hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性ストレスと肥満：なぜ下部尿路機能障害を起こすのか？

副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)の受容体が膀胱にも存在するが生理的意義について検討した。心理ストレス負荷に伴い1日尿量の増加と排尿回数の増加が認められた。ストレス群ではCRF、CRF受容体1、M3受容体のmRNAの発現が増加し、膀胱切片等尺性収縮実験ではカルバコール収縮が有意に増強していた。CRF receptor1拮抗薬antalarminを添加しても変化はみられなかった。さらにストレス群ではCRF、CRFR1の発現増加、ムスカリンM3受容体増加が認められ、M2、アドレナリン受容体には変化がみられなかった。心理ストレスが膀胱CRFを介して膀胱収縮に関与している可能性がある。慢性ストレスはメタボリック症候群のリスク因子であるが、脂肪細胞自体にも作用し、機能障害から各種炎症性サイトカインを増加させる。慢性ストレスは視床下部の室傍核で合成される副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)を増加させ、個体レベルのストレス反応の中核をつかさどる伝達因子とされる。最近になりその受容体が膀胱にも存在することが明らかとなった。CRF受容体にはR1とR2のサブタイプが存在し、前者は下垂体前葉などに発現してACTH分泌促進、不安関連行動や抑うつの惹起などを引き起こす。後者は視床下部、扁桃核、縫線核、骨格筋、心筋、血管壁に存在する。膀胱ではCRFR2が存在し、cyclophosphamide膀胱炎では発現は増加する。われわれはストレス負荷ラット膀胱にCRFが増加すると報告したが、肥満に伴う各種メディエータが増悪因子になって機能障害を惹起しているという仮説をたてた。平成27年度はコミュニケーションボックス法を用いた慢性ストレスが下部尿路機能にどのような影響をもたらすか検討した。病態モデルとしてSHR(自然発生高血圧ラット)を対象とし、心理ストレス負荷をかけても1日の排尿回数、1回の排尿量有意な差がないことが解った。Real-time PCRを用いて摘出膀胱壁におけるCRF発現と、CRF R1の測定を行った結果、ストレス負荷によりCRF自体とCRF R1発現の亢進を認めた。また、摘出膀胱の薬理実験を行った。平滑筋切片はphenylephrineとcarbacholに対して収縮反応を示すが、CRFの追加投与はcarbachol収縮を増強した。ムスカリン受容体はM1からM5が存在するが、M3発現が亢進しているデータも得られている。本研究はin vivoとin vitroから慢性ストレスの下部尿路機能への影響について検討することを目的とした。病態モデルとしてはOLETFラット(メタボリック症候群)、SHR(自然発生高血圧ラット)、DSラット(Dahl-Iwai S;食塩感受性高血圧)を対象とし、心理ストレス負荷をかけ、排尿行動のモニターを行う予定とした。27年度はまずSHRから始めた。代謝ケージによる排尿パラメーターの測定、摘出膀胱の膀胱壁におけるCRFの測定を行って、対照のラットとの比較を行う。次に摘出膀胱のCRF投与時の薬理実験を行った。CRF単独では膀胱収縮を惹起できないが、carbachol投与下であればその収縮を修飾できることが解明され、CRF receptor 1を介している可能性が示唆された。ムスカリン受容体はM1からM5が存在するが、M3発現が亢進しているデータも得られており、CRFの遺伝子レベルで関与も示唆される。このようにSHRにおいて着実に計画は進行しており、今後CRF receptor 1 antagonistの影響も検討する予定である。他の病態モデルには今後の検討課題としたい。CRFのみの投与では排尿筋切片の収縮に変化は認められなかった。しかし、carbacol収縮はストレス負荷により増強し、CRF投与でさらに増加した。Antalarminはストレス負荷した膀胱切片の収縮反応のみ抑制した。phenylephrine投与後のCRF投与では同様の所見は認められなかった。またshamストレス群に対しストレス群ではCRF、CRFR1の発現増加、ムスカリン受容体M3の増加も認められた。しかしM2、アドレナリン受容体α1A/B/Dには変化がみられなかった。病態モデルとしてはWKYとSHRを対象とし、心理ストレス負荷をかけた。ストレスによりSHRのみで1回排尿量の有意な増加がみられた。CRFは膀胱収縮自体には影響しないが、CRFR1を介してM3受容体に何らかのシグナルを出してムスカリン収縮を増強させることが解明された。心理ストレスは高血圧のような病態下では膀胱機能に影響を及ぼすことが解明された。このようにSHRにおいて着実に計画は進行しており、おおむね順調に進展していると判断した。最終年度ではWKYラットに限定して、心理ストレスによるラットの排尿状態の変化、膀胱でのCRF・CRF受容体発現、およびムスカリン受容体の発現、膀胱切片のムスカリン収縮の変化について検討した。ストレス負荷に伴う排尿パラメーターの変化については、1回排尿量には変化がみられなかったが、1日尿量の増加とともに排尿回数の増加も認められた。膀胱の各種受容体のmRNAをreal-time PCR法で測定したところ、心理ストレス群ではCRF、CRF受容体1、M3受容体のmRNAの発現が増加していた。さらに心理ストレス群の膀胱切片を用いた等尺性収縮実験ではカルバコール収縮が有意に増強し、CRF receptor 1 antagonistのantalarmin 10-6Mを添加しても、等尺性収縮に変化は認められなかった。

