hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イノシトールリン脂質代謝酵素欠損による免疫不全症とメンブレントラフィック異常

イノシトールリン脂質(ホスホイノシタイド:PIs)は細胞膜の微量構成因子であり、多様な細胞応答の制御分子として機能する。PIsの中でも特にホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸は、エンドサイトーシス関連分子などを直接的に制御することが知られている。本研究では、PIs代謝酵素欠損マウスを用いた遺伝学的解析により、メンブレントラフィックの異常と免疫細胞が関与する病態との関連を明らかにすることを目的としている。これまでに、ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸産生酵素PIPKIαの欠損マウスを用いて、主にマスト細胞におけるエンドサイトーシスとエキソサイトーシスに関する解析を行った。PIsの中でその存在が最も遅れて発見されたホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸の機能に関しては、出芽酵母で液胞の恒常性維持に関わることが知られている。この興味深いイノシトールリン脂質の哺乳類細胞および個体における機能を明らかにする解析を行った。PIPKIα欠損骨髄由来マスト細胞ではエキソサイトーシス(脱顆粒)が亢進し、PIPKIα欠損マウスではI型アレルギー反応が増悪することを見出した(Sasaki, J.Exp.Med.201,2005)。一方、エンドサイトーシス(Fcε受容体のinternalization)は正常であった。マスト細胞のエンドサイトーシスに関しては、現在、他のPIPKIアイソザイム欠損細胞も用いた解析を計画している。ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸の産生酵素の遺伝子欠損マウスの作製を進めた。このノックアウトES細胞においては、細胞内小胞の顕著な形態異常(大きな空胞の蓄積)を認めた。ホスファチジルイノシトールのイノシトール環3,4,5位水酸基に可逆的なリン酸化を受けた8種類のイノシトールリン脂質は,シグナル分子として個々に固有の機能を持ち,多様な細胞応答を制御する。我々は,種々の細胞外シグナル分子によって活性化されてPI(3,4,5)P3 (PIP3)を産生するPI3Kや,PIP3を脱リン酸化して分解するPTEN,SHIP1,SHIP2の遺伝子欠損マウス、さらにホスファチジルイノシトール二リン酸の代謝酵素欠損マウスを世界に先駆け作製・解析した。その結果,これらの酵素が種々の細胞応答制御に重要であり,その欠損は遊走の異常につながる知見を得ている。本研究では遊走好中球で見出した、uropod(遊走細胞後端部位)におけるエンドサイトーシスの意義を解析した。このエンドサイトーシスはROCK阻害剤で抑制された。また、我々が開発したPI(4,5)P2可視化マウスの利用により見出した、PI(4,5)P2のuropodでの局在化もROCK阻害剤で抑制された。PI(4,5)P2はクラスリンを介したエンドサイトーシスの重要な制御因子であることから、PI(4,5)P2の局在化がuropodでの局所的なエンドサイトーシスを司ると考えられた。次に、PI(4,5)P2産生酵素の一つであるPIPKIαを欠損するPI(4,5)P2可視化好中球でPI(4,5)P2の局在化を解析したが、野生型PI(4,5)P2可視化好中球と同様の局在化が観察され、uropodのPI(4,5)P2局在を規定するイノシトールリン脂質代謝酵素の同定には至っていない。PIPKIαとメンブレントラフィックとの関連に関しては、PIPKIαによるマスト細胞の脱顆粒(エキソサイトーシス)制御機構を明らかにし、PIPKIα欠損マウスでのアレルギー反応の増悪を見出した。
ニューロメジンＵの慢性炎症を介した動脈硬化誘発機序の解明

Apoe-/-Nmu-/-マウスは、高脂肪食負荷により、Apoe-/-マウスに対し血清総コレステロール値は2倍という非常に高値を示したが、動脈硬化性病変の進展は認められなかった。また、両マウスの腹腔マクロファージにおいて、酸化LDLの取り込みや酸化LDL負荷時の炎症反応に差は認められなかった。Nmu-/-マウスは高脂肪食負荷により脂肪性肝炎を誘発するが、Apoe-/-Nmu-/-マウスでは肝臓中の泡沫化マクロファージが増加するのみで脂肪性肝炎の誘発は認められなかった。これらのことから、NMUはコレステロール代謝及び何らかの炎症反応において重要な役割を有することが示唆された。本研究では、慢性炎症のkey moleculeとして、ニューロメジンU(NMU)に着目し、NMUのメタボリックシンドローム及び慢性炎症を介した動脈硬化発症及び進展への関わりとそのメカニズムについて明らかにすることを目的とし、NMU-KOマウスとApoE/NMU-KO (DKO)を用いて解析を行った。平成24年度までの解析により、高脂肪食負荷ApoE/NMU-KO (DKO)マウスは、ApoE-KOマウスに対し血清総コレステロール(Cho)値は2倍という非常に高値を示したが、20週齢時の大動脈組織切片の解析ではプラーク面積に差は認められなかった。本年度は、ApoE-KOとDKOマウスの血清Cho値の違いの原因を明らかにするため、NMU-KO及びDKOマウスにおいて、肝臓、小腸における脂質代謝に着目した。20週齢時では、各マウスにおける肝組織切片の解析から、WT及びNMU-KOマウスは脂肪性肝炎を発症するが、ApoE-KO及びDKOマウスでは脂質を取り込んだ泡沫化マクロファージが多数出現するのみで、脂肪肝を発症しないことが明らかになった。また、DKOマウスでは、9、13週齢において、Cho代謝関連転写因子SREBP2及びその制御下にあるLDL受容体(LDLR)の発現がApoE-KOマウスに比較して低下していた。また、小腸においてもLDLRの発現が低下していたことから、DKOマウスは、ApoE-KOマウスに比較し、各組織のLDLRからのCho取り込み低下により、血清脂質が上昇することが示唆された。本研究では動脈硬化のkey moleculeとしてニューロメジンU (NMU)に着目した。NMUの慢性炎症及び動脈硬化成立における生理的意義を明らかにすることを目的とし、NMU-KOマウスに高脂血症の遺伝的負荷をかけるため、ApoE/NMUダブルKO (ApoE/NMU-KO)マウスを作製した。ApoE-KO、ApoE/NMU-KOマウスに高脂肪食を負荷し、20週齢まで飼育した。ApoE/NMU-KOマウスでは、ApoE-KOマウスに対し、血清総コレステロール値は2倍という非常に高値を示したが(3736 ±996 mg/dL vs1953±275 mg/dL; p<0.01)、en faceによる大動脈の評価及び大動脈洞における組織切片の解析により、プラーク面積に差は認められなかった。このことから、ApoE/NMU-KOマウスでは、ApoE-KOマウスに比較して血清総コレステロール値は上昇するにもかかわらず、動脈硬化は進展しないことが明らかになった。しかしながら、高脂肪食を負荷したApoE/NMU-KOマウスにおいては、ApoE-KOマウスより生存率が低下し、その原因として心臓の中隔枝がコレステリンにより閉塞し、心筋梗塞が誘発されることが示唆された。また、肝臓におけるコレステロール量は、ApoE/NMU-KOマウスではApoE-KOマウスに比較して2倍であったが、肝臓におけるコレステロール合成、代謝関連遺伝子の発現量に差はみられず、CD68のようなマクロファージ関連遺伝子の発現が2倍に上昇していた。また、肝組織切片においては、肝細胞自体は正常であったが、泡沫化マクロファージが多数観察された。以上のことから、NMUはマクロファージにおける脂質代謝に関与していることが示唆された。本研究では、慢性炎症のkey moleculeとして、ニューロメジンU (NMU)に着目し、NMUのメタボリックシンドローム及び慢性炎症を介した動脈硬化発症・進展への関わりとそのメカニズムについて明らかにすることを目的とし、NMU-KOマウスとApoE/NMU-KO (DKO)マウスを用いて解析を行った。高脂肪食負荷DKOマウスは、ApoE-KOマウスに対し血清総コレステロール値は2倍という非常に高値を示したが、20週齢時の大動脈組織切片の解析ではプラーク面積に差は認められなかった。また、各マウスの腹腔マクロファージを採取し、oxLDL添加時の取り込みや炎症関連遺伝子の解析を行ったが、差は認められなかった。

