hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固定化植物細胞による抗ガン剤タキソ-ル生産プロセスの開発

本研究においては,日本産のイチイから培養細胞を誘導し,倍地中に僅かに分泌される目的生産物タキソ-ルを倍地から連続的に回収する一方,固定化の手法によって細胞を反応系内に保持し,長期間に渡って有効に利用するプロセスを提案し,その有用性について様々な角度から検討した。その結果,以下の知見が得られた。2)カルスは液体懸濁培養において,倍地中へ著量のタキソ-ルを放出していることが示された。3)ナイロンメッシュを用いた潅流培養を行い、タキソ-ルの連続生産を行った結果,希釈率を増加させることにより,タキソ-ルの比生産速度は増大し,回分培養の約10倍にまで達した。4)アルギン酸カルシウム包括固定化細胞によるタキソ-ルの連続生産を長期間にわたり実施し,40日間に渡って,安定的にタキソ-ルを生産することに成功した。希釈率を増大させることにより,さらに,生産性の向上が期待できることが明らかとなった。5)限外濾過膜ホロファイバーモジュールを用いたメンブレンバイオリアクター(MBR)システムを構築し,1000時間以上(43日間)に渡って,ゲル包括型固定化細胞とほぼ匹敵する安定的な生産を実現した。希釈率を3倍に増大させることにより,生産性は約22倍に向上した。6)糖の種類,溶存酸素濃度などをシフトさせる2段階培養による効率的な生産の可能性も示唆された。7)生産と分離の2つのサブシステムから構成されるタキソ-ル生産のためのトータルシステムを提案した。8)有機溶媒による連続的な2段階抽出法がタキソ-ルの分離サブシステムとして有効であることが示された。1。培養細胞の誘導条件:植物材料としては,日本産のイチイTaxus cuspidataの葉と茎を用い,窒素源を制限した改変ガンボルグB5固体培地上に置床した。その結果,NAA 0.5ppm,カイネチン0.2ppmの条件では,ほとんどすべての外植片から一週間程度でカルスが誘導された。しかし,この条件では,三週間を過ぎたあたりから,細胞が褐色物質を生産し始め,23ヵ月で増殖を停止してしまった。2。培養細胞が生産する増殖阻害物質の定量:フォリン・チオカルト試薬を用いた定量の結果,この褐色物質の量は,フェノール性の化合物の量と比例関係にあることが確かめられた。3。吸着剤の添加による増殖阻害物質の影響の軽減:褐変物質の影響を軽減源するために,その吸着剤としてポリビニルピロリドンを加えて培養してみたが,カルスの増殖に対して顕著な効果は観察されなかった。4。培養細胞の増殖速度に及ぼすホルモン濃度の影響:そこで,NAA 0.5 ppm,カイネチン0.2 ppmの条件で誘導したカルスを3週間後にホルモン濃度およびその種類の異なる培地へ移植し,3ヵ月後のカルス増殖に対する効果を検討致した。カルスの増殖度はオーキシン濃度に大きく依存し,NAAと2,4-Dを高濃度で加えることにより9倍近い値が得られた。NAAと2,4-DではNAAの方が優れていた。5。タキソ-ルおよびその前駆体の含有量の定量:固体培養3ヵ月のカルス中のタキソ-ル含有量は天然物中とほぼ同程度であった。また,増殖に良い条件は必ずしも生産に良い条件ではなかった。さらに,このようなホルモン濃度に対する依存性は,さらに長期間の培養を行なうことにより変化し,比較的NAA濃度の高いカルスのタキソ-ル含有量が増加し、増殖速度が低下するという,増殖と生産の負の相関を示す傾向が観察された。また,タキソ-ルの前駆体と推定されるHPLCピークの存在も確認した。

昨年度の成果を踏まえ,今年度は以下の検討を行った。(1)膜型リアクターによるタキソ-ルの連続培養:細胞外にタキソ-ルが分泌されることが確認されたので,膜型のバイオリアクター(MBR)を用いて生産物を連続的に取り出すことを試みた。その結果,増殖は遅いものの,固定化細胞の場合とほぼ遜色のない生産速度が得られた。また,希釈率を一日あたり1から3まで上昇させることにより,生産速度を約2.2倍に向上出来,約40日間を経た現在も安定的な連続生産を続けている。(2)固定化細胞によるタキソ-ルの生産:主としてゲル包括固定化イチイ培養細胞を用いた連続生産法により生産性の向上を検討した。希釈率を一日あたり5まで上昇させても流出培地中のタキソ-ル濃度はほぼ一定に保たれ,生産性は比例的に向上した。この減少は,培地中のタキソ-ルの溶解度が生産の律速になっていることを示している。また,数種のイチイ属培養細胞のタキソ-ル生産挙動を比較検討した結果,より生産速度の速い培養条件と細胞株が得られた。希釈律の向上と合わせて,従来の数倍の生産速度が実現された。(3)タキソ-ル類の効率的な生産のための2段階培養:炭素源としてグルコースが増殖に,フルクトースが生産に適していることが示されたため,2段階培養法の適用を試み,生産向上を示す結果が得られた。また,溶存酸素濃度の低下も生産促進に有効であることが,MBRを利用した2段階培養によって示された。(4)固定化イチイ培養細胞を用いたタキソ-ル生産のための効率的なプロセスの確立:イチイ培養細胞を用いたタキソ-ル生産のための効率的なプロセスの構築を目指して,培地からの吸着体によるタキソ-ルの分離方法の検討を行い,他のタキサン類に対して選択的な分離が可能な条件を見いだした。
平成27年9月関東・東北豪雨による災害の総合研究

