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種子の脂質含量制御因子群の単離～オレオシンを利用した新技術の開発と応用～

最近,植物が生産する資源に注目が集まっている.その一つに,種子の貯蔵脂肪がある.本研究では,油糧種子において脂質の集積を制御機構の解明とその応用を目指した研究を行った.オレオシン(脂肪を蓄積しているオルガネラ・オイルボディの膜タンパク質)とGFPの融合タンパク質を発現する種子が緑色蛍光を発するという発見に基づいて薬剤を用いない形質転換体の選抜方法の確立を行った.具体的には,オレオシンのプロモータにGFP融合型オレオシンをつないだDNAコンストラクトが遺伝子組み換え体の選抜マーカーとして有効であることを証明した.本方法をべースとして効率的かつ非破壊的な形質転換体作製技術を開発し,FAST (Fluorescence-Accumulating Technology)と命名した.この技術により,目的別の形質転換体作製のためのFASTベクターを10種類開発した.この技術については,昨年度の国内特許出願についで,今年度はPCT国際出願を行なった.FAST技術を公開した論文(Shimada et al.,Plant J.,2010)がオンラインで公表されて以来,約4ヶ月で70件余のリクエストがあった.ベルギー国のフランダース・バイオテクノロジー研究機関(VIB)の依頼を受け,FASTベクターの配布を委託した.モデル植物の形質転換技術は植物科学の分野で大きな貢献をしているが,FAST法の利用により,研究の一層の加速が期待できる.最近,石油燃料に頼らないエネルギー源としてバイオエネルギー,即ち植物が生産する資源に注目が集まっている.その一つに,種子の貯蔵脂肪がある.本研究では,油糧種子において脂質の集積を制御している因子の単離を目的として,このような生理機能遺伝子の効率的な単離のための新技術の開発を行った.オレオシン(脂肪を蓄積しているオルガネラ・オイルボディの膜タンパク質)とGFPの融合タンパク質を発現する種子が緑色蛍光を発するという発見に基づいて薬剤を用いない形質転換体の選抜方法の確立を行った.具体的には,オレオシンのプロモータにGFP融合型オレオシンをつないだDNAコンストラクトが遺伝子組み換え体の選抜マーカーとして有効であるか否かを検討するため,本コンストラクトと目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子をもたせたDNAコンストラクトをシロイヌナズナに導入した形質転換体を3ライン確立した.ラインのT2世代の種子をジェノタイピングにより,ホモ,ヘテロ,野生型の3群に分類すると同時にそれぞれの群に属する種子の蛍光強度を測定し,複数の個体につき,遺伝子型と蛍光強度の相関を調べた.その結果,1%以下のfalse discovery rateで蛍光強度を指標としてT2種子集団からホモ種子を選抜できることが分かった.また,T1世代の種子集団からヘテロラインを選抜することも可能であることも判明した.マーカーとして用いているGFPは,発芽後速やかに消失することも確認できた.これらの結果から,オレオシンーGFPが薬剤を用いない「高速かつ効率的な選抜マーカ」として有効であることを示すことができた.この成果は,国内特許として出願済みであり,現在海外特許出願の手続き中である.また,学会発表を行うとともに学術誌への論文投稿を行った.最近,植物が生産する資源に注目が集まっている.その一つに,種子の貯蔵脂肪がある.本研究では,油糧種子において脂質の集積を制御機構の解明とその応用を目指した研究を行った.オレオシン(脂肪を蓄積しているオルガネラ・オイルボディの膜タンパク質)とGFPの融合タンパク質を発現する種子が緑色蛍光を発するという発見に基づいて薬剤を用いない形質転換体の選抜方法の確立を行った.具体的には,オレオシンのプロモータにGFP融合型オレオシンをつないだDNAコンストラクトが遺伝子組み換え体の選抜マーカーとして有効であることを証明した.本方法をべースとして効率的かつ非破壊的な形質転換体作製技術を開発し,FAST (Fluorescence-Accumulating Technology)と命名した.この技術により,目的別の形質転換体作製のためのFASTベクターを10種類開発した.この技術については,昨年度の国内特許出願についで,今年度はPCT国際出願を行なった.FAST技術を公開した論文(Shimada et al.,Plant J.,2010)がオンラインで公表されて以来,約4ヶ月で70件余のリクエストがあった.ベルギー国のフランダース・バイオテクノロジー研究機関(VIB)の依頼を受け,FASTベクターの配布を委託した.モデル植物の形質転換技術は植物科学の分野で大きな貢献をしているが,FAST法の利用により,研究の一層の加速が期待できる.
膀胱移植:神経因性膀胱の新しい手術治療法

神経因性膀胱及び低容量膀胱の治療には、従来より腸管利用膀胱拡大術が施行されてきている。しかしながら、腸管粘膜が尿に接触することに由来する術後合併症の発生が問題となっており、必ずしも満足のいく結果が得られていないのが現状である。そこで今回我々は膀胱移植を用い、移植膀胱をレシピエント膀胱に吻合する膀胱拡大術の可能性を実験的に検討した。新生仔BNラットの膀胱(ドナー)を5週齢Lewisラット(レシピエント)の大網に移植した。生着した移植片膀胱を移植後10日目にレシピエントの膀胱に吻合し膀胱拡大術を施行した。免疫抑制剤にはFK506を使用した。その結果、1)ラット同種膀胱移植における免疫抑制剤FK506の有用性を初めて示した。2)移植後大網に生着したドナー移植片をレシピエント膀胱に吻合する、いわゆる膀胱拡大術に初めて成功した。さらに、16週齢成獣ラットをドナーに用いて同様の膀胱拡大術モデルを作成し、これを小腸利用膀胱拡大術モデルと比較検討した。その結果、3)膀胱移植を用いたものは小腸を用いたものに比し、長期経過観察後の合併症の面で有利であった。4)成獣の膀胱でも生着が確認され、生体膀胱移植の可能性が初めて示唆された。【目的】ラットを用いた膀胱移植及び移植膀胱利用膀胱拡大術の可能性を検討した。同種群(Brown Norway→Lewis)は以下6Groupに分類。Group I(n=12)にはFK506を投与せず、Group II(n=16;FK:0.2mg/kg)、III(n=22;FK:0.6mg/kg)、IV(n=16;FK:1.2mg/kg)にはFK506を犠牲死まで投与し続けた。Group V(n=12;FK:0.6mg/kg)、VI(n=12;FK:1.2mg/kg)には移植直後より2週間のみFKを投与し、免疫寛容が得られるかを検討した。また、同系群(n=10)と同種群のGroup III(n=6)のラットでは、移植後10日目に移植膀胱をレシピエント膀胱に吻合、移植膀胱利用膀胱拡大術を施行した。移植後第3、4、5、6週にグラフトを摘出、また膀胱拡大術を行ったラットにおいては術後4週に新膀胱を摘出し、病理学的にその生着状況及び拒絶反応を評価した。【結果】1.同系群:100%のグラフト生着率が得られ、膀胱拡大術も全例で成功した。2.同種群:Group I,II,V,VIでは拒絶反応を認め、免疫寛容を得ることができなかったものの、Group IIIとIVでは拒絶反応を認めなかった。膀胱拡大術は全例で成功し、新膀胱内腔全域に正常な膀胱粘膜を認めた。【結論】移植膀胱利用膀胱拡大術が可能であり、ラット同種膀胱移植において、0.61.2mg/kg/dayのFKを連日筋注投与することで拒絶反応が抑制された。また、今後大動物を用いて同様の膀胱移植を試みる予定である。しかしながら、腸管粘膜が尿に接触することに由来する術後合併症の発生が少なくなく、必ずしも満足のいく結果が得られていないのが現状である。そこで今回我々は膀胱移植を用い、移植片膀胱をレシピエント膀胱に吻合する膀胱拡大術の可能性を実験的に検討した。BN系ラットをドナーに、Lewis系ラットをレシピエントに用いた。生後30日以内のBNラットの膀胱を10-12週齢Lewisラットの大網に移植した。生着した移植片膀胱を移植後2週目にLewisラット膀胱に吻合し膀胱拡大術を施行した。免疫抑制剤にはFK506(0.6mg/kg/day,筋注)を使用した。

