hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボリック症候群を予防する低グリセミック・インデックス食の分子基盤

1)低グリセミック・インデックス(GI)食のメタボリック症候群予防効果に関するラットを用いた分子機構として、門脈内グルコース濃度上昇に応答する早期インスリン分泌能の解明、パラチノースとオレイン酸の組合せ食および長期キシリトールの糖質・脂質代謝改善効果、苦瓜の食後高血糖抑制機序、糖質調整流動食の長期投与による内臓脂肪蓄積予防、2)低GI食のメタボリック症候群予防効果に関するヒトによる評価では、粘性食品の食後高血糖予防効果、糖質調整流動食のメタボリック症候群予防効果、大麦および糖質調整流動食Inslowのメタボリック症候群予防効果、3)メタボリック症候群の予防に関与するヒト末梢血白血球遺伝子としてpyxuvate dehydrogenase kinase, isozyme 4(PDK4)、calnitine palmitoyltransferase 1A(liver)(CPTIA)を同定した。糖・脂質代謝に及ぼす糖質および脂質の組み合わせ効果について検討した。主な糖質としてパラチノース(P)またはシュクロース(S)、脂質としてオレイン酸(O)またはリノール酸(L)高含有オイルを用い、その他の組成はインスローに準じて糖質・脂質の組み合わせのみを変えた4種類の餌(PO、PL、SO、SL)を調整し、Zucker fattyラットに8週間pair-feedingにて投与した。飼育開始から4週間後と終了時に採血を行い、体重及び血糖、IRI、血中脂質の経時的変化を検討した。さらに飼育終了時に開腹後摘出した臓器サンプルより、RNAを調整してreal-time PCRにて脂質代謝関連遺伝子の発現を検討するとともに脂肪細胞の組織学的評価を行った。投与後、内臓脂肪量はPO/PL群で有意に抑制された。血糖、インスリン、中性脂肪、総コレステロール値は、PO/PL群での低値を、SO/SL群での高値を認めた。肝臓での遺伝子発現では、糖新生系酵素(PEPCK、G6Pase)と脂質合成系転写因子(SREBP-1c、SREBP-2、LXRα)は、PO/PL群での低値を、SO/SL群での高値を示し、血液データを反映した発現パターンを示したが、Fatty acid synthase、HMG-CoA reductaseはPO/SO群で発現抑制およびPLISL群での発現増加を示し、脂肪酸による調節が示唆された。糖新生系・脂質合成系遺伝子群は、PO群では発現は抑制され、SL群では発現亢進が見られた。膵島面積はPO/PL群で小さく、SO/SL群で肥大化を認め、パラチノースの膵島肥大化抑制効果が示された。また、PL/SL群で観察されたβ細胞の機能障害は、PO/SO群では認められず、オレイン酸の保護作用が示唆された。さらにPL/SL群では脂肪組織へのマクロファージの浸潤と、これに付随したTNF-α産生能亢進が確認されたが、PO/SO群の脂肪組織ではこれらの炎症性反応は認められなかった。パラチノースとオレイン酸の組み合わせは、食事誘導性の糖毒性と脂肪毒性を回避し、肥満の進展によって生じる代謝異常を総合的に改善することが示された。耐糖能異常を示す患者がインスローを摂取することは、良好な血糖コントロールおよび二次的な膵臓への負担の軽減に対して有効であることが示された。1、メタボリック症候群予防機能を有する新規食品のスクリーニング「めかぶ」の摂取は米飯単独摂取に比較して食後の血糖値および血清インスリン濃度を有意に抑制した。5割麦飯では米飯に比較して食後45分の血糖値は有意に低値を示した。3割麦飯では米飯と比較し、有意差はみられなかったが血糖値の上昇抑制傾向がみられた。血清インスリン濃度は、3割麦飯、5割麦飯ともに食後60分では米飯に比較して有意に低値を示した。2、低グリセミック・インデックス食のメタボリック症候群予防効果とヒト末梢血バイオマーカーの同定血漿デスアシルグレリン濃度は、グルコース摂取後に最も低下し、大麦摂取後は変動が最も少なかった。麦の含有量が多くなるほど血糖値や血清インスリン濃度の上昇が抑制され、血漿デスアシルグレリン濃度の低下が少ない傾向が観察された。以上より、デスアシルグレリンは新規バイオマーカーである。3、メタボリック症候群発症促進に関与する栄養素の相互作用と遺云子の同定無機リンは活性酸素種を産生して動脈硬化を促進することが明らかになった。また、食後高血糖の上昇を反映する白血球遺伝子として、120分で29遺伝子、240分で138遺伝子、120分と240分の両方で変動したのは2遺伝子であった。また、240分で発現が増加した遺伝子はNatural killer cell mediated cytotoxicity pathwayに関与する遺伝子を多く含んでいた。

1)低GI食と脂質の組み合わせによるメタボリック症候群予防効果の解析(武田)肥満モデル動物であるZucker fattyラットに、糖質[パラチノース(P)またはシュクロース(S)]と脂質[オレイン酸(0)またはリノール酸(L)]の組合せを変えた4種類の食餌(PO、PL、SO、SL)を、4週間投与した。血液や肝臓、脂肪組織には上記の差を認めなかったが、P摂取による膵島の代償的肥大化の抑制が観察された。さらに、L摂取群では、膵島中心部へのグルカゴン陽性・細胞の局在が見られ、膵島細胞構造異常が示唆された。膵島面積に対するインスリン陽性・細胞の割合は、PO詳で最も高値、SL群で最も低値を示し、PL群とSO群は同等であった。L摂取群は、アポトーシス促進が観察された。SL群では、線維化とアポトーシスの両方が亢進したために・細胞の減少が著しく、PO群ではその両方が抑制されたために・細胞量が保持されたと考えられた。2)低GI食とキシリトールの組み合わせによるメタボリック症候群予防効果の解析(新井)キシリトールは血糖の上昇は示さないので、低GI食との組み合わせの効果について険討する。SDラットに高脂肪食にキシリトールを添加した食餌を投与し、脂質代謝について評価した。キシリトール投与群の内臓脂肪量、血清インスリン濃度、血清中性脂肪値、血清総コレステロール値は低値を示し、肝臓での脂肪酸酸化は促進し、脂肪合成は抑制された。3)食品の組み合わせによる末梢血白血球遺伝子発現の変動と食品安全性評価法の確立(山本)糖質と脂質の組み合わせ、および低GI食とキシリトールの組み合わせによる末梢血白血球遺伝子発現の変動を評価し、PDK4CおよびPTLAが食後高血糖および食品安全指標になる可能性が示唆された。
日仏語における指示語を伴った名詞句の共通点と相違点

