hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
干潟土壌微生物リン酸加水分解活性の変動に係わる環境生化学的研究

申請課題に基づき,平成16年度から平成17年度にかけては,干潟土壌のリン酸加水分解分解酵素がタンパク質負荷によって活性増加することに着目し,負荷タンパク質の動態について生化学的に解析を行った。その結果,負荷タンパク質が干潟土壌によって加水分解されることを電気泳動的につきとめることに成功した。さらにリン酸加水分解酵素のタンパク質による活性誘導は,河川上・中流域に比較し,干潟土壌において著しく高いことと同時に,タンパク質加水分解の電気泳動パターンから,河口干潟においては河川上流・中流域とは異なるプロテアーゼの存在を示す結果が得られた。平成17-18年度にかけては,世界で初めて土壌中プロテアーゼを直接同定する手法の開発に成功し,広島県竹原市を貫流する賀茂川の河口干潟を対象に,土壌プロテアーゼ種の平面的な分布,及び表層から下層土壌も含めたプロテアーゼの3次元的な分布調査を行った。その結果以下の興味ある結果が得られた。1.賀茂川河口干潟におけるプロテアーゼ種の分布パターンは,4つのタイプに分類される。2.分類された4タイプは干潟土壌の生態的環境を反映している。3.フォスファターゼ活性が高い領域には特徴あるプロテアーゼが存在することが示された。以上本課題に対する研究結果から,特有のプロテアーゼを分泌する微生物種の同定が,タンパク質のフォスファターゼ活性誘導機構の解明に重要であることが示され,今後の研究への進展に繋げることができた。また本研究の成果となる2種類のプロテアーゼ分析法は今後土壌におけるタンパク質の代謝解明に大きな貢献をすることが期待され,数編のオリジナル論文とホームページによりその手法について公開がなされた。干潟,特に河口干潟においては,河川よりもたらされる負荷有機物に対し,干潟土壌に生息する微生物による無機栄養塩変換反応が活発になされており,この代謝活性は海域の生物生態系において極めて重要な反応である事が広く知られている。したがって,河口干潟土壌の微生物代謝活性を精査に把握することは,干潟の生態的環境を検討する上で基本的に重要な情報に繋がることが期待される。本研究は,以上の視点を踏まえ,河口干潟により採取した土壌を用い、酵素活性の変動を解析する室内実験を中心に行われた。その結果,タンパク質,及び脂質が干潟土壌に負荷されることによって土壌フォスファターゼ活性の著しい活性増加が誘導され,さらにこの増加は,好気的環境下においてのみもたらされることを明らかにすることができた。さらに,無機リン酸の土壌への負荷が,土壌フォスフォターゼ活性の低下を導くことが明らかになった。このことは干潟における過剰なリン酸提供が干潟土壌によって抑制されることにも繋がり,リン酸濃度に関する緩衝作用を干潟自身が有することを示唆していると解釈することができる。さらに銅イオンやアルミニウムイオン(1-5mM)の存在が,フォスファターゼ活性に有意な低下をもたらすことを見出した。以上の結果は,海洋水産生物の生態的基盤となる植物プランクトンの成長にとって必須な干潟微生物のリン酸栄養塩提供という機能が,河川より負荷される有機物質や無機リン、重金属によって大きく変動することを明らかにしたものであり,海洋生態系の基盤形成を考える上で、重要な情報提供になるものと思われる。申請課題に基づき,平成17年度は干潟土壌において,我々が見出したタンパク質負荷によるフォスファターゼ活性誘導について,この活性効果が干潟土壌においてのみ発現される現象であるか否かについて明らかにすることに焦点化した研究を行った。具体的には,広島県竹原市を貫流する賀茂川の河口干潟と,上・中流域にあたる数地点間の土壌を対象に,フォスファターゼ活性誘導の差違,及び負荷されたタンパク質の加水分解過程について比較検討を行った。その結果,タンパク質負荷による著しい活性誘導効果は,河川上・中流域に比較し,干潟土壌において著しく高いことが明らかになった。さらに負荷されたタンパク質の加水分解パターンにおいて,活性誘導の高い河口干潟と上・中流域における土壌間には有意な差違が存在するという結果を得ることができた。

この結果は,海洋・河川より有機物負荷の堆積する河口干潟には活発なタンパク質分解活性とそれにリンクしたフォスファターゼ活性誘導を担う特殊な微生物種の存在を示唆するものとなった。この研究においては,タンパク質分解酵素の活性染色法を改良・応用し,採土した土壌に含まれる各タンパク質分解酵素の存在を,分子量と活性の程度から電気泳動的手法で分析できる方法の開発に成功した。これらの結果は,現在,2編の投稿論文として査読の段階にある。特に本課題の遂行過程でなされた技術開発の成果としての,「土壌中のタンパク質分解酵素の分析法」は,電気泳動的には最も高感度タンパク質分析手法として用いられる銀染色法によっても把握できない微量の酵素量であっても,その酵素の活性を,電気泳動終了後のゲル上に酵素の存在を分離・分析できるものであり,土壌タンパク質分解酵素の分析は,国際的にも初めての成功例になると思われる。今後土壌微生物を対象とした環境科学研究の手法として多くの研究者に幅広く採用されることが期待されると思われる。申請課題に基づき,平成18年度は,平成17年度に成功した干潟土壌に含まれるタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)の電気泳動的分離・分析方法の応用について取り組んだ。具体的には,広島県竹原市を貫流する賀茂川の河口干潟を対象に,土壌プロテアーゼ種の平面的な分布,及び表層から下層土壌も含めたプロテアーゼの3次元的な分布調査を行った。併せてアオサ,コアマモ,アマモについてGPSによる計測を行い,プロテアーゼ分布と食相との相関について考察を行った。その結果下記の興味ある事実が明らかになった。1.賀茂川河口干潟におけるプロテアーゼ種の分布パターンは,4つのタイプに分類される。2.植相の分布及び冠水の程度などを反映し,プロテアーゼ分布パターンが異なることが明らかになった。すなわち河口部分の常時冠水されている地点には,分子量の大きなプロテアーゼ種がほとんど存在しない一方,低分子の単一プロテアーゼの存在が示された。3.アオサが密集し,ATPバイオマスの高い地点には多種類の活性の高いプロテアーゼの存在が観察された。4.表層土壌において活性の高い多種のプロテアーゼが分布していることが明らかになった。一方,地下30cm以下には,分子量の低い単一なプロテアーゼが存在することが示された。こうした分布パターンに併せて,ハクセンシオマネキの消化産物である砂団子中に,特異的なプロテアーゼが存在することが示された。以上の結果は,土壌プロテアーゼの存在が,生態的環境と密接に連携していることを示しており,プロテアーゼの分布パターンが,干潟の生態的環境評価の有効な指標となることが強く示唆された。今後は全国の干潟を対象に,プロテアーゼパターンの普遍的な特性を探る方向へ発展させていきたいと考えている。
筑豊のおばあちゃんたちの語りを地域や教育現場で活用するプログラム開発

