hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺癌・中皮腫の微小環境に着目したベバシズマブの耐性関連バイオマーカーの探索

本研究では、がん治療における血管新生阻害薬(ベバシズマブ)の耐性メカニズムを解明することを目的とした。マウスモデルを用いた検討で、ベバシズマブ獲得耐性には宿主側の線維芽細胞増殖因子(FGF2)が重要な役割を果たしており、その産生細胞として線維細胞を同定した。ヒト臨床検体を用いた検討でもベバシズマブ投与後に手術した群では、手術単独群や術前化学療法のみの群に比べ有意に腫瘍組織内の線維細胞数が増加していた。以上より、線維細胞は血管新生阻害薬耐性克服のための新たな治療標的となり得る可能性が示唆された。本研究では、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞(Y-MESO-14細胞)同所移植モデルマウスを用いて、血管新生阻害剤(抗VEGF抗体ベバシズマブ)の耐性メカニズムを解明することを目的としている。既に、上記マウスモデルでベバシズマブ治療実験を行うと獲得耐性現象が認められ、耐性化した腫瘍には宿主側のfibroblast growth factor (FGF2)が有意に増加していることを確認している。平成26年度はベバシズマブ獲得耐性におけるhost FGF2の重要性の検証およびその産生細胞の同定を行った。FGF2がベバシズマブ耐性化に寄与しているか否かについて、FGF受容体阻害薬(BGJ-398)を用いて、ベバシズマブとの併用効果について検討した。Y-MESO-14細胞を胸腔内に移植後、7日目からベバシズマブによる治療を開始し、21日目から35日目にかけてBGJ-398を連日経口投与した。その結果、併用治療群においては単剤治療群よりもさらに生存期間の延長を認めた。以上から、本モデルにおけるベバシズマブ耐性化に腫瘍内のFGF2産生が寄与していることが明らかとなった。次に、FGF2産生細胞について検討を行った。これまでの報告から、ベバシズマブ耐性化に関与する細胞としてMyeloid-derived suppressor cells (MDSC)やマクロファージが報告されている。そこで、MDSCのマーカーであるGr-1、マクロファージのマーカーであるCD68とF4/80による免疫染色を行った。しかしながら、いずれのマーカー発現細胞もFGF2との共染色をほとんど示さなかった。一方、FGF2はCXCR4およびタイプIコラーゲン染色と共染色を示し、これらのマーカー発現から、FGF2を発現する主な細胞はfibrocyteであることが明らかとなった。実際に、タイプIコラーゲンとCXCR4の二重染色法では、両マーカーを発現するfibrocyteと考えられる細胞が、ベバシズマブ耐性腫瘍内で約2倍に増加していた。本研究では、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞同所移植モデルマウスを用いて、血管新生阻害剤(ベバシズマブ)の耐性メカニズムを解明することを目的としている。初年度(平成26年度)にはベバシズマブ獲得耐性における宿主側の線維芽細胞増殖因子(FGF2)の重要性の検証およびその産生細胞の同定を行った。FGF受容体阻害薬をベバシズマブに併用した治療実験の結果、本モデルにおけるベバシズマブ耐性化に腫瘍内のFGF2産生が寄与していることが明らかとなった。FGF2産生細胞の同定については、マウスから採取したベバシズマブ耐性化腫瘍を用いて、様々なマーカーを用いて免疫染色を行った。FGF2はCXCR4およびタイプIコラーゲン染色と共染色を示し、これらのマーカー発現から、FGF2を発現する主な細胞はfibrocyteであることが明らかとなった。このことから、ベバシズマブ獲得耐性には宿主側FGF2が重要であり、その産生細胞としてfibrocyteが同定された。平成27年度では、まず、マウスモデルにおいて、ベバシズマブ耐性化腫瘍におけるfibrocyteの集積メカニズムの検討を行い、ベバシズマブ投与によって惹起された低酸素環境ががん細胞のCXCL12発現を亢進させ、CXCL12/CXCR4 axisを介してfibrocyteが腫瘍内に遊走することを明らかにした。また、マウスモデルで認められた現象がヒトでも認められるか否かについて、ベバシズマブ投与後に手術に至った症例の手術検体を用いて、ヒト肺癌組織中のfibrocyteの集積について検討した。結果、ベバシズマブ投与後に手術した群では、手術単独群や術前化学療法のみの群に比べ有意に腫瘍組織内のFGF2産生細胞数およびfibrocyte数が増加していた。以上より、fibrocyteが抗VEGF治療耐性化のバイオマーカーとなり得る可能性が示唆された。当初の予定では、平成27年度以降は次の3項目について重点的に検討することとしていた。1.マウスモデルにおいて抗VEGFおよび抗FGF2併用療法における耐性メカニズムを明らかにする。2.ヒト肺癌組織内において、宿主側FGF2がどの細胞から産生されているのかを単球、線維芽細胞、好中球等の表面マーカーとFGF2を免疫染色することで検討し、責任細胞を同定する。3.ベバシズマブ耐性における初期耐性の関与について検討する。2.については既に結果が出ており、これまでの結果と併せて誌上発表を行った。1.3.についても既に研究を開始している。よって研究はおおむね順調に進展していると考えている。これまでの検討から、以下のことが明らかとなった。1)ベバシズマブ獲得耐性には宿主側の線維芽

