hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
記号計算の手法を用いた折り紙計算論の構築

本研究では,記号計算の手法を駆使して,折紙の数理を制約解消および定理自動証明の側面から探求した.具体的には,記号計算の手法を駆使して,折紙の計算理論の構築と理論に基づいた折紙計算環境の実現をはかった.2年間の研究実施期間中に,これまでに知られる折紙による幾何オブジェクトの構成例の多くを,制約解消問題として再構成し,さらに,構成の正しさを定理自動証明システムを用いて証明した.本研究のすべてのフェースにわたって,計算機による支援は不可欠であるため,並行して,計算論的折紙計算環境構築をすすめた.上記研究目標への到達を目指して,17年度から推進している次の3つの課題について,18年度も継続して研究を推進した.1.Huzitaの折紙公理として知られる折紙構成法を出発点とする折紙計算論の構築.これに関しては,Huzitaの折紙公理を記述する多ソート一階述語論理の体系を定め,インフォーマルに与えられてきた6つの公理を形式的に記述した.さらに,各公理の代数的な解釈を与えた.この解釈により,折紙の数理研究の基礎が得られ,折紙の定理証明の自動化が可能となった.2.幾何定理自動証明系を活用した,折紙に関する諸性質の形式化と自動証明.これに関しては,具体的な折紙作図の問題に取り組み,BuchbergerアルゴリズムとCylindrical Algebraic Decompositionのアルゴリズムを適用し,最大正三角形の折紙作図問題の自動定理証明に成功した.3.折紙の操作アルゴリズムの開発と折り紙計算論を支援する折り紙計算環境の構築.折紙の操作と折紙の定理証明を系統的に結合するために,記号計算の観点から,データ構造やアルゴリズムを再検討した.これにより,幾何定理自動証明系と制約解消系との整合性のとれた,折紙研究環境を実現できた.このシステムをEos(E-origami System)と名付けた.今後の実用化に向けてさらに改良を図る予定である.次の3つの課題について,研究を推進した.1,Huzitaの折り紙公理として知られる折り紙構成法を出発点とする折り紙計算論の構築2,幾何定理自動証明系を活用した,折り紙に関する諸性質の形式化と自動証明3,折り紙の操作アルゴリズムの開発と折り紙計算論を支援する折り紙計算環境の構築課題1に関してHuzitaの折り紙公理は6つの構成法よりなっている.この構成法は定規とコンパスを用いたユークリッド幾何オブジェクトの構成法より強力であることが知られている.定規とコンパスによる構成法を越える能力を折り紙が持つのは,折り紙では,すでにある折れ目に沿って,点をずらしながら,折り線を決めることができることにある.Huzitaの折り紙公理の第6公理が,これを表現している.この構成法をさらに,拡張し「高階」折り紙構成法の理論を構築した.課題2に関して高次の多項式系の求解にはグロブナ基底を計算するBuchbergerアルゴリズムが用いられる.さらに,折り紙の定理の証明にも,Buchbergerアルゴリズムが用いられる.折り紙の操作と折り紙の定理証明を系統的に結合するためには,記号計算の観点から,データ構造やアルゴリズムの整理が必要になってくる.幾何定理自動証明系を活用しつつ,証明系と制約解消系との整合性のとれた,折り紙の内部表現のデザインをすすめた.課題3に関して折り紙計算論を支援するには,折り紙の操作を実際に計算機で実現できることが重要である.このため,Eos(E-origami System)と呼ぶ計算折紙システムの構築を進めた.本研究では,記号計算の手法を駆使して,折紙の数理を制約解消および定理自動証明の側面から探求した.具体的には,記号計算の手法を駆使して,折紙の計算理論の構築と理論に基づいた折紙計算環境の実現をはかった.2年間の研究実施期間中に,これまでに知られる折紙による幾何オブジェクトの構成例の多くを,制約解消問題として再構成し,さらに,構成の正しさを定理自動証明システムを用いて証明した.本研究のすべてのフェースにわたって,計算機による支援は不可欠であるため,並行して,計算論的折紙計算環境構築をすすめた.上記研究目標への到達を目指して,17年度から推進している次の3つの課題について,18年度も継続して研究を推進した.1.Huzitaの折紙公理として知られる折紙構成法を出発点とする折紙計算論の構築.これに関しては,Huzitaの折紙公理を記述する多ソート一階述語論理の体系を定め,インフォーマルに与えられてきた6つの公理を形式的に記述した.さらに,各公理の代数的な解釈を与えた.この解釈により,折紙の数理研究の基礎が得られ,折紙の定理証明の自動化が可能となった.2.幾何定理自動証明系を活用した,折紙に関する諸性質の形式化と自動証明.これに関しては,具体的な折紙作図の問題に取り組み,BuchbergerアルゴリズムとCylindrical Algebraic Decompositionのアルゴリズムを適用し,最大正三角形の折紙作図問題の自動定理証明に成功した.3.折紙の操作アルゴリズムの開発と折り紙計算論を支援する折り紙計算環境の構築.折紙の操作と折紙の定理証明を系統的に結合するために,記号計算の観点から,データ構造やアルゴリズムを再検討した.これにより,幾何定理自動証明系と制約解消系との整合性のとれた,折紙研究環境を実現できた.このシステムをEos(E-origami System)と名付けた.今後の実用化に向けてさらに改良を図る予定である.
前立腺癌リンパ節転移の機序解明の検討

