hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動療法がサイトカインやアポトーシスを介し脳梗塞後神経細胞死を抑制する機序の解析

運動療法が脳梗塞の二次予防や神経細胞死抑制に寄与するかを研究してきた。平成26-28科研費では、脳梗塞における運動療法が血管内皮障害、線溶機能、血小板活性化、炎症性サイトカインを沈静化する方向に影響することを報告した。運動療法の継続が、血小板活性化の抑制、線溶機能の亢進、血管内皮障害の沈静化を引き起こし、脳梗塞の二次予防に寄与することを示した。本研究課題では、さらに脳梗塞の後に発生するアポトーシスや神経細胞死に与える影響を検討した。初期治療を終えた亜急性期の脳梗塞患者について、運動療法(リハビリテーション)期間中のIL-1β、IL-6、TNF-α、TNFR1、TNFR2、Fas、L-selectinP-selectinを測定し、研究期間中の変化分(ΔIL-1β、ΔIL-6、ΔTNF-α、ΔTNFR1、ΔTNFR2、Fas、ΔL-selectin、ΔP-selectin)を計算し、同期間中に施行された運動療法の平均時間(min/day)との相関関係を解析した。症例集積中かつ解析途上であるが、運動療法の1日当たりの平均時間と、ΔFas、ΔIL-6、ΔIL-1β、ΔTNFR1、ΔTNFR2、ΔP-selectin、ΔL-selectinとが、緩やかな相関関係を持つ傾向がみられた。運動療法の継続が、アポトーシスや神経細胞死の抑制に関連して、脳梗塞の増悪を抑制する可能性が示唆される。今後症例を追加して解析していきたい。目標症例数にはまだ達していないが、概ね研究計画通りに測定、解析が進んでいる。初期治療を終えた亜急性期の脳梗塞患者について、運動療法(リハビリテーション)期間中のIL-1β、IL-6、TNF-α、TNFR1、TNFR2、Fas、L-selectin、P-selectinを測定し、研究期間中の変化分(ΔIL-1β、ΔIL-6、ΔTNF-α、ΔTNFR1、ΔTNFR2、ΔFas、ΔL-selectin、ΔP-selectin)を計算し、同期間中に施行された運動療法の平均時間(min/day)との相関関係を解析した。症例が未だ目標数に達していなかったので今年度の検査測定費用が減額となった。外注測定を先行して、今年度に購入予定だった測定機器等を次年度以降に購入し、検体を凍結して症例が集まった時点で一括測定することにした。
細胞膜裏打ち蛋白質ビネキシンの生理機能の解析

接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンはCAP(c-associated protein)/ポンシン、ArgBP2(Arg Binding protein 2)とファミリーを形成しており、これらはいずれも細胞骨格の制御と増殖因子シグナル伝達系の制御に関与している。これらの分子はN末側にソルビン相同(SoHo)領域と呼ばれる保存された領域を持つ。SoHo領域はアクチン細胞骨格の制御に関わる可能性が考えられているが、その機能はよくわかっていない。今回ビネキシンの生理機能を明らかにするために、SoHo領域結合タンパク質をスクリーニングし、αアクチン断片を候補遺伝子として単離した。ビネキシンSoHo領域とアクチン断片との結合はGST-SoHo領域を用いたin vitro結合実験、および共免疫沈降実験によって確認した。さらにビネキシンSoHo領域と繊維状アクチン(F-アクチン)との結合をF-アクチン共沈実験により確認した。また、ビネキシンファミリーの他の分子のSoHo領域もF-アクチンと結合した。これらの結果からSoHo領域の機能の一つはF-アクチンとの結合にあることが示され、ビネキシンファミリー分子がアクチン細胞骨格を制御するメカニズムの一端が明らかとなった。ビネキシンの機能を詳細に明らかにするために、ノックアウトマウスの解析を行った。ビネキシンノックアウトマウスは野生型マウスと同じく正常に生まれ、成熟し、生殖能力も持っていた。また、組織学的な解析からもビネキシンノックアウトマウスは正常であった。次にビネキシンノックアウトマウス13日胚より初代培養繊維芽細胞を作製した。ビネキシンの欠失は強制発現させたときとは異なり、MAPキナーゼ活性化、およびその細胞接着依存性には影響しなかったが、細胞の運動能力に変化が生じていることがわかった。以上の結果からビネキシンは細胞運動に関与する分子であることを明らかにした。平成14年度はまず、細胞膜裏打ち蛋白質ビネキシンの遺伝子破壊(ノックアウト)マウスの解析を行った。その結果、ビネキシンノックアウトマウスは野生型マウスと同じく正常に生まれ、成熟し、生殖能力も持っていることが明らかとなった。また、ビネキシンが発現している組織を中心に組織切片を作成し、組織学的な解析を行ったが顕著な異常は見つからなかった。このように顕著な異常が見つからないのはファミリー分子の相補による可能性が考えられるが、来年度もさらに詳細に検討する予定である。ビネキシン欠失による増殖因子シグナルと細胞接着に与える影響を細胞レベルより詳細に調べるために、ビネキシンノックアウトマウス13日胚より線維芽細胞を単離した。この細胞を用いて上皮細胞増殖因子および血小板由来増殖因子刺激によるMAPキナーゼ活性化、およびその活性化に対する細胞接着の影響を調べた。しかし、ビネキシンの欠失はビネキシンをNIH3T3細胞に強制発現させたときのようにMAPキナーゼ活性化、およびその細胞接着依存性には影響しなかった。そこで次に細胞接着によって引き起こされるFAK, P130CASなどのタンパク質リン酸化について検討したところ、ビネキシンノックアウト細胞でp130CASのリン酸化が変化している事を見出した。p130CASはリン酸化部位を介してSrcファミリーキナーゼやCrkといったさまざまなシグナル分子と結合するアダプタータンパク質として機能することが知られており、ビネキシンがこの分子を制御することによって細胞接着と増殖シグナルの合流、協調を制御している可能性が考えられる。またビネキシンのSoHo領域に結合する蛋白質の候補として数種類の蛋白質をTwo-hybrid法によって単離した。

