hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファルネシル転移酵素を標的とした大腸がんの化学予防に関する基礎的研究

rasがん遺伝子は大腸がん発生に重要な役割を担っている。Ras蛋白が機能するにはフ7ルネシル転移酵素によりC末端のファルネシル化を受けることが必須である。私どもは、自ら開発したHPLCを用いた簡易活性測定法によりヒト大腸ポリープおよび背景粘膜の酵素活性を測定し、正常粘膜に比較してポリープでは有意に活性の亢進を認め、さらに患者の背景粘膜の検討ではポリープの異型度が高い症例ほど背景粘膜に活性の上昇を認めている。したがって、rasがん遺伝子の活性化変異を高頻度に認める大腸がんの化学予防のために本酵素はその分子標的になりうると考えられる。1.本酵素遺伝子の過剰発現により増殖因子による細胞増殖亢進、ソフト・アガーでのコロニー形成能の獲得、アポトーシス耐性の獲得、造腫瘍性の獲得を認めた。2.本酵素阻害剤により、ヒトがん由来細胞株に対して増殖抑制とRasファルネシル化の抑制を認めたが、laminのファルネシル化には影響が見られなかった。以上より、本酵素の活性亢進は、細胞増殖の亢進、アポトーシス耐性の獲得、造腫瘍性の獲得につながることが明らかになっている。さらに、本酵素阻害剤が、Rasファルネシル化の抑制に有効であることが明らかになったので、ファルネシル転移酵素は大腸がんの化学予防の分子標的になりうると考えられる。
日本語の疑問文とそれに関連する構文の歴史的・対象言語学的研究

本研究では、日本語の疑問文とそれに関連する構文について、主に中世以降に焦点をあててその歴史を記述した。その結果、疑問の助詞「か」「やら」が、中世以降さまざまな用法を派生させていく様相を明らかにできた。また、日本語の歴史を韓国語、琉球語と対照することで、一般言語学に貢献できるような、変化のプロセスの解明を目指した。本研究では、そのような歴史変化のパターンとして、主文に付加した節を標示する形式が、単文内で機能するようになる統語的変化を考えた。それにより、不定の「か」や例示の「やら」の歴史変化が合理的に説明できることを示した。本研究では、日本語の疑問文とそれに関連する構文について、主に中世以降に焦点を当ててその歴史を記述するとともに、日本語の歴史と琉球語を対照することで、諸構文の関連性、及びそれぞれの歴史変化について、一般言語学に貢献しうるプロセスの解明を目指している。本年度は、この研究目標のもと、主に疑問の助詞カの歴史変化について、19世紀までの京阪語を中心に歴史資料の調査を行った。その結果、カは中古まではほぼ疑問の助詞として用いられていたこと、14世紀に文末で選言と意識される用法が発達し、その後15世紀以降名詞句の位置で選言の用法を発達させたこと、不定の用法は江戸前期から、副詞的な用法が見られることが分かった。この内容については22年度に、雑誌論文として公開する予定である。本年度の成果の公開としては、主に、カの間接疑問文の歴史変化と、ヤラの例示用法の成立について、学会発表という形で行った。前者では、カが元は「話し手指向的意味」を持っていたが、それを失っていく過程を示し、一般に「主観化」と言われている歴史変化の過程に反するものであるという議論を行った。後者では、ヤラの例示用法が文末から発達したことを示し、疑問からの派生を考えなければならないことを論じた。これらについても、順次雑誌論文として公開していく予定である。また、琉球語との対照についても調査を進めている。本年度は沖縄県宮古島に二度調査に赴き、話者15名(11集落)から聞き取り調査を行った。その結果、従来は指摘されていない肯否疑問文と疑問詞疑問文の使い分けや、間接疑問文の使用制約についてデータが得られたが、年齢層の絞り込みや日本語史との対照については、22年度の課題として残っている。本年度は、この研究目標もと、疑問に関連する構文の発達について、昨年行った調査を元に学術論文を執筆し、学会誌に掲載した。これまで、古代語において、カが係り結びなどの疑問文で用いられていたことは分かっていたが、その後、「AかBか」のような選言、「何か」のような不定の用法が、いつごろから見られるようになっていったのかは明らかでなかった。この論文では、実証的なデータを示し、カが、中古まではほぼ疑問の助詞として用いられ、15世紀以降に選言の用法を、近世後期に不定の用法を、それぞれ名詞句の位置で発達させたことを明らかにした。このことにより、カが格助詞に前接し名詞としての資格を持つ構文は、間接疑問文を含め全て、中世以降に発達していることが明らかになり、格助詞に後接する中世以降衰退した係り結びと、相補分布している蓋然性が高くなった。また、間接疑問文の歴史についても昨年度に引き続き調査し、発表を行った。その結果、カによる間接疑問文は、上方資料では19世紀まで「話者の不確定性」を表していたが、19世紀以降の江戸語資料では、「話者の不確定性」が薄れていくことが明らかになり、一般言語学で言われる変化の方向性を再検討しなければならないことが分かった。以上のような、疑問文、および疑問に関連する構文ついて本年度も、昨年度に引き続き、沖縄県宮古島市での調査を行った。特に、今年度の調査では、宮古島方言の疑問文が、現代標準日本語や、中古語とは異なる特徴を持っていることが分かり、それについても学会発表を行った。
多雨林の樹木群集における多様性―生産性仮説の検証

