hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発光性ジルコニウム錯体を用いた２重ベータ崩壊実験用液体シンチレータの開発

これまでにジルコニウムODZ錯体を合成し、発光スペクトルのピーク波長は430nm、吸収スペクトルのピーク波長は250nm/290nm/340nmにあり、最大発光は250nmの励起によるものであることがわかった。ガンマ線による事象観測から、ODZ錯体の発光量は標準シンチレータの10%の光量であり、量子収率は13.2%が得られた。量子収率を向上させるためには、ベンゾニトリルよりも短波長側に発光し、ODZ錯体が2wt.%以上溶解する溶媒が必要であったが現存しなかった。そこで、量子収率の向上が期待されるトリアジン基を導入したジルコニウム・キノリノール錯体(Zr(Q-T)4)を合成した。通常のジルコニウム・キノリノール錯体(ZrQ4)は、発光および吸収スペクトルのピーク波長がそれぞれ540nmと385nmであったのに対し、Zr(Q-T)4では、それぞれ520nmおよび260nm/300nm/395nmに存在し、発光波長が予想通り短波長側に移動したことを確認した。しかし、PPOを0.5wt.%加えたZr(Q-T)4含有の液体シンチレータではガンマ線による信号を観測できなかった。そこで、Zr(Q-T)4の量子収率を求めると12.0%であり、ZrQ4の11.5%と同程度しかなく、更に光電子増倍管の量子効率を考慮すると標準シンチレータの5.2%の光量しか得られないことがわかった。これは、ZrQ4の7.4%の光量と同程度の性能であった。以上の結果から、発光性のODZ配位子及びトリアジン基を導入したキノリノール配位子によるジルコニウム錯体では、ガンマ線による発光量は標準シンチレータの10%以下であり、液体シンチレータの発光剤として必要な30%を超える量子収率が得られないことがわかった。素粒子物理学初年度に合成したジルコニウムODZ錯体に観測された最大発光を示す発光スペクトルが、数ヶ月後において観測されなくなったため、この発光による液体シンチレータの試作が行われていないため。新たに合成したジルコニウム・ODZ錯体の発光波長が430nmであり、予想通り光電子増倍管に感度のある波長帯に発光することがわかった。また、溶解度もベンゾニトリルに対して5wt.%を達成した。しかし、吸収波長が予想より短い270nmにあり、溶媒の発光波長と合致しないという課題が発生した。ジルコニウムODZ錯体1gを再合成を行い、250nmに観測された最大発光スペクトルの有無を確認するとともに、その波長に合致する溶媒を用いた液体シンチレータサンプルの試作を行う。また、錯体が非常に不安定である可能性があるため、不活性ガス等の封入による保存を行うとともに、定期的な発光スペクトル観測を行う。一方、発光性錯体としての性質を見極めるため、1光子による発光効率である量子収率の測定を行う。測定には、量子収率測定の専用の測定器を使用する必要があるため、東北大学金属材料研究所が保有しておる機材を使用する計画である。ジルコニウム・ODZ錯体の吸収波長と溶媒の発光波長を合致させるため、発光波長がもっと短い溶媒を選び、液体シンチレータサンプルを作成し、放射線による発光量の計測を行う計画である。また、発光量の増加を目指し、2次シンチレータの発光波長を変えるために、PPOとは別のp-ターフェニルなどの発光材の組み合わせを試す計画である。合成したジルコニウムODZ錯体に観測されていた250nmをピークとして吸収による発光が消失したことにより、再度合成することを想定していたが、消失した原因の特定や、その他の吸収による発光効率を求めることを優先したため、まだ再合成を行っていないため。
黒ボク土における土壌微生物バイオマスリンの動態と添加有機物との関連

1.a)精密実験圃場内のコンクリート枠で黒ボク土に有機物(オガクズ堆肥、籾殻堆肥)投入区と非投入区および植物栽培区と無栽培区を設け,b)土壌培養実験で黒ボク土に有機物(オガクズ堆肥、籾殻堆肥)添加、無添加区を設け^<32>P添加処理し、微生物バイオマスリンの動態を解析すべくAEM(陰イオン交換膜)法によるバイオマスリンの測定を開始した。しかしBDH社から新規に購入したAEMが同じ製品名にもかかわらず従来のAEMと全く異なり機能しないこと、また目下、BDH社で従来のAEMの製造が不能であることが判明した。現在、バイオマスリンの測定に支障を生じており、他の測定法について予備実験をし検討中である。2.a)精密実験圃場(マサ土)で同炭素量の牛糞堆肥、オガクズ堆肥、籾殻堆肥投入区、化学肥料対照区を設けてトウモロコシを栽培した。b)マサ土に有機物(牛糞堆肥、オガクズ堆肥、籾殻堆肥)添加、無添加区を設け25°Cで60日培養した。経時的にバイオマスC, PとCO_2放出量などを測定してバイオマスC, P量と添加有機物との関係を解析した結果、バイオマスC, P量は添加有機物によって大きく異なり、それは主として添加有機物の分解率、特に添加有機物の易分解性画分量に起因することなどを明らかにした。(日本土壌肥料学会1997予定)1.a)精密実験圃場内のコンクリート枠で黒ボク土に有機物(オガクズ堆肥、籾殻堆肥)投入区と非投入区および植物栽培区と無栽培区を設け,b)土壌培養実験で黒ボク土に有機物(オガクズ堆肥、籾殻堆肥)添加、無添加区を設け^<32>P添加処理し、微生物バイオマスリンの動態を解析すべくAEM(陰イオン交換膜)法によるバイオマスリンの測定を開始した。(日本土壌肥料学会1997予定)
アカネズミにおける社会的学習の促進機構

