hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病治療のための標的分子C/EBPαの発現及び活性制御機構についての解析

白血病治療のための重要な標的因子であるC/EBPαの発現及び活性制御機構に関する研究を行った結果、C/EBPαはその発現及び修飾(SUMO化)制御や、STAT5との複合体形成を介して、標的遺伝子であるId1遺伝子の発現を誘導している可能性が示唆された。この作用は白血病細胞を分化誘導し、がん化形質抑制に関与しているので、これら因子の同定は白血病治療において有益な情報となることが期待できる。C/EBPαには血球系の細胞を分化誘導する作用があり、白血病治僚の標的分子として非常に有効な分子であることが予想される。しかしながら、このC/EBPα遺伝子の発現及び活性制御機構に関しては、情報が少ないのが現状である。これまで当研究室では、骨髄芽球性白血病細胞のML-1細胞をATRAとGM-CSFの併用処理により相乗的に顆粒球方向へ分化誘導することに成功した。そこで本研究では、この分化誘導過程でのC/EBPαの発現、活性等についての解析を行った。C/EBPα遺伝子のmRNAレベルでの発現変動を調べた結果、両誘導剤がそれぞれ発現誘導を示すことが分かった。またタンパク質レベルでも併用処理時での発現誘導を確認した。C/EBPαの標的遺伝子の発現を調べた結果、G-CSF receptor、ID-1、Myeloperoxidase、Haptoglobinがこの分化誘導過程で発現上昇していることが検出された。中でも特にID-1遺伝子の発現上昇が激しく、単独処理時に比べ相乗的に発現誘導することが分かった。そこで次に、ID-1遺伝子の発現制御領域におけるC/EBP結合領域へのC/EBPαタンパク質の結合をChIP(Chromatin Immunopresipitation)Assayで調べた結果、ATRAによるこの領域への結合増加が検出された。また、C/EBPαsiRNAを用いた解析により、ID-1遺伝子の発現誘導にC/EBPαが関与していることが確認された。以上の結果より、C/EBPαはATRA処理により発現上昇し、制御領域への結合が増加していることが示唆された。このC/EBPαによるID-1の発現増加はGM-CSFとの併用処理で相乗的に促進されているので、今後はGM-CSFの、C/EBPα活性等(修飾、結合タンパク質)に対する影響を中心に解析を進める予定である.C/EBPαには血球系の細胞を分化誘導する作用があり、白血病治療の標的分子として非常に有効な分子であることが予想される。昨年度の研究結果より、ATRAとGM-CSFの併用処理によりC/EBPαが発現誘導し、その標的因子であるID-1を相乗的に発現上昇していることが明らかとなった。また、ID-1遺伝子の発現制御領域におけるC/EBP結合領域へのC/EBPαタンパク質の結合はATRAによって引き起こされていることが明らかとなった。そこで次に、誘導剤のC/EBPαに対する影響として、C/EBPαタンパク質の修飾状態について調べた。まずser21のリン酸化抗体を用いてウェスタンブロット(WB)を行ったが、併用処理時においてリン酸化状態に変化は検出されなかった。一方SUMO化について免疫沈降法とWB法を用いて解析した結果、併用処理によるC/EBPαのSUMO化の誘導が検出された。さらにGM-CSF処理時において、ID-1遺伝子のC/EBP結合領域の上流0.5Kb近辺に位置するSTAT5結合領域へのSTAT5タンパク質の結合が確認され、STAT5とC/EBPαが複合体を形成している可能性が示唆された。本研究の結果より、C/EBPαはATRAとGM-CSFの併用処理により、発現とSUMO化が促進され、STAT5等の因子と複合体を形成し、ID-1遺伝子の発現制御を行っている可能性が示唆された。
マクロファージ遊走阻止因子による滲出性中耳炎に対する新たな治療戦略の確立

ヒト滲出性中耳炎症例の中耳貯留液中のマクロファージ遊走阻止因子(MIF)濃度をELISA法にて測定したところ、90%以上の症例からMIFが検出された。滲出性中耳炎におけるMIFの役割を明らかにすることを目的にマウスの中耳骨胞内にMIFを注入したところMacropharge Inflammatory Protein-2 (MIP-2)、Interleukin-1b、Tumor necrosis factor-aが誘導された。MIP-2は強力な好中球誘導因子であり、滲出性中耳炎患者における中耳粘膜や中耳貯留液中にMIFの発現と好中球の浸潤が認められることからMIFはMIP-2の誘導を介して滲出性中耳炎の好中球浸潤に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。滲出性中耳炎症例の中耳貯留液中のマクロファージ遊走阻止因子(MIF)濃度をELISA法にて測定したところ、90%以上の症例からMIFが検出され、漿液性貯留液の症例に比べて粘液性貯留液の症例においてより高い濃度で認められた。滲出性中耳炎におけるMIFの役割を明らかにすることを目的にマウスの中耳骨胞内にMIFを注入した後に中耳骨胞を生理食塩水で洗浄し、回収された洗浄液中のMacropharge Inflammatory Protein-2(MIP-2)の濃度をELISA法にて測定した。その結果、MIFの注入後、24時間、48時間後に回収された中耳洗浄液中のMIP-2の濃度は対照群に比べて有意に高いという結果が得られた。ヘリコバクター・ピロリ菌は胃潰瘍や胃癌などの消化管疾患において重要な病原体であることが報告されている。その一方で、呼吸器疾患や自己免疫疾患などでもヘリコバクター・ピロリ菌が病態形成に関与していることが推察されており、滲出性中耳炎症例においても中耳貯留液中からヘリコバクター・ピロリ菌が一部の症例で検出されることが報告されている。エンドトキシンを含むヘリコバクター・ピロリ菌の菌体破砕抽出液をマウスの中耳骨胞に注入し、中耳洗浄液中のMIF、MIP-2、Interleukin-1β、Tumor necrosnecrosis factor-α濃度を測定したところ、生理食塩水を注入した対照群に比べて有意に高い濃度で各サイトカインやケモカインが検出された。これらの結果からヘリコバクター・ピロリ菌陽性の滲出性中耳炎症例の病態形成においてMIFがMIP-2の誘導を介して一定の役割を果たしている可能性が示唆された。ヒト滲出性中耳炎症例の中耳貯留液中のマクロファージ遊走阻止因子(MIF)濃度をELISA法にて測定したところ、90%以上の症例からMIFが検出され、漿液性貯留液の症例に比べて粘液性貯留液の症例においてより高い濃度で認められた。エンドトキシンを含むヘリコバクター・ピロリ菌の菌体破砕抽出液をマウスの中耳骨胞に注入し、中耳洗浄液中のMIF、MIP-2、IL-1β、TNF-α濃度を測定したところ、生理食塩水を注入した対照群に比べて有意に高い濃度で各サイトカインやケモカインが検出された。
侵襲軽減を目的としたフォンタン型手術の改良及び石心補助法に関する実験的検討

