hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フロリゲンを利用した食糧増産のための遺伝子組換えによらない作物改良技術

植物の開花ホルモンであるフロリゲンは、2007年に同定されたばかりであり、フロリゲンの生物学はいまだ黎明期と言える。その分子機能、作用メカニズム、植物改良へ応用の可能性、など多くの重要な分野が、未開拓のままである。本研究においては、フロリゲンの分子機能の解明、及びフロリゲンの植物改良への展開に集中し、次の2つのテーマ、1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子構造、分子機構の解明、2)分子構造に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立、植物への導入技術開発、に分けて研究を進め、フロリゲンに関する新しい重要な知見と応用技術を得ることを目的としている。フロリゲンは2007年に発見されたばかりであり、現在フロリゲンの生物学はいまだ黎明期と言える。その分子機能、作用メカニズム、植物改良へ応用の可能性、など多くの重要な分野が未開拓のままである。本研究においては、フロリゲンの分子機能の解明、及びフロリゲンの植物改良への展開に集中し、次の3つのテーマ、1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明、2)分子機能に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立、3)外部からの植物への導入技術開発と育種高速化技術への展開、に分けて研究を進め、フロリゲンに関する新しい重要な知見と応用技術を得ることを目的としている。今年度は、テーマ1)のフロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明と、テーマ2)の分子機能に基づく人工フロリゲン開発を進めている。これまで行ってきたフロリゲン、フロリゲン受容体、花成転写因子からなる「フロリゲン活性化複合体」の解析に加え、フロリゲンと逆の機能を持つ花成リプレッサーを含む「フロリゲン抑制複合体」の機能構造解析を進め、両複合体の分子構造を決定した。得られた二者の分子構造に基づき、受容体との結合部位や表面残基に改変を行い、開花能や安定性を増強させたフロリゲン(人工フロリゲン)の設計を行った。植物の花成ホルモンであるフロリゲンは、2007年に同定されたばかりであり、フロリゲンの生物学はいまだ黎明期と言える。本研究においては、フロリゲンの分子機能の解明、及びフロリゲンの植物改良への展開に集中し、次の3つのテーマ、1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明、2)分子機能に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立、3)外部からの植物への導入技術開発、に分けて研究を進め、フロリゲンに関する新しい重要な知見と応用技術を得ることを目的としている。今年度はテーマ2)の「分子機能に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立」を進めた。昨年度で得られた人工フロリゲン(アミノ酸変異体)の候補のうち、安定なものについてcDNAを大腸菌のCodon usageに合わせて配列最適化を行い、さらに大腸菌での発現精製条件の検討により、一回の培養で50-100mgの高純度フロリゲンを得ることが出来た。配列最適化を行っていない野生型フロリゲンの発現量は同培養スケールで1-5mgであり、10倍以上の調製効率化となった。これにより100株スケールへの直接導入が低コストで可能となった。本年度は分子機能に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立をおこなった。分子構造に基づくフロリゲンの発現系の改変、培養精製条件の検討により、十分な低コストで植物体への直接導入に十分な量の人工フロリゲンを得ることが出来た。これにより、ほぼ研究実施計画書とおりの成果を上げることが出来た。本研究においては、フロリゲンの分子機能の詳細な解明、及びフロリゲンの植物改良への展開に集中し、次の3つのテーマ、1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明、2)分子機能に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立、3)外部からの植物への導入技術開発、に分けて研究を進め、フロリゲンに関する新しい重要な知見と応用技術を得ることを目的としている。今年度は特にテーマ1の「フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明」研究より、花成リプレッサーと受容体からなる「フロリゲン抑制複合体」の分子構造を、既に得られていた「フロリゲン活性化複合体」の構造と比較、議論しうる十分な分解能で得ることが出来た。これにより両者の複合体の機能の違いを、分子構造やMDシミュレーションから詳細に調べる事が可能となった。フロリゲン活性化及び抑制複合体の分子構造から、受容体との相互作用に関与するアミノ酸残基が高度に保存されており、フロリゲンによる花成制御のメカニズムは植物全般で共通している事が示唆された。また、前年度までに確立したフロリゲンの大量調整法により作成した改変フロリゲン、花成リプレッサーを、それぞれ単体あるいは両者混合し、エレクトロポレーション法を用いて培養細胞への導入を試みた。

その分子機能、作用メカニズム、植物改良へ応用の可能性、など多くの重要な分野が、未開拓のままである。本研究においては、フロリゲンの分子機能の解明、及びフロリゲンの植物改良への展開に集中し、次の2つのテーマ、1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子構造、分子機構の解明、2)分子構造に基づく人工フロリゲンの開発と大量調整法の確立、植物への導入技術開発、に分けて研究を進め、フロリゲンに関する新しい重要な知見と応用技術を得ることを目的としている。本年度は花成リプレッサーを含むフロリゲン転写抑制複合体の解析を行い立体構造を決定し、また、フロリゲン活性化複合体と抑制複合体の分子交換メカニズムの解明にも成功した。これらにより、ほぼ研究実施計画書とおりの成果を上げることが出来た。調製した人工フロリゲンを用いて来年度より「外部からの植物への導入技術開発」課題を進めていく。また、花成促進、抑制複合体の立体構造を基に、受容体上でフロリゲンと花成リプレッサーが競合する分子機構を詳細な生化学実験より明らかにする事で、花成の促進・抑制切り替えの分子メカニズムも明らかにしていく。構造生物学今後は、得られた花成抑制複合体の立体構造と分子交換メカニズムを基に、受容体との結合部位や表面残基に改変を行い、開花能や安定性を増強させたフロリゲン(人工フロリゲン)の設計・大量調整、植物体への外部からの導入を行う予定である。今年度のフロリゲン調整計画が予定通り進み、次年度の植物導入への実験規模の拡大が可能となったため、人工気象器を追加購入する予算として次年度に繰り越しを行った。実施研究計画には変更はない。年度途中で所属組織の異動があり、異動先での次年度の実験継続に必要な装置(植物栽培用装置)、試薬類の準備のために繰越しを行った。年度中に関しては前所属及び現所属組織の実験装置を使用し、実験計画どおりの研究執行を行った。次年度の実施研究計画には変更はない。人工気象器の購入を予定している。実施研究計画に変更はない。次年度の異動先組織においても研究執行計画に変更が起きないよう、前所属と同様の実験環境を立ち上げるために次年度への繰越しを行っている。
肝発がん経路を解明するためのゲノム編集によるがん抑制因子のスクリーニング系の開発