細胞増殖因子(FGF2)が重要な役割を果たしており、ベバシズマブにFGF受容体阻害剤を併用することでVEGF阻害に対する獲得耐性が一部克服された。2)FGF2産生細胞の同定については、マウスから採取したベバシズマブ耐性化腫瘍を用いて、様々なマーカーを用いて免疫染色を行った。これらのマーカー発現から、FGF2を発現する主な細胞はfibrocyteであることが明らかとなった。このことから、ベバシズマブ獲得耐性には宿主側FGF2が重要であり、その産生細胞としてfibrocyteが同定された。3)Fibrocyteが関わるベバシズマブ獲得耐性のメカニズムとして、CXCL12/CXCR4 axisが同定された。すなわち、ベバシズマブ投与によって惹起された低酸素環境ががん細胞のCXCL12発現を亢進させ、CXCL12/CXCR4 axisを介してfibrocyteが腫瘍内に遊走することを明らかにした。4)マウスモデルで認められた現象がヒトでも認められるか否かについて、ベバシズマブ投与後に手術に至った症例の手術検体を用いて、ヒト肺癌組織中のfibrocyteの集積について検討した。結果、ベバシズマブ投与後に手術した群では、手術単独群や術前化学療法のみの群に比べ有意に腫瘍組織内のFGF2産生細胞数およびfibrocyte数が増加していた。以上より、fibrocyteが抗VEGF治療耐性化のバイオマーカーとなり得る可能性があること、また、fibrocyteは血管新生阻害薬耐性克服のための新たな治療標的となり得る可能性が示唆された。本研究では、がん治療における血管新生阻害薬(ベバシズマブ)の耐性メカニズムを解明することを目的とした。マウスモデルを用いた検討で、ベバシズマブ獲得耐性には宿主側の線維芽細胞増殖因子(FGF2)が重要な役割を果たしており、その産生細胞として線維細胞を同定した。ヒト臨床検体を用いた検討でもベバシズマブ投与後に手術した群では、手術単独群や術前化学療法のみの群に比べ有意に腫瘍組織内の線維細胞数が増加していた。以上より、線維細胞は血管新生阻害薬耐性克服のための新たな治療標的となり得る可能性が示唆された。当初の予定では、平成26年度は次の3項目について重点的に検討することとしていた。1.FGF2シグナルを阻害することで、FGF2の血管新生再増生に対する役割を調べる。2.腫瘍組織内において、宿主側FGF2がどの細胞から産生されているのかを単球、線維芽細胞、好中球等の表面マーカーとFGF2を免疫染色することで検討し、責任細胞を同定する。3.FGF2がどのようなメカニズムで宿主細胞から産生されるのか調べる。がん細胞側が何らかの因子を放出してFGF2を産生する宿主細胞を集積している可能性が考えられるため、がん細胞側の遺伝子変化を網羅的に解析することで、その因子の同定を試みる。1.2.については既に結果が出ており、3.についても既に研究を開始している。よって研究はおおむね順調に進展していると考えている。これまでの研究で、ベバシズマブにFGF2 (FGFR)阻害剤を併用することで、ベバシズマブ耐性を一部克服できることを示した。
有機N原料によるInNおよび関連混晶薄膜のMOVPE成長

本研究課題は、平成1920年度実施の本特定領域研究公募研究課題の「有機N原料によるInN薄膜のMOVPE成長」の成果を受けて、さらに発展させることを意図した。本研究の特徴は、有機N原料を有機金属原料とともに用いること、さらに原料間の付加化合物生成の寄生反応を避けるために原料の分離供給法を採用することにある。研究期間内において、MOVPE成長InN薄膜の高品質化を伝導性制御も含めて追求するとともに、作製する材料をInGaNおよびInAlNなどInリッチ窒化物混晶へ発展させること、またガス質量分析器を用いて反応系の詳細を明らかにし、寄生反応を回避する有効な反応経路を明らかにすることを目的とした。最終年度である平成22年度においては、下記各項目に示す成果を挙げた。1)細管により成長領域へ直接導入するガス種がTMInである場合およびDMHyである場合のそれぞれにおいて、成長特性の成長温度、V/III比、圧力依存性、TMIn供給量依存性を明らかにするとともに、最適細管先端位置の確定、および実効的V/III比など、その決定要因を明らかにした。とくに、成長温度500°C570°CにおいてInN成長が効率的に進行することを明らかにした。2)六方晶InNがサファイア基板上において単一ドメインで、[10-10]InN//[11-20]sapphireのエピタキシャル関係で成長することを、広い成長条件の範囲で確立した。3)サファイア基板上にGaN層を形成したGaN擬似基板上へのInN成長において、InNウィスカーないしInN微粒子結晶が成長する性状を明らかにした。4)質量分析器による反応ガス分析システムを活用し、有機N原料として用いるジメチルヒドラジン(DMHy)の熱分解特性を明らかにした。これらの成果は、InNにもとづく光・電子デバイスを実用化するための高品質InN薄膜を、MOVPEにより実現することの可能性を強く示唆するものとなった。本研究課題は、平成1920年度実施の本特定領域研究公募研究課題の「有機N原料によるInN薄膜のMOVPE成長」の成果を受けて、さらに発展させることを意図している。本研究の特徴は、有機N原料を有機金属原料とともに用いること、さらに原料問の付加化合物生成の寄生反応を避けるために原料の分離供給法を採用することにある。研究期間内において、MOVPE成長InN薄膜の高品質化を伝導性制御も含めて追求するとともに、作製する材料をInGaNおよびInAlNなどInリッチ窒化物混晶へ発展させること、またガス質量分析器を用いて反応系の詳細を明らかにし、寄生反応を回避する有効な反応経路を明らかにすることを目的としている。平成21年度は、下記各項目に示すように、原料ガスの分離供給法における詳細なInN成長特性をさらに明らかにした。1)細管により成長領域へ直接導入するガス種がTMInである場合およびDMHyである場合のそれぞれにおいて、成長特性の成長温度、V/III比、圧力依存性、TMIn供給量依存性を明らかにするとともに、最適細管先端位置が存在することを見い出し、実効的V/III比などの影響を明らかにした。とくに、成長温度500°C570°CにおいてInN成長を確認した。3)サファイア基板上にGaN層を形成したGaN擬似基板上へのInN成長において、InNウィスカーないしInN微粒子結晶が成長することを見出した。4)質量分析器による反応ガス分析システムを導入し、基本性能の確認を進めた。これらの成果は、InNにもとづく光・電子デバイスを実用化するための高品質InN薄膜を、MOVPEにより実現することの可能性を強く示唆するものとなっている。

4)質量分析器による反応ガス分析システムを活用し、有機N原料として用いるジメチルヒドラジン(DMHy)の熱分解特性を明らかにした。これらの成果は、InNにもとづく光・電子デバイスを実用化するための高品質InN薄膜を、MOVPEにより実現することの可能性を強く示唆するものとなった。
婦人科腫瘍に対する画像誘導小線源治療の確立に向けた基礎的・臨床的研究