また、DKOマウスの肝臓では、9、13週齢において、コレステロール代謝関連転写因子SREBP2及びその制御下にあるLDL受容体(LDLR)、HMG-CoA還元酵素の発現がApoE-KOマウスに比較して低下していた。また、各マウスにおける肝組織切片の解析から、WT及びNMU-KOマウスは脂肪性肝炎を発症するが、ApoE-KO及びDKOマウスでは脂質を取り込んだ泡沫化マクロファージが多数出現するのみで、脂肪性肝炎は発症しないことが明らかになった。また、NMU-KOマウスでは、腸内細菌Lactobacillales属、Prevotella属の増加が認められ、NMUの欠損による腸内細菌叢の変化と脂質代謝及び炎症との関連が示唆された。医歯薬学NMU-KOマウス及びDKOマウスの病態解析から、NMUの脂肪性肝炎及びコレステロール代謝との関連について明らかにした。研究の目的の一つとして、血管壁における慢性炎症を介した動脈硬化発症、進展におけるNMUの機能解析を挙げているが、本研究により、ApoE/NMU-KOマウスにおいては、ApoE-KOマウスに比較して血清コレステロール値が高いにもかかわらず、動脈硬化の進展は認められないことが明らかになった。このことから、NMUは肝臓のみならず、マクロファージの泡沫化、脂質代謝に寄与することが示唆され、動脈硬化巣においては血管内皮細胞や平滑筋細胞よりも、マクロファージの分化、泡沫化、炎症誘発に寄与すると考えている。また、ApoE/NMU-KOマウスがApoE-KOマウスに比較して生存率が低下する要因として、中隔枝のコレステリンによる閉塞による心筋梗塞の可能性が考えられることから、大動脈の動脈硬化性病変だけではなく、将来的には細動脈の動脈硬化に対する影響についても検討する必要があると考えている。(1)NMUの脂質代謝、炎症と全身臓器との関連の検討本年度に解剖したマウスから、膵臓、脂肪(腹部、皮下、褐色)、骨格筋、小腸、大腸のホルマリン固定標本及び凍結サンプルを得た。これらのサンプルを用い、糖代謝、エネルギー代謝に加え、特に炎症関連遺伝子等の発現解析を行い、NMUと炎症との関連について調べる。また、本年度の成果により、肝臓においてNMUとの関連が示唆されたSREBP2、LDLR等に加え、新たに得られた遺伝子をターゲットとし、ヒト肝細胞HepG2、小腸細胞CaCO2、免疫細胞THP1等を用いて、NMUの添加もしくは発現抑制時に、脂質添加、炎症刺激を行い、NMUと脂質、炎症との関連について細胞レベルにて解析する。(2)NMUとマクロファージ、血管内皮、平滑筋細胞との関連の検討ヒト免疫細胞株、血管内皮細胞株、血管平滑筋細胞株に対し、NMUの添加もしくは発現抑制時に、脂質添加、炎症刺激を行い、NMUと細胞の形質転換、脂質の取り込み、増殖、分化への影響について、蛋白質及び遺伝子発現解析により検討する。これまでの研究により、NMUはマクロファージにおける脂質代謝に関与することが示唆された。ApoE-KO、ApoE/NMU-KOマウスにおいて、腹腔マクロファージを採取し、マクロファージによる脂質代謝、コレステロール逆転送系、泡沫化、さらに炎症についてNMUがどのように寄与するのか検討する。
ガスタービン用耐熱・耐環境セラミックスコーティングの開発

本研究では、コーティング層の微細構造の制御(気孔、形状、界面、多層化)や新規コーティング法を用い、優れた耐熱・耐食性を持つ複合酸化物(例; La, Y, Gdの希土類元素分散)コーティングの製造条件の確立(例:ZrO2系、Silicate系)と、微小領域での機械特性、高温腐食環境下での高温腐食評価による優れた耐食性・耐久性コーティング層を開発する。
形質細胞腫/骨髄腫発生機構におけるインタ-ロイキン6とその受容体発現異常の解析

