hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｔｈ１７細胞分化を負に制御するＬＩＭ蛋白ファミリーの役割の解明

本申請研究において、われわれは、LIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4が、Th17細胞分化に必須の転写因子であるSTAT3に結合するとともに、LIMドメインを介して蛋白脱リン酸化酵素であるPTPBLをリクルートしてSTAT3を脱リン酸化することによりTh17細胞分化を負に制御することを明らかにした。さらに、ヒトのPDLIM4のLIMドメイン内の一塩基多型が、関節リウマチの疾患感受性に関与することも明らかにした。以上より、PDLIM4はTh17細胞分化を負に制御することにより自己免疫疾患の発症を防いでおり、PDLIM4の機能異常が自己免疫疾患の原因になりうるということが示唆された。ヘルパーT細胞(Th)は生体に侵入した病原体の種類に応じてTh1、Th2、Th17と呼ばれる異なった機能を持つT細胞サブセットに分化する。転写因子STAT3は、Th17細胞の分化のマスター遺伝子として、ナイーブT細胞からTh17細胞への分化を誘導する。しかしながら、STAT3によるTh17細胞の分化を負に制御する分子メカニズムは、未だ十分には解明されていない。申請者は、これまでの研究により、LIM蛋白ファミリーに属する核内ユビキチンリガーゼであるPDLIM2 (PDZ and LIM domain protein-2)が、LIMドメインを介してSTAT分子のユビキチン化・分解を誘導することにより、STAT4によるTh1細胞分化、および、STAT3によるTh17分化を負に調節することを明らかにした。本申請研究においては、昨年度までの研究で、同じくLIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4がSTAT3を介するシグナル伝達を負に制御することを見出した。PDLIM4は核内ではなく細胞質に存在しており、興味深いことに、蛋白脱リン酸化酵素であるPTP-BLをリクルートして、STATの活性化に必須のチロシン残基を脱リン酸化することによりSTATを不活性化した。また、PDLIM4欠損マウス由来のT細胞においては、Th17細胞分化が亢進しており、STAT3のチロシンリン酸化も増強していた。さらに本年度は、PDLIM4遺伝子のLIMドメイン内の一塩基多型が、ヒトの関節リウマチの疾患感受性に関係することを明らかにした。この変異を導入したPDLIM4は、PTPBLとの結合が低下するために、STAT3を脱リン酸化・抑制する活性が傷害されていた。以上の結果はPDLIM4の異常が自己免疫疾患の原因となりうることを示唆しており、本研究成果は自己免疫疾患の新たな治療法の開発につながることが期待できる。Th17細胞は、最近新しく発見されたヘルパーT細胞の亜集団であるが、このTh17細胞の過剰な活性化が自己免疫疾患の発症および増悪化に関与することが示唆されている。よって、Th17の活性化は厳密に制御される必要がある。しかしながら、Th17の活性化を負に調節する分子機構はこれまでのところほとんど解明されていない。申請者は、これまでの研究により、LIM蛋白ファミリーに属する核内ユビキチンリガーゼPDLIM2 (PDZ and LIM domain protein-2)が、LIMドメインを介してSTAT3分子のユビキチン化・分解を誘導することにより、STAT3によるTh17分化を負に調節することを明らかにした。また、昨年度までの研究で、同じくLIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4が、脱リン酸化酵素であるPTP-BLをリクルートして、STATの活性化に必須のチロシン残基を脱リン酸化することによりSTAT3を介するシグナル伝達を負に制御することを見出した。さらに、PDLIM4遺伝子のLIMドメイン内の一塩基多型が、ヒトの関節リウマチの疾患感受性に関係することも明らかにした。本年度は、同じくLIM蛋白に属するPDLIM1とPDLIM7がSTAT3の活性を負に制御することを明らかにした。PDLIM7はPDLIM2と同じく核に局在しており、ユビキチンリガーゼ活性を有していた。またPDLIM7はPDLIM2と結合したことから、PDLIM7がPDLIM2とヘテロダイマーを形成して相乗的にユビキチンリガーゼとして働くことが示唆された。一方、PDLIM1は細胞質内に存在し、ユビキチンリガーゼ活性を有しておらず、PDZドメインを介してアクチン結合蛋白であるα-actininと結合して、転写因子を細胞質内に留めて核への移行を阻害することによりシグナル伝達を負に制御することが明らかになった。転写因子STAT3は、それぞれTh17細胞の分化のマスター遺伝子として、ナイーブT細胞からTh17細胞への分化を誘導する。

申請者は、これまでの研究により、LIM蛋白ファミリーに属する核内ユビキチンリガーゼであるPDLIM2 (PDZ and LIM domain protein-2)が、LIMドメインを介してSTAT分子のユビキチン化・分解を誘導することにより、STAT4によるTh1細胞分化、および、STAT3によるTh17分化を負に調節することを明らかにした。さらに申請者は、同じくLIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4がSTAT3を介するシグナル伝達を負に制御することを見出した。ところが、PDLIM4はユビキチンリガーゼ活性を有しておらず、実際PDLIM4はSTATをユビキチン化しなかった。さらに、PDLIM4は核内ではなく細胞質に存在しており、興味深いことに、蛋白脱リン酸化酵素であるPTP-BLをリクルートして、STATの活性化に必須のチロシン残基を脱リン酸化することによりSTATを不活性化した。また、PDLIM4欠損マウス由来のT細胞においては、Th17細胞分化が亢進しており、STAT3のチロシンリン酸化も増強していた。以上より、PDLIM2やPDLIM4などのLIM蛋白は、アダプター分子としてそれぞれ異なった細胞内因子と結合することにより、それぞれ異なったメカニズムでSTAT3シグナルおよびTh17細胞分化を負に制御している可能性が示唆された。Th17細胞は最近新しく発見されたヘルパーT細胞の亜集団であるが、このTh17細胞の過剰な活性化が自己免疫疾患の発症および増悪に関与することが示唆されている。よって、Th17の活性化は厳密に制御される必要がある。これまでに、転写因子STAT3がTTh17細胞分化の誘導に必須であることが明らかになっている。しかしながら、Th17の活性化を負に調節する分子メカニズムはこれまでのところほとんど解明されていない。PDLIM2は、LIM蛋白ファミリーに属する核内蛋白であり、N末端部にPDZドメインを、C末端部にLIMドメインを有する。申請者は、これまでの研究により、PDLIM2がLIMドメインを介してSTAT3分子をユビキチン化しプロテアソーム依存性に分解することにより、STAT3によるTh17細胞分化を負に制御することを明らかにした。本研究においては、同じくLIM蛋白ファミリーに属するPDLIM4が、細胞質において、蛋白脱リン酸化酵素であるPTP-BLをリクルートし、STATの活性化に必須のチロシン残基を脱リン酸化してSTAT4、STAT6およびSTAT3を不活性化することによりTh1, Th2, Th17細胞分化を負に制御することを明らかにした。また、PDLIM
グリア主導で神経回路活動は改変できるか？ー三つ組みシナプス仮説の実証ー