3)胎児の組織が大網に移植された場合、高率に生着することはよく知られているが、新生児の組織(腸管、食道や腎など)は生後1週を過ぎたものでは生着しない。しかし、膀胱では生後1週以上の新生児の組織でも大網に容易に生着することを我々が初めて明らかにした。上記の新しい知見をTransplantationおよびJournal of Urologyの英文雑誌に報告した。今回の研究により、膀胱移植を利用した膀胱拡大術の可能性が初めて明らかにされた。今後は大動物を用い、臨床応用が可能であるかを引き続き研究を行っていく予定である。小児外科領域において、二分脊椎症や脊髄腫瘍に伴う神経因性膀胱は、閉塞性尿路障害および膀胱尿管逆流現象の合併による進行性の腎機能障害に加え、尿失禁によるquality of lifeの低下等深刻な問題をかかえている。現在臨床の場において、神経因性膀胱に対する治療法として、胃、小腸、大腸等の消化管を用いた膀胱拡大術が施行されており、荒廃し伸展性を失った膀胱の容量を増加させることが本症患児の腎機能の温存および尿失禁に対して有用であることが報告されている。しかしながら、これらの消化管を用いた膀胱拡大術において、長期的に経過観察した場合、粘液分泌に伴う結石形成や繰り返す尿路感染症、発癌、消化液による潰瘍形成および出血等の合併症も問題視されており、新たな治療法の確立が切望される。近年我々は、神経因性膀胱に対する新しい治療法について検討する目的で、新生仔ラット膀胱を血管吻合を用いずにレシピエントラット大網に移植し、移植片が生着し得ること、さらに、同種移植モデルを用いた検討で、免疫抑制剤(FK506)投与により、膀胱移植における拒絶反応が十分コントロール可能であることも確認している。今回、生体部分膀胱移植の可能性を考慮に入れ、成獣ラット膀胱を移植片とした膀胱移植において、新生仔膀胱を用いた時と同様の生着率が得られるか否かを検討するとともに、膀胱部分切除術を施行したレシピエント成獣ラットについても術後の評価を行い、その安全性について検討した。その結果、成獣ラット膀胱が新生仔の膀胱と同様に生着し得ることが明らかとなり、また、レシピエント成獣ラットに対する安全性も確認し得た。これらの新しい知見は、国際学会で発表した後、英文誌(Journal of Pediatric Surgery)に掲載予定である。
受容体ノックアウトマウスとPETを用いた痛み受容メカニズムに関する研究

近年様々な遺伝子改変動物が薬理学に応用され、多くの新しい知見が得られるようになっている。遺伝子ノックアウトマウスはその特異性が高くいままで薬理学的方法によって明らかにされてきた遺伝子産物の生体における機能をより明確にすることができる。痛み反応や攻撃性、ストレス反応や薬物依存など幾つかの神経系機能に関してより純系のマウスを作成する必要性がある。5世代以上C57B系マウスに交配し、遺伝的に均一なC57BマウスのヒスタミンH1,H2受容体ダブルノックアウトマウスを作成した。作成したH1,H2受容体ダブルノックアウトマウス、H1受容体遺伝子ノックアウトマウス・H2受容体ノックアウトマウスを用いてアロディニアなどの神経障害後の痛み受容においてもH1、H2受容体とも協調的に作用して痛みの受容促進に作用していることがわかった。さらにモルヒネによる鎮痛作用におけるH1受容体の役割についてH1受容体遺伝子ノックアウトマウスを用いて調べた。モルヒネがヒスタミンを遊離させてH1受容体を刺激してモルヒネ鎮痛作用を減弱させていることが示唆された。痛みの受容メカニズムにおけるオレキシンとヒスタミン作用の違いを明らかにした。オレキシンは覚醒反応を強力に惹起するが、脳内や脊椎内に投与するとモルヒネ様の鎮痛作用を起こした。中枢ヒスタミンはH1、H2受容体を介してオレキシンと同様に覚醒反応を起こすが、痛みの受容については促進させることから痛みの受容についてはオレキシンとは逆の作用を持っていることがわかった。各種ノックアウトマウスにおける脳内オレキシン濃度を測定したところ、H1受容体遺伝子ノックアウトマウスの身にオレキシン濃度の低下があり、オレキシンとH1受容体の関連が示唆された。
粒子シミュレーションによる反応性プラズマダイナミクスの解明

