hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
基礎から子ども文化創造の体験までをも含む劇的表現活動のプログラム開発と指導法の研究

劇的表現活動とは本来、わが国の従来型の学芸会に見られるような作品重視・指導者主導型のトレーニングとは異なる、身近で楽しいグループ活動である。リーダーの導きにより、自分自身の経験に基づいた日常的な言葉と身体の動きによって即興で劇的世界を創造していくプロセスで、想像の世界をイメージし、登場人物の気持ちを深く捉え、もし自分だったらと考えたことを、芸術的・専門的でなくても自分なりに工夫した表現方法によって自信を持って仲間と分かち合う体験である。この体験は、単なる一過性の劇づくりに留まらない。子どもたちの観察力、想像力、表現力、感性、自主性、社会性等の他、自分の思いや考えを、自分自身の感性に基づき自己表出する総合的な自己表現力としてのコミュニケーション能力を育成する体験的学習活動となり得る。そのために、(1)基礎的プログラムで、一回ごとの活動が内容的に充実しているばかりでなく、経験として次につながる発展性を有し、とくに子どものあそびとドラマの共通性、関連性に重点を置いた『クリエイティブ・ドラマの世界』(2)テーマ性を重視し、サークルストーリーズ、セグメンテッドストーリーズ他の新しい技法によって子ども自身による劇的世界の創造的体験を可能にする『サンプル・レッスン・プラン』『クリエイティブ・ストーリーズ』を開発した。また、指導者である大人のドラマティックな技法と実践力の育成ばかりでなく、表現、劇の構成、ドラマの素材、クリエイティブ・ドラマの教育的意義といった指導の基本及び特に創造性の評価に関する指導のあり方について提言した。また、具体的な指導上の留意点は、プログラムの展開に従いながら随時紹介した。劇的表現活動の現状調査、具体的なプログラムづくり並びに指導法考察のための事例収集・調査1.国内の幼稚園、保育園で取り組まれている劇的表現活動の実践と事例の収集いわゆる『ごっこあそび』や『劇あそび』と呼ばれる活動の実践例として、保育室や園庭で日常的に展開する自然発生的な"あそび的活動"から、『表現会』『子ども会』などと呼ばれる"見せる活動"まで幅広く収集した。また、特定のグループ(複数)を抽出し、1つの"あそび的活動"が繰り返し遊ばれるうちに劇的要素を強め、次第に"見せる活動"へと移行していく事例も併せて収集した。2.国内の児童館における劇的表現活動の実践地域社会における身近な表現活動の場としての児童館の果たす役割は今後ますます大きくなるといえる。こうした児童館の活性化を図るために毎年夏期休暇中に実施される厚生省の『児童館活性化事業』に参画し、『劇あそび』『参加劇』といった劇的活動を実践した。また,日常生活における子どもたちのコミュニケーション能力を育成する身近な劇的表現活動として、『ソシオドラマ(sociodrama)』活動を、特定の児童館(複数)において定期的に実践した。3.海外における最新の事例収集特に『総合的表現活動(Integrated arts)』が広範に取り組まれているアメリカのニューヨーク市を中心に、最新の活動事例と文献、資料等を収集した。1.海外の劇的表現活動プログラム情報収集:米国連邦政府機関、ニューヨーク州機関、ニューヨーク市の公・民間機関が提供する最新の劇的表現活動プログラムに関する情報収集調査を行い、特筆プログラムを抽出。2.海外調査の実施:1のデータ収集に基づき抽出したプログラムの具体的な指導方法等を検討・分析するための出張調査。(一部の機関・施設におけるオリジナルプログラム案の実践及び最新の文献及び資料の収集を含む)【主な調査実施機関及び調査・研究内容】(1)ニューヨーク市立大学大学院演劇科『児童演劇』レクチャー聴講及び日本の表現教育の講義担当(2)セントルークオーケストラ+リーモンダンスカンパニーによる『音楽・リズム・ムーブメント』ワークショップ参加(対象:ニューヨーク市立小・中学校教諭約50名)(3)ニューヨーク市立第131中学校『ドラマ』授業参観(3クラス)及びアクター・ティーチャーによる『リズム・ムーブメント』ワークショップ参加(4)ニューヨーク州小・中学校演劇担当教員主催による児童対象ワークショップ『ドラマパワー』参加

(5)ニューヨーク大学(NYU)プロジェクト(CAT=Creative Arts Team)による幼児対象のワークショップ参加(ニューヨーク市立第148小学校内幼児クラス:2グループ)3.国内の活動状況の把握及び実践報告書関係の調査:(財)児童健全育成推進財団、(社)児童演劇協会等関係機関を通して情報収集を行い、幼児(都内:駒場幼稚園)、児童(都内:葛西児童センター)、地域の子どもと大人(親子劇場・九州・沖縄地域支部)を対象とした団体による劇的表現活動の実践(注)日程に都合により親子劇場は情報収集のみ。平成13年度より劇的表現活動実践を随時行う予定。4.モデルプログラムハンドブック作成準備:活動リーダー用モデルプログラムハンドブックの作成準備。1.オリジナルプログラムの作成と実践:平成11年度12年度に収集及び実践した海外(ニューヨーク市中心)並びに国内における劇的表現活動の事例を基本としたモデルプログラムを作成し、特に劇的表現活動の日常的な取り組みを積極的に実践している2施設(東京都目黒区駒場幼稚園・東京都江戸川区葛西児童センター)と1団体(親子劇場九州・沖縄地域支部)を地域における子どもたちの文化創造活動の拠点と位置付け、相互の情報交換を密にしながら、幼児・児童・大人(父母等)・指導者(幼稚園教諭・児童厚生員・地域ボランティア等)を対象としたオリジナルプログラムによる「グループ・ワークショップ」を実施。(実施回数:7回;平均参加者数:50名)2.劇的表現活動指導者(リーダー)向けハンドブックの制作1のワークショップにおける参加者の反応や感想等を参考に、オリジナルプログラムに精査を加えた新たなプログラム集を作成し、その基本・構成・素材・具体的な指導方法・プログラム作成の実際等をまとめた小冊子『たのしいクリエイテイブ・ドラマの世界:ドラマであそぼう:クリエイティブ・ドラマの基本からオリジナルプログラムづくりまで』を制作。(80ページ・5,000部印刷:平成14年度関係機関に随時配布)3.研究成果報告書の準備:国際シンポジウム・セミナー参加及び関係者(機関)との協議・連絡調整平成14年3月22日25日「九州沖縄子どもと舞台芸術出会いの広場」実行委員会主催による『杷木国際子ども芸術フェスティバル』(福岡県杷木町)における「国際シンポジウム:子どもと舞台芸術」及び「国際セミナー:総合学習の始まりに向けて芸術を教育にとり入れた実践を学ぶ」に参加。関係者(機関)と情報・意見交換した本研究課題との接点等の考察を含めた『研究成果報告書』提出の準備を行う。
ヒト母乳から見た食事中ダイオキシン関連物質の無作用濃度

