hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒルシュスプルング病に対する腸管神経系の分化誘導による新しい再生治療法の開発

まず、ヒルシュスプルング病(HD)における腸管神経系の動態異常を調べるにあたり、神経線維の増生や方向性に深くかかわる、微小管に着目した。一般的に、チューブリンのアセチル化は微小管構造の調節および安定性に関与し、神経細胞の様々な機能において重要な役割を果たしているが、今回我々は、前年度に作製したHDモデルマウスであるエンドセリンB受容体(EDNRB)ノックアウトマウス(KO)の胎仔腸管の神経細胞におけるアセチル化チューブリン(Ac-Tub)の発現と神経線維増生との関連を検討した。胎生期13.5日(e13.5)、16.5日(e16.5)の胎仔より有神経堤細胞領域の腸管を採取し、神経細胞マーカーTuj 1抗体とAc-Tub抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、Tuj1陽性神経細胞におけるAc-Tubの発現パターンを調べた。また、Sox10は、未熟な神経細胞には発現するが、成熟すると発現しないため、Tuj1とSox10を共発現する細胞の割合を算出し、神経細胞の成熟度も調べた。Sox10発現細胞はe13.5およびe16.5においてTuj1陽性(+)あるいは陰性(-)を示し、WT群とKO群間で顕著な違いは見られなかった。E16.5おけるSox10とTuj1を共発現する細胞の割合は、KO群でWTに比べ有意に高かった。Tuj1(+)の細胞体におけるAc-Tub発現率は、e13.5からe16.5においてWT群では減少し、KO群では増加する傾向があった。すなわち、HD腸管においては未熟な神経細胞の割合が高く、また、チューブリンの過剰なアセチル化が、HD腸管の正常な神経線維の増生を阻害する可能性が示唆された。今年度に実施する予定であった、HD腸管におけるラミニンの効果を調べる実験は、昨年度に前倒して行い、HD腸管においては、正常腸管でみられたラミニン添加による神経発達効果はみられず、またHD腸管における無神経節腸管のラミニンの発現は高いことが示唆された。この結果を踏まえ、今年度はラミニンの受容体であるインテグリンに着目し、腸管におけるインテグリンの発現の調査を開始したが、免疫染色の条件設定を調整するにとどまった。今年度は、同時進行にて、神経細胞の発達において非常に重要な働きを持つ微小管のチューブリンのアセチル化に着目し、上記結果を得た。来年度は一昨年度の結果を踏まえ、正常腸管とHD腸管におけるラミニンの受容体であるインテグリンの発現を免疫染色およびRTーPCRにて調査し、部位別・発達段階別に調査する予定。まず、腸管神経のみが蛍光発色するSOX10-VENUSマウスと、エンドセリンレセプターB欠乏マウスを交配し、新しいヒルシュスプルング病(HD)モデルマウスを作製した。次に、ラミニンのHD腸管における発現を、免疫染色とISHにて調査した。胎生13.5日の腸管(中腸、近位後腸、遠位後腸)におけるラミニンー1の発現を免疫染色にて比較すると、すべての部位において、コントロールと比べ、HDマウスの無神経節腸管におけるラミニン-1の発現が高いことが示された。続けて、HD腸管における、ラミニンの神経伸長効果について調べた。申請者らは以前、正常腸管において、ラミニン添加により無添加の腸管より有意に腸管神経系の発達が促進されることをすでに示したが、今回のHD腸管では、その結果とは異なり、ラミニン添加による、神経発達効果は認められなかった。免疫染色にてHDマウスの無神経節腸管におけるラミニン-1の発現が高かった結果を踏まえると、HD腸管において、ラミニンの利用障害がある可能性が示唆された。初年度には、ラミニンの局在を免疫染色及びISHにて調べる予定であったが、ISHのセットアップや条件設定に時間がかかり、免疫染色のみにとどまった。そのため、次年度以降に行う予定であった、ラミニンのHD腸管における効果を調べる実験を行った。

Tuj1(+)の細胞体におけるAc-Tub発現率は、e13.5からe16.5においてWT群では減少し、KO群では増加する傾向があった。すなわち、HD腸管においては未熟な神経細胞の割合が高く、また、チューブリンの過剰なアセチル化が、HD腸管の正常な神経線維の増生を阻害する可能性が示唆された。今年度に実施する予定であった、HD腸管におけるラミニンの効果を調べる実験は、昨年度に前倒して行い、HD腸管においては、正常腸管でみられたラミニン添加による神経発達効果はみられず、またHD腸管における無神経節腸管のラミニンの発現は高いことが示唆された。この結果を踏まえ、今年度はラミニンの受容体であるインテグリンに着目し、腸管におけるインテグリンの発現の調査を開始したが、免疫染色の条件設定を調整するにとどまった。今年度は、同時進行にて、神経細胞の発達において非常に重要な働きを持つ微小管のチューブリンのアセチル化に着目し、上記結果を得た。初年度の実験において、ヒルシュスプルング病腸管におけるラミニンの利用障害が示唆されたため、利用障害の原因として、ラミニンのレセプターであるインテングリンに着目し、ヒルシュスプルング病腸管におけるインテグリンの発現を調査することとした。HD腸管の部位別、ステージ別に、免疫染色およびPCRにてインテグリンの発現を調査する。来年度は一昨年度の結果を踏まえ、正常腸管とHD腸管におけるラミニンの受容体であるインテグリンの発現を免疫染色およびRTーPCRにて調査し、部位別・発達段階別に調査する予定。海外で行われる国際学会で発表する予定であったが、国内で開催された国際学会へ参加し、海外へは行かなかったため、旅費が大幅に削減された。
栽培植物に窒素固定力を付与する試み

本年度は、ミヤコグサおよびアルファルファを用いてトランスポゾンタギングを行うため、ミヤコグサ(Gifu strain)およびアルファルファ(ランジェランダダ-)を用いてトウモロコシのトランスポゾンの系(AcおよびDs)を導入することを試みた。ミヤコグサではグリーンカルスの形成率は高いが、最終的にシュート形成し、形質転換植物になるものはなかった。アルファルファではシュート形成の率が高く、最終的にDs導入では3つの個体を得、Ac導入では個体は得られていない。アルファルファについては、当初試行錯誤を繰り返していたが、一定の条件で形質転換植物を得る方法が確立された。またミヤコグサより分離した根粒菌を用い、4リットル培養液よりシグナル分子の分離を試みた。結果、アピジェニンによるシグナル分子誘導では、合成がほとんど起こらないことが判明したので、クリシン、ネリンゲニンを用いたが、ナリンゲニンで誘導されることが分かった。そこで、これらのHPLCフラクションをマススペクトルなどで構造決定中である。さらに、茎粒菌(Azorhizobium caulinodans)の根粒形成関与遺伝子をTn5変異導入により分離し、構造解析を行うことも行なっている。今年度はTn5変異株486株を作製し、根粒形成試験を行なった。しかしながら、全ての株が根粒形成し、目的部分の変異株は得られていない。これは、茎粒菌のゲノムサイズが大腸菌にくらべて非常に大きいことが原因ではないかと考えられる。現在、不定根の伸長を著しく促進する株を1株得ており、これが茎粒形成となんらかの係わりをもつのか検討する予定である。
極性溶媒分子を絶縁層にもつ層状有機超伝導体における新奇な電子状態の探索と解明