来年度はこの結合について他の方法を用いて確認するとともに、それらの結合の意義について解明する。接着斑裏打ち蛋白質ビネキシンはCAP(c-Cb1 associated protein)/ポンシン、ArgBP2(Arg Binding protein 2)とファミリーを形成しており、これらはいずれも細胞骨格の制御と増殖因子シグナル伝達系の制御に関与している。これらの分子はN末側にソルビン相同(SoHo)領域と呼ばれる保存された領域を持つ。SoHo領域はアクチン細胞骨格の制御に関わる可能性が考えられているが、その機能はよくわかっていない。今回ビネキシンの生理機能を明らかにするために、SoHo領域をベイトとしたTwo-hybrid法を行った。得られた陽性クローンのうち2クローンはαアクチン断片をコードする遺伝子であり、SoHo領域がアクチン結合ドメインとして機能していることが示唆された。ビネキシンSoHo領域とアクチン断片との結合はGST-SoHo領域を用いたin vitro結合実験(プルダウンアッセイ)、およびin vivo結合実験(免疫沈降実験)によっても確認できた。さらにビネキシンSoHo領域とF-アクチンとの結合をF-アクチン共沈実験により確認したところ、アクチン約5分子に1分子の割合でビネキシンSoHo領域とF-アクチンが結合することが明らかとなった。<BR>ビネキシンのSoHo領域とCAP/ポンシン、ArgBP2のSoHo領域はそれぞれ34%、69%の相同性を持っていることから、他のSoHo領域もF-アクチンと結合する可能性があると考え、CAP/ポンシン、ArgBP2のGST-融合SoHo領域を用いてF-アクチン共沈実験を行った。その結果、CAP/ポンシン、ArgBP2いずれのSoHo領域もF-アクチンと結合することが明らかとなり、SoHo領域の機能の一つはアクチンとの結合にあることが示された。
大学生のための国内・国外の地域での問題解決型のフィールド環境教育手法の開発と実践

1.都市河川の自然環境の回復と保全を目指したプログラムの開発学生による河川環境の測定・評価を可能にする生物的・化学的指標を用いて、都市河川の現状を学生が主体的に調査する手法を開発し、教育プログラムを企画し、以下を実践した。1)代表的な都市河川である、大学キャンパスに近い横浜市の鶴見川とその支流の早渕川において、学生が(1)河川の物理化学的指標、(2)生物指標、(3)五感を用いた河川調査、(4)河川環境・景観調査を行い、それに基づき、河川の現状、問題点を把握し、各調査地点の河川環境目標を提案するプログラムを平成16,17,17年の各々5,6月に実施した。2)横浜市の鶴見川と共通点の多い、韓国の都市河川である釜山市の温泉川(平成17年)およびソウル近郊の龍仁市の烏山川(平成18年)において、8月初旬に日本の大学生と教員、韓国の東亜大学、慶煕(キョンヒ)大学の大学生、大学院生、教員が合同で、上記1)と同じ河川調査プログラムを実施し、河川環境目標を提案するプログラムを実施した。日本の鶴見川、釜山の代表的な都市河川の抱える問題と課題について共に考えるワークショップを日韓の大学教員、学生、市民と共同実施した。2.「熱帯雨林の保全と復元」プログラムの開発と実施日本の学生を対象として、オーストラリア・クイーンズランド州の熱帯雨林で、英語による熱帯雨林の現状、復元に関する学際的な講義、フィールド演習を実施し、孤立した熱帯雨林を緑の回廊でつなぎ、1生物多様性を高めるプログラムを企画し、平成16年、17年、18年の8から9月に実践した。毎年、プログラム評価を行い、Plan.Do, Check, ActionのPDCAサイクルに基づき、プログラムの改善をおこなった。平成18年度には、樹木に人工的に着生させた着生植物の生育調査をおこなうとともに、学生と教員によるプログラム評価に加え、自由連想法を用いて学生の教育成果を多角的に評価した。[1]都市河川の新たな生物・化学的指標の開発とこれらを用いた問題解決型環境教育の実践大学生が河川環境の保全度(健康度)や水環境を測定・評価でき、しかも都市の水環境の新たな問題や課題を発見できる生物・化学的指標を用いた以下の方法を開発し、これらの手法を用いて、学生が現状の把握と問題点の解決、解決策の提言を行える環境教育・科学教育を実践した。(1)河川生態系の健康度や保全度を数値で評価できる底生生物を生物指標に用いたIBI (Index of Biological Integrity)およびその簡便法を開発した。また、その手法を用いて首都圏河川の保全度(健康度)を評価できるマップの作成、問題点の発見、解決策の提言を行えるプログラムを開発した。さらに、多自然工法による河川改修や復元を行った河川の評価も試みた。(2)新たな微生物指標および微生物による潜在的危険を測定するための簡便法の開発を行ない、多摩川と鶴見川の支流を対象として、大学生による測定、現状評価を行った。(3)河川の景観評価を可能にする簡便法を開発し、「フィールド環境演習」の授業に用いた。(4)環境基準には用いられていない新たな化学的指標(C-BOD、N-BOD)を用いて、神奈川県の3つの河川で、学生主体により、この手法の有効性を検討した。[2]「熱帯雨林の保全と復元」プログラムの開発・実施と学生によるプログラム評価

日本の学生を対象として、オーストラリア・クイーンズランド州の熱帯雨林で、過去のプログラムで植林を行った熱帯雨林、孤立した熱帯雨林を緑の回廊でつなぐ復元活動の結果を現地調査により把握し、その有効性を明らかにできるプログラムを海外共同研究者と共同で開発し、2週間のプログラムをオーストラリアのアサトン高原の世界遺産に登録されている熱帯雨林で実践した。また、学生によるプログラム評価を行い、その結果を統計的手法を用いて解析した。1.都市河川の自然環境の回復と保全を目指したプログラムの開発昨年度学生向けに開発した河川環境の測定・評価のための生物的・化学的指標を用いて、都市河川の現状をモニタリングし、その結果に基づき、問題解決策の提言を行う教育プログラムをデザインし、実施した。(1)都市河川の有機物汚濁の現状を把握できるC-BOD測定手法を用いて、下水処理場からの放流水(再生水)が及ぼす新たな問題に焦点を当てたプログラムを開発、実践した。(2)簡便法COD法の有効性の検証及び学生や市民が本方法を利用しやすい条件を検討した。その結果に基づき、鶴見川で調査を行い、結果をマップ化するプログラムを開発、実践した。(3)日韓の大学生を対象とし、日韓の典型的な都市河川が抱える問題や課題を参加者が自ら発見することを目的として、「都市河川調査と河川の環境目標の作成」をテーマとした環境教育プログラムを開発、実践した。プログラムは環境教育に必要な6つのステップ((1)現場体験、(2)河川調査、(3)調査データの整理と解析、(4)問題の発見、(5)川の環境目標の設定、(6)発表と情報発信)を組み込み、鶴見川(横浜市)と温泉川(釜山)で実施した。温泉川では、日本の2大学の学生、NGO、企業から42名と韓国の2大学の学生、市民61名が参加し、5地点で現地視察、水質調査を行い、ワークショップを実施した。2.「熱帯雨林の保全と復元」プログラムの開発と実施前年度の参加学生によるプログラム評価を多変量解析で解析した結果に基づき、プログラムを改善し、豪州・クイーンズランド州の熱帯雨林で、学生32名を対象とし、2週間のプログラムを実施した。GPSカメラによる新たな手法を導入し、過去のプログラムで植林を行った熱帯雨林、孤立した熱帯雨林を緑の回廊でつなぐ復元活動に用い、その有効性を検証した。また、学生主体の英語によるwebレポート作成を導入し、大学のホームページで公開した。1.都市河川の自然環境の回復と保全を日指したプログラムの開発平成16年度及び平成17年度に開発した学生による河川環境の測定・評価を可能にする生物的・化学的指標を用いて、都市河川の現状を学生が主体的に調査する手法を開発し、教育プログラムを企画し、以下を実践した。1)代表的な都市河川である、大学キャンパスに最も近い横浜市の鶴見川およびその支流の早渕川を調査対象河川とし、学生が(1)河川の物理化学的指標、(2)生物指標、(3)五感を用いた河川調査、(4)河川環境・景観調査を行い、それに基づき、河川の現状、問題点を把握し、各調査地点の河川環境目標を提案するプログラムを2006年5月と6月に実践した。2)横浜市の鶴見川と共通点の多い、韓国のソウル近郊の龍仁市の都市河川である烏山川において、2006年8月初旬に日本の大学の学生と教員、韓国の慶煕(キョンヒ)大学の大学生、大学院生、教員が合同で、上記1)と同じ河川調査プログラムを実施し、河川環境目標を提案するプログラムを実施した。
Brugada症候群における遺伝子多型が心イベントに与える影響

