hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学習障害児の社会的不適応を改善するための学校をベースにした指導法の開発

次年度は、これらの結果を基にして学習障害児の仲間関係と社会的適応の状況を明らかにする。小学校低学年の学習障害児3名と、彼らが在籍する学級の全児童(72名)を対象として、まず、評定法を用いて、学習障害児の仲間受容を測定した。その結果、いずれの学習障害児も、学級の仲間達からの受容度は、学級の平均よりも1.5SD以上低く、社会的不適応の状態にあることが明らかであった。また、自己報告による孤独感尺度や仲間コンピテンス尺度の結果も、学習障害児は仲間達よりも不適応感が強いことが明らかになった。さらに、教師評定用のSSRS-Jを用いて学級の子ども達の社会的スキルを測定したところ、3名の学習障害児は、いずれのカテゴリーにおいても適切な社会的スキル得点は少なく、問題行動得点は高く、不適応的であった。そこで、これらの学習障害児の社会的不適応の原因としての社会的スキルのまずさに焦点を当て、社会的文脈モデルに基づく社会的スキル訓練を実施した。訓練のターゲットスキルとしては、これらの学習障害児が共通して苦手としていた「適切な働きかけ」と「適切な応答」を選んだ。まず、学習障害児1人につき、同じ学級で同性の人気児を選んでペアを作った。各々のペアを学級での「仲間リーダー」に任命し、学級の仲間達とは別に、ターゲットスキルの使い方と、これらのスキルを学級の仲間達に教える方法について、6セッションの特別指導を行った。次に、学級集団に対するSSTを3セッション行った。その際、これらの仲間リーダーには、訓練者の助手として教室の前に立たせ、適切なスキルをデモンストレーションさせた。さらに、訓練の効果を定着させるため、自然場面でのSSTを3セッション行った。その結果、教師評定による学習障害児の社会的スキルと仲間コンピテンスが改善し、それに伴って、仲間による受容が改善した。このことは、文脈論モデルに基づく社会的スキル訓練が低学年の学習障害児にも効果的であったことを示している。通常の学級に在籍する学習障害児は、学習上の困難だけでなく、仲間関係にも問題を抱えやすく、不登校、いじめ、非行、引きこもりなど、二次的な問題のリスクも高いため、この領域についても教育上の特別な支援を必要としている。本研究は、学習障害児の行動傾向が顕著になり始める時期の小学2年生を対象として、このような学習障害児の社会的不適応を改善する目的として実施した。まず、平成15年度に行ったいくつかの尺度(自己報告による孤独感尺度、社会的コンピテンス尺度、教師評価及び自己評価による社会的スキル尺度、学級における人気度投票)によれば、学習障害児は、健常児に比べて孤独感が強く、その他の尺度の全てにおいて、健常児よりも社会的不適応の状態にあることが明らかになった。平成16年度には、この結果に基づいて、文脈論モデルに基づくソーシャルスキルトレーニングを学級全体に対して行い、その効果性を、学習障害児と健常児の両側から評価、検討した。その結果、社会的スキルトレーニングは、これらいずれの尺度においても、学習障害児の社会的適応を改善する効果がみられた。平成17年度には、このような文脈論モデルに基づく社会的スキルトレーニングの効果が、学級のメンバーが変わった1年後にどの程度維持されているのかを査定するために、平成15年度と同様の尺度を実施した。
遺伝子組換えルジグラスの短期固定化技術による育種プロセスイノベーション

環境ストレス応答性遺伝子であるシロイヌナズナ由来DREB1A遺伝子を導入した遺伝子組換えルジグラス後代の乾燥または非乾燥ストレス条件下における形態的特性を明らかにした。乾燥ストレス条件下では、組換え体のみにおいてDREB1A遺伝子の発現が確認され,非組換え体よりも電気伝導度,葉身の相対水分含有率および葉緑素含量値がに高い値を示したことから耐乾燥性が向上したと考えられる。さらに,4倍体組換え体とBrachiaria属4倍体アポミクシス草種B.decumbensおよびB.brizanthaとの種間交雑を行い,DREB1A遺伝子およびアポミクシス関連遺伝子の両方が遺伝した雑種個体を得ることができた。当研究者は、これまでに2倍体のルジグラス(B. ruziziensis)の多芽体または種子由来幼植物体へのコルヒチン処理により作出した4倍体ルジグラスを用いて、エンブリオジェニックカルスを誘導し、そのカルスを標的組織としてパーティクルガン処理し、シロイヌナズナ由来の環境ストレス応答性遺伝子DREB1Aの導入を行った。その結果、DREB1A遺伝子が導入された遺伝子組換え体当代が5系統得られている。本申請課題において、H26年度は、既に得られた5系統の組換え体当代からT1世代(13個体)を作出、選抜し、これらの組換え体T1世代の乾燥ストレス条件下における耐乾燥性について調査した。耐乾燥性の調査では、遺伝子組換え体および非遺伝子組換え体に無潅水処理を14日間行い、導入遺伝子の発現量、電気伝導度(EC)、葉身の相対水分含水率(RWC)および葉緑素含量値(SPAD)を測定した。乾燥ストレス処理3日目では、全ての組換え体T1世代においてDREB1A遺伝子の発現がRT-PCR解析により確認され、その発現量も非遺伝子組換え体よりも有意に高かった。乾燥ストレス14日目では、一部の組換え体T1世代は、全ての調査項目(EC、RWC、SPAD)において、非遺伝子組換え体よりも有意に優れた値を示し、再潅水処理後においても、高い緑部割合が認められた。さらに、これらの組換え体T1世代を種子親として、4倍体アポミクシス草種(B. brizantha、B. decumbens)を花粉親とした種間交雑を行い、得られた交雑種子を発芽させ、PCR解析によりDREB1A遺伝子およびアポミクシス関連遺伝子の両方が遺伝した雑種個体を選抜したところ、B. brizanthaを花粉親とした種間交雑では3個体の、B. decumbensを花粉親とした種間交雑では1個体の計4個体の雑種個体が得られた。我々は、これまでに2倍体のルジグラス(B.ruziziensis)の多芽体(Ishigaki et al., 2009a)または種子由来幼植物体へのコルヒチン処理により作出した4倍体ルジグラスを用いて、エンブリオジェニックカルスを誘導し、そのカルスにシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のDREB1A遺伝子の導入を行った。その結果、DREB1A遺伝子が導入された遺伝子組換え体当代(以下、組換え当代と記す)が5系統得られている。本申請課題において、H27年度は、H26年度に得られた遺伝子組換え雑種個体(シグナルグラスを花粉親とした種間交雑では1個体、パリセードグラスを花粉親とした種間交雑では3個体の計4個体の雑種個体が得られた。)を用いた耐乾性および形態的特性の均一性の調査を行うのに先立ち、遺伝子組換えT1世代を用いた形態的特性および有害物質産生試験について調査した。形態的特性については、草丈、穂長および茎径において組換え体と非組換え体との間に有意差が認められたものの、環境に及ぼす負の影響とは考えられないものであった。組換え体および非組換え体の鋤込み土壌において栽培したダイコンの発芽率、草丈、生重および乾物重は、調査項目全てにおいて系統間に有意差が認められなかった。以上の結果から、本組換え体において新たに有害物質の産生性形質の獲得は確認されなかった。H27年度は、当初は得られた雑種個体における導入遺伝子の発現量、耐乾燥性および形態的特性の均一性について調査を予定していたものの、組換え体の反復数に必要な株を増殖することができなかった。このことから、H27年度は、組換え雑種個体の増殖を行いつつ、新たな課題として組換え体の非組換え体との質的同等性について提起し、追加調査を行った。本申請課題において、これまでに、得られた5系統の組換え当代からT1世代(13個体)を作出、選抜し、これらの組換え体T1世代の乾燥ストレス条件下における耐乾性について調査した。乾燥ストレス処理3日目では、全ての組換え体においてDREB1A遺伝子の発現がRT-PCR解析により確認された。乾燥ストレス処理