多様な餌資源を利用する動物にとって,採食行動は学習による柔軟性を有している方が,新規な餌への対応という点で適応的である.学習には,試行錯誤による自己学習と,他個体から新たな行動様式を獲得する社会的学習がある.試行錯誤では適切な行動を身につけるまでに時間がかかるため,社会的学習の方が一般的には学習効率は高いが,環境条件や個体の齢・血縁関係などによって,社会的学習の効果は変化すると言われている.本研究では,アカネズミによるオニグルミ種子採食技術の学習に着目し,まず,単独生活を送る亜成獣成獣の時期における社会的学習の効果を調べるために,オニグルミ種子を食べたことがない個体に,単独飼育下で種子を与える実験(自己学習のみ),食痕付きの種子を与える実験(食痕に基づく社会的学習),上手に食べる個体を隣接させてその行動を見せる実験(模倣による社会的学習)を行った.自己学習のみの実験では,採食技術を向上させる個体が見られた.食痕および模倣による社会的学習では,自己学習のみの実験を上回る被験個体の行動変化は認められず,これらの社会的学習の効果は検出されなかった.さらに,母親と共に過ごす幼獣の時期における社会的学習の効果を調べるために,育児中にオニグルミ種子を与え続ける実験(母子間伝達による社会的学習)を行った.その結果,母親が育児中に子どもの前でクルミを上手に食べたグループでは,母親がクルミを採食しなかったグループに比べ,上手にオニグルミ種子を食べられるようになった子どもの割合が増加し,採食技術が母から子へ伝達されることが示された.このように,アカネズミは母親と共に過ごす時期には母親から採食行動を社会的に学習し,単独生活を送る時期には自己学習によってその利用効率を高めていた.本研究の成果は動物生態学の基礎的知見となるだけでなく,文化の進化の解明に繋がることが期待できる.採食行動の社会的学習は,採餌効率を高め捕食リスクを軽減させることから,動物生態学者によってその実証が盛んに行われてきた.一方で,社会的学習がどのような状況で起こるのか,という問題についてはほとんど取り扱われてこなかった.本研究では,アカネズミにおけるオニグルミ種子の採食行動について,社会的学習が起こっているのかを検証し,さらにどのような状況で社会的学習が促進されるのかを明らかにすることを目的とした.まず,他個体の行動観察,および食痕からの学習を検討するため,オニグルミにnaiveな個体に,上手に採食する個体を提示する実験,食痕を与える実験をそれぞれ行った.通常のクルミだけを与えた対照実験のグループと採食行動を比較した結果,行動提示実験と食痕提示実験のどちらのグループも,対照実験のグループと差は認められず,これらを手掛かりとした社会的学習は検出されなかった.次に,母親から子どもへの採食行動の社会的学習について検証した結果,母親が育児中に子どもの前でクルミを上手に食べたグループでは,母親がクルミを採食しなかったグループに比べ,上手にオニグルミを食べられるようになった子どもの割合が最も高くなり,母親から子どもへの社会的学習が検出された.オニグルミの自生している地域と自生していない地域とで比較をすると,オニグルミが自生している地域の母子間の方が,上手に食べられるようになる子どもの割合が高く,より社会的学習が顕著である傾向が認められたことから,オニグルミが利用できる環境では採食行動の社会的学習が促進される可能性が示唆された.このように,本研究で野生動物においてどのような状況下で社会的学習が促進されるかが明らかとなれば,動物生態学の基礎的知見となるだけでなく,一般社会でも関心の高い動物の文化の進化の解明に繋がることが期待できる.多様な餌資源を利用する動物にとって,採食行動は学習による柔軟性を有している方が,新規な餌への対応という点で適応的である.学習には,試行錯誤による自己学習と,他個体から新たな行動様式を獲得する社会的学習がある.試行錯誤では適切な行動を身につけるまでに時間がかかるため,社会的学習の方が一般的には学習効率は高いが,環境条件や個体の齢・血縁関係などによって,社会的学習の効果は変化すると言われている.本研究では,アカネズミによるオニグルミ種子採食技術の学習に着目し,まず,単独生活を送る亜成獣成獣の時期における社会的学習の効果を調べるために,オニグルミ種子を食べたことがない個体に,単独飼育下で種子を与える実験(自己学習のみ),食痕付きの種子を与える実験(食痕に基づく社会的学習),上手に食べる個体を隣接させてその行動を見せる実験(模倣による社会的学習)を行った.自己学習のみの実験では,採食技術を向上させる個体が見られた.食痕および模倣による社会的学習では,自己学習のみの実験を上回る被験個体の行動変化は認められず,これらの社会的学習の効果は検出されなかった.さらに,母親と共に過ごす幼獣の時期における社会的学習の効果を調べるために,育児中にオニグルミ種子を与え続ける実験(母子間伝達による社会的学習)を行った.その結果,母親が育児中に子どもの前でクルミを上手に食べたグループでは,母親がクルミを採食しなかったグループに比べ,上手にオニグルミ種子を食べられるようになった子どもの割合が増加し,採食技術が母から子へ伝達されることが示された.このように,アカネズミは母親と共に過ごす時期には母親から採食行動を社会的に学習し,単独生活を送る時期には自己学習によってその利用効率を高めていた.本研究の成果は動物生態学の基礎的知見となるだけでなく,文化の進化の解明に繋がることが期待できる.
ラフカディオ・ハーンの＜トランスナショナル＞アメリカ：報道・翻訳・創作

