hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マラリア原虫の赤血球侵入時におけるシグナル伝達経路の解明

マラリア原虫は細胞内小器官から種々の分子を秩序だって分泌しながら赤血球に侵入するが、そのシグナル伝達経路は不明な点が多いため、ネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiにて誘導性遺伝子ノックダウン/アウト系を確立し、このシグナル伝達経路を明らかにすることを目的とした。その結果、原虫増殖に必須ではない遺伝子では誘導性遺伝子ノックダウン/アウト系が作動したが、増殖必須分子では作動しなかった。そのため、網羅的な原虫分子機能評価の前に、本系の最適化を進めた。また、赤血球侵入活性を保持した原虫の精製法および細胞内Ca2+濃度モニター系を確立し、赤血球侵入時の表現型を解析する基盤を整えた。マラリア原虫の赤血球侵入は宿主体内では必須のステップである。赤血球表面に接着した原虫は、細胞内小器官から種々の分子を秩序だって分泌しながら赤血球に侵入する。ところが、これらの細胞内小器官からの分子分泌に関するシグナル伝達経路は断片的にしかわかっていない。そのため、本研究では、新規コンディショナル・ノックダウン/アウト系により、赤血球侵入期に発現している原虫分子をノックダウン/アウトした組換えネズミマラリア原虫を網羅的に作製し、細胞内小器官からの分子分泌やCa濃度の変化等を指標に、各細胞内小器官の分泌調節機序のシグナル伝達経路を明らかにすることで、ワクチンや薬剤開発の標的を見出す事を目的とする。平成25年度は、組換え法により標的遺伝子座をゲノムから完全に除去する方法と組み合わせて、標的タンパク質を全く発現しない原虫を作製する手法(コンディショナル・ノックアウト)の開発を試みた。P.bergheiで成功しているTet発現誘導系をP. yoeliiに応用するために、まず、栄養体期に発現するmsp8遺伝子の発現を抑制するようにデザインした組換えP. yoeliiを作製したが、Tetによりmsp8の発現量に変化が見られなかった。また、メロゾイト期に発現するeblの発現を抑制するようにデザインした組換えP. yoeliiの作製も試みたが、組換え原虫が得られなかった。そのため、P. bergheiにてTet発現誘導系ができたと報告されたprf遺伝子を標的に、完全に相同なゲノム位置を標的として、使用されたのと同等のプラスミドをP. yoelii用に構築し組換えP. yoeliiを作製したが、Tetによりprfの発現量にも変化が見られなかった。そのため、実験コントロールとして、Tet発現誘導系によりprf遺伝子の遺伝子発現が抑制される遺伝子組換えP. bergheiの入手を進めた。平成25年度に入手したTet発現誘導系によりprf遺伝子の遺伝子発現が抑制される遺伝子組換えP. bergheiでは,我々の手でもTet-OFFが作動することが確認できたため、我々の手技が問題ではないことが明らかとなった。そこで、本組換え体の作製に使用されたプラスミドを基にして、新たにプラスミドをデザインしなおし、Tet投与にてmCherry発現が抑制される遺伝子組換えP. yoeliiを作製した。作製した組換え体を解析したところ、Tet-OFFが作動することが確認できた。続いてTet-OFFをTet-ONに改変し、Tet投与にてmCherryが発現される遺伝子組換えP. yoeliiを作製し、Tet-ONの系も作動することを確認した。さらに、作製したTet-ONの系により部位特異的組換え酵素を発現する遺伝子組換えP. yoeliiを作出し、昨年度に解析を試みたmsp8およびebl遺伝子座を標的にして、Tet-ONにより標的遺伝子座破壊が誘導されるプラスミドの調整を開始した。また、P. yoeliiの赤血球侵入過程をモニターする系を確立した。前年度に調整したTet-ONにより標的遺伝子座破壊が誘導されるプラスミドにより、msp8遺伝子座の発現が調整できる組換え原虫を得た。また、Tet-OFFによる遺伝子発現制御が見られたものの効率が悪いため、プラスミドの塩基配列を再確認したところ予想とは異なる配列を見出した。この点を検討する組換え原虫を作製した。

赤血球に侵入する能力を保持したP. yoeliiのメロゾイトを精製する方法を確立する過程で15°Cでメロゾイトを保持することで、赤血球侵入活性を4時間にわたり精製直後の50%以上の活性で維持できることを見出した。この発見により精製したメロゾイトを長時間にわたり扱うことが可能となった。さらに、Ca2+バイオセンサーYC-Nanoを発現する遺伝子改変マラリア原虫を用いて、細胞内Ca2+濃度を経時的にモニターする検出系も確立した。熱帯熱マラリア原虫の赤血球侵入期における網羅的転写解析により赤血球侵入期に発現する事が分かっている分子のP. yoelii相同体をリスト化し、シグナル伝達に関与すると考えられるキナーゼとフォスファターゼを標的としたノックダウン/アウト用プラスミドの作製を開始した。マラリア原虫は細胞内小器官から種々の分子を秩序だって分泌しながら赤血球に侵入するが、そのシグナル伝達経路は不明な点が多いため、ネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiにて誘導性遺伝子ノックダウン/アウト系を確立し、このシグナル伝達経路を明らかにすることを目的とした。その結果、原虫増殖に必須ではない遺伝子では誘導性遺伝子ノックダウン/アウト系が作動したが、増殖必須分子では作動しなかった。そのため、網羅的な原虫分子機能評価の前に、本系の最適化を進めた。また、赤血球侵入活性を保持した原虫の精製法および細胞内Ca2+濃度モニター系を確立し、赤血球侵入時の表現型を解析する基盤を整えた。ネズミマラリア原虫P. bergheiで作動したと報告されたTet発現誘導系が、ネズミマラリア原虫P. yoeliiで作動が確認できず、原因を明らかにするのに時間がとられた。昨年度に問題を解決したので、全体としては進行がやや遅れているが、現在は研究は順調に進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学本年度はTet発現誘導系とCre/loxP部位特異的組換え法により標的遺伝子座をゲノムから完全に除去する方法を組み合わせて、標的タンパク質を全く発現しない原虫を作製する手法を確立する。Tetによる発現誘導系ができ次第、熱帯熱マラリア原虫赤血球侵入型原虫の網羅的転写解析により赤血球侵入期に発現する事が分かっている分子のP. yoelii相同体を約100分子選択し、コンディショナル・ノックアウト用プラスミドの構築を行う。構築したプラスミドをネズミマラリア原虫に遺伝子導入し、組換え原虫を作製する。得られた組換え原虫を用いて標的遺伝子の発現をノックアウトし、増殖率の低下を指標にスクリーニングし、増殖に関与する分子すなわち侵入効率が減少していると考えられる原虫を選択する。侵入効率が減少した原虫について、各分子の発育・赤血球侵入で作用するステップを明らかにし、そのステップが細胞内Ca濃度が変化する以前か以後か、また、マイクロネームやロプトリー分子の分泌の以前か以後かを明らかにし、赤血球侵入に必須である分子群を分類し、機能と関連付ける。ネズミマラリア原虫P. bergheiで見られたと報告されたTet発現誘導系がネズミマラリア原虫P. yoeliiでの作用が確認できなかったため、この原因を明らかにするのに時間がとられた。
小胞型グルタミン酸トランスポーターによる輸送の分子機構