我々は、インタ-ロイキン6(ILー6)遺伝子の異常発現がミエロ-マ形質細胞腫の発生に重要な役割を果たしていることを報告してきた。C57BL/6(B6)マウスを使用して、ヒトILー6遺伝子を構成的に発現するトランスジェニックマウス(B6Tg)を作成したところ、著明な形質細胞の増加を認めることを以前に報告した。しかしながら、これらの形質細胞は、同系マウスに移植できなかった。今回、プリスティンの投与にて形質細胞腫が容易に発生するBALB/cマウスとB6Tgの交配実験を行なったところ、t(12;15)のクロモゾ-ム転座を伴い、かつヌ-ドマウスに移植可能な形質細胞腫が発生することが明らかとなった。又免疫グロブリン遺伝子は、モノクロ-ナルな再構成パタ-ンを示していた。以上の事実より、ILー6遺伝子の異常発現とcーmyc遺伝子等の癌遺伝子の異常発現により、形質細胞腫が発生することが明かとなった。本研究によって、少なくともマウスにおいては、ILー6遺伝子の異常発現によって、最終的に、形質細胞腫が発生しうること、又このためには、他の癌遺伝子の異常発現が必要であることが明かとなった。ILー6は、ヒトのミエロ-マ/形質細胞腫の増殖因子であり、臨床的に癌が増加する時期には、これら患者血清中にILー6が増加することが知られている。これらの事実は、ILー6遺伝子の異常発現がヒトミエロ-マ/形質細胞腫の発生にも重要な役割を演じていることを示唆している。今後解明されなければならない重要な問題は、ミエロ-マ患者におけるILー6遺伝子の異常発現を誘導している分子機構の解明であると考えられる。
有用海洋シアノバクテリアの培養株構築と生合成遺伝子の解析

カナミエナミドを産生する海洋シアノバクテリアMooreabouilloniについて全ゲノム増幅を行った。吸光度・鎖長とも十分な質のゲノムサンプルが得られたことが確認できたので、次世代シークエンサーによる網羅的配列解析を行った。バイオインフォマティクス的手法によりメチルエノールエーテル構造をもつ鎖状ペプチドlyngbyapeptin Bの生合成に関与すると思われる遺伝子を見出した。現在、モデル基質を用いた酵素反応と機能解析について検討している。また、カナミエナミドの全合成を達成し、その真の生物活性を明らかにした。本研究では、有用物質の生産能力が高い海洋シアノバクテリアを培養株化し、その全ゲノム配列を明らかにし、生合成遺伝子の探索を行う。これまでに、当研究室で単離構造決定した化合物を生産する海洋シアノバクテリアについて、種々培養条件を検討しているが、増殖速度が遅く、培養株化は達成できていない。そこで、並行して少量の鋳型遺伝子から全ゲノム増幅を試みることとした。リポペプチドであるカナミエナミドを生産するシアノバクテリアについて、温和な条件でコンタミの原因となる鞘を除去したのち、ピペット洗浄法によりシアノバクテリアの純度の高いフィラメントを取り出し、ゲノムDNAを抽出した。ついでREPLI-g UltraFast Mini Kitを用いてMultiple Displacement Amplification(MDA)法により全ゲノム増幅を行った。増幅したゲノムDNAを蛍光試薬を用いた蛍光測定により定量し、電気泳動により鎖長を確認した。さらに増幅したゲノムDNAの純度と目的のシアノバクテリア由来遺伝子かの確認を16S rDNAの増幅・配列解析によって評価した。現在、次世代シークエンサーを用いた網羅的配列解析とバイオインフォマティクス的手法を用いた生合成遺伝子の探索を進めている。なお、今回解析に用いたサンプルの元の海洋シアノバクテリアにカナミエナミドが含まれていることも、抽出分離・NMRスペクトルによって確認済みである。カナミエナミドの化学合成についても研究を進めており、カナミエナミドの大環状構造の構築に成功した。現在、他の数種の海洋シアノバクテリアについても、ゲノムDNA抽出と全ゲノム増幅を検討しており、適切なサンプルが得られることが確認できたら、網羅的配列解析・生合成遺伝子の探索を進める。培養株化は達成できていないが、研究当初から困難なことを予想していた。そこで克服するための手段として、生物量に依存しない方法である全ゲノム増幅を行い、網羅的配列解析に必要なゲノムDNAサンプルを調製することができた。コンタミの原因となる鞘の除去に、ピペット洗浄法が有効に機能していることが確認できた。有用物質の生産能力が高い海洋シアノバクテリアの培養について、検討したが、今のところ培養条件の確立・培養株化は達成できていない。そこで、少量の鋳型遺伝子からの全ゲノム増幅を検討した。ついでREPLI-g UltraFastMin i Kitを用いてMultiple Displacement Amplification(MDA)法により全ゲノム増幅を行った。ついで、次世代シークエンサーを用いた網羅的配列解析とバイオインフォマティクス的手法を用いた生合成遺伝子の探索を行った。今のところカナミエナミド生合成遺伝子の特定には至っていないが、別の天然物の生合成に関係している遺伝子の候補が見つかったので、モデル基質を用いた機能解析によりその妥当性を検証している。一方、カナミエナミドの化学合成を達成した。大環状構造を光延法により構築し、エノールエーテル部分を最終段階で導入した。合成品の腫瘍細胞に対する増殖阻害活性は天然物よりも弱いことが判明し、化学合成の達成によりカナミエナミドの真の生物活性を明らかにすることができた。さらに、他の数種の海洋シアノバクテリアについてもゲノムDNA抽出法を検討した。その結果、凍結破砕が有効であった。ゲノム抽出を妨害する鞘の化学的除去は効果が限定的であったので、物理的な方法を検討した結果、抽出操作中に遠心操作を複数回組み込むことにより、鞘をペレットとして除去できることを見出した。現在、得られたゲノムDNAの次世代シークエンサーによる網羅的配列解析を進めている。カナミエナミド生産シアノバクテリアのゲノムDNA増幅に成功したので、今後は網羅的配列解析・生合成遺伝子の探索を進めていく。コンタミの原因となる鞘の除去、ピペット洗浄法が有効に機能していることが確認できたので、この手法を他の海洋シアノバクテリアにも適用し、全ゲノム増幅によりDNAサンプルを調製する。これらの研究には海洋シアノバクテリアのサンプル鮮度が重要であるので、沖縄・奄美地方で採集を行い、新鮮なサンプルを採集して本研究に用いる。

また、現在のところ達成できていない、有用物質を産生する海洋シアノバクテリアの培養株化については引き続き検討を進める。特に18員環マクロリドのビセリングビアサイド類を産生する海洋シアノバクテリアについて、重点的に検討を行う計画である。天然物化学使用額はほぼ計画通りである。溶媒や試薬代として活用する。
二次構造の変形操作による蛋白質立体構造の分類と予測に関する研究

