hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウスTGFβレセプターターゲットRNAiによる慢性肝障害の遺伝子治療

平成17年度はあらかじめ提出している実験計画に基き以下の研究実績を得た。1.マウス生体内への遺伝子導入の確立。(2)免疫組織学的検討により肝細胞にほぼ特異的に取り込まれることを確認した。2.TGFbRII抑制効果の確認のためのマウス生体内における生化学的、形態学的解析。(1)Westernblotting法、Real-time PCR法を用いて、TGFbRIIをターゲットとするRNAi発現vectorがたんぱく質、mRNAレベルにおいて標的遺伝子の発現を抑制することを確認した(それぞれ70-90%程度)。3.マウス生体内でのTGFbRII抑制によるTGFβ1シグナル伝達抑制と細胞障害抑制効果の確認。(1)肝炎惹起物質を用いて細胞内TGFβsignalを活性化させ、シグナル伝達の各ステップ(細胞内シグナル伝達、標的遺伝子の転写)をWestern blotting法、Real-time PCR法を用いて検討したところ、上記の各vectorはシグナル伝達を抑制することが確認された(標的遺伝子の転写は統計学的有意差をもって抑制された。P<0.001)(2)免疫組織学的手法、RIを用いた細胞周期の検討より、上記vectorはTGF-β1シグナルによる細胞障害(apoptosis, cell cycle arrest)を有意に抑制し(P<0.01)、細胞増殖能を維持しえることが確認された。(3)形態学的観察(H&E)により、上記vectorはTGF-β1シグナルによる細胞の形態変化を抑制し、細胞に有利に働くことが確認された。4.マウス生体内でのTGFbRII抑制によるTGFβ1シグナル伝達抑制と予後改善の検討。劇症肝炎モデルマウスを用いて上記のvectorはマウスの予後を改善することを確認した。平成16年度はあらかじめ提出している実験計画に基き以下の研究実績を得た。1.種々のvectorを用いたRNAi発現vectorの作製と遺伝子導入の確立。(2)それぞれのvectorをカチオン脂質による遺伝子導入法により、ヒト、マウスのcell lineにEGFP発現vectorとともに遺伝子導入し、遺伝子導入効率(50-60%)、効果発現までの時間(約12時間)、効果持続時間(約7-10日)を確認した。また、RNAi発現vectorを導入された細胞をselectionするための抗生物質の濃度を検定しPuromycinで(5-10μg/mL)が至適濃度であった。2.TGFbRII抑制効果の確認のための培養細胞上における生化学的、形態学的解析。3.培養細胞上でのTGFbRII抑制によるTGFβ1シグナル伝達抑制と細胞障害抑制効果の確認。(1)recombinant TGFβ1を用いて細胞内TGFβsignalを活性化させ、シグナル伝達の各ステップ(細胞内シグナル伝達、標的遺伝子の転写)をWestern blotting法、Real-time PCR法を用いて検討したところ、上記の各vectorはシグナル伝達を抑制することが確認された(標的遺伝子の転写は統計学的有意差をもって抑制された。

(2)免疫組織学的検討により肝細胞にほぼ特異的に取り込まれることを確認した。2.TGFbRII抑制効果の確認のためのマウス生体内における生化学的、形態学的解析。(1)Westernblotting法、Real-time PCR法を用いて、TGFbRIIをターゲットとするRNAi発現vectorがたんぱく質、mRNAレベルにおいて標的遺伝子の発現を抑制することを確認した(それぞれ70-90%程度)。3.マウス生体内でのTGFbRII抑制によるTGFβ1シグナル伝達抑制と細胞障害抑制効果の確認。(1)肝炎惹起物質を用いて細胞内TGFβsignalを活性化させ、シグナル伝達の各ステップ(細胞内シグナル伝達、標的遺伝子の転写)をWestern blotting法、Real-timePCR法を用いて検討したところ、上記の各vectorはシグナル伝達を抑制することが確認された(標的遺伝子の転写は統計学的有意差をもって抑制された。P<0.001)(2)免疫組織学的手法、RIを用いた細胞周期の検討より、上記vectorはTGF-β1シグナルによる細胞障害(apoptosis, cell cycle arrest)を有意に抑制し(P<0.01)、細胞増殖能を維持しえることが確認された。(3)形態学的観察(H&E)により、上記vectorはTGF-β1シグナルによる細胞の形態変化を抑制し、細胞に有利に働くことが確認された。4.マウス生体内でのTGFbRII抑制によるTGFβ1シグナル伝達抑制と予後改善の検討。劇症肝炎モデルマウスを用いて上記のvectorはマウスの予後を改善することを確認した。
MΦブレブ小胞によるがん分子情報の新規伝達メカニズム

癌細胞はその周辺に腫瘍の進行を加速するサポーターとしての間質細胞を作り出す。癌細胞は自身の分子成分を容れた細胞外小胞を周囲に撒くが、組織中の拡散範囲は限局性である。では癌細胞の分子情報はいかにして広く間質細胞に伝達されるのか?これまで腫瘍マクロファージMΦはTEVを取り込み、組織中を広範囲に移動して遠方の間質細胞に癌由来分子を伝搬する事を見出した。その機構に大きく影響する、MΦが産生する新規細胞外小胞の産生機序と、それにより周辺間質細胞に伝達される癌由来の分子情報を解明する。
病徴進展に関連するビワがんしゅ病菌のプラスミド

ビワがんしゅ病菌の85メガダルトン(Md)プラスミドが欠落すると保有株とは異なり、カルス様組織を伴わない病徴進展を示すようになる。そこで、85Mdプラスミドの機能に関連する知見を得るため、ビワ茎組織における保有株および欠落株の増殖能を比較するとともに、宿主組織および細菌の形態的変化を電子顕微鏡を用いて観察した。その結果、保有株は接種10日後から増殖を続け、20日後にはカルス組織を伴う典型的な病徴を発現した。それに反し、欠落株の菌数は接種後から漸次減少し、40日後まで明瞭な病徴は認められなかった。なお、両菌株の培地中における増殖能には差は認められなかった。また、接種10日後の細胞間隙に観察された両菌株に形態的差異は認められなかった。しかし、接種20日から40日後の保有株は正常な形態を有し、隣接宿主細胞は変性あるいは壊死収縮していたが、欠落株は電子密度が高くなった不整形の菌体が多く観察されるようになり、隣接宿主細胞の壊死は認められなかった。以上のことから、85Mdプラスミドが欠落するとビワ組織中での増殖が阻害され、病徴進展に差が生じることが示唆された。更に、85Mdプラスミドの再導入実験を行うため、ブラスミドの選択標識として利用できる表現型の検出を試みたが検出できず、またTn5やTn7によるプラスミドの標識を試みたが、すべてクロモゾ-ムにのみ挿入されていた。次に、85Mdプラスミドを高電圧パルスを用いて欠落株に再導入を図り、保有株と欠落株のコロニ-の色に極めてわずかな差が認められることを利用して再導入菌株の検出を試みたが極めて困難であった。従って、現在85Mdプラスミドのクロ-ニングを試みており、クロ-ニングしたDNAを遺伝子導入装置を利用して欠落株に導入する予定である。
オンライン手書き記号の高精度認識システムの構築

