hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己組織化したナノ構造を持つ光触媒酸化チタン薄膜における電荷移動と光蓄電性

光蓄電池は単一電極で光電変換と蓄電の行えるデバイスであり,外部充電回路等が不要なことから,小型の独立補助電源などへの応用が期待されている.しかし,光励起電圧に上限があるため,従来の二次電池のように効率的な蓄電をさせることが困難であり,克服すべき課題となっている.本研究ではまず,水素プラズマ処理と光電気化学エッチングにより,自己組織化した酸化チタン薄膜表面にミクロな低エネルギー蓄電サイトを作ることで,薄膜中で光励起されたキャリアを,電解液中のリチウムイオンを取り込む蓄電へ効率的に結びつけることをねらった.その結果,エッチングにより表面に酸素欠損が生じたものは光励起キャリアの再結合確率が増えることにより,光起電力および光蓄電量が減少したが,酸素欠損を伴わないエッチングでは光蓄電量の急激な増加を示すものがあった.もともと比表面積の小さい薄膜で得られた現象であるので,多孔膜等で同様の処理を行うことで,相乗的な効果が見込めることを示した.一方,大気圧化学気相蒸着法において,外部電界と紫外光により励起し結晶成長させ,自己組織化した樹状結晶の表面に高光活性化サイトを露出させることにより,光蓄電の高効率化をねらった.この方法によって結晶形状の制御が可能であることが分かったが,形状の変化はわずかで必ずしも光蓄電量の向上には結びつかなかった.さらに励起エネルギーを上げるなどの方策が必要である.光蓄電池は単一電極で光電変換と蓄電の行えるデバイスであり,外部充電回路等が不要なことから,小型の独立補助電源などへの応用が期待されている.しかし,光励起電圧に上限があるため,従来の二次電池のように効率的な蓄電をさせることが困難であり,克服すべき課題となっている.本研究ではまず,水素プラズマ処理と光電気化学エッチングにより,自己組織化した酸化チタン薄膜表面にミクロな低エネルギー蓄電サイトを作ることで,薄膜中で光励起されたキャリアを,電解液中のリチウムイオンを取り込む蓄電へ効率的に結びつけることをねらった.その結果,エッチングにより表面に酸素欠損が生じたものは光励起キャリアの再結合確率が増えることにより,光起電力および光蓄電量が減少したが,酸素欠損を伴わないエッチングでは光蓄電量の急激な増加を示すものがあった.もともと比表面積の小さい薄膜で得られた現象であるので,多孔膜等で同様の処理を行うことで,相乗的な効果が見込めることを示した.一方,大気圧化学気相蒸着法において,外部電界と紫外光により励起し結晶成長させ,自己組織化した樹状結晶の表面に高光活性化サイトを露出させることにより,光蓄電の高効率化をねらった.この方法によって結晶形状の制御が可能であることが分かったが,形状の変化はわずかで必ずしも光蓄電量の向上には結びつかなかった.さらに励起エネルギーを上げるなどの方策が必要である.光触媒である酸化チタンは,光電変換のほかにそれ自身に電解液中のリチウムイオンを取り込むことで蓄電もでき,単体で「光蓄電池」の電極として動作することが知られている.しかし,酸化チタン自身によって生ずる光起電力が小さいため,リチウムイオンの十分な駆動力が得られず,光蓄電電荷量が小さいことが問題となっている.これまでの研究により,酸化チタン表面の酸素欠損が有効な低エネルギー蓄電サイトとして働くことが分かっている.そこで,直流マグネトロンスパッタリング法を用いて自己組織化によって生じた表面積の大きな220配向柱状結晶薄膜を作製し、水素プラズマ還元処理によって表面に酸素欠損を生成し,電荷移動特性と光蓄電性への影響を調べた.XRDによると,プラズマ処理によってアナターゼ型の220のピークが減少しTiOのピークが生じたことから酸素欠損が生成されていることが確認できた.しかし、プラズマ処理によって光起電力は減少し,光蓄電電荷量は向上しなかった.交流インピーダンス測定の結果、プラズマ処理を施した試料では電気二重層容量の増大が見られ,実効的な表面積が増大していることが分かった.また,光に対する応答速度も遅くなった.以上の結果は、表面付近に生成された酸素欠損は蓄電サイトとして働くものの,結晶内部にまで酸素欠損が生じ,それらが再結合中心として働くため,結果的に蓄電電荷量が減少したことを示唆している.しかし、プラズマの照射条件によっては、光起電力の減少に反して光蓄電電荷量が向上した.この現象は必ず膜厚の減少を伴っていることから,ブラズマエッチングにより表面付近に新規な蓄電サイトが生成されたためと考えられるが、どのような機構が寄与しているのか今後調べる必要がある.光蓄電池は単一電極で光電変換と蓄電の行えるデバイスであり,外部充電回路等が不要なことから,小型の独立補助電源などへの応用が期待されている.しかし,光励起電圧に上限があるため,従来の二次電池のように効率的な蓄電をさせることが困難であり,克服すべき課題となっている.本研究ではまず,水素プラズマ処理と光電気化学エッチングにより,自己組織化した酸化チタン薄膜表面にミクロな低エネルギー蓄電サイトを作ることで,薄膜中で光励起されたキャリアを,電解液中のリチウムイオンを取り込む蓄電へ効率的に結びつけることをねらった.その結果,エッチングにより表面に酸素欠損が生じたものは光励起キャリアの再結合確率が増えることにより,光起電力および光蓄電量が減少したが,酸素欠損を伴わないエッチングでは光蓄電量の急激な増加を示すものがあった.

もともと比表面積の小さい薄膜で得られた現象であるので,多孔膜等で同様の処理を行うことで,相乗的な効果が見込めることを示した.一方,大気圧化学気相蒸着法において,外部電界と紫外光により励起し結晶成長させ,自己組織化した樹状結晶の表面に高光活性化サイトを露出させることにより,光蓄電の高効率化をねらった.この方法によって結晶形状の制御が可能であることが分かったが,形状の変化はわずかで必ずしも光蓄電量の向上には結びつかなかった.さらに励起エネルギーを上げるなどの方策が必要である.
コアディスキングに基づく三次元地圧評価法の実証研究

