hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有限温度および密度での量子色力学

有限温度・密度での量子色力学(QCD)の相構造を明らかにすることは初期宇宙の物質の状態や中性子星やクォーク星の内部構造を明らかにする上で基本的な重要さを持っている。本年度は、ベクトル型相互作用を含む南部-ヨナ・ラシニオ(NJL)型のQCD有効模型を用いてカラー超伝導とカイラル相転移を含むQCD相図を荷電中性の条件のもとでu、dクォークだけの場合(2フレーバーの場合)とさらにストレンジネスクォークを含む場合(3フレーバーの場合)について理論的な研究を行った。3フレーバーの場合には、QCDの軸性異常を表す行列式型の6体相互作用(小林・益川・'t Hooft項)を取り入れた計算を行った。その結果、カイラル相転移とカラー超伝導の境界はカイラル秩序変数とカラー超伝導を結合した新たな揺らぎが大きいこと、そのために理論内のパラメータの値によってはQCDの臨界点の数は1,2,3,4,0に変化し得ることが明らかになった。さらに新しい発見として、これまでその解決が困難とされていたギャップレス超伝導相の不安定の問題は、ベクトル型相互作用の存在によってフェルミ面のミスマッチが緩和されるために自然に解決される可能性があることが示された。ここでいう「ベクトル型相互作用」はその第ゼロ成分である密度-密度相互作用のことであり、そのような相互作用は有限密度系においては、「くりこみ群」による考察から明らかなように、自然に誘引されることを考慮すると、今回の我々の研究は模型によらない普遍的な解決であり得ることを強調する。u,dクォークのみの2フレーバーの場合について、閉じこめ相転移およびカイラル相転移だけでなくカラー超伝導相転移を現実的な状況で取り込み、量子色力学の有限温度・密度での相構造を明らかにすることを目的とした。閉じ込めのダイナミクスはポリヤコフループを力学変数として用いることで取り込み、カイラル相転移とカラー超伝導は南部-ヨナラシニオ模型で記述した。これまでこのような研究はWeiseグループのものがあるが、われわれは物理的に現実的な設定、すなわち、カラーおよび電荷中性の拘束をかけて相図の決定を行った。この計算は6種類の異なる化学ポテンシャルを含み、カイラルとダイクォークニつの秩序変数についての変分計算であり、解析的にも数値計算上もかなり精緻な計算が必要とされる。昨年11月末からの開始にもかかわらず、今年度のうちに大体の結果が出せたのは喜ばしい。その結果は以下の通り:中性条件による拘束は大きく相図の構造に影響することが分かった。すなわち、カイラルダイナミクスとカラー超伝導の結合定数の比に依存して、低温領域の相転移が1次相転移からクロスオーバーに変化する。また、低温領域ではダイクォークとカイラル凝縮の共存することが新たに見出された。これはWeiseグループが見落としていたものである。これまでに、ベクター相互作用の効果やカイラルアノマリーの効果で、高密度かつ低温領域の相転移が1次からクロスオーバーになるとの研究と示唆はあったが、ポリヤコフループによる閉じ込めの効果を取り入れると、中性条件のために1次相転移がクロスオーバーに変化することはこの研究で初めて示された成果である。今後、このような複雑な総転移の機構の物理的かつ直感的理解を目指して解析を行う予定である。量子色力学の現実的な相図を明らかにするべく、荷電中性およびベーダ平衡の条件を課してカイラル相転移とカラー超伝導への相転移を同時に考察した。低エネルギー現象の有効模型として知られる南部・ヨナラシニオ型の有効模型を用いた。その結果、次のことが分がった。荷電中性条件のためにカイラル相転移の強さが弱まり、カイラル結合とダイクォーク結合の強さの比によって、比較的低温度でのカイラル相転移が一次になったり二次になったりあるいはクロスオーバーになる。この効果は顕わにベクター結合を入れるのと類似している。しかも、カイラル結合が弱い場合には臨界点の数が3にもなることが判明した。そこで、顕わにベクター結合を導入すると、確かに、荷電中性条件の効果が増大され、臨界点の数が4にまで増えることが分かった。また、より重大なことは、U(3)xU(3)不変なベクター相互作用を導入すると、荷電中性条件によるフレーバー毎のフェルミ球の相違が緩和され、ギャップレス領域のカラー磁気不安定性が回避し得るということである。この発見は高密度クォーク物質の物理学における重要な発見であり、長年の懸案を少なくとも部分的に解決したことになる。

さらに新しい発見として、これまでその解決が困難とされていたギャップレス超伝導相の不安定の問題は、ベクトル型相互作用の存在によってフェルミ面のミスマッチが緩和されるために自然に解決される可能性があることが示された。ここでいう「ベクトル型相互作用」はその第ゼロ成分である密度-密度相互作用のことであり、そのような相互作用は有限密度系においては、「くりこみ群」による考察から明らかなように、自然に誘引されることを考慮すると、今回の我々の研究は模型によらない普遍的な解決であり得ることを強調する。
細胞性因子による腫瘍ウイルスDNAの転写と複製の調節機構

細胞性因子によるアデノウイルス12型(Ad12)DNAの転写と複製の調節機構について以下に述べる研究成果が得られた。(1)NFーIの同定。Ad12E1A遺伝子の2つの転写のうちD転写を特異的に促進する因子をエ-ルリッヒ腹水癌細胞の核抽出液中に見い出し、精製を行った。精製標品は48,53,55kDaの3つのペプチドを含んでいた。この因子はAd12DNAの左端を1番としたとき22番48番の領域に結合したが、この配列はHeLa細胞のNFーIが認識する配列と一致した。さらにこの因子は、Ad2DNAの複製開始反応とHeLaNFーIと同程度に促進した。よってこの因子はマウスNFーIであると結論された。マウスNFーIはAd12DNAの左端付近に結合することにより、転写と複製両反応を調節すると考えられる。(2)ESFー1の同定。HeLa細胞の核抽出液中に存在するESFー1と名づけた因子が、Ad12E1A遺伝子のP転写を促進することが分った。この因子はTATAボックス直前の5'ーTGTCAー5'配列に結合する。DNAトランスフェクションにおいて、135mRNA由来のE1Aタンパクが自己遺伝子転写を約10倍促進することが分った。12SmRNA由来のタンパクは影響を与えなかった。E1Aタンパクの作用を解析するためにAd12E1Aタンパクの大量生産を、酵母と用いた系により行った。現在まで粗抽出液中にそれらしいペプチドを検出でき、抗体による確認を行っているところである。得られたE1AタンパクとNFーI、ESFー1との相互作用を調べる予定である。12型アデノウイルスのE1A遺伝子の転写調節因子について、以下の解析を行なった。この遺伝子はD,Pと呼ぶ2つの転写単位を持つ。1.D転写調節因子の精製とその性質(1),a領域結合因子の精製D転写はa領域と名づけられたDNA領域により、特異的に促進される。そこでこの領域に結合する因子を、エ-ルリッヒ腹水癌細胞から精製した。最終精製標品は、53および55キロダルトンの2本のペプチドを含んでおり、このいずれもが特異的DNA結合活性を有していた。(2),a領域結合因子とHeLa細胞NFIの比較a領域にはアデノウイルスDNAの複製促進因子であるNFIが結合することが分っていた。そこで精製したa領域結合因子がNFIと同じ性質を持つか否かを調べた。その結果、両者はDNA結合活性、DNA複製促進活性とも、ほぼ同様に有することがわかった。よって、a領域結合因子はマウスのNFIであると結論した。2.P転写調節因子の同定P転写開始部位の上流域とさまざまな長さ欠損する変異体DNAを作製し、無細胞転写反応により解析した。その結果、TATAボックスのすぐ上流の約15塩基対の部分を失うと、P転写が顕著に減少した。次に、この領域に結合する因子と検索したところ、HeLa細胞の核抽出液中に見い出され、これをESF1と名づけた。ESF1は5'TGTCA3'という塩基配列に結合した。このような塩基配列を認識する因子は、これまで知られていない。また、ESF1はE1Aタンパクによる活性変動を受けないことが示唆された。アデノウイルス(Aα)E1Aタンパクと細胞性因子との相互作用を調べるために以下に述べる研究を行った。1.マウスNFーIのcDNAクロ-ニング。マウスNFーIの大量生産ならびにドメイン解析を行うために、cDNAクロ-ン化を試みた。エ-ルリッヒ腹水癌細胞のmRNA

