hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Beyond-Binary Computingのシステム統合

それらをHSPICE等の回路シミュレータを用いて動1作検証するとともに,2値論理・多値論理の混載回路におけるノイズの影響について検討した.C)初年度に検討した単電子トランジスタ(SET)による2値・多値融合論理の基本ゲートとSETICMOS混載回路シミュレータを利用して,比較的大規模な応用システムLSIの設計を試みた.具体的には,単電子連想メモリ(CAM)の設計を行った.また,分子デバイス(人工触媒素子)に基づく無配線ナノエレクトロニクスの可能性についても並行して検討した.本研究で提案する人工触媒素子は,溶液中の特定の反応を選択的に触媒し,その触媒活性は特定のエフェクターに依存して変化する.このような活性制御可能な触媒をトランジスタとして用いることにより,現在の半導体集積回路と質的に同等の回路機能を実現可能である.今回の計画では,人工触媒素子をマイクロ電極デバイスによって実現する方式を検討した.可逆なレドックス分子(キノン/ヒドロキノン等)を情報担体として,その生成・消滅をチップ上に集積化された多数のマイクロ電極(Pt)で制御することにより,目的に応じた反応拡散場をチップ上の微量溶液中に人工的に形成できることを確認した.平成19年度は,交付申請書の(1)(3)に対応して,以下の研究を実施した.(1)2進数系と非2進数系の最適な融合に基づく高性能ハードウェアアルゴリズムをARITHによって系統的にライブラリ化するとともに,これを用いた各種演算回路のモジュールジェネレータを段階的に開発した.第1段階として,並列乗算器を中心としたモジュールジェネレータを開発し,web上で公開した.(2)ARITHによって記述された各種ハードウェアルゴリズムを2値論理(電圧モードCMOS)と多値論理(電流モードCMOS)の混載回路によって最適に実現するための設計のフローを検討した.この設計フローでは.ARITH記述を2値論理・多値論理混載ネットリストに変換するとともに,これを前年度に開発したセルライブラリにマッピングし,自動配置配線により2値論理・多値論理混載レイアウトを生成した.以上で開発した2値・多値統合設計のフローを各種のシグナルプロセッサの設計に適用し,実用上のインパクトについて総合的な評価を行った.(3)前年度に設計した単電子トランジスタ(SET)を用いた連想メモリ(CAM)の性能評価を行い,大規模なLSIシステムへの応用を検討した.また,人工触媒素子に基づく無配線ナノエレクトロニクスの可能性についても前年度に引き続き検討した.各種の非線形結合振動子系を実現する人工触媒ネットワークを設計するとともに,前年度に試作した2次元人工触媒素子チップをプログラムすることにより,その動作を確認した.特に,興奮性反応拡散ダイナミクスをチップ上で再現し,BZ反応のような動的に伝搬する化学反応波の発生を確認した.また,チップ上で発生する化学反応波の可視化を試みた.
S原子を含むメントール誘導体の経皮吸収促進作用

分子内にS原子を含むメントール誘導体(チオメントール誘導体)を合成し、それらの経皮吸収促進活性および皮膚刺激性を評価することにより、従来に無い画期的な吸収促進作用を有する化合物の開発を試みた。(-)ーメントンあるいは(-)ーメントールを原料とし、16種類のチオメントール誘導体を合成し、それらの活性および刺激性をラットにより評価した。各化合物を含有するケトプロフェンヒドロゲルを調製し、ラットの腹部除毛皮膚に適用後、ケトプロフェンの血中濃度を測定した。ケトプロフェンの皮膚透過速度がラグタイムの後一定になると仮定して誘導した薬動学的モデルにより皮膚透過速度を推定し、促進剤を含まないゲルを適用した時の透過速度を基準として各化合物の促進活性を評価した。また実験終了後の皮膚を摘出し、組織学的検査を実施して皮膚に対する刺激性を調べた。その結果、チオメントール誘導体の吸収促進活性と皮膚刺激指数との間には正の相関が認められ、化合物が高い活性を示す場合にはその皮膚刺激作用も相対的に強くなるものと考えられた。促進活性発現には置換基の炭素数が重要であり最適な炭素数の存在が示唆された。また置換位置も重要であり2位と5位のメチル基が活性に大きく関与することが確認された。分子力場計算より求めた化合物の各種パラメーターから、高い吸収促進活性を得るためには最適なlogP値が存在し、またその化合物の構造が立体的に安定で分子サイズが小さいことが望ましいと推測された。さらにNMRスペクトルより求めた化学シフトの値からはC2、C6の化学シフトがより高磁場側に、C4、H1の化学シフトがより低磁場側に位置する化合物に高い経皮吸収促進剤活性が認められた。これらの知見は今後より活性の高い吸収促進剤の構造を設計する上で有効な指標になるものと考えられる。分子内にS原子を含むメントール誘導体(チオメントール誘導体)を合成し、それらの経皮吸収促進活性を評価することにより、従来にない画期的な吸収促進作用を有する化合物の開発を試みた。(-)ーメントンをチオアセタールに変換し、これをブチルリチウムで処理することによりチオメントールを合成した。また(-)ーメントールを原料とし、トシル化の後、チオ酢酸カリウムで処理し、続いて還元を行うことにより、チオメントールの立体異性体であるネオチオメントールを高収率で合成した。次に、これら化合物の3位メルカプト基にメチル基およびエチル基を導入し、合計6種類のチオメントール誘導体を合成した。各化合物を含有するケトプロフェンヒドロゲルを調整し、ラットの腹部除毛皮膚に適用後、薬物血中濃度を測定することにより、経皮吸収促進活性を評価した。その結果、チオメントール誘導体の促進活性は、いずれも(-)ーメントールより有意に高く、以前の研究で最も活性が高くかつ皮膚刺激性の低かったO-エチルメントールと同等以上の活性を示した。さらに、これらの活性の強さは、計算から求めたlog P値と有意な相関を示した。そこで、最も活性の高かったS-エチルネオチオメントールをリ-ド化合物とし、pーメンタン骨格の1位メチル基の欠如した化合物など合計9種類を新たに合成し、先と同様にして促進活性を評価した。その結果、以下に示す知見が得られた。1)経皮吸収促進作用と促進剤のlog P値には密接な関係がみられる。2)チオメントール誘導体の1位メチル基は、活性発現には関与していない。3)チオメントール誘導体の4位置換基は活性発現に必須であり、かつその立体的な大きさが活性の程度に関与している。