日本語の「こ/そ/あ」、英語のthis/thatに見られる話し手と対象との間の距離の指標はフランス語の指示詞の場合、通常な現れない。「この少年」も「あの少年」もフランス語ではce gaconで表現される。ただ、celui-ci/celui-la^^`の場合、-ci/-la^^`の対立が「近/遠」の対立に対応するため、一見したところ「こ」と「そ」もしくは「あ」の対立に相当する関係が見られるのではないかと予測され、今回はデーターベース等を駆使しその対象研究を行った。その結果、celui-ciはcelui-la^^`に比べて、文脈指示用法における出現頻度がより高く、その場合il等のanaphoriqueな代名詞との対立で用いられることがわかった。そして、その用法を細かく観察していくと、フランス語における-ci/-la^^`は文脈指示用法においては、常に他の対象との対比のもとに特定の対象を限定する機能をもっていることもわかる。これはフランス語の中で、de^^′ictiqueな指示がanaphoriqueな指示を補完する関係にあることを示している。対象言語学敵艦点からは、距離の指標に基づいて対立相手なしでも使用されうる日本語の「こ」「あ」とフランス語の-ci/-la^^`は文脈指示用法では全く異なった機能を果たしていると結論づけることができ、現場指示用法における距離の指標は各国語においてかなり普遍的に観察できるものの、その指標の文脈指示用法におけるあらわれは、各国語の多様性によっていると予想されるのである。この研究成果は1996年6月の日本フランス語フランス文学会において口頭発表される。
細胞増殖抑制シグナルによる中心体一基底小体変換機構

一般に、一次繊毛は細胞休止期に形成されるが、増殖抑制シグナルによる中心体ー基底小体変換と一次繊毛形成の分子機構は不明である。本研究では、NDR2、TTBK2の一次繊毛形成における機能を解明することを目的として研究を行い、以下の成果を得た。1)NDR2の一次繊毛形成における機能解析:NDR2は一次繊毛形成に必要であるが、相同性の高いNDR1は一次繊毛形成に関与しない。この理由を解明するため、NDR1とNDR2の細胞内局在を解析し、C末端にAK配列をもつNDR1は細胞内に広く分布するが、C末端にGKL配列をもつNDR2はペルオキシソームに局在することを見出した。NDR2のC末端Leuを欠失した変異体はペルオキシソームに局在せず、NDR2の発現抑制による一次繊毛形成の抑制を回復できなかった。以上の結果から、NDR2のペルオキシソーム局在は一次繊毛形成に重要であることが示された。2)TTBK2の活性化機構と一次繊毛形成における役割:TTBK2キナーゼの活性化機構を解析し、TTBK2のC末端領域はN末端キナーゼドメインと結合し自己阻害領域として機能していること、Cep164はC末端領域と結合することで、この自己阻害を解除し、TTBK2のキナーゼ活性を促進することを見出した。3)アクチンダイナミクスによる一次繊毛形成の制御機構:LIMKやTESKなどのコフィリンリン酸化酵素はアクチン重合を促進し、一次繊毛形成を抑制することが知られている。低密度、血清存在という増殖条件下で培養した細胞にアクチン重合剤であるJasplakinolideを添加すると、意外なことに、一次繊毛形成が誘導されることを見出した。この際、細胞の球形化、接着の低下、Srcの不活性化、YAPの細胞質局在と不活性化、増殖停止が関与することを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。一次繊毛は、細胞外からの機械的・化学的刺激を受容・伝達するアンテナとして、細胞の増殖・分化の制御や組織の形成・恒常性維持に重要な機能を担っている。一次繊毛は細胞休止期に形成されるが、増殖抑制シグナルによる一次繊毛形成の分子機構は不明である。増殖抑制シグナルによって細胞が休止期に移行すると、母中心小体遠位での繊毛小胞の形成、繊毛小胞と細胞膜の融合、軸糸の伸長が連動的に起こり、中心体は基底小体に変換され、一次繊毛が細胞膜上に形成される。軸糸が伸長するためには、軸糸伸長阻害蛋白質であるCP110の母中心小体からの解離が必要であるが、CP110の解離機構は不明である。本研究では、Hippo経路の下流キナーゼであるNDR2、及び増殖抑制シグナル依存的に母中心小体に局在するTTBK2キナーゼを中心に、これらの活性化機構と一次繊毛形成における機能を解明することを目的として研究を行った。本年度は、TTBK2の活性化機構を解析し、母中心小体局在分子Cep164と結合するDNA損傷応答キナーゼATRによる活性化について検討し、TTBK2がATRによってリン酸化されること、ATR阻害剤によって一次繊毛形成が抑制されること、を見出した。また、TTBK2はCep164とDvlの解離を引き起こすことも見出した。インビトロキナーゼアッセイによってTTBK2の基質としてCP110, Cep97を同定したが、これらのタンパク質の母中心小体からの解離に対しては、TTBK2によるリン酸化だけでは十分ではないことを示す結果を得た。また、NDRキナーゼの活性化因子であるFurryがYAPの核移行を制御していることも明らかにした。これらの成果が得られたことから、おおむね順調に進展していると判断した。

NDR2のC末端Leuを欠失した変異体はペルオキシソームに局在せず、NDR2の発現抑制による一次繊毛形成の抑制を回復できなかった。以上の結果から、NDR2のペルオキシソーム局在は一次繊毛形成に重要であることが示された。2)TTBK2の活性化機構と一次繊毛形成における役割:TTBK2キナーゼの活性化機構を解析し、TTBK2のC末端領域はN末端キナーゼドメインと結合し自己阻害領域として機能していること、Cep164はC末端領域と結合することで、この自己阻害を解除し、TTBK2のキナーゼ活性を促進することを見出した。3)アクチンダイナミクスによる一次繊毛形成の制御機構:LIMKやTESKなどのコフィリンリン酸化酵素はアクチン重合を促進し、一次繊毛形成を抑制することが知られている。低密度、血清存在という増殖条件下で培養した細胞にアクチン重合剤であるJasplakinolideを添加すると、意外なことに、一次繊毛形成が誘導されることを見出した。この際、細胞の球形化、接着の低下、Srcの不活性化、YAPの細胞質局在と不活性化、増殖停止が関与することを明らかにした。TTBK2の活性化機構については、ATRによるリン酸化部位を同定し、ATRによる活性化とその増殖抑制シグナル依存性について検討する。また、Cep164との結合による活性化機構についても検討する。また、TTBK2によるCep164とDvlの解離については、その一次繊毛形成における機能を解析する。NDRとFurryについては、YAPの不活性化と一次繊毛形成の相関を解析する。また、CP110の除去を制御するキナーゼや結合因子について、さらに解析を進め、増殖抑制シグナルによる中心体ー基底小体変換機構を解明する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
狭線幅８ｅＶファイバーレーザーによる超高分解能角度分解光電子分光の開発