アストロサイトは三つ組みシナプスを構成して神経伝達に関わるが、アストロサイトを人為制御することで神経伝達を変化させるか否かについては未だ不明である。本研究では淡蒼球アストロサイトをモデルとしてこの現象を検討した。まず自発運動を付加したマウスではアストロサイトの微細突起の複雑性が増すこと、及びOlig2を発現するアストロサイトOlig2-ASとGFAPを発現するGFAP-ASの2種類があり相互排他的であることを見出した。これらのアストロサイトにDREADD法を用いて活性化した際に運動の変化(神経伝達の変化)が検出できたので、現在それぞれのアストロサイトに特異的な現象か否かを検証している。本年度は淡蒼球における三つ組みシナプスの存在を形態学的に示すために、Olig2-CreERマウスとROSAーFlox-GAP43-EGFPマウスを交配させたダブルトランスジェニックマウス(以下ダブルTGマウス)に運動負荷を与える実験を行った。具体的にはダブルTGマウスを3群に分けて、コントロール群は固定して回らないランニングホイールを入れたケージ、ランナー群では回転可能なランニングホイールの入ったケージ、ランナー休息群も同様のケージに入れて3週間飼った。前2群はこの3週目で灌流固定し、淡蒼球におけるGFP免疫組織化学染色を行った。ランナー休息群はさらに3週間今度は固定したランニングホイールの入ったケージで飼育し、その後灌流固定し免疫染色に供した。それぞれの群のGFP陽性アストロサイトの形態をまずレーザー共焦点顕微鏡で比較検討し、顕微鏡画像上の蛍光量をNIHImageソフトで定量し3群を比較した。ランナー群ではコントロールに比して有意に蛍光量が増大しており、またランナー休息群では減少傾向を認めた。さらにこれら3群のGFP陽性細胞の微細構造を電子顕微鏡で観察し、電子顕微鏡画像におけるGFP免疫陽性構造をNIHImageソフトで定量評価した。レーザー共焦点顕微鏡の結果と良く一致して、コントロール群に比してランナー群では単位面積あたりのGFP陽性の突起断片数が有意に増加しており、ランナー休息群ではコントロールと同じレベルにまで減少していた。いずれの群もGFP陽性構造の面積は有意差は無かった。これらの結果はランニングという運動負荷に応じてアストロサイトが形態を複雑化させていること、また一度複雑化した構造も、運動負荷が無くなると再び単純な構造に復することを示唆している。これは神経活動とアストロサイトの形態変化が強調している、すなわち三つ組みシナプスの存在を強く示唆するものと考えられた。当初の研究計画どおりに実験系は進んでいると考える。ただアストロサイト特異的な毒であるFluorocitrateを投与する実験は行ったが、有意な形態変化などが観察されなかった。この理由としてFluorocitrateの有効容量がかなり狭い可能性があり、次年度への課題と考えた。昨年度までの結果で運動負荷が淡蒼球におけるOlig2アストロサイトの形態変化、特に微細突起の複雑性を増す方向に形態変化を起こさせることを示した。これは三つ組みシナプスの形態的な可塑性を示すデータとして論文として報告した(Tatsumi et al. Frontier Cell. Neruosci.2016,文献リスト参照)。当初の目的ではこのOlig2アストロサイトにジフテリアトキシンを発現させることで細胞死を誘導し、その影響を見るということであったが、予備的検討でアストロサイトに細胞死を誘導すると脳血液関門の破綻による組織破壊が著明に起こることで、三つ組みシナプスの有無を検定することは実際上不可能であることが判明した。よってOlig2アストロサイトに光感受性チャネルであるチャネロドプシン、ハロロドプシンを発現させて、レーザー光を用いてそれらチャネルを活性化或いは抑制化することでシナプス伝達(運動機能)に変化が現れるか否かを検討する事にした。具体的にはOlig2-CreERマウスの淡蒼球或いは黒質網様部にアデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれたFloxーStopチャネロドプシン、或いはハロロドプシンを微量注入し、次に同部位に青色レーザー光(チャネロドプシン)、黄色レーザー光(ハロロドプシン)を光ファイバーを用いて導入する実験を試みた。この実験の予備検討としてアデノ随伴ウイルスベクターにFlox-EGFPを組み込んだ試験ベクターを注入してOlig2アストロサイトにEGFPが効率よく発現するかどうかを検討したところ、想定したよりかなり少数のアストロサイトにしかEGFPが発現せず、また発現量(蛍光量)も少ないという事実が判明した。よって現在ウイルスベクターのタイターを上げる、或いはOlig2-CreERマウスではなく、GFAP-Creマウスを用いるなどの手法を検討している。当初のOlig2アストロサイトを特異的にジフテリアトキシンで破壊するという実験は脳構造の大幅な改変につながるということで、よりマイルド且つ特異的なアストロサイトの機能改変を目指して光遺伝学的手法(光感受性チャネル分子であるチャネロドプシン、ハロロドプシンの導入)を用いて主に予備的検討を本年度は行った。手法の変換はあったが、最終的な目的である三つ組みシナプスの機能改変に向けて有用な系の構築が出来ていると考える。これまでの研究でOlig2アストロサイト(Olig2-AS)とGFAPアストロサイト(GFAP-AS)の分布局在が異なることが分かってきたので、本年度は脳内各部位における両者の分布を詳細に比較検討した。Olig2-ASは主に基底核回路、視床、橋、延髄に分布し、GFAPのそれとは明らかに分布パターンが異なっていた。またOlig2-ASはグリア型GABAトランスポーターであるGAT-3や小胞型GABAトランスポーターであるVGATの分布と酷似していた。