手書き記号認識用の識別器を構築する場合、大量の学習パターンが必要となる。しかし、このような学習パターンを収集するのは、非常に大変であった。そこで、少数のオンライン手書き記号データから人工的に学習パターンを生成し、それらを使ってオフライン手書き記号識別器の識別精度向上を行なう手法を考案した。この手法では、元となるオンライン記号データから、一筆で描かれた部分(ストローク)を抽出し、抽出されたストロークごとにアフィン変換を施して変形させ、最後に1つの記号として合成し、学習パターンを生成する。本手法を、手書き平仮名文字10種に適用した結果、記号全体に幾何学的変形を施して記号生成する従来法に比べ、識別器の性能をより向上させることができることを示した。関連論文は、国際会議ICDAR(International Conference on Document Analysis and Recognition)に採択され、成果発表を行なった。次に、識別器の識別精度向上・処理速度向上を狙って、次の手法を考案した。(1).各記号を構成しているオンライン時系列座標データに基づき、DPマッチングを用いて、各記号クラス間の点列マッチングを行なう。(2).対応した点列座標間の位置の変動について、主成分分析を行なう。(3).主成分分析の結果に基づいて、人工的に記号を生成し、さらに、生成した記号の各ストロークに対して、アフィン変換を施して変形させ、1つの記号を合成する。本手法を、手書き平仮名文字10種に適用した結果、主成分分析での適切なパラメータ選択によって、以前の手法に比べて、同等の識別精度で、より処理速度の速い識別器を構築することができることを示した。関連論文は、国際ワークショップDAS(Document Analysis Systems)に採択され、成果発表を行なった。オンラインの手書き楽譜記号認識の高精度化を目指して、次の手法を考案した。(1)筆記ストローク(「ストローク」とはペンで筆記される1画を意味する)からフリーマンコード化によって時系列データを抽出し、そのデータに基づき、DPマッチングを用いてストローク識別を行う。(2)筆記ストロークの画像データから方向性パターン特徴を抽出し、SVM(Support Vector Machine)を用いてストローク識別を行う。(3)上記2つの結果を統合し、さらにSVMを用いて筆記ストローク識別を行う。これらの手法を実際の手書き楽譜記号7,666ストロークに適用した結果、97.60%の認識率を得た。これは、手法(1)、(2)を単独で用いるよりも高精度の認識率である。関連論文は、国際会議ICPR(International Conference on Pattern Recognition)に採択され、成果発表を行った。次に、HMM(Hidden Markov Model)を用いたオンライン手書き記号認識の高速化とシステムの使い勝手向上を目指して次の手法を考案した。(1)筆記ストークの長さに基づき、計算対象となるHMMを限定する。(2)通常のHMMの確率計算は、ストロークの筆記後にまとめて行われるが、本手法では書いている間に計算を行い、処理の分散化を図る。これらの手法を実際の手書き楽譜記号6,999ストロークに適用した結果、通常のHMMと比較し、認識率を落とすことなく、計算時間を73%に抑えることができることを示した。関連論文は、国際ワークショップIWFHR(International Workshop on Frontiers in Handwriting Recognition)に採択され、成果発表を行った。
記憶と記念の社会心理学

研究内容は、大きく2つに大別される。第1は、社会的、もしくは集合的な記憶、および、その伝達・継承に関わる理論的基盤を社会心理学の観点から整備しようとした研究である。すなわち、社会的表象理論、社会構成主義など、社会心理学及びその隣接領域において、現在注目を集めている新しい思潮の導入を図りつつ、体験記憶・伝達のあり方を整理・分類するための独自のフレームワークを提起した。より具体的には、(1)原初の体験が外的に物象化した存在(例えば、廃墟やモニュメントなどのモノ、普遍的な言語メッセージなど)を基調とする「記録」による伝達、(2)原初の体験が内的に物象化した存在(例えば、感情、態度など)を基調とする「記憶」による伝達、(3)原初の体験の現場に、被伝達者の身体状相を遡行させることを企図した「身構え/純粋な風景」による伝達、以上の3つを概念的に区別した。第2の研究内容は、阪神・淡路大震災(1995年)を事例として、上記の提起を実証的かつ実践的に検討した研究である。具体的には、(1)被災者による直接的コミュニケーションに基づく体験伝達の例として、語り部ボランティア「グループ117」の活動を、(2)フィクションによる体験伝達の試みとして、被災地の劇団「青い森」による震災劇を、(3)博物館等における体験伝達のアプローチの一例として、「北淡町野島断層保存館」を、さらには、(4)被災者と非被災者との交流プログラムによる体験伝達の試みとして、「震災モニュメント交流ウォーク」を、それぞれとりあげた。すべての対象について、綿密なフィールドワークが展開されている。あわせて、震災によって広く人口に膾炙した「活断層」という用語を事例に、専門知識の普及・定着という観点からも、集合的な記憶について検討した。なお、上記フィールドとの比較対象として、ヒロシマ・ナガサキにおける被爆体験の継承、ハワイにおける真珠湾攻撃の記憶など、戦争の記憶についても資料を収集した。阪神・淡路大震災(1995年)の体験が、いかなるプロセスを経て、記憶され伝達されるかについて、いくつかの実証的研究を基礎に検討した。具体的には、第1に、被災者が直接的な体験を語る試みとして、「語り部グループ117」(代表:長谷川忠-氏)の活動を1年間にわたって参与観察し、詳細なフィールドノートを作成した。第2に、演劇を通じた記憶伝達の試みとして、「劇団青い森」(代表:細見圭氏)の公演についても、現地調査、聞き取り調査を行い、フィクションという形式がもつ有効性について、実証的検討を試みた。第3に、震災後、各地に建てられたモニュメント(慰霊碑)をめぐって歩く試み「震災メモリアルウォーク」(世話人:堀内正美氏)をとりあげ、被災者相互、ないし、被災者と非被災者との交流、モニュメント等の物質的記憶が果たす役割などについて、実証的に検討した。また、重大事の社会的記憶に関して、異文化における比較対象物として、米国における第2次世界大戦の記憶をとりあげ、ハワイにおいて、予備的な観察と資料収集をも実施した。これらの実証的研究を通じて、また、本研究の理論的基盤である社会構成主義、社会的表象理論、廣松認識論に立脚しつつ、被災体験の保存と伝達の形態を、「記憶」と「記録」の2つに分類・整理した。具体的には、第1に、両者は、それぞれ、廣松の言う「所与的契機-所識的契機の2重成態」を基盤とする体験者の原初的な体験様相から、所与的契機が物象化した形態(「記憶」)、もしくは、所識的契機が物象化した形態(「記録」)であること、第2に、上記実証的研究における試みはいずれも、より原初的な体験様相の保存・伝達を指向したものと位置づけうること-以上の2点を、当面の結論として導いた。
１次元水素化マグネシウムナノファイバーによる高性能リチウムイオン電池の開発

