hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
先駆的有機稲作方法を実現する自律移動型田面改質ロボットの研究

代掻き後に特定の力学的負荷を田面に与え,芽生え期の雑草の生長を阻害し,無農薬で雑草を排除できる先駆的有機稲作方法の機械化・自律化の実現を目的とし,田面改質ロボットを試作した.田面改質による雑草生長の抑制効果を水田で実証し,その萌芽的基盤技術を確立した.田面改質ロボットは,LRFで障害物検出して条間を自律移動する小型構成であり,照明は不要なので夜間も条間および稲間の抑草作業を自律的に行える.超音波センサで水面検出してLRFを位置制御し,傾角センサを使ってLRFのセンシング方向を水面に水平に維持して,水位変化する凹凸不整田面で自律移動と田面加圧用抑草アームの制御を安定化して効果的抑草を実現した.実環境である稲作期間の水田環境で田面改質ロボットによる実験を実施した.稲作期間の後も,実験室での実験を実施して改良型田面改質ロボットを実現できた.抑草機能については,抑草用3DOFマニピュレータとブラシ式エンドエフェクターで構成し,傾角センサを備えて,傾角情報をもとにマニピュレータの姿勢をマイクロプロセッサで自動制御できるように構成した.この構成により,凹凸のある田面を移動する際のロボット本体の傾角を検出しマニピュレータの姿勢を自動制御することによって,マニピュレータ先端のブラシが凹凸田面に常に一定の押圧をかけることができ安定した抑草作業を実現した.抑草効果は,実験室内に構成した水田環境で実験を行い,週1回の抑草作業,週2回の抑草作業の田面と無抑草作業の田面での雑草の発生と生長を観察し,週2回の抑草作業によって十分な抑草効果が得られることを確認した.また,ブラシによる押圧によって芽生え期の雑草を田面から除去できることを確認した.研究成果の一部は,国際会議および国内学会において発表した.代掻き後に特定の力学的負荷を田面に与え,芽生え期の雑草の生長を阻害し,無農薬で雑草を排除できる先駆的有機稲作方法の機械化・自律化の実現を目的とし,田面改質ロボットを試作した.田面改質による雑草生長の抑制効果を水田で実証し,その萌芽的基盤技術を確立した.田面改質ロボットは,LRFで障害物検出して条間を自律移動する小型構成であり,照明は不要なので夜間も条間および稲間の抑草作業を自律的に行える.超音波センサで水面検出してLRFを位置制御し,傾角センサを使ってLRFのセンシング方向を水面に水平に維持して,水位変化する凹凸不整田面で自律移動と田面加圧用抑草アームの制御を安定化して効果的抑草を実現した.自律移動型田面改質ロボットの設計製作,実環境のモニタリング系の構築,屋内実験での機能モデルによる評価の実施を研究計画して研究を実施した.1.自律移動型田面改質ロボットの設計製作と性能評価(1)田面改質部の設計製作と性能評価:研究準備した基本設計と機能設計をもとにして,自律移動型田面改質ロボットの詳細設計と製作を実施した.さらに,考案した田面改質機構の機能モデルについて,田面改質効果を屋内実験環境において性能評価した.(2)環境計測・自律移動のセンサ系,駆動系の設計製作と性能評価:自律移動型田面改質ロボットの環境計測・自律移動に用いるセンサ系の構成要素を,選定し性能評価した.また,田面の自律移動のための駆動系を設計製作し,実験室レベルで性能評価した.2.実環境の整備とモニタリング系の構築次年度の稲作期に実環境での実験を実施するために,実環境のモニタリング系を構築し,実環境データを記録収集できるようにした.最終年度に,実環境である稲作期間の水田環境で田面改質ロボットによる実験および実験室内に構成した水田環境で田面改質ロボットによる実験を実施した.自律移動のために前方障害物を検出するためのレーザレンジファインダー(LRF)について,田面移動時に水面からの高さを超音波センサで検出してLRFの位置制御を行い,傾角センサで本体の傾角を検出して不整田面移動中に本体が傾いてもLRFのセンシング方向を水面に水平に維持して適切なセンシングができるようにLRFの傾角を制御する構成にした.この構成により,凹凸のある田面を移動する際のLRFのセンシング高さと方位を安定化し,水田環境での自律移動と抑草作業を実現した.抑草効果は,実験室内に構成した水田環境での実験と稲作期間の水田環境で適切に得られることを確認した.研究成果は,国際会議および国内学会において発表した.研究期間全体を通して,稲作において,代掻き後に,特定の力学的負荷を田面に与えることによって,芽生え期の雑草の生長を阻害でき,無農薬で雑草を排除できる先駆的有機稲作方法の機械化・自律化の実現を目的として,田面改質ロボットを試作した.その田面改質機能による雑草生長の抑制効果を実環境の水田において実証し,その萌芽的基盤技術を確立した.田面改質ロボットは,水田の条間をLRFによって障害物検出して自律移動する小型構成であり,照明を必要としないため夜間でも抑草作業を自律的に行える.また,本研究で取り上げた稲作初期の抑草用アームによる抑草作業の他に,稲作中期には抜草アームに交換して抑草後に残った雑草を抜草・回収する抜草アームによる抜草回収作業,稲作後期には種をつけた雑草穂部を切草・回収する切草アームによる切草回収作業もできるように,アーム交換して稲作前・中・後期の全期にわたって総合的雑草対策が可能な自律移動ロボットの完成に向けて研究を展開している.機械システム

平成25年度の研究実施計画のとおり,実環境である稲作期間の水田環境で田面改質ロボットによる実験を実施した.稲作期間の後も,実験室での実験を実施して改良型田面改質ロボットを実現できたが,稲作期間終了後のため水田環境での実験と評価ができず,最終研究成果の学会発表等も実施していない.平成24年度の研究実施計画に基づいて研究を実施し,研究項目の多くが計画通りに進展している.研究の過程で得られた研究成果および知見から,一部の研究項目については平成25年度も研究継続して取り組むことが適切と判断して取組を勧めていることから「おおむね順調」との自己点検評価とした.研究計画を変更して,補助事業の期間を1年延長し,次年度に稲作期間の水田環境での実験等と最終研究成果の学会発表等を実施する.未使用額はその経費(田面改質ロボットの部品・材料や性能測定・評価用装置等の備品・消耗品,学会発表旅費,学生補助謝金等)に充てる.平成24年度の研究成果をもとにして,実環境での田面改質ロボットによる有機稲作実験を実施して性能評価し,先進的有機稲作のための田面改質ロボットの実現に向けて研究を推進する.田面改質ロボットによる有機稲作の実験と評価田植え前・田植え後において田面改質ロボットの水田移動と田面改質実験を実施する.また,田面改質と雑草生長の関係を明らかにする.研究成果について,稲作期間に水田環境での実験と評価ができず,最終研究成果の学会発表等も実施できなかった.そこで,計画を変更して研究期間を1年延長し,次年度に稲作期間の水田環境での実験等を実施することにし,次年度の実験等に必要な予算を残した.稲作期間の水田環境での実験等と最終研究成果の学会発表等を次年度に行うこととし,未使用額はその経費(田面改質ロボットの部品・材料や性能測定・評価用装置等の備品・消耗品,学会発表旅費,学生補助謝金等)に充てる.実環境での実験等のために,田面改質ロボットの改良等での部品・材料等の購入や実験機材の購入に物品費を使用し,実験補助等で人件費・謝金を使用する.また,得られた研究成果の発表等に旅費・その他経費を使用する.
ポリマー配向シンクロナイゼーションを用いた分極反転波長変換素子

