hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腺様嚢胞癌の浸潤機構におけるMMPsおよび増殖因子の関与

腺様嚢胞癌は悪性唾液腺腫瘍で、神経・脈管浸潤を特徴とする疾患である.本研究において、腺様嚢胞癌の浸潤機構にはマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)9およびMMP14を中心としたシステムが深く関与していることが示唆された.また、腺様嚢胞癌細胞は血管内皮細胞増殖因子の発現を認め、腫瘍周囲への血管新生を誘導していることが示唆された.さらに、神経ガイダンス因子であるセマフォリンが浸潤機構に関与している可能性が考えられた.腺様嚢胞癌は悪性唾液腺腫瘍で、神経・脈管浸潤を特徴とする疾患である.本研究において、腺様嚢胞癌の浸潤機構にはマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)9およびMMP14を中心としたシステムが深く関与していることが示唆された.また、腺様嚢胞癌細胞は血管内皮細胞増殖因子の発現を認め、腫瘍周囲への血管新生を誘導していることが示唆された.さらに、神経ガイダンス因子であるセマフォリンが浸潤機構に関与している可能性が考えられた.腺様嚢胞癌は悪性唾液腺腫瘍であり口腔領域の悪性腫瘍としては扁平上皮癌に次いで発生頻度が高い疾患である.口腔領域では比較的遭遇することが多く、また特徴的な病態を示す疾患である腺様嚢胞癌であるが、いまだに不明な点が多く、その理由として実験モデルが確立されていないことが挙げられる.われわれは新たに腺様嚢胞癌培養細胞株ACCNSを樹立し、3次元培養において腺様嚢胞癌の病理組織型におけるsolid typeとcribriform tvpeと類似した組織像を示し、腺様嚢胞癌の有用な実験モデルを確立した.本実験モデルにおいて、ACCNSはMWPs阻害剤を添加するとコロニー形成は著しく阻害され、腺様嚢胞癌の浸潤機構にMMPsが深く関与していることが示唆された.本細胞株以外にもこれまでにACCS、SCCMなどの腺様嚢胞癌細胞株が知られそおり、これらの細胞株についても3次元培養を行ったとこち、ACCNSと同様にコロニー形成を認め、ACCSはtubular typeをACCMはsolid typeを示した.また、ACCNSと同様にMMPs阻害剤の添加によりコロニー形成は抑制された.このことから、以後の研究には上記3種類の細胞株を用いることとした.これまでの研究で培養細胞、特に癌細胞は2次元培養と3次元培養ではその性質が異なり、3次元培養において、よりその癌細胞の性質が反映されるとされている.そこで、2次元培養を行ったACCNSと3次元培養を行ったACCNSからRNAを回収し、種々のMMPsについてそのRNA発現を検討した.腺様嚢胞癌培養細胞は2次元培養、3次元培養のいずれにおいてもMMP7, MMP9, MMP14, MMP15の発現を認めた. MMP2は3次元培養では発現を認めず、この培養条件による変化から扁平上皮癌とは異なり、MMP2は腺様嚢胞癌の浸潤機構に関与していない可能性が示唆された.今後、他のMMPsや増殖因子についての解析を行っていく予定である.腺様嚢胞癌は悪性唾液腺腫瘍であり口腔領域の悪性腫瘍としては扁平上皮癌に次いで発生頻度が高い疾患である.口腔領域では比較的遭遇することが多く、また特徴的な病態を示す疾患である腺様嚢胞癌であるが、いまだに不明な点が多い.われわれはACCNSの他に3次元培養でも同様の振る舞いをみせる、ACCMおよびACCSの3種類の細胞株を研究に用いることとした.MMPsについては昨年度までの研究で、腺様嚢胞の浸潤機構にはMMP2が関与していないことが考えられ、腺様嚢胞癌の浸潤機構にはMMP9およびMMP14を中心としたシステムが深く関与していることが考えられた.また、腺様嚢胞癌は神経・脈管へ顕著な浸潤を認め、またリンパ行性ではなく血行性転移が多いことが知られている.このことから腺様嚢胞癌は神経・血管形成に関与する因子に誘導されるように浸潤することが考えられたため、血管形成もしくは神経形成に関与する増殖因子について検索した.ACCSおよびACCMでは強力な血管増殖因子であるVEGFの発現を認めたが、ACCNSでは認めなかった.VEGFのレセプターであるKDRについては発現を認めず、ACC細胞が産生するVEGFはオートクラインとして働くのではなく、パラクラインとして働いている可能性が示唆され、ACCが産生するVEGFにより周囲に血管新生が誘導され、それによりACCの脈管浸潤や血行性転移が惹起されやすい環境にあることが考えられた.また、VEGFのもう一つのレセプターであるニューロピリン1について検討したところ、ACC細胞で発現を認めた.しかし、ニューロピリン1は単独ではVEGFレセプターとはなり得ないため、もう一つのリガンドであるセマフォリンとの関与が考えられた.セマフォリンは神経のガイダンス因子でもあるため、このセマフォリン-ニューロピリンシステムが腺様嚢胞癌の神経浸潤機構に関与している可能性が考えられた.今後は、これらの因子の浸潤機構への関与を詳細に解明し、治療薬として利用できないか検討を行う予定である.
人工の物理的環境による生体影響

人工の物理的環境の生体影響評価のため、電場、磁場、放射線、機械的振動およびイオン流に関し、初年度の解析および予備実験の成果をふまえ、以上のような研究の進展が見られた。1.送電線下電界の実験的解析:縮尺10分の1のモデル送電線を作製し、地表面の人体モデルに誘導される電流の測定を行った。また、人体および樹木による相互しゃへい効果についても実験的解析を行った。2.体表電界計測法の開発:生体表面における低周波(特に商用周波数)電界を実測する方法の開発をめざし、基礎的検討、それに基づく新手法の考案、それらの実用性の確認を行った。センサを人体表面に押しつけること、また薄い柔軟なセンサを用いることにより、精度ならびに空間分解能ともに良好な計測が可能となった。3.電界の刺激効果:ネコを高電界に暴露した際、心拍数に現れる影響を調べるため、心臓支配自律神経繊維からの活動電位の記録を試みた。毛根受容器からの皮膚内臓反射が疑われるが、確認までには至らなかった。4.イオン流の効果:境界要素法に基づく数値計算ならびに実測により、イオン流によって人体へ流入する電流量の評価を行った。その結果、人体の姿勢や絶縁性の違いによる電流量の変化などが明らかになった。5.磁場の生体影響:常磁性体である静脈血の流れと磁場との相互作用の存在を明らかにした。また、生体内化学反応に対する磁場の影響を、高感度に検出する方法の可能性を見出した。6.磁場と放射線の効果:哺乳動物細胞の増殖および細胞間相互作用に対する磁場等の影響につき、実験的検討を加えた。現在までのところ、統計的有意差をもって磁場の影響を示唆する結果は得られていない。7.機械的振動の効果:血液の線溶活性に及ぼす影響につき、実験的検討を加えた。その結果、動脈硬化を生理機能面からスクリーニングするための試験方法の可能性が得られた。
高校生の英作文能力の特徴-新指導要領「ライディング」の指導のために-