小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGLUT)はV-ATPaseがATPの加水分解によって形成するH+の電気化学的勾配を駆動力とし、グルタミン酸を小胞内に輸送するトランスポーターである。この研究ではVGLUTによるグルタミン酸輸送の分子機構を明らかにすべく、VGLUTを含むSLC17型ファミリートランスポーターの輸送機構を速度論的に解析した。小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGLUT)はV-ATPaseが形成したH+の電気化学的ポテンシャルを駆動力としてグルタミン酸アニオンをシナプス小胞内に輸送するトランスポーターである。濃縮されたグルタミン酸は開口放出によって細胞外へ放出され、シグナルを伝達する。したがって、VGLUTはグルタミン酸シグナリングに必要不可欠な因子であると言える。VGLUTの重要性にもかかわらず、このトランスポーターのグルタミン酸輸送の分子機構は不明なままである。我々は、VGLUTによるグルタミン酸認識と輸送のメカニズムを明らかにするために、VGLUTの大量発現、精製、活性測定系を開発した。この系を用いた速度論的な解析から、グルタミン酸輸送が塩素イオンを必要とする事、Na+/リン酸共輸送活性を合わせ持つ事を明らかにした。また、VGLUTの変異型トランスポーターの機能解析から、His128、Arg184、Glu191の3つの残基がグルタミン酸輸送に必須である事が明らかとなった。しかし、これら3つの残基はリン酸輸送には必須でなく、グルタミン酸輸送とリン酸輸送が別個のメカニズムで機能している事が示された。リン酸輸送に関わる残基はまだ同定されておらず、不明なままである。そこで、膜貫通領域内の保存された親水性の残基に注目してさらに変異を導入し、変異型VGLUTを大量発現、精製した。現在、変異型トランスポーターの性状の解析を行っている。また、VGLUTの新しいホモログを発見し、これが小胞型ATPトランスポーターである事を見いだした。このトランスポーターはVGLUTと同様の特性を持っており、VGLUTの機能を明らかにする上で重要な鍵となるものと考えている。小胞型グルタミン酸トランスポーター(VGLUT)はSLC17ファミリーに属するトランスポーターでV-ATPaseが形成したH+の電気化学的ポテンシャルを駆動力としてグルタミン酸をシナプス小胞内に輸送するトランスポーターである。我々は、グルタミン酸認識と輸送のメカニズムを明らかにするために、VGLUTの大量発現、精製、活性測定系を開発した。この系を用いた速度論的な解析から、グルタミン酸輸送が塩素イオンを必要とする事等を明らかにした。VGLUTの構造機能相関を明らかにするために、他のSLC17ファミリートランスポーターとの比較解析を行う事は有用である。そこで、ヒトのSLC17ファミリーの遺伝子を解析したところ、このファミリーに未知のメンバーがある事を見いだした。これを、クローン化しその機能を解析した。その結果、この新規トランスポーターが小胞内にヌクレオチドを蓄積する小胞型ATPトランスポーター(VNUT)である事を見いだした。また、これまでシアリンとして知られていたSLC17A5タンパク質がシナプス小胞内にアスパラギン酸とグルタミン酸を蓄積する小胞型興奮性アミノ酸トランスポーター(VEAT)である事を発見した。これらのトランスポーターは膜電位を駆動力とし、塩素イオンで活性化され、VGLUTと同様な性質を持っていた。しかし、VLGUTの3つの必須残基のうち、2つはVNUTに保存されておらず、この2つの残基は基質特性に重要である事が明らかになった。また、VGLUTのArg184に相当する残基を置換するといずれも活性を失う事から、この残基がグルタミン酸等の有機アニオン輸送に決定的に重要な機能を持っている事が示された。
T細胞受容体欠損マウスを用いた経口免疫寛容の分子メカニズムの解明

TCRα鎖KOマウスを滅菌水と固形飼料を与えて,SPF条件で飼育すると,生後18週前後から約8割の頻度で大腸炎を発症し,MLN,LPや脾臓にはCD4^+TCRβ^<dim>T細胞が出現した.この細胞の増加にともなってTCRα鎖KOマウスのCD4陽性T細胞はSEBを添加するとDNA合成能が著しく上昇した.またCD4^+TCRβ^<dim>T細胞はIL-4を産生することがサイトカインELISPOTで明らかになった.T細胞レセプターではVβ8,Vβ14,Vβ15を主体としたレパトアの出現がみられた.さらにIBD発症マウスでは主にLPにおいてIgA-,IgG-抗体産生細胞数と食餌性タンパク質抗原に対するSFCの増加が観察された。以上の所見より,CD4^+TCRβ^<dim>T細胞がTCRα鎖KOマウスにおいて大腸炎の発症,さらに食餌抗原に対する抗体や自己抗体の出現に深く関わっていることが明らかになった.また同細胞がSEBによって活性化されることから,IBDの憎悪にスーパー抗原が関与していることが強く示唆された.TCRα鎖KOマウスを滅菌水と固形飼料を与えて,SPF条件で飼育すると,生後18週前後から約8割の頻度で大腸炎を発症し,MLN,LPや脾臓にはCD4^+TCRβ^<dim>T細胞が出現した.この細胞の増加にともなってTCRα鎖KOマウスのCD4陽性T細胞はSEBを添加するとDNA合成能が著しく上昇した.またCD4^+TCRβ^<dim>T細胞はIL-4を産生することがサイトカインELISPOTで明らかになった.T細胞レセプターではVβ8,Vβ14,Vβ15を主体としたレパトアの出現がみられた.さらにIBD発症マウスでは主にLPにおいてIgA-,IgG-抗体産生細胞数と食餌性タンパク質抗原に対するSFCの増加が観察された。以上の所見より,CD4^+TCRβ^<dim>T細胞がTCRα鎖KOマウスにおいて大腸炎の発症,さらに食餌抗原に対する抗体や自己抗体の出現に深く関わっていることが明らかになった.また同細胞がSEBによって活性化されることから,IBDの憎悪にスーパー抗原が関与していることが強く示唆された.
ニホンケシ全植物体の休眠に果たす芽と根の役割の解明と休眠の制御

