hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテオーム解析による胆嚢・膵臓癌の戦略的個別治療

二次元電気泳動ラージゲルを比較することによるdifferential display法をもちいて、肝癌患者血清の治療前後に共通して消失・出現するタンパク質を選別し、同定した。データの信頼性より高めるためマイクロアレイのデータ解析の手法を応用し統計学的な処理を加えることで、より信頼性をもって疾患と関連性のある幾つかのタンパク質を同定できた。結果治療後に減少するタンパクには、メジャーなタンパクであるアルブミンやアポリポプロテインA-IVの他に、alpha2-HS-glycoproteinやZn-alpha2-glycoproteinなどの糖鎖修飾タンパクが見出された。治療後に出現する共通タンパクスポットにはハプトグロビンやHemopexin、leucine-rich alpha-2-glycoprotein、SAA(amyloid related serum protein)などが含まれていた。サンプルに対してはウェスタンブロットにて確認した。同様の手法を用いて、胆嚢・膵臓疾患についても治療前後の血清タンパク解析を試みた。しかし、胆嚢・膵臓疾患患者については、二次元電気泳動の結果に一定の傾向がみられず、たんぱく質の同定までにはいたっていない。これらの患者ではgemcitabineなどの抗癌剤での経過観察が数ヶ月に及ぶことが殆どであり、治療効果の著名な例のペア血清を集めるのが困難で、良質な十分な検体数で検討できていないのが、大きな要因と考えられる。対照として検討した、自己免疫性膵炎の罹患患者血清を用いて膵癌患者の膵液に対しウェスタンブロットを行ったところ、膵癌患者の膵液中には正常人血清と比較して強く反応するタンパク質があることを見出しており(二次元ゲル電気泳動、二次元ウェスタンブロット法を用いて現在特定を進めている)、技術的には問題点はなく、今後の更なる検討で何らかの成果が得られるものと思われる。
クロスプライミング機能に関与する樹状細胞の動態及び機能的意義の解明

死細胞を取り込む能力、およびクロスプレゼンテーションによりCD8T細胞(細胞傷害性T細胞)を活性化する能力が高い樹状細胞(DC)サブセットとして、CD8α/CD103+CD11bDCが知られている。このDCサブセットに蛍光タンパクを発現させたり、また、このDCサブセットを一時的に欠失させたりできる遺伝子改変マウスを作成し、in vivoにおける分布、機能的意義を明らかにした。今回樹立したマウスは、種々の実験系で応用可能であり、CD8α/CD103+CD11bDCの新たな機能的意義の解明が期待される。本研究では、CD8α陽性樹状細胞(CD8α+DC)のin vivoにおける機能的意義を明らかにした。まず、CD8α+DCに高発現するケモカイン受容体XCR1の遺伝子座に、蛍光タンパクvenus、あるいは蛍光タンパクとジフテリアトキシン受容体(DTR)との融合タンパクをノックインすることにより、XCR1-venus, XCR1-DTRvenusマウスを作成した。これらのマウスの脾臓において、venusタンパクの発現は、CD8α+DCの約80%に認められたが、他の細胞にはほとんど認められなかった。リンパ節や皮膚、腸管などの末梢組織においては、venusの発現は、CD8α+DCと同系統に属するCD103+CD11b-DCにほぼ選択的に認められた。また、XCR1-DTRvenusマウスにおいては、DTの投与後1-4日間に、CD8α+DCの欠失が一過性に誘導された。このXCR1-DTRvenusマウスを用いて、タンパク、死細胞、細菌に対するCD8T細胞応答(クロスプレゼンテーション)にXCR1を発現する樹状細胞(XCR1+DC)すなわちCD8α+DCが必須であることが明らかとなった。CD8α+DCを欠失させる遺伝子欠損マウスとして、CD8α+DC優位に発現するCD205やClec9Aの遺伝子座へのDTR遺伝子ノックインマウスが樹立されているが、これらのマウスでは、蛍光タンパクが検出できず、また、XCR1-DTRvenusマウスに比較して、欠失細胞の選択性も高くない。本研究で樹立されたシステムは、CD8α+DCを追跡し、欠失させるのに最適のユニークな実験系である。樹状細胞は免疫応答に必須の抗原提示細胞であるが、いくつかの機能的に特化したサブセットにより構成されている。CD8α陽性樹状細胞(CD8+cDC)は、死滅した細胞を取り込む能力が高く、抗ウイルス免疫、抗がん免疫に重要なクロスプライミング機能を担う樹状細胞サブセットであると考えられている。しかし、その生体内での動態、機能的意義については不明の部分が多い。本研究では、CD8+cDC特異的に発現するケモカイン受容体Xcr1の遺伝子座に種々の遺伝子をノックインしたマウスを作成、解析することにより、CD8+cDCの動態、機能的意義の解明を行う。Xcr1-venusマウスを用いて、脾臓、胸腺、リンパ節、パイエル板などのリンパ組織、皮膚、腸管粘膜などの末梢組織において、venus陽性細胞集団の表現型解析、免疫組織学的解析を行う。また、Xcr-Kikumeマウスにおいては、特に生体内の移動を観察できるという利点を生かす。たとえば、皮膚に近紫外線照射後の所属リンパ節において、元々所属リンパ節に存在した集団と末梢組織(皮膚)から遊走した集団を区別して解析する。このマウスを用いて、種々の免疫応答におけるXCR1陽性細胞の動向を追跡する。さらに、Xcr1-DTRマウスにおいては、ジフテリアトキシン投与後、Xcr1-DTAマウスにおいては、恒常的にXCR1陽性細胞を欠失させることができる。このマウスを用いて、Xcr1陽性細胞の機能的意義を、種々の免疫応答、疾患モデルにて明らかにする。(1)XCR1陽性樹状細胞の分布、動態の解析Xcr1遺伝子座へvenus遺伝子をノックインしたマウス(Xcr1-venusマウス)を用いて、種々のリンパ組織、末梢組織における、venus陽性細胞集団の表現型解析を行った。また、Xcr1遺伝子座へKikume遺伝子をノックインしたマウス(Xcr1-Kikumeマウス)を作成した。このマウスでは、近紫外線照射により変色する蛍光物質の特性を指標に、各臓器におけるXcr1陽性細胞の移動を追跡できる。これらのマウスで、二光子レーザー顕微鏡の条件検討も進めた。(2)XCR1陽性樹状細胞欠失マウスの解析Xcr1遺伝子座へジフテリアトキシン受容体遺伝子をノックインしたマウス(Xcr1-DTRマウス)を作成した。このマウスでは、期待通りに、CD8+cDCが欠失した。また、Xcr1遺伝子座にcreレコンビナーゼ遺伝子をノックインしたマウス(Xcr1-creマウス)と、creが作用することによりジフテリアトキシンA