目的:フォンタン循環慢性モデルはこれまで正常実験動物では作製が不可能であると考えられて来たが、モデルを確立することが可能であれば本循環の特性を明かにする上で有用で有るのみならず、右心機能の解析、肺循環の特性の解明、心肺の相互関係の解析など様々な分野にもたらされる情報が大きいと考えられる。そこで遺伝的に人類に近い霊長類を用い、total cavopulmonary connection型のフォンタン循環慢性モデルの作製を試みた。対象及び実験方法:3頭の日本猿成獣(体重68kg)。全身麻酔、気管内挿管、人工呼吸器管理下に後胸骨縦切開を置き、自己心膜を採取し、心膜ロールを作製。大動脈、肺動脈、上大静脈剥離の後、右肺動脈ー心膜ロールの端側吻合を行い、次いで上大静脈を切離しGlenn shuntを作製。続いて右心耳からside-holeを有する脱血管を下大静脈へ挿入。下大静脈に二本のターニケットを巻き、その間の壁を切除し、ここにロールの他端を吻合。一端創閉鎖し、二期的に下大静脈上に残したターニケットをシンチダウンしフォンタン循環を成立させる。結果:一頭が耐術し、良好な運動能力を示した。術後2週間での右肺動脈第三分技での血流速は2cm/secであり、右室から肺動脈に駆出される冠状静脈血は本モデルでは肺動脈血流に拍動をもたらさないことが証明された。結語:人工心肺を用いることなくnon-pulsatile pulmonary flowを有するフォンタン循環慢性モデルの作製に歴史的に初めて成功した。このフォンタン循環慢性モデルの確立は今後心肺循環の解析に多くの情報をもたらすものと考えられ、Lancet誌に投稿予定である。フォンタン型手術の動物モデルの作成に取りかかった。体重10kg程度のラブラドール、ビ-グルの幼弱犬各3頭を全身麻酔下に動脈圧、SVC、IVC圧をモニター。右開胸後ヘパリン化、SVC-RA、IVC-RA間の一時バイパス下にSVC-rPA吻合、IVC-rPAバイパスを作成した。初期の4例ではIVC-rPA間のバイパス材料として自己心膜ロールを使用したが、自己心膜ロールの採取にtechnical problemsが生じるため、後期の2例では8mmPTFE人工血管をバイパス材料として用いた。フォンタン循環を完成する目的で、RA内に6mm経食道超音波プローブを挿入し、ビデオモニター下に心房中隔裂開及び三尖弁破壊を試みたが、画像解析度が不十分であり、剖検での検討では確実な中隔裂開には代替策を要すると考えられた。PTFEを用いた2例では、主肺動脈は放置し、冠状静脈血流を肺動脈から駆出する不完全なフォンタン循環ながら術後数時間の生存を得た。今後、(1)フォンタン循環の完成をめざし代替策を検討する(2)不完全フォンタン循環慢性モデルの作成を急ぎ、右心補助効果を検討する。右心補助法としてのバルーンポンプは駆動装置として補助人工心臓駆動装置とelectrical stimulatorの2種類を想定し、対応するバルーンを各々試作した。平成10年度にはフォンタンモデルに対して体外、体内での駆動効果を循環動態及び、bradykininn,cytokine等の液性因子の面等から検討する。平成9年度は成犬を用い右開胸下に慢性フォンタン循環モデルの作成を試み、急性期生存犬を得たが、循環動態の評価に耐えうる慢性モデルの確立には至らなかった。平成10年3月より肺の組織構造がより人間に近い動物種として日本猿に注目し、成獣を対象に実験を進めた。6頭での準備手術を経て平成10年10月にほぼ手術手技の確立に至った。

手技の要点は(1)二期分割手術(第一期手術:Bidirectional Glenn shunt+IV C to PA extracardiac pathwayの作成、第二期手術:IV Cの心臓側の遮断)によって段階的にフォンタン型循環モデルを完成する、(2)Extracardiacconduit遠位端とIV C吻合に際してtwo stage canula(内シャント)を用いることによって血行動態の安定化を計るの二点である。またextracardiac conduitとして自己心膜ロールを用い血栓症の発生に配慮した。その後本術式で3頭モデル作成を試みた。輸血や血管拡張剤等の特殊な薬剤の投与を要することなく3頭いずれもfirst stage operationを耐術。内一頭は第二期手術を耐えフォンタン循環の慢性モデルが世界で初めて誕生した。本例で術後二週間目にflow velocity meterを用いて肺動脈脈波の検討を行った結果、peakvelocityは2cm/sec(正常:2030cm/sec)でほぼnonpulsatile pulmonary flowであることが確認され、フォンタン循環の様々な角度からの解析に適するモデルであると考えている。
プレフォルディンの形成する多様な構造による変性タンパク質認識機構の解明

本研究課題では超好熱性古細菌(Thermococcus sp. KS-1)の生産する6種類のプレフォルディンのうち、alpha1-beta1ヘテロヘキサマー複合体ならびにbeta2ホモテトラマーの結晶化を行い、alpha1-beta1ヘテロヘキサマーならびにbeta2ホモテトラマー複合体の構造を決定した。また、β2テトラマーと変性インスリンとのドッキングシミュレーションを行い、PFDのもつ構造多様性、基質認識機構について明らかにした。プレフォルディン(PFD)は古細菌や真核細胞の細胞質など広範な生物種に存在する分子シャペロンであり、変性状態のタンパク質を捕捉し、グループII型シャペロニンへと受け渡す。PFDは長いコイルドコイル構造を変化させて広範な種類の変性タンパク質を認識・結合するが、一方でその運動性の高い構造故に立体構造レベルでの研究はあまり進んでいない。そこで、本研究課題では、真核細胞と同様に複数のサブユニット遺伝子をもつThermococcus sp. strain KS-1(T.KS-1)由来PFDを材料とし、様々なサブユニット組成の複合体の構造を、基質との融合タンパク質の利用などの手法を駆使して決定する。さらに、得られた構造をもとに分子動力学(MD)計算、変異体機能解析を行い、PFDのサブユニット構成に基づく構造変化の多様性、変性タンパク質認識機構を明らかにすることを研究目的とした。T.KS-1の生産する2種類のaサブユニット(α1, α2)とβサブユニット(β1, β2)のうち4種類の複合体(α1_2β1_4、α1_2β2_4, α2_2β1_4, α2_2β2_4)、α1サブユニット単独ならびにβ2サブユニット単独について、結晶化を行った。今回、α1_2β1_4(分解能2.8Å)ヘテロヘキサマー複合体、および、α1単独(分解能1.8Å)、β2単独(分解能1.8Å)の結晶構造を決定した。α1_2β1_4の構造は既に報告されているPFDの構造と類似しており、各サブユニットの両末端にあるαヘリックス部がペプチド鎖中央部のβストランドを介して会合した六本足クラゲ様構造を形成していた。一方、β2は単独でも6量体中の構造をほぼ維持しており、6量体からαサブユニットが抜けた構造に相当する4量体を形成していた。そこで、4量体β2の基質認識機構を検討するために、4量体β2と変性蛋白質との分子動力学法によるドッキングシミュレーションを行った。計算の結果、4量体β2では6量体PFDとは異なる基質認識機構である可能性が示唆された。これらの結果は、Thermococcus sp. strain KS-1では、PFDサブユニットの組み合わせを変え、生育環境、基質タンパク質の種類に応じた多様性を生み出していることを強く示唆している。そこで、本研究課題では、真核細胞と同様に複数のサブユニット遺伝子をもつThermococcus sp. strain KS-1 (T.KS-1)由来PFDを材料とし、様々なサブユニット組成の複合体の構造を、基質との融合タンパク質の利用などの手法を駆使して決定する。さらに、得られた構造をもとに分子動力学(MD)計算を行い、PFDのサブユニット構成に基づく構造変化の多様性、変性タンパク質認識機構を明らかにすることを研究目的とした。T.KS-1の生産する2種類のαサブユニット(α1,α2)とβサブユニット(β1,β2)のうち4種類の複合体(α1_2β1_4、α1_2β2_4, α2_2β1_4, α2_2β2_4)、α1サブユニット単独ならびにβ2サブユニット単独について、結晶化を行った。今回、α1_2β1_4(分解能2.8A)ヘテロ6量体、および、α1単独(分解能1.8A)、β2単独(分解能1.8A)の結晶構造を決定した。一方、β2は単独でも6量体と同様クラゲ様構造をしていたが、基質タンパク質結合部位である疎水性領域の配向が異なっていた。また、6量体α1_2β1_4のβ1サブユニットと4量体β2の構造を比較した結果、β1とβ2サブユニットはそれぞれ異なるシャペロニンを認識している可能性が示唆された。

