hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗腫瘍活性アセトゲニン類の不斉合成研究及び作用機序の解明を指向した蛍光プローブ化

バンレイシ科アセトゲニン類は、1から3個のテトラヒドロフラン(THF)環を含む脂肪鎖の末端にγ-ラクトン環を有するポリケチドであり、抗腫瘍活性を代表とする幅広い生物活性を示すことから注目されており、またTHF環部分の立体化学などの構造の違いによって活性の強さなどに差が生じることが知られている。そこで、当研究室ではTHF環部分を立体選択的に合成する手法の開発を目的として研究に着手し、これまでにTHF環部分の系統的不斉合成法を確立し、様々な立体化学を有するmono-及びbis-THF環骨格の立体選択的な合成に成功している。また、本手法を用いた様々なアセトゲニン類の合成の第1段階として、mono-THF環を有するアセトゲニンであるmurisolin類の全合成を達成した。そこで、本手法の更なる展開として、ヒト膵臓癌細胞に対してアドリアマイシンの約10万倍もの細胞毒性を示すことが知られているlongimicin Dの合成を行い、癌細胞に対する細胞毒性評価を行うことを計画した。系統的不斉合成法により合成できるα位に隣接bis-THF環を有するアルデヒドに対して光学活性なアルキンを用いた不斉アルキニル化を行うことにより、longimicin Dのthreo/trans/threo/trans/threo型のbis-THF環骨格を構築した後に、γ-ラクトンとのカップリングを経てlongimicin Dの不斉全合成を達成した。合成したlongimicin Dを用いたヒト培養癌細胞パネル(肺癌7系、胃癌6系、卵巣癌5系、脳腫瘍6系、乳癌5系、腎癌2系、前立腺癌2系、およびメラノーマ1系)によるスクリーニングの結果、longimicin Dはヒト胃癌細胞やヒト肺癌細胞に対して特に強い生育阻害活性を有し、またその他の癌細胞に対しても中程度以上の生育阻害活性を有することが明らかとなった。
Mitochondrial particleを介した細胞間クロストークの解明

本研究課題は、近年新たに提唱された機能的なミトコンドリアを含むMitochondrial particle(MP)を介した細胞間相互作用の生理的・病理的な役割と意義を解明することを目的としている。具体的に、ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異を有するミトコンドリア病のモデル細胞を用いて、MPに存在するタンパクのプロファイリングとミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークの検証、さらに脳組織からのMP単離法の確立と老化及び神経変性疾患に伴うMPの変化を明らかにする。平成30年度は、mtDNA変異を有するサイブリッド細胞(2SD細胞)と正常mtDNAを有するサイブリッド細胞(2SA細胞)の細胞培養上清からMPを回収し、プロテオーム解析を実施した。その結果、1583種類のタンパク質が同定され、「mitochondrion」のアノテーションが付加されているタンパク質は244種類であった。同定された全タンパク質の中から、2SA細胞由来MPと比較して2SD細胞由来MPで発現変化を示すタンパク質を選抜したところ、増加するタンパク質が80種類、減少するタンパク質が70種類同定された。これらの内、「mitochondrion」のアノテーションが付加されているタンパク質はそれぞれ20種類、12種類であった。以上により、mtDNA変異によるミトコンドリア機能低下を示す細胞のMPに特徴的なタンパク質群が同定された。これらの分子はミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークに関与する可能性が考えられる。サイブリッド細胞の細胞培養上清から回収できるMPの量が当初の想定よりかなり少なく、細胞間クロストークの解析を行うには、回収方法の検討と実験計画の見直しが必要となった。そのため、研究実施期間を1年間延長することになった。その後、種々の検討を行った結果、比較的高収量が期待できるMPの回収方法を確立し、プロテオーム解析を実施することができた。それにより、ミトコンドリア機能低下を示す細胞のMPに特徴的なタンパク質群を同定した。当初の計画から遅れているが、平成31年度に残りの課題を達成する予定である。1.プロテオーム解析で同定したミトコンドリア機能低下を示す細胞のMPに特徴的なタンパク質のウエスタンブロット解析を行う。再現性が得られれば、同定されたタンパク質に着目した機能解析を実施する。2.ミトコンドリア機能低下を示す細胞から単離したMPをミトコンドリア機能が正常な細胞に処理し、MPの取り込みと細胞内挙動、MPが細胞及びミトコンドリア機能に及ぼす影響を検討する。また、ミトコンドリア機能が正常な細胞由来のMPをミトコンドリア機能が低下した細胞に処理し、同様の解析を実施する。以上により、ミトコンドリア機能が異なる細胞間でのクロストークにおけるMPの役割と意義を明らかにする。平成29年度は、mtDNA変異を持たないコントロールサイブリッド(2SA細胞)の細胞培養上清からMP分画を回収し、プロテオーム解析を実施した。その結果、1606個のタンパクが同定された。同定されたタンパクの遺伝子についてGO解析を行った結果、「mitochondrion」のGO termが付加されている遺伝子が200種類存在し、データベースに登録されたヒト全遺伝子群と比較して、同定されたタンパクの遺伝子群では有意に出現頻度が高いことが分かった。実際に検出されたタンパクには、呼吸鎖複合体構成タンパク、ミトコンドリアに局在する代謝酵素、ミトコンドリアのタンパク質翻訳に関与する因子などが多数含まれていた。従って、コントロールサイブリッドである2SA細胞の培養上清のMP分画には、ミトコンドリア局在タンパクが存在し、MPが回収されたと考えられた。この成果を基に、mtDNA変異を有するサイブリッド2SD細胞のMP中のタンパクのプロファイリング、ミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークの検証に進むことができる。平成29年度は、ミトコンドリア病のモデル細胞でのMPを介したクロストークの解析を計画していた。具体的に、(1)細胞培養液からのMP単離法の確立、(2)MPの形態観察、(3)MPのプロテオーム解析、(4)MPの取り込みと細胞内局在の観察、(5)MPを介したミトコンドリアDNAのクロストークの検討、(6)MPが細胞に与える影響の検討を予定していた。これまでに、(1)と(3)を実施し、コントロール細胞の培養上清から回収したMP分画にミトコンドリアタンパクが多数存在することを明らかにした。MPに関する報告は限られており、全ての細胞からMPが放出されているかどうかは不明である。今回の結果から、本研究で使用するサイブリッド細胞からもMPが放出されている可能性が考えられ、申請時に計画したミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークの解析が可能であることが分かった。当初の計画を全て実施することはできなかったが、重要な課題の一つであったサイブリッド細胞からのMPの単離法が確立され、やや計画からは遅れているものの、順調に進んでいるものと考えられる。