平成7年度は以下の手順で研究を進めた:a)今まで収集してあった英作文データを学年別、学校の学力レベル別、フィードバックのタイプ別にコーパスデータとして最終的な整理を行った。b)分析項目として中学レベルの基本動詞を選定し、それに対する全英作文データ中の頻度、コロケーションの誤りの頻度、フィードバック別の頻度を算出した。c)基本動詞の誤りのデータがフィードバック別にどのような変化を示すかを各個人の学習者データ毎に追跡し、誤りの矯正の割合を統計的に算出した。これらの結果から以下のことが明らかになった:1)基本動詞のコロケーションの誤りは頻度的には個々の動詞毎に統計処理を行えるほど多くはなかったが、動詞全体で見ると、教師が作文に添削を施したグループ内において、誤りが訂正されずに次回以降の作文に再出現する割合の方が訂正される割合よりも有意に高かった。2)1の結果から、10年間ほど継続して来た英作文のフィードバック研究において、単に統語レベルのみでなく語彙レベルの分析からも「教師による添削は英作文の質をその時間に見合うほど効果的に変えることはない」という主張を裏付けることとなった。3)以上の点から高校における「ライティング」指導は添削という指導方法は適宜用いる程度で、むしろ継続してたくさん書かせることが有効であると思われる。今年度の研究の実施内容は以下の通りである:1)英作文データの整理:過去の一連の英作文指導の研究において中学2、3年、および高校1、2年と経年的にデータが蓄積されており、このデータをコンピューターにおいて次年度以降の構文解析などの目的に資するように整理・統合する作業を進行中である。可能ならば構文の特徴などを記号化してテキスト内に入力し検索可能なデータベースの形にしたい。これは次年度又はそれ以降の課題になる。2)英作文データ分析の枠組み作り:今回は特に構文レベル、語彙レベルの発達過程の研究が中心になる。そのためにどのような構文や語彙を選択すればよいか、特徴分析の方法や観点をどうするかなどの分析システムを検討している。来年度実際の分析をする前にプロトタイプでいろいろな資料を分析してみる試みを行った。平成6年度から従来から蓄積されてきている英作文データの構文レベル・語彙レベルの分析に向けての研究方法の検討、語彙項目の選定、構文の選択などを行うと同時に、海外における語彙習得に関する第2言語習得関連の研究文献を収集した。また英作文データをデータベース化する計画も同時に進めてきており、その際必要になるとおもわれる文法コードなどの体系や、検索のキーワード、情報の切り方などに関しても検討を加えた。英作文データは中学2年から高校3年までのデータを学年別、学校の学力レベル別、フィードバックのタイプ別にKWIC形式のファイルに変換し、語と語の結び付きの様子を統計的に処理できるように整理した。語彙の分析項目に関しては、(1)単語のコロケーション、(2)動詞の自動詞、他動詞別の目的語の選択などの文法的特性の発達、(3)主語にあたる名詞句を把握しているかを見るための疑問文における助動詞のinversionなどをチェックすることとし、それらが(a)学年毎にどのように推移するのか、(b)フィードバックを与えることによってそれらの誤りが解消されていくのか、と言った点に関して分析を行っているところである。最終年度にはこれらの結果を元に包括的な語彙獲得の特徴分析とそれにかかわる教師のフィードバックの効果がより細かいレベルで明らかになると思われる。これらの結果から以下のことが明らかになった:

1)基本動詞のコロケーションの誤りは頻度的には個々の動詞毎に統計処理を行えるほど多くはなかったが、動詞全体で見ると、教師が作文に添削を施したグループ内において、誤りが訂正されずに次回以降の作文に再出現する割合の方が訂正される割合よりも有意に高かった。2)1の結果から、10年間ほど継続して来た英作文のフィードバック研究において、単に統語レベルのみでなく語彙レベルの分析からも「教師による添削は英作文の質をその時間に見合うほど効果的に変えることはない」という主張を裏付けることとなった。3)以上の点から高校における「ライティング」指導は添削という指導方法は適宜用いる程度で、むしろ継続してたくさん書かせることが有効であると思われる。
核内転写因子活性を標的としたヒト着床不全に対する分子標的治療法の開発

マウス妊娠子宮内に高効率に、妊娠経過を阻害せずに遺伝子発現ベクターを導入するシステムを開し、性交後1.5日目にstat-3デコイ、あるいはstat-3ドミナントネガティブ変異体cDMを導入する実験をおこなった。すると通常性交後4.5日目に確認される着床現象が見られず、着床遷延現象も見られず、偽妊娠マウスでの機械的刺激に対する脱落膜化反応が見られない形質が得らた。しかし、このマウスにおける、排卵後の卵巣の黄体形成、血中プロゲステロン濃度、子宮におけるプロゲステロン受容体の発現はコントロールと差がなかった。これらの検討は遺伝子導入によるstat-3活性化障害マウスモデルにおいては内分泌学的変化をもたらすことなく、着床不全が起こることが明らかになった。そこで、患者の同意を得て、通常の子宮内膜日付診検体の一部を薄切し、抗リン酸化stat-3抗体で免疫組織化学染色を行い、個々の患者の妊娠予後との比較検討を行った。体外受精・顕微授精-胚移植プログラムを受けた患者で検討すると二回以内に妊娠が成立した患に比べて、二回以上形態良好胚を移植したにもかかわらず妊娠が成立しなかった患者において、抗リン酸化stat-3抗体で内膜腺上皮の核が染色されない症例が多い傾向にあった。しかし、有意差検定を行うと統計学的に有意差ではなかった。両群間で血中ホルモン値の間に有意な差は認めなかった。今回の我々のマウスを用いた研究成果、ならびにヒト検体を用いた予備的検討の結果、着床のkey moleculeとしてstat-3の活性化が重要な役割を示していることが明らかになった。また、ヒトの着床不全症例の原因は単一のstat-3活性化不全だけでは説明がっかない可能性も示唆された。我々は以前に確立したHVJ-Eベクターを用いたマウス子宮内への一過性遺伝子導入法を用いて、着床時期におけるstat-3阻害を試みた。まず、stat-3結合モチーフを1回もつ2本鎖オリゴデオキシヌクレオチドデコイを作成し、これをマウス性交後1.5日目(1.5p.c)の子宮腔内に導入したが妊娠は成立し、正常に分娩した。次にstat-3結合モチーフをタンデムに2回もつデコイを同様に導入すると、5.0p.c.の子宮における活性化stat-3が50%となり、妊娠率が30%以下になった。同じ5.0p.cにおいて、エバンスブルー静注法にて着床部位を検討すると70%以上のマウスで着床が完全に阻害された。5.0p.cにおけるマウス血中プロゲステロン値、子宮におけるPR-Aの発現、卵巣の形態はデコイの導入によっても変化はしなかった。着床しなかった胚盤胞を子宮腔内より洗い出すと形態的に正常であり、また、stat-3 dominant negative cDNAを組み込んだ発言ベクターを用いて同様の実験を行い、胚盤胞よりDNAを抽出してPCRにより導入遺伝子の胚への移行を検討したが、胚への遺伝子導入は見られなかった。ついで、精管結さつ雄マウスと性交させた偽妊娠マウスにこのデコイを導入し、セサミオイルを注入し、機械的脱落膜反応をみるとstat-3結合モチーフをタンデムに2回もつデコイは脱落膜化を有意に抑制した。これらの結果はマウス子宮内局所でstat-3の着床期の活性化を阻害すると脱落膜化が障害され、内分泌環境を乱すことなく着床不全が起こることを意味する。我々は現在この現象がヒト原因不明不妊患者の子宮内膜でも起こっているかどうか、臨床検体を用いて検討をはじめている。