Olig2-ASの全般的な機能抑制を行うために、Olig2-AS特異的にM3Dq遺伝子を発現させた。この蛋白は人工的なリガンドであるCNOを投与するとGq蛋白を介して細胞機能抑制がかかるものである。CNO投与時と非投与時での主にマウスの四肢の動きをモニターする目的で透明なシリンダーに一定時間入れて前肢の動きをビデオ解析した。また運動評価としてグリッド上を歩行させてどれくらい足を踏み外すかの評価も行った。結果としてはCNO投与時に明らかに片側前肢の動きが正常よりも抑制されていることが明らかとなった。本研究の開始時にはOlig2ーASの人為的機能操作を光感受性チャネルであるチャネロドプシンやハロロドプシンで行うことを計画していたが、実際に計画を遂行する過程で光遺伝子操作よりもより長期に細胞機能の人為操作を行うことができるDREADD法がより目的に合致していることが分かって、特に本年度はその方法を採用して一定の成果が得られている。さらに本年度の分布解析から、Olig2ーASはGABA作動性の伝達を特異的に調節している可能性があるので、今後の計画としてOlig2ーAS特異的にGAT-3のノックダウンを行う系を確立し、機能解析を行う予定である。アストロサイトは三つ組みシナプスを構成して神経伝達に関わるが、アストロサイトを人為制御することで神経伝達を変化させるか否かについては未だ不明である。本研究では淡蒼球アストロサイトをモデルとしてこの現象を検討した。まず自発運動を付加したマウスではアストロサイトの微細突起の複雑性が増すこと、及びOlig2を発現するアストロサイトOlig2-ASとGFAPを発現するGFAP-ASの2種類があり相互排他的であることを見出した。これらのアストロサイトにDREADD法を用いて活性化した際に運動の変化(神経伝達の変化)が検出できたので、現在それぞれのアストロサイトに特異的な現象か否かを検証している。Fluorocitrateの容量が問題となるので、今後の研究においてはOlig2陽性アストロサイトにウイルスベクターを用いてジフテリア毒素を発現させる系を立ち上げて、この毒素実験に変わる物にしていきたい。現在このジフテリア毒素の発現実験を行っているところである。Olig2アストロサイトにウイルスベクターの導入が効率的に入らないという現象にぶつかっているのでこれをブレークスルーするために1)GFAP-Creマウスを用いる、2)ウイルスベクターの種類を変更する、3)ウイルスベクターのタイターを上昇させるという3種類の方策を同時に現在試行している。これとは別に光遺伝学的手法に加えて、Olig2アストロサイト或いはGFAPアストロサイトにDREADDを導入して薬剤刺激でアストロサイトの機能改変を行う実験も同時並行で行っていくことで多角的に三つ組みシナプスの機能改変に取り組んでいく予定である。
起源が異なる２つの間葉系幹細胞の細胞生物学的特徴の解析と疾患モデル治療

私たちは、これまでにヒトiPS細胞から由来が異なる2つの間葉系幹細胞(MSC)、神経上皮(神経堤)細胞と中胚葉細胞の由来、を分化誘導することに成功している。2018年度はこのMSCを使い以下の項目の研究を行い、下記のような結果を得た。1.脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞への分化能力を調べ、多分化能を確認する。由来が異なる2つの間葉系幹細胞(MSC)を脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞へ誘導し、それぞれの細胞系列特異的なマーカーの発現を確認した。また特殊染色を行い、これらの細胞へ分化していることを確認し、多能性を有することを証明した。2. 2つのMSCにて、間葉系幹細胞で発現する分子、PDGFR, CD90, CD73, CD105が発現していることをFACS等を用いて確認した。3.コロニーアッセイ法(CFU-F)を行い、自己複製能力があることを確認した。4.網羅的な遺伝子発現プロファイルをDNAアレイを用いて作成し、クラスター解析、PCA解析を行った。その結果、iPS細胞から誘導した中胚葉細胞の由来MSCは、神経上皮(神経堤)細胞由来のMSCに比べて、骨髄由来のMSCと近い関係にあることが明らかとなった。5. 2つの間葉系幹細胞で異なる遺伝子群のリストを作成し、分泌因子のいくつかで異なる発現が見られることが明らかとなった。さらに、2つのMSCを褥瘡モデルマウスへ移植し、その治療効果を解析した。その結果、移植群が無移植群に比べて治癒スピードが速かった。以上から、皮膚潰瘍に対して治療効果があることが判明した。計画通り、非常に順調に進行している。2019年度は、膝関節の前十字靭帯を切断することによって正常マウスに変形性関節症のモデルを作成することができる。このモデルマウスの関節内へ2種類の間葉系幹細胞を注入しその治療効果を解析する。細胞はすでに効果が認められているヒアルロン酸に混ぜて投与する。投与後2週間目の関節の組織切片を作成し、HE染色による通常の組織解析を行うと伴に、軟骨を染める特殊染色を行い関節軟骨の修復の程度を解析する。
変異型FGFR3で発症する致死型軟骨無形成症の病理組織学的メカニズム

四肢短縮型小人症の一つである致死型軟骨無形成症(TD:thanatophoric dysplasia)の発症原因は変異型線維芽細胞増殖因子受容体III型(FGFR3)で誘導される骨・軟骨異常に起因することが知られている。これまでに、我々は軟骨細胞の分化段階に対するFGFR3の作用機序を副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHrP)との比較で検討を行うと共に、ヒトTDサンプルの組織病理解析を行ってきた。しかし、これらは全て胎生期におけるFGFR3シグナルが軟骨・骨に及ぼす影響を検討したものであり、成人(成獣)を念頭に置いた解析が必要と考えた。そこで、我々はアメリカ・ワシントン大学・David Ornitz博士とカナダ・マッギル大学・Janet Henderson博士の協力を得て、成獣のFGFR3遺伝子欠損マウスの試料を関節軟骨および骨組織の異常を解析した。成獣期(生後4ヶ月)FGFR3遺伝子欠損マウスでは、関節軟骨における軟骨細胞の肥大化が若干亢進し、また、野生型マウスと比較すると骨量がやや増加するものの、骨基質の石灰化は低下傾向を示した。このことは、FGFR3シグナルの欠乏は、成獣期においても胎生期同様に軟骨細胞の肥大化への分化亢進、さらには骨芽細胞の増殖を促進するが、一方で、その成熟化を抑制するために骨基質石灰化が低下する可能性が推測された。さらに、FGFR3欠損状態では無秩序に増大した肥大化軟骨細胞の石灰化誘導が長軸方向に行われないため、軟骨内骨化部位における血管内皮細胞の軟骨侵入も抑制されていた。このように、FGFR3シグナルはヒト・マウス間、また、胎生期・成獣期ともに同じ作用を示すことが確認された。現在、本年度の成獣FGFR3マウスの所見結果をさらに発展させ、学会発表・論文化を進めている。致死型軟骨無形成症(thanatophoric dysplasia : TD)は線維芽細胞増殖因子受容体III型(FGFR3)遺伝子の突然変異に起因し、FGFR3^<R248C>およびFGFR3^<K650E>はそれぞれTDI型、TDII型を発症させることが知られている。本年度の研究ではヒトTDI,TDII胎児の脛骨の組織切片を検討すると共に、TDI,TDIIを発症させるFGFR3^<R248C>,FGFR3^<K650E>を培養軟骨細胞(CFK2)に遺伝子導入し、それら細胞の細胞形態の変化とアポトーシス、さらにはVEGF(血管内皮増殖因子)の発現について検討した。ヒトTDII脛骨の組織切片を検討すると、骨・軟骨の境界構造が陥凹状を示しており、肥大化細胞層も不均一な構造を示していることがわかった。その原因として、TDIIでは骨組織からの血管侵入が局所的に亢進していることも明らかにされた。免疫組織化学では、TDIIにおけるVEGFの発現が亢進していたことから、VEGF発現促進により血管内皮細胞の過剰な軟骨侵入が誘導されることが推察された。さらに、肥大化層の軟骨細胞はアポトーシスに陥っていることも明らかとなった。そこで、FGFR3^<K644E>cDNA(ヒトのFGFR3^<K650E>に相当)を培養軟骨細胞であるCFK2細胞にtransfectionすると、VEGFの発現亢進を示した。また、そればかりではなく、CFK2は細胞萎縮を示すとともに、ストレスファイバーの消失、およびTUNEL陽性反応を呈した。ところが、同じ変異型FGFR3cDNAをtransfectionされたChinese hamster Ovary (CHO)細胞は細胞萎縮およびTUNEL陽性を示さなかった。以上より、変異型FGFR3(FGFR3^<K644E>)は軟骨細胞のVEGFの発現を亢進させるばかりでなく、軟骨細胞特異的にアポトーシスを誘導すると推察された。四肢短縮型小人症に属する軟骨無形成症の一つである致死型軟骨無形成症(thanatophoric dysplasia : TD)は繊維芽細胞増殖因子受容体III型(FGFR3)遺伝子の突然変異に起因し、FGFR3^<R248C>およびFGFR3^<K650E>はそれぞれTD I型、TD II型を発症させることが知られているが、この症例の骨・軟骨の病理組織異常については、それほど解析がすすんでいない。本年度の研究では、カナダ、McGill大学との共同研究で得られたTD I型、TD II型を示すヒト胎児の大腿骨・脛骨試料を病理組織学的に解析することで、TDにおける軟骨内骨化の異常、特に血管侵入と軟骨細胞のアポトーシスについて解明した。正常の胎児試料における明瞭な骨・軟骨の境界構造及び軟骨の石灰化と血管侵入を可能にする肥大化細胞層が均一な層を形成することに対して、致死型軟骨無形成症(TD II)では、骨・軟骨の境界構造が陥凹状を示しており、肥大化細胞層も不均一な構造を示していることが分かった。その大きな原因として、TD IIでは骨組織からの血管侵入が局所的に亢進していることが推察された。また、TD IIの組織切片ではVEGFの発現が上昇していることから、VEGF受容体を有している血管内皮細胞の軟骨侵入が亢進されることが強く示唆された。さらに、肥大化層の軟骨細胞の多くがアポトーシスに陥っていることも明らかとなった。このような変異型FGFR3シグナルはJAK/stat3を介して軟骨細胞のVEGF発現を上昇させることを見出した。以上より、FGFR3^<K650E

