hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質間相互作用部位予測手法の開発

アミノ酸配列情報のみを用いた予測では、予測対象のタンパク質の配列を、非冗長データベースに対してPSI-BLASTにより検索をかけ、類似の配列のマルチプルアラインメントを求め、これをもとにプロファイルを作成し、さらにサポートベクタマシン(SVM)の入力として予測を行う手法を開発した。結果は、特徴量として、残基の出現頻度を利用した場合とPSSMを利用した場合でのRecallが、それぞれ、53.2%、62.3%で、PSSMを用いた場合の予測性能の方が高かった(Precisionは30.0%に揃えた)。また、SVMの段数については、1段の場合は53.2%、2段の場合は54.2%と性能差は小さかった。また、構造情報の利用については、分子表面上、隣接しているアミノ酸残基に対して、構造類似のタンパク質のプロファイルを作成し、これらの残基を構成する疎水性・非疎水性原子の溶媒露出表面積と合わせてSVMの入力とし、予測を行う手法を開発した。予測に用いたデータセットおよび相互作用部位の定義は、上と同じであり、結果は、残基の出現頻度とPSSMを比較した場合、Recanllは、それぞれ、71.4%、66.2%とPSSMを用いた場合の予測性能が高かった。また、残基単位の溶媒露出度と、残基の極性原子および非極性原子の溶媒露出表面積の比較では、66.2%、68.7%と、後者の方が高かった。また、1段と2段のSVWの比較では、66.2%、69.2%と、配列情報のみを利用した予測よりも大幅な性能向上が見られた。さらに、構造情報を用いた予測に関連して、SVR(Support Vector Regression)を用いて、各残基の周辺の相互作用残基数を予測する手法を新たに開発した。これを相互作用部位予測に適用した結果、SVMによる予測と比較して、recallは最大7%、precisionは最大4%向とした。タンパク質-タンパク質間相互作用部位予測において、アミノ酸配列情報のみを用いた予測手法と、配列情報と構造情報の両方を用いた予測手法の2つを開発した。アミノ酸配列情報のみを用いた予測手法については、以下の3つのアプローチから研究を行った。(1)予測対象のタンパク質の配列を、非冗長データベースに対してPSI-BLASTにより検索をかけ、類似の配列のマルチプルアラインメントを求め、これをもとにプロファイルを作成し、これを機械学習SVM(Support Vector Machine)の入力として予測を行う手法を開発した。(2)同様に、類似の配列のマルチプルアラインメントを求め、進化解析を行い、保存部位をもとに予測する手法を開発した。(3)Gene Ontology情報や配列データベースのアノテーション情報、モチーフ、ドメイン構成など、既知の相互作用情報を積極的に利用した予測手法の開発を開始した。具体的には、予測対象のタンパク質に対し複数のデータベースを検索して、これらの情報を収集し予測に利用する。これらの手法を適用した結果を統合して最終的な予測結果とするためのシステム作りに着手した。配列情報と構造情報の両方を用いた予測については、タンパク質の表面における相互作用部位の残基の出現傾向、溶媒露出表面積などをSVMの入力として学習・予測する手法を開発した。現在のところ、従来の手法に比べ、precisionが高い領域で、予測精度を大幅に改善することができている。今後、(3)の手法を採り入れることにより、さらなる精度の改善が期待される。
遺伝子改変ニューロンの光活性化ラベル法を用いた霊長類認知記憶形成の分子機構の解明

本研究の目的は、視覚性連合記憶の学習過程で、サル下部側頭葉の神経細胞群がその反応選択性を獲得する際の分子メカニズムを明らかにすることにある。この目標の達成に向け、本年度は、記憶関連分子をノックダウンしかつノックダウン細胞をChR2ラベルするためのレンチウイルスベクターの開発、およびその有効性をラットにおいて証明するための実験を行った。具体的には、ラットの一次体性感覚野に存在するバレル皮質において、単一機能カラム限定的に上記ベクターを感染させ、ひげの感覚遮断を施した際に誘導される神経細胞の可塑的変化に対する、記憶関連分子の一つであるcofilinlのノックダウンの効果を調べた。感覚遮断実験においては、ウイルス感染による遺伝子発現を2週間待った後、ウイルスを接種した脳半球とは対側の顔面において、一本のウィスカー(D1ウィスカー)のみを残してその他のウィスカーを全て切るという作業を行なった。遮断を3週間以上継続した後、1週間ウィスカーを再生させ、D2カラムの2/3層において、ChR2ラベルを指標としたノックダウン細胞からの電気生理記録を行なった。野生型のラットのD2神経細胞では、感覚遮断によって、唯一残されていたD1ウィスカーに対する反応が上昇し、遮断されていたD2ウィスカーに対する反応が減少した。一方、cofilinlがノックダウンされた神経細胞で同様のことを調べると、D1ウィスカーに対する反応上昇が認められない一方で、D2ウィスカーに対する反応の減少は保存されることが分かった。cofilinlのノックダウンそのものはウィスカー刺激に対する神経細胞反応性に有意な変化をもたらさないことから、cofilin1のノックダウンは感覚遮断に伴う可塑的変化に対して影響を与えたと考えられる。以上の結果は、感覚遮断に伴うバレル皮質2/3層の神経活動の可塑的変化には、アクチンフィラメントの再構成が必要であることを示唆する。この成果は既に学術雑誌へ投稿しており、現在審査の過程にある。また、この成果の一部は第36回日本神経科学大会(2013年6月20日、京都)で発表された。また、サルでの実験に向けて、マカクサル1頭に対して視覚性連合記憶課題の学習を行わせた。今後、ラットでその有効性を証明したレンチウイルスベクターを、このサルの下部側頭葉へ投与し、下部側頭葉の神経細胞群の反応選択性獲得に対する上記記憶関連分子のノックダウンの効果の評価を行っていく予定である。(抄録なし)本研究の目的は、視覚性連合記憶の学習過程で、サル下部側頭葉の神経細胞群がその反応選択性を獲得する際の分子メカニズムを明らかにすることにある。MのA受容体などの記憶関連分子をノックダウンした神経細胞をin vivoの細胞外電気生理記録で同定するために、光遺伝学的ツール(ChR2、NpHR)を用いる。本年度においては、まずラットにおける光遺伝学的神経活動制御法の検討を行った。レンチウイルスベクターを用い、小脳プルキンエ細胞特異的プロモーターであるL7の制御下でChR2およびNpHRを発現させることにより、プルキンエ細胞特異的な神経活動制御法を確立した。次に、この手法を用いることで、小脳虫部第9小葉に存在する循環制御部位内のプルキンエ細胞活動と、ウレタン麻酔下のラット動脈圧との因果関係を示した。以上の成果は、PLoSONE誌(Tsubota et al., 2011)、第34回日本神経科学大会(2011年9月16日、神奈川)、第41回北米神経科学学会(2011年11月13日、ワシントンDC)、GCOEジョイントシンポジウム(2012年1月20日、東京大学)、及びGCOEプログラム「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第5回リトリート(2012年3月3日-4目、山梨)において発表された。また、上記循環制御部位の生理学的意義を示すために、ラットの姿勢変化時に第9小葉プルキンエ細胞活動を抑制する実験を行った。これにより、姿勢変化後の血圧の安定性の維持に、第9小葉プルキンエ細胞活動が必要であることを示した。この成果はNeuroscience誌において発表された(Tsubota et al.,in press)。また、上記の検討実験と並行して、記憶関連分子をノックダウンするためのレンチウイルスベクターの開発を行った。HEK293T細胞にレンチウイルスを感染させ、記憶関連分子が高い効率でノックダウンされることを確認した。NMDA受容体などの記憶関連分子をノックダウンした神経細胞をin vivoの細胞外電気生理記録で同定するために、光遺伝学的ツール(ChR2,NpHR)を用いる。以上の目標の達成に向け、本年度は、光遺伝学的ツールを発現するためのレンチウイルスベクターの開発、およびその有効性を生理学的に確認するための作業を行った。具体的には、小脳虫部第9小葉に存在する循環制御部位の生理学的意義を示すために、NpHRを用いて、ラットの姿勢変化時に第9小葉プルキンエ細胞活動を特異的に抑制する実験を行った。