ポリアゾベンゼンポリマーの光異性化反応や分極配向など、電場や光を初期刺激とした自己組織化反応(シンクロナイズド現象)を利用すると、ポリマー薄膜の膜厚変調(表面レリーフ)や分極配向を光の波長と同程度の周期で変調することができる(フォトニック構造化)。ポリマー薄膜を光導波路として考えた場合、表面レリーフや分極配向の周期変調は導波光の実効屈折率を周期的に変調することに対応する。このため、例えば、表面レリーフの周期、方向、深さを制御することで、導波光の進行方向を自在に制御できる。本研究では、DCMなどのレーザー色素をドープしたアゾベンゼンポリマー薄膜の光異性化反応によって形成される表面レリーフをPOT薄膜導波路への光入出力回折格子型結合器として用いた新しい光増幅素子、光波長変換素子を開発した。レーザー色素であるDCMをPOTに添加し、作製したスピンコート薄膜を光導波路として用いる。光導波路へ光を結合させるための表面レリーフを光異性化反応を利用して記録した。導波光にHe-Neレーザーを用いて、入力結合器からPOT薄膜導波路へ導波したのち出力結合器から出てきる光は0.5%であった。入射角度、入出力結合効率の理論値と実験値とはほぼ一致する。蛍光スペクトルの中心に近いNd:YVO_4赤色パルスレーザー(671nm)を導波させて増幅実験を行い、最大で0.5cm^<-1>の小信号利得を観測した。今後、表面レリーフによるDistributed Bragg's Reflectorを導波路に組み込み、レーザー発振を狙う。また、POTそのものが二次非線形光学効果を示すことが知られている。ポーリングしたPOT薄膜にNd:YAGレーザーを導波させて第二高調波を観測した。今後、表面レリーフにより、導波したNd:YAGレーザー光と第二高調波のQuasi-Phase Matchingを行い、高効率波長変換素子を狙う。強誘電ポリマー薄膜のポーリングが周期分極反転型導波路を作製するための最も重要なプロセスである。テトラフオレエチレン+フッ化ビニリデン共重合体のスピンコート膜を熱処理後にコロナ帯電によりポーリングした。D-Eヒステリシス曲線の残留分極からポーリング膜の結晶化度の上昇が確認できた。また、DSC測定では、融点が上昇すると同時にキューリー点が観測されなかったことから、キューリー点が融点より高く、固相では強誘電性を示すことがわかった。これらの結果から、ポーリング膜は自発分極が膜内で配向し、高い結晶性を持つことがわかる。Nd : YAGレーザー励起光パラメトリック発生器を光源に用いて1.14μmのピコ秒光パルスをポーリング膜に入射すると、SHGにあたる570nmに強いピークを持つ発光を確認した。入射光の偏光方向はポーリングの方向に直交しているので、非線形定数のd_<11>を観測していることに相当する。ポーリングしていない膜ではこのような発光は全く確認できなかったこと、発光強度が入射光強度の二乗に比例すること、等から、ポーリングによる二次非線形性の発現を示すものだと思われる。また、この発光570nmの発光以外に可視にブロードな発光が同時に観測されたが、現在のところ、発光のメカニズムはわかっていない。今後、入射レーザー光波長に対する発光スペクトルの測定を行い、発光メカニズムを解析する予定である。次年度はメイカーフリンジ法による二次非線形定数の定量評価を行うと同時に、周期分極反転構造を有するポリマー薄膜を作製、性能評価を行う。
ＴＡＬを用いたサイトカイン遺伝子の発現調節機構の解明

生体内において免疫応答は微生物を代表とする体外異物への防御反応である。また免疫応答に付随し、生体内では血管拡張や血管透過性の亢進、腫脹や疼痛が引き起こされる「炎症応答」が起こる。免疫・炎症応答の制御破綻は様々な疾患に関与しており、炎症応答の制御機構解明は炎症疾患の新規治療法の開発に繋がる可能性がある。炎症応答の制御に中心的な役割を持つ分子として免疫系細胞から分泌されるサイトカインが存在するが、その遺伝子発現調節機構には未知の部分が多く残されている。本研究ではTranscription Activator-Like protein (TAL)を利用したTargeted ChromatinIPによりサイトカインの遺伝子発現制御に関わる転写因子群を網羅的にプロテオソーム解析できる手法を確立し、その技術を利用することで炎症応答の制御機構の解明を目指す。平成24年度においてはIL-12のサブユニットであるp40の上流遺伝子配列に結合するTranscription Activator-Like protein (TAL)コンストラクトを作製し、ヒト単球系培養細胞に遺伝子導入し、安定発現株の作製を行った。その結果、作製したTALは複数のリピート配列は持つために安定発現株では遺伝子組み換えによって全長TALがほぼ認められないことがわかった。またこのコンストラクトを使用し、Chromatin IPも行ったが特異的な遺伝子配列の回収は認められなかった。そこでTAL自身のコンストラクトのデザインを再考するべきであると判断し、サイレンス変異を入れることでリピート配列の影響を減らした改変型TALを作製した。改変型TALは確かに安定発現株において全長の発現が確認されており、今後はこの改変型のTALを用いてChromatin IPの条件検討を進める。当初の目的では平成24年度にIL-12のサブユニットであるp40の上流遺伝子配列に結合するTALを作製する予定であったが、作製したTALは複数のリピート配列は持つために安定発現株では遺伝子組み換えによって全長TALがほぼ認められないことが明らかとなった。そのため平成24年度はTAL自身のコンストラクトのデザインの再考を行い、改変型TALの作製を進めた。作製した改変型TALを再度ヒト単球系培養細胞に遺伝子導入し、安定発現株の作製を行った。改変型TALは確かに安定発現株において全長TALの発現が確認されており、今後はこの改変型TALを用いてp40の上流遺伝子配列特異的に結合するTALを作製し、Chromatin IPなどの条件検討を進める。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度に作製した改変型TALを用いて任意の遺伝子配列に結合するTALの作製を進める。解析対象とする炎症応答性サイトカイン遺伝子としては、特に炎症においてTh1細胞の分化に必須であるIL-12のサブユニットであるp40、および抗炎症性サイトカインであるTGF-betaに着目して解析を進める。作製したTALコンストラクト・ライブラリーそれぞれを培養細胞、初代培養免疫細胞に遺伝子導入を行い、IL-12、TGF-betaの発現への影響を確認した上で、実際にChromatin IPと同様な手法を用いてタグ抗体によってTALとTALが結合しているDNA配列近辺のゲノムと転写因子群を免疫沈降法にて回収、SDS-PAGE、マス・スペクトル解析を用いて転写因子群の同定を行っていく。また同時にTALを用いたシステムをエンハンサー領域の解析に利用できないかChip-seqなどを利用して検討を行う。
天然化合物特異的モノクローナル抗体による生薬成分の標的分子解明

