hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体神経細胞膜の機能についてのメゾスコピックな解析および合成に関する基礎的研究

近年、実験生理学の分野ではオプティカル・レコーディングやアレイ化された微小電極をはじめとする、高空間分解能、高時間分解能で、また観測領域がある程度広い(したがって観測される細胞数や細胞膜の有効面積単位数が大きい、多チャンネルの)高度な計測技術が急速な進展を見せ、数々の興味深い事実が明らかにされつつある。たとえば、1つひとつの神経信号パルスの(回路間の)相互の同期や反同期の発見、能動的な樹状突起の発見とそこを逆行するパルスの存在、などである。これらの現象を解明するためには、微小電極による膜電位計測に代表される微視的な実験生理学研究と、「機能」のみに着目しがちで巨視的である人工的なニューラルネットワークの研究との橋渡しをするような分野、いわばメゾスコピックな(微視的と巨視的の中間の)ニューラルネットワーク研究分野を切り拓く必要がある。本研究の目的は、申請者らが1996年に提案した2次元のHodgkin′-Huxley方程式を研究の中心的手段として、生体神経細胞膜の機能のメゾスコピックな解析および合成の基礎を築き、それによって上述のような新たなニューラルネットワーク研究の1分野を切り拓く契機を作ろうとすることにある。本研究によって、神経細胞膜の生理物理的性質と情報処理機構との関係を記述する最も基本的な理論的枠組みを構築した。細胞膜を表現するための生理物理的な性質には、細胞の形状の他に、神経細胞膜の単位面積あたりの膜抵抗、膜容量、神経細胞膜の表面内部の物質の抵抗率、等価膜厚、各種イオンチャンネルの面密度、などの空間的に分布したパラメータが存在する。これらパラメータを観測点の(位置の)関数とし、2次元Hodgkin-Huxley方程式によってより精密に電位の振る舞いを記述する方法を確立した。また、単純な形を持ちある程度同じ傾向を有するような膜の各部分をグループ化して構造化し、各種細胞の機能の全体を見渡すことができる枠組みを構築した。今後、生理実験との詳しい対照や電流の評価などの、次段階の研究を進めてゆきたいと考えている。
レセプタ-抗体を用いた甲状腺ホルモン核レセプタ-の分析に関する研究

癌原遺伝子c-erbAがT_3レセプタ-(NT_3R)をコ-ドしいることから、合成c-erbAペプチドをもとにNT_3Rを特異的に認識するポリクロ-ナル抗体を作成した。この抗体は、(1)臓器差、種族差なくNT_3Rを免疫沈降し、T_3とNT_3Rの結合を阻害し、(2)NT_3R以外のT_3結合蛋白とは反応せず、(3)c-erbAα_1及びβのin vitro転写翻訳産物を免疫沈降した。本抗体を用いてラット諸臓器のNT_3R蛋白の分布を、免疫組織染色法(蛍光抗体間接法)で検討し以下の成績を得た。(1)抗体によって特異的に染色されるNT_3R蛋白は、種々の臓器において細胞核に限局して存在した。(2)大脳皮質のニュ-ロン細胞、小脳の顆粒層神経細胞、下垂体前葉細胞、甲状腺瀘胞細胞で特に核の染色性が強陽性であった。一方肝、精巣、脾は核の染色度は弱かった。この結果は、ノザン分析で求められた各臓器のc-erbAα_1及びβ-mRNA量とほぼ平行すると考えられた。(3)NT_3R分布は臓器により一様ではなく、腎では糸球体、遠位尿細管細胞が、また精巣では精母細胞、精子頭部に限局して検出された。従ってこれらの臓器におけるT_3作用に関しては、更に細かい検討が必要である。ポリクロ-ナル抗体の作成に用いたc-erbAペプチドを使ってマウスに免疫し、モノクロ-ナル抗体の作成を行って、三種類のクロ-ンを確立した。またc-erbAα_1、α_2、βに特異的なペプチドを合成し、α_2に対し特異的なポリクロ-ナル抗体を、βに対するモノクロ-ナル抗体を作成出来た。α_1に対するモノクロ-ナル抗体は、現在クロ-ニング中である。以上よりc-erbAα_1+β共通抗体、β特異抗体、α_2特異抗体が得られたことになり、免疫組織化学的検討の他、ウエスタンブロッティング法、サンドイッチ法による定量的検討を開始している。
泥火山・マッドダイアピルが引き起こす地盤災害のメカニズムとその対策

新潟県十日町市,和歌山県田辺市および台湾に分布ずる現世および地質時代の泥火山・マッドダイアピルを対象として現地調査および不運出物の室内分析を行い以下の結果を得た。さらに,ダイアピルの上昇定置に関するアナログ実験を行い,透水性や岩石物性などのパラメータの違いにより様々な上昇形態をとることを明らかとした。(1)新潟県松代町において本州では初めて2つの活動的泥火山、1つの非活動的泥火山を記載し、泥火山の三次元的内部構造を明らかとした(新谷・田中・宮田、応用地質学会、2003.10;自然災害科学、投稿中)。(2)CSAMT法、高密度電気探査法により、わが国では初めて陸上の泥火山の地下数100mに直径約1kmの低比抵抗帯を見出し、カルデラ構造に類似した陥没構造の壁面に沿い地表部へとリング状に連続すること、鍋立山トンネルはこの低比抵抗帯中を掘削したことを明らかとした(徳安・田中・鈴木、応用地質学会、2004.10)。(3)活動的泥火山の泥火山噴出物(地下水、泥、ガス、ビトリナイト)の分析によりこれらは、約3500m以深からもたらされたものであり、異常間隙水圧層の発生原因として粘土鉱物の相転移に伴う水の放出の可能性を指摘した(新谷・田中、日本地質学会、2004.10)。(5)活火山は尾根部において陥没地形を伴い、背斜軸の両翼に分布し、陥没構造内では地質構造が著しく乱れている(徳安・田中・鈴木、応用地質学会、2004.10)。(6)台湾の泥火山は背斜構造、断層と密接な関係にあり、急激な堆積作用と関係していることが明らかとなった(宮田・新谷・三宅・田中、2003.4、堆積学会)新潟県十日町市,和歌山県田辺市および台湾に分布ずる現世および地質時代の泥火山・マッドダイアピルを対象として現地調査および不運出物の室内分析を行い以下の結果を得た。(6)台湾の泥火山は背斜構造、断層と密接な関係にあり、急激な堆積作用と関係していることが明らかとなった(宮田・新谷・三宅・田中、2003.4、堆積学会)新潟県松代町において泥火山を記載し、その地質・地質構造的特徴を明らかとするとともに、噴出物の分析を行なった。露頭観察等により、泥火山の地下構造の推定を行なった。さらに、台湾の泥火山の現地調査を行ない、両者を比較検討した。・松代町の2箇所において泥火山(室野泥火山,蒲生泥火山)を記載するとともに、周辺のガスや石油の噴出場所を特定した。・地表地質踏査を行ない,地質図を作成するとともに、室野泥火山が背斜構造に,蒲生泥火山がベーズン構造に噴出している事を明らかとした。・泥火山は地表部に陥没地形をよび地下浅部に陥没構造を伴い,陥没内は泥火山噴出物、湖沼堆積物が繰り返し充填している。現在活動を停止している蒲生泥火山は約38000年前に活動していた事を明らかとした。・道路拡幅工事における露頭調査から、新たに泥火山の内部構造を明らかとすることが出来た。陥没地形の下部には、泥火山噴出物である含礫粘土と泥岩が漸移的に粘土化する変質粘土化帯とが分布する。後者は新鮮な泥岩岩盤と噴出物との境界や含レキ粘土の下位に分布し、上昇した地下水による粘土化作用が考えられる。・噴出した泥にはスメクタイトが含まれ、現在、噴出している地下水は、塩分濃度が高い地層水と考えられる。・台湾の泥火山について詳細な分布と地質構造との関係を検討した。泥火山は背斜構造の軸部や断層沿いに斜交し、線状に配列する。泥火山の分布地域を囲むように、バッドランドが分布し、侵食の著しい特異な地形を形成している。

