hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性呼吸器疾患に対するグレリン治療の開発研究

本研究では、グレリンの難治性呼吸器疾患における病態生理学的意義を基礎と臨床の両面から解析した。進行期肺癌患者において、化学療法前の血漿グレリン値と化学療法に伴うQOL障害の程度に逆相関があることを見出した。慢性呼吸不全患者にグレリンを投与する容量探索試験を行い、栄養状態と運動耐用能の改善を得た。基礎研究として、グレリン投与は急性肺損傷モデルマウスに対して、肺炎症細胞浸潤と肺線維化と肺上皮細胞のアポトーシスを軽減し、用量依存性の生存率改善作用があることを見出した。以上の結果から、グレリンは難治性呼吸器疾患に対する治療方策として有用である可能性が示唆された。本年度は(1)肺癌患者のグレリンの病態生理学的意義の解明、(2)補完医療による内因性グレリン誘導の検討、(3)慢性呼吸器疾患患者に対するグレリンの臨床応用、(4)肺傷害モデルマウスを用いた線維化と二次性高血圧に対するグレリンの効果の評価を行った。(1)進行肺癌患者26例と健常人49例で血漿アシルグレリン、デスアシルグレリンを測定した。健常人では血漿総グレリンが41.4fmol/mlで、肺癌患者では90.7fmol/mlと有意に上昇していた。多変量解析では、肺癌の有無が血漿総グレリン上昇を予測する独立した因子であった。さらに、化学療法で体重が減少した患者では内因性グレリン産生が増えていた。(2)慢性呼吸器疾患のため、食思不振を訴える患者を対象とした。六君子湯を4週間内服し、内服前、4週間内服後、内服終了4週後に評価を行った。17症例の中間的な解析では、食欲スコアは内服前に比較して内服終了時に有意に改善しており、終了4週後では内服前と有意差を認めなかった。血漿総グレリン、アシルグレリン、デスアシルグレリンは症例間でばらつきが大きく、内服前、終了時、終了4週後で統計学的な有意差を認めなかった。(3)慢性呼吸不全患者にグレリンを投与する用量探索試験を行い、6症例のエントリーを得た。全症例の平均で、摂食量が1640から1775kcal/day、体重が41.7から42.8kg、6分間歩行距離が287から332mへ増えた。グレリン投与により、栄養状態と運動耐容能が改善した可能性が示唆された。(4)ブレオマイシン肺傷害モデルマウスではグレリン投与により、14日後の生存率に有意な改善を認めた。グレリン投与マウスでは組織学的に急性期の炎症細胞浸潤とその後の線維化が抑制され、肺内における炎症性サイトカイン産生が有意に抑制されていた。(1)手術不能進行肺癌患者において、化学療法開始後14日間の血漿グレリンの動態を測定した。アンケートにより食欲、倦怠感、気力、嘔気の程度を評価しグレリン値の動態と比較した。また、化学療法前と14日後のQOLをEORTC, QOL C30で評価し、グレリン値との相関を検討した。化学療法中の血漿グレリンは、QOL障害と平行した動態を示した。化学療法によってEORTC functionスコアが増悪しなかった症例では、化学療法前の血漿グレリン値が低く、経過中に血漿グレリン濃度が上昇した症例ではEORTC functionスコアが増悪する傾向にあった。これらの結果は、グレリンの抗カヘキシア作用と考えられた。(2)食思不振を訴える慢性呼吸器疾患患者を対象とし、六君子湯を4週間投与した。17症例の解析では、食欲スコアは内服前に比較して内服終了時に有意に改善しており、終了4週後では内服前と有意差を認めなかった。血漿総グレリン、アシルグレリン、デスアシルグレリンは症例間でばらつきが大きく、統計学的な有意差を認めなかった。(3)慢性呼吸不全患者にグレリンを投与する用量探索試験を行い、9症例のエントリーを得た。全症例の平均で、摂食量が1784から1968 kcall day、体重が45.4から47.9kg、6分間歩行距離が244から298mへ増えた。(4)ブレオマイシン肺傷害モデルマウスではグレリン投与により、用量依存性に生存率の改善を認めた。また、pair-fedアッセイにより、グレリンによる肺傷害モデルマウスの生存率改善効果は、摂食量増加作用に非依存性であることが明らかになった。さらに肺上皮細胞のアポトーシスはグレリン投与により有意に減少することを明らかにした。
In vitro analysis of the effect of HLA-matching on neural cell transplantation using iPS cell-based culture system

パーキンソン病に対し人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来ドパミン神経前駆細胞による細胞移植治療の治験が本邦で開始された。一方、移植されたドナー神経がホスト脳の神経と機能的なシナプスをどのように形成していくのか、また移植細胞が免疫反応を乗り越えてホスト脳にどのように生着していくのかということは詳細には解明されていない。ヒト多能性幹細胞研究の進歩により各種神経細胞、およびその他の脳の構成細胞(グリア、ミクログリア、脳血液関門等)を誘導する事が可能となった。ヒト脳での特定神経細胞とその周辺細胞の相互作用(シナプス形成や免疫反応など)を解析できるin vitroのシステムが構築できれば、神経科学、医療応用に貢献できる。本研究ではドパミン神経前駆細胞移植の脳内環境を例にヒト細胞でのin vitroモデル系を構築し、移植後のドナー・宿主間のシナプス形成、および脳での免疫反応(特にミクログリアの関与に注目)のメカニズムを解明する。パーキンソン病への移植治療では、移植されたドパミン神経は宿主の被殻に存在するmedium spiny neuron (MSN)とシナプスを形成し、機能を発揮すると考えられている。治験で使用するHLAホモ型iPS細胞と同型のiPS細胞株を含め、複数のiPS細胞、ES細胞からMSNおよびドパミン神経を誘導した。このように誘導したhiPSC-MSNとhiPSC-DAをculture deviceを用いて共培養する系を確立した。今後はこれらの組み合わせにより自家移植、他家移植、HLA適合移植の組み合わせについて、シナプス形成や神経突起の伸長などについて解析していく予定である。hiPS細胞からMSN誘導について既報の方法を複数試した。株による差もあり安定した系を確立するのに時間を要した。免疫染色、分子学的アプローチを用いてシナプス形成などを中心に解析を進める。また、脳に存在するmicroglia, gliaなどについても誘導系の確立を進めていく。
高次複合光応答分子システムの開拓と学理の構築

電子励起状態分子には、一般に、1高位励起状態から最低励起状態への迅速緩和、2集合系における多数励起分子間の高速励起子消滅、3光吸収の選択則によるアクセス可能な電子状態の限定など、光の有効利用に対して共通の制限が存在する。これらの超克をめざし、励起手法や分子・分子集合体、反応場・反応網の開拓・発展させ、従来の“1光子吸収と1分子応答"を超える“複合励起と複合光応答"の学理構築、光子有効利用を可能とする高次光機能集合系の構築と、今後の光利用関連諸課題における共通基盤の確立を目的として展開した新学術領域の研究成果を整理・体系化し、今後の光科学分野の研究の持続的発展に必要な課題を明確にする。
平面グラフの分枝分割アルゴリズムのより広いクラスへの拡張

