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タイ肝吸虫感染による胆管癌の発癌分子メカニズム

本研究はタイ肝吸虫感染による胆管癌の発癌に関与する遺伝子、シグナル経路及び胆管癌の病期、転移、生存率、予後と相関する腫瘍マーカーを同定した。結果は感染が起した慢性炎症、肝吸虫の物理的及び化学的な損害によって、DNAメチルなど遺伝的エピジェネシスが起し、腫瘍抑制因子、細胞の解毒酵素や酸化還元酵素の発現が低下になり、細胞増殖・分化因子及び癌遺伝子の発現が増加及び活性化になり、癌化に至る分子メカニズムを明らかにした。タイ肝吸虫(Opisthorchis viverrini)および肝吸虫(Chlonorchis sinensis)は東南アジアに広く分布しており、その感染者は3500万人と推測される。疫学調査や動物実験から肝吸虫感染が胆管癌を誘発することが明らかにされたが、その発癌機序はいまだ不明である。本研究は、肝吸虫感染発癌動物モデルを用いて、cDNAマイクロアレイ解析により癌化に伴う遺伝子を検索・同定し、その発癌の分子メカニズムの解明及び早期診断・遺伝子治療の研究に応用する目的である。平成21年度の実験はタイ肝吸虫感染による発癌動物モデルの設立、径時的にサンプル採取、RNA抽出、マイクロアレイなどを行った。組織学の観察の結果は感染のみまたDNMA投与のみのハームスタでは炎症などが見られたが、癌化に至らなかった。一方、感染プラスDNMA投与したハームスタでは胆管癌の組織像が確認された。これらのサンブルをマイクロアレイで解析した結果は、感染後1,3及び6ヵ月において、131の遺伝子の発現が高くなり、142の遺伝子の発現が低下になったことを示した。これらの遺伝子の多くは細胞分化(Npdc1, Ltf, Enc1, Pmp22, Cebpd)、変異(Pdgfa, Frat1, Junb, Tgfb1)、増殖(S100a6, Lifr, Klf4, Stat1)、周期(Ccnd1, Id1, Cdk4, Maff)、アポトーシス(Mfge8, Lass4, Phlda3, Tnfrsf12a)に関連するものであり、感染による発癌に関与する候補遺伝子と考えられる。また、発現変化がみられる遺伝子の中に、既知癌遺伝子があるが、癌化に関連について不明である遺伝子も多くあり、今後、これらの遺伝子の詳しい解析は感染による発癌に関わる特異的な遺伝子/シグナル経路の発見が期待される。さらに、発現変化があったCyclinD1を注目し、よく知られている癌化シグナルであるRbシグナル経路に関連遺伝子Rb1, cyclinD1, Cdk4及びp16の発癌動物においての発現動態及び肝吸虫感染歴がある胆管癌患者においての発現を調べた結果はこのシグナル経路が感染による発癌に関与することを明らかにした。平成22年度はマイクロアレイの結果を基づいて、リストした候補遺伝子から重要なものを選べ、詳しく解析を行い、癌化に関与する遺伝子及び分子マーカーを同定する予定である。タイ肝吸虫(Opisthorchis viverrini)の感染は胆管癌の発癌に関連があることが明らかにされたが、その分子メカニズムはいまだ不明である。本研究の目的は発癌の分子メカニズムの解明、早期診断及び遺伝子治療に応用する腫瘍マーカーを同定することである。平成21年度はタイ肝吸虫の発癌モデルを用いて、cDNAマイクロアレイの解析を行って、癌化に関与する候補遺伝子をリストアップした。平成22年度は、リストアップした候補遺伝子から、発癌に関与する重要なシグナル経路、また胆管癌において報告されていない遺伝子を選んで、感染による発癌モデルにおいて発現動態、癌組織に局在の同定、またタイ肝吸虫流行地由来胆管癌患者において発現及び臨床病理との関連性の検討を行った。その結果、細胞増殖・分化(Pdgfa,Pdgfra,Pdpk1,Tgf,Galectin,Catenin,S100a2,S100a6,S100P)、細胞周期(Lass4)、アポトーシス(Mfge8)、細胞骨格(Tubb2b,Krt8/18,Stmn1)、ヒストン脱メチル化酵素(Rbp2)などの遺伝子の発現は感染による発癌において高くなり、それらの発現動態は発癌の病理過程に一致した。一方、肝臓において解毒を行う酵素(Cyp2a)及び炎症によるNOS代謝に関わる酸化還元(Idb1,Idh2,Hgd)などの遺伝子の発現は低下になったことを示した。さらに、Pdgfa及びPdgfraが肝吸虫流行地由来78例胆管癌患者において検討結果は、67例患者の癌組織においてPdgfaのmRNAレベルが高くなっり(85.9%>3folds)、47例において免疫染色が陽性(60.3%)、陽性反応は上皮癌細胞質に局在していることを示した。また、それら陽性は癌の病理分期、生存率及び転移と相関性があった。

ミューテーションの解析した結果はPdgfra遺伝子において、三つのミューテーション(Exon18,824 C>T;Exon13,603 G>A;Exon10,603 G>A)が発見し、患者においてはそれぞれ60%,46%と23%であった。以上の結果はタイ肝吸虫の感染による炎症、物理的及び化学的な損害によって、解毒酵素や酸化還元酵素が低下になり、細胞増殖・分化因子が増加及び活性化になり、癌化に関与することを示唆します。タイ肝吸虫(Opisthorchis viverrini)の感染は胆管癌の発癌を誘導することが明らかにされたが、その分子メカニズムは不明である。本研究の目的はその発癌の分子メカニズムの解明及び早期診断及び遺伝子治療に応用する腫瘍マーカーを同定する。今年度はcDNAマイクロアレイの解析によるリストアップした癌化に関与する候補遺伝子の流行地由来胆管癌患者における発現及び臨床病理との相関性を検討した。Galectin-1は細胞-基質間の接着や細胞のアポトーシス、腫瘍の形質変換などに関与していることが知られている。肝吸虫感染による胆管癌発癌動物モデルにおいて、galectin-1の発現は癌化に伴って著しく増加した。発癌動物及び78例胆管癌患者を解析した結果は、癌組織におけるgalectin-1の発現が高くなり、発現がtumor stromaの線維芽細胞および胆管癌上皮細胞に局在することを示した。さらに、臨床病理性との相関性の解析結果は、発現が胆管癌の進行期、転移及び生存率と相関して、予後因子であることを示した。結果はgalectin-1が肝吸虫感染による胆管癌の発癌に関与すること、腫瘍因子として、診断、治療及び予後に応用性があることを示唆した。同様な解析はRb1,cyclin D1,HSP70,Mfge8及びHDAC6の発現が胆管癌のタイプ、進行期、生存率と相関することを明らかにした。
工学における連続体の理論研究と数値解析