現在当初予定されていた日本国内の14の施設(国立循環器病研究センター、岡山大学病院、都立広尾病院、広島大学病院、大阪市大病院、滋賀医科大学病院、京都大学病院、新潟大学病院、東京女子医大病院、慶應大学病院、北海道大学病院、山口大学病院、金沢大学病院、聖マリアンナ医科大学病院)からのBrugada症候群症例の遺伝子解析を行っている。現在までにる500例を超えるBrugada症候群患者のデータベースを用いて、患者から遺伝子検索の同意を得た後に遺伝子多型も含めたSCN5Aの全エクソンを調べている。現在当施設が移転に向けて実験機材を移動させなければならないために遺伝子解析は遅れている。現状までにまだ学会発表できる研究成果がないために旅費としての支出がなかった。今年度には遺伝子解析結果を基に臨床情報と対比させて結果を解釈し、学会などで報告をするる予定である。
初期化過程で出現する心筋前駆様細胞と光イメージングを用いた新規心臓再生療法の確立

マウス繊維芽細胞に初期化因子を発現させiPS細胞を誘導する早期で発現する表面マーカーとしてSca1とCD34が同定された。興味深いことにSca1, CD34二重陽性細胞群は、iPS細胞へ初期化されることはほとんどなく、無血清条件で増殖因子添加により10回程度まで継代可能でありスフィア形成能を維持していた。このスフィアは、接着培養により自己拍動する心筋細胞へ効率的に分化した。さらに、免疫不全マウスへの移植実験と光イメージングにより腫瘍性増殖能に乏しいことも確認された。このように、Sca1, CD34二重陽性細胞群は、安全かつ効率的な心筋再生のための新たな細胞ソースになると期待される。重症心不全の予後は極めて悪く、喪失した心筋細胞を補う心臓再生療法の実現化は急務である。人工多能性幹(iPS)細胞は、患者由来心筋細胞のソースとして期待される一方、低分化効率や移植後腫瘍形成など重要な課題も残されている。課題克服に向けて、申請者は、iPS細胞形成(=初期化)に関わる分子機構の解析をすすめ、最近、iPS細胞誘導過程で生じる多様な非初期化細胞集団の中から、移植後腫瘍形成が低く多数の心筋細胞が誘導される新規の集団を同定した。本研究では、この細胞集団の特性解析を通じて誘導条件を改良し、未分化iPS細胞を樹立せずに十分量の安全な心筋細胞を効率的かつ俊敏に作成することを目標にする。さらに、その効果と安全性の確認のため、光イメージング技術を利用して心臓内移植細胞の挙動を生体で時空間的に追跡し、次世代心臓再生療法の基盤構築を目指す。そこで、下記の3つのテーマに従って研究を施行した。テーマ1体細胞初期化過程で出現する心筋細胞誘導候補となる細胞群の特性解析テーマ2候補細胞群からiPS細胞樹立を介さない安全かつ効率的な心筋細胞の大量作成テーマ3誘導した心筋細胞の移植効果および光イメージングによる生体細胞追跡テーマ1に関心てはマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、重要な遺伝子群を同定した。テーマ2に関しては、免疫不全マウスへの移植実験により奇形腫め発症率を評価し、安全性を評価した。テーマ3では、移植片が奇形腫を形成する場合、イメージングにより腫瘍の増殖を生体で経時的に解析できることを確認した。テーマ1体細胞初期化過程で出現する心筋細胞誘導候補となる細胞群の特性解析テーマ2候補細胞群からiPS細胞樹立を介さない安全かつ効率的な心筋細胞の大量作成テーマ3誘導した心筋細胞の移植効果および光イメージングによる生体細胞追跡テーマ1に関しては、前年度同定した重要な遺伝子群に関して機能解析を継続して行った。テーマ2および3に関しては、免疫不全マウスへの移植実験により移植片の腫瘍性増殖のリスクを経時的に解析し、心筋細胞の誘導法・選別法の最適化を行った。

テーマ1体細胞初期化過程で出現する心筋細胞誘導候補となる細胞群の特性解析テーマ2候補細胞群からiPS細胞樹立を介さない安全かつ効率的な心筋細胞の大量作成テーマ3誘導した心筋細胞の移植効果および光イメージングによる生体細胞追跡テーマ1に関しては、前年度同定した重要な遺伝子群に関して機能解析を行った。テーマ2に関しては、免疫不全マウスへの移植実験などにより、腫瘍発症リスクをさらに軽減する誘導・選別法の改良のための研究を行った。テーマ3では、光イメージングを用いて移植片の増殖を宿主の生体で経時的に解析することにより、心筋細胞の誘導・選別法の最適化を行った。重症心不全の予後は極めて悪く、喪失した心筋細胞を補う心臓再生療法の実現化は急務である。人工多能性幹(iPS)細胞は、患者由来心筋細胞のソースとして期待される一方、低分化効率や移植後腫瘍形成など重要な課題も残されている。課題克服に向けて、申請者は、iPS細胞形成(=初期化)に関わる分子機構の解析をすすめ、最近、iPS細胞誘導過程で生じる多様な非初期化細胞集団の中から、移植後腫瘍形成が低く多数の心筋細胞が誘導される新規の集団を同定した。本研究では、この細胞集団の特性解析を通じて誘導条件を改良し、未分化iPS細胞を樹立せずに十分量の安全な心筋細胞を効率的かつ俊敏に作成することを目標にする。さらに、その効果と安全性の確認のため、光イメージング技術を利用して心臓内移植細胞の挙動を生体で時空間的に追跡し、次世代心臓再生療法の基盤構築を目指す。そこで、下記の3つのテーマに従って研究を施行した。テーマ1体細胞初期化過程で出現する心筋細胞誘導候補となる細胞群の特性解析テーマ2候補細胞群からiPS細胞樹立を介さない安全かつ効率的な心筋細胞の大量作成テーマ3誘導した心筋細胞の移植効果および光イメージングによる生体細胞追跡前年度の研究成果に基づき、より効率的に心筋細胞を大量誘導できる培養系を構築することができた。また、遺伝子発現解析や免疫不全マウスへの移植実験などにより、腫瘍発症リスクが軽減していること確認することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。幹細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、心筋誘導に重要な遺伝子群を同定し(テーマ1)、候補細胞群の免疫不全マウスへの移植実験により奇形腫の発症率を評価し安全性を確認し(テーマ2)、移植片が奇形腫を形成する場合は、光イメージングにより腫瘍の増殖を生体で経時的に解析できる実験系を確立した。このように、現在までの研究遂行状況は目標達成に向けほぼ順調に進展していると考えられる。前年度までに同定した心筋誘導に重要な遺伝子群(テーマ1)に関しその機能を解析し、候補細胞群の免疫不全マウスへの移植実験により奇形腫の発症率を評価することで、より安全性の高い誘導法の開発を行っている(テーマ2)。さらに、光イメージングにより細胞の増殖を生体で経時的に解析できる実験系を確立し、これを用いて、安全かつ効率的な心筋細胞誘導法の評価をin vivoで行うことが可能となった。以上のように、現在までの研究遂行状況は目標達成に向けほぼ順調に進展していると考えられる。
リボソームRNA複合体による無機栄養感知機構の解明