現在、これらの知見を元に更なる活性の増強を有する経皮吸収促進剤の開発を進めている。昨年度までの研究に引き続き、分子内にS原子を含むメントール誘導体(チオメントール誘導体)16種類を合成し、それらの経皮吸収促進活性および皮膚刺激性をラットにより評価した。各化合物を含有するケトプロフェンヒドロゲルを調製し、ラットの腹部除毛皮膚に適用後、ケトプロフェンの血中濃度を測定した。ケトプロフェンの皮膚透過速度がラグタイムの後一定になるとして誘導した薬動学的モデルにより皮膚透過速度を推定し、促進剤を含まないゲルを適用した時の透過速度を基準として各化合物の促進活性を評価した。また透過実験終了後の皮膚を摘出し、組織学的検査を実施して皮膚に対する刺激性を調べた。その結果、チオメントール誘導体の吸収促進活性と皮膚刺激指数との間には正の相関が認められ、化合物が高い活性を示す場合にはその皮膚刺激作用も相対的に強くなるものと考えられた。促進活性発現には置換基の炭素数が重要であり最適な炭素数の存在が示唆された。また置換位置も重要であり2位と5位のメチル基が活性に大きく関与することが確認された。分子力場計算から求めた化合物の各種パラメーターから、高い吸収促進活性を得るためには最適なlogP値が存在し、またその化合物の構造が立体的に安定で分子サイズがより小さいことが望ましいと推測された。さらに、NMRスペクトルより求めた化学シフトの値からはC2、C6の化学シフトがより高磁場側に、C4、H1の化学シフトがより低磁場側に位置する化合物に高い経皮吸収促進活性が認められた。これらの知見は今後より活性の高い吸収促進剤の構造を設計する上で有効な指標になるものと考えられる。
カポシ肉腫関連ウイルスに対する分子標的治療法の開発研究

本研究課題では、カポシ肉腫関連ウイルスの遺伝子発現による薬剤感受性の変化を検討した。その結果、ウイルス遺伝子発現細胞株では、抗がん剤感受性に感受性、特に、vFLIP発現でブレオマイシンに対して顕著な高感受性化が認められた。その原因について検討したところ、NF-kappaB経路の阻害蛋白質のIkBalphaのノックダウンで同様のブレオマイシン高感受性化が認められた。カポシ肉腫関連ウイルス(Kaposi's sarcoma-associated virus/KSHV、またはヒトヘルペスウイルスー8/HHV-8)は、1994年に同定された比較的新しいガンマヘルペスウイルスである。カポシ肉腫関連ウイルスに対する有効な新しい抗ウイルス薬治療法の確立というのは、実際の患者に有益な研究課題と考えられ、本研究課題では、カポシ肉腫関連ウイルスの遺伝子発現による薬剤感受性の変化のプロファイル作成と、その情報を基盤にしてカポシ肉腫関連疾患に有効な薬剤の探索する実験を計画した。平成20年度では、カポシ肉腫関連ウイルスのゲノムDNAをBCBL1細胞から抽出して、そのDNAから、病原性に関わる因子、LANA、v-cyclin、vFLIP、vGPCRの遺伝子に人工的にFLAG-HAタグを付加してPCRクローニングし、それをG418、puromycin, DHFR, Zeocinなど異なる選択マーカーとのデュアル発現プラスミドにそれぞれサブクローニングする。この発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションして安定導入発現細胞株を樹立した。一般にカポシ肉腫関連ウイルス感染細胞では潜伏感染時には、LANAを中心として幾つかの遺伝子が共発現している。従って、ウイルス感染細胞の細胞生物学的環境に近づけるため、それぞれの遺伝子単独導入細胞株の他にも、LANAを基本としてそれぞれの遺伝子2,3種類の組合せ(LANA-v-cyclin, LANA-vFLIP)で共発現する安定導入細胞株の作成も試みた。しかしながら、vGPCRを安定発現するHEK293細胞株は樹立できたものの、その発現量が低く、活性化していても細胞にあまり変化が認められないことから、vGPCR発現系に関しては、さらに綿密な検討が必要だと思われた。また、LANAとvFLIPを共発現させる試みは何回か行ったが、細胞毒性がでているようであった。その原因については今後の課題と思われる。今後は、今年度に樹立できたHEK293のLANA, v-cyclin, vFLIP, LANA-v-cyclin発現細胞株を用いて抗がん剤に対する感受性変動、それに関するシグナル伝達系の変動を検索する予定である。平成21年度では、前年度に作成した細胞株(病原性に関わる因子、LANA、v-cyclin、vFLIP、vGPCRの発現プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションして安定導入発現細胞株)に対して、既存の抗がん剤10種類以上に対する感受性をMTT法で検討したとろ、ゲムシタビンに対して、LANAとv-cyclinを共発現する安定導入細胞株が感受性を増大させていることが明らかになった。また、vFLIPを安定導入発現させた細胞株では、ブレオマイシン類の抗がん剤に感受性変化が見られている。これらの抗がん剤感受性の増大について、DNA損傷のパラメーターであるgamma-H2AXの出現が増大していた。この結果、ウイルス遺伝子発現細胞では、それぞれの抗がん剤処理によるDNA損傷とそれに続くDNAダメージチェックポイント機構が亢進していることが明らかとなった。今後はその詳細な分子機構の解析が望まれる。前年度までの結果で、ウイルス遺伝子発現細胞株では、抗がん剤感受性に感受性が変わっていることを見出していた。そこで、本年度では、vFLIP発現によるブレオマイシン高感受性の原因については検討したところ、NF-kappaB経路の阻害蛋白質のlkBalphaのノックダウンで同様のブレオマイシン高感受性化が認められた。従って、NF-kappaBの活性化がブレオマシイシンの感受性に重要であることが明らかになった。

一方、ブレオマイシン処理によるDNA損傷について検討したところ、Rad51のfoci形成、Chk2のリン酸化など親株とvFLIP発現細胞の間で明確な違いは無かった。これらの観察から、ブレオマイシンのDNA損傷効果は両細胞で同等に起きていることが明らかになり、その後の過程でことなるシグナル伝達が誘導されているものと思われる。実際に感受性が異なることと相関して、細胞周期停止反応は、vFLIP発現細胞の方が強く起きていた。この結果から、ウイルス遺伝子発現細胞では、それぞれの抗がん剤処理によるDNA損傷とそれに続くDNAダメージチェックポイント機構が、NF-kappaB経路で制御されていることが推測される。今後もその詳細な分子機構の解析が望まれる。
標的遺伝子組換えによる微小管関連蛋白欠失マウスの作製とその神経細胞の極性の解析

