hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペルオキシソーム増殖剤応答性エンハンサーによる転写調節機構の解析

このことは、この領域の機能的重要性を示唆しており、今後の機能解析に貴重なヒントを与えるものである。1.ペルオキシソーム増殖剤によるペルオキシソームβ酸化系遺伝子の誘導機構を調べるため、この系の初発酵素であるアシル-CoAオキシダーゼの遺伝子のエンハンサーと、この調節に関わる核内レセプターPPARとの相互作用を、レポーター遺伝子を用いたトランスフェクション実験と蛋白質/DNA結合実験によって調べた。従来の解析により、このエンハンサー内のダイレクトリピートDR-1に、PPARと別の核内レセプターRXRとのヘテロダイマーが結合して転写を活性化することが知られていた。今回、DR-1のみでエンハンサー機能に十分かどうかを、その周辺部分への変異導入実験によって調べたところ、DR-1の直後の塩基配列がPPAR/RXRの結合にとってきわめて重要であることがわかった。ゲルシフト法とPCR法を組み合わせることにより、ランダムな塩基配列から結合性の高い配列を選択したところ、DR-1に続く4塩基にはA・G・A or T・Tというコンセンサス配列が見いだされ、特に3塩基目のA/Tが必須であることが明らかになった。このことは、PPARの作用には従来提唱されていたDR-1のみならず、その下流側の配列もきわめて重要であることを示している。2.異なる数種類の培養動物細胞を用いたトランスフェクション実験により、上に記したDR-1下流の塩基配列の役割は、細胞によって異なることが示唆された。すなわち、PPARを発現せず、内在性のオキシダーゼ遺伝子の誘導が起こらないHeLaやCV-1では、この配列は転写促進作用そのものに重要であった。これに対し、内在性のオキシダーゼ遺伝子の誘導が観察されるラット肝癌由来細胞H4IIEC3では、この部分の配列はエンハンサー活性には必須ではなく、むしろ誘導剤非存在時に転写を抑制することによって、誘導のON/OFFを確実にする役割があることが示唆された。予備実験の結果、この細胞、さらにはラット肝臓にはPPARと相互作用することにより、その作用を修飾する蛋白質因子が存在すると考えられたので、その因子を同定するべく、現在、検討を進めている。1.前年度までに、ペルオキシソームβ酸化系の初発酵素、アシル-CoAオキシダーゼの遺伝子のエンハンサーについて、詳細な配列要求性を調べた。その結果、この領域の中で、6塩基の配列が1塩基を隔てて2回繰り返すダイレクトリピートDR-1のみならず、その直後4塩基の配列が核内レセプターPPARとの結合、およびエンハンサー活性にとって必須であることがわかった。PPARはもうひとつの核内レセプターRXRとヘテロダイマーを形成してDR-1モチーフに結合する。そこで、DR-1直後の配列を要求するのがPPARなのかRXRなのかを明らかにするため、両者がそれぞれ、どちらの側のリピート配列に結合するのかを調べた。その結果、RXRは上流側に、PPARは下流側に結合することが明らかになった。この結合の極性は、RXRとヘテロダイマーを形成する他のレセプターの場合とは逆である。
話し手の外見的魅力が欺瞞性認知に及ぼす影響－認知および神経基盤からの検討－

本研究は,女性の顔の魅力に着目し,心理実験及びfMRI実験を用いて,欺瞞性認知とその脳内メカニズムについて検討することを目的とした。女性モデルに対し化粧を用いることで高魅力条件,低魅力条件の両条件を構成し,各条件にてビデオカメラの前で同一の話をすることを求め,その様子を録画し,編集した映像刺激を実験参加者に呈示し,魅力度,欺瞞度等の評定を求めた。その結果,魅力度の操作チェックに概ね成功し,またいくつかの刺激において欺瞞度の条件差が認められた。仮説を明瞭に支持する結果ではなかったものの,女性の顔の魅力が高いほど欺瞞性認知が低いことが弱いながらも立証され,fMRI実験実施の準備状態に到達した。本研究は,話し手の外見的魅力が聞き手の欺瞞性認知に及ぼす影響について検討するものである。社会心理学的実験およびfMRI実験の両方を用いて,欺瞞性認知とその脳内メカニズムについて検討していく。前者の実験結果をもとに,その後のfMRI実験で使用する刺激を選別するという流れである。社会心理学的実験については,本科研費獲得前にすでに遂行しているものの(村井・野瀬・坂井,2013),高魅力条件・低魅力条件間で,欺瞞度得点の平均値差が認められなかったため,平成26年度は,村井ら(2013)と同様の手法を用い,映像刺激を再録画,編集し,欺瞞度評定などを求める実験を遂行した。映像刺激収録に際しては,村井ら(2013)と異なる複数の女性モデルに対し,化粧を変えることで高魅力条件と低魅力条件の2回の撮影を実施した(同じモデルを両条件に割り当てることで,モデルの個人差の影響を軽減することができる)。村井ら(2013)とは異なる質問を設定し,モデルが質問に答えている様子を撮影した(各モデルは,両条件間で同じ返答をすることになる)。収録した刺激については,同一モデルの高魅力条件・低魅力条件が同時に含まれることがないように編集し,モデルや質問の違いなど組み合わせを変えた計27個の刺激を,集団実験形式にて評定者(大学生男女)に呈示し,欺瞞性について評定を求めた。取得したデータを分析したところ,魅力の操作が成功していないことが示唆され,現在,データを再分析中である。送り手側の外見的魅力が,受け手側の欺瞞性認知に影響を及ぼすことが示唆されている。本研究は,社会心理学的実験,およびfMRI実験の両方を用いて,欺瞞性認知とその脳内メカニズムについて検討を行うものである。fMRI実験遂行のためには,良質な実験刺激(映像刺激)を作成することが必須である。村井・野瀬・坂井(2013)において,収録した3名の映像刺激の魅力度,欺瞞度について検討するも,高魅力条件・低魅力条件間で,欺瞞度得点の平均値差は認められなかった。そこで,新規の3名のモデルに対して映像刺激そのものを撮り直した上で,大学生85名に対して集団実験形式にて映像刺激を呈示,欺瞞度に関するデータを収集した。村井・野瀬・滝口(2016)において,本データについて再分析を行ったところ,いずれのモデルの魅力度についても,高魅力条件が低魅力条件よりも有意に高いことが示された。すなわち,懸案だった魅力度の操作に成功したことになる。青年期女性では,化粧を用いた低魅力化が困難であることを確認していたことから,魅力度の操作の成功は一定の成果ではあるが,高魅力・低魅力条件間の欺瞞度の差は全般的に小さいものであった。とは言え,有意差が認められた数か所では,概ね「高魅力条件<低魅力条件」となっており,魅力的でないほど欺瞞的という方向性が微弱ながらも認められたことは注目すべき点であろう。モデルの魅力度の操作を精緻にすること,質問内容を改善すること,評定項目を改善すること,などの点を考慮した上で,映像刺激の収録,実験の遂行を重ね,fMRI実験につなげたい。刺激映像について,魅力度の操作チェックには成功したものの,両条件間の欺瞞度の差が全体的にあまり認められず,fMRI実験用の刺激を決定できていない。さらに,新規の映像刺激の作成にも難航している。送り手側の顔の外見的魅力が,受け手側の欺瞞性認知に影響を及ぼすことが示唆されているが,この点について検討するためには,まず魅力度の操作が重要になる。実験刺激作成および欺瞞性認知の検討のために実施された以前の研究では,魅力度に関する実験操作自体が成功しなかった。この原因としては,低魅力条件が,実験者が想定するほどに低魅力にならなかったことが挙げられる。そこで,実験刺激(映像)を再録し,魅力度に関する操作の成功を目指すとともに,高魅力条件・低魅力条件間の欺瞞度の差異について再検討した。すなわち,女性モデル3名に対し,質問内容を伝え,初対面の異性に好印象を抱かせるような回答の入力を求めた上で,各モデルに高魅力・低魅力両条件の化粧を順に行い,入力した回答を高魅力条件・低魅力条件にて同じように発言するよう求め撮影した。以上の刺激を用い再度集団形式の実験を遂行したところ,魅力度の操作には成功したものの,条件間の欺瞞度の差は全般的に小さいことが分かった。これを受け,新規の女性モデル4名に対して再度刺激の収録を行い,刺激の精査,編集を行った。

