hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
国際メタ解析および新たな統計解析法を活用した結核症と類縁疾患の関連遺伝子の探索

我々はタイ、日本、インドネシアでNAT2遺伝子のslow acetylator群において抗結核薬による肝障害の発症リスクが高いことを示した。その中のultra-slow acetylator群が更に肝障害のリスクが高い可能性を検討していたが、3カ国ではサンプル数が少なく、結論づけることはできなかった。そこで、国際メタ解析を行いultra-slow metabolizer群が肝障害のゲノムバイオマーカーとして重要であることを示した。更に、新たな解析アプローチとしてロジック回帰と遠距離にある複数遺伝子のハプロタイプを推定しフェノタイプとの関連を見る遺伝統計手法の有用性を発表した。本研究の目的は、ゲノム情報を用いて結核症の感受性遺伝子を探索するとともに、それを診断および治療に繋げることである。東京大学大学院医学系研究科人類遺伝学分野はこれまでに、理化学研究所、結核予防会と共に、タイ保健省医科学局、マヒドン大学、インドネシアYarsi大学等のアジアの研究者チームと共同して結核症の関連遺伝子研究ネットワークを形成している。本研究計画では、アジア最大の研究グループとしてゲノムワイド関連解析(GWAS: Genome-wide association study)の国際メタ解析へ参加する他、我々のグループが新たに開発した多因子疾患の感受性遺伝子探索の為の統計解析法(Logic Regressionに基づくSNPセット解析法、HLA imputation法を活用した解析、その他)を日本とタイの結核症サンプルに適用し、新たな感受性遺伝子の同定を試みるとともに、これらの解析法の有用性を検証する。また、結核症と類縁疾患のGWASを統合し、疾患間に共通(shared)および固有(unique)の遺伝要因を探索する。さらに、Oxford大学Hill教授が中心になり組織している国際結核人類遺伝コンソーシアム(International Tuberculosis Human Genetics Consortium: ITHGC)に我々は貴重なアジアからのサンプル提供グループとして参加しており、我々の開発した解析法をITHGCのサンプルに対して適用することで、集団間の違いを考慮した結核症の遺伝要因の解明を目指す。タイの結核GWASデータの他に、公益財団法人結核予防会・複十字病院は、文部科学省オーダーメイド医療実現化プロジェクトによるバイオバンクジャパン整備に2003年の開始時より協力し、日本のデータ利用が可能となり、その解析も並行して進めた。新たな統計解析法として、Logic Regressionに基づくSNPセット解析法を応用したクローン病では、関連SNPが遺伝子単位で議論される事が多い中、昨年度にはPathwayレベルでの解析法も開発した[J. of National Cancer Inst.2015]。また、徳永研究室でGWASを実施したPBC症(原発性胆汁性肝硬変症)のデータに応用して、方法論の有用性を確認した。コピー数多型(CNV: Copy Number Polymorphism)のゲノムワイドな解析は、感染症では未だ報告が無いが、ナルコレプシーのCNV解析[J Hum Genet 2014]を実施した若手の研究参加が得られ、昨年度に開始しいくつかの候補領域を同定した。東京大学大学院医学系研究科人類遺伝学分野は、理化学研究所、結核予防会、タイ保健省医科学局、インドネシアヤルシ大学等のアジアの研究者チームと共同して結核症の関連遺伝子研究ネットワークを形成してきた。本研究計画では、我々のグループが新たに開発した多因子疾患の感受性遺伝子探索の為の統計解析法を日本とタイの結核症サンプルに適用し、その有用性を検証する。更に、解析法を国際結核人類遺伝コンソーシアム(International Tuberculosis Human Genetics Consortium: ITHGC)のサンプルに対して適用することで、集団間の違いを考慮した結核症の遺伝要因の解明を目指している。2016年度はITHGCで結核症例15,573、対照例24,843と高い同定力に基づいた一塩基多型(SNP: Single Nucleotide Polymorphism)毎の基本的なメタ解析にて、新しい結核症感受性遺伝子領域を国際共通で2箇所、地域特有で4箇所発見した。我々はそのReplication studyを日本とインドネシアの結核症サンプルを使用し、DigiTag2にて実施した。Logic Regressionに基づくSNPセット解析法では関連SNPが遺伝子レベルで議論される事が多い中、ゲノム上で離れたEnhancerが標的とする遺伝子のPromoterに作用して遺伝子発現に貢献する点に注目し、EnhancerとPromoterに関わる生物学的データベースの情報を活用することで、最大3つの論理的なSNPの相互作用をLogic regressionで同定する方法を開発し、米国人類遺伝学会で発表した。タイの結核GWASデータの他に日本の結核GWASデータの利用を開始した。また、並行して2016年度は複十字病院の臨床データを整備し、追加のGWASデータの取得を完了した。Logic Regressionに基づくSNPセット解析法については、関連SNPが遺伝子レベルで議論される事が多い中、我々はPathwayレベルでの解析法を新たに提案し[J. of National Cancer Inst.2015]、徳永研究室で保有のPBC症(原発性胆汁性胆管炎)のデータに適用することでその有用性を確認している。2016年度は更に、ゲノム上で離れたEnhancerが標的とする遺伝子のPromoterに作用して遺伝子発現に貢献する点に注目し、EnhancerとPromoterに関わる生物学的データベースの情報を活用することで、最大3つの論理的なSNPの相互作用をLogic regressionで同定する方法を開発し、米国人類遺伝学会で発表した。東京大学の研究チームは、理化学研究所、結核予防会、タイ保健省医科学局、インドネシア・ヤルシ大学等のアジアの研究チームと共同研究ネットワークを形成している。

