hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
hTERTにおける選択的スプライシングとテロメラーゼ活性の発現抑制

テロメラーゼの活性化は癌細胞の持続的な成長や進展にとって重要である。ヒトロ腔における正常、前癌病変、癌組織のテロメラーゼサブユニットの発現を検出するとともにテロメラーゼ活性の発現との関連性、またhTERT検出の際、RTモチーフのdomain1,2に加え、domainA,B'領域について検出し、選択的スプライシングの可能性を検討した。テロメラーゼと各mRNAの検出にはヒト培養細胞、口腔扁平上皮癌、白板症、正常歯肉粘膜組織を用いた。テロメラーゼの検出には、modified TRAP assay、hTERT、スプライシングの検出にはRT-PCR法にて検出した。テロメラーゼは、正常歯肉では認めず、白板症、扁平上皮癌において活性の上昇を認めた。hTERTの発現も同様に正常歯肉では認めず、白板症、扁平上皮癌で認めた。テロメラーゼ活性とhTERTの発現は危険率1%で相関係数0.72と高い相関関係を認めた。またhTERT mRNAのdomainA、B'領域で選択的スプライシングを高率に認めた。白板症、扁平上皮癌の検出においてスプライシングの全長が認められる場合でもテロメラーゼ活性が認められない例や選択的スプライシングを認めるにもかかわらずテロメラーゼ活性が存在する例があり、一定の関係は認められなかった。テロメラーゼを構成するサブユニットのうち、hTERTmRNAの発現は、テロメラーゼ活性の発現と高い相関を示し、テロメラーゼ活性発現の律速因子と考えられる。hTERTの選択的スプライシングによるタンパクのVariantがかなりの割合で生じていると考えられ、このVariantはテロメラーゼ活性の制御に何らかの関与をしていると考えられた。ヒトテロメラーゼの主な構成要素としてhTERTがあり、hTERTの発現は前癌病変や癌組織に検出され、そのtranscriptionがテロメラーゼ活性の発現の制御を決定しているとされる。hTERTは1,132アミノ酸からなりC末端側半分にはレトロウイルスなどで見られる逆転写酵素で保存されているドメイン1,2,A,B',C,Dが存在し、それらの境界部分には異なる生物種のTERTで保存されている領域Tが存在する。癌組織や細胞の中にはhTERT(RTモチーフ、ドメイン1,2)が発現されているにもかかわらずテロメラーゼ活性が発現されていないものがしばしば認められることから、テロメラーゼ活性の制御はhTERTのtranscriptionのみではない可能性があることが予想される。口腔癌組織、細胞においてhTERT mRNA RTモチーフの選択的スプライシングが比較的高率に認められ、これにより一つの遺伝子から複数のTERT蛋白のvariantが生じていると考えられる。本研究は選択的スプライシングによるhTERTのvariantがテロメラーゼの活性の制御機構としていかなる意義をもつかを解明することを目的とする。研究の概要としてhTERT、RTモチーフをRT-PCRにて調べるためのPCRプライマーの設計を行う。プライマー設計にはhTERT mRNAの配列はGenBank AF Database AF015950を用いる。ヒト口腔癌組織(SCC)を集め、設計したプライマーを用いたRT-PCRにてhTERT、RTモチーフ中の各領域でのスプラシングを調べ、テロメラーゼ活性の測定は独自に開発した改良TRAP法を用いて定量的に行う。テロメラーゼ活性の発現とhTERTのスプライシング部位との関連性を比較検討する。
総合的な学習として実践する食農・味覚教育のためのプログラム開発

プロの調理人に直接出荷するための品質にこだわる農業生産者と,一般的な農業生産者に対して,農産物や農業教育などに関する調査を行い,分析した。その結果を活かした日本版味覚教育の授業プログラムを作成して小学生に授業実践し,その教育効果を分析し評価した。結果,『和食がより好きになった』および『和食は季節感のある料理』であることを認識する子ども達が授業前に比べ有意に増加した。また児童の食習慣に対する授業効果への影響にも有意な変容が認められ,子ども達の和食への意識を改変するのに,本プログラムは十分な教育効果を持つと結論づけた。本研究の目的は,フランス版味覚教育プログラムを参考に,総合的な学習の時間用の,食農教育を内包する日本版味覚教育プログラムを開発し,その教育的効果を確認することである。初年度(23年度)はフランス版味覚教育プログラム実践の現状を,主にロアール地方を中心に実地調査し,併せてフランスの学制や味覚教育の発達史などに関する文献についても調査した。また,同年度に初めて日本で実施された味覚週間の実施状況について,主として東京の小学校での実施状況および関連文献について,研究計画に追加して調査した。24年度では同年度に実施された日本での第2回味覚週間の実施状況について,主に関西地域で調査し,フランスでの実施状況と比較したときの特徴や課題について検討した。調査対象は小学校で実施された味覚の授業およびレストランなどで実施された味覚の食卓である。また,京都料理アカデミーと京都市教育委員会が共同で,京都市内の小学校において実施している味覚教室を10校程度取材し,主に「うま味」について子ども達の味覚を磨く教育カリキュラムの在り方とその実践について調査した。さらに栽培体験と給食を通じての食の学習を複合的に学習させる「食農学習」を実践してきた小学校について,日本全国から25校を選択して,その教育的意義や課題について調査した。その結果,味覚の授業への小学生の関心度は非常に高く,味覚の感度は予想よりも優れていたこと,「うま味」への関心や感度もとくに京都の小学生で高いようであったが,大阪在住の外国籍の小学生は逆に拒否反応を示す傾向にあったこと,味覚の食卓で出された料理は,大人が味覚を鍛えるために様々に工夫されたものであったことが明らかとなった。上記の調査研究を通じて得られた,日本版の味覚教育プログラム作成に必要な資料・情報を,現在整理しまとめつつある。25年度の研究は日本版味覚教育プログラムの構築に向けて直接必要な情報を入手することにあった。すなわち栽培から調理までを通した食農教育の実践に関する中学校現場対象の調査研究,日本料理の素材である良質な野菜等を,料理人の要求に応じて生産する技術力の高い農家の栽培方法に関する情報収集,外国人と日本の子ども達の味覚の際に関する調査,などである。学校現場にて野菜の栽培と調理を一貫して指導することにより,食に対する理解を深めるだけでなく,食材のありがたさや生産者への感謝の気持ちを育むことが可能となった。また,教員の負担は大きくなるものの,生命を大切にする心の育成まで可能となった。主として料理人に提供する野菜などの素材を栽培している生産者からの聞き取りでは,料理人からの要求は様々であり,最終的な判断は生産者が旨いと感じる生産物を提供することになり,それに応じる栽培技術が要求されること,料理人は野菜の形状,色,大きさへの要求も強いこと,料理人の細かい要求に応じるには多品目少量生産することになり,その結果減・無農薬有機栽培になること,などが認められ,生産者の栽培方法や技術的進歩に利用者である料理人の素材への要求が大きく係わっていることが示唆された。外国人の味覚を日本人のそれと比較すると,特定の味について大きな相違が認められた。とくにコンブの味に関しては,外国人の評価は低い傾向に有り,生臭く海臭いとのネガティブな評価が目立った。日本の子どもについては,「うま味」の評価が想定したよりも敏感であった。カツオやコンブの評価は想定通りであったが,シイタケの味は評価が低く,『いりこ』のうま味は評価が高かった。本研究の目的は,総合的な学習の時間において,食農教育を内包する味覚教育を,児童を対象に実践する効果的なプログラムを開発することである。日本食を中心とした味覚教育であり,日本の食文化の伝承をも意図している。23年度は,(1)フランス版味覚教育プログラムに関する分件や情報の収集,(2)日本の学校現場における,味覚教育を中心とした食教育の現状と課題の分析,を計画・実施した。(1)については,23年度に偶然ではあるが,フランスの味覚教育発祥の地であるロアール地方を中心とした味覚教育視察ツアーが計画されたので,これに参加することとした。フランスの小学校,レストラン,農場における味覚教育が実践されている現場を視察するとともに,味覚教育を体験することなどを通じて,フランスの味覚教育に関する文献や情報を入手するとともに,味覚教育実践者との交流や講演会への参加を通じてフランス流味覚教育の実態を認識できた。

