hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部癌における長鎖遺伝子間ncRNAのエピジェネティック制御について

頭頸部扁平上皮癌細胞株に自己複製能を有する転写因子であるSALL4遺伝子のsiRNAを導入し、mRNAを抽出し次世代シークエンサー発現解析をおこなった。それぞれの細胞株のsiSALL4導入前と導入後を比較し、平均で2倍以上の増減を認めたnon-coding RNAを抽出し解析した。SALL4遺伝子は、頭頸部癌においてエピジェネティックな制御をおこなう転写因子であることが分かっている。SALL4遺伝子をsiRNAでノックダウンすることにより、減増するlincRNAはそれぞれ3.8%、3.6%であった。予測より多い遺伝子が減増していた。腫瘍部と正常部からサンプリングした中咽頭癌手術症例のDNAメチル化解析を次世代シークエンサーを使って解析した。腫瘍部と正常部のlincRNAの発現に違いのあるlincRNAを選び出した。また、UMSCC47細胞株を使って、脱メチル化治療を行い、治療前と比べて発現が変化したlincRNAを抽出した。これらの結果を統合して頭頸部癌に関係のあるlincRNAの特定を今後進める予定である。GALR1遺伝子とSALL3遺伝子との間にあるlincRNAは、RP11-849, -715, -123, -451,-100, -671, -63, -176がある。これらのlincRNAの発現を、次世代シークエンサーでの解析結果と臨床検体での発現解析を照らし合わせ候補となるlincRNAを特定できた。この特定されたlincRNA-XをsiRNAでノックダウンし、GALR1とSALL3遺伝子のメチル化度を調べる準備を行っている。次に、EZH2も併せてノックダウンし同じくGALR1とSALL3遺伝子のメチル化度を調べる準備を行っている。GALR1とSALL3遺伝子のメチル化度が低下し、GALR1とSALL3のmRNA量の増加と細胞増殖低下を認めると、lincRNA-X⇔EZH2⇔GALR1/SALL3のlincRNAを介したエピジェネティック修飾に関して解明できると考える。さらにEZH2阻害剤によるUMSCC47細胞株の治療を行った。今後次世代シークエンサー解析を行い。先に行った実験と併せて遺伝子の変化を確認していく。DNAのメチル化を始めとするエピジェネティックな変化が、RNA合成、ひいてはタンパク質の発現を抑制することから、癌化機構の一つとして認識されている。近年、トランスクリプトーム解析によって同定された遺伝子間領域から転写される大小さまざまな非コードRNA(non-coding RNA)群が、ヒストン修飾酵素複合体と結合し、特異的な標的遺伝子の発現制御にかかわっていることが明らかにされつつある。今回我々は、長鎖遺伝子間non-coding RNA(lincRNA)に注目し、頭頸部癌におけるエピジェネティック制御におけるlincRNAの役割について調べ、エピゲノム異常の知見を蓄積していきたい。本研究計画では、RNAからDNAへの解析と、DNAからRNAへの解析の2つアプローチで行う。1UMSCC1細胞株のtotal RNAを使ってのマイクロアレイ解析2臨床検体のtotal RNAを使ってのlincRNA発現解析と近傍遺伝子のDNAメチル解析3GALR1遺伝子とSALL3遺伝子に関連のある新規lincRNAの探索の3つの研究を行う今回は、長鎖遺伝子間non-coding RNA(lincRNA)に焦点を絞り、頭頸部癌におけるエピジェネティック制御におけるこれらのRNAの役割について調べることを目標とする。マイクロアレイ解析によって、同定されたlincRNAの近傍に位置する新規遺伝子(M)をエピジェネティック修飾(DNAメチル化)しているか解析する。全ゲノムクロマチン免疫沈降シークエンス法によって得られたデーターとの照合も行なった。マイクロアレイ解析した同一症例からのDNAをバイサルファイト処理しDNAメチル化解析を行う。新規遺伝子(M)のプロモータ領域のCpGリッチな領域に定量的メチル化特異的PCR(Q-MSP)のプライマーをデザインする。解析には、当研究室に保有するTaKaRa Real-Time System TP800を使用する。対象は80例で予後解析も併せて行なったDNAのメチル化を始めとするエピジェネティックな変化が、RNA合成、ひいてはタンパク質の発現を抑制することから、癌化機構の一つとして認識されている。今回我々は、長鎖遺伝子間non-coding RNA(lincRNA)に注目し、頭頸部癌におけるエピジェネティック制御におけるlincRNAの役割について調べている。臨床サンプルと細胞株を使ってのシークエンスが終了てきたことは1年目としては順調に進んだと考えている。頭頸部癌において隣り合ったGALR1とSALL3遺伝子に高頻度にDNA methylation(メチル化)を認めている。

GALR1とSALL3遺伝子の高メチル化症例に、蛍光免疫染色でEZH2蛋白の高発現を認め、予後が不良であった。(図7)これらのデーターから、GALR1とSALL3遺伝子の高メチル化は、これらの遺伝子の近傍にあるlincRNAがEZH2を誘導しDNAメチル化を引き起こし発現低下させている可能性がある。その未知のlincRNA-Xを特定し、lincRNA-XとEZH2をsiRNAでノックダウンさせ、GALR1とSALL3遺伝子のメチル化度が変化するのか解析する。頭頸部癌次世代シークエンサー解析によって、同定されたlincRNAの近傍に位置する新規遺伝子(M)をエピジェネティック修飾(DNAメチル化)しているか解析する。全ゲノムクロマチン免疫沈降シークエンス法によって得られたデーターとの照合も行う予定である。マイクロアレイ解析した同一症例からのDNAをバイサルファイト処理しDNAメチル化解析を行う。新規遺伝子(M)のプロモータ領域のCpGリッチな領域に定量的メチル化特異的PCR(Q-MSP)のプライマーをデザインする。解析には、当研究室に保有するTaKaRa Real-Time System TP800を使用する。対象は80例で予後解析も併せて行う。予想より研究がスムースにすすみ消耗品の消費を最小限に済ますことができた。1年目に配分額を多く見積もった影響である。繰り越し制度を利用して本年度も研究を遂行していく予定である。来年度は、大型機器を使った解析を予定しており予算を使用する予定である。2年目の本年度は150万円ほどの使用を予定している。これまでの研究成果の発表と情報収集のため海外の学会参加も予定している。
線型微分方程式の変形理論とその拡張の研究