本研究は、多雨林の樹木群集について、野外データに基づき、生産性が高いほど種多様性が高いという多様性-生産性仮説を検証することを第一の目的とした。地上部の生産性は、積み上げ法によって葉の生産と地上部現存量回転速度の和として推定する。樹木種多様性がすでに明らかになっていて、葉の生産と地上部現存量回転速度の長期継続調査を行っているアジアの2か所の山岳(屋久島・マレーシア)をおもな対象とした。地上部の純一次生産速度を推定するために、鹿児島県屋久島(暖温帯多雨林)では、リタートラップをもちいてリター(落葉・落枝)を月1回回収し、葉・繁殖器官・枝・その他に分別して乾重を測定し、葉の生産速度を推定した。また、地上部の純一次生産の決定要因のひとつであるリターの分解速度を調査した。マレーシアのキナバル山(熱帯多雨林)では、調査区の樹木の幹直径を再測定し、地上部現存量回転速度を推定した。緯度傾度にそった解析のため、沖縄県西表島の亜熱帯多雨林でも調査区を設定した。以上のデータとこれまでに共同研究によって蓄積されたデータにもとづき、広域スケール(緯度・標高傾度)での多様性-生産性関係について検討した。以上の成果のうち、マレーシアで得られた結果の一部は、共著論文として学術誌で発表した。おもな内容は、かんばつが森林の生産性に与えた影響(Aiba & Kitayama 2002)、調査区の樹木組成と種数-面積関係(Aiba, Kitayama & Repin 2002)、異なる地質条件における生産性の標高による変化(Kitayama & Aiba 2002)などである。今年度は、これまでマレーシア・キナバル山と鹿児島県・屋久島の、それぞれ4標高点に設定した永久調査区で、以下のような野外調査をおこなった。キナバル山では、9-10月に調査区の樹木の幹直径を再測定した。屋久島ではリター(落葉・落枝)落下量の継続観測をおこない、リタートラップをもちいて月1回回収し、葉・繁殖器官・枝・その他に分別して乾重を測定した。それと平行して、リターの分解速度を推定するため、リターバッグを用いた分解実験を開始し、年4回にわたって林床のリター層を採取して乾重を測定した。また、緯度傾度にそった解析のため、10月に亜熱帯に位置する沖縄県・西表島にも2標高点に新たな永久調査区を設定し、樹木の種を同定し幹直径を測定した。また、キナバル山での野外調査に基づき、以下のようなデータ解析と成果の発表をおこなった。1997年までに調査区で得られたデータをもとに地上部の純一次生産速度を推定し、その結果をイギリス生態学会の「生態学雑誌」で発表した(Kitayama & Aiba 2002)。また、1995-1999の幹直径データに基づいて地上部の純一次生産速度の変動を分析し、1997-1998年のエルニーニョ南方振動に伴うかんばつが生産を低下させたことを明らかにし、その結果を「熱帯生態学雑誌」で発表した(Aiba & Kitayama 2002)。地形による樹木種の組成と種多様性のちがいについても共著論文の一部を分担して、「植物生態学」誌で発表した(Takyu et al. 2002)。
教員評価システムの再設計とその効果に関する理論・実証的研究

教員を対象とする質問紙調査の結果,「目標管理を自身の振り返りや管理職とのコミュニケーションの手段や機会として捉えている実態やその効果は見られる一方で,教員ー管理職の個別的な営みにとどまり集団的・協働的な営みと捉える実態や効果まで至っていない。」「各学校段階とも,『管理職や同僚からのアドバイスや共有・協働』『校長との肯定的な関係』が正の影響を及ぼす。」などが明らかになった。質的調査においても,この結果を支持する実態が看取された。本研究では,平成24年度から再設計された教員評価システムが導入されたA県を事例として取り上げ,再設計プロセスを明らかにし,再設計されたシステムの効果と要因を検証・分析することが研究課題である。平成25年度の研究実績は以下の通りである。1.平成25年度に実施したA県公立小中高教員を対象とした質問紙調査の詳細な分析を進めた。組織文化,特に校長との肯定的関係性が目標管理の効果認識と関連があること,目標の設定・実施における集団性・協働性に対して意義は認めるものの実施度は低いこと等が明らかになった。研究成果は,川崎医療福祉学会誌にまとめた。2.平成24年度に実施したA県のある中学校を対象とした事例調査(管理職・教員インタビュー,グループ面談(中間面談)の観察,日常の学校観察等)の結果を分析し,目標管理の効果認識を高めるための方策として,管理職が学校経営実践上に目標管理を有機的に位置づけること,日々の管理職と教職員とのコミュニケーションが目標管理の効果認識を高めること等を明らかにした。研究成果は,広島大学学習開発学研究にまとめた。3.A県のある高等学校を対象に事例調査(管理職・教員インタビュー,グループ面談(中間面談)の観察,日常の学校観察等)を実施した。調査結果の分析は平成26年度に行う予定である。研究成果は,九州教育経営学会(平成26年6月,九州大学)にて発表する。4.新しい教員評価システムが導入されて2年が経過した時点での,A県公立小中高教員を対象とした質問紙調査を実施した。平成26年度には,詳細な分析を行い,研究成果は,日本教育経営学会(平成26年6月,北海道教育大学)にて発表する。本研究では,平成24年度から再設計された教員評価システム(以下,本システム)の導入が予定されているA県(本システム導入後5年間における理念と実態との乖離状況を解消する目的で継続的に再設計案を検討してきている)を事例として取り上げ,再設計プロセスを明らかにし,再設計されたシステムの効果と要因を検証・分析することが研究課題である。平成24年度の研究実績は以下の通りである。1.先行研究のレビュー及び申請者(代表者及び分担者)がこれまでに実施した調査結果を再分析した結果,教員評価における目標管理が職能成長と組織の活性化を促す可能性を見出した。2.A県における本システム再設計の主担当者であった現高校校長に対するインタビューより,目標管理に職能成長と組織の活性化の機能を期待して,再設計を行ったことが明らかになった。3.A県の小中高教員を対象として,本システムが導入された初期段階(当初面談終了後)における目標管理の効果に対する認識と関連諸要因に関する質問紙調査を行い,組織文化,特に校長との肯定的関係性が目標管理の効果認識と関連があること等が明らかになった。4.ある中学校を対象に実施した事例調査(当初面談参観,教員インタビュー,日常の学校観察等)を実施し,目標管理の効果的運用に関する多くの知見を得た。以上の研究成果は,日本教師教育学会(平成24年9月,東洋大学),九州教育経営学会(同11月,福岡教育大学)にて発表した。平成26年度の実績は以下の通りである。1.平成25年度に実施したA県のある高等学校を対象とした事例調査(管理職・教員インタビュー,グループ面談(中間面談)の観察,日常の学校観察)の結果を詳細に分析した。目標管理の効果認識を高めるための方策として,管理職が学校経営実践上に有機的に位置付けること,日々の管理職と教職員とのコミュニケーションが目標管理の効果認識を高めること,グループ面談が個業性の高い高等学校教員の行動特性を協働的・集団的なもの変容させる可能性を有していること等を明らかにした。研究成果は,広島大学大学院学習開発学研究誌にまとめた。2.平成27年1月には,A県の公立小学校・中学校・高等学校の校長を対象とする質問紙調査を実施した。前年度に実施した教員調査との比較分析を行うために,調査項目はほぼ同一なものであった。分析の結果,目標管理の効果認識,目標管理の諸実践の重要性や実践度については,全体として,教員よりも校長の方が肯定的回答結果を示した。