由来のcDNAを用いてλgtloをベクタ-としたライズラリ-を作製した。一方、精製したマウスNFーIの部分アミノ酸配列を決定し、それに対応するオリゴDNAを合成した。そのDNAをプロ-ブとしてライブラリ-をスクリ-ニング中であるが、今までのところクロ-ンは得られていない。引き続きスクリ-ニングを行う予定である。E1Aタンパクの大量生産を目的として、大腸菌および酵母を宿主とした発現系の開発を行った。大腸菌を利用した系はうまくゆかなかったが、酵母の系は現在までのところ使えそうである。Ad12E1A遺伝子で形質転換した酵母は、分子量的にE1Aタンパクと思われるペプチドを培地中へ分泌することが分った。現在抗体を用いてE1Aタンパクを同定中である。3.ESFー1の精製とcDNAクロ-ニング。Aα12E1A遺伝子のP転写促進因子であるESFー1の構造を解析するため、ESFー1の精製とcDNAクロ-ニングを試みている。しかしながら現在までいずれの実験もうまく進んでいない。引続き検討も加える予定である。
フィンランドにおける地方分権的教育行政の研究-格差を抑制する教育システムの検討-

地方分権化された教育行政・制度を有しながら、平等性・公正性と優秀性を高い水準で達成しているとされるフィンランドの教育システムのあり方を検証した。その結果、フィンランドの地方分権的教育行政では、教育の中身については現場に権限を委譲しつつも、教育の基盤整備における国の責任を明確化し、国がこれを保障することにより、比較的均質な教育の提供を実現させていることが明らかになった。本研究は、地方分権化された教育行政・制度を有しながら、平等性・公正性と優秀性を高い水準で達成しているとされるフィンランドの教育システムのあり方を、1、教育機会の均等、2、財政配分、3、教員確保、4、カリキュラム(教育内容)という4つの視点から調査研究することにより、「フィンランドの地方分権的教育行政は、平等と公正を担保する機能を制度の中にヴィルトインしている」という仮説の検証を試みるものである。研究初年度である今年度は、まず、関連する文献や政策のレビューを行った。特に、研究代表者自身がこれまでに実施した調査のうち、義務教育費や教員給与に関する研究など、本研究と関連の深いものについて、地方分権及び平等・公正を担保するしくみという観点から捉えなおし、実態把握を試みた。また、地方分権化及び教育行政全般に関する政策・施策、カリキュラム(地方カリキュラム及び学校基盤カリキュラム:SBC)等の文献・資料を整理するとともに、これらエビデンスをもとに、フィンランドの教育の地方分権化の実態の解明に取り組んだ。ここで得た成果をもとに、基礎調査となる第1次現地調査の調査計画を立案した。続いて、10月に、第1次現地調査を実施した。当初案では、まず、国レベルでの施策についての調査を行うこととしていたが、文献調査の結果、(1)地域間格差の拡大が認識されつつあること、(2)現在、国が地域間格差を調整するような取組を行っていること、などが明らかとなったため、基礎自治体を対象とする調査に変更した。フィールドとしては、現在、教育予算の削減により、苦境に立たされている中規模都市を選び、自治体の教育局及び基礎学校において、聞き取り調査を行い、特に予算及び教育の質保証の観点から、国と自治体、自治体と学校の関係の解明に取り組んだ。その結果、急激な地方分権化は、景気が最悪の状況において実行されたことから、経済成長を前提とするものであったため、経済が再び行き詰っている現在、大きな問題に直面している状況が明らかになった。本研究は、地方分権化された教育行政・制度を有しながら、平等性・公正性と優秀性を高い水準で達成しているとされるフィンランドの教育システムのあり方を、(1)教育機会の均等、(2)財政配分、(3)教員確保、(4)カリキュラム(教育内容)という4つの視点から調査研究することにより、「フィンランドの地方分権的教育行政は、平等と公正を担保する機能を制度の中にヴィルトインしている」という仮説の検証を試みるものである。本年度は、まず、平成21年度に中央教育行政機関(国家教育委員会)及び地方行政機関(市町村レベルの教育局)において実施した現地調査により設定した「地方分権化から10年を経て徐々に地域間格差が顕在化しつつある」という仮説について、現地の研究者からフィードバックを得た。その過程の中で、現在、教育の提供における責任について、中央と地方の適切なバランスを探る動きが活発化していることが明らかになった。教育内容に関する自治体や学校の自律性を担保することの重要性を認識しつつも、格差拡大を懸念して国の関与の拡大を求める声が高まりつつある現状を踏まえ、今年度は、当初予定していた機関レベルでの調査を来年度へ延期し、代わって、教育行政における中央一地方間の責任及び役割の調整の取組について調査を行った。その結果、フィンランドでは、地方や学校の裁量を侵すことなく、平等性を担保する仕組みとして緩やかなガイドラインの導入を教育行政の諸領域で進めていることが明らかになった。本年度は、昨年度に引き続き、研究初年度の基礎調査を踏まえ設定した「地方分権化から10年を経て徐々に地域間格差が顕在化しつつある」という仮説について、近年における教育政策の分析を通じて検証を試みた。その過程の中で、2008年以降の経済状況の変化、ならびに近年における政局などの影響により、教育行政における国と地方の役割に変化が生まれつつある状況が明らかになった。昨年度は、主に、教育行政機関を対象として調査を実施し、地方や学校の裁量を侵すことなく、平等性を担保する仕組みとして緩やかなガイドラインの導入を教育行政の諸領域で進めていることを明らかにした。

本年は、そのことを踏まえ、中央教育行政機関(国家教育委員会・教育文化省)、地方教育行政機関(市の教育局)、学校という3つのレベルで調査を実施し、その浸透を明らかにした。このことから、フィンランドの地方分権的教育行政では、教育の中身については現場に権限を委譲しつつも、教育の基盤整備における国の責任を明確化し、国がこれを保障することにより、比較的均質な教育の提供を実現させていることが明らかになった。
マウス初代培養細胞を用いた新規未分化型胃がん発がんモデルの確立