種数g≧1の向き付け可能表面に埋め込まれたグラフの分枝分割に対する近似度(1+2g/3)のアルゴリズムを開発した。この結果は、同様なグラフの分枝幅bw(G)と面幅fw(G)の間にbw(G)≧(3/2)fw(G)の関係が成り立つことを示すことにより得られた。また、平面グラフGの分枝幅と最大の格子マイナーの大きさgm(G)の間にbw(G)≦3gm(G)が成り立つことを示し、それに基づいた平面グラフの分枝分割の高速定数近似アルゴリズムを開発した。Gを平面上に描画されたグラフとし、Gの辺eとfがその描画において交差しているとしよう。Gからeとfを除いたグラフをG'とするとき、eとfがG'のひとつの面のなかに描かれているならば、eとfの交差は単純であるということにする。すべての交差が単純であるように平面上に描画されたグラフを単純交差グラフということにしよう。今年度は、分枝幅と関連した刻み幅(Carvingwidth、研究計画参照)に対する次の予想の証明の詳細を埋めることに努力を傾注した。予想:単純交差グラフGの刻み幅は、平面グラフの場合と同様なねずみ捕りゲームの勝敗によって特徴づけられる。検討の結果、予想は正確な形で成り立つわけではないことが判明した。修正された予想は次の通りである。修正予想:単純交差グラフGの刻み幅は±1の範囲で、平面グラフの場合と同様なねずみ捕りゲームの勝敗によって特徴づけられる。この修正予想の証明はほぼ完成し、現在詳細を詰めているところである。また、この他に平面グラフの分枝幅に対する高速な近似アルゴリズムをQiangping Gu教授とともに開発した。このアルゴリズムの実行時間は0(n^{1+\epsilon})であり、近似率は定数以下である。Gをグラフとするとき、bw(G)によって、Gの分枝幅を表す。また、gm(G)によってGがg×g格子グラフをマイナーとして含むような最大の整数gを表す。我々はすべての平面グラフGに対してbw(G)≦3gm(G)+1が成り立つことを示した。これは、Robertson, SeymourとThomasによる不等式bw(G)≦4gm(G)の改良である。定数3から4への改良は、この不等式に基づいたアルゴリズムの多くにおいて、この定数が実行時間を表す関数の指数部に現れるために重要である。我々の証明は構成的であり、平面グラフの最適分枝分割を求める問題と最大格子マイナーを求める問題の双方に対して2次時間の定数近似アルゴリズムを与える。近似比は最適分枝分割問題に対しては2+εであり、最大格子マイナー問題に対しては3+εである。ここでεは任意の正定数である。我々はまた、上の不等式のタイトさについても調べた。k×hシリンダーとはk頂点の閉路とh頂点経路のデカルト積であり、C_<k,h>で表す。我々はbw(C_<2h,h>)=2gm(C_<2h,h>)=2hが成り立つことを示した。したがって、上の不等式の定数3は、最良の定数の3/2以下である。また、この不等式の証明を基礎とする、より高速な近似アルゴリズムも開発した。また、無向グラフの辺を向き付けし、与えられた複数の始点終点対の間の有向距離をできるだけ短くする最適化問題を考察し、NP完全である場合と多項式時間アルゴリズムを持つ場合の分類を行った。トーラス面に埋め込まれたグラフの分枝幅に対する5/3近似アルゴリズムを開発した。これは、既知最良の(ほぼ自明な)2近似アルゴリズムに対する改良である。この結果は、次のような組み合わせ的な定理に基づいている。グラフGの分枝幅をbw(G)で表し、またトーラスに埋め込まれたグラフGの非分離最短ヌースの長さをns(G)で表す。ここで、Gのヌースとは、トーラス面上の自己交差のない閉曲線でGとの交わりがGの頂点においてのみ起きるようなものを言う。また非分離とは、その閉曲線がトーラス面を切断しないことを言う。ヌースの長さは、その上にあるGの頂点の個数である。このとき、我々は不等式(3/2)ns(G)≦bw(G)が成り立つことを証明した。この定理は、一般の向き付け可能表面に埋め込まれたグラフに拡張することができ、その拡張に基づいて、表面の種数をkとするとき、そのような表面に埋め込まれたグラフの分枝幅に対する(5/3)k近似アルゴリズムを得ることができる。この結果はRobertsonとSeymourによる、平面に埋め込まれたグラフの分枝幅の斜面(slope)による特徴付けのInkmannによる一般の表面への拡張に基づいている。この結果は、Simon Frasor大のQian-Ping Gu教授との共同研究の成果である。
新型クーロン爆発質量分析器による大気微量成分測定法の開発

チタンサファイアフェムト秒レーザーの基本波出力を、分子線中の分子に照射し、解離性多重電離によって生成する娘イオンの反跳速度ベクトルを速度マップ二次元画像観測法によって測定する新しい質量分析法を開発した。同手法は、娘イオンの速度ベクトルが親分子の構造について有用な情報を与えることから、構造の似通っている分子を質量分析した際に、解離性電離によって同じような娘イオンを発生しても、反跳速度ベクトルから化学種の同定が可能になる可能性がある。本研究では、N2Oから生成する窒素原子とOCSから発生する硫黄原子の速度マップを比較し、前者が3つの分布、後者が2つの分布になることから分子内に同一元素が一つあるか二つあるかまで判定できることを示した。また、フェムト秒の時間分解能で行う、光電子画像観測法をも開発した。同手法によって、ピラジン分子の光イオン化動力学を詳細に検討した。基本的な分子、窒素、酸素、NO、OCS等の分子のクーロン爆発を行い、解離生成物である多価イオンの散乱分布を画像化した。ほとんどの場合、生成イオンの分布はレーザーの偏光方向に先鋭な極大を有し、解離以前に親分子がレーザー場中で整列していることを明確に示した。3原子分子では、解離途中での分子変形が無視できないため、中心に存在する原子の散乱が1横方向に起こった。このようなレーザーパルス幅内での分子運動を最小に抑える目的で、非共線型の光パラメトリック発振器を用いたレーザーシステムを新たに導入したが、その動作は実験室内の温度変化に敏感であるため、温度の安定化を試みた。超音速分子線中の分子をフェムト秒レーザーで励起電子状態の複数の回転状態にコヒーレントに励起し、回転波束の時間発展を光電子画像の強度と角度分布の変化から観測する方法を開発した。回転波束は光励起直後に分子軸をcos^2θの精度で整列させるが、異なる角運動量成分の干渉が起こり、高速に等方的分布に変わる。回転温度20Kのピラジン分子の場合、これは2.8psであった。同論文は、光電子角度分布を分子固定系で測定する新手法として注目され、Physical ReviewLettersに現在印刷中である。強レーザー場を導入することで、回転波束の角運動量成分を増やすことが出来るため、分子の空間配向(整列)をより先鋭に確立することも可能である。今後の発展が期待される。この他、平成12年度には、真空紫外光を発生する新しい装置を設計し、現在組み上げている。液滴分子に対して超強レーザーパルスを導入し、非線形光学過程によって発生する真空紫外光を分光器で選択的に取り出し、これまで軌道放射光などの大がかりな設備を必要とした実験を小さな装置で可能にする。この真空紫外光で、分子を高効率にイオン化し質量分析を行う装置を実現する計画である。フェムト秒レーザーを照射した際に起こるクーロン爆発を、光励起分子の化学反応を実時間的に追跡する手段として利用することを考え、フェムト秒パルスの時間幅を従来の100fsから30fs以下に圧縮した。具体的には、チタンサファイアレーザーの出力800nmを倍波に変換し、非直線型の光パラメトリック素子を用いて波長変換し出力をプリズムコンプレッサーにて圧縮した。その結果、自己相関関数、交差相関関数共にパルス幅30fs以下が得られている。Pump-probe実験としては、NOの2量体の紫外光解離を研究した。まず200nmのフェムト秒パルスで二量体を光励起し、300nm付近のフェムト秒パルスを遅延時間を変えながら照射し、二量体の励起状態や生成物であるNOの励起状態からの光イオン化を行い、その際に発生する光電子角度分布を測定した。反応は、1ピコ秒以内に完結し、光電子角度分布は等方的で低エネルギの分布から、異方的で高エネルギーの分布へと時間変化した。また、probe光の波長を変えた際の変化についても定量的に考察した。
蛍光抗体法による生殖細胞形成における特異的分裂の解析

