hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ApoEノックアウトマウスにおけるプラーク破裂モデルの確立とそのメカニズム解明

1.ApoE欠損マウスを用いた粥状動脈硬化巣のプラーク破綻モデル作成とそのメカニズム粥状動脈硬化巣のプラーク破綻は、心筋梗塞などの極めて重篤な疾患の引き金となるが、このプラーク破綻のメカニズムは不明な部分が多い。その一因として、適当な疾患モデル動物が見つかっていないことが挙げられる。我々はApoE欠損マウスのプラークが短期間かつ高確率で破綻する、極めて簡便な手技を発見した。また、このプラーク破綻はヒトの病態を部分的に表していることも判明し、そのメカニズムとして、好中球などの炎症細胞や細胞外マトリックス分解酵素であるMMPの関与を示唆するに至った。これらの研究結果をArteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology誌、vascular Biology Protocols(図書)及び第3回名古屋メタボリックシンドローム研究会において発表した。2.ApoE単独及びApoE/MMP-2両遺伝子欠損マウスを用いた粥状動脈硬化巣形成メカニズムの解明Matrix metalloproteinase(MMP)の一つであるMMP-2は動脈硬化巣において発現が見られ、動脈硬化巣形成に対する関与が示唆されてきた。我々は、動脈硬化巣形成モデルであるApoE欠損マウスとApoE/MMP-2両遺伝子欠損マウスの動脈硬化巣を比較し、そのMMP-2の関与を検討した。その結果、ApoE/MMP-2欠損マウスはApoE欠損マウスよりも動脈硬化病変が有意に小さく、また動脈硬化病変内に遊走するの平滑筋細胞も有意に少なかった。以上のことから、MMP-2は平滑筋細胞の遊走に関与することにより、動脈硬化巣形成に寄与することが考えられた。本研究の結果は、Arteriosclerosis, Thrombosis, and vascular Biology誌において公表された。3.マウス下肢虚血障害後の血管新生におけるMMP-2の関与MMPsは血管新生に対する関与が想定されている。よって本研究では、MMP-2欠損マウスを用い血管新生へのMMP-2の役割を検討した。その結果、マウス下肢虚血モデルにおいて、MMP-2欠損マウスの血流回復は野生型マウスに比べ有意に遅延し、血管新生に対するMMP-2の関与が示唆された。またこの機序として、血管新生には骨髄由来の血管内皮前駆細胞が関与し、そのMMP-2の欠損が、内皮前駆細胞の血管新生機能障害をもたらす可能性が考えられた。本成果はCirclation Research誌に発表された。1、ApoEノックアウトマウスを用いた粥状動脈硬化巣のプラーク破綻モデルの作成粥状動脈硬化巣のプラーク破綻は、心筋梗塞などの極めて重篤な疾患の引き金となるが、このプラーク破綻のメカニズムは不明な部分が多い。我々は、粥状動脈硬化巣の形成メカニズムを研究中に、偶然にもApoE KOマウスのプラークが短期間かつ高確率で破綻する、極めて簡便な手技を発見した。また、このプラーク破綻はヒトの病態を部分的に表していることも判明し、これらの研究結果をArteriosclerosis, thrombosis, and Vascular Biology誌および第7回糖尿病合併症とVascular Biology研究会において発表した。2、ApoEノックアウトマウスおよびApoE、MMP-2ダブルノックアウトマウスを用いた粥状動脈硬化巣の形成メカニスムの解明Matrix metalloproteinase(MMP)の一つであるMMP-2じゃ動脈硬化巣において発現が見られ、その関与が示唆されてきた。我々は、高脂血漿モデルマウスであるApoEKOマウスとApoEおよびMMP-2の両遺伝子欠損マウスの動脈硬化巣を比較することにより、そのMMP-2の関与を検討した。その結果、ApoE、MMP-2ダブルKOマウスはApoEKOマウスよりも動脈硬化病変が有意に小さく、また動脈硬化病変内に遊走するの平滑筋細胞も有意に少なかった。以上のことから、MMP-2は平滑筋細胞の遊走に関与することにより動脈硬化巣の形成に寄与することが考えられた。本研究の結果は、Arteriosclerosis, thrombosis, and Vascular Biology誌において公表された。3、平滑筋細胞におけるカテプシンSの存在動脈硬化巣の形成に大きな役割を果たす平滑筋細胞の細胞膜表面上に、細胞外マトリクスの分解酵素の一つであるカテプシンSが存在し、カテプシンSの動脈硬化症への関与を示唆し、American Journal of Pathology誌に報告した。2.ApoE単独及びApoE/MMP-2両遺伝子欠損マウスを用いた粥状動脈硬化巣形成メカニズムの解明

Matrix metalloproteinase(MMP)の一つであるMMP-2は動脈硬化巣において発現が見られ、動脈硬化巣形成に対する関与が示唆されてきた。我々は、動脈硬化巣形成モデルであるApoE欠損マウスとApoE/MMP-2両遺伝子欠損マウスの動脈硬化巣を比較し、そのMMP-2の関与を検討した。その結果、ApoE/MMP-2欠損マウスはApoE欠損マウスよりも動脈硬化病変が有意に小さく、また動脈硬化病変内に遊走するの平滑筋細胞も有意に少なかった。以上のことから、MMP-2は平滑筋細胞の遊走に関与することにより、動脈硬化巣形成に寄与することが考えられた。本研究の結果は、Arteriosclerosis, Thrombosis, and vascular Biology誌において公表された。3.マウス下肢虚血障害後の血管新生におけるMMP-2の関与MMPsは血管新生に対する関与が想定されている。よって本研究では、MMP-2欠損マウスを用い血管新生へのMMP-2の役割を検討した。その結果、マウス下肢虚血モデルにおいて、MMP-2欠損マウスの血流回復は野生型マウスに比べ有意に遅延し、血管新生に対するMMP-2の関与が示唆された。またこの機序として、血管新生には骨髄由来の血管内皮前駆細胞が関与し、そのMMP-2の欠損が、内皮前駆細胞の血管新生機能障害をもたらす可能性が考えられた。本成果はCirclation Research誌に発表された。
金属/セラミック複合薄膜の三次元マイクロ・メゾ構造体の造形

