hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子の新しい立体構造解析法を目指した蛍光検出円二色性の再定義

本研究の目的は、研究代表者の開発した楕円鏡型蛍光検出円二色性(FDCD)測定装置を用いて、有機小分子やタンパク質の立体構造解析に適用可能な、全く新しい迅速で簡便な方法を開発することである。FDCDを構造解析に適用するにはスペクトル曲線の解釈が鍵と考え、本研究では有機小分子とタンパク質の両面からFDCDとCDの差異を精査した。有機小分子でこの差異が観測される条件を明確に定義するため、透過光CDの理論曲線と蛍光寿命の間に起こり得る励起状態の変化をFDCDと関連づけを試みた。タンパク質では、FDCDを「立体構造のピンポイント解析法」として確立することを念頭に、系統的な合成モデルペプチドの解析を行った。有機小分子を使った実験で、励起子キラリティー系の単純な分子ですらFDCDが透過光CDと異なる曲線を与える例があった。さらに、タンパク質の部分構造でもあるトリプトファン(Trp)のFDCDスペクトルも、透過光CDとは異なる曲線を与えた。すなわち、既知のFDCD理論には修正が必要であり、この修正点を明確に定義するため、量子化学計算により関連分子の系統的な電子遷移モーメントの解析を進めた。ここまで明確な定義には至っていないが、この一環として透過光CDの理論計算により新規天然有機化合物の絶対配置をいくつかの研究グループとの共同研究として進め、報告した。タンパク質のFDCDについては、内在性の蛍光アミノ酸残基であるトリプトファン(Trp)に着目し、Trp含有の合成モデルペプチドの解析から、TrpのC末端側のペプチド鎖伸長によりFDCDは変化するが、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが示された。さらに、FDCDの観測機構にキラルドナーからアキラルアクセプターへの蛍光エネルギー移動(FRET)が関与すると予測し、適当なスペーサー分子にワンポット導入可能なキラルドナーを合成した。本研究の大きな目的は、研究代表者の開発した楕円鏡型蛍光検出円二色性(FDCD)測定装置を用いて、有機小分子やタンパク質の立体構造解析に適用可能な、全く新しい迅速で簡便な方法の開発である。この目標へ近づくために、有機小分子においてFDCDをどのようにCDと差別化して活用できるか、FDCDをタンパク質に適用した場合に「立体構造のピンポイント解析法」としてどう確立するか、という課題を設定した。有機小分子に関する研究代表者らの実験から、励起子キラリティー系の単純な分子でもFDCDが透過光CDと異なる曲線を与える例が明らかになり、現在のFDCD理論はいくらかの修正が必要なことが示唆されている。また、基本分子の一つであるトリプトファン(Trp)のFDCDスペクトルも、透過光CDとは異なる曲線を与えた。現在はFDCD理論の修正点を明確にするため、量子化学計算により関連分子の電子遷移モーメントの詳細な解析を進めている。タンパク質の局所構造をピンポイント解析できる可能性は、研究代表者らの先行研究でもいくつかのタンパク質から示唆された。この可能性は前述のFDCD理論でも言及されているが、この理論は考察から導出されたもので、実験的にはまだ証明が不充分である。本研究では先行研究を受けて、内在性の蛍光アミノ酸残基であるトリプトファン(Trp)に着目し、Trp含有ペプチドによる系統的なライブラリーによりFDCDの解析を進めている。この中で、蛍光基周辺の局所構造をFDCDとしてどう定義するかが重要と考え、固相合成によって系統的に用意した様々なTrp含有オリゴペプチドのFDCDを解析した。現在までに、TrpのC末端側のペプチド鎖伸長によりFDCDは変化するが、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが示された。さらにペプチド鎖がFDCDに影響するのは、ペプチド結合部分に絞り込めることも分かった。タンパク質の新しい立体構造解析法の確立を目指す先行研究において、CDでは追跡しにくい三次構造の変性を本研究で注目するFDCDにより追跡できることが示唆されている。本年度はこれを受け、タンパク質内在性の蛍光性アミノ酸であるトリプトファン(Trp)に関連するFDCDスペクトルを解析した。長く知られるFDCD理論に基づき、有機小分子のFDCDは多少なりとも従来からある透過光CDの波形を反映するものと予想されたが、実際のTrpのFDCDスペクトルはCDとは異なる波形を示した。CDのピークは2つの近紫外吸収領域のうち215 nmで正のCotton効果を示すが、280 nmでは見られない。これをFDCDで観測すると215 nmではなく235 nmに正のピークが見られた。これは考察のみから導かれた既知のFDCD理論は修正が必要であることを示唆しており、現在は量子化学計算により、分子軌道の相互作用から実験結果を合理的に説明できるメカニズムを模索している。これと並行して、タンパク質の立体構造の変化を単純な実験系で再現すべく、系統的なTrp含有ペプチドを合成して編成したライブラリーのFDCDスペクトルを解析した。この結果、Trp含有タンパク質では、立体構造変化は235 nmに観測されるTrp由来の単一ピークの強度変化として集約されること、この変化はTrpのC末端側でのペプチド鎖伸長にのみ依存し、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが分かっている。この単一ピークへの集約を解くと同時に、上で述べた既知のFDCD理論を修正する道筋として、現在は蛍光ラベル化によりエネルギー移動を利用する方法の検討を開始した。