1.高圧水素反応装置を使用し、VS(蒸気から固体結晶を作るvapor-solid法)手法によるMgH2ナノファイバーを合成した。合成したMgH2ナノファイバーを用いて、導電カーボンやバインダーと混合し、圧延法により、MgH2電極の作製を試みた。得られた電極をSwagelok-cellにより、その電極特性を評価した。2.遷移金属酸化物は、例えば酸化鉄、酸化コバルト、酸化マンガン等、水素化物と同様なコンバージョン反応により、リチウムイオン電池の負極材へ適用される。コンバージョン反応メカニズムを深く理解するために、酸化物と水素化物をリチウムイオン電池負極材としての比較実験を実施した。こちらの酸化物負極材の性能の向上には、ナノ構造化や炭素との複合化が必要となる。液体燃焼合成等の手法を利用し、様様な酸化物ナノ構造体や複合体の合成を試みた。3.最終目的であるMgH2負極材を用いたリチウムイオン電池フルセルを作成するため、LiMn2O4、LiNi0.5Mn1.5O4等の正極材の合成を試みた。その正極材の特性を評価し、得られた結果を取りまとめ学会や専門雑誌で発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。Liイオン電池のエネルギー密度の向上には、負極活物質の容量密度の向上が不可欠である。そして、従来のグラファイト負極の5倍以上の容量もあるMgH_2はLiイオン電池の負極材料として極めて有望である。一方、MgH_2をLiイオン電池負極材料に適用する際の問題は、充放電に伴う体積膨張・収縮や低い電子伝導性で、このため良好な繰り返し特性が得られていない。そこで本研究の目的は、上記問題点を解決するため、1Dナノ構造体であるMgH_2ナノファイバーLをLiイオン二次電池の負極材料に適用する。MgH_2ナノファイバーはコンバージョン反応に伴う体積収縮・膨張が生じても応力を緩和し、粉化を抑制しながら、伸長方向に対し十分な電子伝導性を実現でき、従来法で合成したバルクMgH_2より良好な繰り返し特性を得ることが期待できる。前述した目的を達成するために、24年度は以下の研究活動を行なった:(1)本研究室に既存する装置を使用してVS(蒸気から固体結晶を作るvapor-solid法)手法によりMgH_2ナノファイバーを合成した。その結果、MgH_2結晶の形状・純度を制御するために、合成温度・圧力が製品に与える影響が明らかにし、MgH_2ナノファイバーの合成条件を最適化した。現在、一バッチの実験では200mgのMgH_2ファイバーの合成に成功している。(2)電極、電池特性評価のための電池評価装置を購入した。合成したMgH_2を用いて、塗布法や圧粉成型法により、MgH_2電極の作製を試みた。(3)最終目的であるMgH_2負極材を用いたリチウムイオン電池フルセルを作成するため、LiMn_2O_4等の正極材の合成を試みた。その正極材の特性を評価し、得られた結果を取りまとめ学会で発表した。そこで本研究の目的は、上記問題点を解決するため、1Dナノ構造体であるMgH_2ナノファイバーをLiイオンニ次電池の負極材料に適用する。前述した目的を達成するために、25年度は以下の研究活動を実施した。:(1)本研究室に既存する装置を使用してVS(蒸気から固体結晶を作るvapor-solid法)手法によりMgH_2ナノファイバーを合成した。その結果、MgH_2結晶の形状・純度を制御するために、合成温度・圧力が製品に与える影響が明らかにし、MgH_2ファイバーの合成条件を最適化した。これらの成果はLiイオン電池以外にも適用可能な学術的成果であり、水素関連の国際会議で発表し注目を集めている。合成したMgH_2を用いて、導電カーボンやバインダーと混合し、圧延法により、MgH_2電極の作製を試みた。この手順がMgH_2電極開発では極めて重要であり、その手法を現在最先端紛体工学の理論に基づき検討を試みている。

合成したMgH2ナノファイバーを用いて、導電カーボンやバインダーと混合し、圧延法により、MgH2電極の作製を試みた。得られた電極をSwagelok-cellにより、その電極特性を評価した。2.遷移金属酸化物は、例えば酸化鉄、酸化コバルト、酸化マンガン等、水素化物と同様なコンバージョン反応により、リチウムイオン電池の負極材へ適用される。コンバージョン反応メカニズムを深く理解するために、酸化物と水素化物をリチウムイオン電池負極材としての比較実験を実施した。こちらの酸化物負極材の性能の向上には、ナノ構造化や炭素との複合化が必要となる。液体燃焼合成等の手法を利用し、様様な酸化物ナノ構造体や複合体の合成を試みた。3.最終目的であるMgH2負極材を用いたリチウムイオン電池フルセルを作成するため、LiMn2O4、LiNi0.5Mn1.5O4等の正極材の合成を試みた。その正極材の特性を評価し、得られた結果を取りまとめ学会や専門雑誌で発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。各項目共に当初計画した事項は順調に進展している。更に、当初計画に無かったが、最終的にリチウムイオン電池フルセルを作成するためのLiMn_2O_4等の正極材の合成も試みた。以上より、本研究は現在のところ、当初の計画以上に進展している。次年度は今年度で合成したMgH_2ナノファイバーを用いて、電極を作製し、その電極特性を評価する。さらに、導電助剤、バインダー、触媒等の添加がMgH_2電極に与える影響を調べる。次年度は今年度で作成したMgH_2電極の電気特性を評価し、そのコンバージョン反応メカニズムを解析する。さらに、比較のため、同じコンバージョン反応である遷移金属酸化物負極材も合成し、その電気特性を評価する。最後は、各実験結果を整理し、論文にまとめ、国際雑誌で発表する。
バイオモニタリングを用いた難分解性有機汚染物質の簡易高精度大気汚染評価法の開発

