hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高次元データに対する事後確率分布構造の解析

画像,音声,自然言語,塩基配列などの大規模データに対し,確率モデルを構築し,認識,予測など確率推論を行なうことが,計算機性能の急速な向上に伴い可能になっている.ベイズ推論の本質の一つは,データを観測した後の事後確率分布の利用にあるが,その分布の構造については不明な点が多く,分布が奇妙な構造をもつことは十分考えられる.本研究では,事後確率分布から多数のサンプルを生成することで,事後確率分布の構造を反映した意味のある推定量を求める手法を開発した.単純な隠れマルコフモデル,格子型マルコフ確率場を用いて計算機実験をおこない,本手法の有効性を確認した.画像,音声,自然言語,塩基配列などの大規模データに対し,確率モデルを構築し,認識,予測など確率推論を行なうことが,計算機性能の急速な向上に伴い可能になっている.ベイズ推論の本質の一つは,データを観測した後の事後確率分布の利用にあるが,その分布の構造については不明な点が多く,分布が奇妙な構造をもつことは十分考えられる.本研究では,事後確率分布から多数のサンプルを生成することで,事後確率分布の構造を反映した意味のある推定量を求める手法を開発した.単純な隠れマルコフモデル,格子型マルコフ確率場を用いて計算機実験をおこない,本手法の有効性を確認した.ベイズ推論の本質の一つは,データを観測した後の事後確率分布の利用にあるが,その分布の構造については不明な点が多い.この点を調べることが本研究の目的である.ベイズ推論では,あらかじめ対象の規則性を反映した確率分布を構築しておく必要がある.観測データYに対する解釈用の内部(隠れ)変数をXとすると,これは確率分布P(X)とP(Y|X)の設計にあたる.これらP(X),P(Y|X)の設計が確率モデルの開発においては最も重要である.確率モデルを応用する場面では,データYを観測した後の事後確率分布P(X|Y)を利用し,もっともらしい解釈Xを求めることが求められる.ここで,事後確率分布には奇妙な構造が潜んでいる可能性があり,たとえば事後確率を最大にするような解釈が,自然でない場合がある.初年度である平成22年度においては,単純な隠れマルコフモデルを用い,コンピュータシミュレーションによりこの点を調べた.具体的には,1.事後確率を最大にする解釈Xmapをあらかじめ求め,2.事後確率分布にしたがう多数のサンプルXを正確に生成.3.それぞれのサンプルに近い距離にある近傍状態について,事後確率を積分した値を求め,4.事後確率が最大となる状態Xmapが,事後確率を積分した値が最大になるサンプル点に含まれているかどうかを調べた(一致しなければ事後確率分布に奇妙な構造が存在する).その結果,単純な隠れマルコフモデルの場合でも,事後確率分布に奇妙な構造が存在する場合があることがわかった.本研究は,画像,音声,自然言語,塩基配列などの大規模データに対して用いられている確率的生成モデルの,事後確率分布に潜む奇妙な構造を明らかにすることを目的とする.この目的のために平成23年度は以下の研究を実施した.なお,以下では解釈用のモデル(事前確率分布)をP(x),観測データのモデルをP(y|x)と記述する.隠れマルコフモデルにおける事後確率分布構造の解析:事後確率分布P(x|y)にしたがう,多数(n個,10,000個程度)のサンプルx(200-500次元)を,動的計画法を用いた正確なアルゴリズムにより生成した.それぞれのサンプルに対し,多数(m個)の近傍の状態を生成し,サンプルの事後確率P(x|y)とm個すべての状態の事後確率の和を求めた(この和をBとする).こうして得られたn個のBを大きい順に並べかえたとき,その最大値Bmaxを構成するm個の状態に,事後確率を最大にするx(xmapと書く)が含まれていなければ,事後確率分布に不自然な構造が存在する(状態xmapが不自然)というのが本研究の考え方である,昨年度に引き続き,本年度は,いくつかの異なる近傍状態の生成方法を試して実験をおこなった.その結果,事後確率分布に奇妙な構造をもつ例をいくつか検出することができた.本年度は,格子型2次元マルコフ確率場およびツリー型マルコフ確率場においても,事後確率分布構造の解析を同様におこなった.その結果,格子型2次元マルコフ確率場についても,事後確率分布に奇妙な構造をもつ例を発見することができた.ただし,あらかじめ予想していた範囲を超える例は発見できていない.平成25年度は,引き続き,確率的生成モデルの事後確率分布から多数のサンプルを生成することで,事後確率分布の構造を調べた.対象は,データ変数,潜在変数(隠れ変数)が高次元の場合で,1)事後確率を最大にする状態を正確に計算でき,2)事後確率分布から(近似ではなく)正確なサンプリングができ,3)事後確率の値そのものが,正確に計算できるモデルである.具体的には,隠れマルコフモデル,ツリー型構造をもつモデル,格子型構造をもつ2次元マルコフ確率場について解析をおこなった.我々は,事後確率を最大にする状態(および2番目に大きい状態),事後確率の正確な値,事後確率分布からの正確なサンプリングを動的計画法を用い計算する方法を開発し,コンピュータプログラムを作成した.観測データが与えられた後,事後確率分布にしたがうn個の高次元サンプルを生成し,それぞれのサンプルに対し,m個の近傍の状態を生成し,サンプル自身の事後確率と近傍の状態の事後確率の和を求めた.