・今まで申請者が世話役となり,1995年1月27日29日,1995年11月23日25日,1997年1月14日15日,1999年1月21日23日,1999年11月15日17日と5回に渡り破壊力学の理論研究者と応用数学の研究交流の場を設けた。本年度は,2000年11月10日12日に七尾市和倉逓信保養所過雁荘で,「破壊の理論研究と数値解析」として上記研究集会の6回目を参加者18名、講演11件で開催した。・パリ大学6のO.Pironneau教授とF.Hecht氏及び申請者を中心におこなわれているFreeFEM+が正式公開され、申請者はOpenGLによる3次元グラフ表示,アニメーション表示など数値視覚化を含む統合システムとしてのフロントエンドを開発し、公開予定である。また,FreeFem+のオンラインマニュアルの充実を図り,応用数学教育への利用を考えている。作成したソフトウェアは,OpenGL(GLUT)のみから作ったので,UNIXなどでも動作するはずである。ユーザインターフェースの開発やクライアント・サーバ型プログラムも開発中である。・2000年問題やネットワークでのセキュリティの問題が出てきたので,セキュリティ強化とデザイン変更する必要が出てきた。そのため,本研究関係のWWWサーバは停止しているが,本研究費を使ってWWWサーバの再構築を実施した。・本研究課題における研究活動とFreeFem+の公開情報等は、WWWサーバで公開する予定である。・山口大学三好哲彦教授主催の国際会議MSCOM2000(2000年9月29日10月3日)の支援をした。・今まで申請者が世話役となり,1995年1月27日29日1995年11月23日25日,1997年1月14日15日と3回に渡り破壊力学の理論研究者と鷹揚数学の研究交流の場が設けた。本年度は,1999年1月21日23日に東京大学地震研究所で「破壊現象の数理研究とその周辺-地震への応用を念頭に-」として上記研究集会の4回目を開催した。この研究集会は地震研共同研究(研究発表会)として開催したが,本課題研究からも数人の旅費補助と報告集の印刷代補助を行った。・11月9日から20日まで,ロシア科学アカデミーの流体力学Lavrentyev研究所のA.Khludnev教授を招聘した。Khludnev教授は,unilateral条件をもつ亀裂問題を研究している。広島電電機大学で報告者へのレビューと広島大学での講演を行った。・O.Pironneau教授とF.Hecht氏を中心に,従来のFreeFEM(Ver3.4)を全而的にC++で書きなおし,オブジェクト指向言語として拡張することを計画し,FreeFEM+という名前で開発中である。報告者もFreeFEM+の開発グループに参加している。現在はベータ版であるが,近く正式版を公開する予定である。・今まで申請者が世話役となり,1995年1月27日29日,1995年11月23日25日,1997年1月14日15日,1999年1月21日23日と4回に渡り破壊力学の理論研究者と応用数学の研究交流の場が設けた。本年度は,1999年11月15日17日に神奈川県湘南国際村で,「破壊の理論研究と数値解析」として上記研究集会の5回目を参加者21名、講演17件で開催した。・11月14日から25日まで,ロシア科学アカデミーの流体力学Lavrentyev研究所のA.Khludnev教授を招聘した。Khludnev教授から,unilateral条件をもつ亀裂問題について情報収集と議論をした。

なお、Khludnev教授は申請者と共に、「破壊の理論研究と数値解析」と、11月17日19日の京都大学数理研での「偏微分方程式の数値解法とその周辺」に参加し、参加者と研究交流を行った。・パリ大学6のO.Pironneau教授とF.Hecht氏及び申請者を中心におこなわれているFreeFEM+が正式公開され、申請者はMS-Windows版の数値視覚化を含む統合システムとしてのフロントエンドを開発し、α版を申請者のホームページhttp://barnard.cs.hkg.ac.jpで公開している。また、OpenGLを使ったUNIXなどでも動作するユーザインターフェースの開発やクライアント・サーバ型プログラムも開発中である。・ドイツ・シュツツガルト大学のWendland教授を訪ね、Bochniak氏から偏微分境界値問題に関する形状感度解析に関する資料を収集した。・本研究課題における研究活動とFreeFEM+の公開情報等は、上記URLに公開中である。・今まで申請者が世話役となり,1995年1月27日29日,1995年11月23日25日,1997年1月14日15日,1999年1日21日23日,1999年11月15日17日と5回に渡り破壊力学の理論研究者と応用数学の研究交流の場を設けた。本年度は,2000年11日10日12日に七尾市和倉逓信保養所過雁荘で,「破壊の理論研究と数値解析」として上記研究集会の6回目を参加者18名、講演11件で開催した。・パリ大学6のO.Pironneau教授とF.Hecht氏及び申請者を中心におこなわれているFreeFEM+が正式公開され、申請者はOpenGLによる3次元グラフ表示,アニメーション表示など数値視覚化を含む統合システムとしてのフロントエンドを開発し、公開予定である。また,FreeFem+のオンラインマニュアルの充実を図り,応用数学教育への利用を考えている。作成したソフトウェアは,OpenGL(GLUT)のみから作ったので,UNIXなどでも動作するはずである。ユーザインターフェースの開発やクライアント・サーバ型プログラムも開発中である。・2000年問題やネットワークでのセキュリティの問題が出てきたので,セキュリティ強化とデザイン変更する必要が出てきた。そのため,本研究関係のWWWサーバは停止しているが,本研究費を使ってWWWサーバの再構築を実施した。・本研究課題における研究活動とFreeFem+の公開情報等は、WWWサーバで公開する予定である。・山口大学三好哲彦教授主催の国際会議MSCOM2000(2000年9月29日10月3日)の支援をした。
日本人におけるEGFR遺伝子変異型肺がんリスクに関連する遺伝子の解明