さらに,実験で用いる質問紙記載の欺瞞度,魅力度,両方の評定項目を改訂し,評定者の個人特性について測定する項目を加え,評定者への教示も改変した上で,実験に備えた。魅力度の操作の成功は大前提として,欺瞞度の条件差が見出された映像刺激がいくらかでも同定できれば,これらの刺激を今後の実験に使用することができる。映像刺激の作成が,当初の予想よりもはるかに困難であることが,複数の実験を通して明らかになったため。従って,映像の収録,編集,実験の遂行,データ解析,という一連のプロセスを何度か繰り返している状況である。本研究は,話し手の外見的魅力,特に女性の顔の魅力に着目し,心理実験,およびfMRI実験を用いて,欺瞞性認知とその脳内メカニズムについて検討を行うことを目的としていた。実験遂行において最も重要になるのが,質の良い刺激の作成である。複数の女性モデルについて,化粧を用いることで高魅力条件,低魅力条件の両条件を構成し,それぞれの条件においてビデオカメラの前で同一の話をすることを求め,その様子を録画し,編集した映像刺激を実験参加者に呈示し,魅力度,欺瞞度などについての評定を求めた。その結果,まず何より両条件間で魅力度に関する操作チェックを成功させることに難航した。そのため,別の女性モデルについて映像を撮り直し,再度同様の実験を行った結果,魅力度の操作チェックには成功するも,条件間での欺瞞性認知の差を見出すに至らなかった。そこで,再度別の女性モデルに対し同様の方法で映像を撮り直し,最終年度において同様の実験を行った結果,魅力度の操作チェックに概ね成功し,またいくつかの刺激において欺瞞度の条件差が認められた。仮説を明瞭に支持する結果ではなかったものの,部分的にではあれ,女性の顔の魅力が高いほど欺瞞性認知が低いことが立証された意義は大きいと考えている。当初の研究計画では,これらの刺激を用いて,魅力と欺瞞性認知に関する脳内メカニズムについてfMRI実験によって検証する予定であったが,道半ばで研究期間終了となった。しかしながら,これまでの先行研究の多くが,高魅力条件,低魅力条件それぞれに別々のモデルを使用しているのに対し,本研究では両条件とも同一モデルを用いることで交絡を防ぐことに成功している。この点は,欺瞞性認知研究のみならず,他の対人認知研究などにも資するものであり,今後につながる成果である。本研究は,女性の顔の魅力に着目し,心理実験及びfMRI実験を用いて,欺瞞性認知とその脳内メカニズムについて検討することを目的とした。女性モデルに対し化粧を用いることで高魅力条件,低魅力条件の両条件を構成し,各条件にてビデオカメラの前で同一の話をすることを求め,その様子を録画し,編集した映像刺激を実験参加者に呈示し,魅力度,欺瞞度等の評定を求めた。その結果,魅力度の操作チェックに概ね成功し,またいくつかの刺激において欺瞞度の条件差が認められた。仮説を明瞭に支持する結果ではなかったものの,女性の顔の魅力が高いほど欺瞞性認知が低いことが弱いながらも立証され,fMRI実験実施の準備状態に到達した。分析結果は必ずしも期待に沿うものではなかったものの,刺激の収録,実験の実施まで遂行することができたため。本研究を学会発表したが,そこで受けたコメントをもとに,刺激の精査に入る。さらに,新規刺激の収録については,外部の専門業者に発注することで,所要時間の短縮化を図る予定である。新規に作成した映像刺激を用いて集団形式での実験を再度行うが,その分析結果次第では,プロのモデルを用い,言語的行動・非言語的行動を的確にコントロールした映像刺激を再度作成することも考えている。
口腔癌特有の紫外線励起蛍光を発する組織中のポルフィリン関連物質の分析・同定

