hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転写・翻訳反応のＱＣＭ法による時空間的解析

本年度は、翻訳反応の律速段階であると言われている翻訳開始過程の機構を明らかにすることを目指し、mRNA上に結合しまた一方で迅速にスライドしなければならないリボソームの相反するmRNAとの相互作用において、翻訳量を増加させることが知られているRNA上の特異な翻訳増強配列が翻訳開始時にリボソームをmRNAから解離しやすくし、スムーズにペプチド伸長過程へと移行させていることを明らかにした。これは本研究の特色であるQCM装置の「その場」観察が可能な利点を活かし翻訳反応の詳細な動的観察から初めて明らかにされたことであり、米国化学会誌(JACS)にその成果を発表した。本研究の目的は、水晶発振子マイクロバランス(QCM)を用いて翻訳過程の解析を行うことである。昨年度までに、QCM上でmRNAからの翻訳により生成するタンパク質を補足することにより、翻訳速度が求められることを見出した。この成果を受けて本年度は、mRNAの長さを変えて]翻訳されるタンパク質の分子量を長くすると,翻訳時間も長くかかることから翻訳速度を求めることができた。分子量100から500までのタンパク質で調べたところ翻訳速度は1分間に11アミノ酸程度であった。これは翻訳反応を追跡しながらその速度をもとめた世界で初めての例であり、米国化学会誌(JACS)のその成果を発表した。当初目的としていた,水晶発振子上での翻訳反応を測定出来る目処がついたこと、翻訳するタンパク質の長さを変化させると翻訳速度が測定できることがわかったこと、などは想定以上の成果である。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでにいろいろな方法で翻訳速度を求めようとした例はあるが、本研究で示したような、翻訳反応を質量変化としてin situで追跡しながら翻訳速度を具体的な値(11 amino acid/min)と求めた例は初めてである。来年度は,翻訳するタンパク質の長さや、mRNA上のコドンにレアコドンなどを挿入して翻訳速度を実際に求めることを計画している。今年度では,タンパク質の長さは人工タンパク質と言われてもしかたのない単純な配列を繰り返してタンパク質の長さを変化させたが、来年度は長さや構造が異なる天然のタンパク質を翻訳させた時の翻訳速度を求める予定である。また、mRNA上にレアコドンやサイレントコドンを導入したときの翻訳速度についても検討する予定である。
ES細胞の肝不全への移植療法の開発を目指した肝細胞分化の研究

肝不全への移植療法への応用を目指し、胚性幹(ES)細胞より肝細胞を分化・製造する方法を研究した。ブドウ糖は細胞の生存に必須である。ガラクトースは肝細胞のみがエネルギーに変換し、生存可能である。そこでブドウ糖を除き、ガラクトースを添加した培地でES細胞を培養したところ、肝芽細胞への分化が促進され、肝芽細胞が高率に収穫されることを明らかになった。我々はこれまで,胚性幹(ES)細胞を肝芽腫に分化させる培地の開発を試みるとともに,Insulin-like growthfactor(IGF)-IIは,肝細胞の分化を促進する転写因子CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)αの発現を亢進しつつ,肝細胞の分化を促進することを突き止めた。そこで,ES細胞を肝芽細胞に分化させる方法の開発を継続するとともに,IGF-IIがC/EBPαの発現を亢進させる分子生物学的メカニズムの解明を計画した。現在,肝芽腫細胞株をIGF-IIで刺激した際に発現の変動する遺伝子群を,cDNAマイクロアレイを用いて解析中である。肝細胞分化を促進する増殖因子,転写因子の解明が解明され,ES細胞を増殖因子で刺激,または転写因子を導入することにより,肝細胞への分化を促進し,肝細胞を製造する方法の開発に発展することが期待される。ES細胞から肝芽細胞を製造する方法を確立し,特許出願するとともに,国際英文誌に投稿し,現在revise versionを投稿中である。今後,GFPレポーター遺伝子を発現するES細胞を肝芽細胞に分化させ,肝不全マウスに移植し,救命する可能性を探る。Wntシグナルは細胞の分化と増殖に深く関与する。発展的な試みとして,肝細胞の分化におけるWntシグナルの役割の解明を開始した。ES細胞より肝細胞を製造する方法の開発,肝芽腫・肝細胞癌の発癌メカニズムの解明に発展することが期待される。我々はこれまで、胚性幹(ES)細胞を肝芽腫に分化させる培地の開発を試みるとともに、Insulin-like growthfactor(IGF)-IIは、肝細胞の分化を促進する転写因子CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)αの発現を亢進しつつ、肝細胞の分化を促進することを突き止めた。そこで、ES細胞を肝芽細胞に分化させる方法の開発を継続するとともに、IGF-IIがC/EBPαの発現を亢進させる分子生物学的メカニズムの解明を計画した。現在、肝芽腫細胞株をIGF-IIで刺激した際に発現の変動する遺伝子群を、cDNAマイクロアレイを用いて解析中である。肝細胞分化を促進する増殖因子、転写因子の解明が解明され、ES細胞を増殖因子で刺激、または転写因子を導入することにより、肝細胞への分化を促進し、肝細胞を製造する方法の開発に発展することが期待される。ES細胞から肝芽細胞を製造する方法を確立し、国際英文誌に投稿し、掲載された。IGF-IIはIGF-Iレセプター(IGF-IR)を介して細胞増殖を刺激する。今回我々は、肝細胞癌が転移する過程で繊維組織のみから成り、増殖因子の存在しない間質に進展し、増殖するメカニズムとして、IGF-IRが恒常的に活性化しており、IGF-IRを阻害すると、増殖のみならず、転移をも抑制することを見いだした。新規分子標的治療の開発に発展する可能性が示唆され、国際英文誌に投稿し、掲載された。
高速ナノバイオイメージングによる細胞膜透過ペプチドの改良

