hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学習者の授業後報告文に基づく行動特性の推定と授業評価手法の研究

学習者の毎回の授業後の報告文の分析を行い,学習者の学習行動特性や授業評価と関連の強いと思われる語句や表現の抽出を行った.学習行動特性として,学習の意欲や努力度,理解度,協調度,気づき度の5項目を設定し,各項目に関する語句の抽出を行った.これら抽出語句や学習行動特性と,学習者の最終成績との相関を調査した.最終成績推定手法として,様々な機械学習手法を組み合わせて利用し,推定精度の改善を図った.最終成績推定精度と,授業の難易度との間に,相関があることを確認した.特に,報告文の記載には,記載内容の例示やモチベーションアップのためのコメントのフィードバックが必須であることを確認した.平成26年度の研究計画目標は、大別して、次の2点であった。(1)学習者の毎回の授業後の報告文の分析を行い、その結果から、学習者の学習行動特性や授業評価と関連の強いと思われる語句や表現の抽出を行うこと。(2)(1)で抽出した語句や表現と、学習者の最終成績との相関について調査・分析を行うこと。さらに、複数の授業回での各学生についての予測成績の変化や、予測した最終成績のクラス内での分布と、予測精度との間に高い相関があることを確認した。学習者の最終成績推定に関する成果は、査読付きの国際学会6件、査読無し国内学会1件で口頭発表を行うとともに、査読付き英文論文誌2件に公表した。さらに論文誌に1件、投稿中である。その他に、査読付き国際学会4件の受理が決まっている。さらに、サウジアラビアの大学の教員と協力し、学生の授業後報告文の収集を試行した。サウジアラビアの大学の学生に、報告文を記載してもらう際には、記載内容の例示や、モチベーションアップのための、コメントへのフィードバックが必須であることを確認した。平成27年度は,論文誌4件(和文,英文各2件),Book Chapter 1件,国際会議6件に研究成果を報告した.さらに,国際論文誌1件と国際会議2件に投稿中であるなど,研究成果(アウトプット)は計画以上に上げている.具体的な成果の内容は次の通りである.1)授業後に提出してもらった学生自身が記した授業に対する学習内容に関するコメント文に基づき,学生の最終成績についての推定手法を様々考案した.特に,推定精度向上のため,様々な機械学習手法を試し,95%近くのF1値の獲得ができることを示した.高精度の推定が可能となった一つの鍵は,複数回のコメント文の内容を考慮するようにしたことである.2)学習態度や理解度,協調性,予習・復習への努力度など,学習に関連する属性を設定し,コメント文中の言葉とその属性とのマッピングを取ることで,成績のランクに応じた学生の学習属性とその値の特徴などを明らかにした.3)複数の教員のそれぞれの授業で集めた学生のコメント文に対して,我々が提案した最終成績推定手法が適用できること,すなわち,いずれのコメント文に対しても高い精度での最終成績推定ができることを確認した.4)最終成績推定を通して,学生のコメント文の内容の質が,授業回が進むに連れて徐々によくなることを確認した.特に,学習態度や理解度,他の学生との協調度などの,我々が学習属性として重視している項目との関連度が強くなること,それに伴って,最終成績推定精度が向上することを確認した.5)サウジアラビアの大学の教員の協力を得て,その教員の授業を受講している150名の学生からコメント文を取得した.その際,コメント文の質の向上のためには,教員のコメント文の書き方の指導やコメント文の内容に応じた個別の助言が不可欠であること,与えられた助言によって,コメント文の質が向上し,それが最終成績推定精度の向上に役立つことを明らかとした.当初予定していた内容1)学生の学習属性の設定,2)学生のコメント文中の語句と学習属性との対応,3)複数の授業で収集したコメント文への提案手法の適用,4)コメント文の質と授業回との関係の明確化など,ほぼ全て終了した.また,海外の学生からも,コメント文の収集が可能となることを明らかとし,そのコメント文についても同様に,提案手法が適用できることを明らかとした.これらは,3年計画で進めていたが,1年を残し,ほぼ終了した.また,本研究の成果は,中学生の学習状況改善や,コールセンターなどへも応用可能であり,それらからの引き合いも来ている.平成27年度までに,学生の学習能力(最終成績)の推定結果と,授業内容との相関が取れることがわかったことから,平成28年度は,特に,学生の学習状況や学習能力の推定法について注力し,研究を実施した.研究では,推定手法の精度を向上させるために,様々な機械学習手法を組み合わせた実験を行った.具体的には,1) pLSAとLDAというトピックモデルと,Support Vector Machine (SVM)やArtificial Neural Network (ANN)という機械学習手法との組み合わせによる推定精度の向上法の開発,2)二段階マルチインスタンス学習法と,複数授業回の成績推定結果を利用した多数決法との特徴比較,3)SVMやRandom Forest (RF)による学習モデルからの特徴規則抽出による精度向上法の開発,4)教師による学生への振り返り文の書き方指導による,学習者の学習属性の抽出促進法の開発などを行った.研究成果は,論文誌1本の他,国際会議3件で発表を行った.そのうち,1件でBest Student Paper Awardを獲得した.また,学生のコメントに対して返信をできる仕組みをWebサービスとして実現し,コメントと返信内容の対を記録した.

これは,自動返信の仕組みを実現するためのデータ取得に対応する.また,中学生のコメント文に対しても,これまで開発してきた手法を適用することで,大学生とのコメント内容の違い,回答されたコメント内容と,期末試験時期との関連性などの有無について明らかにした.これにより,本研究で開発してきた手法が,大学生のコメント文だけでなく,中学生のコメント文に対しても適用可能となることを確認した.学習者の毎回の授業後の報告文の分析を行い,学習者の学習行動特性や授業評価と関連の強いと思われる語句や表現の抽出を行った.学習行動特性として,学習の意欲や努力度,理解度,協調度,気づき度の5項目を設定し,各項目に関する語句の抽出を行った.これら抽出語句や学習行動特性と,学習者の最終成績との相関を調査した.最終成績推定手法として,様々な機械学習手法を組み合わせて利用し,推定精度の改善を図った.最終成績推定精度と,授業の難易度との間に,相関があることを確認した.特に,報告文の記載には,記載内容の例示やモチベーションアップのためのコメントのフィードバックが必須であることを確認した.本研究で目標としていた学習者の学習行動特性や授業評価に関する語句の抽出については、学習者の新たな授業後報告文の収集が必要であるが、その収集と分析には時間がかかるため、平成26年度には、まず、授業後報告文として収集すべき項目の設定と、報告文の収集だけを優先的に進めた。また、授業後報告文に基づいた学習者の最終成績推定については、その推定精度が十分ではないと感じられていたので、その手法の改善を優先的に進めた。推定精度については、様々な改善手法を提案し、2つの論文誌(さらに1件、投稿中)と9つの国際学会で報告(発表予定を含む)することができ、十分な成果を得たと言える。また、当初、エジプトの大学の学生から授業後報告文を収集することを予定していたが、その収集を許可してもらえなかったため、別の収集協力者を探すことに時間がかかったが、現在は、サウジアラビアの大学の教員と協力し、授業後報告文の収集を続けている。現在はバッチ処理で最終成績推定を行っているが,これをリアルタイム処理可能とし,学生に対して,推定された学習状況の変化を示し,学習行動のモチベーションアップにつなげていきたい.また,本研究の成果を横展開するための仕組みの開発に取り組みたい.情報知能工学まず、平成26年度に収集した学生の授業後報告文の分析を進めるとともに、今年度も、あらたな学生の授業後報告文の収集につとめ、分析を行う。本年度は、特に、授業評価指標の定義と、分析結果の提示を試みる。論文誌に投稿を行っているため,その掲載費用と国際会議出席のための費用として残す必要があったこと,また,新たなシステム開発とデータ取得に利用する携帯型計算機の購入費用として繰越す必要があったため.平成26年度末に、当該年度の成果を国際会議へ投稿し、その旅費確保のために、使用を控えたこと。論文誌掲載費用,国際会議出席費用,携帯型計算機の購入に利用する.採択が決まっている国際会議(AIED,EDM)の発表の一部として利用する。
オゾン層回復に重要な影響を与える大気反応過程の実験的研究