また,国内では日仏会館などを訪問して関連文献や情報を収集した。(2)については,日本での味覚教育は23年度から本格実施されている。同年度は国内で約40の小学校で実践された。その大半が東京都内の小学校での実践であったので,23年度はこのうち9校を選出して現地訪問し,味覚教育担当の教員を対象に面接調査法により情報収集した。その結果,多くの小学校で味覚養育は探りを入れる,単発的な実践であったこと,児童の反応は良好であり,味覚への認識が高まったこと,実践校の多くが味覚の要素のうち『旨味』について学習させていたこと,次年度以降も継続実施する希望が強かったこと,などが明らかとなり,フランスの味覚教育とは幾分異なった実施状況が明らかとなった。26年度の研究は,前年度に実施した『プロの調理人に農業生産物を直接出荷する,いわゆる品質にこだわる農業生産者と,そうでない一般的な農業生産者に対して実施した,農産物や農業教育などに関する調査を京都市内の農業従事者を対象に行い、その結果の分析及びその結果を活かした日本版味覚教育の授業プログラムの製作,そしてそのプログラムに則った授業実践とその教育効果の分析・評価を実施した。その結果、『こだわりの農業生産者』、一般生産者ともに「京野菜」や「地産地消」を意識した生産をしているものの、前者は後者に比べて野菜などの「旬」や「季節性」をとくに大切にした生産を行っていることが明らかとなった。次にその結果を取り入れて日本版味覚教育プログラムを作成した。小学校中学年を対象とする全7単位時間の構成で、いずれも「総合的な学習の時間」において実践する。第1次は『五感で感じよう』を主題にした内容で、料理は味覚だけでなく視覚、触覚など他の感覚を総動員して味わうものであることを児童に理解させる。以下、第2次が『おいしさを耳で感じよう』、第3次が『直径10cmの和食の世界』、第4次が『「だし」を五感で感じよう』、第5次が『旬の野菜を五感で感じよう』、第6次が『和食を作ろう』の全6次構成であり、和食を主題材としている。授業はこのうち第2次と3次について、小学校4年生を対象に2クラス分を実施した。その結果、『和食がより好きになった』子ども達および『和食は季節感のある料理』であることを認識する子ども達が、いずれも授業前に比べ統計的に有意に増加した。また児童の食習慣の授業効果への影響も、一部に有意な変容が認められた。本研究で作成した授業プログラムは、子ども達の和食への意識を改変するのに、十分な教育効果を持つものと結論された。技術科教育、農業教育、環境教育24年度の主な研究計画は(1)フランスの味覚教育の日本版への応用可能性の比較検討,(2)日本人特有の味覚教育に関する検討,の2点である。(1)についてはまず日・仏両国の味覚教育に関連する項目ごとの整理と内容の比較検討を行った。関連項目の舌で感じる「味」および見た目の料理への「視覚」については比較的詳細に比較検討を行ったが,料理への「嗅覚」や「嗜好」については,検討がまだ不十分である。
コムギのジベレリン非感受性変異を用いた感受性要因の分子的解析

