hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
『日越辞典』編纂へ向けての基盤構築研究

主な研究実績(具体的な取り組み)は、以下の通りである。研究代表者は、2013年3月に、ベトナム・フエ外国語大学日本語日本文化学科およびホーチミン国家大学ベトナム文化学科において、日・越両語における漢語表現の使用状況及びその意味・機能に関する資料収集を行なった。また、語順や結合力に関してベトナム語の文法的特徴を持つ漢語要素が含まれる語彙をリスト化し、その意味・用法について考察し、研究成果として発表した(下記の「13.研究発表」)し、日・越両語における複合動詞の後項に使われる「こむ」と“vao"の文法化の特徴を対照して研究成果(下記の「13.研究発表」)を出した。さらに、フエ外国語大学日本語日本文化学科においては、「日本語の否定表現についてー“わけではない"とベトナム語における対応表現」と題する講演を行なった。研究分担者の今井は、研究代表者と緊密に協力して下記の研究成果(下記の「13.研究発表」)を出した。また、2012年12月にハノイ国家大学を訪問し、当大学における日本語学習者の現状について東洋学部およびベトナム学部の教員・学生に聞き取り調査を行ない、『日越辞典』などの日本語教材のニーズの把握に努めるとともに、各種辞典・語学教材の収集を行なった。今年度は日本語とベトナム語で語順が逆になる二字の「漢越語」をリスト化し、その意味・用法の異同について考察した論文をまとめた。一昨年度の和製「漢越語」、昨年度の日越両語に意味が著しく異なる「漢越語」のリスト化とそれについての論文の作成と研究を積み重ねてきており、日越辞典編纂のなかで大きな比重を占める「漢越語」のリスト化と研究に一定の成果をあげたと評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度も引き続き「漢越語」のリスト化と研究を継続し、日越辞典編纂に向けて「漢越語」についてはほぼリスト化を完成させたいと考えている。そのために「漢越語」についての残された課題(たとえば四字熟語、越製「漢越語」など)の研究を行なうとともに、「漢越語」を網羅したリストの作成を進め、語彙集をまとめていきたい。
電気泳動ゲル内各種蛋白質燐酸化酵素の検出法の確立と応用

1.合成オリゴペプチドを基質に用いた電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素の検出法の開発と応用我々が1989年に報告した電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素検出法に合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素の基質として用いる方法を検討し、本検出法の汎用化を目指した。合成オリゴペプチドは単独ではゲル内に固定できないが、ポリリジンに共有結合させると効率よく固定され、蛋白質燐酸化酵素の基質となる特異配列が認識されることが明らかになった。この方法を用いてMAPキナーゼによって燐酸化されるミエリン塩基蛋白質の燐酸化部位周辺のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをゲル内に固定し、細胞の粗抽出液中のMAPキナーゼ活性を特異的にかつ、高感度で検出できることを確認した。2.電気泳動ゲル内蛋白質脱燐酸化酵素の検出法の開発と応用ポリリジンに結合させた合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素で燐酸化した後、ゲル内に固定して蛋白質脱燐酸化酵素を検出する方法を開発した。この方法を用いてCaMキナーゼIIの自己燐酸化部位周辺のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをCaMキナーゼIIで燐酸化した後ゲル内に固定し、ラットの脳の粗抽出液中の脱燐酸化酵素をスクリーニングした。CaMキナーゼIIの自己燐酸化部位を特異的に脱燐酸化する新しい蛋白質脱燐酸化酵素が検出されたので、この脱燐酸化活性を追跡しながらラットの脳からCaMキナーゼII脱燐酸化酵素を純粋に精製し、その性質を明らかにした。1.合成オリゴペプチドを基質に用いた電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素の検出法の開発。我々が1989年に報告した電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素検出法は極めて引用率の高い優れた方法として世界中の研究者によって利用されてきた。しかしこの方法はゲル内に固定する基質として蛋白質を用いており、各種の蛋白質燐酸化酵素の基質蛋白質をゲル内に固め込む程の量を精製し準備することは困難で、実際上限られた蛋白質しか使えないという難点あがった。そこで我々は各種の合成ペプチドをゲル内に固定し蛋白質燐酸化酵素の基質として用いる方法を検討した結果、各種の合成オリゴペプチドをポリリジンに共有結合させると、ゲル内に効率よく固定できまた蛋白質燐酸化酵素の基質として効率よく利用されることが明らかになった。しかも各種の蛋白質燐酸化酵素の基質となるコンセンサス配列を持ったオリゴペプチドはその特異性を維持している。オリゴペプチドは配列を自由に選んで合成できるし、モル濃度も蛋白質に比べれば自由に選択できるので、この方法は組織中の各種の蛋白質燐酸化酵素を解析するのに極めて優れた方法として今後汎用されることが期待される。2.電気泳動ゲル内蛋白質脱燐酸化酵素の検出法の開発。ポリリジンに結合させた合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素で燐酸化し、この燐酸化されたペプチドをゲル内に固定して蛋白質脱燐酸化酵素を検出する方法を開発した。蛋白質脱燐酸化酵素の研究は燐酸化酵素に比べると遅れており、これまでに明らかにされている脱燐酸化酵素の数も燐酸化酵素に比べると極めて僅かである。組織粗抽出液中の蛋白質脱燐酸化酵素を直接解析できる本方法は今後蛋白質脱燐酸化酵素の研究を飛躍的に進める可能性を秘めている。

2.電気泳動ゲル内蛋白質脱燐酸化酵素の検出法の開発と応用ポリリジンに結合させた合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素で燐酸化した後、ゲル内に固定して蛋白質脱燐酸化酵素を検出する方法を開発した。この方法を用いてCaMキナーゼIIの自己燐酸化部位周辺のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをCaMキナーゼIIで燐酸化した後ゲル内に固定し、ラットの脳の粗抽出液中の脱燐酸化酵素をスクリーニングした。CaMキナーゼIIの自己燐酸化部位を特異的に脱燐酸化する新しい蛋白質脱燐酸化酵素が検出されたので、この脱燐酸化活性を追跡しながらラットの脳からCaMキナーゼII脱燐酸化酵素を純粋に精製し、その性質を明らかにした。
フードシステムの動態過程と構造変革期におけるシステムの発展条件に関する研究

