hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3倍体プラナリアが正常な半数体を創る減数分裂の分子機構

扁形動物プラナリアは,多能性幹細胞ネオブラストが全身の30%の細胞を占めるために高い再生能をもつが,その生殖様式には1生殖器官を持たず,分裂と再生のみで無性的に殖えるもの, 2生殖器官をつくり2匹が対合して有性的に殖えるもの,そして3その両者を環境により転換させるものの3種類が共存する.また,核型には,2倍体, 3倍体といった倍数性とともに異数性,混数性など染色体の変化が数多く観察されている.本課題に用いたリュウキュウナミウズムシDugesia ryukyuensisでも核相は2n = 14の2倍体と3n = 21の3倍体が混在し,さらに上記の3種類の生殖様式が共存する.よって,この種では生殖器官をもつ3倍体の個体も存在するが,雌性生殖細胞のみの単為発生によりゲノムを混合することなく子孫を作っていると考えられてきた.申請者は生殖器官をもつ個体の卵巣域,精巣域の染色体観察から,相同染色体が対合し,相同染色体間で乗り換えを起こしたキアズマ構造を確認した.本課題で,申請者は個体ごとのゲノムを識別できるマイクロサテライト遺伝子をマーカーとして用いて親子鑑定を行い,分子レベルでゲノムが混合されていることを示した.これらのことは,減数分裂によりできた卵と精子が受精し,ゲノムが混ぜ合わされて次世代を作っていることを示した.また,2匹の3倍体有性生殖個体が接合して産んだ卵殻から,2倍体の仔虫と3倍体の仔虫が同時に誕生するが,これらの減数分裂時の染色体の詳細な観察から,雄性生殖細胞では第1減数分裂前期で既に2倍体になっているが,雌性生殖細胞の第1減数分裂前期では2価の染色体と1価染色体が共存しており3倍体の状態である事が示された.このようにプラナリアでは雌性と雄性における減数分裂の機構が異なることが示唆された.扁形動物プラナリアは,多能性幹細胞ネオブラストが全身の30%の細胞を占めるために高い再生能をもつが,その生殖様式には1生殖器官を持たず,分裂と再生のみで無性的に殖えるもの, 2生殖器官をつくり2匹が対合して有性的に殖えるもの,そして3その両者を環境により転換させるものの3種類が共存する.また,核型には,2倍体, 3倍体といった倍数性とともに異数性,混数性など染色体の変化が数多く観察されている.本課題に用いたリュウキュウナミウズムシDugesia ryukyuensisでも核相は2n = 14の2倍体と3n = 21の3倍体が混在し,さらに上記の3種類の生殖様式が共存する.よって,この種では生殖器官をもつ3倍体の個体も存在するが,雌性生殖細胞のみの単為発生によりゲノムを混合することなく子孫を作っていると考えられてきた.申請者は生殖器官をもつ個体の卵巣域,精巣域の染色体観察から,相同染色体が対合し,相同染色体間で乗り換えを起こしたキアズマ構造を確認した.本課題で,申請者は個体ごとのゲノムを識別できるマイクロサテライト遺伝子をマーカーとして用いて親子鑑定を行い,分子レベルでゲノムが混合されていることを示した.これらのことは,減数分裂によりできた卵と精子が受精し,ゲノムが混ぜ合わされて次世代を作っていることを示した.また,2匹の3倍体有性生殖個体が接合して産んだ卵殻から,2倍体の仔虫と3倍体の仔虫が同時に誕生するが,これらの減数分裂時の染色体の詳細な観察から,雄性生殖細胞では第1減数分裂前期で既に2倍体になっているが,雌性生殖細胞の第1減数分裂前期では2価の染色体と1価染色体が共存しており3倍体の状態である事が示された.このようにプラナリアでは雌性と雄性における減数分裂の機構が異なることが示唆された.通常3倍体プラナリア個体は減数分裂に置ける対合ができないために、真の有性生殖はできないと考えられている。しかし、申請者は3倍体プラナリアが生殖細胞において染色外がキアズマを形成し、2匹の交接により次世代を作り、その次世代個体には3倍体と2倍体が混在することを示している。この次世代の産生が、真のゲノムを混合する有性生殖を行う事により起こっているか否かを明らかにするために、掛け合わせ実験により次世代個体を作成した。その際、マイクロサテライト遺伝子を用いて、その次世代個体ゲノムには双方の親由来のゲノムが混在している事を示し、3倍体個体であっても有性生殖を行う事を示している。この3倍体個体の生殖細胞形成における染色体分配機構を解明するために、1)生殖細胞形成における染色体削減時期の特定、および、2)分裂期染色体マーカーの創出に取り組んできた。1)生殖細胞形成における染色体削減時期の特定を行うために、2)分裂期染色体マーカーの創出を行っている。トランスクリプトーム解析から、生殖細胞特異的遺伝子としてpiwi1-4, nanos、減数分裂関連の遺伝子としてRad51, Rad51C, Rad51-like, spo11の4つを単離し、その配列と発現部位を明らかにしている。また、それぞれに対するポリクローナル抗体も作成中である。その生殖細胞におけるタンパク質の局在を調べようとしている。生殖細胞形成における染色体削減時期の特定を行うために、これらのマーカー分子を用いた免疫染色,蛍光in situ hybridizationなどと、LSCを用いた核相の決定を同時に行う実験系を開発中である。3倍体