一般的な三次元地圧が作用する場合について,有限要素法を用いてコア内部の引張主応力解析を行った結果,コアディスキングの発生条件,ディスク形状と地圧の関係などについて以下の主な知見が得られた.1)コアディスキングがコア内部で発生する引張応力によるコアの破断現象であると考えることにより,コアディスキングの発生条件式を提案した.2)コア中央部の引張主応力方向の分析から,ディスク中央部には平坦なき裂面が形成されると予想された.これから,ディスク表面中央部の法線方向から,最小主応力の方向を評価する方法を提案した.3)コア外周部の引張主応力方向の分析から,σ_1とσ_2の差が十分大きい場合に鞍型のコアディスキングが生じ.σ_1とσ_2の差が大きいほど顕著な鞍型を呈するようになることを示した.4)地圧の主軸の少なくとも一つがコア軸またはそれと垂直な軸のどれかと一致する場合について,ディスク形状の対称性,ディスク端面中央部の法線方向および凹部軸または凸部軸から地圧の三つの主軸を推定する方法を提案した.また,真三軸圧縮試験装置を用いて実験的研究を行い.コアが長い場合についてのディスキングが生じる地圧条件について次のような主な知見が得られた.5)本研究の理論解析で提案したディスキング条件式は,白河溶結凝灰岩の場合,破壊開始点付近の応力とほぼ一致した.一方,脆性度が小さい来待砂岩の場合はディスキング条件式よりもかなり小さな応力でコアディスキングが生じた.来待砂岩では,ボアホール底部の側面でブレイクアウトに類似した破壊形態が観察されたことから,来待砂岩のディスキングに圧縮破壊が関与していると考えられた.6)破断面の観察から.σ_x>σ_<y2>、σ_z=0の条件でも,コア側の破壊面は横から見ると下に凸で,予想された鞍型の破壊面は形成されなかった.一般的な三次元地圧が作用する場合について,有限要素法を用いてコア内部の引張主応力解析を行った結果,コアディスキングの発生条件,ディスク形状と地圧の関係などについて以下の主な知見が得られた.1)コアディスキングがコア内部で発生する引張応力によるコアの破断現象であると考えることにより,コアディスキングの発生条件式を提案した.2)コア中央部の引張主応力方向の分析から,ディスク中央部には平坦なき裂面が形成されると予想された.これから,ディスク表面中央部の法線方向から,最小主応力の方向を評価する方法を提案した.3)コア外周部の引張主応力方向の分析から,σ_1とσ_2の差が十分大きい場合に鞍型のコアディスキングが生じ.σ_1とσ_2の差が大きいほど顕著な鞍型を呈するようになることを示した.4)地圧の主軸の少なくとも一つがコア軸またはそれと垂直な軸のどれかと一致する場合について,ディスク形状の対称性,ディスク端面中央部の法線方向および凹部軸または凸部軸から地圧の三つの主軸を推定する方法を提案した.また,真三軸圧縮試験装置を用いて実験的研究を行い.コアが長い場合についてのディスキングが生じる地圧条件について次のような主な知見が得られた.5)本研究の理論解析で提案したディスキング条件式は,白河溶結凝灰岩の場合,破壊開始点付近の応力とほぼ一致した.一方,脆性度が小さい来待砂岩の場合はディスキング条件式よりもかなり小さな応力でコアディスキングが生じた.来待砂岩では,ボアホール底部の側面でブレイクアウトに類似した破壊形態が観察されたことから,来待砂岩のディスキングに圧縮破壊が関与していると考えられた.6)破断面の観察から.σ_x>σ_<y2>、σ_z=0の条件でも,コア側の破壊面は横から見ると下に凸で,予想された鞍型の破壊面は形成されなかった.本年度は,ボーリング軸方向可変型フラットジャッキ式真三軸試験装置を設計・製作するとともに,すでに開発した軸対象物体非軸対象荷重問題の有限要素コードを用いて一般的な応力条件におけるコア周辺部の引張主応力と引張主ひずみの解析を行い,コアディスキングが生じる地圧条件やコアディスキングの形状と地圧の方向との関係を理論的に明らかにした。得られた主な結果は次の通りである。1.作製したボーリング軸方向可変型フラットジャッキ式真三軸試験装置の主な緒元は,試験片の寸法30cm立法,最大載荷応力30MPa,ボーリング孔径30mm,ボーリング軸傾斜角最大30°,同方位最大45°である。2.一般的地圧条件におけるコア周辺部の引張主応力を計算し,引張主応力の方向がコア軸方向に近い必要があることから26通りの応力条件を抽出し,コアを貫通する条件からコアディスキングが発生する地圧条件を提案した。また,本条件式が従来の実験結果をよく説明することを示した。また,コア内部の引張主応力の詳細な分析により,σ_1σ_2の差が大きいほど顕著な鞍型を呈するようになることおよび地圧の主軸の少なくとも一つがコア軸またはそれと垂直な軸のどれかと一致する場合について,ディスク形状の対称性,ディスク端面中央部の法線方向および凹部軸または凸部軸から地圧の三つの主軸を推定する方法を提案した。3.上記2の解析を引張主ひずみについても行った結果,引張主応力規準と似てはいるもののコアディスキングを生じるための異なる地圧条件式が得られた。今後の実験によって引張応力基準と引張ひずみ規準のどちらが正しいかを明らかにする予定である。

本年度は,1)昨年度作製した試験装置を用いて,コアディスキングの発生条件と形態に関する実験的研究を行うとともに,2)三次元ネットワークモデルによるシュミレーションを行った。前者については,2種類の岩石試料(白河溶結凝灰岩,来待砂岩)について,予めボーリングコア(直径19mm,長さ150mm)を作成したブロック試験片(300mm立方体)に,コア軸がz軸としてσ_x≧σ_y,σ_z≧0の条件で応力を加え,コアディスキングの発生過程を調べた。また,後者については,モデルの一様性と等方性をできるだけ保証する軸対称モデルを構築し,上記と同様の応力条件でコアディスキングのシュミレーションを行った。得られた主な結果は次の通りである。1.応σ_xを増加すると,ある応力でコアが傾き始め,次に,応力を増加しなくてもコアが傾き続ける点が現れた。これらを,それぞれ,破壊開始応力,不安定成長開始応力と呼ぶと,昨年度の引張主応力解析から得られたディスキング発生条件は,白河溶結凝灰岩についてはほぼ破壊開始応力を与えるが,来待砂岩については不安定成長開始応力よりも大きな応力条件に対応した。破壊面の形状をコア側から見ると両岩石とも全ての応力条件で下に凸であった。しかし,来待砂岩の場合,σ_xがσ_yより大きくなるほど,凸部が大きくなるとともにσ_y方向に大きな切り株が生成した。このσ_y方向に大きな切り株はビット底部での圧縮破壊の影響と考えられた。2.三次元ネットワークモデルによるコアディスクングのシュミレーションの結果,σ_x=σ_yの条件ではコア底部側面からコア軸に垂直なき裂がある長さ不安定成長した後停止し,σ_x≧σ_yの条件ではき裂はσ_x方向から発生するが不安定なき裂成長は起こらなかった。すなわち,き裂はゆっくり進展すると予想された。これは上記の実験結果と調和的であった。本年度は,以下のことを行うとともに,これまでの研究成果のとりまとめを行った.1.これまでに用いてきたポーリング軸方向可変型フラットジャッキ式真三軸試験装置の載荷能力では,地圧下のポーリング実験で十分な地圧範囲についてコアディスキングを実現できないことがわかった.そこで,載荷能力を増加させるため装置の改良を行った.すなわち,試験片を20cm立方体とし.厚さ50mm,面積300mmx300mmの鋼製スペーサ6個を作製して試験片寸法の減少によって得られた空間に挿入した.なお,同スペーサは互いに接触しないよう面取りが施されている.これに伴って,フラットジャッキの寸法も変える必要が生じ,若干小さめのフラットジャッキを設計・作製した.この結果,試験片への載荷能力は,従来の30MPaから約50Mpaに増加した.2.改良したポーリング軸方向可変型フラットジャッキ式真三軸試験装置を用いて,白河溶結凝灰岩に対し,地圧下のポーリングに伴うコアディスキングの予備実験を行った.この結果,同岩石については,昨年までに得られた長いコアに対するディスキング開始条件以上の地圧条件でポーリングを行うと,地圧が大きいほどディスクの厚さが小さくなることが明らかになった.これは,コア長さが小さいほどコア底部の引張応力が小さくなるためであると考えられた.このことは,ディスキング条件に関する理論解析を,本研究で明らかにしたコアが長い場合だけでなく,コアが短い場合についても行う必要があることを示唆した.
組合せ幾何に関する研究

