hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内小胞輸送の経路特異性を規定する新規ArfGAP、SMAP遺伝子群の解析

Eカドヘリンは、上皮細胞の接着結合において、中心的な役割を果たしている接着因子である。上皮細胞の細胞間結合が乖離し、間葉系の細胞のような特徴をもった細胞に性質転換するEMTにおいて、エンドサイトーシスによる細胞内への取り込みが亢進されることによって、細胞表面におけるEカドヘリン量を低下させる。SMAP1はARF6に特異的なGAPであり、その一次構造にクラスリン重鎖と結合できる結合モチーフを有し、ARF6が制御するクラスリン依存的に細胞内をリサイクルしている因子のエンドサイトーシスに関わっている。本研究ではSMAP1がEカドヘリンのエンドサイトーシスに関与しているかどうか、他のARF6GAPであるGIT1とAMAP2/PAG3も含めて検討した。MDCK細胞をTPA存在下でEカドヘリンのエンドサイトーシスを充進させたところ、SMAP1の野生型もしくはGAP活性が欠失したR61Q変異体を過剰発現している細胞ではEカドヘリンの取り込みが顕著に阻害されていた。一方、AMAP2、GIT1双方に関しては、有意な阻害効果が認められなかった。これより、ARF6GAPのうちSMAP1が、MDCK細胞におけるEカドヘリンのエンドサイトーシスを制御していることが示唆された。また、長時間TPAで培養させEMTを誘導させたところ、SMAP1を過剰発現させた細胞において、Eカドヘリンの取り込みが阻害されたため、細胞同士が乖離しにくくなっていた。そこで、Boyden chamber法により細胞運動能を評価したところ、SMAP1の野生型もしくはR61Q変異体を過剰発現している細胞の運動能が著しく低下していた。Eカドヘリンは、その輸送経路にクラスリンもしくはカベオラ小胞を用いる。そこで、SMAP1がカベオラ小胞のエンドサイトーシスに関係しているかどうか、カベオラ依存的に細胞内へと取り込まれるBSAを用いて検討したところ、SMAP1はBSAの取り込みには何ら影響を与えなかったため、カベオラの系にはSMAP1が関与していないことが示された。このことから、MDCK細胞におけるEカドヘリンのエンドサイトーシスは、SMAP1に制御されるクラスリン依存的な経路で細胞内へと取り込まれていることが示唆された。Arf6のGTPaseを活性化するArfGAPとして以前、我々はSMAP1を同定した。さらに、このSMAP1がクラスリンと結合し、トランスフェリン受容体が細胞膜からエンドサイトーシスされる過程で昨日することも報告した。今回、我々はSMAP1のホモログであるSMAP2を同定した。SMAP1同様にSMAP2はArfGAP活性を示し、クラスリンとも結合する。さらにSMAP2はクラスリン重合蛋白であるCALMと結合することも見出した。しかしながらSMAP1と異なりSMAP2は、Arf1のGAPとして働き、また細胞内ではクラスリン・アダプターのAP-1やエプシンRと共局在する。輸送実験の結果、初期エンドソームからトランスゴルジネットワークに至る、クラスリン依存性の逆行輸送にSMAP2が関与していることも明らかとなった。以上の様にSMAP遺伝子群はArfGAPの重要なサブファミリー一を構成しており、SMAP1とSMAP2には類似の働きも特異的な作用も、両方あることになる。
細胞内染色法による嗅球神経細胞の定量形態学的解析

I.単一僧帽細胞の電顕定量形態学的研究:ウサギ嗅球の単一僧帽細胞にHRPを注入し、染色した切片をエポン包埋した。この切片を用いて僧帽細胞の全体像を光顕でトレースした後、以下の各部位を同定し、電顕連続切片を作製した。すなわち、糸球体分枝の末端と基部、一次樹状突起の遠位部と近位部、二次樹状突起の遠位、中位、近位部、細胞体、軸索初節、軸索本幹、軸索側枝である。これを用いて各部位の復構模型を作り、その直径とシナプス密度を計測した。この計測値を先に発表した該細胞の光顕的定量解析値に繰り入れて、単一僧帽細胞のシナプス数を以下のごとく算出した。単一僧帽細胞が嗅球内で持つシナプス総数は63000個であり、そのうち入力シナプスは27000個、出力シナプスは36000個であった。糸球体分枝の末端には4000個の嗅神経シナプスが入る。一次樹状突起には3000個、二次樹状突起には48000個、細胞体には3000個、軸索初節には8個の顆粒細胞との入・出力シナプスが存在した。軸索側枝には3000個の出力シナプスを算出した。論文を投稿中である。II.嗅球外叢状層のシナプス密度の定量形態学的研究:生後2、7、14、21、70日のラットの外叢状層の電顕つなぎ写真を用いて、シナプスのタイプと密度を計測した。主な結果は、生後のいずれの時期においても、外叢状層の浅層のシナプス密度は深層のそれよりも低いことである。このことは、浅層に存在する房飾細胞と顆粒細胞のシナプス密度が深層に存在する僧帽細胞と顆粒細胞のシナプス密度より低いことを示している。第94回解剖学会総会で発表を予定している。III.単一僧帽細胞の軸索の光顕定量形態学的研究:単一僧帽細胞にPHALを注入して、前嗅核、梨状葉皮質前部の軸索を染色した。現在、軸索側枝の数、長さ、軸索終末の数を検索中である。論文を投稿中である。
歴史にみる自然資源利用の「身の丈に合った技術と知恵」