マウス妊娠子宮内に高効率に、妊娠経過を阻害せずに遺伝子発現ベクターを導入するシステムを開発し、性交後1.5日目にstat-3デコイ、あるいはstat-3ドミナントネガティブ変異体cDNAを導入する実験をおこなった。すると通常性交後4.5日目に確認される着床現象が見られず、着床遷延現象も見られず、偽妊娠マウスでの機械的刺激に対する脱落膜化反応が見られない形質が得られた。しかし、このマウスにおける、排卵後の卵巣の黄体形成、血中プロゲステロン濃度、子宮におけるプロゲステロン受容体の発現はコントロールと差がなかった。これらの検討は遺伝子導入によるstat-3活性化障害マウスモデルにおいては内分泌学的変化をもたらすことなく、着床不全が起こることが明らかになった。そこで、患者の同意を得て、通常の子宮内膜日付診検体の一部を薄切し、抗リン酸化stat-3抗体で免疫組織化学染色を行い、個々の患者の妊娠予後との比較検討を行った。体外受精・顕微授精-胚移植プログラムを受けた患者で検討すると二回以内に妊娠が成立した患者に比べて、二回以上形態良好胚を移植したにもかかわらず妊娠が成立しなかった患者において、抗リン酸化stat-3抗体で内膜腺上皮の核が染色されない症例が多い傾向にあった。しかし、有意差検定を行うと統計学的に有意差ではなかった。両群間で血中ホルモン値の間に有意な差は認めなかった。今回の我々のマウスを用いた研究成果、ならびにヒト検体を用いた予備的検討の結果、着床のkey moleculeとしてstat-3の活性化が重要な役割を示していることが明らかになった。また、ヒトの着床不全症例の原因は単一のstat-3活性化不全だけでは説明がつかない可能性も示唆された。
ラット脂肪組織でのRAS蛋白の発現およびRASの脂肪蓄積機構への関与

1.目的脂肪組織におけるレニンーアンジオテンシン系(RAS)の各構成因子[アンジオテンシノーゲン(AGT),アンジオテンシン変換酵素(ACE),AT1,AT2]の発現と各種RAS抑制薬(ACE阻害剤および受容体拮抗薬ARB)投与時での各因子の発現変化を解析し,RASにおける脂肪蓄積の調節機構を解析する。なお,AGT,AT1,およびAT2に対する各ペプチド抗体,そして精製ACEを用いて抗ACE抗体は既に作製している。2.方法2) RAS抑制剤(ACE阻害剤:カプトプリルおよびイミダプリル,AT1拮抗剤:オルメサルタン,AT2:PD12331の各濃度(2用量)をSDラット(5週齢,雄)に腹腔内投与し,体重の変化を測定後,各臓器および各脂肪組織を採取し重量を測定した。3)上記項目で検討した脂肪組織でのRAS構成因子の発現変化をimmuno-blot法で検討した。3.結果1)ラット皮下および腹腔内脂肪組織には,RAS構成因子(AGT,ACE,AT1)の発現が認められた。AGTは腹腔内脂肪組織での発現が優位であり,かつ高度な糖の付加が認められ,ACEは皮下脂肪組織での発現が優位であり,かつ蛋白の産生亢進が認められた。AT1の発現は皮下が優位であったが,AT2の発現は両組織において認められなかった。2)カプトプリルおよびイミダプリルのACE阻害剤は濃度依存的にラット体重の増加を抑制した。AT1拮抗剤オルメサルタン(高用量)はわずかに体重抑制が認めたものの,AT2PD12331は全く増加抑制は認められなかった。3) RAS抑制剤投与ラットの各臓器および脂肪組織でのRAS構成因子の発現についてはimmuno-blot法にて測定し,現在解析中である。
transendocytosis障害による脳小血管病発症機序の解明と治療法開発

【方法】NOTCH3シグナルのリガンド蛋白であるJagged-1のC末側にstop codonまたはmyc-HisタグをつけたpcDNATM5/ FRT/TOベクターを、Flip- In-T-REX host細胞へ導入し、テトラサイクリンによりリガンド細胞一分子のみの発現を制御する細胞株を樹立、リガンド蛋白の発現を免疫染色、ウェスタンブロット法で検討する.【成績】NOTCH3シグナルのリガンド蛋白であるJagged-1のC末側にmyc-Hisタグをつけたベクター作製を確認した.現在テトラサイクリン付加時にdeltaの細胞表面での発現を免疫染色とウェスタンブロット法で確認している.【結論】Jagged-1の細胞表面での発現を確認後、変異蛋白に相同する合成ペプチドによるendocytosisを細胞レベルで検証を行う.【方法】Notchシグナルのリガンド蛋白であるJagged-1にmyc-Hisタグを付けたpcDNATM5/FRT/T0ベクター用いて、リガンドを発現する細胞株を樹立した。CADASIL型変異を有するヒトNOTCH3細胞外ドメインを加えて、transendocytosisの有無を免疫染色、western blottingで確認した。【結果】野生型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片が細胞内に取り込まれ、lysozomeに局在することを免疫染色で確認した。【考察】野生型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片はtransendocytosisでリガンド細胞内取り込まれ、lysozomeで分解されることが示唆された。同様の現象が変異型ヒトNOTCH3細胞外ドメイン断片では障害されているかを今後検討する。野生型ヒトNOTCH3断片は作成可能であったが、変異型NOTCH3細胞断片の作成を試みたところ、細胞内で凝集してしまい、抽出が難しい。作成する断片の大きさを変えながらペプチド合成を現在試みている。transendocytosisを可視化するため、数種類のhost cellへリガンド蛋白一分子を発現するFlip-In systemの導入を試みたが、従来用いられているHEK293株以外の細胞株では導入が困難であり、HEK293株を用いて実験系を再構築するのに時間を要した.種々の変異型NOTCH3細胞断片を作成してendocytosisの有無を検討するとともに、変異型リガンドを作成することで、endocytosisが障害を受けるかを今後検討する。神経内科学目的のリガンド蛋白の導入を確認後、種々のNotch3細胞外ドメイン断片を用いて、endocytosisを細胞レベルで検証する予定である.前年度実験計画が順調に進まず滞ったため、消耗品の使用が予定より少なかった実験に用いるNotch3リガンド発現細胞の樹立に時間を要し、解析が遅れたため本年度実験用の消耗品を主に用いる予定であるNotch3リガンド発現細胞の樹立ができたので、今後このリガンド細胞へのNotch3細胞外断片の取り込みを経時的に免疫蛍光染色、ウェスタンブロットで解析する
人工知能システムにおけるマルチメディア情報の超並列処理の研究