これらのことから、T.KS-1では、PFDサブユニットの組み合わせを変え、生育環境、基質タンパク質の種類に応じた多様性を生み出していることを強く示唆していた。
地震後に変形が加速する伏在不安定斜面の抽出と崩壊時リスク評価

2015年4月のネパール・ゴルカ地震は,その規模(Mw=7.8),震源から首都までの距離(約77km),そして被害額の対GDP比(約1/3)という点で1923年の関東地震に匹敵する.その関東地震で日本の土砂災害対策費が大幅に跳ね上がったことを考えれば,世界一急峻な山岳地を擁するネパールで,斜面災害の影響は今後一層深刻さを増すと考えられる.本研究の目的は不安定斜面とそのリスクを現地の可観測情報から抽出し,定量的に明示していくことである.カトマンズ北西の急峻な山岳地帯をトリスリ川沿いに通過するパサン・ラミュハイウェー沿いの斜面は2015年のゴルカ地展で大きく崩壊したが、いまだに大量の不安定な土塊が残されている。これまで継続的に地形変形観測を進め、トリスリ川に崩落した土塊に加え斜面上に残る不安定土塊量の推定を行い、これらの検討結果はJournal of Nepal Geological Society(55巻、2018)に発表され、また土木学会論文集にも掲載されることが決定した。このトリスリ川沿いの斜面で用いられた調査・解析・検討手法は多発的な斜面災害に苛まれるスリランカなど他国、他地域でも活用が可能なものである。この手法は2018年に発生した北海道胆振東部地震で多発した斜面崩壊の調査でも活用され、その成果はJSCE Disaster Fact Sheetにも2編の論文として報告された。またカトマンズ市内の低丘陵地帯を横断する主要ハイウェーを横切って現れた地盤の側方流動についても調査を進め、地下水面下のシルト層での地盤の軟弱化が原因として最も可能性の高いものであることを示し、併せて、各家庭にある井戸からの排水によって軟弱化する地盤の面積を低減できる可能性を示した。この成果は土木学会論文集A1(74巻4号)にも掲載されるとともに、ネパール復興庁にも報告された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。2015年4月のネパール・ゴルカ地震は,その規模(Mw=7.8),震源から首都までの距離(約77km),そして被害額の対GDP比(約1/3)という点で1923年の関東地震に匹敵する.その関東地震で日本の土砂災害対策費が大幅に跳ね上がったことを考えれば,世界一急峻な山岳地を擁するネパールで,斜面災害の影響は今後一層深刻さを増すであろう.ネパールなど最貧国とされる国々では,当面顕在化しない脅威は往々にして置き去られ,結果的に復興の大きな阻害要因になりかねない.こうした事情から,不安定斜面とそのリスクを現地の可観測情報から抽出し,定量的に明示していくことが本研究の目的である.パサン・ラミュ(Pasang Lhamu)ハイウェーはカトマンズ北西の急峻な山岳地帯をトリスリ(Trishuli)川沿いに通過する.随所に不安定な斜面上の土塊があり,その多くでじわじわと変形が累積している。本年はこのなかで最も土砂災害が顕著であったdhuncheと変形が今も進行するRamcheの2か所でドローンによるフォトグラメトリーを用いて地形の詳細データを得て、崩壊した土砂総量の推定と下流部に流された土砂量を抽出し、下流部の諸施設に与える影響を評価する基礎データを得た。さらにカトマンズ市内で大きな地形変動が生じたアラニコハイウェー沿いの地域のボーリング調査、表面波探査を行い、この変形を生じた地盤の内部構造に関するデータを得た。Ramcheの斜面の観測にウェザーステーションを設置したことでモンスーン納期の降雨と、斜面の状況の定時観測が可能になった。また観測結果の情報共有をネパール復興庁、カトマンズ盆地開発庁とも共有することになった。そこには在ネパール日本大使館の支援も大きかった。これらの成果は、第8回ネパール地質学会議でネパール復興庁の長官の司会のもとに招待講演として発表することになり、ネパールの学術分野ばかりでなく行政関係者とも様々な議論をする環境が整った。2015年4月のネパール・ゴルカ地震は,その規模(Mw=7.8),震源から首都までの距離(約77km),そして被害額の対GDP比(約1/3)という点で1923年の関東地震に匹敵する.その関東地震で日本の土砂災害対策費が大幅に跳ね上がったことを考えれば,世界一急峻な山岳地を擁するネパールで,斜面災害の影響は今後一層深刻さを増すであろう.ネパールなど最貧国とされる国々では,当面顕在化しない吾威は往々にして置き去られ,結果的に復興の大きな阻害要因になりかねない.こうした事情から,不安定斜面とそのリスクを現地の可観測情報から抽出し,定量的に明示していくことが本研究の目的である.カトマンズ北西の急峻な山岳地帯をトリスリ川沿いに通過するパサン・ラミュハイウェー沿いの斜面は2015年のゴルカ地展で大きく崩壊したが、いまだに大量の不安定な土塊が残されている。これまで継続的に地形変形観測を進め、トリスリ川に崩落した土塊に加え斜面上に残る不安定土塊量の推定を行い、これらの知見を国際学術誌(Landslides)などに投稿した。この一連の調査で、不安定土塊の中には変形が加速しているものがあることも指摘されたが、折しも2017年8月にネパールを大豪雨が襲い、不パール全75州の内37州で斜面崩壊や洪水被害が報告されている。