1.ニホンナシおよびナシ属野生種37種・品種の芽の低温要求量を測定した。供試した野生種の中ではPyrus faurieiが最も低温要求量が低く、P.aromaticaとP.communisは最も高かった。主要ニホンナシ品種の中では'豊水'が最も低温要求量が低く、次いで'幸水'、'二十世紀'の順であった。'新水'と'新雪'はニホンナシ品種の中で最も低温要求量が高かった。2.'二十世紀'樹を用いて、自発休眠期に根と枝にそれぞれ低温処理を行った。萌芽は枝の低温処理によって引き起こされたが、枝の伸長は枝のみならず、根の低温処理も必要であった。従って、根にも芽の場合のような低温要求が存在すると思われた。またこれらのことは低温の不足する地域での梨栽培には低温要求の少ない台木種を用いることが必要であることを示すものである。3.'二十世紀'の低温遭遇に伴うタンパク質の変化を2次元電気泳動法により調査した。その結果9つの低温誘導タンパク質が検出され、中でも19-KDaのタンパク質は低温並びに短期間の高温処理によって等電点が変化した。このタンパク質は休眠の深さの生化学的指標になるものと思われる。ナシ属野生種10種、ニホンナシ栽培品種30品種における芽の低温要求量を調査した。野生種はおおむね栽培品種より低温要求量が少なく、なかでもチョウセンマメナシ、マメナシは約800Chill unit(以下C.U)と最も低温要求量が少ないという特性を示した。また栽培品種では`秋栄'、`豊水'の低温要求量が1200C.Uと最も少なく、`新水'、`新雪'のC.Uは約1600と最も多かった。樹体全体の休眠打破に及ぼす芽と根の役割と相互作用を検討するため、C.U0,700,1500の低温に遭遇した台木(マンシュウマメナシ)に、C.U0,700,1500の穂木(`二十世紀')を5節に調整して接木した。その後、温室で加温栽培を行い芽の生長、新根及び新梢の乾物重を調査した。全体的に萌芽率は穂木の低温遭遇量の影響が大きかったが、穂木の低温遭遇量が同じ場合には台木の低温遭遇量が多くなるほど高くなり、この傾向は穂木がC.U700の区で顕著であった。新梢乾物重も萌芽率とほぼ同様の傾向を示し、芽の休眠は打破されているC.U1500区でも台木の低温遭遇が不足した区では充足した区と比べ新梢生長が著しく劣った。一方、新根の乾物重は、穂木の低温遭遇と関係無く台木の低温遭遇量に比例して高くなった。以上の結果からニホンナシの正常な再生長には地下部への低温遭遇も必要であり、またその低温を感知する部位は根にあると判断された。従って人為的に休眠打破を行うには地上部だけでなく地下部にも何らかの低温を代償する処理あるいは低温要求量の少ないマメナシやチョウセンマメナシを台木として用いることが必要と思われる。休眠導入期から露地および温室に置いたニホンナシ`二十世紀'樹の花芽中のタンパク質を2次元電気泳動法により比較した。低温積算にともない9個のスポット(CK)は露地区でのみ増加したため低温誘導性タンパク質と思われた。これらのスポットの内19kDaのタンパク質はCU98からCU414にかけて消え、同時にそのやや塩基性側に新たな19kDaのタンパク質スポットが検出された。さらにCU800とCU1440の時点でもそれぞれ前回の採取時に存在していた19kDaのタンパク質は消失し、新たにそれらの塩基性側に19kDaのタンパク質が出現した。ニホンナシの休眠打破に有効な高温処理前後の花芽中のタンパク質を分析した結果、無処理区に比べ7個のスポットが量的に増大し、2個のスポットが減少した。これらは9個の低温誘導性タンパク質スポットとは一致しなかった。

しかし、19kDaのタンパク質は高温処理後に消失し、同時にやや塩基性側に新たなタンパク質が検出された。マンシュウマメナシ台`二十世紀'の樹皮および細根のタンパク質を分析した結果、低温誘導性タンパク質は全て樹皮中に存在したが、根にはほとんど検出されなかった。しかし、19kDaのタンパク質は樹皮および根においても検出され、低温積算に伴い芽と同様の変化が生じた。以上の結果からニホンナシの芽、根とも休眠打破に関連したタンパク質の変化が起こることが示された。今後このタンパク質の機能・特性を詳細に調査する予定である。マンシュウマメナシ1年生実生を1、10、15及び20°Cの定温庫中に0、800、1400時間置き、十分に低温遭遇(Chill unit 1400)した'二十世紀'1年枝を接ぎ木した。接ぎ木30日後に萌芽率、新梢及び新根の乾物重を測定した。1°C並びに5°C区では処理時間が長くなるほど加温後の萌芽率、新梢並びに新根重が高くなり、1400時間後には両区が最も旺盛な生長を示した。10°C区においても処理時間の増加に伴い萌芽率、新梢及びに新根重が高くなったが、明らかに1°C並びに5°C区より生長が劣っていた。一方、15°C並びに20°C区では時間経過に関わらず、根の活発な生長はみられず、また萌芽率、新梢生長についても実験期間中大きな変化はみられなかった。従って、少なくとも10°C以下の温度に遭遇することが活発な根並びに地上部の再生長に必要なものと思われた。マメナシ1年生実生をChill unit 500及び1000の時期に堀りあげ、高温(45°CX2及び4時間)処理並びに石灰窒素0.02、0.2、及び2%上澄み液への浸せき処理(12時間)を行い、ガラス温室中で砂土を用いて鉢植えした。これらにChill unit 1400の低温に遭遇した'二十世紀'1年枝を接ぎ木した。Chillunit 500及び1000の両区とも高温処理区が最も根並びに新梢生長とも優れており、石灰窒素の高濃度区では生長がむしろ抑制された。しかしChill unit 500の各処理区の樹体生長は明らかにChill unit 1000のそれらより劣っていた。従って、芽と同様に根においても再生長の開始に必要な低温の一部は高温に短時間遭遇することで代償されるものと思われた。
多元的環境正義を踏まえたエネルギー技術のガバナンス