その和(n例ある)を大きい順に並べかえたとき,和が最大となるものを構成するm+1個の状態に,事後確率を最大にする状態が含まれていなければ,事後確率分布に奇妙な構造が存在することがわかる.自然な近傍状態を生成する必要があるが,高次元であるため,ヒューリスティックな手法で近傍を生成した.その結果,隠れマルコフモデル,および2次元格子状のマルコフ確率場において,奇妙な構造をもつ場合を特定できた.一般に,パターン認識に使用されているそれぞれの確率モデルが,奇妙な構造をもつかどうか,本研究の手法で特定できるが,近傍状態を生成する一般的な手法というのは存在しないように思う.それぞれの応用問題に対して,どのような推定量が,事後確率分布の構造を反映した意味ある推定量なのか,という問には答えられていない.これは今後の研究課題としたい.本研究は,確率的生成モデルの事後確率分布に潜む奇妙な構造を明らかにすることを目的としている.平成24年度は以下の研究を実施した.隠れマルコフモデル,ツリー型構造をもつモデル,格子型構造をもつ2次元マルコフ確率場について,事後確率分布構造の解析をおこなった.解釈用のモデル(事前確率分布) P(x)と観測データのモデルP(y|x)はあらかじめ与えられているとし,それぞれ観測データが与えられた後,事後確率分布P(x|y)にしたがう多数(n個,10,000個程度)のサンプルx(200-500次元)を,動的計画法を用いた正確なアルゴリズムにより生成した.それぞれのサンプルに対し,多数(m個)の近傍の状態を生成し,サンプルの事後確率P(x|y)とm個すべての状態の事後確率の和を求めた(この和をBとする).n個のBを大きい順に並べかえたとき,その最大値Bmaxを構成するm個の状態に,事後確率を最大にするx(xmapと書く)が含まれていなければ,事後確率分布に奇妙な構造が存在する,というのが本研究の考え方である.昨年度に引き続き,本年度は,いくつかの異なる近傍状態の生成方法を試して実験をおこなった.その結果,あらかじめ予想していた範囲を超える例は発見できていないが,事後分布が奇妙な構造をもつ例についていくつか検出することができた.また,本年度は,ボルツマンマシンよばれる,個々の素子が確率的に動作する神経回路モデルについて実験をおこなった.このモデルは,外から与えられた確率分布を学習・自己組織化により近似的に実現できる.これまで自己組織化過程を追えなかった実験が,コンピュータシミュレーションできるようになった.この結果については電子情報通信学会ニューロコンピューティング研究会において発表した.あらかじめ予想していた範囲を超える例は発見できていないものの,隠れマルコフモデルにおける事後確率分布構造の解析に引き続き,格子型2次元マルコフ確率場およびツリー型マルコフ確率場における事後確率分布構造の解析をおこなった.25年度が最終年度であるため、記入しない。やや遅れている部分と進んでいる部分が混在しているため「おおむね順調に進展している」とした.遅れている部分は,高次元データに対する事後確率分布において,結果の解釈が明瞭に可能なモデルと例題を発見することである.闇雲に試すだけではダメであることはわかっているが,実験してみないとどのような結果になるかは分からない.
心筋梗塞における心筋細胞保護の分子機構解析と治療

ERK1/2の抑制因子であるSprouty4が急性心筋梗塞の病態においてどのような役割を果たすのか検討を行った。結果Sprouty4は心筋梗塞後の病態において発現が上昇するものの、ERK1/2の活性に影響は与えていなかった。また野生型とSprouty4遺伝子欠損マウスでは、急性心筋梗塞後のリモデリングや梗塞範囲、血管新生の評価において有意差は認めなかった。以上のことからSprouty4は急性心筋梗塞の病態において重要な役割を担っていないと考えられた。Ras-Raf-ERKキナーゼ経路の負の制御因子であるSprouty4のマウス心筋梗塞組織における発現の時間経過をreal-time PCRで調べた。梗塞3時間後に梗塞前に比べSprouty4は約5倍に発現が上昇し、梗塞24時間後まで発現増加は持続していた。ERK1/2のリン酸化をwestern blotで調べたところ、ERK1/2のリン酸化はSprouty4の発現と逆相関を示した。これらの結果は、心筋梗塞の急性期の病態におけるRas-Raf-ERKキナーゼ経路の活性化がSprouty4によって制御されることを示しているのかもしれない。Sprouty4の発現が亢進する時期は、炎症反応や酸化ストレスの増強と共に心筋細胞がアポトーシスを起こす。そこで、心筋梗塞組織における炎症関連遺伝子、酸化ストレス関連遺伝子のreal-time PCRアレイおよびTUNEL染色を行った。その結果、心筋梗塞急性期に、多くの炎症性サイトカインやケモカイン、酸化ストレス関連遺伝子の発現上昇を認めた。また。梗塞6時間後にTUNEL陽性細胞が観察された。これらの結果より、Sprouty4は、心筋梗塞の病態における炎症機転、酸化ストレス障害やアポトーシスによる心筋細胞死に関わる可能性があると推測された。今年度は、Sprouty4遺伝子欠損マウス(Sprouty4-KO)を繁殖させ準備を進めた。心エコー検査を無処置のSprouty4-KOマウスに行ったところ、左心室壁の厚さは正常範囲で左心収縮のうも正常に保たれ、奇形も観察されなかった。また、Sprouty4-KOマウスの心臓組織のHE染色、AZAN染色、EVG染色などを行ったが、心筋組織や血管など特に異常は認めなかった。これらの結果より、Sprouty4遺伝子は心臓の発達や機能には特に影響しないものと考えられた。急性心筋梗塞急性期の病態ではSprouty4遺伝子は心筋細胞や血管内皮細胞に発現することをIn situ hybridizationにて確認した。急性心筋梗塞後7日目の病態では、心エコー上の心収縮力や心臓サイズは、野生型マウスとSprouty4-KOマウスにおいて有意差は認めなかった。また急性心筋梗塞後7日目に組織染色によって梗塞範囲を定量化したが、野生型マウスとSprouty4-KOマウスにおいて有意差は認めなかった。急性心筋梗塞後7日目にCD31を用いて血管新生の評価をおこなったが、野生型マウスとSprouty4-KOマウスにおいて有意差は認めなかった。同様に急性心筋梗塞後6時間後、2日目、7日目のERKのリン酸化をWestern blotで評価したが、有意差は認めなかった。以上のことからERK1/2の抑制因子であるSprouty4は心筋梗塞後の病態において発現が上昇するものの、ERK1/2の活性には影響は与えず、急性心筋梗塞後のリモデリングにおいて重要な役割を担っていないと考えられた。心不全本研究の目的は、Ras-Raf-ERKキナーゼ経路の負の制御因子であるSprouty4の虚血心筋障害・心筋保護機構における役割を明らかにし、Sprouty4が虚血心筋障害の治療標的でることを検証することである。Sprouty4遺伝子のreal-time PCRとwestern blotによるERK1/2のリン酸化の実験より、Sprouty4は心筋梗塞急性期に発現が上昇し、Sprouty4の発現とERK1/2の活性化が逆相関することから、Sprouty4が、確かに、急性心筋梗塞の病態におけるRas-Raf-ERKキナーゼ経路の活性制御に関与していることが示唆され、Sprouty4-KOマウスを用いた実験を行う意義があると考えられた。定常状態において、Sprouty4-KOマウスの心臓は組織学的にも生理学的にも異常を認めなかった。しかし、急性心筋梗塞の病態のようなRas-Raf-ERKキナーゼ経路活性化されるときに、Sprouty4-KOマウスにおいて炎症反応や、酸化ストレス障害や心筋リモデリングがどのように影響されるか非常に興味深いと考えられる。遺伝子改変マウスの飼育管理費用、生化学もしくは分子生物学的な消耗品、学会の交通費と宿泊費、論文校正費用などに使用する予定である。試薬、実験動物等の物品費が想定より安価であったため。今後試薬、実験動物等の物品費の増加が見込まれる
口腔内循環−活性酸素ラジカル連関からみた歯周組織循環不全メカニズムの解明