子宮頸癌に対する3次元画像誘導小線源治療法の線量容積ヒストグラムパラメータを解析した。放射線治療は、標準的な本邦の治療スケジュールを用いた。5年局所制御率は、96%、91%、94%と大きさに関わらず良好な制御が得られていた。高リスクCTVのD90が60GyEQD2超は90%、直腸のD2ccが75GyEQD2未満は99%、膀胱のD2ccが90GyEQD2未満は93%と、一定の指標が確認できた。高リスクCTVの輪郭描出コンセンサスを作成するとともに、現在は多施設前向き研究にて本治療の有効性と安全性を評価している。アプリケータの開発:子宮頸癌に対するアプリケータは、腫瘍の大きさや形状が様々であるにもかかわらず、限定的な種類のアプリケータしか有用ではなかった。今回、地元工業メーカーの協力を得て、組織内照射時に従来型の平行な線源配置のみならず、斜めにも線源配置が可能なアプリケータのガイドを試作した。素材は水等価の電子密度で線量計算上も支障はない。腫瘍の進展に応じて右より、左より、直径の太さを変えるなど20種類以上のバリエーションを作成することができた。また、子宮頸癌の腔内照射と組織内照射併用を目的としたアプリケータ挿入トレーニングファントムを作成した。これにより、アプリケータの挿入位置、方向、深さを確認しながら技術の向上を図ることができる。画像誘導前向き観察研究のプロトコール作成と登録開始:適格条件は以下の通りである。1)局所進行子宮頸癌に対する画像誘導小線源治療を行なうことが、診療上、決定した子宮頸癌患者である。2)生検で組織型が扁平上皮癌、腺癌、または腺扁平上皮癌と診断された子宮頸癌である。3)FIGOの臨床病期(2008年)のIIa2期、IIb期、III期、IVa期である。4)CTにて腹部傍大動脈領域に短径1 cm以上のリンパ節が描出されない。5)骨盤部MRIにより計測可能な病変を有する。6)腫瘍の最大径が4 cmを超える。7)年齢は20歳以上75歳以下である。8)Eastern Cooperative Oncology GroupのPerformance Status(PS)が0-2である。9)子宮頸癌に対して手術、化学療法の前治療歴がない。10)主要臓器(骨髄・肝・腎など)の機能が保持されている。11)本人に病名・病態の告知がなされており、かつ本人に同意能力がある。プロトコールの倫理審査委員会通過後に登録を開始した。画像誘導小線源治療法の線量容積ヒストグラムパラメータの解析を行った。対象は、2008年から2011年まで根治目的で3次元画像誘導小線源治療を施行されたFIGO病期IB期からIVA期までの子宮頸癌患者80名である。年齢の中央値は59歳であった。病理組織学的には、扁平上皮癌68名、腺癌11名、未分化癌1名であり、病期別にはIB期18名、II期33名、III期27名、IVA期2名であった。放射線治療は、全骨盤照射50Gy/25fr(進行期に応じて20-40Gy時に中央遮蔽施行)と小線源治療24Gy/4fr(high risk clinical target volume, HR-CTVのD90に対する処方線量)を原則とした。CTによる小線源治療計画では、内診所見およびMRI画像(治療前と小線源治療前)を参照した。シスプラチンベースの化学療法が32名に同時併用された。観察期間の中央値が60か月の時点で、全80名の5年局所制御率、骨盤内制御率、全生存率はそれぞれ94%、91%、86%であった。5年局所制御率は、I期、II期、III-IVA期でそれぞれ94%、97%、90%であり、有意差は認められなかった。5年全生存率は、I期、II期、III-IVA期でそれぞれ89%、97%、72%であり、II期とIII-IVA期の間で有意差が認められた(p=0.006)。Grade 2の晩期有害反応は、直腸に3名、膀胱に4名認められ、Grade3以上の反応はなかった。線量容積ヒストグラムパラメータでは、腫瘍径が4c以下、4-6cm、6cm超の群別にHR-CTVのD90が69GyEQD2, 68GyEQD2, 67GyEQD2と大きな腫瘍に対しても目標線量(>60Gy EQD2)が投与できており、各群の局所制御率も96%、91%、94%と大きさに関わらず良好な制御が得られていた。以上から、子宮頸癌に対する3次元画像誘導小線源治療では、進行期であっても良好な局所制御が得られていた。画像誘導小線源治療法の線量容積ヒストグラムパラメータの解析を行い、現在の前向き試験の背景を確認できたため。画像誘導小線源治療法の線量容積ヒストグラムパラメータの解析:同室内CTを用いた子宮頸癌に対する3次元画像誘導小線源治療の5年治療成績を遡及的に解析した。

病期別にはIB期18名、II期33名、III期27名、IVA期2名であった。放射線治療は、全骨盤照射50Gy/25fr(進行期に応じて20-40Gy時に中央遮蔽施行)と小線源治療24Gy/4fr(high risk clinical target volume, HR-CTVのD90に対する処方線量)を原則とした。観察期間の中央値が60か月の時点で、全80名の5年局所制御率、骨盤内制御率、全生存率はそれぞれ94%、91%、86%であった。5年局所制御率は、I期、II期、III-IVA期でそれぞれ94%、97%、90%であり、有意差は認められなかった。5年全生存率は、I期、II期、III-IVA期でそれぞれ89%、97%、72%であり、II期とIII-IVA期の間で有意差が認められた(p=0.006)。Grade 2の晩期有害反応は、直腸に3名、膀胱に4名認められ、Grade3以上の反応はなかった。線量容積ヒストグラムパラメータでは、腫瘍径が4c以下、4-6cm、6cm超の群別にHR-CTVのD90が69GyEQD2, 68GyEQD2, 67GyEQD2と大きな腫瘍に対しても目標線量(>60Gy EQD2)が投与できており、各群の局所制御率も96%、91%、94%と大きさに関わらず良好な制御が得られていた。以上から、子宮頸癌に対する3次元画像誘導小線源治療では、進行期であっても良好な局所制御が得られていた。現在は多施設前向き研究にて本治療の有効性と安全性を評価している。子宮頸癌に対する3次元画像誘導小線源治療法の線量容積ヒストグラムパラメータを解析した。放射線治療は、標準的な本邦の治療スケジュールを用いた。5年局所制御率は、96%、91%、94%と大きさに関わらず良好な制御が得られていた。高リスクCTVのD90が60GyEQD2超は90%、直腸のD2ccが75GyEQD2未満は99%、膀胱のD2ccが90GyEQD2未満は93%と、一定の指標が確認できた。高リスクCTVの輪郭描出コンセンサスを作成するとともに、現在は多施設前向き研究にて本治療の有効性と安全性を評価している。アプリケータ開発を終え、前向き観察研究も開始できたから。前向き臨床研究の推進(現在目標症例登録数の半分に達している)を行う。放射線腫瘍学これまでの画像誘導小線源治療成績の解析から、DVHパラメータを本邦の標準治療にてらして解析する。また、高リスクCTVのコンセンサスを確立する。治療抵抗性腫瘍に対しては、生検資料を用いたバイオマーカー検索について検討進める。生検資料を用いたバイオマーカー検討に要する試薬等の消耗品の支出がなかったために次年度使用額が生じた。次年度の計画においては試薬等を購入する予定である。
RNA血液診断による自己免疫疾患・病因遺伝子の探求

