hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GFP遺伝子トランスジェニックラットによる下垂体濾胞星状細胞の生物学的機能解析

脳下垂体前葉に存在する濾胞星状細胞はファゴサイトーシス能を有しており、下垂体前葉内の死細胞を取り込み細胞内で分解し除去などを行っていると考えられている。またホルモンは微量で効果を発揮するためホルモン分泌は厳密に調節されていることは良く知られているが、細胞内で産生されたホルモンが直接分解されることで下垂体からの分泌抑制をする経路についてはよくわかっていない。そこで細胞質内分解系として知られているオートファジーに注目した。オートファジーは細胞内に二重膜構造体であるオートファゴソームによって基質をとり囲み、その後リソソームと融合することで細胞質成分を分解するための経路である。私は前年度までの研究によってPSI-BLASTを用いた検索から新規哺乳類遺伝子Atg14を発見し、その機能解析を行ってきた。その結果、Atg14はオートファジーに必須であることが知られているクラスIII PI3キナーゼであるVps34とBeclin1と共に複合体を形成していることがわかった。興味深いことにVps34-Beclin1と複合体を形成することが知られているUVRAGとAtg14は別々の複合体を形成していることがわかった。さらにAtg14はオートファゴソームの前駆体である隔離膜に特異的に局在しオートファゴソーム形成に関わっていること、UVRAGは後期エンドソームに局在することがわかった。特に注目すべきは、今まで隔離膜マーカーとして使用されているAtg16よりも早い段階で隔離膜と思われる構造体にAtg14が局在できることがわかった。このことはオートファゴソーム膜の起源の解明に繋がると考えられる。これらのことをまとめ昨年論文を発表した(Itakura et al.,MBC,2008)。またさらにこの論文の短総説も発表している(Itakura et al.,Autophagy 2009)。これら哺乳類オートファジーの機能を解明することで下垂体細胞におけるタンパク質分解系の意義の解明にも期待できる。まず始めに下垂体前葉の濾胞星状細(FS)細胞の研究のためにFS細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラット(tg)を作成するため、FS細胞特異的に発現しているS100β遺伝子のプロモーターにGFPを繋げたコンストラクトを作成しtgを作成した。Tgラットの下垂体全葉のGFP発現がFS細胞特異的であるかを調べるために抗S100β抗体で免疫染色を行った。その結果、どのラインでもGFP発現細胞とS100β細胞は同一であることが確認できた。またGFP発現細胞は抗ホルモン抗体で染色される細胞とは異なった。このことはイントロン1によりFS細胞特異的な発現ができたのだと思われる。次にtgの下垂体前葉の細胞を酵素処理により分離し、セルソーターによってGFP発現細胞を分離、培養することに成功した。この分離したGFP^+細胞はFS細胞の新しい実験系として用いることができる。またGFPは組織の抗体では浸透し難い深部情報を得るのに効果的であり、下垂体前葉切片からlaser scanning microscopyを用いてGFP発現細胞の立体構造の構築によりGFP発現細胞が下垂体内で突起同士を繋ぐことによりネットワークを形成していることも解析できた。このFS細胞特異的にGFPを発現するラットが得られた事から下垂体からFS細胞を単離できることが可能になった。この細胞を使用してFS細胞の新しい機能を解明できることが期待される。現在このtgを用いてFS細胞の分化能、食作用の変化、下垂体内での形態的な変化などを調べている。なお、この動物は同じくS100βを特異的に発現する脳のアストロサイトなどを分離するのにも効果的であり、今後種々の研究に役立つことが期待できる。また、本研究はEndocrinology. 2007 Apr;148(4):1518-23に発表した。下垂体においてホルモンを産生しない濾胞星状細胞(FS細胞)の生理学的な役割は未だにわかっていないが、FS細胞がアポトーシスした細胞を食作用によって取り込んでいることが観察されている。しかし電子顕微鏡、組織染色による観察のみであるため、in vitroの実験的な証拠はまだ得られていない。そこで昨年私が作成したS100β産生細胞特異的にGFPを発現するトランスジェニックラット(S100tgラット)を使用した(Itakura, et. al.,2007)。なぜならこのS100tgラットの下垂体内においてFS細胞は特異的にGFPを発現しているため下垂体の初代培養から生きたまま濾胞星状細胞を識別することが可能であり、in vitroにおける食作用を検討できるからである。下垂体初代培養のFS細胞の動態を観察したところ、萎縮した細胞がFS細胞の突起に接し、FS細胞内に取り込まれた。in vitroにおいて下垂体初代培養のFS細胞が食作用を持っていることを初めて証明できた。また、FS細胞は、伸ばした細胞突起の先端部から死細胞を取り込むことが確認された。しかしながらその食作用の調節機構もわかっていない。FS細胞の食作用を調節する物質の存在の有無を検討した。GH産生細胞株であるMtT/S細胞、ACTH産生細胞株であるAtT20細胞の培養上清をFS細胞株TtT/GF細胞に添加すると、マイクロスフィアビーズの取り込みが抑制されることが明らかになった。FS細胞の食作用は、ホルモン産生細胞から分泌される何らかのシグナルを介して調節されていることが示唆された。

一つの可能性として、正常なホルモン産生細胞は、FS細胞の食作用を抑制する因子を放出し、一方でアポトーシスなどにより細胞死するホルモン産生細胞は、FS細胞の食作用を促進する因子を放出することが考えられる。その因子を同定するためにさらなる解析が必要である。脳下垂体前葉に存在する濾胞星状細胞はファゴサイトーシス能を有しており、下垂体前葉内の死細胞を取り込み細胞内で分解し除去などを行っていると考えられている。またホルモンは微量で効果を発揮するためホルモン分泌は厳密に調節されていることは良く知られているが、細胞内で産生されたホルモンが直接分解されることで下垂体からの分泌抑制をする経路についてはよくわかっていない。そこで細胞質内分解系として知られているオートファジーに注目した。オートファジーは細胞内に二重膜構造体であるオートファゴソームによって基質をとり囲み、その後リソソームと融合することで細胞質成分を分解するための経路である。私は前年度までの研究によってPSI-BLASTを用いた検索から新規哺乳類遺伝子Atg14を発見し、その機能解析を行ってきた。その結果、Atg14はオートファジーに必須であることが知られているクラスIII PI3キナーゼであるVps34とBeclin1と共に複合体を形成していることがわかった。興味深いことにVps34-Beclin1と複合体を形成することが知られているUVRAGとAtg14は別々の複合体を形成していることがわかった。さらにAtg14はオートファゴソームの前駆体である隔離膜に特異的に局在しオートファゴソーム形成に関わっていること、UVRAGは後期エンドソームに局在することがわかった。特に注目すべきは、今まで隔離膜マーカーとして使用されているAtg16よりも早い段階で隔離膜と思われる構造体にAtg14が局在できることがわかった。このことはオートファゴソーム膜の起源の解明に繋がると考えられる。これらのことをまとめ昨年論文を発表した(Itakura et al.,MBC,2008)。またさらにこの論文の短総説も発表している(Itakura et al.,Autophagy 2009)。これら哺乳類オートファジーの機能を解明することで下垂体細胞におけるタンパク質分解系の意義の解明にも期待できる。
高機能固体触媒の精密設計及び素反応制御を基盤とした高難度環境調和型分子変換の開発

