hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微細藻類の屋外光環境受容と細胞応答の解析

バイオ燃料原料としての有用性が期待されている微細藻類ユーグレナを屋外で効率よく培養生産するためには、実際のバイオマス生産性を下げる環境要因としての太陽光の強光ストレスが課題である。本研究では、強光照射時のユーグレナ細胞の応答を、細胞増殖やカロテノイド蓄積などの測定値を指標に解析し、強光下での増殖阻害や、カロテノイド分子種の組成変化を明らかにした。ユーグレナのカロテノイド合成遺伝子であるフィトエン合成酵素遺伝子(EgcrtB)などを新たに単離し、RNAiによりその遺伝子発現を抑制した細胞を解析することで、カロテノイド合成と強光ストレスとの強い相関を明らかにした。平成25年度には、ほぼ申請時の計画に沿って研究を実施した。以下に主要な結果を記述する。「強光照射時の細胞応答の解析」について、ユーグレナ細胞を本研究室の「標準的な培養条件」(50μmolm-2s-1、水温25°C)及び細胞増殖が著しく阻害されかつ細胞内に赤褐色の色素を蓄積する「強光・低温条件」(250μmolm-2s-1、水温20°C)にて培養し、それらの細胞に蓄積する色素がカロテノイドであることを確認し、その分子種の組成比について、薄層クロマトグラフィーやHPLCを用いて測定した。その結果、これらの細胞におけるカロテノイド類ではdiadinoxanthinが約7580%を占める主要な分子種であること、標準的な培養条件から強光・低温条件に移して3日間を経過した細胞では、クロロフィル量に対する全カロテノイド量の比率が増加する傾向にあり、いくつかの分子種では含有量の増加や減少が観察された。これにより、ユーグレナ細胞が強光・低温の刺激を受けて増殖阻害を受けると同時にカロテノイド合成が促進されることは明確になった。「強光応答に関わる遺伝子の探索」については、カロテノイド合成系の最も上流に位置するフィトエン合成酵素(PSY)について、既知のゲノムデータベースにおいてPSYとしてアノテーションされている遺伝子配列を選び、そのアミノ酸配列をもとに、石川教授(島根大)の協力を得てユーグレナESTデータベースと照合するBLAST検索を行い、シロイヌナズナのPSYとのアミノ酸配列が約50%の相同性を示すEST配列を見出した。この配列を含むmRNAがユーグレナ細胞において実際に発現していることをPCR法により確認した。これらの結果から、当該EST配列はユーグレナにおけるPSYのオーソログであることが強く示唆されたので、今後、その遺伝子のより詳細な解析を行う。平成26年度には、申請時にこの年度以降に進めることを計画した「強光応答に関わる遺伝子の発現解析と機能解析」に沿った研究を実施した。ユーグレナを水温20度以下かつ光強度240micromol m-2 s-1以上で培養すると、細胞増殖が減少し、カロテノイドと推察される色素を細胞内に蓄積することがわかっていたが、ユーグレナにおけるカロテノイド合成経路は明らかになっていなかった。そこで、モデル植物等で既知のカロテノイド合成系酵素遺伝子の情報およびユーグレナのESTライブラリ情報を活用して逆遺伝学的手法を用い、カロテノイド合成経路の遺伝子の単離と機能解析を進めた。その結果、カロテノイド合成経路の初期段階に作用するゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)合成酵素遺伝子(CrtE)やフィトエン合成酵素(CrtB)、フィトエン不飽和化酵素(CrtP)、ζ-カロテン不飽和化酵素(CrtQ)のオルソログ遺伝子と推察されるESTを見出した。これらの遺伝子のcDNAを単離し、カロテノイド合成系を持たない大腸菌に導入して機能を解析した。好気性細菌PantoeaananatisのCrtE遺伝子とともにユーグレナのCrtB (EgcrtB)を発現させた大腸菌はフィトエンを合成したことから、EgcrtBがフィトエン合成酵素遺伝子であることが、遺伝子配列上の類似性のみならず、機能解析からも示された。今後は、これらの遺伝子が強光や低温条件下でどのような発現制御を受けるのかを解析する。前年度までに、ユーグレナにおけるカロテノイド合成経路の遺伝子群のオルソログ遺伝子と推察されるESTを見出したので、平成27年度は、これらのうち、特にゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素遺伝子(EgcrtE)とフィトエン合成酵素(EgcrtB)遺伝子の機能解析に注力した。その結果、これらに遺伝子がユーグレナ細胞においてもそれぞれ予測された酵素活性をもつことを明らかにした。さらに、実験室での培養実験の結果、ユーグレナを25&#730;C・光強度920 &micro;mol m-2 s-1連続照射下で7日間培養すると、細胞密度が対照区(25&#730;C・55 &micro;mol m-2 s-1)に比べ最大で91%減少すること、EgcrtBの発現量が1.3倍に上昇し細胞内にカロテノイドを蓄積することが明らかになった。また、水温20&#730;Cでは、55-240 &micro;mol m-2 s-1照射下で培養したユーグレナにおいて、対照区に比べ細胞密度が最大でそれぞれ88%と92%減少し、EgcrtB遺伝子の発現量は1.3倍と1.9倍に上昇した。ユーグレナは20&#730;C程度の水温で低温ストレスを受け、光ストレスを受けやすくなること、強光傷害回避のためにカロテノイドを利用していることが考えられた。これらの結果について原著論文として報告した。

