hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温面の非定常冷却中の均一自発生成過程と伝熱特性

衝突噴流による高温面の急速冷却に関する実験を行った.実験範囲は,噴流速度3-15m/s,噴流液温20-95°C,噴流径2,3mm,高温面温度250-600°C,高温面材質,銅,黄銅,炭素鋼の3種類で,試験流体として水をもちいている.高温加熱面を衝突噴流で冷却するとき,冷却開始すなわち高温面の濡れ開始の状況は,高温面の温度が熱力学的過熱限界温度以上にある場合でかつ冷却能力が大きい場合とそれ以外では大きく異なることを高速ビデオカメラでの観察から明らかにした.熱力学的過熱限界温度以上でかっ冷却能力が大きい範囲では,噴流接触後高温面は非常に短い周期で濡れと乾きを繰り返しながら緩やかな冷却状態の継続となっている.固液の接触直後の表面温度が,過熱限界温度以下になると安定な濡れは確保されるが,固体側からの熱供給量が,限界熱流束以上の条件下では,安定な濡れは拡大できずに局所的な領域に留まる.濡れが拡大し始めるまでの時間を迄の滞在時間t*と定義し,その時間を推定する式(1)とその時の表面温度Tw*を推定する式(2)を提案した.本研究で改善された2次元非定常逆問題解を利用して,濡れの拡大が起こっているときの表面温度の変化と最大熱流束の大きさやその位置の移動を正確に測定することができた.また,濡れ範囲内での最大熱流束が現れる位置をより正確に把握することが可能となった.安定な濡れが確保された状況下で達成される最大熱流束q_<max>は,高温面の材質によってその大きさが異なっているけれどもほぼ同じ特性で変化することおよびその特性は定常の衝突噴流沸騰系の限界熱流束q_cを用いて次式で近似できることが明らかになった.なお,ρ,c,λはそれぞれ密度,比熱,熱伝導率である.また,噴流衝突後高温面が直ちに濡らされる条件下での最大熱流束は,上記の式では整理できなかった.これは,急激な濡れ面の移動を逆問題解が十分追従できなかったためと考えられる.衝突噴流による高温面の急速冷却に関する実験を行った.実験範囲は,噴流速度3-15m/s,噴流液温20-95°C,噴流径2,3mm,高温面温度250-600°C,高温面材質,銅,黄銅,炭素鋼の3種類で,試験流体として水をもちいている.高温加熱面を衝突噴流で冷却するとき,冷却開始すなわち高温面の濡れ開始の状況は,高温面の温度が熱力学的過熱限界温度以上にある場合でかつ冷却能力が大きい場合とそれ以外では大きく異なることを高速ビデオカメラでの観察から明らかにした.熱力学的過熱限界温度以上でかっ冷却能力が大きい範囲では,噴流接触後高温面は非常に短い周期で濡れと乾きを繰り返しながら緩やかな冷却状態の継続となっている.固液の接触直後の表面温度が,過熱限界温度以下になると安定な濡れは確保されるが,固体側からの熱供給量が,限界熱流束以上の条件下では,安定な濡れは拡大できずに局所的な領域に留まる.濡れが拡大し始めるまでの時間を迄の滞在時間t*と定義し,その時間を推定する式(1)とその時の表面温度Tw*を推定する式(2)を提案した.本研究で改善された2次元非定常逆問題解を利用して,濡れの拡大が起こっているときの表面温度の変化と最大熱流束の大きさやその位置の移動を正確に測定することができた.また,濡れ範囲内での最大熱流束が現れる位置をより正確に把握することが可能となった.安定な濡れが確保された状況下で達成される最大熱流束q_<max>は,高温面の材質によってその大きさが異なっているけれどもほぼ同じ特性で変化することおよびその特性は定常の衝突噴流沸騰系の限界熱流束q_cを用いて次式で近似できることが明らかになった.なお,ρ,c,λはそれぞれ密度,比熱,熱伝導率である.また,噴流衝突後高温面が直ちに濡らされる条件下での最大熱流束は,上記の式では整理できなかった.これは,急激な濡れ面の移動を逆問題解が十分追従できなかったためと考えられる.衝突噴流による高温面の急速冷却に関する実験を行った.実験範囲は,噴流速度3 15m/s,噴流液温20 95°C,噴流径2,3mm,高温面温度250 600°C,高温面材質,銅,黄銅,炭素鋼の3種類で,試験流体として水をもちいている。高温加熱面を衝突噴流で冷却するとき,冷却開始すなわち高温面の濡れ開始の状況は,高温面の温度が熱力学的過熱限界温度以上にある場合でかつ冷却能力が大きい場合とそれ以外では大きく異なることを高速ビデオカメラでの観察から明らかにした.熱力学的過熱限界温度以上でかつ冷却能力が大きい範囲では,噴流接触後高温面は非常に短い周期で濡れと乾きを繰り返しながら緩やかな冷却状態の継続となっている.その後,高温面がある温度まで降下すると,安定な濡れが確保されるようになる.安定な濡れが確保されると,その濡れ面は急速に拡大を始めることになる.この拡大が起こっているときの温度の変化,最大熱流束の大きさやその位置の移動を正確に測定することができるように,本研究で必要となる2次元非定常逆問題解の改善を行った.その結果,前記の状態量の値をより正確に推定できるようになった.

また,濡れ範囲内での最大熱流束が現れる位置をより正確に把握することが可能となった.安定な濡れが確保された状況下で達成される最大熱流束q_<max>は,高温面の材質によってその大きさが異なっているけれどもほぼ同じ特性で変化することおよびその特性は定常の衝突噴流沸騰系の限界熱流束q_cを用いて次式で近似できることが明らかになった.なお,ρ,c,λはそれぞれ密度,比熱,熱伝導率である.また,噴流衝突後高温面が直ちに濡らされる条件下での最大熱流束は,上記の式では,与えられないので今後更に検討を進める.衝突噴流による高温面の急速冷却に関する前年度の実験データの解析と整理および論文の作成を主に行った.実験範囲は,噴流速度3-15m/s,噴流液温20-95°C,噴流径2,3mm,高温面温度250-600°C,高温面材質,銅,黄銅,炭素鋼の3種類で,試験流体として水を用いている.高温面の表面は,5μmの金メッキを施されている.その内容の概要は,高温加熱面を衝突噴流で冷却するとき,冷却開始すなわち高温面の濡れ開始の状況は,高温面の温度が熱力学的過熱限界温度以上にある場合でかつ冷却能力が大きい場合とそれ以外では大きく異なることを高速ビデオカメラでの観察から明らかにした.安定な濡れが確保され,東にその濡れ面は急速に拡大を始めるまでの時間(滞在時間と呼ぶ)について,検討し,多くの実験データを基にその予測式を提案するに至っている.高温面に噴流が衝突した直後の数μsでは,急激な蒸気の発生後,その蒸気によって高温面は濡らされない状態となっている.そして,この数μsでの固液の接触中に伝えられる熱流束と温度の伝搬深さは数ナノmのオーダーとなっている.この数ナノmの液層が急激に加熱され,自発核生成の状態となっている可能性が高いことを見出した.自発核生成を決定する物理量が,単に温度だけであるのか必要なエネルギー(熱)量であるのかについては,今後更に検討する必要があることを指摘している.
パーキンソン病の構音障害に対する音楽療法の効果と包括的評価法の確立