大規模ながんに対する次世代シーケンシング解析の結果から、遺伝子の変異はドライバー変異とそれによって引き起こされるゲノム不安定性の産物であるパッセンジャー変異とに選別されており、ドライバー変異は腫瘍形成に直接関与すると推定されている。しかし、そのように同定された新規ドライバー候補の多くは綿密な機能解析は行われておらず実際はどの程度、腫瘍形成に寄与するのかは不明なのが現状である。また、単独ではなく複数の変異の組合せによって発がん作用を発揮する可能性もあり、これもドライバー変異の包括的な機能解析を阻んでいる要因とされる。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な上皮幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損を導入する。それによって、既知のがん抑制遺伝子だけでなく、統計的に有意にがんの発生に関与していることが明らかなものの、その発がん過程での寄与率が不明瞭な遺伝子の機能解析を組織ごとにすることで、新規がん抑制遺伝子の機能的な同定をすることさらに、それらの組合せによって多段階的に進展していく発がん過程を再現することを目的としている。ドライバー変異の機能解析結果からがん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子の解析だけでなく、他組織に対する遺伝子にも標的を広げ、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子抑制実験を実施している。さらに遺伝子欠損の組合せによる多段階発がんの実験も同時並行で行っている。当初予定していた、肝臓がんに対する遺伝子だけでなく、より顕著な表現型を確認することができる肺の上皮細胞を用いた検討にも着手しており、そちらの検討でより良好な結果が得られたため、CRISPR-Cas9を用いてがん抑制遺伝子を抑制し、肺の腺がん細胞の源と考えられている小気道上皮細胞、および肺の扁平上皮がんの元と考えられている肺の気管上皮細胞に対して、CRISPR-Cas9で遺伝子の抑制を行うことで、細胞ごとのがん抑制遺伝子の差や発がんへの寄与率を比較検討することが可能になり、より多くの情報を得ることが可能になると期待されたため、そちらの検討も行っている。これらの実験で、同時にがんの元となる細胞の再検証も可能になり、多段階発がんに関与する遺伝子の組合せの同定も同時に進めている。そのため、当初の予定よりもやや遅れている。しかしながら、それらの実験結果は当初予定していたものよりも、重要かつ多くの発がんに対する知見を得られることが強く期待でき、そちらに方向転換することに大きな意義があると申請者は考えている。対象とする細胞の種類を増やしたことによって、CRISPR-Cas9で抑制する遺伝子群は変更になったが、研究の手技的には大きな変化はない。細胞ごとに遺伝子を抑制していき、細胞の増殖率の変化を検証すること、さらには組合せによって、発がんに実質的に寄与する遺伝子およびその組合せの探索を細胞ごとに進めていく。細胞が発がんに至るまでの遺伝子変異の組合せを同定することで、それらを段階的に導入し、多段階的な発がん過程を再現すること、ならびに細胞が浸潤能や転移能を有する上での必須な遺伝子の組合せを網羅的に同定することで、これまでの大規模ながんゲノム解析データから得られた情報を実験的に検証していく。がんゲノム配列の解読によりドライバー変異とそれによって引き起こされるゲノム不安定性の産物であるパッセンジャー変異とに選別されており、ドライバー変異は腫瘍形成に直接関与すると推定されている。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な肝幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損および変異を導入する。それによって正常の細胞から発がんを誘導することで、ドライバー変異の機能評価をする。ドライバー変異の機能解析結果から肝がん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。まずは、実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子を現時点ではそのまま使用予定である。現時点では、CRISPR/Cas9が機能する条件の最適化を行っており、実際の機能解析に移行する段階である。さらに遺伝子欠損を誘導した細胞を免疫不全動物に移植し、発がんの過程を検証するシステムを構築中である。本年度は、培養した初代細胞にCRISPR/Cas9で欠損や一塩基多型を導入する条件の最適化や変異を導入する遺伝子の選択、ガイドRNAのデザインを実施し、実験システムの構築を行った。実験システムの最適化に時間を要し、実際の細胞のがん化の誘導やそれらの免疫不全動物への移植において、十分な結果を得ることができていない。

また、単独ではなく複数の変異の組合せによって発がん作用を発揮する可能性もあり、これもドライバー変異の包括的な機能解析を阻んでいる要因とされる。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な上皮幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損を導入する。それによって、既知のがん抑制遺伝子だけでなく、統計的に有意にがんの発生に関与していることが明らかなものの、その発がん過程での寄与率が不明瞭な遺伝子の機能解析を組織ごとにすることで、新規がん抑制遺伝子の機能的な同定をすることさらに、それらの組合せによって多段階的に進展していく発がん過程を再現することを目的としている。ドライバー変異の機能解析結果からがん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子の解析だけでなく、他組織に対する遺伝子にも標的を広げ、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子抑制実験を実施している。さらに遺伝子欠損の組合せによる多段階発がんの実験も同時並行で行っている。当初予定していた、肝臓がんに対する遺伝子だけでなく、より顕著な表現型を確認することができる肺の上皮細胞を用いた検討にも着手しており、そちらの検討でより良好な結果が得られたため、CRISPR-Cas9を用いてがん抑制遺伝子を抑制し、肺の腺がん細胞の源と考えられている小気道上皮細胞、および肺の扁平上皮がんの元と考えられている肺の気管上皮細胞に対して、CRISPR-Cas9で遺伝子の抑制を行うことで、細胞ごとのがん抑制遺伝子の差や発がんへの寄与率を比較検討することが可能になり、より多くの情報を得ることが可能になると期待されたため、そちらの検討も行っている。これらの実験で、同時にがんの元となる細胞の再検証も可能になり、多段階発がんに関与する遺伝子の組合せの同定も同時に進めている。そのため、当初の予定よりもやや遅れている。しかしながら、それらの実験結果は当初予定していたものよりも、重要かつ多くの発がんに対する知見を得られることが強く期待でき、そちらに方向転換することに大きな意義があると申請者は考えている。CRISPR/Cas9による遺伝子変異誘導系を確立し、発がんに寄与するドライバー遺伝子の機能解析を実施する。それらの組合せによって、より発がんに寄与する遺伝子変異の組合せを同定する実験系の構築を進める。また、in vitroおよび免疫不全動物を用いたin vivoでの遺伝子変異の組合せによる多段階発がんモデルの構築を行う。これらの結果から肝臓の発がんに実質的に寄与する遺伝子変異の機能解析を進める予定である。対象とする細胞の種類を増やしたことによって、CRISPR-Cas9で抑制する遺伝子群は変更になったが、研究の手技的には大きな変化はない。
ディーゼル排気ガス中のNOxとパーティキュレートの同時除去触媒の開発