本研究では、ラフカディオ・ハーンの「トランスナショナル」な語りの方法の特徴を、1)翻訳2)報道、3)創作の三点から分析した。ジャパノロジストとして評価されてきたハーンを、アメリカ・マルチニーク・日本を遍歴した自称「文明化した遊牧民」作家として捉えなおし、文化言語が混淆し「クレオール化」(ハーンの造語)する時代における文学・語りの先駆者として再評価した。平成25年度は、前年度に引き続きラフカディオ・ハーンのアメリカ時代(南部及びマルティニーク)のトランスナショナリティについて検証し、さらにそれを日本時代を比較検討した。これまでの資料や研究成果をみなおしまとめることができたのは収穫である。以下研究実績を具体的に記す。尚タイトル英文は英文での研究発表及び論文。平成24年度は、ラフカディオ・ハーンのアメリカ時代(1870ー1890)の新聞記事や翻訳作品を検証し、トランスナショナルな特徴の記述を目指した。シンシナティ時代に限らず、ニューオリンズ時代の作品にも視野を広げた。ハーンが南部で関心を示した異人種・異言語・異文化混淆を物語る「クレオール化」という現象が本研究のテーマ「トランスナショナル」を考える上で重要だと判断したからである。5月、米国アメリカ文学会で研究発表(“Lafcadio Hearn's `Re-told' Ghostly Narrative; Evoking Ghosts and Creating Home in a Foreign Landscape")を行った。ジャーナリズムと文学についての著書のあるS.フィシュキン教授からもコメントを頂き、翻訳論やトランスナショナリティへの関心の高さを実感した。7月、共同研究者ハッケンバーグ氏を神戸に招き研究会及び学生対象の講演会を持った。9月、スタンフォード大学及びノートルダム大学図書館における資料収集。ノートルダム大学では比較美術史を専門とするM. Kinsey氏にも話を伺う。ハーン研究者關田かをる氏からは、シンシナティ時代の未公開新聞記事のファイル、早稲田大学図書館所蔵の第一次資料を紹介していただいた。12月、富山大学で開催されたハーン学会では、「クレオール化」や複数言語を操るアメリカ作家としてのハーン像が論じられ、今トランスナショナルにハーンを論じる本研究の意義を再確認した。平成25年2月、明治神宮でのシンポジウム「外国人から見た神道」では、ハーンとクローデルの日本観がテーマ。刺激を受け、トランスナショナルな比較文学文化論の視点から拙論の執筆を進めた。ALAの発表を修正加筆し『神戸外大論叢』(2012年第63巻第2号)に論文を掲載した。最終年度には予定していた共同研究者ハッケンバーグ氏とのシンポジウムは残念ながら実現することができなかったが、クロスナショナルな視点から、ノートルダム大学名誉教授ダグラス・キンジー氏(画家)、またクレア・クッチオ氏(日本文化、版画研究)に講演を御願いした。どちらも学生を含めた勉強会の企画となり、フィードバックも十分あり有意義であった。ハーン研究は、今「世界文学」としての視座から見直しが始まっている。今回の研究を基盤にさらにハーン研究を、国境を越えた「物語」の可能性を探るという点から進めていきたいと考えている。比較文学第2年次は、ハーンのアメリカ、ニューオリンズ時代をテーマとしてハーンの報道記事、翻訳について資料収集検証することを目標とした。研究が進み、第3年度に予定していた研究叢書の執筆を一年繰り上げて達成することができた。本研究テーマであるトランスナショナルについてはまだ議論の余地は残したが、トランスナショナルな報道、翻訳、創作についての問題点を提起することはできたと考える。初年度に引き続いて予定した共同研究者ハッケンバーグ教授を招いての研究会は、教授の都合により実現することができなかった。外部研究者との交流は、ポーランドおよび関西比較文学会におけるシンポジウムの発表者たちとの情報交換という形で実現した。ノートルダム大学のキンジー博士との勉強会では、浮世絵の西洋における需要について貴重な話を聞くことができた。平成24年度の目標は、ハーンのアメリカ時代の出版報道記事、翻訳、書評の検討。1)資料収集、内容テーマの分析、2)当時の新聞事情読者層の把握、3)ジャーナリズムと文学という三点の考察であった。研究過程でアメリカ時代のハーンの言説の特徴について違った視点を見いだし、分析対象の資料内容を修正した。米国アメリカ文学会での発表、スタンフォード大学およびノートルダム大学、富山大学へるん文庫閲覧等での資料収集、他日本のハーン研究者とも有意義な意見交換を行うことができた。以下具体的に記す。1)については、研究を進める内にハーンのクレオールへの関心の重要性が浮上し、当初シンシナティでの扇情的新聞記事を中心に資料を検討する予定であったが、扇情的な記事に取り上げられたアフリカ系アメリカ人や貧しい移民たちになぜ注目したのかという根本的な問題を考察するべく軌道修正を行い、ハーンのクレオールへの関心に注目した。この論点については平成25年5月の米国アメリカ文学会で研究発表の予定である。

2)については、共同研究者と意見交換し、ハーンの執筆した新聞雑誌の持つ役割に注目して考察した。特にニューオリンズ時代からの全国誌Atlantic Monthlyへの投稿は、地方から全国(世界)へと視座を開くハーンの意欲的な姿勢を再確認した。3)は本研究全体に繋がる大きなテーマだが、事実報道から創作に向かいながらハーンは新たなリアリズムの手法を工夫したと思われる。この論点は平成25年8月欧州比較文学会で研究発表の予定である。以上、軌道修正を行いつつ研究を進めてきたが、テキスト分析を通してハーンのアメリカ時代の本質的な特徴に「クレオール化」という概念を重ねることで、ハーンのトランスナショナルな語りの特徴が明確になってきた。新たな第一次資料の発見には至らなかったが、発展性のある新たな視点で資料を分析できたのは意義深い。第3年度も引き続きハーンのアメリカ時代と日本時代との比較研究を続ける。さらに、ハーンだけに限らず、同時代や次世代のトランスナショナルな作家、文学についても視野を広げたい。本研究の最終年度となるので、共同研究者ハッケンバーグ教授と研究会、共同発表などを計画し、研究の総括としたい。ハーン(小泉八雲)のすぐれた研究書も出版されるようになっているが、まだアメリカ時代と日本時代との比較研究においては十分とは言えない。アメリカ時代から日本時代をつなぐハーンのトランスナショナルな視点、文体、現代の寓意としての作品の意義について研究を続けていきたい。特に19ー20世紀の変動期日本の現実をみすえたハーンの視点は、日本とアジア、日本と世界という構図においても今意義があると考える。日本時代のハーンのトランスナショナリティについて論をまとめ、グローバルな教育の場においても広い。引き続きハーンのアメリカ時代のテキスト資料を収集精読、共同研究者と議論を重ね、ハーンのトランスナショナルな語りの特徴について学会等で発表、成果を出版する。平成25年度は、「翻訳」と「クレオール」をキーコンセプトに、異言語・異人種・異文化混淆をめぐるハーンの言説を新聞記事と創作に探る。分析は次の三つの観点で行う:1)ハーンの「クレオール化」を巡る言説の分析、2)翻訳に関する記述と翻訳作品の検討、3)ジャーナリズムと文学、創作への移行。比較検討材料としてハーンの日本時代の作品も考慮し、彼のトランスナショナルな特徴をさらに明確にする。成果を発表し(海外研究発表2回、国内シンポジウム1回)、他専門家との意見交換を重ねる。冬期・春期休暇中に資料収集、共同研究者ハッケンバーグ氏を日本に招待し研究会を持ち、研究成果のフィードバックを行う。平成26年度には、ハーンの報道記事や翻訳を彼の幽霊談に結びつけて考察する。異言語異人種異文化接触時に生じる翻訳不可能な沈黙部分、すなわち語り得ないものや民族の過去の記憶は、ハーンの幽霊談(「再話」)の核と考える。
PI3キナーゼ代謝産物の制御がインスリン作用に及ぼす影響と病態での意義の解析