千葉県の小櫃川流域をフィールドの中心とし、野外調査と文献資料調査によって近世から現代における村の歴史を、自然環境の歴史と生業の歴史との関係性を中心にしながら明らかにした。さらに、農村景観の背後に存在する自然資源利用の歴史的な特質とその変遷を、実証的、具体的に明らかにした。地域の農村社会には、自然資源を持続的に利用する技術と知恵が存在した。その特徴とは、自然環境を水田や畑などの生業の場へと開発する場合において、地域社会のなかだけで継続・継承可能な技術を生み出すことであった。それを「身の丈にあった技術と知恵」と称したが、このことが今後の持続的な自然資源利用を考える上で重要な要件になると考えられる。本研究はフィールド調査と文献資料調査によって近世から現代における自然環境・自然資源利用の歴史、それに生業の歴史との関係性を含めて明らかにしつつ、人間側の歴史と生物側の歴史とを統一する方法をあみ出し、農村景観の背後に存在する自然資源利用の歴史的な特質とその変遷を、実証的に明らかにすることである。その上で、地域の人びとが創造してきた自然資源を持続的に利用する「身の丈にあった技術と知恵」の存在と、なぜ現在まで継続・継承されてきたのかを具体的な事例にそって明らかにし、持続的な自然資源利用を考える上で何が必要なのかを提示する。昨年度は千葉県内の生態的な環境や生業が異なり、自然資源利用の方法が異なる候補地を設定した。候補地として、鴨川周辺と木更津周辺の二地点において、調査を行うことにした。千葉県の木更津から鴨川までの海岸地帯の丘陵には、マタバシイの人工林が広がる。明治の初めから植林がはじまるのだが、その用途と魚業の関係性に調査の重点をおいた。鴨川周辺では、現在もさば節の生産が行われている。このサバをいぶすのにマテバシイが利用される。鴨川の背後の丘陵には、東大演習林が広がる。演習林に残された明治30年以来の木材販売の記録と、聞き取り調査とサバ節の制作工程の実地調査とを組み合わせながら、山と海との生業の関係性を明らかにした。木更津周辺でも、マテバシイの植林が認められるのだが、その利用実態は調査されてこなかった。現在は行われていないのだが、この地域では昭和30年代まで海苔養殖が盛んに行われており、海苔を乾燥させるための薪としてマテバシイが利用されていた。聞き取り調査と実地調査を組み合わせることで、海苔養殖における山と海の関係性を具体的に明らかにした。このように昨年度は、海での生業と山利用との関係性を明らかにすることで、自然利用資源が多様に利用されてきた実態を明らかにすることができた。第1の目的は、フィールド調査と文献資料調査により近世から現代における村の歴史を自然環境・自然資源利用の歴史、それに生業の歴史との関係性を含めて明らかにし、人間側の歴史と生物側の歴史とを統一する方法をあみ出し、農村景観に存在する自然資源利用の歴史的な特質と変遷を、実証的、具体的に明らかにすることにある。第2の目的として地域の人びとが創造してきた自然資源を持続的に利用する身の丈にあった技術と知恵の存在と、なぜ現在まで継続・継承さてきたのかを具体的な事例にそって明らかにし、持続的な自然資源利用を考える上で必要なことは何なのかを提示することにある。小櫃川上流地域だけではなく、生態的な環境が異なる、房総半島の海岸部および、小櫃川下流地域まで調査範囲を広げ、生業携帯の多様な地域性は、どのような要因で生じるのか調査・研究した。千葉県内の生態的な環境や生業が異なる地域として,海の生業と山との関係性を明らかにするための木更津市と鴨川市天津小湊でフィールド調査をおこなった。海岸沿岸のマテバシイ林は明治のはじめから植林され、さば節などを生産するために利用されただけでなく、のり養殖においても,マテバシイ林が様々な用途で利用されてきたことが明かになった。小櫃川上流の千葉県君津市の蔵玉・折木沢と比較するため、小櫃川下流の更津市中郷地区周辺および袖ケ浦市坂富周辺で現地調査を行った。小櫃川下流地域でも、土地の高低差によって、江戸時代から水争いが頻繁におこってきた。わずかに土地が髙いため、「水路状の水田」を作り上げてきた。また小櫃川上流とは異なる、複雑な灌漑システムを作り上げてきたことがわかってきた。いずれの生業も,東京という大市場の存在がかかせない。1つの生業の歴史を明らかにするのではなく,様々な生業が,山と海を利用しながら江戸,東京とどのような歴史的な関係性と変遷をたどってきたのかを明らかにした。

「里山」が注目されているが、里山は歴史的な要因や人間側の働きかけによって、その姿をたびたび変えてきた。村落周辺の景観は固定的だったのではなく、その姿は歴史とともに常に変化してきたと捉える必要がある。今回の研究は、選定したフィールドの景観のもつ歴史的特質を知ることが目的の1つなのだが地域の景観すなわち自然資源利用の変化と生態的な環境変遷という生物側の歴史は、それこそ地域よって地域の数だけ多様である。昨年度は、海と山の利用が、密接な関係性を持つ事例を、サバ節と海苔養殖という二つの生業から明らかにすることができたと考えている。東アジア人類史・中国考古学在来技術は、大規模技術や電気・機械を必要としない。自分達の人力と共同体で維持管理が可能な、「身の丈にあった技術と知恵」が、自然資源利用の歴史的な変遷のなかで、どのような過程を経てなぜ創出されたのかという事例研究を推進するとともに、いかにして継承されてきたのか、その背景を探り、今後の自然資源利用の持続的利用を考えるためには、なにが必要なのか、モデルケースを構築したいと考えている。次年度に使用額が生じた理由として、フィールド調査地が、勤務地の近くであり、旅費などの経費を効率的に用いることができたことが大きい。昨年度に引き続き調査地を中心とした調査を継続する。
基礎研究の臨床応用による心血管病の新しい早期診断・予防・治療法の開発