被子植物花粉の発生過程では、小胞子における細胞内核移動と不均等分裂、生殖細胞と栄養細胞の分化、生殖細胞の花粉管内分裂など、細胞の分裂・分化に関連した特徴的な事象が生起する。本研究では、これらの事象に対する微小管、アクチンおよびミオシンの関連性を各種蛍光抗体法および薬物阻害実験により解析した。1.微小管:(1)ヌマムラサツキユクサの間期小胞子細胞で2回の核移動がおきるが、微小管は不均等分裂に不可欠な2回目の核移動にのみ関与する。(2)不均等分裂に関連した非対称的紡錘体および隔膜形成体を形成する。(3)生殖細胞の伸長に関与するが、花粉管伸長には関与しない。(4)エビネ他数種の生殖細胞分裂では、中期染色体が紡錘体軸に沿ってタンデム配列し、後期では紡錘体伸長により逆平行的に分離するという特異な分裂様式に対応した紡錘体を形成する。2.Fーアクチン:(1)小胞子細胞の隔膜形成体内に出現する。(2)核移動や不均等分裂には関与しない。(3)小胞子分裂後、栄養細胞の核の両側より発達し始め、成熟花粉粒では多量で複雑なネットワ-クをつくる。(4)このFーアクチンは花粉管の発芽・伸長と原形質流動に関与するが、生殖細胞分裂には関与しない。以上より、花粉発生過程における微小管とアクチンの分布、細胞機能に対する関与の仕方は両者間で異なることが明らかになった。3.ミオシン:(1)ムラサキツユクサ他2種の花粉の生殖細胞と栄養細胞内顆粒の表面に分布する。(2)アクトミオシンATPア-ゼ活性阻害剤であるNーエチルマレイミド処理により、すべての花粉管内運動と花粉管伸長が阻害される。以上より、生殖細胞と細胞顆粒の花粉管内運動はアクトミオシン系関与であることが示唆された。なお、栄養細胞核についてはミオシンの分布様式が3種間で著しく異なるため、さらに研究継続中である。被子植物の花粉形成過程では、小胞子の不均等分裂により生殖細胞と栄養細胞を、生殖細胞の分裂により2個の精細胞を、また栄養細胞は花粉管を形成する。本年度は主に、小胞子の不均等分裂、不均等分裂に不可欠な細胞内核移動、生殖細胞分裂における染色体のタンデム配列等に対する微小管とアクチンの関連性を、間接蛍光抗体法およびコルヒチン(Col)、サイトカラシンB処理(Cyt・B)法により解析した。ヌマムラサキツユクサの小胞子では、分裂前に2度の核移動がおきるが、特に2度目は不均等分裂に不可欠である。この核移動では、移動に同調した多量の微小管再配列がおき、またColにより阻害されることから微小管関与であることが明らかになった。1度目の移動には微小管は関与しない。小胞子分裂での微小管の動態は、根端細胞など通常の分裂に類似するが、紡錘体は両極間で非同調的に発達しその形態も非対照的で、隔膜形成体が生殖核側に湾曲するなど不均等分裂に関連した特徴を示す。成熟花粉粒では生殖細胞は著しく伸長し、その長軸方向に微小管が多数配向する。この伸長はColにより阻害された微小管関与であることを示す。栄養細胞には微小管はほとんどない。

