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マウス発生分化における細胞競合を介した倍数体排除機構の解明

マウスを始めとした哺乳類では1倍体(1n)胚および4倍体(4n)胚ともに個体として産まれることはできない。一方、それぞれを正常な2倍体(2n)胚とキメラにした場合、1倍体細胞は2倍体化した細胞のみ個体発生でき、4倍体細胞は胎盤には寄与できるが個体にはほとんど寄与できない。しかし、発生分化過程でこれらの倍数性の異なる細胞がどの段階でどのような機構で排除されていくのか明らかにした報告はほとんどない。本研究では、倍数性の異なる細胞が、発生分化過程で自らのもつ細胞運命によって排除されるのか、それとも周りを取り囲む2倍体細胞との競合によって排除されるのか明らかにする。具体的には、1倍体および4倍体のES細胞を用いて、in vitroおよびin vivoにおける分化過程での2倍体細胞との細胞競合を調べる。1倍体細胞は培養中に培養皿から剥がれていくものが多かったため、細胞接着が関与する細胞競合が起きている可能性が示唆された。そこで、接着性の異なる培養皿を用いて、1倍体と2倍体の混合培養を行なったところ、接着性の高い培養皿では、2倍体が優勢となるのに対して、接着性の低い培養皿や浮遊培養では、1倍体と2倍体の間に細胞競合がほとんど起きていないことが明らかとなった。また、血清添加区では、1倍体細胞の排除が進んだことから、1)細胞が接着していること、2)血清が存在していることが、細胞競合が働くための条件であることが判明した。現在、接着関連遺伝子を強制発現あるいはノックアウトした1倍体ES細胞の樹立を進めており、それらのES細胞で1倍体と2倍体の比率がどのように変化するのか調べていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々はこれまでに2倍体細胞と4倍体細胞との間には発生過程においてp53依存的な細胞競合が起きていることを示してきた(Horii etal.,Sci Rep 2015)。そこで、1倍体細胞と2倍体細胞との間にも同様にp53依存的な細胞競合が起きていると予測したが、p53-KO ES細胞やp53阻害剤を用いた実験から、少なくとも1倍体と2倍体の間にはp53依存的な競合はin vitroでは起きていないことが明らかとなった。一方、1倍体細胞は培養中に培養皿から剥がれていくものが多かったため、細胞接着が関与する細胞競合が起きている可能性が示唆された。当初はp53依存的な細胞死による細胞競合を想定していたが、1倍体と2倍体の間では少なくともp53依存的な現象は確認できなかった。一方で、予想していなかった細胞接着因子が関与した細胞競合を示唆する現象を発見しており、当初の計画とはやや異なるが、関連遺伝子の候補を絞ることができているので、この評価とした。

現在、接着関連遺伝子を強制発現あるいはノックアウトした1倍体ES細胞の樹立を進めており、それらのES細胞で1倍体と2倍体の比率がどのように変化するのか調べていく。H29年度の研究成果より、H30年度は細胞接着に関与する遺伝子を抑制もしくは強発現させた1倍体細胞株を樹立し、細胞競合がどう変化するのか検討する予定である。候補遺伝子として、E-カドヘリン、RasおよびSrcを想定している。遺伝子の抑制については、CRISPR/Cas法により行う予定である(Horii et al., PeerJ, 2013)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ペンタクオークの共鳴・散乱状態の厳密5体理論による研究

ハドロン分野における中心課題の一つとして、90年代初頭から4、5、6個のクオークで構成されるマルチクオークシステムの理論的研究、及び探索実験が精力的に行なわれて来た。昨年、5個のクオークからなる新素粒子ペンタクオークΘ^+の発見が大阪大学の実験グループによって発表され、大きなインパクトを与えている。理論側に緊急に要求されていることは「散乱・共鳴境界条件の下に厳密5体問題として取り組み、ペンタクオークΘ^+のスピン・パリティを決め、狭い共鳴の幅を説明し内部構造を解き明かすこと」である。そこで、本研究の目的は、申請者自身が提唱し開発した「無限小変位ガウスローブ基底関数に基づく少数多体系の厳密計算法」を活用し、ハイペロンや、エキゾチックハドロンシステムを構成子クオーク模型に基づいて、その構造を研究することである。平成19年度は、ハイペロンの構造を構成子クオーク模型に基づいて研究するると共に、このハイペロンが原子核内に注入された場合の構造について研究を行った。原子核内にグザイハイペロンが付加された原子核の存在はまだ皆無であったが、理論的に束縛状態の可能性について指摘した。ハドロン分野における中心課題の一つとして、90年代初頭から、4、5、6個のクオークで構成されるマルチクオークシステムの理論的研究、及び探索実験が精力的に行なわれて来た。理論側に緊急に要求されていることは「散乱・共鳴境界条件の下に厳密5体問題として取り組み、ペンタクオークΘ^+のスピン・パリティを決め、狭い共嶋の幅を説明し内部構造を解き明かすこと」である。そこで、本研究の目的は、申請者自身が提唱し開発した「無限小変位ガウスローブ基底関数に基づく少数多体系の厳密計算法」を活用し、構成子クオーク模型に立って、N+K(nuclen+kaon)散乱チャネルを取り入れた厳密5体問題を解き、ペンタクォークΘ^+の諸性質(質量、崩壊幅、スピン・パリティ、内部構造)を解き明かすこと、である。平成17年度は、Θ^+の5体計算に適用し、基底状態の候補スピン・パリティであるT=0,J=1/2^+,J=1/2^-の共鳴の存在の有無について本格的計算を行なった。さらに、他のスピン・パリティ状態(T=1,J=1/2^+,J=1/2^-など)の共鳴の存在の有無についても総合的に研究を行なう。現在までに、準備的計算結果ではあるが、閉じ込めポテンシャルの中に閉じ込められている配位のみ(N+K散乱チャネルを無視する>で解くと、J=0,J=1/2^+,J=1/2^-が実験値近傍に束縛状態として得られる。b)しかし、N+K散乱境界条件の下に解くと、実験値近傍のエネルギー領域には、T=0,J=1/2^+、J=1/2^-が、共鳴状態として存在し得ず、非共鳴連続状態となることが明らかになった。ハドロン分野における中心課題の一つとして、90年代初頭から、4、5、6個のクォークで構成されるマルチクオークシステムの理論的研究、及び探索実験が精力的に行なわれて来た。昨年、5個のクォークからなる新素粒子ペンタクオークΘ^+の発見が大阪大学の実験グループによって発表され、大きなインパクトを与えている。そこで、本研究の目的は、申請者自身が提唱し開発した「無限小変位ガウスローブ基底関数に基づく少数多体系の厳密計算法」を活用し、構成子クォーク模型に立って、N+K(nuclen+kaon)散乱チャネルを取り入れた厳密5体問題を解き、ペンタクオークΘ^+の諸性質(質量、崩壊幅、スピン・パリティ、内部構造)を解き明かすこと、である。平成18年度は、前年度にペンタクオーク状態が、非共鳴状態になったことを受けて、そもそも適用しているモデル計算(構成子クォーク模型)が適切であるのかどうかを調べることを行った。近年、Belleのグループにおいて、4クォークシステム(X(3872))が発見された。この状態が、報告者の用いる計算法で、実験を再現するのかどうかを研究をした。c, c-bar, q, q-barの4体問題に基づき、D-D散乱チャネルを取り入れた厳密4体問題を解いた。用いるq-qbar相互作用は、現存するメソンの質量を再現するものを用いた。しかしながら、本研究では、実験値あたりに共鳴状態は存在しないことが分かった。しかしながら、q-qbar相互作用間に未だに、不定性が多く残されているので、更なる理論研究が必要である。