PI3キナーゼはインスリンの代謝作用発現の重要な役割を担う。我々はPI3キナーゼ産物であるPtdIns(3,4,5)P3を特異的基質としてPtdIns(3,4)P2へ代謝する5'-ホスファターゼ活性を有したリピッドホスファターゼとして、SH2-Containing Inositol 5'-Phosphatase 2(SHIP2)をクローニングした。SHIP2はインスリンの標的細胞において高い発現レベルを認めることから、SHIP2がインスリンの代謝作用へのシグナル伝達に及ぼす影響を検討した。野生型(WT)-SHIP2と5'-ホスファターゼ活性を欠損したΔIP-SHIP2をアデノウイルスを用いて分化した3T3-L1脂肪細胞とL6骨格筋細胞に発現させ、インスリンシグナルに及ぼす影響を検討したところ、いずれのSHIP2の発現もインスリン受容体の自己リン酸化からPI3キナーゼの活性化に至るまでのインスリンの早期シグナル伝達には影響を与えなかった。一方、WT-SHIP2で認められるin vivoでの5'-ホスファターゼ活性を反映して、インスリンの代謝作用の発現に重要なPI3キナーゼの標的分子であるAkt、PKCλ、PP1活性と、GSK3βのリン酸化のインスリンによる亢進作用はWT-SHIP2の発現により低下し、内因性のSHIP2の作用を抑制することによりドミナントネガティブに働くΔIP-SHIP2の発現により亢進した。さらに、インスリンによる糖取り込みとグリコーゲン合成の促進作用はWT-SHIP2の発現により低下し、ΔIP-SHIP2の発現により亢進したことから、SHIP2はインスリン作用の生理的な負の調節機構に重要な役割を担うことが示された。最近、我々は5-ホスファターゼ活性を有するリピッドホスファターゼとしてラットSHIP2をクローニングした。本研究ではSHIP2の骨格筋細胞でのインスリン作用への関与をL6筋肉細胞を用いて検討した。分化したL6細胞にアデノウイルスを用いて野生型(WT)-SHIP2、あるいは、5-ホスファターゼ活性が欠損した変異型△IP-SHIP2を過剰発現させた結果、インスリン受容体の自己リン酸化、インスリン受容体基質(IRS)のチロシンリン酸化、IRSとp85-PI3キナーゼサブユニットの結合、PI3キナーゼの活性化までのインスリンの早期シグナル伝達には影響を与えなかった。しかし、SHIP2は5-ホスファターゼ活性を有し、PI3-キナーゼ産物であるPI(3,4,5)P3をPI(3,4)P2に変換する作用を有することをin vivoでの測定で認め、PI3キナーゼの下流に位置するAktとGSK3 βのインスリンによるリン酸化と活性化は、WT-SHIP2の発現により低下し△IP-SHIP2の発現により上昇する結果を得た。これらのPI3キナーゼ下流分子の変化に一致して、インスリンによるグリコーゲン合成酵素活性とグリコーゲン合成は、WT-SHIP2の発現により低下し△IP-SHIP2の発現により上昇した。このことから、SHIP2はインスリンのグリコーゲン合成へのシグナル伝達を抑制的に制御する働きを有することが示された。また、PI3キナーゼの下流で働くAktはin vitroではPI(3,4,5)P3よりもPI(3,4)P2により活性化され易いことが報告されていたが、本研究により、In vivoではAktの活性化にはPI(3,4,5)P3がより重要である結果を得た。リピッドホスファターゼSHIP2はPI3キナーゼ産物であるPtdIns(3,4,5)P3を特異的基質としてPtdIns(3,4)P2への代謝する5'-ホスファターゼ活性を有するため、SHIP2がインスリンの代謝作用へのシグナル伝達に及ぼす影響を検討した。

野生型(WT)-SHIP2と5'-ホスファターゼ活性を欠損したΔIP-SHIP2をアデノウイルスを用いて分化した3T3-L1脂肪細胞とL6骨格筋細胞に発現させ、インスリンシグナルに及ぼす影響を検討したところ、いずれのSHIP2の発現もインスリン受容体の自己リン酸化からPI3キナーゼの活性化に至るまでのインスリンの早期シグナル伝達には影響を与えなかった。一方、WT-SHIP2で認められるin vivoでの5'-ホスファターゼ活性を反映して、インスリンの代謝作用の発現に重要なPI3キナーゼの標的分子であるAkt、PKCλ、PP1活性と、GSK3βのリン酸化のインスリンによる亢進作用はWT-SHIP2の発現により低下し、内因性のSHIP2の作用を抑制することによりドミナントネガティブに働くΔIP-SHIP2の発現により亢進した。さらに、インスリンによる糖取り込みとグリコーゲン合成の促進作用はWT-SHIP2の発現により低下し、ΔIP-SHIP2の発現により亢進したことから、SHIP2はインスリン作用の生理的な負の調節機構に重要な役割を担うことが示された。少なくとも細胞レベルでは、SHIP2はインスリン作用の負の調節因子として重要であることから、2型糖尿病患者よりインフォームドコンセントを得た上で、末梢血より抽出したgenomic DNAのSSCP解析を行いSHIP2のSNPの有無を調べることにより、2型糖尿病の病態にSHIP2が関与する可能性につき現在さらに検討を進めている。
難治性内因性ぶどう膜炎における網羅的自己抗体解析研究