反応性プラズマを用いた薄膜形成・表面加工技術(プラズマプロセス)は、半導体から液晶ディスプレイにいたる最先端エレクトロニクスを支える基盤技術である。本研究ではセル内粒子法(Particle-in-cell)とモンテカルロ衝突(MCC)法に基づいた粒子シミュレーションをもちいて、半導体製造過程などで用いられるプラズマプロセス装置のプラズマダイナミックスを解明すること目的としている。本研究で用いるPIC法は、電子速度分布関数等を正確に求めるのに適しており、MCC法は化学反応速度などを反応断面積などの基礎的なデータから正確に指定できるため、反応性プラズマのシミュレーションには最適である。平成11年度の研究で、我々は、平衡平板タイプの容量結合型RF放電によるArプラズマを2次元円筒対象形状でシミュレーションできるPIC/MCCコードを開発した。衝突に関しては、電子と中性Arガスに対して電離、励起、弾性衝突を考慮し、また、Arイオンに関しては荷電交換および弾性衝突を考慮してある。現在のところ、中性ガスは室温で一様分布をしていると仮定している。平成12年度の研究は、上記シミュレーションコードを2周波容量結合型放電のシミュレーションを拡張し、また、プロセス装置の外部回路の導入により、より現実的な条件でシミュレーションがおこなえるようにした。更に、イオンの加速解法等を導入してコードの高速化を実現した。本シミュレーションでは、一周波、二周波の両容量結合型放電において、中性ガスの圧力が低くなるにつれて、電子温度の加熱機構が、オーム加熱から非衝突加熱機構にうつり、アルゴンガスの弾性衝突断面積におけるラムザウア極小値の存在により、電子のエネルギー分布が二重Maxwell分布を示すことが観測された。プロセス用プラズマは一般に不完全電離で、イオン化率は電子の速度分布関数に依存するため、電子速度分布の変化がプラズマの生成効率を通して、プラズマダイナミックス全体に影響する。また、本研究では、現在のところArプラズマのみを取り扱っているが、もっと一般のガス種の場合、プラズマ中の各種の化学反応も同様にプラズマの物理的性質に影響を与える。本研究で用いるPIC法は、電子速度分布関数等を正確に求めるのに適しており、Monte Carlo法は化学反応速度などを反応断面積などの基礎的なデータから正確に指定できるため、反応性プラズマのシミュレーションには最適である。本年度の研究で、我々は、平衡平板タイプの容量性結合型RF放電によるArプラズマを2次元円筒対象形状でシミュレーションできるPIC/MCCシミュレーションコードを開発した。衝突に関しては、電子と中性Arガスに対して電離、励起、弾性衝突を考慮し、また、Arイオンに関しては荷電交換を考慮してある。現在のところ、中性ガスは室温で一様分布していると仮定している。中性ガスの圧力が低くなるにつれて、電子温度の加熱機構が、オーム加熱から非衝突加熱機構にうつり、二重Maxwell分布を示すことがシミュレーションで観測された。本研究ではセル内粒子法(Particle-in-cell)とモンテカルロ衝突(MCC)法に基づいた粒子シミュレーションを用いて、半導体製造過程などで用いられるプラズマプロセス装置のプラズマダイナミックスを解明すること目的としている。平成12年度の研究は、平成11年度に引き続き、2次元円筒対象容量結合型RFプラズマシステムのPIC/MCCシミュレーションを行ったが、本年度より新たに、2周波容量結合型放電のシミュレーションをアルゴン放電においておこない、また、プロセス装置の外部回路の導入により、より現実的な条件でシミュレーションがおこなえるようにした。また、イオンの加速解法等を導入してコードの高速化を実現した。

2周波容量結合型放電では、プラズマ生成を高周波電源(我々の計算では27MHz)につないだ電極側でおこない、もう一方の低周波電源につないだ電極側にプロセスをおこなうウエハーを設置してバイアス電圧を加えることで、プラズマ生成と基板に対するイオンフラックスを独立に制御できるようにしてある。本シミュレーションでは、1周波容量結合型放電の時と同様に、中性ガスの圧力が低くなるにつれて、電子温度の加熱機構が、オーム加熱から非衝突加熱機構にうつり、アルゴンガスの弾性衝突断面積におけるラムザウア極小値の存在により、電子のエネルギー分布が二重Maxwell分布を示すことが観測された。また、シミュレーション結果の密度やイオン化率の半径方向の分布を調べることにより、プロセスの一様性に関して、ウエハー設置側の電極の端の効果の大きさを様々な放電条件の下で調べることができるようになった。
1,2-グリコシド型ポリマーを用いる糖鎖エンジニアリングの新機軸

本研究では生理活性物質の特性改変と、高機能性材料及び生体適合性材料の創製を目的とし、1,2-グリコシド型ポリマーの導入法の開発と新物質の特性評価を目標として研究を推進した。その他の天然糖鎖との物性の比較を通して、糖の連結位置が機能に及ぼす効果を明らかとするとともに、官能基された糖鎖を直接導入できる本手法の利点を活かした新物質創製を目指している。本年度は特に、1バルク表面の糖化法の開発、2オリゴ糖配糖分子の合成と水中における自己組織化挙動の解明、3接着剤の開発、及び4構造材料の開発と特性評価に分類して検討を進めた。結果として、1ガラス表面に対し、パーメチル化した1,2-グルコピラナンを共有結合的にグラフト化する手法を確立した。またそのガラス表面が温度に応じて透過度を変化させることを明らかとした。一方で、2様々な重合度の1,2-グルコピラナンが配糖したグリチルレチン酸誘導体を精密合成した。崇城大学の黒岩教授と連携し、水中でのミセル形成について評価を進めた。糖鎖長の短い配糖体からなるミセルは静置時間につれて2次会合体を形成したが、糖鎖長が長い分子では2次会合体はほとんど観測されなかった。配糖分子における糖鎖長はミセルの速度論的な安定化に関与することを示唆している。更に3すでに知られている糖鎖型の接着材料の構造に倣い、1,2-グリコシド型ポリマーによる接着剤の合成について検討した。水素結合や剛直性が接着性に及ぼす効果や、含水率が接着強度に及ぼす効果について評価を進めた。その結果、剪断応力を加えることによって接着強度が顕著に増加するようなユニークな材料骨格を見出した。また剪断応力駆動型の接着について、構造一般性を検討した。4エステルあるいはウレタンを側鎖に有する1,2-グルコピラナンの合成についても検討を開始し、現在フィルム及び繊維の特性を評価している。予定していた各種項目の検討を順調進めたほか、研究計画の時点では全く予想していなかった新材料として、剪断応力で接着力が顕著に強化する糖鎖型接着剤を見出し、その構造因子の解明についての研究を進めることができた。その構造一般性を評価することにやや時間がかかり、連携研究に関する成果の論文投稿が遅れている。なお、今年度中には間違いなく論文を投稿できるものと考えている。これらを総合して、おおむね順調な進展であると判断しているため。今後は特に1構造材料の開発と特性評価として、エステルあるいはウレタンを側鎖に有するポリマーを合成し、フィルム及び繊維としての機能を評価する。ポリマーの機械的物性と熱物性を測定し、その他の天然糖鎖からなる各種誘導体と物性を比較し、糖の連結位置が機能に及ぼす効果を明らかとする。また2接着剤の開発についても更に検討を進める。すでに知られている糖鎖型の接着材料の構造に倣い、1,2-グリコシド型ポリマーによる接着剤を合成する。具体的には、水素結合や剛直性が接着性に及ぼす効果を評価するほか、含水率が接着強度に及ぼす効果を評価する。またその他の天然糖鎖からなる類縁体と物性を比較し、糖の連結位置が機能に及ぼす効果を明らかとする。すでに剪断応力を加えることによって接着強度が顕著に増加するようなユニークな材料骨格を見出している。そのため、その応力駆動型接着能の構造因子についても明らかとする。更に3連携研究であるオリゴ糖配糖分子の合成と自己組織化挙動について成果をまとめる。まず1,2-グリコシド型ポリマーのワンポット配糖化技術により、糖鎖数の異なる天然配糖体を調製する。これまでにグリチルリチン誘導体の合成について報告しており、その手法に沿ってケルセチンやシアニジン、及び脂肪酸の配糖体を合成する予定である。合成が完了次第、水中における自己組織化挙動について検討する。自己組織化はpH、静置時間、糖鎖数に強く依存し、異なる形状の組織を形成することが明らかになりつつあり、その検討結果を論文にまとめる。また一方で、DDSや光線力学療法などへの応用についても検討する。3の点を迅速に進める目的で、ミセルやDDSに関する研究経験のある研究補助員を雇用する予定である。本研究では生理活性物質の特性改変と、高機能性材料及び生体適合性材料の創製を目的とし、1,2-グリコシド型ポリマーの導入法の開発とその動的な構造特性の解明、及び新物質の特性評価を目標として研究を推進した。その他の天然糖鎖(1,3-, 1,4-,及び1,6-グリコシド型ポリマー)との物性の比較を通して、糖の連結位置が機能に及ぼす効果を明らかとするとともに、官能基された糖鎖を直接導入できる本手法の利点を活かした新物質創製を目指している。具体的には、分子設計された糖型の環状サルファイトをモノマーとして用いた重合により、(i)オリゴ糖を配糖した天然物合成と(ii)超分子化学的な特性評価並びに(iii)バルク材料の糖化による外部刺激応答性材料の創製を目的として、有機化学・超分子化学・高分子化学の全サイドから研究を推進している。本年度は特に、11,2-グリコシド型オリゴ糖を配糖した生理活性天然物の合成と特性評価、21,2-グリコシド型ポリマーのカチオン配位能の評価に加え、3材料表面の糖化法の開発に分類して検討を進めた。結果として、1グリチルレチン酸に任意の重合度のオリゴ糖を配糖させる方法論を確立した。また糖鎖の重合度、pH、時間が水溶液中で形成するミセルの形状に及ぼす効果について評価を開始した。