昨年度から定常運転可能となった8 eV励起の高分解能レーザーを用いた光電子分光を行い、Ba1-xKxFe2As2のブリルアンゾーンコーナーにあるクローバーポケットでの超伝導ギャップを精査した。その結果、クローバーポケットにおける超伝導ギャップの異方性は、Kドープ依存性を顕著に示し、K = 0.88ではサイズ1.6 meV程度の等方的なギャップ構造であったのが、K = 0.93, 0.97ではサイズ0 - 1.0 meV程度の異方的なギャップが開くことが分かった。また、K = 0.93, 0.97試料において存在する超伝導ギャップ最小を取る波数空間上での位置が、Kドーピング依存性を持つことも分かった。具体的には、K = 0.93ではフェルミ面のうち、一番ゾーンコーナー寄りの箇所で急激に超伝導ギャップが小さくなり、最小値を取る一方で、K = 0.97ではゾーンコーナー寄りの箇所で超伝導ギャップは小さくならないという大きな違いがある。その代わりK = 0.97ではゾーンセンターに近いフェルミ面の位置で超伝導ギャップが急激に小さくなる。こうした異方性の急激な違いがKドープ僅か3 %の違いで引き起こされ、熱伝導率の結果も加味すると、この違いは「ゾーンセンターFSとゾーンコーナーFS間のinter-band scattering」、「ゾーンセンターの2つのフェルミ面間のinter-band scattering」、「ゾーンコーナーFSにおけるフェルミ面内KZ方向でのintra-pocket scattering」という3種類のペア散乱の競合関係のうちどれが当該組成で支配的かということによって決定されるという内容を示唆する考察を得た。以上により、Ba1-xKxFe2As2のKオーバードープ領域では、スピン揺らぎが超伝導発現に支配的な役割を示すことが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。レーザーは狭い線幅を有するため、高分解能光電子分光用の光源としてその有用性を示してきたが、これまでの最高励起エネルギーが7 eVと放射光に比べて圧倒的に低かったために、銅酸化物や鉄系等の非従来型超伝導体における第一ブリルアンゾーン全体の測定が不可能であった。鉄系超伝導体ではBZの中心と境界に形成されるフェルミポケット同士の相互関係が超伝導の発現に大きく寄与することが理論的に予想されており、銅酸化物超伝導体ではBZ境界近傍でTc以上の高温から発現する擬ギャップ状態が超伝導発現機構を解明する上での重要な鍵を握ることが認知されているため、本研究課題で新たに励起エネルギー8 eVを有する高分解能レーザーを開発し、上記のフェルミ面における超伝導ギャップ測定が可能となった。この装置を立ち上げる過程で真空紫外レーザーのビームラインを構築し、極低温高分解能光電子分光装置と接続したが、途中に紫外領域用の波長板を追加し、自動回転できるチャンバーを取り入れたことで偏光依存性のデータも取ることが可能となった。鉄系超伝導体等のマルチバンド系では軌道成分を選り分けることが重要となるため、偏光可変性を得たことは他の光源にはない重要な進展となった。そして使用開始当初は高次高調波発生部分において出力の不安定性が見られたが、非線形光学結晶の品質向上および温度調節機構の大幅な改良により、物性実験を行う上で十分な安定性(2日以上安定した連続実験が可能)を得た。この光電子分光装置は、従来の放射光では到達できない最低温度1K、最高分解能約1.5meV、中心波長安定、高強度、等の性能をもち、非従来型超伝導体の超伝導状態を精査する手段として世界に類を見ない物となった。銅酸化物や鉄系等の非従来型超伝導体における第一ブリルアンゾーン全体の超伝導ギャップ測定を可能にすべく、本研究課題で新たに励起エネルギー8 eVを有する高分解能レーザーを実用化し、本年度中に定常運転するレベルに引き上げた。上記の通り安定した運転が可能となった高分解能レーザー光電子分光装置を用い、本年度は鉄系超伝導体Ba1-xKxFe2As2における超伝導ギャップ測定を行った。この系のうち、特にKオーバードープ領域(x=0.6-1.0)は超伝導転移温度が3 K - 15 Kと低く、分解能や到達最低温度の点で放射光では超伝導ギャップの精査が困難であったため、今まで7 eV励起のレーザーによる光電子分光によって超伝導ギャップ異方性が調べられてきた。7eV励起の場合、ブリルアンゾーンの中心付近にいる3枚のホールフェルミ面において超伝導ギャップを精査することが可能であるが、励起エネルギーが足りないためにブリルアンゾーンコーナーにあるクローバー型フェルミ面の測定が出来なかった。非弾性中性子散乱ではブリルアンゾーン中心とコーナーを結ぶ波数にスピン揺らぎが観測されているため、スピン揺らぎが超伝導発現に起因するかどうかを調べることで、この系の超伝導状態の理解が進むことが期待される。そこで、本研究課題で定常運転可能となった8 eV励起の高分解能レーザーを用いた光電子分光を行い、Ba1-xKxFe2As2(x=0.88、0.93、0.97、Tc =4-12 K)のブリルアンゾーンコーナーにあるクローバーポケットでの超伝導ギャップを精査した。

その結果、超伝導ギャップの異方性にKドーピング依存性があることが分かり、Kオーバードープ領域では特にスピンの揺動が超伝導状態に起因することが分かった。これらは放射光等の他光源では測定が困難なため、現状では本装置建設によってのみ達成される結果である。昨年度から定常運転可能となった8 eV励起の高分解能レーザーを用いた光電子分光を行い、Ba1-xKxFe2As2のブリルアンゾーンコーナーにあるクローバーポケットでの超伝導ギャップを精査した。その結果、クローバーポケットにおける超伝導ギャップの異方性は、Kドープ依存性を顕著に示し、K = 0.88ではサイズ1.6 meV程度の等方的なギャップ構造であったのが、K = 0.93, 0.97ではサイズ0 - 1.0 meV程度の異方的なギャップが開くことが分かった。また、K = 0.93, 0.97試料において存在する超伝導ギャップ最小を取る波数空間上での位置が、Kドーピング依存性を持つことも分かった。具体的には、K = 0.93ではフェルミ面のうち、一番ゾーンコーナー寄りの箇所で急激に超伝導ギャップが小さくなり、最小値を取る一方で、K = 0.97ではゾーンコーナー寄りの箇所で超伝導ギャップは小さくならないという大きな違いがある。その代わりK = 0.97ではゾーンセンターに近いフェルミ面の位置で超伝導ギャップが急激に小さくなる。こうした異方性の急激な違いがKドープ僅か3 %の違いで引き起こされ、熱伝導率の結果も加味すると、この違いは「ゾーンセンターFSとゾーンコーナーFS間のinter-band scattering」、「ゾーンセンターの2つのフェルミ面間のinter-band scattering」、「ゾーンコーナーFSにおけるフェルミ面内KZ方向でのintra-pocket scattering」という3種類のペア散乱の競合関係のうちどれが当該組成で支配的かということによって決定されるという内容を示唆する考察を得た。以上により、Ba1-xKxFe2As2のKオーバードープ領域では、スピン揺らぎが超伝導発現に支配的な役割を示すことが明らかとなった。本年度は鉄系超伝導体Ba1-xKxFe2As2のブリルアンゾーン端にあるクローバー型フェルミポケットにおける超伝導ギャップ測定を行った。超伝導ギャップを見積もるためには電子の状態密度を表すスペクトルをS/N良く取る必要があるが、昨年度はレーザー強度が弱かったために、長時間データをためる必要があり、測定中にサンプル位置が動く等の問題が存在していた。そこで、本年度はレーザー波長変換素子の温度調整機構の改良及び、ビームライン上に設置してあるレンズの安定性向上に努め、結果として昨年度比でデータ取得時の安定性が一桁程度上昇した。これは当初の予定を上回る成果であり、これによりBa1-xKxFe2As2の超伝導ギャップノードの波数位置を正確に決定することが出来るようになった。より具体的な内容を以下に記す。Ba1-xKxFe2As2(x=0.88、Tc =12 K)のブリルアンゾーンコーナーにあるクローバーポケットでの超伝導ギャップを精査した。その結果、クローバーポケットにおける超伝導ギャップの異方性は、Kドープ依存性を顕著に示し、K = 0.88ではサイズ1.5 meV程度の等方的なギャップであったのが、K = 0.93 0.97ではサイズ0 - 1.0 meV程度の異方的なギャップが開くことが分かった。
住血吸虫由来遊離型ＤＮＡの活動性感染の診断への応用

