hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
３・４・５次元多様体上の葉層・接触・シンプレクティック構造の研究

一方で、これらを1980年代に代数幾何的に扱っていた中村郁氏の研究との比較を開始し、K3曲面の、特にVII型Hirzebruch-Inoue曲面の関連について、代数幾何とは違う位相的な方向からの検討が可能となった。(3)4次元多様体上の2次元葉層のturbulizationに関して、トーラスが現れる場合の具体的構成法を新たに開発した。これにより、cohomologyの障害が消えるほぼ総ての場合の具体的構成法が得られたことになる。この方法は、4次元空間の中で2次元曲面の族がどのように捉えられるかという大きな問題にかかわっている。量子化の方向への研究がまだ進展していない。これがやや遅れていると思われる主な理由だが、その原因はLefschetz fibrationの構成に関する研究に大半の労力を割かれたことにある。一方で、Lefschetz fibrationに関する研究は、予想以上に大きな実りのあるものと思われるので、むしろ、やや予想外の方向への進展が起きているとの評価ができる。2017年度の研究計画で殆ど遂行できなかったAnosov流に付随する3次元接触構造の凸性と接触構造のホモロジー論の問題は、2018年度に引き続き行う。特に、2018年度にはMorse Novikov homologyの専門家であるAndrei Pajitnov氏が来日し、研究打合せの機会を持てるので、その折に研究を再開する。保体積Legendre流の局所構造の複雑性に関しては、代表者が常に継続して研究を続けているので、その部分は、研究の展開のための大きな素地となる筈である。一方、複素曲面、特に楕円曲面の微分トポロジーを2017年度から研究に積極的に取り込むことにした成果が尖点特異点のMilnor fibreにLefschetz fibrationを構成するという研究の方向性を見いださせた。2018年度にはこの方向性を推し進めて、存在・非存在をはっきりさせることがまずは必要である。存在すれば、多くの重要な研究すべきテーマがすぐに従う。一方、非存在が確認された場合は、異種のK3曲面を構成していることになるので、やはり多くの微分位相的問題を提供することとなるが、その場合、一度研究すべきテーマを整理する必要がある。4次元多様体上の葉層構造については、2017年度の成果が極めて良い方向に向いているので、このまま推進していけばよいと考える。1)Lefschetz fibrationに関しては、まだ証明しきれていない特殊な場合がある。これについて最終的に決着させることが急務である。証明できている場合に開発、適用した写像の(無限に)小さな変形理論を、「ある程度小さい変形」の形で適用することに克服できると考えられる。2)この課題のstrange dualityにかかわる部分について、代数幾何的な考察から得られるものを位相的に証明し、更にその枠組みを広げて位相的な問題を定式化し、証明する。代数幾何的な障害があるが、むしろ位相的に解釈することで本来の研究が進むと思われる。3)次数の高い単純楕円特異点や連立でしか得られない尖点特異点の場合にもLefschetz fibrationの理論を拡張する。
挿入的クロマチン免疫沈降法(iChIP)による細胞分化制御因子の転写機構の解明

1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明iChIP-SILAC法を用いて、Pax5遺伝子プロモーター領域にB細胞特異的に結合する蛋白質を同定し、そのうちの一つであるThy28蛋白質がPax5遺伝子の発現に重要な働きをしていることを明らかにした。Thy28結合蛋白質を同定し、Thy28は、そのうちの一つであるmyosin-9 (MYH9)蛋白質のPax5遺伝子プロモーターへの結合に重要であることを示した。加えて、MYH9もPax5遺伝子の発現に重要であることを明らかにした。こうした成果をPLoSOne誌に発表した。また、iChIP-RNA-Seq法を用いて、Pax5遺伝子プロモーター領域にB細胞特異的に結合するRNAを同定した。加えて、iChIP-Seq法を用いて、Pax5遺伝子プロモーター領域にB細胞特異的に結合するゲノム領域を同定した。次に、この領域をCRISPR系を用いて欠損させた細胞株を樹立した。現在、この領域がPax5遺伝子発現制御に果たす役割を解析中である。2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明ジーンターゲティング法を用いて、Foxp3遺伝子のTSS近傍にLexA結合配列を挿入したマウスES細胞を作製した。この細胞を用いて、マウス個体を作製し、これと全身の細胞でCreリコンビネースを発現しているマウスとの掛け合わせによって、ES細胞の選択に用いたネオマイシン耐性遺伝子を除去した。このマウス及び対照として野生型C57BL/6マウスから、T-regと対照細胞であるナイーブCD4T細胞を単離した。現在、新たに開発した組換えタグ付きLexA蛋白質を用いたin vitro iChIP法を用いて、Foxp3遺伝子プロモーター領域を単離し、次世代シークエンス法によるT-reg特異的に相互作用しているゲノム領域の同定を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明2-1. Foxp3遺伝子TSS近傍結合ゲノム領域の同定:iChIP解析用に作製したマウスからT-regとナイーブCD4細胞を単離し、iChIP-Seq法を用いて、T-reg特異的Foxp3遺伝子TSS近傍結合ゲノムDNAを網羅的に同定している。現在、ゲノム支援の枠組みを通じて解析を行っている。1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明Pax5プロモーター領域にB細胞特異的に結合しているゲノムDNA・RNA・蛋白質の同定のステップの全てを修了している。結合蛋白質の機能解析については、それに結合する蛋白質の同定と、その機能欠失実験も終えており、現在、論文を投稿中である。結合ゲノム領域については、別の染色体に存在するPax5発現調節領域と思われる領域を同定しており、現在、CRISPR系を用いたこの領域の欠失実験を行っている。2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明iChIP解析用マウスから単離したT-regとナイーブCD4T細胞を用いた、iChIP-Seq解析を先行させ、現在使用している3xFNLDD-Tgマウスの系がうまく動作しているか否かを検討している。動作確認が取れれば、iChIP-RNA-Seq解析及びiChIP-MS解析を用いて、Foxp3プロモーター領域結合RNA及び蛋白質の同定へと進む。