遺伝子改変動物を用いた基礎研究により、CyPAが肺高血圧症にとって重要蛋白であることを確認した。さらに、ヒト肺高血圧症患者の末梢血での血漿中CyPA濃度の測定法を開発し、患者群で健常者群に比較して、濃度が上昇していることを確認した。さらに、CyPA高濃度群と低濃度群に分け、長期的な予後調査を行ったところ、血漿中CyPA濃度が高い群で、明らかに生命予後が不良であった。さらに、患者由来の組織や血液検体およびハイスループット・スクリーニング(HTS)システムを用い、CyPA分泌抑制・細胞外CyPA受容体阻害に着目した治療薬のスクリーニングを進め、肺高血圧モデルマウスにおける有効性を検証した。【目的】本研究の目的は、心血管病発症における酸化ストレス分泌蛋白サイクロフィリンA (CyPA)およびその受容体Basiginの基礎研究成果を基盤とし、臨床応用研究を加速させ、迅速診断薬開発や治療薬スクリーニング(創薬)を行うことにある。【結果】遺伝子改変動物を用いた基礎研究を継続し、CyPAが肺高血圧症にとって重要蛋白であることを確認し、論文発表を行った。さらに、分泌蛋白としての特徴に着目し、ヒト肺高血圧症患者の末梢血での血漿中CyPA濃度の測定法を開発し、患者群で健常者群に比較して、濃度が上昇していることを確認した。さらに、患者由来の組織や血液検体およびハイスループット・スクリーニング(HTS)システムを用い、CyPA分泌抑制・細胞外CyPA受容体阻害に着目した治療薬のスクリーニングを進めた。スクリーニングはほぼ終了し、現在、in vivoにおける検討を進めている。【学会・論文報告】以上の研究成果を、国内外の学会やシンポジウムで報告し(日本循環器学会総会シンポジウム、米国心臓病学会議、欧州心臓学会議)、12編の論文発表および特許申請を行った。さらに、4542の既存薬ライブラリーからのハイスループットスクリーニングにより、有効な低分子化合物が数種類まで絞り込まれ、新しい治療薬としての可能性につきin vivoで評価を進めると共に、学内での特許申請登録を行った。基礎研究の臨床応用を進める本研究計画において、既に、患者由来の組織や血液検体およびハイスループット・スクリーニング(HTS)システムを用い、CyPA分泌抑制・細胞外CyPA受容体阻害に着目した治療薬の1st2ndスクリーニングが、当初の予定より早く、順調に進んだ。現在、in vivoにおける検討段階に入っていることから、上記区分の判断とした。研究1.CyPA分泌抑制に着目した新しい心血管病治療薬開発:既に臨床応用されている既存薬剤ライブラリープレートを利用し、CyPA分泌阻害という切り口で、心血管病治療効果を有する分子のスクリーニング(HTS)を進めている。既に、選択的Rhoキナーゼ阻害薬やスタチンは血管平滑筋細胞からのCyPA分泌を抑制することを確認した。降圧薬や糖尿病薬、脂質異常症治療薬など、直接的もしくは間接的に心血管組織の酸化ストレス抑制効果のある既存薬剤の中から、より効率的にCyPA分泌を抑制できる薬剤をスクリーニングしている。研究2.CyPA受容体Basigin阻害に着目した新しい治療薬開発:CyPA/Basigin阻害による酸化ストレス制御に着目した新しい治療薬の開発を進めている。当科の遺伝子改変動物(CyPA, ROCK1, ROCK2, Basigin)を駆使し、分子学的機序の基礎研究を継続している。また、薬学系研究科との共同研究により、HTSを用いたBasigin阻害薬検索を進め、動物モデルでの有効性を確認した。研究3.細胞外CyPA吸着による新しい心血管病治療薬開発:CyPAはHIV感染やHCV複製の必須蛋白でもあり、創薬が盛んである。様々なCyPA阻害薬が開発されており、細胞外CyPAと結合するが、細胞内に取り込まれない化合物が開発された。細胞外へ分泌されたCyPAを選択的に吸着・阻害することで、細胞内CyPAの生理学的な役割に影響することなく、心血管病発症を抑制できる可能性があり、各種の心血管疾患モデル動物を用いた検証を開始した。【目的】心血管病発症における酸化ストレス分泌蛋白サイクロフィリンA (CyPA)およびその受容体Basiginの基礎研究成果を基盤とし、臨床応用研究を加速させ、迅速診断薬開発や治療薬スクリーニング(創薬)を行う。【結果】各種の遺伝子改変動物を用いた基礎研究を継続し、CyPAが肺高血圧症にとって重要蛋白であることを確認し、論文発表を行った。スクリーニングは終了し、肺高血圧モデルマウスにおける有効性の検証を進めた。【学会・論文報告】国内外の学会やシンポジウムで報告し(日本循環器学会総会シンポジウム、米国心臓病学会議、欧州心臓学会議)、18編の論文発表および5件の特許出願を行った。

さらに、4542の既存薬ライブラリーからのハイスループットスクリーニングにより、有効な低分子化合物が数種類まで絞り込まれ、新しい治療薬としての可能性につきモデル動物での検証を進めた。これまで、患者由来の組織や血液検体およびハイスループット・スクリーニング(HTS)システムを用い、CyPA分泌抑制・細胞外CyPA受容体阻害に着目した治療薬のスクリーニングが終了し、動物モデルにおける検証を進めたことから、上記区分の判断とした。研究1.CyPA分泌抑制に着目した新しい心血管病治療薬開発:既に臨床応用されている既存薬剤ライブラリープレートを利用し、CyPA分泌阻害という切り口で、心血管病治療効果を有する分子のスクリーニング(HTS)を進めている。既に、選択的Rhoキナーゼ阻害薬やスタチンは血管平滑筋細胞からのCyPA分泌を抑制することを確認した。降圧薬や糖尿病薬、脂質異常症治療薬など、直接的もしくは間接的に心血管組織の酸化ストレス抑制効果のある既存薬剤の中から、より効率的にCyPA分泌を抑制できる薬剤をスクリーニングしている。研究2.CyPA受容体Basigin阻害に着目した新しい治療薬開発:CyPA/Basigin阻害による酸化ストレス制御に着目した新しい治療薬の開発を進めている。当科の遺伝子改変動物(CyPA, ROCK1, ROCK2, Basigin)を駆使し、分子学的機序の基礎研究を継続している。また、薬学系研究科との共同研究により、HTSを用いたBasigin阻害薬検索を進め、動物モデルでの有効性を確認した。研究3.細胞外CyPA吸着による新しい心血管病治療薬開発:CyPAはHIV感染やHCV複製の必須蛋白でもあり、創薬が盛んである。様々なCyPA阻害薬が開発されており、細胞外CyPAと結合するが、細胞内に取り込まれない化合物が開発された。細胞外へ分泌されたCyPAを選択的に吸着・阻害することで、細胞内CyPAの生理学的な役割に影響することなく、心血管病発症を抑制できる可能性がある。【目的】心血管病発症における酸化ストレス分泌蛋白サイクロフィリンA (CyPA)およびその受容体Basiginの基礎研究成果を基盤とし、臨床応用研究を加速させ、迅速診断薬開発や治療薬スクリーニング(創薬)を行う。【結果】各種の遺伝子改変動物を用いた基礎研究を継続し、CyPAが肺高血圧症にとって重要蛋白であることを確認し、論文発表を行った。さらに、分泌蛋白としての特徴に着目し、ヒト肺高血圧症患者の末梢血での血漿中CyPA濃度の測定法を開発し、患者群で健常者群に比較して、濃度が上昇していることを確認した。さらに、CyPA高濃度群と低濃度群に分け、長期的な予後調査を行ったところ、血漿中CyPA濃度が高い群で、明らかに生命予後が不良であった。さらに、患者由来の組織や血液検体およびハイスループット・スクリーニング(HTS)システムを用い、CyPA分泌抑制・細胞外CyPA受容体阻害に着目した治療薬のスクリーニングを進めた。スクリーニングは終了し、肺高血圧モデルマウスにおける有効性の検証を進めた。【学会・論文報告】
短い区間における約数の和に関する研究

短い区間での約数の分布と約数の和の関係を明らかにするために、Voseの手法と私たちのN=n!に対する手法でもあった整数Nの平方根の近くの短い区間での約数の分布についての研究を数論的関数のフーリエ変換を用いて行ないN_<kappa>=PI^<kappa>_<i=1>p_<iota>,p_<iota>素数,N_<kappa>=kappa!,N_<kappa>=lcm{1,2,3,...,kappa}などの整数N_<kappa>において、〓と〓の間で整数iotaとN_<kappa>の約数の中でiotaより大きくて最小のものをd^+(iota)としたとき、d^+(iota)とiotaの差はiotaepsilon_<kappa>ただしepsilon_<kappa>=exp{-(logkappa)^<beta>},0<beta<1/2より必ず小さくなることを得た。また、1からN_<kappa>までの整数をN_<kappa>の約数を用いて表わすとき必要な異なる約数の最小な個数をl(N_<kappa>)とするとき、上で記したbetaが0とlog_2N_<kappa>/(log_3N_<kappa>-log2)の間にあるとき、l(N_<kappa>)の上からの評価はexp{log_2N_<kappa>-beta(log_3N_<kappa>-log2)}で与えられることが分かった。また、下からの評価として(logN)/(logtau(N))(1+〓)を得た。これらの研究はそれぞれの剰余数がPを法として1/iotaと合同であるとき、それらの和をとることによりPを法とするすべての剰余数を表わすのに必要な最小な剰余数の個数と密接な関係があることが分かってきた。つまりPを法とするすべての剰余数を表わすのに必要な最小な剰余数の個数がlogP(log_<2P>)^<1+mu>,mu>0で与えられるならば、約数の和の上からの評価の改良につなげることができることが分かってきた。これがこれからの研究のテーマになる。
膜内蛋白分解酵素により誘導されるＴＮＦの新しい機能の解明と炎症性疾患制御への応用

