調に実験が進展している。今後、上述した1)3)の研究についても進めていく予定である。前年度に続き、1)各種KOマウスにおけるトリプトファン代謝産物の有無によるNKT細胞及びCTL誘導効率の比較、2)トリプトファン代謝産物による腫瘍細胞増殖シグナル経路の制御機構の解析、3)副作用が少なく特異性の高い阻害剤の選択及び投与量、投与法の検討を実施する。上記課題を円滑に実施し、学術的価値の高い雑誌への投稿を目指す。2.肺転移モデルマウスから、肺臓を摘出し、mRNAの抽出および病理組織学的検索を実施した。腫瘍細胞および腫瘍周囲の免疫細胞で、IDO1、KMOおよびKATが高発現していることを定量的PCR法および免疫組織化学染色により確認した。3.腫瘍細胞の増殖とトリプトファン代謝の役割を明らかにするために、キヌレニンを3ーヒドロキシキヌレニンに代謝する律速酵素であるKMOKOマウスを使用した。KMOKOマウスにB16F10腫瘍細胞を尾静脈投与し、肺転移モデルを作製したところ、野生型マウスと比較して有意に肺/体重比が減少していることを明らかにした。さらに、KMO特異的阻害剤であるRo61-8048を投与したところ、KMOKO同様に腫瘍の増殖抑制効果を明らかにした。すなわち、肺転移したB16F10細胞の抗腫瘍メカニズムに重要なトリプトファン代謝産物はキヌレニン、キヌレン酸およびアントラニール酸以外の代謝産物の阻害が重要と考えられた。4.腫瘍投与後2週間で野生型マウスとKMOKOマウスから肺臓を摘出し、肺臓内のトリプトファン代謝産物量をHPLCを使用して解析した。本年度の研究計画として、WT、各種トリプトファン代謝関連酵素遺伝子欠損マウス(IDO1, IDO2, KMO, QPRT KO)及びこれらの酵素阻害剤投与マウスの比較実験を予定していた。具体的には、1)各種転移性腫瘍モデルの作製(B16, LLC, EL-4等)、2)血中・組織中の各種酵素発現及びトリプトファン代謝産物分析、3)IFN-γを中心とした各種サイトカイン量の経時的変化、4)病理組織学的所見、腫瘍量及び生存率の比較を主として明らかにすることを計画していた。1)4)のほぼすべての実験が完了しており、おおむね計画通りに実験が進展している。

2.前年度にキヌレニンを3ーヒドロキシキヌレニンに代謝する律速酵素であるKMOKOマウスにB16F10腫瘍細胞を尾静脈投与し、肺転移モデルを作製したところ、野生型マウスと比較して有意に肺/体重比が減少していることを明らかにした。そこで、KMOKOマウスと野生型マウスの肺臓中トリプトファン代謝産物を測定したところ、。KMOKOマウスでは、野生型マウスと比較して、有意にキヌレニン、キヌレン酸およびアントラニール酸が増加していた。一方で、3ーヒドロキシキヌレニン、3ーヒドロキシアントラニール酸が有意に減少していた。すなわち、高キヌレニン血症のマウスであっても、抗腫瘍効果を失うことはなかった。従来、キヌレニンは細胞障害性T細胞の抑制や制御性T細胞の誘導を介した腫瘍免疫を制御していると考えられていたが、本研究において、少なくともがん微小環境のキヌレニンレベルの増加は腫瘍免疫の制御に関与しないと考えられた。3.ヒト肺癌病理標本におけるトリプトファン代謝関連酵素の発現検討を進めている。特に肺腺癌の検体を中心に、IDO1、IDO2、KMO、KAT等の免疫染色の最適化を実施した。今後は予後や治療効果との関連性を調査していく。本年度の研究計画として、1)各種KOマウスにおけるトリプトファン代謝産物の有無によるNKT細胞及びCTL誘導効率の比較、2)トリプトファン代謝産物による腫瘍細胞増殖シグナル経路の制御機構の解析、3)副作用が少なく特異性の高い阻害剤の選択及び投与量、投与法の検討を予定していた。しかし、研究遂行に伴った新たな制御機構を同定したため、そちらの研究を優先し、おおむね順調に実験が進展している。今後、上述した1)3)の研究についても進めていく予定である。前年度に続き、1)各種KOマウスにおけるトリプトファン代謝産物の有無によるNKT細胞及びCTL誘導効率の比較、2)トリプトファン代謝産物による腫瘍細胞増殖シグナル経路の制御機構の解析、3)副作用が少なく特異性の高い阻害剤の選択及び投与量、投与法の検討を実施する。上記課題を円滑に実施し、学術的価値の高い雑誌への投稿を目指す。(理由)当該年度に目標としていた学会で発表する予定であったが、実験結果が十分に出ていない状況であった。このため、次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度に生じた未使用額は、未達成であった学会等の経費に充てることにしたい。(理由)mRNA-seqの外部委託費が、想定していたよりも安価であったため次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度に生じた未使用額は、今年度の物品費として有効に使用したいと考えている。
土壌水分モニタリングシステムを用いた湿潤熱帯傾斜畑における土壌浸食発生過程の解析