ディーゼル排ガス中のNOとパティキュレートを同時に除去するための触媒の開発を検討した。コ-ジェライトハニカムにアルミナをコートし、それに4種の金属を担持したものを触媒として用いた。それらにパティキュレートを模擬したすす状炭素を析出させたものを出発物質として、NO/O2混合ガスとの反応を行った。種々の触媒を用いて昇温反応を行ったところ、最も低い温度で100%のNO転化率が得られたのはPt触媒であった。O2の転化率は400°C程度で100%となり、またNOが100%窒素に転化するのも400°Cで、炭素の燃焼とNOの還元が同時に起こっていることが分かった。無触媒の場合でも、温度は600°C程度と高いが、炭素の燃焼とNOの還元が同温度域で起こる。これは炭素の燃焼とNOの還元が密接に関係しており、触媒の存在により炭素の燃焼が促進されることによってNOの還元も促進されるという過去の知見と一致している。また、一定温度での繰り返し実験を行ったところ、若干の活性低下が認められた。これは毎回炭素を除去するために700°Cで酸素処理するという苛酷な操作をしたためと考えられ、改善の余地はあるものと考えられる。反応後の試料の昇温脱離を行い、炭素上に吸着している化学種の検討を行い、反応の過程を推定した。触媒の作用としては、酸素による炭素の燃焼反応の促進、NOの解離吸着と炭素への吸着種の供給、それによる炭素のNOとの反応の活性化、炭素上の窒素化合物の脱離促進などに効果があることを明らかにした。
マレーシア・サラワク州の丘陵地農業の土壌生態学的基盤と持続可能性評価

マレーシア・サラワク州の丘陵地農業は,伝統的焼畑からより集約的な農業へと急速に変容している.本研究では,丘陵地農業を構成する焼畑農地,二次林,ゴム園,コショウ畑,油ヤシ園などについて土壌や植生の状況を比較・検討し,また農民やプランテーション実施機関およびその労働者へ聞き取り調査を行うことにより,生態学的観点のみならず,農民の生活を支える農業という視点から,丘陵地農業の現状や問題点を解明しその将来像を提示した.マレーシア・サラワク州の丘陵地農業は,伝統的焼畑からより集約的な農業へと急速に変容している.本研究では,丘陵地農業を構成する焼畑農地,二次林,ゴム園,コショウ畑,油ヤシ園などについて土壌や植生の状況を比較・検討し,また農民やプランテーション実施機関およびその労働者へ聞き取り調査を行うことにより,生態学的観点のみならず,農民の生活を支える農業という視点から,丘陵地農業の現状や問題点を解明しその将来像を提示した.マレーシア・サラワク州ルボックアントゥの丘陵地では、イバン人によるゴムやコショウの換金作物栽培が半世紀以上にわたり焼畑と共存してきた。また、農民自身により、あるいはサラワク土地統合再開発公社(SALCRA)による事業として油ヤシが栽培されている。丘陵地における換金作物栽培を支えてきた基盤や問題点、展望を土壌肥沃度論的見地から明らかにすることを目的に、平成19年8月20日9月5日、11月7日12月22日、平成20年3月4日3月17日の計3回、ゴム、コショウ、油ヤシ園の圃場調査・土壌試料採取を行った。同時に、栽培管理や収量などについて、聞き取り調査を行った。採取した土壌は、日本に輸出し、土壌肥沃度分析に供試した。これらの結果を、我々がこれまでに得てきた焼畑二次林の研究結果と比較検討した。ゴム園では、土壌酸性が強く、養分に乏しく、焼畑二次林と類似した土壌肥沃度であるが、コショウ園や油ヤシ園では、施肥により養分、特にリンが土壌に蓄積する方向に変化していることが明らかとなった。コショウ園では、窒素肥料が硝化を受け、急速に失われている可能性があることが分かった。また、コショウ園では、侵食対策はとられておらず、過剰な施肥にともなう土壌養分の流亡が懸念されるため、適切な圃場管理法の開発が必要であると考えられた。油ヤシ園では、コショウ園ほど養分の増加は認められなかったが、更新時にも施肥成分の残留が認められたことから、次回植栽時の施肥管理は、その影響を考慮する必要があると考えられた。本年度は,次の3つの項目について,現地調査・試料採取および分析を行った.1、二次林の初期遷移と土壌肥沃度:東南アジアの丘陵地の多くでは,Imperata cylindrica草原の拡大が深刻な問題となっている.一方,サラワク州の休閑二次林では,植生遷移の初期に,I. cylindrica,またはシダ類(Dicranopteris lineari)が優先している.現代型の集約化した焼畑では,このような草地を焼畑として利用することから,本研究では,土壌生態学的観点から,それらが優先する休閑地の特徴づけを行った.その結果,土壌肥沃度はI.cylindrica草地の方が高いが,植生バイオマスはD.linearis草地の方が大きく,火入れ時に多量の灰添加が期待できること,しかし,後者はその厚いルートマットが火入れや稲作付けの障害となるため,現地農民は前者を好んで焼畑地に利用していることを見出した.2、休閑林土壌と天然林土壌との比較:一般に,休閑二次林は,年月の経過とともに,植生の多様性が増し,天然林植生に類似してくるとされている.土壌肥沃度も回復すると考えられているが,具体的に検証した事例はない.そこで,「休閑における土壌肥沃度の回復」とは具体的にどのような現象なのかを解明し,丘陵地農業における休閑の意義を明らかにすることを目的に,天然林が保全されているバタンアイ国立公園とその周辺のロングハウスの休閑林や焼畑地において,現地調査を行い,土壌試料を採取した.土壌試料は分析中である.3、Acacia Mangium植林地土壌の肥沃度:サラワク州では、パルプ用材としてのA.Mangium植林地が急速に拡大している.植林地内の土壌肥沃度の現状を明らかにすることを目的に,十壌調査,試料採取を行い,試料は目下分析中である.マレーシア・サラワク州では,パルプ材用のAcacia mangiumの一斉植林地が,地域住民による既存の農地を侵食する形で急速に拡大しており,丘陵地農業への影響は極めて重大である.そこで,同州ビンツルにある植林地において,A. mangium植栽地と保全林の土壌肥沃度を比較検討した.本植林地は,1度目の植栽期間中であり,収穫はまだ行われていない.A.mangium植栽地では,植栽時の整地に重機が用いられるため,土壌が激しく攪乱され,その断面はB層を欠きC層の直上にA層が存在している場合があった.植栽地と保全林について,土壌の各性質に有意差はなかったが,植栽地の方がそれらの変動が大きかった.植栽の経過年数による明確な傾向は認められなかった.