本研究の目的を「lipopolysaccharide(LPS)の血管運動神経調節障害機構の薬理学的解明と活性酸素ラジカル関与の直接的な証明」に集約した。得られた結果を以下に示す。ESR法によりDMPOをスピントラップ剤としてラジカル種を検出した。この結果,口腔内細菌由来LPSからhydroxyl radical(HO)が産生されることを確認した。II.表面灌流法による血管運動神経調節機構に対する活性酸素ラジカルの作用の検討I.における結果を基に,電気刺激により放出される内因性norepinephrine(NE)による血管標本の等尺性張力変化と高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定された放出NE量に対するHOの効果を検討した(表面灌流法)。摘出イヌ腸間膜静脈のラセン条標本にFenton反応由来のHOを暴露すると,神経末端から放出されるNEに応答した血管収縮反応は顕著に抑制された。一方,NEの放出量に変化は認められなかった。また,Ca^<2+>-free Krebs-Ringer溶液で表面灌流した場合,ESに応答した収縮反応はHOに影響されなかった。しかし,HO暴露間のNE放出量は増大した。その増加はESとは無関係のものであった。この結果は,Ca^<2+>非依存性のシナプス前膜NE放出機構が存在しており,この機構がHO感受性である可能性を示唆する。[結論]LPSの血管運動性神経調節障害にLPS自身から産生されるHOが関与していることが確認された。また,HOはシナプス後作用として血管平滑筋α-受容体との相互作用によるNE感受性の低下を引き起こす可能性が示唆された。
ショウジョウバエ気管系をモデルとしたパターン形成の研究

昆虫の呼吸器である気管系は体内に広く分布した管状の上皮細胞のネットワークで,受動的な空気の拡散によりガス交換を可能にしている.気管の形成は外胚葉が陥入した袋状の前駆体が分枝し,となり同士の枝と融合してネットワークを形成する.融合する技の先端にはtip cellと呼ばれる細胞が同定されており,枝の伸展と融合に重要な役割を果たしていると考えられている.融合におけるtip cellの役割を調べるため,融合の様子をtip cellに発現するEsgと細胞接着因子DE-カドヘリンをマーカーとして調べた.tip cellは融合に先立って擬足を相手方に向かって伸ばした.擬足同士が接触するとその界面にDE-カドヘリンが蓄積し,その後擬足が短縮すると共にtip cellの中を気管の内腔(lumen)が貫通して融合が完成した.上村らはDE-カドヘリンが気管の融合に必須である事を示している.従って融合に先立つDE-カドヘリンの蓄積が,気管ネットワークの形成という組織の構築に積極的に関与している事が明らかとなった.次にtip cellの機能に対するEsgの役割を調べるためesgの変異体の表現型を調べた.esgのnull変異体では擬足の伸展と接触までは正常に進行するがDE-カドヘリンの蓄積は起こらず擬足は他の方向を目指して長く伸展して行った.Esgを熱ショックプロモーターを用いて強制的に発現させるとDE-カドヘリンはtip cellの接触面に蓄積し,気管の融合は完全に回復した.これらの結果はEsgがtip cellの接触の際の運動低下とDE-カドヘリンの蓄積に必須である事を示している.昆虫の呼吸器である気管系は体内に広く分布した管状の上皮細胞のネットワークで,受動的な空気の拡散によりガス交換を可能にしている.気管の形成は外胚葉が陥入した袋状の前駆体が分枝し,となり同士の枝と融合してネットワークを形成する.融合する技の先端にはtip cellと呼ばれる細胞が同定されており,枝の伸展と融合に重要な役割を果たしていると考えられている.融合におけるtip cellの役割を調べるため,融合の様子をtip cellに発現するEsgと細胞接着因子DE-カドヘリンをマーカーとして調べた.tip cellは融合に先立って擬足を相手方に向かって伸ばした.擬足同士が接触するとその界面にDE-カドヘリンが蓄積し,その後擬足が短縮すると共にtip cellの中を気管の内腔(lumen)が貫通して融合が完成した.上村らはDE-カドヘリンが気管の融合に必須である事を示している.従って融合に先立つDE-カドヘリンの蓄積が,気管ネットワークの形成という組織の構築に積極的に関与している事が明らかとなった.次にtip cellの機能に対するEsgの役割を調べるためesgの変異体の表現型を調べた.esgのnull変異体では擬足の伸展と接触までは正常に進行するがDE-カドヘリンの蓄積は起こらず擬足は他の方向を目指して長く伸展して行った.Esgを熱ショックプロモーターを用いて強制的に発現させるとDE-カドヘリンはtip cellの接触面に蓄積し,気管の融合は完全に回復した.これらの結果はEsgがtip cellの接触の際の運動低下とDE-カドヘリンの蓄積に必須である事を示している.
新規のヒトTh1型サイトカイン特異的転写因子、Txkの機能解析

Th1細胞分化とTxk発現の関連を知る目的で各種サイトカインがTxk発現に与える影響を調べた。CD4+T細胞にIL-12,IFN-γ,IL-18を加わえるとTxkの発現は増加した。IL-4,IL-13を添加するとTxk発現は減少した。Txkプロモータールシフェラーゼプラスミドを作成し、その発現調節機構を解析した。Txkプロモーター領域にはSTAT-4やSTAT-6の結合領域が複数存在しそれらが上記のサイトカイン刺激に反応して、Txk遺伝子転写の調節に働くことが示された。即ちTxkはヘルパーT前駆細胞がTh1細胞に分化するのに伴い発現され、Th1/Th2型細胞の分化誘導はTxk遺伝子転写、蛋白発現と並行した。IFN-γプロモーターの欠失変異体を用いて、Txkの作用部位を決定しゲルシフト法を用いてTxkが転写因子として作用するIFN-γ遺伝子プロモーターの結合モチーフを同定した。TxkはIFN-γプロモーター-40付近を認識し結合した。Txkの結合モチーフはサル、ウシ、ヒツジ、ラットなどのIFN-γプロモーター領域にも認められた。Th2疾患ではTxk発現が低下していた。Th1疾患においてTxkは発現しておりIFN-γの発現と並行していた。即ちTxk発現と各種病態との関連が示唆された。Txk発現を調節することで多くの疾患の免疫異常と症状を改善できる可能性がある。txk発現ベクターを投与したマウスではコントロールベクター投与マウスに比べて脾細胞によるIFN-γ産生は明らかに亢進した。この成績はtxk遺伝子投与が、in vivoにおいてもTh1細胞を誘導できることを示し、txk遺伝子治療の可能性を示している。本年度はTxkのIFN-γ遺伝子プロモーター領域における結合モチーフの解析を主体に行った。これまでに研究代表者らはTxkの機能発現には核内移行が必須であることを示した。そこでTxkはIFN-γ遺伝子プロモーター領域にTxkの結合領域(結合モチーフ)を詳細に解析した。IFN-γ遺伝子プロモーター領域の様々なdeletin mutantを組み込んだルシフェラーゼベクターを用いて、Txkをトランスフェクトした。IFN-γ遺伝子プロモーター(-39)はTxkに反応しないが、IFN-γ遺伝子プロモーター(-53)はTxkに反応して、その遺伝子転写が亢進することが明らかになった。この領域の二本鎖DNAを合成し、ゲルシフト法を行った。その結果、Txk蛋白はIFN-γプロモーター-39から-53の領域に結合することが示された。しかし、この領域は15塩基対あることから、Txkの結合に必須な部分はより短い可能性がある。そこでこの15塩基対に突然変異を導入した合計8種類の突然変異体を用いてゲルシフト法を行った。その結果、IFN-γプロモーター-39から-53の領域の全体がTxkとの結合に必須であることが示された。結果を確認する目的で、IFN-γプロモーター-39から-53の領域の突然変異体をルシフェラーゼベクターに組み込んだ。Txkが作用するためにはIFN-γプロモーター-39から-53の領域全体が必要であることが確認された。DANデータベースの検索からこの遺伝子配列と高い相同性を持つ遺伝子として、サル、ウシ、ヒツジ、ラットのIFN-γプロモーター領域が見つかり、Txkは動物種を越えてIFN-γの遺伝子転写に関わる転写因子であることが示唆された。さらに、Th1型細胞に特異的に発現されるケモカイン受容体であるCCR5やTNFのプロモーターにも同様の配列が認められた。そこでCCR5やTNFのプロモーター由来の遺伝子配列を用いてゲルシフト法を行った。実際、Txkはこれらの遺伝子プロモーターとも結合し、TXkはTh1細胞特異的な転写因子であることが示された。
臍帯血CD34陽性細胞からの人工血小板輸血製剤の開発

