hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スタチン系薬剤の制がん機構の解明と抗腫瘍効果を予測する新たな評価法への展開

スタチンは、血中コレステロール値の低下作用以外に制がん効果を発揮することが知られており、とくに間葉系のがん細胞で強い効果を発揮することが報告されている。がん細胞は悪性度が増すにつれて上皮間葉転換(EMT)を起こし、E-cadherinが減少して間葉系様の性質を獲得することが古くから知られているが、EMTを起こした上皮系がん細胞のスタチン感受性の変化については明らかでない。本研究では、上皮系のがん細胞に形質転換増殖因子TGF-β1を作用させ、EMT誘導前後のスタチン感受性の変化について解析することを試みた。肺由来がん細胞株NCI-H322Mおよび卵巣由来がん細胞株OVCAR3を用いて血清飢餓培養を24時間行い、その後TGF-β1を培地に添加してさらに72時間培養した。EMT誘導の確認はEMTマーカーの遺伝子発現変化を確認することにより行った。EMTを誘導後、330 uMのスタチンを曝露し、72時間後の細胞数を対照群(EMT非誘導群)の細胞数で除した値を生存率とした。TGF-β1によってNCI-H322MおよびOVCAR3のEMTマーカー遺伝子が変動し、EMTが確実に誘導されたことを確認した。EMT非誘導群ではNCI-H322M、OVCAR3両細胞株ともにスタチンの曝露量が増すにつれて細胞生存率の低下がみられた。一方、EMT誘導群では細胞生存率の低下は起こらず、逆に耐性を示す結果となった。これまでの報告から、スタチンは間葉系のがん細胞に対しより強い効果を発揮することが知られているが、もともと上皮系のがん細胞がEMTを起こしても、スタチンの感受性が高まるわけではないと推察された。しかし、TGF-β1などのサイトカイン誘導性の上皮間葉転換は、薬剤耐性をもたらすことが報告されている。今後はTGF-β1以外の方法でもEMTを誘導し、がん細胞のスタチン感受性の変化を解析する必要がある。近年,血中コレステロール降下薬であるスタチン系薬剤の制がん作用が着目されている。しかし実際のところ,スタチンによる効果はがん細胞種によってかなり差が存在し,スタチンがどのような特徴を有するがん細胞に有効なのか,また,如何にしてがん細胞にスタチン感受性の違いが生じるのか,そのメカニズムはよくわかっていない。これまでの解析から,上皮系細胞マーカーとしても知られる細胞接着因子E-カドヘリンを細胞膜上に発現しているがん細胞ではスタチンが制がん効果を発揮せず,逆にE-カドヘリンを細胞膜上にもたない,つまり間葉系様のがん細胞ではスタチンが強い制がん効果を発揮する可能性が明らかとなってきた。スタチンが効かない耐性株ではE-カドヘリン発現が細胞膜上にみられることから,本研究ではE-カドヘリンがスタチンの細胞内への浸透に対して物理的障壁になっているのではないかと仮説を立て薬剤の動態について検討を試みた。レーザーラマン分光法によりスタチン系薬剤の1つであるアトルバスタチンのラマンスペクトル(特有のレーザー波長)を検出し,薬剤の細胞内への浸透・分布がスタチン耐性株ー感受性株間で異なるか否かについて解析したところ,同じ前立腺がん由来の細胞株であっても,E-カドヘリンを細胞膜上に発現している耐性株(DU-145)は,発現していない感受性株(PC-3)に比べてスタチンが細胞内に浸透しにくいことが示された。しかし,検討したすべてのスタチン耐性株・感受性株で同様の傾向がみられたわけではなかった。このことから,がん細胞のスタチン取込み量の違いはスタチン感受性を左右する1要因であると考えられるが,決定的なものではないと考えられた。スタチンが効かないがん細胞には,取込み以外に何らかの耐性をもたらすメカニズムが存在しているものと考えられ,現在解析中である。がん細胞のスタチン取込み量の検討について,研究計画当初は次年度に計画していたが,先に解析する必要が出てきた。検討項目が全体的に前倒しとなったが,研究の進捗状況はおおむね順調である。スタチンは血中コレステロール値の低下薬としてその有用性が証明され、現在広く使用されている。スタチンが細胞内のコレステロール合成を抑制するメカニズムは、解糖系から派生するメバロン酸経路の律速因子HMG-CoA還元酵素(HMGCR)を阻害するところにあるが、本薬剤は血中コレステロール値の低下作用以外に、制がん作用を発揮することが報告され、がん細胞に対する効果が注目されている。しかし実際のところ、スタチンによる制がん効果はがん細胞種によってかなり差が存在し、スタチンがどのような特徴を有するがん細胞に有効なのか具体的な特徴はよくわかっていないのが現状である。スタチンが阻害するメバロン酸経路からは、最終産物のコレステロール以外に、中間産物としてタンパクのプレニル化に必要なファルネシル二リン酸やゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)、電子伝達系に関わるユビキノン、糖鎖修飾に関わるドリコール等、様々な代謝物が生合成される。これらの中間産物はいずれも細胞活動に重要な物質であるため、抗腫瘍効果にどの程度関与しているのかは不明であった。そこでこれらの中間産物とがん細胞の増殖抑制の関係を検討したところ、スタチンが抗腫瘍効果を発揮するにはタンパクのプレニル化にかかわるGGPPの枯渇が必要であることが明らかとなった。また、我々はこれまでの研究から、上皮系細胞マーカーとしても知られる細胞接着因子E-