無機態窒素量や微生物バイオマス量は全炭素・窒素量と正の相関が認められたが,A. mangiumの窒素固定能によると考えられるような土壌窒素の富化は,無機態窒素量や微生物バイオマス量からは確認できなかった.しかし,植栽後の早い時期にA層が形成され,植栽地の多くの土壌有機物量が保全林に匹敵するものであったことから,A. mangiumやその他の植物種からの有機物供給により,土壌有機物は,重機による攪乱後比較的速やかに回復することが示唆された.このようにA. mangium植栽地では重機による諸作業の土壌への影響は甚大であり,今後,収穫作業や2度目の植栽作業にあたりさらに重機による土壌攪乱を受ければ,土壌の流出や荒廃地化など深刻な影響が生じる可能性があると考えられた.
高周波プラズマ・微粒子間相互作用の放電周波数依存性に関する研究

本研究の目的は,RFからVHF帯にわたる広い周波数範囲で放電周波数を変化させて高周波プラズマ中の微粒子とプラズマの相互作用の放電周波数依存性を明らかにするとともに,その背後にある物理を理解することである.そのため,放電電力一定の条件下で放電周波数を3.528MHzの範囲で変化させ,シランガス高周波プラズマを発生し,以下の成果を得た.1)約10nmサイズの微粒子の密度は,プラズマ密度よりも高く,負帯電および中性微粒子から構成される.2)周波数の増加とともに,プラズマ密度が増加し,それに伴って微粒子は放電開始後早く発生し,微粒子密度は高くなる.これに対して,10nm程度以上のサイズの微粒子間の凝集速度は周波数の増加とともに遅くなる.3)微粒子が存在する高周波電極側のプラズマ/シース境界領域では,負帯電微粒子のみならず,約50eV以上の高速電子が多い場合には正帯電微粒子が共存するようになり,正負帯電微粒子間の凝集によって熱凝集に比べて2桁速い,極めて高速の微粒子成長となる.上記のように,本研究によって,高速電子の存在が微粒子の帯電状態の変化をもたらし,10nm以上のサイズ領域における微粒子の凝集による急速成長に極めて重要な役割を演じていることを明らかにすることができた.本研究の目的は,rfからVHF帯にわたる広い周波数範囲(5150MHz)で放電周波数を変化させて高周波微粒子プラズマ中の微粒子とプラズマの相互作用の放電周波数依存性を明らかにするとともに,その背後にある物理を理解することである.今年度は,放電電力一定の条件下で放電周波数を3.528MHzの範囲で変化して,シランガスを用いて高周波プラズマを発生し,以下の成果を得た.1)放電周波数の増加とともに電子密度が増加し,その結果,微粒子は早く発生し,微粒子密度は高くなる.2)放電周波数を減少すると,放電電圧,自己バイアス電圧が増加する.これに伴い,熱運動による凝集より2桁速い微粒子間の高速凝集が生じる.3)微粒子が存在する高周波電極側のプラズマ/シース境界領域では,負帯電微粒子のみならず,高速電子数が多い場合には正帯電微粒子が共存するようになり,正負帯電微粒子間の凝集が2)の結果をもたらした可能性がある.上記のように,高速電子の存在が微粒子の帯電状態の変化をもたらし,微粒子の成長過程に大きな影響を与えることを示唆する新しい結果が得られており,当初の計画通り研究は順調に進んでいる.今後は,上記の現象をより定量的に理解するために,高速電子を実際に計測するとともに,来年度にVHF帯でのプラズマ-微粒子間相互作用を調べる予定である.本研究の目的は,RFからVHF帯にわたる広い周波数範囲で放電周波数を変化させて高周波プラズマ中の微粒子とプラズマの相互作用の放電周波数依存性を明らかにするとともに,その背後にある物理を理解することである.そのため,放電電力一定の条件下で放電周波数を3.528MHzの範囲で変化させ,シランガス高周波プラズマを発生し,以下の成果を得た.1)約10nmサイズの微粒子の密度は,プラズマ密度よりも高く,負帯電および中性微粒子から構成される.2)周波数の増加とともに,プラズマ密度が増加し,それに伴って微粒子は放電開始後早く発生し,微粒子密度は高くなる.これに対して,10nm程度以上のサイズの微粒子間の凝集速度は周波数の増加とともに遅くなる.3)微粒子が存在する高周波電極側のプラズマ/シース境界領域では,負帯電微粒子のみならず,約50eV以上の高速電子が多い場合には正帯電微粒子が共存するようになり,正負帯電微粒子間の凝集によって熱凝集に比べて2桁速い,極めて高速の微粒子成長となる.上記のように,本研究によって,高速電子の存在が微粒子の帯電状態の変化をもたらし,10nm以上のサイズ領域における微粒子の凝集による急速成長に極めて重要な役割を演じていることを明らかにすることができた.本研究の目的は,RFからVHF帯にわたる広い周波数範囲で放電周波数を変化させて高周波微粒子プラズマ中の微粒子とプラズマの相互作用の放電周波数依存性を明らかにするとともに,その背後にある物理を理解することである.そのため,放電電力一定の条件下で放電周波数を3.528MHzの範囲で変化させ,シランガス高周波プラズマを発生し,以下の成果を得た.1)10nmサイズの微粒子密度は,プラズマ密度よりも高く,負帯電および中性微粒子から構成される.2)周波数の増加とともにプラズマ密度が増加し,それに伴って微粒子は放電開始後早く発生し,微粒子密度は高くなる.これに対して,10nm以上のサイズの微粒子の凝集速度は周波数の増加とともに遅くなる.3)微粒子が存在する高周波電極側のプラズマ/シース境界領域では,負帯電微粒子のみならず,約50eV以上の高速電子が多い場合には正帯電微粒子が共存するようになり,正負帯電微粒子間の凝集によって熱凝集に比べて2桁速い,極めて高速の微粒子成長となる.上記のように本研究によって,高速電子の存在が,微粒子の帯電状態の変化をもたらし,10nm以上のサイズ領域において凝集による微粒子の急速成長に極めて重要な役割を演じていることを明らかにすることができた.
歯周病の分子生物学的病態診断法の確立