パーキンソン病(PD)7症例を3群(言語療法なし群、通常言語療法群、カラオケ療法群)に分け、短期集中型リハビリテーションを実施することで、運動機能とQOLが改善した。全症例で発話の大きさが自覚的に改善したと感じ、特にカラオケ療法群では発音や発話リズム改善を自覚した症例が存在したが、症例数が少ないことも有り発話速度や発声持続時間では有意な変化は認めなかった。また視床下核脳深部刺激術後に構音障害が悪化したPD4症例に音声分析を実施したところ、調音点未到達が原因と思われる単音節繰り返し回数低下と終了時パワー減衰率増悪が顕著であった.これらの所見は構音障害の包括的判定に有効である可能性がある.パーキンソン病(PD)患者のADL・QOL低下の原因である小声・構音障害に対して、「能動的音楽療法」が有効である可能性がある.日本において普及している「歌う」機会としては「カラオケ」が圧倒的にメジャーである.本研究では「カラオケ療法」により,PD患者における小声,構音障害が改善することを明らかにし,他の運動症状や球症状への有効性も確認し、さらに本研究を通じて,音声分析を利用した客観的な構音障害の包括的評価方法を確立することを目標とする.平成25年度はPDFに対するカラオケ療法の精度を高めることと音声分析項目の絞り込みを行った.まずは、脳深部刺激療法後(DBS)に構音障害が顕著になった数症例に対し、一日40分のカラオケ療法を数週間実施した.DBSにより、口腔機関の運動範囲減少や、単音節繰り返しの速度低下、発話時間の短縮による発話不明瞭の増悪をきたすことから調音点未到達となっていた.カラオケ療法により調音点未到達が減少し、構音が明瞭化した.次に、Hoehn-Yahr分類III-IVのPD症例を封筒法による無作為抽出にてアトランダムに「理学療法(PT)+作業療法(OT)のみ」、「PT+OT+言語療法(通常)」「PT+OT+言語療法(カラオケ)」の3群に振り分け、週4日、4週間のリハビリテーションを実施を開始した.評価項目は構音評価(標準ディサースリア検査),運動症状(UPDRS 3rd),QOL・うつ評価(PDQー39,Beckうつ評価尺度),運動機能(歩行速度,歩行距離,timed up and go test,functional reach test),肺機能検査とした.解析結果は来年以降に報告する.本研究では「カラオケ療法」により,パーキンソン病(PD)患者における小声,構音障害が改善することを明らかにし,他の運動症状や球症状への有効性も確認することが目的である.平成26年度は5症例に対して、Hoehn-Yahr分類III-IVのPD症例を封筒法による無作為抽出にてアトランダムに「PT+OTのみ」、「PT+OT+言語療法(通常)」「PT+OT+言語療法(カラオケ)」の3群に振り分け、週4日、4週間のリハビリテーションを実施した.評価項目は構音評価,運動症状,QOL・うつ評価,運動機能,肺機能検査とした.解析結果は来年以降に報告する.さらに本研究を通じて,音声分析を利用した客観的な構音障害の包括的評価方法を検討した.両側視床下部脳深部刺激療法(STN-DBS)後に構音障害が増悪したパーキンソン病(PD)患者における音声分析変化の特徴を検討した.対象はSTN-DBS後に構音障害が増悪したPD患者4例(男3例、女1例.年齢64.3±4.6歳.罹病期間9.5±0.6年).STN-DBS施行前と施行1年後にUPDRS part 3スコア(on/off)を評価し、「ア」の持続発声と単音(パ、タ、カ)と音節(パタカ)の繰り返しを音声解析ソフトで解析した.持続発声は持続時間、開始時パワー、終了時パワー減衰率を、単音・音節の繰り返しは繰り返し回数、開始時パワー、終了時パワー減衰率を算出した.結果としては、発声持続時間、開始時パワーは大きな変化を認めなかったが、終了時パワー減衰率は増悪した.単音・音節の繰り返し回数は減少し、開始時パワー、終了時パワー減衰率ともに低下した.PDにおける構音障害では、目的音の構音点に構音器官の運動が到達する前に、継続する音を生成するための運動が開始する現象である調音点未到達が知られているが、本検討における単音節繰り返し回数低下と終了時パワー減衰率増悪は,調音点未到達を捉えた所見と考えられ、客観的な構音障害の包括的評価方法になりうると考える.3年間で7症例に対し、Hoehn-Yahr分類III-IVのPD症例を封筒法による無作為抽出にてアトランダムに「PT+OT(3症例)」、「PT+OT+言語療法(1症例)」「PT+OT+カラオケ療法(3症例)」の3群に振り分け、週4日、4週間のリハビリテーションを実施し、平成27年度に解析を行った。結果は3群ともに発話の大きさが自覚的、他覚的に改善した。さらにカラオケ群には発音や発話速度の改善を自覚した症例があり、カラオケ療法により発声リズムの再獲得ができた可能性を考えた。全症例で歩行を中心とした運動機能は改善しており、うつ症状(BDI-II)やQOL(SF-36)はの悪化を認めた症例もなかった。症例数をもう少し増やし、統計学的な検討を行い、英文雑誌への投稿を行うことが今後の課題である。また音声分析を利用した客観的な構音障害の包括的評価方法も検討を行った。