さらに、強光や低温ストレスを受けた場合のユーグレナ細胞中の主要なカロテノイド分子種の組成がどのように変化するのかをHPLCで分析する実験に着手し、ユーグレナのカロテノイドとして報告されているネオキサンチン、ジアジノキサンチン、ジアトキサンチン等を分離検出できる条件を確立し、本格的な分析の準備を整えた。また、遺伝子の発現量を変化させて表現型を解析することを目指し、まずは発現量を減少させた場合の影響を観察するためのRNAiによるノックダウン株を作出するための一連の実験環境の整備と条件検討を行い、プロトコールを確定した。平成2527年度には、ほぼ申請時の計画に沿った実験に取り組んで前記の成果を得た。ユーグレナは非モデル生物であるが、結果として短期間にカロテノイド合成系酵素遺伝子群の発現解析や全長クローニングおよび機能解析を迅速に達成することができた。これは、学内外の共同研究者との連携のもとでESTライブラリを活用してゲノム情報が未公開のユーグレナを材料に効率よく遺伝子探索への手順を進めることができたからであると考えている。さらに、HPLCによる詳細なカロテノイドの分子種分析や遺伝子の発現量を調節する実験系にも目処がついたことにより、これまで分子機構が明らかになっていなかったユーグレナの低温強光応答におけるカロテノイドの生合成を通じた生理応答機構を、分子レベルで明確に理解するための基本的なツールを整備しつつあると考えており、強光や低温応答における分子機構解明への道筋が一層明確になった。本研究において見出した、ユーグレナESTに検出されたカロテノイド合成経路の初期反応を触媒する酵素遺伝子群(ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)合成酵素(CrtE)、フィトエン合成酵素(CrtB)、フィトエン不飽和化酵素(CrtP)、ζ-カロテン不飽和化酵素(CrtQなど)のオルソログ遺伝子のうち、今年度は特にユーグレナのCrtB遺伝子(EgcrtB)をRNAiにより発現抑制し、ユーグレナにおけるカロテノイドの機能解析を行った。EgcrtBのdsRNAを導入した細胞におけるEgcrtBの発現量は、培養3日後には対照実験区と比べて著しく減少し、培養7日後でも発現量の減少は持続した。EgcrtBの発現を抑制すると、総カロテノイド含量は対照区の10%に減少し、主要なカロテノイドであるジアジノキサンチンに対するジアトキサンチン比が増加し、1細胞当たりのChl a量、Chl b量およびChl a/b比いずれも有意な減少を示した。これらの細胞は培養3日後以降に細胞増殖が抑制され、細胞が白色化した。透過型電子顕微鏡観察の結果、これらの細胞では葉緑体の数が著しく減少して細胞内にパラミロン顆粒が蓄積した。カロテノイド合成系の、EgcrtBより下流のフィトエン不飽和化酵素遺伝子(EgcrtP1、P2)およびζ-カロテン不飽和化酵素遺伝子(EgcrtQ)の発現を抑制した場合も、EgcrtB発現抑制と同様の表現型を示すことも明らかにした。以上の結果から、カロテノイド合成系遺伝子の発現を抑制した細胞では、通常は良好な増殖が見られる光条件(光強度55 micro mol m-2 s-1連続白色光照射)でも光ストレスを受けたような表現型を示すことが明らかになり、ユーグレナ培養におけるカロテノイドの光ストレス緩和機能の重要性が明らかになった。
アポ蛋白E遺伝子変異とリポ蛋白系球体症に関する研究

アポリポ蛋白(アポ)Eは血清中においてカイロミクロン及び超低比重リポ蛋白(VLDL)レムナントの主要なアポ蛋白である。アポEは細胞表面に存在する低比重リポ蛋白(LDL)受容体などへ結合し、これらのリポ蛋白を細胞内へ取り込む役割をする。アポE変異体はIII型高脂血症、早発性粥状動脈硬化を来す。III型高脂血症の95%以上はアポE2/E2から発症する劣性遺伝病である。我々は、これまでに極めてまれな優性遺伝型式を呈するIII型高脂血症を起こすアポE1(Lys146Glu)などを報告してきた。さらに、III型高脂血症に加えて蛋白尿、腎機能障害を引き起こし病理組織学的に糸球体内にアポB、Eを含むリポ蛋白血栓症を特徴とする原因不明の疾患、リポ蛋白糸球体症(Liporotein glomerulopathy,LPG)の家系の症例においてアポE変異体、アポE Sendai(Arg145Pro)を検出しLPGとの関係を世界で初めて明らかにした。また、アポE SendaiとLPGの関係を調査し、LPGの単独症例の5例及び5家系においてアポE Sendaiを検出した。これに対して、正常コントロール群100例には、アポE Sendaiを認めなかった。また、同様の組織像を示すアポE変異体アポE Kyoto(Arg25Cys)を見い出した。アポE Sendai及びアポE Kyotoの変異遺伝子と正常アポE3遺伝子をCOS-1細胞及び大腸菌に発現させて変異および正常アポEの精製を行った。また、COS-1細胞に発現させ精製したアポE Kyoto及び正常アポEをリン脂質で再構成させヒト皮膚線維芽細胞のLDL受容体への結合を検討し、変異アポEではLDL受容体への結合が低下していることを見いだした。これらの結果からアポE変異体の一部はレムナントの増加をもたらすとともに、LPGの発症に密接に関係している事が考えられた。リポ蛋白糸球体症は日本で発見された新しい疾患であり、その病因がまったく不明であった。我々はこの疾患の特徴であるIII型高脂血症に類似したリポ蛋白像に注目し、III型高脂血症の病因であるアポEの質的異常の分析を行った。その結果、本症の1例にアポEの構造異常(アポEのコドン145番目のアルギニンがプロリンに変異)を見い出し、本症が発見された地名よりアポE Sendai(Arg 145 Pro)と命名した。また、制限酵素Ddelを用い本変異の有無を検討した所、本症を発症した5例全例に同じ変異を認めた。この結果よりアポE Sendaiが本症の病因であることが明らかとなった。更に家系調査の結果よりアポE Sendaiの保因者でリポ蛋白糸球体症を発症していない例も2例認められた。これらの事実は本疾患の発症にはアポE Sendai以外の因子も関与している事が明らかとなった。現在本症の発症に関与する因子の解明のため大規模な家系調査を実施中である。同時に腎糸球体の血管に本変異を有するリポ蛋白が蓄積して閉塞する機序の解明のためアポE Sendaiの発現を行っている。当初の計画ではアポEc-DNAをサブクローニング後baculovirus expression systemで行ったがアポE Sendai発現出来ず、大腸菌にトランスフェクションさせる系に変更し変異アポEの発現に成功し、現在精製段階にある。

アポEは細胞表皮面に存在する低比重リポ蛋白(LDL)受容体などへ結合し、これらのリポ蛋白を細胞内へ取り込む役割をする。アポE変異体はIII型高脂血症、早発生粥状動脈硬化を来す。III型高脂血症の95%以上はアポE2/E2から発症する劣性遺伝病である。我々は、これまでに極めてまれな優性遺伝型式を呈するIII型高脂血症を起こすアポE1(Lys146Glu)などを報告してきた。さらに、III型高脂血症に加えて蛋白尿、腎機能障害を引き起こし病理組織学的に糸球体内にアポB、Eを含むリポ蛋白血栓症を特徴とする原因不明の疾患、リポ蛋白糸球体症(Liporotein glomerulopathy,LPG)の家系の症例においてアポE変異体、アポE Sendai(Arg145Pro)を検出しLPGとの関係を世界で初めて明らかにした。また、アポE SendaiとLPGの関係を調査し、LPGの単独症例の5例及び5家系においてアポE Sendaiを検出した。これに対して、正常コントロール群100例には、アポE Sendaiを認めなかった。また、同様の組織像を示すアポE変異体アポE Kyoto(Arg25Cys)を見い出した。アポE Sendai及びアポE Kyotoの変異遺伝子と正常アポE3遺伝子をCOS-1細胞及び大腸菌に発現させて変異および正常アポEの精製を行った。また、COS-1細胞に発現させ精製したアポE Kyoto及び正常アポEをリン脂質で再構成させヒト皮膚線維芽細胞のLDL受容体への結合を検討し、変異アポEではLDL受容体への結合が低下していることを見いだした。これらの結果からアポE変異体の一部はレムナントの増加をもたらすとともに、LPGの発症に密接に関係している事が考えられた。
高密度の異常シヌクレインを利用したレビー小体病の早期診断技術の開発