前立腺癌患者で前立腺全摘術、骨盤内リンパ節郭清術を施行した症例に対してリンパ管新生因子のひとつといわれているVEGF-C、-Dに対する抗体を用いて免疫染色を施行し、リンパ節転移の有無とVEGF-C、-Dとの発現について検討した。当科で前立腺全摘術を施行し、リンパ節郭清術を施行した症例のうち、リンパ管浸潤を認めた症例は10例であり、リンパ管浸潤が無かった症例より無作為に10例を抽出し、免疫染色を施行した。VEGF-Cではリンパ管転移を認めた症例のうち7例は弱陽性であり3例は陰性であった。リンパ管転移が無かった症例のうち8例が弱陽性であり2例が陰性であった。VEGF-Dについてはリンパ管浸潤を認めた症例のうち5例は強陽性であり、3例が弱陽性、2例が陰性であった。リンパ管転移が無かった症例のうち6例は弱陽性、4例が陰性であった。リンパ管浸潤においてVEGF-C,Dは何らかの関与が示唆された。またリンパ管内皮細胞の単離を施行しているがリンパ管内皮細胞特異抗原であるLYVE-1に対する抗体の作成がうまくいかず、現在調製中であり今後引き続き施行予定である。またVEGF-C、-Dと同じfamilyであるVEGF-Aは低酸素条件下で誘導されるといわれている。そこでリンパ管新生因子といわれているVEGF-B、-C、-D加えた4種類について、前立腺癌細胞株であるPC-3、LN-Capを低酸素条件下で培養し、total RNAを抽出したのち、リアルタイムPCR法を用いてRNAレベルでの発現変化について検討した。当科で前立腺全摘術を施行し、リンパ節郭清術を施行した症例のうち、リンパ節転移を認めた症例は5例であり、リンパ節転移が無かった症例より無作為に5例を抽出し、免疫染色を施行した。VEGF-Cではリンパ節転移を認めた症例のうち2例は弱陽性であり3例は陰性であった。リンパ節転移が無かった症例のうち3例が弱陽性であり2例が陰性であった。VEGF-Dについてはリンパ節転移を認めた症例のうち1例は強陽性であり、2例が弱陽性、2例が陰性であった。リンパ節転移が無かった症例のうち3例は弱陽性、2例が陰性であった。低酸素条件下の実験ではVEGF-AはPC-3、LN-Capそれぞれで7.3倍、20.5倍の発現増加が認められたが、他の因子の発現増加は1.3倍以内であった。今回はリンパ節転移とVEGF-C、-Dとの発現について明らかな関与は示唆されなかった。
がん特別研究の総括

がん特別研究は、がんの予防,診断,治療の基礎となる発癌,癌生物学及び癌治療に関する研究を重点的に実施し、成果をあげ、もって社会の要請に応えることを目標としている。この目標を達成するため、総括班はがん特別研究を計画し、運営し、評価を行ない総括的機関の役目を果たした。本年度の総括班の成果は以下の如くである。1.昭和61年度成立の212班(がん特【I】101班、がん特【II】111班)及び若い研究者46名の運営と総括を行なった。2.年6回総括班会議を開き研究班の計画・運営・評価を行なった。3.特別委員会4、将来検討班5を計画し、これを運営した。4.昭和62年度の計画研究8班を計画した。5.昭和62年度の重点研究10課題を選定した。6.班長会議(第1回昭和61年6月30日、第2回昭和62年2月3日)を行ない、癌研究の新しい方向、研究者の要望等につき討議した。7.がん特別研究の成果を発表し討議する公開シンポジウムを昭和62年2月2、3日の両日開催した。また、ミニシンポジウムを昭和61年12月19日広島市で開催した。8.研究技術交換等ため班員3名の国内派遣を行なった。9.年度初めに、「昭和61年度文部省がん特別研究組織」を、年度末には「文部省がん特別研究報告集録」を編集、印刷し、全員に配布した。10.留保金解除に伴い緊急重点配分を5機関に行なった。11.「がん特ニュース」(別冊2部を含む)を年4回全班員、関係者に配布し、研究連絡伝達を密にした。12.一般向け小冊子「がん研究は、いま」を編集し、広く配布した。13.「遺伝子研究のための実験動物の開発」の研究を行なった。14.「AIDSの成因と病態」の研究を行なった。
有用微生物間の相互作用と植物における生体防御機構の解明

本研究では、AMFであるGlomus mosseaeとPGPFであるPhoma sp.GS8-2、GS8-3、Penicillium simplicissimum GP17-2、Trichoderma harzianum GT3-2を組合せて同時に接種したときのキュウリにおける炭疽病に対する抵抗性の誘導と苗立枯病の発病抑制について調べた。G.mosseaeとPGPFを単独あるいは組合せてキュウリの根に接種し4週間栽培後、病原菌(Colletotrichum orbiculare)の胞子懸濁液(10^5 spores/ml^<-1>)を本葉第2葉に接種した。その結果、いずれのPGPF菌株を接種した場合でも地上部の炭疽病に対し高い病害抑制効果を示した。G.mosseaeを単独接種した場合は病害抑制はみられなかった。Phoma GS8-2とGS8-3を単独接種したときの防除率は71%および36%であったが、G.mosseaeと組合せ接種したときにはそれぞれ57%および19%と低下した。一方、P.simplicissimum GP17-2の単独接種とG.mosseaeとの組合せ接種を比較すると、それぞれ65%および60%と両者ともに高い防除効果がみられた。T.harzianumの単独接種とG.mosseaeとの組合せ接種をした揚合でも同様に、それぞれ60%および64%と同等に高く、組合せ接種による効果の違いはみられなかった。次に、G.mosseaeとPGPF菌株を組合せ接種したキュウリにおける苗立枯病の発病抑制にっいて調べた。立枯病原菌であるRhizoctonia solani AG-4 HGII Mat7の接種濃度は土壌に対し含菌大麦粒を0.3%(w/w)とした。病原菌はG.mosseaeとPGPFを組合せて接種するときと同時に、または12日後に接種した。両病原菌接種濃度においても、G.mosseaeと各PGPFの組合せにおいて病原菌を同時接種した場合には病害抑制はみられなかりたものの、病原菌を12日後に接種した場合には有意な病害抑制効果が認められた。P.simplicissimum GP17-2やT.harzianum GT3-2をG.mosseaeと組合せ接種した場合では、病原菌を12日後に接種したときの防除率はそれぞれ72%および68%であり、それらを単独接種したときの48%およぴ56%よりも有意に高い防除率を示した。すなわち、PGPF菌株とG.mosseaeの組合せ接種による相乗的な防除効果がみられた。我々はアーバスキュラー菌根菌と植物生育促進菌類との相互作用に関する研究を行っている。菌根菌であるGlomus mosseaeとPGPF菌のPhoma spを組み合わせたところ,G.mosseaeが定着したキュウリ根へのPhoma菌の定着は,G.mosseaeが定着しなかった場合と較べて著しく抑制された。