口腔癌特有な赤色の紫外線励起蛍光の発光機序を解明する目的で、ポルフィリン関連物質に焦点を絞って、ヒト口腔癌由来株化培養細胞、ハムスター実験的誘発舌癌および口腔癌患者臨床材料について生化学的に検討し、以下の結果を得た。1)ヒト口腔癌株化培養細胞(HSC2、HSC3、HSC4)は、ポルフィリン前駆物質であるアミノレブリン酸投与下の培養により、培養液中にZnプロトポルフィリン、コプロポルフィリン、プロトポルフィリンIXと蛍光のピーク波長が類似する物質を産生し、その蛍光強度はアミノレブリン酸濃度依存的に増加した。また、HSC2および3により形成されたヌ一ドマウス腫瘍組織抽出液中にプロトポルフィリンIX類似の蛍光物質の存在が示された。2)ハムスター実験的誘発舌癌では、プロトポルフィリンIX類似の蛍光物質が癌化の過程で組織含有量が増加する傾向を示し、癌組織では明瞭な蛍光ピークを呈していた。3)ヒト口腔癌の表層組織の高速液体クロマトグラムによる分析では、癌の蛍光組織は、プロトポルフィリンおよびその関連化合物型、コプロポルフィリンおよびその関連化合物型およびその他の3群に分類されることが示唆された。以上の結果から、口腔癌の特有な紫外線励起蛍光には、プロトポルフィリンIXが関与し、癌組織がその蛍光物質を産生し得ることが示唆された。口腔癌の橙色の紫外線蛍光を発する組織を採取し、酢酸エチル-氷酢酸溶液にて蛍光物質の抽出を行い、その抽出液を蛍光検出器にて分析した。その結果、抽出液には404nmの励起波長により633または634nmにピークを有する蛍光を発する物質が含有していることが確認された。同様に採取した歯垢や舌背の組織抽出液中にも、630nm付近に蛍光波長のピークが認められたが、その蛍光強度は口腔癌と比較すると非常に小さい状態であった。癌組織の蛍光物質抽出液を高速液体クロマトグラフ(カラム:Shodex ODS pak F-511A)にて分離したところ、種々の溶出位置に蛍光のピークが認められた。そのうち蛍光強度の高いピーク3分画を採取して蛍光検出器にて確認したところ、その蛍光波長は630,631および632nmであった。また、プロトポルフィリンIX、コプロポルフィリン、ウロポルフィリンを口腔癌の蛍光物質抽出液と同一条件で高速液体クロマトグラフにて分析したところ、プロトポルフィリンIXの溶出位置は口腔癌抽出物の蛍光強度が最も高いピークと一致していた。これらの結果から、口腔癌の蛍光物質中には、プロトポルフィリンIXが大量に含まれている可能性が示唆され、症例を重ねて結果の確認と他の蛍光物質の同定についても検討中である。ハムスターの実験的誘発舌癌は、現在発癌操作の途中であり、過角化状態の組織サンプルは採取し凍結保存している。今後、初期癌および進行癌の状態の時期に組織サンプルを採取し、組織抽出物中に含まれる蛍光物質をヒト口腔癌の分析システムにて検討する予定である。ヒト口腔癌の表層から採取した組織中には、蛍光分析および高速液体クロマトグラフィーによる分析結果から、プロトポルフィリンが多量に含まれていることが示唆された。しかし、癌と類似した蛍光を発する舌背の白垢および歯垢においてもプロトポルフィリンが含まれていることが示唆され、蛍光分析では癌組織との明らかな差は認められなかった。ハムスター実験的誘発癌において、採取した組織からポルフィリン関連物質を抽出するとともに一部を組織学的に診断した。癌組織には、404nmの紫外線励起により583584nm、629634nm、671672nmの3つ蛍光ピークを認めたが、正常組織、上皮過形成、上皮異形成組織には、629634nmと671672nmのピークはほとんど認めなかった。629634nmの蛍光ピークはプロトポルフィリンと考えられた。ヒト口腔癌株化細胞においては、通常培養およびヘモグロビン存在下での培養では培養液中にポルフィリン関連物質は認められなかった。

しかし、プロトポルフィリンの前駆物質であるアミノレブリン酸を投与することにより、405nm紫外線励起により633636nmの蛍光ピークを示す物質が大量に培養液中に認められ、プロトポルフィリンが扁平上皮癌により産生されることが示唆された。以上の結果から、口腔扁平上皮癌の示す赤色の紫外線励起蛍光は、主に組織中のプロトポルフィリンに起因することが示唆された。さらに、プロトポルフィリンを癌細胞が産生する能力を有していることが示され、ポルフィリンを中心とした癌の生化学的診断の可能性について、次年度も継続して検討を進める予定である。本年度は、ヒト臨床材料およびヒト口腔癌由来の培養細胞中のポルフィリン関連物質の分離、同定を中心に検討した。ヒト口腔癌の赤色の紫外線励起蛍光を示す表層組織を採取し、比較物質として舌苔、歯垢も同一患者から採取し、蛍光分析および高速液体クロマトグラムによるポルフィリンの分析を行った。その結果、蛍光分析では、405nm紫外線励起により633636nmの蛍光ピークを示す物質が癌組織抽出物および舌苔、歯垢に認められ、蛍光波長のピークからプロトポルフィリンが主な蛍光物質と推測された。しかし、これら物質を高速液体クロマトグラムを用いて分析した結果、癌由来の蛍光組織は、プロトポルフィリンおよびその関連物質型、コプロポルフィリンおよびその関連物質型およびその他の蛍光物質型の3群に分類されることが示唆された。また、舌苔や歯垢にも同一患者では癌組織と類似した蛍光物質の型を呈しており、蛍光強度が癌組織に比較して明らかに低いことから、癌組織の蛍光物質が付着して舌苔や歯垢に類似蛍光を生じている可能性が示唆された。また、ヒト口腔癌株化細胞においては、プロトポルフィリンの前駆物質であるアミノレブリン酸を投与下で認められたプロトポルフィリン様の蛍光は、高速液体クロマトグラムによる分析では、明らかなプロトポルフィリンやコプロポルフィリン存在は認められずその他の蛍光物質型に属する可能性が示された。今回の検討で得られた、蛍光物質の3型の臨床的意義を明らかにするまでには至らなかったが、本分類は従来報告されていない新しい知見であり、今後臨床病態像との関連を検討していく予定である。
金属ナノクラスターのポストキラル変換と不斉光学応答

光学不活性な金属ナノクラスターのポストキラル変換と不斉光学応答のコントロール、及びその物理化学的特性を明らかにする研究を行い、以下に述べる重要な結果を得た:(1)キラルフルクトースが表面で結合する反応を利用し、アキラル配位子のフェニルボロン酸で保護した金ナノクラスターのポストキラル変換を達成した。得られた複雑な円二色性(CD)信号は、磁気円二色性(MCD)の測定から解釈できる事を解明すると共に、不斉場効果の起源を確固たるものにした。(2)吸収やCD信号に対する表面配位子の長さ効果を表面アミノ基の反応のコントロールを通して検討した所、特にCD信号には小さいながらも重大な影響を与える事が分かった。(3)光学不活性金ナノクラスターのキラル連結をキラルジチオール配位子交換によって達成し、非常に大きな不斉光学信号を得た。これは、表面におけるヘリカルなクラスター連結を示唆する結果となった。金・銀を中心とする金属ナノクラスターの効果的なポストキラル変換反応探索を行い、得られたナノクラスターの電子状態・不斉光学応答を評価する事を目的とした。まず、アキラルな配位子で修飾された金属ナノクラスターの合成からスタートするが、ポストキラル変換には配位子の高い反応性を必要とする。その様な配位子としてボロン酸に注目し、本年度は「アキラルボロン酸修飾金属ナノクラスターのポストキラル変換とその評価」を中心に研究を行った。フェニルボロン酸(Ph-B(OH)_2)は、キラル単糖類のグルコースやフルクトースなどの1,2-ジオールとエステル結合して安定なボロン酸エステルを形成する。この反応は水溶液系で行うことができるためにその応用範囲が広く、これを本研究のナノクラスター配位子反応系に適用した。その結果、メルカプトフェニルボロン酸を配位子に用いる事によって直径1.1nmの金ナノクラスターを作製することに成功した。尚、粒子径及びその分布は、リガクの佐々木博士の協力によるX線散乱測定によって決定した。このナノクラスターを用いて、キラルな糖類の一種であるフルクトースとの反応を試みたところ、表面配位子とフルクトースの結合が確認され、その結果、不斉光学応答(円二色性:CD)が現れた。またその不斉光学応答は金属コアの遷移に由来するものであった。一方、電子吸収スペクトルに変化はなく、コア自身の歪みは無いものと推察された。これは本研究代表者が提案する不斉場モデルを強く支持するものであった。更に、研究の発展を目指して磁場強度の強い永久磁石からなる磁気円二色性(MCD)測定のためのアクセサリーを購入し、現有設備のCD分散計にこれを取り付け、その測定に取りかかった。現在予備的な結果ではあるが、金あるいは銀ナノクラスターにMCD信号が現れること突き止め、これを解析中である。キラルなチオール配位子で保護された金属ナノクラスターの不斉光学応答に関する研究は最近大きな進歩を遂げ、特に、Au-S結合を巻き込んだ表面が大きな不斉光学応答の原因を担っている事が金25量体の研究を通して明らかになりつつある。しかし、一筋縄ではいかないナノクラスター系も多く、詳細なメカニズム決定には至っていない。本研究者もそのメカニズム解明に向けて研究を遂行しており、本年度は表面が反応活性を示す置換基で修飾された金属ナノクラスターのポストキラル変換を試み、その不斉光学応答の詳細を調べる事、更には、昨年度導入した磁気円二色性測定を通してクラスターが持つ電子状態の解明を試みる事を中心に研究を行った。具体的には「表面アミノ基のキラル誘導体化と円二色性応答の評価」である。アミノ基は反応性の高い官能基であり、表面にアミノ基を持つナノクラスターをキラル誘導体化すればその不斉場の影響を顕わに調べる事が可能となる。反応はエチルイソシアネートを用いたウレア結合生成による配位子化学変換を採用した。ウレア結合生成により配位子の構造は変化するが、その反応進行度の多様性によって「配位子の長さ」が種々異なった金ナノクラスターの生成が確認された。即ち、アミノ基の1つの水素原子を起点としてウレア結合が生成するとエチル基分の長さだけ表面配位子は「伸びる」。しかし反応が更に進行するとウレアの水素原子が薪たな起点となって更に配位子の長さが伸長する。この様な状況の下、様々な配位子長を持った金ナノクラスターが生成したのである。

