hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
SH_3ドメインをもつアダプター蛋白質の活性化と高次構造変化のメカニズム

本研究では、食細胞NADPHオキシダーゼ活性化に必須のSH3ドメイン含有蛋白質(p47^<phox>とp67^<phox>)の作用機構について検討し、平成10年度は特に以下の点を明らかにした。(1)p47^<phox>のSH3ドメインはC末端領域との分子内相互作用によりmaskされている。アラキドン酸あるいはC末端領域の3つのセリン残基のリン酸化は、分子内相互作用を切り、unmaskされたSH3ドメインを介してオキシダーゼ活性化のON/OFFを担う分子間相互作用(標的分子:オキシダーゼ酵素本体であるシトクロームb_<558>)を引き起すことを見い出した。(2)もう1つのスイッチは、p67^<phox>とGTP結合型Racの相互作用であり、この結合はp67^<phox>N末のTPRドメインを介して行われることを示した。(3)Racの活性化(GTP結合型への変換)を検出する新しい方法を開発し、この方法を用いてヒト好中球刺激時のRacの活性化はPl3キナーゼを介することを示した。(4)p47^<phox>のN末に新奇なドメイン(PB2ドメイン)を見い出し、このドメインがオキシダーゼ活性化の増強に働くことを明らかにした。(5)p40^<phox>(オキシダーゼ調節因子)は常にp67^<phox>と会合しているが、この結合は新奇なドメイン間(p40^<phox>のPCモチーフとp67^<phox>のPB1ドメイン)の全く新しいタイプの蛋白質間相互作用によることを見い出した。(6)更に共同研究によって、上記の新奇ドメイン(PB1及びPB2ドメイン)の3次構造を解明した。
一次視覚野への遺伝子導入による脳刺激型人工視覚

本研究では、1.皮質への遺伝子導入法、2.導入効率の高いアデノ随伴ウイルスベクターの血清型の決定、3.導入後の光反応性について調べた。AAV2型に比べAAV5型で導入効率が高いことが明らかとなったが、広範囲に遺伝子導入するためには更なる工夫が必要であると考えられた。また、プロモーターの種類により、光反応性が異なり、脳光刺激型人工視覚を成功させるためには、最適なプロモーターを検索する必要があると思われた。緑藻類クラミドモナスより単離されたチャネルロドプシン-2(ChR2)は、発色団としてレチナールを有し、540nm以下(青色)の光に反応し、細胞内に陽イオンを透過させる光受容陽イオン選択的チャネルとして機能することが知られている。「光受容+陽イオンチャネル」という特性から、神経細胞に発現させた場合、単一の分子の働きで光情報を電気信号に変換することが可能である。これを利用することによって、一次視覚野にChR2遺伝子を導入し、視覚野を直接、映像で刺激するという全く新しい脳刺激型人工視覚装置を作ることができると考えられる。これを達成するために、視覚野への遺伝子導入法について検討した。導入法検討では、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの皮質への親和性についてAAV2/2およびAAV2/5の2つの血清型について調べた。また、感染方法は注入と散布の2種類を試みた。皮質に対する親和性はAAV2/5で高く、注入法で感染が確認できた。また、CAGではなく、CaMKIIプロモーターを用いた場合にわずかに瞳孔反射が確認された。しかし、その発現効率はCAGプロモーターを用いた場合の方が高く、導入効率とその反応は必ずしも一致しなかった。以上の結果から、視覚野に遺伝子導入を行い、視覚野に直接映像を提示する人工視覚を開発できる可能性が示された。しかしその一方で、正常な視覚機能を作り出すためには、細胞種特異的に遺伝子導入することが重要である可能性が示され、今後は細胞種特異的なプロモーターを持つウイルスベクターを開発することが重要であると考えられる。これを達成するには、視覚野への遺伝子導入法を確立すること、次には、視覚野の特定の神経細胞に遺伝子を導入することが必要である。本年度は、上記2点について、遺伝盲ラットを用いて検討した。脳に遺伝子を導入する方法として、マイクロシリンジを用いて一定の圧力で時間をかけて注入する方法がある。今回、アデノ随伴ウイルスベクター2型、および5型を用いて、注入による遺伝子導入法を検討したところ、両ウイルスで遺伝子の導入が確認された。導入効率は5型の方が高いことが確認された。一方、皮質の広い範囲に導入するために、厚膜を剥がし、ウイルス液を散布した。しかし、この方法では皮質に遺伝子を導入することができなかった。皮質の広い範囲に導入する方法を今後検討する必要がある。ウイルス液を注入した場合、遺伝子発現は細胞の種類に関係なく、導入されているようであった。このため、特定の細胞に遺伝子導入をするために、新たにカルモジュリンキナーゼIIα(CaMKIIα)プロモーターを含むウイルスベクターを作製した。次年度、これを用いて遺伝子導入を行い、光反応性を調べる予定である。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて脳への遺伝子導入を行い、遺伝子の発現を確認した。血清型の異なるアデノ随伴ウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行い、導入効率の良い血清型を知ることができた。一方、広範囲に遺伝子を導入する方法については、確立に至っていないものの、通常の方法(ウイルスベクターを散布)では遺伝子を導入できない原因を特定しつつあり、次年度では遺伝子の導入に成功できると考えている。注入により遺伝子を導入できたが、当然のことながら、CAGプロモーターを用いた場合、細胞選択的に導入できなかった。本年度、CaMKIIαプロモーターを有するアデノ随伴ウイルスベクターを作製することができ、次年度にはCaMKIIαプロモーターを持つウイルスを用いた遺伝子導入を実施できる可能性がある。明暗弁別能の行動学的解析東日本大震災の影響により、一部機器が使用できなくなり、23年度予定した研究を、24年度に実施することとし、機器を使用しないで行うことができる24年度実施課題を繰り上げて行った。そのため、当初予定した予算の使用用途と異なったため、予算の繰越が生じた。

今後の研究推進計画は、遺伝子導入後、アクリルガラスで視覚野表面を多い、外界の光が透過するようにする。網膜への遺伝子導入実験では、遺伝子発現が充分に得られるまでに、約2ヶ月を要することが明らかになっているため、遺伝子導入2ヵ月後に、明暗ボックスを用いて、視覚野の光受容能を調べる。提示する光を青色、黄色、暗状態とし、明所、暗所にいる割合を算出することにより、光反応性を調べる。網膜神経節細胞には、メラノプシンを産生する細胞が存在し、視細胞が変性し失明に至っても明暗反応が存在する。そこで、完全に網膜からの入力を遮断することを目的とし、明暗ボックスを用いた光反応性を調べた後、視神経を切断し、再度明暗ボックスを用いて光反応性を調べる。研究費の使用計画使用動物には、遺伝的に失明を来たす遺伝盲ラットを用いる。遺伝盲ラットは唯一、日本クレア(株)が販売し、使用頻度も少ないために、比較的高価である。また、RCSラットは生後3ヶ月でほぼ視細胞は消失にするが、光反応性は6ヶ月まで残っているとも報告されていることから、長期的に飼育し、遺伝子導入を行う必要がある。このため、動物飼育費、動物代金が大半を占める。一方、光を照射する装置も試行錯誤を繰り返して自作する必要があるため、こういったLEDを含む工学部品も必要である。
英米の官民連携による公園緑地マネジメントの運用手法と財源についての調査研究