シヌクレイン(Syn)は、孤発性および家族性パーキンソン病(PD)に共通した危険因子であり、早期診断のマーカーとして利用を試みられている。またパーキンソン病に限らず、レビー小体型認知症や多系統萎縮症でも異常Synの蓄積が認められ、シヌクレイノパチーと呼ばれている。申請者らは、密度と凝集性の違いを利用して異常Synを正常Synと区別する検出法を確立した。さらに、異常Synの構造変化を感知する分子NUB1を同定し、異常Synの目印となることを報告してきた。本研究では、異常Synの目印NUB1に対する特異抗体を作製後、シヌクレイノパチーの早期の臨床診断として利用できるSynの定量技術を開発すること、および異常Syn特異抗体投与による病態への影響を明らかにする。昨年度同定したリン酸化部位に対して特異的なリン酸化NUB1抗体を作成したため、病理学的および生化学的解析をすすめた。その結果、このリン酸化特異的NUB1抗体はレビー小体型認知症のレビー小体を染色することが明らかとなった。一方、多系統萎縮症に認められるグリア封入体などは陰性であった。生化学的検討からレビー小体型認知症では正常対照例にたいしてリン酸化NUB1の量が有意に増加していた。最も効果の高かったNUB1のリン酸化部位を絞り込み、その部位に対する合成ペプチドをウサギに免疫し、順調に、抗体を作製できた。作製した抗体の抗原特異性も確認できた。生化学的解析の結果、シヌクレイノパチーではNUB1がすべて不溶化しており、高度にリン酸化されている(未発表)。さらに病理学的検討を行った。リン酸化特異的NUB1の局在や量的変化を明らかにした。作製した抗体が特異的にリン酸化NUB1を認識することを確認できたため、NUB1の凝集と特に関連が深いシヌクレインの患者切片を用いて、さらにリン酸化NUB1の局在を検討する。具体的には、患者凍結脳組織からサンプルを作製し、今回作製した抗体を用いた免疫沈降が可能な場合には免疫沈降により、リン酸化NUB1結合分子の同定へと進む予定である。質量分析解析を用いて、リン酸化NUB1の有無を確認する。以上、病態の増悪には修飾異常が関与しており、特にリン酸化の異常はアルツハイマー病やパーキンソン病でも見出されている。凝集抑制効果を指標にスクリーニングしたリン酸化NUB1もシヌクレイノパチーの病態に深くかかわる可能性は高く、治療の標的ともなりえる。しかし、健常者の脳にある正常なSynと患者脳内の異常Synを区別できないため、検出法の精度が低く臨床診断に応用するまでには至っていない。さらに、異常Synの構造変化を感知する分子もNUB1を同定し、異常Synの目印となることを報告してきた。そこで本研究では、異常Synおよびその目印NUB1の精製技術を生かし、特異抗体を作製後、レビー小体病の早期の臨床診断として利用できるSynの定量技術を開発すること、および異常Syn特異抗体投与による病態への影響を明らかにする。今年度は予定通り、NUB1/NUB1LのUBAおよびPBRにある11個のセリン、スレオニンをグルタミン酸に置換したリン酸化模倣NUB1、もしくはリン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化変異NUB1を作製した。HeLaもしくはSHSY5Yニューロブラストーマ培養細胞を用いて、レビー小体様封入体の数および細胞分解系への影響を指標にして、変異NUB1の効果を検討した。最も効果の高かったリン酸化部位を絞り込み、その部位に対する合成ペプチドをウサギに免疫し、順調に、抗体を作製できた。シヌクレイノパチーではNUB1がすべて不溶化しており、さらに、高度にリン酸化されている(未発表)。現在、作製した抗体の抗原特異性を確認している。今後、生化学的、病理学的検討を予定している。

作製した抗体の抗原特異性も確認できた。生化学的解析の結果、シヌクレイノパチーではNUB1がすべて不溶化しており、高度にリン酸化されている(未発表)。さらに病理学的検討を行った。リン酸化特異的NUB1の局在や量的変化を明らかにした。作製した抗体が特異的にリン酸化NUB1を認識することを確認した後、生化学的、病理学的検討を予定している。具体的には、NUB1の凝集と特に関連が深いシヌクレインの患者切片を用いて、リン酸化NUB1の局在を検討する。また患者凍結脳組織からサンプルを作製し、リン酸化NUB1の有無を検討する。この抗体を用いた免疫沈降が可能な場合には免疫沈降により、リン酸化NUB1結合分子の同定へと進む予定である。以上、病態の増悪には修飾異常が関与しており、特にリン酸化の異常はアルツハイマー病やパーキンソン病でも見出されている。凝集抑制効果を指標にスクリーニングしたリン酸化NUB1もシヌクレイノパチーの病態に深くかかわる可能性は高く、治療の標的ともなりえる。作製した抗体が特異的にリン酸化NUB1を認識することを確認できたため、NUB1の凝集と特に関連が深いシヌクレインの患者切片を用いて、さらにリン酸化NUB1の局在を検討する。具体的には、患者凍結脳組織からサンプルを作製し、今回作製した抗体を用いた免疫沈降が可能な場合には免疫沈降により、リン酸化NUB1結合分子の同定へと進む予定である。質量分析解析を用いて、リン酸化NUB1の有無を確認する。
新規シグナル伝達分子によるアレルギー制御機構の解明を目指した挑戦的研究