花粉管内における生殖細胞分裂では、ハナニラ、ミドリアマナの紡錘体はほぼ通常の構造であるが、エビネ類、ヌミムラサキツユクサでは染色体のタンデム配列に関連し、半紡錘体同士がオ-バラップした特異な構造をとる。アクチンは小胞子の中間期前期の核周辺と隔膜形成体に局在し紡錘体にはほとんどない。また、Cyt・Bは2度の核移動とも阻害しない。成熟花粉粒ではアクチン繊維が栄養細胞に大量に蓄積し、生殖細胞にはほとんどない。伸長中の花粉管内にはアクチンと微小管がその長軸に配向しCyt・Bにより原形質流動と花粉管伸長が阻害され、Colではともに阻害されない。即ち、花粉管の伸長生長にはアクチンが重要な役割を果たしている。1.近年、多くの植物細胞で微小管とアクチンの相互に関連した分布・機能が報告されている。本年度は、昨年度にひきつづき、花粉の発生過程における微小管とアクチンの動態について蛍光抗体法およびロ-ダミン・ファロイジン染色法によりさらに詳細な比較解析を行った。(1)小胞子および生殖細胞分裂における紡錘体にはFーアクチンは存在しない。(2)小胞子分裂における隔膜形成体にFーアクチンが存在するが、隔膜形成体の湾曲した発達様式には関与しない。(3)生殖細胞の伸長には微小管が関与し、アクチンは関与しない。(4)花粉管内では微小管とアクチンが全長にわたりオ-バ-ラップして分布するが、花粉管伸長および原形質流動にはアクチンのみ関与する。以上および昨年度の結果より、花粉発生過程における微小管とアクチンの分布、機能様式は一部関連するが多くの過程で異なることが明らかになった。2.花粉細胞の分化には分裂極性が重要な役割をはたしている。花粉粒内における分裂軸決定の機構を解明するため、予備実験として、カフェイン処理によりネギ根端に多核および融合核細胞を誘導し、それらの分裂軸決定に関与する微小管のPreーprophase band(PPB)の構築様式を蛍光抗体法により解析した。(1)2核細胞ではそれぞれの核に対し1本ずつのPPB、2核をとり巻く1本のPPB、近接する2核のほぼ中央に1本のPPB、2核のうちの一方のみに1本のPPBが発達する4型に大別される。(2)前2型では、それぞれの核に対し2個、計4個の前期紡錘体極が形成されるが、後2型では、明瞭な極は2核をはさむ両極にに2個のみが観察される。(3)融合核細胞では、1個の融合核に対し1本のPPB、平行な2本のPPB、交さする2本のPPBの3型。(4)その他、4核細胞や融合核を含む多核細胞では、PPBの複雑な構築様式が観察される。被子植物の花粉管にはアクチンが存在し、花粉内細胞器官にはミオシンが分布することから、花粉管内原形質流動はアクトミオシン系関与であることが示唆されている。本研究は被子植物の受精過程における生殖細胞および栄養細胞核の花粉管内運動機構を解析するため、ムラサキツユクサ、ヌマムラサキツユクサおよびハナニラ花粉におけるミオシンの動態を抗ーミオシン間接蛍光抗体法およびアクトミオシンATPア-ゼ活性阻害剤であるNーエチルマレイミド処理実験により解析した。用いた3植物の生殖細胞と栄養細胞内顆粒の表面に、ミオシンが存在し、ムラサキツユクサの生殖細胞では細胞長軸に沿って線状に、他2種ではぼ均一に分布する。ムラサキツユクサにおけるこの分布は、花粉管におけるアクチンの配向によく対応したパタ-ンと考えられる。しかし、栄養細胞核においては3種間で異なり、ムラサキツユクサではミオシン由来の蛍光が生殖細胞と同程度の強さで核表面に均一に検出されるが、ヌマムラサキツユクサでは生殖細胞にくらべて弱く、また、ハナニラではほとんど検出されない。ヌマムラサキツユクサおよびハナニラの成熟花粉粒を5mMN
心筋細胞のβ受容体依存性クロライドチャネルの新しい機能的役割

1.心室筋細胞のClチャネル電流モルモット心室筋細胞にswelling-activated chlorideCurrent(I_<Cl.swell>)があるかどうかを検討したところ、従来の報告と異なり、この標本に低張液によって誘発されるI_<Cl.swell>が高率に検出されることがわかった。2.細胞容積調節におけるCFTR Cl電流の役割の検討細胞容積の変化を観測できる方法の開発を試みた結果、精度の高い方法を開発できた。すなわち、CCDカメラで撮影した細胞像をコンピュータで高速処理し、細胞輪郭の占める面積を経時的連続的に算出する新しい方法である。この方法により次のような研究成果を得た。低張液を作用させることにより膨張させた細胞において、アドレナリンによりCFTR電流を活性化すると細胞の容積が減少すること(RVD)が確認された。いっぽう、CFTR電流は等張環境下においても細胞容積を変化させることが見出された。すなわち、さまざまなK濃度の等張外液中で細胞にアドレナリンを作用させると、510mMKの範囲では細胞容積が減少するが、40140mMKの範囲では細胞が膨張することが判明した。これらの効果は外液からのClの除去やClチャネルブロッカー、またアセチルコリンによって阻害された。これらの成績は、CFTR電流は背景K電流と協調することにより等浸透圧環境下においても細胞容積を調節しうることを示すものである。別の観点からみると、CFTR電流は細胞内溶質量の調節をしているとも考えられ、さまざまな生理的および病態生理学的な意義をもつ可能性がある。以上、二種のCl電流が心室筋細胞の容積調節に関与していることが初めて示された。今後は、膜電位測定や電位固定法を併用し、これら電流の生理的役割についてさらに詳しく検討する予定である。1.心室筋細胞のClチャネル電流モルモット心室筋細胞にswelling-activated chloride Current(I_<Cl.swell>)があるかどうかを検討したところ、従来の報告と異なり、この標本に低張液によって誘発されるI_<Cl.swell>が高率に検出されることがわかった。1.心室筋細胞のC1チャネル電流まずCFTR電流と比較するため、モルモット心室筋細胞にswelling-activated chloride current(I_<C1,swell>)があるかどうかを検討した。その結果従来の報告と異なり、この標本に低張液によって誘発されるI_<C1,swell>が高率に検出されることがわかった。すなわち、I_<C1,swell>とCFTR電流とが協調的に何らかの役割を果たしている可能性が示された。2.細胞容積調節におけるC1電流の役割の検討まず細胞容積の変化を測定するための装置を開発した。細胞の厚みを測定するため、細胞上と細胞周囲に微小なマーカーを置き、それらの垂直距離を顕微ビデオ画像上で測定した。すなわち、顕微鏡対物レンズを一定速度(15μm/s)で上下させながらマーカー像の明度変化をビデオ画像上でフォトトランジスターにより測定すると、それぞれのマーカー明度はそれぞれの焦点面上で最も低くなるので、これを利用して(二点測定)それらの垂直距離、すなわち細胞の厚みを知ることができた。この方法は従来の一点測定に比較して信頼度の高いものである。そこで、細胞に低張液を作用させると細胞の厚みが増加し、さらにアドレナリンによりCFTR電流を活性化すると細胞の厚みが減少することが観察された。すなわちCFTR電流は細胞容積調節に関与していることが確認された。次に、細胞を低張液で刺激しながらI_<C1,swell>のブロッカーであるDIDSを作用させると、細胞の厚みがさらに増加することが観察された。これは、I_<C1,swell>も細胞容積調節に関与していることを示すものである。以上、二種のC1電流が心室筋細胞の容積調節に関与していることが初めて示された。

昨年度の研究で、簡便な細胞厚み測定装置を用いることにより、モルモット心室筋細胞においてCFTR Cl電流が細胞容積調節に関与していることが示唆された。そこでこの現象をより詳しく解析するために細胞容積の変化を精密に測定できる実験方法を開発した。すなわち、CCDカメラで撮影した細胞像をコンピュータで高速処理し、細胞輪郭の占める面積を経時的連続的に算出する新しい方法である。この方法により細胞容積の変化を迅速に観測することが可能になり、次のような研究成果を得た。低張液を作用させることにより膨張させた細胞において、アドレナリンによりCFTR電流を活性化すると細胞の容積が減少すること(RVD)は、今回の方法によっても確認された。いっぽう、CFTR電流は等浸透圧環境下においても細胞容積を変化させることが見出された。すなわち、さまざまなK濃度の等張外液中で細胞にアドレナリンを作用させると、510mMKの範囲では細胞容積が減少するが、40140mMKの範囲では細胞が膨張することが判明した。これらの効果は外液からのClの除去やClチャネルブロッカー、またアセチルコリンによって阻害された。これらの結果は、CFTR電流は背景K電流と協調することにより等浸透圧環境下においても細胞容積を調節しうることを示すものである。別の観点からみると、CFTR電流は細胞内溶質量の調節をしているとも言えるのであって、さまざまな生理的および病態生理学的な意義をもつ可能性がある。以上、CFTR Cl電流が心室筋細胞の容積調節まはた溶質濃度調節に関与していることが示された。今後は、膜電位測定や電位固定方を併用し、これら電流の生理的役割についてさらに詳しく検討する予定である。
竹炭マットの利用による人体への効果