微小管関連蛋白1B(microtubule associated protein 1B,MAP1B)は特に幼若な神経細胞に多量に発現されており、神経細胞の形態形成に重要な役割を果していると考えられている。この分子の機能をin vivoで解析するため我々は標的遺伝子組みかえ法を用いてMAP1B遺伝子を破壊した変異マウスを作成した。ヘテロ接合体は外見上正常でその神経系は光学顕微鏡レベルで異常が認められなかった。ホモ接合体は活動性が低く、体重は野生型の70-80%であり、しばしば眼瞼下垂が認められた。成熟したホモ接合体の脳の重量は野性型の85%程度であったが、光学顕微鏡を用いた観察では、脳の基本的構造は保たれていた。生後8日齢および812周齢の海馬、嗅球、脊髄、視神経、網膜、小脳の各組織の凍結切片を作製し、抗tau、抗MAP1A,抗MAP2の各抗体を用いて、免疫組織化学を行ったが、染色パターンに遺伝子型による差異は認められなかった。更に電子顕微鏡レベルの解析を行ったところ、ホモ接合体には視神経の髄鞘形成に著しい遅れが観察された。一方、成熟した視神経を比較すると、両遺伝子型の髄鞘には全く差がなく、ホモ接合体の髄鞘は形成が遅れるが、最終的には野生型と同様のレベルまで発達していることがわかった。脊髄の錐体前索路にも同様の髄鞘形成の遅れが見い出された。また、幼若ホモ接合体の視神経軸索は直径が野性型の70-90%であったが、成熟した視神経軸索の直径には差がなかった。以上から、視神経が正常のタイムコースをたどって発達するためにMAP1Bが必要であると考えられる。今後は他の微小管関連蛋白変異マウスおよびダブルミュータントの作製、または各種変異マウス由来の初代培養細胞の観察等を行い、神経細胞の形態形成にどのような影響があるか解析する予定である。
連続音声理解の時間的経過に関する知覚的検討とその音声理解システムへの応用

1.連続音声資料の収集および整理ATR連続音声データベース(6話者各35,000円)を購入し、アルバイトの助力を得てこれを整理し分析のための準備を行った(謝金35,500円)。2.韻律を制御した音声の分析再合成方式の確立と実装音声資料をコンピュータ上で処理するため,DATインターフェイス装置(566,500円)およびDATデッキ(167,890円)を購入し,聴取実験を行う場合の音声刺激作成用のツールを作成した。この際,データベースに含まれる音声の韻律を制御するため,まず,発話速度の局所的な振る舞いを制御する方式について検討した。これには,研究代表者らが別途提案した局所発話速度比による発話速度の分析手法を利用し,聴取実験の音声刺激としての実用に耐え得るパラメータの設定のための知覚実験を実施することにより定めた。また,音声の韻律的特徴のうち基本周波数パターンの制御のために,基本周波数パターン生成過程のモデルに基づいて,基本周波数パターンの生成を行うこととした。その結果,音声の韻律的特徴のうち,発話速度と基本周波数パターンとを独立に,かつ柔軟に制御し得る音声の分析再合成を行うツールをコンピュータ上に実装した。3.一様な雑音下での連続音声聴取実験上記2.の音声分析再合成ツールを用いて,音声の韻律的特徴を変化させ,かつ雑音を一様に付加した音声を作成し,音声聴取実験を計画するとともに,若干の実験を行った。本研究の期間内では十分な結論を導くのに必要なデータを得るには至らなかったが,本補助金を得て作成した音声分析再合成ツールを利用し,今後も引き続いて検討を進める予定である。
腎臓における補体調節蛋白の役割の解明とその治療応用

腎不全の原因として多い糸球体腎炎の発症および進展には、補体の過剰な活性化が重要な役割を果たす。一方、生体はこのような補体の過剰な活性化に対する防御機構として補体調節蛋白を備えている。我々は、補体調節蛋白の尿細管間質における機能的意義を調べるため、in vivo antisense法を用い、尿細管における膜型補体調節蛋白の発現を抑制し、蛋白尿に含まれる補体成分の尿細管間質障害の進行に果たす役割と、これに対する生体防御機構としての尿細管における膜型補体調節蛋白の働きを明らかにした。また、メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルとして有名なThy1腎炎を用いて糸球体腎炎における可溶性補体調節蛋白の発現調節を調べ、補体依存性の糸球体障害において局所における可溶型補体調節蛋白の発現が増加していることを示した。更に、このような研究を発展させ、補体調節蛋白を用いた治療応用の可能性を探った。in vivoでは、糸球体細胞への遺伝子導入は技術的に難しいため、可溶型の補体調節蛋白をin vivoで過剰発現させることによる腎炎治療を目指した。可溶型の補体調節蛋白としては、Crryをmutagenesisにより遺伝子工学的に膜貫通部位を除去することにより作成した。可溶型Crryにはmutagenesisでtagを付け、血中濃度測定を容易にした。これと平行して、筋肉、肝臓を含めたどの臓器へ遺伝子導入するのが効率がよいのか、またplasmidのdirect injection、adenovirus、cationic liposomeなどのどのような導入方法を用いるのがよいのかを調べ、adenovirusを静注して肝臓において可溶型補体調節蛋白を発現させることとした。現在、可溶型Crry発現adenovirusベクターの有効性をin vitroでの確認を終了し、今後腎炎モデルを使用してin vivoでの効果を調べる予定である。初年度には、可溶性補対調節蛋白の糸球体腎炎における役割の解明と、尿細管間質障害における補体調節蛋白についての研究を予定していた。可溶性補体調節蛋白については、メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデルをRNAレベルでスクリーニングすることにより、糸球体におけるup-regulationのみられたclusterinに焦点を絞ることとした。Clusterinは、メサンギウムの補体による障害後に局所において発現が亢進することが、in vitro及びin vivoの系でNorthern blot、Western blot、in situ hybridizationを用いて示された。2重染色法による免疫組織化学では、発現されたclusterinは補体による障害部位に一致して沈着が認められ、局所におけるclusterinの発現が生体防御として働いていることを示唆した。尿細管間質障害における補体調節蛋白については、蛋白尿に含まれる補体成分が糸球体疾患に伴う尿細管間質障害の進行に関わっているとの仮説をたて、これに対する生体防御機構としての補体調節蛋白の役割を調べることにした。まず、補体成分の欠損したラットにおける非免疫学的ネフローゼによる尿細管間質障害を調べたところ、補体成分の正常なラットに比べ程度が軽いことが判明し、尿細管間質障害における蛋白尿中の補体の役割を示すことができた。更に、尿細管に発現している補体調節蛋白であるCrryをin vivo antisense法を用いて特異的にブロックしたところ、尿中に含まれる補体成分による尿細管間質障害の悪化が認められた。これは、尿細管における補体調節蛋白の生理的意義を初めて示したものとして、意義深い。以上のように、初年度予定されていた実験結果は、全て滞りなく施行された。