現在開発中の二次構造の変形操作による蛋白質の分類方式に関し、以下の2つの研究を実施した。1開発中の分類方式では、二次構造要素の拡大・移動・回転・削除といった各種変形操作に対して、重みパラメータが導入されており、蛋白質間の変形コストはそれらのパラメータ値に依存して決定される。ここでは、既知の分類結果を教師データとすることにより、計算機を用いてパラメータを自動調整する方式について検討した。既知の分類のもとで、おなじクラスタに属する蛋白質間の変形コストは異なるクラスタに属する蛋白質間の変形コストより小さくなる必要があることに着目し、クラスタ融合の際の違反の度合を評価関数として導入し、これを最小化することで、最適なパラメータ値を探索する方式を考案した。得られた最適パラメータ値によって、高い分類精度が得られることをSCOPの分類データと比較することで確認した。2未分類の蛋白質が既存の分類クラスタのどれに属しているかを決定するルールを作成するため、同一カテゴリ内の蛋白質の構造的特徴を自動抽出する方式について検討した。分類クラスタから特徴を抽出する際、多少の構造的相違を許容する特徴の定義が必要となる。そこで、構造変形操作の考え方をもとに、変形コスト空間上でのクラスタの代表点(特徴構造)とクラスタの広がり(特徴領域)の対として特徴を定義する方式を考案した。各種foldを含む蛋白質群に対して特徴抽出し、得られた特徴を用いて未分類と仮定した蛋白質の分類実験を実施することで、その有効性を確認した。
カシスが秘めるフィトエストロゲン作用 -血管内皮と皮膚に対する保健効果の探索-

我々はカシス由来アントシアニンは子宮などにおける植物性エストロゲン(フィトエストロゲン)活性があることをこれまでに見出してきた。本研究はカシス抽出物(BCE)の皮膚美容と血管機能改善効果を検証することを目的としている。エストロゲンの分泌が低下することによって引き起こされる女性の更年期障害の一つに薄毛が知られている。そこで、平成30年度における本研究の目的はヒト毛乳頭細胞を用いたカシスのフィトエストロゲン作用の検証と更年期モデル動物として、卵巣を除去したラットを用いた毛包におけるカシスの新規保健機能を明らかにすることである。ヒト毛乳頭細胞に1μg/ml BCEを投与して24時間培養した後、RNAを抽出しマイクロアレイおよびリアルタイムPCR解析を行った。その結果、beta-estradiolの下流遺伝子が多数変動しており、毛包の幹細胞マーカーであるkeratin (Krt)19の発現が大幅に亢進していた。更年期女性のモデルラットに3% BCE含有餌を3か月間摂取させた。HE染色により毛の数を計測した結果、カシスを摂取した方が毛包当たり平均0.5本の毛が増加し、免疫染色によって細胞増殖マーカーのki67の発現も亢進していることが明らかになった。さらに幹細胞マーカーのKrt19、Krt15ならびにCD34を蛍光免疫染色で評価した結果、毛包細胞における発現の亢進が認められた。BCEには毛包に対してフィトエストロゲン効果を発揮し、毛包のstemnessを改善することで、更年期モデルラットの薄毛改善に寄与することが明らかになった。更年期モデルラットへの皮膚特に毛包に対するBCEのフィトエストロゲン効果の評価は順調に結果が得られた。さらに本研究の結果は国際的雑誌に論文として掲載されたため。本研究では血管機能の評価をする予定である。これまでにいくつかデータを得ているが、動脈硬化抑制作用の有無についても引き続き検討する。平成28年度における本研究の目的は皮膚におけるカシスの新規保健機能を明らかにすることである。申請者らはこれまでに、カシスアントシアニンにはエストロゲン受容体(ER)αを介したフィトエストロゲン効果があることを見出している。しかし、ERβへのフィトエストロゲン効果は知られていない。そこで、ERβでの発現が高いとされる皮膚におけるカシスアントシアニンのフィトエストロゲン効果を探索した。4種のアントシアニン化合物、cyanidin-3-glucoside, cyanidine-3-rutinoside, delphinidin-3glucoside及びdelphinidin-3-rutinosideについて、ヒトエストロゲン受容体β(ERβ)との結合について推察するため、立体構造を使用したin silico解析を行った。ERβの立体構造は、estradiolとcoactivatorが結合した複合体としてX線結晶構造解析により決定されている。本解析では、このERβとestradiol複合体の立体構造を使用し、ERβへの4種の化合物のドッキングを行った。その結果、化合物のコアの部分であるcyanidin及びdelphinidinは、ERβのリガンド結合ポケット内部に収まることが推察された。ヒト皮膚線維芽細胞をカシスアントシアニンで処理すると約60ものエストロゲン下流遺伝子が大幅に変動しカシスアントシアニンがヒト皮膚においてもフィトエストロゲン効果を有することが示唆された。ヒト血管内皮細胞を用いたマイクロアレイの結果から種々の遺伝子の変動を見出し、血管内皮の保健機能へカシスアントシアニンが寄与していることが示唆された。ERβとアントシアニンとのドッキングアッセイは順調に結果が得られた。ヒト皮膚線維芽細胞でのマイクロアレイ解析も順調に結果が得られた。血管内皮細胞のマイクロアレイ解析は現在進行中である。卵巣除去ラットを用いた皮膚や血管の病理学解析も予定よりも早く進行中である。カシス由来アントシアニンは植物性エストロゲン(フィトエストロゲン)活性がある。大豆由来のフィトエストロゲンには心臓血管系疾患の改善効果や皮膚に対する美容効果があるという報告は数件あるがカシスアントシアニンのフィトエストロゲン作用に関しては報告例がない。本研究はカシスの皮膚美容と血管機能改善効果を検証するものである。平成29年度における本研究の目的はヒト皮膚線維芽細胞やヒト臍帯静脈内皮細胞での効果、さらには更年期モデル動物として、卵巣を除去したラットを用い、皮膚および血管内皮におけるカシスの新規保健機能を明らかにすることである。マッソントリクローム染色法、エラスチカ・ワンギーソン染色法、免疫染色法により、卵巣除去ラットで通常餌を摂取したラットでは、皮膚のコラーゲン層が薄くなるものの、3%カシスを含有した餌を3か月摂取させると、コラーゲン層ならびにヒアルロン酸の産生量、エラスチン生産量が増加した。ヒト皮膚線維芽細胞にカシスアントシアニンを投与すると、エストロゲン下流遺伝子が大幅に変動していた。また、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン合成遺伝子の発現が亢進した。一方、細胞外マトリックス構成分子を分解する、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)やMMP阻害因子であるTissue Inhibitor of Metalloproteinase3の発現が低下していた。ヒト臍帯静脈内皮細胞にカシス抽出物(BCE)を投与し、遺伝子発現をマイクロアレイで解析するとエストロゲン受容体の下流遺伝子が大きく活性化していた。また、卵巣除去ラットの血管では3%BCEを摂取したラットにおいてエラスチンが増加した。