本研究では、地域による侵食発生条件の違いをもたらす気象因子と土壌側の因子に着目し、土壌侵食発生と密接な関係を持つと考えられている表面流去水発生条件を定量的に表現・解析した。調査地点としてモンスーン気候下のタイ国北部・東北部の傾斜畑3点を選択し、小区画(1m四方あるいは2.5m四方)の土壌侵食試験プロットに設置したデータロガーによって、降水量、土壌水分量、表面流去水量を10分間隔で経時的に記録・解析し、降雨由来の水を土壌水分増加量、表面流去水、損失量に分配した上で、土壌水の損失速度、表面流去速度、およびそれらの発生条件を降雨強度、初期土壌体積含水率などの関数として求めた。結果は以下のように要約される。1)降雨時の表面流去水発生速度、土壌水損失速度は、いずれも降雨強度および表層土壌の初期体積含水率の関数として表現される。2)雨季初期の降雨は、主として蒸発散として失われつつ、一部それまで乾燥していた土壌の毛管水として収容される。その結果中細粒質土壌では、雨季全般を通した土壌体積含水率の増加が見られる。3)土壌断面内排水発生量は、土壌が毛管飽和される雨季後期に大きくなる。4)地域により雨季を通した降雨強度分布、土壌体積含水率推移の傾向は異なる。これらの条件を受けて、各調査地における表面流去水発生リスクとして以下の3パターンが観察された。i)随時強降雨リスク型。ii)雨季後期毛管飽和リスク型。iii)雨季後期降雨強度増大リスク型。タイ北部メーホンソン県には急峻な傾斜畑作地が広く分布する。熱帯特有の激しい降雨のもと、表面流去ひいては土壌侵食が起きやすい条件にあり、これを回避することは持続的に農業を行うために必須である。本研究では、耕起、敷き藁の施用などの異なる土壌表面処理下における降雨時の土壌水分変化のモニタリングを通して、表面流去発生過程を明らかにすることを目的とした。調査期間(平成12年5-6月)の累積降雨量は367.5mmで、累積表面流去水量の平均値±標準偏差は耕起区、不耕起区、縦敷き藁区、横敷き藁区でそれぞれ16.6±4.9,18.3±1.7,4.1±1.7,4.2±0.8mmであり、累積土壌侵食量の平均値±標準偏差はそれぞれ1.8±0.4,1.5±0.6,0.3±0.1,0.4±0.1ton/haであった。敷き藁施用区では、表面流去水量および土壌侵食量が非施用区に比べ有意に低かった。TDRプローブを装備したマイクロロガーによって得られたデータに基づいて、不耕起区と耕起区について降雨時における0-15cm層位の土壌水分の変化を比較したところ、耕起区では降雨に伴う土壌水分の増加が遅れる傾向が見られた。これは耕起によって生じた表層の微起伏に雨水が一時的に滞留することのよるものと推測された。同様に、不耕起区、縦敷き藁区、横敷き藁区について0-15cm層位の土壌水分の変化を比較したところ、降雨強度が6mm/10min以上と高い時には、各区でほぼ等しい水分変化を示したが、15mm/10minと低い降雨強度下においては、特に横敷き藁区で水分変化の小さい傾向が見られた。これは敷き藁がいったん雨滴を吸収した後、縦敷き藁区では20度の傾斜角度があるため雨水が敷き藁内を伝ってすぐに土壌表面へ排水されるのに対し、横敷き藁区では傾斜角度は関係なく敷き藁内にある程度雨水が保持されることによると考えられた。試作した表面流去水測定装置の動作状況を、石川県白山麓の焼畑耕地跡で確認した結果、降雨強度、土壌水分含量、表面流去水発生量の間に興味深い関係が観察された。

1)本地域土壌は表層の仮比重が0.8g/cm^3前後と透水良好な、中粒質の褐色森林土である。2)予想に反して、表面流去水の発生は、初期水分含量が0.4未満の比較的乾状態の時に限られた。乾状態では、土壌表面での初期浸透が妨げられるためと考えられた。3)10分間隔で測定した土壌水分増加量と表面流去水発生量の和は、降雨量と比例関係にあった。(降水量)-(土壌水分増加量+表面流去水発生量)より下方浸透水量を推定したところ、降雨強度が2mm/10分未満の場合、表層土壌の体積含水率42を境として、それより湿状態で下方浸透が発生した。一方降雨強度が2mm/10分以上の場合、初期土壌水分含量と下方浸透水発生量の間には明確な関係が見られず、不飽和浸透の起こっていることが示唆された。以上より、本装置によって、降雨強度、土壌水分含量、表面流去水発生量(以上実測)、および下方浸透水量(推定)の測定が可能である。2001年度下半期より、本装置を用いた測定を、北部タイの中粒質焼畑耕地土壌、東北タイの砂質土壌において行っている。土壌水分モニタリングシステムを用いて、傾斜地における表面流去水および土壌侵食発生初期条件とその過程に関する解析を行った。調査地は、石川県の耕作跡傾斜地、タイ国北部の焼畑耕地、タイ国北部の粘土質常畑耕地、タイ国東北部の砂質常畑耕地の4地点である。その結果、降雨強度、土壌水分含量、表面流去水発生量の間に以下のような関係が観察された。1)石川県の耕作跡傾斜地土壌(Dystrudepts)は、表層の仮比重が0.8g/cm^3前後と透水良好な、中粒質の褐色森林土である。ここでは予想に反して、表面流去水の発生は、初期体積含水率が0.4未満の比較的乾状態の時に限られた。乾状態では、土壌表面での初期浸透が妨げられるためであろう。また十分間隔で測定した土壌水分増加量と表面流去水発生量の和は、降雨量と比例関係にあった。降水量と(土壊水分増加量+表面流去水発生量)の差より下方浸透水量を推定したところ、降雨強度が2mm/10分未満の場合、表層土壌の体積含水率0.42を境として、それより湿状態で下方浸透が発生した。2)タイ国北部の焼畑耕地(Haplohumults)の透水性は概して良好であった。表面流去・土壌侵食共に、比較的起こりにくい状況にあった。初期体積含水率が0.45を越えるあたりで、表面流去の発生が認められた。3)タイ国北部の石灰質母材由来暗赤色土常畑耕地(Haplustalfs)では、透水性は良好であり、表面流去水発生条件は、2)の焼畑耕地に類似していた。4)タイ国東北部の砂質耕地土壌(Ustipsamments)は、調査対象地のうちではもっとも透水性が低かった。表面流去水発生限界含水率も低く、数十ton/ha/yrに及ぶ土壌侵食が発生していた。以上、試作された本装置によって、降雨強度、土壌水分含量、表面流去水発生量(以上実測)、および下方浸透水量(推定)の測定が可能である。
岐阜県における祭礼衣裳の構成と意匠の史的実証的研究

