hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
社会不安障害における潜在的連合の検討

本研究は、人前で不安になる心理現象に影響を与えている、個人の認知メカニズムを検討することを目的とした。研究の結果、本人が自身のパフォーマンスを低く評価し、それに捉われる程度が高いほど、スピーチ中の不安感が強いことが示された。一方、潜在的に社会的場面と負の情動の結びつきが強い者ほど、スピーチ中の生理的反応が強まることが示唆された。このことから、認知の顕在的側面と潜在的側面は、異なる不安の様相と関連することが明らかにされた。平成20年度,本研究は実験環境の整備を主に進めてきた。その概要を以下に記す。1)必要備品の調達と整備本研究では,(1)認知課題(個人の潜在的認知を測定するためのコンピュータを用いた課題)の実施(2)スピーチ場面でのパフォーマンスデータ(主に生理データ)の収集,に重点を置いている。そのため,(1)に関してはパーソナルコンピュータ,心理実験用プログラミングソフト,および,心理実験用反応ボックスが,(2)に関しては生理指標測定機器,および,生理データ解析ソフトが必要不可欠であった。そこで,平成20年度は上記備品のうち,生理データ解析ソフト以外の備品の調達を順次進めた。平成21年度に生理データ解析ソフトの調達を実施すれば,実験が開始できる環境が全て整っている。2)心理実験(認知課題)のプログラミング,操作チェック上記備品を用いて,本研究の中核であるGo/No-go Association Task (GNAT)などの認知課題のプログラミングを行った。また,作成した認知課題の操作チェック,および,妥当性の検討を目的として,40名の実験参加者に同様の認知課題を実施する予備実験を行った。その結果,作成された認知課題により全参加者においてデータの収集が可能であることが示された。妥当性の検討に関しては,現在分析中であり,平成21年度の日本行動療法学会にて発表の予定である。3)認知課題の信頼性の検討現在,認知課題の信頼性の検討を行うためデータの収集中である。信頼性に関しては,(1)内的整合性の検討,および,(2)同一参加者に対して1週間間隔で2回データを取ることで,再検査信頼性を検討することとしている。本研究は、社会不安障害の認知メカニズムを解明することを目的とした。特に、認知の潜在的側面と顕在的側面に焦点を当て、それらが実際の社会的状況における個人の不安反応にどのような影響を及ぼすか、大学生を対象としたアナログ研究によって検討した。27名の大学生を対象に、スピーチ場面での不安反応の諸様相(主観的不安感、精神生理学的反応、行動パフォーマンス[他者評価])と潜在的認知(社会的状況や自己に対する潜在的連合:GNAT/IATによる測定)、顕在的認知(パフォーマンスに対する自己評価、パフォーマンスに対する自己焦点型の注意:尺度による自己報告)の関連を検討した。その結果、パフォーマンスに対する自己評価、および、自己焦点型の注意が、スピーチ中の主観的不安感を予測し、潜在的認知と主観的不安感の関連は示されなかった。一方、潜在的認知は精神生理学的反応との関連を示した。行動パフォーマンスは、パフオーマンスに対する自己評価のみと関連していた。これらの結果から、認知の潜在的側面と顕在的側面は、それぞれ異なる不安の様相と関連をしていることが明らかとなった。また、質問紙尺度で測定された社会不安傾向は、スピーチ中の不安反応とは関連を示さず、パフォーマンスに対する自己評価と注意、そして、パフォーマンスに対する評価のバイアス(自己評価と他者評価のズレ)と関連を示した。
副腎交感神経活動電位を指標とした体性および内蔵性侵害刺激反射の同時測定法の確立

(研究目的)ケタミンをそれぞれ別々にラットに投与した際の鎮痛作用について,体性侵害刺激および内臓性侵害刺激各々に対する副腎交感神経活動の反射性変化を指標として調べる。(成果)Wistar系ラット10匹を用いて,体性侵害刺激群(n=5)と内臓侵害刺激群(n=5)の2群にわけてケタミンを静脈内投与した場合の副腎交感神経反射電位を指標とした反応を測定した。体性侵害刺激は後肢へのピンチ、また、内臓群の内臓性侵害刺激は直腸内にバルーンを挿入し、それを伸展して刺激した。交感神経副腎枝を顕微鏡下に露出し双極白金電極にのせて、オッシロスコープで反射電位を確認後、パルスカウンターに接続して反射電位数を測定。この反射電位数の増加によって、侵害刺激への反応とした。ケタミン10mg・kg-1を静脈内投与し、投与1/3/5/10/15/20/25/30/40/50/60分後に侵害刺激を計11回繰り返し、その際の、副腎反射電位数の変化を記録した。その結果,ケタミンは体性および内臓性侵害刺激に対するラット副腎の交感神経反射電位を同程度に抑制した。(Two-wayRepeated-MeasuresANOVA)(研究目的)ケタミンをそれぞれ別々にラットに投与した際の鎮痛作用について,体性侵害刺激および内臓性侵害刺激各々に対する副腎交感神経活動の反射性変化を指標として調べる。(平成9年度研究成果)平成9年度は,Wistar系ラット10匹を用いて,体性侵害刺激群(n=5)と内臓侵害刺激群(n=5)の2群にわけてケタミンを静脈内投与した場合の副腎交感神経反射電位を指標とした反応を測定した。体性侵害刺激は後肢へのピンチ、また、内臓群の内臓性侵害刺激は直腸内にバルーンを挿入、それを伸展して刺激した。その結果、ケタミンは体性および内臓性侵害刺激に対するラット副腎の交感神経反射電位を同程度に抑制した。(Two-way Repeated-Measures ANOVA)その他に,薬剤投与法として,ラットに対し腰部くも膜下腔への慢性的カテーテル留置によるくも膜下腔投与を可能とすることができた。(Two-wayRepeated-MeasuresANOVA)
siRNA導入法を用いたアポプトーシス抑制性樹状細胞によるワクチン療法の開発