当該年度は、英国と米国ですすめられている官民連携による公園緑地マネジメントの運用手法と財源を調査した。まず英国については、ロンドン中心部にて公園緑地マネジメントを展開している複数のトラスト組織の取組みについて重点的に調査した。トラスト組織は、活発な都市開発による開発還元を基金化することによって主たる財源を確保し活動を展開している。しかしながら金利の影響等の経済状況をうけやすく、その持続可能な管理運営の展開が課題となりつつあることが明らかとなった。次に米国については、BIDによる公園緑地マネジメントのブライアントパークでの成功事例から発展した、BIDとNPOの協働によるマネジメントや、地方都市における展開に着目し調査した。公園緑地の部分はNPOが管理運営し、その周辺をとりまくエリアをBIDとして環境整備する役割分担をおこないながら、公園緑地を中心としたエリアのまちづくりを一体的に行っている取り組みがいくつかある。具体的にユニオンスクエアーの取組みを調査したところ、NPOとBIDの構成メンバーが重複しており関係性が構築されていることがわかった。またエリアはビジネスのみならず大学や住宅が混在していることも、NPOとBIDの協働体制がより有効に機能する要因と考えられる。地方都市における展開としてフィラデルフィアとワシントンDCにおけるBIDによる公園緑地マネジメントについて調査した。地方都市の中心市街地活性化は米国における課題でもあり、その対応として広場や都市公園の再整備とその後の管理運営をBIDを中心にとりくんでいる。BIDという同様の手法ではあるが、その展開の仕方は異なることがわかった。現在までの進捗状況はおおむね順調といえる。英国における公園緑地マネジメントの運用手法と財源についての現地調査を終了し、手法ごとの課題と展望をつかむことができた。具体的には、BID(ビジネス・インプルーブメント・ディストリクト)やパークチャージ、そして基金をもとにしたトラスト組織による財源確保の違いについては、特別税であるBIDやパークチャージは比較的安定した財源となるが、その導入の過程については関係者の合意形成が重要であり導入に至らないこともある。他方、トラスト組織はその基金の運用が重要であり持続可能な管理運営体制の構築にむけた工夫が必要であることがわかった。当該年度の米国での調査をうけ、大都市中心部ではBIDによる公園緑地の管理運営のみならず地域の特性によってはNPOとBIDの協働による取組みが行われていることがわかり、大都市中心部における多様なBIDの導入のあり方について、今後引き続き調査する予定である。また地方都市の取組みについては、フィラデルフィアは複数の都市公園の連続性を確保するために再整備が連携して行われ、中心市街地の活性化が持続する工夫がされていた。ワシントンDCについては、都市公園の多くを国立公園事務所が所有しており、その管理体制の複雑さが再整備までに時間を要している状況が明らかとなった。しかしながら、国立公園としても都市の中心に位置する公園を再整備すること、また公民連携の重要性は認識していることがわかった。地方都市におけるBIDの取組みが加速度的に進んでいること、また都市によって取り組みが異なることがわかり引き続き調査を行う予定である。当該年度は、現在英国ですすめられている官民連携による公園緑地マネジメントの運用手法と財源を調査するために、主に次の3点について調査した。まず、英国にて10年程度前に導入されたBID(ビジネス・インプルーブメント・ディストリクト)による公共空間の管理運営については、ロンドン中心部で活動を展開しているハート・オブ・ロンドンと、地方都市の事例としてニューカッスル市のニューカッスルNE1について明らかにした。ロンドン市中心部のBIDエリアは観光客も多く、夜の観光地としても有名であるため、安心安全の観点から、特に公共空間は警備や清掃といった管理について力をいれていた。他方、地方都市においては、中心部の活性化にむけたプレス・メイキングによる環境整備に力をいれていた。各エリアの直面する課題に対して、BIDの活動は集中的に対応策を講じる有効な手法であるといえる。次にパークチャージについては、ロンドン・オリンピック・パラリンピックの開催地ともなったクイーン・エリザベス公園について明らかにした。オリパラ開催後に住宅開発のすすむ公園周辺においては、地元自治体の財政的な負担をさけるため、公園の管理運営にあてるパークチャージが徴収されている。ロンドン市内の他の大規模開発地においても同様の手法がとられていることも明らかとなった。最後に、管理運営基金をもとに自主財源を確保し管理運営を展開しているトラスト組織について、ロンドン中心部と地方都市ニューカッスルの事例を調査した。ロンドンにおいては都市開発にともない創出された公的空間をトラスト組織によって管理運営している箇所が複数存在した。地方都市においては、自治体が管理する公園の一部を新規形成するトラスト組織に管理運営委譲する試みがはじめられていた。公的空間のトラスト組織による管理運営は自主的な活動を可能とし、今後の展開の可能性をさらに確認する必要がある。英国における官民連携による公園緑地マネジメントの運用手法と財源について調査をすすめた結果、自主財源の確保に関わる取り組みが複数あることが明らかになってきた。これは研究助成申請書作成以降も、新たな取組みが展開されているためであり、英国での取り組みについて継続調査する必要があると考えている。