FDCDを構造解析に適用するにはスペクトル曲線の解釈が鍵となるが、現在知られているFDCD理論から予測されるのとは異なり、ある条件の下ではFDCDは透過光CDと異なる曲線を与える。本研究ではこのFDCDとCDの差異の正体と、この差異が観測される条件を明確に定義したい。このため、有機小分子では透過光CDの理論曲線と蛍光寿命の間に起こり得る励起状態の変化をFDCDと関連づけることを、タンパク質ではFDCDを「立体構造のピンポイント解析法」として確立することを、本研究の課題として設定した。有機小分子を使った実験で、励起子キラリティー系の単純な分子ですらFDCDが透過光CDと異なる曲線を与える例があることが分かった。さらに、タンパク質の部分構造でもあるトリプトファン(Trp)のFDCDスペクトルも、透過光CDとは異なる曲線を与えた。現在は既知FDCD理論の修正点を探るため、量子化学計算により関連分子の系統的な電子遷移モーメントの解析を進めている。タンパク質のFDCDについては、内在性の蛍光アミノ酸残基であるトリプトファン(Trp)に着目し、Trp含有ペプチドによる系統的なライブラリーによりFDCDの解析を進めている。この中で、蛍光基周辺の局所構造をFDCDとしてどう定義するかが重要と考え、固相合成によって系統的に用意した様々な長さと配列をもつTrp含有オリゴペプチドのFDCDを解析した。現在までに、TrpのC末端側のペプチド鎖伸長によりFDCDは変化するが、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが示された。さらにペプチド鎖がFDCDに影響するのは、ペプチド結合部分に絞り込めることも分かった。タンパク質の新しい立体構造解析法の確立を目指す先行研究において、CDでは追跡しにくい三次構造の変性をFDCDにより追跡できることが示唆されている。これを受けて昨年度までに、タンパク質内在性の蛍光性アミノ酸であるトリプトファン(Trp)および関連するオリゴペプチドのFDCDスペクトルを解析した。タンパク質を模した最も単純な実験系として、前年度までに、系統的なTrp含有ペプチドを合成して編成したライブラリーのFDCDスペクトルを解析した。その結果、Trp含有タンパク質のFDCDは、立体構造変化は235 nmに観測されるTrp由来の単一ピークの強度変化に集約されること、このFDCDの強度変化はTrpのC末端側でのペプチド鎖伸長にのみ依存し、N末端側のペプチド鎖は影響しないことが分かっている。この単一ピークへの集約を一般化して理解するため、現在までに量子化学計算によって既知のFDCD理論を修正する道筋を模索している。その一方、同一分子内に異なる蛍光基質を併せ持つ場合のFDCDを実験的に調べるため、蛍光ラベル化によりエネルギー移動(FRET)を利用する方法を検討している。FRETモデルの「物差し部」として剛直なオリゴプロリンを選択し、そのN末端にグリシン、C末端にシステインを特異的な連結基として導入したペプチドを設計し、プロリン残基数の異なる数種類のペプチドを固相合成により合成した。
新規リボソーム合成翻訳後修飾型ペプチドハイブリッド化合物の生合成研究

放線菌Streptomyces sp. TP-A0584のゲノム中に存在するリボソーム合成翻訳後修飾ペプチド(RiPPs)-ポリケタイドハイブリッド化合物生合成遺伝子クラスターの解析を行った。これまでに行われた異種発現実験により、予想されたハイブリッド型化合物が生産されることが示唆されていた。そこでこの生合成遺伝子クラスターの機能を解析するために、特にペプチド部分の構造解析と生合成機構解明に取り組んだ。コスミド上で複数の遺伝子を破壊し異種発現を行なったところ、ペプチド部分のみを蓄積する破壊株(Δorf14)を見出した。その破壊株の培養液から単離・精製した目的ペプチド化合物を、高分解能質量分析と各種NMR解析に供し、その構造を決定した。この分子中にはaminovinyl-cysteineとlanthionine構造が融合した新規構造が含まれていた。この新規構造の生合成機構を解明するために、無細胞翻訳系と組換え修飾酵素を組合せることで生合成経路の試験管内再構成を行なった。構築した系を用いて、組み換え修飾酵素の機能解析を行なったところ、2種類の修飾酵素が協働して機能することにより新規構造が形成されることが示され、生合成機構を解明することに成功した。また、ペプチド部分と脂肪酸・ポリケタイド部分を融合させる酵素に関しても解析を行なった。配列情報から、上述の実験で破壊した遺伝子(orf14)はペプチドのN末端にポリケタイドアシル鎖を転移させると予想された。そこでこの組換え酵素を調製し、結晶構造解析を行なった。その結果、再現性良く結晶が得られる条件を見出し、得られた結晶から3.5オングストロームの分解能の結晶構造を得ることに成功した。これら実験結果は新規ペプチド構造の創製や、ハイブリッド化によるペプチド化合物の構造多様性の拡大のための基盤となることが期待される。
薄片端面鏡固体レーザの非線形物理と応用技術に関する研究

半導体レーザ励起薄片固体レーザを用いた非線形物理および応用技術に関する研究により以下の主要成果を得た.1.LD励起薄片固体レーザにおけるパターン形成(1)薄片固体レーザにおける発振パターンへの反射面凹凸および励起ビーム径の影響を系統的に探求し、「量子ビリアードモード」、「複合格子モード」、「スペックルモード」など新奇発振パターンの形成を発見した.(2)市販の平均グレイン・サイズが数10ミクロン以上のセラミック・レーザにおける発振横モードの「局所モード」への分裂と局所モード光電界の干渉に基づく高速自己変調ならびにカオス発振を発見し、理論的に現象を再現した.(3)上記不安定現象を抑圧する手段として、(1)ビーム径がグレイン・サイズより十分大きなインス・ガウス型固有横モードでの発振、及び(2)平均グレイン・サイズが1μm程度の微粒セラミックの採用により安定な発振を実現した.(4)マイクロチップ固体レーザのインス・ガウスモードでの選択発振法を開発し、自作した回転制御型のモード変換により微粒子運動制御用の多様な新規光ボルテックスレーザ・ビームの生成を実現し、理論的に再現した.2.LD励起自己混合薄片固体レーザ計測技術(1)自己混合レーザ計測の主要素である周波数シフト光帰還系"の改善により、2桁程度、光感度を向上させた.(2)光感度の大幅な改善により、振幅1nmの微小振動の実時間計測、1ppm以下の極低濃度の水分散微粒子(粒径:80-500nm)の迅速粒径測定を達成した.自主開発したキャリア周波数多重光帰還方式により、1nm領域での実時間3点同時振動計測を実現した.また、自作のFM検波器を用いて、多重ブラウン粒子の重心運動を初めて観測した.(3)流体計測へ応用し、細管中の流体の流速・動粘度の迅速計測を達成した.また、流体中に混入した異物の高感度検出の実験を行い、粒径262nmのポリスチレン小球について0.01ppmの検出限界が得られた.半導体レーザ励起薄片固体レーザを用いた非線形物理および応用技術に関する研究により以下の主要成果を得た.1.LD励起薄片固体レーザにおけるパターン形成(1)薄片固体レーザにおける発振パターンへの反射面凹凸および励起ビーム径の影響を系統的に探求し、「量子ビリアードモード」、「複合格子モード」、「スペックルモード」など新奇発振パターンの形成を発見した.(2)市販の平均グレイン・サイズが数10ミクロン以上のセラミック・レーザにおける発振横モードの「局所モード」への分裂と局所モード光電界の干渉に基づく高速自己変調ならびにカオス発振を発見し、理論的に現象を再現した.(3)上記不安定現象を抑圧する手段として、(1)ビーム径がグレイン・サイズより十分大きなインス・ガウス型固有横モードでの発振、及び(2)平均グレイン・サイズが1μm程度の微粒セラミックの採用により安定な発振を実現した.(4)マイクロチップ固体レーザのインス・ガウスモードでの選択発振法を開発し、自作した回転制御型のモード変換により微粒子運動制御用の多様な新規光ボルテックスレーザ・ビームの生成を実現し、理論的に再現した.2.LD励起自己混合薄片固体レーザ計測技術(1)自己混合レーザ計測の主要素である周波数シフト光帰還系"の改善により、2桁程度、光感度を向上させた.(2)光感度の大幅な改善により、振幅1nmの微小振動の実時間計測、1ppm以下の極低濃度の水分散微粒子(粒径:80-500nm)の迅速粒径測定を達成した.自主開発したキャリア周波数多重光帰還方式により、1nm領域での実時間3点同時振動計測を実現した.また、自作のFM検波器を用いて、多重ブラウン粒子の重心運動を初めて観測した.(3)流体計測へ応用し、細管中の流体の流速・動粘度の迅速計測を達成した.また、流体中に混入した異物の高感度検出の実験を行い、粒径262nmのポリスチレン小球について0.01ppmの検出限界が得られた.レーザダイオード(LD)励起薄片固体レーザでのパターン形成と付随する非線形ダイナミクスおよび自己混合レーザ計測技術の高性能化を中心に研究を遂行した。主要な成果を述ぺる。1.LD励起薄片固体レーザにおけるパターン形成(1)共振器長に比べて大口径な断面を有するレーザでの発振パターンの形成を、LD励起ビームの大きさ及び形状をパラメータにして系統的に追求した。特に、レーザ結晶の熱レンズ効果と通常の光学研磨で反射端面に存在する凹凸の発振パターン形成へ及ぼす影響に着目した。その結果、結晶の熱伝導率の差異に直接起因する以下の知見を得た。LNPレーザ:強い熱レンズ効果による光閉じ込めが端面凹凸の影響を無力化し、近対称励起時において、ビーム径の増大に伴うEM_<20,7>までのヘルーミート・ガウス(HG)モード、線状励起時の量子ビリアードモードなとを検証した。Nd : GdVO_4