第1章では,食品用大豆に関するフード・システム論的分析を行った.まず,大豆食品の需要と製造の動向,食品用大豆市場とそこにおける制度的,政策的側面を検討して,食品用大豆のフード・システムが分断されていること,つまり,国内の大豆生産者は過去に市場獲得の機会があったにもかかわらず,それをものにすることができなかったことを明らかにした.一方で,ある程度は需要動向に反映した生産対応が行われていることについても,北海道を事例とした大豆の品種選択の検討によって示した.第2章では,近年の砂糖需要の変化を定量的に検証するとともに、その変化が砂糖のフードシステムに与える影響を検討した.その結果,(1)嗜好の変化、(2)代替甘味料、(3)加糖調整品の輸入や実需者の海外シフト,による砂糖需要の減少が明らかとなった.そのため、精製糖と国内産糖のメーカー間でコンフリクトが強まり,この問題の根本的な解消には、国際競争力強化を目指す方向と地域経済を維持する方向とにその目的を分化させ、その目的に添った施策を実施していく体制作りが必要であることを明かにした。第3章では,地球環境を意識した時代にふさわしい食生活が求めらる今日の変化を背景に,食品廃棄物の有効利用の実用例と馬鈴しょデンプンを利用した生分解性容器の開発事例について紹介した.第4章では,国際競争が厳しさを増す環境下において,わが国のフードシステムの成立条件を踏まえた上で,輸入原料および輸入製品との競合関係に焦点をあて,てん菜,馬鈴しょ,たまねぎ,スイートコーンの4作物を起点としたフードシステムの原料産地戦略について検討した.その結果,今日の厳しい競争条件下では,原料産地と加工メーカーとが基本的には共生関係にあることを認識し,産地戦略の立案では、フードシステム全体がいかに発展していくのかという間題意識が重要となっていることが明らかとなった.第1章では,食品用大豆に関するフード・システム論的分析を行った.まず,大豆食品の需要と製造の動向,食品用大豆市場とそこにおける制度的,政策的側面を検討して,食品用大豆のフード・システムが分断されていること,つまり,国内の大豆生産者は過去に市場獲得の機会があったにもかかわらず,それをものにすることができなかったことを明らかにした.一方で,ある程度は需要動向に反映した生産対応が行われていることについても,北海道を事例とした大豆の品種選択の検討によって示した.第2章では,近年の砂糖需要の変化を定量的に検証するとともに、その変化が砂糖のフードシステムに与える影響を検討した.その結果,(1)嗜好の変化、(2)代替甘味料、(3)加糖調整品の輸入や実需者の海外シフト,による砂糖需要の減少が明らかとなった.そのため、精製糖と国内産糖のメーカー間でコンフリクトが強まり,この問題の根本的な解消には、国際競争力強化を目指す方向と地域経済を維持する方向とにその目的を分化させ、その目的に添った施策を実施していく体制作りが必要であることを明かにした。第3章では,地球環境を意識した時代にふさわしい食生活が求めらる今日の変化を背景に,食品廃棄物の有効利用の実用例と馬鈴しょデンプンを利用した生分解性容器の開発事例について紹介した.第4章では,国際競争が厳しさを増す環境下において,わが国のフードシステムの成立条件を踏まえた上で,輸入原料および輸入製品との競合関係に焦点をあて,てん菜,馬鈴しょ,たまねぎ,スイートコーンの4作物を起点としたフードシステムの原料産地戦略について検討した.その結果,今日の厳しい競争条件下では,原料産地と加工メーカーとが基本的には共生関係にあることを認識し,産地戦略の立案では、フードシステム全体がいかに発展していくのかという間題意識が重要となっていることが明らかとなった.本年度は、砂糖フードシステムを中心とした動態過程と構造変革期におけるシステムについて研究を行った。この研究において、砂糖フードシステムが国の甘味資源政策によって規定されていること、しかしその甘味資源政策によって規定されているシステムは必ずしも安定的ではなく、砂糖需要構造の変化によって、システムを構成している主体間にコンフリクトを発生させていることが明かとなった。砂糖需要構造の変化の要因として、(1)健康上の理由などの嗜好の変化による需要の減少、(2)異性化糖などの代替甘味料による代替のための需要の減少、(3)砂糖の内外価格差に基づく加糖調整品の輸入増による需要の減少、(4)実需者の海外シフトや砂糖を使用した加工食品の輸入増による需要の減少の4つが確認された。砂糖需要の構造変化に伴うシステムを構成する主体間でのコンフリクトの調整が行われていた。それは、てん菜糖業者が一定量を超えるてん菜糖については、市販せずに精糖業者へ原料糖として供給し、精糖業者の生産量を確保することを内容としていた。このてん菜糖業者と精製糖業者間の調整は、新たにてん菜糖業者間においても潜在的なコンフリクトを発生させていると推察された。砂糖需要の更なる減少は、甘味資源政策によって砂糖フードシステムを規定することの矛盾を大きくし、特に、甘味資源政策において、アメリカやEUと異なり、加糖調整品の輸入制限を加えていないことがより矛盾を深刻化させていた。したがって、わが国の砂糖フードシステムが維持ないし発展していくためには、甘味資源政策の見直しが必要となっており、特に、わが国の砂糖価格の決定方式を実需レベルで受容可能な水準を基礎として決定することが求められていることが明かとなった。本年度は,まず食品用大豆に関するフード・システム論的分析を行った.

大豆食品の需要と製造の動向,食品用大豆市場とそこにおける制度的,政策的側面を検討して,食品用大豆のフード・システムが分断されていること,つまり,国内の大豆生産者は過去に市場獲得の機会があったにもかかわらず,それをものにすることができなかったことを明らかにした.一方で,ある程度は需要動向に反映した生産対応が行われていることについても,北海道を事例とした大豆の品種選択の検討によって示した.次に,地球環境を意識した時代にふさわしい食生活が求めらる今日の変化を背景に,食品廃棄物の有効利用の実用例と馬鈴しょデンプンを利用した生分解性容器の開発事例について紹介した.最後に,国際競争が厳しさを増す環境下において,わが国のフードシステムの成立条件を踏まえた上で,輸入原料および輸入製品との競合関係に焦点をあて,次の4作物を起点としたフードシステムの原料産地戦略について検討した.てん菜では、近年の砂糖需要の減少によって、フードシステムを構成する主体間でコンフリクトが発生し、新たな制度によるシステム形成が求められている。馬鈴薯はその用途の幅が広いことから多様であるが,ポテトサラダ等の加工では,一部の加工工場の立地が消費地立地型に変化してきており、その立地移動に対応した産地戦略が必要となってきている。たまねぎについては、原料段階で輸入品と厳しい競合関係にあり、第一に安定した原料供給が求められている。スイートコーンについては、製品レベルで厳しい競争下にあり、為替水準に強く影響される構造にある。その結果,今日の厳しい競争条件下では,原料産地と加工メーカーとが基本的には共生関係にあることを認識し,産地戦略の立案では、フードシステム全体がいかに発展していくのかという問題意識が重要となっていることが明らかとなった.
赤痢アメーバの表面レクチンに対する人工ヒト抗体の作製と応用