微細箔状素子のフレキシブルな製造方法として,金型を使用しないマイクロインクリメンタルフォーミング技術を開発し,最小の形状寸法が50ミクロン程度のアルミ箔の微細シェル構造を成形した.成形したアルミ箔の微細構造に,必要に応じて酸化ハフニウムあるいは窒化チタンのコーティングを施した後,水酸化カリウム溶液中で,成形した微細構造部のアルミ箔のみを選択的にエッチングすることにより,セラミック薄膜のみの微細三次元構造体を作成することができた.微細箔状素子のフレキシブルな製造方法として,金型を使用しないマイクロインクリメンタルフォーミング技術を開発し,最小の形状寸法が50ミクロン程度のアルミ箔の微細シェル構造を成形した.成形したアルミ箔の微細構造に,必要に応じて酸化ハフニウムあるいは窒化チタンのコーティングを施した後,水酸化カリウム溶液中で,成形した微細構造部のアルミ箔のみを選択的にエッチングすることにより,セラミック薄膜のみの微細三次元構造体を作成することができた.マイクロスケールの機能素子や要素に対する要求は,近年,急速に多様化している.そこで本研究は,センサー等に応用する立体的な薄膜微細素子の開発のため,金型を使用しないフレキシブルでかつ迅速なマイクロ塑性加工技術を新たに開発することを目的として実施された.また成形した薄膜微細素子に,必要に応じて,コーティングやエッチングを施して高機能化を図るとともに,マイクロ塑性加工の基礎となる金属箔の極めて特異な変形機構を学術的に解明することも目的のひとつである.最初に,薄膜のマイクロインクリメンタルフォーミングを実現するため,先端半径10-100μmの超硬工具を適宜用い,厚さ12μmのアルミ箔上に種々の形状を成形した.底辺1mmのピラミッドの成形では,仰角64°(先端の半頂角26°),伸び128%の成形を実現した.通常の引張り試験での伸びが3%程度であることから,薄膜の微細加工において本成形法が十分に適用可能であることを明らかにした.さらに,底辺50μmのピラミッド,自由曲面形状として高さ150μm,幅100μm,押出し高さ25μmの微細文字を成形した.次に成形した薄膜微細素子の高機能化を図るため,多数の四角錐台を成形したアルミ箔にセラミックコーティングを施し,さらに,四角錐台の部分だけを選択的にエッチングする方法を開発した.四角錐台の底辺の長さは71μm,セラミック薄膜の厚さは約3μmである.これより,インクリメンタルフォーミングで成形した金属箔を犠牲層として,自由形状のセラミック薄膜が成形できることが明らかになった.最後に,マイクロインクリメンタルフォーミングの特異な成形機構を,力学的モデルとAFM観察から検討した.ピラミッドのコーナ部は損傷が最初に生ずる場所であり,これによって成形限界が決まるので,仕上げられたコーナ部の特徴をAFMで観察し,仕上げ面粗さが悪いこと,これが工具と薄膜との接触面積と関連があることなどを明らかにした.マイクロスケールの機能素子や要素に対する要求は,近年,急速に多様化している.そこで本研究は,センサー等に応用する立体的な薄膜微細素子の開発のため,金型を使用しないマイクロ塑性加工技術の新たな開発を昨年度に引き続き実施した.また成形した薄膜微細素子に,必要に応じて,コーティングやエッチングを施して高機能化を図るとともに,マイクロ塑性加工の基礎となる金属箔の成形限界について,箔の種類の影響を検討した.最初に,マイクロインクリメンタルフォーミングにおける箔の成形限界を高めるため,厚さ12μmアルミ箔に対しては先端半径10μmの超硬工具を,厚さ8μmのステンレス箔に対しては先端半径100μmの超硬工具を使用し,種々の形状を成形した.アルミ箔での代表寸法は100μm,ステンレス箔での代表寸法は1mmである.アルミ箔の成形では,寸法の減少にほぼ比例して工具の送り速度を低下させること,ステンレス箔の成形では,一回の等高線加工の後に,工具を箔から引き上げ,箔に蓄積した残留応力を開放することが,精度と成形限界の向上に大きく寄与することを明らかにした.達成した伸びは,アルミ箔とステンレス箔においてそれぞれ162%と64%であり,通常の引張り試験での伸び(それぞれ3%程度と1%程度)に対し,極めて大きな変形が実現した.次に成形した薄膜微細素子の高機能化を図るため,多数の四角錐台を成形したアルミ箔に比較的低温でセラミックコーティングを施し,さらに,四角錐台の部分のアルミ箔だけの選択的なエッチングを試みた.この方法をTiNとHfO_2のコーティング膜に適用したところ,良好な結果が得られることが分かった.最後に,ピラミッドの成形におけるアルミ箔とステンレス箔の成形限界について検討した結果,アルミ箔ではコーナ部での2軸の引張りひずみの和が一定値に達した時,ステンレス箔では側面の伸びひずみが一定値に達した時に成形限界を示すことを明らかにした.マイクロスケールの素子や要素は,製品や部品の重要な機能を担うようになってきた,本研究は,微細箔状素子のフレキシブルなファブリケーション方法として,金型を使用しないマイクロインクリメンタルフォーミングを開発し,遅れている微細塑性加工技術を促進させること,また必要に応じて,成形した薄膜微細素子に種々のコーティングとエッチングを施し高機能化を図ること,マイクロ塑性加工の基礎となる金属箔の極めて特異な変形機構を解明することを目的に,実施された.

加工物としては,加工が容易なアルミ箔の他に,難加工材ではあるが生体適合性や耐腐食性に優れ,バイオエンジニアリング用のマイクロ素子や小型燃料電池用の薄膜セパレータなど,将来的に多くの用途が考案されているステンレス箔を使用した.先端半径10から100ミクロンの種々の超硬工具を適宜使用し,金属箔のマイクロインクリメンタルフォーミングにおける更なる微細化を追求した.アルミ箔については,最適化が一段と進み35ミクロン程度の大きさまでの薄膜微細構造の成形技術がほぼ確立された.しかしステンレス鋼では,さらなる構造寸法の微細化を進めることが未だに困難であることが分かった.成形した多様な形状のアルミ箔に,ヘリコンスパッタ装置を用いて比較的低温でセラミックコーティングを施し,化学的安定性や熱的安定性を有する膜状素子を作成した.その後,水酸化カリウム溶液中でアルミ箔のエッチングを行い,セラミック薄膜のみの微細三次元構造体を作成した.今年度は,特に窒化チタンの微細構造体の作成技術に大きな進展がみられた.難加工材であるステンレス箔の成形機構の解明のため,加工力の測定と潤滑状態の解析を行った.その結果,ピラミッド成形時の加工力の変化が,アルミ箔の場合と大幅に異なることが明らかとなり,工具の回転による静圧の増大が,成形限界に大きな影響を及ぼすことが確認された.
マダイをモデルとした養殖魚の育種-管理-保全に利用可能な高感度個体識別システム