対流圏における不飽和炭化水素類と塩素原子反応の実験的研究BrやClといったハロゲン原子の反応は、大気中のオゾン濃度に大きな影響を与えることが知られている。また、不飽和炭化水素(アルケン)類は、その反応性の高さから、都市域において高濃度の光化学スモッグが発生する一因ともなっている。特に人為排出において、エチレン(C_2H_4)やプロピレン(C_3H_6)、アセチレン(C_2H_2)といった低分子量のアルケン類の排出量が多く、これらアルケン類とCl原子との大気反応過程の理解が、大気オゾン濃度の将来予測のために必要である。また、アルケン類とCl原子の反応は、圧力依存性を示す。付加反応とH原子引き抜き反応が複雑なバランスで競争している低圧側の反応を、高感度な実験手法を用いて詳しく調べることは、基礎的な反応機構の理解のためにも重要である。本研究では、新しいレーザー技術であるレーザー光分解/真空紫外レーザー誘起蛍光(PLP-LIF)法を用いて、Cl原子と低分子アルケン類(C_2H_4、C_3H_6、C_2H_2)との絶対速度定数の測定を行った。測定は、全圧2-100Torr、室温(295±2K)、Cl原子の初期濃度に対して反応物の濃度が過多という擬一次条件にて行った。反応チャンバーにアルケン類(C_3H_6、C_2H_4、C_2H_2)/Cl_2/N_2の混合気体を流す。そこに351nm光分解レーザーを照射し、Cl_2光分解によってCl(^2P_<3/2>)を生成、アルケン類との反応によるCl(^2P_<3/2>)のLIF信号の減衰を観測した。減衰曲線フィッティングから得た擬一次反応速度を様々な反応物濃度に対してプロットし、直線の傾きからそれぞれの圧力条件における2次の速度定数を決定した。本研究によって得られた反応速度k(Cl+C_3H_6)とk(C_2H_4+Cl)、k(C_2H_2+Cl)のいずれも、従来の異なる実験手法による測定値と非常に良く一致していることがわかった。過去の実験手法では、他の反応物とアルケン類との相対的な濃度変化によって速度定数を得る相対速度(RR)法によるものが主であった。一方、本研究(PLP-LIF法)は、134.72nmの真空紫外レーザー光によってCl(^2P_<3/2>)のLIF信号を直接検出して絶対速度定数を得ている。異なる案験手法による測定値の一致は、データの信頼性をより一層高め、将来の大気オゾン濃度予測の精度向上に役立つものとして重要である。臭素(Br)原子の関わる化学反応の理解は、今後のオゾン層回復予測に際して、オゾン層破壊物質であるハロンなどの臭素化合物の大気中の挙動を明らかにするために重要である。本研究では、最新のレーザー技術を用いた新しいBr原子の検出法の開発を行い、Br原子の化学反応過程の詳細を明らかにすることを目指している。本研究で用いる真空紫外レーザー誘起蛍光法は、分子やラジカルの光吸収帯に共鳴するレーザー光を照射し、電子励起された分子やラジカルからの蛍光発光を光電子増倍管で観測する手法である。この方法には、波長可変で波長幅が狭く、時間幅の狭いレーザーパルスによって原子を選択的に検出することができるといった利点がある。本研究においては、158nm付近の真空紫外レーザー光を使ってBr原子の一光子励起LIF信号の検出するため、従来の多光子イオン化法や、二光子励起LIF法などに比べて高感度なBr原子の検出が可能となる。これまでに、Br原子の4p^5 ^2P_<1/2>-4p^45s ^2P_<3/2>遷移に共鳴する157.48nmの真空紫外レーザー光を発生させ、スピン軌道励起状態Br^*(^2P_<1/2>)の一光子励起LIFを検出することに成功している。このBr^*(^2P_<1/2>)検出法を用いて、CO_2などの分子との衝突によって励起状態Br^*(^2P_<1/2>)から基底状態Br(^2P_<3/2>)へ緩和していく過程を調べた。様々な分子との衝突によるBr^*(^2P_<1/2>)の緩和速度を求め、それぞれの分子振動モードの最低振動数と緩和速度との間には相関関係を見出すことができた。今後、基底状態Br(^2P_<3/2>)も同一システム内で検出できるよう実験手法の改良を行う。そして、臭素化合物の量子収率測定などの光分解過程の状態解析に関する実験を進める予定である。

付加反応とH原子引き抜き反応が複雑なバランスで競争している低圧側の反応を、高感度な実験手法を用いて詳しく調べることは、基礎的な反応機構の理解のためにも重要である。本研究では、新しいレーザー技術であるレーザー光分解/真空紫外レーザー誘起蛍光(PLP-LIF)法を用いて、Cl原子と低分子アルケン類(C_2H_4、C_3H_6、C_2H_2)との絶対速度定数の測定を行った。測定は、全圧2-100Torr、室温(295±2K)、Cl原子の初期濃度に対して反応物の濃度が過多という擬一次条件にて行った。反応チャンバーにアルケン類(C_3H_6、C_2H_4、C_2H_2)/Cl_2/N_2の混合気体を流す。そこに351nm光分解レーザーを照射し、Cl_2光分解によってCl(^2P_<3/2>)を生成、アルケン類との反応によるCl(^2P_<3/2>)のLIF信号の減衰を観測した。減衰曲線フィッティングから得た擬一次反応速度を様々な反応物濃度に対してプロットし、直線の傾きからそれぞれの圧力条件における2次の速度定数を決定した。本研究によって得られた反応速度k(Cl+C_3H_6)とk(C_2H_4+Cl)、k(C_2H_2+Cl)のいずれも、従来の異なる実験手法による測定値と非常に良く一致していることがわかった。過去の実験手法では、他の反応物とアルケン類との相対的な濃度変化によって速度定数を得る相対速度(RR)法によるものが主であった。一方、本研究(PLP-LIF法)は、134.72nmの真空紫外レーザー光によってCl(^2P_<3/2>)のLIF信号を直接検出して絶対速度定数を得ている。異なる案験手法による測定値の一致は、データの信頼性をより一層高め、将来の大気オゾン濃度予測の精度向上に役立つものとして重要である。
新規生理活性物質生産株の超ハイスループットスクリーニングプラットフォーム構築