口腔アレルギーは全身での免疫応答を背景として口腔内で起こるアレルギー疾患です。その病態にはT細胞による免疫応答が重要な役割を果たすことが知られていますが、疾患を引き起こす分子メカニズムについては不明な点が多く残されています。我々はアレルギー反応に関する研究を進める過程で、アレルギーに関連したT細胞の分化段階において新しいシグナル伝達分子が発現することを見出しました。この分子を標的としてヘルパーT細胞における発現パターンとサイトカイン産生に及ぼす影響といった機能について解析を行いました。その発現はTh2細胞に限定されるものであり、アレルギー応答の制御に重要な役割をもつ可能性が認められました。口腔アレルギーは全身での免疫応答を背景として口腔内で起こるアレルギー疾患である。その病態にはT細胞による免疫応答が重要な役割を果たすことが知られているが、疾患を引き起こす分子メカニズムについては不明な点が多い。新規シグナル伝達分子を標的としてアレルギーに関わるT細胞の分化と遊走の制御機構を解明することで、口腔アレルギーの病態と新しい治療法の開発へ向けた分子基盤を確立することを目指し、研究計画に従って以下の成果を得た。1)新規分子の発現パターンの解析:ヘルパーT細胞の各種サブセットへの分化条件で、新規分子の発現パターンをwestern blottingにより詳細に解析した。本年度に主要な物品として購入した多本架冷却遠心機一式は、これらサンプル作成などに有効に活用し成果を上げている。2)サイトカイン産生における新規分子の役割:一過性に新規分子を過剰発現させたヒトT細胞株Jurkatを用いて、ルシフェラーゼアッセイによりサイトカイン産生における新規分子の役割を検証した。また、レトロウイルスを用いて恒常的に内在性新規分子の発現をノックダウンしたstable Jurkat細胞株を作製した後、GFPを指標として新規分子を再構築した細胞株を樹立した。さらに、より生理的な条件で解析するために、マウスから分離したT細胞に、レトロウイルスにて新規分子を過剰発現させて、刺激下に各種サイトカイン産生への影響を細胞内サイトカイン染色によるFlowcytometryを用いて比較検証した。3)細胞遊走における新規分子の役割:樹立した新規分子再構築Jurkat細胞株を用いて、トランスウェルでの遊走実験に着手した。4)生体内でのアレルギー反応における新規分子の生理的役割:より生理的な状況下での研究を推進するために、新規分子遺伝子改変マウスの作製に着手した。新規シグナル伝達分子を標的としてアレルギーに関わるT細胞の分化と遊走の制御機構を解明することで、口腔アレルギーの病態と新しい治療法の開発へ向けた分子基盤を確立することを目指し、以下の結果を得た。ヘルパーT細胞の各種サブセットへの分化条件で、新規分子の発現パターンをwestern blottingにより詳細に解析した。発現パターンはTh2細胞に限定されるものであり、他のサブセットでは発現を認めることはなかった。一過性に新規分子を過剰発現させたヒトT細胞株Jurkatを用いて、ルシフェラーゼアッセイによりサイトカイン産生における新規分子の役割を検証した。また、より生理的な条件で解析するために、マウスから分離したT細胞に、レトロウイルスにて新規分子を過剰発現させて、刺激下に各種サイトカイン産生への影響を細胞内サイトカイン染色にて比較検証した。Jurkat細胞株を用いた実験系では、大きな影響は観察されなかったものの、より生理的な条件下で過剰発現させた実験系ではタイプ2サイトカイン産生に影響を及ぼすことが示唆されており、アレルギー応答の制御に重要な役割をもつ可能性が認められた。新たに樹立した新規分子再構築Jurkat細胞株を用いてのトランスウェルでの実験では、遊走に影響を及ぼすことが示唆される結果は得られなかった。本研究で得られた知見に基づき、細胞局在を制御する機構やターゲットとなる低分子量G蛋白質の解析により、新規分子を介したシグナル伝達機構を明らかにしていく。また、アレルギー実験動物モデルの解析を通して、生体内での新規分子の生理的役割を明らかにしていく。研究計画の通り、ヘルパーT細胞の各種サブセットへの分化条件で、新規分子の発現パターンを解析した。また、サイトカイン産生をはじめとする新規分子の役割を明らかにしつつあり、研究計画に沿って進行していることから、予定通りにおおむね順調に進展していると考えられる。免疫細胞生物学研究はおおむね順調に進行しており、予定通りの研究計画に従って研究を実施していくことで、成果をあげていく。申請時に遺伝子改変マウスを用いた実験を研究計画に入れていたものの、申請時と比較して交付額が大幅に減額されていたためにその一部を見送らざるを得なかった。しかしながら、初年度に研究を進める課程で、本研究をさらに推進するためには次年度に遺伝子改変マウスに関わる研究計画の比重を上げることが必要不可欠であると判断した。

そのため、研究計画の本質が変わるものではないが、次年度に動物実験に関わる費用が必要となるため次年度使用額が生じた。実験動物の購入、維持・管理料など378,866円
全反射型赤外分光法による過渡的複合体の解析

細胞内外の情報や物質のやり取りを行う"膜タンパク質"は、生命活動に重要である。我々は、光受容体・ロドプシンと伝達膜タンパク質の"膜分子複合体の過渡的変化"を様々な手法により解析している。このうち、赤外分光(FTIR)法やラマン分光法に代表される振動分光法は、分子振動を鋭敏に捉える手法で、側鎖,主鎖,低分子(イオンや水など)の微細構造変化を捉えることができ、X線結晶構造解析やNMR解析では得ることが難しい情報を取得することができる。本研究では以下の4点について研究を行い、成果を得た。本研究を通じて、膜蛋白質解析のボトルネックである、試料調製法や解析手法を確立できたと考えている。4)全反射型FTIR(ATR-FTIR)におけるイオンと膜タンパク質の相互作用解析を行い、解析の難しい膜タンパク質の微細構造変化を明らかにした[投稿準備中]。細胞内外の情報や物質のやり取りを行う"膜タンパク質"は、生命の維持に重要である。赤外分光法(FTIR)は、分子振動を鋭敏に捉える手法で、側鎖、主鎖、低分子(イオンや水など)の変化を報告し、これら変化が機能にも重要であることを証明した。このように過渡(中間)状態とのFTIR差スペクトルを解析することで、X線結晶構造解析やNMR解析では得ることが難しい、微細構造変化を解析することが出来る。本研究では、1)溶液交換可能な全反射型FTIR(ATR-FTIR)により、イオンや基質の結合による膜貫通型タンパク質の微細構造変化をアミノ酸レベルで明らかにすること、2)時間分解・低温FTIRにより、膜貫通型タンパク質が過渡的に構造変化する様子をアミノ酸レベルで明らかにすることを目指している。1)については、アニオン(Br^-/I^-)結合に伴う7回膜貫通型光受容体の構造変化をFTIRスペクトルとして観測することに成功した。現在はこれら変化が実際にどの主鎖・側鎖に由来するのかを、安定同位体標識及び変異体試料を用いた帰属を行っている。実際に1743cm^<-1>のプロトン化カルボン酸に由来する信号をAsp102と帰属した(投稿中)。2)については、特異な発色団を持つ新規ロドプシン分子を単離し、低温FTIRにより構造変化を解析した[Sudo et al.J.Biol.Chem.2011]。さらにこのMRと命名したタンパク質を用い、時間分解FTIRにより、発色団が数ms以内にall-trans型から11-cis型へ異性化するというこれまでの常識では考えられない光化学反応を示すことを明らかにした(投稿準備中)。現在は、1)2)の研究をさらに押し進めるとともに、Secタンパク質(公募研究代表者より提供)やペプチドトランスポーター(共同研究者より提供)についての研究を開始している。
局所麻酔薬のDNA脱メチル化による腫瘍細胞増殖抑制および致死機序の解明