そこで、本研究の目的は、申請者自身が提唱し開発した「無限小変位ガウスローブ基底関数に基づく少数多体系の厳密計算法」を活用し、ハイペロンや、エキゾチックハドロンシステムを構成子クオーク模型に基づいて、その構造を研究することである。平成19年度は、ハイペロンの構造を構成子クオーク模型に基づいて研究するると共に、このハイペロンが原子核内に注入された場合の構造について研究を行った。原子核内にグザイハイペロンが付加された原子核の存在はまだ皆無であったが、理論的に束縛状態の可能性について指摘した。
in vitro合成RNAを遺伝子として持つインフルエンザウイルスの作製

マイナス鎖RNAを遺伝子として持つインフルエンザウイルスは、転写、複製反応ともウイルス由来のRNAポリメラ-ゼが行っており、遺伝子RNAのみを細胞に導入しても、感染性を有するウイルス粒子を得ることはできない。従って、遺伝子RNAのみを細胞に導入して感染性を有するウイルス粒子を得るためには、なんらかの形でウイルスRNAポリメラ-ゼ及びNP蛋白質を細胞に導入しなければならない。筆者等が樹立したインフルエンザウイルスRNAポリメラ-ゼ、及び、NP遺伝子の発現をデキサメサゾン(dex)投与により誘導できる細胞株(クロ-ン76細胞)は、上記の目的に適った細胞株である。まず、このクロ-ン76細胞にin vitroで合成した1本のウイルスRNAを導入し、導入したRNA以外の7本の遺伝子は感染させたウイルスに由来する組換えインフルエンザウイルス粒子の作製を試みた。dex投与により3種のウイルスRNAポリメラ-ゼ及びNP遺伝子の発現を誘導したクロ-ン76細胞に、ヘルパ-ウイルスを感染させ、感染2.5時間後に、マイナス鎖のキメラNS/CATv RNA(NS遺伝子のコ-ド領域を大腸菌のCAT遺伝子に替えたキメラRNA)を導入し、22時間後の細胞上清をMDCK細胞に感染させたところ弱いながらもCAT活性が認められ、NS/CATv RNAを遺伝子として持つ組換えウイルスが回収された。しかし、キメラRNAの導入6時間後にヘルパ-ウイルスを感染させた場合には組換えウイルスは得られなかった。現在、効率良く組換えウイルス粒子が回収できる系の樹立を試みている。また、dexでウイルスRNAポリメラ-ゼ、及び、NP遺伝子の発現を誘導したクロ-ン76細胞に、8本のウイルスRNAだけを導入し、ヘルパ-ウイルスを必要としない感染性を有するウイルス粒子の作製系の樹立も試みている。
多次元情報を用いた融雪流出管理システムの実用化に関する研究

本研究では,ローカルな水資源としての積雪の重要性や積雪の存在と地球規模での水・エネルギー循環との関連が指摘されていることなどを考慮し,本研究では寒冷圏での水文現象,とりわけ特徴的な現象として融雪を取り上げ,ポイントスケールでの水文応答を表現する一次元モデルについて検討し,これをもとにメソグリッドスケールでの水文現象を表現する分布型モデルの開発・適用を行った.ポイントスケールでの融雪現象を表現するモデルとして,比較的少ない気象要素で雪面熱収支を表現できる小池ら(1985b)のモデルの特性と,放射収支量の算定において雲の効果を日射により推定可能なパラメータにより表現している太田モデル(1992)の特性とを考慮し,雪面熱収支要素の中の放射収支による融雪の表現に太田モデル,顕熱および降雨による融雪量推定に小池らのモデルを用いた融雪モデルを本研究で用いることとした.数kmから数10kmのメソグリッドスケールにおける融雪・流出現象の把握を目的とし,分布型融雪・流出モデルの統合化について検討を行った.この検討では,衛星リモートセンシングによる積雪面積分布情報の抽出,数値地形モデルからの地理情報の抽出,広域気象観測網からの気象情報の取得の手法を確立し,これと統合化された分布型融雪・流出モデルと組み合わせることにより,総合的な「融雪・流出解析システム」を開発した.また解析システムは,現状で入手可能な衛星情報,全国規模で整備されている地理情報およびルーチン的な気象情報の利用を前提にしているなど,実利用を念頭に置いたシステムとなっており,流域規模での融雪・流出の把握やそれに基づいた全国的な水資源としての積雪の総合的な管理体制の確立などへの適用が期待される.本研究では,ローカルな水資源としての積雪の重要性や積雪の存在と地球規模での水・エネルギー循環との関連が指摘されていることなどを考慮し,本研究では寒冷圏での水文現象,とりわけ特徴的な現象として融雪を取り上げ,ポイントスケールでの水文応答を表現する一次元モデルについて検討し,これをもとにメソグリッドスケールでの水文現象を表現する分布型モデルの開発・適用を行った.ポイントスケールでの融雪現象を表現するモデルとして,比較的少ない気象要素で雪面熱収支を表現できる小池ら(1985b)のモデルの特性と,放射収支量の算定において雲の効果を日射により推定可能なパラメータにより表現している太田モデル(1992)の特性とを考慮し,雪面熱収支要素の中の放射収支による融雪の表現に太田モデル,顕熱および降雨による融雪量推定に小池らのモデルを用いた融雪モデルを本研究で用いることとした.数kmから数10kmのメソグリッドスケールにおける融雪・流出現象の把握を目的とし,分布型融雪・流出モデルの統合化について検討を行った.この検討では,衛星リモートセンシングによる積雪面積分布情報の抽出,数値地形モデルからの地理情報の抽出,広域気象観測網からの気象情報の取得の手法を確立し,これと統合化された分布型融雪・流出モデルと組み合わせることにより,総合的な「融雪・流出解析システム」を開発した.また解析システムは,現状で入手可能な衛星情報,全国規模で整備されている地理情報およびルーチン的な気象情報の利用を前提にしているなど,実利用を念頭に置いたシステムとなっており,流域規模での融雪・流出の把握やそれに基づいた全国的な水資源としての積雪の総合的な管理体制の確立などへの適用が期待される.水資源の有効利用を推進するにあたり、衛星による広域データと異なる水循環特性を有する流域データを比較・関連させることによって水資源の年々変動の実態を明らかにし、ケーススタディ領域において、適正な事業の実施、管理業務の効率化といった行政ニーズに応えるための流域情報の整備、共有化、事業の効率化・高度化を実現可能とする情報管理システム構築とシステムを機能させるために必要な下記の項目について検討を実施した。1)対象流域の基礎データの収集整理2)衛星プロダクツを用いた広域場での水循環の年々変動特性抽出3)実務レベルでのリモートセンシングによる土地被覆把握手法検討4)分布型流出モデルの高度化に関する検討5)GISを活用した水資源管理システムの基本事項の検討寒冷圏の流域としては、チベット高原を対象に融雪・凍土水文過程、降水過程プロセスを解析し、それぞれを組み合わせて、凍土融解プロセスおよび土壌水分の空間分布を表現できるモデルを開発し、地表面の空間不均一性が空間平均蒸発量算定に及ばす影響を定量的に評価した。また、水資源利用度が非常に高く、またアジア・オーストラリアモンスーンの年々変動やENSOサイクルが水資源に大きな影響を与えていると考えられるインドネシアのブランタス川流域を対象として、広域変動が地域水資源利用に与える影響度を長時間の資料により明らかにし、今後どのような情報管理システムを整備する必要があるかを調査した。ここでは特に水資源の有効利用を推進するにあたっては、適正な事業の実施、管理業務の効率化といった行政ニーズに応えるための流域情報の整備、共有化、事業の効率化・高度化を実現可能とする情報管理システム構築とシステムを機能させるために必要な事項についても検討した。本研究では,ローカルな水資源としての積雪の重要性や積雪の存在と地球規模での水・エネルギー循環との関連が指摘されていることなどを考慮し,本研究では寒冷圏での水文現象,とりわけ特徴的な現象として融雪を取り上げ,ポイントスケールでの水文応答を表現する一次元モデルについて検討し,これをもとにメソグリッドスケールでの水文現象を表現する分布型モデルの開発・適用を行った.ポイント

