hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海外文化財輸送技術との比較による日本の文化財輸送技術の発展に関する研究

新たな素材による梱包材料を選択しその評価を行い、より良い梱包材を創出する研究においては、既存の梱包材料についてのデータは検討したが、新たな素材のリサーチ及び選択が捗らず、新たな梱包素材による振動軽減データを得られず、研究の遅れが生じた。海外文化財輸送技術についての調査で研究協力者との調査先の選定に於いて調査項目の検討に時間を要したため、調査を行う博物館等の選定に遅れが生じた。本年度はワンボックス商用車用防振システムの開発を主に行ってきた。昨年度に計測を行ったトヨタ自動車社製ハイエースの走行データと今年度行った研究所所有車日産自動車社製キャラバンの走行実験結果を基に防振システムの開発を行いプロトタイプの作製を行った。防振システムは、どちらの担当者も研究協力者である株式会社守谷商会及び株式会社エーエスに製作を依頼した。ワンボックス商用車用防振システムでは、以前製作した4tトラック用防振パレットでは条件として最大積載質量60kgとしたが、ワンボックス商用車では最大積載量が1000kgであるため、防振システムの最大積載量を30kgに設定し開発を行った。走行条件としてハイエースでは、市街地及び一部自動車専用道路を走行してデータを収集した。キャラバンは市街地のみの走行となり、データとしては一部不均一な部分はあるが路面の凹凸や道路状況の悪い部分の計測を行った。併せて、ハイエースでは土製素焼きの植木鉢を出土土器製品に見立て、キャラバンではレプリカの金属製品を輸送対象遺物に見立てて美術梱包を施し、走行実験を行った。梱包材料は、従来より使用されているウレタンフォームを用い、対象資料をサンドイッチ状に挟み込むことと形状に切り抜き資料を埋め込むことにより上下左右の動きが無いように梱包したもの。また、防振ゲルを用いてその上に対象資料を安置することによる梱包の2種類の梱包材料を用いて実験を行った。その結果従来型のウレタンフォームによる梱包よりもゲルを用いた梱包の方が振動を吸収することが判明した。しかしながら、防振ゲルでは、ゲルを包み込むパックの中で対流が起こり、それによる対象資料の移動が微量ながら発生する傾向が確認できた。新たな素材による梱包材料を選択しその評価を行い、より良い梱包材を創出する研究においては、既存の梱包材料ウレタンフォーム・生綿を用いた綿布団・防振ゲルについてのデータは検討できたが、新たな素材のリサーチ及び選択が捗らず、新たな梱包素材を用いた走行実験が出来なかったため研究の遅れが生じた。海外文化財輸送技術についての調査で研究協力者との検討の中で、調査先の選定が良好とはならず調査が出来なかった。また、海外美術館とのコンタクトの中でフランスルーブル美術館への調査打診を美術館担当者へ行ったが、これも今年度は実現出来なかったため研究計画の遅れが生じた。しかし、来年度予定していたワンボックス商用車用防振システムはプロトタイプを今年度作製することが出来た。平成30年度については以下の通り研究を進めていく。
第二のシスチン尿症関連輸送体の分子同定とその生理機能の解明

シスチン尿症は、rBAT(補助サブユニット)とb0,+AT(活性サブユニット)の二つの蛋白からなるヘテロ二量体型シスチン輸送体の変異により発症するが、さらに未知の輸送体の関与が示唆されていた。本研究は、b0,+ATと同じファミリーに属する輸送体SLC7A13が長年不明であったrBATの第二の結合パートナーであり、尿細管シスチン再吸収に寄与するものであることを実証して、シスチン尿症の新規原因遺伝子候補を提示するものである。本研究の成果は、尿細管シスチン輸送機構の長年のパラドックスを解決し、尿細管物質輸送生理学に新たな展開をもたらすものと期待される。シスチン尿症(OMIM220100)は、腎近位尿細管のシスチン再吸収不全により生じる常染色体劣性の遺伝性疾患であり、rBAT(補助サブユニット)とb(0,+)AT(活性サブユニット)の二つのタンパク質からなるヘテロ二量体型シスチン輸送体の変異により発症するが、さらに未知のトランスポーターの関与が示唆されてきた。本研究は、b(0,+)ATと同じファミリーに属するトランスポーターSLC7A13が、長年不明であったrBATの第二の結合パートナーであり、尿細管シスチン再吸収に寄与するものであることを実証して、シスチン尿症の新規原因遺伝子候補を提示することを目的とした。平成25年度は、前年度に確立した精製タンパク質を用いたプロテオリポソーム再構成法を用いて、SLC7A13の基質選択性を輸送活性阻害試験によって解析した。さらに、SLC7A13の基質選択性とその輸送メカニズム解析とプロテオミクス解析の結果から、SLC7A13の生理的機能を明らかにする目的で、機能共役する他のアミノ酸トランスポーターを予測、同定を試みた。その結果、SLC7A13の基質の一部をナトリウム依存的に細胞内に取り込むアミノ酸トランスポーターとSLC7A13が尿細管S3分節において共局在していること、さらに2種のトランスポーターが近接して存在していることを明らかにした。これにより、S3分節においてSLC7A13が効率的にシスチン再吸収を行うメカニズムの一端が明らかになった。本研究は、b(0,+)ATと同じファミリーに属するトランスポーターSLC7A13が長年不明であったrBATの第二の結合パートナーであり、尿細管シスチン再吸収に寄与するものであることを実証して、シスチン尿症の新規原因遺伝子候補を提示することを目的とする。平成24年度は、プロテオミクスを用いて明らかにした、SLC7A13がrBATと結合して輸送機能を獲得することを実証するために、培養細胞発現系でのSLC7A13とrBATのヘテロ二量体化、その細胞膜への局在、および輸送活性と基質特異性の解析を行った。さらに高効率に二量体の細胞膜局在が可能な培養細胞系を得るために、安定発現細胞を作製し、両者が複合体として発現する細胞株を選択した。この安定発現細胞を用いてSLC7A13の輸送基質特異性を解析した。さらに、細胞の内因性のアミノ酸輸取り込み能による影響を完全に除外した状態で、正確な輸送機構を解析する目的で、精製タンパク質を用いたプロテオリポソーム再構成法による活性解析系を確立した。SLC7A13-rBAT複合体を安定発現株より精製し、プロテオリポソームに再構成し、輸送機能を得た。これを用いて、SLC7A13の輸送キネティクス、基質特異性、イオン選択性を詳細に解析した。さらに抗体染色を行い、SLC7A13とrBATの共局在を明確に示し、SLC7A13が長年不明であったS3分節におけるrBATの結合相手であることを結論した。シスチン尿症(OMIM220100)は、腎近位尿細管のシスチン再吸収不全により生じる常染色体劣性の遺伝性疾患であり、腎近位尿細管管腔側の1回膜貫通型蛋白rBAT(SLC3A1)と12回膜貫通型蛋白b0,+AT(SLC7A9)の二つのサブユニットからなるヘテロ二量体型シスチン輸送体の変異により発症する。一方で、どちらにも変異の見られない症例が存在することから、さらに未知の輸送体の関与が示唆されてきた。

