hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
給与飼料の質の変化が和牛成長ホルモンの分泌パターンに及ぼす影響

成長ホルモン(Growth Hormone:GH)は体長の増加やタンパク質合成の促進、脂肪の分解、糖利用の低下などに影響を及ぼし、腺性下垂体より放出されるホルモンである。これまでに和牛(黒毛和種)を用いた実験により濃厚飼料を多給すると粗飼料を多給したときよりも著しくGHの分泌が減少し、そのパターンも著しく異なることを確認した。本研究では和牛の成長時期により給与飼料の質を変化させて、それによって血中GHの分泌パターンがどのように変化するにかを明らかにすることを目的として行った。昨年度は離乳前(3カ月齢時)から徐々に給与飼料を変化させる過程で採血を行い、飼料中の濃厚飼料の割合が増すにつれGHの分泌が著しく減少することを明らかにした。その後、これらの牛は8カ月齢まで濃厚飼料多給で飼養された。本年度は、これらの牛を用いて8カ月齢時より逆に給与濃厚飼料を徐々に減少させる(給与粗飼料の割合を高めていく)過程で採血を行いGH分泌パターンの変化を追求した。給与濃厚飼料を体重比3%,2.5%,2%,1.5%とそれぞれの変化に2週間かけて徐々に減少させながら経時的に採血した。採血方法は一時的に牛頚静脈にカテーテルを装着し、8時間15分間隔の採血を行い、血中より血清を分離し分析までメデイカルフリーザーで保存した。現在RadioimmunoassayによりGH concentrationを定量中である。成長ホルモン(Growth hormone:GH)は体長の増加やタンパク質合成の促進、脂肪の分解、糖利用の低下などに影響を及ぼし、腺性下垂体より放出されるホルモンである。これまでに濃厚飼料を多給すると和牛GHの分泌パターンで粗飼料を多給した和牛とはまったく異なることを確認している。本研究は和牛の成長の著しい育成期(38ヶ月齢)に給与飼料を変化させて、それに伴って血中GHの分泌パターンが如何なる変化を示すのかを解明することを目的に行った。本年度は離乳前(3ヶ月齢時)から徐々に給与飼料を変化させる過程で採血を行いGH分泌パターンの変化を追求した。供試牛は九州大学農学部附属農場高原実験実習場にて生産された黒毛和種雄牛を用いた。血液サンプリングはまず、3ヶ月齢時に母牛から離乳する直前、離乳後、給与濃厚飼料を体重比2%、2.5%および3%以上とそれぞれ2週間をかけて徐々に増加させながら経時的に採取した。採血方法は一時的に牛頚静脈にカテーテルを装着し、8時間15分間隔の採血を行い、血中より血清を分離し分析までメディカルフリーザーで保存した。現在radioimmunoassayによりGH concentrationを定量中である。
既存杭を利用できる新しい建物基礎構造の実大地震観測

近い将来問題になると考えられる大口径既存杭の処理に対し,これを積極的に再利用することで工期短縮とコスト削減さらに資源の有効利用による環境負荷の低減ができる新しい建物基礎構造(非接合パイルドラフト基礎,鋼管杭を用いた極短杭)を研究者らは提案している。その提案基礎を実用可能とするため,実大に近い実験模型を設置し地震観測を行った。当初は基礎の設置方法の問題で想定外の震動特性を示したが,設置方法を修正しさらに加速度センサを追加し詳細に構造物挙動のの分析をしたところ,提案基礎はほかの従来の基礎と比べ構造物の応答加速度が低減され,地震動入力の低減効果があることが明らかになった。近い将来問題になると考えられる大口径既存杭の処理に対し,これを積極的に再利用することで工期短縮とコスト削減さらに資源の有効利用による環境負荷の低減ができる新しい建物基礎(非接合パイルド・ラフト基礎,鋼管杭を用いた極短杭)を研究代表者らは提案している。当初は基礎の設置方法の問題で想定外の震動特性を示したが,設置方法を修正しさらに加速度センサを追加し詳細に構造物挙動の分析をしたところ,提案基礎は他の従来の基礎と比べ構造物の応答加速度が低減され,地震動入力の低減効果があることが明らかになった。観測された地震加速度記録や杭のひずみをもとに数値解析によるシミュレーションを行い提案基礎の入力低減効果について検討した。近い将来問題になると考えられる大口径既存杭の処理に対し、これを積極的に再利用することで工期短縮とコスト削減さらに資源の有効利用による環境負荷の低減ができる新しい建物基礎(非接合パイルド・ラフト基礎、極短杭)を実用可能とするため、提案基礎への地震動入力メカニズムと地震エネルギー吸収機構の有効性を検討し、さらに簡易な設計モデルの構築を目的といている。上記のメカニズムを明らかにするため,実大に近い種々の基礎構造物模型を実地盤上に設置し地震観測を行っている。基礎構造の種類は一般的な直接基礎と杭基礎および本研究で対象とする非接合パイルドラフト基礎の3種類である。これまで数多くの地震記録が得られており,構造物の応答が100galを超えるものも観測されている。記録から基礎構造の違いにより上部構造物の応答が異なることが明らかとなった。また地盤と構造物をモデル化した3次元有限要素法解析によりそれらの応答を概ね再現でき,それら応答特性のメカニズムを明らかにしている。構造物模型を設置し地震記録もある程度の大振幅のものも含め数多く観測されている。また,3次元有限要素法によりシミュレーション解析を行い,観測記録の傾向を概ね再現でき,提案基礎への地震動入力メカニズムについて検討している。しかし提案基礎である非接合パイルドラフト基礎の模型において予想外の震動現象(ロッキング震動)が発生しており,対策が必要である。当初構造物の上面中央に3成分加速度計を1台設置していたが,非接合パイルドラフト基礎では基礎底面を中心に回転するロッキング震動が発生している可能性が見られた。そのためロッキング震動すなわち構造物の回転成分を把握するため構造物の端部に2つの鉛直成分のセンサを追加で設置した。その結果,非接合パイルドラフト基礎では正方形の構造物基礎底面の一方の対角方向に激しくロッキング振動していることがわかった。実際の建築物等の構造物は杭本数が多く本実験模型ほどロッキング震動は起こらないと考えられることから,構造物模型の設置方法について現在再検討をしている。提案基礎について予想外に大きく発生しているロッキング震動を抑制するため,再設置を行う予定である。構造物は1t以上重量があるためクレーンを使って移動する必要がある。その際に他の構造物についてもロッキング震動を把握するため加速度センサを追加するなどについて検討中である。
ウシ乳腺細胞の三次元培養法における上皮小体ホルモン関連蛋白の産生調節機構の解明

