hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
革新的両方向性遺伝学的アプローチによる重度小頭症の病態解明

日本人遺伝性小頭症家系を用いて、次世代シーケンサーによる全エクソーム解析を行った。その結果、遺伝性小頭症の兄妹にWDR62遺伝子の新規変異を同定した。いずれもc.731 C>T (p.Ser 244 Leu)とc.2413G>T (p.Glu 805 X)の複合ヘテロ接合体であった。WDR62の機能を明らかにするために、人工ヌクレアーゼCRISPR/Cas9を用いてWDR62/MCPH2欠損ヒト培養細胞株を樹立した。樹立した欠損細胞は紡錘体形成に異常を来しており、これにより初期発生で十分な神経幹細胞が得られないために小頭症を発症したことが考えられた。遺伝性小頭症は、遺伝的異質性が特段に高いことが知られており、これまでに原因遺伝子として、NBS1、Rad50、Ligase4(DNA二重鎖切断修復遺伝子)、ATR、MCPH1、ORC1(DNA一本鎖損傷修復遺伝子)、PCNT、ASPM、CENPJ、CDK5RAP2、STIL、CEP152、CEP63、BUBR1(有糸分裂制御遺伝子)などが同定された。これらの研究から、遺伝性小頭症の患者は、出生前からのゲノム安定性機構の破綻により、器官形成期で神経幹細胞が十分増殖できず、そのために脳サイズが小さくなることが考えられている。申請者らはこれまでに遺伝性小頭症の日本人2家系にDNA二重鎖切断修復遺伝子Mre11Aに変異を報告しているが、今年度は共同研究によりミオクローヌス運動失調の成人女性にMre11A遺伝子変異を同定し、同遺伝子変異が臨床的に多様な症状を呈することを明らかにした。さらに、ヒトBUBR1欠損症の遺伝子変異をゲノム編集技術を用いて正常細胞に導入して、小頭症のモデル細胞を作成することに成功した。遺伝性小頭症は、遺伝的異質性が特段に高いことが知られており、これまでに原因遺伝子として、NBS1、Rad50、Ligase4、ATR、MCPH1、ORC1、PCNT、ASPM、CENPJ、CDK5RAP2、STIL、CEP152、CEP63などが同定された。これらの研究から、遺伝性小頭症の患者は、出生前からのゲノム安定性機構の破綻により、器官形成期で神経幹細胞が十分増殖できず、そのために脳サイズが小さくなることが考えられた。私たちは最近、日本人10家系11例のサンプルを収集して、DNA修復経路上から原因遺伝子を探索し、2家系にDNA二重鎖切断修復遺伝子Mre11Aに変異を、2家系に中心体構成因子PCNT遺伝子に変異を同定した。いずれの患者細胞もDNA損傷後のアポトーシスが亢進しており、神経幹細胞の増殖不良にアポトーシスの関与が示唆された。一方、残り6家系にはDNA修復経路上の小頭症関連遺伝子に変異を認めず、新規の原因遺伝子が予想された。本研究では、日本人遺伝性小頭症の6家系について、次世代シーケンサーを用いた全エクソーム解析で原因遺伝子を同定して、病因と病態を解明することを目的としている。これまでに日本人遺伝性小頭症4家系について、次世代シーケンサーを用いた全エクソーム解析を行った。具体的には、Nimblegen社のExon captureを用いて、ゲノムDNAのエクソン配列に相当するDNA断片を濃縮し、Hiseq2000で塩基配列を決定した。現在、dbSNPを用いて候補SNPの絞り込みを行っている。遺伝性小頭症は、遺伝的異質性が特段に高いことが知られており、これまでに原因遺伝子として、NBS1、Rad50、Ligase4(DNA二重鎖切断修復遺伝子)、ATR、MCPH1、ORC1(DNA一本鎖損傷修復遺伝子)、PCNT、ASPM、CENPJ、CDK5RAP2、STIL、CEP152、CEP63(有糸分裂制御遺伝子)などが同定された。研究代表者らはこれまでに、遺伝性小頭症の日本人2家系にDNA二重鎖切断修復遺伝子Mre11Aに変異を、さらに2家系に中心体構成因子PCNT遺伝子に変異を同定した。昨年度は、共同研究によりミオクローヌス運動失調の成人女性にMre11A遺伝子変異を同定して、同遺伝子変異が臨床的に多様な症状を示すことを明らかにした。本年度でさらに、遺伝性小頭症の日本人兄妹にWDR62遺伝子変異を同定した。遺伝子変異の機能解析を実施するとともに、人工ヌクレアーゼを用いた遺伝子標的法で小頭症モデルマウスの作製を試みた。

遺伝医学エクソーム解析で新規遺伝子が同定されなかった。当初の計画案に沿って研究が順調に進行中である。遺伝性小頭症6家系の原因遺伝子検索を、全ゲノム解析で実施する。遺伝性小頭症6家系の原因遺伝子探索を継続する。それと同時に、人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術の開発を進める。これにより、遺伝性疾患の細胞モデルならびにマウスモデルを速やかに作成することが可能となる。エクソーム解析により遺伝性小頭症の新規遺伝子が同定されなかったので、小頭症モデルマウスの作成に代えて既知遺伝子のモデル細胞を作成した。全ゲノム解析を実施して新規遺伝子の同定を試みる。平成24年度未使用分を使用して残り2家系の次世代シーケンサによる解析を進める。また、平成25年度予算で高活性のTALEヌクレアーゼを作成して、高効率の遺伝子標的法を開発する。
中世初期イングランドにおける地域社会の形成-ミッドランドの社会経済ネットワーク-