本研究では、b0,+ATと同じファミリーに属する輸送体SLC7A13が長年不明であったrBATの第二の結合パートナーであり、尿細管シスチン再吸収に寄与するものであることを実証して、シスチン尿症の新規原因遺伝子候補として提示することを目指した。本研究の成果は、尿細管シスチン輸送機構の長年のパラドックスを解決し、尿細管物質輸送生理学に新たな展開をもたらすものと期待される。平成26年度は、前年度までに明らかにしたSLC7A13のシスチンを含むアミノ酸輸送活性の特性についてさらに詳細を検討した。さらに、SLC7A13のシスチン取り込みが近位尿細管S3分節の管腔側膜上でグルタミン酸輸送体と機能的相互作用しうることを明らかにした。また、共同研究によりrBAT欠損マウスにおいて、SLC7A13タンパク質が近位尿細管管腔側膜に発現しないことを明らかにした。これによって、rBATがSLC7A13の第二の結合パートナーであることが、裏付けられた。rBAT欠損マウスの尿を用いたメタボローム解析を行い、野生型マウスと尿中漏出代謝物を詳細に比較し、生体内で真にSLC7A13によって輸送されている物質を明らかにした。これまでの研究成果より、SLC7A13が第二のシスチン尿症関連輸送体であることを確立し、研究を総括した。膜タンパク質の生化学前年度に引き続き、精製タンパク質を用いたプロテオリポソーム再構成法を用いることで、SLC7A13の詳細な輸送機能解析を行った。22種類のアミノ酸を用いた取り込み試験に加え、10種類のアミノ酸誘導体を用いた阻害実験を行うことにより、SLC7A13の基質認識についての情報が得られた。さらに、SLC7A13がナトリウム依存的グルタミン酸トランスポーターEAAC1/SLC1A1と近位尿細管S3分節において近接して共局在していることを示したことにより、アミノ酸輸送におけるアミノ酸トランスポーター同士の機能共役によりシスチンの再吸収が行われていることが強く示唆される結果を得た。これは、尿細管物質輸送生理学にシスチン輸送の新しい分子を加えただけでなく、別々の輸送体が機能的複合体を形成し機能共役することで、輸送機能を発揮しているという概念を実証する結果であると考える。この機能的複合体は、多数の輸送体タンパク質と足場タンパク質からなる超複合体の一部である可能性を示唆する予備的結果が得られている。交付申請書に記載した項目については、ほぼ計画通りに達成した。交付申請書に記載したように再構成系を用いた基質結合能を指標にした機能解析系ではなく、さらに難易度が高くかつトランスポーター本来の機能を検出することが可能な、再構成系による輸送活性の解析に成功し、詳細な輸送キネティクスの解析を行った。これにより、明らかにSLC7A13-rBAT複合体にシスチン輸送活性があることを突き止めた。さらに共同研究によりrBATおよびb(0,+)ATの欠損マウス、ダブル欠損マウスの腎臓から刷子縁膜小胞を調製し、抗SLC7A13抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。その結果、rBATが存在しないときにSLC7A13の発現が見られなくなることが示された。これにより、in vivoにおいてSLC7A13とrBATがヘテロ二量体を形成していることが証明された。また、Superresolution Structured Illumination Microscopy(SR-SIM)を用いることにより、SLC7A13の局在を詳細に解析した。本年度、本研究により明らかになった事実から、尿細管シスチン輸送機構の長年のパラドックスが解決され、尿細管物質輸送生理学に新たな展開がもたらされることがより現実的になった。
ケミカルバイオロジーを用いたγセクレターゼモジュレーターの分子機構に関する解析

フェニルイミダゾール型γセクレターゼモジュレーター(GSM)の作用機序を明らかにするため、以下の研究を実施した。1既知の阻害剤の結合に与える影響:既知の阻害剤によるメカニズムとの関係を明らかにするため、種々の阻害剤型プローブの光親和性標識に対する影響を解析した。その結果、GSMの一種であるSTI120は遷移状態模倣型阻害剤由来のプローブ31C-Bpaの結合を増加させることが分かった。すなわち、ST1120は遷移状態の形成を促進していることが明らかとなった。2短い基質を用いたGSM薬理作用の解析:GSMが酵素活性に与える影響を解析するため、短いペプチド生FRET基質を用いて検討を行った。γセクレターゼ複合体の最小構成因子であるPresenilin(PS)1/Nicastrin(Nct)/Aph-1aL/Pen_2を発現・精製し、界面活性剤存在下で基質と反応させ、反応速度を蛍光光度計により解析したところ、ST1120は切断速度を4倍近く上昇させることを確認した。すなわちSTI120はγセクレターゼを活性化することを明らかにした。3GSMの結合に重要な残基の発見:GSMと相互作用するアミノ酸を同定することを目的として、Ala変異体のスクリーニングを行った。ps2NTF内に存在するアミノ酸のうち、(i)保存されている、(ii)フェニルイミダゾールと強い相互作用を作りうる芳香族と極性の高いアミノ酸を選択し、GSM応答性が低下する変異体を探索した。その結果、Y112A、Nl41A、Y246Aの3つの変異体でGSM応答性の低下が認められた。さらにこれらの変異体は光親和性標識プローブST2038の結合が低下していることが確認され、これらのアミノ酸がGSMの結合に重要であることを明らかにした。GSMの作用機序に関して、新規検出系を用いてγセクレターゼの活性化作用を明解に示すことができた。また、GSMの応答性を効率よく測定する方法を確立し、γセクレターゼと化合物の相互作用アミノ酸を網羅的に解析することで、世界で初めてGSMが相互作用する可能性が極めて高いアミノ酸を同定することに成功した。1in vitro再構成系を用いたGSM薬理作用の解析:GSMの一種であるST1120が酵素反応に直接作用しているかを明らかにするため、in vitroγセクレターゼ再構成系を用いた検討を行った。γセクレターゼ複合体の最小構成因子であるPresenilin(PS)1/Nicastrin(Nct)/Aph-laL/Pen-2を発現・精製し、界面活性剤存在下で基質と反応させたところ、ST1120がin vitro再構成系においても薬効を示すことを確認した。すなわち、ST1120は酵素反応に直接作用することを明らかにした。2光親和性標識を用いGSM標的分子の同定:本学天然物合成化学教室(福山透教授)との共同研究により作出した新しい光プローブST2038が薬効を保持することを確認した。このプローブをマウス脳画分に添加し、UVにより標識したところ、内因性のPS1 NTFとAph-1aLが特異的な標識を受けることを発見した。既知の阻害剤等でAph-1と結合するものは報告されておらず、γセクレターゼの活性制御機構について新たな可能性を示唆するものである。3 GSMによる活性制御機構の解明:フェニルイミダゾール型GSMの分子機構について、(A)変異体タンパク質の化合物感受性解析、(B)光親和性標識を用いた既知の化合物との競合実験、(C)酵母を用いたケミカルジェネティクス、により解析を進めた。そしてGSMが活性中心サブユニットの違い(PS1もしくはPS2)に応じて薬効を発揮すること、またGSMが酵素の活性中心部位及び基質結合部位の構造を変化させることを明らかとした。今後さらにその分子機構の詳細を解析するため、Aph-1を完全に消失したAph-1ノックアウトマウス由来線維芽細胞でのγセクレターゼ活性測定系の確立(ジョンズホプキンス大学・Philip Wong教授との共同研究)や、酵母におけるγセクレターゼ再構成系(東京大学大学院総合分化研究科・石浦章一教授との共同研究)の検討を進めた。