昨年度開発した新規ローボリュームエアーサンプラーを用いて大気を捕集し、難分解性有機汚染物質(POPs)のダイオキシン類について、1年4ヶ月間における経週的濃度変動を明らかにした。大阪府枚方市における大気中濃度は、春期から夏期にかけて高濃度を示し、冬期ではむしろ低い傾向にあり、従来指摘されてきた季節的変動とは全く逆である貴重な結果が得られた。経週的濃度変動は比較的大きく、この研究期間における(最大/最小)濃度比は約4倍にもなる。同期間において経週的に採取した黒松の針葉試料には、大気中の気相状態のダイオキシン類が主に蓄積しており、その蓄積濃度は葉齢に相関していた。この結果に基づいて、黒松針葉におけるダイオキシン類蓄積濃度係数を算出し、さらに、これを基にして(1)黒松針葉-大気気相中実測濃度変換係数(2)大気気相-総大気中実測濃度変換係数および(3)大気中実測濃度-TEQ濃度変換係数を算出・設定し、これらの係数および気温を組み込んだ黒松針葉中蓄積濃度から大気中ダイオキシン類濃度が算出できる評価式を構築した。本評価式は大阪府下の環境が異なる8ヶ所の適用した結果、比較的高精度に大気濃度を評価できることが判明した。従って、今回構築した評価式は、今後の環境研究に大きく貢献できるものと思われる。環境総合研究所と共同して全国規模で実施してきた黒松針葉による大気中ダイオキシン類バイオモニタリングは、シュミレーションによる汚染結果と良好な相関を示すことが明らかとなり、黒松針葉によるバイオモニタリング法の有用性を強調することができた。一方、他のP0Ps評価式を構築するための基礎的研究として、DDT類、HCH類、クロルデン、六塩化ベンゼン(HCB)について、ローボリュームエアーサンプラーを用いて大気中の存在状態を明らかにし、今後の有用な知見を得ることができた。大阪府枚方市の二地点において経週的に捕集した大気試料を用いて、難分解性有機汚染物質(POPs)のうち、ポリ塩化ジベンゾ-p-ジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフランおよびコプラナーPCBの濃度変動を明らかにした。大気試料は公定法に従ってハイボリュームエアーサンプラーを使用し、24時間に1,000m^3を捕集した。しかし、経週的な濃度変動は極めて大きく、一定期間における平均濃度を評価することは困難であることが判明した。風速、気温、湿度等の気候条件とPOPs濃度には相関が認められないことから、発生源におけるPOPs排出濃度は経時的に大きく相違することが示唆された。本結果から、信憑性の高い大気中POPs濃度を評価するためには連続捕集試料が不可欠であるとの結論に達した。従って、柴田化学機械工業株式会社と共同して新規ローボリュームエアーサンプラーを製作した。POPs数種類の^<13>C_<12>-ラベル化体をサンプリングスパイクとして使用し、本サンプラーの性能を検討した。40L/分の捕集速度で1週間1ヶ月間連続して大気を捕集し、POPsを分析した。一方、ハイボリュームエアサンプラーによっても大気を経日的に連続して24時間捕集、1週間1ヶ月間のコンポジット試料を調製し、分析に供した。同一捕集期間における両試料のPOPs濃度はほぼ同じであり、また、本機によるサンプリングスパイクの回収率は1ヶ月間まで低下しなかったことから、本機は一ヶ月の連続大気捕集が可能な性能をもつことが判明した。

現在、同一地点において黒松針葉と大気を捕集し、POPsを計測しており、黒松針葉を指標試料とした簡易かつ高精度の大気中POPsの汚染評価法が構築できるものと考えている。昨年度開発した新規ローボリュームエアーサンプラーを用いて大気を捕集し、難分解性有機汚染物質(POPs)のダイオキシン類について、1年4ヶ月間における経週的濃度変動を明らかにした。大阪府枚方市における大気中濃度は、春期から夏期にかけて高濃度を示し、冬期ではむしろ低い傾向にあり、従来指摘されてきた季節的変動とは全く逆である貴重な結果が得られた。経週的濃度変動は比較的大きく、この研究期間における(最大/最小)濃度比は約4倍にもなる。同期間において経週的に採取した黒松の針葉試料には、大気中の気相状態のダイオキシン類が主に蓄積しており、その蓄積濃度は葉齢に相関していた。この結果に基づいて、黒松針葉におけるダイオキシン類蓄積濃度係数を算出し、さらに、これを基にして、(1)黒松針葉-大気気相中実測濃度変換係数、(2)大気気相-総大気中実測濃度変換係数および(3)大気中実測濃度-TEQ濃度変換係数を算出・設定し、これらの係数および気温を組み込んだ黒松針葉中蓄積濃度から大気中ダイオキシン類濃度が算出できる評価式を構築した。本評価式は大阪府下の環境が異なる8ヶ所に適用した結果、比較的高精度に大気濃度を評価できることが判明した。従って、今回構築した評価式は、今後の環境研究に大きく貢献できるものと思われる。環境総合研究所と共同して全国規模で実施してきた黒松針葉による大気中ダイオキシン類のバイオモニタリングは、シュミュレーションによる汚染結果と良好な相関を示すことが明らかとなり、黒松針葉によるバイオモニタリング法の有用性を強調することができた。一方、他のPOPsの評価式を構築するための基礎的研究として、DDT類、HCH類、クロルデン、六塩化ベンゼン(HCB)について、ローボリュームエアーサンプラーを用いて大気中の存在状態を明らかにし、今後の有用な知見を得ることができた。
化学的手法による標的分子の迅速同定とリガンド結合部位の高精度解析一般法の確立

光アフィニティラベル(PAL)法は薬物や生理活性物質の標的となる高分子の同定と結合構造の詳細を明らかにできる優れた方法であるにもかかわらず、従来、それほど広範には利用されていない最大の理由は、ラベルペプチドの特異的回収とこれを高感度・高精度に検出する分析手法が確立していなかったためである。本研究では、この手法を普遍化する必要条件を確立することを目的とし、3年間で取り組んだ。得られた成果は以下の通りである。(1)光アフィニティラベル用試薬(TOY-SG)と類似構造をもつグルタチオン誘導体をハプテンとした抗体を調製した。サブピコモルのハプテンを認識できる抗体力価を有していた。(2)光ラベルしたcMOAT(胆管側膜の薬剤排出ポンプ)を調製、精製した。基質特異性の高いプロテアーゼLys-Cでの消化で、3-4kDaの光ラベルされたペブチド断片が得られる条件を設定した後、抗ハプテン抗体を用いた免疫沈降法による精製を試みたが、沈降率が5%と低く、実用的精製には十分ではないことがわかった。(3)別法として、Lys-C消化フラグメントを逆相系HPLCを用いて分画し、光ラベルフラグメントを含むそれぞれの画分をMALDI-TOF MS分析した結果、これまで我々、および他のグループが点変異法で明らかにした2ヶ所の膜貫通部以外に、新たに2ヶ所のヌクレオチド結合ドメイン近傍がラベルされたフラグメントに合致する分析値が得られた。これは新知見である。(4)本法を一般化するには、高力価のハプテン抗体を得る方法が課題として残った。これは新知見である。薬物や生理活性物質の標的となる高分子の同定と結合構造の詳細を一挙に明らかにできるのは、光アフィニティラベル(PAL)法を用いる化学的手法に限られる。それにもかかわらず、PAL法が、それほど広範には利用されていない最大の理由は、ラベルペプチドの特異的回収とこれを高感度・高精度に検出する分析手法が確立していなかったためである。これをふまえ、本研究では、この手法を普遍化するのに必要な条件を確立し、「高感度・高精度な標的分子の同定およびリガンド結合部位の精密解析の一般法」として提案すること目的としている。研究初年度に当たる本年度に得られた成果は、以下のとおりである。(1)高い力価をもつハプテン抗体の産生:神経のNaチャンネルを特異的にブロックする新しいハチ毒β-PMTXの結合部位解析をめざし、PAL用試薬としてベンゾフェノン基を含むβ-PMTX誘導体1を作製した。また同様の官能基をもつβ-PMTX誘導体をハプテンとして、これを認識する抗体を調製した。この抗体は、1で光ラベルしたラット脳のNaチャンネルを、ピコモル以下の量でも検出できる力価を有していることが確かめられた。(2)MS/MS分析の高感度化:キャピラリーLCとMS/MSをオンライン化することによって、nanoESI-MS/MS用試料の脱塩を超微量で行えるようになった。(3)ユニークな活性をもつβ-PMTXアナローグの合成:活性の強いβ-PMTXアナローグの作製の一環として、いくつかのペプチドを合成したが、その一つ、β-PMTXの部分構造を繰り返すペプチドに、β-PMTXの結合をかなり強く阻害する活性を認めた。