乳汁中には様々なホルモン、成長因子やサイトカインが含まれており、乳腺はそれらにより形態学的ならびに機能学的に変化を受けているが、それらホルモンや成長因子の働きをそれぞれ明確にすることは困難である。上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)も泌乳中の乳腺から産生され、生物活性を有する形で乳汁中に存在する。そこで本研究では泌乳期乳腺の上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)産生に及ぼす上皮成長因子(EGF)およびトランスフォーミング成長因子(TGF)-βの影響を検討した。分娩後1週間以内の乳牛より採材した乳腺組織をコラゲナーゼを用いて腺房に分散し、ラットの尾腱より抽出したコラーゲンに包埋培養した。培地にEGF,TGF-βを種々の濃度で添加し、培養上清中のPTHrP濃度をラジオイムノアッセイ法により測定するとともに、PTHrPの遺伝子発現をノーザン解析した。EGFおよびTGF-βの刺激によりウシ乳腺培養細胞はPTHrP産生量ならびにそのmRNA発現量は濃度依存性に増大した。EGFおよびTGF-βが初乳を中心に乳汁中に存在することから、これらが泌乳期乳腺におけるPTHrP産生の調節因子である可能性が示唆された。メンブレンカルチャーインサートによる培養をしたウシ乳腺腺房のPTHrP分泌の極性を調べたところ、基底側により多くのPTHrPが分泌されていた。乳腺上皮基底側には腺房収縮を担う筋上皮細胞があり、一方PTHrPには平滑筋弛緩機能があるとされていることから、基底側に産生されるPTHrPが乳腺腺房の収縮弛緩による乳汁排出を促進している可能性が考えられた。乳腺は様々なホルモンや成長因子によりその発育や形態学的変化を遂げているため、それらホルモンや成長因子の働きをそれぞれ明確にすることは困難である。乳腺細胞の研究手段としてコラーゲンゲル内に細胞塊を包埋すると、乳腺同様に3次元的に細胞が発育し、より生態に近い条件でホルモンや成長因子の影響を検索できる。上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)は泌乳中の乳腺から産生され、生物活性を有する形で乳汁中に存在する。本研究では乳腺上皮細胞から産生されている上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)の産生機構を解明する目的で乳腺上皮細胞の3次元培養を行った。分娩後1週間以内の乳牛より採材した乳腺組織をコラゲナーゼを用いて腺房に分散し、凍結保存した。ラットの尾腱より抽出したコラーゲンに包埋培養したところ培養2ないし3日目より樹枝状の増殖が観察され、培養10日目前後からゲルの収縮がみられた。培地に15%濃度のウシ胎子血清を加えた培養上清中のPTHrP濃度をラジオイムノアッセイ法により測定したところ、24ng/mlの産生が見られたが、無添加培地では12ng/mlと有為に低下した。パラフィン切片を作成し観察したところ、立方上皮ないしは立方円柱上皮細胞からなる乳管様の腺腔構造がみられ、4種類の抗PTHrP抗体、PTHrP(1-34)、PTHrP(1-36)、PTHrP(15-34)、PTHrP(34-53)を用いて免疫染色を行ったところ、いずれの抗体に対しても上皮細胞が陽性に染まった。ヒトPTHrPのcDNAの塩基配列を参考にプライマーを合成し、培養細胞からRNAを抽出してReverse Transcription-Polymerase Chain Reactionを行ったところバンドが検出された。

このDNAフラグメントをもとにプローブを作成しノーザン解析を行ったところ、1.6kb付近でトランスクリプトが検出された。乳汁中には様々なホルモン、成長因子やサイトカインが含まれており、乳腺はそれらにより形態学的ならびに機能学的に変化を受けているが、それらホルモンや成長因子の働きをそれぞれ明確にすることは困難である。上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)も泌乳中の乳腺から産生され、生物活性を有する形で乳汁中に存在する。そこで本研究では泌乳期乳腺の上皮小体ホルモン関連タンパク(PTHrP)産生に及ぼす上皮成長因子(EGF)およびトランスフォーミング成長因子(TGF)-βの影響を検討した。分娩後1週間以内の乳牛より採材した乳腺組織をコラゲナーゼを用いて腺房に分散し、ラットの尾腱より抽出したコラーゲンに包埋培養した。培地にEGF、TGF-βを種々の濃度で添加し、培養上清中のPTHrP濃度をラジオイムノアッセイ法により測定するとともに、PTHrPの遺伝子発現をノーザン解析した。EGFおよびTGF-βの刺激によりウシ乳腺培養細胞はPTHrP産生量ならびにそのmRNA発現量は濃度依存性に増大した。EGFおよびTGF-βが初乳を中心に乳汁中に存在することから、これらが泌乳期乳腺におけるPTHrP産生の調節因子である可能性が示唆された。メイブレンカルチャーインサートによる培養をしたウシ乳腺腺房のPTHrP分泌の極性を調べたところ、基底側により多くのPTHrPが分泌されていた。乳腺上皮基底側には腺房収縮を担う筋上皮細胞があり、一方PTHrPには平滑筋弛緩機能があるとされていることから、基底側に産生されるPTHrPが乳腺腺房の収縮弛緩による乳汁排出を促進している可能性が考えられた。
ハプロイドES細胞を用いたiPS細胞生成過程の制御因子の探索