また,目標管理の効果的運用に関する自由記述の分析結果,目標管理を個人的な営みから協働的・集団的営みに変容させることの工夫や取り組みが必要であること等が明らかになった。研究成果は,日本教育経営学会(6月:東京大学)にて報告予定である。教育経営学1A県公立小中高教員を対象とする2回目の質問紙調査を実施し,再設計された教員評価システムの効果と課題を明らかにするためのデータが収集できたこと,2平成24年度のある中学校に続き,ある高等学校における年間を通じての事例調査を実施できたことなど,予定されていた量的・質的調査がほぼ達成されたから,である。初年度に予定していた研究計画である,先行研究のレビュー,調査対象自治体における教員評価制度の再設計のプロセス,教員を対象とする新しい教員評価制度に対する意識調査,事例校における質的調査がほぼ達成されたから,である。2年目に行った質問紙調査の詳細な分析をすすめること,高等学校を対象とする質的調査の結果を詳細に分析することである。さらに,可能ならば,年度末頃を目途に,目標管理のみならず,勤務評価も含めて,教員評価システムに対する評価を中心とする質問紙調査を実施したい。初年度に行った質問紙調査の詳細な分析をすすめること,事例校における質的調査を継続すること,事例校以外の校長や教員に対するインタビューを実施すること,初年度に行った質問紙調査の課題を踏まえたフォローアップ調査(質問紙調査)を実施すること,である。残額が少額で使用が困難であったため,次年度使用額が生じた。研究分担者への分担金:30万円,学会発表及び調査旅費:27万円,謝金・謝礼品(謝金:インタビューデータ入力,質問紙調査準備・整理等,謝礼品:インタビュー協力者):16万円,図書費:9万円,調査票・発送封筒・返送封筒・宛名ラベル:6万円,調査票印刷・発送・返送・データ入力・調査報告書:72万8,012円計160万8,012円初年度の予算のうち約20万円を次年度に繰り越すこととなった。理由は,協力予定校の都合等により,質問紙調査の実施数が大幅に減ったからである。具体的には,調査票・同印刷費・発送費・返送費・データ入力代が当初見込みより,低い額となった。次年度においては,次年度配分額と初年度の繰越額を合算して,有効に使用していきたいと考える。具体的には,事例校以外の校長や教員に対するインタビュー調査データの入力代行(文字起こし)費,初年度に行った質問紙調査の課題を踏まえたフォローアップ調査(質問紙調査)の実施に関する経費(調査票・同印刷費・発送費・返送費・データ入力費,関連図書購入費,を計画している。
チミジンホスホリラーゼによる肺癌の転移・浸潤能獲得機構に関する分子生物学的検討

肺腺癌は、難治性固形癌の代表である肺癌の中にあって近年その割合が急増しており、その新しい治療戦略の確立が急務となっている。チミジンホスホリラーゼ(TP)はピリミジン代謝に関わる酵素であるが血管新生因子でもあり、既に癌の増殖・転移機構に関与する分子の1つとして注目されている。他の癌種と同様に、腺癌を含めた非小細胞肺癌(NSCLC)においても腫瘍組織でのTPの高発現、TPと腫瘍組織内血管密度との正の相関や予後不良との関連が報告されており、TPの血管新生を介した増殖・転移機構への関与が示唆されている。しかしその作用に加え、近年、癌細胞自体の浸潤能への関与という新たなTPの作用の存在が、種々の癌腫において示唆されるようになってきた。我々は本研究により、肺癌細胞、特に肺腺癌細胞で、血管新生を介さないような浸潤能にもTPが直接関与する可能性を報告した(Sato J, Sata M, et al. Int J Cancer 2003)。即ち、TPはヌードマウスにおける肺腺癌細胞の転移を増強させたがこれはTPの特異的阻害剤(TPI)投与により抑制された。さらに肺腺癌細胞のMatrigelへの浸潤能はTPの強制発現により増強したが、これはTPIにより著明に抑制された。次にTPと接着因子であるα2,β1インテグリンとの関係を調べた。フローサイトメトリーで肺腺癌細胞(A549)のα2,β1インテグリンの発現を観察したところ、TPI処理によりβ1インテグリンの発現が有意に抑制された。(投稿中)これらの見当結果は、TPのシグナル経路の下流にβ1インテグリンがある可能性を示唆している。我々はまた、抗腫瘍効果が示唆されているマクロライド系抗生剤のクラリスロマイシン(CAM)の肺腺癌細胞への作用についても検討している。CAMはA549肺腺癌細胞の増殖能には影響を及ぼさないが、A549細胞のTP発現を濃度依存性に抑制し、さらにMatrigelへのA549細胞の浸潤能を濃度依存性に抑制した。同様の結果は金コロイド法による検討でも得られている。さらに、CAMのこうした浸潤能抑制作用のメカニズムを解明するために、まずインテグリンへの作用を調べたところ、α2,β1インテグリンの発現が、CAM処理により有意に抑制されることを見い出した(投稿中)。以上の結果から、CAMの肺腺癌細胞浸潤能抑制メカニズムの1つとしてα2,β1インテグリンを介した経路が示唆されるだけでなく、CAMからインテグリンへのシグナル経路がTPを経由している可能性が考えられた。

A549肺腺癌細胞株,A549/CV(コントロールベクター導入細胞),A549/TP(チミジンホスホリラーゼ強制発現株)の各細胞株をヌードマウスの尾静脈より注入し10週間後に肺表面の転移結節数を数え,転移・増殖能の変化につき検討を加えた。その結果,A549/TP群で有意に肺表面の転移結節数が増加し,TP inhibitor(TPI)投与により有意に肺転移を抑制することができた。我々はさらに,肺癌に対する,マクロライド系抗生物質であるclarithromycin(CAM)の抗腫瘍効果の報告に着目し,CAMのTPに対する効果を調べた。その結果,A549細胞においてCAMはTP発現を濃度依存性に低下させることがわかった。さらに,CAMはA549細胞の増殖能には影響を及ぼさなかったが,in vitroでA549細胞の浸潤能を抑制した(Matrigel invasion assay)。今後,CAM→TPのシグナルの下流に存在する分子(蛋白分解酵素,細胞骨格制御分子,接着因子など)を同定し,CAMのTPを介した肺腺癌細胞の浸潤能抑制機構を解明していく予定である。また,他の非小細胞肺癌株での検討,つまり,肺扁平上皮癌細胞株(QG56,EBC1,H520,LK-2),肺腺癌細胞株(PC9,NCI-H23,NCI-H322,NCI-H358,Calu-3,PC-14,LC-2/ad, RERF-LC-KJ,PL16T)を対象に,A549細胞と同様の検討,即ちTPの発現(ELISA),TP cDNA導入細胞の増殖能・浸潤能,in vivo浸潤・転移能,TPIの効果,の各々についても評価していきたい。次にTPと接着因子であるα2,β1インテグリンとの関係を調べた。フローサイトメトリーで肺腺癌細胞(A549)のα2,β1インテグリンの発現を観察したところ、TPI処理によりβ1インテグリンの発現が有意に抑制された(投稿中)。これらの検討結果は、TPのシグナル経路の下流にβ1インテグリンがある可能性を示唆している。我々は本研究に関連して、抗腫瘍効果が示唆されているマクロライド系抗生剤のクラリスロマイシン(CAM)の肺腺癌細胞への作用についても検討している。CAMはA549肺腺癌細胞の増殖能には影響を及ぼさないが、A549細胞のTP発現を濃度依存性に抑制し、さらにMatrigelへのA549細胞の浸潤能を濃度依存性に抑制した。同様の結果は金コロイド法による検討でも得られている。さらに、CAMのこうした浸潤能抑制作用のメカニズムを解明するために、まずインテグリンへの作用を調べたところ、α2,β1インテグリンの発現がCAM処理により有意に抑制されることを見い出した(投稿中)。以上の結果から、CAMの肺腺癌細胞浸潤能抑制メカニズムの1つとしてα2,β1インテグリンを介した経路が示唆されるだけでなく、CAMからインテグリンへのシグナル経路がTPを経由している可能性が考えられた。
精度１nm以下を実現する量産細線技術の開発

