hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CaMキナーゼホスファターゼの生理機能解明を目指した酵素学的研究

CaMKPの活性とその調節機構を調べる為に、組換え体CaMKPの変異体を作製し、その解析を行なった。N末端側の配列は活性のある酵素の形成に必須である事、ポリグルタミン酸クラスターはポリカチオンによる活性化に関与している事、そして、PPMファミリーで保存されているアミノ酸残基がCaMKPの活性に重要である事を明らかにした。CaMKPと共にグループを形成しているCaMKP-Nについて、組織における細胞内局在について解析した。ラットの脳の細胞分画を行ない、得られた画分をウエスタンブロットにより解析した。ほとんどのCaMKP-NはC末端側が欠失しており、細胞質に存在している事が示された。ラットの脳の免疫組織化学による解析により、大部分の神経細胞では細胞質に存在し、一部の神経細胞で核に存在している事が示された。従って、CaMKP-Nは核に存在するCaMキナーゼのみならず、細胞質のCaMキナーゼをも調節している可能性が示唆された。アンチセンス法により、ゼブラフィッシュ胚におけるCaMKP-Nのノックダウン実験をおこない、その発生過程を観察したところ、アンチセンスRNAを注入した胚では脳細胞の異常なアポトーシスが起こり、頭部や脊髄の著明な発生異常が認められた。この結果から胚発生の過程においてCaMKP-Nが重要な役割を担っていることが示唆された。CaMKPをプローブに用いた二次元ファーウエスタンブロッティング法により、ラット脳におけるCaMKP結合タンパク質を検索・同定し、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)をCaMKP結合タンパク質として同定した。GST-プルダウンアッセイによってGAPDHはこれまで機能未知であったCaMKPのN末領域と相互作用していることが判明した。新規プロテインホスファターゼであるCaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)の生理機能を解明するために、ジゴキシゲニンでラベルしたCaMKPをプローブに用いた二次元ファーウエスタンブロッティングと質量分析とを組み合わせた方法により、ラット脳におけるCaMKP結合タンパク質を検索・同定した。ラット脳幹可溶性画分においてはfructose bisphosphate aldolase (aldolase)とglyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase (GAPDH)がCaMKP結合タンパク質として同定された。蛍光偏光法を用いた結合実験により、これらは溶液中でもCaMKPと結合することが確認された。脳幹抽出液を用いてCaMKP特異的抗体による免疫沈降を行うと、GAPDHが共沈されたことから、実際の細胞内においてもCaMKPとGAPDHは複合体を形成していることが強く示唆される。また種々のCaMKP deletion mutantを作製し、GST-プルダウンアッセイによってCaMKPとGAPDHとの相互作用を調べる実験により、GAPDHはこれまで機能未知であったCaMKPのN末領域と相互作用していることが証明された。GAPDHはCaMKPの良好な基質であるCaMキナーゼI(CaMKI)やCaMキナーゼIV(CaMKIV)によって強くリン酸化されることが見出されたが、CaMKPの存在下ではこのリン酸化が強く抑制されることが判明した。このリン酸化の抑制はリン酸化・活性化されたCaMKIやCaMKIVをCaMKPが脱リン酸化・不活性化することによることも示された。以上の結果から、CaMKPがGAPDHと複合体を形成することにより、そのリン酸化レベルを調整している可能性が示唆された。CaMKPとGAPDHは何れも細胞のアポトーシスに関与することが示されているので、これらの分子による細胞死制御のメカニズムの解明に興味が持たれる(論文投稿準備中)。

またCaMKPの生理的基質と考えられる多機能性CaMキナーゼの動態を探る目的で、これらを認識する抗体を作製したところ、これらの抗体が予想外に広い反応性を示したので、その反応性について詳しく調べてみた。その結果、これらの抗体はCaMキナーゼのみならず様々な種類のセリン・スレオニンプロテインキナーゼを幅広く認識することが判明した。"マルチ抗体"と命名したこれらの抗体は新規セリン・スレオニンプロテインキナーゼの発現スクリーニングやセリン・スレオニンプロテインキナーゼの網羅的解析に威力を発揮するものと考えられる。CaMキナーゼホスファターゼN (CaMKPN)はCaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)の核局在型ホモローグとしてCaMKPの配列をもとにデータベース中から見出された新奇プロテインホスファターゼである。CaMKPNは脳に特異的に発現していることから、その脳神経系における機能の解明には興味が持たれる。殊に、記憶など脳の高次機能に転写制御を介して深く関わっているCaMキナーゼIVの活性調節に、本酵素が重要な役割を果たしていることが示唆されている。しかしながらCaMKPNの生理的役割は、全く分かっていない。そこでゼブラフィッシュをモデル動物として、本酵素の生理機能を探ることにした。まずゼブラフィッシュCaMKPN(zCaMKPN)のcDNAを取得し、これを発現させてその性質を調べたところ、哺乳類のCaMKPNと同様の酵素学的性質、細胞内局在を示すことが確かめられた。次にNeuro2a細胞を用いてCaMキナーゼIVとの共発現実験を行ったところ、zCaMKPNを共発現させた細胞では、コントロールに比べてイオノマイシンによるCaMキナーゼIVのリン酸化の亢進が著明に抑制された。更にアンチセンス法により、ゼブラフィッシュ胚におけるzCaMKPNのノックダウン実験をおこない、その発生過程を観察したところ、アンチセンスRNAを注入した胚では脳細胞の異常なアポトーシスが起こり、頭部や脊髄の著明な発生異常が認められた。以上の結果から、CaMKPNが細胞内でCaMキナーゼIVを脱リン酸化し得ること、また胚発生の過程においてCaMKPNが重要な役割を担っていることが示唆された。CaMキナーゼIVはアポトーシスの制御に重要な役割を果たしていることが報告されているので、CaMKPNはCaMキナーゼIVの制御を介して、胚発生に必須なアポトーシスの過程を制御しているのかも知れない(論文投稿中)。CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)はセリンスレオニンホスファターゼであり、多機能性リン酸化酵素であるCaMKI, II, IVを脱リン酸化して、その活性を調節している。CaMKPはPP2Cと同じPPMファミリーに属しているが、PP2Cαの触媒部位の相同性は28%と低い。また、ラットのCaMKPはN末端側にポリグルタミン酸クラスターを含む約150アミノ酸残基を有している。CaMKPの活性とその調節機構を調べる為に、組換え体CaMKPの変異体を作製し、その解析を行なった。N末端側の欠失変異体は活性を示さなかった。
ヒトの歩行に関する感覚運動連関の非侵襲的研究