幾何学的対象に埋め込まれたグラフの研究としては,まず閉曲面の三角形分割や四角形分割についての研究を行った.三角形分割に対しては,対角変形と呼ばれる基本変形による推移可能性に関しての研究を引き続き進め,次数制約のついた問題や,外平面グラフの拡張である外三角形分割について結果を得た.また,平面上の三角形分割であって,他の閉曲面の四角形分割としても埋め込むことのできるグラフについて,曲面が向き付け可能かどうかに依存して,グラフの組合せ的性質が重要な役割を果たしているという,興味深い結果を得た.この結果に見られるような,向き付け不可能な曲面特有の性質として,向き付け可能曲面に切り開ける奇閉路が存在するような四角形分割は,染色数が4以上になることを示した.ここで用いられた議論をトーラスとクラインの壺に適用することによって,それらの曲面の四角形分割の染色数は,ある位相幾何学的性質によって特徴付けられることを示した.さらに,一般の閉曲面の四角形分割においては,閉路の偶奇性に関連した閉曲面の代数的不変量が,染色数に影響を及ぼすことがわかった.本研究の目的のひとつに,平面において知られていた事実を一般の閉曲面へ拡張するための一般的道具立ての開発を挙げていたが,閉曲面上の3連結グラフで,representativityの高いものに対して,それを切り開き,元の構造をあまり破壊せずに全域部分グラフとなる平面グラフを得る手法を開発した.この手法により,そのような3連結グラフがどの程度ハミルトン性に近い性質を持つか,という問いに対する答えとして,最大次数4以下の全域木に関するもの,最大次数8以下の全域2連結部分グラフの存在,次数和の小さい連結部分グラフに関する漸近的に最善の結果を証明した.幾何学的対象に埋め込まれたグラフの研究としては,まず閉曲面の三角形分割や四角形分割についての研究を行った.三角形分割に対しては,対角変形と呼ばれる基本変形による推移可能性に関しての研究を引き続き進め,次数制約のついた問題や,外平面グラフの拡張である外三角形分割について結果を得た.また,平面上の三角形分割であって,他の閉曲面の四角形分割としても埋め込むことのできるグラフについて,曲面が向き付け可能かどうかに依存して,グラフの組合せ的性質が重要な役割を果たしているという,興味深い結果を得た.この結果に見られるような,向き付け不可能な曲面特有の性質として,向き付け可能曲面に切り開ける奇閉路が存在するような四角形分割は,染色数が4以上になることを示した.ここで用いられた議論をトーラスとクラインの壺に適用することによって,それらの曲面の四角形分割の染色数は,ある位相幾何学的性質によって特徴付けられることを示した.さらに,一般の閉曲面の四角形分割においては,閉路の偶奇性に関連した閉曲面の代数的不変量が,染色数に影響を及ぼすことがわかった.本研究の目的のひとつに,平面において知られていた事実を一般の閉曲面へ拡張するための一般的道具立ての開発を挙げていたが,閉曲面上の3連結グラフで,representativityの高いものに対して,それを切り開き,元の構造をあまり破壊せずに全域部分グラフとなる平面グラフを得る手法を開発した.この手法により,そのような3連結グラフがどの程度ハミルトン性に近い性質を持つか,という問いに対する答えとして,最大次数4以下の全域木に関するもの,最大次数8以下の全域2連結部分グラフの存在,次数和の小さい連結部分グラフに関する漸近的に最善の結果を証明した.幾何学的対象に埋め込まれたグラフの研究としては,まず閉曲面の三角形分割や四角形分割についての研究を行った.三角形分割に対しては,頂点数が十分大きければ,同じ頂点数をもつ三角形分割は,対角変形と呼ばれる基本変形を繰り返すことで互いに移りあえることが知られているが,さらに最小次数等の制約条件を付けても同様の結果が成り立つことを示した.平面グラフの性質として,指定された頂点数をもつような連結部分グラフで,どのくらい次数和が小さいものが存在するかについて,漸近的に最善の評価を与えた.本型空間ヘグラフを埋め込む問題に関して,本の背との交差を許す埋め込みについて考え,任意のグラフを3貢の本型空間に,0(MlogN)の交差で埋め込めることと,この埋め込みがある意味で最善であること,つまりグラフがdenseならば下限も同じオーダーになることを証明した.また,平面上の三角形分割であって,他の閉曲面の四角形分割としても埋め込むことのできるグラフについて,任意の閉曲面に対してそのようなものが構成できることを証明した.一方で,平面の5連結三角形分割は向き付け可能な曲面の四角形分割になることはなく,向き付け不可能曲面の四角形分割になるための必要十分条件が,グラフの組合せ的性質で特徴付けられることを証明した.また,向き付け不可能な曲面特有の性質として,向き付け可能曲面に切り開ける奇閉路が存在するような四角形分割は,染色数が4以上になることを示した.ここで用いられた議論をトーラスとクラインの壺に適用することによって,それらの曲面の四角形分割の染色数は,ある位相幾何学的性質によって特徴付けられることを示した.幾何学的対象に埋め込まれたグラフの研究として,従来から行っていた閉曲面の三角形分割や四角形分割の理論を,より一般的なグラフへの理論へ拡張する試みを行った.三角形分割に対する生成定理や,対角変形と呼ばれる操作による変形に関する定理を,外平面グラフの拡張である外三角形分割というグラフについて適用し,特にトーラス及びクラインの壺上で顕著な成果をあげた.四角形分割においては,従来より,閉路の偶奇性に関連した閉曲面の代数的不変量が,変形操作での遷移可能性に影響を及ぼすことが知られていたが,同じ不変量が染色数にも影響を及ぼすことを示した.