(1)昨年度の本研究で我々は臍帯血CD34陽性細胞から効率的に血小板を作製する事に成功した(Matsunaga T, et. al.Stem Cells 24,2006)。具体的には、75-cm^2 flaskを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞と共にstem cell factor,thrombopoietin,Flt3-ligandを添加した培養液に500CD34陽性細胞/10mlの度で細胞を浮遊させ、14日間共培養した(第1相培養)。第1相培養で得られだ細胞を新しい75-cm^2 flaskを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞と共に、上記のサイトカインの組み合わせに更にIL-11を添加して14日間共培養した(第2相培養)。更に、第2相培養で得られた細胞を、第2相培養と同一のサイトカインの組み合わぜで5日間液体培養して血小板の産生を試みた。その結果、妊婦1人分の臍帯血から10.5単位の血小板輸血製剤に相当する2.1×10^<11>個の血小板を産生可能な事を明らかにした。更に、我々は作製した血小板の凝集能およびHLA-class Iの発現が健常成人のそれと同等である事を確認した。(2)今年度は、上記の第3相培養における血小板産生の増強を試みた。即ち、Hamada T, et. al.(J Exp Med 188,1998)の報告を参考にして、第2相培養で得られた巨核球を血管内皮細胞と共培養することにより血小板の産生が亢進するか否かを検討した。具体的には、ヒト血管内皮細胞株であるHUVECおよび初代培養ヒト血管内皮細胞と第2相培養で得られた細胞とをstem cell fator,thrombopoietin,Flt3-ligand,IL-11の存在下で5-14日間共培養して血小板の産生量を測定血小板の産生量を測定で血小板の産生増強は認められなかった。(1)臍帯血CD34陽性細胞から効率的に血小板を作製することに成功した。具体的には、75-cm^2フラスコを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞と共に、stem cell factor, thrombopoietin, Flt3-ligandを添加した培養液に500 CD34陽性細胞/10mlの濃度で細胞を浮遊させ、14日間共培養した。この培養細胞を新しい75-cm^2フラスコを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞とともに、14日間培養して血小板の産生を試みた。産生された血小板浮遊液を遠心分離法で回収して、"血小板ゲート"を用いたFACS解析で算定した。その結果、妊婦1人分の臍帯血から10.5単位の血小板輸血製剤に相当する2.1x10^<11>個の血小板を産生可能なことを明らかにした。(2)Sepharose 2Bカラムを用いたgel filtration法を用いて分離した血小板浮遊液を用いて血小板機能を解析し、健常成人の血小板と機能が同等であることを確認した。

具体的には、ADP(40mmol/l)を添加した際に、P-selectinと活性化GPIIb-IIIa抗原の発現が増強することをFACS解析で確認した。更にADP(2mmol/l)とフィブリノーゲン(600μg/ml)を添加した際の血小板凝集反応および、この凝集反応が抗GPIIb-IIIa抗体で阻害されることを確認した。(4)初代培養骨髄血管内皮細胞の培養を開始した。1.昨年度の本研究で、我々は臍帯血CD34陽性細胞から効率的に血小板を作製する事に成功した(Matsunaga T, et. al. Stem Cells 24,2006)。具体的には、75-cm^2flaskを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞と共に、stem cell factor, thrombopoietin, Flt3-ligandを添加した培養液に500CD34陽性細胞/10mlの濃度で細胞を浮遊させ、14日間共培養した(第1相培養)。第1相培養で得られた細胞を新しい75-cm^2flaskを用いて、confluentになったhTERTストローマ細胞と共に、上記のサイトカインの組み合わせに更にIL-11を添加して14日間共培養した(第2相培養)。更に、第2相培養で得られた細胞を、第2相培養と同一のサイトカインの組み合わせで5日間液体培養して血小板の産生を試みた。その結果、妊婦1人分の臍帯血から10.5単位の血小板輸血製剤に相当する2.1x10^<11>個の血小板を産生可能な事を明らかにした。更に、我々は作製した血小板の凝集能およびHLA-class Iの発現が健常成人のそれと同等である事を確認した。2.今年度は、上記の第3相培養における血小板産生の増強を試みた。即ち、Hamada T,et. al. (JExpMed 188, 1998)の報告を参考にして,第2相培養で得られた巨核球を血管内皮細胞と共培養することにより血小板の産生が亢進するか否かを検討した。具体的には、ヒト血管内皮細胞株であるHUVECおよび初代培養ヒト血管内皮細胞と第2相培養で得られた細胞とをstem cell factor, thrombopoietin, Flt3-ligand, 1.に比べて血小板の産生増強は認められなかった。
キリシタン文献国字本データベースに基づく字体・組版規範の研究