パーキンソン病患者の視覚刺激による歩行障害の改善(矛盾性運動)を始めとし、視覚情報が歩行における感覚運動連関に重要であることを示す臨床的な知見は豊富だが、その神経基盤についてはよく理解されていなかった。われわれはこの3年間で、外側運動野・小脳を解剖学的基礎とする神経回路が起立・歩行運動の視覚運動連関において重要な役割を果たし、さらに矛盾性運動の発現に関わっていることを示した。1.高齢者とパーキンソン病患者において立位課題、歩行課題、視覚刺激下の歩行課題に伴う脳血流変化をSPECTにて検討した。各5分間の課題開始時にテクネシウム製剤を経静脈投与して得られた脳血流像の解析により、課題によって有意に脳血流が増加した部位を検出した。高齢者は立位により小脳虫部・内側一次運動野・補足運動野・視覚野に脳血流の増加を示し、歩行課題により背内側前頭頭頂葉・小脳半球・視覚野などのさらに広い範囲に賦活を示した。パーキンソン病患者では補足運動野と小脳半球の歩行に伴う賦活が健常者に比べ乏しかった。一方視覚刺激に伴うパーキンソン患者の歩行の改善(矛盾性運動)に伴い、外側運動前野の賦活を認めた。正常な立位・歩行には内側運動野・視覚野・小脳活動の統合が必要であると考えられるが、さらに視覚刺激下の特殊な歩行の場合には、主に外的な刺激に対する運動に関わっている外側運動野の働きが重要であることが示された。パーキンソン病では、内側運動野と比べて外側運動野の機能が比較的保たれていることが、矛盾性運動の基盤にあると考えられる。2.脳磁図を用いて、種々の視覚刺激に対する運動課題または運動を伴わない課題を遂行中の脳活動を測定することで、視覚運動関連の脳内処理過程を経時的に観察した。視覚刺激に対する運動課題では、後頭部・感覚運動野で背景脳波の反跳現象が観察され、視覚野と運動野の関係が密接であることが示された。また運動を伴わない単純な視覚刺激によって、前頭葉外側面に反応が誘発され、その反応は注意によって増強することが示唆された。視覚野から運動野への入力は常に存在するが、その入力は行動学的な意味により増強または抑制を受けるものと思われる。ヒトの二足歩行に必要な中枢神経系の制御機構については不明な点が多いが、感覚運動連関が強く関与していることは、パーキンソン病患者において、床に引いた横線を見せると「すくみ足現象」が直ちに改善することから明らかである。本年度は、以下2つの検査を行った。1。トレッドミル歩行検査5分間のトレッドミル上での定常歩行(速度13.3m/分)中と、同じく5分間の開眼仰臥位安静時に259MBqまたは518MBqのTc-99m-HMPAOを静脈内投与し、SPECT撮像は20分間行い、脳血流を統計学的に検討した。健常高齢者10名とパーキンソン病患者群10名で、課題中の歩行量は同じであったが、1分間あたりの歩数は健常高齢者で71、パーキンソン病患者で103と有意差を認めた。

脳血流の検討では健常高齢者では、歩行時には補足運動野・前帯状回・一次運動感覚野の足及び体幹の領域・楔前部・中脳から吻側橋の背側・小脳半球と虫部の賦活が認められた。パーキンソン病では健常者に較べ、上前頭回・楔前部・小脳半球から橋背側にかけての賦活が低下していた。2。視覚運動連関の脳磁図検査2秒間隔の視覚刺激(今回はLEDを使用)を警告刺激、命令刺激として与え、命令刺激に対してすばやく反応させる随伴陰性変動の課題を遂行させた。脳磁場変化を全脳型脳磁図計にて計測し、背景脳活動の解析を健常者5名にて行った。10Hzの背景脳磁場は、運動終了時に後頭部および感覚運動野で反跳現象を示し、20Hz帯域では、運動前に感覚運動野での脱同期化を認めた。後頭部で運動終了時にみられる反跳現象は、視覚野と運動野の密接な関係を示している。感覚運動連関の一端を皮質下、皮質の両レベルで非侵襲的に明らかにすることができた。パーキンソン病患者において、床に引いた横線を見せると「すくみ足現象」が直ちに改善することから、視覚刺激の方向性が歩行時の感覚運動連関に重要な意味を持つことは明らかである。本年度は、パーキンソン病患者における血流変化と健常者における脳磁場変化を、視覚刺激の方向性の観点から検討した。1.軽症から中等症のパーキンソン病患者10名と健常高齢者10名を対象に、毎分13mの速度で動くトレッドミル上での歩行時の局所脳血流変化を記録した。進行方向に対して横方向に等間隔(30cm)でひかれた線で引かれた線をまたいで歩く条件(横線条件)と、進行方向に対して平行にひかれた2本の線の間を歩く条件(縦線条件)を、トレッドミル上で5分間行ない、課題開始30秒後に99mTc-HMPAOを経静脈投与し、有意な局所脳血流を検出した。パーキンソン病患者群は、横線条件において歩行の改善を認め、左小脳半球、両側後部頭頂皮質、右外側運動前野、右前帯状皮質に血流増加が認められた。パーキンソン病で機能の保たれている小脳、外側運動前野が、歩行運動改善に役割を果たすことが示された。2. CRT画面上に提示された輝度の正弦波変調した縞模様が、静止状態より縞と垂直方向に移動開始した際に右手示指で反応する課題を健常成人4名に課した。縦縞が横方向もしくは横縞が縦方向に動く場合の2通りの方向と2種類の運動速度の計4通りの課題において、脳磁場反応、反応時間を記録した。反応時間は、速い運動の場合は240-319ms、遅い運動の場合は269-383msであり、後頭部脳磁場反応の頂点潜時はそれぞれ183-205ms、189-213msであって、視覚刺激の移動方向とは無関係であった。健常人においては、視覚移動認知の段階では視覚刺激の方向性は影響しないと考えられる。外側運動野、小脳を含む視覚運動連関が、歩行運動における重要な役割を示すと考えられる。パーキンソン病患者の「すくみ足」が床に引いた横線によって改善し、小脳失調の起立障害が閉眼によって増悪することから、視覚情報が起立・歩行における感覚運動連関に重要な意味を持つことが示唆される。われわれは外側運動野、小脳を含む視覚運動連関が、歩行運動において重要な役割を示すことを示してきたが、本年度は、健常者における光刺激による運動関連皮質の脳磁場変化と起立時の脳血流変化について検討を行った。1.10名の正常被験者において、眼前1mに置かれたLED刺激に対する視覚誘発磁場を全頭型脳磁場計を用いて記録し、特に前頭葉の反応に注目した。
新規カチオン型光学活性ブレンステッド酸触媒の創製と応用