本研究ではTumor necrosis factor-α(TNF)に対する膜内蛋白分解酵素の作用を明らかにする事が目的である。TNFを産生する細胞株(293T)に種々のシグナルペプチドペプチターゼ様蛋白分解酵素(SPPL)cDNAを遺伝子導入し、細胞溶解後、ウエスタンブロッティングによりTNFのフラグメントを検出したところ、SPPL2aのみがTNF由来細胞内ドメイン形成作用を有することが示された。また遺伝子導入後のウエスタンブロッティングによる解析や上清中のTNF濃度測定によりSPPL3がTNF変換酵素様酵素活性を有する事を初めて明らかにした。<TNFファミリー分子におけるSPP、SPPLの新しい基質の探索>本研究ではTumor necrosis factor-α(TNF)に対する膜内蛋白分解酵素の作用を明らかにする事が目的である。<変異SPPLの作成とSPPLによるTNFの切断後に生じるICDの確認>1)変異SPPL2aの作成: SPPLはGXGDモチーフのアスパラギン酸(D)を変異させると酵素活性が消失することがわかっているため、Inverse PCR法を用いてSPPL2acDNAに酵素活性部位変異を導入した(GXGD→GXGA,変異SPPL2a)。2)T細胞株におけるSPPL2aによるICD形成の確認:TNFを恒常的に産生するT細胞株(Jurkat)にベクターのみ、野生型SPPL2acDNA、変異SPPL2acDNAを発現ベクターを用いて遺伝子導入した。ウエスタンブロッティングにより野生型SPPL2acDNAを遺伝子導入した場合のみ細胞内にICDが出現する事を確認した。<TNFファミリー分子におけるSPP、SPPLの新しい基質の探索>膜内蛋白分解酵素のうち、その構造よりSPP, SPPLはII型膜蛋白を分解すると予想される。TNFファミリー分子の多くはII型膜蛋白であるが、このうちSPP、SPPLの基質としてTNFとFasリガンドのみが報告されている(NatRev Mol Cell Biol 5: 499-504, 2004)。上記2分子以外の基質を見いだすため、本年度はTNFファミリー分子cDNA及びSPPcDNAまたはSPPLcDNAを発現ベクターに組み込んだ。TNFファミリー分子の候補はBAFF, APRIL, TRAIL, CD40リガンド等である。本研究ではTNF由来の細胞内ドメイン(TNF-ICD)が核に移行後、TNFの新しい機能を発揮する可能性に着目し、TNFに対する膜内蛋白分解酵素の作用を明らかにする事が目的である。2)細胞株におけるSPPLによるICD形成の検討:TNFを恒常的に産生する細胞株(293T)にベクターのみ、野生型SPPL2a、SPPL2b、SPPL2c、SPPL3cDNAおよびそれぞれの変異SPPLcDNAを発現ベクターを用いて遺伝子導入した。細胞溶解後、ウエスタンブロッティングによりTNFのフラグメントを検出したところ、野生型SPPL2aを遺伝子導入した場合のみ細胞内にICDが出現した。3)SPPL3のTACE様活性の同定:TNFを恒常的に産生する細胞株(293T)に野生型SPPL3cDNAを遺伝子導入した際には、TNFがTNF変換酵素(TACE)様の切断を受ける事を上記ウエスタンブロッティングにて見いだした。次にSPPL3cDNAを遺伝子導入した細胞株培養上清中の可溶型TNF濃度を測定した所、野生型SPPL3cDNAを遺伝子導入した際には、ベクターのみや変異SPPL3cDNAを遺伝子導入した場合に比較し、TNF濃度は上昇していた。TACE阻害薬を添加すると、野生型SPPL3cDNAを遺伝子導入した際のTNF濃度の上昇は抑制された。以上の結果により、SPPL3がTACE様酵素活性を有する事が初めて明らかになった。医歯薬学本年度までの実績により膜内蛋白分解酵素SPPLの中でSPPL2aのみがICD形成作用を有する事が明らかになった。さらに、SPPL2c、SPPL3がTACE様の酵素活性を有することが初めて明らかになった。本年度の実績により、野生型SPPL2acDNAを遺伝子導入した場合にのみ細胞内にICDが出現する事が明らかになったため、野生型及び変異SPPL2acDNAを遺伝子導入後、細胞の遺伝子発現を比較することにより、ICD形成後の遺伝子発現変化を解析する事が可能となった。またTNFファミリー分子cDNA及びSPPcDNAまたはSPPLcDNAを発現ベクターに組み込んだことにより、今後TNFファミリー分子におけるSPP、SPPLの新しい基質の探索を行う事が可能になった。SPPL2c、SPPL3のTACE様作用についての解析:今回初めて明らかになったSPPL2c、SPPL3のTACE様作用につきさらに詳細な検討を行う。具体的には1)SPPLcDNAを遺伝子導入した細胞株培養上清中の可溶型TNFの濃度を比較する、2)TACE阻害薬による阻害を受けるか否か、等につき検討する。TNFファミリー分子におけるSPP、SPPLの新しい基質の探索:SPP、SPPLの新しい基質を見いだすため、293T細胞株にBAFF、APRIL、TRAIL、CD40リガンドcDNA及びSPPcDNAまたはSPPLcDNAを同時に遺伝子導入後、ウエスタンブロッティングにてICD出現の有無を確認する。

T細胞株におけるICDにより誘導される遺伝子の探索: TNFを恒常的に産生するT細胞株に野生型SPPL2acDNA、変異SPPL2acDNAを遺伝子導入し、RNAを調製後、マイクロアレイを用いて両者の遺伝子発現を比較する。発現量に差が認められた遺伝子については半定量的PCR、およびウエスタンブロッティングにてmRNAレベル、蛋白レベルにおける発現量の確認を行う。TNFファミリー分子におけるSPP、SPPLの新しい基質の探索:SPP、SPPLの新しい基質を見いだすため、293T細胞株にTNFファミリー分子cDNA及びSPPcDNAまたはSPPLcDNAを同時に遺伝子導入後、ウエスタンブロッティングにてICD出現の有無を確認する。該当無し
複雑系における構造形成と動的界面構造:計算機実験と動的構造解析