本研究課題は、近年新たに提唱された機能的なミトコンドリアを含むMitochondrial particle(MP)を介した細胞間相互作用の生理的・病理的な役割と意義を解明することを目的としている。具体的に、ミトコンドリアDNA(mtDNA)変異を有するミトコンドリア病のモデル細胞を用いて、MPに存在するタンパクのプロファイリングとミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークの検証、さらに脳組織からのMP単離法の確立と老化及び神経変性疾患に伴うMPの変化を明らかにする。平成30年度は、mtDNA変異を有するサイブリッド細胞(2SD細胞)と正常mtDNAを有するサイブリッド細胞(2SA細胞)の細胞培養上清からMPを回収し、プロテオーム解析を実施した。その結果、1583種類のタンパク質が同定され、「mitochondrion」のアノテーションが付加されているタンパク質は244種類であった。同定された全タンパク質の中から、2SA細胞由来MPと比較して2SD細胞由来MPで発現変化を示すタンパク質を選抜したところ、増加するタンパク質が80種類、減少するタンパク質が70種類同定された。これらの内、「mitochondrion」のアノテーションが付加されているタンパク質はそれぞれ20種類、12種類であった。以上により、mtDNA変異によるミトコンドリア機能低下を示す細胞のMPに特徴的なタンパク質群が同定された。これらの分子はミトコンドリア機能が異なる細胞間でのMPを介したクロストークに関与する可能性が考えられる。サイブリッド細胞の細胞培養上清から回収できるMPの量が当初の想定よりかなり少なく、細胞間クロストークの解析を行うには、回収方法の検討と実験計画の見直しが必要となった。そのため、研究実施期間を1年間延長することになった。その後、種々の検討を行った結果、比較的高収量が期待できるMPの回収方法を確立し、プロテオーム解析を実施することができた。それにより、ミトコンドリア機能低下を示す細胞のMPに特徴的なタンパク質群を同定した。当初の計画から遅れているが、平成31年度に残りの課題を達成する予定である。今後、mtDNA変異を有するサイブリッド2SD細胞の培養上清から回収したMP分画のプロテオーム解析を行い、コントロール細胞のプロファイルと比較し、それぞれの特徴を明らかにする。その後、MPの取り込みと細胞内局在の観察、MPを介したミトコンドリアDNAのクロストークの検討、MPが細胞に与える影響の検討を行い、ミトコンドリア機能が異なる細胞間でのクロストークの役割と意義を検討する。また当初の計画では、実験動物または臨床検体の凍結脳から単離したMPプロファイリングを行う予定であった。しかしながら、MPを介した細胞間クロストークを解明する上で、細胞レベルでのより詳細な解析が必要になる可能性がある。その場合は、脳由来MPの単離・解析よりも、ミトコンドリア病モデル細胞での解析を優先する。順調に進めば、計画していた(1)脳からのMPの単離法の確立、(2)MPの電顕観察と粒径分布の測定を行う。(3)MPのプロファイリングを実施する。
アルツハイマー病脳内蓄積物質とイノシトールリン脂質代謝異常

細胞膜にはイノシトールリン脂質を特異的に分解してジアシルグリセオールとイノシトールリン酸を生成するホスホリパーゼC(PLC)が存在する。PLCはさまざまな外界情報物質に依存した細胞応答系に関わるシグナル変換酵素といえる。本年度はアルツハイマー病(AD)におけるイノシトールリン脂質代謝異常、特にPLC異常について明らかにした。PLCアイソザイムのPLC-δに対する特異抗体を用いた免疫組織化学的検討で、PLC-δはAD脳の神経原線維変化(NFT)だけでなく、PSPのNFT、Pick病のPick小体、DLB病のcortical Lewyにも異常に蓄積していたことより、数々の神経変性疾患の脳内異常蓄積物質の形成機序にPLC-δ異常が関与している可能性がある。Western blotting解析によりAD脳の可溶性分画およびAD患者血小板の可溶性分画で対照群に比べ、PLC-δ量が有意に増大していた。PLC-δ異常は脳だけでなく全身の代謝異常である可能性がでてきた。今後、アルツハイマー病でのPLC-δの分子異常の特性の検討が必要である。低濃度(25μM-200μM)のグルタミン酸を短時間投与し、その後グルタミン酸不含液で24時間インキュベートすることにより、50μM以上のグルタミン酸により濃度依存的にラット培養大脳皮質ニューロンの細胞死が誘発された。グルタミン酸の同様な投与により、25μMの低濃度からら濃度依存的に、PLC-δの免疫活性の増大が認められた。細胞外カルシウムイオンの除去あるいはNMDAレセプターアンタゴニストのMK-801の投与により、グルタミン酸によるPLC-δの免疫活性増大の有意な減少が認められ細胞死も著減した。これらの結果より、グルタミン酸投与によるカルシウムイオンの流入によりニューロン内のPLC-δの免疫活性が増大し細胞死と関連することが示唆された。PLC-δの増大がニューロン死において果たす病態的意義については、イノシトールリン脂質代謝異常の観点よりさらに検討を要する課題である。
機能性元素をドープした半導体ナノ微粒子の作製と単一微粒子分光による量子光物性

本研究では、半導体ナノ微粒子へ機能性元素をドープしたドープ型ナノ微粒子の作製とそれらの単一物性を評価できる顕微分光システムの開発を行い、ドープ型ナノ微粒子の量子光物性を明らかにした。半導体ナノ微粒子を機能性イオンドープのための新しいナノ空間母体材料と考え、逆ミセル法、共沈法およびイオン打ち込み法により、遷移金属イオン、希土類イオン、さらにドナー・アクセプターとなる不純物などを添加した。低温で光学特性が測定でき高い空間分解能を有する顕微レーザー分光システムとして、ファイバー型及びカンチレバー型の近接場光学顕微鏡を開発した。単一ナノ微粒子においては、自由励起子発光および浅い不純物準位発光の線幅は非常に狭く、発光エネルギーはナノ粒子サイズに敏感であった。一方、II-VI族半導体中のマンガンイオンなどの深い不純物準位発光は、低温においても非常にブロードであった。単一ナノ微粒子における深い不純物発光のスペクトル線幅は、主に電子格子相互作用が決めていることがわかった。また、バンドギャップエネルギーの大きな半導体を表面層に用いるコア・シェル型半導体ナノ粒子を作製した。このコア・シャル型構造では、ドープした不純物イオンが表面に析出しないように表面層を覆うことにより、不純物発光の高度増大が観測できた。不純物をドープしたコア・シャル型ナノ粒子においても、近接場光学顕微鏡を用いてひとつひとつの発光特性を明らかにすることができた。時間分解発光測定と空間分解発光測定を行うことにより、ナノ微粒子から機能性元素へのエネルギー移動などの発光特性を明らかにした。本研究では、半導体ナノ微粒子へ機能性元素をドープしたドープ型ナノ微粒子の作製とそれらの物性を評価できる顕微分光システムの開発を行い、ナノ微粒子の光学特性の研究を行った。ドープ型ナノ微粒子の作製においては、化学的な手法を用いて遷移金属イオンや希土類イオンを母体の半導体ナノ微粒子へドープすることを試みた。溶液法及び逆ミセル法を用い、遷移金属イオンを添加したII-VI族半導体ナノ微粒子の作製を主に行った。溶液法を用いた作製では、遷移金属イオンのドープ量など様々な条件を変化させ作製を試みたが、良質な試料を得ることは難しいことがわかった。そこで、逆ミセル法により遷移金属イオンをナノ微粒子へドープできる方法を開発した。この方法で作製された試料では、吸収スペクトルに量子化された電子準位が明確に観測され、さらに発光特性より母体ナノ微粒子から遷移金属へのエネルギーの移動も確認された。これらの成果により、良質なドープ型II-VI族半導体ナノ微粒子試料の作製方法を確立することができた。イオン打ち込み法においてもナノ微粒子内部に不純物をドープできることを発光特性の研究から明らかにできた。高い空間分解能を有する顕微レーザー分光システムの開発に関しては、ファイバー型及びカンチレバーによる散乱を利用した散乱型分光顕微鏡の開発を進めた。新しい検出系の開発により、試料そのものによる発光等を増強することにより、精密な観測が可能となる。単純なナノ微粒子系である金属ナノ微粒子の全反射一次元フォトニック結晶構造を用いて発光増強等に関する可能性の検証を行った。この顕微分光システムを用いて、作製したドープ型半導体ナノ微粒子の発光スペクトルが測定できることを確認した。本研究では、半導体ナノ微粒子へ光機能性元素をドープしたドープ型ナノ微粒子の作製とそれらの物性を評価できる顕微分光システムの開発を行い、単一のナノ微粒子の光学特性の研究を行った。機能性元素ドープ型ナノ微粒子の作製においては、主に逆ミセル法によりII-VI族半導体ナノ微粒子に遷移金属イオンや希土類イオンをドープした試料を作製した。逆ミセル法で作製した試料では、吸収スペクトルに量子化された電子準位が現れるが発光効率は非常に低く、表面の欠陥に起因したブロードな発光スペクトルのみが観測された。発光効率および母体ナノ微粒子からドープした機能性元素へのエネルギー移動効率は、表面を半導体ナノ層で覆うことにより大きく向上することが確認された。