マウス由来正常胃オルガノイドの継代成功率は当初低かったが、培地組成を変えることで安定的に培養可能となった。そこで、この培養条件で培養した胃オルガノイドにレンチウイルスを用いて遺伝子を導入し、発がん誘導を行った。具体的には、胃がんで変異頻度の高いTP53, CDH1, KRASに注目し、コンデイショナルマウス由来の胃オルガノイドに、Cre遺伝子あるいはshRNAを導入してこれらの遺伝子異常を再現し、ヌードマウス皮下での腫瘍原性を評価した。特定の遺伝子異常の組み合わせにより組織学的に異なる腫瘍が誘導され、胃オルガノイドへのin vitro遺伝子導入で発がん誘導が可能であることを初めて示した。マウス由来正常胃細胞の継代成功率は20%程度であったが、ある試薬を培地に加えることで安定的に培養可能となった。研究代表者以外の技術者が、同様の培養条件で胃細胞の培養を行っても、安定的に培養可能なことから適切な培養条件である可能性が高い。この培養条件で培養された胃細胞にレンチウイルスを用いて遺伝子を導入し、発がん誘導を行った。Krasの活性化を介した発がん誘導については、Krasの活性化単独やp16, Ptenの発現抑制を組み合わせて行っている。Krasの活性化単独では腫瘍形成に不十分だが、p16の発現抑制を組み合わせることで腫瘍形成が認められた。未分化型胃がんを誘導する上で注目しているCDH1およびTP53において、当初はCdh1とTrp53のshRNAによる発現抑制により発がん誘導を行う計画であった。しかしながら、shTrp53の抑制効率が低いことが比較的高頻度に確認された。そのため、新規にTrp53のコンディショナルノックアウトマウスを購入し、Cre遺伝子のcDNA導入によるTrp53のノックアウトを試みた。ゲノムDNAのPCRにより組換えが確認されたことから、以後Trp53のコンディショナルノックアウトマウスを用いることとした。Trp53ノックアウト単独では腫瘍形成には至らなかったが、Cdh1の発現抑制と組み合わせたところ、ヌードマウス皮下で腫瘍形成がみられた。組織学的には、腺管を形成する高分化な成分を主体に一部びまん性に増殖する成分が認められたことから、びまん性胃がんの発がん過程を模倣している可能性が示唆された。以上、マウス由来正常胃細胞へin vitroでの遺伝子導入により、胃以外の環境でもびまん性胃がんの誘導が可能なことが示唆された。そのため、新規にTrp53のコンディショナルノックアウトマウスを購入し、Cre遺伝子のcDNA導入によるTrp53のノックアウトを試みたため、計画よりやや遅れていた。しかし、このマウス由来正常胃細胞にTrp53のノックアウトとCdh1の発現抑制を組み合わせることで発がん誘導に成功しており、以後順調に進むことが期待される。未分化型胃がんを誘導する上で注目しているCDH1、TP53の遺伝子異常をTrp53のコンディショナルノックアウトマウスの胃オルガノイドおよびCre, shCdh1を用いて再現した。Cre遺伝子のcDNA導入によるTrp53のノックアウト単独では腫瘍形成に至らなかったが、shCdh1によるCdh1発現抑制を組み合わせることで、ヌードマウス皮下で腫瘍形成がみられた。組織学的には高分化な腺癌成分を主体に一部にびまん性に増殖する成分を認めた。この組織像はshCdh1の別クローンを用いた実験においても同様の結果が得られたため、びまん性胃がんの発がん過程を模倣している可能性がある。さらに、1度目の皮下腫瘍を再培養し、ヌードマウス皮下へ再移植するとより短期間で大きな腫瘍を形成し、びまん性増殖を示す腫瘍成分の増加および一部の症例で印環細胞様の腫瘍細胞を認めた。このことから、印環細胞は上皮細胞と遺伝子異常(Cdh1、Trp53)だけでなく、微小環境の影響を受けて誘導されていることが示唆された。一方、マウス胃オルガノイドにTrp53欠失とKras活性化を組み合わせた場合においても、ヌードマウス皮下で充実性腫瘍を形成し腺癌であった。Cdh1を組み合わせた場合に比べて腫瘍が大きく、細胞異型も強い傾向にあった。さらに、Trp53欠失とKras活性化で誘導された皮下腫瘍由来オルガノイドにCdh1の発現抑制を行い、ヌードマウス皮下に再移植したが印環細胞様の変化は認められなかった。以上のように、マウス由来正常胃オルガノイドへのin vitro遺伝子導入で発がん誘導が可能であった。マウス

由来正常胃細胞でTrp53のノックアウトとCdh1の発現を抑制させたオルガノイドをヌードマウス皮下に接種し、腫瘍形成が認められた。組織学的には、腺管を形成する高分化な成分を主体に一部びまん性に増殖する成分が認められた。今後は症例数を増やし再現性の確認とoff-target効果を否定するため複数のshRNAクローンを用いて同様の実験を行う。さらに、我々はこれまでに、1度目の皮下腫瘍を再培養し皮下に再移植すると、高確率でより悪性化した腫瘍を形成することを確認している。そこで、Trp53のノックアウトとCdh1の発現抑制で誘導された1度目の皮下腫瘍を再培養し、再移植することでびまん性増殖を示す腫瘍成分が増えるか確認する。Krasの活性化を介した他の経路による発がん誘導についても再現性を確認する。分子腫瘍学年度末に購入した物品の納品が間に合わなかったため、次年度使用額が生じた。新年度に入り購入した製品が納入されたため、その支払いに使用する。
個体内における電離放射線誘発突然変異成立過程の解明