有機超伝導体k_H_(DMEDO-TSeF)_2_[Au(CN)_4_](THF)の層間相互作用が極めて小さいインコヒーレント系であり、結晶学的に異なる2種類の伝導層が異なるバンド充填率をもつことを、磁気抵抗の実験がら明らかにした。これは極性溶媒分子であるTHFの配列に起因するものであると考えられる。超伝導層と電荷秩序層からなる有機超伝導体ka'2-(BEDT-TTF)_2_Ag(CF_3_)_4_(TCE)のフェルミ面を明らかにした。1994年に開発されて以来およそ20年もの間構造が不明であった有機超伝導体(BEDT-TTF)_2_Cu(CF_3_)_4_(TCE)の結晶構造を解明した。平成25年度は1994年に米国のグループで開発された有機超伝導体である(BEDT-TTF)_2_Cu(CF_3_)_4_(TCE)の高Tc相の構造を決定することに成功した。Ag(CF_3_)_4_塩では2種類の高Tc相が存在したが、Cu(CF_3_)_4_塩では1種類であることが過去の実験結果からも示唆されているため、安定な構造が判明することになった。具体的にはBEDT-TTFがk(kappa)型と呼ばれる井桁状に配列した層と、a'(alpha prime)型と呼ばれる捩じれながら積層した層が溶媒分子1,1,2-トリクロロエタン(TCE)を含有するアニオン層を挟んで交互に積層した層状の超伝導体である。Ag(CF_3_)_4_の2つの高Tc相と比較すると、Tc = 9.5 Kの三斜晶の相と同型のka'1型である。単位胞の体積がAg(CF_3_)_4_塩よりも小さいことは、アニオンの大きさを反映していると考えられる。また、同じ化学組成の低Tc相と異なり、アニオンと溶媒分子の乱れはない。溶媒分子TCEの立体構造にはCl原子の位置関係が異なる物同士(対掌体)、1:1の割合で結晶に含まれていることが明らかになったが、これは元の溶媒分子における存在比率を反映していると考えられる。BEDT-TTF分子の結合長からa'層は電荷秩序状態であることが明らかになった。したがって、超伝導を担うのはk層のみであり、伝導シート間距離が大きい極めて2次元性の強い物質である。磁気トルクと抵抗測定の結果から、Tc = 9.4 Kの超伝導体であることを確認した。磁気抵抗から決めた上部臨界磁場(Hc2)の温度依存性から見積もった伝導シート間方向のコヒーレンス長が伝導シートであるk層の厚みに比して十分に短いことから、本物質は2次元超伝導体であると考えられる。極性溶媒分子が強誘電的に配列した絶縁層が互いに反強誘電的にドナー層を挟んだ構造を有する物質、kappa_H_-(DMEDO-TSeF)_2_[Au(CN)_4_](THF)の強磁場角度依存磁気抵抗において新しい現象を発見した。擬2次元系では伝導シートに対して水平近傍の磁場下では、面間方向の抵抗がピークをもつことが知られている。これは、たわんだシリンダー状のフェルミ面によるもので、ピーク幅から面間方向の相互作用を見積もることに利用されている。つまり、ピーク幅は磁場には依存しない。しかし、本物質ではピーク幅が強磁場ほど小さくなる現象を示す。解析の結果ピーク幅は面間方向の磁場の大きさでスケールされることを見出した。これは面間の相互作用が極めて小さいインコヒーレント系(面間方向に電子が移動する確率よりも面内で散乱される確率が大きい)において起こりうる、アンダーソン局在の一種として理論的に説明された。さらに、量子振動により観測されたフェルミ面が2種類あるが、これは結晶学的に異なる伝導シートのバンド充填率が異なる場合にのみ可能である。このようなバンド充填率の異なる伝導シートが絶縁層を挟んで積層している構造が可能なのは、絶縁層の極性分子の配列によると考えられる。極性溶媒分子が陰イオンを分極させて、ドナー層から抜き取る電子の数が2通りになったと説明できる。これは、極性溶媒分子の存在によって引き起こされた新規な電子状態である。平成26年度は1994年に米国のグループで開発された有機超伝導体である(BEDT-TTF)_2_Ag(CF_3_)_4_(TCE)の高T_c_相のひとつであるkappa-alpha'_1相の超伝導特性とフェルミ面を実験により明らかにした。

この物質は電荷秩序層であるalpha'層と超伝導を担うkappa層がアニオンを挟んで積層した構造であるため、極めて伝導シート間距離が大きい。それにもかかわらず、面間方向の電気抵抗の温度依存性は通常のkappa型有機伝導体のそれと酷似していることを見出した。抵抗測定から見積もった超伝導転移温度は9.5 Kと磁気トルクの結果とよく一致した。また、上部臨界磁場の温度依存性から見積もった伝導シート垂直方向のコヒーレンス長はkappa層の厚みに比して十分に短いことから、この物質は2次元超伝導体であると考えられる。さらにこの物質の結晶学的に独立な分子の数が多いことから、分子の結合距離から見積もったバンド充填率のエラーが大きい。そこでkappa層が他のkappa型超伝導体と同様の1/2充填率バンドか否かを確認するために量子振動の実験を行った。量子振動の結果は実効的に1/2充填率バンドのシリンダー型のフェルミ面が存在することを明確に示した。また、バンド分散から計算されたサイクロトロン質量に比べて大きな有効質量が観測されたことから、超伝導転移温度T_c_が大きい物質ほど測定される有効質量と裸の有効質量の比が大きい傾向があると考えられる。有機超伝導体研究実績の概要に記したように、19年間の未解決問題であった(BEDT-TTF)_2_Cu(CF_3_)_4_(TCE)の高Tc相の結晶構造解明に成功した。長年の未解決問題だけに、最終年度まで時間を要しても解決できない可能性も否定できない研究目標であったが、これで本研究の大きな目標としていた課題のひとつを達成できたと考えられる。また、抵抗測定による超伝導転移の確認や磁気抵抗による上部臨界磁場の決定にも成功し、超伝導特性を明らかにするための最初の一歩を踏み出すことができた。研究実績の概要に記したように、ドナー分子・アニオン分子・極性溶媒分子の3成分から構成される有機超伝導体kappa_H_-(DMEDO-TSeF)_2_[Au(CN)_4_](THF)における、極性溶媒分子の存在が引き起こす新規な電子状態を発見・解明した。もう一つの大きな目標である10 K級超伝導体(BEDT-TTF)_x_Cu(CF_3_)_4_(TCE)_y_の構造を確定するにはいたっていない。Ag(CF_3_)_4_塩の構造を確定したときと同じように、しばらく時間を要すると考えられる。本研究では、極性溶媒分子を含む絶縁層をもつ有機超伝導体に注目している。構造を確定させた高Tc相の(BEDT-TTF)_2_Cu(CF_3_)_4_(TCE)や(BEDT-TTF)_2_Ag(CF_3_)_4_(TCE)には結晶学的に独立なドナー分子が4つも存在している。X線結晶構造解析から見積もった電荷移動量の誤差は、超伝導を担うkappa層のバンド充填率が通常の1/2であるか否かを明らかにするために、量子振動によるフェルミ面の観測が不可欠である。また、低Tc相は乱れたアニオンと溶媒分子をもつが、常圧で超伝導を示す。この物質の超伝導特性を明らかにすることで、高Tc相との違いを見出すことを目標にする。具体的には磁気抵抗や磁気トルクの精密測定を行い、超伝導に特有のいくつかのパラメータを明らかにしていく。本研究では、有機超伝導体のなかでも、極性溶媒分子を含む絶縁層をもつ超伝導体に注目する。研究の全体構想は、このような特徴的な絶縁層による電気双極子モーメントと伝導層の伝導電子との相互作用に起因する、新しい電子状態の発見と解明である。結晶を構成する脇役でしかなかった、絶縁層を構成する分子の対称性に起因する、有機伝導体ならではの新奇な電子状態の発見を目的とする。
ソース・シンクモデルによるヒグマ個体群の構造・遺伝子流動の解明と被害管理への応用

