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19世紀畿内先進農村における河川と地域経済-木津川流域を中心に-

19世紀の先進地域南山城においては、木津川水運を利用して肥料や農産物の流通が盛んであったが、その中で茶は、近世からの生産の発達の基礎の上に、開港というインパクトによって爆発的に生産・流通が盛行したこと、そこには近世以来の豪農の豊かな蓄積が金融面で生かされていたこと、そこに至るまでの過程で豪農は領主、大都市両替商、豪農相互などさまざまな関係性の中で蓄積を築く努力をしていったことなどが明らかになった。本研究は、19世紀の先進地域である南山城の農村地帯においていかに経済社会が発展したのかを、木津川という河川を機軸として多角的にとらえようとするものである。平成20年度は、その趣旨に従って、8月2023日と9月12日、それに3月1113日の3度にわたって現地調査を行った。具体的には、相楽郡精華町役場・京都府立山城郷土資料館・木津川市山城図書館・木津川市中央図書館・木津川市加茂町文化財整理保管センターなどで保管する近世・近代社会経済史関係史料の閲覧と写真撮影である。このうち木津川市加茂町文化財整理保管センター保管の旧里村森岡宣也家文書と木津川市中央図書館保管の八木芳郎家文書は、木津川舟運に関する大量の文書群であり、本研究の根幹となるものなので、重点的に写真撮影を行った。また精華町役場保管の安宅孝郎家文書には近世の当該地域の農民家族の存在形態や農民の移動に関する史料が、森嶋国男家文書や大崎国平家文書、松田安司家文書には近代の地域産業や金融に関する史料が大量に含まれ、いずれもやはり本研究での重要な史料であるので、精力的に写真撮影を行った。また8月の調査時には、以前から我々研究グループで研究対象としてきた浅田家の存在する旧西法花野村周辺の巡見調査も行った。また平成20年度には4月、8月、9月、12月、3月と5度にわたり研究会を行い、研究の打合せをするとともに、当該地域の調査で得られた史料を用いた研究報告を井奥、菅野、小川、桜井、油井が行った。平成21年度は、研究グループ全体の史料調査としては、平成21年8月1921日と平成22年3月2426日に、いずれも南山城地域において行い、そのほか個人的に何人かの者が同地域においてそれぞれ23日の史料調査を行い、必要な史料をデジタルカメラにより撮影した。収集史料の主なものとしてまず、精華町森島国男家文書と大崎家文書があげられる。両家史料は近世・近代の南山城地域の経済と金融のあり方を知る上で重要な史料群であり、前年度から引き続きの調査である。次に、同町松田安司家文書があげられる。同家史料は、近代の木津川流域の農業のありかたとその理念を知る上でポイントとなる史料群で、やはり前年度に引き続きの調査である。また今年度の新たな収集史料として、宇治田原の茶商潮見家で文書、木津川市加茂町の梶田家文書、同町の旧里村文書である春日若宮神社文書がある。潮見家文書は近代木津川流域の最重要商品である茶の流通に関するものであり、梶田家文書は旧大庄屋文書であるだけに、地域のきまざまな情報を含む。そのほかにも多数の史料を収集したが、いずれも本研究の主目的である近世・近代の畿内における経済社会の発展の状況を知る上で鍵となるであろう。また21年度には計5回の研究会を行い、メンバー各自の研究の中間報告を行った。平成22年度は、研究グループ全体の史料調査としては、平成22年9月13日と平成23年3月911日に、いずれも南山城地域において行い、そのほか個人的に同地域において史料調査を行った者もいる。史料調査においてはデジタルカメラで必要な史料を撮影した。また5月8日、12月25日に研究会を行い、メンバー各自の研究の中間報告を行った。収集史料の主なものとしては、前年度に引き続き、宇治田原町潮見家文書、精華町森島国男・大崎国平・松田安司家文書、木津川市八木庄五郎・八木芳郎・春日若宮神社・梶田・旧瓶原村役場などがあげられる。潮見家文書は、幕末開港以降当該地域の主要商品となる茶の流通に関するものである。精華町3家の史料は、地域で産業・金融を振興させようとした家としての史料である。両八木家文書は、木津川の河岸史料であり、河川を巡る地域経済を考える本研究としては、両家史料は研究の鍵となっていく史料である。春日若宮神社文書と旧瓶原村役場文書はそれぞれ近世と近代の村の社旗・経済に関する史料群、梶田家文書は大庄屋文書であり、広く当該地域の社会・経済状況がうかがえる史料群である。いずれの史料群も、本研究の主要な目的である近世・近代の畿内における経済社会の発展の状況を知る上で重要な史料であり、メンバー各人がそれぞれ分析に取り組んでいる。
次世代日本語コーパスプロトタイプの構築とその脳認知言語学実験への応用