研究目的筑豊のおばあちゃんの語りを使った教材で学習した筑豊地区の子どもが、自分の郷土の歴史を知り、ふるさとを愛するようになることが目的である。研究方法筑豊のおばあちゃんたちの語りによる音声資料を、1,「いつでも、簡単に」視聴できるように整備する。2,学校などの教育現場で活用しやすいように教材として開発をする。3,継続的な実施のために、今回の取り組み全体をプログラムモデルとしてまとめる。研究成果上記方法の分類別に成果を示す。2,当初は複数の筑豊のおばちゃんによる聞き取りを対象としていたが、2011年1月に、戦前の坑内労働経験女性(橋上カヤノさん、1910年生まれ)に出会い、肉声証言保存の緊急性を考慮し、橋上さんに限定した音声資料の整備を行うことにした。取材、編集を重ね、映像制作者山本祐子氏の協力を経て、インターネット動画共有サービス(YouTube)に配信している(2012年3月20日現在2動画アクセス数合計158)。2,学校現場での教材開発については、飯塚市立大分小学校の中山雅子教諭の協力を得て、ヒアリング、指導案作成、パワーポイント教材作成と修正を行った。2012年1月24日、6年1組21人の児童に「わたしたちが暮らす『筑豊』」の単元の中で中山教諭が教材を使用して授業を行い、評価までを行った。(1)筑豊は好きですか、(2)筑豊はどんなところですか、(3)炭坑について知っていること、(4)炭坑について学習したいこと、の4項目について学習前・後の評価検証を行った。その結果、(1)については、学習前に「筑豊」が「好き」が5人、「だいたい好き」が16人だったが、学習後「筑豊について興味を持って学習することができましたか?」の問いに、「持てた」が14人、「だいたい持てた」が7人と高評価を得た。3,今回一校しか実施できず、教育現場での協力者探しに課題が残った。地域学習の必要性についての説得力と利用の簡便さが教育プログラムには要求されることが分かった。
シンクロトロンCTおよび有限要素解析を用いた骨梁微細骨折の発生メカニズムの研究

骨粗鬆症患者から得られた骨サンプルをシンクロトロンCTで撮影し、骨梁に生じた微細骨折の検出、微細骨折を生じた骨微細構造の解析、および微細骨折発生の力学シミュレーションを行った。全ての症例で複数の微細仮骨が確認され、骨梁レベルの骨折が不顕性に生じていたことが推察された。骨微細構造は、微細骨折を多く生じている骨サンプルほど、骨梁の太さの平均値が小さく骨梁構造の脆弱化が生じていた。有限要素解析では、微細骨折の発生部位に一定の傾向はなく、また、実際に微細骨折を生じていた部位との相関もなく、微細骨折は1軸の静圧縮ではなく、高い歪み速度や、曲げ、捻りなどの複雑な因子が関与していることが推察された。骨粗鬆症患者から摘出された骨サンプルのシンクロトロンCT画像の構造解析を行った。専用ソフトウェアを用いて画像を三次元化し、骨梁に生じた微細仮骨を検出し、微細骨折の発生数を調査した。微細骨折を生じた海綿骨の骨微細構造を解析し、微細骨折が発生した海綿骨の構造的特徴を調査した。多くの骨サンプルで微細仮骨が発生しており、骨梁幅が細い海綿骨に微細仮骨が多い傾向があった。微細骨折の発生数の調査と、微細骨折が発生した海綿骨の構造解析が終了している。骨粗鬆症患者から摘出された骨サンプルのシンクロトロンCT画像から、骨梁に生じた微細骨折の検出と、骨梁の微細構造解析を行った後、力学シミュレーション(有限要素解析)を行った。骨サンプルは骨粗鬆症により大腿骨頚部骨折を生じた高齢女性から手術の際に摘出された大腿骨頭を用いた。大腿骨頭の荷重部直下の5立方ミリメートルの領域で以降の解析を行った。微細骨折には修復機転が生じるため微細仮骨が形成されるが、多くの症例で複数の微細仮骨が形成されており、大腿骨頚部骨折を発生する以前から、骨梁レベルの骨折が生じていたことが推察された。骨梁の微細構造は、骨梁の太さの平均値や、骨梁の単位距離を通過する数量、骨梁の形態的特徴(板状の骨梁など)といった、複数の骨微細構造パラメーターの解析を行った。骨梁骨折を多く生じている骨サンプルほど、骨梁の太さの平均値が小さいなどの微細構造の脆弱化が生じていた。骨梁に強度と力学負荷の条件を与え、骨梁に発生している応力分布のシミュレーションを行った。さらに、骨梁の微細骨折の条件を定義し、骨梁骨折の発生をシミュレーションした。強度は骨密度値に基づいたヤング率を与え、力学負荷は大腿骨頭内の荷重方向に沿って静圧縮力を加えたモデルを作成した。実際に骨梁に生じている微細骨折との相関は必ずしも高くなく、実際の骨折は1軸の静圧縮ではなく、高い歪み速度や、曲げ、捻りなどの複雑な因子が関与していることが考察された。力学シミュレーション(有限要素解析:micro FEA)によって、微細骨折をシミュレーション環境で発生させ、そのメカニズムを解析する。構造の中で、どの部位が最もウィークポイントとなって、骨折が発生しているかを検証する。整形外科学物品費使用の残額が生じた物品費に使用予定である
九州方言の史的研究

1(1)国立国語研究所所蔵の九州方言関係の資料(各県地方調査員の報告物その他)や、九州各県の地方教育委員会所蔵の資料等を探索し、從来における九州方言研究の実態を究明した。(2)九州諸方言の中、肥前・肥後・薩摩・大隅・日向・豊後各地方の主要方言18地点(各地3地点ずつ)の方言を臨地調査した。アクセント・音韻・文法諸現象が中心。(3)国会図書館所蔵の本草書など江戸時代の九州方言関係文献を調査研究した。(4)上記(1)(2)(3)の調査結果をカ-ドに整理した。(5)上記の結果から九州諸方言相互の系譜関係や新古関係を考察した。2筑前・筑後地方の方言調査は実施しなかったが、これは或程度昨年度以前の予備調査の結果を利用する亊ができた。上記1の(2)及び(5)の結果を利用した九州諸方言分布図の作製は今後の課題となった。3その研究成果については、『九州方言の歴史的研究』(1989年2月桜楓社刊)で詳述したが、重要な発見としては次の如きが挙げられる。(1)国会図書館所蔵『庶物類纂』(江戸時代文献)が動植物名等を中心とした貴重な九州方言史料である亊がわかった。(2)從来のいわゆる「豊日方言」はアクセントその他の面からして、少くとも、日向方言と豊前豊後方言との分かつべき亊。豊後の中、日田方言は筑前式方言に入れるべき亊等がわかった。(3)九州諸方言の中、南部の薩隅方言は意外に古い言語形式の残存が少く、むしろ豊前豊後地方に古形の残存が多い亊を明らかにした。
脳内微量透析法による麻酔薬の作用機序に関する研究