本研究では、シロイヌナズナのホウ素輸送体、NIP5;1のリボソームmRNA複合体を介したホウ素濃度感知機構を明らかにすることを目的とした。まず、ホウ素に応答したリボソーム停滞やそれに伴うmRNA分解を制御する因子を同定するため、変異株のスクリーニングを行い、4つの変異株を取得した。さらに次世代シークエンサーとdCapsマーカーによる解析からこれらの変異株の原因遺伝子を特定した。また、NIP5;1で停滞しているリボソームmRNA複合体の構造を低温電子顕微鏡を用いて取得することに成功した。ホウ素は植物に必須な無機栄養素であるが、過剰のホウ素は植物にとって毒である。シロイヌナズナの効率的なホウ素吸収にはNIP5;1が必須であり、その発現は転写後制御を受けている。さらにその制御にはリボソームが重要な役割を果たしていること明らかとなってきた。本研究では、リボソームmRNA複合体による植物のホウ素感知機能の解明を目指した。1)NIP5;1 5'-UTRに存在するAUGUAA配列に、ホウ素依存的にリボソームが停滞することが明らかとなっており、この制御に関わる分子を単離するため、NIP5;1のホウ素感知変異株の単離を進めた。レポーター遺伝子、GFP下流にNIP5;1を接続し5'-UTRを含んだNIP5;1プロモーター制御下で発現させた形質転換シロイヌナズナは、低ホウ素条件下でGFP蛍光が見られるが、ホウ素十分条件では見られない。この植物に塩基置換を誘発する変異誘起剤で処理を行い、高ホウ酸条件(100μMホウ酸)の培地で生育し、GFP蛍光が観察されるものを選抜したが候補株を得ることができなかった。そこで、選抜条件を変更し、ホウ酸通常条件(25μMホウ酸)の培地で生育し、GFP蛍光が観察されるものを選抜した。その結果、3万株のM2種子から一次選抜、二次選抜を経て5株の候補株が得られた。この変異株の原因遺伝子の特定のため、掛け合わせを開始した。2)NIP5;1の発現制御の一つにNIP5;1 5'-UTRに存在するAUGUAA配列に、ホウ素依存的にリボソームが停滞することが明らかとなってきているが、どのようにリボソームがホウ素依存的にAUGUAA上で停滞するのかのメカニズムは明らかとなっていない。そこで、低温電子顕微鏡を使って、AUGUAA上で停滞しているリボソームの構造を解析することにした。サンプルには、NIP5;1 5'-UTRのAUGUAAを含んだ周辺配列、60塩基という短い配列を用いることにした。現在、この60塩基のPCR産物を精製し、それを用いたin vitro転写によりRNAの精製を試みている。ホウ素は植物にとって必須な無機栄養素であるが、過剰は植物にとって毒である。モデル植物であるシロイヌナズナの土壌からの効率的なホウ素の吸収にはホウ酸輸送体であるNIP5;1が必須であり、その発現は転写後制御を受けている。さらにその制御の上流において、リボソームが重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた。本研究では、リボソームmRNA複合体による植物のホウ素濃度感知機能の解明を目的とした。1)NIP5;1の5'非翻訳領域(5'-UTR)に存在する最小上流ORF、AUGUAA配列を介して、ホウ素依存的にリボソームが停滞し、それに伴ってmRNA分解が促進されることが明らかとなっており、これらの制御に関わる因子を同定するため、NIP5;1のホウ素感知変異株の単離を行った。レポーター遺伝子、GPFの下流にNIP5;1を結合し、5'-UTRを含むNIP5;1プロモーター制御がで発現させた形質転換シロイヌナズナを作製し、塩基置換を誘発する変異誘起剤で処理を行い、ホウ酸十分条件でGFP蛍光が観察される個体を選抜した。3万株の種子から一次選抜、二次選抜を経て5株の候補遺伝子を得た。5株の内の2株のいおいて次世代配列解析を行い、変異の原因遺伝子の候補を絞りこんだ。2)リボソームがホウ素依存的にNIP5;1 5'UTRに存在するAUGUAA上で停滞することが明らかとなってきたが、どのようにリボソームがAUGUAA上で停滞するのかは明らかとなっていない。そこで本研究では、AUGUAA上停滞しているリボソームの立体構造を解析することにした。NIP5;15'-UTRのAUGUAA周辺配列、60塩基を用い、小麦胚芽抽出液を用いてin vitro翻訳を行い、AUGUAA上で停滞しているリボソームRNAコンプレックスの精製を行った。1)得られた候補遺伝子、5株の内すでに2株は次世代配列解析を行い、変異の原因遺伝子の候補を絞りこむことができた。現在他の3株についても次世代配列解析を行う準備をすすめており、次年度には全ての候補遺伝子において、変異の原因遺伝子の候補を絞りこむ予定である。これらの変異株は独立なM2集団から単離されたものであり、NIP5;1のホウ素感知に関わる、複数の植物材料の取得が達成された。2)NIP5;1mRNAの5'-UTRに存在するAUGUAA配列上で停滞するリボソームを精製する方法を確立した。現在、低温電子顕微鏡を用いた立体構造解析を行うための準備に着手している。