これまでの報告では、Wister ratsにコルチコステロンを連続投与するとうつ症状と排尿筋過活動を引き起こし、CRF receptor 1 antagonistの同時投与はこの症状を抑制する(Int Urogynecol J. 2016)、あるいは寛解後の潰瘍性大腸炎患者の病状の再燃において、M2/M3受容体及びCRFを発現した好酸球の関与が指摘されている(Gastroenterology. 2)。膀胱におけるCRFとM3受容体の関連性は現時点で不明であるが、心理ストレスが膀胱発現CRFを介して膀胱収縮に関与している可能性が示唆され、さらなる研究を継続する予定である。副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)の受容体が膀胱にも存在するが生理的意義について検討した。心理ストレス負荷に伴い1日尿量の増加と排尿回数の増加が認められた。ストレス群ではCRF、CRF受容体1、M3受容体のmRNAの発現が増加し、膀胱切片等尺性収縮実験ではカルバコール収縮が有意に増強していた。CRF receptor1拮抗薬antalarminを添加しても変化はみられなかった。さらにストレス群ではCRF、CRFR1の発現増加、ムスカリンM3受容体増加が認められ、M2、アドレナリン受容体には変化がみられなかった。心理ストレスが膀胱CRFを介して膀胱収縮に関与している可能性がある。ストレス負荷なしの膀胱平滑筋切片に対するcarbachol収縮に対し、ストレス負荷は反応の増加を認め、またCRFを投与することでさらに増強された。ではストレス負荷なしの膀胱平滑筋切片に対してCRFはどのような反応を示すのか。今年度解析する。CRF receptor 1 antagonistの存在下ではその増強反応はどのように修飾されるのか、また膀胱平滑筋におけるM3発現は減弱するのか、今年度の課題としたい。さらに本研究ではSHRを病態もでるとして用いているが、病態のコントロールとしてのWiter ratでストレスはどうような影響をもたらすのか。ここにストレス負荷時の血圧の影響がどのように関与しているのか、まだ未解決の課題は沢山あり、病態モデルとしてのOLETFラット、DSラットにおけるストレス関与にまでは至っていない。研究の実施速度を増して対応したい。ストレス負荷はSHRとWKYでその病態を異にするが、血漿中のCRFと膀胱壁に発現するCRFには蛋白レベルで両モデルにおいて差があるのか、またストレス負荷前後で差がみられるのか、研究を進めていきたい。さらにCRF R1 antagonistの作用メカニズムについても今年度の課題としたい。まだ未解決の課題は沢山あり、病態モデルとしてのOLETFラット、DSラットにおけるストレス関与にまでは至っていない。泌尿器科学
思考に対する外国語の妨害作用

母語ほどには習熟していない外国語を使用している最中には思考力が一時的に低下するという現象(外国語副作用)に関して、実験的な研究を行なった。どの言語処理プロセスが思考に干渉するかを調べた実験では、音声処理プロセスは思考に干渉せず、語彙アクセス・プロセスと統語解析プロセスは思考に干渉することを示唆する結果が得られた。また、言語課題として読解課題を用いた実験では、課題の難易度が低いときのみ、母語話者に比べ、外国語話者において、計算課題への干渉が大きくなり、難易度が高いときには、そうした差が見られなかった。被験者が思考課題と言語課題を同時に遂行する二重課題実験を3つ実施した。いずれも、言語課題を外国語で遂行した場合、母語で遂行した場合より思考課題の成績が低下すれば、外国語副作用が生じたと判断することができる。実験1と2では、語彙アクセスの段階で外国語副作用が生じるか否かを検討した。思考課題は、知能検査で非言語性知能を測定するための図形問題、言語課題は語彙性判断課題であった。実験1では日本語を母語とする被験者を対象にして、先に行なった実験の結果が追試可能であるか否かを検討し、語彙アクセス段階で外国語副作用が生じることを再確認した。実験2では、英語を母語とする被験者20名を対象とし、やはり外国語副作用が生じるという結果を得た。実験3では、3群の被験者(英語が母語、日本語が母語、フランス語が母語)を対象として、思考課題としては計算課題、言語課題としては英語テキストの聴解課題を行う二重課題実験を実施した。英語テキストには、高難易度と低難易度の2種類を用いた。英語を母語とする被験者の場合には、思考課題の成績は、言語課題が高難易度の条件において、低難易度の条件より低下した。一方、英語を外国語とする被験者の場合には、言語課題の難易度は思考課題の成績に影響しなかった。実験4は二重課題実験ではなく、英語読解実験であった。日本語を母語とする英語学習者25名を被験者となり、1文ずつ提示される英文を読みながら、途中で提示されるテスト文が読解中の英文と意味的に整合するか否かを判断した。意味的に関連する文の直後に提示されたテスト文に比べて、2文後に提示されたテスト文では、判断時間が長くなった。本研究の目的は、言語処理のどのプロセスが思考に干渉し、外国語副作用を引き起こしているかを調べることであった。基本的な実験方法は二重課題法であり、被験者は言語課題と思考課題を同時に遂行した。言語課題は母語あるいは外国語で行い、思考課題の成績が外国語条件で母語条件よりも低かった場合には、外国語副作用が生じたと判断した。実験1では、語彙アクセスのプロセスが思考に干渉するか否かを調べるために、言語課題では語彙性判断課題を行い、同時に行う思考課題(非言語性知能因子に負荷する知能検査問題)への影響を検討した。被験者は英語を母語とする学生・社会人24名。言語課題は母語(英語)と外国語(日本語)で行なった。その結果、思考課題においては、外国語条件では母語条件より成績が有意に低くなり、外国語副作用の生起が確認された。言語課題は聴覚的に提示されたので、この結果から、音声解析プロセスと語彙アクセス・プロセスのどちらか又は両方が思考に干渉することが明らかになった。実験2では、L2英語能力に差があるスイス人(TOEFL国別平均97/120)と日本人(同70/120)では、L2処理の認知負荷にも差あるという仮説を検証した。スイス人大学生40名、日本人大学生38名を対象に、3種類の英文朗読音声を聴取し内容理解問題に解答する言語課題と、聴取前に呈示された図形を聴取後まで保持する記憶課題からなる二重課題実験を行った。実験条件は、記憶図形2つの低負荷条件、4つの高負荷条件、負荷なし条件で、各条件に一つの英文を割り当てる参加者内計画であった。結果は、記憶負荷が大きくなるに連れて、内容理解問題の正答数が減少するという線形傾向が見られたが、この効果に日本人とスイス人の差はなく、参加者群間でL2英語処理による認知負荷に差があるとは言えなかった。母語に比べて習熟度の低い外国語を使用している際には、一時的に思考力が低下する。これを外国語副作用という。この外国語副作用が言語処理の統語解析過程で生じるか否かを検討した。被験者は、日本語を母語とする大学生29名であり、母語(日本語)または外国語(英語)で聴覚的に提示される文に文法的な誤りがあるか否かを判断する統語解析課題と、知能検査の図形問題から成る思考課題を同時に行なった。提示された文に標的音素が含まれているか否かを判断する音素解析課題と思考課題を同時に行なう条件も設定した。