全身麻酔薬によって、中枢神経系の科学的環境がどのように影響されるかを理解することは、全身麻酔薬の作用機序を知るうえで重要である。麻酔深度の変化という動的過程を知るために、脳内神経伝達物質を脳内微量透析法を用いて計測をした。初年度には急性動物モデルにおいてノルエピネフリン遊離に対するケタミンの効果を検討した。また、無麻酔・無拘束の状態から麻酔を施行したときの変化を知るために、慢性動物モデルを作成し、興奮性と抑制性アミノ酸遊離動態に及ぼす麻酔薬の影響を同時に測定し検討することを試みた。静脈麻酔薬のケタミンは、脳内のノルエピネフリン基礎遊離量に影響を与えなかったが、高カリウム性脱分極時のノルエピネフリン遊離増加を抑制した。この効果はケタミン20mg/kg以上の量で認められた。また、NMDAチャンネル遮断薬によりノルエピネフリンの遊離増加が抑制されなかった事より、ケタミンの脱分極性ノルエピネフリン遊離作用にNMDAチャンネル遮断作用は関与していない事が示唆された。また、脳内のアミノ酸遊離動態に対するケタミンの影響は、興奮性アミノ酸のグルタミン酸とアスパラギン酸の基礎遊離量には影響を与えなかった。高カリウム刺激による脱分極刺激ではグルタミン酸遊離量減少が認められた。抑制性アミノ酸のGABAは微量のため高感度電気化学検出法では測定できず途中で蛍光分光検出法に変更したが、それでも痕跡のみしか測定できず、今後、酵素回転法での測定を試みる予定である。また、同時に採取した抑制性及び興奮性両者のアミノ酸の遊離量が測定可能となった後両者の比較を行い、麻酔薬の影響を検討する。また、バルビツレートや麻薬、イソフルレン等の吸入麻酔薬についても検討する。本研究は、ラット海馬を用い脳内神経伝達物質の一つであるアミノ酸の遊離動態におよぼす、麻酔薬の影響を検討する事を目的としている。今までの私共の麻酔薬の作用機序究明の研究においては、脳内微量透析法を用い脳内神経伝達物質の一つであるノルエピネフリン放出に関する研究を急性動物モデルで実験してきた。また、電気生理学的に誘発電位による研究も行ってきた。今年度は、急性実験モデルにおけるアミノ酸(GABA、グルタミン酸およびアスパラギン酸)の基礎遊離量の測定を行った。急性実験モデルにおける検体採取はノルエピネフリン測定の経験を生かして検体採取を行った。検体中のアミノ酸分析は高速液体クロマトグラフ(HPLC)にて行い、その測定には高感度電気化学検出法(Double ECD)を用いて測定する予定であったが、カテコラミンとは異なり安定した値が得られず、アミノ酸の中でもGABAの測定に際しては微細トラブルや夾雑物質の混入が多く、また、フロントピークが大きくリテンションタイムの速いピークが巻き込まれてしまうため、測定方法を蛍光分光検出法に変更することとした。蛍光分光検出法により微量ながらGABAの測定は可能となった。しかしながら、グリシンのピークにアルギニンのピークが重なってしまっため、移動相の変更等の工夫によりピークの分離が可能となり測定を開始した。急性実験モデルにて採取した検体では、カリウム刺激によりGABA・グルタミン酸の放出増加がみられた。現在慢性実験モデル作成中であり、今後は無麻酔・無拘束下の動物を用いて、脳内微量透析法に電気生理学的指標も同時測定し、麻酔の導入・覚醒時(麻酔深度の異なった状態)の変化も含め麻酔薬の中枢神経活動に与える影響を経時に見る。本研究は、ラット海馬を用い脳内神経伝達物質の一つであるアミノ酸の遊離動態におよぼす、全身麻酔薬の影響を検討する事を目的としている。今までの私共の麻酔薬の作用

機序究明の研究においては、電気生理学的に麻酔薬の海馬シナプス伝達に及ぼす研究をしてきた。また、脳内微量透析法を用い脳内神経伝達物質の一つであるノルエピネフリン放出に関する研究も急性動物モデルで行ってきた。今年度は、アミノ酸(GABA、グルタミン酸およびアスパラギン酸)の基礎遊離量の測定及び高カリウム性脱分極刺激時の遊離量の変化の測定を計画した。検体中のアミノ酸分析は高速液体クロマトグラフ(HPLC)にて行い、その測定には高感度電気化学検出法(Double ECD)を用いて測定する予定であったが、測定に対し安定した値が得られず、測定法を蛍光分光検出法に変更することとした。しかし、蛍光分光検出法によってもGABAの測定は不可能であった。急性実験モデルにて採取した検体では、高カリウム刺激によりグルタミン酸とアスパラギン酸の遊離減少がみられた。慢性実験モデルでも同様の結果を示した。全身麻酔薬のケタミンは少量(10mg/kg)では、アミノ酸の遊離量に変化を与えず、大量投与(100mg/kg)では遊離量を減少した。今後、ケタミンの投与量による違い(麻酔深度の変化)を比較すると共に、バルビツレートやエトレンなどの他の麻酔薬による変化も同時に観察する。これらの結果から脳内神経伝達物質の動態に与える麻酔薬の影響を知ることにより、麻酔薬の作用機序究明の一助となると考える。
炭疽菌の病原性に関する研究

炭疽菌によって起こる炭疽は世界中の家畜や野生動物,更には人で最も急性過程をとる細菌感染症である。同時に生物兵器の候補として常に恐れられている。そのため,炭疽の迅速な診断・検出法および予防・治療法の確立は重要である。特に,インドなど発展途上国では炭疽の発生は頻繁に起こり,防疫上重要な感染症である。しかし,防疫上満足のゆく技術は充分とは言えず,その原因は炭疽の病原性について解析が進んでいないからであるとともに,炭疽の環境中での生態もよく分かっていないからである。炭疽菌は体内に進入後,速やかにマクロファージに取り込まれ発芽し,最終的には血流中で爆発的な増殖を繰り返し,宿主を死に至らしめる。そこで,この発芽の過程および爆発的な増殖過程の詳細を理解すれば,炭疽の新たな予防・治療法が確立できると考えられる。そこで本研究では炭疽菌が血流中でどうして宿主免疫機構を無視して爆発的に増殖するのか,そしてその遺伝子制御機構に焦点を当て,炭疽の発症機構について研究を進める。しかし、外国人研究員は来日後実質3ヶ月しか経過していないため、炭疽菌の取り扱い方、実験動物の飼育、遺伝子操作など基礎的な習熟に時間がかかり、大きな研究の進展は無い。しかし、以下の点で成果をあげはじめている。1.炭疽菌の芽胞の作成技術:純度の高い芽胞体が精製でき、感染実験の足がかりとなっている。2.炭疽菌に対する蛍光染色法を確立した:同じく感染実験の基礎技術として有用である。3.炭疽菌のワクチン開発:炭疽菌の防御抗原を用いた乳酸菌による安全なワクチン開発の一環として、マウスへの免疫効果を実験系を構築した。現在ワクチン効果の試験を始めている。
脊椎動物における体軸形成機構の進化発生学的研究