二次元の可解格子模型の相関関数に関して、次のような一般的な性質を発見した。すなわち、6頂点模型を含む一連の頂点模型、面模型であるRSOS模型、辺模型であるKashiwara-Miwa模型、Chiral-Potts模型のn点相関関数はI.Frenkel-N.Reshetikhin及びF.Smirnovによって発見されたqdeformed及びdeformed Knizhnik-Zamolodchikov(q-KZ,dKZ)方程式の自然な拡張と思われる差分方程式を満たす。6頂点模型を含む、Affine量子群の表現に対応する模型に関しては、上記の事実は相関関数がq-頂点作用素のトレースとして記述出きる事から従うことはすでに我々が発見していた事である。今回の結果のポイントは、量子群の表現に必ずしも対応しない模型に関してもその相関関数が差分方程式を満たすことを示した点にある。我々は、この結果を導く過程で、各模型に頂点作用素を導入し相関関数はこの頂点作用素の、角転送行列の固有空間上でのトレースとして表される事を示した。従って今後の大きな課題として適当な代数を発見して、頂点作用素を、その代数の表現の間のintertwining作用素として実現できるかどうかという事がある。6頂点模型の相関関数に関しては次ぎのような結果を得た。この模型のn点相関関数の積分表示を我々は既に導いている。この積分はレベル4のq-KZ方程式を満足する。これは既に述べたようにq-頂点作用素のトレースとしての記述から従う。積分がq-KZ方程式を満足する仕組を直接(表現論を経由しないで)明らかにすることは、他の模型の相関関数の積分表示を導く上でも役に立つと期待される。その仕組を明らかにしたのが結果である。これによりレベル4のdKZ方程式の解でXXX模型の相関関数の積分表示に類似の積分で表されるものの族を求めることが出来た。ここで重要なことは、Riemann面上の微分の留数のあアナロジーを差分系に対して導入し積分を一回自明に実行できる点にある。
超音波振動子接触法による筋肉の硬さ測定の基礎的研究

本年度の計画は1、円形超音波振動子の理論解析、2、円形超音波振子の設計・制作、3、筋肉に近いファントムを用いた基礎実験、であった。13共計画通り研究を進めることができた。以下順に成果を述べる。1、円形超音波振動子の理論解析:2つの部分に分けられる。まず、超音波振動子の音響放射インピーダンスZ_aの解析を行い、接触した物質の硬さに良く対応する粘弾性率とZ_aの関係を求めた。次に、円形超音波振動子の等価回路解析を行い、電気端子から見た振動子のインピーダンスZとZ_aの関係を求めた。両者を結びつけることで振動子の電気的インピーダンスZの測定により接触している物質の硬さに関する情報を得ることができる。2、円形超音波振動子の設計・制作:1の成果を念頭において筋肉の硬さ測定用に圧電ランジバン型超音波振動子を設計し、共振周波数の異なる円形超音波振動子3体を制作した。3、筋肉に近いフントムを用いた基礎実験:ファントムとしては弛緩した筋肉の硬さに近いオイルゼリー2種と、緊張した筋肉の硬さに近いシリコン樹脂を用いた。硬さが大きく異なる前2者と後者それぞれに接触させて測定したZ=R+jXは実部R、虚部X共に大きく異なった。又、前2者間の微妙な硬さの違いもRの差により識別でき、臨床医の触知による結果と矛盾がなかった。これは1の解析結果に基づいた予測とも一致し、本法による筋肉の硬さ測定の可能性を示唆するものである。以上、今年度の成果を述べた。今後は、当面上述の結果をファントム硬度の静的な測定や心理物理的測定により確認し、筋肉の硬度測定装置の開発に向け、さらに研究を進めていく予定である。
ゴーシェー病II型患者由来iPS細胞を用いた新規治療薬の開発

平成30年度は、ゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞から樹立したNeural stem cell(NSC)を使用しての薬剤スクリーニングで効果のあると考えられた8種類の薬剤を候補にして、これらの薬剤作用後のNSC内のGlcSphの定量を行ったが、はっきりした効果が得られる薬剤は見つからなかった。ゴーシェー病II型患者由来NSCと正常者iPS細胞から樹立したNSCをNeuronに分化誘導し、両者間の神経についてカルシウムシグナルについて評価した。すでに、Fluo 4-AMを用いた細胞内のカルシウムシグナル伝達は、ゴーシェー病II型の患者由来NSCから分化させたNeuronにおいて、カルシウムシグナル伝達が正常者NSC由来のNeuronよりも亢進していることが確認できた。さらにカルシウムシグナル伝達の亢進について、カルシウムイオンチャンネルにフォーカスを充ててqPCRにて遺伝子発現の解析とウエスタンブロットは行った。NMDA型グルタミン酸受容体とAMPA型グルタミン酸受容体の発現は、ゴーシェー病II型の患者iPS細胞由来のNeuronでは、亢進していることが判明した。また、ゴーシェー病II型患者Neuronでは、開口放出能が低下していることが予測されるたが、シナプス前終末の機能や分泌現象の計測に活用されているFM1-43を使用して、実際に開口放出能が低下していることも確認できた。さらに、SNAP25やSyntaxin 1aなどのシナプス前終末の機能にかかわるSNARECOMPLEXの遺伝子発現が低下していることも確認できた。ゴーシェー病モデルマウスについては、B6マウス(Gba flox/floxとGba flox/+-Nestin Cre/+との交配マウス)を随時繁殖させ、ゴーシェー病の病態について、検討している最中である。当初の予定していた薬剤ライブラリーから有効薬剤としての治療薬候補があると考えられていたが、はっきりとしたものが現在見つかっていないため。ゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞(2検体:兄弟例)とゴーシェー病III型患者由来のiPS細胞の樹立とそのiPS細胞からのNeural stem cell(NSC)およびNeuron細胞の樹立はできた。ゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞から樹立したNSCを用いて、lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)をマーカーにしながら1392種類の化合物についての薬剤スクリーニングを終えた。この中から、二次スクリーニングを終了した地点で、8種類の化合物にまで絞ることができた。この中から有効薬剤は見つけることができなかった。また違う評価系で候補薬を絞る。また、ゴーシェー病II型患者iPS細胞由来のNSCにおいて、グルコシルスフィンゴシン(GlcSph)が正常者のNSCよりも蓄積していることも確認できた。さらに、ゴーシェー病II型患者iPS細胞由来のNeuronでは、プレシナプス機能の低下とポストシナプス機能(カルシウムイオンの流入)の亢進が現象として証明できた。このプレシナプス機能の低下とポストシナプス機能(カルシウムイオンの流入)の亢進の原因についてさらに検討する予定である。生後2週間でけいれんを発症している神経型ゴーシェー病モデルマウスは獲得でき、現在、繁殖とともに表現型を解析中である。平成29年度は、我々が持つ正常者およびゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞から樹立したNeural stem cell(NSC)を使用して、リソソームの膜蛋白質であるLAMP1の発現が、qRT-PCR、免疫蛍光染色(In cell analyzer 6000によるLAMP1の蛍光面積×強度)でゴーシェー病II型患者由来NSCにおいて優位に高いことが確認できた。また、さらに、この二者のNSCを用いて、プチスクリーニング2014;シグマアルドリッチおよび理化学研究所の橋爪氏らから提供いただいた化合物ライブラリーの化合物合計1392種類の化合物で薬剤スクリーニングを行った。その中からLAMP1の発現が低下している薬剤は、約120種類ほどあった。さらに、二次スクリーニングとして、スクリーニングの検体数を増やすことで、最終的に8種類の薬剤まで絞りこむことができた。さらに、LC/MSにおいて、正常者およびゴーシェー病II型患者由来のNSCにおけるGlcCerやGlcSphの定量に成功した。NSCにおいては、両者の細胞内ではGlcCerの蓄積量に有意な差は認められなかったが、GlcSphにおいては、優位にゴーシェー病II型患者由来のNSCにおいて有意な差を認めた。また、ゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞としては、1検体しか保持てきていなかったが、今年度は、同じ家族内で診断したゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞およびNSCを樹立した。同様に、ゴーシェー病III型患者からもiPS細胞およびNSCも樹立できた。神経型ゴーシェー病モデルマウスとして、Gba flox/floxとGba flox/+-Nestin Cre/+マウスをイスラエルのTony Futerman教授から入手に成功した。すでに、genotypingは終え、現在繁殖させているところである。予定していたようにゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞から樹立したNSCを用いて、lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)をマーカーにしながら1392種類の化合物についての薬剤スクリーニングを終えた。