3150個もの積乱雲群が発生し、鬼怒川上流域において多くの地点で長時間の雨量が既往最大値を上回った。破堤氾濫が発生し、地盤沈下していた浸水域の最大浸水量は3,800万m3であった。水田作物への直接被害や氾濫水排水不良への影響から土砂堆積考慮の重要性が指摘された。大雨特別警報は行政の体制整備に効果があり、河川管理者の自治体へのホットラインは意思決定に有効に機能した。大河川と中小河川を合わせた総合的な判断が求められ、水位の実況・予測の共有、沿岸市民の災害進展過程に関する知識形成の重要性が指摘された。以上の結果を総合し災害進展過程を見える化する災害タイムライン統合閲覧システムを開発した。本研究の概要は次の通りである。1)期間中に3150個の積乱雲群が発生し、その63%は山地で出現したこと及び地形は降水を強化するが線状降水帯発生には寄与せず、どこでもこのような豪雨が起こりうることを示した。また、降雨予測の有効性が示された。2)鬼怒川上流域において多くの地点で長時間の雨量が既往最大値を上回り、36時間や2日雨量のリターンピリオドはほぼ100年であった。表層土壌から基岩への浸透など,主要な流出成分からの損失過程をモデル化することの重要性が示唆され、ダムが無い場合の石井地点のピーク流量は約6,000 m3/sと推定された。3)中流部で洪水の河道貯留効果は700m3/sと推定された。避難のためのリードタイムは少なくとも2時間以上はあった。4)浸水域における地盤沈下は定常的に進行しており、浸水域に大きな影響を与える程度に蓄積していた。堤防天端のアスファルト舗装道路の効果や堤防周辺におけるエネルギー減勢効果について実験で定量的に評価した。5)浸水域の最大浸水量は3,800万m3であった。水田作物への直接の被害や氾濫水排水不良への影響から土砂堆積を考慮することの重要性が指摘された。6)常総市における農業被害額は75.5億円で茨城県の被害総額120億円の2/3であった。堤防決壊地点から国道294号に向かって土砂が運搬され農地内に堆積した。土砂流入による農地被害額は、約12億円と見積もられた。7)特別警報は行政の体制整備に効果があり、河川管理者のホットラインは意思決定に有効に機能していた。大河川と中小河川とを合わせた総合的な判断が求められ、水位の実況・予測の共有、沿岸市民の災害進展過程に関する知識形成を図っていくことが求められる。8)以上の結果を総合し災害タイムライン統合閲覧システムを開発した。以上の結果を自然災害科学総合シンポジウムで紹介した。27年度が最終年度であるため、記入しない。水災害リスクマネジメント27年度が最終年度であるため、記入しない。
一年生植物シロイヌナズナを多年生にする

本研究は、一年生植物であるシロイヌナズナにおいて、ある転写因子を強く発現させた際に見られる多年生的形質やその関連因子に着目し解析することで、一年生植物と多年生植物の違いを生み出す未同定の因子を発見・解析するとともに、分子育種等に役立つ知見を得ることを目的として実施した。その結果、当該転写因子は日長や温度といった外的環境による制御およびスプライシングパターンの制御などの内的制御を受けながら多様な役割を発揮し、植物が適切に一年生植物として生長できるように機能することが示唆された。さらに、これらの制御に関与すると考えられる新規の因子を同定した。本研究では、一年生植物であるシロイヌナズナにおいてある転写因子を強く発現させた際に見られる多年生植物様の形質に主に着目し、解析することで、一年生植物と多年生植物の違いを生み出す未同定の要因を見つけるとともに、分子育種等に役立つ知見を得ることを目的としている。当該形質転換体を各種条件下で栽培し、形質の解析を実施した。その結果、長日条件22°Cで栽培した際に見られていた特徴的な形質が、短日条件22°Cではほとんど見られなくなることを確認した。また、短日条件22°Cで観察されたそのような形質は、短日条件低温環境下で栽培した植物の形質と比較して大きな変化が見られなかった。一方で、野生型や当該形質転換体を長日条件下で栽培した際にはほとんど見られない形質が、短日条件下では当該形質転換体のほとんどの個体で観察された。これらの結果から、この形質転換体でみられる各種の形質は、日長条件依存的であることが示された。当該転写因子の機能欠損株やVP16付加過剰発現体が示す形質に関しては、日長条件の違いによる影響が見られなかった。また、当該転写因子はその機能に必要と考えられるドメインを二つ持っており、スプライシングバリアントにおいてはそのドメインを一つしか持たない。そこでスプライシングによる機能調節の可能性を検討するために、生化学的解析やスプライシングバリアントを過剰発現する形質転換体の解析を実施した。これまでに実施した解析においては、スプライシングの変化による影響は観察されなかった。本研究では、一年生植物であるシロイヌナズナにおいてある転写因子を強く発現させた際に見られる多年生植物的性質に主に着目し、解析することで、一年生植物と多年生植物の違いを生み出す未同定の要因を発見・解析するとともに、分子育種等に役立つ知見を得ることを目的としている。解析対象の転写因子のスプライシングバリアントについて検証を行った結果、スプライシングパターンの変化により花成形質や器官形成において働きが変化する可能性を示す結果を得た。これまでの結果から、この転写因子は、各種の外的環境による制御(日長など)やそれらにより変化する内的制御(スプライシング制御など)を受けながら多様な役割を発揮し、植物が適切に一年生植物として生長できるように機能することが示唆された。また、遺伝子の機能を破壊した際に解析対象としている花成関連因子の遺伝子破壊株と類似した花成形質を示す転写因子ANAC075について解析を実施した。その結果、ANAC075は維管束などで発現する新規の花成関連抑制因子であり、その遺伝子破壊株では花成ホルモン遺伝子などの花成促進遺伝子の発現が上昇することで開花の促進が見られることを発見した。この成果は論文として発表した。解析対象の転写因子のスプライシングバリアントが花成制御や器官形成において果たす役割などについて新たな知見を複数得ることができた。また、当該転写因子と一部重複した機能を持つと考えられる新たな花成抑制因子を発見し、その解析結果の一部を発表することができた。一方で、解析に用いている形質転換体の形質にばらつきが見られることが原因で一部の解析が難しくなっている部分もある。本研究では、一年生植物であるシロイヌナズナにおいて、ある花成制御関連の転写因子を強く発現させた際に見られる多年生的形質に主に着目し解析することで、一年生植物と多年生植物の違いを生み出す未同定の要因を発見・解析するとともに、分子育種等に役立つ知見を得ることを目的としている。なお、本研究は都合により一時中断しており、平成28年度の途中から再開した。シロイヌナズナに多年生的形質およびそれに類似した形質を付与する転写因子を強発現する形質転換体を、シロイヌナズナと異なる日長感受性を示す植物にて作出し、栽培試験を実施したが、それらの植物においては目立った形質は観察されなかった。また、当初の予定では、多年生的形質を獲得したシロイヌナズナの形質転換体のホモ系統を単離し、安定した形質を示す系統を確立した後にEMS処理により変異を導入し、より強い形質を獲得した系統を探索する実験を予定していたが、形質を指標にしたスクリーニング実施のために必須である安定した形質を示すホモ系統が得られなかった。そのため、他のアプローチにより研究を進めることとした。野生型シロイヌナズナに導入した際に多年生的形質を付与することが判明している転写因子過剰発現コンストラクトを用い、ある遺伝子を破壊した変異体に形質転換を行ってT1世代の形質を解析したところ、野生型に導入した際に見られる形質の出現頻度が下がるもしくは見られなくなることを見出した。この結果から、この遺伝子が多年生的形質付与に関与する可能性が示唆された。さらに、花成時期や形態形成などに影響がみられる他の遺伝子の機能欠損株を見出した。