すなわち、ドープ型ナノ微粒子のバンド端発光や不純物発光の研究には、表面効果を抑制できるコア/シェル型構造が有用であることがわかった。さらにゾルゲル法により、これら良質なドープ型II-VI族半導体ナノ微粒子をガラス薄膜に分散させる方法も確立することができた。高い空間分解能を有する顕微レーザー分光システムの開発に関しては、カンチレバーによる散乱を利用した散乱型分光顕微鏡の開発を進め、散乱配置でシリコン基板上の半導体や金属のナノ微粒子の観測に成功した。散乱信号発生のメカニズムは、数値計算結果との比較を行い検討中である。また、2次元空間での発光イメージ測定のためのシステムを構築した。単一ナノ粒子発光測定では、浅い不純物と深い不純物では発光特性が大きく異なることを実験的に観測し、ドープ型半導体ナノ粒子の電子状態を明らかにした。本研究では、半導体ナノ微粒子を機能性イオンドープのための新しいナノ空間母体材料と考え、新しい機能性を有するドープ型ナノ微粒子を作製し、空間分解顕微分光によりその単一粒子の量子光物性を明らかにした。機能性元素ドープ半導体ナノ微粒子の作製は、逆ミセル法、共沈法およびイオン打ち込み法を用いて行った。さらに、低温で光学特性が測定可能なナノ粒子を分散させたSiO_2薄膜をゾルゲル法により作製した。Mnイオンなどの遷移金属イオン、希土類Euイオン、ドナー・アクセプターとなる不純物を添加したII-VI族化合物半導体を中心にそれらの発光特性を詳細に研究した。ガラス中に分散させたナノ粒子の濃度を変化させることにより、集合体および孤立したナノ粒子の発光特性を測定した。単一ナノ粒子においては、浅い不純物準位発光の線幅は狭くナノ粒子サイズに敏感であるが、深い不純物準位発光は非常にブロードであった。単一ナノ粒子発光のスペクトルの線幅は、電子格子相互作用が決めていることがわかった。また、バンドギャップエネルギーの大きな半導体を表面層に用いるコア・シェル型半導体ナノ粒子を作製した。このコア・シャル型構造では、ドープした不純物イオンが表面に析出しないように表面層をコートすることにより、不純物発光の高度増大が観測できた。不純物をドープしたコア・シャル型ナノ粒子においても、近接場光学顕微鏡を用いてひとつひとつの発光特性を明らかにすることができた。また、サイズの揃ったナノ粒子が組織化したナノ微粒子集合体の発光ダイナミクスをフェムト秒レーザー分光法を中心に用いて明らかにし、ナノ微粒子の光学応答やナノ微粒子から機能性元素へのエネルギー移動メカニズムを議論した。
ヒト腫瘍免疫レパトアのプロテオミクスプロフィーリング

CD8+T細胞は標的細胞に提示されるペプチド/MHCクラスI複合体を特異的に認識し、これを傷害する。提示される抗原ペプチドは内在性に発現した蛋白に由来する分解産物であるが、これらのペプチドがどのようなメカニズムでつくられ、またどのようなペプチド群(レパートリー)を形成しているのかは未だに不明な点が多い。本プロジェクトではマススペクトロメトリーを利用し実際に提示されてくるMHCクラスIペプチド群の網羅的解析を行う。当該年度では、1)HLA-A24特異抗体産生ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を精製濃縮し、ペプチド/HLAクラスI複合体を回収するための親和カラムを作成した。2)約1.5×10^9個のHLA-A24発現するヒト大腸癌細胞株(SW480,Colo320,HCT-15/b2m)より細胞抽出液を準備し、親和カラムでペプチド/HLAクラスI複合体を回収した後、弱酸で結合ペプチドを遊離回収した。3)分子量3kDaフィルターを通した遊離ペプチドをRP-HPLCによりフラクション化し、それぞれのサンプルをマススペクトロメトリー(ABI/4800plusMALDI_TOF/TOF)により網羅的にシークエンス解析した。4)SW480,Colo320,HCT-15/b2mからは重複のない186個、コントロールとして用いたHLA-A24発現しないヒト大腸癌細胞株HCT-116からは5個のペプチド配列を検出した(2013年3月現在)。実験の再現性は約80%程度であり、また既知のHLA-A24結合モチーフを利用した親和性解析では前者のペプチド群が有意に高く、後者はいずれもHLA-A24結合モチーフを欠損していた。この結果は、本システムにより高い精度でがん細胞のHLA-A24に提示されるナチュラルペプチドレパートリーを網羅的解析可能であることを示している。交付申請書に記載した研究実施計画通りにプロジェクトが進行している。ヒト腫瘍細胞に提示されるペプチド・MHCクラスIレパートリーを網羅的に解析するためのシステムを日本人に最も多い遺伝子多型であるHLA-A24において樹立し、本プロジェクトにおける目標を達成した。今後はこのシステムを応用し、CD8+T細胞応答を惹起する免疫原性を有したナチュラル抗原ペプチドのスクリーニングを行う予定である。CD8+T細胞は細胞表面に提示されるペプチドとMHCクラスIの複合体(pMHCI)を認識し、これを傷害する。標的となるpMHCIは最終的に小胞体内で完成するが、このプロセスに必要な分子がアミノペプチダーゼであるERAAPやMHCクラスIシャペロンであるtapasinである。いずれかの分子が欠損した場合も細胞表面提示されるpMHCIレパートリーが質的に大きく変化し、結果的にCD8+T細胞を介する免疫応答に変化をもたらす。腫瘍細胞ではこれら分子の発現が低下することも報告されている。一方で、リン酸化ペプチドがMHCクラスI上に提示される例は知られているものの、この生物学的意義および提示の細胞内メカニズムはわかっていない。本研究ではリン酸化ペプチドを含めたpMHCIレパートリーの網羅的解析を行い、抗原提示機構の解明を目指す。平成22年度は、ヒトERAAPに対するモノクローナル抗体を作成し、免疫沈降を用いて細胞内に発現するERAAP蛋白の抽出を確認までを行った。リン酸化チロシン/スレオニン/セリン抗体を利用した解析ではERAAP自体のリン酸化は確認されなかった。当該年度では、1)HLA-A/B/C抗体(W6/32)産生ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を精製濃縮し、ペプチド/HLAクラスI複合体を回収するための親和カラムを作成した。2)約1.5x10^9個のヒト細胞株K562またはHLA-A24を安定発現させたK562/HLA-24より細胞抽出液を準備し、親和カラムを用いてペプチド/HLAクラスI複合体を回収した後、弱酸で結合ペプチドを遊離回収した。3)分子量3kDaフィルターを通した遊離ペプチドをRP-HPLCによりフラクション化し、それぞれのサンプルをマススペクトロメトリー(ABI/4800plusMALDI_TOF/TOF)によりシークエンス解析した。4)このうちK562/HLA-24からは17個、K562からは3個のペプチド配列を得ることが出来、これらはいずれも重複しない配列を有していた。HLA-A24結合モチーフを利用した親和性解析の結果、前者の17個のうち53%がHLA-A24に対する高親和性を示し、後者の3個はいずれも親和性を示さなかった。以上より、HLA-A24に提示されたペプチド群を回収しラージスケールでマススペクトロメトリー解析するための実験系が確立できたと考える。

