hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管皮肉ヘパラン硫酸(Ryudocan)の血管障害における分子病態的機能解析

現在、より簡便かつ精度のよいELISA系開発の検討を行っており、臨床検体でのヒトRyudocan血中濃度の測定法を確立し、各種血管障害時での本分子動態とその病態との関連の解析に応用することにより様々な内皮細胞機能におけるRyudocan分子の役割解析を進めて行く予定である。血管内皮ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)はヘパリン様糖鎖をもち、そのアンチトロンビンIIIコファクター活性を介して血液の流動性を保つことに重要な役割を担っていると考えられている。既に我々は、抗凝固活性をもつヘパラン硫酸プロテオグリカン(Ryudocan)のラットおよびヒト分子コア蛋白cDNAのクローニングに成功している。昨年度は、ヒトRyudoxanコア蛋白CDNAのコードするアミノ酸配列をもとにした合成ペプチドを用いてヒト分子に対する特異抗体・抗ヒトRyudocanモノクローナル抗体を作製したが、今年度はこれを用いて血管内皮様細胞(EAhy926細胞)の培養上清からヒト分子を精製分離し、各種ヘパリン結合蛋白分子との相互作用の解析を試みた。その結果、精製ヒトRyudocan分子は、ミドカイン(MK)、bFGF、およびTisssue Factor Pathway Inhibitor(TFPI)の順にそれぞれとヘパラン糖鎖依存性の強い親和性をもつことが判明した。また、組織免疫学的な本分子存在様式の検索にて、胎盤絨毛トロホブラスト、大動脈粥状硬化巣において粥状部間質、血管周囲の末梢神経線維束に強い染色像が認められた。ヘパラン硫酸は動脈内膜肥厚硬化の原因のひとつである血管平滑筋細胞の増殖抑制作用、あるいはbFGFのレセプター補助作用をもつことが報告されており、血管あるいは組織障害部での修復過程に何らかの重要な働きを果たしている推測された。また、Ryudocan分子が神経線維伸長作用をもつMK、あるいは外因系凝固反応阻止因子であるTFPIなどとも相互作用をもつことが判明し、本分子が生体内でも多機能分子として様々な血管機能に関わっていることが示唆された。
環太平洋生物化学工学国際会議における医工・産官学連携シンポジウム開催に関する調査

調査の対象を本科研研究体制の内部および外部に分けた。すなわち、シンポジウム開催、海外学会調査などによる対外調査および本科研研究協力者自身の研究内容をまとめた内部調査に分けて行った。対外調査としては、国内学会におけるシンポジウム開催、国際学会におけるシンポジウム開催、合宿形式の勉強会開催、海外学会の調査「第46回アメリカ細胞生物学会」、海外からの講師招聘「第3回国際バイオプリンティングシンポジウム」を行った。内部調査としては、本科研研究協力者自身の研究内容、すなわち「セル&ティッシュエンジニアリング研究」を調査し分類してまとめた。その結果、再生医療の実用化の課題として自動化、非侵襲的診断、分化等のモデル化が提案され、国内でも研究されていることがわかった。また、医薬品生産のさらなる発展のためには、高生産株の迅速樹立法確立のほか細胞保存法、無血清培養法、高密度培養法の改良も求められており、国内でも精力的に研究されていることがわかった。さらには、細胞を用いた創薬ターゲットの新規探索法やバイオプリンティングなど、従来のジャンルの枠に収まりきれない課題も生まれつつあることも判明した。環太平洋生物化学工学国際会議(APBioCheC)においては、これらの課題の中から精選して医工・産官学連携国際教育シンポジウム「セル&ティッシュエンジニアリング」を提案すべく、引き続き今回の研究参加者同士で情報交換をしてゆきたい。
脂質膜中での生体防御ペプチド間のヘテロ分子認識に基づく高活性超分子形成

アフリカツメガエル由来の生体防御ペプチドであるマガイニン2とPGLa脂質膜中でヘリックスを形成し、さらに相互に分子認識をして1:1の組成を持つ高活性へテロ超分子複合体を形成することにより高い相乗効果を発現することを平成9年度の研究で見いだした。そこで、次にこの高活性へテロ超分子複合体におけるヘリックスの会合様式を化学架橋法により検討した。マガイニン2のN末端にCGGフラグメントを結合したペプチド(N-MG)、PGLaのN末端にCGGフラグメントを結合したペプチド(N-PG)、およびPGLaのN末端にGGCフラグメントを結合したペプチド(C-PG)を固相法により合成した。これらは、親ペプチド同様、水溶液中でランダム構造、酸性リン脂質膜中でヘリックス構造をとった。N-MGとN-PGの1:1の混合物を水溶液中(pH9)で24時間酸化させたところ、N-MGホモダイマー、N-MG-N-PGへテロダイマー、N-PGホモダイマーが1:2:1の統計的な割合で生成した。N-MGとC-PGの組み合わせでも同様であった。この結果は、水溶液中ではマガイニン2とPGLaの間に特別な分子認識は働いていないことを示している。一方、酸性リン脂質膜存在下で、pH7、10分間酸化反応を行わせたときには、N-MGとN-PGの1:1の混合物では大量のへテロダイマーが生成したのに対し、N-MGとC-PG混合物の場合には、ヘテロダイマーが全く生成しなかった。このことは、脂質膜中でのみ両ペプチド謝こ分子認識が起こり、ヘリックスが平行に会合したヘテロ超分子複合体を形成することを示している。アフリカツメガエル由来の生体防御ペプチドであるマガイニン2とPGLaをFmoc固相法で合成した。大腸菌に対する最小発育阻止濃度はいずれも50μMであったが、両者を1:1で混合したところ6μMとなり、約8倍の相乗効果が確認された。いずれのペプチドも酸性リン脂質からなる人工二分子膜に選択的に作用し膜透過性を上昇させたことから、これらは酸性リン脂質を豊富に含む細菌細胞膜の透過性を上昇させることにより殺菌効果を示すものと思われる。両ペプチドの混合比を変えて、膜透過性上昇活性を調べたところ、1:1の混合比のとき最大の活性を示した。水溶液中では両者は相互作用を示さなかったので、膜中においてのみ1:1の組成を持つ高活性へテロ超分子複合体を形成すると推定された。それぞれのペプチド単独あるいは1:1の混合物も、膜透過性上昇にともない膜脂質のフリップフロップとペプチドの膜透過が観測されたことから、基本的な作用メカニズムは同じで、膜中にペプチド-脂質超分子複合体ポアを形成することであると考えられる。ポアの寿命を測定したところ、マガイニン2が40ミリ秒、PGLaが1ミリ秒、1:1混合物が7ミリ秒であった。ポア形成速度は1:1混合物【greater than or equal】PGLa>>マガイニン2であった。したがって、高活性ヘテロ超分子はPGLaの持つ速いポア形成とマガイニン2の持つ長寿命ポアという両者の長所を合わせ持つために高い活性を発現してアフリカツメガエル由来の生体防御ペプチドであるマガイニン2とPGLa脂質膜中でヘリックスを形成し、さらに相互に分子認識をして1:1の組成を持つ高活性へテロ超分子複合体を形成することにより高い相乗効果を発現することを平成9年度の研究で見いだした。
水稲の湛水土壌中散播栽培法に関する研究