本研究の目的のひとつに,平面において知られていた事実を一般の閉曲面へ拡張するための一般的道具立ての開発を挙げていたが,閉曲面上のrepresentativityの高い3連結グラフに対して,それを切り開き,元の構造をあまり破壊せずに全域部分グラフとなる平面グラフを得る手法を開発した.この手法により,3連結グラフがどの程度ハミルトン性に近い性質を持つか,という問いに対する答えとして,最大次数4以下の全域木で,次数4の頂点の個数が曲面の種数だけに応じた数で抑えられたものが存在すること,最大次数8以下の全域2連結部分グラフで,次数7以上の頂点の個数がやはり種数だけに依存する数で抑えられるものが存在すること,辺の数が頂点数のほぼ4/3倍以下で抑えられる2連結全域部分グラフが存在することを証明した.また,3連結平面グラフでの先行研究の拡張として,次数和の小さい連結部分グラフに関する結果も同じ手法を用いて証明することができた.さらに,4連結性を仮定すると,よりハミルトン性に近い性質を持つこともわかった.
周術期乳がん患者の体重増減に関する続発性リンパ浮腫予防プログラムの開発

本研究は,乳がん術後患者の体重増減とリンパ浮腫発症との関係を明らかにし,術前・術後早期の看護援助につながる「乳がん術後リンパ浮腫発症予防プログラム」の開発を目的とした.第1段階では,乳がん術後リンパ浮腫発症患者の体重増減とリンパ浮腫発症前後の日常生活について質的統合を行った.第2段階では,縦断調査による量的統合を行った.第1段階の結果を基に,体重増減の影響要因となった「ホルモン剤の投与」「術前からの肥満」のリスク因子のある乳がん術後患者を対象に体重変化とリンパ浮腫発症に影響する要因の調査を実施し,体重増減に係るリンパ浮腫発症予防プログラムの構成概念を明らかにした.本研究の目的は,周術期乳がん患者の体重増減が術後の続発性リンパ浮腫発症におよぼす影響に着眼した自己管理行動を遂行するプログラムを開発することである.平成25年度はステップ1について取り組んだ.ステップ1:乳がん術後に放射線治療,内分泌治療後の体重増減の変化と続発性上肢リンパ浮腫発症の関係を明らかにする.研究者所属の大学および研究施設の倫理委員会の申請を行い,2013年9月に承認を得た.研究施設の外来に通院する乳がん術後患者で放射線治療,内分泌治療を受けており,続発性リンパ浮腫の患者を対象に以下の調査を実施した.調査内容:診療録および対象者より調査1術後リンパ浮腫発症までの経過および自己管理行動の内容2リンパ浮腫の状態(症状,皮膚の状態,周囲径の測定)3栄養に関する項目(主観的栄養評価:SGAおよびカルテより客観的栄養評価を調査)4体重変化に関する項目(過去6ヶ月間の体重増減,過去2週間の増減,リンパ浮腫発生時期との関係等,活動の状況について)5既往歴,生活習慣などを調査した.研究参加者は7名で,現在データの分析中である.文献統合・質的統合の結果から,体重変化に影響する自己管理行動の概念を抽出し,妥当性を検討していく.質的統合の結果の公表については、2014年度開催の関連学会発表に向けて準備段階である.本研究の目的は,周術期乳がん患者の体重増減が術後の続発性リンパ浮腫発症におよぼす影響に着眼した自己管理行動を遂行するプログラムを開発することである。2014年度は以下の2点を実施した。1質的統合のまとめおよび結果の公表第一段階では,乳がん術後に続発性上肢リンパ浮腫を発症した患者の体重増減と自己管理行動について明らかにすることを目的とし,49から76歳の乳がん術後続発性リンパ浮腫患者8名に半構成的面接法にてインタビューを実施した。その結果,「術式の理解」や「補助療法の理解」についてはすべての参加者が認識していた。一方,「リンパ浮腫の危険因子」,体重増加がリンパ浮腫の危険因子となることについては認識していない者が多かった。「体重管理」については、体重増減に関する自覚をもち,定期的に体重測定をしている参加者は少数であったが,体重変化が13Kg以内であった。また,体重変化が少ないものは,体重変化や上肢の違和感などを敏感に察知し,自己管理行動がとれていた。一方,体重変化の大きいものは,体重変化に関心がなく,運動習慣はあったもののその他の自己管理行動に結びついていなかった。また,「リンパ浮腫の前兆」を自覚しても,医療機関への受診行動はとれていないことがわかった。さらに,体重増減の前後で「ホルモン療法による影響」が示唆され,ホルモン剤投与中の体重変化とリンパ浮腫について,患者の日常生活の実態調査が必要であることが示唆された。2,量的統合に向けた準備質的統合の結果より,ホルモン療法を受けている期間中の体重変化とリンパ浮腫発症および体重変化に係る日常生活の実態調査の必要性がある。さらに,リンパ浮腫発症リスクの高い肥満患者に焦点化した実態調査を実施する必要があると考え,具体的に倫理委員会の申請,研究実施施設との調整段階である。課題1ではリンパ浮腫発症患者に質的調査を実施し、術後の体重増減とリンパ浮腫発症に関する自己管理行動を明らかにした。その質的統合では、体重増加がリンパ浮腫発症のリスク因子となることを認識していないことやホルモン療法の前後での体重増減があることがわかった。そのため、体重増減にホルモン療法の影響が関与していること、体重増減に係る日常生活の実態調査の必要性が示唆されたことから、研究デザインを修正した。課題2である、乳がん術後ホルモン剤を投与中の患者の体重変化とリンパ浮腫発症について前向き調査を実施している。現在、2施設の外来で術後ホルモン剤を投与されるタイミングから3ヶ月間の継続した日常生活の実態調査を行っている。調査内容は、対象者に日常生活の食事・排泄・活動などの内容、体重と体温の計測と記録を依頼し、外来受診日に日常生活の記録をもとに面接を実施し、さらに詳細なデータを得ている。また、その際に、体組成の測定と上肢の周囲径の計測を実施し、リンパ浮腫発症の有無を確認している。平成27年8月からデータ収集を開始し、1事例につき、6ヶ月から1年の継続調査を実施しているために、研究期間の延長が生じている。現在11例のデータを分析中である。課題1の結果より、研究デザインを修正したことにより研究の進行に遅れが生じたこと、課題2では、1事例につき合計3回の前向きに追跡調査を実施している点から研究期間の延長が生じたため、研究期間を1年間延長をした。