歯周炎患者を対象として、初診時・再評価時・メインテナンス時に歯肉縁下プラーク、微量歯肉組織、末梢血を採取し、従来の検査法に加え分子生物学的手法を導入することによりこれらの検体中の多数の炎症パラメーターを高感度にかつ同時解析することを試みた。その結果、1)genomic PCR法を応用することにより、歯肉縁下プラーク中のP.gingivalis(P.g.)、A.actinomycetem comitans(A.a.)を特異的かつ従来の方法に比し1000倍の感度で検出することが可能になった。2)歯間乳頭部より、needle biopsy法を応用することにより微量歯肉組織を採取し同組織内の20種以上の炎症関連因子のmRNAを半定量的に検出することを可能にした。3)前記手法により歯周炎病巣局所における炎症関連因子のmRNA発現プロファイルをクラスタ分析し、主としてIL-8ならびにIFN_γとその他の炎症関連因子のmRNA発現バランスの特徴から、歯周炎の病巣が5つのクラスタに分類されることが示された。4)歯周治療後のメインテナンス期の歯周炎患者(SPT患者)を対象として、血清中のP.g.に対するIgG抗体価ならびにそのサブクラスを調べた結果、SPT患者では特にIgG4抗体価が高いことが示された。さらに、SPT患者のIgGサブクラス抗体価とメインテナンス期間中の歯槽骨吸収量の関連性を検討した結果、治療後も継続するIgG2抗体産生上昇と難治性歯周炎の関連性が示唆された。5)本研究において樹立したヒト歯肉上皮細胞株をP.g.菌体の超音波破砕上清にて刺激した結果、歯肉上皮細胞がIL-8、MCP-1を選択的に産生することが示された。また、ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)株をリンパ球系細胞と細胞接着させることにより、HGF内に炎症性サイトカインの発現が誘導されることが明らかとなった。歯周病の分子生物学的病態診断法の確立を目的として、本年度は研究試料の採取、ならびに今後の研究に用いる分子生物学的測定系の確立、各歯周組織に由来する各種細胞のin vitro細胞株の樹立を行った。研究試料の採取に関して、成人性歯周炎ならびに早期発症型歯周炎の患者より臨床的研究試料の採取を実施している。この際、視覚的資料の保存に画像解析システムHR600M-SSを利用している。研究試料の解析に用いる分子生物学的測定系として、歯肉縁下プラーク試料中の歯周病原性菌胞測定系と微量歯肉組織試料中の細胞間情報伝達物質mRNA発現測定系を確立した。すなわちGeneAmp^<TM>PCR system9600を用いてgenomic PCRを行うことにより歯肉縁下プラーク試料から歯周病原性細菌であるP.gingivalisならびにA.actinomycetemcomitansを特異的かつ半定量的に検出する系を開発し、この系が従来の細菌検出系と比較して高感度で、試料中の1x10^1個の細菌を検出しうることを確認するとともに、微量の歯肉組織から、RT-PCRを用いて各種炎症性サイトカイン、シクロオキシゲナーゼ、各種細胞増殖因子のmRNA発現を同様に特異的かつ半定量的に検出する系を確立した。これらの系において、得られたPCR産物量の定量にはImage Master^<【cross product】>VDSならびにデータ解析システムM5503J/Aを用いている。

また、歯肉上皮細胞、歯肉線維芽細胞、歯根膜細胞の各in vitro細胞株の単離、培養に成功し、長期継代培養が困難な歯肉上皮細胞に関しては不死化細胞株を樹立したが、これらin vitroの実験に安全キャビネットを利用している。これらの細胞を歯周病原性細菌由来物質にて刺激することにより誘導される各種サイトカイン産生の特徴をマイクロプレートリーダーを用いたELSA法により比較検討する研究をすでに開始している。歯周病の分子生物学的病態診断法の確立のために平成10年度は以下の研究を実施した。平成9年度より開始した臨床的試料の採取ならびに分析を継続して実施している。すなわち、歯周病患者の全身的免疫応答を検討する目的で、大阪大学歯学部附属病院歯周病室を受診した成人性歯周炎患者ならびに若年性歯周炎患者を対象として、インフォームドコンセントを得た後、初診時ならびに歯周基本治療終了時に歯肉縁下プラーク検体ならびに末梢静脈血の採取を行い、主たる歯周病原性細菌とされているP.gingivalis(P.g.)の検出ならびに血清中の抗P.g.IgG抗体価の測定を継続するとともに、患者末梢血より単核球を分離しpgの超音波破砕菌体成分に対する増殖応答を検討している。また、歯周病巣局所における炎症反応を検討する目的で、大阪大学歯学部附属病院歯周病室を受診した成人性歯周炎患者ならびに若年性歯周炎患者を対象として、初診時に臨床的に肉眼的炎症所見の著明な部位ならびに炎症所見の認められない部位をそれぞれ被験部位として選択し微量歯肉組織穿刺生検法を用いた検体の採取を継続している。一方、in vitroにおける歯周組織構成細胞の機能解析を目的として、ヒト歯肉上皮細胞の単離、ならびに長期継代培養可能な細胞株の樹立を行った。さらにこれらの上皮細胞株を用いて歯肉上皮細胞の歯周病巣局所における炎症反応への関わりを検討する実験系を確立した。すなわち歯周病原性細菌の刺激に対するヒト歯肉上皮細胞の応答性を、各種サイトカインのmessengerRNA(mRNA)発現、培養上清中ヘの産生、またその生物学的活性を測定することにより検討する系を確立した。次年度は上記の各検討事項の研究を終了し、歯周病の分子生物学的病態診断法の確立に向けた総合的解析を行う予定としている。平成11年度は、歯周炎病巣局所における炎症関連因子mRNA発現プロファイルの詳細な検討による歯周炎の病態解析を継続して行った。その結果、クラスタ分析によって、主としてIL-8ならびにIFNγと、その他の炎症関連因子のmRNA発現バランスの特徴から、歯周炎が5つのクラスタに分類されることが示された。そこで、このようなmRNA発現プロファイルの差異を生む原因について検討すべく、平成9年度に確立した歯周病原性細菌の高感度検出系を用いて、代表的歯周病原性細菌であるP.gingivalis(P.g.)、A.actinomycetemcomitans(A.a.)の存在とIFNγ、IL-8mRNAの相対的低発現の関連性を検討した。また、IFNγ、IL-8mRNAの低発現部位を有する早期発症型歯周炎患者を被験者として、これらの細菌に対する好中球、単核球の応答性を検討した。その結果、各クラスタ間でP.g.、A.a.の検出率に著明な差は認められず、またP.g.、A.a.菌体の超音波破砕上清(SE)刺激に対する宿主細胞の反応性にもクラスタ間で差が認められなかった。一方、本研究において確立したヒト歯肉上皮細胞株をP.g.SEにて刺激した結果、歯肉上皮細胞がIL-8,MCP-1を選択的に産生することが示された。
分裂病治療のための生理・生化学的機能評価指標の確立