1.ペレット状種籾の作製法と播種比重大な岩石粉「オリビンサンド」と従来品とは異なるカルパー粉剤(Ca【O_2】25%,焼石膏50%含有)の混合物を用いるペレット状種籾作製法の改良で、1cm前後の好適播種深度が得られ、ヘリコプターによる播種も可能となった。播種時に落水状態とすれば、代かきによって形成された土壌表層12cmの軟弱土層中にペレット状種籾が埋没して好適播種深度が得られることを解明した。2.出芽・苗立ちの安定化メソコチルを中心とする維管束系の発達を促す手段は出芽・苗立ちを保障するものであること、出芽不安定はペレット状種籾周辺の局所的かっ急激な土壌還元と関連深いことが明らかになった。播種期の湛水下の最低地温は最低気温に強く影響された。3.栽培法の特徴北陸地域での農家試作では、稚苗移植の収量水準に平均5%弱不足であるが、播種期が遅れなかった場合、基肥減量・穂肥増量によって移植並を確保した例が多い。播種量は34Kg(乾籾/10a)、基肥は稚苗移植に比べ25割減、さらに早期に中干しすることにより過繁茂を防ぎ、有効茎歩合が高まる方向に幼穂形成期までの生育を誘導する。そして穂肥の増施によって単位面積あたり籾数を安定的に確保し、登熟の向上を図ることにより収量の安定化がもたらされると現在のところ判断している。また、散播栽培法においては極端に密立ち密度の低い所(3050本/【m^2】以下)ができなければ、苗立ち密度のムラは減収要因とはならないことがわかった。収量の高位安定化のための播種量、施肥方法、水管理等の生育制御技術確立のためには生育指標の把握が重要であるので、その1つとして散播栽培水稲群落内光環境の測定を行なった。
肝膵同時大量切除の研究-特に膵切除によるホルモンの変化に対する肝再生について-

肝再生率をみると、肝切除のみの群とこれに膵切除50%加えた群ではともに経時的に高くなっていた。肝切除のみの群では1、3、7、14、28日目の肝再生率ははそれぞれ、29.6%、57.7%、69.6%、79.1%、97.9%であった。膵切除を加えた群では、それぞれ、33.9%、43.8%、54.6%、72.4%、92%であった。全体的に肝切除のみのほうが再生率はよい傾向にあった。統計学的に比較すると術後3、7、14日目の再生率が危険率5%で有意差があった。GOT、GPT、アンモニア、血糖の変動で両群に有意差はみられなかった。門脈血中のインスリンとグルカゴンの値では、単開腹下で採血した門脈血のインスリン濃度は平均31.2μU/ml(n=10)でグルカゴン濃度は152.4pg/ml(n=10)であったグルカゴン/インスリン比は約5(pg/μU)であった。術後7、14、28日目で両群ともインスリンは低下していたが、グルカゴンは上昇していた。両群間でみるとインスリンの減少に有意差はみられなかったが、肝切除のみのものは徐々にインスリン濃度が上昇していくのに対し、膵切除群ではその上昇傾向はなかった。グルカゴン濃度の上昇は膵切除を加えて群で著明であるが、肝切除のみの群では経時的に低下していった。しかし、膵切除群では低下傾向が弱かった。グルカゴン/インスリン比をみると、肝切除のみの群では術後の経過とともに低下し28日目には比は9と正常(単開腹時のデータは約5)に近ずいているが、膵切除合併群は低下傾向がなかった。膵ホルモンが肝再生に及ぼす影響のひとつとして、門脈血中のグルカゴン濃度上昇やインスリン濃度の低下が考えられ、グルカゴンとインスリンとのインバランスが肝膵同時切除の際の肝再生に影響を及ぼすもののひとつではないかと考えられ、さらなる詳細な実験と検討が必要であると思われた。
精巣をモデルとした細胞分化過程における細胞接着分子の機能解析

これまで、新規に発見された脳と精巣に特異的に発現する細胞接着分子(brain-and testis-specific immunoglobulin superfamily、BT-IgSF)の受精における役割を調べてきた。これまでの研究で、この分子が精巣の中で染色体が半減した時期である円形精子細胞の時期に発現していることを明らかにした。また、BT-IgSFの細胞内、細胞外領域に対する力価の高い抗体がニワトリで作成することができた。これらの抗体を用いた精子の免疫組織化学的観察から、BT-IgSF分子は精子の成熟に伴って精子上の局在を変え、成熟精子では頭部に分布することを明らかにした。精子をCaイオノフォアA23187で処理し、先体反応を誘起させて免疫組織化学を行ったところ抗BT-IgSF抗体のシグナルは消失した。従って、BT-IgSF分子は精子先体の表面に存在することが予想される。さらに、BT-IgSF分子が卵と精子の受精に関わっているかどうかを明らかにするため、抗BT-IgSF抗体をが受精阻害を起すかどうかを調べた。ラットの卵巣から未受精卵を含む卵胞を採取し、液体培地でヒアルロニダーゼとともに培養し、顆粒層細胞を除いた後、抗BT-IgSF抗体の存在下、あるいはニワトリ血清存在下で精子を媒精し、その後の発生を調べた。ラット卵は培養液中に48時間置くと自己分割を生じるため、分割卵の計測は媒精後30時間で行った。その結果、媒精30時間後、ニワトリ血清存在下のコントロール群では卵割は平均66.3%の卵で生じたが、抗BT-IgSF抗体の存在下では卵割した卵は19.8%であった。また、精子を加えない卵では分割卵は0%であった。以上、本研究の結果より、BT-IgSFは精巣におけるその生合成系が特異的なだけではなく、受精に必要な分子で有ることが明らかにできた。私どもが見出した新規の細胞接着分子BT-IgSF(Brain- and Testis-specific Immunogloblin Superfamily)は既にノーザンドットプロット解析により脳梁、海馬、精巣に強く発現していることを見出している。またRT-PCRの結果から、神経系においてこの分子は神経細胞にもグリア細胞にも両方発現していることを明らかにしている。ラット精巣を用いてBT-IgSF遺伝子のin situ hybridizationを行ったところ、曲精細管内の円形精子細胞にその遺伝子発現が認められた。その発現時期を詳細に同定するために、PAS染色を用いて精子細胞中の先体部位を染め、その大きさから精子細胞のステージを決定した。その結果、BT-IgSF遺伝子はステージIIIVII(特にステージIVVI)の円形精子細胞に強く発現していた。BT-IgSFの細胞内領域に対する抗体を作製し、免疫組織化学を行った結果、精巣から得た未成熟な精子では(1)精子中片と尾部(2)精子尾部が染まる2種類の精子が存在すること、精巣上体頭部から得た精子では精子尾部が、精巣上体尾部から得た成熟精子では精子頭部と尾部および中片基部が染まることが観察された。この結果はBT-IgSFが精子成熟に伴って精子内局在を変えていく可能性を示している。さらに、本年度はin vivo gene electroporation技術の習熟を開始した。材料としてマウス胎仔を用い、脳室内へのBT-IgSF遺伝子の注入を行なった。3日後、胎仔脳を取り出し、切片を作製してBT-IgSF抗体を用いて免疫組織化学を行った。