台湾の南方にある小琉球島はダイアピルで出来た島とされているが、調査の結果、地層は層理面を保存した砂岩泥岩の互層であり、ダイアピル構造は見られず、あったとしても,小規模である可能性が高い。1.新潟県松代町の泥火山から噴出する地下水、泥のX線鉱物分析、同位体分析、ビトリナイト反射率測定などをおこない、それらが地下300m以上深部からもたらされた可能性があることを明らかとした。2.蒲生泥火山周辺の詳細地質調査を行い、すり鉢状陥没地形の周辺の地質構造が著しく乱れており、地質構造的な陥没構造を見出した.3.蒲生泥火山、室野泥火山の地下構造を明らかとするため、高密度電気探査、CSAMT法探査を行い、地表付近には直径800m程度の陥没構造を、又陥没壁周辺には地下から塩分濃度の高い地下水の上昇が、さらに地下800mにはさらに塩分濃度の高い地下水が存在する事を明らかとした。4.鍋立山トンネル掘削時にトラブルの原因となった膨潤性地山はガス、泥の上昇する塩分濃度の濃い地下水の分布域に相当する可能性があることを明らかとした。1.新潟県松代町における室野泥火山より噴出する物質のうち、泥のX線分析、地下水の水質分析および同位体分析、天然ガスの同位体分析、ビトリナイト反射率測定を行い、既存の資料に基づき、それらが、地下3500mから4000mの深部からもたらされていることを明らかとした。2.泥火山噴出物の起源深度から、泥火山の形成のメカニズムとして、地下深部における粘土鉱物の続成作用によりスメクタイトからイライトへの、鉱物の相転移により放出される層間水により形成された異常間隙水圧層であることを明らかとした。3.蒲生地区において平成15年度の測線にさらに2測線を追加してCSA-MT法による地下構造探査を行い、地下600m深度に塩分濃度の高い地下水に飽和した領域が直径約800mの範囲に存在し、それらが陥没構造の壁面に沿って上昇していることを3次元的に明らかとした。4.室野泥火山において噴出する地下水・泥の活動モニタリングを行い、活動が地球潮汐と密接な関係にあることを明らかとした。5.泥火山に関する検討結果を論文として取りまとめ、「自然防災科学」に投稿し、平成17年3月に受理された。
児童養護施設における家族支援に心理職が関わることの有効性に関する検討

児童養護施設における心理職による家族支援の実態を家族に直接会う支援と間接的支援(アセスメントなど)にわけて質問紙で尋ねた結果,6割以上は直接的にも間接的にも家族支援に関わっていないことがわかった。一方,「心理職は家族支援に関わった方がよい」には約85%が同意し,家族支援担当の職員も約75%が心理職の関与に期待していることがわかった。この結果,児童養護施設における心理職の家族支援モデルの構築が望まれる。本年度,実施した研究は,1児童福祉施設における家族支援に関する研究のレビュー2全国の児童養護施設における家族支援の実態調査であった。1については,わが国で公表されている児童福祉施設における家族支援に関する研究をまとめると,(1)児童相談所・市町村・児童福祉施設等における治療的・心理教育的グループ支援プログラムの開発、紹介、実施報告、および効果についての検討、(2)虐待が生じる家族、および虐待を行う親の特性や力動に関する調査や研究、(3)虐待を行う親に対する支援の事例研究または質的研究,の3つにまとめられた。今後の課題としては,被援助動機づけの低い家族へのアプローチに関する研究,障害を抱える子ども等,養育困難に至るリスクの高い親への障害別の支援,児童虐待が生じる背景に関して,親個人の特性とともに家族や家族を取り巻く環境全体の関係性を視野に入れた研究,が求められることがわかった。2の実態調査については,全国679(平成22年6月現在)の児童養護施設のファミリーソーシャルワーカーおよび心理職に対して,児童養護施設における家族支援の実態調査を行った。246施設から回答があった。現在、心理職として家族支援を行っているものは限られていることがわかった。一方で、心理職が家族支援にかかわることにある程度期待すると回答したファミリーソーシャルワーカーは一定数おり、また心理職としても家族支援に関わりたいと考えているものも多いことが分かった。実施されていない理由としては,勤務形態による時間不足や子どもの心理療法が中心であること,心理職としての経験のなさ、また施設文化が影響していることがわかった。本研究は児童養護施設における家族支援の実態を調査すること及び心理職による家族支援の可能性の検討を目的として実施された。まず全国579か所(2010年6月現在)の児童養護施設(以下,施設と略記)に勤務する心理療法担当職員など(以下,心理職と略記),'および,管理職・ファミリーソーシャルワーカーなど家族支援を実際に担当している心理職以外の職員(以下,FSW等と略記)を対象に質問紙調査を行い、実態調査とした。施設における心理職による家族支援の実態を直接的支援(各種心理面接など)と間接的支援(アセスメントやコンサルテーションなど)に分けて尋ねた結果,家族への直接的支援を行っているものは1割程度にとどまり,6割以上は間接的にも家族支援に関わっていないことがわかった。一方,「心理職は家族支援に関わった方がよい」には約85%が同意しており,心理職は家族支援実践に関わることはできていないが強い関心を抱いていることがわかった。またFSW等家族支援担当者への調査では,約75%が心理職の関与に期待していることも分かった。期待の内容としては,「心理職による多様な視点や理解,支援の提供の可能性」を求める声が最も多かった。次いで心理職に対して行われたインタビューからは、施設における家族支援に心理職が関わるパターンには,(1)家族合同面接,親面接など直接的な家族支援を行う「直接援助型」,(2)直接は家族と会わないがFSW等と一緒に家族についての理解・アセスメントを話したり,関係者会議に参加したりして,支援の可能性を検討する「間接援助型」,(3)子どもの内的な家族イメージを肯定的に育んだり,子どもが語るや家族像や面会・外泊等の際に子どもが感じたことや経験したことを丁寧に聞くといった「子ども援助重視型」,という3つがあることが推察され、施設を取り巻く状況と心理職の素質を鑑みながら、施設の心理職それぞれが家族支援に関わることは可能であることがわかった。
大脳新皮質の幹細胞の初期プログラム