iChIP-Seq解析の結果から、T-regにおけるiChIP系が動いていないことが示唆された場合、別の3xFNLDD-Tgマウスを用いることにより改善を目指す。1. Pax5遺伝子転写調節機構の解明Pax5プロモーター結合ゲノム領域については、別の染色体に存在するPax5発現調節領域のCRISPR系を用いた欠失実験の結果、この領域がPax5の発現に必須であることが示された場合、iChIP-Seq解析の結果から、このゲノム領域をいくつかの亜領域に分けて、その亜領域毎の欠失実験を行って、どの亜領域が重要な働きをしているのかを解明する。Pax5プロモーター結合蛋白質については、DT40細胞で得られた知見が、広く他の種にも当てはまるのか、また、細胞系だけでなく動物個体でのB細胞分化にも当てはまるのか、といった疑問を解明するため、マウスを用いた遺伝子欠損実験を進めている。具体的には、当該遺伝子の機能に重要と思われるエクソンをloxP配列で挟んだFloxedマウスを作製し、これとB細胞やリンパ球全般といった組織特異的Cre発現マウスとを交配させることにより、マウスのB細胞分化における当該遺伝子の役割を解明する。2. Foxp3遺伝子転写調節機構の解明iChIP-Seq解析のデータを詳細に解析し、T-reg特異的にFoxp3プロモーター領域と結合しているゲノム領域を網羅的に同定する。結合ゲノム領域を、近傍の遺伝子の性状等を指標として、共通制御下にある遺伝子群や、発現調節領域等に分類する。さらに、相互作用の意義を、CRISPR系を利用した欠失実験によって調べる。加えて、iChIP-RNA-Seq解析及びiChIP-MS解析を用いて、Foxp3プロモーター領域結合RNA及び蛋白質の同定を行う。結合RNA及び蛋白質がFoxp3遺伝子発現に果たす役割を、遺伝子破壊・欠失実験等のloss-of-function実験によって明らかにする。
卵成熟誘起におけるホルモンの作用機構に関する分子生物学的研究:卵成熟誘起ホルモン(MIH)による卵成熟促進因子(MPF)活性化の分子メカニズム

ホルモンによる卵成熟キナーゼカスケード活性化機構の解明を目指し、その構成分子の分子生物学的単離、同定を試み、以下の成果を得た。キンギョ未成熟卵を卵成熟誘起ホルモン:17alpha,20beta-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン存在下で培養し、経時的に回収した卵細胞質よりcdk2キナーゼを免疫沈降してヒストンH1キナーゼ活性を測定したところ、cdk2活性は減数第一分裂中期頃より上昇し始め、減数第二分裂中期に最高値に達したが活性はcdc2キナーゼの1/10程度であった。一方cdc2とは異なり、間期と成熟卵賦活後における不活性化は見られなかった。また、卵成熟過程においてcdk2タンパク質ならびにmRNA量に顕著な変動は見られなかった。キンギョ成熟卵cDNAライブラリーよりプロテインキナーゼの共通領域をコードする合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングを行い、4種6個のクローンを単離し、塩基配列を決定した(以下GFKINと呼ぶ)。推定されるアミノ酸配列に対する相同配列をデータベースで検索したところ、既知のものはなかったが体細胞分裂関連キナーゼのいくつかと低い相同性が見出された。特にGFKIN5と12は出芽酵母S.cerevisiaeのKIN3キナーゼおよびA.nidulansのNIMAキナーゼに、またGFKIN7と9はMAPキナーゼファミリーにそれぞれ3040%の相同性を持っていた。また、ノーザンブロット分析で当該遺伝子の発現が生殖腺でのみ検出されたことからこれらのキナーゼが卵成熟過程に何らかの機能を果たしているものと推測された。これらのcDNAに対する大腸菌組換えタンパク質を作製し、マウスに免疫したがcDNA産物を認識する抗体は今のところ得られておらず、現在複数の異なるタンパク質発現系を用いて再試行している。
マウス・ラットに対する実践的かつ動物愛護に配慮した吸入麻酔法の開発

本助成金にて購入した「ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)」を用いて,マウスやラットに対して,気管挿管ならびに吸入麻酔を施し,麻酔中のバイタルサインや呼吸に関する各種パラメーターに関する情報をを検討した.その結果,MASを用いた1時間程度の吸入麻酔では,ラットに関しては,ヒト同様に比較的安全な麻酔を施せる事が示唆されたが,マウスの場合には,より詳細な検討が必要と思われた.麻酔は実験動物に多大なる影響を及ぼすと共に,動物実験のデータをも左右する.従って,その適正な使用は必要不可欠である.また,動物実験は本来,ヒトへの外挿を想定している.従って,実験動物に対する麻酔も,出来るだけヒトに準じた処置を施す事が望ましいと考えられる.しかし,実際にはヒトと実験動物への麻酔法は大きく掛け離れているのが現状である.そこで本研究では,ヒトや小動物の臨床において一般に用いられている全身麻酔の1つである気管挿管を施して人工呼吸器を用いた吸入麻酔を,出来るだけ簡便かつ確実,そして実践的な方法を開発する事を目的とした.これまで,マウスおよびラットなどの実験動物への気管挿管法に関しては,それらの動物に3種混合麻酔薬を前投薬として投与する事で,内視鏡技術を応用した「TESALA」を用いて安全かつ簡便に気管挿管する方法を開発し,既に報告した(Konno et al. 2014a, b).これらの実験において,麻酔時間の経過と共に,SpO2などの重要な因子が時間の経過と共に少しずつ悪化していく可能性も確認された.そこで,平成27年度は,この点をより詳細に確認するために「ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)」を購入し,まずはラットに対して使用を試みた.従来通り,MouseOXPlusを用いて,動脈血酸素飽和度(SpO2),などのバイタルサインを計測すると共に,MASを用いて実験小動物の麻酔時における呼吸数,1回換気量,回路内圧など,呼吸器系の生体情報も測定し,これまでの気管挿管ならびに吸入麻酔を多角的に再評価した.その結果,キャリアガスとして空気を用いた場合,麻酔時間の経過と共に,SpO2が低下していく事が示唆された.しかしながら,MASは1分間あたりの呼吸回数や回路内圧の上限,Peep機能なども有しており,それらの機能を有効活用する事で,一層安全な吸入麻酔法が得られる事も示唆されている.現職に移籍した事により,動物実験施設の運営が業務として加わっただけでなく,新棟建設の準備も重なった.それらの影響で実験系の立ち上げに時間を要したり,一時的に実験が滞ってしまう事はあったが,現時点では実験が軌道に乗り,その遅れを取り戻しつつある.ただし,デスクワークに時間を取られ,学会発表や論文作成など,研究成果の情報発信まで手が回らなかった.麻酔は実験動物に多大なる影響を及ぼすと共に,動物実験のデータをも左右する.従って,その適正な使用は大変重要である.また,動物実験は本来,ヒトへの外挿を想定している.従って,実験動物に対する麻酔も,出来るだけヒトに準じた処置を施す事が望ましいと考えられる.しかし,実際にはヒトと実験動物への麻酔法は大きく掛け離れているのが現状である.そこで本研究では,ヒトや小動物の臨床において一般に用いられている全身麻酔の1つである気管挿管を施して人工呼吸器を用いた吸入麻酔を,動物実験を行う実験者に普及出来る程度に,出来るだけ簡便かつ確実,そして実践的な方法を開発する事を目的とした.これまで,マウスおよびラットなどの実験動物への気管挿管法に関しては,それらの動物にKawaiらが2011年に発表した3種混合麻酔薬(メデトミジン:ミダゾラム:塩酸ブプレノルフィンをそれぞれ0.3,4.0,5.0 mg/kgの割合で混合した注射麻酔薬;M/M/B = 0.3/4.0/5.0)を前投薬として投与し,それが十分効果を示した頃(投与後3分以上経過)に内視鏡技術を応用した「TESALA」を用いて安全かつ簡便に気管挿管する方法を開発した.その研究成果は,既に論文(Konno et al. 2014a, b )として発表すると共に,学会や研究会での発表や講演等でも情報発信をしてきた.また,獣医師のうち,実験動物学を専門とする獣医師の集まりである実験動物医学会や,その専門医で構成される日本実験動物医学専門医協会が主催するウェットハンド研究会に講師として招かれ,上記気管挿管法や吸入麻酔法を講義すると共に,動物を用いた実習中にはマウスやラットを用いて実際の気管挿管法やその吸入麻酔法を教授させて頂く機会を得ている.昨年度は,現職場に移籍し研究環境を新たに立ち上げるのに時間を要した.また,現職では動物実験施設の専任教官として施設の運営・管理業務も抱えており,それらの業務に慣れる事にも時間を要した.しかしながら,本年度は研究環境も整い,新たな環境にも慣れた事から,予想以上に順調に実験を進める事が出来た.昨年度に本助成金にて購入した「ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)」を用いて,マウスやラットに対して,気管挿管ならびに吸入麻酔を施し,麻酔中のバイタルサインや呼吸に関する各パラメーターに関する情報を得た.また,これまでよりも長時間にわたり麻酔を施し,その安全性や効果に関しても検討を加えた.その結果,人工呼吸器(MAS)を用いた1時間程度の吸入麻酔では,ラットに関しては,ヒト同様に比較的安全な麻酔を施せる事が示唆された.