赤痢アメーバに感染していながら症状を呈さない無症候性嚢子排出者は、有症者ほど高い抗体価を示さないものの、赤痢アメーバの腸粘膜への侵襲を防御できる抗体を保有している可能性が高い。そこで、無症候性嚢子排出肴の末梢リンパ球由来の抗体遺伝子ライブラリーを構築し、抗赤痢アメーバヒトモノクローナル抗体Fab断片の作製を試みた。末梢血液約10mlからリンパ球を分離してRNAを精製し、抗体のL鎖とH鎖Fd領域をコードする遺伝子を増幅した。これらの遺伝子断片を発現ペクターに組み込んで大腸菌に導入し、ライプラリーを構築した。コロニーブロット法でスクリーニングを行い、次に間接蛍光抗体法で虫体表面と反応する1クローン(CP33)を選別した。さらに、CP33のH鎖に別のL鎖を組み合わせた3クローンを選別した。これら4クローンはいずれも260-kDaGal/GalNAcレクチンのcysteine-rich domainを認識していた。そして、これらの抗体で赤痢アメーバ栄養型虫体を前処理してCHO細胞と反応させたところ、接着が有意に抑制された。同様にこれらの抗体で前処理した虫体では赤血球貧食能が有意に抑制された。このように、抗体価が低い無症侯性嚢子排出者の僅かな本梢血液からでも、接着中和活性のあるヒト抗体を効率よく作製することができた。また、このようなヒト抗体をアメーバ症の診断にも応用するため、H鎖遺伝子のクローニング部位の下流にアルカリフォスファターゼ遺伝子を組み込んだベクターを構築し、抗体をアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質として産生させることを検討した。その結果、酵素活性を保持した状態で融合蛋白質を精製することができた。組換え型抗体として産生させることで、簡便に均質な標識ヒト抗体の調製が可能になると考えられた。赤痢アメーバに感染していながら症状を呈さない無症候性嚢子排出者は、有症者ほど高い血清抗体価を示さないものの、赤痢アメーバの腸粘膜への侵襲を防御できる抗体を保有している可能性が高い。そこで、無症候性嚢子排出者由来の抗赤痢アメーバヒトモノクローナル抗体の作製を試みた。末梢血液約10mlからリンパ球を分離してRNAを精製し、抗体のL鎖とH鎖Fd領域をコードする遺伝子をRT-PCRで増幅した。これらの遺伝子断片を発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入してライブラリーを作製した。約6×10^4個のクローンをコロニーブロット法でスクリーニングし、6個の陽性クローンを得た。さらに間接蛍光抗体法を用いて2次スクリーニングを行い、虫体表面と反応する1クローン(CP33)を選別した。抗体遺伝子の塩基配列を決定し、予想されるアミノ酸配列を既知の配列と比較したところ、CP33のL鎖V領域はVκ1、H鎖V領域はMISCに分類された。また、CP33が認識する抗原は赤痢アメーバに特異的な260-kDaのGal/GalNAcレクチンであることが明らかになった。次に、CP33を基にして、L鎖とH鎖のよりよい組み合わせの検索を試みた。その方法として、CP33のL鎖、H鎖遺伝子のそれぞれについて、他方をライブラリーの遺伝子とreshufflingし、再スクリーニングを行った。その結果、新たに70個以上の陽性クローンが得られた。アミノ酸配列の異なるクローンについて、赤痢アメーバ抗原に対する反応性をELISAで比較したところ、L鎖遺伝子をreshufflingして得られた少なくとも2クローンが、CP33よりも高い値を示した。

このような方法を用いることで、抗体価の低い感染者のリンパ球からも、病原体に特異的なヒトモノクローナル抗体の作製が可能であることが明らかになった。赤痢アメーバに感染していながら症状を呈さない無症候性嚢子排出者は、有症者ほど高い抗体価を示さないものの、赤痢アメーバの腸粘膜への侵襲を防御できる抗体を保有している可能性が高い。そこで、無症候性嚢子排出者の末梢リンパ球由来の抗体遺伝子ライブラリーを構築し、抗赤痢アメーバヒトモノクローナル抗体Fab断片の作製を行った。昨年度は、クローニングできたCP33と、CP33のH鎖に無症候性嚢子排出者由来の別のL鎖を組み合わせた2つのクローンが、赤痢アメーバの260-kDaレクチンに高い反応性を示すことを確認した。今年度は、CP33のH鎖を肝膿瘍患者由来のL鎖遺伝子ライブラリーと組み合わせて再スクリーニングし、新たに1クローンを作製した。これら4クローンが認識している抗原について解析したところ、260-kDレクチンを構成する2つのサブユニットのうち、いずれも170-kDa heavy subunitのcysteine-rich domainを認識していることが明らかになった。そして、これらの抗体で赤痢アメーバ栄養型虫体を前処理してCHO細胞と反応させたところ、接着が有意に抑制された。同様にこれらの抗体で前処理した虫体では赤血球貪食能が有意に抑制された。このように、抗体価が低い無症候性嚢子排出者の僅かな末梢血液からでも、接着中和活性のあるヒト抗体を効率よく作製することができた。また、このようなヒト抗体をアメーバ症の診断にも応用するため、H鎖遺伝子のクローニング部位の下流にアルカリフォスファターゼ遺伝子を組み込んだベクターを構築し、抗体をアルカリフォスファターゼとの融合蛋白質として産生させることを検討した。その結果、酵素活性を保持した状態で融合蛋白質を精製することができた。組換え型抗体として産生させることで、簡便に均質な標識ヒト抗体の調製が可能になると考えられた。
新規病原因子SEp22のサルモネラ腸管透過性の調節による病原性発現機構の解析

サルモネラの増殖に伴うsep22遺伝子の発現の変化をRT-PCRで解析した結果、静止期で高い現をしていたものが対数増殖期初期で急速に減少し、増殖に伴って再び漸増し、培養開始6-8時間後にピークとなり、その後やや減少した。これに対し、サルモネラのIII型分泌機構(TTSS)を構成する病原因子invAのmRNAは、静止期で低く、増殖に伴って対数増殖期初期で急激に上昇し培養開始1-2時間後にピークとなりその後減少した。このように、宿主への感染における攻撃因子であるinvAと宿主の免疫系からの攻撃に対する防御因子と考えられるsep22とは、菌の増殖期における発現変化が著しく異なることが明らかになった。一方、sep22遺伝子欠損変異株の1つ、KO-5株にsep22の遺伝子を導入したrevertantsの作成を試みたが、安定な形質変換を示す株を分離することができなかった。この点に関し、異なるベクター系を用いて作成を試みている。また、サルモネラのSEp22のタンパク質レベルでの発現誘導に関与する食品成分を解析した結果、LB培地、ウシ胎児血清、卵黄、キャベツ抽出物などに含まれる種々のタンパク質、ペプチドに活性が認められた。カゼイン分解物であるカサミノ酸からゲル濾過、HPLCなどによってさらに分析を行い、特定の分画に含まれるポリペプチドにSEp22の誘導活性が見られることが示された。また、Caco-2細胞への接着性と侵入性において、SEp22タンパク質の発現の有無はあまり大きな差を示さなかったが、マクロファージへの感染では、接着はSEp22欠損変異株(KO-5)の方がやや高いものの侵入性は低かった。その原因を示唆するものとして、新たに、マクロファージ細胞表面でKO-5株の分裂が抑制されて繊維状に長くなり、細胞へ侵入できない像が観察された。ヒト腸管上皮細胞Caco-2細胞を用い、SEp22を発現する親株とsep22遺伝子欠損変異株KO-5株を感染させた。その結果、感染菌量(MOI)を20-200まで変化させて4°C、1時間における菌の接着を調べた結果、常にKO-5株の方が-高い接着性を示した。この結果はマクロファージ系細胞株J774.1/JA-4細胞に対する接着とほぼ同様の結果であった。次に、上と同様にMOIを変化させてCaco-2細胞にサルモネラを4°C、1時間接着させた後に37°Cでさらに1時間培養して細胞内に取込ませた結果、MOI=20-100までは両菌株で同様の取り込みを示したがMOI=200では親株の方がKO-5株よりも有意に高い取り込みを示した。以上の結果から、SEp22はCaco-2細胞への菌の接着に対しては抑制的に作用するが、細胞内への取り込みには積極的な関与をすることが示唆された。さらに、病原因子であるSEp22の発現を調節する培地中の成分に関する研究を行った。その結果、富栄養のLB培地中の成分と同様、カサミノ酸の高分子の分画中の成分が選択的にSEp22を誘導することが明らかになった。さらに、サルモネラがヒトやマウスの腸管のバリアーを突破する際に遭遇することが予想される好中球やマクロファージの産生する活性酸素分子種がSEp22の発現に及ぼす影響を調べた。その結果、次亜塩素酸、過酸化水素、一酸化窒素、ペルオキシナイトライト(ONOO-)のうち、過酸化水素だけがSEp22を発現誘導することが示された。