そのためホウ素濃度が低い条件では、ホウ素を効率的に吸収するための膜輸送体が必要である一方で、過剰条件では、膜輸送体によるホウ素吸収を抑制しなければならない。シロイヌナズナの効率的なホウ素吸収にはホウ酸輸送体、NIP5;1が必須であり、その発現は転写後制御を受けている。さらにその制御の上流において、リボソームが重要な役割を果たしていることが明らかとなっいる。このことは、リボソームmRNA複合体がホウ素濃度を感知し、下流の発現を制御している可能性を示唆している。そこで、本研究では、リボソームmRNA複合体による植物の無機栄養感知機能の解明を目的とした。1)NIP5;1の5'-UTR上でリボソームがホウ素依存的に停滞し、下流の発現の制御に関わる分子を単離するため、分子遺伝学手法によるNIP5;1のホウ素応答変異株の単離を進めた。レポーター遺伝子GFP下流にNIP5;1を接続し、5'-UTRを含んだNIP5;1プロモーター制御下で発現させた形質転換植物は低ホウ素条件でGFP蛍光がみられるが、ホウ素十分条件では蛍光が見られない。この植物を変異誘起剤で処理を行い、ホウ素十分条件で生育させた時にGFP蛍光が観察されるものを選抜した。その結果、GFP蛍光を指標として3万株のM2種子から一次、二次選抜を経て5株の候補遺伝子を取得した。次世代DNAシークエンサーとマッピングの結果から、4株の候補遺伝子を特定した。その内3株は同じ候補遺伝子で、1株は他とは異なる候補遺伝子を得た。2)リボソームがどのようにホウ素依存的に停滞するのかを低温電子顕微鏡を用い、その立体構造の解析を行った。その結果、ホウ素を含む抽出液で精製した場合、7.7A、ホウ素含まずに精製した場合、6.57Aの80Sリボソームの構造を得た。本研究では、シロイヌナズナのホウ素輸送体、NIP5;1のリボソームmRNA複合体を介したホウ素濃度感知機構を明らかにすることを目的とした。まず、ホウ素に応答したリボソーム停滞やそれに伴うmRNA分解を制御する因子を同定するため、変異株のスクリーニングを行い、4つの変異株を取得した。さらに次世代シークエンサーとdCapsマーカーによる解析からこれらの変異株の原因遺伝子を特定した。また、NIP5;1で停滞しているリボソームmRNA複合体の構造を低温電子顕微鏡を用いて取得することに成功した。1)得られた候補遺伝子をマッピングである程度絞り込み、次世代DNAシークエンサーを用いて、候補遺伝子の特定を行う予定であったが、M3世代で候補株を得られなかった。そこで選抜条件の変更をし、新たに候補株の選抜を試みた。その結果、M3種子で5株の候補株が選抜された。26年度の目標であった候補遺伝子の特定には至らなかったが、新たに有望株を取得することができた。この得られた5株の候補遺伝子に関して、遺伝子同定のためのポジショナルクローニングを進めて行く予定であり、原因遺伝子の特定を目指す。2)NIP5;1mRNAのAUGUAA上で停滞しているリボソームを精製する方法が確立できず、低温電子顕微鏡を用いた立体構造解析まで至らなかった。新たな方法として、mRNAにビオチンを付加し、in vitro翻訳を行うことにより、リボソームmRNA複合体を精製し、ストレプトアビジンビーズによって、リボソームmRNA複合体を回収する方法を考えた。
少数人工原子による人工原子格子のスピン相関と環境との相互作用

本研究課題においては、量子ドット・量子ホール系などの厳密に制御できる系を用い、少数多数の量子ドットの結合系、2次元電子ガスにおける結合系を実現する。その結合系において、量子力学的な結合によって生じる特徴的な電気伝導や電子状態の解明を目指す。また、その量子力学的な結合系における、電子スピンと核スピンの相互作用や電子の干渉性のフォノンの影響などの環境との相互作用の解明を目標とする。研究期間に得られた主な成果は以下の通りである。(1) 2つの量子ドットを結合させた2重量子ドットにおいて、電子が1個ずつ、2つの量子ドットを量子力学的に共鳴して流れるトンネル電流を測定し、その磁場依存性を調べた。高バイアス条件下で、フォノンが介在すると思われるトンネル電流を確認した。そのトンネル電流の磁場依存性には干渉性の寄与が期待される強度の変化が確認できた。(2)2重量子ドットにおいて、3電子が寄与するパウリの排他率に起因した電流閉塞と、その磁場による解除を確認した。解除される磁場の値は、寄与する状態のエネルギー差を反映し、解除の現れ方には、2つの量子ドット間、或は、量子ドット内の核スピンの揺らぎに差を反映していることを示唆する結果が得られた。(3)縦型2重量子ドットを並列に並べることによって、縦結合・横結合を持つ縦型4重量子ドットの作製を行った。低温において、電気伝導の測定を行い、Stability diagramと少数電子状態が実現できていることを確認した。(3) 3つの量子井戸が結合した量子ホール状態を実現し、ν=2,3,4の状態について調べた。縦抵抗の変化は、ランダウ準位の準位交差やスピン状態の変化を反映していることが分かった。ν=2量子ホール状態では、そのスピン状態に応じて、核スピン偏極に起因した縦抵抗の変化を確認することに成功した。本研究課題では、量子ドットを多数結合させることによって、人工原子による結晶を実現するとともに、そのスピン状態や、結合の仕方による対称性に着目し、核スピンやフォノンなどの環境との相互作用の理解を目指すものである。本年度は、(1)電子・フォノンの結合の理解、(2)多重結合量子ドットの作成、(3) 3電子のスピンブロッケイド条件下での核スピン結合について、検討を進めた。(1)電子・フォノン結合においては、光学フォノン介在の共鳴トンネル現象を確認した。2つの光学フォノン介在トンネル電流が重なっている場合でも、トンネル電流に強度の変調(片側のブランチが明るくなり、もう片側が暗くなる)があることを確認した。現在、物理的な解釈について検討を進めている。(2) 2つの量子井戸を内包する半導体基板を用いて、2つのピラーが並んだ並列結合と直列結合をもつ4重量子ドットの作成を行った。クーロン振動などの基礎的特性の確認を行い、極低温での測定の準備を行っている。(3) 2重量子ドット中での3電子のスピンブロッケイドについて、磁場によるスピンブロッケイドの解除について検討を進めた。3電子のスピンブロッケイドは、4重項状態になることで生じると考えらえるが、Zeeman分離によって、2重項状態とエネルギーが等しくなると核スピンとの結合を通じて、スピンブロッケイドの解除が期待できる。2電子のスピンブロッケイドと同様に、電子状態との対応付けと同時に、3電子と核スピンとの結合の仕方について検討を進めている。本研究課題では、多くの量子ドットや量子井戸が結合した系において、その結合・結合の仕方によってできる電子状態・スピン状態の解明と共に、その結合によって生じる電子スピンと核スピンの相互作用や電子の干渉性のフォノンの影響などの環境との相互作用の解明を目指している。今年度は、特に、次の2点で進展が見られた。(1)量子井戸を2つ重ねて形成される2層量子ホール状態は、層間の自由度を反映して、傾角反強磁性状態転移やマクロなコヒーレンス状態など多彩な物性を示すことが明らかにされてきた。本研究では、これまでの量子井戸作製技術の発展として、また、より自由度の大きい系に着目して、3つの量子井戸が結合した3重量子井戸構造を作製、電気伝導特性を調べた。表面・裏面のゲート電圧に応じて、量子井戸のポテンシャル変調を加えることができ、それに応じた磁気振動の変化も観測、また、測定結果から、電子状態の遷移について検討を行っている。これらの結果を、国際学会、国内学会にて報告すると共に、これまでの測定結果の解析、異なる構造を持つデバイスの測定・解析を進めている。(2)電子数が1と4の2重量子ドットにおいて観測されたスピンブロッケイドについて研究を進めた。電子が4つ入っている量子ドットでは、軌道縮退によるフント則の効果で、スピンが揃ったtriplet状態が安定となることが知られている。同じスピンをもつ電子が電子数1の量子ドットに入り、高スピン状態(quadruplet状態)となった場合、スピンブロッケイドが実現することが期待できる。本研究では、電子スピン・核スピン結合によってスピンブロッケイドが解除され、電流にヒステリシスが見られる現象に着目した。測定で得られたヒステリシスと電子状態との対応付けを議論し、本研究結果をまとめ、論文投稿を進めた。