日本語テクストに統辞・意味情報をタグ付けしたコーパスの開発を目指して、現代日本語の多様なデータに適合し、文自動意味解析を行っていくのに十分な統辞情報のタグ付け方法を確立した。実際に、開発した方法に従って10,000以上の文に対して統辞・意味解析情報のタグ付けを行った。また、開発した統辞情報タグ付け法を日英両語のマニュアルとして編集した。統辞情報のアノテーションにおいて問題となる事柄のうち、特に重要な、1個の助詞相当の連語、1個のモーダル助動詞相当の連語、および空要素の扱いについて検討を行った。今年度の研究では、第一に、現代日本語の書き言葉の文に対して、十分な統辞論的情報(句構造)を均質的にタギングするための方法を検討し、実際に統辞情報を付加したプロトタイプ日本語トリーバンクの構築を開始した。さらに、これらの文に付加された統辞情報にもとづいて、文の意味情報(述語論理式による意味表示)をスコープ制御理論を利用して自動的にタグ付けするための手法を開発した。本日本語トリーバンクは、原則的にAnnotation Manual for the Penn Historical Corpora and the PCEEC (Santorini 2010)の規約に従って作成する。この方式は、極力フラットな統辞構造を採用してノードの数を減らすことと、名詞句、動詞句、節等に必要に応じて機能情報(主語、目的語、時間副詞句、節の様々な機能等)をタグ付けすることを特色としている。構造的曖昧性が問題になる場合の多くで統辞的埋め込みをフラットなままに未指定とすることが出来るので記述しやすく、また有用な文法情報に富んでいる。特に今年度は日本語の機能語および構文を網羅的に取り上げ、これらに対する統辞解析の試行錯誤を通じて、コーパス構築のための基本的方法論について検討した。例文として、日本語の文法書である、益岡・田窪『基礎日本語文法ー改訂版ー』(1992年、くろしお出版) を取り上げ、その全例文約1,300文に対して統辞・味情報をタグ付けした。また、国立国語研究所の「現代日本語書き言葉均衡コーパス」の形態素解析情報の信頼性が高いことから、この中の例文に対するアノテーションを開始した。当初からの目標である、約4万文からなる統辞・意味情報付きツリーバンク構築を順調に進めた。そのノウハウは、これまでの研究を通じて(Butler and Yoshimoto 2012,吉本他2013)十分に蓄積されてきている。まず入手したテクストを形態素解析器およびProbabilistic Context-Free Grammarにもとづく統辞解析器にかけ、文の文節への分割およびそれらの間の依存関係に関する情報を得た。これをさらに、木構造の検索・変換用ツールtsurgeonのスクリプトを用いて句構造へと変換した。その結果のほとんどすべてについて人手による修正が必要であり、これが全体の中で主要な作業を占めた。得られた統辞解析結果は、構造変換を経て、SCTシステムに入力されて論理意味表示(新デイヴィドソン式表示)が得られた。その結果は、統辞解析情報の修正へとフィードバックされた。さらに、得られた統辞・意味情報付きツリーバンクの成果を利用しやすくするために、文の論理意味表示の新たな視覚提示法の開発とそれを利用した外国語教育等への応用法の研究を行った。本研究では、日本語の書き言葉文に対し十分な統辞論的情報を均質的にタギングするための方法を確立し、実際にプロトタイプ日本語トリーバンクを構築すること、またこれに対し文の意味情報を自動的にタグ付けし、コーパスの詳しい言語情報を利用して脳内言語処理モデルを構築することを目的とする。極力フラットな統辞構造を採用し、機能情報を付加するという方針の下に、自動解析器を使用しながらも、主として人手によって日本語トリーバンクを構築した。客観的でバランスのとれた分類・解析基準を定めながら構築作業を進めた。また、コーパスの頻度情報を利用して脳内言語処理の研究を進めた。このために、現代日本語の書き言葉の文に対して、ジャンルや文体を問わず、十分な統辞論的情報(句構造)を均質的にタギングするための方法を確立し、実際に相当数の文に対して統辞情報を付加したプロトタイプ日本語トリーバンクを構築した。さらに、これらの文に付加された統辞情報にもとづいて、文の意味情報(述語論理式による意味表示)をSCTを利用して自動的にタグ付けするための手法を開発した。これまでに確立した、アノテーションの方式にもとづいて、順調に作業をす薄めている。特に、「について」「における」などの助詞に相当する連語について検討を行い、単一の助詞として扱うこと、また同様に「にちがいない:などモーダル助動詞に相当する連語を単一の助動詞相当語として扱うための方針を定めて、意味解析の制度を向上させることができた。コーパス言語学アノテーション方式をさらに続けながら、ツリーバンク構築作業を継続する。同時に、マニュアルの執筆も行う。

また、得られた論理意味解析情報について、どのような文法情報を選んで係り受け情報を表示すべきかについて考察し、適切と思われる文法情報表示の候補を数件選ぶ。これらによる日本語テクストの係り受け関係の視覚表示を与えたテクスト読解実験を日本語学習者に対して行い、理解度のテストやアンケートにより、最適のものを選ぶ。フレーム・グラフについては、最下層の意味グループとして採用する、個体、述語、オペレーター等の意味的次元ごとに日本語に特有の構文や機能語の差異を除去していく。これにもとづいて、異なる意味解析法や異なる言語間の比較を行う。現実に使用されている様々な例文について検討することを通じて、アノテーションの方針が固まってきている。実際のトリーバンク開発も、研究補助員の協力もあって、順調に行われている。脳機能測定実験がずれこんだため、当初の計画が実行できなかったため。来年度からは、現実に使用された日本語文を対象とし、「現代日本語書き言葉均衡コーパス」の新聞記事データを中心として、合計約1万文のトリーバンクを構築する。この日本語コーパスプロトタイプの構築を通じて、日本語文に統辞解析情報をタグ付けするための客観的基準を確立する。主たる課題は、解析器による自動解析結果に対する、人手での語句分割、品詞付け、および句・節修飾先の訂正、また機能情報とスコープ情報の付加である。成果を『日本語トリーバンク開発作業マニュアル』としてまとめ、一般に公開する。さらに、開発したコーパスを利用して、上記の日本語かきまぜ文および日英語関係節に関する脳内処理計測実験を行う。コーパス開発に際し、必要に応じて、当該構文に関するデータの収集を優先させる。次年度に実験を行って、謝金等として使用する。
少数サンプルに対応した深層学習を用いた網膜症病変の自動検出処理の開発

無散瞳眼底カメラによる眼底検査は非侵襲で簡便であるため、検診目的で広く実施されているが、眼底画像の判定作業のための精度管理や時間的・人資源的な効率が確保されていない。近年は、深層畳み込みニューラルネットワーク(CNN)の適用が研究の主流であるが、CNNは多くの教師データ画像を必要とする反面、多くの病変画像収集の困難さが医用画像研究の共通の課題である。CNNには、画像内の位置関係の消失問題と、データオーグメンテーション効果の不十分さの問題がある。本研究では、画像内の位置情報保持を目的としたネットワークの検討と、人工画像生成によるオーギュメンテーションを検討する。
網膜芽細胞腫におけるTGF-βスーパーファミリーの生理的機能の解析

本研究により,網膜芽細胞腫におけるTGF-β受容体の発現と生理的意義について,本年度中に以下の内容を明らかにし,第100回日本眼科学会総会および第12回国際眼研究会議において学会発表を行った。今後,本研究の結果を論文発表する予定である。1)網膜芽細胞種細胞株であるY79細胞およびWERI細胞において,TGF-βI型受容体mRNAの発現はノーザン解析で確認されたが,TGF-βII型受容体mRNAの発現はほとんど認められなかった。現在,これら細胞において,TGF-β受容体ゲノムDNAの解析を群馬大学外科学教室と共同で行っている。2)[125I]標識TGF-βを用いた分子間架橋結合法・免疫沈降法では,網膜芽細胞腫細胞ではTGF-βII型受容体蛋白の発現は認められなかった。3)網膜芽細胞腫細胞において,TGF-β1による細胞増殖抑制の効果は,MTTアッセイ法では認められなかった。4)網膜芽細胞腫細胞において,TGF-βのシグナル伝達の下流分子であるsmad分子が細胞質から細胞核に移行しうるか,特異的抗体を用いた免疫組織化学的方法を本年度中に確立することができた。さらに細胞に各種の刺激やTGF-β受容体遺伝子を発現させることにより,smad分子の動きが明らかになるか検討をつづけたい。5)網膜芽細胞腫細胞株へのTGF-β受容体遺伝子導入により,TGF-βによるPAI-1遺伝子のプロモーター領域を活性化する作用がみられるか,ルシフェラーゼ活性の測定を行った。TGF-βI型受容体・II型受容体を2つとも遺伝子導入することにより,23倍程度の活性上昇が認められ,この細胞で,受容体以降のシグナル伝達が保存されている可能性が示唆された。現在さらに効率のよい方法で遺伝子導入する実験系を確立しつつある。本研究により,網膜芽細胞腫においてはTGF-βリガンドの感受性が認められないのは,II型受容体の発現の欠如ないし低発現が原因として最も考えられ,受容体遺伝子導入により,TGF-βのシグナル伝達機構が正常に作動する可能性が強く示唆された。本研究は,臨床的に網膜芽細胞腫の腫瘍増殖抑制機構を解明しようとするものであり,腫瘍の遺伝子治療の可能性にもつながり,極めて重要な意義を有している。
唾液中のラクトフェリン量-歯周病リスクファクターに関する研究-

