hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
羊膜由来間葉系幹細胞がもつEPA-レゾルビン産生と早産予防効果の検討

羊膜由来間葉系幹細胞(MSC)は、出産時に廃棄される卵膜に存在していることが知られており、次世代の再生医療材料として期待されている。申請者らは、ヒト卵膜から短期間でMSCを分離培養する技術を確立し、その細胞を炎症性疾患発症動物モデルに投与したところ、その病態を有意に抑制していることを明らかにしてきた。しかしながら、羊膜MSC由来のどのような因子が、さまざまな炎症性疾患を抑制しているのかの詳細は明らかにされていない。近年、魚油などに含まれるエイコサペンタエン酸(EPA)やドコサエキサエン酸(DHA)などの多価不飽和脂肪酸は、人体で合成されない必須脂肪酸として知られており、これらの多価不飽和脂肪酸は、主に生体内では細胞の脂質二重膜に存在し、細胞膜の柔軟性などを規定している。細胞膜への刺激が加わると、EPAならびにDHAは、ホスホリパーゼA2 (PLA2)により膜から細胞質内に遊離され、その後、代謝される。細胞質内に遊離されると、細胞内でEPA由来レゾルビン、ならびに、DHA由来プロテクチンに代謝され、これらの代謝物における抗炎症効果が知られている。さらに近年、炎症性早産誘導性マウスモデルにおいて、EPA、ならびに、その代謝物であるレゾルビンの投与が早産を有意に抑制させることが報告され、生体におけるEPAならびにレゾルビンの摂取が早産を予防する重要な因子であると想定される。申請者らはこれまでに、複数の組織由来MSCを培養すると、正常羊膜由来MSCのみで、レゾルビンが産生されること、また、その産生に関連するPLA2の遺伝子発現が培養時間とともに上昇することを明らかにしている。申請者らは、羊膜MSC内で代謝産生されるEPA-レゾルビン産生経路が早産における重要な予防因子であると考え、その詳細を明らかにすることで早産における新規治療法の開発を探索する。平成30年度では、EPAならびにその代謝産物がもたらす早産予防効果の可能性を探索するために、羊膜由来MSC内EPAならびにその代謝産物の網羅的解析を行った。具体的には、ヒト正常由来胎児付属物を細切して、コラゲナーゼ(200 U/ml)を添加し、37°Cで1時間振盪する。その後、10%胎児ウシ血清含有培養液にて培養し、MSCを分離培養する。培養後、1×107個の細胞を回収し、有機溶媒を用いた前処理後、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)、ならびに、超臨界流体クロマトグラフィー質量分析(SFC/MS)を用いてMSC内に含まれるEPAを解析した。結果としてMSC内には、EPAが存在していること、また、それに付随した代謝物の存在が明らかとなった。一方で、今年度実施予定にしていたヒト早産由来MSCならびに羊水の解析については、対象ドナーの検体が確保できなかったため次年度以降への実施を予定している。そのため、平成31年度に予定していた項目について実施した。具体的には、妊娠7日目のラットを用いて、10mgのEPAを1日1回の割合で妊娠17日目まで連続投与する。その後、ラットの羊膜を採取し、コラゲナーゼ(200 U/ml)を添加し、37°Cで1時間振盪する。妊娠17日後、10%胎児ウシ血清含有培養液にて分離培養し、細胞ならびにその培養上清を回収し、有機溶媒を用いた前処理後、LC-MS、ならびに、SFC/MSを用いてMSを解析した。結果として、妊娠ラットモデルにEPAを投与するとEPAの代謝物であるレゾルビンの産生がコントロール群に比較して高い上昇傾向を示していた。これによりEPAの投与が羊膜MSC内EPAの含有量を高める結果、レゾルビンの産生を促進し抗炎症効果を発揮している可能性が示唆された。今後の予定としては平成31年-32年度までに以下の項目について実施を予定している。1.ヒト正常ならびに早産由来羊水中の代謝物の網羅的解析具体的には、超音波の器械で胎児や胎盤、羊水の位置を観察しながら、穿刺針を子宮の中へ挿入して、100μlのヒト正常ならびに早産由来羊水を採取する。その後、有機溶媒を用いた前処理後、LC-MSならびにSFC/MSを用いて羊水中に含まれる代謝物の網羅的解析を行う。2. EPA投与後の妊娠ラット羊膜MSC内EPAならびに羊水中の代謝物の網羅的解析具体的には、妊娠7日目のラットを用いて、10mgのEPAを1日1回の割合で2週間連続投与する。2週間後、ラットの羊膜を採取し、コラゲナーゼ(200 U/ml)を添加し、37°Cで1時間振盪する。その後、10%胎児ウシ血清含有培養液にて分離培養する。培養後、1×107個の細胞を回収し、有機溶媒を用いた前処理後、LC-MS、ならびに、SFC/MSを用いてMSC内EPAを解析する。また、正常ならびに早産由来妊娠ラットから100μlの羊水を採取する。その後、有機溶媒を用いた前処理後、LC-MSならびにSFC/MSを用いて羊水中の代謝物の網羅的解析を行う。3.早産リスクを予想する羊水内代謝産物のバイオマーカー探索具体的には、妊娠ラットを用いて100-500ngのLPSをラットの経腟的に子宮頸部へ投与し、早産を誘発させる。

