hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物エンドサイトーシスの細胞膜切断を担う分子装置の同定とその育種利用

昨年度までの研究成果により,陸上植物のエンドサイトーシス小胞形成においては,DRP1,DRP2という分子構造の異なる二種類のダイナミン様タンパク質が,細胞質側に陥入したピット様構造の根元に,直径60nmほどのリング状構造に重合し,次第にその直径を狭めていくことで最終的に細胞膜の切断を実行することを明らかにした.さらに,これらの重合には,方向性が存在することを発見した.これらの成果は,実際の生きた細胞内における細胞膜切断装置の微細構造や特性,そして作動メカニズムを初めて明らかにした研究であり,細胞生物学分野において,大変重要な価値を持つと考えられる.これらの知見を踏まえ,今年度はまずDRP1およびDRP2が,同一のリング状構造に重合するか否かを明らかにするため,両者の細胞膜上における詳細な局在パターンを比較した.この解析には,理化学研究所中野生体膜研究室で開発された多色での超解像観察が可能な共焦点レーザー顕微鏡(Super-resolution Confocal Live Imaging Microscope : SCLIM)を用いた.その結果,細胞膜上における両者のリング状シグナルはよく一致することが明らかになった.さらに,共免疫沈降法を用いて,DRP1とDRP2の分子間相互作用を解析すると,両者は細胞内において結合していることが分かった.これらの結果から,DRP1とDRP2は同一のリング状構造に重合することが示唆された.これまでに異なる分子種のダイナミン様タンパク質が同一の構造体に重合することを示した報告例はなく,これらの成果は,当該分野におけるこれまでの常識を覆す報告であり,大変重要な発見だと考えられる.本研究課題においては,構造化照明を始めとしたという当初の計画にはなかった超解像イメージングの適用により,研究内容に新たな展開を加えることができた.今年度の研究により,得られた主な成果を以下に記す.(1)DRP1とDRP2には分子間相互作用があるDRP1およびDRP2が細胞内で同一の分子装置を構成しているとすれば,両者が結合している可能性も考えられる.そこで今年度は,DRP1およびDRP2の間に直接的な分子間結合が存在するかどうかを,Yeast-two hybrid法,BiFC法,FRET法を用いて検証した.その結果,DRP1とDRP2の間には分子間相互作用が存在することが明らかになった.(2)DRP1とDRP2は細胞膜上でリング状構造を形成するこれまで生体内において,エンドサイトーシスに関与するダイナミン様タンパク質が実際にリング状の構造体を形成するか否かは実証されていない.そこで,全反射照明と構造化照明を組み合わせた超高解像顕微鏡システムを用いて,細胞膜上におけるDRP1およびDRP2の詳細な局在様式を観察した.その結果,DRP1およびDRP2は実際に細胞膜上で内径が60nm程のリング状構造を形成することが分かった.(3)シロイヌナズナSH3P3はDRP1およびDRP2と細胞膜上で共局在する動物のダイナミンと相互作用して機能する主要な分子の一つにAmphiphysinがある.この分子の特徴として,膜の曲率を作り出すために重要なBin-Amphiphysin-Rvs(BAR)ドメインとダイナミンを小胞形成場所へ局在化させるのに必要なSrchomology 3(SH3)ドメインを持つことが挙げられる.そこで本研究では,DRP1およびDRP2を含むエンドサイトーシス小胞形成装置の実体を明らかにすることを目標とし,まずそれらと細胞膜上で相互作用するSH3ドメインを持つ分子の同定に取り組んだ.その結果,シロイヌナズナSH3P3がDRP1およびDRP2と細胞膜上で共局在することが分かった.昨年度までの研究成果により,陸上植物のエンドサイトーシス小胞形成における細胞膜切断には,DRP1およびDRP2という分子構造の異なる二種類のダイナミン様タンパク質が関与することが明らかになった.そこで今年度はさらに,これらのダイナミン様タンパク質が形成する細胞膜切断装置の微細構造とその作動メカニズムを明らかにするため,従来の蛍光タンパク質の使用や試料のライブイメージングが可能な超解像顕微鏡法である構造化照明を全反射照明顕微鏡に組み合わせた光学系を用い,細胞膜上におけるシロイヌナズナDRP1,DRP2の詳細な局在やその挙動を解析した.その結果,DRP1,DRP2は,細胞膜上で外径が60nm程のリング状の構造体に重合することが明らかになった.さらに,このリング状の構造体は,細胞外から見て主に時計回りの方向にDRP1,DRP2が重合することにより形成され,一度その形成が完了するとより小さな直径の構造体に縮合することが分かった.これらの結果は,クラスリン被覆ピットの根元において,DRPがリングもしくはらせん状の構造体に重合し,その直径が収縮することにより,細胞膜を切断するという従来のモデルを支持するものであった.また,興味深いことに,DRP1,DRP2の重合には方向性が存在したことから,エンドサイトーシス小胞形成に機能する細胞膜切断装置には,極性すなわち重合速度の異なる二つの端が存在する可能性が強く示唆された.

これらの成果は,実際の生きた細胞内における細胞膜切断装置の微細構造や特性,そして作動メカニズムを初めて明らかにした研究であり,細胞生物学分野において,大変重要な価値を持つと考えられる.昨年度までの研究成果により,陸上植物のエンドサイトーシス小胞形成においては,DRP1,DRP2という分子構造の異なる二種類のダイナミン様タンパク質が,細胞質側に陥入したピット様構造の根元に,直径60nmほどのリング状構造に重合し,次第にその直径を狭めていくことで最終的に細胞膜の切断を実行することを明らかにした.さらに,これらの重合には,方向性が存在することを発見した.これらの成果は,実際の生きた細胞内における細胞膜切断装置の微細構造や特性,そして作動メカニズムを初めて明らかにした研究であり,細胞生物学分野において,大変重要な価値を持つと考えられる.これらの知見を踏まえ,今年度はまずDRP1およびDRP2が,同一のリング状構造に重合するか否かを明らかにするため,両者の細胞膜上における詳細な局在パターンを比較した.この解析には,理化学研究所中野生体膜研究室で開発された多色での超解像観察が可能な共焦点レーザー顕微鏡(Super-resolution Confocal Live Imaging Microscope : SCLIM)を用いた.その結果,細胞膜上における両者のリング状シグナルはよく一致することが明らかになった.さらに,共免疫沈降法を用いて,DRP1とDRP2の分子間相互作用を解析すると,両者は細胞内において結合していることが分かった.これらの結果から,DRP1とDRP2は同一のリング状構造に重合することが示唆された.これまでに異なる分子種のダイナミン様タンパク質が同一の構造体に重合することを示した報告例はなく,これらの成果は,当該分野におけるこれまでの常識を覆す報告であり,大変重要な発見だと考えられる.構造化照明という先駆的なイメージング技術を用いることにより,ダイナミン様タンパク質が形成する細胞膜切断装置の微細構造や特性,そしてその作動メカニズムを世界に先駆けて解明した.これは,細胞生物学上極めてインパクトのある発見であり,当初の研究計画を超えた大きな進展と言える.本研究課題においては,構造化照明を始めとしたという当初の計画にはなかった超解像イメージングの適用により,研究内容に新たな展開を加えることができた.今年度の重要な研究成果の一つに,ダイナミン様タンパク質からなる細胞膜切断装置には,極性,すなわち重合速度の異なる二つの端の存在を明らかにしたことが挙げられる.そこで今年度は,細胞膜切断装置におけるこの極性の維持や発生を司る分子ネットワークを解明するため,DRP1およびDRP2と相互作用する因子の生化学的な手法を用いた同定を試みる.また,細胞膜切断装置内におけるDRP1およびDRP2の立体配置を明らかにするため,DRP1およびDRP2の生細胞内における結合をより詳細に検証する.
イネ-ヒエ間高度選択性除草剤開発に向けての基礎的研究

