hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経変性に伴うニューロン・ミクログリア間の応答因子の探索

アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などに代表される神経変性疾患は不可逆的、進行性の病態を呈する慢性疾患で、根本的な治療法も存在しない。発症機序は不明であるが、活性化ミクログリアの興奮性神経傷害機序が大きく病態に関与していることが明らかになっている。また、神経変性の病態の大きな特徴として、ニューロン死に至る以前にニューロン自体の機能が十分に発揮されない、いわゆる神経細胞機能不全の状態が長く存続することが挙げられる。これまでに、我々は、ニューロンの神経突起のビーズ状変性(neuritic beading)が神経細胞機能不全の初期現象として観察できることを明らかにし、これを利用した新規神経系細胞機能評価システムを構築し、国内・国際特許を出願した。また、活性化ミクログリア由来のグルタミン酸による興奮性神経毒性が神経変性におけるニューロン死に極めて大きく関与していることを明らかにした。さらに、我々は、活性化ミクログリアのグルタミン酸産生・放出機序が生理的なものと異なる特異なものであることを突き止めた。すなわち、正常では・-ケトグルタル酸からトランスアミナーゼの作用により産生され、グルタミントランスポーターを介して放出されるのに対し、活性化ミクログリアでは細胞外グルタミンを基質としてグルタミナーゼの作用により産生され、ギャップ結合を介して細胞外に大量に放出される。そこで、グルタミナーゼ阻害薬、ギャップ結合阻害薬により生理的なグルタミン酸産代謝を阻害することなく、活性化ミクログリア由来の過剰なグルタミン酸産生・放出のみを抑制し、神経細胞死を抑制することに成功した。以上の成果から、グルタミナーゼ阻害薬、ギャップ結合阻害薬を用いたニューロン死抑制法についても国内・国際特許を出願し、神経変性の病態解明および治療法開発をさらに進めている。神経変性の病態の大きな特徴として、ニューロン死に至る以前にニューロン自体の機能が十分に発揮されない、いわゆる神経細胞機能不全の状態が長く存続することが挙げられる。我々は、経時的解析から、ニューロンの神経突起のビーズ状変性(neuritic beading)が神経細胞機能不全の初期現象として観察できることを明らかにした。その機序としては、各種の傷害刺激により活性化した神経傷害的ミクログリアが大量のグルタミン酸を放出し、グルタミン酸シグナル伝達を介して神経細胞のミトコンドリア呼吸鎖を抑制することで細胞内ATPの低下を生じ、このエネルギー欠乏による軸索輸送の破綻が、モータータンパクや細胞骨格タンパクの軸索での滞留を来たし、形態上、neuritic beadingとして顕在化するものと判明した。神経細胞機能不全の少なくとも初期段階では、症状は可逆的であり、病態に置き換えれば、治療可能な時期(いわゆるtherapeutic window)であると考えられる。この細胞機能不全の状態が存続することで不可逆的なニューロン死に至ると考えられ、活性化ミクログリア由来のグルタミン酸による興奮性神経毒性が神経変性におけるニューロン死に極めて大きく関与していることが判明した。以上から、neuritic beadingは、従来困難であった神経細胞機能の評価マーカーとして極めて有用であると考えられ、我々はこの指標を含めた、ニューロン・グリア細胞双方向の応答を扱える、ニューロン・グリア細胞の共培養系による新規神経系細胞機能評価システムを構築し、特許を出願した。現在、この新規評価系を利用して、各種薬物のニューロア・グリナ細胞への影響の評価、therapeutic windowの把握や治療反応性の評価を行い、ニューロン・グリア細胞間の応答因子を探索・同定し、神経変性の病態解明および治療法開発をさらに進めている。
タンパク質の巻き戻りを制御するシャペロニン(hsp60)のX線結晶構造解析

本研究では、分子シャペロンの一つであるシャペロニン(hsp60)を高度好熱菌Thermus thermophilusより精製、結晶化し、その三次元構造をX線結晶解析によって解明することを目的とした。1.高度好熱菌Thermus thermophilusの培養、ならびにシャペロニンの精製を行い、結晶化用標品を得た。2.ポリエチレングリコールを沈澱剤に用いて、種々の条件で結晶化を行ったところ、平板状および六角柱状の2種の結晶が得られた。3.高エネルギー物理学研究所のシンクロトン放射光を用いて巨大分子用ワイセンベルクカメラによって、この2種の結晶のX線回折実験を行ったところ、平板状結晶は10Å、六角柱状結晶は7Åの分解能の反射が観測された。また、それぞれのX線回折写真を多方面から撮影して、結晶学的データを決定することができた。平板状結晶は単斜晶系、空間群P2あるいはP2_1、六角柱状結晶は六方晶系、空間群P6_322に属することがわかり、それぞれの格子定数を算出した。4.結晶のSDSおよびnativeのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、平板状結晶にはホローシャペロニンの超分子複合体(分子量60Kのcpn60の14量体+分子量10Kのcpn10の7量体)が含まれ、一方、六角柱状結晶には、複合体が解離して得られたcpn60の単量体が、さらにタンパク質分解酵素による分解を自然に受けて分子量50Kの断片となり、これが結晶内に含まれていることがわかった。5.六方晶系結晶の結晶性向上を目指して、1)自然に分解を受けたシャペロニン標品を精製したもの、2)その分解を受けた切断箇所と同定しトリプシンなどのタンパク質分解酵素で意識的に切断したもので結晶化を行った。その結果、異なる格子定数の結晶が得られ分解能も向上したが、これまでのところ、原子レベルの分解能には至っていない。1.高度好熱菌Thermus thermophilusの培養,ならびにシャペロニンの精製を行い,結晶化用標品を得た。2.このThermus thermophilus由来のシャペロニンの結晶化条件を検索した。その結果,沈殿剤としてポリエチレングリコールが有効であることが判明した。ポリエチレングリコールを用いて,種々の条件で結晶化を行ったところ,平板状および六角柱状の2種の結晶が得られた。ほとんどの場合,平板状の結晶が得られたが,六角柱状の結晶がごくまれに出現した。ともにX線回折実験が可能な大きさであった。3.この2種の結晶を用いて,研究室の回転対陰極型X線発生装置でX線回折実験を行ったが,有為な回折は認められなかった。そこで,高エネルギー物理学研究所のシンクロトロン放射光を用いて,そこに設置された巨大分子用ワイセンベルクカメラによってX線回折実験を行ったところ,平板状結晶は10A,六角柱状結晶は7Aの分解能の反射が観測された。また,それぞれのX線回折写真を多方向から撮影して,結晶学的データを決定することができた。平板状結晶は単斜晶系,空間群P2あるいはP2_1,六角柱状結晶は六万晶系,空間群P6_322に属することがわかり,それぞれの格子定数を算出した。4.得られた結晶中に,シャペロニン分子がどのように入っているかを調べるため,SDSおよびnativeのポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。