その後、正常ならびに早産由来ラット羊膜MSC(1×107個)と羊水(100μl)を経時的に採取し、上記と同様な方法で前処理を行い、LC-MSならびにSFC/MSにて羊膜MSC内EPAの含有量ならびに羊水中のEPA由来代謝物の変化を解析する。さらに、ヒト由来正常ならびに早産由来羊水中代謝産物との比較解析を行い、早産リスクを事前に予測できる早期診断バイオマーカー候補の探索を行う。羊膜由来間葉系幹細胞(MSC)は、出産時に廃棄される卵膜に存在していることが知られており、次世代の再生医療材料として期待されている。申請者らは、ヒト卵膜から短期間でMSCを分離培養する技術を確立し、その細胞を炎症性疾患発症動物モデルに投与したところ、その病態を有意に抑制していることを明らかにしてきた。しかしながら、羊膜MSC由来のどのような因子が、さまざまな炎症性疾患を抑制しているのかの詳細は明らかにされていない。近年、魚油などに含まれるエイコサペンタエン酸(EPA)やドコサエキサエン酸(DHA)などの多価不飽和脂肪酸は、人体で合成されない必須脂肪酸として知られており、これらの多価不飽和脂肪酸は、主に生体内では細胞の脂質二重膜に存在し、細胞膜の柔軟性などを規定している。細胞膜への刺激が加わると、EPAならびにDHAは、ホスホリパーゼA2 (PLA2)により膜から細胞質内に遊離され、その後、代謝される。細胞質内に遊離されると、細胞内でEPA由来レゾルビン、ならびに、DHA由来プロテクチンに代謝され、これらの代謝物における抗炎症効果が知られている。さらに近年、炎症性早産誘導性マウスモデルにおいて、EPA、ならびに、その代謝物であるレゾルビンの投与が早産を有意に抑制させることが報告され、生体におけるEPAならびにレゾルビンの摂取が早産を予防する重要な因子であると想定される。申請者らはこれまでに、複数の組織由来MSCを培養すると、正常羊膜由来MSCのみで、レゾルビンが産生されること、また、その産生に関連するPLA2の遺伝子発現が培養時間とともに上昇することを明らかにしている。申請者らは、羊膜MSC内で代謝産生されるEPA-レゾルビン産生経路が早産における重要な予防因子であると考え、その詳細を明らかにすることで早産における新規治療法の開発を探索する。平成30年度では、EPAならびにその代謝産物がもたらす早産予防効果の可能性を探索するために、羊膜由来MSC内EPAならびにその代謝産物の網羅的解析を行った。具体的には、ヒト正常由来胎児付属物を細切して、コラゲナーゼ(200 U/ml)を添加し、37°Cで1時間振盪する。その後、10%胎児ウシ血清含有培養液にて培養し、MSCを分離培養する。培養後、1×107個の細胞を回収し、有機溶媒を用いた前処理後、液体クロマトグラフ質量分析(LC-MS)、ならびに、超臨界流体クロマトグラフィー質量分析(SFC/MS)を用いてMSC内に含まれるEPAを解析した。結果としてMSC内には、EPAが存在していること、また、それに付随した代謝物の存在が明らかとなった。一方で、今年度実施予定にしていたヒト早産由来MSCならびに羊水の解析については、対象ドナーの検体が確保できなかったため次年度以降への実施を予定している。そのため、平成31年度に予定していた項目について実施した。具体的には、妊娠7日目のラットを用いて、10mgのEPAを1日1回の割合で妊娠17日目まで連続投与する。その後、ラットの羊膜を採取し、コラゲナーゼ(200 U/ml)を添加し、37°Cで1時間振盪する。
地震時の機能保持を目的とした建築の安全性のレベル決定支援システムの開発

1.兵庫県南部地震による被害調査報告書の分析兵庫県南部地震後に日本建築学会および建設会社が行った被害調査の報告書から,人的被害の発生が予想される外壁材・ガラス・天井取り付け物・内装材の被害,ドアの変形,防火区画の破綻,家具類の転倒等の被害事例を抽出し,予想される被害の様相別に分類・体系化を行った。2.阪神間の公共施設を対象とした地震による被害状況の調査不特定多数の人が利用する公共施設の地震被害をヒアリング等により明らかにし,被害箇所と被害内容を図面に記録・整理し、建築計画の視点からみた問題点を整理した。3.地震時の被害を軽減する建築計画手法の検討建築計画からみた地震被害の軽減を「人的被害の防止」,「二次災害の防止」,「地震後の機能維持」,「地震後の機能回復」の4点に集約し,それぞれについて建築計画による事前および事後の対策を検討した。4.まとめ(1)当初考えていた「地震時の建築の安全のレベル決定」は,日本建築学会が1998年1月16日に「建築および都市の防災性能向上に関する提言(第三次」で示した耐震メニュー案に近いものであるが,耐震安全のレベルに対して社会一般の理解と合意を得るには,情報開示や内容のわかりやすい表現が必要である。(2)地震時の被害を軽減する建築計画手法の多くは,建築における省エネルギー手法,物理的耐用年数の延長手法(耐震性の向上を含む),機能的耐用年数の延長手法との共通点が多く見出された。(3)本研究で示した「地震時に対応する建築計画手法」は,その他の災害にも通じるところが大であり,本研究が「非常時を想定した建築計画」に発展していく可能性が見出された。1.強震時には,建物の一部を壊して全体の崩壊を防ぐという耐震設計の考え方と,防火区画形成・避難経路確保の考え方の違い,耐震設計に対する一般の理解の違い等を整理した。2.アンケートの結果および被害報告書等の分析から,建物のユーザー・オーナーあるいは意匠・設備設計者と構造技術者の耐震に対する考え方の違いを整理した。3.建築に関する専門知識が豊かと考えられる30歳以上の建築学会会員1,000人を対象に,建物内の避難施設・防災設備の地震被害による危険性の認識と被害の許容程度に関するアンケートを実施した。(1)避難障害や火災拡大要因となる被害が生じないようにする設計目標震度が,現在の耐震水準を震度階で1階級程度上回るものが多く,専門家が現行の水準を不十分とする意識が読みとれる。(2)今後は設計目標震度を7にすべきという評価が最も多い被害項目が存在するものの,今後の設計目標震度の最頻階級が震度7とならないものもあるのは,専門家の工学的判断の結果が現れたものであろう。建物のオーナーやユーザーと専門家の間のみならず,意匠・設備設計者と構造設計者という建築の専門家の間にさえ存在する,耐震性能に対する認識や期待内容のギャップを明確にすることは,耐震安全性を正しく議論するために不可欠である。また、ユーザー・オーナーの立場から求められる安全性のレベルを決定する要因を抽出する必要があると考える。
漢字語彙の運用力を育成するためのカリキュラム開発に関する研究

本研究は、漢字学習について、【評価方法の開発】【理解・表現方略の記述】【漢字学習カリキュラムの開発】を行うことで、漢字の「読字力」「書字力」「運用力」の育成に資するカリキュラムを開発することを目的とするものである。具体的な方法としては、【評価方法の開発】【理解・表現方略の記述】を1年次・2年次に行うとともに、2年次以降は中学校におけるカリキュラムの試験的な実施を行い、その結果についての分析・考察をもとにカリキュラム改訂を経て、成果の公表・配信を行う。
受精卵移植法による口唇口蓋裂発生の母体環境因子の解析

