hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TOLL様受容体5を介した歯槽骨代謝機構に関する分子生物学的探索

そこで、この抑制に関与するサイトカインが何であるかを解明するためにIL-1β、IL-6、TNF-αおよびPGE2に着目した。E1細胞をフラジェリン処理すると処理後1時間でIL-6およびPGE2mRNAのup-regulationが認められた。それゆえ、この2つのサイトカインがOPGmRNAの抑制に関与しているか否かを検討した。フラジェリン+IL-6中和抗体の条件で培養してもE1細胞におけるフラジェリンによるOPGmRNAの発現動態に変化は認めなかった。一方、COX2阻害薬であるNS398を添加したところ、OPGmRNAのdown-regulationは抑制され、PGE2がこの現象をもたらすサイトカインの1つであることが示唆された。Treponema denticolaは歯周疾患の進行に関与する細菌であることが知られているが、歯槽骨の破壊にはToll様受容体5リガンドであるフラジェリンが関与することが今回の研究により示唆された。歯周疾患の進行抑制を実現するための方策を検討する上でToll様受容体に着目した分子生物学的研究を今後も継続していく必要があると思われた。
金属ギャップ間のホットサイトを利用したプラズモニック非線形光学効果

金属ダイマーのナノギャップで生じる局在表面プラズモン(LSP)励起による電界増強効果を利用し、その周辺に配置した2次や3次非線形光学材料によって生じる第二高調波(SH波)や光カー効果の低入力パワー動作を実験的に証明するために次のことを行った。1.非線形光学効果を有する光一分子強結合反応場の作製本特定領域研究内の微細加工グループの協力のもと、2次非線形光学材料のKTP基板、3次非線形光学材料のGaAs基板上に、金ダイマーをEBリソグラフィ技術で作製した。FE-SEM観察により、1辺80nm200nmの金ブロックのギャップ幅が5nm程度であることを確認した。また、顕微分光光学系を用いて1個の金ダイマーからの散乱光スペクトルを観測し、サイズの違いに応じたプラズモン共鳴スペクトルとなることを確認した。2.非線形光学特性の実験評価波長900nmのチタンサファイアレーザ光(パルス幅100fs,繰返し周波数82MHz)を入射光とし、暗視野顕微分光光学系を用いて、KTP基板上の金ダイマー1個で生じたSH波を観測した。SH波強度の金ダイマーの有無による違い、偏光依存性、サイズ依存性から、金ギャップ近傍のKTP内で励起されたLSPによる強い光電界によってSH波が生じたものと考えられる。しかし、基板と金の接触力を高めるために用いられている厚さ数nmのクロム層の存在により、金ダイマーのギャップとKTP基板との距離が離れてしまうことや、クロム層での光吸収があることが原因で、KTP基板内での光電界増強度が十分高められない問題があることが分かった。
中枢神経機能障害に着目した福山型筋ジストロフィーの治療法開発研究

福山型筋ジストロフィー(FCMD)症例は、筋症状だけでなく知的障害を認める。筋組織ではmTOR経路の異常があると考えられているが、中枢神経系でのmTOR経路の関与は不明である。本研究の目的は中枢神経症状へのmTOR経路異常の関与を解明し、治療法の開発に結びつけることである。方法は原因遺伝子のfukutin機能を失った疾患モデル神経細胞、中枢神経系のfukutin機能を失ったマウスを用いて大脳皮質形成異常を含む中枢神経障害の分子機構の解明、治療候補薬の効果の確認を行う。得られる知見はFCMDの中枢神経症状だけでなく、知的障害全体の治療研究に大きく貢献できると考えられる。
構造生物学的アプローチによる小胞体関連分解装置の分子認識と作動機構の解明

小胞体関連分解(ERAD)は、小胞体内で不要となったタンパク質を選別・除去する機構である。このシステムの中核をなすのは、小胞体膜上に集合した多数のタンパク質から構成される精緻な分子装置(ERADマシーナリー)である。本研究では、ERADマシーナリーを構成する要素タンパク質の間の相互作用のネットワークならびに標的分子との動的な相互作用を明らかにすることを通じて、本分子装置の動作メカニズムを解明することを目的とした。本年度の主な成果は、糖鎖およびポリユビキチン鎖ライブラリーの構築・拡張と、ERADマシーナリーの要素タンパク質である細胞内レクチンの分子認識を明らかにしたことである。(1)酵母の各種変異体から種々の高マンノース型糖鎖を精製し高マンノース型糖鎖ライブラリーの構築を行った。得られたライブラリーを利用して、レクチン様タンパク質OS-9との相互作用をフロンタルアフィニティークロマトグラフィーにより解析した。その結果、OS-9は3本鎖糖鎖のD3アームと呼ばれる枝を特異的に認識することが明らかとなった。このことと我々のこれまでの研究成果と考え合わせることにより、分子シャペロン、積荷受容体、分解レクチンなどとして機能している一連の細胞内レクチンが、高マンノース型糖鎖の異なる部位を特異的に認識しており、小胞体からゴルジ体にいたる過程で現れる糖鎖のプロセシング中間体を捕捉することを通じて担体タンパク質の運命を決定していることが明らかとなった。(2)酵素的および化学的反応を駆使して様々な鎖長のポリユビキチン鎖を構築し、ライブラリー化することに成功した。さらに、特定の位置のサブユニットを同位体標識したポリユビキチン鎖にも成功した。これによりX線結晶解析およびNMRを用いてdi-ubiqutin、tri-ubiquitinの構造解析を動的な部分を含めて行うための基盤が整った。
ニューヨーク市におけるバングラデシュ出身の移民：移民第二世代の生活実態調査