両側視床下部脳深部刺激療法(STN-DBS)後に構音障害が増悪した4症例を対象に音声分析変化の特徴を検討した。STN-DBS施行前と施行1年後に「ア」の持続発声と単音(パ、タ、カ)と音節(パタカ)の繰り返しを音声解析ソフトで解析した。持続発声は持続時間、開始時パワー、終了時パワー減衰率を、単音・音節の繰り返しは繰り返し回数、開始時パワー、終了時パワー減衰率を算出した。結果は、発声持続時間、開始時パワーは大きな変化を認めなかったが、終了時パワー減衰率は増悪した.単音・音節の繰り返し回数は減少し、開始時パワー、終了時パワー減衰率ともに低下した。本検討における単音節繰り返し回数低下と終了時パワー減衰率増悪は、目的音の構音点に構音器官の運動が到達する前に、継続する音を生成するための運動が開始する現象である調音点未到達によるものと考えた。本研究について平成26年度の日本神経リハビリテーション学会、平成27年度の日本神経学会総会で発表した。パーキンソン病(PD)7症例を3群(言語療法なし群、通常言語療法群、カラオケ療法群)に分け、短期集中型リハビリテーションを実施することで、運動機能とQOLが改善した。全症例で発話の大きさが自覚的に改善したと感じ、特にカラオケ療法群では発音や発話リズム改善を自覚した症例が存在したが、症例数が少ないことも有り発話速度や発声持続時間では有意な変化は認めなかった。また視床下核脳深部刺激術後に構音障害が悪化したPD4症例に音声分析を実施したところ、調音点未到達が原因と思われる単音節繰り返し回数低下と終了時パワー減衰率増悪が顕著であった.これらの所見は構音障害の包括的判定に有効である可能性がある.エントリー数が当初の目標である年間15症例に達していない.4週間、週4回のリハビリ実施の時間を患者が取れないために本研究に興味はあるが参加を断念したケースがある。エントリー対象者が負担にならないように、外来だけではなく、入院することも含め参加しやすい状況を作り出していくことが重要である。音声分析を用いた包括的な構音評価に関する評価項目は決定できた。音声分析に関しては、DBSを実施されたPD患者の構音障害について、平成26年度の日本ニューロリハビリテーション学会、ならびに平成27年度の日本神経学会総会で発表ないしは発表予定である。カラオケが構音のみならず嚥下に関しても影響を与えるかを確認することも目的となる。本年度は嚥下評価法の研修会に参加し知見を深めた。神経リハビリテーション当初予定である45症例に到達するように、当院神経内科外来で対象患者のリクルートを積極的に行う。DBS実施後に構音障害が顕著になる症例も少なくないので、本研究の除外条件がなければ積極的に参加を検討してもらう。構音障害の評価方法に関しては評価項目選定はできたので、副項目の範疇ではあるが、嚥下に関しても嚥下造影、嚥下内視鏡で評価を進めていく。音声分析に必要な装置を購入し、数症例で検討を行った結果、音声分析の方法に目処はついた。リハビリテーションの具体的な実施に関しての環境も整えられた。音声分析装置を揃えること、および、音声解析方法の目処がつくのに時間を要したこともあり、患者の登録が予定より遅れたため、エントリー数が当初の目標である症例数に達していない。全体として、システムとしては軌道に乗り始めたところであるが、症例数の不足を補う努力が必要である。当院神経内科外来で、対象患者のリクルートを積極的に行う。1ヶ月の目標症例登録数を2-3症例とし、平成26年度で計30症例のエントリーを目指す。データの中間解析を行う。
新規抗高血圧ペプチドの探索とそのレトロインバルソ型アナログの創製

[研究の目的]本研究の最終目標は,ヒトタンパク質中のペプチドにスポットを当て,高血圧症の予防もしくは治療に利用できるツールを創製することである。ヒトタンパク質のアミノ酸配列中には,多くの未知活性ペプチドが含まれている。これらは遊離されて初めて活性を示す潜在性の活性ペプチド群としてその解明と応用が期待されている。本研究では,これらの未知活性ペプチドに着目し新規なアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチド(ACE)を発見し,そのレトロインバルソ型の阻害ペプチドアナログを創製することで新たな医薬品素材を提供する。[研究の成果]1.新規ACE阻害ペプチドの分離精製,機能解析(1)ヒトγグロブリンタンパク質のパパイン分解物中から新規なACE阻害ペプチドを分離精製し,VAW(IC_<50>=4.3μM)及びVSW(IC_<50>=13μM)を発見した。いずれも阻害の機構は競合阻害を示した。(2)ACEの主作用であるアンジオテンシンI基質のアンジオテンシンIIへの変換活性と,副作用であるブラジキニン基質の分解活性とを,逆相HPLCを用いて個別に測定する方法を開発した。AW及びVAWのみに,アンジオテンシンI変換活性のみを強く阻害する選択的阻害が見られ,既存の医薬品の欠点を補うことのできる新規医薬品の開発が期待できることがわかった。(3)構成アミノ酸全てがD型でかつ逆向きの配列を有する3種のレトロインバルソ型ペプチドアナログ(_dW_dA_dV,_dW_dS_dV,_dY_dI_dL)を合成し,ACE阻害活性を測定した。2.ヒトタンパク質中にはさらなる未知の潜在性ペプチドが存在することを実証ヒト血漿のサーモライシン分解物中から4種(Cabin-1,2,3,4),ヒト血清アルブミンのトリプシン分解物中からは2種(Cabin-A1,A2)のカテプシンB阻害ペプチドを分離精製した。[研究の目的]本研究の最終目標は,これまで知られていないヒトタンパク質中の抗高血圧作用ペプチドにスポットを当て,高血圧症の予防もしくは治療に利用できるツールを創製することである。これらは,タンパク質中では単なる配列の一部であるが,遊離されたペプチドとなることで初めて活性を示すため,潜在性の活性ペプチド群としてその解明と応用が期待されている。本研究では,これらの未知活性ペプチドに着目し新規なアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを発見し,そのtransition-states analoguesからデザインされるレトロインバルソ型の阻害ペプチドアナログを創製することで新たな医薬品素材を提供する。[研究の成果]新規ACE阻害ペプチドの探索,分離精製,機能解析1.各種のヒトタンパク質をプロテアーゼ分解し,生成するACE阻害活性を測定したところ,γグロブリンタンパク質のパパイン分解物に強いACE阻害活性が表れた。2.逆相高速液体クロマトグラフィー手法を駆使してACE阻害ペプチドを分離法精製し,2種類のACE阻害ペプチドを単離した。3.得られたペプチドについてアミノ酸分析,アミノ酸配列分析,MS分析を行った結果,それぞれVal-Ala-Trp(VAW)およびVal-Ser-Trp(VSW)のアミノ酸配列をもつトリペプチドであることが明らかとなった。これら新規な配列のACE阻害ペプチドである。4.どちらのペプチドも阻害の機構は競合阻害を示し,50%阻害活性値は,VAWが4.3μM, VSWが13μMであった。