I.マウスにおける同系及び異系母体間で受精卵移植を行い,子宮内に着床,成長した胎仔における先天異常発生率を口唇口蓋裂(CL/P),心血管系,胸腺の異常について検討した結果,以下の諸点が確認された.1.先天異常発生率の高い系の受精卵でも,先天異常発生の低い系の母体に受精卵移植することによりCL/P,心血管系,胸腺の異常発生が抑制された.2.先天異常が自然発生しない系の遺伝子を持つ受精卵は,先天異常の発生率の高い系の母体に受精卵移植を行っても先天異常は発生しなかった.3.多発家系内の多発奇形においても,多因子遺伝病が環境要因の変化により抑制可能であることが示唆された.II.A/J系マウスに,妊娠2週間前から妊娠13日目まではヒト成人1日0.8mg相当量,妊娠14日目から18日目までは0.4mg相当量となるように濃度調整した葉酸を経口投与し,胎仔の体重とCL/Pの発生に与える影響について検討し,以下の結果を得た.1.死亡吸収率は,対照群12.3%,実験群(0.8mg投与群)10.2%と両者に有意差はなかった.2.胎仔の平均体重は,10mg投与群と1mg投与群では対照群と比べて有意に減少したのに対し,0.8mg投与群では対照群との間に有意差を認めず,減少傾向を示さなかった,3.CP単独例の発生率は,10mg投与群と1mg投与群で対照群と比べて有意な減少が認められたのに対し,0.8mg投与群では抑制効果が示されなかった.4.CL/Pの発生率は,10mg投与群,1mg投与群,0.8mg投与群のすべてで,対照群との間に有意差を認めず,減少傾向を示さなかった.これらの結果から,妊娠前から器官形成期までは0.8mg相当量,胎仔発育期では0.4mg相当量の葉酸の投与により,胎仔の体重の減少を防ぐことができた.今後さらに検討することで,CL/Pの予防効果も期待できると考えられる.I.マウスにおける同系及び異系母体間で受精卵移植を行い,子宮内に着床,成長した胎仔における先天異常発生率を口唇口蓋裂(CL/P),心血管系,胸腺の異常について検討した結果,以下の諸点が確認された.1.先天異常発生率の高い系の受精卵でも,先天異常発生の低い系の母体に受精卵移植することによりCL/P,心血管系,胸腺の異常発生が抑制された.2.先天異常が自然発生しない系の遺伝子を持つ受精卵は,先天異常の発生率の高い系の母体に受精卵移植を行っても先天異常は発生しなかった.3.多発家系内の多発奇形においても,多因子遺伝病が環境要因の変化により抑制可能であることが示唆された.II.A/J系マウスに,妊娠2週間前から妊娠13日目まではヒト成人1日0.8mg相当量,妊娠14日目から18日目までは0.4mg相当量となるように濃度調整した葉酸を経口投与し,胎仔の体重とCL/Pの発生に与える影響について検討し,以下の結果を得た.1.死亡吸収率は,対照群12.3%,実験群(0.8mg投与群)10.2%と両者に有意差はなかった.2.胎仔の平均体重は,10mg投与群と1mg投与群では対照群と比べて有意に減少したのに対し,0.8mg投与群では対照群との間に有意差を認めず,減少傾向を示さなかった,3.CP単独例の発生率は,10mg投与群と1mg投与群で対照群と比べて有意な減少が認められたのに対し,0.8mg投与群では抑制効果が示されなかった.4.CL/Pの発生率は,10mg投与群,1mg投与群,0.8mg投与群のすべてで,対照群との間に有意差を認めず,減少傾向を示さなかった.これらの結果から,妊娠前から器官形成期までは0.8mg相当量,胎仔発育期では0.4mg相当量の葉酸の投与により,胎仔の体重の減少を防ぐことができた.今後さらに検討することで,CL/Pの予防効果も期待できると考えられる.1.精卵移植法に口唇口蓋裂発現能を有する受精卵の非発生系マウスへの移植実験仮親を前回確立させた方法に準じ、精管結紮した雄C57BLを使用して偽妊娠マウスを作成した。1)受精卵採取としては口唇口蓋裂自然発生マウスを自然交配させ、妊娠3日目に子宮、卵巣、卵管を摘出し、桑実胚/胚盤胞の状態の受精卵を採取した。2)予備実験の結果より決定した方法に従い、培養液を作成し、これにEDTA-2Na、β-M.E.を加え濾過滅菌を行った。3)あらかじめ作成した仮親に対して、摘出培養液で発生させた受精卵を全身麻酔科にてマイクロマニピュレータ手術顕微鏡下で卵巣真上より切開を加えて、約200μmのピペットを用いて胚盤胞を一頭につき8個移植した。4)娠18日目に帝王切開し、胎仔を取り出し、外表奇形の確認をした上で、胎仔を屠殺せず、従来より我々の行っている手法に従い育種した。5)上記1)4)の実験を繰り返し100頭の胎仔を得て、コントロールをする口唇口蓋裂発現率を算出した。

2.結果口唇口蓋裂(CLIP)の発生率1)対照群(A/J→A/J)では生存胎仔数109例中7例(6%)に、第1群(A/J→C57BL/5)では110例中2例(2%)にCL/Pを認めたが、第2群(C57BL/5→A/J)では111例中にCL/P発生は認めなかった。内訳は唇顎口蓋裂(以下CLP)は対照群で4例(4%)第1群で2例(2%)、第2群すべてで0例、口唇裂単独例(以下CP)は対照群で3例(3%)、第1群、第2群で0例であった。(有意差なし)2)心血管系、胸腺異常の発生率(表4)心血管系の異常は対照群で生存胎仔109例中5例(5%)に認められたのに対し、第1群では1例(0.9%)に認めたが、第2群では発生しなかった。(有意差なし)胸腺の異常は、対照群で生存胎仔109例中12例(11%)に認められたのに対し、第1群では1例(0.9%)に認め、第2群の0例と比較し有意な減少を認めた。精卵移植法に口唇口蓋裂発現能を有する受精卵の非発生系マウスへの移植実験昨年に引き続き、仮親を前回確立させた方法に準じ、精管結紮した雄C57BLを使用して偽妊娠マウスを作成した。1)受精卵採取としては口唇口蓋裂自然発生マウスを自然交配させ、妊娠3日目に子宮、卵巣、卵管を摘出し、桑実胚/胚盤胞の状態の受精卵を採取した。2)予備実験の結果より決定した方法に従い、培養液を作成し、これにEDTA-2Na、β-M.E.を加え濾過滅菌を行った。3)あらかじめ作成した仮親に対して、摘出培養液で発生させた受精卵を全身麻酔科にてマイクロマニピュレータ手術顕微鏡下で卵巣真上より切開を加えて、約200μmのピペットを用いて胚盤胞を一頭につき8個移植した。4)妊娠18日目に帝王切開し、胎仔を取り出し、外表奇形の確認をした上で、胎仔を屠殺せず、従来より我々の行っている手法に従い育種した。
うつ病患者の信念更新におけるネガティブバイアスの神経病態の脳画像研究による解明

うつ病患者が持つ自己・世界・未来に対する悲観的な見方はうつ病の発症や維持に大きな役割を果たしその背後にはネガティブな情報の認知処理を偏重するバイアスが存在する。このバイアスの脳内病態に関する過去の研究では扁桃体など辺縁系領域の異常が示唆されうつ病の脳内モデルの構築に貢献してきた。近年、与えられた情報から自己や世界に関する「信念」をアップデートしていく過程でもうつ病患者ではバイアスが存在することが明らかになってきたが、その脳内病態に関してはほぼ未解明である。本研究では機能的MRIを中心としたマルチモーダルな脳画像データ測定によってこの詳細を明らかにし、うつ病の病態解明前進への貢献を目指す。
オープン・イノベーションとメイカーズ革命時代における製造業の日本的創業モデル