プラナリア個体が真のゲノムを混合する有性生殖を行う事が可能か否かを明らかにするために、掛け合わせにより次世代個体を作成した。マイクロサテライト遺伝子を用いてその次世代個体ゲノムには双方の親由来のゲノムが混在している事を示し、3倍体個体であっても有性生殖を行う事を示した。トランスクリプトーム解析から、減数分裂関連の遺伝子Rad51, Rad51C, Rad51-like, spo11の4つを単離し、その配列と発現部位を明らかにしている。また、それぞれに対するポリクローナル抗体も作成中である。1年目に引き続き、1)生殖細胞形成における染色体削減時期の特定、および、2)分裂期染色体マーカーの創出に取り組む。さらに、1年目に作成した抗体と2)で作成した抗体を用いて、3)染色体削減時の染色体挙動の解析を行い、機構を解明する。1)生殖細胞形成における染色体削減の時期の特定:3倍体の多能性幹細胞から生殖細胞が形成される過程において核相の変化を調べる。完全に有性化した個体もしくは有性化途中の個体から卵巣部の細胞を解離し、免疫染色による細胞の標識とDAPI等による核染色を行う。初期生殖細胞の染色にはPiwiまたはNanos抗体、減数第一分裂前期の生殖細胞の染色にはSpo11およびRad51ホモログに対する抗体を用いる。レーザースキャニングサイトメータを用いてシグナルを検出するとともにDNA含量を測定し、各ステージにおける核相を決定する。それらを比較し、染色体削減が起こる時期を特定する。2)分裂期染色体マーカーの創出:これまでに得られているコヒーシンサブユニットrad21およびsmc1の部分配列を元に、RACE法により全長配列を決定し、抗体作製を委託する。また、セントロメアタンパク質(CENP-A、CENP-Bなど)の相同遺伝子を探索し、全長配列を決定し、抗体作製を委託する。3)染色体削減時の染色体挙動の解析: 1)で特定した染色体削減が起こる時期における染色体の動きを、コヒーシンおよびセントロメアに着目して観察する。有性化個体から卵巣部の細胞を分離し、作製した染色体削減時期を識別する分子マーカーとセントロメア抗体、コヒーシンサブユニット抗体を用いて免疫染色を行い、細胞内の染色体の位置と形状、および相同染色体のペアリングが起きているかどうかを検証する。また、チューブリン抗体により紡錐体の微小管を染色し、染色体の動きとの関連を調べる。生殖細胞形成における染色体削減の時期の特定と染色体挙動の解析においては、免疫染色と核染色を行うため、蛍光標識二次抗体を購入する。染色体挙動の観察時には多重染色を行うため、各種の一次抗体に対して異なる蛍光分子で標識された二次抗体を用意する。免疫染色シグナルが弱い場合には、シグナル増感のためTSA増感システムを購入する。分裂期染色体マーカーの創出には、目的遺伝子の配列を決定するためにRACE用のキットとクローニング試薬およびシーケンス試薬を購入する。さらに、抗体作製のための委託費が必要となる。尚、本年度作成予定の抗体の活性上昇に時間が要したため、本年度中に間に合わず、抗体作成の経費が次年度使用となった。
転移性肺がんにおける酸化ＬＤＬ受容体とＴＬＲ４シグナリングのクロストーク

がんが肺へ転移する際に、がん細胞の肺への生着の可能性を高めるような反応が引き起こされることにより、いわゆる転移前土壌が形成される。本研究では、肺における転移前土壌形成に関する分子の相互作用について解析した。転移前土壌の形成により肺での発現が亢進するS100A8、SAA3タンパク質が血管内皮細胞や上皮細胞に発現する酸化LDL受容体やTLR4/MD-2複合体に結合するかどうかを調べたところ、SAA3はTLR4ではなくアクセサリータンパク質であるMD-2に結合することが明らかとなった。また一部のSAA3バリアントが酸化LDL受容体に結合することを見出した。本研究はがん転移反応におけるがん細胞と転移土壌(肺)間における相互作用を、転移土壌側から解析したものである。転移先の臓器では転移反応を成立させるための有利な条件作りが、腫瘍原発巣由来の分子シグナルによって誘導されるという「転移前状態」説に基づいた実験を行った。細胞間のシグナル分子としてはS100A8、S100A9、およびSAA3に、転移先臓器側の受容体分子としては、TLR4、MD2、および酸化LDL受容体に注目した。TLR4MD2は大腸菌などのグラム陰性菌の細胞壁成分であるエンドトキシンの受容体であることから、調製試料がエンドトキシンを含まない合成ペプチドであることや、エンドトキシンの混入の少ない、動物培養細胞からのものであることが要求されている。そこでS100A8やSAA3を合成ペプチドによって再構成したものを準備し、TLR4MD2や酸化LDL受容体との結合を改めて評価した。その結果合成ペプチドによるSAA3の生理機能は培養細胞から精製したものと同等であることが確認された。また、全長のSAA3だけでなく、その部分配列や新たに見出されたバリアントの解析も行い、SAA3のTLR4MD2への結合は部分配列でも有効であることと、ある種のバリアントSAA3は酸化LDL受容体にも結合することが判明した。本研究では、がん細胞が肺に転移する過程において、転移先臓器である肺で、がん細胞が実際に到達する以前にどのような生体反応が起こっているかを分子レベルで理解することを目指している。腫瘍モデルマウスの研究から、腫瘍原発巣からのサイトカイン・ケモカインシグナリングにより、肺ではS100A8・S100A9および血清アミロイドA3(SAA3)といったタンパク質の発現亢進が起こり、肺血管でこれらのタンパク質レベルが顕著に上昇していることが判明している。いくつかのヒト肺がん細胞を用いて血清アミロイドの遺伝子発現を調べたところ、SAA2およびそのバリアントの発現が炎症性サイトカイン(IL-1b, IL-6)刺激によって上昇することが明らかとなった。さらに詳細な検討を行ったところ、これらのSAA2バリアントは酸化LDL受容体と結合しうることが明らかとなった。そこで、エンドトキシンの影響を避けるために、SAA2バリアントを動物細胞で大量発現させ、(HEK293細胞またはCHO細胞)そこから精製したものを実験に用いることとした。これに合わせて、標的タンパク質の部分配列を合成ペプチドによって構築した。結果から、SAA2バリアントが細胞表面上に発現させた酸化LDL受容体と結合することを見出し、さらに酸化LDL受容体細胞外ドメインとSAA2バリアントの結合定数を生化学的実験により決定することができた。またSAA2バリアントのモノクローナル・ポリクローナル抗体を用いた抗体カラム・ELISAシステムを新たに作成することにより、培養細胞上清のSAA2バリアントを定量することが可能となった。現在これらの研究成果をまとめたものを論文化し、学術雑誌に投稿中である。転移先の臓器では転移反応を成立させる有利な条件作りが、腫瘍原発巣由来の分子シグナルによって誘導されるという「転移前状態」説に基づいた実験を行った。細胞間のシグナル分子としてはS100A8、S100A9およびSAA3に、転移先臓器側の受容体分子としては、TLR4および酸化LDL受容体に注目した。マウス皮下に高転移性腫瘍株3LLを移植し、担癌モデルマウスとし、そこで尾静脈より蛍光ラベルしたがん細胞を注入し、肺への生着が成立するかどうかを見た短期腫瘍転移アッセイでは、酸化LDL受容体ノックアウトマウスでは野生型マウスよりもがん細胞の生着率が低下していた。また3LL細胞の自発的転移を観測する長期腫瘍転移アッセイでも酸化LDL受容体ノックアウトマウスでは野生型マウスよりも肺での転移巣形成は10%程度抑制された。この結果が転移前状態形成と関係するかどうかを明らかにするために、S100A8、S100A9およびSAA3がLDL受容体と直接相互作用するかどうかの検討を行った。