未服薬分裂病患者を対象に、抗精神病薬投与による臨床的、生化学的、精神生理学的指標の変化を検討した。対象はDSM-IIIRの基準を満たす未服薬精神分裂病外来患者12名(男性4例:女性8例、年齢2163歳)である。治療開始前にBPRS(簡易精神症状評価尺度)と、血中モノアミン代謝産物(HVA,MHPG,5-HIAA)濃度の測定、シラブル弁別課題遂行中の事象関連電位(ERP)を記録した。その後、Chlorpromazine,Perphenazine,Bromperidol,Nemonaprideのいずれかを投与量を固定して68週間単剤投与し、再びBPRS評価、血中モノアミン代謝産物濃度測定とERP記録を行った。なお、今年度は対象症例が少ないので、投与薬剤毎の検討は行わず、Chlorpromazine(CPZ)換算量を求めて検討した。抗精神病薬投与によりBPRS合計点が改善したが、特に思考障害と活動生に関連する項目の改善が有意であった。またERPでは、抗精神病薬投与によりP300振幅が有意に改善した。血中HVA濃度は群としては抗精神病薬投与前後で変化しなかったが、投与前のHVA濃度の高いものほど抗精神病薬投与によるHVA濃度の低下が顕著な傾向が認められた。さらに、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではP300潜時が短縮する傾向が認められた。また、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではP300振幅も減少していたが、この振幅減少は服薬量とも相関していた。血中MHPG濃度と5-HIAA濃度は投与前後でほとんど変動しなかった。以上の結果から、治療前の血中HVA濃度が高くかつ抗精神病薬投与による血中HVA濃度の低下が顕著なものほど、P300潜時に反映される認知処理速度の改善が大きい可能性が示された。また、P300振幅は抗精神病薬投与による状態の改善に伴って増大する傾向と、投与量が多いと減少する傾向の2側面を反映する可能性が示唆された。対象はDSM-IIIRの基準を満たす未服薬精神分裂病外来患者12名(男性4例:女性8例、年齢2163歳)、うち8例はこれまでに抗精神病薬治療歴の全くない者である。治療開始前にBPRS(簡易精神症状評価尺度)と、血中モノアミン(MA)代謝産物濃度の測定、シラブル弁別課題とオドボール課題遂行中の事象関連電位(ERP)を記録した。その後、Chlorpromazine,Perphenazine,Bromperidol,Nemonaprideのいずれかを投与量を固定して68週間単剤投与し、再びBPRS評価、血中MA代謝産物濃度測定とERP記録を行った。また、血中MA代謝産物はHVA(ホモバニリン酸)のみを検討した。抗精神病薬投与によりBPRS合計点が改善したが、特に思考障害と活動性に関連する項目の改善が有意であった。またERPでは、抗精神病薬投与によりシラブル弁別課題のP300振幅が有意に改善した。さらに、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではシラブル弁別課題のP300潜時が短縮する傾向が認められた。また、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではシラブル弁別課題のP300振幅も減少していたが、この振幅減少は服薬量(CPZ換算量)とも相関していた。

さらに、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではP300潜時が短縮する傾向が認められた。また、抗精神病薬投与によりHVA濃度が低下するものではP300振幅も減少していたが、この振幅減少は服薬量とも相関していた。血中MHPG濃度と5-HIAA濃度は投与前後でほとんど変動しなかった。以上の結果から、治療前の血中HVA濃度が高くかつ抗精神病薬投与による血中HVA濃度の低下が顕著なものほど、P300潜時に反映される認知処理速度の改善が大きい可能性が示された。また、P300振幅は抗精神病薬投与による状態の改善に伴って増大する傾向と、投与量が多いと減少する傾向の2側面を反映する可能性が示唆された。
クォーク物質創成とフォトン物理