この成果はNeuroscience誌(Tsubota et al., 2012)、第35回日本神経科学大会(2012年9月18日、愛知)、および第42回北米神経科学学会(2012年10月14日、ニューオリンズ)において発表された。また、上記の検討実験と並行して、記憶関連分子をノックダウンするためのレンチウイルスベクターの開発を行った。このレンチウイルスベクターをラット大脳皮質に摂取したところ、in viVoで高効率のノックダウンが起こる一方で、正常な神経伝達機能は阻害されないことを確認した。本研究の目的は、視覚性連合記憶の学習過程で、サル下部側頭葉の神経細胞群がその反応選択性を獲得する際の分子メカニズムを明らかにすることにある。この目標の達成に向け、本年度は、記憶関連分子をノックダウンしかつノックダウン細胞をChR2ラベルするためのレンチウイルスベクターの開発、およびその有効性をラットにおいて証明するための実験を行った。具体的には、ラットの一次体性感覚野に存在するバレル皮質において、単一機能カラム限定的に上記ベクターを感染させ、ひげの感覚遮断を施した際に誘導される神経細胞の可塑的変化に対する、記憶関連分子の一つであるcofilinlのノックダウンの効果を調べた。感覚遮断実験においては、ウイルス感染による遺伝子発現を2週間待った後、ウイルスを接種した脳半球とは対側の顔面において、一本のウィスカー(D1ウィスカー)のみを残してその他のウィスカーを全て切るという作業を行なった。遮断を3週間以上継続した後、1週間ウィスカーを再生させ、D2カラムの2/3層において、ChR2ラベルを指標としたノックダウン細胞からの電気生理記録を行なった。野生型のラットのD2神経細胞では、感覚遮断によって、唯一残されていたD1ウィスカーに対する反応が上昇し、遮断されていたD2ウィスカーに対する反応が減少した。一方、cofilinlがノックダウンされた神経細胞で同様のことを調べると、D1ウィスカーに対する反応上昇が認められない一方で、D2ウィスカーに対する反応の減少は保存されることが分かった。cofilinlのノックダウンそのものはウィスカー刺激に対する神経細胞反応性に有意な変化をもたらさないことから、cofilin1のノックダウンは感覚遮断に伴う可塑的変化に対して影響を与えたと考えられる。以上の結果は、感覚遮断に伴うバレル皮質2/3層の神経活動の可塑的変化には、アクチンフィラメントの再構成が必要であることを示唆する。この成果は既に学術雑誌へ投稿しており、現在審査の過程にある。また、この成果の一部は第36回日本神経科学大会(2013年6月20日、京都)で発表された。また、サルでの実験に向けて、マカクサル1頭に対して視覚性連合記憶課題の学習を行わせた。今後、ラットでその有効性を証明したレンチウイルスベクターを、このサルの下部側頭葉へ投与し、下部側頭葉の神経細胞群の反応選択性獲得に対する上記記憶関連分子のノックダウンの効果の評価を行っていく予定である。光遺伝学的神経活動制御法の検討を終え、その成果を論文・学会において発表したという点において、順調な進展があったと評価できる。また、記憶関連分子をノックダウンするためのレンチウイルスベクターが完成したという点においても、当初の目的を達成したと評価できる。小脳プルキンエ細胞特異的な神経活動制御法を応用して小脳虫部第9小葉の生理学的意義を見出し、その成果を論文・学会において発表したという点において、進展があったと評価できる。
組織非侵入性Entamoeba dispar無菌培養系の確立とその生物学的特徴について