麻酔薬や麻酔方法の違いによる癌の進行、転移、あるいは予後への影響が注目されている。研究代表者らは、局所麻酔薬が臨床使用濃度以下で悪性腫瘍細胞の増殖を抑制、細胞死を誘導することを報告した。最近、エピジェネティックな考えからDNAのメチル化と癌化との関係が注目され、DNAの脱メチル化剤は、癌抑制遺伝子の発現を増加し、細胞死を誘導する分子標的抗癌剤として臨床応用されている。一方、局所麻酔薬プロカインがDNAを脱メチル化するとの報告がある(Villar et al. Cancer Res. 2003 ; 63 : 4984-9.)。DNAのメチル化とは、DNAのシトシン塩基の5位末端の水素イオンがメチル基に置換されることであり、遺伝子の発現が抑制される。逆にメチル基が外れ脱メチル化されると遺伝子の発現が活発になる。本研究の目的は、種々の局所麻酔薬によるDNAの脱メチル化の作用機序を解明し、局所麻酔薬により腫瘍細胞増殖抑制や細胞死を誘導することを検証し、癌患者の麻酔や術後鎮痛に局所麻酔薬を使用することの有用性を示すことである。まず、リアルタイムPCR法を用いて、リドカインなどの局所麻酔薬の暴露で腫瘍細胞においてp53、p21などの癌抑制遺伝子の発現増加を観察した。一方、メチル化DNAと特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて、ドットプロットを行った結果、リドカインやプロカインを暴露した細胞群では、メチル化DNAが相対的に増加した。さらに、制限酵素を用いてメチル化DNAを選択的に切断処理後、定量的リアルタイムPCRで定量した結果、リドカインやプロカインを暴露した細胞群では、メチル化DNAの増加がみられた。これらの結果、リドカイン等の局所麻酔薬はDNAを脱メチル化することで、腫瘍細胞においてメチル化されて発現が抑制されているp53、p21等の癌抑制遺伝子の発現を増加し、アポトーシスを誘導しうることが考えられた。
次世代科学技術系人材の資質・能力を測定する尺度及びパフォーマンス評価の開発

研究目的:スーパーサイエンスハイスクール事業における独自のカリキュラムで学ぶ生徒(以下、SSHクラス)と学習指導要領で学ぶ生徒(非SSHクラス)を比較し、SSH事業が目指す次世代科学技術系人材としての資質・能力の育成について検証する。研究方法: 2016年5月及び2017年2月に1学年314名と2学年301名、合計615名(SSHクラス153名、非SSHクラス462名)を対象として、質問紙調査を実施し、平均得点を比較分析した。分析に用いた変数は次世代科学技術系人材に求められる資質・能力についての9項目「課題発見力」「課題解決力」「プレゼンテーション力」「英語力」「環境問題解決に貢献できる」「経済成長に貢献できる」「地域文化振興に貢献できる」「社会の安全・安心に貢献できる」「科学的な知識を日常生活で活用できる」、及び研究者志望についての3項目「自然科学系研究者志望」「社会科学系研究者志望」「人文科学系研究者志望」である。研究成果:(1)クラス差を検討するために、2016年5月調査で学年×クラスの2要因分散分析を行ったところ、「課題解決力」「科学的な知識を日常生活で活用できる」「自然科学系研究者志望」についてSSHクラスは非SSHクラスより高いことが有意に認められた。(2) 1学年の1年間の変化を検討するために、5月調査2月調査×クラスの2要因分散分析を行ったところ、SSHクラスの「課題発見力」「課題解決力」「プレゼンテーション力」が有意に上昇した。同様に2学年について、5月調査2月調査×クラスの2要因分散分析を行ったが年間の有意な変化は認められなかった。ただし「課題発見力」「課題解決力」「プレゼンテーション力」「環境問題解決に貢献できる」「科学的な知識を日常生活で活用できる」「自然科学系研究者志望」について、SSHクラスは非SSHクラスより高いことが有意に認められた。
VAMP3を介したGPIアンカー型蛋白質の細胞内輸送機構に関する分子解剖学的解析

生殖細胞に特異的に発現しているGIP-アンカー型蛋白質であるTEXIOI、およびその細胞内輸送関連分子VAMP3の機能解析のためのバイオイメージング技術の開発と、それを用いた分子解剖学的解析を行った。TEXIOI関連分子のGFP融合発現ベクター、およびTEXIOIをノックダウンするGFP融合shRNAベクターを作製した。マウス精巣を用いて、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の詳細な検討を行い、生殖細胞への良好なベクター導入に成功し、新しいinvivo遺伝子導入技術の開発に結びついた。最近、我々が新規に同定した生殖細胞特異的GPI蛋白質、TEX101の解析から、その共役分子がvesicle associatedmembrane protein(VAMP)-3である新知見を得ました。VAMPsは、特に神経細胞で、シナプス小胞上のv-SNAREとして開口分泌に重要な役割を担っている分子として報告され、VAMP3は神経細胞以外の小胞上のテタヌス神経毒感受性v-SNAREと考えられていますが、細胞内輸送における特異的機能は不明なままです。共役分子のVAMP3は、GPI蛋白質を細胞膜へ輸送する特異的v-SNAREの有力な候補である可能性を強く示唆しています。GPI蛋白質の細胞膜への輸送機構を解明する大きな手掛かりであり、今回の基盤研究により、バイオイメージング手法を軸にしたVAMP3の機能解析を行っています。新規に同定した生殖細胞特異的GPI蛋白質、TEX101の解析から、その共役分子がvesicle associated membrane protein (VAMP)-3である新知見を得ました。共役分子のVAMP3は、GPI蛋白質を細胞膜へ輸送する特異的v-SNAREの有力な候補である可能性を強く示唆しており、GPI蛋白質の細胞膜への輸送機構を解明する手掛かりであり、今回の基盤研究により、VAMP3、TEX101の機能解析のためのバイオイメージング手法の開発をおこないました。蛍光蛋白質を融合させたTEX101関連分子やshRNA発現ベクターを作製し、その有効性を、COS-7細胞を用いることにより安定して検証することが可能となりました。精子形成開始時期にあたる新生仔期の精巣を用いて、in vivoレベルでのエレクトロポレーションによる遺伝子導入の詳細な検討をおこないました。比較的高めの低電圧(40V)による極短時間(5-10ms)のエレクトロポレーションをおこなった後、引き続き低電圧(20V)でエレクトロポレーションをおこなうことにより、生殖細胞への良好な導入に成功し、新しい精巣内へのin vivo遺伝子導入技術の開発に結びつきました。In vivoでの導入条件を参考に、マウス精巣より分離した精巣初代培養系へ、ベクターのエレクトロポレーションによる遺伝子導入をおこないました。導入した生殖細胞の詳細なリアルタイムバイオイメージング解析が課題として残されました。成果は投稿準備中です。
サンゴの熱ストレス応答の分子レベルでの網羅的解析