宿主の血液・尿・唾液等の体液中に存在する住血吸虫の分泌・代謝物由来のDNA断片「遊離型DNA」について、住血吸虫の活動性感染の診断マーカーとしての有用性を検討した。フィリピンで集団駆虫が実施されている日本住血吸虫症有病地の調査では、遊離型DNAは従来のゴールドスタンダード(糞便検査)の3.5-10倍の検出率であった。難治性輸入ビルハルツ住血吸虫症例では、駆虫後の虫卵消失に反して遊離型DNAは検出され続け、膀胱組織中からは虫卵が確認された。虫卵に依存しない遊離型DNAの検出は活動性感染をより正確に評価できることが期待され、治療効果判定や有病国の感染状況の把握に有用であると考えられた。住血吸虫症の診断は糞便(尿・組織)からの虫卵の検出がゴールドスタンダードであり、その他の従来法も虫卵に付随する事象を捉えている。これらは、宿主の中で生きている虫体や虫卵の存在を示す「活動性感染」を必ずしも正確に反映するものではない。本症の主たる病原は組織中に捕捉された虫卵によって惹起される。その虫卵が産生される前に早期診断・治療を行い、本症の重症化を防止することや正確な治療判定を実現するには、活動性感染を正確に把握出来る新しい診断法の開発が必須である。住血吸虫の遊離型DNAは主に虫体/虫卵の分泌・代謝物、テグメント等の剥離細胞由来のDNA断片で、宿主の血液・尿・唾液等の体液中に存在する。本研究では遊離型DNAの詳細を究明し、住血吸虫症の活動性感染の診断マーカーとして応用することを目的としている。平成25年度は以下の研究を行った。フィリピンの日本住血吸虫症有病地に赴き(3か所)、延べ140名を対象に住民健診を行い、62検体の生体材料(血清・尿)を収集した。検体中の遊離型DNAのデータは、腹部超音波所見(研究分担者・千種担当)、血清抗体価、糞便検査所見(フィリピン研究協力者)と比較解析中である。また、有病地での多検体解析に対応する目的でPCR-ELISAの系を確立し、半定量的解析が可能となったが、有病国での実施はこれからの課題である。研究成果の一部は第82回日本寄生虫学会大会(平成26年3月、松山市)、Journal of Clinical Microbiology、獣医寄生虫学会誌で発表した。また、Acta Tropicaに投稿中である。住血吸虫症の診断法は糞便(尿・組織)からの虫卵の検出が未だにゴールドスタンダードであり、他の従来法の殆ども虫卵に付随する事象に依存している。これらの従来法は、生きている虫体や病害を誘引する虫卵が宿主に存在する「活動性感染」を必ずしも正確に反映するとは限らない。活動性感染を正確に把握出来る新しい診断法の開発は、虫卵産生前の早期診断・治療の実現、本症の重症化の防止や正確な治療判定の実現等に貢献することが期待出来る。平成24年度は以下の研究を行った。フィリピンの日本住血吸虫症有病地に赴き(2か所・計3回)、延べ1583名を対象に住民健診を行い、約800検体の生体材料(血清・尿)を収集した。検体中の遊離型DNAのデータ(一部は現在も解析中)は、腹部超音波所見(研究分担者・千種担当)、血清抗体価、糞便検査所見(フィリピン研究協力者)との比較を行った。遊離型DNAは糞便中の虫卵に比較し検出率が高く、活動性感染を示す新しい診断マーカーとしての有用性を示唆する結果となった。住血吸虫の遊離型DNAは虫や虫卵からの分泌・代謝物由来のDNA断片と考えられ、宿主の血液・尿・唾液等の体液中に存在する。本研究では遊離型DNAを住血吸虫症の活動性感染の診断マーカーとして応用することを目的とする。平成26年度は以下の研究を実施した。フィリピン共和国北サマール州、ダバオデルノルテ州、コンポステラバレー州の日本住血吸虫症有病地(計9か村)において、延べ866名を対象に住民健診を実施し、一部から検体(血清・尿)を収集した。

持ち帰った検体からDNAを抽出し、遊離型DNAの検出を試みた。これまでの調査では、抗体保有率および慢性の日本住血吸虫症を示す肝臓の線維化陽性率が高い有病地でも、臨床検体中の遊離型DNAの検出率は比較的低い傾向にあった。これは集団駆虫などによって活動性感染が実際に減少していることもあるが、検体中のPCR阻害物質や宿主DNAの影響、検体保存方法の不備によるDNA失活の可能性も考えられた。そこで今回、PCR反応試薬中のマグネシウム濃度とdNTPs濃度の上昇や、PCR阻害物質を抑制する増幅試薬の使用によって、検出率が最大45%向上することが出来た。アザイド(終濃度0.02%)とエタノール(終濃度46.7%)を添加して保存した尿検体からDNAを抽出しPCRを実施した結果、それぞれ15.3%(9/59)、48.3%(29/60)の遊離型DNAが検出され、後者で有意な検出率の上昇がみられた(p<0.01)。また、室温保存6年経過後のエタノール処理尿からも遊離型DNAの検出を確認した。以上の結果より、比較的安価かつハイテクすぎない方法でも、電気の供給やコールドチェーンが不安定な有病地からの検体の回収・保存の問題を改善し、有病地の活動性感染状況をより正確に把握できることが見込まれた。本法の発展によって、将来的に住血吸虫症有病地の対策への貢献が期待できる。医歯薬学去年度に引き続き、フィリピンの日本住血吸虫症有病地で生体材料を収集することが出来たが、実験動物系での解析は感染が成立せず遂行できなかった。これまでの高度浸淫地におけるデータから、遊離型DNAは糞便中の虫卵に比較して検出率が高く、特に尿は大量の検体を非侵襲的に採取できることから血液よりも遊離型DNAが検出しやすいことが示唆された。しかしながら、有病地(現場)での応用化には、検体の取扱い・DNA抽出・PCR等の手順の簡便化、コスト面等の問題がある。25年度における研究実績は、得られた知見の一部を寄生虫学会や国内・国際誌で発表することが出来た点は有意義であり概ね一応の成果が得られたと考えたいが、残された課題も多い。実験動物系での解析は材料の都合上遂行できなかったが、フィリピンの日本住血吸虫症有病地に赴き(2か所・計3回)、約800検体の生体材料(血清・尿)を収集することが出来た。これまでの解析では遊離型DNAは糞便中の虫卵に比較し検出率が高く、活動性感染を示す新しい診断マーカーとしての有用性を示唆する結果が得られた。研究で得られた知見の一部を寄生虫学会やアジア地域の住血吸虫症研究集会に発表することが出来、特に後者は住血吸虫症の対策担当者・研究者等に研究成果を知ってもらえる点で有意義だったと考える。研究成果の国際誌への掲載は年度内に間に合わなかったが、現在投稿準備中のものも含め次年度には実現する予定である。以上より、24年度における研究実施は概ね一応の成果が得られたと考えたい。今後も(1)実験動物モデルと(2)住血吸虫症患者の臨床検体による遊離型DNAの動態解析を続行し、(3)有病地で実施可能な検体の取扱い、DNA抽出法や遊離型DNAの検出感度の向上を検討する目的で、リアルタイムPCRやLAMP法を検討する予定である。今後もこれまでのとおり(1)実験動物モデルによる遊離型DNAの動態解析(2)フィリピンの有病地を中心に住血吸虫症患者の臨床検体の収集・解析(3)検体の保存法・DNA抽出法の検討に沿って研究を遂行する予定であるが、特に進行が遅れている(1)実験動物モデルによる遊離型DNAの動態解析に重点を置く予定である。さらに(3)検体の保存法・DNA抽出法の検討に関連し、遊離型DNAの検出感度の向上と(半)定量化を図る目的で、PCR-ELISA法やリアルタイムPCRの検討を行う予定である。
血管内一酸化窒素濃度の実時間計測に基づく血管リハビリテーション法の開発