また,ヒト血漿のサーモライシン分解物中からは,4種類の新規なカテプシンB阻害ペプチド(Cabin-1, 2, 3, 4)を単離した。[研究の目的]本研究の最終目標は,これまで知られていないヒトタンパク質中の抗高血圧作用ペプチドにスポットを当て,高血圧症の予防もしくは治療に利用できるツールを創製することである。ヒトタンパク質のアミノ酸配列中には,多くの未知活性ペプチドが含まれている。これらは,タンパク質中では単なる配列の一部であるが,遊離されたペプチドとなることで初めて活性を示すため,潜在性の活性ペプチド群としてその解明と応用が期待されている。本研究では,これらの未知活性ペプチドに着目し新規なアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチド(ACE)を発見し,そのtransition-states analoguesからデザインされるレトロインバルソ型の阻害ペプチドアナログを創製することで新たな医薬品素材を提供する。[研究の成果]新規ACE阻害ペプチドの機能解析1.ACEの主作用であるアンジオテンシンI基質のアンジオテンシンIIへの変換活性と,副作用であるブラジキニン基質の分解活性とを,逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて個別に測定する方法を開発した。2.上記方法を用いて,これまで見出したヒトタンパク質由来の新規なACE阻害ペプチドについてそれぞれの基質を用いたときのACEに対する阻害活性を測定したところ,C末端にAla-Trpの配列を持つペプチド,Ala-Trp(AW),Val-Ala-Trp(VAW),のみに,アンジオテンシンI変換活性のみを強く阻害しブラジキニン分解活性はあまり阻害しない,という選択的阻害が見られ既存の医薬品の欠点を補うことのできる新規医薬品の開発も期待できることがわかった。3.また,引き続き新規な潜在性の活性ペプチドの探索と分離精製を行い,ヒト血清アルブミンのトリプシン分解物中からは,2種類の新規なカテプシンB阻害ペプチド(Cabin-A1および-A2)を単離した。[研究の成果]レトロインバルソ型のペプチドアナログの合成とそのACE阻害活性1.構成アミノ酸全てがD型でかつ逆向きの配列を有するレトロインバルソ型ペプチドアナログとして,3種のアナログを合成した。2.上記3種のペプチドアナログについて,基質としてHHL (Angiotensin I型),HFR (Bradykinin型),Angiotensin I及びBradykininを用いてACE阻害活性を測定したが,顕著な阻害活性は認められなかった。
総括班

総括班は、本特定研究の立案、各柱問の交流、及び成果の総括を行う。この目的に沿って、第2年度は、6月、10月、61年2月の3回の総括班会議において、班活動と研究成果のまとめを、それぞれの中心課題として討議を行った。又、昭和62年度より発足する重点領域研究申請のための立案と計画班の検討を目的として、61年2月末日に第4回総括班会議が計画されている。昭和59年度の研究成果の評価のため、7月25日に評価委員会を開催し、豊島総括班長、橋本班員より進捗状況の説明と資料の提出を行い初年度としては概ねよく進めているとの評価を得た。8月2日には、研究代表者会議を開催し、各代表者よりの研究進捗状況説明によって、全体の交流をはかった。さらに、各柱においては、10月以降にそれぞれの柱会議を開催し、柱内における研究交流をはかった。又、柱1においては、厚生省「対がん10ヵ年」研究の柱1との合同柱会議により、具体的な研究成果の交流をはかった。又、シンポジウムについては、がん特と合同で2月に研究成果を発表する公開シンポジウムをもった。本年度は、「バイオがん」から、3題の話題提供を行った。研究支緩活動としては、昨年度に引つづきオリゴ又クレオチドの供給を行い、本年度は具体的な成果も得られはじめた。他に、研究上の緊急な必要性から、吉田班員、浜岡班員、渋谷班員に備品を供給した。出版としては、ガんバイオサイエンスニュースにおけるミニレビューに加えて、本年度よりは海外派遺の先進国交流についての投稿を加えた。1、2号は発行済で、現在3号を編集中である。又、年度末には研究成果をまとめて発行する予定である。
生物的原油分解メタン生成ポテンシャルとメカニズムに着目した油層特性評価技術の開発

国内油田を対象として原油生分解メタン生成の地球化学的痕跡を調査した結果生産ガス中のCO2、プロパン、n-ブタンが13Cに富み、原油中のn-アルカンがi-アルカンより少ない油田が見出され、油層を模擬する温度圧力条件でその原油と水を長期間培養した結果、顕著なメタン生成が観察された。13Cートレーサー実験や炭化水素組成分析の結果、トルエン等のアルキルベンゼン類がメタンの主たる根源物質と推定され、メタゲノム解析の結果、優占するバクテリアがアルキルベンゼン類を分解する酵素を持つと推定された。原油生分解の地球化学的痕跡を有する油田において、油層内微生物が原油をメタンに変換していることが実証された。国内の異なる油層の原油分解メタン生成ポテンシャルに関連する現場情報を多角的な視点から収集した。具体的には、秋田県と山形県の油田から7坑井を選定し,新たに油層試料(ガスと油層水と原油)を採取した。これらを用いて,原油分解ポテンシャルに関連する(1)現場油層環境の地球化学的データの収集・解析と(2)現場油層環境の分子生態学的データの収集・解析を行った。また一方で,(3)油層環境模擬高温高圧培養システムを用いて油層のメタン生成環境を実験室で再現し,原油分解活性の有無を調査した。その結果、山形県の油層試料について、飽和炭化水素成分中のn-アルカンの相対的減少等の原油生分解の地球化学的兆候を見出すとともに、炭素-13トレーサーを添加した高温高圧培養実験において原油分解活性を検出した。平成25年度の研究で原油分解メタン生成活性が検出された山形県新堀油田の油層試料を用いて、地下(原位置)環境を模擬する培養実験を継続し、原油分解プロセスの解析を進めた。炭素-13のトレーサー実験、原油炭化水素成分の濃度分析、及び炭化水素分解に関する機能遺伝子の解析結果から、トルエンが主要な分解成分であることが判明した。メタン生成経路としては、まずトルエンへのフマル酸付加でコハク酸の誘導体が生成した後、安息香酸となり、ベンゼン環の開環、酢酸生成と進み、最後は酢酸資化及び酢酸酸化ー水素資化によるメタン生成、と推定された。新堀油田の油層試料から得られた原油分解微生物集積系を、八橋油田の油層水+原油に添加し、油層環境模擬条件で培養した結果、原油分解メタン生成活性が検出された。このことは、バイオオーグメンターションによって枯渇油田の再生が可能であることを示唆する。本年度は本申請課題の集大成として,油層微生物による原油分解メタン生成プロセスの反応メカニズムと関与微生物を解明する目的で、新たに試料を採取し、培養実験と地化学的分子生物学的分析を行った。秋田県・山形県内の油田坑井から嫌気的に原油と油層水試料を採取した後、実験室にてこれらを耐圧容器に分取して油層を模擬するマイクロコズムを構築し、油層と同じ温度・圧力条件(55°C・5MPa)で培養実験を行った。当該実験においては原油分解反応を促進するため、無機塩、ビタミン、ミネラル等で調製した嫌気性微生物培養に一般的に使用される塩水ベース培地(WS培地)を添加した。また、芳香族原油炭化水素成分としてトルエン及び脂肪族原油炭化水素成分としてヘキサデカンにそれぞれ安定炭素同位体を標識化したトレーサーを微量添加した系を設定し、反応経路評価を試みた。さらには16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づく微生物群集構造解析やメタゲノム解析を通じて、機能遺伝子を検知し、関与微生物を特定したうえで、メタン生成経路についても解析を行った。高温高圧培養実験の結果、油田試料による高圧培養試験において、原油分解とみられる顕著なメタン生成が観察された。トレーサーを添加した系において、メタンの炭素同位体比を測定した結果、メタンが主にトルエンに由来することが確認された。また油層微生物の群集構造解析の結果、細菌では未培養細菌であるPeptococcaceae及びJS1がそれぞれ優占化していることが明らかになるとともに、メタゲノム解析の結果、芳香族原油を分解する機能遺伝子(bssA遺伝子)が検知され、炭素同位体トレーサー試験の結果との整合性が確認された。油層試料の採取、原油分解ポテンシャルに関連する地球化学的・分子生態学的データの収集・解析、嫌気高圧培養による油層微生物の原油分解メタン生成ポテンシャルの検出、炭素-13のトレーサー実験と機能遺伝子の解析による原油分解反応の解析の全てに関して、計画どおり研究が進捗しているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。工学山形県新掘油田の流体試料(油層水+原油)の集積培養によって獲得した原油分解メタン生成コミュニティーの遺伝子解析を進め、特徴的に優占するバクテリアが原油分解に関与している可能性を検証する。