本研究では、遺伝子を網羅的に破壊し、その影響を調べることで、様々な遺伝子機能を効率的に同定する方法を樹立した。対象には、マウスES細胞を用いた。ES細胞やiPS細胞は、再生医療への応用の観点から大きな注目を集めているが、細胞系譜の決定因子を明らかにするためのモデル実験系としても有用である。本研究で樹立した手法は、生命科学の様々な分野で応用可能と考える。本研究では、ハプロイドゲノムを有すマウスES細胞を用いて、iPS細胞の生成効率を高める遺伝子変異を同定することを目指している。このために、まずはハプロイドES細胞に対して、ジーントラップ法でゲノムワイドな変異を導入し、その後、ES細胞をEpiSCへ分化誘導し、さらに、EpiSCからiPS細胞へ初期化させ、初期化の効率に影響を与える遺伝子変異を同定する。しかし、ハプロイドES細胞はある一定の頻度でディプロイド化し、これが実験の効率に大きく影響した。ゲノムワイドに遺伝子を破壊するためには、相当数のハプロイドES細胞を用いる必要がある。そこで、ヘキスト染色後にUVレーザーを用いたFACS sortingを行ってハプロイドのDNA量の細胞を回収するのだが、十分な生存細胞を安定的に取得するのが容易ではなかった。一方、本研究課題では、ハプロイドES細胞でスクリーニングしてきた遺伝子をCRISPR/Casシステムで迅速に破壊して、その機能を確定させることを計画していたが、この点については、ES細胞において、タモキシフェン添加によりCas9の発現を簡便に誘導する実験系を開発し、順調に進展しつつある。CRISPR/Casシステムにおいては、最近、ゲノムワイドに遺伝子破壊をするためのguide RNAライブラリが開発された。そこで、上述のCas9誘導型のES細胞株に対してguide RNAライブラリを導入することで、ハプロイドES細胞の場合と同様に、両アレルに変異を有すES細胞を多数取得できると考えた。現在、guide RNAライブラリのES細胞株への導入を終え、その評価を行っている。前年度の本研究において、タモキシフェンの培地への添加によりCas9の発現を誘導できるマウスES細胞株を樹立した。本年度は、このES細胞株に対して、マウスの全遺伝子を網羅したguide RNAライブラリを導入し、タモキシフェンによるCas9の誘導による網羅的遺伝子破壊を行った。guide RNAライブラリは、piggyBacを骨格としたものを作製した。変異ES細胞の集団を分化誘導し、分化抵抗性のES細胞を選択するという過程を繰り返すことで、分化抵抗性の表現型が強い変異ES細胞を濃縮した。しかしながら、piggyBacベクターでは、1つの細胞に複数のベクターが導入されている可能性がある。このため、遺伝子破壊の効率が高いという利点と共に、表現型の原因遺伝子の特定が容易ではないという弱点も有す。そこで、選択後のES細胞からゲノムDNAを精製し、guide RNA領域をPCRで増幅後、レンチウイルスベクターの骨格を有すguide RNAライブラリを作製し、1細胞あたり1コピーのみベクターが導入される条件で、ライブラリの導入と遺伝子破壊を行い、分化抵抗性の変異ES細胞を選択した。得られた細胞からゲノムDNAの精製とguide RNA領域のPCRによる増幅を行ったのち、次世代シーケンサを用いて各guide RNAの出現頻度を定量した。高頻度に出現するguide RNAに対応する遺伝子は、変異導入によってES細胞が分化抵抗性の表現型を示すものと想定される。実際、guide RNAの出現頻度が上位に位置した遺伝子の中には、これまでに文献的に報告された遺伝子が高頻度に含まれており、今回の実験系が機能していることが示された。また、分化抵抗性の表現型が報告されていない遺伝子も、多数同定され、今回構築した実験システムの有用性が示された。ハプロイドES細胞の利用が困難であったために、研究方法を再考する必要があったものの、新たな研究計画により、本来の目的に沿った研究を遂行できている。分子生物学Cas9誘導型ES細胞株とguide RNAライブラリの併用による遺伝子破壊の効果を検証する。さらに、ES細胞を分化誘導したのちにCas9の活性を誘導すれば、当初の実験計画以上に、目的の表現型を示す細胞株を効率的に取得できると期待される。実験上の困難を解決するために、Cas9誘導型ES細胞株を用いた実験系を開始し、次年度使用額が生じた。上記の実験系を検証するための細胞培養用試薬を購入する。
ウイルスによる発癌の防御メカニズムの解析

I型インターフェロン(IFN-α/β)は、ウイルス感染を受けた細胞から産生されるサイトカインであり、抗ウイルス作用、細胞増殖抑制作用、免疫調節作用といった種々の生理作用を標的細胞に誘導する。これまでに申請者はウイルス感染に伴って誘導されるIFN-α/βの産生には、IFN制御因子(IFN regulatory factor : IRF)に属するIRF-3とIRF-7が必須であることを見出した。一方で、これら二つの因子はウイルス感染特異的にリン酸化を受けて活性化されることが申請者の解析で明らかとなっていたが、リン酸化を司るリン酸化酵素の同定には至っていなかった。そこで当該年申請者はIRF-3をリン酸化する酵素の同定を試み、ウイルス感染に対する生体の応答機構の解析を行った。まずin vitroでIRF-3蛋白をリン酸化させる系を樹立し、リン酸化酵素を蛋白精製から同定することを試みた。基質となるIRF-3蛋白にヒスチジンタグを融合させたキメラ蛋白を大腸菌に発現させ、それをニッケルカラムでアフィニティー精製し、得られた組み替え蛋白を用いてin vitroリン酸化反応の系を樹立した。また組み替えIRF3蛋白に対するリン酸化部位を検証する為に部位特異的なアミノ酸変異を導入し、この変異蛋白を用いてリン酸化部位を検討した。その結果、IRF-3組み替え蛋白がリン酸化を受ける部位は、内在性のIRF-3蛋白が細胞内でリン酸化を受ける部位と同様であることが強く示唆された。そこで、このin vitroリン酸化反応の系を用いてリン酸化酵素の精製を試みた。しかしながら分画した細胞粗抽出液を用いてアッセイを行うと、広範囲のフラクションでリン酸化活性が認められてしまい、分画の絞り込みができない結果になってしまった。基質としてIRF-3蛋白全長に代えてリン酸化部位を含むペプチドを用いて検討を試みたが改善は認められなかった。そこで現在はアプローチを変更し、IRF-3に結合する分子をプロテオミクス解析から絞り込む方針から解析を進めている。
環境ガバナンスとしての環境教育の役割についての研究

環境教育は環境基本法にその振興が盛り込まれることで環境基本計画に組み込まれることとなった。このことを契機に、従来は学校教育という狭い場でとらえられてきた環境教育が主要な政策手法の一つ、すなわち環境ガバナンスの一環としてとらえられるようになった。しかし環境ガバナンスの研究がまだ日が浅いことや環境教育がそのアクターや場など個別分散的に研究対象となってきたことなどの理由で、環境ガバナンスとしての環境教育の研究はわが国ではほとんどなされてこなかった。このため本研究においては、アクターを学校のみならず企業やNGO、行政など広くとらえることで環境ガバナンスとしての環境教育の果たす役割、また現状の課題の抽出、その解決に向けた政策などを行うことを目的に研究をすすめた。研究体制としては、研究代表者がプロジェクトリーダーをつとめている(財)地球環境戦略研究機関環境教育プロジェクトの全面的協力を得て、研究組織を構築し取り組んだ。この意味で、本研究は(財)地球環境戦略研究機関環境教育プロジェクトとの共同研究といえる。研究成果として、(1)アジア太平洋地域の環境教育の現状と課題、(2)日本の環境教育の現状と課題、(3)主要アクターの環境教育の現状と課題、の3つに大別することできる。(1)として(1)アジア太平洋地域36カ国(日本含む)の環境教育の現状と課題を広く調査し、課題を抽出し、環境教育推進のための環境ガバナンスの提示(環境教育推進戦略の提示)を行った。また、(2)タイの環境教育の制度化のち研究、(3)インドネシアのNGOによる環境教育の果たす役割の研究、(2)としては(1)日本の学校教育における環境教育の課題、(2)日本の公害教育の制度化についての研究が含まれる。(3)については(1)企業による環境教育の取組、(2)高等教育における環境教育の制度の検討などが含まれる。本年度は国連機関や地域機関、政府機関などにおける環境教育の取り組みに関する資料の収集を行った。特にアジア太平洋地域における環境教育の推進に取り組んでいる地域機関であるASESAN、SACEP,SPREPによる環境教育推進行動計画、日本政府による環境基本計画における環境教育の取り組みなどについて、資料収集と同時に関係者へのヒヤリングを行った。また諸外国における環境教育の取り組みについて特にアジア太平洋地域35ケ国の動向について代表者が研究分担者として加わっている地球環境戦略研究機関の環境教育プロジェクトと連携しながら国際調査も行い、環境ガバナンスとしての環境教育の果たす役割について資料収集を行った。国内については環境省による環境教育推進調査と連携しながら、学校、地域など多様な環境教育の取り組みについて調査を行ったが、特に地方公共団体における環境教育の取り組みについて環境ガバナンスの視点から調査を行った。