放射線の生物影響を真に理解するには、分子から細胞レベルの知見から生体内のネットワークとしての組織応答を知ることが必要である。本研究では、新規改変遺伝子導入技術を利用して、放射線影響の可視化定量評価の系をマウス及びメダカで開発した。さらにメダカで細胞増殖能の高い組織の放射線照射後の応答を評価し、マウスとは異なる新規の応答を見いだした。マウスでも胎児期の腸では、成体と異なり、放射線照射後もアポトーシスが誘発されないで、増殖制御が進行するという報告があり、メダカ成体との共通性が示唆される。これによりゲノム損傷ストレスに対する脊椎動物に普遍的な応答解明の基盤が構築された。放射線にたいする生体防護システムとして、DNA二本鎖切断や塩基損傷に対するDNA修復機構と修復を安全に行うための細胞周期チェックポイント制御機構、損傷をもつ細胞を安全に排除するためのアポトーシス機構がネットワーク制御により協調して働いている。主として培養細胞を用いて、その主要な関連遺伝子の同定がされているが、本研究では、以下に挙げる3点を明らかにすることを目的とする。1)各種突然変異体における突然変異生成の組織特異性の違い2)放射線誘発突然変異生成に対する環境因子の影響3)放射線生物影響を修飾する薬剤のスクリーニング法の開発本年度は、以下の成果を上げた。1)p21遺伝子上流域にGFP遺伝子をつないだコンストラクト作成し細胞で放射線照射し、誘導を確認した。(三谷)2)メダカ胚に蛍光色素をマイクロインジェクションして細胞の生体観察を行った。(三谷)3)胚発生中に放射線高感受性を示すricl突然変異体の細胞死とDNA2本鎖切断修復異常を明らかにし、p53変異体の表現系と比較した。(三谷)4)DR-GFPアッセイによりriclには、相同組み換え修復に異常があることが分かったが、コロニー形成法で見ると放射線に対しては野性型よりむしろ抵抗性であることが判明した。(三谷)2)フレームシフト型突然変異を検出するためのGFPユニットを導入したマウスの系統し、臓器のGFP陽性細胞の検出を行った。(野田)3)メダカの突然変異体系統の放射線感受性を比較した。(石川)4)メダカ咽頭歯の細胞増殖を解析した。本研究では、以下に挙げる3点を明らかにすることを目的とする。1)p53変異体メダカの放射線照射後の組織像変化を野生型と比較した.また組織変化を数値化した。p53突然変異体と類似する表現型が阻害剤でも再現することを培養細胞レベルで確認した(三谷)。2)細胞死とクロマチン修飾をフローサイトメーターで定量化して変異体との違いを定量化した(三谷)3)放射線照射後の腸を解析して、発現誘導する遺伝子のスクリーニングを行った(三谷)。4)放射線ひばくにより突然変異細胞が誕生すると、その細胞が生きたまま光る実験系がin vitro及びin vivoにてそれぞれ1系統確立した。マウス個体系では、小腸幹細胞や精巣内の精原細胞の変異誘発と、変異細胞の動態観察が可能となった(野田)5)メダカの突然変異体系統の放射線感受性を比較した。(石川)6)メダカ咽頭歯の放射線照射後の細胞死と細胞増殖を野生型とp53変異体とで比較した(高野)本研究では、モデル生物としてメダカとマウスで放射線に対する生体防護システムの統合的知見を得ることを目指して以下の成果を得た。1)放射線誘発突然変異細胞を可視化測定するモデルマウスの作製(分担野田朝男)放射線応答を可視化測定するメダカモデルの作製(分担三谷啓志)NBS1、53BP1はDNA2本鎖切断修復因子として知られ、損傷部位へと集積し、修復後にDNAから解離することが知られている。NBS1と53BP1とGFPとの融合蛋白質発現コンストラクトを作製し、安定発現培養細胞株を作製した。これらで放射線誘発foci数の定量が可能であることを確認した。3)メダカp53突然変異体組織細胞の放射線応答(分担三谷啓志、藤原(石川智子)p53-/-胚由来細胞のDSB修復は、p53欠損細胞にDSB修復の遅延が見られたが、コロニー形成法では放射線抵抗性を示した。野生型メダカ細胞に哺乳類p53阻害剤であるPifithrin-αを処理したところp53-/-細胞と同様な表現型が観察された。

p53の機能欠損が哺乳類生殖細胞分化の異常を顕在化させるという報告があったが、魚類では放射線が雄性生殖細胞の性転換を増加させ、p53依存性、非依存性の2種類のアポトーシス経路で排除される知見を得た。4)放射線応答のモデル組織としてのメダカ咽頭歯(分担高野吉郎)咽頭歯胚では、細胞交代に伴うと思われるアポトーシスが恒常的に観察されるが5Gy照射ではアポトーシスは誘導されなかった。しかし照射後1日で咽頭歯の数がほぼ半数に減少しており、放射線高感受性組織であることが判明した。放射線誘発突然変異細胞を可視化測定するモデルマウス/メダカの作製マウスX染色体上のHPRT遺伝子をテスターに選定した突然変異(reversion)が生じると細胞が光るマウスモデル系を作製した。HPRTdupGFPノックインマウスは、HPRT遺伝子座における復帰突然変異により体細胞および生殖細胞が生きたまま緑色に光る。X線(3Gy)照射し突然変異細胞の測定が可能となった。DNA修復タンパク質とGFP融合タンパク質の発現コンストラクトを導入し、メダカ細胞でも哺乳類と同様に修復タンパク質の挙動を検出できることを確認した。2)個体におけるDNA修復タンパク質の可視化DNA修復タンパク質(NBS1)の挙動を蛍光タンパク質により個体内でモニターするベクターを開発してメダカに導入して胚細胞での応答を検出する方法を開発した。3)メダカ突然変異体組織細胞の放射線応答性解析p53突然変異体メダカの精巣組織内では、精原幹細胞が位置する場所に、大きな核と核小体が鮮明な卵様細胞が存在していた。γ線照射を行うと、これらの細胞数が一過的に急激に増加し、巨大化する。この細胞は、卵母細胞に特異的に発現する遺伝子群を発現していた。p53の機能欠損が生殖細胞分化の異常を顕在化させるという報告は哺乳類でもあるが、魚類では放射線が雄性生殖細胞の性転換を増加させ、p53依存性、非依存性の2種類のアポトーシス経路で排除されるという報告はこれまで見当たらず、p53遺伝子機能の新しい知見となった。4)放射線応答のモデル組織としてのメダカ咽頭歯細胞増殖とターンオーバーが極めて盛んな組織であるメダカの咽頭歯を対象に、これまで報告のない放射線の増殖分化影響を組織レベルで観察した。系統間で咽頭歯形成に差があることが分かり、系統選抜の再検討を行った。マウスHPRT遺伝子配列を部分的に重複させたコンストラクトを用いて、その3'側にEGFPを挿入した。このコンストラクトを用いて、非相同性末端修復の結果、フレームシフト変異が生じた細胞をEGFP蛍光で検出できるHPRTdupGFPマウスを作製した。マウスとの比較を行うため、マウスHPRT部分重複遺伝子の上流にメダカβアクチンプロモータを相同組換えによって導入した。さらに系統作製の効率化のため、PiggyBacトランスポゾンサイトを加え、また導入個体の識別マーカーとして、眼にBFP蛍光タンパク質遺伝子発現させるコンストラクトをHPRT部分重複遺伝子の5'側に挿入した。3種類のメダカ系統(Hd-rR、SK2、Cab)の受精卵に対して、それぞれ100個程度マイクロインジェクションにより導入を試みたが、いずれも蛍光を観察することができなかった。
サイコパシーの利己的行動に罰が影響を及ぼす可能性の検討