両生類の頭部形成において、siamoisホメオボックス転写因子は母性Wntシグナルの標的として必要とされる。これは両生類系統の特殊性と考えられていたが、本研究において、原始的条鰭類ポリプテルスのsiamois相同遺伝子dioskouroiを発見し、機能解析を行った。結果として、dioskouroiはポリプテルスの頭部形成のみならず、体軸形成と内胚葉分化に必要とされる事が明らかとなった。この結果は、siamois関連因子の機能獲得が硬骨魚類と四肢動物の共通祖先までさかのぼれる事を示す。各動物種におけるsiamois関連因子は、転写因子としての機能は同じでも胚発生における役割は多様化している。本研究の目的は、ポリプテルスの初期発生機構を解析し、脊椎動物の多様な初期発生機構が進化の過程でどのように獲得されてきたかを理解する事である。昨年度までの研究において、両生類におけるmix-typehomeobox転写因子siamoisの類似遺伝子がポリプテルスで見つかり、dioskouroi (dios)と命名した。diosを機能阻害されたポリプテルス胚では原腸形成が阻害され、体軸の形成が全く不全となる。dios機能阻害胚のマーカー解析によって、オーガナイザー遺伝子以外にnodal-related遺伝子と内胚葉マーカーでも著しい発現低下が観察された。この結果は、アフリカツメガエルsiamoisとは異なり、diosはポリプテルスの胚発生において頭部形成・体軸形成だけでなく、内胚葉分化においても必要とされる事を示唆する。さらに、ポリプテルスのanimal cap assayにおいて、Wntシグナルの亢進が中内胚葉分化を引き起こす事、この際、diosの活性を必要とする事を示唆する結果を得た。すなわち、Wntシグナルはアフリカツメガエル胚ではsiamoisを介した体軸形成において役割を果たすが、ポリプテルス胚では体軸形成・胚葉形成の両面でdiosを介して重要な役割を果たす。従って、脊椎動物においては、Wntシグナルのターゲットとなるsiamois関連遺伝子の有無はもちろん、siamois関連遺伝子の役割の違いが、初期発生分子機構に多様性を生じさせた重要なポイントであると考えられる。本研究の目的は、脊椎動物において初期発生システムの進化・多様化がどのようにしておこったのかを探る事である。そのため、原始的条鰭類ポリプテルスの初期胚発生を分子生物学的手法を用いて解析し、他のモデル脊椎動物との比較解析を行っている。研究初年度である平成24年度は、ポリプテルスESTデータベースにある頭部オーガナイザー遺伝子(gsc, hex, otx, dkk, dan, cerなど)の発現を検証し、これまで行ってきた胚葉マーカーや背側オーガナイザー遺伝子の発現領域と比較する事で、ポリプテルス胚での頭部オーガナイザー領域の時空間的配置を解析した。結果として、頭部オーガナイザー遺伝子の発現は初期原腸胚における原口周辺の深部に見られる事が明らかとなった。また、アフリカツメガエル胚に完全な頭部を誘導できるポリプテルスのsiamois関連遺伝子(上記データベースで発見された両生類以外で初めて見つかったsiamois orthologで、dioskouroiと命名、以下dios)の発現も頭部オーガナイザーで見られる事を明らかにした。一方で、diosの機能解析を進めている。アフリカツメガエル胚での二次軸誘導は、siamois同様に転写活性化因子としての働きである事が判明した。また、siamois/twin機能阻害胚の表現型はポリプテルスの遺伝子であるdiosの異種過剰発現で救済される事から、両遺伝子:アフリカツメガエルのsiamoisとポリプテルスのdiosは同じタンパク機能を有すると考えられる。具体的には、共に転写因子である事から、標的となる遺伝子を同様に制御しうる機能を持っているという意味である。しかしながら、両者の機能阻害によるそれぞれの動物での表現型(アフリカツメガエルでは頭部欠損、ポリプテルスでは体軸形成なし)は異なるため、ポリプテルスでのdios標的遺伝子にフォーカスする。脊椎動物の初期発生機構は、胚発生過程の観察が容易な両生類や真骨魚における研究が活発に行われてきた。アフリカツメガエルを用いた研究において、母性に供給されるT-box転写因子VegTが胚葉パターンの形成だけでなく、Wntシグナルとの協調的な働きにより体軸形成においても重要な役割を果たす事が報告されている。一方、VegT相同遺伝子の母性発現とその機能は他の脊椎動物では見られず、両生類系統で独自に獲得された分子機構であると考えられる。さらに、アフリカツメガエルの体軸形成におけるWntシグナルのメディエーター:homeobox転写因子siamoisは、他の分類群で相同遺伝子が見つかっていなかった。

脊椎動物における初期発生機構のこのような多様性を系統的に理解するため、従来のモデル生物との比較対象として鍵となる原始的条鰭類ポリプテルスの初期発生を解析した。ポリプテルスはその系統的な位置だけでなく、両生類様の全割で発生する事から、四肢動物と硬骨魚の共通祖先を推測する上で非常に重要である。ポリプテルスのEST解析と、Xenopus胚へ異種過剰発現によって、完全二次軸形成能をもつポリプテルスのsiamois関連遺伝子(dioskouroi, dios)を単離した。diosを機能阻害されたポリプテルス胚は原口ができず、原腸形成が阻害される。マーカー遺伝子の発現解析から、この表現型は内胚葉分化が阻害された事によるものと推測される。これらの結果は、脊椎動物初期発生の多様化について以下の示唆を与える:1少なくとも四肢動物と硬骨魚の共通祖先において、siamois関連遺伝子はWntシグナルのターゲットとして体軸形成で重要な働きをしていた。2ゲノム情報の解析が進んでいる羊膜類や真骨魚類ではsiamois関連遺伝子を失っている。3siamois関連遺伝子の役割は、両生類系統で母性VegTの発現や機能の獲得と共に頭部形成に特化した。または、ポリプテルスにおいて内胚葉分化の役割が加わった。分子発生生物学・比較発生生物学当初の予定では、ポリプテルス胚における内在のWntシグナルとdios、またそのターゲットとなる遺伝子群がどのような発現制御ネットワークを構築しているのかについて解析を進める予定であった。これらの解析では、ポリプテルス受精卵へ各種mRNAや特異的機能阻害のためのMorpholino Oligonucleotidesを顕微注入する必要がある。しかしながら現在、ポリプテルスの受精卵を得る事自体が比較的困難な状況であり、研究の進行に直結している。また、試薬や備品が計画どおりに納品されていない事も進捗に影響している。ESTデータベース内の頭部オーガナイザー遺伝子について、発現検証をRT-PCRとin situ hybridizationで行った。いくつかの遺伝子についてはin situ hybridizationでの検出感度を上げる努力が必要であるが、発生進行に伴う時空間的な領域変化の概要は把握できつつある。また、中心的な役割を果たすと考えられるポリプテルスのsiamois関連遺伝子diosの発現も、組織切片で発現の検出が可能となった。diosの転写活性を調べるため、その転写抑制型と恒常的活性化型コンストラクトを構築、アフリカツメガエルsiamoisとの比較検討によって転写アクチベーターである事も確認できた。このように、おおむね研究実施計画にそって結果が出ており、今後の展開に期待できる。引き続き、ポリプテルスのsiamois関連遺伝子diosの機能解析を進める。ポリプテルス胚の入手に問題は残るが、Xenopus胚を使った実験や、これまでに収集した凍結サンプルを有効に活用し、in situ hybridizationを中心に解析を行う事で回避したい。その際、結果を論文としてまとめるための実験を計画的に遂行したい。
スタチンによる糖尿病性潰瘍の新規治療法に関する研究