酵母2ハイブリッド法およびELISA法を用いた実験を行ったところ、酸化LDL受容体とS100A8、S100A9およびSAA3だけでは複合体を形成しないことが明らかになった。これらの分子は細胞膜上でTLR4MD2複合体と結合していることが知られているので、酸化LDL受容体がTLR4MD2複合体と協同して機能している可能性も考えられる。この可能性の是非を調べるために、TLR4MD2とS100A8、S100A9およびSAA3の複合体を調製し、酸化LDL受容体との結合を直接観測することを試みている。S100A8-S100A9の複合体生成実験において、この複合体がS100A13タンパク質と結合していることが示唆されるデータが得られたので、S100A8-S100A9ヘテロダイマーの細胞放出機構とS100A13との関係を明らかにすることを試みた。S100A8-S100A9ヘテロダイマーはシグナルペプチドを持たないため、通常の分泌機構とは異なった分子機構で細胞外へ放出されることが考えられている。また、S100A13は同様のシグナルペプチドを持たない分泌タンパク質であるFGF1の分泌を制御していることが明らかにされていることから、S100A13は注目に値する分子であると考えられる。マウスおよびヒトS100A13のshRNAを作成し、マウスおよびヒト培養細胞にトランスフェクションすることにより、S100A13安定ノックダウン株を作成した。S100A13ノックダウン株では、ヒートショック等の刺激に対して、S100A8-S100A9の培地への放出が増加した。これはFGF1の分泌が、S100A13のノックダウンにより減少するという先行研究の結果とは完全に異なっており興味深い。一方SAA3とTLR4MD2および酸化LDL受容体との結合試験では、昨年度までの研究では、SAA3はTLR4MD2には結合するが、酸化LDL受容体とは結合しないとの結果が得られていたが、新たにSAA3のバリアントが見出され、SAA3のバリアントは酸化LDL受容体に結合することが明らかとなった。マウスを用いた腫瘍細胞転移アッセイでは、個体差が大きく、定量的な結果を得るための条件づくりに難航したが、最終的には再現性のある実験系を確立することができた。転移前状態の形成による肺の解析では、フローサイトメトリーによるCD11b陽性Gr-1陽性細胞の集積および、肺でのS100A8、SAA3遺伝子発現の上昇を的確に捉えることができた。昆虫細胞およびヒト培養細胞におけるS100A8、SAA3タンパク質の大量発現系の構築には予想以上に時間がかかった。これはこれらの遺伝子の発現量が、高発現ベクターを用いているにもかかわらず非常に低いために、収量が上がらなかったためである。低収量の原因としては、これらの遺伝子産物が細胞内に蓄積すると、細胞の増殖を阻害することによるものと考えられている。培養のスケールを上げることで最終的にこの問題を解決した。質量分析による精製タンパク質の解析を実行したところ、SAA3のシグナルペプチドを細胞内で切断されていることと、その切断箇所を特定することが新たな成果となった。またS100A8タンパク質はS100
前立腺におるけ増殖因子の役割

正常前立腺細胞、前立腺腫瘍細胞の増殖および前立腺癌の造骨性骨転移における増殖因子の役割を明らかにする目的で、1)前立腺組織に存在する増殖因子の分析と精製、2)無血清初代培養法を用いた、前立腺細胞の増殖要求性の検討、3)前立腺癌細胞株の産生する増殖因子の同定とその生理的役割の検討を行った。ヒト前立腺組織中の主要な増殖因子は、ヘパリン結合性増殖因子(HBGF)であり、その含量は腫瘍、特に肥大症組織において増加していた。部分精製の結果から、この因子はHBGF-2(6FGF)であることが明らかとなった。前立腺癌組織中には、HBGF-2に加えて骨芽細胞増殖因子が存在していた。正常ラット前立腺の主要な増殖因子は、高分子量EGFとEGFであったが、精製標品の分析結果から、顎下腺EGFとは異なるプロセッシングを受けていることが示された。また、これらの増殖因子の含量は、正常ラット前立腺細胞の増殖と関連した変化を示した。ラット前立腺においては、去勢によりHBGF含量が増加する傾向を示した。ラット前立腺上皮および間質細胞の無血清初代培養法を確立し、その増殖要求性を調べた結果、上皮細胞の増殖はEGF、インシュリン、コレラ毒素、ダイズトリプシンインヒビタ-等により促進されたが、男性ホルモンは増殖促進効果を示さなかった。また、間質細胞は上皮細胞とは異なる増殖要求性を示した。高い転移能を有するラット前立腺癌由来細胞株AT-3は、培地中にIGF-II様因子と不活性型TGF-βを放出しており、各々、AT-3自身の増殖および、AT-3の転移と転移部位における骨芽細胞の増殖に関与している可能性がある。これらの結果から、ヒトおよびラット前立腺細胞の男性ホルモン依存性の増殖、前立腺腫瘍細胞の増殖、癌細胞の造骨性転移などにおいて、種々の増殖因子が重要な役割をはたしている可能性が示された。1.ヒト前立腺に存在する増殖因子:ヒトの前立腺組織中の増殖因子についてheparinカラムを用いてheparin結合性因子(HBGF)と非結合性因子(non HBGF)に区別して調べた。HBGFは正常、BPH(肥大症)及び癌のいずれの組織にも存在するが、その含量は癌とBPHで高かった。nonHBGF含量は正常で高い傾向にあった。nonHBGF中には骨芽細胞の増殖を促進する因子(OGF)が存在するが、OGF含量は癌で最も高く、癌の増殖あるいは造骨性骨転移と関連する可能性が示唆された。2.増殖因子の安定化剤:増殖因子の研究を遂行するためにはその安定化が必須である。両イオン界面活性剤の一種であるCHAPSが最も細胞毒性が弱く、かつFGF類の安定化効果が高いことを見出した。3.前立腺上皮の初代培養:ラット背側部前立腺の上皮細胞を無血清条件下で培養する方法を確立した。即ち、コレラ毒素、インスリン、EGF、デキサメサゾン及びウシ下垂体抽出物の添加により、上皮細胞を培養することができた。4.培養前立腺癌細胞が産生する増殖因子:ラットのDunning adenocarcinomaから樹立されたATー3細胞が産生する増殖因子を調べた。ATー3細胞を無血清培地中で懸濁培養することに成功し、その培地中の因子について検索した。その結果、IGFーII様因子が細胞増殖の盛んな時期に産生されることが明らかとなった。ラット前立腺癌(Dunning tumor)から樹立された細胞株AT-3は高い転移能を有しており、前立腺癌の転移のモデルとして優れている。AT-

