hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オンゴーイング認知と再現認知による体育教師の実践的力量を高める手法の開発

スポーツ教育は,広い空間において学習者と教師が身体を動かしながら実践される.そのため,教師は,空間認知や学習者の身体認知,授業の勢いの認知,予測認知といった認知が教室での座学以上に必要となる.本研究は,授業時にマイクを付けてつぶやくオンゴーイング法と授業者の頭にCCDカメラを取り付け,授業者の視点での認知をVTRに収め,授業後に再現して認知する再現認知法を試みた.その結果,オンゴーイング法は熟達教師の語りが多く表出した.一方,再現認知法では初心者教師が熟達教師と同じ語りを表出する傾向にあった.スポーツ教育は,広い空間において学習者と教師が身体を動かしながら実践される.そのため,教師は,空間認知や学習者の身体認知,授業の勢いの認知,予測認知といった認知が教室での座学以上に必要となる.本研究は,授業時にマイクを付けてつぶやくオンゴーイング法と授業者の頭にCCDカメラを取り付け,授業者の視点での認知をVTRに収め,授業後に再現して認知する再現認知法を試みた.その結果,オンゴーイング法は熟達教師の語りが多く表出した.一方,再現認知法では初心者教師が熟達教師と同じ語りを表出する傾向にあった.本研究は、オンゴーイング認知と再現認知による体育教師の実践的力量を高める手法の開発を行なう。教師の力量を高めるねらいで行なわれる研究授業や各種研修を補うため、何を認知しているのかを授業時に「つぶやく」オンゴーイング認知と教師の認知映像を使って、日常の教育実践の中で力量を高めることのできる手法を開発する。今年度は、授業時に何を認知しているのか教師が声を出してつぶやくオンゴーイング認知と、教師が何を観ているのかの認知映像を使った再現認知によって教師がどのように変容するのか、研究者であり体育教師である自らを研究対象として明らかにした。2ヶ月間、授業時につぶやくオンゴーイング認知授業を行なった。具体的には2ヶ月間、午前に授業を行ない、夕刻に日誌を書いた。夏休みを経て、2ヶ月間、教師の認知映像をみての再現認知を行なった。これもオンゴーイング同様、午前に授業を行ない、夕刻に授業時のつぶやきと認知映像の再現認知を行ない、日誌を書いた。日誌は浅田(2000)による授業日誌法を活用した。その結果、オンゴーイング認知が授業時の認知を克明に表現することが可能であるとともに、リフレクション時の有効なデータとして活用することが可能であるといった示唆を得ることができた。また、教師の認知映像を再現することは、「今ここを観ているのは○○であるため」といったエビデンスを得るために有効に機能することが明らかとなった。そのため、複数の教師で映像を観て検討や評価を加えるために役立つ可能性を示唆することができた。本研究は,オンゴーイング認知と再現認知による体育教師の実践的力量を高める手法の開発を行なっている.教師の力量を高めるねらいで行なわれる研究授業や各種研修を補うため,何を認知しているのかを授業時に「つぶやく」オンゴーイング認知と授業時に教師がどこを観ているのかの認知映像を再現する再現認知法を使って,日常の教育実践の中で力量を高めることのできる手法を開発する.今年度は,授業時に何を認知しているのか教師が声を出してつぶやくオンゴーイング認知と,教師が何を観ているのかの認知映像を使った再現認知の特徴を明らかにするため,初心者教師と熟達教師においてオンゴーイング法と再現認知法のどちらが有効に機能するかについて研究を進めた.具体的には,サッカーにおける初心者教師,中堅教師,熟達教師の授業における学習者,学習過程,学習内容等の条件を一緒にして,オンゴーイング法と再現認知法の認知の数と質を分析した.また,授業日誌法も取り入れて,教師の力量(認知)の変容を明らかにした.日誌は浅田(2000)による授業日誌法を活用した.その結果,オンゴーイング認知が熟達教師の授業時の認知を克明に表現することが可能であるとともに,リフレクション時の有効なデータとして活用することが可能であるといった示唆を得ることができた.また,教師の認知映像を再現する再現認知法は初心者教師のエビデンスを得るために有効に機能することが明らかとなった.本研究は,授業時に教師が何を認知しているのかを語るオンゴーイング認知と授業後に何を認知していたのかを語る再現認知による体育教師の実践的力量を高める手法の開発を行なっている.教師の力量を高めるねらいで行なわれる研究授業や各種研修を補うため,何を認知しているのかを授業時に「つぶやく」オンゴーイング認知と授業時に教師がどこを観ているのかの認知映像を再現する再現認知法を使って,日常の教育実践の中で力量を高めることのできる手法を開発した.今年度は,まとめの年であるため、授業時に何を認知しているのか教師が声を出してつぶやくオンゴーイング認知と,教師が何を観ているのかの認知映像を使った再現認知の有効性を明らかにするため,初心者教師と熟達教師においてオンゴーイング法と再現認知法のどちらが有効に機能するかについて研究を進めた.具体的には,様々な種目での初心者教師,中堅教師,熟達教師の授業における学習者,学習過程,学習内容等の条件を一緒にして,オンゴーイング法と再現認知法の認知の数と質を分析した.また,授業日誌法も取り入れて,教師の力量(認知)の変容を明らかにした.日誌は浅田(2000)による授業日誌法を活用した.

その結果,オンゴーイング認知が熟達教師の授業時の認知を克明に表現することが可能であるとともに,リフレクション時の有効なデータとして活用することが可能であるといった示唆を得ることができた.また,教師の認知映像を再現する再現認知法は初心者教師のエビデンスを得るために有効に機能することが明らかとなった.さらに、オンゴーイング認知と再現認知では、認知の内容が一緒であることが多く、初心者教師、熟達教師の共通の認識のもとで授業分析が可能であることが示唆された。
微小重力場植物実験のための根圏支持培地と養水分供給法の開発