これまで行われているDNAによる診断は有用であるものの、個人の遺伝情報を読むために倫理的な問題があり、さらに特定の病気にとって重要な環境要因について十分な情報を得ることができないなどの問題を含んでいる。今回我々が開発したRNA血液診断法は問題となる遺伝子の発現量を評価するもので、本法ではこのような問題発生の可能性は低い。我々は本研究期間中に血液中の末梢血単核細胞(PBMCs)から抽出したRNAの発現量に着目した新規の診断法を確立した。具体的には、PBMCsでは発現亢進しているがヒト繊維芽細胞(TIG-1)ではほとんど発現していない290遺伝子を同定し、これらの遺伝子をPREPと名付けた。これらの遺伝子群の内50遺伝子は未解析遺伝子であった。我々は7例の小血管壊死性血管炎であるチャーグ・ストラウス症候群(CSS)という自己免疫疾患患者の血液から抽出したPBMCs由来のRNAを用いた選抜アレイ解析を行った。その結果、微生物の感染後にマクロファージなどによる免疫反応を介した分解防御が起こった形跡と考えられるPREPI35(coactosin様タンパク質)、PREP77(プロサポシン)、PREP191(カテプシンD)、PRPE234(c-fgr)、およびPREP136(リゾチーム)の発現亢進を7例のCSS患者すべてにおいて見出した。別の28遺伝子(これらの幾つかは免疫応答や炎症関連遺伝子)も緩やかながら発現が亢進していた。一方、3遺伝子については、すべてのCSS患者で発現の減少が見られた。これらの結果はPBMCsの選抜マイクロアレイ解析が実用的であり、また低コストでもあることから、臨床の現場で利用できる診断ツールとなりうることを示唆している。慢性リウマチ(RA: Rheumatoid arthritis)患者由来の骨髄液細胞では過剰発現しているが、対照としての変形性関節症(OA: Osteoarthritis)患者骨髄液細胞ではほとんど発現していない遺伝子群を、独自に開発した段階的サブトラクション法(多段差引法)を主とし、DNAチップ解析(Agilent, Hu44K)を補完的に用いて103種類単離・同定し、AURA(Augmented in RA)と包括的に命名して解析した。AURA遺伝子群のうち10個以上は新規な遺伝子で、そのほかは免疫応答、増殖シグナル伝達、細胞骨格、細胞周期、転写、染色体動態、翻訣、タンパク質分解、核酸分解、アポトーシスなどを制御する既知遺伝子であった。単離した遺伝子については個々の患者における転写レベルをリアルタイムPCRによって調べた。このうちAURA9(=AREG,アンフィレギュリン)遺伝子は、OAや健常人に比べて大半の患者で顕著な転写量が上昇していたので、より詳細な解析を進めた。AREGは増殖因子を産生するので、RA患者の末梢血流に大量に流れていることを期待してELISAアッセイを行ったが、1割以下の例外を除いてOAや健常人と同様に、検出限界以下の量しか流れていなかった。RA患者の骨髄液細胞におけるAREGの過剰発現が滑膜細胞の増殖亢進に影響を与えているかを調べるため、RAとOAの患者滑膜組織を採取し、そこから滑膜細胞を培養して調べたところ、OAに比べてRAの滑膜細胞がAREGに対してやや敏感に応答した。ウエスタン法により調べたところ、RAの滑膜細胞ではその下流のMAPカイネース・シグナル伝達経路の構成因子(ERK1/2)のリン酸化が亢進していることが分かった。これらの結果は、このシグナル伝達経路の下流にシノビオリンが存在することを示すと結論した。
哺乳動物のHsp40(DnaJ)相同体による細胞機能制御

現在、Hsp70の分子シャベロン活性はDnaJ(Hsp40)一族のタンパク質がHsp70のATPase活性を促進することによって制御されていることは広く受け入れられている。これまで哺乳動物では10個以上のDnaJ(Hsp40)相同体が同定されている。われわれは最近、Hsp40とHDJ2(HSDJ)の機能を解析するためにHeLa細胞でTce-on遺伝子発現系を確立した。Hsp40およびHDJ2(HSDJ)の発現はドキシサイクリン添加によって誘導され、それは用量および時間依存的であった。ウェスタンブロットで調べてみると、誘導のレベルは対照と比較していずれも2-3倍であった。Hsp40の過剰発現は、Hsp70の誘導レベルで調べたところ、熱ショック応答を抑制していたが、HSDJにはそのような効果はなかった。しかしながら、Hsp40およびHSDJの過剰発現は温熱感受性や温熱耐性の発現には影響がなかった。HSDJは正常温度では細胞質と核のいずれにも局在しており、熱ショックによってもこの局在パターンには基本的には変化がなかった。反対に、Hsp40は正常温度では細胞質に局在しているが、熱ショックによって核および核小体に移行した。Hsp40とHSDJはいずれもほとんどすべての組織で発現しているが、Hsp40は肺、気管支や睾丸で特に強く発現しており、HSDJは睾丸、胸腺、脊髄などで発現が高かった。これらの結果から、Hsp40とHSDJは細胞の中で異なった機能を持っていることが示唆された。
国と自治体の多文化共生の比較研究―インターカルチャリズムとしての多文化共生法学－

本研究は、国と自治体の多文化共生政策の異同をめぐり、日本と諸外国における法令、判例、学説を比較分析し、多文化共生社会を実現するための法制度の検討を目的とする。グローバルな立憲主義を進展させるべく、憲法と人権諸条約との整合的な解釈に配慮しながら、国と自治体の多文化共生法制の背後にある人権規範を考察する基礎研究をベースとする。また、国レベルの移民統合政策指数、自治体レベルのインターカルチュラル・シティ指数などを批判検討し、政策や法制度のあり方を考察する。さらに、インターカルチュラリズムとしての多文化共生法学の理念を解明し、日本における国と自治体の多文化共生政策の今後の展望を示す。
自己免疫性間質性腎炎における標的抗原についての研究

尿細管基底膜(TBM)に対する自己抗体によって発症する間質性腎炎の責任抗原の研究において以下のような結果を得た。(1)ウシTBMから抗尿細管基底膜型間質性腎炎の責任抗原物質(gp54)を精製した。アミノ酸組成とN末端sequenceから,この物質はnon-collagenousな性状をもつ新しい基底膜蛋白であると考えられた。(2)ウシgp54をモルモットに皮下注射し,抗TBM型間質性腎炎の惹起性を組織学的に確認した。(3)gp54に対するモノクロナール抗体(H79)を作成した。この抗体のWistarラットへのin vivo transferでは,この抗体は近位尿細管TBMに結合したが,腎炎惹起性はなかった。この抗体はblottingでポリクロナール抗gp54抗体と同一反応を示し,蛍光抗体法ではWistarラット,SDラットの近位尿細管TBMと反応したが,LewisラットのTBMとは反応しなかった。(4)ウサギ腎mRNAから合成された蛋白と抗gp54抗体とのimmunoprecipitationで,54kDと48kDの蛋白が抗原蛋白として明らかになり,gp54によるcompetition testで54kD,48kDとも減弱した。したがって,両者は別々のmRNAにcodeされ,かつ共通の抗原性をもつ物質と考えられた。
抗腫瘍性マクロリドRhizoxinの構造活性相関研究