ニューヨーク市に約2週間滞在して、南アジア出身者から形成されるコミュニティでの実態調査のほか、(1)バングラデシュ出身の第一世代の移民労働者から、彼女・彼ら、そしてニューヨーク市で同居している第二世代の子どもたちの実態、(2)移民第二世代の大学生と大学院生から、学生生活や友人関係、宗教、慣習、言語等について聞き取り調査を行った。(1)バングラデシュ出身の移民労働者とその家族は、同じ出身国・地域の人たちとコミュニティをつくり、世帯間で出身地域同士の交流や情報の共有を行っている。第一世代の移民労働者の雇用形態は、時間労働や季節労働その他の非正規雇用に限定されている。そのため、保護者は、子どもたちに対して少なくともアメリカのカレッジを卒業するように助言しており、殆どの子どもたちがそれを実現している。自分自身の労働によって現金収入を得ている第二世代の子どもたちは、その一部を保護者に渡している。また、女性・男性を問わず結婚後も家族とのつながりは強く、相互扶助関係は顕著である。(2)保護者は第二世代の子どもたちに対しても祈祷をうながし、ベンガル語をも修得させようとしている。子どもたちにとってベンガル語の読み書きは困難であるものの、祈祷は欠かすことがない。しかし「家庭の外で祈祷の場所を探すことは困難であるし、トランプ政権に移行してからは、イスラーム教徒への偏見と差別に満ちた言葉を浴びせられたことがあり、地下鉄内での事件を通して通学に不安を覚えるようになった」と社会環境の悪化に直面している。また、アメリカ合衆国外にルーツを持たない友人と比較してみると、家族との結びつき、帰宅時間、恋愛や結婚に関する保護者の関与、ハラール以外の食事や飲酒が禁忌か否かといった慣習の違いが明確であった。こうした背景から、大学入学後の友人関係は同じ宗教のイスラーム教徒に限られている。本研究は、バングラデシュからニューヨーク市に移住した移民第二世代の実態に関して、ニューヨーク市への移住が貧困問題の解決や本人および家族構成員のウェルビーイング向上に結びついているのか否かといった視点からそれを明らかにする。また、大多数をイスラーム教徒が占めるバングラデシュ出身の移民第二世代が、アメリカ合衆国の社会構造のなかでどのような課題を抱えているのかについても分析する。そのうえで、国際間における移民政策の課題について提起し、これらの研究成果を国際社会に示すことを目的とする。本研究助成の初年度にあたる2018年度は、9月2日から15日までニューヨーク市に滞在して、先行研究と資料の収集、コロンビア大学での研究会参加、そして、バングラデシュ出身者から形成されるコミュニティでの実態調査、バングラデシュの第一世代の移民労働者および第二世代からの聞き取り調査を行った。そのほかにも、パキスタン、インド、エジプト出身者からそれぞれ聞き取り調査を行っている。コロンビア大学で開催された研究会や討論会では、ニューヨーク市でイスラーム教徒が抱える課題が浮き彫りになった。現在、先行研究の分析を行うと同時に先に述べたバングラデシュ出身者からの調査内容をまとめている。2018年度同様、ニューヨーク市において、先行研究と資料の収集およびバングラデシュ出身の第一世代および第二世代双方からの聞き取り調査を実施する。また「国際労働移動は二国間の孤立した現象でなく、グローバルな労働の流れの一環として位置づけられる」(森田桐朗編著『国際労働移動と外国人労働者』同文館、1994年25頁)という指摘から、可能であれば、バングラデシュ以外の出身国・地域にも焦点をあてて、先行研究や資料の収集、実態調査を行う。各国・地域での治安悪化が懸念される場合には、適宜調査日程を変更する。これまでの研究成果については、学会誌や学内紀要に適宜投稿する。

また、大多数をイスラーム教徒が占めるバングラデシュ出身の移民第二世代が、アメリカ合衆国の社会構造のなかでどのような課題を抱えているのかについても分析する。そのうえで、国際間における移民政策の課題について提起し、これらの研究成果を国際社会に示すことを目的とする。本研究助成の初年度にあたる2018年度は、9月2日から15日までニューヨーク市に滞在して、先行研究と資料の収集、コロンビア大学での研究会参加、そして、バングラデシュ出身者から形成されるコミュニティでの実態調査、バングラデシュの第一世代の移民労働者および第二世代からの聞き取り調査を行った。そのほかにも、パキスタン、インド、エジプト出身者からそれぞれ聞き取り調査を行っている。コロンビア大学で開催された研究会や討論会では、ニューヨーク市でイスラーム教徒が抱える課題が浮き彫りになった。現在、先行研究の分析を行うと同時に先に述べたバングラデシュ出身者からの調査内容をまとめている。2018年度同様、ニューヨーク市において、先行研究と資料の収集およびバングラデシュ出身の第一世代および第二世代双方からの聞き取り調査を実施する。また「国際労働移動は二国間の孤立した現象でなく、グローバルな労働の流れの一環として位置づけられる」(森田桐朗編著『国際労働移動と外国人労働者』同文館、1994年25頁)という指摘から、可能であれば、バングラデシュ以外の出身国・地域にも焦点をあてて、先行研究や資料の収集、実態調査を行う。各国・地域での治安悪化が懸念される場合には、適宜調査日程を変更する。これまでの研究成果については、学会誌や学内紀要に適宜投稿する。2018年度の調査旅費において、当初の予定より若干ではあるが滞在日程を縮小したたこと、人件費・謝金に支出しなかったことから、次年度使用額が生じた。2019年度の現地調査に伴い必要となる宿泊費と日当に使用する予定である。また、文献購入を予定している。
シロイヌナズナ花茎の抗重力形態形成におけるブラシノステロイドの機能解析

植物の茎は重力の力に抵抗するために強固な体を構築し、耐倒伏性の獲得や姿勢制御を行っている。これまでに、植物の重力に抗うための体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンのブラシノステロイドの関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていなかった。本研究により、シロイヌナズナ花茎において重力を感受して抗重力形態形成を発現する際に、ブラシノステロイド依存的な細胞壁の強度調整が関与する可能性が示唆された。一時保存用植物の茎は重力の力に抵抗するために強固な体を構築し、耐倒伏性の獲得や姿勢制御を行っている。これまでに、植物の重力に抗うための体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンのブラシノステロイド(BR)の関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていない。本研究では、シロイヌナズナ花茎が重力を感受して抗重力形態形成を発現するまでの各段階において、BR生合成や応答がどのように関与するかを明らかにすることを目的としている。本研究は課題を2つに分けており、課題1ではシロイヌナズナ花茎の茎頂特異的なBR生合成の重力依存性の解明、課題2ではシロイヌナズナ花茎の直立/倒伏や二次細胞壁形成に対するBR依存性の解明を目標としている。課題1では材料となるシロイヌナズナ重力感受変異体や重力応答変異体等のラインを揃えることと、実験系の構築を行うことを今年度の目標としていた。変異体は具体的に重力感受変異体phosphoglucomutaseや重力シグナル伝達変異体auxin influx facilitator1、重力応答変異体auxin resistant3等のラインを整備した。また、シロイヌナズナやエンドウの茎に過重力を与える実験系の最適化を実施した。課題2では、BRが胚軸において茎の剛性を担う分子メカニズムを明らかにすることを今年度の目標としていた。初年度は、野生型シロイヌナズナ花茎の茎頂側から基部側にかけて1 cm毎に輪切りにしてDNAマイクロアレイ解析を行い、花茎の茎頂側と基部側の基本的な遺伝子発現の差異について解析を完了した。これまでに、植物の重力に抗う体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンのブラシノステロイド(BR)の関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていない。本年度は課題2について進捗があった。野生型シロイヌナズナの花茎に外生BR処理およびBR生合成阻害剤(BRZ)処理を行い、花茎の生長と剛性の変化を定量した結果、BR濃度依存的に茎の剛性が変動することが明らかになった。。加えて、外生BR処理時の花茎の茎頂や基部の二次細胞壁の変化を定性的に評価するために、花茎の部位別横断面の細胞壁染色を実施した。更に、シロイヌナズナ支持領域の細胞壁の構築における分子機構に関わることが期待される遺伝子のうち、過重力で発現応答が報告されている遺伝子に着目して解析を進めた。その結果、リグニン合成酵素、キシログルカン転移酵素、ペクチン修飾酵素のなどの遺伝子が伸長領域-支持領域の境界付近で発現変動していることを明らかにした。これまでに、植物の重力に抗う体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンのブラシノステロイドの関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていない。本研究では、シロイヌナズナ花茎が重力を感受して抗重力形態形成を発現するまでの各段階において、ブラシノステロイド生合成や応答がどのように関与するかを明らかにすることを目的としている。本研究は課題を2つに分けており、課題1ではシロイヌナズナ花茎の茎頂特異的なブラシノステロイド生合成の重力依存性の解明、課題2ではシロイヌナズナ花茎の直立/倒伏や二次細胞壁形成に対するブラシノステロイド依存性の解明を目標としている。昨年度までに課題2について進捗があった。野生型シロイヌナズナの花茎に外生ブラシノステロイド処理およびブラシノステロイド生合成阻害剤処理を行い、花茎の生長と剛性の変化を定量した結果、ブラシノステロイド濃度依存的に茎の剛性が変動することが明らかになった。加えて、外生ブラシノステロイド処理時の花茎の茎頂や基部の二次細胞壁の変化を定性的に評価するために、花茎の部位別横断面の細胞壁染色を実施した。