>で誘導される致死型軟骨無形成症は、軟骨細胞の増殖抑制と骨組織からの血管侵入亢進の両方で軟骨組織の低形成を招くことが考えられる(論文作成中)。四肢短縮型小人症の一つである致死型軟骨無形成症(TD:thanatophoric dysplasia)の発症原因は変異型線維芽細胞増殖因子受容体III型(FGFR3)で誘導される骨・軟骨異常に起因することが知られている。これまでに、我々は軟骨細胞の分化段階に対するFGFR3の作用機序を副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHrP)との比較で検討を行うと共に、ヒトTDサンプルの組織病理解析を行ってきた。しかし、これらは全て胎生期におけるFGFR3シグナルが軟骨・骨に及ぼす影響を検討したものであり、成人(成獣)を念頭に置いた解析が必要と考えた。そこで、我々はアメリカ・ワシントン大学・David Ornitz博士とカナダ・マッギル大学・Janet Henderson博士の協力を得て、成獣のFGFR3遺伝子欠損マウスの試料を関節軟骨および骨組織の異常を解析した。成獣期(生後4ヶ月)FGFR3遺伝子欠損マウスでは、関節軟骨における軟骨細胞の肥大化が若干亢進し、また、野生型マウスと比較すると骨量がやや増加するものの、骨基質の石灰化は低下傾向を示した。このことは、FGFR3シグナルの欠乏は、成獣期においても胎生期同様に軟骨細胞の肥大化への分化亢進、さらには骨芽細胞の増殖を促進するが、一方で、その成熟化を抑制するために骨基質石灰化が低下する可能性が推測された。さらに、FGFR3欠損状態では無秩序に増大した肥大化軟骨細胞の石灰化誘導が長軸方向に行われないため、軟骨内骨化部位における血管内皮細胞の軟骨侵入も抑制されていた。このように、FGFR3シグナルはヒト・マウス間、また、胎生期・成獣期ともに同じ作用を示すことが確認された。現在、本年度の成獣FGFR3マウスの所見結果をさらに発展させ、学会発表・論文化を進めている。
TGF-beta阻害戦略によるサルコペニアの病態治療研究

健康寿命を短縮する加齢性筋萎縮(サルコペニア)に対する治療法の開発は、超高齢化社会を迎えたわが国の課題である。われわれは、老化モデルKlothoマウスの骨格筋において、筋量を減少させるマイオスタチン/TGF-βの活性が亢進していることを明らかとした。また、その阻害化合物の投与によって、筋萎縮は改善して寿命が延長した。さらに、Klotho蛋白質自体に、広範なTGF-β阻害作用があることを発見した(未発表)。本研究は、交配によってマイオスタチン活性を阻害したKlothoマウスを作出して、骨格筋の網羅的遺伝子発現解析からマイオスタチン/TGF-βを起点とするサルコペニアの分子機構の解明を目指す。Klothoマウスと同様に骨格筋のマイオスタチン/TGF-β活性亢進が認められた超高齢野生型マウスに対して、阻害医薬Klotho-Fcを投与して、サルコペニアへの治療介入の突破口を開くことを目標とする。平成29年度は、老化モデルKlothoマウスに、マイオスタチン活性阻害マウスを交配しマイオスタチン活性阻害老化モデルKlothoマウスを作出した。このマウスは、Klothoマウスより寿命が延長し、骨格筋では萎縮は改善しマイオスタチンシグナルが抑制されていた。Klothoのサルコペニア抑制効果が明らかとなった。現在、Klotho-Fcリコンビナント蛋白質の大量精製に取り組んでいる。ヒト腎芽細胞HEK293にKlothoの細胞外ドメインの3'末端側にヒトIgG1-Fcを繋いだプラスミドをトランスフェクションし一過性大量発現に成功した。現在、安定発現細胞株Klotho-Fc安定発現細胞株の作成とリコンビナント蛋白質の精製に取り組んでいる。平成30年度以降は、骨格筋遺伝子発現を網羅的に解析する。マイオスタチン阻害による発現変動遺伝子を、筋芽細胞にレトロウイルスベクター導入し筋管分化効果をin vitro解析、蛇毒障害前脛骨筋にプラスミド導入し筋肥大効果をin vivo解析し、マイオスタチン/TGF-βによるサルコペニア発症の分子病態を解明する。並行して、Klotho-Fc蛋白質を超高齢野生型マウスへ全身投与し、マイオスタチン阻害戦略によるサルコペニアの改善、寿命短縮の改善についての非臨床POCを取得する。平成29年度、マイオスタチン活性阻害マウスと老化モデルKlothoマウスの交配によるマイオスタチン活性阻害老化モデルKlothoマウスの作出が予想より加速し実現した。そのため当初は老化モデルKlothoマウス購入および系統維持に予定していた経費が、平成29年度使用額残高となった。これを、平成30年度に骨格筋遺伝子発現の網羅的解析(チップ)に使用する計画としている。
Osteoactivinの機能解析と肝発癌過程における役割に関する研究