開発した、セラミックヌードルを用いてオオムギの栽培を試みた。発芽は、ヌードル間に埋めこむ、接触する程度で100%に近い発芽が確認された。また、表面1cm程度をヌードルのループを小さくすることにより、種子は良好に保持され、人為的な過Gにおいても、種子が培地から脱落するなどの問題は認められなかった。また、栄養生長期においても生育は、対照区と比べ遜色は無かった。さらに、本実験の目的とする、宇宙環境でのseed toseed実験に重要となる、生殖生長での出穂、結実も成された。また、60日間の栽培期間において、毛管現象による水分移動・吸収・蒸発の過程で生じる、表面への塩類の析出が若干見られた。しかし、ポーラス度の高い試験区では、セラミックの内部孔隙の繋がりが良いため、毛官能の減少は確認されなかった。しかし、本対象植物は、耐乾燥性・耐塩性が高い事が挙げられ、培地内水分含量の高い対照区に比べ、含水量が低い本試験区で生長量に差異が生じなかったことは、種の特性に起因する部分が大きいと考えられた。初年度に、自己溶解型の緩効性肥料の溶出特性を明らかにすると共に、その溶出特性を定式化した。その知見を基に、24時間日長でのオオムギの結実までのライフサイクルを短くした条件下で、添加量を決定し栽培を試みた。どの試験区においても、対照区と有意な生育差は観察されなかった。また、含有量の少ないMg濃度の下限を満足するために、添加量が増えたことによる多量元素が上限に近づく状態が確認はされたが、生育遅延、過剰には結びつかなかった。準備段階での、微小重力下での既存の知見(NASAとロシアの植物培養装置など)より、基本的な水移動は重力の影響を回避し、素材孔隙の毛管力による水分移動を基本理念とすることが効果的である。そこで、栽培培地の(セラミック、毛管繊維など)のポーラス度(微細孔隙径と量)を変化させるとともに、セラミック状の問題点である水分ストレスを回避するために根との接触面積を増加させる形状の工夫(ヌードル化)を試みた。その結果、試作培地の三相分布はポーラス度の変化に応じて、植物種の適正に合わせた変化をつけることが可能になった。また、pF水分曲線と透水生は、植物根系の生育に支障がない範囲に維持できていることが明らかになった。既存のような大掛りな溶液調合制御系を設ける事は、宇宙実験の求められる制限からは到底無理である。そこで、自己溶解型の"緩効性肥料"を用いることを考えた。選択した緩効性肥料の各々の溶解特性を調べた結果、多量要素については満足行くものの、微量要素については溶解が遅く、問題が残った。しかし、対象作物のオオムギでの栽培実験では、オオムギの塩類耐性が強いため、微量要素の下限濃度を満足する量の添加量でも、肥料やけ現象は起きず、良好な生育が認められた。
文化と価値と行動:新たな測定法の開発にもとづくその関係の再解釈

本研究の目的は文化を測定するための方法の開発、特に文化のエミック的側面とエティッ的側面とを同時に測定するための方法の開発にあった。交差文化心理学における研究の多くは、個人主義とか集団主義とかいった文化の諸次元が交差文化的に測定可能であるという前提にもとづいている。しかし本研究の予備調査の結果、集団主義および個人主義のいくつかの測定方法の内的信頼性がかなり低いことが明らかにされた。これらのアメリカで開発された測定方法は、交差文化研究で用いることを前提に開発されているが、日本での適用には大きな限界のあることが明らかにされた。このことは、日本人学生にとっての集団主義の意味が、アメリカで測定法の開発にあたった研究者によって想定されていた意味と異なっていることを示唆している。つまり、エティック(すべての文化に普遍的)であると想定された測定法が、日本人学生の持つ集団主義の意味(つまりエミックな、特定の文化にのみあてはまる意味)を測定できなかったわけである。この間題を克服するために、ケリ-の方法をもとにしたSGMC法が開発され、その方法による文化測定と、(集団主義、価値、依存性などの文化特性についての)伝統的な測定法の双方を用いた調査が、札幌と長崎の大学生を対象に行われた。結果は、調査対象者自身にとっての文化や個人主義の意味が、伝統的測定法の測っている内容と実際に異なっていることを示している。また、SGMC法により得られた結果は、これまでの方法では矛盾するとされてきた知見(例えば集団主義社会には通常は存在しないはずの価値の存在)を説明することができる。最後に、興味ある知見として、調査対象者によって日本文化および集団主義の特徴とされている特性を、対象者自身は持っていないと考えていることが明らかにされた。
音楽科教育における教育内容の多様化に即した教材・学習材概念の検討

音楽科における教材を,空間性および身体性などの視点から検討する。その際,サウンド・エデュケーション研究の知見を応用することで,子どもにとっての「あらわれ方」とその「うけとめ方」までをも含む概念として音楽科の学習材概念を再整理する。鑑賞や表現の対象として同一の楽曲が児童生徒に与えられたとしても,一人ひとりの聴き方や五感の働かせ方などは異なる。音楽科授業という場もまた,子どもにとってはサウンドスケープ(音風景)である。実際の授業展開を視野に入れれば,音楽科の教材とは単に楽曲名や楽器名などとして記述される段階に留まるものではなく,それが学習者にとってどう現象するのかまで含めて考える必要がある。
赤外線・ミリ波の新たな観測に基づく銀河相互作用における塵に埋もれた星形成活動の理解