また一方で、21,2-グリコシド型ポリマーの金属イオン認識能をUV及びCDの滴定実験、Job's plotにより評価した。更に3材料表面の糖化法の開発の一環として、ガラス表面のオリゴ糖化についても検討し、1,2-グリコシド型ポリマーをガラス表面から直接グラフト化させるGrafting-from法と、事前調製したプレポリマーを表面に結合させるGrafting-onto法を開発した。得られた各種表面の温度応答性を評価した結果、グラフト法によって温度応答性が大きく異なることが分かった。予定していたオリゴ糖を配糖した生理活性分子(サポニン類)の合成法を確立し、その水溶液中での自己組織化挙動についての検討を進めたものの、当初想定していなかったpHや静置時間が組織化に重大な影響を与えることを見出したため、その精査に時間がかかり、糖鎖の重合度とミセル化の形状の関連性を十分に詰め切ることができなかった。その一方で、1,2-グリコシド型ポリマーの金属認識能の評価は予定通りに終え、また翌年度予定であった材料表面の糖化法について、十分な成果を挙げ論文投稿することができた。これらを総合して、おおむね順調な進展であると判断しているため。本研究では生理活性物質の特性改変と、高機能性材料及び生体適合性材料の創製を目的とし、1,2-グリコシド型ポリマーの導入法の開発と新物質の特性評価を目標として研究を推進した。その他の天然糖鎖との物性の比較を通して、糖の連結位置が機能に及ぼす効果を明らかとするとともに、官能基された糖鎖を直接導入できる本手法の利点を活かした新物質創製を目指している。本年度は特に、1バルク表面の糖化法の開発、2オリゴ糖配糖分子の合成と水中における自己組織化挙動の解明、3接着剤の開発、及び4構造材料の開発と特性評価に分類して検討を進めた。結果として、1ガラス表面に対し、パーメチル化した1,2-グルコピラナンを共有結合的にグラフト化する手法を確立した。またそのガラス表面が温度に応じて透過度を変化させることを明らかとした。一方で、2様々な重合度の1,2-グルコピラナンが配糖したグリチルレチン酸誘導体を精密合成した。崇城大学の黒岩教授と連携し、水中でのミセル形成について評価を進めた。糖鎖長の短い配糖体からなるミセルは静置時間につれて2次会合体を形成したが、糖鎖長が長い分子では2次会合体はほとんど観測されなかった。配糖分子における糖鎖長はミセルの速度論的な安定化に関与することを示唆している。更に3すでに知られている糖鎖型の接着材料の構造に倣い、1,2-グリコシド型ポリマーによる接着剤の合成について検討した。水素結合や剛直性が接着性に及ぼす効果や、含水率が接着強度に及ぼす効果について評価を進めた。その結果、剪断応力を加えることによって接着強度が顕著に増加するようなユニークな材料骨格を見出した。また剪断応力駆動型の接着について、構造一般性を検討した。4エステルあるいはウレタンを側鎖に有する1,2-グルコピラナンの合成についても検討を開始し、現在フィルム及び繊維の特性を評価している。予定していた各種項目の検討を順調進めたほか、研究計画の時点では全く予想していなかった新材料として、剪断応力で接着力が顕著に強化する糖鎖型接着剤を見出し、その構造因子の解明についての研究を進めることができた。
人工永久凍土低温貯蔵庫の開発とその経時変化に対する研究

1987年12月に人工永久凍土のモデルプラントの完成以来、凍土の構築状況および貯蔵庫内の温度分布、湿度の変化を測定して、その経時変化の調査を行ってきた。また、庫内に野菜(主として、バレイショ、ナガイモ、ゴボウ)を貯蔵して、その品質の変化の検討も行った。その結果、充分に実用可能であることが立証されたものの、23の問題点が残された。ヒ-トパイプの冷却効果が過大なため、厳寒期(1月から3月)の庫内温度が氷結温度以下になった。この問題を解決するため、ヒ-トパイプの半数108本の凝縮部フィンに布シ-トを被覆し、その冷却効果の軽減が可能であることが判明した。ヒ-トパイプは、4月に入ると熱ダイオ-ド性により自動的に停止した。凍土地盤の融解状況は、前年度で70cmであったが、今年度は約2m近く融解した。地方、床地盤の凍結保存状態は、前年度より良好で7月末までマイナスを記録した。このような結果は、今年度新しく用いた自動水張りシステムによるもので、庫内温度がマイナスとなると、庫内側壁から散水されるが、ほとんど側壁に着氷されず、床面に多量の氷盤が作られるためである。この効果は庫内温度を一定する働きを示し、最暖月8月で前年は4.1°Cであったが、今年は2.5°Cとかなり低温状態が保持された。食糧貯蔵庫として重要なことは、貯蔵野菜の鮮度を保持することであり、バレイショ、ナガイモ、ゴボウ、ニンジン共に長期保存が可能で、充分な商品価値を示すことが判明した。今年度から開始した生花の貯蔵であるが、菊、鉄砲ユリ、カ-ネ-ション、スタ-チスでは1ケ月以上の貯蔵が可能であることが分った。バラ、チュ-リップ、かすみ草では23週間程度の貯蔵は可能であったが、全く貯蔵のできないものも3種ほどあった。この種の貯蔵システムは、野菜や生花の保存に適し、出荷調整に対して極めて有効であることが判明した。1987年12月に人工永久凍土のモデルプラントの完成以来、凍土の構築状況および貯蔵庫内の温度分布の測定をして、その経時変化の調査を行ってきた。庫内にバレイショなどを貯蔵して、その品質の変化の検討も行った。その結果、充分に実用可能であることが立証されたもののヒ-トパイプの冷却効過が過大なため、厳寒期の庫内温度が低下し、今年度はその問題を解消するため、ヒ-トパイプの半数108本の凝稲部に布シ-トを被覆し、その削減効果の検討を行った。その結果、ヒ-トパイプの作動を抑制することが判明し、冷却効果の軽減が可能であることが分った。ヒ-トパイプは4月に入ると作動は自動停止し、最暖月でも、熱ダイオ-ド性を保ち、凍土地盤は、直管型ヒ-トパイプで70cmL字型ヒ-トパイプでは、40cm程度の融解が発生したものの、良好に凍土が保存されたことが判明した。床表面は前年度より夏期の温度上昇は少なく、10cm程度深く融解したにもかかわらず、床表面の保存状態が良く、良好な貯蔵環境を示した。食糧貯蔵庫として最も重要なことは、貯蔵物質の鮮度を保持して貯蔵期間を延長することである。