我々のこれまでの研究成果から、無菌培養が困難であるEntamoeba disparの増殖が細菌(緑膿菌)の代謝産物、特に糖代謝に関連した物質に大きく依存しているらしいことがわかってきた。先ずE.disparの増殖促進効果をもつ緑膿菌とCrithidia fasciculata(原虫)を熱、H_2O_2或いはホルマリン処理することでnonmetabolicな状態とし、これらを加えることでE. disperへの増殖促進効果について検討した。その結果、従来赤痢アメーバには利用し難いと考えられていたフルクトースを加えた培地にこれらのnonmetabolicな微生物を加えるとよく増殖することがわかった。また、緑膿菌とC.fasciculataから増殖促進物質の抽出を試みた結果、緑膿菌の粗多糖分画にE.disparの増殖を促進する物質が含まれることを見いだした。この結果をもとに、緑膿菌の解糖系を中心に中間代謝物質の増殖促進効果について検討を行った結果、6ホスフォグルコン酸(6PGA)とグリセルアルデヒト3リン酸に増殖促進効果があることがわかった。これらの物質は細菌に特有的ともいえる解糖系(Entner-Doudoroffの経路等)の中間代謝物でもあり、E.disparが細菌の解糖系に類似した代謝経路を有する可能性と、エネルギー依存性のリン酸化の過程を経ることなく細菌から巧妙な方法で効率的にアメーバに有益な中間代謝物を取り込んで利用している可能性を示した。現在E.disparの解糖系の詳細を明らかにすることで、これら得られた結果の真否を検討しようと試みている。組織内で無菌的にも増殖し得る病理性の赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)と異なりその増殖が共棲細胞に高度に依存している非組織侵入性のEntamoeba disparの無菌培養系確立にはアメーバが無菌培地へ対応するための困難が多く、未だ再現性のあるプロトコールがない。両種アメーバ間には解糖系酵素のうちhekisokinase:HKのアイソザイムパターンに違いがみられ、そのHKのタイプがE.histolyticaの場合にはglucokinaseと考えられていることから、E.disparにおいては違うタイプのHKを推定しglucose以外のhexose、手始めにfructoseの増殖への影響を検討した。培養実験の結果からE.histolyticaではfructoseを利用できないのに対しE.disparでは無菌培養に近づけた条件下(熱,H_2O_2そしてホルマリン等で処理したCrithidiaや細菌を増殖促進因子として添加した培養条件)で顕著にglucoseを加えた場合よりも安定して増殖することが示された。fructoseは植物ではfructose-6-phosphateへ主としてリン酸化されるのに対し、動物ではfructose-1-phosphate(F-1-P)への系が主な経路となっている。E.disparの場合もF-1-Pを経て解糖系に入るものと推測している。現在、生化学的にHKを含め両種アメーバの解糖系酵素について比較検討するとともに、得られた情報の培養系への応用、またnon metabolicな増殖促進因子を加えることでのE.disparの無菌培養確立にもこの培養系は有用と考えられることから、ムチン等の既知の増殖促進物質についてもその効果の検討を行っている。我々の研究成果として緑膿菌の粗多糖分画に見いだされたEntamoeba disparの増殖促進効果を有する物質がグルコン酸とジヒドロキシアセトンを加えた培地でより効果的に代謝されることがわかってきた。さらにE.disparの増殖促進物質を供給し得る細菌(緑膿菌)とCrithidia fasciculata(原虫)の糖代謝の特徴を生化学的に検討した結果、C.fasciculataにグルコン酸キナーゼ(GAK)の存在を見いだすとともに、極めて高いグルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ(G^PDH)活性を認めた。しかしながら、E.dispar自身にはGAK及びG6PDH活性を見いだせなかったことから、グルコン酸が既にリン酸化されている6ホスフォグルコン酸(6PGA)のアメーバの増殖に対する効果を検討した。

その結果、G6P、NADP、G6PDHより合成した6PGA及びG6PとC.fasciculataのG6PDH活性を利用して調製した6PGAに富んだ抽出液に明らかな増殖促進効果を見いだし、はじめて増殖促進物質のひとつが同定された。また再現性のある無菌培養も可能となった。この6PGAの関わる緑膿菌を含めた細菌の糖代謝(Entner-Doudoroffの経路等)と緑膿菌によりジヒドロキシアセトンから合成される増殖促進物質についての関連を検討した結果、ジヒドロキシアセトンリン酸には効果が見いだせなかったが、これにトリオースリン酸イソメラーゼが作用することでできるグリセルアルデヒド3リン酸に増殖促進効果があるらしいこともわかった。これらの結果はE.disparが細菌に特有的ともいえる6PGAを経る解糖系のなかからエネルギー産生に関わる部分だけを巧妙に利用していることを示唆しているようにも考えられた。
医事訴訟における医療情報システムのあり方に関する研究

本研究は,進展する医療情報システムに注目し,民事司法システムの情報化に関する今後の可能性を模索しつつ,この医療情報システムを裁判所による訴訟審理,あるいは法律専門家の評価に耐え得るようなモデルとするべく,現時点でのその問題点を析出して確認し,併せて今後の方向性を模索することを目的とした。その結果,法廷においては,医療機関で作成される電子情報への対応が万全ではないことがわかった。新たなシステム形成の検討が必要である。本研究は,進展する医療情報システムに注目し,民事司法システムの情報化に関する今後の可能性を模索しつつ,この医療情報システムを裁判所による訴訟審理,あるいは法律専門家の評価に耐え得るようなモデルとするべく,現時点でのその問題点を析出して確認し,併せて今後の方向性を模索することを目的とする。本年度については,研究会およびアメリカ合衆国での調査を行った。研究会においては,問題点の洗い出しのため,研究会メンバーによる意見交換を行い,主として,以下の点が確認された。訴訟の場合、裁判所からも患者側からも情報公開の要請が来る。患者側に対しては、基本的には紙媒体で渡す。電子的には渡さない。電子化すればCD-ROMないしDVD1枚ですむと思われるが、病院側からすると範囲を限定して欲しいという要望がある。またデータは見せ方を変えると誤解を与えてしまうため、誤解を与えないように理解をしてもらうための見方もセットにならないといけない。生データを交付した時に医療行為の過程に沿った形でみるという仕組みを裁判所側はお持ちだろうか、というところが一番の論点である。また,大阪大学大学院医学研究科附属病院医療情報部において,ヒアリング調査を実施した。大阪大学では,すべての医療情報を電子化するに際し,法的リスクの検討を進めているとのこと。平成21年3月には,アメリカ合衆国カリフォルニア州にあるカリフォルニア大学バークレー校に,Jesse Fried教授,および同大学平スティング校にRichard Marcus教授を訪問し,ヒアリング調査を行った。Marcus教授からは,民事訴訟手続における電子情報の取り扱いに関する最新の資料をいただき,次年度における重要な検討資料となった。まず,大阪地方裁判所医療集中部において,藤本利一が,平成21年7月25日「アメリカ法におけるE-ディスカバリーの現状」と題して,研究報告を行い,その成果を,「米国連邦民事訴訟規則におけるE-ディスカバリー規定の導入とその現状」として阪大法学第59巻3=4号241頁-246頁(平成21年)に掲載した。平成8年民事訴訟法改正に関与された清水正憲弁護士を招聘し,平成21年9月6日「民事訴訟における情報収集について」と題して,報告をお願いし,意見交換を行った。大阪地方裁判所医療集中部において,下村眞美が。平成22年2月17日,「電子カルテの特徴と民事訴訟における問題点」と題して,研究報告を行った。アメリカ合衆国における調査としては,藤本利一が,平成21年11月4日から同月7日まで,ハーバード大学において,資料収集を行った。また,平成22年3月16日から18日まで,シカゴ大学において,資料収集を行った。また,継続して,カリフォルニア大学ヘイスティングス校Richard Marcus教授から,適宜,必要な情報を得ており,若干の意見交換も行っている。本研究は,今日において,著しい発展を見せる医療情報システムに注目し,民事司法システムの情報化に関する今後の可能性を一方で模索しつつ,この医療情報システムを裁判所における訴訟審理で取り扱う場合,裁判官や弁護士など,法律専門家の評価にも耐え得るようなモデルとするべく,現時点でのその問題点を析出して確認し,併せて今後の方向性を模索することを目的とする。本年度については,まず,大阪弁護士会春秋会政策シンポジウム「日本版ディスカバリーをめざして--米国民事訴訴訟制度を参考として--」において,藤本利一が,研究報告を行い,その成果を,「特集I政策シンポジウム:日本版ディスカバリーをめざして--米国民事訴訴訟制度を参考として--」として,Shunjuu83号2頁-44頁(平成22年),とくに,藤本利一「ディスカバリー概説」同7頁-18頁(平成22年)に掲載した。内容は,アメリカ合衆国におけるディスカバリー手続の沿革をたずね,母法であるイギリス法やその継授国であるカナダ法と異なり,その適用領域が,とくに証言録取制度において,拡張運用された根拠を検討するものである。なお,昨年度に引き続き,カリフォルニア大学ヘイスティングス校Richard Marcus教授からは,アメリカ民事訴訟制度改革,とくにE-ディスカバリーについて,適宜,必要な情報を得ており,若干の意見交換も行っている。
レジンセメントの接着力に関する被膜厚さの影響について