この新たな事態を踏まえ平成30年度に予定されていた調査研究費の一部を前倒し使用して豪雨の影響評価を行った。またカトマンズ市内の低丘陵地帯を横断する主要ハイウェーを横切って現れた地盤の側方流動についても調査を進め、地下水面下のシルト層での地盤の軟弱化が原因として最も可能性の高いものであることを示した。Ramcheの斜面にウェザーステーションを2016年度に設置したが、これによって2017年度の8月の豪雨を観測することができた。また斜面崩壊を発生、流動、堆積のプロセスに分けて、それぞれを支配するパラメータの組み合わせを様々に変え最適解を模索する斜面災害プレディクターを改良し、予測精度を高めることができた。そしてTrishuli川沿いの6.25km×6.25kmの観測対象範囲に残る不安定土塊の総量の推定結果を踏まえ、ネパール復興庁(National Reconstruction Authority, Nepal)と今後の対応策を議論できる環境が整った。2015年4月のネパール・ゴルカ地震は,その規模(Mw=7.8),震源から首都までの距離(約77km),そして被害額の対GDP比(約1/3)という点で1923年の関東地震に匹敵する.その関東地震で日本の土砂災害対策費が大幅に跳ね上がったことを考えれば,世界一急峻な山岳地を擁するネパールで,斜面災害の影響は今後一層深刻さを増すと考えられる.本研究の目的は不安定斜面とそのリスクを現地の可観測情報から抽出し,定量的に明示していくことである.カトマンズ北西の急峻な山岳地帯をトリスリ川沿いに通過するパサン・ラミュハイウェー沿いの斜面は2015年のゴルカ地展で大きく崩壊したが、いまだに大量の不安定な土塊が残されている。これまで継続的に地形変形観測を進め、トリスリ川に崩落した土塊に加え斜面上に残る不安定土塊量の推定を行い、これらの検討結果はJournal of Nepal Geological Society(55巻、2018)に発表され、また土木学会論文集にも掲載されることが決定した。このトリスリ川沿いの斜面で用いられた調査・解析・検討手法は多発的な斜面災害に苛まれるスリランカなど他国、他地域でも活用が可能なものである。この手法は2018年に発生した北海道胆振東部地震で多発した斜面崩壊の調査でも活用され、その成果はJSCE Disaster Fact Sheetにも2編の論文として報告された。またカトマンズ市内の低丘陵地帯を横断する主要ハイウェーを横切って現れた地盤の側方流動についても調査を進め、地下水面下のシルト層での地盤の軟弱化が原因として最も可能性の高いものであることを示し、併せて、各家庭にある井戸からの排水によって軟弱化する地盤の面積を低減できる可能性を示した。この成果は土木学会論文集A1(74巻4号)にも掲載されるとともに、ネパール復興庁にも報告された。より広域の山岳地での土砂災害のインパクト評価においては、すでに計測を開始しているDhunche, Ramcheの結果を踏まえ、研究分担者、松島らの深さ方向積分粒子法の最適パラメータの設定を行い、さらに広域の土砂災害のリスク評価に発展させていく。またカトマンズ市内で大きな地形変動が生じたアラニコハイウェー沿いの地域については、地盤変形の原因が当初の想定よりさらに深いところで発生していた可能性が出てきたため、鍵層となる有機質土のC14による年代測定を行い、複数のボーリング調査結果を空間的に補間する作業を進めていく。この付近の井戸の傾斜についても地盤の全体的な動きを推理する上で重要な情報であり計測を進めていく。
下肢虚血組織下の血管新生における、骨格筋細胞の役割

STAT3が血管新生において重要であることが示されているが、虚血下血管新生における骨格筋のSTAT3の役割は不明である。マウス下肢虚血モデルにおいて、急性期に骨格筋STAT3が活性化し、STAT3を活性化するインターロイキン6やG-CSFなどの発現が高いことを見いだした。骨格筋特異的STAT3欠損マウスでは、下肢虚血後の血流の回復、血管新生やインターロイキン1などの炎症性サイトカインおよびCXCL1などのケモカインの発現が障害されていた。これらの結果は、骨格筋のSTAT3が下肢虚血後の炎症反応を制御し、結果として血管新生に重要であることを示している。マウス下肢虚血モデルを作成し、生理学的、組織学的、分子生物学的データの収集を行った。1下肢血流の評価。2モデル作成後、大腿の骨格筋を回収し、HE染色を行い、骨格筋障害、骨格筋再生、炎症細胞浸潤などについて評価。3モデル作成後、骨格筋を回収し、P-STAT3, P-AKT, P-ERK1/2, PAMPK,SOCS3をウエスタンブロットで評価。また、P-STAT3の免疫染色を行い、局在性を評価した。4CD31で免疫染色を行い、毛細血管の数を測定。5血管新生関連遺伝子、サイトカイン関連遺伝子を網羅的にリアルタイムPCRアレイによる発現遺伝子の解析を行った。以上より、下肢虚血における骨格筋の再生、血管新生の過程において、STAT3に関連する炎症性サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子の活性化を認めた。次に骨格筋特異的STAT3-KOマウス(以下KOマウス)においても評価を行い、前述の項目についてコントロールと比較評価した。KOマウスにおいて炎症性サイトカイン、ケモカインが抑制され血管新生が抑制されていることが考えられた。炎症性サイトカインで血管新生にも重要であるIL1betaの発現細胞を明らかにする為に、In situ hybridizationを行いIL1beta mRNAの発現を調べたところ、コントロールの下肢虚血24時間後の組織において、骨格筋細胞の隙間や血管周囲に浸潤している炎症細胞にIL1betaのmRNA発現を認めた。KOマウスでは、コントロールと比較して、IL1beta陽性細胞数は少ない印象であり、血行改善の経路において、炎症経路が何らかの関連があり重要である事が分かった。初期免疫応答に差が無いか、調べる方針としNF-kBをウエスタンブロットや免疫染色で評価行っているが、現段階では明らかな結果は出ていない。可能であれば実験の追加を検討し、メカニズムを確認したい。マウス下肢虚血モデルを作成し経時的に評価を行い、生理学的、組織学的、分子生物学的データの収集を行った。1レーザードップラーによる下肢血流の評価。2モデル作成後、6時間後、1日、3日、7日、14日目に大腿の骨格筋を回収し、HE染色を行い、骨格筋障害、骨格筋再生、炎症細胞浸潤などについて評価。3モデル作成後、骨格筋を回収し、P-STAT3, P-AKT, P-ERK1/2, P-AMPK, SOCS3をウエスタンブロットで評価。4凍結切片にてCD31で免疫染色を行い、毛細血管の数を測定。以上より、下肢虚血における骨格筋の再生、血管新生の過程おいて、STAT3に関連する炎症性サイトカイン、ケモカイン、血管新生因子の活性化を認めた。次に骨格筋特異的STAT3-KOマウスにおいて下肢虚血モデルを作成した。前述の項目についてコントロールマウスと比較評価したところ、骨格筋特異的STAT3-KOマウスにおいて炎症性サイトカイン、ケモカインが抑制されているために血管新生が抑制されていることが考えられた。主要な炎症性サイトカインで血管新生にも重要であるIL1betaの発現細胞を明らかにするために、In situ hybridizationを行いIL1beta mRNAの発現を調べたところ、Controlマウスの下肢虚血24時間後の組織において、骨格筋細胞の隙間や血管周囲に浸潤している炎症細胞にIL1betaのmRNA発現を認めた。骨格筋特異的STAT3-KOマウスでは、コントロールマウスと比較して、陽性細胞数は少ない印象であり、血行改善の経路において、炎症経路や骨格筋細胞に何らかの関連があり重要である事が示唆された。本研究の目的は、下肢虚血組織下の血管新生における、骨格筋細胞の役割を明らかにすることである。現在までに、下肢虚血組織下の骨格筋特異的STAT3-KOマウスにおいて炎症性サイトカイン、ケモカイン、血管新生が抑制され、骨格筋細胞の隙間や血管周囲に浸潤している炎症細胞にIL1betaのmRNA発現が、骨格筋特異的STAT3-KOマウスはControlマウスに比べ、少ないことを明らかにしている。