統語解析課題では、母語条件より外国語条件の方が成績が有意に低く、外国語の統語解析が困難であるという前提条件は満たされていることが確認された。思考課題では、やはり外国語条件の方が成績が有意に低く、外国語副作用が生じていたことが明らかになった。音素解析課題では、母語条件より外国語条件の方が成績が有意に高く、思考課題でも、外国語条件の方が成績が有意に高かった。これは、母語条件の標的/m/と/g/の方が外国語条件の標的/k/と/t/より検出が困難であったためではないかと考えられる。音素解析では外国語副作用が生じなかったことを考慮すると、統語解析課題で生じた外国語副作用は、統語解析に含まれる音素解析過程ではなく、統語解析過程で生じた可能性が高いと考えられる。語義アクセスの段階で外国語副作用が生じるか否かという問題については、最初の実験結果が追試可能であることを確認し、更に、英語の母語話者についても、同様の実験結果を得た。統語解析の段階で外国語副作用が生じるか否かという問題についても、肯定的な結果が得られた。以上は二重課題実験の結果であるが、これらの実験においては、思考課題と言語課題の内容に全く関連がない。日常的な言語使用場面においては、言語入力と思考内容との間に密接な関連がある。英文読解課題では、日常的な言語使用場面と同様、言語入力と思考内容との間に密接な関連がある。この課題においても、外国語を使用している場合には、母語を使用している場合に比べて、矛盾の検出、および、内容の一致判断の成績が低下することが示された。統語解析過程で外国語副作用が生じるか否かを調べることを目的として実験を行い、外国語副作用が生じることを強く示唆する結果が得られた。外国語副作用が生じる言語処理段階を特定するための実験では、統語解析の段階で外国語副作用が生じることを示した実験において、言語課題の材料が適切であったかとうかに、やや疑問が残っている。言語課題の材料を新たに作成し直して、実験を行う必要がある。英文テキストの聴解課題と計算課題の二重課題実験においては、認知負荷を高めた場合にどのような結果が得られるかを調べるために、図形を記憶させるという課題を加えた三重課題実験を行う。英語読解実験においては、外国語の読解と母語の読解を比較した実験を行う。音素解析課題では、日本語と英語で別の標的音素を設定したが、同じ標的音素を設定した実験を行なう必要がある。また、文の聴覚的入力から統語解析に至るまでの過程には、音素解析だけではなく、単語同定の過程も含まれる。単語同定の過程における外国語副作用を統制したとき、統語解析過程のみにおいて外国語副作用が生じるか否かを検討する必要がある。いずれの実験においても、実験材料を新たに作成しなければならない。英語の実験材料を作成、校閲、録音のために、英語の母語話者に謝金を支払う必要がある。また、被験者にも謝金を支払う必要がある。次年度は、これらの謝金が主な支出になると考えられる。日本語と英語において、同じ標的音素を使用することができるようにするためには、文を新たに作成し直さなくてはならない。また、単語同定課題のための文も作成しなければならない。そのために、英語の母語話者の録音および校閲が必要になり、その謝金が主な支出になると考えられる。
前庭動眼反射を積極的に利用した動体視力トレーニング法の確立

頭部加速度センサーである前庭器の刺激によって誘発される前庭動眼反射(VOR)の機能的意義は、「静止物体に対する視線の安定化」であると考えられている。したがって、運動物体を頭部運動によって追跡する場合、VORは運動物体とは反対方向に誘発され、動体視力にとって不利にはたらくとみなされてきた。本研究ではそれとは反対に、「頭部運動は動体視力を向上させる」という独自の仮説を検証するため、能動的頭部運動中における高速運動物体に対する動体視力および眼球-頭部運動の特性について解析をおこなった。本研究により、1)能動的頭部運動が動体視力を向上させる、2)その効果は頭部回転運動よりも頭部直線運動の方が顕著である、3)頭部回転運動による動体視力の向上は体性感覚によって駆動する頸性動眼反射(COR)の関与が大きい、4)頭部直線運動による動体視力の向上は予測性眼球運動(anticipatory SP)の関与が大きい、ことが明らかとなった。当初に予想していた積極的なVORの関与は否定的であったが、それにかわる新たな動体視力を向上させる神経メカニズムを提唱することが出来た。また副次的成果として、瞳孔フラッシュ応答による交感・副交感神経活動測定法を応用した快、不快の客観的評価法を確立することが出来た。実際の頭部運動には回転と直線運動の成分が含まれていることから、動体視力を向上させるためにはCORとanticipatory SPの能力が不可欠である。今後、本研究の成果を基にして、動体視力トレーニング法を確立し、実際のスポーツの場面に応用していきたいと考えている。頭部運動中の動体視力には、前庭動眼反射(VOR)のみならず頸性動眼反射(COR)の関与が大きいと予想されることから、平成18年度は頸部筋緊張を高めることによってCORに影響を与えるマウスガードを用いた実験を実施した。実験は13人の健常被験者を対象に、右方向へ運動する物体に対する動体視力を測定した。頭部運動条件は頭部静止(HS)と能動的頭部右回転(OHR)の2種類とし、それぞれマウスガード装着あり/なしの2条件を実施した。マウスガード装着あり/なしによるHS条件、OHS条件の動体視力スコアの平均値には差は認められなかった。また、各被験者の咬合力を横軸、マウスガード装着による動体視力スコアの変化成分を縦軸にとると、HS条件では両者に明らかな関係は見られなかった。しかし、OHS条件ではマウスガード装着により動体視力が向上した被験者群(R=0.76)、低下した被験者群(R=0.87)ともに有意な正の相関が認められた。この結果は、咬合力の強い被験者ほどマウスガードによる頸部筋緊張の程度が大きくなるため、CORによる動体視力向上効果がより大きくなったものと解釈できる。当初、ほとんどの被験者はマウスガードによって頭部運動中の動体視力は向上するものと予想していた。ところが上記のように、一部ではあるがマウスガードにより明らかに動体視力が低下する被験者が観察された。この結果から、マウスガード装着による不快感が動体視力を含めた身体パフォーマンス全体の低下を引き起こした可能性が考えられる。快・不快という情動(emotion)は、本研究のテーマであるCORやVORといった感覚-運動機能(sensory-motor function)とはまったく異なる現象である。しかし、本研究の結果に大きく影響する要因となり得るため、マウスガード実験を進める上であらかじめ検討する必要がある。このような理由から、現在、マウスガード装着による不快感の客観的評価法に関する実験を実施しており、その成果を平成19年度の本実験に応用する予定である。頭部加速度センサーである前庭器の刺激によって誘発される前庭動眼反射(VOR)の機能的意義は「静止物体に対する視線(gaze)の安定化」と考えられており、通常、VORと頭部運動の方向は正反対である。