サイコパシー傾向が高い者は友人との交流に際しては公正に振る舞うことを明らかにし、評判の下落のような社会的損失が利己的行動の抑止力となる可能性を示唆した。その一方で、金銭的損失のような罰は効果がなく、罰せられる可能性があろうとなかろうと見知らぬ他者に対して不正な利己的行動をすることを明らかにした。そして、サイコパシー傾向が高い者が不正を行うとき、交感神経系の活動性(皮膚電気反応、心拍数の上昇)が低いことが明らかとなった。身体状態の知覚はサイコパシーによる個人差が見られなかったが、一連の研究の結果から、身体の覚醒状態を引き起こすことがサイコパシーによる利己的行動を抑制する手がかりであるといえる。サイコパシーは冷淡さや衝動性などを特徴とし、犯罪などの反社会的行動と強く関連するパーソナリティである。これまでの研究では、サイコパシーの傾向が高い個人は適切に恐怖を喚起することができず、それが原因で刑罰などに応じた行動の修正ができないと考えられていた。ただし、罰の存在によって喚起された感情や生理的反応の低下が、実際に反社会的行動の原因であることは示されていない。また、罰の側面には、罰金のような実害を伴う側面と、評判の下落のような社会的罰の側面があるが、社会的罰の影響は不明である。このような背景から、本研究では罰の有無や罰の種類に応じた行動と身体反応の関連性におけるサイコパシーの影響を検討することを目的とした。社会的生活の中では、一般的に、公正性を保つために自分の利益を犠牲にすることがある。そのような場面を実験室実験として採用し、サイコパシー傾向が公正な行動に及ぼす影響を検討するために、まず、想定型調査を実施した。調査の参加者は他者との金銭分配を想定し、分配した金額によっては他者から罰を受ける場合と、そのような可能性がない場合を設定した。また、参加者と他者との連続的な関係性の有無を設定した。その結果、他者が罰する可能性があるか否かは、サイコパシー傾向が高くても不公正な行動がほとんど見られなかった。一方で、他者との連続性が想定されるか否かによってサイコパシーの行動の変化が確認され、相手が見知らぬ他者で、罰を受ける可能性がない場合に、サイコパシーによって不公正な行動が多くなることが明らかになった。この結果から、サイコパシーの不公正な行動の背景には、自己の評判が強く影響するものと考えることができる。この結果をもとに、自己の評判の下落という社会的罰を取り入れて実験を行い、行動の選択の際の心臓活動とと脳波を測定し、脳における身体反応の情報処理を検討した。サイコパシーの傾向が高い犯罪者は刑罰などに応じた行動の修正が難しく、サイコパシー傾向が低い者と比べて再犯率が高い。その原因は刑罰に対する恐怖などの感情を適切に喚起させることができないことにあると考えられている。実証的な知見として罰刺激を予期した際の自律神経系の活動がサイコパシー傾向に応じて小さくなるということが挙げられるが、このような身体反応が実際にサイコパシー傾向の高い者における反社会的行動に結びつくのかは明らかではない。このような背景から、本研究では罰の有無に応じた規範逸脱行動の抑制と、その際の身体反応の役割について、サイコパシーの影響を検討することを目的とした。具体的な研究方法として,経済学的ゲームを用い,他者と分け合う金銭の額を決める際の皮膚電気反応と心拍数を測定し,自己記入式質問紙によってサイコパシー傾向を測定した。研究の成果として、まず、罰せられる可能性の有無によらず、サイコパシー傾向によって不平等な金銭分配が行われる頻度が高くなることを明らかにした。そして、これらの際に、皮膚電気活動によって示される交感神経系の活動性がサイコパシー傾向によって低下することが明らかになった。ただし、この交感神経系の活動性の低下は、罰せられる可能性がある状況における不平等な金銭分配と関連しなかった。したがって、これまでの仮説とは異なり、罰に対する感受性の低下はサイコパシーの特徴ではあるが、それが直ちに反社会的行動に結びつくものではないことを意味する。その一方で、罰せられる可能性がない場合では、交感神経系の活動がサイコパシー傾向による不平等な金銭分配を媒介することが統計的に認められた。このことは,規範逸脱に伴う内罰的な機能の低下がサイコパシーによる規範逸脱の原因であることを示唆する。当初の計画通り、外部研究機関の協力のもとでデータを集めることができている。データについては解析の途中であるが、別に実施した

予備的調査では仮説を裏づける結果が認められ、本実験による分析結果においても期待された結果を得ることができるという見通しが可能である。27年度が最終年度であるため、記入しない。社会生理心理学研究計画のとおり、脳波を測定して利己的行動における身体活動の情報処理の影響を捉えるという本研究の目的を達成するために、研究代表者の所属機関外の研究者の協力を得て、比較的大規模な生体信号計測装置を使用する研究を行う。また、研究代表者の所属機関に生体信号計測装置を導入したことにより、所属機関での予備的研究が可能となった。これにより、実験の手続きなどに関する問題点の有無を早期に検討することができ、予定される所属機関外の大規模装置を用いた研究を効率的に遂行することができる。実験デザインの洗練性や実験結果の予測性を高め、将来的な研究の進展および研究目的の達成をより確実なものとする。
視床下部で発見した分泌タンパク質の生理的意義と作用機序の解明