我が国の主な死因である虚血性心疾患や脳血管障害を抱えている患者は、動脈硬化による血管機能不全状態に陥っており、これらの患者の血管リハビリテーションと再発防止は重要である。一酸化窒素(NO)は血流による刺激で血管組織から生成し、血管の弛緩による血圧・血流を制御、動脈硬化の抑制などの様々な作用を有している。本研究では、血流中NOをリアルタイムに計測し、血管リハビリテーション法の定量的な評価方法の開発を試みた。その結果、計測法の開発とともにメタボリック症候群の血管機能評価、その他の生体機能を評価できるまでの成果を上げた。虚血性心疾患や脳血管障害に罹患した患者は、動脈硬化に伴う血管機能不全を有しており、これらの患者のリハビリテーションでは、血管機能をできるだけ健全な状態に誘導して維持することが、障害を受けた臓器の機能回復、血管疾患の再発防止の観点から重要である。本研究では、血管内皮細胞が血流による力学的刺激(ずり応力)を受けることで一酸化窒素(NO)を産生し、血管機能を正常に保ち、新たな血管病変を防ぐ点に注目し、リハビリテーションによって生じる血管運動のパターンに関連した血管内皮機能(NO産生能)を明らかにするため、血行力学的負荷時に、血管内皮細胞から産生されるNO濃度を血圧・血流情報と同時にリアルタイムで計測する方法を検討した。その結果、血行力学的負荷時のNO動態を評価可能である事が示された。虚血性心疾患や脳血管障害に罹患した患者は、動脈硬化の危険因子と、それに起因する血管機能不全を有しており、これらの患者のリハビリテーションでは、血管機能をできるだけ健全な状態に誘導して維持することが、障害を受けた臓器の機能回復、血管疾患の再発防止の観点から重要である。本研究では、血管内皮細胞が一酸化窒素(NO)を産生し、血管機能を正常に保ち、新たな血管病変を防ぐ点に注目し、リハビリテーションに関連した血管内皮機能(NO産生能)の状態を検討し、より正常な血管内皮機能の獲得、維持を目指したリハビリテーション法の開発を目指した。そこで、動脈硬化の危険因子と考えられる病態においても、血管内皮細胞から産生されるNO濃度を血圧・血流情報と同時にリアルタイムで計測する方法を検討した。その結果、動脈硬化症進展の重要な危険因子と考えられている、メタボリック症候群(インスリン抵抗性)の病態モデルにおいて、NO動態の異常から血管内皮機能の状態をユニークに評価可能である事が示された。血管内皮機能に関連する因子として、酸化ストレスと抗酸化力の両指標のレベルを評価するシステムを導入し、その基礎的な検討を行った。健常者と実験動物(イヌ)の血中濃度を計測したところ、健常者は両指標ともに正常レベルにあったが、イヌの酸化ストレスレベルはヒトの数分の1のレベルにあり、それに対して抗酸化力レベルはヒトと同レベルかそれを上回るレベルにあったことから、高い抗酸化力による酸化ストレスレベルの抑制メカニズムを備えていると推測された。今後、生活習慣病に関連して、人間ドックの患者などを対象に両指標の計測を実施し、NOレベルとの関連を検討し、血管リハビリテーションを実施した場合のこれらの指標の変動を評価し、リハビリテーション効果の定量的評価方法の確立を目指す。さらに本研究で開発したNOセンサーの応用を試みた。血管内皮機能障害が関連した対象として腹膜透析(CAPD)患者に注目し、使用済み透析液中のNO濃度を計測した。CAPDにおいて、NOは腹膜機能調節と維持に寄与しているとも推測されており、こうした面からもNO計測は重要である。結果は、使用済透析液中に計測可能なレベルでNOが存在し、さらに患者によってNO濃度が大きく異なっていることが明らかとなった。他の腹膜機能指標との関連はまだ評価できていないが、腹膜機能の指標としての可能性が示唆された。また、NO合成酵素の活性維持に必須である補酵素のテトラヒドロビオプテリン(BH4)の濃度をHPLC法で計測したところ、NO濃度との間に有意な正の相関が認められた。BH4は酸化ストレスの増加により、酸化され生理活性を失うため、BH4のbioavailabilityの変動がNO濃度の差異に関与し、腹膜の機能の変動にも影響しているのではないかと推測された。
光ファイバによる化学構造検出機能を付与したスマートマテリアルの検討