その結果、神経細胞の一部に外来BT-IgSF遺伝子が取り込まれる結果を得た。私共は脳と精巣に特異的に発現する細胞接着分子を見出し、その構造からイムノグロブリンスーパーファミリーに属する分子であることからBT-IgSF(Brain- and Testis-Immunogloblin Superfamily)と名づけた。BT-IgSFは精巣では遺伝子が半数体の時期である円形精子細胞に発現することをin situ hybridization法で見出していたが、成熟精子に存在するかどうかは、力価の高い抗体が無く、検証することが出来なかった。本年の研究において、BT-IgSFの細胞内、および細胞外領域に対する抗体を得ることが出来た。ウエスタンブロッティングによる確認で本分子は分子量65kDaであることが明らかになった。COS7細胞に発現させたリコンビナントなBT-IgSFが52kDaであることから、nativeな状態のBT-IgSFはより多くの糖鎖が存在すると考えられる。成熟精子におけるBT-IgSFの役割を明らかにするため、BT-IgSF細胞外領域に対する抗体を用い、ラット受精への影響を調べた。精子培養液に抗BT-IgSF抗体を含む抗血清を添加した後に欄と人工授精させると、受精率は大きく低下した。また、受精した胚でもその発生は遅く、また異常分割も多く見られた。これらの結果は成熟精子のBT-IgSFが卵との相互作用である受精において、重要な働きをしていることを示唆している。さらに、BT-IgSF遺伝子の発現を制御するためのin vivo electroporation技術の習得も継続的に行なっており、マウス胎児脳の脳室内注入技術はほぼ完成した。今後、精巣への応用が可能かどうか試みる予定である。これまで、新規に発見された脳と精巣に特異的に発現する細胞接着分子(brain- and testis-specific immunoglobulin superfamily、BT-IgSF)の受精における役割を調べてきた。これまでの研究で、この分子が精巣の中で染色体が半減した時期である円形精子細胞の時期に発現していることを明らかにした。最近、、BT-IgSFの細胞外領域に対する力価の高い抗体がニワトリで作成することができた。本年はBT-IgSF分子が卵と精子の受精に関わっているかどうかを明らかにするため、抗BT-IgSF抗体が受精阻害を起すかどうかを調べた。ラットの卵巣から未受精卵を含む卵胞を採取し、液体培地でヒアルロニダーゼとともに培養し、顆粒層細胞を除いた後、抗BT-IgSF抗体の存在下、あるいはニワトリ血清存在下で精子を媒精し、その後の発生を調べた。ラット卵は培養液中に48時間置くと自己分割を生じるため、分割卵の計測は媒精後30時間で行った。その結果、媒精30時間後、ニワトリ血清存在下のコントロール群では卵割は平均66.3%の卵で生じたが、抗BT-IgSF抗体の存在下では卵割した卵は19.8%であった。また、精子を加えない卵では分割卵は0%であった。従って、BT-IgSFは受精に必要な分子で有ると考えられる。さらに、本分子の精子内局在を免疫組織化学的に調べたところ、精子頭部に存在することが明らかになった。また、精子をCaイオノフォアA23187で処理し、先体反応を誘起させて免疫組織
分子設計に基づく新規な太陽電池の開発

(1)酸化チタン超微粒子薄膜電極について高機能化のための改善を行った。高効率なバルク内電子移動を行わせるために高伝導性酸化チタン超微粒子薄膜電極の作製法を確立した。(2)酸化チタン超微粒子薄膜電極表面上の光増感色素の効果的な固定方法について検討し、固定量を向上させただけではなく光電流密度、セル開放電位などの光電変換諸特性を改善する手法を見いだした。(3)分子太陽電池の機能性色素として最適とされているカルボシキル基を有するルテニウム金属錯体について酸化チタン電極表面との分子レベルでの結合配列状態を赤外振動分光法などにより決定し、光電変換諸特性との相関を明らかとすると共に表面との電子的相互作用の詳細について検討を行った。さらにフォトルミネッセンス測定により色素の光励起状態における溶液中でのエネルギー準位と効率の相関、超微粒子薄膜電極表面との結合性について統一的な見解を得た。(4)選定された分子システム太陽電池に最適と思われると他の機能色素を用い、透明ガラス電極、ホールリレーシステムからなる太陽電池の試作を行った。分子太陽電池としての光電変換諸特性ならびに耐光性についての特徴を明かにした。(5)分子太陽電池のソリッドステート化の方策について検討した。これまでの湿式太陽電池では電子供与体を含む電解質溶液を用いた方式が検討されてきたが多孔質材料中の固体電解質によるホールリーレー機能化を試み、安定性と電流密度に及ぼす効果を明らかとした。1.励起状態で酸化チタンへの電子注入が可能な有機色素として、既にGratzelによりその有効性が報告されている錯体Ru(dcb)_2(NCS)_2(dcb=4,4'-dihydroxycarbonyl-2,2'-bipyridine)を合成した。この錯体の基礎物性として、吸収スペクトル、蛍光スペクトル、サイクリックボルタモグラムの測定を行った。この錯体の吸収はpHの増加とともにブルーシフトする興味深い現象が見られた。2.酸化チタンの表面修飾法として、アセトニトリル中で酸化チタン微粒子を酸塩化物または酸無水物により処理する手法を試みた。この手法によれば、酸化チタン微粒子表面の水酸基とこれら修飾剤との反応により、エステル結合を形成し、安定な修飾が可能であることがわかった。この修飾法は色素分子の酸化チタン表面への固定化に応用可能であると期待される。3.四塩化チタンを氷冷下、アセトニトリル中で加水分解することによりナノスケールの粒径を有する酸化チタン超微粒子を調製する手法を検討した。4.酸化チタンの超微粒子を用いた新規太陽電池電極のための薄膜化技術を検討した。市販のP25微粉末を成形焼結する手法、三塩化チタンから電着法によって作製する技術、化学的にゾル-ゲル法によって作製する技術、それぞれの技術で作成した超微粒子薄膜について電気伝導性、表面状態、耐溶媒性、物理的強度などを検討し、最適な調製法について多くの知見を得た。5.上記の色素ならびに酸化チタン薄膜を用い、透明ガラス電極、ホールリレーシステムからなる太陽電池の試作を行い、分子太陽電池としての光変換諸特性ならびに耐光性についての予備的な検討を開始した。酸化チタン超微粒子薄膜電極表面上の光増感色素の効果的な固定方法について検討し、固定量を向上させただけではなく光電流密度、セル開放電位などの光電変換諸特性を改善する手法を見いだした。(2)分子太陽電池の機能性色素として最適とされているカルボキシル基を有するルテニウム金属錯体について酸化チタン電極表面との分子レベルでの結合配列状態を赤外振動分光法などにより決定し、光電変移諸特性との相関を明らかとすると共に表面との電子的相互作用の詳細について検討を行った。

