hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
効果的な腸管運動促通手法の検討

腸管運動が低下した患者に対し効果的に腸管運動促通する方法を検証する目的で、温熱療法(TT)、他動的下肢体幹運動(PELT)、COM(TT + PELT)が腸音に及ぼす影響について健常成人男性16名を対象に検証を行った。いずれの手法も安静時と比較して、有意に腸音は増加し、各手法における腸音の増加率はTT(33.0%)、PELT(20.1%)、COM(35.8%)で、COMが最も増加率が高かった。腸音と自律神経の間には相関関係は認められなかった。いずれの手法も実施後に腸音が増加したことから、治療上の制約により自動運動や離床が不可能な腸管運動が低下した患者に対して、臨床応用できる可能性がある。研究1研究1の目的は健常成人を対象に、従来からの温熱療法(TT)と比較して他動的下肢体幹運動(PELT)やCOM(TT+PELT)が腸音に及ぼす影響を検証した。また腸管運動には自律神経活性が深く関与することから、腸音測定と同時に自律神経活性の測定を行い、腸管運動と自律神経活性の関連性を検証した。対象は消化器、骨関節疾患の既往のない健常成人男性16名。3種類の理学療法(PELT、TT、COM)をランダムに実施し、理学療法実施前後の腸音および交感神経活性を記録した。結果はいずれの手法も理学療法実施後、有意に腸音は増加した。各手法の理学療法実施後の経時的変化をみると、PELTは安静時と比較して1分後に有意に腸音は増加し(p<0.05)、その後も高い値で推移した。TTおよびCOMは安静時に比べ有意な差は示さなかったものの、15分にかけ安静時より高い値を示した。自律神経活性ではPELTおよびTTは実施後、有意に心拍数が低下した。高周波領域(HF)は全ての群で有意な差は認められないものの、いずれの群も実施後にHFが上昇した。研究2研究2の目的は研究1で効果のあったPELTを用い、臨床応用の可能性について検討した。対象はICU入室中で腸管運動の低下した患者16名。安静時およびPELT後の腸音を各5分間測定し、PELT実施前後の腸音を比較した。結果は安静時腸音20.4±6.6mV/sec vsPELT実施後21.7±8.3mV/secであり、PELT実施後、腸音は増加したものの有意な差は認められなかった。本研究は二段階の研究により構成されており、本年度は基礎研究として健常成人を対象とし、以下の研究を行った。【研究目的】腸管運動を促通する手法として、これまで温熱療法が臨床現場では主に使用されているが、今回我々が開発した他動的下肢体幹運動と従来からの温熱療法を比較し、どちらの手法が腸管運動をより促通するか、の検討を行う。さらに温熱療法と他動的下肢体幹運動を同時に行うことで、さらなる効果が得られるか、検証する。【対象及び方法】健常成人男性16名(平均年齢21.1歳)を対象とした。昼食摂取(同じ食事、水分を摂取)後1時間後に実験室に集合してもらった。1温熱療法(腹部にホットパックをあてる)、2他動的下肢体幹運動(他動的に被験者の下肢と体幹を動かす)、3combination(温熱療法+他動的下肢体幹運動)をランダムに選択し、各手法を10分間実施した。各手法間の測定は少なくても24時間以上空けた。腸音の測定は電子聴診器、アンプ、A/D変換器を使用しPCに取り込み、腸音の主な周波数である100400Hzで解析を行った。安静時5分間と各手法実施後5分間の積分値を比較した。また腸管運動には自律神経が関係していることから、同時に交感神経、副交感神経の測定も行った。【結果】いずれの手法も安静時と比較して有意に腸音は増加した(p<0.05)。各手法の増加率をみると温熱療法14.5%増加、他動的下肢体幹運動20.9%増加、combination34.8%増加が見られ、combinationが最も腸音が増加した。以上の結果より、従来からの温熱療法や新たに開発した他動的下肢体幹運動を行うことで、腸音は増加するが、combinationを行うことでさらに腸音を増加することが明らかになった。この研究結果は現在、The12th ACPT(アジア理学療法士学会)にentry中である。

当初の目的である健常成人を対象に1他動的下肢体幹運動、2温熱療法、3他動的下肢体幹運動+温熱療法が腸管運動に及ぼす影響についてのデータ収集が進み、その研究結果をまとめ、2013年9月に台湾で行われるThe12th International Congress of Asian Confederation for Physical Therapyで発表予定であることから、当初の計画通り順調に研究は進んでいる。本研究は二段階の研究により構成されている。初年度は基礎研究として、健常成人を対象とした研究を行った。その結果、腸管運動を促通する手法として温熱療法と他動的下肢体幹運動をあわせたcombinationが有効であることが分かった。今年度はこの結果から、実際の臨床応用の可能性を検証する。兵庫医科大学病院倫理委員会承認後に、兵庫医科大学病院ICU入室患者で腸管運動が低下しており、かつ主治医より腸管運動促通手法の実施が許可された患者を対象に、combination(温熱療法+他動的会体幹運動)を実施し、安静時と比較して腸管運動が改善するか、また消化器症状および排便排ガスに効果があるかを検証する。兵庫医科大学病院ICU西信一教授の指導、助言の下、本研究を進める予定である。対象患者は30名ほどとし、その結果は第41回日本集中治療医学会において発表し、その後日本集中治療医学会雑誌に投稿する予定である。
液胞の分化からみた植物器官形成