レーザ:熱伝導率がLNPより4倍大きい、この材料では、熱レンズ光閉じ込めが弱く、端面凹凸の影響が顕在化し、励起ビーム径の増大と共に、「局在モード」の複合体⇒「スペックルモード」での発振を発見した(業績3)。前者は、周波数の違う複数の局在モードが全体として、高次HGや非線形回転対称モードの擬似パターンを形成する。(2)大出力固体レーザとして注目を集めているNd : YAGセラミック・レーザの結晶粒界に起因する、発振パターンの「局在モード」への分裂とそれらの非線形相互作用に直接起因する動的不安定性を「結合局在モード・レーザモデル」によって解明した(業績1)。現在、局在モードを抑圧するアイディアを実験的に検証中である。2.LD励起自己混合薄片固体レーザ計測技術19年度に計画している、ブラウン運動の秘匿通信用暗号への応用実験へ向けて、自己混合レーザ計測装置の各構成素子の高度化を測った。市販のNd : GdVO_4結晶の薄片レーザとしての最適化、TeO_2結晶と水晶発振器より超高安定な光周波数シフターの構築を行い以下の特性を実現した。実時間振動計測:ビエゾマウントに装着した反射鏡をターゲットとした実験により、1nm振動の実時間計測を達成した。現在、キャリア周波数多重方式により、3点同時計測の実験を遂行中。粒子計測:水分散に分散した極微量ブラウン粒子の運動解析と粒径計測の光感度限界を追及し、粒径100500nmの領域で1ppm以下の濃度での迅速・精確な計測を達成した。262nm粒子で、0.05ppmの微量分析(市販装置の10倍以上の感度)を実現した(業績2)流体計測:迅速な流量・粘度の自己混合レーザ計測法、及び、流体中の極微量異物(0.01ppm)の検出法を構築した。1.LD励起薄片固体レーザにおけるパターン形成薄片マイクロチップ固体レーザでの発振パターンの形成を、LD励起ビームの集光条件を変化させ実験的に追求した。特に、通常の光学研磨で反射端面に存在する凹凸の発振パターン形成へ及ぼす影響およびセラミック・レーザにおけるグレインサイズのモード形成への影響を明らかにした。Nd:GdVO_4レーザ:端面凹凸の影響が顕在化し、励起ビーム径の増大と共に、表面凹凸の相関長に比べて大きな励起径において、前年度発見した「局在モード」の複合体から単一周波数「スペックル・モー・ド」への遷移を観測した。付随した動的効果として、直交偏光モード発振およびモード間の協働カオス同期現象を見出し、理論的に解明した。電子ビーム露光により加工した、周期的凹凸を有する反射端面を装着した薄片レーザでのパターン形成の実験に着手した。また、インス・ガウスモード群の単一周波数発振および新規光ボルテックスレーザビームの生成を達成した。セラミック・レーザ:大出力固体レーザとして注目を集めているNd:YAGセラミック・レーザの結晶粒界に起因する、発振パターンの「局在モード」への分裂をグレイン・サイズより十分大きな発振径を有するインス・ガウスモードの選択発振により抑圧した。また、グレイン・サイズが1ミクロン程度の微粒セラミックレーザでは、粒界での熱応力緩和により、熱複屈折効果が低減され、単一周波数・直線偏光TEM_<00>モード発振が起こることを初めて指摘した。2.LD励起自己混合薄片固体レーザ計測技術薄片Nd:GdVO_4レーザ、TeO_2結晶と水晶発振器より構築した超高安定な光周波数シフターを用いて、自己混合レーザ計測の高性能化を進め、以下の成果が得られた。実時間振動計測:自主開発したキャリア周波数多重方式により、1 nm振動の3点同時実時間計測を達成した。
心筋小胞体カルセクエストリン遺伝子の構造の解明