本研究は、抗原提示細胞である樹状細胞のアポプトーシスを抑制することによりその免疫活性を持続させることにある。アポプトーシスは多数の経路を経るが、今回はcaspase群およびBcl-2 family群に注目した。得られた成果として、血液単球由来樹状細胞(monocyte-derived dendritic cells, MoDC)を通常の樹状細胞療法で用いるのと同条件、すなわち自己血漿および無血清培地を用いて末梢血CD14陽性細胞からGM-CSFおよびIL-4の存在下で誘導し、IL-1beta, IL-6, TNF-alpha, PGE2を加えて刺激・成熟させた後の自然経過によるアポプトーシスの程度とそれに関与するcaspase群の発現を解析した。細胞のviabilityは、刺激2日後までは90%以上であったが、3-4日後には60-70%と低下し、さらに5日後には50%となった。アポプトーシス陽性細胞についてみると、刺激後4日までは陽性細胞は10%以下であったが、刺激後6-8日では約70%と著明に増加した。刺激後の樹状細胞の活性化を検討したところ、刺激後2日目からCD86およびHLA-DR抗原の発現増強がみられた。刺激後6日以降は、同抗原を強く発現しているグループと発現の現弱したグループの2つにわかれ、刺激後の時間が長くなるにつれて後者の割合が増加した。このアポプトーシスにおいて関与するcaspase群の相対活性を測定したところ、caspase-2,-3,-7,-8のうちでcaspase-2のみが刺激後5日目から有意に増加した。また、MoDCに対しsiRNAをin vitroで導入する方法について、GAPDHのsiRNAを用いて導入後のMoDCのGAPDH酵素活性を測定することにより検討した。Lipofection法では、Lipofectamine2000【○!R】を用いた場合が最もよく、最大44%のGAPDH siRNAの抑制効果が得られた。また、electrophoration法では最大70%の抑制効果が認められた。現在われわれはcaspase-2のsiRNAをMoDCに導入してMoDCのアポプトーシスが遅延するか否かを検討中である。皮膚腫瘍の免疫療法を行う際に、抗原提示細胞である樹状細胞のアポプトーシスを抑制することは重要と思われる。アポプトーシスの経路の主なものとしては、細胞膜においてはTGF-βsuperfamily受容体やFas(CD95)分子を介する刺激、細胞内においては、p53の調節異常、DNA断片化に関与するcaspase群、さらにはミトコンドリアを介する経路にかかわるBcl-2 fimily(Bcl-2/xl,Bax/Bak)などがあげられる。樹状細胞については、アポプトーシスに関与する分子としてFas,Fas ligand,caspase 3, caspase 8などが報告されている。本年度における成果としては、MoDCを通常の樹状細胞療法で用いるのと同条件、すなわち自己血漿および無血清培地を用いて末梢血CD14陽性細胞からGM-CSFおよびIL-4の存在下で誘導し、IL-1beta,IL-6,TNF-alpha,PGE2を加えて刺激・成熟させた後の自然経過によるアポプトーシスの程度とそれに関与するcaspase群の発現を解析した。

細胞のviabilityは、刺激2日後までは90%以上であったが、3-4日後には60-70%と低下し、さらに5日後には50%となった。アポプトーシス陽性細胞についてみると、刺激後4日までは陽性細胞は10%以下であったが、刺激後6-8日では約70%と著明に増加した。刺激後の樹状細胞の活性化を検討したところ、刺激後2日目からCD86およびHLA-DR抗原の発現増強がみられた。刺激後6日以降は、同抗原を強く発現しているグループと発現の現弱したグループの2つにわかれ、刺激後の時間が長くなるにつれて後者の割合が増加した。このアポプトーシスにおいて関与するcaspase群の相対濃度を測定したところ、caspase-2,-3,-7,-8のうちでcaspase-2のみが刺激後5日目から有意に増加した。現在、caspase群およびBcl-2 family群のsiRNAを設計ないし購入して、樹状細胞のアポプトーシスに影響があるか否かを検討中である。本研究は、抗原提示細胞である樹状細胞のアポプトーシスを抑制することによりその免疫活性を持続させることにある。アポプトーシスは多数の経路を経るが、今回はcaspase群およびBcl-2 family群に注目した。得られた成果として、血液単球由来樹状細胞(monocyte-derived dendritic cells, MoDC)を通常の樹状細胞療法で用いるのと同条件、すなわち自己血漿および無血清培地を用いて末梢血CD14陽性細胞からGM-CSFおよびIL-4の存在下で誘導し、IL-1beta, IL6,TNF-alpha, PGE2を加えて刺激・成熟させた後の自然経過によるアポプトーシスの程度とそれに関与するcaspase群の発現を解析した。このアポプトーシスにおいて関与するcaspase群の相対活性を測定したところ、caspase-2,-3,-7,-8のうちでcaspase-2のみが刺激後5日目から有意に増加した。また、MoDCに対しsiRNAをin vitroで導入する方法について、GAPDHのsiRNAを用いて導入後のMoDCのGAPDH酵素活性を測定することにより検討した。Lipofbction法では、Lipofbctamine 2000(R)を用いた場合が最もよく、最大44%のGAPDR siRNAの抑制効果が得られた。また、electrophoration法では最大70%の抑制効果が認められた。
ライフコース上の居住リスクに関する基礎的研究

本研究の目的は、ライフコースや住居の道筋の中で居住喪失リスクを増大させている出来事を明らかにすること、そのメカニズムを明らかにすること、その出来事がライフコース上のどこに位置づけられるかを明らかにすることである。居住支援団体への聞取り調査や相談記録を分析することで、メンタル面での問題や加齢が生活の脆弱性を構築していることが明らかになった。これまでの生活を支えていた同居家族、就労、住居を支えていた建物などの喪失などが生活の脆弱性を顕在化させた。同居家族が賃貸住宅の契約者であったり主な稼ぎ手であった場合、同居者を失うことで居住の権利を失ったり、住居費などを賄えずに住居を失ったりする。また、生活を支えていた親が亡くなった場合に当事者がメンタル面の問題を抱えていた場合にはたちまち生活を営むことが難しくなる。持ち家の場合には問題を顕在化させない手立てが見つかる可能性があるが、賃貸住宅の場合にはそれも困難な場合が多い。就労を失う原因は病気や怪我などの他に加齢による定年退職による失職がある。定年退職までに居住資産を形成しておれば良いが、寮や社宅で暮らし続けていた場合に失職とともに生活の場を失ってしまう。また、集合住宅の竣工とともに住み続ける者も少なからずいるが、築後4050年以上を経過した建物を建て直す場合に居住者の中に7080歳の高齢者を抱える場合があり、その場合には転居が困難である。生活保護の受給を最期のセーフティネットととらえられているが、生活保護受給前の収入による家賃水準の居住継続が認められなかったり、世帯規模の減少による受給額の減少が転居を余儀なくする。DVを避けるための転居が増加する傾向にある。福島原発事故避難者の支援期限が居住を不安定にした例もある。最期に、メンタル面の問題を抱えている者にとって住居を見つけることは大きな困難を伴い、住居を維持することが重要になる。居住支援を実施している団体への聞取り調査はほぼ予定通りに進んでいるものの、当事者への聞取り調査は、当事者の承諾を得ることなどの問題から当初の予定通りのスケジュールでは進んでいないため。当事者への聞取り調査を本年の夏期及び冬期(2020年当初を含む)に実施する予定である。引き続き、居住支援を実施している団体への聞取り調査は適宜日程調整を行いながら実施する。本年度は「ライフコース上の居住リスク」を明らかにするために、名古屋およびその周辺地域を活動の範囲としている居住支援団体に聞取り調査を実施した。また、当事者から聞取り調査および相談記録の分析を行った。相談記録の分析から居住貧困に至るパターンとして6類型が見出された。1失業や退職などによって住居費負担能力を喪失した場合。2(心身の)疾病によって住居費負担能力や生活能力が低下ないし喪失してしまった場合。3同居者との不和やDVのために居住が続けられなくなったり、死別によって居住を継続できなくなった場合。4災害や事故のために避難や強制退去をせざるを得なくなった場合。5老朽化を理由とした建物の取り壊しのために退去せざるを得なくなった場合。6生活保護の受給開始によって、住宅扶助費を上回る家賃の住宅から転居指導を受けた場合。である。単独の要因によって居住貧困に至る場合は少なく、多くの場合は複数の要因が重なり合って居住困難がもたらされる。その中で「高齢」「病気」「外国人」(言葉と権利の問題)「建物の取壊し」「就労」が居住貧困に大きな影響を与えている。居住貧困の契機となる要因として「高齢化」(人および建物)や「外国人」などのようなグローバル化が指摘できるが、近年の社会経済の大きな変化の影響が指摘できる。また居住貧困が顕在化する要因として親や配偶者との死別が指摘できる。大規模な世帯が内包していた居住支援能力が衰退していることが指摘できる。また、新たな住居として市場から提供される物件は最低居住面積水準を下回るものであるか、交通の不便な立地である。そのため居住貧困に直面した世帯の居住水準改善に困難が伴うことが指摘できる。当初の予定においては東海圏内の居住支援団体の訪問および当事者への聞取りを終える予定であったが、聞取りや調査資料の分析を終えることができていない。