一方,PGPFのPhoma菌が定着した根へのG.mosseae菌の定着はPGPFが定着しない根と大差なかった。さらにPGPFにより誘導される炭疽病に対する抵抗性が,G.mosseaeが定着することにより著しく低下することが明かとなった。アーバスキュラー菌根菌のGlomus mosseaeと植物生育促進菌類のPhomasp.を組合せてキュウリに接種したところ、Phoma sp.のキュウリ根への定着が著しく減少し、その場合のキュウリ炭疽病の抑制効果も低下したことは既に報告した。その後、植物生育促進菌類であるPenicillum sp.をG.mosseaeと組合せてキュウリに接種したところ、Penicillum sp.のキュウリ根への定着は減少せず、キュウリ炭疽病の抑制効果が確認された。一方、土壌病原菌であるRhizoctonia solaniAG4に対するこれらの組合せ接種では、植物根への定着の低下に関わらず相乗的な病害抑制効果が認められた。PCR-DGGE法による土壌微生物相の解析の結果、G.mosseaeとPhoma sp.の接種により共通の糸状菌および細菌種が減少あるいは増加し、組合せ接種によりその変化は著しくなった。これらの微生物種の特定と病害抑制への関与を明らかにする必要がある。また、これまでにPhoma sp.やPenicillum sp.をキュウリに接種することで、細胞壁におけるリグニンの集積や活性酸素種の生成、さらにはペルオキシダーゼやキチナーゼ、β-1,3-グルカナーゼといったPRタンパク質の生成が確認されているが、G.mosseaeとの組合せ接種においてこれら一連の防御関連応答に差異があるのかを今後明らかにしていく必要がある。本研究では、AMFであるGlomus mosseaeとPGPFであるPhoma sp.GS8-2、GS8-3、Penicillium simplicissimum GP17-2、Trichoderma harzianum GT3-2を組合せて同時に接種したとき、それぞれの菌の植物根への定着および病害抑制効果を調べた。G.mosseaeと組合せ接種したときのPhomaGS8-2とGS8-3の栽培4週間目における定着割合は、単独接種した場合に比べ著しく低かった(減少率はそれぞれ82%、84%)。栽培4週間目と6週間目におけるP.simplicissimum GP17-2の定着と根圏土壌中の菌量にG.mosseaeとの組合せ接種による影響はみられなかった。栽培4週間目のT.harzianum GT3-2の定着と根圏土壌中の菌量もG.mossaeeとの組合せ接種による影響はみられなかったが、栽培6週間目においては定着率と菌量が僅かに減少した。一方、G.mosseaeのキュウリ根への定着に関しては、Phoma sp.やP.simplicissimumとの組合せ接種による影響はみられなかったが、T.harzianumとの組合せ接種では定着率の増加がみられた。G.mosseaeと各PGPF菌株を組合せ接種したときのキュウリにおける炭疽病に対する抵抗性の誘導の有無について調べた。G.mosseaeとPGPFを単独あるいは組合せてキュウリの根に接種し4週間栽培後、病原菌(Colletotrichum orbiculare)の胞子懸濁液(10^5 spores/mr^<-1>)を本葉第2葉に接種した。
電気化学的手法によるシトクロームP450の活性発現と不斉有機合成への応用

本研究課題においては、電極からシトクロームP-450camへの電子授受を手段として酵素活性調節の要因を明らかとし、効率的な電極によるシトクロームP-450cam活性発現の方法を開発し、次いで、開発した電極・シトクロームP-450camシステムによる種々の不斉有機化合物の合成法の開発を目指すものである。上記目的のため、1.シトクロームP450cam、プチダレドキシン固定化酵素電極の作成とその電気化学的性質の検討、2.プチダレドキシン-シトクロームP-450camハイブリッドタンパク質の作成と単離、3.プチダレドキシン-シトクロームP-450camハイブリッドタンパク質固定化電極の作成とその電気化学的性質、4.電極からの電子授受によるシトクロームP-450camのモノオキシゲナーゼ活性発現につてい検討した。その結果、適当な長さのリンカーを用いることにより電極上に固定化したプチダレドキシンまたはシトクロームP-450camと電子授受が行われることが確認できた。しかしながら、シトクロームP-450camのみでは活性発現は弱く、酵素の急速な変性がみられた。また、シトクロームP-450camの有無により固定化プチダレドキシンの酸化還元電位がシフトした。これらのことから、活性発現に必要な第二電子の授受がシトクロームP-450camのみでは困難であり、プチダレドキシンのP-450camに対する活性モジュレーターとしての役割の重要性が明らかとなった。プチダレドキシン-シトクロームP-450camハイブリッドタンパク質を作成し、その酵素固定化電極を作成し酵素活性発現について検討した結果、ハイブリッドタンパク質を用いることにより、酵素を変性させる自動酸化によるH2O2の生成を抑制し、より効果的に、電気化学的方法によりシトクロームP-450camのモノオキシゲナーゼ活性を発現できることが明らかとなった。本研究課題においては、電極からシトクロームP-450camへの電子授受を手段として酵素活性調節の要因を明らかとし、効率的な電極によるシトクロームP-450cam活性発現の方法を開発し、ついで、開発した電極・シトクロームP-450camシステムによる種々の不斉有機化合物の合成法を開発する。上記目的のため、本年度は以下のことを明らかとした。シトクロームP-450cam、プチダレドキシンを種々の方法により固定化した酵素電極を作成し、それぞれのタンパク質への電子授受およびシトクロームP-450camの活性発現について検討した結果、両タンパク質のAsp,Gluなどのカルボキシル基を用いて固定化した電極ではタンパク質と電極間での電子授受は観測されず、Lysのアミノ基を用いて固定化した場合のみ電子授受が観測された。また、シトクロームP-450cam固定化電極においては電極とシトクロームP-450cam間のスペーサー長が効率的な電子授受において重要であった。さらに、シトクロームP-450camの活性発現について検討した結果、本酵素の活性発現においてプチダレドキシンが単なる電子伝達タンパク質としての役割のみならず、シトクロームP-450camの活性調節に重要な役割を担っていることが明らかとなった。また、分光学的な検討から、シトクロームP-450camの電気化学的手法による活性発現を効率的に行うには,本酵素のシトクロームP-420への変性を抑制することが重要であることが判った。本研究課題においては、電極からシトクロームP-450camへの電子授受を手段として酵素活性調節の要因を明らかとし、効率的な電極によるシトクロームP-450cam活性発現の方法を開発し、次いで、開発した電極・シトクロームP-450camシステムによる種々の不斉有機化合物の合成法を開発する。