ヒグマの生息環境は均質ではなく,質の高低,死亡リスクの高低がある。分布中心部で人間の活動が少ない奥山と辺縁部で農地や集落などと接する里山を比較すると,秋の奥山は里山より痕跡密度が高いが,夏には低下し,逆に里山の痕跡密度が増加した。また夏には奥山から里山へ多くのオスが移動していた。夏の里山は生息地の質が高く(農作物や駆除されたシカの死体など),同時に出没や農業被害の結果駆除されるリスクが高いことが示唆された。繁殖率が低く自然死亡率が低いヒグマ個体群の構造は,分布中心で繁殖による新規補充が死亡を上回るsource,分布周縁で駆除による死亡が多いsinkとなっていることが予想される。ヒグマの分散習性よりsourceからsinkへの供給は主にオスである。一方sinkにおける死亡は主に有害駆除による。sinkでは,移入により見かけの生息数が保たれても,集団内の性比や遺伝的構造は変化するだろう。見かけ上生息数に変化がないがために有害駆除が継続されると集団中の繁殖メスが絶滅する可能性がある。本研究では,北海道東部阿寒白糠地域のヒグマ個体群を対象に,sinkおよびsourceにおいて,(1)生息密度,および食性の比較,(2)遺伝的空間構造,集団間の移動実態とsink地域における農作物被害との関係,を明らかにするため,(1)-(1)痕跡調査,(2)-(1)DNA解析のためのサンプル回収,(2)-(2)効率的なDNA解析法の検討,(2)-(3)DNA解析とまとめを行った。ヒグマ個体群の空間構造の解明とその被害管理への応用を目的に,北海道東部白糠丘陵地域のヒグマ個体群を対象として,分布中心で繁殖による新規補充が死亡を上回るsource地域として白糠町北部集団(SN)を,分布周縁で繁殖数を死亡数が上回るsink地域として浦幌町集団(UH)を設定し,両地域間の生息密度,性比,遺伝的多様性,集団間の遺伝子流動について検討した.平成20年度は,新たな調査地域となるSN地域において,生息密度調査のためのルート設定と予備調査,捕獲を伴わない遺伝的試料回収(NGS)のための予備調査を実施した.810月に集中的に踏査を行い,定期巡回ルート(19ルート,85km)の設定およびヒグマの糞(41個)や背擦り木(47本)を発見した.痕跡密度は,当初の予想に反し両地域間で違いが見られない可能性が生じた.平成21年度には両地域で一斉調査を実施し再比較を行う.NGSのための予備調査では,6本の背擦り木にヘア・トラップを設置した.またトラップ設置前に背擦り木に付着した体毛を40試料回収することができた.平成21年度にはトラップ設置数を増やすとともに,頻繁な見回りにより回収試料数を増加させる.NGSのための新鮮な糞の回収も行い,DNA抽出条件の検討を行っている.また,白糠町・浦幌町役場より,駆除個体や農地侵入個体の試料回収の協力関係を構築した.DNA解析については,UHにて過去に回収した試料の解析を進めている.これまでに,白糠丘陵地域におけるヒグマの個体識別や血縁関係推定に有効なマーカーの選択を終えた.この成果は現在論文として投稿中である.またmtDNA多型解析により,SN地域からUH地域への個体の移動実態についても,論文執筆中である.また,糞中DNAの抽出条件の検討については,飼育個体の試料を用いた検討を新たに行うことを検討している.ヒグマ個体群の空間構造の解明とその被害管理への応用を目的に,北海道東部白糠丘陵地域のヒグマ個体群を対象として,分布中心で繁殖による新規補充が死亡を上回るsource地域として白糠町北部集団(SN)を,分布周縁で繁殖数を死亡数が上回るsink地域として浦幌町集団(UH)を設定し,両地域間の生息密度,性比,遺伝的多様性,集団間の遺伝子流動について検討した.SN・UHで痕跡調査による生息密度を比較した結果,農業被害発生時期にはUHで痕跡密度が増加し,液果・堅果類が利用可能となる秋にはSN地域の痕跡密度が急激に増加する傾向が認められた.採取した糞の内容物から, 6-9月にUHでは農作物の利用が多いのに対し, SNでは農作物の利用は見られず,草本・アリ・液果を主に利用していた.この結果は,夏に他地域にいた個体が秋にSN地域へと移動してくること, UHでは夏に農業被害が発生しており,駆除による死亡率を高める原因となっているという予想を支持する.遺伝解析については,捕獲を伴わない遺伝的試料回収(NGS),および駆除個体からの試料回収を両地域にて継続して行った.NGSによる試料の解析の効率化のための条件検討を行っている.これまでに白糠丘陵地域におけるヒグマの個体識別や血縁関係推定に有効なマーカーの選択に関する論文が公表された.