欧州CERN研究所LHC加速器の高エネルギー原子核衝突ALICE実験において、鉛タングステン酸単結晶電磁カロリメータPHOSの建設及び運用責任を分担するとともに、同加速器による初めての陽子+陽子衝突及び鉛+鉛原子核衝突実験を遂行し、同検出器により初めて実現される高分解能フォトン物理を推進した。その結果、鉛原子核衝突直後のエネルギー密度及びジェット抑制現象などクォーク物性の解明に繋がる新たな知見を得た。2000年より稼働中の米国RHIC加速器より遙かに高い衝突エネルギーを実現する欧州CERN研究所最新鋭LHC加速器において、核子対あたりの衝突エネルギー5.5TeVの鉛+鉛原子核衝突による史上最高温度のクォーク物質を創りだす。最新の高分割・高エネルギー分解能光子検出器(通称PHOS)をALICE実験装置に組み込み、超高温クォーク物質が膨張し冷却し最後にハドロン化して離散するまでに発する光をこれまでにない高精度で測定し、クォーク物質の物性を解き明かす。本研究では、2光子崩壊する中性パイ中間子を同定し、その運動量分布及び生成多重度から到達エネルギー密度及びハドロン析出温度など、クォーク物質の相境界付近の特性、更に運動量分布の中心衝突度依存性からクォーク物質のエネルギー阻止能を明らかにする。次に直接光子エネルギー分布を測定し、摂動的QCD過程からの光子とクォーク物質からの熱輻射光子成分に分離し、熱光子のエネルギー分布から熱統計力学状態を特定することによりクォーク物質を解明し、極初期物質宇宙の理解を目指す。本研究は、新たな電磁カロリメータ材である鉛タングステン酸結晶(PbWO_4)をシリコン・アバランシェ・フォトダイオード(APD)で読み出す高性能フォトン検出器(PHOS検出器)をCERN研究所ALICE国際共同実験装置に組み込み、最新鋭LHC衝突型加速器を使った史上最高温度のクォーク物質を創成し、物質が輻射する光子をこれまでにない高精度で測定することにより、クォーク物質の詳細を初めて解き明かそうとするものである。研究計画の初年度であるが、従前のPHOS検出器開発研究に係る国際協力の実績及び密接な協議と充分な相互理解のもとで提案した研究計画のため、以下のとおり、きわめて順調な始動に成功した。(1)PHOS検出器の第1モジュール最終組立作業をCERN研究所にて実施し、6月から同研究所PS実験室にて約4000本の検出素子のエネルギー較正作業を遂行した。(2)エネルギー較正実験から検出器性能は当初期待した世界最高エネルギー分解能(3%/√<E>)に達成していることを確認した。その結果を受け、第2及び第3モジュールの組み立てに供する各8,000チャネルのAPD光学素子及び前置増幅器の国内生産を行った。(3)物理データ解析コード開発を推進するため、ALICE実験装置シミュレーション計算コードを広島大学既存の小規模PCクラスターに導入し、PHOS検出器シミュレーション解析に着手した。(4)CERN研究所及びALICE国際共同研究組織と広島大学を責任機関とする日本チームの相互協力関係を公的に樹立する協定書(MOU)の締結を完了した。このような実績を踏まえ、特別推進研究2年目にあたる平成19年度は、引き続き第2モジュール以降の組み立て及び完成モジュールのALICE実験装置への順次組み込みを経て、同年末に初めての陽子+陽子衝突実験を予定する。欧州CERN研究所の最新鋭大型ハドロン加速器LHCに於ける超高エネルギー原子核衝突実験ALICEを遂行し、近年、米国BNL研究所RHIC加速器実験にて発見したクォーク物質を詳細に探求し、強い色相互作用により創られたクォーク物質の物性を明らかにすることを目的とし、2008年LHC加速器による初めての陽子+陽子衝突実験に向け高分解能光子測定器PHOSを準備する。平成19年度に、主として、次の成果を達成した。1.前年度国内生産したAPD光学素子、前置増幅器、T型変換基板の国内テストを経てCERN研究所へ持ち込み、PHOS検出器第2及び第3モジュールの組み立て作業を開始した。また、第4-5モジュール組み立てのためのAPD光学素子、前置増幅器、及び2007年改良型T型変換基板を国内製産した。2.第1モジュールの地上宇宙線観測テストを継続する中、モジュール筐体の断熱気密構造に不具合を発見した。LHC加速器建設の遅延に伴ってPHOS検出器のALICE実験装置への第1号機組込導入作業を平成20年4月に予定するが、第2モジュールを充てることとし、順次不具合の根本的な改善を図ることとした。3.世界各研究機関に分散する高性能計算機を高速計算機ネットワークで強結合し構築する「LHC実験のための世界規模グリッドコンピューティング(Worldwide LHC Computing Grid)」の日本国内サイトとして、広島大学WLCG-Tier-2センターを立ち上げた。同時に、計算能力理論値が約5テラflopsの計算サーバを立ち上げ、同実験のためのシミュレーション計算等の高速化に多大な進展を遂げた。4. PHOS実機と全く同一の検出器素子、読み出し回路系及び制御回路系を組み込んだ総合検査・機能開発拠点を広島大に構築し、基板性能検証及びファームウェア等開発のため宇宙線テストを開始した。欧州CERN研究所LHC

加速器にて高エネルギー原子核衝突ALICE実験を実施する。本課題は、同実験装置に組み込む高分解能光子検出器PHOSの建設及びそれを使ったフォトン物理を推進する。前年度までに建設してきたPHOSモジュールの実験装置への組み込み、及び初めてのビーム衝突実験に取り組み、以下の成果を達成した。1.前年度の長期地上試験で発覚したPHOS第1モジュール筐体の気密断熱構造に関する不具合を根本的に解決する新たな完全気密筐体の設計を完了し、機械工場で製作を開始した。日本側は気密フランジの設計製作を引き受け、国内にて機械部品を製作、CERN研究所にて組み立てた。2. LHC加速器による初めての陽子+陽子衝突実験に向け、第2モジュールの地上最終試験を継続し、5月、ALICE実験装置への組み込みを行った。以後、LED信号及び宇宙線による読み出し改良試験を継続しながらLHC加速器始動を待機した。3.国内では、広島大学に置くPHOS検出器試験装置をPHOS運用環境の零下25度で運用し、システム及び研究者の習熟を図った。また、ALICE実験地域解析拠点となる広島大WLCG-Tier-2センターに大型ファイルサーバを導入し、大容量のデータ解析に向けた準備を進めた。4. LHC加速器は9月10日に加速器リングへの陽子ビーム入射を成功させた。ALICE実験装置にてビーム事象を観測した。同月19日、加速器に障害が発生し、復旧のため長期停止が宣言された。5.故障宣言を受け、2008年秋に計画していた陽子衝突データ収集及び解析にかかる研究計画を翌年度へ繰り越した。2009年11月23日、LHC加速器による初めての陽子+陽子衝突事象を検出した。大学院生4名の協力を得てPHOS事象の解析を行い、明確な中性パイ中間子の同定に成功した。欧州CERN研究所LHC加速器の高エネルギー原子核衝突ALICE実験を実施し、高分解能光子検出器PHOSの建設、及びそれを使ったフォトン物理を推進した。前年9月に生じたLHC加速器の障害復旧を待って初めての陽子+陽子衝突実験を実施し、最初の論文を公表した。H22年2月から18から24ヶ月の連続データ収集期間に突入した。1.前年度から製作中の完全気密筐体が3月末に完成し、4月よりPHOS第3モジュールを新たな筐体に組み込んだ。日本側が製作した気密フランジも取り付け、乾燥置換冷却及び地上テストを継続し、6月30日、ALICE実験装置に組み込んだ。日本側はデータ読出系改良及び宇宙線による検出素子利得較正を担当した。2.並行して製作してきた完全気密筐体2台が8月に完成し、第1及び第2モジュールの組み替えを急ピッチで実施した。8月13-14日に2基をALICE実験装置に組み込んだ。18日の実験区域閉鎖後、乾燥置換冷却を進めながら、LED信号及び宇宙線読み出し試験を継続し、LHC加速器の再起動を待機した。
有害有機化合物分解のためのチトクロームP450遺伝子組込微生物の開発