また、その量子力学的な結合系における、電子スピンと核スピンの相互作用や電子の干渉性のフォノンの影響などの環境との相互作用の解明を目標とする。研究期間に得られた主な成果は以下の通りである。(1) 2つの量子ドットを結合させた2重量子ドットにおいて、電子が1個ずつ、2つの量子ドットを量子力学的に共鳴して流れるトンネル電流を測定し、その磁場依存性を調べた。高バイアス条件下で、フォノンが介在すると思われるトンネル電流を確認した。そのトンネル電流の磁場依存性には干渉性の寄与が期待される強度の変化が確認できた。(2)2重量子ドットにおいて、3電子が寄与するパウリの排他率に起因した電流閉塞と、その磁場による解除を確認した。解除される磁場の値は、寄与する状態のエネルギー差を反映し、解除の現れ方には、2つの量子ドット間、或は、量子ドット内の核スピンの揺らぎに差を反映していることを示唆する結果が得られた。(3)縦型2重量子ドットを並列に並べることによって、縦結合・横結合を持つ縦型4重量子ドットの作製を行った。低温において、電気伝導の測定を行い、Stability diagramと少数電子状態が実現できていることを確認した。(3) 3つの量子井戸が結合した量子ホール状態を実現し、ν=2,3,4の状態について調べた。縦抵抗の変化は、ランダウ準位の準位交差やスピン状態の変化を反映していることが分かった。ν=2量子ホール状態では、そのスピン状態に応じて、核スピン偏極に起因した縦抵抗の変化を確認することに成功した。寒剤の供給に支障が生じたなどの原因から、多重結合量子ドット測定については、まだ、進められていない点が多い。年度後半より復帰したため、遅れを取り戻せるものと考えている。縦横結合4重量子ドットについては、極低温の測定ができていないため、スピン状態の議論ができるよう、早急に測定が行えるように進めていきたい。また、より多くの量子ドットが結合する系についても、研究を進めると同時に、結合量子井戸系についても、電子状態の議論から、核スピンとの結合へ発展させていく。これらの結果、また、核スピン・フォノン系について、これまでの結果を論文にまとめられるよう、尽力して参りたい。フォノンとの結合や核スピンとの結合に関しては、すでに得られている結果について、物理的な解釈を付け加えようとしており、環境との相互作用の議論が少しずつ進められている。今後は、より多重結合した量子ドットについても、極低温の測定を行い、スピン状態の解明と環境との相互作用の解明などの研究を進めていきたいと考えている。寒剤の供給の停止などで、研究遂行に遅れが生じ、測定機器の購入を延期したため。より多重結合した量子ドットでのスピン状態の解明を進めると同時に、高速測定やNMR、ESRなどの測定技術を組み合わせていければと考えている。昨年度末に寒剤の供給が安定的となったため、昨年度の計画を含めて、今年度、研究を遂行する。予定していた発振器の購入や、半導体基板、寒剤の購入に充てたいと考えている。本年度は、素子作成に注力した。所属の変更に応じて、配線やフォルダの準備に時間を要し、極低温での試料の測定が遅れているため。極低温での測定の準備が済み次第、計画通りの執行を進める。
品質指向ソフトウェア開発プロセスを支援する統計分析手法の開発と改善

ソフトウェア開発の上流工程で得られる情報を,下流工程のテスト工程におけるソフトウェアの信頼性評価に盛り込むための統計手法の開発を行った.従来法の多変量解析モデルでは表現しきれなかった部分について,構造方程式モデル,GMDH,ニューラルネットワークの適用によってある程度克服できた.また,ソフトウェア開発支援ツールのSafeManに対して,ブートストラップ法による新しい評価法を盛り込むことができた.一方,コピュラに基づく新しいモデルの開発にも着手することができ,これは今後の進展が見込める.今年度の研究成果は大別して以下の3点に分けられる.これらはすべて国内外の研究集会,国際会議で発表し,一部は論文誌に投稿中である.1)ソフトウェアの製造工程から採取可能な変量に着目し,それらがテスト工程の前の段階で得られたとき,その時点におけるソフトウェア内の潜在フォールト数(プログラムの論理的誤りの個数)を推定する方法について,古典的手法である多変量解析などを,推定精度において凌駕する方法を2種類開発し,その性能について検討した.結果はニューラルネットに基づく方法が良好な成績を残した.この技術によって,ソフトウェアのテストにおいて発見されるはずのフォールト数を予め見積ることが可能となるため,各種の見積もり,出荷後の信頼度推定において有益となる.2)不完全なソフトウェアのテスト作業が,事例として存在することを明示した上で,それを克服する手段として,2チームによる2段階ソフトウェアテストを開発した.ここから得られる定量的データに基づき,各チームのテスト作業に関するスキルの程度,テスト対象となっているソフトウェアの信頼性評価(残存フォールト数の推定)の方法を示した.この,不完全テストの視点は,従来の研究では明示的に扱われてこなかったものであり,得られた知見は有意義なものと考えられる.3)ソフトウェアの潜在フォールト数は,テストの時間の経過とともに減少することが知られているが,それ以外に,フォールト数の減少に寄与する要因としては,テスト項目の消化数がある.このことから,従来から2変量の確率過程を用いてソフトウェアの信頼性を評価する手法がいくつか開発されてきているが,ここではコピュラ(copula)を用いて記述することにより,精緻化を図った.結果としては,ソフトウェアのフォールト数に対する2変量管理図を作成できることが示せた.これは今後,モデルの更なる精緻化を目指す.本年度は研究計画の最終年度であり,研究題目に挙げたソフトウェア開発プロセスを支援する統計分析手法の開発と改善については,ここまでの成果を,ソフトウェア開発支援ツール(以下,ツールと呼ぶ)として既に活用されている「SafeMan」に対して,形ある改良点として実装された.これには研究協力者の存在が不可欠であった.ソフトウェアツールの活用法については,特にソフトウェア開発管理の実務家からは,ツールから読み取るべき情報が既往のツールでは分かりにくいという指摘,また誤ったツールの使い方などの問題点があったが,これについての解決法としてまとめた学術論文を,前記の研究協力者と共に出版することができた.ソフトウェアツールの改善と共に,ソフトウェア開発過程から得られる,多変量データを解析する新しい手法として,コピュラ(接合関数)に基づく数理モデルを第2年度から開発し,いくつかの研究会等で発表した.従来の多変量確率分布における変量間の依存性を,本モデルではより容易にソフトウェア信頼性評価モデルの記述に取り込むことができるという点で,有用な方法であると言える結果が得られた.これについては,今後の研究計画の一つの柱となる予定である.3年間に渡る研究成果全体については,まず初年度においては,それ以前に継続して行っていた関連研究をいくつかの場において発表し,その研究成果であったソフトウェア信頼性評価モデルの改善などに関する批評を受けつつ,それを本申請研究の基盤として進めた.具体的には,従来では単純な多変量重回帰モデルによって記述されてきた,ソフトウェア開発の質に影響する多変量データを,構造方程式モデル(SEM)により記述し直すことで精度が向上することを示すことができた.第2年度はGMDHによる多変量モデルの改善,2チームによるソフトウェアテストの場合の信頼性評価方法などを開発した.ソフトウェア開発の上流工程で得られる情報を,下流工程のテスト工程におけるソフトウェアの信頼性評価に盛り込むための統計手法の開発を行った.従来法の多変量解析モデルでは表現しきれなかった部分について,構造方程式モデル,GMDH,ニューラルネットワークの適用によってある程度克服できた.また,ソフトウェア開発支援ツールのSafeManに対して,ブートストラップ法による新しい評価法を盛り込むことができた.一方,コピュラに基づく新しいモデルの開発にも着手することができ,これは今後の進展が見込める.3年間という研究計画期間の初年度において,本申請研究の前段階から開始していた以下の研究について国際会議等で発表し,この研究の方向付け,指摘された問題点などについて検討を行った.具体的には,以下のような背景と,研究の狙いを示す意味での研究発表を行った.それは,ソフトウェアの製造において計測可能な,いくつかの変量に基づいて出荷直前あるいはソフトウェアテストの開始前において当該ソフトウェアの品質や信頼性を予測するという統計数理モデルの開発であるが,その背景としてはとりもなおさず,組込系を含めた大規模なソフトウェアの開発と品質管理において,なんらかの有用な評価手法が求められていることにある.ここで述べているソフトウェアの製造において計測可能ないくつかの変量とは,たとえば,開発プロセスで得られる様々なドキュメントのサイズ(量),仕様変更の頻度や規模,レビューの実施結果と言ったような,あるソフトウェア開発プロジェクトの良し悪しに影響を与えているような変量を取り上げることとした.これらを用いて,従来の研究としては(非線形も含んだ)