考古学の成果を取り入れつつ文書史料を再検討した結果、10世紀以降に顕著な都市的発展に伴い、都市ウスターと周辺農村との経済的ネットワークが形成されていく様を浮び上がらせることができた。また、9世紀頃から現れる新たな文書実践に注目したところ、地縁や友情など多様な契機で結ばれた人的結合関係が重要な社会的機能を果たしたことが判明した。以上の作業を通じて、中世初期を封建制・荘園制の形成期とする従来の見方に対し、モノや人の結びつきが創り出す動態的で立体的な社会像を、「地域」として理解する必要性を提唱した。本研究は、アングロ・サクソン期社会の形成と変容を、人や物の結び付きとそれが動態的に創りだしていく「地域」に着目しつつ、長期的かつ包括的に追求するものである。(1)史料と先行研究の豊富な西部ミッドランドを主要な対象とし、「地域」の基礎として、人々が共有する経済圏・宗教圏・政治圏などの経験領域を具体的に検証する。(2)その際、歴史地理学、考古学、地名学等の隣接諸科学の成果を導入して、封建制や荘園制といった従来の理論に回収されない、アングロ・サクソン社会の包括的把握を目指す。本研究は,アングロ・サクソン期農村社会の形成と変容を、人や物の結び付きとそれが創りだしていく「地域」に着目して、長期的かつ包括的に追究するものである。この目的を達成するために、2007年度は、都市=農村関係に焦点を絞って考察を進めた。具体的には、10世紀以降のウスター司教座関連文書に登場する、司教座集落ウスターと農村とがリンクした型の所領に注目し、その結合の性格と意味を追跡した。考古資料、文書、ドゥームズデイ・ブックなど、現時点で利用可能な資史料を総動員して分析を進めた結果、明らかとなったのは以下の諸点である。1,ウスターでは、司教座創設当初から、王権の保護を受けつつ司教座主導で中心地機能の強化が押し進められていた。2,宗教、経済、防備など複数の中心地機能が漸次的に蓄積された結果として、10世紀以降には都市住民の顕著な増加も確認できるが、その中で農村領主が都市内に屋敷地を有する、いわゆる都市=農村リンク型所領が散見されるようになった。3,ここから、ウスターの都市的機能が農村経済に重要な役割を果たしていたと結論できる。近年の荘園制研究では所領の自己完結的性格を強調する立場が有力であるが、本考察は、むしろ具体的な地域ネットワークの解明こそが必要かつ有益であることを、ウスターと周辺農村との関係から例証するものである。この成果は、「アングロ・サクソン期ウスターの都市的発展と司教座-所領経済の解明に向けて-」『西洋史学論集』45(2007年)として発表した。また、史料の限定された中世初期について研究を進めていく上で、史料に対する深い理解と新しい解釈の必要性を痛感したため、史料論研究の手法に着目しつつ先行研究を整理した。その過程で、文書集成=Cartularyに関する優れた業績を取り上げ、書評を執筆している。本研究は,イングランド中世初期社会の形成と変容を、人や物の結び付きとそれが創りだしていく「地域」に着目して、長期的かつ包括的に追究するものである。2008年度は、文書史料を新たな視角から利用するための準備作業として,まず大陸学界の動向に目を向けた。比較の観点から浮かび上がったのは,紀元千年封建革命説をめぐる大陸学界の議論で焦点の一つとされているノティス型の文書が,イングランドにおいても9世紀以降に登場していること,それにもかかわらず,イギリス学界においてはこうした類型に注目した考察がなお本格的に進められていないこと,以上の二点であった。これらを受けて出発点として,文書の変動と社会の変化という視角からノティス型文書に着目することの可能性を見出すとともに,文書類型論の必要性を確認した(この作業は「私文書研究の動向とその可能性」として発表している)。その上で実際にノティス型文書にざっと目を通してみた結果,これがたびたびキログラフ(割印証書)として作成され,当事者間のみならず第三者による保持を前提としていたことが判明した。この点は,本研究課題にとって特に重要と思われる。文書に記された取り決めが実行される際,その保証人として指名された第三者は,行為当事者たちといかなる関係を持つ人物であり,具体的にどのような役割を果たしていたのか。ノティス型文書が登場した背景を探るとともに,文書をめぐる人的ネットワークを解明することで,「地域社会」形成過程にアプローチするという,新たな課題を設定することができた。

また,日本学界におけるイギリス中世史研究の動向を整理して,最近の史料論的手法から優れた成果が生みだされていることを指摘した(「2007年の歴史学界ヨーロッパ中世イギリス」)が,この作業によって,文書史料の新たな視角からの再検討という本研究のアプローチが持つ可能性を,確信することができた。本研究は,イングランド中世初期社会の形成と変容を、人や物の結び付きとそれが創りだしていく「地域」に着目して、長期的かつ包括的に追究するものである。2009年度は、10世紀頃から新たに登場した文書実践(割り印証書キログラフ、および複数作成文書)に注目し、その社会的背景を検討するための準備作業を進めた。比較のためにミッドランドからイングランド全域に対象を広げ、およそ1500通伝来している文書に目を通した結果、明らかとなったのは以下の諸点である。1,キログラフ及び複数作成文書は、発給主が聖職者である私文書にほぼ限定される。2,ある文書がキログラフで作成されたと判明するのは、それがオリジナルで伝来している場合に限られる。3,キログラフ及び複数作成文書は主として文書に記載された行為の当事者に宛てられるが、その他の人物による保持を目的とした三部・四部作成の文書が散見される。これらから推測されるのは、キログラフ及び複数作成文書の登場が、(1)文書による取引(所領譲渡など)が活発化する10世紀以降に、とくに聖職者が主導した新たな政策を示すと共に(2)王が発給主である王文書に対する権威の承認、および(3)当事者以外で文書の名宛人とされた人物の保証人としての重要な役割などを表すということである(以上の成果は『愛媛大学教育学部紀要』に掲載予定である)。この予備的考察を受けて、今後は個別の事例を詳細に追跡することで、文書をめぐる人的ネットワークを解明し,「地域社会」の形成過程に接近したいと考えている。昨年度はまた、我が国におけるブリテン諸島史の研究水準向上を目的に進められている、『オックスフォードブリテン諸島の歴史』翻訳プロジェクトに参加した(第3巻『ヴァイキングからノルマン人へ』において、代表者が研究を進めてきた流通や史料論のセクションを担当)。本研究は、イングランド中世初期社会の形成と変容を、人や物の結び付きとそれが創りだしていく「地域」に着目して、長期的かつ包括的に追究するものである。2010年度は、前年度に引き続き、10世紀頃に登場した文書実践(割り印証書カイログラフ)に注目し、その社会背景の理解に向けた準備作業を進めた。具体的には、相対的に多くのカイログラフを伝来させている教会の文書所のうち、ウスター司教座とベリー・セント・エドマンズ修道院を対象に、伝来と作成の特質を探った。その結果(1)名宛人を記載する慣行がなく、オリジナルで伝来している割合の高いウスター司教座に対し、オリジナルは存在せず、転写された文書での名宛人の記載からカイログラフ利用が判明するベリー・セント・エドマンズ修道院という文書伝来上の相違が明らかになり、さらに(2)期限付きの土地貸与に関して広くカイログラフが採用されたウスター司教座と、遺贈について選択的に作成したベリー・セント・エドマンズ修道院というように、作成場面における文書所ごとの特質が浮かび上がってきた(以上の成果は『愛媛大学教育学部紀要』に掲載)。その背景については、各教会組織が置かれていた環境を再現することで理解できるのではないかと考えている。また、カイログラフ形式の文書にも一般的に現れる証人や、第三者であるにもかかわらず名宛人とされた人物・組織については、初期社会の人的ネットワークの紡ぎ方とその意味を考察するための重要な素材であり、「地域社会」形成過程の解明に資するものとして注目している。
集団における植物のリズム運動とコミュニケーションに関する工学的研究