初年度の研究では、糸球体腎炎における可溶性補体調節蛋白の発現調節を調べ、更に蛋白尿に含まれる補体成分の尿細管間質障害の進行に果たす役割と、これに対する生体防御機構としての尿細管および糸球体における補体調節蛋白についての解析を行なった。本年度は、以上の研究を発展させ、補体調節蛋白を用いた治療応用の可能性を探った。in vivoでは、糸球体細胞への遺伝子導入は技術的に難しいため、可溶型の補体調節蛋白をin vivoで過剰発現させることによる腎炎治療を目指した。可溶型の補体調節蛋白としては、C3/C5convertase stepで働く強力な補体調節蛋白として知られるCrryを、PCRなどを用いたmutagenesisにより遺伝子工学的に膜貫通部位を除去することにより作成した。可溶型Crryにはmutagenesisでtagを付け、血中濃度測定を容易にした。これと平行して、筋肉、肝臓を含めたどの臓器へ遺伝子導入するのが効率がよいのか、またplasmidのdirect injection、adenovirus、cationic liposomeなどのどのような導入方法を用いるのがよいのかを調べ、adenovirusを静注して肝臓において可溶型補体調節蛋白を発現させることが望ましいという結論を得た。現在、可溶型Crry発現adenovirusベクターの有効性をin vitroでの補体依存性の溶血反応に対する抑制能として確認を終了し、今後腎炎モデルを使用してin vivoでの効果を調べる予定である。
キュービック液晶形成化合物の階層構造と発光特性

1. 2-Bis(4'-n-alkoxybenzoyl)hydlazines(略称名BABH-n)が形成する2つの液晶相[スメクチックC(SmC)相とキュービック(Cub)相]のメソ秩序構造の違いに注目し、構造形成の詳細を解明するとともに、その特異な構造に立脚した機能開拓のひとつの試みとして、発光性分子との2成分混合系の構築を試みた。主な成果は以下の通り。1. BABH-n系のCub相(Ia3d相とIm3m相の2種類)は、アルキル鎖炭素数nが5以上(現時点では)22までと、過去に類例がないほどに広い範囲のnで形成される。詳細にみると、系はnの増加とともに低分子液晶領域(n=5-13)からブロック共重合体領域(n=15-)へと移行しており、その中間領域(n=13-16)にサーモトロピック系特有のIm3m相が発現しているという特徴が明らかになった。2.等方性液体からの構造形成に対してLandauの現象論を適用することにより、Ia3d相以外にIm3m相の構造が安定化されうることを理論的に示した。3. X線回折パターンから求めた電子密度マップの最適化に最大エントロピー法を適用することにより、Im3m相のメソ秩序構造の解明に成功した。コア部分は局所的にはラメラ的なベシクルとIa3d相のような三分岐型のネットワーク構造の2通りの凝集構造を形成し、Im3m相はSmC相とIa3d-G型Cub相の中間的なメソ秩序構造をもつことが明らかになった。4.アントラセン系の発光性分子を導入した2成分系においては、蛍光強度はIa3d相より高温側のSmC相においていったん増加したのち、等方性液体になると急速に減衰するという興味深い温度特性を示した。詳細は検討中である。1,2-Bis(4'-n-alkoxybenzoyl)hydrazines(略称名BABH-n)が形成する2つの液晶相,スメクチックC(SmC)相とキュービック(Cub)相,のメソ秩序構造の違いに注目し,構造形成の詳細を解明するとともに,機能開拓のひとつの試みとして,発光性分子との2成分混合系の構築を試みた。1.構造形成のアルキル鎖炭素数n(n=4-22)と温度Tに関する依存性を明らかにした。その特徴は,(1)n=8-10にのみ,層状構造のSmC相を発現する。(2)n=5から22まで,過去に類例がないほどに広い範囲のnでCub相(Ia3d-G型とIm3m-PP型の2種類)を発現する。(3)構造形成駆動力は,分子コア部とアルキル鎖部分のミクロ相分離,アルキル鎖の広がり,分子間水素結合であることを明らかにした。(4)構造形成の特徴から,系はアルキル鎖炭素数nの増加とともに低分子液晶領域からブロック共重合体領域へと移行しており,その中間領域にサーモトロピック系特有のIm3m-PP型が発現している。(5)n=13,15,16では,Ia3d-G型とIm3m-PP型の間で温度誘起のCub-Cub相転移を示す。2.X線回折測定から,短鎖(n=5-13)および長鎖同族体(n≧15)のいずれのIa3d-G型Cub相においても,分子コア部分は2回軸(3次元ネットワーク)上にあって,分子拡散は局所的にはその1次元方向に制限されており,分子拡散が層内で自由で2次元的なn=8-10のSmC相と対比を示した。3.2成分系構築に適当な発光性分子の設計・合成を行い,その相転移挙動と蛍光特性を検討した。Biphenylacetylene誘導体が2成分系でも良好な蛍光特性を付与し得ることを見出した。

コア部分は局所的にはラメラ的なベシクルとIa3d相のような三分岐型のネットワーク構造の2通りの凝集構造を形成し、Im3m相はSmC相とIa3d-G型Cub相の中間的なメソ秩序構造をもつことが明らかになった。4.アントラセン系の発光性分子を導入した2成分系においては、蛍光強度はIa3d相より高温側のSmC相においていったん増加したのち、等方性液体になると急速に減衰するという興味深い温度特性を示した。詳細は検討中である。
蛋白質の立体構造のダイナミックスと統計力学基礎論からの検討

柳田の実験によれば、ミオシン分子は、ATPl分子を分解してえられたエネルギ-をなんらかの形で分子内に蓄え、アクチン繊維上で1m秒程度の時間をかけて徐々に放出し、その間繊維上を分子の大きさの100倍程度滑る。分子構造の立場からエネルギ-は分子内にいかにして蓄えられているのか。この蓄えられているエネルギ-は、徐々に利用できなければならない。エネルギ-を小量消費する毎に、ミオシン分子は一連の異なる状態を遷移して行くと考えなければならない。この遷移はm秒の時間領域で起こる。蛋白質の立体構造の面からこれを見ると、ミオシン分子にはエネルギ-の異なる一連の立体構造があり、これらの間をm秒の時間領域で遷移して行くことになる。構造間の遷移はより一般的には立体構造のダイナミックスとして捉えられる。そこで、我々は、立体構造のダイナミックスのモンテ・カルロ・シュミレ-ションを行なった。58アミノ酸残基からなる球状蛋白質BPTIの室温におけるダイナミックスの50万ステップのシミュレ-ションを実行した。この様にしてサンプルされた立体構造をI(Instantaneous)構造と云う。いくつかのI構造から出発して立体構造エネルギ-関数を極小化した。得られた構造をQ(Quenched,急冷)構造と云う。Q構造の分布を調べたところ、立体構造空間内に階層的なクラスタ-を形成して分布していることが解った。これはエネルギ-曲面上の低エネルギ-領域が、階層的な構造をもって分布していることを意味する。統計物理学の分野でこのような構造を持つ系のダイナミックな振舞いが研究されている。それによればそのような系は一般に非常に幅広い緩和時間分布を持つ。このこととは、ミオシン分子に見られる一連の状態間の遅い遷移の仕組みを考える上で示唆に富んでいるのではないかと思われる。この観点からの研究を今後も深めて行く計画である。
「デジタル版山梨方言辞典」作成のための調査研究とデータ構築