大脳新皮質の初期の神経幹細胞は、多種類の神経細胞を生み出せる多能性を有し以降の幹細胞と異なるが、初期の神経幹細胞の多能性には不明な点が多い。そこで、初期の神経幹細胞内の分子機構を明らかにすべく、研究代表者等が発見した初期の神経幹細胞で特異的に発現する遺伝子を軸に、マウス個体のレベルで大脳新皮質形成の研究を行った。初期の大脳新皮質に特異的でユニークな遺伝子Neproの機能を個体レベルで明らかにすべく、前年度の研究で作製したNepro遺伝子座にVenusがノックイン(アウト)されたマウスを交配した。その結果、両染色体のNeproがノックアウトされたホモのマウスは、胎生致死となることが明らかとなり、Neproが個体発生に必須の遺伝子であることが示された。また、様々な発生のステージでNeproの機能を詳細に解析することにより、Neproが機能を発揮するためには、初期の神経幹細胞に特異的な何らかの共因子が必要であることが示唆された。さらに、研究代表者等が開発したexo utero電気穿孔法を用いて、NeproのゲノムDNAと蛍光タンパク質の遺伝子Venusを繋いだコンストラクトを初期のマウス大脳新皮質へ遺伝子導入したところ、神経幹細胞のみでVenusの蛍光が検出され、神経幹細胞での発現を制御するNeproのエンハンサーの位置が明らかとなった。一方、Neproと同様に初期の神経幹細胞に特異的な遺伝子の機能をexo utero電気穿孔法でマウス胎仔内で次々に解析することにより、研究代表者等が発見し未だ発表されていない遺伝子のNepz1が神経幹細胞の制御に重要であることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。そこで、初期の神経幹細胞内の分子機構を明らかにすべく、研究代表者等が発見したユニークな遺伝子のNeproを軸に、神経発生の研究を行った。Neproは発生初期の大脳新皮質で発現し、マウス胎仔への電気穿孔法などを用いた研究により初期の神経幹細胞の維持に必須であり、Notchの下流で機能することを研究代表者等が明らかにした。Neproを発現する細胞を生体内で詳細にモニターするとともにNeproをノックアウトすることを目的とし、当初の計画通り、Neproの遺伝子座に蛍光タンパク遺伝子のVenusがノックインされたマウスの作製を開始した。まず、NeproのゲノムDNAの第1エキソンの開始コドンからVenusタンパクが翻訳されるようにVenus遺伝子を挿入し、ES細胞の選別用にネオマイシン耐性遺伝子を持つDNAコンストラクトを作製した。このDNAコンストラクトをマウスES細胞へ導入後、サザン法などの選別によりノックインされたES細胞を得た。続いて、ES細胞をマウス胚盤胞へ注入しキメラマウスを作出後、キメラマウスの交配で得られた仔マウスのゲノムDNAを解析することにより、Nepro遺伝子座にVenusがノックインされたマウスを得ることに成功した。一方、Neproの転写制御機構を解明すべく、上記のVenusがノックインされたDNAコンストラクトを細工し、Neproゲノムの領域に欠損を有するプラスミドを作製した。さらに、このプラスミドや研究代表者等が発見済みのNepro以外の遺伝子を、研究代表者が開発したexo utero電気穿孔法を用い、胎生11.5日の初期マウス大脳皮質へ遺伝子導入し、Neproの転写制御とNepro以外の遺伝子の機能の解析を開始した。

当初の計画のNeproノックインマウスの作製に関し、順調にES細胞やキメラマウスの作製に成功するのみならず、さらに一歩進みノックインマウスの作出へ至っている。ES細胞やマウスの解析などには時間を要するため、当初はキメラマウスの作製までを本年度の計画としたが、計画を上回る速度で進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究は当初の計画通りの方針で計画を上回る速度で進展しており、今後はNeproノックインマウスを用いた個体レベルでの機能解析やNeproと他の遺伝子との相互作用の解析などを推進する。
核磁気共鳴による藍色細菌時計蛋白質の相互作用とダイナミクスの研究

近年、生物時計をもつ唯一の原核生物である藍色細菌において、時計に関する蛋白質KaiA, KaiB, KaiCの結晶構造が決定された。興味深いことに、よく知られている遺伝子調節の関与なしに、これらの蛋白質とATPのみで24時間のリズムがin vitroで生じる。本研究の目的は、24時間周期の鍵となるこれら3種類の蛋白質どうしの相互作用を核磁気共鳴(NMR)を用いて直接に原子レベルでリアルタイム観測し、時計発振の基本的メカニズムを解明することである。^2H,^<15>N,^<13>Cで標識したKaiA、KaiB、あるいは、KaiCを調製し、二次元NMR実験である^1H-^<15>N CRINEPTスペクトルを測定した。さらにメチル基のみを^<13>C,^1Hで標識し、それ以外の核を^<12>C,^2Hで標識した試料を調製した。この試料では、メチル基からの信号のみをメチルTROSY法を利用して測定できるので、KaiCのような超高分子量との複合体でも対応できる。KaiCにはリン酸化部位が二カ所あり、それぞれがリン酸化される順序が決まっている。そして、そのリン酸化の順序が周期の進行に同期している。そこで、それぞれのリン酸化状態を模倣した変異体を作成し、それぞれがKaiAあるいはKaiBとどのように相互作用するかを観測した。その結果、明らかにKaiCのリン酸化状態に依存してKaiB-KaiC間の相互作用が変化することが分かり、その相互作用の強さは、24時間周期の進行におけるKaiCのリン酸化、脱リン酸化の順序とほぼ一致することが見出された。一方、KaiAとKaiCの間の相互作用は、KaiCのリン酸化状態には依存しなかった。以上より、24時間周期において、KaiA, KaiB, KaiC蛋白質どうしの相互作用がどのように変化したかを原子レベルで観測でき、立体構造をもとに生物時計のメカニズムを議論することが出来た。研究の目的近年、生物時計をもつ唯一の原核生物である藍色細菌において、時計に関する蛋白質KaiA,KaiB,KaiCの結晶構造が決定された。^2H/^<15>N/^<13>Cで標識したKaiBを調製し、3次元のNMR測定を通して主鎖核の共鳴値ほとんど全てを帰属することに成功した。また、KaiAとKaicについても大腸菌の大量培養で発現させ、多量体の安定な状態での調製を達成できた。NMRでのKaiA, KaiB, KaiC複合体の検出KaiA, [^2H,^<15>N]-KaiB, KaiCとATPを混合し、2時間おきに二次元CRIPTスペクトルを測定した。さらに、メチル基のみを^13C/^1Hで、残りの核を^<12>C/^2Hで特異的に標識したKaiBを調製し、二次元TROSYスペクトルを測定することに成功した。これにより、上記のCRIPTによるアミド基の観測よりもさらに高分子量の複合体の測定が可能となった。KaiBとKaiAあるいはKaiCとの相互作用の解析上記のように調製した3種類の蛋白質を試験管内で混合し、その結果、KaiCのリン酸化状態が24時間の周期を持つことが確認できた。現在、NMRでの周期の検出に取り組んでいるところである。現在の問題点は、NMRの検出に必要な高濃度状態では複合体の状態が不安定になることである。これを克服するために、さらに低濃度でも検出できる方法を同時に開発している。