コムギで育種上重要な役割を果たしてきた矮性変異体は,GAに対する非感受性の変異体でもある.今回,GA非感受性突然変異体(Rht3)を用い、GAに対する細胞の応答についての分子的な解析を試みようとした.今回の研究から,種子糊粉層のGA感受性は種子の発達過程の開花後40日以後に発達し,Rht3変異体では,種子発達中には発達しなかった.また,Rht3変異体の成熟種子糊粉層は,GAに対し低い反応性を示した.また,Rht3変異のGA感受性は低温吸水処理により回復することから,この変異がGA感受性の欠失型の変異ではなく,GA感受性に関わる因子が部分的に変更した変異であることが明らかになった.また,低温吸水による感受性の変更は,この因子が細胞膜に存在する可能性を示唆した.正常なコムギ系統とRht3系統の種子糊粉層(開花後40日)のタンパクを2次元電気泳動で分析した結果,20余りのpolypeptidesに違いが見られた.この変異の中で,このRht3変異の上記の生理的結果をもとに解析すると,膜に結合していると思われるタンパクの中に1つの有力なRht3変異に関わると思われるPolypepetideを推定した.また,正常なコムギ系統とRht3系統の種子糊粉層(開花後30日)のRNAを用い,Differential display法でこの感受性に関わる因子を抽出しようとした。この変異体が遺伝子欠失型の変異でないことから,Differential display法でこの変異に関わる因子を抽出することは困難と思われたが,この分子遺伝学的方法の技術的拾得の未熟さもあって成功しなかった.今後,Rht3変異の準同質遺伝子系を用いて,2次元電気泳動により明らかになったpolypeptideがGA感受性に関わるかどうか更に検討する必要がある.コムギで育種上重要な役割を果たしてきた矮性変異体は,GAに対する非感受性の変異体でもある.今回,GA非感受性突然変異体(Rht3)を用い、GAに対する細胞の応答についての分子的な解析を試みようとした.今回の研究から,種子糊粉層のGA感受性は種子の発達過程の開花後40日以後に発達し,Rht3変異体では,種子発達中には発達しなかった.また,Rht3変異体の成熟種子糊粉層は,GAに対し低い反応性を示した.また,Rht3変異のGA感受性は低温吸水処理により回復することから,この変異がGA感受性の欠失型の変異ではなく,GA感受性に関わる因子が部分的に変更した変異であることが明らかになった.また,低温吸水による感受性の変更は,この因子が細胞膜に存在する可能性を示唆した.正常なコムギ系統とRht3系統の種子糊粉層(開花後40日)のタンパクを2次元電気泳動で分析した結果,20余りのpolypeptidesに違いが見られた.この変異の中で,このRht3変異の上記の生理的結果をもとに解析すると,膜に結合していると思われるタンパクの中に1つの有力なRht3変異に関わると思われるPolypepetideを推定した.また,正常なコムギ系統とRht3系統の種子糊粉層(開花後30日)のRNAを用い,Differential display法でこの感受性に関わる因子を抽出しようとした。この変異体が遺伝子欠失型の変異でないことから,Differential display法でこの変異に関わる因子を抽出することは困難と思われたが,この分子遺伝学的方法の技術的拾得の未熟さもあって成功しなかった.今後,Rht3変異の準同質遺伝子系を用いて,2次元電気泳動により明らかになったpolypeptideがGA感受性に関わるかどうか更に検討する必要がある.コムギの糊粉層におけるα-amylase合成は、胚から分泌される植物ホルモンであるジベレリンの刺激により誘導されるが、α-amylaseの発現量は、糊粉層組織のジベレリンに対す感受性の高低によっても変化する。コムギでは、ジベレリンに対する感受性に関わるGai1,Gai2、Gai3の遺伝子が知られているが、これらの物質的な実態は不明である。これらの遺伝子に突然変異を起こした同質遺伝子系(Maris Hurtman)が存在するので、これらの種子糊粉層を用いて分析した。Gai1とGai2の同質遺伝子系統とGai3遺伝子をもつTordoの糊粉層組織から蛋白を抽出し、二次元電気泳動法をもちいて分析を行なった。各系統の糊粉層組織の可溶性蛋白と膜結合の不可溶性蛋白を分析した結果、分子量の大きい2、3の蛋白にGai遺伝子の変化と連動して変化している可能性のある蛋白が推定できた。しかし、繰り返し実験において蛋白のスポットの位置、その濃度が変化するので、まだ特定の蛋白スポットに断定できなかった。また、最もジベレリン感受性の変化が激しく変わっているGai3の遺伝子の同質系統(Maringa)が新しくオーストラリアより得られたのでこの材料を中心に研究を来年度も押し進めたい。コムギのジベレリン感受性に関わる突然変異Gai1,Gai2,Gai3の同質遺伝子系(Maringa-rht,Rht1,Rht2,Rht3)を用い、ジベレリン感受性の発達する受精後30-40日の種子の糊粉層のmRNAをdifferentail display法により比較し、異なるPCR fragmentsからmRNAを探索しジベレリン感受性に関わる遺伝子を明らかにしようと試みた。昨年度、コムギ種子発達期の長雨等の異常気象が、受精後30-40日の種子の収穫を妨げ充分な資料を採取できなかったため、充分な分析が進んでいないが、現在温室の材料を分析中である。

一方、ジベレリン非感受性のGai3突然変異体は、低温処理によりその感受性が正常に戻ることが報告されており(Singhand Paleg.1984a,b,c,Plant Physiol.)、この性質はホルモン感受性遺伝子の性質を知る上で重要な情報であるので、この性質について分析を進めた。現在までの結果では、この突然変異遺伝子は予想に反して、低温処理によりその感受性は変化しないことが明らかになった。Singh等は異なる品種を使用しており、我々は同質遺伝子系を用いていることから、遺伝的な背景の違いが低温による感受性変化に関係している可能性を示唆している。コムギのジベリレン感受性に関わる突然変異Gai3の同質遺伝子系(MaringaのrhtとRht3)及びTordo(Rht3)を用い、低温給水によるジベリレン感受性の変化について調査した。このジベレリン感受性は、30°C12時間の前吸水の後、5°C24時間の低温吸水するとジベレリン感受性が回復することで明らかになった。また、正常系統の種子糊粉層のジベレリン感受性が受精後30-40日の種子で発達することから、種々の乾燥がこの発達に関係していることを示唆した。Rht3系統ではジベレリン感受性は、種子の発達期間中に全く発達しない。これらの知見はジベレリン感受性が乾燥や低温という刺激に作用される形質であることを示すと共に、Rht3変異は感受性に関わる遺伝子が機能的に添加している突然変異体であることを示唆している。このような変異をdifferential display法によって見いだすことは困難と思われるが、可能性を求めて試みた。MaringaのrhtとRht3の受精後35日の糊粉層のmRNAをdifferentail display法により比較した。Arbitrary primerとオリゴdT primerを用いてrhtとRht3間で7つの異なるPCR産物を見いだし、その塩基配列を同定した。これらは、いずれも114bpから180bpの小さいDNA断片であったことやオリゴdT primerを一方のprimerに用いていたために、クローンにした遺伝子は遺伝子の3′末端の配列と思われるもので、DNAデータベースによる検索で既知の遺伝子と相同性はなかった。
藍藻スピルリナの飼料資源化に関する基礎研究