わが国の母乳もPCDDs/PCDFs、Co-PCBsや有機塩素化合物で汚染されている。一方、われわれが日常摂取しているPCDDs摂取量は数pg/kg/dayでありその90%以上が食事からの摂取であると言われているが、正確な摂取量のdateはない。本申請では、PCDDの母乳中濃度と食事中濃度との関係を明らかにし、母乳から見た食事中の無作用濃度を推測する目的とする。厚生省の国民栄養調査に基ずく食品別摂取量表より食品を13群に分類し、各群の摂取上位食品を最低89品目を購入し、各品目の摂取量に応じて調理調整して、各群ごとに混合した試料(マーケットバスケット法)による食品群中のPCDDsを分析することにより、日本人のPCDDs一日摂取量を明らかにした。PCDDsの一日摂取量は53TEQ pg/成人/日(1.1REQ pg/kg/日)で、食品分布は魚類食品(64%)、乳製品(9%)、肉・卵食品(8%)であった。しかしながら、これらのPCDDs汚染はわが国の一日許容摂取量(ADI、暫定基準、100pg/kg/day)を下回っている。一方母乳中のPCDDs濃度は16TEQ/pptで、母乳からの乳児のPCDDs摂取量は72TEQ pg/kg/dayであり、わが国の一日許容摂取量(ADI、暫定基準、100pg/kg/day)に近い値になっている。女性がADIを下回る量のPCDDsを日常食事から摂取していても妊娠出産して乳児を母乳育児すると、母乳経由によるPCDDsの乳児摂取量はわが国のADIに近い値になる。すなわち、母親が食事中から摂取するPCDDs量の65倍が乳児摂取量になる。わが国のPCDDsの一日許容摂取量(ADI、暫定基準、100pg/kg/day)を乳児の基準と考えると、母親の食事中のPCDDs量は1.5pg/kg/dayになる。
反回神経損傷後の疑核における神経細胞再生関連遺伝子の検索

手術時に反回神経を損傷すると,たとえ神経線維の断端を端端吻合しても声帯運動は不可逆的な障害を残す.このような声帯運動障害の原因は,神経過誤支配,筋の萎縮などが考えられているが,そのメカニズムは明らかではなく,分子レベルからの視点で解明することは重要である.神経損傷モデルとして研究の進んでいる顔面神経核,舌下神経核と比較して,反回神経の起始核である疑核は局在,形態が明確でないことや,疑核運動神経の投射先が咽頭,食道など喉頭に限らないことなどの問題からその報告は少ない.そこで我々は,逆行性に蛍光標識した喉頭筋支配疑核運動神経細胞を,一側反回神経切断後に単離しRT-PCR法を駆使することにより当該神経細胞内での分子変化を解明する方法を,免疫組織化学法と組み合わせて試みた.まず蛍光色素DiIを両側甲状披裂筋に注入し疑核運動神経細胞を標識した.続いて右反回神経を切断し,免疫組織学的検討を加えStat3が神経切断によりリン酸化して細胞質から細胞核へ移行したことを示した.疑核運動神経細胞を標識したのち右反回神経を切断し,蛍光顕微鏡下にマイクロマニピュレーター駆動の尖刃を用いてDiI標識神経細胞を単一細胞レベルで採取し,単一細胞由来全cDNAを合成,定量的リアルタイムRT-PCRを施行した.Stat3,Reg-2,Bax,Bcl-2,GAP-43,nNOS,および遺伝子の相対的発現レベルを解析し,それぞれ特徴的な発現変動を示した.Stat3の活性化が,その下流の遺伝子発現を調節していることを示した.本研究で行なった新たな細胞採取法は,喉頭筋群へ投射する神経細胞の分子動態を,着目した単一神経細胞レベルで解析していく上での有力な手法となり得ると考えられた.手術時に反回神経を損傷すると,たとえ神経線維の断端を端端吻合しても声帯運動は不可逆的な障害を残す.このような声帯運動障害の原因は,神経過誤支配,筋の萎縮などが考えられているが,そのメカニズムは明らかではなく,分子レベルからの視点で解明することは重要である.神経損傷モデルとして研究の進んでいる顔面神経核,舌下神経核と比較して,反回神経の起始核である疑核は局在,形態が明確でないことや,疑核運動神経の投射先が咽頭,食道など喉頭に限らないことなどの問題からその報告は少ない.そこで我々は,逆行性に蛍光標識した喉頭筋支配疑核運動神経細胞を,一側反回神経切断後に単離しRT-PCR法を駆使することにより当該神経細胞内での分子変化を解明する方法を,免疫組織化学法と組み合わせて試みた.まず蛍光色素DiIを両側甲状披裂筋に注入し疑核運動神経細胞を標識した.続いて右反回神経を切断し,免疫組織学的検討を加えStat3が神経切断によりリン酸化して細胞質から細胞核へ移行したことを示した.疑核運動神経細胞を標識したのち右反回神経を切断し,蛍光顕微鏡下にマイクロマニピュレーター駆動の尖刃を用いてDiI標識神経細胞を単一細胞レベルで採取し,単一細胞由来全cDNAを合成,定量的リアルタイムRT-PCRを施行した.Stat3,Reg-2,Bax,Bcl-2,GAP-43,nNOS,および遺伝子の相対的発現レベルを解析し,それぞれ特徴的な発現変動を示した.Stat3の活性化が,その下流の遺伝子発現を調節していることを示した.本研究で行なった新たな細胞採取法は,喉頭筋群へ投射する神経細胞の分子動態を,着目した単一神経細胞レベルで解析していく上での有力な手法となり得ると考えられた.1.疑核運動神経細胞の単離技術の確立蛍光神経トレーサーDiIをラット内喉頭筋に注入し、10日後標識された疑核運動神経細胞を、蛍光実体顕微鏡下にマイクロマニュピレーターを用いてトリミングし,標識細胞を単離回収することに成功した。2.疑核単一運動神経細胞レベルにおけるPCR定量DiIをラット内喉頭筋に注入し、10日後に反回神経を切断。一定期間の後に標識細胞を単離回収し、定量PCR法により神経突起伸長関連分子群の1つであるGAP-43mRNAの発現を単一細胞レベルで定量した。GAP-43mRNA発現レベルが反回神経切断後7日目で,非切断側に比べ約8倍上昇していた。この結果は,in situ hybridizationによる解析結果と致すると考えられた。単一細胞を用いた遺伝子解析は,脳神経では顔面神経核や舌下神経核を用いての報告があるが,神経障害モデルを使用した疑核での報告はない。本法は従来困難であった疑核のみを扱う遺伝子解析のみならず,疑核のうち,特定の筋へ投射する支配神経に対象を絞っての遺伝子解析を可能としうる優れた方法であると考えられた。今後,声門開大筋と声門閉鎖筋群との遺伝子発現の比較も可能となれば,以前より問題となっているそれぞれの筋の易傷性の違いを解き明かすきっかけを与えてくれる可能性がある。1.疑核運動神経細胞の単離技術の確立蛍光神経トレーサーDiIをラット内喉頭筋に注入し、10日後標識された疑核運動神経細胞を、蛍光実体顕微鏡下にマイクロマニュピレーターを用いてトリミングし,標識細胞を単離回収することに成功した。