都合により平成27年度途中で研究を中断し、平成28年度の途中から研究を再開したため、研究期間を延長した。実績の概要欄に記入したように、当初の計画において研究に用いる予定であった、安定した形質を示すホモ形質転換体を獲得することができなかったため、他のアプローチから研究を進めることとした。その結果、目的の形質付与に関与する新たな関連因子の候補や、花成や形態形成に関わる新規の遺伝子を見出すことができた。本研究は、一年生植物であるシロイヌナズナにおいて、ある転写因子を強く発現させた際に見られる多年生的形質やその関連因子に着目し解析することで、一年生植物と多年生植物の違いを生み出す未同定の因子を発見・解析するとともに、分子育種等に役立つ知見を得ることを目的として実施した。その結果、当該転写因子は日長や温度といった外的環境による制御およびスプライシングパターンの制御などの内的制御を受けながら多様な役割を発揮し、植物が適切に一年生植物として生長できるように機能することが示唆された。さらに、これらの制御に関与すると考えられる新規の因子を同定した。当該形質転換体が示す複数の特徴的形質が、日長条件の変化により明確に変化を示すことを発見することができた。一方で、変異導入に使用する予定の形質転換系統の形質に多少のばらつきが見られ、その系統に追加で変異導入した場合にその後の解析に支障が出る可能性が懸念されたため、後代で安定した形質を示す系統の選抜を追加で実施した。そのため、変異導入およびその後の解析の予定に遅れが生じた。これまでに得られた知見をもとに、当初から解析対象としている転写因子に加えて新たに単離した因子に関する解析も並行して進める。形質のばらつきの問題については、他系統の選抜の継続などにより柔軟に対処していく。上述のように当初の計画を変更し、花成関連転写因子の過剰発現による多年生的形質の付与に関与する遺伝子や、花成時期の制御や形態形成に関与する遺伝子の単離や解析を異なるアプローチから試み、有望な遺伝子を複数見つけることができた。今後は、当初から進めている多年生的形質を獲得した形質転換体や当該転写因子の解析に加え、新たに発見した遺伝子の働きに関しても解析を進めていく。植物の遺伝子制御および分子育種形質の安定した系統を単離するために延期した変異導入およびその後の解析に関しては、十分な種子量が得られ次第順次実施する。また、当該転写因子が持つ重要とみられる二つのドメインのうち一つがスプライシングの変化により失われるという現象が多年生的形質の付与に関与するかどうかを確認する実験を実施したが、これまでの解析では明確な関与を示す結果を得ていない。この点に関してはより詳細な解析により検証を実施する。使用する形質転換体の形質のばらつきや、都合により研究中断時期が生じたことなどにより、一部の研究を次年度以降に実施することとなったため。また、競合等を勘案し、学会発表を一部見送ったことにより一部旅費を使用しなかったため。平成27年度途中から平成28年度途中の間、都合により研究を中断し、研究期間を一年延長したため。また、当初の計画と異なるアプローチで研究を進めることになったため。変異導入に使用する形質転換体について後代を使用するよう変更し、それに伴い変異導入実験およびその後の解析を平成27年度以降に実施することになったため、物品費に繰り越し金が生じた。
励起多核金属錯体におけるp・d・π電子相互作用

レニウム(III)6核クラスター及びアリールホウ素置換基を有する遷移金属錯体における励起状態のp・π・d電子相互作用について研究を行った。Re(III)クラスター錯体の励起状態においては金属d電子の存在によりスピン・軌道相互作用が加わるため、極めて大きなゼロ磁場分裂を引き起こし、これがクラスター錯体の発光スペクトル及び発光寿命の温度依存性に反映されることを明らかにした。また、ターミナル配位子として電子受容性の4,4'-ビピリジンを含む場合には、励起状態においてp軌道電子の役割のためにmetal-to-ligand charge transfer(MLCT)性を帯びることを明らかにした。一方、アリールホウ素置換基を有する種々のPt(II)、Ru(II)、Ir(III)錯体を合成し、その分光学的・光化学的特性に対するp・π・d電子相互作用の効果を詳細に検討した。その結果、いずれの場合にも金属中心から配位子へのMLCTと配位子からアリールホウ素のホウ素上のp軌道へのCTが相乗的に相互作用することを実験的に明らかにした。このような相乗的な相互作用により、吸収遷移の遷移双極子モーメントが増大するとともに、これを反映して発光量子収率の増大と発光の長寿命化が観測された。特に、1,10-フェナントロリン(phen)の4-位にエチニル基を介してジメシチルドユリルボランを導入したRu(II)錯体においては、室温のアセトニトリル溶液中において発光量子収率=0.11、発光寿命=12μsと、Ru(phen)_3錯体の物性値とは異なる際立った励起物性を示すことを明らかにすることができた。金属六核クラスター錯体およびトリアリールホウ素誘導体の励起状態の詳細を明らかにする研究を行った。まず、レニウム(III)クラスターおよびMo(II)クラスターの液体ヘリウム温度から室温にわたる温度範囲において発光スペクトルおよび発光寿命解析を行い、その解析から、クラスター錯体の発光状態である励起三重項状態のスピン副準位パラメータを決定した。両クラスターともに励起三重項状態は4つにスピン副準位に分裂しており、温度によって各副準位の寄与が異なるために、発光スペクトルおよび発光寿命に大きな温度依存性が現れることを示した。また、両クラスターともに正八面体近似においては、励起三重項状態は3つのスピン副準位から成ると予測されるが、実際には、低温領域における構造歪みにより副準位が分裂する結果、計4つの副準位により励起状態が記述できることを明らかにした。また、モリブデンクラスターについては、固体中における励起状態の性質は対カチオンに依存することが見出され、今後、詳細な研究が必要となることが分かった。一方、ホウ素架橋型配位子を有する発光性の遷移金属錯体の創製を目指し、種々のアリールホウ素誘導体ならびにアリールホウ素部位を有するシクロメタレート型配位子とその金属錯体の合成と測定を行った。三重結合部位を有するアリールホウ素は強発光性であること、ホウ素グループを配位子中に有するシクロメタレート型イリジウム錯体はホウ素部位の存在により励起状態が安定化することを明らかにした。
口腔癌の細胞科学的診断基準ならびに悪性度の定量的指標について