Spirulina plantensis(スピルリナ)は光合成による高い生産能力を有する可食藍藻である。申請者らは形質転換スピルリナを新規飼料添加物として利用することを目指す。まず、安定的遺伝子導入法について検討した。(1)エレクトロポレーション法を用いた形質転換スピルリナの作出のための最適条件を調べたところ、時定数5.0msec、実効電圧4kV/cmの各導入条件下のスピルリナにおいて最も高い抗生物質耐性株の発現とCAT活性が観察されので、これを最適条件と判断した。(2)さらに広宿主領域プラスミドを含む5種のプラスミドのうち、pSTV28・pRL6・pHSG399は細胞内で比較的安定的に複製・保持される導入ベクターであることを確認した。(3)加えて、16s rRNA遺伝子配列をpHSG399プラスミドに挿入し、これをスピルリナに導入したところ、ゲノムDNAにCAT遺伝子が含まれた可能性を示した。次に、形質転換スピルリナのクローン化のため、プロトプラスト化と高感度定量法の確立を試みた。(4)スピルリナプロトプラストの形成には、0.1%グリシンを含む培地で25°C下で培養した後、スピルリナ細胞糸の細胞壁をリゾチームにて溶解する方法が有効であることが判明した。さらに、(5)極微量のスピルリナの発育量は、スピルリナから発する蛍光強度(λex584nm,λem645nm)の測定で、定量的に推定できることを明らかにした。最後に、スピルリナの飼料資源として栄養評価した。その結果、(6)スピルリナを添加した飼料をに給与したところ、工業的に生産された粉末スピルリナ4,8%給与区のブロイラーヒナの体重や飼料効率などの飼育成績は、対照区にほぼ匹敵していた。今後、有用遺伝子や増殖促進関連遺伝子と好適プロモーターとのキメラ遺伝子をスピルリナのゲノムDNAへ導入できれば、有用酵素含有スピルリナやスピルリナ飼料の安定的生産に期待できる。今年度は、スピルリナへの外来遺伝子の導入実験と各種培養条件に対する増殖応答実験を行った。外来遺伝子導入実験では、導入にエレクトロポレーション法を、導入フラスミドとしてCAT遺伝子を組み込んむ2つのブラスミド、pUC系のpHSG399と広宿主領域pACYC系のpSTV28を用いた。なお、宿主は超音波破砕機によって細胞糸を細切し、エレクトロポレーションの条件は、実効電圧6kV/cm、2.5msとした。エレクトロポレーション後、クロラムフェニコールを含む寒天培地で培養したところ、2週間後に抗生物質耐性株の生育を観察した。無処置区で、通常の生育を見せ、クロラムフェニコールで細胞はほぼ死滅したが、外来遺伝子D導入区では、クロラムフェニコール存在下での生育に有意な改善が認められた。また、導入区の間ではpHSG399導入区の方がpSTV28導入区よりも抗生物質耐性株がより多く観察された。顕微鏡像からも、外来遺伝子導入した区で、クロラムフェニコール存在下での生育に改善が認められ、細胞の形態に異常は見られず、たてに螺旋を巻いて通常の細胞糸をつくりながら成長していることが確認された。さらに、スピルリナの光量(60・100・140・180uE/sec/m^2)と温度(18・24・30・36°C)

培養条件に対する野生株の増殖応答を調べたところ、いずれの温度区においても光量が多いほど増殖が速いこと、また総じて増殖は36°Cで最も速く、これに30°Cがほぼ追随していることが明らかとなった。しかし36°C区の多くでまた18°C区で、細胞の褐色化が観察された。以上、CAT遺伝子を組み込んむプラスミドの導入実験におけるクロラムフェニコール耐性株の一過的発現から、エレクトロポレーション法による外来遺伝子の導入は有効であると判断された。またスピルリナ野生株の増殖応答実験から、30°C36°Cの温度が増殖に適し、光量は多いほど生育は活発であることが判明した。Spirulina plantensis(スピルリナ)は光合成による高い生産能力を有する可食藍藻である。申請者らは形質転換スピルリナを新規飼料添加物として利用することを目指し、すでにスピルリナにおける遺伝子導入の可能性があることを明らかにしている。そこで本年度では、スピルリナに対するエレクトロポレーション法を用いた形質転換の最適条件を検討した。まず、スピルリナ(strain N-39)を、SOT培地で温度30°C、光条件100μE/sec/m^2、OD1.0まで通気培養した後、細胞糸を細断し、その懸濁液にCAT遺伝子導入プラスミド(pHSG399)を制限酵素EcoRlで切断したベクターを加えた。ついでエレクトロポレーション処理をパルスの時定数(2.5,5.0msec)と実効電圧(2,4,6,8,10,12kV/cm)を変化させて行い、スピルリナ細胞内への外来遺伝子の導入を試みた。導入後30°C減光下でクロラムフェニコール(Cm)を含むSOT寒天培地で培養し抗生物質耐性株の生育を観察した。その結果、処理後20日では、Cm耐性株の生育は、pHSG399導入区で対照区に比べ良好だった。各種パルス条件下において、時定数5.0msec区で、2.5msec区よりも良好なCm耐性株の生育がみられたが、高電圧では生育が低下し、時定数5.0msec、実効電圧4kV/cmでもつとも活発な生育がみられた。さらに、遺伝子の発現をCATアッセイで、細胞内での導入遺伝子の存在をサザンブロットにより確かめたところ、Cm耐性株の生育状態とほぼ一致し、CAT活性はpHSG399導入区でのみ見られ、時定数5.0msec、実効電圧4kV/cmでもっとも高い活性が認められた。さらに、サザン・ブロットの結果から、pHSG399導入区で細胞内の導入遺伝子の存在が確認された。以上から、スピルリナへの外来遺伝子の導入・発現におけるエレクトロポレーションの最適条件(時定数5.0msec、実効電圧4kV/cm)が明らかとなった。申請者らは形質転換スピルリナを新規飼料添加物として利用することを目指し、すでに、エレクトロポレーション法を用いた形質転換スピルリナの作出のための最適条件を明らかにしている。そこで本年度では、細胞内で安定的に複製・保持される導入ベクターを検索するため、広宿主領域プラスミドを含む5種のプラスミドを導入し、加えて相同組換えを利用したゲノムDNAへのCAT遺伝子の組込みを試みた。さらに、工業的に生産されたスピルリナを添加した飼料をブロイラーヒナに給与し成長判定を行った。
新規骨分化抑制因子fad104の機能解析と骨関連疾患発症における役割の解明