本研究は,乳がん患者の術前・術後における体重増減とリンパ浮腫発症との関係を明らかにし,周術期を通してリンパ浮腫発症予防プログラムを開発することを目的とした。第1段階では、乳がん術後リンパ浮腫発症患者の体重増減とリンパ浮腫発症前後の日常生活について質的統合を行った。第2段階では、縦断調査による量的統合を行った。第1段階の結果を基に、体重増減の構成要素となった「ホルモン剤の投与」「術前からの肥満」のリスク因子のある乳がん術後患者を対象に体重変化とリンパ浮腫発症に影響する要因の調査を実施し、体重増減に係るリンパ浮腫発症予防プログラムの構成概念を明らかにした。第1段階では、乳がん術後にリンパ浮腫を発症した患者8名の体重増減に係る日常生活とリンパ浮腫発症について質的記述的分析を実施した。体重増減を意識していた者は習慣的な体重測定や食事や運動などの日常生活を意識的に送っていた。一方、体重増減の意識がなかった者は体重管理を行っておらず10キロ以上の体重増加が見られる者がいた。また、術後ホルモン剤の投与をきっかけに食欲が増加し、体重増加につながった、ホルモン剤の副作用の自覚から活動が減ったことなどを自覚していた。第2段階では、乳がん術後ホルモン剤を投与中の術後早期の50名を対象に体重変化とリンパ浮腫発症に影響する日常生活について9ヶ月1年半の縦断調査を実施した。術後ホルモン剤投与中に体重増加を示すものが多くみられ、ホルモン剤を変更するなど2剤以上使用した患者および術前から肥満のある患者はより体重増加の傾向にあった。また、体重増加の自覚や体重増加があるものが上肢の周囲径や体組成においてリンパ浮腫の前兆があることが明らかとなった。今後、これらの体重増加と浮腫発症の構成要素を取り入れたリンパ浮腫予防プログラムを用いて、術前および術後早期から継続的に体重変化を確認していく必要がある。本研究は,乳がん術後患者の体重増減とリンパ浮腫発症との関係を明らかにし,術前・術後早期の看護援助につながる「乳がん術後リンパ浮腫発症予防プログラム」の開発を目的とした.第1段階では,乳がん術後リンパ浮腫発症患者の体重増減とリンパ浮腫発症前後の日常生活について質的統合を行った.第2段階では,縦断調査による量的統合を行った.第1段階の結果を基に,体重増減の影響要因となった「ホルモン剤の投与」「術前からの肥満」のリスク因子のある乳がん術後患者を対象に体重変化とリンパ浮腫発症に影響する要因の調査を実施し,体重増減に係るリンパ浮腫発症予防プログラムの構成概念を明らかにした.研究分担者の所属異動に伴い実施施設の変更,研究代表者の進学に伴う研究計画の一時中断などで計画とおり進まなかった点が大きい。現在2施設で11例の研究対象者の調査を実施している。さらに調査対象を増やし、研究期間内に課題3となる体重増減に係るリンパ浮腫発症予防自己管理プログラムモデル案の作成を目指す。課題2の途中経過ではあるが成果発表についても関連学会で発表予定である。看護学乳がん術後早期の患者のうち,BMI25以上の肥満患者の体重変化とリンパ浮腫の発症の関係を前向き手法で量的調査を進めていく。量的統合の結果により,体重増減に係るプログラムの開発につなげる予定である。
麻ひ性貝毒による貝類の毒化機構の再検討

筆者らは大船渡湾において、1982年以来PSPによるホタテガイの毒化をAlexandrium tamarenseの発生との関連で調査し、貝の毒化が毒の食物連鎖による貝への移行蓄積だけでは説明できないことを指摘してきた。本研究の目的は、有毒渦鞭毛藻の捕食による貝類の毒化現象を再検討し、貝の毒化機構を明らかにすることを目的とする。まず、A. tamarenseの培養細胞を貝類に給餌し、貝の毒蓄積のkineticsを検討した。その結果、貝に蓄積した毒は環境水中に放出されることを確認したが、1)貝類は時に与えた毒量以上の毒を蓄積すること、2)給餌を停止後、貝に蓄積した毒量と環境水中の毒量の和は減少した後再び増加するなど、field調査で観察されてきた不思議な現象が観察された。本研究において毒はglutathione (GSH)などのチオールと結合して複合体(thiol-STXs)を作ることを明らかにした。2)の結果は、毒が貝のGSHと結合し、通常の分析では検出できないGS-STXsに変化した後、再び毒として遊離されることを示唆するが、有毒ホタテガイ中腸腺中にはGS-STXsは検出されなかった。この原因は、GS-STXsが組織中のgGTPにより分解される過程で、システインに結合した毒もアルカリ分解物に類似した蛍光物質に分解されることによることが判明した。次に有毒ホタテガイ中腸腺の組織切片をSTXに対する抗体で染色したところ、血球と思われる顆粒の細胞質および栄養細胞を取り巻く膜に強い発色が見られた。中腸腺のbuffer抽出物および膜タンパク画分ををゲルろ過して得た高分子画分をmercaptoethanolで処理したところSTXsが遊離し、PSPがこれら画分中のタンパクのシステイン残基と結合していることが明らかになった。一方、毒と結合したタンパクを含む画分をproteaseで消化したところ、GTXsが遊離し、システインとの結合とは異なる形でタンパクと結合した毒の存在が明らかになった。さらにprotease消化物中には前述の毒の分解物と類似の蛍光物質の存在が認められ、タンパクの消化に伴い、結合した毒が分解されることが考えられた。本研究は、貝の体内で毒が分解を含む代謝を受けることを始めて示したもので、今後のPSPの代謝研究の端緒となるものと考える。有毒渦鞭毛藻の捕食による麻ひ性貝毒による貝類毒化を二枚貝にAlexandrium tamarenseの培養細胞を給餌することにより再検討した。まず従来報告されてきた方法に従い、複数の個体を種類ごとに同一の水槽で飼育し1週間給餌後さらに1週間無給餌で飼育し、貝の蓄積した毒を経時的に個体ごとに分析した。給餌に伴い貝類はそれぞれ毒化した。毒成分も飼育中大きく変化し貝の体内で毒が代謝を受けることを示した。このような毒の成分変換には酵素反応および化学物質による化学反応の両面から研究があるが、詳細は不明である。今回の結果はこのような研究の貴重な情報であると考える。

これに対して毒蓄積量は著しい個体差を示し、蓄積毒量が給餌したプランクトン毒量を越える個体が多く認められた。これは個体間の摂餌量の差に起因し、飼育中のハンドリングによる刺激が貝の摂餌行動に大きく影響することが考えられ、本試験法は貝類毒化の観察には不適であることが判明した。そこでホタテガイを用い、個体別に給餌を行う方法により同様の実験を繰り返したところ、ホタテガイに蓄積される毒量が給餌した毒量を上回る現象が再び観察された。この結果はA.tamarenseを給餌したホタテガイの体内で毒が新たに生産されることを意味し、プランクトンと共に取り込まれたプランクトンに共生する毒生産菌が貝の毒化にも関与することを示唆した。筆者らは毒生産菌に由来すると考えられる微量の毒が水棲生物に普遍的に存在することを認め、毒生産菌が環境に広く分布することを示唆した。そこでサケの持つ微量の毒を精製し、スペクトル分析により毒が麻ひ性貝毒であることを確認した。以上の結果は生物の持つ麻ひ性貝毒と毒生産菌との関係を強く示唆するものである。ホタテガイへのAlexandrium tamarenseの給餌実験により麻痺性貝毒による貝類の毒化を再検討した結果、ホタテガイに蓄積される毒量が給餌した毒量を上回る現象を観察した。この事実はホタテガイに取り込まれた麻痺性貝毒成分が貝の体内で何らかの代謝を受けていることを示すものである。筆者らは先に、麻痺性貝毒の一次生産者が渦鞭毛藻に共生する細菌であることを示唆した。そこで、同細菌を用い麻痺性貝毒の成分変化を検討したところ、細菌抽出物が麻痺性貝毒の11-O-sulfate derivativeであるgonyautoxins(GTXs)をsaxitoxin(STXs)に還元分解する活性を見出し、同活性が細菌のgluthathioneによることを明らかにした。さらにこの反応の過程でGTXsとglutathioneが結合した安定な複合体が生じることに気付いた。本複合体は過剰のチオールにより分解されSTXsを生じる。以上の事実は麻痺性貝毒が生物の体内でチオール化合物と比較的容易に反応することを示し、この反応が起こる際麻痺性貝毒成分が従来の検出法では検出できない形に変化することを意味する。そこでこのような物質を検出するための方法の一つとして、麻痺性貝毒に対する抗体の作成を試みた。すなわち、上記複合体を利用して麻痺性貝毒に結合したチオール化合物を介してタンパクを結合し、これを抗原として麻痺性貝毒に対する抗体を作成した。得られた抗体は殆ど全ての麻痺性貝毒成分にほぼ同様の親和性を示した。そこで本抗体を用いて毒化したホタテガイのタンパク画分をwestern blot法により分析したところ、抗体と反応するタンパク成分を認めた。本成分を含む画分を過剰のチオール試薬で処理し、HPLCで分析したところSTXsと思われるピークを認めた。そこでこの画分を、上記抗体を結合したaffinity columnにかけて精製したところ、STXsが精製された。以上の結果は、ホタテガイに取り込まれた麻痺性貝毒の少なくも一部は、タンパク性のチオールと結合した形で存在することを示し、貝における麻痺性貝毒の新たな代謝動態を示すものである。Alexandrium tamarenseをホタテガイに給餌して毒化の程度を調べたところ、給餌毒量を超える毒が蓄積する現象を観察した。同様の実験をA.catenellaを用いて繰り返したところ、上記の現象はさらに顕著に認められた。
小児白血病および神経芽細胞腫患児の生活の質(QOL)の検討