また、ゴーシェー病II型患者由来のNSCにおいて、グルコシルスフィンゴシン(GlcSph)が正常者のNSCよりも蓄積していることもLC/MSによって確認できた。また、神経型ゴーシェー病モデルマウスもイスラエルのWeizmann Institute of Scienceに所属しているのTony Futerman教授から入手でき、genotypingは終え、さらに生後2週間でけいれんを発症している神経型ゴーシェー病モデルマウスが誕生したことも確認できている。以上のように、平成29年度に予定していた計画はおおむね順調に行うことができた。平成30年度は、ゴーシェー病II型患者由来のiPS細胞から樹立したNeural stem cell(NSC)を使用しての薬剤スクリーニングで効果のあると考えられた8種類の薬剤を候補にして、これらの薬剤作用後のNSC内のGlcSphの定量を行ったが、はっきりした効果が得られる薬剤は見つからなかった。ゴーシェー病II型患者由来NSCと正常者iPS細胞から樹立したNSCをNeuronに分化誘導し、両者間の神経についてカルシウムシグナルについて評価した。すでに、Fluo 4-AMを用いた細胞内のカルシウムシグナル伝達は、ゴーシェー病II型の患者由来NSCから分化させたNeuronにおいて、カルシウムシグナル伝達が正常者NSC由来のNeuronよりも亢進していることが確認できた。さらにカルシウムシグナル伝達の亢進について、カルシウムイオンチャンネルにフォーカスを充ててqPCRにて遺伝子発現の解析とウエスタンブロットは行った。NMDA型グルタミン酸受容体とAMPA型グルタミン酸受容体の発現は、ゴーシェー病II型の患者iPS細胞由来のNeuronでは、亢進していることが判明した。また、ゴーシェー病II型患者Neuronでは、開口放出能が低下していることが予測されるたが、シナプス前終末の機能や分泌現象の計測に活用されているFM1-43を使用して、実際に開口放出能が低下していることも確認できた。さらに、SNAP25やSyntaxin 1aなどのシナプス前終末の機能にかかわるSNARECOMPLEXの遺伝子発現が低下していることも確認できた。ゴーシェー病モデルマウスについては、B6マウス(Gba flox/floxとGba flox/+-Nestin Cre/+との交配マウス)を随時繁殖させ、ゴーシェー病の病態について、検討している最中である。当初の予定していた薬剤ライブラリーから有効薬剤としての治療薬候補があると考えられていたが、はっきりとしたものが現在見つかっていないため。平成30年度は、ゴーシェー病II型患者由来のNSCを使用しての薬剤スクリーニングで、効果のあると考えられた8種類の薬剤を候補にして、これらの薬剤作用後のNSC内のGlcSphの定量を行う。
都市域の廃棄物再資源化拠点としてのアーバンマインの構築とそのホロニック・パス

都市域の廃棄物資源化拠点としてのアーバンマインについて検討し,その構築に不可欠な要素技術を開発するとともに,これらの成果を活用した自律分散型のアーバンマインとそれらを緩やかにリンクさせたシステム(ホロニック・パス)について考察し提言した。主な成果は,以下のようである。1)廃棄物中の有価物を資源化・リサイクルするのに適した湿式比重選別機として網下気室型比重選別機(RETAC Jig)を開発し,本機を用いて次のような実証試験を行い,その有用性を確認した。a)廃コンクリートからの骨材,モルタル分の回収・リサイクルb)廃蛍光管からの各種ガラスの回収・リサイクルc)鉛汚染土壌中の鉛粒子の回収d)使用済自動車や廃家電のリサイクル工場で発生するシュレッダーダスト中の有価物回収2)また本機をベースに,固体粒子の比重と表面濡れ性の差を利用して,比重差が無くても選別できるHybrid Jigを世界で初めて開発した。さらに,水より軽い物質の選別が可能なReverse Jigも開発した。3) Ni-水素電池から正極物質,負極物質を効率よく分離・回収するプロセスを開発した。5)自律分散型のアーバンマインとそれらを緩やかにリンクさせたシステムについて提言した。持続可能な資源循環システムを構築するためには,社会システムにおける資源・廃棄物の流れを見直し,最適化する必要がある。そのためには,都市内の主要ポイントに廃棄物再資源化拠点としてのアーバンマイン(都市鉱山)を創り出し,そこで効率的に有価物を回収し,これを素材あるいはエネルギーとして利用するとともに,最終不用物量を極力減らし,不用物を適正処分,望ましくは自然に戻る形で処分することが重要になる。このようなシステムを備えた自律した各都市域が各地に分散し,相互の緩やかな連携,協働を通して,社会全体として調和が取れるようなシステムとしてホロニック・パスが構想される。本研究では,このようなホロニックな資源循環システムを構築するために,拠点としてのアーバンマインにおける資源化技術の開発と持続可能な資源循環システムの具体化に取り組む。本年度は,廃OA機器,廃コンクリート,都市ゴミ溶融飛灰などの廃棄物を対象に資源化の要素技術について研究し,以下のようなことを明らかにした。1)北大で開発したTACUBジグを基に脈動型比重選別機を製作し,これにより廃OA機器中のプラスチックの成分別回収,廃コンクリートからの粗骨材,細骨材を可能にした。また,リサイクルプラントの概略設計をし,一部は産学連携プロジェクトにより建設に着手した。2)都市ゴミ溶融飛灰中の有価金属をリーチング-硫化法で効率的に回収する方法を見出した。持続可能な循環型社会を構築するためには,都市域に自律分散型の資源・廃棄物の質変換系と輸送系を備えたホロニックなシステムが必要であり,都市域および都市域間でこれらのシステムが緩やかに結合することが重要である。本研究では,このようなホロニックな資源循環システムを構築するために,拠点としてのアーバンマインにおける資源化技術の開発と持続可能な資源循環システムの具現化に取り組む。今年度の主な研究成果は,以下の通りである。1)廃OA機器,廃シュレッダダストについて,そこに含まれている有価物の回収に取り組み,各成分の単体分離に有用な破砕・剥離プロセスを見出し,これとジグ選別,磁気選別,渦電流選別などと組み合わせ,新しい資源化・リサイクルシステムを提案した。2)廃コンクリートから骨材を回収し,この再生骨材を用いてコンクリートを製造するモバイル型のリサイクルプラントの建設に取り組み,骨材回収プロセスを完成させた。この骨材を用いたコンクリートの強度は,JIS規格を満たす骨材を用いたコンクリートより強いことが多いことを見出した。3)都市ゴミの焼却飛廃,溶融飛廃中の有用金属を回収し,資源化するプロセスの開発に取り組み,種々のリーチング法と硫化法,セメンテーションを組み合わせた方法を検討し,新しいプロセスを提案した。4)微生物,自然浄化を利用した廃水処理について検討し,ジャロサイトや硫酸還元菌を利用するヒ素含有廃水の新しい処理法を開発した。持続可能な資源循環システムを構築するためには,都市内の主要ポイントにアーバンマインを創り出し,そこで効率的に有価物を回収し,これを素材あるいはエネルギーとして利用するとともに,最終不用物量を極力減らし,不用物を適正処分,望ましくは自然に戻る形で処分することが重要になる。