上記目的のため、本年度は以下のことを明らかとした。電極表面へのシトクロームP-450camおよびプチダレドキシンの固定化および電子授受について検討した結果、これらのタンパク質を電極に固定化後、電極表面をそれぞれのタンパク質に応じた方法で修飾することにより効率的な電子授受が観測されることが明らかとなった。シトクロームP-450camにおいては表面にカルボキシル基を導入することにより、またプチダレドキシンにおいては4級アミンまたは水酸基を導入することにより電極とタンパク質間でより効果的な電子授受が行われることが明らかとなった。また、シトクロームP-450camの電極を介した活性発現にはプチダレドキシンの存在は必須ではないが、効率的な活性発現に必要であることが判った。電極を用いたシトクロームP-450camの活性発現を効率的に行うにはプチダレドキシンを共存させる必要がある。このため、シトクロームP-450camとプチダレドキシンとを一つのポリペプチド鎖につなげたハイブリッドタンパク質を遺伝子工学的手法により作成した。このハイブリッドタンパク質は通常の再構成系と同様にモノオキシゲナーゼ活性を発現することが判った。本研究課題においては、電極からシトクロームP-450camへの電子授受を手段として酵素活性調節の要因を明らかとし、効率的な電極によるシトクロームP-450cam活性発現の方法を開発し、次いで、開発した電極・シトクロームP-450camシステムによる種々の不斉有機化合物の合成法を開発する。上記目的のため、本年度は昨年度作成したシトクロームP-450camと電子伝達タンパク質であるプチダレドキシンを一つのポリペプチド鎖につなげたハイブリッドタンパク質の電気化学的挙動と、その触媒活性について検討した。シトクロームP-450cam-プチダレドキシンハイブリッドタンパク質をポリアクリル酸コート炭素電極上に種々の方法で固定化した結果、固定化に長鎖リンカーとWSCを用いたとき、再現性のある可逆的なCV応答が観測された。一方、短鎖リンカーを用いて固定化した場合にはファーストスキャンのみにCV応答が観測された。シトクロームP-450camのみを固定化した電極と比較した結果、ハイブリッド固定化電極では過酸化水素の生成が顕著に減少し、酵素反応における副反応である自動酸化によるスーパーオキシドの生成が抑制され、よりプロダクティブな反応経路が優勢になることが明らかとなった。触媒活性はシトクロームP-450camのみを固定化した電極よりハイブリッドタンパク質を用いたものが数倍高い値が得られた。しかしながら、有機合成に使用するには、さらに高い触媒活性と酵素の電極への固定化量の増加が必要である。
水溶性セレン試剤の開発とタンパク質化学への応用

ジスルフィド結合(SS結合)をもつタンパク質のフォールディング試剤としては通常、水溶性イオウ試薬が用いられている。本研究ではイオウよりも酸化還元活性が高いセレンを用いることによって、従来のイオウ試剤とは異なる新しいタイプのタンパク質フォールディング試剤を開発し、これを用いて種々のタンパク質の酸化的フォールディング過程を詳細に解析することを計画した。まず、水溶性セレン試剤として2種類の新規化合物を合成した。これを用いてタンパク質のフォールディング実験を行ったところ、セレン試薬によるタンパク質SS結合の生成反応は瞬時(10秒以内)に、しかも定量的に進行することがわかった。次に、フォールディング過程を詳細に解析するために、クエンチフロー装置を新たに設計・開発し、ウシ膵臓リボヌクレアーゼAのリフォールディング過程の速度論解析を行った。その結果、セレン試薬とタンパク質との反応は1秒以内にほぼ完結し、反応開始後50100msの間にSS結合がタンパク質内に順次生成してくることが明らかになった。タンパク質フォールディングの初期過程の研究は現在注目されているトピックスである。本研究で開発したセレン試剤とクエンチフロー装置を用いることによって,フォールディングのごく初期に短寿命で存在する中間体の補足を行える可能性がある。本研究では並行して、有機化学的な視点(即ち、原子レベルの相互作用)からタンパク質立体構造の支配因子について考察することも重要と考え、タンパク質構造データベース(PDB)の解析や非経験的分子軌道法による理論計算も行った。その結果、PDBの解析からは、タンパク質立体構造の支配因子としてのS...O相互作用の存在を見出した。また、理論計算によって単一アミノ酸の構造特性が二次構造の形成に特に重要な役割を果たしていることを突き止めた。タンパク質の立体構造は,弱い原子間相互作用の微妙なバランスによって維持されている。ジスルフィド結合(SS結合)1よその中では最も強い相互作用に属し,これを切断したり生成したりすることによりタンパク質立体構造を人工的に制御することが可能である。実際にタンパク質の立体構造を制御するためには,これまでグルタチオンやDTT,2-メルカプトエタノールなどの水溶性イオウ試薬が用いられてきた。これらのイオウ化合物はタンパク質と反応してその酸化状態を制御することができる。しかし,反応速度が遅かったり適用できるpH範囲が狭いなどといった問題点があった。本年度は,従来のイオウ試薬のもつこのような欠点を克服するために,イオウよりも酸化還元活性が高いセレンを利用した新しい試剤を開発することを目的に研究を行った。具体的には,(1)効率的で適用範囲が広い水溶性セレン試薬の開発,(2)合成したセレン試薬を用いたタンパク質フォールディング過程の速度論解析,(3)セレン試薬によるタンパク質分子の選択的化学修飾法の開発,について検討を行った。合成したセレン試薬を用いてSS結合を4つもつ典型的なタンパク質であるウシ膵臓リボヌクレアーゼAとの反応を行ったところ,イオウの代わりにセレンを用いることの有用性が明らかになった。即ち,セレン試薬を用いることによって,広いpH範囲で高効率的なSS結合を生成することが可能となった。次年度は,合成したセレン試薬を用いてタンパク質フォールディング過程の詳細な速度論解析を進めると共に,タンパク質立体構造の安定化のメカニズムについても有機化学的観点から再検討することを考えている。本研究ではイオウよりも酸化還元活性が高いセレンを用いることによって、従来のイオウ試剤とは異なる新しいタイプのタンパク質フォールディング試剤を開発し、これを用いて種々のタンパク質のフォールディング過程を詳細に解析することを計画した。