その結果、リグニン合成酵素、キシログルカン転移酵素、ペクチン修飾酵素等の遺伝子が伸長領域-支持領域の境界付近で発現変動していることを明らかにした。昨年度は1年間、産休・育休により研究を中断していたが、全体として研究はおおむね順調に進展している。植物の茎は重力の力に抵抗するために強固な体を構築し、耐倒伏性の獲得や姿勢制御を行っている。これまでに、植物の重力に抗う体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンの関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていない。本研究では、シロイヌナズナ花茎が重力を感受して抗重力形態形成を発現するまでの各段階において、植物ホルモンの生合成や応答がどのように関与するかを明らかにすることを目的に研究を実施した。本研究ではシロイヌナズナ花茎の茎頂特異的なブラシノステロイド(BR)生合成の重力依存性の解明と、シロイヌナズナ花茎の直立・倒伏や二次細胞壁形成に対するBR依存性の解明を目標とした。野生型シロイヌナズナの花茎に外生BR処理およびBR生合成阻害剤処理を行い、花茎の生長と剛性の変化を定量した結果、BR濃度依存的に茎の剛性が変動することが明らかになった。また、花茎の茎頂や基部の二次細胞壁の変化のBR依存性を定性的に評価するために、花茎の部位別横断面の細胞壁染色を実施した。これらの結果から、細胞壁構築や剛性維持にBRが重要な役割を果たすが示された。一方、我々はこれまでの研究で、伸長領域の決定および重力屈性にAuxinとBRが協調的に働くことを示してきた。これらが抗重力反応にどのように関与するかを解明するため、過重力処理した花茎を先端部と基部に分け、遺伝子発現量を測定した。この結果、BR生合成酵素遺伝子の発現量からBR量が変化している証拠は得られなかったが、BRとAuxinの両方に応答するAux/IAA1が先端部で、Aux/IAA19が先端部と基部の両方で発現量が有意に減少していた。これらの結果から過重力処理に応答した抗重力反応において、BRとAuxinが協調的に働く可能性が示唆された。これまでに、植物の重力に抗うための体作り(抗重力形態形成)の発現に、植物ホルモンのブラシノステロイドの関与が示唆されてきたが、植物ホルモンと抗重力形態形成の関わりの大部分が明らかになっていなかった。本研究により、シロイヌナズナ花茎において重力を感受して抗重力形態形成を発現する際に、ブラシノステロイド依存的な細胞壁の強度調整が関与する可能性が示唆された。課題2ではBRが茎の剛性を担う分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。今年度は、野生型シロイヌナズナの花茎に外生BR処理およびBR生合成阻害剤(BRZ)処理を行い、BR濃度依存的な花茎の生長と剛性の変化を定量した。加えて、外生BR処理時の花茎の茎頂や基部の二次細胞壁の変化を定性的に評価するために、花茎の部位別横断面の細胞壁染色を実施した。更に、シロイヌナズナ茎頂部、伸長領域、非伸長領域(支持領域)を含む5画分15サンプルグループの遺伝子発現をマイクロアレイ解析により網羅的に調べた。支持組織の細胞壁の構築における分子機構に関わることが期待される遺伝子のうち、過重力で発現応答が報告されている遺伝子に着目して解析を進めた。その結果、リグニン合成酵素、キシログルカン転移酵素、ペクチン修飾酵素のなどの遺伝子が伸長領域-非伸長領域の境界付近で発現変動していることを明らかにした。
妊娠期の微小粒子曝露が母体環境に与える影響

