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ドコセン酸およびイコセン酸の高度利用技術の開発と栄養学的展開

サンマ油に特徴的に含まれる一価不飽和脂肪酸のドコセン酸、イコセン酸について、高度精製技術の開発と栄養学的意義を検討した。高度精製技術では、リパーゼOFLを用いることでドコセン酸が27.3%、イコセン酸が10.1%、ドコサヘキサエン酸が25.3%、歩留り30%まで濃縮可能となった。また栄養学的意義において、ドコセン酸、イコセン酸は、アトピー性皮膚炎モデルのNC/Ngaマウスで擦過行動回数の減少、さらにII型糖尿病モデルのkkAyマウスで体重増加抑制作用並びにインスリン抵抗性の改善効果が認められた。本結果より、サンマ油の新たな栄養機能性油脂としての有用性が示唆された。本研究は、北海道から関東の太平洋近海で安定的に水揚げされる「サンマ」の加工残渣から得られるサンマ油の有効利用を最終目標に、サンマ油に特徴的に含まれるモノエン酸類のドコセン酸やイコセン酸の高度精製技術の開発、さらに栄養学的意義を明らかにすることで、新たな栄養機能性脂肪酸の実用化・産業化を最終目標としている。本年度は、平成24年度確立した方法にで製造した精製サンマ油(ドコセン酸+イコセン酸45%)のII型糖尿病及び脂質代謝への影響についてkkAyII型糖尿病モデルマウスを用いて検討した。飼育期間は7週間とし、評価項目は、体重や組織重量の測定を始めとして、リアルタイムPCR法による糖代謝、脂質代謝関連の遺伝子発現定量解析、血糖値、インスリン負荷試験、トリグリセリド濃度、コレステロール濃度等の血液生化学的解析、ELISA法による血清中のサイトカインの濃度測定を実施した。試験の結果、精製サンマ油はコントロールに比べ、体重の増加抑制傾向が認められた他、内情脂肪組織の精巣周囲脂肪、腸間膜脂肪、腎周囲脂肪に減少傾向が認められ、特に腸間膜脂肪は統計学的に有意に減少した。一方、各種遺伝子発現定量解析、並びに血糖値、インスリン負荷試験、血清中インスリン濃度については著明な変化は認められず、糖尿病に対する効果は本試験で確認できなかった。以上より、ドコセン酸、イコセン酸を含む精製サンマ油は脂質代謝改善作用を有することが明らかとなった。今後、メカニズムの解明に取り組む予定である。本年度はサンマ油グリセリド画分のドコセン酸やイコセン酸、並びに機能性脂肪酸として有用なn-3系高度不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)について高度精製技術の開発を目的に、基質特異性の異なる4種類の食用リパーゼ、OFL(Candida cylindracea由来)、TL(Pseudomonasu stutzeri由来)、DF(Rhizopus delemar由来)、QLM(Alcaligenes sp.由来)を用いて、酵素量、反応時間、反応温度等の条件を詳細に検討した。試験の結果、リパーゼOFLがサンマ油中のドコセン酸、イコセン酸の高度精製に有用であることが示された。産業スケールでの最適な条件としては、原料油1gに対しリパーゼ600Uを用い、反応温度30°Cで32時間が有用と考えられ、分子蒸留で得られたグリセリド画分においてドコセン酸含量は27.3%、イコセン酸含量は10.1%、DHA含量は25.3%まで濃縮可能となった。また、その時点での歩留りは約30%であった。本法はサンマ油中のドコセン酸の高度利用に有用な濃縮法であると共に、世界的に粉ミルクや機能性食品への利用が拡大しているDHAについても現行のマグロ製品レベルの含有量22%をクリアしたことから、精製サンマ油はDHA含有魚油としても産業的に十分利用可能なレベルに達したと考えられた。本研究は、北海道から関東の太平洋近海で安定的に水揚げされる「サンマ」の加工残渣から得られるサンマ油の有効利用を最終目標に、サンマ油に特徴的に含まれるモノエン酸類のドコセン酸やイコセン酸の高度精製技術の開発、さらに栄養学的意義を明らかにすることで、新たな栄養機能性脂肪酸の実用化・産業化を目指している。本年度は、高度精製サンマ油(ドコセン酸+イコセン酸51%)の抗肥満作用に対する影響を食餌誘導性肥満モデルであるC57BL/6Jマウスを用いて検討した。飼育期間は6週間とし、コントロール群(CT群)、高脂肪食群(HF群)、1%イコセン酸・ドコセン酸濃縮油含有高脂肪食群(1%-HF群)、5%イコセン酸・ドコセン酸濃縮油含有高脂肪食群(5%-HF群)の4群を設定した。評価項目は摂食量や体重測定、各臓器や白色脂肪組織重量の測定、腹腔グルコース試験、各臓器の脂肪酸組成分析のほか、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)濃度等の血液生化学的解析、ELISA法による血清中や膵臓中、精巣囲脂肪中のサイトカインの濃度測定を行った。試験の結果、本モデルでは、体重や各臓器、白色脂肪組織重量は、HF群、1%-HF群、5%-HF群の三群間に有意な差は認められなかった。