神経芽細胞腫マススクリーニング発見症例の生活の質(QOL)について自記式アンケートによる調査を行った.対象:1981年4月から93年12月までの札幌市の6カ月神経芽細胞腫マススクリーニングによる真陽性例40例と偽陽性例80例.これらの例はすべて国立札幌病院小児科に入院して精査を受けた.93年12月までにそれぞれ38例,70例に質問票を発送した。方法:QOLに関する質問票を作成した.内容は,身体発育,運動発達,予防接種など一般的な小児保健に関する質問が主である。これを郵送し,母親に母子手帳の記録などをもとに記入返送させた.94年1月末現在,回収率はそれぞれ約80,70%(真陽性例33例,偽陽性例50例)である.男女別に真陽性例と偽陽性例を比較した.結果:出生時および4,10,18,36カ月(保健所で検診が実施されている月齢)の体重については、男女とも,両群に有意差はなかった.定頸,独歩の月齢についても,男女とも,両群に有意差はなかった.手術およびその後の治療は,3歳までの身体発育,運動発達には大きな影響を与えていないものと思われる.今後の研究:予防接種・感染症などの事項については,今後解析を実施する。また,マンパワーと資金の制約から,今年度実施できたのは神経芽細胞腫マススクリーニング発見症例に対する調査のみであった.次年度には,この結果を踏まえて,白血病患児の生活の質について調査する予定である.神経芽細胞腫マススクリーニング発見症例の生活の質(QOL)について自記式アンケートによる調査を行った.対象:1981年4月から93年12月までの札幌市の6カ月神経芽細胞腫マススクリーニングによる真陽性例40例と偽陽性例80例.これらの例はすべて国立札幌病院小児科に入院して精査を受けた.93年12月までにそれぞれ38例,70例に質問票を発送した。また,マンパワーと資金の制約から,今年度実施できたのは神経芽細胞腫マススクリーニング発見症例に対する調査のみであった.次年度には,この結果を踏まえて,白血病患児の生活の質について調査する予定である.
亜鉛シグナルによる脂肪細胞褐色化の分子機構

本研究では、1亜鉛トランスポーターZIP13を介した亜鉛シグナル(ZIP13-亜鉛シグナル)による脂肪褐色化制御の分子機構を解明すること、ならびに2Zip13欠損による脂肪細胞褐色化亢進は脂肪細胞自律的に起きているのかを調べることを目的とする。これらの解明により、ZIP13を利用した新しいコンセプトの抗肥満糖尿病治療法の開発に繋がることが期待できる。1ZIP13の標的分子の同定昨年度同定したZIP13に結合する分子(ZIP13結合分子)3種類のうち、どの分子がZIP13-亜鉛シグナルを介する脂肪細胞褐色化抑制の経路に関与するか検討した。まず、3種類のZIP13結合分子が細胞内でZIP13と結合することを、免疫沈降を行い確認した。次に、3種類の分子をそれぞれノックダウンや過剰発現することにより、ZIP13と同じ挙動を示す分子Xを同定した。亜鉛輸送能を失ったZIP13変異体では、分子Xの安定性が変化することを見出した。この結果は、ZIP13を介する亜鉛が分子Xの安定性を制御することを示唆しており、分子Xが亜鉛含有タンパク質であることを鑑みると、大変興味深い。現在ZIP13がどのように分子Xを制御するか検討している。2脂肪細胞特異的Zip13欠損マウスの解析Zip13欠損による脂肪細胞褐色化亢進は脂肪細胞自律的に起きているのかを調べるために、Zip13floxマウス(徳島文理大学深田俊幸教授から分与)とAdiponectin-Creマウスとの掛け合わせを行い、脂肪細胞特異的なZip13-KOマウスを作製した。全身のZip13-KOマウスは高脂肪食負荷時の肥満に抵抗性を示すことが観察されているので、現在脂肪細胞特異的なZip13-KOマウスでも同様の表現系が観察できるか検討している。本研究では、亜鉛トランスポーターZIP13を介した亜鉛シグナル(ZIP13-亜鉛シグナル)による脂肪褐色化制御の分子機構を解明することを目的とし、肥満や糖尿病の理解に貢献することを目標とした。本年度は(1) Zip13-KOマウスの糖代謝における役割と(2)ZIP13の下流で働く標的分子の探索を目指した。(1)これまでZip13-KOマウスではベージュ脂肪細胞が増加することにより全身のエネルギー代謝が亢進することを見出していた。そこで本年度は高脂肪食負荷時の耐糖能評価を行ったところ、コントロールマウスに比べてZip13-KOマウスでは耐糖能が有意に改善することを見出した。これらの結果から、Zip13-KOマウスでは、全身のエネルギー代謝が増えることにより末梢組織のインスリン抵抗性が改善し、糖代謝が良くなると考えられた。(2)コントロールマウスとZip13-KOマウス由来の前駆脂肪細胞(Zip13-KO細胞)を用いて褐色脂肪細胞の誘導刺激を与えた際に、既存の褐色化シグナル経路において、蛋白質量やmRNA量発現の顕著な相違があるものを観察した。その結果、褐色誘導刺激を与えた際に、コントロール細胞に比べてZip13-KO細胞でC/EBP-betaの蛋白質量が早期に増加すること、さらにはその増加はC/EBP-beta蛋白質の安定化に起因することを見出した。転写因子C/EBP-betaは、脂肪細胞の褐色化の早期に働く鍵分子の一つとして知られるため、その制御機構の解明は新たな褐色化メカニズムの解明に繋がる可能性を有する。Zip13-KOマウスで褐色化が亢進する1つの要因としてC/EBP-betaが安定化することが原因だと考えられるデーターを得た。本年度得たこれらのデーターと、これまでの解析結果から得られたZip13-KOマウスの皮下脂肪組織での機能的なベージュ脂肪細胞の増加・エネルギー消費量の亢進・糖代謝改善の結果をまとめてリバイスを完了し、リバイス後の原稿を投稿した。本研究では、亜鉛トランスポーターZIP13を介した亜鉛シグナル(ZIP13-亜鉛シグナル)による脂肪褐色化制御の分子機構を解明することを目的とし、肥満や糖尿病の理解に貢献することを目標とする。本年度はZIP13がベージュ脂肪細胞の分化に対して抑制的に作用することを明らかにした論文を公表した(Fukunaka A, et al., PLoS Genet. 2017)。しかしながら、なぜZIP13を欠損するとベージュ脂肪細胞が特異的に分化亢進(ベージュ化)するのか、その分子機序はまだ解明されていない。そこで、申請者が開発したベージュ脂肪細胞分化誘導系を用いて、ZIP13の脂肪細胞褐色化抑制に必要な領域を決定した。鳥類には、ベージュ脂肪細胞が存在しないことが知られているが、ZIP13は鳥類にも保存されている。マウスのベージュ脂肪細胞分化系を適用すると、ニワトリZIP13の亜鉛輸送能はマウスと同程度に保たれているものの、マウスZIP13のように脂肪細胞褐色化を抑制する機能は保存されていなかった。このことは、マウスZIP13は、亜鉛輸送以外に脂肪細胞褐色化に必要な領域を保持していることを示唆している。そこで、その領域を同定するため、ニワトリとマウスのキメラZIP13を作成することにより、脂肪細胞褐色化抑制に必要な領域を同定したところ、マウスZIP13の細胞質側に面した特徴的な長いループ構造が脂肪細胞褐色化抑制に必要十分であることが判明した。