大気汚染物質のPM2.5:微小粒子の次世代影響は、微小粒子の胎仔移行による直接影響か、妊娠環境の変化による間接影響か不明である。そこで、妊娠マウスに微小粒子を処理し、母体肝臓、胎盤、胎仔の遺伝子発現変動を評価し解明を試みた。微小粒子が胎仔移行し直接影響を与える場合、異物代謝に係わる遺伝子(対象遺伝子数125)発現変動は胎仔と母体肝臓や胎盤で同様の変化が認められるが、共通発現変動様式を認めた遺伝子はなかった。一方、母体血中の炎症性サイトカインMCP-3は有意に高値となり、微小粒子による次世代影響は微小粒子の胎仔移行による影響ではなく、母体環境の変化により、次世代に影響を与える可能性が示唆された。浮遊粒子状物質の環境濃度と低出生体重児のリスク、気管支喘息の罹患率に因果関係があるという報告があり、浮遊粒子状物質の胎児期曝露による出生後への影響が懸念されている。また、これまでに微小粒子(PM2.5)などの粒子状物質の胎仔期曝露により、雄性出生仔数の低下や、雄性出生仔の免疫系や生殖系に悪影響が生じることが示唆されている。しかし、PM2.5の胎仔期曝露による胎仔発育・機能への影響や胎盤機能にどの様な影響が生じるか、また、母体環境にどの様な変化が生じているか不明であり、解明が求められている。そこで、妊娠マウスにPM2.5を気管内投与し、胎仔や胎盤機能への影響を検討した。ICR系妊娠マウスにPM2.5を一匹あたり200μg、妊娠7日目および14日目に投与し、15日目に母体血の採血、胎仔胎盤の摘出を行った。PM2.5の投与による妊娠率や胎仔数に有意な変化は認められなかった。一方、PM2.5投与による胎仔重量は対照群と比較し11%有意に小さくなり(p<0.0001)、PM2.5の胎仔期曝露による胎仔発育遅延が認められた。胎盤重量に有意な変化は認められなかった。現在、胎仔の性別判断を行っており、雄性胎仔の発育への影響を確認するとともに、胎仔および胎盤における遺伝子発現解析をDNAマイクロアレイを用い網羅的に行い、胎仔発育遅延のメカニズム解明を行う。さらにPM2.5の胎仔期曝露により生じる出生仔雄性生殖機能への影響、免疫系への影響発現メカニズムの解明を試みる。PM2.5の胎仔期曝露による胎仔発育遅延が認められ、本研究推進におけるモデルが作成できたため。大気汚染物質の1つである微小粒子(PM2.5)が次世代の雄性生殖機能や免疫系に影響を与えることが示唆されているが、PM2.5による影響発生メカニズムは不明である。そこで本研究では、妊娠マウスにPM2.5を処理し、胎仔の遺伝子発現解析を行い、出生仔の雄性生殖機能および免疫系に対する影響発生機序の解明を行うとともに、PM2.5の胎仔移行について検討した。ICR系妊娠マウス10匹を用いた。Control群とPM2.5群に分け、1群5匹とし、PM2.5群には、PM2.5 (0.2mg/匹)を妊娠7日目、14日目に気管内投与した。妊娠15日目に胎仔を摘出した。雄性胎仔と胎盤及び母体の肝臓の発現遺伝子を解析した。DNAマイクロアレイを用いて発現遺伝子の解析を行ったところ、全解析遺伝子56,689のうち、PM2.5群の雄性胎仔の発現量がControl群の雄性胎仔の2倍以上となった遺伝子は2,645、発現量が1/2以下となった遺伝子は298であった。そのうち性分化関連遺伝子(解析対象428遺伝子)でそれぞれ、16、3遺伝子であった。また、細胞分化関連遺伝子(6,179遺伝子)は、それぞれ137、27遺伝子が変動した。このことから、胎仔期におけるPM2.5曝露により、免疫系を含む各組織形成、発育に何らかの影響を及ぼす可能性が示唆される。さらに、母体肝臓と胎仔における異物代謝関連酵素の遺伝子発現変動様式はほとんど一致しなかったことから、PM2.5の胎仔移行は小さいことが示唆された。以上より、妊娠期に曝露したPM2.5は母体環境の変化を介して雄性胎仔の性分化や細胞分化に何らかの影響を及ぼし、雄性出生仔の生殖機能や免疫系に何らかの影響を及ぼすことが考えられる。胎仔の性別判断を行い、雄性胎仔への影響を、DNAマイクロアレイを用い、評価する。環境影響評価次年度使用する保存が利く物品の一部を、キャンペーンを利用して安価に購入したため。
高等植物における細胞周期停止因子の新規機能の探索

高等植物の細胞周期停止因子KRPs (Kip-related proteins)の新規機能を探索するため、シロイヌナズナKRPに対する結合タンパク質候補に対してKRPとの結合をin vitroおよびin vivoで調べた。その結果、1つはプルダウン・アッセイによっても結合が確認された。このタンパク質については酵母two hybrid法により結合領域も特定できた。また、幾つかの候補タンパク質は細胞内でも結合しているようだった。さらにこうした現象を確認するため過剰発現体株も作成した。平成23年度にAtKRP3の各種in vitro発現系を試みたが,殆ど合成されなかった。そこで、本年度はホスト大腸菌を様々変え、異所発現系の構築を目指した。その結果、発現プラスミドにpGEX-4-3を、ホスト大腸菌にBL21派生株であるRosetta株を用い、低温での誘導を短時間行なった場合に少量ではあるが比較的安定した発現を行なうことが可能となった。2) AtKRP3結合候補タンパク質のうち核コード葉緑体タンパク質については平成23年度にコムギ胚芽無細胞転写・翻訳系を用い、生産量に差はあるものの合成には成功していた。24年度はこれらのうちから一分子種について葉緑体移行能を調べた。葉緑体の調製はシロイヌナズナ(Col株)幼芽生えとT87培養細胞からパーコール・ステップワイズ密度勾配遠心法で行った。培養細胞は不定形で巨大な葉緑体をもっており無傷葉緑体を安定的に回収することは出来なかった。幼植物体から葉緑体を調製し、無細胞翻訳系に添加した。葉緑体を再回収し、SDS-PAGEとウエスタンブロッティングで目的タンパク質の移行を検討したところ、抗体を用いた検出方法では目的タンパク質の有意な移行は観察されなかった。3) AtKRP3過剰発現体については35S-プロモータ(Ω配列を有したもの)でドライブした形質転換体を作成した。遺伝子導入はアグロバクテリウムを用いた。F1のヘテロ体ではAtKRP3の過剰発現が確認されている。24年度末よりホモ系統の確立を続けており平成25年度はこのホモ個体を用いて解析を進める予定。AtKRP3と相互作用候補タンパク質のプルダウン・アッセイ:AtKRP3は不安定なタンパク質で、種々検討により平成24年度より導入した大腸菌異所発現系(大腸菌:Bl21派生株Rosetta株,低温条件下で数時間発現)で少量ながら生産できるようになった。AtKRP3はGSTタグとの融合体として生産し、グルタチオン・セファロースで回収した。セファロースから溶出すると分解が進み、結合状態では安定であった。そこで、同セファロースとの結合状態でプルダウン・アッセイを行なった。対象には結合候補の核コード葉緑体タンパク質数種を選び、コムギ胚芽無細胞転写・翻訳後、GST-AtKRP3を混合、回収した。しかし、電気泳動後のCBB染色では検出できなかった。候補タンパク質のうち、大腸菌で比較的安定して生産できるホルモン関連因子に注目し、Hisタグ融合タンパク質として発現させ、GST-AtKRP3に対してプルダウン・アッセイを行なった。その結果、有意な結合が観察された。このタンパ質について酵母ツーハイブリッド法によりAtKRP3との結合領域をドメインレベルで決定した。BiFC法によるAtKRP3と葉緑体タンパク質の相互作用:AtKRP3および結合候補の核コード葉緑体タンパク質数種についてpUCJ4-eYFPに組み込み、シロイヌナズナT87培養細胞に形質転換後、YFPの再構成によって生じる蛍光を指標に結合の有無と細胞内局在を観察した。その結果、いくつかの葉緑体タンパク質において葉緑体に隣接した細胞質でYFP蛍光が観察された。AtKRP3過剰発現体の選抜:平成24年度に調製したAtKRP3過剰発現体のライン化を進めた。同変異体は矮性を示し、既に報告されているAtKRP1やAtKRP2の過剰発現体と同様に成熟葉の形態が楕円型から鋸型に変化していた。また、花芽形成が非常に遅く、ホモ体の選抜は遅れている。1.シロイヌナズナAtKRP3と結合候補タンパク質との酵母内結合実験:AtKRP3と結合候補タンパク質(12種)との結合について酵母Two hybrid法を用いて調べた結果、全てで有意な結合が確認された。次に、AtKRP3との結合部位を明らかにする一環としてAtKRP3C末端のCDK/サイクリン結合ドメインを欠如したAtKRP3ΔCとの結合能についても検討したところ、いずれの候補もAtKRP3ΔCとの結合が観察された。2. In vitro転写・翻訳系を用いた候補タンパク質の合成とAtKRP3との結合実験:結合候補タンパク質12種をコードするcDNAをin vitro転写・翻訳系としてコムギ胚芽無細胞転写・翻訳系に供したところ、それぞれの分子量に合致したタンパク質を調製することに成功。AtKRP3についてはタンパク質を検出することが出来ず、昆虫細胞由来無細胞転写・翻訳系も試みたが合成されなかった。