竹炭マット使用ベッド(マットレス・竹炭マット[竹炭約2.5kgを不織布に一様に分布させてあるもの]・シーツ)と、竹炭マット非使用ベッド(マットレス・綿マット・シーツ)の2つのベッドを用いて、竹炭マットが人体にどのような効果を与えるのか、仰臥位臥床にて実験を実施した。1実験時間は120分間である。被験者は事前に実験内容を説明し、承諾を得た3369才の女性14名である。測定項目は腰部表面皮膚温(ヤコビー線と脊柱の接点から3cm左側の点)・手掌温(手掌中央,MP-PIP関節中央,PIP-DIP関節中央の3点)・血圧・脈拍・血流・ECGである。1人の被験者につき、竹炭マット使用ベッド・竹炭マット非使用ベッドの両方とも実験実施した。実験結果は実験開始030分、4575分、90120分間の平均値、及びそれらの差を求めた。(1)腰部表面皮膚温については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの6例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの4例(4例はデータが取れなかった)であった。手掌温(3点の平均)については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの7例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの7例であった。(2)脈拍数については、最終的に竹炭マットの方が多かったもの4例、綿マットの方が多かったもの10例であった。(3)血圧値については、最高血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの6例、綿マットの方が高かったものは8例であった。最低血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの6例、綿マットの方が高かったもの8例であった。(4)血流量については、最終的に竹炭マットの方が流量の多かったもの6例、綿マットの方が多かったもの6例(2例はデータが取れなかった)であった。実験の結果、腰部表面皮膚温・手掌温・血圧・血流については、竹炭マットと綿マットとの差は顕著には表れなかった。脈拍数については、竹炭マットと綿マットとの差が顕著であった。だが、実験例が14例と少ないため、データ数を増やしていく必要があると考える。ECGについては、検討中である。竹炭マット使用ベッド(マットレス・竹炭マット[竹炭約5kgを不織布に一様に分布させてあるもの]・シーツ)と、竹炭マット非使用ベッド(マットレス・綿マット・シーツ)の2つのベッドを用いて、竹炭マットが人体にどのような効果を与えるのか、仰臥位で臥床して実験を行った。1実験の時間は120分間である。被験者は事前に承諾を得た、2163才の女性12名である。測定項目は腰部表面皮膚温(ヤコビー線と脊柱の接点から3cm左側の点)・手掌温(手掌中央,MP・PIP関節中央,PIP・DIP関節中央の3点)、血圧・脈拍・血流である。1人の被験者につき、竹炭マット使用ベッド・竹炭マット非使用ベッドの両者とも実験を実施した。実験結果は実験開始4560分、7590分、105120分の平均値、及びそれらの差を求めた。(1)腰部表面皮膚温については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの6例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの4例、差のなかったもの1例であった。手掌温(3点の平均)については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの3例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの7例であった。(2)脈拍数については、最終的に竹炭マットの方が多かったもの5例、綿マットの方が多かったもの6例であった。(3)血圧値については、最高血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの5例、綿マットの方が高かったものは6例であった。最低血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの7例・綿マットの方が高かったもの4例であった。(4)血流量については、最終的に竹炭マットの方が流量の多かったもの5例、綿マットの方が多かったもの6例であった。脈拍数・最高血圧・血流量の最終的な差について、竹炭マット5例,綿マット6例となるもの多かったが、同一の被験者ではなかった。今後は、生体の緊張やリラックスに関与する自立神経系に注目し、竹炭マットが自律神経系に及ぼす影響を分析するため、心拍変動解析も取り入れていきたい。測定項目は腰部表面皮膚温(ヤコビー線と脊柱の接点から3cm左側の点)

・手掌温(手掌中央,MP-PIP関節中央,PIP-DIP関節中央の3点)・血圧・脈拍・血流・ECGである。1人の被験者につき、竹炭マット使用ベッド・竹炭マット非使用ベッドの両方とも実験実施した。実験結果は実験開始030分、4575分、90120分間の平均値、及びそれらの差を求めた。(1)腰部表面皮膚温については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの6例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの4例(4例はデータが取れなかった)であった。手掌温(3点の平均)については、最終的に綿マットより竹炭マットの方が高かったもの7例、竹炭マットより綿マットの方が高かったもの7例であった。(2)脈拍数については、最終的に竹炭マットの方が多かったもの4例、綿マットの方が多かったもの10例であった。(3)血圧値については、最高血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの6例、綿マットの方が高かったものは8例であった。最低血圧が最終的に竹炭マットの方が高かったもの6例、綿マットの方が高かったもの8例であった。(4)血流量については、最終的に竹炭マットの方が流量の多かったもの6例、綿マットの方が多かったもの6例(2例はデータが取れなかった)であった。実験の結果、腰部表面皮膚温・手掌温・血圧・血流については、竹炭マットと綿マットとの差は顕著には表れなかった。脈拍数については、竹炭マットと綿マットとの差が顕著であった。だが、実験例が14例と少ないため、データ数を増やしていく必要があると考える。ECGについては、検討中である。
観光客の動機・満足度・再訪意向の関係とリピーター創造に関する研究