植物のコミュニケーションに関連して、集団における個体と個体、個体と全体との関係付けの仕組みについて検討する上で、1個体独立した状態と集団でのリズム運動の違い、さらには様々な配置方法での挙動の変化などを調べることは重要であると思われる。そこで本研究ではこの点を明らかにするため、一定間隔の格子状に配置された複数のマメ科植物の幼根に関して、生長に伴うリズム運動を集団レベルで複数同時に計測できるシステムの開発を行った。また、これを用いて、複数のエンドウ幼根を並べ、個体間の空間的な配置を様々に変化させた場合の、個々の幼根が示す運動リズムの相互関係性について調べた。本システムは、計測対象周辺に配置された4台のCCDカメラを計測時に個々の根が存在する位置に高速で往復移動させることによって、カメラを増設することなく多数の根の運動を同時に捉えることが可能となっている。結果として、2個体を並べた場合では、両者のリズムに位相関係が存在したが、3個体に増やすと、2個体のリズムにコヒーレントな関係が生成される一方で、残りの1個体があまり活発なリズムを示さないなど、2個体に比べて複雑で多様な振る舞いを示した。また、計測途中で3個体のうち1個体を除去すると、残された個体があたかも隣の個体が除去されたを察知したかのように、以前隣に存在していた根の方向へ生長方向を変化させたり、2個体の間に新たな個体を挿入した場合では、新たに植え付けられた個体と一方の隣の個体との間に位相関係が生成されるなど、お互いの位置関係によってリズムパターンが変化した。以上より、個々のリズムパターンの変化が、個体相互間の時間的、空間的な関係付けの仕方と密接に関係があることを示した。無中枢的な植物同士のコミュニケーションを行為系から論じる上で、1個体独立した状態と集団でのリズム運動の違い、さらには様々な配置方法での挙動の変化などを明らかにすることは重要であると思われる。そこで本研究ではこの点を明らかにする手始めとして、一定間隔の格子状に配置された複数のマメ科植物の幼根に関して、生長に伴うリズム運動を集団レベルで複数同時に計測できるシステムも開発を行った。計測方法は,最大9本のエンドウの幼根を2[cm]間隔で3×3の格子状に並べ、垂直2方向から5倍の対物レンズを取り付けたCCDカメラで根先端部の画像を取り込み、その画像をコンピュータで処理することにより、根の3次元運動軌跡を測定する。この場合、内部に配置された根が周囲の根によって隠れてしまうことから、カメラの光軸とエンドウの列に角度(26.6°)をつけ、周囲の根の間から覗き見るように内部に配置された根の挙動を観察することとした。また、計測点が生長等で視野から外れるのを防ぎ、かつ個々の根の位置まで高速にカメラを移動できるようCCDカメラが3軸方向に移動可能な装置を試作した。すなわち、前後、左右に個々が動く4台のCCDカメラを計測対象を取り囲むよう1枚のテーブル上の4辺に設置し、リ-ド2[mm]のボールネジと5相ステッピングモータを使用することによりテーブルを上下に駆動させる。テーブル上に設置された前後、左右の移動機構は、リ-ド1[mm]のボールネジと超小型の5相ステッピングモータ(0.16[kg]により駆動される。また、これらは全てパソコンにより制御される。以上により,サンプリングタイム1分で最大9本までの根のリズム運動を計測することが可能となった。さらに,本システムを用いて3本の幼根の挙動を計測したところ、いずれも周期2時間程度で互いに衝突しないように調子を合わせるがごとくリズム運動を行っていることを見出した。
重心配置空間のホモトピー論への応用

2つの図形の間に連続写像がどの位あるか調べる幾何学をホモトピー論という。従来のホモトピー論の諸問題は、問題ごとにアドホックな方法で解決されてきた。本研究では重心配置空間という空間を定義し、その性質について予想を提示した。この予想が解決されれば、既知の諸定理に統一的な別証明を与えることができ、同時に未解決問題も解決することを解明した。本研究のメリットは以下の点にある。ユークリッド空間内の何枚かの平面たちの補集合は原理的に計算可能である。重心配置空間はこのような補集合の一種なので、連続写像を作るという従来の方法よりもはるかにアプローチしやすい。(1)ホモトピー論は写像の研究という抽象的な数学であり、状況に応じて様々な方法により問題が解決されてきた。一方、配置空間は点の配置という幾何学的対象である。(2) 1つの普遍的な配置空間を用意し、それを研究することによりホモトピー論の種々の問題を統一的に解決しようという試みはなされたことがなかった。(3)本研究の目的は、普遍的な配置空間を具体的に構成し、その研究からホモトピー論の諸定理を統一的に証明し、未解決問題への応用を考察することである。平成18年度はループ空間に付随する,あるホモトピーファイバーの整係数ホモロジーを完全に決定することに成功した.n重根の個数に制限をつけた多項式全体のなす空間は配置空間の中でも特に重要なものであるが,報告者の以前の業績により,この空間を見るためには以下で述べるホモトピーファイバーを見ればよいことが知られている.ΩS^<2n-1>を構成するJames constructionのl-th stageをJ^l(S^<2n-2>)で表すとき,包含写像J^l(S^<2n-2>)〓ΩS^<2n-1>のホモトピーファイバーW^l(S^<2n-2>)が目的のものである.平成18年度のもう一つの成果は,n-arms machineの配置空間の安定ホモトピー型を決定したことである.結節マシンの配置空間は数学の種々の分野と関連して重要であるが,その中でもpolygon spacesをよばれる多角形の空間はsymplectic geometryでの典型的な例であることもあり,特に盛んに研究されてきた.Polygon spacesの種々な一般化が考察されているが,その中で特に重要なものとしてn-arms machineがある.最近の代数的位相幾何学の研究者間の大きな関心として,配置空間を深く研究することによりその情報を非安定ホモトピー論に戻そうというものがある.このような考え方はかなり以前からあり,考察するホモトピー論の問題を特定の配置空間の問題に帰着させて成功した例もある.しかし,多くの応用を含んでいるような一般的な配置空間を設定し,そこから非安定ホモトピー論の種々の定理や予想に統一的な証明を与えようというような大きな枠組みは未だ設定されたことがない.本研究の目的は,このような枠組みを与える配置空間を構成し,その情報を非安定ホモトピー論の情報に戻すためにはどのような問題を解決すればよいかを考察することである.平成18年度の研究成果により,目的の配置空間は通常の配置空間の開集合である重心配置空間ではないかと考えられる.平成19年度は,重心配置空間から非安定ホモトピー論の情報を抽出するために解決すべき問題を予想という形で提示した.もしこの予想が正しければSelickの写像の懸垂を1つ外す問題やCohen-Moore-Neisendorfer予想など,非安定ホモトピー論における多くの予想が解決できることを証明した.報告者はこの研究成果について,2007年12月に京都大学で開催された国際会議で招待講演を行い,多くの聴衆に興味を持たれた.また,幾人かの著名な数学者に論文の請求を受けた.MexicoのGitler教授やSingaporeのWu教授などである.なお,実際には予想は素数pに依存し,p=2のときはむしろ成立しないことが望ましい.平成19年度の研究実施計画に書いたように,p=2のときは不成立であることを証明した.1.本研究の目的は、重心配置空間という具体的な空間を構成し、その研究からホモトピー論の情報を読み取ることである。平成20年度は重心配置空間の一種であるクモの巣装置の配置空間を研究した。クモの巣装置とは多面体の頂点ごとにパワーショベル腕を接合してできるロボットである。まずクモの巣装置の配置空間とモーメント角複体との間のホモトピー同値を証明した。次にクモの巣装置の配置空間を一回懸垂すると、球面のブーケに分解することを証明した。モーメント角複体のホモロジーが自然に分解することはよく知られている。

