hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新興国におけるインフォーマル制度の実験・行動経済学的分析

本研究では、フィリピン農村における田植え労働慣行に注目し「理論上は個人出来高制をとることで労働者の生産性を高められるはずなのに、なぜ全員一律の固定給になっているのか?」という問いに答えるべく研究を実施してきた。平成27年度は、二つの研究を実施した。第一に、前年度に引き続き、既に収集されたデータの解析をもとに、固定給の下では労働者の社会的選好とピアー効果の存在が機会主義的行動を抑制していることを発見した。こうした発見を取りまとめ、フィリピン農村の田植え労働契約を対象に経済的インセンティブと社会的規範および社会的選好の相互関係に関する論文を執筆し、アモイ大学で開催された国際会議を始め、様々な研究集会で研究結果を報告した。第二には、2016年1月に、上記の研究を深めるため、特に、経済的動機付けと労働者間でのピアー効果をより厳密に把握することを目的として、フィリピン・Central Luzon State UniversityのThelma Estera教授の協力の下、ヌエバ・エシハ州の農村にて慎重に設計された新たなフィールド実験を実施した。この実験は、現地での田植え労働における契約形態の違いが生産性に与える影響をより厳密に検証するものである。また、各労働者の社会・経済的属性を把握するための簡単な質問票調査も併せて実施した。新しいデータを加味した解析結果を論文として取りまとめた。本研究の目的は、途上国農村におけるインフォーマルな労働取引制度を対象に、農家の経済行動と村落コミュニティ内部の社会ネットワークとの間にある相互規定性を明らかにすることであった。こうした研究は、市場メカニズムの不備を補完するインフォーマル制度の成立要因を探るという点で、開発ミクロ経済学の根幹を支える重要な課題であるが、慎重に設計されたフィールド実験を元に、そうした課題に対する緻密なエビデンス(科学的証拠)を得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、途上国農村におけるインフォーマルな労働取引制度を対象に、農家の経済行動と村落コミュニティ内部の社会ネットワークとの間にある相互規定性を明らかにすることである。こうした研究は、市場メカニズムの不備を補完するインフォーマル制度の成立要因を探るという点で、開発ミクロ経済学の根幹を支える重要な課題である。平成26年度は、以下の3つの課題に取り組んだ。第一には、フィリピン農村における田植え労働慣行に注目し、「理論上は個人出来高制をとることで労働者の生産性を高められるはずなのに、なぜ全員一律の固定給になっているのか?」という問いについて研究を実施した。その結果、固定給の下では労働者の社会的選好の存在が機会主義的行動を抑制していることを発見した。こうした発見を取りまとめ、フィリピン農村の田植え労働契約を対象に経済的インセンティブと社会的規範および社会的選好の相互関係に関する論文を執筆した。第二に、2013年11月にフィリピン中部を横断し、甚大な悪影響を生み出した台風Yolandaを対象として、自然災害が家計の経済・社会行動に与える影響を明らかにするための予備調査を実施した。また、東日本大震災の後に大船渡に設立された、社会関係資本(ソーシャルキャピタル)蓄積のための施設である「居場所ハウス」をYolanda被災者への適用可能性について検討した。第三には、第三に、スリランカ南部農村地域において灌漑の維持管理等に関する制度についての調査及び実験の可能性を探るための予備調査を実施した。本論文では、フィリピン農村における田植え労働慣行に注目し、「理論上は個人出来高制をとることで労働者の生産性を高められるはずなのに、なぜ全員一律の固定給になっているのか?」という問いについて研究を実施した。

その結果、固定給の下では労働者の社会的選好の存在が機会主義的行動を抑制していることを発見している。また、「制度がどのように選ばれて持続していくのか?」や「機会主義的行動を抑制しているのは社会的選好か、それとも繰り返しゲームの効果なのか?」といった問いには答えるため、「制度の内生的選択ゲーム」といった最新の実験経済学の研究テーマを発展途上国農村における現実の経済問題と結びつけた先端的な研究の準備を行った。より具体的には、フィリピン・中部ルソンの田植え労働契約における内生的な制度選択に関する実験経済学的研究の準備を行った。27年度が最終年度であるため、記入しない。農家の経済行動と村落コミュニティ内部の社会ネットワークとの間にある相互規定性をより明確にし、「制度がどのように選ばれて持続していくのか?」や「機会主義的行動を抑制しているのは社会的選好か、それとも繰り返しゲームの効果なのか?」といった問いには答えるため、平成27年度は、内生的な制度選択メカニズムを解明するためのフィールド実験、つまり田植え労働契約における内生的な制度選択に関する実験経済学的研究を行う予定である。具体的には、フィリピン・中部ルソンで現存の田植え労働契約が社会的に最適であることを実証するための経済実験の設計と実施を行う。調査デザインについて慎重に議論している段階にあり、平成27年度に本調査を行う予定である。収集されたフィールド実験のデータ分析を実施し、国際会議や学会での報告を通じて論文を改訂し、最終的には国際雑誌に投稿する予定である。こうした研究は、最新の実験経済学の研究テーマを発展途上国農村における現実の経済問題と結びつけた先端的な研究である。
顕微視能を拡張する知能眼鏡システムの開発

ユーザの眼球運動と注視対象に応じて制御可能なロボットビジョンシステムとその映像提示インタフェースを構築し,ミクロな観察を支援する視覚拡張技術を確立する.特に,両眼の動きから注視物体を予測し,視認性が高くなるように映像取得・処理を施した一人称立体映像を実時間で提示することで,人の顕微視能を拡張する知能眼鏡システムを実現する.そのために,(1)注視対象を実時間で検出するための両眼運動の予測センシング,(2)同調性の高い視覚システムを実現するためのロボットの眼球運動・焦点の制御,(3)人の顕微視能を拡張するための映像撮影・提示による視認性最適化に取り組み,知的な視覚拡張を実現するための技術を培う.ユーザの眼球運動と注視対象に応じて制御可能なロボットビジョンシステムとその映像提示インタフェースを構築し,ミクロな観察を支援する視覚拡張技術を確立する.特に,両眼の動きから注視物体を予測し,視認性が高くなるように映像取得・処理を施した一人称立体映像を実時間で提示することで,人の顕微視能を拡張する知能眼鏡システムを実現する.そのために,(1)注視対象を実時間で検出するための両眼運動の予測センシング,(2)同調性の高い視覚システムを実現するためのロボットの眼球運動・焦点の制御,(3)人の顕微視能を拡張するための映像撮影・提示による視認性最適化に取り組み,知的な視覚拡張を実現するための技術を培う.
半乾燥熱帯アフリカにおける養水分動態の最適化と増収に資する農業技術の確立