14日目では、組換え体の一部は、全ての耐乾燥性に関する調査項目(SPAD値、相対的水分含水率)において、非組換え体よりも優れた値を示し、再潅水処理後においても高い緑部割合が認められた。さらに、これらの組換え体T1世代を種子親として、4倍体アポミクシス草種(B. brizantha, B. decumbens)を花粉親とした種間交雑を行い、得られた交雑種子を発芽させ、PCR解析によりDREB1A遺伝子およびアポミクシス関連遺伝子の両方が遺伝した雑種個体を選抜したところ、シグナルグラスを花粉親とした種間交雑では1個体、パリセードグラスを花粉親とした種間交雑では3個体の計4個体の雑種個体が得られた。環境ストレス応答性遺伝子であるシロイヌナズナ由来DREB1A遺伝子を導入した遺伝子組換えルジグラス後代の乾燥または非乾燥ストレス条件下における形態的特性を明らかにした。乾燥ストレス条件下では、組換え体のみにおいてDREB1A遺伝子の発現が確認され,非組換え体よりも電気伝導度,葉身の相対水分含有率および葉緑素含量値がに高い値を示したことから耐乾燥性が向上したと考えられる。さらに,4倍体組換え体とBrachiaria属4倍体アポミクシス草種B.decumbensおよびB.brizanthaとの種間交雑を行い,DREB1A遺伝子およびアポミクシス関連遺伝子の両方が遺伝した雑種個体を得ることができた。本申請課題では、環境ストレス、特に耐乾燥性を付与した遺伝子組換え牧草の短期間での固定化を目的としており、第一段階として、遺伝子組換え体の作出ならびにアポミクシス草種との種間交雑、第二段階として遺伝子組換え雑種個体の導入遺伝子の発現量と耐乾燥性および栽培形質の均一性について調査することを目標としている。初年度は、既に第一段階を達成していることから、概ね順調に進展している。H28年度は、H27年度に増殖した組換え雑種個体を用いて、雑種個体における導入遺伝子の発現量、耐乾燥性および形態的特性の均一性について調査を行うものとする。作出された組換え雑種個体の導入遺伝子(DREB1A)が、アポミクシス性の遺伝によって、後代に引き継がれるのか。そして、その導入遺伝子の発現量は世代間において差が生じるのかどうかについて明らかにしていきたい。草類遺伝資源利用学今後、作出された遺伝子組換え雑種個体の導入遺伝子(DREB1A)が、アポミクシス性の遺伝によって、後代に引き継がれるか。当該年度の所要額が若干生じたものの、研究の進捗状況に応じた予算支出を行うことが概ねできている。当年度は、当該年度の所要額が若干生じたものの、研究の進捗状況に応じた予算支出を行うことが概ねできている。生じた次年度使用額については、引き続き、研究進捗に応じた計画的な支出を行う。
肝癌におけるヒストン修飾を介したエピゲノム変化の解析と新規治療の探索

わが国における肝細胞癌の原因が、ウイルス感染から脂肪性肝炎に大きくシフトしている。脂肪性肝疾患からの肝発癌は、食事という環境変化により肝細胞が悪性変化を起こしていることからエピゲノム変化が重要な原因と考えられた。HCVキメラ遺伝子導入HCV産生株HPI細胞、肝発癌マウスモデルSTAMなどを用いた検討からNrf2、EZH2、microRNA-122の発現変化が重要であることが明らかとなった。さらに化学発癌物質を使わずに高脂肪食のみで発癌するマウスモデルを検討した結果、腸内細菌による胆汁酸成分の変化とmTORの活性化が重要な病態因子であることが判明した。HCV持続感染細胞を樹立しHPI細胞と命名し、HCV関連肝細胞癌(HCC)のモデルとして使用した。この細胞では、HCV持続感染における脂質ラフトと脂肪滴の豊富な存在と脂質代謝亢進、転写因子Nrf2の活性化を示した。HCC細胞の増殖とHCV複製の両面からNrf-2の関与を検討することを今年度の目標とした。in vitroのみならずC型肝細胞癌組織においてもNrf2の活性化が亢進していることが認められた。また、HPI細胞にNrf2の阻害薬であるbrusatolを加えることにより、HCV蛋白質とRNA、脂質関連遺伝子発現が著明に減少すること、及び、細胞増殖が著明に抑制されることを明らかにした。一方、マイトマイシン、CDDPなど従来の抗癌剤はHPIに対して細胞増殖抑制効果を示したもののHCV抑制作用が僅かであったことから、brusatolによるHCV抑制作用は単なる細胞増殖抑制によるものではなく、代謝抑制、蛋白合成阻害等を介したbrusatolに特異的なものと考えられた。以上から、brusatolは肝癌細胞増殖抑制作用とともに、抗HCV感染作用を有すると考えられた。これは報告したSAHAと同様の効果と考えられた。一方、高コレステロール高脂質食による9週間の飼育でヒト非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の組織変化を持つマウスモデルを作成できた。本マウスの腸内細菌叢と脂質成分、胆汁酸成分の網羅的解析を進めている。本NASHマウスモデルでは、抗生物質により腸内細菌叢を変化させて解析しているが、抗生物質による腸内細菌叢の変化によってNASHが改善することが判明した。高脂肪食負荷マウスでは、HPI細胞にbrusatolを作用させた際に顕著に低下した脂質関連遺伝子EVOLV6やHMGSなどの発現が著明に亢進し、抗生物質処理で有意に低下することが認められた。一つの目標であるHCV産生肝癌細胞において、抗酸化作用を持つNrf-2の作用効果について明らかにすることができた。また、in vivoの慢性肝疾患モデルを作成することができ、脂質関連遺伝子の動きに共通性があることがわかった。しかし、miR-122, Nrf-2, EZH2の相互の関連についてはまだ不明な点が多く、エピゲノム変化についての検討が未だ行われていない。In vivoの系では、未だ肝発癌が認められていないため、さらに長期の飼育が必要である。1. HPI細胞を使ったHCV増殖システムにおいて、Nrf2阻害薬brusatolを使用してNrf2の作用について検討した。その結果、CDDP, MMCとは異なり、Brusatolは細胞増殖抑制作用に加えてHCV-5'UTRやNS5Aの産生を有意に減少した。また、brusatolにはApoAの転写を抑制し、脂質代謝に影響することがわかった。Nrf2の抑制により脂質代謝を抑制し、さらにHCV RNA複製、HCV関連蛋白発現を抑制する機序が考えられた。2.培養肝癌細胞を用いHDAC阻害薬やDNAメチル化阻害薬等epigenome薬のテロメアあるいはテロメラーゼ活性に対する効果を検討した。その結果、培養細胞の種類によりテロメアの動向に違いがあることがわかり、HDAC阻害薬に共通の効果を見出すことはできなかった。3.味の素製薬(株)の開発したSTHD-01食を用いて、マウス飼育約10週目にはヒトのNASHに相当する肝組織が認められ、さらに長期(40週)に飼育することにより発癌イニシエーターを用いることなしに肝発癌が認められた。抗生物質同時投与によりNASHや肝発癌が抑制されることが明らかとなった。STHD-01食により、腸内Bacteroides, Clostridium cluster XVIIIが増加し、Strptococcus, Bifidobacterium, Prevotellaが減少した。抗生物質投与群では、総菌数が1/100程度に減少し、Enterococcusにて占められていた。STHD-01食飼育では、長鎖飽和脂肪酸の増加による核内受容体の刺激により肝内に炎症が惹起され、腸内に増えた菌により一次胆汁酸が二次胆汁酸に代謝されるが、抗生物資投与によりその割合が有意に減少した。飽和脂肪酸による慢性の炎症に加えて二次胆汁酸が発癌シグナルを惹起するものと考えられた。1. NASHに伴うマウス発癌モデルを発癌イニシエーターを用いることなく作成することができた。2. Nrf2, miR-122, EZH2の関連についてほぼ確定された。3.テロメアの制御とepigenome制御については、一定の法則を見いだすことができなかった。本年度は、C57BL/6に高脂肪食STHD-01を摂餌するだけでNASH様肝組織を経て、肝細胞癌が発生することが確認された。