下肢虚血における、血行改善の経路において、炎症経路や骨格筋細胞に何らかの関連があり重要であることを見いだしている。今後、下肢虚血組織下の血管新生における、骨格筋細胞の役割に重要と考えられる炎症細胞の関与について解析し、骨格筋細胞のシグナル伝達とその制御に関するメカニズムの解析を進める。骨格筋組織における炎症細胞評価を、免疫染色、ウエスタンブロット法などで行う。また、骨格筋細胞のシグナル伝達とその制御に関するメカニズムを、マイクロアレイ解析を行い、In situ hybridization法により、血管新生因子の発現細胞の同定を行っていく。骨格筋特異的SOCS3-KOマウスを用いて下肢虚血モデルを作成し、血管新生促進が認められた場合は、新たな血管新生の手法として、直接導入法もしくはナノ粒子をキャリアに用いたSOCS3-shRNAのマウスの骨格筋への導入を行い、下肢虚血における骨格筋の再生と血管新生について評価を行い効果を検証する。遺伝子改変マウスの飼育管理費用、生化学・分子生物学・組織学的な消耗品の購入。学会の交通費と宿泊費、論文校正費用などに使用する予定。
中枢神経損傷に対する機能回復神経細胞接着分子L1による細胞療法を用いて

[目的]損傷された哺乳類中枢神経の再生は、グリア細胞など種々の阻害要因のため困難とされる。本研究では、神経細胞接着因子L1の神経軸索進展作用に注目し、ラット視神経損傷モデルにおいてL1遺伝子導入細胞による細胞療法を行い、中枢神経再生効果を検討した。[方法]6週齢SD系ラットの左眼窩近傍前頭部を開窓、前頭葉を一部切除圧排し、左視神経の固有硬膜貫通部を縦切開後、視神経を横切断した。損傷部位にマトリジェル包埋L1遺伝子導入線維芽細胞(L1(+)群)あるいは非導入細胞(L1(-)群)を移植した。また切断後週3回500μg/bodyのvitaminB12腹腔内投与を6週間行った。視神経切断3週以後に、OC1(bregmaより後方へ8mm、外側へ3mm)上に硬膜外電極を置き、視覚誘発電位(VEP)を測定した。また左眼球にトレーサーとしてWGA-HRPを投与し、2日後に屠殺、視神経の縦断切片をTMBにより染色し、暗視野で視神経線維を観察した。[結果]L1(-)群では、対側VEPはほぼ平坦な波形を示した。またHRPは、網膜側視神経にわずかに染色されるのみであった。L1(+)群では視神経切断8週目以後に、対照群(前頭葉一部切除のみ)より頂点潜時が少し遅れるが、弱いVEP波形が出現することが観察できた。vitaminB12投与群では、非投与群に比し波形の振幅には相違を認めなかったが、N1頂点潜時が短縮する傾向がみられた。HRPは、切断癒合面より中枢側にも染色されることが確認できた。染色強度および染色陽性線維数は、切断面を越えると低下した。vitaminB12については、投与群、非投与群間に染色性の差は認めなかった。[結論]ラット視神経は末梢神経の介在しない条件下でも、L1発現細胞が存在すれば再生能力を示すことが明らかとなった。神経細胞接着分子L1の神経軸索伸展能に対する影響をみるためラット視神経損傷モデルを作成し、L1産生細胞を損傷部近傍に投与することによるその中枢神経再生効果を検討した。すなわち、6週齡SD系ラットの左視神経を神経管-固有硬膜貫通部で横切断し、損傷部位にL1遺伝子導入線維芽細胞(n=11)あるいは非導入細胞(n=10)をマトリジェルに包埋して投与した。処置7週目に視覚誘発電位(VEP)を測定した。さらに左眼球にトレーサーとしてWGA-HRPを投与し2日後に屠殺、作成した左視神経の縦断切片をTMBにより染色し、暗視野において視神経線維を観察した。その結果、L1(-)群におけるVEPは対側視覚野においてほぼ平坦な波形を示したが、L1(+)群ではコントロール群より頂点潜時が若干遅れるが弱いながら波形の出現することを観察した。組織学的には、L1(+)群において、損傷部より中枢側の視神経では横断部位を越えてトレーサーを含む神経線維が伸展していることを確認した。結論として、損傷ラット視神経の再生には種々の阻害因子がはたらくものの、切断両面の接触や血流を含む周囲構造物の温存などの条件によりL1が再生促進因子となることを電気生理学的および組織学的に証明した。