カドヘリンを細胞膜上に発現しているがん細胞ではスタチンが抗腫瘍効果を発揮しにくいことを報告してきたが、これら上皮系のがん細胞であっても、siRNAによりHMGCRを分子生物学的に抑制するとスタチンが抗腫瘍効果を発揮し始めることを見出した。スタチンががん細胞の増殖を抑える作用点はGGPPの枯渇にあると考えられるが、逆に、がん細胞にスタチン耐性をもたらすメカニズムについては未解明な部分が多く、現在解析中である。スタチンががん細胞の増殖を抑えるメカニズムの1つが、タンパクのプレニル化に必要なゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)の枯渇であることが明らかとなり、研究の進捗状況はおおむね順調であると考えられる。スタチンは、血中コレステロール値の低下作用以外に制がん効果を発揮することが知られており、とくに間葉系のがん細胞で強い効果を発揮することが報告されている。がん細胞は悪性度が増すにつれて上皮間葉転換(EMT)を起こし、E-cadherinが減少して間葉系様の性質を獲得することが古くから知られているが、EMTを起こした上皮系がん細胞のスタチン感受性の変化については明らかでない。本研究では、上皮系のがん細胞に形質転換増殖因子TGF-β1を作用させ、EMT誘導前後のスタチン感受性の変化について解析することを試みた。肺由来がん細胞株NCI-H322Mおよび卵巣由来がん細胞株OVCAR3を用いて血清飢餓培養を24時間行い、その後TGF-β1を培地に添加してさらに72時間培養した。EMT誘導の確認はEMTマーカーの遺伝子発現変化を確認することにより行った。EMTを誘導後、330 uMのスタチンを曝露し、72時間後の細胞数を対照群(EMT非誘導群)の細胞数で除した値を生存率とした。TGF-β1によってNCI-H322MおよびOVCAR3のEMTマーカー遺伝子が変動し、EMTが確実に誘導されたことを確認した。EMT非誘導群ではNCI-H322M、OVCAR3両細胞株ともにスタチンの曝露量が増すにつれて細胞生存率の低下がみられた。一方、EMT誘導群では細胞生存率の低下は起こらず、逆に耐性を示す結果となった。これまでの報告から、スタチンは間葉系のがん細胞に対しより強い効果を発揮することが知られているが、もともと上皮系のがん細胞がEMTを起こしても、スタチンの感受性が高まるわけではないと推察された。しかし、TGF-β1などのサイトカイン誘導性の上皮間葉転換は、薬剤耐性をもたらすことが報告されている。今後はTGF-β1以外の方法でもEMTを誘導し、がん細胞のスタチン感受性の変化を解析する必要がある。前年度に引き続き,siRNAあるいはCRISPR-Cas9システムによりE-カドヘリンの発現を抑制し,スタチン耐性株における感受性の変化を検討する。これによりスタチン感受性が異なる細胞株間の細胞特性をより明確にするとともに,E-カドヘリンの感受性マーカーとしての有用性を評価する。また同様に,スタチンの標的分子であるHMG-CoA還元酵素(HMGCR),および細胞外からのコレステロール取り込みに関与する低比重リポタンパク質(LDL)受容体の遺伝子発現を抑制し,コレステロール代謝調節とスタチン感受性との間にどのような関連があるかを検討する。一方,Hippoシグナル伝達系は複数の異なる細胞外経路からシグナル入力を受け,細胞増殖や抗アポトーシスに関与している。
マイクロバイオアッセイによる赤潮生物の毒性因子解析

赤潮毒性研究には、これまで、魚や貝類など海洋生物を用いた方法が主流であった。本研究では、赤潮生物の毒性を解析するための、通常の実験室でも対応できる高感度でしかも簡便なマイクロバイオアッセイ法の確立とその有効性の検証を目的とした。その結果、調べた赤潮プランクトンの内、カレニア・ミキモトイが特に強い細胞毒性を発現する事がわかった。さらに、カレニア・ミキモトイの強毒株と弱毒株のアワビやクマエビに対する毒性と培養細胞を用いた毒性試験の結果は良く相関していた。以上の結果は、赤潮研究、特にその毒性機構解明にマイクロバイオアッセイ法は有効性を示すことがわかった。赤潮の原因生物である海洋性プランクトンが魚介類を斃死させる事は古くから知られているが、その毒性機構の詳細は未だ不明である。赤潮プランクトンの毒性機構解明には、これまで、魚や貝類など海洋生物を用いた方法が主流であった。しかしながら、これら海洋生物の飼育には特別な施設が必要であることや操作の煩雑さ、さらに再現性に乏しい等の問題が指摘されている。従って、赤潮原因生物の毒性を調べるより簡便な方法の開発が求められている。本研究では、赤潮生物の毒性を解析するための、通常の実験室でも対応できる高感度でしかも簡便なマイクロバイオアッセイ法の確立とその有効性の検証を目的として、多面的取り組みを実施している。昨年度からの継続で本年度においても、特に毒性が強い赤潮原因種であるシャットネラ、カレニア・ミキモトイ、ヘテロカプサ・サーキュラリスクアーマを対象としたマイクロバイオアッセイ法開発に取り組んだ。これまでに実施した種々の動物種の赤血球に対する溶血活性、ワムシやアルテミアなどの動物プランクトンに対する毒性、海洋細菌(ビブリオ属)に対する毒性試験に加え、本年度は特に動物培養細胞をターゲットとして赤潮プランクトンの直接暴露での毒性検定法開発に取り組んだ。ブリ鰓由来上皮細胞やVero細胞に加え、ニジマス鰓由来細胞も導入し、検討した。カレニア・ミキモトイについては、これまでの研究で強毒株と弱毒株が得られており、今回用いた培養細胞に対する毒性も、株の相違を反映する結果が得られた。以上の結果は、現在開発中のマイクロバイオアッセイ法の有効性を示していると考えられる。赤潮は発生海域の多様な生物を斃死させる事は古くから知られているが、その毒性機構の詳細は未だ不明である。赤潮の原因生物は微細祝物プランクトンであるが、その種類は多様であるのに加え、それらの毒性機構も多種多様であり、その解明を困難にしている一因となっている。また、赤潮毒性研究には、これまで、魚や貝類など海洋生物を用いた方法が主流であった。本研究では、特に毒性が強い赤潮原因種であるシャットネラ、カレニア・ミキモトイ、ヘテロカプサ・サーキュラリスクアーマを対象としたマイクロバイオアッセイ法開発に取り組んだ。一般に赤潮生物の毒性試験に用いられている魚類や貝類など海洋生物の飼育維持には特別な施設が必要であり、実験の高コスト化や規模の大型化の原因となっている。多くの場合、この様な試験動物の問題が赤潮研究、特にその毒性試験遂行の妨げとなっている。

そこで、本年度の研究においては赤潮生物の毒性の検出あるいは、赤潮生物が産生する毒性因子を解析するための、通常の実験室でも対応できる高感度でしかも簡便なマイクロバイオアッセイ法の確立とその有効性の検証を目的として、特に培養細胞での実験を実施した。これまでの研究により、その重要性が明らかとなっている赤潮原因種であるシャットネラ、コクロディニウム・ポリクリコイデス、カレニア・ミキモトイ、ヘテロカプサ・サーキュラリスクアーマを対象とした。培養細胞を用いて解析については、これまでの研究で確立した毒性因子検出方法である、種々の動物種の赤血球(溶血活性)、ワムシやアルテミアなどの動物プランクトンに対する毒性、海洋細菌(ビブリオ属)に対する毒性との比較実験も合わせて実施した。その結果、Vero細胞に対する赤潮プランクトンの直接暴露により、プランクトン細胞濃度及び暴露時間に応じて、Vero細胞からLDHの漏れが観察された。LDH(乳酸脱水素酵素)は細胞質マーカー酵素であり、LDHの細胞外への漏れは細胞死あるいは細胞膜の損傷の結果であると考えられる。LDHは比較的微量でも検出可能であることから、本法は赤潮プランクトン暴露によるVero細胞のダメージを把握推定に有効な方法である事がわかった。一方、遠心分離によって調整した赤潮プランクトン培養上清や超音波処理で調整した破壊した細胞浮遊液ではVero細胞に対する影響は著しく低下している事がわかった。興味ある事にLDH細胞外放出の時間経過や強さは赤潮プランクトン種により大きく異なることが判明した。赤潮プランクトンの毒性機構に関しては、これまでの多くの研究にも関わらず、多くの点が不明である。その理由の1つとして、有効な毒性検定法が無かった事が上げられる。この様な状況において、本研究で取り組んでいる、高感度でより簡便なマイクロバイオアッセイ法は赤潮研究の突破口となると考えられる。これまでに開発した種々の動物種の赤血球に対する溶血活性、ワムシやアルテミアなどの動物プランクトンに対する毒性、及び海洋細菌(ビブリオ属)に対する毒性に加え、魚類を含む動物細胞に対する赤潮プランクトンの直接暴露においても、毒性を把握できることを実証した点は高く評価できると考えられる。すなわち、培養細胞を用いた赤潮プランクトン暴露実験の有効性が見出された点は今後の研究に極めて有益な知見となる。赤潮生物が産生する毒性因子を解析するための、高感度でしかも簡便なマイクロバイオアッセイ法の確立に関しては、これまでの研究が基礎となったことから、本年度はさらに方法論に関するさらなる進展をすることができたと考えられる。これまで実施してきた、種々の動物種の赤血球(溶血活性)、ワムシやアルテミアなどの動物プランクトンに対する毒性、海洋細菌(ビブリオ属)に対する毒性も、それぞれに赤潮プランクトンの種類に応じて、興味ある知見が得られたことも、本研究の推進の一部を担ったと考えられる。培養細胞を用いた赤潮プランクトン暴露実験ではLDH放出法を導入したことが本研究の新展開のきっかけとなったと考えられる。マイクロバイオアッセイ法としてこれまでに開発した、種々の動物種の赤血球に対する溶血活性、ワムシやアルテミアなどの動物プランクトンに対する毒性、及び海洋細菌(ビブリオ属)に対する毒性、さらに培養動物細胞に対する赤潮プランクトンの直接暴露による方法により得られた結果から、毒性機構の詳細や背景にある毒性因子は赤潮種により極めて異なることがわかってきた。
幼児教育ゲームへの接触が子どものコミュニケーション能力の発達に及ぼす影響