本研究は口腔癌とその境界病変(前癌性病変)の悪性度ならびに細胞科学的診断基準を得ることを目的として行われた。その主な研究方法は口腔粘膜発癌実験と口腔扁平上皮癌131例を含む臨床例169例について顕微分光側光法による核DNA一核面積の細胞科学的定量2.多重顕微蛍光側光法を用いた核DNA-RNA量の定量ならびにBromodeoxyuridine (BrdU)の標識細胞の免疫組織学的検索による細胞動態解析3.以上の細胞科学的所見と臨床像、細胞、病理組織像との比較検討ならびに多変量解析による予後因子の県道である。これらの研究成果は以下のごとくである。1.DNAヒストグラムにおける異数倍体細胞、多倍体細胞(4倍体以上の細胞)の頻度、核DNA一核面積散布図における分散の大きさは臨床像や通常の組織像では把握し難い悪性潜在能や悪性化の判定の客観的指標として診断的価値を有する2.口腔扁平上皮癌のDNAヒストグラムは単峰型、2峰型、多峰型に核DNA一核面積散布図は集合型、分離型、拡散型、直線型に類別されるが、散布図のパターンは年令、原発部位、臨床進展度、組織学的悪性度、治療法とは独立した予後因子となり、特に直線型ついで分離型は予後不良である。3.口腔扁平上皮癌におけるDNA量とRNA量の2元的定量解析はGO期細胞(低RNA量城の細胞)の識別や複数の増殖系の存在確認を可能にするなど、本症の細胞動態解析により有用な情報を提供した。また治療前DNA-RNAサイトグラムや治療過程のその変動様式は放射線、抗癌剤の感受性工かの指標として有用であることが示された。4抗BrdUモノクロナール抗体を用いた免疫組織学的検索によるS期細胞同定とDNA-RNAサイトグラムの併用は本症のより詳細な細胞動態解析を可能とする。1.口腔癌細胞の核DNA-RNA量所見について。口腔扁平上皮癌新鮮例58例についてアクリジン・オレンジ染色を用いた顕微多重測光法により核DNA,RNA量を同時測光し散布図(以下Cytogram)を作製、両物質の分布動態を解析した。1)測定方法として本法の欠点とされた核DNA量測光時のケラチン蛍光かぶりは2つの測光絞りで細胞質を十分マスクすることにより解決された。2)初診時のCytogramはDNA量の変動にかかわらずRNA量の低い、すなわちGo期細胞が多いタイプ(【I】型),細胞回転に入る細胞が比較的多く、かつ複数のstem limeの存在が推定されるタイプ(【II】型),両物質の相関性が高く単一のstem lineによる細胞増殖を呈するタイプ(【III】型),【III】型にみられる分布の他にDNA2C域に異常に高いRNA量をもつ細胞群(Go期)が認められるタイプ(【IV】型)に大別された。これらの所見は核DNAヒストグラムに比べより詳細な細胞増殖動態の把握を可能とするものである。また放射線,化学療法の感受性との間に密接な関連も認められ、それらの客観的1指標となりうることが示された(1986.11.20.第25回日本臨床細胞学会にて発表)。臨床例では放射線,Peplonycinの治療効果の高いものでは早期に高DNA,高RNA細胞すなわち【G_2】M期細胞ないし異常分裂細胞の蓄積が、逆に治療効果の乏しいものではGo期細胞の残存,蓄積傾向が高く、Cytogramの推移は治療効果の指標として意義をもつことが示唆された。また口腔扁平上皮癌培養樹立株を用いたin viro制癌剤(PEP.5-Fu)

投与下での核DNA-RNA量の推移は制癌剤の作用機序を反映した変化を示した(第31回日口外学会総会)。さらに他の制癌剤および多剤併用療法による細胞動態の解析について、BudR標識法,Flow Cytometry法も加え、検討している。1.口腔扁平上皮癌新鮮例計80例のDNA-RNA量を測定し,臨床,病理像ならびに治療効果との関連性を追求した.DNA-RNA量サイトグラムはI-IV型(前年度報告参照)に大別され,臨床的にはII, III型にリンパ節転移例が多く,組織学的にはIII型に高分化型が, II型に異型度の高いものが多かった.細胞像との対比では, GO期に相当する低DNA低RNA細胞は一般に小型で,核も小さいが,高DNA高RNA細胞は核,細胞質とも大きく,クロマチンが増量し,核分裂を示すものもあった.放射線,化学療法効果との関係では,一般に, I型が効果が低いのに対し, III, IV型は効果が高く,特に,著効例では治療早期から高DNA高RNA細胞(G2M期ならびに異常分裂細胞)の増加がみられるなど,サイトグラムの変動様式は治療効果の予測,評価に有用な指標となることが示唆された.今後,遠隔成績との関係についても検討したい.2.in vitro抗癌剤投与下におけるDNA-RNA量の推移と細胞像の変化. PEPの静細胞効果濃度では高DNA高RNA細胞の増加と核,細胞質の腫大した細胞がみられ,殺細胞効果濃度ではRNA量が異常に高く,核,細胞質の著明に腫大した細胞が増加した.本細胞は細胞死への1過程と思われた.CDDPでは初期に3C域の細胞の増加(S期ブロック)がみられる他は概ねPEPと同様の変化を示したが, 5FUでは,全般にRNA量の増加はみられず, 23C域の細胞の蓄積(GS期ブロック)が認められた.これらDNA-RNA量の変化の様相は抗癌剤の細胞回転における作用機序および細胞増殖動態への影響の強さを反映している.3.口腔扁平上皮癌14例のBrdu標識率を検索した結果,平均標識率は11.5%だが,高分化型では標識細胞(S型細胞)は癌胞巣の周辺に多く,低分化型では混在していた.さらに症例を重ね, DNA-RNAサイトグラムとも合わせ口腔癌の細胞動態の詳細を検討したい.1.口腔扁平上皮癌1次症例67例を対象に、^<60>Co照射、PEP(BLM)、CDDPの術前治療過程におけるDNA-RNA量の推移をDarzynkiewiczの方法を用いて解析し、これと治療効果との関連性を検討した。その結果、GO期細胞はCR・PRではおおむね減少し、特に治療前からGO期が多い割に効果の高いものでは著しい減少を示した。客にNC、PD例ではBO期細胞は増加していた。前者は治療により非増殖相細胞が増殖相に誘導され(リクルートメント現象)。後者は増殖相細胞が減少し、感受性の低い非増殖相細胞が相対的に増加したためと思われた。G_2M期+異常分裂細胞はCR、PR例では増加を示すものが多く、これは^<60>Co外照射、PEP(BLM)のG_2M期ブロックによると考えられた。逆にNC、PD例では治療前からその頻度が低く、わずかな増減にとどまった。異常、DNA-RNA量サイトグラムの変化の様相は治療感受性、効果の客観的な指標となることを明らかにした。2.口腔扁平上皮癌培養細胞に抗癌剤(PEP、DDP、5-Fu)を種々の濃度で投与し、DNA-RNA量、細胞数、細胞像の推移を検討した。その結果、DNA-RNA量サイトグラムの変化は、各薬剤の細胞回転における作用機序に基づいた細胞増殖動態への影響、抗腫瘍効果を直接的に表現していた。
準安定超伝導粒子のフリップ・フロップによる入射粒子のエネルギー決定の検証