高等植物の分化の柔軟性は細胞やオルガネラの分化転換能力に起因していると考えられる.中でも形態的にも機能的にも大きく変動する液胞に着目して,植物の器官の可変性を細胞内のオルガネラの可変性としてとらえて器官代謝機能の転換について理解を深めようとしている.高等植物の液胞は,タンパク質蓄積型の液胞(Protein-Storage Vacuoles)と分解型の液胞(Lytic Vacuoles)に分けられているが,種子の子葉細胞の液胞を登熟期から発芽・成長・老化期と形態的に追っていくと,2種類の液胞が互いに連続的に変換する可能性が示唆される.この変換時にはAutophagic engulfmentが形態観察から窺えるが,この機構をさらに明らかにするために,液胞膜タンパク質(α-TIP,γ-TIP,PPase,ATPase)の抗体を用いた免疫電顕を行った.その結果,発芽カボチャ子葉において,タンパク質蓄積型液胞から分解型液胞への変換期の液胞内部にH^+-PPaseを持った膜成分が頻繁に検出され,Autophagic engulfmentが起こっていることが示唆された.また,登熟期のカボチャ子葉でもタンパク質蓄積型液胞による細胞質や分解型液胞の取り込みが観察された.このように植物細胞が大きく変動するとき,あるいは死に向かうときには不要になった細胞内成分の積極的な分解が必須となるが,この際の速やかな分解には,液胞内の分解系が機能していると考えられる.本年度は,タンパク質蓄積型液胞と分解型液胞のそれぞれに特異的な液胞プロセシング酵素が存在し,機能分担している可能性を解明した.即ち,タンパク質蓄積型液胞の液胞プロセシング酵素は蓄積されるべきタンパク質の成熟化に関与し,一方分解型液胞で働く酵素は分解装置の活性発現に関与していることが示唆された.高等植物の分化の柔軟性は細胞やオルガネラの分化転換能力に起因していると考えられる.中でも形態的にも機能的にも大きく変動する液胞に着目して,植物の器官の可変性を細胞内のオルガネラの可変性としてとらえて器官代謝機能の転換について理解を深めようとしている.高等植物の液胞は,タンパク質蓄積型の液胞(Protein-Storage Vacuoles)と分解型の液胞(Lytic Vacuoles)に分けられているが,種子の子葉細胞の液胞を登熟期から発芽・成長・老化期と形態的に追っていくと,2種類の液胞が互いに連続的に変換する可能性が示唆される.この変換時にはAutophagic engulfmentが形態観察から窺えるが,この機構をさらに明らかにするために,液胞膜タンパク質(α-TIP,γ-TIP,PPase,ATPase)の抗体を用いた免疫電顕を行った.その結果,発芽カボチャ子葉において,タンパク質蓄積型液胞から分解型液胞への変換期の液胞内部にH^+-PPaseを持った膜成分が頻繁に検出され,Autophagic engulfmentが起こっていることが示唆された.また,登熟期のカボチャ子葉でもタンパク質蓄積型液胞による細胞質や分解型液胞の取り込みが観察された.このように植物細胞が大きく変動するとき,あるいは死に向かうときには不要になった細胞内成分の積極的な分解が必須となるが,この際の速やかな分解には,液胞内の分解系が機能していると考えられる.本年度は,タンパク質蓄積型液胞と分解型液胞のそれぞれに特異的な液胞プロセシング酵素が存在し,機能分担している可能性を解明した.即ち,タンパク質蓄積型液胞の液胞プロセシング酵素は蓄積されるべきタンパク質の成熟化に関与し,一方分解型液胞で働く酵素は分解装置の活性発現に関与していることが示唆された.
学習者の関数理解の様相分析に基づく事象を数理的に捉える力の育成に関わる研究

主に数学概念の理解研究に関する先行研究に基づいて前年度に構築した「関数の指導モデル」(現在は「関数の学習モデル」と呼んでいる)に関して,実際に教育実践を行うために児童生徒の認知に関する先行研究を分析し,関数の学習モデルに基づいた学習教材の開発を行った。発生的認識論を基礎に,認知意味論,また3変量の関係概念についての先行研究を分析した。その結果,関数の学習モデルで示した(i)事象の変化を量化して捉える,つまり事象から変量を抽出する,(ii)抽出した2つの変量を対応させる,に関する途上概念を形成するためには,「数値を用いない学習」段階を設定し,「数値を用いない学習」から「数値を用いる学習」へと移行する学習が有効である可能性を得ることができた。次に,「数値を用いない学習」段階で用いる教材の開発に取り組み,児童生徒の認識段階を意識した横地らの先行研究を視座に,児童にとって身近に感じることができる影の変化を題材にして教材化をすすめた。この教材の特徴は,時間の経過を主軸にして事象の変化を量化して捉え,例えば時間と影の長さの2変量を関係づけ,変化の様子を考察する点にある。2変を関係づけて変化の様子を考察することにより,2変量の関係を「増えると増える」「増えると減る」あるいはこれらを組み合わせた論理構造をもった(i)と(ii)に関する途上概念を形成することを目指すものである。量の学習進度を考慮して,これらの学習が最適な時期を小学校第3学年の後半または第4学年の前半と設定した。また第3学年の児童が,日々の生活の場面で時間の経過を認識できているかどうかについて調査問題を作成・実施し,時間の経過を認識できていることが分かり,児童の認識に適した教材であることが示された。教材を児童生徒の学習にいかすために,研究協力者(小学校,中学校,高等学校,大学の教員)と協議しながら進めた。当初の予定は,理論面の研究を前年度から引き続き行い,中学校1,2年生あるいは小学生を対象に調査を実施し,教育実践を視野に入れて教材開発をすすめる予定であった。このうち,理論面における研究は「関数の学習モデル」に基づき,(i)事象の変化を量化して捉える,つまり事象から変量を抽出する,(ii)抽出した2つの変量を対応させる,に関する途上概念を形成するための学習の枠組みを設定することができている。また,認知に関する先行研究や認識調査により,この学習が最適と考えられる時期は小学校の段階であること,学習内容についての妥当性について確認することができた。そのため,中学生を主な対象として研究を進める予定であったが,本年度の研究予定を修正して前年度に引き続いて小学校段階での関数学習のあり方を中心に研究を進めた。一方,中学校1,2年生あるいは小学生を対象に調査について,教育環境の異なる2つの中学校第1学年の生徒を対象に関数の定義理解に関する調査を実施し,分析中である。ただし,調査対象となった中学生は当初の予定から変更になり,縦断的な調査を実施することができていない。研究の理論面において,これまでに構築した「関数の学習モデル」に基づき,(i)事象の変化を量化して捉える,つまり事象から変量を抽出する,(ii)抽出した2つの変量を対応させる,に関する途上概念を形成するための学習の枠組みを設定することができている。また,この学習が最適と考えられる時期や内容の妥当性について,認知に関する先行研究や認識調査により確認することができた。したがって,今後は作成した教材の有効性について,教育実践を通して検証することである。そのために,教育実践の前後に実施する事前事後の調査問題を作成する予定である。以上の内容は当初の計画通り,小学校,中学校,高等学校,大学等の研究協力者と協議しながらすすめていく。また,本年度に実施した調査について,十分に分析できていない部分を詳細に分析する。なお,教育実践の対象について,予定では中学生を対象に実施する予定であったが,本研究の目的を達成するためには小学生を対象に実施することが適切であることが示されたため,この点を修正して実施する。また,これまでの本研究の総括を行う予定である。次年度の取り組みで得られた成果について,国内外の学会で研究発表を行い,他の研究者及び小中高等学校の教員との議論を通して,児童生徒や学校の教育活動にフィードバックしていきたいと考えている。本年度は,児童生徒の関数概念の理解の様相を把握するための調査問題の作成に関わって,主に理論面の研究に取り組んだ。当初はSfardの理論を中心に進める予定であったが,Sfardの理論以外にも複数の理解研究の分析が必要であると判断し,Skemp,van Hiele,Pirie & Kieren等の理論やそれらに基づいた先行研究の分析を行った。その結果,いずれの研究も児童生徒の数学概念の理解の過程の様相について共通した構造があることが示された。これらの理解研究の知見から,指導目標となる一般化・抽象化された関数の概念について,「現実の世界」あるいは「数学の世界」の適切な事象を対象に指導目標の概念を理解するための途上にある概念(本研究では,途上概念と規定した)の形成を促し,次に途上概念を考察の対象にして指導目標としている関数の内容を導くような理論的枠組み(関数の指導モデル)を設定することが有効だと考え,関数の指導モデルを新たに設定した。関数の指導モデルは,「事象の認識段階」,「抽象化途上の段階」,「抽象的表現の段階」の3つの段階からなる。