一定期間の後に標識細胞を単離回収し、定量PCR法により神経突起伸長関連分子群の1つであるGAP-43mRNAの発現を単一細胞レベルで定量した。GAP-43mRNA発現レベルが反回神経切断後7日目で,非切断側に比べ約8倍上昇していた。この結果は,in situ hybridizationによる解析結果と一致すると考えられた。神経傷害後に早い段階で見られるJAK/STAT系のシグナル伝達系の反応について、ラット反回神経傷害後の疑核運動神経細胞を用いて、STAT3蛋白の発現とそのリン酸化、核内への移行を明らかにした。
上咽頭癌における新たなリキッド・バイオプシー法の開発と臨床応用

上咽頭癌患者血清を用いたバイオマーカーの検討を行うにあたり、システムの構築を行った。まずプライマーとPCR設定を行うために、EBV陽性上皮細胞内からDNAとRNAを抽出し、目的のEBV-DNAとEBV-RNAのPCRを行った。PCR産物をゲル電気泳動にかけて、目的のEBV-DNAとEBV-RNAの長さにバンドがあることを確認したうえで、PCR増幅産物のシークエンスを行い、目的の配列であることを確認した。次にEBV-DNAとEBV-RNAのコピー数を定量するため、コントロールプラスミドの作成を行った。それぞれのプライマーを用いてPCRを行ったのちに、それぞれをベクターへ挿入しプラスミドを作成した。このプラスミドを段階的に希釈しコピー数定量のコントロールとした。最後にEBV陽性上皮細胞とEBV陰性上皮細胞を用いて定量的PCR法、RT-PCR法を行いシステムの再調整を行った。上咽頭癌患者組織においてin situ hybridization法によりEBERsを同定できたのは、合計20名であった。また、コントロールとして上咽頭癌以外の頭頸部癌患者20名と健常人20名を対象とした。上咽頭癌患者20名において血清中のEBV抗体価を測定した。BART-miRNAsの一部はエクソソーム以外の蛋白と複合体を形成し細胞外へ放出されることがわかったため、血清からtotalの核酸としてDNAとRNAを抽出した。上咽頭癌患者10名から核酸を抽出し、その一部で血清中のEBV-DNAとEBV-RNAの定量を行った。すでに予定した半分の患者から血清を採取し、EBV-DNA、EBV-RNAの抽出と定量が終わっている。上咽頭癌20名と上咽頭癌以外の頭頸部癌患者20名、健常人20名から核酸を抽出し、EBV-DNAとEBV-RNAの定量を行った。実際に定量したEBV-RNAはmiR-BART2-5p、miR-BART17-5p、miR-BART18-5pとした。そしてこれらの定量結果を解析した。EBV-DNAは上咽頭癌患者全例で治療前に大量に検出され、コントロールからは検出されなかった。またDNAコピー数は臨床病期と相関関係を示し、治療後に全例でコピー数の低下がみられた。治療後に検出された患者はのちに再発を示した。この結果からEBV-DNA定量は腫瘍体積を反映するバイオマーカーであり、治療後検出は予後予測因子となりえることが改めて分かった。それぞれの治療前感度・特異度を計算すると、EBV-DNAが最も高い感度特異度を示した。このことから治療前診断においてはEBV-DNAが有用とわかった。一方、治療後検出で再発遺残を最も反映したのはmiR-BART17-5pであった。さらに11名の上咽頭癌患者を追加しEBV-DNAと比較を行ったが、治療後検出において再発遺残を最も反映したのはmiR-BART17-5pであった。miR-BART17-5pは治療後残存した微小癌細胞をより鋭敏に反映する可能性があり、新たな治療後バイオマーカーとしての可能性が示唆された。残りの患者から血清を採取し、血清からEBV-DNAとEBV-RNAを抽出し、コピー数の定量を行う。そのうえで各種画像検査による治療効果判定とEBV-DNAおよびRNAコピー数を比較する。治療前のEBV-DNAおよびRNAコピー数と予後因子について検討する。耳鼻咽喉科頭頸部外科ほぼ計画通りの額を使用したが、72780円未使用となった。未使用金を次年度の研究で有意義に使う予定としたため。次年度に必要な消耗品の購入にあてる。
癌間質のエピジェネティック変化に着目した癌悪性化機構の解明と診断・治療への応用