一方,ラットと比較して体サイズが1/10程度のマウスの場合には,人工呼吸器の性能を十分発揮させるために,詳細な検討が必要と思われた.なお,これまでの研究成果は,学会発表や研修会等での講演等で、情報公開してきた.また,現在は,研究成果をまとめて論文にて公表するための準備を進めていると共に,来年度には米国で開催予定の米国実験動物学会で発表する準備を進めている.麻酔は実験動物に多大なる影響を及ぼすと共に,動物実験のデータをも左右する.従って,その適正な使用は大変重要である.また,動物実験は本来,ヒトへの外挿を想定している.従って,実験動物に対する麻酔も,出来るだけヒトに準じた処置を施す事が望ましいと考えられる.しかし,実際にはヒトと実験動物への麻酔法は大きく掛け離れているのが現状である.以上の背景を鑑み,本研究では,ヒトや小動物の臨床において一般に用いられている全身麻酔の1つである気管挿管を施して人工呼吸器を用いた吸入麻酔を,実験動物として最も頻繁に使用されるマウスやラットを用いる実験者に普及出来る程度に,出来るだけ簡便かつ確実,そして実践的な方法を開発する事を目的とした.まずマウスやラットに対して,内視鏡を用いて気管挿管を施した.次に本助成金にて購入した人工呼吸器を備えた「ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)」を用いて,イソフルランによる吸入麻酔を施した.また麻酔中のバイタルサインや呼吸に関する各種パラメーターに関する情報も測定し,そのデータを検討した.その結果,MASを用いた1時間程度の吸入麻酔では,ラットに関しては,麻酔時間の経過とともに血中酸素飽和濃度(SpO2)の低下が示唆されたものの,ヒト同様に比較的安全な麻酔を施せる事が示唆された.一方,マウスの場合には,SpO2の経時的低下が顕著で,呼吸に関しても不安定な値を示した事から,より詳細な検討が必要と思われた.本助成金にて購入した「ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)」を用いて,マウスやラットに対して,気管挿管ならびに吸入麻酔を施し,麻酔中のバイタルサインや呼吸に関する各種パラメーターに関する情報をを検討した.その結果,MASを用いた1時間程度の吸入麻酔では,ラットに関しては,ヒト同様に比較的安全な麻酔を施せる事が示唆されたが,マウスの場合には,より詳細な検討が必要と思われた.これまでの研究成果から,マウスやラットに安全かつ安全に気管挿管を施す方法は、ほぼ確立出来た。しかしながら、気管挿管を施す事と、その後に人工呼吸器を用いて安定した吸入麻酔を施す事は別である。そこで昨年度は、ソムノスイート低流量マウス・ラット用麻酔システム(MAS)を導入し,1分間あたりの呼吸回数や回路内圧の上限および下限,Peep機能などを詳細に調節すると共に,経時的な数値変化を記録していった.その結果,非常に安定したバイタルサインの経時的変化が得られ,人工呼吸器を適切に調節する事で実験動物が安定した麻酔状態を得られる事が明らかとなった.しかしながら,これらの機械的な調節にも限界がある事も示唆された.特に,SpO2値が時間の経過と共に低下していく事が明らかとなった.また,MASから得られた呼吸器系のデータから,1分間あたりの呼吸量や1回あたりの呼吸量の低下が,麻酔時間の経過と共に低下していく事も確認され,SpO2値の経時的変化が呼吸器系による換気能の低下に起因する事が示唆された.
構造モデルを必要としない粉末X線結晶構造解析プログラムの開発

