hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移植医療への応用を目指した次世代免疫細胞療法の構築に関する研究

研究期間中、1. iPS細胞から細胞免疫治療に用いる各種DCを簡易に大量作製するための分化誘導法を樹立した。また、制御性DCへの分化誘導を行い、その抑制機能有することを明らかにした。2.マウス肝移植後免疫寛容モデルにて、グラフトにMDSCの存在を確認し、有意にT細胞の増殖を抑制することを明らかにした。3. siRNAを抗原提示細胞特異的なDDS技術と抱き合わせることで、CD40-CD154の活性化を抑制するで、移植心生着延長の効果を明らかにした。4.新規免疫抑制剤として、5-ALA/SFCのHO-1発現誘導効果を検証し、制御性DCを誘導することで、移植心生着延長の効果を明らかにした。本年度の研究は、1.iPS細胞からより簡易・大量に樹状細胞(DC)作製する方法の確立を行った:今まで確立したES、iPS細胞から樹状細胞を作成する分化誘導技術を基盤として、細胞免疫治療に用いる各種DCを簡易に大量に作製するための分化誘導方法を検討した。Step-1で7日間培養し、iPS細胞のコロニーが十分に分化したことを確かめたのち、Step-1の1枚の培養皿をトリプシン処理し、iPS細胞、OP9細胞とも単細胞にし、ゼラチンコートしたStep-1と同サイズの培養皿3枚に等量に播種し、Step-2の培養過程に入り、十分量の分化誘導された浮遊細胞を得ることができた。Step-2の速い時期で、その後の培養により、DCの能力を十分に備えた細胞を既存培養方法よりも3日ほど早く、かつ2倍ほどの大量な分化細胞を得ることができた。また、Step-3での分化誘導培養時に使用する培養皿に多くの細胞が接着し、マクロファージに分化しやすい傾向があった。この点を改良するためHydroCell培養皿に播種したところ、DCの性質に相応した培養ができ、効率的にDCを得ることができた。2.iPS細胞から制御性DC(iPS-DCreg)への分化誘導およびその機能解析を行った:iPS-DCreg細胞の誘導は、IL-10、TGF-β等様々なサイトカインの添加によって検討した。その結果、iPS-DCregでは、骨髄由来制御性DC(BM-DCreg)とほぼ同様で、Ia、CD80、CD86、CD40等表面分子の発現は通常性(Conventional)DC(DCconv)より顕著に減弱した。ギムザ染色による細胞形態の観察においてもBM-DCregとの差が見られなかった。また、卵白アルブミン(OVA、タンパク質抗原)或はデキストラン(Dextran、糖質抗原)の抗原プロセシング機能が維持されていることが確認できた。さらに、iPS-DCregは、BM-DCregと同様アロ刺激によるT細胞増殖の抑制機能がiPS-DCregの用量に比例していた。これらの結果からiPS細胞から制御性DCに分化誘導することができたといえる。本年度の研究は、新規免疫抑制剤として、ALA塩酸塩およびクエン酸第一鉄ナトリウム(SFC)の合剤のヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)発現誘導効果を検証し、臓器移植への応用の可能性を検討した。ヘム生合成経路の中間体である5-アミノレブリン酸(5-ALA)は鉄イオン(Fe2+)と同時に細胞に作用させることで著しいヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)発現を誘導した。実際に、マウスマクロファージ様細胞株RAW 264において5-ALAとFe2+を作用させることで細胞内ヘム量の上昇が確認された。ヘムはHO-1転写抑制因子Bach1と結合することでその分解を誘導することが知られている。Bach1を標的とした免疫沈降により得られたサンプル中にもヘムが確認されたことから5-ALAの添加によってもBach1-ヘム複合体の形成が起き、Bach1分解によるHO-1誘導の促進が起きていることが示唆された。同時に、5-ALAとFe2+はHO-1転写因子Nrf2の核への移行を誘導した。また、Nrf2 siRNAを用いたNrf2発現の抑制は5-ALAとFe2+によるHO-1誘導を阻害した。更に、Nrf2の上流にあるとされるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)ファミリーであるErk1/2とp38のリン酸化も確認されており、それぞれの阻害剤によって部分的にではあるが5-ALAとFe2+によるHO-1誘導が阻害されたことからこれらの経路がRAW 264における5-ALAとFe2+によるHO-1誘導に関係していることがわかった。

これらの結果から5-ALAとFe2+はRAW 264においてヘムへの代謝を促進することでBach1の分解を誘導し、同時にErk1/2とp38を活性化することでNrf2の活性化をもたらす2つの経路によってHO-1を誘導していると考えられた。今後新規免疫抑制剤としての臓器移植への応用の可能性を検討を進める予定である。本年度の研究は、1.マウスアロ同所性肝移植後免疫寛容誘導モデルにて、移植後のグラフトにおけるミエロイド由来抑制細胞(MDSC)の存在を確認した上、非実質細胞(NPC)から単離したCD11b陽性細を用い、有意にT細胞の増殖を抑制出来ることを明らかにした。次に、マウス骨髄細胞にhepatic stellate cells (HSC)を共培養したものにGM-CSFの存在下MDSCへの分化誘導を試み、得られた細胞のCD11b陽性細胞がGr-1の発現は高いものの、CD11cの発現は極めて低く、典型的なMDSCであることを確認した。この細胞をregulatorとして、リンパ球混合反応(MLR)の実験系に添加したものは、CD4、CD8T細胞のアロ反応増殖は抑制された。MDSCが肝移植後免役寛容誘導には関わっていることや、MDSCがin vitroで骨髄から分化誘導することが示唆された。2. siRNAを抗原提示細胞特異的なDDS技術と抱き合わせることで、共刺激因子シグナルCD40-CD154の活性化を抑制するによる移植臓器生着延長の検討を行った。(i) 100日以上の安定的なグラフト生着、(ii)レシピエントにTreg, DCregの誘導を確認したこと、(iii)ドナー特異的な免疫寛容であったことを明らかにした。また、移植後の拍動日数が30日のマウス脾臓から各分画の細胞を調製し、CD11c(+)マクロファージ、或はCD4(+)CD25(+)Treg細胞を添加したグループにおいて、アロ応答による細胞増殖を5065%程度抑制することが確認できた。レシピエントの生体内で誘導されている免疫的寛容状態が、ドナー抗原特異的なものであるかどうか確認する実験として、Adoptive cell transfer (養子移入試験)を実施し、コントロールと比較して、有意なグラフト生着延長を確認した。免疫抑制剤は移植医療を確立させたが、半永久的投与、慢性拒絶、感染症・癌、その他副作用等による、身体的、精神的および経済的負担が大きく、新たな拒絶反応抑制方法や薬剤が切望されている。本年度の研究は、昨年度のALA塩酸塩およびクエン酸第一鉄ナトリウム(SFC)のHO-1発現誘導効果の結果を踏まえ、マウス同種異系心移植モデルを用いて、5-ALA/SFCの投与による免疫抑制、免疫寛容の誘導効果を検討した。ドナーマウスにはC57BL/10(B10)マウス、レシピエントマウスにはCBAマウスを用いた。移植後、5-ALA/SFCの投与で移植臓器の長期生着効果が得られ、その効果は5-ALA/SFCの濃度に依存的であった。また、5-ALA/SFCによる長期的な免疫寛容の誘導はHO-1阻害剤ZnPpIXの投与によって完全に失われたことから、5-ALA/SFCによる移植心への長期的な免疫寛容の誘導にHO-1が関係していることがわかった。一方、5-ALA/SFCを投与したマウスの術後14日における移植心ではCD8陽性細胞の増加は確認されなかったが、Foxp3陽性CD4細胞の増加が確認された。
非メチオニン翻訳開始大腸菌の創出から捉える開始メチオニンの意義