サブユニットが発現するように作成された遺伝子改変マウス(ROSA-loxP-STOP-loxP-DTAマウス)とを交配させることにより、CD8+cDCを恒常的に欠失するマウス(Xcr1-cre-DTAマウス)を樹立した。このマウスにおいてもCD8+cDCの特異的欠失が認められた。(1)XCR1陽性樹状細胞の分布、動態の解析Xcr1-venusマウスにおいては、Venus陽性細胞の表現型解析に加えて、免疫組織学的にその局在を各臓器で検討する。また、種々の免疫アジュバントを用いた免疫応答の際にその局在がどう変化するか検討する。Xcr1-Kikumeマウスにおいては、リンパ節、皮膚、腸管などに存在したXcr1陽性細胞が定常状態、あるいは免疫応答時にどのように移動するか検討を行う。免疫応答を観察する実験系としては、免疫アジュバントばかりでなく、腫瘍接種、ウイルス感染、細菌感染の実験系もセットアップする。(2)Xcr1-DTRマウス、Xcr1-DTAマウスを用いて、種々の免疫応答におけるXcr1陽性細胞の機能的意義を明らかにする。(1)で述べたように、免疫応答を観察する実験系としては、免疫アジュバントばかりでなく、腫瘍接種、ウイルス感染、細菌感染の実験系もセットアップする。また、疾患モデルとしては、TLR7リガンド(イミキモッド)塗布による皮膚乾癬誘発モデル、多発性筋炎モデル、プリスタン投与による自己免疫疾患モデル、高脂肪食摂取による肥満誘発モデルなどを解析する。交配、実験に使用するマウスを購入する。マウスから樹状細胞を調製する際には、FACS AriaIIを用いたソーティング、あるいは磁気によるソーティングが必要になる。そのための蛍光標識抗体、磁気ビーズ標識抗体を購入する。調製した樹状細胞からの各種サイトカインを測定するためのELISAを購入する。また、免疫組織染色のために必要な抗体、試薬を購入する。さらに、マウスに投与する免疫アジュバント、抗原、疾患誘発試薬も購入する。得られた成果を学会で発表するために、ポスター作成、旅費も必要である。
16世紀東アジア海域の諸港市間ネットワークの変動と歴史教育のグローバル化の研究

国ではなく「広域(世界史教育では文化圏)」を基盤とする世界史教育の内容構成の再編と世界史胸囲宇久と日本史教育の相互連関を「ネットワーク論」という理論的枠組みと海域世界を重視することにより明らかにしようとして、理論的には「ネットワーク論」の情報化とグローバル・ヒストリーとの関連、具体的には16世紀の東アジア海域世界の変遷を取り上げて、所謂西洋史、東洋史、日本史の統一的把握のための研究を中国の密貿易ネットワークの変遷、ポルトガル・スペインの東アジア海域進出を軸に行った。その結果、以下のような諸事項で一定の研究成果があがった。1.高等学校「世界史」の内容構成原理「ネットワーク論」の精緻化2.「ネットワーク論」を基盤に据えた東アジア海域世界の再評価と日本史教育のパラダイムの再検討3.人類史の転換期となる諸事象についての考察4.21世紀の社会変化に耐え得るグローバル・ヒストリーと「世界史」の関連。グローバル教育の一部をなす歴史教育の在り方5.明朝の勘合貿易体制の衰退と密貿易の興隆を軸に据えた、16世紀東アジア海域ネットワークの変遷6.16世紀東アジア海域ネットワークの変遷とヨーロッパ諸勢力の進出との関連7.戦後の日本における中学校歴史教科書・高等学校「世界史」・「日本史」教科書の内容構成の変遷8.アジア諸国の歴史教科書における「16世紀海域世界」に関する記述の比較・検討を通じての歴史教育の現状把握国ではなく「広域(世界史教育では文化圏)」を基盤とする世界史教育の内容構成の再編と世界史胸囲宇久と日本史教育の相互連関を「ネットワーク論」という理論的枠組みと海域世界を重視することにより明らかにしようとして、理論的には「ネットワーク論」の情報化とグローバル・ヒストリーとの関連、具体的には16世紀の東アジア海域世界の変遷を取り上げて、所謂西洋史、東洋史、日本史の統一的把握のための研究を中国の密貿易ネットワークの変遷、ポルトガル・スペインの東アジア海域進出を軸に行った。グローバル教育の一部をなす歴史教育の在り方5.明朝の勘合貿易体制の衰退と密貿易の興隆を軸に据えた、16世紀東アジア海域ネットワークの変遷6.16世紀東アジア海域ネットワークの変遷とヨーロッパ諸勢力の進出との関連7.戦後の日本における中学校歴史教科書・高等学校「世界史」・「日本史」教科書の内容構成の変遷8.アジア諸国の歴史教科書における「16世紀海域世界」に関する記述の比較・検討を通じての歴史教育の現状把握アメリカにおけるグローバル教育の視点を踏まえて、都市と都市間ネットワークの成長と変動を軸に「世界史」を構成する方法について考察を加え、特に「世界帝国」の周縁部に位置する港市と海のネットワークの消長が持つ意味を明らかにせんとした。海禁政策と勘合貿易により海上交易を帝国の管理下に置いた明では、16世紀に入ると密貿易といかたちで海上交易が蘇り、明帝国の周縁部における密貿易港の成長と密貿易ネットワークの発達は、やがてポルトガル商船を媒介とするインド洋・東南アジアの物産、日本が産出する豊かな銀と結び付いて、福建・浙江の沿海部は密貿易ネットワークと深いかかわりをもつようになった。海禁政策の空洞化を恐れた明帝国は浙江における密貿易の拠点港市、双嶼港を壊滅させるなどの挙にでたが、交易拠点を五島・平戸・薩摩などに移した密貿易商人は武装貿易を敢行し、浙江における交易拠点の再建を図った。それが嘉靖(後期)倭寇である。王直などが組織した倭寇が如何なる目的を持ち、明帝国の商業ネットワークといかなる関係を有したのかの解明がめざされ、同時に嘉靖倭寇が日本、中国の教科書でどのように扱われているのかをも検討した。中国では抗日戦争期の倭寇観が現在も継承されており、ナショナリズム教育の教材として依然用いられていることが明らかになった。日本人を夷秋視する歴史観は、両国の善隣関係を強化するためにも、再検討が必要であることを論証した。1567年に福建の密貿易港市、月港が開港され、1572年にマニラが開港されると、月港-マニラ-メキシコのアカプルコという新たなネットワークが生まれ、ガレオン貿易によって新大陸のネットワーク、創成期の世界システムとつながることになった。マニラと月港の間の交易を中心に、この新しいネットワークの解明も行った。アメリカにおけるグローバル教育の視点を踏まえながら、都市と都市間ネットワークの成長と変動を軸に「世界史」を構成する内容構成理論(「ネットワーク論」)について検討を加えた。そのために、マクニール、スタヴァリア-ノスなどのグローバル・ヒストリーを構成せんとする試みを分析した。具体的な作業としては、明帝国の周縁部に位置する港市と海のネットワークの消長とポルトガル・スペイン勢力の東アジア世界進出の過程と「世界史」上の位置づけを明らかにする目的で、浙江の双嶼港・福建の月港、マカオ・マニラ・平戸・長崎の興衰、王直と嘉靖倭寇の動向、ポルトガル商人とザビエルの行動、スペインのガレオン貿易などについて研究を進めた。また、その時期の教科書叙述がどうなっているのかを、戦後の中学校歴史教科書、高等学校「世界史」・「日本史」教科書、アジア諸国の教科書で調査・分析したが、その結果としてグローバルな視点が未だ確立されていないことが確認された。