我々の研究成果はホモロジー分解を空間レベルでの分解に一般化したわけで、ホモロジー分解が任意のホモロジー理論で可能になることなど応用は広い。2.クモの巣装置の配置空間を一回懸垂すると球面のブーケに分解するのだが、では何次元の球面が幾つ生じるか具体的に決定せよという問題は一般に手計算では難しい。正多面体の場合は比較的単純なコンピュータプログラムでも計算可能であるがそれ以上は難しい。平成20年度はコンピュータを購入し高速のプログラムを開発することにより、切頂多面体の全ての場合を解決した。例えば切頂二十面体の面は正5角形が12個、正6角形が20個であり、この計算を実行するプログラムを開発した意義は大きい。3.クモの巣装置は、これを懸垂した場合には十分な結果が得られたが、一般に空間を懸垂すると失われる情報がある。コホモロジー環や位相的複雑さがそうである。近年、ロボットの動作の連続性を数学的に解析する手段として位相的複雑が注目されているが、与えられた空間の位相的複雑さを決定することは一般に非常に難しい。平成20年度はクモの巣装置の位相的複雑さを研究した。1.本研究の目的は、重心配置空間という具体的な空間を構成し、そのホモロジーの情報からホモトピー論の情報を読み取ることである。平成21年度は重心配置空間の一種である多角形のモジュライ空間を精密に研究し、そのホモロジーについてここ10年ほど注目されている予想を解決した。一つのロボットが与えられたとき、その動作全体のなす空間を研究することは興味深い。ロボットとして有名なものにクモの巣装置があり、その動作設計のモジュライ空間としては多角形のモジュライ空間が有名である。2.一般に与えられた多様体上のモース関数のうち、最も効率のよいセル分割を与えるものをパーフェクトなモース関数という。最良なモース関数ということもある。多様体が単連結の場合は、パーフェクトなモース関数は理論上存在するが具体的に構成するのは難しい。多様体が非単連結の場合は、その存在さえ不明である。多角形のモジュライ空間は非単連結であるが、その上のパーフェクトなモース関数を構成することに成功した。3.パーフェクトなモース関数が存在すると、それに付随するチェイン複体を非常に効果的に調べることができる。実際、モース・スメール・ヴィッテン複体として扱うことができるからである。我々のモース関数の場合もチェイン複体の挙動を完全に決定できた。応用として、多角形のモジュライ空間のホモロジーには高次2トーションはないという結論が得られた。これはここ10年ほど予想されていたことの解決である。4. LSカテゴリーや位相的複雑さという不変量は、多様体上のモース関数と密接に関係する。我々のモース関数の別の応用として、多角形のモジュライ空間のこれら不変量に関して精密な評価が得られることになる。
自己抗体による内皮細胞アポトーシスとアネキシンVに関する研究

これまでに、SLE患者より得たモノクロナルルプスアンチコアグラント(LAC)および不育症患者のLAC-IgGにはヒト臍帯静脈内皮細胞にアポトーシスを誘導する活性があり、これらの自己抗体免疫グロブリンには血管内皮細胞や絨毛上皮細胞において特に高発現しているアネキシンVへの結合活性があること、また、この活性は抗リン脂質の抗原と想定されているβ2グリコプロテインIとは無関係であることなどを明らかにしてきた。これらの免疫グロブリンによるアポトーシス誘導に対する感受性は細胞の状態によって異なることを見出し、それがルプスアンチコアグラントを有する患者が必ずしも常に血栓を起こしているわけではない理由と関連すると考え、酸化ストレスなどの負荷を細胞にかける実験を継続している。一方、ATP欠乏によってラダー様のDNA切断化が起こることを見出した。この活性はcytosolに存在するが、その性状を調べるために無処理単離核とインキュベートするin vitro測定系を確立した。分析の結果、この活性はセリンプロテアーゼ阻害剤で阻害されるが、カスパーゼ阻害剤であるVADやDEVDでは阻害されず、また、リコンビナントICADによって抑制されなかった。そして、この活性はATP依存性のタンパク分解装置であるプロテアソームによって分解されることを見出した。これまでに、SLE患者より得たモノクロナルルブスアンチコアグラント(LAC)および不育症患者のLAC-IgGにはヒト臍帯静脈内皮細胞にアポトーシスを誘導する活性があり、これらの自己抗体免疫グロブリンには血管内皮細胞や絨毛上皮細胞において特に高発現しているアネキシンVへの結合活性があること、また、この活性は抗リン脂質の抗原と想定されているβ2グリコプロテインエとは無関係であることなどを明らかにしてきた。これらの免疫グロブリンの持つアポトーシス誘導活性はアネキシンVと予めインキュベートすることで抑制されるのであるが、この抑制効果がアネキシンVに特異的であるかどうかを検証するため、他のアネキシン群蛋白であるアネキシンVIやアネキシンIIのリコンビナント蛋白をGST融合タンパクとして発現させ精製するところまで準備を進めた。一方、ATP産生阻害剤であるアジ化ナトリウムによってアポトーシスに特有のラダー様のDNA切断が起こることを見出した。これはアポトーシス、特にカスパーゼ活性化にはATPが必要であるという一般的な認識とは相反する結果である。そこで、被検細胞をより鮮明に効果が観察できる白血病細胞HL60に置き換えて、オリゴマイシンなどによるATP枯渇実験を行い、このDNA切断活性が確かにカスパーゼ非依存性であることを確認した。カスパーゼ下でDNA切断の最終実行に関わるCAD・ICAD系との関係について、現在研究を進めている。これまでに、SLE患者より得たモノクロナルルプスアンチコアグラント(LAC)および不育症患者のLAC-IgGにはヒト臍帯静脈内皮細胞にアポトーシスを誘導する活性があり、これらの自己抗体免疫グロブリンには血管内皮細胞や絨毛上皮細胞において特に高発現しているアネキシンVへの結合活性があること、また、この活性は抗リン脂質の抗原と想定されているβ2グリコプロテイン1とは無関係であることなどを明らかにしてきた。この活性はcytoso1に存在するが、その性状を調べるために無処理単離核とインキュベートするin vitro測定系を確立した。現在、活性の単離を試みている。
センサと電源を用いないアクティブ振動制御システム