長鎖状の脂質分子や高分子は、多様な凝集様式(溶液・融液・結晶・薄膜・ミセルなど)を示し、その動的構造は極めて興味深い。本研究では、界面の動的構造という観点から、脂質や高分子系での秩序構造形成の機構を多面的に検討した。1.固体-液体界面の構造:高分子結晶界面での秩序形成過程を究明する前段階として、計算機実験による固液界面での分子鎖の凝集様式と分子運動性の研究を行った。固液界面近傍では結晶構造は著しく乱れており分子鎖は大きな運動性を示すこと、他方融液構造は界面近傍では秩序化する傾向があることなどが示唆された。2.高分子鎖の秩序化の微視的機構:分子動力学法を用いて、高分子鎖の結晶界面での秩序化をシミュレートした。界面吸着鎖の結晶化に対応する二次元空間での秩序化のシミュレーションを行い、ラメラ構造の形成、微結晶核の安定性、ラメラの厚化現象、など基礎的な微視的素過程を明らかにした。3.接合界面からの拡散と相転移:鎖状分子単結晶の接合界面の光学観察から、鎖状分子の結晶内での拡散現象が直接的に検出できることを見いだし、結晶内長距離拡散の存在を示した。4.ラメラ界面構造と固相転移:n-アルカンにおいて、低温で新たな構造転移の存在を明らかにし、その特徴的な構造変化(積み重なり転移)の詳細をX線回折を用いて究明した。複雑系(脂質や高分子系)における構造形成に関して、実験・計算機実験の両面から研究を行い、今年度は以下の様な知見を得た。1.長鎖状n-アルカン結晶の、代表的な低指数面における結晶成長過程を明らかにするため、界面の微視的構造を計算機実験(モンテカルロ法)を用いて研究した。界面における分子鎖の吸脱着過程、境界面近傍での結晶構造の乱れや液体構造の秩序化現象、などに注目した。異なった面指数を持つ結晶面に関して計算を行い、面指数によって界面構造や結晶化過程が著しく異なることを見いだした。表面自由エネルギの興味深い温度依存性が示唆され、結晶化過程の新たな視点を見いだした。2.アルカン結晶内における分子鎖の長距離拡散の可能性は、以前の実験から予測されていた。ここでは、アルカン単結晶を用いた接合系を作り、接合界面近傍での構造の変化を光学的に観察し、相互拡散現象の存在を直接的に検証した。分子鎖の拡散により顕著な構造相転移を示し、且つ構造相転移が光学的に最も明らかに観察できる様に拡散対を工夫した。接合界面近傍(数十μ)では、分子鎖の相互拡散が明らかに観察された。拡散の速度、異方性、温度依存性などを明らかにした。かなり長い分子鎖が、分子軸に垂直方向および分子軸に平行方向に、活発な相互拡散を示すこと、その素過程がその場観察によって明らかにされた。2.高分子鎖の秩序化の微視的機構:分子動力学法を用いて、高分子鎖の結晶界面での秩序化をシミュレーンした。

3.接合界面からの拡散と相転移:鎖状分子単結晶の接合界面の光学観察から、鎖状分子の結晶内での拡散現象が直接的に検出できることを見いだし、結晶内長距離拡散の存在を示した。4.ラメラ界面構造と固相転移:n-アルカンにおいて、低温で新たな構造転移の存在を明らかにし、その特徴的な構造変化(積み重なり転移)の詳細をX線回折を用いて究明した。
思春期に対する睡眠を中心とした包括的生活習慣教育による介入研究

高校生に対して睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を行い、その介入効果を評価した。16の高等学校の生徒が参加し、有効回答者は3010人であった。教育では、本研究のために開発された教材を用いて、1回5分間の授業を計12回行った。介入群の生徒は観察群と比較して、睡眠障害の有症率の増加が有意に抑制され、不眠症の新規発症率に関しても有意差がみられた。多変量ロジスティク回帰分析で検討したところ、介入群は不眠やうつ状態の新規発症リスクを有意に下げる結果となった。以上より、高校生に対する睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育は、不眠や精神的健康度に関連する症状の発症を抑制するものと考えられた。思春期にある高校生の睡眠問題は、学習効率を低下させるだけではなく、抑うつや身体症状の発生を促進し、心身の健康にも多大な影響を及ぼすと考えられている。そのため、思春期の睡眠問題は、学校教育ならびに学校保健の両面において重要な課題である。また、思春期は健康的な生活習慣を身につける時期として重要である。本研究では、高校生に対して、睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を実施し、こうした保健教育が思春期の睡眠習慣、健康意識、精神的健康度(メンタルヘルス)に及ぼす影響について検証するものである。研究では、同一の生徒集団を対象に、平成27年度と平成28年度に合計2回の自記式質問調査を実施する予定である。平成26年度は、自記式質問調査や保健教育を実施する準備として、複数の高等学校の養護教員と相談しながら、自記式質問調査票、調査票記入マニュアル、睡眠習慣教育に使用する教材を作成した。睡眠習慣教育に使用する教材は、平成26年3月に厚生労働省が発表した健康づくりのための睡眠指針2014に基づき、この内容を紹介するものとした。1回5分の指導を12回にわたって行うプログラムを作成した。また、某市に所在する19校の高等学校長宛に研究の目的と方法を説明した上で、研究への協力を要請した。その結果、17校から質問調査への同意、12校から睡眠習慣教育への同意が得られた。さらに、研究代表者が所属する機関の倫理審査委員会への申請を行い、研究実施の承認を得た。思春期の睡眠問題は、学習効率を低下させるだけではなく、抑うつや身体症状の発生を促進し、心身の健康にも多大な影響を及ぼす。本研究では、高校生に対して、睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を実施し、こうした保健教育が思春期の睡眠習慣、健康意識、精神的健康度(メンタルヘルス)に及ぼす影響について検証を行うものである。平成26年度には、関係諸機関との交渉、自記式質問票や生活習慣教育に用いる教材の作成、倫理審査委員会への申請などを行った。平成27年度には、某市に所在する21の高等学校のうち、最終的に協力が得られた16校においてベースライン調査として自記式質問票調査を実施した。対象生徒は4,300人、参加者は3,227人、有効回答は3,145人であり、参加率は73.7%、有効回答者率は73.1%であった。睡眠時間が6時間未満の者は男性の24.2%、女性の27.8%に認められた。就寝時刻が午前1時以降の者は男性の13.5%、女性の16.1%に認められた。睡眠の質が悪い、または、とても悪いと回答した者は男性の13.1%、女性の13.6%に認められた。多変量解析では、抑うつ状態、消灯後の携帯電話などの使用、長いインターネット利用などと、種々の睡眠問題との間に有意な関連性が認められた。ベースライン調査後には、半数の8校を先行群として睡眠を中心にした生活習慣教育を実施した。残りの8校は待機群とした。平成28年度には、フォローアップ調査を実施して、先行群と待機群を比較することによって睡眠を中心にした生活習慣教育の効果を検証する予定である。27年度の重要な研究活動は、第1にベースライン調査を実施すること、第2に先行群に睡眠を中心にした生活習慣教育を実施することであったが、いずれも予定通り実施することができた。また、ベースライン調査では、73.1%といった高い有効回答者率が得られた。以上のことから、おおむね順調に進展しているものと考えている。本研究では、高校生に対して睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を実施して、睡眠習慣、健康意識、精神的健康度に及ぼす影響について検証を行うものである。平成27年47月に協力の得られた16校の高等学校の生徒を対象にベースライン調査を実施した。16校のうちの8校を介入群(先行群)として、平成27年912月に研究者と養護教諭らが作成した教材を用いて生活習慣教育を実施した。また、介入群(先行群)以外の8校をコントロール群(待機群)とした。平成28年47月に同じ16校の生徒を対象にフォローアップ調査を実施した。2回の調査データが連結できた者で調査に協力する意思を示し、かつ、性別の判明している者を有効回答者とした。有効回答者は3010人であった。有効回答者は介入群では1463人、コントロール群では1547人であった。