こうした研究を通じて、世界史構成理論としての「ネットワーク論」を用いて海域世界の歴史過程を世界史の一部分として位置づけることの重要性が明らかになった。
発光でＣＲＥＢ活性化を計測できるマウスを用いたうつ病からの回復メカニズム解明

Cyclic adenosine monophosphate response element binding protein (CREB)は記憶形成に重要と考えられている転写因子である。我々はCREBの活性化を可視化できるプローブを開発し、それを発現するトランスジェニックマウスを作製した。そのマウスを用いて、抗うつ剤投与で大脳皮質全体でのCREB活性化が起きること、うつ誘導剤で大脳皮質局所でのCREB活性化が起きることを発見した。またうつ誘導剤で起きるCREBリン酸化はうつ症状の重篤度と相関することも見出した。大脳皮質における転写因子CREBのリン酸化は、記憶形成や精神神経疾患に関係があると考えられているが、脳のどの部位で、どのタイミングでCREBリン酸化が亢進するのか今までは生体脳で解析することは不可能であった。今回、スプリットルシフェラーゼ技術を利用したCREBリン酸化検出プローブを、アクチンプロモーター下で発現するトランスジェニックマウスを作製することで、生体脳でのCREBリン酸化解析を可能にし、薬物に対するCREBリン酸化反応の変化を解析するために、うつ症状を誘導することが知られているレセルピンを3日間連続で投与した。投与の前後、マウスにルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを投与し、脳からの発光を計測すると、レセルピン投与後に大脳皮質の一部からの発光が上昇していることが明らかになった。この結果は、うつ誘導剤投与によって大脳皮質の一部でCREBリン酸化が亢進することを示している。さらにこのマウスをうつ症状を計測する解析法であるtailsuspension testで無働時間を調べると、レセルピン投与マウスではうつ症状が亢進していることが分かった。脳表面を33の区画に分け、それぞれの区画での発光強度の変化を計算し、それぞれの変化率とうつ症状の重篤度との相関があるかどうか調べると、特定の区画での発光上昇とうつ症状の重篤度が、高い相関を示した。この結果は大脳皮質における特定の部位でのCREBリン酸化上昇が、レセルピン投与によるうつ症状誘導と深く連関していることを意味する。脳における転写因子cAMP binding element binding protein(CREB)は、記憶形成に必要なタンパク質であると考えられている。CREBがリン酸化されるとCBPと結合し、転写活性を上昇させる。この特徴を利用し、CREBリン酸化を検知する発光プローブタンパク質を作製し、そのタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを作製した。初年度にうつ誘導剤であるレセルピン投与によって脳内CREBリン酸化のパターンが変化することが見いだされたが、26年度はさらに標本数を増やし、そのパターン変化が有意に起きていると結論した。さらにこの発光パターン変化が、プローブタンパク質の発現量変化を介しているのではないこと、プローブタンパク質が脳内神経細胞に存在していること、発光パターンの変化が単に拘束によるマウスへのストレスに対する反応ではないこと、などのデータを得ることができた。また、抗うつ剤イミプラミン投与によって、投与1時間後に脳からの発光量が大きく上昇することを見出した。この発光上昇は5日後には通常値に戻るため、一過性にCREBリン酸化が亢進したと考えられる。このとき脳における内在性CREBのリン酸化も一過的に上昇することが確かめられた。ただしレセルピン投与の場合と異なり、目立ったCREBリン酸化パターン変化は見られなかった。これらの結果は学会発表を行うとともに、論文として投稿し、受理された。この論文とは別に同プローブを薬剤スクリーニングに使用することができることを証明し、CREBリン酸化経路の上流酵素であるアデニル酸シクラーゼの阻害剤を同定することに成功し、論文として発表した。cAMP response element binding protein(CREB)は、様々な脳機能にかかわる転写因子で、リン酸化されることで活性化され、遺伝子発現所上昇を誘導することが知られている。申請者は、ホタルの発光蛋白質を分割したスプリットルシフェラーゼを用いて、CREB活性化を計測できる新規プローブ蛋白質を開発し、その蛋白質を発現するTGマウスを作製した。このマウスを用いることで、生きたマウスの脳内のCREBのリン酸化を発光で計測できる。本研究ではそのマウスを用いて、うつ病から回復する過程でのマウス大脳皮質でのCREBリン酸化の時間的空間的変化や、うつ病を薬剤で誘導したマウスでのCREBリン酸化の変化を計測しようと試みた。三環系抗うつ剤であるイミプラミンをマウスに投与することによって、マウス大脳皮質からの発光が全体的に上昇することが観測された。これはCREBのリン酸化が抗うつ剤誘導されていることを意味する。同様にCREBリン酸化上昇は選択的セロトニン再取り込み阻害剤であるフロキセチンによっても起きることが確認された。これらのことは、抗うつ剤による、うつ症状からの回復にCREBリン酸化がかかわっている可能性を示唆している。また、うつ病様の症状を誘導した際、脳内でのCREBリン酸化の時間的空間的パターン変化と実際のうつ様症状がどれだけ相関しているか相関解析を行った。その結果、うつ様症状を誘導するレセルピンをマウスに投与すると、前頭前野での発光上昇とうつ様症状との相関が高いことがわかった。これはマウス前頭前野でのCREBリン酸化がうつを誘導する際にも必要であることを示唆するものである。

そのマウスを用いて、抗うつ剤投与で大脳皮質全体でのCREB活性化が起きること、うつ誘導剤で大脳皮質局所でのCREB活性化が起きることを発見した。またうつ誘導剤で起きるCREBリン酸化はうつ症状の重篤度と相関することも見出した。昨年度までの研究で、抗うつ剤投与後よりも、うつ誘導剤を投与した後の変化が顕著であることがわかったため、その影響を先に解析する方針をとった。結果として、昨年度かた大幅に検体数を増やし統計的処理が可能となった。うつ誘導剤による発光パターンの変化と、うつ症状重篤度に強い相関がみられた脳部位が発見された。これは発光でCREBリン酸化を計測し、実際の行動との相関を解析する新しい実験手法が認められたことを意味している。抗うつ剤に対する発光の変化は今現在のデータでは、発光量は短時間で増大するが発光のパターン自体は変化が見られない。これらの内容を論文投稿し、受理された。トランスジェニックマウス作製に使用したプローブタンパク質が、薬剤スクリーニングに使用できることを証明し、論文化した。分子神経科学うつ誘導剤の脳内CREBリン酸化に対する影響は調べ終わったので、今後の解析は、抗うつ剤投与や長期記憶形成時の脳内CREBリン酸化パターンがどう変化するか、に焦点を当てていく。また、長期記憶などの現象においてCREBのリン酸化が変化することが分かった場合、そのCREB依存的遺伝子発現を人工的に抑制することで、記憶形成が損なわれるかどうか検証したい。そのためにCREBのシグナル伝達を阻害するような化合物が、脳内でCREB依存的な遺伝子発現を抑制するかどうか確かめたい。具体的にはイミプラミン投与によって上昇するはずのc-fosなどのmRNAが、阻害剤投与によって抑制されるかどうか、定量PCRを用いて解析する。当初の計画で、レセルピンでマウスにうつ症状を誘導し、その後抗うつ剤でうつ症状を緩和する際の、CREBリン酸化を発光計測する予定であったが、レセルピンを投与した時点で、今まで報告がないようなパターンのCREBリン酸化パターンの変化が見られたため、学術的に解析の価値があると考え、抗うつ剤によるCREBリン酸化への影響を調査する前に、うつ誘導剤レセルピンによるCREBリン酸化への影響を調査するほうが先決と判断した。解析自体は問題なく進捗している。26年度での支出はほぼ採用時の予定通り行った。ただし25年度からの繰り越し分がそのまま未使用になり、27年度に使用する形となった。まず現在進行中のレセルピンに対する脳内CREBリン酸化反応のデータを集積し、レセルピン投与によってCREBリン酸化反応がどう変化するか結論する。その後、最初の目標であった、抗うつ剤に対するCREBリン酸化反応の変化を解析する。また、マウスが長期記憶を形成する際に、大脳皮質でのCREBリン酸化が必要であるかどうか解析したい。27年度は、直近に受理された論文の内容を海外や国内で学会発表する予定である。
内耳障害において細胞内タンパク質分解系による生体制御機構が果たす役割の解明