臨床上有効なレジンセメントの被膜厚さを明かにすることを目的として、セメントの被膜厚さと合着力との関係を検討した。円柱形の鋳造物をステンレス板のピットにレジンセメント(ス-パ-ボンドC&B、パナビアEX、ケミエ-ス)、およびリン酸亜鉛セメント(エリ-トセメント100)を使用し、合着した。合着の際、セメントの被膜厚さを30250μmの範囲で変化させ、合着後の維持力を打ち抜き試験法にて測定した。また、サ-マルサイクル試験の影響も検討し、次の結論を得た。1実験に供したすべてのセメントにおいて、被膜厚さと合着力との間には対数的な負の相関が認められた。2エリ-トセメント100、パナビアEXおよびケミエ-スの合着力は被膜が厚くなるにしたがい大きく減少する傾向を示し、被膜厚さの大小にかかわらず合着力はサ-マルサイクルによる影響をほとんど受けなかった。3ス-パ-ボンドC&Bは、サ-マルサイクルを付加しない場合には、被膜が厚くなるにしたがい合着力はわずかに減少していく傾向を示したが、サ-マルサイクルの付加により、その合着力は大きな影響を受け、被膜が厚くなるにしたがい大きく減少していく傾向を示した。4鋳造体表面へのスズ電析および400°C3分間の酸化熱処理は、それぞれパナビアEXおよびス-パ-ボンドC&Bの合着力を2030%向上させた。被膜厚さ規定装置に関して,発注後納入までの期間が当初3ケ月の予定であったのが,特別注文のため設計および製作に時間がかかり納入が2月の初旬になりました.そのため初年度の実験予定が消化されていません.現在,金銀パラジウム合金による鋳造体においてレジンセメントの被膜厚さが接着力に及ぼす影響について実験が進行中です.予備実験において,任意のレジンセメントの被膜厚さがある誤差範囲内が再現されることを確認しました.又ほぼ均一なセメントの被膜厚さも得られることを確認しています.
安定過程の研究

本研究の目的は、偶然によるバラツキが大きい確率現象を記述する数学モデルのひとつである安定過程について、より詳しい数学的な性質を調べ、他分野への応用の可能性を考察することであった。以下、研究成果の主なものを述べる。研究代表者の前島は自己相似的安定過程について引き続き研究を続けた。すなわち、自己相似的安定過程の代表的なクラスである線形型と調和型について、与えられた確率過程がいつそのようなクラスに属するかという特徴づけの問題に、米国の共同研究者と永年とり組んできたが、その問題にほぼ結着をつけた。又、笠原、森田ら国内の共同研究者と共に、大きな値が安定分布を構成する上でどのような役割を果すかについて、見通しのよい結果を得た。上記それらの結果は、研究計画書にも述べたように、従来良く研究されているガウス過程の場合に比べて、いずれも顕著な違いをみせるものであり、それらの知見を得たことは、当初の研究目的のひとつに叶うものであった。更に前島は単独で、ランダムな環境の中を動くランダム・ウォークの挙動について、その環境が多次元である場合についての極限定理を証明し、安定過程に非常に近い多次元値作用素的自己相似過程を構成した。研究分担者の田中、田村は、更に河津の協力を得て、1次元においてランダム媒質が、安定過程的な構造をもつとき、その中の拡散過程の漸近的性質について調べ、更に田中は、その問題への応用を意図して、吸収壁レビー過程のグリーン作用素に関するシルヴァシュタイン公式を、弱い仮定の下で証明した。更に前田は幾何学からの接近を試み、大森、吉岡らとの共同研究として、ポアソン環の変形に関する一連の成果を得た。
原発性胆汁性肝硬変に対する免疫寛容誘導樹状細胞を用いた治療法の開発

抗原提示細胞である樹状細胞(DC)は、免疫の調整を行っており、免疫応答と免疫寛容を誘導することができる。免疫応答を誘導するDCは、様々な研究が行われ、現在では癌の治療に用いられ、臨床応用されている。一方、免疫寛容を誘導する制御性DCは、自己免疫性疾患の治療への応用が期待されているが、制御性DCによる治療に関する報告はほとんどみられない。今回われわれは、制御性DCの免疫制御能について、原発性胆汁性肝硬変(PBC)のモデルマウスを用いて検討した。制御性DCは、マウス骨髄由来DCをIL-10、LPSと特異抗原存在下に培養して作製した。また、骨髄由来DCにIL-10、LPSとPBC特異抗原を加えて培養し、PBC特異的制御性DCを作製した。PBCモデルマウスは、免疫賦活因子である、Poly I:Cを週2回×4ヶ月間投与することにより作製した。Poly I:C単独投与群、Poly I:Cと制御性DC投与群、Poly I:CとPBC特異的制御性DC投与群の3群で実験を行った。Poly I:C単独投与群においては、門脈域を主体とする炎症細胞浸潤がみられ、胆管周囲の炎症細胞浸潤があり,PBC様の病変がみられた。また、血中に自己抗体が出現した。一方、制御性DC投与群とPBC特異抗原でパルスした制御性DC投与群においては、PBC様病変の改善がみられた。血中の自己抗体の出現率は、3群に差はみられなかった。今回の結果から、樹状細胞療法が免疫反応を制御し、PBCの新しい治療法になる可能性が示唆された。樹状細胞(DC)は、病原体を抗原として認識し、抗原特異的にT細胞を活性化することによって病原体の排除にかかわる。しかし、近年、免疫寛容を誘導するDC(制御性DC)が作成され自己免疫疾患に対する新しい治療法となる可能性が報告された。特に原発性胆汁性肝硬変(PBC)は自己免疫疾患であるにもかかわらずステロイド治療は無効であり新しい治療法が必要とされている。本研究は制御性DCを用いたPBCに対する新しい治療法の開発を目的とする。2.制御性DCによる制御性T細胞の誘導。CD4+T細胞をFlt3-Ligandで作成した制御性DCで刺激したところ大量のIL-10を産生するいわゆるTr1細胞を誘導した。3.制御性DCの投与。Preliminaryな実験として自己免疫性胃炎マウスに制御性DCを投与したところ自己抗体産生が抑制された。今後、抗ミトコンドリア抗体の対応抗原であるPDCでパルスした制御性DCをPBCマウスモデルに投与し効果を確認する予定である。制御性樹状細胞(DC)による原発性胆汁性肝硬変(PBC)の新しい治療法の開発を目的に実験を行っている。平成17年度にin vitroでの制御性DCの作製に成功し、その特性を報告した。制御性DCのin vivoでの免疫制御能を、PBCのモデルマウスを用いて検討した。PBCモデルマウスは、免疫賦活因子である、Poly I : Cを週2回×4ヶ月間投与することにより作製した。Poly I : C単独投与群、Poly I : Cと制御性DC投与群、Poly I : CとPBC特異的制御性DC投与群の3群にわけ、組織学的(門脈域の炎症細胞浸潤の程度、実質内の炎症細胞浸潤、胆管病変)、末梢血中の自己抗体(抗核抗体、抗ミトコンドリア抗体)、末梢血中のサイトカイン濃度について比較検討を行った。Poly I : C単独投与群においては、組織学的に門脈域にリンパ球を主体とする炎症細胞浸潤がみられ、胆管周囲の炎症細胞浸潤があり,PBC様の病変がみられた。