本研究では、構造物を単純支持梁と仮定し、その曲げ振動を電源とセンサを用いることなく圧電トランスデューサによってその振動の能動制御を行うことを提案し、エネルギ収支と制振性能の面から、その実現可能性の検討を行うことを目的としている。梁の曲げ振動制御を行う時の状態方程式を導出し、圧電トランスデューサに加えられる電圧や流れる電流から梁のたわみなどの機械的状態量を推定するオブザーバ(カルマンフィルタ)と、最適レギュレータを設計した。数値計算を通じて、カルマンフィルタにより制御を行うことが可能であることを確認し、その制振性能も、制御を行う前に比べて良好であることを示した。同時に、その際に圧電素子に供給すべき電力を見積り、消費電力が負になることを示した。負の消費電力は、圧電素子に接続する電源を回生可能なものにすれば、回生電力が消費電力を上回ることを意味し、発電電力のみで能動制御を行うことができることを示唆している。また、解析対象としてきた単純支持梁と類似した1mの長さのアルミ合金製の梁を用いて実験を行った。梁の中央部に圧電トランスデューサを貼り、三次モードに着目した能動制御を行った。回生電力が消費電力を上回る条件の下、制御なしの場合と比べて、振動を抑えることができることを示した。本研究は,構造物を単純支持梁と仮定し,その曲げ振動から発電を行うトランスデューサによってその振動のセンサレス能動制御を行うことを目的としている,18年度は,トランスデューサに,プルーフマスアクチュエータと圧電素子を用いることを考え,それらによって梁の曲げ振動制御を行う時の,発電と制振性能を計算するモデルの作成を行った.トランスデューサはアクティブ制御を行っておらず,あくまでもパッシブで動作させた時の議論であるが,数値計算により,様々な条件下での発電と制振性能を求め,発電と制振の最適条件が異なることを示し,これらのトレードオフを考慮しながらシステムの設計を行う必要があることを示した.これらの数値計算と平行して,実験装置の作成を行った.単純支持梁を作成し,圧電素子とプルーフマスアクチュエータを取り付けた.加振器を購入し,それによって梁に振動を加えることができるようにした.加振場所は,注目しているモードの節とならない場所を選択し,歪ゲージによって加えている力を計測できるようにしている.梁の応答を調べるために計測用加速度計を設置し,ADボードを通じてパーソナルコンピュータに記録できるようにした.各トランスデューサには電気回路,電源,電流計を設置し,電気的な状態量をモニタリングできるようにしている,実験によって,圧電素子の制振および発電性能,またプルーフマスアクチュエータを自作し,その制振性能を検討した.結果は,理論と定性的に一致しており,構築した数値計算モデルの妥当性を示すことができた.上記の通り,提案するシステムを構築し,数値計算のモデリング,実験装置作成,基礎的な実験を行うことができた.本研究は,構造物を単純支持梁と仮定し,その曲げ振動から発電を行うトランスデューサによってその振動のセンサレス能動制御を行うことを目的としている.20年度は,トランスデューサに,圧電素子を用いるケースを解析対象にとした。19年度に作成した計算モデルを用いて、梁の曲げ振動制御を行う時の状態方程式を導出し、圧電素子に加えられる電圧や流れる電流から梁のたわみなどの機械的状態量を推定するオブザーバ(カルマンフィルタ)と、最適レギュレータを設計した。これにより、加速度センサが不要となり、実用上、センサを用いないで制御を行うことが可能になる。数値計算を通じて、カルマンフィルタにより制御を行うことが可能であることを確認し、その制振性能も、シャント回路などの受動的な制御手法よりも良好であることを示した。実験を行う準備も進めた。上記数値計算により、必要な電源電圧など実験装置に求められる具体的なスペックが明確にし、20年度に速やかに実験を行えるようにした。

上記の通り,目的に適う制御系設計を行い、数値計算によって提案するシステムが実現可能であることを示した。また、実験装置に求められる具体的な性能を明らかにした。19年度の成果により、20年度に実験によって本システムが実現可能であることを示すこと、すなわち本事業の目的を達成することができる見通しが得られるようになった。本研究は、構造物を単純支持梁と仮定し、その曲げ振動から発電を行う圧電トランスデューサによってその振動のセンサレス能動制御を行うことを目的としている。18から19年度は、梁の曲げ振動制御を行う時の状態方程式を導出し、圧電トランスデューサに加えられる電圧や流れる電流から梁のたわみなどの機械的状態量を推定するオブザーバ(カルマンフィルタ)と、最適レギュレータを設計した。数値計算を通じて、カルマンフィルタにより制御を行うことが可能であることを確認し、その制振性能も、制御を行わない場合やシャント回路などの受動的な制御手法よりも良好であることを示した。同時に、その際に圧電素子に供給すべき電力を見積り、消費電力が負になることを示した。負の消費電力は、圧電素子に接続する電源を回生可能なものにすれば、回生電力が消費電力を上回ることを意味し、発電電力のみで能動制御を行うことができることを示唆している。20年度は、上記の知見を実験によって示すことを目的とした。解析対象としてきたものと類似した1mの長さのアルミ合金製の梁を単純支持し、梁の中央部に圧電トランスデューサを貼った。中央に圧電トランスデューサを設置した場合は、偶数モードの制御はできないが、奇数モードに着目した制御を行う場合は、その制御効果を最大限発揮することができ、かつ制御スピルオーバなどの悪影響を防ぐことができる。三次モードの振動を対象にした最適制御を圧電素子によって行った。回生電力が消費電力を上回る条件の下、制御なしの場合と比べて、振動を抑えることができた。19年度までの数値解析結果が妥当であることと、提案する制御が実現可能であることを示すことができた。これにより、本課題の目的を果たした。
震災の記録・資料に基づく災害過程の体系化と防災シソーラスの開発