3細胞がIGF-II様の因子を産生し培地中に放出すること、また、細胞増殖の盛んな時期にその産生が高まることが明らかになっている。AT-3の条件付培地中のTGF-β活性を、NRK細胞に対する増殖阻害を指標として測定した結果、増殖期のAT-3が不活性型のTGF-βを培地中に放出していることが示された。AT-3細胞自身に対するTGF-βの作用を明らかにする目的で2種類の培地、RPMI1640とF12、を用いてAT-3を培養し活性型TGF-βを添加した。RPMI1640を用いた場合、TGF-βの添加によりAT-3はより球型に近い形態に変化し、培養皿から剥離する細胞の割合が増加した。一方、培地としてF12を用いた場合、細胞はより扁平な形態を示し、接着して増殖する細胞の割合が増加した。デキサメサゾンはAT-3のTGF-β産生を約1/5に減少させ、細胞の剥離を抑制した。前立腺癌は、高い頻度で造骨性の骨転移を起こすことが知られている。ラット頭頂骨から樹立された骨芽細胞株MC3T3-F1の増殖に対するTGF-βの作用を検討した結果、血清の非存在下でTGF-βの添加によりMC3T3-E1は細長い形態に変化し、その増殖は対照の約4倍に促進された。これらの結果は、AT-3の産生するTGF-βがAT-3細胞自身の接着性(転移能)と転移部位における骨芽細胞の増殖に関与することを示唆している。
切削における摩耗を利用したサファイアの三次元加工

サファイアは工業上,有用な材料であるが,硬度が高いため,その加工は困難である.本研究では,ガラスをサファイアで切削したときの摩耗を逆に利用して,サファイアを加工することを目的とした.この加工を実現するための小型加工機を製作し,これを用いて実際に加工実験を行った.加工されたサファイアの輪郭は明瞭であり,その仕上げ面の算術平均粗さは,最高で, 0.01μmであった.サファイアは工業上,有用な材料であるが,硬度が高いため,その加工は困難である.本研究では,ガラスをサファイアで切削したときの摩耗を逆に利用して,サファイアを加工することを目的とした.この加工を実現するための小型加工機を製作し,これを用いて実際に加工実験を行った.加工されたサファイアの輪郭は明瞭であり,その仕上げ面の算術平均粗さは,最高で, 0.01μmであった.サファイアやアルミナセラミックスなどの化学式がAl_2O_3で表される物質は工業的に非常に有用な材料である。これらの材料に対して加工を施すために各種の方法が開発されているが,三次元加工を施すことは困難である。本研究では,サファイアやアルミナセラミックスを工具として使用して,SiO_2を主成分とするガラスに対して切削加工を施す。このとき切削点近傍において,Al_2O_3とSiO_2の間で反応が生じてサファイアやアルミナセラミックスが摩耗する。本研究では,この工具摩耗を逆に利用して,サファイアやアルミナセラミックスに対して三次元形状の加工を施すことを目的としている。平成19年度は,化学式がAl_2O_3で表される物質を工具として使用して切削したときに,工具側に対してどの程度の加工を施すことができるかを検証することを目的とし,このための実験装置の試作を行った。主軸は高トルクで高回転数が得られるように,ACサーボモーターを使用した。加工機を試作した後,加工実験を行った。切削速度,切込み量などの加工条件により,どの程度の加工量が得られるかを検討した。加工対象として,最初は異方性の影響がない多結晶体であるアルミナセラミックスを選定し,SiO_2としてはガラスを選定した。アルミナセラミックスでガラスを切削する実験を行い,アルミナセラミックスに対して加工を施すことが可能であることを確認した。次に,サファイアを使用して同様な実験を行い,サファイアに対しても加工できることを示した。加工された面は,その輪郭が明瞭であり,面粗さはRa=0.01μm程度であった。加工された体積は加工時間に比例し,加工量を調整するうえでは都合が良い。サファイアやアルミナセラミックスなどの化学式がAl2O3で表される物質は工業的に非常に有用な材料である.これらの材料に対して加工を施すために各種の方法が開発されているが,三次元加工を施すことは困難である.本研究では,サファイアやアルミナセラミックスを工具として使用して,SiO2を主成分とするガラスに対して切削加工を施す.このとき切削点近傍において,Al2O3とSiO2の間で反応が生じてサファイアやアルミナセラミックスが摩耗する.本研究では,この工具摩耗を逆に利用して,サファイアやアルミナセラミックスに対して三次元形状の加工を施すことを目的としている.平成20年度は,本研究室において昨年度,製作した加工機を用いて,単結晶サファイアでガラスを切削する加工実験を行った.単結晶サファイアのa面,c面,r面のいずれをすくい面としたときにもサファイアに対して加工を施すことができた.3つの面の中では,最も硬度が高いa面をすくい面としたときの加工体積が最も大きかった.これは,本加工方法が加工する材料と加工される材料の硬度差を利用した加工法ではないことに理由があると考えられる.サファイアの相手材料として,ガラス以外の材料についても検討した.その中で,ステンレス鋼を切削したときには,加工量は大きいけれどもサファイアにチッピングや欠けが生じてしまった.そこで,ステンレスで粗加工を行い,ガラスによって仕上げ加工する方法を考案し,実際に多結晶サファイアに対して加工を施した.
顎口腔機能診断のためのデータベース構築に関する研究

本研究では現在国内で開発、市販されている代表的な6自由度顎運動測定器をすでに保有し、研究および臨床に活用している国内の代表的施設の参加を得て、データ評価の互換性を確立し、6自由度顎運動データベースを構築して診断のための基準値を明らかにするとともに、日常臨床で応用するための問題点とその解決法を明らかにすることを目的とした。研究対象顎運動測定器は、ナソヘキサグラフJM-1000T((株)小野測器,(株)GC)、トライメットJKN-1,((株)東京歯材社)、MM-JI, MM-JI-E((株)松風)の3機種である。顎口腔機能診断のためのデータベース構築に際しては、顎運動データとともに収集する被験者の情報項目(年齢、性別、顎口腔機能等)について洗い出しを行い、あわせてその評価基準についても検討を行った。顎運動データについては、各測定器の解析ソフトにてプログラムの新規開発あるいは改造なしに出力可能なデータ形式(運動経路のアスキーシーケンシャルファイル)で集積し、統一的なファイル形式へと変換するカスタムソフトウェアを開発した。これにより研究参加施設以外の研究施設あるいは、研究対象以外の測定器のデータについても既存のソフトウエアを改造することなくデータ解析が可能となった。さらに本研究では、顎運動データの標準フォーマットの提案とデータベース管理システムの開発に加え、測定機種や解析の基準座標系に依存しない顎運動解析項目についても検討を行った。解析項目については、日常臨床での機能評価を考慮し、切歯点の運動経路解析を中心としたパラメータ群と、6自由度顎運動測定のデータ特性を活かし、被験者間の解剖学的相違や測定器の違いなどの影響を可及的に排除した形での解析パラメータ群である。これらの研究の成果については、国内外の学会および学術雑誌等で発表した。平成12年9月5日に鶴見大学、新潟大学、徳島大学、徳島文理大学より各研究代表者および研究担当者が出席して東京にて研究会議を行い、徳島大学より提出した試案について討議検討を行った。またさらに、科学研究費の研究分担者ではないが、北海道大学、岩手医科大学、東京医科歯科大学、東京歯科大学、日本歯科大学歯学部、昭和大学、日本歯科大学新潟歯学部、松本歯科大学、愛知学院大学、九州大学、福岡歯科大学などで顎機能、顎運動を研究する研究者にも参加を募り、顎機能のデータベース化に関する意見を聞いた。この中で情報の主体となる患者(被験者)情報については、プライバシーへの配慮とともに、将来的な公開を考慮し選択する必要性が指摘された。またインフォームドコンセントの必要性から、試案製作が求められた。さらに、咬合における正常者の定義があいまいであるとの指摘があり、データベース構築後、基準値の基となる正常者の選択基準について、矯正学の立場、補綴学の立場から異なる意見があり、さらなる検討が必要であることがあきらかとなった。また顎運動については数種の測定器が市販されており、それぞれに基準平面がことなるため、運動データとしてデータベース化するにあたり、基準平面をどうするかということが大きな問題であるということを各測定器のユーザが認識した。各顎運動測定器からの出力データの相互変換については、徳島文理大学工学部の藤村助教授が検討中である。一方、基盤となるデータベースシステムについては、Microsoft Accessを用いて現在テストモデルを設計構築中である。また徳島大学にて集積されたデータの一部を解析し、第11回日本咀嚼学会(平成12年9月、東京)および、第104回日本補綴歯科学会学術大会(平成12年11月、大阪)にて発表した。平成13年9月4日に鶴見大学、新潟大学、徳島大学、徳島文理大学より各研究代表者およぴ研究担当者が出席して東京にて研究会議を行った。この際に昨年の会議にて議論となったインフォームドコンセントおよび具体的調査項目などについて討議検討が行われた。