これをふまえ、本研究では、この手法を普遍化するのに必要な条件を確立し、「高感度・高精度な標的分子の同定およびリガンド結合部位の精密解析の一般法」として提案すること目的としている。研究2年目に当たる本年度に得られた成果は、以下のとおりである。(1)高い力価をもつハプテン抗体の産生:胆管側膜の薬剤排出ポンプcMOATの基質認識部位構造の解析をめざし、PAL用試薬としてトリフロロメチル-フェニルジアジリン基を含むグルタチオン誘導体1を作製した。また類似構造をもつグルタチオン誘導体をハプテンとして、これを認識する抗体を調製した。この抗体は、1で光ラベルしたラット胆肝膜標品のcMOATを、サプピコモルレベルでも検出できる力価を有していることが確かめられた。(2)MS/MS分析の高感度化:キャピラリーLCとMS/MSをオンライン化することによって、nanoESI-MS/MSの測定が超微量で行えるようになった。(3)光ラベルcMOATの断片化条件の確立:1で光ラベルされた部位をMS/MS分析で同定するために必要な、タンパク質の断片化条件、およびハプテン抗体との反応条件がほぼ確立できた。光アフィニティラベル(PAL)法は薬物や生理活性物質の標的となる高分子の同定と結合構造の詳細を明らかにできる優れた方法であるにもかかわらず、従来、それほど広範には利用されていない最大の理由は、ラベルペプチドの特異的回収とこれを高感度・高精度に検出する分析手法が確立していなかったためである。本研究では、この手法を普遍化する必要条件を確立することを目的とし、3年間で取り組んだ。得られた成果は以下の通りである。(1)光アフィニティラペル用試薬(TOY-SG)と類似構造をもつグルタチオン誘導体をハプテンとした抗体を調製した。サブピコモルのハプテンを認識できる抗体力価を有していた。(2)光ラベルしたcMOAT(胆管側膜の薬剤排出ポンプ)を調製・精製した。基質特異性の高いプロテアーゼLys-Cでの消化で、3-4kDaの光ラベルされたペプチド断片が得られる条件を設定した後、抗ハプテン抗体を用いた免疫沈降法による精製を試みたが、沈降率が5%と低く、実用的精製には十分ではないことがわかった。(3)別法として、Lys-C消化フラグメントを逆相系HPLCを用いて分画し、光ラベルフラグメントを含むそれぞれの画分をMALDI-TOF MS分析した結果・これまで我々、および他のグループが点変異法で明らかにした2ヶ所の膜貫通部以外に、新たに2ヶ所のヌクレオチド結合ドメイン近傍がラベルされたフラグメントに合致する分析値が得られた。これは新知見である。(4)本法を一般化するには、高力価のハプテン抗体を得る方法が課題として残った。
木材の高性能接合法の開発に関する研究

1.接合部材に適したエポキシ樹脂接着剤を選択するために、3種類のエポキシ樹脂接着剤を用いてフィンガージョイント材を作製し、その静的曲げ試験および衝撃曲げ試験を行った。静的曲げ強さおよび衝撃曲げ吸収エネルギーの接合効率から前報の引張りヤング係数が最も高い接着剤が最も適していると考えられた。2.フィンガー基部を傾斜させたスロープト・フィンガージョイントの接合性能を調べるため、レゾルシノール・フェノール共縮合樹脂、エポキシ樹脂接着剤およびポリウレタン樹脂接着剤を用いて、スロープ比0,0.5,1.0,1.5,2.0のスロープト・フィンガージョイント材を作製し、その静的曲げ、衝撃曲げ、静的引張りに対する接合性能に及ぼすスロープ比および接着剤の影響を検討した。静的曲げ強さおよび引張り強さともスロープ比1.0で飽和し、曲げ強さの場合スロープ比1.0以上では接着剤による差異はほとんど認められなかった(最大有効率96%)。引張り強さは接着剤による差異が若干みられ、スロープ比1.0のウレタンが最大値を示した(最大有効率84%)。一方、衝撃曲げ吸収エネルギーの増加割合は、ウレタン以外の接着剤の場合小さく、スロープ比2.0のウレタンが最大値を示した(最大有効率62%)。上記の結果より、スロープト・フィンガージョイントは適した接着剤を用いればスロープ比が小さい場合でもかなり高い接合性能を示すと言える。3.スロープト・フィンガージョイントの曲げ破壊過程で発生するAE特性に及ぼすスロープ比および接着剤の影響を調べた。レゾルシノール・フェノールの場合、低荷重からAEの発生が認められ、なんらかの塑性変形が起こっていることを示唆している。一方、エポキシの場合、スロープ比0以外は破壊荷重の1/2程度でAEの発生が開始し、ウレタンの場合、それらの中間的な特性を示した。1.フィンガー基部を傾斜させたスロープト・フィンガージョイントの接合性能を調べるため、レゾルシノール・フェノール共縮合樹脂、エポキシ樹脂接着剤およびポリウレタン樹脂接着剤を用いて、スロープ比0,0.5,1.0,1.5,2.0のスロープト・フィンガージョイント材を作製し、その静的曲げ、衝撃曲げ、静的引張りに対する接合性能に及ぼすスロープ比および接着剤の影響について検討した。静的曲げ強さおよび引張り強さともスロープ比1.0で飽和し、曲げ強さの場合スロープ比1.0以上では接着剤による差異はほとんど認められかなった(最大有効率96%)。一方、衝撃曲げ吸収エネルギーの有効率はスロープ比の増加にともなって増加したが、その増加割合はウレタン以外の接着剤の場合小さく、スロープ比2.0のウレタンが最大値を示した(最大有効率62%)。最大荷重までの仕事量に対応する衝撃曲げ破壊吸収エネルギーの変動要因と考えられる破壊強さおよび破壊たわみの有効率は一般に静的曲げのそれよりも小さかった。2.スロープト・フィンガージョイント材の曲げ破壊過程で発生するAE特性に及ぼすスロープ比および接着剤の影響を調べた。素材の場合、AEの発生は非常に少なかった。
チタン基生体用形状記憶合金の内部組織制御及び特性改善