岐阜県内各地で行われる祭礼行事の際に着装について史的,実証的に考察する目的で調査をすゝめてきたが,今年度は次の祭礼について調査した.下呂の田の神祭(益田郡下呂町),能郷の能(本巣郡根尾村能郷),東津汲の鎌倉踊(揖斐郡久瀬村東津汲),飛騨一之宮水無神社の祭礼(大野郡宮村一之宮),平方勢獅子(羽島市福寿町平方),寒水の掛け踊(郡上郡明方村寒水).祭礼当日,その衣裳の着装状態を写真撮影し記録した.さらに,昨年度調査した3箇所,今年度の2箇所の祭礼衣裳について再度来訪し衣裳の各部の寸法,構成法,色彩,文様等の記録をとり関係者から聞き取り等の再調査を行った.そのうちの飛騨一之宮水無神社の祭礼衣裳の概略を述べる.御旅所神幸が行われるが,この行列は露払いをはじめ各種旗,神宝類,神輿,神主,神馬等に加えて,鶏闘楽,神代踊,獅子舞の三つの神事芸能に奉仕する人々など総勢約300名で構成される.そして,それぞれの役割の衣裳を着装する.鶏闘楽の約100名は白染という白木綿地に文様を多色に染めた着物を着流しにする.神代踊の約100名は黒の着物に黒紋付きの羽織を着る.他に神輿をかつぐ人々は裼衣を着装する.この裼衣は赤・橙色系の退紅に近い色の木綿地でこの上に裲襠風のものを重ねる.これは裼衣と同色の地に七宝花菱文様をこげ茶色で捺染したものである.また,大槍を持つ人の陣羽織は茶色地に藍色で幾何文様をあらわしている.この製作年代は不明であるが,ろう染のように思われる.これは昭和62年10月3日,日本風俗史学会において発表した.その他,昭和62年5月16日の日本服飾学会で白山長滝神社の延年の衣裳について,また,昭和62年5月30日の日本家政学会では大矢田神社のひんこゝ祭の衣裳について発表した.そして,昭和63年5月21日の日本服飾学会において寒水の掛け踊の衣裳について発表する.今後も他の祭礼衣裳について継続再調査し発表する.岐阜県内各地で行われる祭礼行事の際に着装について史的,実証的に考察する目的で調査をすゝめてきたが,今年度は次の祭礼について調査した.下呂の田の神祭(益田郡下呂町),能郷の能(本巣郡根尾村能郷),東津汲の鎌倉踊(揖斐郡久瀬村東津汲),飛騨一之宮水無神社の祭礼(大野郡宮村一之宮),平方勢獅子(羽島市福寿町平方),寒水の掛け踊(郡上郡明方村寒水).祭礼当日,その衣裳の着装状態を写真撮影し記録した.さらに,昨年度調査した3箇所,今年度の2箇所の祭礼衣裳について再度来訪し衣裳の各部の寸法,構成法,色彩,文様等の記録をとり関係者から聞き取り等の再調査を行った.そのうちの飛騨一之宮水無神社の祭礼衣裳の概略を述べる.御旅所神幸が行われるが,この行列は露払いをはじめ各種旗,神宝類,神輿,神主,神馬等に加えて,鶏闘楽,神代踊,獅子舞の三つの神事芸能に奉仕する人々など総勢約300名で構成される.そして,それぞれの役割の衣裳を着装する.鶏闘楽の約100名は白染という白木綿地に文様を多色に染めた着物を着流しにする.神代踊の約100名は黒の着物に黒紋付きの羽織を着る.他に神輿をかつぐ人々は裼衣を着装する.この裼衣は赤・橙色系の退紅に近い色の木綿地でこの上に裲襠風のものを重ねる.これは裼衣と同色の地に七宝花菱文様をこげ茶色で捺染したものである.また,大槍を持つ人の陣羽織は茶色地に藍色で幾何文様をあらわしている.この製作年代は不明であるが,ろう染のように思われる.これは昭和62年10月3日,日本風俗史学会において発表した.その他,昭和62年5月16日の日本服飾学会で白山長滝神社の延年の衣裳について,また,昭和62年5月30日の日本家政学会では大矢田神社のひんこゝ祭の衣裳について発表した.そして,昭和63年5月21日の日本服飾学会において寒水の掛け踊の衣裳について発表する.今後も他の祭礼衣裳について継続再調査し発表する.岐阜県内の祭礼行事の際に着装される衣裳について史的、実証的に考察する目的で調査を始めたが、今年度とりあげた祭礼は次のとおりである。金蔵獅子舞(吉城郡国府町広瀬)、数河獅子(吉城郡古川町数河)、花奪い祭り(郡上郡白鳥町長滝)、半原文楽(端浪市日吉町半原)、表佐の太鼓踊(不破郡垂井町表佐)。前年と同様、祭礼当日の衣裳の着装状態を写眞撮影し、後日再度来訪し衣裳の寸法、構成法、色彩、文様等を記録した。そのうちの花奪い祭りについて結果の概要を述べると、白山長滝神社の祭礼で六日祭りともいわれ毎年1月6日に行われる。神事が終り酌取りが始まる。この衣裳は白衣、白袴、帯刀し、その衣裳の上に黒地の編綴を羽織り、浅葱色の裃姿である。