次に,設定した関数の指導モデルに基づいて関数指導のあり方についての先行研究のうち,特に児童生徒の認識に基づいた横地,岡森らの研究について分析を行った。この結果,横地,岡森の示した指導内容は,(i)事象の変化を量化して捉える,つまり事象から変量を抽出する,(ii)抽出した2つの変量を対応させる,の途上概念を基礎にしており,児童生徒にとって(i),(ii)の途上概念の形成が関数理解の基盤になることが示された。これらは,関数の重要な概念であることは数学の体系性から認められることであるが,関数の指導モデルを新たに設定し,それに基づいて横地らの指導内容を分析することで,関数指導における(i),(ii)に関する途上概念の形成の重要性が客観的に示されたといえる。当初の予定は,(1)児童生徒の関数概念に関わる認識・理解の様相を明らかにするための調査問題の作成と調査の実施,(2)理論面の研究を進める,である。(1)の調査問題作成にあたって,児童生徒の関数理解の様相を分析する理論的枠組みの設定が本研究において重要であると考え,(2)の理論面の研究に優先的に取り組んだ。その結果,(1)の調査問題の作成と実施は次年度に持ち越すことになった。理論面の研究に関しては,理解研究の知見に基づき関数指導の理論的枠組み(関数の指導モデル)を新たに設定することができている。設定した関数の指導モデルは児童生徒の理解の過程を表しているとも考えられるため,この指導モデルに基づき先行研究を分析した結果,関数理解のために児童生徒が獲得しておくべき概念を特定することができた。これは,関数理解の困難要因の1つと判断している。したがって,この内容を中心にして調査問題を作成する予定で,調査問題の枠組みはできているといえる。主に数学概念の理解研究に関する先行研究に基づいて前年度に構築した「関数の指導モデル」(現在は「関数の学習モデル」と呼んでいる)に関して,実際に教育実践を行うために児童生徒の認知に関する先行研究を分析し,関数の学習モデルに基づいた学習教材の開発を行った。発生的認識論を基礎に,認知意味論,また3変量の関係概念についての先行研究を分析した。その結果,関数の学習モデルで示した(i)事象の変化を量化して捉える,つまり事象から変量を抽出する,(ii)抽出した2つの変量を対応させる,に関する途上概念を形成するためには,「数値を用いない学習」段階を設定し,「数値を用いない学習」から「数値を用いる学習」へと移行する学習が有効である可能性を得ることができた。次に,「数値を用いない学習」段階で用いる教材の開発に取り組み,児童生徒の認識段階を意識した横地らの先行研究を視座に,児童にとって身近に感じることができる影の変化を題材にして教材化をすすめた。この教材の特徴は,時間の経過を主軸にして事象の変化を量化して捉え,例えば時間と影の長さの2変量を関係づけ,変化の様子を考察する点にある。2変を関係づけて変化の様子を考察することにより,2変量の関係を「増えると増える」「増えると減る」あるいはこれらを組み合わせた論理構造をもった(i)と(ii)に関する途上概念を形成することを目指すものである。量の学習進度を考慮して,これらの学習が最適な時期を小学校第3学年の後半または第4学年の前半と設定した。
乳癌および肺癌におけるTYRO3を標的とする治療法開発の妥当性の検討

TRYO3とGas6の発現をRNA in situ hybridizationで検討したところ、発現はluminal A乳癌でみられ、liminal B乳癌ではみられなかった。HER2陽性乳癌では発現がみられないか、みられても弱く、Triple negativeでは発現はみられなかった。これは我々が先行研究で立てたTYRO3発現抑制が乳癌の治療戦略になるという仮説を支持するものであった肺癌でもTYRO3は一部の腺癌に高発現していた。なお、臨床病理学的特徴のうち上皮成長因子受容体の変異やALK融合遺伝子との関連は示唆されなかった。IGF-1受容体阻害薬の耐性乳癌細胞株ではTYRO3のリン酸化が亢進していた。TYRO3は治療標的としては注目されていなかったが、siRNAを用いてTYRO3の発現を低下させたところ耐性株のみならず親株でも増殖が抑制された。各種乳癌細胞株で検討したところ、luminal-typeの細胞株で増殖抑制が観察され、ERK1/2、S6KやSTAT3、cyclin D1のリン酸化も低下していたが、非感受性細胞株では低下しなかった。これらより、TYRO3がIGF-1R阻害薬の耐性克服のみならず、乳がんの治療標的となる可能性が高い。本研究ではTYRO3を標的とした薬物治療の開発を最終的に目指す。乳癌におけるTYRO3の臨床的意義を明確にするため、乳癌の手術検体でTRYO3発現を検討し、その発現と予後との相関を解析する。乳癌の予後因子である各種臨床病理学的情報も収集しTYRO3発現との関連を検討するとともに、予後予測因子としてのTYRO3の意義を検討する際に共変量として多変量解析を行いより正確に評価する。TYRO3の発現は、RNA in situ hybridization (ISH)技術を用いたRNAscopeや免疫組織化学法を用いて検討する。TYRO3関連分子であるGas6やProtein S、アネキシンIIなどの発現も検討する。また、確立された細胞株を用いた2次元培養系では薬物の抗腫瘍効果は正確に評価できない。そこで、TYRO3を標的とした治療の評価に用いるため、3次元培養系や患者検体から樹立したxenograftから作成したin vitro評価系を確立する。TYRO3発現乳癌が予後不良であれば、我々が目指しているTYRO3を標的とする治療法開発の妥当性が支持される。また、肺癌検体を用いてもTYRO3に関して同様の臨床病理学的検討を行い、肺癌治療の標的として可能性も検討する。各種乳癌細胞株での検討では、luminal-typeで増殖が抑制されERK1/2、S6KやSTAT3、cyclin D1のリン酸化も低下していたが、非感受性細胞株では変化なかった。これらより、TYRO3の抑制は、特にluminal-type乳がんの治療となる可能性が高い。TYRO3を標的とした薬物治療を開発するには、TYRO3の臨床的意義を明確にする必要がある。TYRO3の発現が予後不良因子であれば、TYRO3抑制の治療戦略を裏付けることになる。そこで本研究では乳癌の手術検体でTRYO3発現を検討し、その発現と予後との相関を解析する。乳癌の予後因子である臨床病理学的情報も収集し共変量として多変量解析を行いTYRO3の意義をより正確に評価する。TYRO3の発現は、RNA in situ hybridization技術を用いたRNAscopeや免疫組織化学法を用いて検討する。また、確立された細胞株を用いた2次元培養系では薬物の抗腫瘍効果を正確に評価できない。そこで、TYRO3を標的とした治療の評価系として、3次元培養系や患者検体から直接樹立するpatient-derived xenograft (PDX)を確立した。乳癌はPDXの生着率が高くないことが判明したため、脂肪幹細胞を同時に移植する方法を試みたところ、乳癌の増殖が促進することを発見した。TYRO3発現乳癌が予後不良であれば、我々が目指しているTYRO3を標的とする治療法開発の妥当性を支持する。また、肺癌検体でもTYRO3に関して同様の臨床病理学的検討を行い、肺癌治療の標的として可能性も検討する。TYRO3を標的とした治療の評価に用いるための3次元培養系を確立し評価した。3次元培養系ではNanoCulture Plateを用いて足場依存的な培養を行い、乳癌治療として汎用されているパクリタキセル、ドキソルビシン、フルオロウラシルの効果を2次元培養系と比較した。その際臨床におけるAUCと同等の薬物暴露が得られるような濃度を用いた。検討した各種乳癌細胞株のうち、3次元培養でdense multicellular spheroidを形成した3細胞株では2次元培養と比較してパクリタキセルおよびドキソルビシンによるアポトーシス誘導は抑制され、抗腫瘍効果も減弱していた。また、患者検体から直接樹立したpatient-derived xenograftを用いてパクリタキセルおよびドキソルビシンの薬理作用を検討したところ、いずれの薬物の効果も2次元培養では3次元培養よりも大きかった。Dense multicellular spheroidでは内部は低酸素状態となっており、Ki67陽性率も低値であった。