初期モデルを用いずに結晶構造を探索するためにモンテカルロ法を用いたプログラムを開発した。目標としたのは、(1)空間群、(2)組成式とZ数(単位格子中の式数)、(3)格子定数、(4)粉末X線回折データ(d値と積分強度)、が与えられたとき、構造を自動的に捜し出し原子座標を精密化することである。粉末X線回折データの実測値と計算値との適合度(R因子)をでモデルの優劣の判定をした。R因子以外の制約条件としてポーリングの第一則、「原子間距離はお互いのイオン半径の和より大きい」という条件を用いた。本研究で開発したプログラムでは、1:ピークのプロファイルではなく積分強度で計算値と実測値を比較する。2:逆空間の非対称単位内の逆格子点のみ計算し、多重度をかけて粉末X線回折強度を計算できるようにラウエ群ごとの多重度の表を内蔵した。3:格子の型、らせん軸、映進面による消滅則を考慮し、消滅する指数は計算しないように空間群ごとの消滅則の表を内蔵した。などのアイデアを取り入れ、計算の高速化をはかった。またどのようなモデルにも簡単に対応できるように、4:230の空間群の対称性をファイルとして持ち、どの空間群に対しても空間群の番号を指定するだけで計算できるようにした。5:原子散乱因子をファイルとして持ち、原子名を指定するだけで計算できるようにした。6:同じサイトに複数の原子が存在する固溶体や、席占有率が1以下の場合にも対応できる様にした。など使いやすさにも考慮した。この方法をいくつかの構造既知の物質に試みたところ、実用的な時間内で構造を解くことができた。また、独立な原子が6個の構造未知の合成物質に対し本プログラムを用いたところ結晶構造を解くことに成功し、以上の考え方が有用であることが証明された。近年粉末法による構造解析(リートベルト法)が普及し多く用いられている。しかしリートベルト法に於ける最大の問題点は概略の構造データを与えないと計算できないことであり、今後の発展のためには構造モデルを容易に得る方法を開発する必要がある。そこで、粉末X線回折データをもとに自動的に結晶構造を決定するプログラムの開発を進めた。すなわち(1)空間群、(2)組成式とZ数(単位格子中の式数)、(3)格子定数、(4)粉末X線回折データ(d値と積分強度)、が与えられたとき、構造を自動的に捜し出し原子座標と温度因子とを精密化する計算プログラムの開発をめざした。以下のような考えでプログラムを作成し妥当性を検討した。温度因子は等方性としB=1.0で固定したので、求めるべきパラメーターは各原子の部分座標(x,y,z)である。原子座標が決まれば理論的に粉末X線回折データを計算することができ、測定値と比較してモデルの適合度を判定することが出来る(R因子:低いほど適合度が高い)。今年度は最も単純に乱数で原子座標を発生させ、R因子で選別するプロセスを検討した。R因子が低くても全く意味のない構造が得られるのでR因子以外の制約条件を導入した。一つはポーリングの第一則であり、「原子間距離はお互いのイオン半径の和より大きい」という条件を用いた。さらにエワルドの方法によりエネルギー計算を行い、エネルギー値が正になるモデルも棄却した。独立な原子が6個の構造未知の合成物質に対し本プログラムを用いたところ結晶構造を解くことに成功し、以上の考え方が有用であることが証明された。解かれた構造については現在論文にまとめている。

粉末法による構造解析法(リートベルト法)が普及し多く用いられている。しかしこの方法に於ける最大の問題点は概略の構造データが必要なことであり、今後の発展のためには構造モデルを容易に得る方法を開発する必要がある。そこで、粉末X線回折データをもとに自動的に結晶構造を決定するプログラムの開発を進めている。入力データとして(1)空間群、(2)組成式とZ数、(3)格子定数、(4)粉末X線回折データ(d値と積分強度)、が与えられたとき構造を自動的に捜し出し原子座標を精密化する計算プログラムの開発をめざしている。前年度の研究でBasicによる基本的プログラムを作成し妥当性を確認したので、本年は計算速度の向上を目指してFortran90によるコーディングと、操作性の向上のため対称操作データベースの作成を行った。このプログラムの基本的な作業は粉末X線回折パターンの一致度が10個から100個程度の独立なパラメーター(原子座標)の関数であるとき、最適値の組み合わせを探索することであり、いかに素早く探索するかが計算速度向上に必須となる。さらなる速度向上を目指してランダムヲーク法、傾斜法などの探索法を比較したがこれまでの所モンテカルロ法(乱数法)がプログラミングの簡便性から優位である。この点はさらなる研究が必要である。また本プログラムの考え方と計算例を論文にして公表した。本プログラムで解いた酸化物の構造は現在投稿中である。初期モデルを用いずに結晶構造を探索するためにモンテカルロ法を用いたプログラムを開発した。目標としたのは、(1)空間群、(2)組成式とZ数(単位格子中の式数)、(3)格子定数、(4)粉末X線回折データ(d値と積分強度)、が与えられたとき、構造を自動的に捜し出し原子座標を精密化することである。粉末X線回折データの実測値と計算値との適合度(R因子)をでモデルの優劣の判定をした。R因子以外の制約条件としてポーリングの第一則、「原子間距離はお互いのイオン半径の和より大きい」という条件を用いた。本研究で開発したプログラムでは、1:ピークのプロファイルではなく積分強度で計算値と実測値を比較する。2:逆空間の非対称単位内の逆格子点のみ計算し、多重度をかけて粉末X線回折強度を計算できるようにラウエ群ごとの多重度の表を内蔵した。3:格子の型、らせん軸、映進面による消滅則を考慮し、消滅する指数は計算しないように空間群ごとの消滅則の表を内蔵した。などのアイデアを取り入れ、計算の高速化をはかった。またどのようなモデルにも簡単に対応できるように、4:230の空間群の対称性をファイルとして持ち、どの空間群に対しても空間群の番号を指定するだけで計算できるようにした。5:原子散乱因子をファイルとして持ち、原子名を指定するだけで計算できるようにした。6:同じサイトに複数の原子が存在する固溶体や、席占有率が1以下の場合にも対応できる様にした。など使いやすさにも考慮した。この方法をいくつかの構造既知の物質に試みたところ、実用的な時間内で構造を解くことができた。また、独立な原子が6個の構造未知の合成物質に対し本プログラムを用いたところ結晶構造を解くことに成功し、以上の考え方が有用であることが証明された。
痴呆性高齢者に対する介護者の意識調査及び痴呆性高齢者の言語能力評価と介護への応用