高脂肪食に抗菌剤カクテルを投与すると腸内細菌は減少し、数種のEnterococcus strainのみが腸内で生存した。STHD-01食では、脂肪酸延伸反応が進み肝内に長鎖飽和脂肪酸が多くなり炎症反応を強く惹起する一方、抗菌剤によりomega-3系脂肪酸が増加し炎症を鎮めた。胆汁酸解析によりSTHD-01食では、deoxycholate (DCA)など有害種二次胆汁酸が多かったのに対し、抗菌剤によりursodeoxycholate (UDCA)やtauro-UDCA (TUDCA)など無害種二次胆汁酸がほとんどを占めた。抗菌剤投与で残ったEnterococcusの中2strainにはDCAをUDCAやTUDCAに代謝する能力があった。肝内タンパク質発現を解析するとmTORのリン酸化が亢進しており、cholate, chano-DCA, DCAの中ではDCAにmTOR活性能が有意に高かった。また、抗生物質によりNrf2, NAD+, NADP+の発現、GSH/GSSG比が有意に高く抗酸化活性が亢進していた。全体を通じて、HCV産生肝細胞におけるApoA転写亢進/脂肪蓄積、Nrf2の発現亢進、miR-122の転写低下、EZH2転写亢進から、脂肪化、Nrf2, miR-122, EZH2の発現間に相関があり、NASHを介した肝発癌でも同様の病態機序が働いていることが想定されin vivoにおけるNASH発癌モデルでの検証を試みた。ApoA亢進/脂肪化に伴うNrf2発現の刺激、そして脂肪代謝の亢進でepigeneticに悪性回路が形成されると考えられた。腸内細菌の変化による胆汁酸成分の変化がこの悪性回路を断ち切る一つの方法であることが考えられた。わが国における肝細胞癌の原因が、ウイルス感染から脂肪性肝炎に大きくシフトしている。脂肪性肝疾患からの肝発癌は、食事という環境変化により肝細胞が悪性変化を起こしていることからエピゲノム変化が重要な原因と考えられた。HCVキメラ遺伝子導入HCV産生株HPI細胞、肝発癌マウスモデルSTAMなどを用いた検討からNrf2、EZH2、microRNA-122の発現変化が重要であることが明らかとなった。さらに化学発癌物質を使わずに高脂肪食のみで発癌するマウスモデルを検討した結果、腸内細菌による胆汁酸成分の変化とmTORの活性化が重要な病態因子であることが判明した。今後は、HCV RNA増幅と肝癌細胞増殖において、Nrf-2とmiR-122、EZH2の発現の相関性について検討を急ぐ必要性があると考える。さらにin vivoの系では、高脂肪食投与を長期に延伸し、肝発癌の有無について検討する予定である。NASHマウスモデルでは、腸内細菌の検討、脂質成分の解析、胆汁酸成分の解析、トランスポーター発現変化を検討しなければならない。発現変化のある分子に関しては、エピゲノム制御について検討する予定である。今後は、動物モデルにおいて二次胆汁酸の刺激による発癌に至る細胞内シグナルを解明し、in vivoモデルにおけるNrf2、miR122、EZH2の発現との相関を検討する必要がある。現在、論文を作成中である。消化器内科予定よりも消耗品や委託にかかる費用が安価で済んだため。
テラヘルツ帯高出力パルスジャイロトロンの開発