一方、KaiAとKaiCの間の相互作用は、KaiCのリン酸化状態には依存しなかった。以上より、24時間周期において、KaiA, KaiB, KaiC蛋白質どうしの相互作用がどのように変化したかを原子レベルで観測でき、立体構造をもとに生物時計のメカニズムを議論することが出来た。
IV型コラーゲンによる転移性大腸癌の92kdゼラチン分解酵素発現制御の解析

基底膜の破壊は、癌の浸潤、転移の過程において必須のステップである。近年、MMP-2,-9といったIV型コラーゲン分解酵素が発見され、これらが浸潤、転移に関与することを示唆する結果が得られている。従って、これらの酵素の分泌量、活性化を制御する因子を知ることは癌の進展に伴う基底膜の破壊を考えていく上で重要である。前年度、大腸癌細胞において、IV型コラーゲン結合成分がMMP-9の分泌量を増加させることを示唆する結果を得た。また、MMP-2,-9を分泌することが知られてる繊維肉腫細胞HT-1080でも、同様の結果が認められた。今年度は、HT-1080を用いて、IV型コラーゲン、あるいは結合成分がMMP-2,-9の活性化に影響するかを検討した。その結果、細胞培養系においてHT-1080にIV型コラーゲンを添加することによりMMP-2が活性化されることが認められた。ただし、培養基質として、IV型コラーゲンを用いた場合ではなく、培地中に溶液として加えた場合のみ活性化が認められた。また、I型コラーゲンやペプシンにより限定分解したIV型コラーゲンを用いた場合にも同様な結果が得られた。このことは、生体内で、浮遊しているコラーゲンがMMP-2の活性化に寄与している可能性を示している。更に、マトリックスが破壊され始めて浮遊コラーゲンが増加するとMMP-2の活性化が起こり更にマトリックスの破壊が進むという機構も考えられ、上記結果はMMP-2の役割を考える上で興味深い知見である。1.11株の転移性大腸癌の分泌するゼラチン分解酵素を解析した結果、すべての株において、65kd、75kdの酵素が、また3株において92kdの酵素がみとめれた。今年度は、これらの酵素について金属依存性、p-aminophenylmercury(II)acetete(APMA)による分子量変化、phorbol myristate acetate(PMA)による分泌量変化等を検討した。その結果、92kdの酵素はMMP-9と同様の性質を示し、大腸癌においてもMMP-9を分泌する細胞の存在が示唆された。一方、65kd、75kdの酵素の金属依存性、APMA非感受性等の性質はMMP-2,-9とは異なり、乳癌細胞で報告されているtype IV collagenを基質とする非MMP-metalloproteinaseと似ていた。このことは、大腸癌の基底膜の破壊における65kd、75kdの酵素の関与を示唆するものであり、更なる性質の検討が必要である。2.大腸癌の分泌する92kdの酵素は、牛レンズカプセル由来のtypeIV collagenを培養基質とした場合、type I collagenの場合より分泌量が増加した。今年度、更にtype IV collagenの精製、抗type IV collagen receptor抗体を用いた分泌抑制の検討等を行ったところ、92kdの酵素の分泌誘導は、type IV collagen結合性の微量成分によることを示唆する結果が得られた。この微量成分は、繊維肉腫細胞の分泌するMMP-2,9の分泌も誘導する。このことから、この成分が基底膜中のtype IV collagenに結合して存在し、癌細胞に働きかけることにより、基底膜の破壊を促進する可能性が考えられる。
尿中細菌叢を治療ターゲットとした過活動膀胱の根治治療の探索

これまで尿は無菌であると認識されてきたが、細菌学の発展によって尿中には従来の検査方法では検出できない細菌が細菌叢を形成していることが明らかになった。そして、過活動膀胱患者の尿中には健常者とは異なる細菌叢が形成されていることが報告され、この細菌叢がOABの発症に関与している可能性が示唆されている。本研究はOABの根治治療を目指し、尿中細菌叢が頻尿をきたすメカニズムを解明し、過活動膀胱の新規治療薬を開発することを目的とする。
ストレス蛋白hsp90,PA28の分子生物学的特性に基づく癌免疫治療研究

プロテアソーム調節分子PA28は20Sプロテアソームのペプチド分解活性を促進し、癌抗原を初めとする多くの抗原ペプチドのプロセシングを促進すると考えられている。一方、相当数の抗原ペプチドのプロセシングはPA28により促進されないことも報告されている。我々の研究結果はさらに踏み込み、MHCクラスI結合ペプチドのアンカーモチーフ構造がPA28依存性のプロセシングに影響を与える可能性を示唆した。さらには、hsp90がPA28に類似の機能を有することを明らかにし、MHCクラスI抗原のプロセシングがPA28とhsp90のそれぞれ異なる経路に支配されていることが明らかになった。即ち、抗原ペプチドはPA28-、hsp90-、或いはこの両者によってプロセシングされるものに分類され、その大原則にペプチドのアンカーモチーフが関与している。またPA28α鎖のドミナント-ネガティブ分子(PA28αΔC5)を発見した。PA28αΔC5を含むハイブリッドプロテアソームの酵素活性は完全に消失する。本来PA28-プロテアソーム分子は蛋白分解の酵素であり、抗原提示専門の酵素ではないため、非常にバラエティに富む働きを行っていると考えるのが当然であり、事実、細胞周期及びアポトーシスの制御に関与があることがPA28αΔC5を用いた実験で初めて明らかになった。これらの原因は即ちPA28-プロテアソーム分子により、ある程度選択的に細胞周期関連分子の分解が行われているためであり、その結果アポトーシス制御にも影響を及ぼすということである。以上の結果は、抗原提示のみならず、癌細胞の増殖、死滅においてもPA28分子が非常に重要な機能を果たす可能性を示唆しており、今後PA28の機能をうまくコントロールすることにより癌治療に大いに貢献できる可能性があると考えられる。
疼通を制御する新規ニューロキニン受容体のクローニング