本研究では、次世代において必要不可欠であるものの未だ発展途上にある、固体触媒による環境調和型液相有機合成の普及のため、「高機能固体触媒の精密設計及び素反応制御を基盤とした高難度環境調和型分子変換の開発」を研究課題と定めた。(1)固体触媒の精密制御、(2)素反応制御及び反応機構解明、(3)ファインケミカル及びバルクケミカルにおける高難度精密分子変換反応の開発、といった3つのパートを連関させ、上記課題の達成を目指している。第二年度である平成30年度においては、「LDH触媒による末端アルキンの位置選択的形式的ヒドロアシル化反応」を確立した。ヒドロアシル化反応とは、アルキンやアルケンを用いて、アルデヒドを原子効率100%でケトンへ変換する有用な反応である。従来のRh触媒などを用いるヒドロアシル化反応では、高価な金属種の使用、脱カルボニル反応の併発、金属アシル種の挿入反応時の位置選択性制御などが課題であった。本研究では、従来の反応経路とは大きく異なる、末端アルキンの求核付加・プロトトロピーを経る反応経路を開拓することで、遷移金属フリーな末端アルキンの位置選択的形式的ヒドロアシル化反応を行った。上記反応経路に対する触媒作用の発現が期待できる材料として、イオン性・塩基性を有し、構成金属比や層間アニオン種のチューニングが可能なLayered Double Hydroxide (LDH)に着目した。実際に、他の固体触媒では目的のヒドロアシル化反応が全く進行しなかったのに対し、Mg3Al-CO3 LDHでは高収率で進行することを見出した。種々の検討から、LDHのイオン性・塩基性によるアルキニル求核種形成が本反応を進行させる鍵であることが示唆された。本研究成果により、固体触媒特有の触媒系である固体自体のバルク・表面の化学的特性が、新しい高難度反応開発に有効なことを示せたと考えている。研究実績の概要で記した、末端アルキンの遷移金属フリーな位置選択的形式的ヒドロアシル化反応は、固体触媒特有の触媒系を有するLDHを用いることで達成できた反応である。従来の有機反応は分子性の均一系触媒においてほぼすべて開発されているが、本研究成果は従来の反応開発とは異なり、固体自体のバルク・表面の化学的特性を利用して反応開発に成功した。均一系触媒にはない固体触媒の特性が新しい有機合成に効果的であることを示すことができたため、固体触媒による液相有機合成の普及に対して進展を見せたと考えている。また、研究実績の概要で記した個別の3つのパートにおいても、担体としても使用可能な種々の固体材料の調製手法・解析手法をある程度確立できた点、反応機構の解明を経て固体材料と有機分子の新しい相互作用を見出した点、本研究成果を経てアルキンの求核付加を経る他の高難度分子変換への足掛かりをつかんだ点など、予想以上の進展があった。以上より、総合的な観点から当初の計画以上に進展したといえる。さらなる固体触媒による環境調和型液相有機合成の普及には、固体触媒にしか存在しない特性を利用して、より影響力のある高難度分子変換を行う必要がある。その一例として、当初の計画にあった脱水素型カップリングかつ選択性逆転を伴う反応であり、分子状酸素を酸化剤とした環境調和型反応である、第三級アミンの特異な選択的アルキニル化反応を行う予定である。また、これまでに得られた知見を総合し、バルクケミカルへの応用も指向して、酸素化反応や水素分子を同時に生成するアクセプターレス脱水素反応など、さらに反応の幅を広げて反応開発・触媒開発を進めていく。本研究では、次世代において必要不可欠であるものの未だ発展途上にある、環境調和型の固体触媒による液相有機合成の普及のため、「高機能担持金属触媒および素反応の精密制御による高難度分子変換反応の開発」を研究課題とした。(1)担持金属触媒の精密制御、(2)素反応制御及び反応機構解明、(3)ファインケミカル及びバルクケミカルにおける高難度精密分子変換反応の開発、といった3つのパートを連関させ、上記課題の達成を目指している。初年度である本年度においては、「CeO2担持Pd-on-Au二元金属ナノ粒子触媒による選択性逆転を伴うオーロン合成」を確立した。オーロンは自然界に存在するフラボノイドの一種であり様々な生物活性を示すが、特殊な酵素によって生合成され、限られた種類しか存在しない。そのため、種々のカルコンを基質とした触媒的オーロン合成は、薬理的応用に高価値であるものの、自然界の酵素では達成できず、従来の化学的な触媒においても高難度な選択性逆転を引き起こす必要があるため実現できていなかった。本研究では、(1)担持金属触媒の精密制御として、固体触媒の構成成分である、a)担持金属種、b)担体、c)助触媒、に加え、d)モルホロジーを制御し、CeO2担持Pd-on-Au二元金属ナノ粒子触媒を設計した。実際に、Au、Pdの順にCeO2上に析出沈殿法で金属種を担持させた後、焼成処理を行うことで、設計通りの触媒を調製した。次に、(2)素反応制御として、上記設計にそれぞれ、a)オーロン合成触媒、b)フラバノン生成阻害、c)オーロン合成活性の向上、d)フラボン生成阻害、という役割を担わせた。また、種々のコントロール実験により反応機構の解明も行った。結果として、(3)高難度精密分子変換反応の一種である選択性逆転を伴うオーロン合成を達成した。