サンゴの白化現象は海水温、光、塩分濃度など様々な要因が複雑に絡み合った様々な要因が複雑に絡み合った「複合ストレス」で引き起こされる事が示唆されている。複合ストレスを理解する為には、まず「単一」のストレスでのサンゴの応答メカニズムを解明する事から始めるべきだと考えた。本研究では白化現象の最大の要因であるとされる「海水温の上昇」に注目し、サンゴの熱ストレス応答を分子レベルで詳細に明らかにする事を目的とする。実験材料として、沖縄に普通に生息しゲノムプロジェクトが進行中で分子レベルでの研究基盤が最も整っているサンゴ、コユビミドリイシを用いる。22年度に、熱ストレスを与えたサンゴと与えてないサンゴで、cDNAマイクロアレイによる遺伝子発現の違いを網羅的に解析した。その結果、ストレスにより発現の変動する遺伝子(全遺伝子の約4%)を突き止めた。これら遺伝子群から、熱ストレスにより影響を受けているサンゴの代謝系(DNA修復系やタンパク質分解系など)が明らかになった。一方で、共生している褐虫藻の遺伝子発現の変化は、特に検出出来なかった。このことから、熱ストレスは「ホスト」であるサンゴの方に影響を与えている可能性が示唆された。さらに、改良されたコユビミドリイシ・ゲノムの遺伝子モデルセットを元に、cDNAマイクロアレイの再設計を行い(2×108kから4×44kへアップグレード)、マイクロアレイ解析にかかるコストを半分に減らす事が出来た。これにより網羅的遺伝子発現解析がさらに容易になり、今後のサンゴの分子レベルでの研究がより発展することが期待される。実験材料として沖縄に普通に生息し、ゲノムプロジェクトが進行中で分子レベルでの研究基盤が最も整っているサンゴ、コユビミドリイシを用いる。21年度はコユビミドリイシ、Acropora digitiferaの遺伝子データベースの充実を図る事に主に集中した。様々な発生ステージと成体から単離したmRNAを、二種類の次世代シークエンサー(454, illumina)により解読した。これまでに次世代シークエンサーによるトランスクリプトームの解析は、あまり報告されておらず、その手法確立も行った。その結果、約55,000のユニークな配列を取得した(N50 size : 794bp,最長11, 151bp)。これらのデータは、コユビミドリイシのゲノム配列からの遺伝子予測にも用いられ、現在約33,000の遺伝子が予測されている。このように当該年度は、コユビミドリイシの熱応答メカニズムをゲノムワイドに解析を行う上での、基盤となりうるデータを得る事が出来た。
歯根象牙質を介した外向きドラッグデリバリーによる新たな歯周組織再生スキームの構築

本研究は歯周疾患に罹患した部位に残存する無髄歯をドラッグデリバリーのための「バイオセラミックス製徐放カプセル」と位置付け、髄腔内に填入した再生誘導物質を、象牙細管経由で罹患部へ選択的に作用させることで、破壊された歯周組織の治癒と再生を促す新規ドラッグデリバリーシステム(DDS)を開発することを目的に計画されたものである。実験はラットの上顎臼歯部を対象に、臼歯の歯髄腔をDDSのドラッグチェンバーとする再生誘導実験系の樹立を第一の目標としてスタートしたが、ラット上顎臼歯の抜髄処置は国内外ともに前例がなく本研究が初の試みであったため手探りの部分が多く、当初は研究の遂行に大幅な遅れが出たが、老齢ラットの採用、小器具および実験装置の改良と手技の見直しを重ねた結果、ラットの狭小な口腔内で、上顎臼歯の抜髄/貼薬処置を確実に実施する方法を確立した。本実験系では、歯髄腔に填入した蛍光トレーサーが実際に歯根象牙質を介して歯周組織へ拡散することが確認され、本実験系の歯周組織再生誘導への有用性が示唆された。しかし一方で、ラット臼歯は老齢であっても根尖孔が広く開大していることが判明し、in situ DDSチェンバーに填入した誘導因子が根尖性に歯周組織へ到達する可能性を否定できないことがわかった。この問題は抜髄後に根尖孔を封鎖することで解決できるが、老齢ラットは治癒/再生に長期を要することから、残された研究期間内にデータ収集を完了することは難しいと判断された。これら問題は実験動物をマウスに変更し、臼歯の根部歯髄を温存する実験系に切り替えることで克服可能と考えられるため、次年度はマウス臼歯部を対象とする追加実験を実施してデータを収集し、実験系を評価する。本研究は、歯周組織の効果的再生誘導のための新規動物実験系として、老齢ラットの臼歯歯髄腔をバイオセラミックス製ドラッグデリバリーチェンバーと見立てたin situ DDSの作成を目指して進められてきたが、ラット上顎臼歯の抜髄処置は前例がなく、国内外を通して本研究が初の試みであったため、手探りの部分が多く、研究の遂行に大幅な遅れが出た。ほぼ2年に渡る実験器具と動物装置の改良、術式の見直しの結果、最終的にラットの狭小な口腔内で上顎臼歯の抜髄/貼薬処置を確実に実施する方法を確立することができた。しかし老齢ラットは組織の治癒再生に長期を要するため、処置後のデータ収集も遅れる結果となった。実験動物を老齢ラットから比較的短期間にデータ収集が見込まれるマウスに変更し、以下の要領で実験をデータ解析を実施する。1.マウス臼歯の歯髄腔をバイオセラミックス製ドラッグデリバリーチェンバーと見立てたin situドラッグデリバリーシステムの確立2.絹糸結紮法による臼歯部歯槽骨吸収モデルにin situ DDSによる歯周組織再生誘導実験を適用し、誘導効果を評価3.研究成果の公表本研究はヒトの無髄歯をドラッグチェンバー(歯髄腔)を内包したバイオセラミックス製徐放カプセルと位置付け、髄腔内に封入した歯周組織再生因子を直近の歯周組織へ長期安定的に作用させることを可能にするin situドラッグデリバリーシステム(DDS)を確立することを目的に計画されたもので、初年度はパイロットスタディーとして以下の実験を行った。1)ヒト抜去歯を用いた歯根象牙質の物質透過性の評価:動物実験を実施するに先立ち、ヒトの歯がDDSバイオカプセルとして機能するか否かについて抜去歯を用いて検証した。成人抜去歯を抜髄・洗浄後、セメント質を部分削除して歯根象牙質を一部だけ露出させた。その状態で髄腔に蛍光トレーサー(lucifer yellow)を注入して封印し、湿潤下、冷暗所に1数日間放置した。固定・洗浄後、歯根の横断研磨片を蛍光顕微鏡で観察し、蛍光物質はセメント質直下まで到達するがセメント質を透過しないこと、一方セメント質除去部では、象牙細管経由でトレーサーが歯根膜側の露出面まで到達することが確認された。この結果は、歯髄腔を薬物チェンバーとして用いる本DDSが、局所的な歯周組織再生誘導のために有用な治療法となり得る可能性を示唆している。2)In situ DDSによる歯周組織再生実験モデルの構築:本DDSの歯周組織再生誘導療法としての有用性を検証する実験系として、ラット上顎臼歯部を対象とする動物実験モデルの構築を目指した。ラットを背臥位で固定すると上顎臼歯部は比較的術野が広く、手術顕微鏡下で髄腔の開放と歯髄の部分除去が可能であった。しかし既存の歯科用インスツルメンツはラット臼歯の抜髄には不向きであり、適切な小器具の開発が緊急の課題となった。また若齢ラット臼歯は髄腔が著しく広いため、老齢ラットでの実験が現実的であると思われ、今後の課題が明らかになった。ヒト抜去歯を用いた歯根象牙質の物質透過性検証実験は予定通りに進行したが、動物実験モデルとして立案した、ラット上顎臼歯の抜髄および当該部位の歯周組織の手術が予想以上に難しく、術式の習熟に時間を要しているため。本研究は歯周疾患に罹患した無髄歯をドラッグデリバリーシステム(DDS)におけるバイオセラミックス製徐放カプセルと位置付け、根管内に封入した薬液を歯根周囲の罹患部に効率的に作用させるin situドラッグデリバリーシステムの確立を目指している。初年度は、ラット上顎