一方、制御性DC投与群とPBC特異抗原でパルスした制御性DC投与群においては、PBC様病変の改善がみられた。血中の自己抗体の出現率は、3群に差はみられず、自己抗体のパターンに関しても差がみられなかった。制御性DCを投与した群では、炎症抑制のサイトカインであるIL-10の濃度が高かった。今回の結果から、制御性DCが免疫反応を制御し、PBCモデルマウスの組織学的病変の改善をもたらしたことが考えられ、制御性DCが、PBCの新しい治療法になる可能性が示唆された。
米国の国際文化政策に関する調査研究 第II部-中南米に対する米国の国際教育援助から

米国の国際文化政策が、国家的次元を獲得したのは、第二次世界大戦に先立つ1938年にラテンアメリカを対象とした教育文化交流のプログラムによってであった。それまで民間の手に任されていた分野に米国が乗り出してきた背景には、ラテンアメリカへの影響を強めつつあった枢軸諸国に対抗する意図があり、戦時体制をにらんだ宣伝活動をも含みつつ、後に技術協力につながっていく系統と、広く諸外国との交流や理解の深化を目指す系統を併せ持ちながら発展した。戦後の国連を中心とした国際開発協力の分野で、米国は中心的な役割を担うことになる。特に、世界銀行、IMFによる自由主義的な国際経済体制、いわゆるブレトン・ウッズ体制の盟主となったことは、米国の国際的な教育文化政策が、世界銀行を中心とする国際開発援助政策と乖離することなく進行していくことを自明とする。その意味から、開発潮流の「主流」である世界銀行の教育分野の活動は無視できない。さらに、1980年代までの米国の教育分野での二国間援助を考える場合、米国の国際的な教育文化交流の成立の歴史、そして冷戦という状況をふまえることが必要である。その上で、1960年代以降の国際教育に関わる事例を見るとき、それは、孤立主義を脱して未知の分野に望むことになった国の自身の国際化に向けての多様な動きの一環であること、国益重視の観点と理想主義的な観点からの活動を併せ持って発展していること、そして米国自身の国内事情や対外政策によって大きな影響を被っていることを知ることができる。平成7年度は、米国の教育援助の基礎文献を収集し、歴史的把握に努めること、及び、コロンビアとジャマイカに関して資料収集と分析を行うことを目的としている。この追究の過程で、米国に本拠を置き、戦後の発展途上国への教育開発援助の最大のドナーとなってきた世界銀行のこの分野における活動を把握することが、米国の教育援助を知る上で不可欠であることがますます明らかとなった。この点に基づき、本年は、世界銀行の教育援助活動に関して資料を収集することに努めた。その結果、世界銀行の1960年代以降のジャマイカの全教育援助プロジェクトの一次資料を入手した他、世界銀行の教育援助全体に関する政策ペ-パ-や教育分野での刊行物、プロジェクトの名称などを入手、またはその所在を知ることができた。これら資料の整理分析が本研究の今後にとって非常に重要な基礎となると考えている。なぜならば、1960年代以降の途上国の教育開発はユネスコに加えて、豊富な資金力を誇る世界銀行が大きな発言力を持ち主流となってきたプロセスでもあること、また、世界銀行からの援助には、米国のUSAIDなどが技術援助を行うなど側面支援する形で進んできた事例も見られること、などの点から、世界銀行の教育援助の歴史的把握には大きな意味があると考えられるからである。なお、コロンビアについては、第二次資料が中心となっているため、一層の資料の収集に努めたい。平成8年度は、米国において収集した資料の整理分析を続行中である。新たに国内では、1960年以降の教育開発の動きに関わる資料を、東京大学国際資料室を初めとして、各種機関において収集中である。戦後のブレトン・ウッズ体制の要としての世界銀行は、米国が主導する自由主義陣営のイデオロギーを自ずから代表するものとして、米国の国際文化政策と有形無形の関係を保ってきている。発展途上国全体に対する教育開発において、ユネスコをしのぐ影響力を持つようになった世界銀行の歩みは、米国の政策に総体的に見るためにも、是非とも把握すべき基本的事項である。本年は、同機関に関わる戦後の開発理念の跡づけに努める一方、この方面に関わる「開発教育」分野をアメリカが生んできた経緯に注目している。またラテンアメリカにおける教育開発が持っていた性格や特徴を上記理念との関連で考察する試みを行っている。1960年代、世界銀行はむしろ職業教育や中等教育以上の段階において、開発プロジェクトを進めていた。