人工知能システムにおけるマルチメディア情報に関して,超並列処理を行なうため,必要な要素技術毎に次のとおり研究を行なった.1.知的描画アルゴリズムにおける感性表現手法の研究マルチメディア情報を人工知能システムにおいて理解し,知的に解釈・表現するアルゴリズム等を検討してきた.また,別途研究してきた認識システム,帰納学習システムを用いて高次の処理を実現した.また,感性表現として芸術分野での応用を行なった.2.音楽情報処理手法の研究まず,画像の圧縮・進展をフラクタル技術によって行なう方法を発展させ,音楽の作曲・編曲に応用する技術を開発した.さらに,これを音楽の全体の構成を含めて検討し直すことで,音楽の他の構成要素についてもその構造から検討し,多声の音楽として生成・表現できるシステムを開発した.3.戦略的問題解決法を用いた問題解決手法の開発戦略的知識を帰納し,これを問題解決に利用する手法を一般の問題解決の枠組に適用し,その効果と有効性を示した.また進化学習方などの手法を用いた同様の方法も検討してきた.これらを統合することは今後の課題である.4.帰納学習法の超並列化アルゴリズムを利用した知識獲得メディアの分類,知的解釈等のため,帰納学習手法を実現するため,これを超並列化するための方法を検討した.並列化手法として3通りの方法を実装し比較検討し,相当の成果を得ていると考える.さらに大規模の応用に効率的に対応できる手法の開発は今後に残される.5.高次推論超並列化技術を用いた高速仮説推論の研究仮説推論を取り上げ超並列処理技術による高速化,また,現実な環境への応用のため,計算機網によって継れた環境において並列計算を実現する研究を行なってきた.現実の計算機網では多くのタスクが同時に実行されるが,こうした動的環境で良好に動作する並列手法の開発を行なった.人工知能システムにおけるマルチメディア情報に関して,超並列処理を行なうため,必要な要素技術毎に次のとおり研究を行なった.1.知的描画アルゴリズムにおける感性表現手法の研究マルチメディア情報を人工知能システムにおいて理解し,知的に解釈・表現するアルゴリズム等を検討してきた.また,別途研究してきた認識システム,帰納学習システムを用いて高次の処理を実現した.また,感性表現として芸術分野での応用を行なった.2.音楽情報処理手法の研究まず,画像の圧縮・進展をフラクタル技術によって行なう方法を発展させ,音楽の作曲・編曲に応用する技術を開発した.さらに,これを音楽の全体の構成を含めて検討し直すことで,音楽の他の構成要素についてもその構造から検討し,多声の音楽として生成・表現できるシステムを開発した.3.戦略的問題解決法を用いた問題解決手法の開発戦略的知識を帰納し,これを問題解決に利用する手法を一般の問題解決の枠組に適用し,その効果と有効性を示した.また進化学習方などの手法を用いた同様の方法も検討してきた.これらを統合することは今後の課題である.4.帰納学習法の超並列化アルゴリズムを利用した知識獲得メディアの分類,知的解釈等のため,帰納学習手法を実現するため,これを超並列化するための方法を検討した.並列化手法として3通りの方法を実装し比較検討し,相当の成果を得ていると考える.さらに大規模の応用に効率的に対応できる手法の開発は今後に残される.5.高次推論超並列化技術を用いた高速仮説推論の研究仮説推論を取り上げ超並列処理技術による高速化,また,現実な環境への応用のため,計算機網によって継れた環境において並列計算を実現する研究を行なってきた.現実の計算機網では多くのタスクが同時に実行されるが,こうした動的環境で良好に動作する並列手法の開発を行なった.人工知能システムにおけるマルチメディア情報に関して,超並列処理を行なうための要素技術を確立するために,次の項目について研究を行なった.1.知的描画アルゴリズムの開発と応用マルチメディア情報を人工知能システムにおいて活用する場合,単に情報を保持,検索,加工するのみでなく情報の理解に基づいて知的に解釈し,表現することが必要となる.研究では画像をファジ-処理技術及びフラクタル理論に基づき,画像の知的解釈及び表現に基づいた描画アルゴリズムを検討した.アルゴリズムは顔画像および毛筆書体文字を例として,システムとして実現している.アルゴリズムの超並列化は次年度の課題となる.2.戦略的問題解決法の超並列処理技術人工知能システムにおいて問題解決はこれまで深く研究されてきた分野である.本研究ではメディアの一つとしての問題の取り扱いをおよび超並列処理技術を検討した.表現主体は単に表現されるのみでなく属性として目的と手段を内包しており,これらの統一的解決が重要となる.本研究ではそのための基礎として超並列処理技術を使った高速問題解決法を確立し.将棋の戦略的解法に応用した.3.帰納学習法の超並列化のための技術確立帰納学習法はメディアの分類,知的解釈において重要である.研究では最近注目される帰納論理プログラミング法を用いて,情報を分類する方法を確立し,これを超並列化するための基礎技術を検討してきた.4.高次推論超並列化のための技術確立仮説推論を始めとする高次推論には共通して高負化の探索が必要となる,探索を超並列処理により効果的に処理する技術が,これらを利用したマルチメディア処理において重要となる.研究では仮説推論を取り上げ超並列処理技術よる高速化を図った.人工知能システムにおけるマルチメディア情報に関して,超並列処理を行なうための要素技術の発展のために,次の項目について研究を行なった.1.知的描画アルゴリズムにおける感性表現手法の研究マルチメディア情報を人工知能システムにおいて理解し,知的に解釈・表現することを目的としてアルゴリズムを研究してきた.本年度は昨年の手法を発展させ,感性表現法を開発し,実験により有効性を確かめた.