メディア環境の変化に伴い、幼児がゲームやビデオなどの映像メディアに長時間接触することにより、子どもたちの育ちに深刻な影響が出始めている。親たちは"幼児の学習や発達を促す"教材であると考え、早期教育ビデオの巻き戻し視聴を放任し、早期教育用ソフトへの接触を奨励している。これらの映像メディアへの接触が子どもの肉声への敏感性や集中力を失わせ、コミュニケーション能力を遅滞させると言われているが、その証拠は十分ではない。本研究では教育ソフトに長時間接触することにより対人的コミュニケーション能力の発達にどのような影響があるかについて明らかにするため、調査研究、実験研究、短期縦断研究を実施した。第1に、幼児をもつ保護者3000名を対象にして子どもを取り巻くメディア環境を調査した結果、メディアに接触する時間は低年齢ほど長く、強制的しつけスタイルを受けている子どもほどビデオやゲームに長時間接触することが明らかになった。第2に、ビデオゲームの使用経験を絵本の読み聞かせ経験と比較した結果、ビデオゲーム使用時の会話は乏しく、教育目標として掲げられた能力の向上も見られなかった。第3に、ビデオゲーム使用中の母子の会話を縦断的に追跡した結果、ゲーム操作についてのコメントは増えるが、教育ソフトの内容についてのコメントは殆ど見られず、ゲーム中の会話は殆ど見られなくなることが判明した。これらの研究成果を踏まえて幼児期の子どもの学びを促すメディア環境のデザインはどのようなものが望ましいのかについて提言した。(1)親のしつけ観調査を夫施した。1)都内に在住している母子4000組(幼稚園児・保育園児35歳児の母子)を対象にして幼児の生活時間を調査し、教育玩具やテレビ、テレビゲーム、絵本などの文化財(メディア)が幼児の生活環境にどのような位置を占めているのかを捉えるための調査を実施した。2)親のしつけ観を調査することにより、親が子どもの発達において何を大事な活動と捉えているか、子どもの文化財についてどのようなスタンスを取っているのかを明らかにした。【結果の概要】(1)幼児教育ソフトはコンピュータの先取り体験を与えてくれるので教育的によいとする親が3割程度いる一方で、外遊び、スイミング・体操教室で運動能力を高めたい、絵本の読み聞かせにより情操を豊かにしたいと考えている親が7割を占めている。(2)テレビゲームや電子玩具はビデオ視聴よりもよいが、「学習目的で活用できる」と考える親は少なく「発達的な悪影響を考慮して反対」する親がどの年齢群でも多い。(3)パソコンについてはどの年齢児の親も「他の活動の時間を奪わない程度なら賛成」「将来の必要性があるから積極的に賛成する」「無条件に賛成する」という賛成派が多い。(4)子どもが触れるメディアの中で絵本に対する評価は高く、どの年齢群でも一人あたり平均40冊絵本を所有している。また絵本の読み聞かせを行う親は概してパソコンや電子ゲームに子どもが接触することを好まない傾向が見られた。(5)学習塾への指向性は必ずしも高いわけではないが、スイミングや水泳、大人とのコミュニケーション能力の向上などを目的とした早期教育への期待は高い。子どもが学習関連(文字や数)の質問したときには積極的に応じ、精緻化する方向での支援を惜しまない。3)上記生活時間調査の結果を踏まえて、教育ビデオゲーム経験の多い子どもと絵本の読み聞かせ経験の多い子どもを抽出し、形成的評価のための予備実験を実施した。(2)成人による教育ソフトの形成評価を行い、評価実験に用いる評価刺激を選択した。1)形成評価;「幼児教育玩具」であるゲームソフトを学生・大学院生を被験者にして実際に使用してもらい、演出方法やゲームの導入の仕方、強化の与え方、教育目標と演出や仕掛けの整合性について、使用者の視点に立って形成評価を行った。2)上記の結果に基づき評価のための刺激を選択し実験手続きの詳細について検討した。(1)教育ソフトの形成評価実験;目的;ゲーム経験と絵本の読み聞かせ経験の効果を形成的に評価する。