スケールでの融雪現象を表現するモデルとして,比較的少ない気象要素で雪面熱収支を表現できる小池ら(1985b)のモデルの特性と,放射収支量の算定において雲の効果を日射により推定可能なパラメータにより表現している太田モデル(1992)の特性とを考慮し,雪面熱収支要素の中の放射収支による融雪の表現に太田モデル,顕熱および降雨による融雪量推定に小池らのモデルを用いた融雪モデルを本研究で用いることとした.数kmから数10kmのメソグリッドスケールにおける融雪・流出現象の把握を目的とし,分布型融雪・流出モデルの統合化について検討を行った.この検討では,衛星リモートセンシングによる積雪面積分布情報の抽出,数値地形モデルからの地理情報の抽出,広域気象観測網からの気象情報の取得の手法を確立し,これと統合化された分布型融雪・流出モデルと組み合わせることにより,総合的な「融雪・流出解析システム」を開発した.また解析システムは,現状で入手可能な衛星情報,全国規模で整備されている地理情報およびルーチン的な気象情報の利用を前提にしているなど,実利用を念頭に置いたシステムとなっており,流域規模での融雪・流出の把握やそれに基づいた全国的な水資源としての積雪の総合的な管理体制の確立などへの適用が期待される.
生合成経路を活用するステロイド類の効率的合成法の開発

ステロイド骨格を有する化合物は自然界に広く分布し、さまざまな生物活性と複雑な構造を有している。これまで報告されたステロイド骨格の代表的合成法は、多段階を要し、生化学研究に必要な標的化合物の大量供給は困難であった。そこで、生合成経路を活用したステロイドの効率的合成法を開発することとした。ドミノ環化によるステロイドの四環性骨格構築に先立ち、三環性骨格を有するモデル化合物で方法論の妥当性を検討した。三環性化合物の環化前駆体を収束的に調製し、ラジカルを経由するドミノ環化で良好な収率で三環性骨格を構築した。同様の手法で四環性化合物の合成を検討したところ、目的の化合物を少量ながら得ることに成功した。ステロイド類は自然界に広範に存在し、生物活性が多彩で、生体の制御に重要な役割を担っている。これらは、6-6-6-5員環が縮環した四環性骨格を基本構造とし、多様な官能基と多くの不斉炭素を有し、合成化学的にも非常に興味深い化合物である。これまで報告されたステロイドの化学合成法は、複数の環骨格を段階的に構築する手法がほとんどで、より効率的な合成ルートの開発が望まれている。応募者は、生合成経路を活用した多環式骨格の構築により、供給が切望されている生物活性化合物を効率的に合成しようと考えた。具体的には、容易に調製可能なセグメントを順次連結させて環化前駆体を合成し、ドミノ環化を鍵反応としてステロイド類の四環性骨格を一挙に構築することとした。本研究が遂行されれば、望む位置に官能基を導入したステロイド類を簡便に合成することが可能になると期待される。四環性骨格の一挙構築に先立ち、三環性骨格を有するモデル化合物で環化条件の最適化を検討した。三環性モデル化合物の合成において、環化前駆体の調製およびドミノ環化を前年度に報告しているが、収率・効率ともに満足のいくものではなかった。本年度は、試薬・溶媒・温度等、種々の反応条件を検討し、より効率的に環化前駆体を調製可能にした。さらに、ドミノ環化で得られた三環性化合物の脱メトキシカルボニル化と続く塩化水素の脱離を同一反応容器内で行い、ステロイドのABC環部に相当するエノンの合成に成功した。ステロイド類は、多様な生物活性と多くの不斉炭素、6-6-6-5員環が縮環した構造を有し、合成化学的に非常に興味深い化合物である。しかし、その効率的合成法は開発されておらず、また、天然由来ステロイドの部位特異的な官能基化は困難である。そのため、容易に調製可能なセグメントを順次連結させて環化前駆体を合成し、ドミノ環化を鍵反応としてステロイド類の四環性骨格を一挙に構築することとした。ドミノ環化によるステロイド類の四環性骨格構築に先立って、三環性骨格を有するモデル化合物で反応条件の最適化を検討した。三環性化合物の環化前駆体の合成は、以下のように行った。D-マンニトールから誘導したアルデヒドとシアノリン酸エステルとのHorner-Wadsworth-Emmons反応でZ-アルケンを選択的に合成した。続いて脱保護で生じたアルコールを臭素化後、アセト酢酸エチルユニットの伸長反応により、環化前駆体を調製した。この環化前駆体に対しラジカル環化による三環性化合物の一挙構築の反応条件を最適化し、望む三環性化合物を良好な収率で合成することに成功した。生成物の縮環部の立体化学は、標的化合物と同じtrans, anti, transであった。ステロイド類は自然界に広範に存在し、動植物ホルモン、抗菌活性、抗腫瘍活性をはじめ、さまざまな生物活性を有している。これらは、6-6-6-5員環が縮環した四環性骨格を基本構造とし、多様な官能基と多くの不斉炭素を有する合成化学的に非常に興味深い化合物である。これまで報告されたステロイドの化学合成法は、複数の環構造を段階的に構築する手法がほとんどで、より効率的な合成ルートの開発が望まれている。そこで申請者は、ステロイドの生合成経路を活用するドミノ環化を鍵反応として、高度に官能基化されたステロイド類縁体の短段階合成を目指した。具体的には、容易に調製可能なセグメントを順次連結させて環化前駆体を合成し、ラジカルを経由するドミノ環化で四環性骨格を一挙に構築することとした。