2.音楽情報処理手法の研究音楽情報もマルチメディア研究において重要な要素である.本年度はこれを取り上げ,音楽構造を分析することにより圧縮・進展させるための方法の研究,およびこれを利用することによって音楽における情報表現を効果的に行なうための方法を開発し,実際に音楽生成に適用することで有効性を確かめた.3.戦略的問題解決法を用いた問題解決手法の開発戦略的知識を帰納し,これを問題解決に利用する手法が昨年の研究によって提案されたが,本年度はこの手法を用いて問題解決への効果を実測し,有効性を検討した.この方法は理論面,またシステムとしての充実などに改良の余地があり,引き続いて研究を行なう.4.帰納学習法の超並列化アルゴリズムを利用した知識獲得メディアの分類,知的解釈などにおいて重要である帰納学習手法を確立するため,帰納論理プログラミング法を用いた情報を分類方法を研究してきている.これを超並列化するための基礎技術を検討してきたが,本年度はこの方法を並列計算機に実装し基本原理の確認を行なった.5.高次推論超並列化技術を用いた高速仮説推論の研究仮説推論を取り上げ超並列処理技術による高速化を研究してきておるが,本年度はより現実な環境においてこの技術を活かすため,中程度の能力の計算機が計算機網によって継れた環境において並列計算を実現するための研究を行なった.これによって本手法の適用範囲が拡大される.人工知能システムにおけるマルチメディア情報に関して,超並列処理を行なうため,これまでに研究してきた要素技術を踏まえて,次の項目について研究を行なった.1.知的描画アルゴリズムにおける感性表現手法の研究マルチメディア情報を人工知能システムにおいて理解し,知的に解釈・表現するアルゴリズム等を検討してきた.本年度は別途研究してきた認識システム,帰納学習システムを用いて高次の処理を実現した.また,感性表現として芸術分野での応用を行なった.2.音楽情報処理手法の研究画像の圧縮・進展をフラクタル技術によって行なう方法をこれまでに,音楽の作曲・編曲に応用することを行なってきた.本年度はこれを音楽の全体の構成を含めて検討し直した.また,音楽の他の構成要素についてもその構造から検討し,多声の音楽として生成・表現できるシステムを開発してきた.3.戦略的問題解決法を用いた問題解決手法の開発戦略的知識を帰納し,これを問題解決に利用する手法を一般の問題解決の枠組に適用し,その効果と有効性を示した.また進化学習方などの手法を用いた同様の方法も検討してきた.これらを統合することは今後の課題である.4.帰納学習法の超並列化アルゴリズムを利用した知識獲得メディアの分類,知的解釈等のため,帰納学習手法を検討しているが,これを超並列化するための方法を検討してきた.
H、K-ATPaseの高次構造

胃腺によるH^+の分泌はH、K-ATPaseによる。この酵素のアミノ酸一次配列は既に明らかになっている。ATP結合部位、リン酸化部位におけるアミノ酸一次配列はNa、K-ATPaseやCa^<2+>-ATPaseのものとほとんど一致している。しかし、N末端やC末端におけるアミノ酸配列はかなり異なっており、その機能の違いを反映している。この一次構造の違いに基づく高次構造が、「H^+とK^+のアンチポート機能」及び我々が既に明らかにした「H^+、K^+-ATPaseの一部にCL^-チャネル機能も備わっていること(J.Biol.Chem.1987)を可能ならしめている。しかし、現在までのところH、K-ATPaseの高次構造についてはいくつかの仮定的推論があるのみで、実体としてはほとんど捉えられていない。従って本研究では、複数の機能的単クローン抗体を開発し、その高次構造確認部位を明らかにして、これを高次構造プローブとして利用することでH、K-ATPaseの高次構造及びそのイオン能動輸送機序の解明をめざした。ブタ胃H、K-ATPaseを抗原として、単クローン抗体HK2032、HK4001、HK4008、HK4009、HK4013といった、種々の機能修飾性の抗体を得た。HK4001は胃H、K-ATPaseの酵素活性を100%阻害した。抗体1分子がH、K-ATPaseのサブユニット2個を失活させた。このような高効率の阻害活性を有する抗体は、Na、K-ATPaseにおいても知られていない。この抗体はH^+認識部位の高次構造を修飾するとの結果が得られている。この抗体を化学修飾すると、H^+のかわりにCa^<2+>を認識するように変化するという興味深い事実が得られた。他の抗体についても、それぞれ酵素機能を修飾する能力が高い。特にHK4009はCl^-チャネルに特異的に結合する。今後これらの抗体を使った仕事を進めれば、H、K-ATPaseの機構解明は大いに進展することが期待される。
不安定核Beイオンの精密分光を目的とした液体He冷却線形イオントラップの開発