細胞膜透過ペプチド(CPP)/蛋白質導入ドメイン(PTD)は細胞内生理活性蛋白質の細胞導入法を実現できる方法として期待されている。しかし実用化には導入効率の著名な改善が求められている。我々はPTDの細胞内侵入過程を定量的に解析できる1分子イメージング(singlemoleculeimaging;SMI)技術を開発し、その結果、従来のPTD(Tat-PTD)の1000倍ナノ粒子(量子ドット;QD)の細胞導入効率を改善するSuper-PTD(SPTD)の開発に成功した。本研究では、SMIを用い、PTD空間的配置が担体分子導入に与える影響を解析しながらSPTDの実用化の可能性を考察した。QD上に3個以上PTDを配置すると、個々のQDが局所刺激反応を起こし、個々の粒子がナノロボットのように振るまい、細胞膜上を移動し、細胞内に侵入することを発見した。同様の反応がSPTDでも確認され、PTD多量化で粒子にナノロボットとしての性質を付与できることが示された。そこで、SPTD3量体を形成するように(Gly-Pro-Pro)_<8->付与SPTD(GPP-SPTD)は、QD取り込み効率をSPTD-QDの10倍以上の効率を上昇させ、GPP-SPTD融合Creを作成しloxP-stop-loxPリポーター発現細胞で、導入効率がTat-PTD-CreとSPTD-Creに対し、それぞれ30倍、10倍の効率改善であった。多量化をSPTDに起こさせることで、高い蛋白導入効率を実現することが可能で、同様の方法で超効率の蛋白質導入方の実現が可能だと考えられた。細胞膜透過ペプチド(PTD)は細胞内生理活性蛋白質の細胞導入法を実現できる方法として期待されている。しかし実用化には更なる導入効率の改善が求められている。我々はPTDの細胞内侵入過程を定量的に解析できる1分子イメージング(single molecule imaging;SMI)技術を開発した。また、従来のPTD(Tat-PTD)に対してナノ粒子(量子ドット;QD)の細胞導入効率を1000倍改善するSuper-PTD(SPTD)の開発に成功した。今回は、SMIを用い、PTD空間的配置が担体分子導入に与える影響を解析した。(平成23-24年度)QD上のPTD数がQD動態に与える影響を検討した。QD上に8個PTDを配置すると、個々のQDが局所刺激反応を起こし細胞膜上を移動し、細胞内に侵入した。これは細胞上に吸着したQD数に依存せず、QD上でPTDを多量化すると、個々の粒子が独自の細胞動態を示し、あたかもナノロボットのように振るまい細胞内に侵入することを発見した。同様の反応はSPTDでも確認された。(平成24年度)そこで、SPTDが効率よく多量化するよう、コラーゲン由来GPP配列を付加した、GPP-SPTDを合成するとGPP-SPTDは3量体を形成し、GPP-SPTD付着QDは、SPTD付着QDの10倍以上の効率で取り込まれた。(平成24年度)そこで、GPP-SPTD融合Creを作成しloxP-stop-loxPリポーター発現細胞で、導入効率を検討した。GPP-SPTD融合CreはTat-PTD-CreとSPTD-Creに対し、それぞれ30倍、10倍の効率改善であった。以上より、GPP-SPTDは予想されたように高い蛋白導入効率を示し、我々のSPTDを用いて、その多量化を改善することで、実用に耐えうるPTDを作成しうる可能性が示唆された。(1)量子ドット(QD)ラベルした細胞膜透過ペプチド(PTD)を用いて、細胞膜結合及び細胞内侵入の瞬間・過程を単一分子レベルで動態を直接可視・定量化を行い、PTDの改良を行った。

PTD細胞内侵入にはPTDに共通する細胞表面受容体が必須で、受容体結合後、受容体架橋によりエンドサイトーシスを活性化して、細胞内に取り込まれ、エンドソームを突き破り細胞内に親侵入する。ところが、既存のPTDsはいずれもエンドソームを突き破る効果が非常に弱いことが明らかになった。そこで、既存のPTDに様々なウイルス由来のcell fusion peptideを付加して改良型PTDsを作成し、透過効率のよい改良型PTDを一分子可視化技術で選択した。この結果、我々が作成した改良型PTD(以下Super-PTD(SPTD)と呼称)では95%以上の分子がエンドソームを突き破り効率を示すのに対して、originalのHIV-1Tat由来PTD(TatP)では数%のエンドソームを突き破り効率しかなく、エンドソームを突き破り効率を50倍程度改善することに成功した。一方、このSPTDを多量化すると細胞表面受容体への結合定数が上昇し、QD上に3個以上のSPTDをつけることで、QD上に1個TatPが結合している場合の20倍程度結合力が改善して、そのために3価SPTDではTatPの1000倍まで細胞内侵入能が一分子可視化技術では明らかになった。そこで、(2)SPTDを融合したCreレコンビナーゼを作成しloxP-stop-loxPリポーター発現細胞を用いて生物学的活性を測定するために、SPTDを融合Creレコンビナーゼ作成ベクターを構築した。3量体Super-PTD作成のためには(Gly-Pro-Pro)10配列をSPTDのNー端側に付加した。PTDs融合Cre蛋白が大腸菌で作成されたことをゲルを用いて確認をした。我々の研究課題では、独自に開発した一分子ナノイメージングの機器を用いて研究を行う事になっていたが、東日本大震災で、施設と共にこのシステムが大きく損傷し、in vitroイメージング機器の復旧は9月初旬までかかった。一方、in vivoでの一分子観察の系の復旧は現在精力的に行っているところである。加えて、我々の施設の-80度冷蔵庫、細胞培養装置、細胞観察器具、及びその他の様々な研究機器が損壊した結果、計画どおりに研究を遂行することが困難となった。特に冷蔵庫の故障により、研究のために樹立していた細胞膜透過ペプチド受容体発現細胞株、各種タンパク質、細胞染色用試薬が破損し、改めて、これらの細胞株の樹立、各種タンパク質の作成等を行う必要があった。さらに、実験に用いられる試薬等も全て購入するわけには行かず、正常に機能するかどうか確認する作業が必要になり、研究計画が遅れることになった。このために今回の研究テーマについてはin vitroのassayにのみ集中することとなり、研究では特に作成した様々なSPTDの細胞上への結合定数、その細胞表面上での一分子動態及び細胞内エンドソームを突き破り効率の定量的な解析を中心に研究を行った。今年度の研究では、PTDの改良をさらに行いSuper-PTD(SPTD)を開発したが、このSPTDはoriginal TatPの千倍強まで量子ドット(QD)の細胞導入効率が改善しており、特に細胞内にエンドソームにより取り込まれた後に、その90%が細胞内に侵入するという点がユニークで、エンドソーム遊出能に関しては、original TatPの350倍改善しており、SPTDは我々が調べた限り世界で最良の効率を持つPTDのひとつである事が明らかになった。
HPLC/MSによる血清糖タンパク質糖鎖及び糖ペプチドの網羅的解析法の確立