重回帰モデルによって,たとえば実際に発見されたソフトウェア欠陥の数(バグ数)が説明できるものとした研究が散見されたが,本研究では,それを進め,SEM(structure equation model;構造方程式モデル)による予測方法を構成し,10を超える実際のプロジェクトからのデータに適用することによって,従来法との比較を,ソフトウェア欠陥数の推定精度の側面から行った.結果は,いくつかのデータセットでの結果を除くと,良好なものであり,特にどの変数がどの中間変数に影響を及ぼしているかなどの,重回帰モデルでは表現できていなかった部分について推定・検討を加えることが可能になった.1)については,潜在フォールト数の予測技術として,GMDH,ニューラルネットワークを用い,少なくとも従来法よりは良い結果を得る成果を得ており,かなりの程度進捗したと言える.しかしながら,この問題(フォールト数の早期予測問題)に対する多変量解析的なアプローチは多数あり,今後の手法の模索に鑑みて,達成度は60%程度と思われ,次年度に達成を目指す.また,3)については,本申請研究の趣旨に照らして,必要な信頼性評価技術であり,比較的簡単なモデルによる成果を得ているが,この達成度は40%と見積もっている.以上,全体としては当初の計画より進捗したと総括できる.初年度の計画部分については順調に推移している.SEM(構造方程式モデル)でうまく当てはまらなかったいくつかのデータセット(実ソフトウェアプロジェクトから抽出されたもの)について,モデルを改良する余地があるか,あるいはデータセットが偶然誤差による異常値を含んでおり,それに釣られる形で当てはまりが悪化したのかについては,次年度検討を行うこととした.モデル改良の側面からのアイディアとしては,GMDH(group method of data handling)などのような,データが生成される構造やメカニズムを一旦度外視することによって予測を行う方法は,試す価値があると思われる.本年度の後半はこの点について検討を加え始めている.また,極値分布に基づく数理モデルについてもソフトウェア信頼性評価手法の開発から派生的に考察の対象となり,それらについても研究発表を行った.これについても並行して次年度以降も行う予定としている.開発属性データに基づいて,開発されるソフトウェア内に潜在するフォールト数を,精度よく見積る新技術については,モデルの開発と共に,実際に採取できる各種のデータを得る必要がある.このため,IPA/SECの協力の下で,実企業からの実測データの提供を受けられるよう,手続きを進めている.これが実現すれば,実企業の実務の中で,より計測のしやすいデータを用いた,信頼性予測問題への解が得られる可能性が高い.
樹脈弁を損傷しない安全な静脈注射方法の検証

平成21年度は、前年度に引き続き解剖体における上肢皮静脈の観察、臨床での静脈注射実施方法の把握と看護基礎教育課程における静脈注射に関する教育内容を把握するために質問紙調査を行った。上肢皮静脈の観察では、皮静脈の分枝部周辺に静脈弁を観察した。数的には、従来の報告よりも少ない傾向であった。今回の観察により、分枝部への針の刺入は静脈弁への損傷の可能性が考えられる。質問紙調査については、5県10病院に勤務し、静脈注射を実施している看護師910名を対象とし、回収率90.1%(820名)であった。この内「静脈注射実施経験年数」が無回答の14名を除き、806名について、各項目の記述統計と、「静脈注射実施経験年数」と各項目についてχ^2検定を行った(有意水準は0.05未満)。静脈注射実施経験年数は、3年以下191名(23.7%)、45年149名(18.5%)、610年197名(24.4%)、11年以上269名(33.4%)であった。実施経験年数と関連を認めた項目は、注射針の知識として「筋肉注射とは針の長さが異なる」353名(43.8%)、静脈注射実施時の工夫として「母指を中にして手を握ってもらう」711名(88.2%)、「対象に合わせ針を変える」492名(61.0%)「腕を降ろす」217名(26.9%)であった。このことから、経験年数を積むことで一定の工夫は可能になると考えられる。一方、教育機関については、全国の看護系大学・短大と看護専門学校(3年課程・4年統合課程)682校の看護技術担当教員を対象とし、回収率38.3%(261校)であった。皮静脈の伴走神経については84.3%、皮静脈の深部の神経・動脈については87.5%が教育していた。また、血管迷走反応については、38.8%が教育していた。このことから、静脈注射時の形態・機能学の知識を十分に教授する必要があると考えられる。「臨床での静脈注射実施方法の把握」と「看護師基礎教養課程における銃脈注射に関する教育内容の把握」について、無記名式調査を行うための調査項目の検討を実施した。まずは、研究分担者および連携研究者とともに関連文献の検討を実施した。結果、専門基礎知識の知識をどのように教育し、活用されているかを中心的に調査する必要性があると考えられた。その内容を具体的な項目にした調査用紙を作成した。同時に、静脈注射時に必要な形態学の知識について抽出を行った。特に大切と考えられた「皮膚構造」「皮静脈の走行」「皮静脈と深静脈との吻合」「穿刺の危険が考えられる動脈・神経」について、まとめて資料を作成した。特に、尺側皮静脈については、その深部に正中神経が上腕動脈とともに走行しているため、正中皮静脈または橈側皮静脈への穿刺が望ましいことを記載した。一方、形態学的な確認については、実習解剖体により連携研究者と共に予備の確認を実施した。結果、10側中肘窩(屈曲側)の近位、遠位5cmの範囲において、近位で4側、遠位で6側に静脈弁を確認できた。2側で近位、遠位共に静脈弁は認めなかった。弁付近には静脈根を確認できた。また、顕微鏡による観察では、Hematoxylin Eosin染色、Elas tica van Giwson染色、Kluver-Barrea's染色による切片を対象とした。結果、弾性繊維に富む弁を観察することができた。神経線維は確認できなかった。