血液生化学的解析では、1%-I、D-HF群においてHF群と比較して、血糖値やTC、TG濃度の減少傾向が確認された。また血清並びに精巣囲脂肪タンパク質中のインスリン濃度が1%-HF群、5%-HF群においてHF群と比較して減少した。血清中、精巣囲脂肪タンパク質中のアディポネクチン濃度が1%-HF群、5%-HF群においてHF群と比較して増加傾向にあることが確認された。以上より、本モデルにおいてドコセン酸やイコセン酸の抗肥満作用を確認するまでには至らなかった。本研究課題は、北海道から関東の太平洋近海で安定的に水揚げされる「サンマ」の加工残渣から得られるサンマ油の有効利用を目的に、サンマ油に特徴的に含まれるモノエン酸類のドコセン酸やイコセン酸等の高度精製技術の開発、さらに栄養学的意義を明らかにすることで、新たな栄養機能性脂肪酸の実用化・産業化を目指している。最終年度は、昨年度に引き続き高度精製サンマ油(ドコセン酸+イコセン酸51%)の抗肥満作用を食餌誘導性肥満モデルであるC57BL/6Jマウスを用いて検討した。C57BL/6Jマウス雄、5週齢を2週間の馴化期間後、コントロール群(CT群)、高脂肪食群(HF群)、1%イコセン酸・ドコセン酸含有高脂肪食群(1%群)、5%イコセン酸・ドコセン酸含有高脂肪食群(5%群)の4群に分け、6週間飼育した。評価項目は摂食量や体重測定、各臓器や白色脂肪組織重量の測定、腹腔グルコース試験、各臓器の脂肪酸組成分析、総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)濃度等の血液生化学的解析、ELISA法による血清中や膵臓中、精巣囲脂肪中のサイトカインの濃度測定、リアルタイムPCR法による脂質代謝に関連する遺伝子発現定量解析を行った。結果として、昨年と同様イコセン酸、ドコセン酸が抗肥満作用を明確に確認するまでは至らなかったが、遺伝子発現定量解析で、1%群、5%群においてHF群と比較して、精巣囲脂肪中のPPARγ、SREBP-1c発現量の減少傾向が認められた。また、血清中、精巣囲脂肪タンパク質中のインスリン濃度も減少したことから、精巣囲脂肪中のPPARγが抑制されたことにより、脂肪細胞が小型化され、アディポネクチン産生が亢進し、インスリン感受性が改善されたこと、さらに、脂質合成転写因子であるSREBP-1cが抑制されたことにより、インスリン分泌障害の改善や糖や炭水化物の脂肪酸合成を抑制されたことが考えられた。サンマ油に特徴的に含まれる一価不飽和脂肪酸のドコセン酸、イコセン酸について、高度精製技術の開発と栄養学的意義を検討した。高度精製技術では、リパーゼOFLを用いることでドコセン酸が27.3%、イコセン酸が10.1%、ドコサヘキサエン酸が25.3%、歩留り30%まで濃縮可能となった。また栄養学的意義において、ドコセン酸、イコセン酸は、アトピー性皮膚炎モデルのNC/Ngaマウスで擦過行動回数の減少、さらにII型糖尿病モデルのkkAyマウスで体重増加抑制作用並びにインスリン抵抗性の改善効果が認められた。本結果より、サンマ油の新たな栄養機能性油脂としての有用性が示唆された。本研究課題については、当初の計画度通り、平成24年度はサンマ油に含まれるドコセン酸、イコセン酸の含有量向上等の高度精製技術をウィンタリング法とリパーゼ酵素法を用いて確立し、平成25年度は精製サンマ油を用いて、II型糖尿病及び脂質代謝に対する効果をkkAyII型糖尿病モデルマウスをお用いて検討した。さらに、平成26年度は抗肥満作用に対する影響を食餌誘導性肥満モデルのC57BL/6Jマウスを用いて検討した。成果として、ドコセン酸、イコセン酸を含む精製サンマ油の脂質代謝改善作用は確認できたが、抗肥満作用については明瞭な結果は得られなかった。
コドン置換TALENライブラリーを応用した非コード長鎖RNAの生理的意義の解明

新たに同定した長鎖非コードRNAが炎症性サイトカインであるIL-6やTNFα、GM-CSFなどの産生に極めて重要であることを示してきた。また、このメカニズムとして転写因子NF-kBのプロモーター領域への動員およびそれに続くRNAポリメラーゼIIの動員の低下による転写レベルにおける制御であることを明らかにしてきた。本研究ではこの長鎖非コードRNAをゲノム編集技術を用いて遺伝子改変マウス(ノックアウトマウス)を作製し、個体レベルにおける炎症応答への寄与を明らかにすることを目的とした。これまでにゲノム編集技術を用いて、ノックアウトマウスの作製に成功し、このノックアウトマウスはLPS投与によるエンドトキシンショックに対して抵抗性を示し、全身性の炎症応答において重要な非コードRNAであることが示唆された。一方で硫酸デキストランナトリウム(DSS)誘導性大腸炎において野生型マウスに比べて、ノックアウトマウスは感受性を示し、体重減少とともに早期に死亡した。腸管固有層のCD11b陽性マクロファージを野生型およびノックアウトマウスより単離し、炎症性サイトカインの発現を検討したところ、CD11b陽性細胞でIL-6やIL12p40、GM-CSFの発現が顕著に低下していた。これらのサイトカインは炎症応答を惹起するとともに腸管上皮細胞の恒常性維持において重要であることが知られている。以上のことから、長鎖非コードRNAが腸管においては抗炎症性に作用し、腸管の恒常性維持に重要であることが示唆された。ロングノンコーディングRNA(lncRNA)による制御が炎症性サイトカインの発現制御における新たな階層として注目されているが、その生理的意義は明らかではない。これまでに申請者は炎症性サイトカインの発現を転写レベルで制御する新規のlncRNAを同定しており、TALENに代表されるゲノム編集技術を応用した遺伝子改変マウスを申請者が新規に開発した安定発現に最適化したコドン置換TALENを用いて、1TALE人工転写因子トランスジェニックマウスによるlncRNAの発現制御、2タモキシフェン誘導型TALENによるコンディショナルノックアウトマウスを作製することで炎症制御における意義を明らかにすることはもとより、ゲノム編集技術を応用した新たな技術基盤の確立を目的とした。平成27年度はTALE人工転写因子およびタモキシフェン誘導型TALEの最適化を試みた。モデルとしてマウスIL-1βおよびTNFαの転写調節領域に特異的なTALEを作製し、そのC末端側に転写活性化ドメインであるVP16やNF-kappaB p65の転写活性化ドメインを融合した。また、転写抑制因子であるSIN3aを融合することで転写抑制を試みた。その結果、VP16を融合したTALE人工転写因子では効率的な転写活性化が見られた一方でp65転写活性化ドメインでは十分な活性化が誘導されないことを明らかにした。また、TALE人工転写因子は転写開始点に近いほど効率的に活性化が誘導できることを明らかにした。エストロゲンレセプター融合TALE(ERーTALE)のタモキシフェン依存的な活性の誘導を検証するためにERーTALEのC末端側にVP16を融合してタモキシフェンによる標的遺伝子の誘導を検証したところタモキシフェン非存在下においても標的遺伝子の活性化がある程度見られた。平成27年度の研究においてTALE人工転写因子による効率的な転写誘導の転写活性化ドメインはVP16が有効であること、標的とする遺伝子の転写開始点に近いほど効率的であることを明らかにした。また、転写抑制因子の融合による標的遺伝子の発現抑制にも成功し、転写活性化因子および転写抑制因子としてTALE人工転写因子が有用であることを示すことができた。一方でタモキシフェン誘導型TALEはタモキシフェン非存在下においても標的遺伝子の一定程度の活性化が認められたため、TALE分子の最適化によるタモキシフェン依存的な核移行の制御が必要であると考えられる。ロングノンコーディングRNA(lncRNA)による制御が炎症性サイトカインの発現制御における新たな階層として注目されているが、その生理的意義が明らかにされたlncRNAは非常に限られている。これまでに申請者は炎症性サイトカインの発現を転写レベルで制御すす新規のlncRNAを同定し、TALENやCRISPR/Cas9に代表されるゲノム編集技術を応用して遺伝子改変マウスを作製し、lncRNAの生体内における役割を明らかにすることを目的とした。平成28年度はゲノム編集を用いてlncRNAのノックアウトマウスの作製を行なった。lncRNAは3つのエクソンから成り、lncRNAの欠損変異体のレスキュー実験により第3エクソンが炎症性サイトカインの発現亢進において重要な作動エレメントであることが明らかになった。そこで第2エクソンにポリA鎖付加配列をノックインしたマウスを作製した。SV40 late poly A signal sequenceを相同配列で挟んだドナーDNAを調整し、Cas9をコードするmRNAと第2エクソンを標的としたgRNAをマウス受精卵へマイクロインジェクションし、ノックインマウスを得た。ポリA付加配列ノックインマウスは第3エクソン以下の発現が消失していた。さらに、LPSの腹腔内投与によるendotoxin shockに対して抵抗性を示した。また、コドン置換TALEライブラリーはレトロウィルスやレンチウィルスを用いた遺伝子導入に際して組換えを抑制し、極めて有用であることを明らかにした。lncRNAの欠損変異体のレスキュー実験により第3エクソンが炎症性サイトカインの発現亢進において重要な作動エレメントであることが明らかになった。