本研究では、宇宙の星形成を支配する高光度赤外線銀河について多角的・統計的・定量的に調査した。特に、日本の「あかり赤外線天文衛星」および米国の「スピッツアー赤外線宇宙望遠鏡」を駆使したことにより、新しいエネルギー源診断法の確立とスターバースト銀河における物理化学状態を明らかにした。特に、本研究のサンプルは、近傍宇宙のLIRGsを網羅したものであり、初めて均質かつ統計的なデータを用いることによりLIRGsの全体像を捉えた。本研究員が筆頭研究者として取得した、あかり衛星の2.5-5μm帯の近赤外線分光データを利用し、新たなエネルギー源診断の手法を確立した(図1)。この波長帯では、スターバーストを示唆するダスト粒子・多環芳香族炭化水素(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAH)の輝線が3.3μmに、星形成率の指標となる水素原子の再結合線が4.05μmにあり、さらに、AGNに起因する高温の塵からの熱放射(連続光)を観測することができる。スピッツアー宇宙望遠鏡には、この波長帯を分光観測する装置がないために、この情報を得ることは一切できない。特に3.3μmのPAH輝線は、将来ジェイムズ・ウェッブ宇宙望遠鏡が打ち上げられた際に、非常に重要な役割を持つ。次に短い波長にあるPAH輝線は6.2μmであり、赤方偏移が4以上の遠方銀河では、望遠鏡の観測可能波長帯の外側(長波長側)にシフトしてしまい、観測が不可能になるためである。この成果により、遠方銀河にも応用することができる新しいエネルギー源診断法を初めて確立することができた。ジェイムズ・ウェッブ宇宙望遠鏡の時代には、この業績は非常に重要になることが期待されている。これに加え、4.05μmの水素再結合線の等価幅を調べることにより、銀河を構成する星の年齢を明らかにした。この輝線と3.3μmのPAHダスト放射の放射強度比からは、近傍宇宙にあるLIRGsの電離度も調べることができた。近傍LIRGsの性質をこのように網羅的に調査した研究は初めてであり、これらの成果は高赤方偏移の銀河を調査するための基準点となる。宇宙の単位体積あたりの星形成率で優位を占める、高光度赤外線銀河(Luminous InfraRed Galaxies, LIRGs;赤外線光度L_<IR>が太陽光度L〓の10^<11>倍以上)を調べることにより、宇宙の星形成史を明らかにしようとしている。これらの銀河が赤外線で非常に明るいのは、銀河どうしの衝突によって誘発された、塵に埋もれた激しい星形成(スターバースト)や活動銀河核(AGN)があるためだと考えられている。この現象は銀河合体のシミュレーション(e.g.Barnes 2004)等により実現可能だと言われてきた。本研究では、銀河の赤外線光度とその形態の占める割合を比較することにより、銀河相互作用が高光度赤外線銀河の成因になり得ることを観測的にも実証した。また研究代表者の提案により取得された「あかり」の近赤外分光観測データの整約とそれを基にした銀河診断も行った。更に、本年度は解像度の高いSpitzer赤外線宇宙望遠鏡の撮像観測により、1つの星形成領域だけで巨大銀河に匹敵する赤外線を放射していることが初めてわかった天体について、X線・紫外線・可視光線・赤外線・電波など、多波長に渡り徹底的に調べた。特にこの星形成領域は銀河核には存在せず、その外にありながらも、銀河全体のほとんどの赤外線放射を担っているため、非常に特異なものであることが分かった。中心核外で赤外線放射が強い天体としてアンテナ銀河などが有名であるが、この銀河はアンテナ銀河よりも約10倍も明るい。更に、この領域は紫外線と可視光線領域では全く放射が見られず、塵に深く埋もれていることを明らかにすることが出来た。赤外線のスペクトルでは、PAH分子からの輝線が非常に強く受かっており、この銀河のエネルギー源はスターバーストであることが明らかにされた。この天体に関する論文は、本研究員が筆頭著者として投稿済みである。宇宙の星形成史を理解するために、活発に星形成を高光度赤外線銀河(Luminous Infrared Galaxies, LIRGs)に着目している。この銀河は、宇宙の単位体積あたりの星形成率で優位を占めている上に(Goto et al.2011)、過去にさかのぼるにつれて更にその傾向が急激に強まることから(Goto et al.2010a)、宇宙の進化を理解するための重要な役割を担っている。LIRGsの膨大なエネルギー放射源は、非常に激しい星形成、または活動中心核だと考えられている(Armus et al.2009)が、その機構などはまだ完全に理解されていない。現在、最も有力なメカニズムとして提案されているは、銀河どうしの衝突や合体である(e.g.Petric et al.2011)。本研究では、過去最大の近傍LIRGsのサンプルの多波長による観測データを用いることで、銀河の形態とその物理・化学状態の関係を明らかにすることにより、宇宙の銀河進化と星形成について解明しようとしている。特に、本年度は、NASAスピッツアー赤外線宇宙望遠鏡での高分散分光データを主力に、LIRGsの物理化学状態に制限をつけた。

観測された輝線どうしの光度比と大質量星からの紫外線放射と衝撃波による励起のモデル計算により得られる輝線比を比較することにより、LIRGsの年齢・金属量・電離度・密度・衝撃波速度・磁場等を求めた。これにより、スターバーストが主なエネルギー源の近傍LIRGsの年齢は1Myrから4.5Myr,金属量は太陽金属量と同程度から2倍程度、電離度は2×10^7-8×10^7cm s^<-1>に制限することができた。一方で、活動中心核が主なエネルギー源だと考えられる近傍LIRGsは、スターバーストのLIRGsよりも約1桁電離度が高いことがわかった。また、衝撃波モデルと観測値を比較すると、活動中心核をもつLIRGsには衝撃波の存在が示唆された。しかし、衝撃波の指標である鉄イオンの放射が強いソースは、衝撃波モデルでは説明することができなかった。また、銀河形態と銀河ガスの状態には相関はみられなかった。本研究では、宇宙の星形成を支配する高光度赤外線銀河について多角的・統計的・定量的に調査した。特に、日本の「あかり赤外線天文衛星」および米国の「スピッツアー赤外線宇宙望遠鏡」を駆使したことにより、新しいエネルギー源診断法の確立とスターバースト銀河における物理化学状態を明らかにした。特に、本研究のサンプルは、近傍宇宙のLIRGsを網羅したものであり、初めて均質かつ統計的なデータを用いることによりLIRGsの全体像を捉えた。本研究員が筆頭研究者として取得した、あかり衛星の2.5-5μm帯の近赤外線分光データを利用し、新たなエネルギー源診断の手法を確立した(図1)。この波長帯では、スターバーストを示唆するダスト粒子・多環芳香族炭化水素(polycyclic aromatic hydrocarbon,PAH)の輝線が3.3μmに、星形成率の指標となる水素原子の再結合線が4.05μmにあり、さらに、AGNに起因する高温の塵からの熱放射(連続光)を観測することができる。スピッツアー宇宙望遠鏡には、この波長帯を分光観測する装置がないために、この情報を得ることは一切できない。特に3.3μmのPAH輝線は、将来ジェイムズ・ウェッブ宇宙望遠鏡が打ち上げられた際に、非常に重要な役割を持つ。次に短い波長にあるPAH輝線は6.2μmであり、赤方偏移が4以上の遠方銀河では、望遠鏡の観測可能波長帯の外側(長波長側)にシフトしてしまい、観測が不可能になるためである。この成果により、遠方銀河にも応用することができる新しいエネルギー源診断法を初めて確立することができた。ジェイムズ・ウェッブ宇宙望遠鏡の時代には、この業績は非常に重要になることが期待されている。これに加え、4.05μmの水素再結合線の等価幅を調べることにより、銀河を構成する星の年齢を明らかにした。この輝線と3.3μmのPAHダスト放射の放射強度比からは、近傍宇宙にあるLIRGsの電離度も調べることができた。近傍LIRGsの性質をこのように網羅的に調査した研究は初めてであり、これらの成果は高赤方偏移の銀河を調査するための基準点となる。
生物時計の進化にともなう時計タンパク質KaiBの構造と機能の変化