これらをサイズ分画し、同じサイズの試料で電子スペクトルを比較するとそれらは全く同一である一方、円二色性応答には違いが見られた。これはまさしく「不斉場効果」である。また、金ナノクラスターの磁気円二色性(MCD)の測定も世界に先駆けて開始しており、ナノクラスター系に特徴的と考えられる信号得ている。キラルなチオールで保護された金属ナノクラスターの不斉光学応答に関する研究は最近大きな進歩を遂げ、構造が明確に定義されたAu25やAu38クラスターの光学活性発現の概要が明らかとなった。特に興味深いのは、その起源が表面構造の本質的不斉や、配位子の不斉場誘起効果による場合など、単純ではない点にある。本研究者も、様々なナノクラスターが示す光学活性とその表面・電子状態との関連を研究し、詳細なメカニズムを解明する事を目指して来た。本年度は、ポストキラル変換手法を用いて、シングル金属ナノクラスターが発現する不斉光学応答と、磁気円二色性(MCD)応答との相関を詳細に調べる事、高次構造化によるその変化を明らかにする事を最大の目的として研究を展開した。MCDは印加外部磁場によって分裂したナノクラスターの基底状態や励起状態間の遷移を検出するものであり、その縮退の有無等、電子状態の詳細を知る事ができる。表面がフェニルボロン酸で保護された単一サイズの金ナノクラスターを新規に作製し、これがキラルなフルクトースと反応する事を利用してポストキラル変換を試みると共に、その電子状態等をMCD測定により詳しく調べた。この系の不斉光学応答はpH可逆性を示す興味深い結果が得られた。また、MCD測定によって吸収スペクトルに隠れていた新たな電子状態が明らかとなり、これまで説明ができなかった不斉光学(CD)応答の複雑な形状を解釈する事が可能となった。この手法をAu25クラスターに適用し、その電子状態(特に励起状態)の縮退性などを初めて解明した。これは理論からの予測とは異なり、更なる検討の必要性を訴える事となった。更に、金クラスターのキラル連結をキラルジチオールによって試み、そのCD応答発現のメカニズムに迫った。その結果、本質的に不斉となり得るヘリカルな表面連結が大きな光学活性を与える可能性がある事を実験的に示した。本年度の主たる研究目的は、反応活性を持つ置換基で表面修飾された金属ナノクラスターの作製とそのポストキラル変換、そのクラスターが発現する不斉光学(CD)応答の解析とメカニズム探求、更には、磁気円二色性測定によるナノクラスターの電子状態の解明を試みる事であった。本目的の達成に向けて、キラルアミノ基を有する配位子で表面修飾された金ナノクラスターを作製、それを化学反応させて配位子の長さ(構造)を変化させる事に成功した。その試料に対してCD応答を詳細に調べた結果、クラスターのサイズが同じならば電子吸収スペクトルに「配位子の長さ」依存性はなく、CDスペクトルにのみ変化を捉える事ができた。これは本研究者が提案する「不斉場効果」の確固たる証拠である。更に、磁気円二色性の測定も行い、ナノクラスターに特徴的な信号を得ることができた。以上の成果は目的が順調に進展している事を示しており、今後もその進行の手は緩めない。24年度が最終年度であるため、記入しない。本質的には研究計画に変更はなく、金属ナノクラスターのポストキラル変換を通じてその光学活性性能発現の詳細な挙動解明を行っていく予定である。
チャネル機能発現における膜上集合・離散動態の新しい機構の解明