本研究では,細胞内の全開始メチオニンtRNAをメチオニン以外のアミノ酸をチャージさせるように改変し,全てのタンパク質がメチオニン以外のアミノ酸から始まるような細胞を作成する.そして,その細胞の翻訳効率,プロテオーム,表現型を観察することでタンパク質合成における開始メチオニンの役割を理解することを目的としている.申請者は大腸菌ゲノム中の全ての開始tRNA遺伝子を欠損し,プラスミドによってそれを相補することによって生育可能となるような細胞を作成した.このプラスミドを開始tRNAに変異を入れたプラスミドと置き換えることで,その変異開始tRNAが細胞の生育を可能にするものかどうか判別することができる.初年度では,開始tRNAのアンチコドン部位の塩基を改変し,生育可能な変異開始tRNAの探索を中心に研究を進めた.まず,アンチコドンを1塩基ずつ元の開始tRNAと異なる塩基に改変していったところ,全ての場合について生育可能な変異tRNAは得ることはできなかった.次に,アンチコドンを中心に3,5,7塩基についてランダマイズを行った.その結果,計9種類の変異開始tRNAの配列をもつ開始tRNA変異細胞を単離することができ,その中の7種類についてはアンチコドンとその周囲に複合的に変異が入っていた.また,興味深いことに,そのうち6種類の細胞では異なる2種類のプラスミドが共存している状態を維持するものであり,それらについては翻訳開始においてお互いに機能を補っている可能性が示唆された.現在はこれら変異開始tRNAが受容しているアミノ酸の解析と細胞内タンパク質のN末アミノ酸の解析を進めている.また,並行して,開始tRNAのアンチコドンに本来備わっていない修飾塩基を導入した細胞を作成し,リボソームプロファイリング,プロテオーム解析を行ったところ,非AUG開始コドンにおいて翻訳開始の低下が観察された.本研究では,細胞の全開始tRNAを変異型にするために,元の野生型開始tRNAをコードしたプラスミドを変異開始tRNAをコードしたものに置き換えるといったカウンターセレクション法を用いている.しかし,対象が開始tRNAといったタンパク質合成に重要な因子であるためか,継代しているうちに生育不可能になってしまうことが多く,変異細胞株の維持が不安定であることが考えられた.当初の対策として,カウンターセレクション法に用いる抗生物質の濃度や開始tRNAをコードするプラスミドのコピー数などを検証してみたが,改善がみられず変異細胞株の単離作業が困窮していた.そこで,宿主内でプラスミドが置き換わる際に細胞が不安定になると考え,元の野生型開始tRNAプラスミドと変異型プラスミドを共存させる時間を長くとってみたところ,カウンターセレクションの成功率を上げることができ,現在は得られた変異細胞株を安定的に維持することができるようになっている.また,次年度の予定として挙げていたリボソームプロファイリングについて予備実験として修飾塩基をアンチコドンに導入した変異開始tRNA細胞を用いて行っていたが,最近,翻訳開始状態をモニターするためにはリード長が長いmRNAフットプリントを解析することが一般的な解析法と確立されたため,再解析なども行っている.以上の理由により、申請時の予定よりもやや遅れていると考えている。今後の予定としては,得られた変異開始tRNAについて受容しているアミノ酸の解析やその受容効率の測定を行う.その結果次第では,アミノ酸受容能を向上させるような変異を検討し,さらなる開始tRNAの改変を行う.また,並行して、獲得できている開始tRNA変異細胞について、栄養飢餓や酸化ストレスなど生育環境ストレスに対する感受性を観察し,その表現型の探索を行っていく.影響が顕著に見られた場合は順次,その条件下で細胞内のプロテオーム解析やリボソームプロファイリングを行い,遺伝子発現パターン,特にそれぞれの遺伝子の翻訳開始段階に注目し,どのような影響が表れているかを追究していく予定である.本研究では,細胞内の全開始メチオニンtRNAをメチオニン以外のアミノ酸をチャージさせるように改変し,全てのタンパク質がメチオニン以外のアミノ酸から始まるような細胞を作成する.そして,その細胞の翻訳効率,プロテオーム,表現型を観察することでタンパク質合成における開始メチオニンの役割を理解することを目的としている.申請者は大腸菌ゲノム中の全ての開始tRNA遺伝子を欠損し,プラスミドによってそれを相補することによって生育可能となるような細胞を作成した.このプラスミドを開始tRNAに変異を入れたプラスミドと置き換えることで,その変異開始tRNAが細胞の生育を可能にするものかどうか判別することができる.初年度では,開始tRNAのアンチコドン部位の塩基を改変し,生育可能な変異開始tRNAの探索を中心に研究を進めた.まず,アンチコドンを1塩基ずつ元の開始tRNAと異なる塩基に改変していったところ,全ての場合について生育可能な変異tRNAは得ることはできなかった.次に,アンチコドンを中心に3,5,7塩基についてランダマイズを行った.その結果,計9種類の変異開始tRNAの配列をもつ開始tRNA変異細胞を単離することができ,その中の7種類についてはアンチコドンとその周囲に複合的に変異が入っていた.また,興味深いことに,そのうち6種類の細胞では異なる2種類のプラスミドが共存している状態を維持するものであり,それらについては翻訳開始においてお互いに機能を補っている可能性が示唆された.