細胞の品質管理において重要な役割を果たすタンパク質分解系が、内耳障害の際に果たす役割について、細胞レベルで明らかにすることを目的として、主たるタンパク質分解系である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に介して解析を行った。オートファジー・リソソーム系に関しては、内耳有毛細胞特異的にオートファジーがノックアウトされたマウスを作製したところ、生後早期より内耳機能の低下と有毛細胞の消失を認めた。ユビキチン・プロテアソーム系については、内耳培養細胞において、プロテアソーム阻害剤は、低濃度では細胞保護機能を認め、高濃度では細胞障害作用があることが判明した。細胞の品質管理に重要な役割を果たす細胞内タンパク質分解系が、内耳障害において果たす役割を明らかにすることを目的とし、主たる細胞内タンパク質分解系である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に関して、解析を進めている。1.オートファジーリソソーム系については、オートファジーの活性化を観察可能なGFP-LC3トランスジェニックマウスより摘出した蝸牛の培養細胞を用いて検討を行った。耳毒性物質の無いコントロール状態において、GFP-LC3のドットが観察され、リソソーム阻害剤を投与するとドットの数が大幅に増えたことから、内耳においては、通常の状態においてもオートファジーが生じていることが確認された。また、耳毒性物質であるゲンタマイシンを投与すると、このGFP-LC3のドットはさらに増加した。また、ラパマイシンによってオートファジーを活性化すると、ゲンタマイシンの細胞毒性は軽減されることを確認した。以上より、オートファジーは、ゲンタマイシンによる耳毒性を軽減する役割を果たしているものと推察された。2.ユビキチン・プロテアソーム系については、幼若マウスより摘出した蝸牛の培養組織を用いて、プロテアソーム阻害剤であるMG-132の効果を調べた。MG-132は、10microM以上のの濃度では、ほぼ全ての有毛細胞が消失することから、ユビキチン・プロテアソーム系のタンパク質分解は、有毛細胞の生存に必須であることが確認された。細胞の品質管理に重要な役割を果たす細胞内タンパク質分解系が、内耳障害において果たすわ役割を明らかにすることを目的とし、主たる細胞内タンパク質分解系酵素である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に関して解明を進めている。1.オートファジー・リソソーム系に関しては、Pou4f3-CreトランスジェニックマウスとAtg5 floxマウスおよびGFP-LC3トランスジェニックマウスを交配することによって、内耳有毛細胞特異的にオートファジーがノックアウトされ、オートファジーをモニター出来るマウスを作製した。このマウスで聴性脳幹反応(Auditory brain stem response: ABR)で聴力測定を行ったところ、生後1カ月時点で聴力が高度に障害されることが判明した。生後6日目の内耳有毛細胞の組織学的解析においては、明らかな形態学的異常は認められず、生後14日目においては内耳有毛細胞の一部に障害を認めた。これが、高度難聴の原因となりうる障害かどうかについて、現在検討を進めている。2.ユビキチン・プロテアソーム系に関しては、幼若マウスより摘出した蝸牛の培養細胞を用いて、プロテアソーム阻害剤であるMG-132の効果についての検討を前年度に引き続いて行った。MG-132の効果は、高濃度では、ほぼ全ての有毛細胞が消失するが、低濃度では、細胞の保護効果を持つ可能性があることが判明した。細胞の品質管理において重要な役割を果たすタンパク質分解系が、内耳障害に際に果たす役割について、細胞レベルで明らかにすることを目的とし、主たる細胞内タンパク質分解系である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に関して並行して解析を進めている。1.オートファジー・リソソーム系に関しては、昨年度の研究で作成した、Pouf3-CreトランスジェニックマウスとAtg5 floxマウスを交配することによって作製した、内耳有毛細胞特異的にオートファジーがノックアウトされたマウスの内耳障害について、検討を進めた。このマウスでは、聴性脳幹反応(Auditory brainstem response: ABR)を用いた聴力測定で、生後14日目において既に高度難聴を示した。内耳の組織学的検査では、内耳有毛細胞特異的オートファジーノックアウトマウスでは、生後5日目ではほぼ正常形態であったが、生後14日目になると内有毛細胞、外有毛細胞の双方において、聴毛の損傷を認め、生後28日になるとほとんどの有毛細胞が消失していた。この有毛細胞の消失はワイルドタイプのマウスでは認めなかった。また、生後5日目の内耳有毛細胞特異的ノックアウトマウスにおいては、異常なタンパクの凝集体を多数認めた。これらの凝集体は、免疫染色においてユビキチンとp62ともに陽性であった。2.ユビキチン・プロテアソーム系に関しては、本年度は蝸牛由来のcell lineであるHEI-OC1 cell lineを用いて、H2O2に対するプロテアソーム阻害剤であるMG-132の保護効果についての検討を行った。MG-132は、30 nMの濃度では、H2O2に対する保護効果を有することが確認された。現在、別のプロテアソーム阻害剤でも同様の効果を持つか検討を行っている。