特にアジア太平洋地域における環境教育の推進に取り組んでいる地域機関であるASEAN, SACEP, SPREPによる環境教育推進行動計画、日本政府による環境基本計画における環境教育の取り組みなどについて、資料収集と同時に関係者へのヒヤリングを行った。また諸外国における環境教育の取り組みについて特にアジア太平洋地域35ヶ国の動向について代表者が研究分担者として加わっている地球環境戦略研究機関の環境教育プロジェクトと連携しながら国際調査も行い、環境ガバナンスとしての環境教育の果たす役割について資料収集を行った。国内については環境省による環境教育推進調査と連携しながら、学校、地域など多様な環境教育の取り組みについて調査を行ったが、特に地方公共団体における環境教育の取り組みについて環境ガバナンスの視点から調査を行った。
膵ラ島β細胞ミトコンドリアを標的とする遺伝子治療の開発

ミトコンドリアはDNA修復酵素系に富み,ダイナミックにミトコンドリアDNA (mtDNA)変異の修復を受けていることがわかってきた.mtDNA修復系の特徴から,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesの有効性が期待されている.海外共同研究者のd'Alarcao教授らはoligonucleotidesをアルキルトリフェニルホスホネート(APP)誘導体化すると,ミトコンドリア内へ効率よく集積することを発見した.本研究では,mtDNA変異を標的としたChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを作成し,APPで誘導体化して,ミトコンドリア集積性を高めて,mtDNA変異を標的とする一塩基置換修復法を開発する.1.ミトコンドリアDNAを分子標的とする特異的一塩基置換修復法の開発ミトコンドリアDNA3243A/G変異を標的とするChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成した.正常ミトコンドリアDNAと3243G変異DNAのmixtureをテンプレートとしたミトコンドリアDNA複製系に,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを添加すると,容量依存性に3243G変異が修復されることが明らかにした.Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成し,アルキルトリフェニルホスホネート誘導体(APP)による修飾が可能か,検討した.対照としたDNA oligonucleotidesに比べて,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesは,APP化修飾効率が対照の約20%と低いことが明らかになった.ミトコンドリアはDNA修復酵素系に富み,ダイナミックにミトコンドリアDNA (mtDNA)変異の修復を受けていることがわかってきた.mtDNA修復系の特徴から,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesの有効性が期待されている.海外共同研究者のd'Alarcao教授らはoligonucleotidesをアルキルトリフェニルホスホネート(APP)誘導体化すると,ミトコンドリア内へ効率よく集積することを発見した.本研究では,mtDNA変異を標的としたChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを作成し,APPで誘導体化して,ミトコンドリア集積性を高めて,mtDNA変異を標的とする一塩基置換修復法を開発する.1.ミトコンドリアDNAを分子標的とする特異的一塩基置換修復法の開発ミトコンドリアDNA3243A/G変異を標的とするChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成した.正常ミトコンドリアDNAと3243G変異DNAのmixtureをテンプレートとしたミトコンドリアDNA複製系に,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを添加すると,容量依存性に3243G変異が修復されることが明らかにした.Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成し,アルキルトリフェニルホスホネート誘導体(APP)による修飾が可能か,検討した.対照としたDNA oligonucleotidesに比べて,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesは,APP化修飾効率が対照の約20%と低いことが明らかになった.ミトコンドリアはDNA修復酵素系に富み,ダイナミックにミトコンドリアDNA (mtDNA)変異の修復を受けていることがわかってきた.mtDNA修復系の特徴から,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesの有効性が期待されている.海外共同研究者のd'Alarcao教授らはoligonucleotidesをアルキルトリフェニルホスホネート(APP)誘導体化すると,ミトコンドリア内へ効率よく集積することを発見した.本研究では,mtDNA変異を標的としたChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを作成し,APPで誘導体化して,ミトコンドリア集積性を高めて,mtDNA変異を標的とする一塩基置換修復法を開発する.1.ミトコンドリアDNAを分子標的とする特異的一塩基置換修復法の開発ミトコンドリアDNA3243A/G変異を標的とするChimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成した.正常ミトコンドリアDNAと3243G変異DNAのmixtureをテンプレートとしたミトコンドリアDNA複製系に,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを添加すると,容量依存性に3243G変異が修復されることが明らかにした.Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesを化学合成し,アルキルトリフェニルホスホネート誘導体(APP)による修飾が可能か,検討した.対照としたDNA oligonucleotidesに比べて,Chimeric RNA/DNA oligonucleotidesは,APP化修飾効率が対照の約20%と低いことが明らかになった.
新しい電子機能を目指した分子内自由度の開発