エネルギー技術と社会の関係について事例調査と理論的整理を行い、多様な主体の福利に適う技術とするための条件を明らかにした上で適切なガバナンスを実現する社会実験を行った。その結果(1)技術がもたらす広義の利害関係を明らかにし、(2)世代間と世代内で発生する法的・倫理的・社会的課題を図式化した。(3)そこで必要とされる分配的正義や手続き的正義を具体化するため社会実験を試行し、政策としての有効性を確認した。この過程でエネルギー技術の社会的影響について間接的効果を含めた分析枠組みを確立し、手法の汎用性を高めた。また参加型手法による適地選定や条例など、現実のガバナンスに応用可能な方策も提示した。エネルギー技術と社会の関係について多面的に明らかにするために(1)持続可能な社会に関する社会理論研究(2)エネルギー技術の社会化過程の実証研究(3)エネルギー技術のガバナンスを実現する社会実験、という三つの研究領域を設けて研究を進めた。国内外の事例調査を通じて、エネルギー技術に付随する多様な価値を網羅的把握し、諸価値の齟齬や対立を含めた全体像を明らかにした。実証的研究では導入地域における諸問題や合意形成過程を定性的に明らかにし、現実のプロジェクトにおいてはステークホルダ間の利害の齟齬があることと、その配分構造が合意形成上の障害など関連していることを明らかにした。また導入を進める側と受け入れる側とでは評価の枠組みが異なっていることもあり、これを共有する過程を省略することが手続き的正義にかかわる問題の原因となっていることも明らかにした。その一方で、地域の主体が能動的に関与しながら多様な付加価値をもたらす事業が存在することも明らかになった。このことを踏まえてエネルギー利用に伴う諸問題を時空間の枠組みの中で整理すると同時に、その利害配分を最適化するためのガバナンスの理念と方法を図式化した。実証的研究と理論研究によって明らかにされた知見と並行して社会実験を立案し、その一部を実施した。具体的には、経済セクターも含めた多様な主体の利益を実現する事業モデルを構築する協議会や、規制での対応が困難な環境影響を制御するための方策を支援しつつ、その成果を検証するための方法論を確立した。エネルギー技術と社会の関係についての調査に基づき、多様な主体の福利に適う技術とするための条件を明らかにした。これをふまえて適切なガバナンスを実現する社会実験に応用可能な一般的知見を得た。社会理論班、実証研究班、社会実験班の三つの研究グループを構成し、それぞれ以下のような実績をあげた。(1)社会理論班では、実証研究班・社会実験班の知見も踏まえてエネルギー技術がもたらす広義の利害関係を明らかにし、世代間と世代内で発生する法的・倫理的・社会的諸課題についての図式を明らかにした。その上で、分配的正義や手続き的正義などの規範を具体化する方策を提示し、社会実験班にフィードバックした。(2)実証研究班:電力自由化に伴うエネルギー技術への選好とその理由を明らかにするために、国内外で定性的・定量的調査を実施した。その結果、単なる技術特性だけではなく参加の機会や情報公開など、社会的制御の可能性や程度が影響していることを明らかにした。社会的受容性についての実証研究では、反対や異議申し立てが存在しないことと受容されていることとの差異を定量的に明らかにし、ステークホルダから積極的に支持される要件について明らかにした。(3)社会実験班:アクションリサーチを継続するととともに、社会理論班の中間考察の内容を、進行中の事業に応用し、多様な主体の利益に適う社会的制御の方法を試行した。また海外事例としてドイツの再公営化やエネルギーシフトについての調査を実施した。いずれの研究班も一定の成果をあげた。事例研究では国内外におけるエネルギー事業の取り組みについて網羅的に把握し、その理論的示唆についての考察も大きく進展した。また、この成果を踏まえたアクションリサーチも具体的に進行している。各研究領域の知見は適宜共有されており、総合的な知識生産が実現している。雑誌論文8本、共編著や単著を含む図書が8本、学会などでの報告12報を発表した。国際会議においても積極的に成果を報告しており、昨年度に引き続き海外からの招待講演も実現している。研究としての成果だけではなく、社会へのアウトリーチも実現している。本研究の存在は国内外で認知されており、一般向けの講演依頼もある。研究報告、研究報告合わせて20報以上の成果発表を行った。社会理論班、実証研究班、社会実験班の三つの研究グループを構成し、それぞれ以下のような実績を得た。(2)実証研究班:電力自由化に伴うエネルギー技術への選好とその理由を明らかにするために、国内外で定性的・定量的調査の分析をさらに進めた。その結果、エネルギー技術の選好に影響を与えている要因は技術特性そのものではなく、その背景に存在する社会的制御の可能性や程度であることを確認した。

社会的受容性についての実証研究では、別地域での調査を実施し、反対や異議申し立てが存在しないことと受容されていることとの差異を再度確認した。この調査を通じて確立した社会受容性とその要因を測定する手法には一定程度の汎用性を期待できることが明らかになった。(3)社会実験班:アクションリサーチを継続するととともに、社会理論班の中間考察の内容を、進行中の事業に応用し、多様な主体の利益に適う社会的制御の方法を試行した。利益分配なども含めて地域に適した条件を設定した上で、条例などの方法を用いて制度化し、その条件に従って個別の事業や事業者の参入条件を制御するという方法を確立した。またこうしたガバナンスの手法が事業者にとっても合理的であることも明らかになり、汎用的な手法となりうる可能性も示された。エネルギー技術と社会の関係について事例調査と理論的整理を行い、多様な主体の福利に適う技術とするための条件を明らかにした上で適切なガバナンスを実現する社会実験を行った。その結果(1)技術がもたらす広義の利害関係を明らかにし、(2)世代間と世代内で発生する法的・倫理的・社会的課題を図式化した。(3)そこで必要とされる分配的正義や手続き的正義を具体化するため社会実験を試行し、政策としての有効性を確認した。この過程でエネルギー技術の社会的影響について間接的効果を含めた分析枠組みを確立し、手法の汎用性を高めた。また参加型手法による適地選定や条例など、現実のガバナンスに応用可能な方策も提示した。(1)社会理論(2)実証研究(3)ガバナンスの社会実験いずれの研究領域においても一定の成果を上げた。事例研究では国内外におけるエネルギー事業の取り組みについて網羅的に把握し、その理論的示唆へのフィードバックも進んでいる。これを踏まえた社会実験の方も具体的に動きつつある。各領域相互の知見も適宜共有されており、総合的な知識生産が実現している。単なる経済論や技術論、あるいは社会論という特定の枠組みを超えるという当初の目標に向けて順調に進捗している。時宜に適った成果を発表しつつあり、社会的にも注目を集めている。雑誌論文10本、図書2点、学会報告14報を発表し、招待講演も含めて国際会議においても積極的に成果を報告している。こうしたことから国内外において当該研究の存在が認知されつつある。事例調査の結果、量的調査の手法と方法について内容と時期の見直しが必要となった。このため当該調査の実施は当初予定の年度末よりは遅れている。ただし、より発展的な内容を含む調査が実現する見込みとなっているため全体としての遅れは生じていない。引き続き事例調査、社会理論、社会実験の連携を図りながら研究を進める。研究会を複数会実施しながらそれぞれのエネルギー技術についての社会的課題について網羅的に把握する。国内外での事例調査や研究交流にも積極的に取り組み、研究テーマに関する知見とアクションリサーチの方法論の一般化に努める。今年度はアクションリサーチに重点を置き、社会実験を通じての実証データの取得とガバナンスのための理論の精緻化に注力する。
オートファジーの栄養代謝学的意義の解析