マダイの養殖現場では高成長かつ耐病性形質を有した系統の開発が求められる一方で、養殖が盛んな海域では養殖魚の逸出が確認されていることから、育種から天然資源の管理・保全にまで利用できる個体識別方法の開発が求められている。申請者は、次世代シーケンサーを用いた一塩基多型(SNP)検出系を開発することで、多検体同時平行処理が可能な個体識別システムの開発ができると考えた。そこで、本研究では、個体識別や多様性解析に最適なSNPマーカーセットを開発し、次世代シーケンサーによる多検体同時並行解析システムを構築することで、今後の研究を加速度的に進める基盤整備を行う。
細菌分子によるマトリックス・アンカーリングの機構解明と実用化を目指した前臨床研究

人喰いバクテリアと呼ばれる細菌は、組織のコラーゲンを水解する酵素であるコラゲナーゼを産生する。本酵素の一部であるコラーゲン結合ドメイン(CBD)は、安定な小分子であり、サンドイッチ様構造をとってコラーゲン分子のらせんが緩んだ部分に結合した。細胞増殖を促進するタンパク質である成長因子とCBDを連結し、組織の膠原線維、脱灰骨、コラーゲン基剤に結合させることで、骨新生や血管新生を誘導することができた。コラーゲンはヒトの細胞外マトリックスの主要な構成成分である。病原細菌にはコラゲナーゼを産生し組織を破壊して急速に病巣を拡大するものがある。Clostridium属細菌のコラゲナーゼから基質結合ドメインを単離し、これをアンカーとして用いる新しい薬物送達システム(DDS)を開発し、鼓膜再生や血管新生誘導に応用できることを示した。本年度は以下のことを明らかにした。1)結合部位の解析C. histolyticum class Iコラゲナーゼ(ColG)のコラーゲン結合ドメイン(CBD)は、コラーゲン様ペプチドのC末端に結合した。C末端では三重螺旋構造が緩んでいることから、CBDはこの構造を好んで結合する可能性がある。そこで、Gly→Ala置換により特定部位の螺旋を緩めたコラーゲン様ペプチドを作製してCBDの結合部位を決定したところ、CBDはその部位に選択的に結合することが明らかとなった。(Protein Sci., 2012)2)構造活性相関の解析マトリックス・アンカーとして利用してきたC. histolyticum class IIコラゲナーゼ(ColH)のCBDの三次構造を決定し、Ca2+結合部位の構造とコンフォメーション変換、基質との結合様式を明らかにした。ColGとColH由来の各CBDのアミノ酸配列同一性は約30%に過ぎないが、上述の構造と機能は両者でよく保存されており、ともに薬物アンカーに利用可能と考えられる。(J Bacteriol., 2013)3)薬物シーズとモデル実験ヒト型塩基性線維芽細胞成長因子(hbFGF)とCBDの融合タンパク質を高密度コラーゲン膜に結合させ、この複合材をモデル動物に投与し骨新生能を比較したところ、PBS処理したコラーゲン膜を用いたコントロールより有意に高い骨形成を認めた。(論文準備中)コラーゲンはヒトの細胞外マトリックスの主要な構成成分である。病原細菌にはコラゲナーゼを産生して組織を破壊し病巣を急速に拡大するものがある。Clostridium属細菌のコラゲナーゼから基質結合ドメインを単離し、これをアンカーとして用いる新しい薬物送達システム(DDS)を開発し、骨新生や血管新生誘導に応用できることを示した。1) PKDドメインの構造解析Clostridium属細菌のコラゲナーゼには、触媒ドメインと基質結合ドメインの間に、ヒトの多発性嚢胞腎の病原因子であるPKD1内で繰り返されているPKDドメインと相同な領域を12コピー有するものがある。C. histolyticum class Iコラゲナーゼ(ColG)から一種、class IIコラゲナーゼ(ColH)から二種、計三種類のPKDドメインの三次構造をX線回折法により決定したところ、これらは共通に免疫グロブリン折りたたみ構造(Vドメイン)に類似した構造を取ることが明らかとなった。Ca2+結合部位はよく保存されており、Ca2+が結合するとPKDドメイン中央部はより柔軟な構造をとると考えられる。(論文準備中)2)薬物シーズとモデル実験ヒト型塩基性線維芽細胞成長因子(hbFGF)とCBDの融合タンパク質を高密度コラーゲン膜に結合させ、この複合材をモデル動物に投与し骨新生能を比較したところ、PBS処理したコラーゲン膜を用いたコントロールならびにhbFGF単体を添加したコントロールに比し有意に高い骨新生を認めた。また、不溶性コラーゲンを微細顆粒状に加工し、注射可能とした基剤を用いた場合も同様の高い骨新生誘導能を示した。(J Biomed Mater Res A. 2013)さらに、リンパ管新生への応用を目指してコラーゲン結合型VEGF-Cの生産を行った。病原細菌には、細胞外マトリックスの主要な構成成分であるコラーゲンの水解酵素を産生するものがある。これまでに細菌性コラゲナーゼから基質結合ドメインを単離し、これをアンカーとして用いる新しい薬物送達システム(DDS)を開発し、人工組織における層構造の形成、鼓膜再生や血管新生誘導に応用できることを示した。引き続き本年度は以下のことを明らかにした。1)薬物シーズの作製に用いたアンカーの構造活性相関の解析これまでにマトリックス・アンカーとして利用してきたClostridium histolyticum class IIコラゲナーゼ(ColH)のコラーゲン結合ドメイン(CBD)を生産・精製後、X線結晶学的に立体構造を決定した。2)新たなECMアンカーの創出マトリックス・アンカーリングの実用化には、最小のアンカーで十分な基質選択性と結合性を確保する必要がある。本年度は四種のアンカー領域をヒト由来成長因子との融合タンパク質として生産した。