研究実績の概要で記した選択性逆転を伴う触媒的オーロン合成は、従来の酵素や触媒では達成できなかった反応である。機能集積型の高機能担持金属触媒を設計し、素反応を精密に制御するという、固体触媒の特長を存分に活かすことで、初めて本研究において達成することができた。従来のほぼすべての有機反応は均一系触媒において開発されており、液相有機合成における固体触媒の研究は、従来反応を固体触媒で行う、活性を向上させることを目的とするものが大半である。本研究成果は従来のそうした研究とは一線を画し、固体触媒を精密に設計することで未踏の新奇反応を開発できるという概念実証を行った点で、固体触媒による液相有機合成の普及に対して大きな進展を示せたと考えている。また、個別のパートにおいても、幅広く担持金属触媒を精密制御するための調製手法・解析手法をある程度確立できた点、反応機構の解明を経て当初計画していなかった他の反応へ応用できる可能性を見出した点、上記オーロン合成だけでなく他の高難度分子変換反応の足掛かりをつかんだ点など、当初の計画以上の進展があった。以上より、総合的な観点から当初の計画以上に進展しているといえる。本研究では、次世代において必要不可欠であるものの未だ発展途上にある、固体触媒による環境調和型液相有機合成の普及のため、「高機能固体触媒の精密設計及び素反応制御を基盤とした高難度環境調和型分子変換の開発」を研究課題と定めた。(1)固体触媒の精密制御、(2)素反応制御及び反応機構解明、(3)ファインケミカル及びバルクケミカルにおける高難度精密分子変換反応の開発、といった3つのパートを連関させ、上記課題の達成を目指している。第二年度である平成30年度においては、「LDH触媒による末端アルキンの位置選択的形式的ヒドロアシル化反応」を確立した。ヒドロアシル化反応とは、アルキンやアルケンを用いて、アルデヒドを原子効率100%でケトンへ変換する有用な反応である。従来のRh触媒などを用いるヒドロアシル化反応では、高価な金属種の使用、脱カルボニル反応の併発、金属アシル種の挿入反応時の位置選択性制御などが課題であった。本研究では、従来の反応経路とは大きく異なる、末端アルキンの求核付加・プロトトロピーを経る反応経路を開拓することで、遷移金属フリーな末端アルキンの位置選択的形式的ヒドロアシル化反応を行った。上記反応経路に対する触媒作用の発現が期待できる材料として、イオン性・塩基性を有し、構成金属比や層間アニオン種のチューニングが可能なLayered Double Hydroxide (LDH)に着目した。実際に、他の固体触媒では目的のヒドロアシル化反応が全く進行しなかったのに対し、Mg3Al-CO3 LDHでは高収率で進行することを見出した。種々の検討から、LDHのイオン性・塩基性によるアルキニル求核種形成が本反応を進行させる鍵であることが示唆された。本研究成果により、固体触媒特有の触媒系である固体自体のバルク・表面の化学的特性が、新しい高難度反応開発に有効なことを示せたと考えている。研究実績の概要で記した、末端アルキンの遷移金属フリーな位置選択的形式的ヒドロアシル化反応は、固体触媒特有の触媒系を有するLDHを用いることで達成できた反応である。従来の有機反応は分子性の均一系触媒においてほぼすべて開発されているが、本研究成果は従来の反応開発とは異なり、固体自体のバルク・表面の化学的特性を利用して反応開発に成功した。
非小細胞肺癌患者に対するEGFR-TKIsの治療薬物モニタリング確立のための研究

「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は、予定症例登録数の70例の登録が終了し、2017年9月に行われた欧州臨床腫瘍学会においてその結果を発表し、現在論文投稿準備中である。エルロチニブの曝露量と奏効割合、無増悪生存期間などの有効性は相関を認めなかった。日本人おいては血中濃度に個人差は大きいものの、現在の承認用量で十分な優子政が期待できることが示唆された。また、エルロチニブの曝露量と副作用には有意な相関を認め、副作用を軽減するためにEGFR-TKIの投与量を調整することは個別化医療において重要な可能性が示唆された。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は症例登録が38例で終了しており、ゲフィチニブの血中濃度の測定も集積し、解析中である。ゲフィチニブ連日投与されている患者と隔日投与されている患者における曝露量を検討し、有効性や毒性について評価する。本試験においては、EGFR-TKIの有効性に及ぼす曝露量の影響のみならず薬効予測因子との関連性についても検討する。「高齢者EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌患者に対する低用量アファチニブの第II相試験」は平成29年8月より登録を開始し、現在も症例登録中である(予定症例数25例のうち、21例が登録)。上記研究において、EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌において、EGFR-TKIの曝露量と効果は認めず、副作用を減らすために曝露量を調整することの有用性についてはさらに検討が必要であると結論付けた。EGFR-TKIはEGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺がん患者に対するキードラッグであり、今後も個別化投与の確立を目指す。「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は、予定症例登録数の70例の登録を達成し、エルロチニブの血中濃度の測定、CYP3A5とCYP1A2およびABCB1とABCG2の遺伝子型解析も終了している。治療効果(奏効割合、無増悪生存期間)や副作用と、エルロチニブの薬物動態パラメーターの関係について解析中である。本研究の結果は、今年度の国内外の学会で発表を予定している。EGFR-TKIの薬物動態の解析は幾つかの報告があるものの、いずれも副作用と初回投与時血中濃度の関連性に関する検討である。有効性に関する解析は未だ世界的に報告されておらず、とくにEGFR遺伝子変異陽性患者における有効性解析は画期的な着想といえる。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は症例登録が現在進行中であり、ゲフィチニブ連日投与されている患者と隔日投与されている患者における曝露量を検討し、有効性や毒性について評価する。「高齢者EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌患者に対する低用量アファチニブの第II相試験」は平成29年8月より登録を開始し、現在も症例登録中である。本試験は症例毎にアファチニブの血中濃度を測定している。アファチニブ20mg/日で投与を開始、副作用が許容され、アファチニブのトラフ濃度が低い場合にはアファチニブの投与量を増量する試験である。EGFR-TKIはEGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺がん患者に対するキードラッグであり、患者毎に副作用と効果の両面において適切な投与量を検討することは極めて重要である。本研究を行なうことにより、EGFR-TKI投与患者における効果を確実なものとするための個別化投与の確立を目指す。「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は平成26年3月より患者登録を開始し、平成27年11月に予定症例登録数の70例の登録を達成。エルロチニブの血中濃度の測定、CYP3A5とCYP1A2およびABCB1とABCG2の遺伝子型解析も終了している。また、エルロチニブの血中濃度に影響を与える因子について、薬理遺伝学な因子も含めて検討を行う予定である。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は現在症例登録が進行中であり、平成29年4月現在31例の登録(予定症例登録数45例)があり、現在も進行中である。ゲフィチニブの血中濃度測定、および薬理遺伝学解析も予定している。「高齢者EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌患者に対する低用量アファチニブの第II相試験」は平成29年8月より登録を開始し、現在までに9例の登録がある(予定症例登録数25例)。「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は、予定症例登録数の70例の登録が終了し、2017年9月に行われた欧州臨床腫瘍学会においてその結果を発表した。