生物時計は、昼夜の変化に適応するために、様々な活性を24時間周期で自律的に振動させる細胞内分子機構である。藍色細菌の生物時計はKaiA、KaiB、KaiCからなっており、ATP存在下においてこれらの3つのタンパク質が相互に作用しあうことで自律的な時間振動を生み出すことができる。KaiBは進化の初期では2量体であり、藍色細菌において時計として進化した結果、4量体を形成するようになったのだと考えられる。4量体構造と機能の関わりを検証するために、C末端酸性残基(95-108)を欠失させた変異体KaiB、KaB_<1-94>を作製した。KaiB_<1-94>は2量体と見積もられた。KaiB_<1-94>はin vitroで野生型と同様にリズム発振する機能があることが示された。原子間力顕微鏡(AFM)を用いた解析によって、KaiB_<WT>のオリゴマー構造を検証した。AFM解析は、鋭い探針によって試料表面を走査し上下方向への変位を計測することにより、試料表面の凹凸形状の評価を行う手法である。この結果、KaiB_<WT>では3つのタイプの粒子が観察された。この結果は、KaiB_<WT>が4量体-2量体-単量体の平衡状態にある可能性を示唆する。この結果およびKaiB_<1-94>がin vitroでリズムを発振できるという結果を踏まえると、2量体もしくは単量体構造のKaiB<WT>がKaiCと複合体を形成するのではないかというモデルが示唆された。また、蛍光相関分光法(FCS法)により、時間振動中のKaiAとKaiBの複合体形成を詳細に調べた。KaiAとKaiBはともに、KaiCのリン酸化状態によってKaiCの結合親和性が変わり、異なる複合体形成の位相を示すことが明らかになった。育児のため短時間勤務をしており、研究の進捗はややゆるやかなものになっている。しかし、KaiB_<WT>が異なるオリゴマー構造をとっていることをAFM解析によって示し、また、時間振動中のKaiA-KaiC複合体形成およびKaiB-KaiC複合体形成の時間振動をFCS法により明らかにするなど、新しい知見を得ている。KaiBのオリゴマー構造がKaiB-KaiC複合体形成にどのように関わるか、また、SasA-KaiC複合体形成をどのように阻害するかを明らかにするため、X線結晶構造解析やNMR解析等によって、KaiB-KaiC複合体およびSasA-KaiC複合体の構造解析を進める。平成25年度に古細菌型Kaicの精製条件の検討を進めてきたので、精製手法の確立および古細菌型KaiB-Kaic複合体の機能の検討を行う。相互作用に4量体構造が必要であるか否かを検証するために、電子スピン共鳴法によって、KaiB上のKaiAもしくはKaiCとの相互作用部位の同定を行った。電子スピン共鳴法はタンパク質にスピンラベルを導入し、スピンラベルの運動状態を調べることによって、スピンラベル近傍のアミノ酸残基の状態変化を解析する手法である。KaiAおよびKaiCともに、様々なアミノ酸残基でスピンラベルシグナルの変化が観察された。興味深いことに、KaiAおよびKaiCともに、E56-Y64のアミノ酸残基の多くで、スピンラベルの変化が生じた。今後、古細菌型KaiBの構造解析の知見を踏まえて、KaiAおよびKaiCとKaiBの相互作用と、KaiBのオリゴマー構造の関わりの検証を試みる。続いて、4量体構造と機能の関わりを検証するために、2量体変異体KaiBを作製し、2量体変異体KaiBが時間発振に寄与できるか否かを検証した。C末端酸性残基(95-108)を欠失させた変異体KaiB、KaiB_<1-94>を作製した。In vivoでの遺伝子発現リズムを検証した結果、KaiB_<1-94>はリズムを発振する機能はあるものの、野生型KaiBに比べ振幅が弱くなることが明らかになった。4量体構造と機能の関わりを検証するために、昨年度、C末端酸性残基(95-108)を欠失させた変異体KaiB、KaiB_<1-94>を作製した。

KaiB_<1-94>は2量体と見積もられた。KaiB_<1-94>はin vitroで野生型と同様にリズム発振する機能があることが示された。In vivoでの遺伝子発現リズムを検証した結果、KaiB_<1-94>はリズムを発振する機能はあるものの、野生型KaiBに比べ振幅が弱くなることが明らかになった。このことから、KaiB_<1-94>は時間情報の出力に欠陥があるのではないかと考え、主要な出力系のタンパク質であるSasAへの影響を調べた。すると、KaiB_<1-94>はSasA-KaiC複合体の形成を阻害することが分かった。KaiB_<1-94>および野生型KaiB、SasAのKaiC_<DD>(リン酸化状態のKaiCを擬似した変異体)に対する結合親和性を調べると、結合親和性は高いものから、KaiB_<1-94>>SasA>野生型KaiBであった。SasAは藍色細菌のみにみられるタンパク質なので、KaiBはSasAとの競合関係によって2量体から4量体に進化した可能性が考えられる。生物時計は、昼夜の変化に適応するために、様々な活性を24時間周期で自律的に振動させる細胞内分子機構である。藍色細菌の生物時計はKaiA、KaiB、KaiCからなっており、ATP存在下においてこれらの3つのタンパク質が相互に作用しあうことで自律的な時間振動を生み出すことができる。KaiBは進化の初期では2量体であり、藍色細菌において時計として進化した結果、4量体を形成するようになったのだと考えられる。4量体構造と機能の関わりを検証するために、C末端酸性残基(95-108)を欠失させた変異体KaiB、KaB_<1-94>を作製した。原子間力顕微鏡(AFM)を用いた解析によって、KaiB_<WT>のオリゴマー構造を検証した。AFM解析は、鋭い探針によって試料表面を走査し上下方向への変位を計測することにより、試料表面の凹凸形状の評価を行う手法である。この結果、KaiB_<WT>では3つのタイプの粒子が観察された。この結果は、KaiB_<WT>が4量体-2量体-単量体の平衡状態にある可能性を示唆する。この結果およびKaiB_<1-94>がin vitroでリズムを発振できるという結果を踏まえると、2量体もしくは単量体構造のKaiB<WT>がKaiCと複合体を形成するのではないかというモデルが示唆された。また、蛍光相関分光法(FCS法)により、時間振動中のKaiAとKaiBの複合体形成を詳細に調べた。KaiAとKaiBはともに、KaiCのリン酸化状態によってKaiCの結合親和性が変わり、異なる複合体形成の位相を示すことが明らかになった。野生型は4量体である藍色細菌時計タンパク質KaiBの2量体型変異体(KaiB_<1-94>)の分離に成功した。そして、野生型KaiBと同様にKaiB_<1-94>が試験管内で時間振動を発振できることを明らかにした。
視覚障害者のWebアクセシビリティを保証する医療機関標準Webページの要件定義