本研究では我々が開発した自己抗体検出システムを用いて難治性内因性ぶどう膜炎の自己抗体を網羅的に検索・同定した。フォークト-小柳-原田病患者を3プール群に分けて検討した結果、患者3プール群すべてにおいて、健常コントロール群に比べて1.5倍以上の産生を示すタンパク質を10種類同定した。ベーチェット病においても同様に患者プール群すべてにおいて、健常コントロール群に比べて1.5倍以上の産生を示すタンパク質を6種類同定した。これら同定したタンパク質のうち、3種類は両疾患において共通であった。研究実施計画に則り研究を遂行し、本実験系における自己抗体検出システムの測定精度、実験者の手技、およびプロトコールはほぼ安定的に確立することが出来たと判断している。ベーチェット病患者2症例から、新たな自己抗体の標的タンパク13種類が検出された。コントロールに比べ3倍20倍の値を示した。他のぶどう膜炎疾患においてこれら自己抗体の産生は認められなかったため、これらがベーチェット病において特異的に産生されるものである可能性がある。検体は眼病変主体のものと消化管病変主体のものであるが、上記13種タンパク質に対して同様に抗体が産生されていることが分かった。今後さらに検討していく予定である。24年度には予想外の新たな発見もあった。癌関連網膜症の一種であるBilateral diffuse uveal melanocyticproliferation (BDUMP)の一症例についても検討したところ、2種類のタンパクに対しコントロールと比較し数百倍といった自己抗体の存在が明らかとなった。しかもこれは卵巣の明細胞癌に起因する網膜症症例であった。現在他の明細胞癌患者検体を収集しており、発見した自己抗体が明細胞癌はなくBDUMPに特異的に出現してくる抗体であることを今後調べていく予定である。25年度はこれら13種類と2種類のタンパク質の解析をさらに進め、自己抗体プロフィールの網羅的な解析を完了させることで、ぶどう膜炎特異的自己抗体を指標とした病態解析および診断技術の開発が可能になることが期待される。本研究では自己抗体検出システム(コムギ胚芽無細胞タンパク質合成ロボット)を用いて難治性内因性ぶどう膜炎であるVogt-小柳-原田病(原田病)およびベーチェット病を対象に自己抗体プロフィールの網羅的な自己抗体スクリーニングを系統的に行い、難治性内因性ぶどう膜炎に特異的な自己抗体の同定を行った。原田病患者14例を3プール群(5例、5例、4例)に分けて自己抗体スクリーニングを行った結果、患者3プール群すべてにおいて、健常コントロール群に比べて1.5倍以上の産生を示すタンパク質を10種類同定した。ベーチェット病においても、患者15例を3プール群(各5例ずつ)に分けて自己抗体スクリーニングを行った結果、患者3プール群すべてにおいて、健常コントロール群に比べて1.5倍以上の産生を示すタンパク質を6種類同定した。これら同定したタンパク質のうち、3種類が両疾患において共通であった。また、両疾患で得られた結果をスコア化してタンパク質のランク付けを総合的に行った結果、さらに12種類のタンパク質が両疾患に共通して関連することが示唆された。本研究で得られた結果をさらに検討することで、難治性内因性ぶどう膜炎特異的な自己抗体を指標とした疾患の病態解明が期待される。さらに、本研究の成果により、難治性内因性ぶどう膜炎の早期診断を行う臨床バイオマーカーといった有用な診断技術の開発が可能になることが期待される。本研究では自己抗体検出システム(コムギ胚芽無細胞タンパク質合成ロボット)を用いて難治性内因性ぶどう膜炎における自己抗体プロフィールの網羅的な解析・検出を行った。研究計画に則り、現在までにベーチェット病患者2検体において、13種類のタンパク質に対する自己抗体が、コントロール群に比べ3倍以上の高値を示すことを確認した。解析に用いたベーチェット病患者2検体は眼病変主体のものと消化管病変主体のものであるが、同一のタンパク質に対して抗体が産生されていることが分かった。13種類のタンパク質のうち、2種類のタンパク質(H、J)が眼炎症患者において非常に高値を示したが、これが病勢または病型を反映しているものか、或いは個人差によるものなのかは今後検体数を増やし検討していく必要がある。他の疾患においてこれらタンパク質に対する自己抗体の産生は認められなかったため、これらがベーチェット病において特異的に産生されるものである可能性が示唆された。23年度の結果から、本実験系における自己抗体検出システムの測定精度、実験者の手技、およびプロトコールはほぼ安定的に確立することが出来たと判断している。あわせてベーチェット病患者2検体から、新たな自己抗体の標的タンパク2種類が検出されたことから、これらのタンパク質の解析をさらに進め、今後自己抗体プロフィールの網羅的な解析を完了させることで、ぶどう膜炎特異的自己抗体を指標とした病態解析および診断技術の開発が可能になることが期待される。

ほぼ研究実施計画通りに進行し、内因性ぶどう膜炎の標的タンパク候補が13種類検出できた。一方、癌関連網膜症症例から、当初予想していなかった、健常者の数百倍の値を示すタンパクを2種類新たに見いだした。本年度はこの2種類も合わせて詳細に検討する予定である。研究計画初年度の目標である、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成ロボットを用いた自己抗体検出システムが、難治性内因性ぶどう膜炎における自己抗体プロフィールの網羅的な解析・検出に有効であることが示された。解析に必要な各種プロトコールがほぼ確定できた。今年度はこれらタンパク質の解析をさらに進め、今後自己抗体プロフィールの網羅的な解析を完了させることで、ぶどう膜炎特異的自己抗体を指標とした病態解析および診断技術の開発が可能になることが期待される。今回ベーチェット病の症例を対象に解析を行い、解析した13種類のうち眼炎症の活動性の高い患者で有意な変動があったのは2種類(タンパク質H, J)であった。今後さらに症例数を増やして解析を進めるとともに、患者の臨床症状を再度詳細に検討する。特に眼病変の有無、あるいは腸管など特殊病型の有無での自己抗体プロフィールの網羅的な解析を行う。病理標本のある例では病理組織像との関連も検討する。最終的にはぶどう膜炎特異的自己抗体を指標とした病態解析、活動性の評価、予後判定、および診断技術の開発につなげたい。25年度は検索対象症例、疾患対照者、および健常対照者がさらに増加する予定であり、研究費は計画通り使用される予定である。23年度研究開始当初は検索予定の患者、健常対照者からの同意取得数が比較的少なく、検討症例数が減少したため、消耗品費、薬品費の使用が計画より減少した。24年度は検索対象症例、疾患対照者、および健常対照者が増加する予定であり、その検索のためにこの研究費が使用される予定である。
新規抗真菌剤UK-2Aの作用特性

本研究代表者らが見いだした新規抗真菌剤UK-2Aの作用は、真菌細胞に特異的であって、動物細胞に作用しない。一方、構造類似体である呼吸阻害剤アンチマイシンAは、いずれの細胞にも作用し、また、UK-2Aとは異なり、活性酸素の発生を惹起する。両物質は種々の生物由来のミトコンドリアにおける電子伝達系の複合体IIIに作用を及ぼすが、ウシ心筋から調製した亜ミトコンドリア顆粒のチトクロームbc_1複合体における差スペクトルが異なった。この複合体IIIにおける阻害様式の違いが、活性酸素の発生の有無に反映し、その事を通じてUK-2Aの最大の作用特性である低毒性の仕組みを説明しうるものと推察した。UK-2Aあるいはその関連化合物はまもなく農薬として実用化されるであろう。現時点での具体的な課題は、UK-2Aの生産性と抗真菌作用の持続性の一層の向上である。前者の課題に関連して、ある糸状菌の産生する多糖は放線菌の細胞内に存在するUK-2Aを細胞外に分泌させ、生産性を向上させた。この多糖は少なくとも50%以上のβ-1,3結合を有する極めて高分子のグルカンであった。後者の課題に関連して、構造活性研究の中から興味深い事実を見いだした。すなわち、UK-2Aとは側鎖の異なる9員環ジラクトン部分および3-formylaminosalicylic acid部分からなるアンチマイシンAとUK-2Aとの間で合成したいくつかのハイブリッド体、たとえばUK-2Aの9員環部分とアンチマイシンAの3-formylaminosalicylic acid部分とからなる化合物、はUK-2AやアンチマイシンAと同等以上の呼吸阻害作用を示し、UK-2Aと同程度の細胞毒性、つまり低毒性を示した。これらのハイブリッド体の農薬としての評価については現在試験中である。新規9員環ジラクトンUK-2A、および、その構造類似体である呼吸阻害剤antimycin(AA)は共に強力な抗真菌活性を有するが、UK-2Aの動物細胞に対する低毒性が何に由来するのかを明らかにすべく検討した。まず、種々ミトコンドリアの呼吸鎖複合体IIIでの電子伝達を阻害することを確認した。ついで、ウシ心筋ミトコンドリアから調製した亜ミトコンドリア顆粒を用いて、チトクロームbcl複合体の差スペクトラムを測定したところ、UK-2AとAAで異なり、複合体IIIにおける阻害様式に明らかな違いのあることがわかった。UK-2Aの活性発現に必要な部分構造を描出すべく、9員環ジラクトン部を直鎖アルキル基(炭素数4,8,12,16)やイソプレニル基に置換した誘導体をいくつか合成した。さらに、2-hydroxylnicotinic acid、3-hydroxylpicolinic acid、3-formylaminosalicylic acidからも同様のアナログを合成した。これら誘導体の抗菌活性を評価したところ、いずれもUK-2AやAAよりも弱いものであったが、炭素数8の直鎖アルキル誘導体が比較的良好な活性を示した。標的蛋白チトクロームbは膜貫通型であるので、阻害剤は細胞膜中に溶け込んで阻害部位までたどり着かなければならず、直鎖アルキル部の疎水性度が重要な役割を果たしていることを示唆している。ある糸状菌が産生する多糖はUK-2Aの菌体外生産を促進した。また、UK-2A、および、その誘導体の1つは圃場試験において、稲イモチ病のみならず小麦サビ病に著効を示した。それらの詳細は現在継続して検討中である。