エルロチニブの曝露量と奏効割合、無増悪生存期間などの有効性は相関を認めなかった。日本人おいては血中濃度に個人差は大きいものの、現在の承認用量で十分な優子政が期待できることが示唆された。また、エルロチニブの曝露量と副作用には有意な相関を認め、副作用を軽減するためにEGFR-TKIの投与量を調整することは個別化医療において重要な可能性が示唆された。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は症例登録が38例で終了しており、現在ゲフィチニブの血中濃度の測定中である。ゲフィチニブ連日投与されている患者と隔日投与されている患者における曝露量を検討し、有効性や毒性について評価する。本試験においては、EGFR-TKIの有効性に及ぼす曝露量の影響のみならず薬効予測因子との関連性についても検討する。「高齢者EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌患者に対する低用量アファチニブの第II相試験」は平成29年8月より登録を開始し、現在も症例登録中である(予定症例数25例のうち、18例が登録)。本試験は症例毎にアファチニブの血中濃度を測定している。アファチニブ20mg/日で投与を開始、副作用が許容され、アファチニブのトラフ濃度が低い場合にはアファチニブの投与量を増量する試験である。EGFR-TKIはEGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺がん患者に対するキードラッグであり、患者毎に副作用と効果の両面において適切な投与量を検討することは極めて重要である。本研究を行なうことにより、EGFR-TKI投与患者における効果を確実なものとするための個別化投与の確立を目指す。「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は平成26年3月より患者登録を開始し、平成27年11月に予定症例登録数の70例の登録を達成し、本研究の結果は2017年9月の国際学会で発表済である。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は現在症例登録が進行中であり、平成29年7月38例の登録(予定症例登録数45例)で登録を終了し、ゲフィチニブの血中濃度測定、および薬理遺伝学解析を現在行っている。「高齢者EGFR遺伝子変異陽性の非小細胞肺癌患者に対する低用量アファチニブの第II相試験」は平成29年8月より登録を開始し、現在までに18例の登録がある(予定症例登録数25例)。「非小細胞肺癌患者におけるエルロチニブの有効血中濃度に関する研究」は、予定症例登録数の70例の登録が終了し、2017年9月に行われた欧州臨床腫瘍学会においてその結果を発表し、現在論文投稿準備中である。「非小細胞肺癌患者におけるゲフィチニブの血中濃度に関する研究」の研究は症例登録が38例で終了しており、ゲフィチニブの血中濃度の測定も集積し、解析中である。
光増強場における多光子光化学反応誘起とそのダイナミクス

本研究では、主に金微粒子や金ナノ構造体を「光・分子強結合反応場」として用い、その電場増強能を利用して、高い効率で多光子吸収反応を誘起する試みを行なっている。化学におけるこの概念を一般的確立を大きな目標とし、(1)実際の反応系の探索と確認、(2)反応誘起の最適条件と特徴の明確化、(3)反応のダイナミクスの解明、などを推進した。光-分子強結合反応場(貴金属微細構造体など)を活用し、実際に微弱光でも多光子吸収により光化学反応を達成できる系を探索・実証することを目指す。さらに、そのような多光子反応高効率化を目指し、動的挙動を分光学的に計測し、反応の素過程の理解を深めることを大きな目的とする。より具体的には、(1)微小共振器としての微粒子の有効性(光閉じ込め機能)の評価と、それを用いた光-分子強結合応場の構築、(2)金属ナノ構造体を用いた同様アプローチ、(3)サブピコ秒ナノ秒時間分解能を有した顕微分光システムの開発、(4)それを用いた分子・ナノ粒子の空間局在(捕捉)、などを目的とし、光-分子強結合反応場を用いた多光子光化学の学理と技術の基盤を確立する。などを目的とし、光-分子強結合反応場を用いた多光子光化学の学理と技術の基盤を確立する。高効率に多光子光反応を利用できれば、近赤外光で駆動する太陽電池や光触媒などの開発への扉を開けることになる。その意義は疑いようなく高い。光-分子強結合反応場(貴金属微細構造体など)を活用し、多光子吸収により光化学反応を達成できる系を探索・実証することを目指した。1)成果1:微小共振器としてのエアロゾルやミクロ液滴をレーザー捕捉・顕微分光きる計測システムを構築し、Cavity Enhanced Raman Signalを実際に観測することができた。2)成果2:微小共振器としてのポリマービーズを用いて、cavity効果に基づいた2光子蛍光の高効率化を達成できた。すなわち、イオン交換樹脂であるMCIゲルビーズにローダミン色素をドープすれば容易にレーザー発振することを見出したので、これを「強結合場」に用いることを試みた。顕微鏡下で微弱な1064nmレーザー光をデフォーカスして単一ポリマービーズに照射し、ローダミンの2光子蛍光を誘起したところ、ローダミンをドープしたポリマーフィルム等の場合と比較して著しく強い2光子蛍光が観測された。Q値の計算から、この現象がCavity効果に帰属できることがわかった。3)成果3:広い面積と高いSERS能を持つ金ナノ粒子集積基板を作ることが出来た。すなわち、ガラス基板上に化学的に金ナノ粒子を集積させた基板を作製した。金ナノ微粒子の凝集状態を制御すれば、この基板にSERS機能を付与できることが確認できた。4)成果4:この基板を用いて、高い効率で2光子光化学反応を誘起することができた。すなわち、ジアリールエテン類の開環反応を近赤外光照射で達成することに成功した。我々のグループでは、主に金微粒子や金ナノ構造体を「光-分子強結合反応場」として用い、その電場増強能を利用して、高い効率で多光子吸収反応を誘起する試みを行なっている。化学におけるこの概念を一般的確立を大きな目標とし、(1)実際の反応系の探索と確認、(2)反応誘起の最適条件と特徴の明確化、(3)反応のダイナミクスの解明、などを推進する。また、金ナノ粒子の表面プラズモン吸収に基づくポリマーフィルムのサブ波長ナノ加工も推進している。金ナノ粒子を集積固定したガラス基板を作製し、そのSERS機能が発現するように最適化した。この基板にジアリールエテン類を添加したポリマーフィルムをスピンコートした。この分子(閉環体)の光開環反応(脱色反応)は、通常は可視光励起で起こる。我々は、作製した金ナノ粒子の光電場増強能に基き、近赤外光(808 nm)照射によってこの開環反応を誘起することに成功した。この場合、近赤外光照射は金基板のギャップモード励起に相当する。こ反応収率の励起高強度依存性より、この反応は2光子吸収により開始されたと考えられる。照射はパルスではなく連続光照射であり、照射光強度は>0.1W/cm^2であり、微弱な光照射により2光子反応が誘起できたと考えられる。さらに、光照射時の金ナノ粒子近傍の温度上昇に関しても実験的な検討を行ない、熱反応の可能性を除外できた。また、これと類似した金ナノ粒子固定基板にニートのポリマーフィルムをスピンコートし、金ナノ粒子の表面プラズモンを共鳴励起する波長532 nmのナノ秒パルスレーザー光をシングルショットで照射した。その結果、レーザー光波長の1/10以下の直径1050nmのホールをフィルム表面に形成することに成功した。