前年度までの研究では、β型Ti基形状記憶合金のマルテンサイト相(α"相)において、格子定数が合金組成によって変化することで変形双晶の活動頻度が変化することを明らかにした。また、そのような変形双晶の活動頻度の組成依存性が、加工集合組織の組成依存性と関連していることを示唆した。そこで本年度では、すべりや双晶による変形が内部組織にどのような影響を及ぼすのかを調べることで、加工集合組織の形成機構を明らかにすることを目的とした。Tiにβ相安定化元素としてNbを添加したTi-Nb二元系合金をアーク溶解により作製した。合金組成を変化させることで、α"相の格子定数を変化させることができる。作製した合金に対し、室温において圧延による変形を施した。この際、圧延率を変化させた試料を作製し、変形過程を観察するための試料とした。圧延後の試料に対し、透過型電子顕微鏡を用いて内部組織観察を行った。すべり変形が主要な変形モードとなっている組成では、圧延率の増加に伴い転位密度の増加がみられた。このような組成には強い(100)_<α">[010]_<α">加工集合組織が形成された。変形双晶が活動的な組成では、圧延初期に多数の太い双晶バンドの導入がみられ、その後はバンドの内部に新たな双晶が導入されることによって変形が進んでいくことがわかった。結晶粒が双晶界面で分断されることで、圧延加工によって組織が微細化し、強い加工集合組織は形成されなかった。以上のように、本研究ではβ型Ti基形状記憶合金の合金組成と変形機構、形成される加工集合組織との関連性を明らかにした。この成果は、β型Ti基生体用形状記憶合金の内部組織制御技術の確立に大きく貢献するものである。本研究の目的は、生体に安全な元素のみで構成されたβ型Ti基生体用形状記憶合金に対し、内部組織制御による特性改善技術を確立することである。本年度は、圧延により形成される加工集合組織を調べ、加工集合組織の形成に影響を及ぼす因子を特定することを目指した。Tiにβ相安定化元素としてNbまたはTaを添加したTi-Nb二元系合金およびTi-Ta二元系合金を作製し、室温において圧延加工を施した。どちらの合金も加工性に優れており、室温で98%以上の圧延加工が可能であった。合金のNbまたはTaの濃度を増加させると、マルテンサイト変態開始温度(M_s)の低下や、母相(β相,bcc)およびマルテンサイト相(α"相,orthorhombic)の格子定数の変化をもたらす。加工集合組織を測定した結果、M_sが室温より低く圧延時にβ相で塑性変形が起こる組成の場合、Ti-Nb合金、Ti-Ta合金共に強い{001}_β<110>_β加工集合組織が形成されることがわかった。一方、M_sが室温程度あるいは室温より高く圧延時にα"相で塑性変形が起こる組成の場合、NbまたはTaの濃度が高い場合は強い(100)_<α">[0101]_<α">加工集合組織が形成されるが、NbまたはTaの濃度が低くなるにつれ、加工集合組織は弱いものになっていくことがわかった。このようなα"相の加工集合組織におけるNbまたはTa濃度依存性は、NbまたはTa濃度の変化がもたらすα"相の格子定数変化と、それによる塑性変形モードの変化によるものであると結論づけた。以上まとめると、β型Ti基生体用形状記憶合金に形成される加工集合組織には、添加したβ相安定化元素の種類や濃度ではなく母相とマルテンサイト相の相安定性および格子定数が強く影響していることがわかった。前年度の研究においては、β型Ti基形状記憶合金の加工集合組織形成に影響を及ぼす因子を調べ、母相(β相,bcc)とマルテンサイト相(α"相,orthorhombic)の相安定性および格子定数が大きく影響していることを明らかとした。そこで本年度では、それら相安定性および格子定数を変化させたβ型Ti基合金を作製し、それぞれの合金がどのような変形モードによって塑性変形を生じるのかを調べ、相安定性および格子定数と変形モードとの関連性について明らかにすることを目指した。合金のNb濃度を変化させることで、母相とマルテンサイト相の相安定性およびそれらの格子定数を変化させることができる。作製した合金に対し、室温での引っ張り試験によって塑性変形を生じさせた後、透過型電子顕微鏡による変形組織観察を行った。Ti-30Nb(at.%)合金は室温でβ相単相であり、引っ張り変形後の試料には多数の<111>_β転位が観察された。一方、室温でα"相単相であるTi-20Nb(at.%)合金においては、引っ張り変形後の試料に多数の変形双晶が観察された。α"相の格子定数を用い、観察された双晶のせん断歪み量を計算したところ、いずれも小さな値であり活動しやすい双晶であることがわかった。さらに、観察された変形双晶のうち{130}_<α^">。・複合双晶および{110}_<α^">複合双晶に関しては、合金のNb濃度が減少するにつれ観察頻度が高くなる傾向がみられた。これは、Nb濃度によってα"相の格子定数が変化することに対応して、これら複合双晶のせん断歪み量が減少するためであると結論づけた。

以上のように、β型Ti基形状記憶合金の塑性変形機構を明らかにしたことが、本年度の成果である。前年度までの研究では、β型Ti基形状記憶合金のマルテンサイト相(α"相)において、格子定数が合金組成によって変化することで変形双晶の活動頻度が変化することを明らかにした。また、そのような変形双晶の活動頻度の組成依存性が、加工集合組織の組成依存性と関連していることを示唆した。そこで本年度では、すべりや双晶による変形が内部組織にどのような影響を及ぼすのかを調べることで、加工集合組織の形成機構を明らかにすることを目的とした。Tiにβ相安定化元素としてNbを添加したTi-Nb二元系合金をアーク溶解により作製した。合金組成を変化させることで、α"相の格子定数を変化させることができる。作製した合金に対し、室温において圧延による変形を施した。この際、圧延率を変化させた試料を作製し、変形過程を観察するための試料とした。圧延後の試料に対し、透過型電子顕微鏡を用いて内部組織観察を行った。すべり変形が主要な変形モードとなっている組成では、圧延率の増加に伴い転位密度の増加がみられた。このような組成には強い(100)_<α">[010]_<α">加工集合組織が形成された。変形双晶が活動的な組成では、圧延初期に多数の太い双晶バンドの導入がみられ、その後はバンドの内部に新たな双晶が導入されることによって変形が進んでいくことがわかった。結晶粒が双晶界面で分断されることで、圧延加工によって組織が微細化し、強い加工集合組織は形成されなかった。以上のように、本研究ではβ型Ti基形状記憶合金の合金組成と変形機構、形成される加工集合組織との関連性を明らかにした。この成果は、β型Ti基生体用形状記憶合金の内部組織制御技術の確立に大きく貢献するものである。
新規アジュバントを用いた鼻腔投与型インフルエンザウイルスワクチンの開発