3GSMの結合に重要な残基の発見:GSMと相互作用するアミノ酸を同定することを目的として、Ala変異体のスクリーニングを行った。ps2NTF内に存在するアミノ酸のうち、(i)保存されている、(ii)フェニルイミダゾールと強い相互作用を作りうる芳香族と極性の高いアミノ酸を選択し、GSM応答性が低下する変異体を探索した。その結果、Y112A、Nl41A、Y246Aの3つの変異体でGSM応答性の低下が認められた。さらにこれらの変異体は光親和性標識プローブST2038の結合が低下していることが確認され、これらのアミノ酸がGSMの結合に重要であることを明らかにした。結合分子として初期的検討では検出できていなかったAph-1を新たな標的分子として同定し、GSMによる活性制御機構について新たなメカニズムを提示することができたため。また、結合残基の同定についても引き続き実験系の検討を進めている。GSMの作用機序に関して、新規検出系を用いてγセクレターゼの活性化作用を明解に示すことができた。また、GSMの応答性を効率よく測定する方法を確立し、γセクレターゼと化合物の相互作用アミノ酸を網羅的に解析することで、世界で初めてGSMが相互作用する可能性が極めて高いアミノ酸を同定することに成功した。今後は光親和性標識とランダム変異による結合残基の同定を遂行し、同定した残基の変異体解析によって確認していく研究を完成させる予定である。酵母では化合物感受性がやや低いという問題点があるため、感受性を高める工夫をすると共に、別の培養細胞を用いて同様の解析を行うことも検討する予定である。また、結合残基の同定に留まらず、分子機構の解明をめざして構造変化や酵素-基質相互作用について定量的な解析も行っていくことを予定している。
発達障害児の個別的な災害時避難訓練方法に関する探索的研究

◆火災や地震などの災害あるいは校内侵入者などの緊急時に避難をするための訓練は、学校において不可欠である。発達障害児には、一人一人の児童の特徴に配慮した個別的な訓練を行わないと、真に有効な訓練にならない。また、避難訓練では強い情動が喚起されるためマイナスの記憶となって、実際の避難時に適切な行動を阻害してしまうことにもなりかねない。◆そこで、本研究では次の手順で、火災と地震の二つについて、在籍する発達障害児の「個別の避難訓練プログラム」を作成することとした。(1)学校全体の避難計画と避難訓練計画と、発達障害児の個別的な避難計画と訓練プログラムとの間に整合性を持たせるように、学校内の調整を行った。(2)実際の避難計画にそって、避難行動の要素と順序から構成される具体的な台本「スクリプト」による避難訓練プログラムを児童個別に作成した。(3)新奇な事態にパニックを起こしやすい児童には、パニックに配慮した「スクリプト」、聴覚過敏のある児童には、聴覚刺激に配慮した「スクリプト」など、個別的な訓練プログラムを作成した。作成に際しては、SST、ソーシャルストーリーの技法や観察法等を用いた。(4)スクリプトに基づく訓練は、障害児童にはできるだけ視覚化したガイドを作成し、訓練当日だけではなく、事前・事後の指導にも活用した。(5)月例の避難訓練で、児童の反応と達成度を考慮しながら指導プログラムをリファインした。◆避難訓練プログラムを用いることによって、・活動の見通しをもつ・活動をリアルタイムで確認する・一緒に活動する仲間を意識する等の行動が見られ、児童が安定した気持ちで避難訓練に参加するようになった。◆校内の全教師が、具体的な「スクリプト」を共有することで、個に応じたプログラムを円滑に実施できるようになった。◆作成したプログラムは、学校と関係する放課後等デイサービス施設や発達障害児の託児所にも配布した。◆今後特殊教育学会やLD学会で発表する予定である。
日本と英国の田園住宅地で実践された住宅改善の事業・思想に関する比較研究

事業計画書で立ち上げた調査内容は以下の項目である。(1)ロンドンの公共資料館、図書館で公営住宅機関に関する史料調査を行う。(2)各史料館における史料入手(事業報告書、仕事書、当時の地図類、雑誌事項、人文広告、景観写真等)(3)レッチワースにおける住宅地調査このうちイギリスについては、Letchworth-cheap housing exhibitionの史料解読と住宅地計画に精力を傾けた。そのため住宅展覧会の内容については個々のレベルまでその展示物の内容が明らかになりつつある状況にあるものの、それらの展示物が具体的に、現存するのか、否かも含めて、さらに掘り下げて調査を進めて行く必要があるであろう。学会等への研究実績の公開は、その後のことと考えており、もう少し時間をかけて検討したい。日本における住宅改善思想についての研究は、既住発表論文の整理が主体である。これまでの日本の戦前期に於いて実地された展覧会について、リスト化し、グラフなどを使ってヴィジュアルな形で整理を進めたいと考えている。しかしながら、Letchworth-cheap housing exhibitionとこれまで日本で実地された住宅改善衛生思想の展覧会の関連性については、具体的な特色を検討する領域としては発表のレベルまで達していない。さらに資料収集を積み重ね、個々の住宅展覧会の内容を分析し、日本とイギリスの相互比較に検討を加えながら発表の方法を考察したい。病気、加療のため。初年時事業計画書<研究目的>で記したように、現地=イギリス-Letchworth-を主体した調書は2年次を中心に考えている。住宅地における調査項目は、(1)レッチワースで建設された住宅すべて(一軒一軒)を明らかにする。建設年・設計者・間取り、外観デザイン・庭園・付帯設備・家具など。(2)レッチワースで開催された2つの展覧会(テープ・コッテイジ住宅展覧会及びテープ・コッテイジ展覧会)の展示物の内容を明らかにする。(3)レッチワースの労働者住宅(コモン・ビュー)の住宅改善を検証する。(4)建築規約によるレッチワースの公共空間・衛生思想を明らかにする。(5)レッチワースの都市デザイン(配置・街路・レイアウト)を明らかにする。(6)レッチワースの工業施設(工場・インフラなど)を明らかにする。である。レッチワースでの研究期間中はにおいては、主にレッチワースで開催された「チープ・コッテイジ住宅展」について調査し、それらの住宅の拾党の配置、部屋の間取り、住宅の設備、外観デザイン、設計者の履歴などについて調べて内容を明らかにする。国内研究調査旅費、外国研究調査旅費、謝金等-提供資料の閲覧、論文投稿複写費。病気、加療のため。である。
新しいキメラベクターの開発と骨軟部腫瘍に対するコンビネーション癌遺伝子治療法