1.糖ペプチドの高感度な分析法の確立これまでに私は両性イオン型親水性クロマトグラフィー(ZIC-HILIC)により糖鎖・糖ペプチドの選択的かつ高分離能な分離が可能であることを示してきた。今回、カラムをキャピラリーサイズ(75μmI.D.)にし、nanoESIでイオン化することで、わずか150ngのエリスロポイチン(糖タンパク質)から100種以上の糖ペプチドを解析することに成功し、非常に高感度な分析法を確立した。2.糖鎖・糖ペプチドの2次元HPLC/MS分析法の確立プロテオミクスにおいて、複雑なサンプルからより多くのタンパク質を同定するために、イオン交換カラムと逆相カラムを組み合わせた2次元HPLC/MSによるタンパク同定法が使用されている。しかし、これまで糖鎖分析に関してはこのような2次元HPLCの手法は存在せず、非常に複雑なサンプルの解析は困難であった。そこで私は、イオン交換カラムと糖鎖・糖ペプチドの分離に非常に有効な手段であるZIC-HILICカラムを組み合わせることで、2次元HPLC/MSによる糖鎖解析法を初めて確立した。これにより、非常に複雑なサンプルであっても分析することが可能となった。3.安定同位体による比較グライコミクス法の確立プロテオミクスでは、サンプル間の相対的定量をするめに安定同位体ラベルを使用した比較プロテオミクス手法がよく使用されている。近年、糖鎖においても比較グライコミクスの手法が報告されている。しかし、親水的な糖鎖に疎水的なラベル化を用いるため、逆相カラムにおいて軽ラベル体と重ラベル体が分離してしまい、定量性の悪化が問題点としてあった。そこで、私はZIC-HILICを用いることで軽ラベル体と重ラベル体が単一ピークとして観測できることを示した。これにより、プロテオミクスと同レベルの定量性を有した比較グライコミクス研究が可能となった。1.質量分析による糖ペプチド解析法の確立糖鎖をタンパク質から切り離すことなく、糖ペプチドの状態のまま解析することで、糖鎖構造、ペプチド配列(タンパク質の同定)、糖鎖とタンパク質の結合位置の解析が可能となる。しかし、これまでの糖ペプチドの解析方法ではペプチド配列の決定は比較的容易だったのに対し、糖鎖構造を決定することは不可能であった。私はこれまで網羅的な糖鎖のMs^nスペクトルライブラリーの構築を行ってきた。そこで、糖ペプチドの糖鎖部分のMS^3スペクトルを取得し、糖鎖MS^nスペクトルライブラリーと比較することで糖鎖部分を含めた糖ペプチドの解析が可能となった。これにより、どのタンパク質の、どの部分に、どのような糖鎖が結合しているかを解析することが可能となり、疾患により糖鎖変化を起こしているタンパク質の同定への応用が可能となった。2.糖ペプチドの選択的かつ高分離能な分離法の確立糖ベプチドを調整するには、まずタンパク質をプロテアーゼによるペプチド断片化を行った後に、大量のペプチド混合物の中から糖ペプチドを精製する必要がある。これまでの精製法では、糖ペプチドの選択的な精製は可能であったが、糖ペプチド間の分離、特に異性体糖ペプチド(同じペプチド配列に異性体糖鎖が結合した分子)の分離は極めて困難であり、糖ペプチドの糖鎖部分の構造解析をより複雑化していた。そこで、私は両性イオン型親水性クロマトグラフィー(ZIC-HILIC)を糖ペプチドの分離に応用することで、異性体糖ペプチドをも含めた選択的かつ高分離能な糖ペプチドの分離が可能であることを見出した。以上の結果により、これまでの血清糖鎖の解析に加え、血清糖ペプチドの網羅的解析の基盤技術を確立した。今後、疾患により変化する糖鎖及びそのキャリアータンパク質の同定を網羅的に行っていく予定である。
植物のエネルギー代謝におけるオートファジーの意義とその制御機構の解析

本研究では、植物の成長や生存戦略を支えるエネルギー恒常性の維持機構において、体内栄養リサイクル系であるオートファジーが担う生理的意義と、その制御の分子メカニズムについて明らかにすることを目的とし研究を行っている。本年度は、前年度までに整備したシロイヌナズナー重、二重変異体系統を使用し、ミトコンドリア内で分岐鎖アミノ酸の異化代謝を担う酵素とオートファジーの二重変異体が、それぞれの一重変異体よりもさらに糖欠乏耐性が低下することを見出した。オートファジーによるタンパク質分解から派生する分岐鎖アミノ酸が異化されることが、重要なエネルギー恒常性維持機構となっている可能性が示されたと言える。また前年度に構築したイネにおけるオートファジー可視化法を適用し、過去にシロイヌナズナで得られていた知見と同様に、イネ葉においても暗処理によるエネルギー欠乏でRubisco-containing body (RCB)/オートファジーが活性化されることを明らかにした。また、シロイヌナズナ葉においてRCB形成の誘導様式について解析を行い、紫外線照射時にはRCBによる部分分解ではなく、クロロファジーと命名した葉緑体丸ごとの全分解がより活発に起きることを明らかにした。オートファジー欠損変異体の葉では、紫外線照射後のクロロファジー依存的な葉緑体数の減少が起きておらず、構造が異常な葉緑体が頻繁に観察され、紫外線障害に対する耐性も低下していた。よって、紫外線障害により機能が失われエネルギーを獲得できなくなった葉緑体については、クロロファジーで除去することにより細胞機能への更なる傷害を防ぐ機能があることが示唆された。(抄録なし)本研究では、植物の成長や生存戦略を支えるエネルギー恒常性の維持機構において、体内栄養リサイクル系であるオートファジーが担う生理的意義と、その制御の分子メカニズムについて明らかにすることを目的とし研究を行っている。本年度は、Rubisco-containingbody(RCB)/オートファジーによるエネルギー供給の生理的意義について評価を行い、オートファジーが糖に代わる呼吸基質としてのアミノ酸供給を担うこと、さらにその供給機能が光合成による糖獲得が制限される短日条件下においてシロイヌナズナの成長に寄与していることを明らかにした。また一方で、シロイヌナズナ葉においてRCB形成の誘導様式について解析を行った結果、紫外線照射によりオートファジーによる葉緑体成分の分解が誘導される可能性を見出した。オートファジー欠損変異体では、紫外線照射後に葉の枯死が野生体に比べ早く起き、生存率も低下したことから、紫外線障害により機能が失われた葉緑体の分解に、オートファジーが機能していることが考えられる。また、オートファジーから呼吸系へのエネルギーフローの評価を行うために、オートファジーに必須の遺伝子と、ミトコンドリア内でのアミノ酸異化代謝・エネルギー生産に関わる遺伝子との二重変異体系統を交配により作出し、代謝物解析に必要な変異体系統の整備が完了した。イネについては、オートファジーに必須の遺伝子OsATG7に内在性レトロトランスポゾンが挿入された変異体を獲得し、オートファジーの可視化・評価のための蛍光タンパク質発現系統を形質転換により作出した。その形質転換体を用いてRCBの検出を行い、イネ葉においてもRCB/オートファジー系が機能することを証明した。初年度において、植物のエネルギー代謝におけるオートファジーの意義として、糖に代わる呼吸基質供給系として光合成制限下でのシロイヌナズナ成長に寄与する、という一つの重要な役割を示すことができたとともに、今後の解析に必要な変異体や形質転換体系統の整備をほぼ完了することができたため。大きな研究計画の変更は必要なく、概ね当初の計画に沿って今後も研究を推進していく。ただし、これまで実験系が確立されていないクラミドモナスを使用した変異体選抜に関しては、計画の実現性を考慮しながら研究を進めていく必要がある。(抄録なし)
樹木の水分通導調節による水ストレス回避機構の解明