マウスを用いた新規アジュバントを用いたインフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザウイルス自体の投与量を減らし有効性を高めることが確認された。これまで本邦で季節性インフルエンザウイルスワクチンに付加するアジュバントは認可されておらず、新たなワクチン作成のための基礎的データとなりうる。鼻腔投与型ワクチンにおけるアジュバントの免疫賦活能力を検討するために、Balb/cマウスを用いてA/Puerto Rico/8/34 H1N1インフルエンザウイルスの感染モデルを作成した。非致死的用量でのウイルス感染後にアジュバントとしてAlumやCpG ODNを鼻腔投与した。その後再度致死的ウイルス感染を起こしたのち、脾臓や肺などの臓器を採取した。それぞれの臓器を様々な抗体で染色しフローサイトメトリーにてT, B細胞の分化や, NK細胞などの発現について検討を行った。特にAlumとCpGの2種類のアジュバントを投与したマウスでは肺でB220+CD22highCD19+のMature/Transitional Bcellが強く誘導されていた。今後はさらに有効性を高めるだけでなく、安全性の高める検討が必要となる。安全性に関しては組織学的なマウスの鼻腔粘膜肥厚の程度と、TSLPなどのサイトカインの免疫染色で確認していく予定としている。これまで検討してきた結果は、日本耳鼻咽喉科学会総会や耳鼻咽喉科免疫・アレルギー学会、さらにアメリカウイルス学会で毎年報告しており、他施設の研究者などから助言などもいただき、さらにクオリティの高い研究を進めているところである。最終年になる本年には研究成果を英文で報告する予定としている。アジュバントを用いたインフルエンザウイルスワクチンの有効性については、検討を終了したところでありこれから安全性の確認を行う段階となっている。概ね研究については順調に進展しており、本年度中には研究結果の報告を行う予定である。アジュバントを用いた新規インフルエンザウイルスワクチンの作成は順調に進んでおり、今後は株型の異なるウイルスにも有効なワクチン作成を行う必要がある。世界中で用いられるワクチンは流行株が合致した場合には有効であるが、予測の外れたワクチン株と流行株が異なった場合には有効性は低下するため、インフルエンザウイルスのクロスプロテクション機能などを応用したさらに有効性の高いワクチン作成を行うことを予定している。インフルエンザウイルスワクチンに付加するアジュバントの検討を行なった。主にTh2タイプのAlumとTh1タイプのCpG ODNを用いて、インフルエンザウイルスワクチンに使用できるかを鼻腔投与し確認を行なった。Alum, CpG ODN単独でもワクチンの効果を増強することがわかったが、特にこれら2つのアジュバントを組み合わせて用いることで、インフルエンザウイルスに対する非特異的な抗体反応を誘導することがわかってきた。鼻腔投与型ワクチンにおけるアジュバントの免疫賦活能力を検討するために、Balb/cマウスを用いてA/Puerto Rico/8/34 (PR8) H1N1インフルエンザウイルスの感染モデルを作成した。ウイルス感染8週間後にTh2タイプのアジュバントであるAlumやTLR9のアゴニストであるCpG ODN、PR8のリコンビナントHAを鼻腔投与し、14日後に再度インフルエンザウイルス感染を起こした。2回目の感染後14日でマウスの血清や鼻腔洗浄液を採取し、ELISAにてIgGやIgAなど抗体産生の測定を行った。またマウスの血清、リンパ節、肺、脾臓を採取し、各臓器内のCD4+T細胞、CD8+T細胞などの発現についてフローサイトメトリーにて評価した。さらにCD4+T細胞とCD8+T細胞のCD25やCD44など様々な抗体の発現をみて、免疫細胞の活性化やメモリー分化などの詳細な検討を行った。非致死的なウイルス感染後にアジュバントを投与し、その後致死的なインフルエンザウイルスを投与した場合に、アジュバントを2種類加えたマウス群ではマウスの致死率が低い傾向にあった。結成内の抗体産生ではIgG1aの誘導が強くなっており、Th2系の反応の増強が認められた。これはAlum単独群では認めない傾向であり、2種類のアジュバント加えた相乗効果と考えられた。研究成果についてはデータをまとめ、国際学会においても発表を行なっている。研究の進捗状況としては予定通りと考えている。実際にマウスに投与したアジュバントはインフルエンザウイルスに対し有効性を認めており、今後新たなインフルエンザウイルスワクチンの開発が期待できる。特に鼻腔投与型ウイルスワクチンはまだ本邦において未導入であり、さらなる研究が必要と考えられる。

安全性に関しては組織学的なマウスの鼻腔粘膜肥厚の程度と、TSLPなどのサイトカインの免疫染色で確認していく予定としている。これまで検討してきた結果は、日本耳鼻咽喉科学会総会や耳鼻咽喉科免疫・アレルギー学会、さらにアメリカウイルス学会で毎年報告しており、他施設の研究者などから助言などもいただき、さらにクオリティの高い研究を進めているところである。最終年になる本年には研究成果を英文で報告する予定としている。アジュバントを用いたインフルエンザウイルスワクチンの有効性については、検討を終了したところでありこれから安全性の確認を行う段階となっている。概ね研究については順調に進展しており、本年度中には研究結果の報告を行う予定である。今後はアジュバント付加型インフルエンザウイルスワクチンの生体内に与える影響について検討する必要がある。ワクチンは有効性が高いと同時に、安全でなくてはならない。副作用の出現などについてサイトカインの測定や組織障害の程度を、実際のマウスの鼻腔や肺組織、リンパ節や脾臓を用いて検討する必要がある。また有効性については血清内に生成される抗体だけでなく、鼻腔局所や肺組織内に産生される抗体なども検討する必要がある。今後の検討成果については2018年度もアメリカ、メリーランド州で行われるアメリカウイルス学会で発表予定である。現在のところ概ね良好に実験は進んでいると考えられ、実験計画については大きな変更はない。アジュバントを用いた新規インフルエンザウイルスワクチンの作成は順調に進んでおり、今後は株型の異なるウイルスにも有効なワクチン作成を行う必要がある。世界中で用いられるワクチンは流行株が合致した場合には有効であるが、予測の外れたワクチン株と流行株が異なった場合には有効性は低下するため、インフルエンザウイルスのクロスプロテクション機能などを応用したさらに有効性の高いワクチン作成を行うことを予定している。英文構成費として2106円を計上していたが、提出書類が期限までに間に合わず取り下げの上繰越としました。
ヒトマラリアの防御抗原を発現する組み換えBCGワクチンの作製