近年多くの肺がん感受性マーカーが明らかになってきたことにより、今後は原因遺伝子に応じた治療が開発されることが期待される。日本人における肺がんリスクに対するEGFR遺伝子変異の寄与を検討するため、我々はEGFR突然変異の有無を高速に解析するプロトコールを確立し、変異の有無と肺がんの組織型・喫煙状況・性別など臨床病理学的因子との相関関係を統計学的に解析した。まずは1ランあたり768サンプルのシークエンスができるプロトコールを確立した。768検体をシークエンスした結果、EGFRのエクソン1821に変異が見つかったのは214件体(27.9%)、そのうち25検体では2つ以上のエクソンに変異が同定された。未知の変異は同定できなかった。過去に申請者らは、日本人集団の肺がん患者検体2,415例、対照群検体4,794例の全ゲノム関連解析(GWAS)を実施している。今回のシークエンス結果を足すと、計551件体がEGFR変異あり、1008検体が変異なし、ということが判明した。GWAS結果を用いてEGFR遺伝子変異の有無を考慮した関連解析、さらに肺がんの組織型・喫煙状況・性別などとの相関関係を統計学的に解析した。EGFR変異陽性vsコントロール群など様々なsubtype解析を実施したが、GWAS有意を示す新たなSNPは見つからなかった。しかしながら患者とコントロール群の間で有意差を示すSNPは多数見つかっているため、今後は独立した集団の検体を用いた再現性検証のため検体数の増加につとめる。日本人の肺がんのおよそ3040%は、このEGFR遺伝子変異が原因で起こることが知られている。感受性遺伝子を特定し発症危険群を特定することは発症予防を目的とした治療を可能とする研究になることが期待され、医学の観点からも大きな貢献となるであると考えている。本課題では日本人におけるEGFR遺伝子変異型肺がんリスクに関連する遺伝子の解明を目的とし、MiSeq次世代シーケンサーを用いてEGFRの突然変異の有無を高速に解析する新しいプロトコールを確立する。EGFR遺伝子変異はチロシンキナーゼドメインに集中しているが、特に頻度が高いものはエクソン19の欠失変異と、エクソン21の点突然変異L858Rである。しかしながら、まれな点突然変異等もエクソン18と20に少数認められるため、当初予定していたエクソン19と21に加えて18と20もシーケンス対象とし、シーケンスライブラリをローコストで作製可能なプロトコールを作った。MiSeqランにはIllumina社のキットを使用するがプロトコール通りに実施すると莫大な費用を要することになるため、1ランあたり768サンプルのシーケンスができるような条件検討を開始した。サンプル調製では、まずターゲット領域の両側にシーケンスを行うためのアダプターとサンプルを識別するためのバーコード配列を結合させる。そこで上記領域を増幅するプライマーの末尾にアダプターが結合可能な共通配列をオーバーハングで持たせ、それぞれをTailed PCRすることでオーバーハング領域を付加した。PCRはマルチプレックスPCR法を用いて1反応液内で各エクソンを同時に増幅させることに成功した。また、反応液を標準プロトコールの約1/3の系に縮小したことによって試薬コストの削減を行うことができた。384サンプル分のバーコード配列はillumina社より購入し、アダプターとバーコード配列の付加はillumina社のキットを使用しPCRによって付加した。残りの384サンプル分は申請者らが開発したバーコードを付加することに成功した。バーコード付加に関しても反応液を1/4に縮小してコスト削減を行った。コスト削減のためマルチプレックスPCR法を実施することにしたため、各エクソンの増幅効率を合わせるのに時間を要したが、おおむね順調に進展している。本研究は日本人における肺がんリスクに対するEGFR遺伝子変異の寄与の解明のため、次世代シーケンサーを用いて変異の有無を高速に解析するプロトコールを確立することを目的としている。EGFR変異型肺がんリスクに関連する遺伝子は、その変異を伴う肺がんの頻度が欧米人とアジア人で異なることから、人種・遺伝的背景によって異なることが予想される。この知見により、日本人における肺がんの、新たな早期診断・予防・治療を可能とし、医学の観点から大きな貢献となる。EGFR遺伝子変異はチロシンキナーゼドメインに集中している。特に頻度が高いものはエクソン19の欠失変異と、エクソン21の点突然変異L858Rであるが、エクソン18と20の点突然変異等も同時にシーケンスできるプロトコールを作製した。前年度までに1ランあたり768サンプルを解析できるようなバーコード設計と条件検討を行った。MiSeqシステムのランには、これらの768サンプルをプールし、1回のランで同時に解析を行う。まずはprimer dimerを除くためAmpureビーズを使用してclean upを実施した。目的のクラスター密度を得るためには複数サンプルを等量ずつプールする必要がある。サンプル間での量の均一化するためビーズを使用し、DNA量のnormalizationを行った。768ライブラリを1つにプールし、リアルタイムPCRで定量後、シーケンスを開始した。ラン試薬にはMiSeqReagent Kit v2を用いてペアエンドシーケンスを実施した。MiSeqで産出されたデータは、シーケンシングと並行して専用のサーバーに転送され、得られたシーケンシングデータに品質管理を施した。GATKのHaplotype CallerとUnified Genotyperで参照配列と比較しmutation callを実行した。

サンプルの平均リード数は3200ほど、そのうち平均3000ほどが正しいゲノム上の位置にマップされた。768検体の4つのエクソンのシーケンスを現在解析中である。コスト削減のため使用する試薬を最小限にするプロトコールを実現させるのに時間を要した。また、ランのために最低限必要な試薬のみの購入でも高額になってしまったため、2つのエクソンを1500検体分ではなく、4つのエクソンを768検体分シーケンスすることにした。近年多くの肺がん感受性マーカーが明らかになってきたことにより、今後は原因遺伝子に応じた治療が開発されることが期待される。日本人における肺がんリスクに対するEGFR遺伝子変異の寄与を検討するため、我々はEGFR突然変異の有無を高速に解析するプロトコールを確立し、変異の有無と肺がんの組織型・喫煙状況・性別など臨床病理学的因子との相関関係を統計学的に解析した。まずは1ランあたり768サンプルのシークエンスができるプロトコールを確立した。768検体をシークエンスした結果、EGFRのエクソン1821に変異が見つかったのは214件体(27.9%)、そのうち25検体では2つ以上のエクソンに変異が同定された。未知の変異は同定できなかった。過去に申請者らは、日本人集団の肺がん患者検体2,415例、対照群検体4,794例の全ゲノム関連解析(GWAS)を実施している。今回のシークエンス結果を足すと、計551件体がEGFR変異あり、1008検体が変異なし、ということが判明した。GWAS結果を用いてEGFR遺伝子変異の有無を考慮した関連解析、さらに肺がんの組織型・喫煙状況・性別などとの相関関係を統計学的に解析した。EGFR変異陽性vsコントロール群など様々なsubtype解析を実施したが、GWAS有意を示す新たなSNPは見つからなかった。しかしながら患者とコントロール群の間で有意差を示すSNPは多数見つかっているため、今後は独立した集団の検体を用いた再現性検証のため検体数の増加につとめる。日本人の肺がんのおよそ3040%は、このEGFR遺伝子変異が原因で起こることが知られている。感受性遺伝子を特定し発症危険群を特定することは発症予防を目的とした治療を可能とする研究になることが期待され、医学の観点からも大きな貢献となるであると考えている。バーコードが付加された768サンプルは精製後混合し、MiSeqを用いてシーケンスする。申請者らが実施した日本人集団の肺がん患者検体と対照群検体のGWAS結果を用いて、現在までに報告のない日本人におけるEGFR遺伝子変異の有無を考慮した関連解析、さらに肺がんの組織型・喫煙状況・性別など臨床病理学的因子との相関関係を統計学的に解析する。本課題が成功しEGFR遺伝子変異型肺がんリスク感受性遺伝子の全貌を明らかにすることで、人種間や病態・環境因子・生活習慣における相対的貢献度を解明することが可能になる。また、新たな分子診断や予後の予測、新薬の開発等につながれば社会的に大きな貢献も期待できる。
アンジオテンシンII受容体拮抗薬/ネフリライシン阻害薬の動脈硬化抑制メカニズム