教育用ゲームに従事する過程で起こる大人と子どもの相互交渉と絵本(絵本と仕掛け絵本の2種)の読み聞かせ経験中の大人と子どもの相互作用の内容を析出する。実験計画;年齢2(4歳児・5歳児)×文化財3(ゲーム・絵本・仕掛け絵本)の2要因計画。手続き;生活時間調査に基づき抽出した絵本やゲームへの接触頻度を釣り合わせた4,5歳児各60名、計120名を対象にして、(1)絵本の読み聞かせる、(2)仕掛けで遊びながら絵本を読み聞かせる、(3)物語世界をゲームでゴールまで体験するという3つの過程でゲームの教育目標(推理能力と熟慮性の向上)が達成されたかどうかを事前・事後調査で測定した。さらに3つの場面での子どものパフォーマンスを測定するとともに、大人とのコミュニケーションの様態をビデオで収録した。結果;教育目標の達成度;推理能力や集中力は、絵本群・仕掛け絵本群がゲーム群に比べて優位に向上した。鮮明な輝度の高い映像刺激に曝されることにより、30分のゲーム終了後は疲労が出て推理能力や集中力がかえって減衰した。しかも、映像の再認記憶の成績も優位に低かった。また物語内容の理解や記憶の成績については絵本群と仕掛け群はゲーム群よりも優位に成績が高く、ゲーム群は物語の内容を殆ど記憶していないことが判明した。総じて、幼児期のゲーム使用経験の効果は教育目標が達成されないだけでなく、映像記憶、物語内容の理解などについても否定的であった。(2)教育ソフトの繰り返し使用経験の短期縦断追跡研究;目的;家庭でのゲームへの繰り返し接触経験と絵本の読み聞かせ経験の効果を比較するため、2カ月間の短期縦断追跡を行った。手続き;3,4歳児のゲーム使用中の母子コミュニケーションの様態をビデオで収録して分析する。結果;ビデオ資料から相互作用のトランスクリプションを作成した。発話分析中であるが、ビデオ使用中は操作に関する会話が多く、絵本場面では母親の読みに集中している。また強制型しつけスタイルの母親は知識を問うような発話が多くみられる。1)昨年度に引き続き、家庭での幼児教育ゲーム経験と絵本の読み聞かせ経験の効果を比較するための短期縦断研究を実施し、データ分析を実施した。データを母子相互作用の変化、教育目標の達成度、コミュニケーション能力の変化について、総括的に検討し、子どもの学びの環境の望ましいあり方やメディア環境のデザインについて提言を行った。2)絵本の読み聞かせ場面の母子相互交渉を観察し、育児スタイルや子どもの年齢、出生順位などの要因が読み聞かせ方にどのような影響を及ぼすかについて検討した。子どもの出生順位は母親のことばかけに影響をもたない。一方、「強制的しつけスタイル」をとる母親は指示的・質問応答的ことばかけが多く、「受容的しつけスタイル」をとる母親は共感的で子ども中心の発話を受容することばかけが多かった。(『発達心理学研究』に投稿中。)3)母親の語りかけ方が子どもの語彙や語意の獲得にどのような影響を与えるかについて日米比較研究を行った。断定的文末表現(米は動詞)「だよ」"be"に埋め込まれた語彙は獲得されやすく、不確定的表現「かな」"may be"に埋め込まれている語彙は学習されにくい。
脂溶性ビタミン二分子膜小胞体の創製と癌治療への応用

本研究では、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームが、細胞表面のcaveolin-1と相互作用し、カベオラ介在性エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることを見出した。さらに、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームが殺細胞効果を有すること、及び他の薬剤の薬理活性を増強し得ることを明らかにした。本研究で用いているコレカルシフェロール誘導体は、既に生体内における代謝・消失過程が詳細に把握されており、生体適合性に優れる構成成分である。そのため、本研究成果は有効かつ安全な治療計画の構築のための医薬品開発に資するものである。最終年度は二分子膜小胞体化したコレカルシフェロール誘導体含有リポソームの薬理活性評価を行った。コレカルシフェロール誘導体は、非活性体であるコレカルシフェロールと、代謝活性体であるカルシジオール及びカルシトリオールに大別される。HeLa細胞、HT-29細胞及びHepG2細胞を用いて、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームの細胞毒性評価を行った結果、全ての細胞種において、カルシトリオール含有リポソームで最も高い殺細胞効果が得られた。また、既存の抗癌剤であるドキソルビシンと低濃度コレカルシフェロール誘導体含有リポソームの併用によって、ドキソルビシンの殺細胞効果が増強されることを明らかにした。さらに、これらの効果発現メカニズムを解析した結果、コレカルシフェロール誘導体が細胞内カスパーゼ発現量を増強し、アポトーシスが亢進することで殺細胞効果、並びに既存抗癌剤の薬理活性増強効果が得られることを見出した。本研究期間全体を通じて、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームは、その表面に一部露出したコレカルシフェロールと細胞表面のcaveolin-1との相互作用を介したカベオラ介在性エンドサイトーシスがその細胞内取込に一部関与している可能性を見出した。さらに、リポソームにコレカルシフェロール誘導体を含有することで、リポソーム自体に殺細胞効果を付与できること、さらに他の薬剤の薬理活性を増強できることを明らかにした。本研究において用いているコレカルシフェロール誘導体は、既に生体内代謝・消失過程が詳細に把握されており、生体適合性に優れる構成成分であると共に、近年、多様な新規薬理活性が見出されつつある。従って、本研究成果は生体適合性に優れ、かつ高い抗腫瘍活性等を示し得る新規リポソーム製剤を提供すると共に、有効かつ安全な治療計画の構築のための医薬品開発に資するものである。平成24年度は、コレステロール類似構造を有する脂溶性ビタミンD3であるコレカルシフェロールを構成成分として導入したリポソーム製剤の調製を試み、その物性評価及び細胞内取込特性評価を行った。製剤調製法の最適化検討の結果、コレカルシフェロール単独では小胞体構造が形成されず、補助脂質としてリン脂質又はコレステロールの添加が不可欠であることを見い出した。次にコレカルシフェロール含有リポソームの細胞内取込経路を明らかにするために、ヒト子宮頸癌由来HeLa細胞株を用いてエンドサイトーシス阻害実験を行った。その結果、通常のリポソーム製剤は過去の報告通り、クラスリン介在性エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた一方、コレカルシフェロール含有リポソームの細胞内取込には、一部カベオラ介在性エンドサイトーシスが関与していることが示唆された。また同様の検討を、ヒト肝癌由来HepG2細胞株及びヒト大腸癌由来HT-29細胞株を用いて行った結果、細胞種によってカベオラ介在性エンドサイトーシスの関与に多寡が見い出され、本現象には細胞種に応じたcaveolin-1発現量の差異が影響していることが示唆された。さらに機能性脂質として汎用されるポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質をコレカルシフェロール含有リポソームの構成脂質として用いた場合の影響について評価した結果、カベオラ介在性エンドサイトーシスによるリポソームの細胞内取込が、PEG修飾リン脂質含有時には認められないことが示された。本知見は、リポソーム表面に一部露出したコレカルシフェロールと細胞表面との相互作用が、コレカルシフェロール含有リポソームのカベオラ介在性エンドサイトーシスに関与している可能性を示唆するものである。以上、リポソーム構成脂質としてコレカルシフェロールを含有することで、製剤の細胞内取込経路を制御できることが明らかとなった。交付申請書記載の本年度の研究実施計画は、1脂溶性ビタミン誘導体含有リポソームの設計及び構築、2脂溶性ビタミン誘導体含有リポソームのin-vitro細胞内動態評価、3脂溶性ビタミン誘導体含有リポソームのin-vitro抗腫瘍活性評価となっている。研究実績概要に記載の通り、脂溶性ビタミン誘導体含有リポソームの設計・構築、及び調製した製剤のin-vitro細胞内動態評価については研究実施計画通りの進捗状況である。特にin-