SV40 late poly A signal sequenceを相同配列で挟んだドナーDNAを調整し、Cas9をコードするmRNAと第2エクソンを標的としたgRNAをマウス受精卵へマイクロインジェクションし、ノックインマウスを得た。ポリA付加配列ノックインマウスより調製したマクロファージにおいてLPS刺激によるlncRNAの発現は期待通りに第2エクソンで停止し、第3エクソン以下の発現が消失していた。このマウスにLPSの腹腔内投与によるendotoxinshockモデルを用いてin vivoの炎症応答を検討したところ抵抗性を示したことから新規に同定したlncRNAが生体内において炎症応答の惹起に重要であることが示唆された。興味深いことにデキストラン硫酸ナトリウム誘導性大腸炎モデルにおいては逆にポリAノックインマウスは早期に死亡するデータを得た。以上のことから、このlncRNAが炎症応答の抑制因子として働く可能性が示唆された。一方でコドン置換TALEライブラリーはレトロウィルスやレンチウィルスを用いた遺伝子導入に際して組換えを抑制し、極めて有用であることを明らかにした。新たに同定した長鎖非コードRNAが炎症性サイトカインであるIL-6やTNFα、GM-CSFなどの産生に極めて重要であることを示してきた。また、このメカニズムとして転写因子NF-kBのプロモーター領域への動員およびそれに続くRNAポリメラーゼIIの動員の低下による転写レベルにおける制御であることを明らかにしてきた。本研究ではこの長鎖非コードRNAをゲノム編集技術を用いて遺伝子改変マウス(ノックアウトマウス)を作製し、個体レベルにおける炎症応答への寄与を明らかにすることを目的とした。これまでにゲノム編集技術を用いて、ノックアウトマウスの作製に成功し、このノックアウトマウスはLPS投与によるエンドトキシンショックに対して抵抗性を示し、全身性の炎症応答において重要な非コードRNAであることが示唆された。一方で硫酸デキストランナトリウム(DSS)誘導性大腸炎において野生型マウスに比べて、ノックアウトマウスは感受性を示し、体重減少とともに早期に死亡した。腸管固有層のCD11b陽性マクロファージを野生型およびノックアウトマウスより単離し、炎症性サイトカインの発現を検討したところ、CD11b陽性細胞でIL-6やIL12p40、GM-CSFの発現が顕著に低下していた。これらのサイトカインは炎症応答を惹起するとともに腸管上皮細胞の恒常性維持において重要であることが知られている。以上のことから、長鎖非コードRNAが腸管においては抗炎症性に作用し、腸管の恒常性維持に重要であることが示唆された。当初の計画通りにゲノム編集技術を用いて長鎖非コードRNAをポリAシグナル配列をノックインすることでノックアウトすることに成功した。ノックアウトマウスより単離したマクロファージ細胞はLPS刺激により誘導される長鎖非コードRNAの発現が消失していた。
マイクロＲＮＡ制御による新規動脈硬化予防法・治療法の開発

マイクロRNAとよばれる内在性の小さなRNAが遺伝子発現を精巧に調節し、種々の疾患形成に関与する事が明らかとされてきた。以前、我々はSREBP2のイントロンに存在するマイクロRNA-33(miR-33)が、細胞内コレステロール恒常性と血中HDL形成を調節していることを示した。今回の研究ではmiR-33が、動脈硬化形成にどのような影響を与えるかを検討した。アポE欠損マウスと呼ばれる動脈硬化形成モデル動物においてmiR-33を欠損させると、血中HDL上昇およびマクロファージ形質を変化させ、動脈硬化形成が抑制された。これらの結果からmiR-33が動脈硬化治療の新規標的となりうることが示唆された。内在性のマイクロRNA (miRNA;miR)とよばれる20塩基長程度のRNAが種々の疾患形成に関与する事が明らかになってきた。コレステロール代謝を制御する転写因子SREBP2のイントロンにmiR-33が種を超えて存在している。私達は、miR-33欠損マウスを作製し、SREBP2とmiR-33が協調的にコレステロール輸送蛋白であるABCA1の発現を制御し、細胞内コレステロールのレベルを調節する事を明らにした。このマウスは組織中のABCA1発現の上昇と、血中HDLコレステロールの上昇を認めた(Proc Natl Acad Sci U S A. 2010)。動脈硬化形成における役割を明らかにするためアポE欠損マウスとmiR-33欠損マウスを交配させた。アポE欠損マウスにおいてmiR-33を欠損させると機能的なHDLの上昇を示し、動脈硬化形成を抑制した。また、マクロファージにおいてABCA1/ABCG1の発現上昇を認め、コレステロール引き抜き能の改善を認めた(J Am Heart Assoc. 2012)。これらの結果から、miR-33制御が新たな動脈硬化治療法の開発につながりうることが示唆された。引き続き、miR-33抑制による効果の検討を開始し、現在解析を行っている。また、患者血清における血中のマイクロRNA測定を開始し、ヒト病態との関連につき検討を行っている。一方、コレステロールのみならず、miR-33は脂肪酸合成経路に影響を与える事が明らかとなった。予期せぬことにmiR-33欠損マウスは、脂肪肝を呈した。miR-33欠損マウスは肝臓において脂肪酸合成が亢進しており、その原因としてSREBP1の発現が亢進していることを見出した(Nat Commun. 2013)。これらの結果はこれまでに知られていないmiR-33を介した新たな脂質代謝制御機構が存在することを示し、これらの知見が新たな創薬の標的となりうると考えられる。本研究課題の目的は、マイクロRNAの動脈硬化形成における役割を解明し、その機能制御による新規治療法の開発へと結びつける事である。申請者らはSREBP-2のイントロン16に存在するmiRNA-33がHDL-C形成を負に制御する事を報告した(Horie T, et al. Proc Natl Acad Sci U S A.2010)。HDL-C値は心血管イベントおよび心血管死の発症と逆相関を示し、動脈硬化はこれらの主たる原因の一つである。本研究では、miRNA-33と動脈硬化の関係を明らかにし、既存の治療法とは全く異なる機序を介した新規の動脈硬化予防法・治療法の開発を目指す。本年度は、動脈硬化形成におけるmiR-33の役割につき検討を行った。miR-33・アポEダブル欠損マウス作製し、アポE欠損マウスと比較を行った。ダブル欠損マウスは25%の血中HDL-C増加を示した。動脈硬化性病変、病変内脂質含量、病変内のマクロファージ浸潤はダブル欠損マウスで低下を示した。ダブル欠損マウスから採取した腹腔内マクロファージはコレステロール輸送蛋白ABCA1およびABCG1の発現上昇、アポA-IおよびHDL-Cに対するコレステロール引き抜き能の増加を示した。マクロファージ内のmiR-33欠損の影響を生体で検討するため、骨髄移植実験を行った。ダブル欠損マウスの骨髄を移植したアポE欠損マウスは、アポE欠損マウスの骨髄を移植したアポE欠損マウスと比較し、血中HDL-Cは同等ながら、動脈硬化病変の抑制傾向および病変内脂質含量の低下が認められた(Horie T, et al. J Am Heart Assoc. 2012)。これらの結果から、miRNA-33の抑制はは血中HDL-Cの上昇、マクロファージのコレステロール引き抜き能の増強を介した動脈硬化に対する新たな治療戦略の一つになりうると考えられた。