本年度は、主調査地であるタンザニアへ計3回渡航し、現地研究圃場において、研究計画通り、安定同位体で標識したトウモロコシ残渣を施用した栽培試験を行った。また、国際誌へ論文を3本(うち受理1件、査読中2件)投稿し、国際学会での研究発表2回(うち招待講演1回)、国内学会での研究発表1回を行い、精力的に研究へ取り組んだ。得られた研究成果は以下の通りである。1残渣の施用法(すき込み、表面散布)が養水分保持機能に与える影響を明らかにするために、タンザニアの土壌型が異なる2サイト(粘土質サイト、砂質サイト)において栽培実験を実施した。その結果、粘土質サイトでは施用法による表層土壌中の土壌水分および無機態窒素量には違いは見られなかった。その一方、砂質サイトでは、残渣を表面散布することによって、もともと低かった砂質土壌の保水性が向上し、土壌中の無機態窒素量も増加し、作物生育が改善されることが明らかとなった。2上記栽培試験中に土壌呼吸速度を定期的に測定し、施用有機物の分解量を推定した。その結果、粘土質サイトでは表面散布を行うことで、すき込みよりも分解率が24%抑制できる一方で、砂質サイトでは添加方法による分解率の顕著な違いがないことが明らかとなった。上記1、2の研究成果は、半乾燥熱帯アフリカにおいて、畑地土壌中における養水分動態を最適化する有機物の施用法が、土壌型の物理性よってに異なることを示している。27年度が最終年度であるため、記入しない。半乾燥熱帯に位置する東アフリカでは、水食と溶脱による養水分損失が作物収量の低下を引き起こしており、その抑制技術の構築は喫緊の課題となっている。そこで、本研究では、養水分動態を最適化する有機物施用技術を確立するため、タンザニアの2圃場(粘土質土壌・砂質土壌)において、トウモロコシ残渣を用いた異なる施用方法(すき込み区、表面散布区)の処理区を設け、トウモロコシの栽培試験を行った。まず、土壌呼吸速度を定期的に測定し、施用した残渣の分解量を推定した。また、作物生育期間中、表層土壌(0ー30cm深)中の無機態窒素量を定期的に測定した。その結果、粘土質サイトでは、表面散布区に比べてすき込み区において顕著な無機態窒素量の増加が観察されたが、砂質サイトでは、すき込み区に比べて表面散布区において顕著に無機態窒素量が増加した。土壌水分も水分センサーによって継時的にモニタリングを行った。その結果、粘土質サイトでは、表面散布区においてすき込み区に比べて高い水分含量で推移したが、砂質サイトでは両区に差は見られなかった。作物収量は、表層土壌中の無機態窒素量に対応して、粘土質サイトではすき込み区のほうが表面散布区よりも収量が高く、砂質サイトでは表面散布区のほうがすき込み区よりも高かった。当初の研究計画通り、栽培試験を行い、想定していた結果を得られている。しかしながら、多雨年の結果を得るために灌漑を行っていたが、今季も非常に雨が少なく、灌漑量も多雨年の降雨量に足りるほどの量を確保することが出来なかったので、これまでに得られた結果を少雨年との対照的な降雨量として考察を進めることは慎重に検討する必要がある。安定同位体によって標識したトウモロコシ残渣を施用し、残渣の分解に伴って放出された養分の作物への移行量を、土壌型・施用法ごとに解明する。少雨に対する対策として、引き続き灌漑を行い、栽培試験を実地する。
温熱刺激によるアクアポリン制御を介した胃癌低浸透圧細胞破壊増強機構の解明

様々な癌種におけるアクアポリン5(AQP5)発現が報告されているが、温熱刺激によるAQP5発現制御を介した抗腫瘍メカニズムについての報告は存在しない。AQP5高発現肝癌細胞株(Alexander cell)に温熱刺激を加えると、細胞膜・細胞質におけるAQP5発現が減弱し、G0/G1期での細胞周期停止、細胞増殖抑制、細胞遊走・浸潤能低下、アポトーシス増強が生じることを確認した。AQP5-siRNAによりAQP5発現を下方制御した際にも同様の結果が得られ、AQP5高発現癌細胞株における“温熱刺激によるAQP5発現下方制御を介した細胞周期、細胞遊走・浸潤能・アポトーシス制御機構"を明らかにした。我々はすでに肝癌細胞株において温熱刺激による低浸透圧細胞破壊の増強効果を確認していたため、まずは肝癌細胞株を用いた実験を行った。ウエスタンブロット法により肝癌細胞株(HLE、Alexander、Hep-G2)におけるアクアポリン1, 3, 5蛋白発現を比較検討したところ、Alexander細胞でアクアポリン1, 5発現が高いことを確認した。一方、温熱刺激(42度)による殺細胞増強効果もAlexander細胞において最も高く、アクアポリン発現レベルに応じて温熱刺激による殺細胞増強効果に違いがあることを確認した。アクアポリン高発現株であるAlexander細胞を用い、温熱刺激によるアクアポリン1, 5蛋白の発現変化を解析したところ、アクアポリン1に変化を認めなかったが、細胞膜および細胞質のアクアポリン5発現が減弱することを確認した。高分解能型自動細胞解析装置を用いた細胞容積変化の解析では、温熱刺激によりAlexander細胞の細胞容積が減少したが、アクアポリン5 siRNAを用いてAlexander細胞のアクアポリン5発現を制御した際にも同様の細胞容積減少が確認された。Alexander細胞の細胞周期解析では温熱刺激によるG0/G1停止を認めたが、アクアポリン5のノックダウン実験でも同様にG0/G1停止が生じることを確認した。以上の結果から、アクアポリン5発現癌細胞株における、“温熱刺激によるアクアポリン5の下方制御を介した細胞増殖抑制"という新たな分子生物学的・生理解剖学的メカニズムを明らかにした。一方で、低浸透圧刺激による癌細胞破壊療法については、胃癌、大腸癌、肝癌細胞株において、クロライドチャネル、カリウムチャネル、水チャネル阻害薬併用による殺細胞増強効果を明らかにしており、これらの研究成果はすでに学会発表するとともに英文雑誌に投稿している。肝癌細胞株を用いた実験ではあるものの、当初の研究計画のとおり、肝癌細胞株におけるアクアポリン発現レベルの解析、温熱刺激によるアクアポリン蛋白の発現、局在、容積変化・殺細胞効果の反応性の解析(温熱刺激によるアクアポリン活性制御のメカニズム解析)の検討は終了している。研究計画時には、温熱刺激によりアクアポリン活性が上昇し、低浸透圧刺激時の細胞内への水の流入が増加することで癌細胞破壊が増強するとの実験仮説を立てていたが、実際には温熱刺激によりアクアポリン5発現は下方制御され、細胞容積は縮小することが明らかになった。しかしながら、温熱刺激による癌細胞株の細胞増殖抑制にはアクアポリン5蛋白の下方制御が深く関与しているという新たなメカニズムを明らかにした。すでに、次年度に計画していたアクアポリン発現制御系を用いた研究も進行中であり、研究計画は順調に進展していると考えている。平成27年度、アクアポリン5(AQP5)高発現肝癌細胞株(Alexander細胞)に温熱刺激を加えると、細胞膜および細胞質のAQP5発現が減弱し、細胞容積の減少およびG0/G1停止による細胞増殖抑制が生じることを確認した。一方で、AQP5 siRNAによりAQP5発現を下方制御した際にも、同様の細胞容積減少やG0/G1停止を認めたことから、AQP5発現癌細胞株における、“温熱刺激によるAQP5下方制御を介した細胞容積および細胞周期制御機構"を明らかにした。平成28年度には、Alexander細胞において、温熱刺激あるいは特異的siRNAでのAQP5下方制御により、細胞遊走・浸潤能が低下しアポトーシスが増強することを確認したことから、“温熱刺激によるAQP5下方制御を介した細胞遊走・浸潤能およびアポトーシス制御機構"を明らかにした。さらに、温熱刺激によるAQP5発現減弱のメカニズムを解明するため、cycloheximide(CHX)投与下に温熱刺激を加えるとともに、proteasome inhibitor、autophagy inhibitorを用いてchase assayを行った。その結果、温熱刺激によるAQP5発現低下はAQP5分解促進により生じており、AQP5分解促進にはautophagyの活性化が関与していることを明らかにした(Int J Oncol. 2017)。低浸透圧刺激による癌細胞破壊療法については、ヒト肝癌細胞株において、クロライドチャネル、カリウムチャネル、水チャネル阻害薬併用による殺細胞増強効果を明らかにした(J Cancer. 2016)。胃癌についても、カリウムチャネル阻害薬併用による低浸透圧殺細胞増強効果をin vitro、in vivo両実験系で明らかにしており、これらの研究結果は英文雑誌に投稿している。