ウサギ骨格筋のアミノ酸配列はcDNA配列より決定され遺伝子構造も明らかにされ、またイヌとウサギの心筋CSに対してのcNAクローニングが報告されていることから我々は、ウサギ心筋ScDNAの翻訳領域と非翻訳領域を含むcDNA制限酵素断片P^<32>でラベルしプローブとしてλファージウサギ遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。次に制限地図とサザンプロッティンにより解析し遺伝子内のexonの分布を決定し、更にsubcloningしたDNA断片の塩基配列を決定し、exon・intoron境界を明らかにし、ウサギ心筋CS遺伝子であることも確認した。[結果]1、遺伝子ライブラリーをスクリーニングした結果、6個の異なるクローンを得た。その中で3個は遺伝子内exonの分布を決定した。一方、他の3個のクローンについてはライマ-を用いてexon・intoron境界を明らかにした。2、離された6個の相異なるゲノムDNAクローンがウサギ心筋CS遺伝子であることを確定することができた。3、心筋CS遺伝子のexonの分布は白筋CS遺伝子のexonの分布に近似していた。またexon2から10の大きさは白筋遺伝子と同じ大きさでった。[総括]心筋CS遺伝子のexonの分布及大きさは、白筋CS遺伝子と近似していた。今後この遺伝子のプロモーター領域と5'調節領域を詳細に分析し更には心筋において特異的に発現を配する遺伝子をクローニングし基礎的に詳細に分析すれば心筋にける遺伝子発現を支配する分子メカニズムの理解に役立つと思わ将来の臨床応用への道が開かれる。
『倭姫命世記』の本文・付訓に関する国語学的基礎研究

『倭姫命世記』の現存する諸本の数は、確認したわけではないが、200を超えて、優に300に達しようとしている。平成14年度、中村幸弘は國學院大學所蔵の諸本を調査し、善本と認められる六本を選定して、その付訓を調査報告した。翌年、遠藤和夫が引き継いで、山田正之写本の研究報告をした。最終年度になって神宮文庫の調査を許され、諸本中で、もっとも古い本は、神宮文庫所蔵にかかる「応永二十五年戌仲夏端午後一日書写畢、校点了」という奥書を有する巻子本であることが判明した。これは御神宝で今回の研究においては、一見に止めるしかなかった。流布本の元祖本は、度会延佳の書写した本であることもほぼ明らかにしえた。国語学の研究対象となる付訓資料を重視するところから、とりあえず、遠藤和夫架蔵の山田正之書写本を底本として國學院大學所蔵の岡田正利書写本・秦信元書写本・黒川文庫の「書入本」と「校本」・河野文庫の十種神宝図付載本・摂津堀川神社旧蔵本の六本の対行本をもって対照させた校本を作成した。また、『倭姫命世記』の典拠の一つに数えられる『古語拾遺』の注釈書を刊行し、今後の研究資料として、普通行われている訓読本文を対照した校本を作成した。その異体字が多くてその処理に手間取り、度会延佳書写本の本文翻刻公開はこの成果報告書からは割愛せざるをえなかった。本研究が平成14年度科学研究費補助金の採用を受けるに先立って、研究代表者中村は、「『倭姫命世記』の付訓-語法・敬語表現編-」(國學院大學大学院文学部研究科創立五十周年記念論文集)「『倭姫命世記』の付訓-同字異訓語・字音語・文選読み・訛語・誤読語・神社祭祀関係用語編-」(國學院大學大學院紀要-文学研究科-第三十三輯)の二編の論文を発表してある。その付訓の徹底した整理には、可能なかぎりの諸写本の校本作成が必須作業となる。國學院大學図書館蔵の写本二十一本のうち六本を選定、その訓みの異同が一覧できるよう、各本の本文・付訓のコピーの貼り込みを行い、校本化を進めている。一方、付訓を取り入れた活字本『中世神道集』所収『倭姫命世記』(大隈和雄氏)と唯一の活字本注釈書『倭姫命世記注釈』(和田嘉寿男氏)との対校を試み、独自の訓読文を作成、現在、その訓読文に従って現代語訳を進行させている。また、その現代語訳に併せて、語義・語法の解説も加えて、かつてない読解研究となりうる方向で執筆を始めている。研究分担者としての遠藤は、中村の現代語訳を追いかける形で、『日本書紀』『古語拾遺』『延喜式祝詞』など、本文の引用関係文献について確認、いわゆる典拠の整理を進めている。いま一人の研究分担者阪本は、神道学の立場から、中村・遠藤に、随時、助言を与えてくれている。研究代表者中村幸弘は、平成14年度に行った『倭姫命世記』の五種の写本の翻刻を整理した結果を踏まえて、『倭姫命世記』の本文校訂作業を進展させた。また、現在唯一の活字化された注釈書たる、和田嘉寿男氏の『倭姫命世記注釈』の訓読文を参考にしながら、より適正な読み下し文を模索して、その本文の作成を進行させた。これと併行して、来るべき最終報告書の資にすべく、『倭姫命世記』の本文著作の依拠資料の一つと考えられる『古語拾遺』の注釈書「『古語拾遺』を読む」を刊行して、その注釈の正否を世に問うた。

研究分担者のひとり、遠藤和夫は、『倭姫命世記』の本文校訂作業を通じて、遠藤の所持本(山田正之写本)と、國學院大學図書館所蔵河野文庫本(番号273)とを比較して得られた結果、<山田正之写本は当該河野文庫本より素性が良く、河野文庫本は、岡田正利がその師跡部良顕の跋文に基づいて改作した可能性の強い本である>ことを『國學院大學大学院紀要-文学研究科-』第35輯に発表した。そして山田正之写本の訓読など国語学的事項についての報告は、「國學院雑誌」7月号に掲載予定で、準備中であるが、その結果は最終報告量たる『倭姫命世記』の注釈作業の中に生かすことを予定している。さらにもうひとりの研究分担者、阪本是丸は、常に詳密な神社等に関する知識をもって注釈作業の相談に与かり、倭姫命を祀る神社である伊勢の皇大神宮の別宮である倭姫宮の創建の経緯や近代以降における倭姫命に関する神道学及び歴史学の研究成果等の知識を提供するとともに、神宮文庫や関係神社などとの連絡を取り、当該研究の進展に寄与している。昨年までは、主として國學院大學付属図書館所蔵の『倭姫命世記』の写本、あるいは複製本・新規購入の江戸期の写本の調査に終始していたが、其の訓点の拠り所の確実性が捕らえ切れず、苦悩していた。今年度は、力強いアドバイスと応援・紹介者を得て、『倭姫命世記』の伝本の一番の基となっていると思われる神宮文庫に所蔵されている諸本(行方不明になっている二本を除いて)すべてを調査して、其の大元と推せられるものを確定できた。すなわち、(1)諸本の原本は、「応永廿五年仲夏端午後一日」に書写された巻子本であって、神宮文庫の宝物と称すべきものであることが判明した。この本は時間の関係上、本研究での詳細な調査は断念せざるを得なかったが、朱書・訂正・付訓など、日を改めて詳しく調査し、別途、研究を公にしたいと目論んでいる。(2)通行の本は、「寛文九年九月一日」度会延佳校訂のほぼ前文に付訓を施した本から出ていると思しく、大多数の諸本がこれにしたがっている。我々の研究グループは、此の本文を基にして、報告書を兼ねて、近く注釈書を刊行する計画である。更に『国書総目録』によれば、「寛文元年」の写本が、京都北野神社に所蔵されていることになっているが、今回の踏査でそれは「九」を「元」と誤読していたことも判明した。(3)神宮文庫には御巫清直筆の写本が存し、其の本には出典などが記入されていて、それらは注釈に大いに参考になることが判明した。現段階で最も信頼できる本文の制定が可能になり、近くそれを実現し、読解・語法・語彙注解・索引の研究を公刊することが期待できるようになった。以上、簡単ながら概要を記した。詳しくは、別途刊行の注釈書に譲る。
新規ナフトキノン構築法および分子内二量化を鍵とするロマイビチシン合成戦略の開発