同時に、有機化学的な視点(即ち、原子レベルの相互作用)からタンパク質立体構造の支配因子について考察するために、タンパク質構造データベース(PDB)の解析や非経験的分子軌道法による理論計算も行った。本年度はまず、これまでに合成した水溶性セレン試剤とタンパク質との反応速度論解析を行うために、(株)ユニソクの協力の下、速い反応過程(50ms1s)を追跡することができるクエンチフロー装置を設計・開発した。昨年度までの研究成果から、セレン試薬とタンパク質との反応は瞬時(1秒以内)に進行することがわかっている。装置は1月中旬に完成し、以降、タンパク質としてウシ膵臓リボヌクレアーゼAを用いて、フォールディング過程の詳細な解析を行った。50100msの間にタンパク質とセレン試剤との反応によってSS結合が生成してくる様子を、フォールディング中間体をイオン交換HPLCで分離することによって観測することに成功した。タンパク質フォールディングの初期過程の解析は現在注目されているトピックスである。本研究で開発したセレン試剤とクエンチフロー装置を用いることによって,フォールディングのごく初期に単寿命で存在する中間体の補足と観測を行える可能性があるものと考えている。PDBの解析からは、タンパク質立体構造の支配因子としてのS...O相互作用の存在を見出した。また、理論計算によって単一アミノ酸の構造特性が二次構造の形成に特に重要な役割を果たしていることを突き止めた。
ヒマラヤ産ツリフネソウ属植物の進化と花型の多様性

1.中国・ヒマラヤ地域を中心に収集した野生ツリフネソウ属植物約20種について、DNA抽出とrbcL、ITS1、trnF-trnL non codingregion(trnF-L)の遺伝子領域について解析を行い、これまでに得られたデータとあわせて、分子系統樹を作成した。その結果、ツリフネソウ属は、ヒマラヤ地域を起源の地とし、北半球温帯地域に分布し多様化した群と旧熱帯地域に分布し多様化した群とヒマラヤ地域自身で多様化した群に大きくわけられることが明らかにされた。2.上記の研究成果と形態学的解析の成果をあわせて考察し、系統進化を反映した形態形質を明らかにした。3.上記の研究成果と染色体の多様性の解析の成果をあわせて考察し、染色体の進化方向について明らかにした。4.研究成果の一部を論文にまとめて専門雑誌において発表した。なお、分子系統研究の成果は、(社)日本植物学会第64回大会において発表した。比較対照とすべき試料の一部が国内で入手できず、国外からの入手を手配したため、その入手に時間がかかり、論文発表が遅れたが、まもなく成果が発表される予定である。また、染色体の多様性と分子系統研究成果および形態学的解析の成果をあわせた考察は、研究期間内に予想を上回る染色体試料が中国より入手できたため、現在も解析中であり、その成果をあわせて発表する予定である。1.中国・ヒマラヤ地域を中心に収集した野生ツリフネソウ属植物約20種について、rbcL、ITS1、trnF-trnL nondoding region(trnF-L)の遺伝子領域を用い、分子系統解析を行なった。rbcLとtrnF-Lを用いた分子系統樹によって、ツリフネソウ属の種間系統関係に関する情報が初めて得られた。得られた結果より、ツリフネソウ属は、ヒマラヤ地域に分布する種、東アジアおよび北半球温帯地域に分布する種、旧熱帯地域に分布する種は、それぞれの地域ごとに系統的にも近縁であることが明らかになった。また、ヒマラヤ地域の種は2つのグループに分かれることが明らかになった。2.上記の研究成果をこれまでにえられた形態学的研究成果、特に、花型、花序、染色体数と比較し、系統進化を反映した形態形質は何かを明らかにした。また、分子系統樹と花序との相関関係を明らかにした。花序形態については、分子系統樹からは、総状花序が短縮されていく進化傾向にあるという説が支持されることが明らかになった。さらに、染色体数については、n=9が祖先種であるということが示唆された。一方、花の進化を解明する上で重要であり、分類形質としても最重要であった下萼片の形態は平行進化した可塑性の高い形質であることが示唆された。3.成果を第16回国際植物科学会議(1999年8月17日、アメリカ合衆国セントルイスにて開催)で発表し、国外研究者との情報交換を行った。1.中国・ヒマラヤ地域を中心に収集した野生ツリフネソウ属植物約20種について、DNA抽出とrbcL、ITS1、trnF-trnL non coding region(trnF-L)の遺伝子領域について解析を行い、これまでに得られたデータとあわせて、分子系統樹を作成した。

また、染色体の多様性と分子系統研究成果および形態学的解析の成果をあわせた考察は、研究期間内に予想を上回る染色体試料が中国より入手できたため、現在も解析中であり、その成果をあわせて発表する予定である。
胃癌患者末梢血中の癌細胞由来浮遊ＤＮＡ検出法の確立