「準安定超伝導粒子」を用いて「フリップ・フロップによる入射粒子のエネルギー決定」の研究を、平成7年度から行ってきた。錫の直径が50-20μmの実験から得られた結論は1.フリップの信号が外部磁場を変化させたとき、徐々に小さくなり、臨界磁場で決まるある値の外部磁場で消失することが判明した。この事実は中間状態の存在をしめし、局部加熱のモデルで磁化曲線を考察することによって説明できた。従って、局部加熱のモデルに従う錫のような物質はフリップ・フロップを調べるには適していない。フリップ・フロップ現象の検証には全体加熱に従うアルミニュウムが適している。2.α線の照射する角度に関する解析から、錫と言えども完全な局所的加熱ではなく、試料のかなりの部分が加熱されていたと解釈できる。従って20μmより更に小さい試料では、より全体的な加熱が働きをフリップ・フロップ現象が観測できると考えられる。の2点である。2つ目の結論はスイスのベルン大学のグループによって粒径11μmで検証された。の2点である。過熱状態(superheated state)の準安定状態のみを利用する場合リアルタイムで蓄積エネルギーを測定出来ない欠点がある。過冷却(supercooled state)の準安定状態も同時に利用(フリップ・フロップ効果)することによって、原理的にリアルタイムでエネルギーの測定が可能である。第6回低温粒子検出器に関する国際ワークショップ(LTD6, 28 August1 September, Beatenberg, Interlaken, Swizerland)までは実験的検証がなされていなかった。LTD6で我々は直径20μmの錫粒子で局部的加熱のためフリップ・フロップが観測できないと発表、ベルン大学は直径11μmの錫粒子で観測したと発表。直径が半分の為、試料の温度上昇が8倍で、局部的加熱に全体的加熱が加わって観測に成功したものと考えられる。まだプレリミナリーな実験結果であり、我々は全体的加熱の性質を示すアルミニュウムの粒子を用いてより完全なフリップ・フロップの検証を目指す。従って20μmより更に小さい試料では、より全体的な加熱が働きフリップ・フロップ現象が観察できると考えられる。の2点である。
Ｒａｄｉｘｉｎのリン酸化変化に伴う胆汁排泄輸送体の局在変化が及ぼす生体への影響

本研究では、慢性肝炎モデルにて、胆汁うっ滞の改善に伴う肝病態に対する影響を評価すると共に、胆汁排泄輸送体の局在変化に関わる因子としてRadixinなどのアンカー蛋白質のリン酸赤状態の変化の生体への影響について検討を行った。その結果、胆汁輸送体の局在制御を担う可能性のある複数の蛋白質(Anexin A2)を同定し、MRP2の膜局在の制御因子であることを明らかとした。さらにMRP2と同様に胆汁流の生成に関わるBSEPの機能低下時において、培地中の胆汁酸に依存した毒性感受性の亢進することをヒト、ラット及びヒト肝細胞を用いたSandwich cultured hepatocyteにおいて見出した。申請者は急性の酸化ストレス時に胆汁排泄輸送体の局在変化による機能低下を伴う肝内性胆汁うっ滞を明らかとし、そのメカニズムを解明してきた。一方でC型肝炎などの慢性肝疾患時にも胆汁排泄輸送体の膜局在性の低下による胆汁うっ滞が報告されている。これら胆汁うっ滞は胆汁酸等の蓄積により肝硬変や肝癌への病態の悪化を招く。そこで本研究では、これまでに明らかとしたMRP2の局在性を上昇させるシグナル伝達の関連因子についてEthan DIGEを用いた2次元蛍光ディファレンシャルの解析を行った結果、MRP2と新規に結合する蛋白質としてAnnexinA2を同定した。さらに本蛋白質とMRP2との結合に関してGST-pull down assayにより検討を行ったところ、MRP2の局在の上昇時には、AnnexinA2と結合が減少している一方で、局在の低下時において、結合の増強が認められた。本検討における詳細な解析からAnnexinAが、MRP2を含む膜蛋白質の細胞内動態に関わる重要な因子であることを明らかとした。また、MRP2と同様に毛細胆管側膜に発現し胆汁うっ滞の生成に関わるBSEPの機能低下時において、培地中の胆汁酸に依存した毒性感受性の亢進することをヒト、ラット肝細胞Sandwich cultured hepatocyteにおいて見出した。本年度において明らかとしたこれら結果は、胆汁うっ滞の生体への影響を明らかとする本研究において、重要な知見となることが期待され、今後に発展性のある研究結果である。申請者は急性の酸化ストレス時に胆汁排泄輸送体の局在変化による機能低下を伴う胆汁うっ滞を明らかとし、そのメカニズムを解明してきた。一方でC型肝炎などの慢性肝炎時にも胆汁排泄輸送体の膜局在性の低下による胆汁うっ滞が報告されている。これら胆汁うっ滞は胆汁酸等の蓄積により肝硬変や肝がんへの病態の悪化を招く。そこで本研究では、これまでに明らかとしたMRP2の局在性の低下を上昇させるシグナル伝達の関連因子についてEthan DIGEを用いた2次元蛍光ディファレンシャル解析を行った結果、MRP2と結合する複数の蛋白質を新規に同定した。その中の一つであるAnnexinA2と結合することでMRP2が内在化することを見出し、LPS投与による胆汁うっ滞モデルにおいてもAnnexinA2とMRP2の結合量の減少が見られ、MRP2の細胞内動態に関わる蛋白質であることが明らかとなった。また、消化管においてもRadixinと同じFamilyに属するEzrinのリン酸化状態の変化により、MRP2やMDR1の管腔側膜での局在性を制御しており、消化管における発現プロファイルの違いを説明しうることが明らかとなった。そこで本研究では、これまでに明らかとしたMRP2の局在性を上昇させるシグナル伝達の関連因子に着目し、それら活性化、阻害剤及び利胆薬等を慢性肝炎モデルマウスにて、胆汁うっ滞の改善に伴う肝病態に対する影響を評価すると共に、ヒト肝スライス等を用いてヒトでの有効性を検証することを目的として研究を行った。本研究においては、モデルとして汎用されるLipopolysachalideの投与を行い、胆汁排泄輸送体の局在変化に関わる因子として膜裏打ちタンパク質であるRadixinとの結合が重要な因子であることを明らかとし、更にヒト及びラット肝スライスを用いて、酸化ストレスがヒトにおいても胆汁輸送体の局在に影響を与えていることを明らかとした。更に、Ethan DIGEを用いた2次元蛍光ディファレンシャル解析により胆汁輸送体の局在制御を担う可能性のある複数の蛋白質の同定に成功した。