本研究では、脂肪細胞分化を促進する新規遺伝子として単離したfactor for adipocyte differentiation (fad)104と骨分化を制御する細胞内シグナル伝達因子Smad1の相互作用様式の一部を明らかにした。さらに、fad104が骨分化だけでなく、がん細胞の浸潤、転移、足場非依存的増殖能を抑制する機能を有すること、さらにその過程でFAD104が骨分化制御にも寄与することが知られているSTAT3のリン酸化レベルを調節していることも新たに明らかにした。骨組織は常にその一部が破骨細胞により吸収され、同時にほぼ同量の新しい骨が骨芽細胞の分化により形成されることにより、恒常性が維持されている。骨芽細胞から骨への分化の異常は、骨粗鬆症をはじめとした骨関連疾患を引き起こす重大な一因となる。そのため、骨分化の分子機構を解明することは、骨分化異常を原因とする疾病に対する有効な創薬開発のために極めて重要である。最近申請者らは、脂肪細胞分化初期に発現が増加する新規遺伝子として単離したfad104が骨分化抑制因子としても機能することを明らかとしたが、その作用機序については不明な点が多い。そこで本年度は、細胞内におけるfad104の作用機序とその発現制御機構に特に注目し、検討を行った。複数のGST融合fad104欠損変異体を作製した。大腸菌で発現させ、精製したFLAG融合Smad1とのpull down assayの結果、FAD104の161-277アミノ酸がSmad1との相互作用に重要である可能性が示唆された。この領域には、タンパク質相互作用に重要なグリシンリッチ領域を含むことから、グリシンリッチ領域がSmad1との相互作用に重要である可能性が示唆された。さらに、fad104の発現調節機構についても検討を行った結果、脂肪細胞分化誘導剤の一つであるデキサメタゾンがfad104の発現に重要であることが明らかになった。また、fad104の転写開始点の探索を行った結果、fad104には異なる転写開始点を有するtranscript variantが2種類存在すること、さらに、脂肪細胞分化初期に発現変化を示すのは、transcript variant 1のみであることが明らかになった。今後、相互作用機構と発現調節機構についてより詳細な検討を引き続き行っていく。骨分化の分子機構を解明することは、骨分化異常を原因とする疾病に対する有効な創薬開発のために極めて重要である。昨年度申請者らは、脂肪細胞分化初期に発現が増加する新規骨分化抑制因子fad104の161-277アミノ酸がSmad1との相互作用に重要であることを明らかとした。また、fad104には異なる転写開始点を有するtranscript variantが2種類存在すること、さらに、脂肪細胞分化初期に発現変化を示すのは、transcript variant 1のみであることも明らかにした。そこで本年度は、fad104による細胞内シグナル伝達制御機構について検討を行った。Fad104は、BMP-Smadシグナルに加えて、STATシグナルも制御していることを明らかにしている。STATシグナルも骨分化に重要な役割を担うことから、fad104とSTAT3の相互作用領域とそのリン酸化制御における役割について検討した。GST-pull downassayと免疫沈降法により、fad104の1-277アミノ酸がSTAT3との相互作用に必須であることを明らかにした。また、fad104は、STAT3のSH2ドメインと転写活性化ドメインを介して相互作用することも明らかにした。さらに、FAD104の過剰発現はSTAT3のリン酸化レベルを減弱する一方で、FAD104の1-277アミノ酸を欠失した欠損変異体は、抑制できないことを見出した。以上の結果より、fad104は、1-277アミノ酸の領域を介して、STAT3のSH2ドメインと転写活性化ドメインに相互作用し、そのリン酸化レベルを抑制することが明らかになった。本年度は、FAD104とSTAT3の相互作用機構とfad104によるSTAT3リン酸化レベルの制御機構についていくつかの新しい知見を見出すことができた。骨分化過程におけるFAD104の役割と機構を考えるためには、FAD104がSmad1/5/8やSTAT3をはじめとした骨分化に重要な様々な細胞内シグナル伝達系をどのような機構で制御しているかについて明らかにすることが必要不可欠である。特に、FAD104は、proline rich regionやglycine rich region、さらに、fibronectin type IIIドメインといった他のタンパク質との相互作用に重要な役割を担う構造を持っている。そのため、FAD104と細胞内シグナル伝達因子との相互作用機構を明らかにできれば、その作用機序の解明につながる。本年度の検討により、FAD104が1-277アミノ酸の領域を介して、STAT3のSH2ドメインと転写活性化ドメインに相互作用し、そのリン酸化レベルを抑制することをはじめて明らかにした。本検討により明らかにされた知見は、骨細胞分化過程において、FAD104がどのような機構でSTAT3ならびにSmad1/5/8といった細胞内シグナル伝達因子と相互作用し、そのリン酸化レベルを制御するのかについてその作用機序の一端を明らかにしたものであり、概ね目標通りの進展であると考えられる。本年度得られた知見をベースに来年度以降も研究を進めることによって、骨分化過程におけるFAD104の役割と機能の全容解明につなげていきたい。

骨組織は常にその一部が破骨細胞により吸収され、同時にほぼ同量の新しい骨が骨芽細胞の分化により形成されることにより、恒常性が維持されている。骨分化の分子機構を解明することは、骨分化異常を原因とする疾病に対する有効な創薬開発のために極めて重要である。昨年度申請者らは、Fad104がBMP-Smadシグナルに加えて、STATシグナルも制御していること、さらにSTATシグナルも骨分化に重要な役割を担うことに着目し、検討を進め、FAD104の1-277アミノ酸がSTAT3との相互作用に必須であることを明らかにした。また、fad104は、STAT3のSH2ドメインと転写活性化ドメインを介して相互作用することも明らかにした。さらに、FAD104の過剰発現はSTAT3のリン酸化レベルを減弱する一方で、FAD104の1-277アミノ酸を欠失した欠損変異体は、抑制できないことを見出した。以上の結果より、fad104は、1-277アミノ酸の領域を介して、STAT3のリン酸化レベルを抑制することを明らかにできた。本年度は、SmadならびにSTATシグナルが重要な役割を担う生命現象の一つである上皮間葉転換(EMT)にfad104が及ぼす影響について検討を進めた。検討の結果、FAD104はEMTの過程でその発現が顕著に増加することを見出した。さらに、FAD104の発現を抑制するとEMTの誘導が亢進されること、逆に、FAD104の過剰発現によりEMT誘導が阻害されることを見出した。また、その過程においてFAD104はTGF-b依存性のSmadシグナルを制御することも新たに見出した。EMTはがん細胞の浸潤や抗がん剤に対する抵抗性惹起に極めて重要な生命現象である。本年度の検討により、FAD104が脂肪細胞や骨細胞の分化にとどまらず、EMTの誘導にも重要な役割を担うという新しい知見を得ることができた。本研究では、脂肪細胞分化を促進する新規遺伝子として単離したfactor for adipocyte differentiation (fad)104と骨分化を制御する細胞内シグナル伝達因子Smad1の相互作用様式の一部を明らかにした。さらに、fad104が骨分化だけでなく、がん細胞の浸潤、転移、足場非依存的増殖能を抑制する機能を有すること、さらにその過程でFAD104が骨分化制御にも寄与することが知られているSTAT3のリン酸化レベルを調節していることも新たに明らかにした。本年度は、FAD104とSmad1/5/8との相互作用機構とfad104の発現調節機構についていくつかの新しい知見を見出すことができた。骨分化過程におけるFAD104の役割と機構を考えるためには、FAD104の相互作用因子であるSmad1/5/8とどのように相互作用するのか、さらに、Smad1/5/8のリン酸化レベルをどのような機構で抑制するのかについて明らかにすることが必要不可欠である。
microRNA機能の制御による発生分化調節機構の研究