胃癌患者の血漿中遊離DNAをBEAMingあるいは次世代シーケンサーで解析し、胃癌原発巣と同一の遺伝子変異(circulating tumor DNA: ctDNA)の定量的検出を行った。ctDNAの定量値を治療経過および臨床所見と比較した。進行胃癌術前血漿をTP53に関して解析した6例中3例でctDNAの検出が可能であり、切除や術後再発や抗癌剤治療の効果と関連していることを示した。胃癌患者においてもctDNAは腫瘍量のモニタリングに有用なマーカーとなる可能性が示された。1.胃癌原発巣における変異の検出原発巣の変異解析は平成24年度も継続して行った。サンガー法によるTP53のシーケンシングを42例に行い10例(24%)に変異を同定した。これらの変異はいずれもアミノ酸変化を伴うものであった。またctDNAをより汎用的なマーカーとするためには、大半の症例で何らかの遺伝子変異を同定する必要がある。このための試みとして、複数の癌関連遺伝子を一度にシーケンシングすることが可能な次世代シーケンサー用Cancer Panelを用いた原発巣解析を開始した。これまでに3例に解析を行い、全例でTP53以外にもctDNA検出に有用と考えられる遺伝子変異が同定された。2.血漿中の変異遺伝子の検出血漿中に存在する希少な変異アレル検出の方法として、次世代シーケンサーIon Torrentによる実験系の確立を行った。このプラットフォームは、BEAMingと同じ化学反応を使用しつつも実験手法が比較的簡便で、かつPCRで増幅した血漿中のDNAを変異点のみでなく全長にわたり解析する点で拡張性が高い。原発巣におけるTP53変異を同定した上記10例のうち6例に対して本手法を用いた術前血漿の解析を行い、3例でctDNAの検出が可能であった。この3例では治療経過を追跡し、切除後、再発後、化学療法後などの血液検体を解析した。結果としてctDNAの定量値は、病勢や治療効果と合致する推移を示した。1.胃癌原発巣における変異の検出サンガー法によるTP53のシーケンシングを42例に行い10例(24%)に変異を同定した。このための試みとして、複数の癌関連遺伝子を一度にシーケンシングすることが可能な次世代シーケンサー用Cancer Panelを用いた原発巣解析を追加した。これまでに3例に解析を行い、全例でTP53以外にもctDNA検出に有用と考えられる遺伝子変異(PIK3CA, FBXW7)が同定された。これらの3例の変異に関して、健常人WBCゲノムのコントロールシーケンス24ランのデータから、本アッセイ系におけるノイズ(シーケンスエラーレート)を調べ、検出閾値の決定を行った。TP53以外の遺伝子による検証でもctDNA定量値は同様の推移を示した。まず胃癌切除標本から採取した凍結腫瘍組織を用いて、TP53,APC,K-RASの遺伝子変異の検索を行った。TP53は32例解析し9例(28%)に変異を同定した。APC,K-RASは解析した25例中に変異を同定しえなかった。一方、胃癌患者の手術前後および化学療法前後の血液サンプルは平成23年度中に53症例(97検体)集積した。サンプルは血漿分離した上で凍結保存し、適宜血漿中の遊離DNAを抽出している。原発巣の解析でTP53の変異を同定した症例のうち、これまで4例でBEAMingの技術を用いた血漿からの変異DNA検出実験を行った。BEAMingの実験に用いるプライマーおよびハイブリプローブを症例毎に設計し、3例でBEAMingの結果(野生型/変異型のビーズカウント)が得られたが、これまでの3例では変異フラグメントは検出されなかった。血漿中の癌細胞由来DNA検出法として、BEAMingに代わって次世代シークエンサーIon Torrentを使用した実験系の確立も行っている。本方法を用いた場合、血漿中のDNAフラグメントを全て解読するため、原発巣での変異同定が必ずしも必要でなく、さらに症例毎のハイブリプローブ設計も不要となる。

このため将来的に多数の症例のスクリーニング検査にも応用可能な極めて有用な検査法になりうると考えられる。まず、腫瘍サンプルの変異解析に関し、申請時に予定していた症例数にほぼ達している。変異が同定された割合が想定を下回ったため血漿の解析対象数が予定より少ないものの、解析を実施したサンプルにおいては高頻度にctDNAを検出できている。さらに、再発症例においては化学療法の効果などと比較可能な結果を得られている。検出閾値を調べるための正常検体を用いたコントロールアッセイもほぼ終了している。血漿サンプルは予定通り集積できている。胃癌切除サンプルは予定数(50例/年)のうち約半数程度の集積状況であり、遺伝子変異の同定頻度はこれまでのところ約3割と想定を下回っている。このため血漿の解析対象数が予定より少ない現状である。腫瘍における変異検索に関して、APC、K-RAS、CDH1などの変異が殆ど検出されないため、結果としてTP53を中心に解析している。結果として原発巣での変異同定割合が想定より低く、血漿の解析対象数が制限されている。これに対し、今後は原発巣の解析に次世代シーケンサー用Cancer Panel(多数の癌関連遺伝子を一度に検索)を導入することにより、解決が可能と考えている。症例集積を続行し、原発巣で変異を同定した患者の血漿解析をすすめる。変異を調べる遺伝子に関しては、頻度の高いとされるものを追加する。胃に発生する腫瘍の一つである消化管間葉系腫瘍(GIST)も解析対象として追加し、同様の実験を行う。実験試薬の購入実験試薬の購入
新たな消化管ペプチドグアニリンとグレーリンによる消化管上皮機能の分子生物学的研究

【1】オーファン受容体であった成長ホルモン分泌促進因子受容体の内因性リガンドとして、ヒトとラットの胃からグレリンを発見し、その細胞局在を示した。グレリンは、脳内では視床下部弓状核に産生ニューロンが存在する。グレリンは強力な成長ホルモン分泌活性に加え、脂肪蓄積、摂食亢進や体重増加、消化管機能調節などエネルギー代謝調節に重要な作用を持つ(Nature2001)。【2】グレリンは膵α細胞でグルカゴンと共存している。膵β細胞にはグレリン受容体が存在し、グレリンはCa2+系を介してβ細胞からのインスリン分泌を促進する(Diabetes2002)。【3】胃から分泌されたグレリンの摂食亢進と成長ホルモン分泌促進に関する情報は、胃に分布する迷走神経求心路を介して、脳に伝達されることを明らかにした。グレリン受容体は迷走神経節で合成され、迷走神経求心路により胃に輸送される。胃内分泌細胞から分泌されるグレリンは受容体に結合後、迷走神経求心路の電気活動を抑制することにより、情報を延髄へ伝達する。この情報は延髄の弧束核で別のニューロンを経由し、最終的に視床下部のNPYニューロンやGERHニューロンへ伝達される(Gastroenterology2002)。【4】グレリンの産生と分泌は、絶食やインスリンおよびレプチン投与で促進され、摂食やグルコース負荷で抑制されたヒト血漿グレリン濃度は体格比と逆相関し、神経性食思不振症のようなやせで高く、肥満者で低い。またヒトでの概日リズムの研究により、グレリンが各食前に増加し、末梢から脳へ空腹情報を伝える液性因子であることを指摘した(J Clin Endocrinol Metab2002)。【5】グレリンの脳内での摂食調節回路網を解析するために、視床下部外側野で産生される2つの摂食亢進ペプチドオレキシンとMCRとの解剖学的、機能的連関を検討した。グレリン神経線維はオレキシンニューロンに直接投射し、その電気活動を亢進した。グレリンによる摂食亢進作用は、オレキシン系の遮断により減少した。一方、MCR系の遮断はグレリン作用に影響しなかった。オレキシンノックアウトマウスでは、グレリンによる摂食亢進作用は野生型より有意に低かった。グレリンの摂食亢進は、オレキシンニューロンとの直接的な経路によっても生じることを明らかにした(Endocrinology2003)。【6】G蛋白結合型オーファン受容体GPR66の内在性リガンドがニューロメジンUであることを示した。ニューロメジンUのエネルギー代謝亢進や褐色脂肪細胞における交感神経活動刺激作用ならびにバゾプレシンとオレキシンの分泌促進作用を明らかにした。ニューロメジンUのニューロンは、視床下部弓状核に存在し、CRHニューロンに投射してCRH系を介して摂食抑制やストレス反応に機能している(Endocrinology2002)。