その結果,平板状結晶にはホローシャペロニンの超分子複合体(分子量60Kのcpn60の14量体+分子量10Kのcpn10の7量体)が含まれ,一方,六角柱状結晶には,複合体が解離することで得られたcpn60の単量体が,さらにタンパク質分解酵素による分解を自然に受けて分子量50Kの断片となり,この50Kの断片だけが(cpn10はなしに)含まれていることがわかった。本研究では,分子シャペロンの一つであるシャペロニン(hsp60)を高度好熱菌Thermus thermophilusより精製,結晶化し,その三次元構造をX線結晶解析によって解明することを目的とする.昨年度までに,高度好熱菌Thermus thermophilusのシャペロニンの結晶化を行い,平板状および六角柱状の2種の結晶形が得られ,平板状結晶ではcpn60とcpn10がオリゴマーとして存在しており,単斜晶系,空間群P2_1に属していること,六角柱状結晶ではcpn60サブユニットが自然に分解を受けた結果50kDのフラグメントとなって存在しており,六方晶系,空間群P6_322に属していることがわかった.これまで得られた2種の結晶について,高エネルギー物理学研究所放射光実験施設のシンクロトロン放射光を用いて,巨大分子用ワイセンベルクカメラによって回折強度測定を行った.しかし,その分解能はそれぞれ8A程度であり,高分解能のX線構造解析を行うには不十分で,完全な回折強度データを得ることができなかった.六方晶系結晶の結晶性向上を目指して,1)自然に分解を受けたシャペロニン標品を精製したもの,2)その分解を受けた切断箇所と同定しトリプシンなどのタンパク質分解酵素で意識的に切断したもので結晶化を行った.その結果,異なる格子定数の結晶が得られ分解能も向上したが,これまでのところ,原子レベルの分解能には至っていない.また,すべての結晶について低温での回折強度測定を行い,その有効性を確認した.種々の結晶学的諸計算を効率的に行うため,われわれが使用経験の豊富なタンパク質構造解析用総括プログラム“PROTEIN"を核としたシステムを,グラフィックスワークステーション上に構築して,X線構造解析の迅速化をはかった.
シグナルの同期性を検出する分子メカニズム

1.2つのシグナルの同期を検出する「同期性検出器」は、シナプス可塑性の誘導を含めさまざまな脳機能において重要な役割を担っている。本研究では、PLCbetaとNMDA受容体という二つの同期性検出分子に注目し、その生理的役割を明らかにすることを試みた。前半では内因性カンナビノイド放出におけるNMDA受容体の役割、後半ではムスカリン性アセチルコリン受容体を介するニューロンの興奮性調節におけるPLCbetaの役割、について検討した。2.実験には培養海馬ニューロンを用い、double whole-cell記録により抑制性シナプス後電流を測定した。高濃度のNMDAを投与するとシナプス伝達は抑制され、その効果はカンナビノイド受容体阻害剤で消失した。また、低濃度のNMDAを投与すると、単独では効果は見られないが、group I mGluRやM1/M3ムスカリン受容体などのGq/11共役型受容体の活性化と組み合わせると、シナプス伝達は抑制され、その効果もまたカンナビノイド受容体阻害剤で消失した。以上より、NMDA受容体は、強く活性化されると単独で、弱く活性化される場合はGq/11共役型受容体と同期することにより、内因性カンナビノイド放出を引き起こすことが明らかとなった。3.次に、ムスカリン性受容体を介する興奮性調節におけるPLCbetaの役割について調べた。培養海馬ニューロンにムスカリン性受容体アゴニスト(oxo-M)を投与すると、多くのニューロンで脱分極がみられ、この効果はPLC阻害剤により消失した。また、oxo-Mによる脱分極の大きさおよび静止膜電位は細胞内Ca2+濃度の影響を受け、Ca^<2+>濃度が高い方がより発火し易い傾向を示した。4.以上より、同期性検出器として働きうるPLCbetaとNMDA受容体は、細胞の興奮性やシナプス伝達の調節に重要な役割を担っていることが判明した。1.脳の大脳皮質や海馬では、シナプス前ニューロンと後ニューロンのスパイク発生のタイミングに依存しシナプス伝達効率が長期的に変化する(spike timing-dependent long-term potentiation or depression : tLTP or tLTD)。tLTPに関しては、NMDA型グルタミン酸受容体がタイミング検出器として働くと考えられている。一方、tLTDに関与するタイミング検出器については未だ不明である。最近になり、tLTDの誘導に内因性カンナビノイド(eCB)が関与していることが報告され、eCB放出に重要な役割を担うPLCβがタイミング検出器として働く可能性が示唆された。一方、NMDA受容体がeCB放出に関与するかどうかについてはほとんど調られていない。そこで、本研究においてその可能性を検討した。2.実験には培養海馬ニューロンを用い、eCB放出はカンナビノイド感受性IPSCの振幅の減少を指標にして調べた。200μMNMDA投与ではIPSC振幅は著しく減少した。また、20μM NMDAは単独ではIPSCの減少を引き起こさないが、低濃度のムスカリン受容体アゴニストあるいはグループI型代謝型グルタミン酸受容体(I-mGluR)アゴニスト投与によるIPSCの減少を著しく増強した。また、電位依存性Ca^<2+>チャネル阻害剤の影響をほとんど受けなかった。NMDA投与によるIPSCの減少はカンナビノイド受容体アンタゴニスト処理により完全に消失することから、eCB放出を介することが判明した。放出されるeCBの分子実体としては、DAG lipase阻害剤が有効であることから、2-AGである可能性が高いと考えられた。3.以上より、NMDA受容体の活性化による細胞内Ca^<2+>濃度上昇がI-mGluR活性化と同期することにより、より効率的にeCB放出を引き起こしうることが証明された。本研究により、eCB放出にPLCβとNMDA受容体という二つのタイミング検出分子が関与していることが明らかとなった。これらがtLTDの誘導にどのように関わっているのかについて今後さらに検討する予定である。

また、oxo-Mによる脱分極の大きさおよび静止膜電位は細胞内Ca2+濃度の影響を受け、Ca^<2+>濃度が高い方がより発火し易い傾向を示した。4.以上より、同期性検出器として働きうるPLCbetaとNMDA受容体は、細胞の興奮性やシナプス伝達の調節に重要な役割を担っていることが判明した。
氷河性海水準変動により形成された大桑層のカシパンウニ化石密集層