現在, mtDNA多型を用いた両地域間の移動実態に関する論文を執筆中である.また,マイクロサテライトを用いた両地域間の遺伝的多様性と集団間遺伝子交流についても,駆除個体については解析が終了し投稿準備中であり, NGS試料をもとにした解析を進めている.これらの結果から,分布周縁で継続的に発生する被害の発生原因を明らかにできる。ヒグマ個体群の遺伝的空間構造の解明とその被害管理への応用を目的に,北海道東部白糠丘陵地域のヒグマ個体群を対象とし,分布中心で繁殖による新規補充が死亡を上回るsource地域として白糠町北部集団(SN)を,分布周縁で繁殖数を死亡数が上回るsink地域として浦幌町集団(UH)を設定し,両地域間の生息密度,性比,遺伝的多様性,集団間の遺伝子流動について検討した.今年度は,昨年度までに実施した痕跡調査による生息密度および食性の比較に関する成果をまとめ,学会発表および論文執筆のための準備を進めた.生息密度は,初夏および秋にはsource地域の方が高かったが,晩夏の農業被害発生時期には減少し,逆にsink地域で痕跡密度が増加した.農業被害発生時期におけるsourceからsinkへの個体の移動という可能性が理由として考えられた.この仮説は,mtDNA多型を用いたsourceからsinkへの個体の移動実態に関する研究によって指示された.食性については,source地域では農作物の利用は見られず草本・アリ・液果を主に利用しており,一方sink地域では農作物の利用が多く,食害を通じた人間との軋轢が駆除による死亡率を高める原因となっていた.遺伝解析については,捕獲を伴わない遺伝的試料回収(NGS),および駆除個体からの試料回収を両地域にて継続して行った.NGSによる試料の解析の効率化のための条件検討を行い,マルチプレックスPCRによる効率的な解析ができるようになった.現在,mtDNA多型を用いた両地域間の移動実態に関する論文を投稿準備中である.また,SN・UH地域を含む北海道東部のmtDNA多型による遺伝的空間構造に関する論文,マイクロサテライトを用いた両地域間の遺伝的多様性と集団間遺伝子交流に関する論文についても論文執筆準備中である.次年度はこれらの成果の公表に力を入れ,分布周縁で継続的に発生する被害の発生原因を,個体群の遺伝的空間構造から明らかにする。ヒグマ個体群の遺伝的空間構造の解明とその被害管理への応用を目的に,北海道東部白糠丘陵地域のヒグマ個体群を対象とし,分布中心で繁殖による新規補充が死亡を上回るsource like地域として白糠町北部集団(SN)を,分布周縁で繁殖数を死亡数が上回るsink like地域として浦幌町集団(UH)を想定し,両地域間の生息密度,食性,個体の移動,遺伝的多様性,集団間の遺伝子流動について検討した.今年度は,これまでに得られた成果をもとに学会発表および論文執筆を進めた.両地域間の個体の移動については,メスのmtDNAハプロタイプの異所的分布をもとにオスの出生地と駆除による死亡地点を見分ける方法により,source like地域からsink like地域へオス成獣が多く移動していることがわかった。その理由として,分布周縁部のsink like地域には,分布中心部のsource like地域よりも農作物やシカの死体等質の高い採食資源が分布し,かつ高い駆除圧により競争相手が少ないことが考えられた。その結果,分布周縁部は質の高い資源を利用可能であるが,駆除による死亡率が高いというattractive sink
航空リモートセンシングによる地表面音響特性時間変動マップを用いた広域騒音評価

地面が音を吸収する程度を表す地表面音響特性は,屋外騒音伝搬に大きく影響するものの,その時空間変動の様相は明らかでない。そこで本研究では,地表面音響特性の時空間変動が騒音伝搬に及ぼす影響の解明を目的とし,地表面音響特性の時間変動を考慮した地表面音響特性マップの作成,および地表面音響特性マップを用いた騒音伝搬計算の2つの課題に取り組む。
CRMP4タンパク質の機能解析ー視床下部と嗅球を中心としてー

CRMP4は、マウス視床下部に存在する性的二型核(anteroventral periventricular nucleus)で性差形成タンパク質候補の1つとして、プロテオミクス解析により我々が同定したタンパク質である(Iwakura et al., 2013)。CRMP4は基本的知見が殆どなかった。本研究では、CRMP4がニューロンの形態形成や脳の層構造形成に関わっていることや、神経の興奮・抑制バランス形成のための神経回路の発達に関与していることを、嗅球を中心とした解析から明らかにした。更に嗅覚識別能力の発達などの脳の高次機能発現にも関与することを見出した。平成25年度は、Collopsin response mediator protein 4 (CRMP4)の機能解明に関して、以下の実績をあげた。1.マウス視床下部の神経核(anterior ventral periventricular nucleus(AVPV))でのCRMP4タンパク質欠損の影響について解析した結果を纏め、Developmental Neurobiologyに発表した。概略は以下の通りである。性差の明瞭なAVPVでの発現タンパク質について、性差形成時期にプロテオミクス解析を行い、発現に雌雄差のあるタンパク質を同定した。その1つが、CRMP4であった。そこでCRMP4欠損マウスのAVPVを調べたところ、THニューロンの数に異常が見られた。この事から、CRMP4タンパク質はAVPVに存在するTHニューロンの数の決定(性差の決定)に関与する可能性を見出した。2.嗅球に関するCRMP4タンパク質の機能についても解析を進めた。その結果、CRMP4タンパク質欠損マウスでは、(1)層の厚さの異常が生後早期に起こる事、(2)僧帽細胞数には差がないが、細胞密度に異常が起こる事、(3)DiIによる細胞の逆行性トレース実験により、僧帽細胞のapical dendriteの長さに異常が起こる事などの形態異常が見つかった。(4)生理学的にも、仔マウスの嗅刺激識別能力の低下が見られた。(5)さらにその原因は、ニューロンの興奮が抑制されたためでなく、興奮が過剰となり、興奮の局在化が妨げられたためであると考えられる結果が得られた。(6)CRMP4遺伝子欠損によるTHニューロン数の異常が嗅球でも見つかった。これらのことから、CRMP4タンパク質は生後初期の層構造、樹状突起形成、そして神経回路形成に関わるタンパク質であることが示された。またTHニューロンの分化・生存に関わる可能性も示唆された。平成26年度は、CRMP4タンパク質の機能解析を主に嗅球を中心におこなった。Crmp4ノックアウト(KO)マウスの嗅球の形態的・生理学的解析の結果、Crmp4遺伝子の欠損により、それぞれ以下の異常が生じることを明らかにした。まず形態学的異常としては、Crmp4-KOマウスでは嗅球の僧帽細胞の先端樹状突起が野生型(WT)マウスと比べて長く、嗅球の層構造の異常が生じていることを明らかにした。生理学的異常としては、Crmp4-KO仔マウスでは匂い識別能力の低下が起こる事、匂い刺激による嗅球での神経細胞の活動過多が生じることを明らかにした。さらに、CRMP4の樹状突起伸長への役割を明確にするため、培養系を用いたCrmp4 siRNA導入およびCrmp4ベクター導入実験を行った。その結果、Crmp4 mRNAの発現が抑制されると樹状突起伸長が促進すること、逆にCrmp4 mRNAの発現が過剰になると、樹状突起伸長が抑制されることを見出した。以上から、CRMP4は樹状突起伸長に抑制的に作用することを初めて見出した。また、生理学的機能に関連して、Crmp4-KOマウスではGlu受容体(GluR1)のmRNAおよびタンパク質の発現が嗅球で増大していることも明らかにした。これらの事から、CRMP4は樹状突起伸長や(恐らくはそれを介した)興奮性シナプスの増大に関わる可能性が示唆された。今後さらにCRMP4の神経回路形成における役割を、嗅球および視床下部を中心として明らかにした。平成27年度は、平成26年度までに明らかにしたCRMP4タンパク質の欠損による機能異常や形態異常について、嗅球を中心に解析を続け、論文2報に結果をまとめ公表した(業績欄参照)。さらに、CRMP4欠損による行動異常についても解析した(こちらについては現在纏めている)。まず形態学的には、野生型に比べてCRMP4-KOマウスでは、嗅球の層構造に異常が生じることを明らかにした。さらに僧坊細胞の先端樹状突起の長さに生後初期に違いがあることを見出した。そして、野生型とCRMP4-KOマウスを用いた初代培養細胞との比較、およびCRMP4-KOマウス由来の初代培養細胞にCRMP4を強制発現させた細胞との比較により、CRMP4が樹状突起伸長を抑制的に制御することを見出し、樹状突起伸長異常と層構造異常との関連性を示した。CRMP4-KOマウスの生理的機能については、野生型とCRMP4-KOマウスとで以下の点を比較した。(1)匂い識別能力、(2)単一匂い刺激に対するc-Fosの発現誘導、(3)興奮性および抑制性の神経伝達にかかわる遺伝子発現。その結果、CRMP4-KOマウスでは匂い識別能力が低下していること、その原因として、興奮性と抑制性のバランスが崩れ、興奮性過多が生じていることが明らかになった。さらに行動解析実験から、CRMP4-KOマウスのSocial interaction時間に異常があること、特にオスでその傾向が強いことを明らかにした。