がんが人類の最大の死因になって久しく、抗がん作用を示す新規創薬候補化合物の創出は急務である。申請者は、天然より単離された二量化体ロマイビチシンAが、詳細な作用機序はいまだ不明ながら抗がん作用を有することに着目し、本化合物が創薬シード化合物として有用であると考えた。しかし、天然より単離可能な量は限られている。加えて、構造活性相関研究による作用機序解明と、より強力な活性を有する非天然類縁化合物の創出を狙うと、遺伝工学的手法により創出可能な誘導体群の化学構造多様性は限られる。そこで私は、化学構造多様性を有する誘導体群の統一的化学合成への展開を見据えた、本天然物の量的供給可能な全合成法を確立する。
ＢＲＡＰ、ＴＬＲ４、ＡＰＯＢ遺伝子多型の生活習慣病罹患リスクに関する縦断研究評価

本研究では、日本の一般人において縦断調査を行い、BRCA1-関連蛋白(BRAP)遺伝子、Toll様受容体4遺伝子、アポリポタンパク質B遺伝子の多型の、生活習慣病の発症との関連を明らかにし、予防医学的に評価することを目的とした。生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などの発症や、検査結果の経年変化について検討を進め、BRAP遺伝子のrs11066001多型が、糖尿病発症や、HbA1cの上昇について、有意に関連していることが明らかとなった。BRCAI-関連蛋白(BRAP)の遺伝子多型は、心筋梗塞患者での疫学調査により見出され、冠動脈の炎症が、その機序として指摘されている。また、Toll様受容体4(TLR4)については、炎症反応におけるサイトカイン誘導を介する動脈硬化に関連するとされ、心筋梗塞や心筋梗塞後の心不全との関連が報告され、近年ではメタボリック症候群、耐糖能異常、脂質代謝異常にも関連が報告されている。アポリポタンパク質B(APOB)遺伝子についても、高コレステロール血症との関連が報告されており、注目を集めている。しかしながら、日本人における調査はほとんどなく、縦断的な検討もなされていない。そこで、本研究では、日本の一般人において大規模かつ長期間にわたる縦断調査を行い、これらの遺伝子の、生活習慣病の発症との関連を明らかにし、生活習慣や、すでに測定した遺伝子多型との影響を比較し、さらに、遺伝子同士の組み合わせによる相互作用を予防医学的に評価することを目的とした。本年度は、BRAP(rs11066001)の測定の一部が終了した。結果として、男性TT型81人(59.1%)、CT型43人(31.4%)、CC型23人(9.5%)、女性TT型91人(62.3%)、CT型45人(30.8%)、CC型10人(6.8%)であった。Hardy-Weinberg Equilibriumについて検討したところ、男性ではp=0.06、女性でp=0.23であり、平衡に矛盾しない結果であった。現在さらに分析を計測して終了させるとともに、生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などについて横断的に関連性の検討を進めている。BRCA1-関連蛋白(BRAP)の遺伝子多型は、心筋梗塞患者での疫学調査により見出され、冠動脈の炎症が、その機序として指摘されている。本年度は、TLR4 (rs76014534, rs200276033, rs4986790, rs148638298, rs4986791)の測定の一部が終了した。結果として、男性50人、女性44人の測定をしたが、全員がそれぞれ、AA型(rs76014534)、GG型(rs200276033)、AA型(rs4986790)、CC型(rs148638298)、CC型(rs4986791)で多型性は現時点では認められなかった。今後は、さらに分析を計測して終了させるとともに、APOB遺伝子についても測定を進め、昨年測定したBRAP遺伝子の結果をあわせ、生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などについて横断的、さらに縦断的にも関連性の検討を進めている。本年度は、BRAP(rs11066001)の測定が終了し、s111800925、s77447086、rs74325447、rsなしの新規遺伝子多型、rs80154506についても終了した。

結果として、rs11066001については、男性では、CC型88人(6.0%)、TC型457人(31.4%)、TT型911人(62.6%)、女性では、CC型53人(4.5%)、TC型384人(32.3%)、TT型752人(63.2%)であった。rs111800925については、男性では、GG型1456人(100.0%)、女性では、GG型1189人(100.0%)であった。rs77447086については、男性では、CC型1456人(100.0%)、女性では、CC型1189人(100.0%)であった。rs74325447については、男性では、AA型1456人(100.0%)、女性では、AA型1189人(100.0%)であった。rsなしの新規遺伝子多型については、男性では、AA型1453人(99.8%)、AC型3人(0.2%)女性では、AA型1189人(100.0%)であった。rs80154506については、男性では、AAの削除なし1456人(100.0%)、女性では、AAの削除なし1189人(100.0%)であった。現在、5年間の縦断データと測定結果を結合し、生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などの発症について検討を進め、rs11066001のCC型でTT型に比し糖尿病発症のリスクが3.8倍高いことを見いだした。平成23年度は測定対象の遺伝子多型の測定順序の変更は行ったが、遺伝子多型の測定を主として実施しており、測定そのものについては特に問題などは生じていないため。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、BRAPの遺伝子多型として、メインのrs11066001の他、rs111800925、rs77447086、rs74325447、rsなしの新規遺伝子多型、rs80154506について、2600を超える検体の測定を終了している。さらに5年間の追跡データと結合し、高血圧、糖尿病、高脂血症などの新規発症との関連の調査をおおむね終了したため。TLR4、APOBの遺伝子多型について、順次測定を進めていくとともに、それぞれの遺伝子多型とその組み合わせについて、生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などについて横断的、縦断的に関速性を検討していく方針である。TLR4、APOBの遺伝子多型について、さらに順次測定を進めていくとともに、それぞれの遺伝子多型とその組み合わせについて、生活習慣との交互作用を含めて、高血圧、糖尿病、肥満、高脂血症、高尿酸血症、高γGTP血症などについて横断的、縦断的に関連性を検討していく方針である。
持久的トレーニングが摂食後の血中消化ホルモン変動に及ぼす影響