これは3次元培養の方がより生体での腫瘍を反映し抗腫瘍効果の評価系としてより適していると考えられた。一方、乳癌はpatient-derived xenograftの生着率が高くないため、脂肪幹細胞を同時に移植したところ腫瘍の増殖が促進することが判明した。乳癌手術検体を用いたTYRO3発現解析については、兵庫県立がんセンター乳腺外科で手術された乳癌患者で研究に用いる同意が得られている患者を調査した。また本研究の実施計画書を作成した。まだ実際にはTYRO3の解析は着手していないため、計画よりは若干遅れていると自己評価している。IGF-1受容体阻害薬の耐性乳癌細胞株ではTYRO3のリン酸化が亢進していた。TYRO3は治療標的としては注目されていなかったが、siRNAを用いてTYRO3の発現を低下させたところ耐性株のみならず親株でも増殖が抑制された。各種乳癌細胞株で検討したところ、luminal-typeの細胞株で増殖抑制が観察され、ERK1/2、S6KやSTAT3、cyclin D1のリン酸化も低下していた。これらより、TYRO3が乳がんの治療標的となる可能性が高いと考えた。本研究では乳癌におけるTYRO3の臨床的意義を明確にするため、乳癌の手術検体でTRYO3発現をRNA in situ hybridization (ISH)技術を用いたRNAscopeを用いて検討した。加えてTYRO3関連分子であるGas6の発現も検討した。現在までに乳癌5例で解析を終了し、luminal Aでは腫瘍細胞にTYRO3とGas6のいずれもが発現していた。一方、liminal Bでは発現がみられなかった。HER2陽性乳癌の2例のうち1例では発現がみられず、もう1例ではTYRO3もGas6も発現していたがluminal Aに比べると発現は弱かった。Triplenegativeでは腫瘍細胞には発現はみられなかった。この結果は我々が先行研究で明らかにした乳癌細胞株におけるTYRO3発現抑制による増殖抑制効果がluminal typeで顕著でありHER2 typeでは弱かったことと合致する所見であり、我々の仮説を裏付けるものであった。加えて肺がんでもTYRO3の発現を予備的に解析し、肺腺癌6例中2例でTYRO3が高発現し、さらに1例で弱いながらも発現していることを見出した。これは肺癌でもTYRO3抑制効果を今後検討する研究に発展するものである。今後は本研究を発展させ乳癌の予後因子である各種臨床病理学的特徴とTYRO3発現との関連を検討し、予後予測因子としてのTYRO3の意義を検討することにより、TYRO3を標的とした薬物治療の開発を最終的に目指す。TRYO3とGas6の発現をRNA in situ hybridizationで検討したところ、発現はluminal A乳癌でみられ、liminal B乳癌ではみられなかった。HER2陽性乳癌では発現がみられないか、みられても弱く、Triple negativeでは発現はみられなかった。これは我々が先行研究で立てたTYRO3発現抑制が乳癌の治療戦略になるという仮説を支持するものであった肺癌でもTYRO3は一部の腺癌に高発現していた。
（旧）水害常襲農村におけるリスク対応の変遷と社会的結束：日韓の地域比較分析