さらに本申請課題の集大成として、これまで多様な油層水の集積培養実験で得られた微生物の原油分解メタン生成ポテンシャルに関する情報、油層温度や原油や油層水中の有機物組成等の地球化学的情報、および油層微生物の多様性や炭化水素分解等の機能に関する遺伝子情報を総合的に解析することによって、生物的原油分解メタン生成ポテンシャルの指標となるバイオマーカーを提示し、油層特性を迅速に評価する技術を確立する。油層試料の採取、原油分解ポテンシャルに関連する地球化学的・分子生態学的データの収集・解析、及び高温高圧培養システムを用いての原油分解活性調査の全てに関して、計画どおり研究が進捗しているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度の研究で油層試料から原油分解メタン生成微生物コミュニティーを獲得し、26年度にその代謝経路と関与微生物を解明するための実験作業を進めたが、嫌気・高圧条件での当該コミュニティー中の微生物の生育速度が遅く、メタゲノム解析と代謝産物の分析によって原油分解微生物の特定とその機能を解明するために、なお培養を継続し集積度を高めることが必要と判断したため。平成25年度の研究で油層試料から獲得した原油分解メタン生成微生物コミュニティーの原油分解代謝経路および関与微生物の特定とその各種役割について、有機物分析・炭素同位体トレーサー実験等の地球化学的手法と次世代シーケンス解析等の分子生態学的手法を用いて明らかにする。これにより,対象とした油層環境における原油分解メカニズムを解明する。さらに原油分解活性が認められる油層に特徴的な現場データを抽出し,上記の原油分解メカニズムの知見を基にバイオマーカーに成り得る指標を選定する。有機物分析・炭素同位体トレーサー実験、遺伝子解析等の手法を用いて、油層微生物の原油分解代謝経路および関与微生物の特定とその役割について解析を進めるために、実験補助を行うテクニカルスタッフの人件費とメタゲノム解析等の外注費に使用する。平成25年度の研究で山形県油田の油層試料から原油分解メタン生成微生物コミュニティーを獲得することに成功したが、嫌気・高圧条件での微生物プロセスの進行速度が低く、本コミュニティの獲得に当初計画より時間がかかったために、その代謝経路を解明するための実験作業に入ることができなかった。有機物分析・炭素同位体トレーサー実験等の地球化学的手法と次世代シーケンス解析等の分子生態学的手法を用いて、原油分解メタン生成微生物コミュニティーの原油分解代謝経路および関与微生物の特定とその各種役割について、明らかにするために、実験補助を行うテクニカルスタッフの人件費に使用する。
生体メカニズムに基づく新しい分子計算パラダイムの研究

(1)DNA配列の組み替え現象をモデル化したスプライシング演算をさらに一般化することにより「環状スプライシングモデル」を提案し,この計算モデルの理論的能力を解析した.結果として,この計算モデルがTuring機械と等価な万能計算の能力を有することを示した.(2)本研究において,1994年のScience誌に掲載されたAdlemanのDNA計算の実験で用いられた"アニーリング","融解',"検知"という分子計算における3つの基本操作が,実は計算能力として(従来の計算機と同等な)Turing万能計算能力をもつことを示した.この計算モデルにおいては計算物質としてDNAが想定されていた.そこで,より抽象的な枠組みを設定して,各分子は符号化できかつ分子同士が自律的に会合する能力を有する計算モデルを研究した.その結果,『計算=自律的会合+形態変化』という新計算パラダイムが成り立つことが分かった.上記の考えを一般化し,自然界における様々な現象・原理を問題解決のための設計論という視点で見直すことにより"分子プログラミング"という概念を提唱した.そして,分子プログラミングのために必要な要素技術の検討と実現手法の開発の基礎的な研究を行なった。(1)計算的な視点から行われる生命制御機構に関する従来研究・文献を調査し,物理化学的な現象・分子生物化学的な反応などを分析することにより計算メカニズムの基本操作として容認できる要素現象・要素反応を探究した.その結果「アニーリング(annealing)」,「融解(melting)」という従来から論じられているDNA分子に対する基本操作に加えて,「検知(detect)」という基本操作を用いると,計算能力として(従来の計算機と同等な)Turing万能計算能力をもつ分子計算モデルが実現できることを示した.これらの基本操作は1994年のScience誌に掲載されたAdlemanのDNA計算の実験で用いられたものと基本的に同じものであり,『単にある問題と解くだけでなく上記三つの基本操作だけで万能な計算能力を有する』ということを示したという意味で重要な成果である.(2)上記の計算モデルを抽象化し,かつ制限することにより新たな分子計算モデル(Computation by Conformational Change:CCC)を提案し,代表的な幾つかのNP完全問題を多項式時間で解く方法を示した.ただし,この場合計算材料の量は一般には指数的に増大する可能性はある.また,一般に『計算=自律的会合+形態変化』という計算パラダイムが成り立つことを提唱した.(3)さらに分子計算の新たな視点から細胞膜を抽象化した「膜計算モデル」を提案しその計算モデルの理論的能力を解析し,Turing機械と等価な万能計算の能力を有することを示した.(1)DNA配列の組み替え現象をモデル化したスプライシング演算をさらに一般化することにより「環状スプライシングモデル」を提案し,この計算モデルの理論的能力を解析した.結果として,この計算モデルがTuring機械と等価な万能計算の能力を有することを示した.(2)本研究において,1994年のScience誌に掲載されたAdlemanのDNA計算の実験で用いられた"アニーリング","融解',"検知"という分子計算における3つの基本操作が,実は計算能力として(従来の計算機と同等な)Turing万能計算能力をもつことを示した.この計算モデルにおいては計算物質としてDNAが想定されていた.そこで,より抽象的な枠組みを設定して,各分子は符号化できかつ分子同士が自律的に会合する能力を有する計算モデルを研究した.その結果,『計算=自律的会合+形態変化』という新計算パラダイムが成り立つことが分かった.上記の考えを一般化し,自然界における様々な現象・原理を問題解決のための設計論という視点で見直すことにより"分子プログラミング"という概念を提唱した.そして,分子プログラミングのために必要な要素技術の検討と実現手法の開発の基礎的な研究を行なった。
遺伝性腫瘍の家系員発症予防のための医療者間連携による効果的な家族支援に関する研究