私達はKcsAカリウムチャネルが他の膜蛋白質と同様に細胞膜上で動き回り、その活性化状態によって集合・離散することを初めて原子間力顕微鏡で明らかにした。この仕組みを明らかにするための脂質2重膜での実験において、チャネルの向きをそろえてチャネル蛋白質を膜に組み込む方法を確立した。一方、チャネル機能に関しては新しく開発した液滴接触2重膜法によって、膜リン脂質の組成を膜内外葉毎に変えられることを利用し、チャネル活性へのリン脂質の効果を詳細に検討した。イオンチャネルは他の膜蛋白質と同様、細胞膜上を動き回り、チャネル間で集合・離散を繰り返し、同種のチャネル同志が密な集合体を形成することがある。しかし、集合・離散状態でチャネル機能がどう変化するかということに関する報告はない。その理由は、チャネル一分子の機能状態と集合・離散を同時に捉える実験手法がなかったからである。最近私達は原子間力顕微鏡により、チャネル個々のゲート開閉構造を初めて捉えることに成功し、開閉に伴って膜上で集合・離散することを発見した。本研究ではこの成果をもとに、チャネルのどのような構造変化が膜上での集合・離散を引き起こすのかその分子機構を解明する。チャネル機能発現に集合・離散が密接に関わるという未知の局面を明らかにし、チャネル生理機能の新しい調節機構を提案したい。チャネルの膜上での機能を明らかにするために、従来私たちが使ってきた脂質平面膜法を改良し、顕微鏡での観察と膜の特性を変えることのできる方法を開発した。特にこの方法では膜脂質組成をリーフレットごとに変えるだけでなく、膜の曲率を変えることができ、チャネルのゲーティングや集合・離散における機械的な影響を検討することができる。さらにさまざまな物質を使って膜の曲率を変えた実験も開始している。これとは平行して原子間力顕微鏡の高空間・時間分解能の測定を目指している。一方、計算機シミュレーション(分子動力学法)を使って、チャネルを透過するイオンの新しい振る舞いを明らかにした。チャネル蛋白質は他の膜蛋白質と同様に細胞膜上で動き回っている。私達はチャネルの活性化状態によって集合・離散することを初めて原子間力顕微鏡で明らかにした。この結果は脂質2重膜に再構成されたチャネルで行われたものであり、他の蛋白質の寄与なしに自己集合している。本研究ではこれらの成果をもとに、チャネルの機能状態がどのようにして膜上での集合・離散を引き起こすのか、その分子機構を明らかにすることが目的である。生体膜と異なり、脂質2重膜に精製したチャネルを再構成するにはチャネルの向きを揃えることが不可欠であるが、これまでに方法が確立していなかった。この方法の確立のために多くの実験を行った。またチャネル集合離散状態によってチャネル機能の差を捉えるためには原子間力顕微鏡で捉えられる事象でなければならず、様々な方法を試みてきた。その中で隣り合うチャネル機能に差があるという結果を得つつある。チャネル機能発現に集合・離散が関わる未知の局面を明らかにし、チャネル生理機能の新しい調節機構を提案したい。チャネル蛋白質の膜での配向性をそろえる方法がほぼ確立し、原子間力顕微鏡による実験は高速測定も含めさらに精度が上がっている。チャネルが膜とどう相互作用するかという点を明らかにする上で膜リン脂質の組成はきわめて重要である。私達は様々なリン脂質を使ってリポソームを形成し、膜上での集合離散状態を蛍光色素で測定した。その結果、リン脂質の組成だけではなく、膜の相分離・厚さなど膜の物理的特性によって集合離散状態が大きく変化することを明らかにした。一方、チャネル機能に関しては新しく開発した液滴接触2重膜法によって、膜リン脂質の組成を膜リーフレット毎に変えられることを利用し、チャネル活性へのリン脂質の効果を詳細に検討してきた。さらに現在この方法をさらに発展させる方法を確立し、より効率的な実験が可能となっている。私達はKcsAカリウムチャネルが他の膜蛋白質と同様に細胞膜表面上を動き回るだけでなく、その活性化状態によって集合・離散することを初めて原子間力顕微鏡で明らかにした。この仕組みを明らかにするために、チャネル蛋白質を膜に組み込むとき、チャネルの向きをそろえる方法を確立し、発表した。細胞外側が表面に向いていることをKチャネルに対するペプチド毒を作用させることによって原子間力顕微鏡で証明することができた。この方法によって、従来の膜形成法では膜にチャネルがランダムに配向していることが否定できなくなったが、集合・離散に関しては向きをそろえた場合にも起こることを確認することができた。さらに膜組成を変えたときにチャネルの集合・離散がどう変化するか、を系統的に実験した。この時、温度によって膜の動態の変化とともに、チャネルの集合状態が大きく変化することを見つけた。原子間力顕微鏡による実験は高速測定も含めさらに精度が上がった。一方、チャネル機能に関しては新しく開発した液滴接触2重膜法によって、膜リン脂質の組成を膜リーフレット毎に変えられることを利用し、チャネル活性へのリン脂質の効果を詳細に検討した。さらに膜組成を急速に変化させる方法を開発し、これにより様々な疎水性分子のチャネルに対する効果が明らかになった。チャネルの向きをそろえた膜にペプチド毒がどのように結合するか、を高速原子間力顕微鏡で捉えることに成功し、このときチャネルが集合しているときと離散しているときに結合に差が出るかを検討した。生体膜と比べて膜脂質組成を自由に変化させることのできる脂質平面膜法でチャネルとリン脂質、チャネルと膜の関係について基礎的な情報を蓄積することができた。

私達はKcsAカリウムチャネルが他の膜蛋白質と同様に細胞膜上で動き回り、その活性化状態によって集合・離散することを初めて原子間力顕微鏡で明らかにした。この仕組みを明らかにするための脂質2重膜での実験において、チャネルの向きをそろえてチャネル蛋白質を膜に組み込む方法を確立した。一方、チャネル機能に関しては新しく開発した液滴接触2重膜法によって、膜リン脂質の組成を膜内外葉毎に変えられることを利用し、チャネル活性へのリン脂質の効果を詳細に検討した。チャネルの膜上での振舞いを明らかにするための新しい方法を開発し、論文として発表した。この方法により、チャネルの機能を測定しながら膜上での集合・離散を蛍光色素などで観察することができる。特にこの方法では膜の曲率を変化させることができるので、チャネルのゲーティング状態と膜上空間分布の関係を明らかにすることができる。またチャネルの膜上のオリエンテーションを制御する方法を開発しつつあり、これを原子間力顕微鏡(AFM)で高分解能で観察している。一方、チャネルの膜上での動態は高速AFMを適用することにより、従来の観察よりはるかに時間分解能の高い動態を捉えられる。さらにチャネルの開ゲート状態におけるイオン透過特性の特徴を明らかにすることに成功し、論文を投稿中である。チャネルが集合離散したときにどのようなチャネル機能の差が見られるか。これは電気生理学的方法では明らかにすることが難しい。膜に複数個のチャネルが存在するとき、通常すべてのチャネルが同一のゲーティングキネティクスを示すという前提で解析されるからである。これに対して原子間力顕微鏡では個々のチャネルが見えるので、機能状態を明らかにする方法を開発中である。この方法は従来の方法では捉えられないチャネル個々の状態変化を一分子で記録することのできる新しい方法として期待できるものである。28年度が最終年度であるため、記入しない。生理学一般AFMの測定が高分解能になるにしたがって、さまざまな実験上の困難が現れてきた。しかしこの課題を解決することが本プロジェクトのブレークスルーにつながるはずであり、集中して実験を進める。これらの問題は基本的なリポソーム作成法や脂質平面膜法、さらにチャネル蛋白への変異導入などの基本的技術を組み合わせることによって解決の糸口をたどりつつある。本年度は平行して進めている技術的課題を克服し、新しい結果を得ることである。これによって来年度の統合的過程に進めることができる。
デルタ堆積粘性土の力学特性評価法に関する研究