核融合研究を進展させる上で、超高温・高密度プラズマ中のイオンの温度を正しく計測することは極めて重要である。本研究では、このための新しい装置を開発する際の計測用光源として、テラヘルツ帯高出力電磁波の発振器であるパルスジャイロトロンの開発を行った。新着想を取り入れた結果、周波数349GHzで最大出力約50kW、390GHzで最大出力約40kWを得た。これらは、この周波数領域の2次高調波発振ジャイロトロンとして世界最高値である。本研究の目的は、400GHz帯100kW級の高出力パルスジャイロトロンを実現し、協同トムソン散乱計測への道を開くことである。2年の研究期間で以下の目標を掲げている。1. 400GHz帯で100kW級の高繰り返しパルス発振ジャイロトロンの実現パルス幅は100μs、繰り返し10Hz以上を目指す。2.核融合科学研究所大型ヘリカル装置LHDにおいて協同トムソン散乱計測の光源として用いるために必要なジャイロトロンの性能仕様(周波数、出力、パルス幅、繰り返し率等)を明確にする。3.本研究の結果に基づき、上記2.項で設定した仕様のジャイロトロン開発のための学術的・技術的課題を明らかにする。今年度の研究実績は以下の通り。既存のマグネトロン入射型電子銃(40kV, 1A)を用いて、基本波発振200GHz・10kW級パルスジャイロトロンを開発した。基本波TE_<0.3>、周波数約203GHzの発振を確認した。さらに、周波数約400GHzの第二高調波発振が得られること、また35kV以上の高加速電圧でも単独発振することが分かった。次に、高出力化のため、ジャイロトロンをより高電流および高電圧で動作させる改良電子銃を設計・試作し、この電子銃を用いるジャイロトロンを設計・製作した。電子銃の専門家Manuilov教授を短期招聘し、電子銃の設計とキャビティー系の設計の整合性を確認した。以上のジャイロトロン開発と並行して、協同トムソン散乱スペクトルの計算コードを開発した。LHDにおいて最近の10^<20>m^<-3>以上の高密度プラズマを想定し、散乱スペクトル・入射波および散乱波の伝播を計算し、計測に適したポートを選定した。昨年度は、既存の電子銃(40kV, 1A)を用いて、基本波200GHz・10kW級パルスジャイロトロンを開発し、周波数約400GHzの2次高調波が35kV以上の高ビーム電圧でも単独発振することを示した。今年度はこの成果に基づき、2次高調波400GHz帯の高出力(50kW)の実証を目指した。この設計においては、昨年度から整備してきたコードを用いて、競合モードからの孤立性の高い発振モードの探索とモード競合計算を行い、TE65モード及びTE85モードを選択した。また、Manuilov教授の協力を得て設計した高出力用電子銃を採用した。さらに、超伝導マグネットによる磁場分布を考慮し、発振モードに対して入射電子ビーム半径が最適化されるように、電子光学的整合性のある設計とした。このジャイロトロンを用いて実験を行い、TE65モード及びTE85モードの2次高調波単独発振の確認、発振出力のビーム電圧依存性、ビーム電流依存性、補助磁場電流依存性データ等詳しい物理データを取得した。さらに実験を進め、ビーム電圧60kV,ビーム電流11Aまでの運転に成功した。この結果、TE65モードで350GHz、最大36kW、TE85モードで390GHz、最大29kWの単独発振水負荷測定出力を確認した。これらは、400GHz帯の出力としてこれまでの報告記録を上回り、世界最高値である。さらに、ジャイロトロンの真空窓や水負荷の反射率等を考慮すると、最大出力は50kWに到達したと考えられ、当初の目標を達成した。今後、2年間の研究期間で得られた知見を元にして、さらなる設計改善、高ビーム電圧での運転により、400GHz帯、100kW級管の実証につなげてゆく。また、このジャイロトロンの核融合研LHDにおける協同トムソン散乱への適用性検討を行い、100kWでSN比5が得られるという見通しを得た。
がん細胞文脈のシステム的統合理解による新たながん診断・治療概念の確立

がん細胞文脈のシステム的統合理解による新たながん診断・治療概念の確立するために、上皮間葉転換(EMT)、がん転移・浸潤性、オートファジー変調など種々の悪性特性が検証できるモデルがん細胞株を樹立した。膵臓がん細胞株Panc-1の皮下移植担がんマウスの循環血中から、循環腫瘍細胞(CTC)を分離してPanc-1-CTCと命名した。Panc1-CTCは、親株よりも高いin vitroでの移動浸潤能、in vivoでの腫瘍形成能を示した。網羅的遺伝子発現解析から、TGFBIがPanc-1-CTCにおいて有意に発現上昇し、TGFBIの過剰発現は細胞の移動・浸潤能を亢進させることを明らかにした。また、臨床検体の解析から、TGFBIは膵臓がんの治療標的ならびに予後予測バイオマーカー候補となる可能性が示された。オートファジー、レドックス、抗アポトーシスに関与する遺伝子群を標的とするmiR-634を見出し、これをシーズに核酸抗がん薬開発の分子基盤構築を進めた。マウス皮膚化学発がんモデルにおいて、合成2本鎖miR-634を内包した軟膏製剤の塗布による顕著な抗腫瘍効果を確認し、GLP基準の前臨床試験を行うためのPOCを取得した。また、卵巣がん細胞株を用いたオミクス解析から、細胞生存に必須な栄養源アミノ酸が、がん細胞ごとで異なっていることを明らかにした。グルタミン合成酵素活性が無い卵巣癌の一群を見出し、グルタミン枯渇による新たな卵巣がん個別化治療法の可能性を示した。独自に樹立したリンパ節高転移口腔がん細胞株HOC313-LMを用いた766種FDA承認薬のスクリーニングから、強い増殖抑制能を示すMCG-P(ラボネーム)を同定した。ニワトリ胚を用いたin ovo実験系を構築して、MCG-Pの腫瘍抑制制御機構の解明とDRによる新たながん治療法の確立に向けた研究を進めた。上皮間葉転換(EMT)、がん転移・浸潤性、オートファジー変調など種々の悪性特性が検証できるモデルがん細胞株を樹立し、それらを駆使したin vitro/in ovo/ in vivo解析とマルチオミクスデータ膵臓癌浸潤・転移機構に関与するTGFBIを同定し、さらに、臨床検体の解析から、TGFBIは膵臓がんの治療標的ならびに予後予測バイオマーカー候補となる可能性を示すことができた。また、癌細胞文脈を構成するオートファジー、レドックス、抗アポトーシスなどの特性に関与する複数遺伝子群を標的とするmiR-634を見出し、これをシーズに核酸抗がん薬開発の分子基盤構築を進めた。マウス皮膚化学発がんモデルにおいて、合成2本鎖miR-634を内包した軟膏製剤の塗布による顕著な抗腫瘍効果を確認し、さらに、具体的なデータは秘匿情報の為に明示できないが、放射線・化学療法抵抗性のペット犬自然発症癌を対象にした治療試験においても効果が確認されている。このことは、当該新学術領域の基礎研究から抗癌核酸薬の強力な候補シーズが見出された言える成果でであり、人対象の臨床試験を目指したGLP基準の前臨床試験に着すべく計画中である。さらに、卵巣がん細胞株を用いたオミクス解析から、細胞生存に必須な栄養源アミノ酸が、がん細胞ごとで異なっていることを明らかにした。グルタミン合成酵素活性が無い卵巣癌の一群を見出し、グルタミン枯渇による新たな卵巣がん個別化治療法の可能性を示すこともできた。また、従来の方法では生物学的特性評価が難しかった血管新生と転移浸潤の可視化アッセイを可能とするニワトリ胚を用いたin ovo実験系を構築して、今回研究で見出された抗癌薬シーズの新たながん治療法の確立に向けた研究解析のシステムが整備され、がん細胞文脈のシステム的統合理解による新たながん診断・治療概念の確立の成果が一層期待できる。以上により、当該研究課題は、当初の計画以上に進展していると判断した。当該研究課題の成果達成を目指し、独自に確立した上皮間葉転換(EMT)、がん転移・浸潤性、オートファジー変調など種々の悪性特性が検証できるモデルがん細胞株を利用して研究を推進する。特に、核酸抗がん薬候補miR-634製剤のヒト対象臨床試験に向けての前臨床試験のデータ取得を目指す。モデル細胞株や東京医科歯科大学疾患バイオリソースセンターを拠点に収集された症例検体を利用してオミクス解析、血清・細胞アミノ酸分析などを実施する。得られたオミクス解析データや機能的スクリーニングデータ、ならびにネットワーク解析などで得られる膨大な各種網羅的解析ビッグデータを、領域内計算科学者と連携して独自アルゴリズムを構築し、がんの細胞文脈システム変化プロファイルを解析する。これにより細胞文脈構成ネットワークとそれを駆動する関連分子を抽出し、遺伝統計学的解析や疫学的アプローチにより患者集団での意義づけやがん細胞文脈の違いによる新たながん層別化分類とそれに基づく新たながん個別化治療の概念の可能性を追究する。さらに、がん細胞特異的な細胞文脈を構成分子候補データに基づいて、がん細胞株アッセイ系を構築し、既存化合物ライブラリーや上市薬ライブラリースクリーニングを実施し、特に後者スクリーニングにおいては細胞文脈特異的に抗腫瘍効果を認める候補を選出し、既承認薬再配置(DR)によるfast trackの実用化を目指す。さらに、in vitro/ in ovo/ in vivo検証モデル系を用いた機能的解析を行い未知のがん関連候補遺伝子群(セット)や関連シグナル・パスウェイなどについて、機能的な確認を行う。