内耳においてオートファジー・リソソーム系が果たす役割の検討に関しては、内耳有毛細胞特異的ノックアウトマウスの作製、解析とほぼ順調に進められているが、ユビキチン・プロテアソーム系が果たす役割の検討に関しては、内耳の器官培養からHEI-OC1 cell lineに変更して、検討をおこなっているが、MG-132以外のプロテアソーム阻害剤の効果が一定せず、さらなる条件検討を行っている段階である。細胞の品質管理において重要な役割を果たすタンパク質分解系が、内耳障害の際に果たす役割について、細胞レベルで明らかにすることを目的として、主たるタンパク質分解系である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に関して解析を行った。1.オートファジー・リソソーム系に関しては、Pouf3-CreトランスジェニックマウスとAtg5 floxマウスを交配することによって、内耳有毛細胞特異的にオートファジーがノックアウトされたマウスを作製し、その内耳機能についての解析を行った。このマウスでは、聴性脳幹反応(ABR)による聴力測定では、生後14日目以降では高度難聴を呈した。内耳の組織学的検査では、生後5日目ではほご正常状態であったが、生後14日目になると、内有毛細胞、外有毛細胞ともに、聴毛の損傷を認め、生後28日目になるとほとんどの有毛細胞が消失していた。ワイルドタイプのマウスにおいては、聴力は正常で、有毛細胞の消失も認めなかった。生後5日目の内耳有毛細胞特異的Atg5ノックアウトマウスにおいては、有毛細胞無いに異常なタンパクの凝集体を多数認めた。これらの凝集体はユビキチンとp62ともに陽性であった。同時期の有毛細胞の機能について、FM1-43で計測したところ、正常であることを確認した。2.ユビキチン・プロテアソーム系に関しては、蝸牛由来おcell lineであるHEI-OC1を用いて、H2O2による細胞障害二対して、プロテアソーム阻害剤ではるMG-132とborzotemibの保護効果について、検討を行った。MG-132およびborzotemibはともに、濃度依存的にプロテアソーム活性を抑制した。細胞増殖アッセイでは、いずれの薬剤においても低濃度では細胞保護機能を認め、高濃度では細胞障害を引き起こした。細胞の品質管理において重要な役割を果たすタンパク質分解系が、内耳障害の際に果たす役割について、細胞レベルで明らかにすることを目的として、主たるタンパク質分解系である、ユビキチン・プロテアソーム系とオートファジー・リソソーム系の双方に介して解析を行った。オートファジー・リソソーム系に関しては、内耳有毛細胞特異的にオートファジーがノックアウトされたマウスを作製したところ、生後早期より内耳機能の低下と有毛細胞の消失を認めた。ユビキチン・プロテアソーム系については、内耳培養細胞において、プロテアソーム阻害剤は、低濃度では細胞保護機能を認め、高濃度では細胞障害作用があることが判明した。オートファジーの内耳有毛細胞特異的ノックアウトマウスの作製は、順調に進展しているが、プロテアソーム阻害剤の内耳培養細胞に対する効果は一定せず、一進一退の状況である。内耳有毛細胞特異的ノックアウトマウスにおいては、難聴が生じるメカニズムについて、更なる検討を進めるとともに、論文化を行う。
顆粒球コロニー刺激因子による好中球の増殖、分化の分子機構

本研究では,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)による好中球前駆細胞の増殖・分化の分子機構を解明することを目的とした。まず,好中球の増殖・分化に関与するZnフィンガー転写因子であるMZF-2の種々の変異体を作成して転写活性化能を解析した結果,N末端領域(1-117a.a)は転写に抑制的に働くこと,それよりC末端側の50アミノ酸残基から成る領域(318-367a.a)には強い転写活性化能が存在することが分かった。この領域はホメオボックス型転写因子であるPax6の転写活性化領域と顕著な相互性を示し,両者の転写制御に共通の機構が関与することが示唆された。転写活性化領域のみからなるMZF-2変異体が優性ネガティブに作用することなどから,この領域が骨髄細胞に特異的な未知のコアクチベーターと相互作用することが示唆された。また,G-CSF刺激によって活性化されるMAPキナーゼの標的プロテインキナーゼのひとつであるMNK1の生理的機能を明らかにするために,MNK1の構成的活性型変異体や,優性ネガティブ変異体を作成した。これらの変異MNK1を発現させた細胞における翻訳開始因子4E(eIF-4E)のリン酸化レベルを解析した結果,MNK1がeIF-4Eのリン酸化を介してタンパク合成開始の制御に関与する可能性が示唆された。MNK1は翻訳開始因子4G(eIF-4G)と会合してeIF-4Eをリン酸化することも明らかになった。一方,細胞周期の制御に関与するCyclinE/Cdk2プロテインキナーゼの基質スクリーニングを行ない,出芽酵母のAse1pと相同性を有するヒトのタンパク質(PRC1)をCyclinE/Cdk2の新規な標的タンパク質として同定した。PRC1は細胞質分裂の時期に中央体(midbody)に局在化し,細胞質分裂の制御に重要な役割を果たすことが明らかになった本研究では,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)による好中球前駆細胞の増殖・分化の分子機構を解明することを目的とした。PRC1は細胞質分裂の時期に中央体(midbody)に局在化し,細胞質分裂の制御に重要な役割を果たすことが明らかになった本研究では,顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体を介する細胞内シグナル伝達のメカニズムとその細胞増殖・分化への作用機序を解明することを目的としている。平成10年度は,G-CSF受容体のホスホチロシン残基に結合するタンパク質の解析を行ない,その一つとしてSHIP(SH2-containing inositolpolyphosphate 5'-phosphatase)を同定した。G-CSF刺激によってSHIPがチロシンリン酸化されることも明らかになった。また,好中球の増殖・分化に関与すると考えられるZnフィンガー転写因子であるMZF-2の機能解析を行い,転写を負に制御するドメインと骨髄系細胞特異的に機能する転写活性化ドメイン(50アミノ酸残基)を同定した。さらに,この転写活性化には骨髄系細胞に特異的なコファクターが関与していることを示唆する結果を得た。現在,MZF-2の生理的機能を解明するために,Diffential screeningによる標的遺伝子の探索とMZF-2遺伝子ノックアウトを進行中である。一方,細胞周期の制御に関与するCdkキナーゼの標的タンパク質を同定するために,CyclinE/Cdk2の基質スクリーニングを行ない,出芽酵母のAselpと相同性を有するヒトのタンパク質(PRC1)を同定した。PRC1は,M期の進行に伴って紡錘体中央領域(midzone)に,さらに細胞質分裂の時期には中央体(midbody)に局在化し,その後急速に分解されることが分かった。さらに,PRC1に対する特異抗体を細胞に微量注入することによって細胞質分裂が阻害されることから,PRC1が細胞質分裂の制御に重要な役割を果たすことが示された。

本研究では,顆粒状コロニー刺激因子(G-CSF)受容体を介する細胞内シグナル伝達のメカニズムとその細胞増殖・分化への作用機序を解明することを目的とした。平成11年度には,好中球の増殖・分化に関与するZnフィンガー転写因子であるMZF-2の機能を明らかにするために,種々のMZF-2変異体を作成し,ルシフェラーゼ転写レポーター系による解析を行った。その結果,N末端領域(1-117a.a)には転写に抑制的に働く領域が存在し,それよりC末端側の50アミノ酸残基から成る領域(318-367a.a)には強い転写活性化能が存在することが分かった。この領域はホメオボックス型転写因子であるPax6の転写活性化領域と顕著な相同性を示し,両者の転写制御に共通のメカニズムが関与するすることが示唆された。また,転写活性化領域のみからなるMZF-2変異体が優性ネガティブに作用することから,この領域が他の転写因子と相互作用することが示唆された。しかし,既知のコアクチベーターであるCBPやp300との結合は認められないことから,MZF-2による転写活性化には骨髄細胞に特異的なコアクチベーターが関与していると考えられる。一方,G-CSF刺激によって活性化されるMAPキナーゼの標的プロテインキナーゼのひとつであるMNK1の生理的機能を明らかにするために,MNK1の構成的活性型変異体や,優性ネガティブ変異体を作成した。これらの変異MNK1を発現させた細胞における翻訳開始因子4E(eIF-4E)のリン酸化レベルの解析により,MNK1がeIF-4Eのリン酸化を介してタンパク合成開始の制御に関与する可能性が示唆された。また,MNK1は翻訳開始因子4G(eIF-4G)と会合してeIF-4Eをリン酸化することも示した。
門脈内骨髄移植による自己免疫疾患の治療 -ストローマ細胞と樹状細胞の動態の解析-