この研究は、近世期には水害常襲地域として苦難の経験を重ね近代以降に穀倉地帯へと変貌した地域を対象に、「土地に刻まれた歴史」(古島敏雄)が各地域の社会的特性をいかにかたち作ってきたのかを比較研究することを目的とした。換言すれば、現時点での社会構造の特性を、水害克服にいたる歴史的経験に遡及しつつ比較分析することを課題とした。4地区(日本3地区と韓国1地区)の比較分析を通じて、各地区固有のリスク対応が固有の社会的結束を生み、それがインフラ整備の態様を規定する一方、その物的な整備水準が当該地区の生産力構造と社会的結束の形態を規定したことを、実証的に明らかにした。この研究は、近世期には水害常襲地域として苦難の経験を重ね近代以降に穀倉地帯へと変貌した日本国内3地区(能美市牛島地区/亀田郷/新利根川土地改良区地区)と韓国1地区(全羅北道益山地区)を対象に、「土地に刻まれた歴史」(古島敏雄)が各地域の社会的特性をいかにかたち作ってきたのかを比較研究することを目的とする。すなわち、現時点での社会構造の特性を、水害克服にいたる歴史的経験を遡及しつつ比較分析することを課題としている。第1年度である今年度は、上記の4地区を対象に、a)文献収集、b)史料・資料収集、c)聞取り調査を行う予定であった。a)とb)の作業についてはほぼ計画通りに研究が進捗した。c)に関しては、亀田郷での聞き取り調査を行うことができたものの、他の地域については現地調査をすることができなかった。今年度の研究の結果、a)水害などの自然災害が現地の社会構造に規程的な影響を及ぼしている、b)インフラストラクチャーの整備などを通じて自然災害が克服されてゆく過程の特質が当該農村の生産構造・社会構造にその地域固有の特質を刻印している、という2つの作業仮説の実証可能性を確認することができた。それと同時に、インフラストラクチャーが巨大な官僚組織によって維持されていることによって、地域住民の意識の裡に上りづらくなっているという現状が、論点として浮上してきた。すなわち、水害克服過程と当該農村の生産構造・社会構造の特質との相互関係性(因果関係)に関する認識が、当事者の間では欠落する傾向にあり、それは、この研究の意義を強めるものであるということができる。今年度(第2年度)は、a)第1年度からの継続作業としての史料・資料収集および聞取り調査、b)第1年度に収集した史資料を用いたデータベース作成、c)史資料およびデータベースを用いた分析、d)一部の分析課題を対象とする地区ごとの比較分析、という4つの課題を設定していた。具体的な成果としては、まず、石川県牛島地区での聞き取り調査・資料収集、利根川下流域(佐倉)での資料収集および韓国(韓国国家記録院)での資料収集を挙げることができる。また、信濃川・亀田郷土地改良区からは、昨年度の訪問の際に依頼していた資料の寄贈を受けた。これらの研究活動により、この研究に必要な資料の入手が大幅に進んだ。そして、それらの資料を整理し、必要な部分についてデータベースを作成した。松本は、この作業をもとに、農村災害史研究の前提となるような試論的な論文を作成した。2014年7月には、今年度に作成したデータベースを活用して、学会報告を行う予定であり、その準備作業を行った。戸石は、災害リスクに対する対応という視点から、近世村落の機能に関する分析を深めた。その研究成果を、4度にわたって学会の個別報告として発表した。また、その成果の一部を論文にまとめて『共済総合研究』誌に投稿・発表した。さらに、2014年5月の学会発表に向けての準備を行った。安藤は、利根川下流域に関する実態調査および資料の整理を行い、研究成果として発表するための準備を行った。この研究では、近世期には水害常襲地域として苦難の経験を重ね近代以降に穀倉地帯へと変貌した日本3地区と韓国1地区を対象に、「土地に刻まれた歴史」(古島敏雄)が各地域の社会的特性をいかにかたち作ってきたのかを比較研究することを目的として設定した。各地区固有のリスク対応が固有の社会的結束social cohesionを生み、それがインフラ整備の態様を規定する一方、その物的な整備水準が当該地区の生産力構造と社会的結束の形態を規定する。そうした相互規定的な関係を、具体的な地域の歴史と実情に即して実証的に分析することを課題としている。松本は、おもに韓国全羅北道万頃江流域における植民地期の治水事業の展開過程を分析した。植民地権力による事業計画に対する地域住民の対応(事業推進の陳情、事業反対の示威など)を、朝鮮総督府の一次史料や新聞記事をもちいて分析した。戸石は、利根川流域の千葉県・佐倉地区を対象に、近世末から近代初期にかけての旧佐倉藩士による茶園の開拓と経営に関して、一次史料を渉猟しながら分析をおこなった。安藤と松本は、災害と地域社会という観点をより広い視点から捉えるために、東日本大震災によって浮き彫りにされた東北地方の社会経済的特質を、明治以降の近現代史の文脈に位置づけて捉えるために、他の研究者との共同研究に加わって、共著を出版した。

この研究では、近世期には水害常襲地域として苦難の経験を重ねて近代以降に穀倉地帯へと変貌した日本3地区(牛島・亀田・新利根川)と韓国1地区(益山)を対象に、各地区における「土地に刻まれた歴史」が現状の農村社会構造にどのように反映しているのかを、経路依存性という観点に注目しつつ、比較研究することを課題として設定た。それぞれの地区に固有なリスク分散制度は社会構造を規定し、社会構造は「土地に刻まれた歴史」=インフラ整備の態様を規定する、他方でインフラ整備の態様は当該地区の生産力構造と社会構造、そして営農組織の形態を規定する。比較分析の枠組みとして、こうした相互規定的・経路依存的な関係性を想定した。韓国=旧植民地という視点からの比較も課題とした。具体的な研究実績は、次の3点である。1)近世における牛島・亀田両地区における割地地慣行の実証を深めた。割地制度は、特殊な地域における例外的な制度ではなく、近世の日本の広く見出すことができることを確認したうえで、両地区における水害リスクへの対応方式を分析した。2)植民地期全羅北道益山地区におけるインフラ(治水・水利)整備の進捗度と地域の土地所有構造・村落社会構造および地域住民のインフラ整備事業に対応(抵抗と受容)を明らかにした。3)人口減少・高齢化という4地区をとりまく現局面での共通性に着目し、それに対する地域営農の対応の異同を明らかにした。とくに現状分析という観点から、牛島地区と新利根地区における営農組織の特徴を、地域社会構造の差異に着目しながら比較分析を行った。この研究は、近世期には水害常襲地域として苦難の経験を重ね近代以降に穀倉地帯へと変貌した地域を対象に、「土地に刻まれた歴史」(古島敏雄)が各地域の社会的特性をいかにかたち作ってきたのかを比較研究することを目的とした。換言すれば、現時点での社会構造の特性を、水害克服にいたる歴史的経験に遡及しつつ比較分析することを課題とした。4地区(日本3地区と韓国1地区)の比較分析を通じて、各地区固有のリスク対応が固有の社会的結束を生み、それがインフラ整備の態様を規定する一方、その物的な整備水準が当該地区の生産力構造と社会的結束の形態を規定したことを、実証的に明らかにした。調査予定地であった新利根川土地改良区の旧知の職員が退職してしまったために、調査交渉に手間取り、まだ調査をおこなえていない。また、石川県・牛島地区の調査も、カウンターパートが急用で不在となってしまい、調査交渉が進まずに調査を実施できていない状態にある。韓国調査の場合も、研究協力員が2014年3月に大学正規教員として職を得たために多忙となり、現地調査が充分に進捗していない。全体として現地調査の進捗度が想定よりも遅れており、そのために、個別の研究にはある程度の進展がみられるものの、共同研究メンバーによる総括的な共同研究会が組織できていない。27年度が最終年度であるため、記入しない。農業史日本に関しては、当初の調査予定地である、新利根川土地改良区と石川県・牛島地区に対しては、今年度現地調査を行う。ただし、カウンターパートとの調整が不調に終わるケースも念頭に置き、調査地を現状よりも絞ることも想定しておく。その場合には、佐倉地区など、すでにある程度の調査を実施してきた地域に対して集中的な調査を行うこととする。韓国に関しては、研究協力者の協力を得ながら、全羅北道万頃江流域に関する調査と分析を深めてゆく。(延長後の)最終年次として、共同研究メンバーによる総括的な共同研究会を開催して、共同研究のとりまとめを進めてゆく。今年度予定していた3つの研究課題のうち、(1)文献収集と(2)史料・資料収集については予定していた以上の作業を行なうことができた。
大規模欠陥データを利用したソフトウェア開発におけるプロジェクト比較の枠組みの研究