骨肉腫の5年生存率は60%前後でこの10数年間停滞しており、更なる飛躍的な治療成績の向上には何らかのbreak throughが必要である。従来の抗癌剤とは全く機序を異にする分子標的治療や遺伝子治療の開発が急務の課題となってきている。我々は現在有効な治療法のない骨肉腫肺転移に対する新しい治療法としての遺伝子治療の早期の臨床応用を目的として、臨床像を反映する動物モデルを作成し、自殺遺伝子治療およびサイトカイン遺伝子治療治療効果を検討した。<研究実績>骨肉腫モデル動物の作成:マウス骨肉腫細胞株LM8をマウス皮下注入に加え尾静脈より注入することで全例に原発巣と致死的肺転移巣をおこすモデルを作成した。アデノウイルスベクター(ADV)によるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)およびインターロイキン-2(IL-2)遺伝子治療:LM8はADVによる遺伝子導入効率が非常に低値であり、HSV-tk/GCV療法では治療効果が得られなかった。これに対しIL-2遺伝子治療は原発巣への1回のADVの注入で原発巣の増殖抑制だけでなく肺転移の著明な抑制効果を認めた。有効で副作用のないアデノウイルスの力価を立証することができ、局所や肺での抗腫瘍機序を証明した。<考察と今後の方針>遺伝子治療の真の効果を評価するためには適切な動物モデルによる検討が必要であり、今回我々は骨肉腫の臨床像を反映する動物モデルを作製した。さらにこのモデルにおいて、ADVによる遺伝子導入効率の低い骨肉腫でもIL-2のような分泌蛋白を局所で産生させることにより遠隔転移までにも治療効果が得られることを明らかにした。今後は様々な腫瘍細胞株に対し、IL-2以外のサイトカイン遺伝子治療や、HSV-tkとのコンビネーション遺伝子治療を行い、臨床応用を目指して副作用を含めた詳細な検討、プロトコールの最適化を行っていきたい。本研究は骨軟部腫瘍に対する新しい治療法として癌遺伝子治療法の基礎的研究を行い、早期臨床応用を目指すものである。共同研究者の一人である小財はアデノウイルスベクターを用い自殺遺伝子とサイトカイン遺伝子を導入するコンビンネーション癌遺伝子治療法の有効性を世界で初めて開発し(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:2577-2581,1995)、その治療法の有効性を種々の癌に対して実験的に証明してきた。さらに飛躍的な治療効果をあげるべく、新しい手法の開発に取り組んでいる。本年度は骨肉腫に対して、従来のコンビネーション癌遺伝子治療法の臨床応用を目指す研究を先ず行った。この手法は、p53遺伝子導入等による腫瘍細胞の正常化をねらう方法と違い、腫瘍細胞を直接殺傷化し、さらにバイスタンダー効果をも期待できるものであり、腫瘍細胞全体に導入されなくても、治療効果はかなり高く、非常に実用的である。骨肉腫細胞株4株に対して1)Pro-drugのガンシンクロビルの取り込み2)Herpes simplex virus thymidunekinase(HSV-tk)遺伝子のadenovial vectorへの取り込み3)Adenoviral vectorの上記細胞へのtransfectionを行い、導入効率を90%以上にすることができた。細胞死も平均80%にもたらすことができた。一方、in vivoの実験系も確立すべく、ヌードマウスへの骨肉腫可植系も作成した。現在、同系マウスへの可植系も作成中である。また、マウス可植が報告されている骨肉腫細胞株についても実験系に組み込み検討を開始している。

次年度には骨肉腫に発現が強い幾つかの遺伝子を選び、その遺伝子の発現(つまり骨肉腫)依存的に増殖するアデノウイルスベクターを種々作製し、100%癌細胞へのin vivoでの遺伝子導入を目指す予定である。<目的>現在有効な治療法のない骨肉腫肺転移に対する新しい治療法としての遺伝子治療の早期の臨床応用を目的として、臨床像を反映する動物モデルにおける自殺遺伝子治療およびサイトカイン遺伝子治療治療効果を検討する。<今年度の研究実績>骨肉腫モデル動物の作成:マウス骨肉腫細胞株LM8をマウス皮下注入に加え尾静脈より注入することで全例に原発巣と致死的肺転移巣をおこすモデルを作成した。アデノウイルスベクター(ADV)によるヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)およびインターロイキン-2(IL-2)遺伝子治療:LM8はADVによる遺伝子導入効率が非常に低値であり、HSV-tk/GCV療法では治療効果が得られなかった。これに対しIL-2遺伝子治療は原発巣への1回のADVの注入で原発巣の増殖抑制だけでなく肺転移の著明な抑制効果を認めた。<考察および今後の方針>遺伝子治療の真の効果を評価するためには適切な動物モデルによる検討が必要であると考えられ、今回我々は骨肉腫の臨床像を反映する動物モデルを作製した。さらにこのモデルにおいて、ADVによる遺伝子導入効率の低い骨肉腫でもIL-2のような分泌蛋白を局所で産生させることにより遠隔転移までにも治療効果が得られることを明らかにした。今後は様々な腫瘍細胞株に対し、IL-2以外のサイトカイン遺伝子治療や、HSV-tkとのコンビネーション遺伝子治療を行い、臨床応用を目指して副作用を含めた詳細な検討、プロトコールの最適化を行う予定である。
ベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤のAhR活性化に起因する代謝運命と毒性機構の解明

AhRリガンドであるベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤(BUVSs)のリスク評価を試みた。まず、8種の主要なシトクロムP450によるBUVSsの酸化的代謝を検討した。その結果、BUVSsはAhR依存的および非依存的な複数のシトクロムP450によって酸化されAhRリガンド活性を失うこと、更にUV-P、UV-9については酸化的代謝物の存在を確認した。また、umu試験を用いてBUVSsのDNA損傷性を評価したところ、UV-326を除いていずれも陰性であり、総合して低リスク群のリガンドであるとと推察した。UV-326は陽性に近い反応を示したため、より詳細なDNA損傷性の解析が必要だろう。本研究では申請者が見出した、ヒトアリルハイドロカーボン受容体(AhR)リガンドとして機能するベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤(BUVSs)が一般的なAhRリガンドの3分類(ダイオキシン型、PAHs型、無害型)のどの型に属するかを明らかにするものである。なおダイオキシン型とは、生体内で代謝を受けずに長期間残留し、AhRの活性化に連なる様々な遺伝子の転写を促進し続けて生体に影響を及ぼすタイプのリガンドである。またPAHs型はAhR関連薬物代謝酵素によって究極活性物質に変化し、DNA損傷性や変異原性を示すことで発ガンを促す可能性を持つリガンドである。最後に無害型はポリフェノールやフラボノイドなどのように一次的にAhR関連遺伝子を発現誘導し、自らは速やかに代謝排泄される物質である。すなわち、ダイオキシン型やPAHs型に分類されるAhRリガンドは、ヒトへのリスクになる物質である。平成28年度は、BUVSs4種類(UV-P、UV-9、UV-326、UV-090)について、代謝後のAhR活性の変化を調べた。AhRの活性化によって発現誘導されるヒトチトクロムP450酸化還元酵素であるCYP1A1、1B1、1A2とBUVSsを3時間反応させ、反応液のAhR活性を酵母レポータージーンアッセイで評価した。また反応液中に存在するBUVSs代謝物の探索をLC-MS/MSを用いて実施した。結果として、4種類のAhRリガンドとなるBUVSsのうちUV-PのAhR活性がCYP1A1、1B1、1A2のいずれの酵素との反応によっても著しく低下し、AhR活性を失った。また、LC-MS/MS探索結果からUV-Pには水酸基が1つ付加したと思われる代謝物のピークを見出し、大まかな分子構造をえた。一般的にAhRリガンドは自らが誘導するCYPsによって代謝、排泄されるが本年度の検討によってUV-Pのみに著しいリガンド活性の低下を確認した。UV-PはBUVSsの中では比較的強いAhR活性を持つ物質であるが、同程度の活性化能を持つUV-9との生体内挙動の差がある、ひいてはヒトへのリスクに差がある可能性が判明した。次年度この差の原因を明らかにしたい。AhRリガンドとして働くベンゾトリアゾール系紫外線吸収剤(BUVSs)のAhRリガンドとしてのリスクを評価した。AhRリガンドはAhRを活性化したのち、速やかに代謝排泄される無害なものと、ダイオキシンのように代謝されず体内にとどまるもの、多環芳香族炭化水素類のように代謝活性化を受けてDNA損傷性を示すものに分類される。本研究はBUVSsがAhRリガンドとしてどのタイプに属するかを検証するものである。BUVSsの酸化的代謝について検討した。生体異物を代謝する酵素にはAhR活性化依存的ではないものも存在すること、またそれらの酵素がAhRリガンドを代謝する可能性もあることから、評価対象とする酵素をCYP1A1、1B1、1A2、2A6、2B6、3A4、2C19、2E1とした。またこれらの酵素以外が酸化的代謝に関与している可能性もあることから、ヒトプールドミクロゾームを用いた評価も実施した。その結果、UV-Pはヒトミクロゾームの他、CYP1A1、1A2、1B1、2A6で、UV-9はヒトミクロゾーム、CYP1A1、1A2、1B1、2A6、2B6で、UV-326はヒトミクロゾームで、UV-090はCYP2B6で酸化された。これらのBUVSsのAhRリガンド活性はいずれも低下し、速やかに代謝・排泄される可能性が示唆された。また、それぞれのCYPsに合わせて特徴的な酸化的代謝物の存在を明らかにした。AhRリガンドは一般的には自らがAhRを活性化した際に誘導されるCYP1A1、1A2、1B1によって代謝されるが、今回いずれのBUVSsもAhR非関連CYPsによる代謝とAhRリガンド活性の低下を確認した。また、UV-326においてはヒトミクロゾーム以外には今回試験に供したいずれのCYPsによっても酸化されず、他のCYPsによる代謝が疑われた。また、医薬品の遺伝毒性試験にも利用されるumu試験を用いてBUVSsのDNA損傷性を調査したところ、いずれも活性を示さなかった。以上の結果からBUVSsのAhRリガンドとしてのリスクはPAHsのようには高くないと推察した。

まず、8種の主要なシトクロムP450によるBUVSsの酸化的代謝を検討した。その結果、BUVSsはAhR依存的および非依存的な複数のシトクロムP450によって酸化されAhRリガンド活性を失うこと、更にUV-P、UV-9については酸化的代謝物の存在を確認した。また、umu試験を用いてBUVSsのDNA損傷性を評価したところ、UV-326を除いていずれも陰性であり、総合して低リスク群のリガンドであるとと推察した。UV-326は陽性に近い反応を示したため、より詳細なDNA損傷性の解析が必要だろう。平成29年度はUV-P以外のAhRリガンド性BUVSsについてAhR活性化に関与しないチトクロムP450や抱合反応による代謝の有無を評価し、いかなる条件においても生体内で安定的なダイオキシン型リガンドであるか決定する。またAhR関連CYPによって代謝されたUV-Pについては、代謝後のDNAとの反応性をDNAアダクトーム解析等を用いて検討し、迅速に代謝され人体へ影響を及ぼさない無害型リガンドか、DNA損傷性を持つPAHs型リガンドであるかを決定する。以上から、UV-P、UV-9、UV-326およびUV-090がAhRリガンドとしてどのタイプに分類されるのか決定する。環境毒性学平成28年度においては代謝酵素とBUVSsの反応および反応産物の探索を中心に行ったため必要な物品数が想定より少なかった。また、学会参加も宿泊等を伴わない開催地であったため、次年度使用額が生じた。DNAアダクトーム実験用の酵素、変異原試験用の物品、分析機器消耗品、旅費や論文投稿関連費用に使用予定である。
多糖類の化学合成と修飾による高機能化に関する研究

タンパク質や核酸と並んで多糖は、生命現象に必須の生体高分子である。生体組織や細胞における複合多糖の機能が解明されるようになり、生理活性物質としての多糖の役割が注目されるとともに、機能性材料としての多糖の有用性が見直されている。多糖およびその誘導体の分子設計法を探索し、分子生物機能をもつ新しい高分子物質・材料を構築することを目的として本研究を行い、次の成果を得た。(1)新規高分子材料の創出単糖の高選択的合成、セルロース・キチンへの反応性機能団の導入、オリゴ糖を主鎖にもつポリ尿素や精密グルコシル化を応用した擬似四糖の合成など、新手法を確立した。モデル合成多糖の固相構造をCP/MAS【^(13)C】-NMR法を応用して解析した。(2)生体分子機能の発現カルボキシメチルキチンにハプテンを結合させて、画期的なハプテン特異的抗体を調製した。オルトエステル法によりつくった分枝多糖が優れた抗腫瘍活性を示すことや、硫酸化した合成多糖が高い抗凝血作用を発現することを見出した。ガラクトース糖鎖をもつポリスチレンか肝細胞により特異的に認識され、新しい型の細胞分離材料や細胞培養材料として応用できることを示した。(3)生物型機能の人工的構築認識能をもつオリゴ糖を固定したナイロンカプセル膜を用いて、可逆的透過制御を発現させた。位置特異的修飾をシクロデキストリンに施し、不斉アミノ酸の合成や選択的カルボキシル化などの酵素機能を発現する人工物質を作製した。優れた光学分割能をもつセルローストリカルバメート誘導体を開発した。昭和61年1月28・29日名古屋において、各分担者が一堂に会して研究集会を開き、研究の中間の取りまとめと討議、および意見の交換を行ったことは、本研究を推進、発展させる上で有意義であった。
パーソンズ理論の体系的再評価にもとづく現代社会論の構築