肝細胞癌の多くは肝硬変を背景に発生し、その発癌にはウイルスのみならず長期持続する炎症と再生、線維化といった因子が関与している。コリン欠乏アミノ酸置換食(CDAA)食によるラット肝癌モデルは、肝硬変を背景に発生するヒト肝細胞癌に類似したモデルである。我々は、CDAA食飼育ラット肝における増殖因子発現、細胞増殖およびアポトーシスの経時的変化を検討した。肝細胞増殖因子はCDAA食早期に発現誘導されるのに対して、TGF-αは中期から後期にかけて誘導された。また肝細胞増殖抑制因子であるTGF-βは早期から持続的な発現誘導が認められた。一方、細胞増殖は持続的に亢進していたが、アポトーシス細胞は8週目まで増加するものの以後減少した。これらの結果からCDAA食開始早期(8週)に発癌に関わる重要な因子が関与していることが示唆された。そこで、次に、CDAA食開始早期の肝組織で発現亢進している遺伝子群をsuppression subtractive hybridization法を用いて単離し、これらの遺伝子群に含まれていた未だ機能が明らかでないosteoactivin遺伝子の解析を行った。Osteoactivinは、正常肝での発現は痕跡程度であったが、CDAA食開始1週間目から発現増強し中等度の発現が持続していた。種々のヒト肝癌細胞株における発現を検討したところ、検討した6種の肝癌細胞株全てにおいてosteoactivinの発現が認められた。また、ヒト肝癌の摘出組織を用いて癌部・非癌部のosteoactivin発現を検討したところ、66.7%の肝癌組織で非癌部組織よりも高いosteoactivin発現が認められ、特に高分化型肝癌において有意に発現増強していた。一方、osteoactivinの機能解析のためにsense-およびantisense-osteoactivin発現ベクターを肝癌細胞株に導入した。osteoactivin強発現は細胞増殖に影響を与えなかったが浸潤能を亢進させ、ヌードマウスに脾注するとその肝転移を促進した。一方、osteoactivin発現を抑制すると浸潤・転移は阻害された。以上の結果から、osteoactivin遺伝子は慢性肝炎から肝硬変に至る過程で発現し、肝発癌に関わり微小環境で重要な役割を果たしている可能性が推測された。我々は、CDAA食開始早期の肝組織で発現冗進している遺伝子群をsuppression subtractive hybridization法を用いて単離し、これらの遺伝子群に含まれていた未だ機能が明らかでないosteoactivin遺伝子の解析を行った。Osteoactivin mRNA発現をCDAA食飼育ラットの肝組織を用いて検討したところ、正常肝での発現は痕跡程度であったが、CDAA食開始1週間目から発現増強し34ヶ月でピークとなり、以後中等度の発現増強が持続していた。次に種々の組織における発現を検討したところ、肺と脾臓において強く、脳と心臓では弱く発現していたが、大腸や腎臓では発現していなかった。

一方、胎児(胎生15日)の脳と心臓では生体と同程度の弱い発現が検出され、胎児肝でも生体同様に痕跡程度の発現しか認められなかった。さらに種々のヒト肝癌細胞株における発現を検討したところ、程度に差はあるものの検討した6種の肝癌細胞株全てにおいてosteoactivinの発現が認められた。また、ヒト肝癌の摘出組織を用いて癌部・非癌部のosteoactivin発現を検討した。66.7%の肝癌組織で非癌部組織よりも高いosteoactivin発現が認められ、特に高分化型肝癌において有意に発現増強していた。一方、osteoactivinの機能解析のためにsense-およびantisense-osteoactivin発現ベクターを肝癌細胞株に導入した。osteoactivin強発現は細胞増殖に影響を与えなかったが浸潤能を亢進させ、ヌードマウスに脾注するとその肝転移を促進した。一方、osteoactivin発現を抑制すると浸潤・転移は阻害された。以上の結果から、osteoactivin遺伝子は慢性肝炎から肝硬変に至る過程で発現し、肝発癌に何らかの関わりを有していることが推測された。肝細胞癌の多くは肝硬変を背景に発生し、その発癌にはウイルスのみならず長期持続する炎症と再生、線維化といった因子が関与している。コリン欠乏アミノ酸置換食(CDAA)食によるラット肝癌モデルは、肝硬変を背景に発生するヒト肝細胞癌に類似したモデルである。我々は、CDAA食飼育ラット肝における増殖因子発現、細胞増殖およびアポトーシスの経時的変化を検討した。肝細胞増殖因子はCDAA食早期に発現誘導されるのに対して、TGF-αは中期から後期にかけて誘導された。また肝細胞増殖抑制因子であるTGF-βは早期から持続的な発現誘導が認められた。一方、細胞増殖は持続的に亢進していたが、アポトーシス細胞は8週目まで増加するものの以後減少した。これらの結果からCDAA食開始早期(8週)に発癌に関わる重要な因子が関与していることが示唆された。そこで、次に、CDAA食開始早期の肝組織で発現亢進している遺伝子群をsuppression subtractive hybridization法を用いて単離し、これらの遺伝子群に含まれていた未だ機能が明らかでないosteoactivin遺伝子の解析を行った。Osteoactivinは、正常肝での発現は痕跡程度であったが、CDAA食開始1週間目から発現増強し中等度の発現が持続していた。種々のヒト肝癌細胞株における発現を検討したところ、検討した6種の肝癌細胞株全てにおいてosteoactivinの発現が認められた。また、ヒト肝癌の摘出組織を用いて癌部・非癌部のosteoactivin発現を検討したところ、66.7%の肝癌組織で非癌部組織よりも高いosteoactivin発現が認められ、特に高分化型肝癌において有意に発現増強していた。
発展型セルフモデリング法の開発