本年度の検討により得られたこれら結果は、本研究を遂行することで得られるC型肝炎モデルマウスでの検討結果をヒトに応用する際の重要な知見となることが期待され、今後に発展性のある研究結果である。当該研究計画において本年度は、前年度において見出したAnnexinA2の解析を行い、MRP2の局在性のキーファクターであることを明らかとした。また、BSEPの機能低下が、胆汁酸の毒性感受性の亢進に関わっており、胆汁うっ滞が及ぼす生体への影響についてIn vivoで明らかとすることを目的とした本研究において、次年度につながる研究成果が得られていると考えられる。当該研究計画において本年度は、MRP2の局在性を上昇させるシグナル伝達の関連因子に着目し、それら活性化、阻害剤及び利胆薬等の胆汁うっ滞の改善について評価を行い、Ethan DIGEを用いた2次元蛍光ディファレンシャル解析によりAnnexin2aをMRP2と結合する新規結合因子として同定した。最終年度となる平成25年度においては、本年度において得られたAnnexinA2についてIn vivo、In vitroでその遺伝子発現を抑制するためアデノウイルスノックダウンベクターの構築を行う。構築されたベクターにおいて、MRP2、BSEPの機能変動と、肝臓における生体内基質の蓄積について併せて評価を行うことで、胆汁うっ滞の生体への影響と、効果的な利胆作用を持つ化合物の選択を行う。今後、23年度に行った研究において同定したAnnexin2a等の新規結合因子について、利胆薬による影響を分子レベルで解析を行うことで、新規利胆薬となる化合物の選別を行う予定である。また、Groningen大学Geny Groothuis教授のグループとの共同研究としてヒト肝スライスを用いた検討を追加することで、動物種差等を考慮した臨床で使用可能な利胆薬の開発につながることが期待される。アデノウイルスの構築にあたり必要な研究試薬(TAKARA adeno virus knockdown vetor)を研究の効率化のためキットとして購入する(25万円)。これは本年度購入を予定していたものであったが、輸入手続きの遅延等により本年度購入ができなかったため、本年度の未使用分の384,685円を充てる。また、ヒト肝スライスは研究のGroningen大学Geny Groothuis教授のグループとの共同研究として実施する。そのサンプルの輸送費として20万円を計上した。また細培養試薬・器具は、培養液、ウシ血清、細胞培養ディッシュを含み、これらは昨年度の消費量を参考に本研究に必要な分を算出した。一般消耗品は、ピペットチップ、遠心管、ガラス器具などを含んでいる。旅費には、本研究の成果をさらに発展させると共に広く認知させるためのオランダで開催される国際薬物動態学会への参加・発表にかかる経費を計上した。ヒト肝スライスは研究のGroningen大学Geny Groothuis教授のグループとの共同研究として実施する。
リアルタイムプログレッシブサーフェス生成