平成24年度は病態解明のためマウスモデルを用いたmiR-33の機能解析を行う予定であったが、上記のとおりmiR-33の動脈硬化における機能解析を行い、学術誌に報告することができた。平成25年度は当初の予定通り下記の研究計画を遂行を目指す。1miR-33インヒビターによる抗動脈硬化作用の検討miRNAの機能制御には様々な方法が用いられる。我々は、すでにmiR-33と相補的な配列をレンチウイルスベクターに組み込んだmiR-33デコイ遺伝子の作成を行い、実際にこのベクターが細胞実験で、miR-33の機能を抑制することを確認した。このウイルスベクターをアポE欠損マウスに導入することにより、miR-33の機能抑制による動脈硬化の進展程度および血中の脂質プロファイルを評価する。特定のmiRNAの機能を抑制することのできる修飾RNAプローブも市販されており(Dharmacon社;Antagomirプローブ、Exiqon社;LNAプローブ)、これらの静脈内投与を行うことにより同様の実験を組み立てることも可能であるので、ウイルスベクターによる生体への遺伝子導入が困難な場合にはこれらの使用も考慮する。2動脈硬化疾患患者における血中miR-33レベルの検討マイクロRNAは血中をエキソソームと呼ばれる脂質二重膜で囲まれた小粒子の中で安定に存在し、癌をはじめとした疾患マーカーになりうることが明らかとなってきた。本研究では、動脈硬化性疾患患者において血中miR-33レベルがどのように関わるかを調べる。「心血管疾患患者における血中バイオマーカーおよびRNA発現レベルと病態との関連の検討(ヒト遺伝子解析承認番号G-322)」は既に倫理委員会で承認され、現在、京都大学病院循環器内科への入院患者を中心として症例を増加させている。消耗品や分子生物学キットなどの物品費に対して約800000円、学会発表などの旅費に対して約200000円、人件費・謝金に対して約100000円、その他、京都大学動物事件施設でのマウス飼育費などに約500000円を予定している。
卵数法による資源量推定にむけた駿河湾産サクラエビの産卵特性の解明

生物学的調査により駿河湾のサクラエビの資源量を推定するために必要な情報である、1日当たりに産卵する雌の割合(産卵頻度)、雌1個体が1回に産む卵数(バッチ産卵数)などの繁殖生態に関する研究を行った。産卵直前のサクラエビの雌を、卵巣の色彩に基づいて目視・デジタル画像のそれぞれによって分類する方法を開発した。産卵直前・直後の個体の卵巣の形態学的特徴を明らかにするとともに、これらを指標に産卵盛期中の産卵頻度を0.20.3と推定した。また、2013・2014年級の雌の成熟体長が1990年代以前に比べ小型化していることを示した。バッチ産卵数については、追加実験を行ってから発表する予定である。2013年1012月の駿河湾の漁獲物からサクラエビ雌の標本を収集した。飼育実験を2013年6月・8月、2014年8月・10月に行い、合計336個体の成熟雌を飼育し、200個体を産卵させた。平成26年度に予定していた研究の実績は次の通りである。最終成熟卵の観察方法の開発|卵巣内に最終成熟卵をもつ雌を産卵直前の状態と判断できるようになった。最終成熟卵の有無を調べる方法として、エビの第3歩脚の基部において背腹に垂直な組織切片を作成し、HE染色することで、輸卵管周辺を観察する方法を開発した。最終成熟卵の観察方法の応用|最終成熟卵をもつ個体を産卵直前個体と判断し、産卵期中の調査日ごとに占める割合を求めると920%となった。これによって、産卵頻度(その日に産卵する雌)のうち、標本中に占める産卵直前の雌を識別することが可能になった。産卵予測|本研究以前は卵巣が青色を呈する個体は、当日に産卵する成熟個体としてカウントされていた。本研究では、卵巣の色彩を3段階に分けることができ、段階ごとの産卵直前個体の割合は約10%、50%、100%とであることが示された。これまで外見的に成熟個体と判断されてきた雌の成熟段階は一様ではないことが明らかになった。産卵履歴の推定|産卵の直接的な証拠である排卵後濾胞はサクラエビでは観察されなかった。しかし、産卵直後の卵巣は卵巣腔が大きく開き、未成熟卵群によって構成されるという特徴をもつことを明らかにできた。これを産卵直後個体と判断すると、調査日ごとの割合は620%となった。産卵直後の雌が識別可能になり、産卵頻度の推定精度の改善が期待される。バッチ産卵数|飼育下で産卵させた173個体について、バッチ産卵数を求めた。体サイズが大きな個体ほど多くの卵を産む傾向が視覚的に認められるものの、ばらつきが大きく、季節性・産卵経験などの要因を検討する必要がある。平成26年度の研究において、サクラエビの卵巣の色彩によって個体の産卵可能性が評価できると推測された。このときのサンプル数は約30と限られたものであったため、平成27年度はより多数の個体について、卵巣色彩の定性分類とデジタル画像解析、卵巣の組織学的観察を行い、卵巣の色彩に基づく成熟段階判別の精度向上を主な目的に研究を行った。平成27年6月から10月に駿河湾の200 m等深線上付近において、調査船によって約2000個体の雌サクラエビの成体を採集した。卵巣の色彩を平成26年度同様に、定性的に淡青灰、濃青灰、緑青灰の3段階に分類し、最も発達段階が進んだ卵母細胞をもつ個体の割合を調べた。その結果、青灰色に緑色の要素が入った緑青灰色の卵巣をもつ個体は、すべてが産卵直前と思われる最終成熟卵を有していた。また、中間色の濃青灰の個体では、約半数が最終成熟卵を持っていたのに対し、淡青灰の個体で最終成熟卵をもつ個体はいなかった。これらの定性分類の結果と、組織観察の結果は、卵巣色彩のデジタル画像解析によっても支持されたことから、後半の調査では研究室と船上で撮影された画像をもとに、定性分類を行い、天然海域における産卵頻度(当日産卵個体の割合)の算出に応用した。このほか、サクラエビ漁業および調査船調査によって採集された産卵期前半の標本の組織観察を進め、平成26年度に明らかにした「産卵直後」および「産卵期終了後」の卵巣組織像をもとに、天然海域における本種の産卵動態についての研究を行った。本研究では大きく3つの目的を掲げている。それぞれの達成度を以下のように自己点検し、その平均から全体の達成度を2と評価した。【目的1】最終成熟卵を指標に用いた個体の産卵予測・排卵後濾胞を指標に用いた個体の産卵履歴の推定、については、すでに平成26年度の研究によって目的を達成することができ、平成27年度はその成果に基いて卵巣組織の観察を行った。【目的2】目的1の結果を天然個体群に応用し、産卵頻度・初産・経産個体の出現率の季節的変化を推定する|初産・経産の判別は平成26年度の段階では困難と結論づけられた。一方、産卵頻度に関しては、卵巣の色彩を基に多数の個体を迅速に評価できることが明らかになり、本研究による成果を漁業・資源管理の現場で応用する目処がついたと思われる。【目的3】バッチ産卵数の推定|昨年度の段階で173個体分のバッチ産卵数のデータを得ることができた。その要因を検討するために、一般化線形モデルによる解析などが必要である。