平成1618年の3年間で、我々の所属する施設の外来またはフィールドにおいて、351名の被検者から全唾液を採取して、サンドイッチ法によるELISA法にてラクトフェリンを定量し、年齢層別に評価した。また、40歳以上の被検者では歯周病の者と健常な者とのラクトフェリン量を比較した。(結果)1)全年齢層におけるラクトフェリン量は、0.05142μg/mLと値の幅が大きかった。どの年齢層においても個人差が大きかった。2)0歳代、10歳代、20歳代のラクトフェリン量は、いずれも50歳代以上のすべての年齢層のそれと有意差が認められた。30歳代、40歳代のラクトフェリン量は60歳代、70歳代以上のそれと有意差が認められた。3)ラクトフェリン量は加齢とともに増加する傾向が認められた。60歳代、70歳代以上のラクトフェリン量は、0歳代から40歳代のすべての年齢層のそれに比較して有意に増加していた(p<0.05)。4)全唾液中のラクトフェリン量と歯周病との間には、有意な相関は認められなかったことから、ラクトフェリン量は歯周病のリスクファクターではないことが明らかとなった。(考察)本研究の結果では、ラクトフェリン量は加齢による減少は認められなかったばかりか、60歳代以降においては有意な増加傾向が認められた。また、歯周病の罹患状態とも何の関連も認められなかった。このことからラクトフェリンは、口腔内免疫系において、どの年齢層においても関与している因子であることが示唆された。しかし、今回の研究はあくまでも横断的研究による結果であり、ラクトフェリン量が年齢によって変化するかについては、今後縦断的研究が必要である。また、唾液中のラクトフェリン量に影響を与える因子についても、今後更なる研究が必要である。歯周病における個人の罹患性(ペリオリスク)を調べるために、平成1618年の3年間で、我々の所属する施設の外来またはフィールドにおいて、100200名前後の健常者または歯周病に罹患した被検者から唾液を採取して、総タンパク質量、ラクトフェリンを定量する予定である。得られた唾液中のラクトフェリン量を統計的に処理し、歯周病罹患の有無により有意な差が認められるか、個人のラクトフェリン量からペリオリスクが判定可能かどうかを調べるのが本研究の目的である。本課題が採択されてから、平成16年度末までに1)北海道大学病院歯科診療センター保存系歯科診療室において、本研究への参加に承諾の得られた外来患者から全唾液の採取を開始し、現在までに55人分の検体を得ることができた。これらは現在、凍結保存中である。平成17年度は、さらに50100名から唾液を採取する予定である。2)唾液中のタンパク質濃度定量については、そのうち50人分が終了した。タンパク質濃度は年齢層による差異は認められず、その幅は200900μg/mlと個人差が認められた。3)唾液中のラクトフェリン量に関しては、サンプル数が足りないため、まだ測定を実施していない。サンプルが予定数に達し次第、ラクトフェリン定量キット(購入済み)にて測定を開始する予定である。

歯周病における個人の罹患性(ペリオリスク)を調べるために、平成1618年の3年間で、我々の所属する施設の外来またはフィールドにおいて、200名前後の健常者または歯周病に罹患した被検者から唾液を採取して、総タンパク質量、ラクトフェリンを定量する予定である。得られた唾液中のラクトフェリン量を統計的に処理し、歯周病罹患の有無により有意な差が認められるか、個人のラクトフェリン量からペリオリスクが判定可能かどうかを調べるのが本研究の目的である。本課題が採択されてから、平成17年度末までに1)北海道大学病院歯科診療センター保存系歯科診療室において、本研究への参加に承諾の得られた外来患者から全唾液の採取を開始し、現在までに125人分の検体を得ることができた。平成18年度は、さらに50名から唾液を採取する予定である。2)唾液中のラクトフェリン量については、0.84±0.55μg/ml(最小値0.09μg/ml、最大値1.93μg/ml)。唾液タンパク質1mgあたりに換算すると1.78±1.57μg(最小値0.15μg、最大値10.5μg)と個人差が大きかった。3)唾液中のラクトフェリン量と歯周病との間には、有意な相関が認められるか否かはまだ不明である。今後は様々な統計解析法を駆使して、更に調べる予定である。平成1618年の3年間で、我々の所属する施設の外来またはフィールドにおいて、351名の被検者から全唾液を採取して、サンドイッチ法によるELISA法にてラクトフェリンを定量し、年齢層別に評価した。また、40歳以上の被検者では歯周病の者と健常な者とのラクトフェリン量を比較した。(結果)1)全年齢層におけるラクトフェリン量は、0.05142μg/mLと値の幅が大きかった。どの年齢層においても個人差が大きかった。2)0歳代、10歳代、20歳代のラクトフェリン量は、いずれも50歳代以上のすべての年齢層のそれと有意差が認められた。30歳代、40歳代のラクトフェリン量は60歳代、70歳代以上のそれと有意差が認められた。3)ラクトフェリン量は加齢とともに増加する傾向が認められた。60歳代、70歳代以上のラクトフェリン量は、0歳代から40歳代のすべての年齢層のそれに比較して有意に増加していた(p<0.05)。4)全唾液中のラクトフェリン量と歯周病との間には、有意な相関は認められなかったことから、ラクトフェリン量は歯周病のリスクファクターではないことが明らかとなった。(考察)本研究の結果では、ラクトフェリン量は加齢による減少は認められなかったばかりか、60歳代以降においては有意な増加傾向が認められた。また、歯周病の罹患状態とも何の関連も認められなかった。このことからラクトフェリンは、口腔内免疫系において、どの年齢層においても関与している因子であることが示唆された。しかし、今回の研究はあくまでも横断的研究による結果であり、ラクトフェリン量が年齢によって変化するかについては、今後縦断的研究が必要である。また、唾液中のラクトフェリン量に影響を与える因子についても、今後更なる研究が必要である。
レーザー光の放射圧によるナノメートル分子集合構造の形成:全く新しい方法論の確立