耐食FRPの化学的な腐食劣化に対し,光ファイバを利用したオンラインモニタリングにより非破壊で定量的評価を行うことを目的に研究を行った.まず,耐食FRP用マトリックス樹脂として使用されているイソフタル酸系不飽和ポリエステル樹脂を水酸化ナトリウム水溶液中に浸せきし,腐食挙動を観察したところ,表面から変色層を形成しながら腐食が内部に進行するタイプの腐食層形成型腐食であることが明らかになった.変色層はアルカリの浸入層および加水分解を受けた層と一致し,「変色層=浸入層=腐食層」であることが確認された.次に,このような腐食劣化をモニタリングする方法として,コア部分(光線透過部)を露出させた光ファイバを樹脂内に埋設することにより,光ファイバ内を通る光の波長特性の変化をフーリエ変換型赤外分光光度計(FT-IR)を用いて検出し,化学構造の変化を検出する機能を付与したスマートマテリアルの作製を試みた.昨年度,未硬化の液状樹脂と,その液状樹脂に水酸化ナトリウム水溶液を加えて加水分解反応を起こさせたものについてFT-IR分析を行い,エステルの加水分解を示すIRピークの変化が観察されたことから,本システムを用いて樹脂の加水分解による腐食劣化をオンラインモニタリングにより検知できる可能性を見出した.これについて,種々の条件における加水分解を確認するとともに,光ファイバを埋設した状態で硬化させた樹脂のモニタリングを検討した.この結果,アルカリ環境下では不飽和ポリエステル樹脂の加水分解が進行して透過光量の変化は得られるものの,赤外領域の光を十分透過するカルコゲナイドファイバ自身も損傷して最終的には溶解するために,波長特性の変化は非常に小さかった.そこで,硝酸環境下で劣化する系と比較した結果,劣化に伴う波長特性は異なり,劣化における化学反応の違いを検知することができることを見出した.これにより,化学構造の自己検出機能を持ったスマート材料の創製が可能となる.耐食FRPの化学的な腐食劣化に対し,光ファイバを利用したオンラインモニタリングにより非破壊で定量的評価を行うことを目的に研究を行った.まず,耐食FRP用マトリックス樹脂として使用されているイソフタル酸系不飽和ポリエステル樹脂を水酸化ナトリウム水溶液中に浸せきし,腐食挙動を観察したところ,表面から変色層を形成しながら腐食が内部に進行するタイプの腐食層形成型腐食であることが明らかになった.変色層はアルカリの浸入層および加水分解を受けた層と一致し,「変色層=浸入層=腐食層」であることが確認された.次に,このような腐食劣化をモニタリングする方法として,コア部分(光線透過部)を露出させた光ファイバを樹脂内に埋設することにより,光ファイバ内を通る光の波長特性の変化をフーリエ変換型赤外分光光度計(FT-IR)を用いて検出し,化学構造の変化を検出する機能を付与したスマートマテリアルの作製を試みた.昨年度,未硬化の液状樹脂と,その液状樹脂に水酸化ナトリウム水溶液を加えて加水分解反応を起こさせたものについてFT-IR分析を行い,エステルの加水分解を示すIRピークの変化が観察されたことから,本システムを用いて樹脂の加水分解による腐食劣化をオンラインモニタリングにより検知できる可能性を見出した.これについて,種々の条件における加水分解を確認するとともに,光ファイバを埋設した状態で硬化させた樹脂のモニタリングを検討した.この結果,アルカリ環境下では不飽和ポリエステル樹脂の加水分解が進行して透過光量の変化は得られるものの,赤外領域の光を十分透過するカルコゲナイドファイバ自身も損傷して最終的には溶解するために,波長特性の変化は非常に小さかった.そこで,硝酸環境下で劣化する系と比較した結果,劣化に伴う波長特性は異なり,劣化における化学反応の違いを検知することができることを見出した.これにより,化学構造の自己検出機能を持ったスマート材料の創製が可能となる.耐食FRPの化学的な腐食劣化に対し,オンラインモニタリングにより非破壊で定量的評価を行うことを目的に研究を行った.まず,耐食FRP用マトリックス樹脂として使用されているイソフタル酸系不飽和ポリエステル樹脂を水酸化ナトリウム水溶液中に浸せきし,腐食挙動を観察したところ,表面から変色層を形成しながら腐食が内部に進行するタイプの腐食層形成型腐食であることが明らかになった.変色層は加水分解を受けた層と一致し,「変色層=腐食層」であることが確認された.次に,このような腐食劣化をモニタリングする方法として,光ファイバのコア部分(光線透過部)を露出させて樹脂と接触させることにより,光ファイバ内を通る光の波長特性の変化をフーリエ変換型赤外分光光度計(FT-IR)を用いて検出することを試みた.光ファイバと樹脂の濡れ性がよい状態で実験を行うため,未硬化の液状樹脂中にコア露出光ファイバを埋設した.この液状樹脂に水酸化ナトリウム水溶液を加えて加水分解反応を起こさせ,FT-IR分析を行った結果,エステルの加水分解を示すIRピークの変化が観察された.以上のことから,本システムを用いて樹脂の加水分解による腐食劣化をオンラインモニタリングにより検知できる可能性を見出した.この方法は,エステルの加水分解だけでなく,IRピークが顕著に変化する系であれば,他の材料例えばエポキシ樹脂やビニルエステル樹脂にも適用できる.今後は,樹脂硬化物の腐食劣化のモニタリングを行っていく.耐食FRPの化学的な腐食劣化に対し,光ファイバを利用したオンラインモニタリングにより非破壊で定量的評価を行うことを目的に研究を行った.まず,耐食FRP用マトリックス樹脂として使用されているイソフタル酸系不飽和ポリエステル樹脂を水酸化ナトリウム水溶液中に浸せきし,腐食挙動を観察したところ,表面から変色層を形成しながら腐食が内部に進行するタイプの腐食層形成型腐食であることが明らかになった.

変色層はアルカリの浸入層および加水分解を受けた層と一致し,「変色層=浸入層=腐食層」であることが確認された.次に,このような腐食劣化をモニタリングする方法として,コア部分(光線透過部)を露出させた光ファイバを樹脂内に埋設することにより,光ファイバ内を通る光の波長特性の変化をフーリエ変換型赤外分光光度計(FT.IR)を用いて検出し,化学構造の変化を検出する機能を付与したスマートマテリアルの作製を試みた.昨年度,未硬化の液状樹脂と,その液状樹脂に水酸化ナトリウム水溶液を加えて加水分解反応を起こさせたものについてFTIIR分析を行い,エステルの加水分解を示すIRピークの変化が観察されたことから,本システムを用いて樹脂の加水分解による腐食劣化をオンラインモニタリングにより検知できる可能性を見出した.これについて,種々の条件における加水分解を確認するとともに,光ファイバを埋設した状態で硬化させた樹脂のモニタリングを検討した.この結果,アルカリ環境下では不飽和ポリエステル樹脂の加水分解が進行するものの,赤外領域の光を十分透過するカルコゲナイドファイバ自身も損傷して最終的には溶解するために,透過光量の変化は得られるものの,波長特性の変化を検知することができなかった.そこで,酸環境下で劣化する系で検討を進めた結果,波長特性としては弱いものの,十分劣化に起因する化学構造の変化を検知することを見出した.
StAR蛋白質結合蛋白質(SBP)のステロイドホルモン産生における役割の解明