ソフトウェア開発においては、ソフトウェアに不具合を与える様々な欠陥が作りこまれ、試験(テスト)によってモニタリングされる。開発中に欠陥数がどれだけ存在するかを予測する方法が数多く提案されているが、それぞれの方法は特定の状況下でのみ有効であり、条件が異なる場合に利用できない。また、ドメインや開発手法の異なるプロジェクトを対象とした評価は行われておらず、それぞれの特性を考慮したものはない。そこで様々な企業におけるソフトウェア開発で発見された欠陥情報を収集しドメインや特性に関する知見を分析しまとめ広く公開する。
自発性異常味覚の評価にマグネシウムは応用できるか？

自発性異常味覚は、安静時に生じる味覚である。最も多い主訴は苦味である。この研究の目的は、苦味を有する自発性異常味覚の原因を調査することである。病歴、服用薬剤、心理検査等の問診を行った。唾液中および血清中のマグネシウムを測定した。各平均値を患者群と対照群とで比較した。唾液中のマグネシウムの値、GHQ30およびSDS合計点は、対照群よりも患者群で有意に高かった。患者群は健常群と比較して有意にアレルギー疾患を有していた。多くの患者は、味覚障害の副作用を伴う投薬を受けていた。以上の項目は、苦味の自発性異常味覚に影響を及ぼす要因となり得ることが示唆された。味覚障害のうち、自発性異常味覚は「安静時の口腔内の味(苦味等)」の訴えを有するものであり、定量的、客観的な評価が極めて困難である。明確な診断基準が存在しないため、これまでに科学研究費補助金(H22H25)をうけて、その診断に用いることができる指標を検証してきた。次の段階としては、苦味の原因となる要素を探索することが必要である。本研究では、苦味物質である可能性が示唆されているマグネシウム(Mg)の値に着目し、自発性異常味覚の診断における指標のとしての有用性を検討することを目的として立案した。本年度は、データ収集のための準備を以下の要領で行った。1質問紙・同意書の作成、倫理書類提出2必要器具等の準備3試薬の調整:苦味物質を吸着するリポプロテイン含嗽溶液の調整4委託業者との摂政:血液検査施行時の検体・依頼書の授受および金額等の確認。5コントロールデータ収集のための人材の確保このうち、1の倫理申請であるが、遺伝子を絡めたものと思われ、遺伝子倫理審査委員会に申請していたため審査に時間を要し、結果的にはその委員会に申請すべき内容ではないとの審議結果が出たため再度作成し申請し直していたため、いまだ許可がおりていない状況である。上記のほかの項目はすべて準備済みであり、申請許可が下り次第速やかにデータ収集を行えるよう整えている。本研究によって診断に用いることのできる指標が明確になれば、患者の治療およびQOLの向上に大きく寄与できると考えられる。前回の研究では苦み物質の存在は明らかにすることができるようになったが、さらに唾液中のMgの定量評価を行うことで、苦味物質の具体的な原因を解明し、客観的指標のない自発性異常味覚の診断に寄与できるものと考えている。研究計画概略:最初に健常者を対象としたデータ収集を行った。続いて自発性異常味覚患者の唾液・血液・味覚検査等のデータ収集を行い、得られた結果を元に2群間の比較検討を行った。方法:健常者データを19名(女性11名、男性8名、2344歳)より収集した。さらに外来患者データとして9名(女性、5081歳)より収集した。収集した内容は、自記式の検査表(GHQ30、SDS)による精神健康度およびうつ度、既往歴、服用薬剤、口の中の苦味の有無および苦味をマスクする含嗽テストへの反応、唾液分泌量および唾液中のコルチゾール・クロモグラニンA・マグネシウム、血中のマグネシウム・鉄・ビタミンB12・亜鉛・銅、歯肉からの排膿の有無、テーストディスクによる味覚評価、である。結果(考察):唾液中のマグネシウムは、患者群で高い傾向があったが、有意差までは認められなかった。しかしながら、突出して高い者が2名いたことにより、苦味を生じている原因が唾液中のマグネシウムである可能性が示唆された。血中のマグネシウムには群間の有意差を認めなかったことから、唾液中のマグネシウムが高くなる理由をさらに考えていく必要がある。また、服用薬剤を調べた結果、患者群の服用薬剤中に、添付文書に味覚異常との記載のあるものが含まれていた者が9名中7名と高頻度に認められた。従って、自発性異常味覚の苦味の一因として、薬剤が原因となっている可能性が考えられた。唾液中のストレス関連要素であるコルチゾールとクロモグラニンAには群間に有意差を認めなかったが、自記式の調査票による精神神経症状のトータルスコアは有意に患者群が高かった。この双方の結果の乖離については、さらに客観的データを加えて検証する必要がある。自発性異常味覚患者の受診が少なく、なかなかデータを増やすことができていない。そのほかは順調に進展している。本年度に行った内容について:当院味覚外来を受診された味覚障害を有する患者のうち、自発性異常味覚を訴える患者のみを対象としてピックアップしたところ、10名に満たない患者数であったが、そのうち同意が得られた6名を対象に、患者データ収集を行い、前年度までに収集した患者データに追加した。結果および考察:唾液中のマグネシウムは苦い味を励起させることが報告されており、その実際について検証するべく、データ収集を行った。前年度までには、健常者データ19名と患者データ9名とで比較して、唾液中のマグネシウムの値について検討したところ、値が突出して高い者が認められたものの、有意差は得られなかった。しかし患者群では高い傾向にあり、データを追加していくことで、差は明らかになろうと予測していた。このたび6名分のデータを追加したところ、やはり患者群が有意に高い結果が認められたことは、研究開始時に予想していた結果と一致し、有意義なものであった。

しかしながら、予想に反して、血中のマグネシウムの値には有意差が認められなかった。したがって、ヒト体内におけるマグネシウムの同行は不明な点が多いが、今後は、唾液中のマグネシウムが高くなる理由を考えていく必要がある。他に有意差が認められた項目として、1唾液分泌量(患者群が有意に少ない)、2服用薬剤(患者群が有意に多い)、3アレルギー疾患の有無(患者群が有意に多い)、4口腔カンジダ症(患者群が有意に多い)、5逆流性食道炎(患者群が有意に多い)、6自記式の調査票GHQ30による精神神経症状のスコア(患者群が有意に多い)の6項目が認められた。これらの関連について検討すべく、さらに客観的データを加えて、今後も検討していく予定である。自発性異常味覚は、安静時に生じる味覚である。最も多い主訴は苦味である。この研究の目的は、苦味を有する自発性異常味覚の原因を調査することである。病歴、服用薬剤、心理検査等の問診を行った。唾液中および血清中のマグネシウムを測定した。各平均値を患者群と対照群とで比較した。唾液中のマグネシウムの値、GHQ30およびSDS合計点は、対照群よりも患者群で有意に高かった。患者群は健常群と比較して有意にアレルギー疾患を有していた。多くの患者は、味覚障害の副作用を伴う投薬を受けていた。以上の項目は、苦味の自発性異常味覚に影響を及ぼす要因となり得ることが示唆された。遺伝子を絡めた研究として倫理申請をすすめていたため、その審査に時間を要していた。加えて結果的に遺伝子倫理審査は必要ないとの審議結果となったため、再度他の委員会に申請し直すこととなったため、現在まだ倫理申請の許可がおりていない状況である。従って、実際のデータ収集を行えていないため、研究計画よりも遅れることとなった。患者データがなかなか取れないので、患者データを追加して、N数を増やして検証を加えたい。味覚本年度は患者データ収集のみ行う予定であったが、倫理申請が下り次第、初年度に予定していたコントローデータ収集を同時に行っていく予定として、計画を組み直す。本年と来年の前半期で全データを収集し、その後解析を加える予定である。データ測定に関しては委託しているが、患者データが当初予定よりも少なかったため、その分の差額が生じた。倫理申請の許可がおりていないため、予定していたコントロールデータ収集ができなかった。従って、その消耗品やデータ解析に関わる費用は、コントロールデータ収集を行うために使用するべく、次年度に繰り越しとなった。次年度は、患者データ採取は予定していなかったが、引き続き、可能な限りデータ収集し、その際に差額を消費する予定である。上記理由につき、繰越額は本年データ収集の際に使用する。患者データは予定通り本年より開始するため、予定金額を利用できると考える。
液中原子分解能原子間力顕微鏡の多機能化と生体膜研究への応用