1.タルコット・パーソンズ生誕百年記念シンポジウムの開催平成14年(2002年)12月7日8日に「タルコット・パーソンズ生誕百年記念シンポジウム」を開催した。このシンポジウムは、17本の報告、1本の特別講演、4本の話題提供から構成され、2日間の参加者総数は220名あまりにのぼった。パーソンズ生誕百年を期に、パーソンズ・イメージの革新を図ろうとするわれわれの試みは、日本社会学会・日本社会学史学会を中心に大きな反響を呼んだ。2.研究成果の公表平成14年度には、パーソンズ最晩年の著作であるAction Theory and the Human ConditionのPart IIIとPart IVを翻訳出版した。これまであまり顧みられることのなかった晩年の著作を翻訳紹介することによって、パーソンズ理論の現代的意義を日本の社会学界に認識させることに貢献した。平成15年度には、シンポジウムの成果を『パーソンズ・ルネッサンスへの招待』として出版した。この論文集は、現代社会における諸問題(モダニティ、宗教、医療など)に対するパーソンズ理論の意義、およびパーソンズ理論の理論的・学説史的意義について多面的に考察している。3.ハーバード大学アーカイブズ資料研究平成14年度、15年度に1回ずつハーバード大学アーカイブズにおけるパーソンズの未公刊資料の調査・収集を行った。その中でもとくにToward the American SocietalCommunity草稿に注目し、晩期パーソンズの理論における社会共同体の概念の重要性、パーソンズのアメリカ社会の現実へのコミットメントが確認された。4.内外のパーソンズ研究者・社会学理論家との交流パーソンズ研究と現代社会論の2つの側面から、研究分担者および内外の研究協力者と定期的な研究会を開催した。とくに平成14年度にはローランド・ロバートソン教授(英・アバディーン大学)、平成15年度にはブライアン・ターナー教授(英・ケンブリッジ大学)による講演会を開催し、国際的な研究交流を行った。(1)パーソンズ研究会の組織化。タルコット・パーソンズの生誕(1902/12/13)100年記念シンポジウム開催をめざして7人のコアメンバー(のち8人に増加)が結集し、1999年から研究会を組織した。2002年度から科学研究費が得られたが、それ以前は民聞財団からの研究費を受け、法政大学百年記念館を中心に毎年45回合宿して、内部と外部から報告者を招きパーソンズ研究を重ねた。(2)パーソンズ『宗数の社会学』『人間の条件パラダイム』の翻訳出版(勁草書房)。シンポジウムの前夜祭として、パーソンズの死(1979)の前年に出版された大著"Action Theory and Human Condition"を8人の協同で翻訳し、研究会を訳文調整の場とした。『宗教の社会学』は第3部の訳で徳安・挾本・油井・佐藤が担当、『人間の条件パラダイム』は第4部の訳で富永・高城・盛山・鈴木が担当。富永が第4部のあとに解説論文を書いた。(3)パーソンズ生誕100年記念シンポジウム(東京シンポジウム)の開催。パーソンズの誕生日に因み2002年12月78日、法政大学ボアソナード・タワー26階スカイホールで東京シンポジウムを開催した。これははからずもニューヨーク・シンポジウムと同時開催となった。報告者はコアメンバーが8人、外部から9人(うち1人は海外からRobertsonを招聘)、話題提供者が4人、会場には2日とも220人の熟心な聴衆が集まった。(4)同「神戸セミナー」の開催。

東京シンポジウムの1週間後の12月1415日、油井の主導により、ニューヨーク・シンポジウムの報告者からRidz, Bershedy(アメリカ),Wnzel, Staubmann(ドイツ)の4人を招聘、これに東京シンポジウムの報告者と関西からの報告者が加わって、オックスフォード大学神戸インスティテュートの講堂で英語のセミナーが行われた。(5)ハーバード・アーカイブズでの文献調査。米国ケンブリッジのハーバード大学図書館に付設されている古文書館(アーカイブズ)をコアメンバーのうち4人が訪問、ここに保存されているパーソンズのunpublished manuscriptsその他多くの文献を閲覧した。とくに、"American Society"と"American Societal Community"の2つの遺著の状態を調査し、それらのコピーをとった。2003年度のパーソンズ研究会でこれらを読み合わせ、"American Societal Community"を協同翻訳することを考えたい。1.平成14年度の研究の成果公表平成14年12月7日8日に開催した「タルコット・パーソンズ生誕百年記念シンポジウム」に基づいて、研究分担者および研究協力者(計21名)による論文集を作成した。この論文集は、現代社会における諸問題(とくにモダニティ、宗教、医療など)に対するパーソンズ理論の意義、またパーソンズ理論の理論的・学説史的意義について考察している。平成16年3月に、富永健一・徳安彰(編)『パーソンズ・ルネッサンスへの招待』(勁草書房)として刊行予定である。2.ハーバード大学アーカイブズ資料研究平成14年度に行ったハーバード大学アーカイブズ調査に基づき、収集したパーソンズの未公刊資料の整理を行った。また、その中でとりわけ重要と思われるToward the American SocietalCommunityの草稿について、研究分担者および研究協力者による各章の内容の検討、あるいは草稿の構成の経緯についての検討を行った。理論的には、とくに晩期パーソンズの理論における社会共同体の概念の重要性が確認された。平成16年3月に、あらためてハーバード大学でフォローアップ調査を行い、同草稿の研究の深化をはかる予定である。3.内外のパーソンズ研究者・社会学理論家との交流現代社会論に重点を置いて、研究分担者および内外の研究協力者(計16名)と定期的な研究会を開催した。とくに平成15年9月1日2日には、イギリスのブライアン・ターナー教授(ケンブリッジ大学社会科学・政治学部)によるパーソンズ理論と現代社会に関する講演を開催し、国際的な研究交流を行うことができた。この研究会の成果は、平成16年中に論文集として刊行すべく、作業を進めている。
皮膚樹状細胞におけるCD326分子の新規機能解析