スタチンは、高コレステロール血症治療薬であるが、血管新生促進作用があることが知られてきた。そこで、スタチンによる糖尿病性潰瘍などの難治性潰瘍に対する新規治療法の開発に向けて実験を行った。糖尿病マウスの皮膚潰瘍に対し、スタチンの全身投与および外用投与を行った。スタチンを投与した群の方が、創傷治癒が促進し、創部により多くの血管およびリンパ管が新生した。スタチンの外用剤が、糖尿病性潰瘍の治療薬になる可能性が示された。難治性皮膚潰瘍のモデルである2型糖尿病マウス(C57BLKS/J-m^<+/+> Lepr^<db>)を用いて、背部に皮膚全層欠損創を作成し、スタチン(rosvastatin)の全身投与および局所投与を行い、その有効性を主にin vivoで検討した。創作成から、7日目、14日目の創の観察では、腹腔内注射による全身投与群および白色ワセリンに溶解させた局所投与群において、コントロール群に比べて有意に高い創面積の縮小率が認められた。また、創の組織学的な検討により、スタチン投与により潰瘍部肉芽組織において、コラーゲンの増生などの成熟促進の効果が確認された。CD31の免疫染色により、血管新生の促進効果も確認された。本研究では、スタチンの血管新生促進作用に着目し、糖尿病性潰瘍などの難治性潰瘍に対する新規治療法の開発に向けて実験を行っているが、スタチンの糖尿病性潰瘍に対する治療効果が動物実験で実証された。スタチンの投与により肉芽組織の成熟促進効果が見られたが、これは一部はスタチンの線維芽細胞に対する直接効果であることが示唆され、スタチンにこのような効果があることは新知見であると考えられる。特記すべきこととして、スタチンの外用薬としての局所投与による効果が、全身投与と同様あるいはそれ以上の効果を示した。このことは、糖尿病性潰瘍のスタチンによる臨床的な治療を考えた場合に、副作用が少なく、投与法も簡便な外用療法という治療法として確立いていく上で非常に有用なデータである。難治性皮膚潰瘍のモデルである2型糖尿病マウス(C57BLKS/J-m^<+/+>Lepr^<db>)を用いて、背部に皮膚全層欠損創を作成し、スタチン(rosvastatin)の全身投与および局所投与を行い、その有効性を主にin vivoで検討した。さらに肉芽組織におけるリンパ管新生についても、リンパ管内皮細胞のマーカーであるLYVE-1で染色し、リンパ管内皮をラベルした。スタチン治療群では、LYVE-1陽性細胞は対照群と比較して有意な増加を認めた。
睡眠相後退症候群の睡眠制御破綻におけるアデノシン受容体シグナル異常の解析

睡眠相後退症候群(DSPS)は、明け方まで眠れず、午後まで起きられない睡眠障害であり、社会生活に深刻な支障をきたす。徹夜の後、健常者は直ちに回復睡眠に入るのに対し、患者は明け方まで眠ることができないという特徴もある。回復睡眠には、脳内に蓄積するアデノシンが大きく関わっている。このことから申請者は、DSPS患者における睡眠制御の破綻にアデノシンシグナリングが関わっている可能性を考え、病態モデルマウスを用いてそれについて検証した。その結果、前脳基底核において断眠によるアデノシン受容体発現制御における障害を示唆する結果を得た。人間は朝に目が覚めて活動し、夜に睡眠をとって休息するという24時間周期のサイクルを、日々繰り返しながら生活している。体内時計の異常は概日リズム睡眠障害を引き起こすが、最も発症率が高い睡眠相後退症候群(DSPS)は、不眠患者の6-16%を占める。その症状は、本人の意志に関わらず、明け方まで眠れず、午後まで起きられないというものであり、社会生活に深刻な支障をきたす。しかし現在までのところ、DSPSに関する研究は臨床研究に限られており、発症機序の詳細は不明である。一方、実験動物を用いた研究において、断眠により前脳基底部からのアデノシン放出とアデノシンA1受容体の活性化が引き起こされることが報告されており、睡眠のホメオスターシス制御には、アデノシン受容体を介した神経情報伝達が関与していると考えられている。このことから申請者は、DSPSにおける睡眠ホメオスターシス制御の破綻に脳内の細胞外アデノシン及びその受容体のシグナル伝達異常が関与している可能性を考え、それについて検証した。申請者の前所属研究室により、時計遺伝子clockの変異マウスを離乳まで恒明条件で飼育することで、DSPS様の行動リズムを示すことが報告されている。本研究では、clock変異マウスを入手し、交配を行い、その再現性がとれることを確認した。次いで、前脳基底部におけるアデノシンA1受容体量をさまざまなパターンで注意深く検討した。野生型(明暗飼育及び恒明飼育)及びclock変異マウス(明暗飼育及び恒明飼育の中でDSPS症状を示さなかった個体)では三時間の睡眠剥奪によりアデノシンA1受容体量の上昇が見られたが、DSPS症状を示すclock変異マウスではそれが見られないという興味深い結果を得た。体内時計の異常は概日リズム睡眠障害を引き起こすが、そのうちの睡眠相後退症候群(Delayed sleep phase syndrome; DSPS)は、不眠患者の6-16%を占める。その症状は、明け方まで眠れず、午後まで起きられないというものであり、社会生活に深刻な支障をきたす。学齢期に発症する例も多いことから、近年社会現象となっている不登校や引きこもりの一因となることが懸念されている。しかし発症機序は不明であり、治療は対症療法に限られている。また、24時間の断眠をした場合、健常者は直ちに回復睡眠に入るのに対し、DSPS患者は明け方まで入眠できない。時計遺伝子clockの変異マウスは体内時計破綻が見られるが、このマウスを離乳まで恒明条件で飼育することで、DSPS様の行動リズムを示すことが報告されている。本研究では、この病態モデルマウスを作製し、前脳基底部におけるアデノシンA1受容体発現量を検討した。野生型では三時間の睡眠剥奪によりアデノシンA1受容体量の上昇が見られたが、DSPS症状を示すclock変異マウスではそれが見られないという興味深い結果を得た。またこの研究の途上で、野生型マウスでも離乳まで恒明条件で飼育することで体内時計に破綻が見られることを発見し、乳児期における光条件の重要性についての新たな知見も得ることができた。時間薬理学研究実績の概要に示したように、DSPSの睡眠ホメオスターシス制御の破綻に脳内の細胞外アデノシン及びその受容体のシグナル伝達異常が関与している可能性を検証するのが本研究の目的であった。25年度はコントロールに比較してDSPS症状を示すマウスのみで睡眠剥奪によるアデノシンA1受容体量の上昇が見られないという結果が得られ、DSPSへのアデノシン受容体の関与を示すことができた。よって、おおむね順調に進展していると判断した。DSPS発症にアデノシン受容体が関与していることを示すことができたので、今後は細胞外アデノシン濃度の検討を行う。