キンクロラックに対して感受性を示すイヌビエでは、処理後にエチレンの前駆物質である1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)含量の増加やACC合成酵素活性の増大、またそれに伴うエチレン発生量の増加、シアン化物の蓄積が起こる。これに対し、抵抗性を示すイネでは、これらの増大や蓄積が起こらないことから、キンクロラックの両植物種間での高い選択性は、主にエチレン生合成系の反応の差に起因するシアン化物蓄積量の差により引き起こされていると推定されている。これまで我々は、キンクロラックに対して感受性を示すトウモロコシやタイヌビエでは、光照射下において本剤の作用が増強することから、光で増加する葉部での活性酸素等が作用発現に関与している可能性を示唆し、さらに、本剤によるイネ-タイヌビエ間の高度選択性の発現に両植物種間での抗酸化能の差も関与している可能性があることを報告してきた。しかし、キンクロラックの生育抑制作用は、光照射下で増強されるものの、暗条件下でも、ある程度起こることが観察されていた。そこで本年度は、キンクロラックの作用メカニズムの詳細を解明することを目的として、本剤の暗条件下での症状と生育抑制作用の有無、そして、生育抑制作用が確認された場合、その要因について検討を行った。その結果、本剤の生育抑制作用は光照射下だけでなく、暗条件下でも引き起こされることが実際に示された。また、共焦点レーザー走査顕微鏡によって、本剤処理後の根部観察(活性酸素発生の検討)を行った結果、キンクロラック処理15時間後のトウモロコシ根部からは、強い蛍光が認められた。活性酸素検出の蛍光プローブとしては、dihydroethidium(DHE)を用いて根部染色を行ったが、DHEは、活性酸素種の中でもO_2^<-^.>をより特異的に検出するとされている。このため、本剤は根部処理15時間後には、すでに根部でO_2^<-^.>発生を引き起こしていることが考えられる。このことから、キンクロラックの暗条件下での生育抑制作用には、この根部における活性酸素発生が密接に関与している可能性がある。これまで、キンクロラックは、葉部でのみ活性酸素発生を引き起こすことが示されていたが、本研究により、初めて、根部においても活性酸素発生が引き起こされている可能性が示された。また、活性酸素種は反応性が高く捕らえにくいが、この実験手法は、今後、さまざまな薬剤による根部での活性酸素発生の検討に役立つと思われる。現時点で高い選択性を有する除草剤の作用機構ならびに選択作用機構を理解することは、さらに高度な選択性除草剤を開発する上で重要不可欠な知見となる。キンクロラックは、すでにイネ-ヒエ間に非常に高い選択性を示すことが知られている水稲用除草剤である。しかしながら、キンクロラックのイネ科植物における作用機構やイネ-ヒエ間選択性発現機構の詳細は、未だ明らかとなっていない。本研究では、キンクロラックのイネ科植物間、特にイネ-タイヌビエ間における選択性発現機構の詳細を調べることにより、高い選択性を発揮する諸要因を分子レベルで明らかにすることを目的としている。本年度は、キンクロラックの高い選択作用性にイネ科植物間における抗酸化能の差異が関与している可能性について検討した。供試植物は、キンクロラックに対して感受性が異なる5種のイネ科植物(イネ、トウモロコシ、イヌビエ、ヒメタイヌビエ、タイヌビエ)を用い、それらのキンクロラックによる酸化傷害の程度と、抗酸化酵素活性(スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)、グルタチオンリダクターゼ(GR))との関連を検討した。その結果、本剤に対して耐性を示すイネでは、いずれの抗酸化酵素活性においても、先天的に高い活性を有していたが、感受性の高いイヌビエ、ヒメタイヌビエ、ダイヌビエではいずれの活性においても先天的に非常に低く、中程度の感受性を示すトウモロコシでの抗酸化酵素活性は、ほぼそれらの中間の活性を示していた。特に、それら5種間でのAPX、GR活性は、本剤処理後のクロロフィル含量の減少と負の相関が認められた。これらの結果や本剤処理後の脂質過酸化、抗酸化物質による軽減効果等の実験から、本剤のイネ科植物間における高い選択作用性には、活性酸素の発生と消去系が関係しており、それらの差により本剤の選択性が高められていると推察された。また、薬剤処理後の活性酸素種の発生ついては、現在、化学発光法やESRによる検出を試みている。しかしながら、本剤のイネ科植物における作用機構やイネ-ヒエ間選択性発現機構の詳細は、未だ明らかとなっていない。本年度は、キンクロラックの作用発現に活性酸素種の発生が関与している可能性について検討するため、まず、植物体内で発生する活性酸素分子種の同定と定量法についての検討を行った。活性酸素分子種は、非常に高い反応性を有し生体成分とも素早く反応するため、実際に植物体内で生じる活性酸素分子種を同定・定量することは難しく、報告例も少ない。そこで、本年度は化学発光法や電子スピン共鳴(ESR)法を用いて植物体内で発生する活性酸素分子種(O^・_2^-、・OH、H_2O_2)の測定法について検討した。