研究項目1)灌水を制限して育成したマツ苗木の木部のキャビテーション感受性の変化が,マツの水ストレス回避にはたす役割クロマツは水欠差に対して、葉の浸透ポテンシャルを調節することで膨圧を保ち、かつ葉が萎凋しないように高い水ポテンシャルの段階で気孔を閉じ、樹体からの水の損失を防ぐ適応方法をとっており、キャビテーションによる水分通道機能の低下は樹体水分の調節機構としては機能しない樹種であることがわかった。研究項目2)亜高山帯から高山帯への移行帯に分布するオオシラビソの偏形樹形の形成におよぼすキャビテーションの影響亜高山帯から高山域への移行帯に分布するオオシラビソの偏形樹形は、積雪上部シュートのキャビテーション感受性が高いために、容易に水分通道機能を失い、葉、ひいては枝の枯死をまねきやすい状態になっていることが原因で形成されることがわかった。亜高山帯から高山域への移行帯に分布するオオシラビソと高山域に分布するハイマツの葉が春に褐変化する原因の一つとして、これまでは冬期の強風により氷切片が葉に吹き付けられることで傷つき、その結果葉からの脱水が促進され、萎凋枯死すると考えられていた。このことを形態学、解剖学的に確認したところ、ハイマツの葉では傷が確認できたが、オオシラビソでは傷は確認できず、オオシラビソに関しては従来の考えは誤りであることがわかった。研究項目3)針葉樹各種のキャビテーション感受性評価日本のおける代表的な針葉樹であるスギ、ヒノキ、ハイマツそして本研究で扱ったクロマツ、オオシラビソのキャビテーション感受性を比較すると、土壌条件や気象条件の良くない箇所でも生育可能なマツ科樹木は、より良好な立地に生育するスギ、ヒノキに比べて木部のキャビテーション感受性は高く、水欠差への対応はキャビテーションによる水分通道機能の低下を抑制するために、葉の水ポテンシャルが高い段階で葉による蒸散の調整を行なう樹種であることが明らかになった。研究項目1)灌水を制限して育成したマツ苗木の木部のキャビテーション感受性の変化が,マツの水ストレス回避にはたす役割(担当,池田・シュペリー)平成15年度に準備していたクロマツ鉢植え苗に対して水ストレスを誘導するために,4月上旬より苗木に2段階の灌水条件を設定した(ガラス室内)。一つは毎日灌水する区,他は週に一回灌水をする区とし,あと処理でマツに水ストレスを与えた。以上の処理を行ったマツにかかる水ストレスの程度を評価するため,定期的に針葉の水ポテンシャルの最低値(正午前後)と最高値(夜明け直前)をプレッシャー・チャンバーで,蒸散速度や気孔コンダクタンスをスーパーポロメーターで測定した。鉢の土壌の含水量も測定する。苗木の内,半数の苗木について,平成16年10月にシュートのP-V曲線を作成してマツの水分生理特性をもとめ,水不足に対する浸透調節能力を評価する。さらに,マツ木部のvulnerability curveを作成してキャビテーションに対する感受性を評価した。アメリカへの海外出張し、水ストレスに対するsafetymarginの解析を行った。研究項目2)亜高山帯から高山帯への移行帯に分布するオオシラビソの扁形樹形の形成におよぼすキャビテーションの影響(担当,池田・丸田・シュペリー)研究を行う場所は,北アルプスの南端に位置する乗鞍岳東斜面の亜高山帯上限から高山帯への移行帯(標高約25002600mに)である。

現地での測定項目:オオシラビソのシュートの水ポテンシャルの最低値(正午前後)と最高値(夜明け直前)をプレッシャー・チャンバーで,蒸散速度や気孔コンダクタンスをスーパーポロメーターで測定した。・研究室での測定項目:オオシラビソ木部のキャビテーション感受性の評価のために,現地で採取した試料のvulnerability curveを作成した。研究項目1)灌水を制限して育成したマツ苗木の木部のキャビテーション感受性の変化が,マツの水ストレス回避にはたす役割(担当,池田・シュペリー)平成16年度よりクロマツ鉢植え苗に対して水ストレスを誘導するために,4月上旬より苗木に2段階の灌水条件を設定した(ガラス室内)。一つは毎日灌水する区,他は週に一回灌水をする区とし、あと処理でマツに水ストレスを与えた。以上の処理を行ったマツ苗のうち、2年目にあたるマツ苗にかかる水ストレスの程度を評価するため,定期的に針葉の水ポテンシャルの最低値(正午前後)と最高値(夜明け直前)をプレッシャー・チャンバーで、蒸散速度や気孔コンダクタンスをスーパーポロメーターで測定した。鉢の土壌の含水量も測定する。苗木の内,半数の苗木について、平成17年10月にシュートのP-V曲線を作成してマツの水分生理特性をもとめ、水不足に対する浸透調節能力を評価する。さらに、マツ木部のvulnerability curveを作成してキャビテーションに対する感受性を評価した。アメリカへ海外出張し、新たな実験手法の開発とデータ解析を行った。研究項目2)亜高山帯から高山帯への移行帯に分布するオオシラビソの偏形樹形の形成におよぼすキャビテーションの影響(担当,池田・丸田)研究を行う場所は,北アルプスの南端に位置する乗鞍岳東斜面の亜高山帯上限から高山帯への移行帯(標高約25002600mに)である。現地での測定項目:前年度に引き続きオオシラビソのシュートの水ポテンシャルの最低値(正午前後)と最高値(夜明け直前)をプレッシャー・チャンバーで、蒸散速度や気孔コンダクタンスをスーパーポロメーターで測定した。研究室での測定項目:オオシラビソ木部のキャビテーション感受性の評価のために,現地で採取した試料のvulnerability curveを作成した。針葉の形態観察を行った。研究項目1)灌水を制限して育成したマツ苗木の木部のキャビテーション感受性の変化が,マツの水ストレス回避にはたす役割(担当,池田)平成16年度と17年度に行った生理生態的実験とキャビテーション感受性に関する実験に用いた2段階の灌水条件下で育成したマツ苗木について、vulnerability curveを作成したマツ木部の解剖学的特性、特に仮道管と壁孔の形態の特性を明らかにし、木部キャビテーション発生機構の解明につなげ、本研究のとりまとめを行った。さらに、ポルトガル・リスボン市で開催された国際会議(PINE WILT DISEASE : a worldwide threat to forest ecosystems)に海外出張し、マツの様々な特性に関する最新の情報を得ることができた。研究項目2)亜高山帯から高山帯への移行帯に分布するオオシラビソの偏形樹形の形成におよぼすキャビテーションの影響(担当,池田・丸田)北アルプス南端に位置する乗鞍岳東斜面の亜高山帯上限から高山帯への移行帯(標高約25002600mに)に分布するオオシラビソが研究対象である。
日本人小児における身体計測値の成長曲線作成