Phizoxinは、極めて高い抗腫瘍活性を有している注目すべきマイクロライド抗生物質である。しかし化学的安定性および微生物による産生も悪い。それ故有機合成的アプローチによる構造活性相関研究が最も望ましい。本研究はRhizoxin構造を下図に示したようにRight-half(1)とLeft-half(2)に分け、16員環部分を構築した後側鎖クロモファを結合すべく計画した。3位に置換基を有するGlutarate-typeの対称ジェステルを種々合成し、それらについてPig liver esteraseにより不斉加水分解を検討し、キラルハーフエステルを得たのみ、cyclic hydroborationで目的物1を得た。当初はL-型酒石酸を原料として出発したが、良好な結果が得られず、(S)-β-hydroxy isobutyric acidメチルエステルを出発原料とする合成戦略により2を合成すべく、かなりの進展が見られた。
英・独両国における欧州統合教育に関する研究

1年間の研究の内容は、以下の3点からなる。1.戦後のドイツの政治・経済の教科書におけるヨーロッパ統合に関する記述部分の収集および分析。2.戦後のイギリスの政治・経済の教科書におけるヨーロッパ統合に関する記述部分の収集および分析。3.両国が関与したヨーロッパ評議会によるヨーロッパ教育をめざす諸活動に関する資料の収集および分析。当初は、1.と2.の活動を等しい比重で行う予定であったが、イギリスの教科書の収集が予想外に難航したため、結果的に両国の教科書の比較という本来の目標に代わり、本年度の実質的な研究は3.を中心に進めざるを得なかった。限定的な資料に基づく限りにおいて、計画の時点で仮定された「歴史教科書に見られるのと同様の傾向」が、両国の政治・経済の教科書に対しても推定できるが、特に、イギリスに関して調査対象数が少ないため、現在の時点では結論を下すことはできない。それに対して、3.からは、特に1950年代に、予想を越える両国間の交流が存在したことが明らかになった。その結果、申請者は、イギリスの教育はヨーロッパ統合に消極的であるという従来のイメージは、必ずしも正しいのではないか、という新たな仮説を持つに到った。この仮説の正否を更に解明した上で、改めて、イギリスとドイツの教科書の比較に戻ることが必要であるように思われる。
量子情報通信用のInGaSb系正孔局在型量子ドット構造の開発

有機金属分子線エピタキシ法(MOMBE)を用いてGaAs(001)基板上にType II正孔局在型量子ドット構造を作製した.原料分子との表面反応を制御した成長法により,10^6 cm^<-2>の低密度でサブミクロンサイズのGaAsSbドットを自己組織的に作製できた.TDMASbを用いた選択エッチングにより,頂点は円形の(001)ファセット(直径120nm),側面は{111}と{110}のファセット構造が形成できた.また,高さが6nmで直径が400nmのリング状GaAsナノ構造を自己組織的に形成でき,その上に2個の量子ドットを対で選択的に成長することができた.これは量子ドットの生成が(411)Bファセット上で優先的に生じることを示唆している.本研究で開発した新しい作製プロセスにより,密度および生成位置を制御して正孔局在型量子ドット構造を作製することが可能になった.有機金属分子線エピタキシ法(MOMBE)を用いてGaAs(001)基板上にType II正孔局在型量子ドット構造を作製した.原料分子との表面反応を制御した成長法により,10^6 cm^<-2>の低密度でサブミクロンサイズのGaAsSbドットを自己組織的に作製できた.TDMASbを用いた選択エッチングにより,頂点は円形の(001)ファセット(直径120nm),側面は{111}と{110}のファセット構造が形成できた.また,高さが6nmで直径が400nmのリング状GaAsナノ構造を自己組織的に形成でき,その上に2個の量子ドットを対で選択的に成長することができた.これは量子ドットの生成が(411)Bファセット上で優先的に生じることを示唆している.本研究で開発した新しい作製プロセスにより,密度および生成位置を制御して正孔局在型量子ドット構造を作製することが可能になった.本研究では、量子情報通信用単一量子ドット光源を実現するために、正孔局在型InGaSb系量子ドットの作製技術を開発することを目的とする。量子ドットは、主として基板との格子不整合度を利用したStranski-Krastanov(SK)モードにより作製されるが、ドットの低密度化やその生成位置を制御することが困難である。そこで、表面反応制御による低密度ドットの作製手法と、ナノファセットによるドット生成位置の制御手法の開発を行った。量子ドットの低密度化では、トリスジメチルアミノアンチモン原料を用いて成長表面反応を制御することにより、10^6cm^<-2>台と低密度でサブミクロンサイズのGaAsSbドットを自己組織的に作製する技術を開発した。さらに、ドット表面を選択エッチングし、ドット上部に直径100nm程度の真円形状の(001)ファセットのテラスを形成した。InGaSb層をこのドット表面に2次元成長することにより、ファセットでの成長速度の差により生じる井戸幅揺らぎを利用したディスク状の量子ドットが低密度で作製可能になる。また、GaAsSbドットを選択エッチングで除去すると、その位置に直径が数百nmで、高さが6nm、幅が50nm程度のGaAsリング構造が自己組織的に形成できた。その表面上にSKモード条件でGaSbを成長すると、SKドットが生成される前に、2個の量子ドットがナノリング上に選択的に対に形成されることがわかった。従来のSKモードでは量子ドットの生成位置制御は困難であるが、ナノリングのファセット面を利用することにより10^6cm^<-2>台の低密度で位置を制御して量子ドットを作製することが可能となった。本研究では、量子情報通信用単一量子ドット光源を実現するために、正孔局在型lnGaSb系量子ドットの作製技術を開発することを目的とする。半導体量子ドットは主として基板との格子不整合差を利用したSKモードにより作製されるが、ドットの低密度化やその生成位置を制御することが難しい問題がある。これまでに有機金属(MO)原料分子と表面との反応を制御することで、GaAs(001)基板上にマスクなしで10^6cm^<-2>の低密度でサブミクロンサイズのメサ構造を作製する手法を開発した。選択エッチングによりその上部に円形の(001)ファセットが形成でき、そこに井戸幅揺らぎを利用してディスク状lnGaSb量子ドットを形成することにより単一量子ドット光源が可能になる。当該年度では成長温度とMO原料供給量の制御を進め、メサ構造のサイズを直径300640nm、高さ80180nmで制御可能になった。さらにバンドオフセットを制御するためAsを添加したGaAsSb混晶のメサ構造作製を進め、頂点が直径120nmの円形(001)ファセット、側面は{111}と{110}ファセットで構成されたGaAsSbメサ構造が10^6cm^<-2>台の低密度で自己組織的に作製可能になった。また、トリスジメチルアミノアンチモン原料を用いた表面反応制御により、GaAs基板上に高さ6nmで、直径400nm、幅50nm程度のGaAsナノリング構造を自己組織的に形成できる。その直径制御および表面平坦性の改善を行い、量子ドットの選択成長制御を進めた。2個の量子ドットがナノリング上の[1-10]方向に沿って対に形成され、(411)Bファセット上に選択的に成長されることがわかった。

