hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造血幹細胞移植における口腔管理及び慢性口腔GVHDの病態解明に関する検討

造血幹細胞移植時の口腔粘膜障害の重症度を軽減する因子として専門的口腔清掃が選択され、移植時の口腔ケアの有用性が証明された。また口腔慢性GVHD患者の口腔粘膜について蛍光観察法で検討したところ、口腔粘膜症状が改善したと評価した症例を蛍光観察法で評価すると炎症が残存している可能性が示唆された。またNIH OMSと口唇組織の病理組織所見とは関連性を認めたが、小唾液腺組織とは関連性は認めなかった。HPV感染を示唆する免疫染色P16の検討については、口腔慢性GVHDの口唇組織、小唾液腺組織で陽性例が多く、HPV感染と口腔慢性GVHDの病態と何らかの関連性があることが示唆された。造血幹細胞移植は、近年は骨髄移植のみだった移植法も多様化し、適用は高齢者にも広がり、移植成績が向上するにしたがい慢性GVHDが生命予後に影響を与える因子として問題になっている。また移植対象の高齢者が増えることで移植前後の口腔管理が重要になってきている。本研究の目的は、1造血幹細胞移植患者の口腔内環境の調査、GVHD患者の口腔衛生状態、口腔内環境の調査を行い検討する。その結果から造血幹細胞移植患者の口腔管理法を検討し口腔有害事象を減少させることである。2慢性GVHDの口腔内病変を病理学的、免疫学的に明らかにすることである。当該年度は、造血幹細胞移植患者のデータベースを作成するために、過去5年分の患者基本情報(原疾患、移植法、血培結果、急性GVHDの有無、慢性GVHDの有無など)、口腔内の基本情報(口腔内基本検査、X線所見、口腔有害事象の有無、移植前後の歯科処置の有無、口腔慢性GVHDの有無、口腔乾燥の有無、味覚障害の有無)を収集し、一部の情報については解析を行った。造血幹細胞移植時の口腔管理については、実際に口腔管理を行うことで現在データを収集している。口腔慢性GVHDの診断を得るため口唇生検を実施している。その検体を用いてHPV感染の有無を検討するため、p16免疫組織染色を行った。結果は造血幹細胞移植患者の口唇粘膜、小唾液腺では高頻度でHPV感染を示唆する結果であった。またHPV感染の検討に関しては分子病理学的解析を行うために、口唇生検の検体(パラフィン切片)からDNAを抽出して予備実験を行った。造血幹細胞移植は、近年は骨髄移植のみだった移植法も多様化、適応も高齢者までに広がっている。しかし、治療成績が向上するにしたがい慢性GVHDなどが問題となっている。以前は移植患者の対象が若年者のみだったが、高齢者に適応が広がったことにより、移植前後の口腔管理が重要になってきている。2慢性GVHDの口腔内病変を病理学、免疫学的に検討していくことである。1造血幹細胞移植患者の口腔内環境の調査、GVHD患者の口腔衛生状態、口腔内環境の調査については、造血幹細胞移植患者の口腔管理法を検討し口腔有害事象を減少させることである。本年度は、前年度で作成した造血幹細胞移植患者のデーターベースを利用し、解析を行った。造血幹細胞移植時の口腔有害事象と、口腔管理内容の関係性について多変量解析を実施した結果、移植時の口腔粘膜炎の重症度と移植直前の口腔清掃の有無について関連性を認めた。2慢性GVHDの口腔内病変を病理学、免疫学的に検討することであるが、口腔慢性GVHDの診断のために、口唇生検を実施するが、その試料を用いて、p16の免疫染色を実施した。高頻度でHPV感染を認めていた。また口唇生検部、頬粘膜の粘膜性状の蛍光観察を開始した。分子病理学的に口唇生検組織からHPV感染の有無を明らかにする検出法を検討した。当該年度に予定していた研究内容はほぼ実施できているため。造血幹細胞移植は、近年は移植法も多様化し、60歳以上でも可能になってきている。移植成績が向上するにしたがい、移植後の慢性GVHDなどが問題となっている。以前は移植患者の対象が若年者のみだったが、高齢者にも適応が広がったことにより、移植前後の口腔管理が重要になっている。本研究の目的は、1造血幹細胞移植患者の口腔内環境、慢性GVHD患者の口腔衛生状態の調査を行い検討する。2慢性GVHD患者の口腔病変を病理学、免疫学的に検討することである。造血幹細胞移植患者の口腔内環境、慢性GVHD患者の口腔衛生状態の調査、また造血幹細胞移植患者の口腔管理法を検討した。昨年度の研究成果として、口腔粘膜障害の重症度に関連する因子として移植時の口腔管理介入の有無が選択された。本年度は移植患者全例に口腔管理介入を行い、結果については現在解析中である。NIH Oral Mucosal Scoreと口腔生検所見、またNIH Oral Mucosal Scoreと口腔粘膜の蛍光観察所見の比較検討では、症例収集は終了し、現在解析中である。分子病理学的手法を用いて口腔生検組織からHPV感染の有無を明らかにする検出法の検討も現在継続中である。

NIH Oral Mucosal Scoreと口腔生検所見、NIH Oral Mucosal Scoreと口腔粘膜の蛍光観察所見との比較検討、分子病理学的手法を用いて口腔生検組織からHPV感染の有無を明らかにする検出法に関する検討は、本年度で終了することができなかったため、次年度に研究期間を延長し、検討を行うことにした。造血幹細胞移植は、近年は移植法も多様化し、60歳以上でも可能になってきている。移植成績が向上するにしたがい、移植後の慢性GVHDなどが問題となっている。以前は移植治療の対象が若年者のみだったが、近年は高齢者にも適応が広がったことにより、口腔環境が不良の患者が増加し、歯性感染症の増加、口腔粘膜障害の重症化が問題となった。移植開始前から歯科による専門的口腔管理を行うことで口腔有害事象が減少したという報告もあり、専門的口腔管理を行うことが推奨されている。本研究の目的は、1造血幹細胞移植患者の口腔内環境、慢性GVHD患者の口腔衛生状態の調査を行い検討する。2慢性GVHD患者の口腔病変を病理学、免疫学的に検討することである。造血幹細胞移植患者の口腔内環境、慢性GVHD患者の口腔衛生状態の調査、また造血幹細胞移植患者の口腔管理法を検討したところ、口腔粘膜障害の重症度に関連する因子として移植前の専門的口腔清掃が選択された。当科の造血幹細胞移植患者全例に専門的口腔清掃を導入したところ、口腔粘膜障害の重症度は軽減した。また口腔慢性GVHD患者の口腔粘膜について蛍光観察法で検討したところ、口腔粘膜症状が視診では改善したと評価した症例で、蛍光観察法で評価すると炎症が残存している可能性が示唆された。NIH Oral Mucosal Score(NIH)と口唇組織との関連性については、NIH OMSと口唇組織の病理組織所見とは関連性を認めたが、小唾液腺組織とは関連性は認めなかった。HPV感染を示唆する免疫染色P16の検討を行ったが、口腔慢性GVHDの口唇組織、小唾液腺組織で陽性例が多く、HPV感染と口腔慢性GVHDの病態と何らかの関連性があることが示唆された。造血幹細胞移植時の口腔粘膜障害の重症度を軽減する因子として専門的口腔清掃が選択され、移植時の口腔ケアの有用性が証明された。また口腔慢性GVHD患者の口腔粘膜について蛍光観察法で検討したところ、口腔粘膜症状が改善したと評価した症例を蛍光観察法で評価すると炎症が残存している可能性が示唆された。またNIH OMSと口唇組織の病理組織所見とは関連性を認めたが、小唾液腺組織とは関連性は認めなかった。HPV感染を示唆する免疫染色P16の検討については、口腔慢性GVHDの口唇組織、小唾液腺組織で陽性例が多く、HPV感染と口腔慢性GVHDの病態と何らかの関連性があることが示唆された。当該年度に予定していた検討内容はほぼ実施できているため。当初の研究計画通りに今年度も研究を行う。また定期的に研究協力者に研究方法、結果について意見をもらい、問題がある場合は計画を修正していく。本年度に終了できなかった検討項目について終了させる。また研究協力者と密に連絡をとり、助言をもらいながら、終了していない項目を終了し、研究成果をまとめる。口腔内科当初の研究計画通りに今年度も研究を行う。前年度の分子病理学検討で、高額試薬を購入せずに研究を行えたこと、人件費・謝金の使用がなかったため、次年度に繰り越し金が生じた。前年度に予定していた分子病理学検討で、高額試薬を購入しなかったことと、統計処理を行うPCなどを購入しなかったため。
除草剤抵抗性植物細胞の選抜・再分化と抵抗性酵素