コントロール群では、2回の調査における入眠障害、夜間覚醒、早朝覚醒、不眠のそれぞれの有訴者率は、6.5%から8.9%、2.3%から3.9%、2.7%から4.0%、9.5%から12.7%と有意に増加したのに対して、介入群では7.5%から7.1%、3.6%から2.9%、3.5%から2.8%、11.2%から10.3%といずれも有意な変化は認められなかった。これらを統計学的に検定したところ、介入群とコントロール群との間に有意な違いが示された。また、多重ロジスティック回帰分析にて、介入群とコントロール群を比較したところ、夜間覚醒、早朝覚醒、不眠の新規発症について有意な違いが認められ、介入群ではコントロール群に比べてこれらの症状の新規発症のリスクが有意に低くなっていた。以上の所見より、高校生に対する睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育は、不眠に関連する症状の発症を抑制するものと考えられた。引き続き、統計解析を行っていくとともに学会発表や論文執筆を進めていく予定である。28年度までにベースライン調査とフォローアップ調査を行うことと、睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育の教材を作成して実施することを目標としていた。現在の進捗状況はいずれの目標も達成しており、おおむね順調に進展していると考えられる。本研究では、高校生に対して、睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を実施し、こうした保健教育が思春期の睡眠習慣、健康意識、精神的健康度(メンタルヘルス)に及ぼす影響について検証を行った。平成27年47月に協力の得られた16校の高等学校の生徒を対象にベースライン調査を実施した。調査方法は自記式質問調査であった。16校のうちの8校を介入群(先行群)として、平成27年912月に研究者らが高校生向けに作成した教材を用いて睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を実施した。この教育では1回5分間の保健教育を合計12回実施した。また、残りの8校をコントロール群(待機群)とした。平成28年47月に同じ16校の生徒を対象にフォローアップ調査を実施した。フォローアップ調査の内容と方法はベースライン調査と同一にした。2回の調査データが連結できた有効回答者は3010人であった。多重ロジスティック回帰分析にて、介入群とコントロール群を比較したところ、夜間覚醒、早朝覚醒、不眠の新規発症について有意な違いが認められ、介入群ではコントロール群に比べてこれらの症状の新規発症のリスクが有意に低くなっていた。また、ベースライン調査のみを用いてメンタルヘルスや不眠症の関連要因を検討した。その結果、うつ状態には、不眠症、睡眠の質が悪いこと、インターネットの過度な利用が有意に関連することが判明した。不眠症には、うつ状態と友人とのトラブルが有意に関連することが判明した。さらに、2回の調査データを用いて縦断的に寝坊による遅刻の危険因子を検討した。その結果、インターネットの過度な利用と朝食の欠食が、危険因子となることが示唆された。高校生に対して睡眠を中心にした包括的な生活習慣教育を行い、その介入効果を評価した。16の高等学校の生徒が参加し、有効回答者は3010人であった。教育では、本研究のために開発された教材を用いて、1回5分間の授業を計12回行った。介入群の生徒は観察群と比較して、睡眠障害の有症率の増加が有意に抑制され、不眠症の新規発症率に関しても有意差がみられた。
水俣病における地域再生の比較研究と「第三水俣病」問題の再検討-水俣病紛争の「解決」以後における社会学的課題-

周知のように、水俣病における未認定患者問題が長期に亘って紛糾した根本には、「認定基準の過度の厳格化」という問題がある。そして、この厳格化を引き起こした重要な契機として「第三水俣病」の発生問題(有明海、山口県徳山湾、新潟県関川流域など)が存在する。すなわち、「認定基準を変更しなければ、第三水俣病の発生も認めてしまうことになる」という懸念が、認定基準の厳格化を導いた一要因となったのである。1995年の「水俣病の政治的解決」によって、熊本・新潟の両水俣病未認定患者が、「解決対象者」となったが、水俣病と認められなかった人々は、決してこれだけではない。「第三水俣病」の発生を否定された地域に住む人々も存在するからである。「未認定患者を解決対象者とする」なら、当然これらの人々も対象となるべきである。しかし、実際は、検討の対象にさえなっておらず、社会的公正という観点からも甚だ問題であり、「政治的解決」と言わざるを得ない。公害被害においては、その被害におけるミニマムは何か、を解明することが極めて重要である。これなくして、被害の全貌が分からないからである。「第三水俣病」の否定は、この水俣病被害におけるミニマムの解明を阻害する大きな契機ともなっている。わが国では、既に終息したかにみえる水銀汚染問題だが、世界各地では現在でも深刻な問題となっている。しかし、わが国における水俣病の厳格な認定=診断基準が適用されてしまうために、世界でも未認定患者が発生してしまっている。「第三水俣病」の否定は、このように水俣病被害のミニマムの解明を阻害し、世界の水俣病を否定するという意味をも有しているのである。熊本の水俣市では、公害で疲弊した地域の再生のための試みが、行政と住民、被害者が一体となって展開されている。しかし、新潟ではそうなっていない。例えば、1,原因企業のある鹿瀬町(阿賀野川の上流)の町史の年表には「新潟水俣病」の文字は一言も書かれていない。また、町長は「水俣病の問題はできれば早く忘れたい」と言い、「行政として、水俣病の歴史を語り継ぐ気はない」と述べる。2,一方、下流域では、水俣市の場合を参考に、新潟水俣病資料館の建設を進めているが(水俣病の教訓化事業、場所は阿賀野川から少し離れた豊栄市の福島潟に予定)、地元の漁業や水俣病の認定患者(新潟水俣病被災者の会)から反対運動が提起され、県は対応に苦慮している。水俣病の教訓化、そしてそれに伴う地域再生の試みの熊本と新潟との相違はどこに起因するのであろうか。相違の原因の基底にあるのは、「地域社会の分裂と不和」という問題であった。当初の汚染、そしてその後の紛争の過程で阿賀野川流域住民の中には水俣病被害者とそうでない人々という区別が生み出され、さらには前者の中に様々な立場の違う集団が作り出された。これらの集団の中には、微妙な反目と不和が見いだされ、これらが教訓化事業に対する意義付けの相違を形成していた。そして、そこに、1,熊本と新潟それぞれにおける原因企業の教訓化に対する姿勢の違いや、2,新潟の場合、原因企業の位置する自治体と教訓化事業展開の中心地が地理的に分離していること、が大きく関係し、資料館の建設をはじめとする教訓化事業の合意形成を困難なものにしていたのであった。
ハーブ・香辛料処理による食品中有害アミンの増加抑制についての研究