しかしながら金利の影響等の経済状況をうけやすく、その持続可能な管理運営の展開が課題となりつつあることが明らかとなった。次に米国については、BIDによる公園緑地マネジメントのブライアントパークでの成功事例から発展した、BIDとNPOの協働によるマネジメントや、地方都市における展開に着目し調査した。公園緑地の部分はNPOが管理運営し、その周辺をとりまくエリアをBIDとして環境整備する役割分担をおこないながら、公園緑地を中心としたエリアのまちづくりを一体的に行っている取り組みがいくつかある。具体的にユニオンスクエアーの取組みを調査したところ、NPOとBIDの構成メンバーが重複しており関係性が構築されていることがわかった。またエリアはビジネスのみならず大学や住宅が混在していることも、NPOとBIDの協働体制がより有効に機能する要因と考えられる。地方都市における展開としてフィラデルフィアとワシントンDCにおけるBIDによる公園緑地マネジメントについて調査した。地方都市の中心市街地活性化は米国における課題でもあり、その対応として広場や都市公園の再整備とその後の管理運営をBIDを中心にとりくんでいる。BIDという同様の手法ではあるが、その展開の仕方は異なることがわかった。現在までの進捗状況はおおむね順調といえる。英国における公園緑地マネジメントの運用手法と財源についての現地調査を終了し、手法ごとの課題と展望をつかむことができた。具体的には、BID(ビジネス・インプルーブメント・ディストリクト)やパークチャージ、そして基金をもとにしたトラスト組織による財源確保の違いについては、特別税であるBIDやパークチャージは比較的安定した財源となるが、その導入の過程については関係者の合意形成が重要であり導入に至らないこともある。他方、トラスト組織はその基金の運用が重要であり持続可能な管理運営体制の構築にむけた工夫が必要であることがわかった。米国における官民連携による公園緑地マネジメントの運用手法と財源についての調査をおこなう。具体的には、1NPOによる官民連携のしくみ、2都市開発による特例制度、また3BIDや4TIFなどの税制度、5企業による寄付や援助等を含む自主財源確保の取り組みなどについて、調査を行う予定である。調査の方法としては、まず文献調査を通して各手法のしくみと具体の運用事例について基礎調査を行なう。次に、基礎調査から特徴的や代表的な視点から調査対象を選定し現地調査を行なう。同時に、調査対象となった公園緑地を運用する自治体および民間組織に対して、運用状況および効果と仮題についてヒアリング調査を行なう。現地・ヒアリング調査の対象は、大規模都市と地方都市において複数都市を考えている。
X染色体における一塩基多型マイクロハプロタイプの検索と血縁鑑定への応用

近年、DNAを用いた血縁鑑定などにおいて、短い断片内の数個の一塩基多型からなるマイクロハプロタイプというマーカー概念が提唱され、既存のマーカー(STR)の問題点を解決できる可能性が示唆されている。申請者はSTRの解析を通じて、X染色体は「マーカーとしての性質を理解すること」や、「遺伝形式の特徴を活かした血縁鑑定への利用」に有用であることを示してきた。そこで本研究では未だ報告のないX染色体マイクロハプロタイプを解析し、X染色体の遺伝形式を活かした血縁鑑定事例を想定し、確率的評価のための計算法を開発する。
ヒト遺伝病領域の比較ゲノム・集団ゲノム解析

生物の種内には突然変異のプロセスによって生成されたゲノムレベルでの様々な多様性が見られる。これらの突然変異がどう表現型に影響するか、そして遺伝的な多様性がどう表現型の多様性と結びついているかを明らかにすることは生物学における中心的な命題である。そこで大量の集団ゲノムデータを解析することでこの命題に取り組むのが本研究課題のテーマである。本研究課題を開始して以来、我々は北海道の牧場より数百頭の競走馬のサンプルを入手し、数十万の一塩基多型を同定した。競走馬は毎世代少数のオスに対して非常に強い人為選択がかかっており、また表現型や遺伝病に関する知見が充実しているため、遺伝学研究を行う上でユニークなモデルとなりうる。本年、これら数百頭の大量の塩基多型データを用いた集団ゲノム解析を行うことで様々な知見を得ることができた。まず、人為選択のターゲットになり、表現型の多様性と深く関係していると考えられる領域を複数同定した。さらに、ここ100-200年のみならず、もっと以前に頻繁に行われていた近親交配が現在の遺伝的多様性の欠如に結びついていることがわかった。現在これらの研究結果をまとめた投稿論文を国際誌に投稿中である。また、生物の遺伝的多様性に深く関係している反復配列の進化に関するモデルを提唱した論文も国際誌に投稿した。ゲノム中の各領域、サイトがどういう役割を果たしており、表現型とどう結びついているのかという問いに対して、比較ゲノム解析や集団ゲノム解析を通して迫っていこうというのが本研究の大きな研究テーマである。昨年より私は日高育成牧場においてウマの生産、育成を行っている研究者と提携し、彼らの持つ育成馬数百頭のDNAサンプルを入手した。そしてIlluminaのSNP Chipを用いてこれらの個体のゲノム中に存在する約60万のSNPを同定した。現在、このデータをもとに集団ゲノム解析などを行い、また彼らの持つ各個体の筋肉や心肺機能など様々な表現型に関するデータと組み合わせることで、様々な表現型や遺伝病、疾病と関係のあるゲノム領域の探索を行っている。特に、ゲノムワイド関連解析を通して複数の候補領域を選定することがすでにできている。また、このデータに加え、約10年にわたる約10万頭の全交配記録、全血統情報を入手することができた。そこでこれらのデータをもとに、近親交配の度合いが交配や個体の生育にどう関係しているのか、そして近親交配がゲノムにどういう影響を及ぼすのか、遺伝病とどの程度関係があるのかについても検証を行っている。ウマの表現型に関して非常に優れた見識を持つ研究者と共同研究を開始することができ、独自のサンプルを使った解析を行うことができている。またすでに、様々な表現型と関連のある領域や人為選択を受けてきた領域の候補を複数同定できており、今後の発展が期待できる。本研究は、ゲノム中の各領域・サイトがどういう役割を果たしており、表現型とどう結びついているのかについて、比較ゲノム解析や集団ゲノム解析を通して迫っていこうというものである。なかでも遺伝病と関係のある領域がどのような特性を持っているか、そういった領域をどのように同定できるかをより明らかにしていこうというのが大きなテーマである。我々は疾病など様々な表現型に関する見識が充実しているウマについて、生産・育種を行なっている日高育成牧場の研究者と協力関係を築き、研究を進めている。これまで日高育成牧場からウマ数百頭のDNAサンプルをいただき、Illumina SNP Chipを用いて同定したゲノム中の数十万のSNPを用いた集団ゲノム解析を行なってきた。本年もまた新たに100頭近くのDNAサンプルを入手し、同様にSNPを同定して解析に追加した。本年は特に、遺伝病と大きく関係しているとされている近親交配(インブリード)に着目した解析を行なった。まず、血統情報から推測されるインブリードの度合いを算出し、さらに、ゲノム中に見られる過去のインブリードの結果と思われるホモ接合領域を同定した。この結果、ウマのゲノムは血統情報から推測されるよりはるかにインブリードの度合いが濃く、ウマの成立初期の家畜化のプロセスでたくさんのインブリードが行われた結果を反映している可能性が高いことがわかった。昨年末にこれらの研究成果をウマ科学会において報告し、現在投稿論文を準備している。独自のサンプルを用いた集団ゲノム解析を進めることができており、特に遺伝病と大きく関係していると思われるインブリードがゲノム構成に与える影響に関する重要な知見を得ることができた。