スルホニルウレア系除草剤は、極めて低濃度で植物分岐アミノ酸生合成の初段階の酵素アセトラクテート合成酵素(ALS)を阻害することにより、分岐アミノ酸・蛋白含量を減少させ、生育を抑制する。ベンスルフロンメチル(BSM)を含む培地で段階的選抜で得られたニンジンあるいはイネ懸濁培養細胞はそれぞれ10^<-7>Mあるいは10^<-5>MBSMに抵抗性であるが、BSM処理によるアミノ酸・蛋白含量の低下がわずかで、また、ALSの阻害が小さく、感受性低下が見られた。BSM抵抗性ニンジン細胞の生育はスルホニルウレア系のピラゾスルフロンエチル(PE)やイミダゾリノン系のイマザキン(IQ)に対し交差抵抗性が示された。ALSの阻害様式は、感受性・抵抗性細胞とも、BSM、PEはピルビン酸と非拮抗(混合)型で、IQでは不拮抗型であった。ピルビン酸のミカエリス定数(Km)は抵抗性細胞で大きくなる傾向であった。両細胞のALS阻害度の差は、BSMで約100倍あったが、PE、IQでは数倍で交差抵抗性は小さかった。分岐アミノ酸によるフィードバック阻害は同程度に見られた。植物ALSは不安定であり電気泳動等を用いた分離精製ができなかったが、粗酵素のゲル濾過カラムクロマトグラフィにより2つの活性ピークが検出された。2番目のピークはBSM及びアミノ酸により阻害されたが、抵抗性細胞ではBSMによる阻害が小さかった。分岐アミノ酸含量は抵抗性細胞の方が1.5数倍高く、ALSのフィードバック阻害に対する感受性の低下に由来し、一方、可溶性蛋白質の組成は、SDS-PAGEで調べると処理による変化がほとんどなく、分岐アミノ酸含量の変化とは関連していないように思われた。以上によりBSM抵抗性はBSMや分岐アミノ酸に対する感受性低下やKmの変化で示されるALS酵素の変異が主要因と考えられる。スルホニルウレア系除草剤は分岐アミノ酸生合成の初段階のキーエンザイムのアセトラクテート合成酵素(ALS)を阻害することにより殺草効果を示す。ニンジン懸濁培養細胞を低濃度のベンスルフロンメチル(BSM)に段階的に数ヵ月間暴露することにより10^<-8>10^<-6>Mに抵抗性の細胞を得た。ALS活性は、感受性細胞ではBSMにより強く阻害されたが、抵抗性が進むにつれて総活性が低下すると共に阻害度が小さくなり不感受性化が進んでいた。10^<-7>M BSM抵抗性細胞の生育はスルホニルウレア系のピラゾスルフロンエチルやイミダゾリノン系のイマザキンに交差抵抗性を示した。ALSの阻害は感受性抵抗性ともBSM、ピラゾスルフロンエチルではピルビン酸に対して非拮抗(混合)型で、イマザキンでは不拮抗型であった。ピルビン酸のミカエルス定数は抵抗性細胞で大きくなる傾向であった。ALS阻害度の差はBSMで約100倍あったが、ピラゾスルフロンエチル、イマザキンでは数倍で交差抵抗性は小さかった。分岐アミノ酸によるフィードバック阻害は両細胞で同程度に見られた。植物ALSは不安定であり電気泳動での分離ができなかったが、ゲル濾過カラムクロマトグラフィによりALS粗酵素を分離すると主な2つの活性ピークが検出された。2番目のピークはBSM及びアミノ酸により阻害されたが、抵抗性細胞ではBSMによる阻害が小さくなっていた。BSM抵抗性への薬剤の吸収・代謝要因の寄与はあまり大きくないと考えられた。以上よりBSM抵抗性はALSのBSM感受性の低下・不感受性化やKmの変化で示される酵素の変異が主要因と考えられる。

スルホニルウレア系除草剤は、極めて低濃度で植物分岐アミノ酸生合成の初段階の酵素アセトラクテート合成酵素を阻害することにより生育を抑制する。それにより分岐アミノ酸含量と共に蛋白質含量も減少する。ニンジン及びイネの懸濁培養細胞では、それぞれ10^<-7>M及び10^<-5>Mベンスルフロンメチル(BSM)処理により生育が抑制され、それに応じて分岐アミノ酸及び蛋白質含量が4050%以上減少した。電気泳動(SDS-PAGE)で、細胞の可溶性蛋白質を分析すると多数のバンドが検出されたが、蛋白質組成は処理による変化がほとんどなく、分岐アミノ酸含量の変化とは関連していないように思われた。ニンジンの10^<-7>M、イネの10^<-5>M,BSM抵抗性細胞ではBSM処理によるアミノ酸含量及び可溶性蛋白質含量の減少はほとんどなく蛋白質組成の変化も見られなかった。蛋白質組成は感受性細胞と比べると若干の違いが認められた。この蛋白質及びALS蛋白の同定は今後の課題である。一方、抵抗性細胞の分岐アミノ酸含量は感受性細胞よりはるかに(1.5倍数倍)高く、in vitroでの結果と合わせ、ALSのフィードバック阻害に対する感受性が低下していることに由来すると考えられる。ダイス培養細胞はBSMに非常に感受性であり(生育50%阻害濃度5×10^<-10>M)、抵抗性細胞は選抜されなかった。これらのALSに種による差異があるかどうかも今後の課題である。
化学気相蒸着法によるFe/非磁性金属/Fe超格子ナノワイヤ作製と磁気特性評価