遺伝性腫瘍症候群に罹患した患者・家族は「がん」と「遺伝」の両方の精神的苦痛、身体的な負荷、経済的な問題などが生じてくるが、考え方、価値観、家族への思いは多様で、血縁者の発症予防、早期発見・早期治療につながらない可能性がある。遺伝専門職が少ない地域においては、遺伝子診療部門と各医療施設が連携して、長期的に患者・家族支援を行う必要がある。本研究は、山陰地域における遺伝性腫瘍に関する看護職の認識および患者・家族への対応を明らかにし、クライエントの患者や家族に対する思いを考慮した遺伝性腫瘍症候群の家系員発症予防のための医療者間連携による効果的な家族支援を明らかにすることを目的としている。本年度は遺伝性腫瘍症候群を含むゲノム医療・遺伝医療に関連して受診したクライエント・家族を対象に、受診までの経過、準備状況等の情報収集および遺伝カウンセリングで提供された情報の理解、家族への思い・説明、満足感等について質問紙調査を実施する。さらに遺伝学的検査を受け、診断告知された対象者に対して、検査についての思い、期待、結果についての思い、家族への思い等を明らかにするために質問紙調査を実施するために、鳥取大学医学部倫理審査委員会への倫理審査申請準備中である。山陰地域における遺伝性腫瘍症候群に関する看護職の認識および患者・家族への対応、看護職者間の連携、家族支援について検討するために、鳥取大学医学部附属病院遺伝子診療科における看護師の役割について考察し、学会発表を行った。がんゲノム医療が急速に進展し、昨年より一部の悪性腫瘍に関しては、治療薬選択のためのコンパニオン診断として、遺伝性腫瘍症候群の原因遺伝子の遺伝学的検査が保険収載され実施されている。遺伝性腫瘍症候群に関する家族歴がない患者もコンパニオン診断を希望し、遺伝カウンセリングで検査についての説明を受け、血縁者への影響について理解、認識するクライエントもいる。また、コンパニオン診断結果が治療薬選択に関係するため、陽性・陰性どちらの結果になってもクライエントへの心理的影響が大きいと考えられる。したがって、遺伝性腫瘍症候群を含むゲノム医療・遺伝医療に関連して受診したクライエント・家族を対象に、受診までの経過、準備状況等の情報方収集および遺伝カウンセリングで提供された情報の理解、家族への思い・説明、満足感等についての質問紙調査内容について、さらに遺伝学的検査を実施、診断告知を受けた対象者に対して、検査についての思い、期待、結果についての思い、家族への思い等を明らかにするための質問紙調査内容に関する検討が必要となり、当大学医学部倫理審査委員会への申請が予定より遅れている。平成31年度以降は、以下の調査および心理テストについて鳥取大学医学部倫理審査承認後、実施する。1研究協力が得られたクライエント等を対象に、遺伝カウンセリング前後でPOMS2&reg;日本語版成人用短縮版を用いて遺伝カウンセリングによる気分・感情の変化をみる。2対象者に対して遺伝カウンセリングの認識、準備状況等について質問紙調査を行い、遺伝カウンセリングを実施する。3遺伝カウンセリングの理解、思い、満足感、家族への説明・思いなどについて質問紙調査を行う(郵送にて回収)。4遺伝学的検査実施、診断告知を受けた対象者に対し、検査についての思いおよび期待、検査を決めたときの気持ち、家族への思い、家族へ検査結果を伝えるか、医療者への期待・要望について質問紙調査を行う。5対象者の気分・感情の変化および収集した情報、質問紙調査等の結果を分析する。6山陰地域の看護職を対象に、遺伝性腫瘍症候群に関する相談経験の有無、遺伝学的検査に関する相談の有無、遺伝性腫瘍症候群の認識、遺伝カウンセリングおよび他科への紹介経験の有無、遺伝性腫瘍症候群患者・家族への対応、遺伝性腫瘍症候群が考えられる患者・家族への対応等について質問紙調査を実施し、分析、検討する。得られた結果をもとにクライエントの心理的影響、家族関係、家族に対する思いを考慮した医療者間連携による効果的な家族支援モデルを作成する。家族支援モデルの作成を吹く研究成果を取りまとめ、成果発表および勉強会を開催する。

遺伝性腫瘍症候群に関する家族歴がない患者もコンパニオン診断を希望し、遺伝カウンセリングで検査についての説明を受け、血縁者への影響について理解、認識するクライエントもいる。また、コンパニオン診断結果が治療薬選択に関係するため、陽性・陰性どちらの結果になってもクライエントへの心理的影響が大きいと考えられる。したがって、遺伝性腫瘍症候群を含むゲノム医療・遺伝医療に関連して受診したクライエント・家族を対象に、受診までの経過、準備状況等の情報方収集および遺伝カウンセリングで提供された情報の理解、家族への思い・説明、満足感等についての質問紙調査内容について、さらに遺伝学的検査を実施、診断告知を受けた対象者に対して、検査についての思い、期待、結果についての思い、家族への思い等を明らかにするための質問紙調査内容に関する検討が必要となり、当大学医学部倫理審査委員会への申請が予定より遅れている。平成31年度以降は、以下の調査および心理テストについて鳥取大学医学部倫理審査承認後、実施する。1研究協力が得られたクライエント等を対象に、遺伝カウンセリング前後でPOMS2&reg;日本語版成人用短縮版を用いて遺伝カウンセリングによる気分・感情の変化をみる。2対象者に対して遺伝カウンセリングの認識、準備状況等について質問紙調査を行い、遺伝カウンセリングを実施する。3遺伝カウンセリングの理解、思い、満足感、家族への説明・思いなどについて質問紙調査を行う(郵送にて回収)。4遺伝学的検査実施、診断告知を受けた対象者に対し、検査についての思いおよび期待、検査を決めたときの気持ち、家族への思い、家族へ検査結果を伝えるか、医療者への期待・要望について質問紙調査を行う。5対象者の気分・感情の変化および収集した情報、質問紙調査等の結果を分析する。6山陰地域の看護職を対象に、遺伝性腫瘍症候群に関する相談経験の有無、遺伝学的検査に関する相談の有無、遺伝性腫瘍症候群の認識、遺伝カウンセリングおよび他科への紹介経験の有無、遺伝性腫瘍症候群患者・家族への対応、遺伝性腫瘍症候群が考えられる患者・家族への対応等について質問紙調査を実施し、分析、検討する。得られた結果をもとにクライエントの心理的影響、家族関係、家族に対する思いを考慮した医療者間連携による効果的な家族支援モデルを作成する。家族支援モデルの作成を吹く研究成果を取りまとめ、成果発表および勉強会を開催する。平成30年度は鳥取大学医学部附属病院遺伝子診療科で、ゲノム医療・遺伝医療に関連して受診したクライエント・家族を対象に、気分・感情の変化測定、遺伝カウンセリングに関する認識、準備状況等の質問紙調査、遺伝カウンセリング後に内容理解、満足感、家族への思い、医療者への要望等の質問紙調査を行う。さらに、遺伝学的検査を実施した対象者に対し、検査および家族への思いについて質問紙調査する予定であった。しかしながら、一部の悪性腫瘍の治療薬選択のためのコンパニオン診断が始まり、質問紙調査内容を検討する必要が生じたため、当大学医学部倫理審査委員会への申請が遅れている。そのため調査が開始できず次年度使用額が生じた。
フラーレンプラズマによる新機能性薄膜形成法の開発