π電子共役系の電子機能性を引出すため、共役系の形状や大きさ、組込むヘテロ原子の種類と位置、更には共役系外の置換基を自在に設計し、実際に多様な電子状態を持つ物質を合成した。環境変化や外部刺激に対する応答を検討し、パルス光照射に超高速に応答する分子性導体の電子状態と結晶構造の変化過程を0.1ピコ秒単位で計測するなど、基礎科学の新展開を促進する成果が得られた。さらに、実用電子材料の動作原理を与える成果も得られた。分子自由度を用いた物質開拓において、分子の内部構造自由度に着目した設計を行う。分子性凝縮系の電子物性を支配する共役電子系の形状、大きさ、更に、共役系を構成するヘテロ原子の種類と共役系内での位置を自在に設計し、実際に物質を合成し、新規な電子物性の発現を目指す。設計指針の第1として、比較的小さなπ電子共役系を持つ導電性成分分子の錯体を開拓する。分子サイズが小さい場合、強い電子-格子(分子振動)相互作用や電子-電子相互作用のみならず、相転移に伴う際立った分子変形や外場変化に対する巨大応答も期待される。第2の設計指針として、20個程度のpz軌道からなる比較的大きなπ電子共役系を用いて、超伝導体や、新規な共役系を持つ導電性成分分子の開拓を行う。また、第3の指針として、導電性を担うπ電子系に加え光応答性部位を同一分子内に導入し、電子物性の光制御を試みる。さらに第4の指針として、π電子共役系の幾何学的な構造を制御する事により、安定な開殻中性種を構築する事を試みる。得られた機能性物質を領域内外に提供するのみならず、構造と基本物性を明らかにし、その情報の共有・提供を行う。分子そのものの設計・合成を行い、それら自身とそれらの錯体の構造と機能性を検討した。研究代表者らはその光誘起相転移に興味が持たれている(EDO-TTF)_2PF_6とその関連錯体の動的・静的物性の研究を行うとともに、MeEDO-TTFの錯体を系統的に比較検討した。後者については、隣接する分子同士の相対配置と錯体全体の電子構造の相関が明らかになった。分担者(御崎)らは、TTFとTSEが融合した比較的大きなπ電子系を持つドナー(STP誘導体)とその錯体の合成に成功した。これらの内、(ST-STP)ReO_4および(TM-PDS-STP)PF_6(PhCl)が分子内電分離状態をとっていることが示唆された。またEDO-TTF類縁体として一連のEDO-EBDT誘導体の合成に成功した。それらのうち、(DMEDO-EBDT)_2PF_6の結晶育成に成功し、これがEDO-TTF錯体と類似の分子配列をとり、185Kで金属-絶縁体転移を示す事を見いだした。分担者(藤原)らは、光応答性・光電変換機能性を有する物質の開発を目的とし、光応答性部位としてベンゾチアゾール誘導体を組込んだ各種EDT-TTF誘導体の合成を行った。各部位間の相互作用を制御するために、ベンゾチアゾール部位を直接結合させた分子と、アルケンスペーサーを挟んだ分子の合成に成功し、ドナー性や分子内における光誘起電子移動挙動などについて検討を行った。分担者(森田)らは、25π共役電子系骨格を有するトリオキソトリアンギュレン型中性ラジカルの安定性の起源を実験的に明らかにするために、既知分子に導入されていたtert-ブチル基よりも立体保護効果の小さいイソプロピル基やブトキシカルボニル基を持つ誘導体を設計・合成した。これらの誘導体も空気中で安定であることを見出し、不対電子の高い分子内非局在性が分子自身の安定性に大きく寄与していることを明らかにした。昨年度に引き続き、分子の設計・合成を行い、それら自身とそれらの錯体を検討した。研究代表者らは比較的小さなπ電子系を用いた物質開拓を行った。金属状態が多重不安定性を持つ(EDO-TTF)_2PF_6中に、メチル置換されたドナー分子を固溶させた混晶を得た。メチル置換体のモル分率が約0.13の時、元の錯体が示す多重不安定性の内、電荷秩序化不安定性のみが消失した。即ち、多重不安定性の1因子のみを選択的に抑制出来た。分担者(御崎)らは、TTFとTSFが融合した比較的大きなπ電子系を持つST-STPの化学修飾を行い、エチレンジオキシ置換体を合成した。これらに基づく分子性導体の開拓・解析を行った。一例として、(EDO-TS)_2PF_6はβ型ドナー配列を有する金属であり、50K以下で絶縁化することが明らかとなった。また、2分子のTTFが融合した新規TTP誘導体も検討し、メトキシ基を有する誘導体やクロペンテン縮環化合物から新規な分子性金属を開拓した。

分担者(藤原)らは、光機能性物質の開発を目的として、ベンゾチアゾール誘導体を組込んだ新規TTF誘導体を合成し、薄膜試料での光電変換機能性を検討した。これらの複合分子は、吸収スペクトルに対応した光電流のアクションスペクトルを与え、光電変換機能性を持つ事を見いだした。さらに、複合分子をM(hfac)_2(M=Cu,Co,Mn,Ni)に配位させた遷移金属錯体も作製し、構造と磁気的性質を明らかにした。分担者(森田)らは、トリオキソトリアンギュレン型中性ラジカルの物性制御や機能探索を目的として、様々な置換基を導入した誘導体の設計・合成を検討した。臭素原子を導入した誘導体の合成と、交叉カップリング反応を基盤にした幾つかの誘導体への変換を実現した。また、立体保護効果が小さいにもかかわらず空気中で安定な中性ラジカルの合成にも成功した。新規電子機能性物質の開拓を継続・発展させた。フラーレン錯体としては初めての2次元的な金属状態を示す錯体を開拓し、極低温まで絶縁化しない事を見出した。結晶水を含むBEDO-TTF錯体の微結晶を高分子膜に組込み、X線回折と導電性の湿度依存性を同時測定し、乾燥状態では大気下とは異なる低導電性構造となる事を明らかにした。分担者(御崎)らは、TTFとTSFが融合したTTP系ドナーであるST-STPを用いた新規分子性錯体、(ST-STP)_2X(X=ClO_4, ReO_4, AsF_6, SbF_6)を開拓した。これらの錯体においては1:1組成を持つ(ST-STP)ReO_4に見られるような分子内における電荷の偏りはなく、ドナー分子全体に正電荷がほぼ均一に非局在化していた。そのため全ての錯体がσ_<rt>=10^2-10^3S cm^<-1>と高い伝導性を示し、低温まで金属的挙動を示すことを明らかにした。分担者(藤原)らは、光機能性物質の開発を展開し、2つのベンゾチアゾール基を組込んだ新規の各種TTF誘導体を合成し、その単結晶試料と薄膜試料において光照射による光電流の発生を観測した。一方、各種カルボン酸誘導体の合成を行い、色素増感太陽電池の作製と性能評価を行ったところ、2つのカルボン酸をTTF側に置換したTTF-ベンゾチアゾール複合分子において、量子効率(0.16%)を見いだした。分担者(森田)らは、トリオキソトリアンギュレンのハロゲン置換体の合成に成功した。合成は市販の試薬から6段階で効果的に行い、いずれも室温空気中で扱えるほどの高い安定性を示した。また、臭素置換体を合成中間体として用いて遷移金属触媒を用いたクロスカップリング反応を試み、フェニル基やアルコキシ基の導入に成功した。酸化還元挙動や電子スピン構造、各種固体物性を測定した結果、導入した置換基に応じた顕著な電子的効果が現れた。新規分子性固体の開拓と解析を進展させた。3種の機構が協同した金属絶縁体(MI)転移を起す多重不安定物質[(EDO-TTF)_<1-x>(MeEDO-TTF)_x]_2PF_6(x=0)の混晶を検討した。x=0.10,0.21の場合はPeierls機構のみによる転移が起きることを明らかにした。EDO-TTFのモノ塩素置換体の錯体開拓を行い、中性と+1価状態の振動スペクトルを測定した。分担者(御崎)らは、TTP系ドナー開発開始時から20年間合成が達成されていなかったテトラメチル誘導体(TMTTP)の合成に成功した。新規の合成経路によりTTPの両末端に異なるアルキル基を導入することも可能となった。TMTTPとReO_4,PF_6,AsF_6,SbF_6の新規錯体を作製した。
胃癌におけるBRCA1/2遺伝子変異解析およびタンパク質発現とその臨床的意義