ステレオ時系列画像から,サーフェスとフレーム間のカメラ運動の同時推定を効率的に行う技術を開発し,この手法に基づいて,広範囲な地形状のサーフェス生成をプログレッシブに行うアルゴリズムを開発した.その要素技術であるステレオ画像からのサーフェス生成やステレオ時系列画像からの平面姿勢とカメラ運動の同時推定について,それらをリアルタイムに行うシステムを作成した.また,インクリメンタルStructure from Motion技術により,単眼画像が撮影される度に出力される撮影時のカメラ位置と3次元点群を用い,プログレッシブにサーフェスを生成する手法を開発した.そして,撮影しながらモデリング結果をリアルタイムに確認できるオンラインシステムを実現し,SSII2012においてベストデモンストレーション賞を受賞した.ステレオ時系列画像から,サーフェスとフレーム間のカメラ運動の同時推定を効率的に行う技術を開発し,この手法に基づいて,広範囲な地形状のサーフェス生成をプログレッシブに行うアルゴリズムを開発した.その要素技術であるステレオ画像からのサーフェス生成やステレオ時系列画像からの平面姿勢とカメラ運動の同時推定について,それらをリアルタイムに行うシステムを作成した.また,インクリメンタルStructure from Motion技術により,単眼画像が撮影される度に出力される撮影時のカメラ位置と3次元点群を用い,プログレッシブにサーフェスを生成する手法を開発した.そして,撮影しながらモデリング結果をリアルタイムに確認できるオンラインシステムを実現し,SSII2012においてベストデモンストレーション賞を受賞した.本年度の計画は,プログレッシブサーフェス生成に必要な基本アルゴリズムの開発であった.そのために,以下の項目について検討を行った.(1)多眼ステレオカメラによるサーフェス生成:この推定は,プログレッシブサーフェス生成において,カメラ運動が得られたことを想定した推定と等価である.よって,この研究には,多数のカメラが存在したケースにおける基準座標系の取り方や,サーフェス生成の基本的な性質を明らかにするという意義がある.この研究により,復元の際に必要な基準座標系は,特定のカメラ座標系に定めるのではなく,撮影対象の形状に対して適切な座標系を定めることで,より良好なサーフェスが生成できることがわかった.また,安定に最適化を行うには,初期値および形状に関する拘束項を適切に定めることが重要であることがわかった。これらの結果は,サーフェス拡張アルゴリズムにおける初期メッシュの生成方法に洞察を与えており来年度以降の研究に役立てる予定である.(2)カメラ運動推定のリアルタイムデモ作成:このデモは,単一平面を見たときのカメラ運動推定をオンラインで行うものであり,推定対象の形状(サーフェス)が単一平面であったときの計算効率を確認するという意義がある.ここでは,特別なハードウェアを利用せずとも,高速化の枠組みを利用することで,30フレーム/秒の推定が安定にできることを確認した.(3)魚眼レンズを利用したマルチベースラインステレオ:この研究では,一般的なカメラよりも視野の広い魚眼レンズを利用したケースを検討した.ここでは,1台の魚眼カメラとミラーとを同時に利用することにより,1台のカメラを用いても多眼ステレオと等価なシステムを実現できることを示すとともに,キャリブレーション手法および3次元計測手法を開発した.本年度の計画は,プログレッシブサーフェス生成を実時間で行うための並列処理を実装することであった.本年度では,まず,昨年度の成果であるリアルタイムステレオサーフェス生成アルゴリズムを時系列ステレオに拡張することにより,サーフェスとカメラ運動を同時に推定するアルゴリズムを開発した.ここでは,昨年度に開発した形状に関する拘束項を付与することにより,推定の安定性を高めた.そして,このアルゴリズムを4段の並列処理を用いて実装することにより,プログレッシブサーフェス生成を準実時間で行うプログラムを作成した.同プログラムにより毎秒約3フレームの処理を実現できた.来年度では,ハードウェアを用いた実時間処理の実現が計画されており,本成果をこれに役立てる予定である.その他の成果としては,画像からの3次元計測では不可欠なカメラキャリブレーションのための手法として,従来のように特徴点対応を利用するのではなく,プログレッシブサーフェス生成と同様に全画素値を推定に寄与させることで高精度化する手法を開発した.また,プログレッシブサーフェス生成と同じ高速化のフレームワークを活用して,単眼時系列画像を用いて各時刻におけるテンプレートサーフェスの3次元形伏を高精度かつ効率的に推定する手法を開発した.その他,グラフカットアルゴリズムを利用して,ステレオ画像からシーン中の平面領域とその幾何学的パラメータを同時に推定する手法を開発した.本年度の計画では、画像間の特徴点対応を利用して推定の安定性を向上させるとともに、プログレッシブサーフェス生成をリアルタイムで実現するシステムを作成することであった。本年度では、画像間の特徴点対応に基づいて、単眼動画像からプログレッシブに3次元復元を行うStructure from Motion(SfM)の技術を開発した。ここでは、3次元復元に適した画像や特徴点を選択することで、効率的かつ安定な3次元復元を実現した。そして、画像中の特徴点とDelaunayt riangulationを利用して画像上に三角メッシュを生成し、メッシュ全頂点の3次元位置をリアルタイムに推定するプログレッシブサーフェス生成技術を開発した。このサーフェス生成では、前記SfMによる3次元点の復元結果を拘束として、各三角形パッチの位置・姿勢をそれぞれ独立に推定する。これにより、大規模な線形システムを解く必要がなくなるため、特別なハードウェアを用いなくてもリアルタイムのプログレッシブサーフェス生成が実現できた。なお、このサーフェス生成手法を用いたシステムは、平成24年6月に学会でデモンストレーションを行う予定である。その他の研究成果として、前記SfMの初期復元に不可欠な画像間の基礎行列をグローバル最適化により推定する手法、および、アウトライヤを含む特徴点対応からSfMを行うための効率的な最適化手法を開発した。

また、ダイレクトイメージアライメントを用いたカメラ運動手法において、最適化におけるパラメータ更新規則の近似方法の違いによる推定精度の比較を行った。最終年度の目標は、昨年度までに開発した、画像間の特徴点対応に基づいて単眼動画像から効率的かつ安定に3次元復元を行うプログレッシブStructure from Motion(SfM)技術と、画像上の特徴点からのドロネー三角形分割に基づいて生成された三角メッシュ全頂点の3次元位置をリアルタイムに推定するプログレッシブサーフェス生成技術とを融合した、完成度の高いデモシステムを作成することにあった。作成したシステムを、画像センシングシンポジウムにおいてデモンストレーションを行った結果、好評を得てベストデモンストレーション賞を受賞した。また、2枚の未較正画像からカメラ間の相対運動とカメラ焦点距離を復元できる6点アルゴリズムについて、推定の際の縮退条件を検出するアルゴリズムを開発した。この成果は、CVIM研究会での発表において卒論セッション優秀論文賞を受賞した。その他、地表面の3次元サーフェスをダイレクトイメージアライメントに基づいてステレオ画像から効率的に推定する手法を開発し、さらに、その手法に基づいて、ステレオ動画像から広範囲の地表面サーフェスマップを生成する手法を開発した。この成果については、現在特許出願のための手続きが進められている。他の研究成果として、3次元座標が既知の点の画像投影点からカメラ姿勢を推定するPerspective-n-Point問題において、データ量の多い場合でも高速に大域的最適解を得るアルゴリズムを実現した。さらに、アウトライヤ・不観測・ノイズを同時に含む膨大なデータからモデルフィッティングを行うための低ランク行列近似分解問題(low-rank matrix factorization)に対し、実用性の高いロバストかつ効率的な最適化アルゴリズムを実現し、その技術が非剛体変形推定や、Photometric stereoにも応用できることを示した。本年度の目標であるプログレッシブサーフェス生成をリアルタイムに実現するシステムの構築は、ほぼその目標どおりに実現できた。当初の計画ではハードウェアによる実装を用いてリアルタイム推定を実現する予定であったが、本年度に開発した各三角パッチを独立して推定するアルゴリズムにより、ハードウェアを利用しなくても、撮影しながらその場でサーフェス推定を行えるようになった。これは、今後の改良に対しても優位性がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在作成中のデモシステム作成の完成度を高める。
家族性高コレステロール血症の遺伝子治療の開発 -HVJ-リポゾーム-レトロウイルス法による肝細胞へのin vivo遺伝子導入-