色素成分の分離能の異なる強陰イオン交換カラムの充填剤を用いて、光強度の差異から生じるH_2O_2量の差を化学発光量として検出できるか検討した結果、充填剤の粒径を一定以下に下げて分離能を高めた場合、H_2O_2が検出可能となることが明らかとなった。さらに、この条件下で活性酸素発生剤であるパラコート(PQ)をイネ幼植物に処理し、化学発光量を測定したところ、明らかなH_2O_2量の増大が認められた。しかしながら、本条件では、植物種によってはカラム条件の更なる変更が必要であることがわかった。これは植物種によっては光照射やストレス等により色素成分の増大を伴いやすいものがあり、それらによってH_2O_2による化学発光が抑制されるためであると考えられる。ESR法による活性酸素分子種の検討ついては、ホウレンソウ葉部から、包膜を持ったIntact葉緑体と包膜が破壊されチラコイド膜が露出した状態のBroken葉緑体を調整し、それらから発生する活性酸素種の検討を行った。Intact葉緑体からは、PQ添加によるO^・_2^-のシグナルは検出できなかったが、・OHのシグナルは検出された。また、Broken葉緑体を用いた場合、PQ添加により明らかなO^・_2^-のシグナルが検出できることが明らかとなった。キンクロラックに対して感受性を示すイヌビエでは、処理後にエチレンの前駆物質である1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid(ACC)含量の増加やACC合成酵素活性の増大、またそれに伴うエチレン発生量の増加、シアン化物の蓄積が起こる。これに対し、抵抗性を示すイネでは、これらの増大や蓄積が起こらないことから、キンクロラックの両植物種間での高い選択性は、主にエチレン生合成系の反応の差に起因するシアン化物蓄積量の差により引き起こされていると推定されている。これまで我々は、キンクロラックに対して感受性を示すトウモロコシやタイヌビエでは、光照射下において本剤の作用が増強することから、光で増加する葉部での活性酸素等が作用発現に関与している可能性を示唆し、さらに、本剤によるイネ-タイヌビエ間の高度選択性の発現に両植物種間での抗酸化能の差も関与している可能性があることを報告してきた。しかし、キンクロラックの生育抑制作用は、光照射下で増強されるものの、暗条件下でも、ある程度起こることが観察されていた。そこで本年度は、キンクロラックの作用メカニズムの詳細を解明することを目的として、本剤の暗条件下での症状と生育抑制作用の有無、そして、生育抑制作用が確認された場合、その要因について検討を行った。その結果、本剤の生育抑制作用は光照射下だけでなく、暗条件下でも引き起こされることが実際に示された。また、共焦点レーザー走査顕微鏡によって、本剤処理後の根部観察(活性酸素発生の検討)を行った結果、キンクロラック処理15時間後のトウモロコシ根部からは、強い蛍光が認められた。活性酸素検出の蛍光プローブとしては、dihydroethidium(DHE)を用いて根部染色を行ったが、DHEは、活性酸素種の中でもO_2^<-^.>をより特異的に検出するとされている。このため、本剤は根部処理15時間後には、すでに根部でO_2^<-^.>発生を引き起こしていることが考えられる。
自閉スペクトラム症児の「聞き取り」と「読み取り」の困難さの要因を探る実証研究

言語を獲得することができ、就学後通常の学級に通う自閉スペクトラム症(ASD)児の中には、聞き取りが困難である子どもや、独立した単語は理解できても、文章理解(読み取り)が難しいといった子どもが少なからずいる。しかしこれまで国内ではASD児の聞き取りの困難さにつながる認知特性に関する研究は非常に少なく、体系的な実証研究はほぼ皆無である。そこで我々はASD児の音韻知覚の特異性を示唆する新たな研究結果を受け、国内のASD児を対象に、音韻知覚の特異性が、語や文の構造理解のつまずきや、授業における学年相当の「聞き取り」と「読み取り」の困難さの要因となるかどうかを検証する。
難分解性有機物を直接処理する促進酸化プロセス(AOP)の開発に関する研究

本研究では生物難分解性有機物として自然界に,特に水道水源中に広く存在が見られるフミン酸と,塩素消毒の結果生成する有機塩素化合物の例としてトリクロロエチレン(TCE),1,1,1-トリクロロエタン(1,1,1-TCE)を取り上げ,実験室規模の反応器を作成し,オゾン,過酸化水素水,紫外線を組み合わせた促進酸化処理プロセスの処理特性ならびに反応機構について検討した。オゾン単独処理では,フミン酸の脱色過程がMichaclis-Menten型の式で表現が可能であり,その反応速度定数は単位時間に送入するオゾン量に,半飽和定数はフミン酸初期濃度に比例することを明らかにした。また,TCEは30分間で91.7%分解されたが,1,1,1-TCEは全く分解が見られなかった。これに対してオゾン-過酸化水素併用処理ではオゾン単独処理では分解できなかった1,1,1-TCEが30分間で22.2%分解され,TCEの反応速度もオゾン単独処理の1.5倍に増加することが確認された。また,オゾン-紫外線併用処理ではフミン酸の色度除去はもちろんのこと,4.7W以上の紫外線強度でTOCが95%以上無機化されることが明らかになり,TOC無機化率はオゾン単独処理の2倍に達した。オゾン単独処理ではフミン酸が有機酸までしか酸化されないのに対し,オゾン-紫外線併用法では有機酸の酸化分解が起こっていることがpHの変動から推測されたことから,このTOC無機化率の向上は主に有機酸の酸化分解の有無によるものと考えられた。TCE,1,1,1-TCEの処理においても,30分間のオゾン-紫外線併用処理で分解率がそれぞれ97.8%,53.2%となり明らかな処理性能の向上が確認された。以上の結果,難分解性有機物処理において促進酸化プロセスが有効性が示され,特にオゾン-紫外線併用処理の効果が大きいことが明らかとなった。本年度は、生物難分解性有機物の例として自然界に、特に水道水源中に広く存在が見受けられるフミン酸を取り上げ、これの促進酸化プロセスに関する基礎的情報を文献より収集するとともに、実験室規模の反応器を作成し、オゾン単独処理処理およびオゾン紫外線併用処理での各々の反応特性並びに反応機構について検討するとともに、促進酸化処理を行うことの効果について検討した。オゾン単独処理に関して、挿入オゾン別におよびフミン酸所期濃度別にオゾン単独処理実験(脱色実験、無機化実験)を行ない、この反応はフミン酸の原型(色度成分)の濃度に関するMichaelis-Menten型の式で表現が可能なこと、またその反応速度定数は単位時間に送入するオゾン量に、半飽和定数はフミン酸初期濃度に比例することを明らかにした。しかしTOCは43%以上は無機化されないことも示した。これに対してオゾン-紫外線併用法では、色度成分は紫外線強度に関係なく除去されるが、紫外線を併用することにより、紫外線強度4.7W以上ではTOCを95%以上分解されることを実験結果として得た。また、オゾン単独処理後ではpHは低下したままであるが、紫外線を併用することにより処理水のpHは一度低下するもののその後に回復することも明らかにした。これらの結果よりオゾン単独処理ではフミン酸は有機酸までは酸化されるもののそれ以上の酸化分解は行われないこと、促進酸化法により有機酸の分解までなされることを示し、反応の動力学的特性を明らかにした。また紫外線を併用することにより、オゾンの消費率が90%と高く維持されることを示し、促進酸化プロセスの効率性についても明らかにした。