申請者はサブスタンスP(SP)と疼通の関係を解析し、以下の知見を得た。1.脊髄シナプス膜におけるSPの分解:SPの生理作用は、シナプス膜に存在する膜結合性のプロテアーゼにより分解され、その作用を停止すると考えられる。そこで、シナプス膜標品によるSPの分解を解析した結果、その主要代謝産物はSP N-末端フラグメントSP(1-7)、(1-4)であり、エンドペプチターゼ-24.11(NEP)がSPの分解に主要な役割を演じているを明らかにした。2.SP N-末端フラグメントの薬理学的性質:NEPによるSPの分解が、生理的不活化か否かを明らかにするため、SP-N末端フラグメントの生理作用を調べたところ、それ自身ではSP様活性を示さず、逆にSP誘発性知覚神経異常行動を強く抑制した。更に、この抑制効果はニューロキニン(NK)-1受容体アンタゴニストでは無影響であった。このことはSP N-末端フラグメントにはNK-1受容体とは異なる新規の受容体が脊髄に存在することを示唆している。以上のように、脊髄内NEPによるSP分解の生理的意義は、SPの生理作用を終結させることと同時に、新たなる生理活性を引き出すために、SP N-末端フラグメントを産出するという二面性をもつことが推察される。3.新規ニューロキニン受容体のクローニング:新規のニューロキニン受容体を単離するため、PCR法を用いて、いくつかのクローンを得ているが、それらが生理的機能を持った受容体か否か、今後の詳細な検討を必要とする。疼通を制御する新規ニューロキニン受容体の構造を明らかにすることによって、より選択的で、強力な阻害剤を創出することが可能となり、臨床上問題(耐性、依存性など)のあるオピオイドとは異なる、新しいタイプの脊髄作用型非麻薬性鎮痛薬の出現をもたらすであろう。
近世啓蒙書をめぐる食養生の様相

本年度は、(1)麻疹に関連する文芸作品に示された情報、(2)食物の優劣争いの系譜、(3)養生訓を説く江戸後期の文芸作品、を中心に研究を行った。(1)では、幕末の麻疹流行時に制作された麻疹絵、滑稽本『麻疹太平記』等の分析を通じて、疫病流行時、庶民に普及した情報について考察した。特に『麻疹太平記』に関しては、描かれた食物を通して、物語と本草学との関連について分析を試みた。そして、食物本草や救荒の分野の啓蒙が意識されていた歴史的背景をもふまえ、人々の食物に対する関心が、物産から健康維持に関する情報へと変容、それが物語に反映された可能性があると結論づけた(説話文学会平成25年度大会で発表)。(2)では、酒と飯の争いを描く「酒飯論絵巻」や、酒と菓子の争いを主題とする「酒餅論」関連作品について検討した。室町時代の「酒飯論絵巻」には食物本草の影響が見られないこと、一方で複数の黄表紙に本草学の知識が見えること、そして(1)の成果にも鑑みて、時代を下るにつれ、本草学が文芸作品に与える影響が強くなったのではないかと推察するに至った(『アジア遊学』172号等で発表)。「酒餅論」作品に関しては、都立中央図書館加賀文庫等の所蔵資料調査を通して、江戸中後期の複数の作品から読み取れる酒や菓子の種類、産地、店名等の情報を見立番付・絵双六の情報と対照した。また、見立番付と食物の優劣争いの物語との関連性にも言及した(「第1回日本文化に関する国際シンポジウム」で発表)。(3)では、錦絵「飲食養生鑑」・「房事養生鑑」等、体内の臓腑や器官を擬人化する絵物語を取り上げ、これらに表現された身体と養生について考察した。その結果、上記二画は、先行研究が指摘する、過度の飲食や房事を慎むという養生訓のみならず、臓腑の配置、形状等の情報を知ることも、養生の要としていることを明らかにした(「絵ものがたりの世界ー異類・異界・異形ー」で発表)。(抄録なし)本年度は、(1)食物の対立を描く絵画に表現される食養生・医学的知識の分析、(2}江戸後期から幕末における飲食物の対立を描く物語本の精読、(3)食物本草を中心とする教訓を和歌形式で継承する伝統に関する考察、(4)養生書における養生知識普及の目的についての調査を行った。(1)では、擬人化された食物の合戦を描く幕末の錦絵、および江戸初期から中期、食物が主体的に描かれた「酒飯論絵巻」や「果蔬浬槃図」を取り上げ、当時の食物本草書の記述から、描かれた食物に対して人々が想定していた人体への影響を分析した。その結果、江戸初期から中期、食物を描く際に食養生は意識されず、江戸中期以降、徐々に意識されるようになったと推察するに至った。この成果は『アジア遊学』154号、「フランス国立図書館写本室蔵『酒飯論絵巻』をめぐって」で発表した。(2)では、物語本に反映された情報の分析により、産地、有名店等の物産情報だけでなく、医学的知識までをも楽しむ文化の存在を指摘した。そして、医学的知識を含む江戸後期の情報伝達が、異類合戦物の伝統を利用、発展した可能性を提示した。この成果は「文化創造の発展とその展開一食・戦い・装い、室町から江戸」等で発表した。(3)では、『和歌食物本草』などの食物本草書において、各食物の効能や害毒が、五・七・五・七・七の和歌形式で記述されていることに注目し、これらの食物本草書が和歌形式で記された背景について考察を行った。その結果、食物本草、ひいては食養生が、中国医学からの影響だけでなく、和歌という日本古来の伝統をも踏襲しながら表現されている事実を明らかにした。この成果は『言葉と文化』14号に発表した。(4)では、東北大学附属図書館、京都大学附属図書館、大阪府立中之島図書館等に所蔵される養生書について資料調査を行った。この他、パリ・セルヌスキ美術館において、同館所蔵和書の調査を行っており、この解題目録を近く発表する予定である。