AQP5-siRNAによりAQP5発現を下方制御した際にも同様の結果が得られ、AQP5高発現癌細胞株における“温熱刺激によるAQP5発現下方制御を介した細胞周期、細胞遊走・浸潤能・アポトーシス制御機構"を明らかにした。我々はこれまでに、ヒト食道癌細胞株におけるアクアポリン5蛋白の発現、アクアポリン5蛋白の発現制御系を用いた細胞周期およびアポトーシス制御機構の解明のほか、ヒト食道癌組織におけるアクアポリン5蛋白発現とその臨床病理学的意義を明らかにしている(J Gastroenterol. 2014)。今後は、肝癌あるいは胃癌をはじめ種々の癌におけるアクアポリン5発現の臨床病理学的意義、温熱刺激によるアクアポリン5制御の詳細なメカニズム、温熱刺激によるアクアポリン5発現の下方制御を介した抗腫瘍効果について、癌細胞株、癌切除検体、マウス癌転移モデルを用いて明らかにしていく予定である。消化器外科学
コンディショナルターゲティング法を用いた脳機能解析モデルマウスの作成

本研究の目的は、Cre/loxP組換え系を用いたコンディショナルターゲティング法により脳機能解明をおこなうためのマウスを開発することである。このために、脳の各種細胞特異的にCreあるいは薬剤誘導型のCrePRを発現するマウスを樹立する。本年度は、アストログリアのマーカー遺伝子のGFAP、オリゴデンドログリアのマーカー遺伝子のNG2、発生過程の幼若神経細胞のマーカー遺伝子のβIII Tubulin、及び神経幹細胞マーカー遺伝子のNestinそれぞれに、Cre遺伝子をノックインしたマウスを作成した。また、時期特異的な神経細胞での遺伝子破壊を目指して、神経細胞マーカー遺伝子として認知されているNeuron Specific enolase(NSE)遺伝子に着目し、ステロイドホルモンで活性誘導が可能なCrePRをノックインしたマウスの作成を進めた。それぞれの遺伝子にCre遺伝子あるいはCrePR遺伝子をノックインしたベクターを作成し、我々が樹立したC57BL/6由来ES細胞株RENKAに導入した。標的組換えをおこした細胞からキメラマウスを作出し、生殖系列遺伝する5種類のマウス系統を樹立することに成功した。これらのCre発現マウスのうちβIII tubulin-Cre(Tb3Cre)とlacZを発現するレポーターマウスとを交配させ、両者の遺伝子を持つマウスを選択し、発達時期を追って細胞特異的なCre活性の存在とその組換え効率を検索した。その結果、生後4週のマウスではほぼ全ての神経細胞がβガラクトシダーゼ陽性を示したが、白質には陽性細胞像はほとんど認められなかった。一方、生後5日では、βガラクトシダーゼ陽性を示す細胞は、神経細胞あるいは神経前駆細胞と思われるものであったが、いずれも成体ほど多くなかった。また、Nestin-Cre(NesCre)マウスの組換え能力を検索した結果、このマウスでは神経細胞特異的な組換えが認められたが、全ての神経細胞ではなかった。この両者はいずれも神経細胞特異的な組換えマウスとして利用可能である。
エンゲル構造とその特性葉層の位相幾何学的研究