本研究では強磁性ナノワイヤ構造体を自在に創成する技術を確立するため、独自に開発を進めてきた化学気相蒸着法(CVD法)を改良して、単一プロセスでFe/非磁性金属(NM)/Fe超格子構造をナノワイヤに作り込み面直通電型巨大磁気抵抗効果(CPP-GMR)を評価することを目的とする。FeナノワイヤがVS機構で成長すること、FeとNMがエピタキシャル成長可能であることに着目して原子レベルで平坦な界面を持つFe/NM/Fe超格子構造を1本のナノワイヤに構築することを目指す。本研究が発展すれば、強磁性体を利用したナノ構造をナノワイヤ中に自在に作り込むことができるようになる。
試験管内再現系を用いた、クロマチンの構造制御/転写活性制御の解析

クロマチン構造を変化させる因子と、その因子がもたらす具体的な構造変化の相関を明らかにすることを目指し、以下のことを明らかにした。(1)コアヒストンのアセチル化によりもたらされるヌクレオソーム間の反発力の強化と、リンカーヒストン依存的ファイバーの太さの変化を明らかにした。(2)ヌクレオソームのスライディングや解離の様子を、高速AFMによる動画観察により可視化解析を行った。(3)複製開始領域を決定するORCにより形成されるクロマチン/ORC複合体のAFM可視化解析を行った。本年度の研究計画の、「(i)試験管内で長鎖ヌクレオソームファイバーを、"凝縮転写不活性型"あるいは"弛緩転写活性型"クロマチンへと操作する系の確立を行なう」については、高度にアセチル化されたコアヒストンを用いたクロマチン再構成に成功し、"弛緩転写活性型"クロマチンの作製に成功した。このクロマチンは、アセチル化されていないクロマチンに対し、塩濃度依存的なクロマチン凝集能が低いことを示した。"凝縮転写不活性型"クロマチンの作製は、現在進行中である。「研究計画(ii)AFMによる構造解析を行なう」については、凝縮型・弛緩型クロマチンの比較の前段階として、新たなクロマチン観察方法の開発に重点を置いて研究を実行した。すなわち、研究発表(雑誌論文)Suzuki Y. etal(Ultramicroscopy)に発表したとおり、高速AFMによるヌクレオソームの動画撮影に成功し、ヌクレオソームのDNA上でのスライディングや、ヌクレオソームがDNA上から脱落する様子を、分子イメージングすることに成功した。この動画撮影は、2flame/secondで取得されたものであり、ヌクレオソームの動的性質を追跡するうえで、前例のない新規な解析例である。「研究計画(iii)再構成高次クロマチン複合体の生化学的性質を解析する」および「研究計画(iv)GFP融合タンパク質を発現する細胞のセットアップ」については、分裂酵母の材料を用いて実行した。リンカーヒストンを持たない分裂酵母のクロマチンにリンカーヒストンを加えた影響を調査する目的で、再構成分裂酵母クロマチンにリンカーヒストンを加え、MNase処理を行い、分裂酵母クロマチンに対してもリンカーヒストンは凝集能を持つことを証明した。また、GFP融合リンカーヒストンを発現する分裂酵母細胞株を作製した。出芽酵母を材料として、クロマチン構造と複製制御、更には、転写活性の異なる領域間における複製開始制御の相違について調査するため、出芽酵母クロマチンの再構成系とその原子間力顕微鏡(AFM)観察手法を確立した。まず、大腸菌で発現させた酵母コアヒストンのサブユニットから、コアヒストンオクタマーを形成させ、精製・単離した。それを用いて、ヌクレオソームファイバーを形成させ、原子間力顕微鏡により観察することに成功した。また、複製開始点(ARS)配列を含むDNAと、複製開始点を決定するORC複合体の相互作用をAFM観察により解析した。その結果、ARS配列非依存的にDNA上にORC複合体が結合している様子が観察された。現在、ORCと再構成ヌクレオソームファイバーとの相互作用の可視化解析に挑戦している。更に、酵母細胞内から、ヒストンやORC複合体、MCM複合体などのタンパク質と相互作用したままの状態のプラスミドを精製し、AFM観察に供した。細胞周期が、非同調およびG1期同調の酵母細胞内から1.8kbのプラスミドを精製し、Pre-RCと思われる複合体(ヌクレオソームよりも明らかにサイズの大きな構造体)がDNA上に相互作用している様子が観察された。ヌクレオソーム構造に加え、ORCやMCM等の複合体が相互作用したクロマチンファイバーを解析する上で、AFMにより観察されたDNA上の"物体"がどのタンパク質であるかを特定することは、困難であるが重要な課題である。これを解決する手段として、AFMの探針の先端に特定のタンパク質を認識する抗体を接着して、これを用いてAFM観察を行ない、特異的タンパク質のAFM像内での位置を特定する手法が挙げられる。その技術の確立を目指し、Actinin-4タンパク質を、抗Actinin-4抗体により修飾したAFM探針により観察し、AFM画像内でのその位置を特定することに成功した。遺伝子の転写活性が高いクロマチン領域は複製開始の時期が他の領域と比較して早期であるなど、遺伝子活性とDNA複製との相関性についてはこれまでの多くの報告がなされている。本研究では、遺伝子活性と相関したクロマチン構造の研究のアプローチとして、「クロマチン構造とDNA複製制御」に焦点を絞り、本年度は研究を遂行した。<複製開始の制御(ORCの複製開始点(ARS)領域への特異的結合)における、ヌクレオソームの役割の追究>真核生物の複製はゲノム上の複数の位置から開始されるが、その開始領域のDNA配列が特定されている実験生物は出芽酵母だけである。

本研究では、出芽酵母のARSを含むDNA上にクロマチン再構成を行い、複製開始領域結合因子であるORC(Origin Recognition Complex)を加え、生化学的解析および原子間力顕微鏡による観察を行なった。その結果、DNAを用いるよりもクロマチンを用いた方が、ORCとARSのDNA配列特異的な結合が促進される様子が検出された。また、ORCを加えることによりARS付近のヌクレオソームのポジショニングが影響を受けること、さらに、ORCは、リンカーDNAとヌクレオソームとの二つの結合を両立して安定にARS上に結合することが示唆された。前記のように、複製開始領域のDNA配列のモチーフが酵母以外で見つからなかったことから、"クロマチン構造が複製開始点の決定に影響を及ぼしている"というモデルはこれまでに提唱されていたが、本研究において初めて、クロマチンがORCとARSとの結合の特異性と安定性に寄与するという実験的証明を行なった。ORCに引き続いて複製開始領域に集合するCdc6,Cdt1,MCM複合体のAFM観察を開始した。これら因子を、ORCとともにDNAに添加し、AFM観察を行なったところ、ORCよりも大きな複合体がDNA上に形成されている様子が検出された。今後、本実験条件を改良し、複合体の会合様式(観察された大きな複合体内でのMC賊複合体の空間配位)を同定することを目指す。
カーボンナノチューブを用いた蛋白質の光クロマトグラフィ