現在はこれら変異開始tRNAが受容しているアミノ酸の解析と細胞内タンパク質のN末アミノ酸の解析を進めている.また,並行して,開始tRNAのアンチコドンに本来備わっていない修飾塩基を導入した細胞を作成し,リボソームプロファイリング,プロテオーム解析を行ったところ,非AUG開始コドンにおいて翻訳開始の低下が観察された.本研究では,細胞の全開始tRNAを変異型にするために,元の野生型開始tRNAをコードしたプラスミドを変異開始tRNAをコードしたものに置き換えるといったカウンターセレクション法を用いている.しかし,対象が開始tRNAといったタンパク質合成に重要な因子であるためか,継代しているうちに生育不可能になってしまうことが多く,変異細胞株の維持が不安定であることが考えられた.当初の対策として,カウンターセレクション法に用いる抗生物質の濃度や開始tRNAをコードするプラスミドのコピー数などを検証してみたが,改善がみられず変異細胞株の単離作業が困窮していた.そこで,宿主内でプラスミドが置き換わる際に細胞が不安定になると考え,元の野生型開始tRNAプラスミドと変異型プラスミドを共存させる時間を長くとってみたところ,カウンターセレクションの成功率を上げることができ,現在は得られた変異細胞株を安定的に維持することができるようになっている.また,次年度の予定として挙げていたリボソームプロファイリングについて予備実験として修飾塩基をアンチコドンに導入した変異開始tRNA細胞を用いて行っていたが,最近,翻訳開始状態をモニターするためにはリード長が長いmRNAフットプリントを解析することが一般的な解析法と確立されたため,再解析なども行っている.以上の理由により、申請時の予定よりもやや遅れていると考えている。今後の予定としては,得られた変異開始tRNAについて受容しているアミノ酸の解析やその受容効率の測定を行う.その結果次第では,アミノ酸受容能を向上させるような変異を検討し,さらなる開始tRNAの改変を行う.また,並行して、獲得できている開始tRNA変異細胞について、栄養飢餓や酸化ストレスなど生育環境ストレスに対する感受性を観察し,その表現型の探索を行っていく.影響が顕著に見られた場合は順次,その条件下で細胞内のプロテオーム解析やリボソームプロファイリングを行い,遺伝子発現パターン,特にそれぞれの遺伝子の翻訳開始段階に注目し,どのような影響が表れているかを追究していく予定である.進捗が予定よりも遅れていたため、消耗品などの物品購入や学会報告に必要な旅費に使う出費額が予定よりも少なくなった。次年度は、得られた変異体についてプロテオームやリボソームプロファイリングなど比較的費用がかさむ解析を中心に行うため、経費を使用する見通しを立てている。
高水素生成型腸内細菌叢プロファイルの解明と酸化ストレス防御への寄与

大腸水素がアスコルビン酸と同様に電子供与体として生体内における酸化還元反応に寄与する可能性を検証するため、アスコルビン酸合成不能ラット(ODSラット)を用い、難消化性糖質摂取による大腸における高水素生成が生体内でビタミンEの再生を促進し、酸化ストレスの軽減に寄与する可能性を調べた。1)難消化性糖質を与えたODSラットにおける大腸水素生成変動と生体内ビタミンE変動ODSラットに難消化性糖質としてフラクトオリゴ糖を与え、大腸発酵による水素生成を促したときの各組織中水素濃度変動と、それらの組織におけるビタミンE濃度の変化を調べた。その結果、正常ラット同様に脂質含量の高い脂肪組織に水素分子が多量に蓄積することが確認され、その組織においてビタミンE含量が有意に増加することが判明した。これは、脂質に親和性の高い水素分子が脂肪組織で電子供与体として働き、ビタミンEラジカルからビタミンEの再生を促している可能性を示唆するものである。2)難消化性糖質を与えた高水素生成ODSラットおけるビタミンE再生促進と酸化ストレス軽減フラクトオリゴ糖投与による高水素生成ODSラットを用い、脂肪組織における大腸水素によるビタミンE再生とその組織における酸化ストレス変動を調べた。その結果、前述したように脂肪組織で再度水素分子の蓄積が認められ、ビタミンEの再生が促進することが見出された。また、還元型グルタチオンの再生が促進することも明らかとなった。すなわち、大腸発酵で多量に発生した水素分子が、脂肪組織に多量に移行し、そこでビタミンEの再生を促すことによりレドックスバランスを還元方向にシフトすることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大腸発酵により発生する水素分子が生体内で還元性を示すことをこれまでに明らかにしており、大腸水素生成の促進に最適な難消化性糖質の化学特性を調べ、高水素生成を可能にする腸内細菌叢パタンを検証した。1)難消化性糖質の構成糖と大腸水素生成の関係:構成糖としてグルコース、フルクトースおよびガラクトースから成る難消化性オリゴ糖(難消化性デキストリン、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖)をラットに与え、大腸水素生成の変動を調べた。グルコース構成糖のオリゴ糖に比べ、フルクトースおよびガラクトース構成糖のオリゴ糖で水素生成量を有意に上昇させることが判明した。また、in vitro嫌気培養法を用い、それぞれの難消化性オリゴ糖をラット腸内細菌叢により発酵させ、生成したガス量および水素量を調べたが、ラットに投与したときと同様の結果が示された。2)難消化性糖質の重合度と大腸水素生成の関係:重合度の異なる難消化性オリゴ糖をラットに与え、大腸水素生成の変動を調べた。グルコースを構成糖とする低重合度体として難消化性デキストリンを、高重合度体として高アミロースでんぷんを用いた。また、フルクトースを構成糖とする低重合度体としてフラクトオリゴ糖を、高重合度体としてイヌリンを用いた。いずれにおいても低重合度体のほうが高重合度体より発酵が亢進し、発酵速度も早く、大腸水素生成量が有意に多くなることがわかった。3)高水素生成細菌叢の解明:難消化性糖質として高アミロースでんぷんを用いラットに与えた後、大腸水素生成量を測定し、高水素生成ラットと低水素生成ラットを選別した。それらの盲腸内容物を採取し、腸内細菌叢をクローンライブラリおよび16Sメタゲノム解析により測定した。高水素生成ラットの腸内細菌叢は低水素生成ラットのそれと異なり、特にBifidobacteriumの顕著な増加とBacteroidesの低下が確認された。新しい職場に移って以来、人員がまだ揃っていないため大腸水素がアスコルビン酸と同様に電子供与体として生体内における酸化還元反応に寄与する可能性を検証するため、アスコルビン酸合成不能ラット(ODSラット)を用い、難消化性糖質摂取による大腸における高水素生成が生体内でビタミンEの再生を促進し、酸化ストレスの軽減に寄与する可能性を調べた。本研究では、大腸における安定的な高水素生成を可能にするため、高水素生成に必要な腸内細菌叢プロファイルを解明する。また、その高水素生成細菌叢を移植することにより安定した水素供給が可能な大腸内環境を実現することを目的とした。