また、生物の遺伝的多様性に深く関係している反復配列の進化に関するモデルを提唱した論文も国際誌に投稿した。昨年より取り組んでいるウマの集団ゲノム解析をさらに進めていく。また、このウマを一つのモデルケースとし、遺伝病領域がどのような特徴を持つのか、特に近親交配がゲノムにどのような影響を与え、遺伝病とどう関連しているのかに関する体系的な理解を構築していきたい。まずこれまでの研究成果をまとめた原著論文を国際誌に投稿する。また本年もサンプルを追加し集団ゲノム解析を進め、遺伝病の候補領域の特徴を探る。特に現在、遺伝病の疑いのある骨の疾患に関する表現型の情報とこの疾患を発症している馬のサンプルを優先的に集めてもらっており、原因領域の特定を目指す。非常に少額であり、概ね想定どおりに経費を使用した。DNA抽出やSNPの同定にかかる費用を共同研究者が負担したため。次年度はさらにサンプルを追加することを念頭においており、その分のDNA抽出やSNPの同定に助成金を使用する予定である。DNAのSNPの決定や、学会参加費用、論文投稿費用などに使用する
ヒトiPS細胞膵臓分化系を用いた生活習慣病胎児期起源説の検証

生活習慣病胎児期発症説は疫学・動物実験により研究が行われているが、ヒトにおいて妊娠時の低栄養が胎児臓器の発生分化にどのように関与するかを実験的に評価することは困難である。そこで、本研究ではヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系を用いて、細胞に対して単一アミノ酸除去培地による低栄養負荷を与え、その後の細胞の機能を評価した。検討の結果、分化の特定の段階である種のアミノ酸を除去することにより、その後のインスリン陽性細胞数が低下することを見出した。げっ歯類を用いた研究で胎仔期の低栄養による出生後の膵臓β細胞数減少が報告されており、iPS細胞分化系はBarker説の検証に有用であることが示された。本研究では、ヒトの発生過程を模倣するヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系をモデルとして生活習慣病胎児期発症説を検証することを目的とする。生活習慣病胎児期発症説(Barkar説)に関しては、疫学・動物実験により研究が行われているが、ヒトにおいて妊娠時の低栄養が胎児臓器の発生分化にどのように関与するかを実験的に評価することは困難である。そこで、本研究ではヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系において、細胞に対して単一アミノ酸除去培地による低栄養負荷を与え、その後の細胞の機能を転写・代謝・エピジェネティック解析により多方面から評価することを目的とした。研究初年度である平成26年度は、本研究で利用するヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系の構築(shahjalal et al., J. Mol. Cell. Biol., 2014)を行うとともに、必須アミノ酸であるメチオニンがヒトES/iPS細胞の未分化性および分化制御に重要な役割を担っていることを明らかにした(shiraki N., et al., Cell Metab., 2014)。生活習慣病は、遺伝素因と環境因子の二つが発症に関わっていると考えられるが、母親の胎内環境が生活習慣病の発症に深く関与することが疫学研究や近年のエピジェネティック研究から明らかになってきた。この生活習慣病胎児期起源説(Barker仮説)に関しては、健康と疾病の素因は受精時から乳幼児期に決定されるというDOHaD(Developmental origins of health and disease)説という概念に発展している。DOHaDに関しては、疫学、動物実験、分子レベル等多方面にわたって積極的に行われているが、倫理面からヒトにおける検証実験は非常に困難である。そこで、ヒトの発生現象を模倣することができるヒトiPS細胞(induced pluripotent stem cell)の分化誘導系を用いて、生活習慣病胎児期発症説の検証を行った。研究初年度であるH26年度には、本研究で利用するヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系の構築(Shahjalal et al., J. Mol.Cell.Biol., 2014)を行うとともに、必須アミノ酸であるメチオニンがヒトES/iPS細胞の未分化性および分化制御に重要や役割を担っていることを明らかにした(Shiraki et al., Cell Metab., 2014)。2年目であるH27年度には、栄養組成が分化に与える影響を検証しやすくする目的で分化誘導法の改善を行った(Nakashima et al., Genes Cells, 2015)。構築した方法を用いた未分化細胞、膵臓前駆細胞、及び膵臓β細胞分化における各種アミノ酸の役割を検証し、各分化段階で必要なアミノ酸が異なることを見出した(白木ら、第9回日本アミノ酸学会学術大会、2015)。さらに、細胞の性状評価として細胞内のミネラルを測定する新規測定方法を構築し、未分化iPS細胞および分化細胞における鉄・亜鉛・銅の含有量を測定した(Arakawa et al., Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques, 2016)。生活習慣病胎児期発症説(Barker説)に関しては、疫学、動物実験、分子レベル等多方面にわたって積極的に行われており、膵臓に関してはラットやマウスを用いた実験で、胎児期の低栄養により出生後の膵臓β細胞の数が減少することが報告されている。しかし、ヒトにおける検証は非常に困難である。本研究では、ヒトの発生過程を模倣するヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系をモデルとして生活習慣病胎児期発症説を検証を行った。研究初年度であるH26年度には、本研究で利用する膵臓分化誘導方法の構築をおこなった。さらに、栄養因子としてのみならず生体内のメチル化反応の基質として利用されてるメチオニンが分化初期に非常に重要な役割を果たしていることを見出し、報告した。メチオニンは未分化細胞では分化細胞よりも要求性が高く、メチオニン欠乏により未分化性が破綻することを見出し、単一アミノ酸がヒトのiPS細胞分化に与える影響を世界で初めて報告した。2年目であるH27年目には、細胞分化系を低分子化合物主体のシンプルなものに改良した構築した分化誘導系を用いた細胞分化過程におけるアミノ酸要求性の違いについて報告した。最終年度であるH28年度では、ヒトiPS細胞を用いた生活習慣病胎児期発症説の検証研究の基盤となる生体環境擬似培地を作成し、その培地を用いたiPS細胞から膵臓への分化誘導法を再構築した。H26, 27年度に行った解析から従来の高栄養価の分化培地を利用して検証実験を行う際には、低栄養暴露の影響が他の豊富な栄養因子の補完によって判定しずらいことが示唆されたため、分化方法の培地組成を根本から見直し生体環境に近い培養組成による分化系の構築した。