本研究では、防災研究に文化人類学的視点を導入し,被災者の生活のあらゆる事項について,被災者や災害対応者の対応行動の記録や資料の実証的な分析を通して,災害過程を構成する基本要素の抽出とそれぞれの基本要素間のシステム論的記述をおこなう.そこで平成11年度において阪神・淡路大震災の被災者・災害対応従事者へのインタビュー調査を実施しデータベース化した.次にその内容を文化人類学で人間社会・文化を分析する際に標準的に用いられる体系である文化項目分類を用いて分析し,被災者の生活復興過程における災害関連の文化要素の抽出をおこなった.また,阪神・淡路震災記念協会に保管されている震災関連資料(チラシ,掲示物等)の一部をデジタル化し,文化項目分類を用いて分類をおこない,これら震災関連資料が,統一的な基準で分類可能であることを明らかにした.平成12年度においては,構築された災害関連項目のデータベースを用いて,防災研究の専門的視点,および文化人類学的視点から,各項目間の関連性の検討と防災シソーラス構築に関する基礎的研究をおこなった.まず,時間フェーズごとに出現する項目の頻度とその順位付けの分析によって,阪神・淡路大震災発災直後から現在に至るまでの過程を,時系列的に同定する手法を開発した.この手法を用いて分析をおこない,地域や被災者のライフステージによって異なるさまざまな災害過程のシステム論な記述を可能にした.次に,これらの分析で得られた項目間の順序関係や時間フェーズ関係を整理し,防災シソーラス構築のための基礎的な枠組みの提案をおこなった.防災問題に関する人文・社会科学的研究は,これまでおもに被災者の避難行動や避難所・仮説住宅などの住環境問題,あるいは災害の経済的影響評価など,比較的定量化しやすい個別的課題に限定して研究が進めらてきた.そのため、それぞれの個別的課題間の関係をシステム論的に記述することや,災害によって影響を受ける人間社会の事象を枚挙し,災害課程の全体像を把握する試みは,これまでなされてこなった.そこで本研究では,防災研究に文化人類学的視点を導入し、被災者の生活のあらゆる事項について被災者や災害対応者の対応行動の記録や資料の実証的な分析を通して,災害過程を構成する基本要素の抽出とそれぞれの基本要素間のシステム論的記述をおこなう.本年度は,まず阪神・淡路大震災の被災者・災害対応従事者へのインタビュー調査を実施した.特に震災発生時に意思決定をする立場にあった被災者・災害対応従事者を中心に資料の収集をおこなった.収集されたインタビュー原稿は文化項目分類を用いて分析され,被災者の生活復興過程における災害関連の文化要素の抽出をおこなった.原稿はさらに編集を加えた後データベース化した.つぎに阪神・淡路震災記念協会に保管されている震災関連資料(チラシ,掲示物等)の一部をデジタル化し,文化項目分類を用いて分類をおこなった.その結果,インタビューのような震災記録とチラシ・掲示物等に代表される震災関連資料が,統一的な基準で分類可能であることが明らかになった.さらに,昨年発生したトルコ・台湾における震災事例と阪神・淡路大震災との比較から,被災地における住まいの問題を文化人類学的視点を用いて構造分析を試みた.本研究では、防災研究に文化人類学的視点を導入し,被災者の生活のあらゆる事項について,被災者や災害対応者の対応行動の記録や資料の実証的な分析を通して,災害過程を構成する基本要素の抽出とそれぞれの基本要素間のシステム論的記述をおこなう.そこで平成11年度において阪神・淡路大震災の被災者・災害対応従事者へのインタビュー調査を実施しデータベース化した.次にその内容を文化人類学で人間社会・文化を分析する際に標準的に用いられる体系である文化項目分類を用いて分析し,被災者の生活復興過程における災害関連の文化要素の抽出をおこなった.また,阪神・淡路震災記念協会に保管されている震災関連資料(チラシ,掲示物等)の一部をデジタル化し,文化項目分類を用いて分類をおこない,これら震災関連資料が,統一的な基準で分類可能であることを明らかにした.平成12年度においては,構築された災害関連項目のデータベースを用いて,防災研究の専門的視点,および文化人類学的視点から,各項目間の関連性の検討と防災シソーラス構築に関する基礎的研究をおこなった.まず,時間フェーズごとに出現する項目の頻度とその順位付けの分析によって,阪神・淡路大震災発災直後から現在に至るまでの過程を,時系列的に同定する手法を開発した.この手法を用いて分析をおこない,地域や被災者のライフステージによって異なるさまざまな災害過程のシステム論な記述を可能にした.次に,これらの分析で得られた項目間の順序関係や時間フェーズ関係を整理し,防災シソーラス構築のための基礎的な枠組みの提案をおこなった.
自閉症発症機序の解明に向けた新規自閉症感受性遺伝子Auts2の分子機能の解析

自閉症感受性遺伝子AUTS2は、自閉症や統合失調症などの精神発達障害との関連性が示唆されるが、中枢神経系でのAuts2の生理的役割については全く分かっていない。本研究では、神経細胞においてAUTS2が成長円錐に集積し、RhoファミリーG蛋白質Rac1の活性化を介して、神経突起伸長を促進することを見出した。逆にAuts2 KOマウスを用いた解析では、神経突起伸長や神経細胞移動に著しい障害が認められた。また行動解析では、野生型マウスに比べて不安様行動の低下、記憶障害などが認められた。以上のことから、Auts2は大脳皮質の発生および高次精神機能の獲得に重要な役割を果たしていることが示唆された。精神発達障害の発症機構を分子レベルで明らかにすることを目標に、自閉症感受性遺伝子のひとつ、Autism Susceptibility Candidate 2 (Auts2)に着目して研究を行ってきた。Auts2遺伝子は、自閉症や知的障害を示す多数の患者で、相互転座など染色体構造異常の認められる遺伝子座にあることが報告されており、また大脳皮質や海馬、小脳など、高次機能を司る脳領域で強く発現していることから、これら精神疾患との関連が強く示唆されている。しかし、脳の発生過程においてAUTS2がどのような生理的役割を担っているのか未だ全く分かっていない。本研究では、AUTS2がRac1やCdc42などRhoファミリーGタンパク質シグナル伝達経路を介して、アクチン細胞骨格系の再構築を制御する分子であることを見出した。さらに、本研究で作製したAuts2ノックアウト(KO)マウスでは、神経細胞移動や神経突起伸長に著しい障害が認められた。つまりAUTS2は、胎生期の大脳皮質においてアクチン細胞骨格系制御を介して、神経細胞の形態形成や脳組織構築など中枢神経系の発生に重要な役割を果たしていると考えられる。興味深いことに、このKOマウスはヘテロ接合体でも発生学的な異常に加え、行動解析では記憶障害などの高次精神機能障害も示している。さらに、これまでヒトで報告されている疾患例がいずれもヘテロ接合体患者であることから、このマウスがAuts2遺伝子異常によるヒト精神疾患様症状を反映していることが示唆される。つまり、Auts2遺伝子異常によるヒト精神疾患のモデルマウスとして、自閉症などの精神疾患の病態の理解や新たな診断法、治療法の開発に大きく貢献できることが期待される。自閉症は社会性構築やコミュニケーションに困難を生じる精神障害の1つであり、先天性の脳機能障害であるとされているが、未だ病態の分子・細胞学的なレベルでの発症機序はよくわかっていない。自閉症感受性遺伝子Autism susceptibility candidate 2(Auts2)はこれまでに、大脳皮質や海馬など脳の高次機能を司る領域で強く発現していることや、自閉症のみならず、知的障害や統合失調症、ADHDなど広範囲な精神・神経発達障害との関連性が示唆されてきたが、その機能や生理機能については全く分かっていなかった。本研究で我々は、AUTS2がアクチン細胞骨格系調節因子の一つとして働き、神経系の発生に重要な役割を果たしていることを見出した。発生初期の大脳皮質では、AUTS2は主に核に局在が認められるが、発生が進むにつれて細胞体や神経突起にも局在が認められる。また海馬初代培養神経細胞では成長円錐に強く集積しており、さらにこの分子を強制発現させることにより、P-Rex1やElmo2/Dock180などの上流因子を介して、RhoファミリーG蛋白質Rac1の活性化を誘導し、神経突起の伸長を促進することを見出した。逆にRNAiによるノックダウン実験やノックアウト(KO)マウスを用いた解析では、神経突起伸長や大脳皮質の神経細胞移動に著しい障害が認められた。以上のことから、この分子は神経細胞において、Racシグナルを介してアクチン細胞骨格を制御し、細胞移動や神経突起など神経細胞の形態形成に関与する可能性が考えられる。さらに、Auts2 KOマウスを用いた一連の行動解析により、野生型マウスに比べてAuts2 KOマウスでは、自発活動量や不安様行動の低下が認められ、また複数種類のテストにおいて、記憶形成の障害が認められた。以上のことから、この遺伝子は正常な大脳皮質の発生に必須の分子であり、高次精神機能の獲得に重要な役割を果たしていることが示唆された。神経科学平成25年度研究計画として、(1)培養細胞を用いたin vitro実験系によるAUTS2の分子機能を明らかにすること、(2)子宮内エレクトロポレーション法を用いた個体レベルでのAUTS2機能解析、(3) Auts2 KOマウスを用いた解析を行なうことにより、大脳皮質形成過程でのAUTS2の生理的役割を明らかにすることを目標とした。