[概要]昨年度に開発した液体He冷却線形イオントラップを用いてガス冷却及びレーザー冷却されたイオン(不安定核超微細構造分光の対象であるBe^+及びCa^+イオン)のトラップの寿命測定をレーザー誘起蛍光法を利用して行い,冷却型線形イオントラップの有効性を実験的に検証した.[実験・結果]Be^+の実験では,Heガス冷却及びレーザー冷却状態での閉じ込めの寿命を測定した.Beは質量数が9(安定核の場合)と特に軽い元素である.よって,残留ガスとの衝突加熱効果が大きく,これまでHeガス冷却を利用した実験の報告はない.しかし,イオントラップ外部で生成されたイオンの入射・捕獲をしなければならない不安定核実験の場合,トラッピング初期過程におけるHeガス冷却法の利用は不可欠である.そこで本研究では液体He冷却された線形トラップ中にHeガスを導入し,トラップの寿命に対する効果を観測した.その結果,室温の線形トラップでは数10秒程度であった寿命が約15分まで延長されることを確認した(ガス圧約10^<-4>Paの場合).トラップ寿命の飛躍的な延びは冷却パネルにおけるクライオポンピング効果によって導入ガス中の不純物が大幅に取り除かれたことと,Heガス自身が冷却パネルで冷却されたためにイオンに対するガス冷却が有効に働いたことが理由と考えられる.さらに途中でガスを遮断した場合,時間経過(数10秒数分程度)とともに蛍光強度が増加する様子が観測され,ガス冷却からレーザー冷却への移行も可能であることを確認した.また,本研究ではレーザー冷却されたBe^+のトラップ寿命の測定も行った.軽元素イオンであるBe^+の場合,たとえレーザー冷却されていても僅かな残留ガスとの衝突による加熱・消失を避けることができないが(真空度10^<-7>Paの場合,室温状態でのトラップ寿命は数分10分程度),液体He冷却線形イオントラップを用いた場合,トラップの寿命が約3時間まで延長され,さらに結晶化されたイオン集団をロスすることなく約30分間保持することが可能となった.一方,Caイオンを用いた実験では液体窒素冷却された線形イオントラップを利用し,Heガス冷却下でのトラップ寿命の測定を試みた.Beの場合と同様に寿命の飛躍的な延長を確認できた.トラップの寿命は少なくとも10時間まで延長され,長時間にわたる測定では液体窒素による冷却を続ける限りイオンのレーザー誘起蛍光が消失することはなかった(4日間の閉じ込めまでを確認).よって長寿命の不安定Ca同位体の超微細構造分光に対しては液体窒素冷却のみで十分である.なお,Cryogenic領域の真空度は直接測定できないが,コンダクタンスとガス放出率の見積りから,トラップ周辺では10^<-10>Pa以下であると推定できる(ガス導入なし,液体He冷却の場合).[結論]液体He冷却線形イオントラップはレーザー冷却されたイオンのトラップ寿命の延長に大きな効果があり,残留ガスに起因するイオンロスを極力小さくできることを実証した.また,Heガス冷却された軽元素イオンの寿命の延長に対しても非常に有効であることを実験的に初めて確認した.平成11年度には主に液体Heクライオスタットの開発を行った.クライオスタットは液体窒素容器(約3.0l)と熱的に接触した輻射シールドで囲まれた液体He容器(約1.6l)とで構成される.液体He注入管からの熱流入を極力避けるため,注入管は液体窒素容器内を貫通させ,しかも冷却面側を超高真空に維持できるような複雑な構造を採用し,実際にそれを完成させた.液体窒素及びHe容器に液体窒素を充填した状態では,線形イオントラップを設置する容器底部の温度は約77Kであり,この状態を約16時間維持できることを確認した.この予冷の後,液体Heの注入を行った.容器内に設置した炭素抵抗(Allen-Bradley社,56Ω)の抵抗値変化を測定することによって,液体Heの液面を確認した.テスト試験のため容量の1/3程度の充填としたが,極低温状態(容器底部で約4K)を約1時間維持できることを確認した.また,クライオスタット外部の到達真空度は6×10^<-8>Paであった.従って,線形イオントラップ付近における実際の残留ガス圧はこの値より少なくとも1桁程度低い10^<-9>Pa台と予想している.以上の冷却テストによって,今回製作した装置が当初目標としていた性能をほぼ満足していることを確認できた.また,新たに立ち上げた紫外及び赤外半導体レーザーシステム及び線形イオントラップを用いて,トラップに閉じ込められたCa^+レーザー誘起蛍光法によって確認することができた.現在,冷却線形イオントラップに閉じ込められたCa^+の蓄積時間の測定を行っている.なお,平成11年度には高エネ研田無分室の閉所に伴う装置移動,及び理化学研究所との共同研究での若干の計画変更があり,トラップするイオン種をやむを得ずCa^+に変更した.来年度以降,これら液体He冷却線形イオントラップまたはその製作技術を不安定核Ca,Beの精密超微細構造分光実験に供する予定である.[概要]昨年度に開発した液体He冷却線形イオントラップを用いてガス冷却及びレーザー冷却されたイオン(不安定核超微細構造分光の対象であるBe^+及びCa^+イオン)のトラップの寿命測定をレーザー誘起蛍光法を利用して行い,冷却型線形イオントラップの有効性を実験的に検証した.[実験・結果]Be^+の実験では,Heガス冷却及びレーザー冷却状態での閉じ込めの寿命を測定した.

Beは質量数が9(安定核の場合)と特に軽い元素である.よって,残留ガスとの衝突加熱効果が大きく,これまでHeガス冷却を利用した実験の報告はない.しかし,イオントラップ外部で生成されたイオンの入射・捕獲をしなければならない不安定核実験の場合,トラッピング初期過程におけるHeガス冷却法の利用は不可欠である.そこで本研究では液体He冷却された線形トラップ中にHeガスを導入し,トラップの寿命に対する効果を観測した.その結果,室温の線形トラップでは数10秒程度であった寿命が約15分まで延長されることを確認した(ガス圧約10^<-4>Paの場合).トラップ寿命の飛躍的な延びは冷却パネルにおけるクライオポンピング効果によって導入ガス中の不純物が大幅に取り除かれたことと,Heガス自身が冷却パネルで冷却されたためにイオンに対するガス冷却が有効に働いたことが理由と考えられる.さらに途中でガスを遮断した場合,時間経過(数10秒数分程度)とともに蛍光強度が増加する様子が観測され,ガス冷却からレーザー冷却への移行も可能であることを確認した.また,本研究ではレーザー冷却されたBe^+のトラップ寿命の測定も行った.軽元素イオンであるBe^+の場合,たとえレーザー冷却されていても僅かな残留ガスとの衝突による加熱・消失を避けることができないが(真空度10^<-7>Paの場合,室温状態でのトラップ寿命は数分10分程度),液体He冷却線形イオントラップを用いた場合,トラップの寿命が約3時間まで延長され,さらに結晶化されたイオン集団をロスすることなく約30分間保持することが可能となった.一方,Caイオンを用いた実験では液体窒素冷却された線形イオントラップを利用し,Heガス冷却下でのトラップ寿命の測定を試みた.Beの場合と同様に寿命の飛躍的な延長を確認できた.トラップの寿命は少なくとも10時間まで延長され,長時間にわたる測定では液体窒素による冷却を続ける限りイオンのレーザー誘起蛍光が消失することはなかった(4日間の閉じ込めまでを確認).よって長寿命の不安定Ca同位体の超微細構造分光に対しては液体窒素冷却のみで十分である.なお,Cryogenic領域の真空度は直接測定できないが,コンダクタンスとガス放出率の見積りから,トラップ周辺では10^<-10>Pa以下であると推定できる(ガス導入なし,液体He冷却の場合).[結論]液体He冷却線形イオントラップはレーザー冷却されたイオンのトラップ寿命の延長に大きな効果があり,残留ガスに起因するイオンロスを極力小さくできることを実証した.また,Heガス冷却された軽元素イオンの寿命の延長に対しても非常に有効であることを実験的に初めて確認した.
神経内分泌肺癌の網羅的プロテオーム解析