本研究の目的は、胃癌におけるBRCA1/2遺伝子異常とDNA二本鎖修復機構関連タンパク質発現状況、およびPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の治療効果との関係を明らかにすること、および、胃癌におけるDNA二本鎖修復機構の異常に着目した個別化治療発展の科学的基盤を確立することである。平成30年度は、胃癌患者において腫瘍にBRCA1/2変異がある7症例を詳細に解析すると、3症例にBRCA1/2の病的な胚細胞性変異が同定された。これらの症例では胃癌の家族歴や他臓器癌を有することを確認した。BRCA1/2変異は家族性胃癌の素因となる可能性があり、BRCA1/2遺伝子検査は、癌のサーベイランスと治療法の選択に役立ち得ると結論し、JCO Precision Oncology誌に紙上発表した。また、切除不能進行再発胃癌27例のうち、DNA二本鎖修復機構のうち相同組み換え修復に関わる遺伝子(BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD50, FANCD2)の異常(HR破綻)を認めたものは6例であり、この6例ではプラチナ系抗癌剤(Cisplatin、Oxaliplatin)の奏効率および病勢制御率が有意に高く、生存期間中央値も長いことを確認し、第73回日本消化器外科学会総会で発表した。さらに胃癌術後症例130例に対しても相同組み換え修復に関わる遺伝子異常(HR破綻)を検索したところ、31例にHR破綻を認め、特に癌遺残再発症例において、HR破綻は良好な予後と関連があることを確認し、第26回日本消化器関連学会週間JDDW2018で発表した。臨床的に胃癌におけるBRCA1/2遺伝子異常とDNA二本鎖修復機構関連タンパク質発現状況、およびPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の治療効果との関係を明らかにした。それらを紙上発表および国際学会で発表した。今後はタンパク質発現異常の頻度が高い遺伝子を対象として、胃癌細胞株におけるタンパク質発現をwestern blottingにて評価する。タンパク質発現の高い胃癌細胞株を対象に、shRNAを導入したノックダウン細胞株を樹立する。令和元年度は、遺伝子発現を調節した細胞株と未処理の細胞株に対するPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の細胞増殖抑制効果を、細胞増殖アッセイを用いて評価する。平成29年度は、先行研究でBRCA1およびBRCA2の遺伝子変異が明らかとなっている胃癌腫瘍組織に対する抗BRCA1及び抗BRCA2抗体を用いた免疫組織化学染色にて、タンパク質発現と遺伝子変異形式との関連を確認した。腫瘍にBRCA1/2変異がある7症例を詳細に解析すると、3症例にBRCA1/2の病的な胚細胞性変異が同定された。また、プラチナ系抗癌剤に対する治療効果が高い症例が確認された。BRCA1/2変異は家族性胃癌の素因となる可能性があり、これを第90回日本胃癌学会総会にて発表した。また、当科で胃癌に対する胃切除を施行された症例を対象に、抗BRCA1及び抗BRCA2抗体を用いた免疫組織化学染色を施行し、それぞれのタンパク質発現と、年齢、性別、組織型、腫瘍径、TNM、Stage、リンパ管侵襲、静脈侵襲などの臨床病理学的因子、および再発や全生存との関連を統計学的に解析中である。DNA二本鎖修復機構のうち相同組み換え修復に関わる遺伝子(BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD50, FANCD2)の異常と、再発治療の効果との関連を検討した。胃癌症例27例中、6例に遺伝子異常を認め、その6例ではプラチナ系抗癌剤(Cisplatin、Oxaliplatin)の奏効率が有意に高く、生存期間中央値も長かった。当科で胃癌に対する胃切除を施行された症例の免疫組織化学と病理学的因子との関連を解析中であるが、免疫組織化学が全症例完了していないため。

さらに胃癌術後症例130例に対しても相同組み換え修復に関わる遺伝子異常(HR破綻)を検索したところ、31例にHR破綻を認め、特に癌遺残再発症例において、HR破綻は良好な予後と関連があることを確認し、第26回日本消化器関連学会週間JDDW2018で発表した。臨床的に胃癌におけるBRCA1/2遺伝子異常とDNA二本鎖修復機構関連タンパク質発現状況、およびPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の治療効果との関係を明らかにした。それらを紙上発表および国際学会で発表した。平成30年は、遅れている免疫組織化学を完了する。残りの症例についても遺伝子異常を検索する。その後に、タンパク質発現異常の頻度が高い遺伝子を対象として、胃癌細胞株におけるタンパク質発現をwestern blottingにて評価する。タンパク質発現の高い胃癌細胞株を対象に、shRNAを導入したノックダウン細胞株を樹立する。平成31年は、遺伝子発現を調節した細胞株と未処理の細胞株に対するPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の細胞増殖抑制効果を、細胞増殖アッセイを用いて評価する。今後はタンパク質発現異常の頻度が高い遺伝子を対象として、胃癌細胞株におけるタンパク質発現をwestern blottingにて評価する。令和元年度は、遺伝子発現を調節した細胞株と未処理の細胞株に対するPARP阻害剤やプラチナ系抗癌剤の細胞増殖抑制効果を、細胞増殖アッセイを用いて評価する。研究計画の遅延により、予定していた遺伝子検索にかかる費用が余剰となったため。平成30年度に遺伝子検索、遺伝子改変実験および細胞培養関連実験に使用する。国際学会への参加、研究結果発表に使用する。細胞実験がやや遅れたために余剰が生じた。令和元年度の細胞増殖アッセイを用いた実験に使用する見込みである。
スフィンゴシン1リン酸はビスホスホネートの骨形成抑制を制御できるか