そこで、平成24年度はBrevibachillus分泌系を導入し、分泌タンパク質として回収予定。結果を待って結合実験を次年度以降に行う予定。3.BiFC法によるin vivo結合実験:酵母two hybrid法によりAtKRP3と結合した12種のタンパク質のうち8種について、細胞内でのAtKRP3との結合をBiFC法により検討した。eYFPnを各候補タンパク質に融合させるように、また、eYFPcとAtKRP3を融合させるようにそれぞれデザインしたコンストラクトをシロイヌナズナT87株培養細胞に導入し、細胞内で再構成されるYFP蛍光を観察し、結合の有無を調べた。その結果、調査した8種の候補タンパク質で有意と思われるシグナルが観察された。なお、葉緑体の自家蛍光が強く、シグナルが明確でないものもあり、24年度に再度、実験を行い、複合体の細胞内局在を明らかにする予定。当初計画と比べ、方法論的な困難さ等が重なり、達成度はやや遅れている。例えば、平成23年度には(1)酵母内での候補タンパク質の発現量が極端に低く,免疫沈降法やウエスタンブロッティング法での検出が出来なかったこと、(2)AtKRP3が非常に不安定なタンパク質であり、in vitro転写・翻訳系を含む異所発現系の構築が滞り、平成24年度には酵母発現系やin vitro転写翻訳系に代え、ホスト大腸菌や発現ベクターの組み合わせを種々検討する方法を検討し、かなりの時間を費やしてしまった。結果的に大腸菌BL21のRosetta派生株と発現ベクターpGEX-4-3の組み合わせに回帰し、発現条件を種々検討した結果、低温で短時間の誘導によって少量ではあるものの比較的安定した発現系を構築した。また、(3)平成23年度末よりAtKRP3と結合候補タンパク質との細胞内での結合を蛍光タンパク質再構成法(Bimolecular fluorescent complementation, BiFC法)により進めているが、幾つかの候補タンパク質との結合については,結合により再構成されたYFP蛍光が細胞質中で大きなドット状に分布することが観察された。これらは細胞内での人工異物としての「封入体」や「ファゴソームに取り込まれた複合体」とも考えられる。そこでこうした可能性を検討すべく平成24年度には候補タンパク質のN末およびC末にYFP断片が結合できる発現ベクターを調製し直した。加えて、平成24年度よりAtKRP3過剰発現体とC末端欠損AtKRP3の過剰発現体の作製を行い、現在、両者についてホモ化を進めているが、(4)AtKRP3のノック(アウト)ダウン体については形質転換体の作成を進めることが出来なかった。現状では平成25年度中にノック(アウト)ダウン体の作製を終了することは困難となっている。「研究実績の概要」でも述べたように当初計画の3つの項目については進展がみられるものの、次に述べるような問題もあった。
多機能型地盤調査ツールの開発と常時微動観測を組み合わせた地盤内情報化手法の構築

本研究では,近年多発する地盤災害の予測・防災・減災に資することを目的に,斜面崩壊の危険度や谷埋め盛土宅地等の安定性を合理的に診断し,対応策の検討に貢献することのできる地盤調査手法を構築した。具体的には,1)小口径のボアホールを対象とした孔内直接せん断試験ツールを開発するとともに,2)面的な非破壊調査手法である「常時微動観測技術」によって潜在すべり面を推定する手法を提案した。本研究では、近年多発する地盤災害の予測・防災・減災に資することを目的に、斜面崩壊の危険度を合理的に診断するための地盤調査技術を開発している。具体的には、1)小口径のボアホールを対象とした孔壁直接せん断試験と透水試験を行える多機能型地盤調査ツールを開発した上で、2)面的な非破壊調査手法である「常時微動観測技術」を組み合わせた3次元の地盤内情報化技術を構築する。平成26年度には、多機能型地盤調査ツール(孔内せん断試験ツール)に関する研究開発を実施した。本試験ツールは、予めポータブルドリルで削孔した小口径のボアホールにせん断プローブを挿入し、孔壁に対してせん断部を所定の圧力で拡張・圧着した状態で引き上げ、孔壁で摩擦・せん断試験を行おうとするものである。せん断面に作用する水平載荷応力とせん断応力を測定することによって地盤の強度定数を求めることができる。先行して試作したプローブでは、内圧をかけてせん断部を拡張した際に、同面が樽型に変形したり、塑性変形を起こして収縮時に元に戻らないといった問題点があった。当該年度には、CAEに基づいて再設計し、これらの問題点を改良したプローブを新たに開発するとともに、室内にて模型チャンバー試験を実施し、その試験性能を評価した。その結果、改良プローブで取得した土の強度定数と別途一面せん断試験を実施して得られたそれらが一致し、せん断試験機としての妥当性を確認することができた。今後は、他の土質試料を用いた室内模型実験や現場実験を実施し、性能や機能の検証を行うともに、実用化に向けた検討を行っていきたいと考えている。本研究では,近年多発する地盤災害の予測・防災・減災に資することを目的に,斜面崩壊の危険度や谷埋め盛土宅地等の安定性を合理的に診断し,対応策の検討に貢献することのできる地盤調査手法を構築する。具体的には,1)小口径のボアホールを対象とした孔内直接せん断試験ツールを構築するとともに,2)面的な非破壊調査手法である「常時微動観測技術」によってすべり面を推定する手法を確立する。平成27年度には,前年度までに試作した孔内せん断試験ツールを用いて,室内土槽と野外に構築した試験盛土での実証実験を行った。その結果,開発した試験機によって一面せん断試験結果と同等の強度定数を求められることが分かった。さらに,平成25年9月に発生した福井県嶺南地域の土砂災害現場の調査を行い,崩壊斜面の土質および強度特性を調べた。ここでは,斜面の不安定化に及ぼす粘着力の低下,水圧の上昇,自重の増加の影響を分離して評価することのできる斜面安定解析手法を構築し,当該斜面の崩壊メカニズムを明らかにした。本研究で開発を進める孔内せん断試験ツールでは,ボアホールを浸水した状態で試験することで飽和状態の強度定数を求めることができる。浸水前後の強度定数の変化を調べることができるようになり,その試験結果を提案する解析手法に入力することで,斜面が崩壊する地下水位が予測できるようになる。また,地下水位の変動をモニタリングすることで,時々刻々と変化する斜面の安全率を評価することができるようになる。このように平成28年度には,斜面の危険度評価するための強度定数の計測技術とそのデータを危険度診断に使用するための解析手法を構築した。平成28年度には,斜面の危険度診断の精度を向上させるために,常時微動観測によるすべり面の推定方法についての検討を行うとともに,本研究で開発した技術の統合化を図る。平成27年度には,模型土槽を用いた室内実験や試験盛土を行ったフィールド実験によってデータの蓄積を行い,孔内せん断試験ツールの原位置試験システムとしての有用性を検証することができた。本研究は、斜面崩壊の危険度や谷埋め盛土宅地等の安定性を合理的に診断し、対応策の検討に貢献することのできる地盤調査手法を構築することを目的とする。具体的には、1)小口径のボアホールを対象とした孔内直接せん断試験ツールを構築するとともに、2)面的な非破壊調査手法である「常時微動観測技術」によってすべり面を推定する手法を確立する。最終年度である平成28年度には、土砂災害警戒区域に指定されている実斜面を対象に、前年度までに試作した孔内せん断試験ツールを用いた計測実証実験を実施した。同現場において不かく乱サンプリング試料を採取して室内一面せん断試験を行い、両者を比較した結果、孔内せん断試験は一面せん断試験に比べて粘着力を過小評価する傾向があるものの、内部摩擦角については良い一致が見られた。また、当初ハンドドリルによってボアホールを削孔していたが、単管パイプの打ち込み/引き抜きによる削孔方式に替えることで、試験時間の短縮と孔壁乱れの影響の低減など試験の実用性を向上させることができた(試験は作業者2名程度で実施できる)。また、同年度には、実斜面に対して常時微動観測技術を応用したすべり面検出の実測実証実験を行った。