天然化合物特異的モノクローナル抗体をツールとして、生薬成分の細胞内への取り込みや局在、そして標的分子に至るまでの生薬成分の全体挙動解明を目的とした。1)バイカレインの持つ癌細胞増殖抑制能及び抗炎症能に注目し、バイカレインがオルガネラ中の約70kDaのタンパク質と結合していることを明らかにした。2)リクイリチン及びリクイリチゲニンが35-38kDaのタンパク質と結合しメラニン合成を促進することを明らかにした。平成25年度はオウゴンの主要生理活性成分であるバイカレイン(BE)の標的分子同定と作用機序解析を行った。オウゴンの主要生理活性成分であるバイカリン(BI)及びBEを用いて炎症マーカー及び癌細胞増殖への影響を調べた結果、BEはBIに比べて強い抑制能を示した。抗BI/BE特異的モノクローナル抗体(抗BI/BE-mAb)用いたImmunocytochemistry (ICC)によりBEの細胞内局在を確認したところ、HepG2においてBEは細胞質内のドット状のオルガネラに局在することが示唆された。BEの標的分子同定を目的として、抗BI/BE-mAbを一次抗体としたWestern Blotting (WB)により、BE処理したRAW264及びHepG2のセルライセートの解析を行った。両細胞株のBE処理細胞由来のセルライセートにおいて約70kDaのBE結合タンパク質が検出された。さらに、BE処理細胞から調整した細胞画分を用いたWBから、BE結合タンパクは主に膜/オルガネラ画分に局在していることが分かり、この結果は抗BI/BE-MAbによるICCの結果と一致した。一方、BI処理したセルライセート及び細胞画分では、BI結合タンパク質は検出されなかった。これらの結果から、BEは膜/オルガネラ画分に局在する約70kDaのタンパク質と特異的に結合していることが示唆された。さらに我々はBE標的タンパクを同定するために、BE結合セファロースを作製し、HepG2由来セルライセートとインキュベート後、プルダウン法によりBE結合タンパク質の回収し、電気泳動により分離することでBE標的タンパク質の単離を試みた。しかしながら、CBB染色の結果、約70kDaにバンドは検出されなかったことから、in vitro条件下ではBEはBE標的タンパク質に結合しないことが示唆された。本研究は、天然化合物特異的モノクローナル抗体(MAb)をツールとして生薬成分の生体内への吸収・組織内への取り込み、細胞内蓄積、最終的な標的分子に至るまでの生薬成分のダイナミックな全体挙動を明らかにすることを目的としている。本研究室で作製した天然化合物特異的MAbを用いて、各種細胞系および疾患モデル動物を軸に研究を行う。平成26年度は、1オウゴンの主要活性成分であるバイカレインの標的分子の解析、2甘草フラボノイドのリクイリチン及びリクイリチゲニンの細胞内挙動解析、3他の生薬成分への発展研究を中心に研究を進めた。1バイカレインの標的分子特定:初年度の解析の結果、オウゴンの主要活性成分であるバイカレインが抗炎症や癌細胞増殖抑制効果を発揮すること、さらにバイカレインが細胞質内の約70kDaのタンパク質に特異的に結合していることを見出した。この標的タンパク質の同定のために、バイカレインに対するMAbをツールとして免疫沈降やアフィニティーカラムにより標的タンパク質の精製条件を検討した。2リクイリチン及びリクイリチゲニンの細胞内挙動解析:甘草フラボノイドのリクイリチン及びリクイリチゲニンに対するMAbを用いて細胞内挙動解析を行った。種々の細胞を用いた解析の結果、リクイリチン及びリクイリチゲニンは細胞内には入らず、細胞膜レセプターに作用することが示唆された。3他の生薬成分への発展研究:当初の計画通り、1の研究手法をモデルとして他の生薬成分の標的分子の同定を行うことを目標とし、細胞内品質管理機構を制御する生薬成分の探索と作用機序解析をスタートした。本研究は、天然化合物特異的モノクローナル抗体(MAb)をツールとして、生薬成分の細胞内蓄積や局在分布、そして標的分子に至るまでの生薬成分のダイナミックな全体挙動を解析することを目的としている。前年度までに、オウゴンの主要活性成分であるバイカレインの細胞内挙動および標的分子の解析を行い、天然化合物特異的MAbによる解析の有用性を証明している。最終年度は、MAbによる解析を他の生薬成分へと展開した。1甘草フラボノイドのリクイリチン(LQ)とそのアグリコンであるリクイリチゲニン(LQG)が、B16メラノーマ細胞においてメラニン合成誘導活性を持つことを見出し、LQおよびLQGはTyr、TRP-1、TRP-2の発現を高めることでメラニン合成を促進していることを明らかにした。抗LQ/LQG-MAbを用いた競合的ELISAの結果、LQおよびLQGは細胞内に多く取り込まれずに細胞膜表面のレセプター等に関与していると考えられた。さらに抗LQ/LQG-MAbを一次抗体としたWestern Blottingの結果、35-38kDa付近にLQ結合タンパク質のバンドが検出された。これはp38、ERK、CREBがリン酸化された時間と一致していことから、LQ結合タンパク質のメラニン誘導機構への関与が示唆された。2オウバクやオウレンの主要活性成分であるベルベリン(BBR)が、ヒト白血病細胞HL-60においてCaspase-8を介したCaspase-3活性化によりアポトーシスを惹起することを見出した。