vitro細胞内動態評価については、ビタミンD3として知られているコレカルシフェロールをリポソーム構成脂質として含有することで、製剤の細胞内取込経路が変化するという興味深い知見が得られている。また、脂溶性ビタミン誘導体含有リポソームのin-vitro抗腫瘍活性評価については現在研究遂行中であり、平成25年度も継続してより詳細な検討を行う予定である。コレカルシフェロール誘導体は、アポトーシス誘導に基づく抗腫瘍効果、抗炎症作用、並びに抗癌剤耐性克服作用を示すことが近年報告されている。そこで、平成25年度は二分子膜小胞体化したコレカルシフェロール誘導体含有リポソームにおいても同様の効果が得られるか否かを評価する。ビタミンD3誘導体は、非活性体であるコレカルシフェロールと、代謝活性体であるカルシジオール及びカルシトリオールに大別される。まず細胞毒性評価として、複数種類の癌細胞に各種コレカルシフェロール誘導体含有リポソームを添加し、一定時間後における細胞生存率をWST-8アッセイにより測定することで、製剤の抗腫瘍活性を評価する。さらにコレカルシフェロール誘導体含有リポソームによるサイトカイン応答を評価することで、コレカルシフェロール誘導体含有リポソーム添加による炎症抑制効果を検討する。また抗癌剤耐性癌細胞に対して、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームとドキソルビシンを添加し、一定時間後の細胞内ドキソルビシン存在量及び細胞生存率を指標として、抗癌剤耐性克服作用を評価する。また、平成25年度はコレカルシフェロール誘導体含有リポソーム内への安定的薬物封入法を構築する。具体的には、現在臨床応用されているドキソルビシン内封ポリエチレングリコール修飾リポソームにおける硫酸アンモニウム勾配に基づく能動的薬物封入方法に準じて行い、コレカルシフェロール誘導体含有リポソーム内薬物封入効率及び安定性をドキソルビシン放出実験等により評価する。さらにコレカルシフェロール誘導体含有リポソームとドキソルビシンを単一製剤化したことによる抗腫瘍活性増強効果、生体毒性、並びに抗癌剤耐性克服作用への影響を評価する。平成25年度は、コレカルシフェロール誘導体含有リポソームによる抗腫瘍活性評価、及びコレカルシフェロール誘導体含有リポソーム内への薬物封入法の確立を主な研究課題としている。本研究遂行のための研究費使用計画としては、まずコレカルシフェロール誘導体含有リポソーム調製のために、試薬として製剤調製用試薬及び多機能性付与の為のPEG修飾リン脂質やカチオン性リン脂質、蛍光標識試薬等が多量に必要であるため、適時購入する。また細胞培養のための培地、血清、抗生物質等の添加因子、並びに必要な消耗品を購入する。併せて、通常使用する細胞培養用のプラスチック製品に加えて、生細胞観察用のガラスボトムディッシュ、細胞培養用マイクロプレート等の特殊な消耗品を購入する。さらにコレカルシフェロール誘導体含有リポソームによる細胞毒性評価ために、細胞毒性評価キット(WST-8)、サイトカイン応答評価のためのELISAキット、アポトーシス評価キット等を購入する予定である。また、コレカルシフェロール誘導体含有リポソーム内への薬物封入法の確立のために、モデル薬物として用いる抗癌剤を複数種類購入する予定である。
第二次大戦後日本の教育再建と日系キリスト教

アメリカ日系人史上の重要事件(強制収容)が戦後日本の教育再建に及ぼす影響を越境教育史の事例として考察する。強制収容事件はアメリカ民主主義の持つ人種主義的体質を露出させる一大事件であった。この事件に対して被収容者の支援者として直接的に関与した日系人キリスト者(比較対照としての仏教徒)、日本人キリスト教エリート、元在日キリスト教宣教師等が、戦後日本の民主主義教育構築過程にどのように関与したのかを共同研究グループによって検討する。
廃プラスチックのケミカルリサイクリングによるガソリン製造プロセスの開発

廃プラスチックは主にポリエチレン(PE)、ポリプロピレンを主体としたポリオレフィン系プラスチック、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート(PET)そしてポリ塩化ビニル(PVC)で構成されている。これらプラスチックのケミカルリサイクリングについて研究を行い、次の成果を得た。(1)ポリオレフィンの代表であるポリエチレン(PE)を773K以上の温度で熱分解することで、全てを液状物とガスに分解した。生成液状物中の重質成分は我々が新しく開発したNi担持希土類金属交換Y型ゼオライト触媒(Ni/REY)を用いて水蒸気雰囲気下でガソリン成分に分解できた。得られたガソリンはオクタン価100以上であり、その収率はプラスチック質量基準で50%以上であった。(2)PETについて、従来20%生成する残さを全く生成せず、量論的にテレフタル酸とエーテル、アルデヒド、アルコールに転換するトリクルベッド型熱分解装置を作製した。さらに、鉄系触媒を開発し、テレフタル酸を100%ベンゼン等に転換することに成功した。(3)PVCについては、その質量の約60%が塩素である。さらに熱分解すると10%強の残渣が残る。そのため、PVCから燃料油を高収率では望めず、生成する残渣の有効利用に重点を置いた。380°C以下でPVCはHClとして除去できた。また、水蒸気雰囲気下PETで開発した鉄触媒を用いると残渣の架橋構造が発達し、非常に固い残渣を生成することを見いだした。この試料は活性炭や土壌改良剤に転換することができる。(4)廃プラスチックは混合系であるため、PEとPET混合物の熱分解をトリクルベッド型反応器で実証実験を行った。その結果、従来のタンク式反応器では軽油と重質油がほとんどであったが、ガソリン、灯油、軽油を70%以上生成することに成功した。既にポリオレフィンからは、オクタン価100以上のガソリンをプラスチック質量基準で50%以上の収率で得ることに成功している。そこで、平成6年度は重点的にPETのケミカルリサイクリングについて研究を進めた。ケミカルリサイクリングではまず、プラスチックを熱分解し、ついで生成した重質油やワックスをガソリンに転換する。PETは窒素中で熱分解すると400°Cから急激に分解し、20%程度の残差が残り、これがPETの処理を困難にしている。本研究では残差低減のため、水蒸気雰囲気で熱分解したところ加水分解反応を併発することにより分解温度を350°Cに低温化するとともに、残差を数%まで低減することに成功した。さらに、鉄系触媒を用いて300°Cまで低温化することにも成功した。また、PEとの混合系についても水蒸気雰囲気で処理することで残差をほぼ無くすることを確認した。PET単独からの生成油は炭素数が7以下のアルデヒド、ケトン、エーテル等の有用物質が主成分で200°Cの蒸留で全てが留出した。またPEとの混合物については、PEから生成した重質油が含まれていた。そこで、既に我々が開発しているNi担持REY触媒を用いて接触分解を水蒸気雰囲気で行った結果、生成油はほとんどがガソリン成分であることが分かった。平成7年度は連続処理装置を試作して、本プロセスの有効性を実証するとともに、PVCについて研究を行う計画である。

既にポリオレフィンからは、オクタン価100以上のガソリンをプラスチック質量基準で50%以上の収率で得ることに成功している。また、平成6年度はPETについて研究を行い、従来20%生成する残さを全く生成せず、量論的にテレフタル酸とエーテル、アルデヒド、アルコールに転換するトリクルベッド型熱分解装置を作製した。さらに、鉄系触媒を開発し、テレフタル酸を100%ベンゼン等に転換することに成功した。そこで、廃プラスチックを構成する残りのPVCのリサイクルについて平成7年度は重点的に研究を行った。PVCの質量の約60%が塩素である。さらに熱分解すると10%強の残渣が残る。そのため、PVCから燃料油を高収率では望めず、生成する残渣の有効利用に重点を置いた。380°C以下でPVCはHC1として除去できることをFT-IR分析で確認した。その試料を窒素中などで熱分解すると脆い残渣が残る。そこで、水蒸気雰囲気下PETで開発した鉄触媒を用いると残渣の架橋構造が発達し、非常に固い残渣を生成することを見いだした。この試料は活性炭や土壌改良剤に転換することができる。また、廃@プラスチックは混合系であるため、PEとPET混合物の熱分解をトリクルベッド型反応器で実証実験を行った。その結果、従来のタンク式反応器では軽油と重質油がほとんどであったが、ガソリン、灯油、軽油を70%以上生成することに成功した。
南九州の放牧牛における膵蛭類の簡易診断法の開発と疫学調査