これらの結果から、BCEは皮膚や血管内皮においてフィトエストロゲン効果を発揮していることが示唆された。カシスが及ぼす卵巣除去ラットへの効果の評価は順調に結果が得られた。血管内皮細胞のマイクロアレイ解析も順調に進み、卵巣除去ラットを用いた血管病理学解析もおおむね順調に進行している。我々はカシス由来アントシアニンは子宮などにおける植物性エストロゲン(フィトエストロゲン)活性があることをこれまでに見出してきた。本研究はカシス抽出物(BCE)の皮膚美容と血管機能改善効果を検証することを目的としている。エストロゲンの分泌が低下することによって引き起こされる女性の更年期障害の一つに薄毛が知られている。そこで、平成30年度における本研究の目的はヒト毛乳頭細胞を用いたカシスのフィトエストロゲン作用の検証と更年期モデル動物として、卵巣を除去したラットを用いた毛包におけるカシスの新規保健機能を明らかにすることである。ヒト毛乳頭細胞に1μg/ml BCEを投与して24時間培養した後、RNAを抽出しマイクロアレイおよびリアルタイムPCR解析を行った。その結果、beta-estradiolの下流遺伝子が多数変動しており、毛包の幹細胞マーカーであるkeratin (Krt)19の発現が大幅に亢進していた。更年期女性のモデルラットに3% BCE含有餌を3か月間摂取させた。HE染色により毛の数を計測した結果、カシスを摂取した方が毛包当たり平均0.5本の毛が増加し、免疫染色によって細胞増殖マーカーのki67の発現も亢進していることが明らかになった。さらに幹細胞マーカーのKrt19、Krt15ならびにCD34を蛍光免疫染色で評価した結果、毛包細胞における発現の亢進が認められた。BCEには毛包に対してフィトエストロゲン効果を発揮し、毛包のstemnessを改善することで、更年期モデルラットの薄毛改善に寄与することが明らかになった。更年期モデルラットへの皮膚特に毛包に対するBCEのフィトエストロゲン効果の評価は順調に結果が得られた。さらに本研究の結果は国際的雑誌に論文として掲載されたため。卵巣除去ラットにおけるカシスアントシアニンのフィトエストロゲンの評価を行う。1.皮膚の評価112週齢の雌ラットを卵巣摘出後3ヶ月間飼育し、内因性エストロゲンの影響を受けない状態にする。次にカシスアントシアニンを含んだ餌を3ヶ月投与する。卵巣を除去したラットからはエストロゲンが分泌されず、フィトエストロゲン活性の評価をするモデルとして一般的に用いられている。2皮膚のHE染色、コラーゲン、ヒアルロン酸を染色し、病理学的な変化を評価する。2.血管内皮の評価1上記のラットの大動脈をHE染色、エラスチンの染色により病理学的に評価する。2血管内皮機能バイオマーカーとして内皮型NO合成酵素(eNOS)、NOの代謝産物であるNOxの発現をウェスタンブロット法等で解析する。ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いたタンパク質解析など分子生物学的な解析を行う。
立位姿勢制御における感覚予測と実感覚入力の統合

本研究は、姿勢制御における感覚予測の貢献を明らかとすることを目的として行った。仮想現実(VR)空間内での予測可能な周期的視覚外乱に対して、前方の壁が近づいてくると姿勢を前に倒すという応答が観察された。これは、自らが積極的に動くことによって運動と感覚との間の矛盾を解消する、という方略を示唆している。これらの結果は、2つの国際学会(ISPGR, SfN)で発表された。また、歩行中の外乱に対する姿勢制御では、外乱のタイミングが予測可能な際には、反射的姿勢制御活動の潜時が短縮することを示した。この成果は2016年2月に、Frontiers Human Neuroscience誌に掲載された。本研究は、「姿勢制御システムが感覚予測と実際の感覚入力を統合して立位姿勢を制御している」ことを明らかとすることを目的として行った。特に、従来の姿勢制御研究では重視されてこなかった感覚予測の役割に注目した。周期的視覚外乱の振幅が立位姿勢制御に与える影響を調べる実験を行った。被験者は、ヘッドマウントディスプレイ(HMD)を装着し、仮想現実(VR)空間で静止立位を行った。被験者は4分間、前方の十字マークを注視するよう求められた。最初の1分は、視覚外乱は与えられない通常の立位条件、続く3分は予測可能な視覚外乱としてVR空間内での視点を、前後方向に周波数0.2 Hzで周期的に移動させた。周期的視覚外乱の振幅は、身長の0.3%, 3%, 10%とした。これまでの研究では、視覚的外乱が与えられると、それを自己運動の結果と解釈する錯覚(Vection)が生じ、それに対して、時間遅れを伴う同位相でのフィードバック的姿勢応答が観察されることが知られている。すなわち、前方の壁が近づいてくると、自分が前に倒れているという錯覚が生じ、それに対して姿勢を後方に倒す応答が観察される。本研究では、通常の同位相での姿勢応答に加えて、特に外乱の振幅が大きい条件において、逆位相での姿勢応答が観察された。中枢神経系の働きとして、自信の運動結果に伴う感覚予測と、実感覚入力を統合する際に、その差が最小になるような制御が行われると考えられる。本研究で観察された逆位相の姿勢応答は、このような感覚運動統合の結果であると解釈される。すなわち、被験者はあるタイミングで前方へ倒れるかのような視覚入力が得られることが予測できる状況で、自らが積極的に前方に倒れることによって、運動と感覚との間の矛盾を解消する、という方略があり得る、ということが示された。本研究は、姿勢制御システムが感覚予測と実際の感覚入力を統合していることを明らかとすることを目的として行った。HMDを用いない従来の研究においては、ごく小さい振幅の周期的視覚外乱n対しては、それを自己運動の結果と解釈する錯覚(Vection)が生じ、それに対して、時間遅れを伴う同位相でのフィードバック的姿勢応答が観察されることが知られている。本研究では、ヘッドマウントディスプレイ(HMD)を用いて、静止立位中に、身長の0.3%の振幅の周期的視覚外乱を仮想現実(VR)空間で暴露した。しかしながら、多くの被験者に共通した同位相での姿勢応答は観察されなかった。それに対して、身長の3%, 10%といった大きな振幅での視覚外乱は、同位相での姿勢応答に加えて、逆位相での姿勢応答も観察された。昨年度得られた結果を追試できたため、間違いがない結果であると考えられるが、VRを用いない先行研究の結果が再現できず、解釈が困難であった。上記のように立位姿勢の制御においては、予想していたような進捗が得られなかったため、歩行中の外乱に対する姿勢制御を対象として感覚予測の役割を調べる研究を行った。トレッドミル歩行中に片方のベルトを急加減速させることにより生成した外乱に対する下肢筋群の反射的姿勢制御活動を記録した。これまでに計測していたデータを解析し、歩行中に与えられる外乱のタイミングが予めわかっていた際には、反射的姿勢制御活動の潜時が短縮することを示した。それに対して、外乱方向に関する事前知識は潜時に影響を与えなかった。先行研究において、振幅が0.5 mm程度という意識に上らない程度の視覚外乱に対しては、無意識的に生じる自己運動錯覚(vection)に対する姿勢応答が観察される、ということが報告されている。本研究は、この結果を追試しつつ、振幅が大きくなると位相が反転したモードも観察されるのではないか、という仮説を検証するものであった。