初年度に作成したラット視神経損傷モデルに対して、当初より計画したように(1)L1発現細胞局所投与群、(2)L1発現細胞局所およびVitamin B12副腔内継続投与群、(3)Vitamin B12継続投与群に分け治療実験を行った。その結果、(1)L1発現細胞の局所投与のみでVisual evoked potential(VEP)の回復が確認でき、視神経の再生が不可能ではないことがわかったが、それに(2)Vitamin B12をあわせて継続投与するとVEP波形の伝動速度は不変ながら、若干、VEP波形の振幅が増加した。(3)Vitamin B12のみの継続投与では電気生理学てきには神経機能の回復は認められなかった。すなわちL1のみで視神経損傷の再生は可能であるがVitamin B12投与によりL1によって回復する神経軸索が若干増加することが示唆された。その治療実験の組織学的評価としてTetramethyl benzidine(TMB)を投与、軸索を移送されるTMBを暗視野コンデンサシステムにより検出する実験法を実施計画どうり確立し、L1投与群で神経損傷部位を越えてTMBが軸索中を移送されていることを認めた。しかしながら、あわせてVitamin B12を継続投与した群との差はみとめられず、Vitamin B12継続投与による神経再生実験への影響は本実験法では確認できなかった。その結果に基づき、次年度は主にL1、GFAP、Neurofilament、反応性アストログリアなどを認識する抗体を使用して免疫組織化学的検討を行い、神経再生部位に限局した組織変化、再生を阻害する因子などを同定し、神経再生におけるより有効な局所条件を解明する予定である。[目的]損傷された哺乳類中枢神経の再生は、グリア細胞など種々の阻害要因のため困難とされる。本研究では、神経細胞接着因子L1の神経軸索進展作用に注目し、ラット視神経損傷モデルにおいてL1遺伝子導入細胞による細胞療法を行い、中枢神経再生効果を検討した。[方法]6週齢SD系ラットの左眼窩近傍前頭部を開窓、前頭葉を一部切除圧排し、左視神経の固有硬膜貫通部を縦切開後、視神経を横切断した。損傷部位にマトリジェル包埋L1遺伝子導入線維芽細胞(L1(+)群)あるいは非導入細胞(L1(-)群)を移植した。また切断後週3回500μg/bodyのvitaminB12腹腔内投与を6週間行った。視神経切断3週以後に、OCl(bregmaより後方へ8mm、外側へ3mm)上に硬膜外電極を置き、視覚誘発電位(VEP)を測定した。また左眼球にトレーサーとしてWGA.HRPを投与し、2日後に屠殺、視神経の縦断切片をTMBにより染色し、暗視野で視神経線維を観察した。[結果]Ll(-)群では、対側VEPはほぼ平坦な波形を示した。またHRPは、網膜側視神経にわずかに染色されるのみであった。L1(+)群では視神経切断8週目以後に、対照群(前頭葉一部切除のみ)より頂点潜時が少し遅れるが、弱いVEP波形が出現することが観察できた。vitaminB12投与群では、非投与群に比し波形の振幅には相違を認めなかったが、N1頂点潜時が短縮する傾向がみられた。HRPは、切断癒合面より中枢側にも染色されることが確認できた。染色強度および染色陽性線維数は、切断面を越えると低下した。vitaminB12については、投与群、非投与群間に染色性の差は認めなかった。[結論]
分子間相互作用解析装置を使ったマトリックスメタロプロテアーゼ活性の測定

(1)Real-timeの観察が可能であり,分解初速度を計測可能であり,単位重量あたりの組織内に含まれるMMPによる細胞分解活性の評価が5分と言う短時間で可能であった.(2)基質の固定化はゼラチンが最も良子であった.Type1 collagen, lamineは分解速度が遅く,微量の生体材料の場合には30分程の判定時間が必要であった.(4)生体材料を用いた検討でも解析が可能であり,浸潤・転移予測に有効であった.(5)甲状腺癌での検討では,未分化癌で最も浸潤・転移能が高くこれらの細胞ではmaspin (mammary serpin)の過剰発現がみられた.(6)maspinの発現とdegradation assayの結果は相関していた.matrixdegradation assayはがんの浸潤・転移能の判定ばかりでなく,新規MMP inhibitorのスクリーニングにも有用な方法であり,分子標的治療法の開発に大いに貢献すると思われた.2.また,食道癌培養細胞株から抽出した可溶化蛋白質でも分解活性を有していることを確かめた.bio sensorchipによる細胞外マトリックスの分解解析法は,腫瘍細胞の浸潤転移能の評価に有効と考えられた(投稿中).本年度の研究実施計画で上げたbiosensor graphyによる細胞外マトリクスの分解活性測定法の確立は100%達成できたものと考える.3.次年度は従来の浸潤・転移能の研究法であるmatri gelinvasion assayとの相関を,食道癌・大腸癌・脳腫瘍で解析し比較する.分子間相互作用解析装置を使ったinvasion assayの妥当性を明らかにし,その上で内視鏡生検材料のような臨床検体による解析を行う.解析の結果を臨床病理学的事項と比較検討して,細胞外マトリックスの分解能の評価によって,患者の予後予測が可能であるか検討する.(1)Real-timeの観察が可能であり,分解初速度を計測可能であり,単位重量あたりの組織内に含まれるMMPによる細胞分解活性の評価が5分と言う短時間で可能であった.(2)基質の固定化はゼラチンが最も良子であった.Type1 collagen, lamineは分解速度が遅く,微量の生体材料の場合には30分程の判定時間が必要であった.(4)生体材料を用いた検討でも解析が可能であり,浸潤・転移予測に有効であった.(5)甲状腺癌での検討では,未分化癌で最も浸潤・転移能が高くこれらの細胞ではmaspin (mammary serpin)の過剰発現がみられた.(6)maspinの発現とdegradation assayの結果は相関していた.
白血球・免疫細胞における受容体結合因子の病態生理学的意義

本研究では,「白血球・免疫細胞におけるATRAP発現調節異常が,生活習慣病関連臓器障害の発症・進展に関与し,白血球・免疫細胞でのATRAP(AT1 receptor-associated protein)の発現レベルの制御により生活習慣病関連臓器障害を改善できる」との仮説を検証するため,生活習慣病モデル動物,組織ATRAP発現制御動物およびヒト血液検体などを用いて,生活習慣病関連臓器障害の発症・進展における白血球・免疫細胞でのATRAPの病態生理学的意義を生体レベルで明らかにし,ATRAPに着目した新規分子標的治療開発に向けた多面的な基礎的知見を得ることを目指す.本研究では,「白血球・免疫細胞におけるATRAP発現調節異常が,生活習慣病関連臓器障害の発症・進展に関与し,白血球・免疫細胞でのATRAP(AT1 receptor-associated protein)の発現レベルの制御により生活習慣病関連臓器障害を改善できる」との仮説を検証するため,生活習慣病モデル動物,組織ATRAP発現制御動物およびヒト血液検体などを用いて,生活習慣病関連臓器障害の発症・進展における白血球・免疫細胞でのATRAPの病態生理学的意義を生体レベルで明らかにし,ATRAPに着目した新規分子標的治療開発に向けた多面的な基礎的知見を得ることを目指す.
切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドルの開発