富山県小矢部市法楽寺の大桑層に見られるカシパンウニ化石密集層の形成過程について研究を行った.ここでは,氷河成海水準変動により形成されたS1S4の4つのシーケンスが見られる.シーケンス全体を観察できるS2とS3では,上部浅海帯の化石を含む粗粒砂岩に始まり,シーケンス中上部では下部浅海帯の化石を含む泥岩を経て,最上部に泥炭や汽水成層を含む.また,S3基底には生痕化石を含む.S2,S3,S4のシーケンス下部にK1,K2,K3の3枚の化石密集層が見られ,それらの中にカシパンウニの化石(Echinarachnius ishioi)が密集する部分がある.K1は主に中粒砂岩からなり,長さ50mm程度の大きさのものと長さ20mm未満の幼殻を多数含み,大きさのピークが2つある.大きな個体は斜交葉理上に並び,20mm以下の幼殻はそのまわりに吹き寄せ状に産出する.K2,K3は粗粒極粗粒砂岩ならびに石灰質砂岩から産出し,K2の内部は5070mmの成殻が一列に並ぶ密集層と散在して産出する部分に区分され,散在多産部では斜交葉理を形成したり,カシパンウニによる覆瓦状構造が見られる.石灰質砂岩にはカシパンウニの他,Mizuhopecten yokoyamaeが多産する.散在層には,Panopeaのような套線湾入が大きく,砂中に深く潜る二枚貝が洗い出されている.また,半数以上のカシパンウニの殻表に物理的に破損・磨耗が見られ,ゴカイの生痕や海綿が付着する異地性の化石群集である.K3はK2とよく似た産状を示すが,より,カシパンウニの破損が著しい.破損・磨耗したカシパンウニ密集層がシーケンス下部の粗粒極粗粒砂岩に見られることから,これらの密集層は侵食による洗い出しや細粒物質の運び去りによって堆積速度が低下し,大きな化石が残留して形成されたオンラップ型化石密集層である.富山県小矢部市法楽寺の大桑層に見られるカシパンウニ化石密集層の形成過程について研究を行った.ここでは,氷河成海水準変動により形成されたS1S4の4つのシーケンスが見られる.シーケンス全体を観察できるS2とS3では,上部浅海帯の化石を含む粗粒砂岩に始まり,シーケンス中上部では下部浅海帯の化石を含む泥岩を経て,最上部に泥炭や汽水成層を含む.また,S3基底には生痕化石を含む.S2,S3,S4のシーケンス下部にK1,K2,K3の3枚の化石密集層が見られ,それらの中にカシパンウニの化石(Echinarachnius ishioi)が密集する部分がある.K1は主に中粒砂岩からなり,長さ50mm程度の大きさのものと長さ20mm未満の幼殻を多数含み,大きさのピークが2つある.大きな個体は斜交葉理上に並び,20mm以下の幼殻はそのまわりに吹き寄せ状に産出する.K2,K3は粗粒極粗粒砂岩ならびに石灰質砂岩から産出し,K2の内部は5070mmの成殻が一列に並ぶ密集層と散在して産出する部分に区分され,散在多産部では斜交葉理を形成したり,カシパンウニによる覆瓦状構造が見られる.石灰質砂岩にはカシパンウニの他,Mizuhopecten yokoyamaeが多産する.散在層には,Panopeaのような套線湾入が大きく,砂中に深く潜る二枚貝が洗い出されている.また,半数以上のカシパンウニの殻表に物理的に破損・磨耗が見られ,ゴカイの生痕や海綿が付着する異地性の化石群集である.K3はK2とよく似た産状を示すが,より,カシパンウニの破損が著しい.破損・磨耗したカシパンウニ密集層がシーケンス下部の粗粒極粗粒砂岩に見られることから,これらの密集層は侵食による洗い出しや細粒物質の運び去りによって堆積速度が低下し,大きな化石が残留して形成されたオンラップ型化石密集層である.
遺伝性てんかんラット(IGER)海馬における神経微小形成異常の病理発生の解明

遺伝性てんかんミュタントラット(IGRER)の海馬体には神経細胞の微少形成異常が認められる。この神経細胞の微少形成異常の発現機序を解明することはこの遺伝性てんかんラットにおけるてんかん発作の原因に直接的に迫るものである。本研究はIGER海馬に見られる微少神経形成異常の病理形態学的異常の詳細を明らかにし(実験1)、次いでBrdUを神経細胞の分裂・移動のトレーサーとして用い以下の事を明らかにしようとするものである。(1)海馬錐体細胞が胎生期においていつ分裂し、どのようなルートをたどり目的部位へ移動するか(実験2)。分裂、移動の障害があるかどうか、またあるとすればそれはどのようなものであるか(実験3)。結果並びに考察:第1の実験によりIGER海馬体には錐体細胞の配列の乱れ、層構造の途絶並びにSt.rad領域の異常神経細胞集簇よりなる微少神経形成異常が認められた。形成異常は2ヶ月齢の動物に雌雄の差無く常に認められ、常染色体遺伝形式を示すことが明らかとなった。遺伝的に決定された形成異常であり、胎生期に発現する遺伝子異常があると考えられるた。第2の実験によりてんかんラットの微小形成異常を構成している神経細胞の主体は胎齢16,17日に分裂するものであった。移動のルートには特に異常を認めなかった。第3の実験によりIGERでは海馬原基で分裂した細胞は中間帯に移動した後,長く同部に止まることが明らかとなり、この中間帯での停滞による移動遅延が結果的には移動の障害を招き微小形成異常の病理発生に関与していることが類推された。遺伝性てんかんラットの海馬領域には神経細胞の異常な集簇や、配列の異常が常に認められる。我々はこの神経細胞の異常配列は海馬領域の神経細胞形成異常であり、神経形成期における移動障害によって生ずるという作業仮説を立てた。本研究はこの作業仮説を実証し、神経細胞の移動障害の機序を解明する為にためにBrdUを神経細胞の分裂・移動のトレーサーとして用い、胎生期における神経細胞の移動を解析し形成異常の本態を明らかにしようとするものである。平成10年度は基礎情報を得る目的で、遺伝性てんかんラットの行動観察並びに神経細胞微少形成異常の病理学的検索をおこなった。IGERは生後2ケ月頃よりwild running,jumpingなどの異常運動を発現し、生後3カ月頃より回転運動、生後6カ月頃より全身性強直・間代性けいれん発作(GTC)を発症することが明らかとなった。一部の動物では異常運動のみ、あるいは回転運動のみのものもあり、全てのラットがGTCに達するものではない。海馬の組織学的検索の為に生後2,6,10ケ月齢のIGER脳を灌流固定し、凍結連続切片をニッスル染色して観察した。海馬では背側全部においてST.radiatum部に異常神経集簇が見られ、CA 1錐体細胞層と海馬采移行部には強い神経細胞の分散性配列が見られた。海馬腹側後部には錐体神経細胞の配列の乱れや、配列の微少な途絶が認められた。この様な海馬の異常所見は雌雄、月齢、更には発作タイプに関係なく全ての動物に常に認められ、遺伝子異常に基づく神経細胞の微少形成異常であることが確認された。平成10年度の研究により遺伝性てんかんラット(IGBR)の海馬領域にみられる微少神経形成異常は、遺伝的に決定された形成異常であることが確認された。平成11年度では、神経細胞の移動障害の機序を解明する為にためにBrdUを用いた神経細胞の分裂・移動のトレーサー実験を行った。研究は形成異常を来す神経細胞の最終分裂日の特定とその移動部位を明らかにする実験(実験1)と、海馬原基で最終分裂した神経細胞が海馬へ移動する経時的過程を明らかにする実験(実験2)によって構成された。