本研究では、精度1 nmの量産細線技術を実現するために、ナノ空間に自己組織化単分子膜の作製を試み、自己組織化パターンをうまく利用することで、ナノ空間界面制御を高度に行えるようにメカニズムの解明、およびナノ空間にビルディングブロックである化学修飾した金属ナノ粒子を高度に位置制御することを目的としている。そのためには、1 nm以下のラフネスを制御するためには、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程を解明することが必要必要不可欠である。本年度は、昨年度に引き続き、銀イオンをはじめとした金属イオン前駆体を含んだ固体子分子膜(ポリスチレン(PS)やポリメタクリレート(PMMA)中での金属ナノ粒子のアグリゲーション過程を原子間力顕微鏡を用いて調べた。具体的には、電子線(EB)描画装置でを微細パターンを形成させると同時に、高温(100-600°C)に加熱して金属ナノクラスターのアグリゲーション過程の温度依存性を走査型電子顕微鏡(SEM)で調べた。その結果、400°Cまでは金属ナノ粒子がアグリゲーションしてしまい、金属ナノ粒子の粒子サイズが大きくなることが明らかなった。一方、600°Cでは高温になりすぎて金属ナノ粒子が溶けてしまうことが明らかになった。加えて、微細なSAMパターンを形成したシリコン基盤を金属前駆体の水溶液中にいれてガンマ線照射したところ、微細パターン上に金属ナノ粒子がアグリゲーションすることができることが明らかになった。所属機関の異動により、研究実施場所の変更があり、当初計画していた金属ナノ粒子のアグリゲーション過程の実験を思うように進めることができなかったため精度1nmの量産細線技術を実現するための新しい微細加工技術を開発できたので、平成31年度は、引き続き表面ラフネスの原因の解明を目指す。具体的には、ラフネス形成へのSAM膜またはリガンドの構造および金属コアの影響および金属ナノ粒子のサイズの影響を調べる。解像度およびラフネスの計測には、SEM、限界解像度の計測にはAFMやSTEMを使用する。パターン表面のラフネス形成の解析には、解析ソフトを用いてSEM画像の解析を行い、ラフネス形成メカニズムを解析する。本研究では、精度1 nmの量産細線技術を実現するためナノ空間に自己組織化単分子膜の自己組織化パターンをうまく利用することでナノ空間界面制御を高度に行えるようにメカニズムの解明およびナノ空間にビルディングブロックである化学修飾した金属ナノ粒子を高度に位置制御することを目的としている。そのためには1 nm以下のラフネスを制御するためには、より均一かつ微細なナノ粒子またはナノクラスターを作製する必要がある。平成28年度は量子ビーム(ガンマ線および電子ビーム)を使ってポリプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)溶液中および水溶液でより均一かつ微細な銀ナノ粒子および金ナノ粒子の作製に試み、それらの安定性へのポリマー依存性、線量効果、金属ナノ粒子のサイズ、ポリマー構造の金属ナノ粒子形状依存性を調べた。その結果、ガンマ線および電子線照射によってPGMEA中で銀ナノ粒子および金ナノ粒子を作製することに成功した。また、ガンマ線を用いて水中で作製した銀ナノ粒子および金ナノ粒子を金基板上に鎖長の長さの異なるジチオールの自己組織化単分子膜(SAM)のパターン上に付着させることができるかを試みた結果、鎖長の違いによって付着しやすさが異なることが明らかになった。さらに、ポリスチレン薄膜中に金イオン前駆対および銀イオン前駆対を混ぜた高分子膜に電子線を照射することによっても銀ナノ粒子および金ナノ粒子が作製することができることが確認された。精度1 nmの量産細線技術を実現するために、平成28年度は量子ビーム(ガンマ線および電子ビーム)を使ってポリプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)溶液中および水溶液でより均一かつ微細な銀ナノ粒子および金ナノ粒子の作製に試み、10以下の均一な金属ナノ粒子を作製することができることが明らかになった。実際に、透過型電子顕微鏡(TEM)で粒子サイズや粒子サイズ分布についても調べ、プロセス依存性についても明らかにすることができた。このように得られた結果から、精度1 nmの量産細線技術を実現するためのビルディングブロックであるより均一かつ微細な金属ナノ粒子の作製できる糸口が見つけることができた。また、ガンマ線を用いて水中で作製した銀ナノ粒子および金ナノ粒子を金基板上に鎖長の長さの異なるジチオールの自己組織化単分子膜(SAM)をパターン化し、ジチオールをバインディングとして使用することができ、鎖長の違いによって付着しやすさが異なることが明らかになった。この結果から、金属ナノ粒子の配列制御法の開発に糸口が見つけることができた。加えて、ポリスチレン薄膜中に金イオン前駆対および銀イオン前駆対を混ぜた高分子膜に電子線を照射することによっても銀ナノ粒子および金ナノ粒子が作製することができることができ、固体高分子中での電子線によって誘起される金属ナノ粒子の生成過程を解明することもできた。そのためには1 nm以下のラフネスを制御するためには、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程を解明する必要がある。本年度は、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程の解明を試みた。