バレイショは貯蔵期間242日で減耕率は男爵3.76%,メ-クイン3.56%、ゴボウは貯蔵期間207日で、2.172.56%であった。ナガイモは貯蔵期間206日で、2.162.41%で、ニンジンは貯蔵期間205日で、2%と、いずれも充分な商品価値があると判断された。成分分折の結果からも含水率は品質への影響が無視できるほどの増加で、問題がない事も判明した。タマネギ、ダイコンの貯蔵性は不良で、この種の貯蔵は難かしいと言える。今後は、庫内温度の厳密な調整方法の確立が必要であり、これには自動水張りシステムが有効と考えられることから、次年度はこのシステムについて実験を行う予定である。1987年12月に人工永久凍土のモデルプラントの完成以来、凍土の構築状況および貯蔵庫内の温度分布、湿度の変化を測定して、その経時変化の調査を行ってきた。また、庫内に野菜(主として、バレイショ、ナガイモ、ゴボウ)を貯蔵して、その品質の変化の検討も行った。その結果、充分に実用可能であることが立証されたものの、23の問題点が残された。ヒ-トパイプの冷却効果が過大なため、厳寒期の庫内温度が氷結温度以下になることである。ヒ-トパイプの半数108本の凝縮部のフィンに布シ-トを被覆し、その冷却効果の軽減が可能となった。しかし、気象変動による外気変動に対応するために、本年度は自動水張り装置を開発し、庫内温度がマイナスになると、庫内側壁の配管を通じて散水される工夫を行った。その結果、期待した程、側壁に氷盤が形成されず着氷しないことが分った。他方、散水された水は流下し、庫内底部に多量の氷盤が形成された。したがって、凍結地盤の側壁は前年度で70cm程度の融解であったのが、今年度は約2m近くまで融解する結果となった。床地盤は前年度より凍結保存状態は良く7月末までマイナスを記録した。自動水張りシステムの効果により、最暖月8月でも2.5°Cとかなり低温状態が保持される結果となった。前年と同様に野菜保持状態は良く、根菜類は通年貯蔵可能となった。他方、今年度4回に渡って生花の貯蔵を開始したが、菊、鉄砲ユリ、カ-ネ-ション、スタ-チスでは1ケ月以上の貯蔵が可能であることが判明した。貯蔵時には蒸散作用を抑えるため、フィルムラップで包装も不可欠であった。他方、バラ、チュ-リップ、かすみ草については23週間程度の貯蔵が限界であった。全く貯蔵できない生花は、アイリス、リアトリス、シンピジュ-ムであり、貯蔵方法の改善が必要と考えられる。この様に比較的高価な生花貯蔵は野菜貯蔵と同様に重要となってくると考える。
三次元計測技術を用いた新羅王陵石像彫刻の総合的比較研究

韓国・慶州市とその近郊に所在する新羅王陵には、多種多様な石像彫刻が配置されおり、その様式は中国陵墓の強い影響を受け、それに独自の要素を加味し成立したものと考えられている。本研究では、先ず新羅王陵の幾つかに見られる石像彫刻並びに墳丘外護列石の十二支像レリーフを対象としレーザーにより三次元計測を行った。墳丘に至る神道を挟んで、華表、武人、文官、獅子、亀趺等が配置されている。調査は新羅王陵の内、石像彫刻が存在する古墳を対象とした。調査を実施した古墳は眞徳王陵・武烈王陵・聖徳王陵・景徳王陵・元聖王陵・憲徳王陵・興徳王陵の各古墳である。さらにこれら新羅王陵と関連する資料として、ほぼ同時期に築造された古墳、或いは当該時期に製作された石塔、燈籠、浮屠等に見られる十二支像レリーフを三次元計測し、比較材料として資料の蓄積を計った。調査対象としたのは九政洞方形墳、遠願寺址東西層層石塔(慶州市外東友邑毛火里山8-2)、太和寺址浮屠(蔚山廣域市中區鶴城洞67)、陵旨塔(慶尚北道慶州市排盤洞621-1)、開心寺址五層石塔(慶尚北道慶州市泉邑南本里200)、縣一洞三層石塔(慶尚北道英陽郡英陽邑縣一里398-5)、慶州校洞石燈(慶尚北道慶州市校洞)、臨河洞十二支三層石塔(慶尚北道安東市臨河面臨河里794)、琴韶洞三層石塔(慶尚北道安東市臨河面琴韶里560)、化川洞三層石塔(慶尚北道英陽郡英陽邑化川里835)、華嚴寺西五層石塔(全羅南道求禮郡華嚴寺)の石塔及び浮屠である。これらの三次元画像のデータ資料は、日本へ持ち帰った後、画像処理をおこない、データの蓄積を計った。更にそれらの画像資料を基とし、実際のレリーフに中には、風化や汚れのためその細部が判別しにくくなっている事例が含まれるため、それらの画像資料を基に再度現地にて確認・校正作業を行った。それと共に、各地域の博物館や大学収蔵されている類似資料にも目を向け、これらの実測調査も同時に行った。九政洞方形墳隅柱石、石函、滑石製十二支像等の資料についても計測を行いデータの集積を計った。また、石像彫刻の内、特に武人像や文官像には、顔立ちや衣装或いは持物に、顕著な西域的要素が認められる事、更に、石像物の中には連珠文などペルシア或いはソグド美術と深い関係が考えられる事などを考慮し、中国西域地域の類例調査を実施した。現地調査を実施した地域は、新彊・烏魯木齋、喀什、和田、民豊、庫車、吐魯番の各地域の博物館並びに石窟寺院である。特に陶〓に見られる人物、衣装等の表現に注目し、新羅石像武人像に見られる表現との比較を行った。これにより顔立ちなどの表現は勿論、衣装に見られるポシェットなどの持物についても関連する部分が多い事が判明した。更に石窟寺院に見られる壁画の中から、連珠文関係の資料を収集した。国立慶州博物館が所蔵する連珠文石像物は、文様としては樹木、獅子、孔雀などモチーフが使われており、類似する部分が多く認められる。しかし文様構成に目を向けると中心に見られる樹木を挟み左右対称な事例が多いのに反し、左右秘対称性など韓半島で変容、構成されたと見られる部分が存在している点が指摘出来た。これらのモチーフが韓半島、特に新羅の地域でどのように受容され、そして変容していったのかを具体的に知る材料が得られたと考える。