オートファジーは細胞内の主要な分解システムである。本研究では、オートファジー必須遺伝子Atg5を欠損させたマウスを用い、オートファジーの栄養学的役割を解析した。その結果、Atg5ノックアウト肝では絶食時の解糖系およびβ酸化の亢進が見られないことが分かった。また、絶食時の肝臓内アミノ酸濃度およびタンパク質合成が低下していたことから、オートファジーが絶食時のタンパク質合成に重要であることが示唆された。オートファジーは細胞内の主要なタンパク質分解システムである。本研究課題では、オートファジーの栄養学的重要性を理解するために、(1)Tet-Offシステムを応用した時期得的Atg5^<-/->マウス、(2)脳でのみAtg5を発現させたAtg5^<-/->マウスの2つのモデルマウスを作成し、成獣における全身性Atg5^<-/->マウスの解析を行う。まず、Tet-Offシステムを利用した時期特異的Atg5^<-/->マウス(Atg5^<-/->:TRE-Atg5:tTA)の作成を開始した。本年度はTRE-Atg5トランスジェニックマウスを5ライン作成した。これらのマウスとtTAトランスジェニックマウスを交配し、TRE制御下におけるAtg5の発現を確認したところ、全身性にAtg5を発現するマウスを2ライン得ることができた。今後、これらのマウスとAtg5^<-/->マウスを交配し、目的のAtg5^<-/->:TRE-Atg5:tTAマウスを作成する。このモデルマウスを用いてオートファジーの栄養学的意義の解析を行う。また、(2)のモデルマウスについては、組織学的観察を中心に表現型解析を行った。Atg5^<-/->:NSE-Atg5マウスは発育遅延、低体重、低脂肪量などの表現型を示した。このため栄養代謝学的考察には、様々な要因を考える必要があることが分かった。解釈が複雑になる可能性を考えると、肝臓特異的ノックアウトマウスなど他のモデルの利用も考える必要があるかも知れない。また、精巣・赤血球・脾臓・腸管に異常が認められた。特に異常が著しい精巣および赤血球については、今後解析を続ける。(1)について前年度作成したTRE-Atg5トランスジェニックマウスを用い、本年度は目的のAtg5^<-/->:TRE-Atg5:tTAマウスを作成した。このマウスが従来の単純ノックアウトの表現型である新生仔死亡を回避できるかを確認する必要があるが、まだAtg5^<-/->:TRE-Atg5:tTAマウスの出生後の生存が確認できていない。交配数を増やし、これを確認する必要がある。(2)について前年度のAtg5^<-/->;NsE-GFPAtg5の表現型解析から、このマウスは様々な表現型を示すため栄養代謝学的考察が難しいことが考えられた。そこで、肝臓特異的Atg5ノックアウトマウスも導入することにした。本年度は、肝臓特異的ノックアウトマウスのメタボローム解析を行い、オートファジー欠損が肝臓の栄養代謝にどうのような影響を与えるかを調べた。その結果、オートファジー不全はタンパク質代謝よりも、脂質代謝に大きく影響することが分かった。肝臓のグリコーゲンおよびトリグリセリドの貯蔵を調べたところ、ノックアウトマウスでは飢餓に伴うグリコーゲンの消費が遅く、一方、飢餓に伴うトリグリセリドの蓄積が抑制されることが観察された。アセチルCoAの極端な低下が見られたため、β酸化の異常を疑いさらに解析を行った。律速代謝酵素のqPCR解析および脂肪酸・トリグリセリド・グリセロールの測定を行ったところ、β酸化が低下していることが分かった。現在、なぜオートファジー不全がこのような変化をもたらすのか、肝初代培養細胞なども用いてその機序を調べている。オートファジーは細胞内の主要な分解システムであり、飢餓応答・細胞内浄化・免疫など様々な生理現象に重要である。本研究課題では、1Tet-offシステムを利用した時期特異的Atg5ノックアウトマウス、2神経特異的Atg5レスキューマウス(神経のみAtg5を発現させたAtg5ノックアウトマウス)を作製し、これらのマウスによりオートファジーの栄養学的意義を解析する。1のTet-offマウスは、トランスジェニックマウスを作製したが十分なAtg5の発現を得ることができなかった。これはtTAの発現が弱かったためと考えられる。よってこのマウスの作製は中断となった。2の神経

特異的レスキューマウスは、重篤な貧血・精巣卵巣の異常・肝膵の肥大など様々な異常を示した。このマウスは血中鉄濃度が低く、鉄代謝にオートファジーが関与することが示唆された。このモデルマウスは様々な異常を示すため、このモデルのみでは栄養代謝学的解析が難しいと考え、栄養代謝に重要な肝臓特異的Atg5ノックアウトマウス(Atg5flox;Mx1-Cre)も導入した。このマウスの肝メタボローム解析を行ったところ、解糖系とβ酸化に異常があることが示唆された。β酸化関連遺伝子の発現をqPCRで調べたところ、ノックアウトマウスにおいてこれらのmRNAの発現が抑制されていた。また、アセチルCoAに次いでアミノ酸関連代謝産物の変化が大きかったため、アミノ酸について調べた。肝臓内アミノ酸濃度を調べたところ、絶食後6時間でノックアウトマウスの肝臓内アミノ酸濃度が著しく低下しており、オートファジー由来のアミノ酸が絶食時のアミノ酸プールの維持に重要であることが示唆された。このときのノックアウト肝ではタンパク質合成が低下していたことから、肝臓のオートファジーによるアミノ酸供給は絶食時のタンパク質合成に重要であることが示唆された。(1)について:3種類のマウスを交配してAtg5^<-/->:TRE-Atg5:tTAマウスを得るため、予定よりも時間がかかっている。しかし、目的のマウスを得る交配までたどりついたので交配数を増やして解析を始める。(2)について:メタボローム解析に必要なマウス数を準備するのにやや時間がかかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)について:Atg5^<-/->:TREーAt85:tTAマウスを得る交配までたどり着いたので、交配数を増やし、このマウスの評価を行う。また、ドキシサイクリンでAtg5の発現抑制がでるかどうかの条件検討になるべく早く取りかかる。(2)について:メタボローム解析から興味深いデータが得られているので、マウスだけでなく、肝初代培養細胞をうまく利用して解析を進める。
中枢神経系の局所神経回路を解析する

1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法と微小ガラス電極による細胞内染色法を組み合わせて、1個の錐体ニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンへの連絡を調べた。興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンへ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンへはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。さらに、VI層の錐体ニューロンへの入力を調べII/III層及びV層の錐体ニューロンからの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだしており、報告をまとめている。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとした。現在、GABAニューロンのマーカーであるKv3.1というカリウムチャンネルの遺伝子を利用したトランスジェニックマウスを作成し、pGFPの発現特異性を検討している。4.Vesicular glutamatetransporter(VGluT)を認識する抗体を作成し、中枢神経系の局所神経回路の解析に応用した。VGluT1は主として大脳皮質の出力ニューロンが使用しており、VGluT2は視床のニューロンが用いているために、線条体・大脳皮質などの領域で、大脳皮質由来および視床由来の興奮性神経終末を区別して標識出来るようになった。Sindbisvirusなどの遺伝子工学的手法によりGolgi染色様に標識された一個の大脳皮質ニューロンあるいは線条体ニューロンに、どの様にそれぞれの興奮性入力が入るのか現在解析中である。5.線条体の投射ニューロンには、今までわかっていた2種類以外に、neurokinin B発現と無名質投射で特徴づけられる第3の投射系が存在することを明らかにした。大脳皮質へ投射する無名質GABAニューロンにはneurokinin Bの受容体が発現していて、興奮性の反応を示すことを報告した。1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により、前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を作成した。微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録してニューロンを分類し、Biocytinを注入した。スライス標本を固定した後、組織学的な検索として免疫蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。次に、Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidin-biotinylated peroxi-dase complex法によって青黒色に染色し、逆行性に標識された出力ニューロンの樹状突起をPeroxidase anti-peroxi-dase酵素免疫染色法で赤く染色し、1個のニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンへの連絡を調べた。その結果、興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンへ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンへはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。