動脈硬化性疾患は心筋梗塞、脳梗塞といった致命的な心血管疾患や、血管内皮障害による臓器障害を引き起こす。しかし動脈硬化を退縮させる薬は未だ開発されていない。本研究はアンジオテンシンII 1型受容体拮抗薬(ARB)バルサルタンとネフリライシン阻害薬サクビトリルを組み合わせた薬剤(ARNI)の動脈硬化抑制メカニズムについて検証する。ARNIは既に欧米では臨床応用されている新規心不全薬であり、本研究は将来臨床研究も可能なトランスレーショナルリサーチである。心不全患者は動脈硬化性疾患を高率に合併しており、ARNIの動脈硬化抑制メカニズム解明の臨床的意義は大きい。
「工藤忠関係資料」による東北アジア近代史研究

中国の1910年代から1920年代初頭に関わる工藤忠が残した資料を、歴史研究の史料として活用できる形にして、研究成果報告書として『「工藤忠関係資料」による東北アジア近代史研究』を印刷公表できた。またこれによって、資料に関わる中国・日本の各種問題、具体的には白狼軍問題、東亜同文会の辺境通信員問題、日中合弁銀行の大東銀行の問題などについて、掘り下げた研究を進めることができ、新知見を提示できた。本研究は、20世紀前半の東北アジアにおいて多くの重要事件に関わった工藤忠(初名は工藤鉄三郎)の残した各種資料を収集・整理し、それを東北アジア近代史研究の史料とし、それによって新たな歴史理解を提示しようとするものである。この目的遂行のために、初年度に引き続き関係史資料と関係研究の収集・検討に努め、かつ「工藤忠関係資料」の整理・著録作業を進めた。その中でも工藤の前半生の記録「手記」と甘粛への「旅行日誌」の著録を進め、細かな地名の検討に時間を費やしながらも、一応の整理を終えた。これをベースにして前年度からの課題であった工藤が入った白狼軍の研究を進め、論文投稿して「工藤忠資料から見た民国初年の白狼軍(白朗軍)」として公表できた。これによって、孫文・黄興の白狼軍への強い関わりを指摘してきた先行研究を全面的に批判し、孫文・黄興は白狼軍との関係は希薄だとみられることを明らかにし、また詳細な白狼軍内部情報によって“盗賊化した専業武力集団"と規定できる存在であったことなどを述べた。これによって工藤資料が中国史の大問題研究において重要な史料たりうることを明示できた。同時並行的に第三革命への工藤の関わりも検討し、その一部については平成25年度中に公表される予定の工藤忠研究の意義を論じた拙稿で言及した。また前年度から継続している甘粛からの諸報告については、検討課題がかなり出来し、その解決のためにも多方面の研究を余儀なくされている。たとえば、細かな地名の比定が容易ではないこと、あるいは工藤が関わった銀行について1920年代の日本・中国の銀行情報を得る必要にも迫られたこと、また滞在したチベット寺院についてもチベット語とチベット仏教の組織の理解が必要になる、などである。これらの基礎的検討の上に一つ一つの資料の整理・著録が可能になるので、地道にその作業を進めている。以上が平成24年度の研究実績である。本研究は、20世紀前半東北アジア近代史の重大事件の多くに関わった工藤忠(初名鉄三郎)が残した各種資料(「工藤忠関係資料」と呼ぶ)の研究を進めて、東北アジア近代史研究の史料として公表し活用することが主要な目的であり、同時に工藤が関わった各種事件の考察も行おうとするものである。前年度までに、特に1910年代に関わる諸資料を中心として研究を展開してきたが、最終年度である今年度は工藤の関わった第二革命、第三革命、及び1920年代初頭の第三回甘粛旅行における東亜同文会の辺境通信員制度と工藤の商業活動に関わる問題点の掘り下げを行い、同時に各種資料の著録作業を推進した。第三革命発端期の上海からの工藤報告の史料としての重要性、従来あまり言及されてこなかった東亜同文会の辺境通信員制度の問題についてその全体像を提示できたこと、また工藤が進めた商業活動の中で関わった日支合弁銀行の大東銀行の問題を浮かび上がらせることもできた。さらに、著録作業においては、歴史地理的考察を不可欠とする事柄が多く困難を伴ったが、第二回甘粛旅行の記録である「第二回甘粛旅行日誌」の著録や工藤の商業活動に関する諸資料の著録を終えることができた。商業活動の中では工藤が残した北京から蘭州までの諸費用記載メモ「支出簿」が、蘭州での銀行開設、寧夏での洋行開設に関わる当該地の最高権力者や有力者たちの招待などその設置における具体的諸状況がわかる貴重なものであることを明示できた。そして、それら成果の全体をA4版全340頁の大部の研究成果報告書『「工藤忠関係資料」による東北アジア近代史研究』として印刷製本して、東北アジア近代史関係研究者・大学・図書館などにすでに送付し終えており、1910年代から1920年代初頭に関わる貴重な「工藤忠関係資料」を研究に利用できる史料として広く公開し、新知見も呈示できた。本研究は、20世紀前半の東北アジアにおいて多くの重要事件に関わった工藤忠(初名は工藤鉄三郎)が作成した各種資料を集成し、それを東北アジア近代史研究の史料とし、新たな歴史理解を提示しようとするものである。この目的に沿って、初年度は、工藤忠周辺の人物の探求と、工藤忠関係資料の調査を主として行い、それにより所期の目的を達成することができた。特に、民国初年の大反乱白狼軍と、1915年1916年の第三革命時期について、工藤の資料をほぼ整理することができた。ただ、その詳細な検討には、関係する歴史的事項や関係人物が多いため、多大な時間を要している。