カリウム-フラーレン(K-C_<60>)プラズマによる薄膜形成実験を行った結果、K内包フラーレン@C_<60>を含む薄膜の形成に成功した。しかし、C_<60>に対するK@C_<60>生成率が最大で30%(平均10%以下)であるため、プラズマ効果と内包化機構の関係解明が困難であった。以上の結果を踏まえた上で、イオン直径がカリウムよりも小さいナトリウムを用いてNa-C_<60>プラズマを生成して成膜実験を行った。結果は、以下の通りである。(1)Na-C_<60>プラズマによる成膜実験と組成分析の結果、Na内包フラーレンに相当するNa-C_<60>複合物質(Na(@)C_<60>)が検出された。更に、C_<60>に対する平均生成率は3050%に達し、基板のある領域における生成率は、最大200%以上に達する結果が得られた。(2)成膜基板に印加するバイアス電圧を変化させた場合のNa(@) C_<60>平均生成率に関しては、正バイアスのある値で最大値を示すことが判明した。(3)薄膜の組成・構造に対するプラズマ効果を明確にする手段として、高分解能電子顕微鏡による直接観察を行った。ナノスケールでの詳細な観察を行った結果、中心に黒点を持つC_<60>分子が数多く観察されており、黒点直径がNa^+イオン直径に一致することから、NaがC_<60>に内包したものであることを直接的に検証することができた。以上の結果から、フラーレンプラズマによるNa@C_<60>を主とした複合物質の大量生成とその薄膜化に成功した。このことは、物質の組成・構造分析を専門とする研究者に対しての試料提供を可能にしたのみならず、フラーレンをベースとした半導体素子などの新機能性デバイス薄膜の形成に大いに貢献できると考えている。(1)まず、半導体機能や超伝導発現などで注目されているフラーレン・アルカリ金属複合物質を対象とするために,現有真空容器中の一端から,接触電離により完全電離カリウムプラズマ流を一様磁場中に発生した.このQマシーンの中央付近に設置されたオ-ブンからC_<60>を入射し,電子付着の結果、軸中心付近ではプラズマ中の電子1個に対しC_<60>^-イオン(1価)100個以上、また周辺領域の広い空間では10,000個以上のほぼ完全な高質量負イオンプラズマを生成し,これを制御することに成功した。(2)この二層構造を持つK^+-C_<60>^-プラズマにおいて,接触電離プラズマ源と対向して終端基板電極を設置し,プラズマを安定な条件に保つための基板径方向位置と印加バイアス極性の関係を調べた.このような基板バイアス印加をすることにより,プラズマから基板は向かうK^+とC_<60>_-をシースを介して選択的に加速または減速し,双方のイオンの基板への入射フラックスのみならずエネルギーも制御された形で成膜を行った.この場合,フラーレンプラズマの物性の詳細が重要となるので,粒子シュミレーションによる解析を開始した.(3)成形された薄膜をFT-IRとX線マイクロアナライザーにより解析した結果,膜中のC_<60>及びK組成は各々プラズマ電位よりも正及び負のバイアス領域で支配的であった.

又,レーザーイオン化飛行時間型質量分析器結果は,正バイアス領域で,C_<60>以外に金属内包フラーレンK@C_<58>及びK@C_<60>を示すスペクトルピークの存在を明らかにした.更に,薄膜の電気伝導度のバイアス依存性をその場測定した結果,プラズマ電位近傍で最大導電率が得られた.(4)以上の結果を真空蒸着法により形成された薄膜特性と比較するために,超高真空装置を製作し10^<-10>Torr以下に達したことを確認した.(1) K^+-C_<60>^-プラズマを用いて形成された薄膜をレーザーイオン化飛行時間型質量分析を行った結果,基板バイアスがプラズマ空間電位より5V以上高い場合に薄膜中の金属内包フラーレンK@C_<58>,K@C_<60>の存在を示唆する明確なスペクトルが得られた.また,これらの金属内包フラーレンの空のフラーレンC_<60>に対する組成比率は高々数10%,平均的には数%に過ぎないことが明らかになった.(2)そこで,更なる内包化の促進と内包機構の解明を目的として,フラーレンプラズマのアルカリ金属種を変える実験を試みた.すなわち,カリウムのイオン直径はC_<60>ケージの平均六員環直径よりも大きいが,ナトリウムのイオン直径はそれとほぼ同程度であるのでNa^+-C_<60>^-プラズマを生成して,金属内包フラーレンNa@C_<60>を多量に含む薄膜形成を目指した.(3)生成されたNa^+-C_<60>^-プラズマ中の正イオンと負イオンの半径方向分布をイオンセンシティブプローブで測定した.正イオンは磁場を著しく横切る拡散型の分布であり,負イオンは更に著しく拡散しプラズマエッヂ領域にピークをもつ局在型分布であることが明らかになった.(4)このプラズマ中に半径方向に細かく分割された基板を挿入し各々にバイアスを印加して成膜を行い,形成された薄膜の組成の半径方向分布をレーザーイオン化飛行時間型質量分析器により調べた.その結果,C_<60>^-イオンが局在する半径方向位置での薄膜中には,正バイアスの場合にNa@C_<60>が極めて高い含有率で存在することが示唆された.(5)また同時に,この薄膜を冷陰極電界放射形走査電子顕微鏡により表面観察し膜質及び膜構造を調べ,超高真空装置で作製されたC_<60>のみの蒸着膜の膜質・膜構造と比較検討する実験も開始した.フラーレンプラズマによる薄膜形成実験とその評価・分析を行った結果、以下のような結果が得られた。(1)フラーレンC_<60>への原子内包の高効率化とその機構解明を目的としたNa-C_<60>プラズマによる成膜実験と組成分析の結果、Na内包フラーレン(Na@C_<60>)を含むNa-C_<60>複合物質が検出された。C_<60>に対する平均生成率は3050%に達し、更に成膜基板のある領域における生成率は、最大200%以上に達する結果が得られた。(2)成膜基板に印加するバイアス電圧を変化させた場合のC_<60>に対するNa@C_<60>の平均生成率に関しては、C_<60>は正バイアス電圧の上昇に伴って増加するのに対してNa@C_<60>は、正バイアスのある値で最大値を示し、それ以上の値では減少する傾向がみられた。(3)薄膜の組成・構造に対するプラズマ効果を明確にする手段として、冷陰極電界放射形走査電子顕微鏡及び高分解能電子顕微鏡による直接観察を行った。薄膜表面はバイアス電圧の変化に伴い、大きく変化するのが観察された。更に、ナノスケールでの詳細な観察を行った結果、中心に黒点を持つC_<60>分子が数多く観察されており、黒点直径がNa^+イオン直径にほぼ一致することから、NaがC_<60>に包したものであることを直接的に検証することができた。以上の結果から、Na@C_<60>を含むNa-C_<60>
ゲノム情報を利用した転写因子の標的遺伝子単離法の開発