これまでmiRNAは発現している組織では常に標的遺伝子の翻訳抑制や分解を引き起こしていると考えられてきた。しかし、近年の研究からmiRNAの機能は発生過程や組織特異的に制御されていることが示唆されている。本研究ではこの新しい遺伝子発現制御メカニズムについて、その分子メカニズムや生理的な意義を理解することを目的に研究を行ってきた。脊椎動物において、miRNAによる遺伝子発現制御において中心的な役割をはしているAgoタンパク質には4つの相同遺伝子が存在しており、それぞれに機能分担している可能性が考えられる。脊椎動物のモデル生物であるゼブラフィッシュにおいて4つのAgo遺伝子を同定しそれぞれの発現をinsituハイブリダイゼーションによって解析したところ、発生の初期過程において異なる発現パターンを示すことが明らかとなった。しかし現在のところ、これら4つの遺伝子の翻訳やmRNAの分解に対する効果には差が見られていない。一方、ゼブラフィッシュの生殖細胞では特定の遺伝子に対するmiRNAの働きが解除されていることが示唆されていた。本研究では生殖細胞特異的にmiRNAの働きを解除している因子としてDAZLが重要な役割を果たしていることを明らかにし、学術誌PLoS ONEに発表した。さらに、DAZLによるmiRNA機能解除の分子メカニズムについて解析を進めており、現在学術誌に投稿する準備を進めているところである。以上の結果は、miRNAの機能を制御するメカニズムの一端を明らかにしており、生物の発生過程における複雑な遺伝子発現制御機構の理解に貢献する物であると考える。本研究ではmiRNA機能の制御という新たな遺伝子発現制御のメカニズムを解析し、このメカニズムが発生・分化調節機構に果たす役割を理解することを目的としている。この目的に鑑み、本年度では以下の2つの研究を行った。1)DAZLタンパク質の機能解析我々はこれまでに生殖細胞特異的な遺伝子発現の制御機構について解析を進めてきた。この中で、生殖細胞特異的に発現するdazlが、生殖細胞特異的遺伝子tdrd7に働くmiRNAの抑制を解除できる事を示していた。今年度の研究ではさらにdazl自身もmiRNAによって抑制されている事、dazlに働くmiRNAの機能もDAZLによって解除される事を示した。この結果は、dazlによるmiRNA機能の制御が体細胞/生殖細胞間の遺伝子発現パターンの差異を生み出すのに重要な役割を果たしている可能性を示している。これらの結果をまとめ、本年度の10月に学術誌「PLOS ONE」上で報告した。2)ゼブラフィシュAgo遺伝子の同定および発現解析脊椎動物に4種類あるAgo遺伝子の発生/分化過程における機能的を検証するため、ゲノムデータベースを元にゼブラフィッシュにおける4種類のAgo遺伝子の全長ORFをクローニングした。Ago遺伝子の機能を解析するために、λN/BoxBのシステムを用いてタンパク質をmRNAへと強制的にテザーリングさせる系を導入した。この系を用いて、各Ago遺伝子の翻訳やmRNAの安定性への効果を検証していく予定である。また、in situ hybridization法によって初期発生過程における各Ago遺伝子の時間的/空間的発現を解析したところ、それぞれの遺伝子には特異的な発現パターンがみられた。この事から、Agoタンパク質の組織や時期特異的な発現が発生・分化を制御している可能性が示唆されたため、今後はモルフォリノオリゴや過剰発現によって機能的な解析を行っていく予定である。
クロスセクション解析とマッピングATRを組み合わせた複層塗膜の分析手法の確立

漆膜は天然高分子であり、古くから種々の用途に利用されている。特に、文化財に用いられている手法は多層膜であり、これまでの分析方法では各層の分析を行うことは不可能であった。本研究では、この漆膜について側面からの分析(クロスセクション解析)を行う事で、漆膜の構造をより詳細に分析することを可能とした。実際に歴史的な試料を分析したところ、修復層と当初層で違いが確認でき、このことから他の分析手法の解釈についてより適切な評価を行う事が出来た。漆膜3種(中国産・ベトナム産・ミャンマー産)について厚さ76μmの試料(二年間経過した試料)について、サンシャインウェザーアーク及びキセノンアークランプによる劣化試験を100時間・200時間の2通りについて行った。これら15パターンの試料についてマッピング分析を行い、漆膜の劣化は通常の高分子とは異なることが示唆された。具体的には、合成高分子の場合には劣化深度は一定であり、ある一定の深度範囲のみで劣化が進行する。つまり、全体の厚さはほとんど変化せずに深い部分の劣化状態がより深刻になっていく。一方、漆膜の場合は劣化の進行に伴ってその劣化深度が深くなっていくことが本研究により明らかとなった。これは、これまでの研究により明らかになっている、漆膜は劣化に伴った薄くなるという結果と合わせて考えると、漆膜の劣化は表面から進行し、ある深さになったときに表面部分の欠損が発生すると言うことを示唆している。この欠損により、厚みが減るとその分深い部分まで劣化が進行するということが繰り返されることで漆膜の劣化が進行していることが判明した。この結果は、実際の試料の分析を行った場合に得られた結果を解析する上で本来の厚さ(試料の有り様)を予想する場合に重要な要素である。この解析には様々なパターンをあらかじめ予想し、様々な漆膜についての検討を行う必要があることが判明した。現状では、主に顔料や油の含まれた漆膜についての検討を行う予定である。2012年度より利用を開始したATR-FT/IRによるマッピング分析により、クロスセクション用に作成した試料において断面からの化学的な分析が可能となった。本測定手法を用いて、2012年度におこなった中国産の生漆膜の分析のみだけでなく、ベトナム産・ミャンマー産およびその混合漆膜までその測定対象を拡大した。これらの漆膜について、表面・裏面・側面(クロスセクション)からの分析を行った。これらの分析には作成直後の漆膜と、紫外線照射器によって強制劣化を行った漆膜を用いた。その結果、48時間の照射までは劣化が表面から浸透していく様子が見られたが、168時間経過時点では裏面まで劣化の指標となるアルデヒド基が存在していることが確認できた。このことは、2012年度に確認された、『ある一定の厚さで劣化が進行し、塗膜全体の厚さが薄くなってその深度は変わらなかった』という結果と異なっている。このことから、強制劣化で使用するランプの波長や強度によって、漆膜の劣化の進行速度だけでは無く、その深度にも影響を与えることが指摘された。これは、一般の合成高分子が劣化する際の『全体の厚さが不変で表面からある厚さまで劣化がより悪化する(化学反応が進行する)』という事象と大きく異なっており、漆という天然高分子が持つ特性を良く表現している結果だと考えられる。漆膜断面のマッピング分析により、漆の劣化の進行は一般の合成高分子とは異なることが確認できた。この点は計画目標を達成できた。しかしながら、機械の移動・引っ越しなどにより多層膜の評価が不十分で有りこの点が予定よりも若干進行が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。漆膜自身の劣化が一般的な高分子と異なる事が分かった為、劣化深度はその劣化時間との関連性がある事が予想される。このことは非常に有用な結果であるが、塗膜表面が欠損した場合にその劣化状態が本来の状態とは異なってしまうためこの点を解決する必要がある。考古試料に関しては浦添市美術館館長宮里正子氏・東京都文化財研究所北野信彦氏のご協力により、琉球漆器・東南アジアの漆器・安土桃山江戸時代の漆器・漆塗装について多くの試料が提供された。これらの分析結果は随時発表を行う予定である。
グローバル時代のアジア開発途上国における地域間格差：家計調査データによる分析