これは、まだ実施できていない。以上より、目的1と2の達成度は高いものの、目的3は研究に遅れが生じていることから、全体としては区分2であると評価した。平成28年度は1件の論文を発表した。平成29年度における論文投稿原稿の作成および必要なデータ解析を行った。平成27年度までに明らかにすることができた、サクラエビの卵巣色の発達と、卵巣内の卵母細胞の成熟の関係について、色彩の定性分類とデジタルデータ解析、卵巣の組織学的観察を行った結果を取りまとめ、日本水産学会誌83巻2号で発表した。これにより、サクラエビの雌を、その卵巣の外見的特徴のみに基いた簡便な手法によって、産卵が数日以内に近づいた成熟雌とそうではない成熟雌にわけることが可能になった。平成27年度までに実施した、船上におけるサクラエビの産卵実験の結果の解析を行った。バッチ産卵数については、実験日ごとの変動が大きかったことから、調査船による採集の対象になった群れを構成する個体の繁殖経験や経験水温が群れごとに異なっていたためと、推測された。また、産卵時刻の結果について、生存時間解析を行った。これらの結果は、同じ実験により明らかになった、産卵前後の組織像の結果とともに、論文投稿予定である。サクラエビのバッチ産卵数は、卵数法における資源評価において重要なパラメータであるが、バッチ産卵数は大きくは雌の体サイズにより決定されるものの、それ以外の要因にも大きく左右することがわかった。過去3年分の繁殖期から繁殖期終了後を通じて採集された雌の卵巣の組織学的観察を行い、産卵前の成熟雌および産卵後の雌の割合を求め、結果を得ることができた。組織観察の結果は、上述の卵巣色によって求めた成熟雌の成熟段階の割合と一致していたことから、同手法の有効性を確認することができた。また、繁殖期後のとくに冬期には、繁殖期中の卵巣とは異なる形態を示す個体の割合が増加したことから、そのような卵巣をもつ雌の活性や、春季以降の産卵の可能性について検討を行った。本研究で掲げた3つの主な目的について、それぞれの達成度を以下のように自己点検し、その平均から全体の達成度を2と評価した。【目的1】最終成熟卵を指標に用いた個体の産卵予測と、排卵後濾胞を指標に用いた個体の産卵履歴の推定:平成26年度にすでに目的を達成することができ、平成28年度はその成果の一部を論文として公表した。【目的2】目的1の結果の天然個体群への応用により、産卵頻度・初産・経産個体の出現率の季節的変化を推定:初産・経産個体の判別は平成26年度の段階で困難であるとの結論に達した。一方、産卵頻度については、卵巣の色彩に基いて多数の個体を迅速に評価することができるようになり、その成果を論文として公表できた。【目的3】バッチ産卵数の推定:平成27年度までに得られたバッチ産卵数と体長に関するデータについて、統計解析を行った結果、その変動要因として、体長以外にも採集日が重要であることが示された。この結果については、平成28年度以内に論文投稿を行う予定であったが、解析方法の修得に時間を要し、達成することができなかった。以上より、目的1、2は当初の予定通りに達成できているが、目的3には遅れが生じており、全体では区分2であると評価した。平成29年度は、3件の論文を投稿し、うち2件が年度内に受理・公表された。もう1件は、研究期間終了後の平成30年4月20日に受理された。このように平成29年度は研究期間の最終年度にあたることから、当初の予定通り、結果の解析と取りまとめに注力した。
自己抗体で認識される自己抗原分子上のエピト-プ領域の分子生物学的解析

自己免疫疾患患者血清中に出現する自己抗体の産生機序を追求する目的で、自己抗原を規定するcDNAをクロ-ニングし、これを蛋白発現プラスミドに組み換えてリコンビナント自己抗原を発現させた。このcDNAの3'末端からエクソヌクレア-ゼIIIにてDNAを削っていき、種々の削除変異株を作成し、それぞれを蛋白発現させた。これら蛋白をノムノブロットや、既に確立している固相酵素抗体法(ELISA)を用いて患者血清との反応性を検討した。シェ-グレン症候群患者血清が特異的に反応するSS-B/La蛋白については、2つの主要エピト-プ領域の存在を確認し、この1つのエピト-プのアミノ酸配列がfeline sarcomaウィルスのgag蛋白と相同であることを見いだした。現在、ウィルス感染と抗SS-B/La抗体の産生についての関与をより詳細に検討しているところである。MCTDやSLE患者血清に認められる抗RNP抗体については、その対応抗原であるU1snRNPの68K蛋白、A蛋白、C蛋白についてエピト-プマップを行い、その主要なエピト-プ領域を同定した。その結果、68K蛋白については、RNA結合部位、C末荷電部位などの機能的に重要な領域に、A蛋白はU2snRNPのB"蛋白と相同性のあるC末に、またC蛋白ではSm抗原のB/B'蛋白と相同性のある領域に主要エピト-プに存在が見いだされた。現在これらの結果をふまえて、抗RNP抗体産生が、自己抗原そのものの免疫によるものなのか、外来の異物との相同性部位への免疫反応が引き金となっているかを検討中である。
光電変換色素を使った人工網膜(岡山大学方式人工網膜)の安全性および機能性評価