本研究では、斜面の直線測線上に4点の地震計を設置し、直線アレイ観測に基づいて風化層/基岩境界までの深度推定を行った。常時微動観測を浅層の傾斜成層構造に適用した研究事例は少なく、その適用性と課題を明らかにした点で新規性のある研究であると考えている。常時微動観測と孔内せん断試験を組み合わせて実施し、それぞれの結果を斜面安定解析に反映させることによって、力学特性に基づく合理的な斜面の危険度診断が可能になると考えている。本研究では,近年多発する地盤災害の予測・防災・減災に資することを目的に,斜面崩壊の危険度や谷埋め盛土宅地等の安定性を合理的に診断し,対応策の検討に貢献することのできる地盤調査手法を構築した。具体的には,1)小口径のボアホールを対象とした孔内直接せん断試験ツールを開発するとともに,2)面的な非破壊調査手法である「常時微動観測技術」によって潜在すべり面を推定する手法を提案した。平成26年度には、せん断試験機能に着目した要素技術開発とその検証を行った。模型土槽を用いた実証実験では不良個所等が現れたが、当該期間中にそれらを改良した装置を完成させることができた。改良したプローブでは概ね良好な実証実験データが得られており、せん断試験ツールに関して実用化の目途を立てることができた。平成28年度には,土砂災害警戒区域に指定されている地区を対象に,常時微動観測によるすべり面の推定に関する検討を行うとともに,開発した孔内せん断試験ツールによる現地試験データを利用した危険度診断システムを構築したいと考えている。地盤工学平成27年度には、既に開発したせん断試験プローブによる室内および現場実証実験を行い、実用化にむけた更なる改良、性能・機能評価を行っていきたい。また、当初計画では、ハンドドリルで削孔したボアホールを利用することを考えていたが、現地調査の更なる簡便化を目指して、小口径ロッドの動的貫入によってボアホールを作成する方法について検討したいと考えている。ドリル削孔の手間が省ける上、岩盤との境界面(すべり面)を検出できるようになると考えている。そこで、既に開発したプローブの実証実験を行うとともに、ロッド貫入によって作成されるボアホールにも対応できる小口径のプローブを開発したいと考えている。孔内せん断試験ツールの実験に要した材料費・試料費等が安く抑えられたことによる。孔内せん断試験機開発に要した材料費が安く抑えられたことによる。開発する機器の材料費や実験試料費として使用する予定である。孔内せん断試験機改良のための材料費として使用する予定である。
再灌流不整脈発生に関すNa^+/H^+とCI^-/HCO3^-交換系の役割と関連性

目的:再灌流不整脈の発生機序に関して最近、Ca^<+12>過剰負荷が重要な役割を果たしていることが指摘されている。細胞内Ca^<2+>はさまざまな機構で制御されるが、特に再灌流時に、急激な変動が考えられるNa^+/H^+交換系の役割は重要である。また同様に細胞内pHの制御に関係するCl^-/HCO3^-交換系も再灌流不整脈に影響を与えることが推測される。またこの両交換系は互いに関連を持っているが、その詳細は不明である。本研究では、再灌流不整脈の発生機序に関するNa^+/H^+交換系とCI^-/HCO3^-交換系の役割を明らかにするためにそれぞれの阻害薬であるamilorideと4-acetamido-4'-isothiocyanostilbene-2,2'-disulfonicacid(SITS)を用いて検討を行った。結果:再灌流不整脈の発生率は、KHB群100%,KHB+AM群0%,KHB+SITS群100% KHB+AM+SITS群57%であった。これらの結果より、(1)Na^+/H^+交換系が再灌流不整脈の発生に大きく関与している。(2)Na^+/H^+交換系を抑制した条件下ではCl^-/HCO3^-交換系が再灌流不整脈の発生に大きく関与していることが示唆された。
旋光法による興奮性膜チャネル高分子の活動様式の解析