ベトナム側研究者とともに行ったメコンデルタ2箇所における原位置調査、並びに採取土に対する室内試験の結果、以下のような知見を得た。即ち、(1)メコン川の大流量、大量の土砂供給、東シナ海の大きな潮汐変動等、要因の影響を受けるメコンデルタの発達過程は非常にダイナミックである。したがって、それらの相対的な影響が異なるメコン川の本流(Haw River)の堆積作用によって形成されたCan Tho粘土とメコン川流域とは異なる蛇行河川であるVan Co Tay川沿いに堆積したTan An粘土とでは、物理、力学特性に大きな差がある。(2)C^<14>の年代測定によるとCan Thoの19.5mの深さのTan Anの6.5mの深さの年代がほぼ同じであり、またCan Thoでは深さ方向に堆積速度が大きく異なり、特に深さ5mから14mの堆積速度が他の深さの10倍近くと評価された。この深さは低塑性粘土、薄い砂層が混じった層の混在が見られた箇所である。このような不均質の把握のためにはCPTなどの連続的なサウンディングが必要不可欠である。(3)Can Tho粘土のように低塑性粘土の場合は、サンプリングの乱れを受けやすく、ベトナムの標準的なShelby式オープンサンプリグでは高品質の試料採取は難しく、日本標準方法である固定ピストン式シンフォールサンプリングが望まれる。しかし、サンプリング方法以外にも、運搬、試料準備過程で、不適切な扱いのために大きな乱れが試料に生じており、その改善が必要である。(4)メコンデルタには広範な種類の軟弱地盤が広がっており、その力学特性解明のためには、良質なサンプリングと室内試験、現場試験を組み合わせた継続的な研究が望まれる。メコンデルタ地帯の土質情報については,超軟弱から固い粘土まで,さらには,有機土の有無に関係なく,従来の研究結果と同様なelog pが報告されていることがある.この原因として,サンプリング法またはその後の室内試験方法が適切に行われていないことが挙げられる.そこでベトナムの首都ホーチミン市から南西へ車で1時間ほどのTan an市にて,ベトナム式(シェルビー式サンプラー)と日本式(固定シンウォール式サンプラー)にてサンプリングを行った.その後,日本に持ち帰り,港湾空港技術研究所にて室内試験を行い,サンプリング形式の違いが粘土の物性および強度・変形特性に与える影響を調べた.実施した試験は一軸試験,標準圧密試験,定ひずみ速度圧密試験である.また,一軸試験では,供試体作成後にサクションを測定している.その結果,Tan An粘土は非常に軟弱(IP=70-90),高塑性・高圧縮粘土であったシェルビー式サンプラーと固定ピストン式では,35m程度の浅い試料においてはあまり差が見られなかった.しかし,57mの深い位置で採取した試料においては,サンプラー間に差が見られた.全体的にシェルビー式の方が強度・圧密特性の様々な値でばらつきが大きく,固定式と比較して乱れが大きい結果となった.しかし,シェルビー式を用いた場合でも,固定式と同程度の品質を得られる場合もあり,シェルビー式を使用して品質安定性の向上のためには,施工監理を含めてさらなる検討が必要である.平成17年度は、ホーチミン市から南西約160kmの位置にあるカントー市、メコン川の本流(Haw River)の河岸沿を調査地とした。この調査地はメコンデルタの中心部に位置し、軟弱層が厚く堆積している。土質は平成16年度の調査地のTan Annの地盤のものとは大きく異なり、比較的低塑性な典型的なデルタ堆積粘土である。

この地点において昨年度と同様、ベトナム式(シェルビー式サンプラー)と日本式(固定シンウォール式サンプラー)にてサンプリングを行い、港湾空港技術研究所にて室内試験を行い,サンプリング形式の違いが粘土の物性および強度・変形特性に与える影響を調べた.実施した試験は一軸試験,標準圧密試験,定ひずみ速度圧密試験、K_0圧密非排水せん断試験、定体積一面せん断試験である.また、サンプリングと合わせて三成分コーン貫入試験、ベーン試験等の原位置試験も実施した。その結果、以下のようなことが明らかとなった。(1)浅い部分と深い部分で力学特性、乱れの影響等かなり異なり、浅部の軟弱地盤は鋭敏で乱れを受けやすく、良質なサンプリングが必須である。(2)洪水等の影響により深さ方向の土質性状が局所的に変化し、薄い砂層や非常に低塑性な土の層が混在し、そのため乱れの影響の受けやすさも局所的であり、サンプリング間隔が大きすぎると誤った地盤特性評価につながる可能性もある。従って、地盤調査においては原位置試験とサンプリングを組み合わせて慎重な検討が必要となる。(3)ベーン強度を使うと浅部のコーン係数N_<kt>が10程度で、深部は14弱となるのに対して、一軸強度を使うと傾向がその逆となった。この原因としては浅い部分のサンプリング試料の品質の問題が考えられるが、この他に低塑性な土におけるベーン強度に及ぼす排水の影響等もその一因に挙げられる。平成18年度は、過去2年間に行ったメコンデルタ2箇所の原位置調査について、堆積年代測定、圧密試験等の追加試験を含めて詳細に検討した。その結果、以下の事が明らかになった。(1)メコン川の大流量、大量の土砂供給、東シナ海の大きな潮汐変動等、要因の影響を受けるメコンデルタの発達過程は非常にダイナミックである。したがって、それらの相対的な影響が異なるメコン川の本流(Haw River)の堆積作用によって形成されたCan Tho粘土とメコン川流域とは異なる蛇行河川であるVan Co Tay川沿いに堆積したTan An粘土とでは、物理、力学特性に大きな差がある。(2)C^<14>の年代測定によるとCan Thoの19.5mの深さのTan Anの6.5mの深さの年代がほぼ同じであり、またCan Thoでは深さ方向に堆積速度が大きく異なり、特に深さ5mから14mの堆積速度が他の深さの10倍近くと評価された。この深さは低塑性粘土、薄い砂層が混じった層の混在が見られた箇所である。(3)薄いサンドシームを縞状に含む粘土のVoid Index(I_<v0>)はSedimentary Compression Line(SCL)を大きく上回っており、一般的に報告されている自然堆積粘土とは大きく異なる。これは、独立に存在する砂と粘土を混合練り返すことにより物理特性を評価することによるものであり、この種の土の物理特性、液性指数の評価、その解釈と利用には十分な注意が必要である。(4)上記粘土を単に粘土として扱うと、非常に乱れやすい鋭敏な張軟弱な土と評価されてしまい、極めて高価な地盤改良等の導入が必要という結果になることが考えられる。しかし、砂と粘土の中間的な性質を持つ中間土として扱えば、典型的な粘土より工学的には好ましい力学特性を発揮することが期待される。そのためにもより正確な地盤調査法の適用が必須である。
筋萎縮性側索硬化症とTDP-43：その始まりと広がり方 の分子神経病理学的解明