本研究では、CRMP4-KOマウスを用いて形態学的、生理学的、行動学的に異常を見出し、それぞれの異常の特徴の関連性が推察された。さらに本研究による解析により、正常脳発達過程でのCRMP4の機能が推察された。本年度、CRMP4遺伝子の点変異による自閉症発症の連絡が米国小児病院よりあり、CRMP4と発達障害発症との関連について研究意義が深まった。CRMP4は、マウス視床下部に存在する性的二型核(anteroventral periventricular nucleus)で性差形成タンパク質候補の1つとして、プロテオミクス解析により我々が同定したタンパク質である(Iwakura et al., 2013)。CRMP4は基本的知見が殆どなかった。本研究では、CRMP4がニューロンの形態形成や脳の層構造形成に関わっていることや、神経の興奮・抑制バランス形成のための神経回路の発達に関与していることを、嗅球を中心とした解析から明らかにした。更に嗅覚識別能力の発達などの脳の高次機能発現にも関与することを見出した。Crmp4 mRNAの発現が出生時に多い嗅球に着目して今年度の研究を進めた。その結果、野生型と比較してCrmp4ノックアウトマウスに、生理学的異常および形態学的異常が見出された。それらの異常を詳細に調べ、また培養系での遺伝子ノックダウンや強制発現実験を実施することにより、CRMP4の新たな機能を発見できたため、今年度は当初の計画より研究を進展させることができた。神経発生学CRMPファミリータンパク質は、統合失調症や自閉症の発症に関わるとの報告が、過去にされている。そこで、Crmp4-KOマウスを用い、嗅覚実験のみでなく他の行動実験も実施し、これらの疾患様行動が現れるか調べ、本研究の臨床的意味についても推進する。CRMP4の機能解明に繋がるCrmp4遺伝子欠損による形態学的異常や生理学的異常を見出すことができた。この異常を足掛かりとして、その原因を細胞レベル分子レベルまで掘り下げて調べることにより、CRMP4の脳発生過程での役割りを明らかにできると考える。初年度として次につながる十分なデーターを得ることができたので、おおむね順調と判断した。これまでの実験結果から、CRMP4が樹状突起およびTH細胞の細胞数の決定調節に関係するタンパク質である可能性が示されたので、今後は細胞レベルおよび分子レベルでCRMP4がこれらの調節に関与するメカニズムについて明らかにすることを目指す。方法としては、1野生型とCRMP4欠損マウスの嗅球間で発達の差が著しく観察されるPD0日(出生日)について、両嗅球に発現するmRNAの違いを、マイクロアレイ解析により調べる。これによりCRMP4タンパクの有無が発現に影響を及ぼす遺伝子を捉えることができると考える。2次に、嗅球の初代培養あるいは株化神経細胞の培養系を用いて、CRMP4の欠損の及ぼす形態的影響を明らかにする。(これまでの予備実験により、樹状突起の異常とTHニューロン数の異常が、初代培養系でも確認されている。)
耳下腺細胞における受容体作動性カルシウム流入の分子制御機構に関する研究

1)容量性Ca^<2+>流入に対するプロテインキナーゼ阻害薬の効果。キナーゼ阻害薬であるスタウロスポリンでラット耳下腺細胞を前処置したところ、細胞内Ca^<2+>ストアの枯渇によって活性化するCa^<2+>流入(容量性Ca^<2+>流入)が有意に増強された。2)容量性Ca^<2+>流入に対するフォスファターゼ阻害薬の効果。セリン・スレオニン・フォスファターゼ阻害薬(オカダ酸、カリクリンA、トウトマイシン)はラット耳下腺細胞における容量性Ca^<2+>流入を有意に抑制した。1)、2)の結果から、容量性Ca^<2+>流入は、蛋白質のリン酸化-脱リン酸化反応によって調節されていることが示唆された。3)ATPによるCa^<2+>流入の解析。ラット耳下腺細胞をATPで刺激すると、イノシトールリン脂質代謝を介さずに細胞外からのCa^<2+>流入が惹起された。この反応はP_<2Z>プリン受容体の活性化によるものと思われる。4)細胞内Ca^<2+>動員の画像解析システムによる検索。ムスカリン受容体を刺激すると、腺腔側領域でCa^<2+>上昇が始まり、速やかに基底側領域に広がった。ストアの枯渇後、細胞外にCa^<2+>を添加すると、主に基底側領域でのCa^<2+>上昇が観察された。5)ヒト耳下腺培養細胞における細胞内Ca^<2+>ストアの分布の解析。容量性Ca^<2+>流入は細胞内Ca^<2+>ストアの枯渇と密接に連関している。そこで画像解析システムを用いてストアの細胞内分布を調べたところ、核周辺部よりは細胞の辺縁部に密なCa^<2+>ストアが観察された。トリプシンとコラゲナーゼ処理により調整したラット耳下腺細胞にfura-2を取り込ませ、その蛍光から細胞内Ca^<2+>([Ca^<2+>]i)を測定した.1.容量性Ca^<2+>流入に体するプロテインキナーゼ阻害剤の効果細胞をCa^<2+>-free液中でカルバコール刺激し、ストア内のCa^<2+>をで枯渇させた後、外液にCa^<2+>を加えると、Ca^<2+>流入による著しい[Ca^<2+>]iの上昇が起こった.スタウロスポリンはそのCa^<2+>流入を濃度依存的(EC_<50>10nM)に増強した.スタウロスポリンは、タプシガ-ギンやイオノマイシンでストアを枯渇させた場合でも同様にCa^<2+>流入を増強した.Ca^<2+>流入増強作用はK252aでも認められたが、ゲニステインハfura-2の蛍光に対する干渉作用のため使用できなかった.2.Mn^+流入に対するプロテインキナーゼ阻害剤の効果Mn^<2+>がCa^<2+>チャンネルを通過する性質を利用して、Ca^<2+>流入機構について検討した.ストアの枯渇によって、Mn^<2+>の流入が促進したが、スタウロスポリンはそれをさらに増強した.3.Ca^<2+>流入に対するフォスファターゼ阻害剤の効果上記の容量依存性Ca^<2+>流入およびMn^<2+>流入は、フォスファターゼ阻害剤(オカダ酸、カリクリンA、トウトマイシン)によって抑制された.これらの事から容量性Ca^<2+>