過去に例のない全く新しいキラルなイオン性ブレンステッド酸を開発した。この分子は、一般に難しいとされるニトロオレフィンへのヘテロ求核剤の付加反応を効率的に促進し、高い選択性で望みのエナンチオマーを優先して与える。ここで得られた生成物は、生理活性化合物の有用な合成中間体であるキラルなジアミンや、キラルなタウリン誘導体の原料として非常に有望である。さらに、分子構造を修飾することでより進化した触媒分子を合成することに成功した。未来型の有機合成プロセスを指向した高度分子変換を実現する上で、高活性な機能性触媒の開発は最も重要な位置を占める課題の一つであり、大きな技術的進歩とそれに向けての新規概念の提案が必須である。本研究では、分子の中心骨格であるHN-P^+-NH構造に起因した二重水素結合形成能を有するテトラアミノホスホニウム塩に適切な分子修飾を施すことで、申請者がこれまでに明らかにしてきた塩基性条件下での触媒作用とは一見相反するホスホニウム塩の潜在的ブレンステッド酸触媒作用を引き出し、新規カチオン型光学活性ブレンステソド酸触媒の創製を目指した。具体的には、キラルユニットとしてビナフチルジアミンを利用した、新規アリールアミノホスホニウムバフェートを設計・合成し、これを触媒とするニトロオレフィンへのアザ共役付加反応を高エナンチオ選択的に実現した。本反応は、完全な原子効率で進行することに加え、有用合成素子であるキラルジアミン類へと簡便に導き得る生成物を与えることから極めて合成化学的価値が高いが、既存の触媒では比較的困難な反応系の一つとして知られており、これを低触媒量で穏和な条件下で実現したことは本研究で開発した触媒系の力量を明確に示すものであるといえる。また、光学活性ブレンステッド酸の化学が爆発的に進展している今日においても未知の部分が多い、カチオン型ブレンステッド酸の新たな機能性と特異性を示したことで、その本質に迫る端緒となることが期待される。前年度までに、新規光学活性アリールアミノホスホニウムボレートの合成法を確立し、そのBronsted酸触媒活性の評価を行った。その過程で、本分子が電気的に中性のニトロオレフィンを効果的に活性化し、従来型のBrensted酸では困難であった塩基性求核種を用いる共役付加反応を高エナンチオ選択的に実現することを見出した。本年度はこの知見を基に、引き続きニトロオレフィンへのヘテロ共役付加反応について検討を行い、高エナンチオ選択的なサルファ共役付加反応の開発に成功した。ここで得られた生成物は、これまで合成し難かった光学活性タウリン誘導体の有望な前駆体である。さらに並行して、アミノホスホニウム中心の電子密度の制御による酸性度の向上を図り、広範な合成反応へ本触媒系を展開することでカチオン性のBronsted酸触媒に特有の触媒機能性の明確化を目指した。すなわち、酸性プロトンに直接結合する窒素原子と共役したリンカチオンに電気陰性度の高い酸素原子を導入することで、より高い酸性度を示す新たな分子構造を設計・合成した。また本分子の触媒機能を、極めてシンプルかつ有用な反応であるにもかかわらず、一般に強い酸が必要とされ立体選択性の獲得が難しいとされてきた、エノラートの触媒的不斉プロトン化反応により評価し、高エナンチオ選択的に保護アミノ酸を得ることに成功した。本法の実現は、最小の原子である水素を制御するための新たな方法論の提案につながるのみならず、これまで積極的に注目されることのなかった、カチオン性Bronsted酸の特性を利用した反応開発の端緒になると期待される。
Tagless-final DSL embedding: how to keep extending the language and be sure it will still work

研究実績の概要に述べた通り、2018年度に立てた目標はすべて達成されました。2018年度に、前年度と比べて旅行(と旅行費)がすくなかったため、2019年度に使用額が生じました。2018年度に、旅行の代わりに著書と論文を書いていました。著書(単著)が掲載されました。論文は査読中です。その使用額を2019年度に旅行費として利用する予定です。
小角散乱を用いた次世代ナノ構造解析

小角散乱法は、ナノ構造の形成過程、消滅過程等ナノ構造の運動をその場・実時間観測を可能にするという長所を持ち、ナノサイエンス・ナノテクノロジーを支える基礎学問として小角散乱は今後ますます重要な地位を占めることが予想される。今までは小角散乱を用いたナノ構造解析が様々な分野で独自に発展しているが、分野間の情報交換が少なく、またSPring-8、PF、JAERI、KENSなどの大型共同利用施設との情報交換も希薄な現状にある。本研究の目的はこのような状況に鑑み、2006年の小角散乱国際会議(SAS2006)が日本で開催される事を契機に、小角散乱をキーワードに様々な分野を代表する研究者を集め、今後日本のナノ構造解析への方向性とそのための基礎学問・技術開発の重点化を議論するための企画調査である。我々は数回にわたり、特に次世代に向けての小角散乱研究の方向性を以下の観点から重点的に討議をおこなった。(1)大型放射光施設(SPring-8、PF)を利用した新しいX線小角散乱測定技術の開発、(2)研究用原子炉(JRR-3M)、大強度陽子加速器計画中性子実験施設(J-PARC/JSNS)を見据えた新しい中性子小角散乱実験技術の開発、(3)小角散乱法および理論研究の発展に基づく次世代ナノサイエンスの創製、(4)小角散乱を用いたナノ構造研究を進める民間企業および散乱装置製造メーカーと大学間の産学連携の推進。これらの議論を全研究分野にわたり、且つ全国的規模で展開し、小角散乱を用いた次世代ナノ構造解析の方向性を定めるとともに、来る2006年我国で開催する国際会議SAS2006に向けて日本からの情報発信の準備を行うことができた。
バイオインフォマティクスを利用した神経変性細胞死・TRIADの分子機構解明