切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドルを試作した.切込み方向の位置は,静電容量式センサでモニタし,磁気アクチュエータにフィードバックする.静圧軸受の作動媒体には水を用いることにより,環境対応型システムとした.試作スピンドルの回転精度は0.23μm,スラスト方向の静剛性1060N/μmを実現した.試作したスピンドルを立軸ロータリー研削盤に搭載し,#3000のダイヤモンド砥石で450mmシリコンウエハ研削を行い,2nmRaの面粗さを実現した.試作した砥石スピンドルが正常に動作しなかったたため、その調整を行った。1)電気マイクロを用いて位置決め精度を確認した。本システムはナノメータオーダの位置決め能力を有しているため、微細位置決め精度の測定方法を検討した。12mmのストロークでナノメータオーダの位置決め精度を測定する簡便な装置は実用化さていないことがわかた。2)試作スピンドルシステムは室温の影響を受けるので、室温・湿度変化等設置環境について測定を行った。3)本システムの構造をわかりやすく説明するための簡単なスピンドルモデルを試作して「切り込み機構内蔵水静圧砥石スピンドル」の設計・組立調整における問題点を明らかにした。切込み機構内蔵砥石スピンドルを試作するために,簡易モデルを試作して問題点の洗い出しを行った.簡易モデルの試作結果を踏まえて,「切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドル」を設計した.半導体加工機械および工作機械に搭載する「切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドル」を開発した.静圧軸受の作動媒体に純水を用いることにより,環境対応型システムとすることができた.開発したスピンドルの回転精度は,0.23μm(1300rpm),静剛性は1060N/μm,切込み精度0.2μmを得ることができた.本スピンドルをロータリ研削盤に搭載し,研削性能を評価した.本スピンドルシステムを搭載した研削盤のループ剛性163N/μmと十分に高い値を実現できた.すなわち.回転機構と切込み機構を一体化することにより,スピンドルシステムの単純化と高剛性化を実現した.さらに,#3000のダイヤモンドホイールにより450mm大口径ウエハの研削実験を行い,表面粗さ2nmRaを実現することができた.切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドルを試作した.切込み方向の位置は,静電容量式センサでモニタし,磁気アクチュエータにフィードバックする.静圧軸受の作動媒体には水を用いることにより,環境対応型システムとした.試作スピンドルの回転精度は0.23μm,スラスト方向の静剛性1060N/μmを実現した.試作したスピンドルを立軸ロータリー研削盤に搭載し,#3000のダイヤモンド砥石で450mmシリコンウエハ研削を行い,2nmRaの面粗さを実現した.「切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドル」を設計・試作した.研究協力者のA.H.Slocum教授(マサチューセッツ工科大学),X.D.Lu博士(ブリティッシュコロンビア大学)そして研究統括者の由井らの基本設計に基づいて,研究協力者の小林久志氏(岡本工作機械)が生産設計を完了した.切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドルの加工・組み立ては岡本工作機械のクリーンルームにて行った.スピンドルの最小送り単位は10nmと小さいため静電容量型非接触センサよりフィードバックを行い,磁石の吸引力を利用して駆動しているため,システムゲインが非常に高くなった.そこで,砥石質量を固定することにより発振を抑えて,精密なゲイン調整を実施した.平成24年度の実施予定を前倒しして,試作スピンドルを「立て軸ロータリー研削盤」に搭載した.研削盤の静剛性(ループ剛性),位置決め精度などの基本的特性について評価した.設計・加工・組み立ての打ち合わせ及び試作機の基本的性能の測定のために研究統括者及び研究分担者が岡本工作機械へ出張した.また,関連情報の収集のためにセミコン・ジャパン,精密工学会などに出席した.立て軸ロータリー研削盤を防衛大学校の実験室(クリーンルーム)に移設した.現在は,岡本工作機械にて測定した基本的データの再現テストを準備中である.防衛大学校と岡本工作機械の間で,本システムの借り上げ及び保守契約を締結し,平成23年度分として299,999円を支払った.1)「切り込み機構内蔵水静圧砥石スピンドル」の設計・組立を完了した。2)開発したスピンドルシステムを立て軸ロータリー研削盤に搭載し、防衛大学校の高温実験室に設置した。3)試し研削を行い,シリコンウエハの研削加工が出来ることを確認した。4)基本性能を測定するための準備を行い,設置環境(温度・湿度変化)の測定を行った。5)本システムの構造をわかりやすく説明するための簡単なスピンドルモデルを試作した。平成23年度は,岡本工作機械のクリーンルームにて装置を完成させて基本的特性を評価するる予定であったが,平成24年度に計画した1)立て軸ロータリー研削盤への試作スピンドル搭載および防衛大学校クリーンルームへの移設まで完了することができた.今後は,切込み機構内蔵水静圧砥石スピンドルの性能をより詳細に評価する予定である.1)砥石スピンドルの静的位置決め精度の測定用測定装置の開発。ミクロンオーダの位置決め精度測定は可能であるが、ナノメータオーダーの位置決め精度の測定は困難である。すなわち、本システムの位置決め精度を簡便に測定できる計測器は市販されていないため試作する。試作した装置でナノメータオーダの位置決め精度測定を試みる。2)砥石スピンドルの静的・動的剛性の測定。

3)砥石スピンドルの回転精度の測定。4)今までの成果の学会発表。平成24年度は,1)砥石スピンドルの静的位置決め精度,位置決めの周波数特性を測定する.2)砥石スピンドルの静剛性を測定する.3)砥石スピンドルの回転精度を測定する.4)簡単なスピンドルモデルを試作し,本システムの構造を分かり易く説明できるようにする.5)研究協力者のA.H.Slocum(マサチューセッツ工科大学),X.D.Lu(ブリティッシュコロンビア大学)と研究成果について打ち合わせを行い,今後の研究方針を修正・再確認する.本年度が最終年度であるため、直接経費を確認の上、全額を使用する計画である。1)スピンドル・ロータリー研削盤の賃借・保守料の支払い。2)国際会議参加費および研究調査旅費。3)位置決め精度測定用のレーザースケールの購入。平成23年度に購入予定のリニアモータが年度内に納入しなかったため研究費を繰り越した.平成24年度は,リニアモータ,流量計,小形定流量ポンプ&駆動装置を購入し,スピンドルシステム・ロータリー研削盤の賃借・保守料を支払い,国際会議参加費及び研究調査旅行費の執行を予定している.
高分子量ストレス蛋白質の構造と機能

1,マウスの高分子量ストレス蛋白質HSP105と42°C加温によってのみ誘導される42°C特異的ストレス蛋白質(42°C-HSP)の構造を明らかにするため,42°C加温したFM3A細胞のpoly(A)+RNAで作成したcDNAライブラリーを抗マウスHSP105抗体でスクリーニングし、2つの全長cDNAクローン(pB105-1,pB105-2)を分離した。pB105-1は858アミノ酸を、pB105-2はpB105-1から44アミノ酸を欠いた814アミノ酸をコードしていた。2,pB105-1およびpB105-2各々のin vitrotranscription/translation産物はSDS-PAGEでそれぞれHSP105および42°C-HSPと同じ位置に泳動された。3,pB105-1をプローブとして用いたNorthern blot法により、FM3A細胞に約4kヌクレオチドのRNA転写産物が検出され、熱ショックと亜砒酸、およびアミノ酸アナローグ処理により強く誘導された。4,RT-PCR法を、pB105-2において欠損する132ヌクレオチドを検出できるプライマーを用いておこなうと、pB105-2産物は42°C加温においてのみ増加したが、pB105-1産物は42°Cと45°Cの熱ショック、また他のストレスによっても増加した。以上の結果からpB105-1とpB105-2はそれぞれHSP105と42°C-HSPに相当すると考えられた。5,蛋白質ホモロジー検索により,マウスHSP105がヒトBリンパ球に特異的なHSP70RY(54%)、ウニ卵子の精子受容体(34%)、およびマウス誘導型HSP70(25%)と高い相同性をもつことが明らかとなった。6,HSP105mRNAはマウスの種々の臓器、特に脳に強く発現していた。
光重合型レジンに生ずる表層未重合層に関する研究