前年度、分子末端にケトエステルを有するポリエン環化前駆体に酢酸マンガンと酢酸銅を作用させるラジカル環化と続く脱アルコキシカルボニル化を経て、ステロイドのABC環部構築に成功した。そこで、この手法を最適条件とし、四環性骨格を形成しうる環化前駆体に対しドミノ環化を試みたところ、期待に反し二環のみで環化が停止した。望む反応が進行しなかったのはアルケンの置換基に原因があると考え、環化前駆体の置換基を種々検討した結果、わずかではあるが四環性骨格を有する生成物を得ることに成功した。今後、環化前駆体およびドミノ環化の最適化により、望む四環性骨格がより良い収率で得られると期待される。天然物化学、有機合成化学鍵反応であるドミノ環化の環化前駆体を収束的に合成し、ステロイドのABC環部に相当するエノンの合成に成功した。モデル化合物の環化前駆体を合成するとともに、ドミノ環化の反応条件を最適化し、目的の三環性化合物が良好な収率で得られた。これまで得られた知見をもとに、次年度は四環性骨格のドミノ環化に挑戦する。具体的には、環化前駆体の効率的調製法の開発およびドミノ環化の反応条件を最適化する。三環性化合物の合成で得られた知見をもとに、ステロイドの四環性骨格の一挙構築を目指す。経費を節約し、有効に使用するため。研究計画をより推進させる器具および試薬を購入する。消耗品として有機合成用試薬およびガラス器具を購入する。さらに、研究実施期間中の海外および国内における学会・シンポジウムでの研究成果発表および研究課題の動向調査をおこなう。また、研究成果を学術論文として投稿する準備として英文校閲を外部に依頼する。
哺乳類精子形成におけるホルモン・センシティブ・リパーゼの役割の解明

研究実施計画に基づき、野生型マウスおよびHormone-sensitive lipase欠損マウスの精子をICSI(卵細胞質内精子注入)の手技を用いて野生型雌マウス卵子に注入し、受精およびその後の胚発育に関して検討を行った。その結果、Hormone-sensitive lipase欠損精子であっても正常に受精し、in vitroで胚盤胞までの発育を観察した。ここまでの結果について、第54回日本産婦人科学会およびASRM 58^<th> annual meetingにおいて学会発表を行った。さらにこの受精卵を偽妊娠マウス子宮に胚移植することにより、Hormone-sensitive lipaseヘテロ欠損マウスの出生を確認した。この結果については現在投稿準備中である。野生型マウス精巣およびHormone-sensitive lipase欠損マウス精巣からmRNAを抽出し、cDNA subtraction methodを用いて、野生型マウス精巣により発現が多く認められるcDNA,およびその逆のパターンを示すcDNAをスクリーニングした。これらの配列をsequencerを用いて解析し、homology検索にて既知の遺伝子、約25種類ずつをつきとめた。現在、これらの発現差に関して詳細に解析中である。
子宮内膜癌の悪性度へのテロメラーゼ活性の役割とブラシ生検による癌の早期診断の試み

近年,テロメラーゼ活性の検出法としてTRAP assayが報告されて以来,多くの癌組織で極めて高率でテロメラーゼの活性が検出され,また正常組織ではほとんど検出されないことが報告されてきた。この方法は極めて少量のサンプルからでも十分に検出できるほど感度が高く,前癌状態や癌細胞の数が少ない場合でも検出できる可能性があり,癌の初期診断法の一つとして期待されている。実験と方法正常子宮内膜30例、子宮内膜増殖症31例、子宮内膜癌32例、妊娠14週の脱落膜1例の手術摘出組織の一部をKimらの方法に従いホモジナイズしこのうち3mgを実験に使用したすべての症例は閉経後1年以上経過した婦人を対象に行われた。正常子宮内膜56例、子宮内膜増殖症20例、子宮内膜癌23例そしてタモキシフェン服用中の正常子宮内膜27例から子宮内膜ブラシで細胞を採取し、これをTRAPassay同様にホモジナイズし、1mgを実験に使用し、BOEHRINGER社のTelomerase ELISA Kitを用いてテロメラーゼ活性を測定した。子宮内膜癌、増殖症は組織学的に診断を確定した。実験結果内膜組織の測定ではテロメラーゼ活性は正常内膜でも活性を認め、さらに性ホルモンの影響下にあること明らかになった。しかし、閉経期内膜ではテロメラーゼ活性は認めず、閉経期での癌診断の手段となりうると考えられるが、ブラシによるサンプルからの測定では,子宮内膜増殖症ー子宮内膜異型増殖症ー子宮内膜癌のテロメラーゼ活性はオーバーラップしており、これらをすぐに癌の早期診断として使用するにはさらに方法の改良が必要と考える。しかし、閉経期内膜ではテロメラーゼ活性は認めず、閉経期での癌診断の手段となりうると考えられるが、ブラシによるサンプルからの測定では,子宮内膜増殖症-子宮内膜異型増殖症-子宮内膜癌のテロメラーゼ活性はオーバーラップしており、これらをすぐに癌の早期診断として使用することにはならない。
プロテオームを用いた単純性骨嚢腫の発生・再発メカニズムの検討