さらにデータ提供時のフォーマットなどについても具体的に検討が行われた。この会議の後もE-mail等を用いて意見交換を続け,データフォーマットについては各測定器個々に出力可能なフォーマットにてデータ提供を行い,データベース化する際に統一的なフォーマットヘ変換することとした。また咬合における正常者の定義については一元的に定めず,データベース内に咬合に関するチェックポィントを整備し,解析者が必要とする選択基準でのケース抽出が可能となるようにすることとした。さらに異なる測定器間でのデータ比較やデータを統合する際に障害となる基準平面の違いに関する問題については,測定器間で基準平面を統一するのではなく,基準平面や測定形式に依存しない解析方法について研究開発を行うことを徳島大学から提案した。一例を挙げるなら,顎運動範囲などは従来顎運動軌跡の前頭面投影図や矢状面投影図からの計測によって求められていたが,これらは基準平面が異なれば同じ運動であっても計測結果が異なることになる。一方,投影という手法によらず3次元空間のなかで運動軌跡を捉え,軌跡がつくる空間図形の体積や曲面の面積などを直接計測すれば基準平面の違いによる影響を排除することが可能となる。これについてはその研究結果の一部を第106回日本補綴歯科学会学術大会(平成13年10月,盛岡)にて発表した。現在は,各測定器から提供されるデータから標準データフォーマットへの変換プログラムを開発するとともに,解析パラメータについても広く意見を求めながら顎運動を多面的に捉えることが可能となるように研究中である。まず、平成14年3月69日にアメリカ合衆国、カリフォルニア州サンディエゴで開催された第80回のIADR(国際歯科研究学会)にて、データの応用解析を行った研究成果を発表した。続いて平成14年9月1518日に横浜で開催された第1回国際咀嚼学会にて、集積されたデータから咀嚼に関する解析を行い、この研究成果を発表した。鶴見大学、新潟大学、徳島大学における研究担当者間での討議では、昨年に引き続きインフォームドコンセントおよび具体的調査項目、さらにデータ提供時のフォーマットなどについて具体的に検討が行われた。また咬合における正常者の定義については一元的に定めず,データベース内に咬合に関するチェックポイントを整備し,解析者が必要とする選択基準でのケース抽出が可能となるようにすることとした昨年の協議事項を確認した。さらに異なる測定器間でのデータ比較やデータを統合する際に障害となる基準平面の違いに関する問題については,昨年度に徳島大学から提案した内容を確認し、測定器間で基準平面を統一するのではなく基準平面や測定形式に依存しない解析方法について徳島大学にて研究開発を続けていることを報告した。これについては、昨年度に第106回日本補綴歯科学会学術大会(平成13年10月,盛岡)にて発表した内容に加え、顎間軸(工学的には螺旋軸)という概念を導入することで空間における立体の運動を基準平面に影響されにくい形で表現できることを説明し、パラメータとして導入するためにシステムを開発中であることを報告した。現在は,最終的なシステムの開発を行っている。
環境ストレス・生体警告情報の受容とその視床下部統御機構

本研究は中枢性ストレス反応発現機構を明らかにするため、(1)情動ストレスによる視床下部神経機構を単一ニュ-ロンレベルおよび物質動態レベルで解析し、(2)情動ストレスに対する視床下部・免疫系連関の神経機構を解析した。本研究によって得られた研究成果を以下に概略する。(1)ラットの短期拘束ストレスによってその後の摂食量が有意に抑制され、この抑制はセロトニン受容体拮抗薬であるメチセルギドによって有意に減弱した。インビボボルタメトリ-法と慢性ニュ-ロン活動記録実験から、拘束ストレス時視床下部外側野のセロトニン代謝産物(5ーHIAA)の増大とニュ-ロン活動の抑制が起こることが明かとなった。(2)脳マイクロダイアリシス法を視床下部外側野でのセロトニン測定に適用し、(a)灌流液中のK^+濃度に依存して放出量が増加すること、(b)Ca^<2+>を除去したリンガ-液の灌流では放出されないこと、(c)縫線核の電気刺激により放出量が増大することなどを確認し、無麻酔・無拘束ラットでの視床下部外側野セロトニン測定技術を確立した。さらに本方法を用いて拘束ストレス時視床下部外側野でセロトニン遊離の有意な促進が起こり、これはdiazepamの前投与(1mg/kg,i.p.)で著しく抑制されることを明らかにした。(3)本研究で確立した微小透析法を臓器微小透析法へと応用し、ラット拘束ストレス負荷後に起こる脾臓NAの経時的変動を解析した。拘束ストレス開始後脾臓NA濃度はすみやかに上昇し始め、拘束開始後20分で拘束負荷前の基礎遊離量の約8倍まで増大した。この拘束ストレスによってひき起こされる脾臓NAの増大はあらかじめ脾臓交感神経を切除することによりほぼ完全に阻害することができた。以上の結果は拘束ストレスによって脾臓交感神経終末からNAの放出がおこり、免疫担当細胞(NK細胞)の活性を抑制する可能性を示唆する。本研究は生体システムとしての視床下部警告情報処理機構を解明することを目的とし、神経生理学および神経薬理学的研究から以下の点を明らかにした。I.ラットの短期拘束ストレスによってその後の摂食量が有意に抑制され、この抑制はセロトニン(5ーHT)受容体阻害剤であるメチセルジドによって有意に拮抗される。カ-ボンファイバ-電極を用いたin vivoボルタメトリ-法とニュ-ロン活動の同時記録から、拘束ストレス時、視床下部外側野の5ーHT代謝物(5ーHIAA)の上昇とニュ-ロン活動の抑制が起こる。II.脳マイクロダイアリシス法による視床下部外側野の5ーHT測定に関する予備実験を行い、(1)潅流液中のK^+濃度に依存して放出売が増加する、(2)Ca^<2+>ーfree潅流液では放出されない、(3)縫線核の電気刺激により放出量が増大することなどを確認し、無麻酔・無拘束ラットでの視床下部外側野5ーHT測定技術を確立した。さらにこの方法を用いて拘束ストレス時の視床下部外側野の5ーHT動態を検討した結果、視床下部5ーHT放出の促進が観察され、これがdiazcopamの前投与(1mg/kg,i.p.)で有意に抑制されることを明らかにした。III.ストレスによる細胞性免疫の抑制機構を解析するため、脾臓ノルアドレナリン(NA)の放出をマイクロダイアリシス法を用いて測定した。その結果、拘束ストレスによってNAの放出が平常値の約7倍に増大し、この増大はあらかじめ脾臓への交感神経を切除しておくる消失することが明らかになった。また拘束ストレス負荷により、脾臓のナチュラルキラ-細胞活性が抑制され、この活性抑制も除神経によって減少することから、ストレスによるナチュラルキラ-細胞活性抑制は、脾臓交感神経からのNA放出の促進による可能性を示唆した。