牛の膵蛭および小形膵蛭の生体診断法として、ナイロンメッシュ濾過虫卵検査法および糞便内抗原検査法を開発した。日本各地および海外(ブラジル、ベトナム)から得た虫体の遺伝子を解析して2種の種としての独立性を明らかにしたが、一方で、形態学的鑑別が困難であることを示した。さらに、これまで詳細な検討がなかった治療法として、プラジカンテル25mg/kg1回経口投与が有効であることを示した。膵蛭類の虫卵検査法の改善を目的とし,ナイロンメッシュ法を試みた。一般に膵姪は糞便中への排出虫卵数が少ないと考えられており,診断の精度を上げるには,一度に多くの,あるいは数日間連続して糞便を検査する必要がある。実験に用いた糞便は膵姪重度感染牛から得たものでEPGは22であった。糞便は肝蛭用(目開き150μm)金網メッシュを通した後,500mlのビーカーにて3回簡易沈殿を行い,沈渣を60μm,41μmおよび20μmのナイロンメッシュに通した。メッシュ不通過物および通過物を検査したところ,ほぼすべての虫卵が20μmメッシュにトラップされることがわかった。糞便量を変えて検査したところ,5gまでは糞便中に含まれるほぼすべての虫卵が20μmメッシュにトラップされていたが10g以上では処理過程での虫卵ロスが多くなった。本法では検査対象物(20μmメッシュ不通過物)の量が極めて少なく,5gの糞便を検査することで,検査の効率化が図れることがわかった。次に,明確な結論が出ていない膵蛭および小形膵蛭の種の独立性について検討した。石垣島の感染牛から採取した虫体22隻を形態学的に同定したところ,17隻が膵蛭,3隻が小形膵蛭,2隻が両種の中間型であった。これらについて,虫体の一部からDNAを抽出し,膵蛭類で唯一GenBankに登録配列のある18S rRNA領域のPCR-ダイレクトシークエンスを行った。この結果,形態学的に判別できた膵蛭7隻,小形膵蛭2隻,中間型1隻の塩基配列を決定することができたが,いずれもGenBankに登録されている膵蛭のものと一致した。今後,サンプル数を増やしてさらに検証を行う必要がある。島根県および沖縄県の食肉衛生検査所に協力を依頼し、各県の屠畜場で採取した膵蛭類感染牛から虫体および糞便を収集して、昨年度開発したナイロンメッシュ簡易虫卵検査法の信頼性を評価した。寄生虫体数と糞便10gの虫卵検査結果を比較した結果、48検体中47検体において虫卵が認められた。虫卵が検出されなかった検体は寄生虫体数が5匹であった。寄生虫体数が5匹以下であった牛は全部で10頭であり、残りの9頭からは虫卵が検出された。よって、本法が高い信頼性を持つことが示された。また、収集した虫体の一部は培養液中で2-3日間培養し、培養液から分泌排泄抗原を、虫体から虫体粗抗原を作成して、それぞれウサギに投与して、糞便内抗原検出法に使用する抗膵蛭ウサギポリクローナル抗体を作成した。次年度に本法を開発・評価する。さらに、屠畜場での採材時には血餅も採取しており、そこから得られた血清は血清診断法の評価で使用する予定である。膵蛭および小形膵蛭の種の独立性について検討するため、上記虫体サンプルに加え、東京都芝浦食肉衛生検査所で検出した虫体、およびベトナム、ブラジルから虫体を入手した。その一部について、CO1およびITS2領域の系統樹解析を行ったところ、解析したサンプル群は2つのクレードを形成した。系統樹解析に用いた各虫体については圧偏標本を作成しており、今後、虫体の形態とクレードの関係を解析し膵蛭および小形膵蛭の種の独立性を検証する。これらを明らかにした後、膵姪と小形膵姪を区別するmultiplex PCR法の開発および疫学調査を開始する予定である。これに加え、沖縄県八重山家畜保健所の協力を得て、八重山諸島の畜産農家を調査し、感染牛を対象に駆虫試験を現在実施している。膵蛭と小形膵蛭の種の独立性を遺伝学的に評価し、形態学的な差異との関連性を解析した。東京都港区、島根県大田市、沖縄県石垣市、ブラジル、ベトナムの屠場で採取した虫体計125検体について、核ITS2とミトコンドリアCO1遺伝子のPCR、塩基配列解読を行ったところ、103検体で両領域の配列が得られた。系統樹解析では、両領域ともに2つのメインクレード(ITS2:α、β;CO1:a、b)に分かれ、69検体および33検体がα-a(遺伝子型A)およびβ-b(遺伝子型B)の組み合わせに含まれた。

これらの虫体について、形態分類に利用される体長、体幅、口吸盤径/腹吸盤径比、精巣分葉、卵巣分葉の5項目について評価したところ、遺伝子型Aは48/69(69.6%)において4項目以上で膵蛭の、遺伝子型Bは7/33(21.2%)において4項目以上で小型膵蛭の特徴を示し、遺伝子型Aは膵蛭、遺伝子型Bは小形膵蛭であると考えられた。しかし、残りは形態学的に鑑別できない虫体であった。このことから、膵蛭と小形膵蛭は遺伝学的に区別できるものの、形態学的には完全な区別が困難であることがわかった。また、牛の産地を感染場所と考えると、島根県、九州内部からは膵蛭のみが、沖縄県本島・鹿児島県徳之島では小形膵蛭のみが、沖縄県八重山諸島では両種が分布すると推測され、2種の分布には地域的な偏りが存在すると考えられた。虫卵排出牛13頭に対してプラジカンテル(25mg/kgおよび50mg/kgの1回経口投与)による駆虫試験を実施した結果、全頭で投与後7日以内に糞便内虫卵が陰転し、本法で駆虫が可能であることがわかった。また、糞便内抗原検出法の開発を目的に、虫体粗抗原およびES抗原に対するウサギ抗体を作成し、サンドイッチELISAの各種条件設定を行った結果、粗抗原0.5ngを検出できるassay系を開発することができた。沖縄県石垣島屠畜場での材料採取の調整やブラジル材料の通関手続きに手間取ったため、虫体の遺伝子解析が遅れ、multiplex PCR法の開発および疫学調査を開始するまでに至らなかった。次年度に実施する予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。診断法の開発に必要な材料、および膵蛭と小形膵蛭の種の独立性を検討する材料はおおむねそろったので、次年度前半にこれらを完了させ、まだ手つかずのmultiplex PCR法の開発および疫学調査を開始する。一方で、本年度に八重山諸島で駆虫試験の行える状況があったので、次年度予定の駆虫試験を前倒しで実施した。なお、本年度は、学会や雑誌での研究発表にも力を入れる予定である。
物質表面から真空中への熱ミュオニウムの蒸発過程の系統的な研究