単純性骨嚢腫は漿液性の液体で満たされた空洞が骨髄内で形成される特に小児期に発生する腫瘍様類似疾患である。比較的発生頻度が高く、罹患した骨が菲薄化し脆弱性をきたし、痛みや、病的骨折による機能障害をきたすことが知られている。また、手術後の再発率が高いことも問題点となる。これらの問題点を解決するためには、本疾患の発生,再発のメカニズムの解明が必要不可欠である。過去にもいくつかの単純性骨嚢腫の発生メカニズムに関する研究が行われてきているが、未だに尚、その原因については未解明のままである。本研究では単純性骨嚢腫を臨床的な病態の違いから、1.長管骨単純性骨嚢腫2.再発した長管骨単純性骨嚢腫3.踵骨骨嚢腫に分類し、それぞれの病変から回収した手術試料を検討することで、発生、再発因子の解明を試みる予定としている。単純性骨嚢腫の壁細胞はどちらの骨芽細胞系または破骨細胞系のどちらの形質が優位であるのかを証明するために、壁細胞からRNAを回収することによりその遺伝子発現を解析した。長管骨単純性骨嚢腫の壁細胞から嚢胞壁細胞の細胞培養したところ紡錘形細胞の増殖が確認された。また、長管骨単純性骨嚢腫の壁細胞からRNAを回収し、cDNAとし、骨芽細胞系の分化に関する遺伝子発現および(RUNX2オステオポンチン,骨シアロプロテイン,オステオカルシン)また破骨細胞系の分化に関する遺伝子発現(CAII,TRAP, RANK)の検討を行ったところ、破骨細胞系統の遺伝子発現は確認できなかったが、オステオポンチン、骨シアロプロテイン、オステオカルシンの骨芽細胞系統の発現が確認され、単純性骨嚢腫の壁細胞ではRNAレベルでは破骨細胞系統ではなく骨芽細胞系統にその発現が傾いていることが確認された。また、分化のレベルは初期の骨芽細胞レベルと考えられた。平成30年度病理組織像の検討(HE染色、免疫染色法)に関して、1.長管骨単純性骨嚢腫2.再発した長管骨単純性骨嚢腫3.踵骨骨嚢腫で染色を行った。単純性骨嚢腫ではその骨に空洞ができる病態の特徴から、特に破骨細胞活性に注目し、TRAP染色を行った。しかしながら、長管骨単純性骨嚢腫および再発した長管骨骨嚢腫の間において強視野(×400倍)にてTRAP染色による破骨細胞活性には有意差を認めなかった。更に、長管骨単純性骨嚢腫と踵骨単純性骨嚢腫の間においてもTRAP染色による破骨細胞活性の有意差を認めなかった。組織学的な特徴として、特に踵骨単純性骨嚢腫の特徴として慢性出血像をしめすCholesterol granulomaの存在が認められた。従来の予測では踵骨の単純性骨嚢腫での破骨細胞の活性が低く、長管骨単純性骨嚢腫での破骨細胞の活性が高く、更に再発した長管骨単純性骨嚢腫の破骨細胞活性が更に高いことを推測していたが、いずれの組織においてもTRAP染色陽性となる破骨細胞数が非常に少なく、統計学には有意差は確認できなかった。単純性骨嚢腫の内溶液を用いてのプロテオーム解析に関しては単純性骨嚢腫の発生・再発の関連タンパクの同定するために現在サンプル試料調整中である。明らかに臨床病理の異なる、長管骨単純性骨嚢腫と踵骨骨嚢腫の内容液の標本を用いて解析を試みている段階である。単純性骨嚢腫の内溶液のプロテーム解析に関して、現在、長管骨単純性骨嚢腫、踵骨単純性骨嚢腫のサンプル試料の調整を行っている。1例毎の解析をおこなうより、その臨床的特徴をつかむために3例づつ、混合して解析する方向性ですすめている。現在サンプルを調整中の段階である。これらの問題点を解決するためには、本疾患の発生,再発のメカニズムの解明が必要不可欠であると考えた。過去にもいくつかの単純性骨嚢腫発生にメカニズムに関する研究が行われてきているが、未だに尚、その原因については未解明のままである。まず初年度の平成29度は単純性骨嚢腫がその骨内嚢胞を形成するという特徴をもつことから、その空洞形成には破骨細胞による骨吸収作用が強く関与しているのではないかと考え、過去に切除された単純性骨嚢腫のホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを用いての壁細胞の病理組織像の検討(HE染色、免疫染色法)を計画した。また、内容液の生化学的検査では、骨芽細胞系(ALP、BAP)及び破骨細胞系(ACP)の骨代謝マーカーの上昇をともに認めていることから、単純性骨嚢腫の壁細胞はどちらの骨芽細胞系または破骨細胞系のどちらの形質が優位であるのかを証明するために壁細胞からRNAを回収することによりその遺伝子発現の解析する予定とした。

また、長管骨単純性骨嚢腫の壁細胞からRNAを回収し、cDNAとし、骨芽細胞系の分化に関する遺伝子発現および(RUNX2オステオポンチン,骨シアロプロテイン,オステオカルシン)また破骨細胞系の分化に関する遺伝子発現(CAII,TRAP, RANK)の検討を行ったところ、破骨細胞系統の遺伝子発現は確認できなかったが、オステオポンチン、骨シアロプロテイン、オステオカルシンの骨芽細胞系統の発現が確認され、単純性骨嚢腫の壁細胞ではRNAレベルでは破骨細胞系統ではなく骨芽細胞系統にその発現が傾いていることが確認された。また、分化のレベルは初期の骨芽細胞レベルと考えられた。このことから長管骨発生の単純性骨嚢腫の壁細胞の形質は破骨細胞系ではなく、骨芽細胞系に傾いていることが推測された。単純性骨嚢腫は漿液性の液体で満たされた空洞が骨髄内で形成される特に小児期に発生する腫瘍様類似疾患である。比較的発生頻度が高く、罹患した骨が菲薄化し脆弱性をきたし、痛みや、病的骨折による機能障害をきたすことが知られている。また、手術後の再発率が高いことも問題点となる。これらの問題点を解決するためには、本疾患の発生,再発のメカニズムの解明が必要不可欠である。過去にもいくつかの単純性骨嚢腫の発生メカニズムに関する研究が行われてきているが、未だに尚、その原因については未解明のままである。本研究では単純性骨嚢腫を臨床的な病態の違いから、1.長管骨単純性骨嚢腫2.再発した長管骨単純性骨嚢腫3.踵骨骨嚢腫に分類し、それぞれの病変から回収した手術試料を検討することで、発生、再発因子の解明を試みる予定としている。単純性骨嚢腫の壁細胞はどちらの骨芽細胞系または破骨細胞系のどちらの形質が優位であるのかを証明するために、壁細胞からRNAを回収することによりその遺伝子発現を解析した。長管骨単純性骨嚢腫の壁細胞から嚢胞壁細胞の細胞培養したところ紡錘形細胞の増殖が確認された。平成30年度病理組織像の検討(HE染色、免疫染色法)に関して、1.長管骨単純性骨嚢腫2.再発した長管骨単純性骨嚢腫3.踵骨骨嚢腫で染色を行った。単純性骨嚢腫ではその骨に空洞ができる病態の特徴から、特に破骨細胞活性に注目し、TRAP染色を行った。しかしながら、長管骨単純性骨嚢腫および再発した長管骨骨嚢腫の間において強視野(×400倍)にてTRAP染色による破骨細胞活性には有意差を認めなかった。更に、長管骨単純性骨嚢腫と踵骨単純性骨嚢腫の間においてもTRAP染色による破骨細胞活性の有意差を認めなかった。組織学的な特徴として、特に踵骨単純性骨嚢腫の特徴として慢性出血像をしめすCholesterol granulomaの存在が認められた。
インフォーマルな学習環境における学生の多様性に配慮した協働作業の実践と評価