平成16年度実績報告書に示した5つのデータセットのうち成長曲線未報告であった(2)2000年度、0-5歳、頭囲(厚生労働省)(3)1992-1994年度、5-20歳、頭囲、手掌長、手指長、眼間距離、耳長(人間生活工学研究センター)(4)1990年度、0-5歳、頭囲(厚生労働省)を用い、成長曲線をそれぞれ作成、A)日本人小児における体型変化あるいは体型のバランス変化を明らかにするために、年代別の成長曲線を同一のグラフ上に提示し年代間比較を、B)日本人小児における身体的特徴を明らかにするために、既報の諸外国における成長曲線との国際間比較を行った。1)頭囲の成長曲線からA)日本人乳幼児の頭囲は1990年度および2000年度の年代間において変化なし、B)国際的基準値(Nellhaus G : Pediatrics 41:106,1968)と比較し1990-1994年度(1990年度0-5歳および1992-1994年度5-20歳データ)における日本人小児の頭囲は、乳幼児期ではほぼ同等、あるいはやや小さく、7歳以降では大きいことが示された。2)手掌長、手指長、眼間距離、耳長の成長曲線からB)国際的基準値(Feingold M & Bossert WH : Birth Defects 10[Supple 13],1974)と比較し、1992-1994年度における日本人小児の手掌長は小さく、手指長(第3指長)はほぼ同等、すなわち相対的第3指長(第3指長/総手長)が大きいこと、眼間距離は大きく、耳長は小さいことが示された。(1)データ収集・整理現在までに、以下の既に連結不可能匿名化されているデータを入手、エクセルファイルで整理した(カッコ内は協力機関名)。(1)2001年度、5-17歳、身長、体重、座高(文部科学省)(2)2000年度、0-5歳、身長、体重、頭囲(厚生労働省)(3)1991-1994年度、0-20歳、身長、体重、座高、頭囲、手掌長、手指長、眼間距離、耳長(人間生活工学研究センター)(4)1990年度、0-5歳、身長、体重、頭囲(厚生労働省)(5)1979-1981年度、0-18歳、身長、体重(日本規格協会)(2)データ分析各データを2000-2001年((1)(2))、1990-1994年((3)(4))、1979-1981年((5))の年代別に分類、身長、体重、BMI(体重/身長^2)、座高および座高身長比(座高/身長>について、それぞれ成長曲線を作成した。日本人小児における体型変化あるいは体型のバランス変化を明らかにするために、年代別の成長曲線を同一のグラフ上に提示し、年代間比較を、日本人小児における身体的特徴を明らかにするために、既報の諸外国における成長曲線との国際間比較を行った。BMI成長曲線から1)過去20年間において肥満の頻度あるいは程度が増加した、2)特に学童期男児において英国、中国人に比べ肥満の頻度が多いあるいは程度が重症である可能性が示された。座高身長比成長曲線から1)座高の成長は主に思春期後半の身長増加に寄与する、2)英国人に比べ思春期年齢以降により座高身長比が大きくなることが示された。
クメール都市空間像の探求－アンコール・トム中央寺院バイヨンの発掘調査を中心に－

本研究課題は、バイヨン寺院を中心とした都城アンコール・トムの発掘を基盤として、クメール都市空間、特に生産、技術、流通の解明を行ったものである。具体的には、(1)既往調査記録の整理、考古編年構築に向けての記録作業、目録作り(2)バイヨン寺院伽藍内外における発掘調査(3)都城アンコール・トム内の悉皆調査、考古遺物の表面採取調査(4)サンプリングした自然遺物、金属遺物の輸送、分析と金属遺物の保存処理(5)池出土鎮壇具の将来的保存処理にむけた基礎整理(6)カンボジア人若手考古学者への技術移転を行った。また資料の年代や材質などの比較について国内都市遺跡出土品の調査を行い、上記を補った。平成23年度は、(a)既往調査記録の整理、考古編年構築に向けての記録作業、目録作り(遺跡情報の整理、既往発掘地点の配置図作成、既往発掘地点の現地確認と遺跡環境の把握および既存の報告書との照合)、(b)後期バイヨンの寺院配置関連遺構の解明に向けた、バイヨン寺院伽藍内外における発掘調査、(c)都城アンコール・トム内の悉皆調査、考古遺物の表面採集調査、(d)サンプリングした自然遺物、金属遺物の輸送、分析と金属遺物の保存処理(極力カンボジアでの保存処理を追求し、やむをえないものについては調査後日本国内にて行った)、(e)カンボジア人若手考古学者への技術移転、(f)調査の進行状況を公開するホームページの作成準備、以上6項目を中心に研究を行った。また、比較参考資料の整理、収集等を中心とした国内作業により上記6項目を補った。具体的には(a)は通年作業として進めながら、(b)と(c)のフィールド調査を行い、これらにより得られた資料をもとに、資料の特性により日本国内若しくは現地カンボジアにおいて(d)を行った。(e)については、前述の(a)(b)(c)を進めるなかで平行して行った。主に日本人専門家渡航時に集中して行ったが、その他の期間も電子メール等を用いて1年間の継続した研究教育を行うようにした。(f)はその他の同エリアで活動する保存修復団体のホームページ等を参考に、現地NGOと共に検討を重ねた。最終的な情報公開の方法につては、新規ホームページ作成ではなく、既存のものと融合することを検討している(H24年度実績報告参照)。平成23年度の発掘調査(b)は寺院南側に延びる排水溝の追跡及び東正面における南貯水池周辺において実施したが、より検討を深化させるため、H24年度も継続して同エリアの発掘を進めていく。また、これらの調査結果による図面の作成・出土遺物の整理作業は,逐次進行中である。平成25年度は、(a)既往調査記録の整理(遺跡、遺構、遺物、各詳細図の作成と検証)、考古編年の構築に有効な資料抽出、(b)バイヨン後期の寺院外郭域における遺構配置解明のための発掘調査、および石材採掘遺跡の調査、(c)航空地形測量データに基づく都城アンコール・トムおよび都城外の水路、道路など、広域に及ぶ都市形態の基礎的解析、(d)自然遺物、漆製品、金属製品、鉛同位体分析など、生産、技術、流通の解明に結びつく試料抽出と解析、金属遺物の保存処理に向けた基礎目録作成の以上4項目を中心に進めた。また、資料の年代や材質などの比較について国内都市遺跡出土品の調査を行い、上記4項目を補った。具体的には(a)は通年作業として進めながら、(b)のフィールド調査を行い、(c)の地図データ資料を加え、都市像の各時代的特色を押さえるための資料化作業を重点的に行った。(d)は遺物の種類により材質・技術研究、保存状態が異なるため、保存処理については基本的にはカンボジア内で進めるが、設備や高度技術管理が必要となる遺物は調査後、日本国内で行った。継続調査によって考古資料も各様なものが大量に蓄積されており、カンボジア人若手考古学者の技術力量も上がっているが、さらに高度な研究に向けて多様な技術習得や組織力も必要となっている。発掘調査(b)はバイヨン寺院の外郭南東部を継続し、外回廊東面側と東参道の交叉する外側、東参道東辺部・南辺部、南池中央部の3箇所で行った。この結果外回廊基礎は東参道基礎より先行して造成された点が明らかとなる。南池中央部調査の結果では池底部は全面ラテライト敷と考えられ、さらに砂岩3段を積んだ方形プランの構築物が確認された。この中心部は小石室となり、亀形砂岩製彫刻、円形鉛容器、金箔、水晶、鉄器、銅板、金属板(錫か)などの鎮壇具が出土した。国家寺院バイヨンの水に関わる祭祀の一端が判明し、今後追究を行う。