生産性が良好で、従来のアンカーより約11 kDa小さく、しかも十分なコラーゲン結合能を示すアンカー領域を見出した。3)ヒト型薬物シーズを含む新規機能性タンパク質の作製とモデル実験ヒト型塩基性線維芽細胞成長因子(hbFGF)とコラーゲン結合ドメインの融合タンパク質を作製した。同種骨基剤の表面処理を行って膠原線維を露出させ、この融合タンパク質を骨基剤に効率良く結合させることができた。この複合材をモデル動物に投与し骨新生能を比較したところ、単体のhbFGFを用いて同等の処理を行なったコントロールよりも有意に高い骨形成を認めた。研究実績の概要に記載したように、それぞれのサブテーマにおいて初年度に目処をつけた各研究が、二年度目にはpublication qualityにまでpolishされ、特筆すべき結果につながった。我々は細菌性コラゲナーゼ由来のCBDが薬物アンカーとして利用できることを示してきた。平成24年度はその基礎研究として、まずCBDの結合部位について作業仮説の検証を行なった。変異コラーゲン様ペプチドに対するCBDの結合部位をNMR perturbationと小角X線散乱により解析し、ColG CBDは三重螺旋が緩んだ領域に選択的に結合する事を証明した。この業績は高く評価され、ProteinScience誌に論文掲載されるとともに、その表紙を飾ることができた。次に薬物アンカーの構造活性相関の解析では、ColH CBDの構造がX線回折により分解能2.0 Aまでrefineでき、示差走査熱量分析、小角X線散乱等による基質結合様式に関するデータも集積して、米国微生物学会誌に論文を発表できた。さらに、骨新生に係る前臨床研究では、初年度に部分脱灰骨を基剤として用いた骨新生誘導法を確立したが、平成24年度は供給が無尽蔵で入手が容易な高密度コラーゲン膜を基剤とした骨新生誘導法の検討を行なった。地道な条件検討を繰り返し、新たな骨再生用複合材とそれを用いた治療法を開発できた。初年度に達成した骨バンク活用による骨新生誘導法とともに現在論文作成中である。平成24年度は、研究代表者、研究分担者、連携研究者の異動により、年度当初の研究速度は必ずしも十分では無かったが、各研究者の環境が安定するにつれ研究が加速し、上述の結果につなぐことができた。専門性の異なる第一線の研究者がそれぞれの特性を生かし有機的に連携できたことが目標達成の理由と考えられる。研究実績の概要に記載したように、それぞれのサブテーマにおいて、初年度として妥当な進展があった。個別的には、CBDの構造生物学的解析における結晶の作製・回折データの取得・位相の決定、DDS用のマトリックス・アンカーの選択と組換え融合タンパク質の生産法の確立、コラーゲン結合性成長因子・基剤・投与方法の開発において、飛躍的な進展があった。幸運に恵まれた側面があったことも否定できないが、他方で多くの失敗を経験しながらも地道に条件検討を繰り返したことが、これらの領域における順調な進展につながったと考えられる。
エージェントベースドミュレーションを用いた企業戦略の創発に関する研究

近年,企業を取り巻く生産環境のグローバル化,市場ニーズの低迷ならびに多様化により,企業は新しい市場ニーズや消費者の嗜好をより早くとらえ,競争に打ち勝つことが必要である.このように複雑化した環境に適応し,継続的な競争優位を確立するため,独自の企業戦略の策定が求められている.企業戦略立案においては,消費者の行動,市場の状態に大きく影響を及ぼす競合企業の行動を予測することが大きな課題となる.現状では,企業が自身のノウハウにより,市場や消費者の選好に関する要因を分析し,販売戦略に反映させているが,直接,販売戦略の立案支援を行うツールは少ない.本研究では,市場挙動シミュレーションを自律分散エージェントシステムとして実現する方法論の確立を目指し,自動販売機デマンドチェーンシミュレータのプロトタイプシステムを構築し実験を行った結果,定性的に妥当な結果を得た.今後,飲料水メーカ,オペレータエージェントに対し,自律的に戦略を更新していく機能を加えるとともに,想定したシナリオに基づく実験と実際のデータに基づいた評価を行う.また,利用者にとって使いやすいユーザインタフェースを備えたデマンドチェーンシミュレータの研究開発を行う予定である.近年,企業を取り巻く生産環境のグローバル化,市場ニーズの低迷ならびに多様化により,企業は新しい市場ニーズや消費者の嗜好をより早くとらえ,競争に打ち勝つことが必要である.このように複雑化した環境に適応し,継続的な競争優位を確立するため,独自の企業戦略の策定が求められている.企業戦略立案においては,消費者の行動,市場の状態に大きく影響を及ぼす競合企業の行動を予測することが大きな課題となる.現状では,企業が自身のノウハウにより,市場や消費者の選好に関する要因を分析し,販売戦略に反映させているが,直接,販売戦略の立案支援を行うツールは少ない.本研究では,市場挙動シミュレーションを自律分散エージェントシステムとして実現する方法論の確立を目指し,自動販売機デマンドチェーンシミュレータのプロトタイプシステムを構築し実験を行った結果,定性的に妥当な結果を得た.今後,飲料水メーカ,オペレータエージェントに対し,自律的に戦略を更新していく機能を加えるとともに,想定したシナリオに基づく実験と実際のデータに基づいた評価を行う.また,利用者にとって使いやすいユーザインタフェースを備えたデマンドチェーンシミュレータの研究開発を行う予定である.近年,企業を取り巻く生産環境のグローバル化,市場ニーズの低迷ならびに多様化により,企業は新しい市場ニーズや消費者の嗜好をより早くとらえ,競争に打ち勝つことが必要である.このように複雑化した環境に適応し,継続的な競争優位を確立するため,独自の企業戦略の策定が求められている.企業戦略立案においては,消費者の行動,市場の状態に大きく影響を及ぼす競合企業の行動を予測することが大きな課題となる.現状では,企業が自身のノウハウにより,市場や消費者の選好に関する要因を分析し,販売戦略に反映させているが,直接,販売戦略の立案支援を行うツールは少ない.本研究では,市場挙動シミュレーションを自律分散エージェントシステムとして実現する方法論の確立を目指し,自動販売機デマンドチェーンシミュレータのプロトタイプシステムを構築し実験を行った結果,定性的に妥当な結果を得た.今後,飲料水メーカ,オペレータエージェントに対し、自律的に戦略を更新していく機能を加えるとともに,想定したシナリオに基づく実験と実際のデータに基づいた評価を行う.また,利用者にとって使いやすいユーザインタフェースを備えたデマンドチェーンシミュレータの研究開発を行う予定である.近年,企業を取り巻く生産環境のグローバル化,市場ニーズの低迷ならびに多様化により,企業は新しい市場ニーズや消費者の嗜好をより早くとらえ,競争に打ち勝つことが必要である.このように複雑化した環境に適応し,継続的な競争優位を確立するため,独自の企業戦略の策定が求められている.企業戦略立案においては,消費者の行動,市場の状態に大きく影響を及ぼす競合企業の行動を予測することが大きな課題となる.現状では,企業が自身のノウハウにより,市場や消費者の選好に関する要因を分析し,販売戦略に反映させているが,直接,販売戦略の立案支援を行うツールは少ない.本研究では,市場挙動シミュレーションを自律分散エージェントシステムとして実現する方法論の確立を目指し,自動販売機デマンドチェーンシミュレータのプロトタイプシステムを構築し実験を行った結果,定性的に妥当な結果を得た.本年度は飲料水メーカ,オペレータエージェントに対し,自律的に戦略を更新していく機能を加えるとともに,想定したシナリオに基づく実験と実際のデータに基づいた評価を行う.また,利用者にとって使いやすいユーザインタフェースを備えたデマンドチェーンシミュレータを開発し,評価を行った.
シス・トランス光異性化を鍵とする高性能π共役系高分子の開発