そこで高水素生成を実現する腸内細菌叢プロファイルを調べ、そのような細菌叢をラットに移植し、定着させ、ラット高水素生成の安定化を実現するかどうかを調べた。1)水素生成能の異なるラットにおける酸化ストレス抑制の違い大腸水素生成を促進する難消化性糖質をラットに与え、呼気と放屁に排出される水素量にもとづき高水素生成型ラットと低水素生成型ラットに分別した。これらのラットに肝虚血-再灌流処置により酸化ストレスを与えた結果、高水素生成型ラットほど肝臓における酸化ストレスおよび酸化障害の軽減が認められた。2)高水素生成をもたらす腸内細菌叢プロファイルの明確化と高水素生成細菌叢の移植による高水素生成ラットの作製難消化性糖質をラットに与え、同様に高水素生成型ラットと低水素生成型ラットにわけ、盲腸内容物から水素生成能の異なる細菌叢カクテルを得た。高水素生成型ラットを安定的に得る目的で、高水素生成型細菌叢を低水素生成型ラットに移植し、先の細菌叢カクテルとともにこれらのラットの腸内細菌叢プロファイルと水素生成能を解析した。低水素生成型ラットの水素生成能は高水素生成型細菌叢の移植により有意に上昇し、高水素生成型ラットとほぼ同等となった。その細菌叢プロファイルは高水素生成型細菌叢と類似した。一方、生理食塩水を投与した低水素生成型ラットの細菌叢プロファイルは低水素生成型のままだった。また、水素生成細菌と水素利用細菌の占有率により正味の水素生成量が決まることが示唆された。当初計画したものから、細菌叢移植実験に遅れを生じたため、繰越して鋭意実施した。その結果、順調に成果が得られたため、当初計画案に準ずるものが最終的に得られた。そのため、概ね順調であると判断した。水素生成にかかわる腸内細菌叢の概要を把握しつつあるが、詳細については不明な点も多い。高水素生成細菌叢を低水素生成ラットに移植することで水素生成が亢進するかを検証し、高水素生成にかかわる腸内細菌叢の構成を明らかにしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大腸水素がアスコルビン酸と同様に電子供与体として寄与する可能性を検証するため、アスコルビン酸合成不能ラット(ODSラット)を用い、難消化性糖質摂取による高水素生成がビタミンEの再生を促進し、酸化ストレスの軽減に寄与する可能性を調べる。また、ODSラットの細菌叢が低水素生成タイプの場合、高水素生成細菌を移植し、高水素生成化を行う。1)難消化性糖質を与えたODSラットの水素生成変動とビタミンE再生ODSラットに難消化性糖質としてフラクトオリゴ糖を与え、水素生成変動を検証する。同時に盲腸内細菌叢の変化を調べる。また、各組織におけるビタミンE濃度の変化を調べる。2)難消化性糖質を投与した高水素生成ODSラットのビタミンE再生と酸化ストレス軽減フラクトオリゴ糖を与えた高水素生成ODSラットを用い、大腸水素が脂肪組織におけるビタミンE再生に与える影響とその組織における酸化ストレス変動を明らかにする。
柔軟空気圧シリンダを用いた低コスト・可搬型上肢リハビリ機器の開発

高齢化社会を迎え,リハビリ機器やパワーアシスト装置の開発が盛んに行われている.本研究では,以前に2つの柔軟空気圧シリンダをリング状に曲げ直角に交差させて構成した球面アクチュエータを試作し,手に持って腕や肩などのリハビリテーションを行うための可搬型上肢リハビリテーション機器へ応用した.本年度は,この球面アクチュエータを空気圧ではなく水道水圧で駆動することを検討した.水道圧は,家庭で簡単に入手できる流体圧力源であり,その圧力の利用には,防錆性のある弁が必要になるが,その性質から,これらの弁は総じて高価であることが多い.そこで,屈曲させた2本の軟質ポリウレタンチューブ(内径2.5mm,外径4.0mm)と2種類のチューブコネクタ,小型RCサーボモータから構成される低コスト4ポート型サーボ弁使用する.このサーボ弁はチューブの屈曲角を制御し,管路断面積を増減させることで気体/液体の両流体の流量を制御できる弁であり,金属製の摺動部や錆の心配がなく使用できるメリットがある.この弁と以前開発した3次元位置計測装置を可搬型上肢リハビリ機器に搭載した.実験より,防水などの課題は残るものの,水道水圧による機器の姿勢制御を実現した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。高齢化社会を迎え,リハビリ機器やパワーアシスト装置の開発が盛んに行われている.本研究では,以前に2つの柔軟空気圧シリンダをリング状に曲げ直角に交差させて構成した球面アクチュエータを試作し,手に持って腕や肩などのリハビリテーションを行うための可搬型上肢リハビリテーション機器へ応用した.本年度は,アクチュエータの保持ステージの相対位置を計測する3次元位置計測システムを提案・試作し,試作システムを搭載した機器の制御について検討した.計測システムは,同一平面上の異なった位置に配置した3つのワイヤ式リニアポテンショメータから構成される.各設置点から同一の計測点(x,y,z)までの距離を測ることで,幾何学的な関係から3次元座標を知ることができる.ワイヤ式リニアポテンショメータは,本研究で開発した安価なワイヤ巻き取り式のリニアポテンショメータであり,材料費は1000円程度と安価である.このポテンショメータは10回転分を計測できるヘリカルポテンショメータと,板バネによるワイヤ巻取り機構から構成され,10bitのA/D変換器を介した検出分解能は0.45mmである.また,各ワイヤは計測位置で結合されている.このシステムを搭載したアクチュエータを,試作システムの出力電圧より算出された保持ステージ座標と事前に設定された目標値との偏差を求め,各シリンダ変位をx,y方向で独立して制御する.また,座標データはシリアル変換モジュールを介し,PCで記録する.ここで,シリアルデータの送信を含めた制御のサンプリング周期は5msである.実験より,シリンダの摩擦の影響と思われる偏差はあるものの,座標計測によるステージ部の位置決め制御が実現できた.当該年度の研究成果は,当初の計画通り,ゼンマイによるワイヤ巻き取り器と多回転可能なヘリカルポテンショメータを用いた安価なワイヤ式リニアポテンショメータを開発し,このワイヤ式リニアポテンショメータを3つ使用し,三点測量の原理から3本のワイヤの先端座標を求めることができる装置を開発した.さらに,この3次元座標計測装置をコンパクト化し,柔軟空気圧シリンダを2本用いた球面アクチュエータから構成される可搬型上肢リハビリテーション機器に組込み,その保持ステージの座標データをフィードバックすることで、機器の姿勢制御を行うシステムを構成した.また,上述の研究成果を,福岡とアメリカで開催された2つの国際会議で発表し,さらに,専門分野である国際ジャーナルに投稿し,掲載が決まっている.高齢化社会を迎え,リハビリ機器やパワーアシスト装置の開発が盛んに行われている.本研究では,以前に2つの柔軟空気圧シリンダをリング状に曲げ直角に交差させて構成した球面アクチュエータを試作し,手に持って腕や肩などのリハビリテーションを行うための可搬型上肢リハビリテーション機器へ応用した.本年度は,この球面アクチュエータを空気圧ではなく水道水圧で駆動することを検討した.水道圧は,家庭で簡単に入手できる流体圧力源であり,その圧力の利用には,防錆性のある弁が必要になるが,その性質から,これらの弁は総じて高価であることが多い.そこで,屈曲させた2本の軟質ポリウレタンチューブ(内径2.5mm,外径4.0mm)と2種類のチューブコネクタ,小型RCサーボモータから構成される低コスト4ポート型サーボ弁使用する.このサーボ弁はチューブの屈曲角を制御し,管路断面積を増減させることで気体/液体の両流体の流量を制御できる弁であり,金属製の摺動部や錆の心配がなく使用できるメリットがある.この弁と以前開発した3次元位置計測装置を可搬型上肢リハビリ機器に搭載した.実験より,防水などの課題は残るものの,水道水圧による機器の姿勢制御を実現した.家庭で利用できるリハビリテーション機器を開発するにあたり,流体圧力源の確保は大きな課題である.現状では小型のコンプレッサの開発などが進められているが,未だ吐出圧力が高く,長時間駆動できるようなものは開発されていない.そこで,家庭で身近に確保できる圧力源として,水道圧に注目する.水道圧を使用する場合,防錆性を有するステンレス製の弁が必要となるが,これらの弁は概して高価である.そこで,以前に所属研究室で開発した屈曲チューブを用いたサーボ弁を用いる.