提示される抗原ペプチドは内在性に発現した蛋白に由来する分解産物であるが、これらのペプチドがどのようなメカニズムでつくられ、またどのようなペプチド群(レパートリー)を形成しているのかは未だに不明な点が多い。本プロジェクトではマススペクトロメトリーを利用し実際に提示されてくるMHCクラスIペプチド群の網羅的解析を行う。当該年度では、1)HLA-A24特異抗体産生ハイブリドーマよりモノクローナル抗体を精製濃縮し、ペプチド/HLAクラスI複合体を回収するための親和カラムを作成した。2)約1.5×10^9個のHLA-A24発現するヒト大腸癌細胞株(SW480,Colo320,HCT-15/b2m)より細胞抽出液を準備し、親和カラムでペプチド/HLAクラスI複合体を回収した後、弱酸で結合ペプチドを遊離回収した。3)分子量3kDaフィルターを通した遊離ペプチドをRP-HPLCによりフラクション化し、それぞれのサンプルをマススペクトロメトリー(ABI/4800plusMALDI_TOF/TOF)により網羅的にシークエンス解析した。4)SW480,Colo320,HCT-15/b2mからは重複のない186個、コントロールとして用いたHLA-A24発現しないヒト大腸癌細胞株HCT-116からは5個のペプチド配列を検出した(2013年3月現在)。実験の再現性は約80%程度であり、また既知のHLA-A24結合モチーフを利用した親和性解析では前者のペプチド群が有意に高く、後者はいずれもHLA-A24結合モチーフを欠損していた。この結果は、本システムにより高い精度でがん細胞のHLA-A24に提示されるナチュラルペプチドレパートリーを網羅的解析可能であることを示している。交付申請書に記載した研究実施計画通りにプロジェクトが進行している。研究計画の一部変更を予定している。これは当教室において、ヒト大腸癌細胞株より癌幹細胞および非癌幹細胞それぞれ由来の細胞株クローン樹立に成功したことによる。前者は後者に比べ高い癌幹細胞含有比率を維持しつつ細胞増殖し、今回確立した実験系に必要な約1x10^9個相当の癌幹細胞を得ることが可能となった。すなわち、これらのペアを利用して癌幹細胞および非癌幹細胞それぞれに提示されているHLAクラスI抗原ペプチド群の網羅的解析を研究計画に組み込みたい。ヒト腫瘍細胞に提示されるペプチド・MHCクラスIレパートリーを網羅的に解析するためのシステムを日本人に最も多い遺伝子多型であるHLA-A24において樹立し、本プロジェクトにおける目標を達成した。今後はこのシステムを応用し、CD8+T細胞応答を惹起する免疫原性を有したナチュラル抗原ペプチドのスクリーニングを行う予定である。
数値シミュレーションによる磁気圏磁場トポロジー分岐の解明

惑星間空間磁場斜め北向き時の太陽風一磁気圏相互作用を電磁流体数値シミュレーションで再現し、磁場トポロジーの観点から磁束循環(プラズマ対流)を調べた。その結果、これまで予想されていたものとは異なる磁束循環のモードが発見された。それは地球の開いた磁力線と閉じた磁力線が起こす交換型磁力線再結合が介在するモードで、惑星間空間磁場と地球双極子軸のなす向きによってさまざまな現れ方がある。これまで観測されてきた電離圏対流パターンはこの新しい考え方で解釈し直すことができる。1.平成22年度はシミュレーションの物理環境を整えることが大きな目標であった。まずTanaka(J. Comput. Phys.,111,381-389,1994)が開発したコードを情報通信研究機構(NICT)のスーパーコンピュータ上で動くようにした。NICTではOpenSpaceNetというクラウドコンピューティングシステムが平成22年10月から稼働を始め、スーパーコンピューターはこのシステムに組み込まれた。OpenSpaceNetを九州大学から利用できるよう、またシミュレーション結果の可視化や解析に使えるよう、Linuxワークステーションを立ち上げた。シミュレーションコードを修正して、磁気双極子が傾いている場合と電離圏コンダクタンスが一様な場合を扱えるようにした。しかしシミュレーション結果の可視化ツール開発はまだ不十分である。2.磁気圏磁場トポロジー分岐の解明(特にサブストーム時)が本研究の課題であるが、シミュレーション環境整備の途上で行った計算で、研究代表者が過去に行っていた研究に示唆を与えるものがあった。代表者は惑星間磁場が北向き時の磁気圏対流を観測面から研究していたが、その時の解釈を支持する結果がシミュレーションで得られた。惑星間磁場北向き時には、南向き時とは逆向きの対流セル対が極域電離圏に現れるが、その一方が閉じた磁力線上にあることがシミュレーションで確かめられた(観測では制約が多く確実ではなかった)。これは開いた磁力線と閉じた磁力線が起こす磁力線再結合(交換型磁力線再結合)に起因すると理解される。太陽表面で交換型磁力線再結合が存在することは知られているが、磁気圏での交換型磁力線再結合は非直観的であり想像すらできない研究者が多い。そのような中、数値モデリングで交換型磁力線再結合の存在が確実になった意義は大きい。可視化ツールの開発が進めば、この成果は本研究課題とは別にまとめる。前年度に計算機環境を調えることができたので、課題である磁場トポロジーを解析・可視化する手法の開発にとりかかった。しかし結論を先に言うと開発は成功していない。アルゴリズムは2つに分かれる。アルゴリズムの第1段階は磁気中性点の探索であるが、この部分の開発は一応成功した。しかし問題点も残る。まず、グリッド間の磁場データ補間(線形補間を採用)がどの程度信用できるのかわからない。本研究で用いているシミュレーションコードは変形極座標格子であるので、地球から遠くなるほど格子間隔が大きくなる。そのような場所では補間に限界があると想像できる。また、磁気中性点かどうか判定する閾値によって磁気中性点の数が大きく変わる。数値的に厳密な磁気中性点になることはまずない。よって閾値を設ける必要があるが、その基準が明らかでない。アルゴリズムの第2段階は磁気中性点同士を結ぶ磁力線(セパレーター)を発見することであるが、この部分の開発が成功していない。セパレーターを見つけるためには、ある磁気中性点から広がる磁気面を追跡する必要があるが、とれが数値的に極めて困難であることが次第に明らかになった。そこでかねてから考えていた研究方針の手直しを行った。すなわち、それまで磁場トポロジーがある程度わかっている惑星間空間磁場北向き時の磁気圏を題材に上述のプログラム開発を行っていたので、厳密なトポロジー解析は置いておき、トポロジーから予想される磁力線再結合の様態やその結果生み出される磁気圏プラズマ対流について議論することにした。惑星間空間磁場の向きを変えて何通りかシミュレーションを行ったところ、真北から35度の角度では、昼間側のみならず(観測ではあまり知られていない)夜側においても惑星間空間磁場朝夕成分に依存する夜側電離圏対流が存在することが判明した。このシミュレーション結果は交換型磁力線再結合で解釈できる新知見である。
メチル化カテキンはNASH(非アルコール性脂肪性肝炎)の治療薬として有効か?