また工藤が大量に残した甘粛報告書(1920年以降、東亜同文会宛に送ったもの)については、かなりの数の新資料を追加できた。甘粛関係資料の中でも、特に詳細な検討を要する工藤の甘粛での商業活動関係の資料を、史料化するための作業にも入ることができた。なお、工藤忠が作成した報告書類は、従来考えられていたよりも広い範囲に及んでおり、軍部ではそれを再録して大陸の情報将校などに配布していたこともわかった。これら関係人物、関係事項、各種資料の探索作業を通じて、工藤の1913年以降1920年代初頭に至る各種活動について、詳細な情報が得られた。これらを基にして具体的には白狼軍関係資料の史料化作業に入り、著録を終えた。さらに「工藤忠関係資料からみた白狼軍」として論文化するため、鋭意努力中である。また同時に、第三革命期の資料についても著録を終えて、細部の検討に入っている。これに関しては、もう少し時間をかけるつもりである。さらに、工藤忠の資料調査と研究進展により、2つの学会で招待講演をし、またNHKのBSプレミアム「シリーズ辛亥革命第2回」で、山田の開拓した関係資料が利用され、また山田も出演して工藤忠の事績を社会的にも広めることもできた。上記「研究実績の概要」に記載したように、前年度からの課題であった白狼軍に関して論文を公表でき、それによって日本・中国の先行研究の理解を批判し、訂正できたことは大きな研究成果であると考えている。また「工藤資料」の著録・整理作業も、スピードは決して速くないが着実に遂行できている。その過程で個別の検討課題がかなり多数出来しているが、それらについての考察を進めることで、従来の研究では言及されていないようないくつかの問題について詳細な情報を得ることができた。また「溥儀の忠臣・工藤忠と二〇世紀前半の東北アジアー工藤忠研究が近代史研究にもたらすものー」と題して、工藤忠研究の意義を述べた拙稿を用意しており、平成25年度中に公表される予定である。それによって改めて「工藤忠関係資料」研究の意義と工藤資料の東北アジア近代史研究における重要性を、広く知らしめることができると考えている。ただし、著録作業は多数の課題出来のため必ずしも順調とはいえない側面もあり、そのため達成度としては「(2)おおむね順調に進展している」に該当すると自己評価する。上記「実績の概要」に記載したように、工藤忠関係資料の調査面で、かなりの数の新資料を得て、白狼軍と第三革命時期の資料を著録できたことにより、順調な研究進展だと評価できる。さらに関係事項・関係人物の研究についても、広範な調査研究を行うことができ、東北アジア近代史に関する独自の視点をもつことができ、それらにより複数論文を作成する下準備とすることができた。この面でも順調な進展だとすることができる。しかし、2011年3月11日の大震災以降、余震なども含めて研究環境が大きな影響を受け、居住面、研究面での立ち直りが6月以降にずれこんでしまった。その後、鋭意回復に努めて、特に資料調査で成果をあげることができたが、論文化の面で当初予定した時間をとることができず、2011年度の投稿はできなかった。この面、「やや遅れている」側面があるといわねばならない。しかしながら、工藤忠の資料調査と研究進展により、2つの学会で招待講演をし、またNHKのBSプレミアム「シリーズ辛亥革命第2回ラストエンペラー
日本の知的財産制度とイノベーション

本年度は、以下の三つの分野で研究を進めた。(1)第1に理論的な研究として、知的財産権がイノヴェーションに与える影響を分析した主要な理論論文をサーベイし、今後の研究課題を明らかにする論文を書いた。その成果を以下の二つの論文にまとめた。一つは特許研究に掲載された『累積的な技術革新と知的財産権:最近の理論研究の含意』である。技術革新が累積的であることが、知的財産保護の効果にどんな影響を与えるかを、最近の理論研究によりながら分析している。もう一つはビジネス・ビューに掲載した『知財産権とイノベーション:最近の研究動向と今後の課題』である。この論文は理論研究を中心に最近の研究の進展を全般的に分析評価している。(2)第二に日本の知的財産制度の制度的な研究として、知的財産権侵害に対する日本の損害賠償制度の特徴と問題点を分析した。その成果は、ビジネス・レビューに掲載予定の『知的財産保護に於ける損害賠償制度の役割-経済学的な視点からの分析』である。この論文では日米の損害賠償制度の比較を行うとともに、損害賠償制度のあるべき姿を逸失利益の賠償の観点及び抑止力の観点から行っている。本研究の遂行にあたっては、特許法改正を審議した工業所有権審議会の損害賠償等委員会の委員を務めたことも有用であった。(3)第三に、日本の知的財産保護制度の現状と問題点、企業の研究開発に於ける知的財産戦略の位置づけ等を明らかにする目的で、他大学や他の研究期間(東京大学、信州大学、科学技術庁)の研究者の参加も得て、昨年6月から月に約一回の頻度で計8回研究会を行った。知的財産権とイノヴェーションの研究会には、特許庁の幹部(審判部長)、企業の知的財産部長(住友化学、富士通)、弁護士(ソフトウエア特許)、法学者(バイオテクノロジー保護)等を講師に招いて、活発な論議を行った。
環境における化学物質分解微生物群の分子遺伝学的挙動解明