光電変換色素をポリエチレン・フィルムに結合した人工網膜(岡山大学方式人工網膜)の試作品は、網膜神経細胞や網膜組織を刺激し、人工網膜として機能することを示してきた。この研究では、人工網膜の機能と安全性について検討した。人工網膜表面に培養した網膜神経細胞は、光刺激に反応して、細胞内カルシウムイオンの上昇をきたすことを明らかにした。また、素材として、ポリエチレン・フィルムの結晶状態を変えると、グリア細胞が付着しにくい人工網膜を作成することが可能になった。安全性としては、人工網膜の素材として使っている光電変換色素は、光照射下でも網膜神経細胞や網膜色素上皮細胞に対して毒性がないことを証明した。また、人工網膜をラット眼球の網膜下へ埋め込む手術方法を開発し、その組織反応を調べた。その結果、グリアの増殖反応はみられるが、網膜神経細胞に対しては悪影響を及ぼさないことが判明した。網膜色素変性症のモデルラット(RCSラット)の眼球内の網膜下に人工網膜を埋め込むと、失明状態から視覚を回復させることを、ラットの行動実験から明らかにした。本研究では、光ダイオードを使った人工網膜の問題点を解決するため、光電変換色素を使った人工網膜(岡山大学方式人工網膜)の開発を進め、その実用化をめざしている。光電変換色素は、小分子であり、また、弱い光でも反応して電位差を生じるので、光ダイオードの問題点を解決できる。さらに、光電変換色素を固定化するフィルムを選ぶことによって、生体適合性の問題も解決できる。岡山大学方式人工網膜の臨床研究に向けた準備として、その安全性と機能性評価を行った。光電変換色素を固定化した膜に対する細胞接着性の評価まだ視細胞外節ができていない時期のニワトリ胚眼球の網膜から、網膜神経細胞とグリア細胞を混合培養した。光電変換色素を固定化した膜の表面において、神経細胞とグリア細胞を混合付着培養させ、神経細胞とグリア細胞が付着して増殖する様子を、免疫染色法を使って染め分けて評価した。光電変換色素を固定化した膜の安定性の評価人工網膜試作品をラット眼球に埋め込むことによって行った。眼球の外側から強膜に窓を作り、脈絡膜を露出させ、そこに切開を入れて、網膜下、つまり、網膜色素上皮と神経網膜との間に光電変換色素を固定化したフィルムを挿入した。1か月後に眼球摘出し、パラフィン包埋し、パラフィン切片を作成した。HE染色と免疫染色を行い、人工網膜試作品のまわりの組織反応、炎症反応を見た。また、人工網膜試作品に接している神経細胞の状態、グリア細胞の状態を免疫染色で染め分けた。人工網膜の安全性を調べるため、その素材である光電変換色素について、培養した網膜細胞および分離した網膜色素上皮細胞を使って、安全性を検討した。具体的には、暗所あるいは明所で、網膜神経細胞と光電変換色素をいっしょに培養し、死細胞の数を計測した。光電変換色素の存在下で死細胞の増加は見られなかった。網膜色素上皮細胞と光電変換色素を3時間反応させたときの細胞膜の透過性の変化を調べた。その結果、光電変換色素の存在下で、細胞膜の透過性の亢進はみられなかった。光電変換色素をポリエチレン・フィルムと化学結合させた人工網膜の試作品を、ラット眼球の網膜下に埋め込み、1週間後と1ヶ月後に眼球を摘出して、組織学的に検討した。人工網膜による組織障害はほとんど見られず、また、炎症細胞の浸潤もみられなかった。グリア細胞の反応をみるため、GFAPに対する免疫組織化学染色をおこなった。人工網膜を埋め込んだ網膜部位では、まわりの網膜と比べて、GFAPの発現が上昇していた。また、人工網膜を取り囲むグリア細胞は、1ヶ月で人工網膜全周の50%を超えることはなかった。これらの結果から、岡山大学方式の人工網膜の短期の安全性が証明された。光電変換色素を結合したポリエチレン・フィルム(岡山大学方式の人工網膜)の機能をみるため、網膜色素変性症のモデルラット(RCSラット)の網膜下に人工網膜を埋め込んだ。一方、ラットの視覚を測定するための装置を作成した。この装置は、十分広さのある透明な容器に入れたラットの周りを、毎分2回転あるいは4回転のゆっくりした速度で、黒白の縞模様を描いた円筒を回し、ラットの行動をビデオで録画し、縞模様の回転方向と同じ向きへのラットの頭部運動を数える。

回転しない場合、回転する場合、反対方向に回転する場合の頭部運動を解析した。その結果、人工網膜を埋め込む手術をしていないラット、および、切開などの手術のみを行ったが人工網膜は埋め込んでいないラットと比べて、人工網膜を埋め込んだラットでは、縞模様に対する反応が見られ、岡山大学方式の人工網膜は、失明したラットの視力を回復させることが明らかになった。人工網膜を埋め込んだRCSラットの眼球を摘出し、組織学的に調べた。人工網膜を埋め込んだ場合には、埋め込まない場合、あるいは、切開のみの手術を行った場合と比べて、網膜神経細胞の変性が有意に減っていた。つまり、人工網膜の埋め込みによって、神経細胞の生存が促進されたことを意味している。
フラビウイルス感染におけるBcl-2タンパク質の制御