都市域には,自律分散型の資源・廃棄物の質変換系と輸送系を備えたホロニックなシステムが必要であり,都市域内および都市域間でそれらが緩やかに結合する。本年度の本研究では,このようなホロニックな資源循環システムを構築するために,拠点としてのアーバンマインにおける資源化技術の開発と持続可能な資源循環システムの具体化に取り組み,以下のような成果を得た。1)無機有機複合廃材(廃OA機器,廃自動車シュレッダーダストなど)の再資源化・リサイクルのための要素技術開発と最適プロセスの検討を行い,ウレタン類に絡み付いているハーネス類,繊維類,プラスチック類を剥離する方法を開発した。2)上記の成果を基に,研究代表者の研究室で開発した湿式比重選別機による金属,各種プラスチックを精度よく分離するための制御法を開発し,また装置の改良を行った。3)比重差のほとんどないプラスチック相互を湿式比重選別するため,表面の濡れ性の差をあわせて利用するハイブリッドジグを開発し,その有用性を実証した。4)建設系廃棄物の再資源化・リサイクルのための要素技術開発と最適プロセスの検討を行い,実用化に向けてのプロセスの提案をした。5)都市ゴミ中の有価物の回収・資源化のための要素技術開発と最適プロセスの検討を行い,浸出法の改良,有価金属の回収について有益な知見を得た。最終年度の本年度では,平成1618年度の成果に基づき,都市域の廃棄物資源化拠点としてのアーバンマインについて検討し,その構築に不可欠な要素技術を引き続き開発するとともに,実証試験を協力研究者のいる事業所で実施した。得られた主な成果は,以下のようである。1)廃棄物中の有価物を資源化・リサイクルするのに適した湿式比重選別機として網下気室型比重選別機(RETAC Jig)を開発し,本機を用いて次のような実証試験を行い,その有用性を確認した。a)廃コンクリートからの骨材,モルタル分の回収・リサイクルb)廃蛍光管からの各種ガラスの回収・リサイクルc)鉛汚染土壌中の鉛粒子の回収d)使用済自動車や廃家電のリサイクル工場で発生するシュレッダーダスト中の有価物回収2)また本機をベースに,固体粒子の比重と表面濡れ性の差を利用して,比重差が無くても選別できるHybrid Jigを世界で初めて開発した。3)さらに,水より軽い物質の選別が可能なReverse Jigも開発した。4)上記の成果を活用した自律分散型のアーバンマインとそれらを緩やかにリンクさせたシステム(ホロニック・パス)について提言した。
補償光学適応走査型レーザー検眼鏡を用いた虚血性黄斑症の病態解析

虚血性黄斑症は、糖尿病網膜症患者における視力障害の原因の一つであり、その病態の解明が待たれる。近年開発された補償光学(Adaptive Optics: AO)の眼底イメージングへの応用は、眼底の細胞レベルでの観察を実現でき、これまでに観察できなかった病態を可視化できる可能性があると期待されている。我々は、補償光学を利用した走査型レーザー検眼鏡(adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy: AO-SLO)を用いて正常眼および糖尿病網膜症患者の傍中心窩毛細血管網を観察し、赤血球列の伸長率、速度に差があることを示した。赤血球列の糖尿病網膜症における病的な変化は毛細血管の場所に依存しないものと考えられ、新たなパラメータとして糖尿病網膜症の病態解明や早期発見方法の確立に応用できると考えられる。平成24年度には健常者および糖尿病網膜症患者におけるAO-SLOデータの収集、解析を行った。撮影した人数は健常者が24人、糖尿病患者が100眼であった。糖尿病患者のうちも糖尿病網膜症を認めたのは59人で、その内訳はmild NPDRが22人、moderate NPDRが25人、severe NPDRが3人、PDRが9人であった。目標人数は糖尿病網膜症のあり・なし各群30名ずつ計60名120眼の撮影であったが、データ収集はおおむね予定通り行えたと考えられる。糖尿病網膜症を有する患者のうち解析に使用できる画質を得られたのはわずか10人(16.9%)であった。画像取得の成功率が低かった理由として、黄斑浮腫、白内障の併発、固視不良などが挙げられ、ハードの更なる改良が必要と考えられた。健常者と比較して、血流速度は糖尿病網膜症眼で有意に速くなっていた。一方で6眼(60%)の患者で急激に血流速度が遅く変化する血管を認め、虚血性変化の前段階と疑わせる所見と考えられた。これら画像解析は、血流速度の計測および毛細血管網の自動抽出に加えて、心拍動との同期、血管像の自動パノラマ作成など血流解析ソフトウェアのバージョンアップを経て可能となり、得られた結果である。研究計画の全体的な遅れに伴いAO-SLOデータの全身的なパラメータとの相関に関する検討や動物モデルを用いたNADPHオキシダーゼ阻害剤の網膜虚血に対する影響の検討は期間内に行うことができなかった。補償光学(adaptive optics: AO)を適用した走査型レーザー検眼鏡(AO-SLO)は、眼球光学系全体の収差を補正し眼底を細胞レベルで観察することが可能である。近年、AO-SLOを用いて傍中心窩網膜毛細血管内を流れる高輝度粒子を観察し、白血球と推察する報告がなされているが、その特定には至っていない。AO-SLOを人眼において非侵襲的に網膜微小循環を評価できる機器に完成させるためには高輝度粒子の正確な解釈が必須である。我々はその正体に迫るべく、血管の影の中を黒い尾を引きながら流れる高輝度粒子の定量的画像解析を行った。結果、AO-SLOで観察される高輝度粒子の正体は、視細胞層に映った暗い血管の影の中で順番に明るくなる視細胞群であると考えられた。このような現象の原因となるのは、その光学的特性を考えると毛細血管中を流れる白血球あるいは血漿(plasma gap)であると考えられる。つまり、透明に近い白血球あるいは血漿はレーザー光を透過し、視細胞で反射、われわれの目に戻ってきて観察される。一方、赤血球はレーザー光をブロックし、レーザー光が視細胞層に到達するのを妨げるのである。この現象はBlue field entoptic phenomenonの原理と非常によく似ている。我々はこの発見を世界に向けて発信し、AO-SLOを用いた網膜血流の正確な解釈に新しい光明を投じた。また今回の観察でもう一つ発見をした。いわゆる"dark tail"である。おそらく赤血球列(rouleaux formation)による強いブロックと考えられ、今後その臨床的意義が注目される。健常者及び患者より問題なくAO-SLOデータは収集できている。FAZおよび周囲の毛細血管ネットワークの形態変化と視機能の相関に関しても検討中であるが、新しいパラメーターの解析も同時に行っていることを考えれば、おおむね順調に進展していると考えられる。1)虚血性黄斑症患者におけるAO-SLOデータの収集と解析を引き続き行う予定である。2)糖尿病患者におけるAO-SLOデータの収集と解析を予定している。以上2項目については当初予定していなかった、新しいパラメーターである赤血球列の評価も行う。