我々のグループでは、主に金微粒子や金ナノ構造体を「光-分子強結合反応場」として用い、その電場増強能を利用して、高い効率で多光子吸収反応を誘起する試みを行なっている。化学におけるこの概念を一般的確立を大きな目標とし、(1)実際の反応系の探索と確認、(2)反応誘起の最適条件と特徴の明確化、(3)反応のダイナミクスの解明、などを推進している。本年度の成果は以下の通りである。(1)プラズモン励起によるホトクロミック反応の高効率化:1光子型のジアリールエテンのホトクロミック開環反応に対し、その反応収率に対するプラズモン励起の効果を詳細に検討した。その結果、プラズモン励起の効果により、反応効率が1.52.5倍に増大することが再現性よく確認された。(2)プラズモン増強光化学反応においては、貴金属ナノギャップ・ナノアンテナに局在する光電場を用いて反応の高効率化をはかる。この際、光子だけでなく、対象とする分子や触媒微粒子がギャップに捕捉・局在することになれば、より一層の反応効率の向上を図ることができるであろう。そこで、プラズモン増強電場に基く微粒子の光捕捉を試みた。その結果、10nmの微粒子を微弱な光照射で捕捉することに成功した。プラズモン増強光化学反応においては、貴金属ナノギャップ・ナノアンテナに局在する光電場を用いて反応の高効率化をはかる。さらに、(1)分光学的にプラズモン捕捉の動的挙動を解明した、(2)鎖状高分子の光捕捉にも成功した、(3)光共鳴法の導入により捕捉効率を大きく向上することができた、(4)短パルスレーザーを用いた捕捉効率の向上成功、などの成果を得た。一例として(2)では、2種類の蛍光色素を添加したポリマーナノビーズを用意し、非共鳴励起条件と共鳴励起条件下で捕捉挙動を調べた。その結果、共鳴条件下で一桁程度捕捉力が増大したことがわかった。現在、定量的な解析を急いでいるところである。この他にも、蛍光性ポリマーナノビーズを捕捉対象にし、捕捉力の光強度依存性を詳細に調べた。その結果、安定な捕捉には光強度の最適値があることがわかった。光強度が最適値を超えれば捕捉力は増すものの、捕捉を阻害する作用(例えば熱対流)が拮抗すると考えられる。捕捉挙動の光強度依存性ならびに粒子サイズ依存性に関して定量的な一連のデータの収集を行ない、さらに光共鳴効果を最初に実証し、プラズモン光捕捉の全貌を明らかにしたい。
実験的ポルフィリン症の発症機構とヘム生合成系酵素の組織差に関する研究

赤血球型および肝型δ-アミノレブリン酸(ALA)合成酵素が別々の遺伝子の産物であることをニワトリ酵素について確認し、さらに哺乳動物本酵素へ研究を進めるため、ラット赤血球型ALA合成酵素の精製を行なった。1.ニワトリ網状赤血球および肝ALA合成酵素CDNAのクローン化と一次構造の比較およびそれらをプローブとしたNorthern blot analysis:網状赤血球および肝のλgt11cDNAライブラリーより抗ニワトリ肝ALA合成酵素IgGを用いて赤血球型および肝型cDNAをクローン化し、それらをプローブとしてpoly【(A)^+】RNAのNorthern blot analysisを行った。その結果、赤芽球poly【(A)^+】RNA画分からは赤血球型酵素cDNAプローブによって、肝poly【(A)^+】RNA画分からは肝型酵素cDNAプローブによって、それぞれ大きさの異るmRNAが特異的に検出された。また、薬物でALA合成酵素を誘導すると、肝では肝酵素cDNAによって検出されるmRNAが著しく増加していた。さらに、両型酵素cDNAの塩基配列およびそれから導かれるアミノ酸配列のホモロジーは約50%に過ぎなかった。これらの結果は両酵素が別々の遺伝子の産物であることを示すものである。2.赤血球型ALA合成酵素の精製とその性質の肝酵素との比較:ラット網状赤血球よりALA合成酵素の精製を試み、限定分解物ながら活性を保持した精製標品を得ることができた。すなわち、溶血液から硫安分画、パパイン消化、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイトおよびQセファロースカラムクロマトグラフィー、次いでCo-Aアガロースアフィニティークロマトグラフィーを行い精製した。最終標品はSDS-ゲル電気泳動上ほとんど均一で、分子量は49000であった。その性質を肝型酵素と比べると、分子量がやや小さく(肝酵素:51000)、スクシニルCoAによる基質阻害が見られないなどの差がみられた。現在精製標品に対する抗体調製を試みている。
モノクローナル抗体による慢性関節リウマチの進展制御に関する実験的治療研究

モノクローナル抗体を用いて慢性関節リウマチ(RA)を治療するという新しいRA治療戦略の試みとして、本実験計画を立て実験を遂行した。その結果、抗CD4(ヘルパーインデューサー)抗体を用いてRAの動物実験モデルであるコラーゲン誘導関節炎(CIA)を治療したところ、100%のマウスにその発症を抑制することがわかった。このことから、CIAの発症に係わっている血球はリンパ球であることが強く疑われた為、免疫不全マウスであるSCIDマウスにCIAのリンパ球を移入し、関節炎を発症させ得るか否かを検討した。その結果、全17匹中16匹のマウスにCIAと同様の関節炎を形成することに成功した。さらに、その原因となるリンパ球サブセットを決定する目的で、あらかじめ補体と抗CD4、抗CD8(サプレッサーインデュサー)抗体で処理したリンパ球をSCIDマウスに移入したところ、抗CD4抗体治療群では100%関節炎の発症を抑制したのに対し、抗CD8抗体で処理した群ではSCIDマウスの関節炎はむしろ増悪し、抗II型コラーゲン抗体価の有意な上昇を認めることも判明した。これらのことから、抗CD4抗体はRA治療に有効であることが推察されたが、より副作用発現が少ないと考えられる選択的な抗体治療開発のため、T cell receptor(TCR)V beta familyを用いた抗体治療を試みたが、V beta-2,5,7,8,10,11,17いずれの抗体においてもTCR単クローンの抗体治療は無効であり、このことからmonoclonalなTCR療法は困難であると判断された。
造影剤投与による急性腎障害の機序解明および医薬応用