実験1:受精15日より22日までの妊娠ラットにBrdUを投与し,胎児脳にBrdUを取り込ませる。生後4週日に屠殺し微少神経形成異常に関わる細胞の分裂日と、移動部位をBrdU免疫組織化学によりトレースした。その結果胎生15日から20日に分裂したすべての細胞が錐体細胞層の配列異常に関与しており、胎生16に分裂した神経細胞が配列異常の主体を占めていた。実験2:妊娠16日目のIERおよび対照ラットにBrdUを投与し胎児脳にBrdUを取り込ませた。最終投与後1時間,1日,・・,6日目の胎児脳、および出生当日(P0),2日後(P2),・・,P14の仔ラット脳における神経形成異常構成過程をBrdU免疫組織化学によりトレースした。その結果IGERでは分裂細胞は原基部位より、より早くintermediate zone(IMZ)へ移動し、長い期間IMZに留まり、最終移動部位である錐体細胞層やSt.rad.への移動が遅れることが明らかとなった。以上のようにIGERでは胎生16日分裂する細胞が配列異常の主体を占め、これらの細胞は早期にINZに移動し同部で長く留まり、錐体細胞層、St.radへの移動が遅延することが明らかとなった。
皮膚悪性腫瘍の増殖・進展における血管新生のメカニズムとその意義

間葉系皮膚悪性腫瘍である隆起性皮膚線維肉腫における増殖因子として、platelet-derived growthfactorが重要であることを我々は過去に報告した。その発現は腫瘍細胞とそれに付随する新生血管にみられ、血管新生と腫瘍の増殖との関連を想定させる。他の血管新生因子としてはvascular endothelial growthfactor(以下VEGFと略す)およびbasic fibroblast growthfactor(以下bFGF)がよく知られている。我々はまず隆起性皮膚線維肉腫の組織標本を用いVEGF、bFGFの発現について検討した。腫瘍細胞はVEGFおよびbFGFの発現を示した。引き続き、隆起性皮膚線維肉腫由来の培養細胞を用い、VEGFおよびbFGFの発現とその作用について検討した。Mitogenic AssayではVEGFおよびbFGFは正常線維芽細胞と比較し腫瘍細胞に対してより強い増殖刺激活性を示した。RT-PCRではVEGFおよびbFGFの発現は腫瘍細胞と正常線維芽細胞との間の差ははっきりしなかったが、腫瘍細胞は各々のレセプターであるflt、KDR, flgを正常線維芽細胞より強く発現していた。またウエスタンブロツト法ではVEGF、flt、flgの発現が腫瘍細胞で亢進していた。しかしながらKDRの発現は両者で余り差がみられなかった。以上より隆起性皮膚線維肉腫の増殖にVEGFおよびbFGFの関与が想定された。次に各種の悪性黒色腫のcell lineを用いてVEGFの発現を検討した。VEGFの産生は原発由来株、リンパ節転移由来株、内蔵転移由来株の問に明らかな差はみられず、TGF-βおよびIL-6による誘導にも差はみられなかった。またflt、KDRの発現も株間に差はみられなかった。以上より悪性黒色腫のVEGFの発現は腫瘍の進展によって変化しないことか想定された。我々は間葉系皮膚悪性腫瘍である隆起性皮膚線維肉腫における増殖因子として、platelet-derived growthfactor(PDGF)が重要であることを過去に報告した。その発現は腫瘍細胞とそれに付随する新生血管にみられ、血管新生と腫瘍の増殖との関連を想定させた。血管新生因子としてはvascular endothclial growth factor(以下VEGFと略す)がよく知られている。我々はまず隆起性皮膚線維肉腫の組織標本を用い、抗VEGF抗体を用いてVEGFの発現について検討した。腫瘍細胞は血管内皮細胞と同様にVEGFの発現を示した。引き続き、隆起性皮膚線維肉腫由来の培養細胞を用い、vascular endothelial growth factorの発現とその作用について検討した。Mitogenic AssayではVEGFは正常線維芽細胞と比較し腫瘍細胞に対してより強い増殖刺激活性を示した。RT-PCRではVEGFの発現は腫瘍細胞と正常線維芽細胞との間の差ははっきりしなかったが、腫瘍細胞はVEGFのレセプターであるflt、kdrを正常線維芽細胞より強(発現していた。またウエスタンブロット法ではVEGF、fltの発現が腫瘍細胞で亢進していた。しかしながら、kdrの発現は両者で余り差がみられなかった。以上より隆起性皮膚線維肉腫の増殖にVEGFの関与が想定された。今後は様々な転移能を有する各種の悪性黒色腫のcell lineを用いてVEGFの発現と転移能および他の細胞成長因子との関連について研究を進める予定である。
口腔顔面機能にかかわる脳内回路を解明し、その重要性をコネクトーム研究に反映させる