交付申請書にも記しているように、平成13年度の研究においては、UK-2Aおよびその関連化合物の実用化にあたって、障害になっているいくつかの問題点の解決に力を注いだ。まず、抗真菌剤UK-2Aの生産性向上に関し、この物質は菌体内成分であることから、菌体外への分泌を誘導するような種々の条件検討を行った。その結果、ある糸状菌の産生多糖が分泌誘導活性を示した。この活性物質は粘性が高く、少なくとも50%以上のβ-1,3結合を有する極めて高分子のグルカンであることがわかった。次いで、9員環ジラクトン部分および3-hydroxy-4-methoxypicolinic acid部分からなるUK-2Aの構造活性相関の解明とあわせて持効性の高い化合物を探索した。その結果、9員環部分を炭素数9の直鎖アルキル基に置換した誘導体に顕著な抗真菌作用を認めた。しかし、この作用は呼吸阻害に起因せず、細胞膜障害によるものであり、動物細胞膜にも障害を及ぼしたことから、いわゆる薬害が危惧された。そこで、持効性に加えて安全性という観点からも有望物質の合成・探索を行った。その結果、UK-2Aとは側鎖の異なる9員環ジラクトン部分および3-formylaminosalicylic acid部分からなるアンチマイシンAとUK-2Aとの間で合成したいくつかのハイブリッド体、たとえばUK-2Aの9員環部分とアンチマイシンAの3-formylaminosalicylic acid部分とからなる化合物、はUK-2AやアンチマイシンAと同等以上の呼吸阻害作用を示し、UK-2Aと同程度の細胞毒性、つまり低毒性を示した。これらのハイブリッド体の農薬としての評価については現在試験中である。
陸棲シアノバクテリアが営む無水生活様式を司る機能性分子の解明

陸棲シアノバクテリア(Nostoc commune)は,非常に強い乾燥耐性を示す光合成生物である。本研究では,無水環境下における生命維持機構に関わる機能性分子のひとつとしてマイコスポリン様アミノ酸(MAA)を解析した。本生物がもつ新規MAAは,糖を結合した特異な化学構造をもち,抗酸化活性を示す多機能性分子であることを明らかにした。また,遺伝子型ごとに含まれているMAA配糖体の違いが発見され,N. communeは3種類の型に大別されることが分かった。陸棲シアノバクテリア(Nostoc commune)は乾燥状態で100年以上の長期にわたり生命を維持し,吸水することによって生命活動を再開する。本研究は,細胞外マトリクス,紫外線吸収物質,抗酸化物質に着目し,これらの機能性分子の詳細な役割を明らかにすることを目的とする。(1)紫外線吸収物質マイコスポリン様アミノ酸(MAA)を精製して化学構造解析を行うとともに,抗酸化活性の解析を行った。吸収スペクトラムの異なる2種類のMAAが検出され,どちらも新規の化学構造を持ち,抗酸化活性を示すことが明らかになった。(2)細胞外マトリクスに含まれているタンパク質について網羅的解析を行った。細胞外マトリクスタンパク質の70%以上を占める主要タンパク質は,既に報告のある水ストレスタンパク質(WspA)であった。WspAの他に7種のタンパク質が検出され,細胞外マトリクスの機能に関わると考えられるものとしてカタラーゼ,スーパーオキシドディスムターゼ,およびフェリチンが同定された。(3)Nostoc属シアノバクテリアについて光合成による酸素発生量を指標として乾燥と凍結に対するストレス耐性を調べるとともに細胞外多糖を比較解析した。Nostoc punctiforme M-15株は乾燥および凍結に対する耐性を示した。Nostoc sp.PCC 7120株およびNostoc comune KU002株は乾燥耐性を示さず,凍結耐性のみを示した。Nostoc muscorum M-14株は乾燥および凍結に対して感受性であった。野外に生育しているN.communeから細胞外多糖を精製し構成単糖を分析した。主成分はグルコース,キシロース,ガラクトース,マンノースおよびグルクロン酸であった。陸棲シアノバクテリア(Nostoc Commune)は乾燥状態で100年以上の長期にわたり生命を維持し,吸水することによって生命活動を再開する。(1)本生物は紫外線吸収物質としてMycosporine like amino acid (MAA)およびスキトネミンを持つ。本生物で見いだした吸収スペクトラムの異なる2種類のMAAを精製し化学構造解析を行った。その結果,それぞれ分子量478Daおよび1050Daの新規の化学構造を持つMAA配糖体であることが分かった。また,これらのMAA配糖体が抗酸化活性を示すことを明らかにした。さらにスキトネミンを精製し,本物質が抗酸化活性を示すことを明らかにした。以上の結果は,MAA配糖体およびスキトネミンが紫外線防御だけでなく酸化ストレスに対する防御にも働く多機能性分子であることを示す。(2)細胞外マトリクスを持つ水棲シアノバクテリアNostoc Verrucosum(アシツキ)とN.Communeとの間で比較解析を行った。その結果,N.Verrucosumは,乾燥耐性を示さないが乾燥ストレス処理に応答して非還元二糖トレハロースを蓄積すること,これまで細胞外マトリクスタンパク質としてN.Communeだけで報告されていたWspAを持つこと,および細胞外多糖を構成する単糖の組成は異なるがその化学的性質は類似していることを明らかにした。(3)国内外の約140地点から採集したN.Communeの試料について遺伝子型の解析を実施した。この結果,外見上区別することが困難なN.Communeに遺伝的多様性が発見され,日本国内におけるN.Communeは4種類の遺伝子型に大別されることが分かった。本研究の目的は,本生物がもつ機能性分子を解析し,極限的な乾燥耐性における役割を明らかにすることである。(1)N. communeは,紫外線吸収物質としてMycosporine like amino acid (MAA)をもつ。これまでに分子量478 Daおよび1050 DaのMAA配糖体を明らかとしている。本年度はさらに研究を進めて,分子量508 Daおよび613 Daの新規MAA配糖体を抽出・精製することに成功し,これらの化学構造を解明した。また,これらの新規MAA配糖体は,これまでに明らかにしたMAA配糖体と同様に抗酸化活性を示した。以上の結果は,N. communeで見いだされるMAA配糖体は,共通の性質として,紫外線防御だけでなく酸化ストレスに対する防御にも働く多機能性分子であることを示す。