環境中の未知微生物から生理活性物質生産株をハイスループットにスクリーニングする技術の確立を目的としている。このために、微生物二次代謝産物のラマンスペクトラムデータベースを構築し、ドロップレットを基礎としたシングルセルラマンスペクトラム取得と微生物単離・遺伝子情報取得の機構の統合を目指している。1)微生物二次代謝産物のラマンスペクトラムデータベース(DB)の構築:本年度までに、184種類の化合物の計測、装置校正用データも同時に取得し、ウェブ基盤のプロトタイプDBを構築し、スペクトル同定を行えるインターフェイスの初期版を構築した。次に、実際に放線菌のラマン分光マッピング計測を行い、多変量スペクトル分解等を行い菌体内で各種二次代謝産物の可視化に成功した。さらに、DBを用いることで、構造の近い誘導体についても各々同定ができる可能性を見出した。2)シングルセル解析のためのドロップレットマイクロフローシステム構築:ラマン分光法を用いたハイスループットスクリーニングで取得される微生物の性状解析手法の1つとして、ゲルマイクロドロップレットを用いたシングルセルゲノム解析手法を開発した。多様な生理活性物質の合成能を有するカイメン等の無脊椎動物の共在細菌や海水等の環境細菌や腸内細菌などを対象として多数のシングルセルゲノムデータが獲得され、複数の細菌種の高精度ドラフトゲノムの構築が可能なプラットフォームの構築が達成された。3)シングルセルゲノミックスによる新規生理活性物質遺伝子群の解析:カイメン共在細菌を用いて、ラマン分光解析で同定された細胞内物質とシングルセルゲノム解析から得られた情報を照合したところ、獲得されたゲノム中にはラマンスペクトルから予想される生理活性物質の合成遺伝子の存在が確認できた。現在は、これらを統合するプラットフォームの構築中である。ラマンシグナルDB構築のためのラマン機器の設定や標準化のためのプロトコル策定が順調に進み、DBの蓄積が進んでいる。また、参照方法等のインターフェイスに関しても進んでいる。シングルセルゲノミックスのプラットフォームも順調に進んでおり、環境サンプルから高精度のシングルセルゲノム配列を多数決めることができている。ラマン解析ーシングルセルゲノム解析の統合に関しても検証がゲノム情報から達成できている。ラマンシグナルDBの構築を継続的に進め、生体物質同定のインターフェースの向上を行い、より正確な同定が可能なシステムの基礎を構築する。一方、シングルセルゲノミックスとの統合システムを目的にマイクロデバイスのデザインを進める。また、培養チャンバーの作製と統合もデザインする。本研究では、環境中の未知微生物から生理活性物質生産株をハイスループットにスクリーニングする技術の確立を目的としている。このために、微生物二次代謝産物のラマンスペクトラムデータベースを構築し、ドロップレットを基礎としたシングルセルラマンスペクトラム取得と微生物単離の機構の統合を目指している。1)微生物二次代謝産物のラマンスペクトラムデーターベース構築:本年度は、二次代謝産物データ50種までを構築することを目的とし、新規の計測システム導入と測定法検証を進めた。成果として、すでに申請者らがインハウスで作成したラマン分光機器にてペニシリン等の様々な抗生物質のin vivo検出が可能であることを確認した。一方で、色素、蛍光のバックグラウンドが高いサンプルに関して、励起光の変更の必要性が生じた。これを受け、新年度に新たに計測システムを自作し、改めて二次代謝産物データを拡充する計画である。2)シングルセル解析のためのドロップレットマイクロフローシステム構築:ドロップレットシステムとラマン分光を統合した計測システムを開発する計画であったが、上述の理由により次年度実施に計画変更した。3)シングルセルゲノミックスによる新規生理活性物質遺伝子群の解析:シングルセルゲノムの情報科学的解析法を改良し、バイアスやキメラリード等に由来するエラーを補正してシングルセルゲノムデータを取得する方法を開発し論文報告した。ドロップレットシステムと組み合わせることで、シングルセルから凖完全長ゲノム情報が網羅的に取得できるようになり、コストと効率を大幅に改善したシングルセルゲノム解析法を確立することができた。現在、本法を応用し、難培養性微生物からの生理活性物質生合成遺伝子の同定を進めている。将来的な技術の汎用性を考慮して、市販されているラマン分光機器によってデータベース化を進める予定で、機器の購入を行ったが、納品が大幅に遅れたことと、微生物を対象として用いる励起光での感度等に不具合があることが判明した。それによって、目標とするデータ取得が遅れた。

多様な生理活性物質の合成能を有するカイメン等の無脊椎動物の共在細菌や海水等の環境細菌や腸内細菌などを対象として多数のシングルセルゲノムデータが獲得され、複数の細菌種の高精度ドラフトゲノムの構築が可能なプラットフォームの構築が達成された。3)シングルセルゲノミックスによる新規生理活性物質遺伝子群の解析:カイメン共在細菌を用いて、ラマン分光解析で同定された細胞内物質とシングルセルゲノム解析から得られた情報を照合したところ、獲得されたゲノム中にはラマンスペクトルから予想される生理活性物質の合成遺伝子の存在が確認できた。現在は、これらを統合するプラットフォームの構築中である。ラマンシグナルDB構築のためのラマン機器の設定や標準化のためのプロトコル策定が順調に進み、DBの蓄積が進んでいる。また、参照方法等のインターフェイスに関しても進んでいる。シングルセルゲノミックスのプラットフォームも順調に進んでおり、環境サンプルから高精度のシングルセルゲノム配列を多数決めることができている。ラマン解析ーシングルセルゲノム解析の統合に関しても検証がゲノム情報から達成できている。購入したラマン分光機器(標準市販品)の改造をスタートするのと同時に、すでに申請者らが保有(自作)しているラマン分光器の波長スペックの拡充を行い生理活性物質のin vivo検出の目的に特化した機器仕様を備えた体制を早期に構築する予定である。すでに、仕様は検討済みである。この対策により、ラマンスペクトルデータベースの構築の遅れを挽回、かつ加速化できる見込みである。ラマンシグナルDBの構築を継続的に進め、生体物質同定のインターフェースの向上を行い、より正確な同定が可能なシステムの基礎を構築する。一方、シングルセルゲノミックスとの統合システムを目的にマイクロデバイスのデザインを進める。また、培養チャンバーの作製と統合もデザインする。
ヘテロ芳香族骨格をもつ大環状化合物による新規キラリティーの設計