TDP-43がエクソン6内で複数の選択的スプライシングを行い、その量を自己調節していることを見出した。ALS患者脊髄では、この自己調節に関係するTDP-43 mRNAの比率が増加していることを突き止め、このバリアントがTDP-43陽性の封入体と共局在することを確認した。このことから、この異常蛋白がALS病変のはじまりとなる可能性が示唆された。また、新たなALS側頭葉皮質におけるTDP-43病理像の検討では、3つのタイプ(1, 2a and 2b)の存在が示された。タイプ2bには臨床病理学的特徴が認められ、これらの個々の群は独立したサブタイプであり、かつ、その病理像の間に移行はないと考えられた。筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS)は、成人を侵す神経変性疾患である。病理学的には、残存する下位運動ニューロンの胞体内に出現するユビキチン陽性の封入体が病因に直結する所見とされてきた。2006年、この構成成分として核蛋白であるTDP-43が同定された。我々は孤発性及び家族性ALSを、詳細にTDP-43による免疫組織化学的検証を行い、本症が運動神経のみならずグリア細胞を含め広汎な広がりをもつ疾患であること、さらにTDP-43の遺伝子変異を発見し本症にTDP-43が根本的に関わっていることを示した。しかし、「TDP-43の細胞レベルにおける核からの消失と細胞質での凝集体形成、及びそれが引き起こす細胞死の系統(運動神経系)選択性について」は、まだ不明である。我々は、ALSの細胞レベルでのTDP-43病理と系統選択性の分子病態機序を明確にすることを目的とした。まず,本年度は、患者剖検組織におけるTDP-43異常スプライシング産物の病理学的意義の検証を行った。一般に病態に関係する不溶性封入体の形成とその成長には、はじめに“種"が形成されることが重要とされる(シード仮説)。しかし、この最初のシードが明らかでない。我々は、TDP-43がエクソン6内で2カ所にイントロンを形成する選択的スプライシングを行い、その量を自己調節していること、このスプライシングの過程で生じる異常蛋白がシードとなる可能性を明らかとした。我々は、これまでTDP-43がエクソン6内で2カ所にイントロンを形成する選択的スプライシングを行い、その量を自己調節していること、このスプライシングの過程で生じる異常蛋白がシードとなる可能性を明らかとした。本年度はこのタンパク質特異的抗体を用いて、凝集体の中にこのタンパク質が存在することを明らかとした。計画通りに、スプライシング多様体の同定に成功している。またパラフィン切片を用いたRNA解析方法も確立してた。ほぼ順調に病理変化を説明する分子病態機序を明らかとしつつある。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、成人を侵す神経変性疾患である。我々は孤発性及び家族性ALS剖検例について免疫組織化学的検証にて、本症が運動神経のみならずグリア細胞を含め広範な広がりをもつ疾患であること、さらにTDP-43の遺伝子変異を発見し、本症の発症にTDP-43が直接的に関わっていることを示した。本研究では、これまでの研究をさらに発展させ、ALSの細胞レベルでのTDP-43病理のはじまりと系統的選択性(運動神経の細胞死)の分子病態機序を明確にすることを目的とした。研究成果として、我々は、TDP-43がエクソン6内で複数の選択的Spを行い、その量を自己調節していることを見出した。驚いたことに、ALS患者脊髄では、この自己調節に関係する、正常とは異なるC末を有するTDP-43 mRNA(バリアント)の比率が増加していることを突き止めた。このバリアントがALS患者前角細胞にて同産物がTDP-43陽性の封入体と共局在することを確認した。

このことから、この異常蛋白がALS病変のはじまりとなる可能性が示唆された。近年、ALSの原因タンパク質はliquid phaseという特殊なタンパク特性を持つことが指摘されている。本年度はこのバリアント産物がこのようなタンパク特性を持つかを精製タンパク質を用いて検証したが、本バリアントにはこのような特性は見いだせなかった。さらに、このシードの細胞毒性を遺伝子改変動物を作成し検証した。本バリアントの導入魚類では毒性を示唆する所見を得たが、マウスでは、12ヶ月例で、神経細胞死を認めなかった。本バリアントの本質的な意義について、引き続き検証が必要である。TDP-43がエクソン6内で複数の選択的スプライシングを行い、その量を自己調節していることを見出した。ALS患者脊髄では、この自己調節に関係するTDP-43 mRNAの比率が増加していることを突き止め、このバリアントがTDP-43陽性の封入体と共局在することを確認した。また、新たなALS側頭葉皮質におけるTDP-43病理像の検討では、3つのタイプ(1, 2a and 2b)の存在が示された。タイプ2bには臨床病理学的特徴が認められ、これらの個々の群は独立したサブタイプであり、かつ、その病理像の間に移行はないと考えられた。計画通りに、スプライシング多様体の同定に成功している。またパラフィン切片を用いたRNA解析方法も確立している。今後、更に本方法を発展させる予定である。患者剖検組織において、TDP-43異常スプライシング産物のmRNAとTDP-43病理像との関連を検討する。方法として免疫組織化学法、レーザーマイクロダイセクション法とDroplet digital PCR法を用いる。さらにQunatiGene; ViewRNA法を用い、スプライシングバリアントを特異的に認識するin situ hybridization probeとその定量方法の開発を試み、TDP-43陽性封入体と本バリアントmRNAとの関連を可視化して提示し、mRNAレベルでの変化がTDP-43病理像に先行するか、否かの検証を継続する。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経病理学免疫組織化学的及びin situ hybridization法にて、次の2点を明確にする。A)本異常バリアントmRNAの増加がTDP-43陽性封入体の形成に先行するか否かを検証する:単一細胞でバリアントmRNAとTDP-43陽性封入体、核外移動の関連を検証する。まず、TDP-43とSpバリアント特異抗体での2重免染により、両者の関係を明確にする。次に、患者剖検組織において、一細胞レベルでのTDP-43異常スプライシング産物のmRNAとTDP-43病理像との関連を検討する。さらにQunatiGene 174; ViewRNA法を用い、スプライシングバリアントを特異的に認識するin situ hybridization probeとその定量方法の開発を試み、TDP-43陽性封入体と本バリアントmRNAとの関連を可視化して提示し、mRNAレベルでの変化がTDP-43病理像に先行するか、否かを検証する。
神経細胞分化成熟因子としての一酸化窒素の作用;超微量技術による解析