視覚障がい者が必要な時に必要な医療情報を取得でき、それによって視覚障がい者の自立とQOLの維持に貢献出来るWebページを多くの医療機関が安価かつ少ない人的資源で作成・運用できる社会を実現するために、医療機関のWebアクセシビリティの現状を調査し、現状を改善するための医療機関Webページ標準仕様を検討した。調査の結果、大学病院、公立病院でもWebアクセシビリティへの認識・知識が不十分で十分な対応がなされていない施設が多いことが判明した。その改善のためにJISのガイドラインを満たし医療機関Webページでニーズの高い情報項目と機能をWebページの上位に配置することを要件とした標準仕様案を作成した。Web Contents Accessibility Guidelineを満たし、かつ視覚障がい者のWeb利用の特性を考慮して標準化された医療機関Webpageの標準仕様を作成し、それを普及させる為に次の2つの調査を実施した。1)医療機関Webpageの現状を確認し標準仕様を検討するためのTest-pageを作成するために、国立大学病院のTop-pageを対象に,1Accessibility評価によるサイトの分類,および2Webpage上の情報項目とその出現順序,について調査した.その結果、1JIS規格を十分に満たさないWebsiteが多く,全体として対応が不十分であること,および2殆ど全ての病院において患者の受診に必要と思われる情報は提示され,提示順序も比較的上位にあるものの,病院毎の差が非常に大きいこと,が判明した.またその結果に基づき、Guidelineを満たし且つコンテンツの提示方法・提示順序まで考慮した標準Webページを試作した。2)医療機関の視覚障がい者Web Accessibilityに対する認識について調査するために、広島の公的医療機関および全国の大学病院に対し、記述・選択式のアンケート調査を実施した.その結果、六割以上の医療機関ではWeb Contents Accessibility Guidelineを知らない,あるいは良く知らない状況であることが判明した.また,今までWeb Accessibilityが問題になったことはない,あるいは,この問題についての情報が少ない,と認識していることも明らかになった.上記と関連して、ITによる視覚障がい者支援、および視覚障がいに至る緑内障や黄斑変性症の病態についても研究を実施した。2015年度の後半から視覚障がい者の協力を得て試作標準Webページの検証試験を行う予定であったが、まだ実施できていない。当初はスクリーンリーダを使う全盲者を対象にテストを行う予定であり、WebページのHTML部分のみで実施する予定であった。しかし研究を進めていく内に、公共のシステムとして視覚障がい者のみならず晴眼者の意見を取り入れることの重要性を指摘された。晴眼者およびロービジョン者を対象にこのような検証試験を行う際にはHTMLの構造よりもWebページのデザインに影響される可能性が高い。そのため検証試験の再設計、およびテストページのデザインの検討を行ったことによる。医療機関標準Webpage仕様において、現状を踏まえてJISのどの等級までアクセシビリティを保証すべきかについて検証を行った。医療機関標準Webpage全国の国公私立の大学病院(分院含む)117施設、および広島県の公的病院(日赤、済生会含む)30施設のWebサイトのトップページを調査対象とし、miChecker (Ver. 2.0)を用いて、Webアクセシビリティの評価を行ったところ、多くの病院がJISを殆ど満たしていないか、または等級AAを大凡満たすものの2つの群に分かれる傾向があった。特に、音声読み上げソフトへの対応の評価はほぼWebページ上の情報の知覚可能性に依存する傾向がうかがえた。知覚可能性の問題の多くは技術的な問題よりは作り手が加えるべき情報が正しく記載されていない事によるものであり、昨年度行った医療機関向けアンケート調査から、医療機関側のこの問題に対する意識が低いこと、および7割以上の施設がWebページの制作を外注していることを併せて考えると、Webアクセシビリティに対する専門知識が無くてもmiCheckerが指摘するWebアクセシビリティの問題を解決することを仕様に盛り込めば、JISの等級AAをほぼ満たすWebアクセシビリティを実現することが現在の平均的なWeb制作の技術力で充分可能になることを明らかにした。また関連分野として、IT機器を用いた際の文字の見え方、視覚障がい者の自立を促すIT機器の利用法の研究、および我が国で我が国における失明原因第1位の緑内障の危険因子の探索についての研究を併せて遂行した。当初視覚障がい者を主たる対象として操作方法と医療機関Webページに対する需要の調査を行う予定であったが、研究発表に対する意見として、視覚障がい者のみならず、晴眼者についても見やすく、判り易くする配慮が必要であるとの意見があったため、調査対象としての晴眼者の重要性が大きくなったため、実験環境におけるWebアクセシビリティを、実際の利用を想定して、どこまで保証するかについて時間をかけて検討した。視覚障がい者当事者の当事者に対するアンケート方法は実験環境に依存するため、実験環境の整備に当初予定していたよりも時間がかかってしまった。視覚障がい者はWebページの読み上げソフトウェアによる音声情報に頼ることが多い。音声によるWebページ閲覧は、1SoftwareがHTML-FileをSequentialに読むため情報の提示順序が一意になること、及び2意味論的にTag付けされた見出し語句を説明・強調して読み上げると共に情報をスキップする際の目印にすること、の2つの点で晴眼者の閲覧とは大きく異なる。前年度までの調査では、病院毎にWebページ上の情報項目の提示順序と用語にかなりの差異があり、初見の利用者を迷わせる原因となっている。また見出しTagが適切に配置されていないため、特定の項目への到達までに時間や手順の掛かるWebページも少なくないことが判明している。

これらの問題を解決し当事者にも晴眼者にも利用しやすい医療機関Webページ標準仕様案を提案するために、特に操作性と理解し易さに大きく関係する1情報提示の順序を決めるための情報項目・機能のニーズ、および2見出しTagの付け方、に焦点を絞って利用者側の意見を電子メールを用いたアンケートおよびユーザのWebページ操作の記録(ビデオ撮影)から調査した。その結果1については受診(診療内容、アクセス、連絡先)に関するニーズおよび情報を探すためのサイト内検索機能のニーズが高いことが判明した。また2については特に30歳以上の年齢層に大きな文字の見出しをつけた方が読み易いとの評価を受けるが、その分スクロールが多くなると操作し易さの評価が低くなる傾向が見られた。以上の結果から標準仕様案および標準Webページの実装案を作成した。また関連分野として、IT機器を用いた際の文字の見え方、視覚障がい者の自立を促すIT機器の利用法の研究、および緑内障の治療の研究を併せて遂行し、緑内障により視野を失った患者にとっても参照しやすいWebページの条件についてのアイデアを得た。視覚障がい者が必要な時に必要な医療情報を取得でき、それによって視覚障がい者の自立とQOLの維持に貢献出来るWebページを多くの医療機関が安価かつ少ない人的資源で作成・運用できる社会を実現するために、医療機関のWebアクセシビリティの現状を調査し、現状を改善するための医療機関Webページ標準仕様を検討した。調査の結果、大学病院、公立病院でもWebアクセシビリティへの認識・知識が不十分で十分な対応がなされていない施設が多いことが判明した。その改善のためにJISのガイドラインを満たし医療機関Webページでニーズの高い情報項目と機能をWebページの上位に配置することを要件とした標準仕様案を作成した。質的研究法によるテストページ評価を予定しているが、研究の性質上、症例数を大きくすることが難しい。従って評価の客観性を高め、質的研究法でカバーできない部分を補うために大きなデータ数を集めやすいアンケート調査を、標準仕様書およびそれに基づいたモデルページの最終的な評価の前に行う。また、実際にWebページの標準仕様やモデルページを使用した際に生じる法的な問題の処理の仕方については今まで検討の対象からは抜けていたため、今後法律の専門家にアドバイスを求め、標準仕様書やモデルページの使用条件について定めていくこととする。現時点で本研究は本学の倫理審査委員会を通過予定である。また、研究対象者を募集する当事者団体との下打ち合わせも既に行っている。正式に倫理審査委員会の決定が出た後、9月まで、視覚障がい者当事者(ITスキル髙/低、各50名ずつ)および晴眼者(50名)による、医療機関標準Webページ仕様に基づく実験用Webページの操作実験(およびアンケートの実施)を行う。
生物時計の分子メカニズムにおける受容体キナーゼの役割解明