我々は、鳥類ニワトリの視床下部から分泌性小タンパク質をコードする新規遺伝子を見出し、NPGLと命名した。本研究では、合成NPGLの産出方法の確立、ラットとマウスにおける生理的意義と作用機序を解明する研究を行った。ラットにおいて、NPGLは摂食行動や脂肪組織重量の増加を引き起こすことが分かった。絶食や血中インスリンレベルの低下により遺伝子発現が増加した。次に、マウスを用いて、NPGL遺伝子の発現分布や局在解析を行った。マウスでは視床下部の弓状核尾側部に発現し、その神経線維は同じく弓状核のa-MSHニューロンへ投射していることが分かった。さらに、NPGLを脳室内投与した結果、摂食行動を亢進した。我々は、鳥類や哺乳類の視床下部から分泌性タンパク質をコードしている新規遺伝子を発見している。この分泌性タンパク質を合成し、成熟ラットの脳室内へ慢性投与すると、体重増加量の減少と脂肪蓄積効果が認められた。さらに、アデノ随伴ウイルスを用いた前駆体遺伝子の過剰発現解析の結果、下垂体中の成長ホルモンmRNA量が減少していた。成長ホルモンは、成長のみならず、脂肪分解に関与していることが知られている。以上の結果から、新規分泌性タンパク質は、成長ホルモンの合成・分泌を抑えることで成長遅延と脂肪蓄積が生じているのではないかと予測し、本研究ではその可能性を検討した。平成26年度の研究では、成長ホルモンとの相互作用を解析する目的で、より成長段階である幼弱ラットを用い、過剰発現系における表現型解析を行った。その結果、脳下垂体中の成長ホルモンmRNA発現量、血中の成長ホルモン、さらに血中のインスリン様成長ホルモン(IGF-1)には対照群と比較して変化は認められなかった。しかしながら、顕著な体重増加抑制効果が認められ、体長、筋肉量、臓器重量も減少していた。一方で、皮下脂肪である鼠経部脂肪の蓄積が亢進していた。以上の結果から、新規分泌性タンパク質は、成長ホルモンの合成や分泌に影響を与えることなく、成長遅延と脂肪蓄積を促す作用があることが明らかとなった。今回の研究は、付加的な実験結果であるため、今後は本来発現している遺伝子の機能低下を生じさせ、生じる表現型を解析していく予定でいる。我々は、鳥類や哺乳類の視床下部から分泌性の小タンパク質をコードしている新規遺伝子を発見し、その機能解析を進めている。ラットを用いて前駆体遺伝子の過剰発現や小タンパク質の慢性投与実験により、成長抑制や脂肪蓄積が生じることを明らかにしている。昨年度の研究により、成長ホルモンやインスリン様成長因子へは影響を及ぼさずに、成長を抑制していることを見出している。本年度は、マウスを用い前駆体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを用い、表現型解析を行うことで、新規遺伝子の機能解析を行った。ユビキタスに過剰発現が生じるCMVプロモーターに新規遺伝子を連結したトランスジェニックマウスを産出した。その後、約26週間飼育し、表現型をコントロールマウスと比較した。摂食量には変化は見られないが、体重が若干重かった。興味深いことに、白色脂肪組織の重量が増加した。しかし、肝臓と褐色脂肪組織の重量には変化が見られなかった。さらに、肝臓、褐色脂肪組織、白色脂肪組織における脂肪合成及び脂肪酸化酵素の遺伝子発現レベルを解析したところ、褐色脂肪組織と白色脂肪組織では有意な変化は認められなかったが、肝臓では、脂肪酸化に関わる因子の発現レベルが上昇していた。形態学的解析から、白色脂肪組織と褐色脂肪組織では脂肪細胞の肥大化が生じていたが、肝臓では脂肪蓄積は認められなかった。以上の解析から、新規小タンパク質は、肝臓での脂肪蓄積を敢えて生じない様にし、脂肪組織でのみ特異的に脂肪蓄積を促す脳因子であることが明らかになった。前年度までのラットでの解析に加え、マウスでも同様な表現型が生じることを明らかにできた。本研究課題は、新規遺伝子と翻訳産物の分泌タンパク質の生理機能の普遍性を証明することを目的としており、その目的の一つが達成できたと考えている。昨年度までに、前駆体遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、表現型解析を行ってきた。本年度も引き続き、本トランスジェニックマウスを用いて解析を進めたが、繁殖継代を進めるにしたがって、次第に表現型が不明瞭になり、最終的に年度途中でコントロールマウスと差が認められないことがわかった。したがって、途中でこれまで進めてきた解析を断念させなくてはならなくなった。そこで、これまで野生型マウスでの新規遺伝子の解析を行っていなかったことから、原点に立ち返り、野生型マウスでの新規遺伝子及び翻訳産物である小タンパク質の機能解析を進めることとした。形態学的解析や餌によるエネルギー代謝環境を変化させ、遺伝子発現の変動解析を行った。その結果、視床下部の弓状核後外側部でのみ新規小タンパク質が産生されていること、エネルギー状態の悪い時に発現量が増加し、逆に高カロリー食摂餌下では発現量が低下することを見出した。さらに、既知の摂食抑制因子であるプロオピオメラノコルチン(POMC)産生ニューロン上に新規小タンパク質の神経線維が投射していることを見出した。最後に、脳室内に新規小タンパク質を投与すると、摂食亢進作用があることが示された。

以上の解析から、新規小タンパク質は、POMCニューロンの活動を低下させ、摂食亢進作用を示すことが示唆された。トランスジェニックマウスを用いた解析を途中で放棄せざるを得なくなったが、野生型マウスを用い、新規小タンパク質の生理機能及び作用機序の解明を達成できたため。我々は、鳥類や哺乳類の視床下部から分泌性の小タンパク質(NPGLと命名)をコードしている新規遺伝子を発見し、その機能解析を進めている。これまで、鳥類のニワトリ、哺乳類のマウスとラットで解析を進めてきた。平成29年度は、研究最終年度であるため、論文投稿・受理へ向けた再現性確認、論文投稿作業、論文リバイスへ向けた実験を行った。まず、ニワトリのヒナを用いた先行研究では、NPGLを皮下に投与すると、摂食量に影響を及ぼさないものの体重増加作用を見出した。NPGLは脳内の視床下部領域特異的に発現しているため、脳へ作用させた際の影響を調べる必要があった。NPGLをニワトリ・ヒナの脳室内へ慢性的に投与する系を立ち上げ、慢性投与を行った。その結果、摂食量、飲水量、体重を増加させる作用が認められ、NPGLが摂食や成長に関与していることを見出した。マウスにおいては、前年度にNPGL神経線維の視床下部内での投射部位を解析したところ、POMCニューロンに投射していることを見出している。そこで、脳室内にNPGLを投与して摂食行動を解析したところ、摂食量を増加することを見出した。最後に、ラットを用いた解析から、普通食ではNPGLの摂食亢進作用は弱いが、高ショ糖高脂肪食の高カロリー食摂餌かでは、顕著な摂食亢進作用を示すことを見出した。以上の解析から、NPGLは鳥類や哺乳類で共通して、摂食行動を含むエネルギー代謝調節に関与している可能性が示唆された。我々は、鳥類ニワトリの視床下部から分泌性小タンパク質をコードする新規遺伝子を見出し、NPGLと命名した。本研究では、合成NPGLの産出方法の確立、ラットとマウスにおける生理的意義と作用機序を解明する研究を行った。ラットにおいて、NPGLは摂食行動や脂肪組織重量の増加を引き起こすことが分かった。絶食や血中インスリンレベルの低下により遺伝子発現が増加した。次に、マウスを用いて、NPGL遺伝子の発現分布や局在解析を行った。マウスでは視床下部の弓状核尾側部に発現し、その神経線維は同じく弓状核のa-MSHニューロンへ投射していることが分かった。さらに、NPGLを脳室内投与した結果、摂食行動を亢進した。当初、平成27年度に計画していた研究内容も平成26年度に遂行することができた。成長ホルモンへの関与を予想していたが、それを支持しない結果を得た。したがって、選択肢が減り、今後の解析がよりスムーズに進むものと考えられる。今後は、ラットとマウスで得られた脂肪蓄積の分子的な作用メカニズムを解明したいと考えている。そのために、ゲノム編集技術を用いたノックアウト動物での解析を進める予定でいる。さらに、既知の因子との相関に関しても解析を行っていく予定でいる。
IL-23産生腸管粘膜マクロファージのクローン病病態への関与

a)LPMC中のTh17抑制因子および産生細胞の同定。予備検討としてIL-23のクローン病粘膜固有層単核細胞(以下LPMC)および単離した粘膜固有層CD4+T細胞今の影響について検討を行った結果、CD4+T細胞からはIL-23刺激によりTh1サイトカインIFN-γ、およびTh17サイトカインIL-17の産生が亢進した。しかしながらLPMCではIFN-γのみ誘導されIL-17の誘導は認めら九なかった。このLPMC中に認められるIL-17産生抑制因子について検討を行った結果、Th1サイトカインであるIFN-γ、およびIL-12存在下では単離した粘膜固有層CD4+T細胞からのIL-17産生は著明に抑制されることが明らかになった。以上より、クローン病腸管粘膜固有層CD4+T細胞はIFN-γ, IL-17双方の産生能を有するものの、クローン病粘膜局所におけるNK細胞などから産生される過剰なIFN-γをはじめとするTh1優位な炎症環境がIL-17誘導を抑制し、結果としてIL-23刺激においてもIL-17よりむしろIFN-γが強く誘導されると考えられる。b)腸内細菌刺激により誘導されるIL-23補助因子の同定。クローン病腸管CD4+T細胞をIL-23で刺激すると多量のIFN-γ産生が認められる。本研究でIL-23と協調的に働く因子について検討編した結果、炎症性サイトカインであるTNF-α, IL-1βがIL-23との共刺激により腸管CD4+T細胞から過剰なIFN-γ, IL-17を引き起こすことが明らかになった。一方でIL-6にはこのような相乗作用は認められなかった。以上より、腸管粘膜局所では腸内細菌などの刺激により活性化した腸管マクロファージから産生されるIL-23がTNF-αやIL-1βと協調的に働き、T細胞の過剰な活性化、IFN-γ産生誘導を介してクローン病の病態に寄与していることが示唆された。
糖尿病性腎症におけるリハビリテーション運動療法の有効性の機序解明