本研究では4次元多様体上の積分不可能な2次元平面場であるエンゲル構造の大域的挙動の解明を目指した.特にエンゲル構造に付随する1次元の特性葉層に着目し,その微分位相幾何学的考察を重点的に行った.まず,「特性葉層としてどのくらい多様な1次元葉層が実現できるか」について考察した.成果としてGershkovichの提起した問題「4次元ユークリッド空間上にコンパクトな特性葉を許容するエンゲル構造は存在するか?」を具体的な例を構成することにより肯定的に解決した.この結果はAustralia数学会誌に掲載された.また,研究代表者との研究との討議を通して,海外共同研究者P.Walczakはアノソフ流を用いた例を構成したが、この例が接触構造の延長として得られる従来より知られている如何なるものとも決してイソトピックにならないことを本研究代表者が指摘した.次に,「エンゲル構造の特性葉層とならない1次元葉層を挙げよ」という問題に取り組んだ.必要条件として横断的平行化可能であることと接射影構造及び横断的接触構造を許容することが知られているが,それに加えて,エンゲル構造の特性葉層のコンパクト葉が高々有限なホロノミー群を持つならば,その葉は決してアフィンでないことを観察した.この事実を用いて,平行化可能な4次元多様体上の接向き付け可能かつ横断的平行化可能な1次元葉層であって,どんなエンゲル構造の特性葉層とも位相共役にならないものを作ることができた.3番目の課題として,エンゲル構造の積分曲線の剛牲に関するBryant-Hsuの結果の拡張の可能性を探究し,エンゲル構造を高次元化した構造への拡張の目処がついた.京都で国際会議を開催し,剛性に関する研究発表を行った.また,海外共同研究者P.Walczakを招聘し,研究連絡を行った.本研究では4次元多様体上の積分不可能な2次元平面場であるエンゲル構造の大域的挙動の解明を目指した.特にエンゲル構造に付随する1次元の特性葉層に着目し,その微分位相幾何学的考察を重点的に行った.まず,「特性葉層としてどのくらい多様な1次元葉層が実現できるか」について考察した.成果としてGershkovichの提起した問題「4次元ユークリッド空間上にコンパクトな特性葉を許容するエンゲル構造は存在するか?」を具体的な例を構成することにより肯定的に解決した.この結果はAustralia数学会誌に掲載された.また,研究代表者との研究との討議を通して,海外共同研究者P.Walczakはアノソフ流を用いた例を構成したが、この例が接触構造の延長として得られる従来より知られている如何なるものとも決してイソトピックにならないことを本研究代表者が指摘した.次に,「エンゲル構造の特性葉層とならない1次元葉層を挙げよ」という問題に取り組んだ.必要条件として横断的平行化可能であることと接射影構造及び横断的接触構造を許容することが知られているが,それに加えて,エンゲル構造の特性葉層のコンパクト葉が高々有限なホロノミー群を持つならば,その葉は決してアフィンでないことを観察した.この事実を用いて,平行化可能な4次元多様体上の接向き付け可能かつ横断的平行化可能な1次元葉層であって,どんなエンゲル構造の特性葉層とも位相共役にならないものを作ることができた.3番目の課題として,エンゲル構造の積分曲線の剛牲に関するBryant-Hsuの結果の拡張の可能性を探究し,エンゲル構造を高次元化した構造への拡張の目処がついた.京都で国際会議を開催し,剛性に関する研究発表を行った.また,海外共同研究者P.Walczakを招聘し,研究連絡を行った.本研究の目的は,4次元多様体上の積分不可能な2次元平面場であるエンゲル構造の大域的挙動の解明である.特に,エンゲル構造に付随する1次元の特性葉層に着目し,その微分位相幾何学的考察を重点的に行う.2年間にわたる本研究の前半である本年度は,まず,「特性葉層としてどのくらい多様な1次元葉層が実現できるか」について,特性葉層の許容する幾何構造との関連にも留意しつつ研究を進めた.第1の成果として,ゲルシュコビッチの提起した問題「4次元ユークリッド空間上にコンパクトな特性葉を許容するエンゲル構造は存在するか?」を具体的な例を構成することにより肯定的に解決した.そして例の構成法をより一般の場合に適用することにより「与えられた4次元開多様体がエンゲル構造を許容するならばその構造を改変して,コンパクト特性葉を持つようにできる」ことも示した.この結果は論文の形にまとめ,現在投稿中である.第2の成果として,「エンゲル葉層の特性葉層とならない1次元葉層を挙げよ」という問題に取り組んだ.特性葉層が横断的接触構造を許容していることから、特性葉層となるためにはそのホロノミー(第一帰還写像)が常にある種の条件を満たしていなければならないことがわかった.従って特性葉層とならない1次元葉層は量産される.また,特性葉層が接射影構造を許容していることを用いて,悪集合を持つ1次元葉層で特性葉層とならないものを提示した.これらについてはまだ発展の余地があり更に研究を継続中である.第3の成果として,エンゲル構造の特性葉層は摂動に関する剛的曲線であるというブライアント・スーの結果が,エンゲル構造を高次元化したある種の構造に拡張可能であることがわかってきた.

これについても次年度で完成に導きたいと考えている.二年間にわたる本研究の後半である本年度は,昨年度に行った考察を更に押し進めた.我々の研究対象は4次元多様体上の積分不可能な2次元平面場であるエンゲル構造である.我々はその大域的挙動の解明を目指した.特にエンゲル構造に付随する1次元の特性葉層に着目し,その微分位相幾何学的考察を重点的に行った.コンパクト4次元多様体上のエンゲル構造は3次元多様体上の接触構造の延長(prolongation)やその有限被覆として得られるものの他には具体例が極めて少ないため,新しい例を作ることも重要な課題のひとつである.本年度はまず,研究代表者との研究討議を通して,海外共同研究者P.Walczakがアノソフ流を用いた例を構成した.この例においては特性葉層が接アフィン構造をもつため,接触構造の延長として得られる従来より知られている如何なるものとも決してイソトピックにならないことを本研究代表者が指摘した.将来的に研究対象とすべき興味ある例を得たことになる.また,これに関連して,エンゲル構造の特性葉層のコンパクト葉が高々有限なホロノミー群を持つならば,その葉は決してアフィンでないことを観察した.この事実を用いることにより,平行化可能な4次元多様体上の接向き付け可能かつ横断的平行化可能な1次元葉層であって,どんなエンゲル構造の特性葉層とも位相共役にならないものを作ることができた.これは全ての葉がコンパクトであり,悪集合が空でない葉層である.ただし,この例は開多様体上の例である.更に,剛性に関しては,エンゲル構造の孤立コンパクト特性葉は剛的かという問題を設定し,考察を進めつつあるが,まだ解決には至っていない.本年度は京都で国際会議を開催し,剛性に関する研究発表を行った.また,海外共同研究者P.Walczakを招聘し,研究連絡を行った.前年度の研究成果については論文として今年度出版された.
抗血栓性因子の機能低下による血栓症発症の解明とその成果に基づく予防戦略の確立