日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルスといったフラビウイルスの感染におけるBCL2ファミリー蛋白質の制御機構を検討した。フラビウイルスに感染した細胞では、BCL2蛋白質の1つであるMCL1の発現が低下し、感染細胞の生存がBCLXLに依存することを見出した。BCLXL欠損細胞やBCLXL阻害剤を処理した細胞にフラビウイルスを感染させると、速やかに細胞死が誘導され、また、BCLXL欠損マウスは日本脳炎ウイルスの感染に抵抗性を示した。以上の成績から、BCLXLの機能を抑制すると、フラビウイルスに感染した細胞は細胞死を誘導し、ウイルスの増殖を抑制されると考えられた。フラビウイルス感染におけるMCL1の分解のメカニズムを検討するため、RNA decayによるMCL1 mRNAの分解を検討した。XRN1欠損細胞を作製し、日本脳炎ウイルスを感染させたところ、MCL1の分解は、野生型と同程度であった。日本脳炎ウイルス感染細胞と、非感染細胞を放射線ラベルしたメチオニンを加えて、新規の蛋白質合成を検討したところ、ウイルス感染において、顕著な蛋白質合成の低下が認められた。そこで、GFP蛋白質にPESTドメインをつないだ、D2GFPを発現する細胞を作製し、日本脳炎ウイルスを感染させたところ、D2GFPもMCL1と同様に分解されることがわかった。さらに、MCL1やD2GFPと同様に半減期が短く不安定な蛋白質のサイクリンD1も日本脳炎ウイルス感染により分解されていることがわかった。以上の成績から、日本脳炎ウイルス感染により、細胞の蛋白質合成が阻害され、半減期の短いMCL1は新しい蛋白質ができないため、分解されていることが分かった。ウイルス感染によるMCL1の分解メカニズムは不明であったが、本年度はタンパク質合成阻害のメカニズムを明らかにすることができた。また、マウスを用いた動物実験においては、BCLX欠損マウスを作製することができた。来年度は、BCLX欠損マウスを用いた検討を行い、生体レベルでの役割を検討する。以上のことから、研究は、概ね順調に進展させることができた。BCLX阻害によるフラビウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導する生理学的意義を考察するために、日本脳炎ウイルス感染細胞とマクロファージの共培養を行った。その結果、BCLXを阻害することによりマクロファージの貪食が有意に更新することがわかった。無処理のHuh7細胞では貪食の亢進が見られなかったことから、BCLXを阻害することによりEat Meシグナルが提示され、貪食が亢進したと考えた。そこで、生体内におけるBCLX阻害の影響を検討した。BCLX欠損マウスは胎生致死であるため、CRISPRによりBCLXヘテロマウスを作製した。このマウスを野生型マウスと共に致死量の日本脳炎ウイルスを感染させると、BCLXヘテロマウスでは有意に生存率が改善された。また、野生型マウスにおいてBCLX阻害剤を投与することによっても、生存率の改善が見られた。感染部位での炎症性サイトカイン量やウイルスRNA量はBCLX阻害することで顕著に低下していた。これまでの結果からフラビウイルス感染細胞では、MCL1の発現が低下しており、BCLXを阻害することでウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導することで、Eat Meシグナルを効率良く提示させることによりマクロファージによる貪食を促進させ、ウイルス感染の拡大を防ぐことができることがわかった。したがって、BCLXを阻害できる化合物は広範囲なフラビウイルスに対する治療薬としての可能性を見出した。今後は、ウイルス感染による蛋白質合成阻害の引き金となる、センサー分子、あるいは、それに関与する分子の同定を検討する。さらには、マウスを用いた解析を詳細に進め、ウイルス感染におけるMCL1分解における生体での意義について検討する。ウイルス学
エピソード記憶の「再活性化の仮説」に関する検討

本研究では健常被験者を対象に、PETより時間解像度が高く、事象関連デザインを使用することが可能な機能的磁気共鳴画像法(fMRI)を用いて、記憶の記銘と想起に関連して再活動が認められる領域を特定し、さらに刺激の記銘・想起に成功した場合と失敗した場合を分離して解析することで、それらの領域の記憶における機能的役割を明らかにすること、また同一の被験者に対し、皮質下の白質線維束の線維走行の状態や方向を検証することが可能な拡散テンソル画像を撮像することで、賦活が同定されるであろう内側側頭葉と後方皮質領域間の繊維連絡を定量化し、「再活性化の仮説」を構造の面で検討することを目的とした。このことにより、健常者のエピソード記憶のメカニズムを機能・構造の二つの側面から検討することが出来ると考えた。ここで用いる実験パラダイムは、先行研究を概観することで明らかになった課題設定、及び解析方法の問題点を克服したものであり、「再活性化の仮説」を検討するために最適であると思われるもの用いたいと考えている。そのため今年度は、過去の研究で用いた無意味図形に色と動きを付加した、言語的な情報を使用しない課題が適切かどうかの確認を行うために、先行研究の調査、及び刺激作成のための予備実験を行った。その結果、無意味図形を用いることにより課題の難易度が増す点、先行研究においては全て有意味な刺激を用いていることが判明した。23年度から学術振興会特別研究員として、当該テーマに関する研究を継続する予定であるので、その研究に今年度の成果を反映させていく予定である。
農村における新たな近隣自治システムの構築と人材開発に関する国際比較研究

農村地域の住民をはじめとした多様な関係者の参加を通して、行政サービスの提供や地域環境保全機能の向上を可能にする近隣システムの構築に関して、フランスに見る多様な人材を参加させる制度と重層的なネットワークの形成について明らかにした。特に、生産者をはじめとした有機業界が組織する非営利社団に加えて、慣行農業団体内に配置される有機農業の推進グループや地方団体の有機農業振興担当者など、従来の農業界に比べて、業界-地域の双方のネットワークについて示した。平成21年度は海外調査では、リヨン農業技術院(ISARA)、クレールモンフェラン農業環境技術研究センター(CEMAGREF)の協力を得て、ドローム県およびピュイドーム県における有機農業をはじめとした環境低付加型の農業振興の課題と組織体制、人材の配置に関する調査・ヒアリングを実施した。とりわけ、有機農業の振興体制は有機農業者が組織する非営利社団や有機農産物や安全性の高い地場産農産物を求める消費者が組織する非営利社団に加えて、慣行農業団体内に配置される有機農業の推進普及を担う人材や地方団体における有機農業振興担当者らが、重層的なネットワークを形成していることがわかった。他方、国内調査では宮城県丸森町H地区において、指定管理者制度に基づき地域住民が組織する管理組合が主体となって、観光施設(滞在型市民農園)の管理運営を行う事例をとりあげ、管理運営の実態や組織体制、人材の配置に関する課題について調査・ヒアリングを行った。町内各地区で設置された自治運営協議会を媒介に進めている近隣自治の構築プロセスにおいて、指定管理者制度のあり方や管理運営する施設の特性から吟味する必要がわかった。平成22年度はフランス農業環境技術研究センター(CEMAGREF)クレールモンフェランセンター、および食品・動物衛生・農学・環境高等教育研究機構(VetAgro Sup)の研究協力により、有機農業をはじめとした地域環境との調和をはたす農業技術の普及にかかる人材育成のプログラムについて、調査検討を行うことができた。他方、国内調査では福島県南相馬市K集落において、有機農業に取り組む集落営農のリーダーと生産組合構成に対するヒアリング、農家、非農家16歳以上の住民に対する集落の水田環境に関するアンケートを実施した。これに基づき、住民参加による水田環境保全の枠組み作りの作業開始の手はずが整えられた。VetAgroSupミシェル・ガスペラン研究員、カンボジア王立大学マリン・ネアン研究員を招聘し、K集落における調査を共同で実施するとともに、東京にて農林水産政策研究所の協力を得て、セミナー「農業がもたらす環境サービスのガバナンス有機農業を素材とした国際比較」を開催した。有機農業をはじめ、農薬、化学肥料の使用を避ける農法の普及には、農業者の関心喚起に加えて、集落の範囲、市町村の範囲における関心や理解の増幅が求められる点、共通の関心事項となった。平成23年度はストラスブール大学にて開催されたフランス農業経済学会および/有機農業振興合同技術ネットワークの共催シンポジウム(共通論題「有機農業の横断性」)において、「日本の有機農業は離陸できるか-地域と結びついた発展の課題」の報告を行った。平成22年度に行ったセミナー「農業がもたらす環境サービスのガバナンス有機農業を素材とした国際比較」では、有機農業をはじめ、農薬、化学肥料の使用を避ける農法の普及には、農業者の関心喚起に加えて、川上・川下の各事業者のネットワーク、各種地域アクターのネットワークの同時展開の重要性について議論された。これを踏まえ、ストラスブールにおける報告では、我が国の稲作に見る有機農業の展開の可能性として、基礎自治体レベルに設置される協議会や集落営農などの近隣集団を媒介とした技術普及の課題について明示した。有機農業の推進と発展から生まれる多様な地域のネットワークとイノベーションは、有機農業者間や有機農業・食品業界のネットワークにとどまらず、地場の有機食材利用、地域環境保全、社会的弱者に対する農を通じた就労機会の提供など、公共セクターと市民社会のネットワークの構築に及ぶ点で、横断的な近隣システムの構築に寄与することがわかった。
高校生が用いる心身の状態を表すオノマトペ表現の実態