1970年代は、それまでの開発理念のオールタナティブが模索された時期であり、ベーシック・ヒューマン・ニーズが謳われ、教育の上でも様々な理論的展開とそれに対する対応が見られる。本年はジャマイカとコロンビアを参照しつつ、主に70年代までのこうした流れについての概括を行った。米国の国際文化政策が、国家的次元を獲得したのは、第二次世界大戦に先立つ1938年にラテンアメリカを対象とした教育文化交流のプログラムによってであった。それまで民間の手に任されていた分野に米国が乗り出してきた背景には、ラテンアメリカへの影響を強めつつあった枢軸諸国に対抗する意図があり、戦時体制をにらんだ宣伝活動をも含みつつ、後に技術協力につながって系統と、広く諸外国との交流や理解の深化を目指す系統を併せ持ちながら発展した。戦後の国連を中心とした国際開発協力の分野で、米国は中心的な役割を担うことになる。特に、世界銀行、IMFによる自由主義的な国際経済体制、いわゆるブレトン・ウッズ体制の盟主となったことは、米国の国際的な教育文化政策が、世界銀行を中心とする国際開発援助政策と乖離すること進行していくことを自明とする。その意味から、開発潮流の「主流」である世界銀行の教育分野の活動は無視できない。さらに、1980年代までの米国の教育分野での二国間援助を考える場合、米国の国際的な教育文化交流の成立の歴史、そして冷戦という状況をふまえることが必要である。その上で、1960年代以降の国際教育に関わる事例を見るとき、それは、孤立主義を脱して未知の分野に望むことになった国の自身の国際化に向けての多様な動きの一環であること、国益重視の観点と理想主義的な観点からの活動を併せ持って発展していること、そして米国自身の国内事情や対外政策によって大きな影響を被っていることを知ることができる。
大脳基底核を介する自律神経回路の解析:辺縁下野と側坐核の線維連絡と免疫組織

ラット側坐核の芯(core)と殻(shell)に、線維連絡のマーカーとしてでデキストランビオチンを注入し線維連絡を調べた。芯への注入により、腹側淡蒼球の背外側部、淡蒼球、内核内側部、黒質緻密部、黒質外側部、赤核後野、および脚橋被蓋核に投射がみられた。殻背内側および腹内側部への注入により、腹側淡蒼球の背内側部と腹外側部、内側視索前野、視床下部外側核、扁桃体、脚内核内側部、脚間核、黒質緻密部、腹側被蓋野、赤核後野、脚橋被蓋核、脚傍核、中脳水道周囲灰白質、青斑核に投射が見られた。殻腹側および腹外側部への注入により、腹側淡蒼球の腹外側部、脚内核の内側部、黒質緻密部、赤核後野、および脚橋被蓋核に投射が見られた。ラット側坐核の芯は運動系により密接な関係があり、殻は自律神経、辺縁系により深い関係が見られた。サル(Macaca fuscata)の辺縁下野にbiotinylated dextran amineを注入し、その投射部位を検索した。終末の分布する部位は、尾状核腹内側部、側坐核の芯と殻、対角帯、無名質、分界条床核であった。視床下部では、背内側、腹内側核、視床下部外側核、視床下部後核に標識神経終末が見られた。扁桃体では内側核、基底核の内側部、基底外側核の大細胞部と小細胞部および外側核がIL殻の投射を受けていた。視床では、室傍核、束傍核、前内側間核、内側中心核および結合核等の正中核群の他、背内側核の大細胞部と小細胞部、視床枕核内側部および境界核が投射を受けている。さらに、標識軸索終末は、黒質網様部、中脳中心灰白質、青斑核および橋の結合腕傍核内側、外側部に見られた。次いで、サルの辺縁下野にWGA-HRPを注入して、その入力の起始部位を検索した。標識された細胞体は、Brocaの対角帯、前障の腹側部、梨状皮質、外側視索前野、無名質および内側中隔核に見られた。扁桃体では,基底核大細胞部、皮質核、基底外側核大、小細胞部に標識細胞が見られた。視床下部では、外側、背内側、腹内側、背側および後視床下部核に標識細胞が分布していた。視床の正中核群では、室傍核、束傍核、内側中心核、菱形核および結合核が、また、視床前腹側核の大細胞部および背内側核内側部に標識細胞が見られた。さらに、標識細胞は海馬CA1の錐体細胞、腹側被蓋野のA10細胞、脚橋被蓋核、外側手網核、外側結合腕傍核、青斑核および楔状核にも見られた。

視床の正中核群では、室傍核、束傍核、内側中心核、菱形核および結合核が、また、視床前腹側核の大細胞部および背内側核内側部に標識細胞が見られた。さらに、標識細胞は海馬CA1の錐体細胞、腹側被蓋野のA10細胞、脚橋被蓋核、外側手網核、外側結合腕傍核、青斑核および楔状核にも見られた。1)ラットの側坐核の芯(core)と殻(shell)は、免疫組織化学的にまたその線維連絡からも異なる性質の領域であることが知られている。芯と殻それぞれの領域に、線維連絡のマーカーとしてでデキストランビオチンを、イオントフォレ-シスにより注入し、線維連絡を調べた。A)芯への注入により、腹側淡蒼球の背外側部、淡蒼球、内核内側部、黒質緻密部、黒質外側部、赤核後野、および脚橋被蓋核に投射が見られた。B)殻背内側部および殻腹内側部への注入により、腹側淡蒼球の背内側部と腹外側部、内側視索前野、視床下部外側核、扁桃体、脚内核内側部、脚間核、黒質緻密部、腹側被蓋野、赤核後野、脚橋被蓋核、脚傍核、中脳水道周囲灰白質、青斑核に投射が見られた。C)殻腹側部および腹外側部への注入により、腹側淡蒼球の腹外側部、脚内核の内側部、黒質緻密部、赤核後野、および脚橋被蓋核に投射が見られた。2)ラット側坐核の芯と殻は、その投射部位から見て明らかに性質が異なり、芯は運動系により密接な関係があり、殻は自律神経、辺縁系により深い関係が見られる。殻の亜区画で見ると、背内側部と腹内側部はとくに自律神経関連核との連絡が密であり、腹側部と腹外側部は運動系に関係すると思われた。3)サルの辺縁下野と側坐核に、HRPないしデキストランビオチンを圧注入ないしイオントフォレ-シスにより注入し、線維連絡を調べた。予備的なデータの解析では、細胞の標識された部位は、対角帯核,腹側前障,尾状核前内側部,外側視索前野,視床下部外側核,扁桃体前基底核,扁桃体基底核,扁桃体皮質核,中隔内側核,海馬,海馬支脚,視床下部背側野,視床下部後核,視床背内側核,視床腹側前核,視床結合核,黒質,腹側被蓋野,脚橋核,内,外側脚傍核,青斑核などであった。この結果は細かいところで種差の存在をうかがわせるが、本質的には、ラットとサルで線維連絡部位に大きな差異が無いことを示唆した。サル(Macaca fuscata)の辺縁下野にbiotinylated dextran amineを注入し、その投射部位を検索した。この投射神経線維は非常に細いのが特徴的であり、終末部では細胞の周囲に細かい網状の終末部軸索が分布し、軸索膨大を伴っていた。終末の分布する部位は、尾状該腹内側部、側坐核の芯と殻、対角帯、無名質、分界条床核であった。視床下部では、背内側、腹内側核、視床下部外側核、視床下部後核に標識神経終末が見られた。扁桃体では内側核、基底核の内側部、基底外側核の大細胞部と小細胞部および外側核がIL殻の投射を受けていた。視床では、密傍核、束傍核、前内側間核、内側中心核および結合核等の正中核群の他、背内側核の大細胞部と小細胞部、視床枕核内側部および境界核が投射を受けている。さらに、標識軸索終末は、黒質網様部、中脳中心灰白質、青斑核および橋の結合腕傍核内側、外側部に見られた。次いで、サル(Macaca fuscata)の辺縁下野にWGA-HRPを注入して、その入力の起始部位を検索した。WGA-HRPで標識された細胞体は、Brocaの対角帯、前障の腹側部、梨状皮質、外側視索前野、無名質および内側中隔核に見られた。扁桃体では、基底核大細胞部、皮質核、基底外側核大、小細胞部に標識細胞が見られた。視床下部では,外側、背内側、腹内側、背側および後視床下部核に標識細胞が分布していた。視床の正中核群では、室傍核、束傍核、内側中心核、菱形核および結合核が、また、視床前腹水側核の大細胞部および背内側核内側部に標識細胞が見られた。
腎機能低下によるサルコペニア発症の検証と老化抑制因子αKlothoの役割の解明