具体的には、金属イオン前駆体を含んだ固体高分子膜(ポリスチレン(PS)やポリメタクリレート(PMMA))に電子線を照射することで、金属ナノクラスターを高分子中に生成し、その後、加熱することによって、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程をSEMおよびAFMによって調べた。その結果、固体高分子膜中では溶液中とは異なり、加熱しないと金属ナノクラスターのアグリゲーションが抑制されて金属ナノ粒子が生成しないことが明らかになった。また、高温領域まで加熱しながらAFM測定を行い、薄膜中で金属同士がアグリゲーションする様子をin situで調べたが、ドリフトが観測され、ドリフトを最小限に抑えられる必要があることがわかった。加えて、電子線リソグラフィやナノインプリント法およびブロック共重合体のテンプレートを使って微細パターンを形成し、そのナノ空間領域に自己組織化単分子膜(SAM膜)を形成し、微細なSAM膜パターン上での金属ナノ粒子の配列制御を行った結果、金属ナノ粒子を配列制御することができることが明らかになった。精度1 nmの量産細線技術を実現するために、平成29年度は、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程の解明を試みた結果、金属イオン前駆体を含んだ固体高分子膜(ポリスチレン(PS)やポリメタクリレート(PMMA))に電子線を照射するのみでは、金属ナノ粒子が生成されないことが明らかになった。しかしながら、電子線照射後にポリマー薄膜を加熱することによって固体高分子膜中でも金属ナノ粒子のアグリゲーション過程が引き起こることを見出した。ドリフトが原因で金属アグリゲーションのIn situ測定はAFM測定によって成功されていないが、加熱することをしないとポリマー中で金属ナノクラスターのアグリゲーションが抑制されてしまい、アグリゲーションには電子線照射後の加熱が必要不可欠であることが示唆されている。それゆえ、金属微細配線を作製するためには照射後の加熱が必要不可欠であることを明らかにした。このように、得られた結果から、精度1 nmの量産細線技術を実現するための新しい微細加工技術の創成に糸口を見つけることに成功した。本研究では、精度1 nmの量産細線技術を実現するために、ナノ空間に自己組織化単分子膜の作製を試み、自己組織化パターンをうまく利用することで、ナノ空間界面制御を高度に行えるようにメカニズムの解明、およびナノ空間にビルディングブロックである化学修飾した金属ナノ粒子を高度に位置制御することを目的としている。そのためには、1 nm以下のラフネスを制御するためには、金属ナノ粒子のアグリゲーション過程を解明することが必要必要不可欠である。本年度は、昨年度に引き続き、銀イオンをはじめとした金属イオン前駆体を含んだ固体子分子膜(ポリスチレン(PS)やポリメタクリレート(PMMA)中での金属ナノ粒子のアグリゲーション過程を原子間力顕微鏡を用いて調べた。具体的には、電子線(EB)描画装置でを微細パターンを形成させると同時に、高温(100-600°C)に加熱して金属ナノクラスターのアグリゲーション過程の温度依存性を走査型電子顕微鏡(SEM)で調べた。その結果、400°Cまでは金属ナノ粒子がアグリゲーションしてしまい、金属ナノ粒子の粒子サイズが大きくなることが明らかなった。
脂質輸送粒子リポホリンの分子基盤

カイコのリポホリンについて、前年度に引き続き電子顕微鏡による観察と単粒子構造解析を進めた。前年度は試料の溶液条件を中性条件から少し酸性側のpH6.5に変更することで、試料の分散性が均一になることを見出した。本年度はpH6.5の条件でクライオ電子顕微鏡を用いた撮像を行った。クライオ用のグリッド調製においては、試料濃度やグリッドの種類を検討し、十分な数の粒子数が氷に包埋された条件においてデータセットを収集した。単粒子構造解析の結果は、中性条件で撮像した場合から大きな変化はなく、分解能も改善しなかった。しかし二次元再構成の結果から、リポホリン粒子は2つの大きなドメインに区分することができ、片方は脂質を多く含むドメインで、もう片方は主にタンパク質によって構成されるドメインであることが示唆され、リポホリン粒子の外形や特徴に関して有用な情報が得られた。pH6.5の溶液条件の場合、クライオでの観察においても粒子の分散性は改善していたが、中性条件の場合に較べると粒子の方位が限定されており、三次元再構成まで進めることはできなかった。リポホリンのX線結晶構造解析に関しては、前年度までに得られていた結晶化条件を最適化し、データセットの収集に成功したが、構造解析の結果、リポホリンではなくカイコのstorage proteinであることが判明した。解析した構造は、既報のものと異なる部分も見つかったため、構造の精密化を進めている。前年度に着手したカイコのLipid Transfer Particle(LTP)に関しては、クライオ電子顕微鏡での観察を行った。前年度にはLTPの形状が特徴的な頭部と柔軟性に富む尾部から構成されることをネガティブ染色像から見出していたため、本年度はクライオ電子顕微鏡を用いた観察を行なった。現在はデータセットの撮像に向けてクライオ条件の検討を行なっている。カイコリポホリンの単粒子構造解析を進めた。これまでに低分解能ながらリポホリン粒子の構造決定に成功しており、本年度は、精製方法と電子顕微鏡のクライオ条件の検討を行い、さらにリポホリンが輸送している脂質の解析に着手した。リポホリンはカイコの体液から密度勾配超遠心法とゲルろ過クロマトグラフィーで精製している。これまでは、精製に用いているバッファーは中性条件であったが、精製バッファーのpHを弱酸性から中性まで展開したところ、ゲルろ過クロマトグラフィーのピークはより単一となり、ネガティブ染色法では単分散の粒子が観察された。クライオ電子顕微鏡で観察するグリッド作製の条件検討として、グリッドの種類、サンプル濃度、界面活性剤の添加などを検討したが、劇的な改善には至っていない。リポホリンが輸送する脂質の解析においては、リポホリンから脂質を抽出し、TLCで展開して標準サンプルと比較した。カイコ体液より精製したリポホリンは、リン脂質を含む複数種類の脂質と結合していることが判明した。また、本年度はカイコの脂質輸送粒子の1つであるLTPについて、構造生物学的研究と生化学的研究を新しく始めた。LTPはリポホリンと脂質の受け渡しを行うことが知られている。カイコLTPについてもリポホリン同様にカイコ体液から精製し、ネガティブ染色による観察を行い、LTP粒子が頭部と尾部から形成される特徴的な形状を有していることを見いだした。カイコのリポホリン粒子の立体構造解析に向けて、最適な精製条件を決定した。リポホリンとともに脂質輸送に携わるLTPについても調製系を確立し、ネガティブ染色像を得た。リポホリンが輸送する脂質の解析も着実に進んでいる。引き続きリポホリンの立体構造解析を進める。

クライオ電子顕微鏡によるデータ収集に向けて、引き続きグリッド調製の条件を検討する。リポホリンの構成要素の1つである、apoLp-IIIについては、組換え発現系を用いて調製を始める。調製後は、脂質との結合実験、X線結晶構造解析などに着手する。リポホリンが輸送している脂質の解析は、質量分析装置を用いて、詳細な解析を始める。カイコのLTPについては精製条件を展開し、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出位置、ピーク形状、電子顕微鏡における粒子形状から評価する。最適な条件を見いだした後は、クライオ電子顕微鏡を用いた観察へと移行する。また、高速AFMを用いて、LTPの溶液中での動的な構造変化を観察する。最後に、リポホリンとLTPが複合体を形成するかをゲルろ過を用いて調べ、複合体を形成した場合は、粒子形状を電子顕微鏡で観察する。本年度は立体構造解析のための条件検討に多くの時間と労力をさくことになった。来年度は、本年度の結果を生かし、クライオ電子顕微鏡による観察、データ収集が多くなる予定である。そのため来年度に向けて、一部予算を残し、クライオ電子顕微鏡の使用料や学会での成果発表、解析PCに充てる予定である。
網羅的変異解析に基づく新規プロリン異性化酵素の発掘と創製