メチオニン・コリン欠乏食(MCD)投与非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルマウスに「べにふうき」緑茶メチル化カテキンを投与後、炎症細胞浸潤、風船化肝細胞、Mallory-Denk body、肝細胞周囲線維化が改善した。肝細胞内8OhdG免疫反応産物の発現は明らかに減.し酸化ストレスも抑制された。TNFR、pAkt、pNFκBの蛋白発現は明らかに減.し抗炎症作用が見られ、pIRS-1の蛋白発現は増加しインスリン感受性も回復した。メチル化カテキンはMCDによるNASHモデルマウスの肝病変を改善した。緑茶カテキンよりさらに強力な抗酸化作用を持つ「べにふうき」緑茶メチル化カテキンが非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を改善するか否かを検討した。生後7週目雄性C57BL/6マウスにメチオニン・コリン(M/C)欠乏飼料を摂取させNASHモデルを作製した。18週目からM/C欠乏飼料とともに、20%メチル化カテキン含有緑茶エキスを投与した群(高濃度群)、2%メチル化カテキン含有緑茶エキスを投与した群(低濃度群)、メチル化カテキン以外の緑茶カテキンを投与した群、M/C欠乏飼料のみ投与した群の4群を作製した。28週目に殺戮し、1)肝体重比の算出、2)血液生化学的検査、3)肝組織学的評価、4)抗8-hydro-2'-deoxyguanosine(80hdG)抗体を用いた免疫組織化学による酸化ストレスの評価、5)TNFαシグナル系の観察では抗TNFα、Akt、p(リン酸化)Akt、NFκB、pNFκB各抗体を用いて、インスリンシグナル系では抗IRS、pIRS抗体によるWestern Blotを行った。肝体重比は4群間でほぼ同様の値を呈し有意差は見られなかったが、高濃度群の血中ALT、血糖値は他の群に比較して有意に低値であった。4群間で脂肪沈着の程度には有意差は見られなかったが、炎症細胞浸潤、風船化肝細胞、肝細胞周囲線維化の程度は他の群に比較して高濃度群で有意に低値であった。高濃度群の肝細胞内80hdG免疫反応産物の発現は他の3群に比較して明らかに減少し酸化ストレスも抑制された。Western Blotによる検討では、高濃度群の肝臓におけるTNFα、Akt、リン酸化(p)Akt、NFκB、pNFκBの蛋白発現は他の群に比較して明らかに減少したが、IRS、pIRSの蛋白発現は明らかに増加していた。「べにふうき」メチル化カテキンが非アルコール性脂肪肝炎(NASH)を改善するか否かを検討した。28週目に殺戮し、1)肝体重比の算出、2)肝組織学的評価、3)抗8-hydro-2'-deoxyguanosine(8OhdG)抗体を用いた免疫組織化学による酸化ストレスの評価、4)TNFαシグナル系の観察では抗TNF受容体(R)、Akt、リン酸化(p)Akt、NFκB、pNFκB各抗体を用いて、インスリンシグナル系では抗IRS-1、pIRS-1抗体によるWestern Blotを行った。肝体重比は4群間でほぼ同様の値を呈し有意差は見られなかった。4群間で脂肪沈着の程度には有意差は見られなかったが、炎症細胞浸潤、風船化肝細胞、Mallory-Denk body、肝細胞周囲線維化の出現頻度は他の群に比較して高濃度群で有意に低値であった。高濃度群の肝細胞内8OhdG免疫反応産物の発現は他の3群に比較して明らかに減少し酸化ストレスも抑制された。Western Blotによる検討では、高濃度群の肝臓におけるTNFR、pAkt、pNFκBの蛋白発現は他の群に比較して明らかに減少したが、pIRS-1の蛋白発現は増加していた。メチオニン・コリン(M/C)欠乏食によるNASHモデルマウスにおいてメチル化カテキンは他の緑茶カテキンより強い抗酸化作用とともに抗炎症作用を惹起し、インスリン感受性も回復させNASHを改善した。肥満、耐糖能異常、高脂血症などヒトの生活習慣病類似病態を呈する生後7週Rの雄性KKA^yマウスにメチオニン・コリン欠乏食(MCD)を4週間摂取させNASHモデルを作製した。