マスクレスで自己形成したメサ構造およびナノリング構造を利用することで、10^6cm^<-2>台の低密度で生成位置を制御して量子ドットを作製することが可能となった。量子情報通信用InGaSb系正孔局在型単一量子ドット光源を実現するためには,急峻なヘテロ界面のドットを低密度で位置制御して作製する必要がある.本研究では有機金属原料分子との表面反応制御によるInGaSb系量子ドット光源の作製技術を開発することを目的とし,本年度は次の研究を実施した.・GaAsSbサブミクロンドット上へのInGaSb/InGaAs系正孔局在型量子ドットの選択成長:TDMASbとTDMAAs原料を用いた表面反応制御によりGaAsSbドットを作製した.ドット中のAs組成は874%で制御でき,成長温度500580°Cで10 6 cm-2台の低密度で成長できた.サイズは直径280460nm,高さ60120nmで制御でき,さらにTDMASb選択エッチングで(001),{111},{110}ファセットで囲まれた等方的なドット構造に加工できた.また,S-K成長によるGaSb/GaAs量子ドットはウエッティング層からの発光が強いが,N照射して成長すると抑制できた.界面制御でドットからのType II発光を高効率化でき,さらにNラジカルを用いることで急峻なヘテロ構造が作製可能になった.・自己組織化GaAsナノリング上のInGaSb系量子ドットの選択成長:GaSbサブミクロンドットをエッチングすると,直径400nm程度で,幅が50nm,高さが6nmのGaAsナノリング構造が作製でき,量子ドットはその(411)Bファセット位置に最優先に形成される.リング直径の制御およびそのファセット構造の改善を進めることにより,量子ドット対の距離を制御して選択成長可能になった.量子ドットをGaAsで埋め込む際は,まず400°Cの低温でドット状に成長させた後,450°Cに昇温して2次元的に成長することでSbの表面偏析を抑制でき,急峻なヘテロ構造によるドットの長波長発光化が可能となった.表面反応を制御した正孔局在型量子ドット構造の作製はおおむね順調に進展しているが、光学特性の改善が遅れており、ヘテロ界面制御をさらに進める必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。MO原料のジメチルアミノ基による表面エッチングやInやSb原子の表面偏析によりヘテロ界面の急峻性の劣化を防ぐため、窒素ラジカル源を現有装置に組み込んだ。窒素ラジカル照射により表面を安定化させ、急峻な界面のヘテロ構造を作製することにより、光学特性の改善を行う。
TGF-βの標的遺伝子TMEPAIとMafKの発がん促進能に関する研究

トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)は、がん遺伝子で分泌が誘導され、TGF-αと共に軟寒天上での足場非依存性増殖を誘導する分子として発見された。本研究では、TGF-βによって誘導される標的遺伝子で、足場非依存性増殖や腫瘍形成を誘導する分子としてTMEPAIとMafKを同定し、その作用機序を解析した。その結果、TMEPAIはTGF-β/Smadシグナルの抑制とAKTの活性化作用、MafKには上皮間葉転換と膜タンパク質GPNMBの誘導能によって足場非依存性増殖と腫瘍形成を誘導していた。さらにTMEPAIとMafKに対する抗体を作製し、臨床病理学的研究を行う材料を開発した。TMEPAIの腫瘍形成促進能を肺腺癌細胞ならびに口腔扁平上皮癌細胞で示した。また、ファミリー分子であるC18ORF1もTMEPAIと同様の機能をもつことを示した。現在、TMEPAIの種々の変異体を作成し、腫瘍形成におけるTMEPAIの作用機序について、さらに詳細に解析中である。MafKによる乳腺上皮細胞のがん化作用は、足場非依存性のスフェア形成促進能については、Gpnmbの発現誘導によってもたらされることが示された。上皮間葉転換の誘導については、Gpnmbを介する作用とそれ以外の機序の両者が働いていることが示された。Gpnmbによるスフェアならびに腫瘍形成の誘導には、hemITAMモチーフのチロシン残基が必須であった。現在、細胞外にあるRGD, PKD, KLDなどの種々のドメイン構造の腫瘍形成における役割とhemITAMを介するシグナル機構について解析を進めている。MafKは転写活性化ドメインをもたない転写制御因子であり、この分子がどのような機序でGpnmbの遺伝子発現を促進するのかはいまだ回答が得られていない。一部がん細胞では、Gpnmbの発現がTGF-betaシグナルに依存することを示唆するデータが得られており、今後の検討課題である。TMEPAI, MafK, Gpnmbともに、いくつかの有益な抗体を得ているが、ヒト病理標本で信頼性の高い染色結果が得られていない。今後も継続して抗体あるいはその代替分子の開発に取り組む必要がある。●TMEPAI, MAFK, GPNMBが足場非依存性増殖と腫瘍形成を誘導する機序を解析した。TMEPAIは、TGF-β/Smad経路の活性化を抑制するとともに、AKTの脱リン酸化を抑制し、さらにWNTシグナルにも作用することが示唆された。また、TGF-βシグナルとともにEGFシグナルも協調的にTMEPAIの発現を促進しており、肺腺がん細胞の腫瘍形成と転移に関与していることが示された。●MAFKは、E-cadherin発現制御領域に直接結合して上皮間葉転換(EMT)を誘導するとともに、GPNMBの発現を誘導して足場非依存性増殖と腫瘍形成を誘導することが示された。GPNMBは、SRCによって細胞質内のhemITAMにあるチロシンがリン酸化されEMT、足場非依存性増殖、腫瘍形成を誘導する。また、細胞外のKLDドメインを欠損させるとE-Cadherinの発現は抑制されるが、管状構造の形成は維持され足場非依存性増殖と腫瘍形成の誘導能は著しく抑制されることが示された。●TMEPAIノックアウトマウスとC18orf1のノックアウトマウスを交配し、ダブルノックアウトマウスを作製した。ダブルノックアウトマウスはほぼメンデル則に従って誕生した。今後、継時的に表現型を解析する予定である。また、Apc-Min/+マウスと交配も行なう予定である。●TMEPAIとMAFKに対するモノクローナル抗体を作製し、蛍光免疫染色とウエスタンブロッティングに使用可能であることを示したが、ホルマリン固定パラフィン包埋標本の安定な染色は得られていない。モノクローナル抗体に代わり、特異的な結合活性を示す環状ペプチトのスクリーニングを行い、GPNMBに特異的に結合する特殊環状ペプチドに蛍光色素をラベルすることにより、蛍光染色と生細胞におけるGPNMBの動態解析に使用可能であることを示した。トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)の標的遺伝子で強力な腫瘍形成促進作用を示すTMEPAIとMafKが、どのような機序で働くかを解析するとともに、臨床診断に向けた橋渡し研究を行うことを目的とした。1TMEPAI, MafK, Gpnmbが足場非依存性増殖を誘導する分子機構。TMEPAIの作用機序として、すでに明らかにしているTGF-β/Smad経路の抑制とともに、AKTのリン酸化亢進とWntシグナルの抑制作用があることを新たに明らかにして、その分子機構の解析を進めた。また、TMEPAIにはa, b, c, dの4つのisoformがあるが、乳がんや肺がん細胞で発現しているのは主にisoform dであることを示した。MafKについては、上皮間葉転換とGPNMBの発現誘導により腫瘍形成を促進するが、GPNMBの種々の変異体の解析から、GPNMBの作用機序の一端を明らかにした。また、GPNMBに特異的に結合する特殊環状ペプチドを作製して解析した結果、GPNMBは平面培養時には機能していないが、スフェア培養での細胞増殖には必須であることが示唆された。2TMEPAIノックアウトマウス、C18orf1ノックアウトマウスの研究。TMEPAIとC18orf1のダブルノックアウトマウスの作製と脂質代謝への影響を検討したが、優位な差は得られなかった。また、これらのマウスとApc-Min/+マウスの交配による大腸腺腫の形成に対する作用に関する研究を持続している。