CD326分子は同種親和性を示すカルシウム非依存性の細胞間相互作用に関与する膜タンパクである。CD326はランゲリン陽性真皮樹状細胞に発現し、遊走したリンパ節内において、その発現を増強することを発見した。皮膚樹状細胞サブセット特異的CD326分子ノックアウトマウスを作成し、遺伝子銃、タンパク抗原、アレルギー性接触性皮膚炎モデルを用いた経皮的な免疫応答を検討することで、ランゲリン陽性真皮樹状細胞におけるCD326の機能を解析することを試みた。また、表皮顆粒層におけるCD326の発現を発見し、活性化したランゲルハンス細胞の樹状突起との間に機能的な細胞接着に関わっている可能性が示唆された。皮膚および皮膚所属リンパ節において各樹状細胞サブセットにおけるCD326分子の発現および局在を明らかにした。C57BL-6マウスの体幹皮膚を表皮、真皮に分離した後、それぞれを酵素処理して細胞浮遊液を作成しフローサイトメトリで解析した。また、マウスの皮膚所属リンパ節も同様に解析した。皮膚由来の樹状細胞はLangerin、CD11b、CD 103分子の発現パターンによって5種類のサブセットに分類が可能であった。我々はLangerin+ CD11b+;ランゲルハンス細胞(以下、LC)、Langerin+ CD11b- CD103+;Langerin陽性真皮樹状細胞(以下、langerin+ dDC)に注目した。LCは表皮、真皮、リンパ節内でもCD326分子を強発現していた。Langerin+ dDCは真皮においてCD326分子を弱発現し、遊走した皮膚所属リンパ節内においてその発現を増強することを見出した。次に共焦点顕微鏡による皮膚樹状細胞サブセットの局在解析を行った。マウスの耳介より採取した皮膚を使用し、チオシアン化アンモニウムを使用して表皮を剥離し真皮シートとして抗Langerin、抗CD326、抗CD103抗体を用いた多重染色を行って染色した。抗CD103抗体を用いた染色は成功していないが、langerin+ dDCが毛嚢周囲に多く認められる知見が得られている。最後に経皮的な免疫応答の解析の手段として遺伝子銃を用いた経皮的genetic immunizationの実験系が機能するかを検討した。β-galactosidaseをコードするプラスミドDNAをコーティングされた金粒子を用いてマウスの剃毛した腹部に遺伝子銃を用いて免疫を行った。免疫1週間後に抗原特異的なIgGをELISA法を用いて測定したところ、抗原特異的な液性免疫応答が得られていることを確認した。共焦点顕微鏡による皮膚樹状細胞サブセットの局在解析の点では、電子顕微鏡レベルで樹状細胞を同定するため、post-embedding法での免疫電子顕微鏡を試行した。具体的にはC57 BL-6マウスの耳介より採取した皮膚をpost-embedding免疫電顕の基質として使用した。検体を1mm以下程度の大きさに切りだし、-190°Cに冷却した液体プロパン中に急速に投入し凍結固定する。-80°C下でメタノールにより凍結置換を行った。その後、-60°C下でLowicryl K11Mにて樹脂包埋し、紫外線重合によりブロックを作成した。超薄切片を作成したのち、1次抗体と反応後、15nm以下の金コロイド標識2次抗体を反応させ透過型電子顕微鏡にて観察した。しかし、アーチファクトが強い検体不良、および抗体の染色性不良があり、詳細な観察が困難であったため、免疫電子顕微鏡は技術的なハードルが高いことがわかった。しかし、前述の通り共焦点顕微鏡による多重染色で表皮、真皮共に樹状細胞の局在が解析可能であった。平成29年度以降に予定している経皮的な免疫応答の解析に用いる経皮的genetic immunizationの実験系、かつOVA(chicken ovalbumin)を皮膚に外用する経皮免疫の実験系も機能することが確認できており、来期の研究計画を前倒しして開始できている。骨髄移植による皮膚樹状細胞サブセット特異的なCD326分子ノックアウトマウスの作成を試みたが、コントロール群においてLCの数的減少が見られ、今回の実験において、骨髄移植マウスは経表皮的な免疫操作に適しないと判断した。そこで、CD326分子をランゲリンプロモーター下、CD11cプロモーター下に特異的に欠損させるコンディショナルノックアウトマウス(各々、LC-CD326 cKO、DC-CD326 cKO)を使用した。LC-CD326 cKOでは、LCにおいてのみCD326分子が欠損し、DC-CD326 cKOでは、LCおよびlangerin+ dDC両者からCD326分子が欠損する。β-galをコードするプラスミドDNAをコーティングされた金粒子を用いてマウスに遺伝子銃を用いて免疫を行い、免疫1週間後に抗原特異的なIgGをELISA法を用いて測定したところ、LC-CD326 cKO、DC-CD326 cKO間において、抗原特異的なIgGの産生に明らかな差異は認められなかった。次に、OVAを経皮免疫し、産生された抗OVA特異的IgGのサブクラスを解析した。野生型マウスに比して、LC-CD326 cKOでは抗OVA特異的IgG1産生が亢進し、既報告と矛盾しない結果が得られた。DC-CD326とLC-CD326cKO間では抗OVA特異的IgGの産生に、差異は認められなかった。

次にCD326の表皮における発現を解析した。顆粒層にて表皮間をシーリングするようにCD326分子の発現が確認され、興味深いことに、活性化したLCの樹状突起が、顆粒層と結合するポイントでCD326分子が高発現していた。さらにLC-CD326 cKOにおいては、結合ポイントのCD326分子の発現が消失した。今後はより詳細な表皮顆粒層におけるCD326分子の発現パターンとその機能を解析する予定である。CD326分子は同種親和性を示すカルシウム非依存性の細胞間相互作用に関与する膜タンパクである。CD326はランゲリン陽性真皮樹状細胞に発現し、遊走したリンパ節内において、その発現を増強することを発見した。皮膚樹状細胞サブセット特異的CD326分子ノックアウトマウスを作成し、遺伝子銃、タンパク抗原、アレルギー性接触性皮膚炎モデルを用いた経皮的な免疫応答を検討することで、ランゲリン陽性真皮樹状細胞におけるCD326の機能を解析することを試みた。また、表皮顆粒層におけるCD326の発現を発見し、活性化したランゲルハンス細胞の樹状突起との間に機能的な細胞接着に関わっている可能性が示唆された。引き続き共焦点顕微鏡による多重染色を用いて、表皮、真皮、所属リンパ節における樹状細胞の局在を解析する。抗CD103抗体を用いた染色は成功していないため、Biotinをコンジュゲートした抗CD103抗体で検体を染色し、蛍光標識ストレプトアビジンによって検出を試みる。LCおよびlangerin+ dDCの密着像が認められれば、例えば皮膚においては毛嚢周囲なのか血管周囲なのか、皮膚所属リンパ節ではT細胞領域なのかなど、位置情報を詳細に確認する。平成29年度は骨髄移植による皮膚樹状細胞サブセット特異的な4種類のCD326分子ノックアウトマウス(グループ1;LC、langerin+ dDCともにCD326を発現、グループ2;LCのみがCD326を発現、グループ3;langerin+ dDCのみがCD326を発現、グループ4;LC、langerin+ dDCともにCD326を発現しない)作成する予定である。このノックアウトマウスが作成できしだい、遺伝子銃を用いた経皮的genetic immunizationによる免疫を行い、抗原特異的なIgGサブクラスをELISA法を用いて測定し、CD326分子の選択的欠損が液性免疫反応に与える影響を解析する。遺伝子銃を用いた免疫後、T細胞性免疫にあたえる影響を解析するために、所属リンパ節におけるIL-4(Th2型サイトカイン)およびIFN-γ(Th1型サイトカイン)のメッセンジャーRNAのレベルをPCR法によって検討する。OVAを皮膚に外用した場合、LCによって抗原特異的IgG1産生(Th2型液性免疫反応)が誘導される事が分かっている。そこで、経皮的genetic immunizationと並行して、上記で作成した骨髄移植マウスにOVAを1週間間隔で2回経皮免疫し、抗OVA特異的IgGのサブクラスをELISA法を用いて詳細に解析する。皮膚免疫、皮膚バリア機能使用予定であった抗体などは、過去に購入した抗体を使用することでまかなうことができた。また購入予定であったELISA用抗体などは在庫不足であったため、翌年度に購入することになった。全体的に効率よく物品調達を行うことができたため、未使用金が発生した。
ジアシルグリセロールキナーゼαが癌細胞増殖を促す一方でT細胞を不活化する分子機構