さらにフォトルミネッセンス測定により色素の光励起状態における溶液中でのエネルギー凖位と効率の相関、超微粒子薄膜電極表面との結合性について統一的な見解を得た。(4)前年度に選定された分子システム太陽電池に最適と思われると他の機能色素を用い、透明ガラス電極、ホールリレーシステムからなる太陽電池の試作を行った。分子太陽電池としての光変換諸特性ならびに耐光性についての特徴を明かにした。分子太陽電池のソリッドステート化の方策について検討した。これまでの湿式太陽電池では電子供与体を含む電解質溶液を用いた方式が検討されてきたが多孔質材料中の固体電解質によるホールリーレー機能化を試み、安全性と電流密度に及ぼす効果を明らかとした。1.前年度に引き続き安定性と耐候性向上の為にホール輸送層の固体化の為の方策を検討した。物質としては電子伝導性のある電解重合ポリマー(ポリピロール)をとりあげ、色素担持の多孔質酸化物半導体の細孔中に溶液内にて固体ホール輸送層を構築す事に成功した。また、電解重合時の電位、ド-ピング密度、重合量などについて詳細な検討を行い、光電変換諸特性との相関を明らかとし、新しいシステムとしての可能性と応用のための指針を明確にした。2.新しい光増感層として無機半導体超薄膜の可能性を検討した。物質としてはGaAsにならぶ最高の理論変換効率を有することがわかっているCdTeを用いて薄膜を酸化物半導体多孔質表面へ構築した。還元電着法を用いて電位、溶液組成などを制御することにより、伝導型と構造の規定されたCdTe薄膜を酸化物半導体多孔質表面へ構築することに成功した。3.従来のシステムにおける電池の構成部品、即ち透明電極、対極、電解質溶液組成の最適化を試み、実用的応用における諸問題の解決を図った。また、有機光増感層である色素の吸着配向の評価をより詳細に行い、システムをより安定に高感度に作製する指針を明確化した。4以上の検討を総合的に判断し、現在のSi系の固体型太陽電池との種々の観点からの比較検討を行い、分子設計型太陽電池の特長を明かとした。
中国北京市の大気環境の新たな観測システムの構築と動態解析による環境対策への評価

中国北京市では2008年五輪開催に向けた都市改造の最中であり、すでに高濃度である大気粉塵がさらに増加する危険性がある。従って大気粉塵の発生源を明らかにし対策を進めることが重要である。本研究では中国北京市清華大学において大気粉塵試料を1日ごとに採取し、微量化学成分の分析を行った。北京市における微量金属成分濃度は、全ての成分において東京都の濃度を上回り、特にヒ素に関しては25倍を超える高濃度であった。回帰分析を用いて微量金属濃度の長期的動向を調べた結果、2001年3月2006年2月の期間において、銅・亜鉛・ヒ素・カドミウム・鉛といった石炭燃焼由来の重金属濃度が年率4.9%19.8%の割合で増加していることが判った。さらに、CMB(Chemical Mass Balance)法を用いて大気粉塵の発生源の推定を行ったところ、約8割の大気粉塵が人為起源であり、特に石炭燃焼が全体の35割を占める主な発生源であることが判った。北京市における総多環芳香族炭化水素類(ΣPAHs)濃度は東京都と比べると数十数百倍高濃度であった。また、暖房期におけるΣPAHs濃度は非暖房期に比べて10.7倍高くなった。この原因は主に一般家庭における石炭燃焼の影響であると考えられた。大気粉塵中PAHs濃度測定結果を基にPMF(Positive Matrix Factorization)法を用いて大気粉塵中PAHs発生源の推定を行った。PAHsの主な発生源として石炭燃焼、廃棄物燃焼、木材燃焼、自動車排気が考えられた。暖房期、非暖房期における各発生源からの寄与率を求めると、暖房期では石炭燃焼、廃棄物燃焼、木材燃焼からの寄与が合計約70%となり、これらの発生源からPAHsが多量に放出されていることが推定され、石炭、廃棄物、木材が一般家庭において冬季の暖房用燃料として使用されていることが示唆された。2003年9月2日2004年7月3日の期間の中国北京市清華大学構内におけるPM10(粒径10μm以下の大気粉塵)質量濃度平均値は145.3±91.0μg/m^3(n=289)であり、これは横浜市に比べて約5倍、アテネの約2倍、さらにカルガリーの約6倍であった。中国北京市清華大学構内における大気粉塵中微量金属15種(Al,Ti,V,Cr,Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,As,Se,Cd,Sb,Pb)の合計濃度は15.1±10.2μg/m^3(n=287)となった。これは川崎市の約8倍、マドリードの約4.5倍にあたる。以上のように中国北京市清華大学構内においては、PM10質量濃度及び大気粉塵中微量化学成分濃度ともに世界各都市と比較して28倍程度高濃度となっており、大気粉塵による汚染が非常に深刻になっている事がわかった。次に、中国北京市における新たな大気観測地点として、清華大学から東に5kmの地点にある中国科学院の屋上に観測機材を設置し、大気観測を開始した。中国科学院は片側三車線の道路に面しており、また隣接した土地では建造物の建築が行われている。分析の結果、中国科学院屋上での大気粉塵中微量金属濃度はほとんどの金属について清華大学構内よりも濃度が高くなった。特にZnやCdについては約1.7倍の高濃度となった。