大腸癌は腺管組織を構成する上皮細胞より発生し、遺伝子変異を蓄積する。我々は腺管組織を取り囲む間質組織の役割に着目した。2例の大腸癌の正常および癌組織を対象に、腺管分離法を用いて、それぞれから腺管組織と間質組織を分離・回収した。DNAメチル化の網羅解析を実施し、各分離組織のDNAメチル化プロファイルを得た。正常腺管と癌腺管のメチル化プロファイルの違いは、癌細胞の発育・進展に関わる癌抑制遺伝子などの存在を示唆した。一方、正常間質と癌間質の間では、少数だがメチル化レベルが大きく異なる遺伝子が確認された。エピジェネティクス機構による癌間質の機能変化が大腸癌において重要な役割をする可能性が示唆された。癌の悪性化には、癌細胞自身の変異の蓄積のみならず、癌細胞をとりまく微小環境、すなわち間質細胞の変化によっても影響される。間質が癌悪性化に寄与する分子機構は多様であるため、正常組織の間質と癌組織の間質との間の生物学的な差異を包括的かつ系統的に把握することが重要となる。本研究では、癌間質の生物学的役割をエピジェネティクス機構に着目し解明する。すなわち、腺管分離法を用いて上皮腺管と間質を分離・回収し、正常組織の間質と癌組織の間質との間でDNAメチル化状態の異なる遺伝子を網羅解析により探索する。癌間質のDNAメチル化プロファイルの変化を明らかにすることで、癌の発育・進展の新しい分子機構を発見するとともに、癌の生物学的分類や浸潤・転移などの予後の予測、さらには抗癌剤治療に対する感受性の予測への応用を試みる。平成27年度は、1)癌腺管とその間質、正常腺管とその間質、の4者を同一症例より分離・回収できる、2)癌間質と癌腺管を識別するための遺伝子変異(TP53、APC遺伝子など)を有する、の2条件を満たす2症例の大腸癌手術摘出組織を選出した。これらの組織のDNAを対象に、DNAメチル化の網羅解析(Infinium MethylationEPIC、Illumina社)を実施し、合計85万箇所以上のDNAメチル化のプロファイルを得た。現在、データの解析を行い、分離された各組織のを妥当性を検証している。DNAメチル化網羅解析は、450Kから850Kにバージョンアップされた最新チップに変更した(価格は若干高くなった)。癌間質組織の分離が予想以上に時間を要したこと、実体顕微鏡が故障したため、平成27年度は2症例の解析に留まった。分離組織の選出は次年度も継続して行うこととし、そのための費用を一部、繰り越した。癌は上皮細胞より発生し、変異を蓄積しながら進展する。その過程においては、癌細胞をとりまく微小環境、すなわち間質細胞の変化が影響することもわかってきた。本研究では、大腸癌における間質の生物学的役割をエピジェネティクス機構に着目し解明する。平成28年度は、1症例を追加し、合計3症例において、癌組織の腺管と間質および正常組織の腺管と間質を分離してゲノムDNAを得た。3症例の癌腺管ではTP53遺伝子変異がホモで検出されたため、癌間質では同様の変異が検出されないことを確認することで、分離の精度を証明した。2症例の組織のDNAを対象に、DNAメチル化の網羅解析(Infinium MethylationEPIC、Illumina社)を実施し、合計854,251箇所以上のDNAメチル化のプロファイルを得た。各CpG部位におけるメチル化レベルの差を2症例の間あるいは4種の組織間で比較すると、その差は組織間においてより大きくなる傾向が認められた。このうち正常腺管と癌腺管におけるメチル化プロファイルの違いは、癌細胞の発育・進展に関わる癌抑制遺伝子などの存在を示唆した。一方、正常間質と癌間質の間では、メチル化レベルの差が大きいCpG部位の数は少なかったが、癌間質の機能変化に関与する遺伝子が存在する可能性が考えられた。本研究で困難が予想された腺管と間質の分離については、TP53遺伝子変異の有無により確認することができ、さらには実際に得られたDNAメチル化プロファイルの違いからも分離の妥当性が証明された。症例数はまだ少ないが、計画した方法により本研究の遂行が可能であることがわかった。大腸癌は上皮腺管組織より発生し、多段階で遺伝子変異を蓄積する。最近では、癌腺管の周囲の間質組織の機能変化が重要な役割を果たすこともわかってきた。我々は癌間質においてDNAメチル化状態が変化する遺伝子を探索するため、3症例の大腸癌を対象に、腺管分離法を用いて腺管組織と間質組織の分離・回収を試みた。特に癌組織における腺管と間質は、実体顕微鏡で観察される形態のみでは分離が困難であったため、癌腺管の有するTP53遺伝子変異を指標に分離を確認した。2症例を対象に、Infinium Methylation EPICを用いた網羅解析を実施し、正常腺管、正常間質、癌腺管、および癌間質における合計854,251箇所のCpG部位のDNAメチル化プロファイル(β値)を得た。

各組織の間でβ値の平均値および標準偏差には顕著な差は認められなかった。同じ組織どうしを2症例の間で比較すると、β値の差が大きいCpG部位数は癌腺管で多く、DNAメチル化状態の差が大きかった。同じ症例について4種の組織間で比較すると、癌間質と癌腺管、癌腺管と正常腺管および正常間質と正常腺管の間で、β値の差が大きい部位数が多く、DNAメチル化状態の差が大きかった。一方、癌間質と正常間質の間では、DNAメチル化状態の差は相対的に小さかった。だが、一部のCpG部位で観察されたDNAメチル化レベルの差は、間質組織において重要なはたらきをする遺伝子の存在を推測することができる。これらの遺伝子を対象に発現および機能解析をすることで、癌間質の役割が明らかになる可能性がある。大腸癌は腺管組織を構成する上皮細胞より発生し、遺伝子変異を蓄積する。我々は腺管組織を取り囲む間質組織の役割に着目した。2例の大腸癌の正常および癌組織を対象に、腺管分離法を用いて、それぞれから腺管組織と間質組織を分離・回収した。DNAメチル化の網羅解析を実施し、各分離組織のDNAメチル化プロファイルを得た。正常腺管と癌腺管のメチル化プロファイルの違いは、癌細胞の発育・進展に関わる癌抑制遺伝子などの存在を示唆した。一方、正常間質と癌間質の間では、少数だがメチル化レベルが大きく異なる遺伝子が確認された。エピジェネティクス機構による癌間質の機能変化が大腸癌において重要な役割をする可能性が示唆された。網羅解析のデータをもとに、正常間質と癌間質でDNAメチル化状態が異なる遺伝子を選出する。これらの遺伝子の発現変動、機能をヒト大腸癌培養細胞を用いて検証する。また、組織切片を対象に、間質における発現の変動を確認する。分離したサンプル(腺管と間質)の純度を確認することに時間を要したため、予定していたDNAメチル化網羅解析を次年度にも実施することとした。DNAメチル化網羅解析データをさらに詳細に吟味し、正常間質と癌間質でメチル化状態の異なる遺伝子を抽出する。分子腫瘍学当初計画していた分離組織の採取が予想した以上に時間を要し、また実体顕微鏡が故障のため一時期、使用できなかった([現在までの到達度]に記載)。一部は次年度に継続して行う予定であるため、その解析費用として次年度に繰越した。分離したサンプル(腺管と間質)の純度を確認することに時間を要したため。計画していた次年度分と合わせて、DNAメチル化網羅解析に使用する。予定していたDNAメチル化網羅解析を次年度にも実施することとした。
集団の構造化過程における人間関係メンタル・マップに関する研究