タンパク質を構成するアミノ酸残基の中でプロリン残基は、その直前の残基とのペプチド結合(X-Pro)に関して、トランスもシスも容易に取りうる点で特異な残基である。近年、このX-Proの構造異性化が、プロリン異性化酵素(PPIase)により制御され、様々な生理活性に活用されている事が明らかになってきた。ところが、PPIaseの機能に関しては、「そもそも、なぜX-Proの構造異性化機能をもつのか?」という基本問題に対してさえ明確に答えられないのが現状である。そこで、私は、PPIaseの酵素活性に注目し、基質結合部位に導入した網羅的変異を手がかりに、PPIaseが酵素活性を発現するのに必要な条件を解析してきた。その結果、PPIase活性の発現には側鎖の関与は必ずしも必要とされず、適当なサイズのポケットだけがあれば発現される機能であると推察するに至っれ。この推察を確かめるため、本研究では、PPIase活性を示さないタンパク質としてバルナーゼ用い、アミノ酸残基置換により人為的にポケットを作成し、PPIase活性の発現を調べた。その結果、Phe56Gly/Arg59Gly/His102Tyr/Tyr103Glyの四重変異により、ポケットを導入したバルナーゼは、野生型FKBPの約4%の活性を示すことがわかった。このようにして、適当なサイズのポケットが存在することがPPIase活性発現に必要十分であることが実際に確認された。そこで、これらの実験結果に基づき、新たにPPIase活性発現機構モデルを提案した。タンパク質の構成要素であるプロリン残基の異性化反応は、プロリン異性化酵素(PPIase)により制御され、様々な生理活性に活用されている事が明らかになってきた。しかし、PPIaseの機能に関しては、依然として未解決なままである。私はPPIaseのこの活性に注目し、FKBP12をモデルとして2年前からPPIaseが酵素活性を発現するために必要な条件を解析してきた。その結果、活性部位の主鎖構造が適当な配置をとりさえすれば、側鎖の種類にかかわらずPPIase活性が発現することが示唆された。次に、この結果を別の面から検証するために、FKBP12の活性部位と同様な主鎖配置を持つ非PPIase蛋白質がPPIase活性を示すかどうか調べることにした。まず、そのための検索条件を決定し、それを用いてPDBデータベース中の全エントリーからFKBP12の活性部位に類似した立体構造を持つ蛋白質を全て抽出した。検索条件の満足度に応じてスコアを定義すると、上位スコアを持っものにはFKBPファミリーに属する蛋白質が並び、中位スコアを持つものにはPPIaseのシクロフィリンファミリーやパルブミンファミリーに属する蛋白質が並んだ。また、上位スコアから中位スコアまでには、PPIase以外の蛋白質も数多く含まれていた。そこで、それらの中から、入手が容易なプロリルエンドペプチダーゼを選び、PPIase活性の有無を調べる実験を行った。その結果、この蛋白質は野生型FKBP12の20%の比活性を有することがわかった。このことは、活性部位の主鎖構造のみがPPIase活性の発現に必要であることを示す一例となっている。なお、データベース検索において東大・医科学研究所の木下賢吾博士からご協力をいただいた。(論文投稿準備中)タンパク質を構成するアミノ酸残基の中でプロリン残基は、その直前の残基とのペプチド結合(X-Pro)に関して、トランスもシスも容易に取りうる点で特異な残基である。
強誘電性液晶と高分子複合体のフォトリフラクティブ特性の研究

平成18年度では,光導電性モノマー,液晶性モノマーによって高分子安定化した強誘電性液晶のフォトリフラクティブ特性及び他の物理特性についての検討を行った.強誘電性液晶を用いたフォトリフラクティブ材料は,非常に高速に応答する利点があるが,液晶配向欠陥に起因する光散乱によりフォトリフラクティブ効果が大きく阻害される欠点がある.強誘電性液晶を高分子安定化することにより,液晶配向欠陥が少なく外部刺激に耐性を有する材料が得られた.配向させた強誘電性液晶/モノマー混合材料に光を照射することにより,形成された高分子は液晶配向膜のラビング方向に凝集することを確認した.更に,電気光学ヒステリシス特性は光照射前では双安定性を示すが,高分子安定化し強誘電性液晶中に高分子を導入することにより単安定性となることを見出した.液晶性モノマーで高分子安定化した強誘電性液晶材料において,フォトリフラクティブ効果が発現することを見出した.液晶性高分子の導入によりフォトリフラクティブ効果の応答時間に大きく影響することが分かった.光導電性モノマーによって高分子安定化した強誘電性液晶についての検討を行った.高分子安定化することにより,液晶フィルム厚の増加に伴うフォトリフラクティブ効果の著しい減少を緩和できることを見出した.また,厚いフィルム中では印加電界の極性がフォトリフラクティブ効果の発現に大きな影響を及ぼすことを見出した.高分子と強誘電性液晶との複合体のフォトリフラクティブ効果の検討を行っている.フォトリフラクティブ効果とは,光を吸収することによって屈折率が可逆的に変化する現象である.光吸収で屈折率が変化する現象には様々なものがあるが,光吸収による電荷分離状態の形成と電気光学効果の発生というメカニズムを経て屈折率が変化するものを特にフォトリフラクティブ効果と呼ぶ.フォトリフラクティブ効果は,二次元光信号(画像信号)の制御や演算に直接応用できるため,優れた材料の出現が待たれている.フォトリフラクティブ物質中でレーザー光を干渉させれば,屈折率の値が周期的に変化した格子縞(屈折率格子)が形成される.フォトリフラクティブ効果を示す物質は,光導電性化合物,電子捕捉剤,電気光学応答性化合物(電圧によって屈折率が変化する)の3成分で構成される.このような物質中でレーザー光を干渉させると,先ず干渉縞の明るい部分で光導電性化合物が光を吸収して正負の電荷が発生する.電子は捕捉剤に捕捉されて動けないが,正電荷(ホール)は,熱的に全体に拡散する.すると,明るい部分はマイナスに,暗い部分はプラスに帯電する.その結果,干渉縞の明るい部分と暗い部分との間に,電界(内部電界)が発生する.この電界によって電気光学効果が誘起され,屈折率が変化する.本研究では,光導電性高分子を用い,フォトリフラクティブ材料としての高性能化を目指した.低分子量の光導電性化合物を分散させた場合に比べて,高分子では光導電性クロモフォアが密集しているため,内部電界の形成が容易になると考えられる.高分子と強誘電性液晶との複合体のフォトリフラクティブ効果の検討を行っている.フォトリフラクティブ効果とは,光を吸収することによって屈折率が可逆的に変化する現象である.光吸収で屈折率が変化する現象には様々なものがあるが,光吸収による電荷分離状態の形成と電気光学効果の発生というメカニズムを経て屈折率が変化するものを特にフォトリフラクティブ効果と呼ぶ.フォトリフラクティブ効果は,二次元光信号(画像信号)の制御や演算に直接応用できるため,優れた材料の出現が待たれている.フォトリフラクティブ物質中でレーザー光を干渉させれば,屈折率の値が周期的に変化した格子縞(屈折率格子)が形成される.フォトリフラクティブ効果を示す物質は,光導電性化合物,電子捕捉剤,電気光学応答性化合物(電圧によって屈折率が変化する)の3成分で構成される.このような物質中でレーザー光を干渉させると,先ず干渉縞の明るい部分で光導電性化合物が光を吸収して正負の電荷が発生する.負電荷は電子捕捉剤に捕捉されて動けないが,正電荷(ホール)は,熱的に全体に拡散する.すると,明るい部分はマイナスに,暗い部分はプラスに帯電する.その結果,干渉縞の明るい部分と暗い部分との間に,電界(内部電界)が発生する.この電界によって電気光学効果が誘起され,屈折率が変化する.本研究では,強誘電性液晶に光導電性モノマーを分散し光重合した高分子安定化材料についての検討を行った.平成18年度では,光導電性モノマー,液晶性モノマーによって高分子安定化した強誘電性液晶のフォトリフラクティブ特性及び他の物理特性についての検討を行った.強誘電性液晶を用いたフォトリフラクティブ材料は,非常に高速に応答する利点があるが,液晶配向欠陥に起因する光散乱によりフォトリフラクティブ効果が大きく阻害される欠点がある.強誘電性液晶を高分子安定化することにより,液晶配向欠陥が少なく外部刺激に耐性を有する材料が得られた.配向させた強誘電性液晶/モノマー混合材料に光を照射することにより,形成された高分子は液晶配向膜のラビング方向に凝集することを確認した.更に,電気光学ヒステリシス特性は光照射前では双安定性を示すが,高分子安定化し強誘電性液晶中に高分子を導入することにより単安定性となることを見出した.液晶性モノマーで高分子安定化した強誘電性液晶材料において,フォトリフラクティブ効果が発現することを見出した.液晶性高分子の導入によりフォトリフラクティブ効果の応答時間に大きく影響することが分かった.