以上の結果をもとに、今後はマウスを用いたループ結紮法によって、SEp22発現株と非発現株の腸管透過性を評価する予定である。本年度は、まず、サルモネラの増殖に伴うsep22遺伝子の発現の変化をRT-PCRで解析した結果、静止期で高い発現をしていたものが対数増殖期初期で急速に減少し、増殖に伴って再び漸増し、培養開始6-8時間後にピークとなり、その後やや減少した。これに対し、サルモネラのIII型分泌機構(TTSS)を構成する病原因子invAのmRNAは、静止期で低く、増殖に伴って対数増殖期初期で急激に上昇し培養開始1-2時間後にピークとなりその後減少した。このように、宿主への感染における攻撃因子であるinvAと宿主の免疫系からの攻撃に対する防御因子と考えられるsep22とは、菌の増殖期における発現変化が著しく異なることが明らかになった。一方、sep22遺伝子欠損変異株の1つ, KO-5株にsep22の遺伝子を導入したrevertantsの作成を試みたが、安定な形質変換を示す株を分離することができなかった。現在、異なるベクター系を用いて再度試みている。次に、サルモネラのSEp22のタンパク質レベルでの発現誘導に関与する食品成分を解析した結果、LB培地、ウシ胎児血清、卵黄、キャベツ抽出物などに含まれる種々のタンパク質、ペプチドに活性が認められた。カゼイン分解物であるカサミノ酸からゲル濾過、HPLCなどによってさらに分析を行い、特定の分画に含まれるポリペプチドにSEp22の誘導活性が見られることが示された。また、Caco-2細胞への接着性と侵入性において、SEp22タンパク質の発現の有無はあまり大きな差を示さなかったが、マクロファージへの感染では、接着はSEp22欠損変異株(KO-5)の方がやや高いものの侵入性は低かった。その原因を示唆するものとして、新たに、マクロファージ細胞表面でKO-5株の分裂が抑制されて繊維状に長くなり、細胞へ侵入できない像が観察された。
潤滑特性におけるエッジ効果

本研究では、従来の弾性流体潤滑理論を拡張して、滑り運動する機械要素のエッジ曲率半径の影響を数値計算によって求め、潤滑特性に及ぼすエッジ曲率半径ならびにエッジ部の摩耗形状の影響を明らかにすることを目的として以下のことを行なった。1.解析方法計算モデルを無限幅の直方体の両端に小さな曲率半径をもたせた形状にし、この形状の代表寸法による無次元化と離散値化メッシュの取りかた以外は従来の線接触EHLの数値計算法と同じである。計算の初期値としては、断面が四次曲線の端面をもつ直方体を平面に固体接触させたときの圧力分布を用い、油膜厚さは適当な値を用いた。2.計算結果まず、エッジ曲率を一定にし荷重と速度の影響を調べたところ、速度を小さく荷重を大きくすると油膜厚さが薄くなり、エッジ付近での応力集中が起こりやすくなることがわかった。平坦部では凹面状の弾性変形が起こっているが、圧力が低いためにその変形量は小さく、従来のハ-ドEHLとは異なった結果になった。次に、この形状で傾けて滑らせた場合を調べたところ、正のくさび状態はエッジでの応力集中がなくなり、油膜厚さが厚くなっているのに対し、負のくさび状態では入口側のエッジ付近だけに応力がさらに集中し、油膜厚さが極端に薄くなっているのがわかった。この時、荷重を支えている部分では、弾性変形により油膜厚さがほとんど平行になった。最後に、エッジの曲率の影響を調べたところ、油膜厚さにおよぼすエッジ曲率半径の影響が曲率半径の小さいところで顕著であることが明らかになった。3.今後の展開本研究で調べた条件のうち、最も厳しい負のくさび状の潤滑状態について詳しく研究する予定。
心筋症関連ミトコンドリア・核内遺伝子の協奏的制御を可能にする人工転写因子の開発

心筋症において近年、ミトコンドリアで産生される過酸化酸素種(ROS)および関連するシグナル経路とエピジェネティック制御の重要性が明らかになっている。これには核およびミトコンドリア遺伝子が協奏的に関わっているが、これらを適切に制御する手法はいまだ報告がない。天然転写因子がエピジェネティックコードと呼ばれるタンパク修飾を利用して様々な制御を行っていることを踏まえ、本研究ではナノ粒子上にさまざまな機能性化合物を導入することでこれを模した人工転写因子SMART-TFの開発を行う。これによりROSレベルおよび細胞内エネルギー代謝を制御し、心疾患治療に革新的なストラテジーを提供できると考えられる。
テロメア機能を担うタンパク質複合体の統合的制御システムの解明