MCDと同時に、通常餌投与対照(A)群、MCD+Zn,Se微量元素強化餌投与(B)群、MCD+分岐鎖アミノ酸(BCAA)強化餌投与(C)群、MCD+微量元素+BCAA強化餌投与(D)群、MCD+微量元素+BCAA+ビタミン強化餌投与(E)群を作製した。5週目に殺戮し、1)体重、肝重量を測定し肝体重比の算出、2)血液生化学的検査、3)肝組織学的評価、4)抗8-hydro-2'-deoxyguanosine(80hdG)抗体、4hydroxynonenal抗体を用いた免疫組織化学による酸化ストレスの評価、5)炎症系を観察するためリン酸化(p)NFκB、NFκB各抗体を用いて、脂質代謝系を観察するため抗SREBP-1c、pAcelCoA抗体、またERstress関連では抗Grp78,PERK,pELF,ATF6抗体によるWestern Blotを行った。平均肝体重比はA群、B群、C群、D群、E群に従い低値となった。血液生化学検査ではC,D,E群の総ビリルビン、LDH,ALT,AST,およびヒアルロン酸の値が他の群に比較して有意に低値であった。肝組織像の検討ではC,D,E群の脂肪沈着、細胞浸潤、マロリー・デンク小体、線維化の程度が他の群に比較して改善していた。また免疫組織化学による酸化ストレスの検討でC,D,E群の抗酸化作用も他の群に比較して有意に改善していた。Western Blotでは、微量栄養素の種類が増えるにつれ脂質代謝系のSREBP-1c発現が減弱する一方pAcelCoA発現は増加し、ERstress関連のGrp78,PERK,pELF,ATF6の発現はE群が最も減少していた。炎症系のpNFκBの発現は微量栄養素の種類が増えるにつれ減少していた。以上の結果から、分岐鎖アミノ酸はNASHの発症進展に関わる脂質代謝異常、ERstress、酸化ストレス、炎症に対し抑制的に作用するとともに微量元素、ビタミン類が更に効果を増強することが明らかとなり、NASHに対する新たな治療薬として活用できる可能性も推察された.
好酸性細菌群による酸化鉄ナノ構造体形成を利用したレアメタル回収技術の開発

本研究では、好酸性鉄酸化菌による酸化鉄ナノ構造体の生産系を確立し、微生物形成した酸化鉄を用いてレアメタル等の金属イオンの吸着回収を検討した。新規の好酸性鉄酸化細菌GJ-E10株を分離し、培養条件(温度、pH)を制御することにより、異なる構造特性をもつ酸化鉄ナノ構造体(シュベルトマナイト及びゲーサイト)を作製できるようになった。これらの酸化鉄のモリブデン酸等に対する吸着特性を調査解析し、レアメタル類の吸着剤として利用可能であることを示した。本研究では、好酸性鉄酸化菌による酸化鉄ナノ構造体の生産系を確立し、微生物形成した酸化鉄による金属イオン捕集機能を利用した効果的なレアメタル回収システムを開発する。本年度は、鉄酸化細菌の単離株を種々のpH、温度条件でバイオリアクターを用いて回分培養し、生成する酸化鉄の結晶構造に及ぼす培養条件の影響を明らかにした。また、生成した酸化鉄の金属イオン吸着特性を調査し、レアメタル回収技術への適用性を検討した。pH制御下で単離株E1010株を培養し、粉末X線回折法により酸化鉄の結晶構造を解析した。その結果、培養温度25度、pH 2.5とpH 3.0では、シュベルトマナイトの生成が確認された。しかし、pH 3.5ではゲーサイトが混在し、さらに、pH 3.8及び4.2ではゲーサイトを主成分とすることが明らかになった。また、培養温度を37度に上昇させると、pH 3.0でもゲーサイトが混在し、pH 3.5ではゲーサイトが主成分となった。pH及び温度条件により酸化鉄の結晶構造は大きく影響を受けることが明らかになった。培養温度25度、pH 3.0で生成したシュベルトマナイトとpH 4.2で生成したゲーサイトの金属イオン吸着特性を調査した。pH 3.05.0の溶液中におけるAs(III)、As(V)、フッ化物イオンの吸着では、どのpHでもゲーサイトと比較して、シュベルトマナイトの吸着量が大きいことがわかった。25度、pH 4.0の条件でAs(V)およびMo(VI)に対する吸着等温線を作成した結果、ゲーサイトよりもシュベルトマナイトの吸着量が多いこと、さらにラングミュア式で解析した結果、シュベルトマナイトの最大吸着容量はAs(V)で303 ug/mg-Fe、Mo(VI)で335 ug/mg-Feに達し、金属イオンの優れた吸着材として機能することが明らかになった。前年度までに、新規の好酸性鉄酸化細菌GJ-E10株を単離して増殖特性を明らかにするとともに、培養条件を変えることにより、異なる構造特性をもつ酸化鉄ナノ構造体(シュベルトマナイト及びゲーサイト)を形成することができた。本研究により、好酸性鉄酸化細菌を用いてゲーサイトを主成分とする酸化鉄を生成できることがはじめて明らかにされた。本年度は、これらの酸化鉄の構造特性を透過型電子顕微鏡観察により特徴付けるとともに、種々のレアメタル(金属オキシ陰イオン)の吸着特性を詳しく調査し、レアメタル回収への適用性を評価することとした。GJ-E10株の培養液(25度、pH 3.0)で生成したシュベルトマナイトは針状(幅:4 nm程度)であり、化学合成品の構造とよく一致していた。一方で、37°C、pH 3.8の培養条件で生成したゲーサイトは、不定形のナノ粒子が凝集して二次粒子(粒子径:数十nm)形成しており、一般的な化学合成品と比較して結晶性が低いことが示された。これらの酸化鉄を用いて、セレン酸(Se)、モリブデン酸(Mo)、クロム酸(Cr)、亜ヒ酸(As(III))、ヒ酸(As(V))の吸着に及ぼすpHの影響(10 mM硫酸ナトリウム存在下)を調査した結果、両酸化鉄ともpH 35の範囲でSe、Mo、As(V)の吸着量はほぼ一定であった。またCrとAs(III)ではpH 5のとき吸着量は最も大きくなった。シュベルトマナイトとゲーサイトでは結晶構造は大きく異なるが、オキシ陰イオンに対する吸着特性は類似していた。前年度の吸着容量の結果と併せると、本研究で微生物生成した酸化鉄は、弱酸性から中性付近の溶液から効率よくオキシ陰イオン種のレアメタルを吸着回収可能であることが明らかになった。H23年度は、酸化鉄を高効率で産生する微生物培養系(集積培養系)を構築するとともに、その培養系で鉄酸化を担う細菌群を特定することを目的とした。また培養系で産生される酸化鉄の結晶構造について調査した。本研究の結果、酸性河川底質を植種として、第一鉄(Fe(II))および窒素・リン成分を添加した無機塩培地を用いた回分培養(pH 3、温度25度)により、7 mM Fe(II)を2日で酸化鉄に変換する集積培養系を得ることができた。