ビスホスホネート(BP)による顎骨壊死の副作用が世界的に認知され,本邦でも2008年に日本口腔外科学会が予防・診断・治療に関するガイドラインを策定し一定のコンセンサスが得られた.しかし,その病態は未だ不明な点が多く,治療への手がかりはない.最近sphingosine-1-phosphate(S1P)が骨リモデリング調節に関与するとの報告がなされた.我々はBPにリスク因子を付加することでRANKL/OPGの不均衡を生じることを実験的に示したが,本研究ではさらにS1PがBPの骨リモデリングへの影響を与えるかの検証を行うことを目指した.ビスホスホネート(BP)による顎骨壊死の副作用が世界的に認知され,本邦でも2008年に日本口腔外科学会が予防・診断・治療に関するガイドラインを策定し一定のコンセンサスが得られた.しかし,その病態は未だ不明な点が多く,治療への手がかりはない.最近sphingosine-1-phosphate(S1P)が骨リモデリング調節に関与するとの報告がなされた.我々はBPにリスク因子を付加することでRANKL/OPGの不均衡を生じることを実験的に示したが,本研究ではさらにS1PがBPの骨リモデリングへの影響を与えるかの検証を行うことを目指した.【目的】ゾレドロン酸(ZOL)の骨抑制効果が破骨細胞への直接作用だけでなくリンパ球由来のRAML/OPGの発現に影響を及ぼすか検証するため,B/Tリンパ球を欠損した状態での骨形態変化,血清RANKL/OPG濃度の変化,T細胞の局在について検討する。【材料および方法】C57BL/6, NOD-scid,健常ヒト末梢血単核球を移植したNOD-scidの3群で8週齢の雄マウスを用いた.実験系はこれまでの報告と同様にしてプレドニゾロン(PSL)徐放性ペレット(1.5mg/3週)を皮下へ埋入し,ZOL(100μg/kg)を投与し対照と比較した.またLPSは下顎骨膜下に局注した.解析はμCT評価,骨形態計測,ELISA法による血清RANKL/OPG濃度測定,免疫組織学的検討等を行った.【結果】いずれもZOLの投与で骨抑制効果を認め,特に石灰化能の抑制が著明であった.ZOL投与で成長板軟骨幅の増加を認めた.ZOL+PSL併用投与C57BL/6群でLPS処理による血清RANKL濃度の有意な上昇を認めた.1次海綿骨領域においてT細胞の局在変化を認めた.【考察】ZOLの骨抑制は石灰化不全と考えられ,破骨細胞の抑制と同時に軟骨の骨分化抑制への関与が示唆された.またZOLとPSLの併用とLPS処理によるRANKL発現上昇にはリンパ球由来の存在が示唆され,潜在する免疫能がRANKL発現に影響すると思われた破骨細胞より放出されるS1Pは,間葉系幹細胞の遊走,生存,骨分化を促進する一方で,RANKLを発現して骨吸収活性を促進するカップリング因子として作用すると思われる.このことはBPが骨吸収活性を抑制し,かつ骨形成能も抑制する作用を持つことから,S1P調節系への影響が示唆される.我々はこれまでBRONJのリスク因子に挙げられているコルチコステロイドや口腔感染を想定したLPSをBPと併用することでOPG,RANKLへの影響を検討してきたが,S1P機能との関わりついては未知である.そこで,仮にS1PがOPG/RANKLのバランスを制御できるとすれば,BRONJの予防・治療への応用の可能性が期待できるのではないかと考える.本研究の目的は,BRONJの病態解明を目指してこれまで進めてきた基礎研究を発展させてさらなる理解を深めることであり,S1Pに関する以下の疑問点を議題として,これを明らかにするために達成目標を立てた、すなわち議題として,破骨細胞の活性化促進によりS1Pが放出され,パラクライン作用で間葉系幹細胞が骨吸収領域へ動員するか.S1Pは動員された間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化も誘導するか.S1PはRANKL,OPGの血清濃度に影響するか.S1PはBPの作用に影響を及ぼすか.これに対する達成目標としては以下,1.S1P受容体(既知の5種類)について間葉系幹細胞の発現を明らかにする.5.S1PがRANKL,OPG発現にどのように影響するか明らかにする.6.BP投与下でS1Pを処理することによって骨形成の抑制を回復するか明らかにする.当初の目標としては間葉系幹細胞から骨芽細胞が分化し骨形成を行う過程におけるS1Pのシグナル伝達経路を解明することであった。まずはS1P受容体(既知の5種類)について間葉系幹細胞の発現を明らかにするために、各種受容体の発現検討をRT-PCR法を用いて行い、マウス、ラット、ヒト由来の細胞株を用いて発現様式をキャラクタライズした。また、各種受容体の抗体を入手し、タンパクレベルでの発現検討を現在進めている。一方で、S1P受容体のシグナル伝達経路を明らかにするため、まずはS1P添加による細胞増殖能の検討を行った。検討項目に上げていた間葉系幹細胞と骨芽細胞では異なる増殖活性を示した。そしてS1Pシグナルを網羅的に探索するためにマイクロアレイ解析を行い、本研究で注目している間葉系幹細胞のS1Pに対する反応様式を探索した。現在、解析を進めており、今後主に転写因子に着目してシグナル伝達の解析を進めていく予定である。

S1Pが間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化への影響については、分化マーカーの発現や石灰化能を指標とした骨分化能の検討を行ったところ、その作用はむしろ増殖や遊走能に優位であった。S1Pによる間葉系幹細胞のchemokinesisについては、現在進行中であるが、増殖、分化、生存、遊走能のアレイ解析の結果と照合しながらさらなる条件を重ねて検討していく予定である。また、BP投与下での影響についても卵巣摘出モデルを用いて検討するため、準備を進めている。この動物実験ではBRONJのリスク因子であるコルチコステロイドやLPSをBPと併用することで生じる骨形成抑制をS1Pが回復するかを解明する目的で、骨形態計測、RANKL/OPG血清濃度測定などの項目を今後検討していく予定であり、進行中である。代表研究者は平成23年1月付けにて研究機関の移動があったことから研究基盤の変動があった.このため,現在基盤整備の必要があり進行の遅れを生じている.24年度が最終年度であるため、記入しない。転出先である東京大学の機器等に関わる研究基盤は良好であるが,実験室や機器の使用にあたっての制限があり諸手続きを行っているところである.細胞培養関連実験の基盤は整いつつある.予定している動物実験は施設内の飼育条件の制限やスペース確保の関係で申請等を行っているところであり,使用許可が下り次第,遂行していく予定である,24年度が最終年度であるため、記入しない。
p53標的遺伝子の単離とその機能解析