本研究計画では、多因子疾患の感受性遺伝子探索の為の新たな統計解析法を開発するとともに、国際結核人類遺伝コンソーシアム(International Tuberculosis Human Genetics Consortium: ITHGC)のゲノムデータを活用して集団間の違いを考慮した結核症の遺伝要因の解明を目指す。平成29年度は、新たな統計解析法開発として、ゲノム上で離れた複数遺伝子によるハプロタイプが自己免疫疾患に関連する報告に注目し、1Mb以上離れた複数遺伝子が関与するハプロタイプを集団毎に網羅的に解析する手法を開発した。人類遺伝学分野で保有するゲノムワイド関連解析(GWAS)データを活用して解析した結果、6番染色体のHLA領域を含め様々な染色体部位にハプロタイプが検出され、その頻度は集団特異的であった。そして、原発性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis:PBC)のGWASデータから、PBCと関連する2つのハプロタイプを同定した。本成果を日本人類遺伝学会で発表し論文化を進めている。また、11月にITHGCの会議を東京で行い、一塩基多型(SNP: Single Nucleotide Polymorphism)毎の国際メタ解析から新しい結核症感受性遺伝子領域を同定した成果について論文化を進めている。並行して、抗結核薬による肝障害に関して、我々自身が収集した日本人・タイ人・インドネシア人各集団のサンプルにおけるGWASならびに国際メタ解析を実施し、その成果の論文化を進めている。我々はタイ、日本、インドネシアでNAT2遺伝子のslow acetylator群において抗結核薬による肝障害の発症リスクが高いことを示した。その中のultra-slow acetylator群が更に肝障害のリスクが高い可能性を検討していたが、3カ国ではサンプル数が少なく、結論づけることはできなかった。そこで、国際メタ解析を行いultra-slow metabolizer群が肝障害のゲノムバイオマーカーとして重要であることを示した。更に、新たな解析アプローチとしてロジック回帰と遠距離にある複数遺伝子のハプロタイプを推定しフェノタイプとの関連を見る遺伝統計手法の有用性を発表した。我々がこれまで蓄積してきた新たな解析法を活用したゲノムワイド関連解析(GWAS)をタイと共に利用可能となった日本のデータにて進める。
光感受性タンパク質の多様な光反応機構解明

光によって感応・応答するタンパク質には、動物や植物などに広く分布する発色団を含み、生命維持に関与するなど重要な役割を果たすものが知られる。近年では、こうした光感受性タンパク質を利用して、細胞などの光操作する技術に応用され(光遺伝学)、これまでに多くの生理現象の解明に利用されてきた。本研究計画では、疾病治療への利用が期待されている、またはツールとしての重要性が高いとされる光感受性タンパク質について、XFELを用いた高速分子動画実験を行うことで、タンパク質内部で起こる光エネルギー移動や高速な構造変化について明らかにする。
欧米大都市における労働・住宅政策の変容とソーシャル・ミックス