メドウスイートと呼ばれるハーブの熱水抽出液に含まれるTellimagrandin II、Rugosin A、Rugosin Dを、ヒスタミン産生菌の代表的な菌であるモルガン菌が有するヒスタミン合成酵素(HDC)に作用させたところ、強い阻害を示した。ハーブティーとして飲用される濃度の熱水抽出液によってもHDC活性が十分に阻害された。そこで、この抽出液に浸漬させたサバの切り身のヒスタミン蓄積を調べたところ、コントロールに比べてヒスタミン量が大幅に減少した。メドウスイート熱水抽出液は赤身魚でのヒスタミン蓄積を抑制し、食中毒予防に有効である可能性が高いと考えられた。食品から過剰に摂取すると有害とされる、生理活性アミンのヒスタミンとセロトニンについて、ハーブや香辛料を下処理に用いることによって赤身魚中の生理活性アミンの生成を抑制するための検討を行うために、平成26年度は赤身魚中の有害アミンを増加させている主要微生物である、モルガン菌についてその菌由来のヒスタミン合成酵素(HDC)を大量に得て精製品を用意することを目的とした。モルガン菌については、研究協力者である兵庫県立大学の北元憲利教授より提供を受け、モルガン菌由来HDCのアミノ酸配列はゲノム情報を提供するインターネットサイト上に掲載されており、そのアミノ酸配列を増幅するようにプライマーを設計した。モルガン菌よりゲノムを取り出し、PCRによって増幅したPCR産物をプラスミドに取り込み、発現用プラスミドを作成し、大腸菌の形質転換を行った。精製を容易にするため得られるタンパク質にはヒスチジンタグもしくはGSTタグをつけ、常法に従い大腸菌の培養、発現、精製を行った。その結果酵素活性を有する精製酵素をmg単位で得ることができた。精製した酵素の至適pHや各pHでのKm値は、過去に報告されているモルガン菌から精製したHDCの値とほぼ一致していた。今回得た酵素を用いてモルガン菌HDCの活性を阻害する成分の探索が可能であると考えられ、まずはヒトHDCの活性を阻害する食品成分について検討したところ、ヒトHDCと同様に酵素活性を阻害することを確認した。前年度に精製法を確立したモルガン菌由来のHDCを使用して、その酵素活性を阻害するハーブ、香辛料を探索する計画に基づき、ハーブのメドウスイートについて検討を行った。メドウスイート抽出液は、ヒト由来HDC活性を強く阻害することを既に確認しており、また阻害成分も同定している。その阻害成分はモルガン菌由来HDCにも作用し、ヒト由来HDCと同程度の阻害を示した。更に、メドウスイート熱水抽出液をサバの切り身に浸漬させると、PBSに浸漬させた場合に比べてヒスタミン蓄積が抑制されることも確認した。これらの結果は"Inhibition of Morganella morganii Histidine Decarboxylase Activity and Histamine Accumulation in Mackerel Muscle Derivedfrom Filipendula ulumaria Extracts."というタイトルでJournal of Food Protectionに掲載された(2016 Mar;79(3):463-7. doi: 10.4315/0362-028X.JFP-15-313.)。当初予定していた時期よりも早い時期に論文としてまとめることができたため。サバ肉中でのアミン分析として、セロトニン含有量をELISAにて分析した。ヒスタミンが生成蓄積する条件、25°Cで1日経過後、2日経過後、3日経過後でのセロトニン量を3検体について定量した。その結果、セロトニン量の増加は見られず、量としても0.7mg/100g程度で、中毒症状を引き起こす量ではなかった。このことから、サバに代表される赤身魚での有害アミンとしてセロトニンは考慮しなくてもよいと考えられた。精製を簡易にするために作成した、モルガン菌由来のヒスタミン生成酵素の大腸菌での組換え体タンパク質について、アフィニティー精製およびイオン交換生成を行い、X線結晶構造解析のための試料作りに取り組んだ。精製後のタンパク質を4°Cに保存し、時間経過に伴う変化を調べたところ、ジスルフィド結合による凝集が進行することを確認した。還元剤を添加しても完全に凝集を防げなかったことから、ジスルフィド結合に関与すると思われる残基を置換した変異体作成を行った。変異を一つ導入するよりも二つ導入する方が凝集を防ぐことができたが、それでも凝集を完全に防げなかった。変異導入の際には、ヒト由来のヒスタミン生成酵素の結晶構造を元に凝集に関与すると予測される残基を特定したが、それだけでは凝集を防げなかったことから、モルガン菌由来ヒスタミン生成酵素に特異的な構造が関与していることが示唆された。一方、ヒト由来の酵素で触媒に重要であることがわかっている特定の残基について、モルガン菌由来の酵素でその残基に対応するアミノ酸を置換すると、触媒能が失われたことから、ある程度両者の酵素の構造は類似していると考えられた。

メドウスイート熱水抽出液は赤身魚でのヒスタミン蓄積を抑制し、食中毒予防に有効である可能性が高いと考えられた。モルガン菌由来HDCの発現系の構築にもっと時間を要すると考えていたが、検討項目が最小限で済み、早い段階で精製酵素を得ることができ、最終年度に予定していた阻害成分との相互作用を見ることができたため。赤身魚中のセロトニン定量をELISA法にて行う。調理科学モルガン菌HDCの活性を阻害する成分をさらに検討する。赤身魚中のヒスタミン量が、モルガン菌HDCの活性を阻害する成分によって抑制されるかどうかを検討する。また赤身魚中のセロトニン量についてELISA等を用いて検討する。最終年度の予算の一部を昨年度に前倒しで使用したため、今年度の予算の一部を次年度分に持ち越した。試料を保管するディープフリーザーが急きょ必要になったため。実験に使用する試薬や機器の購入にあてる。ディープフリーザーの購入と、進展している実験用の試薬購入にあてる。
microRNA-6126によるHBV増殖抑制機構の解明