当該研究ではカーボンナノチューブをリガンドとするカラム(カーボンナノチューブカラム)を作製し、光照射によって蛋白質を分離する新規技術開発に取り組んだ。カーボンナノチューブカラムには芳香族アミノ酸、とりわけトリプトファンを保持する性質があり、また、システインを酸化させてジスルフィド結合を形成する作用があることが明らかになった。したがって、蛋白質を精密に分離するためには、芳香族アミノ酸残基を介した蛋白質の過剰な非特異的吸着を抑制するとともに、システイン残基の酸化を抑制することが必須であると考えられる。本研究ではカーボンナノチューブをリガンドとするカラムを作製し、光を使用した蛋白質精製システム「光クロマトグラフィ」を開発する。本精製法では、溶媒を変えることなく、光照射により蛋白質のカラムへの吸着・脱着を制御するため、溶離液を用いる従来法では不可能であった、凝集・変性しやすい不安定な蛋白質の精製が可能になる。当手法は抗体などの多様なバイオ医薬品の高純度・高効率な精製に応用可能であり、バイオ医薬品の発展に大きく貢献するとともに、次世代のバイオテクノロジーの基盤技術となる。当該年度ではリガンドとなるカーボンナノチューブの担体への結合の検討を行った。従来報告のあるアミノ基で修飾されたシリカゲルへのカーボンナノチューブの結合を確認できた。有機溶媒中だけでなく、酸性から中性のpH領域にある水溶液中でも結合は安定であることが実証され、蛋白質分離への使用に有効であることが明らかになった。カラム作製のための予備実験としてカーボンナノチューブが結合したシリカゲルと結合していないシリカゲルへの蛋白質(ウシ血清アルブミンとニワトリ卵白リゾチーム)の吸着を比較したところ、カーボンナノチューブが結合したシリカゲルへの吸着量のほうが大きく、これらの蛋白質とカーボンナノチューブの相互作用を確認することに成功した。今後は蛋白質とカーボンナノチューブの相互作用が制御可能であることを実証することが本テーマを確立させる上で必須である。12月にカラム担体作製のための実験に使用していた遠心分離装置に不足の故障が生じたため、当該装置の修理・調整が必要となり、遅延が生じた。本精製法では、光照射により蛋白質のカラムへの吸着を制御し、従来には無い蛋白質の溶出法を確立させる。当該年度ではカーボンナノチューブを結合させた担体を用いて、カーボンナノチューブに対する蛋白質の吸着力をバッチ吸着試験で評価した。モデル蛋白質としては、ニワトリ卵白リゾチームを用いた。蛋白質をカラム溶出するためには、カーボンナノチューブに対する蛋白質の非特異的な吸着を防ぐことも重要であり、アミノ酸の一つであるアルギニンが非特異的吸着の抑制に有用であることを見出した。さらに、カーボンナノチューブへの蛋白質の吸着は主として芳香族アミノ酸によって引き起こされるものであることを、カーボンナノチューブを固定化したカラムクロマトグラフィにアミノ酸を流す実験で明らかにした。芳香族アミノ酸の中でも、とりわけトリプトファンのカーボンナノチューブに対する親和性が強いことが示された。また、これらの一連の研究の過程で、アミノ酸の一つであるシステインがカーボンナノチューブと反応してジスルフィド結合を形成することを発見した。この結果は蛋白質をカーボンナノチューブをリガンドとするカラムに流す際に、蛋白質の構造変化や会合を引き起こす可能性を示唆するものであり、ジスルフィド結合形成反応を抑制することも本テーマを完成させる上で必須であると考えられる。初年度に遠心分離器の故障があり、繰越申請などを行ったため、一部の研究進捗がやや遅れている。しかしながら、最終年度に予定していたカーボンナノチューブカラムを前倒しで試作することに成功し、カラム中でのアミノ酸の挙動などを明らかにするなどの一定の成果を出すことができており、全体的には概ね順調と判断できる。当該研究ではカーボンナノチューブをリガンドとするカラムを作製し、新規の蛋白質の精製システムを開発することを目的としている。当該精製システムでは、光照射により蛋白質のカラムへの吸着を制御し、従来にはない蛋白質の溶出法を確立させる。当該年度では昨年度までに明らかになったカーボンナノチューブによるシステインのジスルフィド結合形成の物性を詳しく調査することで、カーボンナノチューブと蛋白質の相互作用を詳細に理解することに注力した。その結果、カーボンナノチューブの溶液中での酸化還元反応がシステインのジスルフィド結合の酸化還元反応と共役していることが明らかになった。このようなカーボンナノチューブとシステインの相互作用は還元変性させたニワトリ卵白リゾチームやヒト血清アルブミンにおいても観察されたことから、カーボンナノチューブと蛋白質のシステイン残基の間に起こる普遍的な化学反応の一つであることが示唆される。加えて、水溶液中におけるカーボンナノチューブの酸化還元反応はカーボンナノチューブ表面に吸着した分子の構造や密度に影響を受けることが分子動力学計算と分光学的実験から明らかになった。以上のように、当該研究ではカーボンナノチューブとシステインの化学反応という予想外の物性が明らかになり、この物性の全容解明が当該技術の開発に必須であると考えられたため、当初予定していた光照射による溶出の実証は今後検討することになる。

カーボンナノチューブカラムには芳香族アミノ酸、とりわけトリプトファンを保持する性質があり、また、システインを酸化させてジスルフィド結合を形成する作用があることが明らかになった。したがって、蛋白質を精密に分離するためには、芳香族アミノ酸残基を介した蛋白質の過剰な非特異的吸着を抑制するとともに、システイン残基の酸化を抑制することが必須であると考えられる。当該研究で明らかになった蛋白質とカーボンナノチューブの相互作用をさらに詳細に定量的に調査するとともに、溶液環境や光照射等によってこれらの相互作用が制御可能であることを実証することで、当該技術の有用性を示す。本年度に明らかになったカーボンナノチューブと蛋白質またはアミノ酸との相互作用に関する知見をもとに、蛋白質分離用の光クロマトグラフィを完成させる。そのためには、カーボンナノチューブに対する蛋白質の非特異的な吸着や化学反応をさらに抑制するための溶液条件の検討を行う必要がある。必要に応じて分子動力学計算を利用し、その分子機構を明らかにする。加えて、最近の研究進捗によって、カーボンナノチューブの表面物性は光だけでなく、酸化還元剤に寄っても制御可能であることが明らかになってきた。今後も引き続き酸化還元剤の影響なども考慮し、蛋白質の適切な分離法を確立させる。28年度が最終年度であるため、記入しない。蛋白質科学カーボンナノチューブ固定化カラム担体への蛋白質吸着の実験のために各種カラム充填剤を複数購入する予定であったが、繰越申請した実験の結果や状況に応じて購入を判断したほうが予算の効果的な使用に繋がると判断したため次年度使用額が生じた。初年度に遠心分離器の故障があり、繰越申請などを行ったため、一部の研究進捗がやや遅れており、予定していた消耗品の購入を延期したため。繰越申請したカラム担体作製のための実験の結果に基いて、有効と考えられるカラム充填剤を判断し、これらの購入に使用する予定である。また、カラム充填剤を充填させるエンプティカラムやこれらの作業に必要な各種消耗品の購入にも使用する。本年度に明らかになったカーボンナノチューブと蛋白質またはアミノ酸との相互作用に関する知見をもとに、次年度は蛋白質分離用の光クロマトグラフィを完成させる予定である。そのためには、カーボンナノチューブに対する蛋白質の非特異的な吸着や化学反応を抑制するための溶液条件の検討が必要がある。これらの溶液条件の検討のための研究試薬の購入に当該研究費を用いる予定である。
グリコサミノグリカン等鎖合成のシナリオ