新規p53標的遺伝子として、DFNA5, SEMA3F, BLNK, UNC5A, TMPS, NEEP21, Mieap遺伝子を同定し、その機能を明らかとして、p53によるがん抑制機能のメカニズムに新しい概念を提起した。特に、p53による細胞死誘導機能の新規経路のメディエーターとして、DFNA5, UNC5A, TMPS, NEEP21などを同定し、さらに、腫瘍血管新生抑制因子としてSEMA3Fを同定したことは、従来から重要とされてきたp53の機能に、新しいメディエーターを加え、それらのメカニズムの詳細な解明に大きく貢献できた。一方、BLNKは、細胞質分裂を抑制することで、ゲノムの安定性維持に関与することを明らかとし、さらには、Mieapは、ミトコンドリアの品質管理に全く新しい機序で貢献することを明らかとした。これらの成果は、p53の機能に全く新しいメカニズムを追加するだけでなく、がんの本態解明に大きく貢献しうると考えられる。がん抑制遺伝子p53はヒトがんで最も高頻度に異常の認められる重要な遺伝子であり、そのコードする蛋白質は転写因子である。従ってその標的遺伝子として転写制御を受ける遺伝子群は、p53の生理機能を実行する因子であると考えられているが、その数は00300近くに達すると予測されている。最近では、これらp53標的遺伝子の中に、それ自体ががん抑制遺伝子として機能するものが存在する事実が明らかとなってきた。p53の生理機能の全貌解明と、新しいがん抑制遺伝子の単離の目的で、p53標的遺伝子の単離とその機能解析を進めている。本年度は、DFNA5遺伝子とSEMA3F遺伝子が新規p53標的遺伝子であることを明らかとした。DFNA5遺伝子は元々遺伝性非症候性難聴の原因遺伝子として報告されていたが、一方で我々はDFNA5遺伝子が、ガンマ線によるDNA傷害発生時に大腸細胞においてp53依存性に発現誘導される事実を見出し、さらに、DFNA5はp53非存在下にはDNA傷害誘導性の細胞死を抑制し、逆にp53存在下には、この細胞死を促進する事実を見出した。また、SEMA3F遺伝子は元々肺がんなどで高頻度の欠失を認める第3番染色体短腕21.3に存在するがん抑制遺伝子として報告されていたが、年度の我々の研究から、SEMA3Fの機能は、腫瘍血管新生抑制作用に重要な働きを持っていることが明らかとなり、さらにはp53による腫瘍血管新生抑制機能の重要なメデイエーターの一つであることが推察された。本年度の研究成果によって、p53によるDNA損傷時の細胞死誘導機構において新たな分子の関与が明らかとなり、その全貌解明のための重要な手がかりを見出すことが出来た。また、以前より多くの研究報告から推測されていたp53による腫瘍血管新生抑制作用について、具体的な実行分子を発見したことで、そのメカニズムの解明に大きく貢献し、その応用による腫瘍血管新生を標的とした新しいがん治療法開発のための基盤を作ることが出来たと考えている。従ってその標的遺伝子として転写制御を受ける遺伝子群は、p53の生理機能を実行する因子であると考えられているが、その数は200300近くに達すると予測されている。我々はp53の生理機能の全貌解明と、新しいがん抑制遺伝子の単離の目的で、p53標的遺伝子の単離とその機能解析を進めている。本年度は、NRP2遺伝子、NCCRI1遺伝子、NCCRI2が新規p53標的遺伝子であることを明らかとした。NRP2はSEMA3Fのレセプターで、リガンドSEMA3Fからのシグナルを細胞内へ伝達する。SEMA3F遺伝子は元々肺がんなどで高頻度の欠失を認める第3番染色体短腕21.3に存在するがん抑制遺伝子として知られていたが、昨年度の我々の研究から、SEMA3Fが腫瘍血管新生抑制作用に重要な働きを持っていることが明らかとなり、p53の腫瘍血管新生抑制機能の重要なメディエーターの一つであることが示唆された。本年度の研究成果から、p53はリガンドのSEMA3FとレセプターのNRP2の両方を直接転写制御することで、オートクリンやパラクリンの様式で、腫瘍血管新生抑制や細胞増殖抑制などの抗腫瘍作用を発揮している可能性が示された。

また、本年度は、NCCRI1遺伝子が細胞分裂の制御因子であることや、NCCRI2遺伝子がDNA修復に重要な働きを有する分子であることなどを明らかとしており、これらの研究の成果は、発がんのメカニズムの解明にとどまらず、それらの機能を応用した新しいがん治療法開発のための重要な基盤となりうると考えられる。がん抑制遺伝子p53はヒトがんで最も高頻度に異常の認められる重要な遺伝子であり,そのコードする蛋白質は転写因子である。従ってその標的遺伝子として転写制御を受ける遺伝子群は,p53の生理機能を実行する因子であると考えられているが,その数は200300近くに達すると予測されている。最近では,これらp53標的遺伝子の中に,それ自体ががん抑制遺伝子として機能するものが存在する事実が明らかとなってきた。我々はp53の生理機能の全貌解明と,新しいがん抑制遺伝子の単離の目的で,p53標的遺伝子の単離とその機能解析を進めている。本年度は,NCCRI1遺伝子及びNCCRI2遺伝子の機能解析を進めた。NCCRI1は,細胞質分裂を抑制し,DNA損傷後の染色体異数性発生の防御に重要な役割を果たしていることを証明した。また,NCCRI2は,新規オートファジー関連蛋白質であることを明らかとし,p53によるがん抑制機序の一端が,オートファジーの制御である可能性を示した。これらの研究の成果は,発がんのメカニズムの解明にとどまらず,それらの機能を応用した新しいがん治療法開発のための重要な基盤となりうると考えられる。がん抑制遺伝子p53はヒトがんで最も高頻度に異常の認められる重要な遺伝子であり、そのコードする蛋白質は転写因子である。従ってその標的遺伝子として転写制御を受ける遺伝子群は、p53の生理機能を実行する因子であると考えられているが、その数は200から300近くに達すると予測されている。最近では、これらp53標的遺伝子の中に、それ自体ががん抑制遺伝子として機能するものが存在する事実が明らかとなってきた。我々はp53の生理機能の全貌解明と、新しいがん抑制遺伝子の単離の目的で、p53標的遺伝子の単離とその機能解析を進めている。本年度は、BLNK遺伝子及びNCCRI2遺伝子が新規p53標的遺伝子であることを明らかとし、BLNKが、細胞質分裂を抑制し、DNA損傷後の染色体異数性発生の防御に重要な役割を果たし、染色体分離の新しい監視機構であることを明らかとした。p53によるゲノム安定性維持機構は不明であったが、BLNKの解析により、全く新しいメカニズムを明らかとすることができた。また、NCCRI2は、新規オートファジー関連蛋白質であることを明らかとし、ヒトがんで高頻度に不活性化され、腫瘍増殖を強力に抑制する活性を有している事実を見出した。p53によるがん抑制機序の一端が、オートファジーの制御である可能性を示した。これらの研究の成果は、発がんのメカニズムの解明にとどまらず、それらの機能を応用した新しいがん治療法開発のための重要な基盤となりうると考えられる。