3)AO-SLOで得られたデータと蛍光眼底造影写真の比較検討を行う。4)全身的なパラメータとの相関に関する検討を予定している。4)NADPHオキシダーゼ阻害剤の網膜虚血に対する影響を動物実験にて検討する予定である。実験動物や実験試薬、器具の購入に充てる予定である。またAO-SLO画像は容量が大変大きく、その解析にはかなりの記憶媒体を必要とすることがわかってきている。そのため、大型の記憶媒体複数個の購入には高額の研究費が必要であると考えている。その他、海外学会での研究成果の発表や、科学誌への成果投稿に研究費を使用する予定である。
神経回路網の可塑性におけるサイクリン依存性キナーゼ5(CDK5)の役割〜CDK5, p35トランスジェニックスマウスによる解析〜

ラット及びマウスの脳においてCdk5/p35の活性が生後約23週で最も高くなっていた。Cdk5,p35の含量変動では、Cdk5は週令を通じてほとんど変化せず、p35が活性と同期して増減を示した。、両者の分布は胎生12日目より発現し、生後2週目で最も染色性が高くなった。これは活性の変動と同じであった。部位別では海馬に最も多かったが、皮質をはじめほとんどの脳の部位において神経細胞特異的に発現していた。ヒトのアルツハイマー(AD)脳とそれと同年齢の対象脳をそれぞれ12検体をカナダ・カルガリ大学医学部のDr.Clarkより入手した。部位的には前頭葉が主で10例あり、海馬も4例あった。これらの脳切片を用い抗Cdk5抗体を用いた免疫染色法でCdk5が脳のどの部位に存在するかを解析した結果、AD脳で見られる老人斑部によく一致して認められた。また全体的にもAD脳で対象脳より高い染色性が認められた。p35の発現についてもこれら脳切片を用いて調べているがCdk5に比べて明らかな差を見いだせず、比較的均等に染色性が認められた。一部抗体にも原因があると考えられたので、in situ hybridization法にてmRNAの分布を調べたが、これにも明らかな差が認められなかった。Cdk5活性を凍結脳標品について測定したところ、前頭葉でも海馬でも1020%高い活性を認めた。老人斑の部分においてはさらに高い活性を持つことが予測された。AD脳のCdk5,とアクティベーターであるp35,p39、さらにこれらのインヒビターとしてp27,p21などの関与を解析した。Cdk5とp35はAD脳で対象として用いた同年齢の脳に比べ、海馬において約30%多い発現が認められた。p27及びp21については免疫化学的に発現は確認したが、量的な差は認められなかった。Cdk5及びp35のPC12細胞に対するトランスフェクション実験は、アデノウィルスを用いる系において遂行した。両者の発現はPC12細胞において確認したが、明らかな表現型の変化を来さなかった。p35あるいはCdk5高発現型トランスジェニックマウスの作成を引き続き試みたが不成功に終わった。AD脳のCdk5,とアクテイベーターであるp35,p39、さらにこれらのインヒビターとしてp27,p21などの関与を解析した。以上より、ラットならびにマウス脳の胎生後期から生直後の発達における神経回路網形成の過程で、Cdk5/p35が重要な役割を果たすとともに、アルツハイマー病態においても関連性があることが示唆された。

p27及びp21については免疫化学的に発現は確認したが、量的な差は認められなかった。以上より、ラットならびにマウス脳の胎生後期から生直後の発達における神経回路網形成の過程で、Cdk5/p35が重要な役割を果たすとともに、アルツハイマー病態においても関連性があることが示唆された。ラット及びマウスの胎仔より成熟個体までの各段階で採取した脳を用い,ホモジナイズして得た100,000*g上清画分のCdk5,p35の含量変動及びリン酸化活性の動態についてWestern blot等により同定し,活性変動をHiston H1を基質として測定した。その結果生後約23週で最も活性が高くなっていた。Cdk5,p35の含量変動では,Cdk5は週令を通じてほとんど変化せず、p35が活性と同期して増減を示した。各発達段階におけるCdk5/p35の分布を光顕ならびに電顕による免疫組織解析では、両者の分布は胎生12日目より発現し、生後2週目で最も染色性が高くなった。これは活性の変動と同じであった。部位別では海馬に最も多かったが、皮質をはじめほとんどの脳の部位において発現していた。しかしこの発現は神経細胞特異的でありグリア細胞には存在しなかった。脳以外の組織においては網膜において同様の解析をした。その結果脳で認められたのとほとんど同様の発達に伴う変化が認められた。他のシステムとして、キンドリングてんかんラットを作成し、Western blotとNorthern blotによりCdk5/p35の発現の変化を検索した。またヒト・アルツハイマー病の脳組織から上清を調整し,Cdk5/p35活性を測定して,非アルツハイマー病脳ならびに正常ラット脳との比較を行った。これらはまだ定性的な結果を得ていない。1.ヒトのアルツハイマー(AD)脳とそれと同年齢の対象脳をそれぞれ12検体をカナダ・カルガリ大学医学部のDr.Clarkより入手した。部位的には前頭葉が主で10例あり、海馬も4例あった。2.これらの脳切片を用い抗Cdk5抗体を用いた免疫染色法でCdk5が脳のどの部位に存在するかを解析した結果、AD脳で見られる老人斑部によく一致して認められた。また全体的にもAD脳で対象脳より高い染色性が認められた。3.Cdk5のアクティベータ-であるp35の発現についてもこれら脳切片を用いて調べているがCdk5に比べて明らかな差を見いだせず、比較的均等に染色性が認められた。一部抗体にも原因があると考えられたので、in situ hybridization法にてmRNAの分布を調べたが、これにも明らかな差が認められなかった。4.Cdk5活性を凍結脳標品について測定したところ、前頭葉でも海馬でも1020%高い活性を認めた。老人斑の部位においてはさらに高い活性を持つことが予測された。5.Cdk5及びp35のPC12細胞に対するトランスフェクション実験は、アデノウィルスを用いる系において遂行した。両者の発現はPC12細胞において確認したが、明らかな表現型の変化を来さなかった。今後は細胞表面のレセプターにおける変化がないかなどを解析していく。6.トランスジェニックマウスの作成はまだ完成していない。1.ラットならびにマウス脳の発達と神経回路網形成過程でのCdk5の蛋白質、mRNAレベルでの発現、その活性及びリン酸化状態の変動を解析した。
運動軌道上で生成される情報次元数の少ない中間的物体表現に関する視覚・脳科学的検討