また、集合住宅の竣工とともに住み続ける者も少なからずいるが、築後4050年以上を経過した建物を建て直す場合に居住者の中に7080歳の高齢者を抱える場合があり、その場合には転居が困難である。生活保護の受給を最期のセーフティネットととらえられているが、生活保護受給前の収入による家賃水準の居住継続が認められなかったり、世帯規模の減少による受給額の減少が転居を余儀なくする。DVを避けるための転居が増加する傾向にある。福島原発事故避難者の支援期限が居住を不安定にした例もある。最期に、メンタル面の問題を抱えている者にとって住居を見つけることは大きな困難を伴い、住居を維持することが重要になる。居住支援を実施している団体への聞取り調査はほぼ予定通りに進んでいるものの、当事者への聞取り調査は、当事者の承諾を得ることなどの問題から当初の予定通りのスケジュールでは進んでいないため。今後は東海圏内の居住支援団体の訪問を継続しつつ、東海圏外の居住支援団体の訪問を実施する。当事者への聞取り調査を本年の夏期及び冬期(2020年当初を含む)に実施する予定である。引き続き、居住支援を実施している団体への聞取り調査は適宜日程調整を行いながら実施する。次年度使用額が生じた理由は、中京大学における研究倫理審査実施のために居住支援団体や当事者への接触開始が遅れたことにある。当該研究の採択決定後、研究倫理審査の体制を整え、審査が行われた。実質的な審査が終了するまでの間、調査を開始することは困難であった。翌年度分として請求した助成金は、当該年度で実施できなかった訪問調査を実施することに充当する計画である。当事者への聞取り調査を実施・終了すること及び居住支援団体への聞取り調査の実施を終了できなかったために次年度使用額が生じた。両調査を計画的に実施することで本年度内に調査を終了させる。
韓国に生息するキバノロの生体及び生理機構の網羅的解明と潜在的感染症の疫学的調査

キバノロは、朝鮮半島および中国東北部に生息するシカ科に属する原始的な反芻動物であり、国際自然保護連合による評価では絶滅危惧種に指定されている。しかしながら、本種の生体および生理機構はほとんど明らかになっていないため、本研究で解析を実施した。その結果、本種における、他の反芻亜目の動物種と類似および相違点が明らかに成り、生物多様性の観点からとても興味深い知見が数多く得られた。調査研究実施国である韓国のソウル大学獣医学部・獣医解剖学研究室(海外共同研究者:木村順平准教授)を拠点にして、韓国国内で出るロードキルや救護後死亡キバノロ個体を回収し解剖ののちホルマリン水溶液で保存した。本年度入手できた死亡キバノロ個体数は50以上にのぼる。その中で比較的新鮮で状態がいい胎子期から成熟個体までの様々な発育段階の内臓諸臓器について、韓国の輸出許可を取るとともに日本の動物検疫所へ連絡して検査を受け日本国内へ正式な手続きを経て輸入した。さらに、韓国国立森林公園で飼育されているキバノロの新鮮個体も入手でき、各種臓器をブアン固定した。現在、これらの臓器を用いて原始的な反芻動物であるキバノロの骨格系、筋系、神経系、泌尿器、内分泌系及び循環器系などを肉眼解剖学な観察を実施しており、今後の様々な臓器の組織学的な研究を実施に展開する。本年度の具体的な成果を上げると、1)キバノロの腕神経叢を肉眼解剖学的に観察し、腕神経叢は第六頚神経から第一胸神経から形成されていることや、牛などと同様に腋窩動脈を巻き込む腋窩ワナを形成していることを明らかにした。2)他の鹿科の動物と同様に肝臓に胆嚢がないことを明らかにした。3)膵臓は右葉、左葉、膵体からなり、膵切痕を形成し、そこを門脈や肝動脈が通過することも明らかにした。さらに特殊皮膚腺、舌乳頭の種類、食道筋層の構成筋の種類と分布、甲状腺の構造、副腎の構造、消消化管内分泌細胞の局在、リンパ器官の構造などの解析を行うための予備実験を行っている。死亡個体の中に肺炎や腸炎などの感染症の疑いのある症例がいるのでホルマリン固定したので今後、病理学的な観察を行う。また、韓国の救護センターで飼育されているキバノロ生体3頭に冬期の体温変化の観察を行うための体温測定用のデータロガーの埋め込みを行った。ロードキルおよび救護後死亡したキバノロ個体から内臓を採出し、ホルマリン固定、ブアン固定あるいは凍結保存を行った。保存した臓器を用いて昨年度と同様に、(1)キバノロの舌乳頭および味蕾の形態学的な観察と系統発生学的な比較を実施した。さらに出生後の観察個体数を増やすとともに、胎子個体を入手できたので、個体発生を追って追跡した。(2)死亡個体を解剖中に肺炎や腸炎などの病変がある個体がいれば、採材しホルマリン固定をおこなった。合計30頭以上の個体を解剖したが、病変を持つ個体は少数であった。今後、病理学的な診断を実施する。(3)キバノロの腸管付属リンパ組織も同様に胎子期の個体から組織を採取し、個体発生を追ってデータの蓄積を行った。(4)昨年発見したアイメリア属の腸管内寄生虫から遺伝子を増幅し、系統樹を描き、これまで報告されていない種であることを確認し、現在論文を執筆中である。(5)膵臓の組織学的な観察を行い、膵島構成細胞の局在を免疫組織化学的に明らかにするための、抗体(抗インスリン、抗グルカゴン、抗ソマトスタチン、抗PP抗体)の選別、希釈濃度決定などの予備実験を行った。(6)妊娠子宮が入手できたので、胎盤や胎子の計測と固定を行った、今後比較解剖学的な検討を行う。(7)冬期休眠様低体温の利用が明らかになったので、ソウル動物園、ソウル大学間で追加実験の打ち合わせを行った。展示動物であるので、体温データロガーをできるだけ侵襲の無い方法で挿入する必要があるなどの確認がされた。ロードキルおよび救護後死亡した個体から内臓を採出し、ホルマリン固定、ブアン固定あるいは凍結にて保存した。保存した臓器を用いて以下の研究を実施した。(1)キバノロの舌乳頭および味蕾の形態学的観察と系統発生学的な比較。(2)キバノロの腸管附属リンパ組織の免疫組織化学的観察を行い、他の反芻動物と系統発生学的に比較解析した。(3)咬筋の肉眼解剖学的観察。(4)腕神経叢の肉眼解剖学的観察。(5)アイメリア属と考えられる腸管内寄生虫の発見した。まず形態学的な解析を終了し、現在は分子生物学的な解析を行っている。(6)膵臓の血管分布と膵管の走行について肉眼解剖学的に観察を行った。次に、ソウル動物園とソウル大学獣医学部の協力を得て、ソウル動物園で飼育されている個体を用いて次の研究を行った。