1、1996年から2010年までの家計調査データを用いてインドネシアの家計間消費支出格差の推移を空間的な観点から分析した。都市農村間の格差は消費支出格差の約15-25%を説明しているが、それに対して県・市間の格差についてはその寄与度に関して都市と農村地域で異なる値を示していることが分かった。都市と農村の構造的な違いを考慮して2段階格差分解手法により県・市間格差の消費支出格差への寄与度を計測すると約15-25%になる。すなわち、都市農村間格差と県・市間格差を合わせると消費支出格差への総寄与度は約40%になる。2、2005年と2010年の全国家計所得消費データを用いてバングラデッシュの教育と所得格差に関する分析を行った。この研究ではまずバングラデッシュを都市と農村地域に分け、Gini係数により都市農村間と都市農村内の教育格差の分析を行った。教育をほとんど受けていない家計が2010年時点でも約半数おり、家計間の教育格差は依然高い。特に農村地域の無教育家計の比率は非常に高く、総教育格差を押し上げる要因になっている。一方、Blinder-Oaxaca手法による都市農村間の所得格差の分析によると、教育格差が都市農村間所得格差の主な要因になっている。したがって、初等教育の拡充と強化は所得格差是正のために重要な政策課題である。3、2005年から2013年までの州別・産業別の地域所得データを用いて2次元格差分解手法によりインドネシアにおけるサービス産業化と州間所得格差の分析を行った。この研究によると、州間所得格差の約70%から80%がジャワ・バリ地域内の州間格差により説明できることが分かった。また、ジャワ・バリ地域内州間格差寄与度が分析対象期間増加しているが、その多くはサービス産業、特に商業部門と交通通信部門の州間格差寄与度の上昇により説明できる。平成30年度は研究プロジェクトの第1段階として、アジア経済研究所、世界銀行、国連大学世界開発経済研究所、アジア開発銀行、国際通貨基金などのホームページや研究代表者が所属する大学が契約している検索システム(EBSCOhost、JSTOR、Science Direct、Oxford Journals、Springer Link、Wiley Interscience Journalsなど)を用いて、地域間/都市農村間所得(消費支出)格差に関する最新の資料と学術的な文献の収集を行った。また、インドネシア、バングラデッシュ、ミャンマー、ブータンの最新の家計所得消費データの収集も行った。1、インドネシアの家計間消費支出格差の空間的な観点からの研究については、アジア開発銀行研究所のセミナーでその研究成果を発表し同研究所出版の本の中で公表した。また、Social Indicators Research誌にも修正バージョンを公表している。2、2005年と2010年の全国家計所得消費データを用いたバングラデッシュの教育と所得格差に関する研究については、その研究成果を学術雑誌(Review of Urban and Regional Development Studies)で公表した。また、バングラデッシュの研究で使われた手法と同様な手法を用いて、ミャンマーとブータンにおける教育と消費支出格差の分析も始めた。3、2005年から2013年までの州別・産業別の地域所得データを用いた2次元格差分解手法によるインドネシアにおけるサービス産業化と州間所得格差の研究については、7月に中部ジャワ州ソロで開催された国際会議(インドネシア地域学会)でその研究成果の一部を発表した。以上から、本研究は計画に沿って行っておりおおむね順調に推移している。平成31年度も30年度に引き続き、国際機関などのホームページやオンライン検索システムにより、地域間/都市農村間格差に関する資料と学術的な文献の収集を行う。また、インドネシアの国家開発計画庁(Bappenas)・統計局とタイの国家経済社会開発庁(NESDB)・統計局などを訪問し、インドネシアとタイの地域格差是正策に関する資料と最新の家計所得消費調査データなどを収集する。ミャンマー、ブータン、バングラデシュ、ネパールの最新の家計調査データも収集する。なお、ミャンマーについては2006年と2012年の家計所得消費調査データ(HIES)、ブータンについては2007年と2012年の生活水準調査データ(BLSS)、バングラデッシュについては2005年と2010年の家計所得消費調査データ(HIES)、ネパールについては2010年の生活水準調査データ(NLSS)を取得済みである。具体的な実証分析としては、第1に、バングラデッシュの研究で使われた手法と同様な手法を用いてミャンマーとブータンにおける教育と家計間消費支出格差の分析を行い、研究成果を公表する。第2に、2005年から2013年までの州別・産業別の地域所得データを用いた2次元格差分解手法によるインドネシアにおけるサービス産業化と州間所得格差の研究については、7月にタイのバンコックで開催される国際会議(Pacific Regional Science Conference Organization)でその研究成果を発表しワーキングペーパーとして公表する。第3に、2段階格差分解手法を用いたインドネシアにおける消費支出格差の空間的な観点からの研究については、期間を2010年代まで延長し分析を行う。

2、2005年と2010年の全国家計所得消費データを用いてバングラデッシュの教育と所得格差に関する分析を行った。この研究ではまずバングラデッシュを都市と農村地域に分け、Gini係数により都市農村間と都市農村内の教育格差の分析を行った。教育をほとんど受けていない家計が2010年時点でも約半数おり、家計間の教育格差は依然高い。特に農村地域の無教育家計の比率は非常に高く、総教育格差を押し上げる要因になっている。一方、Blinder-Oaxaca手法による都市農村間の所得格差の分析によると、教育格差が都市農村間所得格差の主な要因になっている。したがって、初等教育の拡充と強化は所得格差是正のために重要な政策課題である。3、2005年から2013年までの州別・産業別の地域所得データを用いて2次元格差分解手法によりインドネシアにおけるサービス産業化と州間所得格差の分析を行った。この研究によると、州間所得格差の約70%から80%がジャワ・バリ地域内の州間格差により説明できることが分かった。また、ジャワ・バリ地域内州間格差寄与度が分析対象期間増加しているが、その多くはサービス産業、特に商業部門と交通通信部門の州間格差寄与度の上昇により説明できる。平成30年度は研究プロジェクトの第1段階として、アジア経済研究所、世界銀行、国連大学世界開発経済研究所、アジア開発銀行、国際通貨基金などのホームページや研究代表者が所属する大学が契約している検索システム(EBSCOhost、JSTOR、Science Direct、Oxford Journals、Springer Link、Wiley Interscience Journalsなど)を用いて、地域間/都市農村間所得(消費支出)格差に関する最新の資料と学術的な文献の収集を行った。また、インドネシア、バングラデッシュ、ミャンマー、ブータンの最新の家計所得消費データの収集も行った。1、インドネシアの家計間消費支出格差の空間的な観点からの研究については、アジア開発銀行研究所のセミナーでその研究成果を発表し同研究所出版の本の中で公表した。また、Social Indicators Research誌にも修正バージョンを公表している。2、2005年と2010年の全国家計所得消費データを用いたバングラデッシュの教育と所得格差に関する研究については、その研究成果を学術雑誌(Review of Urban and Regional Development Studies)で公表した。また、バングラデッシュの研究で使われた手法と同様な手法を用いて、ミャンマーとブータンにおける教育と消費支出格差の分析も始めた。3、2005年から2013年までの州別・産業別の地域所得データを用いた
戦災復興にみる復興都市計画の思想的系譜と都市構造の再編に関する研究