3臨床病理学研究。ヒトGPNMB結合特殊環状ペプチドの蛍光ビデオ撮影での使用やFACS解析への応用を実施して、その特性を解析した。また、抗GPNMB抗体を用いて、ヒト膀胱がん、腎細胞がんなどにおける発現解析を行った。このほかにもがん幹細胞マーカーになる可能性を持つ分子を標的とした特殊環状ペプチドのスクリーニングを開始した。トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)は、がん遺伝子で分泌が誘導され、TGF-αと共に軟寒天上での足場非依存性増殖を誘導する分子として発見された。本研究では、TGF-βによって誘導される標的遺伝子で、足場非依存性増殖や腫瘍形成を誘導する分子としてTMEPAIとMafKを同定し、その作用機序を解析した。その結果、TMEPAIはTGF-β/Smadシグナルの抑制とAKTの活性化作用、MafKには上皮間葉転換と膜タンパク質GPNMBの誘導能によって足場非依存性増殖と腫瘍形成を誘導していた。さらにTMEPAIとMafKに対する抗体を作製し、臨床病理学的研究を行う材料を開発した。●TMEPAIの構造予測によって新規ドメインの存在が示唆され、当該ドメインの機能を実験的に確認できたことは、当初計画では予測していない成果だった。TMEPAIによるAKTのリン酸化亢進の機序については、おおむね順調に解析が進んでいる。●MAFKとGPNMBの機能解析はおおむね順調に進展している。GPNMBのKLDドメインとhemITAMモチーフがEMT誘導と足場非依存性増殖、腫瘍形成に必須の役割を果たしていることを示したことで今後の研究の方向性が示された。●Apc-Min/+マウスの腫瘍形成について、チミジン類似体であるEdUによるラベルを行ない、FACS解析をする実験手法を確立した。TMEPAIノックアウトマウス、C18orf1ノックアウトマウスとの交配を行なう計画であるがこれについてはやや進捗が遅れている。●TMEPAIとMAFKのモノクローナル抗体の臨床病理学研究への応用は遅れているが、GPNMBに特異的に結合する特殊環状ペプチドによって蛍光染色や生細胞におけるGPNMBの動態を解析できる可能性を示したことは、計画を上回る成果だった。27年度が最終年度であるため、記入しない。実験病理学、腫瘍学●TMEPAIの作用機序について、腫瘍形成に重要なシグナルの同定を行なう。また、TMEPAIによるAKTのリン酸化亢進ならびにWNTシグナルへの作用の機序を解析する。●GPNMBの各種変異体を作製して、EMT誘導ならびに足場非依存性増殖、腫瘍形成に関わるドメインの同定と同定されたドメインの機能解析を行なう。●Apc-Min/+マウスとTMEPAIノックアウトマウス、C18orf1ノックアウトマウス、ダブルノックアウトマウスの交配を行い、Apc-Min/+マウスの大腸腫瘍形成におけるTMEPAIファミリーの作用について解析する。●GPNMBを始めとして、特異結合環状ペプチドを用いて特定の分子の発現と分布を解析する手法を開発する。また、培養細胞に特殊環状ペプチドを作用させて、生細胞でのGPNMBの動態解析を試みる。
咬合小面に加わる咬合力の解析

1.天然歯列を有する被験者の平行模型より咬合小面を分析する方法として、万能投影機を用いてトレースする従来の中野の方法は多大な労力を必要とするために、画像入力システムを用いて直接パーソナルコンピュータに取り込み、分析する方法を検討した。2.咬合記録材として従来より多用されているブラックシリコーンと最近市販されている付加型シリコーン咬合採得材を用いて、接触面積の差異、再現性などを検討した。ブラックシリコーンに比較して、付加型シリコーン咬合採得材は色調が薄いために、境界部分での判定にばらつきがみられたが、画像処理での閾値操作によって、実用上問題ないと考えられた。3.画像入力した平衡模型の咬合小面と咬合記録の咬合接触像の重ね合わせを試みた。平衡模型と咬合器録を別々に採得した場合、両者を正確に重ね合わせることは困難であった。そこで、付加型シリコーン咬合採得材は弾性ひずみや永久ひずみが小さく、寸法安定性に優れている点に着目し、この材料を用いて咬合記録を採得し、これに石膏を注入することにより同時に平衡模型を製作し、咬合小面と咬合接触像を重ね合わせる手法を現在検討している。4.プレスケールによる咬合圧測定はややばらつきが大きく、各咬合小面ごとに咬合分圧を定量的に測定するにはやや難があり、相対的な表示の方が適切と考えられた。5.前歯部の開口症例について、犬歯部のガイドを変化させた際の咬合接触状態、下顎運動経路、咀嚼筋筋電図などの変化について総合的に検討し、報告した。
マウス胚性幹細胞の肝細胞への効率的分化誘導-細胞移植治療にむけて-