室町時代の「酒飯論絵巻」には食物本草の影響が見られないこと、一方で複数の黄表紙に本草学の知識が見えること、そして(1)の成果にも鑑みて、時代を下るにつれ、本草学が文芸作品に与える影響が強くなったのではないかと推察するに至った(『アジア遊学』172号等で発表)。「酒餅論」作品に関しては、都立中央図書館加賀文庫等の所蔵資料調査を通して、江戸中後期の複数の作品から読み取れる酒や菓子の種類、産地、店名等の情報を見立番付・絵双六の情報と対照した。また、見立番付と食物の優劣争いの物語との関連性にも言及した(「第1回日本文化に関する国際シンポジウム」で発表)。(3)では、錦絵「飲食養生鑑」・「房事養生鑑」等、体内の臓腑や器官を擬人化する絵物語を取り上げ、これらに表現された身体と養生について考察した。その結果、上記二画は、先行研究が指摘する、過度の飲食や房事を慎むという養生訓のみならず、臓腑の配置、形状等の情報を知ることも、養生の要としていることを明らかにした(「絵ものがたりの世界ー異類・異界・異形ー」で発表)。当初予定していた往来物、料理本といった資料の精読には至っておらず、完全に計画通りに進んでいるとは言い難い。これは、江戸後期の日常的な食物だけでなく、酒や煙草等、いわゆる嗜好品の生産や普及、当時の人々の想定した医学的効果までをも研究対象に含めたためである。しかし、このことにより、より広い意味で人体に取り入れるものに対する当時の人々の意識を究明し、当初の計画以上の成果が得られると考えている。上記のように、嗜好品の生産や普及、当時の人々の想定した医学的効果等の分析を通して、日常の食だけでなく、人体に取り入れるもの全般に対する生活の中での位置付けを明らかにすることができる。その上で、日常の食物の位置付けについて再検討し、日常の食物が養生に際してどのような効果を持つと考えられていたのかを考察することで、当時の人々の生活における食養生の本質を、より鮮明に浮き彫りにできると考えている。また、このような食物や嗜好品に関する近世資料の多くが、研究対象として未だ分析されていないため、次年度はより精緻な資料調査を行う必要がある。(抄録なし)
新聞の中のアメリカ植民地〜17世紀後半イギリスの情報伝達に関する研究

本年度は、以下のような調査・研究を行なった。(1)前年度に引き続き史料の収集調査をおこなった。具体的には、ピューリタン革命中に発行された新聞のうち、前年度までに収集できなかった1640年代初頭の新聞を調査した。その結果、これまで2年間の調査を合わせて、1641年から1695年までにイギリスで発行された新聞のうち、16591660年と168889年の時期を除いては、ほぼすべてを調査することができた。16591660年と168889年は複数の新聞が発行された時期であるが、調査に充てられる時間の制約のため、それらを網羅的に調査することはできなかった。ただし、その間の主要新聞については調査を終えており、当該時期の全体傾向を知る上では問題はないと判断した。(2)収集調査した史料の分析をおこない、研究を総括した。具体的には、各紙に登場するアメリカ植民地関連記事の掲載頻度、分量、内容等を分析し、当該時期のイギリスの新聞に見られるアメリカ植民地についてのイメージをできるかぎり明瞭な形で再構成した。併せて、当該時期の植民地関連記事を含む外国記事がどのようにしてつくりだされたかについて、書誌学的・史料論的見地から考察した。これらの研究成果は、研究成果報告書『新聞の中のアメリカ植民地17世紀後半イギリスの情報伝達に関する研究』として公刊された。ここには上記の史料批判部分と史料分析部分を本文としてまとめたほか、付録として調査によって判明したアメリカ関連記事の見出し目録をつけた。これは今後、同種の研究をおこなう場合の便宜を図るためのものである。本年度は、以下のような3つの史料群を対象として、アメリカ植民地関連の記事が17世紀の新聞に掲載された頻度、分量、内容等を調査した。(1)ピューリタン革命中発行の各新聞については、おもに政府系新聞を中心に1650年代発行の各紙を調査した。この時期の新聞は発行点数・発行総数ともに相当の分量になるため、史料収集の面では予定通りとは言い難い。しかし、外国情報はおもに政府系新聞に由来するので、系統的な調査という面では十分な成果が得られている。(2)『ロンドン・ガゼット』紙については、1660年代後半から1680年代初めまでの発行分の調査が終了した。京都大学附属図書館所蔵資料の調査が中心であり、2度の出張をつうじて順調に調査は進行している。(3)1660年代前半の政府系新聞については、対象史料すべてについて調査を完了した。手書きのニューズレターについては、現存する一部については調査したが、今後さらなる所蔵・内容調査が必要である。これら調査結果のうち、『ロンドン・ガゼット』紙にかんしては、1660年代後半について調査結果を分析・整理し、3月に開催された第4回社会・生活研究会において「新聞の中のアメリカ植民地1660年代発行の『ロンドン・ガゼット』からの素描」と題して中間報告を行った。(1)ピューリタン革命中発行の各新聞については、1640年代前半および1650年代前半発行の各紙を調査した。とくに、165455年の西インド遠征に関しては、新聞掲載記事のみならず関連する書籍・文書等も網羅的に史料収集し、当時の海外情報の伝達の有り様を示す具体的事例として詳細に調査した。(2)『ロンドン・ガゼット』については、1680年代後半から1690年代半ばまでの発行分の調査が終了し、前年度の調査分とあわせ、予定していた調査分を完了した。また、収集した史料については、関係記事の頻度、分量、内容等に関しての分析をほぼ終了した。(3)1670年代後半から1680年代前半に発行された非政府系新聞については、対象史料すべてについて調査を完了した。

ここには上記の史料批判部分と史料分析部分を本文としてまとめたほか、付録として調査によって判明したアメリカ関連記事の見出し目録をつけた。これは今後、同種の研究をおこなう場合の便宜を図るためのものである。
細胞転写技術を用いた新規口蓋裂治療法の確立

分離培養したヒト臍帯ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞(W-MSC)を転写したヒト羊膜をマウス頭蓋骨欠損部に置き、マウス頭蓋骨骨欠損モデルを用いて骨再生能について評価した。骨再生の評価として、マイクロCTを用いて、移植後3、5週の経時的骨形成評価を行った結果、W-MSC転写ヒト羊膜を移植した群において明らかな骨形成を認めなかった。細胞転写技術を用いた新規口蓋裂治療法の確立を目的に当研究において、まず移植細胞の採取を行った。帝王切開にて出産予定のインフォームドコンセントを得られた患者より、採取した月臍帯は直ちにantibiotics (100U/ml penicillin, 100μg/mLstreptomycin, 0.025 μg/mL amphotericin)含有phosphate-buffered saline (PBS)にて洗浄し、約3cmに裁断する。裁断された臍帯から月齊帯動静脈を取り除き、1 x antibiotics, 1mg/mL collagenase含有PBS 25mL内で室温下にてW-MSCを分離する。1618時間後に臍帯組織を取り除き、細胞懸濁液を二分し、最終量が50mLになるようにPBSを加え、3回洗浄する。最終的に採取できたW-MSCを6穴プレートに5x10^6/DMEM 1mLにて播種した。採取した細胞をフローサイトメトリーを用いて、表面抗体を確認した。結果、CD73、CD44、CD90を発現しており、間葉系幹細胞のマーカーを認めた。また、採取した、細胞が間葉系幹細胞であるかを確認するため、ヒト間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地キットを用いて分化培養した結果、Oil Red O染色にて染色され、脂肪細胞への分化を確認した。また、ヒト問葉系幹細胞骨芽細胞分化培地キットを用いて分化培養した結果、Von Kossa染色にて染色され骨芽細胞への分化を確認した。同様にヒト間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地を用いて分化培養した結果、アルシアンブルー染色にて染色され軟骨細胞への分化を確認した。以上より、上記方法にて採取した細胞は臍帯ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞(W-MSC)であると考えられる。平成23年度において、上記細胞を用いて、細胞転写羊膜のマウス頭蓋骨骨欠損部への移植を行う予定である。今回われわれは、昨年度に分離培養したヒト臍帯ワルトンゼリー由来間葉系幹細胞(W-MSC)を用いた骨再生能についてマウス頭蓋骨骨欠損モデルを用いて、評価した。実験動物として、Tie-2GFPRag-1ノックアウトマウス7週齢オスを用いた。まず、細胞転写技術を用いてパターン化したW-MSCをヒト羊膜上に転写し、移植に供した。マウス頭蓋骨骨欠損モデルは、マウスの頭頂部に皮膚切開を加え、骨膜を除去し、頭蓋骨にトレフィンバーにて4.6mmの骨欠損を作成した。細胞転写したヒト羊膜をマウス頭蓋骨欠損部に置き、周囲骨膜と縫合し細胞転写ヒト羊膜を固定した。骨再生の評価として、マイクロCTを用いて、移植後3、5週の経時的骨形成評価を行った。また、対照として羊膜のみの移植を行い、同様に評価した。結果、W-MSC転写ヒト羊膜を移植した群において明らかな骨形成を認めなかった。また同様に対照群においても骨形成を認めなかった。今回われわれは、W-MSCのin-vitroにおける骨形成については確認できたが、in-vivoにおける骨形成は確認できなかった。骨形成の欠如は、W-MSCがマウス頭蓋骨骨欠損部において、in-vitroと同様な骨芽細胞への分化がおこらなかったことに起因すると考えられる。骨再生における移植細胞として、問葉系幹細胞の移植ではなく、よりニッチに合致した細胞、すなわち骨芽細胞の移植が適切と考えられる。
再開通後の閉塞性動脈硬化症の分子生物学に基づいた再発予防の検討