テロメアは染色体末端を構成するDNA-タンパク質複合体であり、染色体インテグリティの維持に必須な機能エレメントである。テロメアの機能は、DNA損傷等によって生じる二重鎖切断末端と真の染色体末端とを区別すること(末端保護機能)、および染色体末端をテロメラーゼに依存的に複製させること(末端複製機能)である。本研究は、細胞周期において、テロメアのもつ二つの拮抗的機能が調整される分子機構の解明を通じて、テロメア機能を担うタンパク質複合体が秩序だって制御される分子機構(統合的制御システム)を明らかにすることを目的とした。出芽酵母のCST(Cdc13-Stn1-Ten1)複合体はテロメア末端DNAに結合し、両機能に関与することが知られている。我々は、CST複合体が細胞周期短縮を感知するATMキナーゼと、細胞周期における複製制御に関与するCdkの連携により順次リン酸化され、これにより短縮したテロメアに特異的なテロメア伸長が活性化されてテロメア定常長が維持されることを示した。また、Stn1が、複製阻害剤の添加により複製フォークが停止したのちの複製再開過程を調整する活性をもつことを示唆した。さらに、新規突然変異の解析から、Stn1のN末のもつ末端保護機能と、C末の末端複製機能との連携により細胞の増殖が維持されていることを明らかにした。本研究により、CSTタンパク質がシグナルを受容し、自身の機能を変化させてテロメア恒常性維持に関与する分子機構が明らかにすることができた。テロメアの最も重要な機能は、DNA損傷等によって生じる二重鎖切断末端と真の染色体末端とを区別することにある。これまでの研究から、テロメアが細胞周期特異的な「保護」と「非保護」の二つのテロメアクロマチン構造を繰り返していること、そのうち「非保護」の時期を利用してテロメア複製反応が進行していること、を明らかにしている。つまり、テロメアの複製は末端の構造を細胞周期の時期特異的に変換する分子装置によつて厳密に制御され、異常な伸長や過度の短縮が防止されていると考えられる。本研究は、細胞周期におけるテロメア構造変換の分子機構とそのテロメア複製における機能、およびその破綻による染色体構造異常の発生機序を中心命題に、テロメア機能を担うタンパク質複合体が秩序だつて制御される分子機構(統合的制御システム)を解明することを目的とする。特に、細胞周期およびテロメア長によりテロメア複製活性が制御されるメカニズムを、分子レベルで明らかにすることを目指している。テロメアは、染色体末端を構成する機能構造体として遺伝情報の安定的維持に関与する。我々は出芽酵母をモデルにした解析から、テロメアに局在化するタンパク質複合体が細胞周期において動的に変化すること、その変化がテロメアのキャッピング機能と複製機能の調整に重要であることを見いだしている。今年度は、テロメア構成タンパク質のうち、一本鎖DNA結合活性をもつCdc13-Stn1-Ten1複合体の動態と制御に関する解析を進め、以下の知見を得た。1.Stn1の細胞周期におけるリン酸化制御Stn1はテロメア複製が進行する時期に電気泳動度の異なる分子種が出現する。この変化はStn1におきるリン酸化修飾が原因であることを見いだした。このリン酸化にはATMファミリータンパク質Te11とMec1、およびCdkであるCdc28が関わっている。網羅的な部位特異的置換体の作成によりこのリン酸化部位を特定し、その部位に対するリン酸化特異的抗体の作成を行った。その結果、この修飾がテロメラーゼによるテロメア伸張反応を制御していることが示唆された。2.Stn1の動態と機能ドメインの解析Stn1はCdc13、Stn1と複合体を形成し、テロメア一本鎖DNAが最も伸長するS期後期にテロメア結合量が増加することを示した。

また、Stn1のC末端部位を欠失させても細胞は増殖可能であり、このドメインはCdc13複合体のもつ末端保護活性には必須でないことが示唆された。テロメアは,染色体末端を構成する機能構造体として遺伝情報の安定的維持に関与する。我々は出芽酵母をモデルにしてテロメア構成因子の細胞周期動態の解析を行っており,昨年度までにテロメアに局在化するタンパク質複合体が細胞周期において動的に変化すること,その変化がテロメアのキャッピング機能と複製機能の調整に重要であることを見いだしている。本年度は,昨年度に引き続き,テロメアー本鎖DNA結合活性をもつCdc13-Stnl-Tenl複合体の動態と制御に関する解析を進め,以下の知見を得た。1.リン酸化制御に関わるキナーゼCdc13およびStn1は細胞周期がS期からG2/M期に進行する際に電気泳動度の遅い分子種が出現する。これらの変化はリン酸化修飾であり,そのリン酸化にATMファミリータンパク質TellとMec1,およびCdkであるCdc28が関わっていることを見いだした。このリン酸化部位を網羅的な部位特異的置換体の作成により特定し,このリン酸化がTell/Mec1による最初のリン酸化,およびCdkによる最初のリン酸化に依存するリン酸化,という二段階の制御が存在することを見いだした。2.Cdc14ホスファターゼによる制御Cdc14はM期の後期においてテロメア領域の分離に必要なことがわかっている。Cdc14によって脱リン酸化される標的タンパク質の検索を行い,Cdc14の制限温度下で高リン酸化状態に保たれるテロメアタンパク質を見いだした。テロメアは、染色体末端を構成する機能構造体として遺伝情報の安定伝達に必須である。我々は出芽酵母をモデルにしてテロメア構成因子の細胞周期動態の解析を行っており、昨年度までにテロメアに局在化するタンパク質複合体が細胞周期において特異的修飾を受けることを見いだしている。本年度は、テロメアー本鎖DNA結合活性をもっCdc13-Stn1-Ten1複合体の動態と制御に関する解析をさらに進め、以下の知見を得た。1.細胞周期依存的リン酸化のテロメア長による制御リン酸化制御に関わるキナーゼStn1はSt細胞周期がS期からG2/M期に進行する際にリン酸化を受ける。このリン酸化に関与するキナーゼとしてATMファミリータンパク質Te11とMec1、およびCdkであるCdc28依存的であることを見いだした。このリン酸化が細胞内では最階的に起こること、また第一段目のリン酸化がテロメア短縮により昂進することを明らかにした。また、試験管内反応により、Stn1がCdkの直接の標的であることがわかった。2.STN1の新規変異の単離STN1のN末端領域の変異を単離し、この変異株でテロメアが伸長することを見いだした。この変異とC末端領域変異との組合せにより、細胞の増殖が極端に低下する。従って、Stn1は複数のタンパク質と結合するハブとして機能すること、それら結合タンパク質問の機能連携によりテロメア恒常性が相補的に維持されていることが示唆された。本研究では出芽酵母を実験材料として、細胞周期におけるテロメア構成因子の機能制御の分子機構の解明を目指した。
慢性関節リウマチに対する骨髄移植療法の基礎的研究