1.入射光と神経との角度を変化させる実験。分子の光学活性は、二階のテンソル(旋回テンソル)によって特長づけられるので、神経線維のような秩序ある構造の旋光性は、入射光と神経線維との角度に依存するはずである。これを確めるため次の実験を行った。光路に対し神経を±10°にわたって傾けることのできるチェンバ-を作り、神経を傾けた時の旋光性シグナルを測定した。次のような結果が得られた。(a)旋光性シグナルが、前応答を持っている時、シグナルのこの部分は神経を傾けてもほとんど変化しない。(b)これに対し、神経の旋光性シグナルの主応答は、神経を傾斜させることによって大きく変化する。変化は、+10°の場合と-10°の場合で逆方向となる。振巾の変化と同時に、しばしばその符号を逆転させる。(c)中枢端刺激と末梢端刺激とでは、神経を傾斜させない時、旋光性シグナルは、しばしば逆符号をとる。しかし、神経を傾斜させるとき、変化の方向は、刺激部位に関係なく同じ方向に起る。従って、傾斜させた実験では、刺激部位の差による符号の差は少なくなる。以上のような実験から次のことが結論できる。(a)旋光性シグナルを、膜電位勾配による膜高分子の傾きのみによっては説明できない。神経を傾けても応答の変化分には変化が出ないはずである。(b)旋光性シグナルの発生原因は興奮伝導によって起る分子の傾きと分子の形態変化の相乗に求めなければならない。分子が傾いている時、その分子の形態変化は旋光性シグナルとして検出され、シグナルの大きさと方向は分子の傾きの凾数となる。以上の假説は実験を説明するが検証は今後の問題である。2.旋光性シグナルに対する薬物の作用。麻酔薬(ベンゾカイン等)は旋光性シグナルの主応答を消失させるが前応答は残存させる。テトロドトキシンも同じである。150mMK^+はシグナル全部を可逆的に抑える。1.装置の改良。本年度購入したシグナルアベレージャは、よい条件で稼動している。従来より時間描記の精度が高まり、較性の操作の一部が自動化されて、故障の可能性が低下したことが主要な利点である。2.イセエビの歩脚神経を使用した実験成果。主要な目的は、旋光シグナルの方向が一定しない理由を探ることであった。次のような所見は、この不定性の解析に役立つものであった。旋光シグナルは、2つの成分に分離できることが認められた。これらを、それぞれ前シグナル、主シグナルと呼ぶことにする(1)前シグナルは、時間的にシグナルの初期に現れる。主要な特徴は、陽極刺激によりその方向を逆転させること、刺激部位を光測定部位から離すとき、この成分が消失すること、不応期を持たないこと、等である。これらの事実は、前シグナルが、刺激部位からの電気緊急性膜電位変化に依存していることを示す。しかし、一方大部分の例において刺激部位が光測定部位の右側にあるか左側にあるかに従ってその方向を逆転させることは、このシグナル成分が膜電位そのものではなく、膜電位の空間的勾配によって発生していることを示す。(2)主シグナルは、陽極刺激により方向をかえず、刺激部位を離しても消失せず、不応期を持つので、伝導性の活動電位に伴って発生していると考えられる。主シグナルも、大部分の例において、刺激部位と光測定部位を反対にすると、その方向を逆転させるので、その発生原因に、膜電位の空間的勾配が大きく関与していることがわかる。しかし、神経線維を光軸に対し傾けると、前シグナルにはほとんど変化が見られないのに対し、主シグナルはその大きさを変え、時に反転する。主シグナルのこの成分は、膜電位の勾配により生ずる変化とは異る成分であろう。3.イカ巨大線維を使用した実験成果。シグナルの大きさは詳しい解析を行うに充分ではなく、色素の使用と、レーザによる実験を試みたい。

分子が傾いている時、その分子の形態変化は旋光性シグナルとして検出され、シグナルの大きさと方向は分子の傾きの凾数となる。以上の假説は実験を説明するが検証は今後の問題である。2.旋光性シグナルに対する薬物の作用。麻酔薬(ベンゾカイン等)は旋光性シグナルの主応答を消失させるが前応答は残存させる。テトロドトキシンも同じである。150mMK^+はシグナル全部を可逆的に抑える。
日本人英語学習者の語用論的能力習得のためのeラーニング教材開発

本研究は、英語語用論の"理解"の過程を習得の重要なステップと捉え、日本人学習者がどのように英語の語用論を理解するか、語用の誤解や取り違えはなぜ起こるのかを明らかにし、日本人学習者の英語語用論の理解に役立つマルチメディアeラーニング教材の開発を研究課題とした。最終目標は「eラーニング教材試作版」を作成することであった。具体的な手順と内容は以下の通りである。(1) 20年作成の誤解のカテゴリー一覧表にしたがってeラーニング教材用のストーリーを作成した。(2)ストーリーごとの素材をもとに、日本語、英語のスクリプトを作成した。(3) eラーニング教材の提示方法としてのビデオ動画を、利用の簡便なデジタルカメラを用いて作成した。(4)教材案(ストーリー、プロット)を実際のeラーニング素材に編集し、作成した。(5)これと並行して、留学経験のある日本人英語学習者にアンケート調査を行い、ミスコミュニケーションや誤解のケースを明らかにした。(6)これらの教材を使った日本人英語学習者のための語用論学習用シラバスを完成させた。(7)海外、国内の学会で成果を発表した。国内ではJALT PanSIG学会(東洋学園、5月23日)、全国語学教育学会(JALT)国際大会(静岡、11月21日)での発表、海外ではIPrA(国際語用論学会(オーストラリア・メルボルン、7月15日)の発表を行った。意義、重要性等:コミュニケーションを目的とする語学の習得は単語や表現(文法)を使えるようになるだけでは不十分で、文化の違う相手の意図をくみとり、相手に自分の意向を伝えるための細かい配慮が必要である。映像を伴うeラーニングによって自習学習できる本教材の意義は大きい。海外の学会では言語の異なる研究者からも本教材を十分使用できる(例:中国語、フランス語など)との指摘を得、本教材の重要性が認識された。本研究の平成19年度の目標は基礎データの収集と整理である。具体的には、1)体系的基礎データの作成:語用論およびeラーニングの最新の研究動向を整理する。2)パイロット調査:英語圏生活経験のある日本人、日本在住の英語圏出身者に対して、発話行為を中心とする話題に関しての失敗談や誤解などについて聞き取り調査を行い、アンケート調査を行う。3)eラーニング教材の調査:異文化間語用論理解のために最適なeラーニング教材とその方法を調査する。4)バーチャルな素材の調査:アニメーションやゲーム等を教材へ応用することの効果を検討する。の4点である。その結果、(1)国内、及び海外で発表されている異文化間比較語用論関係の論文の主要なものを収集し、整理した。また国内外の最新の研究動向を探るため、世界語用論学会(7月)、JALT全国語学教育学会(11月)、Thai TESOL(08年1月)に分担で参加し、新しい理論や教授法に関する情報を集めた。(2)聞き取り調査とアンケート調査を行ったが、カテゴリー別の一覧表作成は次年度の課題とした。(3)CALL関係の学会、CASTEL/J国際会議(8月)、CALICO国際学会(3月)に参加して情報収集したほか、インターネットで関連サイトを調べた。(4)e-ラーニングのための教材提示方法の中で、本年度は現在世界的に注目を集めているコンピュータ上のバーチャル空間「セカンド・ライフ」のCALL教育への応用の可能性を詳細に調査した。SLの教育への応用は世界的にも始まったばかりなので、海外の動向をいち早く取り入れた本研究は日本の英語教育の中で先駆的となる。上記の他、2の結果を参考に異文化間の誤解場面をスクリプト化し、次年度の教材試作に向けての準備とした。なお、研究協力者としてネルソン・フォレスト(東海大学)が加わり、主にCALL教材の実際の運用面についてグティエラスとともに研究を担当した。(798字)本研究では、英語語用論の“理解"の過程を習得の重要なステップと捉え、学習者(日本人)が、どのように第二言語(英語)の語用論を理解するか、語用論に関係する英語の誤解や取り違えはどのような頻度でなぜ起こるのか、を明らかにし、日本人学習者の英語語用論の理解を助けるような、マルチメディアeラーニング教材の開発を研究課題としている。20年度は19年度にパイロット調査により作成した誤解のカテゴリー一覧表にしたがってeラーニング教材用のストーリーあるいはプロットをいくつか作成した。ストーリーごとに作成した素材をもとに、日本語(山下・川手)、英語(Jungheim)のスクリプトを作成した。eラーニング教材の提示方法として、“セカンドライフ"(Second Life)形式、ビデオ動画、イラスト、まんがなどを調査し、継続して最適の素材を検討した。本年は、昨年度に引き続き“セカンドライフ"の考え方を利用したeラーニング教材の可能性を探ったが、“セカンドライフ"を実際に利用するには、さまざまな制約が生じることがわかった。そのため、20年度後半では、さらに効果的な形式を探った。海外、国内のコンピュータを使った語学教育に関する学会(CALL関係)において中間発表を行なった(業績参照)。国内外の学会では、“セカンドライフ"を利用した教材開発と模索が盛んに行われているが、実際に使用する場合の問題点を確認できたのは、本萌芽研究の意義・重要性と考えることができる。