本研究では、製造業のアントレプレナーシップ(起業活動)を促進する地域イノベーション・エコシステムの日本型モデルを提示した。具体的には、1東京圏におけるグローバル企業発のスピンオフ・ベンチャー創出モデル(大手電機メーカーのオープン・イノベーション事例)、2中山間地域におけるクラフト型のメイカーズ(個人のマイクロ製造業)の創業モデル、3地方拠点都市における多様な産業クラスターの形成モデル、といった三点である。いずれも、実践コミュニティの概念を導入して事例を分析した。その結果、アントレプレナーシップに対してネガティブな国民的制度の制約を乗り越えた、日本型の起業活動モデルを導出することができた。今年度は、所期の研究目的で言及した「アジア都市の成長とグローバル都市・東京のプレゼンス低下」に関する論文を執筆した。そこでは、世界経済の多極化・アジア経済のブロック化の動向について、「フラグメンテーション」「グローバル・バリュー・チェイン」「オープン・イノベーション/リバース・イノベーション」の鍵概念から実態を明らかにした。その上で、アジアの諸都市と東京のデータを分析し、アジア経済の中心がもはや東京ではない事を再確認した。欧米系の多国籍企業の多くは、中国の上海・北京にアジア地域統括本部を設置し、そこを中国市場向け・BOP市場向けの研究開発拠点としている。その一方で、欧米系の多国籍企業からの技術移転を進めた中国の現地企業が台頭し、中国発の多国籍企業が誕生する。中国政府と中国発の多国籍企業は連携して中国国内市場およびアジア市場を席巻し、さらに中国発の新しいルール・制度の構築を目指し、それがアジアの新しいブロック経済化の動きと軌を一とする。日系の多国籍企業の多くは、加工貿易モデルを未だに踏襲し、中国市場での現地化が進まない。「国家戦略特区」の指定を受けた東京都は国際都市の旗を掲げるものの、未だに古典的なグローバル・シティ論(フリードマンやサッセン)の枠内で議論し、中国発のアジアの新しいブロック経済化の動きを看過している。当初の研究計画では、オープン・イノベーションによる大企業とスタートアップ企業の連携関係などを見出し、日本の製造業の新たな創業モデルを見出すことにあった。そのため、ソニーや富士通など日本の大手電機メーカーに対する実態調査を進めたが、上記のような「グローバリゼーション再考/グローバル都市再考」を踏まえ、今後は中国発の多国籍企業に対する調査を進める必要がある。今年度は、研究計画に掲げたとおり、大企業のオープン・イノベーションの実態とスピンオフ・ベンチャーとの連携状況について調査を行った。その調査結果にもとづき、「東京圏におけるグローバル企業発のスピンオフ・ベンチャー叢生ー大手電機メーカーの事例を中心に」というテーマにて、日本中小企業学会全国大会で報告し、その上で、同テーマでの論文を執筆した(査読受理)。この論文では、長山(2012)での仮説を実証することに加えて、大手電機メーカーを母体組織とするスピンオフ企業家が国際的企業家精神を発揮し、BGC(Born Global Companies)のようにスタートアップ期から早期国際展開を実施する事例を新たな事実発見として示した。以上に加え、今年度も引き続き、地域経済学・「グローバル都市」研究の観点から、上海に立地する外資企業(多国籍企業)のリバース・イノベーションに関する調査を行った。その調査結果にもとづき、日本比較経営学会において「中国市場における日系多国籍企業のイノベーション」というテーマにて報告した。今後、国際経営論(多国籍企業論)とアントレプレナーシップ論(ベンチャー企業論)を接合するBGC研究について深めていくが、その際には、グローバル都市研究(地域経済学)の観点から実際の事例を分析していくことに意義がある、と見出せた。研究計画に掲げた「オープン・イノベーションによる大企業とスタートアップ企業の連携関係」については、大手電機メーカーを事例に実態調査を進め、その調査結果にもとづく学会発表および論文執筆(査読受理)を実施できた。これまで筆者の主な研究対象であったスピンオフ・ベンチャーに加えて、今年度は、BGC(Born Global Companies)の事例を新たに見出せた。このことにより、研究計画に掲げた「製造業の日本的創業モデル」の新たな展開へとつなげることが出来た。その一方で、研究計画に掲げた「メイカーズ革命とデジタル起業家」に関する調査は十分に進んでいない。今年度は、「メイカーズ」の定義の再考から始めた。クリス・アンダーソン(2012)によれば、「メイカーズ」は、趣味人、デザイナー、発明家、職人などの個人も「作り手」ならば全て対象となる。また、こうした個人の作り手が、WEBや3Dプリンターなどデジタルツールを活用することにより容易に量産化のプロセスを辿って、ハイテクでイノベーティブな製造業(ベンチャー企業)まで成長する現象を「メイカーズ革命」と呼んだ。このアメリカ発の「メイカーズ」の定義では、生産ロットの大小で成長ステージを区別しており、創業の準備段階の「シード期」と創業後の「創業期・成長期」との区別がない。日本の場合は、アメリカと異なり「起業の壁」が高いので、「メイカーズ」の対象を限定しなければ論点が見えなくなる。そこで、本研究では、メイカーズの対象をシード期の起業家予備軍と捉え直した。その上で、「メイカーズ」から「ベンチャービジネス」へと成長し、日本の製造業(ハードウェア分野)の創業が増えていく条件とは何か、といったリサーチ・クエスチョンを設定した。この問いに答えるため、近年の日本における「メイカーズ」の実態やベンチャービジネスの創業プロセスに関する調査を行った。その結果、各種メディアで取り上げられる日本のメイカーズの典型事例の実態は、スピンオフ・ベンチャー(長山,2012)であることが分かった。

また、ファブラボなど「メイカーズ」を支援するスペースを利用する会員の多くは、販売目的・事業化意識のないDIYに留まっており、「起業の壁」を超えてベンチャー企業を創業するケースが少ないことが分かった。したがって、日本の場合、アメリカ発の「メイカーズ革命」により製造業の新規開業数が増加するとは考えにくい。ただ、地方調査の結果、製造業の日本的創業モデルは、中山間地域の移住起業家によるハンドメイド型のマイクロ製造業の起業にあると捉えた。研究代表者が手術入院したことにより、予定していたアンケート調査の実施が遅れたため。また、アンケート調査の対象リストの作成に、想定外の時間を要したため。詳しくは、「補助事業期間延長承認申請書(2017年1月18日)」を参照のこと。本研究は、「メイカーズ革命」(アンダーソン2012)により、日本の製造業の創業は増えていくか、という問題意識から出発した。製造業の経営は、これまで生産手段を保有する企業のみの特権であった。ただ、近年、3Dプリンターなどデジタルツールの登場により、「個人」による製造業(メイカー)が成り立つ時代となった。しかしながら、日本の場合、労働・技術・金融の各領域における国民的制度の制約があって、起業活動(アントレプレナーシップ)は活発でない。アメリカ発のメイカーズ革命の議論のように、「量産化の壁」さえ乗り越えれば、容易に創業してベンチャー企業へと成長できる訳ではない。本研究では、日本の大都市圏と中山間地域におけるメイカーの実態を調査した。また、メイカーの聖地とされる中国(深セン)の実態を調査して比較分析した。その結果、日本の場合、「メイカーズ革命」によって、中山間地域における製造業の創業が増えることを見通した。それは、ベンチャービジネスの創業ではなく、成長性の低いハンドメイド・クラフト型のマイクロ製造業の創業である。中山間地域の中でも移住者の受入れに寛容な農村・集落において、マイクロ製造業の創業(移住起業家)が増えて集積する見通しを示した。その担い手は、職人やフリーランス的人材であり、日本型労働市場の制度的制約を受けにくい。また、農業・林業などの副業を持つことで、ローリスク・ローリターン型の創業を実現できる。こうした事実を天竜区春野町などで発見した。以上のように、本研究では、アメリカ発の「メイカーズ革命」を批判的に検討し、「メイカー」の用語を再定義したうえで、日本の国民的制度の制約を踏まえた個人製造業(メイカー)の創業モデルの一端を示した。「地方創生」や「働き方改革」の政策的含意を与える。2017年度は、こうした日本と中国のメイカーズに関する研究成果について、学会などで公表した。本研究では、製造業のアントレプレナーシップ(起業活動)を促進する地域イノベーション・エコシステムの日本型モデルを提示した。
圧受容器反射脳内機構の解析ー新しい組織化学的手法の応用