流入は、蛋白質リン酸化反応によって抑制され脱リン酸化反応によって促進される事が示唆された.cGMP生成促進剤や阻害剤は容量性Ca^<2+>流入には影響を与えなかった.1.細胞内Ca^<2+>動態の画像解析システムによる検索。酵素処理により調製した腺房細胞にFura-2あるいはFluo-3を取り込ませ、細胞をカバーグラス上に固着させた後、細胞内Ca^<2+>測定システムと共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)の変動を観察した。カルバコール(CCh)で刺激すると1秒以内に腺腔側領域で[Ca^<2+>]iの上昇が始まり、速やかに基底側に広がった。タプシガ-ジンによる[Ca^<2+>]iの上昇には腺腔側と基底側で時間差が認められなかった。ストアの枯渇後、細胞外にCa^<2+>を添加すると主に基底側領域での[Ca^<2+>]i上昇が観察された。2.ATPによるCa^<2+>流入の解析。耳下腺腺房細胞をATPで刺激すると大きな[Ca^<2+>]iの上昇がみられた。この反応は細胞外Ca^<2+>を除くと消失すること、また、イノシトールリン酸生成は刺激されないことから、ATPによる[Ca^<2+>]i上昇は細胞外からのCa^<2+>の流入によることがわかった。3.ヒト耳下腺培養細胞における細胞内Ca^<2+>ストアの分布の解析。容量性Ca^<2+>注入は細胞内Ca^<2+>ストアの枯渇と密接に連関している。そこで画像解析システムを用いてストアの細胞内分布を調べた。その結果、核周辺部よりは細胞の辺縁部に密なCa^<2+>ストアが観察された。
ヒ素化合物の形態別抽出による新規系統的ＧＣ／ＭＳ分析法の確立

本研究では、GC/MSによる、尿中ヒ素化合物(ヒ酸、亜ヒ酸、メチルアルシン酸)の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的に、誘導体化剤や還元条件、抽出条件の最適化を行った。その結果、尿中の3価ヒ素を2,3-ジチオ-1-プロパノールで抽出、次に5価ヒ素を3価ヒ素に還元して3価ヒ素と同様に抽出することで、ヒ素の化学形態別抽出が可能となった。尿中ヒ素の検出下限は1 ng/mL (S/N > 3)、検量線の範囲は2.0200 ng/mLで良好な直線性が得られた(r>0.996)。尿中からの回収率は91.9106.5%で、ばらつきも2.9513.4%と再現性も確認できた。本研究では、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)による、生体試料中ヒ素化合物(ヒ酸、亜ヒ酸、メチルアルシン酸)の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的とするが、本年度は、1)系統的化学形態別抽出法の検討、2)固相抽出並びにスケールダウンの検討、3)バリデーションの評価を行った。1)系統的化学形態別抽出法の検討:前年度の結果をもとに、塩化スズ+ヨウ化カリウムで還元した後に2,3-ジチオ-1-プロパノール(BAL)で誘導体化して有機溶剤抽出することで無機ヒ素(亜ヒ酸、ヒ酸)と有機ヒ素(メチルアルソン酸)を区別して検出することが可能となった。また、無処理のままBALで誘導体後に有機溶剤抽出、抽出残渣を塩化スズ+ヨウ化カリウムで還元した後に2,3-ジチオ-1-プロパノール(BAL)で誘導体化して有機溶剤抽出することで亜ヒ酸、ヒ酸メチルアルソン酸を区別して検出することが可能となった。2)固相抽出並びにスケールダウンの検討:MonoSpinC18を使用して0.5mlからの抽出が可能となり、スケールダウンに成功した。固相抽出基剤の種類を検討したが、回収率の面でC18が優れていたため、以降の実験ではC18を使用することとした。3)バリデーションの評価:FDAの生体試料中の薬毒物分析ガイダンスに則り、再現性などを検討し、ガイダンスを満足する結果が得られ、本研究で開発した方法は、再現性の高い方法であることが保証された。本研究では、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)による、生体試料中ヒ素化合物(ヒ酸、亜ヒ酸、メチルアルシン酸)の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的とするが、本年度は、前処理の最適条件を確立するために、以下4項目を検討した。対象とするヒ素化合物は、食餌の影響を受け難く、モニタリングに適しているとされている3種類のヒ素化合物(亜ヒ酸、ヒ酸、メチルアルソン酸)とした。1)誘導体化剤の検討:誘導体化剤として、チオグリコール酸メチル、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、2,3-ジチオ-1-プロパノール(BAL)などのSH基誘導体化剤を検討したが、GC/MSでの検出にはBALが適していた。2)誘導体の構造解析:本研究で検出されたBAL誘導体が、既報で報告されているマススペクトルと異なったことから誘導体を単離し、NMRなどでの構造推定を行った。これまでは、ヒ素化合物とBALとの反応生成物は、1,3-dithia-2-arsacyclopentaneの5員環構造をとるとされていたが、本研究で得られた生成物は1,3-dithia-2-arsacyclohexaneの6員環構造であることが示唆された。そこで、1,3-ジチオ-2-プロパノールを誘導体化剤として使用し、構造確認を行っている。3)還元剤の検討:ヨウ化カリウムなどの無機系還元剤、アスコルビン酸などの有機系還元剤を中心に検討を行ったが、5価のヒ素を3価に還元するには、塩化スズ+塩酸(0.5%)とヨウ化カリウム(20%)を溶液で添加する方法が適しており、操作上も簡便であった。4)抽出溶剤の検討:ヘキサン、酢酸エチルなど一般的に使用される溶剤を検証した結果、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタンで良好な回収率が得られたため、毒性や溶剤分取の操作性などを考慮して抽出溶剤はジクロロメタンとした。