前年度は、有機電界効果トランジスタ(OFET)のp型半導体材料として優れた特性を示すことが知られるイソインディゴ(IID)と1,2-ジチエニルエテン(DTE)の交互共重合体(P1)について、シス体の合成経路を確立するとともに、シス体からトランス体への熱異性化が薄膜状態において起こることを明らかにした。本年度は、(1) P1の熱異性化、ならびに、(2)合成法・熱異性化の一般性について検討した。(1) cis-P1の薄膜状態における異性化について検討した結果、240 °C以上で加熱することにより、ほぼ定量的にトランス体へと異性化することがわかった。また、cis-P1から熱異性化により調製したトランス体(trans-P1_iso)の薄膜を用いて作成したFETは、高い正孔移動度を示した(別途合成したトランス体の薄膜を用いて作成したFETの移動度の約20倍)。薄膜をAFMにより調べたところ、trans-P1_isoの薄膜の均質性は高く、そのために高い移動度を示すことがわかった。以上のように、シス体はトランス体の優れた前駆体として機能することが明らかとなった。2.前年度確立した合成法(直接的アリール化重合(DArP))は、様々なシス体ポリマーの合成にも有効であることがわかった。例えば、ジケトピロロピロール(DPP)誘導体とDTEの共重合体(P2)について、従来の合成法であるStilleカップリング重合により得られた生成物は多くのホモカップリング欠陥を含んでいたのに対し、DArP生成物は構造欠陥をほとんど含んでいなかった。また、DArPにより得られたcis-P2は、薄膜状態においてトランス体へと熱異性化することがわかった。これまでの検討により、主鎖のビニレン部位がシス構造に制御されたドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)の合成法を確立している。また、シス体ポリマーがトランス体の優れた前駆体として機能することも明らかにしている。このように、本研究は、当初の計画通り、順調に進展している。前年度に引き続き、確立した手法を用いて種々のドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)を合成し、そのシス-トランス異性化挙動と電荷輸送特性、結晶性、配向性を評価する。特に、溶解性の問題により、従来の合成手法では合成できなかったポリマーについて検討を行う。高性能π共役系高分子半導体の要件である「結晶性(電荷輸送特性)」と「成膜性(溶解性)」は、トレード・オフの関係にある。本研究では、これらを同時に実現可能なポリマーとして、主鎖のビニレン部位がシス構造に制御されたドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)について検討を行った。まず、有機電界効果トランジスタ(OFET)のp型半導体材料として優れた特性を示すことが知られるイソインディゴ(IID)と1,2-ジチエニルエテン(DTE)の交互共重合体(P1)を標的とした。そのシス体およびトランス体について合成経路の確立を目指し、種々検討を行ったところ、直接的アリール化重合(DArP)が有効であることがわかった。すなわち、IIDのジブロモ体と(Z)-および(E)-DTEとをPd2(dba)3とP(2-MeOC6H4)3、ピバル酸を組合せた申請者独自の高選択的DArP触媒の存在下で反応させることにより、高度に構造制御された高分子量ポリマーP1が得られた(cis up to 92%, trans >99%)。得られたtrans-P1は、純度の高さを反映し、従来の合成法であるStilleカップリング重合で得られた生成物に比べて優れた電荷輸送特性を示すことがわかった。また、得られたcis-P1は、その溶解性の高さに起因し、trans-P1よりも優れた成膜性を示した。続いて、cis-P1の異性化について検討を行ったところ、溶液中、ならびに、薄膜状態において光(600-740 nm)を照射することにより、対応するtrans-P1へと片道異性化することが明らかとなった。さらに、検討を行ったところ、加熱条件下においては、光を照射せずともシス体からトランス体への片道異性化が起こることが明らかとなった。初年度の検討により、主鎖のビニレン部位がシス構造に制御されたドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)について合成法を確立できた。また、得られたシス体ポリマーが、薄膜状態においてトランス体へと片道異性化することを明らかにした。

薄膜をAFMにより調べたところ、trans-P1_isoの薄膜の均質性は高く、そのために高い移動度を示すことがわかった。以上のように、シス体はトランス体の優れた前駆体として機能することが明らかとなった。2.前年度確立した合成法(直接的アリール化重合(DArP))は、様々なシス体ポリマーの合成にも有効であることがわかった。例えば、ジケトピロロピロール(DPP)誘導体とDTEの共重合体(P2)について、従来の合成法であるStilleカップリング重合により得られた生成物は多くのホモカップリング欠陥を含んでいたのに対し、DArP生成物は構造欠陥をほとんど含んでいなかった。また、DArPにより得られたcis-P2は、薄膜状態においてトランス体へと熱異性化することがわかった。これまでの検討により、主鎖のビニレン部位がシス構造に制御されたドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)の合成法を確立している。また、シス体ポリマーがトランス体の優れた前駆体として機能することも明らかにしている。このように、本研究は、当初の計画通り、順調に進展している。初年度の検討により得られたイソインディゴ(IID)と(Z)-1,2-ジチエニルエテン(DTE)の交互共重合体(cis-P1)の薄膜から異性化により調製したtrans-P1の薄膜について、電荷輸送特性と結晶性、配向性を評価する。また、初年度に確立した手法を用いて種々のドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)を合成し、そのシス-トランス異性化挙動と電荷輸送特性、結晶性、配向性を評価する。前年度に引き続き、確立した手法を用いて種々のドナー・アクセプター型ポリ(アリーレンビニレン)を合成し、そのシス-トランス異性化挙動と電荷輸送特性、結晶性、配向性を評価する。特に、溶解性の問題により、従来の合成手法では合成できなかったポリマーについて検討を行う。
小型魚類変異体に基づく脊椎動物遺伝子の網羅的機能比較解析

モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおいてTol2トランスポゾン転移システムを用いて、遺伝子トラップ法、エンハンサートラップ法、Gal4-UAS法、in vivoで転移を誘導する方法などの新しい遺伝学的方法論の開発に成功した。これらの方法を駆使し、組織・細胞・器官特異的にGFPあるいはGal4を発現するトランスジェニックフィッシュを600系統以上作製した。これら系統を基に、重要な発生関連遺伝子の機能解析を行った。さらにデータベースを構築し国内外の研究者との共同研究を推進した。これらの研究成果を通じて脊椎動物遺伝子機能解明研究の進展に大きく貢献した。(1)トランスポゾンにhsp70プロモーターとGFP遺伝子を組み込んだエンハンサートラップベクターを構築した。このエンハンサートラップベクターをゼブラフィッシュゲノムにランダムに挿入させると、挿入部位近傍のエンハンサーによりhsp70プロモーターが活性化され、GFPを組織特異的・器官特異的に発現するゼブラフィッシュが非常に効率よく得られることがわかった。(2)トランスポゾンにhsp70プロモーターと酵母転写因子Gal4を組み込んだGal4エンハンサートラップベクターを構築し、ゲノムにランダムに挿入させた。これらGal4系統をGal4結合配列であるUASの下流にGFPをもつUAS-GFPリポータートランスジェニックフィッシュとかけあわせ、Gal4が組織特異的・器官特異的に発現することによりGFPが組織特異的・器官特異的に発現されるゼブラフィッシュを効率よく得ることができた。この結果は、ゼブラフィッシュにおけるGal4エンハンサートラップ法の世界で初めての成功である。(3)トランスポゾンを用いた遺伝子トラップ法、エンハンサートラップ法、Gal4エンハンサートラップ法を実施し、GFPあるいはGal4を組織特異的・器官特異的に発現するゼブラフィッシュ200系統を樹立した。(4)これらトラップ系統中のトランスポゾン挿入をインバースPCR法などで解析し、100系統についてトランスポゾン挿入部位の塩基配列を決定した。(5)遺伝子トラップ系統については、5'RACE法等によりトラップされている遺伝子を決定した。エンハンサートラップ系統については、トランスポゾン挿入部位のDNA塩基配列のデータベースを用いた解析により、エンハンサートラップベクターが非常に高頻度で蛋白質をコードしている遺伝子内に挿入されていることがわかった。1.メダカTol2因子がもつDNA塩基配列の機能解析を行い、転移に必要な最小シス領域の同定に成功した。2.この成果をもとに、Tol2トランスポゾンベクターにスプライスアクセプター部位、GFP遺伝子あるいはGal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだ遺伝子トラップコンストラクトを構築した。また、hsp70プロモーター、GFP遺伝子あるいはGal4遺伝子、SV40ポリAシグナルを組み込んだエンハンサートラップコンストラクトを構築した。3.これらトラップコンストラクトをゼブラフィッシュゲノムにランダムに挿入させ、GFPあるいはGal4を組織・細胞・器官特異的に発現するゼブラフィッシュ系統の分離、同定、系統化を行った。これまでにGFP遺伝子トラップ系統102、GFPエンハンサートラップ系統73、Gal4遺伝子トラップ系統129、Gal4エンハンサートラップ系統56を作製した。これらについて発現パターンの詳細な解析、トランスポゾン挿入部位の決定を行いつつある。4.これらトランスポゾン挿入のホモ2倍体胚を作製し、解析することにより、計15系統の発生異常変異を分離した。これら変異においては、新規母性因子misty somite、核孔蛋白質nup214、翻訳延長因子eef21、転写因子cdc73、tcf7、GTP交換因子synembrynをコードする遺伝子の機能がトランスポゾン挿入により破壊されていた。5.GFP及びGal4の組織・細胞・器官特異的な発現パターンとトランスポゾン挿入部位のデータベースzTrapを構築し,公開を開始した。(1)Tol2トランスポゾン転移システムを用いて、ゼブラフィッシュにおいて遺伝子トラップ、エンハンサートラップスクリーニングを実施した。約500のGal4あるいはGFPを細胞・組織・器官特異的に発現するトランスジェニックフィッシュの作製を行った。(2)心臓特異的にGFPを発現するトランスジェニックフィッシュを用いて、心臓の機能にミオシンリン酸化酵素が重要な働きをしていることを明らかにした。また、皮層の表面に存在するイオンのホメオスタシスに重要な細胞群特異的にGFPを発現するトランスジェニックフィッシュを用いて、これらの細胞の挙動を明らかにした。(3)約200系統についてトランスポゾン挿入部位近傍のゲノムDNAをクローニングし、塩基配列決定を行った。さらに、これら系統のホモ2倍体を作製し、初期発生に重要な働きをしている遺伝子の変異を同定した。Tcf7遺伝子は、ヒレ形成におけるWntシグナルの伝達に重要であることを明らかにした。Synembryn-like遺伝子は、G蛋白質を介したシグナル伝達に重要で、色素胞形成に関わっていることを明らかにした。Parafibromin遺伝子は、筋肉細胞形成及びヒレ形成に必須であることを明らかにした。(4)トランスジェニックフィッシュにおけるGFP及びGal4の組織・細胞・器官

特異的な発現パターンとトランスポゾン挿入部位のデータベースzTrapに上記データを追加し公開している。また支援班の支援を得てこのデータベースの改良を行った。このデータベースを基に共同研究を推進した。(1) To12トランスポゾン転移システムを用いて、ゼブラフイッシュにおいて遺伝子トラップ、エンハンサートラップスクリーニングを実施した。平成20年度は約200の改変型酵母転写因子Ga14FFを細胞・組織・器官特異的に発現するトランスジェニックフイッシュ系統の作製を行った。(2)これらトランスジェニックフィッシュにおけるトランスポゾン挿入のサザンプロット解析、インバースPCRによる解析を行い100系統以上についてトランスポゾン挿入部位を決定した。(3)発現パターン情報・トランスポゾン挿入部位近傍ゲノム情報をzTrapデータベースにとりこんだ。これにより遺伝子・ゲノム機能解析、国内外の研究者とのトランスジェニック系統を用いた共同研究が促進された。(4)ヒートショック遺伝子の下流に転移酵素遺伝子を組み込んだもつトランスジェニックフィッシュを作製した。この転移酵素遺伝子トランスジーンと単一のTo12挿入をもつ二重トランスジェニックフイッシュのオス成魚を37度のお湯につけると、To12が生殖細胞で効率よく転移することがわかった。この方法により、To12挿入を効率よく容易に作製できるようになった。(5)ゼブラフイッシュ側線の求心性神経で特異的にGFPを発現するエンハンサートラップ系統を用いて、求心性神経が側線の神経小丘上の有毛細胞の極性を識別してシナプス結合をつくっていくことが明らかになった。(6)転写因子evx1は脊髄内の特異的な介在神経で発現している。我々は、BACトランスジェネシスによりevx1遺伝子近傍に存在する、脊椎動物において種を越えて保存されている介在神経発現のためのエンハンサーを初めて同定した。(1)モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおいて、To12トランスポゾン転移システムを用いた遺伝子トラップスウリーニング、エンハンサートラップスクリーニングを実施した。平成21年度には、改良型酵母転写因子Ga14FFを細胞・組織・器官特異的に発現するトランスジェニックフィッシュ系統を約200系統新たに作製した。(2)これらトランスジェニックフィッシュがもつトランスポゾン挿入のサザンブロットによる解析、インバースPCRによる解析を行った。
国際法における法の実現過程の分析－日韓の国際組織犯罪防止条約受容を事例に