Cytochrome P450(以下P450)は多種多様な反応パターンを展開し,生体内で薬物などの生体外異物の代謝に深く関与している。P450の持つ性質は,生物が本来持つ代謝能力を超えた合成有機化合物の分解に都合がよい。そこで,細菌が産生するP450を用いた有害有機化合物分解菌の開発について,基礎的検討を行った。8種類のP450誘導剤を単一炭素源とした培地を用いて,P450産生細菌を環境中から分離することを試み,2-ethoxyphenolを単一炭素源とした培地で7株,2-methoxy-phenolを単一炭素源とした培地で2株,camphorを単一炭素源とした培地で1株のP450産生細菌を分離した。P450産生細菌は環境中に広く分布していることが明らかとなった。P450産生細菌の生育がP450阻害剤であるmetyrapone(2-methyl-1,2-di-3-pyridyl-1-propanone)で阻害されたことから,これらの細菌はP450を用いてP450誘導剤を資化していることが明らかとなった。チトクロームP450を産生する細菌を環境中から分離しようとする試みはほとんど行われていなかった。我々は,M9最少培地に8種類のP450の誘導剤を加え,P450を産生する細菌を環境中から分離することを試み,2-ethoxyphenolを単一炭素源とした培地により6株(EP1EP6株),2-methoxyphenolを単一炭素源とした培地により1株(MP1株),camphorを単一炭素源とした培地により1株(CP1株)のP450産生細菌を分離した。P450産生細菌は環境中に広く分布していることが明らかとなり,環境中における有害有機化合物の分解に細菌のP450が関与していることが示唆された。これら8株の基礎的性質を検討した結果,EP1株は2-ethoxyphenol及び4-ethoxybenzoic acidを単一炭素源として生育したときに,また,MP1株は2-mthoxyphenol以外にlinaloolを単一炭素源として生育したときにP450を産生していた。なお,これら8株はグルコース等の一般的な生育基質で生育したときにはP45Qを産生していなかった。P450阻害剤であるmetyraponを培地に添加し,各株の増殖を検討した結果,P450誘導剤を単一炭素源とした培地で増殖が阻害された。この結果から,これらの株は産生するP450を用いてP450誘導剤を資化していることが明らかとなった。8株のP450産生細菌のうちCorynebacterium sp.と同定されたEP1株の産生するP450(P450_<EP1>)をゲルろ過及び陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。その結果,P450_<EP1>の分子量は約45kDaであることが明らかとなった。P450_<EP1>のN末端アミノ酸配列を解析した結果,Rhodococcus rhodochrous 116株の産生するP450_<RR1>と類似性が高いことが明らかとなった。さらに,ほうれん草のフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼを用いてP450_<EP1>の代謝再構成系を確立した。この代謝系により有害有機化合物分解活性を検討した結果,P450_<EP1>は、benzene,toluene,carbon tctrachloride,1.1.1-trichloroethaneを代謝することが明らかとなった。M9最少培地に8種類のP450誘導剤を単一炭素源として加え,8株のP450産生細菌を分離した。本年度は,新たに有害物質汚染土壌からのP450産生細菌の分離を試み,2-ethoxyphenolを単一炭素源とした培地で9株,2-methoxyphenolを単一炭素源とした培地で5株を分離した。現在,この14株について種々の培養条件におけるP450産生量を測定するとともに,産生されたP450の性質等を調べている。

この結果から,P450産生細菌は環境中に広く分布していることが明らかとなり,環境中における有害有機化合物の分解に細菌の産生するP450が関与していることが示唆された。以前に分離した8株は,それぞれの菌株の分離に使用した誘導剤を単一炭素源とした培地で生育した場合のみP450を産生しており,グルコース等の栄養源が培地に存在しているとP450は産生されなかった。また,P450阻害剤であるmetyraponeを培地に添加し,各株の増殖を検討した結果,栄養培地では増殖量に変化がなかったものの,P450誘導剤を単一炭素源とした培地では明らかに増殖が阻害された。この結果から,これらの株は自身が産生するP450を用いてP450誘導剤を資化し,増殖していることが明らかとなった。各株の無細胞抽出液を用いて有機化合物の代謝を検討したところ,EP1株の無細胞抽出液が有害有機化合物であるbenzene等及び防菌防黴剤であるpropyl alcohol等を分解したが,他の菌株では分解量が著しく少なかった。代謝再構成系が不完全であった可能性があり,現在EP1株以外の菌株の無細胞抽出液による代謝再構成系を検討している。8株のP450産生細菌のうちEP1株の産生するP450_<EP1A>を精製した。P450_<EP1A>の分子量は約45kDaであり,N末端アミノ酸配列がRhodococcus rhodochrous116株の産生するP450_<RR1>と類似性が高いことが明らかとなった。現在,EP4株の産生するP450の精製を行っている。M9最少培地に8種類のP450誘導剤を単一炭素源として加え,環境中からP450産生細菌を分離した。本年度は,新たに活性汚泥から2株のP450産生細菌を分離した。本研究で分離したP450産生細菌は,2-ethoxyphenolを単一炭素源として生育したときにP450を産生する細菌が7株,2-methoxyphenolで生育する株が2株,camphorで生育する株が1株の合計10株となった。これらの細菌は,河川水,一般環境中土壌,水田などから分離されたものであり,P450産生細菌は環境中に広く分布していることが明らかとなった。10株のP450産生細菌は,それぞれの菌株が資化できる誘導剤を単一炭素源とした培地で生育した場合のみP450を産生しており,グルコース等の栄養源が培地中に存在しているとP450は産生されなかった。また,P450阻害剤であるmetyraponeを培地に添加し,各株の増殖を検討した結果,明らかに増殖が阻害された。