G蛋白質共役7回膜貫通型受容体キナーゼ(GRK)は、G蛋白質共役7回膜貫通型受容体(GPCR)をリン酸化することによりGPCRを脱感作へと導くキナーゼとして知られてきた。我々はGRK5のノックアウトマウスの心臓においていくつかの時計遺伝子の発現量が変化していることを見出した。そこで、GRK5と生物時計の分子メカニズムとの関連を調べたところ、GRK5が時計タンパク質、PER1, 2, 3およびCRY1,2と相互作用することを見出した。また、生物時計の中枢を司る視交叉上核においてGRK5のmRNAが日周リズムを示す事を見出した。私達の睡眠・覚醒のように、約一日の周期をもつ生物リズムは概日リズムと呼ばれ、体内に存在する概日時計によって支配されている。この概日時計は、恒常条件下においても約24時間の周期で自律的に時を刻むと共に、光などの環境因子によって周期を補正することができる。概日時計の生成は、PERIOD(PER)やCRYPTOCHROME(CRY)など、種々の時計タンパク質によるNegative feedback loopによって制御されている。時計蛋白質のリン酸化は、この制御において、その蛋白質の核内移行や分解などに関して重要な役割を果たしているが、依然として不明な点は多い。GRKは、アゴニストが結合して活性化した種々のGPCRのC末端部をリン酸化するキナーゼである。リン酸化された受容体はβアレスチンと結合し、脱感作へと導かれる。現在、哺乳類においてGRKファミリー分子は7種存在する。GRKは長い間、GPCRをリン酸化するキナーゼとしてのみ知られてきた。しかし、最近になってGRKがGPCR以外のタンパク質をリン酸化することが報告され、脱感作以外の機能も有する事が明らかとなりつつある。我々は、研究の過程でGRKが生物時計の分子メカニズムに関与する可能性を得た。そこで、我々はその関与を明らかにするために実験を行い、(1)GRKがある種の時計蛋白質と相互作用を示す事、(2)GRKがある種の時計蛋白質の転写を制御する事、(3)GRKがある種の時計蛋白質の局在を変化させることを示唆する結果を得た。現在、哺乳類においてGRKファミリー分子は7種、βアレスチンは2種存在する。研究実績の概要の項目で示した様に(1)GRKがある種の時計蛋白質と相互作用を示す事、(2)GRKがある種の時計蛋白質の転写を制御する事というGRKの生物時計の分子メカニズムへの関与を示す上で大きな手がかりとなる結果を得たため。今年度は昨年度までに得られた研究成果を軸にして、GRKの生物時計への関与のさらに詳細に解析していく予定である。その際には、GRKのノックアウトマウスの行動周期に異常がみられるのかについても検討していく予定である。
動物細胞における超ラセンDNA形成活性の検索

超ラセンDNA形成に関与する酸素DNAジャイレースは,バクテリアに存在することが知られているが,真核細胞ではまだ確認されていない.ジャイレースそのもの,またはDNAトポソメラーゼその活性を付与する因子を,動物細胞で検出することを目指し,トポイゾメラーゼの精製と高感度の超ラセン検出法の確立を試みた仔牛胸腺核抽出液よりバイオレックス・イオン交換カラム,ブルーアガロース・アブィニティカラム,ハイドロキジルアパタイトカラム,ショ糖密度勾配遠心等を用いて分離精製したI型およびII型DNAトポイソメラーゼは電気泳動的に約90%の純度と認められる.この酸素標品は共にネガティブ超ラセン構造を持つプラスミドDNAを弛緩させるが,通常の反応条件において完全な弛緩型にはなず,アガロース電気泳動で中間位置に数本のバンドをつくる.このバンドは予想に反してポジティブ超ラセンを持った分子であることを二次元電気泳動で確認した.別の酸素標品は同じ反応条件で基質分子を完全に弛緩型にするので,標品の間の違いはポジティブ超ラセン構造を与えるように働く何らかの因子の有無にあると考えられる.現在,この因子の酸素分子からの分離を疎水性クロマトグラフィ等を用いて試みている.一方,超ラセン形成の有無を通常の臭化エチジウム染色法よりはるかに高い感度で検出するために,トポイソメラーゼで弛緩型にしたPBR322プラスミドDNAをフォトビオチンでラベルし,電気泳動後にニトロセルロース膜上へサザン・ブロッティングして染色する方法を検討した.検出感度は臭化エチジウム法の場合の100倍以上になり,微弱な超ラセン形成活性でも検出できる可能性が高くなった.現在さらにブロティング効率向上などの技術的検討を続けている.超ラセンDNA形成に関与する酸素DNAジャイレースは,バクテリアに存在することが知られているが,真核細胞ではまだ確認されていない.ジャイレースそのもの,またはDNAトポソメラーゼその活性を付与する因子を,動物細胞で検出することを目指し,トポイゾメラーゼの精製と高感度の超ラセン検出法の確立を試みた仔牛胸腺核抽出液よりバイオレックス・イオン交換カラム,ブルーアガロース・アブィニティカラム,ハイドロキジルアパタイトカラム,ショ糖密度勾配遠心等を用いて分離精製したI型およびII型DNAトポイソメラーゼは電気泳動的に約90%の純度と認められる.この酸素標品は共にネガティブ超ラセン構造を持つプラスミドDNAを弛緩させるが,通常の反応条件において完全な弛緩型にはなず,アガロース電気泳動で中間位置に数本のバンドをつくる.このバンドは予想に反してポジティブ超ラセンを持った分子であることを二次元電気泳動で確認した.別の酸素標品は同じ反応条件で基質分子を完全に弛緩型にするので,標品の間の違いはポジティブ超ラセン構造を与えるように働く何らかの因子の有無にあると考えられる.現在,この因子の酸素分子からの分離を疎水性クロマトグラフィ等を用いて試みている.一方,超ラセン形成の有無を通常の臭化エチジウム染色法よりはるかに高い感度で検出するために,トポイソメラーゼで弛緩型にしたPBR322プラスミドDNAをフォトビオチンでラベルし,電気泳動後にニトロセルロース膜上へサザン・ブロッティングして染色する方法を検討した.検出感度は臭化エチジウム法の場合の100倍以上になり,微弱な超ラセン形成活性でも検出できる可能性が高くなった.現在さらにブロティング効率向上などの技術的検討を続けている.
ミトコンドリア機能およびマイトファージ調節による急性腎障害の新規治療法開発