質問紙調査により、特別養護老人ホームの介護職員における認知症高齢者のコミュニケーション等の状態に対する認識を検討した。独自の質問項目からなる質問紙による調査の結果、346人の有効回答について俳徊の有無別に実施した因子分析の結果、「身体」「不適応」「コミュニケーション」「表現」の4因子から構成され、4因子各々の項目は同一であった。また、因子スコアを使用して各因子間の相関係数を算出すると各因子間において相関が認められた。このため、俳徊の有無に関わらず、介護職員は認知症高齢者の状態を「身体」「不適応」「コミュニケーション」「表現」の視点から捉えていると考察した。また、昨年度に引き続き、太田ステージの評価方法であるLDT-R(言語解読能力テスト改訂版)を用いて、89人の認知症高齢者の表象能力を段階別に分類できるのかを検討した。認知症高齢者の表象能力は、LDT-Rによって認知発達の低い順から段階別に分類できたため、太田ステージによる評価は認知症高齢者の表象能力を段階別に示していると推察した。認知症高齢者の表象能力を評価できれば、理解できるコミュニケーション方法を見出すことが可能になり、援助者との間にコミュニケーションが成立し、認知症高齢者の安定した生活につながると考えた。さらに、認知症の進行で表象能力や言語能力が低下し、物事への興味・関心が薄れることも考慮して、表象能力の段階が低いものには視覚的手がかりがあるパズル、高いものにはカルタを使ったレクリエーションを行った。各々集中して一定時間取り組むことができ、介護職員や利用者とのコミュニケーションをとることが増えたため、意欲的な生活につながっていると推察した。平成17年度においては、アンケート調査により、介護職員が、介護を行っている認知症高齢者の言語能力を含む認知能力についてどの程度把握していると考えているのか、および認知症高齢者のコミュニケーションをとるときに認知能力に応じた配慮をどの程度心がけていると考えているのかを検討した。認知症高齢者に対する介護職員の認識について、症状や行動の理解に関しては「認知障害の理解」「行動障害の理解」「生活障害の理解」、認知能力の把握に関しては「概念把握」「生活把握」「運動把握」、コミュニケーションでの心がけに関しては「具体的心がけ」「受容的心がけ」という概念構造が確認された。また、グループホームの介護職員の方が特別養護老人ホームの介護職員よりも、認知症高齢者の症状や行動に関する「生活障害の理解」、認知能力に関する「概念把握」「生活把握」「運動把握」、およびコミュニケーションに関する「受容的心がけ」の程度を高く捉えていることが示された。さらに、介護職員が認知症高齢者とのコミュニケーションを行う際、コミュニケーションをとりやすいような配慮をすること、相手に理解しやすいように非言語的コミュニケーションをとること、およびコミュニケーションをとりやすい工夫を心がけることの3つの側面について捉えようとしていることが示唆された。このため、介護職員は、認知症高齢者の言語理解の程度を把握したうえで、言語理解の程度に応じたコミュニケーション手段を考慮しながらコミュニケーションをとることを心がけていることが推察された。総じて、認知症高齢者の介護に携わる介護職員が、認知症高齢者の認知能力を把握する際の視点、および認知症高齢者とコミュニケーションをとるときに心がけている視点を見出し、これらについて検討した。アンケート調査により、特別養護老人ホームとグループホームの介護職員における、認知症高齢者の認知能力とコミュニケーションでの心がけに関する認識について検討した。独自の質問項目からなる質問紙調査において介護職員393人から有効回答が得られた。因子分析により、認知能力の把握については「生活性」「概念性」「言語性」「運動性」の4因子、コミュニケーションでの心がけについては「具体的対応」「受容的対応」「把握的対応」の3因子が各々抽出された。7因子共グループホームの介護職員の方が肯定的な認識を持っていた。グループホームには定員が少ないこと、認知症高齢者だけを介護していること、生活空間がはっきりしていること、個室であること等の特性が認知能力の把握とコミュニケーションでの心がけに関する認識に違いをもたらしていると考えた。太田ステージの評価方法であるLDT-R(言語解読能力テスト改訂版)を用いて認知症高齢者の表象能力を段階別に分類し、認知症高齢者の表象能力を評価する意義について検討した。LDT-Rを使用して54人の認知症高齢者の表象能力を評価すると5つのステージすべてに該当者がおり、5つのステージに明確に分かれたため、認知症高齢者の表象能力を評価できることが示唆された。また、ステージが高くなるほどLDT-R得点が高い者が多くなり、各ステージ間のHDS-R(長谷川式認知症スケール)得点の差には有意差が認められた。このため、太田ステージによる評価は認知症高齢者の表象能力を段階別に示していると考えた。表象的思考が困難な認知症高齢者とコミュニケーションをとる際非言語的要素を含めること、表象的思考が可能な場合は言語コミュニケーションに努めることが働きかけの留意点となる。認知症高齢者の表象能力を評価するとによってコミュニケーションにおける留意点を見出すことが可能になると考察した。上記のアンケート調査に関する論文を作成し、老年社会科学29(1)(2007.4刊行)に掲載予定。

また、因子スコアを使用して各因子間の相関係数を算出すると各因子間において相関が認められた。このため、俳徊の有無に関わらず、介護職員は認知症高齢者の状態を「身体」「不適応」「コミュニケーション」「表現」の視点から捉えていると考察した。また、昨年度に引き続き、太田ステージの評価方法であるLDT-R(言語解読能力テスト改訂版)を用いて、89人の認知症高齢者の表象能力を段階別に分類できるのかを検討した。認知症高齢者の表象能力は、LDT-Rによって認知発達の低い順から段階別に分類できたため、太田ステージによる評価は認知症高齢者の表象能力を段階別に示していると推察した。認知症高齢者の表象能力を評価できれば、理解できるコミュニケーション方法を見出すことが可能になり、援助者との間にコミュニケーションが成立し、認知症高齢者の安定した生活につながると考えた。さらに、認知症の進行で表象能力や言語能力が低下し、物事への興味・関心が薄れることも考慮して、表象能力の段階が低いものには視覚的手がかりがあるパズル、高いものにはカルタを使ったレクリエーションを行った。各々集中して一定時間取り組むことができ、介護職員や利用者とのコミュニケーションをとることが増えたため、意欲的な生活につながっていると推察した。
前立腺癌骨特異的転移機構の解明と薬物療法への展開