次の当弁の舞の衣裳は、白地に赤・青・黄色の草花文様が肩から袖の上部および裾にあしらわれた小袖に白地の大口に狩衣姿で舞うが、狩衣は薄緑地に竹に笹と雀の文様の刺繍、また同じ薄緑地に梅樹と鶯の文様が刺繍されたものを着装する。これの製作年代は明らかではないが、この神社には能衣裳の狩衣で黄地梅樹に揚羽蝶の刺繍がほどこされ元和6年の銘のものがある。この梅樹の構図と現在の狩衣の梅樹の構図に類似点がみられる。次に露払いは赤のたつつけ袴をはき緋色で綾織のウール地の陣羽織を着装するが、薄青色の0.5cmのふちどりや、前肩部分に十字繍いの飾りなどが地色の鮮やかな色彩と共に戦を離れて形式化された陣羽織の美しさをみることができる。次に乱拍子、田歌、当弁ねり歌、しろすりと続くが、しろすりの衣装は朱色地に白で花文様を染めだした絹地の襦袢に、白・黒の格子柄のたつつけをはき、黒の襷がけという姿で田打ちのしぐさを行う。資料によっては、たつつけが絣と記されているのもあるが、現在は白・黒の格子柄である。これらの結果については62年度服飾学会に発表の予定である。なお、他の祭礼衣裳についても継続し整理し発表する予定。
大脳皮質特異的遺伝子欠損システムを用いたバレル形成分子機構の研究

マウス体性感覚野のバレル形成は、活動依存的神経回路発達のモデルとして注目されてきたが、その分子機構の解明は顕著に遅れている。本研究では、我々自身が開発したシステムを用いて、バレル形成分子機構解明に挑んだ。本年度は、2つのことを行った。(1)大脳皮質特異的なNMDAR下流候補遺伝子欠損マウスの作製。相同組換えによってloxPが標的遺伝子を挟む形で導入されたESクローンを同定し、キメラマウスを作製。3種類の系統において生殖系列への伝達を確認。受精卵にflp組換え酵素を導入し、FRT配列によって挟まれた薬剤耐性マーカー遺伝子を除去。我々が以前作製したEmx1-Creマウスと交配し、大脳皮質特異的遺伝子欠損マウスを作製中。(2)大脳皮質特異的NMDAR1欠損(CxNR1KO)マウスの解析。このマウスでは、視床-皮質軸索終末から構成されるプレシナプスパターンが、完全ではないが形成される。生後間もないマウスでヒゲからの入力を変化させ、プレシナプスパターンの可塑性を定量し、それが正常であることを発見。これは、従来の薬理学による結論を覆すものである。CxNR1KOマウスでは、第4層神経細胞の細胞体からなるポストシナプスパターンが形成されない。この細胞レベルの原因を調べる目的で、樹状突起の形態を解析。正常マウスの体性感覚野第4層の興奮性神経細胞の樹状突起は、非対称的にバレル中心に向かって伸びる。それに対して、CxNR1KOマウスでは、非対称性が顕著に減少していた。樹状突起の長さの総計は長くなるが、樹状突起の発達の全体的な促進ではなく、枝分かれが増え、複雑さが増大することによっていた。さらに、スパインの密度にも有意な増大が見られた。これらの結果から、NMDARが樹状突起の方向性選択により、ヒゲとバレルの1対1対応を作り、それによってバレル形成が始まるということが示唆された。マウス体性感覚野のバレル形成は、活動依存的な脳発達のモデルとして注目されてきたが、これまで方法論の不備のため、その分子機構の解明は顕著に遅れていた。私は、その問題点を克服するため、Cre/loxP組換えシステムを応用して、大脳皮質特異的遺伝子欠損システムを開発した。本研究では、バレル形成におけるAC1の役割を解析するために、AC1遺伝子を大脳皮質特異的に欠損したマウスを作製することを目的とする。今年度、まず、AC1ゲノムをライブラリーからスクリーニングし、その遺伝子構造を解析した。その結果、AC1が多数の小さなエキソンからなる大きな遺伝子であることが判明した。エキソン1は比較的大きく、機能的にも重要と考えられるので、ターゲッティングベクターとして、エキソン1をloxPで挟む形が最も適当と考えられた。loxPの挿入自体が、エキソン1の機能を阻害しないためには、2個のloxPの間隔を大きく取る必要があり、全長22kbの大きなベクターをデザイン、作製した。このベクターをES細胞に導入し、281クローンをスクリーニングしたところ、4クローンのみが相同組換えによる挿入であった。そして、その中に、5', 3'両端ともloxPの外側で相同組換えを起こしているクローンは得られなかった。この結果は、この領域における相同組換えの効率が悪いことを示す。対策として、強力なネガティブ選択能を持つDTAをコンストラクトに挿入した新たなベクターを作製し、ES細胞に導入した。そして、1000個以上の多数のクローンを単離、凍結した。現在、それらのES細胞クローンをサザンブロットによってスクリーニングしている。

さらに、スパインの密度にも有意な増大が見られた。これらの結果から、NMDARが樹状突起の方向性選択により、ヒゲとバレルの1対1対応を作り、それによってバレル形成が始まるということが示唆された。
新生鎖フォールディングとシャペロン効果の網羅解析