拘束ストレス開始後脾臓NA濃度はすみやかに上昇し始め、拘束開始後20分で拘束負荷前の基礎遊離量の約8倍まで増大した。この拘束ストレスによってひき起こされる脾臓NAの増大はあらかじめ脾臓交感神経を切除することによりほぼ完全に阻害することができた。以上の結果は拘束ストレスによって脾臓交感神経終末からNAの放出がおこり、免疫担当細胞(NK細胞)の活性を抑制する可能性を示唆する。情動ストレスによる脳・免疫系連関を解析するため本年度は以下の3点について研究を行なった。(1)脾臓Natural Killer(NK)細胞活性ラット脾臓NK細胞活性は拘束ストレスによって有意に抑制された。このNK細胞活性の抑制は脾臓を支配している交感神経をあらかじめ切除しておくことにより著しく減弱した。(2)臓器微小透析法による無麻酔ラット脾臓ノルアドレナリン(NA)の測定臓器微小透折法による脾臓NAの測定法を確立した。微小透析プロ-ブ内に回収したNAが主として脾臓交感神経由来のものであることは、クロマトグラム上のNAに対応するピ-クが、(a)シナプス終末からのカテコ-ルアミンの放出促進作用、あるいは再取り込み阻害作用を有するアンフェタミン、コカイン、デシプラミンなどを潅流液中に投与すると有意に増大すること、(b)潅流液中のCa^<2+>除去あるいはテトロドトキシン(10^<ー6>M)の潅流液中への投与により有意に減少すること、(c)高K^+リンガ-液の潅流(100mM)および脾臓交感神経の電気刺激(0.5mA,0.5mS,60Hz)によって(NA)の遊離量が基礎値の23倍に増大することなどから確認した。(3)細胞性免疫機能抑制と脾臓交感神経NA動態の関連本研究で確立した臓器微小透析法を用い、ラット拘束ストレス負荷後に起こる脾臓NAの経時的変動を解析した。
看護学科新入生への理科的基礎知識の教授方法の開発

看護の大学に入学した時点での学生の理科的基礎知識を調査した。その結果、「入試の形態」や「高校在学時に履修した理科の科目」が影響していた。また、いくつかの実験的な教授方法を開発した。これらを学生に体験させたところ、圧力や単位について、学生の理解をサポートする傾向が観察された。今後、これらをより発展させていく必要があると考えられた。平成26年度は、「(1)圧力に関する知識の調査とこれの教授方法の開発」ならびに「(2)平成27年度4月実施用アンケート」の検討・作成を実施した。(1)は、医療現場で使用されるチェスト・ドレーン・バックの管理にも必要な知識として実施した。通常、バックには低圧持続吸引器が接続され、バックの「吸引圧調整ボトル」部分に水を一定の高さまで補足することで、目的の陰圧状態を保つことができる。調査の結果、密封かつ気相だけのボトルの内圧は容易に予想できるものの、チェスト・ドレーン・バックのような半解放系では内圧の変化の予想はかなり難解であることがわかった。そこで、「吸引圧調整ボトル」部分の簡易実験モデルを何種類か開発・検討した。この結果、アスピレーターや負圧計といった理化学機器を除き、医療関係の養成校が所有している類の物品でも、簡単にモデルを作成できることがわかった。なお、これを用いた演示実験だけの解説では、学生の著しい理解の促進は得られなかった。また、物品のうち、負圧計が他の機材と比べて、極端に高価な機材であった。今後、学生が個々に体験しながら学べるように、より低コストのモデルの開発、個々の体験による教授方法の有効性の検討が必要と考えられた。(2)は、どのような項目が必要なのかを検討し、「食塩をはじめとする基本的な化学式」、「医療系で使用する単位」、「希釈方法」などを含めた。これを用いて平成27年度新入生よりアンケート調査を実施予定である。平成27年度は、「理科的基礎知識のアンケート」を実施し、不足している知識の教授方法を模索した。アンケートは3月に倫理委員会の審査を受けた上で、看護学科に入学したばかりの1年生に対して実施した。この結果、ごく初歩的な「二酸化炭素」や「水」の化学式を解答する問いでは全ての学生が正答した。しかし、「塩化ナトリウム」は高い正答率にもかかわらず、同じものと言ってもよい「食塩」の化学式の問いでは、正答率が48%であった。また、これらの関連事項として、「生理食塩水の濃度」の問いでは15%など低い正答率のものも散見された。。物理単位の問題では1gを1000mgに変換する問題で正答率は33%であった。他の設問も合わせて考察すると、接頭辞を数として認識していないことが示唆された。また、1dL, 1ccならびに1合をmLに変換する問題も各々、低い正解率であったことから体積(容積)に関して日常的に意識が低い可能性も考えられた。現に、これらの知識の積み重ねとその応用問題である「ごく簡単な希釈の問題」でも正答率は低値を示した。したがって教授する側が現状を把握したうえ、理科的基礎知識も看護の遂行に必要な事項として、学生に意識させる必要があると考えられた。そこで、理科的実験を含む科目の演習項目に、点滴などの看護に密接に関連するものを取り入れて理科的な要素を学生に検討させることで、興味を示す方向がプライマリーな試行として得られた。研究対象者である入学したばかりの大学1年生が入学するのとほぼ同時期に研究費の補助が内定したため、1年目に理科的基礎知識のアンケートがとれず、学年全体の把握が2年目になった。この結果をもとに2年目にも「看護学科で必要な理科的基礎知識についての項目をピックアップする」作業を検討したが、1年分のデータだけでは確定したものが得られなかった。また、理科的実験を含む演習での教授方法も、学生に興味を持たせる方法の方向性はみえてきたものの、1年分だけでは不十分なデータしか得られなかった。ただし、全体的にはややおくれているものの、研究の展開としては、回収すべきアンケートの設問内容や、一部の項目での教授方法の方向性も検討できた。前年度に引き続き、平成28年度にA大学に入学した新入生へのアンケート調査を実施した。この結果、前年度と同様な内容を含む次の結果が得られた。化学式に関する問いでは、「二酸化炭素」「酸素」「水」と「塩化ナトリウム」は両年度とも90%以上の高い正答率(以下%は正答率を示す)であった。これに対し「食塩」の化学式の問いでは、1年目が48%、2年目が57%であった。物理単位の問題では、1Lや1mを、1000mL(92%, 99%)や1000mm(90%, 87%)に変換できるにもかかわらず、1gを1000mgに変換する問題では33%と50%であった。この原因として接頭辞を数として認識していないことが考えられた。この他、体積(容積)の変換に関しても低い日常的に意識が低い可能性が伺えた。現に、これらの知識の積み重ねとその応用問題である「ごく簡単な希釈の問題」でも正答率は30%,39%と低値を示した。小学校3年生で学習する「1dLは100mL」など、多くの項目が大学入学以前に習得すべき項目であるものの、多数の学生は忘れてしまっている現状が明らかになった。