本研究では、16世紀末から17世紀初頭に掛けて日本での布教の為にイエズス会によって生産された、いわゆる「キリシタン文献」のうち、漢字仮名交じりで印刷された「キリシタン版国字本」の後期版全てを対象とした字体総合データベースの構築を完了した。具体的には、「さるばとるむんぢ」「落葉集」「ぎやどぺかどる」「朗詠・雑筆」「太平記」である。このデータベースによって、漢字字書である「落葉集」と、それに基づいて組版された「ぎやどぺかどる」の字体対照・計量的操作が初めて可能になり、ここから、後期キリシタン文献国字本の用字・組版方針が極めて意図的な整理を経ている事を論証する事が出来た。その用字規範は「定訓」に基づいた整理であって、特定の漢字と特定の日本語形態素とが対応した一種の「常用漢字」体系を作り上げ、その中で用字・組版が進められている事、且つ「異体字」と「別字」に一線を画する字体認識が行われた上で金属活字が準備されていたことを明らかにすることができた。但し、この「常用漢字」用字体系は漢字制限ではない事を、固有名詞など稀にしか出現しない漢字であっても、躊躇せずその集合への追加がなされた事によって示した。この概括は既に論文として公刊済であり、詳細は本研究の報告書として公刊した。このデータベースは、最も大部のテキストである「太平記」の異体字・合字までも区別した電子化を含んでいるが、これは、今後、日本側の「古活字本」出版に於ける用字・組版規範との対照研究を進める事を意図したものである。本研究は、16世紀末から17世紀初頭に掛けて、日本での布教の為にイエズス会によって生産された、いわゆる「キリシタン文献」のうち、漢字仮名交じりで印刷された「キリシタン版国字本」の活字印刷字体の総合的な研究の一環であり、この2年間では、特に、漢字・仮名の合字(ligature)のバリエーションの統計的な把握、異体字相互の使い分けの探求、合字の使用と形態素の分節との関連等を調査する事を目的としている。今年度の研究は、年度半ばを過ぎて研究経費の交付を受けたために、盛期キリシタン版の「ぎやどぺかどる」、「落葉集」電子テキスト化に対する、異体字や漢字・仮名の合字までも区別した形での厳密な電子校正を行う事と、同時代の他の字体規範文献の調査を行うにとどまった。1.盛期キリシタン版国字本の校正「ぎやどぺかどる」、「落葉集」について、既入力の電子化テキストに対し、仮名の異体宇・合字までも区別した厳密な校正を進めた。この結果、統一した翻刻規準に基づく、精度の高い再データ化を行う事ができた。2.キリシタン文献データベースの維持上記の校正結果に基づき、過年度からの研究で維持しているキリシタン文献データベースの維持・更新を行った。この成果の一部を、論文として公刊した。3.同時代の他の字体規範文献の撮影と調査古活字版印刷史の参考資料となる「龍龕手鑑」元和版などの調査・写真撮影を行って、キシリタン版印刷活字との対照を開始した。具体的には、「さるばとるむんぢ」「落葉集」「ぎやどぺかどる」「朗詠、雑筆」「太平記」である。

このデータベースによって、漢字字書である「落葉集」と、それに基づいて組版された「ぎやどぺかどる」の字体対照、計量的操作が初めて可能になり、ここから、後期キリシタン文献国字本の用字、組版方針が極めて意図的な整理を経ている事を論証する事が出来た。その用字規範は「定訓」に基づいた整理であって、特定の漢字と特定の日本語形態素とが対応した一種の「常用漢字」体系を作り上げ、その中で用字、組版が進められている事、且つ「異体字」と「別字」に一線を画する字体認識が行われた上で金属活字が準備されていたことを明らかにすることができた。但し、この「常用漢字」用字体系は漢字制限ではない事を、固有名詞など稀にしか出現しない漢字であっても、蹟曙せずその集合への追加がなされた事によって示した。この概括は既に論文として公刊済であり、詳細は本研究の報告書として公刊する。このデータベースは、最も大部のテキストである「太平記」の異体字、合字までも区別した電子化を含んでいるが、これは、今後、日本側の「古活字本」出版に於ける用字、組版規範との対照研究を進める事を意図したものである。
心筋代謝異常が虚血再潅流障害に対する吸入麻酔薬の心筋保護作用に及ぼす影響

マウス心房由来のHL-1細胞の培養、ラット心筋ミトコンドリアの分離を習得し、インタクト細胞、分離ミトコンドリアの酸素消費量を測定してこれらのミトコンドリアバイオエナジェティクスを評価した。糖とパルミトイル酸それぞれをエネルギー源とする環境下での測定を行った。パルミトイル酸添加培地ではHL-1細胞の酸素消費量は用量依存性に増加した。糖添加培地ではこの増加は見られなかった。イソフルラン添加によりパルミトイル酸培地でのHL-1細胞の酸素消費量は糖添加培地と同様に低下した。イソフルランによるHL-1細胞の保護作用モデルは確立する事は出来なかった。平成25年度中の半年間はウィスコンシン医科大学で、心筋細胞培養、ラットのミトコンドリアの分離を習得し、インタクト細胞、分離ミトコンドリアでの心筋酸素消費の測定の研究を行った。本研究の目的の第一段階でもある糖、飽和脂肪酸をエネルギー源としたときの酸素消費をインタクト心筋細胞、分離ミトコンドリアで測定し、ミトコンドリアバイオエナジェティクスについて評価した。帰国後、引き続き心筋細胞培養を行い、当施設既存の設備を使用して細胞の酸素消費量を測定し評価する基盤を整えている。本研究の主目的である糖、飽和脂肪酸を栄養源としたときのイソフルランに対する反応については平成25年中には結論づける事が出来ず、平成26年度にも引き続きさらに研究する予定である。また、基礎研究経験のない大学院生に細胞培養、細胞酸素消費測定、ミトコンドリアバイオエナジェティクスについて指導を行っている。今後、細胞培養、各エネルギー源を使用したときのイソフルランに対する反応の研究を継続し、実験計画にある目的の2番目である活性酸素測定を行うための高感度ルミノメーターを購入予定であり、平成26年度への繰り越しとした。パルミトイル酸培地ではHL1細胞の酸素消費量は用量依存性に増加した。イソフルラン添加によりHL1細胞の酸素消費量は低下したが、コントロール群でも同程度に低下するという本研究の仮説とは異なる結果が得られた。また、HL1細胞のパルミトイル培地下での結果は本研究者が留学中に行った分離ミトコンドリアの結果とはやや異なるものであり、インタクト細胞と分離ミトコンドリアの相違点を考察中である。また、イソフルラン添加による心筋保護作用(プレコンディニング)はパルミトイル培地で認められなかったが、コントロール群でもやはり認められず、これまでに文献的に報告されている結果とも本研究の前提とも異なる結果しか得られていない。実験培地にFetal Bovine Serumを少量添加して細胞の状態を良くする事を試みたり、H2O2による細胞障害の程度を検討したり、イソフルラン濃度、暴露時間を検討しているところである。本研究の仮説にはなかった者であるが、細胞障害の実験ではパルミトイル培地群で常に細胞障害がコントロール群に比べて高く、パルミトイル培地には何らかの細胞障害機構があると考えているところである。本研究で予定したマウス培養心筋細胞(HL-1細胞)の入手が出来なかった為、入手可能であったマウス筋芽細胞を培養し、これを用いてミトコンドリア呼吸を測定した。測定に最適な細胞数、培養液の調整を行った。ミトコンドリア呼吸の評価に必要な試薬のATP阻害薬(オリゴマイシン)、脱共役薬(FCCP)、ミトコンドリア複合体III阻害薬(アンチマイシンA)の調整を行い、糖をエネルギー源としたときの基礎酸素消費量、ATP関連酸素消費量、最大酸素消費量、ミトコンドリア外の酸素消費量を測定した。さらに脂肪酸をエネルギー源としたときにミトコンドリア呼吸の評価を行う為、アルブミンとパルミトイル酸結合液を作成した。仮説とは異なる結果が出たため検討に時間を費やしている。また、本研究者の学位取得のため、本研究とは別の研究に関する論文作成・投稿に多くの時間を費やし、本研究に割く時間が限られた。吸入麻酔薬による心筋保護現在得られている結果の考察を行い、仮説に沿った結果が得られるよう実験環境を整える。それでも仮説に沿った結果が得られない場合は得られた結果の考察を行い、その考察に沿って必要と考えられる実験を行う。半年間ウィスコンシン医科大学で研究していたため本施設での研究基盤を整えることに時間がかかっている。また、基礎研究の経験のない共同研究者と行っているため時間を要している。本研究の進行が遅れているために当初予定していた機器の購入をしなかったため。また、結果が得られなかったため、学会発表などの支出がなかったため。本研究の主目的である糖、飽和脂肪酸を栄養源としたときのイソフルランに対する反応については平成25年中には結論づける事が出来なかったため、平成26年度にも引き続きさらに研究し終了させる。その後、同様の条件で活性酸素産生についても評価する。