本研究では生物難分解性有機物として自然界に,特に水道水源中に広く存在が見られるフミン酸と,塩素消毒の結果生成する有機塩素化合物の例としてトリクロロエチレン(TCE),1,1,1-トリクロロエタン(1,1,1-TCE)を取り上げ,実験室規模の反応器を作成し,オゾン,過酸化水素水,紫外線を組み合わせた促進酸化処理プロセスの処理特性ならびに反応機構について検討した。オゾン単独処理では,フミン酸の脱色過程がMichaelis-Menten型の式で表現が可能であり,その反応速度定数は単位時間に送入するオゾン量に,半飽和定数はフミン酸初期濃度に比例することを明らかにした。また,TCEは30分間で91.7%分解されたが,1,1,1-TCEは全く分解が見られなかった。これに対してオゾン-過酸化水素併用処理ではオゾン単独処理では分解できなかった1,1,1-TCEが30分間で22.2%分解され,TCEの反応速度もオゾン単独処理の1.5倍に増加することが確認された。また,オゾン-紫外線併用処理ではフミン酸の色度除去はもちろんのこと,4.7W以上の紫外線強度でTOCが95%以上無機化されることが明らかなり,TOC無機化率はオゾン単独処理の2倍に達した。オゾン単独処理ではフミン酸が有機酸までしか酸化されないのに対し,オゾン-紫外線併用法では有機酸の酸化分解が起こっていることがpHの変動から推測されたことから,このTOC無機化率の向上は主に有機酸の酸化分解の有無によるものと考えられた。TCE,1,1,1-TCEの処理においても,30分間のオゾン-紫外線併用処理で分解率がそれぞれ97.8%,53.2%となり明らかな処理性能の向上が確認された。以上の結果,難分解性有機物処理において促進酸化プロセスが有効性が示され,特にオゾン-紫外線併用処理の効果が大きいことが明らかとなった。
遺伝子工学的手法による神経並びに筋細胞のバンクシステムと診断キットの開発

ヒト神経筋疾患の診断には、生検筋の組織学的、組織化学的、生化学的検索が必要である。さらにDuchenne型筋シストロフィ-、ミトコンドリアミトパチ-にみられるように、遺伝子異常が明らかにされた疾患にはDNA解析が不可欠となっている。このような多岐にわたる検索を全て一施設で行うことは、不可能に近い。この問題を解決のために、我々は全国レベルの診断システムを作ることを心がけ、また、生検材料はバンク化し、多くの研究者に自由に貸出を行い、研究の推進の為に役立てた。我々が意図した診断のシステム化は最初の目的の通り達成された。年間400を越える全国から送られ検体に対して、組織化学的検索を行い、必要な例には電顕的検索も行った。また生化学的検索は我々の研究所だけでなく、全国各大学との協力体制のもとに完璧を期した。Duchenne型ジストロフィ-、ミトコンドリアミオパチィ-については、分子生物学的研究レベルの研究を行うことが出来た(Goto et al,1990)。現在、神経筋疾患の診断は世界でトップレベルで行うことが出来るようになった。バンク化した、組織、培養細胞を用いて多くの研究が成された。特に、検索検体数の4分の1を占めるミトコンドリアミオパチ-については、分子生物学的研究、組織化学的研究(Yamamoto et al 1989,Koga et al.1989,Nonaka et al 1990)がなされ、筋培養細胞についての分子生物学的研究も進行中である(Kikuchi et al 1990)。生検材料(皮膚、筋)の一部は培養系に移され、その細胞はバンク化している。そのバンク化した細胞でも多くの研究が成された(Kikuchi et al 1988,1990)。また、その保存法技術的な面にも、改善、検討を加えた(Kikuchi et al 1990)。本研究によって、我々は神経筋疾患の診断システムを全国的で確立させ、組織、細胞バンクを充実させ、臨床家に対する診断援助だけでなく基礎研究者に対しても研究の推進に大きく寄与した。(1)ミトコンドリアDNA欠失を伴う家系を世界で初めて提出できた。このミトコンドリアDNA欠失は、母子間で検出されたが、共通の欠失部位と相異なる欠失部位がある。(BBRC、154:1240、1988)現在、細胞レベルでのミトコンドリアDNAの検討を培養皮フ繊維芽細胞、筋細胞で行っている。(2)ミトコンドリアDNAと核DNAにコードされた遺伝子廃物から構成されるミトコンドリア酵素、そうした特異な性格を持つ酵素に活性異常(低下又は欠損)を呈するミトコンドリア脳筋症についてa、皮フ、筋ともにミトコンドリア酵素活性低下を認める例、b、筋にのみ異常と有する例、c、単細胞の筋細胞には活性が認めるが筋管形成を認める例について、いずれもミトコンドリアDNAの異常を認めなかったが現在培養皮フ繊維芽細胞と培養筋細胞よりmRNAを抽出し、ミトコンドリアDNA及び核コードのミトコンドリア酵素に対応するchromisomal DNA probeを用いて、Norther法による解析の準備を始めた。

(3)筋細胞は、培養して、再構成された筋管において、CCO(cyfochrome c-osidase)を指標とすると、活性染色される筋管とされない筋管との2つの系列に分かれることが分かった。(4)皮膚繊維芽細胞も、モザイシズムを活性染色で示すことがあることがわかった。3、4は、電顕cco染色による観察結果である。ヒト神経筋疾患の診断には、生検筋の組織学的、組織化学的、生化学的検索が必要である。さらにDuchenne型筋ジストロフィ-、ミトコンドリアミトパチ-にみられるように、遺伝子異常が明らかにされた疾患にはDNA解析が不可欠となっている。このような多岐にわたる検索を全て一施設で行うことは、不可能に近い。この問題を解決のために、我々は全国レベルの診断システムを作ることを心がけ、また、生検材料はバンク化し、多くの研究者に自由に貸出を行い、研究の推進の為に役立てた。我々が意図した診断のシステム化は、最初の目的の通り達成された。年間400を越える全国から送られた検体に対して、組織化学的検索を行ない、必要な例には電顕的検索も行った。また生化学的検索は我々の研究所だけでなく、全国各大学との協力体制のもとに完璧を期した。Duchenne型ジストロフィ-、ミトコンドリアミオパチィ-については、分子生物学的研究レベルの研究を行うことが出来た(Goto et al,1989,Nanaka et al1990)。現在、神経筋疾患の診断は世界でトップレベルで行うことが出来るようになった。バンク化した、組織、培養細胞を用いて多くの研究が成された。特に、検索検体数の4分の1を占めるミトコンドリアミオパチ-については、分子生物学的研究、組織化学的研究(Yamamoto et al.1989,Koga et al.1989,Nonaka et al 1990)がなされ、筋培養細胞についての分子生物学的研究も進行中である(kikuchi et al 1990)。生検材料(皮膚、筋)の一部は培養系に移され、その細胞はバンク化している。そのバンク化した細胞でも多くの研究が成された(Kikuchi et al 1988,1990)。また、その保存法技術的な面にも、改善、検討を加えた(Kikuchi et al 1990)。本研究によって、我々は神経筋疾患の診断システムを全国的で確立し、組織、細胞バンクを充実させ、臨床家に対する診断援助だけでなく基礎研究者に対しても研究の推進に大きく寄与した。
強磁性半導体ヘテロ構造-物性制御と応用