臨床症例を用いた多角的解析を実施してがん細胞文脈関連事象を理解し、がん細胞文脈のシステム的統合的理解を進めて文脈層別化という切り口から、高齢者がんや希少性難治癌の診断と治療の最適化方法の確立を目指す。今回の研究は、種々のがん細胞株やモデル動物ならびに臨床サンプルのオミクス解析によって得られた多階層分子ネットワークデータに基づいて、個々で異なるがん細胞文脈のシステム的統合理解を図りその情報に基づきがん診断と治療の最適化方法を確立することを目的に研究を行った。その結果、上皮間葉転換(EMT)、がん転移・浸潤性、オートファジー変調など種々の悪性特性が検証できるモデルがん細胞株を確立した。また、細胞文脈関連miRNAの探索を実施した。加えて独自保有の23がん種446がん細胞株の細胞文脈の構成別分類化を進めた。さらに、東京医科歯科大学疾患バイオリソースセンターを拠点に詳細な臨床情報を付随させたバイオバンク、特に高齢者がんサンプルに関して体系的な収集を進めた。さらに、モデル細胞株や収集された症例検体に関してオミクス解析、血清・細胞アミノ酸分析などを行い、得られたオミクス解析データや機能的スクリーニングデータ、ならびにネットワーク解析などで得られる膨大な各種網羅的解析データをもとに、がんの細胞文脈システム変化プロファイルを解析した。その結果、がん転移性にタンパク質翻訳に関与するハイプシン経路の活性化が見出された。さらに、機能的スクリーニング法により胃がん細胞においてmiR-544aのEMT誘導性を明らかにした。また、酸化ストレス応答転写因子NRF2活性化がんにおいてmiR-634が強い細胞増殖抑制、細胞死誘導することを明らかにした。Exosome回収の技術的な確立を進め、高転移性の口腔がん細胞株から放出されるExosomeに内包される浸潤制御性miRNAを明らかにしている。がん特異的な細胞文脈の構成分子候補データに基づいた、がん細胞株アッセイ系を構築し、既存化合物ライブラリーや上市薬ライブラリースクリーニングを実施するシステムが確立できている。これを用いることで、細胞文脈特異的に抗腫瘍効果を認める既承認薬の候補の複数が浮上している。さらに、in vitro/in vivo検証モデル系を用いた機能的解析を行い、未知のがん関連候補遺伝子群(セット)や関連シグナル・パスウェイなどについて機能解析が進んでいる。加えて、臨床症例を用いた多角的解析を実施してがん細胞文脈関連事象を理解し、がん細胞文脈のシステム的統合的理解を進めて文脈層別化という新しい切り口から、高齢者を含めたがん診断と治療の最適化方法の確立の基盤が構築できており、以上をもって当該研究は順調に進捗していると判断する。個々で異なるがん細胞文脈のシステム的統合理解を図りその情報に基づきがん診断と治療の最適化方法を確立するための研究を推進した。具体的には、上皮間葉転換(EMT)、がん転移・浸潤性、オートファジー変調など種々の悪性特性を検証することができるがん細胞株モデルを確立した。加えて独自保有の23がん種446がん細胞株を対象に細胞文脈の構成別分類化を進めた。さらに、モデル細胞株や収集された症例検体のオミクス解析データ、機能的スクリーニングデータ、ならびにネットワーク解析から、がんの細胞文脈システム変化プロファイルを明らかにした。
プロトンポンプに倣ったプロトン勾配をもつ錯体ヘテロ積層膜の構築とメモリスタ機能