また、ヒトでは24時間睡眠剥奪を行っているので、マウスでもその条件に近づけることで、更なる詳細な解析を行う。マウスの脳内前脳基底核付近をくり抜いて定量PCRを行うことでアデノシン受容体のDSPS発症への関与を示すことができたが、睡眠剥奪によるアデノシン受容体の増加は脳の部位によって大きく異なるという報告が出ている。今後は脳スライスを用いたin situハイブリダイゼーションにより、より詳細な脳部位の特定を目指すこととした。脳スライス作製とin situハイブリダイゼーションに用いる試薬等の物品費として次年度使用額を活用する計画である。
先史モンゴロイド集団の拡散と適応戦略

計画研究A05「拡散モデルの構築」の協力を得て、各研究項目が蓄積する専門的・個別的デ-タベ-スを収集・編集・加工し、各種画像デ-タベ-スを構築した。1.鳥居龍蔵写真資料画像デ-タベ-ス鳥居龍蔵博士が約1世紀前に撮影した日本周辺モンゴロイド諸民族の写真資料約2500枚を、写真イメ-ジ、博士自身の記録、写真属性デ-タをあわせて画像デ-タベ-ス化した。2.モンゴロイド系諸民族の古写真画像デ-タベ-ス19世紀後半ー20世紀初頭におけるモンゴロイド諸民族の映像資料を、欧米の研究施設や個人コレクションにて発掘、複写し、付帯資料とあわせて系統的に整理・分析して画像デ-タベ-ス化する作業をすすめている。3.人類拡散・移住画像デ-タベ-スアフリカ大地溝帯で発見されている約400万年前の最古の人類遺跡から、南アメリカ最南端で発見された約1万年前の遺跡までの1034遺跡について、14項目の属性デ-タを収集し、それを加工、編集したデ-タベ-ス(遺跡ファイル)を構築した。そのファイルと、各時代の自然環境(古地理)、遺跡景観、遺跡に伴った各種遺物等の映像を重ね併せ、数百万年前アフリカで発生した人類がその後どのように居住域を広げていったかを、時間の経過をたどりながら再現する画像デ-タベ-スを構築した。
警察組織の非軍事組織化による職員の意識変化：比国を事例として

平成30年度の予定では、調査票を作成し、フィリピンコーストガード職員に配布することとしていた。しかし、初年度の実績にも記述したとおり、フィリピンコーストガードの主要な業務内容の変化により、分離後にも職業的アイデンティティの変化が生じた可能性が否定できない。本年度は、現地調査において、そうした変化の影響について聞き取り調査するとともに、引き続き元長官等へのインタビューを実施した。その結果として、海難救助や海洋環境の保全といったフィリピンコーストガードの当初の主要業務よりも、テロ・海賊対策、海洋権益確保といった、フィリピン海軍のミッションでもある業務が政治的に注目されており、軍と合同での訓練の必要性について言及する幹部職員も見られた。軍から独立した当初のフィリピンコーストガード職員の専門性は再びフィリピン海軍時代のそれに接近しつつある可能性が改めて示唆されたのである。専門性が職業人のアイデンティティを形成するとすれば、こうした業務内容の変化は無視できない。現在は調査票作成の最終段階にあり、フィリピンコーストガード関係者の協力を得つつ、文言調整を実施するとともに、調査票の理論的背景について論文化する予定であり、6月には調査票を回収、分析する予定である。平成30年度には実施が完了していなければならなかった調査票の配布が未了であるため、これを早期に実施する必要がある。他方、本研究において一つの目標に掲げていた国際的な発信を平成30年度中に実施できたことは、ポジティブに捉えている。調査票の配布、回収、集計までを6月中に実施し、簡易的な分析を実施した上で8月頃、質的な追跡調査のためにフィリピンコーストガード本庁を訪問する。初年度は、調査票の作成に必要な基礎的な研究を実施する計画であった。形式的な実績については、主に以下3点である。第一に、マニラにおける現地調査を実施した。キーパーソンとなる3名の元長官または長官代行及び教育訓練の責任者にインタビュー調査を実施した。結果として、軍からPCGが分離するに当たって、どのような手続きがなされたのか詳細に把握することができた。また、関係諸規則、内部文書(公にできるもの)等を収集した。第二に、日本関係者への聞き取り調査を実施した。特に、PCGが軍から分離する前の時代にフィリピンに駐在していた元海上保安官の協力が得られ、当時の状況を第三者的な目で観察していた実務家から多くの知見を得た。第三に、平成30年度に実施予定のサーベイ調査について、どのような手続きを取ればPCGの組織的な協力をえられるかサウンディングし、可能性のあるルートを確認するとともに、現長官を表敬訪問した際に、計画の趣旨を説明する機会を得た。これらの結果明らかとなった事実のうち、計画遂行に深く影響するものは以下の2点である。第一に、PCGが軍に属していた時代にも、PCG職員の資格制度のようなものが存在しており、資格保有者には制服につけるバッジが与えられていたことである。このことは、PCGが軍から分離する前からPCG職員の専門性は組織的に認識されており、それが職員のアイデンティティの源泉となっていた可能性があることを示唆している。第二に、PCG幹部職員の一部には、PCGの主要業務が急激に変化してきたという認識があることである。この変化の認識が職員にも共有されているとすれば、PCG職員のアイデンティティと呼べるものが形成される前に、その源泉が揺らいだ可能性もある。調査票の作成に当たっては、これらの仮説に踏み込む必要がある。このことが明らかとなったことが、平成29年度の実質的な実績である。上述の調査票作成に当たって生じた問題を解消する必要に迫られており、遅れが生じている部分もある。他方で、平成30年度の計画であった基礎的事項の報告については、平成29年度に実施できた部分もある(原稿は書籍の記事として出版社に提出済み。研究発表の入力は校正が完了する平成30年度とする)。よって、概ね順調といえる。調査票の完成とサーベイの実施を急ぎ、平成31年度は当初から成果の公表に向けた準備に専念できる体制を整える。