本研究では、日韓両国が近年まで締結を遅らせてきた国際組織犯罪防止条約の法実現過程の特性を条文の分析、および両国で法律が作成された過程や歴史的な背景について検証する。歴史的背景に関しては国会議事録等の資料分析を主軸とし、政治判断については公開資料および聞き取りを活用して分析を進める。また、研究代表者は韓国政府のテロ対策に関する諮問委員を務めているため、各種の政権および省庁内の資料収集が可能であり、独自の観点や資料を提示することができる。そこで、政治的な資料収集については韓国国内のものを初年度より先行させ、その上で日本の同様の資料を当たるという手法をとる。
「形象」に関する芸術学的考察

芸術の問題を狭い範囲でとりあつかわれるのを避け、広義な意味での「形象」という概念でとりあげ、そこで他のジヤンルの表現形態との関連をさぐってきた。Formという言葉は哲学、生理学、言語学などでも使われるが、19世紀末から精神科学の領域にも適用されている。それはデイルタイの形象学的解釈学であり、それは世界観に諸々の類型があり、その形成の合法則性を認識しなければならないとするものである。またゲシユタルト心理学においては、目に直接与えられた形象がそれ以上還応できない事実であるとする。さらにフッサールの現象学は、彼が「根本現象」と呼ぶ本質的な現象を把握を目指すものであった。カッシラ-の「象徴形式の哲学」では、カント的な「慣性」や「感性」と区別しその新たなる総合を目指したのであった。又「構造主義」においても、構造を形象学的にとらえている。この流れはプラトンのイデア論のようにまず「神」とか「イデア」といった背景の観念から発し、それが「形相」としてアリストテレスが述べるような4つの因果性(質料、形相、運動、目的)からなるものとする。伝統的な概念と対立するものである。あるいは近代的なプラトン批判の系列に属する。イデアだけが本来実在するものであるとするのに対し、形象だけが本来実在し、そこから観念、が生まれる、というものである。われわれの研究成果はこのように西洋のプラトンから発する観念的な立場と反対の、物象そのものを「形象」としてとらえる立場の中から、さらに実践的に芸術作品そものの分析を通してその実相を明らかにするものである。研究代表者は美術作品を通して、そこから解釈できるさまざまな思想-イデアを抽出した。とくにミケランジエロ、レオナルド・ダ・ヴィンチなどの芸術作品はまさに「形象学」の対象として深い考察を行なった。又各分担者はそれぞれの分野から以上の方法論的な意識をもって考察を行なっている。形象(形態)=FORMという言葉は哲学、生物学、言語学などの諸学にわたっているが、とくに美術史を中心にすえて、その芸術学的考察を行うために、各分担者と何度か検討を行った。とくにゲーテが行った形象学的考察は、生物学上の形象を扱ったものであるが、これは生物学のみならず、19世紀末から精神科学の領域にも適用されるようになったことを検討した。その思潮は5つに分けられることがわかった。(1)ディルタイの形象学的解釈学は、世界観には諸々の類型があり、その形成の合法則性を認識しなければならないとするもので、シュプランガーの「文化形態学」やシュペングラーの「世界史の形象学」のなかでも継承されている。(2)ゲシュタルト心理学は、形象が要素に還元できないと考える「ホーリスム」と要素への還元を目指す還元論に別れて行った中で、心理学における「ホーリスム」というべきものである。この立場によれば、目に直接に与えられた形象は究極的な、それ以上還元できない事実であるとする。(3)フッサールの現象学、ゲーテの形象学やゲーテの色彩論は、彼が「根本現象」と呼ぶ本質的な現象の把握を目指すものであった。これは、フッサール以降の現象学に於て同じ試みがなされている。フッサール自身はゲーテの研究は知らなかったが、現象学派の一部はゲーテをその先駆者と見なしていた。

(4)カッシーラーの「象徴形式の哲学」では、ゲーテが思惟と感性の関係を問題にしたと考え、これをカント的な「悟性」や「感性」と区別し、その新たなる統合を目指したのである。(5)「構造」主義の役割として、ゲーテの形態学があり、レヴィ・シュトロースやチョムスキーが「構造」の新しい捉え方へと導かれて行った。以上5つの潮流があるが、このE.カッシーラーの「象徴形式の哲学」がパノフスキーに影響を与え、全ての知は結局のところ現実の形象化に発するとの考えを受け継ぎ、その形象化のうち典型的なものを芸術と考える。その自由な精神的活動が形象へと変貌するとき、そこに存在の全体性として表現されるのである。「形象」Formという概念は狭義の意味での美術のそれであれ、広義の意味での自然や社会のそれであれ、あくまで対象そのもののあり方を問題にしている。これは「イデア」だけが本来実在する、というプラトン的な西洋思想に対して、「形象」からそこに精神性、観念性の人間の表現を見出し、自然そのものの人間にとっての意味をさぐる態度から出発している。それはすでにディルタイが形象学的解釈学にも示され、世界観に諸々の類型があるという考察に結ひついている。又ゲシュタルト心理学においての形象の重要性や、又フッサールの現象学における「現象」の中にも包含されるものでもある。カッシラ-は「学術形式」の哲学において、カント的な「悟性」や「感性」の新たなる統合を目指した態度とも関連している。このような広い意味での「形象学」の近代における成果をふまえて、それを「芸術」解釈学とどのような関係を生み出すか考察した。「芸術論」の系譜をたどればパノフスキーの「イデア」にもあるように、プラトンが芸術を否定し「ミメ-シス」論を展開したがそこには「イデア」だけが存在するのであつて芸術は存在する必要はないものであった。しかし、プラトン主義者たち、プロティノスアウグスティヌスからフィチ-ノまで「芸術」がその「イデア」を反映し、「芸術」こそがそのイデアから発する「美」の顕現であると考えられた。しかしはじめにプラトンが、イデアとエイドス(formの原語と考えられる)を一致したものと見られたものが次第にイデアだけが注目され、形相(エイドス)が二義的なものとなり,アリストテレスにおいては質料との関連においてと考えられるようになった。しかし上記近代の「形象学」は、まさにそれと逆の立場で、物象そのものから発する「現象学」的立場から発している。しかしフィードラ-をはじめとする芸術作品の形成の問題を考えなから、さらに人間の創造物を新たな立場で解釈することが必要となる。上記研究分担者はその立場からそれぞれの分野において成果をあげた。
対称二分裂におけるオルガネラ分配の質的非対称性の解明