BBRの細胞内取り込みを抗BBR-MAbを用いた競合的ELISAにより解析したところ、BBRは処理後ただちに細胞内に蓄積し、ERKおよびp38のリン酸化を誘導することが明らかとなった。一方、本MAbを一次抗体としたWestern BlottingではBBRの標的分子の検出は出来なかったことから、認識部位の異なるMAbでの解析等の必要性が示唆された。天然化合物特異的モノクローナル抗体をツールとして、生薬成分の細胞内への取り込みや局在、そして標的分子に至るまでの生薬成分の全体挙動解明を目的とした。1)バイカレインの持つ癌細胞増殖抑制能及び抗炎症能に注目し、バイカレインがオルガネラ中の約70kDaのタンパク質と結合していることを明らかにした。2)リクイリチン及びリクイリチゲニンが35-38kDaのタンパク質と結合しメラニン合成を促進することを明らかにした。バイカレインに関する研究結果より、天然化合物特異的モノクローナル抗体(MAb)を用いることで細胞内の生薬成分の局在や挙動、さらに標的分子の同定まで可能であることが明らかになった。本研究成果は、第5回食品薬学シンポジウムで優秀発表賞を受賞、さらに第30回九州支部会学術奨励賞を受賞している。さらに本年度はこれらの成果の一部が薬学雑誌に掲載された(YakugakuZasshi, 134(10):1061-7, 2014)。また第19回日本フードファクター学会(2014年11月8日)で英語口頭発表した。さらにリクイリチン及びリクイリチゲニンをはじめ、他の生薬成分でもMAbを用いた解析を進行しており、バイカレインに関する研究成果をモデルとして研究の更なる発展に努めた。生薬学、天然物化学バイカレインの標的分子同定に向けて、免疫沈降やアフィニティーカラムにより標的タンパク質の精製条件を検討したが、平成27年度は標的分子の同定を早急に進める。標的分子同定後、速やかに詳細な作用機序解析を行う。また動物個体レベルでのバイカレインの分子挙動解析も進める。他の生薬成分での発展研究をすでにスタートしているが、本研究室では、ベルベリン、ジンセノサイド代謝物、グリチルリチン代謝物に対する抗体も保有しているので、これらを用いた解析も同時進行する。平成25年度の成果として、抗BI/BE特異的モノクローナル抗体(抗BI/BE-mAb)を用いたImmunocytochemistryによりバイカレインの細胞内局在を解明し、さらにWestern Blottingによりバイカレインの標的分子が膜/オルガネラ画分に局在する70kDaのタンパク質であることを解明した。この結果は、抗天然物モノクローナル抗体を用いることで生薬成分の標的分子同定に繋がる初の報告である。これまでの低分子化合物の標的分子同定法のひとつとして、目的とする低分子化合物をセファロースに結合させプルダウン法により標的分子を特定する方法があるが、我々の方法は、非特異的な吸着による標的分子の偽陽性を防ぐ方法であるため、より生体内での現象を反映している手法であることも平成25年度の研究成果で示唆された。本研究成果の学会発表が優秀発表賞を受賞した(2013年11月第5回食品薬学シンポジウム)。さらに本研究内容を含む研究課題が、日本薬学会九州支部学術奨励賞を受賞した(2013年12月)。
エストロゲンレセプタ-の生物学的意義と臨床応用に関する研究

エストロゲンは女性生殖器の他、神経系、血管系、筋、血液系にも影響を与えている。これらの影響は細胞増殖と細胞機能分化の結果と考えられる。エストロゲンには細織増殖力の強いエストラジオ-ル17β(E_2)や組織増殖性の少ないエストリオ-ル(E_3)があり、両者に作用発現機構の違いがある。またE_2は体癌へのリスクが高いがE_3は逆効果を示している。これらエストロゲンは核レセプタ-を介して主に作用を示すが、本研究はこれらの現象を分子生物学的に解明することを目的としている。(1)エストラジオ-ルー17βとエストリオ-ルとの結合部位(R)がウサギ、ヒト子宮に独立して存在することを明らかにした。さらにウサギ性器外組織である脳、肝、腎、血管にE_2R、E_3Rが分布している。ウサギではこれらE_2R、E_3RはE_2によって主に誘導される。脳や子宮と比べ、下垂体ではE_3Rの方が含量が多い。子宮で抗エストロゲン剤であるクロミフェンやタモキシフェンは、E_2RよりE_3Rに約2倍の強い親和性を示した。これらのことから、E_3の下垂体への作用の重要性と、抗エストロゲン剤の下垂体E_3Rへの作用の優位性とが考えられる。ウサギの心血管系、骨格筋でのE_2R、E_3R量に雌雄差や部位別差が生しており、これらが心血管疾患の発症部位差、骨格筋の発育に男女差の生じることと関連する。エストロゲン依存性発育する腫瘍に対して、増殖抑制作用をする黄体ホルモン剤酢酸メドロオキシプロゲステロンはウサギ子宮で抗E_2作用を発揮し、E_2RやE_3Rを減少させる。(2)正常組織間では腟〉体部〉頸部の順にE_3Rの優位性が認められた。正常組織ではE_2RとE_3Rの比は約2倍であるが体癌ではE_2Rの46倍のE_3Rが検出された。また頸部のE_3RはE_2Rの約8倍に検出され、しかも他の正常組織に比し優位に高値を示した。E_3Rが腟に特異的に存在していることはE_3の腟への作用を指示するものである。また、E_3類似体の抗腫瘍性を探ることも可能である。エストロゲン作用は子宮・乳腺などの組織に増殖力の強いエストラジオ-ル-17B(E_2)とこれらの組織への増殖力のない、しかも作用する組織に限られ、抗E_2作用を発揮するエストリオ-ルとに分けられる。この研究はこういった違いが、生殖生理、腫瘍内分泌においてどのように反映されるかを検討するものである。

1)E_2やE_3に特異的に結合するレセプタ-(E_2RとE_3R)が、ヒトやウサギ子宮で独立して存在することをリガンド特異性、スカッチャ-ド解析で明らかにした。また、E_2やE_3もE_2RやE_3Rにそれぞれある程度の親和性を示す。2)E_2RやE_3R濃度はE_2により調節(増加)されている。3)ウサギでE_2RとE_3Rとの体内分布は異なり、その違いが生体でのエストロゲンの最終効果となって現われていると考えられる。4)ヒト生殖器においてE_3Rの分布は膣>体部>頸頭の順となり、このこととE_3の生物学的作用との関連性が考えられる。5)婦人科腫瘍のうち、体癌はその発育でエストロゲン作用と関係深い。そこではE_2Rの46倍のE_3Rが検出される。体癌でのE_3の役割は明らかに出来ないが、E_3の組織増殖性の欠如の面から、E_3類似体の抗腫瘍性を探ることが必要であると考えられた。6)ヒト子宮内膜の形質膜にE_2Rが存在する。E_2とプロゲステロンはアラキドン酸遊離を促進するが、E_3はこの作用に対して促進もしなければ抑制もしない。このことから、E_3の作用は形質膜を介して作用しないと考えられる。エストロゲンは生物学的作用と腫瘍増作用の面より興味がもたれる。エストロゲンは大きく、子宮、乳腺などの組織に増殖力の強いエストラジオ-ル-17β(E_2)とこれら組織への増殖のない、しかも作用する組織の限られたエストリオ-ル(E_3)とに分けられる。また、E_3の作用のひとつに、抗E_2作用をすることが知られてい、病学的に生殖器癌の予防的効果がある可能性も知られている。E_2やE_3にそれぞれ特異的なレセプタ-(E_2RとE_3R)が独立して存在することを明らかにしてきた。このような違いが、生殖生理、腫瘍内分泌においてどのように反映されているかを検討する。1.ウサギの脳や子宮と比べ、下垂体ではE_3Rの方の含量が多い。ウサギ子宮で、抗エストロゲン剤であるクロミフェンやタモキシフェンは、E_2RよりE_3Rに約2倍の強い親和性を示した(Ki=1.8×10^<-9>M)。下垂体へのE_3の作用の重要性と、抗エストロゲン剤の下垂体への作用の優位性とが考えられる。2.ヒト生殖器由来の細胞では各種スチムラントにより、細胞膜を介する現象が惹起される。たとえば、子宮内由来線維芽細胞に対するエンドトキシン刺激によるプロスタグランディン系や卵巣顆粒膜細胞に対するLHーRHによるイノシト-ルリン脂質系などにE_2は増幅作用を示す。ところがE_3はこの作用を示さないことから、E_3とE_2との作用発現機構は異なる面を有していると考えられる。エストロゲン作用には、細胞増殖と細胞機能分化とに分けられる。またいわゆるエストロゲンの中には主に細胞増殖作用の強いエストラジオ-ルー17B(E_2)と細胞機能分化と関係し、抗E_2作用を発揮するエストリオ-ル(E_3)とがあると考えられる。このような違いが、生殖生理、腫瘍内分泌においてどのように反映されるかを検討した。(1)エストロゲンにはE_2RタイプIとタイプIIとがあり、前者は増殖、後者は分化と関係すると考えられる。ヒト単球・マクロファ-ジは主にエストロゲンの機能分化的標的であり、E_2RタイプIとタイプIIとが存在する。臨床的に免疫機能を抑制するダナゾ-ルは、生体やin vitroで、両結合部位を減少させ、特に機能面を有するタイプIIを減少させ、特に機能面を有するタイプIIを減少させることに一致する。in vitroで単球のサイトカイン(インタ-ロイキンー1B,TNF)の産生をエストロゲンやプロゲステロンは生理的濃度では促進するが、高濃度では抑制する。一方、アンドロゲン作用も有するダナゾ-ルは濃度依存性にこのサイトカイン産生を減少させる。
分子線によるカシオペヤ座分子雲複合体の高感度広域観測