NOS反応の生成物のNADP^+を増幅し蛍光測定する超微量測定法を新たに開発し,凍結乾燥小脳組織切片微小試料のNOS活性が測定し,生後発達するラット小脳の各層(外顆粒層,分子層,内顆粒層)の活性が,小脳の発育に伴う顆粒細胞の分化成熟に並行して増加して行くことを定量的に示した.また神経芽細胞層である小脳外顆粒層にNOS活性が発現している事を見い出した.また上述の微小層試料の蛋白質を10-20mmの範囲で電気泳動して,合蛋白質のバンドに分離するmicro-electrophoresisを工夫し,NOSの各isoform(nNOS,neuronal NOS;iNOS,endothelial NOS;eNOS,inducible NOS)の抗体をを用いて染色して抗原を検出するmicro-immunoblot法を工夫した.そしてラット小脳の分子層や(内)顆粒層に多量のnNOSと少量のeNOSが発現されている示し,また神経芽細胞層である外顆粒層にも少量のnNOSと多量のeNOSが発現している事を見い出した.iNOSはどの層にも検出出来なかった.さらに従来のRT-PCR法をスケールダウンして,マウスnNOSmRNAの定量的micro-RT-PCR法を開発した.同時にPCRの酵素学的Kineticsを考案し,この方法を応用して,ラット小脳外顆粒層がnNOSmRNAを発現している事を見い出した.成熟ラットと生後3日のラットにN^G-nitroarginine(NArg,NOSの特異的阻害剤)を腹腔内投与すると,成熟ラットの小脳各層のNOS活性は部分阻害されるが,層構造には変化が見られない.しかし生後3日ラットの小脳各層のNOS活性は完全に阻害され,層形成が著しく乱れて顆粒細胞は萎縮する.従って分化成熟する小脳の層形成過程に置いて,NOは一種の栄養因子又は形成過程の一部を制御する因子として作用すると考えられた.並行して生後9日目の分化しつつあるラット小脳から顆粒細胞群を分離して培養し,nNOS活性は顆粒細胞の成熟と共に増加し,nNOSmRNA発現も並行して増加するこ事を見い出した.また生後9日目のマウス小脳の500μmの生の切片を切り出して培養し,位相差顕微鏡下で層構造が形成され顆粒細胞が分化成熟する過程を見ることが出来た(organotypic culture).だがこの切片の層形成は一様でなく,生化学的に分析出来る微小凍層試料の調製には適さなかった.先ずラットのnNOS(neuron特異的)-mRNAの定量的RT-PCRを開発した.upstreamprimer(1663-1682)とdowntream primer(2335-2355)を用いると,マウスと異なりラットのcDNA fragmentが制限酵素BamHIの作用塩基配列(GCG↓C,2088)を持つ事を利用し,既知量のマウスmRNAを内部標準としてラットmRNA試料に加えてRT-PCRを行った.PCR後BamHIを生成されたcDNAに作用させて,523bpのラットcDNA fragmentを切り出し,切れない693bpのマウスcDNAfragmentと比較して定量した.生後発達成熟するラット小脳の外顆粒層(神経芽細胞層)は既にNOS活性を持ち,生後Nitroarginine(NArg,NOSの特異的阻害剤)の投与により,外顆粒神経芽細胞の分化成熟が阻害されることを既に見いだしていた.この所見に基づき,外顆粒層にnNOS,eNOS(血管内皮特異的),iNOS(誘導性,グリア細胞に存在)が発現されていることを,既に開発したmicro-Western blot法を用いて証明した(加藤,中山).更にnNOSのmRNAを外顆粒層に始めて見い出した(加藤,井上).並行して小脳顆粒細胞の初代培養を行い,生後7日(P7)の小脳から培養すると2週間にわたってnNOSのmRNAが増加し,生成蛋白質としてはcytosoleに可溶性nNOSが成熟小脳に比べて高濃度に見い出された(井上,加藤).これらの結果は,外顆粒層に於いてneuronにより生成されたNOがautoacrine的に働いて,小脳顆粒細胞の分化成熟を支持していることを示している.またP7小脳切片のorganotypic cultureの系を確立したが,小脳切片の表面の層(厚さ約200μm)にのみ細胞分化と層形成が見られ,500μm程度の切片が培養に適当であると考えられる(中山,加藤).RT-PCRを確立するのに時間がかかり,micro RT-PCRの開発は次年度回しとした.NOS反応の生成物のNADP^+を増幅し蛍光測定する超微量測定法を新たに開発し,凍結乾燥小脳組織切片微小試料のNOS活性が測定し,生後発達するラット小脳の各層(外顆粒層,分子層,内顆粒層)の活性が,小脳の発育に伴う顆粒細胞の分化成熟に並行して増加して行くことを定量的に示した.また神経芽細胞層である小脳外顆粒層にNOS活性が発現している事を見い出した.

また上述の微小層試料の蛋白質を10-20mmの範囲で電気泳動して,合蛋白質のバンドに分離するmicro-electrophoresisを工夫し,NOSの各isoform(nNOS,neuronal NOS;iNOS,endothelial NOS;eNOS,inducible NOS)の抗体をを用いて染色して抗原を検出するmicro-immunoblot法を工夫した.そしてラット小脳の分子層や(内)顆粒層に多量のnNOSと少量のeNOSが発現されている示し,また神経芽細胞層である外顆粒層にも少量のnNOSと多量のeNOSが発現している事を見い出した.iNOSはどの層にも検出出来なかった.さらに従来のRT-PCR法をスケールダウンして,マウスnNOSmRNAの定量的micro-RT-PCR法を開発した.同時にPCRの酵素学的Kineticsを考案し,この方法を応用して,ラット小脳外顆粒層がnNOSmRNAを発現している事を見い出した.成熟ラットと生後3日のラットにN^G-nitroarginine(NArg,NOSの特異的阻害剤)を腹腔内投与すると,成熟ラットの小脳各層のNOS活性は部分阻害されるが,層構造には変化が見られない.しかし生後3日ラットの小脳各層のNOS活性は完全に阻害され,層形成が著しく乱れて顆粒細胞は萎縮する.従って分化成熟する小脳の層形成過程に置いて,NOは一種の栄養因子又は形成過程の一部を制御する因子として作用すると考えられた.並行して生後9日目の分化しつつあるラット小脳から顆粒細胞群を分離して培養し,nNOS活性は顆粒細胞の成熟と共に増加し,nNOSmRNA発現も並行して増加するこ事を見い出した.また生後9日目のマウス小脳の500μmの生の切片を切り出して培養し,位相差顕微鏡下で層構造が形成され顆粒細胞が分化成熟する過程を見ることが出来た(organotypic culture).だがこの切片の層形成は一様でなく,生化学的に分析出来る微小凍層試料の調製には適さなかった.既に開発したmicro-RT-PCRを改良し,NOS-isoform mRNAの1コピーを測定可能とした.先ず通常の1/4の6.3mg/250μlのoligo-dT cellulose懸濁液をmicro-spin columnに加え,その底に2×5mmのpelletを形成した.guanidium thiocyanateとN-lauroyl sarcosine溶液50μlで凍結乾燥組織切片または一次培養神経細胞から抽出した1コピーのmRNAを加えたpelletを,よくvortexしてpoly A mRNAをcelluose粒子に結合させ,続いて十分に洗浄した.50μlの1ng poly[dA]30merを含む10mM Tris-HCl,pH7.5-1 mMEDTA溶液を加えてよくvortexした後,65°Cで5分加熱してから15,000rpmで10秒室温で遠心し,更に50μlの同じ溶液でcellulose粒子を洗った洗浄液を加えて,25μgのglycogentとmRNAを共沈させ,その沈殿に50μlのRT-PCR反応液を加え29-32cyclesの増幅を行った.この範囲のcyclesで1コピーが測定出来る事は,100ngのラット脳total RNAを10μlのRT反応液に加え倍々希釈し,40μlのPCR反応液を加えて反応させ,希釈系列の或倍数でagarose gelのbandが消える直前の希釈倍数の,bandを十分測定出来る最小cycles数を用いて昭栄した.この1コピーのPCRの確立と並行して,PCRの増幅率を計算する理論式を工夫した(詳細省略).