粉末X線結晶回折法、透過型電子顕微鏡観察およびエネルギー分散型X線分析法により、集積培養系で形成された酸化鉄の鉱物形態はシュベルトマナイトと一致した。この集積培養系からのFe酸化菌の単離を試み、β-プロテオバクテリア綱に属する新規細菌を分離することができた。16S rRNA遺伝子配列に基づくクローンライブラリー法で集積系の細菌群集構造を解析した結果、本菌は得られたクローンの8%を占め(92%は従属栄養細菌Acidiphilium属およびAcidocella)、集積系の主要なFe酸化細菌であると推察された。ジャーファーメンターを用いて増殖に及ぼすpHの影響を調べた結果、培養温度25度にて、本菌の最適pH=3.0付近、最大比増殖速度=0.078/hと算出された。また、pH 2.5および3.0ではシュベルトマナイトが形成していることが明らかになった。本年度の研究目的は、単離株の増殖に及ぼす培養条件の影響について詳細に調査するとともに、生成した酸化鉄の化学特性の解析を進めること、さらにレアメタル等の金属陰イオンに対する吸着特性を明らかにすることであった。培養温度とpHを制御したリアクター試験により、増殖と酸化鉄形成に及ぼす培養条件の影響を詳細に検討し、新規の知見として酸性条件でゲーサイトを主成分とする鉱物相が得られることを提示できた。またシュベルトマナイト、ゲーサイトをそれぞれ主成分とする酸化鉄を調製し、ヒ酸、亜ヒ酸、モリブデン酸、フッ化物イオンの吸着に及ぼす諸条件の影響を明らかにすることができた。本年度の当初の目的はほぼ達成されており、順調に進展していると評価できる。本研究では、目的とする安定な鉄酸化集積培養系が得られたこと、その集積培養系で鉄酸化を担う細菌を分離して特定できたこと、および培養系で産生される酸化鉄の鉱物形態を特定できたことから、当初の計画に対して順調に進展しているといえる。分離された鉄酸化細菌は新規性が高いものと推察され、独自性をもちながら研究を進められると期待された。次年度は、鉄酸化細菌E1010株による酸化鉄生成の化学構造と金属イオン吸着特性について、さらに詳細な検討を行って研究成果の完成度を高める。化学構造に関する検討では各培養条件でシュベルトマナイトとゲーサイトの組成比を明らかにする。吸着特性に関する検討では、シュベルトマナイトとゲーサイトへの金属イオンの吸着メカニズムを解析するとともに、pHや温度に対する吸着性能の安定性を調査し、レアメタル回収への適用性を評価する。今後は単離株の増殖に及ぼす培養条件の影響について詳細に調査するとともに、酸化鉄の化学特性の解析を進める。さらに、種々の金属陰イオン(Se, W, Mo, Sb等のオキシ陰イオン)との相互作用を解析し、酸化鉄形成を利用した金属陰イオンの回収効率に及ぼす環境因子を特定する。得られた単離株を用いた培養試験および各種金属イオンとの相互作用解析実験を効率よく進めるために、培養、分析試験の実験補助員を雇用し、研究の一層の推進を図りたい。消耗品としては、遠沈管等プラスチック器具類のほか、ICP-MS用アルゴンガス等を購入する。また成果発表旅費(日本水処理生物学会第50回大会、兵庫県、11月)および研究打合せ旅費(岡山大学、1回、9月)として利用する予定である。
集合値写像の非線形スカラー化手法の研究と数理計画への応用

本研究では,先行研究(基盤研究(C) 19540120)で導入した,集合に対する非線形スカラー化手法の理論的解析と数値計算アルゴリズムの開発を行い,数理計画問題への応用研究を行った。つまり,集合間の大小関係がこのスカラー化関数によって通常の実数の順序関係で保存されることを利用して,集合値写像に対する様々な不等式や不等式に関係した数理的性質を古典的な理論に帰着して導いた。本研究は,先行研究(基盤研究(C)課題番号19540120)で導入した統一的非線形スカラー化手法に関して理論的解析と数値計算アルゴリズムの開発,及び応用研究を行うことを目指すものである。平成21年度に得られた結果は以下の通りである。1.大学院生との共同研究によって,集合値写像に対する統一的非線形スカラー化関数の凸性・半連続性の遺伝的性質に関する結果を得た。特に,実数値の半連続性の概念に当たる性質を集合値写像に一般化して,それらの性質が統一的非線形スカラー化関数で保存される点を世界で初めて明らかにした。現在,その内容を学術論文として投稿中であると同時にその応用研究を行っている。2.非線形スカラー化関数の値を実際に計算するための手法について国内の複数の学会で講演し貴重な意見を頂いた。また,山田准教授及び大阪大学の谷野教授と,大域的最適化問題の外部近似法についての共同研究を行った。特に,DC計画問題に関する結果とリプシッツ最適化問題に対する結果は学術論文として公表できた。3.DEA(包絡分析法)や統計手法を利用して多次元データに関する評価方法の応用研究を行った。また,DEAについて包絡線を自動計算する方法を提案した。現在,論文を投稿中である。4.得られた結果を京都大学数理解析研究所での研究集会や日本オペレーションズ・リサーチ学会,自動制御連合講演会などで発表するとともに台湾で開催された2つの国際会議で口頭発表を行った。平成22年度に得られた結果は以下の通りである。1.大学院生との共同研究によって,集合値写像に対するKy Fanのミニマックス不等式を従来のものより簡潔な表現で与えることができた。その証明には,集合値写像に対する統一的非線形スカラー化関数の凸性と半連続性に関する遺伝的性質が効果的に利用されている。2.上記の応用研究として,集合値写像に対するミニマックス定理とベクトル値関数を目的関数とするDC計画問題に対する研究に取り組み,新規の研究方向につながるような結果を得た。特に,DEAについて効率的フロンティアを生成するファセットを形成する方程式を求めることにより,従来よりも精度の高いクロス効率評価値の近似値を計算できる手法を開発した。4.ベクトル最適化や集合値最適化の数理科学への応用として,半順序空間に値をとる非加法的測度についてのEgoroffの定理とLusinの定理に関する研究に取り組み始めた。5.得られた結果について,京都大学数理解析研究所での研究集会やタイと中国で開催された2つの国際会議(NAO-Asia2010,ICOTA8)で口頭発表を行った。平成23年度に得られた結果は以下の通りである。1.大学院生(D3)との共同研究によって,集合値写像に対する錐凸関数の連続性を証明することができた。2.大学院生(D2)との共同研究によって,ベクトル最適化や集合値最適化の数理科学への応用として,半順序ベクトル空間に値をとる非加法的測度についてのEgoroffの定理とLusinの定理に関する結果が得られた。また,半順序ベクトル空間に値を取るベクトル値関数に対する,Hahn-Banachの定理の別証明を与えた。3.大学院生(M2)との共同研究によって,集合値写像に対するEkelandの変分原理を従来の結果に比べて簡単な形で示すことができた。4.上記の応用研究として,集合値写像に対するミニマックス定理とベクトル値関数を目的関数とするDC計画問題に対する研究に取り組み,新規の研究方向につながるような結果を得た。5.DEA(包絡分析法)や統計手法を利用して多次元データに関する評価方法の応用研究を行った。6.以前行った2規準についての結果を利用して,3規準二人ゼロ和行列ゲームに対する行列の分類について新たな結果を得ることができた。7.得られた結果について,京都大学数理解析研究所での研究集会や韓国で開催された国際会議(NACA2011)で口頭発表を行った。
戦後から高度成長期における定時制高校の生徒文化に関する研究