静脈血栓塞栓症の遺伝的背景に関する研究では、患者の遺伝子解析を行い、日本人では、プロテインS遺伝子変異が多いことを明らかにした。血栓性血小板減少性紫斑病の原因となるADAMTS13の研究では、日本人では約114万人に1人の割合で先天性ADAMTS13欠損症が存在すると見積もった。マウスモデルを用いてADAMTS13のC末端領域の重要性を明らかにした。ADAMTS13のDTCSドメインの結晶構造を決定した。血栓症は、凝固制御因子や血小板凝集抑制因子の機能低下がリスクとなる。私達は、血管内皮細胞が示すプロテインC抗凝固機構を構成する凝固制御因子プロテインSのK196E変異が、静脈血栓症の遺伝的リスクであることを報告した。一方、血小板凝集抑制因子の機能低下がリスクとなる血栓症として、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)がある。本疾患は、ADAMTS13の活性著減による超巨大フォンビルブランド因子(VWF)マルチマーの蓄積が原因となる。本研究では、血栓症発症におけるプロテインS K196E変異、およびTTPとその類縁疾患におけるADAMTS13に関して、基盤的研究および臨床研究を進め、日本人の血栓症発症のリスクを評価し、その成果に基づいて予防戦略を確立することを目的とする。本研究で、私たちはプロテインS K196E変異を有するノックインマウスおよびプロテインS遺伝子ノックアウトマウスを作製した。また、妊娠出産時に静脈血栓症を発症した患者を対象に、プロテインS,プロテインC,アンチトロンビンの活性と遺伝子を解析し、プロテインS遺伝子変異が多いこと、K196E変異が素因となる例があることを明らかにした。血栓症は凝固制御因子や血小板凝集抑制因子の機能低下がリスクとなる。私達は日本人55人に1人が保有する凝固制御因子プロテインSのK196E変異が、静脈血栓症の遺伝的リスクであることを報告した。一方、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)はADAMTS13活性の著減による超巨大フォンビルランド因子(VWF)マルチマーの蓄積が原因となる。本研究は、私達がこれまで行ってきたこれら2つの抗血栓因子の解析を進め日本人の血栓症発症のメカニズムを解明し、それらを血栓症の予防・予知に資する。プロテインSに関する研究:プロテインS K196E変異は日本人の静脈血栓症のリスク(オッズ比、4.8)であることを報告した。今回、周産期での静脈血栓症患者18名を収集し、遺伝的背景を調べたところ、4名にプロテインS遺伝子の変異、1名にプロテインC遺伝子の変異を同定し、4名のプロテインS遺伝子変異のうち2名はK196E変異であった。このことから、周産期での静脈血栓症の発症にプロテインS K196E変異がかかわっていることが明らかとなった。ADAMTS13に関する研究:私達はADAMTS13遺伝子欠損マウスを作製し、血小板血栓がおこり易い状態であることを明らかにした。今年度は、C末端389アミノ酸を欠くマウスを作製し、その抗血栓能を調べた。その結果、このマウスは遺伝子欠損マウスよりずり応力下の血小板血栓能は抑制されていたが、野生型マウスより血栓能は亢進していることが明らかとなった。また、私達は以前ヒトADAMTS13遺伝子に日本人の10人に1人がヘテロ接合体であるP475S変異を同定していた。今回、本変異体を発現させ酵素活性を測定したところ、1.5M尿素存在下のVWF切断活性は約10%まで低下するものの、尿素を使わない蛍光性合成基質での活性は約70%にしか低下しないことが明らかとなった。私達はプロテインSK196E変異が静脈血栓症のリスクであることを報告した(Kimura et al,Blood,107,1737-8,2006)。プロテインSは、プロテインC依存性とTFPI依存性の2つの抗凝固作用を示す。このうち、TFPI依存性の活性を調べるため、Nidgenl遺伝子のシグナル配列とTEVプロテアーゼで切断可能なHisタグ配列をもつ野生型およびプロテインSK196E変異型発現プラスミドを作成し、CHO-Lec細胞を用いてプロテインSを発現させる系を構築した。ADAMTS13はVWFのTyr1605-Met1606結合を特異的に分解することにより、血管内皮細胞で生合成されたばかりの超巨大VWFマルチマーを、正常な止血反応を行う適当な大きさのマルチマーへと切断する。ADAMTS13がVWFを切断する際、局所に濃縮されて反応が進行すると考えられるが、そのメカニズムは全く明らかではない。私達は、ADAMTS13とLysプラスミノーゲンが特異的に結合することを見いだした。この結合が細胞上のプラスミノーゲン受容体を介して両者の局在にかかわる可能性がある。

そこで、この結合に必要な領域を明らかにするため、プラスミノーゲンをエラスターゼ処理し、C末端約350残基のミニプラスミノーゲンを調製し結合を確認した。また、分子間相互作用解析装置BIACOREを用いて結合を詳細に検討し、結合定数を求めた。1.血栓性素因としてのプロテインS K196E変異の研究私達はプロテインS K196E変異が静脈血栓塞栓症のリスクとして同定した。今年度は、国立循環器病研究センターなどの施設で集めた周産期での静脈血栓症患者18名の遺伝子解析を行った。その結果、4名にプロテインS遺伝子変異、1名にプロテインC遺伝子変異を見出した。アンチトロンビンに遺伝子変異をもつ患者はいなかった。このうち2名はプロテインS K196E変異の保有者であった。遺伝子変異を保有する5名は全員妊娠初期に静脈血栓症を発症していた。以上の結果から、日本人の静脈血栓症を発症した妊婦にはプロテインS遺伝子変異が多く見られ、変異保有妊婦の静脈血栓症は妊娠初期に見られることが判明した。この結果はより大規模な研究で確認する必要がある。2.血小板凝集抑制因子ADAMTS13の研究ADAMTS13はマルチドメインプロテアーゼである。私達は以前(ディスインテグリン様ドメイン)-(TSP1様リピート)-(Cysリッチドメイン)-(スペーサードメイン)の立体構造を結晶構造解析により決定し、基質であるフォンビルブランド因子が結合する様式を明らかにした。今回、(メタロプロテアーゼドメイン)-(ディスインテグリン様ドメイン)の立体構造を明らかにするため、動物細胞を用いた発現系を構築した。3.脳虚血耐性モデルを用いた評価両側の頸動脈と一側の中大脳動脈等の頭蓋内血管の計3血管を同時に閉塞させる一過性脳虚血モデルを用いて、脳で高発現するストレス蛋白質Ndrg4遺伝子のノックアウトマウスの虚血耐性能を評価し、ノックアウトマウスは脳虚血に脆弱であることを明らかにした。血栓症は、凝固制御因子や血小板凝集能抑制因子の機能低下がリスクとなる。私達は、凝固制御因子プロテインSのK196E変異が、静脈血栓症の遺伝的リスクであることを報告した。一方、血栓性血小板減少性紫斑病は、ADAMTS13の活性著減による超巨大フォンビルブランド因子マルチマーの蓄積が原因である。本研究は、私達がこれまで行ってきた2つの抗血栓性因子の解析を進め、日本人の血栓症発症のメカニズムを解明し、それらを血栓症の予防・予知に資することにある。1.血栓性素因としてのプロテインS K196E変異の研究本年度は、プロテインS K196E変異マウスおよびプロテインS遺伝子欠損マウスの抗凝固能を、両側の頸動脈と一側の中大動脈等の頭蓋内血管の三血管を閉塞させる三血管閉塞法による脳虚血再灌流モデルを用いて調べた。本法の特色は、糸を用いて脳血管を閉塞させる手法ではないので、血管に傷がつかず、虚血再灌流の影響だけを評価できる。両遺伝子改変マウスは、野生型マウスと較べて、いずれも脳梗塞巣の拡大は観察されなかった。また、動物細胞を用いて組み換えヒトプロテインSの性ホルモン結合グロブリン様(SHBG)領域の発現系を確立した。2.血小板凝集抑制因子ADAMTS13の研究ADAMTS13はフォンビルブランド因子のY1605-M1606結合を特異的に分解することにより、超高分子量VWFマルチマーを低分子化する。これによりVVWFは通常の止血能を獲得する。
新しい手法による癌の浸潤・転移規定遺伝子の同定-マイクロディセクションとDNAマイクロアレイの併用-