1.これまでに組み換えBCGのシステムを用いてPlasmodium falciparumのMSP1のC末端部をコードする遺伝子を組み入れた組み換えBCG菌を作製し、BCG菌からのMSP1-Cの分泌を確認した。またその構造は本来の立体構造に近い構造をとっていることも分かった。しかしながら分泌量に関してはまだ十分ではないことから、この抗原により誘導される防御免疫を高めるのは難しいものと考えられた。今回、発現量を増加させる対策として、MSP1-Cの遺伝子のコドンを抗酸菌型のコドンに適合させた人工の合成遺伝子を作製した。この合成遺伝子を用いて上記と同様にして組み換えBCG菌を作製し、BCGからのMSP1-Cの分泌量を検討したところ分泌量が上昇しているのが確認された。またMSP1-Cの発現領域を修正することによりBCGからの分泌量をさらに増加させることができた。2.SERA(SE47')は我々の発現システムを用いた場合、大量分泌系には適さない可能性が示されたことから、今回ストレス蛋白質であるHSP60及びα-crystallin like proteinのプロモーターを用いて菌体内の発現を目指した新しいベクターの構築を行い、BCGを形質転換した。得られた組み換えBCG菌からのSE47'の発現を検討したところ、BCG菌体内でのSE47'の発現が確認された。菌体内での発現はα-crystallin like proteinのプロモーターを用いた場合においてより多く発現しているのが確認された。次に、SE47'の発現が確認された組み換えBCG菌をマウスに投与し、抗体産生誘導能について検討した初回免疫後4週、8週、21週後の抗血清を用いて抗SE47'抗体価をABC-ELISA法で測定したところ、抗体価の上昇は認められなかった。
社会性昆虫の利他性に関わる遺伝子の分子進化に関する研究

代表的な真社会性昆虫であるセイヨウミツバチのワーカーは羽化後の加齢に伴って仕事を変える事が知られている.この分業は脳キノコ体における学習能力の発達と関係していると考えられている.当研究室では,ワーカーを社会的環境から隔離した状態(独房)で飼育する事により,学習能力が発達しないミツバチ(独房蜂)を作出する事に成功している.ディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて特定された,通常の学習能力が高いミツバチ(コロニー蜂)で特異的に発現するmajor royal jellyprotein(MRJP)1遺伝子について詳細な発現解析実験を行い,記憶・学習能力の発達とこの遺伝子の発現が密接に関わっているという証拠をつきとめた,また,マイクロアレイ法により独房蜂とコロニー蜂の脳キノコ体での網羅的な遺伝子発現の比較を行い,有意に発現に差がある80個の遺伝子を特定した.これらのうち,特に興味深いいくつかの遺伝子について,リアルタイム定量RT-PCR法にて詳細な発現解析をし,記憶・学習能力の発達に関わっていると思われるいくつかの遺伝子を特定した.もう一つの真社会性昆虫の大グループであるシロアリ類においては,テルペン類を噴射する事により最も進化的な化学的防衛を行うタカサゴシロアリを用いて研究を行ってきた.全てのテルペン類はイソペンテニルニリン酸を前駆物質として,メバロン酸を経由して合成される事が知られている,今年度は,その合成経路の最も上流の遺伝子であるacetoacetyl-CoA thiolase遺伝子に焦点をあて,RT-PCR法,RACE法にて遺伝子全長のクローニングに成功した.またこの遺伝子は,いくつかのコピーが存在する事も確認でき,テルペン類を合成しないワーカーと防衛を行う兵隊では,発現している遺伝子コピーが異なる事も確認できた.代表的な真社会性昆虫で,社会行動学的な研究が大きく先行しているセイヨウミツバチにおいて,記憶・学習能力に関わる遺伝子を特定するために,まずはディファレンシャルディスプレイ法(DD法)を行う事にした.最初に,効率良く質の高い全RNAを単離するため,記憶・学習能力に差が生じる条件下で飼育したワーカーの頭部から,速やかに脳キノコ体を摘出し,様々な方法で全RNAを抽出し,その質の検討をRT-PCRを用いて行った.その結果,最適な解剖法,RNA抽出法を特定でき,各比較系統群間で抽出の効率に差異がない事も確認できた.現在,これらの全RNAを用いて最適なDD法を行うための条件を検討中である.昆虫における社会性獲得の進化経路を比較する上で重要な,もう一つの真社会性昆虫の大グループであるシロアリ類においては,テルペン類を噴射する事により最も進化的な化学的防衛を行うタカサゴシロアリを用いて研究を行ってきた.これまでのDD法を用いた研究で,いくつかの兵隊特異的に発現する遺伝子の候補が得られており,その内の一つにゲラニルゲラニル一リン酸合成酵素遺伝子が含まれていた.この遺伝子は,in situハイブリダイゼーションにより,防衛物質の生合成が行われていると考えられている額腺細胞層での発現が認められた事から,防衛物質の生合成に関与している可能性が強く示唆された.この結果は,シロアリがテルペンを合成しているという初めての分子生物学的な証拠であり,防衛物質が額腺細胞で合成されるという初めての直接的な証拠でもある.しかし,この酵素は植物ではよく知られているが,動物ではテルペン合成に関与している報告はなく,今後,この遺伝子の分子進化を研究する事で,シロアリの兵隊特異的テルペン合成経路の獲得の進化経路を考察できると考えられる.現在,この遺伝子についての成果を論文にまとめ,投稿準備中である.セイヨウミツバチにおいて,当研究室ではワーカーを社会的環境から隔離した状態で飼育する事により,学習能力が抑えられたミツバチ(独房蜂)を作出する事に成功している.そこで,この独房蜂とコロニーにて飼育された学習能力が高いミツバチ(コロニー蜂)との間でディファレンシャル・ディスプレイ法(DD法)を用いて遺伝子発現プロファイルを比較した.その結果,独房蜂は遺伝子発現レベルでも抑制されている事が明らかになった.その後,コロニー蜂特異的に見られたバンドの内,最もシグナル強度の差が顕著なバンドに焦点をあて,塩基配列を決定したところ,major royal jelly protein(MRJP)1遺伝子である事がわかった.また,リアルタイム定量的RT-PCRでこのバンドがDD法の擬陽性ではない事も確かめられた.MRJP1は,下咽頭腺で合成されるローヤルゼリーに含まれる主要な9個のタンパク質の一つであり,全てのMRJP遺伝子について,コロニー蜂のキノコ体での絶対的な発現量をリアルタイム定量的RTPCRで比較したところ,MRJP1遺伝子の発現量が他のMRJP遺伝子に比べて明らかに高く,MRJP1遺伝子がキノコ体において重要な機能を果たしている可能性を示唆した.ここまでの結果を論文としてまとめ,現在投稿準備中である.シロアリ類においては,テルペン類を噴射する事により最も進化的な化学的防衛を行うタカサゴシロアリを用いて,昨年度特定したジテルペンの合成に関わる遺伝子の発現解析について,「Insect Molecula rBiology」に投稿し受理された.またこの成果は,8月に行われた国際社会性昆虫学会,日本進化学会大会にて報告された.また,この遺伝子のシロアリ系統内での分子進化を調べるため,様々な系統のシロアリ採集を沖縄県西表島およびマレーシアのボルネオ島にて行った.代表的な真社会性昆虫であるセイヨウミツバチのワーカーは羽化後の加齢に伴って仕事を変える事が知られている.