つる巻き状の構造をもつ有機化合物の合成をめざし,いくつかの分子を合成することに成功した。この分子は,不斉炭素をもたなくてもキラリティを有する分子不斉有機化合物であり,含窒素ヘテロ芳香族であるイミダゾール誘導体のCHホモカップリング反応やルテニウム触媒を用いる閉環メタセシス反応を利用することで合成を達成することができる。得られた生成物の構造は,X線結晶構造解析により明らかとなり,またキラルカラムを用いるHPLC分析および分取により,光学異性体の分離と光学分割に成功した。また,同様の分子不斉化合物として硫黄原子をもつヘテロ芳香族のチオフェン誘導体においても合成を達成した。平成24年度の研究において達成された,アゾール類としてのビスベンゾイミダゾールより得られる軸性不斉化合物に加え,本年度では,骨格をヘテロビアリールであるビチオフェンへと展開させ,閉環メタセシス反応を利用する軸性不斉大環状ビチオフェンの合成を検討した。まず,原料となるビチオフェン誘導体,とくにチオフェン環3位に末端オレフィンを有する置換基を導入する効率的な合成法確立を検討した。大別して3種類の合成法を検討した結果,3ーメチルチオフェンを出発原料として用いる方法が最適な方法であることを明らかとした。続いて,ホモカップリングによるビチオフェン合成,閉環メタセシス反応による軸性不斉の発現を検討し,ビチオフェンにおいてもビスアゾールと同様に,軸性不斉を有する大環状化合物が合成でき,X線結晶構造解析により分子構造を確定し,さらにはキラルカラムを有するHPLC分析により両エナンチオマーの分離を確認した。また,ビスアゾールについても前年度のベンゾイミダゾールに加え,無置換イミダゾール,イミダゾール環に二つおよび四つの臭素原子が置換した誘導体においても,閉環メタセシス反応による大環状化合物の生成,軸性不斉の発現を明らかにすることができた。アゾール類の触媒的ホモカップリングとE-選択的オレフィンメタセシスにより構築する大環状のシクロオレフィン骨格が発現する,新規な軸性不斉によるキラリティーの創成をめざした。得られた生成物がキラリティーをもつことを実証し,キラリティー発現と分子構造の相関を解明,光学分割によるエナンチオマーの単離をめざした。まず,ベンゾイミダゾールのNH基にたいして4ブロモ1ブテンを反応させすことによりNアルキル化をおこなった。続いて,銅/銀触媒を用いてイミダゾールの触媒的CHホモカップリング反応することにより,メタセシス前駆体であるビスイミダゾールを得た。得られたビスイミダゾールをルテニウム触媒の存在下に閉環メタセシス反応をおこなうことで,環化した生成物の合成をめざした。ルテニウム触媒のみで反応をおこなったところ,低収率で生成物が得られるのみであったが,ルイス酸として,チタンテトライソプロポキシドまたはヨウ化亜鉛を触媒量加えたところ,収率が向上した。得られたメタセシス生成物の1H-NMR測定およびX線結晶構造解析によりビスアゾール骨格をもつ大環状オレフィンが得られていることを確認した。また,オレフィンの立体化学がE体特異的に得られていることも確認した。さらに,キラルカラムを用いてHPLC分析をしたところ,両エナンチオマーが分離したことがわかり,生成物が軸性不斉をもつキラル化合物であることを明らかにした。紫外可視吸収スペクトルを測定することにより,閉環メタセシス反応の前後で,最大吸収波長が短波長側に移動することがわかった。この結果およびX線構造解析からビスアゾールの炭素炭素結合がねじれ構造をとり,そのためにπ共役系の拡張がくずれことが明らかとなった。目的の構造の生成物の合成に成功し,そのオレフィンの立体化学がE体であることを明らかにすることができた。また,キラルカラムを用いるHPLC分析により,分子不斉をもつ化合物の両エナンチオマーが分離する条件をみつけることができた。次年度には,イミダゾール環以外の骨格をもつ化合物での分子不斉の発現や,光学分割または不斉合成による,一方のエナンチオマー単離および,得られたキラル化合物を利用する反応性の検討や機能の発現などをめざしていく予定である。該当なし
白血病発症にかかわるアポトーシス制御因子の同定

アポトーシスの制御異常と白血病発症の関連を分子生物学的に解明する目的で、B前駆細胞で機能するBH3(Bcl-2 Homologous Region-3)因子を同定し、その制御機構を解析、発癌遺伝子との関連について検討を行った。BH3因子はBcl-2ファミリー因子が共有するBHl4領域のうちBH3ドメインのみを有し、Bcl-2ファミリー蛋白と結合し、その機能を抑制することによって細胞をアポトーシスに誘導する蛋白である。IL-3依存性B前駆細胞であるBaf-3細胞を用いてサイトカイン依存性に発現が制御されているBH3因子を検討したところ、既知の哺乳類のBH3因子のうち、BimがそのmRNA・蛋白レベルで制御されていることが判明した。Bimを強制発現させると細胞をアポトーシスに導くことから、全く逆の動きをするBcl-x_Lと共同でサイトカイン依存性アポトーシスを制御していることが判明した。Bimの発現制御はIL-3受容体全域にまたがる領域由来の複数の経路が共同でコントロールしている可能性が考えられた。またIL-3はBimをリン酸化してその機能を調節しているようであるが、これらの点についてはなお検討中である。われわれがこれまでに同定してきた、サイトカイン欠乏によるBaf-3細胞のアポトーシスを抑制する発癌遺伝子のうち、Bcr-AblキナーゼはBcl-x_Lの発現を促進しBimの発現を抑制した。これに対し活性化Ras変異体とE2A-HLF転写因子はBimの発現に影響をおよぼさなかった。サイトカインはBcl-x_Lの発現をコントロールすることが知られていたが、さらにBimの発現とリン酸化を通じてアポトーシスを制御していることが明らかとなった。また、Bcr-AblキナーゼがBcl-x_Lの発現促進とともに、Bimの発現を抑制することは、BimやBH3因子が発癌遺伝子の標的分子であることを示唆したものであり、そのメカニズムの検討が次年度の課題として残された。
WT1 免疫療法におけるCD4 陽性ヘルパーT 細胞の解析と機能増強法の探索