前立腺癌の骨特異的転移機構の解明においては二つの方向から検討した。一つは前立腺癌が男性ホルモンに依存性の癌であること、また骨特異的転移を示し乳ガンは女性ホルモンに依存することより、性ホルモンが骨特異的転移機構に関与しているのではないかとの推測である。次に、性ホルモンには関係なく骨組織に前立腺癌骨特異的転移を示す原因物質が存在するのではないかとの推測である。最初の推測では、性成熟をした雄雌のラット、性未成熟の雄雌のラットを基本モデルとした。それらの骨髄を抽出し、前立腺癌培養細胞の接着具合を検討した。その結果、性成熟をした雄ラットの骨髄抽出液には前立腺癌培養細胞は強い接着を示したが、性成熟したメスラットや性未成熟の雄雌ラットのそれには接着を示さなかった。また、メスラットにテストステロンを負荷したモデルでは血中テストステロンは増加したが、やはりその骨髄抽出液には前立腺癌細胞は背着を示さなかった。以上より性成熟した雄ラットの骨髄抽出液中には、たとえテストステロン値が高値でもメスラットの骨髄中には存在発現しない、前立腺癌骨特異的転移に関与する物質が存在すると考えられた。一方、雄ラットの骨髄抽出液を、クロマトグラフィーで分画し、前立腺癌培養細胞と最も接着を示す分画を決定した。そのアミノ酸配列や分子量を検討するとヘモグロビンであることがわかった。ヘモグロビン自体は人体に大量にある物質であり、骨特異的転移の原因物質と特定するには抵抗がある。しかし、その構造の一部やアミノ酸配列の一部が一致した何らかの物質が骨髄中に存在し、それが前立腺癌骨特異的転移の原因物質の一つである可能性はあると思われた。前立腺癌は骨に特異的に転移するが、その機構は完全には解明されていない。今回の研究では骨組織にその原因となる物質が存在すると考えそれを同定した。ウサギ骨髄から骨髄液を抽出し、高速クロマトグラフィーを用いて分画に分けた。それぞれの分画の成分に対する細胞接着性を確認した。用いた細胞はヒト前立腺癌細胞株(PC-3:骨転移巣由来)である。In vitroにおいてこの細胞株が一番接着する分画の成分に前立腺癌の骨特異的転移の原因物質が存在すると考えた。その分画を決定したのち、その分画をSDS-PAGEで分けて単離されていることを確認。アミノ酸解析と分子量解析を行った。その結果hemoglobin α鎖であることを確認した。用いたサンプルはウサギであったため、種を同じくするためにヒトhemoglobinをもちい、PC-3と接着の確認実験を行った。HemoglobinをFITCラベルしてHemoglbinとPC-3の接着を検討した。濃度依存的にPC-3は接着を示した。またFITCラベルをしていないhemoglobinでブロックしておい後の接着実験においてFITCラベルをしたhemoglobinの接着はブロックしたhemoglobin濃度に依存してブロックされた。RC-3のほかコントロールとして、非特異的転移の代表としてヒト大腸癌細胞と非固形腫瘍の代表としてヒト白血病細胞を用いてhemoglobinとの接着実験を行った。PC-3がhemoglobinともっとも接着を示した。以上より前立腺癌の骨特異的転移の骨組織中の原因物質としてhemoglobinが考えられた。一つは前立腺癌は男性ホルモンに依存性の癌であること、また骨特異的転移を示し乳ガンは女性ホルモンに依存することより、性ホルモンが骨特異的転移機構に関与しているのではないかとの推測である。

最初の推測では、性成熟をした雄雌のラット、性未成熟の雄雌のラットを基本モデルとした。それらの骨髄を抽出し、前立腺癌培養細胞の接着具合を検討した。その結果、性成熟をした雄ラットの骨髄抽出液には前立腺癌培養細胞は強い接着を示したが、性成熟したメスラット、や性未成熟の雄雌ラットのそれには接着を示さなかった。また、メスラットにテストステロンを負荷したモデルでは血中テストステロンは増加したが、やはりその骨髄抽出液には前立腺癌細胞は背着を示さなかった。以上より性成熟した雄ラットの骨髄抽出液中には、たとえテストステロン値が高値でもメスラットの骨髄中には存在しない、前立腺癌骨特異的転移に関与する物質が存在すると考えられた。一方、雄ラットの骨髄抽出液を、クロマトグラフィーで分画し、前立腺癌培養細胞と最も接着を示す分画を決定した。そのアミノ酸配列や分子量を検討するとヘモグロビンであることがわかった。ヘモグロビン自体は人体に大量にある物質であり、骨特異的転移の原因物質と特定するには抵抗がある。しかし、その構造の一部やアミノ酸配列の一部が一致した何らかの物質が骨髄中に存在し、それが前立腺癌骨特異的転移の原因物質の一つである可能性はある。
腸管樹状細胞を支配する転写プログラムの解明

樹状細胞(Dendriric cells ; DC)には複数のサブセットが存在し、それぞれが少しずつ異なった機能を持ち、多様な免疫応答を制御している。なかでも腸管粘膜固有層樹状細胞(Lamina propria dendritic cells ; LPDC)は腸管免疫系の中枢を担い、常に大量の異物が存在する腸管という特殊な環境において、その恒常性を保つために独特な機能を持つ。しかしながら、LPDCの分化や機能発現を制御している分子機構は完全には明らかになっておらず、その多様かつ特殊な機能がいかにして維持されているかは、現在の免疫学における大きな謎である。そこで申請者は、樹状細胞分化に関与することが知られている転写因子であるIRF4およびIRF8に注目し、LPDCの分化・機能における転写因子の役割について研究を行っている。本年度は、LPDCの単離法の確立を行った。その結果、小腸および大腸の粘膜固有層よりLPDCを単離する手法を確立することができた。さらに、IRF4およびIRF8欠損マウスの小腸および大腸の粘膜固有層より細胞を単離し、解析を行ったところ、一部のLPDCサブセットの著しい減少が確認された。また、より正確にLPDCにおけるIRF4およびIRF8の機能を明かにするために、DC特異的にIRF4およびIRF8を欠損したマウスを入手し、現在解析の準備を進めている。今後、IRF4およびIRF8依存的に分化するLPDCサブセットの腸管免疫系における役割を明らかにし、さらにその機能発現の分子機構について解析を進める予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
a-Siイメージセンサを用いたPIXE用蛍光X線分析装置の開発