現在、GABAニューロンのマーカーであるParvalbuminとCalretininというカルシウム結合タンパク質の遺伝子をBACを用いてクローニングしている。Calretininトランスジェニックマウスは作成済みで、pGFPの発現特異性を検討している。1.大脳皮質出力ニューロンを逆行性に細胞体・樹状突起をGolgi染色様に標識する方法により、前もって出力ニューロンを標識したラットの大脳皮質スライス標本を作成した。微小ガラス電極を各層のニューロンに刺入し、基本的な電気的性質を記録してニューロンを分類し、Biocytinを注入した。スライス標本を固定した後、組織学的な検索として免疫蛍光法を用いてBiocytinを注入したニューロンが興奮性あるいは抑制性であるか検討した。次に、Biocytinを注入したニューロンと特にその出力である神経軸索をAvidn-biotinylated peroxi-dase complex法によって青黒色に染色し、逆行性に標識された出力ニューロンの樹状突起をPeroxidase anti-peroxi-dase酵素免疫染色法で赤く染色し、1個のニューロンから一群の大脳皮質投射ニューロンヘの連絡を調べた。その結果、興奮性のIII層錐体ニューロンの出力はV層の皮質脊髄投射錐体ニューロンヘ多く入力しているが、VI層の皮質視床投射錐体ニューロンヘはその4分の1しか入力していないことを見出し報告した。さらに、V1層の錐体ニューロンヘの入力を調べII/III層及びV層の錐体ニューロンからの入力は少ないが、IV層・VI層からの入力が多いことを見いだしており、報告をまとめている。3.GABA作動性のインターニューロンをGolgi染色様に染色する手法を、トランスジェニックマウスを利用して作ろうとしている。1.Vesicular glutamatetransporter(VGluT)を認識する抗体を作成し、中枢神経系の局所神経回路の解析に応用した。VGluT1は主として大脳皮質の出力ニューロンが使用しており、VGluT2は視床のニューロンが用いているために、線条体・大脳皮質などの領域で、大脳皮質由来および視床由来の興奮性神経終末を区別して標識出来るようになった。Sindbisvirusなどの遺伝子工学的手法によりGolgi染色様に標識された一個の大脳皮質ニューロンあるいは線条体ニューロンに、どの様にそれぞれの興奮性入力が入るのか現在解析中である。さらに、VGluT1およびVGluT2の分布を小脳皮質と脊髄後角・延髄後角で調べ、両者が異なる分布をしていることを見出した。小脳皮質では平行線維終末は専らVGluT1を使用し、登上線維はVGluT2を用いていること、面白いことに苔状線維終末にVGLuT1とVGluT2の両方を使用していることなどを明らかにした。
家族性モヤモヤ病に関与する新規巨大ユビキチンリガーゼ/ATPアーゼの研究

家族性モヤモヤ病の感受性遺伝子としてミステリン/RNF213を同定し、クローニングに成功した。ミステリンタンパク質の細胞内局在、ユビキチンリガーゼ活性、ATPアーゼ活性等を明らかにし、また、ミステリンが発生過程における正常血管新生に関わることを明らかにした。精製ミステリンを用いて、ミステリンの構造を明らかにし、また、ミステリンの細胞内共沈降物解析から、脱ユビキチン化酵素がミステリンと結合し機能的に相関していることを見出した。日本人に多い脳血管疾患、モヤモヤ病の感受性因子として同定された新規巨大タンパク質ミステリンは、ユビキチンリガーゼ活性とATPアーゼ活性を持つ。しかし、ミステリンの細胞内における機能と、血管組織における機能の詳細、また、疾患原因変異がミステリンの機能にどのような影響をおよぼし、どのような機序で疾患が引き起こされるのか、いずれも現在までほぼ全く不明である。そこで、ミステリンの生理機能を探る目的で、既知の血管関連因子群との物理的・機能的相互作用を検討すると共に、ミステリンと物理的に相互作用するタンパク質群を、LCMSを用いて網羅的に探索した。その結果、ユビキチン関連因子を含む複数のタンパク質を見出した。現在、これらのタンパク質とミステリンの機能的関わりについて、細胞レベルでの解析を進めている。また、二次構造予測からは、ミステリンはAAA+型ATPアーゼであることが示唆された。AAA+型ATPアーゼは、ATPの加水分解と共役して物理的な仕事をする多量体型ATPアーゼである。ミステリンの機能を考える上で、ミステリンが実際にAAA+型ATPアーゼとしてはたらくのかどうか、またその機構はどのようなものかは重要であると考えられた。そこで、現在までにまず全長ミステリンの発現・精製系を確立し、得られた精製標品を用いて、多量体形成の有無やATP加水分解にともなう構造変化の詳細などについて、分子レベルでの解析を進めている。免疫沈降法とMS解析を用いて、ミステリンと物理的に結合する因子の探索を行い、脱ユビキチン化酵素をはじめ、幾つかの因子を同定した。ミステリンがユビキチン化酵素であることから、この脱ユビキチン化酵素とミステリンの物理的結合、機能的相関に焦点をあてて解析を行い、この2つの因子が細胞内で一過的複合体を形成し、機能的に相関することを見出した。ミステリンは血管新生に重要な因子であることが過去のデータから示唆されているので、現在、培養細胞等を用いて、ミステリンと脱ユビキチン化酵素の機能相関が血管新生においてどのような役割をはたしているのか、解析を進めている。また、全長ミステリンの精製に成功したので、この精製標品を用いて、生化学的、構造生物学的解析を行っている。生成標品の電子顕微鏡観察からは、ミステリンはリング状構造を形成していることが示唆された。これはミステリンを含むAAA+タンパク質の一般的性質と考えられるが、この際、何量体を形成しているのか、またAAA+タンパク質のリング状構造形成はATP結合状態と関連することが知られているが、ミステリンのATP結合活性、ATPアーゼ活性はどのようにこのリング構造形成に関与しているのかについて、引き続き解析を進めている。ミステリンのATPアーゼ活性を変化させる各種変異体において、複合体形成能が変化していることから、ATPの加水分解と密接に関係した複合体(リング状構造)形成が起こっていることが示唆された。
驚きと感動をつたえ理科離れを未然に防ぐ理科大好きプロジェクト