本研究は、表面・界面の磁気状態を探索するために画期的な方法である超低速ミュオンビームを生成効率を向上させるために、熱ミュオニウムを効率的に生成できる物質を探索する事が目的である。熱ミュオニウムとは、電子と正の電荷を持つミュオンの束縛状態であり、本研究では、高温に熱された金属表面からの熱ミュオニウムの蒸発現象を利用する。研究を計画時には、J-PARC MLFに設置される予定であった大強度バルス真空紫外レーザー発生装置を利用し、蒸発した熱ミュオニウムを選択的にイオン化し電場で引き出す事で標的近傍から輸送し、バックグランド放射線ノイズの少ない環境で測定を行う予定であった。また、ミュオンを打ち込んだ時刻とイオン化レーザーの照射時刻、およびイオン化して検出されたミュオンの量の相関を測定することで、時間・空間分布を測定できるため、これまでにない感度で測定を行う予定であった。しかしながら、大強度パルスレーザーを生成用の結晶の生成が困難であった為、研究期間内に使用できない事が明らかとなった為、急遽計画を変更する必要に迫られた。この為、プラスチックファイバ検出器を用いたホドスコープを用いて、熱ミュオニウムが真空中に拡散しながら崩壊していくベータ線の分布の時間発展を測定することで熱ミュオニウムの生成量を算出する。本年度は、バックグランド放射線ノイズを低減させる為に、熱ミュオニウム生成用真空チェンバを改良・試験を行い、問題となっていたバックグランド放射線ノイズを半分以下に抑える事に成功した。また、高速ベータ線検出器を開発する事によって、検出効率の向上を図った。熱ミュオニウム生成の標的として標準とされる熱タングステンからの熱ミュオニウムの蒸発過程を確認することに成功した。イリジウム箔を用いた場合には、タングステンよりも低温で熱ミュオニウムの生成が確認できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。熱エネルギー程度をもつ電子を束縛したミュオン(熱ミュオニウム、熱Mu)は、表面・界面の局所的な磁気プローブとして応用される超低速ミュオンビーム源として重要であり、その上、その超低速ビームの質が極めて良いため、ミュオンの異常磁気モーメント(g-2)や電気双極子モーメント(EDM)の標準模型を超える物理を探索する精密測定への応用に期待が寄せられている。これらg-2とEDMの精密測定は世界的に熾烈な競争が行われており、熱Muを大量に生成できる物質の探索が急務となっている。本年度の研究では、世界でも最高強度のミュオンビームを供給できるJ-PARCセンターミュオン実験施設のD2ポートにおいて熱ミュオニウム発生装置を立ち上げた。熱ミュオニウム生成装置は、超高真空槽とその内部に固定された300Aの大電流によるジュール熱で高温に熱される金属箔および熱放射温度計から構成される。コリメートされたミュオンビームをその高温金属箔に打ち込んだ後、遅れて真空中に発生する熱Muからの崩壊陽電子をホドスコープで捕らえることで、熱Muを同定し、様々な金属からの熱Muの生成量を系統的に調査する。熱Muの生成物質として、ミュオンと同じ性質の水素の溶解エンタルピーの大きなイリジウムを試験した。この結果、1200°C以上の高温のイリジウム純金属からの熱Mu生成信号を得ることが出来た。現時点で熱Muの生成量が最大とされる1700°Cのタングステン純金属と同程度の生成量を示唆する結果であったが定量的な議論には至っていない。これは、パルス状に大強度のミュオンビームが供給されるため、大量のバックグランドノイズとの区別が現行の検出システムでは困難であることが原因であった。また、ミュオンの散乱をシミュレーションした結果、この大量のノイズは、高温金属で散乱し真空槽内壁に止まったミュオンの崩壊による陽電子であることも判明した。

熱ミュオニウム生成の標的として標準とされる熱タングステンからの熱ミュオニウムの蒸発過程を確認することに成功した。イリジウム箔を用いた場合には、タングステンよりも低温で熱ミュオニウムの生成が確認できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度において、熱ミュオニウム生成装置やホドスコープ検出器等から構成される熱ミュオニウム生成装置を構築し、J-PARCセンターにおいて、熱イリジウムおよび熱タングステンからの熱ミュオニウム由来の信号を得ることに成功した。しかし、大強度ミュオンビームによる散乱ミュオンのバックグランド放射線ノイズが研究提案時の予測よりも遥かに大きかったために、当初の検出器システムでは、研究対象である熱ミュオニウムの信号と当該バックグランドノイズとを十分に区別することができいことが判明した。その為、散乱ミュオンの影響を抑える為の熱ミュオニウム発生装置の真空箱の形状の改良および耐高検出性能をもつ検出器の開発と導入が避けられず、計画を送らせる必要が生じた。散乱ミュオンのバックグランドノイズを抑えるために、バックグランドノイズとなる散乱ミュオンの崩壊の様子をモンテカルロシミュレーションにより評価し、今年度の測定結果を踏まえて、超高真空槽の形状を最適な形状に変更し改善を行ったので、実際のミュオンビームを用いてバックグランドの抑制効果を確認する。このモンテカルロシミュレーションと、本年度得た実験データと照らし合わせると、バックグランドノイズを半分以下に抑えられることが期待される。また、検出器をより細分化しマルチピクセルフォトセンサ(MPPC)を用いた耐高計数率検出器を導入することで、パルス状に大量のデータが来た場合においても、バックグランドノイズとの分解能を高める。更に、検出器の数を増やし、二次元の空間分解能を持たせるように検出システムを変更する。この結果、バックグランドノイズを除去を可能にするととも熱ミュオニウムの真空中への拡散の様子をより精密に測定できるようになる為、より定量的に熱ミュオニウムの生成量を得ることができると期待している。また、イリジウムの再測定を行い定量的な生成量を得るとともに、ルテニウムやプラチナ等の他の金属を試験し、熱ミュオニウムの生成メカニズムを解明する。
ベーチェット病におけるM2マクロファージ機能不全とその修復による治療戦略