(2)N. communeと遺伝的に近縁ではあるが乾燥耐性を示さない水棲シアノバクテリアNostoc verrucosum(アシツキ)において,本生物がもつMAAを抽出・精製して解析を行った。その結果,N. verrucosumは,紅藻で報告されているポルフィラー334をもつことが明らかとなった。これまでにN. communeがポルフィラ-334配糖体をもつことを明らかとしており,N. verrucosumは糖鎖の付加機構をもたない祖先的なシアノバクテリアであると考えられる。(3)複数の地点から採集したN. communeの試料について,これらの遺伝子型と含まれているMAA配糖体のタイプの違いを解析した。その結果,含まれているMAA配糖体による違いが発見され,N. communeは3種類の型に大別されることが分かった。当初に計画していた研究項目について,4件の学術論文として研究成果を発表することができた。また,新規の紫外線吸収物質および抗酸化物質を発見することができ,研究開始時点では未知であった研究項目を次年度に継続して研究することが可能となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究により見いだしている第3のMAA配糖体について化学構造を決定する。また,N.Commune抽出物中に検出されている抗酸化物質を精製し化学構造解析を実施する。さらに,N.Communeの遺伝子型の違いによって産生する紫外線吸収物質の型が異なるのか否かについて解析を進める。これらによりN.Communeの多様化と環境適応のメカニズムの解明を推進する。
ブロッホライン対書き込み操作のシミュレーション

磁性薄膜中に存在する磁壁上の磁化構造であるブロッホラインを情報の記憶単位として用いるブロッホライン記憶装置は、次世代の不揮発性高密度個体記憶装置として現在研究が進められている。情報の書き込み操作であるブロッホライン対の書き込みの操作の一つとして、ブロッホポイント注入法が提案されている。この手法ではまずunwindingな二つのブロッホライン対を生成し、それぞれの内側のブロッホラインを消去することで、windingで安定なブロッホライン対を生成する。内側のブロッホラインの消去過程において、ブロッホポイントの発生が仮定されているが、実験ではブロッホポイントは直接観測することは出来ない。ここでは計算機シミュレーションを行なうことで、ブロッホライン書き込み操作の一部であるブロッホポイントの注入によるブロッホライン対の消滅過程の詳細を求めた。これらの計算は東京大学大型計算機センターのスーパーコンピュータを用いて行なった。計算は三次元の動的計算であるために、その結果として膨大な数値データが得られるが、これを詳細に解析するためには数値の視覚化が必要になる。この作業は研究室のワークステーション上で行なった。数値データと視覚化した画像データは膨大な量になるために、専用のハードディスク装置を購入した。
新しいVIP属ペプチド、ヘロデルミンの構造と受容認識に関する研究

1.平成1年度において、既に報告した様にHdのC末端を順次欠いたHd(1ー33)ーNH_2,Hd(1ー31)ーNH_2,Hd(1ー30)ーNH_2およびHd(1ー28)ーNH_2を液相法により合成し、合成品の犬大腿動脈血流増加の検討結果ならびに合成ペプチドおよびHd,VIPの二次構造解析結果よりHdがその特微とする持続的血流増加作用を発現するためには31位Thr残基よりC端部ペプチド配列および分子C端部のβータ-ン構造が必須であることを明らかにした。さらにVIPのN端部構造とHdのC端部構造を合わせ持つVIP(1ー11)ーHd(12ー31)ーNH_2,VIP(1ー11)ーHd(15ー31)ーNH_2および[Gly^5]ーVIP(1ー11)ーHd(12ー31)ーNH_2の新たなHd関連ペプチドを合成し、その血流増加作用を検討した。その結果、いずれも作用はHdの1/5以下であったがVIPとは相加的に作用し、一方Hdとは拮抗的に作用することが明らかとなり犬大腿動脈血流増加作用発現にはVIPとHdが互いに異なる受容体を介して作用していることを示す知見を得た。2.平成2年度においては当初の計画に従い、(1)哺乳動物組織内免疫活性Hdの分布を検討した。組織内Hd様免疫活性成分の分布の検討いは先に確立した。Hd(7ー35)特異ラジオイムノアッセイ(RIA)系を用い、ブタ脳および消化管組織抽出物中の免疫活性を測定した。その結果、測定した全ての組織に免疫活性が検出され、脳では特に視床下部、延髄、小脳に、また消化管では小腸、回腸および結腸で特に高値であった。(2)ついで、以上の結果に基づき、まずブタ小腸抽出物中のHd様物質の単離を目指し、その存在様式の検討を行った。その結果、ブタ小腸の1.0M酢酸抽出物をSephadex Gー50Superfineカラムによるゲル濾過画分中Hd様免疫活性はVoからVtに広く溶出され、Hdが多様な分子型で存在することを明らかにした。同時にデルタパックC_<13>カラムを用いる逆相HPLCにより0.01N HCl中のアセトニトリル濃度を30%および60%の段階的溶出法で溶出した結果、Hd様免疫活性の約60%がアセトニトリル30%画分に溶出され、この画分の分析用逆相HPLCにおける溶出液中のHd様免疫活性として主要な2成分が検出された。この結果、ブタ腸組織中のHd様免疫活性成分は多様な分子型であるが、0.01N HCl/CH CN系溶出溶媒を用いる逆相HPLCにより主要成分が分離されHd様成分の単離が可能であることを示した。同時にデルタパックC_<13>