本研究ではITO基板上にプロトン共役電子移動(PCET)を示し、かつ異なる酸化還元電位とpKaを有する二種類のRu二核錯体を、錯体末端のホスホン酸基とZrイオンとの錯形成によるlayer-by-layer法により表面に自己集積させた2つの修飾電極を作成した。それらを二端子として(1)0.1M中性水溶液を挟んだ二電極系でプロトンロッキングチェア型レドックスキャパシタを構築できた。(2)電荷の貯蔵ができることから、次に中間層にプロトン伝導性を有するポリ-4-ビニルピリジンポリマー( P4VP)を挟むことで、2電極型の薄膜型分子固体デバイスを作成し、その電流電位(IV)特性を調べ、メモリスタ機能を検討した。最初に錯体の修飾ITO基板をP4VPでコーティングした3電極式のサイクリックボルタンメトリー(CV)測定ではRu(II/III)の酸化還元電位は負側へシフトしたことから、錯体の架橋配位子部位に存在するプロトン解離サイトであるイミノNーH基とP4VPのピリジン基との間には水素結合が生成していると考えられる。また、P4VPのプロトン伝導性は知られているので、ITO||(錯体)|(P4VP)|(錯体)||ITOの2電極型デバイスのIV曲線を測定すると、高/低伝導状態を示すヒステリシスが観測された。インピーダンス測定からRH湿度の上昇に伴い、伝導性が増大することが明らかになった。また架橋基のN-HをN-Me基にするとこのヒステリシスは観測されない。以上の結果から、2つの錯体の酸化還元に伴うpKaの差によりP4VPとのプロトン平衡が、P4VPと錯体膜界面で大きくずれ、プロトン伝導に変化が生じ、ヒステリシス挙動として観測されるプロトンメモリスタ機能を発現させることができた。これに加えて、カーボンナノチューブやグラフェンなどナノ炭素電極上への表面修飾についても検討した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。混合原子価状態をとる剛直な二核錯体を表面に集積化させた自己組織化膜(SAM膜)は単一分子伝導・整流効果・分子スイッチなど様々な特性を示す。本年度の成果として、(1)両端にホスホン酸アンカー基をもつ対称Ru二核錯体のSAM膜をITO電極上に自己組織化させた一連のRu錯体の単一分子伝導を、ITO被覆カンチレバーを用いたCP-AFMを用いて測定した。Ru単核錯体のI-V特性(電流ー電位特性)では正負で対称的なI-V特性を示し、測定系の湿度を変えても対称的なI-V特性は変わらない。一方、両端に4脚ホスホン酸基をもつRu二核錯体RuN-Pでは、高湿度(60%)で非対称的なI-V特性となり、その整流比が1000と大きくなることを見出した。表面場での対称錯体が、外部環境の変化で伝導性での非対称性が大きく反映される点は興味深い。次に、(2)プロトン共役電子移動可能なベンズイミダゾール三座配位子をもつ二つの錯体RuNH-PとRuCH-Pを、配位結合を用いたLayer-by-Layer(LbL)法によりヘテロ積層膜をITO基板上に作成した。このヘテロ積層膜が印加電位、pH、光による論理ゲートとして働くことを見出した。集積アシンメトリーをもつヘテロ接合系としてのITO||(RuCH-P)4とITO||(RuNH-P)4はpH7ではそれぞれ+0.09 Vと+0.59 V vs Ag/AgClだが、4層ヘテロ接合膜ITO||(RuCH-P)4|(RuNH-P)4では内層のRuCH-Pのレドックス応答が+0.09 Vに見られるが、外層のRuNH-Pの応答は触媒波としてのみ観測された。このヘテロ接合膜に光照射すると、酸性領域でのアノード電流が、塩基性領域ではカソード電流に変わるスイッチング現象が観測された。現在プロトン勾配をもたせたプロトン伝導性高分子を挟んだ二端子デバイスについて評価している。プロトン共役電子移動を示す錯体のLbL積層膜が安定なプロトン応答性を示すことがわかったので、これを二端子デバイスとするプロトンによる動作するメモリスタの研究の初期動作を観察できたことからさらなる性能向上をはかれる可能性がでてきた。最初に錯体の修飾ITO基板をP4VPでコーティングした

3電極式のサイクリックボルタンメトリー(CV)測定ではRu(II/III)の酸化還元電位は負側へシフトしたことから、錯体の架橋配位子部位に存在するプロトン解離サイトであるイミノNーH基とP4VPのピリジン基との間には水素結合が生成していると考えられる。また、P4VPのプロトン伝導性は知られているので、ITO||(錯体)|(P4VP)|(錯体)||ITOの2電極型デバイスのIV曲線を測定すると、高/低伝導状態を示すヒステリシスが観測された。インピーダンス測定からRH湿度の上昇に伴い、伝導性が増大することが明らかになった。また架橋基のN-HをN-Me基にするとこのヒステリシスは観測されない。以上の結果から、2つの錯体の酸化還元に伴うpKaの差によりP4VPとのプロトン平衡が、P4VPと錯体膜界面で大きくずれ、プロトン伝導に変化が生じ、ヒステリシス挙動として観測されるプロトンメモリスタ機能を発現させることができた。これに加えて、カーボンナノチューブやグラフェンなどナノ炭素電極上への表面修飾についても検討した。二端子デバイスのサイズの微小化をはかり、プロトン伝導による記憶デバイスとするための錯体の多様化、プロトン伝導ポリマーの選択、プロトン伝導性を示すMOF錯体の採用など、メモリスタ動作のさらなる性能向上をはかれる工夫をしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
吸入麻酔薬とGLP-1の心筋保護相互作用―ミトコンドリア機能に与える影響―

吸入麻酔薬であるイソフルランを前投与によって心筋保護効果が得られることが報告された(Kersten JR et al., Anesthesiology 1996;85:794-807)。これを吸入麻酔薬によるプレコンディショニング(APC)作用という。APCのメカニズムは現在までに報告されている虚血再灌流障害に対する心筋保護のメカニズムと類似した部分が多く、それらは心筋保護作用に対して共通の経路を共有するものと考えられている。現在までに、プレコンディショニング作用がある様々な薬剤が研究されているが、臨床応用に至っている薬剤は少ない。申請者の研究グループは、早くから吸入麻酔薬の心筋保護作用に注目し、その経路を明らかにしてきた。また、GLP-1受容体作動薬は、近年本邦においても臨床承認され糖尿病患者に対して広く使用されている。そのため、周術期患者においてもGLP-1と吸入麻酔薬との相互作用を明らかにすることは、臨床的にも極めて重要であると思われる。本年度は、低酸素再灌流モデルにて、ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにした。分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べることで、ミトコンドリアの融合タンパクであるOpa-1が有意に増加することを明らかにした。また、ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため、Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入、トランスフェクションさせた細胞を用い、各群の心筋保護作用が棄却するかを調べた。これらの結果、吸入麻酔薬の心筋保護作用にミトコンドリアも融合タンパクが重要な役割を演じていることが明らかになった。吸入麻酔薬とGLP-1の心筋保護効果は、ミトコンドリアダイナミクスに関連するという仮説のもと、以下の研究を行った。GLP-1は小腸のL細胞から分泌されるペプチドであり、ブドウ糖濃度依存性にインスリンの分泌を亢進させる働きがあり、新しい糖尿病治療薬として注目を浴びている。他にも、膵β細胞の増殖、胃内容物の排出遅延作用、食欲抑制などが知られている。近年の研究によるとGLP-1受容体は心筋細胞にも分布していることが明らかにされ、心機能の制御や虚血に対する心筋保護作用についても報告されている。実験1においては、ラットの摘出心から得られた遊離心室筋細胞をディッシュに接着させ、特殊チャンバーを用い、1時間低酸素状況(95%N2, 5%CO2)に暴露することで心室筋細胞に虚血状態をつくりだした。その後1時間通常の培養状態に戻すことで再潅流状態とした。GLP-1群は、低酸素-再潅流の1時間前にGLP-1受容体作動薬にて細胞を処置することによって作った。これによりGLP-1によるプレコンディショニング作用が明らかとなった。同様に、吸入麻酔薬イソフルラン(1.0 minimum alveolar concentration [MAC])にて30分間刺激を与え前処置を行ったAPC群においてもその心筋保護作用が明らかとなった。さらに、これらの両方を与えた場合の生存率を対照群と比較検討すると、GLP-1とAPCの相互作用が明らかとなった。実験2においては、実験1.の低酸素再灌流モデルにて、ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにする研究を行っているところである。上記のように研究計画書に記載のとおりの進捗具合であり、おおむね順調に進展していると思われる。