本年度の研究実績として、計画(1)では、初代培養大脳皮質神経細胞などを用いた、各種Auts2変異タンパク発現実験およびRNAi干渉実験により、AUTS2がRhoファミリーGタンパク質シグナル伝達を介して、神経突起伸長や神経突起の分岐構造形成に関わることを明らかにした。また、計画(2)および(3)により、Auts2の発現をshRNAでノックダウンした場合、あるいは本研究で作成したAuts2 KOマウスを解析した結果、大脳皮質の神経細胞移動および神経突起伸長に著しい障害が起ることを明らかにしており、Auts2が大脳皮質の発生に重要な役割を担うことを見出した。また、平成26年度に予定していた、(4) Auts2 KOマウスを用いた行動解析も既に完了しており、不安行動や記憶形成など高次精神機能に障害を持つことを明らかにした。現在、上記の結果をまとめ論文として投稿中である。以上のことから、本研究の進行状況は当初の計画以上に進展していると考えられる。本年度ではAUTS2の下流因子として、Rac1およびその活性調節因子を見出したが、AUTS2を制御する上流因子やその他、AUTS2と相互作用する分子がまだ明らかとなっていない。また、AUTS2はCdc42シグナルに対して抑制的に働くことがRNAi実験などから明らかとなったが、直接これらを制御するAUTS2相互作用分子もまだ未定である。これまでにプロテオミクス解析により、in vitroでAUTS2と結合する候補分子が既に多数得られており、これら分子群より検索・検討を行って上記の分子機序を明らかにしていく。また、Auts2遺伝子欠損により引き起される行動解析上の異常の脳責任領域を絞り込むために、今後は脳領域特異的なAuts2 KOマウスを用いた解析を行なう予定である。これまでの結果から、恒常性Auts2 KOマウスは胎生致死であったため、生後の脳発達過程におけるAUTS2の生理的役割については未だ解明できていない。しかし現在作成中のコンディショナルKOマウス、具体的には、現在大脳皮質特異的にCreを発現するEmx1-Cre、および小脳特異的なKOマウスを作成するためにEn1-Creとの掛け合わせを行なっており、既に解析に十分な数の成体のマウスが得られている。これらのマウスを用いて神経細胞の形態学的解析や電気生理学的手法を用いた神経回路網形成の解析、また行動解析など個体レベルでの解析を中心に本研究をさらに進める予定である。本年度はAUTS2の主にin vivoにおける生理的役割を明らかにするための解析を優先したため、本年度および次年度の実験計画に予定しておりました、AUTS2結合因子のプロテオミクス解析により得られた結合候補分子に関する分子機能の解析については、次年度に集中的に行なう予定にしており、解析に必要な抗体や試薬、また発現ベクターやshRNAベクター作成に必要なDNA関連試薬等の購入は次年度に行なうことにしました。また、解剖学的・発生学的解析に加え、行動解析には大量のマウス繁殖・維持が必要であり、今後の行動解析の追加実験のために次年度分の予算を確保する目的で当該助成金が発生しました。
ミカズキモの有性的細胞分裂を誘起する活性物質の特性解析

本年度は有性的細胞分裂を誘起する物質について遺伝子の単離を行った。昨年度の決定した本物質のアミノ酸配列をもとにして、対応するオリゴヌクレオチドを合成した。一方、接合を行わせたミカヅキモ細胞よりRNAを単離し、常法に基づきcDNAを合成した。これらを用いて、RACE-PCR法により本物質をコードする全長のcDNAを単離することに成功した。得られた全長cDNAは906bpの長さであり、630bpのタンパク質推定コード領域を含んでいた。推定タンパク質のN末端には26アミノ酸で構成されるシグナル配列と思われる疎水性の高い領域が存在し、それに続いて、精製標品のN末端と一致する配列までに33アミノ酸の機能未知の中間配列が存在していた。培地中に分泌されるポリペプチド部分は150アミノ酸で構成される16,723Daの分子であり、アスパラギン結合型糖鎖の付加シグナルも見出された。得られたDNA配列およびアミノ酸配列を元に、データベース上で相同性検索を行ったが、既知の遺伝子、タンパク質との有意な相同性は見られなかった。しかしながら、別種のミカヅキモC.pslcから単離された性フェロモン(PR-IP Inducer)との間にアミノ酸レベルで49.4%の高い相同性が見られた。本年度は、ミカヅキモの優性生殖成立に極めて重要な役割を担うと思われる、有性的細胞分裂を誘起する物質について単離精製を行い、その生理的及び生化学的特性に関する知見を得ることに成功した。1.有性的細胞分裂を誘起する活性物質の精製接合を行わせた後の培地を、DEAE陰イオン交換カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、S-100HRゲル濾過カラム、Superose12ゲル濾過カラムに順次添加し、見かけの分子量二万の、+型細胞に対する有性的細胞分裂誘起活性を示す画分を得た。その画分をSDS-PAGEに添加したところ、20kDaの推定分子量を持つタンパク質のバンドが確認された。本物質の活性は熱に不安定であり、比較的高分子であることからも、ここで見られるタンパク質のバンドが活性物質の本体であることが示唆された。また、通常単量体で存在していることも示唆された。2.生理学的及び生化学的特性の解析本物質は光の存在下で、+型細胞と-型細胞を共存培養することにより、-型細胞から放出された。また、+型細胞に対する有性的細胞分裂誘起活性は、光の下でのみ見られた。あらに精製標品と同じ画分中に、+型細胞を-型細胞に誘引する活性も検出された。このタンパク質は、PAS染色に対して陽性を示したことから、糖鎖が付加された糖タンパク質であることも推定された。また、このタンパク質の数カ所のアミノ酸配列を、気相プロテインシークエンサーで決定した。
舌移植腫瘍に対するPerfluorechemicalsの放射線増感効果