また、高校での理科の履修状況についても分析を進めたが、履修の科目群間などでの特徴的な差異はなかった。ただ、受験の方法の区分に若干の差がみられる傾向もあったことからこれが有意な差なのかを調査していく必要性が明らかになった。現段階では、教授する側が理科的基礎知識の現状を認識しておくことが最も大事な教授方法の1つであり、看護の遂行に必要な学習項目として、入学後の学生に意識させる必要があると考えられた。研究対象者である入学したばかりの大学1年生が入学するのとほぼ同時期に研究費の補助が内定したため、1年目に理科的基礎知識のアンケートがとれず、学年全体の把握が2年目になった。この結果をもとに2年目にも「看護学科で必要な理科的基礎知識についての項目をピックアップする」作業を検討したことで、一部の重要な知見は得られてきたが、不十分な点もあった。また、理科的実験を含む演習での教授方法も、学生に興味を持たせる方法に試行錯誤の要素も多く、確定的な方向性には至らなかった。「看護学科新入生の理科的基礎知識の現状を調査する為のアンケート」を縦断的な調査として実施した(本年度が3年目)。これらのデータのうち、直近の2年度分を用いて「高校での理科の履修科目」と「入学試験の形態」に着目した分析を行った。この結果、年度間に有意な差は認められなかった。しかし入試の形態別の比較では、薦入学試験(センター試験の利用無し)よりも一般入学試験(センター試験の利用有り)の方の正答率が有意に高かった(推薦:59%,一般:66%)。回答者全員(156名)の履修科目の合計数は676科目で、生物基礎(148)、化学基礎(148)、生物(119)、化学(111)、物理基礎(80)の5つの科目で大半(90%)を占めていた。続いて地学基礎(38)、物理(14)、その他(18)であった。具体的な項目例として、「塩化ナトリウム(NaCl)の化学式」を問う設問では全体で94%が正答したが、「食塩の化学式(NaCl)」に変える設問に正答した学生は59%であった。後者の設問の回答を「入学形態と化学の履修の有無」で分類して比較した場合、「化学を履修した一般入試の学生」の69%が最も高く、「化学は未履修で推薦入試の学生」の43%が最も低かった。同様な傾向は「1gをmgに変換」する設問において「物理基礎を履修していた群間同士でも、一般入試の学生の52%の方が推薦入試の学生20%よりも高い正答率であった。したがって、各学校が入試形態と履修状況を把握しながら授業科目とその内容を構築していく必要が示唆された。実際、これらの状況を把握した上で、「実際に溶液を作成する」などの理科実験的な演習形態の授業を展開したところ、理解したことの短期的(数か月)な定着は良好な傾向が観察された。看護の大学に入学した時点での学生の理科的基礎知識を調査した。その結果、「入試の形態」や「高校在学時に履修した理科の科目」が影響していた。また、いくつかの実験的な教授方法を開発した。これらを学生に体験させたところ、圧力や単位について、学生の理解をサポートする傾向が観察された。今後、これらをより発展させていく必要があると考えられた。平成27年度と平成28年度に調査したアンケートを整理・再検討していくとともに、2年度間の結果を比較し、その変動や正解率が低値であるもののについて考えられる理由を検討していく。また、模擬授業の方法を模索し、順調に進んだ場合は、アルバイトとして募集した学生に対して教授方法の実際の効果の評価を検討する。
家畜におけるin situ hybridization法による染色体マッピング