細胞培養に必要な培養フラスコ、培地、ピペット、などのディスポーザブル実験器具、試薬に使用予定である。また、学会への参加費用として用いる。平成25年度中の半年間はウィスコンシン医科大学で、心筋細胞培養、ラットのミトコンドリアの分離を習得し、インタクト細胞、分離ミトコンドリアでの心筋酸素消費の測定の研究を行った。帰国後、引き続き心筋細胞培養を行い、当施設既存の設備を使用して細胞の酸素消費量を測定し本研究の目的を遂行する基盤を整えている。本研究の主目的である糖、飽和脂肪酸を栄養源としたときのイソフルランに対する反応については平成25年中には結論づける事が出来ず、平成26年度にも引き続きさらに細胞培養、各エネルギー源を使用したときのイソフルランに対する反応の研究を継続し、実験計画にある目的の2番目である活性酸素測定を行うための高感度ルミノメーターを購入予定であり、平成26年度への繰り越しとした。細胞培養に必要な培養液、培養フラスコ、ピペットなどのディスポーザブルの実験器具、試薬、活性酸素測定のための高感度ルミノメーターを購入予定である。また、実験結果を発表する学会への参加費用として用いる。
質量分析計を用いた皮革製品の簡便な動物種鑑定法の開発

動物革製のかばん・衣料・手袋については、家庭用品品質表示法により雑貨工業品品質表示が定められ、これを一部でも使用したものには、動物種の鑑別が必須となっている。近年カシミヤ製品の不当表示が発覚したことから、消費者保護の観点からこの法律の厳格化が求められている。当初は皮革に含まれるDNAを用いたPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法での鑑定を念頭に置いていたが、革の加工処理の過程でDNAが損傷を受けるため、PCR法での鑑定が不可能であることが判明した。そのため、顕微鏡観察による鑑定が主となっているが、国内で生産される革製品だけでも、年間150万点を超え(平成27年度)、簡便かつ科学的な鑑定手法の確立が急務となっている。そこで、皮革に含まれるタンパク質を抽出し、酵素消化したペプチドを用いて、質量分析計による動物種鑑別法の確立を行うことを目的とする。今年度は、「動物革製品からのタンパク質抽出法・酵素消化処理方の最適化の検討」を実施した。皮革を凍結乾燥後に粉砕したサンプルを用いて、(1)タンパク質抽出の温度・時間、(2)酵素消化処理時間、(3)質量分析に供するサンプル量に関する条件検討を行った。サンプル処理の条件の判断は、質量分析計によって検出されるペプチドの多様性によって検証を行った。その結果、3種類のコラーゲンタンパク質(I型コラーゲンα1鎖(COL1A1)、I型コラーゲンα2鎖(COL1A2)、III型コラーゲンα1鎖(COL3A1))由来のペプチドが、確実に数十種類検出されるようになった。今年度の研究目的であった、「動物革製品に含まれるタンパク質の抽出・酵素消化処理法の最適化の検討」を実施し検討の結果、皮革に含まれるコラーゲンタンパク質由来の多様なペプチドを得ることができた。当初の計画通り、おおむね順調に進展している。今後の研究課題として「動物種に特異的なペプチドの探索」を行う。各動物革由来のペプチドを質量分析で解析し、ペプチドのアミノ酸配列を決定し、各動物種に特異的な配列のペプチドを探索する。これまでの研究結果より、加工された皮革からはコラーゲンタンパク質のみが検出されている。今回の研究対象となる動物の中には、進化学的な見地から非常に近縁な種を含んでいる。また、コラーゲンタンパク質は、生物にとって重要なタンパク質であり、進化的によく保存されている。以上のことから、各動物種に特異的なペプチドを検出することは、困難であることが予想される。各動物種に特異的な配列をもつペプチドが検出できない場合は、動物種間でアミノ酸配列の異なる複数のペプチドをうまく組合わせて鑑別する方法を試行する。
微小電界パターンによる人工材料へのタンパク・血小板吸着の制御

本研究は、マイクロマシン技術で人工材料の表面に作成した電極を用いて変動する電界パターンを発生させることで、タンパク・血小板の吸着を制御する手法を開発することを目的とする。さらに、表面プラズモン顕微鏡を応用して、このような加工を施した人工材料と血液との相互反応を明らかにすることを目的とする。1.血液中のタンパク・血小板と人工材料との反応血液中のタンパク・血小板と人工材料との反応について、より詳細に検討するため、単一のタンパク溶液からタンパク混合溶液、全血に至るまで、人工材料との相互作用を観察した。具体的には、アルブミン-PBS溶液、γグロブリン-PBS溶液、アルブミン-γグロブリン混合溶液、全血におけるポリウレタンへの吸着を表面プラズモン顕微鏡で観察した。この結果、アルブミンはin-situでは多層の吸着を示すが、洗い流しによりかなりの部分が離脱した。γグロブリンは、単層の吸着を示し、洗い流しによる離脱はわずかであった。アルブミン-γグロブリン混合溶液では、多層の吸着を示し、洗い流しによる離脱はわずかであった。全血では、厚い吸着層を形成し、一部は洗い流しにより離脱した。この離脱は血小板であると考えられた。さらに、電界によるこれらの吸着反応の修飾についても現在実験中である。2.電界による吸着反応の修飾本年度は、ガラス基板上に電極をもった試料を作成し、表面プラズモン顕微鏡でこの電極表面へのタンパク吸着が観察可能であることを確認した。作成した試料は、高屈折率ガラス基板の表面を高精度に表面研磨したものの上にクロム及び金を蒸着し、さらにこの上にスパッタにてガラスを積み、再び白金をスパッタしたものである。この電極を表面プラズモン顕微鏡のキュベットに装着し、さらに対向する白金電極をキュベット内に設け、タンパク溶液を潅流して電極表面へのタンパク吸着の時系列変化と、印加電圧との関連について測定を行った。本研究は、マイクロマシン技術で人工材料の表面に作成した微少な電極を用いて変動する電界パターンを発生させることで、タンパク・血小板の吸着を制御する手法を開発することを目的とする。本年度は、ガラス基板上に電極をもった試料を作成した。さらに、表面プラズモン顕微鏡でこの電極表面へのタンパク吸着が観察可能であることを確認した。作成した試料は、高屈折率ガラス基板の表面を高精度に表面研摩したものの上にクロム及び金を蒸着し、さらにこの上にスパッタにてガラスを積み、再び白金をスパッタしたものである。この電極を表面プラズモン顕微鏡のキュベットに装着し、さらに対向する白金電極をキュベット内に設け、タンパク溶液を灌流して電極表面へのタンパク吸着の時系列変化と、印加電圧との関連について測定を行っている。今後、試料表面の材料をポリシリコン、窒化シリコン、酸化シリコンに変えて同様の計測を行うため、これらの薄膜を試料表面上に形成する手法について、検討を行っている。なお、この試料における微小電極の作成については、試料表面の金をウェットエッチング、リアクティブイオンエッチングを用いて微小な電極パターンに加工する手法について検討を行っている。