前年度に引き続き、3元および4元混晶のIII-V磁性半導体とヘテロ構造の形成と制御およびその応用につき、以下の研究を行った。1.3元混晶(GaMn)As,4元混晶(GaInMn)As磁性半導体、MnデルタドープGaAsの磁気特性(保持力、残留磁化、飽和磁化、磁気抵抗、ホール抵抗など)の最適化と制御の研究を行った。2.上記磁性半導体を含むヘテロ構造を作製した。3.MnデルタドープGaAsおよびそのヘテロ構造については、強磁性とともに大きな磁気光学効果を示すことがわかった。そのスペクトル、磁場依存性の詳細な評価と解析を行った。4.MnデルタドープGaAsおよびそのヘテロ構造の断面TEMによる詳細な構造評価を行い、閃亜鉛鉱型半導体構造を保っていることがわかった。5.MnデルタドープGaAsおよびそのヘテロ構造のプレーナホール効果と磁気異方性を明らかにした。および4元混晶のIII-V磁性半導体とヘテロ構造の形成と制御およびその応用につき、以下の研究を行った。・3元混晶(GaMn)As,4元混晶(GaInMn)As磁性半導体、MnデルタドープGaAsを分子線エピタキシーにより成長し、その磁気特性(保持力、残留磁化、飽和磁化、磁気抵抗、ホール抵抗など)の評価を行った。・上記磁性半導体を含むヘテロ構造を作製した。・低温アニール処理による欠陥制御、キャリア濃度と強磁性転移温度の高温化を試みた。・磁気円2色性(MCD)測定により磁気光学特性を明らかにした。MnデルタドープGaAsおよびそのヘテロ構造では大きな磁気光学効果を示し、GaAsと同様の閃亜鉛鉱型バンド構造をもつことがわかった。
部分設問群を用いた系統誤差評価に基づく国際的通用性のある教育効果分析法の構築

本研究では,FCIの妥当性を系統的誤差として定量化し,その振る舞いを分析した。我々が着目した系統的誤差は,偽正答に由来するものである。偽正答の判定にあたっては,部分設問群を用いた。部分設問群を作成した設問には,以前の聞き取り調査で偽正答が見出された問6,7,16に加えて,調査対象としなかった設問についての概算のために問5を含めた。分析の結果,FCIの得点およびその平均規格化ゲインについての系統的誤差は真値と同程度の値に達することを明らかにした。また,問6, 7, 16についての真正答率とFCI30問の生正答率の関係において閾値が存在することを明らかにした。本研究課題は、前研究課題から継続的に取り組んでいるものである。そのため平成26年度は、前研究の調査データを本研究課題の目的に基づいて再分析することから始めた。具体的には、部分設問群の妥当性評価を目的として、調査した大学間で、部分設問群を用いた分析結果にどのような違いが見られるかを調べた。その結果、調査したFCIの設問すべてについて、分析結果に大学間の違いは見られず、部分設問群を用いた分析に一定の妥当性があることが確認された。このほか、前研究の未公表成果も合わせて論文としてまとめ、「物理教育」誌から出版した。2.FCIの系統誤差を分析し、国際会議で発表した。これまでの研究では、判明した不備がFCI総得点に与える影響を定量的に評価することができていないなどの問題点があった。そこで我々は、設問の不備を定量化して系統誤差として表現し、FCIの妥当性を評価することを試みた。具体的には、FCIの単純な正答率を「生の得点」、部分設問群の正答率を考慮したFCIの正答率を「真の得点」とし、それら2変数について回帰分析を行った。分析においては、線形近似、および健全な設問の一様性を仮定した。その結果、偽正答による系統誤差はFCIのクラス平均値に30%以上の補正を与えることが明らかになった。さらに、この補正が平均規格化ゲインに与える影響を分析した結果、同ゲインは線形変換の下で不変であるため、同ゲインへの系統誤差からの補正は、近似の2次以上の項から与えられることが明らかになった。この成果は、物理教育国際会議(International Conference on Physics Education, ICPE)2014で公表し、国際的に理解されることを確認した。物理教育の効果を測定するための指標の一つとして,学習者の力学概念の測定を目的にしたForce Concept Inventory(FCI)である.FCIの妥当性は様々な観点から評価されているが,ほとんどの研究はFCIの設問が妥当であるか,ないかという二元論的な評価方法を採っている.このようなアプローチでは,ある設問が妥当でないと判定されたとしても,その設問の非妥当性がFCIの総得点等に与える影響がどの程度なのか判然としないという問題があった.そこで本研究では,FCIの妥当性を系統的誤差として定量化し,ある設問の非妥当性がFCIの正答率や平均規格化ゲインに与える影響を分析した.妥当性評価の観点として我々が着目したのは偽正答である.偽正答の判定においては,部分設問群(Subquestions)の方法を用いた.部分設問群を作成した設問はFCI全30問中4問に限られる.4問中3問は,前研究の聞き取り調査で偽正答が得られたすべての設問(invalid-likeな設問)であり,残る1問は同調査で偽正答が得られなかった設問(valid-likeな設問)から選び出したものである.この1問についての調査結果は,本調査で部分設問群を作成しなかった26問の系統的誤差を概算する際に用いた.分析の結果,概算で用いるfitting関数次第であるが,FCIの真正答率が生正答率の半分以下に達すること,また,真の平均規格化ゲインが生の平均規格化ゲインの半分程度に達することが明らかになった.さらに,invalid-likeな設問3問には,生スコアと真正答率の関係に閾値が存在するが,valid-likeな設問1問には,同様の閾値が存在しないことが明らかになった.その閾値は,conceptual threshold,mastery thresholdと呼ばれる閾値にほぼ一致した.本研究では,FCIの妥当性を系統的誤差として定量化し,その振る舞いを分析した。平成26年度においては、研究の目的で示した「部分設問群の妥当性評価」および「系統誤差の複合的な変数への影響評価」について、公表可能な段階の成果が得られた。