第1臼歯の頬側根管をDDSのドラッグチェンバー(DC)とすべく検討を重ねてきたが、根管処置用器具の小動物への適応の困難さや根管口の視認性の悪さがネックとなり、十分な成果を得るには至らなかった。そのため、今年度は手用器具の改良と手技の向上に努めるとともに、様々な月齢のラットを対象に歯髄処置を繰り返し試行した。その結果、体重500g前後の老齢ラットの上顎第1臼歯近心根管をDCとする実験系が手技的に最も確実で再現性も高いことが確認され、今後実験での対象動物を老齢ラットとすることとした。ラット臼歯は成獣でも根管が太く根尖孔が開いている場合が多いため、根管に貼薬すると根尖孔から薬液の漏洩が懸念されるが、老齢ラットは臼歯の根尖が厚いセメント質で覆われ、根尖孔が狭小化しているためにそのような危険性は少なく、象牙細管経由のDDSを構築する上で理に適っている。また、老齢ラット臼歯は髄腔が著しく狭小化しているため、近心部に限局して髄腔開放を行うことで、冠部歯髄の他部位へ重篤な影響を与えることなく歯髄処置を行なえる点も、大きな利点である。本実験系では、近心根管内に貼薬した蛍光トレーサーLucifer yellowが、象牙細管経由で歯根膜側に拡散することが蛍光顕微鏡で確認されており、本in situ DDSが実際に薬物の徐放に機能することは大いに期待できる。現在、老齢ラット根管腔に封入した再生誘導因子の局在の経時的変化(歯周組織への拡散動態)の解析が進行中である。歯周組織再生誘導の動物実験モデルを構築するにあたり、敢えて老齢ラットを用いることで初年度に困難を極めた実験手技の困難さが克服され、実験の進行が大幅に加速した。老齢ラットの臼歯の組織構造の特性から、機能歯の根管をドラッグチェンバーとするドラッグデリバリーシステムの信頼性が高まったことも特機すべき進展である。本研究は歯周疾患に罹患した部位に残存する無髄歯をドラッグデリバリーのための「バイオセラミックス製徐放カプセル」と位置付け、髄腔内に填入した再生誘導物質を、象牙細管経由で罹患部へ選択的に作用させることで、破壊された歯周組織の治癒と再生を促す新規ドラッグデリバリーシステム(DDS)を開発することを目的に計画されたものである。実験はラットの上顎臼歯部を対象に、臼歯の歯髄腔をDDSのドラッグチェンバーとする再生誘導実験系の樹立を第一の目標としてスタートしたが、ラット上顎臼歯の抜髄処置は国内外ともに前例がなく本研究が初の試みであったため手探りの部分が多く、当初は研究の遂行に大幅な遅れが出たが、老齢ラットの採用、小器具および実験装置の改良と手技の見直しを重ねた結果、ラットの狭小な口腔内で、上顎臼歯の抜髄/貼薬処置を確実に実施する方法を確立した。本実験系では、歯髄腔に填入した蛍光トレーサーが実際に歯根象牙質を介して歯周組織へ拡散することが確認され、本実験系の歯周組織再生誘導への有用性が示唆された。しかし一方で、ラット臼歯は老齢であっても根尖孔が広く開大していることが判明し、in situ DDSチェンバーに填入した誘導因子が根尖性に歯周組織へ到達する可能性を否定できないことがわかった。この問題は抜髄後に根尖孔を封鎖することで解決できるが、老齢ラットは治癒/再生に長期を要することから、残された研究期間内にデータ収集を完了することは難しいと判断された。これら問題は実験動物をマウスに変更し、臼歯の根部歯髄を温存する実験系に切り替えることで克服可能と考えられるため、次年度はマウス臼歯部を対象とする追加実験を実施してデータを収集し、実験系を評価する。
ヌクレオソーム配置を介した遺伝子発現制御機構の解明：ゲノム高次構造と遺伝子共発現