B型慢性肝炎は,肝臓にB型肝炎ウイルスが感染し,増殖することにより発症します.放置すれば,肝硬変及び肝細胞癌といった合併症を引き起こすことがあります.私達は,B型肝炎ウイルスの増殖を抑える物質の一つに,microRNA-6126があることを報告しました.本研究では,microRNA-6126がB型肝炎ウイルスの増殖を抑える際のメカニズムを解明すべく,microRNA-6126により発現が抑えられる遺伝子の同定を試みたいと考えています.B型慢性肝炎は,肝臓にB型肝炎ウイルスが感染し,増殖することにより発症します.放置すれば,肝硬変及び肝細胞癌といった合併症を引き起こすことがあります.私達は,B型肝炎ウイルスの増殖を抑える物質の一つに,microRNA-6126があることを報告しました.本研究では,microRNA-6126がB型肝炎ウイルスの増殖を抑える際のメカニズムを解明すべく,microRNA-6126により発現が抑えられる遺伝子の同定を試みたいと考えています.
病原真菌・放線菌の系統保存にかかわる遺伝子とその発現

生物資源の一つとして重要視されている微生物の保存は,微生物学の根底をなす仕事である。保存に際しては,菌株を生存させるだけでは不十分で,分離あるいは実験当初からのその遺伝的性質が保持されていなければならない。微生物は,保存の過程において性質が変化し易い。従って保存における遺伝子構造あるいは情報の変動について知見を得ることは極めて重要な意義を有する。我々は,世界諸国から病原真菌・放線菌の収集を試みてきた。それらは,真菌症原因菌として最も重要なCandida albicans, Cyptococus neoformans,また新興原因菌であるCandida dubliniensisなどの病原性酵母類,Trichophytophyton mentagrophytes等の皮膚糸状菌類,Paracoccidioides brasiliensis,等の輸入真菌症原因菌,Nocardia brasiliensisなどの放線菌症原因菌,Fonsecaea pedrosoi等の黒色真菌症原因菌である。この他マイコトキシン生産菌,発酵食品の応用に利用される菌類が分類されているAspergillus属菌についても収集を行った。これら菌類については,分類,同定,系統発生,分子診断,分子疫学,分子生態学などの観点から研究を行い,ribosomal DNAの種々の領域,cytochrom b遺伝子などのゲノム情報を蓄積した。この他,病因因子としての酵素類の遺伝子解析,さらに種内変異情報についても明らかにした。二次代謝物質の生産性と保存に関する研究課題では,抗真菌活性などをもつ新規物質や病因性物質と生産菌との関連に関するデータが蓄積された。保存の問題では,一定の時間経過後の解析が必要となる。近年,各微生物の機能遺伝子の総数が判明すると同時に,それら機能遺伝子を特定する方法が次第に一般化しつつあり,より身近なものとなった。本研究により得た遺伝子情報は,それらの方法と照らし合わせ行うことにより,保存におけるゲノム情報の変化を知る貴重な基礎データになる。微生物の系統保存にはその微生物本来の性質(形態,生理生化学的性状など)を維持していくことは非常に重要な反面,極めて困難な課題である。本センターでは病原真菌を主に,病原性放線菌,マイコトキシン産生菌および関連菌を国内外から収集し,保存している。真菌は保存中に変異を起こしやすく,そのために同定すら困難となる場合も多いため,本年度は特に,医真菌学的,また生態,疫学的研究を目的に見据え,分子生物学的手法による同定法の研究を行った。皮膚糸状菌ならびに関連菌であるArthrodermataceaeの菌類については,先ずユビキノンシステム(Q)がこれらすべての菌類で主QをQ-9とすることを明らかにした。また皮膚糸状菌についてはRandom Amplified polymorphicDNA(RAPD)法による同定可能なプライマーシステム見出した。皮膚糸状菌として最も分離頻度の高いT.mentagrophlytesについては形態と核酸の多型性との関係についても新たな知見を得た。Cryptococcusneoformansについても,serotype AあるいはBの同定法として,RAPD法をもとにした新しいプライマーシステムを見出した。また本菌については細胞生物学的研究としてserotype AD株のploidyについて研究を行い,大多数でdiploidであることを見出した。さらに近年患者数も増加傾向にあるアスペルギルス症の主な原因菌である,Aspergillus fumigatus,A.flavusなど形態的には同定困難の菌類に対し,ミトコンドリアのチトクロームb遺伝子に関連したプライマーシステムによる同定法を見出した。このほか,放線菌,Candida albicansの薬剤耐性化にかかわる遺伝子解析の研究からいくつかの成果を得た。

ヒトはもとより色々な生物のゲノム解析が報じられており,真菌類についても遺伝子レベルの情報が増加しつつある。微生物はその多様性を条約締結をもって保護されるほど貴重な資源である。本センターには病原真菌を主に,病原性放線菌,マイコトキシン産生菌および関連菌を国内外から収集し,保存している。本年も保存株を医真菌学また生物活性物質のオリジンとの観点から研究を行い成果を得た。先ず医真菌領域では皮膚糸状菌において、世界の異なる地域の患者から分離されたTrichophyton tonsuransが遺伝子的にhomogeneousであることを見いだし、またヒト、動物で起因菌となるT.Mentagrophytesがヒト分離株と動物分離株では異なるDNAパターンを示すことを見出した。パラコクシジオイデス症の原因菌であるParacoccidioides brasiliensisに関する研究では、先に中間宿主として指摘したアルマジロからの分離株とヒト分離株について遺伝子レベルまた病原性の比較から本菌の多様性を指摘した。発酵食品の製造に重要な菌類と最強のmycotoxinであるaflatoxinsの産生菌が分類されているAspergillussection Flaviについて、cytochrome b geneの426bpの塩基配列の比較がこれら菌類の分類に有用であることを示した。近年エイズ患者の真菌症原因菌として注目されているCandida dubliniensisに関する研究では、小児HIV患者からブラジルでは初めての分離、同定に成功し、また遺伝子レベルでの同定用PCR primerを見出した。真菌の多様性で期待される二次代謝産物の研究ではAuxarthron conjugatum, Oidiodendron sp.,Nocardia brasiliensisなどから新規抗真菌性物質の単離に成功した。微生物は、生物多様性条約締結に示されるように、国益にかかわる貴重な資源として認識され、各国の固有財産として保護されつつある。ヒトをはじめ多くの生物の研究はポストゲノム時代に入り、機能開発研究が微生物分野でも重要なテーマとして競われている。本センターには病原真菌を主に,病原性放線菌,マイコトキシン産生菌および関連菌を国内外から収集し,保存しているが、本年度更にこれら特性を有する菌類の収集・保存を促進した。本年度も従来からの保存株に新たに加えられた菌株を対象に、ヒト病原性真菌、放線菌ならびに生理活性物質の供給資源としての観点から研究を行い次のような結果を得た。医真菌領域では、パラコクシジオイデス症の原因菌であるParacoccidioides brasiliensisについて、本菌の感染マウス・パラフィン包埋ブロックからnestedPCR法により、本菌に特異的な遺伝子の検出に成功し、診断法としての可能性を示した。