顕微鏡下に集光した近赤外レーザービームにより、溶液中高分子、超微粒子、ミセルなどをnm次元のコロイド粒子焦点に集め、捕捉し、μmサイズの単一微粒子を形成させる全く新しい現象の研究を行った。レーザーマニピュレーション技術として注目されてきたこの現象は、光圧という新奇な摂動による新しい分子集合の構造形成へ応用することができる。本研究では目的にあったコロイド粒子を選び、精度の高いレーザー捕捉・分光実験を積み重ねることにより、以下の興味ある結果を得た。集光ビームの光圧は帯電したコロイド粒子間の静電原発を抑え会合させることができる。光圧により捕捉しうる最小のコロイド粒子の大きさは12nmと決定した。また光圧に応答する分子パラメーターは分極率であることを証明した。nmコロイド粒子からμmサイズの単一粒子形成のメカニズムは熱力学的化学平衡に光学的ポテンシャル形成が重なったものとして説明できる。形成された単一微粒子の形状はラグビーボールを縦にした形をしている。また水溶液の場合、水分子が近赤外レーザービームを吸収し、その光熱変換により焦点近傍20μm程度に1020゚Cの温度勾配をつくる。光圧で形成した単一微粒子はレーザービームを切ると当然すぐミクロブラウン運動を開始し消失するので、単一微粒子を固定化するため、高分子基板に過渡溶融を誘起し接着する方法を提案した。本研究では光圧という全く新しい力によるコロイド粒子の集合体形成過程を調べ、その機構を明らかにし、かつそれを律する分子パラメータを示すことに成功した。有機物質のレーザー科学に新しい研究領域を開拓することができた。溶液中に可溶化、分散した高分子を光の放射圧で会合させ、その動的挙動及び会合状態を解析し、さらに他の作製法では実現できない新たなナノメートル分子集合構造を形成することを目的として研究を行っている。本年度は、特に微粒子によるエバネッセント場の散乱を用いた放射圧ポテンシャル絶対測定法の開発と、ナノメートルサイズ高分子電解質の水溶液中で微粒子形成を行った。波長1064nmのNd^<3+>:YAGレーザーを捕捉用、He-Neレーザーを散乱測定用とし、液体中の単一高分子微粒子(4μm)を光の放射圧で捕捉し、ガラス基板に近づけ、下から全反射条件下もれてくるエバネッセント波を光散乱させ、その強度を解析することにより、三次元的な放射圧ポテンシャルを決定した。水溶液中で単一高分子ミセルを形成するpoly(A/Cd/Py)を試料として用い、微粒子の生成実験を行った。試料溶液中に捕捉用近赤外レーザー光(波長1064nm)を照射すると、その直後から微粒子の生成が確認された。近赤外レーザー光照射中止後の微粒子溶解速度は非常に速かった(<1秒)。このことは水溶液中のpoly(A/Cd/Py)自己組織化様式の知見に基づくと、生成微粒子中で高分子は互いに絡まらず、高分子ミセルが凝集した構造をとることを示している。これらの結果から、放射圧による微粒子形成法は、高分子間に働く強い静電反発に打ち勝って微粒子を生成することができる有効な手法であることが証明された。また、高分子にペンダントしたピレンの時間分解顕微蛍光分光測定では、蛍光の減衰は溶液に比べて生成微粒子の方が速く、新しい構造をもつ微粒子の形成が示唆された。現在、この微粒子形成による蛍光減衰の変化について、ピレン周囲の屈折率・極性の観点から検討している。溶液中に可溶化、分散した高分子を光の放射圧で会合させ、単一微粒子の形状がどのように形成されていくか追跡するとともに、その動的過程と化学構造、濃度、熱、レーザー光強度等のパラメーターとの関係をピコ秒顕微蛍光分光法を駆使し検討した。

加えて光形成された局所構造の知見を、高分子に蛍光性分子を化学結合でペンダントし、そのスペクトルシフト、寿命、エキシマー形成等を測定解析することにより求めた。カルバゾールやピレンとアクリルアミドスルホン酸誘導体の共重合高分子は、水溶液中で単一高分子でミセルを形成し会合しないので、光圧によりレーザーマニピュレーション可能なサイズを実験的に決めることができる。数種類の異なった化学構造をもつこの共重合体について、室温条件、水溶液中で有効な光圧を受ける最小サイズは15nmであることを証明した。また芳香族環が多く含まれている高分子ほど早く会合が起こり、分子の分極率が誘起される光圧の大小を判断するパラメーターであることを示した。また光圧により形成される分子集合構造は特殊であるので、光圧をかけたまま安定な固体としてとり出す、あるいは基板上固定化する必要がある。これについては高分子基板に高分子微粒子を光熱的に固定化する方法を開発した。この固定化技術は現在は数μm微粒子を対象としているが、さらにnm高分子に適用していく足がかりを得た。このように他の作製法では実現できないナノメートル領域の分子の配向、会合、集合状態を形成する方法論として確立しつつある。水溶液中に分散したアクリルアミド系ポリマーは、集光レーザービームの光熱変換に基づく焦点近傍の温度上昇により相転移を引き起こす。グロビュールコンホメーションは疎水性であるため会合し、小さな会合体を形成し、集光レーザービームの光圧により焦点に引き寄せられ、目に見える大きさの単一微粒子を形成する。この新しい分子集合構造の形成を9-(4-N,N-ジメチルミノフェニルフェナントレン)のCT蛍光をプローブとして化学的に結合したポリ(N-イソプロピルメタクリルアミド)についてこの2つの方法で評価した。まず捕捉用ビームと蛍光測定用励起ビームを独立に3次元的にずらして動かし、CT蛍光のピーク波長と減衰曲線の3次元分布を調べ、局所温度分布とコンホメーションの知見を求めた。次に焦点面から微粒子をずらして透過像を観察し、形成された微粒子の形状を求めた。この取り組みにより光圧によるnm高分子の集合会合構造を明らかにするとともに、光圧ポテンシャルの空間分布の見積もりを可能とした。
植食性昆虫が進化に至る、最初の変化は何か