本計画研究の目的は、生化学、分子生物学、遺伝学、生物物理学などを駆使して、翻訳途上の新生ポリペプチド鎖(新生鎖)がどのような過程を経ながら立体構造を形成(フォールディング)するのか、また、新生鎖のフォールディングを助けるシャペロンの分子機構を明らかにすることである。大腸菌、出芽酵母、ヒト細胞由来の翻訳系の再構成系を中心に研究を推進し、29年度は以下のような研究を推進した。【田口】大腸菌にて負電荷アミノ酸の連続配列などがリボソームを不安定化して、翻訳の途中終了を引きおこすこと、さらにその仕組みをマグネシウムイオンの感知機構として活用していることを発見した(Mol Cell 2017)。新生鎖フォールディングを助けるシャペロンの一つ、シャペロニンGroELがどのようなタンパク質のフォールディングを細胞内で助けるのかについてフォールディングの速度論解析をなどを行った。ショットガンプロテオミクスを用いて、細胞内での新生鎖フォールディングを大規模に調べる系を構築している。【富田】酵母由来再構築型翻訳システムの改良を重ね、翻訳アレストやフレームシフトを高い精度で評価できるシステムを確立した。システムを利用し、eIF5A、eEF2、eEF3、Stm1などの翻訳伸長因子の機能解析を行った。以下に示すように、当初の計画を大きく超えて新たな研究を展開できている。【田口】1)本研究では当初細胞内での新生鎖のフォールディングに焦点を絞っていたが、新生鎖研究を進める中で、新生鎖の合成途上で起こる通常ではないリボソームの振る舞いを発見した(新生鎖に依存したリボソーム不安定化:MolCell 2017)。これは、終止コドンに依存しない翻訳の終結という見方ができるため、新生鎖そのものが自らの機能発現に積極的に関わる新たな例を見出したと言える。現在、この現象の発見を契機として、より普遍的に終止コドンに依らない翻訳終結を解析している。これは従来想定されている遺伝子読み枠(ORF)の考え方を拡げるという点でも興味深いと考えている。2)シャペロニンGroELが細胞内でフォールディングを助けるタンパク質(GroEL基質)をGroEL非依存に変換するためのスクリーニングを行った結果、点変異でGroEL依存性をスイッチすることができ、さらにはその変異がフォールディングの性質をどのように変化させるかについて特徴を解析することができた。3)ショットガンプロテオミクスを使うことで、細胞内のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)をプロテオームレベルで解析できるようになってきた。【今高】再構成型人工細胞体の中で合成したハンチントン病の原因タンパク質が、生きた細胞内と同様の凝集を呈した。つまり、タンパク質凝集病の一端を試験管内で再現し解析できるシステムを樹立できたと言える。【富田】今年度は特に、連続プロリン配列による翻訳アレスト機構と翻訳後修飾がなされていないeIF5Aの役割について従来の研究計画以上に明らかにできた。【田口】1.新たに見出した負電荷アミノ酸翻訳時のリボソーム不安定化現象の分子機構や生理学的意義をさらに明らかにする。2.新学術領域のサポートを受けて導入した質量分析装置を用いた定量的ショットガンプロテオミクスをさらに推進する。さまざまな研究が推進できる例として、新生鎖、すなわちリボソームにまだ留まっているペプチジルtRNAの大規模解析、タンパク質フォールディングやシャペロンとの相互作用の相関の大規模な調査、翻訳因子やシャペロンの翻訳後修飾の網羅解析とその生理的意義の解明などがある。3.大腸菌で実施した大規模な翻訳一時停止解析を出芽酵母など真核細胞へ拡張する。また、新生鎖に依存したリボソーム不安定化現象についても出芽酵母やヒト細胞にて起こっているのか解析を進める。この真核細胞への拡張では分担者の今高・富田グループと既に共同研究を始めており、新学術領域のプラットフォームのサポートを受けた有意義な共同研究となりつつある。4.生細胞内での翻訳の可視化技術を用いて、細胞内での翻訳速度調節、翻訳時フォールディングを可視化する。(国際支援班によるサポートを受けた国際共同研究)【今高】ヒト因子由来完全再構成システムとそれを基盤とした人工細胞を用いて、細胞骨格タンパク質であるアクチンの合成、フォールディング、線維化を行う。それによりアクチン関連遺伝病の解析を行う。また、この再構成システムを領域内メンバーに供与することにより共同研究を続行する。【富田】シャペロンによる翻訳伸長制御機構の解析や、tRNAの再構成に取り組む予定である。また、また、この再構成システムを領域内メンバーに供与することにより共同研究を推進する。26年度は、私たちが礎を築いた新生鎖の生物学に関するユニークな実験系を元に新生鎖フォールディングの分子機構・シャペロンの役割を解明、さらに、真核生物PUREシステムを完成させて一層の研究展開を図った。1.新生鎖フォールディングの分子機構:新生鎖フォールディングを助けるHsp70(DnaK)やシャペロニン(GroEL/Hsp60)などのシャペロンは翻訳されてくる蛋白質に応じて、連携したり、単独で働いたりしているらしい。特に、複数種のシャペロンがどのような連携機構で新生鎖フォールディングを助けているのか不明である。そこで、種々のシャペロンが新生鎖のフォールディングをどのように助けているのかを大腸菌の再構築型無細胞翻訳系(PUREシステム)を使った生化学、遺伝学的に当該シャペロンを欠損もしくは条件欠乏させた大腸菌で解析した。2.大規模な翻訳速度調節