目的:閉塞性動脈硬化症に対するバルーン拡張術、ステント、およびステントグラフトによる血管内治療後に問題となる再狭窄の発生要因およびその予防法を検討する。方法:体重約3kgの日本白色種ウサギならびに遺伝性高脂血症ウサギを実験に使用した。静脈麻酔下に頚動脈を切開し、下行大動脈にカテーテルを挿入、血管撮影を行った後、直径0.2mm0.3mmのステンレスワイヤー(SUS304)で作成した、長さ1cm1.5cmのGianturco型メタリックステント(Zステント)を下行大動脈に挿入留置した。ステントの直径は留置する大動脈径の約1.2倍とした。ステント留置後に、一部のウサギには組織プラスミノーゲンアクチベータ(t-PA)を静脈内投与した。ステント留置から経時的に血管撮影を行い、ステント留置部の血管狭窄の有無を観察した。また、動脈壁とステント表面の粥状硬化、血栓形成、内膜肥厚などの状態を観察し、組織学的検討を行った。一方、Zステントをpolytetrafluoroethylene(e-PTFE)膜でカバーしたステントグラフト(膜張りステント)をウサギの下大静脈に留置し、血管造影像および組織像の変化を検討した。結果:大動脈のステント留置部には、ステントのワイヤーと血管壁の接触部に軽度の内膜肥厚が認められた。内膜肥厚は特に高脂血症ウサギで著明であった。これらの変化は、t-PA投与群では有意に少なく、薬剤投与が再狭窄の予防に有効である可能性が示唆された。一方、大静脈のステントグラフト留置部では、ステントの両端部に内膜肥厚を生じ、軽度の内腔の狭小化が認められた。目的:閉塞性動脈硬化症におけるバルーン拡張術、メタリックステント、およびステントグラフトによる治療後に問題となる再狭窄の発生に対して、薬剤投与による予防効果を検討する。方法:体重約2.5kg3.5kgの日本白色種ウサギならびに遺伝性高脂血症ウサギを実験に使用した。静脈麻酔下に頚動脈を切開し、胸部下降大動脈にシースとカテーテルを挿入、血管撮影を行って大動脈の血管径を測定した。直径0.2mm0.3mmのステンレスワイヤーで作成した、長さ1cm1.5cmのGianturco型のメタリックステント(Zステント)、および同ステントを0.1mm厚のpolytetr afluoroethylene(PTFE)膜でカバーしたステンドグラフト(膜張りステント)をシースから下降大動脈に挿入、留置した。ステント留置の2日後に、一部のウサギに40.00080.000IU/kgの組織プラスミノーゲンアクチベータ(t-PA)を静脈内投与した。ステント留置から2週、4週、および8週後に血管撮影を行い、ステント留置部の血管狭窄の有無を観察した。また経時的に剖検し、動脈壁とステント表面の粥状硬化、血栓形成、内膜肥厚などの状態を肉眼的に観察すると共に、組織学的な検討を行った。結果:Zステントの留置部には、ステントのワイヤーと血管壁の接触部全体に内膜肥厚と軽度の血管腔の狭小化が認められた。一方、ステントグラフトの留置では、ステントの両端部に内膜肥厚が認められ、グラフトの内面には血栓の付着が認められた。動脈壁の変化は高脂血症ウサギでより明らかであった。これらの変化は、t-PA投与群では軽度となる蛍光が認められ、薬剤の投与が再狭窄の予防に有効である可能性が示唆された。目的:閉塞性動脈硬化症などにおけるバルーン拡張術、メタリックステント、およびステントグラフトによる血管内治療後に問題となる再狭窄の発生に対する予防効果を検討する。

方法:体重約3Kgの日本白色種ウサギならびに遺伝性高脂血症ウサギを実験に使用した。静脈麻酔下に頚動脈を切開し、下降大動脈にカテーテルを挿入、血管撮影を行って大動脈の血管径を測定した。直径0.2mm0.3mmのステンレスワイヤー(SUS304)で作成した、長さ1cm1.5cmのGianturco型メタリックステント(Zステント)を下降大動脈に挿入、留置した。ステントの直径は留置する大動脈径の約1.2倍とした。ステント留置後に、一部のウサギには組織プラスミノーゲンアクチベータ(t-PA)を静脈内投与した。ステント留置から2週、4週、および8週後に血管撮影を行い、ステント留置部の血管狭窄の有無を観察した。また、動脈壁とステント表面の粥状硬化、血栓形成、内膜肥厚などの状態を肉眼的に観察し、組織学的検討を行った。一方、Zステントをpolytetr afluoroethylene(e-PTFE)膜およびpolyethy lene telephthalate(PET)でカバーしたステントグラフト(膜張りステント)をウサギの下大静脈に留置し、血管造影像および組織像の変化を検討した。結果:ステント留置部には、ステントのワイヤーと血管壁の接触部に軽度の内膜肥厚が認められた。一方、ステントグラフトの留置部では、ステントの両端部に内膜肥厚を生じ、内腔の狭小化が認められた。動脈壁の変化は高脂血症ウサギでより明らかであった。これらの変化は、t-PA投与群では軽度となる傾向が認められ、薬剤の投与が再狭窄の予防に有効である可能性が示唆された。
ショウジョウバエ雄の減数分裂開始を負に制御する新たな分子機構に関する研究