本研究は、多様な学生の特性をいかした協働活動の実践を目指して取り組んだものである。プロジェクト型学修で協働作業する際にソーシャルメディア上で行われる学生間のコミュニケーションの実態を把握するとともに、プロジェクトの遂行や学修の質向上につなげていくために必要な教員による支援・介入方法を明らかにした。特に、昨今注目されている協働型問題解決能力の育成につながる実効的な協働作業の実現に寄与するため、学生・教員双方で共有・確認すべきルーブリック、また、状況に応じた教員による適切に介入・支援のためのガイドラインを含む、協働作業のデザイン手法を提案し、実践例を示した。過年度研究で実践したオンライン協働作業に着目し、コミュニケーションデータを、タスク遂行のためのいわば公式なやり取りに加えて、それ以外の日常的な非公式なコミュニケーションに関するものを入手した。これに、当該オンライン協働作業を実施した学生へのインタビューデータを加えて分析を試みた。対象とした実践は、日本の生徒・学生と海外の生徒・学生の混成チームによる英語プレゼンテーションを核とするイベント、World Youth Meeting(WYM)である。より具体的には、WYMでの英語協働プレゼンテーションに向けたオンライン協働作業に焦点を当てた。日本の学生とチームを形成する海外の学生は8月のイベント開催に合わせて来日するが、対面での準備期間は限られており、プレゼンテーションに関する実質的な議論は来日前にオンラインで着実に実施しておくことが重要である。対面後にはお互いに距離も縮まり、その後はオンラインでもやり取りが活性化すると一般的に言われるが、WYMでは、対面前に踏み込んだ議論をオンラインで行う必要がある。効果的な支援のあり方を追求するための基盤とすべく、この事前のオンラインでの協働作業に向けた現状を確認するとともに、分析とその結果を踏まえた支援のあり方について検討した。分析の結果、SNSの普及により、学生達は一見、活発にコミュニケーションしているようではあるが、特に、新参者となる1年生は十分に参画していない傾向が見られた。実作業に対する支援だけでなく、非公式なコミュニケーションにも配慮し、グループメンバー間での社会的存在感を向上(例えば、お互いが距離を縮め仲良くなること)させるような指導・支援の必要性が示唆された。こうした結果を踏まえ、学生のオーナーシップを損なうような介入とならないように留意しつつ、要件やガイドラインを示すなどの指導・支援方法を検討した。学生アルバイトに、SNS上でのコミュニケーションデータの収集・整理を依頼することを当初より計画していたが、機関のルールにおいてアルバイト作業の場所が学内に限定されることになり、十分に対応することができなかった。国際協働でのプロジェクト型学習(PBL)を昨年度に継続して実践した。海外学生が1名あるいは2名、日本側が多人数(100名程度)というパターンでの実践の他、日本学生と海外学生各2-3名程度、計4-6名程度のグループによる協働調査・研究活動もデザイン・実践した。さらに、学生グループ(6名)が主体となり独自に海外フィールドワークを企画・実践する取り組みの支援も行った。本年度はこれら実践を評価するためのルーブリック作成に取り組んだ。多様性に関する先行研究調査結果や、VALUEルーブリック等、公開されているルーブリックで関連するものを参考として研究者・研究分担者で協議の上、作成した。ルーブリックは、活動全般を評価可能な指標とした。活動全般を評価しながら、本研究としては、中心的テーマであるオンラインコミュニケーションに着目して分析を深めていくことを予定している。作成したルーブリックは、対象となる実践に中心的に取り組んだ学生に開示の上、意見・コメントを得て改定していく予定であり、そのための調整を行った。eポートフォリオに関しては、学生個人による作成は、非技術系の学生にとって敷居が高く、現時点では困難であるとの認識に至った。そこで、ともに取り組むメンバーの間で活動のプロセスを蓄積していくことを意識し、グループとしてのeポートフォリオ構築に取り組むこととし、実践により各種ICT環境上に多くの情報を蓄積した。こうして蓄積された情報を振り返り等、学生の学習や次なる活動にいかしていくための方策・可能性について検討した。昨年度、学生にアルバイト・研究協力として、オンライン協働作業時のプロセスの記録、ログデータの整理・類型化といった作業の依頼を予定していたが、作業場所の問題で十分に進めることができなかった。本年度は概ね順調に進め、遅れを若干取り戻しはしたものの、すべてを取り戻すには至らなかった。国際協働でのプロジェクト型学習(PBL)を継続的に実践した。従来に引き続き、海外学生が少数、日本側が多人数(100名程度)というパターンでの正課授業の中での実践、および、日本学生と海外学生各2-3名程度、計4-6名程度のグループによる協働調査・研究活動を実践した。これら実践の形成的な評価のためのルーブリックは、まずは、昨年度に作成したものを活動の中心となる学生達に提示し、協議の上、改訂した。内容面での大きな変更はなく、学生にとってよりわかりやすい、簡易な表現とするような修正が行われた。その上で、活動事後のみでなく、プロセスの中で形成的な評価を行いながら実践を進めていった。実践を進める中で、活動中の際には、綿密なふり返りよりもむしろ、簡易なものでも回数を増やしたほうがよいと思われたため、ルーブリックをさらに簡易なものへと改定した。実践の際には、グループによる活動記録(グループとしてのeポートフォリオ)も前年度同様に進め、さらに本年度は、活動から得られる知識・スキル面に着目したふり返りテストにも取り組んだ。

テストの内容は、学生たちの協働活動を観察・支援している教員が、協働活動を効果的に進めるための理論や、協議内容に関する前提知識等、タイムリーなものを取り上げた。これら実践時の学生の行動の観察、また、学生へのアンケート、インタビュー調査により、本取り組みに関する評価を行った。グループ活動に積極的な傾向にある学生は、ルーブリックにより、自身の活動のみならず、他者とともに行動することへの意識が高まることが示唆された。また、従来、あまり協働しない傾向にあった学生も、知識面での裏付け等から、積極性が増している様子が見られた。課題として、事後のふり返りをより深いものへとしていくことが見出され、グループeポートフォリオの新たな記録・活用を検討していくこととした。本研究は、多様な学生の特性をいかした協働活動の実践を目指して取り組んだものである。プロジェクト型学修で協働作業する際にソーシャルメディア上で行われる学生間のコミュニケーションの実態を把握するとともに、プロジェクトの遂行や学修の質向上につなげていくために必要な教員による支援・介入方法を明らかにした。特に、昨今注目されている協働型問題解決能力の育成につながる実効的な協働作業の実現に寄与するため、学生・教員双方で共有・確認すべきルーブリック、また、状況に応じた教員による適切に介入・支援のためのガイドラインを含む、協働作業のデザイン手法を提案し、実践例を示した。オンラインコミュニケーションの分析の結果得られた知見・仮説を踏まえて、オンライン協働作業を伴うプロジェクトのデザインを見なおし、実践を継続する。大学教育の質保証に向けて改めて注目されているルーブリックの動向も踏まえ、協働作業のためのコミュニケーションの要件を設定する。これら要件に従った評価を、教員だけでなく学生自身にも行わせ、そのフィードバックを得て要件自体の評価も行い、改定への見通しを立てる。学習のプロセスで生成される各種成果物(中間成果物・最終成果物)を、学生が活動の振り返りや次へのステップに活用していけるよう、実践の中で現実的に運用可能な蓄積・共有方法を追求する。これらの作業は、学習活動の一環として遂行するものもあるが、実験的な要素も含まれるため、それらの作業や評価用のデータ収集は、学生から実験協力者を募り依頼する。機関のルールにおいて作業場所が限定され、依頼する学生の作業時間確保が課題となるため、大学の滞在時間が長い低学年層へ依頼できるように、作業の切り分けを検討する。調査・研究自体は、予定に従って実施していく。アルバイト作業を依頼した学生の複数名から、継続的な協力が得られる見込みであるため、2年目のペースで遅れを取り戻すことで、計画した内容はすべて遂行できる予定である。ルーブリックの評価・検証では、新たな協力者を募る必要があるため、事務的作業が滞り、研究推進に影響することも懸念される。手続き的作業に慣れた学生の支援も得て、事務作業を滞りなく行い、研究計画に支障が出ないように留意する。
関節リウマチ患者における手および足X線画像全自動評価システムの開発