最終目標は「eラーニング教材試作版」を作成することであった。具体的な手順と内容は以下の通りである。(1) 20年作成の誤解のカテゴリー一覧表にしたがってeラーニング教材用のストーリーを作成した。(2)ストーリーごとの素材をもとに、日本語、英語のスクリプトを作成した。(3) eラーニング教材の提示方法としてのビデオ動画を、利用の簡便なデジタルカメラを用いて作成した。(4)教材案(ストーリー、プロット)を実際のeラーニング素材に編集し、作成した。(5)これと並行して、留学経験のある日本人英語学習者にアンケート調査を行い、ミスコミュニケーションや誤解のケースを明らかにした。(6)これらの教材を使った日本人英語学習者のための語用論学習用シラバスを完成させた。(7)海外、国内の学会で成果を発表した。国内ではJALT PanSIG学会(東洋学園、5月23日)、全国語学教育学会(JALT)国際大会(静岡、11月21日)での発表、海外ではIPrA(国際語用論学会(オーストラリア・メルボルン、7月15日)の発表を行った。意義、重要性等:コミュニケーションを目的とする語学の習得は単語や表現(文法)を使えるようになるだけでは不十分で、文化の違う相手の意図をくみとり、相手に自分の意向を伝えるための細かい配慮が必要である。映像を伴うeラーニングによって自習学習できる本教材の意義は大きい。海外の学会では言語の異なる研究者からも本教材を十分使用できる(例:中国語、フランス語など)との指摘を得、本教材の重要性が認識された。
SDNFと名づけたシュワン細胞由来神経突起伸長因子の同定・精製と神経修復への応用

SDNFはマウスシュワン細胞由来IMS32細胞を100μMのアドレナリンで一晩処理した際、その培養液中に現れる物質で、ラット褐色細胞種由来のPC12細胞の神経突起を伸長させる生理活性を持っている。SDNFが蛋白質かどうかを推定するためにSDNF含有の培養液を37度Cで30分間、0.5、5、50μgのトリプシンで処理し、消化液にトリプシンインヒビターを100μg添加した後、PC12細胞に与えた。コントロールとしてウシ血清アルブミン(BSA)を添加したDMEMを同様に処理したものを用いた。トリプシン50μg以上で処理したコントロールの細胞は抑制が完全ではなく細胞が浮き上がってしまい判定できないが、少なくとも0.5μg処理のものでは著変は見られなかった。この条件で、SDNF含有培養液の活性は消失しなかった。この実験とSDNFの生理活性を消失させるのに100度C、10分間の強い過熱処理が必要であること、アルブミン(BSA)に結合すること、しかも脱脂していないBSAでは細胞にとって毒性効果がでること、などからSDNFは脂質類か、あるいは少なくとも脂質成分を含む可能性が高くなった。カットオフが100kDa、10kDa、3kDaの3種類のセントリコンを用い、遠心法を使って分子量を推定する実験を行った。コントロールとして、アドレナリンを添加していない培養液を用いた。PC12細胞の突起は100kDa以上の分画と10から100kDaの分画で見られたが、前者でより強かった。アルブミンの分子量は約60kDaだから、SDNFの分子量はおそらく40kDa以上と推定された。特異吸光があるかどうかをフェノールレッド不含の培養液にて調製したSDNF含有培養液を190-700nmでスキャンしたが、無刺激の培養液に比べ、刺激した培養液では約360nmにピークを持つ、300-400nmに広がりのあるピークが見られた。2年間の研究期間にSDNFのさまざまな生化学的性状を明らかにできたが、分離・同定にはいたらなかった。今後さらに解析を続け、SDNFを精製していく予定である。マウスのシュワン細胞由来株細胞IMS32をアドレナリンで刺激すると、ラット褐色腫細胞由来PC12の神経突起を伸長させる因子が細胞外に分泌される。これをSDNFと名付けた。SDNFは100度C10分間の加熱処理で失活する。その精製を容易にするため、IMS32細胞を刺激する時には、蛋白成分として0.5%のウシアルブミン(BSA)を含む血清不含の培養液にて培養している。精製の便を考えるとBSAの濃度はできるだけ低いほうがよいので、SDNFの活性のBSA濃度による影響を検討した結果、SDNF活性はBSA濃度依存性であることがわかった。このことはSDNFがBSAと結合し、これをキャリアーとしていることを推定させる。さらに、BSAの種類を検討したところ、SDNFは脱脂されたBSAにて最大の突起伸長活性を示したが、ヒトアルブミンや卵白アルブミンでは活性が低下した。アセチィル化BSAでは全く活性が見られなかった。これらのことより、SDNFは中性溶液中では陽性に荷電し、アルブミンとはイオンおよび疎水的に結合しているものと考えられた。次に、セントリコンを用いて、遠心法により分子量を推定した。分子量のカットオフが100kDa、10kDa、3kDaのものを用いて、100kDa以上(f100)、10-100kDa(f10)、3-10kDa(f3)、およびそれ以下(f4)の4つに分画したところ、SDNF活性はf100およびf10分画に見い出された。BSAとの結合を考慮すると、SDNFの分子量は40kDa以下のものと、40kDa以上のものとの2種類以上が考えられる。現在、陰イオン交換クロマトグラフィーを行なうてそのイオン性を調べると同時に、BSA不含の培養液で調製したSDNFを用いて、分子量の推定を行なっている。

コントロールとして、アドレナリンを添加していない培養液を用いた。PC12細胞の突起は100kDa以上の分画と10から100kDaの分画で見られたが、前者でより強かった。アルブミンの分子量は約60kDaだから、SDNFの分子量はおそらく40kDa以上と推定された。特異吸光があるかどうかをフェノールレッド不含の培養液にて調製したSDNF含有培養液を190-700nmでスキャンしたが、無刺激の培養液に比べ、刺激した培養液では約360nmにピークを持つ、300-400nmに広がりのあるピークが見られた。2年間の研究期間にSDNFのさまざまな生化学的性状を明らかにできたが、分離・同定にはいたらなかった。今後さらに解析を続け、SDNFを精製していく予定である。