造影剤による急性腎障害に対する新規治療法としての水素ガスの効果および機序を解明するにあたり、水素ガスを吸入させたラットの組織内溶存水素濃度を高感度水素モニターを用いて測定し、複数臓器で濃度変化を観察、水素の臓器分布動態を考察した。具体的には、SDラットに、水素濃度3%の混合ガスを流速0.2L/分で吸入させ、脳、肝臓、腎臓、腸間膜脂肪、および大腿筋腹を露出させて、水素濃度モニター先端を臓器表面から深さ1mmまで挿入し、水素濃度を0.5秒ごとに測定した。水素濃度測定値は生体外および生体内で各測定毎に補正を行った。水素濃度曲線から、最大水素濃度、水素飽和時間、および濃度変化を定量的に反映する複数の測定値を算出し、臓器ごとに比較した。水素飽和時間は筋肉で平均20.2分であり、その他臓器の6.39.4分と比較し有意に長かった。また、90%、63%、10%濃度到達時間も筋肉のみで有意に長く、筋肉では緩徐な水素濃度上昇を認めた。一方で、水素濃度上昇開始時間に関しては、全臓器間で有意な差を認めなかった。また、最大水素濃度は臓器ごとに異なり、最低濃度は腎臓で18μmol/Lであったが、最高濃度は肝臓で29μmol/Lであり、投与水素濃度の22.1μmol/Lよりも高い濃度を示した。これら水素濃度変化に関する測定値の比較結果に基づき水素の臓器分布動態を考察すると、濃度上昇開始時間に臓器間で差を認めず、分時血流が相対的に低い筋肉のみで緩徐な濃度上昇を認めたことから、水素は拡散単独によって分布しているのではなく、血流によっても分布している可能性が高いことが示唆された。また、得られた水素濃度曲線が、拡散単独分布による予測水素濃度曲線よりも血流単独分布による予測水素濃度曲線に近似していることから、血流により強く依存した水素の臓器分布が示唆された。今後は、造影剤腎症モデル動物を使用して研究を遂行する。本課題の基盤となる水素ガス吸入後の腎臓を含めた臓器別評価を行うことに成功し、意義深い知見を得ることができた。この内容は既に論文発表している。造影剤腎症モデル動物も用いた検討、水素分子含有造影剤を用いた検討を行う。造影剤に水素分子を含有させる技術については複数の方法を検討し、もっとも高濃度になった造影剤を使用することで成果に結びつけたい。水素ガスボンベを使用せず、水素ガス発生器を使用することができたため、水素ガスボンベ費用を抑えることができた。一方で、本年度は実験用動物や各種抗体などの費用が当初の想定を上回るため、その部分に充当させていただきたい。
CALPの育成を意識したCAN-DOストラテジーリストの策定と実践

平成23年度に文科省が発表した『国際共通語としての英語力向上のための5つの提言と具体的施策』では,各中学・高校において,学習の到達目標をCAN-DOを制定することを求めている。このような政策は歓迎されるべきだが,課題も残されている。CEFRでは,教育領域に係るCAN-DOリストが圧倒的に少ない。また,B1以下のレベルにおいて,CALPの育成に関連した言語活動が乏しい。そこで,本研究では,B1以下のレベルのCALPを育成するCAN-DOリストを作成した。また,これまでの研究に欠けていた学習ストラテジーの視点を取り入れ,そのそれぞれのレベルに到達するのを助ける学習ストラテジーリストを作成した平成26年度はCALPの育成を意識したCAN-DOリストの開発することが目的であり,そのための調査・研究を行った。目的:比較的習熟度の低いレベル(A1,A2,及びB1)におけるCALPの育成を意識した暫定版CAN-DOリストを開発する。調査協力者:中学・高校・大学英語担当教員(計50名)調査の内容:(1) CALPやリテラシーに関する専門書及び論文(Chamot, 2009; Gunderson, D'Sylva, & Odo, 2013)などを参考に,習熟度の低いレベルの学生のCALPを育てるのに必要なディスクリプターを作り,暫定版CAN-DOリストを策定した。(2)新しく作成したディスクリプターの精微化を行うため,教員によるディスクリプターの並び替え調査(尾関, 2013)を実施した。調査では,リーディング,ライティングのなかのカテゴリー(例えば,ブックレポート,短いエッセイなど)ごとに作成したA1, A2, B1(それぞれのレベルでさらに,2つのレベルに細分される)のディスクリプターをそれぞれの紙に書き,カテゴリーごとに,教師にレベルが低いと思われるディスクリプターから高いと思われるディスクリプターの順に並べ替えをしてもらった。同時に,意味がよく理解できなかったディスクリプターについて記述してもらった。(3)教師による並べ替え調査の結果,レベルを間違える教師が多かったディスクリプターについては,レベルを調節し,意味がよく理解できなかったディスクリプターの表現を変えて,暫定版CAN-DOリストを策定した。26年度は,既存の調査・研究や教材からどのようなディスクリプターが,習熟度が低い学習者のCALP(認知学術言語能力)を育てるのに必要か選別したり,新たに作成した。その後,CAN-DOリストの暫定版を作成し,その妥当性の検証を教員による並べ替え調査により,CAN-DOリストの作成を完成させた。27年度は,完成させたCAN-DOリストに基づき,それぞれのディスクリプターに描かれた言語活動を支援する学習ストラテジーを考え,CAN-DOストラテジーリストを策定する予定であった。既存の学習ストラテジーリストといったトップダウン的視点とともに,教員や学習者の実態を反映したボトムアップ的視点を取り入れたCAN-DOストラテジーリストの作成を目標としているが,現在,その研究の半ばまで来ている。計画書にある第二段階の4つのフェーズのうち,2つ目のフェーズまで実施した。第1フェーズ:既存の学習ストラテジーリスト(O'Malley & Chamot, 1990など)を参考に選定した学習ストラテジーをCAN-DOリストのそれぞれのディスクリプターの下に組み入れた。第2フェーズ:CAN-DOリストにある言語活動を行うには,どのような学習ストラテジーが必要だと認識しているか,約50名の中・高・大の教員に質問紙調査した。具体的には,それぞれの学習ストラテジーの意味する思考過程や行動を詳しく説明しておき,どのストラテジーが必要か選んでもらった。併せて,自由記述による追加ストラテジーの候補も収集した。上記の第2フェーズと同じような質問紙調査は,今度は,中・高・大の学生に行う準備をしている。大学では,約50名の学生に実施をしたが,中学,高校に関しては,調査を行う学校と連絡を取り合っている段階である。研究計画の第二段階では,教員と生徒(学生)に質問紙調査をする予定であったが,学生の方は,時間が足りずに質問紙調査ができなかった。27年度に完成予定であった第2フェーズの学習ストラテジーの視点をいれたCAN-DOリストを完成させた。28年度は,第3フェーズにあたり,CAN-DO学習ストラテジーリストに準拠した指導例を開発した。すべてのスキルとレベルに合わせて指導例を作成するのは,不可能であるので,特に現在必要とされているスキルである,スピーチ・プロダクション,スピーチ・インタラクションとライティングに焦点をあてたタスクを開発した。もちろん,この3つスキルのみを取り扱うタスクではなく,リーディングをしてからスピーキングをしたり,リスニングをしてからライティングを行ったりするタスクで,リーディングやリスニングも含まれる。このタスクの特徴としては,次の4つが挙げられる(Robinson, 2011; Swales, 2009)。1活動をするさいに,学習者間にインタラクションを伴う2学習者は,特定の言語を使うわけではなく,学習者が使う言語を選ぶことができる3意味に焦点がある4活動のゴールが明確にある。タスクは,現実社会で行われているコミュニケーションを教室内で行うものであると定義づける研究者もいるが,教室内で行われるアクティビティは,必ずしもこの定義があてはまらないので,この定義は除いた。各タスクでは,CAN-DOリストに書かれた学習目的に効率的に取り組むことができる学習ストラテジーの指導も兼ねて教えられるように工夫してある。