一方、教育機関については、全国の看護系大学・短大と看護専門学校(3年課程・4年統合課程)682校の看護技術担当教員を対象とし、回収率38.3%(261校)であった。皮静脈の伴走神経については84.3%、皮静脈の深部の神経・動脈については87.5%が教育していた。また、血管迷走反応については、38.8%が教育していた。このことから、静脈注射時の形態・機能学の知識を十分に教授する必要があると考えられる。
精巣腫瘍における染色体コピー増加(殊にX染色体)の果たす腫瘍生物学的意義の研究

精巣腫瘍は好発年齢が20-40歳の青壮年男子であること、化学療法の進歩にも関わらず未だ非治癒症例も少なからず存在するなどから、その社会的な影響が極めて大きい悪性腫瘍と考えられる。しかしながら、精巣腫瘍の分子遺伝学的発生メカニズムについてはこれまで明確な癌遺伝子、癌抑制遺伝子の同定がなされていないのが現状である。われわれは精巣腫瘍の核型分析において二倍体、三倍体といった異数体が高頻度にみられることより染色体コピー数の増加と精巣腫瘍の発生という点に着目し、特にX染色体に主眼をおいて研究を展開した。その結果、X染色体上にクラスターとして存在するCancerTestisantigensの発現は精巣腫瘍においては腫瘍抗原ではなく、むしろ胚細胞発生過程の分化抗原として機能していることを明らかにした(Yusasa et al.,J Urol 2001)。またKlenefelter syndromeに発生した小細胞癌の細胞株を樹立しKlinefelter syndromeの腫瘍発生メカニズム解析の為の重要な研究材料を得た(Kim et al.,Pro state. 2000)。一方、Xq27上に家族性精巣腫瘍の候補遺伝子座(TGCT1)がXq27にマッピングされたことは精巣腫瘍発生におけるX染色体の関与をいよいよ決定づけるものである。しかし、X染色体には正常女性核型XXにみられるようにXISTを介したX染色体不活化機構が存在しcounting mechanismによる余剰Xの不活化というユニークな機能が存在する。このことよりX染色体におそらく存在すると思われる精巣胚細胞腫瘍の感受性遺伝子がgene dosageにしたがって働く癌遺伝子的分子なのかまた癌抑制遺伝子的分子であるのかは極めて興味深い問題点であると考え精巣腫瘍の余剰Xに対してX染色体の不活化機構が腫瘍発生にどう関与するかについても検討を行った。精巣腫瘍発生の分子生物学的発生機構については不明のことが多く、殊に精巣腫瘍に関わる癌遺伝子、癌抑制遺伝子は同定されていない。われわれは精巣腫瘍におけるX染色体コピーの増加に着目し同染色体上の遺伝子変化が精巣腫瘍発生に関わる可能性を検索し平成11年度には以下の結果を得ている。まずわれわれの研究室で保存しているヒト精巣腫瘍組織より抽出したRNA、担癌患者末梢リンパ球より得られたRNAおよび当教室で前立腺腫瘍の際に去勢術を施行した精巣組織より得られたRNAをコントロールとして用いX染色体上の遺伝子(XIST,Cancer/Testis Antigens genesほか)について発現異常の検討をおこなった。XIST遺伝子については正常精巣では発現が認められないものの多くの精巣腫瘍では発現を認めこの結果はLooijengaらの報告と一致した。つまり精巣腫瘍においてはX染色体コピーの増加が頻回に認められるがこれらの付加X遺伝子については正常のcounting mechanismが働きX染色体の不活化をおこなっている可能性が示唆された。さらにX染色体上に数多く存在し正常組織では精巣特異的に発現を認めるCancer/Testis Antigens genesのうちMAGE(A),MAGE(B),GAGE,PAGE-1,HOM-MEL-40,NY-ESO-1,LAGE-1の発現も検討したところ精巣腫瘍ではむしろこれらCTA遺伝子の発現欠損がみられこの欠損パターンはむしろ精巣腫瘍の組織分化に依存している傾向が見られた。平成12年度には各症例のCGHを行うとともにXIST遺伝子に依存もしくは依存しない精巣腫瘍感受性遺伝子の検索を行う予定である。

しかしながら、精巣腫瘍の分子遺伝学的発生メカニズムについてはこれまで明確な癌遺伝子、癌抑制遺伝子の同定がなされていないのが現状である。われわれは精巣腫瘍の核型分析において二倍体、三倍体といった異数体が高頻度にみられることより染色体コピー数の増加と精巣腫瘍の発生という点に着目し、特にX染色体に主眼をおいて研究を展開した。その結果、X染色体上にクラスターとして存在するCancerTestisantigensの発現は精巣腫瘍においては腫瘍抗原ではなく、むしろ胚細胞発生過程の分化抗原として機能していることを明らかにした(Yusasa et al.,J Urol in press)。またKlenefelter syndromeに発生した小細胞癌の細胞株を樹立しKlinefelter syndromeの腫瘍発生メカニズム解析の為の重要な研究材料を得た(Kim et al.,Prostate.2000)。一方、Xq27上に家族性精巣腫瘍の候補遺伝子座(TGCT1)がXq27にマッピングされたことは精巣腫瘍発生におけるX染色体の関与をいよいよ決定づけるものである。しかし、X染色体には正常女性核型XXにみられるようにXISTを介したX染色体不活化機構が存在しcounting mechanismによる余剰Xの不活化というユニークな機能が存在する。このことよりX染色体におそらく存在すると思われる精巣胚細胞腫瘍の感受性遺伝子がgene dosageにしたがって働く癌遺伝子的分子なのかまた癌抑制遺伝子的分子であるのかは極めて興味深い問題点であると考え精巣腫瘍の余剰Xに対してX染色体の不活化機構が腫瘍発生にどう関与するかについても検討中である。