太陽系に近い低質量星形成領域であるカシオペヤ座分子雲複合体に属する暗黒星雲Khav216、L1333、L1358、L1394を含む領域を、^<13>CO(J=1-0)輝線で、また、雲の高密度部分を<CO>^^^<18>(J=1-0)輝線でマッピングした。使用した装備は名古屋大学理学部の4m短ミリ波望遠鏡と、4K冷却のSISミキサ-受信機、バックエンドはバンド幅40MHzで1024チャネルの音響光学型分光計である。グリッド間隔は主に2 ́である。Khav216の速度は約+3km s^<-1>、励起温度は7.1K、^<13>CO雲のコアの大きさは0.74pc×0.67pc、総質量は12M【of sun】、H_2の平均密度は9.2×10^2cm^<-3>となる。L1333領域の^<13>CO雲は銀河面にほぼ平行に伸びた、視線速度約-2km s^<-1>と約+3km s^<-1>の2個の細長い雲からなり、その中に高密度の<CO>^^^<18>コアが13個埋もれていることが分かった。この領域にはHα輝線星18個と低温のIRAS点源が5個(うち3個はHα輝線星と一致する)見つかった。これらは生まれたての原始星である可能性が強く、この領域では星が活発に形成されていると思われる。IRAS点源の1個は<CO>^^^<18>コアの一つと一致していて、その赤外域のスペクトルから推して、特に若い原始星らしい。そこでは<CO>^^^<18>輝線の幅が約1.6km s^<-1>(強度0で)と広く、分子流の存在を示唆する。その<CO>^^^<18>コアは13個のコアのうちでビリアル質量とLTE質量の比が最も小さく、内部運動エネルギーが重力エネルギーに比べて最も小さいコアで星形成が起こり易いことを示す。L1358は視線速度の違う3つの雲から成る。その総質量は約2×10^3M【of sun】である。この領域には原始星候補の低温IRAS点源が6個あり、いずれも^<13>CO雲のコアに付随している。これはこの雲で盛んに星が生まれていることを物語る。太陽系に近い星形成領域であるカシオペヤ座分子雲複合体内の暗黒星雲L1355、L1357、L1358を含む領域を13COとC18O(J=1-0)輝線でマッピングした。また、COガスの励起温度を求めるための12CO(J=1-0)輝線の観測をこれらの分子雲内の18点で行った。

観測装置はいずれも名古屋大学理学部物理学教室の4m短ミリ波望遠鏡と、4K冷却のSISミキサ-受信機、バックエンドはバンド幅40MHzで1024チャネルの音響光学型分光計である。観測は周波数スィッチングで行い、グリッド間隔は2′である。13CO輝線の観測から、これらの分子雲は視線速度が約-15、-11、-3kms-1の3成分から成ることが分かった。一方、C180輝線は-15kms-1付近の成分だけが検出された。これらの雲の距離を、中・高速のものは600pc(近くにある視線速度約-15kms-1のL1340で得られた距離と同じとして)、低速のものは300pcとすると、その総質量は約2×103太陽質量となり、カシオペヤ座分子雲複合体中で有数の大質量を持つことが明らかになった。この領域には原始星である可能性が大きい低温のIRAS点源が6個あり、いずれも13CO雲のコアに、そのうち2個はC18O雲のコアに付随している。この事実はこれらの分子雲で星が形成されていることを示す。また、ディジタル化したパロマ-写真星図に基づくスターカウントから求めた星間減光の分布は13CO輝線強度の分布とよく一致し、この分子雲でガスとダストが混在していることが明らかになった。今年度は4m望遠鏡の整備・立ち上げが遅れたために十分な広さの領域について分子線マッピングを行うに至らなかったが、一方では、コンピューター上でスターカウントができるようになった。この方法は暗黒星雲の分布、物理量の導出、など暗黒星雲の今後の研究に威力を発揮すると期待される。太陽系に近い低質量星形成領域であるカシオペヤ座分子雲複合体に属する暗黒星雲Khav216,L1333,L1358,L394を含む領域を^<13>CO(J=1-0)輝線で、また、雲の高密度部分をC^<18>O(J=1-0)輝線でマッピングした。使用した装置は名古屋大学理学部の4m短ミリ波望遠鏡と、4K冷却のSISミキサ-受信機、バックエンドはバンド幅40MHzで1024チャネルの音響光学型分光計である。グリッド感覚は主に2'である。Khav216の速度は約+3Kms^<-1>、励起温度は7.1K、^<13>CO雲のコアの大きさは0.74pc×0.67PC、総質量は12M_<【of sun】>、く_2の平均密度は9.2×10^2cm^<-3>となる。L1333領域の^<13>CO雲は銀河面にほぽ平行に伸びた、視線速度約-2Kms^<-1>と約+3Kms^<-1>の2個の細長い雲からなり、その中に高密度のC^<18>Oコアが13個埋もれていることが分かった。この領域にはHa輝線星18個と低温のIRAS点源が5個(うち3個はHa輝線星と一致する)見つかった。これらは生まれたての原始星である可能性が強く、この領域では星が活発に形成されていると思われる。IRAS点源の1個はC^<18>Oコアの一つと一致していて、その赤外域のスペクトルから推して、特に若い原始星らしい。そこではC^<18>輝線の幅が約1.6Kms^<-1>(強度0で)と広く、分子流の存在を示唆する。そのC^<18>Oコアは13個のコアのうちでピリアル質量とLTE質量の比が最も小さく、内部運動エネルギーが重力エネルギーに比べて最も小さいコアで星形成が起こり易いことを示す。L358は視線速度の違う3つの雲から成る。その総質量は約2×10^3M_<【of sun】>である。この領域には原始星候補の低温IRAS点源が6個あり、いずれも^<13>CO雲のコアに付随している。これはこの雲で盛んに星が生まれていることを物語る。
組織・細胞の力学応答機構の統一的理解のための組織内微視的力学・生化学場の統合解析