したがって、頭部が運動物体と同じ方向に運動する場合にはVORは運動物体と反対方向に誘発され、動体視力にとって不利にはたらくと推測される。ところが本研究代表者はこのような条件下において、頭部運動が動体視力に有利にはたらく場合があることを見出した。本研究では、生理学的エビデンスに基づいた動体視力向上トレーニングを開発する目的で、運動物体追跡中の眼球-頭部運動について解析をおこなった。予想に反して頭部運動中の動体視力向上はVORよりも頸動眼反射(COR)が寄与するという結果であった。CORは頸部の固有知覚からの入力によって駆動される眼球運動であり、頭部運動と反対方向(Compensatory)のCORと同方向(Anti-compensatory)のCORが報告されている。Compensatory CORはVORと協調してはたらくと考えられるが、これまでAnti-compensatory CORの機能的意義は不明であった。そこで今回、Anti-compensatory CORが頭部運動中の動体視力に与える影響について検討した。実験は健常被験者を対象に、頭部回転中における頸筋の緊張状態と頭部・眼球運動および動体視力の関係を解析した。結果から後頸部の筋電位と眼球運動ゲイン(眼球運動速度/頭部運動速度)の間には有意な負の相関(R=-0.66,p=0.02)が認められ、眼球運動ゲインと動体視力の間にも有意な負の相関(R=-0.59,p=0.04)が認められた。頭部を体幹に固定して回転させると後頸筋が緊張しても眼球運動ゲインに変化がみられなかったことから、上記の結果にはCORが関与していると考えられた。以上より、Anti-compensatory CORには頭部運動中のVORを抑制することにより動体視力を向上させるはたらきがあると推測され、動体視力向上トレーニングの重要な要因になると思われる。
パーキンソン病治療用ドパミン産生細胞培養セル・チップの開発

I)生体適合性を目的フッ素樹脂表面への官能基置換(1)プラズマ・光併用照射効果:試料表面にプラズマ照射すると、一時的に接触角が小さくなる。この試料面と水との密着性が高い間に紫外線を照射すると、未処理で110°であった水との接触角が25°まで小さくなり、光表面改質の効率が1000倍向上し、蛋白質の付着量が増大する事を見出した。(2)電界・光同時照射効果:フッ素樹脂表面に形成した水の薄液層に1kV前後の直流を印加し、接触角を小さくした状態で、ArFレーザー光(5mJ/cm^2)を照射すると、従来、水との接触角を110°から70°にするのに、2000ショット必要であったものが1/20に低減した。(3)拒絶反応抑制表面形成:PMMA樹脂表面をテフロン化した後、水の存在下で微細パターン状ArFレーザー光を照射し、微細な親水基と疎水基を交互に光置換したミクロドメイン構造を世界で始めて形成し、タンパク質の付着量が極端に少ない表面を作った。II)細胞培養と動物への移植(1)蛋白質・細胞付着効果:フッ素樹脂表面に置換する親水基密度(接触角:110°25°)を連続的に変え、夫々の接触角毎に蛋自質(フィブリン、アルブミン)を付着させたところ、接触角が小さい程、蛋白質の付着量が増大し、接触角が25°では110°時の2.5倍であった。(2)拒絶反応抑制表面の形成:微細パターン状のArFレーザー光を投影露光して、親水基と疎水基の間隔(20250ミクロン)を変化させた試料を、フィブリン水溶液に漬けたところ、20ミクロン間隔に配列した試料へのフィブリン付着が未処理PMMAの1/20、テフロン化した試料表面の1/15と蛋白質の付着量が極減した。(3)ドーパミン産生細胞培養および動物への移植:多孔質内孔に官能基を置換する手法開発が優先し、今年度中に、PC-12細胞培養、およびパーキンソン病モデル猿の線条体に、セル・チップに培養したドパミン産生細胞を移植には至らず、これらの研究継続は平成17年度基盤研究(A)に申請中で有る。
津波・高潮氾濫流に粘り強い建物の安全照査のための数値計算技術の開発

低頻度であるがひとたび発生すれば大災害を引き起こす津波に対して,我々の生命・財産を守ることは必須であり,そのためにも建物の安全性の評価基準を確立することは強く要求される.既往研究では,単一建物に対する耐力評価の様々な検討が行われているが,街区規模における隣接した建物群に作用する津波氾濫の流体力の特性の把握は未解明と言える.本研究では,街区の建物群を3Dプリンターで正確に再現した模型実験を基に,各建物に作用する津波氾濫流の流体力を明らかにした.さらに,建物の津波耐力評価として,建物面積率および建物円形度の指標を提案し,建物倒壊の危険性を判断するための指標になり得ることを示唆した.本研究では,津波や高潮の遡上氾濫流に対しての建物の粘り強さを照査するための数値計算技術を確立すべく,流体-建物の連成解析可能な数値水槽を開発することを主要な目的とする.当該年度では,津波氾濫流の先端部の衝撃的な段波現象に続く準定常的な持続波に着目した.なぜならば,構造物側面に作用する持続波の流体力の評価や前面と側面の流体特性に関しては,余りよく知られていないためである.そこで当該年度では,津波氾濫流の準定常部を満たした流れとして,岩手大学の所有する循環式開水路(計測区間:長さ10m,高さ0.8m,幅1.0m)を用いて準定常流を発生させ,その中に設置された模型構造物周りの流体特性を検討した.特に,その前面と側面の水位,流速および圧力の関係を明らかにすると共に,準定常流中の構造物前面および側面の流速の推定を図った.その結果として,次のような主要な結論を得た.1)準定常流中に構造物が存在することによって,構造物側面の浸水深は,前面の約0.5倍移低下し,その流速は約2倍速くなることがわかった.2)構造物側面の浸水深が初期水深の0.5倍を超えるようになると,常流から射流に流れの状態が変化し,側面の位置によって圧力の値に違いが生じ,構造物側面前方部で負圧になることを明らかにした.3)水位および圧力の構造物前面と側面の関係は,無次元入射水位を用いた指数関数として表せることを提示した.4)準定常流中の構造物前面および側面の流速は,フルード数を用いた推定式で評価できる可能性を示唆した.今後の課題として,津波氾濫流の重要な形態である衝撃的な段波波圧の実験を実施し,構造物前面と側面の各物理量の比較を行い,準定常的な持続波圧との違いを明確にする必要がある.2011年東北地方太平洋沖地震に伴う津波では,平野部を伝播する津波氾濫流が多くの建物を流失させた.岩手県においても,木造建物の65%が流失あるいは全壊の被害を受けた.陸域における津波氾濫流の流体特性を理解することは重要である.特に,遡上過程における流速の鉛直構造を明確にすることは,建物に働く流体力を正しく評価するためにも必要と言える.2011年の震災以降,建物に作用する津波氾濫流の流体力に関する研究は,盛んに行われるようになって来たが,陸上に遡上した津波段波の流速の鉛直構造については,未解明な部分が多いと考えられる.本研究では,津波氾濫流を発生させることが可能な開水路による水理模型実験を実施し,津波氾濫流の陸域における遡上伝播特性について検討する.特に,流速の鉛直構造およびフルード数を用いた建物の耐力評価式が提案されていることから,フルード数の鉛直分布を明らかにする.さらに,フルード数で表されるベルヌーイの定理と氾濫流の流体力との関係を明確にし,適用範囲を検証する.その結果,次の主要な結論を得た.(1)水路底面から浸水深の46割の範囲で概ね一様な鉛直分布となることを明らかにした.(2)建物の耐力評価式の重要な因子と考えられるフルード数は,最大流速時で鉛直分布が大きく変化するが,それ以深では津波氾濫流の規模や流れの状態に依らず,概ね鉛直一様な分布になることがわかった.(3)通過波流速が急激に増加してから最大になるまでの間,通過波流速と浸水深を用いたフルード数で表されるベルヌーイの定理は,建物の耐力評価に適用させることができないことを明らかにした.(4)通過波で表したフルード数が最大値に達した以降では,建物の耐力評価にベルヌーイの定理を適応できるものと考えられる.つまり,粘り強い建物を考える上で,最大のフルード数になるまで,耐えることができる構造の工夫が必要と考察される.津波氾濫流の水位および速度は,水理実験を実施して,サーボ式波高計およびプロペラ流速計から得られたデータより水位および流速の時間的変化の特徴を明らかにしている.高潮氾濫の水位および速度は,海洋モデルを用いてイベント的な気象条件や震災前後の地形変化を踏まえた計算を行っている.また,宮古湾での現地観測より,その水質特性を明らかにしており,これらの情報を海洋モデルに反映させて,計算精度の向上を図っている.氾濫流発生装置付き数値水槽の開発について,陽的アルゴリムによるMPSの3次元数値水槽は概ね完成し,ベンチマーク問題よりその計算精度を確認している.また,高精度圧力計算可能な2DMPSは,様々な初期水位の基,計算を継続しているところである.