オレキシンノックアウトマウスでは、グレリンによる摂食亢進作用は野生型より有意に低かった。グレリンの摂食亢進は、オレキシンニューロンとの直接的な経路によっても生じることを明らかにした(Endocrinology2003)。【6】G蛋白結合型オーファン受容体GPR66の内在性リガンドがニューロメジンUであることを示した。ニューロメジンUのエネルギー代謝亢進や褐色脂肪細胞における交感神経活動刺激作用ならびにバゾプレシンとオレキシンの分泌促進作用を明らかにした。ニューロメジンUのニューロンは、視床下部弓状核に存在し、CRHニューロンに投射してCRH系を介して摂食抑制やストレス反応に機能している(Endocrinology2002)。【1】新たな視床下部ペプチドホルモングレリンを発見した。【2】グレリンは摂食を亢進し、レプチンに拮抗すること明らかにした。【3】グレリンの摂食亢進作用は、GH欠損ラットでも見られることから、GHを介した作用ではない。【4】抗グレリンIgGの脳室内投与により、内因性グレリン作用を阻止すると暗期および絶食後の摂食量は減少したことから、グレリンは内因性の摂食亢進物質として機能していることが証明された。【5】浸透圧ポンプを用いてグレリンを慢性投与ると摂食量と著明な体重増加を認めた。グレリンの連続皮下投与でも体重は著増した。【6】グアニリンは、腸の吸収上皮細胞に、ウログアニリは胃のECL細胞と腸のEC細胞に存在することを免疫組織化学的に証明した。GC-CはECL細胞に発現しており、ウログアニリはECL細胞からのヒスタミン分泌を促進した。ウログアニリは腎臓の遠位尿細管上皮にも存在していた。【7】ラットを用いた実験により、腸のウログアニリンmRNA量は経口NaCl負荷で容量依存性に増加することを示した。【8】GC-C受容体を発現しているヒト大腸癌細胞株(T84 cell line)を用いて、cyclicGMP産生量を指標としたguanylin peptide familyの生物活性の測定系を確立した。【9】グアニリン投与によりGC-C発現大腸癌細胞の増殖が抑制され、その効果は10-8M以上で認められた。グレリン産生細胞の形態的特徴を詳細に解析した。グレリン細胞は、既知の消化管ホルモン産生細胞とは異なる新たな内分泌細胞で、胃で2番目に多い内分泌細胞であることを報告した。グレリンが迷走神経を活性化して、胃酸分泌と胃運動能を亢進することを示した。胃機能に及ぼすグレリンの新たな生物活性を見出した。ヒトおよびラット膵臓でのグレリンの局在と膵内分泌系におけるグレリンの作用について検討した。ヒトおよびラット膵臓でのグレリンは膵ラ氏島の辺縁部に存在し、グルカゴンと共存していた。逆相高速液体クロマトグラフィーとラジオイムノアッセイを用い、ラット膵臓でのグレリン分子を同定した。膵ラ氏島にグレリンとグレリン受容体の両者のmRNA発現を認めた。グレリンは膵β-細胞の細胞内Ca^<2+>濃度とβ-細胞からのインスリン分泌を増加させた。グレリンは、グルカゴン産生膵α-細胞に存在し、エンドクリンあるいはパラクリン的にβ-細胞からのインスリン分泌を制御し、エネルギー代謝調節に関与している可能性が示唆された。カヘキシアに対するグレリンの治療薬としての可能性についても研究した。ヒトメラノーマ細胞(SEKI株)をヌードマウスに移植したカヘキシア惹起マウスにグレリンを連日投与すると、体重と摂食量が生食投与群よりも優位に増加した。癌重量は両群で差を認めなかった。
脳虚血耐性獲得に要する刺激強度と各種薬剤の修飾作用に関する研究