本研究の目的は、ゲノム情報の明らかになっている線虫をモデル動物として、効率の良い標的遺伝子群の単離法を開発し、多くの動物種で保存されている、発生過程における転写調節機構を明らかにすることである。我々がマウスHoxの標的として単離した遺伝子の一つ(mmab1)は、線虫の形態形成に関わる遺伝子mab21のマウスオーソログであった。遺伝学的解析からmab21は線虫Hox遺伝子の一つeg15の標的である可能性が指摘されていた遺伝子であった。このことはこの遺伝子が種をこえたHox標的遺伝子であることを示していると考えられる。この遺伝子の発現調節機構を明らかにするため、トランスジェニック線虫、トランスジェニックマウスを作製し解析した。線虫mab21遺伝子はhypodermis, neuron,ray(雄の生殖に関わる感覚器官)で特異的に発現しているが、トランスジェニック個体の解析から、それぞれの領域での特異的発現に関わるエレメントを特定した。hypodermisでの特異的発現調節エレメントは遺伝子の上流に、neuronおよびrayでの調節エレメントは第4イントロンの異なる領域に存在した。Hox(eg15)遺伝子との遺伝学的な相互作用はrayにおいて観察されるが、rayでの特異的発現がeg15遺伝子産物によって規定されているかどうかを明らかにするため、eg15ミュータント中でのreyでの特異的発現エレメントの働きを解析した。egl5遺伝子を異所的に発現させた個体中でこのエレメントに依存したレポーター遺伝子の特異的発現が観察されたことから、egl5がこのエレメントを介しでmab21遺伝子の発現を制御していると考えられる。マウスmab1遺伝子は中脳、脊髄、生殖原器などで発現しているが、トランスジェニックマウスの解析から、これらの発現をコントロールしている配列が、遺伝子の上流約2kbに存在することが明らかになった。この配列は、Hox抗体によって単離された配列であり、この領域にHox標的配列が存在することを示唆している。上記の結果は、mab21遺伝子が線虫においてもマウスにおいてもHoxの標的であるということを強く示すとともに、我々の単離法が標的遺伝子の特定に有効であるということを表している。
未熟児網膜症の病態研究とその治療薬剤の検討

未熟児網膜症モデルマウスとコントロールマウスの遺伝子発現をリアルタイムPCR法によって包括的に検討した結果、炎症性サイトカインの発現上昇は網膜新生血管の発現前から消退後に至るまで上昇しており、一方、新生血管に関連する血管内皮細胞増殖因子、アンギオポイエチン-2に代表されるサイトカインは新生血管の発現の直前に上昇し、新生血管の消退とともに発現が低下していることが判明した。C57BL/6Nマウスを用いて既報に従い、未熟児網膜症モテルマウス(OIRマウス)を作成した。P12P21のOIRマウスおよびコントロールとして高濃度酸素投与を行わなかった生後同日のマウス各々2匹(計40匹)の眼球から網膜を分離し、個体毎のばらつきを補正する意味からOIRマウスおよびコントロールマウス各々2個体からの網膜を混ぜたサンプルからtotal RNAを抽出し、cDNA Synthesis System for Quantitive RT-PCR(Marligen Biosclence)を用いてcDNAを合成した。DKAマイクロアレイ法でコントロールマウス網膜に比しOIRマウス網膜で2倍以上の発現上昇が得られた遣伝子のうち新生血管発現に関与する遺伝子約90個を解析できるようにカスタムメイドのカードをTaqMan Low-Density Array(TLDA)で作成した。これまでサンプル解析に先立ち内在性のコントロール遺伝子として最も適したものを検索するためにCt法を用いてβアクチン、18SrRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehaydrogenease(GAPDH), TATA box binding protein(TBP)などを候補として検討した。その結果、βアクチンが最も安定して発現しており内在性のコントロール遺伝子に適していることが判明した。次にOIRマウスの遺伝子発現をTLDAによって包括的に検討した結果、炎症性サイトカインの発現上昇は網膜新生血管の発現前から消退後に至るまで上昇しており、一方、新生血管に関連する血管内皮細胞増殖因子、アンギオポイエチン-2に代表されるサイトカインは新生血管の発現の直前に上昇し、新生血管の消退とともに発現が低下していることが判明した。未熟児網膜症における新生血管発現抑制に効果があると予想される物質として臨床で実際に頻用されている(1)トリアムシノロン(TA;ステロイド剤の薬効ランクでIV群:mild)、およびTAより強力で、TAと同様に懸濁液で徐放効果が期待できる(2)ジフルブレドナード(同II群:very strong)ついて検討を行った。対象はC57BL/6Nマウスを用いて、既報に順じて作成した未熟児網膜症モデルマウス(OIRマウス)で、OIRマウスが新生血管を発現する直前の生後12日目に腹腔内に両ステロイド剤((1)、(2))のいずれか、あるいは対照として生理食塩水を各群5匹に投与した。OIRマウスで新生血管発生がピークに達する生後17日目に眼球を摘出し、網膜伸展標本を作成し、新生血管の発現を検討した。その結果、新生血管の発現は(1)、(2)のステロイド剤投与群で対照に比し、著明に抑制されているのが確認できた。しかし、(1)、(2)のステロイド剤投与群では対照に比し、体重増加が約30%不良で、成長障害がみられた。ステロイド薬の投与は新生血管の抑制には有効であったが、今回の検討からは全身的な副作用が強いことが判明した。今後、ステロイド剤の眼局所投与(後部テノン嚢下)を行うこと、他のtenoodulinなどの新生血管抑制作用を持つ薬剤の効果について検討を進める予定である。前年度にC57BL/6Nマウスにて作成した未熟児網膜症モデルマウス(OIRマウス)を用いて未熟児網膜症における新生血管発現抑制効果を(1)トリアムシノロン(2)ジフルブレドナードを腹腔内投与することで検討したが、これらステロイド剤では成長障害が強いことが判明した。今年度はこれらステロイド剤を眼周囲に投与する方法に変更し、新生血管抑制効果を検討した。OIRマウスが新生血管を発現する直前の生後12日目に眼周囲(テノン嚢下)に可溶最大濃度の(1)あるいは(2)を約0.1ml(各群5匹)に投与した。対照として生理食塩水を同量投与(5匹)した。投与した。その結果、(1)、(2)のステロイド剤投与群で対照に比し、無血管領域はやや広く、新生血管も抑制されている傾向が確認できたが、画像解析によって統計学的に検討を行うと(P=0.10)と有意とは言えない結果であった。