細胞内シグナリングの分岐器として機能する脂質キナーゼDGKαの分子基盤を解明することを目的として研究を行った.触媒ドメインの構造解析:前年度にDGKα全長の試料の発現系を昆虫細胞を用いて確立した.本年度はDGKα全長の試料の大量発現と精製を進めた.精製試料の活性の確認,二次構造解析を行った後(Takahashi et al., Peer J, 2018),結晶化スクリニーングを進めたが,蛋白質結晶は得られなかった.さらに今後の結晶化のための試料調製の効率を上げるため,新規のコンストラクトを作成した.2年間の研究を通して,これまで理解が乏しかったDGKの構造生物学的研究を進めた.昆虫細胞を用いて活性を保持したDGKα全長の試料を初めて大量発現させ,結晶化のための高純度に精製した試料を得た.さらにN末端の活性制御領域であるDGKαEFのCa2+結合型の結晶構造を決定するとともに,Ca2+が結合するとDGKαEFがプロテアーゼ耐性のあるリジッドな構造へと変化することを生化学・物理化学的手法により明らかにした.本研究によるDGKα試料調製法の確立と,N末端領域に関する構造生物学的理解は,がん免疫治療の標的の一つとして注視されているDGKαの阻害剤開発へ貢献し得る.ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は,二次メッセンジャーとしてはたらくジアシルグリセロールとホスファチジン酸の細胞内濃度を調節するシグナル伝達系の制御因子である.なかでも,そのαアイソザイム(DGKα)は,「がん細胞を増殖させ,逆にT細胞を不活化する」という,申請者の知る限り他に例をみない機能をもち,がん免疫治療の標的の一つとして考えられている.本研究では,未決定・未探索のDGKαの立体構造解析と相互作用ネットワーク解析を行い,細胞内シグナリングの分岐器としてはたらくDGKαの分子機構を解明することを目的としている.本年度は,当初の予定通りDGKα構造解析・相互作用ネットワーク解析のための蛋白質試料の発現・精製系の確立に加え,DGKαの活性をカルシウム依存的に制御するN末端EF-hand motif(DGKα-EF)の構造解析を行った.全長DGKα試料の調製:数種の可溶性タグを融合したDGKα触媒ドメイン(DGKα-CD)の大腸菌での発現,或いは昆虫細胞-バキュロウイルス発現系による発現・精製を試みたが,いずれの系においてもDGKα-CDは,不溶性或いは可溶性の凝集体を形成した.しかしながら,これまで豚の胸腺から精製の報告がある全長DGKαを,昆虫細胞発現系を用いて,活性を保持した単量体として収率良く精製することができた(論文投稿済み).DGKα-EFの構造解析: DGKα-EFへのカルシウムの結合と,結合による構造変化を等温滴定型カロリメトリー,ゲル濾過クロマトグラフィー,質量分析を組み合わせて解析した.さらに,カルシウム結合型DGKα-EFの結晶化に成功し,結晶構造を単波長異常散乱法(S-SAD法)により解析した.現在,構造の精密化を進めている(論文投稿準備中).これまで可溶性画分への発現と精製が非常に困難であったDGKαを,DGキナーゼ活性を持つ単量体として精製した.さらに濃縮による蛋白質試料の凝集がないことを確認し,結晶化のスクリーニングを開始することができた.このDGKα試料は,プルダウンアッセイによるがん細胞とT細胞における相互作用蛋白質の探索にも利用することができる.今後,DGKαの大量発現と精製を行い,結晶化のスクリーニングを進めれば,X線回折実験のための結晶を得る可能性は高いと考える.また,DGKαの活性制御に関与するN末端EFハンドモチーフ(DGKα-EF)の立体構造を初めて決定し,生物物理学的手法によりカルシウム結合による構造変化も特徴づけることができた.これらの結果は,DGKαの分子内相互作用による活性制御の分子基盤を理解するための新たな知見である.細胞内シグナリングの分岐器として機能する脂質キナーゼDGKαの分子基盤を解明することを目的として研究を行った.触媒ドメインの構造解析:前年度にDGKα全長の試料の発現系を昆虫細胞を用いて確立した.本年度はDGKα全長の試料の大量発現と精製を進めた.精製試料の活性の確認,二次構造解析を行った後(Takahashi et al., Peer J, 2018),結晶化スクリニーングを進めたが,蛋白質結晶は得られなかった.さらに今後の結晶化のための試料調製の効率を上げるため,新規のコンストラクトを作成した.2年間の研究を通して,これまで理解が乏しかったDGKの構造生物学的研究を進めた.昆虫細胞を用いて活性を保持したDGKα全長の試料を初めて大量発現させ,結晶化のための高純度に精製した試料を得た.さらにN末端の活性制御領域であるDGKαEFのCa2+結合型の結晶構造を決定するとともに,Ca2+が結合するとDGKαEFがプロテアーゼ耐性のあるリジッドな構造へと変化することを生化学・物理化学的手法により明らかにした.本研究によるDGKα試料調製法の確立と,N末端領域に関する構造生物学的理解は,がん免疫治療の標的の一つとして注視されているDGKαの阻害剤開発へ貢献し得る.概ね順調に進行しており,当初の計画に沿って研究を進めていく.

DGKαの大量発現と精製を行い,次年度内の結晶化と構造解析を目指す.またリガンド(AMP-PNP或いは阻害剤)との複合体など,結晶化に適した試料の最適化も同時に進め,結晶化成功の確率を上げていく.また得られたDGKα試料を用いてプルダウンアッセイによるがん細胞とT細胞における相互作用蛋白質の探索,或いは共免疫沈降法によるがん細胞,T細胞における相互作用蛋白質の探索も進めていく.国内学会への旅費が抑えられたため.2018年度も引き続きジアシルグリセロールキナーゼの構造・相互作用解析のために必要な分子生物学・生化学試薬類の購入を予定している.