光導電性モノマーによって高分子安定化した強誘電性液晶についての検討を行った.高分子安定化することにより,液晶フィルム厚の増加に伴うフォトリフラクティブ効果の著しい減少を緩和できることを見出した.また,厚いフィルム中では印加電界の極性がフォトリフラクティブ効果の発現に大きな影響を及ぼすことを見出した.
ヒトアンジオテンシン受容体の構造情報に基づく血圧調節機構の理解から創薬へ

血圧の調節はアンジオテンシン受容体というGタンパク質共役受容体により行われており、昇圧を担う1型と降圧を担う2型(AT2R)が存在する。特にAT2Rは血圧調節以外に血管保護作用においても重要な役割を担っている。我々は生理的に重要な機能を果たすAT2Rの立体構造から血圧調節機構の解明を目指した。AT2R単独では結晶化が困難であったが、AT2Rを特異的に認識する抗体と複合体を形成させることで結晶化に成功した。さらにSPring-8のマイクロフォーカスビームラインであるBL32XUにより構造解析に必要なデータを収集することに成功した。現在、このデータを用いて構造決定を行っているところである。平成25年度に予定されていた研究計画では、先行しているアンジオテンシン受容体2型(AT2)については結晶化を、1型(AT1)については安定化変異体の作製を行うこととであった。現状ではAT2については計画通り順調に進んでいるものと考えられる。しかしながらAT1については変異体の作製に問題があり必ずしも順調とは言えないのが現状である。AT2については現在、細胞内第3ループに挿入しているT4リゾチームからアポ型チトクロームB562の変異体であるBRILを挿入する事で結晶化に成功した。これまでに検討していたT4リゾチームが挿入された変異体と今回新しく構築したBRIL挿入変異体と比較して、1昆虫細胞を用いた発現における生産量、2精製後の変異体サンプルにおけるゲル濾過の単分散性や熱安定性など、その性質に顕著な差は認められていない。しかしながら結晶はBRIL変異体でのみ得られている。この事は精製サンプルを用いた従来法による安定性の検討は必ずしも結晶のなり易さを反映するとは限らない事を示しているものと考えられる。AT1については変異体の作製に時間を要しているのが現状である。AT2と異なり、AT1はN末端やC末端の欠損や細胞内第3ループへのT4リゾチームやBRILの挿入によって安定化していない。また、昆虫細胞を用いた発現、精製でも結晶化まで進んでいるAT2と比較して、ゲル濾過による単分散性の欠如や低熱安定性を示している。これはAT1の安定化が不十分である事が原因だと考えられる。以上のように現状ではAT1は結晶化を行えるようなサンプルは得られていない。しかし、得られたサンプルを基にAT1の安定化を目的とした特的抗体の作製が可能であるかどうかを検討中である。平成26年度に予定されていた研究計画では、現在得られているアンジオテンシン2型受容体(AT2)とその特異的抗体の共結晶を大型放射光施設SPring-8のマイクロフォーカスビーム(BL32XU)においてタンパク質の結晶であることを検討する、および1型受容体(AT1)の安定化変異体の作製を行うことであった。AT2の結晶化において、前年度までに得られた結晶の再現性は非常に良く、安定してX線回折実験を行うことができた。しかしながら、その分解能は構造解析に至る程ではないことが確認された。そこで本年度は、更なる結晶性の向上を目指してAT2変異体の作製およびリガンドの変更を行った。具体的には、AT2の細胞内第3ループに挿入されている細菌由来の親水性タンパク質であるbRILの挿入位置を変えることによる結晶性の変化を検討した。その結果、現在bRILを挿入している位置を変えると結晶の質がむしろ低下することが明らかとなった。さらに、AT2の精製・結晶化に用いるリガンドによる結晶性の変化を検討した。前年度までに用いていたリガンドはPD123319という低分子アンタゴニストであったが、Sarileというペプチドアンタゴニストによる結晶化を行った。AT2の変異体作製およびリガンドの変更を行った結果、昆虫細胞による生産量および精製純度に変化は見られなかったが、結晶化においては従来よりも結晶性の改善が認められた。そこで、この新しい結晶をBL32XUで回折実験を行ったところ、最大分解能が4Åで、空間群がI222、結晶格子がa = 95Å、b = 154Å、c = 415Å、α= β= γ= 90°であることが明らかとなった。一方、AT1の安定化変異体の作製は非常に難航しており、現在までに結晶化に資するサンプルの調製までに至っていない。これまでの研究成果から、AT2bRIL変異体と4A03Fabの複合体をLCP法により結晶化し、その結晶を得ることに成功した。さらにこの結晶を用いた回折実験をBL32XU(SPring-8)で行った結果、最大4Åの回折点を確認した。そこで最終年度となる本年度は、結晶化条件の向上およびX線回折データの収集を行った。また、分子置換法による構造決定を目的として4A03Fab単独の結晶化を行いその構造を明らかにした。具体的には、4A03Fab単独の構造は蒸気拡散法により結晶化を行うことで初期結晶を得た。さらにSeeding法による結晶の質の向上を行った。この結晶を用いてPhoton Factory(高エネルギー加速器研究機構)のBL-1Aビームラインで回折実験を行った。その結果、1.7Åの分解能でデータセットを取得でき、このデータから構造決定を行った。次にAT2/4A03Fab複合体の共