研究代表者がこれまで従事していた,デジタル山梨方言辞典・データベース作成と成果公開を継続し,山梨方言辞典の完成をめざして調査研究とデータ構築をおこなうことが目的である.最終目的は「デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開」であるが,科学研究費交付期間内に設定する研究計画は以下の6点である.1,山梨方言資料860点余の一次調査と電子化.2,同資料主要30点の詳細分析調査.3,年次累積形式でのデータ公開(CD-ROMと冊子の作成).4,年次ごとの作業知見の報告.5,方言の電子辞典・DB作成方法の公開と方法の理論化.6,未見・未入手資料の探索調査.平成19年度の研究実施状況は以下の通りである.1,未見・未入手資料の探索調査と,方言音声資料収集調査のため,3日間の出張をおこなった。また,研究発表のため,2日間の出張をおこなった。2,収集資料の電算データ化をおこなった。データ整理に84日人を投入し,63資料・24092項目を入力した。その結果,山梨県方言資料182点の一次調査と電子化が完了し,辞典用データ項目総数は138632項目となった。3,平成19年度中に電算化したデータを加工し,平成18年度以前に加工したデータ分と併せて『デジタル版山梨方言集2007』(CD-ROM+冊子)を作成した。4,平成19年度中の作業による知見を報告書としてまとめ,3のCD、ROMに収録した。5,期間内に実施した調査研究とデータ構築の内容をとりまとめ,デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開に向けての今後の作業計画を立案し,作業継続の準備を整えた。研究代表者がこれまで従事していた,デジタル山梨方言辞典・データベース作成と成果公開を継続し,山梨方言辞典の完成をめざして調査研究とデータ構築をおこなうことが目的である.最終目的は「デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開」であるが,科学研究費交付期間内に設定する研究計画は以下の6点である.1,山梨方言資料860点余の一次調査と電子化.2,同資料主要30点の詳細分析調査.3,年次累積形式でのデータ公開(CD-ROMと冊子の作成).4,年次ごとの作業知見の報告.5,方言の電子辞典・DB作成方法の公開と方法の理論化.6,未見・未入手資料の探索調査.平成17年度の研究実施状況は以下の通りである.1,未見,未入手資料の探索調査のため,2日間の出張をおこなった.2,収集資料の電算データ化をおこなった。データ整理に108日人を投入し,34資料・25798項目を入力した.その結果,山梨県方言資料88点の一次調査と電子化が完了し,辞典用データ項目総数は91408項目となった.3,平成17年度中に電算化したデータを加工し,平成16年度以前に加工したデータ分と併せて『デジタル版山梨方言集2005』(CD-ROM+冊子)を作成した.4,平成17年度中の作業による知見を報告書としてまとめ,3のCD-ROMに収録した.研究代表者がこれまで従事していた,デジタル山梨方言辞典・データベース作成と成果公開を継続し,山梨方言辞典の完成をめざして調査研究とデータ構築をおこなうことが目的である.最終目的は「デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開」であるが,科学研究費交付期間内に設定する研究計画は以下の6点である.1,山梨方言資料860点余の一次調査と電子化.2,同資料主要30点の詳細分析調査.3,年次累積形式でのデータ公開(CD-ROMと冊子の作成).4,年次ごとの作業知見の報告.5,方言の電子辞典・DB作成方法の公開と方法の理論化.6,未見・未入手資料の探索調査.平成18年度の研究実施状況は以下の通りである.1,未見,未入手資料の探索調査のため,5日間の出張をおこなった.2,収集資料の電算データ化をおこなった。データ整理に76日人を投入し,31資料・23132項目を入力した.その結果,山梨県方言資料119点の一次調査と電子化が完了し,辞典用データ項目総数は114540項目となった.3,平成18年度中に電算化したデータを加工し,平成17年度以前に加工したデータ分と併せて『デジタル版山梨方言集2006』(CD-ROM+冊子)を作成した.4,平成18年度中の作業による知見を報告書としてまとめ,3のCD-ROMに収録した.研究代表者がこれまで従事していた,デジタル山梨方言辞典・データベース作成と成果公開を継続し,山梨方言辞典の完成をめざして調査研究とデータ構築をおこなうことが目的である.最終目的は「デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開」であるが,科学研究費交付期間内に設定する研究計画は以下の6点である.1,山梨方言資料860点余の一次調査と電子化.2,同資料主要30点の詳細分析調査.3,年次累積形式でのデータ公開(CD-ROMと冊子の作成).4,年次ごとの作業知見の報告.5,方言の電子辞典・DB作成方法の公開と方法の理論化.6,未見・未入手資料の探索調査.平成19年度の研究実施状況は以下の通りである.1,未見・未入手資料の探索調査と,方言音声資料収集調査のため,3日間の出張をおこなった。

また,研究発表のため,2日間の出張をおこなった。2,収集資料の電算データ化をおこなった。データ整理に84日人を投入し,63資料・24092項目を入力した。その結果,山梨県方言資料182点の一次調査と電子化が完了し,辞典用データ項目総数は138632項目となった。3,平成19年度中に電算化したデータを加工し,平成18年度以前に加工したデータ分と併せて『デジタル版山梨方言集2007』(CD-ROM+冊子)を作成した。4,平成19年度中の作業による知見を報告書としてまとめ,3のCD、ROMに収録した。5,期間内に実施した調査研究とデータ構築の内容をとりまとめ,デジタル山梨方言辞典・データベースの完成と公開に向けての今後の作業計画を立案し,作業継続の準備を整えた。
光誘起トンネル電子移動を利用した分子素子の新しい走査プローブ顕微鏡による研究