まず抗生物質合成工場の廃水処理施設から採取した活性汚泥よりメタゲノムライブラリーの構築を行った。本研究では、ベクターとしてフォスミド(Fosmid)を用いて、約5万クローンから構成されるライブラリーを作製した。次に、β-ラクタム系抗生物質耐性遺伝子の分離を目的として、抗生物質(ペニシリン)耐性能を有するメタゲノムクローンの分離を行い、結果的に6種類のクローンを取得した。さらに、抗生物質耐性遺伝子の同定とDNA塩基配列の決定を行い、抗生物質耐性に関わる新規な遺伝子を検出することが出来た。続いて、β-ラクタム系抗生物質耐性能を有する微生物の分離培養を行った。分離源は上述の抗生物質合成工場の廃水処理施設から採取した活性汚泥を用いた。分離方法として、培地の固化剤としてジェランガムを用いた平板培地を利用した。これは、ジェランガム培地が通常用いられる寒天培地に比べて未分離の微生物群を効率的に分離・培養することが実証されているためである。本研究によって純粋分離した微生物は、微生物の16S rRNA遺伝子配列に基づいた分子系統解析の結果から、系統学的に20種類の微生物に分類され、5種類の微生物については新種の微生物である可能性が示唆された。ところで、近年、抗生物質の分解酵素とN-Acy1-L-homoserine lactones(AHL)分解酵素の相関性が検討されている。そこで、得られたメタゲノムクローンと微生物に対して、AHL分解能力の検討を行った。結果的に1種類のメタゲノムクローンはAHL分解能力を有しており、DNA塩基配列の結果から、AHL分解に抗生物質耐性遺伝子の関与が示唆された。また、7種類の分離微生物はAHL分解能力を有しており、AHL分解産物の検討結果から、AHL分解に対してペニシリンを分解する酵素(アシラーゼ)が関与している可能性が示唆された。本研究では微生物群集における化学物質分解遺伝子の多様性と、微生物種の多様性を解析することによって、群集機能とその構成の相関に関する知見を得ることを目的とした。コークス炉ガス洗浄廃液処理プラントから入手した活性汚泥を微生物源として、実験室においてフェノール(0.5g/1/day)を炭素源とした培養を継続し、フェノール分解微生物群集を構築した。この活性汚泥培養液を2mlとり、遠心後上清を除き、FastPrep SPIN Kit for Soilを用いてDNAの抽出を行った。このDNAをテンプレートとして、NCBIデータベースから取得したフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子配列(15配列)によるアラインメントにより構築した縮退プライマーによりPCRを行った。その結果、予想サイズとほぼ等しい約500bpの増幅産物が得られた。この増幅産物を用いてTAクローニングを行い、機能遺伝子のクローンライブラリを構築した。このクローンライブラリに含まれる機能遺伝子について配列解析を行ったところ、解析したクローンの約87%が同一の遺伝子を持っていた。BLASTによる類似配列検索の結果、この遺伝子はComamonas testosteroni R5のphcN遺伝子と83%の相同性を持つことが明らかとなった。一方、微生物の16S rRNA遺伝子についても同様のクローン作成を行い、配列解析を行ったところ、微生物種に関しては多様性に富んだ群集であることが明らかとなった。これらの結果より、本研究で構築した微生物群集において、フェノール分解という機能に関しては一つの遺伝子の優占化、および微生物種の構成については多様性が保たれていることが明らかとなった。しかし、機能遺伝子の優占化に至る過程や微生物多様性との関連については未だ不明な部分が多いことから、今後さらに研究を進める予定である。昨年に引き続き、微生物群集における化学物質分解遺伝子の多様性と微生物種の多様性を解析することによって、群集構造と機能の相関を明らかにする研究を行った。本年度は環境中で有害物質として認知されているBTEX(ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン)の分解に関わるモノオキシゲナーゼの微生物群集における多様性を明らかにするために変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)による解析を行った。機能遺伝子解析に応用するにあたっては従来群集全体からDNAを抽出し目的遺伝子をPCRで増幅、塩基配列を決定するという煩雑な操作が必要だった。なぜならば通常のDGGEでは特定の機能遺伝子情報から縮退プライマーをデザインする必要があり、このことが非特異的なバンドの生成や不明瞭なバンドの生成を引き起こしていたからである。この間題を解決したDGGE法を行うために、CspC1と呼ばれる制限酵素の認識配列をあらかじめ縮退プライマーの端末につなげ、PCRを行ったあとの制限酵素処理後の消化物をDGGEに供するという、まったく新しい方法を開発した。この方法の有効性を立証するために、まず、12の既知の微生物のゲノムからモノオキシゲナーゼを縮退プライマーによって増幅し、CspC1処理を行いDGGE解析を行ったところ明瞭なバンドを得ることができた。次に本手法を用いて活性汚泥、霞ヶ浦の底泥、油田排水の試料からDNAを抽出し、同様の方法でDGGEを行った。その結果、きわめて明瞭なバンドが得られたとともに、油田の排水試料からは多様なモノオキシゲナーゼの存在を示唆する多数のバンドが得られた。今後本手法を他の機能遺伝子の検出と多様性解析にも適用する予定である。

次に、β-ラクタム系抗生物質耐性遺伝子の分離を目的として、抗生物質(ペニシリン)耐性能を有するメタゲノムクローンの分離を行い、結果的に6種類のクローンを取得した。さらに、抗生物質耐性遺伝子の同定とDNA塩基配列の決定を行い、抗生物質耐性に関わる新規な遺伝子を検出することが出来た。続いて、β-ラクタム系抗生物質耐性能を有する微生物の分離培養を行った。分離源は上述の抗生物質合成工場の廃水処理施設から採取した活性汚泥を用いた。分離方法として、培地の固化剤としてジェランガムを用いた平板培地を利用した。これは、ジェランガム培地が通常用いられる寒天培地に比べて未分離の微生物群を効率的に分離・培養することが実証されているためである。本研究によって純粋分離した微生物は、微生物の16S rRNA遺伝子配列に基づいた分子系統解析の結果から、系統学的に20種類の微生物に分類され、5種類の微生物については新種の微生物である可能性が示唆された。ところで、近年、抗生物質の分解酵素とN-Acy1-L-homoserine lactones(AHL)分解酵素の相関性が検討されている。そこで、得られたメタゲノムクローンと微生物に対して、AHL分解能力の検討を行った。結果的に1種類のメタゲノムクローンはAHL分解能力を有しており、DNA塩基配列の結果から、AHL分解に抗生物質耐性遺伝子の関与が示唆された。また、7種類の分離微生物はAHL分解能力を有しており、AHL分解産物の検討結果から、AHL分解に対してペニシリンを分解する酵素(アシラーゼ)が関与している可能性が示唆された。
気相成長法による炭化珪素繊維強化アルミナ複合材の高速製造

本研究では、温度勾配化学気相浸透法(CVI法)による繊維素材強化複合材の高品位高速製造とその製造プロセスの解析を行うことを目的として、実験ならびに数学的モデリングと計算機シミュレーションを行った。実験では、市販の炭化珪素繊維でプリフォームを作製し、その空隙内でアルミナを形成することにより、炭化珪素繊維強化アルミナ複合材を作製した。アルミナ成膜反応の原料系として、アルミニウムトリイソプロポキシドと三塩化アルミニウム-二酸化炭素-水素系とを比較したところ、後者の反応系の方が、製品中に混入する炭素量が飛躍的に少ないことがわかった。また、後者の原料では、前者に比べて粉体が生成しにくく、高速化を容易に行える可能性があることが示された。さらに、温度勾配を付加してCVIを行えば、高い成膜速度でも、外表面近傍での細孔閉塞を抑制し、緻密な複合材を製造できることが確認できた。ただし、三塩化アルミニウムを原料とする場合には、水蒸気生成反応律速となるように原料組成等を設定する必要があることがわかった。数値シミュレーションでは、繊維質多孔体(プリフォームおよび複合材)を、従来の直交無限長繊維モデルに代えて、単位セル間に間隙をもたせた新しいモデルで表現したところ、CVIに伴う複合材内の温度分布変化を正確に計算できるようになった。その結果、数値シミュレーションにより、複合材の重量増加および空隙率変化の実験結果を非常に精密に再現することができた。数値シミュレーションによれば、水蒸気生成反応律速条件を満たしていれば、原料濃度を増加させても、外表面近傍での細孔閉塞は起こらず、プロセス所要時間を短縮できることが示された。このことは、実験的にも確認することができた。実験とシミュレーションの比較から、主要な反応経路が気相反応であることがわかったが、反応機構については、今後さらに詳細に検討する予定である。
微量元素存在量による塊状硫化物鉱床の形成場の解明