研究計画に照らして、下記の結果を得た。なお、サイクロトロンの開発が、当初の計画より大幅に遅れ、平成6年5月に予備実験が行えたが、その直後に、開発を行っていた会社の社長が急死し、その後開発者の方針で、別会社にサイクロトロンを移設する必要が生じ、現在まで、サイクロトンによる実験は行えない状況であった。そのため、検出器の特性等は、X線発生装置を用いて取得されている。また、当初予定していたセメントにおける3CaO・SiO_2と2CaO・SiO_2の混合比の定量分析は、今後加速器が稼働され次第行う予定である。1)a-Siイメージセンサについて、キャノン製と鐘縁化学製のセンサについて、5.4keVの単色X線により、X線強度に対する比例性、位置分解能、暗電流の安定性、およびX線感度などについてのデータを取得し、キャノン製が適していることが分かった。2)有感領域の幅が広いa-Siセンサを特注して製作するのが困難であったので、TI社製のCCDによる二次元X線検出器および信号処理装置を製作し、蛍光体を用いないで、直接X線を検出する方式により、5.4keVの単色X線により、位置分解能、およびX線感度などについてのデータを取得した。また可視光により、照度に対する出力の比例性や暗電流の安定性に関するデータを取得し、検出限界の評価を行った。CCDを冷却する装置も製作したが、加速器と一体となった真空容器中で行う必要があり、上述の理由により、冷却した場合のCCDの特性は、取得されていない。3)これまでの結論として、X線強度が十分に得られる場合には、多くの元素が同時に分析出来るa-Siセンサの検出器が有効である。また、特定のエネルギーピークを、高いエネルギー分解能や検出感度で分析する必要がある場合には、冷却型CCDの検出器が有効である。実施計画に照らして、下記の結果を得た。1)分析対象をNaからPとするので、分光結晶としてRbAPを選定し、別途受託研究費で購入した。2)光受光部と蛍光体の距離を極力短くしたことより、キャノン製のa-Siイメージセンサを選定し、購入した。また、比較の為に、東芝製の長尺のリニアCCDイメージセンサも購入した。いずれも、センサの画素のピッチは125mumである。またセンサの設置位置は目標のエネルギー幅などを考慮して、計算により求めた。3)蛍光体としてCsI(T1)を選定し、真空蒸着によりセンサ表面に蛍光膜を形成させ、単色X線を用いて検出効率を求めた。4)信号処理回路を自作し、パーソナルコンピュータ制御の計測システムを完成させた。5)ソフトウェアの開発も平行して行なった。6)Crの5.4KeVの特性X線を用いて、センサの感度の蛍光膜厚依存性、出力のX線強度に対する比例性、位置分解能、システムの時間的安定性などの特性を測定により求めた。サイクロトロンを用いた実験は、サイクロトロンの開発が遅れたため、次年度に延期せざるを得なかった。また、当初の計画以外に、以下のことを行った。1)実際の測定場で、種々のエネルギーに対する検出感度を求める為に、光電子増倍管からなるX線計数器を自作した。2)回折X線の分布を詳しく測定し、高検出効率のセンサの設計に役立てるために2次元イメージセンサを購入し、信号処理回路の一部を製作した。4)先の2次元センサは、高エネルギー分解能でかつ高感度のPIXE用システムとしても有望であり、そのためには、ローノイズな信号処理システムの開発が必要であるので、低サンプリング時でもノイズレベルやノイズ周波数の測定が可能なディジタルオシロスコープを購入し、信号処理回路を自作中である。
難治性小児白血病に対する移植片対白血病効果における細胞傷害因子の臨床意義の解明

難治性の小児急性リンパ性白血病においては、同種造血幹細胞移植による移植片対白血病(GVL)効果が残存白血病を駆逐する可能性が知られている。GVL効果の機序として、細胞傷害性Tリンパ球やNK細胞上に発現されている細胞傷害因子であるTRAILが、白血病細胞上に発現されているdeath受容体を介して白血病細胞に細胞死を誘導することが、その1つにあげられる。本研究では、17 ; 19転座やPhiladelphia染色体陽性の白血病において、転座に由来する融合遺伝子が白血病細胞のdeath受容体の発現を増強してTRAIL感受性に関与していることを明らかにした。本研究では、同種造血幹細胞移植における移植片対白血病(GVL)効果で中心的な役割を担う細胞傷害因子のTRAIL感受性について、転座由来の融合遺伝子産物の作用と、TRAIL受容体遺伝子プロモーターのメチル化状態との関連性、の2点を重点的に解析した。このうち17;19転座型急性リンパ性白血病(ALL)では、転座由来のE2A-HLFがTRAIL受容体のDR4・5発現を誘導することを明らかにしているが、E2A-HLFはDR4・DR5遺伝子のプロモーターを活性化させるものの、この領域にはE2A-HLFが結合する塩基配列は存在せずE2A-HLFは間接的に作用していると想定された。一方、DR4とDR5遺伝子のプロモーター間では相同性が極めて低く、E2A-HLFが特定の転写因子を介さずに両者のプロモーターを活性化している可能性も含めて解析を進めている。Philadelphia染色体(Ph1)由来のBCR-ABLがDR4・5遺伝子の発現を誘導することを明らかにしているが、Ph1陽性白血病細胞でImatinibによってBCR-ABLの活性を抑制するとDR4・DR5の発現も抑制される。この時に細胞周期の停止も誘導されることから、TGFβやover-growthによる細胞周期停止でのDR4・DR5発現の変化を解析したところ、DR4の発現のみ低下したことから、少なくともBCR-ABLによるDR4発現の維持は細胞周期促進効果と直結していることが示唆され、さらに解析を進めている。プロモーターのメチル化との関連性に関しては、T細胞性ALLでのDR4・DR5の低発現への関与について報告し、11q23転座型ALLでのDR4・5低発現において、遺伝子のメチル化とともに転写活性自体が低いことも関与している可能性を見いだして解析を進めている。Ph1陽性白血病細胞は、高頻度で細胞傷害因子のTRAILに対するdeath受容体であるDR4とDR5を発現し高いTRAIL感受性を示すことから、TRAIL-DR4/DR5系はPh1陽性白血病に対する同種造血幹移植後のGVL効果に関与している可能性が示唆されている。しかし、Ph1陽性白血病細胞であってもDR4/DR5発現が低くTRAILに耐性を示す場合があり、このTRAIL耐性の克服は同種造血幹移植の治療成績向上のために重要な課題である。いくつかの癌腫では、小胞体ストレス(ER stress)誘導剤がDR4/DR5の発現を誘導してTRAIL感受性を高めることが報告されており、またBCR-ABLのチロンシンキナーゼ活性阻害剤であるImatinibが心筋においてはER stressを誘導することが報告されている。そこで、Ph1陽性白血病細胞のTRAIL感受性に対するER stress誘導剤およびImatinibの効果について検討した。その結果、各種のER stress誘導剤がPh1陽性白血病細胞にDR4/DR5の発現を誘導してTRAIL感受性を高める一方で、ImatinibはPh1陽性白血病細胞にER stressを誘導せずに、むしろBCR-ABLの抑制効果によつてDR4/DR5発現を抑制することを明らかにした。またPh1陽性白血病細胞をあらかじめImatinibで処理するとTRAIL感受性が低下することを見いだした。その一方で、ImatinibとTRAILを同時に作用させるとTRAIL感受性は維持された。これらの知見は、同種造血幹移植後にImathibを投与する場合には、条件によってはGVL、効果をかえつて抑制してしまう可能性を示唆している。これまでの本研究では、1.imatinibおよびsiRNAを用いてPh1陽性細胞株および臨床検体のBCR-ABLの活性を抑制するとDR4/DR5の発現が低下すること、2.BCR-ABLをPh1陰性白血病細胞株に遺伝子導入するとDR/DR5発現が誘導されること、3.imatinibでPh1陽性細胞を前処理するとTRAIL感受性が低下することを明らかにしてきた。