冬期越冬戦略として休眠様低体温の利用の有無を観察するために、体温測定用のデータロガーをキバノロの皮下に埋め込む手術を初冬に実施した。今回は雄雌各1頭手術を行った。同時に環境測定用のデータロガーを飼育ケージ内に5カ所設置した。3月下旬に手術によって、飼育個体からデータロガーを取り出した。2頭中1頭に埋め込んだデータロガーからデータの回収に成功した。同時に、環境温度測定用のデータロガーも回収し、環境温度の推移も解析した。環境温度が冬期ー20度前後を推移した1-2月に、キバノロの体温が30度以下になることが確認された。キバノロは、朝鮮半島および中国東北部に生息するシカ科に属する原始的な反芻動物である。本年度は、以下の3点について主に研究を実施したので概要を報告する。1.キバノロの越冬戦略として日内休眠を使っているかどうかの研究を実施した。一昨年、キバノロの頚部皮下にデータロガーを挿入し体温を測定した結果、厳冬期の1-2月にかけて体温が29度以下になる低体温現象が観察された。そこで本年度は,一昨年休眠様低体温が観察された時期と同じ時期に、深部体温を計測する研究を実施した。ソウル大学獣医学部とソウル動物園の協力を得て、ソウル動物園の展示動物を用いて実験を行った。深部体温を測定する目的でデータロガーをキバノロ(メス2頭)の膣内に留置して、一ヶ月間留置して体温の計測を行った。同時に環境温度の計測も実施した。データロガーの解析は1頭のみで成功した。その結果、体温は恒常性を維持しており、低体温状態は観察されなかった。さらに、外気温を解析したところ、マイナス5度程度を推移していた。つまり、この冬は外気温が高く、キバノロの日内休眠が誘導できなかったと考えられた。2.キバノロの頭蓋骨の骨間縫合の癒合時期について雌雄差を比較して、ドイツ国のほ乳類学会で発表した。3.キバノロの腸管寄生コクシジウムの遺伝子解析と形態学的解析を実施した。キバノロのロードキル個体(19個体)から腸管を採取して検査した結果3個体からEimeria ITS-1領域の遺伝子が増幅できた。分子系統樹から、一つはE. wyomingensisに近縁であったが、残りの2つはウシのEimeria属とはやや離れていることが明らかになった。形態的には、メロゾイト、シゾント、ガメートサイト、チゴートなどが認められた。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度から十分量のキバノロの死亡個体が入手でき,肉眼解剖学的な研究に着手できているため、当初予定どおりの進捗状況であると考えている。キバノロの肉眼および組織学的な観察さらには生態学的な研究を実施した。今後はこれまで報告のある反芻動物と比較解析を行ていくこよによって、キバノロの解剖学的、生態学的な特徴を明らかにしていきたい。当初予定したどおりの研究が実施できている。学会発表や学術論文の作成も行っている。入手したキバノロ臓器の肉眼解剖学手な検察や組織切片の作製、各種免疫染色によって本動物の特徴を明らかにしていく。今後も、肉眼解剖的および組織学的な観察を継続して実施するとともに、冬期の越冬戦略として休眠様低体温の利用について研究を行い、結果のとりまとめ論文の執筆と投稿を行う。一昨年韓国から日本へ持ち帰ったキバノロのホルマリン固定標本の肉眼解剖学的および組織学的解析を引き続き実施する。
ケヤキの年輪解析による過去の気候復元をめざした日韓共同研究の組織化

国内ではスギ,ヒノキ,コウヤマキなどの針葉樹について過去約2,000年間におよぶ年輪幅標準パターンが作成されているが,これらの樹種は本州以南の日本に限局して分布する。本研究は日本列島のほか朝鮮半島にも分布するケヤキの年輪を解析し,過去の気候を復元する際の問題点を事前に検討するために企画された。単年度の企画調査ではあるが,日本各地のケヤキの生育状況を把握するとともに,寺院や神社の建築部材の年輪画像を効率的に収集する方法についても検討した。平成12年の8月,9月,12月にはのべ4名の班員が訪韓し,韓国側共同研究者の協力を得て韓国国内のケヤキの生育状況や建築部材としてのケヤキの利用状況について情報収集を行った。また,同年12月に京都市で開催された,研究打合せ会議参加のために来日した海外共同研究者を京都や奈良市内の寺社のほか,国の重要文化財に指定されている勝興寺(富山県高岡市)の修理現場などに案内し,日本の寺社建築におけるケヤキの利用状況や低山帯に自生するケヤキの生育状況について説明した。研究打合せ会議には海外共同研究者を含む4名の年輪年代学研究者を韓国から招き,ケヤキを用いた年輪解析の可能性や古気象に関連するさまざまなデータの収集方法などについて意見交換を行った。その結果,試料の収集など困難な点も多いが解析可能であることが共通の認識として得られた。さらに,東アジアモンスーン地帯の気候復元を進める上で,ケヤキに限定せず他の樹種についても日韓両国のみならず,より広範な国々の間で共同研究を進めることが重要であると結論付けられた。
膵癌におけるBMPシグナルの作用機構の検討