2011年東北地方太平洋沖地震に伴う津波では,国土交通省都市局が実施した東日本大震災による建物被災調査データを基に,岩手県沿岸の建物の被災状況の特性を明らかにしてきた.その結果から,数百メートル規模の街区内で隣接する建物であっても,各建物の被災規模が異なることが確認されている.そのため,津波に強いまちづくりを考える上で,単一建物の耐力評価に限らず,街区規模の面的な建物群としての各建物の必要津波耐力の評価が重要と言える.これまでの既往研究では,単一建物に対する耐力評価の様々な検討が行われている.しかしながら,街区規模における隣接した建物群に作用する津波氾濫の流体力の特性の把握は未解明のままと言える.そのため,建物群における各建物の津波耐力の評価が必要と考えられる.そこで本研究では,街区の建物群を3Dプリンターで正確に再現した模型実験を基に,各建物に作用する津波氾濫流の流体力を明らかにする.さらに,街区における各建物の必要津波耐力の評価方法について,建物群の面積または形状を指標とした検討を行う.その結果,前方(海側)に建物が存在することによって,後方の建物に作用する流体力は,著しく減少し,後方の建物に作用する流体力は,入射波の増大に関わらず,小さくなることがわかった.また,前方の建物の高さより低い津波の場合,背後の建物への津波到達時間が遅くなることがわかった.さらに,建物の津波耐力評価として,建物面積率および建物円形度の指標を提案し,建物倒壊の危険性を判断するための指標になり得ることを示唆した.今後の課題として,建物円形度の指標において,建物の複雑さを十分に表現できているとは言えない.また,建物面積においても,地形勾配や海岸からの距離を踏まえた改良が必要であると考えられる.低頻度であるがひとたび発生すれば大災害を引き起こす津波に対して,我々の生命・財産を守ることは必須であり,そのためにも建物の安全性の評価基準を確立することは強く要求される.既往研究では,単一建物に対する耐力評価の様々な検討が行われているが,街区規模における隣接した建物群に作用する津波氾濫の流体力の特性の把握は未解明と言える.本研究では,街区の建物群を3Dプリンターで正確に再現した模型実験を基に,各建物に作用する津波氾濫流の流体力を明らかにした.さらに,建物の津波耐力評価として,建物面積率および建物円形度の指標を提案し,建物倒壊の危険性を判断するための指標になり得ることを示唆した.津波・高潮氾濫流の発生条件の確立に向けた,水理実験は高速・高解像度カメラによる可視化実験まで進んでいないが,他の計測機器(波高計,流速計,圧力センサー)を用いた実験により,氾濫流の発生条件に対するポイントや課題などが明らかとなりつつあり,2015年度の実験実施計画につなげていける状況である.
ヒト集団の長期追跡に基づく発がんと免疫の分子疫学研究

埼玉コーホート研究と原爆被爆者免疫コーホート研究を統合して、免疫、炎症、放射線被曝、発がんの関係を明らかにするのが本研究の目標である。埼玉コーホート研究により、末梢血リンパ球のNK活性の主たる遺伝的要因が活性型受容体NKG2D遺伝子領域のハプロタイプであることを見出し、コーホート内症例対照研究によりNKG2Dハプロタイプの発がんリスクを評価した。NK活性が低いハプロタイプを持つ人は一般集団の32%を占め、かつ発がんリスクも約2倍高いことになり、発がん全体への大きな寄与危険を示した。さらに、環境因子がNK活性に与える影響の程度は個人個人のNKG2Dハプロタイプによって異なることが示唆された。免疫学的がん予防はがん以外の免疫・炎症関連疾患の予防とも重複した効果を期待でき、今後の重要な研究課題と考える。現在、原爆被爆者免疫コーホートにおいてNKG2Dハプロタイプの発がんリスクと放射線被曝の関係を検討すべく準備している。原爆被爆者免疫研究では、放射線被曝と炎症性免疫の関係を示した。すなわち、一連の炎症指標で示される亜臨床的炎症状態は加齢によって亢進するが、被爆者では被曝線量に応じて炎症状態がさらに亢進する。1Gyの放射線被曝は、9年の加齢による炎症状態の亢進に相当する影響を与える。また、ゲノム解析により、炎症の指標の一つであり免疫抑制作用を持つIL-10遺伝子領域に同定したハプロタイプが、放射線被曝とともに原爆被爆者の胃がん発生に強く関連していることを見出した。このハプロタイプは血漿IL-10濃度と強く関連した。さらに、原爆被爆者免疫コーホートの10年の追跡調査により、変異性の指標である赤血球GPA変異率の被曝線量による増加の割合ががん罹患群では非罹患群に比べ顕著に大きいことを見出した。NK活性の場合と同様の表現型・遺伝子型関連解析より、放射線感受性の遺伝要因を探索中である。
アルコール性肝炎進展における虚血の関与とその機序の解明