弁は屈曲させた2本の軟質ポリウレタンチューブと2種類のチューブコネクタ,小型RCサーボモータから構成される.モータが時計回りに回転すると給気ポート側のチューブの屈曲角がゆるみ,管路断面積が増えると同時に,排気側チューブはさらに屈曲を生じ,完全に閉じられる.また,反時計回りに回転すると給気側が閉まり,排気側の管路断面積が増加する.これにより,給気・排気両方の流量を制御することができる.また,内部に腐食を生じるような部品を使用していないため,気体だけでなく,液体の流量制御も可能である.動作流体に空気を用いた場合,弁の最大流量は約60 l/minと現在使用しているON/OFF弁から構成される疑似サーボ弁(約30 l/min)より大きく,球面アクチュエータなどの姿勢制御に十分適用可能である.本年度は,この弁を球面アクチュエータに組み込んだ一体型の上肢リハビリテーション機器を構成し,さらに水道圧による機器の姿勢制御も行う予定である.以上の研究成果を,国内外の学会にて発表する予定である.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
FGF－2誘導性再生歯根膜における末梢神経ネットワーク再構築

神経特異的タンパクであるNeurofilamentProtein (NFP)を指標として神経線維のネットワークを観察するため、抗NFP抗体を用いた免疫組織染色法の確立を行った。その結果、歯と歯周組織を含むブロックから厚さ30μmの組織切片を作製し、200kDのNFPを認識するウサギポリクローナル抗NFP抗体と抗ウサギIgGブタポリクロナール抗体をそれぞれ一次および二次抗体とした抗体処理を行い、アビジンービオチンーペルオキシダーゼ法で可視化することによりNFP陽性神経線維ネットワークの検出が可能であることが明らかとなった。次に、ビーグル犬人工的3壁性歯周組織欠損モデルを用いて、FGF-2投与群の新生歯根膜と無処置群の歯根膜の神経線維の再生像を上記のNFP抗体を用いた免疫染色により観察し、FGF-2投与により誘導された歯根膜における神経ネットワークの再生について検討した。その結果、FGF-2により誘導された新生歯根膜中のNFP陽性神経線維は、通常の歯根膜と同様の分布や走行を示すことが組織学的に明らかとなった。また、FGF-2誘導新生歯根膜において、無処置群の歯根膜と同様に、樹枝状に分枝した自由神経終末に加えて、軸索終末が激しく分枝した歯根膜の機械受容器と考えられているルフィニ様神経終末がNFP陽性線維の終末形態として観察され、FGF-2は歯根膜の構造的な再生を誘導すると同時に、感覚器官としての機能も回復させる可能性が示唆された。FGF-2により再生された歯根膜組織が、咬合力などの外力を感知し、咀嚼を制御する歯根膜の神経生理学的な機能を再現しているか否かという、これまでほとんど注目されていなかった歯周組織再生における歯根膜の末梢神経ネットワーク再構築に関してFGF-2により再生した歯根膜組織と正常歯根膜組織の神経線維を免疫組織学的に比較検討することにより評価することを目的として研究を開始した。H22年10月の科研費追加採択後、本年度は歯根膜組織内の神経線維をネットワークとして評価できる免疫組織染色法の確立を目指し、ビーグル犬から採取した歯を含む正常歯周組織を、中性緩衝ホルマリン液で浸潰固定した後、蟻酸溶液で脱灰した。そして、ショ糖溶液で浸漬した後、コンパウンドに包埋し、クリオスタットで凍結切片を作製した。切片をPBSで洗浄後、過酸化水素水を含むメタノールで処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活化した。そして、PBSで洗浄後、神経特異的蛋白であるNeurofilament Protein (NFP)に対する抗体を加え反応させた。再度、PBSで洗浄後、ビオチン標識IgG抗体を反応させ、洗浄後ABC complexを加え反応させた。そして、Horseradish peroxidaseを3,3-diaminobenzidineと過酸化水素水を含むトリス塩酸緩衝食塩水で発色.可視化し、硫酸ニッケルアンモニウムで増感した。反応後、切片はスライドガラスに貼付し、風乾後メチルグリーンで対比染色し、上昇エタノール系列で脱水、非親水性溶媒で透徹後封入し、光学顕微鏡で観察した。その結果、NFP陽性線維が検出されることが明らかとなった。現在、至適な切片の厚さ並びに抗体濃度その他各種条件を検討中である。
再分化植物からの育種母本選抜のためのRFLP利用に関する研究

1.イネカルスにおける葉緑体DNAの変異イネ品種Tadukanの種子よりカルスを誘導し、継代培養期間の異なるカルスより全DNAを抽出し、制限酵素Hind lllで切断後に、非放射性のDigoxigeninで標識した葉緑体DNAプロ-ブとのサザンハイブリダイゼ-ションを行なって、その多型を分析した。その結果、1年以上の長期間継代培養したカルスでは塩基置換によって新たな切断部位が生じること、この変異の断片はイネ葉緑体DNAの全塩基配列と照合すると遺伝子ののっていない非コ-ド領域で塩基置換によって生じたものであることが明らかになった。2.再分化植物とその後代での変異の遺伝変異のみられるイネカルスより植物を分化され、60個体につき変異を調べた結果、7%においてカルスにおけるのと同様の変異した断片が検出された。またこの変異の断片は正常のDNA断片によりシグナルが薄いので、この場合、葉緑体DNAは正常な分子種と変異した分子種のキメラであることが考えられる。再分化当代で変異を示すもの2系統の次代(R2)を調べた結果、いずれでも再分化当代で認められた変異した断片は検出することができなかった。このことは変異型と比較して正常型のみが優先的に複製されることを暗示している。3.イネカルスにおけるミトコンドリアDNAの変異同様にしてミトコンドリアDNAをプロ-ブとしてミトコンドリアDNAの変異を解析した結果、シトクロム酸化酵素サブユニットI遺伝子(CoxI)の近傍に8Kbpの挿入変異が認められた。このことからオルガネラDNA遺伝子の改良には組織培養による変異の誘起が有効であることが推察される。
ディペンダブル制御実現に向けた基礎理論の構築