理科離れを防ぐために種々の事業を実施した.お助け隊として小学校に学生を派遣し,理科室の整理や授業の補助に従事させた.科学館の行事,三郷市の遊学館や川越市のふれあい事業等にも派遣した.観察実験教室では附属小学校や騎西小学校等で種々の驚きと感動を伝えた.また,天体観望会やワークショップを開催した.ホームページで多数の質問に回答し,水溶液の作り方,実験のシミュレーションや理科カレンダーを公開した.理科離れを防ぐために種々の事業を実施した.お助け隊として小学校に学生を派遣し,理科室の整理や授業の補助に従事させた.科学館の行事,三郷市の遊学館や川越市のふれあい事業等にも派遣した.観察実験教室では附属小学校や騎西小学校等で種々の驚きと感動を伝えた.また,天体観望会やワークショップを開催した.ホームページで多数の質問に回答し,水溶液の作り方,実験のシミュレーションや理科カレンダーを公開した.小学校高校における理科離れを未然に防ぐため,理科の学習や実験を支援する活動等を行った.ホームページの質問箱(化学)の閲覧総数が年間18,900件あり,追加質問を含めて64件の質問にメールで回答し,ホームページにも公開した.質問内容より,質問者の6割は高校生と大学生である.教員や指導主事等からの質問はまだ少ない.水溶液の作り方(濃度計算,調製方法,注意事項)として,「過酸化水素水」「ミョウバンとその関連物質の溶解度」を改良し,「炭酸水素ナトリウム水溶液」「炭酸ナトリウム水溶液」「塩化カリウム水溶液」「水酸化カリウム水溶液」「塩化アンモニウム水溶液」を試作した(ダウンロード可能).これらは学校における理科実験の準備等に活用できよう.定量分析シミュレーションとして,重要な酸化・還元実験である「ヨウ素滴定」を制作した.実験・観察の基礎を習得した学生等を市内の2小学校へお助け隊として派遣し,理科実験の補助(準備・片付)や実験室の整備に従事させた.また,研修会や出前授業等にも関連して,市内の宇宙科学館イベント,三郷市おもしろ遊学館,川越市理科ふれあい事業にも学生等を各複数回派遣した.さらに,附属小学校と共催し,わくわく観察実験教室を開催した(参加者203人).子供達の元気なこと,理科に対する興味・関心等の熱気に圧倒された.また,地域を対象として冬に天体観望会を実施した.教材関係では,人体パズルと理科カレンダーを制作した.理解し難い物理量の変化,受精・発生の観察と実験方法,気候変動と地球温暖化等の教材を試作中である.秩父・長瀞でのジオパークの設立に参加した.本年度分の成果を約1000冊印刷・製本し,理科専修の大学生,さいたま市・埼玉県等の教員や指導主事等を中心に約600冊を配布済みである.残りは大学説明会の参加者等に配布予定である.また,図書館を通じてweb上でもpdf版の報告書を配布している.小学校高校における理科離れを未然に防ぐため,理科の学習や実験を支援する活動等を行った.ホームページの質問箱(化学)の閲覧総数が年間8,500件あり,追加質問を含めて53件の質問にメールで回答し,ホームページにも公開した.質問内容より,質問者の6割は高校生と大学生である.教員や指導主事等からの質問はまだ少ない.水溶液の作り方(濃度計算,調製方法,注意事項)として,「食塩水(塩化ナトリウム水溶液)」を改良し,9種類でpH=113をカバーする「pH緩衝液」を制作した(ダウンロード可能).これらは学校における理科実験の準備等に活用できよう.定量分析シミュレーションとして,水の硬度測定(水質検査)である「キレート滴定」を制作した.実験・観察の基礎を習得した学生等を市内の小学校へお助け隊として派遣し,理科実験の補助(準備・片付)や実験室の整備に従事させた.また,研修会や出前授業等にも関連して,市内の宇宙科学館イベント,三郷市おもしろ遊学館,川越市理科ふれあい事業にも学生等を各複数回派遣し,埼玉・栃木・群馬小中合同理科教育研修会でワークショップを開いた.さらに,附属小学校と共催し,わくわく観察実験教室を開催した(参加者200人).子供達の元気なこと,理科に対する興味・関心等の熱気に圧倒された.また,地域を対象として冬に天体観望会を実施した.教材関係では,理科カレンダーを制作した.理解し難い物理量の変化,受精・発生の観察と実験方法,気候変動と地球温暖化等の教材を制作中である.秩父・長瀞でのジオパークの運営に参加した.本年度分の成果を約1000冊印刷・製本(162頁)し,理科専修の大学生,さいたま市・埼玉県等の教員や指導主事等を中心に約630冊を配布済みである.残りは大学説明会の参加者等に配布予定である.また,図書館を通じてweb上でもpdf版の報告書を配布している.小学校高校における理科離れを未然に防ぐため,理科の学習や実験を支援する活動等を行った.質問箱(化学)の閲覧総数が年間7,100件あり,62件の質問にメールで回答し,ホームページにも公開した.質問内容より,質問者の7割は高校生と大学生である.教員や指導主事等からの質問はまだ少ない.水溶液の作り方として「水酸化カリウム水溶液」を改良し,溶液の希釈・濃縮にも対応した「食塩水(塩化ナトリウム水溶液)」を試作した.ヨウ素滴定シミュレーション用の色見本を充実させ,水の状態変化(凝固)に使用する寒剤の実験レシピを2つ制作した.