疾患モデルマウス(MRL/lprマウス)に5.5Gyx2回放射線分割照射後、門脈内に正常異系骨髄細胞を移植した群はほぼ全例が長期(処置後6ヶ月以上)生存し、一方、静脈内移植群は、処置後6ヶ月で全例が死亡した。従って、経門脈的骨髄移植は従来の経静脈的骨髄移植に比しドナー細胞の生着を促進することが明かである。門脈内投与におけるドナー細胞の早期動態(314日後)の解析の結果、1.門脈内に骨髄細胞を投与した群においては、脾臓、骨髄、肝臓内のリンパ・骨髄球系細胞は急速にドナー由来細胞に置換されること、2.これらの細胞中のドナー由来造血前駆細胞(成熟分化マーカー陰性・c-kit陽性細胞)の頻度は門脈内投与群において有意に高値を示すこと、3.門脈内投与後、肝臓内もしくは脾臓内においてドナー由来細胞の造血巣が認められ、造血巣と同部位あるいはこれに隣接してストローマ細胞が存在すること、4.門脈内投与群において、ドナー由来ストローマ細胞が宿主骨細片の培養により検出されること、が明らかにされた。これらの結果から骨髄細胞の門脈内投与は肝臓内における造血幹細胞とストローマ細胞の相互作用を促進し、肝臓もしくは脾臓における初期造血巣の形成とその後のドナー由来リンパ・骨髄球系細胞の増殖・分化およびその生着効率を高めることが想定された。また、門脈内骨髄移植群では移植後14日の時点でドナー細胞による血液系細胞の再構築が認められるが、脾臓および肝臓内にドナー由来樹状細胞(MHCクラスII陽性/CD11c陽性)も出現している。これらレシピエントではドナーMHCに対するトレランスが誘導されており、移植後早期の樹状細胞の出現がドナー特異的トレランスを誘導している可能性が高いことが明らかになった。疾患モデルマウス(MRL/lprマウス)に5.5Gyx2回放射線分割照射後、門脈内に正常異系骨髄細胞を移植した群はほぼ全例が長期(処置後6ヶ月以上)生存するが、静脈内移植群は、処置後6ヶ月で全例が死亡した。従って、骨髄細胞の門脈内投与はドナー細胞の生着を促進するものと考えられる。この機序を解明するため、門脈内投与におけるドナー細胞の早期動態(314日後)について解析を行った。その結果1)門脈内に骨髄細胞を投与した群においては、脾臓、骨髄、肝臓内のリンパ・骨髄球系細胞は急速にドナー由来細胞に置換され、移植後14日の時点ではほぼ100%がドナー由来細胞となる。これに対し、静脈内に骨髄細胞を投与した群では7日後に一過性のドナー由来細胞の増殖がみられるものの、移植後14日ではドナー由来細胞がほとんど消失した。2)さらにこれらの細胞中のドナー由来造血前駆細胞(成熟分化マーカー陰性・c-kit陽性細胞)の頻度は門脈内投与群において有意に高値を示した。3)実際に共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察から、門脈内投与後、肝臓内もしくは脾臓内においてドナー由来細胞の造血巣が認められ、造血巣と同部位あるいはこれに隣接してストローマ細胞の存在も確認された。門脈内投与群においては、ドナー由来ストローマ細胞が宿主骨細片の培養により検出されることも明らかになっており、これらの知見を総合すると骨髄細胞を門脈内に投与することにより造血幹細胞がストローマ細胞と相互作用し、肝臓もしくは脾臓で初期造血巣を形成し、ドナー由来リンパ・骨髄球系細胞の増殖・分化およびその生着を促進することが想定された。

一方、静脈内投与群においてはドナー由来細胞の初期増殖に問題があることが伺われ、このため最終的にドナー細胞の生着不全を来すことが考えられた。疾患モデルマウス(MRL/lprマウス)に5.5Gyx2回放射線分割照射後、門脈内に正常異系骨髄細胞を移植した群はほぼ全例が長期(処置後6ヶ月以上)生存するが、静脈内移植群は、処置後6ヶ月で全例が死亡した。従って、骨髄細胞の門脈内投与はドナー細胞の生着を促進することが判明している。門脈内投与におけるドナー細胞の早期動態(314日後)の解析の結果、1.門脈内に骨髄細胞を投与した群においては脾臓、骨髄、肝臓内のリンパ・骨髄球系細胞は急速にドナー由来細胞に置換されること、2.これらの細胞中のドナー由来造血前駆細胞(成熟分化マーカー陰性・c-kit陽性細胞)の頻度は門脈内投与群において有意に高値を示すこと、3.門脈内投与後、肝臓内もしくは脾臓内においてドナー由来細胞の造血巣が認められ、造血巣と同部位あるいはこれに隣接してストローマ細胞が存在すること、4.門脈内投与群において、ドナー由来ストローマ細胞が宿主骨細片の培養により検出されること、が明らかになっている。骨髄細胞の門脈内投与は肝臓内における造血幹細胞とストローマ細胞の相互作用を促進し、肝臓もしくは脾臓における初期造血巣の形成とその後のドナー由来リンパ・骨髄球系細胞の増殖・分化およびその生着効率を高めることが想定された。また、門脈内骨髄移植群では移植後14時の時点でドナー細胞による血液系細胞の再構築が認められるが、脾臓および肝臓内にドナー由来樹状細胞(MHCクラスII陽性/CD11c陽性)も出現している。これらレシピェントではドナーMHCに対するトレランスが誘導されているが、樹状細胞出現の経時的変化を樹状細胞サブセットと関連させて解析することによりトレランス誘導の時期・機序を今後解明してゆきたい。疾患モデルマウス(MRL/lprマウス)に5.5Gyx2回放射線分割照射後、門脈内に正常異系骨髄細胞を移植した群はほぼ全例が長期(処置後6ヶ月以上)生存し、一方、静脈内移植群は、処置後6ヶ月で全例が死亡した。従って、経門脈的骨髄移植は従来の経静脈的骨髄移植に比しドナー細胞の生着を促進することが明かである。門脈内投与におけるドナー細胞の早期動態(314日後)の解析の結果、1.門脈内に骨髄細胞を投与した群においては、脾臓、骨髄、肝臓内のリンパ・骨髄球系細胞は急速にドナー由来細胞に置換されること、2.これらの細胞中のドナー由来造血前駆細胞(成熟分化マーカー陰性・c-kit陽性細胞)の頻度は門脈内投与群において有意に高値を示すこと、3.門脈内投与後、肝臓内もしくは脾臓内においてドナー由来細胞の造血巣が認められ、造血巣と同部位あるいはこれに隣接してストローマ細胞が存在すること、4.門脈内投与群において、ドナー由来ストローマ細胞が宿主骨細片の培養により検出されること、が明らかにされた。これらの結果から骨髄細胞の門脈内投与は肝臓内における造血幹細胞とストローマ細胞の相互作用を促進し、肝臓もしくは脾臓における初期造血巣の形成とその後のドナー由来リンパ・骨髄球系細胞の増殖・分化およびその生着効率を高めることが想定された。また、門脈内骨髄移植群では移植後14日の時点でドナー細胞による血液系細胞の再構築が認められるが、脾臓および肝臓内にドナー由来樹状細胞(MHCクラスII陽性/CD11c陽性)も出現している。これらレシピエントではドナーMHCに対するトレランスが誘導されており・移植後早期の樹状細胞の出現がドナー特異的トレランスを誘導している可能性が高いことが明らかになった。
中世都市の考古学的研究-石清水八幡宮門前と普賢寺谷中世居館群のGIS分析-