生体組織は受ける力に応じて能動的に自らを作り変える.このメカニズムを明らかにするには組織内に作用する力の大きさを細胞レベルで知り,個々の細胞が産生するタンパクとの相関を調べる必要がある.そこで,胸大動脈薄切片を顕微鏡下に引張試験して,内部の微細変形を調べた.その結果,無負荷状態で弾性板が蛇行しているところほど生理状態で作用する力が小さいことが示された.また,RNAマイクロアレイ解析で胸大動脈腹側と背側で発現の異なる遺伝子を見出し,その中から弾性板の蛇行度と有意な相関のあるタンパクを複数同定することに成功した.生体組織は受ける力に応じて能動的に自らを作り変える.このメカニズムを明らかにするには組織内に作用する力の大きさを細胞レベルで知り,個々の細胞が産生するタンパクとの相関を調べる必要がある.そこで,胸大動脈薄切片を顕微鏡下に引張試験して,内部の微細変形を調べた.その結果,無負荷状態で弾性板が蛇行しているところほど生理状態で作用する力が小さいことが示された.また,RNAマイクロアレイ解析で胸大動脈腹側と背側で発現の異なる遺伝子を見出し,その中から弾性板の蛇行度と有意な相関のあるタンパクを複数同定することに成功した.生体組織の力学応答メカニズムを解明するために,主にブタ胸大動脈を対象とし,生理状態で組織内部の微細構造に加わる力を可能な限りの精度で推定し,この力と組織内のタンパク質の発現との関係を明らかにすることを目的として4年間に亙る研究を進めている.研究初年度の本年度は,解析対象を主に弾性板とし,弾性板の蛇行度合が部位により大きく異なる原因を調べた.蛇行度の差の原因としては,生理状態で作用する力が異なること以外に,1)弾性板の力学特性が異なる,2)弾性板の変形が壁内で均質でない,なども考えられる.そこで,この点を確認するために,まず,血管壁内の各部より弾性板を単離し,現有するマイクロ引張試験機で弾性板の力学特性を求めた.この結果,弾性板の力学特性には部位による差は見られず,弾性率と蛇行度あるいは壁内位置にはとくに相関が見られなかった.次に大動脈の薄切(厚さ10μm)組織片の引張に伴う変形を計測した.本研究の開始前に試作した顕微鏡下引張試験装置で薄切片を引張り,その際の組織内の細胞レベルの変形がどのように進むのか細かく観察した.当初計画したコラーゲン線維の鮮明な可視化にはまだ成功していないが,弾性板の局所変形や平滑筋の変形を詳細に観察することが可能となり,弾性板はまず長さが変わらずに蛇行が解消されて行き,真っ直ぐになった後に伸び始めること,平滑筋層には単純な引張だけでなく,細胞の回転や剪断など複雑な変形が生じていることが明らかとなってきた.また,同様の結果が厚い試料でも得られたことから,このような不均質な変形が試料の薄切によるアーチファクトでないことを確認した.以上より,部位による弾性板の蛇行の違いは,弾性板の不均質性ではなく,実際に加わる力が異なることにより生じているらしいことが明らかとなった.生体組織の力学応答メカニズム解明のため,生理状態で血管壁内部の微細構造に加わる力を推定し,この力とタンパク発現との関係を明らかにすることを目的として4年間に亙る研究を進めている.研究2年目の平成23年度も主に弾性板に関する力学解析を進めた.引張に伴い,弾性膜に描かれた蛇行線が,ゴム膜の引張と共に真っ直ぐになるモデルと,弛んだゴム紐が引張に伴い真っ直ぐになり,その後,伸び始めるモデルの2種を考え,実際の血管壁の変形が両モデルの中間で表されることを確かめた.この結果を基に生理的な円周方向ひずみを加えられた状態の弾性板に作用する力を推定した.次に生理的な円周方向ひずみを加えられた状態で弾性板をレーザ・マイクロダイセクタで切断し,切断点の孔の開き具合を調べた.その結果,孔の開き具合はモデルで推定された力の大きさと良い相関があり,モデルの妥当性が確認できた.推定された弾性板の張力は最低血圧で64-83 kPa,最高血圧で129-154 kPaであり,壁内の弾性板の負担張力には20%程度の差が有る可能性が示唆された.また,理化学研究所の協力を得て,弾性板の3次元形態を観察する方法を確立した.更に,生化学分析のためにRNAを壊さないように血管を摘出し,共同研究先の千葉大に送る方法を確立した.送った試料をマイクロアレイで解析し,十分な精度で解析できることを確認した.その後,平成24年度に入り,繰越分の予算でマイクロアレイ解析を積み重ねると伴にPCR解析も行ない,両者に良い相関があることを見出した.生体組織の力学応答メカニズム解明のため,生理状態で血管壁内部の微細構造に加わる力を推定し,この力とタンパク発現との関係を明らかにすることを目的とし,4年間の研究を進めた.本年度の成果は以下の3点に要約される.1)血管薄切組織片引張に伴う変形計測:顕微鏡下でブタ胸大動脈の薄切組織片を引張り,その際の細胞レベルの変形がどのように進むのかを,平滑筋層と弾性板層の特徴点の移動を追うことで細かく解析した.その結果,同一の弾性板層,平滑筋層であっても伸び比は,部位により異なり,マクロな伸び比の0.52倍程度の範囲にばらついていることが判った.