本研究で次の結果を得た。(1)意識に上らない閉口筋筋紡錘感覚は、三叉神経中脳路核ニューロンによって三叉神経上核に運ばれた後、視床後腹側内側核の尾腹内側部に伝達され、さらに顆粒性島皮質の小領域に伝達された。異常な咬合がこの経路によって、情動や自律神経機能に悪影響を与え得ると考えられる。(2)他のほとんど全ての口腔顔面感覚は、三叉神経節ニューロンによって三叉神経感覚核群に送られた後、視床後腹側内側核の中央部に伝達され、さらに感覚の弁別に関わる一次と二次体性感覚野に伝達された。(3)上記の2経路は交通せず別個であった。歯科領域での新発見が将来のコネクトーム研究に大きく貢献した。咬合感覚が自律神経機能に直接影響を与えることに働いている脳内神経回路の解明し、世界中で推進されているコネクトーム研究に口腔顔面機能の重要性を反映させることが本研究の目的である。ラットを用いたこれまでの研究で、口腔顔面の感覚のうち、咬合感覚以外の感覚は三叉神経節ニューロン--三叉神経感覚核--視床後内側腹側核中央部(coreVPM)の経路で視床に伝達されるが、咬合感覚だけは別の経路、つまり三叉神経中脳路核ニューロン--三叉神経上核--視床後内側腹側核尾腹内側辺縁部(VPMcvm)の経路で視床まで伝達されることが明らかになった。そこで、咬合感覚の、VPMcvmから大脳皮質への投射の様態を明らかにするため、咬合感覚入力を持つことで同定したVPMcvmに両方向(順行+逆行)性神経トレーサーであるWGA-HRPを微量注入した後、全大脳皮質内に分布する標識軸索終末の分布を調べた。その結果、密な標識終末は、これまでの通説から予期していた体性感覚野には存在せず、自律機能に関わる島皮質の中の顆粒性島皮質の吻尾的中央の小部位(vrs2GI)のみに存在することを示すデータが得られつつある。vrs2GIが咬合感覚が入力する部位であることは電気生理学的に確認されている。データは、咬合感覚はそれ以外の口腔顔面感覚とは異なる視床--大脳皮質路によって伝達されることを示している。さらに、vrs2GIへの逆行性トレーサーであるFGの微量注入によって、vrs2GIは、VPMcvmのみではなく、視床味覚部位(VPPC)からの入力も受ける可能性が示されつつある。本研究で明らかになったVPMcvmが、Parkinson syndromeやTourette syndrome患者の脳内深部刺激治療の対象部である可能性とVPMcvm-vrs2GI路がそれらの治療効果に関連する可能性を、現在考察中である本研究で解明をめざしている視床--大脳皮質経路の起始部位(視床後内側腹側核尾腹内側辺縁部、VPMcvm)も終止部位(顆粒性島皮質の吻尾的中央の小部位、vrs2GI)も、実験前の予想とは違って小領域であることが、結果が得られ始めてわかった。よって、大きな注入では、VPMcvmまたはvrs2GIの外にまで拡散し、咬合感覚以外の感覚が伝達される経路を含んでしまう可能性が高いので、これら小さなVPMcvmまたはvrs2GIに限局した神経トレーサーの注入が必要になった。しかしそれは容易ではなく、その解決に時間を要している所である。具体的には、(1)注入の対象であるVPMcvmまたはvrs2GI自体を注入中により厳密に同定することが容易ではなかった。その解決のため、電気生理学的手法を用い、咬筋神経の電気刺激による誘発電位を記録して注入部位を決定することにした。また、(2)これらの各注入部位がVPMcvmまたはvrs2GIに充分に限局していることを注入後に、より厳密に確認することが容易ではなかった。その解決のため、標準切片を作成してその観察からやり直し、VPMcvmとvrs2GIの細胞構築学的同定法を確立した。さらに、(3)WGA-HRPのVPMcvmへの注入では、三叉神経上核に限局して逆行性標識細胞が認められた注入例のみをVPMcvmに限局した注入と判断し、この例における順行性標識された軸索終末の分布のみをデータとした。以上の対策を踏まえつつ、限局された注入が得られるように、多くのラットに注入を試みている所である。28年度の研究で、意識に上らない閉口筋筋紡錘感覚が、三叉神経中脳路核ニューロンによって三叉神経上核(Su5)に運ばれた後、視床後腹側内側核の尾腹内側部(VPMcvm)に伝達されることが示された。一方、他のほとんど全ての口腔顔面感覚は、三叉神経節ニューロンによって三叉神経感覚核群(TSNC)に送られた後、視床後腹側内側核の中央部(core VPM)に伝達されることが解明された。そこで29年度は、28年度の結果の展開をはかり、上記の両感覚の視床から大脳皮質への投射路の解明を試みた。咬筋神経の電気刺激と受動的開口時のニューロン活動からVPMcvmを同定し、そこに両方向性神経トレーサーであるWGA-HRPを微量注入した。

逆行性に標識されたニューロンが、Su5には存在するがTSNCには存在しない注入例では、順行性に標識された神経終末が顆粒性島皮質の吻尾的中央の小部位(dGIrvs2)に認められたが、大脳皮質の体性感覚野には認められなかった。またdGIrvs2ニューロンから、咬筋神経の電気刺激と受動的開口時に活動が記録された。一方、末梢神経刺激に対する応答からcore VPMを同定し、そこにWGA-HRPを微量注入した。逆行性に標識されたニューロンが、TSNCには存在するがSu5には存在しない注入例では、順行性に標識された神経終末が大脳皮質の体性感覚野に認められたが、島皮質には認められなかった。29年度の研究によって、他の口腔顔面の感覚は弁別機能に関わるのに対し、閉口筋筋紡錘感覚は情動や自律神経機能に関わる事が明らかになった。この解明は、全身の他の筋では未だ行われておらず、大発見と言える。歯科で重要な閉口筋筋紡錘感覚の中枢投射経路の解明が、全身の無意識感覚-情動関連にかかわる脳内コネクトーム研究の飛躍的発展に貢献するのである。本研究で次の結果を得た。(1)意識に上らない閉口筋筋紡錘感覚は、三叉神経中脳路核ニューロンによって三叉神経上核に運ばれた後、視床後腹側内側核の尾腹内側部に伝達され、さらに顆粒性島皮質の小領域に伝達された。異常な咬合がこの経路によって、情動や自律神経機能に悪影響を与え得ると考えられる。(2)他のほとんど全ての口腔顔面感覚は、三叉神経節ニューロンによって三叉神経感覚核群に送られた後、視床後腹側内側核の中央部に伝達され、さらに感覚の弁別に関わる一次と二次体性感覚野に伝達された。(3)上記の2経路は交通せず別個であった。歯科領域での新発見が将来のコネクトーム研究に大きく貢献した。研究の進捗状況欄に記載したように、解明をめざしている視床--大脳皮質経路の起始部位(VPMcvm)と終止部位(vrs2GI)に限局した注入例を増やし、より限局した注入に一日でも早く成功するように努めたい。29年度は、より細心の注意を払って、多くの動物に注入する予定を立てている。また、得られた注入部位の厳格な評価が本研究結果の高い信頼度につながるので、妥協せずに評価を行う予定である。一日でも早く実験を完遂させ、データの分析を開始し、図を作成して、論文を完成しなければならない。それを国際的学術誌に投稿して受理された後、ラットコネクトームデータを取りまとめているドイツのRostock大学の解剖学講座のNeuroscience groupに研究成果を送付する予定である。我々のデータの受領状況によっては、相手側研究者の代表であるSchmitt教授との相談が必要になろう。脳神経解剖学口腔解剖学28年度末報告書の研究業績欄の記載の如く、我々が明らかにしたい視床ー大脳皮質間の投射の概要は28年度初期の実験で明らかになった。しかし、その実験結果の信憑性が不充分であるので、より精度を上げる必要があることが28年度初期中にわかった。その為には、より精度の高いトレーサー注入法をより多くの動物に施す実験を多数行う必要があることが、28年度初期中にわかった。よって29年度には、動物は勿論、実験器具、薬品をより多く購入する必要が生じた。さらに、本実験に従事してもらっている特任研究員の雇用時間を考慮しなければならなくなった。さらに、得られる研究成果を、世界中(ラット脳はドイツの研究者が中心になっている)で展開されているコネクトーム研究に反映させるために、国際学会での発表をより積極的に行う必要がある。29年度に使用するお金の使途は、研究助成金の申請当初と基本的には大きくは変わっていない。しかし、上述の様に、実験回数を,当初の計画よりも大幅に増やす必要が出てきたので、動物、器具、薬品などの購入量を増やす予定である。また実験を遂行してくれる研究者の一人である特任研究員の雇用時間を増やすつもりである。
ピロリ菌除菌後の胃発がんにおける新規バイオマーカの解析および臨床応用の検討