ところが、本研究のセットアップでは、身長の0.3%という意識に上らない小さな振幅に対して、先行研究で報告されているような結果は得られなかった。この点について、先行研究は、プロジェクターとスクリーンを用いているのに対して、本研究ではヘッドマウントディスプレイを用いている等の差異による影響も考えられるため、原因を特定する必要があると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。身体運動科学まずは、小さい振幅に対する姿勢応答において先行研究の結果が追試できなかった点についての追試を行う。ヘッドマウントディスプレイの解像度やディスプレイサイズが小さかった点などが原因として考え得るので、平成27年度は、より没入感が得られるようなヘッドマウントディスプレイを用いる。また、外から光が漏れてくることによる影響も除外するため、照明を落とした暗室環境下で実験を行う。追試に成功した場合は、昨年度計画と同様に、まずは外乱の振幅に対する影響を調べ、その後は振動刺激やGVSを用いて、体性感覚や前庭感覚との統合の影響を明らかにする実験を行う。ヘッドマウントディスプレイを用いた実験系で追試が行えなかった場合は、ヘッドマウントディスプレイとスクリーンという環境の違いが、姿勢制御における感覚運動統合に影響を与える、という仮説を立てて実験を行う。
神経変性疾患の創薬標的たるマイクログリア特異的発現分子のPETイメージングの開発

ミクログリアに特異的に発現する分子を標的とした新たなPETリガンドとして、[11C]NCGG401の標識合成法を確立し、その有効性評価を行った。健常ラット及び、てんかん重積モデルラットに[11C]NCGG401を尾静脈投与し、PET撮像及び動脈血代謝物分析を実施した。その結果、[11C]NCGG401は健常ラットにおいて、PETイメージングのための十分な脳内移行性と早い洗い出しを認めた。また、非標識NCGG401の前投与により、分布容積は減少し、てんかん重積モデルラットにおいて、分布容積は増加した。以上の結果より、[11C]NCGG401は標的分子への結合特異性を有し、ミクログリアイメージング用PETリガンドとして有用である可能性が示唆された。本年度は、ミクログリアに特異的に発現する分子を標的とした新たなPETリガンドとして、[11C]NCGG401の標識合成法を確立し、その有効性評価を行った。また、計画する新たな標的に対するPETリガンドの前駆体合成も終了したため、計画通り進捗している。本研究では、ミクログリア特異的な2種類の分子を標的としたPETリガンドの評価・開発として、それぞれの標的に対するシーズ化合物を元にしたPETリガンドの標識合成法の確立を行い、小動物においてそれらの有効性を明らかにする。本年度は、それぞれの新規PETリガンドの小動物における有効性評価として、以下の検討を行う。まず、健常ラットに投与し、PETイメージングによる脳移行性を評価する。ミクログリア密度や、疾患関連ミクログリアが増えている疾患モデルマウス(放医研に導入済みの虚血モデルやタウオパチーモデルrTg4510)を用いて、特異結合の程度、他分子との選択性、脳内・血漿中代謝、定量性の評価を行う。また、autoradiographyや結合性試験、標的分子の特異的抗体を用いる免疫染色、レーザーマイクロディセクション質量分析イメージングを用いて、PETリガンドの細胞特異的な集積評価を行う。小動物において有効性が認められた場合は、安全性評価の後、臨床PET試験を実施し有効性を評価する。
骨髄間葉系細胞における胚葉を超えた分化転換機構の解明

骨髄間葉系細胞にNotch細胞質ドメインの遺伝子導入とサイトカイン刺激を組み合わせることによって神経細胞や骨格筋細胞が特異的に誘導される。本研究では間葉系細胞からの胚葉を超えた分化転換機構を解明するために, Notch導入による骨髄間葉系細胞内シグナル系や遺伝子発現の変化を解析し,ある特定のシグナル系の変動を認め,またそれらは通常の発生過程における神経幹細胞/前駆細胞や筋前駆細胞でのNotchの反応とは異なるものであった。骨髄間葉系細胞における特殊性を反映しているものと思われる。・骨髄間質細胞にNICDを導入すると、神経前駆細胞へ分化する。この現象に関わる分子を明らかにするために、NICD導入後、様々な各種阻害剤を加えて、分化への影響を検討した。その結果、NICDはMEK1/2シグナル系を主体として作用をしている可能性が示唆された。・NICDの様々なdeletion mutantを作成し、トランスフェクションすることによって、神経細胞への分化転換に必要最小限のNotch細胞内領域を検索しところ、アンキリン・リピート領域に強い誘導活性があることが示唆された。これは、NICDによってもたらされる神経細胞誘導が、従来言われている核における転写制御作用によるものではないことを示唆しており、大きな所見である。また、アンキリン・リピートとGFPとの融合蛋白質の発現ベクターも作成したが、これをトランスフェクションしてもやはり同様の高効率で神経細胞へと分化させうることが確認できた。したがって、今後はこの融合蛋白質を骨髄間質細胞へと導入し、抗GFP抗体で免疫沈降を行うことによって、アンキリン・リピートと相互作用する蛋白質を同定することを計画した。・NICD-GFP融合蛋白質を骨髄間質細胞へと導入し、抗GFP抗体で免疫沈降を行うことによって、NCIDへの結合蛋白の同定を試みた。・これまでの研究で骨髄間葉系細胞にNotch Intracellular Domain(NICD)を導入し、サイトカイン刺激をすると神経細胞に分化すること、また誘導順序を逆にしてサイトカインで刺激しNICDを導入すると骨格筋が誘導されることを見出した。この間葉系幹細胞の分化転換機構をNICDの果たす役割から検証した。そこで、様々な各種阻害剤を加えて、分化への影響を検討した結果、NICDはMEK1/2シグナル系を主体として作用をしている可能性が示唆された。・ラットおよびヒトの骨髄間葉系細胞にNICDを導入し、その前後におけるDNA microarrayを行い、signal pathway解析を行った。その結果、誘導前の細胞で発現している未分化性に関わるGATA3, GATA4, GATA6, Foxo1AなどがNICD導入によって発現が消失し、逆にPARP, BRCA, STAT2などのpathwayが活性化されることがわかった。・NICDの様々なdeletion mutantを作成し、トランスフェクションすることによって、神経細胞への分化転換に必要最小限のNotch細胞内領域を検索しところ、アンキリン・リピート領域に強い神経と筋肉の誘導活性があることが示唆された。・骨髄間質細胞へAnkyrin-FLAGを導入し免疫沈降を行うことによって、アンキリン・リピートと相互作用する蛋白質を同定したところconventional Notch pathwayに関連するもの以外の分子と結合することが分かった。
歯根膜の血行性幹細胞供給とその分化過程を追跡するイメージングシステムの開発