この領域はZIPファミリー間で保存性が低い領域であったため、この領域がZIP13-亜鉛シグナルの特異性を決定し、この領域に結合する分子が脂肪細胞褐色化抑制に重要ではないかと想定した。そこでZIP13のループ構造をbaitとして、yeast two hybrid(Y2H)を行い、結合する分子(結合分子)を3種類選定した。本年度はZIP13-亜鉛シグナルの脂肪細胞褐色化抑制に必要な領域を同定できた。また、その領域に結合する分子(標的分子)を3種類選定した。今後、選定してきた標的分子候補の脂肪細胞褐色化における役割を明らかにし、ZIP13-標的分子の脂肪細胞褐色化における役割を解明する。以上のように本年度は、ZIP13の標的分子の候補が得ることができたため、当初の計画通り進んでいると考えられる。本研究では、1亜鉛トランスポーターZIP13を介した亜鉛シグナル(ZIP13-亜鉛シグナル)による脂肪褐色化制御の分子機構を解明すること、ならびに2Zip13欠損による脂肪細胞褐色化亢進は脂肪細胞自律的に起きているのかを調べることを目的とする。これらの解明により、ZIP13を利用した新しいコンセプトの抗肥満糖尿病治療法の開発に繋がることが期待できる。1ZIP13の標的分子の同定昨年度同定したZIP13に結合する分子(ZIP13結合分子)3種類のうち、どの分子がZIP13-亜鉛シグナルを介する脂肪細胞褐色化抑制の経路に関与するか検討した。まず、3種類のZIP13結合分子が細胞内でZIP13と結合することを、免疫沈降を行い確認した。次に、3種類の分子をそれぞれノックダウンや過剰発現することにより、ZIP13と同じ挙動を示す分子Xを同定した。亜鉛輸送能を失ったZIP13変異体では、分子Xの安定性が変化することを見出した。この結果は、ZIP13を介する亜鉛が分子Xの安定性を制御することを示唆しており、分子Xが亜鉛含有タンパク質であることを鑑みると、大変興味深い。現在ZIP13がどのように分子Xを制御するか検討している。2脂肪細胞特異的Zip13欠損マウスの解析Zip13欠損による脂肪細胞褐色化亢進は脂肪細胞自律的に起きているのかを調べるために、Zip13floxマウス(徳島文理大学深田俊幸教授から分与)とAdiponectin-Creマウスとの掛け合わせを行い、脂肪細胞特異的なZip13-KOマウスを作製した。全身のZip13-KOマウスは高脂肪食負荷時の肥満に抵抗性を示すことが観察されているので、現在脂肪細胞特異的なZip13-KOマウスでも同様の表現系が観察できるか検討している。Zip13-KO細胞でC/EBP-betaの蛋白質が安定化することを見出したので、今後はどのような修飾の変化によりC/EBP-beta蛋白質が安定化するのか、またその修飾にZIP13がどう関わるかをZip13-KO細胞を用いて明らかにする。論文投稿時に査読者から、Zip13-全身KOマウスは結合組織の脆弱性が見られることから、今回観察されたベージュ脂肪細胞の増加が脂肪組織に起因するものであるかを確かめた方がいいという指摘があった。この点に関しては組織特異的なZip13-KOマウスを作製し、解析する必要があると考えられたため、今後Zip13-floxマウスを用いた解析も視野に入れて研究を進める。
活性酸素障害除去におけるセレン蛋白質の役割とその動物種差-特にモルモットに注目して-

肝臓、腎臓中でclassical glutathione peroxidase(cGPx)活性が著しく低いモルモットにおいて、他のどのようなセレン蛋白質が発現しているのか検討した。肝臓、腎臓中のセレン蛋白質を^<75>Seでin vivoで標識し、SDS-PAGEで分離したところ、肝臓ではphospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx)と思われる分子量18kDaのセレン蛋白質のバンドが最も強く標識された。そこで、この蛋白質を2次元電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で分離したところ、確かにPHGPx活性を持つ蛋白質であることを確認した。さらに、肝臓のmRNAを用い、ラットのPHGPxの配列を元に作製したprimerでRT-PCRを行ったところ、PHGPxのbandが増幅されたので、増幅されたcDNAを切り出してその塩基配列を決定したところ、ラットのPHGPxと98%の相同性を持つことがわかった。従って、cGPx遺伝子がほとんど発現していないモルモットの肝臓中においても、PHGPx遺伝子は発現し、活性を持つ蛋白質としてl8kDaのPHGPxが存在していること、他の動物種とは異なり、モルモットの肝臓中ではPHGPxが主要なセレン蛋白質であること、が明らかになった。このPHGPxの活性はセレン欠乏時に他のセレン蛋白質の活性が減少しているときにもほとん減少せず、セレン欠乏時に体内に取り込まれたわずかなセレンは積極的にPHGPxに利用されることも明らかになった。一方、腎臓ホモジネートのSDS-PAGE分析によって、腎臓中には22kDaの未知のセレン蛋白質が存在している可能性が示された。そこで、この蛋白質の性状を解析したところ、cGPxの単量体と分子量は近いが等電点が異なること、しかし、cGPx同様4量体を形成している可能性が高いこと、などがわかった。また、同様のセレン蛋白質がラットの肝臓中にも存在する可能性が示唆された。この蛋白質の性状については、さらに今後検討する必要性がある。【モルモット血漿中のSe蛋白質の性状】モルモットの血漿中glutathione peroxidase(GPx)活性及びSe濃度は、他の動物種と比べて大きな差がないことを見いだし、血漿型GPxの精製を行った。カラムクロマトグラフィーにより最終的に得られた蛋白質はSDS-PAGE上で23kDaの単一のバンドを示し、Seを含んでいた。peptide mappingにより、部分アミノ酸配列を決定したところ、既知のラット血漿型GPxと高い相同性を示した。また、human pGPx cDNAをプローブとしてNorthern blot分析を行ったとこ、この遺伝子の主な発現組織は腎臓であることを見いだした。一方、GPx活性を持たない分子量52kDaのSe蛋白質がモルモット血漿中に存在していたので、その性状を解析した結果、ヘパリン結合性を持ち、^<75>SeO_3^<2->投与後に迅速に標識される、等のラットselenoproteinPと共通する性質を持っていた。【モルモット組織中のSe蛋白質の性状】モルモットは肝臓や腎臓においてGPx活性がほとんど検出できないが、Se濃度は決して低くない。そこで、^<75>SeO_3^2をモルモットに投与し、各組織のホモジネートをSDS-PAGEで分析することにより、どのような蛋白質が^<75>Seで標識されるかを調べた。