本研究は、ピロリ菌除菌後の胃発がんに関わる遺伝子異常を同定し、発がんリスク予測マーカーとして臨床応用することを目的とする。胃がん予防目的のピロリ菌除菌治療が普及し、今後は除菌後の胃発がん対策が急務になると考えられる。これまでに申請者らは、ピロリ菌感染によって誘導されるメチル化異常の蓄積が胃がんリスク予測マーカーとなること、マイクロバイオーム(微生物群ゲノム)と消化器がんの発生の関連について報告してきた。しかし除菌後の胃におけるメチル化異常、除菌後の胃内マイクロバイオームの変化については殆どわかっていない。そこで、除菌後発がん症例の除菌前後におけるゲノム・エピゲノム解析とメタゲノム解析により除菌後発がんの分子病態を明らかとし、除菌後発がんリスクおよび早期診断体系を構築すること目指している。内視鏡治療の適応となった胃がん患者さんを対象としているため、本研究課題について当学の倫理審査委員会へ申請し、平成31年1月に実施の許可が下りた。同年2月より、患者さんからの同意を得た上で、腫瘍からの遺伝子抽出・精製や培養実験を開始しており、今後の解析に必要な検体数の収集を行っている。少数例であるが次世代シークエンスを用いた網羅的解析を開始し、その結果について検討中である。これまでの研究では、ピロリ菌感染によって誘導される遺伝子異常が注目されているが、除菌後に発生した胃がんに着目した研究は殆どない。今後、胃がん予防目的の除菌治療が普及するに伴って、除菌後に発症する胃がんへの対策が重要になると予想される。除菌後胃がんの分子病態を明らかとすることで、除菌後胃がんの予防・早期発見に必要な知見が得られると期待される。1ピロリ菌除菌後発がん症例と非発がん症例のエピゲノム、メタゲノム解析2非がん部における除菌後発がんに関連する遺伝子異常の同定3除菌前後の胃がんの分子病態の比較当初計画していた平成30年度の目標は上記であり、少数例ながらいずれもすでに開始できている。平成31年度の目標である「多数例での検証と機能解析」へ順調に向かうことができている。対象が「内視鏡治療を受ける胃がん患者さん」のため、多くの施設から症例や検体を集積することができればさらに解析が早く進むことになる。当科の関連施設へ広く呼び掛けていくことで、研究の更なる推進を期待したい。次世代シークエンスに必要な試料等を共同研究者と使用しており、本年度は余剰物品のみで解析していた。本来今年度使用予定としていた試料等の購入費が来年度必要となり、総費用としては当初の予定と同程度になる見込みである。
乾癬の病態形成におけるレクチンを発現する真皮樹状細胞の重要性の解明

慢性炎症性皮膚疾患の一つである乾癬の発症や病態形成に、樹状細胞(DC)による免疫応答制御が重要であることが報告されている。しかし、未だ乾癬の原因は不明であり、難治例も多い。近年、乾癬モデルマウスにおいて、MGL2 (Macrophage galactose-type C-type lection 2)というレクチンを発現するDCが病態の形成に寄与することが報告されたが、ヒト皮膚におけるMGL陽性DCの存在や、病態形成におけるMGLの分子機能は不明である。本研究は乾癬の原因追究と病態解明の糸口としてMGL陽性DCに注目し、ヒトの皮膚組織からMGL発現細胞を同定し、その分布・特性と乾癬の病態との関連につき解析し、治療法開発のための基盤とする。
マクロ視角とミクロ視角の協調による溶接ロボットの知的複合視角システムの研究開発

本研究では、物体認識用のマクロ視覚と高精度な物体位置・姿勢計測のためのハンドアイミクロ視覚の両サブシステムからなる知的複合視覚システムの構築を目的としたものである。本研究では、まずミクロ視覚のための計測方向・位置決定のために必要となる物体全体像の形状デ-タを階層構造とし、どの階層からでも他の階層のデ-タを高速参照できる双方向リスト構造とした。これを基にロボット作業に必要となる箇所およびその部分を高精度に位置計測するためのハンドアイカメラの位置・姿勢決定アルゴリズムを確立し、その有効性を立証した。また、マクロ視覚においては、形状を特徴付ける縁辺情報の抽出に関する検討を行った。ロボットの作業作業対象物体における縁辺は大部分が直線と楕円成分であり、これらを正確にかつ効率的に抽出する方法として、ρーθHough変換平面からの抽出法を確立した。従来、直線の抽出に関してはρーθパラメ-タ平面へのHough変換により容易に直線の抽出が行われていたが、楕円を抽出するには5次元のパラメ-タ空間が必要で、処理時間が長く、莫大なメモリ容量が必要であったが、本研究では、ρーθパラメ-タ平面から楕円も抽出できる処理方法を確立し、これにより、溶接作業等の実環境下でのノイズを多く含む画像からでも短時間でかつ少ないメモリ容量で、信頼性の高い線分抽出が可能となった。さらに、ミクロ視覚のおけるスリットレ-ザ光の投光位置計測において、投光レ-ザの広がり角、撮像カメラのレンズ絞り、対象面の表面粗さが計測精度に及ぼす影響を明確にし、撮像面上で5画素程度の幅になるように投光レ-ザの広がり角を調整し、さらにレンズ絞りをできるだけ開放にするのがより高精度に位置計測が可能なことを明らかにした。
軸不斉化合物を活用する不斉場の構築

1,1′-ビナフチル誘導体に代表される軸不斉を持つ化合物は2つのナフチル環により構成される大きな不斉場を提供する。中心不斉では不斉源そのものには柔軟性は全く無いがビナフチル誘導体は2つのナフチル環のねじれ角が理論的には0°-180°の間を連続的に変化できるため、同じ絶対配置を保ちつつ不斉源そのものに柔軟性がある。これらの特性のために光学活性ビナフチル誘導体、特に1,1′-binaphthalene-2,2′-diol(BINOL)誘導体は不斉分子認識及び不斉合成に頻繁に利用されてきた。本研究はナフタリン環を組み込んだ新しい軸不斉化合物を設計しそれを不斉分子認識に応用しようとするものである。具体的にはフォトクロミック化合物として注目を集めているスピロビンゾピランの合成と機能開発である。光学活性BINOLを組み込むことにより紫外線による構造変化をCDにより感知する機能を持たせた化合物の創製をひとつの柱とした。このような化合物はアミノ酸の光学異性体を認識しメロシアニン型による発色の持続時間に大きな差のあることを認めた。もうひとつの柱として2結合を経た軸不斉化合物の創製をとりあげた。先に述べたBINOLに代表される軸不斉化合物は一つの単結合の回転束縛によるものであるが本研究の目的化合物は二つの単結合を隔てたものであり全く未知の軸不斉化合物である。本化合物はナフチル環のπ-電子を含む二つの平面により構成される大きな不斉場を提供できること、及び不斉源自体に二つの回転できる結合を持っているため非常に柔軟性の大きな不斉場を提供できる。8,8'-位に充分大きな置換基を有する1,1′-ビナフチルエーテルは期待通り光学活性体が存在することを証明し、またそれぞれのエナンチオマーの単離に成功した。このものは単一分子で出来た二枚羽の傘歯車に対応し極めて興味深い物性を示すことを明らかにした。1,1-ビナフチル誘導体に代表される軸不斉を持つ化合物は2つのナフチル環により構成される大きな不斉場を提供する。中心不斉では不斉源そのものには柔軟性は全く無いがビナフチル誘導体は2つのナフチル環のねじれ角が理論的には0°180°の間を連続的に変化できるため、同じ絶対配置を保ちつつ不斉源そのものに柔軟性がある。これらの特性のために光学活性ビナフチル誘導体、特に1,1'binaphthalene-2,2'diol誘導体は不斉分子認識及び不斉合成に頻繁に利用されてきた。本研究はナフチル環を組み込んだ新しい軸不斉化合物としてスピロベンゾピラン誘導体およびビナフチルエーテル型化合物を設計しそれを不斉分子認識に応用しようとするものである。本年度は特に8,8'-位にかさ高い置換基を有する1,1'-ビナフチルエーテルの合成を行った。先に述べた1,1'-binaphthaene-2,2'-diolに代表される軸不斉化合物は一つの単結合の回転束縛によるものであるが本年度の目的化合物は二つの単ヶ愚答を隔てたものであり全く未知の軸不斉化合物である。