申請者らは転写抑制性細胞死(Transcription Repression Induced Cell Death, TRIAD)の分子メカニズムを解明するにあたり、ショウジョウバエRNAiライブラリーを用いたin vivo遺伝子スクリーニングを行う計画を立てた。遺伝子スクリーニングを行うにあたり、まずはショウジョウバエでも、2006年に星野らが発表したオリジナルのTRIAD(Hoshino et al., 2006 JCB)と同様の細胞死が起こるかを確認した。ショウジョウバエの個体においてもタマゴテングタケ由来のRNA polymerase inhibitorであるalpha-amanitin (AMA)による転写抑制性は中枢神経細胞においてTRIADと同様の形態を示す細胞死を誘導した。これによりショウジョウバエをTRIADの解析に用いることの根拠が担保されたと考えられる。そこで、実際にRANiライブラリーのスクリーニングを行った結果、ノックダウンによりTRIADを抑制する遺伝子を複数見出した。これらの遺伝子の相互関連を明らかにするため、Ingenutity IPAソフトウェアを用いた遺伝子間相互作用解析を行った。その結果、スクリーニング結果には含まれなかった複数の遺伝子がTRIADの分子経路において中心的な役割を果たしていることが示唆された。PLK1, Htt, hnRNPAB等の遺伝子が重要であることを示すため、これらの遺伝子の過剰発現を行ったところ、ショウジョウバエ及びオリジナルのTRIADにおいても抑制効果があった。また、hnRNPABはHttのスプライシングを調節することでTRIADをコントロールしていることが明らかとなった。これらの結果はCell Death and Diseaseにアクセプトされている。申請者らはこれまで新規モデルショウジョウバエを作成することで、神経変性疾患の分子メカニズムを明らかにしてきた(Tamura et al., PLoSONE 2009, J. Neurosci. 2010 etc.)。さらに、α-amanitinがin vivo(ショウジョウバエの個体)においてもTRIADと形態的に類似した神経細胞死(dTRIAD)を引き起こすことを明らかにしている(図1)。そこで、ショウジョウバエの強力な遺伝学を活かしdTRIADを抑制できる遺伝子をスクリーニングする計画を思い立った。申請者は近年、ショウジョウバエin vivoスクリーニングから得られた結果をネットワーク的に理解するための新たな手法を提示した(Tamura et al., Hum. Mol. Genet. 2013)。そこで、本研究計画ではこの手法を応用しようと考えている。すでに、dTRIADを抑制できる遺伝子のin vivoスクリーニングを完了した。ショウジョウバエを用いたRNAiライブラリーのin vivoスクリーニングを行い、dTRIADの分子経路で働く遺伝子を約30個特定している。さらに、スクリーニングの結果をもとに、実際にもっとも注目するべき遺伝子は何か?それぞれの細胞死を結びつけることの出来る遺伝子は何か?遺伝子ネットワークをバイオインフォマティクス的に解析することで推定した。IPA (Ingenuity)は公的データベースを利用し、分子間の結合をネットワーク的に推定するソフトウェアである。IPAを用いることにより、スクリーニング結果をから“分子間ネットワーク"を構成する。ネットワーク図を構成することで、どの遺伝子(または遺伝子同士の結合)の重要度が高いか見積もっている。また、未知の遺伝子・遺伝子間相互作用を発見し、今後はこれらの遺伝子の重要性についてネットワーク的・生化学的・遺伝学的な手法により実証する。さらに、ネットワーク解析を行うのみにとどまらず、この結果を実験的に実証していく。どのような機能を持つ遺伝子が見つかるかにより、以降の解析は異なったものになるが、まずは以下の3点について解析する。1哺乳類ニューロンのTRIADにおいても効果があるか明らかにする。ショウジョウバエで解明された現象がマウスやラットでも共通であれば、治療に対して大きな期待が持てる。2その遺伝子の阻害剤がTRIADを抑制できるか示す。効果のある薬剤が見つかれば、即に治療薬候補として考えることが出来る。3加えて、生化学的(WBやIP、免疫組織化学)、遺伝学的(二重変異体による上下関係の推定)な経路の検証を行う。

実証実験について、特に注目する遺伝子に治療効果が得られなかった場合には、ショウジョウバエと哺乳類でどの遺伝子が共通に効果があるか網羅的に解析する。これにより、種間で保存されたTRIADの経路を明確にし、TRIADの進化的な意義についても解明できる可能性がある。
超分散環境におけるピア・ツー・ピア型コンテンツ発見に関する研究

本年度は,昨年度の検討を推し進めるとともに,適応型コンテンツルーティング機構の開発,及びテストベッドの構築に関して検討を行い,各種機構を構築したテストベッド上へ実装した.さらに,テストベッド上での実験評価をフィードバックして各種機構の展開・改善を行い,アプリケーションプロトタイプの実装を完了した.1.適応型コンテンツルーティング機構の開発と実装昨年度開発を行ったコンテンツルーティング機構の検討をさらに推し進め,各ノード端末の処理能力,帯域,遅延などの「ノード環境」が不均一である状況に対処可能な適応型コンテンツルーティングの開発を行った.具体的には,ノード環境の情報に基づいて論理的オーバレイネットワークを再構成する適応化機構を開発し,実装を行った.さらに,トラヒック測定などによるノード環境推定機構を開発するとともに,XMLを用いたノード環境の表現方法を開発した.2.テストベッド構築とアプリケーションプロトタイプの実装これまでに開発・実装を行った各種機構の実験評価を行うためのテストベッドネットワークを構築した.具体的には,ノード環境の多様性を擬似するために,ネットワークへのアクセス手段としてイーサネットだけでなく無線LANを用意し,dummynetを用いて帯域及び遅延制限を導入し,さらには,CPUなどの処理能力が異なる端末を取り入れたテストベッドネットワークの構築を行った.また,アプリケーションプロトタイプとしては,ファイル共有,コンテンツ配信,及び分散コンピューティングをベースとした「超分散コラボレーション」を実現した.本年度は,セマンティックピアツーピア(P2P)検索機構,P2Pコンテンツ推薦機構,分散ストレージ機構の検討を推し進め,各機構における基本的機能を開発するとともにアプリケーションプロトタイプの初期的実装を行った.1.セマンティックP2P検索機構の開発と実装キーワード間の関連性を利用することにより,検索キーワードと類似するキーワードを保持するコンテンツを発見できるようなP2Pコンテンツ検索機構を開発した.さらに,類似キーワード発見に利用されるデータベースの生成,更新機能を具備するアプリケーションプロトタイプをLimeWire上に実装した.分散コンテンツ共有環境において,ユーザによる相対的評価の高いコンテンツが自動的に提示される推薦システムを開発した。具体的には,各コンテンツに対するルートノードの分散的発見機構,ルートノードによるコンテンツ評価管理機構,コンテンツ推薦機構の実装を行った.3.分散ストレージ機構の開発コンテンツの永続性及び透過性を保証する広域ストレージサービスを実現する分散ストレージ機構のアーキテクチャを設計した.具体的には,コンテンツの関連性を利用して関連コンテンツ群を高速かつ確実に発見することができるコンテンツクラスタリング機構及びハイブリッドコンテンツルーティング機構の開発を行った.本年度は,昨年度の検討を推し進めるとともに,適応型コンテンツルーティング機構の開発,及びテストベッドの構築に関して検討を行い,各種機構を構築したテストベッド上へ実装した.さらに,テストベッド上での実験評価をフィードバックして各種機構の展開・改善を行い,アプリケーションプロトタイプの実装を完了した.1.適応型コンテンツルーティング機構の開発と実装昨年度開発を行ったコンテンツルーティング機構の検討をさらに推し進め,各ノード端末の処理能力,帯域,遅延などの「ノード環境」が不均一である状況に対処可能な適応型コンテンツルーティングの開発を行った.具体的には,ノード環境の情報に基づいて論理的オーバレイネットワークを再構成する適応化機構を開発し,実装を行った.さらに,トラヒック測定などによるノード環境推定機構を開発するとともに,XMLを用いたノード環境の表現方法を開発した.2.テストベッド構築とアプリケーションプロトタイプの実装これまでに開発・実装を行った各種機構の実験評価を行うためのテストベッドネットワークを構築した.具体的には,ノード環境の多様性を擬似するために,ネットワークへのアクセス手段としてイーサネットだけでなく無線LANを用意し,dummynetを用いて帯域及び遅延制限を導入し,さらには,CPUなどの処理能力が異なる端末を取り入れたテストベッドネットワークの構築を行った.また,アプリケーションプロトタイプとしては,ファイル共有,コンテンツ配信,及び分散コンピューティングをベースとした「超分散コラボレーション」を実現した.
ｐ３００／ＧＡＴＡ４のプロテオミクス解析による新規心筋細胞肥大反応制御因子の探索