本年度は、血液中のタンパク・血小板と人工材料との反応について、より詳細に検討するため、単一のタンパク溶液からタンパク混合溶液、全血に至るまで、人工材料との相互作用を観察した。具体的には、アルブミン-PBS溶液、γグロブリン-PBS溶液、アルブミン-γグロブリン混合溶液、全血におけるポリウレタンへの吸着を表面プラズモン顕微鏡で観察した。この結果、アルブミンはin-situでは多層の吸着を示すが、洗い流しによりかなりの部分が離脱した。γグロブリンは、単層の吸着を示し、洗い流しによる離脱はわずかであった。アルブミン-γグロブリン混合溶液では、多層の吸着を示し、洗い流しによる離脱はわずかであった。全血では、厚い吸着層を形成し、一部は洗い流しにより離脱した。この離脱は血小板であると考えられた。この点を明らかにするため、血漿による吸着を比較実験として行っている。さらに、電界によるこれらの吸着反応の修飾についても現在実験中である。
船体まわりの波高の画像計測システムの開発

船舶に関する実験は、曳航水槽で行われることが多いが、船体周りにできる波高分布を計測するためには、波高計をトラーバスしながら行う必要があり、多大な労力を必要とする。本研究では、曳航水槽を一定の速度で航行する特性を利用して、水槽内にレーザシート光面を作り、この面を通過する時に計測される波形形状をコンピュータ上に描くことによって、船体周りの波高分布を求めようとするものである。まず、昨年に引き続き、計測原理を確かめるとともに実験の精度を上げる試みを行った。その結果、画像処理に工夫することで、波面の同定が容易になり精度がよくなることが示された。また、応用的な研究の一つとして波浪中の船体周りに出来る波形を計測した。この結果は、従来の方法では計測出来なかったものであり、本研究の大きな成果の一つと考えられる。また、計測法にモデルベースト法を応用するために、比較的応用の簡単なPIV手法への応用を試みた。その結果、モデルを変更することで船体と波を表すポテンシャル分布なども間接的に実験地から求めることができることが明らかになり、新しい計測方法として展開できる可能性は非常に強いことが判明した。本研究は、1年目の代表であった西尾茂・神戸商船大学商船学部助教授が長期海外出張になったため、2年目になって奥野が代表を交代したもので、新しい画像解析システムを使って、実用化に向けた研究が行われた。自由表面における大気と水の光散乱度の違いを利用して、波高分布計測を行なう画像計測システムの開発を行なった。画像を利用した流場の計測システムは、PIVに代表されるように流れを可視化し、これに含まれる物理量を抽出するといったプロセスを通じて行われる。画像計測の手法を波高分布に応用するには、この可視化をどのように実現するかが重要となる。自由表面は大気と水の境界面であり、物理的には面として存在するが厚さのない量である。このような計測対象の特殊性は、可視化の難しさにも反映しており、これまで自由表面への計測用格子の投影やモアレ縞を利用した可視化が行われてきた。本研究では、レーザーシート光を自由表面下部から照射し、水の光散乱度が大気のそれより格段に大きいことを利用して、画像上で観測される明暗部の境界を自由表面位置として認識させ、その位置の抽出を行なうことにより、安定して自由表面位置の同定を行なうことができた。計測システムは、曳航水槽において計測される画像の輝度、時間ならびに空間の解像度などを勘案し、構築を行なった。具体的には、レーザー出力の調整、シリンドリカルレンズを使った計測精度の向上、計測断面の船体との相対位置の同定などが検討された。本システムでは、シート光を通過する船体が造る波の断面形状を時系列で計測し、それを計算機上で再構成することにより、比較的短い時間で波高分布の計測を行なうことができた。

本研究は、昨年代表であった西尾茂・神戸商船大学商船学部西尾茂助教授が長期海外出張になったため、奥野が代表を交代したもので、新しい画像解析システムを使って、実用化に向けた研究が行われた。
自家骨由来コラーゲングラフトによる組織再建