WT1ワクチン療法を展開するうえでCD8陽性CTLのみならずWT1腫瘍抗原特異的CD4陽性T細胞(ヘルパーT細胞(Th))の役割を明らかにした。すなわち(1) MHC classII拘束性にマウスWT1特異的CD4陽性T細胞を誘導できるマウスWT1エピトープを同定し、in vivoで、classII拘束性WT1特異CD4陽性T細胞によるWT1特異的CTLの誘導活性化に対する影響、およびそのメカニズム解析を行った。(2)ヒトWT1_<332>ペプチドにより、HLA-DRB1*0405のタイプのみならずHLADRB1*1501、HLA-DRB1*1502、HLA-DRB1*0901のタイプに対しても特異的CD4陽性T細胞の反応が誘導された。WT1_<332>2ペプチドが“promiscuous"に反応するWT1特異的ヘルパーエピトープであり、今後HLA-class I拘束性のWT1ペプチドと組み合わせて、さまざまなHLA-class IIタイプでWT1特異的ヘルパーペプチドとしてのがんワクチン療法の相乗効果が考えられた。がんワクチン療法において抗腫瘍免疫反応の主体となるのはCD8陽性キラーT細胞である。しかしながら、その効果的な活性化や作用にはCD4陽性のヘルパーT細胞(Th)の関与が重要となる。本研究ではその詳細な機能解析と機能増強法の追求により強力なWT1免疫療法を展開することを目的としている。平成19年度では以下の研究成果が得られた。(1)WT1特異的CD4陽性T細胞を誘導できるMHC class II拘束性マウスWT1ペプチドを同定した。すなわちマウスWT1のアンカーモチーフからコンピュータ解析し、2種類の候補を選択し、MHC class II拘束性にマウスWT1特異的CD4陽性T細胞を誘導できる15 merのマウスWT1エピトープを同定した。(2)マウス(C57BL/6)と同系統由来であるマウスグリオーマ細胞203Gを培養し、そのグリオーマ細胞がWT1が発現していることを、WT1抗体による免疫組織化学的検討により明らかにした。また同じく、MHC class IIが発現していることを抗class II抗体を用いた免疫組織学的染色により明らかにした。(3)マウスグリオーマ細胞203Gを定位的に脳内移植する手法を確立するため、マウス(C57BL/6)を麻酔後、固定装置に装着、穿頭し基底核部に細胞を1×10^7個注入、担脳腫瘍マウスモデルとして可能なことを確認した。また、麻酔後に大後頭孔より大槽内に腫瘍細胞を注入し、安定して簡便な担脳腫瘍モデルとして可能なことを確認した。(4)MHCclass II拘束性のWT1特異的CD4陽性T細胞をフリーサイトメトリーで分離し培養株を樹立、さらにそのクローン樹立を行っている。WT1がんワクチン療法において、CD4陽性のヘルパーT細胞(Th)を介しての応答がCD8陽性キラーT細胞に呼応して反応することが重要となる。本研究では、その詳細な機能解析と機能増強法の追求により強力なWT1免疫療法を展開することを目的としている。平成20年度は、同定したWT1特異的CD4陽性T細胞を誘導できるHLA-DRB1^*0405特異的MHC class II拘束性WT1ペプチド、WT1_<332>(KRYFKLSHLQMHSRKH)を用いていて、以下の研究結果を得た。(1)WT1_<332>により、HLA-DRB1^*0405のタイプのみならずHLA-DRB1^*1501、HLA-DRB1^*1502、HLA-DRB1^*0901のタイプに対しても特異的CD4陽性T細胞の反応が誘導された。(2)これらのHLAclass II拘束性WT1332特異的CD4陽性T細胞を株化することに成功し、培養上でWT1_<332>特異的CD4陽性T細胞株は、WT1_<332>の刺激によりサイトカインのうちINF-γを産生したが、IL-4やIL-10は誘導されなかった。すなわちTh-1タイプのプロファイルであることがわかった。

(3)さらにHLA-DRB1^*1501、HLA-DRB1^*1502ともにWT1_<332>特異的CD4陽性T細胞はWT1発現細胞に反応することを同定し、WT1_<332>ペプチドが免疫応答に関与していることを確認した。すなわちWT1_<332>2ペプチドが"promiscuous"に反応するWT1特異的ヘルパーエピトープであり、今後HLA-class I拘束性のWT1ペプチドと組み合わせて、さまざまなHLA-class IIタイプでWT1特異的ヘルパーペプチドとしてのがんワクチン療法の相乗効果が考えられた。医歯薬学
ヒトセントロメア結合蛋白質に相同性をもつ分裂酵母のARS結合蛋白質Abp1の解析

動原体は染色体の分配において重要な機能を担っているがその構造と機能については不明な点が多い。本研究では分裂酵母S.pombeをモデルとして、動原体を構成するタンパク質の同定を試み、その構造と機能を明らかにすることを目的とした。ヒト・マウスのセントロメアDNA結合タンパク質CENP-Bは動原体の形成に必要な因子であることが強く示唆されている。我々はこのCENP-Bと相同性を示す分裂酵母のタンパク質Abp1を同定しその遺伝子をクローニングし、このタンパク質が複製の開始、染色体の分配に関与することを示唆する結果を得ていた。本年度はこのタンパク質について以下の点を明らかにすることを目標とした。(1)染色体分配における役割を明らかにする。(3)Abp1と相互作用するタンパク質の同定を試みる。(4)共同研究者J.Hurwitz博士のグループによって同定された第二のCENP-BホモログCbhとAbp1の<本年度の成果>(1)Abp1遺伝子破壊株で染色体分配がTBZに超感受性となり、metaphase-anphase transitionの遅延が起こるとともに異常な染色体分配が誘導される。さらに、Abp1全体、もしくはDNA結合ドメインのみの過剰発現によっても異常な染色体分配が誘導される。その表現型の観察からabp1がセントロメアに結合し動原体の形成に関与していることが強く示唆された。(2)DNA結合能を欠く変異型Abp1の過剰発現によりG2/Mの遅延がおこる。これはAbp1と相互作用するタンパク質のsequesteringによるものと考えられた。一方、yeast two hybrid法によるAbp1結合タンパク質のスクリーニングからクロマチン構造の変化に関わると思われる因子が得られた。この因子と上記の過剰発現による効果との関連について検討中である。(3)cbhの遺伝子破壊を行っても細胞の生育には影響がでないことが明らかとなった。これにより、abp1とcbhの機能にredundancyがある可能性がでてきたので現在検討中である。
旋毛虫感染防御反応における抗原提示細胞の機能分化とIL-3