心不全の進展にはp300/GATA4複合体の協調的作用が重要な役割を果たしている。我々は新たなGATA4結合因子であるHDAC1/2を含む転写抑制複合体構成因子であるRbAp48/46を見出した。RbAp48/46はGATA4とHDAC1/2の結合を仲介、抑制複合体を形成し、フェニレフリン誘導性GATA4のアセチル化、ANF,ET-1の転写活性、心筋細胞の肥大を抑制した。この抑制機能にはHDAC1/2が必須であった。以上の結果からRbAp48/46は心筋細胞肥大反応時にHDAC1/2とともにp300/GATA4と機能的な複合体を形成していることが判明した。高血圧、心筋梗塞などを起因として分泌される液性因子による刺激は最終的に心筋細胞核に到達し、核内において何らかの転写調節因子が活性化されることにより心筋細胞はその遺伝子発現パターンを変化させ、心筋細胞の肥大を引き起こす。この際、HAT活性を有するp300がGATA4転写因子群と協調的に作用し、心不全発症における遺伝子発現調節に極めて重要であることを我々は報告している。そこで、更なるp300/GATA4経路の活性制御機構解明の為に、これらの結合タンパクとの肥大反応制御機構について解析を行った。(1)GATA4結合因子として同定したRbAp48/46はp300とGATA4との結合を競合的に阻害し、HDAC1/2をGATA4へリクルートすることでGATA4の脱アセチル化、肥大反応因子の転写活性の抑制を誘導すること、またp300のHAT活性には影響を与えないことが判明した。(2)またRbAp48/46をノックダウンさせるとp300/GATA4の結合が増強・GATA4のアセチル化や肥大反応因子の転写活性化が誘導された。(3)PMA刺激や活性型MEK1によってGATA4のリン酸化を誘導するとGATA4とRbAp48/46との結合能が減少し、p300/GATA4複合体の形成が増強された。この反応はリン酸化能を欠失した変異型GATA4やMEK1阻害剤PD98059によって抑制された。以上より新たなp300結合因子であるRbAp48/46が心肥大反応においてp300/GATA4複合体を制御していることが示唆された。現在、RbAp48/46や新たなp300結合因子の更なる解析を進めており、新たな心不全治療のターゲットとなる因子を模索している。高血圧、心筋梗塞などを起因として分泌される液性因子は心筋細胞膜状のレセプターを活性化し、心筋細胞肥大を誘導する。その過程において様々な細胞内シグナル伝達系が活性化し、そのシグナルは最終的には心筋細胞核に到達、HAT活性を有するp300を活性化し、転写因子GATA4のアセチル化を誘導することで肥大反応因子の転写を亢進する。この心筋細胞核内のp300/GATA4複合体による活性制御機構を解明するために、p300/GATA4結合因子であるRbAp48/46及びその構成因子であるHDAC1/2について解析を行った。1)免疫沈降-WB及びリコンビナントタンパクを用いたGSTプルダウンの結果、GATA4はRbAp48/46と直接結合するがHDAC1/2とは直接結合しないことが判明した。またRbAp48/46はHDAC1/2と強固に結合していることを見出した。HEK293T細胞にてRbAp48/46をノックダウンしたところ、GATA4とHDAC1/2との結合が減少、p300/GATA4複合体の増加及びGATA4のアセチル化の亢進がみられることが判明した。2)HDAC1/2のノックダウンはフェニレフリン刺激による心筋細胞肥大を増悪させ、RbAp48/46の過剰発現による肥大抑制が見られなかった。またクラスIHDAC阻害剤であるバルプロ酸を用いて検討したところ、同様の結果が得られた。3)心筋細胞へのフェニレフリン刺激はGATA4のリン酸化を誘導するが、それとともにGATA4-RbAp48/46複合体が解離し、GATA4のアセチル化が亢進した。この反応はMEK/ERK阻害剤であるPD98059により抑制された。p300HAT阻害剤ではGATA4のリン酸化は抑制せず、PD98059ではGATA4のアセチル化の阻害が見られた。以上の結果から、RbAp48/46はHDAC1/2とともに転写抑制複合体を形成し、GATA4の転写活性を抑制していることが判明した。この複合体の制御にはGATA4のリン酸化がキーであることが示唆された。

GATA4結合因子の解析は概ね順調に行うことが出来ているが、新たなp300結合因子のプロテオミクス解析に関しては難航している。問題点としてはp300は想定される分子量が約260kDaと巨大な核タンパクで不安定であることから、心臓組織からの精製・結合タンパクの単離が非常に困難を極めることである。今後心臓組織からの核タンパクの精製方法を条件設定することで問題点に対処していきたい25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)これまでの研究によってGATA4結合因子であるRbAp48/46はGATA4の105番目のセリンのリン酸化によってGATA4との結合能が制御されていることが示唆された。このリン酸化はMEK1/ERK経路によって行われており、p300とは異なるGATA4の制御経路である。またRbAp48/46はp300によるGATA4の脱アセチル化を誘導することから、GATA4のリン酸化、アセチル化による制御機構にRbAp48/46が密接に関与していることが考えられる。今後実際の心筋細胞肥大反応時や心肥大モデル動物においてRbAp48/46がどのようにGATA4を制御しているのか検討していく。(2)p300TGマウスの心臓を摘出、核タンパク質を抽出し、抗FLAG抗体によるアフィニティー精製を行うことで心臓特異的なp300結合タンパク質を獲得する。次にこれをペプチターゼ処理し、LC-LC/MS-MSにて分離・解析、データベース検索を行うことでp300結合タンパク質を同定する。これによってp300の上流・下流の調節因子および心不全治療のターゲット因子を模索する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
英語口頭運用能力を測定するための共通参照尺度の開発