腸管由来エンドトキシン及び肝虚血がアルコール性肝炎の成立進展に重要であることを我々は既に報告した。一方、死菌を投与したラットでは、肝マクロファージ活性が亢進しており、これらにエンドトキシンを静注すると広範な肝壊死を生じ、この際、類洞内皮細胞障害と肝血管内凝固を介する虚血がその成立進展因子となることを偶偶見い出した。そこで、アルコール性肝炎の進展においても同様の機序が関与するか否かを知る目的で、死菌投与群と比較検討し、以下の成績が得られた。1)我々が開始した方法で肝マクロファージの活性状態を評価すると、エタノール群では対照に比し、活性酵素産生能が有意に亢進していたが、その程度は死菌投与群より軽度であった。2)エタノール群にエンドトキシンを静注すると、広範な肝凝固壊死を生じ、その際、電顕で肝類洞内にフイブリン塊形成と内皮細胞障害を認めた。これは死菌投与群で得られた所見と類似していた。3)エンドトキシン投与時に抗凝固剤を静注すると、両モデルとも肝細胞壊死は有意に軽減した。4)エンドトキシン投与後よりsuperoxide dismutaseを反復静注すると、死菌投与群では肝細胞壊死と凝固因子異常が改善されたが、エタノール群では不変であった。5)エタノール群に肝虚血操作を加えると、対照に比し、著名な肝細胞壊死が生じ、この際、肝の脂質過酸化が亢進していた。以上より、エタノール投与群においても、内皮細胞障害と血管内凝固を介する虚血が肝壊死成立に重要である証拠が得られたが、肝マクロファージの関与は死菌投与群に比し軽微であった。この血管内凝固の成立機序は未だ不明確であるため、肝マクロファージに加えて、申請時に着目した好中球の役割を今後検討する。
脳腫瘍抗原とそのペプチド等価体を用いたMHCクラスI拘束性細胞療法の開発

本研究では、独自に同定した脳腫瘍抗原とそのペプチド等価体を用いて悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法の開発を目指した。開発プロセスとして、(1)脳腫瘍特異または関連抗原を同定し、それを用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラス1拘束性細胞療法を開発する、(2)同定した抗原ペプチドを基に、ペプチド等価体を作製し、生体内で、より安定的に免疫を惹起できることを確認し、GMPに対応した細胞調製法を確立する、(3)それらの臨床研究の実施を目指す、の3つを掲げた。プロセス(1):脳腫瘍抗原として有望視される分子の同定を行った。同定できたのは、XIAP、Aurora-B、JNK及びFasであった。次に、それぞれの分子を取り巻くシグナル伝達系をenzyme-immunoassay法、Western blot法並びに免疫蛍光法で詳細に調べた。その結果、XIAP、Aurora-B、JNKの3分子の機能を抑制するためにデザインしたsiRNAあるいは化合物が効率よく細胞死を誘導したり、免疫の増強効果を示したりすることがわかった。プロセス(2):Fas及びXIAPについては、それぞれを鋳型にしてデザインしたペプチド等価体が脳腫瘍細胞において効率よく細胞死を誘導し、免疫を賦活化することを証明した。さらにこれらの分子あるいはその関連化合物を臨床研究で使用できるレベルまで品質を高めるため、名古屋大学内の品質保証体制及び調製施設の整備を行い、研究2年目には、ISO9001:2000とISO13485:2003を取得した。プロセス(3):取得したISOの元でのMHCクラスI拘束性細胞の調製を行い、臨床研究を悪性脳腫瘍の患者2症例で実施し、調製した細胞の安全性を確認した。インターフェロン遺伝子治療との併用についてはプロトコールを作製した。また、ペプチド等価体の研究では、生物学的活性が出たものの安定性に問題が残った。本研究では、我々が独自に同定してきた脳腫瘍抗原とそのペプチド等価体を用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法の開発を目指す。その開発プロセスとして、(1)脳腫瘍特異または関連抗原を同定し、それを用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法を開発する、(2)同定した抗原ペプチドを基に、ペプチド等価体を作製し、生体内で、より安定的に免疫を惹起できることを確認し、GMP (Good Manufacturing Practice)に対応した細胞調製法を確立する、(3)それらの臨床研究の実施を目指す、の3つの課題を掲げた。今年度はこのうちの(1)及び(2)の課題をスタートした。はじめに、脳腫瘍抗原として有望視される分子の同定を行った。今年度標的分子として同定できたのは、X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)、Aurora-B、JNK及びFasである。また、Fasについては、Fasを鋳型にしてデザインしたペプチド等価体が脳腫瘍細胞において効率よく細胞死を誘導し、免疫を賦活化することがわかった。合わせて、これらの分子あるいはその関連化合物を臨床研究で使用できるレベルに高めるため、名古屋大学を中心に品質保証体制及び調製施設の整備を進めた。