空間的に離れた物体が適切な時間間隔で交互に提示されると運動が知覚され(仮現運動),物理的入力が何ら存在しない運動軌道上に内的な物体表象が形成される。本研究では,まず仮現運動軌道上に提示されたターゲット刺激に対する感度の低下を指標に,輝度極性や方位,形といった低次の物体特徴に関して,運動物体表象は誘導刺激と同じ物体特徴を保持して内的に表現されることを明らかにした。一方,運動物体表象が保持する奥行き情報について,物体の定位位置ずれ量を指標とした検討を行ったところ,運動物体表象は,特に凸に関して2次元と3次元との間の中間的な奥行き情報を持つ情報圧縮された物体として表現され,低空間周波数成分の濾過というアルゴリズムによって内的に実現されることが明らかとなった。また,仮現運動軌道上で生じる運動方向反転に対する気づきの度合いを指標とし,運動物体表象形成過程には,局所的には一貫性のない物理入力を一貫性のある滑らかな運動知覚へと内的に変換する機能があることを示した。以上の知見から,運動物体表象の形成は脳内で機能局在的に実現されるよりむしろ,初期視覚処理,運動処理,物体認知を司る部位の間のネットワークとして実現されていると考えられた。事実,NIRS(近赤外光スペクトロスコピー)を用いた脳機能測定の予備実験では,運動処理と物体処理を司る高次の領域以外にも多くの脳活動が見られ,ネットワークの特定には,空間的側面だけではなく,時間的側面の詳細な検討が必要であると考えられた。さらに,実際には静止している映像が,動きの情報を持つ音によっていて動いて見えることも明らかとなり,運動物体表象が異なる感覚処理経路において共有されることが示唆された。以上,人が脳内で行う情報処理方略に関する知見は,情報工学あるいは臨床的に応用可能であり,現実場面への貢献も期待されると考えられる。空間的に離れた物体が適切な時間間隔で交互に提示されると運動が知覚される.仮現運動と呼ばれるこの現象では,物理的入力の存在しない運動軌道上に内的な物体表象が形成される.本研究では,運動軌道上の物体表象がどのような奥行き情報を保持するのか調べた.陰影および両眼視差によって定義された3次元的な仮現運動物体の運動軌道上に,凸,凹,平らのいずれかの奥行き情報を持つ物体(プローブ物体)を瞬間提示し,プローブ物体の奥行き情報が知覚された運動の滑らかさに及ぼす影響を検討した.仮現運動する物体が凸図形の時,平らなプローブ物体が提示された条件で,凹の物体が提示された条件よりも滑らかな動きが知覚された.運動する物体と同じ奥行きを持つ凸ではなく平らな図形が提示された時に最も滑らかな動きが知覚され,運動する物体と逆の奥行きを持つ凹物体で動きの滑らかさが阻害されたこと,さらに仮現運動物体が凹図形の時にはプローブの効果は見られなかったことなどから,仮現運動物体表象は特に凸に関して,2次元と3次元との間の中間的な奥行き情報を持つことが明らかとなった.また,運動物体の消失位置に関する運動方向側への定位位置ずれ量(representational momentum; RM)に関して,物体同一性が維持されている時にはRM量が多くなるという特性を利用した検討からも,同様の知見を見出した.さらに,凸の仮現運動物体が提示される事態において,その運動軌道上に低空間周波数成分優位のぼけた凸図形を提示した条件では,凹図形を提示した条件よりもRM量が多くなった.この結果は,2次元と3次元との間の中間的な奥行き情報を持つ物体表象は,低空間周波数成分優位の処理によって実現されることが分かった.空間的に離れた物体が適切な時間間隔で交互に提示されると運動が知覚される.仮現運動と呼ばれるこの現象では,物理的入力の存在しない運動軌道上に内的な物体表象が形成される.本研究では,運動軌道上の物体表象がどのような奥行き情報を保持するのか調べた.運動物体の消失位置に関する運動方向側への定位位置ずれ量(representational momentum;RM)に関して,物体同一性が維持されている時にはRM量が多くなるという特性を利用した.仮現運動する物体が凸図形の時,平らなプローブ物体が提示された条件で,凹の物体が提示された条件よりも位置ずれ量が多くなった.さらに,低空間周波数成分優位のぼけた凸図形を提示した条件では,凹図形を提示した条件よりもRM量が多くなった.このことから,仮現運動物体表象は,2次元と3次元との間の2.5次元の奥行き情報を持ち,低空間周波数成分優位の処理によって2.5次元の奥行き情報が実現されることが分かった.また,仮現運動表象がどのようにして時空間一貫性のある運動知覚を形成するのかを調べた.5点間の仮現運動系列のうち,第4,第5刺激の時空間的な順序が先行系列と逆行する事態では,逆行していない場面と同様,両刺激間で先行系列と一致した運動方向知覚が生じた.この現象は,第4刺激の色が他の刺激と必ず異なる事態や第4刺激の垂直位置がランダムに変化する事態,2刺激に先行する系列が1刺激(3点間運動)の事態で生じた.以上のことから,運動処理の比較的初期の段階で,可塑性のある運動表象生成過程が,遡及的に時空間一貫性のある運動方向知覚を生み出すことが分かった.空間的に離れた物体が適切な時間間隔で交互に提示されると運動が知覚され(仮現運動),物理的入力が何ら存在しない運動軌道上に内的な物体表象が形成される。

本研究では,まず仮現運動軌道上に提示されたターゲット刺激に対する感度の低下を指標に,輝度極性や方位,形といった低次の物体特徴に関して,運動物体表象は誘導刺激と同じ物体特徴を保持して内的に表現されることを明らかにした。一方,運動物体表象が保持する奥行き情報について,物体の定位位置ずれ量を指標とした検討を行ったところ,運動物体表象は,特に凸に関して2次元と3次元との間の中間的な奥行き情報を持つ情報圧縮された物体として表現され,低空間周波数成分の濾過というアルゴリズムによって内的に実現されることが明らかとなった。また,仮現運動軌道上で生じる運動方向反転に対する気づきの度合いを指標とし,運動物体表象形成過程には,局所的には一貫性のない物理入力を一貫性のある滑らかな運動知覚へと内的に変換する機能があることを示した。以上の知見から,運動物体表象の形成は脳内で機能局在的に実現されるよりむしろ,初期視覚処理,運動処理,物体認知を司る部位の間のネットワークとして実現されていると考えられた。事実,NIRS(近赤外光スペクトロスコピー)を用いた脳機能測定の予備実験では,運動処理と物体処理を司る高次の領域以外にも多くの脳活動が見られ,ネットワークの特定には,空間的側面だけではなく,時間的側面の詳細な検討が必要であると考えられた。さらに,実際には静止している映像が,動きの情報を持つ音によっていて動いて見えることも明らかとなり,運動物体表象が異なる感覚処理経路において共有されることが示唆された。以上,人が脳内で行う情報処理方略に関する知見は,情報工学あるいは臨床的に応用可能であり,現実場面への貢献も期待されると考えられる。
見た目の良い野菜は栄養性・機能性も優れているのか?