本研究全体の最終的な目的は,学校教育現場で教員が生徒のスピーキング技能の熟達度を簡便に評価する際に使用可能な評価尺度を開発することである。本研究期間においては,上記目標の達成に向けて以下の成果を挙げることができた。(1)評価尺度に含めるルーブリック(試案)の文言の妥当性について検証し,必要な修正を行った。(2)新規にルーブリックの開発を行い,評価尺度に追加した。(3)項目応答理論と潜在ランク理論の併用の可能性について検討することができた。本年度は3年間の研究の最初の段階として、英語口頭運用能力を測定する際に用いる評価尺度として使用する記述子の精緻化を図った。ここで言う記述子とは、学習者の言語使用の熟達の度合いを言葉で描写した短い文のことである。具体的な方法としては、すでに実施済みのパイロットスタディーから得られた学習者の英語口頭パフォーマンス映像を用いた。高等学校の英語教員3名に対して映像を見ながらの半構造化インタビューを間隔をあけて2回実施することで、英語教員が学習者のパフォーマンスを記述する「ことば」をスムーズに引き出した。具体的な手順は以下の通りである。(1)さまざまなレベルの学習者のパフォーマンス映像を2つずつ対にして編集した上で調査協力者(高等学校英語教員)に見せた。そして、「どちらのパフォーマンスのほうが優れており、どのような点で優れていると思うか」について尋ねる「比較判定法」と呼ばれる方法を用いた。(2) (1)によって引き出された調査協力者の記述的な言語が、パイロットスタディーの結果から得られている当該パフォーマンスの質を表す記述子でどの程度カバーできているかを確認した。(3) (2)において記述子の過不足や著しいズレの有無について調査協力者とともに検討し、教員がパフォーマンスの質を記述する際に用いる生の言語に各記述子の文言をすり合わせた。本研究全体の最終的な目的は、学校教育現場で教員が生徒のスピーキング技能の熟達度を簡便に評価する際に使用可能な評価尺度を開発することである。その中で、本年度はその開発の一段階としてNekoda, Nekoda, & Miura(2007)の中で量的データによって開発された英語口頭運用能力に関する評価尺度の妥当性を質的側面から検証した。当初の予定では本年度より、追加のデータ収集の準備を行う予定であったが、先の研究より得られた評価尺度の修正が今後の研究に与える重要性に鑑み、昨年度からの研究課題を継続することとした。具体的には、高等学校の英語教員3名に学習者の英語口頭パフォーマンス映像を見せ、英語教員が評価に際して使用する評価言語を引き出し、これをNekoda et al. (2007)において開発された評価尺度に含まれる記述表現と照らし合わせる作業を行った。具体的には、(1)英語教員の評価言語には含まれていないが記述子の特徴記述に含まれている内容の削除・修正、(2)英語教員の評価言語と記述子の特徴記述の両方に含まれる内容(一致・近似している内容)のすり合わせ・微調整、(3)英語教員の評価言語には含まれているが記述子の特徴記述には含まれていない内容についての記述子の新規作成を行った。本年度は3年間の研究の最終年度でありぐすでに収集したデータを分析し、発表することに注力した。具体的には、本研究においてこれまで使用してきた評価規準および基準(=ルーブリック)が、現職の英語教員が学習者のスピーキング・パフォーマンスを評価する際に用いる記述言語(=評価言語)と整合しているかについて、質的データを用いて検討し、2本の論文にまとめた(いずれも査読付きの全国レベルの専門誌に掲載:「11.研究発表」欄を参照)。その中では(1)英語教員の評価言語には含まれていないがルーブリックに含まれていた言語特徴記述を削除・修正するとともに、(2)英語教員の評価言語には含まれているがルーブリックには含まれていなかった言語特徴記述を新規にルーブリックとして作成した。また平行して、手元にあるデータを今年度入手した各種データ分析ソフトを用いて反復して複層的に分析を行った結果、評価者が判断(judging)に基づいてパフォーマンスに対して下す分析的評価データの新たな分析視点を発見するに至っており(未発表:来年度論文として発表予定)、今後の研究の進展に繋がる大きな成果が得られた。
高発癌性遺伝病の修復欠損要因と修復遺伝子の解析

1.色素性乾皮症(XP)の相補遺伝子クローニングと蛋白の解析。XPーA群を部分相補するマウス・ヒトcDNAが多数のλとプラスミドにクローニンクできた。その中1.0と1.3kbXPーAcDNAは新遺伝子で215アミノ酸の中性蛋白(25KDa)をコードした。このXPーAcDNAによるサザン分析はゲノム遺伝子(9q)の欠失などの大変異はなく、多数A群では第3イントロンのスプライス受容部位のG→C点尖然変異が発見され、ノザン分析でmRNA転写の異常欠損が見られた。一方、仔牛胸腺から分離カラム組合せで精製したXPーA相補蛋白は42KDaの塩基蛋白で、90KDa複合体としてミクロ注入でXPーA細胞のみでDNA修復を完全回復させた。部分精製XPーC因子は高分子量(160KDa)のDNA親和性の高い蛋白であった。2.XPのDNP修復欠損、突然変異と発癌。全国調査の結果433XP患者が存在した。相補テストの結果、A群105例、C9、D14、E14、F19、G2、Variant(Va)62の計208例が決定され、欧米に比し、A、E、F、Va群が多く、CD群が少ない。全患者の48名が発癌し、ほぼ完全な修復欠損のA、C群は平均10歳の若年性発癌を、中間修復能のEF群とVa群では36ー48歳の平均遅延発癌を示し、よい相関が得られた。LIVによる主要なダイマーと(6ー4)産物に各々特異的単クローン抗体が樹立され、A、C、D群では両損傷修復とも80ー100名欠損し、Va群は高変異性(6ー4)産物のみの部分欠損を示し、発癌したVa群はカフェイン感受性であったので(6ー4)産物が原因損傷と考えられた。シヤトルベクターpZ189のsupF遺伝子のUV突然変異の塩基配列研究はXPーA、C、F群において70%が点突然変異で、TCとCC配列のCではほぼ全部の変異が生じたので(6ー4)産物が発癌性変異にとって重要と考えられた。微底光防御はXP発癌抑制に大変有効である。XPの分子研究が格段に進歩した。多相補群のXP遺伝子と産物および分子修復作用機構の系統的解明が向後の重要な研究展開課題である。
強誘電体／固体電解質界面の局所イオン伝導率の計測