本研究では,中学校新入生を対象にして,学級内の友人関係の測定や学校への適応感や学習意欲などを複数回にわたって測定し,1.学級内の仲間集団の形成過程と,2.仲間集団からの影響過程について縦断的に検討した。1.学級内の仲間集団の形成過程については,ひとりでいることへの不安である「孤立不安」に着目し,孤立不安の高い生徒と低い生徒の仲間集団の形成過程を,質問紙調査と面接調査によって検討した。その結果,孤立不安の高い生徒は,入学当初の段階では友人からの受容が高く,良好な友人関係を形成しているのに対し,入学してからの時間経過にしたがって友人からの受容は低下し,夏季休業前には孤立不安の低い生徒に逆転されることが示された。このことから,孤立不安の高さは,初期の関係形成には促進的に作用するが,関係を維持し親密化するには妨害的に作用することが示唆された。本研究では、コンピュータを媒介としたコミュニケーション(以下、CMC)において、どのような性格特性がCMCの様相に関連するのか、また、他の成員の性格特性の推測や、成員間の人間関係の推測(好意度評定の推測)がどのような情報に基づいて判断され、どの程度正確に判断されているのかを検討することを目的とした。実験の実施方法は、お互い面識のない大学生14名を実験対象として、約3週間、インターネット掲示板上でコミュニケーションを行わせた。その間、実験開始後6日目、実験最終日に、(a)自己の性格評定と、他の成員の性格評定の推定、(b)他の成員に対する好意度と、他の成員間の好意度評定の推定に関する調査を行った。掲示板上のコミュニケーションについては、発信日時、発信回数・発信文字数、発信相手、コミュニケーションの内容(学業関連、趣味、人間関係etc.)などを分析・集計した。その結果、(1)自己の性格と掲示板上のコミュニケーションの関連については、自己の外向性と情緒不安定性、誠実性が、コミュニケーションの発信数や内容に関連すること、(2)他の成員の性格評定は、コミュニケーションの発信数や内容から推定され、特に外向性や調和性が推定されやすいことが示された。一方、自己の他の成員に対する好意度、他の成員間の好意度の推定と、掲示板上のコミュニケーションの関連については、(3)好意を持っている相手に対して、多くの発信や特定の内容を発信しているわけではないこと、即ち、他の成員に対する好意度とコミュニケーションとはあまり関連しないことが示された。しかし、(4)他の成員間の好意度の推測は、実際の好意度を反映していないにもかかわらず、発信相手への発信数や発信内容から判断されていることが示された。平成15年度では、中学新入生の親密化過程を縦断的に測定し、学級内での友人関係の親密化過程や仲間集団の形成過程について検討した。また、同じ仲間集団に所属することで、生徒同士にどのような影響が認められるのかについても検討した。研究の方法と手続きについては、入学当初、お互いにほとんど面識のない生徒で構成される中学校の新入生を対象として選定し、入学してから1ヶ月後の5月期と、入学してから7ヶ月後の10月期の2回にわたって、学級内の友人関係をソシオメトリック的な手法によって測定した。また、学業に対する興味関心や学級内での適応感については、同時期に質問紙調査法により収集した。以上のデータを分析したところ、以下のことが示された。1.女子については、自分と類似した生徒と交友する傾向があり、類似した者同士で構成される、凝集性の高い仲間集団を形成しやすいことが示された。一方、男子では、類似した友人と交友する傾向は認められず、形成される仲間集団も大きく、かつ構成メンバーが入れ替わるなど、女子にくらべて流動性が高いことが示された。2.同じ仲間集団に長期間にわたって所属することによる影響については、男女とも、それほど大きな影響は見られなかった。ただし、教師との関係などの学級に対する適応感については、仲間集団の影響が認められ、適応のよい集団に所属している生徒の適応感は上昇し、逆に適応の悪い集団に所属している生徒の生徒の適応感は低下する傾向があることが示された。
網膜・視神経の神経保護と軸索再生研究

日本における最大の失明原因は緑内障であり、40歳以上の有病率は約6%にのぼる。緑内障は眼圧上昇により網膜神経節細胞死とその軸索である視神経の変性が起き、結果的に回復不能な視野障害に陥るものと考えられてきた。しかし、本邦では眼圧が正常であるにもかかわらず緑内障症状を発症する正常眼圧緑内障(NTG)が全体の約7割を占めることが判明している。また、この中には十分な眼圧降下が得られても病期が進行する症例もある。今後の緑内障治療においては眼圧以外の病態寄与因子の解明や新たな神経保護療法の開発が求められる状況にある。本研究ではNTGの疾患モデル動物と、非侵襲的な網膜観察法を組み合わせることにより、既存薬を含めた神経保護薬の探索を行う。候補薬については培養細胞における遺伝子や蛋白発現量の変化を、マイクロアレイや生化学的な手法で調べることにより選定する。投与後の網膜変性の状態を光干渉断層計や多局所網膜電図を利用して経時的に観察することにより、客観的なデータの取得を行う。また、Dock3と呼ばれるグアニンヌクレオチド交換因子には視神経損傷後の軸索再生を促進する効果だけでなく、RGC保護効果も報告されている。現在はDock3のアデノウイルスベクターが使用可能となっており、視神経挫滅後の軸索再生についてDock3による遺伝子治療効果を検討する。選定された候補薬による相乗効果を含めて、できるだけ視神経再生が促進しやすい条件を探索する。フリーラジカルスカベンジャーであるEdaravoneにおいてNTGモデル動物に対する網膜神経節細胞保護効果を確認している。脳梗塞と筋萎縮性側索硬化症の治療に用いられるedaravoneはフリーラジカルを直接不活化することにより、神経保護作用を発揮すると考えられている。NTGモデル動物であるEAAC1欠損マウスにedaravoneの腹腔内投与を行ったところ網膜神経節細胞死に加えて視機能障害の進行抑制が確認された。EdaravoneのEAAC1欠損マウスに対する神経保護効果の作用機序を明らかにしていく予定である。その他の候補薬についても検索を進めていく予定である。また、視神経挫滅モデルにDock3ウイルスベクターを投与し視神経軸索再生や網膜神経節細胞保護効果を確認していく予定である。3月に納品となったが4月に支払いとなったため次年度使用額が生じた。
メゾ相を経由する高分子結晶化による高次構造制御

高輝度のX線源と高速の時分割測定が可能な放射光施設(SPring-8)、および、自ら開発した急冷過程をX線回折装置内で再現する高速温度ジャンプ装置を用いて、アイソタクチックポリプロピレン(iPP)がメゾ相を形成する瞬間のその場観測に成功した。また、iPP以外のメゾ相を形成する結晶性高分子の探索を行い、ポリブチレンナフタレート(PBN)がiPPと類似のメゾ相を形成することを突き止めた。さらに、上述の2種類のメゾ相形成高分子に対して、メゾ相からの加熱過程での結晶化を伴う高次構造形成過程についても示差走査熱量測定、変更解消光透過測定、小角X線散乱等を用いて明らかにした。平成19年度の目的は、当初の研究計画で述べたようにメゾ化と言う現象を急冷下で顕微鏡を用いて直接観察することにより、どのようなことが、何度で起っているかを突き止めることである。一般に結晶性高分子の高温溶融物を冷却していくと、球晶の核が発生する。球晶の成長速度は、温度に応じて変化し、融点とガラス転移温度との間ぐらいで最速となる。また、融点近傍では過冷却度が小さ過ぎて成長速度は0に近い値となる。また、ガラス転移温度近傍でも粘性が高過ぎて、やはり、成長速度は0に近い値となる。DSCを用いた研究から、メゾ相は、ガラス状態に近い固体であることがわかった。よって、メゾ化すれば、ガラス化と同様、球晶の成長を阻害し、球晶成長速度は激減するとの予測のもと、アイソタクチックポリプロピレンの急冷過程の顕微鏡観察を行い、球晶成長速度の温度依存性を調べた。その結果、アイソタクチックポリプロピレンのガラス転移温度は、文献によると、-10-20°Cと言われているのに対して、この温度より遥かに高い3040°C付近で球晶の成長速度が激減するという観察結果を得た。すなわち、3040°C付近がメゾ化温度である可能性が有力となった。平成20年度には、この3040°C付近に実際にメゾ化が起っているのかについて構造的見地からの証拠を得るべく、急冷過程のX線散乱実験(SPring-8)を計画している。結晶性高分子は、非晶相と結晶相との混合物からなると考えられてきたが、これらの量的な混合物ではなく、質的に非晶相と結晶相との中間的な構造を持つとされる「メゾ相」が本研究の興味の対象である。アイソタクチックポリプロピレンのメゾ相は、溶融状態から氷水中への素早い浸漬(急冷)により得られることが経験的に知られていたが、そのような極端な急冷過程中の極短時間の間に起こる構造変化をX線回折で追跡することは技術的に困難でありこれまで手つかずであった。これを解決することが平成20年度の主要な目標であった。高輝度のX線源と高速の時分割測定が可能な放射光施設(SPring-8)、および、自ら開発した急冷過程をX線回折装置内で再現する高速温度ジャンプ装置(リンカム-ジャパンハイテックLK-300型試作機)を用いて、アイソタクチックポリプロピレンがメゾ化する瞬間を測定することに成功した。これにより、X線回折レベルでのメゾ化の直接的証拠とメゾ化温度(約35°C)を特定することが出来た。また、アイソタクチックポリプロピレン以外のメゾ化する結晶性高分子の探索を行い、ポリブチレンナフタレートがアイソタクチックポリプロピレンと類似のメゾ相を形成することを突き止めた。さらに、上述の2種類のメゾ相形成高分子に対して、メゾ相からの加熱過程での結晶化を伴うメゾスケールでの高次構造形成過程についても示差走査熱量測定、変更解消光透過測定、小角X線散乱等を用いて明らかにした。
ラット前立腺モデルによる内分泌攪乱物質のエストロゲン受容体発現への作用解析