本化合物はナフチル環のπ電子を含む二つの平面により構成される大きな不斉場を提供できること、及び不斉源自体に二つの回転できる結合を持っているため非常に柔軟性の大きな不斉場を提供できるため本化合物が光学活性体で存在し且つ単離できれば極めて興味深いものである。このような考えに基づいて我々は8,8-位に種々の置換基を有する1,1'-ビナフチルエーテルを合成し、それらが光学活性体として存在しうるかどうかを検討した。その結果8,8'-位に充分大きな置換基を導入すると期待通り光学活性体が存在することを証明し、またそれぞれのエナンチオマーの単離に成功した。このものは単一分子で出来た二枚羽の傘歯車に対応し極めて興味深い物性を示すことを明らかにした。1,1'-ビナフチル誘導体に代表される軸不斉を持つ化合物は2つのナフチル環により構成される大きな不斉場を提供する。中心不斉では不斉源そのものには柔軟性は全く無いがビナフチル誘導体は2つのナフチル環のねじれ角が理論的には0°180°の間を連続的に変化できるため、同じ絶対配置を保ちつつ不斉源そのものに柔軟性がある。これらの特性のために光学活性ビナフチル誘導体、特に1,1'-binaphthalene2,2-diol誘導体は不斉分子認識及び不斉合成に頻繁に利用されてきた。本研究はナフチル環を組み込んだ新しい軸不斉化合物としてスピロベンゾピラン誘導体およびビナフチルエーテル型化合物を設計しそれを不斉分子認識に応用しようとするものである。スペロベンゾピラン誘導体はフォトクロミック化合物として学問的興味ばかりでなく新機能性材料の創製という点からも注目を集めている化合物群である。これらの化合物は紫外線照射によりzwitter ion構造を持つメロシアニン型となり発色する。アミノ酸は一般にはzwitter ion型で存在するためスピロベンゾピラン誘導体がメロシアニン型となったときには容易に取り込まれ、これが室温或いは白色光によりスピロ型に戻るとアミノ酸との相互作用が減じ取り込んだアミノ酸を再び放出することが期待される。これに更に不斉源を導入すればD-或いはL-アミノ酸の不斉を認識させることが可能であると考えられる。このような方針の下に本年度は特に1,1'-binaphthalene-2,2'-diolを不斉源とし、これをスピロベンゾピラン骨格に組み込んだホスト化合物を数種合成した。予備的段階ではあるが一部のスピロベンゾピラン誘導体は期待通りアミノ酸の光学異性体を認識しメロシアニン型による発色の持続時間に大きな差のあることを認めた。1,1′-ビナフチル誘導体に代表される軸不斉を持つ化合物は2つのナフチル環により構成される大きな不斉場を提供する。中心不斉では不斉源そのものには柔軟性は全く無いがビナフチル誘導体は2つのナフチル環のねじれ角が理論的には0°-180°の間を連続的に変化できるため、同じ絶対配置を保ちつつ不斉源そのものに柔軟性がある。これらの特性のために光学活性ビナフチル誘導体、特に1,1′-binaphthalene-2,2′-diol(BINOL)誘導体は不斉分子認識及び不斉合成に頻繁に利用されてきた。本研究はナフタリン環を組み込んだ新しい軸不斉化合物を設計しそれを不斉分子認識に応用しようとするものである。本年度は前年度に引き続きフォトクロミック化合物として注目を集めているスピロビンゾピランを不斉源としてBINOLを組み込んだホスト化合物の合成を継続した。既に前年度、アミノ酸の光学異性体を認識しメロシアニン型による発色の持続時間に大きな差のあることを認めているが、これを更に系統的且つ定量的に取り扱った。その結果フェニルアラニンではD-体がL-体より7.5倍発色時間が長くなることを確認した。
インビボ光イメージングを用いた癌骨転移の血管新生におけるTGFβシグナルの解析