結晶化の最適化条件の検討およびデータ測定法の改善をさらに進めた結果、前年度まで4 Åであった最大分解能が3.03Åまで向上した。これらの最適化された結晶はBL32XUでデータ測定を行い、得られたデータのうち解析可能なものをmergeすることにより3.2 Åでデータセットの取得を完了することができた。また得られた結晶の空間群はP21212、格子定数はa = 49.03, b = 56.07, C = 467.39 Åであった。得られたデータセットから分子置換法により構造解析を行った結果、モデルとデータの適合度を表すFree R/Rは0.394/0.323であった。この結果は恐らく全体構造としては間違っていないものと考えられるが、現状の解析結果では構造が解けたとはいえないのも事実である。この点については今後、モデル分子を変更するなど更なる解析が必要であると考えられる。血圧の調節はアンジオテンシン受容体というGタンパク質共役受容体により行われており、昇圧を担う1型と降圧を担う2型(AT2R)が存在する。特にAT2Rは血圧調節以外に血管保護作用においても重要な役割を担っている。我々は生理的に重要な機能を果たすAT2Rの立体構造から血圧調節機構の解明を目指した。AT2R単独では結晶化が困難であったが、AT2Rを特異的に認識する抗体と複合体を形成させることで結晶化に成功した。さらにSPring-8のマイクロフォーカスビームラインであるBL32XUにより構造解析に必要なデータを収集することに成功した。現在、このデータを用いて構造決定を行っているところである。当該年度において達成すべき内容はAT2の結晶をSPring-8にてタンパク質の反射があるかを確認する、およびAT1の安定化変異体を作製することであった。AT2において、得られたAT2とその構造特異的抗体の共結晶はタンパク質のものであるということが、SPring-8のマイクロフォーカスビーム(BL32XU)をもちいることで明らかとなった。さらに本年度の更なる結晶の最適化により、その分解能が向上し、最大分解能が4Å、空間群がI222、結晶格子がa = 95Å、b = 154Å、c = 415Å、α= β= γ= 90°であることが分かった。この点においては当該年度の目的は達成したものと考えられる。一方、AT1については当該年度に予定していた安定化変異体の作製には残念ながら至っていないのが現状である。この点においては残念ながら当初の目的を達成できていない。しかしながら、GPCRの構造解析の難しさを考慮すると全体としては概ね期待通りと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。構造生物学本年度は本研究課題の最終年度であるので、AT2の構造解析に集中し、その構造を明らかにすることとする。現状では、AT2と抗体の共結晶化において、その結晶性は向上しており、またそれに伴い最大分解能の向上も認められた。しかしながら未だ構造解析にまでは至っていない。この原因として、1構造解析を行うために必要なデータを収集しきれていない、2最大分解能が足りないことが考えられる。これらの問題点は結晶化に問題があるものと考えられる。そこで本研究年度では、結晶化条件の最適化を行う。また、最低化の効果を実際にマイクロフォーカスビーム(110μm x 110 μm)を用いた回折実験によりその確認しながら進めて行く。
熱帯アジアにおける在来反芻家畜の潜在能力の把握に関する調査研究-資源の持続的有効利用に基づいた乳肉生産を目指して-

(1)代謝試験を行い、タイ在来種雄山羊および在来種雌牛のエネルギーおよび窒素の利用性に関するデータを得た。低中程度の窒素・エネルギーレベルで、在来家畜が効率的な窒素・エネルギー代謝を行うことが示された。(2)南タイのPaspalumplicatulum草地で若干の濃厚飼料を補給してタイ在来種育成雌牛を1年間連続放牧した場合、弱放牧区(3頭/ha)に比較して強放牧区(6頭/ha)の牧草現存量は年後半から木きく低下したが、牛の成長は抑制されないことを示した。(3)タイ在来種若雄牛に、Paspalum plicatulum乾草を基礎飼料としてアブラヤシ核粕を主体とする濃厚飼料(CP=13.7%)を体重比1.0%補給した場合、日増体量0.19-0.34kgを達成し、比較的効率的な窒素代謝を行うことが示された。(4)ネパール国チトワン県における酪農家の耕地面積、規模、経営状況の詳細を調査した。耕地面積が0.5-2haの中規模農家が70%以上を占め、平均の泌乳頭数は1.2、全支出に占める購入飼料費割合が40%を超える場合が多かった。(5)当該地域において同一年齢で比較した場合雌牛の体重の変異は雌水牛に比べて非常に大きく、ホルスタイン系雑種の雌に比べて雌水牛の初期成長は遅いが、成熟サイズは大きいと推定された。(6)当該地域において無発情の家畜には鈍性発情、微弱発情、発情見逃し症候群が多く認められ、その頻度は水牛に比較して牛で高かった。また水牛・牛とも卵胞発育障害例が多いと診断された。(7)三つの農村における牛・水牛の乳量、体重、栄養状態に関する調査から、暑期に分娩した牛の305日乳量は他の季節に分娩した牛に比べて低いこと、特定の農村で冬期から暑期にかけて半数以上の牛の血中総タンパク、血中尿素窒素濃度が標準値以下であることを示した。(8)冬期の良質粗飼料不足を補う目的でトウモロコシサイレージをイナワラに0,33%,67%,100%代替させる区を設定し、水牛・牛を対象に泌乳試験を行った。乳牛ではサイレージ給与水準の上昇に従って乾物摂取量と乳量は増加する傾向が認められた。水牛ではサイレージ給与水準の上昇に従って乾物摂取量は増加したが、乳量には反映されなかった。1.マレー半島(タイ南部)における研究実績タイ南部で広範に飼養されているタイ在来種山羊(TN)の栄養特性を調べる目的で、特に窒素代謝に焦点を絞り、アングロヌビアン種との交雑種(F1)との比較検討を行った。2-3歳齢のTNとF1の雄山羊各4頭を用いた。異なるCP含量の濃厚飼料を調整し、体重の1%量を与えた上で乾草(CP2%)を自由採食させ、代謝試験を行った。