調査対象としたのは九政洞方形墳、遠願寺址東西層層石塔(慶州市外東友邑毛火里山8-2)、太和寺址浮屠(蔚山廣域市中區鶴城洞67)、陵旨塔(慶尚北道慶州市排盤洞621-1)、開心寺址五層石塔(慶尚北道慶州市泉邑南本里200)、縣一洞三層石塔(慶尚北道英陽郡英陽邑縣一里398-5)、慶州校洞石燈(慶尚北道慶州市校洞)、臨河洞十二支三層石塔(慶尚北道安東市臨河面臨河里794)、琴韶洞三層石塔(慶尚北道安東市臨河面琴韶里560)、化川洞三層石塔(慶尚北道英陽郡英陽邑化川里835)、華嚴寺西五層石塔(全羅南道求禮郡華嚴寺)の石塔及び浮屠である。これらの三次元画像のデータ資料は、日本へ持ち帰った後、画像処理をおこない、データの蓄積を計った。更にそれらの画像資料を基とし、実際のレリーフに中には、風化や汚れのためその細部が判別しにくくなっている事例が含まれるため、それらの画像資料を基に再度現地にて確認・校正作業を行った。それと共に、各地域の博物館や大学収蔵されている類似資料にも目を向け、これらの実測調査も同時に行った。九政洞方形墳隅柱石、石函、滑石製十二支像等の資料についても計測を行いデータの集積を計った。また、石像彫刻の内、特に武人像や文官像には、顔立ちや衣装或いは持物に、顕著な西域的要素が認められる事、更に、石像物の中には連珠文などペルシア或いはソグド美術と深い関係が考えられる事などを考慮し、中国西域地域の類例調査を実施した。現地調査を実施した地域は、新彊・烏魯木齋、喀什、和田、民豊、庫車、吐魯番の各地域の博物館並びに石窟寺院である。特に陶〓に見られる人物、衣装等の表現に注目し、新羅石像武人像に見られる表現との比較を行った。これにより顔立ちなどの表現は勿論、衣装に見られるポシェットなどの持物についても関連する部分が多い事が判明した。更に石窟寺院に見られる壁画の中から、連珠文関係の資料を収集した。国立慶州博物館が所蔵する連珠文石像物は、文様としては樹木、獅子、孔雀などモチーフが使われており、類似する部分が多く認められる。しかし文様構成に目を向けると中心に見られる樹木を挟み左右対称な事例が多いのに反し、左右秘対称性など韓半島で変容、構成されたと見られる部分が存在している点が指摘出来た。これらのモチーフが韓半島、特に新羅の地域でどのように受容され、そして変容していったのかを具体的に知る材料が得られたと考える。今年度は当初の予定通り、韓国慶州市周辺に分布する新羅王陵(掛陵・聖徳王陵・九政洞方形墳・興徳王陵・景徳王陵・金庚信墓・眞徳王陵・憲徳王陵)に所在する、十二支レリーフのレーザー3次元計測を国立慶州文化財研究所の協力を得て実施した。十二支レリーフは墳丘のそれと共に、それぞれの彫刻に就いて熟観調査を実施し、略測によるメモ図面の作成及び詳細な部分写真撮影を実施した。これによって風化作用の進行によって、レーザー計測では認識されにくくなってしまっている細部表現を中心に検討を重ね、大部分については復原的な図化を行うことが出来た。また、各古墳から現在は博物館に移動している石像も幾つか認められる。博物館資料としては国立中央博物館に聖徳王陵の十二支(申)及び金庚信墓出土の滑石製十二支像、壇国大学校博物館に滑石製十二支像(1点)、国立慶州博物館に九政洞方形墳の隅石、金庚信墓出土滑石製十二支像(3点)等が所蔵されているが、これらの内の幾つかに関して、同様のレーザー計測作業を行った。これらについては各所蔵博物館に於いて測図を行ったが、地元慶州市以外の機関にも分散所蔵されているため、今後継続的に計測を行う予定である。実測後、直ぐにデータの解析に当たり、1mmコンタ図、立体画像図、コンタ図と立体画像図の合成図面等を作成した。また、現地での観察結果も踏まえ、これらの図面を基に実測図を起こした。これら同一スケールによる図面の完成によって各古墳の彫像、レリーフ等の比較が極めて容易くなった。特に十二支が身につける衣装、持ち物等の細部比較等美術史的検討を行う上では極めて有効な手段であることが改めて認識された。考古学的にも各レリーフの断面図が意図する箇所で簡単に作成できる利点があり、制作面から見たレリーフの時期的変遷をより視覚的に表すことが可能となった。今年度は慶州市一帯に分布する統一新羅期の石塔に見られる十二支像のレーザー三次元計測を実施した。十二支像は新羅王陵外護列石に見られるものと深い共通性があり、両者のレリーフの比較研究は、モチーフの変遷を辿る上で重要なテーマである。石塔の調査については、国立慶州博物館の協力を得て共同で進めた。
コムギ無細胞系とNGS技術を融合したドチザメナノボディ選抜・構築技術の開発