アッセイ:翻訳の一時停止(翻訳アレスト)を含めた翻訳速度調節とフォールディングが関連していることがわかってきた。その手始めとして、大腸菌をモデル生物として、大規模に翻訳一時停止アッセイを行った。3.真核生物の再構築型無細胞翻訳系(真核PUREシステム):(今高)真核細胞、特にヒト細胞における新生鎖の研究を行うための研究基盤として、ヒト因子由来再構成型翻訳システムを樹立した。(富田-竹内)出芽酵母因子由来の再構築型無細胞翻訳系の完成をめざした。当初目標に掲げた研究計画について以下のような進展があったので、おおむね順調に研究が進んでいると判断した。1.新生鎖フォールディングの分子機構:大腸菌のHsp70ファミリーであるDnaKの欠損株にてシャペロニンGroELの基質蛋白質を発現させて、そのフォールディングがDnaK欠損株で影響を受けるかどうか解析した。DnaK欠損株ではフォールディングに影響がなければ、その蛋白質はGroELには依存するが、DnaKには依存しないこと、DnaK欠損株でGroEL基質蛋白質がフォールディングに失敗して凝集もしくは分解されれば、その蛋白質はDnaKとGroEL両方に依存することがわかる(「GroEL&DnaK基質」)。GroELの基質蛋白質数十種類をDnaK欠損株で発現させたところ、約半数がGroEL&DnaK基質であることが判明した。シャペロンの基質蛋白質について、GroELやDnaKなど個別には明らかとなってきているが、その連携について新たな知見を得た。2.大規模な翻訳速度調節アッセイ:大腸菌で、細胞内およびPUREシステムを用いて、1000種類以上の遺伝子(ORF)を発現させ、翻訳途上産物であるペプチジルtRNA(新生鎖)が蓄積するかどうかを電気泳動で逐一調べて、一時停止の状況を評価した。3.真核生物の再構築型無細胞翻訳系(真核PUREシステム):(今高)翻訳伸長因子、翻訳終結因子、リボソーム、tRNA(すべてヒト由来)だけでタンパク質合成ができるシステムを樹立した。このシステムを用いて、脳心筋炎ウイルスの2Aペプチドによる翻訳終結・再開始が翻訳開始因子や終結因子そして特別な因子無しで起こることを証明した(JBC 2014 289:31960)。(富田-竹内)精製した出芽酵母の翻訳因子を使い、翻訳開始過程をスキップした条件にて翻訳系を再構成することに成功した。27年度は、前年度の研究をさらに発展させるとともに、新たな研究にも着手した。1.新生鎖フォールディングの分子機構:これまでにシャペロンによる新生鎖フォールディングの分子機構を調べてきたが、品質管理がどのように成し遂げられているのかについて分子機構はほぼ不明である。そこで新生鎖に関わるシャペロンに加えて、LonなどATP依存プロテアーゼも加えた状態にて、新生鎖フォールディングと品質管理の再構成を目指した。
国内スポーツ総生産（GDSP）の推計によるスポーツ産業活性化方策の検討

スポーツ産業は、日本再興戦略2016で取り上げられ、わが国の経済発展に重要な役割を果たすことが期待されている。しかし、わが国のスポーツ産業の経済統計は十分に整備されているとは言い難い。そこで本研究は、欧州のスポーツ産業経済規模の推計方法であるスポーツサテライトアカウントの日本版を開発し、国際比較可能なスポーツ産業統計値を推計することを目的とした。最終年度は、平成28年度、平成29年度に実施したスポーツサテライトアカウントに関する英国調査の成果に基づき、政府系金融機関および経済統計の専門家らと共に、日本版スポーツサテライトアカウントの開発をし、スポーツ産業の経済統計値としてスポーツ付加価値(スポーツGVA)とスポーツ雇用者数を推計し、スポーツ産業の構造分析および欧州諸国との比較を行った。その結果、スポーツGVAは、2011年約6.6兆円、2012年約6.3兆円、2013年約6.6兆円、2014年約6.7兆円であった。また、部門別の構成を見ると,スポーツの財・サービスの生産をするための上流(投入)の過程で約1兆円(約15%)の付加価値が生まれ、スポーツの財・サービスの生産そのものによって約4.4-4.7兆円(約70%)の付加価値が生み出され、そして生産されたスポーツの財・サービスを流通させるために約1兆円(約15%)の付加価値が生み出されている構造が明らかとなった。また、国内全産業のGVAに占めるスポーツ産業GVAの割合は、1.36-1.40%であることが明らかとなった。スポーツ産業雇用者数は、2011年は約101万人、2012年は約98万人、2013年は約102万人、2014年は約103万人であった。国内全体の雇用者数に占める割合は、1.47-1.52%であった。以上の結果を欧州諸国と比較すると、わが国スポーツ産業は成長余地がある産業であることが考察された。政府は、日本再興戦略2016においてスポーツ産業を新たな有望成長市場の一つに選定し、2025年までに15兆円にする目標が掲げられている。しかしながら、日本においてスポーツ産業の統計は十分に整備されているとは言い難い。諸外国においては、国民経済計算(SNA)に準拠してスポーツ産業規模を推計する研究が増加しており、特に英国およびEU諸国においては、スポーツサテライト勘定(Sport Satellite Account)が採用されている。日本においては、これまでスポーツ産業をSNAに準拠した考え方で推計しようする試みはいくつか見られるが、スポーツ産業規模推計の方法論においては課題が多く改善の余地がある。そこで、平成28年度は、推計方法を確立することの必要性から、平成29年度の計画を前倒し、英国へのインタビュー調査を実施した。具体的には、英国のスポーツ産業を推計しているSheffield Hallam UniversityのSport Industry Research centreにおいて、推計方法および日本への適用可能性を調査した。その結果、EUにおいては、スポーツサテライト勘定を導入するにあたりVilnius Definitionと言われるスポーツ産業の定義を作成し、産業連関表および民間・公的統計、社会調査などによって国民経済計算体系に準拠してスポーツ産業規模の推計を実施していることが明らかとなった。平成28年度の調査を通じて、平成29年度以降に日本におけるスポーツ産業規模推計を実施する際に、必要な手順や方法論が明らかになったと考える。当初計画していた平成28年度の消費面からの調査は実施しなかったが、これは英国におけるスポーツ産業規模推計のインタビュー調査を前倒し、方法論の見直しをした結果である。したがって、平成29年度において引き続き具体的な調査に入ることができるため、おおむね順調に推移している。本研究は、英国およびEUのスポーツ産業市場規模の推計方法であるスポーツサテライトアカウントの手法をわが国に導入することで、日本版スポーツサテライトアカウントを作成し、国際比較可能なスポーツ産業統計値の開発をすることを目的とした。平成29年度は、第一に英国Sheffield Hallam UniversityのSport Industry Research Centreにインタビュー調査を実施した。この英国調査は平成28年度に引き続き、本年度は、前回調査で不足していた推計方法に関する情報を補うための調査であった。また第二に、政府系金融機関および経済統計の専門家らと共に、日本版スポーツサテライトアカウント構築の検討を行った。第一に、英国調査によって、スポーツサテライトアカウントの作成方法が明らかとなった。スポーツサテライトアカウントは、欧州標準産業分類NACEおよび欧州生産物分類CPAに基づいてスポーツ産業の具体的な財・サービスの定義であるヴィルニュス定義が作成され、スポーツ産業シェア調査を経て,産業連関表によってGVA(租付加価値)、雇用者数、消費支出など、スポーツ産業統計値を推計していることが明らかとなった。第二に、経済統計の専門家らと日本版スポーツサテライトアカウント開発の検討を行った。国際比較可能な指標とするため、わが国における経済統計を検討した上で、国内生産額品目表を基盤とし、日本版スポーツ産業定義を作成した。また、スポーツ産業定義作成においては、有識者による会議体における検討を実施し、実際の計測は産業連関表および雇用表を用いて推計を実施した。スポーツ産業シェア調査においては、今後、供給側・需要側を考慮したより精緻な調査をすることが望ましいことが示唆された。平成28年度に引き続き、平成29年度においても推計方法の検討をし、わが国のスポーツ産業における経済規模推計の方法論をモデル化することができたため。