本研究では、モデル植物シロイヌナズナを対象に、遺伝子発現パターンが類似する遺伝子群(共発現遺伝子群)をゲノム情報から推定する手法の開発に取り組んだ。遺伝子発現制御に影響を及ぼす高次のゲノム特徴量としてヌクレオソームポジショニングに着目して解析を進めた結果、転写開始点近傍のヌクレオソーム形成状態が遺伝子の平均発現量に強く影響することや、平均発現量が同程度の遺伝子同士が強く共発現することを明らかにした。さらに、タンパク質コード領域の進化的新旧度とヌクレオソーム形成状態が強く相関することを発見し、遺伝子発現制御と遺伝子機能の両面から遺伝子共発現ネットワークの形成原理を理解するための基盤を構築した。本研究では、モデル植物シロイヌナズナを対象に、ゲノムにおける様々な特徴の類似性を利用して、遺伝子発現パターンが似ている遺伝子群(共発現遺伝子)を推定するバイオインフォマティクス的手法を開発することを目標としている。特に、ゲノム高次構造が遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするために、多様な組織における網羅的なヌクレオソーム配置解析を実施する。平成27年度は、次世代シークエンサーを用いたヌクレオソーム配置決定手法であるMNase-Seq法に必要な核酸サンプルを取得するために、シロイヌナズナの各組織(葉、茎、花、根、種子)からのゲノムDNAの調製およびMicrococcal Nuclease(MNase)処理実験を実施した。また、RNA-Seq法による遺伝子発現定量に必要なTotal RNAの抽出を行った。これらの実験と並行して、ヌクレオソーム配置解析が進んでいるヒトのMNase-Seqデータを公共データベースから取得し、データ解析手法の検討を行った。COXPRESdb(http://coxpresdb.jp)が提供しているヒトの遺伝子共発現データとの比較解析の結果、タンパク質コード領域におけるヌクレオソーム密度を特徴量として用いることで、共発現遺伝子を効率よく推定できることを見出した。また、遺伝子共発現に寄与するゲノムの一次配列上の特徴を探索したところ、コドン使用頻度の類似性が重要であることを見出した。結果は、高等植物の遺伝子共発現データベースATTED-II(http://atted.jp)および微細藻類の遺伝子共発現データベースALCOdb(http://alcodb.jp)の一部として公開した。研究対象としていたシロイヌナズナの組織の一部(根および種子)では、植物体からゲノムDNAを抽出する際の効率が極めて低く、ヌクレオソーム配置を決定するために十分な量のゲノムDNAを調製できなかった。このため、進捗に若干の遅れが生じている。現在、追加でシロイヌナズナの育生を実施しており、植物体の準備が整い次第、核酸サンプルを調製する。本研究では、モデル植物シロイヌナズナを対象に、ゲノムにおける様々な特徴の類似性を利用して、遺伝子発現パターンが似ている遺伝子群(共発現遺伝子群)を推定するバイオインフォマティクス的手法を開発することを目標としている。平成28年度は、次世代シークエンサーを用いたヌクレオソーム配置決定手法であるMNase-Seq法に必要なDNAサンプルと、遺伝子発現定量手法であるRNA-Seq法に必要なRNAサンプルの調製実験を進めた。RNAサンプルについてはシロイヌナズナの各組織から調製することに成功したものの、DNAサンプルは一部の組織において実験に十分な量が調製できなかったため、調製手法の条件検討を実施した。これらの実験と並行して、公共データベースに登録されているMNase-Seqデータの解析を行い、ヌクレオソーム配置と遺伝子共発現の関係について洞察を深めた。共発現する遺伝子同士は同程度の発現量を示すことを見出し、また、転写開始点上流40bp領域のヌクレオソーム密度が遺伝子発現量と強く相関することを明らかにした。さらに、この現象を説明する本質的な因子として「遺伝子の進化的な新旧度」があることを発見し、論文執筆を進めるとともに学会等で報告を行った。ここで得られた知見の一部は、運用中の微細藻類遺伝子共発現データベースALCOdb(http://alcodb.jp)で提供している遺伝子共発現データの品質向上に応用した。MNase-Seq解析に供するDNAサンプルの調製実験において、参考にした過去研究事例の再現性が取れないことや、根や茎などの一部の組織において調製効率が著しく低いという問題が発生した。このため、十分な量のDNAサンプルを取得するために、植物材料の再調達ならびにDNA調製実験のスケールアップが必要になった。特に、ゲノム高次構造が遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにするために、多様な細胞条件におけるヌクレオソーム形成領域/オープンクロマチン領域の動的変化に着目する。平成29年度は、前年度に引き続き、MNase-Seq法をはじめとしたヌクレオソーム形成領域/オープンクロマチン領域の特定手法の次世代シークエンサーデータを網羅的に公共データベースから取得し、遺伝子発現ならびに遺伝子共発現との関係性を解析した。転写開始点直上のヌクレオソーム形成状態が遺伝子発現に強く影響することを明らかにすると共に、タンパク質コード領域の進化的新旧度によって個々の遺伝子のヌクレオソーム形成状態をある程度は推定可能であることを見出した。タンパク質の進化的新旧度は遺伝子共発現ネットワークの基本構造に強い影響を及ぼしており、ヌクレオソーム配置を介在因子として注目することで、遺伝子発現制御と遺伝子機能の両面から遺伝子共発現ネットワークの形成メカニズムを考察することが可能となった。

得られた知見は、運用中の高等植物遺伝子共発現データベースATTED-II(http://atted.jp)ならびに微細藻類遺伝子共発現データベースALCOdb(http://alcodb.jp)で提供している遺伝子共発現データの品質向上への応用を進めている。本研究では、モデル植物シロイヌナズナを対象に、遺伝子発現パターンが類似する遺伝子群(共発現遺伝子群)をゲノム情報から推定する手法の開発に取り組んだ。遺伝子発現制御に影響を及ぼす高次のゲノム特徴量としてヌクレオソームポジショニングに着目して解析を進めた結果、転写開始点近傍のヌクレオソーム形成状態が遺伝子の平均発現量に強く影響することや、平均発現量が同程度の遺伝子同士が強く共発現することを明らかにした。さらに、タンパク質コード領域の進化的新旧度とヌクレオソーム形成状態が強く相関することを発見し、遺伝子発現制御と遺伝子機能の両面から遺伝子共発現ネットワークの形成原理を理解するための基盤を構築した。ヒトのMNase-Seqデータと遺伝子共発現データの比較解析を通じて、本研究課題で必要となるデータ解析のパイプラインは概ね完成した。平成28年度は、不足しているシロイヌナズナの核酸サンプルの調製を速やかに遂行し、各種次世代シークエンサー解析(MNase-SeqおよびRNA-Seq)に供する。NGSデータを取得し次第、ATTED-IIが提供しているシロイヌナズナの遺伝子共発現データとの比較解析を進めていく。植物材料が調達でき次第、早急にDNAサンプルの調製実験を進める。核酸サンプルの準備が整い次第、MNase-Seq解析およびRNA-Seq解析を実施する。次世代シークエンサー解析のデータを取得できた後は、平成28年度までに概ね完成させたデータ解析パイプラインを用いてヌクレオソーム配置の決定や遺伝子発現量との関連解析を進めていく。分子生物学・バイオインフォマティクス・植物分子生理科学・ゲノム生物学当初は平成27年度に次世代シークエンサーによる大規模解析を計画しており、その経費として交付決定額の大半を支払い請求していた。しかし、次世代シークエンサー解析に供するゲノムDNAサンプルの調製に遅れが生じたため、次世代シークエンサー解析は次年度(平成28年度)に持ち越すことにした。このため、次年度使用額が発生した。MNase-Seq解析に供するDNAサンプルの調製実験において、参考にした過去研究事例の再現性が取れないことや、根や茎などの一部の組織において調製効率が著しく低いという問題が発生した。このため、次世代シークエンサー解析の実施に遅れが生じ、次年度使用額が発生した。次世代シークエンサー解析を実施するための経費として使用する予定である。核酸サンプルの調製実験で用いる試薬の購入費、および、次世代シークエンサー解析の外注経費として使用する予定である。