観光客の動機・満足度・再訪意向の関係とリピーター創造に関する研究として、主にベネフィット・セグメンテーション、満足度と再訪意向の関係、バラエティ・シーキング行動に焦点をあて進めた。研究対象は、日本人のほか東アジアからのインバウンドである。平成28年度は、それまでの研究成果を基に、旅行動機、満足度、再訪意向の関係について整理、先行研究のサーベイを行った。より自分の好みに合う観光地を探索するバラエティ・シーキング(VS)行動に着目した研究を進めることが、本研究の目的であるリピーター創造について重要であると考えるに至った。平成29年度は、訪日経験が2回以上の台湾人を対象にweb調査を実施した。旅行動機は「楽しむ」「リラックス」が主であるとわかった。満足度と再訪意向は高い傾向にあるが、次に行きたい観光地として日本以外を回答した人も多く、観光地の選択や再訪につながる動機、意向の関係をより深く追究することが重要という課題が明らかになった。平成30年度は、前年度の課題について、タイ、韓国、台湾の訪日経験者を対象に計27名にインタビュー調査を行った(中国本土は予定が合わず未実施)。その結果、訪日理由はビザの緩和、近い、安いが主であった。初回は団体ツアーで訪日し、満足度は高いが「好きなように回れない」という心残りがあった。2回目以降は団体ツアーは利用せず、自分たちの好きなように計画する傾向があり、それが日本の魅力ということだった。リピーターには、VS行動をする、毎回同じ観光地で同じことをするタイプがいた。また同じ観光地でも時期やメンバーが異なれば「再訪ではない」と考えていた。リピーター創造では多様かつ新規の体験メニューばかりでなく、いつ行っても同じように過ごせることも重要であることがわかった。また、グループで意思決定をする特徴があり、同行者の意見により訪問先を変えることが多くみられた。(1)平成26、27年度に受けた若手研究B(26870551)の成果に基づく検討本研究が対象とする予定の温泉客以外の日本人観光客、訪日外国人の分析に向けて、旅行動機項目を中心に検討した。温泉客を対象にした研究であったため、分析結果から旅行動機の特徴を精査した。その結果、必ず「リラックス」があり、日本人温泉客のリラックスとはなにか、について先行研究レビューも含めて研究した。また、ハワイ、沖縄の観光客の旅行動機について分析した結果から、同じカテゴリーと思われる観光地間の旅行動機の違いを検討した。これらの検討についてまとめた成果を国内外の学会で報告し、さまざまな助言等を得た。得た助言は、平成29年度の研究に活かす。(2)満足度、再訪意向・満足度、再訪意向について、先行研究のレビューを行った。旅行動機、満足度、再訪意向の関係を中心に研究するが、それらに関わると思われるライフスタイルについても先行研究をレビューした。先行研究のレビューに基づき、アンケート調査のみならず、口コミや感想の分析も重要であるという考えに至った。そのため、テキストマイニング用のソフトを購入し、分析に備えた。当初、これまでの研究に基づいて温泉観光客を対象に動機・満足度・再訪意向の関係を調査分析し、リピーターになるセグメントと特徴を明らかにする予定であった。しかしながら、新たに調査分析に着手するよりも、これまでの研究成果について、旅行動機について整理し、そこから得られる知見を精査したほうが、今後の研究に役立てられると判断した。そのため、平成28年度は調査を実施しなかった。一方で、満足度や再訪意向を把握するためには、アンケート調査のみならず、口コミや感想を分析することも必要と考え、定性分析の準備も始めた。本研究の目的は、旅行動機、満足度、再訪意向の調査分析を通じて、リピーターとなる客層を明らかにすることである。調査対象は、日本人のほか、訪日観光客(インバウンド)である。当初、平成29年度は温泉客以外の日本人観光客を対象に調査分析を行う予定であったが、インバウンドの急増やリピーターの重要性に対する観光地等の関心の高まりがあり、またこれまでの研究成果やインバウンドに関する先行研究をレビューし、インバウンドのバラエティ・シーキング行動に着目した研究を進めることが、本研究の目的であるリピーター創造についてより重要であると考えるに至った。そのため平成29年度にバラエティ・シーキング行動に関する基礎的な情報を得ることを目的に、インバウンドを対象にした調査を実施した。調査実施に向けて、これまでに複数回実施した日本人観光客を対象にした調査を基に、旅行動機、満足度、再訪意向について検討をした。具体的には、旅行動機、満足度、再訪意向の関係について分析、結果の考察を行ったほか、消費者行動論のひとつであるバラエティ・シーキング行動の観光への適用可能性について検討した。こうした検討を基に、訪日経験のある台湾人を対象にweb調査によりアンケート調査を実施した。その結果、Enjoy, Sports, Escape, Discover, Luxuryという旅行動機が抽出され、4つのセグメントに分かれた。また、満足度と再訪意向は総じて高い傾向にあるが、次に行きたい観光地として日本以外を回答した人も多く、観光地の選択プロセスや再訪につながる動機、意向の関係をより深く追究することが重要であるという課題が明らかになった。これらの検討についての成果は国内外の学会で報告し、さまざまな助言等を得た。また、日本人温泉客を対象にした研究については、2冊の書籍にそれぞれ1章分として掲載された。

平成29年度は、平成28年度に検討した旅行動機、満足度、再訪意向に関する研究成果を基に、インバウンドを対象にwebによるアンケート調査を実施し、分析した。同時に、回答者の海外旅行経験についても調査し、より自分の好みに合う観光地を探索するバラエティ・シーキング行動に関する基礎的な情報を得ることができた。満足度と再訪意向は総じて高い傾向にあるが、次に行きたい観光地として日本以外を回答した人も多く、観光地の選択プロセスや再訪につながる動機、意向の関係をより深く追究することが重要であるという課題が明らかになった。観光客の動機・満足度・再訪意向の関係とリピーター創造に関する研究として、主にベネフィット・セグメンテーション、満足度と再訪意向の関係、バラエティ・シーキング行動に焦点をあて進めた。研究対象は、日本人のほか東アジアからのインバウンドである。平成28年度は、それまでの研究成果を基に、旅行動機、満足度、再訪意向の関係について整理、先行研究のサーベイを行った。より自分の好みに合う観光地を探索するバラエティ・シーキング(VS)行動に着目した研究を進めることが、本研究の目的であるリピーター創造について重要であると考えるに至った。平成29年度は、訪日経験が2回以上の台湾人を対象にweb調査を実施した。旅行動機は「楽しむ」「リラックス」が主であるとわかった。満足度と再訪意向は高い傾向にあるが、次に行きたい観光地として日本以外を回答した人も多く、観光地の選択や再訪につながる動機、意向の関係をより深く追究することが重要という課題が明らかになった。平成30年度は、前年度の課題について、タイ、韓国、台湾の訪日経験者を対象に計27名にインタビュー調査を行った(中国本土は予定が合わず未実施)。その結果、訪日理由はビザの緩和、近い、安いが主であった。初回は団体ツアーで訪日し、満足度は高いが「好きなように回れない」という心残りがあった。2回目以降は団体ツアーは利用せず、自分たちの好きなように計画する傾向があり、それが日本の魅力ということだった。リピーターには、VS行動をする、毎回同じ観光地で同じことをするタイプがいた。また同じ観光地でも時期やメンバーが異なれば「再訪ではない」と考えていた。リピーター創造では多様かつ新規の体験メニューばかりでなく、いつ行っても同じように過ごせることも重要であることがわかった。また、グループで意思決定をする特徴があり、同行者の意見により訪問先を変えることが多くみられた。今年度は、温泉客以外の日本人観光客も対象として、旅行動機、満足度、再訪意向の関係について、調査分析を行う。対象は、平成30年度に訪日外国人を対象にすることを踏まえ、京都や北海道等いくつかの有名観光地の観光客を候補にする。また、国内外の学会や研究会で研究成果を報告し、助言等を得て、研究の向上を図る。リピーターを創造するために、まず再訪意向やバラエティ・シーキング行動を把握することが重要である。これらの行動を理解することなしに、効果的なリピーター創造や誘致策は検討できないと考えるためである。
能力的記憶活動における記憶モニタリングの正確度に関する実験的研究