マウスES細胞が肝細胞にin vitroで分化し得ること、またある種の肝細胞分化関連遺伝子導入ES細胞ではその効率がよいことが判明した。本年度は、ES細胞の細胞移植療法の次ステップとして、肝障害マウスへの経脾的移植を試みた。すなわち、四塩化炭素肝障害マウスにES細胞を脾臓内に移植し、肝臓におけるES細胞の分化について検討した。ES細胞は129SVJ系マウス由来GFP標識細胞を用いた。マウスは6週齢C57BL/6雌マウスを用い、肝障害は四塩化炭素(0.5ml/Kg週2回腹腔内投与,CCl4処置群)にて誘導し、細胞移植後も継続した。移植細胞には未分化ES細胞あるいはhanging drop法にて作成した6日目胚様体(EB)を使用した。未分化ES細胞あるいはEBをCCl4処置群および非CCl4処置群の脾臓内に移植し、移植後10日,20日,30日目に肝を採取し組織学的に検討したところ、移植後10日目および20日目のCCl4処置群では、未分化ESおよびEBのいずれの移植マウスにおいても、門脈域を中心として肝構築に参画するGFP陽性細胞を認め、これらGFP陽性細胞は、Albumin, CK18, HNF4alpha陽性であった。一方、非CCl4処置群の肝にはGFP陽性細胞は認めなかった。観察期間中、未分化ES細胞投与マウスを含めて全移植マウス(30匹)において肝に腫瘍形成は認めなかった。以上の成績は、肝障害を有するマウスへのES細胞の経脾的肝移植において、移植細胞の肝細胞様細胞への分化が確認され、ES細胞の細胞移植療法の有用性を示唆するものと考えられた。今日、ドナー肝の慢性的不足は肝移植治療の普及に大きな障害となっており、替わるべき新たな移植法が切望される。このような背景のもと、我々は、胚性幹細胞(Embryonic stem cell : ES細胞)から機能的に成熟した肝細胞を作ること、および、その効率的な方法の開発を目的として本研究をスタートした。初年度の目的は、まず、ES細胞から肝細胞が得られるかを検討することであった。まず、胚発生初期における自然発生プログラムがかなり保持されている胚様体形成法によるES細胞のin vitro分化を試みた。ES細胞をhanging dropにて5日間培養して胚様体を形成させた後に付着培養に移行した。付着培養後約3週目にはアルブミン産生細胞が確認され、肝細胞に特異性の高い種々の血清蛋白や代謝酵素のmRNA発現が認められた。また、indocyanin green (ICG)による生細胞染色は、種々の細胞系譜に分化した培養細胞から生きたまま「肝」細胞候補を識別するのに有用と考えられた。このように、ES細胞が「肝」細胞に分化することを明らかにすることができたが、そのようなICG染色陽性細胞あるい「肝」細胞は、全細胞のわずかにすぎなかった。そこで、効率的な「肝」細胞への分化誘導を目的に、肝臓の発生分化に深く関わる転写因子hepatocyte nuclear factor 3 beta (HNF3β)をES細胞に遺伝子導入した。HNF3β導入ES細胞では効率のよい「肝」細胞誘導ができつつある。また、本遺伝子導入細胞をspheroid状にて立体構築を維持して培養したところ、高いアルブミン産生能、尿素合成能、脂肪酸合成能を数ヶ月の長期にわたり維持することができた。マウスES細胞が肝細胞にin vitroで分化し得ることを明らかにした。とくに、肝臓の発生分化に深く関わる転写因子hepatocyte nuclear factor 3 beta(HNF3β)を遺伝子導入したHNF3β導入

ES細胞では、キチンファイバーを添加することにより、スフェロイド状態で細胞増殖が維持され、かつ、アルブミン産生能、尿素合成能、脂肪酸合成能も長期間維持されることが判明した。さらに、HNF3β導入ES細胞は、5日間のhanging drop法による胚様体形成後にステロイド、インスリンおよびニコチナマイドなどを含む肝細胞分化促進培養液にて付着培養すると、付着培養開始2日目にはほぼ全細胞が免疫染色にてアルブミン陽性となった。すなわち、HNF3β導入ES細胞は分化誘導開始7日でアルブミン産生細胞に分化誘導可能であった。さらに、このHNF3β導入ES細胞の肝細胞分化過程で、アニオントランスポーター(oatp1.multidrug resistance-associated proteins(mrp1,mrp2,mrp3),uridine diphosphate glucuronosyltransferase(ugt1a1)を発現し、oatp1はデスモプラキンと、mrp2はCD26と共在した。マウスES細胞由来肝細胞は、移植目的の細胞源としてのみならず、基礎研究における代替肝細胞としての使用も期待されることが判明した。マウスES細胞が肝細胞にin vitroで分化し得ること、またある種の肝細胞分化関連遺伝子導入ES細胞ではその効率がよいことが判明した。本年度は、ES細胞の細胞移植療法の次ステップとして、肝障害マウスへの経脾的移植を試みた。すなわち、四塩化炭素肝障害マウスにES細胞を脾臓内に移植し、肝臓におけるES細胞の分化について検討した。ES細胞は129SVJ系マウス由来GFP標識細胞を用いた。マウスは6週齢C57BL/6雌マウスを用い、肝障害は四塩化炭素(0.5ml/Kg週2回腹腔内投与,CCl4処置群)にて誘導し、細胞移植後も継続した。移植細胞には未分化ES細胞あるいはhanging drop法にて作成した6日目胚様体(EB)を使用した。未分化ES細胞あるいはEBをCCl4処置群および非CCl4処置群の脾臓内に移植し、移植後10日,20日,30日目に肝を採取し組織学的に検討したところ、移植後10日目および20日目のCCl4処置群では、未分化ESおよびEBのいずれの移植マウスにおいても、門脈域を中心として肝構築に参画するGFP陽性細胞を認め、これらGFP陽性細胞は、Albumin, CK18,HNF4alpha陽性であった。一方、非CCl4処置群の肝にはGFP陽性細胞は認めなかった。観察期間中、未分化ES細胞投与マウスを含めて全移植マウス(30匹)において肝に腫瘍形成は認めなかった。以上の成績は、肝障害を有するマウスへのES細胞の経脾的肝移植において、移植細胞の肝細胞様細胞への分化が確認され、ES細胞の細胞移植療法の有用性を示唆するものと考えられた。