私たちは、rIL-3投与マウスに旋毛虫を感染させると、Th2応答や防御反応が促進することを報告してきたが、どのような機序でTh2応答を促進するのかは不明であった。本研究ではIL-3を投与したC3H/He雄性マウスから脾細胞を単離し、同系マウスに移入し、感染防御反応とTh2応答を促進する細胞群を解析した。感染前にrIL-3を腹腔注射し、旋毛虫筋肉幼虫を経口感染した。対照群と同様に、IL-3投与群においても抗CD4処理群では成虫の排除が遅れた。しかし、IL-3投与によって直接CD4細胞が影響をうけたのか、あるいは別の細胞群の関与があったのか明らかではない。そこで、IL-3投与マウスから脾細胞を正常マウスに移入し、感染防御が誘導できるかどうか調べた。その結果、移入した脾細胞量依存的に感染防御反応が発現した。次に脾細胞を分画すると、プラスチック付着性の細胞群が感染防御能を移入できた。さらにMACSによりCD11b+、CD11b-CD45R+、CD11b-CD45R-細胞群を分離し、正常マウスに移入し防御反応への影響を調べた。感染後の成虫数を調べると、CD11b+細胞移入マウスでは有意に少なかった。感染マウスの脾細胞を抗CD3刺激下で培養し、その上清中のIL-4を測定すると、CD11b+細胞移入群で有意に高値をしめした。一方、IL-2産生についてはすべてのグループ間で有意の差はなかったが、IL-10の産生をみるとCD11b+細胞移入群では対照群にくらべ抑制されていた。以上の結果からIL-3はCD11b+細胞に作用し、Th2サイトカインの差次的発現を介して防御反応を調節しているのではないかと推測された。私たちは、rIL-3処理したマウスに旋毛虫を感染させると、感染防御反応およびTh2応答が促進されることを明らかにしてきた。今回の研究では、IL-3が第一段階でどの細胞群に作用して、これらの反応が誘導されるのか調べた。rIL-3処理したマウスの脾細胞、腹腔細胞を正常マウスに移入し、翌日、旋毛虫筋肉幼虫400隻を経口感染した。感染31日目に全身の横紋筋に寄生する幼虫数を調べた。その結果、脾細胞移入群で有意の低下が観察された。移入脾細胞の量依存的に回収される幼虫数が減少した。対照群と有意の差がみられたのは4x10^7 cells移入群であった。次に、成虫の回収数を調べた。4x10^7脾細胞を移入した群では回収数が低い傾向がみられ、7日目では有意に低かった。感染7、12日目の上部小腸をカルノア固定包埋後、切片をアルシアンブルー、サフラニンOで染色した。小腸粘膜マスト細胞は脾細胞移入群で有意の増加が観察された。続いて、どの細胞群が作用しているのか調べた。rIL-3処理したマウスの脾細胞をプラスチックシャーレ付着細胞と非付着細胞に分画し、次に非付着細胞をslgの有無によりパンニング法でT細胞を得た。1x10^7付着細胞移入群で幼虫数は有意の差がみられた。1x10^7 T細胞移入群では差はなかった。次に、rIL-

3処理したマウス脾細胞をMac1,B220単クローン抗体と反応させ、磁性ビーズ法により分画し、各細胞1x10^7を移入した。感染7日目の小腸内成虫数を調べたところ、Mac1陽性1x10^7細胞移入群で成虫数は有意に差があった。以上の結果から、rIL-3処理したマウス脾細胞を正常マウスに移入し、旋毛虫を感染させると、防御反応が促進されることが分かった。この実験系において、IL-3がプラスチック付着性Mac1陽性細胞に作用し、その細胞群を介して防御反応促進に関与していることが示唆された。私たちは、rIL-3投与マウスに旋毛虫を感染させると、Th2応答や防御反応が促進することを報告してきたが、どのような機序でTh2応答を促進するのかは不明であった。本研究ではIL-3を投与したC3H/He雄性マウスから脾細胞を単離し、同系マウスに移入し、感染防御反応とTh2応答を促進する細胞群を解析した。感染前にrIL-3を腹腔注射し、旋毛虫筋肉幼虫を経口感染した。対照群と同様に、IL-3投与群においても抗CD4処理群では成虫の排除が遅れた。しかし、IL-3投与によって直接CD4細胞が影響をうけたのか、あるいは別の細胞群の関与があったのか明らかではない。そこで、IL-3投与マウスから脾細胞を正常マウスに移入し、感染防御が誘導できるかどうか調べた。その結果、移入した脾細胞量依存的に感染防御反応が発現した。次に脾細胞を分画すると、プラスチック付着性の細胞群が感染防御能を移入できた。さらにMACSによりCD11b+、CD11b-CD45R+、CD11b-CD45R-細胞群を分離し、正常マウスに移入し防御反応への影響を調べた。感染後の成虫数を調べると、CD11b+細胞移入マウスでは有意に少なかった。感染マウスの脾細胞を抗CD3刺激下で培養し、その上清中のIL-4を測定すると、CD11b+細胞移入群で有意に高値をしめした。一方、IL-2産生についてはすべてのグループ間で有意の差はなかったが、IL-10の産生をみるとCD11b+細胞移入群では対照群にくらべ抑制されていた。以上の結果からIL-3はCD11b+細胞に作用し、Th2サイトカインの差次的発現を介して防御反応を調節しているのではないかと推測された。CD11b+細胞と樹状細胞DC2や"alternatively activated macrophage"の関連については今後解析すべき課題として残されている。
地域の美術館と学校の連携を支援する表現・鑑賞プログラムの共同開発