前年度は、Fukabodyの評価系の構築を目指し、ドチザメ科IgNAR遺伝子のクローニングを行った。さらにVenusタンパク質をモデルに、ドチザメの1種で愛媛県沖で入手が容易なエイラクブカのFukabody(愛媛県産サメ抗体の名称)の単離、抗体価評価に成功した。得られた抗VenusFukabodyを用いてFukabodyの評価系の構築を行った。本年度は、次世代シークエンス技術を基盤としたエイラクブカのFukabody遺伝子のクローン化技術の開発を行った。これら一連の実験から、エイラクブカFukabody技術の開発の全容と、企業化に向けた課題も明らかとなった。1)次世代シークエンス技術を用いたエイラクブカFukabody遺伝子のシークエンス現時点でサメの抗体産生細胞のハイブリドーマ化は不可能であり、また抗体産生細胞マーカーの存在も未解明であるため、抗体産生細胞の濃縮は困難である。そこで本年度は近年技術革新が目覚ましい次世代シークエンス技術による可変領域Amplicon sequencingデータを用いた。上記のVenusタンパク質を免疫したエイラクブカを用いてファージライブラリーを作成し、抗原を用いたバイオパンニング前と3回までのバイオパンニング後の各ライブラリーを次世代シークエンスにより解析したところ、バイオパンニングごとに濃縮されるFukabody遺伝子が見出され、それらは抗原への結合能を有していた。この結果、次世代シークエンス技術を用いて抗原特異的エイラクブカFukabody遺伝子の単離法が確立できた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ドチザメナノボディ開発の基盤データとなる、世界初のドチザメ血球細胞由来RNAを用いた次世代シークエンサーによる、ドチザメ科4種の免疫系のwhol e transcriptome解析を行った。ドチザメの飼育および採血は、愛媛県栽培資源研究所と共同で行った。I.ドチザメ科サメ4種の免疫系遺伝子発現解析1)免疫系遺伝子群の評価:ドチザメ科4種類(ドチザメ、シロザメ、ホシザメ、エイラクブカ)からそれぞれ採血し、挑戦的萌芽予算で確立したドヂザメ血液からのRNA単離法を用いて、DNAのコンタミを極力無くした単離RNAを材料に、Illumina社HiS eq1500によるRNA-seq解析を行い、これまでにサメでは報告のなかった、Toll様受容体などを新たに見出すことに成功した。2)完全長ドヂザメナノボディ遺伝子のクローン化:ドチザメ以外のシロザメ、ホシザメ、エイラクブカのナノボディ遺伝子(完全長の場合IgNAR遺伝子と)の配列は未知であった。I-1)で得られた配列データからプライマーをデザインし、最終的RT-PCRにより完全長ナノボディ遺伝子を単離するができた。3)免疫抗原応答性ドチザメナノボディ遺伝子発現解析:本年度は、モデルとしてGFP抗原を用いて実験を行った。複数匹のドチザメ科4種の抗原GFP免疫の前後の血液を採血し、新たにドチザメナノボディ認識抗体を用いて、抗原により誘導されたナノボディを検出することができた。その結果、1種類のドチザメ種において、抗原依存的なナノボディの産生が確認できた。当初の予定通り、研究は進んでいる。ドチザメナノボディおよびigWを認識する抗体産生に成功し、サメの種類によっては、ナノボディよりもIgWの誘導が多い種がいることには驚きであった。前年に、ドチザメ科のエイラクブカ、シロザメ、ホシザメの3種のRNAを混合したサンプルを用いて、免疫関連遺伝子群およびドチザメ抗体(Fukabody)遺伝子のwhole transcriptome解析を行った。本年度は、Fukabodyの評価系の構築を目指し、ドチザメ科IgNAR遺伝子のクローニングを行った。さらにVenusタンパク質をモデルに、エイラクブカのFukabodyの単離、抗体価評価に成功した。1) Fukabody検出抗体の構築前年度の配列情報を元にRT-PCRを行った結果、ホシザメ、エイラクブカのIgNAR遺伝子のクローニングに成功した。得られた遺伝子配列情報を元に、エイラクブカのIgNARのコンスタント領域のタンパク質を大腸菌で合成し、ウサギに免疫し、抗エイラクブカIgNAR認識2次抗体の作製を行い、その結果、3種のFukabody遺伝子の配列情報とホシザメ、エイラクブカのIgNAR遺伝子のクローニングに成功した。次に、Venusタンパク質をそれら3種のサメに免疫した結果、エイラクブカの血液中に抗原依存的なIgNARの誘導が確認されたので、免疫したエイラクブカの脾臓を単離し、Fukabody遺伝子領域をPCRで増幅し、ファージライブラリーを作製し、Venusタンパク質に結合するFukabodyを3種類単離することに成功した。得られたFukabodyを抗体評価を行ったところ、Fukabodyは80°Cで1時間ボイルしても活性を保持しており、抗体価は平均で約10E-08であることが分かった。当初の予定通り進み、抗原に特異的結合するFukabodyの単離に成功した。また、Fukabodyタンパク質の発現系の構築に成功し、mgオーダーでFukabodyが生産できる体制が確立できた。

さらにVenusタンパク質をモデルに、ドチザメの1種で愛媛県沖で入手が容易なエイラクブカのFukabody(愛媛県産サメ抗体の名称)の単離、抗体価評価に成功した。得られた抗VenusFukabodyを用いてFukabodyの評価系の構築を行った。本年度は、次世代シークエンス技術を基盤としたエイラクブカのFukabody遺伝子のクローン化技術の開発を行った。これら一連の実験から、エイラクブカFukabody技術の開発の全容と、企業化に向けた課題も明らかとなった。1)次世代シークエンス技術を用いたエイラクブカFukabody遺伝子のシークエンス現時点でサメの抗体産生細胞のハイブリドーマ化は不可能であり、また抗体産生細胞マーカーの存在も未解明であるため、抗体産生細胞の濃縮は困難である。そこで本年度は近年技術革新が目覚ましい次世代シークエンス技術による可変領域Amplicon sequencingデータを用いた。上記のVenusタンパク質を免疫したエイラクブカを用いてファージライブラリーを作成し、抗原を用いたバイオパンニング前と3回までのバイオパンニング後の各ライブラリーを次世代シークエンスにより解析したところ、バイオパンニングごとに濃縮されるFukabody遺伝子が見出され、それらは抗原への結合能を有していた。この結果、次世代シークエンス技術を用いて抗原特異的エイラクブカFukabody遺伝子の単離法が確立できた。平成29年度は、ドチザメナノボディの単離および評価系構築を行う。これにより、4種のドチザメナノボディの抗体価などの評価ができると同時に、組換え単一ナノボディの選抜が可能となるため、我々が既に保持している抗体との比較から、サメを免疫生物種とすることによる、抗原性の広がり、抗体価、安定性など、ドヂザメナノボディの利点と欠点を評価できるものと思われる。平成30年度は、抗原に結合したFukabodyの構造解析を行う。これにより、Fukabodyがどの様な構造を形成し、抗原を認識しているか理解できると期待される。また、次世代シークエンスの解析を行い、抗原特異的なFukabodyの選抜過程を配列情報としてトレースしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
中国西部内陸部における人工湿地の植生管理がその水質浄化能に及ぼす影響の定量的評価