本研究は、家畜染色体における遺伝子座位の決定のために、in situ hybridization法の確立を目指すものであった。まず、ヒトにおいて染色体上の座位が既知である(No.16q22)LCAT(レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ)遺伝子のDNAを用いて、ヒト染色体におけるin situ hybridization法を習熟し、次にウシLDL(低比重リポ蛋白質)レセプターDNAを用いてアイソトープ法によるin situ hybridization法を検討し、この方法の家畜染色体における確立を目指した。しかし、このLDLレセプターDNAは、in situ hybridizationのプローブとしては適切なものでなかったようであり、詳細な遺伝子座位の決定には至らなかった。次に、アイソトープ法によるin situ hybridizationの欠点を補うとして、近年汎用されつつある、アビジン-FITCなどの化学標識物質を用い、短時間に、直接に、正確にプローブの検出を行うことができるといわれている蛍光標識プローブによるin situ hybridization、すなわちfluorescence in situ hybridization(FISH)法を家畜染色体について応用すべく実験を行った。まず、ヒト染色体標本においてセントロメア領域に散在する高頻度反復配列(αサテライト)をプローブとして用い、FISH法の一連の操作の習熟を目的とし実験を行なった。さらに、YSニューテクノロジー研究所において作成されたトランジェニックラットの血液の分与を受け、これを材料として、導入されたマウスWhey Acidic Proteinを標識プローブとしてトランスジェニックラットの導入遺伝子座位の染色体上での決定を試み、その遺伝子座位の決定を行なうことができた。本研究により、家畜および実験動物におけるin situ hybridization法による染色体マッピングが確立し得たものと考えられる。家畜における染色体地図の作成は、ヒトのそれと比較して非常に遅れている。しかし、家畜育種の観点からはもちろん、繁殖、飼養などの他の学問分野の点からも染色体地図の作成は今後の重要な課題といえる。ヒトの遺伝子地図作成は、近年急速に発展してきた遺伝子工学的手法を用いることにより著しい進展を遂げている。この遺伝子の染色体上の位置を知る方法の一つにin situ hybridization法がある。本研究は、家畜染色体における遺伝子座位の決定のために、このin situ hybridization法の確立を目指すものである。平成3年度において、東北大学遺伝子実験施設より供与を受けた、染色体上の座位が既知である(No.16q22)ヒトのLCAT(レシチンコレステロ-ルアシルトランスフェラ-ゼ)遺伝子のDNAを用いて、ヒト染色体におけるin situ hybridizaーtion法を行ない、プロ-ブの放射性同位元素(トリチウム)による標識法、オ-トラジオグラフィの結界および染色体の解析法などについて習熟すると共に種々の検討点を明らかにした。すなわち、オ-トラジオグラフィにおける露出時間の設定が重要であることおよびバックとして表われる銀粒子の数を減少させるためには洗いが重要であり、その洗いの条件設定について種々の検討要件があることを知った。また、牛染色体の高精度分染法については、エチジウムブロマイド法とBrdU法を検討し、これらの方法で作製した標本をトリプシン法やASG法で処理しGーバンドを得ることにより、これまでの中期染色体より長い前中期染色体で数多くのGーバンドを観察することができた。これらの成果を基とし、平成4年度は高精度分染を施した牛染色体においてin situ hybridizationを行なう予定である。平成4年度では、平成3年度に確立した牛染色体の高精度分染法をさらに改良して、G-バンドとR-バンドを同一の標本上で得ることができるBrdUヘキストギムザ法により標本作製および染色を行うことで、より精度の高い核型分析が可能となるよう検討した。次に、この方法により作製した牛染色体標本を用いて、ラジオアイソトープのトリチウムをラベルしたウシLDLレセプターDNAをプローブとして、in situ hybridization法の検討を行った。

しかし、このLDLレセプターDNAは、in situ hybridizationのプローブとしては適切なものでなかったようであり、詳細な遺伝子座位の決定には至らなかった。しかし、ウシ染色体におけるin situ hybridizationは、本研究において技術的には安定したものと思われ、今後種々のウシDNAプローブを用いて遺伝子座位の実験を行う基礎を築けたものと思われる。また、アイソトープ法によるin situ hybridizationでは反応が鋭敏である反面、実験期間が長く、バックグランドノイズが多い、間接的マッピングのためシグナルの位置が正確ではないなどの欠点があるとされている。そこで、近年ヒト染色体において盛んに用いられつつある蛍光標識プローブによるin situ hybridization、すなわちfluorescence in situ hybridization(FISH)法を家畜染色体について応用すべく実験を行った。まず、ヒト染色体において蛍光色素のビオチンで標識したY染色体DNAをプローブとしてin situ hybridizationを行うことで方法を検討し、次いで、牛染色体におけるin situ hybridizationを試みている。このFISH法は、アイソトープ法に比べて反応が弱いなど検討を要する点が残されてはいるが、家畜染色体についても応用できるものと考えており、更に実験を継続する予定である。
アルツハイマー病発症のTGFbeta2説と防御因子説の展開

<目的>アルツハイマー病(ア病)の神経細胞死に関するTGFβ2仮説の検証、ア病神経細胞死を抑制する防御因子ヒューマニン(HN)のシグナル伝達系を明らかにする研究、そしてHNの誘導体Colivelinの前臨床試験を遂行した。<成果>1.TGFbeta2説の検証。TGFbeta2発現がAβにより誘導されること、in vitroでAβによる神経細胞死誘導系に関与することそしてTGFbeta2発現がア病罹患者の残存大脳皮質神経細胞内で増強していることを示した。2.TGFbeta2説におけるPS1の役割解明。ア病関連細胞死シグナル伝達系にPS1が必須であることを示しまたPS1とを結ぶ分子としてPOSHとMOCAを同定した。3.HN受容体の基本性格の解明。同じく可溶型WSX-1を同定し、全長WSX-1と同じく可溶型WSX-1も機能的HN受容体を構成しうることを示した。また、HN受容体を構成する3つのリコンビナント蛋白質はin vitroでHN存在下に3量体形成が生じることを示した。4.HN受容体以降のシグナル伝達経路の解明。STAT3以外にPI3K/Aktが一部にかかわることを示した。5.脳萎縮を伴うア病モデルマウスの作成。WSX-1-/-マウスと変異PS1ノックインマウスを交配したマウスを作成中である。6.内因性HN様分子の同定。マウス精巣組織から2次元電気泳動により4kDと10kDのHN様蛋白質を精製することに成功した。7.受容体を刺激する神経細胞死抑制小分子のスクリーニング。LT-20が二つのアッセイによりHN様活性を有することを確認し、さらに幾つかのより低い濃度でHN作用を示す有力なリードコンパウンド小分子を同定した。8.臨床応用をめざしたHNの前臨床試験。トランスジェーニックア病動物モデルでの治療効果を確認することに成功した。<結論>1、2より、TGFβ2仮説の妥当性が、3、4、6によりHN防御因子説の妥当性が裏付けられた。また7、8のHNの前臨床試験は順調に進捗し、HNによる細胞死を抑制するア病の治療は臨床応用に一歩近づいた。前研究でアルツハイマー病(ア病)の神経細胞死が過剰産生されたTGFβ2のAPPへの結合によって引き起こされるという仮説を提唱し、ア病関連の神経細胞死を抑制するヒューマニン(HN)の細胞膜受容体がWSX-1/CNTFR/gp130の3量体からなることを示した。本申請ではこれらの仮説あるいは知見の妥当性をさらに検証した。また、HNの誘導体Colivelinの前臨床試験を遂行した。(2)TGFbeta2説におけるPS1の役割解明:TGFβ2/APP/JNK/NADPH oxidase/caspasesア病関連細胞死シグナル伝達系にPS1が必須であることを見いだした。またPS1とこの経路を結ぶ分子としてPOSHとMOCAを同定した。(3)HN受容体の基本性格の解明:WSX-1のエクソン8ノックアウトマウス由来PCNではHNの効果が残存することから、全長WSX-1と同じく可溶型WSX-1も機能的HN受容体を構成しうることを示した。