水溶性イオン成分に関しては、中国科学院屋上の方が清華大学構内に比べ約2倍高濃度であった。特に、NO_3^-は約3倍高くなっており、自動車排気の影響をより強く受けている可能性がある。2001年9月-2005年6月の北京市のPM10質量濃度の平均値は157±108μg/m^3(n=1130)であった。これは北京市環境保護局が公開している市内13地点のPM10濃度の平均値(2001年9月-2005年6月、153±90μg/m^3, n=1334)とほぼ一致した。また両者の経日変動も一致したことから、本研究におけるPM10濃度の観測結果は、北京市内全域の値をほぼ代表していると言える。北京市における測定全期間のエアロゾル中微量金属及び水溶性イオン成分濃度は、測定された全成分について北京市は東京よりも高濃度であり、特にCa, As, Seについては10倍以上、またMn, Co, phについても5倍以上高濃度であった。中国北京市におけるPM10およびエアロゾル中化学成分について、それぞれの濃度の長期的動向を調べるために、最小二乗法を用いて統計的に回帰式を決定し、2001年3月から2005年3月までの各成分濃度の年変化率を求めた。PM10濃度はこの期間においてほぼ横ばいであったのに対し、Cu, Zn, As, Cd, Pbといった人為起源と考えられる微量金属成分濃度は16.8-36.7%という極めて高い年率で増加していることが判り、近年および今後の重金属汚染の深刻化が懸念される結果となった。2003年9月2005年10月の期間における北京市のエアロゾル中PAHs(多環芳香族炭化水素類)濃度の平均値は134±215ng/m^3(n=89)であった。また、北京市において暖房が許可されている期間(11月15日翌年3月15日)のPAHs濃度(305±279ng/m^3, n=33)は、非暖房期(33±28ng/m^3, n=56)と比較して9.3倍と顕著に高くなった。この傾向は暖房期における北京市での石炭使用量の増加を反映していると考えられる。中国北京市では2008年五輪開催に向けた都市改造の最中であり、すでに高濃度である大気粉塵がさらに増加する危険性がある。従って大気粉塵の発生源を明らかにし対策を進めることが重要である。本研究では中国北京市清華大学において大気粉塵試料を1日ごとに採取し、微量化学成分の分析を行った。北京市における微量金属成分濃度は、全ての成分において東京都の濃度を上回り、特にヒ素に関しては25倍を超える高濃度であった。回帰分析を用いて微量金属濃度の長期的動向を調べた結果、2001年3月2006年2月の期間において、銅・亜鉛・ヒ素・カドミウム・鉛といった石炭燃焼由来の重金属濃度が年率4.9%19.8%の割合で増加していることが判った。さらに、CMB(Chemical Mass Balance)法を用いて大気粉塵の発生源の推定を行ったところ、約8割の大気粉塵が人為起源であり、特に石炭燃焼が全体の35割を占める主な発生源であることが判った。北京市における総多環芳香族炭化水素類(ΣPAHs)濃度は東京都と比べると数十数百倍高濃度であった。また、暖房期におけるΣPAHs濃度は非暖房期に比べて10.7倍高くなった。この原因は主に一般家庭における石炭燃焼の影響であると考えられた。大気粉塵中PAHs濃度測定結果を基にPMF(Positive Matrix Factorization)法を用いて大気粉塵中PAHs発生源の推定を行った。PAHsの主な発生源として石炭燃焼、廃棄物燃焼、木材燃焼、自動車排気が考えられた。
動力用電線ケーブル廃棄被覆材からの熱エネルギー回収のための燃焼技術開発

本試験研究では、動力用電線ケーブル廃棄被覆材から熱エネルギー回収を行うことを目的に、廃棄被覆材の実用燃焼技術開発に必要な基礎燃焼特性のより詳細な解明と本システムの実用化を支援するための総合的な燃焼特性を明らかにした。結果として、本実験で使用した廃棄被覆材は、2段階で燃焼し、第1段階は揮発分燃焼であり約500Kから開始する。一方、第2段階は残留固形分の表面燃焼であり、約700800Kの温度範囲で生じる。試料の着火温度の粒径依存性を実験したところ、150300μmの粒子が最低温度を示し、また、着火温度のばらつきも少ない。そこで、この粒径粒子を電気加熱式層流1次元燃焼炉によって燃焼させたところ、炉上流でCOならびに低級炭化水素が生成するものの炉出口ではすべて完全燃焼する。以上の基礎燃焼実験より、廃棄被覆材の燃焼性は一般的な微粉炭よりも良好であると判断し、次に旋回式乱流燃焼炉による実用燃焼実験を行ったところ、微粉炭粒子よりも約6倍大きい粒径300440μmの粒子でも完全燃焼が可能となった。しかし、分級粒子の場合、500μm以上の粗粒子では、着火するものの安定燃焼は達成できなかったが、未分級粒子では微粒子が助燃効果を示すことから1000μm程度までの粗粒子が混入しても十分燃焼できることを明らかにした。以上の成果を利用し、廃棄被覆材燃焼によるサーマルリサイクル技術の実用化に資する燃焼設計指針の提示を行った。動力用電線ケーブルの被覆材は、ケーブル更新に伴い年間約15万トンにのぼる量が埋立廃棄されている。しかし、このような埋立廃棄は、エネルギー回収の面から不合理であるばかりでなく、環境破壊の一つの要因として中止すべきことは論を待たない。このような背景から、本研究では、熱エネルギー回収における動力用電線ケーブル廃棄被覆材の実用燃焼技術開発に必要な基礎燃焼特性のより詳細な解明と本システムの実用化を支援するための総合的な燃焼特性を明らかにすることを目的とする。本年度では、まず、廃棄被覆材の物理・化学的物性の解明、パルスフィード式電気加熱炉による着火温度測定、電気加熱式層流1次元小型燃焼炉による最適燃焼条件の探索および旋回式乱流燃焼実験炉による実用燃焼特性を、一般的な微粉炭燃焼と対比させながら明らかにした。熱天秤による実験結果として、本実験で使用した廃棄被覆材は、2段階で燃焼し、第1段階では揮発分燃焼であり約500Kから開始する。パルスフィード式着火温度測定装置により着火温度の粒径依存性を実験したところ、150300μmの粒子が最低温度を示しまた着火温度のばらまきも少ない。以上の基礎燃焼実験より、廃棄被覆材の燃焼性は一般的な微粉炭よりも良好であると判断し、次に旋回式乱流燃焼炉による実用燃焼実験を行ったところ、微粉炭粒子よりも約6倍大きい300440μmの粒子でも完全燃焼が可能となる。来年度では、旋回乱流式燃焼炉で完全燃焼可能な粒径限界ならびにそのための最適装置および操作パラメータの究明を行う。本試験研究の最終年度に当たる本年度では、動力用電線ケーブル廃棄被覆材の主成分であるポリエチレンのほか、ポリプロピレエン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ABS樹脂、フェノール樹脂などの各種廃棄プラスティックスの基礎熱物性の解明、着火特性ならびに基礎および実用燃焼特性を明らかにし、燃焼によるサーマルリサイクルのための各種廃棄プラスティックスのキャラクタリゼーションとともに、実用技術に資する支援研究を実施した。得られた結果を以下にまとめる。(1)熱天秤によって各試料の基礎熱物性を解明したところ、試料によって熱分解特性、着火特性は異なり、これは試料製造のための原料とプロセスの差異に関連する。

(2)実用燃焼条件における各試料の着火温度を計測したところ、熱天秤実験と同様、着火温度は試料によって異なり、試料の有する放射物性、密度、水素含有率などのパラメータの差異に依存する。(3)以上の基礎実験の結果を踏まえ、廃棄被覆材およびその主成分であるポリエチレンを旋回式乱流燃焼炉を用いて実用燃焼実験を行ったところ、その燃焼性は一般的な微粉炭よりも良好である。(4)廃棄被覆材の場合、微粉炭粒子よりも約6倍大きい300440μmの粒子でも完全燃焼が可能である。(5)500μm以上の粗粒子の場合は、着火するものの安定燃焼は達成できない。(6)本旋回乱流式燃焼炉で完全燃焼可能な廃棄被覆材の粒径限界は500μm未満である。(7)以上の成果を利用し、廃棄被覆材燃焼によるサーマルリサイクル技術の実用化に資する設計方針を提案した。
血小板・巨核球造血を制御する骨髄微小環境の解明に向けた実験基盤構築