平成24年度は、(a)既往調査記録の整理、考古編年構築に向けての記録作業、目録作り(遺跡情報の整理、既往発掘地点の配置図作成、既往発掘地点の現地確認と遺跡環境の把握および既存の報告書との照合)、(b)後期バイヨンの寺院配置関連遺構の解明に向けた、バイヨン寺院伽藍内外における発掘調査、(c)都城アンコール・トム内の悉皆調査、考古遺物の表面採集調査、(d)サンプリングした自然遺物、金属遺物の輸送、分析と金属遺物の保存処理(極力カンボジアでの保存処理を追求し、やむをえないものについては調査後日本国内にて行った)、以上4項目を中心に研究を行った。また、比較参考資料の整理、収集等を中心とした国内作業により上記4項目を補った。具体的には(a)は通年作業として進めながら、(b)と(c)のフィールド調査を行い、これらにより得られた資料をもとに、資料の特性により日本国内若しくは現地カンボジアにおいて(d)を行った。加えて、平成25年度以降行うより高度な研究に向けての基礎情報の蓄積及び整理と、カンボジア人若手考古学者への技術支援及び技術移転については、上記4項目と並行して、これまでと同様重点的に実施した。両者とも一定の成果を得ていると言えよう。平成24年度の発掘調査(b)は寺院南側に延びる排水溝の追跡及び東正面における南貯水池周辺において実施し、バイヨン寺院の前・後期平面計画において未知部が多く残る南東部外郭周辺の空白部について一定の知見を得ることができた。これらの調査結果による図面の作成・出土遺物の整理作業は,現在継続して進行中である。これら全ては、平成25年度から行う「アンコール都市建設過程における資源、資材供給システム等の総合分析」に向けての基礎準備でもある。以下の6項目を実施した。(a)既往調査記録の整理、出土遺物整理:通年継続作業で図面担当と遺物整理各1名を訓練し、遺物整理の洗浄、注記を終了した。(b)バイヨン寺院外郭域における遺構配置の解明のための発掘調査、水利・地質調査:重点的に実施した。東参道基壇では数期に及ぶ複雑な遺構が検出され従来以上に慎重な調査を要し、また現地担当者へのより高度な専門的技術指導も徹底した。発掘個所は(1)外郭東部、南池中心部、東参道外部南辺、東参道外部南西・南東隅にて、池底の確認及び水利や地下地質に関して地盤調査。(2)参道西55塔周辺部と東参道にて、55塔東前面に4期の象徴的な建物跡を確認。参道基壇では大きく3段階の変遷を示す遺構を把握し、過去のEFEOによる研究成果に対して詳細な部分が追加され、本研究の際立った成果の一つとなる。またこのエリアでは過去にEFEOの修復が実施されており、これらの改変に対する判断基準や記録方法についてカンボジア人専門家に教示した。(3)外郭南東部、外周壁南東隅で、その位置は周壁東辺と南辺の交点にあたり、寺域の境界を確定する事でバイヨン面積の約1/4にあたる南東域の正確な図化が達成された。(c)外郭域南東部、東参道の基準測量:上記南東部、東辺部遺構を集約するため実施した。参道部分の変遷についての推定年代は112世紀後半、314世紀後半を上限とし、2はこの間に位置する。1及び3についての年代根拠は本研究費によって過去実施した調査内容の総括を含み、バイヨン寺院の建造システムへの言及が可能となった。(d)南経蔵鎮壇具の保存処理の完了と資料体系化(e)池出土鎮壇具の将来的保存処理にむけた基礎整理(f)
高齢者の生活からみた「地縁」の形成と変容に関する研究

1)高齢者の地域における生活実態の把握を通して,高齢者の日常生活における「地縁」の構造や、その変容過程を明らかにするとともにその構造や変容の地域特性による比較を行うため、東京都S区を対象にして,訪問・ヒアリング調査を実施した.これは,対象地域内に居住し、通所介護サービスおよび訪問介護サービスを利用する高齢者16名を対象として,ご自宅を訪問し,毎回12時間程度のヒアリングを行うものであり,2001年12月,2002年9月の2回に渡って行った継続的な調査である.調査手法としては、非構造的なヒアリングの形式をとり,会話を通じて,日常生活の様子や人間関係,生活に対する日頃の想いや考えなどについて訊ねている.これにより得られた情報を,これまでに行ってきた農山村地域の事例と比較しつつ、地域とのかかわりという観点から整理・分析し,生活行動や人間関係を通じて形成されている個人の生活と地域との関係について考察した.さらに、都市部における事例をもとに、生活の時間的要素についての分析を行い、それによってこれまでの地縁構造の分析手法に改良を加えた。この成果は,「都市部における要介護高齢者の生活と地域との関係に関する事例的研究」という題目で論文としてまとめている(雑誌論文の項を参照).2)国際的な学会において、高齢者と地域社会との関係に関する研究の発表を行い、海外の研究者との意見交換・議論を行った(雑誌論文の項を参照)。3)これまでの研究成果を「高齢者の生活からみた地縁の形成と変容に関する研究」という題目で研究成果報告書としてまとめた。
双胎間輸血症候群の発症機序と病態の解明