歯根膜は歯と骨を結合する組織であり、その恒常性を担うのは豊富な組織幹細胞の存在である。歯根膜の細胞は発生学的には主として神経堤に由来することが知られているが、その他の起源については明らかでない。本研究では骨髄に由来し、血行性に供給される幹細胞の存在を明らかにするために、蛍光色素によって標識された骨髄間質細胞を免疫不全ラットの大腿骨に移植したところ、移植4週後の歯根膜組織において骨髄由来細胞が観察された。さらに歯の再植により、骨髄由来細胞は増加した。本研究により歯根膜の組織幹細胞は発生期から維持されているものだけではなく、必要に応じて骨髄から供給される血行性幹細胞が存在することが示唆された。本研究計画では歯根膜組織における骨髄由来間葉系幹細胞の存在と組織維持への寄与を明らかにするために、Green Fluorescence Protein(GFP)にて標識された骨髄細胞を大腿骨に移植し、一定期間後の歯根膜組織におけるGFP陽性細胞の存在と局在について解析を行った。歯根膜は血管が豊富で代謝回転が早いこと、歯根膜周囲の歯槽骨には骨髄が豊富であることの理由から、遠隔骨髄からの細胞供給を検出するために、放射線照射は行わず、以下の系を用いた。8週齢の免疫不全ラット(F344/NJcl-rnu)の大腿骨骨髄に同週齢のGFPラット(SD-Tg (CAG-EGFP))から採取した骨髄間質細胞を移植する。移植4週間後に組織標本を作製し、歯根膜組織におけるGFP陽性細胞の検出を行った。さらに各種細胞マーカーを用いて、GFP陽性細胞中の間葉系幹細胞、神経堤幹細胞、造血系幹細胞、周皮細胞について組織学的に解析を行った。さらに歯根膜に供給された骨髄由来細胞の組織内での分化能を明らかにするために、歯の再植実験を行った。移植4週間後に上顎左右第一臼歯を抜歯し、即時に再植した。治癒過程、および治癒期間後に組織標本を作製して歯根膜組織におけるGFP陽性細胞の検出を行い、創傷治癒における骨髄由来細胞の寄与について解析をおこなった。咬合機能の維持に重要である歯根膜組織の恒常性は、その極めて早い組織の代謝回転によって維持されており、豊富な幹細胞の存在が重要な役割を果たしている。歯根膜は由来の異なる多様な細胞を含むが、我々はその一部が発生由来とは異なる、血行性に供給された細胞に由来するものであることを示唆する結果を得ている。つまり、発生段階では存在しない幹細胞群が血行性に供給され、歯根膜という“ニッチ"において歯根膜の構成細胞へと分化する幹細胞の分化メカニズムが存在する。本研究の目的は、歯根膜組織において血行性に供給される幹細胞の分化過程を明らかにし、その分化過程を歯根膜器官培養法とライブイメージングを用いて解析することにより、歯根膜への全身的な細胞供給システムと、歯根膜の再生へとつながる細胞分化メカニズムを明らかにする事である。これまでに大腿骨骨髄から歯根膜への血行性細胞遊走ならびに遊走細胞の一部は間葉系幹細胞マーカーを発現していた。さらに骨髄由来細胞数は歯の再植により増加した。また骨髄由来細胞の遊走はSDF-1/CXCR4 axisによって制御されていることを明らかにした。本年度に予定していた骨髄由来細胞の歯根膜への遊走メカニズムについて、SDF-1/CXCR4 axisが関わることを明らかにし、これまでの成果を学術論文に投稿中であり、進捗状況は順調である。発生段階では存在しない幹細胞群が血行性に供給され、歯根膜において歯根膜の構成細胞へと分化する幹細胞の分化メカニズムが存在する。これまでの解析結果から大腿骨骨髄から歯根膜への血行性細胞遊走ならびに遊走細胞の一部は間葉系幹細胞マーカーを発現しており、骨髄由来細胞数は歯の再植により増加した。再植後に末梢血中の幹細胞数ならびに誘導因子の濃度上昇が観察されたことから、再植による歯根膜組織中の骨髄由来細胞増加は歯根膜組織中の増殖と更なる血行性の誘導両者が寄与しているものと考えられる。さらに再植による末梢血中の幹細胞および誘導因子について解析を行った。現在歯根膜由来細胞の培養上清を回収し、この中に含まれる細胞誘導因子ならびに分化誘導因子の解析を行っている。当初予定していた解析は概ね終了し、研究成果は英文学術誌に投稿し受理された。