スポーツ産業は、日本再興戦略2016で取り上げられ、わが国の経済発展に重要な役割を果たすことが期待されている。しかし、わが国のスポーツ産業の経済統計は十分に整備されているとは言い難い。そこで本研究は、欧州のスポーツ産業経済規模の推計方法であるスポーツサテライトアカウントの日本版を開発し、国際比較可能なスポーツ産業統計値を推計することを目的とした。最終年度は、平成28年度、平成29年度に実施したスポーツサテライトアカウントに関する英国調査の成果に基づき、政府系金融機関および経済統計の専門家らと共に、日本版スポーツサテライトアカウントの開発をし、スポーツ産業の経済統計値としてスポーツ付加価値(スポーツGVA)とスポーツ雇用者数を推計し、スポーツ産業の構造分析および欧州諸国との比較を行った。その結果、スポーツGVAは、2011年約6.6兆円、2012年約6.3兆円、2013年約6.6兆円、2014年約6.7兆円であった。また、部門別の構成を見ると,スポーツの財・サービスの生産をするための上流(投入)の過程で約1兆円(約15%)の付加価値が生まれ、スポーツの財・サービスの生産そのものによって約4.4-4.7兆円(約70%)の付加価値が生み出され、そして生産されたスポーツの財・サービスを流通させるために約1兆円(約15%)の付加価値が生み出されている構造が明らかとなった。また、国内全産業のGVAに占めるスポーツ産業GVAの割合は、1.36-1.40%であることが明らかとなった。スポーツ産業雇用者数は、2011年は約101万人、2012年は約98万人、2013年は約102万人、2014年は約103万人であった。国内全体の雇用者数に占める割合は、1.47-1.52%であった。以上の結果を欧州諸国と比較すると、わが国スポーツ産業は成長余地がある産業であることが考察された。当初計画においては平成29年度に行う予定であった英国での調査を前倒ししたため、順番が前後するが、スポーツ産業規模推計の具体的調査を実施する。平成30年度においては、より精緻なスポーツ産業調査を実施し、スポーツサテライトアカウントによる推計を実施する。平成28年度に予定していた消費調査を実施しなかったため。平成29年度に実施する予定であった方法論に関するインタビュー調査を前倒しした結果、方法論の見直しが必要となった。平成28年度に実施しなかった調査は平成29年度において実施する予定である。
細菌の細胞周期における蛋白質の燐酸化,カルシウムイオン、細胞骨格様蛋白質の役割

1大腸菌のoriC-膜複合体中にヒストン様蛋白質H-NSを抗H-NS抗体を用いて検出した。さらにその欠失変異体は、野性株と比べて高頻度に無核細胞を放出し、細胞あたりの核数(ploidy)が減少していることを見い出した。これはH-NSが染色体の複製と分配において重要な役割を果たしていることを示唆している。2大腸菌の細胞周期におけるカルシウムの役割を明らかにするために、培地中の高濃度のカルシウムによって生育が阻害される変異株CS2-29と、高温感受性が抑制される株SH3450を分離し、その解析を行った。CS2-29株のカルシウム感受性にかかわる変異を相補する遺伝子を、コスミドベクターを用いてクローン化した。得られたクローンは大腸菌染色体地図上48分にマップされた。同様に、SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子についてコスミドクローンを分離した。得られたクローンは90分にマップされた。現在、これらのクローンからカルシウムに関わる遺伝子のサブクローニングを行っている。3過剰発現により細胞内に細胞骨格様構造体を形成するcafA遺伝子の機能を明らかにするためにcafA遺伝子の破壊株cafA::catを構築した。RNaseEの変異株ams1の温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されること、ams1 cafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されることを見い出した。cafA::cat株では16S rRNAの前駆体である16.3S rRNAが蓄積しており、cafAプラスミドの導入によって回復されることを見い出した。これらのことよりcafAは16S rRNAの成熟過程にかかわるRNaseE様のエンドリボヌクレアーゼであることが示唆された。oriC複合体画分中にヒストン様蛋白質H-NSが見い出されたため、H-NSの染色体複製における役割を検討した。in vitroのoriCプラスミド複製系においてH-NSは阻害効果を示した。少量のHUによりoriCからの複製開始が増加することが知られているが、H-NSはこれを代替しなかった。大腸菌の細胞周期におけるカルシウムの役割を明らかにするために、培地中の高濃度のカルシウムによって生育が阻害される変異株と、高温感受性が抑制される株を探索した。fcsA29変異株として分離されていたCS2-29株がカルシウムによって細胞分裂が阻害され、巨大細胞を形成して死に至ることを見い出した。カルシウム感受性はfcsA29変異とは異なる変異によるものであった。また新たに、高温感受性がカルシウムによって抑制されるts88変異株を分離した。現在、これらの遺伝子のクローニングを行っている。大腸菌のヒストン様蛋白質H-NSの欠失変異株では、野生株と比べて核様体が不規則に分布していることを見い出した。これはH-NSが染色体の分配において何らかの役割を果たしていることを示唆している。大腸菌の細胞周期におけるカルシウムの役割を明らかにするために、培地中の高濃度のカルシウムによって生育が阻害される変異株CS2-29と、高温感受性が抑制される株SH3450の解析を行った。得られたクローンはKoharaの大腸菌染色体整列クローンに対するハイブリダイゼーションによって大腸菌染色体地図上48分にマップされた。