我々はアンテナ分子と電子受容体(A)、光受容体(S)、電子供与体(D)の三部位を持つA-S-D三っ組分子との混合単分子膜を形成することにより、天然の光合成と同様に光量子捕集と電荷分離とを分業する二種のサブユニットから成る「分子光ダイオード」の作製を検討してきた。この「分子光ダイオード」の効率向上のためにはS^*-A、S^*-D系の光誘起電子移動速度の距離依存性、エネルギーギャップ依存性を明らかにする必要がある。そこで本研究では、4)ピコ秒パルスレーザーを用いた蛍光寿命測定によるS^*-A、S^*-D系の光誘起トンネル電子移動速度の距離依存性を上記、1)、2)、3)の観点から検討する。5)STMのトンネル電流の距離依存性が試料金属表面とSTMチップ間に介在する単分子膜の電子状態、あるいは単分子膜と金属表面またはチップとの結合状態にどのように依存するかを解明する。本年度は特に以下の点について検討した。1.分子光ダイオードの効率向上のためにS^*-D系の光誘起電子移動速度の距離依存性を検討した。特に、フェロセンをD、ピレンをSとした二っ組両親媒性分子S-DについてS-D間の距離をS、D部位を結ぶアルキル鎖の長さを変えたものを種々合成し、これらのLB膜内での光誘起トンネル電子移動速度の距離依存性を調べた。2.分子との光接続のために、光STM用に開発されている光ファイバーの製造技術をさらに改良して、分子レベルでの二次元空間分解能を持つ近視野光学顕微鏡の開発を試みた。3.光ダイオード分子と絶縁性両親媒性分子との混合単分子膜を形成し、混合単分子膜内での混合状態をAFM・FFM・SSPMで観察し、製膜条件と機能性分子の膜内での分子レベルでの二次元配列形成との関連を検討している。
遺伝子導入マウスにおける遺伝子機能発現と宿主遺伝子の相互作用

ノックアウトマウスの遺伝的背景について、特に行動薬理学において、その表現型に大きく影響を与えることが明らかにされ問題となったが、トランスジェニック(Tg)マウスではマウス自身のもっている野生型遺伝子と導入遺伝子の相互作用、すなわち、拮抗的、相加的あるいは相乗的に働くかなどは必ずしも明らかでない。そこで、この点を明らかにするために、プリオンタンパク(PrP)遺伝子導入マウスを用いて、宿主のマウス遺伝子がヒト・プリオンタンパク遺伝子のマウス体内での発現とその機能に及ぼす影響について調べた。マウスPrP遺伝子exson3のORFのSma IからBstEII間をヒト型のプリオンタンパク遺伝子に換えたヒト/マウスキメラプリオン蛋白遺伝子発現Tgマウスをプリオン蛋白遺伝子欠損マウス(Prnp0/0)(糸原博士作製)に戻し交配し、Tg蛋白発現量と内在性野生型マウスプリオン蛋白の発現量の異なるマウス3系統12ラインのマウスを作製した。これらのTgマウスについてヒトプリオンに対する感受性を調べた。その結果、3系統すべてにおいてそれぞれ、内在性マウスプリオン蛋白の発現がないablated-PrP遺伝子背景のラインが最も感受性が高く、次に内在性マウスプリオンが1/2量のPrnpw/0ライン、ワイルドマウスの遺伝的背景を有するPrnpw/wラインとなった。すなわち、マウス内在性プリオン発現量に比例して、ヒトプリオンに対する感受性が低下した。このことから、ヒト・プリオンタンパク遺伝子Tgマウスでは、マウスが本来有している内因性の宿主遺伝子発現が導入遺伝子発現産物の機能に抑制的、もしくは拮抗して作用していることが強く示唆された。マウス由来のexson3のORFのSmal-BstEII間をヒト型プリオン遺伝子に変え導入遺伝子としたマウス・ヒトキメラ型Ygマウス(Mo/Hu+/-・w/w)を用いた。これらのマウスの内因性プリオン蛋白遺伝子を除くためにプリオン蛋白遺伝子欠損マウス(Prnp0/0)マウスに戻し交配を行いAblated Tgマウス(Mo/Hu+/-・0/0)を作製した。また、この過程で得られるTgマウス(Mo/Hu+/-・w/0)を内因性遺伝子の発現が1/2の群として考えた。Tgマウスにおけるヒト型のプリオン蛋白の発現とその量を調べるために半定量的ウエスタンブロットを行った。一次抗体として、抗N末合成ペプチドウサギ血清、B103(帯広大学、品川森一教授提供)、マウス・ヒトのリコンビナントTgの発現確認にはマウスモノクローナル抗体3F4を用いた。発色系はalkaline phosphatase-PCIB/NBT(Promega)で行った。その結果、内因性マウスプリオン蛋白は産出されずヒト型のプリオン蛋白のみを発現するマウス、マウス・ヒトの両方のプリオン蛋白を産出するマウスがそれぞれ作製された。これらのマウスに散発性CJD患者10%脳乳剤20μlを脳内接種(i.c.)し、接種日を0日として、反応遅延、運動失調、削痩、無動などのマウスCJDの症状を呈し安楽死させる日までを潜伏期間として測定した。継続実験中であるが、現在までのところマウス内因性の遺伝子発現産物が導入遺伝子のヒトプリオン感受性に対して抑制的に働くという結果が得られつつある。

マウスPrP遺伝子exson 3のORFのSma IからBstEII間をヒト型のプリオンタンパク遺伝子に換えたヒト/マウスキメラプリオン蛋白遺伝子発現Tgマウスをプリオン蛋白遺伝子欠損マウス(Prnp0/0)(糸原博士作製)に戻し交配し、Tg蛋白発現量と内在性野生型マウスプリオン蛋白の発現量の異なるマウス3系統12ラインのマウスを作製した。これらのTgマウスについてヒトプリオンに対する感受性を調べた。その結果、3系統すべてにおいてそれぞれ、内在性マウスプリオン蛋白の発現がないablated-PrP遺伝子背景のラインが最も感受性が高く、次に内在性マウスプリオンが1/2量のPrnpw/0ライン、ワイルドマウスの遺伝的背景を有するPrnpw/wラインとなった。すなわち、マウス内在性プリオン発現量に比例して、ヒトプリオンに対する感受性が低下した。このことから、ヒト・プリオンタンパク遺伝子Tgマウスでは、マウスが本来有している内因性の宿主遺伝子発現が導入遺伝子発現産物の機能に抑制的、もしくは拮抗して作用していることが強く示唆された。
微小液滴の界面選択的高感度蛍光プローブ装置の開発と生体分子への応用