双胎間輸血症候群(twin-twin transfusion syndrome : TTTS)の発症機序と病態の解明を行うため,超音波Doppler法を用いた胎児・胎盤循環の評価と胎盤における吻合血管の形態評価を行った.その結果, TTTSの供血児では臍帯動脈血流速度波形の拡張期末期途絶や逆流といった異常波形が生命予後と関連し,病態の重症化の指標として有用であると共に,動脈-動脈吻合の存在がその重症化に関与している事が明らかとなった.双胎間輸血症候群(twin-twin transfusion syndrome : TTTS)の発症機序と病態の解明を行うため,超音波Doppler法を用いた胎児・胎盤循環の評価と胎盤における吻合血管の形態評価を行った.その結果, TTTSの供血児では臍帯動脈血流速度波形の拡張期末期途絶や逆流といった異常波形が生命予後と関連し,病態の重症化の指標として有用であると共に,動脈-動脈吻合の存在がその重症化に関与している事が明らかとなった.双胎間輸血症候群(TTTS)の発症機序と病態の解明を行うため,一絨毛膜二羊膜性(MD)双胎を対象として,超音波Doppler法を用いた血行動態の評価を行う事を第一目的とした.妊娠16週26週のMD双胎に対し,一週間毎に臍帯動脈,胎児中大脳動脈,胎児静脈管,胎児下大静脈及び,胎児静脈管の血流波形を測定し,得られた情報から同妊娠期間における正常値を算出した.また,そのデータを用いて,TTTS発症患者における血行動態の変化を検討した.その結果,TTTS発症妊婦では,受血児の胎児中大脳動脈のPulsatility Index(PI)が低下している事が明らかとなった.また,胎児鏡下胎盤吻合血管レーザー凝固術を行うと,低下していたPIは上昇するとともに,中大脳動脈収縮期最高血流速度が上昇する事が明らかとなった.レーザー凝固の前後で,受血児の胎児血中酸素分圧の上昇によって同現象が引き起こされている事が推察されている.また,供血児においては,臍帯動脈拡張期末期血流途絶を有する症例が約30%を占めていたが,胎児鏡下胎盤吻合血管レーザー凝固術によって8割の症例が改善する事が明らかとなった.TTTSにおいて,供血児は臍帯動脈を通じた胎児心臓からの血液の拍出が障害され,同治療で改善する事が明らかとなった.平成18年度は上記の結果が明らかとなったが,継続中の研究として,TTTSの胎盤吻合血管の形態的特徴の解析を行っている.双胎間輸血症候群(TTTS)の発症機序と病態の解明を行うため、一絨毛膜二羊膜性(MD)双胎を対象として、超音波Doppler法を用いた血行動態の評価を行う事を第一目的とした。妊娠16週26週のMD双胎に対し一週間毎に臍帯動脈、胎児中大脳動脈、胎児静脈管、胎児下大静脈、及び、胎児静脈管の血流波形を測定し、得られた情報から同妊娠期間における正常値を算出した平成18年度のデータを基礎として、TTTS発症患者における血行動態の変化を検討した。その結果、TTTS発症妊婦では、受血児の胎児中大脳動脈のPulsatility Index(PI)が低下している事が明らかとなった。また、供血児の臍帯動脈血流波形において、拡張期末期の血流途絶や逆流を認める症例において、レーザー治療による吻合血管の遮断により、血流波形が改善する症例が一部に存在することが明らかとなった。そのような症例では、動脈-動脈吻合血管が有意に高率で存在することから、供血児の血流異常に対して、動脈-動脈吻合が原因となっていることが示唆された。また、TTTSの前段階に位置づけられると思われるselective IUGRの症例においては、この臍帯動脈血流波形の異常が、その後のTTTSの発症に大きく関与することが明らかとなった。双胎間輸血症候群(以下,TTTS)の発症機序と病態解明を行うために,一絨毛膜二羊膜性双胎(以下,MD双胎)を対象として,超音波Doppler法を用いた胎児・胎盤の血行動態の評価を行った.平成19年度の研究方法に則り,妊娠16週から25週のMD双胎を対象として,臍帯動脈,中大脳動脈,静脈管,下大静脈,臍静脈の血流波形計測を行い,同時にTTTSを発症したMD双胎での各血流波形の計測を行い,比較検討を行った.また,TTTSの診断基準をみたしていないが羊水量較差を認めるAmniotic Fluid Discordance(以下,AFD)症例における血行動態の変化を検討し,その後のTTTSの発症との関連性を検討した.また,TTTSでは,供血児の循環血液量が減少している事が病態として想定されるが,その病態を把握すると共に,治療における効果を見いだすため,供血児の血流を維持するmodified sequential methodを考案し,胎児鏡下胎盤吻合血管レーザー凝固術において同治療方法を導入し,その効果の検討を行った,TTTSにおいては供血児の臍帯動脈血流における拡張期末期血流途絶/逆流が病態の悪化に関連する事が明らかとなった.

また,AFDにおいても同所見がその後のTTTSの発症や胎児死亡等の予後不良との関連において有意な所見であり,TTTSでは,供血児の循環血液量不足が結果的にTTTSの発症や悪化に対し寄与している事が明らかとなった,また,modified sequential methodによるレーザー凝固によって,臍帯動脈血流途絶/逆流を呈している虚血児の生存予後は有意に改善する事が明らかとなり,供血児の循環塩液量不足は,TTTSの病態として重要な役割を担う因子である事が明らかとなった.
アルツハイマー病βアミロイド・ペプチド生成調節機構の分子生物学的解析

アルツハイマー病(AD)の分子病態はβアミロイドペプチド(Aβ)の脳への異常蓄積であるとする説が有力である。本研究はAβ仮説の多角的な解析・検証と新たな治療法開発を目的とするものである。Aβは前駆体蛋白(APP)からβおよびγセクレターゼによる蛋白分解を経て生成分泌されるが、なかでもAβの病原性を決定付けるγセクレターゼの解析に焦点を当てる。(1)Aβ生成の調節機構の解析;我々はγセクレターゼがプレセニリンを含むタンパク質複合体であること、その構成タンパク質にニカストリンがあることを明らかにしてきた。さらに、APP切断とNotch切断にはニカストリンを含む同じ複合体が関わること(Nat Cell Biol,2001)、複合体構成タンパク質として同定されたPEN-2はγセクレターゼの活性化に重要な働きをすること(J Neurochem, in press)、Alcadeinは新たな基質でありAPPとともにFe65を介する遺伝子発現調節に関わること(J Biol Chem, in press)などの成果を発表した。また、原因遺伝子として知られるプレセニリンの変異は病原性の高いAβ(Aβ_<42/43>)の生成を増加させる。そのメカニズムを明らかにするため、PS1分子へのランダム変異導入による変異体のスクリーニングを行い、Aβ_<42/43>生成活性のみを示すきわめて特異なPS1変異体を同定することに成功している(投稿準備中)。この成果は今後、Aβ_<42/43>生成活性を選択的に抑制する方策を探り、新たな治療法を開発するための基礎研究と位置付けている。(2)Aβ仮説の検証;よりヒトに近いADモデル動物を確立するため、霊長類のうち実験動物化の進められたカニクイサルを用いて遺伝子改変個体の作製を試みつつある。これにより、Aβ仮説を検証するとともに病態の詳細な解明と治療法開発評価に有用なモデルを樹立する予定である。アルツハイマー病の原因ペプチドと考えられるβアミロイド(Aβ)はβアミロイド前駆体蛋白(APP)から限定分解によって生成されるが、これに関わるγセクレターゼ活性の発現には膜蛋白であるプレセニリンとニカストリンが必須であることが判明している。しかし、その活性発現様式には未だ不明な点も多い。そこで本年度はγセクレターゼのin vitroアッセイ法を確立してその活性に影響を与える因子について検討を試み、Aβ生成の調節機構解明への第一段階とした。培養細胞の膜分画を用いたin vitro反応系を調製し、γセクレターゼによるAPP切断に伴って生じるC末端断片(APP-CTFγ)をウェスタン解析により検出するアッセイ法を確立した。本法によってもプレセニリン・ノックアウトマウスに由来する線維芽細胞ではγセクレターゼ活性は検出されなかった。また、膜分画のCHAPSやCHAPSOによる溶出液中では活性が認められるものの、NP40やTriton-X100による溶出は活性を阻害した。既知のγセクレターゼ阻害剤はこのin vitroアッセイ系においても有効であった。今回用いたプレセニリンやニカストリンの部分ペプチドや特異抗体は活性に有意な影響を与えなかったほか、蛋白リン酸化に影響する各種薬剤にも効果は認められなかった。一方、αおよびβセクレターゼによる切断を受けたAPPのC末端断片APP-CTFαとAPP-CTFβのγセクレターゼによる切断を比較すると、APP-CTFαはAPP-CTFβよりも良い基質となることが示唆された。本アッセイ法のγセクレターゼ活性評価への特異性と有用性が示された。