固体電解質のイオン伝導率が誘電率と相関する点に着目し、振幅変調型AFM(AMーAFM)を用いて、ガラス電解質の局所比誘電率を計測する手法を確立した。ガラス電解質の一つであるリン酸リチウムオキシナイトライド(LiPON)を導電性基板上に成膜し、AM-AFM測定を用いてその比誘電率を計測した結果、およそ20の値が得られた。これは文献値(16-20)とほぼ一致する値である。この知見を用いて、BaTiO3-LiPONの界面近傍の比誘電率の分布を調べた結果、界面近傍にバルクとは異なる比誘電率をもつ領域が存在する可能性を見いだした。強誘電体等の材料(添加材料)を固体電解質と複合化すると、固体電解質の全イオン伝導率が向上する場合がある。これらは「複合固体電解質」に分類される。複合化して全イオン伝導率が向上するのは、界面近傍でイオン伝導率が向上する領域が形成されるためと考えられている。しかし、そのイオン伝導率を実測した例は少なく、イオン移動機構のモデルも多数ある。このため、複合電解質の材料設計指針は現状では明確でない。そこで本研究は、Li+伝導性のセラミックス固体電解質を強誘電体と複合化したたモデル界面を構築し、界面近傍の局所イオン伝導率を電流計測AFMを用いて計測する手法の開発を目的としている。H25年度は、ダイヤモンド或いは白金-ロジウム等の市販されている探針材料への金属被覆、固体電解質上に異なる面積のAu集電膜を備えた試料を用いた導電率計測から、電流計測AFM装置の等価回路の構築を行った。これにより、探針部及び制御部の各抵抗を見積もった。また、この際に探針にかける荷重を変えて電圧計測を行い、荷重の適正範囲を絞った。一方、Au蒸着膜と固体電解質上でのフォースカーブの計測から、荷重をかけた場合に前者ではAuの変形が認められる(接触する)のに対し、セラミックス固体電解質の形状変化は認められなかった。即ち、一般的な探針を直接セラミックス固体電解質に押しつけるだけでは十分な接触を稼ぐことが難しく、局所導電率の計測は難しい。セラミックス固体電解質と接触しやすくするための改良が必要と考えられる。本研究は、Li+伝導性の固体電解質を強誘電体単結晶基板上に形成して複合電解質のモデル界面を作製し,電流計測原子間力顕微鏡(AFM)を用いて界面近傍の局所イオン伝導率を計測する手法を開発する。本成果により、複合電解質の界面近傍でイオン伝導率が変調する機構を解明できれば、高Li+伝導性複合固体電解質の開発への研究が期待できる。H26年度はBaTiO3微粒子を分散した基板上にガラス電解質を被覆し、基板面内方向でのイオン伝導率の分散率依存性を評価した。その結果、BaTiO3の分散率に依存して新しい緩和過程が生じ、その領域の活性化エネルギーが低減した。即ち、界面近傍に高LI+伝導領域が存在することを示唆している。この領域に関する情報を得るためにBaTiO3単結晶/ガラス電解質の積層体を作製し、EELS及びSIMS測定を用いてLiの分布を計測した。いずれの手法においても、界面近傍でLiの濃度がわずかに増大する結果が得られた。この詳細について現在検討を進めている。AFMを用いた局所伝導計測において、液体Ga-In合金を用いて探針-試料表面の接触抵抗の低減を検討した。その結果、Ga-In合金を固体電解質基板上に大量に乗せたときには電解質のイオン伝導に起因する半円弧が認められたが、先端にのみGa-Inを付着させインピーダンス測定を行うと測定値が高周波領域で発散し、期待した効果が認められなかった。一般的なRC並列回路では、R値が大きくなるにつれ、高周波数域における測定確度は低下する。Pt櫛形電極上に約20 nmのガラス電解質を成膜し、探針を0.02 Hzの速度で走査させながら、100 mVの振幅電圧と500 mHzの固定周波数でインピーダンス測定を行った。その結果、Pt電極領域の直上でLiPON膜の抵抗が最小となるインピーダンスの分布が得られ、周波数を適切に設定することで、局所イオン伝導率の差異を膜厚方向に検出できる可能性を見出した。AFMの振幅変調型モードを用いて、探針先端と試料との間での外力変化に起因する振幅・位相変化を計測・解析し、これを用いて試料の局所誘電率及び表面電位を計測する手法を確立した。始めに金と高配高性熱分解黒鉛の二種類の導電性基板を使用し、探針・試料間の電位差を制御しながらフォースカーブを測定し、この値を自作した計算プログラムに入力して、各測定位置での高さ変位(Z点)における探針試料間の相互作用力を求めた。この結果をグローブボックス中での試料の比誘電率及び表面電位を計測するための検量線及び初期物性値として用いた。強誘電体の一つであるBaTiO3粒子を分散し、この上にLi+伝導性ガラス電解質(LiPON)を被覆して複合モデル固体電解質を作製した。薄膜中のLiPONバルク領域及びBaTiO3との複合領域における比誘電率を計測した。LiPONバルク領域の誘電率はおよそ20の値が得られ、これは文献値(16-20)に近い値を示した。一方、LiPON層で被覆されたBaTiO3粒子近傍を計測した結果、BaTiO3粒子近傍で位相が負に変位する領域が観測された。

これは、BaTiO3粒子の周辺でLiPON内での電子伝導性或いはイオン伝導性が増加していることを示唆している。BaTiO3粒子を静電噴霧法で櫛型電極上に分散し、その上にLiPON薄膜を成膜した場合複合モデル電解質の伝導率をEISで計測すると二つの緩和成分が認められる場合がある。この緩和に対応する現象がAFMで可視化して計測されていると考えられる。固体電解質のイオン伝導率が誘電率と相関する点に着目し、振幅変調型AFM(AMーAFM)を用いて、ガラス電解質の局所比誘電率を計測する手法を確立した。ガラス電解質の一つであるリン酸リチウムオキシナイトライド(LiPON)を導電性基板上に成膜し、AM-AFM測定を用いてその比誘電率を計測した結果、およそ20の値が得られた。これは文献値(16-20)とほぼ一致する値である。この知見を用いて、BaTiO3-LiPONの界面近傍の比誘電率の分布を調べた結果、界面近傍にバルクとは異なる比誘電率をもつ領域が存在する可能性を見いだした。局所イオン伝導率の計測における強誘電体/固体電解質界面近傍でおこるイオン伝導挙動及びそのLi+濃度分布を計測できた点は予想以上の成果と考えられ、あとはこの領域のイオン伝導挙動を計測する段階に入っている。この局所評価には、AFMを用いた計測を第一に考えているが、現在の所は計測においてノイズが混入する、抵抗が大きすぎて計測できない等の問題点が生じており、この部分の改良が必要である。27年度が最終年度であるため、記入しない。電気化学H26年度はAFM探針に直接リード線を取付けることで、インピーダンスのノイズが減少し、ある程度の接触面積までは半円弧が測定できることがわかった。現在、探針で直接測定するところまでできていないが、AFM探針に直接リード線を取付けた状態で、測定回路系をさらに改良していく。測定系については、導電性探針に金粒子を先端に付けたAFM探針を使用することで接触面の安定化させる。また、窒素またはアルゴンを導入したグローブボックス中で導電率測定を行う。結晶質固体電解質のLLZ固体電解質ペレットも使用する。固体電解質表面に存在している炭酸リチウムや水酸化リチウムをグローブボックス内で研磨し、即座に測定を開始することで表面の接触抵抗の低減を図る。LLZ表面の粒界を横断するように測定し、インピーダンスの相対変化に注目する。この際、周波数を固定し、インピーダンスを測定しながら表面を走査させ、結晶粒、粒界が持つ抵抗変化の傾向に注目する。この測定を試料表面の何箇所についても行い、局所的なイオン伝導率変化の定量化を行う。電流計測AFM装置を用いて、基礎的な測定が可能な段階まで到達した。固体電解質上のイオン伝導率を探針を用いて計測する場合に、探針とセラミックス固体電解質の接触に問題点があるということを突き止め、課題を克服するための指針が明確化できた。セラミックス固体電解質と探針との接触が大きな課題である。固体電解質側では、ガラス、ポリマー電解質などセラミックス固体電解質よりも柔らかい固体電解質の利用で問題を回避できる手法として考えられる。また、セラミックス固体電解質との接触が起こりやすい探針の開発が第二の手法と考えられる。
中鎖脂肪酸トリグリセリド食を基盤とした先天性魚鱗癬の治療法開発