その結果。モルモット肝臓中の主要な^<75>Seのバンドは18KfDaのPHGPxと同じ分子量の位置に見いだされた。そこで、モルモットの肝臓、腎臓、精巣のPHGPx活性を測定し、マウス、ラットと比較したところ、大きな種差は認められず、また、肝臓、腎臓より精巣で活性が高いという共通の傾向が認められた。肝臓、腎臓中でclassical glutathione peroxidase(cGPx)活性が著しく低いモルモットにおいて、他のどのようなセレン蛋白質が発現しているのか検討した。肝臓、腎臓中のセレン蛋白質を^<75>Seでin vivoで標識し、SDS-PAGEで分離したところ、肝臓ではphospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx)と思われる分子量18kDaのセレン蛋白質のバンドが最も強く標識された。そこで、この蛋白質を2次元電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で分離したところ、確かにPHGPx活性を持つ蛋白質であることを確認した。さらに、肝臓のmRNAを用い、ラットのPHGPxの配列を元に作製したprimerでRT-PCRを行ったところ、PHGPxのbandが増幅されたので、増幅されたcDNAを切り出してその塩基配列を決定したところ、ラットのPHGPxと98%の相同性を持つことがわかった。従って、cGPx遺伝子がほとんど発現していないモルモットの肝臓中においても、PHGPx遺伝子は発現し、活性を持つ蛋白質として18kDaのPHGPxが存在していること、他の動物種とは異なり、モルモットの肝臓中ではPHGPxが主要なセレン蛋白質であること、が明らかになった。このPHGPxの活性はセレン欠乏時に他のセレン蛋白質の活性が減少しているときにもほとんど減少せず、セレン欠乏時に体内に取り込まれたわずかなセレンは積極的にPHGPxに利用されることも明らかになった。一方、腎臓ホモジネートのSDS-PAGE分析によって、腎臓中には22kDaの未知のセレン蛋白質が存在している可能性が示された。そこで、この蛋白質の性状を解析したところ、cGPxの単量体と分子量は近いが等電点が異なること、しかし、cGPx同様4量体を形成している可能性が高いこと、などがわかった。また、同様のセレン蛋白質がラットの肝臓中にも存在する可能性が示唆された。この蛋白質の性状については、さらに今後検討する必要性がある。
アデノ随伴ウイルスベクターを用いた血友病Aの治療法の開発と改良

パルボウイルスのB19のプロモーターを用いたBドメイン欠如型のAAV-FVIIIベクターを作製した。In vitroでは、CAGプロモーターを用いたDual VectorによるFVIIIの発現量と比較して、約85%と十分な発現が得られたので、AAVの血清型の内、筋肉に対する親和性が高いとされるAAV1ないしAAV9のベクターをヘルパーフリーシステムにて作製した。これらのベクターを用いてマウス(C57BL/6マウス,5週齢)の前頸骨筋に筋注して、その発現を2週間ごとに採血して血中のヒトFVIII抗原をELISA法にて測定した。残念ながら、十分な発現はAAV1ベクター、AAV9ベクターともにみられず、さらにBethesda法による中和抗体の測定によって、2週後から徐々に中和抗体が上昇する事が確認された。この中和抗体の産生を抑制するために、Nature Medicine 12(5),p585-591,2006を参考にして、FVIIIのcDNAの下流に血液系の細胞のmicroRNAに感受性のあるシーケンスを付加した。この目的は、筋肉中にある樹状細胞に導入された場合にはFVIIIが産生されず、抗体産生の抑制されることを期待されるという事であった。このシーケンスを付加した構造をもつAAV1およびAAV9ベクターを作製して同じく,5週齢のC57BL/6マウスに筋注してヒトFVIIIの発現を観察した。どちらの血清型のベクターを筋注したマウスでも、FVIII抗原は測定感度以下であり、筋肉細胞中でも付加したシーケンスはmicroRNAに感受性があると考えられた。Bethesda法による中和抗体の測定でも、抗体は検出されず、これは抗原の発現が無いためと考えられた。第VIII因子の重鎖/軽鎖を2つのAAVベクターによって発現させる方法を開発している.この方法の問題点のひとつが第VIII因子重鎖(FVIIIHC)の発現量が低く,両者の発現量がアンバランスなことであった.これを改善するために,FVIIIHCベクターのCAGプロモーターの一部を切除し,3'側にWPREを付加した.この新しいFVIIIHC発現ベクターとCAGプロモーターをもつFVIIILC発現ベクターを用いて,In vitroでFVIIIの発現量と活性を測定した.両者ともCAGプロモーターを使用したベクターと比較して,活性は約1.3倍とわずかな上昇を認めた.またこの両遺伝子を発現するベクターをFVIII因子欠乏マウスに筋注すると非常に高い中和抗体が検出され、その原因も両遺伝子の発現のアンバランスにあると考えた。そこでFVIIIのBドメイン欠如型の遺伝子(4374bp)を使用する1ベクタースタイルのAAVベクター作製を計画した.サイズが小さいプロモーターとしてパルボウイルスB19のP6プロモーター(約340bp)に着目した.3'側を100bp削除した240bp長のプロモーターと340bp全長のものと、コントロールとしてcmvプロモーターをそれぞれもつ、EGFP発現ベクターを作製した。これを293細胞(胎児腎細胞由来),N2a細胞(神経芽腫由来)にトランスフェクションしてEGFP発現量をFACSにて解析して比較した。293細胞では340bp長のプロモーターはcmvプロモーターとほぼ同等で、N2a細胞では約半分の発現を示した.240bpのプロモーターは340bp長のものに対してそれぞれの細胞で約80%の活性を示した.AAVベクターはITRも含めて5kb以下でないとベクター作製効率が非常に悪化するため,240bpのp6プロモーターを用いたBドメイン欠如型FVIIIのAAVベクターを作製中である。これを用いて筋注による高い中和抗体価の原因が実際に重鎖・軽鎖のアンバランスに起因するのかを検討する。