膵癌ではSmad4の遺伝子異常が約半数に認められるが、Kras活性化+Smad4ノックアウトマウスは嚢胞を伴う腺癌を呈し、我々が樹立したKras活性化+TGF-beta II型受容体ノックアウトマウスは著明な間質の増生・線維化を伴うヒト膵癌組織と近似した管状腺癌を呈した。この結果から膵発癌・進展にBone morphogenetic proteins (BMPs)が重要な役割を果たしている可能性を考えた。膵発癌に重要なADMにおいてBMPが促進的に作用することを示し、さらに癌進展にも促進的な影響を与えることを示し、BMPsが治療標的となる可能性を見出した。TGF-betaファミリーの一つであるBone morphogenetic proteins (BMPs)は癌の転移に重要であるが、膵癌における機能は未だ不明な部分が多い。膵癌では発癌の過程でTGF-betaシグナルに重要なSmad4の遺伝子異常が約半数に認められることから、膵癌におけるBMPシグナルの解明は膵発癌・進展・転移の分子機構を解明するうえで重要と考えられる。我々は、膵臓上皮特異的な変異型Kras発現+TGF-betaII型受容体ノックアウトにより、膵癌の臨床像・組織像をよく近似するマウス膵発癌モデルを既に樹立しており、本研究ではこのモデル用いて、膵癌の発癌進展におけるBMPsの役割及び転移機序の一端を明らかにし、さらにBMPsを標的とした治療可能性について検討した。当科で樹立しているマウス膵癌細胞株とマウスPanIN細胞株でBMP関連分子の発現状態を確認するため、定量的RT-PCRで検討すると、有意差は認めないものの膵癌細胞株でリガンドのBMP4,BMP7の発現が亢進しているものの、阻害物質のNogginの発現も亢進している傾向にあり、まずBMPシグナルが癌に促進的に働くのか、抑制的に働くのか検討した。マウスPanIN細胞に対してBMP4, BMP7, Nogginを投与すると増殖能、浸潤能では差を認めなかったが、BMPを投与すると接着能を亢進させ、Noggin投与で抑制されることがわかった。次にBMPR2安定ノックダウン株を作成し、同様の実験を行うと、BMPR2ノックダウンにより増殖能、浸潤能に変化はなかったが、接着能が低下していることが分かった。BMPによる接着能への影響を調べるために、特に接着能を亢進させたBMP7投与群とコントロール群で定量的RT-PCRアレイを用いて比較し、見出した分子が、BMP7を投与時にBMPR2ノックダウン株では上昇が抑制された。今後はさらにその分子の機能を解析する予定である。膵癌は依然として最難治癌であり、膵癌の病態の理解に基づいた、より有効な治療法の開発は急務といえる。我々は膵臓上皮特異的な変異型Kras発現+TGF-betaII型受容体ノックアウトにより、膵癌の臨床像・組織像をよく近似するマウス膵発癌モデルを既に樹立しており、本研究ではこのモデル用いて、膵癌の発癌進展におけるBMPsの役割及び転移機序の一端を明らかにし、さらにBMPsを標的とした治療可能性について検討した。膵発癌にAcinar ductalmetaplasia(ADM)という現象が重要であることから、ADMにおけるBMPシグナルの役割を検討したところ、BMPシグナルがADMを誘導し、またTGF-betaノックアウトでBMPシグナルが活性化しADMが誘導されていることがIn vitroのアッセイで明らかとなった。この結果からBMPシグナルが膵発癌に重要であることが明らかとなった。また、我々が以前施行したマウス膵癌細胞株(変異型Kras発現+TGF-betaII型受容体ノックアウトマウスより樹立)とPanIN細胞株(変異型Kras発現マウスより樹立)の発現アレイでBMP7が膵癌細胞株で発現亢進していることがわかり、PanIN細胞株でBMP7強制発現株を作成したところ、In vitroでは接着、遊走能が亢進し、In vivoではヌードマウスの皮下腫瘍モデルでBMP7強制発現株でより腫瘍の増殖を認めた。またこのマウスモデルの膵癌とヒト膵癌組織の免疫染色で癌・間質ともにBMPシグナルが亢進していることが分かった。この結果からBMPシグナルは癌の進展にも重要であることがわかった。BMPシグナルは膵発癌・進展ともに重要であることが示唆された。BMPを標的とした治療法の開発は今後の課題であり、さらに研究を進める必要がある。膵癌マウスPanIN細胞を用いたvitroの実験で、BMPがPanINに促進的に働き、接着能を亢進させることを見出し、それに重要と考えられる分子を特定できた。In vitroでBMPの解析を行う条件検討に時間を要したが確立できた。その条件を今後は膵癌細胞や線維芽細胞にも応用できるため、さらなる解析が可能となる。BMPR

2安定ノックダウン株をPanIN細胞で樹立できた。同じレンチウィルスを用いて癌細胞、線維芽細胞でも同様にBMPR2ノックダウン株を樹立できるため、今後は腫瘍・間質相互作用への機能解析も可能となる。またIn vivoでの評価が不十分なので、今後はBMPの機能を評価できるvivoの系を確立できるように努力する必要がある。BMPによる接着能亢進を担う分子の強制発現株や安定ノックダウン株を作成することでさらなる機能解析行うとともに、BMPシグナルが癌細胞・線維芽細胞でどのような機能を果たすかをPanIN細胞で確立した系を用いて評価する。またin vivoで細胞の接着に注目して肝転移・肺転移のモデルや、同所移植を用いた転移・増殖のモデルを確立し、BMPR2安定ノックダウンPanIN細胞株や癌細胞株で転移能を比較する。また線維芽細胞におけるBMPの役割を検討するため癌細胞・PanIN細胞との共培養や、混合皮下移植モデルなどを用いて、腫瘍間質相互作用におけるBMPシグナルの役割を解析する。
マウス胎児脳組織における神経前駆細胞の移動様式

マウス胎児脳組織における神経前駆細胞の移動を観察するため、神経前駆細胞に特異的に発現する遺伝子であるT α1 tubulinのpromoterを用いて、オワンクラゲ由来の蛍光蛋白質であるGFPを発現するトランスジェニックマウス系統を作成した。このマウスでは終脳から脊髄に至る神経前駆細胞において強いGFPの発現が胎生10日から15日の間に観察された。この胎児期のマウス嗅球を取り出し、ゲル内で器官培養し、数時間の間に起こる神経前駆細胞の嗅球内での移動をタイムラプス観察した。嗅球内での神経前駆細胞の移動は胎生13日および14日において活発であり、しかもその移動は極めて急速で、かつアメーバ様の運動様式を示した。このような運動はこれまで胎児期の脳組織において観察された事がなく、新しい神経前駆細胞の運動であると考えられる。移動中のGFP陽性細胞を固定し、神経細胞のマーカー分子であるMAP2で染色した所、移動中のGFP陽性細胞はMAP2陽性の神経前駆細胞である事が確認された。また、この神経前駆細胞の運動はアクチン重合阻害剤により抑制され、またカルシウムチャネルの阻害剤により抑制された事から、細胞内カルシウムによるアクチン依存性の細胞運動によっている事が示唆された。今回作成したT α1 tubulin promoterによってGFP分子を発現するトランスジェニックマウスは神経前駆細胞の胎児期脳内での移動様式を研究する上で極めて有用であり、また嗅球全体の器官培養をレーザー顕微鏡によるタイムラプス観察と組み合わせる事により、これまでの脳スライス標本では観察する事の出来なかった神経組織内での細胞移動様式を解析する事が可能になると考えられる。
難治性白血病の分子機構の解明：ＦＬＴ３ーＩＴＤによる薬剤耐性と関連分子の診断応用