家族性高コレステロール血症に対するLDL受容体遺伝子導入法を確立し、その効率を検討するため、細胞融合能を持つHVJ(センダイウイルス)とDNAを核内へ効率よく移行させる(HMG1)とを組み合わせたリポゾームにマーカー遺伝子(β-galactosidase)を封入し、ラット及びマウスに経門脈的あるいは肝被膜下に直接投与したところ、最終的に約5-10%の肝細胞において1-2週間のマーカー遺伝子の発現が認められた。次に、本法を用いてラット生体の肝臓にヒトLDL受容体遺伝子を導入したところ、肝細胞での発現がmRNAレベルで確認され、約20%の血中コレステロール値の低下が認められた。ラット生体肝臓に対する本法によるLDL受容体遺伝子導入が可能であることが証明されたが、肝組織を免疫染色で確認したところ蛋白レベルでは外来ヒトLDL受容体遺伝子の発現はなお不十分であった。そこで、発現ベクターをpMy3から、より小さく(7.5kb)、chicken βactin promoterを有するpCL1に変更し、その遺伝子導入効率が改善されることを確認した。次に、家族性高コレステロール血症のモデル動物であるWatanabe heritable hyperlipidemic(WHHL)ラビットに本法により遺伝子導入を行ったところ、約20%の血中コレステロール値の低下を認めた。しかしながら、対照としてHVJ-リポゾームのみを投与したラビットにおいても同様かやや軽度のコレステロール値の低下を認めたため、現在Northern blotting、RNase protection assay、肝細胞免疫染色などで、このラビットにおけるLDL受容体の発現様式、発現量を検討中であるとともに、HVJ-リポゾームによるコレステロール低下作用の機序についても検討中である。さらに、従来米国においてex vivoの遺伝子治療に使用されていたレトロウイルスをこのHVJ-リポゾームに組み込むことによって、in vivoにおいてレトロウイルスを肝臓へ効率よく導入する方法についても開発中である。これは、レトロウイルス遺伝子をHVJ-リポゾームに封入することによって、従来分裂細胞に限定されていたレトロウィルスによる遺伝子導入を静止期にある肝細胞にin vivoで導入しようという試みである。今後、ヒトへの応用に向けて、LDL受容体ノックアウトマウス、WHHLラビットにヒトLDL受容体遺伝子の導入を試みていく予定である。第一に、遺伝子導入法の確立を行った。細胞融合能を持つHVJ(センダイウイルス)とDNAを核内に高率よく移行させる核蛋白HMG1とを組み合わせたリポゾームにマーカー遺伝子を封入し、ラットあるいはマウスに経門脈的または肝被膜下に投与することにより、約510%の肝細胞において12週間のマーカー遺伝子の発現が確認された。次に本法を利用してラット生体の肝臓にヒトLDL受容体遺伝子を導入したところ、約20%の血中コレステロールの低下を認め、ラット生体肝臓に対する本法によるLDL受容体遺伝子導入が可能であることが証明されたが、その発現はなお不十分であると考えられた。そこで我々は発現ベクターをpMy3からより小さく(7.5kb)、chicken βactinpromotorを有するpCL1に変更することによって、遺伝子導入効率が著しく改善することを確認した。さらに発現ベクターとして従来米国においてex vivoの遺伝子治療に使用されていたレトロウイルスを使用し、上記の如く開発、確立したin vivo遺伝子導入システムを併用することによって非侵襲的かつ反復投与可能で高い発現効率を達成すると共に、従来分裂細胞に限定されたレトロウイルスによる遺伝子導入を静止期にある肝細胞への導入を可能にした。

今後ヒトへと応用に向けてまずLDL受容体を欠損しているマウス及びラビットへ本法を用いてヒトLDL受容体遺伝子の導入を試みる予定である。まず遺伝子導入法の確立および効率を検討するため、細胞融合能を持つHVJ(センダイウイルス)とDNAを核内に効率良く移行させる核蛋白(HMG1)とを組み合わせたリポゾームにマーカー遺伝子(β-galactosidase)を封入し、ラットおよびマウスに経門脈的または肝被膜下に直接投与した。最終的に約5-10%の肝細胞において12週間のマーカー遺伝子の発現が確認された。次に本法を利用してラット生体の肝臓にヒトLDL受容体遺伝子を導入すると、約20%の血中コレステロールの低下を認め、ラット生体肝臓に対する本法によるLDL受容体遺伝子導入が可能であることが証明されたが、肝組織の免疫染色で確認したところ外来ヒトLDL受容体遺伝子の発現はなお不十分であると思われた。そこで発現ベクターをpMy3からより小さく(7.5Kb)、chicken βactinpromotorを有するpCL1に変更し、その遺伝子導入効率が改善することを確認した上で、家族性高コレステロール血症のモデル動物であるWHHLラビットに投与したところ約20%の血中総コレステロールの低下を認めた。しかし、対照としてのHVJ-リポゾームのみを投与したラビットにおいても同様かやや軽度のコレステロールの低下を認めたため、現在Northern blotting、RNase protection assay、肝細胞免疫染色等でこのラビットにおけるLDL受容体の発現形式、発現量を検討中であるとともに、HVJ-リポゾームによるコレステロール低下作用の機序も検討中である。また、従来米国においてex vivoの遺伝子治療に使用されていたレトロウイルスをこのHVJ-リポゾームに組み込むことによってin vivoにおいてレトロウイルスを肝臓へ効率良く導入する方法も開発中である。これはレトロウイルス遺伝子をHVJ-リポゾームに封入することによって、従来分裂細胞に限定されていたレトロウイルスによる遺伝子導入を静止期にある肝細胞にin vivoで導入しようとせんものである。今後、ヒトへの応用に向けてLDLノックアウトマウス、WHHLラビットにLDL受容体遺伝子の導入を試みる予定である。