また,タスクを作るさい,高校で指導例がなるべく使用されやすいように,英語Iでは,東京都で最も採択数が多いVISTA communication English I,英語IIでは,VISTA communication English IIを対象として考えた。(東京都にもレベルの高い学校からそうでもない学校があり,他の地域と同じような状況であると推測し,採択数を公表している東京都のデータから教科書を選んだ。)昨年度は,特別研究を学校からもらい,学部の授業や学校運営に関わる仕事を免除されたため,自分の研究に専念ができ,昨年度の計画は,予定通り遂行できた。平成23年度に発表された『国際共通語としての英語力向上のための5つの提言と具体的施策』(文部科学省)では,各中学校・高校において,学習の到達目標をCAN-DOリストの形で設定することを求めている。このような取り組みは歓迎されるべきであるが,課題もある。CEFRでは,私的,公的,職業,教育の4つの領域を想定し,CAN-DOリストを作成しているが,教育領域に係るCAN-DOリストが他の3つの領域に比べて圧倒的に少ないことから,CEFRのCAN-DOリストを学校教育に取り入れにくくなっている。特に,CEFRでは,B1以下のレベルにおいて,学校の授業でよく行われているCALP(Cognitive Academic Language Proficiency)の育成に関連した言語活動が乏しい。そこで,本研究では,昨年度までは,以下のことを行った。(1)現在のCEFRにはない,A1,A2,B1レベルにおいてCALPを育てるためのディスリプターを検討し,それらを取り入れたCAN-DOリストを作成した。新しく取り入れたディスクリプターについては,その妥当性を検証した。(2) (1)でできたCAN-DOリストにある言語活動を支援する学習ストラテジーを組み入れたCAN-DOストラテジーリストを作成した。このリストには,言語を使って何ができるかというディスクリプターとともに,そのディスクリプターが示す言語活動を支援する学習ストラテジーを組み入れ,CAN-DOストラテジーリストを策定した。昨年度は,策定したCAN-DOストラテジーリストに基づいた,授業で行う指導例を開発する。CEFRには,インタラクション,スピーキング,リスニング,リーディング,ライティングという5つのスキルにおいて,それぞれ6つのレベルがあるが,それぞれのスキル,それぞれのレベルにおいて教室内で実行可能な指導例を作成した。平成23年度に文科省が発表した『国際共通語としての英語力向上のための5つの提言と具体的施策』では,各中学・高校において,学習の到達目標をCAN-DOを制定することを求めている。このような政策は歓迎されるべきだが,課題も残されている。CEFRでは,教育領域に係るCAN-DOリストが圧倒的に少ない。また,B1以下のレベルにおいて,CALPの育成に関連した言語活動が乏しい。そこで,本研究では,B1以下のレベルのCALPを育成するCAN-DOリストを作成した。
二光子励起法を用いた神経細胞スパインの形態可塑性とカルシウム動態の研究