ステロイドホルモン合成を調節するSteroidogenic acuteregulatory protein (StAR)蛋白質と結合するStAR蛋白質結合蛋白質(SBP)のステロイドホルモン産生における役割を解明した。1. SBPのプロモーター解析SBP遺伝子の転写開始点が複数存在することは以前から知られていた。エクソン1では大まかには2種類ある。エクソン1aと1bである。それぞれのプロモーター領域をレポーター遺伝子pGL_4に組み込み、転写活性を測定した。副腎癌細胞H295R細胞では1aのプロモーター活性は1bに比べて100倍以上に高いことが判明した。また、コレステロール硫酸を培養細胞に2μg/ml加えると、転写活性は増加することが判明した。SBP遺伝子とコレステロール硫酸がリガンドであるRORαがSBPの発現に関与することが明らかになった。2.コレステロール硫酸とSBPの解析StAR蛋白質のC端側と相同性の高いドメインはコレステロールをはじめ脂質が結合する領域であるため、StAR関連脂質転送(START)ドメインと命名された。SBPはSTARTドメインに結合する。SBP蛋白質、StAR蛋白質およびコレステロール硫酸の関連をステロイドホルモンの産生の観点から解析し、コレステロール硫酸のステロイドホルモンの産生に与える影響について明らかにした。3.無精子症とSBP遺伝子の関連非閉塞性無精子症および乏精子症の患者のSBP遺伝子変異をRT-PCRとダイレクトシークエンス法により解析した。SBP蛋白質構造の変化が無精子症との関連に相関することを明らかにした。(1)SBP遺伝子のステロイドホルモン産生におよぼす作用(2)無精子症とSBP遺伝子の関連非閉塞性無精子症および乏精子症の患者のSBP遺伝子変異をRT-PCRとダイレクトシークエンス法により解析した。(3)細胞死の解析siRNAによりSBPの発現を抑制すると、培養細胞は細胞死を起こす。細胞毒性テストによりLDHおよびCaspase-3/7の酵素活性を測定し、細胞死のメカニズムについてアポトーシスかネクローシスを解析した。細胞死のメカニズムとしてはアポトーシスであることが判明した。イーストのハイブリット法によりSBP蛋白質と結合する蛋白質を解析した。候補蛋白の局在を同定し、SBPがエンドゾームに局在することを明らかにした。1.SBP老ステロイドホルモン産生の解析ステロイドホルモンの産生の律速段階はコレステロールをミトコンドリアの内膜に輸送する段階であり、StAR蛋白質がステロイドホルモンの産生を調節している。下垂体ホルモン(LH, FSHおよびACTH)の作用は内因性cAMPの増加による。今回、SBPのプロモーター1aと1bについてクローニングすることに成功した。2.SBPの細胞機能の解析SBPはSTARTドメインに結合する。SBP蛋白質のコレステロールおよびリン脂質の輸送機構をGFP融合蛋白質を作成し、SBPとコレステロールの細胞内の移動を形態学的に明らかにした。3.卵巣機能不全とSBP遺伝子ステロイドホルモンの産生不全から生じる疾患は単一な遺伝子疾患よりもむしろ多因子疾患である可能性がある。ステロイドホルモンの産生に関与する因子は複数の因子が複雑に関連している。ステロイドホルモンの産生に関与する卵巣機能不全、月経異常、不妊症、流産、寡少精子症、不育症あるいは多嚢胞性卵巣における疾患のうち、SBPの遺伝子多型と寡少精子症の関連が明らかになった。1.SBPのプロモーター解析SBP遺伝子の転写開始点が複数存在することは以前から知られていた。

SBP遺伝子とコレステロール硫酸がリガンドであるRORαがSBPの発現に関与することが明らかになった。2.脂質輸送とSBPとの関連StAR蛋白質のC端側と相同性の高いドメインはコレステロールをはじめ脂質が結合する領域であるため、StAR関連脂質転送(START)ドメインと命名された。SBPはStAR蛋白質のSTARTドメインに結合することを明らかにした。3.婦人科腫瘍とSBP遺伝子StAR蛋白質は卵巣癌では腫瘍間質、子宮内膜癌では間質および子官内膜癌組織に発現を認め、子宮内膜癌では癌組織における局所のステロイドホルモンの産生を認めている。SBP遺伝子のマウス卵巣および副腎における発現を解析し、SBP遺伝子が正常卵巣では内夾膜細胞、顆粒膜細胞および副腎では皮質に発現することが明らかになった。悪性腫瘍における発現は解析している。1.SBPのステロイドホルモン調節機構の解析性腺組織におけるSBP遺伝子発現に関するプロモーター領域を解析した。レポーターアッセイにより遺伝子発現に関与する転写因子を解析した。SBPおよびStAR遺伝子の発現をPCR法により解析し、SBPおよびStAR遺伝子発現およびステロイドホルモンの調節機構を明らかにした。2.コレステロール硫酸とSBPの解析StAR蛋白質のC端側と相同性の高いドメインはコレステロールをはじめ脂質が結合する領域であるため、StAR関連脂質転送(START)ドメインと命名された。SBPはSTARTドメインに結合する。SBP蛋白質、StAR蛋白質およびコレステロール硫酸の関連をステロイドホルモンの産生の観点から解析し、コレステロール硫酸のステロイドホルモンの産生に与える影響について明らかにした。3.SBPと疾患の解析コレステロール硫酸はステロイドスルファターゼ(STS)により脱硫酸化を受けてコレステロールになる。STSにより細胞内に増加したコレステロールがStAR蛋白質およびSBP蛋白質に与える影響について解析し、StAR蛋白質の発現が低下することを明らかにした。StAR蛋白質の発現をコントロールすることによりステロイドホルモンの産生を調節することを明らかにした。先天性リポイド副腎過形成の卵巣のSBPの発現を免疫染色法を用いることにより明らかにした。
光応答にからむ果実生理へのABA依存性の解明およびABAのオキシリピンへの影響