本研究では、治療抵抗性白血病の分子病態と診断マーカーを明らかとするため、予後不良因子FLT3-ITDを有する白血病細胞において、抗がん剤ara-C耐性の機序を解析した。FLT3-ITD導入株化白血病K562細胞において、遺伝子発現プロファイリングの結果に基づき、FLT3下流シグナルのRUNX3に着目し、その発現の制御と意義を検討した。レポータアッセイによるRUNX3プロモータ活性上昇、shRNAノックダウンによる耐性低下、RUNX3過剰発現による耐性増強から、RUNX3はFLT3-ITD陽性白血病細胞のara-C耐性に不可欠な分子であり、診断さらに治療標的の分子マーカー候補と考えられた。本研究では、予後不良な染色体・遺伝子異常、特にFLT3-ITDを有する白血病細胞における抗がん剤耐性の機序を明らかにするため、骨髄微小環境、特に低酸素状態に着目し、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常とそれを制御する関連miRNA分子について、新たなバイオマーカーとしての意義を明らかとし、それらを指標とした抗がん剤耐性の評価法を確立することを目的とする。本年度は、前年度成果に基づき、FLT3-ITD導入した白血病細胞株の性状の解析を進めた。FLT3-ITD導入した骨髄性白血病細胞株K562において、低酸素条件での細胞増殖の安定性の確認を行った。puromycinにて細胞選択した後、FLT3の野生型とFLT3-ITDの状態、さらにFLT3リン酸化の状態を、それぞれRT-PCRとウェスタンブロットにて確認した。細胞の増殖率は、選択後3-4週に低下し、それにともないFLT3リン酸化の状態も低下した。低酸素条件での細胞増殖は不安定であることが判明した。骨髄微小環境におけるFLT3-ITD陽性白血病細胞の増殖優位性に寄与しうる遺伝子発現を知るため、DNAマイクロアレイ(Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips, Affymetrix社)を用いた遺伝子発現プロファイリングを行った。2つのFLT3-ITD導入K562において、41,000遺伝子の内、311遺伝子が発現亢進し、18遺伝子が発現低下していた。これらから、細胞増殖、増殖因子受容体、細胞外マトリックス受容体に関連する遺伝子に着目した。細胞増殖関連のFGFR1, IGFBP2, NNMT、RUNX3をコードする遺伝子、キナーゼ型activin受容体、細胞外マトリックスfibronectin受容体、very late antigen (VLA)4受容体などの遺伝子発現の亢進が明らかとなった。本研究では、予後不良な遺伝子変異FLT3-ITDを有する白血病細胞における抗がん剤耐性の機序を明らかにするため、骨髄微小環境、特に低酸素状態に着目し、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常について、新たなバイオマーカーとしての意義を明らかとし、それらを指標とした抗がん剤耐性の評価法を確立することを目的とする。本年度は、白血病細胞株K562にFLT3-ITDを導入し、遺伝子発現異常を反映する蛋白のスクリーニングを行った。まず、TOPO TAクローニングキットにて2種類のFLT3-ITDを作製し、それぞれNeon Transfection systemにてトランスフェクションし、2種のFLT3-ITD陽性細胞を得た。puromycinにて細胞選択後、FLT3野生型とFLT3-ITDの有無、さらにFLT3リン酸化の状態を、それぞれRT-PCRとウェスタンブロットにて確認した。低酸素(5%)下での細胞増殖は、コントロール細胞で著しく低下したのに対し、FLT3-ITD陽性細胞では抑制されず、低酸素下での細胞増殖能が判明した。これらの細胞での蛋白発現についてプロテオミクス解析を行った。抽出蛋白を2次元-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のイメージについて、PD Questソフトウエアを用いてコントロール細胞の蛋白発現と異なるスポットを選択し、その蛋白の質量分析結果についてMascot search(Swiss proデータベース)で解析した。その結果、heat shock protein、mitochondrial cytochrome oxylase、eukaryotic translation initiation factorなどの蛋白発現増加が判明した。これらの蛋白は、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常に基づく可能性が示唆された。本研究では、急性骨髄性白血病の予後不良な遺伝子異常として知られているFLT3-ITDを有する白血病細胞において、抗がん剤耐性の機序を明らかにするため、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常と関連分子について、新たなバイオマーカーとしての意義を明らかとし、それらを指標とした抗がん剤耐性の評価法を確立することを目的とした。骨髄微小環境におけるFLT3-ITD陽性白血病細胞の増殖優位性に寄与しうる遺伝子発現を知るため、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリングを行った。2つのFLT3-ITD導入株化培養白血病細胞(K562)において、41,000遺伝子の内、311遺伝子が発現亢進し、18遺伝子が発現低下していた。細胞増殖関連のFGFR1, IGFBP