perfluorochemicalsであるFC-43、抗癌剤Mytomycin CをddY系マウスの尾静脈より濃度を変えて注入し、LD_<50>を求めた。また、各濃度における肝、脾、腎のHE染色による観察を行った。照射実験として、マウスの舌に対して対数増殖期にあるEhrlich腹水癌細胞を55万個移植し、腫瘍体積が約1000mm^3に達した時点で次の各群に分けて放射線20Gy1回照射(X線:線量率0.66Gy/min)を行い、腫瘍体積変化と生存率を観察した。第1群:非処置群(対照群)、第2群:照射のみ施行、第3群:FC-43を20ml/Kg投与後、100%O_2存在下で照射を施行、第4群:FC-43を20ml/kg、Mytomycin Cを0.03mg/kg投与後、100%0_2存在下で照射を施行LD_<50>はFC-43において90ml/kg、Mytomycinにおいて0.10mg/kgであった。FC-43の毒性症状として眼球突出、立毛が、剖検所見として肝、脾の腫大が認められたが、生存群ではこれら所見は認められなかった。組織学的検索:FC-43投与群では、20ml/kgより肝において軽度の空胞細胞出現がみられたが、変性として認められるのは60ml/kg以上であった。脾、腎ではいずれの濃度でも異常は認められなかった。照射実験:腫瘍体積変化の測定の結果、第1群と比較したTumor growth delay(腫瘍発育の遅れ)は、第2群において、約7日であり、第3群と4群はともに約9日であった。照射実験後の死亡による半減日数は、第1群で14-15日、第2群で22-24日、第3、第4群で27-28日であった。移植Ehrlich癌細胞に対する放射線照射による発育抑制効果は、有意に認められ、FC-43によるその増強効果はやや認められる傾向にあったが、Mytomycin Cを付加した場合の効果は、今回の実験では、認められなかった。現在、さらに条件を改善して、照射実験を進行中であり、細胞単位での検討を行うため、in vitroにおける培養実験を施行中である。
環境DNA分析によるシクリッド魚類群集の多様性把握

環境DNA技術を適応した、マラウイ湖シクリッド魚類群集の多様性把握手法の確立を目指した。研究開始早々に同所的に生息する103魚種を入手し、D-loop領域およびITS領域の配列情報を得た。D-loop領域を対象にしたユニバーサルな環境DNAプライマーを作成し、魚類由来の環境DNA採集方法を確立した。シクリッド魚類の組成や多様性が異なるマラウイ湖6地域12地点で採水・濾過を行い、DNA抽出を終えた。D-loop領域のDNA配列における種間変異が想定外に乏しかったため、ITS領域を対象としたプライマーの再設計が進行中である。シクリッド魚類由来の環境DNAを増幅するプライマーを開発するためには、対象水域に生息する魚類のDNA配列情報が欠かせない。そこで、2013年6月から7月にかけて、マラウイ湖国立公園内において、魚類全般を網羅的に採集・購入した。111種287個体(うちシクリッド魚類は103種267個体)からDNA抽出を行った上で、遺伝子資源管理当局の許可を得て日本国内に持ち帰った。全DNAサンプルについて、ミトコンドリアDNAのD-Loop領域をPCR増幅し、シーケンスを行った。また、核DNAのITS領域をシーケンスするための準備も進めている。環境DNAサンプルの収集については、マラウイ湖国立公園内チュンビウエスト島をモデルフィールドとして、効率的な環境DNA回収のための採水法を模索する調査を行った。具体的には、採水水深間の回収率の比較、分解速度の把握、環境DNA濃度の日周変化の把握などである。その上で、魚類の多様性が異なる湖内7地点に赴き、採水調査を行った。残念ながら、他水域で有効だったGF/Fフィルターがマラウイ湖水からの環境DNA回収に不向きであったことが分かり、最適フィルターの模索と一部調査の再実施を計画している。環境DNA法によって得られる群集組成に関する情報は、目視調査の結果と対照して、その確度や精度を検証する計画である。環境DNAの採取を行っている地点には、コドラートを常時設置しており、潜水士による目視調査を複数回実施し、種ごとの体長組成を定期的に把握している。また、シクリッド魚類群集のバイオマス組成を潜水調査によって簡便に把握する上で欠かせない体長と体重の関係については、主要23種を対象に回帰分析を行った結果をJApplIchthyol誌に投稿中である。この回帰式と定期目視調査により、バイオマスベースでのシクリッド魚類群集組成情報が蓄積されつつある。シクリッド由来の環境DNAを増幅するプライマ設計には、マラウイ湖に生息する全魚種のDNA配列情報が欠かせない。本研究では、2013年前半に湖内で最も魚種数が多いTW島にて111種287個体の収集を行っていた。全魚体試料からDNAを抽出し、当局の許可を得て日本国内に持ち帰った。これらのDNA試料を用い、当初計画通り2013年度後半にミトコンドリアDNAのD-Loop領域の配列解読を終えたが、当該領域のDNA配列は予想以上に種間変異が乏しく、種や属に特異的な環境DNA用プライマを設計するのは困難であることが分かった。これは、網羅的に配列情報を得たからこそ新たに分かった(計画上残念な)知見である。そこで、2つ対策を講じた。1つは、ティラピアを除く全シクリッドに共通する、かつ固有のD-loop領域内の配列に対しプライマを設計した。このプライマを用いた定量PCRでは、シクリッド群集の内訳を示すことは出来ないが、シクリッド由来の環境DNAが採集できたか否かを半定量的に示すことができる。これにより、昨年度難航した環境DNA回収方法の再検討を進めることができた(下記)。もう1つは、より種間変異がありそうな核DNAのITS領域の配列解読を上記DNA試料に対して行った。配列解読の前処理として行うDNA増幅が、先行研究で紹介されていたプライマでは綺麗に見られなかったために難航したが、研究協力者から新たなプライマの提供を受け、2014年度内に配列情報を得るところまで到達できた。マラウイ湖水からの環境DNA採取法の再検討については、GFFで回収できない環境DNAが、膜フィルタでは十分量回収できることが分かった。同程度の目合いでも回収量が大きく違うことから、素材の違いが高pH条件下で影響していると考察された。潜水による群集組成調査と並行して膜フィルタを用いた採水を再計画し、2015年内に湖内7地点での採水と環境DNA抽出を完了した。魚類生態学入手したシクリッド魚類のD-Loop領域(ミトコンドリアDNA)の種間変異は想定以上に乏しく、特定分類群に由来する環境DNAのみをPCR増幅するプライマーの開発は困難であることが発覚した。このようなケースは、これまでの環境DNA研究の経験で初めてのことであり、別の領域や手法によりアプローチする必要が出てきた。