1.虚血耐性を獲得させた神経細胞のNMDAに対する反応性の変化の有無を電気生理学的に検索した.虚血耐性はラット脳表面に直接3MKClを浸した綿栓で化学的に刺激して誘発した.その24時間後Bregmaから4mm尾側の大脳スライス冠状切片標本を作製し、これをWhole cellpatch clamp法を用いて電気生理学的に検索した.化学的刺激を加えた側を前処置側、何もしていない側を対象側として頭頂から側頭にかけての大脳皮質第2層の神経細胞に微小ガラス電極を刺入し膜電流を記録した.膜電流の安定後、種々の濃度のNMDA潅流液に対する膜電流の変化および膜電流が観察された細胞に対して外部から電位を変化させ,NMDAの反応によって流れる電流を観察して電流一電圧曲線を得た.その結果、前処置側、対象側共に数μMのNMDA濃度で反応し、電流一電圧曲線にも両群に有意な差は認められなかった.以上の結果より、虚血耐性獲得機序がNMDA受容体のNMDAに対する反応性を変化させることによるものではないことがわかった.2.虚血耐性誘発に利用されるCortical Spreading Depression(以下CSD)が、その後の遺伝子発現に与える影響を検索した.ラット脳表面を直接電気刺激してCSDを定量的に誘発し、その1時間後にBregmaから約4mm尾側、厚さ250μmの大脳スライス標本を作製した.これをin situ hybridization法により早期発現性遺伝子の一種であるc-fosの発現を検索した.その結果c-fosの発現量は麻酔薬の種類・麻酔濃度によらず、CSDの回数に依存して発現した.このことからCSDによって虚血耐性を誘発させる場合、少なくとも早期発現性遺伝子まではそのCSDの刺激回数(刺激強度)に応じて発現してくることがわかった.1.虚血耐性を獲得させた神経細胞のNMDAに対する反応性の変化の有無を電気生理学的に検索した.虚血耐性はラット脳表面に直接3MKClを浸した綿栓で化学的に刺激して誘発した.その24時間後Bregmaから4mm尾側の大脳スライス冠状切片標本を作製し、これをWhole cellpatch clamp法を用いて電気生理学的に検索した.化学的刺激を加えた側を前処置側、何もしていない側を対象側として頭頂から側頭にかけての大脳皮質第2層の神経細胞に微小ガラス電極を刺入し膜電流を記録した.膜電流の安定後、種々の濃度のNMDA潅流液に対する膜電流の変化および膜電流が観察された細胞に対して外部から電位を変化させ,NMDAの反応によって流れる電流を観察して電流一電圧曲線を得た.その結果、前処置側、対象側共に数μMのNMDA濃度で反応し、電流一電圧曲線にも両群に有意な差は認められなかった.以上の結果より、虚血耐性獲得機序がNMDA受容体のNMDAに対する反応性を変化させることによるものではないことがわかった.2.虚血耐性誘発に利用されるCortical Spreading Depression(以下CSD)が、その後の遺伝子発現に与える影響を検索した.ラット脳表面を直接電気刺激してCSDを定量的に誘発し、その1時間後にBregmaから約4mm尾側、厚さ250μmの大脳スライス標本を作製した.これをin situ hybridization法により早期発現性遺伝子の一種であるc-fosの発現を検索した.その結果c-fosの発現量は麻酔薬の種類・麻酔濃度によらず、CSDの回数に依存して発現した.このことからCSDによって虚血耐性を誘発させる場合、少なくとも早期発現性遺伝子まではそのCSDの刺激回数(刺激強度)に応じて発現してくることがわかった.本年度は以下のような検索を中心に研究を進めた。1.ラット脳スライス標本を用いて低酸素・無グルコース負荷による大脳皮質神経細胞外遊離グリタミン酸の上昇、ならびに細胞内遊離Ca^<2+>の変化を同時に両側で観察可能か否か検索した。グルタミン酸またはCa^<2+>個々の変化は、一側大脳半球において測定可能であったが、測定装置の解像度・視野の制限により両側同時の測定は不可能であった。従って以下の研究は、Spreading depression(SD)前処置したものとそうでないものを別々に観察した。定量性に関しては基準溶液による補正によって細胞外グルタミン酸の定量は可能と考えられたが、スライス標本では測定プローベの接触面が小さく、実際の動物における虚血状態でのグルタミン酸上昇時の濃度とは異なる可能性が考えられた。細胞内遊離Ca^<2+>に関しては濃度変化を観察した。2.SD処置後1日のラット脳スライス標本を用いて、低酸素・無グルコース負荷時におけるCa^<2+>の上昇とグルタミン酸上昇との関係を検索した。SD処置後1日のラット脳スライス標本をFura-2で染色し、グルタミン酸測定用プローベをスライス表面の大脳皮質神経細胞に接触させて測定値が安定した後、低酸素・無グルコースを負荷してグルタミン酸とCa^<2+>の変化を観察した。SD前処理した大脳半球の神経細胞と前処置しなかった大脳半球の神経細胞間には、細胞外遊離グルタミン酸上昇から細胞内遊離Ca^<2+>上昇までの時間に差は認められなかった。またCa^<2+>の上昇の程度にも有意な差は認められなかった。

このことよりSD前処理後1日では、虚血に対するグルタミン酸・Ca^<2+>の反応性にSD前処理したものとSD前処置しなかったもので差は認められず、SDによる虚血耐性獲得の機序がNMDA receptorの活性化からCa^<2+>上昇の段階には関係していない可能性が示唆された。1.虚血耐性を獲得させた神経細胞のNMDAに対する反応性の変化の有無を電気生理学的に検索した。虚血耐性はラット脳表面に直接3MKClを浸した綿栓で化学的に刺激して誘発した。その24時間後Bregmaから4mm尾側の大脳スライス冠状切片標本を作製し、これをWholecellpatchclamp法を用いて電気生理学的に検索した。化学的刺激を加えた側を前処置側、何もしていない側を対象側として頭頂から側頭にかけての大脳皮質第2層の神経細胞に微小ガラス電極を刺入し膜電流を記録した。膜電流の安定後、種々の濃度のNMDA潅流液に対する膜電流の変化および膜電流が観察された細胞に対して外部から電位を変化させ、NMDAの反応によって流れる電流を観察して電流-電圧曲線を得た。その結果、前処置側、対象側共に数μMのNMDA濃度で反応し、電流-電圧曲線にも両群に有意な差は認められなかった。以上の結果より、虚血耐性獲得機序がNMDA受容体のNMDAに対する反応性を変化させることによるものではないことがわかった。2.虚血耐性誘発に利用されるCortical Spreading Depression(以下CSD)が、その後の遺伝子発現に与える影響を検索した。ラット脳表面を直接電気刺激してCSDを定量的に誘発し、その1時間後にBregmaから約41mm尾側、厚さ250μmの大脳スライス標本を作製した。これをin situ hybridization法により早期発現性遺伝子の一種であるc-fosの発現を検索した。その結果c-fosの発現量は麻酔薬の種類・麻酔濃度によらず、CSDの回数に依存して発現した。このことからCSDによって虚血耐性を誘発させる場合、少なくとも早期発現性遺伝子まではそのCSDの刺激回数(刺激強度)に応じて発現してくることがわかった。
慢性虚血心に対するインビボ・ティッシュエンジニアリング法

<目的>慢性虚血心に対する骨格筋芽細胞移植に足場となる細胞外マトリックスと細胞増殖因子徐放投与を併用して、その効率化を図る。<方法>Lewis ratを用いて、慢性心筋梗塞モデルを作成した。これに骨格筋芽細胞移植と塩基性線維芽細胞増殖因子徐放投与、肝細胞増殖因子徐放投与の併用を行い、心機能(エコー、カテーテル検査)と移植細胞の生着度、血管新生の程度(組織化学的検査)の評価を行った。また、別にコラーゲンシートに塩基性線維芽細胞増殖因子徐放投与を併用し、1週間後にシート内に骨格筋芽細胞移植を行った。同様の評価を行った。<結果>骨格筋芽細胞移植に塩基性線維芽細胞増殖因子、あるいは肝細胞増殖因子を徐放投与すると、骨格筋芽細胞移植単独群に比し、有意に心機能が改善し、生着した移植細胞のvolume、その周囲に血管密度が増加した。コラーゲンシートに塩基性線維芽細胞増殖因子を併用すると、シート内に血管新生を誘導することが可能であったが、移植細胞はコラーゲンに起因すると思われる炎症反応のために、ほとんど生着しなかった。骨格筋芽細胞移植に対する細胞増殖因子徐放投与併用は有効であるが、コラーゲンシート内での移植細胞の生着・増殖は不可であった。同様の評価を行った。