プロテオグリカンの多糖側鎖である硫酸化グリコサミノグリカンはヘパラン硫酸タイプとコンドロイチン硫酸タイプに大別されるが、ともに増殖因子などの種々のシグナル分子と相互作用し、それらのタンパク質の機能を調節する。しかし、本特定領域が開始される頃には、その生合成のメカニズムはほとんど解明されていなかったので、それらの生合成のシナリオを解明することを本プロジェクトの目的とした。我々は、この方針に従って、ヘパラン硫酸とコンドロイチン硫酸の生合成における、合成の開始、伸長、重合、鎖長調節をヒト、線虫、ハエの系を用いて解明し、研究課題「グリコサミノグリカン糖鎖合成のシナリオ」の解明を基本的に達成した。即ち、それらの過程に係る糖転移酵素、硫酸基転移酵素、調節因子の同定,それらのタンパク質間の相互作用の証明である。さらに、線虫のコンドロイチン合成酵素と重合化因子のRNAiによって、コンドロイチンの細胞質分裂における必須の役割を証明した。また、硫酸基転移酵素の欠損による遺伝病の発見にも貢献した。一方、脳のコンドロイチン硫酸によるプレイオトロフィンや肝細胞増殖因子など増殖因子を介した神経突起伸長促進活性発現のメカニズムを解明した。また、コンドロイチン硫酸のウイルス感染レセプターとしての機能を実証し、プレイオトロフィンやサイトカインとの結合に必要な糖鎖配列も解明した。これらの研究成果は、当該分野だけでなく、周辺領域への大きな波及効果を示しつつある。現在進行中のGlcAT-1とEXTL2のKOマウスの解析は、グリコサミノグリカン機能の重要性の証明を確固たるものとするであろう。我々は以前に、コンドロイチン硫酸の繰り返し二糖単位(GlcUA-GalNAc)の合成に預かるヒトのコンドロイチン合成酵素(chondroitin synthase)やコアタンパク質の結合領域四糖GlcUA-Gal-Gal-Xylに最初のGalNAcを転移したり、繰り返し二糖単位にGalNAcを転移して糖鎖の伸長ができるヒトのコンドロイチナーゼGalNAc転位酵素(chondroitin GalNAcT)のクローニングに成功していた。今回、我々は、後者の酵素と相同性が高いヒトの酵素をクローニングし、その基質特異性を明らかにした。その結果、この酵素も上記の酵素と同様の2種類の酵素活性をもつ事が分かったが、両者はアグリコンに対する認識が異なっており、両者は異なるコアタンパク質をもつプロテオグリカンの認識に関与すると考えられ、以前の酵素をGalNAcT-1、新規の酵素をGalNAcT-2と命名した。一方、グリコサミノグリカンの生合成のカギ酵素の一つであるグルクロン酸転位酵素-Iは、上記の四糖結合領域を完成させる酵素であり、ヒトの酵素は当研究室で始めてクローニングされた。今回、ショウジョウバエの遺伝子データベースを調べ3種類の相同遺伝子を見い出し、これらのcDNAをクローニングし、タンパク質を発現させ、3種類ともに活性の強さは異なるものの、三糖Gal-Gal-XylにGlcUAを転移し、結合領域を完成させる活性をもつ事を証明した。ヒトガン抑制遺伝子EXTファミリーメンバーの一つEXTL2はヘパラン硫酸(HS)の生合成に関わり、コアタンパク質との結合領域四糖に最初のα-GlcNAcを転移する酵素をコードする。そのマウスホモログの細胞外ドメインを可溶性タンパク質として大腸菌で発現させ、EXTファミリーで始めてX線結晶構造解析に成功し、触媒ドメインの3つのアミノ酸を同定し、酵素反応機構を解明した。EXTファミリーメンバーEXT1とEXT2はともにHSの二糖繰り返し領域にGlcNAcおよびGlcAを転移し伸長反応できるが、単糖しか転移できず、これまで重合化反応は成功していなかった。

今回、両酵素の遺伝子をCOS-1細胞で同時に発現させて精製し、結合領域四糖構造をもつトロンボモジュリンおよびグリピカンのコアタンパク質、あるいはGlcA-Gal-人工アグリコンを受容体基質として、分子量200kDa(1,000糖残基)を越える高分子重合ヘパランの合成に始めて成功した。ヒトのコンドロイチン合成酵素のホモログを見い出し、cDNAをクローニングし、コンドロイチン合成酵素cDNAと共発現させ精製したものを酵素原、トロンボモジュリンやGlcA-Gal-人工アグリコンを受容体基質として、高分子コンドロイチンの重合化に成功した。このタンパク質をchondroitin polymerizing factorと名づけた。線虫のゲノムデータベースにコンドロイチン合成酵素のオルソログを見出し、cDNAをクローニングし、GaINAcとGIcAの転移活性を確認し、二本鎖RNAを用いてRNAiを行ったところ、コンドロイチンの合成の阻害とともに細胞質分裂の阻害と細胞分裂の逆転現象を認めた。正常な培養線虫細胞をコンドロイチナーゼで処理して細胞表面のコンドロイチンを除去しても同様の現象を認め、コンドロイチンが細胞分裂に必須の分子であることを始めて示した。生理機能をもったグリコサミノグリカンがどのように生合成されるのかを解明するための実験を行ない、以下に示す成果が得られた。1.ヘパラン硫酸(HS)の生合成酵素EXT1のノックアウトマウスを作成したところ、胎生致死であった。このマウスはEXT1遺伝子を殆ど発現していないにも関わらず、正常な硫酸化修飾構造を持ったHS鎖を合成していた。しかし、このHS鎖は鎖長が3分の1以下に減少していた。HSの生理活性は、硫酸化構造のみならず鎖長の変化によっても調節されている可能性がある。2.コンドロイチン硫酸(CS)の糖鎖伸長調節メカニズムを解明するため、モデル生物である線虫を利用した。線虫には、コンドロイチン合成酵素であるcChSy以外に、これとホモロジーのあるPAR2.4という遺伝子があった。PAR2.4について酵素活性測定、RNAi実験を行なったところ、PAR2.4は酵素活性は持たないが、cChSyの活性調節因子として線虫におけるコンドロイチン合成に不可欠であることが分かった。3.先天性脊椎・骨端異形成症の原因遺伝子として、コンドロイチン6硫酸転移酵素1(C6ST-1)が候補となった。そこで、患者のC6ST-1遺伝子および遺伝子産物を調べた。すると、C6ST-1遺伝子に点突然変異が起こっており、酵素活性が失われ、患者CSの硫酸化構造が変化していた。CSは軟骨に多量に存在するため、CSの構造変化が関節軟骨や椎間板の異常を引き起こしていると予想された。4.細胞表面に存在する主要なHSプロテオグリカンであるシンデカンのうち、シンデカン-1と-4は、CS鎖も持つ。同一のマウス乳腺上皮細胞が産生するシンデカン-1と-4のHS鎖の構造は極めて酷似しているが、CS鎖の構造は異なっており、シンデカンと細胞増殖因子との結合には、HS鎖のみならずCS鎖やコアタンパク質も関与していることを証明した。(1)ブタ胎児脳から、海馬ニューロンの突起伸長促進
生理機能を有する光学活性アルコール類の合成