従来の武士と農民だけの中世史を見直すために、京都や鎌倉など中世を代表する中心都市以外の村や町や都市的な場の復原を、考古学資料を軸に文献史料と歴史地理を合わせた地理情報システムの方法によっておこなってきた。研究の対象は、京都府八幡市に所在する石清水八幡宮門前と京都府京田辺市に所在する普賢寺谷中世館群である。研究は歴史情報の取得、歴史情報の分析、歴史情報の総合の3段階でおこなった。歴史情報取得では、木津川の改修によって水没した石清水八幡宮の周辺旧村落跡の分布調査を2001年度におこない、2002年度と2003年度に普賢寺谷の新宗谷館跡で試掘調査と発掘調査をおこなった。歴史情報分析はデジタルマップを利用して石清水八幡宮の周辺村落を推定し、また普賢寺谷の地形と中世の古絵図の関係を検討した。歴史情報の総合では、中世の集落に関わる南山城および他地域の史料および遺跡情報をデータベース化し、普賢寺谷と石清水八幡官門前の復原のためのモデルを作成した。これらの研究の結果、普賢寺谷の中世館群はあたかも根来寺や平泉寺でみられるような宗教を核とした城塞都市に類似することがわかった。これは当時の一般的な中世村落とは異質であり、山城国一揆の見直しにもつながる。石清水八幡宮門前では従来の研究が中世後半のみの復原であったことを明らかにし、宮寺が最も中央権力と結びついていた平安時代後期から鎌倉時代の風景は、水陸交通の要衝として淀を最大の門前としていた可能性を指摘した。これは中世前半の都市論に対する新しい提案である。中世史を見直すにあたり、今、最も注目されているのが都市研究である。これまで、中世史研究の主要な対象は、荘園制の下で生活していた農民と武士であったが、中世の日本列島で活躍していたのは彼らだけではなく、商人や職人そして各地の都市的な場で生活していた人々でもあったことが、網野善彦氏や石井進氏をはじめとする多くの研究者によって指摘されてきている。しかしその一方で、それでは中世都市とは具体的にどのようなものであったのかについては、京都や鎌倉などの中心都市以外は明らかにされている部分が少ない。本研究ではこのような研究の現状を鑑み、京都府南部に所在する石清水八幡宮門前の木津川河床遺跡と、普賢寺川流域の居館跡群を対象にした考古学とGISの複合的な研究をすすめている。平成13年度においては、最初に普賢寺川流域の居館群の中でも、最も保存状態の良い都谷居館跡を対象に、GIS分析を可能とするための遺跡情報のデジタル化として、デジタル画像から遺跡の等高線データを作成するソフト(アジア航測製「計測名人」)を導入し、その使用を試みた。ソフトはデジタルカメラで取得したステレオ画像を、自動計算によって等高線やベクトルデータおよび断面図などに転換するものであって、館跡などの測量作業を大幅に軽減しながら、しかもGIS分析に必要なデジタル情報の取得を可能とするものであることが確認された。今年度は、複数の郭からなる居館跡のうちの1郭のみのデータ化にとどまったが、次年度はこの方法を駆使して居館跡のデジタル化の拡張をすすめたい。また木津川河床遺跡については、遺跡と遺物の分布調査をおこなった。GPSによって位置情報を取得しながら、4カ所以上での遺物の採集をおこない、おおむね平安時代以降で近世まで連続した遺跡を確認した。しかもその遺物の分布が調査地点ごとに微妙に異なっていることも確認され、それが中世都市の特質に関わってくる可能性を予測させるものともなった。これについてもGIS分析が期待できる。

これまで、中世史研究の主な対象は農民と武士であったが、中世の日本列島で活躍していたのは彼らだけではなく、商人や職人そして各地の都市的な場で生活していた人々でもあったことが多くの研究者によって指摘されてきている。本研究ではこのような中世史研究の現状を鑑み、山城国一揆の拠点の可能性もある普賢寺谷遺跡群の景観復原と、石清水八幡宮門前の空間分析を考古学とGISの複合的な研究によりおこなっている。普賢寺谷遺跡群の景観復原では、昨年の調査結果をふまえ、そのなかでも本学京田辺キャンパスに所在する新宗谷館跡を中心としたデータ取得を重点的におこなった。研究調査は、普賢寺谷遺跡群の景観復原に際してベースマップとなる、広域地形のデジタル測量データの取得にかかる研究と、新宗谷館跡地点に集中した遺跡の情報取得調査である。このうち広域地形測量データについては、アジア航測に依頼して、京田辺キャンパスの開発に際して作成された測量図をデジタライズし、あわせてそのデータを加工閲覧し、その図面に各種歴史情報を追加できるソフトの開発を指導し、おこなった。このデータとソフトにより、新宗谷遺跡を中心とする普賢寺谷主要地区を景観復原する基盤データが整備されたことになる。来年度は後述する新宗谷館跡の遺跡清報もふくめた各種歴史情報をリンクしていきたい。一方、新宗谷館跡の遺跡情報取得については、同遺跡を含む普賢寺谷一帯の調査が、今年度よりわたしの所属する本学歴史資料館の事業としてはじめられ、その試掘調査が歴史資料館としておこなわれたため、本研究ではその成果をうけて、調査後の資料整理をおこない、遺跡の情報取得につとめた。石清水八幡宮門前の空間分析では、昨年度におこなった木津川河床遺跡の分布調査をふまえ、その結果を分析するための空間分析ソフトとして、GIOMEDIAとARC VIEWを導入し、その解析の準備を整えた。来年度は、このGISソフトを利用して、八幡市内遺跡データの解析を進め、石清水八幡宮門前の空間分析による都市構造の解明をおこないたい。これまで中世史研究の主人公であった、武士と農民ではなく、彼ら以上に日本列島の各地で活躍していた商人や職人、そして彼らの拠点となった都市をキーワードにして中世史を見直す試みをおこなっている。今年度は、普賢寺谷遺跡群と石清水八幡宮を対象とした、本研究のまとめとして、南山城に視野を広げたそれらの位置づけの検討をおこなった。普賢寺谷遺跡群では、昨年度より開始された本学歴史資料館の学術調査の成果を取り込む形で、新宗谷館跡の遺跡情報の取得をおこなった。その結果、推定される館跡地点の調査において、絵図史料に描かれている時期と一致する、15世紀代の中国製陶磁器が出土し、当該地点が山城国一揆において一定の役割を果たした場所であったことを確認した。これは普賢寺谷の歴史的景観復原を進める基礎資料と評価できる。また、普賢寺谷中世館群の南山城における位置づけを検討するために、山城国一揆関係の研究史をふまえた、普賢寺谷以外の地域の歴史情報の収集をおこなった。その結果、一般的な中世後期の館と集落は中心とされる館を軸に散在的に存在しており、これに対して普賢寺谷の場合は、同じランクの館が谷を見下ろす形で密集しており、こういった景観が、南山城ばかりでなく同時期の日本列島の中でも希有な状況を示していることが看取された。これは本研究の新知見として正報告で詳述するつもりである。石清水八幡宮関係としては、中世的景観の源流となった古代の風景にも考察をひろげた。
標識アミノ酸投与動物の全身オートラジオグラフィーと代謝産物の分離分析