腎臓内科学の分野では、『腎臓は老化を制御している臓器である』と考えており、その中心的役割は、老化制御タンパク質と考えられているαklothoが担っている。骨格筋でもこのタンパク質は存在するが、その働きは完全に明らかになっていない。研究が進んでいる腎臓でのαklothoは、腎臓を保護する働きを持っているので、骨格筋においても、筋萎縮から守る働きをしているかもしれない。本研究の目的は、骨格筋でのαklothoの働きを明らかにすることである。
CD34陽性造血幹細胞の選択的分離とCD34細胞による移植法の開発

HLA一致同胞あるいは非血縁ドナーを持たない患者のために、HLAが異なる血縁ドナーからの造血幹細胞移植を可能にするための新しい移植方法の開発を行った。骨髄あるいは末梢血中に含まれる造血幹細胞の指標とされるCD34抗原陽性細胞をIsolex systemを用いて選択的に分離した。CD34陽性細胞の回収率は4060%であり、最終純度は半数以上が90%を超えていた。骨髄と末梢血を比較すると、純度に有意の差はなかったが、回収率は末梢血の方がやや良好であった。HLA23抗原不一致の血縁者から採取した骨髄あるいは末梢血幹細胞からCD34陽性細胞を分離して造血幹細胞移植を行った。21例中19例でドナー由来の造血回復が確認された。生着がえられた20例における各血球の生着日は白血球1045日(中央値14日)、好中球1044日(中央値13日)、網赤血球14日未到達(中央値24日)、血小板2万16日未到達(中央値31日)、血小板5万19日未到達(中央値68日)であった。急性GVH病はほとんどの症例で0I度にとどまった。移植されたT細胞の数は大多数の症例で10^4/kgレベルであり、T細胞数や不一致HLA抗原数とGVH病の重症度の間には相関が認められなかった。しかし、移植後の免疫能の回復が遅延し、感染症や白血病の再発などの合併症が多発した。以上の結果はCD34陽性細胞のみによる造血幹細胞移植が可能であることを示唆しているが、移植後のリンパ球免疫能の回復を図るための方策が必要であることを意味していると考えられた。1. CD34陽性細胞の純化方法の検討骨髄中の造血幹細胞の表面上に発現されているCD34抗原をマーカーにして、多能性造血幹細胞を純化する方法につき検討した。用いた方法はIsolex Systemで、CD34抗体(1次抗体)と抗マウス2次抗体結合免疫ビーズによりCD34陽性細胞を選択的に分離した。12人の健康ドナーからえられた骨髄の単核球分画中のCD34陽性細胞の比率は3.610.0% (平均6.6%)であり、ナイロンウ-ルにて単球を除去した後にIsolex SystemによりCD34陽性細胞を分離したところ、22.256.4% (平均36.8%)のCD34陽性細胞が回収された。回収された最終細胞中のCD34陽性細胞の純度は61.698.6% (平均92.9%)であった。ナイロンウ-ル処理により単核球数を減少させることが、CD34抗体の単球への非特異的結合を防ぎ、用いるCD34抗体を節約することが可能になった。2.純化されたCD34陽性細胞による骨髄移植10人の予後絶対不良の症例に対してHLA抗原が23個異なる血縁ドナーの骨髄からCD34陽性細胞を選択的に分離して骨髄移植を行った。ドナーは両親が8例、同胞が1例、子供が1例であり、移植されたCD34陽性細胞は患者体重あたり1.015.85x10^6/kg(平均3.49x10^6/kg)であった。10例中9例で生着が認められたが、生着9例中1例が晩期拒絶に陥った。生着が認められた9例における急性GVH病は1例でgrade I、8例でgrade Oであった。