本研究者の開拓した光学活性ジホスフィンとジアミンを配位子とするルテニウムジクロロ錯体は、アルカリ塩基の存在下、種々の芳香族およびα,β-不飽和ケトン類、アミノケトン類等の水素化に対して極めて高い触媒活性とエナンチオ選択性を示す。この塩化物錯体は、大気中でも安定なため操作性に優れているが、活性種を発生させるために強塩基の添加が不可欠である。したがって、塩基性条件下で不安定なケトン類の水素化には適用が困難であった。本研究では、塩基を添加せずに活性種を発生する触媒前駆体の探索研究を行った。塩化物錯体trans-RuCl_2[(S)-xylbinap][(S,S)-dpen](XylBINAP=2,2'-ビス(ジ-3,5-キシリルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル、DPEN=1,2-ジフェニルエチレンジアミン)に水素化ホウ素ナトリウムを作用させることにより、ヒドリド錯体trans-RuH(η^1-BH_4)[(S)-xylbinap][(S,S)-dpen]を得た。この錯体は、塩基無添加条件でケトン類の水素化に対して極めて高い触媒活性とエナンチオ選択性を示した。例えば、アセトフェノンを10万分の1当量の錯体を用い、水素8気圧で水素化すると、反応は7時間で完結し、(R)-1-フェニルエタノールが99%の鏡像体過剰率で得られた。次に、塩基性条件下で容易に異性化するラセミ体α位置換シクロヘキサノン類の不斉水素化を経る速度論分割を検討し、所期の目的を達成した。例えば、α-メトキシシクロヘキサノンをtrans-RuH(η^1-BH_4)[(S)-xylbinap][(S,S)-dpen]の存在下で水素化し、53%の変換率で反応を停止すると、Rケトンが94%の鏡像体過剰率で回収された。この光学活性ケトンは抗菌剤として期待されるサンフェトリネムの合成中間体として重要である。光学活性第二級アルコールは、有用生理活性物質およびその合成の鍵となる中間体の部分構造として数多く見受けられる。とくに、光学活性なα-、β-およびγ-アミノアルコール類とその誘導体は、薬剤としてもっとも活躍している化合物群の一つであり、次代の新薬として期待される多くの化合物が臨床で試験されている。本研究者はこの事実に鑑み、光学活性アミノアルコール類の効率的かつ一般性の高い不斉合成法の開拓を計画した。光学活性アミノアルコール類のもっとも直接的な合成法の一つに対応するアミノケトン類の不斉水素化がある。本研究者は、すでに光学活性ホスフィンとジアミンを配位子とするルテニウム錯体触媒を用いて、様々な芳香族ケトン類およびα,β-不飽和ケトン類の高エナンチオ選択的水素化に成功している。この方法論が種々のアミノケトン類の不斉水素化に適用できれば、一般的かつ効率的な光学活性アミノアルコール類の合成法になりえると考えて検討を行った。2-[(アルキル)(ベンゾイル)アミノ]アセトフェノン類の水素化をtrans-RuCl_2[(R)-xylbinap]-[(R)-daipen]を触媒前駆体に用いて、塩基の存在下で行ったところ、対応するα-アミノアルコールが99%の極めて高い鏡像体過剰率で得られた。この反応を基軸として、強心薬の(R)-デノパミンの合成に成功した。β-(ジメチルアミノ)プロピオフェノンは、塩基の存在下でアミノ基が容易に脱離するため、水素化の困難な基質であったが、塩基の使用を最少量に抑える工夫をすることにより、対応するβ-アミノアルコールを97.5%の鏡像体過剰率で得ることができた。この手法を用いて抗鬱剤として実用されている(R)-フルオキセチンの合成に成功した。さらに精神病薬として期待される、γ-アミノアルコールのBMS 181100を99%の鏡像体過剰率で合成できた。

例えば、アセトフェノンを10万分の1当量の錯体を用い、水素8気圧で水素化すると、反応は7時間で完結し、(R)-1-フェニルエタノールが99%の鏡像体過剰率で得られた。次に、塩基性条件下で容易に異性化するラセミ体α位置換シクロヘキサノン類の不斉水素化を経る速度論分割を検討し、所期の目的を達成した。例えば、α-メトキシシクロヘキサノンをtrans-RuH(η^1-BH_4)[(S)-xylbinap][(S,S)-dpen]の存在下で水素化し、53%の変換率で反応を停止すると、Rケトンが94%の鏡像体過剰率で回収された。この光学活性ケトンは抗菌剤として期待されるサンフェトリネムの合成中間体として重要である。
犬を用いた自己免疫性疾患発生メカニズム解明へのアプローチ

犬の自己己免疫疾患の研究にはT細胞を認識するモノクローナル抗体が必要不可欠であるが、利用できる抗体が非常に少ないため、これらに必要なモノクローナル抗体の作製から開始した。犬胸腺細胞を免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞(P3X63-Ag.653)をポリエチェングリコール法により細胞融合を行い、スクリーニング法にはセルアナライザーを用い、11種のハイブリドーマを得た。このなかの3種のハイブリドーマ(7F1、6H6、8C12)の分泌する抗体が認識する抗原について性状を明らかにした。免疫沈降法、抗体に陽性に反応する細胞の機能分析、血液および組織における陽性細胞の分布について検索した。モノクローナル抗体(MAb)7F1、6H6、8C12はマウス免疫グロブリンのアイソタイプはそれぞれIgG1(k)、IgG3(k)、IgG1(k)であった。MAb7F1および6H6は免疫沈降法における還元条件下の分析で、末梢血リンパ球表面の72kDaおよび55kDaのタンパクをそれぞれ認識していた。MAb8C12は33kDaならびに38kDaの2種の異なった分子量のタンパクを認識していた。免疫組織科学的検索で、7F1陽性細胞は胸腺の髄質に多く分布し、これに対し6H6ならびに8C12陽性細胞は比較的皮質に多く認められた。セルソーターを用いてソ-トした細胞の機能分析では、7F1あるいは8C12陽性細胞群では、各々の陰性群に比較して分裂増殖能が強く観察され、一方、8C12陽性細胞群では陰性細胞群に比べ低い分裂増殖能であった。各々の抗体の陽性細胞群と陰性細胞群の培養上清について、CTLL-2細胞を用いた生物学的アッセイ法でIL-2活性を調べたところ、7F1あるいは6H6陽性細胞群は各々の陰性細胞群に比較してIL-2活性が高く認められた。これに対して8C12陽性細胞群では陰性細胞群に比較してIL-2活性が低かった。末梢血の単核球についてセルアナライザーにより分析したところ、7F1(63.7【.+-。】2.9%)、6H6(42.5【.+-。】3.6%)、8C12(14.5【.+-。】1.0%)の如く、それぞれに陽性を示した。以上のことから、MAb7F1、6H6および8C12はそれぞれCD5、CD4、CD8をそれぞれ認識していると結論した。残り8種のハイブリドーマが分泌するMAbについても検討中であり、さらに有用な抗体が得られるものと期待される。これらの抗体は犬リンパ球表面抗原の検索、免疫組織化学、細胞機能の検索に利用可能である。現在、犬における経口免疫寛容誘導の研究、自己免疫疾患症例のリンパ球分析、消化管や呼吸器粘膜の免疫組織学的検索の研究を進めている。