本研究は、1945年以降の我国の戦災復興都市計画について、その背景となる計画思想を明らかにするとともに、各都市における戦災復興都市計画の実態を明らかにし、戦災復興都市計画における計画思想と実際の計画・事業との関係について考察することを目的とする。対象年代としては、計画思想の系譜を明らかにするため、1930年から1960年の30年間とし、また、復興計画の実態については、東京、神戸の2都市をとりあげた。第1年度は、戦災復興都市計画の思想的な背景を明らかにするため、19301945年の都市計画理論に関して言説分析を行い、戦前期における都市計画理論を構造的に把握することを試みた。また、第2年度は、東京における戦災復興都市計画に関して、その計画理論について同様な言説分析を行うとともに、その計画・事業の実態について明らかにすることを試みた。第3年度である本年度は、神戸市における戦災復興都市計画をとりあげ、同様に計画をめぐる言説について分析するとともに、計画・事業の実態とそれによる都市構造の再編について考察を行った。また、復興都市計画に関する国際比較を行うため、米国サンフランシスコ市の1906年以降の震災復興都市計画を取り上げ、当初の大規模な計画が縮小されていった過程について分析を行った。これらの結果、戦災復興都市計画の思想的な背景として、交通網を中心とした産業基盤の整備を中心とした計画思想があり、このような思想は、戦前期の都市計画思想と基本的に連続したものであったこと、また、このような思想に基づいた戦災復都市計画が、都市の空間的な形態を再編成するとともに、都市の社会的な構造を同時に再編成していったこと、などが明らかになった。また、このような復興都市計画の特徴に関しては、国際的にも共通性があること、などが明らかになった。
高分解顕微鏡観察を主としたカリウムチャネルKcsAの柔軟な構造と機能の相関解明

pH依存性カリウムチャネルKcsAの構造は、大きく分けて膜貫通ドメインと細胞質ドメインに分けられる。膜貫通ドメインの高分解構造は結晶構造により明らかになっているが、細胞質ドメインの高分解構造は不明である。本研究では、水中・非結晶化状態におけるKcsAチャネルの細胞質ドメインの構造および構造変化の端緒をつかむことを目的とした。原子間力顕微鏡観察により、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、硬い特定の構造をとらないことを明らかにした。蛍光色素を用いた実験により、閉状態から開状態へ変化する際に、細胞質ドメイン末端同士の距離が離れることが示唆された。pH依存性カリウムチャネルであるKcsAは、酸性条件下でイオンの通り道を開く。KcsAの構造は、大きく分けて膜貫通ドメインと細胞質ドメインに分けられる。開閉各状態における膜貫通領域の構造は結晶構造により明らかになっているが、細胞質ドメインの構造は未だ不明である。本研究では、水中・非結晶化状態におけるKcsAチャネルの細胞質ドメインの構造、および細胞質ドメインの構造変化がチャネル機能に及ぼす影響について明らかにすることを目的とする。平成26年度は、細胞質ドメインが水中で特定の硬い構造をとっているのか、それとも柔軟に揺らいでいるのかを原子間力顕微鏡(AFM)観察により検討した。脂質膜に再構成したKcsAチャネルを雲母基板上に組織化し、開閉各状態をとるpH条件下でAFM観察した。膜表面から数nm突出した細胞質ドメインらしき構造が観察されたが、得られた構造は不鮮明な粒状であり、一分子毎の鮮明な構造は観察されなかった。ここで用いた一般的なAFM観察では、一枚の画像の取得に10分程度要しており、構造揺らぎに対して走査速度が遅すぎて構造が平均化されたために、不鮮明な粒状の構造として観察されたのだと考えられた。さらに構造が揺らいでいるのかどうか確認するため、10 frame/secの走査速度で高速AFM観察を行った。すると、高速に揺らぐ細胞質ドメインと思われる構造が観察された。このことより、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、KcsAの細胞質ドメインは水中において硬い特定の構造をとらないことが示唆された。pH依存性カリウムチャネルであるKcsAは、ホモテトラマー構造によりチャネルを形成し、酸性条件でイオンの通り道を開く。開閉各状態における膜貫通領域の構造は結晶構造により明らかになっているが、細胞質ドメインの高分解結晶構造は不明である。本研究では、水中・非結晶化状態におけるKcsAチャネルの細胞質ドメインの構造および構造変化の端緒をつかむことを目的とする。平成26年度は、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、KcsAの細胞質ドメインは水中において硬い特定の構造をとらないことを原子間力顕微鏡観察により確認した。平成27年度は、揺らいでいる細胞質ドメインの4つの末端同士の距離が、チャネルの開閉に際して変化するかどうか検討した。細胞質ドメインの末端を蛍光標識し、開閉各条件での蛍光強度の変化を測定した。比較として、開閉に際して色素間の距離が変化しないと思われる細胞外の部位に標識したものを用いた。結果として、細胞外に標識した蛍光色素は開閉どちらの条件においても蛍光強度は変化しなかったが、細胞質末端では開状態において蛍光強度の増大が確認され、閉状態から開状態へ変化する際に、細胞質ドメイン末端同士の距離が離れることが示唆された。高速AFMにより、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、KcsAの細胞質ドメインは水中において硬い特定の構造をとらないことが示唆されたため、研究はおおむね順調に進行していると言える。生物物理学水中で特定の構造をとらないということは、瞬間凍結で構造の動きを止める低温電子顕微鏡観察が有力ということになる。今後は電子線トモグラフィー観察の試料調製条件の検討および情報収集に重点を置いて研究を推進する予定である。共同研究先である沖縄科学技術大学院大学の電子顕微鏡のマシンタイムが不足していたため、当初の予定よりも試薬代、旅費等がかからなかった。共同研究先への旅費、生化学実験器具および試薬に使用する予定である。