調査票の配布、回収、集計までを6月中に実施し、簡易的な分析を実施した上で8月頃、質的な追跡調査のためにフィリピンコーストガード本庁を訪問する。予定していたパソコン等の物品の購入を次年度に持ち越したこと及び、海外出張を平成30年度に2度計画することとしたため旅費の使用を抑制したため。平成30年度の計画として、研究協力者とのフィリピン出張を予定していたが、他の用務に併せての出張となったため、助成金による支出が不要となった。また、計画されていた統計ソフトについても、大学の経費から支出されることとなった。この次年度使用額については、平成31年度のフィリピン調査の旅費に充てるほか、執筆にかかる関連機器、ソフトウエア等の購入、調査票の集計事務等に支出する予定である。
保型形式の数論的研究

なることはよく知られている。この関係を誘導表現に適用すれば、以下に述べる微妙な問題を法として、Gの既約表現τに対応するG上の保型形式と(τop_1)【cross product】ω_Jに対応するG_J上の保型形式とが同型に対応する。Gの既約表現τを固定する。Gのコンパクト部分群Kを取りK=p^<-1>(K)とおく。Kの既約表現δに対して、((τop_1)【cross product】ω_J)|_Kにおけるδの重複度は、一般には有限とは限らない。そこで次のように定義する;なることはよく知られている。そこで次のように定義する;
煮干し脂質のだし汁風味に及ぼす影響

水産加工食品は、アジア諸国で古くから用いられている水産物を加工することにより保存性を高め、独特の風味や種々の栄養的価値を付加したものである。しかし、これらは、生臭みの故に好まれないことがある。生臭みの要因の一つとして考えられるのが、水産物の加工工程中におこる脂質酸化を含むいくつかの成分変化である。そこで本研究では、水産加工食品の生臭みの解明を目的に、成分分析や嗜好テストを行った。まず、煮干しだしについてその風味に及ぼす脂質酸化の影響を調べた。数種類の市販煮干しの脂質性状を調べ、酸化がかなり進んでいることを認めた。さらに、HPLCを用いて脂肪酸組成を調べ、脂質の酸化がより進んでいると考えられる煮干しほど、n-3系多価不飽和脂肪酸が減少していることが明らかになった。また、煮干しだし汁の風味と脂質の酸化程度には相関がみられ、酸化が進んでいると考えられる煮干しからとっただし汁ほど生臭みが強く、味も好まれないという結果を得た。次に、さばなれずしの成分を分析し、嗜好テストを行った。さばなれずしの成分で注目されたのは灰分含量であり、骨ごと食べることのできる有用な食品であるといえた。塩分濃度は塩さばと同程度であった。真空パンクをして冷凍しておくと、数ヶ月は脂質を含むいずれの成分にも変化はなかった。嗜好テストでは、酸味と塩味が特に好まれなかったが、なれずしを食べた経験のある人ほど嗜好性が高く、生臭みは好まないが、独特の香りを好む傾向がみられた。さらに、魚や水産加工食品の消費減少によるn-3系脂肪酸の摂取比率低下を解消するための策として、魚介類やその加工品以外のn-3系脂肪酸供給源としてのあまに油利用を検討した。あまに油の保存に対してごま油の添加が有効であり、20°C以下では数ヶ月の保存が可能であった。あまに油を用いたマヨネーズでも、ごま油の添加による保存性と嗜好性への有効性が明らかになった。煮干しは、古くから用いられている風味調味料である。近年、インスタント風味調味料が開発、商品化され、その利用が増加し、家庭でのかつおや昆布からのだし汁調製は減少してきている。このような状況の中で、煮干しは、比較的簡便にだし汁調製ができることに加えて、カルシウム供給源になることもあって、家庭では、現在もなお、広く用いられている。しかし、一方で、煮干しはその生臭さの故に好まれないことがある。この煮干しの生臭みの要因は、煮干しに含まれる脂質の酸化生成物であると考えられている。煮干し、特にその脂質の性状は、生いわしからの加工工程中に大きな変化を受け、煮干しだし汁の風味に大きく影響していると予想された。本研究では、煮干しだし汁の風味に及ぼす煮干し脂質の酸化の影響を調べた。数種類の市販煮干しから脂質を抽出し、その性状を調べた結果、脂質含量は約4.3%と四訂食品成分表に示された値より高く、頭部には体部の1.32.2倍多い脂質が含まれていた。また、製品による程度の差はあったが、カルボニル価、チオバルビツール酸反応性物質値はいずれも高い値を示し、脂質酸化がかなり進んでいることが認められた。さらに、高速液体クロマトグラフィーにより、これら煮干しの脂肪酸組成を分析したところ、脂質の酸化が進むことによって、脂肪酸組成は変化し、魚に多く含まれているIPAやDHAなどの多価不飽和脂肪酸が減少していることが明らかになった。一方、煮干しだし汁の風味と脂質の酸化程度には相関が見られ、酸化が進んでいると考えられる煮干しからとっただし汁ほど生臭みが強く、味も好まれないという結果を得た。本研究により、煮干しのだし汁の生臭みと脂質との関係が明らかになった。今後さらに研究を進めることにより、生臭みの生成機構を解明し、より嗜好性の高い煮干しだし汁調製を検討していこうと考えている。

嗜好テストでは、酸味と塩味が特に好まれなかったが、なれずしを食べた経験のある人ほど嗜好性が高く、生臭みは好まないが、独特の香りを好む傾向がみられた。さらに、魚や水産加工食品の消費減少によるn-3系脂肪酸の摂取比率低下を解消するための策として、魚介類やその加工品以外のn-3系脂肪酸供給源としてのあまに油利用を検討した。あまに油の保存に対してごま油の添加が有効であり、20°C以下では数ヶ月の保存が可能であった。あまに油を用いたマヨネーズでも、ごま油の添加による保存性と嗜好性への有効性が明らかになった。
高融点金属粉末の常温固化成形法の開発と強度向上に関する研究