糖尿病性腎症モデルラットに対する長期的運動(EX),アンジオテンシンII受容体拮抗薬losartan (LOS)の併用療法による,運動耐容能,腎機能,腎組織障害,蛋白尿(UP),骨格筋線維組成,骨格筋毛細血管新生,骨格筋酸化能,骨代謝速度,骨塩密度に対する影響を検討した.【方法】後藤-柿崎ラットに片腎摘手術を行い,高カロリー食と30%ショ糖溶液を与えた.UPが300mg/dlを超えた後に4群に分け[(1)非治療(C)群,(2)EX群,(3)LOS(5mg/kg/日)群,(4)EX+LOS群],12週間治療した.EXは速度20m/分の連続走行を1回60分間,1週間に5回行った.2週間毎に収縮期血圧(SBP),4週間毎にUPを測定し,最終日に断頭採血,残存腎および長趾伸筋摘出を行った.EX開始前と12週間後にトレッドミルテストを行い,総走行可能距離(TRD)を評価した.残存腎では糸球体硬化指数(IGS)と皮質間質容積比(RIV)を算出した.また,3種の抗体(ED-1,WT-1,α-SMA)で染色し,マクロファージ,足細胞,平滑筋の様態を評価した.更に,長趾伸筋のタイプI線維比,毛細血管/筋線維比(C/F),毛細血管密度(CD)を解析した.【結果】速度20m/分走行時の酸素摂取量は最高酸素摂取量の約75%であった.EX,LOS,EX+LOS群のUP,IGS,RIVはC群に比して有意に改善した.特にEX+LOS群のIGS,ED-1発現,α-SMA発現は他の3群に比較して最も低値を示し,WT-1発現は最も高値であった.EX,EX+LOS群のTRDはCおよびLOS群に比較して有意に長距離であった.更に,EX,EX+LOSは有意な毛細血管新生効果とタイプI線維増加効果を示した.【結論】EXによる持久力増強作用,EXとLOSによる腎保護作用,EXとLOSの併用による腎保護作用の増強効果が示唆された.また,EXとLOSは糸球体でのマクロファージ浸潤や線維芽細胞増殖を抑制し,メサンギウム細胞の活性化や足細胞の分化に影響を与えて腎保護効果を発揮する可能性が示唆された.更に,EXは,体力(持久力)の改善に重要なタイプI線維比や毛細血管を増加させることが示唆された.以上のように,糖尿病性腎症における運動療法の有効性の機序を解明する重要な知見が得られた.糖尿病性腎症モデルラットに対する長期的運動(EX),アンジオテンシンII受容体拮抗薬losartan (LOS)の併用療法による,運動耐容能,腎機能,腎組織障害,蛋白尿(UP),骨格筋線維組成,骨格筋毛細血管新生,骨格筋酸化能,骨代謝速度,骨塩密度に対する影響を検討した.【方法】後藤-柿崎ラットに片腎摘手術を行い,高カロリー食と30%ショ糖溶液を与えた.UPが300mg/dlを超えた後に4群に分け[(1)非治療(C)群,(2)EX群,(3)LOS(5mg/kg/日)群,(4)EX+LOS群],12週間治療した.EXは速度20m/分の連続走行を1回60分間,1週間に5回行った.2週間毎に収縮期血圧(SBP),4週間毎にUPを測定し,最終日に断頭採血,残存腎および長趾伸筋摘出を行った.EX開始前と12週間後にトレッドミルテストを行い,総走行可能距離(TRD)を評価した.残存腎では糸球体硬化指数(IGS)と皮質間質容積比(RIV)を算出した.また,3種の抗体(ED-1,WT-1,α-SMA)で染色し,マクロファージ,足細胞,平滑筋の様態を評価した.更に,長趾伸筋のタイプI線維比,毛細血管/筋線維比(C/F),毛細血管密度(CD)を解析した.【結果】速度20m/分走行時の酸素摂取量は最高酸素摂取量の約75%であった.EX,LOS,EX+LOS群のUP,IGS,RIVはC群に比して有意に改善した.特にEX+LOS群のIGS,ED-1発現,α-SMA発現は他の3群に比較して最も低値を示し,WT-1発現は最も高値であった.EX,EX+LOS群のTRDはCおよびLOS群に比較して有意に長距離であった.更に,EX,EX+LOSは有意な毛細血管新生効果とタイプI線維増加効果を示した.【結論】EXによる持久力増強作用,EXとLOSによる腎保護作用,EXとLOSの併用による腎保護作用の増強効果が示唆された.また,EXとLOSは糸球体でのマクロファージ浸潤や線維芽細胞増殖を抑制し,メサンギウム細胞の活性化や足細胞の分化に影響を与えて腎保護効果を発揮する可能性が示唆された.更に,EXは,体力(持久力)の改善に重要なタイプI線維比や毛細血管を増加させることが示唆された.以上のように,糖尿病性腎症における運動療法の有効性の機序を解明する重要な知見が得られた.糖尿病性腎症モデルラットに対する長期的運動の運動