2, NNMT、RUNX3をコードする遺伝子、キナーゼ型activin受容体、細胞外マトリックスfibronectin受容体、very late antigen (VLA)4受容体などの遺伝子発現の亢進が明らかとなった。遺伝子発現プロファイリング結果を踏まえて、急性骨髄性白血病の予後不良因子として報告されているFLT3下流シグナルのRUNX3に着目し、RUNX3発現の制御と意義を検討した。レポータアッセイでFLT3-ITDの株化培養白血病細胞へのトランスフェクションは、用量依存性にRUNX3プロモータ活性を上昇させ、これは阻害剤(PKC4)にて抑制された。shRNAのノックダウンにて、FLT3導入細胞および内在保有する細胞において、ara-C耐性が低下した。RUNX3の導入による過剰発現にてara-C耐性が増強した。以上より、RUNX3はFLT3-ITD陽性白血病細胞のara-C耐性に不可欠な分子であり、診断指標さらに治療標的の分子マーカー候補となると考えられる。病態検査学本研究では、予後不良なFLT3-ITDを有する白血病細胞における抗がん剤耐性の機序を明らかにするため、骨髄微小環境に着目し、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常について、新たなマーカーとしての意義を明らかとし、それらを指標とした抗がん剤耐性の評価法を確立することを目的とする。本年度は、FLT3-ITDを有する白血病細胞K562の低酸素下で増殖優位性が確認されてものの、不安定であることが判明した。K562細胞以外の細胞として、骨髄系白血病HL-60にて、FLT3-ITD導入を試みるも成功しなかった。そこで、低酸素下での細胞培養による性状評価について難渋している。一方、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイルにより、細胞生存、細胞増殖因子、細胞外マトリックスに関連した候補遺伝子をスクリーニングできた。これら遺伝子は、FLT3-ITDを有する白血病細胞での抗がん剤耐性への関与が示唆されるため、これらの意義を細胞薬理学、細胞内シグナルの観点から調べる予定である。本研究では、予後不良な遺伝子変異FLT3-ITDを有する白血病細胞における抗がん剤耐性の機序を明らかにするため、骨髄微小環境、特に低酸素状態に着目し、抗がん剤耐性をもたらす遺伝子発現異常について、新たなバイオマーカーとしての意義を明らかとし、それらを指標とした抗がん剤耐性の評価法を確立することを目的とする。本年度は、下記のごとく成果が得られ、研究の目的は、おおむね順調に進展していると評価した。すなわち、まず白血病細胞株K562にFLT3-ITDを導入し、2種のFLT3-ITD陽性細胞を得た。FLT3野生型とFLT3-ITDの有無、さらにFLT3リン酸化の状態を、それぞれRT-PCRとウェスタンブロットにて確認した。
ブレンド膜における共役高分子の導電特性向上の解明

共役高分子膜の電気伝導度や移動度が、単体のニート膜よりもポリスチレンなどの絶縁性高分子とブレンドすることによって低下するのではなく、向上するという一見すると直観とは相反する現象であり、従来の概念では説明できない挑戦的な研究である。従来の概念では説明できない現象であるがゆえに、まずは特定の組み合わせでのみ生じる特異な現象であるのか、多くの組み合わせで見られる普遍的な現象であるのかを探求する。特定の系について機構が解明できれば、他の系にも演繹することで普遍的な機構をさらに探究する。
カベオラ機能の改変による細胞機能制御法の開発

細胞膜の小陥凹であるカベオラは,受容体やシグナル伝達に関連する分子が集合しており,シグナル制御を行う膜領域であると考えられている.我々は生きている細胞に様々な操作を加えてカベオラの機能に変化を生じさせ,そのことを通じて細胞機能を制御する方法を見出すことを目的として研究を行い,以下の成果を得た.1.細胞質側にのみ露出したカベオリン分子に膜貫通ドメインを接合させ,細胞外に露出した部分を持つ人工蛋白質を作製した.この蛋白質はカベオリンと同じ分布を示すだけでなく,細胞外ドメインに対する抗体で架橋することにより,細胞の一部に凝集する傾向を示した.この方法はカベオラの分布を細胞外から操作するために利用可能であると考えられる.2.培養カハール細胞を用いた実験により,ジヒドロピリジン非感受性のカルシウム振動がペースメーカー機能に関係すること,カベオラに局在するTRP4を介するカルシウム流入がこの振動に重要であることを明らかにした.カベオラにはIP3R受容体やカルシウムポンプの局在もあり,TRP4はカベオラ機能修飾の新たなターゲットとなりうる.3.カベオリンが局在し,コレステロールエステルの貯蔵庫でもある脂質滴に,特異的なRab蛋白質(LD-Rab)が局在することを見出した.LD-RabはGTP依存性に脂質滴に集中するだけでなく,脂質滴の構造蛋白質であるADRPの脱落を誘導し,さらに粗面小胞体の一部と脂質滴の密着を引き起こした.LD-Rabの機能は細胞内コレステロール動態に関与していると予想され,その発現操作を通じて細胞膜ミクロドメインの機能制御を行うことができると考えられる.以上の実験を通じて,カベオラの分布を操作する方法が得られ,またカベオラやカベオリンの機能を修飾するためのターゲットとなる分子を明らかにすることができたと考えられる.細胞膜の小陥凹であるカベオラは,受容体やシグナル伝達に関連する分子が集合しており,シグナル制御を行う膜領域であると考えられている.我々は生きている細胞に様々な操作を加えてカベオラの機能に変化を生じさせ,そのことを通じて細胞機能を制御する方法を見出すことを目的として研究を行い,以下の成果を得た.1.細胞質側にのみ露出したカベオリン分子に膜貫通ドメインを接合させ,細胞外に露出した部分を持つ人工蛋白質を作製した.この蛋白質はカベオリンと同じ分布を示すだけでなく,細胞外ドメインに対する抗体で架橋することにより,細胞の一部に凝集する傾向を示した.この方法はカベオラの分布を細胞外から操作するために利用可能であると考えられる.2.培養カハール細胞を用いた実験により,ジヒドロピリジン非感受性のカルシウム振動がペースメーカー機能に関係すること,カベオラに局在するTRP4を介するカルシウム流入がこの振動に重要であることを明らかにした.カベオラにはIP3R受容体やカルシウムポンプの局在もあり,TRP4はカベオラ機能修飾の新たなターゲットとなりうる.3.カベオリンが局在し,コレステロールエステルの貯蔵庫でもある脂質滴に,特異的なRab蛋白質(LD-Rab)が局在することを見出した.LD-RabはGTP依存性に脂質滴に集中するだけでなく,脂質滴の構造蛋白質であるADRPの脱落を誘導し,さらに粗面小胞体の一部と脂質滴の密着を引き起こした.LD-Rabの機能は細胞内コレステロール動態に関与していると予想され,その発現操作を通じて細胞膜ミクロドメインの機能制御を行うことができると考えられる.以上の実験を通じて,カベオラの分布を操作する方法が得られ,またカベオラやカベオリンの機能を修飾するためのターゲットとなる分子を明らかにすることができたと考えられる.カベオリン-1,2はヘテロオリゴマーを形成し,カベオラの構造と機能の基盤を形成する膜蛋白質である.これらの分子の基本的性質を明らかにする目的で実験を行い,以下のような結果を得た.1)カベオリン-1のアイソフォーム(α,β)は,従来,同一のmRNAから翻訳開始点の違いによって生じると考えられていた.ESTデータベースを検索,βアイソフォームだけを産生するmRNA(5'バリアント)を見出した.5'バリアントは多くの細胞において,従来から知られていたmRNA(FL)とほぼ同じ程度に発現しており,カベオリン-1のアイソフォームの量比が転写レベルで制御されていることを示唆した.2)カベオラを持たない培養細胞にカベオリン-1を発現させると,αアイソフォームはβアイソフォームに比較してより多くの陥凹を形成したが,陥凹形成の効率は低かった.カベオリン-1,2の両方を共発現する細胞ではカベオリン-1が単独で発現する場合に比較して,深い陥凹がはるかに効率的に形成された.この結果はカベオリン-2がカベオラの陥凹形成に関与していることを示唆した.3)カベオリン-2あるいはEGFP・カベオリン-2の融合蛋白質を内在性カベオリンを持たない細胞に発現させると,細胞質に存在する脂肪滴の外層に沿ってパッチ状に分布した.一方,N末,C末,疎水性部分を欠失する変異分子は脂肪滴には局在しなかった.これらの結果はカベオリン-2が形質膜,ゴルジとともに脂肪滴にも局在しうる分子であることを示し,カベオラ形成以外の役割を持つ可能性を示唆する.初代培養ラットメサンギウム細胞および株化メサンギウム細胞(Mes13)にカベオリン-1αまたはカベオリン-