過剰発現により細胞内に細胞骨格様構造体を形成するcafA遺伝子の機能を明らかにするためにcafA遺伝子の破壊株cafA::catを構築した。RNaseEの変異株amslの温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されること、amsl cafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されることを見い出した。また、cafA::cat株においてAdhE(アルコールデヒドロゲナーゼ)が過剰発現していることを見い出した。1 SH3450株のカルシウム依存的増殖にかかわる遺伝子はP1トランスダクションによりargHとrpoBの間にあることが示されたが、この領域のどのDNA断片によっても相補されず、優性変異であることが示唆された。2 H-NSの欠失変異株にmukAまたはmukB遺伝子を含むマルチコピープラスミドを導入しても、無核細胞の放出は抑制されなかった。また定常期特異的シグマ因子Rposの有無に関わらず無核細胞の放出の放出が認められた。これらのことはH-NSは直接染色体DNAと結合することによって染色体分配を制御していることを示唆している。3 RNaseの変異株amslの温度感受性がcafAプラスミドによって部分的に回復されること、amslcafA::catの二重変異株ではその温度感受性が増強されることを見い出した。またアルコールデヒドロゲナーゼadhEとcafA::catの二重変異株は生存可能であった。cafA::cat株では16S rRNAの前駆体である16.3S rRNAが蓄積しており、cafAプラスミドの導入によって回復されることを見い出した。これらのことによりCafAは16S rRNAの成熟過程にかかわるRNaseE様のエンドリボヌクレアーゼであることが示唆された。4試験管内蛋白質燐酸化反応系を構築し、カルモジュリン阻害剤W7によって阻害される燐酸化反応を見い出した。また大腸菌のW7感受性がtolC(mukA)遺伝子のコピー数に依存することを見い出した。
シナプス終末で働く遺伝子群の共役的発言制御機構の解明

記憶等神経高次機能を制御する神経細胞間情報伝達はシナプスによって担われている。原田はこれまでに、神経伝達物質がシナプス前終末に異常蓄積する変異体の解析から正常なシナプス伝達にはこれらの遺伝子群が神経細胞で共役的に発現することが必須であることを明らかにした。この共役的遺伝子発現の調節機構の解明がシナプス伝達を知る鍵となると考えられる。そこで、(1)シナプス伝達関連遺伝子群の共役的発現制御領域をを明らかにし、(2)神経前終末遺伝子発現の共通性・互換性からシナプス伝達に寄与する因子の遺伝子発現制御ネットワークの構築が本研究の目的である。1.神経特異的な発現制御領域の同定のため線虫C.elegans unc-18およびunc-64ゲノムDNAをクローニングした。PCRで増幅した当該遺伝子上流域DNA断片をGreen Fluorescent Protein(GFP)をレポータ-遺伝子とする発現ベクターに組み込み、トランスジェニック線虫のGFPの発現パターンを観察した。その結果、unc-18遺伝子では上流域-366から-53bpのDNA断片で、またunc-64では上流域-800bpのDNA断片で両者共に神経特異的な発現を示した。2.C.elegansの近種であるC.briggsaeのunc-18上流域をC.elegans unc-18とDNA配列を比較したところC.elegans unc-18上流域-359から-34lbpの19bp範囲で非常に高い相同性を示せす領域を見つけた。しかし、この配列はunc-64中では高い相同性を示す領域は認められなかった。unc-18上流域内の19bpについてsite-directed mutagenesis法により2文字毎に塩基置換を行った発現ベクターを構築し、レポーター活性の局在を指標に神経特異的発現に必須なヌクレオチドを決定した。この結果から19bp内の5'ACX_4SSX_4TTG3'配列がunc-18遺伝子発現に不可欠であることを明らかにした。以上の結果からC.elegans unc-18の神経特異的な遺伝子発現は上記配列に特異的に接合する因子において制御されていることが示唆されたが、unc-64上流域との比較からは共役的発現制御にはさらに別の領域が関与することが推定される。2.さらにこのことを検証するためにC.elegansの近種であるC.briggsaeのunc-18遺伝子上流域をクローニングし、C.elegans unc-18遺伝子とDNA配列を比較した。その結果C.elegans unc-18遺伝子上流域-359から341bpの範囲と非常に高い相同性を示す領域を見つけた。この19bpについてsite-directed mutagenesis法により2文字毎に塩基置換を行った発現ベクターを構築し、レポーター活性の局在を指標に神経特異的発現に必須なヌクレオチドを決定した。この結果から19bp内の5'ACX_4CCX_4TTG 3'配列がunc-18遺伝子発現に不可欠であることを明らかにした。3.トランス因子同定のため19bp領域においてゲルシフトアッセイを行った。この結果19bpに結合する因子を同定した。また、この因子は19bpのsense-strand DNAを加えると特異的に結合が阻害されることから、single-strand DNAに結合することを明らかにした。以上の結果からC.elegans unc-18の神経特異的な遺伝子発現は5'ACX_4CCX_4TTG 3'配列に特異的に結合する因子おいて制御されているとが示唆された。

以上の結果からC.elegans unc-18の神経特異的な遺伝子発現は上記配列に特異的に接合する因子において制御されていることが示唆されたが、unc-64上流域との比較からは共役的発現制御にはさらに別の領域が関与することが推定される。