関節リウマチの手および足のX線画像において、煩雑なSharp/van der Heijde法にかわるコンピュータ自動解析法を考案し、100例においてベースラインと1年後のX線画像を検討した。医師によるSharp/van der Heijde法の読影結果とコンピュータ自動解析法の計測結果を比較した結果、コンピュータ自動解析法は医師と同等の診断精度を持ち、験者内/験者間の再現性も高いことが示された。本研究で開発したコンピュータ自動解析法が臨床において有用な知見を提供できる可能性が示唆された。関節リウマチ(RA)の診断は、X線画像・CT・MRI・エコーなどマルチモダリティの環境下に行われる。中でもX線画像は広く普及しており、情報を有効に利用することが出来れば利用価値が高い。手のX線画像自動評価用ソフトウエアは完全な自動化には至らなかったが、誤検出の手動補正を加えたほぼ実用段階のソフトウエアが完成した。DICOMヴューワーにおいて験者内ICCはerosion=0.68、JSN=0.71、験者間ICCはerosion=0.61、JSN=0.69、開発したソフトウエアにおいて験者内ICCはerosion=0.81、JSN=0.85、験者間ICCはerosion=0.80、JSN=0.89、であり開発したソフトウエアの方が再現性に優れていた。臨床使用に耐えうる手X線画像評価用ソフトウエアが完成し、従来DICOMヴューワーにおける計測よりも良好な精度が確認できた。同ソフトウエアのクラウド化も進行しており、今後の臨床利用に向けてシステム調整中である。本システムで利用するX線画像は容量が10MBであるが、3MBまで可逆に圧縮できることを確認しているので、通常の通信環境で問題なく運用することが出来る。次年度以降で、本班研究の分担研究である一般住民コホートを用いた疫学的検証、関節破壊が進行するRA患者の危険因子同定におけるX線学的検討での使用を検討中である。関節リウマチ(RA)の構造学的評価には、手および足の関節のX線画像にて、びらん(erosion)と関節裂隙狭小化のカテゴリカルな得点の総和を求めるmodified Total Sharp Score (mTSS)が利用されるが、同評価法はCeiling Effect、評価者内・評価者間のばらつきから点数が一定とならない、などの問題点を持つと共に、煩雑で日常診療で利用することが難しかった。本研究においては、erosionとJSNの評価を全自動化することで、日常診療に利用可能な簡易なRA患者の構造学的評価システムを開発を行う。昨年度には、複数のデジタルフィルタと統計学的なアルゴリズムにより、関節裂隙の最小距離と面積、骨軸のなす角度、Erosionの範囲は面積で各関節部位別に定量評価を行う「RA患者における手および足X線画像全自動評価システム」の開発を進めた。今年度は1,535例の一般住民の両手X線画像データベースを用いてRAの専門医による読影とソフトウエアによる検出を比較して検討を行った。1,535例の両手X線画像とリンクした臨床情報より、データベース内でRAの治療歴を有していたのは9例であった。この全てにおいて、いずれかの手指にRA専門医の判定するErosionを認めた。1,535例全画像でのRA専門医の読影結果は、左右PIP関節とも1.0-3.0%(14ー46指)にErosionを認め、MCP関節やその他の関節には明らかなErosionを認めなかった。これに対しソフトウエアでは、左右PIP関節とも3.1-6.6%(49ー101指)にErosionの判定で、MCP関節やその他の関節には明らかなErosionを検出しなかった。RA専門医の判定するErosionはソフトウエアで全て検出しており、3%程度が偽陽性と判定された。以上により臨床使用に耐えうる手X線画像評価用ソフトウエアが完成した。既存の同ソフトウエアのクラウド化も進行しており、今後の臨床利用に向けてシステム調整中である。次年度以降で、関節破壊が進行するRA患者の危険因子同定におけるX線学的検討での使用を検討中である。

本研究で開発したコンピュータ自動解析法が臨床において有用な知見を提供できる可能性が示唆された。1,535例の両手X線画像データベースを用いてRAの専門医による読影とソフトウエアによる検出を比較して検討を行い、ソフトウエアの良好な精度を確認し、臨床使用に耐えうる手X線画像評価用ソフトウエアが完成したため。また同ソフトウエアのクラウド化も進行しており、今後の臨床利用に向けてシステム調整中である。本システムで利用するX線画像は容量が10MBであるが、3MBまで可逆に圧縮できることを確認しているので、通常の通信環境で問題なく運用することが出来る。次年度以降で、関節破壊が進行するRA患者の危険因子同定におけるX線学的検討での使用を検討中である。関節リウマチ既に試験が終了したRAの治療効果を判定するRCTの評価に本システムを導入し、有用性に関する検証を行う。具体的なRCTは、MTXを8 mgの容量で使用してもDAS28が中等度(3.2)以上のRA患者に対して、MTXの増量か生物製剤への切り替え(各25例、計50例)を行い、ベースラインと1年後の臨床情報(Rheumatoidfactor、MMP3、CRP、DAS28、ESR、HAQ、ACR/EULAR改善率)と「RA患者における手および足X線画像全自動評価システム」を適用した画像評価定量評価値、同システムによる自動判定したmTTS、医師が従来の方法で判定したmTTSをアウトカムとした評価を行う。CTによるErosionの描出における空間分解能が優れていることに疑いの余地はないが、被爆の問題などから汎用することは出来ない。本研究においては手足X線画像(100例)、これと対応したCT画像(100例)が蓄積したデータベースの構築が終了し、CT画像をもとに医師によるErosionの部位の読影が進行中である。患者個人情報を棄却して、対象となる画像を匿名化してクラウド上で解析を行うアプリケーションをDLL(Dynamic Link Library:汎用性の高いプログラムを部品化してファイルとして保存しておき、必要に応じてメモリに呼び出して利用する)化して、本システムのモジュールに組み込む予定であるが、こちらに関してもプログラムの準備が進んでいる。X線画像データベースを用いてRAの専門医による読影とソフトウエアによる検出を比較して検討を行う作業が、スムーズに進行し、良好な結果が得られた。この結果予定より早く臨床使用に耐えうる手X線画像評価用ソフトウエアが完成したため。完成したシステムを適用し、上述した如くのデータ解析を行うことにより、mTTSの自動化が可能となるとともに、新たな判定基準としてJSNおよびErosion関連の定量値が出力されるが、実臨床において、mTTSと新たな判定基準のどちらが有用であるかの結論を出すことは出来ない。このため、RAの治療効果を判定するRCT(Randomized Controlled Trial)に本システムを導入し、有用性に関する検証を行う。上述した如く、クラウド化したシステムを適用する。
変形性顎関節症における COX-2 誘導性軟骨破壊機序の解明と消炎鎮痛薬治療の確立