海馬錐体細胞では,カルシウム依存性にシナプス可塑性と樹状突起スパインの形態可塑性が起きることが知られている。本研究ではケージドグルタミン酸の反復アンケージングにより単一シナプスで形態可塑性を誘導し,そのときのカルシウム動態と形態可塑性の関係を解析した。その結果,形態可塑性が生じる場合にはスパインにおいて主にNMDA受容体を介した強いカルシウム上昇生じること,およびスパイン近傍の樹状突起幹にもカルシウムが拡散することが示された。海馬錐体細胞では,シナプス長期増強に伴って樹状突起スパインの形態可塑性(増大)が起きることが知られている。ケージドグルタミン酸(MNI-glutamate)をスパイン近傍で2光子アンケージすることにより,単一のスパインに選択的に形態可塑性を引き起こすことが可能である。はじめにカルシウム指示薬を細胞内に負荷して,刺激時のカルシウム動態と形態可塑性の関係を解析した。比較的親和性の高いカルシウム指示薬(Fluo-5F)を負荷した場合,スパイン増大が起きにくい傾向があったが,親和性の低いカルシウム指示薬(Oregon Green 488 BAPTA-5N)の負荷時には,無負荷時と同程度にスパイン増大が生じた。Mg^<2+>を含まない細胞外液中でケージドグルタミン酸を反復してアンケージした場合(シナプス単独刺激条件),スパインで強いカルシウム上昇が記録された。カルシウム上昇の強さとスパイン増大の程度には相関がみられた。カルシウム上昇はNMDA受容体を介した流入により生じ,流入したカルシウムの一部は樹状突起幹へ拡散していた。一方,Mg^<2+>を含む細胞外液中で,ケージドグルタミン酸のアンケージをシナプス後細胞の発火と組み合わせて行った場合(同期発火刺激条件),刺激時のカルシウム上昇は比較的弱かったが,このカルシウム上昇にもNMDA受容体を介した流入が最も寄与していると考えられた。さらにケージドカルシウムを細胞内に負荷してスパインでアンケージするとスパイン増大が生じたことから,スパインのカルシウム上昇がスパイン増大を引き起こすのに十分であることが示された。樹状突起スパインの近傍で,ケージドグルタミン酸をMg^<2+>を含まない細胞外液中で反復して二光子アンケージングすると,刺激されたスパインにおいて選択的に,スパイン体積の増大と,グルタミン酸電流の増強が生じることが知られている。スパイン体積の増大とグルタミン酸電流の増強は,スパインのNMDA受容体を介して流入したカルシウムが引き起こす。細胞内にカルシウム指示薬を負荷して刺激時のカルシウム動態を測定すると,スパインにおいてもっとも強いカルシウム上昇がみられたが,樹状突起幹においても弱いカルシウム上昇が測定された。樹状突起幹におけるカルシウム上昇は通常,スパインから数μm程度の範囲に限局していた。これはスパインのカルシウムが,スパインネックを介して拡散した結果と考えられた。しかし一部の測定においては,より広範囲に強いカルシウム上昇が認められることがあった。これはスパインからの単なる拡散では説明できず,カルシウム誘発性カルシウム放出が起きている可能性が考えられた。そこで次に,樹状突起幹におけるカルシウム上昇の役割を解明するために,ケージドカルシウムを細胞内に負荷して,樹状突起幹においてアンケージングを行いカルシウム上昇を引き起こした。しかしこれによってスパイン形態に顕著な変化はみられなかったことから,樹状突起幹でのケージドカルシウムによるカルシウム上昇は,単独では顕著なスパイン形態可塑性を引き起こすには不十分であると考えられた。
DNA分析技術を利用した新たな林木育種システムの構築-DNA分子マーカーによる家系管理技術を用いた次代検定システムを中心として-

DNA分析技術を導入した効率的な育種システムを構築する上で必要となるDNA分子マーカーの開発を行うと共に、その応用を試みた。1.品種識別のための新たなDNA分子マーカーの開発:アカシアマンギウムおよびスギにおいて、RAPD(random amplified polymorphic DNA)フラグメントのSCAR(sequence characterized amplified regions)化を行った。この結果、両樹種においてそれぞれ18個以上の多型SCARマーカーが開発された。これらのマーカーを組合せ、multiplex-PCR(polymerase chain reaction)分析することにより、約26万(21^8)品種を識別できる分析系(MuPS;multiplex-PCR of SCAR markers)を確立した。3.MuPS分析による九州産スギ在来品種と精英樹の再整理:MuPS分析系を用いて、在来品種(77品種)と精英樹(589クローン)のMuPS型を決定し、データベースを構築した。九州産スギ精英樹には、多くの在来品種が含まれていた。また、精英樹中には、在来品種としては認知されていないクローンも多数存在していた。重複したクローンは今後削除する必要がある。DNA分析技術を導入した効率的な育種システムを構築する上で必要となる技術開発を行った。1.高変異性マイクロサテライトDNAマーカーの開発:スギ、クロマツ、カラマツ、アカシアの4樹種を対象として、RAMP(random amplified microsatellite polymorphism)法を用いてマイクロサテライトDNA領域のスクリーニングを行った。その結果、各樹種で2040個のマーカーが得られた。3.葉緑体DNA型の簡便識別法の開発:PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)分析を導入し、ヒノキ、カラマツ、クロマツ、アカシアの葉緑体DNA型の簡便分析法を開発した。4.電算機による家系管理プログラムの作成:DNA分析によって得られる各個体のDNA型を遺伝子型に変換し、さらに親個体の遺伝子型データと照合することにより、両親を遡及探索するプログラムを作成した。DNA分析技術を導入した効率的な育種システムを構築する上で必要不可欠となるDNA分子マーカーの開発を行った。1. RAPD-SCARマーカーの開発とこれを利用した品種識別法の開発:スギにおいて、さらに24個(昨年度との合計で48個)のRAPD(random amplified polymorphic DNA)フラグメントを選抜し、その塩基配列を決定し、SCAR(sequence characterized amplified regions)化を行った。SCARの欠点を克服するため、一度に多数(9個)のマーカーの分析を可能とするmultiplex-PCR(polymerase chain reaction)における増幅条件について検討を行った。2組(各組9マーカー)のmultiplex-PCRを行うことにより、全18マーカーのDNA型から約26万品種の識別が可能となった。これにより、高い信頼性をもつスギ品種識別システムが確立された。さらに、熱帯早成樹種であるアカシアマンギウムについても同様なシステム開発に着手した。効率的な育種システムを構築する上で必要不可欠となるDNA分子マーカーの開発をアカシアとクロマツにおいて行った。1.アカシア品種識別のためのMuPS(Multiplex PCR of SCAR markers)法の開発:現在、東南アジア地域において最も植林され、多数の育種プロジェクトが進められているアカシアマンギウムの品種識別法の開発を行った。アカシアのRAPD(random amplified polymorphic DNA)分析の結果を基に58個のフラグメントを選抜し、その塩基配列を決定し、SCRA(sequence characterized amplified regions)化を行った。この結果、18個の多型SCARマーカーが開発された。これらのマーカーを3組(各6プライマー)に分け、multiplex-PCR(polymerase chain reaction)分析することにより、約26万(2^<18>)品種を識別できる分析系を確立した。2.クロマツにおける父性遺伝マーカーの開発:昨年度に引き続いて、父性遺伝する葉緑体DNAを対象として種内変異の探索を行った。塩基配列上の1塩基置換を検出するBESS(base excision sequence scanning)T-Scan分析に加えて、SSR(simple sequence repeats)分析も行った。その結果、遺伝子間スペーサー領域に5個の変異を確認した。これらのマーカーを実際の親子鑑定に応用し、種子の胚と胚乳の両組識の葉緑体DNAを分析することにより、その種子の母樹(母親)と花粉親(父親)を遡及できることを確認した。