本研究では,制御システムの頑健さの新たな指標(ディペンダビリティ)を与えることを目指しており,制御システムを対象に「ディペンダビリティの定式化」,「ディペンダブルな制御システムの実現方法」,「ディペンダビリティの解析手法」などを与えることを目標としている.研究初年度である本年度は,具体的な解析・設計問題を通して検討を行った.具体的には,動的システムの分散状態推定,ゲーム理論にもとづく協調制御を取り上げた.前者は,ある大きな観測対象の状態変数を,複数のセンサノードにより推定する問題である.そこでは,各センサノード単独では不可観測であってもノード間で情報交換をどのように行えば推定値が真値へと収束するかを考え,各センサノードにおいて推定できる部分は各自のセンサ情報のみを用いて推定し,推定できない部分についてのみ,周りのセンサノードの情報を用いて推定値を更新していけばよいことがわかった.そして,情報交換頻度がまばらになったとしても推定が可能といういみでディペンダブルな推定手法を与えた.与えた枠組みは二つあり,一つは一定周期で情報交換を行った場合,通信周期をどれだけ長くすることが可能かについて,もう一つはリアルタイムに情報を交換するべきか/しないべきかを判断する方法である.そして,後者の問題では,自律的に動作する複数のエージェントからなるマルチエージェントシステムに対して,システム全体で達成したい目標があったとき、各エージェントに対してどのような目標を与えればよいかを考えた.そして,この目標を設計するための計算量に着目し,エージェント数に比例する計算量の設計法を与えた.当初の計画通り,具体的な問題を取り上げ,ディペンダビリティについて検討することができた.初年度に引き続き,具体的なテーマを取り上げ,ディペンダビリティについての知見を積み上げることを目的とする.また,初年度に取り上げた,分散状態推定やゲーム理論に基づく制御方策についても,引き続き研究を続け,耐故障性などの解析などを行っていく.本研究では,制御システムの頑健さの新たな指標(ディペンダビリティ)を与えることを目指しており,制御システムを対象に「ディペンダビリティの定式化」,「ディペンダブルな制御システムの実現方法」,「ディペンダビリティの解析手法」などを与えることを目標としている.研究初年度である本年度は,具体的な解析・設計問題を通して検討を行った.具体的には,動的システムの分散状態推定,ゲーム理論にもとづく協調制御を取り上げた.前者は,ある大きな観測対象の状態変数を,複数のセンサノードにより推定する問題である.そこでは,各センサノード単独では不可観測であってもノード間で情報交換をどのように行えば推定値が真値へと収束するかを考え,各センサノードにおいて推定できる部分は各自のセンサ情報のみを用いて推定し,推定できない部分についてのみ,周りのセンサノードの情報を用いて推定値を更新していけばよいことがわかった.そして,情報交換頻度がまばらになったとしても推定が可能といういみでディペンダブルな推定手法を与えた.与えた枠組みは二つあり,一つは一定周期で情報交換を行った場合,通信周期をどれだけ長くすることが可能かについて,もう一つはリアルタイムに情報を交換するべきか/しないべきかを判断する方法である.そして,後者の問題では,自律的に動作する複数のエージェントからなるマルチエージェントシステムに対して,システム全体で達成したい目標があったとき、各エージェントに対してどのような目標を与えればよいかを考えた.そして,この目標を設計するための計算量に着目し,エージェント数に比例する計算量の設計法を与えた.当初の計画通り,具体的な問題を取り上げ,ディペンダビリティについて検討することができた.初年度に引き続き,具体的なテーマを取り上げ,ディペンダビリティについての知見を積み上げることを目的とする.また,初年度に取り上げた,分散状態推定やゲーム理論に基づく制御方策についても,引き続き研究を続け,耐故障性などの解析などを行っていく.数値計算用計算機の発注が遅れたため繰り越しが生じたが,次年度早々に使用する見込みである.
ヘガードフレアーホモロジート曲面の写像類群に関する研究