ブドウの成熟に及ぼすIPT(イソプロチオラン:イネいもち病防除剤)およびNDGA(ABA生合成抑制剤)の影響を検討した。IPTおよびNDGA処理はブドウ果皮のクロロフィル減少を抑制した。次世代シーケンサー(NGS)を供試したトランスクリプトーム解析の結果、無処理区と比較してIPT処理区では2218遺伝子、またNDGA処理区では2270遺伝子の発現についての相違が認められた。IPTおよびNDGA処理は植物ホルモンであるアブシシン酸(ABA)、オーキシンおよびエチレン代謝を制御した。これらの植物ホルモンはいずれも植物の老化に関与する物質である。MapMan解析およびqRT-PCR解析は、ABA代謝経路上でのネオキサンチン酸化開裂酵素遺伝子(VvNCED1:ABA合成に関連するの鍵遺伝子),VvCYP707A1(ABA水酸化酵素遺伝子:ABAの代謝に関連), VvAAO4およびVvGEM様遺伝子がIPTおよびNDGA処理により同様に負に制御されることを示した。さらにIPTおよびNDGA処理は糖代謝経路上のVvSUS, VvAI, VvHT遺伝子を経由して、ブドウの主要な糖であるグルコース代謝を抑制した。さらに、IPTおよびNDGA処理はVvLOX, VvADH, VvGPPS, VvTPSのような香気成分代謝経路上の遺伝子発現を抑制し、香気成分合成も阻害した。これらの結果はIPTおよびNDGA処理が成熟過程において、クロロフィル発現、ABA蓄積、糖合成、および香気成分合成に影響することを示唆する。ブドウは貯蔵性が高くない果実であるがIPTあるいはNDGAの利用により、今後ブドウの貯蔵性を高める技術としての可能性が示唆された。今回はABA非依存のIPTおよびABA合成抑制物質であるNDGAを供試して、ブドウの成熟に及ぼす影響を、次世代シーケンサー(NGS)で解析を行い、影響を受ける遺伝子を網羅的に解析することができ、計画通りの試験が実行でき成果を得ることができた。NGS解析前はブドウにおけるIPTの作用性については不明であったが、NDGAと極めて類似した作用性を示すことが示唆され、ブドウの成熟制御および貯蔵性向上への実用的な利用について検討する予定である。NGS解析により、ブドウの成熟に及ぼすIPTおよびABAの作用性が明らかになったので、今後は光質とABA合成およびABAのシグナル伝達がブドウの成熟に及ぼす作用性を解明する。すなわち、ABAの成熟への関わりが質的なものか、あるいは量的なものかを明らかにする。一般に、アブシシン酸は果実のポリフェノール合成、糖代謝および気孔開閉等に密接に関与するとして知られる物質であるが、ブドウ果粒のポリフェノール、糖代謝および香気成分濃度に及ぼす影響については不明な点が多いため検討した。最初にブドウ果粒の着色などに影響するアブシシン酸の合成部位を明らかにした。従来の試験では、葉の切除などにより葉からのアブシシン酸合成を遮断することが試みられたが、この場合には光合成産物も遮断されてしまうため、本実験ではアブシシン酸の上記成分に及ぼす影響を明らかにするため、アブシシン酸合成阻害剤NDGAあるいはアブシシン酸受容体アンタゴニストであるAS-6を処理し、ブドウにおけるアブシシン酸の合成部位を明らかにすることを試みた。その結果、葉におけるアブシシン酸合成を阻害した場合、果房のアブシシン酸濃度、アブシシン酸合成の鍵酵素であるネオキサンチン酸化開裂酵素遺伝子であるNCED1およびアブシシン酸の代謝に関連するアブシシン酸8'位水酸化酵素遺伝子であるCYP707A1の発現レベルが無処理区に比べ大きく低下したため、葉で合成されるアブシシン酸が果粒の上記成分に密接に影響するものと考えられた。ブドウ果房にNDGAもしくはAS-6を処理した場合、アントシアニン濃度、糖濃度および香気成分が無処理に比較し有意に低下したため、内生アブシシン酸がこれら成分に有意に影響しているものと考えられた。このほかエステル、アルコールなどブドウの香気線分に関連する遺伝子発現も同様な傾向を示した。平成28年度はブドウのアントシアニン合成、糖合成およびアントシアニン合成などに及ぼす内生ABAの影響について、樹体内におけるABAの合成部位も含めて詳細に検討した。得られた結果は有意性があり、当初予定していた内容について計画通り進行したと考えられた。植物ホルモンであるアブシシン酸とは直接的な関連性はないものの、ブドウ果実のアントシアニン合成、糖代謝および香気成分合成に影響すると考えられるイソプロチオランのブドウに及ぼす影響を、および光の影響に関して、アブシシン酸濃度、糖代謝および香気成分合成について検討した。さらに、アブシシン酸とともにアントシアニン合成などブドウ果粒の成熟に影響すると考えられる光質について検討した。処理は太陽光利用型植物工場において、1:青色LED照射区(満開後より果房および葉を中心に照射)、2:青色LEDおよびAS-6(アブシシン酸レセプターアンタゴニスト)処理区、3:AS-6処理区、4:イソプロチオラン処理区、5:無処理区の5区を設けた。アントシアニン濃度は高速液体クロマトグラフィー、内生アブシシン酸濃度はガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー、アントシアニン合成に関連する遺伝子であるUFGTおよびMYB遺伝子、内生アブシシン酸代謝に関連するネオキサンチン酸化酵素遺伝子およびアブシシン酸水酸化酵素遺伝子、並びに香気成分合成に関与する遺伝子発現についてはリアルタイムPCR装置により解析した。アントシアニン合成に関しては、1:青色LED光照射区が有意に高く、一方3:AS-6処理区および4:イソポロチオラン処理区では最も低下した。

2:青色LEDおよびAS-6は無処理区より増加する傾向であり、これらの値はアントシアニン合成に関与するUFGTおよびMYB遺伝子の発現とも一致した。これらの結果は、内生アブシシン酸はブドウのアントシアニン合成などに影響するものの、光の影響がより強く影響する可能性を示唆した。また、イオプロチオランのアントシアニン合成に及ぼす影響を確認した。本年度は植物ホルモンであるアブシシン酸とは直接的な関連性はないものの、ブドウ果実のアントシアニン合成、糖代謝および香気成分合成に影響すると考えられるイソプロチオランのブドウに及ぼす影響を、アブシシン酸濃度、糖代謝および香気成分合成の観点から計画通り解析した。ブドウの成熟に及ぼすIPT(イソプロチオラン:イネいもち病防除剤)およびNDGA(ABA生合成抑制剤)の影響を検討した。IPTおよびNDGA処理はブドウ果皮のクロロフィル減少を抑制した。次世代シーケンサー(NGS)を供試したトランスクリプトーム解析の結果、無処理区と比較してIPT処理区では2218遺伝子、またNDGA処理区では2270遺伝子の発現についての相違が認められた。IPTおよびNDGA処理は植物ホルモンであるアブシシン酸(ABA)、オーキシンおよびエチレン代謝を制御した。これらの植物ホルモンはいずれも植物の老化に関与する物質である。MapMan解析およびqRT-PCR解析は、ABA代謝経路上でのネオキサンチン酸化開裂酵素遺伝子(VvNCED1:ABA合成に関連するの鍵遺伝子),VvCYP707A1(ABA水酸化酵素遺伝子:ABAの代謝に関連), VvAAO4およびVvGEM様遺伝子がIPTおよびNDGA処理により同様に負に制御されることを示した。さらにIPTおよびNDGA処理は糖代謝経路上のVvSUS, VvAI, VvHT遺伝子を経由して、ブドウの主要な糖であるグルコース代謝を抑制した。さらに、IPTおよびNDGA処理はVvLOX, VvADH, VvGPPS, VvTPSのような香気成分代謝経路上の遺伝子発現を抑制し、香気成分合成も阻害した。これらの結果はIPTおよびNDGA処理が成熟過程において、クロロフィル発現、ABA蓄積、糖合成、および香気成分合成に影響することを示唆する。ブドウは貯蔵性が高くない果実であるがIPTあるいはNDGAの利用により、今後ブドウの貯蔵性を高める技術としての可能性が示唆された。今回はABA非依存のIPTおよびABA合成抑制物質であるNDGAを供試して、ブドウの成熟に及ぼす影響を、次世代シーケンサー(NGS)で解析を行い、影響を受ける遺伝子を網羅的に解析することができ、計画通りの試験が実行でき成果を得ることができた。NGS解析前はブドウにおけるIPTの作用性については不明であったが、NDGAと極めて類似した作用性を示すことが示唆され、ブドウの成熟制御および貯蔵性向上への実用的な利用について検討する予定である。平成29年度はABAの代謝を制御しているABA8'水酸化酵素阻害剤であるアブシナゾールおよびABAとは直接に関連性を持たない、イソプロチオラン剤の処理によるブドウのアントシアニン、糖および香気成分合成に及ぼす影響を検討する予定である。