残り8種のハイブリドーマが分泌するMAbについても検討中であり、さらに有用な抗体が得られるものと期待される。これらの抗体は犬リンパ球表面抗原の検索、免疫組織化学、細胞機能の検索に利用可能である。現在、犬における経口免疫寛容誘導の研究、自己免疫疾患症例のリンパ球分析、消化管や呼吸器粘膜の免疫組織学的検索の研究を進めている。平成2年度までの研究で確立したモノクローナル抗体について、セルアナライザーで分析したところ、凍結切片法でスクリーニングした結果と矛盾していることが判明した。凍結切片法によるスクリーニング方法の問題点として、細胞表面抗原と細胞内抗原の識別が困難な点がある。そこで、急遽細胞融合法を行い、スクリーニングにはセルアナライザーを用いモノクローナル抗体の作製を再度試みた。この結果、11種のモノクロナル抗体を得た。これらのモノクローナル抗体について犬末梢血リンパ球を対象にしてセルアナライザーを用いて分析を行ったところ、末梢血リンパ球において、約30%陽性を示す抗体2種、約70%陽性を示す抗体4種、約20%陽性を示す抗体2種、50%前後の陽性を示す抗体3種が認められた。現在免疫沈降法で特異抗原を回収したのち、ウエスタンブロッテイング法による分析で認識している抗原の分子量について検索中である。まだ、セルソーターによって単離した陽性細胞について機能を検討する実験が残っているが、これらのなかに目的遂行に必要な抗体が存在すると考えられる。すなわち、T細胞全般(CD2)、ヘルパー・インデユサーT細胞(CD4)、サプレッサー・キラーT細胞(CD8)等に対する抗体が本研究では重要である。一方、米国においてMoore博士らが犬のT細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を確立しており、分与の申込を行って了承を得ている。以上の状況により、全体の進行が遅れているが、実験的な免疫亢進状態、免疫寛容状態の作出条件について検討中であり、モノクローナル抗体の確立あるいは入手次第、自己免疫病態下におけるT細胞の動態について検討可能と考えている。前年度までの研究で得られた11種のモノクローナル抗体のうち3種について、免疫沈降法とウエスタンブロッテイング法により認識する抗原の分子量を検討した結果、7F1は(72KD)、6H6は(55KD)、8C12は(33KD and 38KD)をそれぞれ認識していることが判明した。マウス免疫グロブリンのクラスとしては7F1(IgG1)、6H6(IgG3)、8C12(IgG1)であった。このことから、これらの抗体はヒトのCD5、CD4及びCD8を認識していることが予想された。この推測を裏付けるために、機能試験としてmitogen刺激試験、IL-2生産能、細胞障害活性を測定したところ、これらの抗体はヒトの汎T細胞抗原(CD5)、ヘルパー/インデューサーT細胞抗原(CD4)及びサブレッサー/キラーT細胞抗原(CD8)を認識していることが確認できた。これらの抗体を用いて、正常犬の末梢血及び各組織(胸腺、腸間膜リンパ節、脾臓、扁桃、肝臓、腎臓、骨髄)についてflow cytometry及び免疫組織化学的検索を行った。この結果、末梢血リンパ球において7F1抗体は63.7±2.7%、6H6抗体は42.5±3.6%、8C12抗体は14.5±1.0%のリンパ球を認識していた。この値はヒトや他の動物のCD5、CD4及びCD8の分布と同様な傾向を示していた。免疫組織化学的検討でも、いずれの抗体も各臓器でT細胞領域を認識しており、抗原陽性細胞の分布は7F1>6H6>8C12であった。
自己免疫性水疱症の病因ならびに診断に関する基礎的研究

自己免疫性水疱性皮膚疾患に種々の病型があるが抗表皮細胞膜抗体を示す代表的疾患は天疱瘡であり、自己免疫学的機序により表皮細胞間接着の障害を生ずる。表皮細胞間接着に最も重要なものはデスモソームであり、種々の天疱瘡の抗原物質はデスモソーム構成蛋白であることが明らかとなってきた。また、皮膚基底膜に病変を生ずる代表的疾患は水疱性類天疱瘡であり、自己免疫学的機序により表皮基底膜部接着の障害を生ずる。表皮基底膜部接着に最も重要なものはヘミデスモソームであり、水疱性類天疱瘡の抗原物質はヘミデスモソーム構成蛋白であることが明らかとなってきた。このほかの皮膚基底膜に病変を生ずる疾患としては、瘢痕性類天疱瘡、後天性類天疱瘡などがある。また、IgAの関与する疾患としてはジューリング疱疹状皮膚炎と線状IgA水疱性皮膚症がある。今回の研究では、まず、米国国立衛生研究所のスタンレー博士とデスモグリエン(落葉状天疱瘡抗原)と尋常性天疱瘡抗原について研究を進めた。まず、そのcDNAを利用しバキュロウィルス発現系を用いてより高度な高次構造を有する落葉状天疱瘡抗原と尋常性天疱瘡抗原それぞれのリコンビナント蛋白を作成した。以前より患者血清中のIgGを新生マウスに投与すると落葉状天疱瘡と尋常性天疱瘡それぞれの病変を再現できることが知られていた。この新生マウス動物実験系において、作成したリコンビナント蛋白を用いて患者血清中の自己抗体を吸収することにより実際に病原性のある自己抗体吸収できることを見出した。この事実は将来これらのリコンビナント蛋白の抗原特異的カラムを用いた血漿交換療法による新しい天疱瘡治療の可能性を示すもと言える。これらの成果はすでにいくつかの英文誌に報告した。次にデスモグリエンのcDNAを繊維芽細胞にトランスフェクトしその細胞膜上に発現された抗原に対する反応を調べることによりすべての落葉状天疱瘡血清がデスモグリエンと反応することを確認した。この実験系は落葉状天疱瘡抗原の解析をする上で非常に有用な手法になると期待される。さらに、将来トランスジェニックマウスないしノックアウトマウスを用いてin vivoにおけるこれらの分子の機能を研究するために、現在これらの蛋白のマウスのゲノムDNAを単離することをめざしている。これらの実験は天疱瘡の真の病態の解明、また治療法の確立に不可欠なものになると思われる。また米国ユタ大学のゾーン博士とは主としてIgAの関与する疾患を解析した。まず、私どもが、経験した稀なfibrillar typeの疱疹状皮膚炎患者につき詳細に検討し、さらに本邦における全疱疹状皮膚炎患者をいろいろな観点からまとめ、欧米の症例を比較検討し論文として欧文誌に発表した。さらに、現在、線状IgA皮膚症の抗原物質は明らかにされてないが、未知の97kD蛋白が抗原の一つである可能性を見出した。また一部の線状IgA皮膚症患者血清は290kD後天性表皮水疱症抗原と反応する事を見出した。これらの結果はすでにいくつかの英文誌に報告した。それ以外にもいくつかの米国皮膚科学会に出席し、また多くの米国の大学を訪問し、多くの研究者と様々な研究プロジェクトについて検討する機会を持つことができた。これらの交流を通じて将来様々な共同研究を進めることを決定することができた。現在、医学領域の研究の進歩は目を見張るものがあり、かつ、非常に高度の技術が必要になってきている。しかしながらその研究を施行している施設は各国に分割しており、必要な抗体、cDNAも個々の施設で各自が保存している状況である。また、研究技術的にも、生化学的、分子生物学的、免疫学的手法など多種必要である。今回行い得た、多施設での共同の研究は、種々の自己免疫性水疱症の病因および治療の進歩に大きな貢献をしたものと思われる。今後さらに、このような多施設の共同研究を進めることにより種々の自己免疫性水疱症の研究にさらに大きな成果をもたらすことが期待される。