慢性関節リウマチに対する根治的治療としての骨髄移植療法の可能性を検討するために、その誘発モデルであるタイプ||コラ-ゲン関節炎マウスに対する骨髄移植の効果を検討した。8週齢のDBA/1Jマウスを用いて、型通りタイプ||コラ-ゲン関節炎を発症させた。この関節炎マウスに対して致死量の放射線照射を行ない、24時間後に同系であるDBA/1Jマウスおよび異系であるBALB/cマウスから採取した骨髄細胞を移入した。なお、BALB/cマウスの場合は移植片対宿主反応を避けるために、T細胞を除去した後に移植した。関節炎に対する効果を発症率と関節炎指数および抗タイプ||コラ-ゲン抗体値により判定した。二次感作1週前に骨髄移植を行なった群では、同系、異系ともに完全に関節炎発症を抑制した。二次感作後2週の関節炎発症後の骨髄移植では、発症の遅延と関節炎指数の減少を認め、この関節炎抑制効果は二次感作後9週まで持続した。抗タイプ||コラ-ゲン抗体値は移植後早期に減少を認めた。これらの発症後の治療効果はより異系移植に強く認められた。そこで、タイプ||コラ-ゲン関節炎の発症に対する遺伝的背景の関与も示唆され、異系移植の際のキメリズムの確認を補体依存性細胞障害性試験を用いて行なった。クラス1および2抗原は移植後1週で60%、4週で80%、8週で90%以上がドナ-の抗原に置換され、リンパ球表面抗原に関しては2から4週以内に90%以上がすでに置換されていた。さらに、異系骨髄移植後4週で再感作を行なっても関節炎の新たな発症を認めなかった。以上より、骨髄移植は関節炎発症予防と治療効果を持つことが明らかとなり、また、関節炎発症に対する遺伝的背景の関与が示唆された。慢性関節リウマチに対する根治的治療としての骨髄移植療法の可能性を検討するために、その誘発モデルであるコラ-ゲン関節炎マウスに対する骨髄移植の効果を検討した。8週齢のDBA/1Jマウスを用いて、Bovine typeII collagenとFreund's complete adjuvantにて初回感作、3週後に追加感作を行い、関節炎を発症させた。この関節炎マウスに対して、致死量の放射線照射(コバルト9Gyとよび11Gy)を行い、24時間後に同系であるDBA/1Jマウスおよび異糸であるBALB/cマウスから採取した骨髄細胞を5×10^6または25×10^6個移入した。なお、BALB/Cの場合はgraft versus bost reactionを避けるために、抗thy1,2抗体を用いたcomplement lysisによりT細胞を除去した後に移植を行った。骨髄移植の時期は、二次感作の1週前、4日後、2週後の3種類とし、関節炎に対する効果を発症率とarthritic indexを用いて判定し、免疫学的な効果はELISA法による抗タイプIIコラ-ゲン抗体価の測定により判定した。二次感作1週前に行った骨髄移植では、同系、異系ともに放射線照射量、移植骨髄細胞数にかかわらず完全に関節炎発症を抑制した。4日後、2週後の骨髄移植群では、発症の遅延とarthritic indexの減少を認め、特にこの効果は、11Gy照射群、異系移植群、25×10^6個移入群で著明であった。これらの関節炎抑制効果は二次感作後9週間の観察期間の間持続した。抗タイプIIコラ-ゲン抗体価は、どの群でも骨髄移植後早期に減少を認め、特に異系移系植群では二次感作後9週の時期にはほとんど検出できなかった。このことから、異系移植により免疫学的にほぼ正常化したことが示唆された。以上の結果より、骨髄移植を行うことにより、関節炎発症の予防効果と、発症後の関節炎に対する治療効果が得られることが明らかとなった。

さらに、異系骨髄移植後4週で再感作を行なっても関節炎の新たな発症を認めなかった。以上より、骨髄移植は関節炎発症予防と治療効果を持つことが明らかとなり、また、関節炎発症に対する遺伝的背景の関与が示唆された。
脂質トランスポートソームを介した脂質代謝制御と破綻の分子機構

【内容】本研究の目的は、脂質転移蛋白Stard10に注目して肝臓における脂質代謝の制御と破綻の分子機構を明らかにし、新たな治療戦略の分子基盤を構築することである。H23年度は、Stard10ノックアウトマウス(Stard10 KO)の肝臓においてコレステロールおよび中性脂肪の含有量が野生型マウス(WT)に比較して有意に低く、高脂肪食の負荷に対して脂肪肝になりにくいことを見出した。平成24年度は、さらに詳細な網羅的メタボローム解析と胆汁酸解析を行い、胆汁酸の腸管循環を検討した。その結果、以下の研究成果を得た。(1)マウス肝臓細胞においてStard10は、肝細胞膜、毛細胆管側膜、脂肪滴膜とその近傍の小胞体周囲など、胆汁酸分泌やVLDL産生に重要な場所に局在していた。(2)Stard10 KOではWTに比較して胆汁酸および脂肪酸の代謝産物に著名な変化が認められ、また、関連遺伝子の発現レベルも同様に変化していた。(3)Stard10と胆汁酸取り込みトランスポーター(ASBT)は、小腸粘膜上皮細胞膜に共局在しており、Stard10 KOではASBTの発現が著名に低下していた。(4)上記(1)(3)から予測された通り、Stard10 KOでは糞便中に排泄される胆汁酸の量がWTに比較して有意に高かった。Stard10 KOにおける胆汁酸消費の亢進は、肝臓に脂質が蓄積しにくい理由の一つと考えられた。(5)Stard10がPPAR-α制御遺伝子の一部、すなわち胆汁酸代謝や脂肪酸代謝に関わる遺伝子の転写制御に関わっているという重要な知見を得た。(6)肝臓においてStarD10と複合体を形成する蛋白として、リポ蛋白生成および脂質代謝調節に関連する蛋白を同定した。【意義・重要性】Stard10は、胆汁酸代謝および脂肪酸代謝に関連したPPAR-α制御遺伝子の発現調節を介して脂質代謝の制御に関与していることが明らかとなった。1マウス肝臓細胞においてStard10は、肝細胞膜、毛細胆管側膜、脂肪滴膜とその近傍の小胞体周囲など、胆汁酸分泌やVLDL産生に重要な場所に局在していた。2Stard10 KOではWTに比較して胆汁酸および脂肪酸の代謝産物に著名な変化が認められ、また、関連遺伝子の発現レベルも同様に変化していた。3Stard10と胆汁酸取り込みトランスポーター(ASBT)は、小腸粘膜上皮細胞膜に共局在しており、Stard10 KOではASBTの発現が著名に低下していた。4上記13から予測された通り、Stard10 KOでは糞便中に排泄される胆汁酸の量がWTに比較して有意に高かった。5Stard10がPPAR-α制御遺伝子の一部、すなわち胆汁酸代謝や脂肪酸代謝に関わる遺伝子の転写制御に関わっているという重要な知見を得た。6肝臓においてStarD10と複合体を形成する蛋白として、リポ蛋白生成および脂質代謝調節に関連する蛋白を同定した。