H30年度は前年度の研究に引き続き申請者らが同定した骨髄巨核球造血微小環境を構成するPDPN陽性間質細胞(BM FRC-like cellとして報告)の細胞学的特性解析を行った。PDPN陽性間質細胞の骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化誘導実験の結果、PDPN陽性間質細胞は近年報告された新しい間葉系幹細胞の一種であるskeltal stem cellもしくはその分化系譜に位置する細胞に近い間質系細胞であるという知見が得られた。また、H30年度はPDPN陽性間質細胞のより詳細な分離技術を確立することができた。これまでにPDPN陽性間質細胞の分子生物学的特性解析として遺伝子プロファイリング解析を行い、骨芽細胞と近い特性を持つことが明らかになっていたが、新たに得た知見および確立した技術を駆使し、改めてskeltal stem cellおよびその系譜の細胞とPDPN陽性間質細胞の遺伝子プロファイリングを行なうことでより詳細なPDPN陽性間質細胞の細胞学的および分子生物学的特性が明らかになると予想される。これまでの研究成果により、全く不明であったPDPN陽性間質細胞の細胞起源について仮説が立てられる段階になった。今後は組織学的および分子生物学的手法を駆使してPDPN陽性間質細胞の細胞起源を解明し、個体が骨髄内で巨核球造血微小環境を構成するメカニズムの解明へと発展させていく。当初の計画どおりにPDPN陽性間質細胞の遺伝子遺伝子プロファイリングと細胞学的な分化誘導実験を行い、PDPN陽性間質細胞の特性の一端が明らかになりつつある。その知見にはPDPN陽性間質細胞特異的もしくはPDPN陽性間質細胞を含む間葉系細胞系譜特異的な遺伝子改変のターゲットとなりうる候補遺伝子も挙がってきているため、概ね順調に進展しているとの評価とした。これまでに実施したPDPN陽性間質細胞とリンパ管FRC、リンパ管内皮細胞、骨髄血管内皮細胞、骨芽細胞との遺伝子発現プロファイリングに加えて、skeltal stem cellとその分化系譜細胞とのプロファイリングを行なう。また、これまでの結果からPDPN陽性間質細胞特異的もしくはPDPN陽性間質細胞を含む間葉系細胞系譜特異的な遺伝子改変のターゲットとなりうる候補遺伝子が挙がっており、特異遺伝子Cre発現マウスを導入してCre誘導性EGFP発現マウスと交配することでPDPN陽性間質細胞特異的EGFP発現マウスを作出する。作出したPDPN陽性間質細胞レポーターマウスは骨髄の組織学的検討やFACSを用いた細胞学的検討でPDPN陽性間質細胞の細胞期限の探索を進める。本研究の目的はBM FRC-like cellが制御する骨髄環境形成機構の解明に向けた実験基盤の構築である。今回、その基盤的知見を得るためにBM FRC-like cellの細胞特性解析として、網羅的遺伝子発現プロファイリングを行った。野生型マウス(C57BL/6)の大腿骨および脛骨から骨髄を採取し、BM FRC-like cellをFACS AriaIIでソーティングした。比較細胞として、リンパ節FRC (LN FRC)、リンパ管内皮細胞(LEC)と骨髄血管内皮細胞(BMEC)と骨芽細胞を同様に採取した。網羅的遺伝子発現プロファイリングはGeneChip MouseGene 2.0 ST Arrayで行った。H29年度の計画・目標はマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現プロファイリング解析により、BM FRC-like cell特異的に発現する遺伝子を同定することであった。遺伝子プロファイリングの結果、BM FRC-like cellは骨芽細胞系の特性を保持する骨髄間葉系細胞である可能性が考えられた。また、今回BM FRC-like cell特異的に高発現が認められる遺伝子(e.g., Hbb-bt)を見出した。以上の結果からH29年度の進捗状況は当初の計画通りであり、おおむね順調な進展であると判断した。その知見にはPDPN陽性間質細胞特異的もしくはPDPN

陽性間質細胞を含む間葉系細胞系譜特異的な遺伝子改変のターゲットとなりうる候補遺伝子も挙がってきているため、概ね順調に進展しているとの評価とした。これまでに実施したPDPN陽性間質細胞とリンパ管FRC、リンパ管内皮細胞、骨髄血管内皮細胞、骨芽細胞との遺伝子発現プロファイリングに加えて、skeltal stem cellとその分化系譜細胞とのプロファイリングを行なう。また、これまでの結果からPDPN陽性間質細胞特異的もしくはPDPN陽性間質細胞を含む間葉系細胞系譜特異的な遺伝子改変のターゲットとなりうる候補遺伝子が挙がっており、特異遺伝子Cre発現マウスを導入してCre誘導性EGFP発現マウスと交配することでPDPN陽性間質細胞特異的EGFP発現マウスを作出する。作出したPDPN陽性間質細胞レポーターマウスは骨髄の組織学的検討やFACSを用いた細胞学的検討でPDPN陽性間質細胞の細胞期限の探索を進める。
遺伝子導入による異種間臓器移植モデルの作製

本研究は宿主免疫系から回避して寄生する寄生虫、マンソン住血吸虫Schistosomamansoniとイヌ糸状虫Dirofilaria immitisは、宿主内での免疫系から身を守るために虫体表皮成分または分泌物中に特殊なタンパクを所有していると推測されるが、まだこのようなタンパクが見つかったという報告はない。そこでこのような免疫抑制に関わるタンパクをコードするcDNAを検索し、これをmammalianで高発現するベクターを用いて遺伝子導入し、overexpressionさせることにより、宿主免疫系でどのような機構で免疫抑制反応が行われているのか検討することにした。マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)及びイヌ糸状虫(Dirofilaria immitis)の虫体からRNAを抽出しmRNAを精製後、cDNAライブラリーを構築した。このphageを大腸菌に感染させ、抗S.mansoni抗体及び抗D.immitis抗体を用いてスクリーニングし、寄生虫由来タンパクをコードするcDNAを含むcloneを取得した。このうちS.mansoniより得られたcDNAはそのシークエンスが免疫抑制遺伝子と推定されているRas遺伝子とホモロジーを有していた。次にこのRas遺伝子(以下SmRasと呼ぶ)をクローニングし、種の違う2種類のcell line、マウスのファイブロブラスト(NIH3T3)及びヒト正常血管内皮細(HUVEC)に遺伝子導入することを試みた。まず、mammalian発現ベクターであるpCDNA3.1にSmRas遺伝子をサブクローニングし、これをNIH3T3及びHUVECにトランスフェクトし、薬剤耐性株のみクローニングし、数種類のクローンを得た。これらを異種のリンパ球(NIH3T3とヒト抹消血リンパ球またはHUVECとマウス脾細胞)と共培養することにより、宿主免疫反応をMLR(Mixed Lymphocytes Reaction)にて評価した。その結果、遺伝子導入していないcell lineとSmRasを過剰発現するcell lineとの間に有意な差は見出されなかった。この結果よりまだ他に免疫抑制に関与するたくさんのファクターがあるものと考えられ、これからさらにそのファクターを同様な方法で検索する予定である。このphageを大腸菌に感染させ、得られたコロニーにタンパク発現を誘導するIPTGをしみ込ませたニトロセルロースメンブレンをかぶせ、マンソン住血吸虫及びイヌ糸状虫の虫体をホモジネートした抗原を用いて取得した抗S.mansoni抗体及び抗D.immitis抗体との抗原抗体反応によりスクリーニングし、寄生虫由来タンパクをコードするcDNAを含むcloneを取得した。しかしながら、いまだこの遺伝子の機能の全容は知られておらず、今後この遺伝子を用いて異種間における宿主側の免疫系を回避する機序を解明していく予定である。
角質層保湿の分子機構の解明