旭川市内美術館と小・中学校,北海道教育大学旭川校の連携による本研究の成果は以下の様である。(1)旭川市内の美術館と学校教育の連携を支援する表現・鑑賞プログラムの開発・提供の実現(2)児童・生徒の鑑賞・表現能力の向上(3)地方美術館と学校教育による互恵的な教育プログラム運営の実現(4)参画した学生の教育実践力向上旭川市内美術館と小・中学校,北海道教育大学旭川校の連携による本研究の成果は以下の様である。(1)旭川市内の美術館と学校教育の連携を支援する表現・鑑賞プログラムの開発・提供の実現(2)児童・生徒の鑑賞・表現能力の向上(3)地方美術館と学校教育による互恵的な教育プログラム運営の実現(4)参画した学生の教育実践力向上旭川市教育研究会図画工作美術研究部会,北海道旭川美術館,中原悌二朗記念旭川市彫刻美術館,北海道教育大学旭川校の四者により以下に記す表現・鑑賞プログラムを開発。旭川市内・周辺郡部小中学校の児童生徒に対して提供した。各プログラムについては,参加児童生徒の活動の観察,事後アンケートの結果,参加教員からの感想から参加者の満足度が高く、鑑賞学習や造形・表現活動に対する意欲の向上,美術館及び美術作品への関心の高まりといった学習効果が見られた。また,プロジェクト推進のための役割分担,組織化が図られ,計画的な運営と各組織の負担軽減がなされた。■道立旭川美術館企画展「片岡球子展」鑑賞プログラムギャラリートーク,アートゲームの二つの鑑賞方法によって構成された鑑賞プログラム。6月に全5回実施。旭川市内・周辺郡部中学校美術部生徒延べ340名が本展をプログラムに沿って鑑賞した。■道立旭川美術館企画展「ウルトラマン・アート展」ワークショッププログラム本展キュレーターによる講義およびオリジナル怪獣フィギュアの制作と展示によって構成されたワークショッププログラム。旭川市内・周辺郡部の中学校美術部生徒延べ320名が8月から11月にかけて講義および制作と展示に参加した。■旭川市立彫刻美術館巡回展出前授業プログラム市内小・中学校への彫刻作品貸出巡回展を有効活用するための鑑賞プログラム。全体ガイダンス,対話型鑑賞,体感型鑑賞によって構成され,市内12の小中学校にて延べ760名の児童生徒が参加した。地域美術館と学校教育の連携を支援するための表現・鑑賞プログラムを開発・提供することを目的とする本研究では平成23年度に以下の4つのプログラムを開発、提供した。■造形まつり「工作玉手箱!いろんな形みつけちゃおう」(7月実施参加者4000名)道立旭川美術館、旭川市彫刻美術館を会場に、複数のワークショップを児童、生徒、一般の市民に向けて提供した。■道立旭川美術館企画展「巨匠たちの饗宴」展鑑賞プログラム(8月実施参加生徒262名)旭川市内・上川管内中学校美術部生徒が旭川美術館企画展「巨匠たちの饗宴」展の作品をプログラムにより鑑賞した。■中原悌二郎賞関連ワークショップ「つなげてめぐるアートの力」(9月10月実施参加生徒100名)平成23年度中原悌二郎賞受賞者の小泉俊己氏監修のもと、旭川市内、上川管内中学校美術部によるワークショップと鑑賞会を氏の講話も交えながら行った。■旭川市立彫刻美術館巡回展出前授業プログラム(8月12月実施参加児童生徒829名)市内小中学校、盲学校に貸し出し展示された彫刻美術館所有の彫刻作品を当該校の児童生徒保護者がプログラムにより鑑賞した。いずれのプログラムも地域の美術館、学校、大学が連携することで実現したものであり、参加児童生徒、保護者、教員へのアンケートからプログラムが有効に働き、美術作品の鑑賞や造形表現活動に対する理解の進展や意欲の高まり。学校教育へ美術館利用の普及、美術館での教育普及活動の活性化が図られた。また、これに伴い、プログラム運営での効率化や内容の充実、本プログラムを基にした市内小・中学校教諭向け研修会の実施がなされた。本研究によって開発された表現・鑑賞プログラムを平成23年度に引き続き実施。年間事業として定着できた。また,プログラムの開発,提供を地域美術館と学校が相互に担保し合いながらサステナブルに行う組織が形成されている。具体的な実施プログラムは、6月に旭川市内・上川管内の中学校美術部生徒350名が,旭川美術館企画展「椅子と絵の対話」展をプログラムに沿って鑑賞した旭川美術館鑑賞プログラム。7月に児童,生徒のみならず地域の人々も含めた2000名が旭川美術館を主会場とした複数のワークショップに参加した造形まつりプログラム。7月から11月にかけて,旭川市内・上川管内の中学校美術部生徒約200名が北海道立旭川美術館が企画する「愛のヴィクトリアン・ジュエリー」展をもとにワークショップを行ったワークショッププログラム。6月から3月にかけて旭川市内1120名の児童,生徒と保護者,教員が彫刻美術館から貸し出された作品を鑑賞した旭川市立彫刻美術館巡回展出前授業プログラムである。成果と課題としては、プログラム参加児童,生徒の表現,鑑賞活動への意欲化及び表現,鑑賞能力の質的変化が見られるようになった点。人員不足の解消や参画主体の特性を生かしたプログラム内容の多角的な見直しにより,単一の主体では叶わなかったプログラムの実現と適正化が為された点。本プログラムに関連した学校教員,美術館学芸員の研修及び教員志望学生の教育支援が行われた点。本プロジェクトを基に,学校,各主体,地域や保護者が相互に交流する状況が生み出された点。学習効果や事業効果についての検証については未だ不十分であるため,今後も継続した取り組みが求められる点が挙げられる。

本研究において開発されたプログラムは、いずれも参加児童生徒にとって美術館及び美術作品への関心の高まりや見方、考え方の深まり、進んで鑑賞しようとする姿勢等をうながすものとなっており、例年参加している生徒では学習の積み上げも見られた。また、プログラムの充実と運営面での効率化、地域に開かれた美術館としての活用と周知、大学施設の活用なども図られ、その目的をおおむね果たしていると言える。教員志望学生の更なるスキルアップ及び、実施状況の分析を基にした改善をさらに進めたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。(1)柔軟な組織を安定的に運用する為の方策について研究、開発する。(2)本プログラムをテーマとした市内小・中学校教諭向け研修会の拡充。(3)教員志望学生のより実践的なスキルアップを図る方法の開発。(4)研究記録の収集や分析、分析結果の応用に向けた実践的研究組織の運用。
コモンマーモセットの示す向社会行動の遺伝―環境－脳内神経ネットワーク機能関連

本研究の目的は、向社会行動(利他行動)の生後発達の神経機構を、脳内機能分子および神経ネットワーク機能から明らかにすることである。向社会行動を発現することが知られている非ヒト霊長類であるコモンマーモセットを用いて、以下の項目で実験を実施した。I.向社会行動の定量的評価:利他行動を評価するため、検査者の立ち合いの必要がない自動化されたオペラント行動課題装置の開発を行った。課題ボックスへの移動および馴化を効率化するための改良を重ね、2つの課題ボックスとその間の仕切り版を電磁式可視不可視とする、タッチパネル式TWINケージを導入した。また、自律神経系指標として心血管系動態をモニターするため、小型無線発信機の生体内への装着およびテレメトリー装置によるオンライン測定を行った。II.遺伝子解析:DNAサンプル試料として体毛および頬粘膜を採取し、オピオイド受容体、バソプレシン受容体、ドーパミン受容体の遺伝子多型データを蓄積した。II.脳機能イメージング:養育環境の異なる個体群を用いてセロトニントランスポーター、ドーパミンD2受容体、セロトニン1A受容体特異的PETトレーサーによるPET画像データを蓄積した。マーモセット用MRIコイルの評価、高解像度MRI解剖および機能画像取得に係る動物の麻酔環境、撮像および解析パラメータの最適化を進めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、向社会行動(利他行動)の生後発達の神経機構を明らかにするために、非ヒト霊長類であるコモンマーモセットを用いて脳内ペプチドおよびモノアミン神経伝達に関連する遺伝子検索および脳機能イメージングを行う。平成26年度は、以下の項目で実験を実施した。1.向社会行動の定量的評価これまで、コモンマーモセットの向社会行動の一指標として、二分室に分かれたボックス内におけるトレー引きによる報酬課題を行ってきた。このテスト法は検査者が立ち会うことが必須であったが、幼少時の養育環境(人工補育/親哺育)や6月齢以降の社会的環境(集団飼育/個別飼育)を操作した個体を調査するにあたり、検査者が飼育者でもある場合、検査者によって行動が影響されることが判明した。そのため、完全自動化した課題装置の開発に取り組んだ。新しい課題装置は、レバー入力すると報酬皿がモーターによって近づくようプログラム制御されている。また、課題ボックスへのスムーズな個体の移動のため、移動ボックスと課題ボックスを同一にしてボックストレーニングを開始した。ボックストレーニングおよび実験室への馴化までに、養育環境の違いは認められていない。2.遺伝子型解析体毛から得られるDNAサンプルを採取し、脳内ペプチドおよびモノアミン神経伝達に関連する遺伝子多型について調査した。その結果、オピオイドμ受容体エキソン領域にアミノ酸置換を伴う一塩基多型の存在が明らかとなり、多型頻度のばらつきもみられた。一塩基多型と行動指標との関連については、現在まで親として仔をcarryingしている期間を養育態度の一指標としてその関連性を調査したが、明らかな関連性は認められなかった。今後、性格判定や向社会行動指標を用いて、関連性を探るほか、オピオイドμ受容体特異的PETトレーサーを用いたPETさらにfMRIイメージングを行う予定である。向社会行動評価にあたって、遺伝・環境ー脳機能ー行動関連を系統的に調査するには行動課題の完全自動化が必須である。行動課題装置を新規開発したことにより、現在当該装置によってテストを開始できる段階にある。また、環境要因の異なるコモンマーモセットを作出し、オピオイドμ受容体の遺伝子多型を見出したことで、行動指標との関連性を調査する基盤を整えることができた。環境要因の異なるコモンマーモセットは、新規開発した課題装置を用いた行動評価と同時に遺伝子多型検索およびPETイメージングを行い、同一個体における複数のモダリティーデータからその関連性解析を進める。また、行動評価中の自律神経系指標としてオンライン血圧測定を行う。コモンマーモセットの機能的神経ネットワークの同定には、fMRI撮像のため詳細な条件検討を進める必要があるため、これは行動評価、遺伝子検索およびPET解析と並行して推進していく予定である。
新規の接着因子、JCADの血栓症への影響の解明