一方,コラーゲン線維の明瞭な可視化には成功しなかった.しかし,年度末に別途導入された2光子顕微鏡でエラスチンとコラーゲンを明瞭に同時観察できることが判明し,今後,この方法で血管壁内の微視的変形を精度良く追うことができるものと期待される.2)弾性板ならびに平滑筋の血管壁内の3次元形態の計測:理研の3次元内部構造観察顕微鏡で,ウサギ胸大動脈組織内部の弾性板蛇行形態と平滑筋細胞の走行状態の関係を調べた.平滑筋の可視化はある程度可能となったが,弾性板との同時観察は困難であり,弾性板の蛇行と平滑筋走行の関係は明らかにできなかった.しかし,無負荷状態の血管壁内では平滑筋細胞が比較的ランダムな方向を向いているのに対し,生理状態では配向が一様に揃うこと,また,それは血管壁の均質な変形を仮定しては説明できないことなどが明らかとなった.3)生化学因子と組織像の関係の探索:ウサギ胸大動脈の腹側と背側の発現遺伝子の違いから,組織の免疫蛍光染色を行った.その結果,腹側,背側で夫々有意に発現するタンパクが見つかった.また,弾性板の蛇行度と付近のタンパクの発現量についても検討し,弾性板の蛇行度と有意な相関のあるタンパクを複数同定することに成功した.生体組織の力学応答メカニズム解明のため,生理状態で血管壁内部の微細構造に加わる力を推定し,この力とタンパク発現との関係を明らかにすることを目的として4年間に亙る研究を進めている.研究3年目の本年度の成果は大きく3つある:1)ブタ胸大動脈薄切試料の引張試験に関しては,まず,試料厚みと力学特性の関係を調べた.その結果,14μmまで試料を薄くしても,正常血管の力学特性から有意に軟化することはなく,逆に初期弾性率は有意に上昇していた.この傾向は薄切に伴う血管壁の伸びを考慮しても変わることはなく,少なくとも,本研究で行っている程度の血管試料の薄切は血管の構造には影響を与えていないと考えられた.しかし,この硬化の原因は現在のところ不明である.また,コラーゲン線維の走行観察についても偏光顕微鏡でリターダンス変化を計測する方式を試したが,明瞭な画像が得られて居らず,今後の課題となった;2)理化学研究所の協力の下,ウサギ胸大動脈弾性板の3次元形態を観察し,無負荷状態の血管壁において,弾性板が円周方向に蛇行しているだけでなく,この蛇行が軸方向に波打っていることを見出した.これは血管摘出に伴う血管の軸方向への収縮の可能性が考えられた;3)ウサギ胸大動脈の腹側と背側の試料それぞれについてRNAマイクロアレイ解析を行い,両者で発現の異なる遺伝子を見つけた.また,RT-PCR法による解析を行い,ほぼ同様の結果を得た.RT-PCRによる確認が得られた遺伝子について,組織染色で確かめるため,抗体の選定を進めた.当初計画した組織引張に伴うコラーゲン線維の変形についてはまだ計測していないが,弾性板の3次元形態の計測法を確立し,また,生化学分析に関してもRNAを壊さないように血管試料を摘出する方法を確立しただけでなく,実際にマイクロアレイ解析を行うことができたなど,計画以上に進展が見られたから.また,H24年度に繰り越した予算を用いてマイクロアレイ解析を積み重ね,PCR解析と良く一致することを見出したため.25年度が最終年度であるため、記入しない。課題であった組織引張に伴うコラーゲン線維の変形について,リターダンスを用いた方法を採用し,計測を開始することができ,また,弾性板の3次元形態について,興味深い知見を得ることができ,更に,大動脈の腹側と背側で発現する遺伝子に違いについてRNAマイクロアレイ解析とRT-PCR解析でほぼ同様の結果を得られるなど,研究がほぼ計画通りに進行しているため.
ゾル-ゲル法による透明導電性酸化インジウム薄膜の作製とその性質に関する研究

申請者は,硝酸インジウム-塩化スズ水溶液にアンモニア水を添加して調整したコロイド粒子を用いたゾル・ゲル法により透明導電性ITO薄膜を作製することを目的として,コロイド粒子の性質,ITO薄膜の生成過程および薄膜の性質などについて検討した結果,以下のことが明らかになった.(1)硝酸インジウム-塩化スズ水溶液にアンモニア水を添加して調整したコロイド粒子は,水酸化インジウムからなる微細な粒子が50nm程度の大きさに凝集した二次粒子であった.(2)550°C,2分間の焼成によりITO薄膜は生成するが,その短い時間内でコロイド粒子と塩化インジウムの熱分解が生じること,さらにコロイド粒子の熱分解反応は瞬時に終了するのに対し,塩化インジウムの熱分解は持続性があることが明らかになった.また,薄膜の基本的な微細構造はこの短い時間内にほぼ出来上がるが,実用的な導電性を有したITO薄膜を作製するには20分間以上の焼成時間が必要であった.(3)コロイド粒子の解膠剤として有効な塩化インジウムは,焼成時に熱分解して酸化インジウムとなり,薄膜を形成している微粒子同士や基板と微粒子とをつなぎ合わせるなど,成膜に対して非常に重要な役割をなすことが明らかになった.(4)550°C,30分間で作製したITO薄膜の気孔率は約44%であり,解膠剤として塩化インジウムを添加したゾルから一回の塗布-焼成の操作により最大2mumの膜厚を有し,クラックや剥離がなく基板に対して密着性に優れたITO薄膜が得られた.その薄膜の表面抵抗の最小値は500OMEGA/cm^2であり,可視光に対する光透過率は90%以上であった.申請者は,硝酸インジウム-塩化スズ水溶液にアンモニア水を添加して調整したコロイド粒子を用いたゾル・ゲル法により透明導電性ITO薄膜を作製することを目的として,コロイド粒子の性質,ITO薄膜の生成過程および薄膜の性質などについて検討した結果,以下のことが明らかになった.(1)硝酸インジウム-塩化スズ水溶液にアンモニア水を添加して調整したコロイド粒子は,水酸化インジウムからなる微細な粒子が50nm程度の大きさに凝集した二次粒子であった.(2)550°C,2分間の焼成によりITO薄膜は生成するが,その短い時間内でコロイド粒子と塩化インジウムの熱分解が生じること,さらにコロイド粒子の熱分解反応は瞬時に終了するのに対し,塩化インジウムの熱分解は持続性があることが明らかになった.また,薄膜の基本的な微細構造はこの短い時間内にほぼ出来上がるが,実用的な導電性を有したITO薄膜を作製するには20分間以上の焼成時間が必要であった.(3)コロイド粒子の解膠剤として有効な塩化インジウムは,焼成時に熱分解して酸化インジウムとなり,薄膜を形成している微粒子同士や基板と微粒子とをつなぎ合わせるなど,成膜に対して非常に重要な役割をなすことが明らかになった.(4)550°C,30分間で作製したITO薄膜の気孔率は約44%であり,解膠剤として塩化インジウムを添加したゾルから一回の塗布-焼成の操作により最大2mumの膜厚を有し,クラックや剥離がなく基板に対して密着性に優れたITO薄膜が得られた.その薄膜の表面抵抗の最小値は500OMEGA/cm^2であり,可視光に対する光透過率は90%以上であった.
多孔性リン酸カルシウムセメントへのアプローチ