1βのcDNAを一過性または安定的に導入し,MAPキナーゼ系のシグナル伝達と細胞増殖に対する影響について検討した.使用細胞は内在性のカベオリン-1を発現するので,導入分子にはHAタグを付加し,発現効率と発現増加量を定量的に検討した.低濃度血清で12日間培養した細胞にPDGF,bFGFを投与し,経時的に細胞サンプルを作製して電気泳動,ウェスタンブロッティングを行い,活性化ERK1/2についてチロシン燐酸化分子特異的抗体を用いて検索した.その結果,カベオリン-1発現量の増加に伴い,ERK1/2燐酸化の抑制が観察された.またカベオリン-1を高発現させたMes13細胞では細胞増殖が抑制された.上記の結果はカベオリン-1の発現増加が初代培養メサンギウム細胞の増殖を抑制することを示し,生体内メサンギウム細胞へのカベオリン-1 cDNA導入がメサンギウム増殖性腎炎の治療戦略となりうる可能性を示した.カベオリン-1によるシグナル伝達制御のメカニズムとしては,カベオリン-1分子内のカベオリン骨格ドメインがシグナル分子と直接結合して後者の機能を抑制する機構と,カベオリン-1によるコレステロール輸送能が細胞膜ミクロドメインの機能に影響を与える間接的な機構が想定されている.C末のシステインを置換したカベオリン-1はパルミチン酸が付加されず,コレステロール結合能を欠くと報告されている.このミュータントカベオリン-1をメサンギウム細胞に導入した場合のERK1/2活性化の変化を見ることにより,カベオリン-1によるシグナル伝達制御メカニズムの解析を行う.細胞膜の小陥凹であるカベオラは,受容体やシグナル伝達に関連する分子が集合しており,シグナル制御を行う膜領域であると考えられている。これらのカベオラの機能は,1)精製したカベオラに含まれる分子の諸性質をin vitroで分解する,2)カベオラの基本骨格を作るカベオリンの発現増強あるいは阻害の影響を検索する,などの方法によって明らかにされてきた。一方,我々は細胞内カルシウム濃度制御に関わると推測される2種類の膜蛋白質(IP3受容体様蛋白質,形質膜カルシウムポンプ)がカベオラに局在することを見出し,カベオラが細胞内カルシウム濃度調節にも関わる構造であるとの仮設を提唱してきた。しかし,生きている細胞でこの機能を直接的に促えることはできなかった。今回の実験では,小腸筋層の蠕動運動を司るカハール細胞を培養系に移し,細胞内カルシウム濃度変化について検索した結果,ジヒドロピリジン非感受性のカルシウム振動を検出した。この振動は徐波に対応しており,SK&F 96365-感受性かつstore-operatedである選択性陽イオンチャンネルに依存していた。さらに免疫電顕により,カハール細胞に多数存在するカベオラにTRP4が局在することを見出した。これらの結果はカハール細胞のカルシウム振動がペースメーカー機能に関係しており,TRP4を介するカルシウム流入に依存している可能性を示唆する。上記の結果は,生体内の細胞のカベオラに第3カルシウム輸送関連蛋白質と言うべきTRP4が存在し,重要な機能を果たしていることを示したものである。
周期的生体π空間およびπ空間ネットワークを利用したヘムπ電子系の機能開発

π電子を通して生体分子の機能を原点から見直すと共に、四重鎖DNAのG-カルテットにより形成される周期的π空間、タンパク質内部のπ電子系アミノ酸側鎖のシステム化により形成されるπ空間ネットワーク、およびヘムタンパク質等の補欠分子族として生物界に遍在しているヘム(鉄-ポルフィリン錯体)のπ電子系等、様々な生体π空間を融合させた"高次π系生体分子"を創製する研究を行った。その結果、立体構造が決定されて以来半世紀以上も謎であった酸素貯蔵ヘムタンパク質ミオグロビン(Mb)の酸素親和性および外部配位子識別はπ空間の性質によって調節されていることを発見した。また、四重鎖DNAのG-カルテットにより形成される周期的π空間とヘムπ電子系が部位特異的に相互作用することも明らかにした。さらに、これらの研究成果に立脚して、Mb中のヘムπ電子系への系統的電子操作がMbの機能に与える影響を解析する研究を通して、生体π空間電子論の確立に寄与する知見を得た。また、高次π系生体分子におけるπ空間の電子を制御することにより、生体分子の機能を操作する手法を提案するための基礎的知見を得ることができた。このように、様々な生体π空間の自己組織化により生成する一連の高次π系生体分子に対してストラテジックリサーチを行うことにより、高次π系生体分子におけるπ電子密度やπ空間の歪み、サイズ、安定性等の構造化学的因子がヘムπ電子系の機能を調節する分子機構を解明する研究に寄与することができた。DNAの立体構造としては、Watson-Crick塩基対により形成される二重らせん構造が知られているが、塩基配列や水溶液条件によっては四重鎖(四重鎖DNA)等としても存在する。真核生物の染色体末端に存在するテロメア部位にあるグアニンに富んだ繰り返し配列は、高濃度のカリウムイオン(K^+)存在下でG-カルテットと呼ばれる四重鎖構造を形成する。G-カルテットの構造は、グアニン4つが同一平面内で環状にHoogsteen塩基対を形成することにより安定化されている。G-カルテットのπ電子系の平面性と大きさは、π-πスタッキング相互作用を通したヘムのポルフィリン環の認識には適している。また、四重鎖DNAには、G-カルテットの分子間におけるπ-πスタッキング相互作用により二量化する性質があり、ヘムの分子認識に活用可能である。本研究では、四重鎖DNAに内包されたπ空間とヘムのπ電子系の相互作用により生じる複合体の立体構造を解析すると共に、四重鎖DNAπ空間中の特異なヘム電子構造について明らかにした。その結果、ヘム-DNA複合体におけるヘムは、四重鎖DNAの3'末端のG-カルテットのπ平面2つによって分子間にサンドイッチされた、言わば四重鎖DNAのπ空間に孤立した状態で存在していることを初めて見いだした。また、この複合体のヘム鉄は低スピン状態で存在していることから、ヘム鉄とG-カルテットの間には比較的強い相互作用の存在が示唆された。