これらは学校における実験等に活用できよう.実験・観察の基礎を習得した学生等を市内の小学校へお助け隊として派遣し,理科実験の補助(準備・片付)や実験室の整備に従事させた.研修会や出前授業等にも関連して,さいたま市と埼玉大学で共催した「キッズ・ユニバーシティ・さいたま」に参加し,市内の宇宙科学館イベント,三郷市おもしろ遊学館,川越市理科ふれあい事業にも学生等を各複数回派遣し,埼玉・栃木・群馬小中合同理科教育研修会でワークショップを開いた.さらに,附属小学校と騎西小学校(東日本大震災の児童の避難先)で観察実験教室を開催した.また,地域を対象として冬に天体観望会を実施した.教材関係では理科カレンダーを制作した.理解し難い物理量の変化,受精・発生の観察と実験方法,気候変動と地球温暖化等の教材を制作中である.秩父・長瀞でのジオパークの運営に参加した.本年度分の成果を約900冊印刷・製本(119頁)し,理科専修の大学生,さいたま市・埼玉県等の教員や指導主事等を中心に約700冊を配布済みである.残りは大学説明会の参加者等に配布予定である.また,図書館を通じてweb上でもpdf版の報告書を配布している.小学校高校における理科離れを未然に防ぐため,理科の学習や実験を支援する活動等を行った.質問箱(化学)の閲覧総数が年間55,300件あり,16件の質問にメールで回答し,ホームページにも公開した.質問内容より,質問者の7割は高校生と大学生である.水溶液の作り方(濃度計算と調製方法)として「食塩水(塩化ナトリウム水溶液)」,「水酸化ナトリウム水溶液」,「炭酸水素ナトリウム水溶液」,「塩化カリウム水溶液」,「塩化アンモニウム水溶液」,「硝酸」を改良して使い易くした.計算方法,調製方法,注意事項,使用方法等も説明している.また,ヨウ素滴定の詳細な色見本を制作した.これらは学校における実験等に活用できよう.実験・観察の基礎を習得した学生等をさいたま市内の小学校へお助け隊として派遣し,理科実験の補助(準備・片付)や実験室の整備に従事させた.研修会や出前授業等にも関連して,さいたま市青少年宇宙科学館イベント,三郷市おもしろ遊学館,川越市小・中・大学連携理科ふれあい事業,八木崎小学校のおもしろ実験教室にも学生等を派遣した.埼玉・栃木・群馬小中合同理科教育研修会でワークショップを開いた.さらに,附属小学校でわくわく観察実験教室を開催し,秩父市の理科おもしろ実験教室に参加した.また,地域を対象として天体観望会を複数回実施した.教材関係では理科カレンダーを制作した.本年度分の成果を約900冊印刷・製本(168頁)し,理科専修の大学生,さいたま市・埼玉県等の教員や指導主事等を中心に約600冊を配布済みである.残りは大学説明会の参加者等に配布予定である.また,図書館を通じてweb上でもpdf版の報告書を配布した.理科離れに関する対策として,質問箱,水溶液の作り方,実験レシピや理科カレンダー等のコンテンツの作成,お助け隊(学生派遣),観察実験教室,天体観望会や報告書の配布等が実施できた.24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度が本研究の最終年度となる.過去3年間と同様に,理科離れに関する対策を推進していく.24年度が最終年度であるため、記入しない。
新生児血小板減少症および輸血関連急性肺障害発症機序の解明

(研究目的)一方、輸血関連急性肺障害(TRALI; transfusion-related acute lung injury)は、非心原性の急性肺水腫による呼吸困難を主徴とし、輸血関連死の3番目に多い死因とされている重篤な輸血副作用であり、その発症機序を解明することが必要不可欠と考えられる。TRALIの発症には、白血球抗体(HLA抗体、HNA (human neutrophil antigen)抗体)が重要な役割を果たしているとされおり、白血球抗体が白血球に結合することによって様々なサイトカイン等が放出され、これらが血管内皮細胞を傷害するという説があるが、その機序については十分解明されていない。本研究では、これらの同種抗体のNAIT及びTRALI発生への関与を明らかにすることを目的とした。計画)NAITについての検討1.抗血小板抗体検査法の比較検討:MPHA法とMAIPA法の抗体同定の検出感度、特異度の向上を目指して反応時間、試薬などの詳細な条件設定をおこなった。この条件の下、二法の比較検討を行い、HPA型毎の抗体検出感度や特異度、またそれぞれの方法の長所と短所を明らかにした。2.NAIT症例の検討:当院のNAIT疑い例、類似症例について、臨床像、経過などについて解析し、母親血清を用いて、レトロスペクティブにHPA抗体およびHLA抗体の検出、同定をおこなった。TRALIについての検討血管内皮細胞傷害活性:蛍光染色した臍帯静脈血管内皮細胞(HUVECs)を96wellプレートに培養し、白血球抗体により活性化した白血球を添加し、数時間のインキュベーションの後、生細胞の蛍光を測定し、死細胞の割合を算出し、血管内皮細胞傷害活性を求めた。結果)MPHA法及びMAIPA法の詳細な条件設定をおこない、より安定で確実な検査方法に改良した。そこで、各HPA抗体について、二法の検出感度及び特異度の比較検討をおこなった結果、HPA型毎に二方法間の検出感度や特異度が異なることが明らかとなった。また、原因抗体非検出NAIT症例について、上記の方法を用いてレトロスペクティブに再検査を実施した結果、新たにHPA抗体が検出された。現状では、単一の検査方法を用いて、全ての臨床的意義のある血小板同種抗体を検出することは不可能であることがわかった。また血管内皮細胞傷害試験において、HNA抗体と反応した白血球がLPS活性化内皮細胞を傷害することが確認された。これまでの検討では、HLA抗体による影響は確認できていないが、更に検討を加えていく予定である。
巨核球cDNA発現ライブラリーによる自己血小板特異的T細胞抗原の単離

免疫性血小板減少性紫斑病(以下ITP)における自己血小板反応性T細胞を単離し、そのT細胞をハイブリドーマ化して活性化T細胞核内因子エレメントの制御下にLacZをレポーターとする検出系を用い、血小板の自己抗原を発現クローニングで同定することを計画した。常法である末梢血単核球を抗原提示細胞とする系ではそれらがすでに血小板に暴露されている影響で、血小板の超音波破砕物や膜分画によるT細胞刺激効果が一定しなかった。そのためEBウィルスにより株化した患者由来B細胞を、ビオチン化抗IgG抗体・アビジン・ビオチン化血小板で順に標識し、血小板膜抗原を取り込ませる抗原輸送系を用い、血小板に対するT細胞増殖反応が検出可能であるか検討した。患者末梢血リンパ球のこの抗原輸送系を利用した血小板に対する増殖反応は血小板非存在下あるいはB細胞株のみの系に比較して2から3倍の刺激効果を示し、血小板特異的なT細胞増殖が検出可能であった。現在、この系を利用してT細胞株のあらたな樹立および特性検討を行っている。免疫性血小板減少性紫斑病(いわゆるITP)患者由来T細胞株6クローンについて血小板特異性を検討した。患者骨髄由来CD14陽性付着細胞をフィーダーとする系では血小板を加えることにより増殖反応の増加するものと逆に減少するものがみられた。IL-2添加により良好な増殖を示したクローンについてさらに脾細胞をフィーダーとする分析を行ったところ、血小板添加による増殖刺激指数はせいぜい2前後であった。ぞこでこれらのクローンを用いるのは抗原単離の出力系として適性でないと考えたので現在血小板をビオチン化しB細胞表面IgGに対する抗体を用いて患者由来B細胞株に高効率に血小板をとりこませ抗原提示させる系(抗原輸送系)を用いた解析や、また、そういった抗原輸送系を用いて血小板特異的T細胞を単離することを再度試みている。さらに、血小板自己抗原を同定分離する方法として、新たに患者由来脾細胞よりファージデイスプレー法を用いて抗体可変領域のヒト型抗体ライブラリーを作成し、固相化血小板上に結合させることによって、血小板に親和性を有するヒト抗体を単離することを試みている。これまでパンニングを繰り返して濃縮したファージクローン48個中2個に比較的親和性を有するものを同定し、さらなる検討を行っている。