本研究では,空間中に捕捉した単一微小液滴の界面を選択的にプローブするための実験装置を開発し,界面で生じる蛍光励起エネルギー移動の高感度観測を試みた.まず,単一微小液滴を安定に空間捕捉するために平行平板型イオントラップを製作した.微小液滴はエレクトロスプレー法を用いて生成した.色素分子が溶存した微小液滴にナノ秒パルスレーザーを照射すると,液滴からのレーザー発振が観測された.これを利用して,液滴の表面に形成した単分子膜と溶存分子との蛍光励起エネルギー移動を高感度で観測することに成功した.細胞中における重要な生化学過程の多くは,膜構造が形成する界面近傍で生じている.界面に存在する生体分子の水和構造には著しい非対称性が存在することが考えられる.本課題では,バルクとは著しく異なる,界面における非対称な水和環境が生体分子の構造や機能,化学反応性にどのような影響を及ぼすかに注目して研究を進めている.特に,単一微小液滴界面に誘起されるWhispering Gallery Mode (WGM)を利用して,界面選択的高感度蛍光プローブ装置の開発し,これを生体分子に適用することで,界面近傍におけるタンパク質の構造転移や拡散・輸送ダイナミクスを分子レベルで調査することを目指している.今年度は,単一微小液滴を空間捕捉するためのイオントラップ装置を開発し,これを自作のレーザー顕微分光装置に組み込んだ.1本課題では,空間捕捉された単一微小液滴の温度制御が鍵となるが,温度を精密かつ迅速に制御するためには,装置を出来るだけ小型化することが重要であることが分かったので,予備的な実験で製作していたイオントラップ装置のダウンサイズ化を行った.また,トラップ電極を取り囲む温度制御チャンバーの形状と温度制御システムとのマッチングを最適化することで,温度制御速度と温度安定性の著しい向上を達成した.2レーザー顕微鏡は多くのメーカーから市販されているが,今回製作したイオントラップ装置を組み込めるようなものは市場に存在しないので,レーザー顕微鏡部分を自作した.レーザー顕微鏡にイオントラップ装置を組み込むことで,空間捕捉された単一微小液滴の顕微画像をリアルタイムで観測することに成功した.生体反応において界面は重要な役割を果たしている.本研究課題では,生体反応の素過程を研究するために,微小サイズの曲がった界面が存在し,非対称な水和環境をもつ微小液滴に着目している.微小液滴の気液界面では,全反射を繰り返した光の位相が揃うことで,Whispering Gallery Mode (WGM)とよばれるQ値の高い共鳴光が発生する.これを利用して,微小液滴表面の分子を選択的に励起する高感度蛍光プローブ法を用いた計測装置を製作し,界面における分子の振る舞いを微視的レベルで解明することを目指して研究を進めている.バルク溶液では,気液界面において両親媒性分子が膜構造を形成することが知られている.本研究では,色素ラベルされた両親媒性分子に注目した.この両親媒性分子が溶存した単一微小液滴を自作の3次元イオントラップで空間捕捉し,これにレーザー顕微分光を適用することで,両親媒性物質の発光スペクトルがどのような特徴をもつかについて調査した.両親媒性物質として,親水基がローダミンB,疎水基がオクタデシル基で構成された両親媒性物質であるオクタデシルローダミンB (ODRB)を使用した.ODRBの親水基部分に相当するローダミンB(RhB)を含む微小液滴では,580nm付近にブロードな発光と640nm付近に非常にシャープで強い発光が観測されている.一方,ODRBを含む微小液滴をNd:YAGレーザーの第二高調波で励起すると,630nm付近にシャープで強い発光のみが観測された.このことは,単一微小液滴の気液界面に両親媒性分子による膜構造が形成されていることを示しており,微小液滴からの発光を用いることで,微小液滴界面に形成された膜構造を高感度に観測できることを示している.本研究では,微小液滴が微小な光共振器と見なせるという特徴を生かし,界面選択的蛍光プローブ装置を開発することが目的の一つである.今年度は,色素標識された両親媒性分子であるODRBを含む微小液滴にレーザー顕微分光を適用した.ODRBは両親媒性物質であるために,そのほとんどは微小液滴の気液界面上に吸着していると予想される.よって,ODRBからの発光は気液界面での全反射条件を容易に満たすことができるため,シャープな発光(レーザー発振)のみが観測された.このことは,単一微小液滴の気液界面に両親媒性分子による膜構造が形成されていることを示しており,微小液滴からのレーザー発光を用いることで,微小液滴界面に形成された膜構造の高感度観測に成功したと言える.このように,当初の研究目的に沿った研究成果が得られているので,本研究は,おおむね順調に進展していると言える.直径が数数十マイクロメートルの微小液滴の気液界面において,光の全反射条件が満たされると,微小液滴内で発生した蛍光は液滴内部に閉じ込められる.

このとき,液滴の外周の長さが光の波長の整数倍に一致すると,液滴内に定在波(Whispering Gallery Mode)が形成される.また,微小液滴を強い励起光で光励起すると,溶存分子からの発光がレーザー発振に至る.本研究課題では,このような微小液滴の特異な光物性を用いて,界面選択的な高感度蛍光プローブ法の開発とその応用に取り組んでいる.昨年度の研究では,親水基がローダミンB,疎水基がオクタデシル基で構成された両親媒性分子であるオクタデシルローダミンB (ODRB)を用いて,両親媒性分子が微小液滴の気液界面に膜構造(単分子膜)を形成することを明らかにした.その結果を踏まえ,本年度は,微小液滴からのレーザー発光を利用することで,膜構造を形成する分子(ODRB)と微小液滴内部に溶存している分子(ローダミン700(R700))とのフェルスター型エネルギー移動過程に関する研究を行った.微小液滴内に溶存するR700の濃度が増加するにしたがって,液滴界面に吸着したODRBからのレーザー発光が減少することがわかった.これは,液滴表面に膜構造を形成するODRBから,液滴の表面近傍に存在するR700へフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)が生じていることを示している.微小液滴からのレーザー発光を利用したFRETの検出は,バルク溶液でのFRETの検出に比べて,検出感度が約一桁向上していることを明らかにした.この結果は,微小液滴からの特異的な発光を用いることで,界面近傍で生じる分子ダイナミクスを高感度に観測できることを示している.本研究では,微小液滴が微小な光共振器と見なせるという特徴を生かした界面選択的蛍光プローブ装置を開発し,これを界面近傍における分子ダイナミクスの解明に応用することが目的である.今年度は,本研究課題によって開発した3次元イオントラップとレーザー顕微鏡を用いて,微小液滴の気液界面に膜構造を形成する両親媒性分子(ODRB)と液滴内部に溶存している分子(R700)との間で生じる共鳴エネルギー移動を観測した.その結果,微小液滴の発光に特徴的なWhispering Gallery Modeとそのレーザー発振を観測すれば,界面近傍で生じる分子間の共鳴エネルギー移動過程を高感度に観測できることを示した.このように,当初の研究目的に沿った研究成果が得られているので,本研究は,おおむね順調に進展していると言える.分析化学や量子光学の分野において,微小液滴を用いた研究が報告されている.また,分子科学分野では,タンパク質の荷電状態の分布やラマン散乱スペクトルの研究が幾つか報告されている.しかしながら,微小液滴に溶存した分子や分子集合体が示す化学反応素過程を詳細に解明した研究例は限られてる.本課題では,イオントラップを用いて空間捕捉した単一微小液滴からのレーザー発振を利用することで,液滴界面に形成された単分子膜と溶存分子の間で生じる蛍光励起エネルギー移動に注目して研究を行った.色素ラベルされた両親媒性分子であるオクタデシルローダミンB(ODRB)を用いて,空間補足した単一微小液滴上に両親媒性分子による単分子膜を構築した.また,同じ微小液滴内にはローダミン700も溶存している.この微小液滴をナノ秒パルスレーザーで光励起するとODRBの単分子膜に起因するレーザー発振が観測されるが,このレーザー発振の振る舞いは,液滴内部に溶存しているローダミン700の濃度に依存していることが明らかになった.ODRBは4準位系を構成していると仮定し,これに関するレート方程式を解析した.その結果,励起光強度に対するレーザー発振強度のプロットの傾きから,ODRBとローダミン700との蛍光励起エネルギー移動効率を算出できることを明らかにした.微小液滴とバルク溶液における実験結果を比較すると,微小液滴中ではバルク溶液よりも長距離まで励起エネルギー移動が生じていることが分かった.
肺癌進展におけるHMGA2遺伝子の発現誘導機構と活性化パスウェイの網羅的解析