生きているマウスの中で、乳癌骨転移巣における血管新生とTGF-β/BMPシグナル伝達を同時に可視化し、それを定量する新しいテクノロジーを開発し、乳癌骨転移巣の血管新生におけるTGF-β/BMPシグナルの係わりを明らかにした。さらに骨血管新生阻害剤やTGF-β/BMPシグナル阻害剤の乳癌骨転移における効果をインビボで解析し、その分子メカニズムを明らかにし、新たな癌骨転移治療法開発のための基礎的知見を得た。本研究の目的は、生きているマウスの中で、乳癌骨転移巣における血管新生とTGF-β/BMPシグナル伝達を同時に可視化し、それを定量する新しいテクノロジーを開発し、乳癌骨転移巣の血管新生におけるTGF-β/BMPシグナルの係わりを明らかにすることである。さらに、骨血管新生阻害剤やTGF-β/BMPシグナル阻害剤の乳癌骨転移における効果をインビボで解析し、その分子メカニズムを明らかにし、新たな癌骨転移治療法開発のための基礎的知見を得る。まず、乳癌骨転移巣における新生血管の可視化とその定量化を試みた。具体的には、近赤外蛍光イメージングの特性を活かして、骨転移モデルの新生血管を可視化した。申請者が樹立したヒト乳癌細胞株MDA-MB-231細胞の亜株で骨に高率に転移するMDA-231-D細胞を用いて、骨転移巣の血管新生を可視化することができた。撮影条件を検討することで鮮明な画像を得るとともに、さらにZスタック撮影によって三次元画像を得、イメージング画像を定量化することに成功した。次に、TGF-β/BMPシグナルを蛍光で可視化するトランスジェニックマウスの作製に取り組んだ。インビボでTGF-βまたはBMPのシグナルを可視化するトランスジェニックマウスを作製するために、TGF-β応答性プロモーターである9xCAGA配列の後方に赤色蛍光蛋白(red fluorescent protein:RFP)を繋いだプロモーターレポーター遺伝子のベクターとBMP応答性プロモーターであるBRE配列の後方にRFPを繋いだプロモーターレポーター遺伝子のベクターを作製した。さらに、ベクターを培養細胞にトランスフェクションし、TGF-β/BMP添加によって細胞が蛍光を発するか否かをin vitroで確認した。本研究の目的は、生きているマウスの中で、乳がん骨転移巣における血管新生とTGF-β/BMPシグナル伝達を同時に可視化し、それを定量する新しいテクノロジーを開発し、乳がん骨転移巣の血管新生におけるTGF-β/BMPシグナルの係わりを明らかにすることである。さらに、骨血管新生阻害剤やTGF-β/BMPシグナル阻害剤の乳がん骨転移における効果をインビボで解析し、その分子メカニズムを明らかにし、新たながん骨転移治療法開発のための基礎的知見を得る。まず、血管用近赤外蛍光プローブAngioSense750(VisEn社)を用いた血管新生の可視化と定量化については、皮下に移植したGFP発現ヒト線維肉腫細胞株HT1080細胞において得られた血管のカラー画像を白黒画像に変換して画像定量ソフトイメージJを用いて新生血管の面積を算出するとともに、同HT1080細胞の肺転移を定量化することに成功し、その成果を論文発表した(Hanyu et al., Cancer sci, 2009)。また、骨内血管のイメージングに関しては、骨用近赤外蛍光プローブOsteoSense680(VisEn社)とAngioSense750を組み合わせることで、微小血管をイメージングすることに成功した。次に、TGF-β/BMPシグナルを蛍光で可視化するトランスジェニックマウスの作製に関しては、シグナル応答性プロモーター配列の後方にRFPを繋いだプロモーターレポーター遺伝子は確かにシグナルに応答するが、その蛍光は弱く、インビボで骨の中での観察は難しいことがわかったので、変異型RFP、VenusやKaedeなど他の蛍光蛋白を検討し、ルシフェラーゼを融合させた変異型蛍光蛋白が強い蛍光を発することが判ったので、それを加えて、引き続きトランスジェニックマウスの作製をおこなった。本研究の目的は、生きているマウスの中で、乳がん骨転移巣における血管新生とTGF-β/BMPシグナル伝達を同時に可視化し、それを定量する新しいテクノロジーを開発し、乳がん骨転移巣の血管新生におけるTGF-β/BMPシグナルの係わりを明らかにし、さらに骨血管新生阻害剤やTGF-β/BMPシグナル阻害剤の乳がん骨転移における効果をインビボで解析し、その分子メカニズムを明らかにし、新たながん骨転移治療法開発のための基礎的知見を得ることを試みることである。血管新生については、昨年度までに血管用近赤外蛍光プローブAngioSense750( VisEn社)を用いた血管新生の可視化と定量化および骨用近赤外蛍光プローブOsteoSense680(VisEn社)とAngioSense750を組み合わせることで骨内血管の微小血管をイメージングすることに成功した。本年度は、乳がん骨転移におけるTGF-βシグナルの係わりにおいて、TGF-βシグナルとエストロゲンシグナルのクロストークについての新しいメカニズムを発見した。

具体的には、エストロゲンレセプターERαがTGF-βの細胞内シグナル伝達因子Smadに結合し、E3ユビキチンリガーゼSmurf1をリクルートすることでSmadの分解を促進し、TGF-βを抑制することを明らかにした。さらに乳がんにおいて、ERαの発現が低下するとSmadの発現が上昇し、TGF-βシグナルがオンになり、細胞の悪性化を促すことがわかった。これは、新たながん骨転移治療法開発のための有用な基礎的知見である。
社会的合意形成における倫理的価値構造に関する研究

本研究の目的は、現代の社会で緊急を要する社会的合意形成のもつべき倫理的な価値の構造を明らかにすることである。ここでいう社会的合意形成とは、社会基盤整備や環境問題等で、人々の価値観や価値意識によって生じる意見の対立や論争、紛争を解決し、対立する人々の間で満足のいくような合意を実現するためのプロセスである。3年にわたる研究の成果として、多様な関係者の間のコミュニケーションをどうはかるかということが話し合いの成否を左右する相互信頼という倫理的課題の根底にあるということ、それぞれの関係者の発話の構造を決定している文法の相互認識が非常に重要であることを認識しえた。すなわち、住民と事業の主体である行政や企業との間で、しばしば、「ご理解いただくための分かりやすい説明」と「陳情・批判」という文法構造の食い違いが生じており、この構造的食い違いが相互の信頼関係の醸成を阻害しているということである。すなわち、社会基盤整備や環境問題解決において求められる利害関係者どうしのコミュニケーションの課題を「信頼の醸成をめぐる発話の文法構造の違いをどう克服するか」という課題として捉え、この視点から社会的合意形成のもつべき倫理的な価値の構造を考察した。本研究の代表者は、いくつかの合意形成の現場に立ち会い、しかも話し合いの進行役やアドバイザー役という当事者として研究を推進する機会を得た。合意形成の研究では、こうした現場性、当事者性が研究の成果を左右する本質的な要因であるとの認識を得た。こうして得られた知見は、「平成15年度科学研究費補助金・基盤研究(C)・社会的合意形成における倫理的価値構造の研究」と題する報告書において詳細に論じた。本研究の目的は、現代の社会でもっとも緊急を要する社会的合意形成のもつべき倫理的な価値の構造を明らかにすることである。ここでいう社会的な合意形成とは、環境問題等で、人々の価値観や価値意識によって生じる意見の対立や論争、紛争を解決し、対立する人々の間で満足のいくような合意を実現するためのプロセスである。初年度は、河川事業や道路事業あるいは農村空間整備事業などに関してインタビューやフィールドワークを行うとともに、国土交通省や農水省関係の団体によって依頼された講演を機会に合意形成の課題について情報を収集し、本課題の重要性を再認識するとともに、伝統的な日本社会における合意形成プロセスでの空間的協働行為の意義について理解を深めることができた。また「合意形成」の概念そのものについて深める研究会も継続的に行った。社会的合意形成という課題の解決を求めている領域として、現代日本の農山村地域の存在を認識しえたことが本年度最大の成果である。高齢化と少子化によって農村空間の危機が叫ばれるなか、「環境」と「地域社会の存続」をキーワードに、農家と非農家、環境団体、行政など多様な関係者の対立の構造が浮かび上がっている。こうした歴史的伝統社会での合意システム研究のためには、日本文化の深い理解が必要であることも認識できた。本年度の研究によって長野県の一地方のため池整備の問題を本研究のフィールドとして位置づけることが可能になった。また京都における日本文化の伝統のなかに合意形成の倫理的価値について考察する手がかりが見いだされたことから、来年度の研究では、社会的合意形成の倫理的価値構造について、主として、環境倫理と合意形成の倫理という側面から研究を進めるに当たって、京都における日本文化の伝承という歴史的視点から、また長野県のため池整備という空間的視点から、多様な関係者がよりよい農村空間を構築するプロセスでの倫理的価値構造についての深い考察が得られるものと期待できる。ここでいう社会的な合意形成とは、社会基盤整備や環境問題等で、人々の価値観や価値意識によって生じる意見の対立や論争、紛争を解決し、対立する人々の間で満足のいくような合意を実現するためのプロセスである。