初期の臨床例における経験からCD34陽性細胞による骨髄移植は可能であり、移植に必要なCD34細胞数は2x10^6/kg程度ではないかと推測され、HLA抗原が23個異なっていても急性GVH病の合併は回避される可能性が示された。1.CD34陽性造血幹細胞の選択的分離法の確立免疫ビーズを用いた分離システムであるIsolexsystemにより、骨髄造血幹細胞あるいは末梢血幹細胞を純化する方法を確立した。CD34陽性細胞の5060%の回収率と95%以上の純度が確保された。CD34陽性細胞の大量増幅法の検討を開始し,造血前駆細胞までの増殖は可能であったが,自己複性能を保持した造血幹細胞の増幅はまだ達成されていない。2.CD34細胞による移植法20例の予後絶対不良の難治性疾患患者において、HLAが23抗原異なる血縁者をドナーとしてCD34陽性細胞による造血幹細胞移植を施行した。いずれも血縁者あるいは非血縁者間にHLA適合ドナーを持たず、本人もしくは両親から希望のあった症例で倫理委員会の承認を得た症例である。a.生着18例において生着がえられた。不生着の2例中1例で別のドナーからの再移植を行い、生着がえられた。生着に必要なCD34陽性細胞は2x10^6/kg前後ではないかと推測された。移植細胞中のT細胞は10^4(10^5)/kgであり、34logのT細胞除去が達成された。生着がえられた19例(1例は再移植後)においてIII度以上の重症GVH病はなく、ほとんどが0I度であり、23抗原HLA不適合移植としてはほぼ完全なGVH病予防であったと考えられる。3カ月以上の長期生存者において慢性GVH病の合併は認められていない。c.白血病の再発適応となった症例が進行白血病であったため、またGVH病の合併がほとんどなかったため,白血病の再発が認められた。そのため,今後の課題の1つとして,移植後のドナーリンパ球輸注(DLT)をどのように行うかがあげられる。d.感染症の合併多くの症例でサイトメガロウイルス感染を合併し,2例においてEBウイルスによる致命的リンパ腫を合併した。T細胞回復遅延がその原因と考えられ,その予防あるいは治療としてDLTもしくはウイルス特異的キラーT細胞の輸注が必要であると考えられた。HLA一致同胞あるいは非血縁ドナーを持たない患者のために、HLAが異なる血縁ドナーからの造血幹細胞移植を可能にするための新しい移植方法の開発を行った。骨髄あるいは末梢血中に含まれる造血幹細胞の指標とされるCD34抗原陽性細胞をIsolex systemを用いて選択的に分離した。CD34陽性細胞の回収率は4060%であり、最終純度は半数以上が90%を越えていた。骨髄と末梢血を比較すると、純度に有意の差はなかったが、回収率は末梢血の方がやや良好であった。HLA23抗原不一致の血縁者から採取した骨髄あるいは末梢血幹細胞からCD34陽性細胞を分離して造血幹細胞移植を行った。21例中19例でドナー由来の造血回復が確認された。生着がえられた20例における各血球の生着日は白血球1045日(中央値14日)、好中球1044日(中央値13日)、網赤血球14日未到達(中央値24日)、血小板2万16日未到達(中央値31日)、血小板5万19日未到達(中央値68日)であった。急性GVH病はほとんどの症例で0I度にとどまった。移植されたT細胞の数は大多数の症例で10^4/kgレベルであり、T細胞数や不一致HLA抗原数とGVH病の重症度の間には相関が認められなかった。しかし、移植後の免疫能の回復が遅延し、感染症や白血病の再発などの合併症が多発した。以上の結果はCD34陽性細胞のみによる造血幹細胞移植が可能であることを示唆しているが、移植後のリンパ球免疫能の回復を図るための方策が必要であることを意味していると考えられた。
異相界面を利用した結晶配向制御による高機能非線形光学材料の設計

非線形光学効果は情報の高密度記録化や高速光変調を実現することから、現在非常に主目されている現象である。我々は混合系の単独成分だけではSHGが発現しないポリ-ε-カプロラクトン(PCL)とパラニトロアニリン(p-NA)複合系を混合結晶化させると、電界を印加することなしにニオブ酸リチウムより大きな光第二高調波(SHG)活性となることを見いだした。さらに大きな非線形光学効果を得るためにはSHG活性な結晶の配向制御を行なう必要があるが、そのための条件はまだ明らかになっていない。今回、我々はテフロンをラビングしたガラス基板上でp-NAの配向制御を行なった。試料であるPCLとp-NAを精製後ベンゼン/アセトン(50:50wt%)溶液に溶かし、テフロンでラビング処理したガラス基板上にスピンコートした。p-NAが20-30wt%の時、PCL球晶の表面にのみ、p-NA結晶が成長することがわかった。このフィルム上ではp-NA結晶がラビング処理した方向に高度に配向しており(トランスクリスタル)、試料にNd:YAGレーザー(波長1.064μm)を照射した所、第二高調波が観察され、p-NA結晶がSHG活性であることが証明された。50μmのITO櫛形電極を作製し、電界印加方向と平行になるようにテフロンをラビング処理し、その上にp-NA/PCLトランスクリスタルを作製した。この試料に電界を印加すると、電圧印加時にのみ回折光が観察された。p-NAトランスクリスタルの回折格子の回折効率は電界印加時に5.3%であった。この回折効率よりp-NAトランスクリスチルの電気光学定数r33を求めると、約50pm/Vであることが判明した。この値は大きなr33を持っていることで良く知られている、ニオブ酸リチウムの1.倍の値であり、p-NAトランスクリスタルが高機能な非線形光学材料であることを示している。
神経伝達物質遊離における分子機構の解析のための遺伝子移入再構成系の開発とその応用

ラット脳から抽出したメッセンジャーRNA(mRNA)をアフリカツメガエル卵母細胞に移入し、その卵母細胞に神経終末と同様の機能を発現させることを目的とした。I.ドパミン作動性神経終末機能の発現(1)ドパミン取込み機能の発現:mRNA移入細胞では浸漬液中のドパミン取込み量が濃度依存性に増加した。ドパミン遊離機能の発現:ドパミンを取り込ませたmRNA移入卵母細胞に高K(50mM)液を適用することによりドパミン遊離を惹起した。この高K誘発ドパミン遊離は外液のCa^<2+>に依存し、開口放出機能の発現を呈したものと考えられる。しかし、取り込み機能が発現していた卵母細胞で必ずしも高K誘発ドパミン遊離が起こるとは限らなかった。II.γ-アミノ酪酸(GABA)作動性神経終末機能の発現(1)γ-アミノ酪酸(GABA)取り込み機能の発現:mRNA移入卵母細胞をGABAを含む溶液に浸漬することにより、この卵母細胞はGABAを特異的に取り込んだ。一方、mRNA非移入卵母細胞や、蒸留水を移入した卵母細胞ではGABAの取り込みは見られなかった。(2)GABA遊離機能の発現:GaイオノフォアであるA23187をGABAを取込んだmRNA移入卵母細胞に適用すると、GABA遊離が増加し、外液中のCa^<2+>を除去すると増加は見られなくなった。(3)GABA遊離におけるプロテインキナーゼC(PKC)の関与:A23187誘発GABA遊離はPKCの活性化物質であるホルボールエステルで更に増加したことから、mRNA移入卵母細胞には、神経終末と同様にPKCが発現したものと考えられる。(4)GABA遊離における膜融合蛋白質であるシナプトフィジン(SP)の関与:SPの抗体を用いたイムノブロット法により、mRNA移入卵母細胞にSPが発現していることが確認された。A23187誘発GABA遊離は、mRNA抽入と同時にSPの抗体を抽入した卵母細胞では、mRNAのみを抽入した卵母細胞の約40%に減少した。従って、膜融合蛋白質であるSPがGABA遊離に関与しているものと考えられた。本研究はラット脳から抽出したメッセンジャーRNA(mRNA)をアフリカツメガエルの卵母細胞に移入し、その卵母細胞にドパミン作動性神経の終末部と同様の機能を発現させることを目的とした。卵母細胞中および卵母細胞灌流液中の夫々のDA量とDA代謝産物は高速液体クロマトグラムで測定した。(1)ドパミン(DA)取込み機能の発現:mRNA移入卵母細胞を10^<-4>M DAを含む液に90分間浸漬した後、60分間洗浄することにより、非特異的に取込まれるDA量を除去することができた。10^<-4>M DA液への浸漬時間が90分でDA取込み量は最大値に達し、その後一定になった。