そこで本年度の研究では、imatinibおよびsiRNAによるPh1陽性白血病細胞株におけるDR4/DR5発現の抑制が細胞死誘導による二次的な変化ではないことを、カスパーゼ阻害剤の添加によって細胞死を抑制してもDR4/DR5発現が抑制されることで証明した。また、imatinibによるPh1陽性白血病細胞株のTRAIL感受性低下がDR4/DR5の発現抑制を介する現象であることを、imatinibのDISC(death-inducingsignahngcomplex)分子発現への影響がTRAIL感受性低下に関係している可能性が低いことからも確認した。さらにBCR-ABLの下流でMAPK経路がDR4/DR5発現に関与していることを、ERK1のsiRNA導入によってDR4/DR5発現が低下する事で確認した。こうした解析結果は、BCR-ABLがPh1陽性白血病におけるDR4/DR5発現に直接に関与していることを示しており、この研究成果は2012年4月にOncogene誌にacceptされた。
モモシンクイガの食害で誘導されるリンゴ果実の防御応答機構に関する研究

モモシンクイガ幼虫が食入したリンゴ果実に誘導される化合物のうち、幼虫の死亡率が高い着果に特異的な化合物としてクロロゲン酸(CGA)及びp-クマロイルキナ酸(p-CoQA)を同定した。幼虫の発育阻害程度は個体によって異なり、食入初期に死亡するものから、数ヶ月を経て老熟幼虫が果実を脱出するものまで、ばらつきが大きい。そこで、CGA及びp-CoQAの動態と幼虫の発育阻害程度との関連性を調べた。幼虫食入前の果実では両化合物はいずれも少なかったが、幼虫が食入初期に死亡した果実では、幼虫に発育阻害が見られない果実に比較して、食入孔付近におけるCGAの誘導量が多かった。食入初期には死亡せず発育遅延した幼虫が内部に存在する果実では、食入孔付近のCGA及びp-CoQAの濃度は幼虫に発育阻害が見られない果実と差がないが、果実内部における両化合物の濃度が高かった。果実全体を1cm角に切り、発育阻害関連物質の分布を調べた結果、部位による濃度の偏りが見られた。果実内の分布が一様ではなく局在するために幼虫の摂取量に違いが生じ、発育阻害程度に個体間差をもたらしていることが考えられた。モモシンクイガが食入したリンゴでは、食害部位に3-oxo-TAやpomaceic acidなどのトリテルペン類も誘導される。これらは幼虫死亡率が低い摘果でも誘導されるため、幼虫の発育阻害に関与しないと推定され、実際にトリテルペン類を含む画分を人工飼料に添加しても、発育に悪影響は認められなかった。同じく果実を食害するナシヒメシンクイに対しても活性は認められなかった。一方、リンゴを加害しないハスモンヨトウや、リンゴの葉を主体に加害するリンゴコカクモンハマキに対しては摂食阻害活性を示した。トリテルペン類にみられる活性の種間差は、リンゴをとりまく各種昆虫の食性とリンゴの防御反応に対する適応の一端を説明できる可能性がある。モモシンクイガによる被害果に誘導される化合物の同定、及び誘導された化合物の生理活性の評価が順調に進んでいる。また、標的化合物の果実内分布が明らかになり、リンゴ果実における誘導メカニズムの解明につながる成果が得られている。果実内で食害により誘導される化合物の果実断面におけるイメージングを試みる。浜松ホトニクスのイメージングマスの新技術ではイチゴ等果実断面の化合物分布を高解像度で追跡することが可能になっており、この技術が当該研究でも実用可能かを検討する。また、モモシンクイガ幼虫体内各部位の抽出物中から、リンゴ果実における様々な二次代謝物を誘導するエリシターを探索する。鱗翅目幼虫で植物防御応答のエリシターとして知られるFACs(fatty acid amino acid conjugates)がモモシンクイガ幼虫の唾液からも検出されている。通常、活性が知られるグルタミン型FACs(N-linolenoyl-L-glutamine)に加えてグルタミン酸型FACs(N-linolenoyl-L-glutamic acid)も持っており、これら化合物をリンゴ幼果に処理して、誘導される二次代謝物質をLCMS分析することで生理活性を明らかにする。これら既知のエリシターがクロロゲン酸類やトリテルペン類の誘導に関与していなかった場合は、未知のエリシター探索を試みる。リンゴ果実に食入したモモシンクイガ幼虫は大半が発育途中で死亡する。高い死亡率は樹に着果した果実(着果)のみで認められ、樹から切り離した果実(摘果)では幼虫は正常に発育する。これまで、モモシンクイガが食入したリンゴ果実において複数の誘導性化合物を確認しており、そのうち着果に特異的に誘導される化合物としてクロロゲン酸およびp-クマロイルキナ酸を同定している。両化合物が幼虫の発育阻害に関与することを裏付けるために、次のような実験を行った。1果実当たり1個体のモモシンクイガ幼虫を食入させて一定期間経過させた着果被害果サンプルを作成し、幼虫の発育阻害程度の違いによって「初期死亡果実」(幼虫が食入直後に死亡し、果実内に糞、幼虫とも確認されない果実)、「発育阻害果実」(果実内部に糞が存在し、幼虫がある程度発育していることが確認できるが、老熟幼虫の脱出まで至っていない果実)、「幼虫脱出果実」(老熟幼虫がすでに脱出している果実)の3つのグレードに分類し、発育阻害程度とクロロゲン酸およびp-クマロイルキナ酸の誘導量との関係を調査した。その結果、発育阻害程度の低い「幼虫脱出果実」と比較して、「初期死亡果実」や「発育阻害果実」ではクロロゲン酸およびp-クマロイルキナ酸の誘導量が多く、特に「初期死亡果実」では、幼虫の食入口付近で既に誘導量が多かった。この結果は両化合物のモモシンクイガ幼虫に対する発育阻害活性を示すものであると考えられた。また、傷害によって果実に誘導される化合物として、これまで2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12- ursen-28-oic acid(3-oxo-TA)を明らかにしていたが、同様に傷害によって誘導される3-oxo-TAの類縁体の構造解析を行い、Pomaceic acidと同定した。着果被害果に特異的に誘導される化合物がモモシンクイガに対する発育阻害活性を有することを示すデータを得られたことから、おおむね順調に進んでいると考える。