本研究では、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)による、生体試料中ヒ素化合物(ヒ酸、亜ヒ酸、メチルアルシン酸)の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的とするが、対象とするヒ素化合物は、食餌の影響を受け難い、3種類(亜ヒ酸、ヒ酸、メチルヒ酸(メチルアルソン酸))とする。前年度までに確立したMonoSpin C18を用いたヒ素の系統的化学形態別抽出法(塩化スズとヨウ化カリウムで還元した後、2,3-ジチオ-1-プロパノールにて誘導体とする方法)を使用してGC/MSにて分析を行い、従来用いられているHPLC-ICP/MSとの相関性について検討を行った。また、実際の健康診断への活用を検討した。無機ヒ素(亜ヒ酸、ヒ酸)量と有機ヒ素(メチルアルソン酸)量の規格化された尿(ClinChek, RECIPE)を購入し、本法で検証した結果、精度良く規格値内に入ることも確認できた。また、ICP/MSと分析値を比較した結果、無機ヒ素(亜ヒ酸、ヒ酸)量と有機ヒ素(メチルアルソン酸)量に分けた相関は、良好な関係が得られた。本法は、塩化スズを使用する必要があるものの遠心分離のみで抽出が行えることから、特殊な技能も必要とされないことから実用的にも有用であると考えられた。本研究で確立した方法では、亜ヒ酸とヒ酸を分離することも可能であるが、労働安全衛生規則等の一部を改正する省令では、亜ヒ酸とヒ酸を分割して分析する必要性は明記されていないことから、無機ヒ素(亜ヒ酸、ヒ酸)と有機ヒ素(メチルアルソン酸)を同時に抽出できる方法が、工程数を削減でき、実務的な方法であることも検証された。中毒学交付申請書に記載したとおりの目的を達成し、研究は概ね順調に進行している。交付申請書に記載したとおり、当初の目的は概ね順調に進行している。ただし、生成したヒ素とBAL誘導体(反応生成物)が既報の構造と異なることが示唆されるデータが得られたため、詳細な構造確認を行っていく予定である。必要に応じて、既存の高速液体クロマトグラフ/質量分析計などの機器を使用して構造確認に必要なデータを採取していく予定である。また、既報の構造と異なる誘導体が如何にして生成するかなどの挙動や反応条件による生成率の差などについても詳細に検討を加える予定である。次年度は、本研究期間の最終年度の当たるため、開発した方法の評価・改良を行うとともに、現状で実施されているHPLC-ICP/MSで指摘されている施設間誤差の問題について検討を行い、研究を総括する。1)開発した方法の評価・改良については、既存の報告例などと比較することで、実務面での利点・欠点を整理して、実際の健康診断などに活用できる手法へとシェイプアップする。2)施設間誤差などについては、中央労働災害防止協会の竹内靖人氏らから本研究で構築した方法についての助言をもらい、施設間誤差などについての検証を行う。前年度検討した結果をもとに一つの試料から系統的にヒ素化合物を抽出し、形態分析を可能とする方法やスケールダウン、確立した分析法のバリデーションデータの収集を検討する。1)系統的化学形態別抽出法の検討:抽出の選択性を高めるとともに少量の検査試料からの検査実施は、将来の健康診断などへの適用を考慮すると不可欠な課題である。本検討においては、最近少量の試料調製手法として注目されているMonoSpinを活用し、スケールダウンを検討する。抽出の選択性を高めるためには、MonoSpinの吸着剤の性質が大きく影響すると考えられるため、オクタデシルスルホン基(ODS,C18)以外にもイオン交換など性質の異なった吸着剤の適用を検討する。また、ヒ素の原子価数の違いによる誘導体化能、MonoSpinへの吸着能の違いを利用し、少量の検査試料からの系統的化学形態別抽出法を確立する。交付申請書に記載したとおり、全て消耗品費として使用する予定である。消耗品は、試薬以外に、最近少量の試料調製手法として注目されているMonoSpinを活用し、スケールダウンを検討する目的で、抽出用のカラムを購入する予定である。
バクテリオロドプシン・ミュ-タントの構造・機能解析

バクテリオロドプシン・ミュ-タントの構造・機能を分光学的手法により調べた。(1)膜中深い位置に存在すると予想されている荷電性アミノ酸残基(Asp196)を置換したミュ-タントの光化学反応サイクルおよび光プロトンポンプ活性を調べ,プロントの通り道に関する知見を得た。(西独マックスプラン研究所Oesterhelt博士,理研国際フロンティア・生物素子グル-プ大友純博士との共同研究)(2)トリプトファン残基をフェニルアラニンに置換したミュ-タント(8種類)の光化学反応を調べた。2種類のミュ-タントでトランス反応サイクルの異常が観察された。(米国MIT研究所・Khorana博士らとの共同研究)(3)システイン残基を導入したミュ-タント(e.g.S132c)を用いて,蛍光エネルギ-移動法による構造解析を行なった。システイン残基を蛍光色素で修飾し、エネルギ-移動速度の測定からレチナ-ルとの相対位置を明らかにするための実験を行い、現在、未反応蛍光色素の影響などの評価を行なっている。(米国MIT研究所Khorana博士らとの共同研究)バクテリオロドプシン・ミュ-タントの構造・機能を分光学的手法により調べた。(米国MIT研究所Khorana博士らとの共同研究)
共在性に基づく個人間協調がリハビリテーション場面での運動支援に及ぼす効果

本研究の目的は、実環境でのリハビリテーション(以下、リハビリと略記)において共在性に基づく患者-セラピスト間の身体協調が運動支援に及ぼす効果を解明することで、時空間の共有過程と運動機能回復の関係を明らかにすることである。研究の背景には、近年、医療リハビリ分野でコミュニケーションの重要性が認識されている一方、現状のVR・遠隔技術では、実環境と異なり、適切に時空間が共有されないことによる課題が残されている状況がある。そこで、本研究では、リハビリ場面における患者とセラピスト間のコミュニケーション(とくに身体協調)が運動機能の回復にもたらす効果を、臨床における縦断的フィールド観察と、実験的手法により検証する。当該年度では、フィールド(実際の病院でのリハビリの現場)にて患者-セラピスト間での言語的・身体的コミュニケーションの記録(ビデオデータ)、行動の計測(センサデータ)を実施し、それらデータに対し質的分析・量的分析を実行することを計画していた。しかし、倫理的・技術的な問題から、センサ機器の導入、及び、それらセンサデータに対する量的分析は行えなかった。そのため、当該年度の実績としては、ビデオデータに基づいた質的分析の結果を国内外の研究会、学会で発表し、成果を残した。研究結果の概要としては、40分ほどのリハビリ場面の観察を通し、セラピストが患者の身体と環境との力学的なインタラクションや能動的な触知覚を利用し臨床的な評価・治療を行っていること、オノマトペを用いたり動き方の見本を視覚的に提示したりすることにより非言語的に情報の表現・伝達を行っていること、言語的な働きかけにより患者の心理的・精神的な側面にも働きかけていることなどが分かった。当該年度では、実際のリハビリ現場のフィールドデータを収集し、目標データ数にも達することができた為、おおむね順調に進展していると評価した。ただ、当初の計画にあったセンサ機器を用いた量的データの計測・分析は、倫理的・技術的な問題から実現しなかった。しかし、技術的にはセンサの開発が完了した為、倫理的に問題のない対象者をリクルートし、次年度に少数事例データでもセンサデータを取得する計画である。現在、センサ機器のソフトウェアとの調節、および、実験協力者のリクルートを行っている状況である。当該年度に得られたデータの分析結果から、仮説を生成し、次年度では実験を計画して、仮説検証を行う予定である。具体的には、高齢者を対象に介入実験を計画し、介入(訓練)前後で姿勢や歩行の機能を定量評価し、共在性の効果となる要因を実験的に検証する計画である。また、当該年度に達成できなかった、センサ機器を用いたフィールドデータの取得も行う予定である。その際、必要に応じて、共同研究者と連携・協力しながら、協力者のリクルート、データの収集・分析などを分担しながら進める計画である。