Wistar系雄性ラットを用いて、食刺激後の血液中の消化ホルモン変動と膵組織中の消化酸素であるアミラーゼ,リパーゼの活性値変動との関連について,持久的トレーニングの有無で比較検討して以下の結果を得た.1.体重,ヒラメ筋重量の食刺激前値は両群間に有意な差が認められ,持久的なトレーニング効果が得られていた.2.血中グルコースは実験食投与60分後に最高値を示す血糖曲線が得られ,両群間に差は認められなかった.3.血中インスリンはグルコース変動とほぼ同様の変動を示したが,コントロール群では,実験食投与90分後に最高値を示した.4.血中ガストリンはコントロール群ではグルコースと同様の変化を示したが,トレーニング群ではコントロール群に比較して投与後の増加が小さかった.5.血中セクレチンは両群とも投与後30分に最高値を示し,ガストリン同様トレーニング群ではコントロール群に比較して投与後の増加が小さかった.6.膵アミラーゼ活性値は,コントロール群では食刺激後に一旦増加し,その後減少傾向を示して陰性相が出現し,90分後に最小値を示した後,投与前値に回復した.トレーニング群では刺激後の増加は認められず,60分後に最小値を示した後回復する変化であった.7.膵リパーゼ活性値は,アミラーゼ活性値とほぼ同様の変動を示したが,コントロール群の最小値は刺激180分後で,トレーニング群のそれは60分後であった.以上の結果から,持久的トレーニングによって食刺激に対して膵消化酵素活性値変動の早い応答が得られ,消化ホルモン変動幅が小さく,ホルモン刺激による消化器系臓器の感受性が増大している可能性が示唆された.従って,持久的トレーニングにより,消化機能は亢進するのではないかと考えられる.Wistar系雄性ラットを用いて、食刺激後の血液中の消化ホルモン変動と膵組織中の消化酸素であるアミラーゼ,リパーゼの活性値変動との関連について,持久的トレーニングの有無で比較検討して以下の結果を得た.1.体重,ヒラメ筋重量の食刺激前値は両群間に有意な差が認められ,持久的なトレーニング効果が得られていた.2.血中グルコースは実験食投与60分後に最高値を示す血糖曲線が得られ,両群間に差は認められなかった.3.血中インスリンはグルコース変動とほぼ同様の変動を示したが,コントロール群では,実験食投与90分後に最高値を示した.4.血中ガストリンはコントロール群ではグルコースと同様の変化を示したが,トレーニング群ではコントロール群に比較して投与後の増加が小さかった.5.血中セクレチンは両群とも投与後30分に最高値を示し,ガストリン同様トレーニング群ではコントロール群に比較して投与後の増加が小さかった.6.膵アミラーゼ活性値は,コントロール群では食刺激後に一旦増加し,その後減少傾向を示して陰性相が出現し,90分後に最小値を示した後,投与前値に回復した.トレーニング群では刺激後の増加は認められず,60分後に最小値を示した後回復する変化であった.7.膵リパーゼ活性値は,アミラーゼ活性値とほぼ同様の変動を示したが,コントロール群の最小値は刺激180分後で,トレーニング群のそれは60分後であった.以上の結果から,持久的トレーニングによって食刺激に対して膵消化酵素活性値変動の早い応答が得られ,消化ホルモン変動幅が小さく,ホルモン刺激による消化器系臓器の感受性が増大している可能性が示唆された.従って,持久的トレーニングにより,消化機能は亢進するのではないかと考えられる.
骨軟部悪性腫瘍における癌遺伝子に関する研究

当教室において、両側性網膜芽腫治癒後に骨肉腫を発症した例、いわゆるsecond primary osteosarcomaの症例で、体細胞(線維芽細胞)、網膜芽腫パラフィン包埋組織及び、骨肉腫組織より樹立した骨肉腫細胞株(OSrb/N-M)の、網膜芽腫遺伝子(Rb遺伝子)、p53遺伝子の変異に関してDNA、mRNA、蛋白のそれぞれのレベルでの検討をするべくサザン、ノザン、ウェスタン・ブロット分析を行った。その結果、Rb遺伝子は、網膜芽腫では一部欠失又は、遺伝子変換により、また骨肉腫では正常alleleの喪失と変異alleleの重複により、それぞれ不活化されていた。そして、p53遺伝子については、網膜芽腫では異常が検出されなかったのに対して、骨肉腫では、一方のalleleの一部が欠失し、他方のalleleではエクソン8でミスセンス変異(コドン281:GAC→TAC、Asp→Tyr)が起こって、不活化されていた。更に、網膜芽腫の既往のない骨肉腫患者より樹立された4種の骨肉腫細胞株でも、同様の検討を行った。4例ともRb遺伝子の異常は認めなかった。しかるに、p53遺伝子は、全例でOSrb/N-Mとは異なり、エクソン5において、同じ点突然変異(コドン156:CGC→CCC、Arg→Pro)が検出され、更にノザン分析、ウェスタン分析で、p53mRNA、p53蛋白のメッセージのシグナルは正常コントロールに比較して、それぞれ過剰に発現されていた。以上の結果は、骨肉腫発症には、Rb遺伝子よりもp53遺伝子の関与の方が重要であることを示唆するものと考えられた。更に、骨肉腫におけるp53遺伝子変異も、構造異常ではなく、他の癌腫で認められる微少変異(ミスセンス変異)によることが多く、また、骨肉腫に比較的特異的な、変異の起こり易い部位の存在することを示唆するものと思われる。そして、ミスセンス変異による変異p53蛋白の過剰発現は、必ずしもstabilityの増加ではなく、転写レベルの亢進による可能性があることも示唆された。当教室において、両側性網膜芽細胞腫に続発した骨肉腫例、いわゆるsecond primary osteosarcomaの症例を経験し、腫瘍摘出時に正常線維芽細胞株並びに骨肉腫細胞株(OSrb/N-M)を樹立することができた。second primary osteosarcoma例の細胞株は世界的にみても2例目と極めて貴重なものと考えられ、この細胞株のcharacterizationを行っている。Rb遺伝子変異については、サザンブロット解析及びPCR-RFLPにて、異常な側の(first hitを受けた)Rb遺伝子の重複並びに正常側のRb遺伝子の喪失、もしくは遺伝子転換、即ち、腫瘍細胞ではfirst hitを受けたRb遺伝子のisodisomyが起こり、結果としてRb遺伝子の不活化そして発癌が起こったものと解釈された。また、初代凍結保存細胞をin vitroで培養後、limited dilution法にて複数のクローンを得て、PCRによる結果がそれぞれのクローンで再現されており、全てのクローンで同じ変異が起こっていることを明らかとした。同一患者のパラフィン包埋網膜芽細胞腫標本よりDNAを抽出し、これを鋳型とする同様なPCRによる分析の結果、骨肉腫細胞と異なるLOHが起こっており、網膜芽細胞では変異Rb遺伝子内に更に点突然変異が加わり、その後、この領域を含むRb遺伝子の一部で分裂組換えが起こったものと考えられた。