【目的】多くの内分泌攪乱物質の標的分子であるエストロゲン受容体(ER)は、胎生期の生殖腺や脳の性分化といった過程で精密に発現調節されており、それへの内分泌攪乱物質の影響が指摘されている。しかし、受容体発現調節の分子メカニズムについてはほとんどわかっていない。そこで、我々はラット前立腺をモデルにERの発現様式を解析した。【結果】1)2、3週齢ラットの前立腺では、ERαが主要な発現型であるが、5、10週齢でみるとβ型の発現が亢進しα型の発現はほとんどみられなくなった。2)ERβの発現は、去勢により低下し、テストステロン(T)の補充により回復した。3)1週令時のビスフェノールA(BPA)の単回投与により、4週令時のERαおよびβの発現レベルが変化することが示された。4)前立腺においても、ERαのプロモーターB領域を介した転写がみられることが示されたが、in vitroでこの領域を介した明確な転写活性化のTによる調節は観察されなかった。またERβcDNAのRACE法解析により、未知の上流域が同定された。【考察】ラット前立腺において、ERαおよびβのmRNA発現は、Tによりそれぞれ負と正の調節をうけていることが示された。また、ERは成長過程を通じてα型からβ型へ動的に発現移行しており、おそらくこの過程もTにより調節されていると考えられる。さらに、新生児でのエストロゲン作用物質の投与は、成熟後のER発現に影響を残しうることが示され、メカニズムを含めた検討が必要と考えられる。受容体遺伝子の上流域プロモーターの調節における役割は明確には示されなかった。ERαについては、既報のプロモーターB領域による転写活性化が前立腺においてもみられたが、ホルモンおよび内分泌攪乱物質の作用は見いだされなかった。ERβについてはRACE法により未知領域を同定したので、今後遺伝上でのプロモーター領域の同定と機能解析を行いたい。
糖分子鎖集合体の微細構造制御に基づく物質分離機能の発現に関する研究

カルボキシル基やスルホン酸基を固定キャリヤ-にもつ陽イオン交換膜が金属イオンを、またアミノ基を固定キャリヤ-とする陰イオン交換膜がハロゲン化物イオンをそれぞれの濃度勾配に逆らって上り坂輸送することをこれまでに報告してきた。本研究では、糖鎖集合体の代表的なものの一つであるアミノ基を固定キャリヤ-にもつキトサン膜と、四級アンモニウム基を固定キャリヤ-とする四級化キトサン膜を用いて、安息香酸やベンゼンスルホン酸などの有機酸、L-フェニルアラニンなどのアミノ酸、また、アデニン、ウラシルなどの核酸塩基など、生体関連成分の上り坂輸送について検討した。キトサン膜を用い、膜を介して酸性、塩基性とした溶液に同濃度の安息香酸を入れると、時間と共に安息香酸濃度は塩基性側で増し、酸性側から塩基性側に濃度勾配に逆らって上り坂輸送された。一方、L-フェニルアラニンの場合には塩基性側から酸性側に上り坂輸送された。そこで、キトサン膜の左右両液に安息香酸とL-フェニルアラニンの混合液を仕込むと、単独系の場合と同様に安息香酸は酸性側から塩基性側に、L-フェニルアラニンは逆に塩基性側から酸性側にそれぞれ上り坂輸送され、安息香酸とL-フェニルアラニンとが濃度勾配に逆らった交差上り坂輸送によって分離できることが明らかとなった。一方、四級化キトサン膜を用いたアデニンとウラシルの上り坂輸送では、塩基性側のpHを13とし、酸性側のpHを1とすると、アデニンは塩基性側から酸性側に、ウラシルは酸性側から塩基性側に上り坂輸送され、この場合にもアデニンとウラシルの交差上り坂輸送による分離の可能性が暗示された。酸性側のpHが2の時は、アデニン、ウラシル共に酸性側から塩基性側に同方向上り坂輸送された。これらの有機酸、アミノ酸、核酸塩基の上り坂輸送の機構が膜と輸送種との静電化学的相互作用の観点で議論された。
金属人工格子等の超微細構造に起因した異常力学物性の解明

本課題では、金属人工格子の異常力学物性について、実験的、理論的な研究を行った。金属人工格子の力学物性(弾性率、降伏応力、破壊応力、硬さ等)が複合則から予測される値に比べて異常に増加したり減少したりすることは古くから知られている。実験的研究では、積層周期が8.871ÅのAl/Ni金属人工格子を、高周波マグネトロンスパッタ法により多数作製し、ブリルアン散乱法を用いて、その表面弾性波(レーリー波)速度を測定した。その結果すべての膜について、レーリー波速度は複合則から予測される値よりも小さな値を示すこと、積層周期24Å付近で極小を示すことが明らかになった。理論的研究では、MEAM(Modified Embedded Atom Method)法を用いてAg,Au,Cu,Ni,Pd,Ptの面心立法金属の組み合わせの金属人工格子の二軸弾性率を求めた。MEAM法は半経験的方法であり、自己無撞着に解く電子密度汎関数法に比べ計算量を大幅に節約できる近似的方法でありながら、実験値と非常に良く一致することが知られている。計算の結果、ほとんどの系で二軸弾性率は複合則から予測される値よりも小さな値を示すことがわかった。さらに、Ni/Pd等の系では、二軸弾性率の積層周期依存性は単調な変化とはならず、Ni 1原子層/Pd1原子層やNi 3原子層/Pd 3原子層の人工格子での二軸弾性率の値よりもNi2原子層/Pd2原子層の人工格子の値が小さくなることがわかった。この結果は、既に報告されている実験によって得られた結果と良く一致している。以上の結果を総合すると、人工格子の弾性率は複合則から予測される値よりも小さくなる傾向があること、積層周期によって大きく変化することが考えられる。既に報告されている弾性率が増大するという実験結果は膜構造の不完全性、基板の影響等が関係していると考えられる。
福島原子力発電所事故由来のホットパーティクルによる事故状況の解明