(5)Stard10がPPAR-α制御遺伝子の一部、すなわち胆汁酸代謝や脂肪酸代謝に関わる遺伝子の転写制御に関わっているという重要な知見を得た。(6)肝臓においてStarD10と複合体を形成する蛋白として、リポ蛋白生成および脂質代謝調節に関連する蛋白を同定した。【意義・重要性】Stard10は、胆汁酸代謝および脂肪酸代謝に関連したPPAR-α制御遺伝子の発現調節を介して脂質代謝の制御に関与していることが明らかとなった。本研究の目的は、脂質転移蛋白Stard10に注目して肝臓におけるトリグリセリドとVLDLの生合成過程の制御と破綻の分子機構を明らかにし、新たな治療戦略の分子基盤を構築することである。そこで下記の実験を実施し、成果を得た。(1) Stard10ノックアウトマウス(Stard10 KO)の肝臓における脂質代謝を野生型マウス(WT)と比較検討したところ、コレステロールおよびトリグリセリドの含有量がStard10 KOではWTに比較して有意に低かった。また、高脂肪食の負荷によりWTは脂肪肝を呈したのに対し、Stard10 KOは肝臓に脂肪が蓄積しにくく脂肪肝になりにくいことを見出した。(2)メタボローム解析および胆汁酸解析を行った結果、Stard10 KOはWTに比較して胆汁酸の分泌と排出が亢進していることを見出した。また、マイクロアレイ解析とqRT-PCR解析により、Stard10 KO肝臓ではPPAR-αで制御される胆汁酸合成制御関連遺伝子の発現が顕著に低下していることを明らかにした。(3)マウス肝臓pull-downサンプルのプロテオーム解析によりStard10と複合体を形成する蛋白を探索したところ、リポ蛋白生成および脂質代謝調節に関連する蛋白を同定した。(4)超解像画像解析技法により、マウス肝臓細胞におけるStard10の細胞内局在を解析した。Stard10は肝細胞膜、特に毛細胆管側膜、および脂肪滴膜とその近傍の小胞体周囲に局在することを見出した。(5) Stard10はin vitroの実験からフォスファチジルコリン(PC)転移活性を有することが示されているが、その生理的意義は不明である。そこで、肝臓および胆汁中のPC含量を測定したところ、Stard10 KOとWTの間で有意差は認められなかった。当初予定していた実験は、ほぼ全て実施することができた。その結果、以下に示す知見を得た。1) Stard10 KOマウスはWTマウスに比較して肝臓に脂質が蓄積しにくいこと、その理由として2) Stard10 KOではWTに比較して胆汁酸の分泌と排出が亢進していることを見出した。よって、Stard10 KOはWTに比較して胆汁酸の消費が亢進していると考えられた。また、Stard10がPPAR-αの活性制御に関わっているという重要な知見を得た。さらに3)肝臓においてStarD10と複合体を形成する蛋白を探索したところ、リポ蛋白生成および脂質代謝調節に関連する蛋白を同定した。今後、それらの相互作用の機能的意義を明らかにする予定である。4)マウス肝細胞においてStard10は肝細胞膜、特に毛細胆管側膜、および脂肪滴膜とその近傍の小胞体周囲に局在していた。これらは肝細胞において胆汁酸分泌やVLDL産生に重要な場であることから、非常に意義深い知見である。
光駆動型バイオリアクターを用いた有用物質の生産技術の開発と応用

前年度は、バクテリオロドプシンを含む紫膜、ATP合成酵素を膜内に配備したエネルギー生産小胞(リポソーム)を調製し、ルシフェリンールシフェラーゼ法を用いてこの光駆動のATP再生活性を確認した。しかし、本システムでは、高度好塩菌の培養と紫膜の調製に1週間、さらに好熱菌ATP合成酵素の大腸菌発現株の培養とATP合成酵素の精製に5日、リポソームの調製に2日を要するため、ATP再生小胞の構築に約2週間を要する点が問題となっていた。また、ATP再生小胞を再構成する際に、ATP合成酵素の膜に対する配向性を制御できないという欠点があった。一方、バクテリオロドプシンと同様な光駆動型プロトンポンプとして、近年、バクテリオロドプシンと53%の相同性を有するHalotterrigena turkmenica由来のデルタロドプシンが発見された。このデルタロドプシンはバクテリオロドプシンとは異なり、大腸菌で機能的に発現させることが可能である。そこで、デルタロドプシンを過剰発現させた大腸菌の反転膜小胞を調製することで、ATP再生小胞を構築することに成功した。このデルタロドプシン型ATP再生小胞は、大腸菌の培養に2日、反転膜の調製に1日と合計3日で調製可能になった。この大幅な講製期間の短縮は、本システムを実用化する際に大きく貢献すると考えられる。また、バクテリオロドプシン型のように再構成する必要がないため、ATP合成酵素は全て望む向きに配向する。さらに、デルタロドプシン型光駆動ATP再生小胞とヘキソキナーゼを共役させることで、光駆動でグルコースからグルコース6リン酸が生じるのを確認した。本年度は本研究で最終的に目指す光駆動型バイオリアクターの構築の前段階として、紫膜小胞リアクターの構築を行った。本システムは、バクテリオロドプシンを含む紫膜、ATP合成酵素を膜内に配備したエネルギー生産小胞(リボソーム)である。バクテリオロドプシンは高度高塩菌の細胞膜に斑点状に存在する紫膜に含まれる。東京工業大学大谷弘之先生より分譲していただいたバクテリオロドプシンを過剰に生産する高度高塩菌H.salinarium ET1001株を高食塩濃度の培地を用いて培養した。集菌後、浸透圧により細胞膜を部分的に破壊し紫膜を分離した。また、好熱菌由来ATP合成酵素の大腸菌発現系を東京工業大学吉田賢右先生、鈴木俊治先生より分与していただき、安定性の高いATP合成酵素を精製した。以上のようにして得られた紫膜およびATP合成酵素の混合液にリン脂質を添加し、小胞を再構成した。以上のように調製した紫膜小胞は、バクテリオロドプシンおよびATP合成酵素が、細胞に存在するときの向きと反対の向きになる。そのため、紫膜小胞に光を照射すると、小胞内部にプロトンを取り込み、小胞外部に対してプロトン濃度が高くなる。この小胞内外のプロトン濃度勾配がATP合成酵素を駆動し、ADPからATPが再生される。これまでにルシフェリンルシフェラーゼを用いてこの3光駆動のATP再生活性を確認した。また、ATP駆動酵素としてグルタチオン合成酵素や、ジペプチド合成酵素などのATP駆動酵素を精製し、ATP存在下における生産物の産生を確認するに至っている。今後は、紫膜小胞の光駆動ATP再生活性を利用して、共存させたATP駆動型有用物質生産酵素を駆動し、持続的に有用物質を生産させる。
科学衛星巨大データセットを用いた電磁波動現象の多次元発見的解析に関する研究