生活習慣病胎児期発症説は疫学・動物実験により研究が行われているが、ヒトにおいて妊娠時の低栄養が胎児臓器の発生分化にどのように関与するかを実験的に評価することは困難である。そこで、本研究ではヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系を用いて、細胞に対して単一アミノ酸除去培地による低栄養負荷を与え、その後の細胞の機能を評価した。検討の結果、分化の特定の段階である種のアミノ酸を除去することにより、その後のインスリン陽性細胞数が低下することを見出した。げっ歯類を用いた研究で胎仔期の低栄養による出生後の膵臓β細胞数減少が報告されており、iPS細胞分化系はBarker説の検証に有用であることが示された。本研究では、ヒトiPS細胞の膵臓分化誘導系を用いて、各分化段階の細胞に対して単一アミノ酸除去培地による低栄養負荷を与え、その後の細胞分化を多方面から解析する。1低栄養負荷直後の分化に与える影響および2最終的な膵臓β細胞の機能に与える影響を評価する。研究初年度は、必須アミノ酸であるメチオニンが未分化状態および分化初期において細胞増殖(EdU assay)・細胞死(Tunel assay)・分化状態の評価(免疫染色)・網羅的遺伝子発現解析(GeneChip, Affymetrix)・網羅的DNAメチル化解析(Human Methylatin 450 BeadsChip, illumina)・CE-TOF-MS法を用いたメタボローム解析(Human Metabolome Technologies)を用いて評価した。次年度は、構築した評価系を用いて他のアミノ酸が分化に与える影響を評価することが可能だと考える。H26,27年度の検討により、膵臓分化誘導方法および評価方法を構築でき、単一アミノ酸除去については結果も得られてきている。さらに、各分化段階の細胞凍結保存技術についても開発を進め、研究材料も十分に準備できた。最終年度であるH28年度は、作成済みである未分化細胞、内胚葉細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞および膵臓β細胞を用いて各分化段階における低栄養負荷が直後の細胞分化に与える影響を多面的に評価するとともに最終分化時の膵臓β細胞のインスリン分泌に与える影響を評価する。また、研究成果については国際的な学術雑誌への投稿にむけて準備を進める。幹細胞制御学今後は、各分化段階における低栄養が最終的な膵臓β細胞の機能に与える影響を評価する。それぞれの分化段階において単一アミノ酸除去培地で培養後に通常培地に戻し、最終分化を行う。最終日に細胞を回収し、各段階のアミノ酸除去が最終産物に与える影響を評価する。細胞・分化誘導系・培地については初年度と同様なものを利用する。評価に関しては、網羅的遺伝子発現解析・メタボローム解析・網羅的DNAメチル化解析については、初年度同様に行うが、膵臓β細胞の機能については糖濃度に応答してインスリン分泌する機能に与える影響を検討する前年度末に熊本大学から東京工業大学に研究室が移動したために実施する実験計画が変更になり、次年度使用額が生じた。熊本大学から東京工業大学への移動に伴う実験計画変更により、次年度使用額が生じた。物品費に充てて、細胞培養に利用する培養液およびプラスチック消耗品の購入代金とする。
葉脈走行パターン解析と高感度DNA分析による高度消化食物残渣における植物種の同定

殺人事件の被害者から採取される食物消化残渣の検査は、被害者の生前の足取りや死後経過時間を知る上で犯罪捜査上極めて重要な検査の一つである。本研究では、高度に消化されながらも消化管内に残存していることの多い葉菜類について、1顕微鏡を用いた葉脈の走行パターン解析、2trnL-P6loopを標的にしたリアルタイムPCRによる融解曲線分析に着目して、植物種の新たな同定法の開発について検討した。葉脈の走行パターン解析にっいては、葉部の一部から水酸化ナトリウムを用いて葉脈標本を作製し、顕微鏡で詳細に観察することによって行った。葉脈は、太い主脈から側脈へと枝分かれし、さらに細かい葉脈に分岐する。キャベツ、ハクサイを観察した結果では、いずれも双子葉植物であることから葉脈は網状を呈していた。この網状構造は、観察した部位においては、大きさ、形状に違いが認められるものの、その構造はかなり複雑であった。またその最小構造単位は約3×6mm程度であり、葉脈パターンの違いを観察するためには、ある程度の大きさが必要であり、実際の高度消化残渣に応用するには、さらなる検討が必要であると考えられた。trnL-P6loopを標的にしたリアルタイムPCRによる融解曲線分析では、葉菜7種(キャベツ、ハクサイ、コマツナ、キクナ、レタス、タマネギ、ネギ)について検討した。植物試料から市販のキットを用いてDNAを抽出し、PCRに供した。trnL-P6loopを標的としたプライマー配列は、Taberlet等(*)が報告しているものを使用した。リアルタイムPCRの前に、通常のPCRを行い、アガロースゲルで電気泳動して確認した結果、いずれの植物試料で単一バンドによる増幅産物を確認することができた。次に、最適な条件下でリアルタイムPCRを行い、融解曲線分析を行った結果、trnL6-P6を用いた解析では、標的とする領域が小さい分、高度な消化を受けた植物試料でも検出することが可能であった。しかし、同属試料の中には融解温度での識別は困難なものもあり、高感度ではあるが識別力において問題点が残された。消化残渣における植物種同定についは、試料に残存するDNAの質・量を考慮し、その検査法の選択をする必要性があると判断された。
貿易に体化された職とグローバル・バリュー・チェーン

日本に関するグローバル・バリュー・チェーン深化を新たに分析する為の核となる、輸出企業と非輸出企業別の教育水準別/就業上の地位別労働投入と中間財・サービス投入の構造に関するデータベースは、賃金センサスと工業統計のミクロデータをマッチングさせ、成功裏に作成できた。我々はこのデータに基き、海外の需要が日本で生み出している労働需要や財・サービス需要を計算してみたところ、輸出企業と非輸出企業の違いを無視した既存のOECDのデータベース(TiVA)による分析結果とは大きく異なることが分かった。この成果を2016年秋にOECDの科学技術産業局産業分析作業部会総会で報告し、国際連関表の専門家から高く評価された。今後TiVAの研究にも、本研究の成果が反映される可能性が高い。この他、中国の多国籍企業に関する研究成果を国際学術誌"Applied Economics"に掲載することができた。また、日本及び海外諸国の貿易に体化された職種別とタスク別労働投入のデータベースを整備するため、日本の人口センサス、JIP(日本産業生産性)データベース、日本の企業ミクロデータ、フローニンゲン大学のWIOD(世界投入産出データベース)等を用いた作業を進めた。また、グローバル・バリュー・チェーンの深化によって、貿易に体化されたタスクの内容が、どのように国内における産業別職種別・タスク別労働投入や高・中・低熟練労働者の賃金格差に影響を与えているかについて、英国で開催された国際学会"Dynamics, Economic Growth and International Trade DEGIT XXI Conference"、他において報告をした。28年度が最終年度であるため、記入しない。日本及び海外諸国の貿易に体化された職種別とタスク別労働投入のデータベースを整備するため、日本の人口センサス、JIP(日本産業生産性)データベース、(子会社による海外での生産活動や輸出に関する)日本の企業ミクロデータ、フローニンゲン大学のWIOD(世界投入産出データベース)等を用いた作業を進めた。これらの作業結果は、2015年10月にパリのOECDにおいて開催された国際産業連関表に関する国際会議に於いて深尾が報告した。また、グローバル・バリュー・チェーンの深化によって、貿易に体化されたタスクの内容が、どのように国内における産業別職種別・タスク別労働投入や高・中・低熟練労働者の賃金格差に影響を与えているかについて、第74回日本国際経済学会全国大会において報告した。さらに、2015年9月に中国・北京に於いて開催された国際コンファレンスにおいて、日本と中国の国際比較に関する報告をした。この論文はApplied Economicsに掲載された。第一に、日本に関するグローバル・バリュー・チェーン深化を新たに分析するための核となる、輸出企業と非輸出企業別の教育水準別/就業上の地位別労働投入と中間財・サービス投入の構造に関するデータベースは、賃金センサスと工業統計のミクロデータをマッチングさせることにより、成功裏に作成できた。この結果をOECDで報告したが、海外で先端研究を行っている研究者たちにも好評であった。更にこのデータに基づいて、海外の需要が日本で生み出している労働需要や財・サービス需要を計算してみたところ、その結果は、輸出企業と非輸出企業の違いを無視した既存のOECDのデータベース(TiVA)による分析結果とは大きく異なることがわかった。この他、中国の多国籍企業に関する研究成果を国際学術誌に掲載することができた。また、現在、政府統計ミクロデータを用いて日系多国籍企業の海外進出と撤退に関する研究を東京大学のKonstantin Kucheryavyy研究員と共同で進めているが、この研究からも興味深い結果が得られそうである。2015年度に作成したデータベースを用い、Grossman and Rossi-Hansberg (AER, 2009)が提案した、仕事の貿易(“trade in tasks")の視点から、国際分業が日本の労働市場に与えた影響について分析を行う。分析にあたっては、フローニンゲン大学、OECD、ハーバード大学のジョルゲンソン教授、等とも連携し、国際比較研究にも注力する。