1.別子型鉱床は,黒鉱鉱床に比較して,Sn,Co,Se,Teに富んでいる。日高帯の下川鉱床は特にSn含有量が高く,それが別子型鉱床の高いSn平均値に大きく影響している。Seは別子型鉱床ではSeに富む独立相を作っていることはなく,硫化鉱物の硫黄を置換して存在している。黒鉱鉱床に比較して硫化鉱物のSe/S比は別子型鉱床で有意に高い。高いTe含有量は別子型鉱床でTeに富む砒四面銅鉱が見出されることに対応している。2.現世の海嶺中軸部の海底熱水系では,陸源堆積物の有無が硫化鉱物の種類,微量元素の含有量,硫黄同位体比等に大きな相違を生じている。背弧海盆や大陸内火山性リフトにおいても,地殻の発達段階に応じて化学的鉱物学的に幅のある鉱床が形成されると考えられる。阿武隈帯の日立や舞鶴帯の柵原鉱床は拡大する背弧海盆あるいは大陸内火山性リフトの大陸性地殻上で形成された可能性がある。3.秩父帯の名野川鉱床は鉱床形成後熱水性珪質堆積物に覆われ,海水による酸化消失を免れた。熱水性珪質堆積物はMnに富むスティルプノメレーンを多く含んでいる。三波川帯で別子型鉱床や塩基性片岩に伴って産出するMnに富む珪質片岩の起源を考える資料を提供する。名野川鉱床の硫化物は現世の海嶺熱水性鉱床と同様に磁硫鉄鉱で代表される低い硫黄分圧の条件で形成された。4.石炭紀後期に海嶺で形成され,ジュラ紀に大陸縁辺部に付加された丹波帯の土倉鉱床は,チャートが卓越した塁層中に胚胎される。硫化物鉱床は熱水性珪質堆積物によって酸化消失から保護されたと考えられる。黄鉄鉱中には鉄に富む閃亜鉛鉱が包有されている。現世の海底熱水性鉱床と同様に,続成作用の過程で硫黄が添加される反応が生じたと考えられる。5.別子型鉱床の形成場の解明は日本列島構造発達史を解明する上で極めて重要である。1.資源地質学会からの記念出版物「資源環境地質学」に別子型鉱床の形成場に関して現在代表者が考えていることを纏めた。2.秩父帯の低変成別子型鉱床である,高知県名野川鉱床の露頭調査を2度に渡って行い,厚さ30cm程の珪質な縞状鉱と薄い塊状鉱を包含する珪質層を見出し,その顕微鏡・EPMA等による観察を行った。その結果,鉱床層準を胚胎する珪質層は,マンガンに富むスチルプノメレーンを含むチャート層であり,それは硫化物層の上位をも覆っていることが見出された。この発見は,海底で形成された硫化物鉱床が引き続く熱水活動によって堆積した熱水性の珪質堆積物の急速な堆積によって海水から遮断され,その結果酸化を免れたことを示している。

今後,この珪質堆積物が真に熱水性の堆積物であることを,酸素同位体比測定等の手法によって確実にさせることが必要であるが,不純物を含む珪質層に包含される鉱床には,別子などこの型の代表的な鉱床があるので,これらの鉱床が熱水性珪質堆積物に覆われることによって酸化を免れたことが明らかにされれば,それは可能な鉱床形成場の範囲を拡大する役割を果たす重要な貢献になる。3.高知県名野川鉱床,滋賀県土倉鉱床,北海道下川鉱床,岩手県田老鉱床の鉱石試料(名野川を除いて保管試料を使用)について,研磨片,研磨薄片を作成し,微量成分分析用の試料選定のための顕微鏡観察(約200試料),及び一部の試料(約50試料)についてはEPMAによる閃亜鉛鉱等の化学分析を行った。その結果,廃鉱石を収集した名野川鉱床の鉱石試料は,鉱床形成時の鉱物組み合わせ,鉱石組織を保存していると考えることが妥当であるが,土倉鉱床の硫化物については,続成作用の段階で硫黄の添加を伴う反応が起こり,硫黄分圧の高い鉱物組み合わせに変わっている可能性があることが判明した。分析用試料の選定・結果の解釈には注意を必要とするであろう。1.15年度に行った四国秩父帯の低変成鉱床である名野川鉱床の珪質岩の研究で,別子型鉱床に伴う珪質岩には遠洋性堆積物だけでなく熱水性堆積物ががあり,それが直接硫化物鉱床を覆うことによって鉱床の酸化消失が妨げられることが示唆された。今年度は,このような観点から珪質堆積物(チャート)の多い滋賀県土倉鉱床のチャートを顕微鏡的に分類し,そのREEの分析を行った。結果は,Euに正の異常を持つチャートと弱い負の異常を持つチャートが,またCeにも正と負の異常を持つチャートが見出され,今後この研究を継続して進めていくことに意義があることが判明した。2.奈良県五条鉱床の硫化物鉱石の研磨片を丹念に顕微鏡,EPMAによって調べた。その結果,名野川鉱床や土倉鉱床の鉱石と同様に,鉱床形成時の鉱石組織を残していること,低温で沈積した微細な結晶,およびフランボイダル黄鉄鉱に混在して粗粒自形黄鉄鉱が認められる。この組織は変成度の低い鉱床の特徴であると考えられるので,この鉱石組織の成因を考える必要がある。五条鉱床の受けた変成度を明らかにするために鉱床周辺から岩石試料を採取し顕微鏡観察を行い,弱い変成度を確認した。3.滋賀県土倉,高知県名野川および奈良県五条鉱床の鉱石ならびに珪質岩に関して微量成分の分析(REE,硫黄同位体比を含む)に供する試料の準備が略完了した。EPMAによる予察的分析結果では,これら四万十帯や秩父帯の鉱床も三波川帯の鉱床の鉱石と類似して,例えばCoに富みNiに乏しい特徴を持つ。今後,これらの鉱石の化学組成の特徴を明らかにし,三波川帯の別子,佐々連等の特徴と比較し,別子型鉱床全体の形成場を議論する。1.滋賀県土倉鉱床の鉱石や岩石について,EPMAによる閃亜鉛鉱の分析,及び全岩(塩基性岩,砂岩)のREEのICPによる分析を更に行った。黄鉄鉱に包有される閃亜鉛鉱と粒間の閃亜鉛鉱でFeS含有量に違いがあることが明きらかになった。粒間の閃亜鉛鉱は続成作用の過程で硫黄分圧が上昇するような変化を受けたこと,及び包有物として産出する閃亜鉛鉱は続成変化を免れたと解釈される。黄鉄鉱中の包有鉱物の種類と組成は,熱水条件を反映している可能性が高い。2.高知県名野川鉱床の直接約な下盤を構成するチャートは,特徴的にスティルプノメレーンを含み,化学組成上はFe, Mnを多く含む。三波川変成帯で,Mnを含む赤鉄鉱や紅簾石を有する珪質片岩は名野川鉱床のチャートに化学組成上類似し,熱水起源である可能性が強い。3.沖縄トラフの活動的なチムニーから錫を含む黄銅鉱,プラチナを含む輝蒼塩鉱がEPMAによって見出された。熱水活動は酸性火山活動に伴っているが,プラチナを著量含む鉱物が塊状硫化物鉱床や海底熱水性鉱床から発見されることは極め亡稀である。プラチナの起源と濃集について鉱床成因について有意な私指示元素になり得るか,検討を続ける。4.鉱石中の鉛含有量や鉛の同位体組成は鉱床の形成場を探る重要な指示元素である。顕微鏡的には極めて見出すことが困難である極く微細な方鉛鉱粒子の含有量の概数をEPMAの反射電子線像を用い推定した。
microPETを用いた低酸素性虚血性脳症の病態解明と治療法に関する研究