今年度本研究において検討を行なったのは以下の通りである.1)大量データ解析システムの構築あけぼの衛星が取得した観測生データから解析用途に応じて一次処理したデータを取りだし,オンライン化するシステムの検討および構築を行なった.2)磁気圏内の波動強度分布マップの作成地球磁気圏内で観測される電磁波動から磁気圏構造や圏内の物理過程の様相を発見的に解析するために,先に掲げた大量データ解析システムを利用して,あけぼの衛星で観測された10年間のデータに基づく地球近傍磁気圏内の波動の強度分布マップを作成し,各種波動活動の周波数特性と,ローカルタイム・季節・太陽活動度・地磁気活動度変化による強度依存性を定量的に調べた.さらに,波動の種別を計算機上で自動判別するアルゴリズムとして,波動強度の頻度分布解析という新たな手法を開発し,同手法が種別分類に有力であることを確認した.3)波動の到来方向推定に関する研究波動分布関数法は衛星上で観測された波動の到来方向推定のもっとも有力な手法であるが,必ずしも一意に解が決定できない逆問題であり,従来提唱された手法にはさまざまな問題点があった.我々は,到来波のエネルギー分布がガウス状に分布していると仮定し,最適なパラメータをフィッティングにより求めるモデルを提唱しその有効性を検証した.パラメータの推定には最適な初期値が必要だが,パラメータの全探索は計算量が膨大で現実的でないため,ニューラルネットのホップフィールドマシーンなどで用いられるエネルギー関数の概念を導入した初期値探索法を開発した.これにより先験的知識なしに,物理的に意味のある到来波の数と分布状態を知ると共に,最終的に得られた解の良さを客観的に評価することが可能となった.今年度本研究において検討を行なったのは以下の通りである.1)大量データ解析システムの構築あけぼの衛星が取得した観測生データから解析用途に応じて一次処理したデータを取りだし,オンライン化するシステムの検討および構築を行なった.2)磁気圏内の波動強度分布マップの作成地球磁気圏内で観測される電磁波動から磁気圏構造や圏内の物理過程の様相を発見的に解析するために,先に掲げた大量データ解析システムを利用して,あけぼの衛星で観測された10年間のデータに基づく地球近傍磁気圏内の波動の強度分布マップを作成し,各種波動活動の周波数特性と,ローカルタイム・季節・太陽活動度・地磁気活動度変化による強度依存性を定量的に調べた.さらに,波動の種別を計算機上で自動判別するアルゴリズムとして,波動強度の頻度分布解析という新たな手法を開発し,同手法が種別分類に有力であることを確認した.3)波動の到来方向推定に関する研究波動分布関数法は衛星上で観測された波動の到来方向推定のもっとも有力な手法であるが,必ずしも一意に解が決定できない逆問題であり,従来提唱された手法にはさまざまな問題点があった.我々は,到来波のエネルギー分布がガウス状に分布していると仮定し,最適なパラメータをフィッティングにより求めるモデルを提唱しその有効性を検証した.パラメータの推定には最適な初期値が必要だが,パラメータの全探索は計算量が膨大で現実的でないため,ニューラルネットのホップフィールドマシーンなどで用いられるエネルギー関数の概念を導入した初期値探索法を開発した.これにより先験的知識なしに,物理的に意味のある到来波の数と分布状態を知ると共に,最終的に得られた解の良さを客観的に評価することが可能となった.
遺伝子工学的手法によるジフテリア毒素リセプターの解析

本研究は、ジフテリア毒素リセプターの構造と毒素の細胞内侵入機構を遺伝子工学的手法を用いて解析し、これによってジフテリア毒素の毒性発現機構や高分子物質の細胞内輸送メカニズムを理解しようとするものである。研究の方法は、(1)培養細胞よりジフテリア毒素リセプターを分離、精製し、(2)これをマウスに免疫して毒素リセプタ夕ーに対するモノクローナル抗体を作製し、(3)この抗体を用いて毒素リセプターcDNAをクローニングし、(4)そのcDNAによってリセプターの構造と機能の解析を行うというものである。昭和62年度、筆者らはサル腎由来Vero細胞よりジフテリア毒素リセプターの分離に成功し、分子量14.5Kdの蛋白が毒素リセプター、あるいはその毒素結合部位であることを明らかにした。またアフィニティークロマトグラフィー等により、そのリセプターを約2万培養精製することができた。昭和63年度は、62年度で得られたリセプター分画を材料に、リセプターに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。現在までに約5種類のモノクローナル抗体が得られた。このうちの1種は、ジフテリア毒素のリセプターへの結合を阻害し、毒素の毒性を阻害する。この抗体を用いて免疫沈降法によってリセプター蛋白を解析すると、昭和62年度に見い出した14.5Kdのリセプター蛋白と同じ分子量の蛋白がSDSーゲル上で認められる。したがって、この抗体がジフテリア毒素リセプターを確かに認識するものであることがわかった。得られたモノクローナル抗体を用いて、現在cDNA分離のための準備を行っている。当初の研究計画からは若干遅れているが、本研究計画の最大の難関であったモノクローナル抗体の作製にも成功したので、今後さらに大きな成果が得られるものと思われる。本研究は,ジフテリ毒素リセプターの構造と毒素の細胞内侵入機構を遺伝子工学的手法を用いて解析し,これによってジフテリア毒素の毒性発見機構や高分子物質の細胞内輸送メカニズムを理解しようとするものである.研究の具体的方法は次の通りである.まず,(1)培養細胞よりジフテリア毒素リセプターを分離,精製し, (2)これをマウスに免疫して毒素リセプターに対するモノクローナル抗体を作製し, (3)この抗体を用いて,毒素感受性細胞mRNAから作製されたCDNAライブラリーをスクリーニングし,毒素リセプターCDNAを分離し, (4)このCDNA塩基配列の解析からリセブターの蛋白構造を明らかにし, (5)このCDNAをジフテリア毒素非感受性細胞に導入発現させることによって,毒素リセブターの機能を明らかにする.上記の研究計画に関して,これまで次の事柄を明らかにすることができた.まず第1のステップであるジフテリア毒素リセブターの分離と精製はほぼ完了した.これによって,分子量1万5千の蛋白質がジフテリア毒素リセプターそのもの,あるいはそのコンポーネントであることがわかった.この蛋白質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でシングルバンドになるまで精製が可能である.さらに部分精製したリセプター標品をマウスに免疫し,ジフテリア毒素リセプターに対する抗体を含む抗血清を得ることができた.このマウスのスプリーン細胞とミエローマ細胞を融合させてリセプターに対するモノクローナル抗体を作製中である.実験の進行状況は,計画調書に記載したペースより若干遅れているが,計画遂行に支障をきたすような問題点はないので, 63年度にはさらに大きな成果が得られるものと期待している.本研究は、ジフテリア毒素リセプターの構造と毒素の細胞内侵入機構を遺伝子工学的手法を用いて解析し、これによってジフテリア毒素の毒性発現機構や高分子物質の細胞内輸送メカニズムを理解しようとするものである。

研究の方法は、(1)培養細胞よりジフテリア毒素リセプターを分離、精製し、(2)これをマウスに免疫して毒素リセプターに対するモノクローナル抗体を作製し、(3)この抗体を用いて毒素リセプターのcDNAをクローニングして、(4)そのcDNAによってリセプターの解析を行なうというものである。上記の研究計画に関して、昭和62年度において筆者らはサル腎由来Vero細胞よりジフテリア毒素リセプターを分離、同定し、約2万倍まで精製することに成功した。そこで今年度(昭和63年度)は、得られたリセプター分画を材料にリセプターに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。現在までに約5種類の抗体を得ることができた。このうちの1種類の抗体は、ジフテリア毒素のリセプターへの結合を阻害し、毒素の毒性発現も阻害する。この抗体を用いて免疫沈降法によってリセプター蛋白を解析すると、昭和62年度に筆者らが蛋白精製の結果からジフテリア毒素リセプターであると同定したものと等しい分子量を持つ蛋白がリセプターとして認められた。したがって、この抗体がジフテリア毒素リセプターを認識するものであること、また毒素リセプターが以前筆者らが同定した蛋白に間違いがないことが明らかになった。そこで得られたモノクローナル抗体を用いて、cDNAの分離の準備を始めている。当初の研究計画からは若干遅れているが、本研究の最大の問題点であったモノクローナル抗体の作製にも成功したので、今後さらに大きな成果が得られるものと思われる。