1. JCADが血栓形成を制御していることをJCAD-/-マウスを用いて、直接的に明らかにした。下大静脈結紮モデルという、DVTモデルを用いて血栓を作製した。JCAD-/-マウスでは血栓サイズが野生型マウスと比較して、大型化することが明らかになった。2.培養細胞を用いて、JCADの血栓形成にかかわる分子メカニズムを明らかにした。培養ヒト血管内皮細胞(HUVECなど)において、分子細胞学的検討の結果、JCADはVEGF刺激によるERKシグナル活性化を制御していることが明らかとなった。近年のヒトゲノムワイド関連研究(GWAS)によって、心筋梗塞に関連する新規の分子としてJCAD(Junctional protein associated with coronary artery disease)が同定されたが、JCADが心筋梗塞に影響する分子機構は不明である。(1)心筋梗塞は動脈血栓症であること、(2)JCADは血管内皮の接着因子であること、(3)トロンビン刺激でリン酸化修飾を受けることから、JCADは血管内皮において血栓形成を制御していると考えられる。それゆえ、in vitro, in vivoの系でJCADが血栓形成を制御する分子機構を解明する。1.JCADの血栓症発生への影響の解明JCADが血栓形成を制御しているか否かを直接的に確認するために、JCAD-/-マウスと野生型マウスにおけるDVTサイズを比較した。開腹手術下に下大静脈を結紮するIVC結紮モデルを用いた。手術後、day 4, 7, 14において血栓サイズをJCAD-/-マウスと野生型マウスの間で比較したところ、day4において、JCAD-/-マウスでは、DVTサイズが野生型と比べて長さ、重さともに大型となることが明らかになった。すなわち、JCADは血栓形成を制御していることが明らかとなった。2.分子イメージングによるJCADの血栓形成への影響機序の解明今年度の予算で蛍光顕微鏡を購入した。今後、実際に検討を開始していく。分子イメージング技術を駆使して、血栓形成において重要な役割をもつ、炎症活性や血栓関連因子(組織因子、PAI-1等)などへのJCADの影響を生体下に明らかにする。DVTサイズを比較する際には、血栓サイズがマウスの中では一番大きく、計測に適した下大静脈を使用するが、下大静脈の場合は、周囲の腸などの腹腔内臓器や、体表から深部にあるという、位置的問題により、生体下での顕微鏡的観察は困難である。それゆえ、申請者が近年に独自に作製した(Hara T, et al, Circulation. 2014)、頚静脈のDVTモデルを使用する蛍光顕微鏡の納品が3月であったため、蛍光顕微鏡を用いた検討は今年度は始めたばかりであり、結果はまだ得られていない。今年度に明らかにしていく。今年度はマウスを飼育している動物実験室において、Helicobacter hepaticus感染があり、そのクリーニング作業として、一旦、JCADノックアウトマウスを極限まで減らす必要があり、JCADノックアウトマウスを用いた研究が進行できなかった。そのため、本年度はヒト血管内皮培養細胞を用いたJCAD分子の血栓形成機序の解明を中心に検討した。ヒト血管内皮培養細胞(HUVEC)にsiRNAを用いてJCAD特異的ノックダウンを行った。JCAD特異的ノックダウンはウェスタンブロットにより確認できた。JCADのノックダウンにより、トロンビン刺激によるシグナル伝達に変化があるか否か検討した。その結果、JCADノックダウンによってトロンビン刺激後のERKの活性化が抑制された。すなわち、JCADはトロンビン刺激後のERKのリン酸化を制御しており、それにより、なんらかの血栓性ないしは血栓抑制性のシグナルを制御していることが示唆された。実際、JCADノックアウトマウスに下大静脈結紮を行ったところ、JCADノックアウトマウスでは大型の血栓が得られたことを踏まえると、このJCADノックダウンによるERKのリン酸化は血栓抑制性のシグナルであることが推察され、何らかのネガティブフィードバック機構に関与していることが推察された。今後、JCADノックアウトマウスを再び繁殖させて、研究を継続していく予定である。1.蛍光顕微鏡を用いた分子イメージング手技により、JCADノックアウトマウスと野生型マウスにおいてのDVTと形成における各種分子の挙動、炎症活性の変化を生体下に明らかにしていく。血栓形成には血管内皮細胞の障害に続く、組織因子等の血栓関連因子の発現や、好中球、マクロファージなどの炎症性細胞の浸潤が重要であることから、白血球を市販のローダミン6Gで可視化し、血栓への浸潤を計測する。血栓自体はFITCデキストランによる血流イメージングで造影CTのようなfilling defect像として検出される(図2)。

炎症活性も市販のイメージング製剤(MMPsense, Prosense)を用いて、実際のDVT部位で起きている炎症活性を可視化、定量することが生体下に可能である2.培養細胞を用いて、JCADの血栓形成にかかわる分子メカニズムを明らかにする。培養ヒト血管内皮細胞(HUVECなど)にsiRNA等を用いてJCAD特異的なノックダウンや過剰発現を誘導しトロンビン刺激による血管内皮細胞の血栓性変化に関わる分子(組織因子、PAI-1など)の変化を分子細胞学的に検討する。循環器内科学