申請者の研究グループは、早くから吸入麻酔薬の心筋保護作用に注目し、その経路を明らかにしてきた。また、GLP-1受容体作動薬は、近年本邦においても臨床承認され糖尿病患者に対して広く使用されている。そのため、周術期患者においてもGLP-1と吸入麻酔薬との相互作用を明らかにすることは、臨床的にも極めて重要であると思われる。本年度は、低酸素再灌流モデルにて、ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにした。分裂・融合タンパクについてイムノブロット・real-time PCRを用いて調べることで、ミトコンドリアの融合タンパクであるOpa-1が有意に増加することを明らかにした。また、ミトコンドリア融合に関与するOpa-1の影響を明らかにするため、Opa-1 siRNAを電気穿孔法にて細胞に注入、トランスフェクションさせた細胞を用い、各群の心筋保護作用が棄却するかを調べた。これらの結果、吸入麻酔薬の心筋保護作用にミトコンドリアも融合タンパクが重要な役割を演じていることが明らかになった。実験2においては、実験1.の低酸素再灌流モデルにて、ミトコンドリア染色色素(MitoTracker)、光褪色後蛍光回復法(FRAP assay)を用いて各群のミトコンドリアダイナミクス(ミトコンドリアの分裂と融合)を明らかにする研究を行っているところである。今後は、研究計画書に記載したとおりに、この実験2をさらに進め、次にミトコンドリア融合に関するOpa-1の影響を明らかにするために、実験3を行う予定である。
中学校国語科においてアナログ方式とデジタル方式による学習効果の差異を検証する。

1.研究目的本研究は、中学校国語科において文字言語による学習(アナログ方式)と、画像の視聴を中心とした学習(デジタル方式)を比較し学習効果の差異を検証しようとしたものである。2.研究方法以下のIIIIの資料をACの方法で生徒に提示し、内容の理解度を10項目の確認テスト(10点満点)で評価した。I「図表を含んだ文章」A-図表を除いた文章のみにして配布して読ませる・B-配布して読ませる・C-スクリーンに提示して読ませるII「動物の写真(18種類)」A-資料を配布する・B-18種類の動物をスクリーンに順番に提示する・C-9種類ずつ2枚に分けた資料をスクリーンに提示するIII「動物の写真(20種類)」A-20種類の動物をスクリーンに順番に提示する・B-20種類の動物を表す漢字をスクリーンに順番に提示する・C-20種類の動物を表すカタカナをスクリーンに順番に提示する3.研究成果結果をまとめると、IではAが最も理解度が高く、Cは最も低かった。IIでは、1種類ずつの画像を提示したBよりもまとめたCの方が記憶に残りやすく、B・CよりAの方が得点が高かった。IIIでは、A→C→Bの順で得点が高くなった。以上から画像を見ての理解は、文章を読んでの理解には及ばず、文章と画像の併用は、画像が文章理解の妨げになる場合もあることがわかった。また、画像より漢字・カタカナなどの文字で提示された方が記憶に残りやすいという結果もみられた。デジタル方式での資料の提示に関しては、画像は文章と切り離して提示した方が効果的であること、物の画像はその名称を文字で提示した方が記憶に残りやすいことなどもわかった。
癌・精巣抗原ＴＥＸ１０１を分子標的とした頭頸部癌ミサイル療法の開発

新規の癌・精巣抗原TEX101は、精子の子宮から卵管への移行と卵細胞との結合に必須の分子であり、この過程にはADAM3というエフェクター分子が関係していることが示唆された。従って本分子は細胞接着・遊走制御能を有している可能性が高いと考えられた。またTEX101は精細胞膜上でLy6k分子と共役しており、両分子は互いに細胞膜上での分子安定性に寄与していることが判明した。癌細胞におけるTEX101のエフェクター分子や共役分子は同定されていないが、これらのTEX101関連分子も頭頸部扁平上皮癌の診断マーカーや免疫療法における標的分子となりうる可能性がある。TEX101は、我々が発見した生殖細胞マーカー糖タンパク質である。本分子は生殖細胞以外の正常組織には発現しないことから、配偶子形成あるいは受精過程に重要な役割を果たしていると考えられている。TEX101はそのアミノ酸配列中にシステインリッチドメインを有するGPIアンカー型タンパク質で、構造的にはLy-6/uPARファミリーに属する分子である。この分子群の一部は、癌抗原として種々の癌細胞に発現しているが、我々はTEX101もまた80%以上の頭頸部扁平上皮癌症例で癌組織に発現していることを見いだし、本分子が新規の癌関連抗原であることを報告した。さらに頸部リンパ節転移症例において本分子の発現頻度が低下している傾向を認めた。以上の結果からTEX101は癌細胞においてはその細胞接着・遊走制御に関与していると推測された。この推論を裏付けるべく、我々はTEX101遺伝子欠損マウスを用いた検討を行い、本分子が精子の透明帯結合と子宮から卵管への遊走に重要な役割を果たしていることを明らかにした。しかしその詳細な分子メカニズムについては依然不明であるため、我々はTEX101遺伝子欠損マウスのさらなる検討を行った。本マウスの精巣では、TEX101の共役分子の一つであるLy6k分子の遺伝子発現は認められたが、本分子はタンパク質レベルでは検出されなかった。そこでLy6k遺伝子の転写の有無をポリソーム解析法で検討したところ、本遺伝子の転写はTEX101遺伝子欠損マウスにおいても正常マウスと同等に行われていた。以上の結果は、Ly6kはTEX101遺伝子欠損マウスの雄性生殖細胞においてもタンパク質として生成されているが、TEX101分子の欠損状態では本分子は生殖細胞に安定に存在できないことを示している。従ってTEX101が細胞接着・遊走制御機能を発揮するためにはLy6k分子との共役が必須である可能性がある。TEX101は、我々が世界に先駆けて同定した生殖細胞マーカー糖タンパク質である。本分子は生殖細胞以外の正常組織には発現せず、かつ雌雄生殖細胞の発生段階で発現パターンが変化することから、配偶子形成あるいは受精過程に重要な役割を果たしていると考えられてきた。さらに我々はTEX101は、頭頸部扁平上皮癌においてそれらの症例の80%以上の癌組織において発現していることを見いだし、本分子が新規の癌関連抗原(癌・精巣抗原)であることを報告している。TEX101遺伝子欠損マウスを用いた解析では、それらのマウスは雄性不妊を示し、その原因は精子の卵管移行障害によることが明らかとなった。TEX101は精子形成過程においてADAM3と分子関連しており、またその発現はアンギオテンシン変換酵素により制御されていることが明らかとなった。本分子はそのアミノ酸配列中にシステインリッチドメインを有するGPIアンカー型タンパク質であり、Ly-6/uPARファミリーに属する分子である。この分子群の一部は、細胞接着・遊走制御能を有することが知られている。また頭頸部扁平上皮癌症例におけるTEX101発現の有無と各臨床症状との関連を解析したところ、性別・年齢・原発部位・腫瘍サイズとは関係性を認めなかったが、頸部リンパ節転移症例において本分子の発現頻度が低下している傾向を認めた。以上の結果から、TEX101は癌細胞においては、そのエフェクター分子(例えば精巣におけるADAM3のような分子)を介して、細胞接着・遊走制御に関与している可能性が想像される。今後本分子を標的としたミサイル療法開発のための基礎データを得ることを目的に、癌細胞浸潤・転移抑制能を有する抗ヒトTEX101単クローン抗体の作製を予定している。TEX101は、我々が世界に先駆けて発見した生殖細胞マーカー糖タンパク質である。本分子は生化学的にはLy-6/uPARファミリーに属するGPIアンカー型タンパク質であり、本遺伝子欠損マウスを用いた研究により、成熟精子が子宮から卵管に移動するための機能維持に必須な分子であることが判明している。