即ち、これら二つの腫瘍の発癌過程では、Rb遺伝子に異なったsecond hitが加わったことを示唆する結果を同一患者で初めて得ることができ、研究発表を行った。Rb遺伝子とともに癌抑制遺伝子として知られるp53遺伝子について、蛋白発現を調べるためWestern blottingを行ったところ、OSrb/N-Mのp53に過剰発現がみられた。蛋白の過剰発現がみられる場合、point mutationの存在することが多くあることより、p53遺伝子において、point mutationの多発することが知られているexon49についてPCR-SSCPを行ったところ、OSrb/N-Mのexon8に異常バンドを検出した。そこで、この領域のsequecingを行ったところ、codon281のGACがTACとなるpoint mutationを発見した。今後は、更にサザンブロット、ノーザンブロットによる検討を加える予定である。当教室において、両側性網膜芽腫治癒後に骨肉腫を発症した例、いわゆるsecond primary osteosarcomaの症例で、体細胞(線維芽細胞)、網膜芽腫パラフィン包埋組織及び、骨肉腫組織より樹立した骨肉腫細胞株(OSrb/N-M)の、網膜芽腫遺伝子(Rb遺伝子)、p53遺伝子の変異に関してDNA、mRNA、蛋白のそれぞれのレベルでの検討をするべくサザン、ノザン、ウェスタン・ブロット分析を行った。その結果、Rb遺伝子は、網膜芽腫では一部欠失又は、遺伝子変換により、また骨肉腫では正常alleleの喪失と変異alleleの重複により、それぞれ不活化されていた。そして、p53遺伝子については、網膜芽腫では異常が検出されなかったのに対して、骨肉腫では、一方のalleleの一部が欠失し、他方のalleleではエクソン8でミスセンス変異(コドン281:GAC→TAC、Asp→Try)が起こって、不活化されていた。更に、網膜芽腫の既往のない骨肉腫患者より樹立された4種の骨肉腫細胞株でも、同様の検討を行った。4例ともRb遺伝子の異常は認めなかった。しかるに、p53遺伝子は、全例でOSrb/N-Mとは異なり、エクソン5において、同じ点突然変異(コドン156:CGC→CCC、Arg→Pro)が検出され、更にノザン分析、ウェスタン分析で、p53mRNA、p53蛋白のメッセージのシグナルは正常コントロールに比較して、それぞれ過剰に発現されていた。以上の結果は、骨肉腫発症には、Rb遺伝子よりもp53遺伝子の関与の方が重要であることを示唆するものと考えられた。更に、骨肉腫におけるp53遺伝子変異も、構造異常ではなく、他の癌腫で認められる微小変異(ミスセンス変異)によることが多く、また、骨肉腫に比較的特異的な、変異の起こり易い部位の存在することを示唆するものと思われる。そして、ミスセンス変異による変異p53蛋白の過剰発現は、必ずしもstabilityの増加ではなく、転写レベルの亢進による可能性があることも示唆された。
テネイシンCの軟骨変性抑制作用における遺伝子発現の解析

われわれは、関節軟骨の変性を抑制する新しい治療法として、テネイシンC(TNC)に着目しており、これまでin vivoにおいて、変形性膝関節症モデルマウスの膝関節内にTNCを投与することで軟骨変性抑制効果が得られたことを報告した。今回、in vitroにおいて、ヒト軟骨の培養細胞を用いTNCを添加しreal time PCRを行ったところ、TNCを添加しない群に比べ、TNC、炎症性サイトカインであるTNFα、IL-1β軟骨基質代謝におけるanabolic factorであるTGFβ、TIMP3が有意に上昇し、軟骨破壊に関わるとされるADAMTS5は有意に発現が低下することが分かった。関節軟骨は自己修復能がほとんどないため、変性軟骨に対する治療法はいまだに確立されたものがなく、整形外科領域において早急に解決されるべき課題のひとつである。われわれは、関節軟骨の変性を抑制する新しい治療法として、マトリックス細胞タンパクの一つであるテネイシンC(TNC)に着目しており、in vivoにおいて、マウスの前十字靭帯・内側側副靭帯を切離した変形性膝関節症モデルを用いた研究で、TNC 10μg/mlを関節内に投与することで良好な軟骨変性抑制効果が得られたことを報告した。今回、in vitroにおいて、ヒト軟骨の培養細胞を用い、外因性のTNC(10 μg/ml)を添加することにより、サイトカイン、Growth Factor、軟骨基質分解酵素などの発現を、real time PCRを行い検討した。結果、培養軟骨細胞にTNCを添加することにより、TNCがアップレギュレートすることが分かった。また、TNCをアップレギュレートすると報告されているTNF-α、IL-1βもTNCの添加によりアップレギュレートした。また、軟骨基質代謝におけるanabolic factorであるbFGF、TGFβが有意に上昇した。また、TIMP3はアップレギュレートしたが、catabolic factorであるADAMTS4、MMP3はTNCを添加しても上昇しないことが分かった。われわれは、関節軟骨の変性を抑制する新しい治療法として、細胞外基質糖タンパクのひとつであるテネイシンC(TNC)に着目しており、これまでin vivoにおいて、マウスの前十字靭帯・内側側副靭帯を切離した変形性膝関節症モデルを用いた研究で、full-lengthのTNC10μg/mlを関節内に投与することで軟骨変性抑制効果が得られたことを報告した。今回、in vitroにおいて、ヒト軟骨の培養細胞を用い、full-lengthのTNCを添加することによる、サイトカイン、Growth Factor、軟骨基質分解酵素などの発現を、real time PCRを行い検討した。結果、培養軟骨細胞にTNCを添加することにより、内因性TNCの発現が増加することが分かった。TNCをアップレギュレートすると報告されているTNFα、IL-1β、NFκBもTNCの添加により発現が増加した。また、軟骨基質代謝におけるanabolic factorであるTGFβ、TIMP3が有意に上昇し、軟骨破壊に強く関わるとされるADAMTS5は有意に発現が低下した。研究計画書であげた平成26年度の計画に従い、Real time PCRによる定量的解析を行うことができた。整形外科平成26年度の検討の結果から、培養軟骨細胞にTNCを添加することにより、TNC、TNF-α、IL-1β、bFGF、TGFβ、TIMP3が有意に上昇することが分かった。平成27年度は、平成26年度の計画を継続・発展させ、ヒト軟骨細胞に対するTNCの効果を調べるために、PCRアレイの手法を用いて、TNC添加により変化する遺伝子を見出す。また、in vivoにおける、TNCの変性抑制効果を調べるために、マウス変形性膝関節症モデルを作製し、TNC投与群とコントロール群それぞれリアルタイムPCR、PCRアレイの手法を用いて、TNC投与による変化する遺伝子を見出すことを計画している。
アスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼの反応機構