本課題では、ミヤマカラスアゲハを入手することが不可欠であるが、山間部に生息している蝶であるため採集には大きな労力を要した。3個体のメス成虫を確保することができたが、食草の一つであるカラスザンショウの生葉および乾燥粉末を水で溶いた溶液では産卵しなかった。主たる食草であるキハダの生葉を入手して与えた結果、3個体とも産卵を確認できた。研究代表者はこれまでに、人工飼料によるアゲハチョウの飼育プロトコールを開発しており、多くの種類のアゲハチョウを飼育した経験があるので、同じ手法でミヤマカラスアゲハ幼虫の飼育を試みた。その結果、初齢幼虫の人工飼料への食いつきが悪く、多くの個体が二齢に到達できずに死んでしまった。ミヤマカラスアゲハに限っては、他の種と比較して食草粉末の割合を半分程度に減らし、「薄味」にする必要があった。二齢に到達できた個体は順調に生育し、成虫を得ることができたが、メス1個体とオス2個体のみであったため、今冬の累代飼育と個体数増加を断念し、メス1個体分の前脚を用いてRNA-seqを行なった。Illumina TruSeq RNA kitを用いてシークエンスライブラリーを作成し、Illumina MiSeq 600サイクルkitで塩基配列決定した。その結果、29個の化学感覚受容体候補遺伝子が見つかった。そのうち、完全長と推測されるものが5個あった。クロアゲハのトランスクリプトームデータを対象として、BLASTPを用いたホモロジー検索を行なった結果、部分配列ではあるもののクロアゲハの味覚受容体候補と高い相同性を示す配列が見つかった。両種に保存されている味覚受容体であれば、フェラムリン受容体である可能性が示唆される。今後は、実験に用いることができる個体数を増やし、ダイレクトmRNAシークエンスを行うことで、完全長配列の取得を試みる。研究開始当初、初年度ではフェラムリン受容体候補遺伝子の完全長配列の取得を目指していた。ミヤマカラスアゲハは関西地域では採集が難しい種ではあるが、3個体のメス成虫を確保することができ、それぞれから多数の卵を得ることができた。飼育条件が他のアゲハチョウ科昆虫とは異なっていたため、残念ながら核酸精製用サンプルの個体数を十分に確保することができず、メス成虫一個体分の前脚からのmRNA精製となったため、結果としては目標達成に向けて最小限のシークエンスリード数にとどまった。しかしながら、インサート長が平均500bpになるように改変したプロトコールでシークエンスライブラリーを作成し、300bpペアエンドでシークエンス可能なMiSeqの特徴を活かした配列決定を行ったことにより、Trinityを用いたde novoアセンブルでN50が2486bpとなる良好な結果が得られた。Trandecoderを用いたアミノ酸コード領域の推定と相同性検索により、29個の化学感覚受容体遺伝子の候補配列を検出することができた。7回膜貫通型受容体をコードすると推定される完全長配列は5つであり、残りは部分配列であった。これら候補遺伝子の中には、クロアゲハの味覚受容体候補配列と高い相同性を示すものが一つ見つかり、クロアゲハとミヤマカラスアゲハの2種で機能が保存されたフェラムリン受容体を持っているという仮説が正しければ、フェラムリン受容体遺伝子の重要な候補であると考えられる。クロアゲハに関しては、Trinityによるde novoアセンブルのデータ中から、フェラムリン候補遺伝子の完全長と思われる配列を取得しており、RNAiのための二重鎖RNAを合成する作業に着手している。候補遺伝子の完全長配列取得とはならなかったものの、重要な候補配列を検出することができ、初年度での取り組みとしては概ね順調であったと思われる。今後、フェラムリン受容体候補の機能を解明するためには、ミヤマカラスアゲハについても遺伝子の完全長配列を取得することが不可欠である。ミヤマカラスアゲハで完全長の配列を取得できなかった理由として、Trinityでのアセンブルに十分な量のリード数が得られなかった可能性が考えられる。MiSeqによるシークエンスリードを追加することでも改善できる可能性があるが、理想的にはNanopore MinIONを用いたダイレクトmRNAシークエンスを行い、1パスでの完全長配列の取得であると考えられる。そのためには5個体分の前脚組織が必要となるため、十分な個体数を確保できるよう採集と飼育を改善する。初年度の取り組みで、ミヤマカラスアゲハに関しては、他のアゲハチョウと異なり「薄味」の人工飼料を用意することで初齢幼虫の食いつきと生存率が改善できることを確認している。採卵可能なメス成虫を確保できれば、実験に必要な個体数を飼育することが可能であると考えている。ミヤマカラスアゲハは、生きた蛹がネットオークションで出品されることも多い。大阪府内での採集にこだわらずにこのような機会を利用し、必要な数のサンプルを入手することも検討する。上記のミヤマカラスアゲハでの候補遺伝子全長配列取得と並行して、クロアゲハに関してはフェラムリン受容体候補の機能解析に着手する。クロアゲハは大阪府内でも入手性が良いので、実験に必要な個体数を確保することは容易である。クロアゲハのフェラムリンに対する忌避行動は明瞭であるため、受容体遺伝子のRNAiによる産卵行動の変化の観察と、電気生理実験による感受性の変化を観察する予定である。ただ、フェラムリンを製造・販売していた米Ark社が業務停止状態となっており、購入が困難な状況が続いている。当初の予定には無かったが、委託で合成するか、キハダから精製することを検討する。

本課題では、ミヤマカラスアゲハを入手することが不可欠であるが、山間部に生息している蝶であるため採集には大きな労力を要した。3個体のメス成虫を確保することができたが、食草の一つであるカラスザンショウの生葉および乾燥粉末を水で溶いた溶液では産卵しなかった。主たる食草であるキハダの生葉を入手して与えた結果、3個体とも産卵を確認できた。研究代表者はこれまでに、人工飼料によるアゲハチョウの飼育プロトコールを開発しており、多くの種類のアゲハチョウを飼育した経験があるので、同じ手法でミヤマカラスアゲハ幼虫の飼育を試みた。その結果、初齢幼虫の人工飼料への食いつきが悪く、多くの個体が二齢に到達できずに死んでしまった。ミヤマカラスアゲハに限っては、他の種と比較して食草粉末の割合を半分程度に減らし、「薄味」にする必要があった。二齢に到達できた個体は順調に生育し、成虫を得ることができたが、メス1個体とオス2個体のみであったため、今冬の累代飼育と個体数増加を断念し、メス1個体分の前脚を用いてRNA-seqを行なった。Illumina TruSeq RNA kitを用いてシークエンスライブラリーを作成し、Illumina MiSeq 600サイクルkitで塩基配列決定した。その結果、29個の化学感覚受容体候補遺伝子が見つかった。そのうち、完全長と推測されるものが5個あった。クロアゲハのトランスクリプトームデータを対象として、BLASTPを用いたホモロジー検索を行なった結果、部分配列ではあるもののクロアゲハの味覚受容体候補と高い相同性を示す配列が見つかった。両種に保存されている味覚受容体であれば、フェラムリン受容体である可能性が示唆される。今後は、実験に用いることができる個体数を増やし、ダイレクトmRNAシークエンスを行うことで、完全長配列の取得を試みる。研究開始当初、初年度ではフェラムリン受容体候補遺伝子の完全長配列の取得を目指していた。ミヤマカラスアゲハは関西地域では採集が難しい種ではあるが、3個体のメス成虫を確保することができ、それぞれから多数の卵を得ることができた。飼育条件が他のアゲハチョウ科昆虫とは異なっていたため、残念ながら核酸精製用サンプルの個体数を十分に確保することができず、メス成虫一個体分の前脚からのmRNA精製となったため、結果としては目標達成に向けて最小限のシークエンスリード数にとどまった。しかしながら、インサート長が平均500bpになるように改変したプロトコールでシークエンスライブラリーを作成し、300bpペアエンドでシークエンス可能なMiSeqの特徴を活かした配列決定を行ったことにより、Trinityを用いたde novoアセンブルでN50が2486bpとなる良好な結果が得られた。Trandecoderを用いたアミノ酸コード領域の推定と相同性検索により、29個の化学感覚受容体遺伝子の候補配列を検出することができた。7回膜貫通型受容体をコードすると推定される完全長配列は5つであり、残りは部分配列であった。
可溶性HLAテトラマー(4量体)を用いた抗悪性黒色腫T細胞クローニングの試み