本研究の目的は、人間が記憶活動を行う際に、記憶方略および記憶状態に対するモニタリング(監視)がぞの程度正確になされるかを実験心理学的手法により検討することにある。一般成人(大学生・短期大学生)を対象に、自由再生課題を用いた心理学的記憶実験を実施し、記憶モニタリングの正確度を明らかにする。記憶モニタリングに関連する実験測度として、(a)再生可能項目数の予想、(b)再生可能性判断、(c)学習容易性判断、の3つを取り上げる。それぞれの実験測度と実際の記憶課題成績とのズレの大きさを中心にデータ解析を行う。当初の研究計画のとおりに記憶実験が行われ、主として、次のような新たな知見が得られた。1.再生可能項目数の予想に反映される記憶モニタリングは、実際の再生成績に比べて、刺激項目の呈示速度などの実験変数の影響がさほどみられず、十分な感度(sensitivity)をそなえているとはいいがたい。2.しかし、再生可能項目数の予想による記憶モニタリングの正確度は、項目リストの学習の進行にともなって変化し得る。ただし、その正確度は必ずしも直線的に向上するわけではない。3.再生可能性判断と学習容易性判断とを比較検討したところ、実際の再生成績との相関は、再生可能性判断の方が学習容易性判断よりもやや高かった。4.再生可能性判断と学習容易性判断のいずれにおいても、その判断の正確である者が必ずしも記憶方略の選択に巧みであるとは限らない。上記の1と2の研究結果は、清水(1994)にまとめ公表した。同じく3と4の結果は、日本心理学会(1994)にて発表し、現在、論文を執筆中である。また、2の結果をさらに詳しく検討する実験を計画中である。
食後血糖制御に関わる小腸管腔内の自由水の生理作用解明に関する研究

これまで、食後血糖は消化管内容物の粘度との関係から説明されることが多かった。しかし、小腸内容物の粘度を上昇させないにも関わらず、食後血糖を緩和する水溶性食物繊維が存在する。一方、これまでの研究で、食後血糖は、消化管内容物中の糖の拡散に依存することがこれまでの研究から明らかである。本課題では、食後血糖を決定する新たな因子の探索を行った。その結果、不溶性食物存在下で糖の拡散は、粘度ではなく、ブラウン運動に影響を及ぼす水の拡散や自由水が関わっていることをベイジアンネットワークを用いて明らかにした。すなわち、糖の吸収速度は、水の拡散や自由水が関わっている可能性が不溶性食物存在下条件で示唆された。糖尿病の予防と治療において、食後血糖のコントロールは最重要課題である。しかし、小腸内容物の粘度を上昇させないにも関わらず、食後血糖を緩和する水溶性食物繊維がいくつも存在する。食後血糖は小腸での糖の吸収速度に依存する。これまでの研究から、小腸での糖の吸収速度は小腸管腔内での糖の拡散速度に依存することを数学モデルと動物実験から示してきた。一般的に、拡散速度は、粘度に依存すると言われている。一方で、拡散速度は、ブラウン運動にも依存すると言われている。ブラウン運動は、水の拡散速度や自由水の含量に依存する。そのため、糖の拡散が、粘度、拡散速度、自由水の含量のいずれに依存するかを体外実験で測定した。粘度が同一で、なおかつ自由水含量が異なる難消化性糖類添加試料で拡散を計測した。難消化性糖類については、サイズが異なる結晶セルロースと分子量が異なるカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いた。糖の拡散係数はキャピラリー法で測定し、自由水と水の拡散はMRIを用いた。目的変数を糖の拡散係数、説明変数を粘度、T2値、ADCとして樹木構造(回帰木)を用いて解析を行った。その結果、糖の拡散係数を制御する因子として、ADCとT2値が挙げられた。不溶性食物存在下で糖の拡散は、粘度ではなく、ブラウン運動に影響を及ぼす水の拡散や自由水が関わっていることを明らかにした。今後は、水溶性食物繊維存在下での糖の拡散を決定する要因を明らかにする。そのため、糖の内容物中の拡散が、内容物の粘度、水の拡散速度、自由水の含量のいずれに依存するかを体外実験で測定した。水溶性と不溶性の食物繊維を用いて、拡散係数の測定を6種類の系で行った。繊維には、結晶セルロース、分子量が異なるカルボキシメチルセルロースナトリウムおよびペクチンを用いた。内容物中の糖の拡散係数と因果関係がある因子をベイジアンネットワークで解析を行った。添加した繊維によって、内容物中の糖の拡散係数に影響を与える因子が異なるので、繊維ごとに解析を行った。ペクチン添加の場合、内容物中の糖の拡散係数を制御している因子は水の拡散係数(ADC)と自由水含量(T2)であった。セルロース添加の場合、内容物中の糖の拡散係数を制御している因子は、内容物中の水の拡散係数(ADC)、自由水含量(T2)、粘度であった。すなわち、内容物中の水の拡散係数(ADC)、自由水含量(T2)を制御することで、食後血糖を制御できる可能性がたかい。予定では、不溶性食物繊維を用いて糖の拡散に影響を与える要因の検索を平成26年度に行うことになっており、27年度以降に解析を行うことになっている。現在、この予定通りに進捗している。今後は、解析をさらに進めていく予定である。そのため、おおむね順調に進展していると判断した。食後血糖上昇は小腸での糖の吸収速度に依存する。