今年度は、当初から研究計画であった、福島第一原子力事故由来のホットパーティクル(HP)の破壊分析に史上はじめて成功した。帰宅困難区域で採取された環境試料から、オートラジオグラフィーによって強放射能源の位置を特定し、最終的に顕微鏡下でHP粒子を取り出した。単離されたHPを、高純度ゲルマニウム半導体検出器で測定し、HPに含まれる放射性セシウムを定量した。この放射能測定の結果から、Cs-134/Cs-137放射能比が得られる。この放射能比は、福島第一原子力発電所の原子炉ごとに異なる値をとるため、それらの値との比較から、今回採取されたHPがすべて一号機から放出されたことが推測できた。アルカリ溶融法によってHPを溶液化したのち、固相抽出ーイオン交換法によってSr-90を分離した。分離されたSr-90を含む溶液をチェレンコフ光測定することで、Sr-90の放射能を定量した。これまで、計6つのHPに対して上記のSr-90分析を行った。HPに含まれるSr-90は最大で1.3 Bqであった。また、Sr-90/Cs-137放射能比は、すべて0.0001のオーダーであった。これらの結果から、今回分析対象としたHPのSr-90の含有量は低く、Sr-90による人体への被ばく影響はCs-137に比べて無視できると言える。この傾向は、事故後に行われた大規模な陸域の調査からも知られている。一般的に、原子炉過酷事故において、Csは、核燃料から放出されやすい揮発元素として知られており、Srは、比較的放出されにくい非揮発性核種として知られている。定性的にいえば、SrはCsに比べて核燃料からの放出率が低いために、最終的に環境中に放出された放射性物質のSr-90/Cs-137放射能比は低い傾向にある。これら成果は、測定試料の公開手続きを経て、随時論文化して発表する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。福島第一原子力発電所の事故により環境中に放出された放射性物質のなかには水や酸に溶けない組成のものがある。チェルノブイリ原子力事故時は「ホットパーティクル(HP)」と呼ばれ、今回の事故では気象研究所のグループにより「セシウムボール」と名づけられている。HPはその頑強な性質ゆえに、現在も事故当時の組成を保っていると考えられる。それゆえ、HPの元素組成等を分析することで、事故時の炉内の様子などの情報を得ることができ、今後の廃炉措置を行う際の基本的な情報を得られる可能性が高い。HPを分析するためには、まず環境試料から取り出さなければならない。昨年度の計画では、福島県にて土壌試料を採取し、HPがどのような部分に多く含まれているか、といった基礎的な情報を得ることを計画していた。実際に昨年度は、福島県飯館村に出向いて土壌試料を採取した。採取地点は、事故当時に放射性物質を含む気団の直撃を受けたと思われる防風林の土壌を採取した。防風林の際の線量が最も高く、林の中へ入っていくほど線量は低くなっていき、事故当時に防風林が放射性の気団を一方向から受け止めていたことが予想できる。その際の土壌からHPの回収が期待できる。採取された土壌は大阪大学にて放射能濃度を計測後に、化学処理を行うための前処理を行っている段階である。HPを取り出すためにはイメージングプレートによって放射線像を撮り、放射能が特別高い点を見つけて、サンプルからその箇所を切り出す操作を繰り返すことで取り出す。しかし、サンプル全体の放射能が高いと放射線像全体がぼやけるため、HPの位置を特定できなくなる。そこで、HPが水や酸に溶けない性質を利用して、酸処理によってHP以外の放射能を取り除いている最中である。その他、気象研究所と理化学研究所から事故直後に採取された大気粉塵試料を入手し、その中に含まれるHPの回収も並行して行っている。福島第一原子力発電所の事故により環境中に放出された放射性物質のなかには、水や酸に溶けない組成のものがある。初めに気象研究所のグループによって発見されたものは「セシウムボール」と名付けられている。私は博士課程の三年間で環境中からセシウムボールを採取し、様々な分析を行い、どの原子炉から放出されたのか、どのタイミングで放出されたのか、そしてセシウムボールがどのように生成されたのかといった疑問について研究を行っていくことにした。我々は今年度に、昨年度にサンプリングした福島県浪江町の土壌からセシウムボールを摘出することに成功した。セシウムを豊富に含む部位の大きさは、およそ2マイクロメートルであった。元素マッピングを行ったところ、セシウム部位の下部にステンレスとケイ素繊維があることが分かった。ステンレスは圧力容器や格納容器の構成材料であり、ケイ素繊維は格納容器に豊富に含まれる断熱材の寄与であることが推測できる。今回発見されたものは、炉内の構成物の塊の一部にCsを豊富に含むという点で、特異的である。セシウムボールに含まれるSr-90の測定も行った。セシウムボールは、メインの組成がケイ酸であるため、塩酸や硝酸では溶液化できない。そこで私はアルカリ溶融法を用いて、セシウムボールを溶液化した。