本研究では、液中で原子スケール(1 nm以下)の構造を観察できる原子間力顕微鏡と呼ばれる計測装置を改良して、観察に使用る液体の温度やそこに含まれるイオンの濃度を精密に制御できるようにした。さらに、生体の基本的なパーツである生体膜の分子ス研究へと開発した装置を応用し、生体膜の主たる構成成分である脂質分子とコレステロールの複合体の構造を分子レベルで観察すことに世界で初めて成功した。本研究は,液中で原子分解能を有する原子間力顕微鏡に対して,温度制御、濃度制御機能を付加する装置開発と,開発した装置を用いた生体膜の分子レベル研究を目的としている。平成19年度は,温度制御機能と濃度制御機能を付加する装置開発を中心に行った。新たな試料スキャナ,試料ホルダ,カンチレバーホルダを設計、製作し,原子、分子分解能を維持したまま探針位置をかえることなく,溶液を置換できるシステムの開発に成功した。開発したホルダは,従来の大気開放型のオープンセルではなく,密閉型のクローズドセルになっているため,溶液の蒸発が避けられイオン濃度などが精密に制御された条件下で実験をすることが可能となった。一方,温度制御機能については,ペルチェ素子により温度制御された恒温槽を開発し,その中に装置全体を入れて利用可能とした。現在,室温から37°Cへと設定温度を変更した際に,1時間以内に約±1°C以内の精度で装置全体のあらゆる部分の温度を制御することが可能となっている。温度のばらつきのほとんどは,試料ホルダ周辺のポリマー材料で構成された部分で生じている。これは,金属に比べてポリマー材料の熱伝導度が大幅に低いことに起因するが,この点を解決すれば,より短時間により高精度な温度制御が可能となる。対策としては,試料ホルダ周辺のみを温度制御するための小型のセラミックヒータか,もしくはペルチェ素子を導入することを検討している。また,溶液置換機能を利用すれば溶液温度を外部で制御し,その溶液でセル内の溶液を置換することも可能であり,この方法も含めて対策を検討する。溶液置換機能はすでに利用可能となっているため,脂質二重層などのモデル生体膜をイオン種やイオン濃度を換えて観察するなどの実験を開始しており,平成20年度の応用実験へとつながる準備が整いつつある。本研究では、溶液中で原子分解能観察が可能な原子間力顕微鏡(AFM)に、溶液の濃度や温度を制御する機能を付け加え、それを使って精密に制御された溶液環境での分子スケール生体膜研究を行うことを目標としている。平成19年度には、AFM観察時に、観察位置を変更することなく溶液を置換できるシステムを完成させた。さらに、本年度は、この溶液置換システムを電動で制御可能とし、溶液置換の速度や時間を精密に制御できるようにした。また、温度制御に関しては、溶液だけではなく装置全体を銅製の断熱容器で囲み加熱するシステムを開発した。これにより、温度を変化させたときの装置内部の温度分布を1度以下に収めることに成功した。また、開発した装置を用いて、モデル生体膜の分子スケール構造観察を行った。代表的な脂質分子であるDPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)分子の二重層をベースとして、それにコレステロールを含有させたモデル生体膜をマイカ基板上に作製した。その構造を開発した装置を用いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS溶液)中で観察した。その結果、コレステロールのDPPC分子間への挿入により、DPPC分子の配列に不規則性や欠陥が増加することがわかった。また、DPPCのみのモデル生体膜が擬六方の2次元結晶構造を有しているのに対し、コレステロールが30%以上混入されると、それが斜方晶の2次元結晶構造へと変化することが新たにわかった。このような分子スケールの異種分子複合体の形成やその構造は、膜輸送や膜内の分子拡散、さらにはラフト構造形成に深く関与しているとされ、これまで盛んに研究が行われてきたが、分子スケールでその複合体構造を直接観察した例はこれまでになく、この分野における大きな進展が得られた。
標的臓器癌のステロイドホルモン依存性消失の分子機構

本年度の計画のうち、(【I】)癌細胞中に通常のステロイドホルモンレセプターと異る性状を示すレセプターが存在すること、特にレセプター蛋白の燐酸化がホルモン結合能を維持する為に重要であること(【II】)エストロゲン又はアンドロゲン依存性増殖を示す癌細胞の無血清培養系を樹立し、性ホルモンは標的細胞癌を刺激し増殖因子を分泌させAutocrine Controlで癌増殖を刺激すること、(【III】)増殖因子の活性の定量法の確立等を報告した。レセプターの癌化にともなう変異に関しては、ホルモンに対する親和性が著明に低いレセプター、通常の条件ではホルモンと結合せず3745°Cの高温下で結合可能となるレセプター等を同定した。前者のレセプター(エストロゲン系)は燐酸化蛋白で、細胞をバナジル酸(フォスファターゼ阻害剤)に露することにより高親和性(Kd【10^(-10)】M)に転換し、エストロゲンによる細胞増殖も低濃度(【10^(-10)】【10^(-9)】M)で最大刺激を得ることを明らかにした。又無血清培地系を用いエストロゲンやアンドロゲンで刺激される増殖因子はPDGF,EGFやInsulin-like grouth factorとは異ることを報告した。特にシオノギ癌由来のSC-3細胞から分泌されるアンドロゲン依存性腫瘍増殖因子は、分子量5060Kの熱に比較的安定な蛋白であることを示した。この増殖因子は陰イオン交換樹枝に吸着され、-SH還元剤で失活する蛋白であった。この増殖因子を添加することによりSC-3細胞の形態が敷石状から紡錘状に変化した。又マウスdeydig Cell Tumor由来の1つの培養細胞株でエストロゲン非刺激下でレセプターがクロマチンと強固に結合しエストロゲン依存性増殖因子を分泌することを明らかにした。以上本年度の計画の大略は行い得たと思うが今後の最重要課題として、性ホルモン依存性腫瘍増殖因子の構造決定の問題が残った。次年度は増殖因子に対するモノクローナル抗体の作成と遺伝子工学的手法による増殖因子の構造決定を試みたい。
テロメラーゼ機能の解析と細胞の不死化癌化への役割