野菜には生活習慣病や老化を予防する機能性成分が多く含まれることが明らかになっている。近年、市場では色の異なる野菜や小型のものなど、見た目に珍しい野菜が出回わり、野菜を購入する際の選択肢が多様化している。そこで本研究では、野菜に含まれる機能性成分のうちラジカル捕捉活性とそれに寄与する成分について着目し、本年度は、野菜の品種、栽培条件、大きさ等に焦点をあて研究を行った。大きさの異なる野菜として、大ショウガと小ショウガの成分を比較したところ、アスコルビン酸量は相違ないものの、総ポリフェノール量やラジカル捕捉活性は大ショウガの方がやや高いという結果が得られた。次に、形状の異なる7品種のナスを用いて、塩もみ・浅漬け・揚げる・煮る・蒸す・焼くの各調理を行い、調理適性を明らかにするとともに、各調理法における美味しさに影響を与える食感について検討したところ、調理後のおいしさと食感、調理適性に品種間差があること、同品種内でもそのおいしさは調理法により差があることが示された。ラジカル捕捉活性は米ナスが最も高く、庄屋大長が最も低かった。栽培条件として、生育日数と機能性成分との関連性を調べたところ、ヤマトマナのラジカル捕捉活性は播種後11日目が最も高く、生育日数の増加に伴い低下し、26日目では11日目の約60%であった。総ポリフェノール量はラジカル捕捉活性と同様、生育日数の増加に伴い減少した。コマツナのラジカル捕捉活性と総ポリフェノール量もヤマトマナと同様の変動傾向を示した。さらに、LED照射によるカイワレダイコンの栽培を行い、LED照射の機能性成分への影響を検討したところ、LED照射試料では、太陽光に類似した波長を持つメタルハライドランプ照射に比べて各機能性成分は低値を示した。また、生物リズムが異なる変動を示すことが明らかとなった。そこで本研究では、野菜に含まれる機能性成分のうちラジカル捕捉活性とそれに寄与する成分について着目し、色と大きさの異なる野菜の調理特性を評価した。緑(大・小)、赤(大・小)、オレンジ、黄色の6種類のピーマンまたはパプリカを電子レンジ加熱(5分間)、炒め加熱(5分間)、ゆで加熱(5分および30分間)し、調理後のラジカル捕捉活性と総ポリフェノール量、アスコルビン酸含量、トコフェロール含量、フラボノイド含量、β-カロテン含量および総カロテノイド量を測定した。ラジカル捕捉活性とアスコルビン酸含量は、オレンジパプリカと赤パプリカで高く、ポリフエノール量は緑ピーマンで高かった。フラボノイドとして検出されたルテオリンおよびケルセチン量は緑ピーマンに最も多く、オレンジパプリカにはわずかに含まれる程度であった。次に、加熱調理の影響を調べたところ、調理後のすべてのピーマンにおいてアスコルビン酸含量、ラジカル捕捉活性、総ポリフェノール量、トコフェロール含量、総カロテノイド量の減少がみられたが、生のピーマンと比べて電子レンジ加熱および炒め加熱では有意な差ではなかった。一方、5分および30分ゆで加熱後のすべてのピーマンのアスコルビン酸含量、ラジカル捕捉活性、総ポリフェノール量は著しく減少した。ゆで加熱後の抗酸化性の減少は、成分のゆで汁への流出のためであった。加熱の際に水を使用しない電子レンジ加熱と炒め加熱は、抗酸化成分をより保持する加熱法であることが明らかになった。赤パプリカ、オレンジパプリカ、黄パプリカでは、小型の緑ピーマンおよび赤ピーマンに比べて調理中に抗酸化成分が残存する傾向にあった。そこで本研究では、野菜に含まれる機能性成分のうちラジカル捕捉活性とそれに寄与する成分について着目し、色および品種の異なる野菜の加工・調理特性を評価した。まず、緑キャベツおよび赤キャベツを1mmにスライスしたものに砂糖、塩、酢、もしくは砂糖・塩・酢の混合調味液を加えて、10°Cで35日間浸漬した漬物についてラジカル捕捉活性の変化を調べたところ、緑キャベツの砂糖漬けおよび塩漬けでは3日目から、酢漬けおよび混合調味液漬けでは1日目から著しく低下した。特に、酢漬けにおいてはその傾向が顕著にみられ、ラジカル捕捉活性に大きく寄与するアスコルビン酸が酢の浸透圧によって急激に引き出されたためであると考えられた。赤キャベツにおいても同様の傾向がみられた。ポリフェノール量に関しては、酢漬けおよび混合調味液漬けでは減少しなかったが、砂糖漬けおよび塩漬けでは経時的に減少した。次に、品種の異なるサトイモの機能性と調理適性について調べたところ、サトイモ7品種のラジカル捕捉活性は、「唐の芋」で最も高く、「大野芋」「田原本系」「上庄系」では低い値を示した。総ポリフェノール量は、ラジカル捕捉活性とほぼ同じ傾向を示し、品種間差があることが明らかになった。アスコルビン酸量はいずれの品種においても低く、ラジカル捕捉活性への寄与率は311%であった。また、味噌汁、田楽、煮っ転がしなどの調理適性にも品種間差がみられた。