本研究は、腫瘍抗原ペプチドを含む可溶性HLA-A2及びA24テトラマー(4量体)分子の作製とそれを用いた抗悪性黒色腫T細胞の染色とソーティングを目的とした。1.HLA-A2/gp100_<(209-217)>、HLA-A2/MART-1_<(27-35)>、及びHLA-A24/EBV-Pテトラマー分子を作製した。各合成抗原ペプチド(メラノーマ抗原ペプチド(gp100_<(209-217)>,MART-1_<(27-35)>、EBウイルス抗原ペプチド(EBV-P))と大腸菌発現HLA-A2及びA24の重鎖とβ2-mを混合再構成した後、Bir A(ビオチン化酵素)で処理し、ゲル濾過続いてイオン交換クロマトで精製後、ビオチン化HLA/抗原ペプチド複合体(単量体)を得た。その単量体4分子をフィコエリスリン(PE)標識ストレプトアビジン1分子で結合させ、可溶性HLA/抗原ペプチドテトラマー(4量体)を作製した。2.PE標識HLA-A2/gp100_<(209-217)>及びHLA-A2/MART-1_<(27-35)>テトラマーとFITC標識抗CD8抗体を用い、各抗原ペプチドを認識する培養腫瘍浸潤T細胞(TIL1520及びTIL1235)を染色しFACSで解析した。その結果各テトラマーの用量及びTILの細胞数に依存して2重染色細胞(CD8^+T細胞中抗原特異的T細胞)を最大で90%以上認めたが、抗原特異性の異なるTIL1370では染色を認めず、抗原特異的T細胞を特異的かつ定量的に測定できた。また同様にPE標識HLA-A24/EBV-Pテトラマーを用いEBV-Pで刺激したHLA-A24の健常人PBMCを染色した結果、EBV-P抗原特異的T細胞を測定できた。以上の結果より、作製された可溶性HLAテトラマーを用いてHLA-A^*0201とA^*2402拘束性悪性黒色腫抗原を特異的に認識するT細胞の解析及び選択的増殖が可能となった。抗原ペプチドと結合した可溶性HLAテトラマー分子の作製1.HLA-A2ないしA24の第一ATGを含む5'側プライマーと,Bir A(E-coli biotin holoenzyme synthetase,ビオチン化酵素)の基質ペプチド(Bir A substrate peptide;BSP)とグリシン・セリンリンカーを介してHLAのα3ドメインに連なる3'側プライマーを用いて,すでにクローニングされているHLA-A2ないしA24cDNAを鋳型にPCR法を行った(PCR法により得られたHLA分子は3'側の膜貫通領域を欠く)。両プライマーはそれぞれ異なる制限酵素切断部位を有する。2.制限酵素消化後,大腸菌蛋白発現ベクターpHN1+にクローニングし,常法により大腸菌に蛋白を大量発現させ,HLA分子モノマーを封入体として回収した。

封入体を尿素により変性した後,希釈法と限外濾過法を用いて可溶化したHLA分子モノマーを,種々のプロテアーゼ阻害剤存在下でHLA結合性ペプチドおよびβ2ミクログロブリンと共に適当な立体構造を保持するように巻き戻した。本年度は既に同定されているHLA-A2に結合するインフルエンザペプチドあるいはHLA-A24に結合するEBVペプチドを用いて合成を進めた。3.25°C,12時間Bir A(Avidity社)存在下でビオチン化したHLA-ペプチド分子をゲル濾過クロマトグラフィー,続いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製後,4:1のモル比にてフィコエリスリン(PE)標識したストレプトアビジンに結合させ,可溶性HLA-ペプチドテトラマー分子を作製した。1.今年度は、HLA-A2/gp100(209-217)、HLA-A2/MART-1(27-35)及びHLA-A24/EBV-Pテトラマー分子を作製した。すなわちそれぞれの合成抗原ペプチド(メラノーマ抗原ペプチド(gp100(209-217),MART-1(27-35))、EBウイルス抗原ペプチド(EBV-P))と大腸菌で発現させたHLA-A2あるいはHLA-A24の重鎖とβ2microglobulinを混合再構成した後、Bir A(ビオチン化酵素)でビオチン化し、ゲル濾過とイオン交換クロマトグラフィーにより精製後、ビオチン化HLA/抗原ペプチド複合体(単量体)を得た。単量体をフィコエリスリン(PE)標識したストレプトアビジンに4:1のモル比で結合させ可溶性HLA/抗原ペプチドテトラマー(4量体)を作製した。以上の結果より、作製された可溶性HLAテトラマーを用いてHLA-A^*0201とA^*2402拘束性悪性黒色腫抗原を特異的に認識するT細胞の解析及び選択的増殖が可能となった。
超分子結晶を用いる固相光反応の強制的制御

新しい有機合成手法やその汎用性を高める観点から、「結晶反応は何処まで強制的に制御できるか」は興味ある問題である。我々は、このために、固体光反応の選択性を結晶性超分子の形成により強制的に変換する新しい手法を開発している。本研究では、オレフィン類の結晶光二量化反応を制御するために、ジアミンの他にジカルボン酸およびメタルを非共有結合性リンカーとして用いた研究をした。更に、電荷移動結晶の励起により生成するイオンラジカルの固相反応も研究した。(1)非共有結合性リンカーを利用した固相光二量化反応の強制的制御。(a)ジアミンを用いた研究。ケイ皮酸類を固体状態で光二量化させるときに、ゴーシュ型1,2-ジアミンと複塩結晶を形成させることが反応を強制的かつ選択的に起こすために有効であった。(b)ジカルボン酸を用いた研究。ケイ皮酸アミド類の固相光二量化反応はフタル酸や蓚酸により強制的に制御できた。フマル酸の場合はヘテロ二量体が生成した。(c)メタルを用いた研究。ケイ皮酸類の固相光二量化反応は二価メタル(Mg,Ca,Sr,Ba,Zn)との塩を形成させる方法によっても制御できた。Znの場合は第三成分としてアミンを配位させ、その影響を調べる。(2)新しい電荷移動結晶の固相光反応性。テトラシアノベンゼンをアクセプターとする弱いドナーとの電荷移動結晶の光反応を研究している。強いドナーとの電荷移動結晶は光に対して安定であった。(3)炭酸ガスを取り込む超分子結晶。炭酸ガスを含む二成分結晶を作製したが、阻相光反応性は無かった。(4) 2,4,6-トリイソプロピルベンゾフェノン類の固相光反応。4'-メトキシカルボニル体から生成する安定なラジカル結晶、および、(S)-フェニルアラニンメチルエステル誘導体の固相不斉誘導反応を研究した。
カーボンナノチューブにおける選択的分子認識の解明及びそれに基づいた高純度分離精製