また、多国籍企業の活動に関する産業レベルデータと国際産業連関表の接合や、賃金センサスや工業統計調査のミクロデータを利用することにより、輸出や直接投資をしている企業とそうでない企業の間で、投入する労働の属性や、原材料調達先や生産物販売先がどのように異なるかも、分析することを検討する。またサービス貿易を通じたサービス産業の国際分業についても調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
プラセオジウム化合物における4f電子の磁気相転移が伝導電子に及ぼす効果

核の磁性はその磁気モーメントが電子に比べて3桁小さいが故に、核スピンによる磁気相転移はマイクロケルビン以下で起こる。ところが、Van Vleck常磁性体では、電子の磁気モーメントが部分的に復活し電子間の交換相互作用が生まれ、磁気相転移が可能となる。この交換相互作用が強い場合には、電子主導による磁気相転移となるが、弱い場合には超微細相互作用を介して、核スピン間の相互作用で核主導の磁気相転移が見られる。本研究では、プラセオジウム化合物の中でも典型的な核主導の磁気相転移を引き起こすPrCu6を選び、電気伝導に対する核の磁気相転移が及ぼす影響について調べた。核磁気相転移が電子の輸送現象である電気抵抗に及ぼす効果を調べた結果、電気抵抗は転移温度で測定周波数に強く依存した鋭いピークを示し、転移後の減少すること、また外部磁場によって転移のぼやけが生じることが我々の研究でわかってきた。今回、電気伝導との対比の意味で、帯磁率測定と磁化測定を行った。その結果、電気抵抗のピーク現象は推定した通り帯磁率からの寄与であり、電気抵抗の減少は磁化の増加に対応していることが明らかにした。また磁化の磁場依存性は散乱理論の最低次の近似式とよく一致する結果が得られた。さらに正のワイス温度と磁化の突然の発生から、転移は強磁性的である。測定磁場の範囲で磁化の飽和がないこと、および零磁場では磁化がわずかしか出ないことから、磁気モーメントの向きは測定磁場と垂直のb軸(Van Vleck帯磁率が最も大きい軸一容易化軸と考えられている)方向であると考えられる。
ラット脊髄損傷後の機能的神経筋電気刺激治療モデルの確立

脊髄再生治療後に併用可能な低侵襲な機能的電気刺激(FNS)治療モデルを考案し,脊髄不全損傷ラットでの三次元動作解析によるキロヘルツ(kHz)刺激治療の効果の評価を行った。成熟雌Fischerラット20匹を用いた。脊髄不全損傷後7日目から3日間のFNS治療を施行した。三次元歩行解析は損傷後14日目に評価した。FNS治療75 Hz群, 8 kHz群,損傷コントロール群,正常群(各5匹)の4群間で比較検討した。BBBスコアは有意差を認めなかった。三次元歩行解析では損傷コントロール群に比較して,75Hz群で左右後肢の共同運動の改善傾向を認め,8kHz群では有意な改善を認めた。平成25年度は以下の成果が得られた。1.脊髄不全損傷後のより低侵襲な機能的神経筋電気刺激治療モデルを使用し、脊髄不全損傷ラットでの短期での下肢運動機能の改善を三次元動作解析にて確認した。この成果は現在英文雑誌に投稿中で、近日中にAcceptされる予定である。2.また、同モデルを使用し、刺激条件の違い、特に刺激周波数を変更することによる運動機能への影響について検討した。刺激周波数を従来の75Hzにした群と、臨床的に有用性が報告されているkHz刺激を行った群の運動機能改善に与える影響について、三次元動作解析を行って評価した。結果は刺激周波数が、75Hz刺激群で、kHz刺激群に比較して、有意な運動機能の改善が得られることが確認できた。この成果はInternational Spinal Cord Society 2014で報告し、現在論文の作成中である。3.さらに、有効なリハビリテーションの組み合わせについて検討するため、機能的神経筋電気刺激治療に併用して、体重免荷トレッドミルトレーニングを併用した治療の効果について検討するため、機能的神経筋電気刺激治療群、トレッドミル歩行訓練併用群に分けて、運動機能の改善効果について検討する実験を行い、現在データの解析中である。4.脊髄不全損傷ラットにおいて、機能的神経筋電気刺激治療の効果が確認されたことは、今後の再生治療との併用効果を検討する上でも重要な成果であると考える。初年度は以下の成果が得られた。1.脊髄不全損傷後のより低侵襲な機能的神経筋電気刺激治療モデル確立のための、条件設定を行い、動作解析により評価した、モデリング研究の論文がJournal of Spinal Cord Medicineの5月号に掲載された。同モデルは正常ラットを使用したラット後肢の足関節主動筋である両側の前脛骨筋と腓腹筋のMotor pointに経皮的針電極を使用して、歩行のリズムで15分間刺激を行い、刺激中の両側の足関節の運動を三次元動作解析により評価したものである。結果は筋疲労による足関節角度の減少は認めたが、歩行リズム刺激に応じた、足関節のリズム運動を確認でき、歩行リズム刺激に成功した。2.同モデルを使用し、脊髄不全損傷ラットにおける経皮的刺激電極を使用した後肢足関節主動筋の機能的電気刺激治療を行い、短期治療効果について、三次元歩行解析を行って評価した。同実験では、脊髄不全損傷ラットにおいても、経皮的針電極を使用した機能的電気刺激治療が可能であることを確認し、脊髄損傷後1週間目から3日間、電気刺激治療を行った治療群とコントロール群で、2週間目の歩行機能を三次元歩行解析で評価した。結果は、治療群において、後肢共同性の改善を確認できた。3.上記の成果を昨年のNeuroschience2012で報告し、現在論文の作成中である。脊髄不全損傷ラットにおいて、機能的神経筋電気刺激治療の効果が確認されたことは、今後の再生治療との併用効果を検討する上でも重要な成果であると考える。平成26年度はキロヘルツ(kHz)刺激による歩行リズム刺激の実験データの解析を行い、脊髄不全損傷コントロール群に比較して、有意な運動機能の改善が得られることを、三次元動作解析により確認した。この結果は国内および国際学会において報告し、現在英語論文の作成中であり、近日中に海外雑誌に投稿予定である。さらに、機能的電気刺激(NMES)治療とトレッドミル歩行訓練との併用効果の解析も行った。12週齢のFisherラット(体重平均160g)25匹を使用した。脊髄不全損傷後のラットをNMES治療のみを行った群(以下NMES群, n=5)とトレッドミル上での歩行訓練を行った群(以下TM群, n=5)、およびこの2つの治療を併用した群(以下併用群, n=5)と損傷コントロール群(n=5)、正常コントロール群(n=5)の5群に分けた。脊髄損傷作成装置IH-400 Impactorを使用し、第9胸椎レベルで150kDyneのForceで圧挫し脊髄損傷を作成した。NMES治療は損傷後5日目から行った。刺激部位は足関節主動筋である前脛骨筋と腓腹筋を選択した。