実際に、「部分設問群の妥当性評価」については論文として公表し、「系統誤差の複合的な変数への影響評価」については国際会議で発表するなど、それぞれの成果について公表を遂げた。さらには、平成27年度においても、4月初旬に調査をすでに済ませ、現在分析に着手している。以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると評価できる。物理教育研究平成27年度においては、4月初旬に調査をすでに済ませ、現在分析に着手している。この分析においては、系統誤差の特性評価を行い、さらには、FCIの不確実さを取り込んだ教育効果分析法について検討する予定である。この成果は、研究論文として、Physical Review ST Physics Education Researchに投稿することを予定している。
事業継続のためのミッションマネジメントに関する研究

主たる研究成果は以下の通りであり、これらの成果は学術誌並びに国際会議を通して公表した。1)プロジェクトエンジニアリング業務における価値連鎖構造の解明とシステム化2)プログラムマネジメントとしての事業継続における価値連鎖構造の解明3)ミッションマネジメント手法の確定とミッションマネジメントツールの開発主たる研究成果は以下の通りであり、これらの成果は学術誌並びに国際会議を通して公表した。1)プロジェクトエンジニアリング業務における価値連鎖構造の解明とシステム化2)プログラムマネジメントとしての事業継続における価値連鎖構造の解明3)ミッションマネジメント手法の確定とミッションマネジメントツールの開発平成21年度の成果は、以下の通りである。1.プロジェクトエンジニアリング業務における価値連鎖構造の解明価値連鎖を阻害するプロジェクトトラブルに着目して、エンジニアリング振興協会が収集した1035件のトラブルに関して、業務プロセスを通した伝播構造の解明を行った。この結果、同じトラブル原因であってもプロセスの途中で伝播を阻止する構造があることが判明した。今後は、この構造から"負の価値連鎖"構造を解明すると共に、エンジニアリング企業内において如何にレッスン&ラーンが行われ、非金銭的価値(トラブル経験の形式知化)の創造と経営活動における金銭的価値(トラブルによるロスの低減)の創造が為されたかを調査する。2.ミッションマネジメント手法の確定コンセプトには2つのパート、(1)プラスパート:ミッション成功に貢献、(2)マイナスパート:ミッションの成功を阻害があり、その両パートの関係の把握と維持がコンセプト形成に関して重要であることがわかった。このため、コンセプトをAHP法における評価項目とし、プロジェクト・フェーズ間におけるコンセプトプラス・マイナスパート間の因果関係を内部制約、外部制約とすることで、ミッション実施の際の不整合を計画段階で把握する手法を考案した。今後は、ツール化を行う。平成22年度の成果は、以下の通りである。【ミッションマネジメント手法の確定】プロジェクトミッションのコンセプトを明確なものとして、それをプロジェクト運営期間中維持することは、サステナビリティを配慮したプロジェクト運営に不可欠である。平成21年度は、コンセプトには2つのパート、1)プラスパート:ミッション成功に貢献2)マイナスパート:ミッションの成功を阻害があり、その両パートの関係の把握と維持がコンセプト形成に関して重要であることがわかった。このため、平成22年度は、上記(3)ミッションマネジメントの確定と制度化を中心に検討を進め、特にプラスパートとマイナスパートを明確化し、両者の関係性を可視化するための手法の開発を行うこととする。(1)プロジェクトエンジニアリング業務における価値連鎖構造の解明(2)事業継続における価値連鎖構造とプロジェクトマネジメント活動間の価値連鎖構造の解明(3)ミッションマネジメントの確定平成23年度の成果は、以下の通りである。【ミッションマネジメント・ツールの開発とミッション達成のための人的資源配分】プロジェクトミッションのコンセプトを明確なものとして、それをプロジェクト運営期間中維持することは、サステナビリティを配慮したプロジェクト運営に不可欠である。このため、平成23年度は、プロトタイプソフトウエアの開発とミッションを成功させるための人材配分方法に関して研究を進めた。(1)ミッションマネジメント・ツールの開発ミッションに合わせて製品の設計から使用に至る複数の関係者が評価指標を明示した討議を通して、製品コンセプトを維持しつつ夫々の立場で意思決定を支援するツールが不可欠である。このため、PC上のExcelマクロとして、プラス並びにマイナス評価パートを持つ意思決定ツールのプロトタイプを作成し、現場で複数の設計者が意見を集約しながら使用することを想定して、iPadやiPhoneで作動するアプリを試作した。(2)プロジェクトエンジニアリング業務における人材配分構造の解明技術や人的資源の経営的管理問題を人的資源の適切な配置・配分に関する問題として考察し、これを要求(量と質)と利用可能資源(量と質)の関係に一般化することで、熱エネルギーの有効利用手法として広く利用されているピンチテクノロジーがインプリケーションできることを明らかとした。
移植治療への応用を目指した機能性３次元積層リンパ管組織のエンジニアリング