骨欠損部でリン酸カルシウム多孔体を形成する多孔性リン酸カルシウムセメント調製の可否を検討した。多孔体形成のためにセメントの粉末部を顆粒とし、溶解性が比較的大きいα型リン酸三カルシウム球を調製した。(知的財産部分は後日開示)リン酸カルシウム多孔体が形成されることがわかった。アパタイトに代表されるリン酸カルシウムは組織親和性に優れるだけでなく、骨伝導性を示す場合もあることから人工骨補填材として着目されている。一方、骨には力学的機能だけでなく造血機能などの生物学的機能があることを考えると骨に置換される材料であることが好ましい。さまざまなリン酸カルシウムの中でリン酸三カルシウムやリン酸水素カルシウムは生体吸収性を示すことが知られている。さらにリン酸カルシウムが生体内で吸収され、骨に置換されるには細胞が浸入できる連続気孔構造が好ましく、操作性の観点から硬化性を示すことが好ましい。本研究では骨に置換される多孔性のリン酸カルシウムを形成するセメントの創製の可否を検討する目的でリン酸三カルシウム球を調整し、調整したリン酸三カルシウム球をリン酸水素カルシウムで硬化させる検討を行った。研磨法でリン酸三カルシウム球を調整し、リン酸溶液を練和として硬化反応を検討した。その結果、リン酸濃度にかかわらず溶液が中性あるいはアルカリ性の場合は硬化反応を示さないことがわかった。一方、酸性リン酸溶液を用いるとリン酸三カルシウム球が硬化性を示すことがわかった。そこで錬和液にさらにカルシウム成分を導入することを検討した。すなわち、リン酸第一カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸の三原系で成分濃度を変動因子として硬化液を調製し、リン酸三カルシウム球の硬化反応を検討した。0.2モル濃度相当のリン酸第一カルシウムを0.1モル濃度リン酸に溶解させて調製した錬和液が硬化時間、硬化体の機械的強さの観点から好ましいと結論した。本研究はα型リン酸三カルシウム小球を調製し、当該小球を酸性リン酸カルシウム溶液で硬化させ、完全連通気孔構造を形成できるセメントを創製する研究である。本年度は研究計画の最終年度に当たり、硬化性組成物の疑似体液中での反応および酸性溶液が組織に炎症性反応を惹起するか否かを検討した。前年までの研究の結果、0.2モル濃度相当のリン酸第一カルシウムを0.1モル濃度リン酸に溶解させて調製した錬和液が硬化時間、硬化体の機械的強さの観点から好ましいと結論したため、当該硬化液を用い、α型リン酸三カルシウム小球を硬化させた。得られた硬化体を体液の無機組成を模倣した疑似体液に37°Cで1,3,7日間浸漬して評価した。その結果、疑似体液浸漬前はリン酸水素カルシウムに特有の板状結晶に覆われていたが、経時的に結晶形態が変わり、アパタイト特有の結晶となることがわかった。また、X線回折分析およびフーリエ分光光度計による分析の結果、α型リン酸三カルシウム小球の表面に形成されていたリン酸水素カルシウムがB型炭酸アパタイトに組成変換されることがわかった。なお、B型炭酸アパタイトとはリン酸基の一部が炭酸基に置換されたアパタイトであり生体骨の炭酸アパタイトと同じである。また、本多孔性リン酸カルシウムセメントは酸性水溶液を用いるため、炎症反応を惹起する可能性がある。そこでラットに骨欠損を形成し、α型リン酸三カルシウム小球で骨欠損を充填し硬化液で硬化させた。一週間まで経過観察を行ったが、著明な炎症反応は惹起されず条件を選択すれば本多孔性リン酸カルシウムセメントによる骨欠損部の再建が可能であることがわかった。23年度が最終年度であるため、記入しない。
組織切片からの疾患遺伝子シーケンスシステムの確立

本研究は組織切片上から異常な細胞群を形態学的に観察し、その細胞内メッセージをDNAシーケンスすることによって病態をより迅速に判定しうるシステムを確立することにある。1枚のパラフィン切片から効率良く遺伝子増幅の可能な手法を探索するためマイクロダイセクション法を利用し、ウレタン誘発肺腫瘍組織からゲノム遺伝子を抽出することに成功した。この方法を利用する疾患モデルとして、レニンノックアウトマウス、糖転移酵素トランスジェニックマウス、先天的白内障モデルマウス、雌性生殖器腫瘍マウス、雄性不妊マウスなどの形態解析を行い、本法の利用価値の高い組織の検索に努めた。さらに、マレック病潜伏感染細胞を用いてホストゲノムサブトラクション法を試行し、未報告のゲノム多型を検出することに成功した。また、マウス精巣の精子形成過程において、減数分裂中期特異的に多数のアポトーシスの出現する系統としてMRLマウスを発見した。本マウスには熱ショック耐性の精母細胞が存在し、生後発達の一時期卵細胞が形成されていた。これらのことから、熱ショック耐性のMRLマウス精母細胞は減数分裂中期チェックポイント完成前は卵細胞へと分化し、チェックポイント完成後は精母細胞のアポトーシス像として観察されるものと考えられた。この減数分裂中期特異的アポトーシスならびに熱ショック耐性に関連する遺伝子を同定するため、MRLマウスとC57BL/6マウス精巣cDNAを用いてdifferential display法を行ったところ、いくつかの既知ならびに未知遺伝子クローンを検出することに成功した。特に、減数分裂中期特異的アポトーシスに関しては、連鎖解析の結果から責任遺伝子(MSApと略称)は第1染色体の100cMの位置に存在することが明らかとなった。本研究は組織切片上から異常な細胞群を形態学的に観察し、その細胞内ゲノム遺伝子あるいはメッセージを直接採取しDNAシーケンスすることによって病態をより迅速に判定しうるシステムを確立することにある。本年度は組織切片からの遺伝子抽出に有効な手法の確立をめざした。その結果、1枚のパラフィン切片からも非常に効率良く遺伝子増幅の可能な手法を確立した。その際、組織の固定条件によっては目的の遺伝子の単離は不可能であることも確認された。さらに顕微鏡下にて目的の細胞を採取するため、マイクロダイセクション法を利用しウレタン誘発肺腫瘍組織からゲノム遺伝子を抽出することに成功した。本法は30μm径に集蔟する目的の細胞をレーザーによってプレパラート上から剥がし取るために開発されたもので、本研究には有効な手段であることが確認された。これらの成績から遺伝子解析をよりin situで行う端緒が築かれた。また、これらの方法を利用する疾患モデルとして、レニンノックアウトマウス、糖転移酵素トランスジェニックマウス、先天的白内障モデルマウス、精巣内減数分裂異常マウス、雄性不妊マウスなどの形態解析を行い、マイクロダイセクションの利用価値の高い組織の検索に努めた。さらに、形態学的に異常の検出できない細胞から遺伝子の微量な変化を検出する手段として、ホストゲノムサブトラクション法を試行した。本実験にはマレック病潜伏感染細胞を用い、ウイルスDNAを調整後Repr esentation Difference Analysis変法を行った。その結果、未報告のゲノム多型を検出することに成功し、ウイルス株間で起こる培養細胞の微妙な形態変化をゲノム多型から解析できる端緒を築くことができ、本方法の株間多型解析における有用性が示唆された。