運動を学習する際には、まず示範者の運動(モデル)を観察し、それを模倣することが有効な手段である.モデルの対象は、上級者の場合が多いが、ビデオ機器を利用し自分自身をモデルにするセルフモデルの場合もある.本研究は、両モデルの長所を活かし、両者の中間に位置する架空のモデルを開発することを目的として実施された.まず学習者の人体セグメントモデルを人体計測法と画像解析法によって作成した.次に、実際の投球動作を3次元的に解析し、各セグメントの相対座標位置を求めた.このデータに人体セグメントモデルを合わせることによってコンピュータグラフィックスによるセルフモデルを作成した.上級者についても同様の解析・操作を行い、学習者の目標モデルを作成した.ここで、本研究における学習者と上級者の動作の違いとして、コッキング期の上肢の関節角度(肩関節内外転角、肩関節内外旋角、肩関節水平内転角および肘関節の最大屈曲角)の違いが顕著でり、肩関節外転運動および水平内転運動のパターンの相違が認められた.そこで、学習者の運動を上級者に近づけるべく、肩関節外転運動および水平内転運動について任意にkinematicデータを操作し、その結果得られたデータを元に両者の中間に位置するモデルを作成し、これをAdvanced Virtual Self-model(AVS model)と命名した.現在のところ、人体セグメントモデルの作成には、人体計測法のみの方が時間的な面から有効であることが示唆された.また、AVS modelは矯正すべき運動を視覚的に把握できるためにイメージしやすいという内省を得ている.しかし問題点として、モデルのリアリティとモデル作成時間のTrade-offが挙げられる.この問題はごく近い将来、電子機器の発展と普及により解決できるであろう.今後、このモデルの利用は、運動学習指導法の研究に大いに役立つものと期待できる.運動を学習する際には、まず示範者の運動(モデル)を観察し、それを模倣することが有効な手段である.モデルの対象は、上級者の場合が多いが、ビデオ機器を利用し自分自身をモデルにするセルフモデルの場合もある.本研究は、両モデルの長所を活かし、両者の中間に位置する架空のモデルを開発することを目的として実施された.まず学習者の人体セグメントモデルを人体計測法と画像解析法によって作成した.次に、実際の投球動作を3次元的に解析し、各セグメントの相対座標位置を求めた.このデータに人体セグメントモデルを合わせることによってコンピュータグラフィックスによるセルフモデルを作成した.上級者についても同様の解析・操作を行い、学習者の目標モデルを作成した.ここで、本研究における学習者と上級者の動作の違いとして、コッキング期の上肢の関節角度(肩関節内外転角、肩関節内外旋角、肩関節水平内転角および肘関節の最大屈曲角)の違いが顕著でり、肩関節外転運動および水平内転運動のパターンの相違が認められた.そこで、学習者の運動を上級者に近づけるべく、肩関節外転運動および水平内転運動について任意にkinematicデータを操作し、その結果得られたデータを元に両者の中間に位置するモデルを作成し、これをAdvanced Virtual Self-model(AVS model)と命名した.現在のところ、人体セグメントモデルの作成には、人体計測法のみの方が時間的な面から有効であることが示唆された.また、AVS modelは矯正すべき運動を視覚的に把握できるためにイメージしやすいという内省を得ている.しかし問題点として、モデルのリアリティとモデル作成時間のTrade-offが挙げられる.この問題はごく近い将来、電子機器の発展と普及により解決できるであろう.今後、このモデルの利用は、運動学習指導法の研究に大いに役立つものと期待できる.
肺扁平上皮癌におけるCD271標的治療開発のための基礎検討

肺癌は全癌種中死亡者数が一位である悪性度の高い癌である。しかし、そのほとんどは腺癌に関するものであり、全体の三割を示す扁平上皮癌については、有効な治療標的の報告がほとんどない。申請者らは最近、CD271が下咽頭癌の悪性度を規定することを見いだした。さらに、CD271は複数の扁平上皮癌(頭頚部・肺・食道・外陰部・陰茎・子宮頸)に共通して発現することを見出し、肺扁平上皮癌においては予後と相関することを見いだした。以上から、肺扁平上皮癌においてもCD271は有望な治療標的になると考えた。
レーザーフラッシュによる投与酸素輪液の微小循環動態の動的画像解析

人工赤血球:ヘモグロビン(Hb)小胞体が細網内皮系で捕捉される過程を、レーザー共焦点顕微鏡を利用して動的観測した。Hb小胞体および血漿相を蛍光色素でラベルし、麻酔下ハムスターに負荷投与した。腹部を切開し肝臓を露出させ肝表面をin situ観測し、Hb小胞体が類洞血管内の血漿相を流れる様子と、投与直後から次第にこれが貪食細胞に捕捉されて食胞内に集積し蛍光強度を高める挙動が観測された。組織病理学的検討から、Hb小胞体は1週間以内に分解消失し蓄積は無く、また血液生化学的検査からも臓器の機能に不可逆の影響を与えず、安全度が高いことが明らかになった。微小血管内の血球を静止させて撮影するため、発光時間40μsec、発光周期1/60secのフラッシュランプをCCDカメラと同調させる方法を利用した。Q帯吸収波長を照射して血球のコントラストを得て、皮膚表面での散乱抑制には限外照明系を採用した。アルブミン5%溶液で血液希釈(ラット)後の血流動態(有効毛細管密度と毛細血管内ヘマトクリット)の変動を解析し、心拍出量の変動との相違を得た。Hb小胞体が酸素透過性を有する微小血管内(内径約28μm)を流動するときの酸素放出挙動を顕微鏡下、分光学的に数値解析した。Hb小胞体の酸素放出速度は赤血球と同等であったが、Hb溶液は、赤血球との混合比に応じて酸素放出速度が増大した。Hb溶液ではHbO_2自体の拡散により、酸素の促進輸送効果を示したものと考えられる。本方法は、体内の微小血管を流動するHb小胞体の測定にも利用できると考えられる。また、Hb小胞体の内水相にフラビンモノヌクレオチドとエチレンジアミン四酢酸を添加して可視光照射すること、酸素結合機能を失ったメトHbが瞬時に還元されて、酸素結合機能を回復できることを確認でき、体内投与後の経皮的照射による機能的寿命の延長に貢献できると考えられる。1.フラッシュ照射による微小循環動態解析:経皮的血球流動観測手段は、血球を静止させて撮影するため発光時間40μsec、発光周期1/30-1/60secの高エネルギーXeフラッシュをCCDカメラと同調させる方法を利用。照射波長をHbのQ帯吸収の550nmとして血球のコントラストを得、皮膚表面での散乱抑制には限外照明系を採用。アルブミン溶液で高度血液希釈(80%超)を行った場合の毛細管内の血球流速、有効毛細管密度、ヘマトクリットが観測できた。また、酸素輸液(ヘモグロビン小胞体)で血液希釈を実施したときの動態を観測している。2.酸素輸液の投与から細網内皮系での代謝過程の詳細検討:組織病理学的な検討から、投与Hb小胞体が主に細網内皮系にて捕捉され貪食能に変化をもたらすが、2週間以内に全て代謝され貪食能も正常値に戻ることを確認できた。経時的変動が明らかに成ったので、非侵襲的手段により細網内皮系の微小循環を追跡する実験に移行する。3.Skinfold window chamber法による微小循環動態の観測:ハムスター背部皮下微小循環を無麻酔非侵襲観測できる実験系の導入を完了。