三次元人工組織の構築が可能な細胞集積法により構築した人工ヒト脈管組織は移植可能であり、再生医療への応用が期待される。本研究では人工組織移植によるリンパ管再生医療を目指し、ヒト線維芽細胞とリンパ管内皮細胞を材料とした人工リンパ管網組織(AHLT)の構築、マウスへの移植、並びに治療効果の検証を目的とした。AHLTはヌードマウス皮下および筋膜上に生着し、人工リンパ管は毛細リンパ管の機能形態を有していた。これに加えヒトマーカー陽性の小血管様構造の生着も認められ、リンパ管-血管転化を含む脈管リモデリングを見出した。さらにリンパ節郭清モデルへのAHLT移植では、リンパ流路再生誘導を示唆する結果を得た。細胞集積法によりヒト皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて作製した三次元血管ネットワーク組織について、ヌードマウス背部皮下への移植を行い、生着後の脈管構造について形態学的な解析を行った。ヒトCD34陽性の血管ネットワークの生着とホスト血液の流入を確認した他、ホスト血管との吻合部ではヒトCD34陽性の脈管と陰性の脈管がモザイク状に分布し、wrapping-and-tappingによる吻合構造が示唆された。生着したヒト脈管構造の光顕・電顕による観察では、ラミニン陽性の基底膜の形成、alpha smooth muscle actin陽性のペリサイト様細胞の付着を確認し、毛細血管構造の成熟が強く示唆された。本成果については、現在論文投稿中となっている。また、ヒト皮膚線維芽細胞およびヒト皮膚リンパ管内皮細胞を用いて構築した三次元リンパ管ネットワーク組織について、ヌードマウス背部皮下、および筋膜上への移植を行った結果、ヒトpodoplanin等、ヒトリンパ管マーカー陽性のリンパ管が開存して生着していた。また、一部ではalpha smooth muscle actin陽性の平滑筋様細胞の付着がみられ、集合リンパ管様構造の形成が示唆された。以上のように、細胞集積法によりIn vitroで構築した人工脈管は、生体に移植した後、In vivoの微小環境下で生体の血管およびリンパ管の機能構造を成熟させる可能性を示していた。改善の余地はあるが、細胞集積法により作製した人工脈管ネットワーク組織の移植の条件について手技を確立した。(2)同手法で作製した人工ヒトリンパ管ネットワーク組織のヌードマウスへの移植については、背部、臀部、腹壁の皮下および筋膜上、さらに腋窩、膝窩への生着を確認した。また、レシピエント組織との同化に伴うヒト細胞の増殖と組織構築を確認した。光顕および電顕による解析では、生着したヒトリンパ管は毛細リンパ管様の形態を示し、一部に平滑筋アクチン陽性の平滑筋様細胞の付着を認めた。さらに興味深いことに、生着した人工ヒトリンパ管の近傍で血管ネットワークが形成されることを見出した。これらはヒト血管内皮マーカーに陽性を示し、平滑筋様細胞が壁細胞様に管腔を取り巻いて小血管に類似した構造を形成していた。さらに、血液の流入が認められたことから宿主循環系との吻合が強く示唆された。これらより、人工リンパ管の生着と、リンパ管-血管転換を含む機能的な成熟を示す結果を得た。(3)マウスリンパ浮腫モデルの作製を目的として膝窩リンパ節および腸骨下リンパ節の郭清を行い、後肢の腫脹によるリンパ浮腫の形成を確認した。同時に、ICGの投与とIn vivoイメージングにより、足底-膝窩-臀部(外側仙骨リンパ節)に至るリンパ流を可視化した。しかし、上記リンパ浮腫は側副流路の形成により早期に回復することが判った。本モデルを人工脈管組織移植によるリンパ浮腫治療評価系として用いるためには、更なる浮腫症状の誘導を要する。本研究課題では、当初In vitro組織構築での遺伝子導入による人工血管/リンパ管構造の改良とリンパ浮腫治療への応用を目的としていた。しかしこれまでの結果から、改変を加えていないヒト線維芽細胞とリンパ管内皮細胞から成る人工脈管組織の皮下/筋膜上移植により、脈管構造が生体内で予想以上に機能形態的に成熟しうることが判った。近年の人工組織を用いた再生医療研究では、生体内微小環境における組織同化と形態的・機能的成熟についての報告も多くみられる。さらに人体への移植も鑑みて、本人工脈管組織の再生医療への応用に関しては、遺伝子導入によるin vitroでの脈管構造改善に比べ、移植後のレシピエント生体内成熟の検討がより有効であるという方針に至った。現在、移植後に生体内成熟を経た人工ヒト血管およびリンパ管の機能形態、宿主脈管系との吻合、リンパ液排導機能、およびリンパ管-血管転換機構について解析を進めている。マウスリンパ浮腫モデルの作製については、膝窩リンパ節郭清後の後肢腫脹とin vivoリンパ流イメージングによる評価系を開発しているが、人工脈管組織移植の効果を検討するには更なる浮腫症状誘導のための方策を要する。[1]細胞集積法を用いてヒト新生児皮膚由来線維芽細胞(NHDF)および同由来リンパ管内皮細胞(HDLEC)を材料とした人工ヒト三次元リンパ管網組織を作製し、ヌードマウス皮下および筋膜上への人工リンパ管網組織移植の手技を確立した。[2]人工ヒトリンパ管網組織の筋膜上移植生着後の組織学的な解析を行ったところ、人工ヒトリンパ管の生着を確認したことに加え、その周囲にヒト血管内皮マーカーに陽性を示す脈管構造の生着も確認した。これらには血流がみられ、宿主血管系との吻合構造を持っていた。

更に、これらの脈管構造はヒトマーカーに陽性を示す壁細胞様細胞で被覆されていた。これらの超微細構造では、人工ヒトリンパ管は係留フィラメントを含む毛細リンパ管の機能形態、ヒト血管マーカー陽性の脈管構造は小血管様の機能形態を持つことが判った。[3]これらについてin vitroでの組織構築およびin vivoでの生着の過程を追跡したところ、リンパ管内皮細胞の一部血管内皮細胞への転化と宿主血管系との吻合、ヒト線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化と脈管の被覆等、組織構築と移植に伴う脈管リモデリングを見出した。[4]人工リンパ管網組織移植の効果を評価するため、インドシアニングリーン(ICG)投与による後肢-臀部浅層リンパ流路の生体イメージング行い、さらにリンパ節郭清によるリンパ流路再生モデルを作製した。これらにおいて人工リンパ管網組織を移植し、リンパ流路の変化および流路形成促進を示す結果を得た。現在動物モデルを用いたリンパ浮腫軽減効果の解析を行っている。これらの結果から、本人工組織は機能性人工リンパ管グラフトとして有用である可能性が示された。この中で、人工組織の機能発現には、移植後の生体内再構築と成熟が研究当初の予想よりも大きな役割を持つことが推測され、今後間葉系幹細胞等を加えた再生医療研究に取り組む予定である。三次元人工組織の構築が可能な細胞集積法により構築した人工ヒト脈管組織は移植可能であり、再生医療への応用が期待される。本研究では人工組織移植によるリンパ管再生医療を目指し、ヒト線維芽細胞とリンパ管内皮細胞を材料とした人工リンパ管網組織(AHLT)の構築、マウスへの移植、並びに治療効果の検証を目的とした。AHLTはヌードマウス皮下および筋膜上に生着し、人工リンパ管は毛細リンパ管の機能形態を有していた。これに加えヒトマーカー陽性の小血管様構造の生着も認められ、リンパ管-血管転化を含む脈管リモデリングを見出した。さらにリンパ節郭清モデルへのAHLT移植では、リンパ流路再生誘導を示唆する結果を得た。人工ヒト血管ネットワーク組織の基本モデル(皮膚由来線維芽細胞;NHDFと臍帯静脈内皮細胞;HUVEC)および人工ヒトリンパ管ネットワーク組織の基本モデル(NHDFと皮膚由来リンパ管内皮細胞;HDLEC)のヌードマウスへの移植を行ない、分子形態学的に解析したところ、生着に加え、他の細胞要素が加わることによる血管構造およびリンパ管構造の構築を見出した。この結果より、上記基本モデル移植後の生体内での変化および機能解析を先に行うこととした。よって、初年度に予定していた、血管およびリンパ管形成関連因子発現プラスミドの構築と導入は準備段階にとどまっている。基本モデルの生体内での機能形態を更に明らかにし、正常機能に足りない要素を精査して、これに関連する導入遺伝子を再考する予定である。(1)これまでの結果から、細胞集積法により作製した人工脈管ネットワーク組織の移植後、宿主生体内での機能形態的な成熟が示唆された。この過程では、ヒト線維芽細胞由来の平滑筋様細胞が人工ヒト血管・リンパ管構造の周囲に壁細胞様に付着し、脈管構造成熟に与ることが判っている。
免疫組織の新規構築による疾患制御のための技術開発