経皮的に各筋のMotor point近傍に針電極を設置し、過去の実験データを基に左右後肢の各筋を歩行リズムで15分間/日、連続3日間の刺激を行った。トレッドミル治療群は損傷後7日目から歩行訓練を開始し、15分間/日を連続5日間行った。併用群は上記2つの治療の両方を行った。脊髄損傷後14日目にトレッドミル上で歩行させ、4台のCCDカメラで両前後肢各関節に設置したカラーマーカーを撮影して三次元歩行解析を行い治療効果の評価をし、各群の比較を行った。トレッドミル歩行単独に比較して、機能的電気刺激治療併用群では後肢の左右の接地の位相の改善が得られることを確認した。この結果についても、国内学会において報告した。さらに、この結果は英語論文とし、海外雑誌に投稿した。脊椎脊髄外科当初の計画の刺激条件を変更による運動機能への影響についての検討は、データの解析の終了し、コントロールと比較して有意な運動機能の改善が得られることが確認できており、おおむね順調であると評価した。当初予定していたラット不全損傷における、足関節の主動筋の機能的電気刺激治療により、短期治療効果の検討を行う研究において、後肢運動機能の改善が確認できたことから、計画はおおむね順調に進行していると評価した。現在得られている実験データの解析を進め、脊髄損傷後のリハビリテーションについて、有効な機能改善を得るための、最適な条件、機能訓練の組み合わせ、時期等について検討していく予定である。過去の研究から得られた刺激条件で、運動機能の改善効果が確認できた。しかし、筋疲労によると思われる、刺激中の関節角度の経時的な減少を認めたため、次年度では、刺激条件を変化させた際に、筋疲労による関節角度の減少防止への効果や運動機能の改善に及ぼす影響を中心に研究を進めていく予定である。本年度の実験計画、内容について、当初の予定どおり推進できた。次年度に実施する実験データの解析のために必要となる消耗品費と併せて使用する。該当なし
慢性関節リウマチ滑膜に特異的に浸潤したT細胞のクローニングによる解析

【目的1】同一患者における慢性関節リウマチ(RA)滑膜及び末梢血由来のT細胞クローンの解析については、2例のRA患者の滑膜及び末梢血より単核球を分離し、限界希釈法によりT細胞クローンを作成した。得られたT細胞クローンは患者Aでは滑膜から65個、末梢血から53個、患者Bでは滑膜から81個、末梢血から85個であった。各々のT細胞クローンよりmRNAを抽出し、RT-PCR法より使用しているTCR Vβgeneの決定をすでに終了した。滑膜ではTCR Vβ14が多く末梢血で少ないとの報告があるが、われわれの検討ではこのような傾向は認めていない。また、患者A、Bの滑膜および末梢血のT細胞クローンで特定のVβの使用頻度が高い傾向は認めなかった。現在、これらのT細胞クローンのCDR3領域のシークエンスを進めている段階である。この操作でRA滑膜と末梢血共通のT細胞クローンを選び出し、これらのクローンの機能をサイトカイン(interleukin-2,interkeukin-4,interferon-γ)を中心に解析する予定である。【目的2】RA滑膜由来のT細胞クローンのTCR Vαgeneの解析については、2例のRA患者の末梢血リンパ球から抗体を用いて特定のTCR Vαを持つT細胞をフローサイトメトリを用いてソーティングし、回収したT細胞のクローニングを行なっている。今後、異なるTCR Vα抗体を用いてこれらの2種のTCR Vαを表現しているT細胞クローンを選択する予定である。
ニワトリ生殖系列幹細胞で発現する遺伝子のエピジェネティック解析