耐容能、腎機能、腎組織障害、尿蛋白排泄量(UP)、骨格筋線維組成、骨格筋毛細血管密度、骨格筋酸化能、骨代謝速度、骨塩密度に対する影響。【方法】後藤-柿崎ラットを手術し、片腎を摘出した。術後より高カロリー食と30%ショ糖溶液を与え、1週間毎に血糖値とUPを測定して経過観察した。各々の値が200mg/dl以上かつ300mg/dl以上に達した時点でトレッドミル運動負荷試験(TT)と呼気ガス分析を行った後、12週間にわたる長期的運動療法を開始した。運動はラット用トレッドミル装置を用いて、速度20m/分の走行を、1日1回60分間ずつ、1週間に5回実施した。定期的に収縮期血圧(SBP)、体重、摂食量、尿量、UPを測定し、最終週には、TTにて運動耐容能を評価した後に断頭採血を行い、血清クレアチニン値(SCr)、血液尿素窒素値(BUN)を測定した。また、腎を病理組織学的に検討し、糸球体硬化指数(IGS)、relative interstitial volume(RIV)を算出した。また、心、大動脈、ヒラメ筋、長趾伸筋、大腿骨を摘出した。【結果】本モデルラットにおいて、速度20m/分で走行時の酸素摂取量(VO_2)はpeakVO_2の75%であった。長期的運動群と運動をしない対照群のSBPに差異を認めなかった。長期的運動群のUPは対照群に比較して有意に低値を示した。長期的運動群のTTにおける走行可能距離は対照群に比較して有意に長距離であった。長期的運動群のIGSとRIVは対照群に比較して有意に低値を示した。【結論】糖尿病性腎症モデルラットにおける長期的運動療法の腎保護効果が示唆された。また、その腎保護効果は全身血圧の変化を介さずにもたらされることが示唆された。さらに、長期的運動による運動耐容能(持久力)増強効果が示唆された。以上より、まだ解析は半ばであるが、糖尿病性腎症における運動療法の有効性の機序を解明する手がかりが得られた。糖尿病性腎症モデルラットに対する長期的運動(EX),アンジオテンシンH受容体拮抗薬losartan(LOS)の併用療法による,運動耐容能,腎機能,腎組織障害,蛋白尿(UP),骨格筋線維組成,骨格筋毛細血管密度,骨格筋酸化能,骨代謝速度,骨塩密度に対する影響を検討する.【方法】後藤-柿崎ラットに片腎摘手術を行い,高カロリー食と30%ショ糖溶液を与えた.UPが300mg/dlを超えた後に4群に分け[(1)非治療(C)群,(2)EX群,(3)LOS(5mg/kg/日)群,(4)EX+LOS群],12週間治療した.EXは速度20m/分の連続走行を1回60分間,1週間に5回行った.2週間毎に収縮期血圧(SBP),4週間毎にUPを測定し,最終日に断頭採血,残存腎および長趾伸筋摘出を行った.EX開始前と12週間後にトレッドミルテストを行い,総走行可能距離(TRD)を評価した.残存腎では糸球体硬化指数(IGS)と皮質間質容積比(RIV)を算出した.また,3種の抗体(ED-1,WT-1,α-S漁)で染色し,マクロファージ,足細胞,平滑筋の様態を評価した.更に,長趾伸筋のタイプI線維比,毛細血管/筋線維比(C/F),毛細血管密度(CD)を解析した.【結果】速度20m/分走行時の酸素摂取量は最高酸素摂取量の約75%であった.EX,LOS,EX+LOS群のUP,IGS,RIVはC群に比して有意に改善した.特にEX+LOS群のIGS,ED-1発現,α-SMA発現は他の3群に比較して最も低値を示し,WT-1発現は最も高値であった.EX,EX+LOS群のTRDはCおよびLOS群に比較して有意に長距離であった.更に,EX,EX+LOSは有意な毛細血管増加効果とタイプ1線維増加効果を示した.【結論】
二光子顕微鏡による小脳神経細胞集団のCa2+シグナル測定と計算論的解析

二光子顕微鏡と高速共焦点顕微鏡を用いて、小脳皮質のCa2+蛍光イメージングを試みた。後足に電気ショックを与えると、小脳プルキンエ細胞樹状突起でCa2+蛍光強度が一過的に増加した。自発的発火では、隣り合ったプルキンエ細胞が同期して活動していた。この同期は、介在ニューロンのstellate細胞とも相関があり、頭尾方向により強い相関が見られた。同期範囲は、顕微鏡視野内では境界が見つからなかった。脳がどのように情報処理をしているのかを明らかにするために、二光子顕微鏡で麻酔下マウスの小脳皮質の細胞集団のカルシウム活動を観測した。カルシウム蛍光色素を直径500ミクロンの範囲の神経細胞に導入した。小脳プルキンエ細胞の樹状突起部で自発的カルシウム活動を捉え、この活動は隣のプルキンエ細胞と著しく同期して活動することを見つけた。隣のプルキンエ細胞という空間解像度レベルでの同期は、現時点ではカルシウムイメージングのみ観測できるものであり、プルキンエ細胞の入力元の下オリーブ核の電気活動が同期しているという知見とも合致する。次に、マウスに自然刺激を与えて、カルシウム応答が見えるか調べた。使った刺激は光、髭と眼へのエアパフ、白色ノイズ音、後足への電気刺激であった。今までの時点でカルシウム応答を見いだしたのは、後足への電気刺激のみであった。刺激の200ミリ秒以内にカルシウム応答があらわれた。1試行だけでは、カルシウム活動が自発的なものか刺激依存なものか判別できないので、数十回の試行のカルシウム応答の平均を求めた。また、ニポウ型ディスクの高速共焦点顕微鏡でも、二光子顕微鏡と同様のカルシウム活動を見いだすことができた。高速共焦点顕微鏡では、顕微鏡視野全体を毎秒30枚で取得できるので、広い範囲でのカルシウム活動パターンを捉えることができる。また、データ量が膨大になるので、解析の自動化が必要になってきた。画像処理の技術により、目的の形の細胞を関心領域として自動的に抽出できるようにした。自動化により、リアルタイム解析の結果に応じて自動的に刺激の種類や強さを変えるという、一種のブレイン・マシン・インターフェイスの手法の基盤が整った。Ca2+イメージングにおいて、二光子顕微鏡とニポウ型ディスク高速リアルタイム共焦点顕微鏡へ容易に光路を切り替えられるように測定系を改善した。麻酔下のマウス小脳皮質において、二光子顕微鏡で詳細な神経回路の立体構造を調べてから、リアルタイム共焦点顕微鏡で高速(30Hz)かつ広範囲(300マイクロメートル四方)にCa2+活動を調べることができるようになった。Ca2+イメージングの結果、全体的に小脳皮質の細胞は一斉に活動しており、とりわけ縦方向(頭尾方向)でCa2+活動に強い相関があることが分かった。つまり、縦方向に並んだ細胞は、同じタイミングで活動しているということである。また電気生理とCa2+イメージングの同時記録により、登上線入力による電気活動とCa2+活動が対応することを確かめた。この縦方向の同期は、強力な登上線維入力の元にある下オリーブ核が同期していること、1本の登上線維は縦方向に並んだプルキンエ細胞に入力しているという過去の知見と合致する。過去の電気生理実験では、複数の神経細胞活動を調べようとしても、電極間距離が数百マイクロメートルも離れており、電極の個数も限界があった。高速Ca2+イメージングにより初めて、近くの隣り合う細胞での活動が比較できるようになった。また、プルキンエ細胞と、分子層の介在ニューロンであるstellate細胞の活動を比較した。同じ種類の細胞同士だけでなく、プルキンエ細胞とstellate細胞でも、縦方向に並んだ細胞は相関が高かった。Stellate細胞が登上線維入力を受けるという報告は、スライス電気生理実験や覚醒ラットの電気生理実験より示唆されていたが、実際の脳で登上線維からstellate細胞へ入力があるか不明であった。高速かつ広範囲のCa2+イメージングによって、生きたマウスでstellate細胞が登上線維入力を受けて活動している可能性が高まったCa2+イメージングにおいて、二光子顕微鏡とニポウ型ディスク高速リアルタイム共焦点顕微鏡へ容易に光路を切り替えられるように測定系を改善した。また、電気生理とCa2+イメージングの同時記録により、登上線維入力による電気活動とCa2+活動が対応することを確かめた。