グルタミン酸伝達物質ならびに、神経シナプス興奮時に多シナプス的に発現される癌遺伝子の1つである、Cーfos発現蛋白質を免疫組織化学的に染色することにより圧受容器反射脳内機構の検討を行った。まず対照実験として、無麻酔ラット腹腔内ホルマリン液適用による疼痛刺激1時間後の脊髄切片において、Cーfos発現蛋白質が脊髄後角内に多数発現していることを認めた。これは即に報告されている結果と一致し、本実験方法の妥当性を証明している。次にラットを麻酔下に左側大動脈神経を電気刺激(50Hz、0.1msec、10分間)したのち1時間後のラット延髄切片を染色し、Cーfos発現蛋白質が弱いながら同側の孤束核に、ごくうすク延髄腹外側部に発現していることを認めた。Cーfos発現蛋白質の過剰によって吸着した後の抗Cーfos発現蛋白質抗体を使用した場合には全ったく染色ニュ-ロンの存在を認めなかった。無処置ラット延髄切片におけるグルタミン酸染色を行い、孤束核ならびに延髄腹外側部にグルタミン酸含有ニュ-ロンが密に存在することを認めた。ついでCーfos発現蛋白質とグルタミン酸の二重染色を試みた。グルタミン酸の染色には、Cーfos発現蛋白質の発色(褐色)と区別するためにジアミノベンチジンのかわりに4ークロロ-ノ-ナフト-ル(青色に発色)を使用した。しかし、この二重染色は現在のところ成功するに至っていない。これは、グルタミン酸とCーfos発現蛋白質の固定条件が異なることならびに、グルタミン酸染色自体のむずかしさに起因しており、さらに検討中である。以上、孤束核ニュ-ロンならびに延髄腹外側部ニュ-ロンがたしかに圧受容器反射に関与していること、両部位にはグルタミン酸ニュ-ロンが密に分布していることを明らかにした。この結果は、先の生理学的実験結果にもとずく推論をニュ-ロンレベルにおいて実証したこととなる。
組織特異的p19ARF遺伝子導入による口腔癌治療法の開発

平成13年度・研究報告1.ARF遺伝子をヒト舌由来扁平上皮癌細胞株NAおよびHSC-4に導入し、MDM2のmRNA発現についてRT-PCR法にて解析した。その結果、両細胞群ともにMDM2mRNAの発現減弱傾向が認められた。2.ARF遺伝子導入後の両細胞株におけるp53のmRNA発現についてRT-PCR法にて解析した結果、対照群と比較してp53mRNAの発現は増強傾向を示した。3.同様にP53蛋白の発現についてwestern blot法にて検討した結果、ARF遺伝子導入株ではP53蛋白の発現増強が認められた。4.ARF遺伝子導入細胞群の細胞増殖は対照群に比べ有意に抑制された。5.フローサイトメトリーによる細胞周期の検討において、ARF遺伝子導入細胞群ではG1期の細胞比率が上昇していた。以上の結果より、口腔扁平上皮癌細胞へのARF遺伝子導入により、MDM2阻害によるp53蓄積・安定化が示唆され、G1停止による細胞増殖抑制効果が認められた。
硬組織形成における薬物評価としてのラット切歯象牙質の応用

我々は、硬組織石灰化に対する薬効および毒性を評価する手段として、ラットの切歯象牙質を用いることの利点を示すいくつかの実験結果を報告した。切歯象牙質における石灰化の程度を、その未脱灰横断標本のコンタクトマイクロラジオグラフィーおよび脱灰標本のヘマトキシリン染色性によって評価した。象牙質の石灰化が既に抑制状態にある副甲状腺摘出ラットを用い、種々のカルシウム塩、ビタミンD代謝物および副甲状腺ホルモンの処置により切歯象牙質に再び生じた石灰化の程度を、それぞれの石灰化に対する治療効果の指標として用いた。この実験モデルは、象牙質形成を担う細胞の活力に及ぼす薬効をin vivoで評価するのに適した実験系と思われた。一方、正常ラット切歯象牙質の石灰化の抑制程度は、薬物の硬組織に対する毒性評価の指標とすることが出来た。この実験系において石灰化の抑制が認められたクロルプロマジンについて、血中カルシウムレベルに及ぼす作用、脱灰骨に対するミネラルの物理化学的な沈着に及ぼす作用および培養マウス歯胚における石灰化およびアルカリホスファターゼ活性に及ぼす作用を段階的に検討した。そして、この石灰化抑制が硬組織形成細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の抑制と関連していること、また、培養マウス歯胚におけるW5およびW7との作用の比較から、クロルプロマジンの石灰化抑制に、カルモジュリンを介した作用が関与していることを示唆した。さらに、骨吸収の亢進している卵巣摘出ラットにて、HEBPの骨および象牙質石灰化に対する作用を同時に検討し、骨密度を改善した条件でも、象牙質石灰化を明らかに抑制することを示した。これらの結果は、硬組織におけるコラーゲンマトリックスの石灰化に及ぼす薬効を研究する上で、象牙質が有用であることを示している。今年度は、ラット切歯象牙質の石灰化を観察するのにコンタクトマイクロラジオを用い、硬組織形に対する薬効を評価した。実験Iでは、顕著な石灰化抑制を示すビタミンD欠乏副甲状腺摘出(PTX)ラットに、25ー(OH)D3(25D,50u/d)の単独またはPTH(20u/d)との併用投与、1,25(OH)2D3(1,25D,5u/d)およびPTH(60u/d)のそれぞれ単独投与を5日間行った。25DとPTHとの併用投与は、1,25Dと同様に血中カルシウム値を上昇させ石灰化を回復させた。しかし、25D単独投与ではいずれも回復しなかった。一方、高用量のPTH(60u/d)は、血中カルシウム値を上昇させなかったが石灰を回復させた。実験IIでは、正常ラットにチオフェン(125,250,500mg/kg)、アスピリン(0.25,0.5,1.0g/kg)インドメタシン(10,20,40mg/kg)、カルチトニン(12.5,25,50u/kg)、HEBP(2,8,32mg/kg)、テトラサイクリン(50,100,200mg/kg)、レセルピン(2.5,5,10mg/kg)、クロルプロマジン(10,50,250mg/kg)、ニフェジピン(40,200,1000mg/kg、クロニジン(25,50,100mg/kg)を7日に一度の割合で三回、順次用量をあげて投与した。また、薬物投与後の血中カルシウム値を経時的に調べた。チオフェン、アスピリンおよびカルチトニンは、血中カルシウム値の低下に極めて良く対応した石灰化の抑制を示した。一方、HEBPテトラサイクリン、レセルピン、クロルプロマジンおよびクロニジンは、血中カルシウムの低下を伴わない石灰化の抑制を示した。