ラットおよびラビットの長管骨を用いて,一部がコラーゲン線維,残りが石灰化された骨のまま残る骨-靭帯-骨様の構造を有するコラーゲングラフトを作製し,靭帯の再建を行う方法について研究した.まず採取骨を部分的に被覆し,脱灰液に浸漬することにより,骨-靭帯-骨様の構造を有するコラーゲングラフトの作製方法を開発し,コラーゲングラフトが屈曲性と強度を備える靭帯様のグラフトであることが明らかとなった.また生体内での埋植試験により自家組織と同様に組織反応など生じないで吸収されることが明らかとなった.ついで靭帯再建実験を行った.ラットでの膝側副靭帯の再建実験においては,グラフトを骨に固定する部位において極めて早い時期に骨とグラフトの癒合が生じており,強固な早期固定を達成することが確認できた.また靭帯実質部においては,グラフト内の本来骨髄があった中空部位に新生血管と線維芽細胞の侵入が生じており,経時的にグラフトが自家組織に置換されつつあることが確認できた.ウサギを用いた十字靭帯再建実験モデルを開発し,ラットの場合と同様に脱灰骨グラフトを利用して再建手術を行ったが,十字靭帯の場合にはグラフトの破断が生じた.これはグラフトが靭帯に置換され強度が回復する以前に,グラフトに過大な荷重が負荷され強度的な破綻が生じているものと思われた.そこでグラフトにグルタルアルデヒトおよびエポキシ化合物を用いた架橋を導入し,グラフトの強度の増大を図った.架矯されたグラフトによる前十字靭帯再建の結果では,エポキシ化合物による架橋ではグラフトは柔軟性を保ち,早期の破断は生じなかったが,12週まででは半数程度に破断が生じた.これは架橋にもかかわらずグラフト自体の強度が足りないと考えられた.さらに生体吸収性材料でグラフトを補強して使用する方法を開発した結果112週まで再現性良く靭帯を再建することが可能となった.ラットおよびラビットの長管骨を用いて,一部がコラーゲン線維,残りが石灰化された骨のまま残る骨-靭帯-骨様の構造を有するコラーゲングラフトを作製し,靭帯の再建を行う方法について研究した.まず採取骨を部分的に被覆し,脱灰液に浸漬することにより,骨-靭帯-骨様の構造を有するコラーゲングラフトの作製方法を開発し,コラーゲングラフトが屈曲性と強度を備える靭帯様のグラフトであることが明らかとなった.また生体内での埋植試験により自家組織と同様に組織反応など生じないで吸収されることが明らかとなった.ついで靭帯再建実験を行った.ラットでの膝側副靭帯の再建実験においては,グラフトを骨に固定する部位において極めて早い時期に骨とグラフトの癒合が生じており,強固な早期固定を達成することが確認できた.また靭帯実質部においては,グラフト内の本来骨髄があった中空部位に新生血管と線維芽細胞の侵入が生じており,経時的にグラフトが自家組織に置換されつつあることが確認できた.ウサギを用いた十字靭帯再建実験モデルを開発し,ラットの場合と同様に脱灰骨グラフトを利用して再建手術を行ったが,十字靭帯の場合にはグラフトの破断が生じた.これはグラフトが靭帯に置換され強度が回復する以前に,グラフトに過大な荷重が負荷され強度的な破綻が生じているものと思われた.そこでグラフトにグルタルアルデヒトおよびエポキシ化合物を用いた架橋を導入し,グラフトの強度の増大を図った.架矯されたグラフトによる前十字靭帯再建の結果では,エポキシ化合物による架橋ではグラフトは柔軟性を保ち,早期の破断は生じなかったが,12週まででは半数程度に破断が生じた.これは架橋にもかかわらずグラフト自体の強度が足りないと考えられた.さらに生体吸収性材料でグラフトを補強して使用する方法を開発した結果112週まで再現性良く靭帯を再建することが可能となった.まずラットおよびラビットの腓骨と大腿骨を用いて、一部がコラーゲン線維、残りが石灰化された骨のまま残るコラーゲングラフトの作製法について研究した。その結果、強度、脱灰時間、グラフトの生体適合性の観点から、希塩酸中に浸漬して脱灰する方法が最適であることが分かった。グラフトの破断はつねに脱灰部と非脱灰部の境界で生じており、これは界面で物性が急激に変化することから応力集中が生じるためと考えられた。そこで非脱灰部と脱灰部分の境界付近での保護膜の巻き方を工夫し、脱灰が傾斜的に生じるようにすると、さらに強度を増加させることができるようになった。作成されたグラフトについて、ラットおよびうさぎに背部皮下における生体適合性試験を行ったところ、炎症なども生じず、無張力状態では経時間的に吸収されていくことが分かった。グラフトを用いて、ラットおよびうさぎの膝側副靱帯の再建実験を行った。その結果、骨とグラフトの固定部では4週程度と極めて早い時期に骨とグラフトの癒合が生じており、強固な早期固定を達成することが確認できた。またこの時点で、靱帯実質部においては、グラフト表層部に線維芽細胞の侵入が生じており、経時的にはグラフトは自家組織に置換されることが予想された。また実験度物はケージ内で正常な運動を行うことが可能であり、グラフトが機能していることが確認できた。

ラットおよびラビットの腓骨と大腿骨を用いて,一部がコラーゲン線維,残りが石灰化された骨のまま残るコラーゲングラフトを作製し,靭帯の再建を行う方法について研究した.ラットでの膝側副靭帯の再建実験においては,グラフトを骨に固定する部位において極めて早い時期に骨とグラフトの癒合が生じており,強固な早期固定を達成することが確認できた.また靭帯実質部においては,グラフト内の本来骨髄があった中空部位に新生血管と線維芽細胞の侵入が生じており,経時的にグラフトが自家組織に置換されつつあることが確認できた.また靭帯と骨との移行部位においては軟骨の存在も確認でき,最終的にはグラフトが靭帯として成熟しつつあることが確認できた.ラットでは手技的に関節内の前十字靭帯の再建手術を行うことが困難であることから,ウサギを用いた実験モデルを開発した.ラットの場合と同様に,脱灰骨グラフトを利用して再建手術を行ったが,十字靭帯の場合にはグラフトの破断が生じた.これはグラフトが靭帯に置換され強度が回復する以前に,グラフトに過大な荷重が負荷され強度的な破綻が生じているものと思われた.そこでグラフトにグルタルアルデヒトおよびエポキシ化合物を用いた架橋を導入し,グラフトの強度の増大を図った.架橋されたグラフトによる前十字靭帯再建の結果では,グルタルアルデヒト架橋では移植されたグラフトにおいて4週程度の早期に破断が生じた.これはアルデヒトの架橋により材料が硬くなり,靭帯実質部がもろくなったためと考えられた.一方,エポキシ化合物による架橋ではグラフトは柔軟性を保ち,早期の破断は生じなかったが,12週まででは半数程度に破断が生じた.これはグラフト自体の強度が足りないと考えられるため,現在は,グラフトを吸収性材料で補強して使用する方法で,慢性期におけるグラフトの破壊を避ける方法を開発している.ラットおよびラビットの腓骨と大腿骨を用いて,一部がコラーゲン線維,残りが石灰化された骨のまま残るコラーゲングラフトを作製し,靭帯の再建を行う方法について研究した.ラットでの膝側副靭帯の再建実験については,昨年度と同様の方法で再建手術を行う実験を継続し,組織標本を作製して組織再建状況を観察した.その結果,骨とグラフト骨の間で早期の骨癒合が生じること,グラフト内の髄腔部分には骨髄由来の細胞や血管侵入が生じて,線維組織が再建されること,またグラフト表面からの細胞侵入も生じ,経時的にグラフトが自家組織に置換されることが確認できた.十字靭帯再建手術については,昨年度開発したウサギを用いた実験モデルを利用して靭帯再建実験を行った.ラットの場合と同様な脱灰骨グラフトを利用して再建すると,グラフトの破断が生じることから,今年度は吸収性の縫合糸をグラフト髄腔内に通し補強材とする術式に改良して再建を行った.糸を2本用いて固定すれば,グラフト単独使用例に見られた早期のグラフト破断の防止が可能であることが分かった.12週までの実験例でグラフトは残存していた.肉眼所見ではグラフト表面が靭帯様の光沢を持つことが確認され,グラフトが靭帯として機能しているようであった。組織標本においても,骨髄内からグラフトへの細胞侵入と線維組織の形成が確認できた.このように脱灰骨グラフトによる膝前十字靭帯再建が可能であることが証明された.