ブタ下顎頭由来培養軟骨細胞に10%機械的伸張刺激を負荷した結果、COX-2, MMP-1,3,9遺伝子発現は有意に増加し、COX-2選択的阻害剤(セレコキシブ)の添加により有意に抑制されることが明らかとなった。その一方、機械的伸長刺激によって減少したII型コラーゲンおよびアグリカンは、セレコキシブの添加により回復したが、インドメタシンおよびアンフェナックナトリウム添加により有意な変化は認められなかった。したがって、セレコキシブは機械的負荷による軟骨破壊を抑制するだけでなく、軟骨基質産生を亢進することが明らかとなった。平成24年度では、平成23年度に引き続きブタ下顎頭由来培養軟骨細胞に対する機械的伸長刺激によるCOX-2の誘導および軟骨基質代謝に対するCOX-2選択的阻害剤(セレコキシブ)およびNSAIDs(インドメタシン、アンフェナックナトリウム)の影響について比較検討を行った。機械的伸張刺激により増加したMMP-1,3遺伝子発現はセレコキシブ添加により有意に抑制されることが明らかとなった。また、インドメタシンおよびアンフェナックナトリウム添加は、機械的伸長刺激によって増加したMMP-1,3遺伝子発現を有意に抑制することが示された。さらに、in vivo実験系では、6週齢Wistar系雄性ラットを用い、一日一時間30mmの強制開口を20日間行い、TMJ-OAモデルを作製した。実験群では、10日間負荷を加えた後、セレコキシブ,インドメタシン、アンフェナックナトリウムを10日間1日2回経口投与し、非投与群および無処置群と比較検討を行なった。20日間の実験終了後、ラット頭部を摘出し、顎関節矢状面の組織切片を作製し、免疫組織化学染色を行ったところ、セレコキシブ、インドメタシン、アンフェナックナトリウム経口投与群では、COX-2およびMMP-1, 3の発現が減少していることが明らかになった。今年度は、まず第一に剪断応力が下顎頭軟骨に及ぼす影響についてCOX-2およびIL-1βの発現を組織学的および遺伝子学的に検討を行った。今回、我々はブタの頭部全体を振り子型摩擦試験機に固定し、さらにモーターを接続して持続的に剪断力を負荷できるように装置を改良した。14kgの荷重下で16時間負荷をかけたところ、繊維層と軟骨層の間にIL-1βの発現の亢進が認められた。さらに、軟骨層においてCOX-2の発現亢進が認められた。次に、負荷後に下顎頭軟骨層より軟骨細胞を抽出し、COX-2の遺伝子発現について検討したところ、コントロール群と比較して有意に増加していることが明らかとなった。次に、軟骨基質代謝に対する機械的伸張刺激の影響について明らかにするために、ブタ下顎頭軟骨層より軟骨細胞を採取し、培養細胞伸展機を用いて10%機械的伸張刺激を負荷し、COX-2、MMP、PGE2発現について検討した。その結果、負荷開始1時間よりCOX-2遺伝子発現は有意に増加し、負荷開始6時間経過後もコントロール群と比較して有意に高い値を示した。MMP-1,3,9の遺伝子発現は、いずれも負荷開始6時間後に有意に増加を認めた。培養上清中のPGE2レベルは非負荷群と比較して高い値を示したものの、有意差は認めなかった。さらに、下顎頭由来培養軟骨細胞に対する機械的伸張刺激によるCOX-2の誘導および軟骨基質代謝に対するCOX-2選択的阻害剤(セレコキシブ)の影響について検討を行った。その一方、MMPー13遺伝子発現は、セレコキシブ添加により有意に増加し、他のMMPと異なる反応を示すことが明らかとなった。当初の計画では、我々の研究グループにおいて行われた過去の研究と同様の実験条件で、機械的伸張刺激を負荷する予定で計画を進めていたが、初代軟骨細胞は接着が弱く、早期にプレートから剥離することが続いた。そこで、今回我々は、機械的伸張刺激を負荷する条件を再度検討したため、当初の計画よりやや遅れてしまった。さらに、組織学的検討においては、ブタの頭部を振り子型摩擦試験機に装着し、モーターを使用した自動振り子型摩擦試験機を考案することができたが、そのことに時間を要することになった。組織学的実験では、自動振り子型摩擦試験機を使用し、せん断応力を長時間かけた際の軟骨細胞層における炎症性サイトカインの遺伝子発現について検討するとともに、組織学的検討につぃては個体数を増やして検討を続ける。

in vitro実験系では、下顎頭由来培養軟骨細胞に対する機械的伸張刺激によるCOX-2の誘導および軟骨基質代謝に対するCOX-2選択的阻害剤(セレコキシブ)およびNSAIDs(インドメタシン、アンフェナックナトリウム)の影響について検討する。セレコキシブ添加によるMMP遺伝子発現に対する影響についてはすでに明らかになったので、今後は基質産生に対する影響についても検討を行う。さらに、in vivo実験系では、6週齢Wistar系雄性ラットを用い、一日一時間30mmの強制開口を20日間行い、TMJ-OAモデルを作製する。実験群では、10日間負荷を加えた後、セレコキシブ(0.13mg/kg) ,インドメタシン(0.011 mg/kg ),アンフェナックナトリウム(0.011 mg/kg)を10日間1日2回経口投与し、非投与群および無処置群と比較検討を行う。20日間の実験終了後、ラット頭部を摘出し、顎関節矢状面の組織切片を作製し、H-E染色およびトルイジンブルー染色を行い、病理組織学的変化を観察する。さらに、COX-2およびMMPs (MMP-1, 3, 9, 13)の発現について免疫組織化学染色により検討行う。次年度の研究においては、現有機器を用いる。研究費は、Western blot法およびreal time PCR法を行うための消耗品に使用する予定である。さらに、培養細胞伸展機には専用プレートが必要なため、購入する予定である。また、本年度は動物実験を行う計画であるため、実験動物や飼料の購入も考えている。さらに、英語論文発表の際の投稿料や、学会発表に研究費を使用する予定である。