肺扁平上皮癌の浸潤性増殖制御を目指した分子標的治療法の確立のための新たな標的分子の選定を目標とし、予備実験データから肺扁平上皮癌細胞のepithelial-mesenchymal transition(EMT)に深く関わることが推定されるhighmobility group A-2(HMGA2)遺伝子に着目し、その発現誘導に関わる遺伝子群とHMGA2により扁平上皮癌細胞内で活性化されるパスウェイを選別し、肺扁平上皮癌進展におけるHMGA2を介したEMTの分子機構を明らかにすることを目的に研究を行った。1.浸潤性の異なる扁平上皮癌組織における浸潤先端部近傍の反応性間質部のcDNAアレイ法を用いたトランスクリプトームの比較解析から、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク分解酵素を含む約30遺伝子が選別された。2.HMGA2高発現部の扁平上皮癌細胞のトランスクリプトーム解析では、細胞接着分子、細胞骨格、タンパク分解酵素、細胞内シグナル伝達分子を含む約20遺伝子の発現変化が選別された。肺扁平上皮癌の浸潤性増殖の制御を目指した分子標的治療法の確立のための新たな標的分子の選定を目標とし、肺扁平上皮癌細胞の上皮間質転換(EMT)におけるHMGA2の関与を蛋白(免疫染色とwestern blot法)ならびにmRNA (real time RT-PCR法)で明らかにすると共に、HMGA2の蛋白・mRNA発現と術後生存期間の有意な逆相関を示した。HMGA2発現によるプラコグロビン遺伝子発現抑制、抗癌薬に対する耐性などの関連から研究をさらに発展させ、非上皮系腫瘍におけるプラコグロビンの肺転移抑制作用と骨肉腫カフェイン併用化学療法の作用機序に関わる新たな遺伝子群も明らかにした。
鉄欠乏性貧血由来ヘリコバクター・ピロリの新規病原因子の解明

鉄欠乏性貧血(IDA)患者においてHelicobacter pylori感染との関与が指摘されている。IDAに対する菌側病原因子を検索し、発症のメカニズムを明らかにすることを目的として、小児IDA患者由来H. pyloriと対照患者由来株の性状比較を行った。DNAマイクロアレイ法によるH. pyloriの全遺伝子の発現比較の結果、本菌の鉄関連遺伝子のうちfrpB1, frpB2, ceuEの発現がIDA患者由来株で有意に低かった。さらに、鉄制限培地中の培養を実施して遺伝子発現を解析したところ、frpB1, pfr遺伝子の発現誘導は全ての菌株において顕著でそれぞれの菌株が鉄制限状態の遺伝子応答をしていることが確認されたが、IDA患者由来株は他の鉄関連遺伝子の発現誘導が認められず、対照患者由来株ではfrpB2, fecA1, fecA2などの発現誘導が認められた。これらの結果はIDA由来株が鉄取り込み機構において、対照患者由来株と異なる遺伝子制御または別の分子を使っている可能性を示唆するものであった。また、IDA患者由来株において全ての菌株がVacA毒素産生性を有しており、空胞化毒素が消化管における宿主の鉄吸収に影響し宿主に鉄欠乏状態を導く可能性が示された。鉄欠乏性貧血患者(IDA)においてH.pylori感染との関与が指摘されている。鉄剤投与による治療のみでは貧血の再発を繰り返すが、H.pyloriの除菌治療により貧血状態の改善と再発が見られなくなったとの報告がある。小児における鉄欠乏性貧血患者由来H.pyloriと貧血症状のみられない患者由来の菌株の性状比較を行った。消化管出血のないIDA小児4例および年齢・性をあわせた対照小児4例から分離したH.pyloriを対象とした。鉄含有の培養条件として、Brucella brothに7%の馬血清を添加して行い、鉄制限の培養条件としてさらに50μM Deferoxamine mesylate (DFM)添加培地を用いた。対数増殖期の各菌株より総RNAを抽出し、マイクロアレイ法にてIDA由来菌株と対照菌株のあいだで双方の培養条件にともなう各遺伝子発現の差を比較した。鉄関連遺伝子群として、鉄貯蔵タンパクであるpfr遺伝子の発現は両群ともに鉄制限培地での増殖時に鉄含有培地と比べて0.1から0,3倍に減少した。また、鉄イオン輸送タンパクであるfecA1およびfrpB1遺伝子の発現は4.0-17.3倍増加した。病原性関連遺伝子のうちvacA遺伝子の発現がIDA患者由来株で高かった(鉄含有培地使用時)。さらに、培養上清中に認められたVacA毒素の産生量および培養細胞を用いた毒素活性の比較においてもIDA患者由来株で4株中3株に高い毒素活性が示され、対照群においては4株中1株が毒素産生株であった。この結果はマイクロアレイ法の結果とよく一致した。これらの解析の結果から、IDA患者由来株は、対照菌株と比較して、細胞空胞化毒素の産生に亢進が認められ、何らかの機序でIDAとの関わりがある可能性が示唆された。鉄欠乏性貧血患者(IDA)においてHelicobacter pylori感染との関与が指摘されている。H.pyloriの増殖に必要な鉄源として、ヘミン、トランスフェリン、ラクトフェリンなど、生体由来鉄を加えた培養の結果から、H.pyloriはこれらの鉄を利用可能であることが示され、菌株によってその依存度が異なる現象が認められ、鉄の保存状態との相関について検討する必要性が示唆された。さらに、宿主の鉄取り込み能に対するH.pyloriの影響を見る系の確立を目的として、培養細胞でありながら小腸同様の鉄の取り込み能を有するCaco-2細胞とH.pyloriの相互作用について検討した。Caeo-2細胞にH.pylori生菌を添加した場合、18時間後には接種菌の0.8-から3.5倍の生菌数であった。しかし、細胞のない同条件の培養では、生菌数は10分の1から100分の1に低下した。