【目的】レーザー顕微鏡下マイクロダイセクション(LCM)法とDNAマイクロアレイにてで病理組織切片から癌細胞のみを解析した。【方法と結果】胃癌3例大腸癌3例の癌部、非癌部、および転移巣より総計18検体採取した。各検体20枚ずつ(合計360枚)の凍結切片を作成し、LM200(OLYMPUS)を用いて目的の細胞のみを一検体につき百から1万個採取した。mRNAはT7poluymeraseにて増幅した。(3)原発巣-転移巣間の発現プロファイルと生検標本との比較:生検標本においても同様の発現パターンの所見が見られた。【結論】LCMおよびDNAマイクロアレイを用いたことから、in vivo環境下で細胞の混入無く癌化あるいは転移において重要な遺伝子群を精確に同定し得た。また、その結果得られた発現プロファイルは生検標本から得られたそれと相関関係にあり、LCMおよびDNAマイクロアレイを用いた生検標本の評価は癌の悪性度あるいは転移の予測をする上で極めて臨床的に有用であることが示された。
実験・理論の融合による溶液中における分子集合体の高次構造解析手法の確立

本研究課題は、超分子をはじめとする分子集合体が溶液中で形成する構造を、実験的手法である小角X線散乱(SAXS)等と、理論的な手法である計算化学的手法(分子動力学法、分子軌道法)等を融合することにより予測する方法の確立を目指している。特に、比較的ソフトな構造であると言われているミセルやリポソームは、主に球状の高次構造をとっており、定まった構造はとっていないと言われていた。しかし、我々の研究成果において、嵩高い置換基を有する界面活性剤がミセル構造をとる場合、それらの会合数が低い条件においては、プラトンの正多面体数と同じ会合数でのみ安定なミセル構造を示すことが示唆された。これらのミセルは「プラトニックミセル」と名付けられ、今まさに構造解析が進められているところである。平成30年度は、まず前年度に確立した手法を用いてカリックス[4]アレーンの静的構造(初期構造)を作成し、そのモデルを三次元的に複数個配置することでプラトニックミセルモデルを作成し、分子動力学シミュレーション(MD)によりこのミセルのダイナミクスの解析を試みた。MDシミュレーションでは、ある一定の計算ごとに構造の三次元座標を抜き出すことが可能である。そこで、得られる三次元座標から理論的なSAXSプロファイルを作成し、実験的手法にて測定した実際のSAXSプロファイルとの差を、類似度の1つであるJaccard係数を指標として比較を行った。その結果、プラトニックミセルは熱により揺らいでいるものの、ある周期で再度安定なプラトニックミセルの構造に戻ることが示唆された。つまり、一度プラトニックミセルを形成することができれば、その後は安定に存在すると言える。本研究課題では、分子集合体をはじめとする機能性分子の水溶液中における構造およびダイナミクスを、小角X線散乱(SAXS)等の実験的手法および計算化学的手法の融合によって解析する手法の確立を目指しており、平成30年度は、実験的手法であるSAXSと理論的手法である分子動力学(MD)シミュレーションによりミセルの動的挙動を解析することができた。当初の実験計画では、MDシミュレーションによる解析は平成31年度に行う予定であったが、前年度の静的分子モデルの作成手法の確立が順調に進行したため、若干前倒しにて進展している。平成30年度には、末端にカチオン性のアミノ基を有するカリックス[4]アレーンについて検討を行った。この分子は、様々な実験的手法により解析結果より、低pH条件では会合数が6でミセルを形成し、プラトニック性を示すが示唆されている。この現象を計算化学的手法を用いて検証した例は無く、学術的にも重要な意味を成すものと思われる。今後は、本研究にて確立した手法がカリックス[4]アレーン以外の分子についても適用できるかを検討する予定である。対象としては、自然界で多くの菌が生産しているバイオサーファクタントを考えている。また、より単純な界面活性剤についても検討を行いたい。一方で、MDシミュレーションの結果から理論的なSAXSプロファイルを求めるには、MD経過ごとに得られる三次元座標の抽出やCRYSOLによる処理等で膨大な時間がかかるのが現状である。これらの解析に有効なプログラム(アプリ)の開発を行う予定である。本研究課題では、分子集合体をはじめとする機能性分子の水溶液中における構造およびダイナミクスを、小角X線散乱(SAXS)等の実験的手法と、分子動力学法をはじめとする計算化学的手法の融合によって解析する手法の確立を目指している。脂質、タンパク質、核酸などの生体内で機能を発現する分子、およびミセルやリポソーム等のソフトな分子集合体の構造的理解は、それらの機能を十分に利用するために必要不可欠である。特に、多くの機能性分子は水溶液中でその機能を発現するため、水溶液中における立体構造や相互作用の理解は、科学者にとって非常に有意義な情報となる。平成29年度はSAXSの散乱データから静的分子モデルを構築する手法の確立を目的とした。研究対象として、既往の研究により小角X線散乱およびその他の実験的手法により会合数等が明らかとなっているカリックス[4]アレーンが形成するミセルを採用し、計算化学的手法である分子力学法および分子軌道法を駆使して単分子モデルを作成した後、SAXSの結果から予想されるミセルのサイズになるよう三次元的に配置することでミセル体の分子モデルを作成した。その後、CRYSOLにて分子座標より理論的にSAXSのプロファイルを求め、SAXSの実験結果とフィッティングを行い、適宜分子座標を修正することで、より現実系に近いサイズ、形状のミセル構造を得ることが可能となった。タンパク質をはじめとするマクロな分子の動的挙動の検討には、計算化学的手法の1つである分子動力学(MD)法が有効である。このMD法の結果は、計算開始時の初期構造に大きく依存することが知られていることから、今回の研究で確立した方法にてMDシミュレーションで利用する初期構造を作成することで、より信頼性の高いシミュレーション結果が得られることが期待できる。本研究課題では、分子集合体をはじめとする機能性分子の水溶液中における構造およびダイナミクスを、小角X線散乱(SAXS)等の実験的手法および計算化学的手法の融合によって解析する手法の確立を目指しており、平成29年度はSAXSの散乱データから静的分子モデルを構築する手法の確立を目的として研究を遂行した。これまでの研究により、化学修飾を施したカリックスアレーンが、pHの異なる溶液中において様々な会合数を示すことが明らかとなっている。そこで本年度は、単純な分子骨格を有するカリックス