今回の研究では、腎臓におけるオートファジーやミトコンドリアのオートファジーであるマイトファジー(Mitophagy)について急性腎障害での役割について検討し報告した。具体的には、尿細管細胞におけるオートファジー系の腎保護への関与の検討を行った。特にオートファジーを誘導し、ミトコンドリアの保護作用のある安全な薬剤として、ALA(5-aminolevurinic acid)の腎保護作用を報告した。ラットを用いたシスプラチン腎障害モデルでALAと鉄を経口投与するとCr,BUNの上昇が顕著に軽減され、ALAは尿細管障害を軽減することを報告した。ミトコンドリアでAutophagozomeがおこるマイトファジーを現在確認できる系ができつつあり、Sestrin2遺伝子とBNIP3遺伝子のマイトファジーへの影響を検討する。同時にRT-PCR, Western blotを用いた遺伝子とタンパク発現の両面からSestrin2とBNIP3のオートファジー系への作用を検討した。ALA(5-aminolevurinic acid)の低酸素負荷時のミトコンドリアへの保護作用を、マイトファジーへの影響とLC-3, BNIP3, Sestrin3などマイトファジー関連遺伝子の発現調節をLCGFP TGマウスを用いて検討した。安全性の高いアミノ酸(ALA;5-aminolevurinic acid)のミトコンドリア保護作用および、急性腎障害の予防作用をミトコンドリア酵素の発現調整と抗apoptosis作用および安全性を動物実験で確認した。平成26年度は、急性腎障害におけるオートファジーやミトコンドリアのオートファジーであるマイトファジー(Mitophagy)についてラットモデルと細胞培養の系で検討した。オートファジーを誘導し、ミトコンドリアの保護作用のある安全な薬剤があれば、急性腎障害の新規の薬剤となる可能性がある.今回ALA(5-aminolevurinic acid)の腎保護作用とそのメカニズムについて検討を加えた。シスプラチン腎障害モデルでは、ミトコンドリア関連酵素のATP5a, COX-IV, PGC-1a,ならびにUCP2の発現は低下したが、ALAはこの低下を回復した。ラットを用いたシスプラチン腎障害モデルでALAと鉄を経口投与するとCr,BUNの上昇が顕著に軽減され、AKI防止効果を有することを見いだした。組織学的検討でも尿細管の障害は著明にALA投与により抑制され、定量的に測定した尿細管障害スコアでも優位にALAは尿細管障害を軽減した。またTUNEL染色でアポトーシスを検出すると、シスプラチン腎障害モデルではTUNEL陽性細胞が増加したが、ALA投与はTUNEL陽性細胞数を減少させた。またcaspase3の活性化もALAは抑制した。また急性腎障害時に発現亢進するHeat shock protein beta-1 (HSPB1,あるいはHSP27)がLC-3の発現亢進を起こし尿細管細胞のオートファジーを引き起こし、酸化ストレスによるアポトーシスを抑制することをラットモデルと細胞培養の系で報告した。上記内容を学会発表し、下記の論文で発表をした。腎臓内科安全性の高いアミノ酸(ALA;5-aminolevurinic acid)のミトコンドリア保護作用および、急性腎障害の予防作用をミトコンドリア酵素の発現調整と抗apoptosis作用および安全性を動物実験で確認し報告した。現在、末期腎不全により、透析療法に至っている患者数は、全国で30万人を越え、今後、糖尿病性腎症の増加、高齢化も加わり、さらに患者数の増加が予想され抜本的対策が急務である。腎障害には、大きく分けて糖尿病などの慢性的な腎障害と、急性腎障害のような虚血などによる数時間でおこるものがある。慢性腎障害時にはストレスにより酸化した蛋白の分解・清浄化の障害が働いていると考えられ、定常的に機能しているオートファジーの低下による異常蛋白の蓄積と細胞障害が病態に関与している可能性がある。また虚血などによる急性腎障害では、細胞は栄養飢餓状態になり、急速に誘導されるオートファジー/マイトファジーの関与が考えられる。このような細胞内のタンパク質分解系が、腎疾患の病態にも深く関与している可能性が高い。そこで申請者らは、特にオートファジー/マイトファジー系について近年のタンパク分解系の分子機構の解明の細胞生物学的研究の発展をふまえて、腎疾患の病態への関与、解明を目指したい。モデル動物の飼育が予定より遅く、研究計画遅延のため。モデル動物の飼育は現時点で回復しており、平成25年度に実施できなかった実験は平成26年度研究実施予定である。
新規ミューテーターマラリア原虫の開発と突然変異体創出システムの構築