本研究ではベーチェット病(B病)のHO-1発現低下、遺伝的なIL-10産生低下より、抗炎症性M2マクロファージの機能不全がB病炎症病態の本質であるとの仮説を立てた。末梢血単球からGM-CSFおよびM-CSFにより分化誘導したM1、M2細胞において、M2細胞はHO-1、IL-10に加え、B病疾患感受性遺伝子であるCCR1を発現し、MIP-1aに対して高い遊走能を示した。このことはB病のマクロファージ機能異常がM2細胞機能不全に集約されることを示している。また、M1細胞はM-CSF添加によりIL-10産生などのM2形質を獲得することから、その形質転換がB病治療戦略となる可能性が示唆されたベーチェット病(B病)は眼皮膚粘膜病変を主体とした炎症性疾患である。先に私たちはB病患者白血球では抗炎症蛋白であるheme oxygenase-1(HO-1)の発現が低下し、その発現調節に関わるIL-10が疾患感受性遺伝子であることを報告した。本研究ではこれらの異常がM2(抗炎症性)マクロファージの機能不全に起因するという仮説を立てた。本年度はまず、GM-CSFあるいはM-CSFを用いて、in vitroにおけるM1/M2分化能を検討した。末梢血単球分画をGM-CSFあるいはM-CSF存在下で培養すると前者は球状、後者は紡錘状の形態をとり、M-CSF添加細胞ではCD163、HO-1、フェリチンH鎖mRNAの高発現が確認され、GM-CSF添加細胞ではほとんど検出されなかった。フローサイトメトリーによる細胞表面解析でもCD163はM-CSF添加時のみに検出され、CCR1発現細胞頻度もM-CSF添加時に有意に高かった。LPS刺激によるサイトカイン産生能はIL-6はGM-CSF添加時に有意に高く、IL-10はM-CSF添加時のみに、TNF-aは両培養系でほぼ同等に産生された。以上より、GM-CSFはM1の、M-CSFはM2マクロファージの分化を誘導することが検証された。B病患者由来単球で同様の検討を行った結果、M1、M2分化誘導系のいずれにおいてもサイトカイン産生、細胞表面形質に健常者と差異はなかった。本研究でHO-1発現、IL-10産生とともに、CCR1発現もM2マクロファージの特性であることがわかった。発現低下と関連したCCR1アレルはB病のリスクアレルであり、B病の単球の機能異常はM2マクロファージの機能異常に集約される可能性が高い。ベーチェット病(B病)は眼皮膚粘膜病変を主体とした炎症性疾患である。昨年度、末梢血単核細胞をGM-CSFおよびM-CSF存在下でM1およびM2分化誘導系を確立した。CD163、HO-1、フェリチンH鎖などのM2分化マーカーのmRNAおよび蛋白はM-CSF存在下でのみ、その発現が観察された。また、機能的にもLPS刺激時にTNF-a、IL-6はM1/M2ともにほぼ同等の産生が見られたが、IL-10の産生はM2のみであった。さらに、B病のIL10のリスクアレルの有無によるM2分化細胞のIL-10産生能を解析した結果、リスクアレルなし>ヘテロ>リスクアレルホモであり、既報と同様にリスクアレルがIL-10産生不全に寄与することが確認された。同じくB病の疾患感受性遺伝子の一つであるCCR1はM2マクロファージに選択的に発現することも明らかになった。以上よりB病病態の一部はM2マクロファージ機能不全により一元的に説明しうる可能性が高い。本年度は上記の健常者での成績を確認するとともに、B病患者(24例)を対象に健常者と比較検討した。その結果、GM-CSFおよびM-CSFによるM1およびM2分化誘導系には健常者と差異はなく、B病患者の末梢血単核細胞でも分化の可塑性が保たれていると考えられた。ただし、B病治療は病型、重症度により多様なので、その影響については、今後継続的に検討する必要がある。再現性の高い、in vitroのM1/M2分化誘導系を確立した。B病の疾患感受性遺伝子として同定されているIL-10、CCR1はいずれもM2マクロファージで発現が高く、B病病態の一部はM2マクロファージ機能不全により一元的に説明しうる。今年度、横浜市大から日本医科大学への異動に伴い、施設内倫理委員会申請、実験室のセットアップなどため、研究全体の進行が当初の予定より一部遅延している。私たちは先にB病患者白血球において抗炎症蛋白であるhemeoxygenase-1(HO-1)の発現が低下していることを報告し、その後の遺伝子解析でその発現調節に関わるIL-10が疾患感受性遺伝子であることを見出した。いずれも抗炎症性M2マクロファージの機能に関与することから、本研究ではその機能低下がB病炎症に寄与するという仮説を立てた。

まず、ヒト末梢血単球をGM-CSFおよびM-CSF存在下で培養することで、in vitroにおけるM1およびM2分化誘導系を確立した。M2分化マーカーのCD163、HO-1、フェリチンH鎖などのmRNAおよび蛋白はM-CSF存在下で培養したときのみ、その発現が観察された。こうして樹立した健常者由来M1/M2マクロファージはLPS刺激に反応し、ほぼ同等のTNF-a、IL-6を産生するが、IL-10はM2のみで産生された。また、B病の疾患感受性遺伝子の一つであるCCR1は健常者由来M2マクロファージに選択的に発現し、リガンドであるMIP-1aにもM1より高い感受性を示した。一方、B病患者の末梢血からもほぼ同様にM1/M2マクロファージが分化誘導されたが、M1におけるCCR1発現は健常者由来M1より亢進していた。したがって、炎症局所からのMIP-1aなどのケモカインに対して、健常者では主にM2マクロファージが集積し、炎症制御機転が働くのに対し、B病患者では一部にM1マクロファージの遊走も加わり、量的にも質的にもM1>M2となるため逆に炎症が増幅すると考えられた。さらに、樹立したM1マクロファージをM-CSFで刺激するとIL-10産生能を獲得することから分化したマクロファージの機能的可塑性が確認され、マクロファージ形質転換がB病治療戦略の一つとなる可能性が示唆された。本研究ではベーチェット病(B病)のHO-1発現低下、遺伝的なIL-10産生低下より、抗炎症性M2マクロファージの機能不全がB病炎症病態の本質であるとの仮説を立てた。末梢血単球からGM-CSFおよびM-CSFにより分化誘導したM1、M2細胞において、M2細胞はHO-1、IL-10に加え、B病疾患感受性遺伝子であるCCR1を発現し、MIP-1aに対して高い遊走能を示した。このことはB病のマクロファージ機能異常がM2細胞機能不全に集約されることを示している。また、M1細胞はM-CSF添加によりIL-10産生などのM2形質を獲得することから、その形質転換がB病治療戦略となる可能性が示唆された再現性の高い、in vitroのM1/M2分化誘導系を確立したことが、最大の収穫であり、また、CCR1の発現異常も我々の仮説のもとM2マクロファージ機能不全により一元的に説明しうる可能性もでてきたものと評価できる。現時点ではBD患者単球にin vitroの分化誘導能に関する異常は見出されておらず、仮に生体内でM2マクロファージ機能不全があったとしても、分化の可塑性は保たれ、薬理学的に是正される可能性は高い。今後、患者生体内でのM1/M2分化状況と分化環境を解析するために、血清中HO-1、各種サイトカイン、sCD163などの解析を行う予定である。また、病変部に浸潤したマクロファージの解析なども今後の検討課題である。臨床リウマチ学現時点ではB病患者単球にin vitroの分化誘導能に関する異常は見出されておらず、仮に生体内でM2マクロファージ機能不全があったとしても、薬理学的に是正される可能性は高い。今後、患者の病型や疾患活動性との関連、治療介入の影響の検討、GM-CSFおよびM-CSF分化誘導系におけるB病治療薬のin vitroでの影響を検討し、M2マクロファージ機能不全の病態における役割を明確にし、その知見の治療応用を検討する。今年度、施設の異動により、本研究プロジェクトを横浜市立大学単独施設の研究から同大学と日本医科大学との共同研究に変更した。