Neutrallipidstoragediseasewithichthyosis(NLSDI,別名Chanarin-Dorfman症候群)は細胞内のトリグリセリド(TG)代謝に必須の酵素であるCGI- 58/ABHD5の欠損による、重症型の魚鱗癬症候群である。NLSDIのモデル動物であるCGI-58ノックアウトマウスでは表皮ケラチノサイト(KC)の分化が胎生期早期から予想外に大きく障害されていた。食事療法の一つである、Middle-chain triglyceride diet(MCT食)は全身性に脂肪を異化し、肥満患者の体脂肪の減少をもたらし、てんかん等の治療に用いられている。NLSDI症例において、MCT食が皮膚を含めた全身の症状緩和をもたらした報告があるが、1例のみの短報にとどまっている。また、NLSDIにおける細胞内脂質蓄積による表皮分化障害については、その存在は想定されるものの、詳細な研究はなされていない。本研究ではMCT dietがNLSDIモデルマウスの皮膚形成にもたらす影響を細胞生物学的に検討し、本療法の有用性の理論的基盤を確立する事を目的とした。MCT食をマウスに投与する事により、血清中の遊離脂肪酸およびTG濃度は減少した。NLSDIモデル仔マウスでは正常仔マウスに比べて、経費水分蒸散量は上昇したが、MCT食を与えられた母マウスから出生したモデル仔マウスでは、上昇は抑制された。それぞれの仔マウスの表皮構造と角層内に蓄積する脂肪滴について組織学的に比較検討したが、明らかな変化を認めなかった。また、表皮の分化マーカーであるインボルクリン、ロリクリンの発現レベルについて、有為な差異は認められなかった。本研究により、MCT食がNLSDIの皮膚症状を改善させる可能性が示唆されるものの、その機序については更なる検討が必要である。
リボソーム蛋白の核小体への移行シグナル

細胞質で作られたリボソーム蛋白は、核小体へ集まった後、リボソーム粒子に組み込まれる。リボソーム蛋白の核小体ヘの集合は、この蛋白自身の持つ何らかのシグナルによってもたらされていると考えられる。我々はこのようなシグナルを特定するために、二つのアプローチをとった。先ず、真核細胞リボソーム蛋白には、シグナルとなる配列が保存されており、同様の配列は前核細胞の蛋白には必ずしも存在しないと考えられるので、真核細胞の蛋白に特徴的な構造を検索することとし、これまでに報告のあるリボソーム蛋白のアミノ酸配列のデータを構築した。集めた1066種の蛋白のうち、真核細胞蛋白と前核細胞の蛋白の間で相同蛋白として対応づけられるものが54組あった。この54組について詳細な検討を行い、真核細胞のリボソーム蛋白には、KX_2KX_<12>K;KX_<15>KX_2;KX_4KK;KX_<12>KX_2K;KXRX_<11>Rなどの塩基性アミノ酸、特にリジンの分布に、前核細胞には無い特徴的なパターンのあることが判明した。現在、さらにこの部分のとる高次構造について検討を加えている。次にこのように求められた配列が実際に核小体への移行シグナルとして働いていることを証明するとともに、核小体への低行シグナルと核への移行シグナルの判別、またシグナルとして持つべき要件などを調ベるため、このようなシグナルを大腸菌のβガラクトシダーゼに附加した融合蛋白を培養動物細胞中で発現させ、その分布を調べることにした。ラットのリボソーム蛋白L27の一部をシグナルとした融合蛋白を、COS細胞中で発現させた所、この融合蛋白が主として核小体に分布していることが観察された。現在色なシグナルを組み込んだコンストラクトを作製し、発現実験を続けている所である。
琵琶湖における湖水と地下水との相互作用

琵琶湖あやめ浜沖における地下水漏出量の連続観測によって、1994年3月から8月にかけて、地下水漏出量の減少が確認された。これは、降水量の減少による湖水位及び湖底地下水の動水勾配の低下が原因である。また、地下水漏出量と動水勾配の周波数分析の結果、地下水漏出量については68分16秒と44分43秒を中心とする卓越周期が、また動水勾配については70分22秒と39分50秒を中心とする卓越周期が得られた。この様に地下水漏出速度と動水勾配の卓越周期が一致し、これらの周期は、琵琶湖固有の湖面振動である静振の周期とも一致することから、琵琶湖の静振による地下水漏出量の変化が認められた。さらに、風波による波高と地下水漏出量との解析から、波高の上昇にともない地下水漏出量が増大することが確認された。風波の期間中、動水勾配はあまり変化していないことから、風波による湖底砂層のルーズパッキング化にともなう透水係数の増大が、地下水漏出量の増大の原因と考えられる。イベント降雨に対する地下水漏出量の応答は、観測期間の降水量が少なかったため、定量化はできなかったが、降雨に伴う湖底地下水の動水勾配の増大及び地下水漏出量の増大が観測された。本研究によって開発されたヒートパルス式自己漏出量計は、従来困難であった地下水漏出量の連続観測を可能にした。この自記地下水漏出量計を用いた研究は、湖水と地下水の相互作用を明らかにするうえで、重要な役割を果たすと考えられる。