大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)はその活性部位に補酵素ピリドキサ-ルリン酸(PLP)を持ち,アスパラギン酸のアミノ基をPLPに渡しピリドキサミンリン酸とオキザロ酢酸を生成する反応を触媒する。AspATおよびその変異型酵素のX線結晶解析を行ない,酵素化学的,遺伝子操作法による研究を参考にして,この酵素の反応機構を解析した。AspATおよび基質アナログとの複合体の結晶を作り,放射光を用いて回析デ-タを収集した。その結果この2つの構造を1.8A^^°の高分解能で決定できた。AspATは基質取り込みに際し,分子全体が大きなコンホメ-ション変化を起こしていた。活性部位の構造の詳細な解析の結果,基質特異性および反応の立体特異性がどのようにして達成されているかを明らかにした。基質取り込み時のコンホメ-ション変化は,基質結合時の数多くの水分子の放出によるエントロピ-の増加が駆動力になって起こると考えられる。触媒反応で重要な役割をする活性部位のアミノ酸残基は,他のアミノ酸で置換すると活性が著しく低下する。この重要な残基の役割を明らかにするために,他のアミノ酸で置換した変異型酵素のX線結晶解析を行なった。Y70Fの全体構造は野生型と同じであり,F70のベンゼン環の位置はY70と同じ位置にあった。活性部位にC_5基質をモデルフィッテイングすることにより,ベンゼン環はC_5基質の認識に関与している可能性が示された。Y70Wでは活性部位の基質アナログが結合していたがPLPとシッフ塩基を作っていなかった。これはミハエリス錯体が補捉できたことを意味する。R292Vの全体構造は野生型と同じである。驚くべきことに292番の電荷の消失にもかかわらず,V292の側鎖はR292のと同じ位置にあった。Y225Fの構造解析から,Y225の水酸基のPLPとの水素結合が反応に重要であることがわかった。大腸菌アスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼ(AspAT)および2ーメチルアスパラギン酸との複合体の高次構造をX線結晶解析法により高分解能(1、8A^^゚)で決定した。各結晶のX線回折デ-タは高エネルギ-物理学研究所放射光実験施設において収集した。回折デ-タはIP(イメ-ジングプレ-ト)に記録されるが,このIPデ-タの処理プログラムWEISを本大学計算センタ-で使えるようにした。WEISで処理した反射デ-タを用いて,プログラムXPLORとTOMーFRODOによりタンパク構造の精密化と再修正を繰り返した。その結果信頼度因子RはAspATとAspAT・2ーメチルアスパラギン酸に対しともに0.22に下がった。AspATは2個のサブユニットからなるα_2ダイマ-であり,サブユニットと小ドメインと大ドメインに分けられる。高等動物AspATに見られる基質取り込みに際しての大きなコンホメ-ション変化が大腸菌の場合にも見られた。この動きは小ドメインが活性部位を閉じる様に大ドメイン方向に約5゚回転することによるものである。活性部位の重要なアミノ酸残基の空間配置は高等動物と大腸菌の間でよく保存されていた。

基質類似体である2ーメチルアスパラギン酸が結合すると活性部位から4個の水が追い出され,2ーメチルアスパラギン酸のの2個のカルボキシル基はアルギニント塩橋を形成する。この水分子の放出と塩橋の形成による電荷の打消しが大きなコンホメ-ション変化の主な理由と考えられる。AspATおよびAspAT・2ーメチルアスパラギン酸の高分解能での構造決定は基準座標が得られた事を意味し,反応機構の解明にとって重要な意味を持つ。活性部位の重要な残基Y70を下でまたY225を下で置換した人工変異体のX線結晶解析を行なって,分光デ-タと共にこれらの残基の役割の解明を行なった。大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(Asp AT)はその活性部位にピリドキサ-ルリン酸(PLP)を補酵素として持つ,PLP依存型酵素の一つであり,アスパラギン酸のアミノ基をPLPに渡して,オキザロ酢酸を生成する酵素である。活性部位のPLPの回りにあって,触媒反応において重要な役割をになっているTyr70,Tyr225およびArg292を他のアミノ酸で置換した変異型酵素Y70F,Y70W,Y225FおよびR292VのX線結晶構造解析を行なった。デ-タは4軸型自動回折計または高エネルギ-物理研究所放射光を用いて収集した。構造の精密化は分子動力学,分子力学,X線デ-タの3つを併用して行なった。Y70Fは野生型にくらべ15%の活性を持っている。Y70Fの全体構造は野生型と同じであり,F70のベンゼン環は野生型のY70のベンゼン環と同じ位置にあった。モデルフィッテングでC_5基質はベンゼン環と相互作用しており,C_5基質を認識している可能性が示された。Y70Wは基質アナログを加えて結晶化した。構造解析の結果,基質アナログは活性部位にあるが,野生型と違ってPLPとシッフ塩基を作っていなかった。これはW70がかさ高く,立体的な障害によるものと考えられる。R292Vは基質であるアスパラギン酸に対する活性はよくなるが芳香族アミノ酸に対する活性が増大する。X線解析の結果全体構造は野生型と同じであり,おどろきべきことに292番の電荷の消失にもかかわらずV292の側鎖は野生型のR292の側鎖と同じ位置にあった。Y225Fの活性は野生型の0.3%である。結晶解析の結果は活性の大きな低下にもかかわらず構造変化がほとんどなかった。結局野生型のY225のOHとPLPの水素結合が無くなることによるPLPのピリジン環とシッフ塩基の共役系の電子状態の変化が原因と考えられる。