[4]アレーンを研究対象とし、まずは分子力学法、分子軌道法を駆使してカリックスアレーン単分子モデルを作成した。その単分子モデルを、実験的手法にて明らかとなっている会合数の数だけ用意し、さらにSAXSにて予測されるミセルのサイズになるよう三次元的に配置した。その後、CRYSOLプログラムにて理論的に散乱カーブを算出し、適宜SAXSの結果とフィッティングを行うことで、より実験的手法にて得られた散乱カーブに近いミセル構造を作成する手法を確立した。一方で、SAXSの散乱プロファイルからある程度のミセルのサイズと形状を予測することができるDAMMINプログラムの検討も行ったが、今回の系のような比較的小さな分子集合体では、予測結果が仮想ビーズのサイズと数に依存したため、パラメータの決定が非常に難しいことが示唆された。しかし、本プログラムはタンパク質のような大きなサイズの分子の形状予測には力を発揮することから、分子集合体に関してはある程度のサイズのものであれば適用可能だと考えられる。本研究課題は、超分子をはじめとする分子集合体が溶液中で形成する構造を、実験的手法である小角X線散乱(SAXS)等と、理論的な手法である計算化学的手法(分子動力学法、分子軌道法)等を融合することにより予測する方法の確立を目指している。特に、比較的ソフトな構造であると言われているミセルやリポソームは、主に球状の高次構造をとっており、定まった構造はとっていないと言われていた。しかし、我々の研究成果において、嵩高い置換基を有する界面活性剤がミセル構造をとる場合、それらの会合数が低い条件においては、プラトンの正多面体数と同じ会合数でのみ安定なミセル構造を示すことが示唆された。これらのミセルは「プラトニックミセル」と名付けられ、今まさに構造解析が進められているところである。平成30年度は、まず前年度に確立した手法を用いてカリックス[4]アレーンの静的構造(初期構造)を作成し、そのモデルを三次元的に複数個配置することでプラトニックミセルモデルを作成し、分子動力学シミュレーション(MD)によりこのミセルのダイナミクスの解析を試みた。MDシミュレーションでは、ある一定の計算ごとに構造の三次元座標を抜き出すことが可能である。そこで、得られる三次元座標から理論的なSAXSプロファイルを作成し、実験的手法にて測定した実際のSAXSプロファイルとの差を、類似度の1つであるJaccard係数を指標として比較を行った。その結果、プラトニックミセルは熱により揺らいでいるものの、ある周期で再度安定なプラトニックミセルの構造に戻ることが示唆された。つまり、一度プラトニックミセルを形成することができれば、その後は安定に存在すると言える。本研究課題では、分子集合体をはじめとする機能性分子の水溶液中における構造およびダイナミクスを、小角X線散乱(SAXS)等の実験的手法および計算化学的手法の融合によって解析する手法の確立を目指しており、平成30年度は、実験的手法であるSAXSと理論的手法である分子動力学(MD)シミュレーションによりミセルの動的挙動を解析することができた。
知的障害者のための無痛的採血方法の研究

静脈穿刺時の疼痛軽減のため、リドカインイテープやイオントフォレーシスなどが応用されているが、皮膚内にどれだけのリドカインが通過するのかは明らかにされていない。そこでこのリドカインの経皮的透過量についてin vitorで検討した。方法としては60ml入りシャーレの底面に陰極を置き、このシャーレの上に除毛した豚皮を置き、シャーレ内を電解質液で満たした。陽極はシリコン枠(内容量5cm×3cm×0.25cm)の枠内埋め込み、枠内に綿花を置き、10%リドカイン3mlを満たし、豚皮表面に固定した。イオントフォレーシスは9V、3mA、10分間及び27V、10mA、10分間の直流通電を行った。その後、枠を除去し、経時的に84時間後までシャーレ内の電解質液を抽出し、リドカイン量を蛍光偏免疫去を用いて測定した。対照としては60%リドカインテープを豚皮表面に2時間貼付した後に、テープを除去し、以下同様に経時的にリドカインの濃度測定を行った。結果84時間後のシャ-レ内のリドカインの皮膚透過量は、27V、10mA、10分間では、3.9±0.3mg9V、3mA、10分間では1.9±0,3mgとなった。対照のリドカインテープは0,4±0,2mgの透過量となり、臨床て測いられる9V、3mA、10分間のイオントフォレーシスでもリドカインテープの5倍の透過量となった。
リンパ行性薬剤投与と超音波によるリンパ球への遺伝子導入とがん免疫療法への応用

多くのがんでは,リンパネットワークを介して腫瘍細胞が遠隔臓器に転移することが知られており,リンパ管の経路上に存在するリンパ節への転移は,転移の第一段階であると考えられている.したがって,リンパ節転移の効果的な抑制ががん治療成績を向上させると考えられる.しかし,従来のアプローチでは転移がん治療成績の飛躍的な向上は望めない状況にある.そこで,低侵襲,低費用で根治性の高いリンパ節転移治療法を開発することが喫緊の課題である.本研究は,ヒトのリンパ節と同等のリンパ節サイズを有するリンパ節腫脹マウスを用いて,リンパ行性薬剤投与とソノポレーション法を組み合わせた効果的なリンパ節転移治療法開発をおこなった.転移腫瘍細胞はリンパ節内の辺縁洞と呼ばれる場所に最初に到達・生着し遠隔転移の起点になることから,リンパ節内辺縁洞の転移腫瘍細胞の効果的な治療が極めて重要な意味を持つ.研究代表者はリンパ行性薬剤投与法と高周波超音波を駆使し,転移リンパ節内での微小気泡の動態解析により,リンパ行性薬剤投与法は,高濃度の薬剤を転移リンパ節内辺縁洞に高濃度に集積させることを明らかにした.このとき,外部から微小気泡破壊用の超音波を照射すると,超音波の強度依存的に抗腫瘍効果が増大すること,抗がん剤に限らず分子量の大きい分子も転移リンパ節内細胞へ導入可能なことを明らかにした.また,節内浸潤を有するリンパ節転移に対してリンパ行性投与とソノポレーションによる治療は,リンパ節構造を維持したまま効果的に治療が可能であることを明らかにした(論文投稿中).これに加えて,マウス肺がんモデルに,免疫チェックポイント阻害剤(抗体医薬)を投与すると腫瘍抗原特異的リンパ球の活性化により腫瘍縮退が誘導されることから,超音波と微小気泡によってリンパ球への遺伝子導入が可能になれば,新たな免疫療法へとつながる可能性があるとの知見を得た.がん死の原因はその9割以上が転移によるものである.リンパ管とその経路上に位置するリンパ節はがんの主な転移経路であり,効果的なリンパ節転移治療ががん治療成績の向上に直結する.従来の転移リンパ節治療法は,侵襲性,組織特異性,安全性,費用対効果の面で課題があった.本研究は,リンパ行性薬剤投与と超音波により,リンパ球へ遺伝子を導入し,転移リンパ節に対する新たな腫瘍免疫療法開発に展開することを目的とする.超音波をはじめとする物理的な外来分子導入方法の問題点は,導入効率の低さである.そこで超音波強度と薬剤の導入効率を最適化する必要がある.はじめに超音波照射域の音場特性の可視化をおこない,入力実効電圧に対する超音波強度を測定し,超音波照射域の音圧分布を求めた.超音波強度は,ニードル型ハイドロフォンを使用して計測し,実測値と理論値が一致することを確かめた.次に,蛍光分子(TOTO-3)とナノ・マイクロバブル(平均粒径:約200nm)の混合溶液をリンパ管へ注射し,下流のリンパ節へ送達した.送達した段階で,外部から超音波を照射した.超音波照射したリンパ節は摘出して凍結切片にし,蛍光免疫染色をおこなった.顕微鏡により蛍光画像を取得し,超音波強度の違いによるTOTO-3蛍光強度を定量化した.その結果,TOTO-3はリンパ管内皮近傍のリンパ球に導入されており,超音波強度依存的にTOTO-3蛍光強度が増大し,導入効率の増大が認められた.このとき,最も高い超音波強度でも組織侵襲は認められなかった.これは本手法が低侵襲でリンパ球へ遺伝子導入を実現できる可能性を示唆するものである.超音波強度による最適化だけではなく,遺伝子などの分子量が大きい物質に対する導入効率の最適化が必要になると考えられる.適切な腫瘍リンパ節転移モデル作製には,転移における免疫応答の正確な理解が必要になると考えられる.多くのがんでは,リンパネットワークを介して腫瘍細胞が遠隔臓器に転移することが知られており,リンパ管の経路上に存在するリンパ節への転移は,転移の第一段階であると考えられている.したがって,リンパ節転移の効果的な抑制ががん治療成績を向上させると考えられる.しかし,従来のアプローチでは転移がん治療成績の飛躍的な向上は望めない状況にある.そこで,低侵襲,低費用で根治性の高いリンパ節転移治療法を開発することが喫緊の課題である.本研究は,ヒトのリンパ節と同等のリンパ節サイズを有するリンパ節腫脹マウスを用いて,リンパ行性薬剤投与とソノポレーション法を組み合わせた効果的なリンパ節転移治療法開発をおこなった.転移腫瘍細胞はリンパ節内の辺縁洞と呼ばれる場所に最初に到達・生着し遠隔転移の起点になることから,リンパ節内辺縁洞の転移腫瘍細胞の効果的な治療が極めて重要な意味を持つ.研究代表者はリンパ行性薬剤投与法と高周波超音波を駆使し,転移リンパ節内での微小気泡の動態解析により,リンパ行性薬剤投与法は,高濃度の薬剤を転移リンパ節内辺縁洞に高濃度に集積させることを明らかにした.このとき,外部から微小気泡破壊用の超音波を照射すると,超音波の強度依存的に抗腫瘍効果が増大すること,抗がん剤に限らず分子量の大きい分子も転移リンパ節内細胞へ導入可能なことを明らかにした.また,節内浸潤を有するリンパ節転移に対してリンパ行性投与とソノポレーションによる治療は,リンパ節構造を維持したまま効果的に治療が可能であることを明らかにした(論文投稿中).