高い免疫誘導能を発揮し長期間安定なヒト型リンパ節組織を人工的に構築する方法を確立した。新たに作製したヒトストローマ細胞とヒトI型コラーゲンペプチドの混合培養よりスフェロイドを形成、そのスフェロイドとヒト末梢血リンパ球を混合し免疫不全マウスの腎臓被膜下に移植して100%の確率で機能的ヒトリンパ組織を構築する事が可能となった。免疫組織は1)ヒトT細胞、B細胞、樹状細胞から構成、2)明瞭なT細胞領域とB細胞濾胞領域の形成、3)抗原刺激で抗原特異的高親和性抗体の産生、抗腫瘍キラーT細胞の誘導、4)高内皮細静脈及び機能的な小血管、リンパ管の形成,5)摘出、他の個体への再移植が容易、等の特徴を持つ。本研究の目的はリンパ組織特異的ストローマ細胞由来の環境因子を解明し、その情報を基に高い免疫誘導能を有し、かつ動物種を超えてヒトにも適応し得る免疫組織を人工的に新規構築する方法を確立することである。我々はストローマ細胞を用いてマウスの系でリンパ節組織を人工的に構築することを報告してきたが、本年度はリンパ組織形成において必要とされる液性因子のみを用いて、マウス生体内に人工リンパ組織の構築を検討した。種々のケモカイン、サイトカインを主とする液性因子を徐放性ハイドロゲルに含有させ、支持体コラーゲンスポンジと組み合わせてマウス腎臓被膜下へ移植を行った。3週間後、移植片内に明瞭なT細胞及びB細胞のクラスターが形成され隣接して存在した。樹状細胞、濾胞性樹状細胞も分布していた。この人工リンパ組織を持つマウスを抗原で刺激すると強い抗原特異的二次免疫反応が誘導された(論文準備中)。次にヒト型のリンパ節組織の構築を行うべく、重症免疫不全マウスにヒト末梢血リンパ球を移入して作製したヒト化マウスにヒトの液性因子を用いて人工リンパ組織形成を行った。このヒト化マウスの末梢血中ではヒトB細胞の割合が極端に少なくT細胞が大部分を占めるが、再構築リンパ節移植片においてはよく発達したT細胞クラスターに加えてやや小型ではあるが明瞭なB細胞クラスターが形成された。今後は、抗原特異的免疫誘導能について検討をするとともに、さらに組織構造の安定性を保持させるために、添加する液性因子および添加方法について検討を行う。マウス新生児の脾臓組織細胞中に(白脾髄、赤脾髄および血管系を有する)完全な脾臓を再構築する能力を持つストローマ細胞を同定した。その表面マーカーの確定、遺伝子発現パターンを確定した(論文投稿中)。また、この脾臓再構築におけるリンフォトキシンの役割について解析した(論文投稿中)。本研究ではヒトリンパ組織特異的ストローマ細胞を樹立して、それを基盤として高い免疫誘導能を発揮出来、かつ長期間安定な「ヒト」型リンパ節組織を人工的に構築する方法を確立し、さらに人工リンパ組織の感染防御能、腫瘍免疫誘導能、抗原特異的高親和性ヒト抗体産生細胞の樹立などについて検討することを目的とする。今年度の成果の一つとしてヒト間葉系幹細胞由来のヒトリンパ組織特異的ストローマ細胞の樹立に成功した。樹立したヒトリンパ組織特異的ストローマ細胞を各種の条件で培養あるいはin vivo(重症免疫不全マウス体内)に移植するとFDCおよびFRCなどのリンパ節特有のストローマ細胞に分化し、それぞれがCCL19, CCL20, CXCL13などのリンパ節ケモカインを産生分泌することが示された。次にこのヒトリンパ組織ストローマ細胞株およびヒト末梢血リンパ球を混合してコラーゲンスポンジに付着させ、さらにLTα1β2, sRANKL, TNFαおよびIL-4, GM-CSFなどのサイトカインを含む徐放性ゲルをスポンジに添加した後に、重症免疫不全NOGマウスの腎臓皮膜下に移植した。その結果、再現性良く、移植片内にはT細胞、B細胞クラスターから構成されるリンパ組織が形成され、T細胞クラスター内に多くの樹状細胞、B細胞クラスター内にFDCの局在を認めた。ヒトリンパ節様3次元組織を人工的に構築することが(世界で初めて)可能となった。また、マウス飼育ケージの新規拡充を行いヒト人工リンパ節組織に抗原刺激を行い、その免疫機能を調べる研究も進展した。順調に研究は進行している。間葉系幹細胞由来のヒトリンパ組織特異的ストローマ細胞の樹立に成功したことにより、高い免疫誘導能を発揮し、かつ長期間安定な「ヒト」型リンパ節組織を人工的に構築する方法の確立に向けて順調に進行している。(1)本研究の目的は高い免疫誘導能を有し、かつ長期間安定なヒト型リンパ節組織を人工的に構築し、人工リンパ組織による感染防御能、腫瘍免疫誘導能、抗原特異的高親和性ヒト抗体産生能を示すことである。今年度はストローマ細胞を用いずにスキャホールドと液性因子のみを用いてリンパ節組織をマウス体内に構築することを試み成功した。LTα1β2, sRANKL,およびIL-4, GM-CSF等のサイトカイン、CCL19, CCL20, CXCL12, CXCL13などのケモカインをそれぞれ含ませた徐放性ゲルをコラーゲンスポンジ内にパックした後にBalb/cマウスの腎臓皮膜下に移植した。その結果、再現性良く、T細胞、B細胞のそれぞれのクラスターから構成されるリンパ組織が形成された。