富栄養化が進む中国雲南省最大の淡水湖、テン池では、湖岸植生帯の設置による水質浄化が試みられている。そこに栽植されたヨシの刈取りは、窒素・リン等の栄養塩類除去に貢献すると考えられているが、刈取りしたバイオマスの処理が問題となり実用化されていない。一方、流域外から持ち込まれる家畜飼料が、テン池への窒素負荷を増大させる主要因であると指摘されている。そこで、湖岸植生帯のヨシの飼料化により飼料自給率を向上させ系外からの窒素負荷量を抑えるため、本研究では、テン池の湖岸植生帯において、ヨシの収量・飼料価値を向上させる刈取り方法を検討すると共に、刈取りが湖岸植生帯での窒素除去能へ及ぼす影響を評価した。1)ヨシの刈取り再生後も出穂期までに収穫することを前提に、年3回刈取りが高いTDNを維持しながら総収穫量、窒素持ち出し量を最大化できる刈取方法であることを示した。2)広域分布種であるヨシは遺伝的多様性が高いとされることから、テン池を含む中国南西部の植生帯などから収集したヨシ属を対象に、ハプロタイプネットワークの作成とAFLP解析を実施した。推定した系統関係によると、中国南西部のヨシ属は、大きく熱帯型と温帯型に分類され、さらに主に4つのハプロタイプに分類された。3)ヨシ群落における窒素動態に対するリターの影響を評価するため、前年度に人工湿地に15N標識リターを添加したが、今年度はリター、植物体、そして、土壌試料を採取し、取り込まれた同位体量を測定した。添加から半年で、リター由来窒素の植物体による回収率は約1割で、底質表層にあるルートマットによる回収率は約2割であった。残る7割の窒素は水へ溶出したか、脱窒したものと推察された。以上より、これまで報告例が比較的少なかった中国における農業に起因する環境負荷の改善方策、すなわち湖岸植生帯での合理的なヨシの粗飼料生産の方策とその根拠を提示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。環境負荷改善のために設置された中国西部の人工湿地におけるヨシ群落の水質浄化能と、そのヨシの飼料化によって実現される物資循環の回復における重要課題である刈り取りしたヨシの飼料価値を評価するために、昆明市内の二箇所の湿地で現地調査を実施し、以下の成果を得た。1.ヨシ群落における窒素除去動態の評価:刈り取り時期とその頻度を組み合わせた試験区を人工湿地に設置し、植物体、底質、水を定期的に採取・分析し、ヨシ群落の刈り取り時期と頻度がヨシ群落の窒素除去動態に及ぼす影響を明らかにした。2.ヨシの飼料価値の評価:刈り取り時期の異なるヨシの生産量と可消化養分総量の季節変化を調査し、ヨシを家畜飼料として利用する場合の最適な刈り取り時期を明らかにした。3.ヨシ系統の収集と評価:水質浄化能や飼料価値の高いヨシを導入するために、中国西部内陸部の20地点からヨシを採取し、それらの系統間差の評価を開始した。本研究では、環境汚染が深刻な中国の耕地生態系(耕地ー作物ー家畜ー大気・水域)における物質循環の回復による環境負荷の低減を最終目的としている。平成26年度は、中国西部内陸部の環境汚染が深刻な地域において環境負荷改善のために設置された人工湿地におけるヨシ群落の水質浄化能と、そのヨシの飼料化による物資循環の回復においての重要課題である刈取りしたヨシ地上部の飼料価値の季節変化を明らかにした。そして、最適な刈取り方法(時期・頻度)を水質浄化能と飼料価値の季節変化から総合的に検討した。1)ヨシ群落における窒素動態の評価:昆明市内の異なる二箇所の人工湿地において、異なる頻度(年0ー3回)の刈取り試験を今年度も継続して行い、植物体、底質、水を定期的に採取し、植物体の窒素吸収能、底質における窒素動態を定量的に分析し、ヨシ群落の刈取り時期と頻度がヨシ群落の窒素除去動態に及ぼす影響を評価した。また、ヨシ群落における窒素動態に対するリターの影響を評価するために昆明理工大学で栽培・作成した15N標識リターを人工湿地に添加した。2)ヨシの飼料価値の評価:上記刈取り試験から得られた植物体飼料の収量と飼料成分を解析した結果、刈取り頻度の増加は、収量性と飼料価値を著しく向上できることを明らかとした。3)ヨシ系統の収集と評価:水質浄化能や飼料価値の高いヨシを導入するために、今年度は中国西部内陸部の新たに20地点(雲南省、四川省、貴州省、重慶市など)からヨシ属の植物体を採取し、葉身からDNAを抽出した。初年度のサンプルも合わせて合計40点のサンプルを用いて、ハプロタイプ解析とAFLP解析を行い、遺伝的多様性の評価を行った。2地点の人工湿地のヨシ群落において、同位体希釈法による土壌培養と植物体の窒素分析を行ってきた。その結果から、窒素持ち出し量を増加させるための刈取りの必要性を確認できた。また、ヨシの収量性と飼料価値を両立させるための刈取り頻度の検討することができたことから、おおむね順調に進展していると考えている。

一方、流域外から持ち込まれる家畜飼料が、テン池への窒素負荷を増大させる主要因であると指摘されている。そこで、湖岸植生帯のヨシの飼料化により飼料自給率を向上させ系外からの窒素負荷量を抑えるため、本研究では、テン池の湖岸植生帯において、ヨシの収量・飼料価値を向上させる刈取り方法を検討すると共に、刈取りが湖岸植生帯での窒素除去能へ及ぼす影響を評価した。1)ヨシの刈取り再生後も出穂期までに収穫することを前提に、年3回刈取りが高いTDNを維持しながら総収穫量、窒素持ち出し量を最大化できる刈取方法であることを示した。2)広域分布種であるヨシは遺伝的多様性が高いとされることから、テン池を含む中国南西部の植生帯などから収集したヨシ属を対象に、ハプロタイプネットワークの作成とAFLP解析を実施した。推定した系統関係によると、中国南西部のヨシ属は、大きく熱帯型と温帯型に分類され、さらに主に4つのハプロタイプに分類された。3)ヨシ群落における窒素動態に対するリターの影響を評価するため、前年度に人工湿地に15N標識リターを添加したが、今年度はリター、植物体、そして、土壌試料を採取し、取り込まれた同位体量を測定した。添加から半年で、リター由来窒素の植物体による回収率は約1割で、底質表層にあるルートマットによる回収率は約2割であった。残る7割の窒素は水へ溶出したか、脱窒したものと推察された。以上より、これまで報告例が比較的少なかった中国における農業に起因する環境負荷の改善方策、すなわち湖岸植生帯での合理的なヨシの粗飼料生産の方策とその根拠を提示した。中国西部内陸部における人工湿地の植生管理がその水質浄化能に及ぼす影響を定量的に評価するために、異なる刈り取り条件の試験区を設置し、現地調査を開始した。さらに、刈り取ったヨシの可消化養分総量と収量の季節変化を調査し、ヨシを家畜飼料として利用する場合の最適な刈り取り時期を明らかにした。1ヨシのリターが介する窒素動態を明らかにするため、人工湿地に添加した15N標識リターの定期的なサンプリングと同位体分析を行う。2ヨシの多回刈りは次年度の生育に影響することが予想されたため、継続して人工湿地においてヨシ地上部と地下部の試料の採取と窒素分析を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。湿地における現地調査を継続的に実施する。今後は、植物の窒素吸収量の評価のみならず、底質における硝化・脱窒・無機化・有機化といった窒素動態を定量的に調査する。最終的には、窒素循環モデルを作成し、ヨシ群落における窒素除去能を向上させるための最適な刈り取り方法を開発する。