カラムを用いる逆相HPLCにより0.01N HCl中のアセトニトリル濃度を30%および60%の段階的溶出法で溶出した結果、Hd様免疫活性の約60%がアセトニトリル30%画分に溶出され、この画分の分析用逆相HPLCにおける溶出液中のHd様免疫活性として主要な2成分が検出された。この結果、ブタ腸組織中のHd様免疫活性成分は多様な分子型であるが、0.01N HCl/CH CN系溶出溶媒を用いる逆相HPLCにより主要成分が分離されHd様成分の単離が可能であることを示した。研究目的に従い、まずヘロデルミン(Hd)に特徴的な持続的血流増加作用とその受容体認識に必須な構造を明かにするためHdのC末端を順次欠いたHd(1-33)-NH_2,Hd(1-31)-NH_2,Hd(1-30)-NH_2,およびHd(1-28)-NH_2の4種類のHd関連ペプチドを液相法により合成した。粗成生物は、逆相HPLCで精製し、アミノ酸分析および逆相HPLCにより精製品が高純度単一物質であることを証明した。得られた4種類のHd関連物質についてSaidとMuttのVIP bioassay法を用い、犬大腿動脈血流増加をHdおよびVIPのそれと比較検討した。その結果、Hd(1-33)-NH_2およびHd(1-31)-NH_2ではHdと同等の持続的血流増加作用を示した。一方Hd(1-30)-NH_2およびHd(1-28)-NH_2では血流増加作用は示すが、その作用の持続性は消失していた。さらにこのペプチドの二次構造をChou-Fasman法により解析した結果、持続作用を有するHd,Hd(1-33)-NH_2およびHd(1-31)-NH_2では分子C端部がβ-タ-ン構造であり、Hd(1-30)-NH_2およびHd(1-28)-NH_2のそれはランダムコイルであった。すなわち本研究によりHdがその特徴である持続的血流増加作用を発現するには31位Thr残基よりC端部ペプチド配列および分子C端部のβ-タ-ン構造が必須であることを明らかにした。ついで以上の知見に基づき、強い血流増加作用を有するVIPのN端部構造と、持続作用を示すHdのC端部構造を合わせ持つVIP(1-11)-Hd(12-31)-NH_2,VIP(1-11)-Hd(15-31)-NH_2および〔Gly^5〕-VIP(1-11)-Hd(12-31)-NH_2の3種類の新たなHd関連ペプチドをデザインし合成した。この3種類のHd関連ペプチドの血流増加作用はいずれもHdの1/5以下であったが〔Gly^5〕-VIP(1-11)-Hd(12-31)-NH_2はVIPとは相加的に、一方Hdと拮抗的に作用することを明らかにし、犬大腿動脈血流増加作用発現においてVIPとHdが互いに異なる受容体を介して作用していることを示す有力な知見がえられた。1.平成1年度において、既に報告した様HdのC末端を順次欠いたHd(1ー33)ーNH_2,Hd(1ー31)ーNH_2,Hd(1ー30)ーNH_2およびHd(1ー28)ーNH_2を液相法により合成し、合成品の犬大腿動脈血流増加の検討結果ならびに合成ペプチドおよびHd、VIPの二次構造解析結果よりHdがその特徴とする持続的血流増加作用を発現するためには31位Thr残基よりC端部ペプチド配列および分子C端部のβ-タ-ン構造が必須であることを明らかにした。さらにVIPのN端部構造とHdのC端部構造を合わせ持つVIP(1ー11)ーHd(12ー31)ーNH_2,VIP(1ー11)ーHd(15ー31)ーNH_2および[G1y^5]ーVIP(1ー11)ーHd(12ー31)ーNH_2の新たなHd関連ペプチドを合成し、その血流増加作用を検討した。その結果、いずれも作用はHdの1/5以下であったがVIPとは相加的に作用し、一方Hdとは拮抗的に作用することが明らかとなり犬大腿動脈血流増加作用発現にはVIPとHdが互いに異なる受容体を介して作用していることを示す知見を得た。2.平成2年度においては当初の計画に従い、(1)哺乳動物組織内免疫活性Hdの分布を検討した。組織内Hd様免疫活性成分の分布の検討には先に確立したHd(7ー35)特異ラジオイムノアッセイ(RIA)系を用い、ブタ脳および消化管組織抽出物中の免疫活性を測定した。
間葉系細胞由来のPDGFが網膜神経節細胞の神経突起再生能に及ぼす影響について

昨年確立させた培養細胞の実験系を用いて、培養液にNGF(100ng/ml)、BDNF(l00ng/ml)を加えて、網膜神経節細胞の細胞生存率と神経突起伸長率を測定したところ、両神経栄養因子とも、有意に増大させた。中枢神経系の網膜神経節細胞において、NGF、BDNFがニューロンの分化促進・生存維持作用を示すことが確認できた。また間葉系細胞の増殖因子で神経細胞にも発現しているPDGF-BB(10ng/ml)について同様に検討したが、有意な結果は得られなかった。しかしラット小脳細胞ではPDGFにより生存日数の延長や神経突起の延長が報告されており、再度検討する必要がある。また培養液にNGF、BDNF、PDGF-BBを加え、どのような遺伝子が発現しているかアイソトープ標識のプローブを用いたin situ hybridization法により検討した。PDGFβreceptorgene、PDGF gene、c-fos、c-iun、trkBが発現しているか否か検討した。その結果、私の実験系では、NGF、BDNF、PDGF-BB投与によりPDGFβreceptor gene、PDGF gene、c-fos、c-jun、trkBの発現は観察されなかった。しかし、プローブのラベルにむらがあることやin situhybridizationの処理過程において細胞が脱落するという技術的な問題、網膜神経節細胞の数が少ないことなどの検討課題がいくつかあり、これらの課題を解決してから、再度検討する必要がある。今後は、RT-PCR法の採用を含め実験的手法の変更を検討している。新生児ラット眼球から硝子体や網膜色素上皮細胞が混入しないように網膜を取りだした。このため。5、6匹の新生児ラット眼球から1回の実験に必要な網膜が得られた。さらに、われわれの方法で網膜細胞の培養は、可能であった。この網膜細胞が、網膜神経節細胞であること(網膜神経節細胞の同定)は、神経節細胞に発現しているThy-1に対する抗体を用いて行った。本年度は、培養細胞を用いた実験系を確立することができた。続いて、培養液にNGF、BDNFを加えて、細胞生存率、神経突起伸長率を測定した。両神経栄養因子とも、細胞生存率、神経伸長率を増大させる傾向にあるが、現在実験回数を増やし、有意差を検討中である。