これら実験IおよびIIの結果は、PTXラットや正常ラットの切歯象牙質が薬物による硬組織形成促進および硬組織形成障害をみるのに極めて簡便に精度よく評価できる生体材料であることを示した。さらに、硬組織形成に及ぼす効果がカルシウムの変動に基づかないことが判明した。薬物に関しては、次年度に石灰化能を有する歯胚および骨芽細胞にて器官および細胞レベルでの薬効を検討する。昨年度は、ラットにおける種々の薬物による切歯象牙質の形成障害の有無と血中CaおよびP濃度の変動について検討した。本年度は、血中CaおよびPの変動を伴わないで象牙質形成障害を来たしたクロルプロマジン(CPZ)に注目し、そのin vitroでの作用を調べ、薬物による硬組織形成障害を体系的に検討した。まず、CPZの物理化学的石灰化抑制作用について、脱灰骨を用いた石灰化モデルについて検討した。ラットの脱灰済み大腿骨を血液のミネラル組成に等しい無機塩溶液に浸し、CPZと同じく物理化学的石灰化抑制作用を持つビスホスフォネート(HEBP)の石灰化物の骨における再沈着に対する効果について比較した。0.1mMHEBPは石灰化物の沈着を著しく抑制したにもかかわらず、同じ濃度のCPZは抑制せず、CPZの硬組織形成障害が物理化学的な石灰化抑制に因らないことが示された。そこで、石灰化能を有する培養歯胚においてCPZの作用を検討した。歯胚の象牙芽細胞の機能および石灰化の指標として、歯胚中のアルカリホスファターゼ(ALP)活性およびCa含有量をそれぞれ測定した。1μMおよび10μMのCPZは培養7日目のALP活性およびCa含有量を著しく低下させた。さらにカルモジュリン拮抗薬のW7は、CPZ同様にALP活性およびCa沈着を強く抑制した。しかし、W7に比べカルモジュリン拮抗作用の弱いW5は石灰化抑制作用も著しく弱かった。以上の結果は、CPZによる石灰化障害が硬組織形成細胞のALP活性の抑制と関連すること、また、カルモジュリンを介した作用であることを示唆した。来年度は、硬組織形成細胞の機能マーカー酵素であるALPがエクトエンザイムであること、また亜鉛含有のメタロエンザイムであることに注目して、骨芽細胞におけるALP活性と石灰化とを関連させて検討し、一連の研究成果をまとめる計画である。昨年度までにラット切歯象牙質が硬組織形成における薬効評価に有効であるか否か検討し、PTXラットや正常ラットの切歯象牙質が薬物による硬組織形成促進およびその抑制を観察するのに極めて簡便に且つ精度よく評価できる生体材料であることを示した。また、ラット切歯象牙質の石灰化を抑制した薬物のうち血中のカルシウムおよびリン濃度に影響を及ぼさなかったクロルプロマジン(CPZ)に注目し、その作用部位および作用機序を検討した。その結果、CPZによる石灰化抑制作用は硬組織の形成を司る細胞に直接影響を及ぼした結果と考えられ、カルモジュリンを介したアルカリホスファターゼ(ALP)活性の抑制に関連している可能性を示した。本年度は硬組織形成細胞におけるALPの生理的役割について検討を加えた。硬組織形成細胞の機能マーカー酵素であるALPは亜鉛含有のメタロエンザイムであり、最近このALPがホスファチジルイノシトールをアンカーとして細胞膜の外側に局在していることが示されている。
マイクロ充填粒子の形態・強度・界面制御による高分子材の高強度・多機能化

充填粒子が充填高分子材の高強度・多機能化に重要な役割を果たしている.本研究では,充填粒子の強度・形態・界面状態の影響を全般的に考慮できるモデルを構築し,数値シミュレーションにより,高分子材の基本設計指針を与えることを目的とする.上記研究期間中の研究実績として,まず,マクロスケールの充填高分子材の変形応答に大きく影響するマイクロスケールの充填粒子と高分子母材界面における界面効果に着目し,実験観察結果に基づき,マイクロスケールの充填粒子と高分子母材界面の変形挙動をモデル化した.次に,界面の変形挙動に平均化操作を行い,充填粒子と高分子母材との相互作用を評価可能な界面のモデルを構築した.ついで,構築したモデルと分子鎖網目モデルを用い,均質化法を導入することにより,マイクロ・メゾ・マクロ領域における充填高分子材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,軟質な界面は母材部のクレージングの発生を抑制できることを明らかにした.充填粒子の形態の影響について,二種類の充填高分子材を対象とし,検討を行った.まず,キャビテーションの寸法依存性を考慮したゴム粒子充填ポリマー材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,キャビテーションの発生しない小粒子は母材部の塑性変形を促進せず,周りの局所的な変形挙動に従い,形を変化することを明らかにした.次に,カーボンブラックのミクロ構造を考慮した充填ゴム材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,凝集的なミクロ構造を有する充填ゴム材の変形抵抗とヒステリシスロスが大きいことを明らかにした.さらに,高分子材の粘弾性特性を起因する分子鎖のすべり変形挙動を再現可能なモデルの構築を試みた.充填粒子が充填高分子材の高強度・多機能化に重要な役割を果たしている.本研究では,充填粒子の強度・形態・界面状態の影響を全般的に考慮できるモデルを構築し,数値シミュレーションにより,高分子材の基本設計指針を与えることを目的とする.上記研究期間中の研究実績として,まず,マクロスケールの充填高分子材の変形応答に大きく影響するマイクロスケールの充填粒子と高分子母材界面における界面効果に着目し,実験観察結果に基づき,マイクロスケールの充填粒子と高分子母材界面の変形挙動をモデル化した.次に,界面の変形挙動に平均化操作を行い,充填粒子と高分子母材との相互作用を評価可能な界面のモデルを構築した.ついで,構築したモデルと分子鎖網目モデルを用い,均質化法を導入することにより,マイクロ・メゾ・マクロ領域における充填高分子材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,軟質な界面は母材部のクレージングの発生を抑制できることを明らかにした.充填粒子の形態の影響について,二種類の充填高分子材を対象とし,検討を行った.まず,キャビテーションの寸法依存性を考慮したゴム粒子充填ポリマー材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,キャビテーションの発生しない小粒子は母材部の塑性変形を促進せず,周りの局所的な変形挙動に従い,形を変化することを明らかにした.次に,カーボンブラックのミクロ構造を考慮した充填ゴム材の変形挙動の数値シミュレーションを行い,凝集的なミクロ構造を有する充填ゴム材の変形抵抗とヒステリシスロスが大きいことを明らかにした.さらに,高分子材の粘弾性特性を起因する分子鎖のすべり変形挙動を再現可能なモデルの構築を試みた.
ｑNMRに基づく相対感度係数を利用した新しい食品品質評価法の確立