CRISPR/Cas9を用いて、熱帯熱マラリア原虫3D7株の主要なミスマッチDNA修復タンパク質のひとつと考えられるMSH2-1の513番目のプロリンをスレオニンへ置換した変異体を作製した。野生型原虫(3D7株)とMSH2-1変異体をin vitro培養系で約200日間継代し、その間に自然発生した突然変異を次世代シーケンサーでゲノムワイドに評価した。MSH2-1変異体ではマイクロサテライトにおける挿入・欠失変異の増加やサブテロメア領域の構造変異の増加が認められた。熱帯熱マラリア原虫では、過去あらゆる抗マラリア薬に対して耐性株が出現してきた。最近では、現在最も有効とされるアルテミシニンに対してさえも耐性株が報告されてきている。マラリアの制御を達成していくためには、薬剤耐性など重要な形質に関するより詳細な生物学的理解が必須であり、これまでにない革新的な研究アプローチが求められる。本研究では、熱帯熱マラリア原虫が持つDNA修復遺伝子MLH1の機能を欠損させることで新規のミューテーター原虫(MLH1ミューテーター原虫)を開発し、その変異発生傾向を詳細に解明する。さらに、MLH1ミューテーター原虫を用いた効率的な突然変異体創出のための実験系の構築を目指す。本年度は、MLH1ミューテーター原虫をCRISPR/Casシステムにより作製するためのベクターの開発に取り組んだ。熱帯熱マラリア原虫のMLH1(PfMLH1)とヒトや酵母のMLH1のアミノ酸配列を比較し、保存性の高いアミノ酸サイトを特定した。その中から、1) Cas9エンドヌクレアーゼによる切断サイトに近接していること、2)変異を導入することで予想されるミューテーター形質の強さを考慮し、PfMLH1遺伝子上の変異を導入する候補サイトと導入変異の種類を決定した。CRISPR/Casシステムに用いるベクターにCas9エンドヌクレアーゼを誘導するガイドRNA配列と部位特異的変異導入法で作製した変異型PfMLH1遺伝子配列を組み込むことで、ベクターを構築した。CRISPR/Casシステムによる熱帯熱マラリア原虫のゲノム編集に必要なベクターを複数個構築することに成功した。構築したベクターを用いて、電気穿孔法による原虫のトランスフェクションも既に試みている。今後、薬剤選択により組換え原虫をセレクションし、増殖が確認された場合は限外希釈によるクローニングでMLH1ミューテーター原虫を確立する。本研究は、ゲノム編集技術CRISPR/Casシステムにより熱帯熱マラリア原虫で突然変異を蓄積しやすい変異体(ミューテーター原虫)を作製し、その特性の解明と効率的な突然変異体創出系の構築を目的としている。本年度は下記の実験を行った。1) CRISPR/Casシステムによる熱帯熱マラリア原虫のゲノム編集技術の条件検討のため、赤色蛍光蛋白質を発現する熱帯熱マラリア原虫を作製した。この目的のため、P230p遺伝子にCasエンドヌクレアーゼを誘導するガイドRNA配列を組み込んだベクターを作製した。また、pfef1αの5 ́領域、赤色蛍光蛋白質遺伝子、pbdhfrの3 ́領域を連結したDNA配列を有するベクターを作製した。これらのベクターを電気穿孔法により熱帯熱マラリア原虫3D7株にトランスフェクションして、ブラストサイジンSとピリメサミンにより薬剤選択した。25日間の薬剤添加の後に赤色蛍光を発する原虫が得られ、その原虫ではP230p遺伝子領域への赤色蛍光蛋白質遺伝子の挿入が確認された。以上より、CRISPR/Casシステムが機能することが確認された。2) CRISPR/Casシステムを用いてDNA修復遺伝子MSH2-1に変異を導入したミューテーター原虫候補を作製した。当初はMLH1遺伝子に変異を導入する予定であったが、現在のところ成功していない。そこで、MLH1遺伝子と同様にDNA修復に関わるMSH2-1遺伝子に着眼した。1)の実験により決定した条件を適用し、熱帯熱マラリア原虫3D7株のMSH2-1遺伝子にP513Tのアミノ酸置換を導入することに成功した。このミューテーター原虫候補と野生型原虫とのin vitro培養系における増殖を詳細に比較したところ、成長速度には差がなかったが、原虫密度の最大値では野生型原虫よりもミューテーター原虫候補において統計学的に有意な低下が見られた。当初予定していたMLH1遺伝子への変異導入には現在のところ成功していないが、その代替としてMSH2-1遺伝子に変異を導入した原虫の作製に成功した。今回導入に成功したアミノ酸変異は他の生物においてミューテーター形質を付与することが報告されていることから、作製された原虫がミューテーター形質を有する可能性は十分に高いと考えられる。本研究課題は、DNA修復系の機能不全によるミューテーター株を熱帯熱マラリア原虫において作製して詳細なゲノム解析を行うとともに、それをマラリア研究の新たなツールとして突然変異体創出システムに利用することを目的としている。本年度は熱帯熱マラリア原虫3D7株においてCRISPR/Casシステムにより作製したミスマッチ修復タンパク質MSH2-1の変異体(3D7-Mut)における突然変異率の上昇の程度を明らかにするため実験を行った。まず、3D7-Mutと親株の3D7-WTについて限外希釈によるクローニングを行った後に、in vitroの培養系での継代を繰り返してゲノムに変異を蓄積させた。継代ラインは3D7-WTと3D7-Mutについてそれぞれ独立した6反復を設けた。

0世代目の原虫と約200日間継代を行った原虫からそれぞれDNAを抽出し、Illumina HiSeq4000で全ゲノムシーケンス解析を行った。200日間継代した原虫において検出された変異から0世代目原虫において検出された変異を差し引くことで継代の過程で蓄積した変異(塩基置換、挿入・欠失、ゲノム構造変異)を同定し、3D7-WTと3D7-Mut間で比較した。3D7-WTでは挿入・欠失が全く検出されなかったが3D7-Mutでは平均1.7個検出されマイクロサテライトの不安定化が生じていると考えられた。一方で、塩基置換については3D7-WTと3D7-Mut間で差は見られなかった。また、染色体末端のサブテロメア領域における相同性組換えなどのゲノム構造変異が3D7-WTで平均0.8個、3D7-Mutでは平均2.8個検出され、3D7-Mutで増加傾向にあった。これらの結果から、熱帯熱マラリア原虫のMSH2-1は挿入・欠失やサブテロメア領域の相同性組換えの発生を抑制することで、ゲノム安定性の維持に関わっていると考えられた。CRISPR/Cas9を用いて、熱帯熱マラリア原虫3D7株の主要なミスマッチDNA修復タンパク質のひとつと考えられるMSH2-1の513番目のプロリンをスレオニンへ置換した変異体を作製した。野生型原虫(3D7株)とMSH2-1変異体をin vitro培養系で約200日間継代し、その間に自然発生した突然変異を次世代シーケンサーでゲノムワイドに評価した。MSH2-1変異体ではマイクロサテライトにおける挿入・欠失変異の増加やサブテロメア領域の構造変異の増加が認められた。作製したMLH1ミューテーター原虫について、1)長期のin vitro継代培養によるゲノムDNAへの変異の蓄積、2)次世代シーケンサーを用いた蓄積変異のゲノムワイド変異解析を行う。これらの結果から、野生型原虫と比べてMLH1ミューテーター原虫の突然変異率がどの程度上昇したのか、また、どのような変異蓄積傾向を示すのかを明らかにする。作製したミューテーター原虫候補の特性を解明する。具体的には、突然変異率を明らかにするためin vitroで長期間培養してゲノムに変異を蓄積させた後に、次世代シーケンサーで蓄積した変異を網羅的に同定する。継代した期間と蓄積変異数から突然変異率を算出する。また、野生型原虫とミューテーター原虫候補を抗マラリア薬を添加した培地で培養し、耐性原虫が得られるかを試験する。また、現在のところ成功していないMLH1遺伝子への変異導入の試みも引き続き行う。寄生虫学備品や消耗品の価格変動などにより次年度使用額が多少生じたが、概ね計画通り使用できている。本年度は次世代シーケンスの受託解析まで解析を進めることができなかったなどの理由から、次年度使用額が生じた。主に試薬などの消耗品の購入に使用する予定である。研究成果がある程度まとまり次第、学会などで積極的に発表していく。次年度予算は主に培養実験や分子生物学実験にかかる試薬やプラスチック類等の物品費と、次世代シーケンスの受託解析費用に使用する。