生殖細胞で特異的に発現する遺伝子(Ddx4, Dnd1, Dazl)は生殖細胞の増殖・生存に必須である.これら遺伝子の発現とプロモーター領域のメチル化との関係を精子で解析した.精子では,未分化細胞マーカー遺伝子も含めてこれらの遺伝子は発現しない.しかし,プロモーター領域のメチル化レベルは肝臓の遺伝子に比べると精子で極めて低いことが認められた.肝臓で発現するAlb遺伝子は低メチル化であるが,精子では高メチル化であった.このように、生殖細胞の増殖・生存に関係する遺伝子のメチル化は低く,関係しない遺伝子は高メチル化であるという知見から,生殖細胞の遺伝子は選択的にメチル化されていることが示唆される.本研究では,ニワトリの配偶子形成と生殖系列幹細胞に特異的な遺伝子の転写開始点上流域のDNAメチル化の関係を解明することを目的としている。昨年度実施した生殖細胞特異的に発現する3遺伝子の転写開始点上流域のメチル化状態の調査では、肝臓の比べると精子では圧倒的に低メチル化状態であった。このことは肝臓でこれらの遺伝子の発現が抑制されていることを裏付けるものである。生殖細胞特異的に発現する3遺伝子は生殖細胞の増殖と生存に深く関係していることから、本年度は確認のために、未分化細胞で発現するNanog遺伝子と肝臓で発現するアルブミン遺伝子(Alb)について、転写開始点上流域のメチル化状態を調査した。その結果、肝臓で発現しないNanogのメチル化状態は高く、肝臓で発現するAlbは低いという結果が得られた。肝臓でのこれらの遺伝子の発現は転写開始点上流域のメチル化から説明が付けられる。しかし、精子ではNanogのメチル化状態は低く、Albは高いメチル化状態を示した。生殖細胞特異的に発現する3遺伝子と未分化細胞マーカーの遺伝子は、始原生殖細胞から精子まで転写開始点上流域のメチル化は殆ど起こらない。一方、生殖細胞にとって重要な遺伝子ではないAlbはメチル化されている。Nanogについては受精後の初期胚で高度に活性化されるべき遺伝子であることから、受精後の雄性前核期後に起きるクロマチンの再構築と胚性遺伝子活性化とを考えると、Nanogの遺伝子発現の準備が出来上がっていることを示唆するものである。生殖細胞で特異的に発現する遺伝子(Ddx4, Dnd1, Dazl)は生殖細胞の増殖・生存に必須である.これら遺伝子の発現とプロモーター領域のメチル化との関係を精子で解析した.精子では,未分化細胞マーカー遺伝子も含めてこれらの遺伝子は発現しない.しかし,プロモーター領域のメチル化レベルは肝臓の遺伝子に比べると精子で極めて低いことが認められた.肝臓で発現するAlb遺伝子は低メチル化であるが,精子では高メチル化であった.このように、生殖細胞の増殖・生存に関係する遺伝子のメチル化は低く,関係しない遺伝子は高メチル化であるという知見から,生殖細胞の遺伝子は選択的にメチル化されていることが示唆される.本研究では,ニワトリの配偶子形成と生殖系列幹細胞に特異的な遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化の関係を解明することを目的としている。本年度は生殖細胞の分化の最終ステージである精子と体細胞である肝臓からそれぞれゲノムDNAを抽出し,バイサルファイト処理を行った後に大腸菌を用いたサブクローニング,シークエンス解析を行った。本研究で解析する遺伝子として生殖細胞特異的に発現するvasa,dnd,dazlを候補として実験を進めている。各遺伝子の転写開始点上流500bpをカバーするプライマーを設計し,その領域内に存在するシトシン-ホスホジエステル結合-グアニンサイト(CpGサイト)の数を調べたところ,vasaは1箇所,dndとdazlにおいてはそれぞれ30箇所と28箇所のCpGサイトが確認された。メチル化の様式は細胞単位で異なるとされているため,サブクローニングにより12個のクローンを作製し,各クローンにおけるメチル化CpGサイト数の平均値をメチル化割合とした。その結果,vasa,dnd,dazlの転写開始点上流域におけるメチル化割合は精子においてそれぞれ33%,13%,1%と低かった一方で,肝臓においてはそれぞれ75%,81%,85%と高い割合を示した。このことは肝臓において生殖細胞特異的遺伝子の転写がメチル化による抑制を受けていることを示唆している。一方で,精子においては各タンパク質の発現が低下していることからそれらをコードする遺伝子の転写が抑制されるという仮説に反する結果が得られた。この結果から,精子においては遺伝子が転写後に翻訳されずmRNAの状態で貯蔵されていることが考えられる。本研究では、ニワトリの配偶子形成と生殖系列幹細胞に特異的に発現する遺伝子の転写開始点上流域のDNAメチル化の関係を解明することを目的として実施されたものである。これまでの研究成果として、生殖細胞に特異的に発現する3遺伝子(Ddx4, Dnd1, Dazl)の転写開始点上流域のメチル化状態が肝臓に比べると低メチル化であること(24年度)、未分化細胞で発現が見られる遺伝子(Nanog)は精子では低メチル化であるが、肝臓では高メチル化であること(25年度)を明らかにしてきた。しかし、生殖細胞にとって重要な遺伝子ではないAlbは高度にメチル化されていることが示された(25年度)。これらの知見から考えられることは、受精後の雄性前核期後に起きるクロマチンの再構成と胚性遺伝子の活性化のためには、Nanogの遺伝子発現の準備が出来上がっていることである。

しかし対照として調査したAlb遺伝子がメチル化されていることから、生殖細胞のメチル化環境を明らかにするためにメチル化酵素(Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b)の発現をRT-PCRにより解析した。標準遺伝子としてGapdhの発現を調べた。精子では、GapdhのmRNAは検出されたが、全てのメチル化酵素のmRNAは検出されなかった。一方、肝臓では、Dnmt3b以外のmRNAは検出された。以上の結果を総合すると、精子では遺伝子はメチル化される環境ではないと結論される。しかし、臓器特異的に発現する遺伝子(Alb)はメチル化されていることから、生殖細胞での“履歴"を表し、肝臓に分化されることによって特異的に脱メチル化が起こって遺伝子の発現が誘導されるものと示唆される。生殖内分泌学、時間生物学、発生生物学生殖細胞特異的に発現する3遺伝子に加えて、未分化細胞で発現する遺伝子Nanogおよび肝臓で発現して生殖細胞では発現しない遺伝子アルブミンについてのメチル化の新たな情報が得られたこと。24年度計画として、低メチル化状態と思われるPGCおよび成熟雄の精原細胞,孵化直後の卵母細胞,高メチル化状態と思われる成熟ニワトリの精子・卵子から精製したゲノムDNA,および比較のために体細胞(脳,肝)から精製したゲノムDNAを用いて,対象とする遺伝子プロモーター領域(あるいは転写開始点上流域)のメチル化状態の判定を行うことを予定していた。このうち、成熟ニワトリの精子および体細胞(肝)からのDNAのプロモータ領域の解析は終了しており、今年度中に成果を取りまとめて国際誌に投稿する予定である。25年度からは、引き続き残りの解析を予定している。このような進行状況から順調に進展していると判断される。残された問題点は、生殖細胞では通常発現しないアルブミン遺伝子が高度にメチル化されていることは、精子においてメチル化酵素は発現と機能に関することである。最終年度は、メチル化酵素の発現を解析する必要がある。受精卵(Stage X)の胚盤葉の細胞培養によって形成されたPGCコロニーからPGCを分離(FACSで精製),さらに胚性腺フィーダー細胞系で培養したPGCから精製したゲノムDNAを用いて,遺伝子プロモーター領域(あるいは転写開始点上流域)のメチル化状態の判定を行う.生殖細胞の精製をパコール法としていたが、研究環境が改善されたので、FACSで精製に切り替え、精製度を上げた方法で進める。日本に在庫がなく海外から物品を取り寄せのため日数がかかり、年度をまたぐ形となったため。物品が届き次第、支払伝票を提出する予定。生殖細胞の精製をパコール法からFACSで精製に切り替えることにより、発生した経費に充てる。研究内容の変更はないが、生殖細胞の精製法の変更のみである。