この活性は界面活性剤に感受性であること、細胞外領域の短いI型膜蛋白をより良い基質とすることなどの知見が確認された。このアッセイ系を用いたγセクレターゼ活性発現機構のさらなる解析を行うとともに、βセクレターゼの解析も合わせAβ生成過程の詳細を明らかにしていく予定である。アルツハイマー病の病原ペプチドと考えられるβアミロイド・ペプチド(Aβ)はβアミロイド前駆体蛋白(APP)から蛋白分解によって生成されるが、これに関わるプロテアーゼのうちγセクレターゼ活性には膜蛋白であるプレセニリンとニカストリンが必須であることが判明している。しかし、その活性発現メカニズムや活性調節機構には未だ不明な点も多く、その解明が本研究課題の目的である。本年度はプレセニリンに結合する蛋白のうちγセクレターゼ活性に影響を与える分子を同定解析する目的でイースト2ハイブリッドスクリーニングを行った。その結果、新たなプレセニリン結合蛋白としてPBV-33とPBF-38を同定した。プレセニリンとの結合は哺乳類細胞での発現系を用いた免疫共沈によって確かめられた。これらはともにII型膜蛋白と予想され、前者は膜蛋白の細胞内輸送に、後者はカルシニューリン活性阻害に関わる機能が推測される。それぞれを過剰に発現する細胞株を樹立して解析したところ、前者は細胞のAβ分泌レベルを増加させ、後者は減少させた。しかしこれらがプレセニリンの発現レベルや細胞内局在に明瞭な影響を及ぼす所見は確認できていない。どのようなメカニズムによりAβ分泌レベルに変化を与えるのかなどを含め、さらに検討を続ける予定である。本研究課題により、Aβ生成調節に働く新たな蛋白が同定されれば、それらを介したAβ生成抑制法を見出せる可能性があり、新たな治療法開発につながることも期待できる。アルツハイマー病の病原ペプチドであるβアミロイド(Aβ)は前駆体蛋白(APP)から蛋白分解によって生成されるが、これに関わるプロテアーゼのうちAβの病原性を決定するγセクレターゼはプレセニリン(PS)複合体がその分子実体であることが判明してきた。PSはその活性基をもつと予想されるものの活性調節機構には未だ不明な点が多く、特に病原性の高いAβを産生するメカニズムの解明は重要課題である。本年度は、PS1分子へのランダム変異導入による変異体cDNAライブラリーの作製とγセクレターゼ活性に変化を与える変異体のスクリーニングを行った。γセクレターゼ活性によるAPP切断にはγ40,γ42/43,εの各切断点が知られる他、PS1自身の切断も含まれるとされる。今回の変異体スクリーニングの結果、PS1切断、ε切断、γ40切断に対する活性はいずれも喪失しながら、γ42/43切断活性のみが亢進する新たなPS1変異体を同定することに成功した。γ42/43切断は病原性の高いAβの生成に関与することからアルツハイマー病の発症につながる分子病理機序の上で重要な位置を占めている。この変異体PS1の検討から、病原性Aβの生成活性は既存の阻害剤に対する感受性に乏しいことが判明し、また切断特異性とPS複合体の立体構造変化との相関が推測された。
標注を中心とした近世詩論の基礎的研究

祇園南海(延宝四年<一六七六>宝暦元年<一七五一>)が『明詩俚評』(享保六年<一七二一序文)『詩学逢原』(宝暦十三年<一七六三>刊)『南海詩訣』(天明七年<一七八七>刊)において「影写」は顕著であるし、それは日本詩論史上特異でもある。ただ南海詩論においてその「影写」的理論は「影写」という語だけに表出されているわけではない。南海詩論における「影写」的な説は、まず題意を直接言わないことである。さらにその題意を言外に表すということで、その言外に表す題意は、景物だけでなく、作者の意趣も含まれる。その二重構造が、一句中に虚字で結び付けられて直喩表現になったり、実字によって縁語仕立てで構成されたりすると、それは「アイシライ」になる。「影写」説を含めて南海詩論には、典拠を見出すことも事実である。「鏡花水月」「斡旋」という語や理論は中国の詩論に見られるものであり、「アシライ」は室町連歌論に見られる語である。祇園南海の詩文論において、自身の「影写」説を「古人」の言とするだけで、その原拠を明示してはいない。ただ「鏡花水月」に関しては、『唐詩訓解』がその直接の原拠であると考えられる。葛西因是は唐の律詩に、情緒・諷託が幽遠であり、同時に字句が典麗であるとする。ここに葛西因是が唐の律詩を推奨する所以がある。葛西因是は金聖歎の注釈にも同様に「前後解」と「諷託」があるとし、それらは表裏の関係を成していると考えていた。つまり、語と語、句と句の関係を過度に取ることが、過度に寓意を取ることに自然と繋がっているとした。この両者を葛西因是は自ら詩論に受容している。ただ葛西因是詩論は、金聖歎詩論に収まらない。その機能的な解釈が元代詩論から続く格論にその淵源を確認することができるように、その寓意もまた金聖歎以外の詩論と決して無関係ではない。これが葛西因是の『通俗唐詩解』における詩論の骨格である。基礎的な事項を確認し、さらに現状に対して新たな提案をすることができている。近世における詩文標注者のなかでも、遯庵の注釈活動は群を抜いている。彼の注釈の内、唯一の抄物である万治四年(一六六一)の『頭書錦繍段抄』を始めとして、寛文四年(一六六四)の『錦繍段首書』、貞享元年(一六八四)の『錦繍段首書』、元禄十五年(一七〇二)の『錦繍段詳註』の標注を制作している。その『錦繍段』は、遯庵にとって創作する上でも重要な詩集であった。彼には『遯庵詩集』という詩集と『遯庵先生文集』という詩文集が存在するが、それら詩には、『錦繍段』の詩句引用が色濃く見られるからである。さらにそれらのなかには、『錦繍段』注釈と関連する受容も見られる。遯庵が『錦繍段』の押韻・平仄を参考にしながら作詩をしていたとするならば、それは構造的に一詩を受容していたということである。そもそも遯庵は題を設定する場合、『錦繍段』の題を用いている場合がある。同様に詩の押韻をする際にも、遯庵は『錦繍段』を活用していると考えらえる。遯庵はの『漢和三五韻』は漢句の押韻ためでもあったはずである。同様に『錦繍段』標注も作詩のための語彙・詩句集であったと考えられる。そもそも、『首書錦繍段』『錦繍段詳註』の『錦繍段』本文には、それまでの「錦繍段抄」および遯庵自身の『頭書錦繍段抄』になかった題の上に墨の陰刻で、韻字が新たに示されている。そこには押韻の意識を見ることができる。その入り組んだ念入りな受容は、やはり彼の四度の注釈によって培われたものであると考えられる。近世漢文注釈者を代表する宇都宮遯庵の注釈態度について大方の実態を解明できている。漢詩文を注釈した学者のうち、宇都宮遯庵(寛永十年<一六三三>宝永六年<一七〇九>)はその注釈数において群を抜いている。集部に限ったでも対象とした詩文集は、『錦繍段』『古文真宝前集』『三体詩』『杜律集解』『千家詩』『国朝七子詩集』を挙げることが出来る。のみならずなかでも特に『錦繍段』への注釈は頻繁で、唯一の抄物である万治四年(一六六一)の『頭書錦繍段抄』を始め、後に、寛文四年(一六六四)の『錦繍段首書』、貞享元年(一六八四)の『錦繍段首書』、元禄十五年(一七〇二)の『錦繍段詳註』と、三度の標注を製作して四度も『錦繍段』に注を付している。