本研究ではカーボンナノチューブ(CNT)における選択的分子認識を解明し、CNTの高純度分離精製に向けて分子設計を行うことを目的としている。まず、金属性単層カーボンナノチューブ(m-SWNT)と半導体性単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)における選択的分子認識を調べた。アフィニティークロマトグラフィー法を用い、溶出時間に基づいて検体と固定相との相互作用を見積もる方法を参考に実験を行った。各m-SWNTとs-SWNTを固定相とする液体クロマトグラフィー(LC)用カラムを作製し、多環芳香族分子の溶出時間を調べ、各カラムから得られた多環芳香族分子の溶出パターンを比較し、選択的分子認識を分析した。各カラムから得られたクロマトグラムに差は見られたが、詳細なメカニズムに関しては現在考察中である。一方、SWNTバンドル界面における選択的分子認識を調べた。SWNTバンドルに存在する外部溝はSWNT表面と比較し、分子がより安定に吸着できる特異的界面を与える。この界面における分子の吸着挙動を調べることは複合体デザインに向け興味深い知見を与えると期待できる。異なる濃度のSWNT可溶化溶液中に存在するSWNTはバンドル(凝集により束になった構造)程度が異なっており、シリカゲルにコーティングするとバンドル程度がフリージングされる。そこで、異なる濃度のSWNT可溶化溶液に等量のシリカゲルを加え、バンドル程度の大小を制御したSWNTコーティングを行った。薄い濃度でコーティングされたSWNTとシリカゲルの複合体(isolated-SWNT-silica)にはSWNTバンドルがほとんど見られないのに対し、濃い濃度でコーティングされた複合体(bundled-SWNT-silica)にはSWNTバンドルが多数見られ、バンドル程度を制御したSWNT-sillcaの作製ができた。各SWNT-silicaを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の固定相として用いるため、空カラムに充填し、HPLC用カラムを作製した。SWNT-silicaをHPLC用カラムとして用いSWNTと検体との相互作用を分析する方法は簡便でかつ正確性があり、各バンドル状態における分子との相互作用を調べるにあたり、適切な方法である。検体は多環芳香族分子を用いた。孤立分散したSWNTとバンドルしたSWNTを固定相とするカラムから得られたクロマトグラムから興味深い現象が見られた。p-Terpheny1以外は溶出順や溶出パターンが変化せずSWNT量に従い溶出時間が全体的にシフトする傾向が見られたことに対し、p-terphenylはSWNTバンドルが多い場合に他分子のシフトよりも大きく溶出時間が遅くなった。上記の結果からSWNTバンドル界面がp-terpheny1を選択的に認識することが示唆された。外部溝はSWNT間に存在する1次元性吸着サイトであるため、1次元性分子への選択性が強く現れたと考えられる。研究課題だけに限らず、データを解析する際に見つけた興味深い現象をシステマチックに分析し、論文としてまとめることができたので、期待以上に研究が進展したと思われる。カーボンナノチューブバンドルに存在する特異的界面(外部溝)において細長い芳香族分子が選択的に相互作用する現象を発見しており、外部溝における特異的相互作用を液相で分析したのは初めてである。この成果はカーボンナノチューブ-分子複合体のデザインに有用であると思われる。

SWNT-silicaをHPLC用カラムとして用いSWNTと検体との相互作用を分析する方法は簡便でかつ正確性があり、各バンドル状態における分子との相互作用を調べるにあたり、適切な方法である。検体は多環芳香族分子を用いた。孤立分散したSWNTとバンドルしたSWNTを固定相とするカラムから得られたクロマトグラムから興味深い現象が見られた。p-Terpheny1以外は溶出順や溶出パターンが変化せずSWNT量に従い溶出時間が全体的にシフトする傾向が見られたことに対し、p-terphenylはSWNTバンドルが多い場合に他分子のシフトよりも大きく溶出時間が遅くなった。上記の結果からSWNTバンドル界面がp-terpheny1を選択的に認識することが示唆された。外部溝はSWNT間に存在する1次元性吸着サイトであるため、1次元性分子への選択性が強く現れたと考えられる。研究課題だけに限らず、データを解析する際に見つけた興味深い現象をシステマチックに分析し、論文としてまとめることができたので、期待以上に研究が進展したと思われる。カーボンナノチューブバンドルに存在する特異的界面(外部溝)において細長い芳香族分子が選択的に相互作用する現象を発見しており、外部溝における特異的相互作用を液相で分析したのは初めてである。この成果はカーボンナノチューブ-分子複合体のデザインに有用であると思われる。
生理的および病的なメカノトランスダクションにおけるNOX4の役割