皮膚表皮の角質層は、バリアー機能において重要な機能を果たしている。顆粒層SG1細胞は、自身の細胞死により角質層を形成する。顆粒層細胞を分離・培養・細胞死を誘導する系を初めて構築した。細胞生物学的解析により、弱酸性・高Ca2+が、試験管内の角質化に重要であることが明らかとなった。また生体内におけるケラチン構造変化を可視化するプローブを作成し、生きたマウスの顆粒層細胞におけるケラチンネットサークを可視化した。フィラグリン欠損マウスでは、顆粒層におけるケラチンネットワークに異常が認められた。以上の結果から顆粒層細胞生物学は、角質層バリアの理解に重要なツールとなると考えられる。皮膚表皮の角質層は、保護・バリアー機能・保湿などの重要な機能を果たしている。最近、申請者らは、皮膚顆粒層特異的プロテアーゼSASPaseを欠損させたマウスは、アトピー性皮膚炎の最大の疾患素因蛋白質であるProfilaggrinの分解異常を伴う乾燥肌になることを明らかにした。このマウスの顆粒層が、なぜ保湿不全の角質層を形成するのかを明らかにすることは、アトピー性皮膚炎や角化症の理解に重要である。本年度は、既に予備実験としては行われていた顆粒層の最上層SG1細胞の分離手法の再確認とその至適化を行った。SG1細胞にGFPを特異的に発現するヘアレスマウス系統を用いて、SG1細胞を分離する手法を至適化した。現在までの所、マウス皮膚表皮からのトリプシン処理により、多角形をとり、細胞内に顆粒が存在する顆粒層細胞が分離される方法を確立し、それらの中に、GFP陽性・陰性細胞が混在していることが明らかとなった。GFP陽性細胞は、表皮の凍結切片上の解析では、SG1に相当すると考えられる。また、分離した顆粒層細胞の細胞表面の蛍光ラベルを行い、共焦点顕微鏡を用いて形状解析を行う方法も至適化した。その結果、マウス表皮の顆粒層の細胞は、中央部に凹みのあることにより、横断面では鎌形の形状をしていることが明らかとなった。また形状は変化してしまうが、サイトスピン(Thermo Scientific社)によって、このSG1細胞を含む細胞集団をカバーグラス上に貼り付ける手法も至適化した。この方法を用いることにより、実際にSG1細胞に発現していると考えられる表皮分化マーカー(Loricrin, Involucrin, SASPase, Filaggrin等)に対する免疫蛍光抗体染色による解析が可能になった。以上のように本年度は、SG1細胞の表皮からの分離法と細胞生物学的解析手法の確立を行った。皮膚表皮の角質層は、保護・バリア機能・保湿などの重要な機能を果たしている。申請者らはこれまでの報告で、皮膚顆粒層特異的プロテアーゼSASPaseを欠損させたマウスは、アトピー性皮膚炎の最大の疾患素因蛋白質であるProfilaggrinの分解異常を伴って乾燥肌になることを明らかにしている。このマウスの皮膚表皮の生細胞の最上層である顆粒層(Stratum granulosum:SG)が、細胞死を伴う最終分化を行い、どのように保湿不全の角質層を形成するのかを解明することは、角質層バリアが破綻しているアトピー性皮膚炎や角化症の発症の理解に重要である。本年度は、昨年度までに至適化した顆粒層SG細胞の分離法を更に応用し、免疫染色法を至適化した。SG細胞は構造的に多角形でありながらも横断面は鎌形をとる特徴的な形態を保持していることが明らかになっていた。本年度は、この特殊形態を維持するために、細胞を溶液中に浮遊させたまま、免疫蛍光抗体染色を行う方法の至適化を行った。また培養用のSG細胞をより濃縮するために、セルソーターを用いて、SG細胞のみを分離しようとしたが、お互いに接着が強固であるためか、分離は困難であった。そこで、微小マイクロピペットを用いて、SG細胞のみを1細胞づつ吸い上げて培養・観察を行う方法を構築した。この方法により形態学的にも典型的なSG細胞を、撮影視野の中に捉えてタイムラプス撮影をすることが可能になりつつある。一方で、CRISPR/Casシステムを応用し皮膚表皮顆粒層に特異的に蛍光蛋白質を発現させるトランスジェニックマウスを作製した。以上のように、SG細胞を分離・培養・生細胞イメージングする方法が構築された。申請者らは、以前に皮膚顆粒層特異的プロテアーゼSASPaseを欠損させたマウスは、アトピー性皮膚炎の最大の疾患素因蛋白質であるProfilaggrinの分解異常を伴う乾燥肌になることを明らかにしている。本年度は、これまで至適化した顆粒層SG(Stratum granulosum)細胞の分離法に引き続き培養液中のカルシウムイオン濃度の至適化、pHの至適化を行った。その結果、SG細胞は、多角形を保ちながらも細胞死が起こり、顆粒が消失する現象が、弱酸性・高カルシウムイオン濃度の下で再現性良く誘導されることが明らかとなった。また核膜が凝集してくる現象も認められることが明らかとなり、in vivoにおけて以前より報告されていた弱酸性・高カルシウムイオンという条件がSG細胞に対して大きな変化を及ぼすことが明らかとなってきた。