M期進行の制御機構は、体細胞分裂、減数分裂を問わず、真核生物の間で共通と信じられている。ショウジョウバエ雄の減数分裂の前には、細胞周期がいったんG2期で停止し、減数分裂や精子形成に必要な産物が合成、蓄積される。その後サイクリンBが合成されMPFが活性化して、減数第1分裂が始まる。我々が分離したmeteor(mtr)突然変異体は、雄雌不妊であり、減数分裂前のシスト内に小さな細胞が認められる。この細胞では、すでに核膜が崩壊しており、クロマチンが凝縮した染色体様の構造を示す。さらにその減数分裂前の細胞において束化したスピンドル様の微小管構造も認められた。これはM期が早期に開始したことを意味する。ところがこれらの細胞にはサイクリンBの蓄積が認められず、CDKは活性化していない。代わりに凝縮途中のクロマチン上にAurora Bが多量に蓄積していることを認めた。mtr遺伝子産物は、機能未知なLARPタンパクのショウジョウバエホモログであった。MTRタンパクは、減数分裂前の成長期には細胞質に存在しているが、減数分裂の直前に核へ進入する。前中期では中心体に、中期以降はスピンドル上に局在が認められる。MTRタンパクは適切なタイミングで減数分裂が始めるように抑制的な役割を担っていると考えられる。mtr変異体では、このタンパク量の低下により、核膜が早期に崩壊し、サイクリンB-CDKの活性化の前に染色体の凝縮、スピンドル形成が開始された可能性が考えられた。またmtr突然変異体では減数分裂の際にスピンドルにも形態異常を認めた。このため染色体の不均等分配が高頻度におこる。さらにmtr^W変異体が産む卵においても、分裂前期において核構造の異常、中心体分離の阻害、スピンドル形態の異常が認められ、染色体分配が欠損することがわかった。この結果は体細胞においてもMTRがM期に重要な役割をもつ可能性を示唆する。M期進行の制御機構は、体細胞分裂、減数分裂を問わず、真核生物の間で共通であることが知られている。ショウジョウバエ雄の減数分裂の前には、細胞周期がいったんG2期で停止し、減数分裂およびそれ以降の精子形成に必要な産物が合成、蓄積される。我々が分離したショウジョウバエのmeteor(mtr)突然変異体は、雄雌不妊であり、減数分裂前のシスト内に小さな細胞が認められる。この細胞では、すでに核膜が崩壊しており、クロマチンが凝縮した染色体様の構造を示すことをみいだした。これはM期が早期に開始したことを意味している。ところがこれらの細胞にはサイクリンBの蓄積が認められず、CDKは活性化していないことがわかった。これらの細胞でもサイクリンBの蓄積、CDKの活性化は正常なタイミングでおきていた。しかし早期に形成されたスピンドルは、本来の双極な構造ではなく、形態も異常なため、染色体の不均等分配が高頻度におこると考えられる。この原因遺伝子をP因子プラスミドレスキュー法によりクローニングした。遺伝子産物は自己免疫疾患の原因のひとつであるLupas抗原と相同な配列をもつLARPタンパクのショウジョウバエホモログであった。

抗体を作成し細胞内局在を調べたところ、核膜に局在を認めた。mtr変異体では、MTRタンパク量の低下により、核膜が早期に崩壊し、サイクリンB-CDKの活性化の前に染色体の凝縮、スピンドル形成が開始された可能性が考えられた。M期進行の制御機構は、体細胞分裂、減数分裂を問わず、真核生物の間で共通である。ショウジョウバエのmeteor(mtr)突然変異体は、雌雄とも不妊になる。この雄では分裂期開始前にCdk1も活性化していないにもかかわらず、減数第1分裂を早期に開始する。代わりにクロマチン上にAurora Bの蓄積を認めた。早期に減数第1分裂を始めた細胞ではスピンドル形態が異常となり、染色体の不均等分配が高頻度におこる。この原因遺伝子産物であるMeteor/LARPタンパクは減数分裂前にはクロマチンと核膜に局在する。mtr変異体では、同タンパク量の低下により、核膜が早期に崩壊し、サイクリンBの蓄積前に染色体凝縮、スピンドル形成が始まった可能性が考えられる。本年度は、体細胞分裂への影響も調査した。まずMeteorの細胞内局在をショウジョウバエの培養細胞の分裂を追って調べた。分裂前期では核膜に存在し、Laminと複合体を形成することがわかった。前中期では中心体に、中期以降はスピンドル上に局在していた。さらにmtr^w突然変異体の雌が産む卵において、分裂前期において核構造の異常、中心体分離の阻害、スピンドル形態の異常が認められ、染色体分配が欠損することがわかった。また分裂期の開始および中心体の分離に必須なタンパクキナーゼPoloとMeteorタンパクが会合することが明らかになった(英国ケンブリッジ大学D.M.Glover教授との共同研究、論文投稿中)。Meteorは核膜に局在し、中心体分離、スピンドル形成に必要なPoloをそこに呼び込む働きをする可能性が示唆された。さらにmtr遺伝子の致死変異体を分離した。この結果はmtr遺伝子が体細胞分裂にも必須であることを示している。体細胞において同タンパクがG2/M期進行の制御およびM期における核膜と中心体との相互作用に果たす役割についてさらに検討している。
ダックB型肝炎ウィルスレセプター;B型肝炎ウィルス感染のモデルとして

ダックB型肝炎ウィルス(DHBV)は、B型肝炎ウィルスで唯一in vitro感染系が確立されたウィルスであり、B型肝炎ウィルスのモデル系として分子生物学的にもっともよく理解されているウィルスである。我々は、B型肝炎ウィルスの感染機構のモデルとしてDHBVを対象に研究を進めている。最近、我々はレセプター候補としてユニークな構造上の特徴をもつ新規の膜結合性カルボキシペプチダーゼを発見し、gp180と命名した。ダックB型肝炎ウィルス(DHBV)のエンベロープ(preS)と特異的に結合する宿主膜蛋白質gp180について以下の知見を得ることができた。1. DHBVエンベロープ蛋白質(preS)は、gp180上にタンデムに配列した3個のカルボキシペプチダーゼ様ドメインのうちCOOH末端側の領域(ドメインC)と特異的に結合するが、このドメインには、アルボキシペプチダーゼ活性がない。2. DHBVpreSは、ダックgp180ドメインCのCOOH末端側領域に結合する。3.ダックgp180ドメインC内のThr^<1240>とTyr^<1250>が、DHBVpreSとの結合に重要。4. DHBVpreSは、ヒトgp180とはまったく結合せず、ニワトリgp180との親和性もあまりない。5. gp180は、DHBV粒子の細胞へのadsorption、internalizationに機能する。