ヒト正常線維芽細胞は,テロメラーゼの触媒ユニット遺伝子(hTERT)の導入によってテロメラーゼを発現し、テロメアサイズが延長し、分裂寿命が延長したにもかかわらず、不死化するものは得られなかった。テロメラーゼのほかに不死化に必要な遺伝子機能を探る目的で、DNA型癌ウイルスSV40の癌遺伝子であるT抗原遺伝子を導入した線維芽細胞(有限分裂寿命)にhTERTを導入した。薬剤選択によって、hTERTが導入された細胞を選択しクローニングしたところ、ほぼすべてのクローンがテロメラーゼを発現し、テロメアサイズが延長し、不死化した。すなわち、ヒト線維芽細胞は、T抗原遺伝子とhTERT遺伝子の両方があれば不死化することが明らかになった。これらの細胞は、温度感受性を持つT抗原遺伝子を導入してあるので、非許容温度によりT抗原を失活させたところ、延命中の細胞は増殖を停止したにもかかわらず、不死化後の細胞は全く増殖が低下しなかった。T抗原による癌細胞表現型(パイルアップ増殖など)は非許容温度では失われた。不死化するためにはT抗原とテロメラーゼの両方の機能が必要であるが、不死化が成立した後はT抗原の機能は不要であるか、または非許容温度でも残存するごく一部の機能があればよいかのいずれかである考えられる。これを明らかにするために、現在、hTERTを導入した有限分裂寿命の線維芽細胞に、T抗原機能の内のごく一部を保持するt抗原遺伝子を導入し、延命・不死化の有無を検討している。また、前年度に確立した、テロメラーゼ活性の高感度・定量的測定法により,早々期の癌診断への可能性については、肝癌、肝前癌病変、慢性肝炎・肝硬変および正常肝でのテロメラーゼ活性の発現と,テロメラーゼの各サブユニットがどのように発現するかを調べた。特にテロメラーゼ活性の低い前癌病変と慢性肝炎や肝硬変における、高感度で定量的な活性測定により、前癌病変の約半数に極めて低活性ながら、非癌部に比べて有意な活性の存在を認めた。これらの病変は,将来は癌に移行する可能性が有るものとして対処すべきものと考えられた。このように、早々期を含めた肝癌の診断に有効であることがわかり、臨床に役立つ成果が得られた。本研究の目的は,テロメラーゼ酵素コンポーネントが明らかになりつつあることを踏まえて,すでに得られている触媒コンポーネント(hTERT)の機能を明らかにするとともに,特にヒト正常細抱の有限分裂寿命・不死化にかかわるテロメア・テロメラーゼの機能・役割を明らかにすることである。具体的には,ヒトテロメラーゼサブユニットcDNAの導入により,正常細胞におけるテロメラーゼ活性発現と,細胞分裂寿命延長および不死化への機能を調べる。この研究の一つの応用として,酵素活性を高発現する細胞株を樹立して,テロメラーゼ阻害剤のスクリーニング法を開発することも計画する。本年度の研究により,以下の様な成果が得られた。1)選択薬剤と共発現させるために,IRESベクターにつないだhTERTの構築に成功した。2)ヒト正常線維芽細胞にhTERT遺伝子のcDNAを導入し,一時的な発現によるテロメラーゼ活性の有無を測定したところ,高い活性が発現していることがわかった。3)cDNAを導入された細胞を薬剤耐性によって選択しクローニングしたところ,大部分がテロメラーゼ活性陽性になっていた。

4)導入された線推芽細胞は、テロメア配列が著しく延長していることがわかった。5)導入された線推芽細胞は、正常のものに比べて分裂寿命が延長することがわかった。6)導入された線維芽細胞はすべて分裂寿命を迎え,不死化するものはまったく得られなかった。7)分裂寿命の最後まで,テロメラーゼ活性は陽性でテロメアは長いまま保たれていることがわかった。以上の結果から,従来予想されていたような,テロメラーゼが発現すれば細胞は不死化するという単純な機構ではないことが明らかになった。次年度は,この機構にさらに迫ると共に,テロメラーゼ活性を高発現する細胞を得ることにする。ヒト正常線維芽細胞は、テロメラーゼの触媒ユニット遺伝子(hTERT)の導入によってテロメラーゼを発現し、テメロアサイズが延長し、分裂寿命が延長したにもかかわらず、不死化するものは得られなかった。テロメラーゼのほかに不死化に必要な遺伝子機能を探る目的で、DNA型癌ウイルスSV40の癌遺伝子であるT抗原遺伝子を導入した線維芽細胞(有限分裂寿命)にhTERTを導入した。薬剤選択によって、hTERTが導入された細胞を選択しクローニングしたといころ、ほぼすべてのクローンがテロメラーゼを発現し、テロメアサイズが延長し、不死化した。すなわち、ヒト線維芽細胞は、T抗原遺伝子とhTERT遺伝子の両方があれば不死化することが明らかになった。これらの細胞は、温度感受性変異を持つT抗原遺伝子を導入してあるので、非許容温度によりT抗原を失活させたところ、延命中の細胞は増殖を停止したにもかかわらず、不死化後の細胞は全く増殖が低下しなかった。T抗原による癌細胞表現型(パイルアップ増殖など)は非許容温度では失われた。不死化するためにはT抗原とテロメラーゼの両方の機能が必要であるが、不死化が成立した後はT抗原の機能は不要であるか、または非許容温度でも残存するごく一部の機能があればよいかのいずれかである考えられる。これを明らかにするために、現在、hTERTを導入した有限分裂寿命の線維芽細胞に、T抗原機能の内のごく一部を保持するt抗原遺伝子を導入し、延命・不死化の有無を検討している。また、前年度に確立した、テロメラーゼ活性の高感度・定量的測定法により,早々期の癌診断への可能性については、肝癌、肝前癌病変、慢性肝炎・肝硬変および正常肝でのテロメラーゼ活性の発現と,テロメラーゼの各サブユニットがどうのように発現するかを調べた。特にテロメラーゼ活性の低い前癌病変と慢性肝炎や肝硬変における、高感度で定量的な活性測定により、前癌病変の約半数に極めて低活性ながら、非癌部に比べて有意な活性の存在を認めた。これらの病変は、将来は癌に移行する可能性が有るものとして対処すべきものと考えられた。このように、早々期を含めた肝癌の診断に有効であることがわかり、臨床に役立つ成果が得られた。