様々なプロテオミクス手法を駆使し、肺癌診断に有用なマーカータンパク質の獲得を目指した。1.抗体プロテオミクス:腫瘍組織もしくは細胞を直接免疫する、所謂ランダム免疫法により、肺癌、膀胱癌細胞と反応する単クローン性抗体を合計1,522個作製した。この中で、肺腺癌(AD)細胞と特異的に反応する抗RACK1抗体を樹立し、その性状を報告した。この抗体により、PACK1の発現は臨床病期、腫瘍径、リンパ節転移と逆相関しており、新たな腺癌のマーカーとして有用であることを報告した。2.Secretome解析:大細胞性神経内分泌肺癌(LCNEC)由来細胞株LCN1の培養上清中の腫瘍由来ペプチドを、独自の培養上清の精製法を駆使して解析した。その結果、神経内分泌細胞由来のVGF nerve growth factor inducible (VGF)のN末側の40とC末側の19このアミノ酸からなるペプチドを見出した。このペプチドは、神経疾患のある患者の髄液中にも、同一のペプチドが見出されており、神経内分泌肺癌の新たな血清中のマーカーとなる可能性が示唆された。3.二次元電気泳動法による腫瘍抗原の解析:神経内分泌癌である小細胞癌(SCLC)とLCNEC腫瘍由来の細胞株を用いて、二次元電気泳動法で発現に相違のあるタンパク質の解析を行った。その結果、cytokeratin (CK) 7, 8, 18, 19を含む両者で発現量に相違のある25のタンパク質を同定した。さらに、CK 7, 8, 18, 19に対する抗体を用いて、各種肺癌組織を免疫染色した。その結果、二次元電気泳動法の結果と同じく、4つのCKともSCLCに比してLCNECで有意に発現が亢進していることが明らかとなった。4.肺癌患者血清中の自己抗体解析:肺癌細胞を二次元展開し、肺癌患者血清を一次抗体として用いる方法で、腫瘍特異的自己抗体の解析を行った。その結果、SCLCとLCNECを鑑別可能なvillin-1に対する自己抗体を見出した。腫瘍関連自己抗体の有無は肺癌患者血清を一次抗体として肺の腺癌(AD)、小細胞癌(SCLC)、大細胞性神経内分泌癌(LCNEC)、扁平上皮癌(SCC)由来細胞株の細胞抽出液を用いて一次元、もしくは二次元免疫プロット法で検討した。その結果、cytokeratin18とvillin-1に対する自己抗体の存在がADとSCLC患者血清から同定された。さらに、cytokeratin18とvillin-1に対する精製抗体を用いて、124例の各種肺癌組織を免疫染色した。その結果、cytokeratin18の発現はほとんどの症例で認められたが、染色スコアはADとLCNECでSCCやSCLCに比して統計学的に高い傾向が認められた。一方、villin-1の発現はADやLCNEC症例ではそれぞれ61.8%、38.6%で陽性を示したが、1例のSCLCの弱い染色を除いてその他では陰性であった。さらに、LCNECでは膜状に陽性を示し、同じ神経内分泌肺癌であるSCLCとの鑑別に有用であることが確認された。

また、villin-1は消化管からの転移性肺癌に有用なマーカーであるとの報告があるが、今回の検討から原発性ADでも半数例以上の症例で陽性を示すことから、必ずしも転移性肺癌のマーカーとして有用ではないことが証明された(論文投稿中)。肺癌の標準的化学療法としてシスプラチンやカルボプラチンが中心の多剤併用療法が用いられているが、その効果は未だ不十分である。シスプラチン感受性を予測する分子を網羅的に解析するために、シスプラチン耐性LCNEC由来細胞株2株を樹立し、その親株とのタンパク発現プロファイリングを行った。その結果、両細胞株で共通して変化する24個を含めた合計で201個の発現量が変化するタンパク質を見出した。これら分子は抗癌剤感受性の結果が出ている肺癌組織の生検材料を用いて、さらに検討する予定である。網羅的に肺の小細胞癌細胞株、大細胞性神経内分泌癌細胞株、腺癌細胞株を免疫源にランダム免疫法で作製した1,172の抗体に関して、免疫プロット可能か否か検討した。対象は4つの代表的な組織型の細胞株(小細胞癌、大細胞性神経内分泌癌、腺癌、扁平上皮癌由来)でそれらのライセートとの反応を確認した。その結果、187抗体(16.0%)で明らかなバンドが確認された。この中で、細胞ごとに分子量が異なる、もしくは発現量が異なる、両方の特微を有する抗体は16種類見出された。その中で、No.97は60kDa付近と40kDa付近にそれぞれの細胞株で分子量がそれぞれ異なっていた抗体で、免疫沈降法で、この抗体が認識するタンパク質はbasiginであることが明らかとなった。この抗体は腫瘍細胞の細胞膜に局在している分子であり、肺癌組織を染色した結果、非腫瘍性肺組織では気管支上皮細胞に弱い飯能が見られるが、肺癌組織では、組織型に関係なく、様々な腫瘍細胞の細胞膜に強い発現が認められる。また、腺癌組織では腫瘍の分化度の低下に伴って発現が亢進する傾向を示し、高分化型に比して、中分化型、低分化型では統計学的有意差を持って染色性が亢進していた扁平上皮癌では腫瘍の分化度に伴って、発現が亢進する傾向を示した。また、扁平上皮癌ではNOに比して、N1,N2と進行して行くに従い、発現が低下する傾向を示し、NOとN2との間には統計学的有意差が認められた。この抗体は、肺癌におけるステージやリンパ節転移の有無を予測出来るマーカーの一つとなり得る可能性があり、肺癌症例における免疫プロット法の検討を含めたさらなる検討が必要と考えられた。1.抗体プロテオミクス:腫瘍組織もしくは細胞を直接免疫する、所謂ランダム免疫法により、肺癌、膀胱癌細胞と反応する単クローン性抗体を合計1,522個作製した。この中で、肺腺癌(AD)細胞と特異的に反応する抗RACK1抗体を樹立し、その性状を報告した(論文業績8)。この抗体により、PACK1の発現は臨床病期、腫瘍径、リンパ節転移と逆相関しており、新たな腺癌のマーカーとして有用であることを報告した。2. Secretome解析:大細胞性神経内分泌肺癌(LCNEC)由来細胞株LCN1の培養上清中の腫瘍由来ペプチドを、独自の培養上清の精製法を駆使して解析した。その結果、神経内分泌細胞由来のVGF nerve growth factor inducible (VGF)のN末側の40とC末側の19このアミノ酸からなるペプチドを見出した。このペプチドは、神経疾患のある患者の髄液中にも、同一のペプチドが見出されており、神経内分泌肺癌の新たな血清中のマーカーとなる可能性が示唆された(論文業績5)。
オートファジー系を分子標的とする新規神経疾患治療薬スクリーニング系の開発