Hb小胞体および血球成分、血漿蛋白質、内皮細胞に蛍光ラベルをして、共焦点顕微鏡による循環動態の観測による末梢組織の三次元的データの集積と、フラッシュ照射による経皮的観測を行い、酸素輸液の微小循環動態に与える影響の解析に着手。4.レーザー照射によるHb還元:酸化型Hb(Fe^<3+>)に近紫外レーザーパスル照射することで還元され、過渡吸収スペクトルから酸素配位機能が復元されることを確認、その機構を解明した。Hb小胞体とした場合も還元されることを確認。体内投与後の機能回復への利用の可能性を示唆した。1.Skinfold window chamber法による微小循環動態の観測:ハムスター背部皮下微小循環を無麻酔非侵襲観測できる実験系を利用し、出血ショック蘇生試験を実施した。循環血液量の50vol%を急速脱血し血圧を40mmHgに1時間維持した後、Hb小胞体(HbV)を投与した。血圧・血液ガス組成(pO_2,pCO_2,pH,塩基余剰)の速やかな回復がみられ、脱血液を投与した場合と同等であり、対照のアルブミン単独と比較して有意に優れていた。背部皮下微小循環動態はHbV投与により改善されるが、抵抗血管の収縮が非可逆的であるため、観測時間内では十分な回復ではなかった。しかしアルブミン投与群に比較して優れており、HbVの酸素運搬の効果と考えられた。これらの結果を整理して論文投稿することができた(Am. J. Physiol.)。また、共焦点顕微鏡により、蛍光ラベルしたHbVを観測。肝臓への捕捉の経時変化を計測することができた。脾臓や梗塞モデル臓器での観測も行う予定である。2.フラッシュ照射による微小循環動態解析:経皮的血球流動観測手段としては、血球を静止させて撮影するため発光時間40μsec、発光周期1/30-1/60secの高エネルギーXeフラッシュをCCDカメラと同調させる方法が利用できる。照射波長をHbのQ帯吸収の550nmとして血球のコントラストを得、皮膚表面での散乱抑制には限外照明系を採用している。アルブミン溶液で高度血液希釈(80%超)を行った場合、心拍出量は1.5倍に増大するが、毛細管内の血球流速は初期値の3倍にまで増大する場合があることが明らかになった。また、有効毛細管密度、ヘマトクリットが観測でき、新しい診断技術としての可能性が示された。本結果は整理して論文として投稿済(Microvasc. Res.印刷中)。酸素輸液ヘモグロビン(Hb)小胞体が細網内皮系で捕捉される過程を、レーザー共焦点顕微鏡を利用して動的観測した。Hb小胞体および血漿相を蛍光色素でラベルし、麻酔下ハムスターに負荷投与した。腹部を切開し肝臓を露出させ肝表面をin situ観測し、Hb小胞体が類洞血管内の血漿相を流れる様子と、投与直後から次第にこれが貪食細胞(Kupffer細胞)に捕捉されて食胞(phagosome)内に集積し蛍光強度を高める挙動が観測された(血中半減期:約24時間)。組織病理学的検討から、Hb小胞体は1週間以内に分解消失し蓄積は無く、また血液生化学的検査からも臓器の機能に不可逆の影響を与えず、安全度が高いことが明らかになった。また、Hb小胞体の内水相にフラビンモノヌクレオチドとエチレンジアミン四酢酸を添加して可視光照射すること、酸素結合機能を失ったメトHbが瞬時に還元されて、酵素結合機能を回復できることを確認でき、体内投与後の経皮的照射による機能的寿命の延長に貢献できると考えられる。
西洋古典文献の伝承史と中世東西地中海世界の修道制をめぐる実証的研究

西洋中世において文献伝承に携わった人々の精神的境位を、文献伝承史および概念受容史のレベルで具体的に捉えることが本研究の目的であった。プラトン/アリストテレス的な古代哲学の枠組みは,キリスト教中世において基本的に継承されつつも,その神学体系の中で様々な変容を被り多様な展開を遂げることになる。研究分担者桑原はこの間の経緯を明らかにした。また秋山は著書『教父と古典解釈』において、教父時代における異文化理解のあり方が、後のヒューマニストたちの古典理解を基本的に準備したばかりでなく、その間の修道士たちの文献伝承筆写作業の実際をも規定したことを実証的に記述した。キリスト教東西の修道制の父と仰がれる大バシレイオス,東方修道制の今日に至る基礎を築いたストゥディオスのテオドロス,西方修道制の霊的父たるアウグスティヌス,同じく西方修道制の礎を据えたヌルシアのベネディクトゥス,また12世紀ルネッサンスの展開の中で修道制の霊的刷新に努めた人々,そして学究的托鉢修道会を設立して現在に至る修道霊性を拓いたドミニコなどは,上記の修道的文化伝承者として挙げられよう。彼らは,修道霊性の理解において種々多様な展開を見せながらも,いずれも地中海文化に端を発する古典古代文化の教養を破棄することなく,福音書朗読と詩編唱和より成る聖務日課を基軸とした日々の霊的歩みの中に,古典古代作品の筆写作業や,古代哲学の著作をテキストとする観想的学究活動などを採り入れ,哲学史・文化史にも名を残す人々となったのである。古代・中世思想文化を集大成したトマス・アクィナスの学術活動も,本質的にはドミニコ会士としての彼のあり方に支えられている。2年間にわたる本研究計画の第1年目に当たる今年度は、秋山・桑原両名が月1回定期的に研究発表会を催し、相互の研究動向について報告しあった。まず桑原は、トマス・アクィナスにおける倫理哲学を理解するための一つの手掛かりとして、「親和的認識」に着目した。桑原によれば、トマス・アクィナスは「徳」「友愛」「正義」「責務」といった様々なテーマを、アリストテレスと古代哲学から継承しつつキリスト教神学により変容させる上で「聖霊の賜物」の自覚とエネルギーに依拠している。この賜物は共同体における相互の「親和的認識」において働くが、トマスがこのような発想に至った根幹には、彼の生活の座たる托鉢修道会と、使徒伝承を継ぐ修道制の歴史が厳然として存在する。この他、今年度討議に取り上げられたテーマとしては「随順的可能性」「類比」などがあるが、いずれも古代哲学の中世における受容と変容に根本的に関わるものであった。一方秋山は、西洋古典文献の伝承史を中世哲学・精神史的研究の視点から再検証する作業を継続的におこなった。論文「バシレイオスと「ルネッサンス」」では、総じて9世紀以降に成立する現存西洋古典文献手写本をめぐり、当時の地中海東西の写字修道士たちの精神的地平が、ギリシア教父神学および初期修道制にまで遡ることを明らかにした。その中でさらに、修道制の父祖的存在であるバシレイオス像が、その弟であるニュッサのグレゴリオスによる位置づけを通じて旧約のモーセに比せられるものを持つに至り、総じて写字行為を、モーセによる律法授受に似た地平において成立させる可能性を披いたこと、また「出エジプトの原則」に照らし、異教文化の積極的利用へと向かわせたことを仮説として提示した。また1617世紀ルネッサンス期の神学者たちの原典訳と解説を通じて、彼らが古典文献と教父神学に立脚しつつ反対宗教改革期の神学を形成した点を強調した。
レーザースペックルを用いた視覚復号型秘密分散暗号法の開発研究