動物、植物、菌類など多くの生物を構築する真核細胞は、ミトコンドリアなどオルガネラを含み、これらは細胞分裂時に母細胞から娘細胞へ分配される。動物の幹細胞やパン酵母は、非対称に分裂し、寿命の異なる二つの娘細胞に分かれる。この際、オルガネラ分配は非均質であり、例えば新しいミトコンドリアは、寿命が長い細胞に選択的に分配される。これは生物の生存戦略の一つであると考えられている。私達は、一見、対称分裂で増殖する細胞においても同様の戦略が存在する可能性を検証した。本研究では、対称分裂を行う生物でもペルオキシソームというオルガネラが非均質に分配されることを示し、そのメカニズムを解明するツールを得た。真核細胞は、固有の機能を担う細胞小器官、即ちオルガネラを含み、これらは細胞分裂時に母細胞から娘細胞へと分配される。動物の幹細胞や出芽酵母は、非対称に分裂し、寿命の異なる二つの娘細胞に分かれる。近年、興味深いことに、オルガネラが非均質に分配されることが娘細胞間の差に寄与することが分かってきた。しかしながら、対称分裂を行う生物でも、オルガネラの非均質な分配が見られることが示唆されており、細胞の寿命や分裂について新しい問題が提起されている。本研究は、対称分裂で増殖する単細胞紅藻Cyanidioscyzonmerolae(シゾン)をモデルに、真核生物の対称分裂におけるオルガネラ分配の質的非対称性を明らかにすることを目的としている。<ミトコンドリアの非均質な分配について>ヒト幹細胞では、非均質な分配の前提となる質の異なるミトコンドリアがミトコンドリア分裂時に生じる可能性が示唆されており、この可能性を検証することにした。シゾンはほぼ全てのオルガネラを1つずつしか含まず、明暗周期によって細胞分裂とそれにともなうオルガネラ分裂を同調化できる。28年度は研究の基盤として、(i)ミトコンドリア分裂のダイナミクスをライブイメージングによって明らかにした。さらに、(ii)ミトコンドリアタンパク質の質の違いとして、新旧、すなわち合成されてからの時間を識別できるシステムを確立中である。<ペルオキシソームの非均質な分配について>シゾンではペルオキシソームの酵素であるカタラーゼが非均等に分配されることがある。この過程をさらに解析するにあたり、(iii)カタラーゼのライブイメージング系を構築した。また、(iv)細胞質分裂は短時間でおこり、オルガネラがどのように分配されたか解析しにくいという問題があったため、遺伝子操作により細胞質分裂をコントロールできるシステムを構築した。平成28度はミトコンドリア、ペルオキシソームの分裂過程をライブイメージングで明らかにした。また、細胞質分裂を特定の段階で停止させる仕組みを構築することができた。今年度は、これらを利用してさらに研究を進めていくことができると考えている。一方、ミトコンドリアの質的に異なるタンパク質を検出するシステムについては、改良が必要である。28年度は質の違い(タンパク質から合成されてからの時間)を区別できるよう、相同組換えにより、SNAP-tagのついたミトコンドリアタンパク質を安定して発現する株を作成した他、GFP融合ミトコンドリアタンパク質をヒートショックプロモーター下で一過的に発現させる株を作成した。SNAP-tag融合タンパク質を発現する細胞にSNAP-tag用の蛍光試薬を添加すると、共有結合によってtagが蛍光ラベルされる。一過的にラベルすることによって、ラベルした時期に存在するタンパク質だけを標識することができる。作製したミトコンドリアタンパク質-SNAP-tag株では、蛍光標識をしたところ、ミトコンドリアを標識することは可能であったが、実験にはより高いラベリング効率が必要である。また、ヒートショックプロモーター下でGFP融合ミトコンドリアタンパク質を発現させる株は、一過的にヒートショックを与えることにより、誘導時に合成されたタンパク質だけをGFPで検出できる。観察に十分なGFPの輝度を得られるよう、現在改良を進めている。しかしながら、対称分裂を行う生物でも、オルガネラの非均質な分配が見られることが申請者らの実験で示唆されており、細胞の寿命や分裂について新しい問題が提起されている。本研究は、対称分裂で増殖する単細胞紅藻Cyanidioscyzonmerolae(シゾン)をモデルに、真核生物の対称分裂におけるオルガネラ分配の質的な非対称性(非均質性)を明らかにすることを目的とした。本研究課題では、特にタンパク質の合成されてからの時間(新旧)に着目し、ミトコンドリアとペルオキシソームについて解析した。オルガネラタンパク質の新旧を区別する種々のシステムを検討し、ヒートショックにより一過的にGFP融合ミトコンドリアタンパク質を発現させる系を構築した。ミトコンドリア分裂が開始する12時間前にこれらのタンパク質を一過的に発現させ、対になる娘ミトコンドリアにおけるGFPの輝度を比較した。有為な差は見られず、ミトコンドリアのタンパク質分配は均等(均質)であることが示唆された。しかしながら、本システムで検出できる新旧の差が、十分大きくなかった可能性もあり、さらなる検討が必要である。

ペルオキシソームについては、細胞が持つ本来のカタラーゼが一定の頻度で不均等分配されるのに対し、GFPを融合したカタラーゼは均等二分配されることが分かった。カタラーゼは結晶構造をとることが知られ、結晶構造が分配に影響する可能性や、GFPが結晶構造に影響する可能性がある。今後は本知見をもとに不均等分配のメカニズムが解明されると考えられる。動物、植物、菌類など多くの生物を構築する真核細胞は、ミトコンドリアなどオルガネラを含み、これらは細胞分裂時に母細胞から娘細胞へ分配される。動物の幹細胞やパン酵母は、非対称に分裂し、寿命の異なる二つの娘細胞に分かれる。この際、オルガネラ分配は非均質であり、例えば新しいミトコンドリアは、寿命が長い細胞に選択的に分配される。これは生物の生存戦略の一つであると考えられている。私達は、一見、対称分裂で増殖する細胞においても同様の戦略が存在する可能性を検証した。本研究では、対称分裂を行う生物でもペルオキシソームというオルガネラが非均質に分配されることを示し、そのメカニズムを解明するツールを得た。今後は、進捗状況に述べたよう、ミトコンドリアタンパク質の質的な違いを検出できる株について改良を行い、ミトコンドリアタンパク質がどのように分配されるか解析をすすめる。さらに、娘細胞間でミトコンドリアの質的な違いが検出された場合には、セルソーターを用いて、異なるミトコンドリアを持つ娘細胞の集団を分離し、それぞれの細胞の増殖速度や、熱、pH、重金属、活性酸素などのストレス下で培養し、増殖によって環境適応能の差を評価するなど、非均質なオルガネラ分配が細胞生理に与える影響を多角的に検証する。さらに、ペルオキシソームについても非均等分配の頻度やメカニズム、非均等分配が娘細胞にあたえる生理的違いについて同様の検証を行っていく。細胞生物学必要な試薬を年度末に発注していたが、納品が間に合わなかったため残額が生じてしまった。納品が間に合わなかった試薬を再度発注し、購入する予定である。