食品中の機能性成分、食品添加物、残留農薬などの有機化合物の含量は、品質評価における重要な値の一つとして扱われる。多くの場合、試料となる食品の抽出物は、複数の成分が共存したものである。したがって、定量法には、分離分析に優れたクロマトグラフィーが広く利用されている。しかし、クロマトグラフィーから得られる分析値の信頼性は、使用した分析種の標品の純度に依存する。本研究は、定量用標品の拡充が遅れている食品衛生分野において、分析値の信頼性を確保するための検討を行っている。具体的には、定量NMR(qNMR)を用いて、クロマトグラフィー条件下における代替定量用標品に対する分析種の相対モル感度(RMS)を決定し、分析種の定量用標品不要なクロマトグラフィー(RMS法)を確立する。今年度は、天然酸化防止剤ローズマリー抽出物の品質評価へ応用した。昨年度に検討した手順にしたがい、認証標準物質が市販されているジフェニルアミン(DPA)を代替定量用標品として、HPLC/PDAにおけるDPAに対する抗酸化物質カルノソール(CL)およびカルノシン酸(CA)のRMSを決定した。ローズマリー抽出物を試料として、確立したRMS法を評価した。従来法である検量線法から求めたローズマリー抽出物中のCLおよびCA含量を100としたとき、DPAを内標準とするRMS法から得られた相対含量は9798(CL)、101103(CA)であった(検量線は、qNMRでCL試薬およびCA試薬の純度を決定し、その純度を考量して作成した)。RMS法は、その正確性はもちろん、定量用標品が入手できない場合のクロマトグラフィーとして運用が可能であった。したがって、代替定量用標品や分析条件の情報を共有することで、定量用標品供給不足の問題にとらわれることなく、RMS法を公的な分析法として展開することが期待できた。本研究では1H-qNMRを利用して、クロマトグラフィー検出器における、任意の基準物質に対する分析対象物質の相対モル感度(Relative Molar Sensitivity:RMS)を算出する。そしてRMSを、認証標準物質(CRM)が入手できない機能性表示食品や食品添加物のクロマトグラフィーに展開し、分析対象物質のCRMを必要としない分析法を開発し、さらに本法を公定分析法として運用する際の注意すべき点や課題点の抽出を試みる。今年度は、天然添加物コチニール色素の主成分カルミン酸(CA)を分析対象物質、CRMが入手できるカフェイン(CAF)を基準物質とする、HPLC/PDAにおけるRMSをモデルにして、主にRMSのHPLC装置間差について検討した。CA市販試薬とCAF市販試薬の混合試料を1H-qNMRとHPLC/PDAに付し、PDA検出器における両者の応答比を、1H-qNMRから求めたモル比で補正しRMSを求めた。PDA検出器における応答比は、5つの装置(1台はHPLC-UV)を用いて求めた。CAとCAFに共通する極大吸収波長274nmを検出波長とした際、RMSの装置間差は相対標準偏差(RSD)として1.8%であった。一方、CAFの検出波長を274nm、CAの検出波長を可視部の極大吸収波長494nmにした際のRSDは3.2%で、274nmだけを検出波長とした際のRSDより大きかった。この原因として、各HPLC装置のPDAスペクトルの分解能および各波長の光強度の差異が考えられた。RMSを利用したHPLC/PDAを公的な分析法として展開する際、基準物質は、分析対象物質と同じ波長に極大吸収を示す物質を選択することが、試験機関間における分析値のバラつきを小さくするために重要であることを示した。今年度は、当初の計画通りクロマトグラフ間におけるRMSのバラつきについて、具体的な例を挙げて考察することができた。RMSを利用するクロマトグラフィーを公定分析法に展開する際に注意すべき点が抽出できたといえる。よって、おおむね順調に進呈しているといえる。

従来法である検量線法から求めたローズマリー抽出物中のCLおよびCA含量を100としたとき、DPAを内標準とするRMS法から得られた相対含量は9798(CL)、101103(CA)であった(検量線は、qNMRでCL試薬およびCA試薬の純度を決定し、その純度を考量して作成した)。RMS法は、その正確性はもちろん、定量用標品が入手できない場合のクロマトグラフィーとして運用が可能であった。したがって、代替定量用標品や分析条件の情報を共有することで、定量用標品供給不足の問題にとらわれることなく、RMS法を公的な分析法として展開することが期待できた。引き続き、分析対象物質のCRMが流通していない機能性表示食品や食品添加物に対して、RMSを利用したクロマトグラフィーを適用し、本法の有用性を示していく。当初予定していた海外旅費が、別の予算で支出できたため。次年度使用額については、標準試薬、HPLC分析カラム、重溶媒などの購入に充てたい。
組織再生のための細胞封入ファイバースキャホールドの創製技術の開発