加えて本分子は、癌・精巣抗原として80%以上の頭頸部扁平上皮癌症例の癌組織に発現しており、さらに頸部リンパ節転移症例において本分子の発現頻度が低下することが明らかとなっている。これらの結果はTEX101が生殖細胞や癌細胞において細胞接着・遊走制御能を有する可能性があることを示唆している。そこで我々は本分子の細胞生物学的な分子機能を明らかにする目的で、HEK293細胞株にTEX101遺伝子を導入した。本遺伝子導入細胞株においても、TEX101は細胞膜上でGPIアンカー型タンパク質として発現していたが、細胞増殖能や接着能に変化は認められなかった。さらにマウス精巣におけるTEX101共役分子の1つであるLy6kの遺伝子をTEX101発現細胞株に導入しても細胞増殖能及び接着能に影響しなかったが、siRNAを用いて本細胞株のTEX101発現を抑制したところ、Ly6kの発現も減弱した。逆にLy6kの発現を抑制するとTEX101の発現量が減少した。TEX101遺伝子欠損マウス並びにLy6k遺伝子欠損マウス双方において、その精巣内では両分子の発現量が減弱していることから、TEX101とLy6kは互いの分子安定性に寄与していると考えられた。TEX101と同様、Ly6kも癌・精巣抗原として頭頸部癌に発現していることが報告されており、両分子は共同で癌細胞や生殖細胞機能に関与している可能性がある。耳鼻咽喉科学本研究は新規癌・精巣抗原TEX101を標的とした、頭頸部癌のミサイル療法開発を目的に研究を開始した。まずその前段階として、TEX101の生物学的機能に関する研究を行った。我々の作製したTEX101遺伝子欠損マウスを用いた解析によって、本分子が精子の透明帯結合及び卵管への遊走に関与していることが判明した。この結果はTEX101が癌細胞の接着・遊走制御能も有している可能性があり、またこの分子機構にはLy6kが関与していることが示唆される。現在TEX101及びLy6kに対する単クローン抗体の樹立を目指しており、研究はほぼ順調に進展していると考えられる。本研究は新規癌・精巣抗原TEX101を標的とした、頭頸部癌のミサイル療法開発を目的に開始された。TEX101の生物学的機能解析については、TEX101遺伝子欠損マウスを用いた解析によって、本分子の分子活性及びその発現制御機構が明らかとなった。これらの実験結果及びヒト頭頸部癌組織における発現動態を基盤にして考察すると、TEX101は細胞接着・遊走にも関与していることを示唆しており、このことは本分子の頭頸部癌ミサイル療法標的分子としての有用性を示している。現在TEX101に対する単クローン抗体の樹立を目指しており、研究はほぼ順調に進展していると考えられる。本研究は新規癌・精巣抗原TEX101を標的とした、頭頸部癌のミサイル療法開発を目的としている。そこでまずヒトTEX101特異的単クローン抗体作製のため、手術によって採取した癌組織より癌細胞を分離、継代培養し、頭頸部癌由来細胞株を樹立する。樹立した細胞株はRT-PCR及びフローサイトメトリーを用いて、TEX101発現株・非発現株に分類する。作製したTEX101発現細胞から抗TEX101多クローン抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによりTEX101を精製する。
藻類と原生動物における細胞内共生形態の解明

自己細胞内に多数の球状緑色藻類を共生させる様々な原生動物(MARP)がいる。しかし、それら共生藻の種、共生関係の安定度、地域依存性や共生による互いのメリットの有無など、その実態は不明な点が多い。本研究では広くMARPを採集し、どんな共生藻を持つのか、それらは宿主内でクローン化されているのか、さらに、宿主種間、採集地間、採集時期間など詳細な比較・解析をおこない、共生の実態を明らかにする。中でも共生による進化を考える上でカギとなりそうな共生種に関しては、ゲノム解析のほか、共生・非共生条件下での比較トランスクリプトーム解析をおこなうことで、MARP内で何が起きているのかを探っていく。
Circulating Tumor Cellの機能的解析と転移メカニズムの解明

がんの予後を規定するものは転移である。転移において末梢血液中の循環がん細胞circulating tumorcell(CTC)の存在は重要であるが、その機能的役割の解明は十分ではない。近年、がん幹細胞が再発、転移などの起源と考えられ、がん幹細胞とCTCの関係も注目されている。現在までに我々はがん幹細胞マーカーであるCD44に着目し、CD44のバリアントアイソフォーム(CD44v)を介した酸化ストレス回避機構をもとに、マウス乳癌細胞株の肺への転移の分子機構を見出した。さらに複数のヒト肺癌細胞株におけるCD44の発現プロファイルを、CD44の選択的スプライシングが生じる部位よりN末端、C末端側(exon5、exon16)のプライマーを用いて、RT-PCRにより検討したところ、PC9やHCC827などのヒト肺癌細胞においてCD44vが優位に高発現しており、A549などの細胞ではCD44standard formの発現が主であった。そしてPC9やHCC827では高濃度の分子標的治療薬での処理後、残存する耐性細胞集団では肺癌幹細胞マーカーであるCD133が高発現し、Sphere形成能やNOGマウスにおける腫瘍生着能も著明に亢進しており、CD44vも同様に高発現していた。これらは非小細胞肺癌における薬剤耐性の肺癌幹細胞におけるCD44vの機能的意義を示唆していると考える。今後は、これまでの我々のCD44vが転移促進を引き起こす知見と分子メカニズムを基盤に、肺がんにおけるCTCの機能的解析及び転移制御を目指した分子標的治療法を開発することを目的とする。