これに加えて,マウス肺がんモデルに,免疫チェックポイント阻害剤(抗体医薬)を投与すると腫瘍抗原特異的リンパ球の活性化により腫瘍縮退が誘導されることから,超音波と微小気泡によってリンパ球への遺伝子導入が可能になれば,新たな免疫療法へとつながる可能性があるとの知見を得た.遺伝子などの分子量の大きい分子の導入効率の最適化をおこなう.腫瘍と免疫応答の正確な理解により,リンパネットワークを介した適切な腫瘍転移誘導を実現する.購入予定の物品が在庫物品で代替可能であったため購入を見送った.次年度は,フローサイトメトリー抗体等の物品購入費に充てる予定である.
抑制性伝達物質のGABAからグリシンへの発達スイッチング

ラット聴覚中継路核である内側台形体核(NMTB)から外側上オリーブ核(LSO)に入力する抑制性回路において、NMTBを刺激してその入力様式を電気生理学的手法により検討した結果、生後0-3日目は主にGABA作動性入力であり、発達に従い次第にグリシン性成分増加し、生後14日以降はグリシン作動性に変化した。終末から放出される単一シナプス小胞によるイベントである微小シナプス電流(mIPSCs)について、発達各時期において解析を行なった結果、mIPSC自体が未熟期のGABA作動性から、GABA+グリシンのco-releaseを経て成熟期のグリシン作動性に変化することが判明した。免疫伝顕にて個々のグリシン陽性終末内のGABA含有量が発達に伴い次第に減少することが判明した。この結果はLSOに入力する抑制性伝達様式が単一シナプスレベルでGABAからグリシンへ発達スイッチすることを意味する。伝達物質の単一終末レベルでのスイッチという全く新しい神経回路の発達再編を提起できた。次に、GABAが同様のCl-チャネルを活性化するグリシンへ発達変化する生理学的意義を検討するために、代謝型GABA-B受容体の発現/機能の発達変化を検討した。未熟期LSO細胞にはGABA-B受容体が強く表現しており、LSOへの抑制性入力を低頻度刺激すると、シナプス後細胞GABA-B受容体を介するGABA入力の長期抑圧(LTD)が観察された。発達に伴い、LSO細胞のGABA-B受容体の染色性、抑制性LTD発生は消失した。成熟期LSOの本来の機能である音源定位という安定した機能回路を獲得するために、未熟期における回路再編に関連すると考えられるGABAによる可塑性が張ったつと共に消失し、sharpな抑制性シナプス電流を惹起するグリシンへ発達スイッチするのかも知れない。更に、神経終末におけるGABA-B受容体による抑制性伝達抑制も発達異伴い減少することが判明し、LSOにおける伝達の単純化が音源定位の機能獲得にひつようである可能性が示唆された。発達期における抑制生回路機能の変化のメカニズムを解明するため、ラット外側上オリーブ核に入力する抑制生入力様式の発達変化を調べた。出生直後は台形体核からの入力はGABA作動生であるのに対し、発達に従い、次第にグリシン作動性成分が増加し、生後3週目にはその始どがグリシン作動性成分となった。そのメカニズムをしらべるため、神経付着急性単離標本を用いて、微小シナプス電流(mIPSC)を調べたところ、発達し従い、GABA作動性のmIPSCの割含の減少、グリシン作動性のmIPSCの増力とともに、GABAとグリシン作動性成分の混在しているmixed mIPSCが移行期には著明になることが判明した。mixed mIPSCのみを抽出すると、その中においてもグリシン作動性の増加とGABA作動性の増加が観察され、single synapseレベルにおける変化であることが示唆された。さらに免疫染色法を用いると,発達期の外側上オリーブ核においてGADの染色性の減少とグリシン染色性の増加が観察された。また、しばしば移行期には、GADとグリシンの染色が混在した神経終末観察された。Gold particle法を用いた免疫電顕による観察では、グリシン終末内のGABA particleの数が移行期から3週目かけて、激減することが判明した。これらの結果から、台形体核から外側上オリーブ核に入力する抑制性伝達伝達物質は未熟期にGABAから成熟期のグリシンへ単一神経終末内でスイッチすることが判明した。