この新生マウス動物実験系において、作成したリコンビナント蛋白を用いて患者血清中の自己抗体を吸収することにより実際に病原性のある自己抗体吸収できることを見出した。この事実は将来これらのリコンビナント蛋白の抗原特異的カラムを用いた血漿交換療法による新しい天疱瘡治療の可能性を示すもと言える。これらの成果はすでにいくつかの英文誌に報告した。次にデスモグリエンのcDNAを繊維芽細胞にトランスフェクトしその細胞膜上に発現された抗原に対する反応を調べることによりすべての落葉状天疱瘡血清がデスモグリエンと反応することを確認した。この実験系は落葉状天疱瘡抗原の解析をする上で非常に有用な手法になると期待される。さらに、将来トランスジェニックマウスないしノックアウトマウスを用いてin vivoにおけるこれらの分子の機能を研究するために、現在これらの蛋白のマウスのゲノムDNAを単離することをめざしている。これらの実験は天疱瘡の真の病態の解明、また治療法の確立に不可欠なものになると思われる。また米国ユタ大学のゾーン博士とは主としてIgAの関与する疾患を解析した。まず、私どもが、経験した稀なfibrillar typeの疱疹状皮膚炎患者につき詳細に検討し、さらに本邦における全疱疹状皮膚炎患者をいろいろな観点からまとめ、欧米の症例を比較検討し論文として欧文誌に発表した。さらに、現在、線状IgA皮膚症の抗原物質は明らかにされてないが、未知の97kD蛋白が抗原の一つである可能性を見出した。また一部の線状IgA皮膚症患者血清は290kD後天性表皮水疱症抗原と反応する事を見出した。これらの結果はすでにいくつかの英文誌に報告した。それ以外にもいくつかの米国皮膚科学会に出席し、また多くの米国の大学を訪問し、多くの研究者と様々な研究プロジェクトについて検討する機会を持つことができた。これらの交流を通じて将来様々な共同研究を進めることを決定することができた。現在、医学領域の研究の進歩は目を見張るものがあり、かつ、非常に高度の技術が必要になってきている。しかしながらその研究を施行している施設は各国に分割しており、必要な抗体、cDNAも個々の施設で各自が保存している状況である。また、研究技術的にも、生化学的、分子生物学的、免疫学的手法など多種必要である。今回行い得た、多施設での共同の研究は、種々の自己免疫性水疱症の病因および治療の進歩に大きな貢献をしたものと思われる。今後さらに、このような多施設の共同研究を進めることにより種々の自己免疫性水疱症の研究にさらに大きな成果をもたらすことが期待される。本年度は、国外派遣2回、および3名の外国研究者招へいを行ない、非常に活発に、かつ最新の意見交換を行なうことができた。西川は、多数の外国研究者と情報を交換し、多数の患者血清材料を交換することにより、新しい共同研究実験計画をたてた。現在、天疱瘡の自己抗原は種々のデスモソームカドヘリン接着分子であることが明かとなっている。橋本は各国の研究者よりデスモグレインおよびデスモコリンcDNAの供与を受け、デスモコリンが新しい天疱瘡抗原となりうる可能性を示しデスモグレインの部位特異的リコンビナント蛋白を造ることにより、エピトープマッピングを行なった。さらに、尋常性天疱瘡抗原cDNAをバキュロウイルス発現ベクター系により発現させることにより、正しいコンフォメーションを有する蛋白を得た。
海陸一体運航管理システムに関する研究

海陸一体運航を効果的に行うためには、海陸で運航管理基準を共有して相互に支援することが重要である。本研究では70隻の自動車専用船の運航実績すなわち、年間の事故・トラブル、スケジュールの遅れおよび乗船して運航状況をチェックした検船結果を分析して、運航状況を改善する方策を検討した。評価手法として運航の現状把握には統計的手法を用い、改善方策の検討には数理的手法である包絡分析法を用いた。事故データと遅延時間のデータから機能別事故率、損害率を求めて、これらと検船評価との関係を調べた結果、機関故障など船内システムの不適合に起因すする事故は対応する評価項目との統計的対応が見られるが、衝突など外部との不適合で生じる事故は検船では検出する事が難しいことが判明した。本研究は船舶の運航管理に必要な合理的な評価項目、基準を作成し、海陸一体運航を管理するシステムとして構築し、その効果を検証することである。本申請の研究期間3年内に評価基準の合理性の検証および運航管理システムの有効性を示すことを目的としている。本年度は初年度に当たるので、研究に必要な航行状況を検船の模擬システムを開発することを中心にして次の手順で研究を実施した。(1)実海域における航行状況の再現実海域における70隻の自動車専用船の運航状況データによって調べた。検船データは航海技術、機関運用水準など8大項目、55小項目からなり、評価対象船の運航状況を運航管理者が主観的に評価したものである。(2)主観的評価と事故率検船データとその対象船の事故データとの関係を統計的に検討した。その結果、検船によって整備不十分による事故はある程度予測できるが、運用上の事故は予測が難しいことがわかった。(3)運航管理者の知識ベースの作成分析結果を基礎にして、どのような検船がが安全運航か否かの判断のために重要なのかを抽出して運航管理者の知識ベースを作成を試みた。