本研究は、戦後から高度経済成長期における定時制高校の生徒文化の変容を明らかにしようとしたものである。研究対象とした定時制高校の学校文書を主な資料として、生徒文化に関する考察を行った。考察の結果と得られた知見は以下の通りである。戦後の社会変動と教育変動に伴い、定時制高校の学校文化、生徒文化は大きく変容した。戦後の定時制高校における生徒文化の変容の要因に関しては、各時期によって異なり、教員文化の影響もみられたが、最も大きな要因は戦後の社会変動及び教育変動に伴う生徒の社会的属性の変化であった。先行研究において、1950年代前半には、勤労青少年の大衆文化とエリートの教養主義には断絶がみられるとされていたが、本研究で得られた知見では、勤労青少年が通った定時制高校において、教養主義と大衆文化が混在しており、中間的な文化がみられた。したがって、本研究の事例に限れば、エリート文化と大衆文化は断絶しておらず、むしろ連続していたという結論が得られた。本研究の意義に関しては、第一に、これまで研究の空白であった領域を開拓した点、第二に、事例研究ではあるが、先行研究で指摘された知見とは異なる新たな知見を得られた点で研究上の意義があると考えられる。本研究は、戦後復興期から高度経済成長期における公立定時制高校(普通科)における生徒の社会化・自己形成の側面に注目し、生徒の社会的属性、実態と生徒文化の変容を明らかにしようとしたものである。今年度は、前提となる基礎的作業として、先行研究を検討し、定時制高校に関する歴史的研究の課題を整理した。その成果を論考にまとめた。そして、都市型と地方都市型の定時制高校の事例に関して、定時制高校、公文書館、図書館などにおいて資料の収集を行い、地方都市に位置する定時制高校の生徒の社会的属性と生活の実態について考察した。考察にあたっては、『学校要覧』に掲載された生徒に関する統計資料や生徒会の機関紙、学校新聞などの資料をもとにして、歴史的事案を明らかにするという実証的な手法を用いた。考察の結果、明らかになった内容をまとめると表1のように整理することができる。表1-地方都市型定時制高校の変容(1)創設期(19481953年)1)生徒の社会的属性=(1)多数の無職者等、(2)地元勤労青少年2)定時制高校の社会的機能=(1)無職者の受け皿(中卒者の就職難という社会的状況のバッファ機能)、(2)地元勤労青少年の教育(2)発展期(19531960年)1)生徒の社会的属性=(1)地元勤労青少年、(2)無職者等の減少2)定時制高校の社会的機能=(1)地元勤労青少年の教育(3)充実期(19601970年)1)生徒の社会的属性=(1)地元勤労青少年、(2)多数の流入勤労青少年2)定時制高校の社会的機能=(1)地元勤労青少年の教育、(2)流入勤労青少年の教育地方都市型定時制高校の生徒文化に関しては、データの入力作業および分析を行っているところであり、この成果に関しては、次年度の学会において発表し、論文としてまとめる予定である。また、都市型定時制高校と農村型定時制高校の考察に関しても、次年度に行う予定である。本研究は、戦後から高度経済成長期における公立定時制高校(普通科)における社会化の側面に注目し、生徒文化の変容を明らかにしようとしたものである。今年度は、昨年度に引き続き、定時制高校、公文書館、図書館などにおいて資料の収集を行い、主に地方都市に位置する定時制高校の社会的機能と生徒の社会的属性などの変化について考察した。これらの考察の結果を論文にまとめた。また、研究対象とした定時制高校の学校文書を主な資料として、主に地方都市に位置した定時制高校の生徒文化に関する考察を行った。

戦後の定時制高校における生徒文化の変容の要因に関しては、各時期(創設期、過渡期、安定期、転換期)によって異なり、能力別クラス編成などの制度文化の影響や教員文化の影響もみられたが、各時期を通じて、最も大きな要因は戦後の社会変動及び教育変動に伴う生徒の社会的属性の変化であった。先行研究において、1950年代前半には、勤労青少年の大衆文化とエリートの教養主義には断絶がみられるとされていたが、本研究で得られた知見では、勤労青少年が通った定時制高校において、教養主義と修養主義・大衆文化が混在しており、中間的な文化がみられた。したがって、本研究の事例に限れば、エリート文化と大衆文化は断絶しておらず、むしろ連続していたという結論が得られた。本研究の意義としては、第一に、これまで研究の空白であった領域を開拓した点、第二に、事例研究ではあるが、先行研究で指摘された知見とは異なる新たな知見を得られた点で研究上の意義があると考えられる。
粘膜上皮と上皮内樹状細胞の相互作用制御による抗原認識機構の調節

鼻咽腔・鼻粘膜は、外来病原体に対する生体防御の最前線に位置し、その粘膜は自然免疫、獲得免疫において重要な役割を担っている。我々は、感染・アレルギーの免疫機構解明のため、ヒト鼻咽腔粘膜上皮・鼻粘膜上皮における抗原提示機構と上皮バリア機能を解析し、また粘膜上皮と樹状細胞の相互作用についての研究を行った。近年盛んに検証されている舌下免疫療法の基礎的裏づけと,効率的な特異的免疫療法の確立のため,口腔粘膜上皮と樹状細胞の相互作用について検討することを目的とする。生体防御の最前線である口腔・咽頭粘膜では,免疫応答誘導あるいは免疫寛容のための抗原の認識・提示が行われ、この機構には上皮細胞と樹状細胞の相互作用と連携が不可欠である。特に,樹状細胞の活性化や上皮内への突起の伸長の調整は抗原認識に重要な点であろう。今回の研究の特徴は、申請者が開発したテロメラーゼ遺伝子導入培養ヒト粘膜上皮細胞を用い,単に免疫療法の機序解明だけでなく,抗原認識機構の調節により獲得免疫の賦活化や免疫寛容の誘導に結びつけるという将来性のある研究を目指している。〈ヒト口腔粘膜・口蓋扁桃・咽喉扁桃上皮のバリア機能の解析〉ヒト正常口腔粘膜・扁桃上皮のタイトおよびギャップ結合の発現機構の解析正常口腔粘膜・口蓋扁桃・咽頭扁桃上皮に発現していると考えられるタイト結合関連蛋白(claudin-1-14, occludin, ZO-1, JAM-1)およびギャップ結合蛋白を免疫染色,Wbstern blot, RT-PCRなどの手法を用いて,蛋白およびmRNAレベルで発現を検索した.〈テロメラーゼ遺伝子導カン培養口腔粘膜細胞系の確立〉テロメラーゼ活性化により初代培養ヒト口腔粘膜上皮細胞を不死化させ正常ヒト口腔粘膜上皮細胞株を樹立に成功した。この系を用いて、種々の刺激条件でのバリア機能を解析した。<口腔粘膜-扁桃上皮に分布する樹状細胞の性状の解析>抗原提示細胞(M細胞および樹状細胞)と上皮のバリア機能との関係を検索するために,抗原提示細胞の様々なマーカーとタイト結合関連蛋白の2重染色により共焦点レーザー顕微鏡を用いて詳細に題察した.さらに,粘膜下の樹状細胞との性状の違いを紐織学的に検討した<テロメラーゼ遺伝子導入培養口腔粘膜細胞系の確立>テロメラーゼ活性化により初代培養ヒト口腔粘膜上皮細胞を不死化させ正常ヒト口腔粘膜上皮細胞株を樹立に成功した。培養ヒト鼻粘膜上皮と培養ヒト鼻粘膜線維芽細胞とのnoncontact cocluturesystemを用いてin vivoに近い状態での樹状細胞との関連を探った.さらに、種々の分子量の物質の透過性や樹状細胞への物質の取り込みなどの調節機構を探った。この培養上清を用いてリンパ球機能の変化についても検討した。