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、運動ニューロンの選択的変性を特徴とする神経変性疾患である。本研究では、細胞・個体レベルでのオートファジー動態の可視化を可能にする新たなツールを開発するため、mKeima-RedとLC3Bの融合タンパク質を発現する新たなTGマウスの作出を試みた。その結果、神経系及び心筋・骨格筋においてmKeimaRed_LC3Bを高発現する2系統のTGマウスを樹立するとともに、培養細胞実験によりmKeimaRed_LC3B動態観察によりオートファゴソームの成熟過程をモニターすることに成功した。今後、これらのツールを用いて、治療候補化合物のスクリーニングを継続する必要がある。近年、神経変性疾患の分子病態解析が進展し、それら疾患の発症に膜小胞・物質移送系と連携した異常タンパク質の蓄積、細胞内小器官の異常が関わっていることが明らかにされている。特に、オートファジー・リソソーム系の変調は、疾患の発症及び進行を左右する重要な要因とされている。よって、そのような細胞内調節系は新たな治療標的系と捉えることができる。しかし、これまでに、その様な細胞内恒常性維持機構の改善を目指した疾患治療薬の開発研究はほとんど行われていない。本研究では、細胞内恒常性維持機構の改善を定量的に測定する手法を開発することにより、筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対する新たな新規治療候補化合物スクリーニング系を確立することを目指す。具体的には、まずpH感受性蛍光タンパク質(mKeima-Red)融合型LC3トランスジェニック(TG)マウスを作出する。その上で、ALSのマウスモデルを用い、それらと新規作出TGマウスと交配し、神経変性疾患発症・進行に伴うオートファジー・リソソーム系の異常を可視化できる評価系動物を作出することを目指す。H25年度は、マウス全身でmKeima-Red融合型ヒトLC3Bを発現する系統を作出した。作製したコンストラクトをマウス受精卵にマイクロインジェクションにより導入し、ファウンダーマウスを3匹得ることに成功した。現在、交配によるF1個体の作出、挿入遺伝子コピー数の解析、及び導入遺伝子発現レベルの検討を行っている。また、培養細胞レベルでの検討については、既にこれまでに利用されてきたEGFP-LC3Bを陽性対照群として、mKeima-Red融合型LC3Bの細胞内で発現及び動態に関して検討した。その結果、mKeima-Red融合型LC3Bは、EGFP融合型のものと同等に飢餓培養条件下でオートファゴソームへ局在化することが確認された。本研究では、先行研究から得られた知見を基に、細胞内恒常性維持機構の改善を定量的に測定する手法を開発することにより、筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対する新たな新規治療候補化合物スクリーニング系を確立することを目指す。具体的には、まずpH感受性蛍光タンパク質(mKeima-Red)融合型LC3-TGマウスを作出する。研究初年度は、mKeima-Redをレポーターとする融合タンパク質(mKeima-Red_LC3B)を始め、EGFP_LC3B、mCherry_LC3B等の発現コンストラクトを構築し、培養細胞系での発現解析を行った。その結果、各蛍光タンパク質融合型LC3Bの発現を確認するとともに、生細胞での蛍光観察でもLC3B融合タンパク質のオートファゴソーム様膜小胞への局在が確認された。また、マウス全身で導入遺伝子を発現する系統を作出するため、遺伝子プロモーターとしてCAGプロモーター制御下でmKeima-Red_LC3Bを発現する発現コンストラクトも完成させ、マウス受精卵へのマイクロインジェクションに用いる導入遺伝子断片の調整が完了した。近年、神経変性疾患の分子病態解析が進展し、それら疾患の発症にオートファジー・リソソーム系等の細胞内恒常性維持機構の変調が関わっていることが明らかにされつつある。しかし、これまでに、その様な機構の改善を目指した疾患治療薬の開発研究はほとんど行われていない。

本研究では、細胞内恒常性維持機構の改善を定量的に測定する手法を開発することにより、筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対する新たな新規治療候補化合物スクリーニング系を確立することを目指す。具体的には、細胞・個体レベルでのオートファジー動態の可視化を可能にする新たなツールを開発するため、mKeima-RedとLC3Bの融合タンパク質を発現する新たな発現コンストラクトの作製と同融合タンパク質を発現する新規トランスジェニック(TG)マウスの作出実験を実施した。まず、CAGプロモーターの制御下でmKeima-RedとヒトLC3Bの融合タンパク質を発現するベクターを作製した。この発現ベクターをHeLa細胞に導入し、Keima-Red_LC3B融合タンパク質の発現を生化学的、細胞生物学的手法により解析し、培養細胞でのオートファジー動態の解析を行った。同時に、C57BL/6マウスの受精卵に当該発現ベクターをマイクロインジェクション法で導入し、TGマウス作出を試みた。その結果、培養細胞実験により、mKeimaRed_LC3Bがオートファゴソームの成熟過程をモニターすることに成功するとともに、神経系及び心筋・骨格筋においてmKeimaRed_LC3Bを発現する3系統の新規TGマウスを樹立することに成功した。従って、本研究の遂行により、これまでには無かった新たなオートファジー動態の可視化のためのツールを開発することができた。今後、これらのツールを用いて、ALS新規治療候補化合物のスクリーニングを継続する必要があると考えている。神経解剖学・神経病理学本研究は、細胞内恒常性維持機構の改善を定量的に測定する手法を開発することにより、筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対する新たな新規治療候補化合物スクリーニング系を確立することを目指すものである。研究2年目に当たる平成25年度は、研究初年度に作製した発現コンストラクトを用いてTGマウスを作出することに成功している。但し、400個の受精卵にインジェクション行い、移植を行ったが、現時点で3匹のファウンダーマウスしか得られていない状況で、予定より作出効率が低い。さらに、その中のマウスから樹立した1系統については、挿入コピー数が1コピーであると推定され、蛋白質発現レベルも極めて低いことが判明している。今後、残りの2匹のファウンダーから樹立中の系統の解析を進める。一方、対照実験として計画しているEGFP-LC3B発現マウスとALSモデルマウスとの交配実験は順調に進み、LC3Bの過剰発現は疾患の発症及び進行に影響しないことが明らかとなった。従って、LC3B分子は、疾患進行時のオートファジー・リソソーム系の異常検出に有効なマーカーであると結論できる。更に、培養細胞レベルでの検討については、既にこれまでに利用されてきたEGFP-LC3Bを陽性対照群として、mKeima-Red融合型LC3Bの細胞内で発現及び動態に関して検討した。その結果、mKeima-Red融合型LC3Bは、EGFP融合型のものと同等に飢餓培養条件下でオートファゴソームへの局在化することが確認された。現在、ライブイメージングを含めて、細胞内LC3B陽性小胞の動態解析を進めている。以上より、計画の進捗状況としては、若干の遅れはあるが、全体としてはほぼ順調に進んでいると考えられる。