発生段階では存在しない幹細胞群が血行性に供給され、歯根膜において歯根膜の構成細胞へと分化する幹細胞の分化メカニズムが存在する。本研究の目的は、歯根膜組織において血行性に供給される幹細胞の分化過程を明らかにし、その分化過程を歯根膜器官培養法とライブイメージングを用いて解析することにより、歯根膜への全身的な細胞供給システムと、歯根膜の再生へとつながる細胞分化メカニズムを明らかにする事である。これまでの解析結果から大腿骨骨髄から歯根膜への血行性細胞遊走ならびに遊走細胞の一部は間葉系幹細胞マーカーを発現しており、骨髄由来細胞数は歯の再植により増加した。再植後に末梢血中の幹細胞数ならびに誘導因子の濃度上昇が観察されたことから、再植による歯根膜組織中の骨髄由来細胞増加は歯根膜組織中の増殖と更なる血行性の誘導両者が寄与しているものと考えられる。遠隔細胞の誘導に関わる制御因子としてSDF-1に着目し、その濃度が血中で変化すること、SDF-1の阻害剤により細胞誘導が抑制されることを明らかにし、以上の結果を国際誌にて発表した。歯根膜は歯と骨を結合する組織であり、その恒常性を担うのは豊富な組織幹細胞の存在である。歯根膜の細胞は発生学的には主として神経堤に由来することが知られているが、その他の起源については明らかでない。本研究では骨髄に由来し、血行性に供給される幹細胞の存在を明らかにするために、蛍光色素によって標識された骨髄間質細胞を免疫不全ラットの大腿骨に移植したところ、移植4週後の歯根膜組織において骨髄由来細胞が観察された。さらに歯の再植により、骨髄由来細胞は増加した。本研究により歯根膜の組織幹細胞は発生期から維持されているものだけではなく、必要に応じて骨髄から供給される血行性幹細胞が存在することが示唆された。本年度に予定していた歯根膜組織中の大腿骨由来GFP陽性細胞の検出に成功しており、ほぼ予定通り進展している。今後は歯根膜へと遊走した骨髄由来幹細胞の歯根膜細胞への分化メカニズムを解析する予定であり、歯根膜細胞培養上清を用いた細胞の文化誘導により、歯根膜特異的発現遺伝子の解析を行う。本課題を基課題とする国際共同研究強化の採択により、現在骨髄由来細胞の分化を制御するメカニズムの解析を進めている。29年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学予備実験の結果から、血行性に供給された間葉系幹細胞が歯根膜という場において、歯根膜を構成する各種細胞へと分化する可能性を示唆する結果を得ている。この現象を培養系にて再現するために共培養法を用いる。ヒト歯根膜細胞を培養皿(直径35mm)に播種し、アスコルビン酸存在下にて2週間培養し、歯根膜細胞/マトリックス複合体(細胞シート)を作製する。この歯根膜細胞シート上にGFPラット骨髄から分離した骨髄幹細胞を播種し、その分化過程を解析する。更に歯根膜線維芽細胞への分化が歯根膜の基質によるものなのか、細胞が分泌する液性因子によるものであるかを明らかにする為に、骨髄間質細胞を直接歯根膜細胞シート上に播種するものだけでなく、トランスウェルを用いて液性因子による影響についても解析を行う予定である。初年度に購入を予定した顕微鏡が購入できなかったため、昨年度に続き繰越し金が生じている。余剰金の一部は本年度、分光光度計の購入費用に充当した。本研究課題を基課題とする国際共同研究強化に採択となったため、本研究課題についてもより詳細な解析が可能となった。部分的に本研究課題を国際共同研究強化と並行して行う必要性から次年度繰越予算を確保した。
C-H結合活性化反応によるアトロプ選択的軸不斉ビアリール合成法の開発とその応用

本年度、申請者は鈴木啓介教授の元、プルラマイシン類の合成を指向した、α-C-グリコシド結合構築法の研究に携わった。プルラマイシン類は、アグリコンのアントラピラン骨格に対し、L-バンコサミン及びD-アンゴロサミンの二つのアミノ糖が、それぞれC-グリコシド結合した構造を持つ天然物群である。その特徴的な構造から、これまで数多くの合成研究がなされてきたが、プルラマイシン類に多く見られるL-バンコサミンのα-C-グリコシド結合の構築法は、未だ見出されていない。これは、αグリコシドは一般的に、βグリコシドと比較すると熱力学的に不安定であり、種々の反応条件において、β体への異性化が進行してしまうためである。今回我々は、新たに設計したバンコサミン前駆体を利用することで、α-C-グリコシド結合構築法の開発に成功した。バンコサミンのC5位の立体が反転し、脱離基Xを持つバンコサミン前駆体と、ナフトール誘導体とのグリコシル化反応により、β体のC-グリコシドを高収率で得ることに成功した。続いて、フェノール基の保護の後、塩基により脱離基を脱離させることで、C5位をオレフィンへと変換した。最後に、立体選択的な水素添加反応を行うことで、C5位の立体を反転させることで、目的の立体構造を有したα-C-グリコシド体を合成することに成功した。本合成手法は、安定なβ体のグリコシドを経由して、合成の終盤でα体への変換を行うことから、実際のプルラマイシン類の全合成への展開が期待できる。本研究課題は平成27年度の交付申請を辞退するため、記入しない。
多因子遺伝性糖尿病・肥満モデルマウス成因遺伝子の解明

我々は、疾患モデルマウスの解析を通して、ヒトの肥満や糖尿病の成因・病態生理の解明をめざしている。そのひとつとして、肥満を伴うヒト2型糖尿病の良いモデルであるTSOD(Tsumura,Suzuki,Obese Diabetes)マウスの遺伝学的解析を行い、本マウスの肥満・糖尿病が、ともに多因子遺伝性で、それぞれ異なる遺伝子の組合せにより引き起こされていることを見出した。本研究は、コンジェニックマウスを用いた遺伝学的解析と、ゲノムリソースを有効に生かした候補遺伝子解析を併用して、TSODマウスにおける、1)量的形質遺伝子QTLs(quantitative trait locus)の実体の解明、2)複数の遺伝子異常がどのように肥満および耐糖能異常を引き起こすかの、病態モデルの呈示、を目的とする。我々は、第11、第2、第1染色体上に、血糖値、インスリン値、体重などに関するQTLsを見出しており、それぞれに関するコンジェニックマウスを確立した。これらコンジェニックマウスの表現型を計測し、親系統と比較することにより、単一遺伝子異常を反映した表現型を同定し、QTL遺伝子の生物学的作用や局在領域をさらに限定する。これまで予備的なデータであるが、第11染色体(Nidd4)のコンジェニックマウスについて血糖値、第2染色体(Nidd5)、第1染色体(Nidd6)のコンジェニックマウスについて体重が、TSODマウスに比し低い値を示すことを見出している。遺伝因子は同一でも、環境因子や分娩時の個体数などによって表現型のばらつきは予想以上にあり、ケージあたりの飼育数、分娩時の母親の年令等の因子をできるだけ同一にする努力をすることによって、表現型の違いを検知できるようになった。今後コンジェニックマウスの繁殖により、多数の個体の表現型の計測を行い、遺伝子の局在を限局させていきたい。