心臓は収縮弛緩を繰り返しているため常にメカノストレス下にある。我々は心筋細胞でのメカノトランスダクションにおいてNADPHoxidase 4(NOX4)由来の活性酸素( ROS: Reactive oxygen species )が大きく関わっているとの仮説をもとに、独自の単離心筋細胞伸展システムを用いてNOX4が生理的および心不全形成に関わる病態生理的メカノトランスダクションに及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。1.NOX4欠損マウス系統維持及び心不全モデルマウスの作成:心筋細胞における力学刺激を解明するためには成熟した心筋細胞が必要であり、毎回急性単離を行わなければならない為NOX4欠損マウスを系統維持にて必要数を準備した。また、圧負荷による心不全モデルマウスは、昨年度より引き続きTAC手術により作成しデータを蓄積中である。2.生理的・病理的ミトコンドリア膜電位:単離心筋細胞伸展時はミトコンドリア膜電位が過分極し、電子伝達系の稼働を促しATP産生増加に備え収縮力増加に対応できるようになると我々は考えている。心不全においてミトコンドリアの機能異常が報告されていることもあり、重要な細胞内小器官であるミトコンドリアの機能指標として病理的ミトコンドリア膜電位について測定をおこなった。現時点で、伸展刺激時のミトコンドリア膜電位は、正常マウス同様に過分極傾向にあり正常心筋細胞との間に有意差は確認できていない。3.NOX4欠損細胞における進展時のミトコンドリア膜電位:NOX4の局在は、ミトコンドリアに多いことを免疫染色にて確認し、伸展時のミトコンドリア膜電位を測定した。NOX4欠損細胞におけるミトコンドリア膜電位は、伸展時に過分極し通常のマウスと有意差はなかった。この結果より伸展時ミトコンドリア膜電位変化においてNOX4は、影響がないことが示唆された。本研究では、NOX4欠損マウスを購入し研究に必要な動物個体を維持しつつ、単離心筋細胞を用いて伸展時のNOX4の生理学的機能を明らかにしてきた。生理的・病理的ミトコンドリア膜電位の測定やNOX4欠損マウスにおけるミトコンドリア膜電位の測定を行い、申請時における実験計画書通りの研究成果が得られている。また、圧負荷モデル作成おいては、手技習得と術後の経過時間が必要な為、初年度から研究を着手しつつデータを蓄積している。以上の点を考慮し、おおむね順調に進展していると判断した。横行大動脈縮窄術をC57BL6・NOX4欠損マウスそれぞれで行い、心臓に圧力負荷を加え病態モデルを作成し経時的に圧負荷に伴う心機能の変化を心エコーで測定し、NOX4と病態との関連性を解明していく。また、伸展刺激時の病態生理を明らかにすることを目的とし、C57BL6由来病態モデルマウス・NOX4欠損由来病態モデルマウスのリモデリング単離心筋細胞を用いてROS生産量や発生張力等を測定する予定である。心臓は収縮弛緩を繰り返しているため、常にメカノストレス下にある。我々は心筋細胞でのメカノトランスダクションにおいてはNOX4由来の活性酸素( ROS:Reactive oxygen species )が大きく関わっているとの仮説のもとに、本研究では、独自の単離心筋細胞伸展システムを用いてNOX4が生理的および心不全形成に関わる病態生理的メカノトランスダクションに及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。心筋細胞がどのように力学刺激を受け入れているかを解明するためには、成熟した心筋細胞が必要であり、毎回急性単離を行わなければならない。そこで、NOX4KOマウスをジャクソン社より購入し系統維持にて必要数を準備した。また、圧負荷による心不全モデルマウスは、TAC手術により作成し心エコーによって心機能の評価を行ってデーターを蓄積中である。2.NOX4KOマウスを用いたNOX4の生理的機能評価NOX4KOマウス由来の単離心筋細胞にて伸展時のROS産生量やCa2+スパーク量の測定を行った。NOX4KOマウス由来の単離心筋細胞では、コントロールで見られる伸展時のROS産生が見られなかったが、Ca2+スパーク量は、通常と同様に増加している。これまでに明らかにっている伸展時のNOX2由来ROS産生時のメカニズムとは異なった経路が関与している可能性が考えられる。また、単離心筋細胞でのNOX4の収縮力の指標として、負荷依存性のない最大弾性率を長さ・張力関係より求めるとNOX4欠損時には、コントロールと比較し明らかな張力低下が見られた。これらの結果より、NOX4由来の活性酸素がメカノトランスダクションに関与している可能性が高いと示唆された。本研究では、NOX4KOマウスを購入し研究に必要な動物個体を維持しつつ、NOX4KOマウス由来単離心筋細胞を用いて伸展時のROSの産生量の失活や発生張力の低下など、NOX4の生理学的評価が明らかになってきていることから、申請時における実験計画書内容の予定通りの研究成果が得られている。また、圧負荷モデル作成おいては、手技習得と術後の経過時間が必要な為、初年度から研究を着手した。以上の点を考慮しおおむね順調に進展していると判断した。我々は心筋細胞でのメカノトランスダクションにおいてNADPHoxidase 4(NOX4)

由来の活性酸素( ROS: Reactive oxygen species )が大きく関わっているとの仮説をもとに、独自の単離心筋細胞伸展システムを用いてNOX4が生理的および心不全形成に関わる病態生理的メカノトランスダクションに及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。1.NOX4欠損マウス系統維持及び心不全モデルマウスの作成:心筋細胞における力学刺激を解明するためには成熟した心筋細胞が必要であり、毎回急性単離を行わなければならない為NOX4欠損マウスを系統維持にて必要数を準備した。また、圧負荷による心不全モデルマウスは、昨年度より引き続きTAC手術により作成しデータを蓄積中である。2.生理的・病理的ミトコンドリア膜電位:単離心筋細胞伸展時はミトコンドリア膜電位が過分極し、電子伝達系の稼働を促しATP産生増加に備え収縮力増加に対応できるようになると我々は考えている。心不全においてミトコンドリアの機能異常が報告されていることもあり、重要な細胞内小器官であるミトコンドリアの機能指標として病理的ミトコンドリア膜電位について測定をおこなった。現時点で、伸展刺激時のミトコンドリア膜電位は、正常マウス同様に過分極傾向にあり正常心筋細胞との間に有意差は確認できていない。3.NOX4欠損細胞における進展時のミトコンドリア膜電位:NOX4の局在は、ミトコンドリアに多いことを免疫染色にて確認し、伸展時のミトコンドリア膜電位を測定した。NOX4欠損細胞におけるミトコンドリア膜電位は、伸展時に過分極し通常のマウスと有意差はなかった。この結果より伸展時ミトコンドリア膜電位変化においてNOX4は、影響がないことが示唆された。本研究では、NOX4欠損マウスを購入し研究に必要な動物個体を維持しつつ、単離心筋細胞を用いて伸展時のNOX4の生理学的機能を明らかにしてきた。生理的・病理的ミトコンドリア膜電位の測定やNOX4欠損マウスにおけるミトコンドリア膜電位の測定を行い、申請時における実験計画書通りの研究成果が得られている。また、圧負荷モデル作成おいては、手技習得と術後の経過時間が必要な為、初年度から研究を着手しつつデータを蓄積している。以上の点を考慮し、おおむね順調に進展していると判断した。ミトコンドリアにおける伸展刺激時の病態生理を明らかにすることを目的とし、病態モデル由来のリモデリング単離心筋細胞を用いてミトコンドリアの膜電位を測定する予定である。また、圧負荷によるNOX4発現量変化に伴う心機能の変化を心エコー・ROS生産量・RT-PCR・Ca2+スパーク数変化・発生張力を測定し、NOX4と病態との関連性を解明していく。今後も引き続き、当初の計画に従ってデーターを蓄積していく予定である。横行大動脈縮窄術をC57BL6・NOX4欠損マウスそれぞれで行い、心臓に圧力負荷を加え病態モデルを作成し経時的に圧負荷に伴う心機能の変化を心エコーで測定し、NOX4と病態との関連性を解明していく。また、伸展刺激時の病態生理を明らかにすることを目的とし、C57BL6由来病態モデルマウス・NOX4欠損由来病態モデルマウスのリモデリング単離心筋細胞を用いてROS生産量や発生張力等を測定する予定である。ノックアクトマウスを購入し、マウス維持管理に経費が必要となった。