金属が再結晶せず、圧縮負荷とせん断荷重と塑性流動により強固な酸化膜を破壊して、金属粉末を固化成形できる新しい成形プロセス「常温圧縮回転せん断法(CROSM-RT)」を開発した。この成形プロセスを開発することで、高融点材料であるTi粉末等を室温で成形が可能であり、粉末冶金を利用した成形加工なのでニアネットシェイプ化できる。本成形プロセスは材料の強度向上とニアネットシェイプを同時に行う成形プロセスであると考える。高融点材料であるTi粉末を加熱せず室温の環境下で固化成形するシステムおよび装置を構築した。(1)成形プロセスにおける粉末の変形挙動解析:十分な強度を有する試料を作製するために、固化成形プロセスにおける金属粉末(Ti粉末等)の動的な変形挙動解析(FEM解析: CATIA, Deform, FLUENTを使用)を行い、製造プロセスの最適化を図った。FEM解析では、ツールの形状、金型形状、ツールの回転数などの諸条件を入力し、その製造プロセスのシミュレーションを行った。(2)常温圧縮回転せん断法を用いた装置の開発: FEM解析によって得られた製造プロセスの最適条件を十分発揮できる装置を開発した。モーター、金型、ツール、制御装置等を組み合わせて装置を開発した。(3)常温圧縮回転せん断法による成形: FEM解析によって得られた製造プロセス最適化データによって製造された常温圧縮回転せん断装置を用いて、ツールの回転速度および荷重等の加工条件を変化させ試料を作製した。(4)評価・解析:作製した試料の材料強度評価、組織評価を行った。材料強度評価では、ビッカース硬さ試験機を用いたビッカース硬さ試験、密度測定機を用いた相対密度測定を行った。組織評価には、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡、X線解析装置、デジタルマイクロスコープを用いた表面・内部組織・集合組織観察を行った。「ニアネットシェイプ化に関する研究」ニアネットシェイプ化した加工方法を開発し、寸法精度±10μmの構造部品を作製することを目的とした。(1)ニアネットシェイプ化における粉末の変形挙動の解析:ニアネットシェイプ化するために、固化成形プロセスにおける金属粉末(Ti粉末等)の動的な変形挙動解析(FEM解析:CATIA, DEFORMを使用)を行い、製造プロセスの最適化を検討した。FEM解析には、ツールの形状、金型形状、ツールの回転数などの諸条件を入力し、その製造プロセスのシミュレーションを行った。(2)ニアネットシェイプ用製造装置の開発:任意形状に成形するニアネットシェイプ化できる製造技術を開発するためにツール形状等を検討した。(3)常温圧縮回転せん断法による成形体の製造:FEM解析によって得られた製造プロセス最適化データによって製造されたインプラント製造装置を用いて、ツールの回転速度および荷重等の加工条件を変化させ試料を作製した。(4)寸法精度評価:成形したインプラントの寸法制度を評価する。寸法精度評価の測定には、デジタルマイクロスコープ(解析ソフト一式)を用いた3次元形状測定・評価を行った。(1)ニアネットシェイプ化における粉末の変形挙動の解析:ニアネットシェイプ化するために、固化成形プロセスにおける金属粉末(Ti粉末等)の動的な変形挙動解析(FEM解析:CATIA,DEFORMを使用)を行い、製造プロセスの最適化を検討した。
遺伝子改変技術を応用したロタウイルスワクチンの新たなプラットフォーム

ロタウイルス(RV)は、乳幼児の急性胃腸炎の原因ウイルスである。本研究課題では、新規RV遺伝子操作系技術を駆使することで、ワクチンシードウイルスとなりうる組換えRVの開発を目的に、RV感染における下痢症・腸重積症の発症機構および感染動態について解明を行う。本年度は以下の研究成果が得られた。1)NSP遺伝子変異RV及びレポーター遺伝子発現RVの作製RV NSP1(抗インターフェロン作用)、NSP3(翻訳制御因子)、NSP4(エンテロトキシン)についてはウイルス複製ならびに病原性に関与することが報告されている。SA11株(サルRV)由来NSP3遺伝子のC末端領域を欠損させた変異体の作製を行った。作製したNSP3変異ウイルスの培養細胞における複製能は野生型と比較して低下していた。これらの結果から、NSP3のC末端領域はウイルスの増殖に重要な役割を担っていることが示唆された。NSP1のORF領域を部分的に欠損させ、様々なレポーター遺伝子を挿入した組換えRVの作製を行った。培養細胞での長期継代後でもウイルスゲノムに挿入したレポーター遺伝子は安定的に発現されていた。2)マウスで増殖性の高い組換えRVの作製RV感染には種特異性があり、サルやヒトRVはマウスでの感染、増殖性は低い。SA11株をマウスで継代することで、増殖能が向上したマウス馴化SA11株の分離を試みた。また、マウスRVの人工合成系の確立も試みた。マウスRV(EW株)とサルRV(SA11株)とのリアソータントウイルスの作製に成功した。今後、得られたリアソータントウイルスの病原性解析を行う。本年度は、培養細胞で増殖性が異なるNSP3変異ロタウイルス(RV)の作製に成功した。外来遺伝子を安定的に発現できる組換えRVの開発に成功した。また、サルRVをバックボーンとして、マウスRV由来の分節ゲノムを持つリアソータントウイルスの作製にも成功した。これらの成果はRVの増殖機構の解明ならびにワクチンベクター開発研究に有用と考えられる。上記の成果から、研究目的を達成する上で本年度の研究計画は概ね順調に進展している。1)NSP遺伝子変異ロタウイルス(RV)及びレポーター遺伝子発現RVの作製今後の研究の推進方策として、引き続き、ウイルス複製ならびに病原性に関与するNSP1、NSP3ならびにNSP4の機能領域に変異を加えた様々な組換えRVを作製し、in vitroおよびin vivoにおける性状解析を行う。NSP遺伝子内に様々なレポーター遺伝子を挿入した組換えRVを作製し、in vivoにおけるイメージング解析を行う。2)マウスで増殖性の高いRVの作製及び解析サルRV(SA11株)をマウスで継代することで、増殖能が向上したSA11株(マウス馴化RV)の作製を試みる。既に作製したマウスRV(EW株)とサルRV(SA11株)とのリアソータントウイルスの病原性についてマウスモデルを用いて解析を行う。マウスRVの完全な人工合成系の開発を試み、より有用なRVのマウス病態モデルの開発を行う。1)NSP遺伝子変異ロタウイルス(RV)及びレポーター遺伝子発現RVの作製今後の研究の推進方策として、引き続き、ウイルス複製ならびに病原性に関与するNSP1、NSP

3ならびにNSP4の機能領域に変異を加えた様々な組換えRVを作製し、in vitroおよびin vivoにおける性状解析を行う。NSP遺伝子内に様々なレポーター遺伝子を挿入した組換えRVを作製し、in vivoにおけるイメージング解析を行う。2)マウスで増殖性の高いRVの作製及び解析サルRV(SA11株)をマウスで継代することで、増殖能が向上したSA11株(マウス馴化RV)の作製を試みる。既に作製したマウスRV(EW株)とサルRV(SA11株)とのリアソータントウイルスの病原性についてマウスモデルを用いて解析を行う。マウスRVの完全な人工合成系の開発を試み、より有用なRVのマウス病態モデルの開発を行う。