センサ機器を導入したフィールドデータの収集に関して、当該年度内では倫理的・技術的な問題から、達成できなかったため、センサ機器の開発・購入に関する予算が残った為、次年度の使用額が生じた。次年度は、この予算によるセンサ機器を用いた事例データの取得を行う計画である。
悪性グリオーマ治療の製剤化に向けたHSVtk遺伝子導入細胞株の構築

外科的切除では根治が望めない悪性グリオーマでは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSVtk)遺伝子とガンシクロビル(GCV)の投与による遺伝子細胞治療の開発が期待されている。HSVtk遺伝子を腫瘍にデリバリーするには遊走能を有する幹細胞が適しているが、治療に向けては技術的課題がある。本研究では、hTERT遺伝子による細胞の寿命延長技術により、HSVtk遺伝子を搭載した幹細胞の安定供給を可能とし、製剤化の確立を目指す。
多元計算解剖学の外科における臨床展開

本研究では、多元軸に基づく疾患治療モデルを用いた治療効果予測、ナビゲーション治療の評価およびデジタル医療技術評価システムの構築を目指している。そのために抗癌剤投与/未投与のKPCマウスモデルを作製し、治療前治療後の経時的なマイクロMR像や連続病理像を集積した。治療効果予測の検討として、連続病理像を3次元構築し管状構造や癌細胞、Ki67陽性細胞、間質などの検出を試みた。Invasive frontでの癌細胞の浸潤の走行を検討するため、HE像よりinvasive frontに絞って、管状構造を3次元構築した。癌細胞領域では多数の管状構造が見られたが、正常なacinar cell領域や間質領域では管状構造はほとんど見られなかった。また、管状構造の方向はランダムではなく、腫瘍中央の壊死領域の表面に沿って、特定の方向に沿って伸びる分布を示した。Ki67像とHE像を3次元構築し比較したところ、未分化型の領域にKi67陽性細胞多く分布していた。分化型と未分化型の癌領域ではKi67陽性細胞の分布が空間的な分布のもとでも異なる所見を認めた。また、ホルマリン固定後のMR像と3次元HE像を統合した結果、MR像に見られるintensityの差とHE像に見られる間質の分布との間に特定の相関を認めた。この統合データに間質細胞が抽出できる3次元MT像を組み込み、病理像の定量評価による診断支援を目標に、ニューラルネットワークを基にした特徴抽出を応用して、膵癌のHE像の予測も行なった。深層学習を用いた画像解析をもとに、病理像からがん組織に特有の特徴を抽出するモデルも構築した。さらに、動作に伴う自然な皮膚の変形を可能とする詳細な四次元全身モデルシミュレーションや、先天性横隔膜ヘルニア治療後の患児の肺の成長過程の予測モデル構築も進めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今回の研究では、CTやMRなどデジタル情報だけでなく病理像や組織像、解剖所見や手術肉眼所見などの臨床情報をデジタル化して集約する。基礎的な検討として、膵癌自然発症モデルマウス(KPCマウス)を用い、病理像とマイクロCT、マイクロMR画像の統合を行うため、膵腫瘍形成前形成後までの経時的なMR像を集積した。膵癌の悪性度診断や腫瘍増大パターンによる化学療法の治療効果を予測する為、抗癌剤投与KPCマウスモデルを作成し、治療前治療後の経時的なMR画像を集積している。このMR画像より3Dに再構築後、腫瘍の容積を計測し、腫瘍が縮小する群と変化しない群とで病理像やMR画像を比較し、癌細胞の増殖能や転移能の評価に応用できないかも検討する。また、IPMN患者の経時的CT像から腫瘍増大の様子を3D動画にて再現した。MR画像との統合用に膵臓のルーペ像の作製も行ったので、今後はそれらの画像情報を元に腫瘍の将来を予測する予測シミュレーションのモデルを確立していく。様々なモデルにおいて病理像と経時的なマクロCT、マクロMR画像を統合することは、将来のCT、MR画像や病理像を予測し、悪性度診断や腫瘍の増大パターンによる術前化学療法の治療効果予測や切除後の再発の術前予測、浸潤範囲(臓器内進展、臓器外の多臓器への浸潤)を予測できるような多元解析モデルを構築する上で大変重要である。更に、この多元解析モデルを法医学の分野にて応用する為、死後の経時的なCT画像や解剖所見、病理像などから死亡経過時間を推定しようと試みており、ラットを用いて死後の経時的なCT画像の集積を行っている。また、動作に伴う自然な皮膚の変形を可能とする詳細な四次元全身モデルによるシミュレーション、小児成長の四次元表示と成長モデルの構築、四次元モデル表示装置の開発、肝胆膵領域の開腹下外科手術における術中ナビゲーションシステムの開発も進めている。更に臓器モデルを作成するため、実際の臓器の機械的特性(臓器プロパティ)を計測する実験装置を作成し臓器(豚の肝臓)の時間的変化を検討した。今回の研究では、CTやMR像だけでなく病理像や組織像、解剖所見や手術肉眼所見などの臨床情報をデジタル化して集約する。基礎的な検討として、膵癌自然発症モデルマウス(KPCマウス)を用い、病理像とマイクロMR画像の統合を行うため、膵腫瘍形成前&#12316;形成後までの経時的なMR像を集積した。膵癌の悪性度診断や腫瘍増大パターンによる化学療法の治療効果を予測する為、抗癌剤投与KPCマウスモデルを作成し、治療前&#12316;治療後の経時的なMR画像も集積した。また、同モデルマウス膵癌の1区分より900枚の連続病理像を作製し、HE染色の他にKi67や間質の染色も行った。連続病理像を3Dに再構築することで管状構造や癌細胞の浸潤方向などの検出を試みる。また、HE染色の病理像よりKi67陽性細胞の予測が可能かも検討する。3D再構築後のMR画像より、腫瘍の容積を計測し、腫瘍が縮小する群と変化しない群とで病理像やMR画像を比較し、癌細胞の増殖能や転移能の評価に応用できないかも検討する。臨床応用として、経時的CT像のある剖検用膵臓の病理切片を作製した。