今年度は研究課題「ヘガードフレアーホモロジーと曲面の写像類群に関する研究」のうち,曲面の写像類群について研究を行った.とくに組み紐群と円周上め一点穴あきトーラス束の基本群の表現について,写像類群の観点から詳細に考察した.その際,トーラス束の新しい不変量を導入するとともに,Dehn fillingで得られた3次元多様体の基本群との関係についでも考察した.以下得られた結果の概略を述べる.3次元多様体の研究において,基本群の表現は基本的かつ重要な役割を果たすことが知られている.一方で,与えられた群に対してその線形表現を見出すこと,または組織的な構成法を与えることは,一般に難しい問題である.今年度は円周上の一点穴あきトーラス束に注目し,その基本群の既約4次元表現の1パラータ族を複素数体上で具体的に構成した.これは、組み紐群のSO(n)またはU(n)表現の1パラメータ変形から自然に導かれるもので,とくに,曲面束のモノドロミーに対応した生成元の像を用いることで,不変量を導入することができる.さらに,この不変量は,8の字結び目の外部空間に対して最小化されることもわかった.また,上記表現のもう一つの応用として,トーラス束のカスプに沿ってDehn fillingして得られる閉3次元多様体の基本群の表現も構成した.これらは4次元(特殊)ユニタリ表現となり,とくに扱いやすい対象となっている。今年度は,有限表示群とその線形表現の組に対して,一般に有理関数として定義されるねじれアレキサンダー不変量について,主として研究を行った.とくに,3次元球面内の絡み目のアレキサンダー多項式に関する古典的なトレス条件のねじれアレキサンダー不変量への拡張,および「ねじれアレキサンダー不変量がいつ多項式になるか」という基本的な問題について,詳しく考察した.以下,得られた結果の概略を述べる.有限表示群に対するねじれアレキサンダー不変量は,1990年代前半に導入されたものの,近年に至るまで組織的な研究はあまり行われてこなかった.このため,その基本的な性質としていまだに解明されていない点も数多く残されている.この状況を鑑み,古典的な結果である,絡み目のアレキサンダー多項式がみたすべきトレス条件を,ねじれアレキサンダー不変量の場合に具体的に計算可能な形で記述した.また,ねじれアレキサンダー不変量は,古典的なアレキサンダー多項式の一つの一般化になっているものの,定義からは,それがいつ多項式になるかは明らかでない.この基本的な問題について,与えられた線形表現にごく弱い条件を課すだけで,比較的広範な有限表示群に対して,ねじれアレキサンダー不変量が多項式になることを示した.一つの応用として,3次元球面内のファイバー結び目のアレキサンダー多項式がみたすべき次数に関する条件式を,ねじれアレキサンダー不変量の場合に記述した.今年度は,有限表示群とその線形表現の組に対して,一般に有理関数として定まるねじれアレキサンダー不変量について,引き続き研究を行った.とくに,3次元球面内のファイバー結び目のアレキサンダー多項式がみたす古典的な条件を,ねじれアレキサンダー不変量と結び目群の表現空間の言葉を用いて記述し,今後の研究発展が期待される指針を得ることができた.以下,得られた結果の概略を述べる.3次元球面内のファイバー結び目のアレキサンダー多項式はモニック多項式(つまり最高次係数が1の多項式)になることが知られている.この結果は,研究代表者を含む複数の研究者により様々な形でねじれアレキサンダー不変量に拡張されている.今回はある結び目のクラスに対して,ファイバー結び目となる必要十分条件を結び目群の表現空間の言葉を用いて記述した.具体的には,ツイスト結び目と呼ばれる結び目のクラスに対して,ねじれアレキサンダー不変量がモニック多項式となる結び目群の非1可換表現の共役類の個数が有限個であることと,ファイバー結び目でないことが同値であることを示した(その個数はツイスト結び目を表示するパラメータを用いて記述される).以上のことから,一般の結び目に対しても,ねじれアレキサンダー不変量がモニック多項式となるような非可換表現の共役類の個数から,その結び目の幾何学的な情報を導けることが期待される.今年度は研究課題「ヘガードフレアーホモロジーと曲面の写像類群に関する研究」のうち,曲面の写像類群について研究を行った.とくに組み紐群と円周上め一点穴あきトーラス束の基本群の表現について,写像類群の観点から詳細に考察した.その際,トーラス束の新しい不変量を導入するとともに,Dehn fillingで得られた3次元多様体の基本群との関係についでも考察した.以下得られた結果の概略を述べる.3次元多様体の研究において,基本群の表現は基本的かつ重要な役割を果たすことが知られている.一方で,与えられた群に対してその線形表現を見出すこと,または組織的な構成法を与えることは,一般に難しい問題である.今年度は円周上の一点穴あきトーラス束に注目し,その基本群の既約4次元表現の1パラータ族を複素数体上で具体的に構成した.これは、組み紐群のSO(n)またはU(n)表現の1パラメータ変形から自然に導かれるもので,とくに,曲面束のモノドロミーに対応した生成元の像を用いることで,不変量を導入することができる.さらに,この不変量は,8の字結び目の外部空間に対して最小化されることもわかった.また,上記表現のもう一つの応用として,トーラス束のカスプに沿ってDehn fillingして得られる閉3次元多様体の基本群の表現も構成した.
初期栄養計画の新たな指標としての新生児オートファジー研究

オートファジーは非選択的タンパク分解機構で出生直後飢餓応答機構の一つと考えられている。本研究では出生直後新生児臍帯の凍結標本からのオートファジー指標蛋白(LC3-II)評価法の確立および、その臨床背景との関連を検討した。ウエスタンブロット法を用いてヒト凍結臍帯組織からLC3-II発現量を半定量することが可能となった。入院治療を要した新生児において、出生直後の臍帯組織LC3-II発現量は入院時に評価した静脈血糖、総蛋白と正相関する傾向にあった。オートファジーがヒト新生児において栄養産生や胎内発育に関与しているかどうかについて、さらなる検討が望まれる。新生児では出生直後の飢餓対応能に個体差がある。出生直後、胎盤からの栄養供給が突然遮断され飢餓状態に陥る。出生に莫大なエネルギーを要するにもかかわらず、ほとんどの児は限られた哺乳量で問題なく過ごすことができる。申請者は出生直後の飢餓状態応答機構として、オートファジーによるエネルギー供給に着目した。マウス新生仔においてはオートファジー活性と出生直後の生命維持の関連が報告されているが、ヒトでの臨床研究は未だ乏しい。本研究の目的は、ヒト臍帯組織を用いたオートファジー活性の定量化法、迅速評価法を確立し、出生直後の低栄養(低血糖、低蛋白血症等)との関連を明らかにすることである。これにより、飢餓対応能に応じた新生児初期栄養管理のテーラーメード化が可能となる。初年度においては、臍帯抽出蛋白を用いた新生児オートファジー活性の抽出実験系の確立を行った。ヒト臍帯凍結組織から蛋白を抽出しWesternblottingにてLC3-1、LC3-II、P62を検出した。蛋白発現量をImageJ ver.1.43を用いてβアクチンのバンド濃度との比較を行い半定量化した。本年度はLate preterm以降の限定的な症例数での検討となった。LC3-II発現量を出生直後と生後5時間で比較し在胎週数、出生体重等の周産期情報との関連を検討した。出生直後優位群において在胎週数が短い傾向がみられた。これら成果を日本小児科学会学術集会で報告し、有識者からの助言を得る予定である。オートファジーは新生児において期が応答、細胞内浄化、発生分化等、ホメオスタシス維持に重要かつ多様な役割を担っていると考えられるが、その臨床意義についての知見は乏しい。当院で出生した新生児の出生直後臍帯凍結標本を用いてオートファジー活性の指標とされるLC3をWestern blottingで検出し、そのピクセル値をβアクチンのピクセル値で補正し発現量を半定量した。本年度の解析で、初年度から症例数を増やすことができた。来年度においてはこれら発現量を血糖等の新生児栄養指標を比較ののち、学会発表、論文等での成果を予定している。オートファジーは新生児において飢餓応答、細胞内浄化、発生分化等、ホメオスタシス維持に重要かつ多様な役割を担っていると考えられるが、その臨床意義についての知見は乏しい。当院で出生した新生児の出生直後妻帯凍結標本を用いてオートファジー活性の指標とされるLC3をWestren blottingで検出し、βあく朕とのピクセル値で補正して半定量した。当年度においては、新生児集中治療室において加療を要した児を対象としてLC3と新生児計測、血液ガス、生化学所見との比較検討を実施したが、LC3の発現量の再現性確認が不十分であるため、成果報告には至らなかった。WesternblottingによるLC3発現の再現性が不安定であり、実験系の再検討を要したため。【背景】Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3)は細胞質内で生成され,特にLC3-II量はオートファゴゾーム形成と正相関し、オートファジーのマーカーとして汎用され、新生児栄養管理の新たな指標としての活用が期待される。マウスにおける先行研究があるが、ヒトでの検討はいまだ乏しい。【目的】出生直後の新生児臍帯凍結標本におけるLC3-II発現量と新生児の臨床背景(在胎週数や栄養指標)との相関を検討した。【方法】対象は当院にて出生し本研究への参加を同意した新生児のうち、入院加療を要した18例。出生直後に凍結保存した臍帯組織からLC3-I,LC3-IIを抽出、ウエスタンブロットでβアクチンとのピクセル比として半定量し臨床背景との相関を検討した。在胎週数中央値36週(27週-41週),出生体重中央値2,237g (993g-4,130g)。臨床所見(胎盤重量,新生児計測,臍帯動脈・新生児静脈血液ガス,新生児血糖、総蛋白)との相関をスピアマン順位相関係数検定で検討し、p<0.05を有意とした。【結果】臨床所見との比較においてはLC3-IIは新生児静脈血糖(ρ=0.55、p=0.02)、総蛋白pH(ρ=0.51、p=0.02)と正相関する傾向にあった。【結論】LC3-II発現は新生児血糖、総蛋白質と相関する傾向にあった。新生児においてオートファジーは血糖、蛋白維持に寄与している可能性がある。ウエスタンブロット法を用いてヒト