単独では意味を持たないが、合成すると秘密画像が再生される視覚復号型暗号を実現するために、従来のランダムグリッドに替わり、粗面からの散乱光によるスペックルパターンを初めて用いた。秘密画像が埋め込まれたランダムパターンであるシェアを作成するために、スペックルパターンを切り出し、二値化した。このシェアと元のスペックルパターンを重ね合わせることにより、秘密画像を再生することに成功した。これは、直接シェアにスペックルパターンを照射することによって、秘密画像を解読できることを意味する。平成26年度の計画に関して、光源、散乱体の材質、光学系の配置、画像の分散法、および画像再生法に関する実施状況について報告する。光源はレーザー光を用い、平均粒径の異なるスペックルを作成するため、その照射面積を変化させた。偏光面は、散乱体を斜めに照射することから、反射率が大きくなるように入射面に対して垂直な偏光とした。散乱体は表面テクスチャの異なるフォトペーパーとコピー用紙を用い、コンピュータによって作成された十分に発達したスペックルパターンのヒストグラムと比較した。その結果、コピー用紙によるスペックルパターンの方が、十分に発達したスペックルパターンに近いことが分かった。光学系の配置は、光源をレンズで絞って散乱体に当てることにより、適度な粒径を持ち十分な明るさのスペックルを作成することができた。また、散乱光が平行に重なることにより理論的な解析が容易になるため、レンズを用いて散乱光をコリメートするような配置にした。画像の分散では、スペックルパターンを2値化して、従来のランダムグリッド法と同様の2値論理によって、画像をほぼ完全に秘匿できることが明らかになった。その際、2値化されたスペックルパターンの白と黒の割合が50%であることが、画像秘匿の必要条件であることが分かった。さらに、レーザー光がガウシアン分布であることに起因するスペックルパターンの輝度斑に対して、スペックルパターンを幾つかのセクションに分割し、それぞれに異なる閾値で2値化し、局所的に条件を満たすパターンを作成することにより、画像のほぼ完全な秘匿に成功した。分散画像の復元では、2値化された分散画像と元のスペックルパターンをコンピュータ内で積を取った結果、秘密画像を復元することができた。したがって、実験系でスペックルパターンを照射することによっても、秘密画像の復元が可能であるという有力な根拠を得ることができた。一つの画像を二つ以上の複数の媒体にランダムに分散したものをシェアという。シェア単体では意味を持たず、すべてのシェアを重ねることによってのみ情報が復元される暗号化法を視覚復号型秘密分散法、または視覚復号型暗号法という。この方法では、計算機等の演算なしに、ランダムな情報から秘密画像を再生することができるが、透明な記録媒体が必要であることと、画像の大きさに合わせた媒体が必要であることが問題であった。本研究は、粗面からのレーザー散乱光に現れるスペックルを鍵として、画像を復元する新しい方法の実証研究である。この方法は、透明な媒体が不要、大きなランダム画像が不要、複製が極めて困難、等の利点がある。平成26年度では、紙にレーザー光を照射し、高コントラストのスペックルを発生させ、それを2値化したランダムグリッドからシェアを作成した。その際、一律に同じ閾値を使うのではなく、画像の小部分毎に異なる閾値で2値化した。その結果、埋め込まれた画像が認識できないシェアを作成することに成功した。平成27年度では、計算機上でシェアとスペックルパターンの積を計算した。その結果、元の画像を復元することに成功した。しかし、シェアに直接スペックルを照射した場合には成功しなかった。その理由は、スペックル照明光には光の振幅に加え、位相の情報も含まれていることが原因と考えられる。今後は、スペックルパターンの位相分布まで含めてシェアを作成することを計画している。まず、回折場を利用した位相推定法を用いて、スペックルの位相分布をスペックルパターンから推定する。そして、位相分布を含めた透過率の計算によりシェアを作成し、スペックルの直接照射による画像の復元を試みる。この方式により、シェアを透過した光を強めることが可能となり、復元画像のコントラストが向上する効果が期待できる。平成26年度の研究実施計画についてその達成度を評価すると:レーザー光源を粗面に照射し、スクリーン上にスペックルパターンを発生させることは、レーザーダイオード、紙およびスリガラスを用いて達成した。ランダム画像を取得することは、スリガラスに映ったスペックルパターンをカメラに取り込むことにより達成した。スペックルの精密な位置決めは、レールに固定した精密な移動ステージを用いた光学系により達成した。スペックルのコントラストおよび平均粒径を変化させることは、ピンホールによる照射ビーム径の制御、および粗い紙を用いることにより達成した。ランダム画像の最適化は、スペックルパターンの分割2値化により達成した。材料の最適化は。

2種類の材質の異なる散乱体からのスペックルパターンのヒストグラムを、理想的なスペックルのヒストグラムと比較することによりほぼ達成した。照明条件の最適化は、結像系スペックルと回折系スペックルを比較することによりほぼ達成した。画像の秘匿は、スペックルパターンを2値化し、セクションに分割して局所的に白黒割合を50%にしたランダムパターンを用いることによりほぼ達成した。合わせて、2値論理に依存しない画像の秘匿方法についても検討したが、画像を完全に秘匿できるアルゴリズムの発見には至っていない。レーザーの偏光面や、レンズ伝達関数の検証は、スペックルの明るさに影響を与えることを確認したことによりほぼ達成した。画像の復元は、2値化された分散画像と元のスペックルパターンの積から秘密画像が復元できることを確認したことによりほぼ達成した。これら各項目の達成状況から判断して、当該年度の研究目標は概ね達成されたと判断される。ただし、連続画像を秘匿できるアルゴリズムの発見には至っていないことから、当該計画以上の進展があるとは認められない。光情報処理平成27年度は、2値化したランダムパターンをスクリーンに投影し、スペックルパターンを照射することにより、実験的に画像の復元を行う。その際、自動ステージを用いて精密な位置合わせを行う。また、散乱体の照射位置を微小に変化させた場合の復号画像の変化を観測するとともに、ランダムパターンの多重化についても検討し、異なる照射位置に別の画像を分散記録した画像の復元についても検討する。それ以降の年度では、それまで活用されていなかった光の位相を含めた画像の分散法について研究を進める予定である。画像のランダム化に光の位相を取り入れることにより、画像の透過率を下げるだけでなく、上げることも可能となり、復号画像の画質が各段に向上することが期待できる。光の位相を活用する上で課題となることは、散乱体からのスペックルパターンから、散乱体の位相分布を推定することである。そのために、位相回復のためのアルゴリズムの適用可能性について十分検討する必要がある。そこで、散乱体モデルを用いた位相回復アルゴリズムのシミュレーションを行い、位相復元の可能性について検証を行う。位相回復の可能性を示すことができれば、その情報をもとに秘密画像をホログラフィックに分散記録し、秘密の対攻撃性や鮮明な画像の復元などの検証を行う。また、波長の多重化により、カラー画像の分散記録、再生についても検討の余地がある。本研究を推進するために、今後も科学研究費補助金の申請を継続的に行っていく。