投与されたアミノ酸の体内分布と代謝の経時的変化及び臓器特異性を明らかにする為に,マウスに^<14>C標識アミノ酸の静脈注射を行い,一定時間後(5,30,60,180分)の体内分布を酸処理及び未処理全身切片のオートラジオグラフィーにより追究した.オートラジオグラフィー黒化度測定にドラムスキャナーを用い臓器内分布の詳細を知ることができた.他の一群では注射後, 1,5,10,30分に主要臓器を剔出し,酸可溶性,酸不溶性,脂質画分に分画し,酸可溶性画分には高速液体クロマトグラフィーを,酸不溶性画分にはSDSゲル電気泳動法あるいはゲル濾過法を行った.対象としたアミノ酸は生理活性アミンの前駆体でもあるチロシン,トリプトファン,ヒスチジン,アルギニン及びロイシン(分岐鎖アミノ酸)とGABA(蛋白質非構成アミノ酸)である.全身オートラジオグラフィーにより, 5つの蛋白質構成アミノ酸の体内分布は投与後5分で膵の放射能が最も高く,肝,腎,消化管,唾液腺が比較的高く,脳,精巣が低く,時間と共に酸不溶性物質への取り込み率が高くなるなど共通のパターンを示した.しかし臓器の黒化度の経時的変化は個々のアミノ酸により多少異なった.一方GABAはこのパターンを示さなかった.主要臓器の酸可溶性画分の高速液体クロマトグラフィーにより臓器で検出された放射性代謝産物及びその量比には臓器による差違が認められ,アミノ酸代謝の臓器特異性を示唆する結果を得た.酸不溶性画分(蛋白質画分)の分析の結果,放射性物質を取り込んだ蛋白質の分子量にはちがいがないことが明らかになった.以上のように6つのアミノ酸代謝の動態に関する知見が得られたが,アミノ酸代謝産物あるいは他のアミノ酸の体内分布やアミノ酸代謝の臓器相関性など解明すべき問題を提起している.投与されたアミノ酸の体内分布と代謝の経時的変化及び臓器特異性を明らかにする為に,マウスに^<14>C標識アミノ酸の静脈注射を行い,一定時間後(5,30,60,180分)の体内分布を酸処理及び未処理全身切片のオートラジオグラフィーにより追究した.オートラジオグラフィー黒化度測定にドラムスキャナーを用い臓器内分布の詳細を知ることができた.他の一群では注射後, 1,5,10,30分に主要臓器を剔出し,酸可溶性,酸不溶性,脂質画分に分画し,酸可溶性画分には高速液体クロマトグラフィーを,酸不溶性画分にはSDSゲル電気泳動法あるいはゲル濾過法を行った.対象としたアミノ酸は生理活性アミンの前駆体でもあるチロシン,トリプトファン,ヒスチジン,アルギニン及びロイシン(分岐鎖アミノ酸)とGABA(蛋白質非構成アミノ酸)である.全身オートラジオグラフィーにより, 5つの蛋白質構成アミノ酸の体内分布は投与後5分で膵の放射能が最も高く,肝,腎,消化管,唾液腺が比較的高く,脳,精巣が低く,時間と共に酸不溶性物質への取り込み率が高くなるなど共通のパターンを示した.しかし臓器の黒化度の経時的変化は個々のアミノ酸により多少異なった.一方GABAはこのパターンを示さなかった.主要臓器の酸可溶性画分の高速液体クロマトグラフィーにより臓器で検出された放射性代謝産物及びその量比には臓器による差違が認められ,アミノ酸代謝の臓器特異性を示唆する結果を得た.酸不溶性画分(蛋白質画分)の分析の結果,放射性物質を取り込んだ蛋白質の分子量にはちがいがないことが明らかになった.以上のように6つのアミノ酸代謝の動態に関する知見が得られたが,アミノ酸代謝産物あるいは他のアミノ酸の体内分布やアミノ酸代謝の臓器相関性など解明すべき問題を提起している.投与されたアミノ酸の体内分布と代謝の経時的変化及び臓器特異性を明らかにする為に、マウスに【^(14)C】標識アミノ酸の静脈注射を行い、一定時間後(5,30,60,180分)の体内分布を酸処理及び未処理全身切片のオートラジオグラフィーにより明らかにした。オートラジオグラフ黒化度測定に前年度と同じくドラムスキャナーを用い臓器内分布の詳細を知ることができた。他の一群では注射後1,5,10,30分に主要臓器を剔出し酸可溶性、酸不溶性、脂質画分に分画し、酸可溶性画分にはHPLCを、酸不溶性画分にはゲル濾過を行った。本年度はロイシン,ヒスチジン,アルギニンについて行った。全身オートラジオグラフは投与後5分ではロイシン,アルギニンは膵の放射能が特に高く、ヒスチジンは膵,肝で高かった。酸処理切片のオートラジオグラフィーによる各臓器の黒化度の減少度はアミノ酸により多少異なるが体内分布は殆んど変っていないことが明らかになった。各臓器の黒化度の経時的変化はアミノ酸により異なり、ロイシンの場合殆んどの臓器の黒化度は時間と共に減少し、アルギニンは投与後5-30分で最大値を示し、ヒスチジンでは投与後180分までほぼ同じ値を示すか増加する傾向が見られた。ヒスチジン投与の場合、酸可溶性画分のHPLCによる分析の結果、投与後1分の血液にはヒスチジン画分以外にイミダゾールピルビン酸画分にも放射能が認められたが、主要代謝物であるヒスタミン及びウロカニン酸画分には放射能が検出されなかった。肝,腎,脳や小腸でも同様の結果を示した。代謝物の【^(14)C】取り込みの経時的変化はヒスチジン