凍結臍帯組織からLC3-II発現量を半定量することが可能となった。入院治療を要した新生児において、出生直後の臍帯組織LC3-II発現量は入院時に評価した静脈血糖、総蛋白と正相関する傾向にあった。オートファジーがヒト新生児において栄養産生や胎内発育に関与しているかどうかについて、さらなる検討が望まれる。臍帯組織からのLC3抽出に時間を要し、症例数の確保が困難であった。当初予定では、免疫電顕等によるLC3発現の確認を計画していたが、現在、検体処理中であり、観察が実施できていない。蛋白抽出方法の変更等を行うことで実験結果の精度向上を図る予定である。Western Blotting以外の手技や、ほかのオートファジーマーカーの導入を検討する。新生児学保存検体における血糖、たんぱく質等の栄養指標測定や電顕評価を学内の研究推進機構の協力を得るなどして早期に実施したい。再現性確認のためにWestern blottingの再評価を行いたい。場合によっては精度向上のため機器の更新を計画したい。症例数の蓄積が十分とは言えない。実験系の確立に時間を要した。実験結果の再現性確認のための実験系の再確立に時間を要したため、再実験用の費用を次年度に持ち越すことになった。再現性確認等の実験が次年度に持ち越しとなったため、本年度の抗体購入費等が計画よりも少なくなった。また成果発表が準備中であり、旅費が次年度に持ち越しとなった。蛋白抽出試薬、抗体等の消耗品購入および、実験成果発表準備に使用する予定である。次年度においては、症例数の蓄積を図るとともに、早産症例を研究対象に加えたい。また、オートファジー関連蛋白質発現量と新生児臨床検査値(とくに臍帯血の総蛋白質等の栄養関連生化学検査)との関連の検討を進める予定である。持越しとなった実験実施において消耗品(LC3抗体等)の購入に当てる予定である。旅費は次年度における成果発表の際に使用する。実験系確立に時間を要し、処理症例数が当初予定より少なかったため、抗体等の購入額が当初予定を下回ったため。本年度も症例蓄積を継続することとしたため、オートファジー関連抗体等の購入量を投与所定よりも増やす必要がある。また、検討抗体の種類を増やすこと、電子顕微鏡での評価の費用として使用したい。
メカニカルストレスの受容機構と骨芽細胞分化・骨形成促進作用機序の解明

培養下のマウス頭蓋冠縫合部にメカニカルストレスを加えると骨芽細胞の分化とそれに続いて骨形成が促進される。骨芽細胞のマーカー遺伝子(In situ hybridization法、ISH)やアルカリフォスファターゼ活性、細胞の形態学的変化、などを指標に調べた結果、既存の骨芽細胞の近傍にある前骨芽細胞および線維芽細胞様細胞が、まずBMP-4mRNAを発現するようになり、これらの細胞が骨芽細胞に分化することが確認された。BMP-4mRNAの上昇はメカニカルストレス負荷後3時間以内に起こることがわかった。これらの細胞はBMP-4に続いてCbfal,osteopontin,osteocalcinなどを順に発現し、通常の骨芽細胞分化と同様に推移することが確認された。このことから、BMP-4は、オートクリン/パラクリン的因子としてと骨芽細胞の分化に寄与すると考えられた。BMP-4がメカニカルストレスによって刺激される骨形成に必須であるか否かを調べるために、アデノウイルスベクターを用いて本遺伝子の発現を変動させる実験を行った。また、メカニカルストレスが直接BMP-4遺伝子の転写を調節する可能性についても検討した。上記の既知の遺伝子以外にメカニカルストレスの骨形成にかかわる未知の遺伝子を検索するため、メカニカルストレスの負荷により発現状況の変化する遺伝子の検出と単離を、RAP法を用いて検討した。メカニカルストレスにより再現性よく変動する遺伝子を解析した結果、tetranectinおよびadaptinが同定された。また、データベースに登録されている遺伝子とは異なる新規の遺伝子がひとつクローニングされ、この機能について現在検討中である。さらに、メカニカルストレスによって発現レベルの変化する遺伝子を網羅すべく重鎖分化cNAAライブラリーの構築,および,これを用いるクローニングを行った。培養下のマウス頭蓋冠縫合部にメカニカルストレスを加えると骨芽細胞の分化とそれに続いて骨形成が促進されるが、そのメカニズムを解明するため、細胞の形態学的変化と種々のマーカー遺伝子の発現状況の変化とを追求している。我々はメカニカルストレスを負荷した頭蓋冠縫合部において、6時間以内にBMP・4遺伝子の発現が増加することを認めたが、in situ hybridization法を用いて細胞レベルの遺伝子発現を調べてみると、骨形成が進行中の部位から離れたところに位置し、扁平な線維芽細胞様の細胞にもBMP-4遺伝子の発現を認め、さらに骨芽細胞特異的と考えられている転写囚子Cbfa1もほぼ同様に発現することを見出している。このことから、メカニカルストレスにより分化してくる骨芽細胞の起源として、少なくとも、いわゆる骨原性細胞とは異なる細胞が関わっていることが示唆される。上記の既知の遺伝子以外にメカニカルストレスの骨形成にかかわる未知の遺伝子を検索するため、メカニカルストレスの負荷により発現状況の変化する遺伝子の検出と単離を試みている。Differential display(DD)法、および、RPA法を用いて検討しているが、これまでのところRPA法による解析が好結果を生んでいる。メカニカルストレスにより明らかに発現レベルが変化する遺伝子として、細胞の接着あるいは骨格にかかわる遺伝子やある種のチャネルをコードする遺伝子をはじめ、未知遺伝子も含めて十数種の遺伝子が単離されている。それらについて順次解析を進めている。さらに、メカニカルストレスによって発現レベルの変化する遺伝子を網羅すべく重鎮分化cDNAライブラリーの構築を始める予定である。