しかし、ラジカル捕捉活性、総ポリフェノール量およびアスコルビン酸量と、調理適性と関係が深いと考えられる粘り、硬さおよびほくほく感に対する食感並びに美味しさとの間には有意な相関は認められなかった。野菜には生活習慣病や老化を予防する機能性成分が多く含まれることが明らかになっている。近年、市場では色の異なる野菜や小型のものなど、見た目に珍しい野菜が出回わり、野菜を購入する際の選択肢が多様化している。そこで本研究では、野菜に含まれる機能性成分のうちラジカル捕捉活性とそれに寄与する成分について着目し、本年度は、野菜の品種、栽培条件、大きさ等に焦点をあて研究を行った。大きさの異なる野菜として、大ショウガと小ショウガの成分を比較したところ、アスコルビン酸量は相違ないものの、総ポリフェノール量やラジカル捕捉活性は大ショウガの方がやや高いという結果が得られた。次に、形状の異なる7品種のナスを用いて、塩もみ・浅漬け・揚げる・煮る・蒸す・焼くの各調理を行い、調理適性を明らかにするとともに、各調理法における美味しさに影響を与える食感について検討したところ、調理後のおいしさと食感、調理適性に品種間差があること、同品種内でもそのおいしさは調理法により差があることが示された。ラジカル捕捉活性は米ナスが最も高く、庄屋大長が最も低かった。栽培条件として、生育日数と機能性成分との関連性を調べたところ、ヤマトマナのラジカル捕捉活性は播種後11日目が最も高く、生育日数の増加に伴い低下し、26日目では11日目の約60%であった。総ポリフェノール量はラジカル捕捉活性と同様、生育日数の増加に伴い減少した。コマツナのラジカル捕捉活性と総ポリフェノール量もヤマトマナと同様の変動傾向を示した。さらに、LED照射によるカイワレダイコンの栽培を行い、LED照射の機能性成分への影響を検討したところ、LED照射試料では、太陽光に類似した波長を持つメタルハライドランプ照射に比べて各機能性成分は低値を示した。また、生物リズムが異なる変動を示すことが明らかとなった。
海苔の有用品種作出に向けた紅藻スサビノリにおける高温応答機構の解明

本研究では当初、エチレン(ACC)と高温耐性の関連に焦点を当てて解析を行ったが、高温耐性以外の効果について以下のことが明らかとなった。スサビノリ由来のACC合成酵素遺伝子PyACSが銅およびH2O2ストレス条件下において発現が誘導されることから、エチレンがこれらのストレスに対して応答するために重要な機能をしている可能性が示唆された。そこで、ACC処理による銅ストレスやH2O2ストレス耐性の効果を調べたところ、未処理の藻体と比較して、ACC処理藻体では大量の果胞子様細胞を形成することにより、これらのストレスに適応することが明らかとなった。また長期間(2週間以上)のACC処理により、光合成色素タンパク質であるフィコエリスリン、フィコシアニンおよびクロロフィルの分解が促進されること、生殖細胞の形成が促進されることが明らかとなった。そのため、エチレンの応答機構を解明することにより、高温耐性等の環境ストレス応答機構に加えて、色落ちや有性成熟の機構の解明につながることが期待される。そしてこれらの知見は海苔の品種改良を進めていく上で重要な知見になることが予想される。またエチレンのスサビノリに対する作用機序に関する知見を得るために、エチレンによって制御されている遺伝子群の網羅的な同定を試みた。次世代シーケンサー(イルミナ社Hiseq2000)を用いてRNA-seq解析を行った結果、ストレス耐性に関与する候補遺伝子として、カタラーゼ、分子シャペロン(DnaJ)およびプロテインキナーゼ遺伝子等の発現が、ACC処理藻体サンプルにおいて上昇することが明らかとなった。またエチレン応答性遺伝子として、RWP-RKドメインを持つ遺伝子を見出した。この遺伝子は他の生物において転写調節因子をコードすることから、スサビノリにおいても重要な機能を持つ可能性が考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。
悪性グリオーマにおけるWT1免疫療法・化学療法併用新規集学的治療法の開発

初期化学療法に同期した集学的治療のひとつとしてWT1免疫療法を行う妥当性、安全性および相乗効果を、詳細な免疫担当細胞の機能解析を行い検討した。(1)悪性神経膠腫患者におけるWT1特異的T細胞の割合と数は、テモゾロミド・放射線(TMZ/RT併用療法)の治療前0.196%からTMZ/RT併用療法6週終了後に0.256%と上昇傾向を示した。Treg細胞の割合はWT1療法前が4.83%からTMZ/RT併用療法6週終了後には7.50%と増加したが、絶対数は有意な変化を示さなかった。(2)「悪性神経膠腫に対するテモゾロミド併用WT1ペプチドワクチン療法の第I相臨床多施設共同研究」を平成22年5月から実施した結果、安全性は確保され、併用による有意なリンパ球総数の減少は見られなかった。(3)WT1ペプチド投与よって反応したWT1特異的CD4陽性ヘルパーT細胞からのIFN-γ、IL-10の発現量をRT-PCRにより評価した結果、WT1ペプチドワクチン療法有効群はワクチン投与4週間後から投与終了後にかけてIL-10typeのヘルパーT細胞の反応からIFN-γtypeのヘルパーT細胞の反応にシフトしていた。(4)総括すると、TMZ維持療法中にWT1免疫療法を行っても効果的に抗腫瘍効果が誘導されると考えられた。集学的治療のひとつとしてWT1免疫療法を行う妥当性、安全性および相乗効果を、治療前後の細胞性免疫反応を中心として以下の機能解析を行った。(1)悪性グリオーマ患者未治療時およびWT1単独免疫療法時のWT1特異的免疫反応をキラーT細胞の誘導をみることで解析した。その結果、悪性グリオーマ患者では未治療時にすでに血中WT1特異的キラーT細胞分画は健常人に比して増加しており、治療前から腫瘍細胞表面抗原であるWT1タンパクが認識され感作されていることが明らかになった。それはWT1発現再発乳癌患者に比べても増加していた。悪性グリオーマでのWT1ワクチン療法中において、時間経過あるいは治療有効群と無効群とでWT1特異的キラーT細胞の分画割合の数的変化はなかった。(2)WT1特異的CTL分画の動態解析を行う目的で細胞をCD27/CD45RAで2重染色し、FACS解析によりナイーブT細胞の表現形であるCD27^+CD45RA^+の比率を求めた。さらに同様の解析によりナイーブ細胞分画、エフェクター細胞分画の比率を求めた。その結果、WT1免疫治療による反応良好群ではWT1特異的T細胞のうち、ナイーブ分画からエフェクター分画へ増加がみられた。(3)悪性グリオーマに特異的な抑制性T細胞(Treg)の免疫療法前後の動態をみる目的でCD4/CD25の2重染色を行い、FACS解析によりCD4^+T細胞に占めるTreg細胞の割合を求めた。その結果、TMZ治療によりTregの数的増加はみられないが、T細胞の中でのTreg分画の増加がみられた。さらにWT1免疫治療中、過去の化学療法治療やステロイド投与によるWT1特異的キラーT細胞分画への影響はみられなかった(第9回日本分子脳神経外科学会発表)悪性神経膠腫患者におけるWT1特異的T細胞の割合と数が、テモゾロミド・放射線治療(TMZ/RT併用療法)によりどのように変化するかを調べた。すなわち、初発悪性神経膠腫患者22名を対象に、TMZ/RT併用療法開始前と6週終了後に末梢血リンパ球中CD8陽性T細胞、制御性T(Treg)細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞の割合と数を測定した。WT1免疫治療患者12名には、WT1特異的T細胞の割合と数、その中の4分画(ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、エフェクター細胞)の割合も測定した。