これまでの研究から、小腸での糖の吸収速度は小腸管腔内で内容物中の糖の拡散速度に依存することを数学モデルと動物実験から示してきた。一般的に、拡散速度は、粘度に依存すると言われている。一方で、拡散速度は、ブラウン運動にも依存すると言われている。ブラウン運動は、水の拡散速度や自由水の含量に依存する。そのため、糖の内容物中の拡散が、内容物の粘度、水の拡散速度、自由水の含量のいずれに依存するかを体外実験で測定した。水溶性と不溶性の食物繊維を用いて、拡散係数の測定を6種類の系で行った。繊維には、結晶セルロース、分子量が異なるカルボキシメチルセルロースナトリウムおよびペクチンを用いた。糖の拡散係数はキャピラリー法で測定し、自由水と水の拡散はMRIを用いた。内容物中の糖の拡散係数と因果関係がある因子をベイジアンネットワークで解析を行った。添加した繊維によって、内容物中の糖の拡散係数に影響を与える因子が異なるので、繊維ごとに解析を行った。ペクチン添加の場合、内容物中の糖の拡散係数を制御している因子は水の拡散係数(ADC)と自由水含量(T2)であった。セルロース添加の場合、内容物中の糖の拡散係数を制御している因子は、内容物中の水の拡散係数(ADC)、自由水含量(T2)、流動係数(粘度の指標の一つ)であった。すなわち、内容物中の水の拡散係数(ADC)、自由水含量(T2)を制御することで、食後血糖を制御できる可能性が高い。これまで、食後血糖は消化管内容物の粘度との関係から説明されることが多かった。しかし、小腸内容物の粘度を上昇させないにも関わらず、食後血糖を緩和する水溶性食物繊維が存在する。一方、これまでの研究で、食後血糖は、消化管内容物中の糖の拡散に依存することがこれまでの研究から明らかである。本課題では、食後血糖を決定する新たな因子の探索を行った。その結果、不溶性食物存在下で糖の拡散は、粘度ではなく、ブラウン運動に影響を及ぼす水の拡散や自由水が関わっていることをベイジアンネットワークを用いて明らかにした。すなわち、糖の吸収速度は、水の拡散や自由水が関わっている可能性が不溶性食物存在下条件で示唆された。予定では、不溶性食物繊維を用いて糖の拡散に影響を与える要因の検索を平成26年度に行うことになっている。現在、この予定通りに進捗している。今後は、同26年度と同様の技術を使うため、技術的な障壁は存在しない。そのため、おおむね順調に進展していると判断した。本課題は、小腸管腔内での糖の拡散に影響を与える要因を明らかにすることを目的としている。これまでに、水溶性食物繊維存在下での、糖の拡散に影響を与える要因を明らかにする実験を行った。今後は、データマイニングを用いた解析を行うことで、小腸管腔内の環境から食後血糖の制御について考察する。栄養生理学本課題は、小腸管腔内での糖の拡散に影響を与える要因を明らかにすることを目的としている。今後は、水溶性食物繊維存在下での、糖の拡散に影響を与える要因を明らかにする実験を行う。実験終了後、データマイニングを用いた解析を行うことで、小腸管腔内の環境から食後血糖の制御について考察することが可能になると考えている。実験終了後には論文化を進めていきたいと考えている。本課題で測定を行った自由水等の測定のために、MRIを稼働させるためのオペレーターに対する謝金を計上していたが、オペレーターに対する謝金が必要なくなったため、繰越金が生じた。
溶液中での自由度に着目した抗体の抗原認識機構と抗原結合に伴う構造変化の解明

いくつかの抗原抗体間相互作用系を対象として、溶液中での蛋白質の動的挙動が反映される熱力学量や速度論量を主な指標として、静的な構造情報を補完する一般側の導出や方法論有効性の検証を目指した。抗体の抗原認識は多種多様であり、その解析から分子認識の一般側が得られ、さらに複数の抗原結合部位の可動性を解析することで、抗原上の比較的小さな構造変化から大きな構造変化にいたる動的挙動に関する結果が得られた。1、抗体Fab腕の溶液中での可動範囲を解析するため、大きさの異なる蛋白質抗原と各蛋白質に対するモノクローナル抗体を準備し、その分子間相互作用を超遠心分析、TOF-MS、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて解析した。その結果、溶液中にある抗体は、ウシ血清アルブミン(BSA,67kDa)程度の抗原に対しても2本のFab腕が結合に関与できる(抗原:抗体=2:1)のに対して、抗体のFc部分を固定化した状態では、BSAに対して1:1でしか結合できないことが明らかになった。これは抗体のもつ自由度を明らかにしたと同時に、抗4-hydroxy-3-nitrophenyl(NP)抗体で認められた抗原結合に伴う微小な構造変化、すなわち抗体Fc部分の構造情報がFab部分にも影響を及ぼすことを支持し、細胞表面上でB細胞受容体の架橋を伴わないシグナル伝達に抗体の構造変化が寄与することを示唆した。2、抗体の自由度解析に応用しうるフォトンエコー分光法を米国スクリプス研究所にて学んだ。非常に有効な手法ではあるものの、感度にまだ問題点があり、抗NP抗体に適用するにはさらなる改善が必要であることがわかり、その研究を進めている。3、親和性成熟過程にある抗NP抗体のFab部分の1つについて、抗原との複合体の結晶が得られたので、そのX線解析実験を行った。その結果、分解能が3Å程度だったので、さらなる結晶の改良を目指すこととした。4、抗NP抗体のヘテロクリシティ解明のため、いくつかのモノクローナル抗体と3種類の抗原、NP、4-hydroxy-3-iodo-5-nitrophenyl(NIP)、4-hydroxy-3,5-dinitrophenyl(NNP)との各相互作用解析を、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて行った。各pH条件下での解析の結果、ヘテロクリシティによる分子認識の違いが各抗原の水酸基の解離状態に起因することが明らかになった。1、分子量の異なるタンパク質(卵白リゾチーム:HEL,14kDa、ウシ血清アルブミン:BSA,67kDaなど)にハプテンとなる4-hydroxy-3-nitrophenyl(NP)の数を変えて結合させたものを抗原として用い、親和性の異なる各種抗NP抗体との分子間相互作用を、表面プラズモン共鳴バイオセンサーや超遠心分析法、質量分析法、電子顕微鏡などを用いて解析した。その結果、抗原のハプテン価や大きさ、抗体の抗原結合親和性と、抗原・抗体間相互作用における結合の強さ(avidityの寄与)や形成される複合体の大きさの間に相関関係が見出された。特に質量分析法と電子顕微鏡による解析では、測定手法の有効性の検証としても重要な研究課題であったが、前者では分子間相互作用をマス値として良く検出できることが明らかとなり、また後者では複合体形成を比較的簡便に可視化できることを証明した。なおこれらの成果の一部は第36回日本免疫学会総会にて発表し、現在、論文投稿も準備している。2、いくつかの抗NP抗体について、そのFab部分を調製し、抗原存在下、非存在下それぞれで結晶化スクリーニングを行った。いくつかの条件下で微結晶が形成されたが、X線結晶構造解析を行うには不十分であり、さらなる条件検討を進めている。分子量の異なるタンパク質(卵白リゾチーム:HEL, 14kDa、ウシ血清アルブミン:BSA, 67kDaなど)にハプテンとなる4-hydroxy-3-nitrophenyl(NP)の数を変えて結合させたものを抗原として、さらに親和性の異なる各種抗NP抗体(IgGおよびIgM)を調製し、それぞれの分子間相互作用を、表面プラズモン共鳴バイオセンサーや電子顕微鏡などを用いて解析した。その結果、抗原のハプテン価や大きさ、抗体の抗原結合親和性や結合価と、抗原・抗体間複合体の大きさの間に相関関係が見出された。またHELのS-S結合を欠損させ、立体構造を部分的に崩した変異体を調製し、抗HEL抗体との分子間相互作用解析を行ったところ、抗体の結合速度の低下が認められた。これは抗原が抗体結合時に構造変化を必要とすることに起因すると考えられる。これらの成果は第37回日本免疫学会総会、および第45回日本生物物理学会年会にて発表し、現在、論文投稿も準備している。上記、立体構造を認識する抗HEL抗体を対象として、そのエピトープ決定を行うべく、質量分析やX線結晶構造解析の適用を試みた。前者については、手法としても新たな取り組みであるが、酵素消化による十分な断片化に課題があり、引き続き研究を行っている。また後者については、抗原との複合体の結晶がいくつか認められたものの、構造決定時の分解能としては不十分で、さらなる改良を必要としている。