塩化カルシウム溶液内に押出した軟骨細胞混合アルギン酸ナトリウム(SA)をドラムで巻取ることでシート状のファイバースキャホールドを作製する紡糸技術を開発した.軟骨細胞がファイバー内で一様に分布し,巻取り速度とトラバース速度を変えることでファイバーピッチと細胞ピッチが制御できることを確認した.スキャホールド内において,低細胞密度ではコラーゲンは局在したが,高細胞密度では一部のコラーゲンがファイバー状に分布する様子が確認された.EDTA処理によりスキャホールドからSAを除去した場合,細胞ピッチ33.7±15.1 μmのスキャホールドにおいて産生された細胞外基質によりファイバー構造が維持された.軟骨細胞を封入したファイバーを集積させることにより,軟骨細胞の均一な分布と一様な再生組織の形成を促すため,軟骨細胞混合アルギン酸ファイバーシートの紡糸技術の開発を行った.ブタ大腿骨より単離した軟骨細胞を混合した培養液にアルギン酸ナトリウム(SA)を溶解させ,1.0 w/v%のSA溶液を作製した.アルギン酸ファイバーの作製のために,SA溶液を押出すシリンジ,SA溶液を固化させるための塩化カルシウム水溶液バスおよび巻取りドラムで構成される自作の紡糸装置を作製した.SA溶液の押出しにはシリンジポンプを使用した.シリンジの先端には,ガラス製のマイクロニードルを装着した.シリンジを用いてSA溶液を塩化カルシウム水溶液内に押出すことで,アルギン酸ファイバーを作製した.巻取り時にはファイバーを左右にトラバースさせることでシートを作製した.開発した紡糸装置を用いて細胞を封入したアルギン酸ファイバーによるシート状スキャホールドが作製可能であった.トラバース速度と巻取り速度を調整することにより,ファイバーの直径およびピッチの調整が可能であった.また,細胞密度の調整により細胞間距離の調整が可能であった.巻取り速度とトラバース速度を途中で変更することで,軟骨の階層構造を模擬するように異なるファイバー密度を有する2層構造のスキャホールドを作製した.位相差顕微鏡により上下層でファイバー密度が異なる様子が観察された.多光子励起顕微鏡により細胞の分布を観察した結果,高密度層では低密度層の約1.5倍の細胞が観察され,紡糸条件を調整することで異なる細胞密度を有する2層構造のスキャホールドが作製できることが示された.また,スキャホールド内に存在する生細胞の割合は88.5%であり,軟骨細胞封入アルギン酸ファイバースキャホールドにおいて紡糸過程では細胞死が引き起こされないことが示された.研究実施計画として細胞を封入したポリ乳酸ファイバーをエレクトロスピニング法により作製する計画であった.乾燥環境下において培養液を内部溶液に使用した2重ノズルのエレクトロスピニングでは安定した中空構造が形成されず,また紡糸後の死細胞も多く観察された.この結果に基づき研究計画で検討していた別途手法として湿環境下で紡糸可能なアルギン酸ファイバーの作製に取り組んだ.紡糸装置の設計・作製を行い,軟骨細胞を封入したアルギン酸ファイバーの作製に成功した.また,細胞密度,巻き取り速度,トラバース速度を調整することで,ファイバー密度の異なるスキャホールドの作製を可能とし,異なる細胞密度を持つ2層構造のスキャホールドの作製を可能とした.以上より,概ね順調に進展していると評価できる.軟骨細胞を封入したアルギン酸ファイバーを集積させることにより軟骨細胞の均一な分布と一様な再生組織の形成を促すため,軟骨細胞封入アルギン酸ファイバースキャホールドによる培養軟骨の作製技術の開発を行った.昨年度は,軟骨細胞を封入したアルギン酸ファイバーによるシート状スキャホールドを作製する紡糸装置を開発し,トラバース速度と巻取り速度を調整することにより,ファイバーの直径およびピッチの調整が可能であることを示した.今年度は,さらに均一な細胞分布を得るためにファイバー径を小さくすることに取り組むとともに,生体軟骨組織に近い厚みをもつ細胞封入ファイバーによる培養軟骨の作製と培養軟骨の長期培養を試みた.ノズル径と巻取り速度を調整することで,ファイバー径を減少させファイバー内部での軟骨細胞の凝集を低減することが可能であった.また,巻取り時間を長くすることで培養軟骨の厚みを厚くすることや,巻取り速度とトラバース速度を途中で変更することで生体軟骨の階層構造を模擬するように異なるファイバー密度(細胞密度)を有する2層構造の培養軟骨を作製することが可能であった.多光子励起顕微鏡により培養軟骨内の細胞分布を観察した結果,ファイバー密度が高い層ほど細胞密度が高くなっていること,スキャホールド内に存在する生細胞の割合は約89%となりファイバースキャホールド作製時に細胞死が引き起こされないことが確認された.一方で,ファイバーの巻取りテンションによって培養軟骨の厚みと細胞密度を巻取り時間によって線形的に制御することが困難であった.長期培養においては,細胞外基質の産生が観察され,軟骨細胞封入アルギン酸ファイバースキャホールドにおいて紡糸過程では細胞活性の低下が引き起こされないことが確認された.しかし,培養過程におけるコンタミネーション発生など紡糸作業における清潔維持といった問題を改善する必要がある.研究実施計画として,昨年度に開発した軟骨細胞封入アルギン酸ファイバーの創製技術を用いて軟骨細胞封入ポリ乳酸ファイバーによる培養軟骨の構造化技術を開発する計画であった.開発した軟骨細胞封入ファイバーの湿式紡糸技術によりシート状の培養軟骨スキャホールドの作製が可能となった.また紡糸条件の検討により,培養軟骨の厚みや細胞密度の調整が可能であったが,紡糸時のファイバー巻取りテンションの影響によりその調整範囲は制限された.作製した軟骨細胞封入ファイバーによる培養軟骨の長期培養を試みたが,コンタミネーションを起こすことがあり,紡糸行程における清潔操作の改善が必要であることが分かった.以上より,やや遅れていると評価した.

軟骨細胞を封入したアルギン酸ファイバーを巻取ることにより,3次元網目構造を有する軟骨細胞混合アルギン酸ファイバー構造体の作製技術の開発を行った.ファイバー作製用材料としてアルギン酸ナトリウム(SA)を採用した.ブタ大腿骨より単離した軟骨細胞とSAを培養液に混合することで細胞混合SA溶液を準備した.開発したSAファイバー紡糸装置を用いて,塩化カルシウム溶液槽内に押出した細胞混合SA溶液をドラムで巻き取り,ファイバーをトラバースさせることでシート状の軟骨細胞封入SAファイバー構造体を作製した.蛍光顕微鏡観察により,細胞密度の増加に伴い細胞間距離が短くなり,細胞生存率は83%以上を示すことを確認した.14日間培養した構造体の多光子励起顕微鏡(MPM)観察より,細胞密度が低い場合はコラーゲンが細胞周囲に局在したが,細胞密度が高くなると一部のコラーゲンがファイバー状に分布する様子が確認された.また,サフラニンO染色からも,細胞周囲に産生された細胞外基質がファイバーに沿って産生されており,ファイバー状の組織の形成が確認された.EDTAの添加によりSAを除去した構造体をサフラニンO染色により観察した結果,細胞間距離約33.7μm以下で産生された細胞外基質により構造体の形態が維持された.これらより,本研究で開発した軟骨細胞封入SAファイバー構造体により産生された細胞外基質のみで3次元構造の軟骨組織の作製が可能であることが示唆された.塩化カルシウム溶液内に押出した軟骨細胞混合アルギン酸ナトリウム(SA)をドラムで巻取ることでシート状のファイバースキャホールドを作製する紡糸技術を開発した.軟骨細胞がファイバー内で一様に分布し,巻取り速度とトラバース速度を変えることでファイバーピッチと細胞ピッチが制御できることを確認した.スキャホールド内において,低細胞密度ではコラーゲンは局在したが,高細胞密度では一部のコラーゲンがファイバー状に分布する様子が確認された.EDTA処理によりスキャホールドからSAを除去した場合,細胞ピッチ33.7±15.1 μmのスキャホールドにおいて産生された細胞外基質によりファイバー構造が維持された.次年度は,今年度までに開発した細胞封入アルギン酸ファイバーの作製技術を発展させ,さらに安定したファイバー形状や細胞ピッチを可能とするよう紡糸装置の改良を進める.また,作製した細胞封入アルギン酸スキャホールドの長期培養を行い,培養過程における細胞活性や細胞外基質の産生と組織構造の形成について評価を行い,細胞封入ファイバーの有効性について評価を行う.次年度は,今年度までに開発した軟骨細胞封入アルギン酸ファイバースキャホールドの作製技術を発展させ,さらに安定したファイバー形状と細胞ピッチの調整を伴う培養軟骨の作製を可能とするよう紡糸装置の改良を進める.また,作製した軟骨細胞封入アルギン酸ファイバースキャホールドの長期培養が可能となるよう,清潔環境下での紡糸行程の検討と紡糸装置の改善を進める.