品質保証体制についてはISOの取得を目指すこととし、調製施設の整備についてはinstitutional GMPを策定し、これによる保証体制の確立を目指すことになった。本研究では、我々が独自に同定してきた脳腫瘍抗原とそのペプチド等価体を用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法の開発を目指している。その開発プロセスとして、(1)脳腫瘍特異または関連抗原を同定し、それを用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法を開発する、(2)同定した抗原ペプチドを基に、ペプチド等価体を作製し、生体内で、より安定的に免疫を惹起できることを確認し、GMP(Good Manufacturing Practice)に対応した細胞調製法を確立する、(3)それらの臨床研究の実施を目指す、の3つの課題を掲げた。今年度は、昨年に引き続き、このうちの(1)及び(2)の課題を研究した。その結果、悪性脳腫瘍の特異的抗原となりうる新規のペプチド配列を、genome-information drug design法を用いて見出し、そのペプチドにより、効率よく、細胞障害性Tリンパ球が誘導できることを証明した。現在、そのペプチドを鋳型にして、ペプチド等価体またはその有機化合物のデザイン化を進めている。一方、GMP(Good Manufacturing Practice)に対応した細胞調製法を確立するためのステップとして、ISOの取得を目指した。その結果、細胞調製に関しては、ISO9001:2000とISO13485:2003の取得が内定した。これにより、名古屋大学においては、来年度以降、国際基準をクリアした形で、細胞調製が進められることになった。来年度は、今年度までの研究成果を基盤にして、課題(3)にあげた臨床研究の実施を目指すことになる。本研究では、我々が独自に同定してきた脳腫瘍抗原とそのペプチド等価体を用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法の開発を目指した。その開発プロセスとして、(1)脳腫瘍特異または関連抗原を同定し、それを用いた悪性脳腫瘍に対するMHCクラスI拘束性細胞療法を開発する、(2)同定した抗原ペプチドを基に、ペプチド等価体を作製し、生体内で、より安定的に免疫を惹起できることを確認し、GMP(Good Mallufacturing Practice)に対応した細胞調製法を確立する、(3)それらの臨床研究の実施を目指す、の3つの課題を掲げた。昨年度はこのうちの(1)及び(2)の課題をスタートし、標的分子として、X-linked inhiditor of apoptosis protein(XIAP)、Aurora-B、JNK及びFasを同定した。そして、XIAP、Aurora-B、JNKの3分子の機能を抑制するsiRNAあるいは化合物が効率よく細胞死を誘導したり、免疫の増強効果を示したりすることを証明した。一方で、これらの分子あるいはその関連化合物を、臨床研究で使用できるレベルに高めるための取り組みとして名古屋大学医学部附属病院内において品質保証体制及び調製施設の整備をはじめた。
胸腺退縮に伴うT細胞ミトコンドリア障害のメカニズムと機能的意義の解明

病原体やがんに対して中心的役割を果たす「T細胞」の産生臓器「胸腺」は、思春期以降に退縮する。このため、末梢T細胞は加齢の影響を受けやすく、増殖能低下・炎症性サイトカイン産生能の上昇など様々な機能的変容を来す。この現象は「T細胞老化」と呼ばれ、多くの加齢関連疾患の基礎をなすことが明らかになってきた。申請者らは加齢に伴いT細胞のミトコンドリア量と膜電位が低下することを見出した。本研究では、1)胸腺退縮に伴いT細胞のミトコンドリア障害を誘導する機構、および2)ミトコンドリア変化がT細胞老化の機能的特徴に果たす役割を解明し、3)T細胞老化を正常化する介入法を探索することを目的とする。
マクロファージにおける薬剤誘発性ホスホリピドーシス発症メカニズムの解明

薬剤誘発性ホスホリピドーシス(DIPL)の発症機作は不明であり,今日いくつかの仮説が提唱されている。本研究課題では,細胞によるリン脂質の取り込み能の亢進,および,細胞内酸性オルガネラの中和,がその原因であるかどうかを検討した。細胞内リン脂質量は細胞の各種リン脂質取り込み経路の阻害剤を添加しても変化はなく,細胞のリン脂質取り込みがDIPLの原因ではないと考えられた。また,薬物による酸性オルガネラの中和能については,人工リポソームにおいてはDIPL誘発能の有無によって違いはなかった。1.カチオン性両親媒性薬物(CAD)によって生じる薬剤誘発性ホスホリピドーシス(DIPL)の原因が,細胞によるリン脂質取り込みの充進ではないことを立証した.具体的には,DIPLを起こす代表的CAD(アミオダロン,クロルプロマジン,イミプラミン,プロプラノロール,クロロキン)をRAW264細胞に投与し,過剰に蓄積されたリン脂質が,リン脂質の代表的取り込み経路(LDL受容体,SR-A受容体,CD36,ピノサイトーシス)の阻害剤によって減少しないことを示した.2. DIPL陽性のCADは内水相が酸性のべシクル内に効率的に集積するが,DIPL陰性のCADも同様に酸性ベシクル内に集積することを立証した.具体的には,上記5種のDIPL陽性のCADは内水相pH4,外水相pH7のリポソーム内に集積し,その濃縮比は約70450倍(内水相体積0.25%)であった.一方,DIPL陰性の代表的CADであるジソピラミドも約40110倍の濃縮比を与え,DIPL陽性/陰性のCAD間で濃縮効果に明確な差異は認められなかった.3.上記2の結果を受けて,DIPL陰性のCADも酸性ベシクル内に同様に集積した結果,ベシクル内のpHを上昇させることを確認した.具体的には,DIPL陽性のイミプラミンと陰性のジソピラミドはともに,リポソーム(内水相pH5,外水相pH7)の内水相pHを約6.3まで上昇させ,その効果は同等であった.4.以上13の結果から,DIPLの発症はリン脂質取り込みの充進が原因ではないこと,ならびにリソソーム等の酸性オルガネラの中和がDIPL発症の唯一の原因ではないこと,の2点が示唆された.1.カチオン性両親媒性薬物(CAD)の持続暴露によって生じるRAW264細胞内リン脂質の蓄積量の継持変化を観測した。薬物(クロルプロマジン、イミプラミン)の暴露時間の増加に伴いリン脂質蓄積量が増加し、暴露を中止するとその後のリン脂質量は減少した。リン脂質蓄積量と細胞内薬物量との関係を現在調査中であり、蓄積量のモデル構築とシミュレーションが可能かどうかを検討する。2.pH依存性蛍光標識化合物をRAW264細胞に取り込ませ、CADの暴露にともなう細胞内酸性オルガネラ内水相のpH変化を検出した。CAD(イミプラミン)の暴露によって酸性オルガネラ内水相のpHは一過的に上昇し、その後pHが減少することが観察された。一過的上昇後のpHの減少が、酸性オルガネラのプロトンポンプの働きによるものかどうかを現在調査中である。もしプロトンポンプの働きによるものであれば、CAD投与による酸性オルガネラ内pHの上昇は細胞の恒常性維持機構により打ち消されるため、pH上昇が薬剤誘発性ホスホリピドーシスの原因にはならないと示唆される。3.CADによるホスホリパーゼの活性阻害がホスホリパーゼA2のクラス間で異なることを見出した。イミプラミンはボスホリパーゼIB(ブタ膵臓由来)を非拮抗的に阻害したのに対し、ホスホリパーゼIII(ハチ毒由来)を拮抗的に阻害した。ホスホリパーゼ阻害が薬剤誘発性ホスホリピドーシスの原因の一つとして示唆されていることから、リソソーム由来のホスホリパーゼについても阻害の有無、様式、程度を調査中である。
CAM型光合成における概日リズム制御の分子機構