光重合型レジンの修復物の表層にはレジンの未(低)重合層が存在している。この層は修復物の硬さ,摩耗抵抗性,変色抵抗性,表面あらさなどの表面物性と関連があり、ひいては修復物の予後に影響を与えているものである。本研究はこの表層部に生じた未(低)重合層の実態を把握し、臨床的な対策を考えることを目的としたものである。そこでまず表層部の未(低)重合層についてさらに解明するための実験を行なった。その結果、この未(低)重合層は硬化後の時間が経過しても、硬化物全体の重合度は向上するもののその相対的な未(低)重合層としてはかなり長期的にわたって表層部に残留し、修復物表面の劣化の原因となる危険性が予想された。一方、この修復物の表層の重合度を向上させる臨床手技としてすでに認められているマトリックスの使用,照射時間の延長,白色チッププロテクターの使用など試みたが、いずれの手技をもってしても、表層部の重合度の向上は認められるものの未(低)重合層の出現を阻止することは不可能であった。そこで臨床的対策としてはこの未(低)重合層部を研磨操作によって削除してしまうことが、現時点においては最良の対策であるものと考えられた。そこでこの未(低)重合層幅を知るために市販製品を使用して、その表層部に生ずる重合度の最もよい位置を求め、その位置から表層にかけて未(低)重合層が存在するものと考え硬化物のヌープ硬さを照射表層部から深部にかけて、光線照射方向に沿って測定して、ヌープ硬さ曲線を求め、そのピーク位置からそれぞれの製品の研磨削除量を推測することにした。その結果、光重合型レジンでは、填塞時に0.5mm程度のオーバーフィリングを行ない硬化後、そのオーバーフィリング分を研磨することによって未(低)重合層部を削除し、結果的には修復物の表面物性の最も良好な面を露呈することができるという結論を得た。
外来種の侵略性に関る遺伝的基盤の解明

生物が持つ適応力は種によって異なる。本研究は、重複遺伝子保持率から生物が持つ環境適応力を予測する手法の確立を目指し、動物ゲノムの重複遺伝子保持率と生態的特徴の関係を調査した。本研究で侵略的外来種アメリカザリガニの全ゲノム配列決定し、本種を加えたゲノム配列既知の動物を対象にした比較ゲノム解析により、侵略的外来種の重複遺伝子保持率が高いことを明らかにした。重複遺伝子保持率と環境適応力との関連を強く支持するものであり、ゲノム配列情報からの環境適応力評価への応用が期待される。人間活動により持ち込まれた外来生物が、在来生物の生息域を奪うなど生態系に悪影響を及ぼすことが問題となっており、植物から動物まで幅広い外来種が世界各国で報告されている。日本国内における代表的な侵略的外来種として北米原産のアメリカザリガニ(Procambarus clarkii)が挙げられるが、本種はアメリカ大陸のみならず、アジア、ヨーロッパ、アフリカにおいても爆発的に生息範囲を広げており(図1)、際立って高い環境適応能力を持っている。特定の種が世界各地で独立に何度も侵略的外来種となっている背景には、これらの種に共通する遺伝的な基盤があると考えられるが、その詳細は全く分かっていない。本研究では、特に国内外で問題となっている侵略的外来種アメリカザリガニの全ゲノム配列決定を実施し、1環境適応能力の高さを生み出す遺伝的多様性の調査、2新規環境に侵入した少数個体が近交弱勢を起こさずに繁殖成功する遺伝的背景の解明を目的とする。本研究により、生物の侵略性に関る遺伝的基盤が明らかとなる。さらに、遺伝的構成から生物の侵略性を推察できるようになれば侵略種の拡散防止や在来生物保全の観点からも重要な研究となる。本年度は、侵略的外来種アメリカザリガニのゲノム配列を次世代シークエンサーで決定し、得られたゲノム配列を用いて遺伝子予測を行った。得られた遺伝子の配列とショウジョウバエの遺伝子配列を用いて相同性検索を実施し、相同性の高い遺伝子が多数取得できていることを確認した。日本国内における代表的な侵略的外来種として北米原産のアメリカザリガニ(Procambarus clarkii)が挙げられるが、本種はアメリカ大陸のみならず、アジア、ヨーロッパ、アフリカにおいても爆発的に生息範囲を広げており、際立って高い環境適応能力を持っている。本研究では、特に国内外で問題となっている侵略的外来種アメリカザリガニの全ゲノム配列決定を実施し、環境適応能力の高さを生み出す遺伝的多様性の調査、および、新規環境に侵入した少数個体が近交弱勢を起こさずに繁殖成功する遺伝的背景の解明を目的とする。昨年度に引き続きザリガニゲノムのde novo assemblyを実施した。また、全国からサンプリングした複数集団のザリガニと近縁種のリシークエンスを行った。侵略的外来種アメリカザリガニの侵略性に関わるゲノム構造の検証を行うため、全ゲノム配列決定(ゲノムサイズ2.6Gb)を実施した。累代飼育を行ってきたメス1個体よりゲノムDNAを抽出し、Paired-endライブラリ、および、長さの異なるMate pairライブラリを作成し、次世代シークエンサー(Illumina HiSeq 2000)により約100xのカバレッジで塩基配列決定を行った。ゲノムアセンブラーplatanusを用いて、得られた配列のde novoアセンブリを行い、N50が410kbのドラフトゲノム配列を得た(全長2.4Gb)。さらに、F2個体を用いたddRADseqを実施してscaffold間の関係性を調査し、連鎖地図を作成した。Augustusを用いてアメリカザリガニゲノムから遺伝子予測を行い、36000のタンパク質コード遺伝子を同定した。同定した遺伝子の配列を用いて相同性検索を行い、重複遺伝子を推定した。その結果、アメリカザリガニは他の節足動物と比較して非常に多くの重複遺伝子をゲノム上に保持していることが明らかとなった。アメリカザリガニのゲノム配列が得られたことで、国内外個体のリシークエンスが可能となった。国内野外個体(仙台)と米国在来個体のゲノムリシークエンスを行い、得られたreadを参照配列にマッピングしてSNPを得た。遺伝的多様性を調べるため、コールされたSNPを用いてWatterson thetaを推定したところ、国内導入個体は在来個体よりも遺伝的多様性が低いことが分かった。また、ゲノムシークエンスに用いた個体のWatterson thetaの推定も行ったところ、他個体と比較してthetaが低く、累代飼育により遺伝的多様性が低下していることが示された。