また、SG1に特異的に発現することが確認されているSASPase遺伝子座位にEGFP遺伝子をノックインしたヘアレスマウスを用いて、SG1細胞(最上層の顆粒層細胞)とSG2細胞の細胞死の挙動の違いを解析した。その結果、細胞死のマーカーとなる核染色試薬のDRAQ7はSG2において既に陽性で分離されるが、SG1細胞では生細胞の状態で分離されるものがあることがわかり、今後のSG1のみの分離系、細胞死におけるタイムラプス観察系に有用な知見が得られた。SG細胞に対する電子顕微鏡解析も進めており、角質化に向かう際の細胞膜変化、顆粒消失の変化、核凝縮の変化が、in vitroでとらえれるようになり、in vivo表皮の形態とどのように異なるかなど、詳細な微細構造解析ができる準備が整った。SG1培養系は、培地の条件やカルシウムイオンの添加時期などに大きく影響をうけることが明らかとなり、タイムラプス撮影に困難が生じた時期があったが、新しいロットの培養液や試薬を調製する毎に至適化することで解決できることが明らかとなった。DRAQ7をはじめとする蛍光化合物との組み合わせによりSG細胞の状態をより詳細に明らかにできることがわかり、今後のin vitro角質化解析が大きく進展した。皮膚表皮の角質層は、バリアー機能において重要な機能を果たしている。顆粒層SG1細胞は、自身の細胞死により角質層を形成する。顆粒層細胞を分離・培養・細胞死を誘導する系を初めて構築した。細胞生物学的解析により、弱酸性・高Ca2+が、試験管内の角質化に重要であることが明らかとなった。また生体内におけるケラチン構造変化を可視化するプローブを作成し、生きたマウスの顆粒層細胞におけるケラチンネットサークを可視化した。フィラグリン欠損マウスでは、顆粒層におけるケラチンネットワークに異常が認められた。以上の結果から顆粒層細胞生物学は、角質層バリアの理解に重要なツールとなると考えられる。本年度は、昨年度(H25年度)に計画予定であったSG細胞に対する免疫染色法を構築することができた。特に浮遊状態にある細胞の形態を保ったまま免疫染色を行う点が困難であったが、ブロッキング方法を工夫することによって解決できたことで、今後の細胞内構造の形態解析が容易になると考えられる。また、H27年度に予定していたマウス表皮におけるSG細胞特異的遺伝子発現を、CRISPR/Casシステムを用いて試み、予想通り高効率で皮膚表皮に蛍光蛋白質を発現できる系ができたことから、今後のSG細胞イメージング用ツールとして有用であると考えられる。顆粒層細胞の分離法をさらに至適化し、タイムラプス撮影による角質層不全マウスに対する解析を行う。分離した顆粒層細胞の微細構造解析は既に解析ができているが、タイムラプス観察時に変化が起こった時期に、変化が起こった細胞に対して微細構造解析を行う系を確立していく予定である。またDRAQ7をはじめとする様々なオルガネラを染色する蛍光化合物を加えつつイメージングを行い、SG細胞間における分化段階に応じたクラス分けを行うことを試みる。さらには様々な細胞内現象に対する阻害剤を用いて、SG1細胞死においてどのような影響が現れるのかを解析して、角化の分子基盤を明らかにしていく。皮膚科学本年度に、SG細胞の分離・培養・蛍光染色法がほぼ確立できたことから、実際に顆粒層角質層に異常が認められるSASPase欠損マウスの細胞生物学的なSG細胞の解析を進めていく。
キリシタン対訳辞書の語彙比較

1.『羅葡日辞書』(1595年)『落葉集』(1598年)『日葡辞書』(1603ー1604年)の相違(1)同じ日本イエズス会による印刷物である『羅葡日辞書(ラテン語ポルトガル語日本語対訳)』『落葉集(漢字語集)』『日葡辞書(日本語ポルトガル語対訳)』の収載語のうち、「玉色(ぎょくしき/ぎょくしょく)」、「禁制(きんせい/きんぜい)」のように漢字語のよみが異なるものが少なくないことを明らかにした。特に漢字・ひらがなで印刷された『落葉集』は、ラテン文字の『羅葡日』『日葡』とよみが異なるものが少なくない。(2)『羅葡日』と『日葡』の全体を比較し、文体および注記の面で位相の相違があることを明らかにした。文体について、『羅葡日』が文末にnari(なり)を使うなど書き言葉を基調としているのに対し、『日葡』は原則として、文末にgia(ぢゃ)gozaru(ござる)を使うなど京都周辺で用いられていた話し言葉を基調としている。また『羅葡日』では、後年印刷された『日葡』において仏法語あるいは方言など使用上の注記がされた語が少なからず用いられており、各語についての知識・認識が異なっていたことをうかがわせる。2.『越葡羅辞書』(1651年)と日本キリシタン版日本禁教のためベトナム宣教に従事することになったアレクサンドル・ド・ロードの『越葡羅辞書(ベトナム語ポルトガル語ラテン語対訳)』に、日本語の使用および日本キリシタン版の影響がみられることを明らかにした。ロードの辞書本文にcatana(刀)など日本語からの借用語はみられるものの、『羅葡日』『日葡』などキリシタン版辞書との直接的な影響関係は見出しがたい。しかし辞書に付された「ベトナム語概説」には、中国語と日本語の発音に関する記述など、ロードの日本語教本であったとみられるジョアン・ロドリゲス『日本小文典』(1620年)によったと思われる箇所がある。平成27年度は、キリシタン版の主要三辞書である羅葡日辞書(1595年刊)・落葉集(1598年刊)・日葡辞書(1603-04年刊)の語彙調査により、主に以下の2点を明らかにした。1羅葡日辞書・落葉集・日葡辞書の漢語のよみの相違(1)落葉集・日葡辞書両方に掲出されている漢語を比較すると、「玉色(ぎょくしき/ぎょくしょく)」のような呉音・漢音の違いや「禁制(きんせい/きんぜい)」のような連濁の有無など、よみの異なる語が約180あった(一辞書内で複数のよみがある語を除く)。また落葉集で、日葡辞書において「(語形が)AよりBの方がまさる」と注記されたAの方のよみを採っている語もみられた。(2)落葉集・日葡辞書でよみの異なる漢語について羅葡日辞書を加えて調査したところ、羅葡日辞書に使用されていた約40語では、日葡辞書と同じよみの語が多数を占めるものの、「乱逆(らんぎゃく/らんげき)」のように落葉集・日葡辞書の両形を収載する語も複数あった。上記(1)(2)は、当時のよみのゆれの実態だけでなく、各辞書の編纂目的および典拠・編者の違いを反映したものと考えられる。2羅葡日辞書・日葡辞書の仏教語使用の相違羅葡日辞書では、日葡辞書において仏法語(Bup.)と注記された語が、「解脱」など少なくとも6語使われており、注記のない語でも「回向」のように当時仏教色が強かったと思われる語が使用されている。この背景には、イエズス会での仏教語使用の厳格化と、ラテン語学習・日本語学習という辞書の編纂目的の違いがあったと考えられる。キリシタン版三辞書の語彙調査を行い、研究発表および図書の公刊により、本研究課題の成果を含めたキリシタン辞書研究の現状を伝えることができた。1.フランス学士院本羅葡日辞書影印の解説・参考文献目録公刊キリシタン版羅葡日辞書(1595刊)の現存諸本のうち、保存状態は良いものの閲覧が困難なフランス学士院本の影印に、三橋健氏による書誌解題と合わせ、本研究の成果を取り入れた解説および参考文献目録を付して公刊した。2.羅葡日辞書と日葡辞書(1603-04刊)の文体・語彙の比較(1)文体人称代名詞や文末表現の選択をみるに、羅葡日は文末にnari(なり)を使うなど書きことばを基調にしているが、日葡では文末にgia (ぢゃ)やgozaru(ござる)を使うなど話しことばを中心にしつつ、書きことばも用例を付したり注記で示したりしながら取り入れており、文体に大きな相違がある。(2)注記語日葡では方言語彙や仏法語、文書語など使用上注意が必要な語について注記が付されているが、日葡の約8年前に刊行された羅葡日においては、日葡の注記語が日本語訳にしばしば用いられている。これは羅葡日の凡例にもあるように、羅葡日が見出しのラテン語の語義を多様な日本語で示そうとした結果とも考えられるが、方言と共通語の混用例などから、羅葡日ではまだ日葡ほど、語ごとの知識が詳細でなかったためとも推測される。