【研究目的】高校生が保健室に来室した際、心身の状態をどう表現して養護教諭に伝えようとするのかを調査し、心身の状態の理解とその表現方法について明らかにするとともに、養護教諭が対応する際の示唆を得ることを目的とした。【研究方法】A県Y市内の公立高校の1年生から3年生を対象に、2017年6月7月、選択肢と自由記述からなる自記式質問紙調査を実施した。自由記述は、高校生が保健室に来室した際の場面(イライラして思わず机を蹴り足を負傷した)をイラストで表し、それを見て実際に養護教諭に話をするように記述してもらった。分析は、数量化III類及びKH Coderを用いた。対象校の所属長へは書面で、対象者へは口頭で研究協力を依頼し同意を得た。【研究成果】調査の結果、高校生411名から回答が得られた。その内、84.7%が日常的にオノマトペを「とてもよく使う」「よく使う」「時々使う」と回答し、「読書好きである」「子どもの頃からよく本を読む」「マンガをよく読む」と回答した高校生は、オノマトペをよく使う傾向が見られた。しかし自由記述では、イラストの登場人物と周りの事物を関連させながら記述しているものの、オノマトペを使用した記述はあまり見られなかった。また、経過を含め事実を「ありのまま」伝えようとする記述と、「今そこにある事実だけ」を伝えようとする記述が見られた。この結果から、イラストから場面を想起し記述する手法であり、相手の頷きや相づちなどのある日常会話と違い、オノマトペの使用があまり見られなかったと考えられる。また、感情表出や思考・行動様式のパターンにより、表す言葉や伝えようとする内容が個々に違ってくると推察された。そのため、来室した高校生が心身の状態を伝える言葉や表現は、これまでに経験した出来事や対応する養護教諭との関係性によっても違いが見られると考えられ、それを踏まえた対応が求められる。
深海熱水噴出孔のフジツボ亜綱エボシガイ亜目Neolepasの分類と系統

エボシガイ亜目(現在はミョウガガイ類と改称)Neolepas"属"は、模式種のN.zevinae(東太平洋EPR)、Vulcanolepas. osheai(昔Neolepas属に収容されていた南西太平洋ラウおよびハブル海盆)集団、冷湧水性エボシガイ類となったAshinkailepas seepiophiliaの初島沖集団(同種の熱水集団として伊豆小笠原海嶺の明神海丘、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺)、冷湧水性のLuecolepas longa(エディソン海山)(西太平洋)(同熱水集団のマヌス海盆(西太平洋))、および同冷湧水性Luecolepas別種のスンダ海溝(北インド洋)、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺(北西太平洋)集団のDNAの分析と系統を解析した。以上の分類群は、現在は4属に分けられているが、研究出発時点で単一のNeolepas属であった。ミトコンドリアDNA・16SrRNA遺伝子、12SrRNA遺伝子の分子生物学的な解析で、それらの分類群は分子系統学的に独立した単一の系統群になり、形態分類と一致する。エボシガイ亜目4属は、最も原始的なAshinkailepas属が南西太平洋に分布するVulcanolepas属に派生し、さらにNeolepasおよびLeucolepas属が派生したという系統関係が構築できた。この系統関係は、4つの分類群の南西太平洋起源および地理的分散過程を示すと考える。熱水・冷湧水エボシガイ亜目の蔓脚類は南西太平洋のAshinkailepasに起源を持ち、それらは西太平洋沿いに北西太平洋に分散した。次にVulcanolepasが派生し、それらは現在南西太平洋から南東太平洋に分散した。次にNeolepasとLeucolepasが派生し、前者は南西太平洋からインド洋および東太平洋に分散、後者は西太平洋に分散した。深海熱水噴出孔のエボシガイ亜目Neolepas属の模式種N.zevinae、N.rapanuii(以上東太平洋)、およびN.osheai(南西太平洋)の3集団、伊豆小笠原海嶺の明神海丘、沖縄トラフの北伊平屋海嶺、伊平屋海嶺、伊是名海穴、鳩間海丘、第四与那国海丘(以上北西太平洋)、マヌス海盆(西太平洋)、北フィージー海盆、ラウ海盆(以上南酉太平洋)、インド洋、からの合計13集団の形態の記載、比較、分類を行った。また最初の冷湧水性となるエボシガイ類となるShinkaialepas(仮称)新属が、熱水域(北伊平屋海嶺、明神海丘)に見つかり、それらの新属新種を分類・記載した。分子系統学的研究として、DNA解析の可能な標本をもつ下線をつけた4集団を用いてミトコンドリアDNAのCOI遺伝子および16SrRNA、12SrRNA遺伝子の塩基配列を分析し、それらの系統関係を構築した。Neolepas属およびShinkaialepas属はそれぞれ単系統をなした。全4集団からのNeolepas属は、共通の祖先からインド洋集団とその他の集団とに分岐し、さらに他の集団はマヌス海盆と北伊平屋海嶺とに分岐した。したがって、南西太平洋にそれらの起源を求めることが可能である。またマヌス海盆および北伊平屋海嶺のNeolepas属および北伊平屋海嶺および明神海丘のShinkaialepas属はそれぞれほとんど遣伝的距離が小さく、形態的特徴に加えて分子生物学的に同種と考えることが出来る。またそれらの遺伝的距離の小ささは、それらの分散過程を考える上で重要な問題を提供するように思える。