CAMの概日リズム制御機構を分子レベルで明らかにするために, 3種CAM植物(セイロンベンケイソウ,ハナガサベンケイソウ,アイスプラント)からCAM関連遺伝子(ppcD, Ppck, Ppc1, McPpck1, Mod1)のプロモーターを単離した.これらプロモーターは,アブシジン酸,エチレン,水ストレス,塩ストレス応答,及びMyb結合領域,光応答因子Dof結合領域,時計遺伝子発現調節領域を含んでいた.レポーター遺伝子を用いた一過性発現解析を行い, McPpck1の転写調節部位が転写開始コドン上流-1600bp-1100bpにあることを明らかにした.遺伝子の機能解析のためにin planta法による形質転換法を確立した.成長点,脇芽,種子にアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入した.形質転換効率はそれぞれ,約20%, 90%,及び70%であった.CAMの概日リズム制御機構を分子レベルで明らかにするために, 3種CAM植物(セイロンベンケイソウ,ハナガサベンケイソウ,アイスプラント)からCAM関連遺伝子(ppcD, Ppck, Ppc1, McPpck1, Mod1)のプロモーターを単離した.これらプロモーターは,アブシジン酸,エチレン,水ストレス,塩ストレス応答,及びMyb結合領域,光応答因子Dof結合領域,時計遺伝子発現調節領域を含んでいた.レポーター遺伝子を用いた一過性発現解析を行い, McPpck1の転写調節部位が転写開始コドン上流-1600bp-1100bpにあることを明らかにした.遺伝子の機能解析のためにin planta法による形質転換法を確立した.成長点,脇芽,種子にアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入した.形質転換効率はそれぞれ,約20%, 90%,及び70%であった.今年度は、CAMの概日リズム制御機構を明らかにすることを目的に、アイスプラントCAM型欠損突然変異体におけるCAM関連遺伝子の発現量の日変化を調べた。また、GAM遺伝子の転写開始点5'上流域を単離し、さらに、アイスプラント形質転換体を作出する基礎として外植体からの再分化法を検討した。発現解析の結果、変異株では、CAMの炭酸固定酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)、PEPCの活性を制御するPEPCキナーゼ(PEPCK)、リンゴ酸を脱炭酸するNADPリンゴ酸酵素(NADP-ME)、解糖系関連酵素ホスホグルコムターゼ及びホスホグルコイソメラーゼ等をコードする遺伝子の発現量が低下していることがわかった。上記のCAM鍵酵素、すなわちPEPC、PEPCK、及びNADP-MEをコードする遺伝子Ppc1、Ppck、及びMod1の転写開始点5'上流約1400bp、2000bp及び1200bpのDNA断片をそれぞれ単離し塩基配列を決定した。相同性検索の結果、これらには、エチレン誘導性、光応答、アブシジン酸誘導関連転写因子の結合サイトが含まれていることがわかった。また、単離したDNA断片からデリーションクローンを作製し、プロトプラストに導入してレポーター遺伝子の一過的発現解析を行なったところ、Ppck転写開始点5'上流約11001600bpが発現制御に関わる領域であることがわかった。アイスプラント外植体のカルス形成能は、葉を一部残した胚軸で最も高く、ついで胚軸で高かった。葉付胚軸を外植体に用い、1.0mg/I 2,4-Dと0.2mg/Iカイネチンを含むカルス誘導培地で4週間培養し、さらに5.0mg/I TDZを含むシュート誘導培地で培養することで、地上部再分化能を有した緑色細胞が形成された。緑色細胞を新しい培地で培養すると、地上部再分化個体が得られた。CAMの概日リズム制御機構を分子レベルで明らかにするために、CAM植物のセイロンベンケイソウ及びハナガサベンケイソウからCAM型光合成のCO_2固定酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)及びPEPCリン酸化酵素であるPEPCキナーゼ(PEPCK)をコードする遺伝子プロモーターをそれぞれ単離した。セイロンベンケイソウから単離したPEPC遺伝子(ppcD)の転写開始点上流約2700bpのDNA断片にはエチレン誘導性、光応答、アブシジン酸誘導に関与する転写因子結合サイトがおり、ハナガサベンケイソウから単離したPEPCK遺伝子(Ppck)の転写開始点上流約1200bpには光応答関連転写因子の結合サイトがあることが確認された。またC3植物であるシロイヌナズナのPEPC遺伝子(Atppcl)転写開始点上流約2700bpを単離し、構造を解析するとともに、それぞれ長さの異なる断片をレポーター遺伝子に連結したベクターを作製した。アイスプラント形質転換法の基礎となるカルスからの植物体再分化及び外植体からの植物体再生の培養条件を検討した。ここでは特に、他種で有効性が明らかにされている活性炭の効果を調べた。活性炭を含む培地でカルスから植物体が再生したが再分化効率は改善されず、外植体からの植物体の再生に効果がみられた。この効果は子葉節を外植体にした場合に特に高く、活性炭を0.2-0.5g/L含む培地では置床後3週間でシュート及び根をもつ健全な個体が得られた。この方法はアイスプラント形質転換体の作出に有効であると考えられる。CAMの概日リズム制御機構を分子レベルで明らかにするために,CAM関連遺伝子のプロモーターを単離し解析した.ハナガサベンケイソウのPEPC

キナーゼ(PPCK)をコードする遺伝子Ppckのプロモーターには,水ストレス及びアブシジン酸応答に関わるシス配列が確認された.セイロンベンケイソウのホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)をコードする遺伝子ppcDのプロモーターには転写因子Mybの結合領域が確認された.アイスプラントからはPEPC,PEPCキナーゼ及びNADPリンゴ酸酵素をコードする遺伝子,Ppc1,McPpck1及びMod1のプロモーターを単離した.Ppc1には5箇所に塩ストレス応答に関与するシス領域が確認された.McPpck1にはエチレン及び塩ストレス応答に関わるシス領域が,Mod1には時計遺伝子の発現に関わるシス領域が確認された.また,いずれのプロモーターにもトウモロコシの光応答遺伝子の転写促進に関与するタンパク質(Dof)の結合サイトが認められた.レポーター遺伝子を用いた一過性発現解析の結果、アイスプラントMcPpck1は転写調節は転写開始コドン上流-1600bpから-1100bpまでの配列が関与していることが示唆された.遺伝子の機能解析に必要な遺伝子組換え技術を確立するためin planta法を新たに適用した.ここでは,胚軸外植体,実生成長点,脇芽,及び種子等にアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入する方法を検討した.胚軸外植体はアグロバクテリウムの感染によって枯死し形質転換体は得られなかったが,成長点,脇芽,及び種子にアグロバクテリウム処理した個体は健全に生育した.形質転換効率はそれぞれ,約20%,90%,及び70%であった.