従来から用いている一連の化学操作によりSr-90を単離し、液体シンチレーションカウンターよるチェレンコフ光測定でSr-90の放射能を定量した。その結果、一粒あたり3000 BqのCs-137を含むセシウムボールのSr-90の放射能は2.3 Bqであった。Sr-90/Cs-137放射能比は0.0008となり、現在予測されている一号炉から放出された放射性物質のSr-90/Cs-137放射能比0.01に比べて二桁ほど低い値となった。二年目の計画は、セシウムボールを取り出し、それについて非破壊分析を行うといったものであった。実験に必要な電子顕微鏡といった設備が、他大学のものを使う予定でいたのが、本学で配備できたこともあって、計画した以上に早く、セシウムボールに関する非破壊分析を行うことができた。ついてにセシウムボールを最初に発見した気象研究所のグループの電子顕微鏡も使用し、結果についてクロスチェックも行った。以上の計画は達成されたうえ、来年度に予定されていた破壊分析と予定以上の成果が得られている。筑波大学の研究グループからセシウムボール試料を譲り受け、Sr-90分析に実績がある本研究室で、セシウムボールを破壊分析して、Sr-90を化学分離し、チェレンコフ光測定により定量した。得られた結果は、予想されていた値よりも二桁程度低いものであった。今年度は、当初から研究計画であった、福島第一原子力事故由来のホットパーティクル(HP)の破壊分析に史上はじめて成功した。帰宅困難区域で採取された環境試料から、オートラジオグラフィーによって強放射能源の位置を特定し、最終的に顕微鏡下でHP粒子を取り出した。単離されたHPを、高純度ゲルマニウム半導体検出器で測定し、HPに含まれる放射性セシウムを定量した。この放射能測定の結果から、Cs-134/Cs-137放射能比が得られる。この放射能比は、福島第一原子力発電所の原子炉ごとに異なる値をとるため、それらの値との比較から、今回採取されたHPがすべて一号機から放出されたことが推測できた。アルカリ溶融法によってHPを溶液化したのち、固相抽出ーイオン交換法によってSr-90を分離した。分離されたSr-90を含む溶液をチェレンコフ光測定することで、Sr-90の放射能を定量した。これまで、計6つのHPに対して上記のSr-90分析を行った。HPに含まれるSr-90は最大で1.3 Bqであった。また、Sr-90/Cs-137放射能比は、すべて0.0001のオーダーであった。これらの結果から、今回分析対象としたHPのSr-90の含有量は低く、Sr-90による人体への被ばく影響はCs-137に比べて無視できると言える。この傾向は、事故後に行われた大規模な陸域の調査からも知られている。一般的に、原子炉過酷事故において、Csは、核燃料から放出されやすい揮発元素として知られており、Srは、比較的放出されにくい非揮発性核種として知られている。定性的にいえば、SrはCsに比べて核燃料からの放出率が低いために、最終的に環境中に放出された放射性物質のSr-90/Cs-137放射能比は低い傾向にある。これら成果は、測定試料の公開手続きを経て、随時論文化して発表する予定である。今年度の計画は土壌試料の入手とその前処理であるが、飯館村への土壌試料採取および大阪大学における酸処理と、いずれもおおむね計画通りに遂行している。加えて、本来は計画にはなかった事故直後に採取された大気粉塵試料を入手した。
糸球体上皮細胞における細胞間コミュニケーションの役割

糸球体濾過の調節、糸球体病変形成機序など生理学的・病理学的に重要な糸球体上皮細胞(足細胞)の役割を理解するためには、足細胞間にどのような相互作用が存在するのかを解明する必要がある。本研究では、ギャップ結合の構成分子であるコネキシン43(Cx43)を中心に解析を進めた。足細胞傷害モデルであるラットpuromycin aminonucleoside(PAN)腎症において、Cx43の経時的変化をタンパク質レベル、mRNAレベルで検討した。免疫電顕での観察により、PAN投与後足細胞に特異的にCx43が増加することが示された。mRNAとタンパク質の検討からは、PAN投与後、Cx43発現とリン酸化の劇的な亢進が生じていることが明らかとなった。足細胞の初代培養にマイクロインジェクション装置でLucifer yellowを注入することによって、機能的なギャップ結合が足細胞間に存在することが確かめられた。ヒトの足細胞間にはCx43が生理的状態でラットより多く存在しており、発生学的にみるとCx43の足細胞での発現は足細胞の分化に応じて多くなることが明らかとなった。また、ギャップ結合が形成されるためには細胞同士を接着させるための他の結合が必要である。カドヘリン・カテニン系は観察されず、これ以外の接着分子が予想されていた。ギャップ結合に近接して存在するタイト結合の構成成分としてイムノグロブリン・スーパーファミリーに属する細胞接着に関わるCoxsackie virus and adenovirus receptor(CAR)が存在していることを示すことができた。以上の結果は、足細胞間にギャップ結合が存在し、足細胞傷害時にこの結合が増加することを示している。すなわち、足細胞は傷害時にギャップ結合を介して合胞体的な振る舞いをする可能性が示された。本研究では、gapjunctionの構成分子であるコネキシン43(Cx43)を中心に解析を進めた。ヒトネフローゼのモデルであるラットpuromycin aminonucleoside(PAN)腎症にて、Cx43の経時的変化を検討した。PAN投与後6時間、1日、2日、4日、6日、10日目の腎臓で、Cx43の免疫染色し、また糸球体を単離してribonuclease protection assay、Western blottingにてCx43のmRNAと蛋白質の変化を解析した。免疫染色では、PAN腎症を通じてCx43を示す点状の染色が糸球体係蹄壁に沿って特異的に増加した。免疫電顕では、Cx43が隣接する足細胞間に著明に増加するのが、確かめられた。mRNAと蛋白質は、PAN投与後、6時間目ですでに、増加とリン酸化の亢進が生じていた。足細胞の初代培養にマイクロインジェクション装置でLucifer yellowを注入し、機能的なgap junctionの有無を検討した。足細胞間にLucifer yellowの拡散が高頻度に観察されgap junctionが存在することが確かめられた。対照として用いたBowman嚢壁側上皮細胞はこのようなLucifer yellowの拡散は稀であった。以上の結果は、足細胞間にgap junctionが存在し、足細胞傷害時にこの結合が増加することを示している。すなわち、足細胞は傷害時に傷害に対して合胞体としてふるまう可能性が示された。本研究では、ギャッブ結合の構成分子であるコネキシン43(Cx43)を中心に解析を進めた。

足細胞傷害モデルであるラットpuromycin aminonucleoside(PAN)腎症において、Cx43の経時的変化をタンパク質レベル、mRNA,レベルで検討した。免疫電顕での観察により、PAN投与後足細胞に特異的にCx43が増加することが示された。mRNAとタンパク質の検討からは、PAN投与後、Cx43発現とリン酸化の劇的な亢進が生じていることが明らかとなった。足細胞の初代培養にマイクロインジェクション装置でLucifer yellowを注入することによって、機能的なギャツプ結合が足細胞間に存在することが確かめられた。ヒトの足細胞間にはCx43が生理的状態でラットより多く存在しており、発生学的にみるとCx43の足細胞での発現は足細胞の分化に応じて多くなることが明らかとなった。また、足細胞間には、ギャップ結合に近接して、タイト結合が存在しており、この構成成分にイムノグロブリン・スーパーファミリーに属するCARが存在していることも示すことができた。以上の結果は、足細胞間にギャップ結合が存在し、足細胞傷害時にこの結合が増加することを示している。なわち、足細胞は傷害時にギャップ結合を介して合胞体的な振る舞いをする可能性が示された。
cfDNAを用いた大腸癌特異的メチル化マーカーによる大腸癌存在診断法の開発

体細胞変異に比べて一般に症例間や腫瘍内での不均一性が少ないDNAメチル化異常を標的として癌の存在診断を行う。Public databaseを用い、32種類という多癌腫間での比較から大腸癌特異的なメチル化異常部位を抽出し、ctDNA解析に応用する。すなわち、採血のみで他癌腫を鑑別し、大腸癌原発巣および転移巣の早期発見を可能とする技術開発を目指す。また、本アプローチは他癌腫にも応用可能であることから、各癌腫特異的なメチル化異常部位を標的として、採血のみで癌腫診断を可能にする検診技術の確立への発展性を有する研究である。