1.昨年と同様の方法でHIE新生仔ブタモデルの作成した:実験中は温熱ブランケットを用いて口腔内体温はブタの平熱である38.5°Cに維持した。HIE-低体温群(LT)群:HIE群と同様の負荷を行った後、温熱ブランケットを巻かずに・体温を35.5°Cに維持した。LT群:低酸素・虚血負荷を行わず、体温を35.5度に冷やした。コントロール(CTL)群:低酸素・虚血負荷、冷却とも行わない。2.各群の新生仔ブタについて、micro PETによる脳の糖代謝動態の検討を行った。新生児ブタはコントロール群でも取り込みが少ないため、無麻酔で覚醒した状態でFDGを投与し脳への取り込みが終了後にプロポフォール麻酔下にmicroPETを行った。その結果、今年度は低酸素虚血負荷による取り込みの低下を明らかに認めることができた。3.各群の新生仔ブタについて・HIE群とLT群で動脈ラインより採血し、pH、BE、PaCO2、PaO2を測定し低酸素虚血負荷の程度を比較し同等の負荷がかかっていることを確認した。LT群では血中ビオプテリンの上昇はあまり見られず、HIE群では有意な血中ビオプテリンの上昇を認めた。しかし髄液と脳ではビオプテリンの上昇は認められなかった。4.脳の組織科学的検討で、HIE群では大脳皮質の神経細胞にiNOSの出現が認められたがLT群では認められなかった。5.脳の組織化学的検討で、HIE群ではNOの産生が増加していたが、LT群ではNOの増加は認められなかった。以上の結果より、新生児ブタのHIEモデルでは、NOが増加し大脳にiNOSの出現が認められたがビオプテリンの増加が認められず、iNOSにより産生されたNOがテトラヒドロビオプテリンが少ないためONOO-となり組織障害性に働き、脳細胞のグルコース取り込みが低下したと考えられた。この現象は、microPETの画像でFDGの取り込みの減少として認められた。1.HIE新生仔ブタモデルの作成:生後1-3日のミニブタを、腹壁静脈よりルートを確保し、プロポフォール麻酔下に気管切開し人工換気を行う。低酸素は酸素と窒素の混合で6%酸素濃度を作成し人工換気装置で付加をした。虚血は両側頸動脈に動脈クリップで止血した。HIE群:低酸素・虚血負荷は45分間行い、負荷後は酸素、強心剤等を投与して蘇生した。温熱ブランケットを用いて口腔内体温はブタの平熱である38.5°Cに維持した。HIE-低体温群(LT)群:HIE群と同様の負荷を行った後、温熱ブランケットを巻かずに、体温を35.5°Cに維持した。新生児ブタはコントロール群でも取り込みが少ないため、睡眠や麻酔の影響について検討し、無麻酔で覚醒した状態でFDG microPETを行った。その結果、低酸素虚血負荷による取り込みの低下をわずかに認めることができた。3.各群の新生仔ブタについて、動脈ラインより採血し、pH、BE、PaCO2、PaO2を測定し低酸素虚血負荷を重症群と軽症群に分類した。

軽症群では血中ビオプテリンの上昇はあまり見られず、重症群では有意な血中ビオプテリンの上昇を認めた。しかし髄液と脳ではビオプテリンの上昇は認められなかった。4.脳の組織科学的検討で、重症群では大脳皮質の神経細胞にiNOSの出現が認められたが軽症群では認められなかった。以上の結果より、新生児ブタのHIEモデルでは、重症仮死群で大脳にiNOSの出現が認められたがビオプテリンの増加が認められず、iNOSにより産生されたNOがテトラヒドロビオプテリンが少ないためONOO-となり組織障害性に働き、脳細胞のグルコース取り込みが低下したと考えられた。この現象は、microPETの画像でFDGの取り込みの減少として認められた。1.昨年と同様の方法でHIE新生仔ブタモデルの作成した:実験中は温熱ブランケットを用いて口腔内体温はブタの平熱である38.5°Cに維持した。HIE-低体温群(LT)群:HIE群と同様の負荷を行った後、温熱ブランケットを巻かずに、体温を35.5°Cに維持した。LT群:低酸素・虚血負荷を行わず、体温を35.5度に冷やした。コントロール(CTL)群:低酸素・虚血負荷、冷却とも行わない。2.各群の新生仔ブタについて、micro PETによる脳の糖代謝動態の検討を行った。新生児ブタはコントロール群でも取り込みが少ないため、無麻酔で覚醒した状態でFDGを投与し脳への取り込みが終了後にプロポフォール麻酔下にmicroPETを行った。その結果、今年度は低酸素虚血負荷による取り込みの低下を明らかに認めることができた。3.各群の新生仔ブタについて、HIE群とLT群で動脈ラインより採血し、pH、BE、PaCO2、PaO2を測定し低酸素虚血負荷の程度を比較し同等の負荷がかかっていることを確認した。LT群では血中ビオプテリンの上昇はあまり見られず、HIE群では有意な血中ビオプテリンの上昇を認めた。4.脳の組織科学的検討で、HIE群では大脳皮質の神経細胞にiNOSの出現が認められたがLT群では認められなかった。5.脳の組織化学的検討で、HIE群ではNOの産生が増加していたが、LT群ではNOの増加は認められなかった。以上の結果より、新生児ブタのHIEモデルでは、NOが増加し大脳にiNOSの出現が認められたがビオプテリンの増加が認められず、iNOSにより産生されたNOがテトラヒドロビオプテリンが少ないためONOO-となり組織障害性に働き、脳細胞のグルコース取り込みが低下したと考えられた。