第1は、住宅手当の不在により、アフォーダビリティが軽視されている日本の実態を、欧州との比較から相対化するために、とくにポスト工業化社会への移行にともなう新しい「社会リスク」に直面している若者、一人親世帯の子供、高齢者に焦点をあてて、究明した。第2は、日本における住宅手当の不在の構造を、欧州と日本の住宅政策の歴史的なプロセスから照射することで相対化した。第3は、日本への住宅手当の導入条件を欧州との比較のもとで検討した。2013年度の「研究の目的」、「研究実施計画」は、前年度に引き続き、欧米諸国における労働市場の動向と住宅政策の連関を分析すべく、その連関の結節点にある住宅手当に焦点をあてながら、日本へのサジェスチョンをえること、そのための外国人研究者との交流を意図していた。前者については、高齢者住宅財団の発行する『いい住まい・いいシニアライフ』に「住宅手当はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その1)」(vol.114, 2 013年5月)、「住宅手当はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その2)」(vol.115, 2013年7月)、「住宅手当はなぜ必要かー住宅政策としての住宅手当の不在」(vol.116, 2013年9月)、「住宅手はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その3)」(vol.117, 2013年11月)、「住宅手はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その4)」(vol.119, 2014年3月)として連載中である。後者(外国人研究者との交流)については、現地調査などについて、こちらの都合と相手方との時間的な調整がつかなかったことから、メールでの情報交換が主体となった。また英国新聞、ガーディアン紙が主催する情報交換のための「ハウジング・ネットワーク」のメンバーとなり、とくにイギリスと日本の住宅問題について、紙面を活用しながら意見の交換をした。2012年度の「研究の目的」、「研究実施計画」では、欧米における住宅政策のタイプをソーシャル・マーケットとコマンド・システムに区分し、この2つのタイプにアフォーダビリティ型とセーフティネット型の住宅手当を対応させたマークステファンなどの論旨を日本に応用すべく、労働市場の変容をふくめた論点の深化と外国研究者との交流を意図していた。前者については、高齢者住宅財団の発行する『いい住まい・いいシニアライフ』に「居住水準を保障する住宅手当(スウェーデン)」(vol.109,2012年7月)、「居住水準を保障する住宅手当(フランス)」(vol.110,2012年9月)、「岐路にたつ所得補塡としての住宅手当(イギリス)」(vol.111,2012年11月)、「住宅手当・支出増大の要因はなにか(イギリス)」(vol.113,2013年3月)、「周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者」(vol.114,2013年5月)を連載中である。この連載の主旨説明は、「国の制度としての住宅手当の不在は、経済成長、終身雇用・年功序列の賃金体系、社宅等に支えられながら、最終的には持家取得に至る、という日本型雇用システムと相関していた。しかしながら1990年代後半からの失業率の上昇、非正規労働の拡大は、日本型雇用システムを不安定化させ、住宅手当の導入が検討されている」というもので、国際比較の観点から、日本の状況を検討している。後者(外国研究者との交流)については、フランスからFrederique PIEUCHOT氏を2012年7月に招聘し、住宅手当と社会住宅の実態について、日仏の比較について研究会を実施した。2014度の「研究の目的」、「研究実施計画」は、前年度に引き続き、欧米諸国における労働市場の動向と住宅政策の連関を分析すべく、その連関の結節点にある住宅手当に焦点をあてながら、日本へのサジェションをえること、そのための外国人研究者との交流と、海外の実態調査を意図していた。前者については、高齢者住宅財団の発行する『いい住まいいいシニアライフ』(2014年度、発行)で、「住宅手当はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その6)」、「住宅手当はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その5)」、「住宅手当はなぜ必要かー住宅扶助はどう改変されるべきか::基準部会のゆくえ」、「住宅手当はなぜ必要かー周辺としての若者、一人親世帯、単身高齢者(その4)」として連載した。後者については、オランダ、フランスにおける高齢者住宅の状況と介護保険、住宅手当の機能、それらの関連を明らかにすべく、高齢者住宅団地の実態を見学、関係者にヒヤリングをした。社会科学Aこれまでの研究成果により、国際比較の観点から日本の状況にアプローチした『いい住まい・いいシニアライフ』の諸論考は、それなりの手応えがあった。

ガーディアン紙が主催する情報交換のための「ハウジング・ネットワーク」に参加したことで、日本からの意見を発信し、複数の専門家から有意義なコメントをえた。これまでの研究成果により、国際比較の観点から日本の状況にアプローチした『いい住まい・いいシニアライフ』の論考は、それなりの手応えがあった。海外研究者との交流、情報の交換については、フランスの研究者を招聘したことで、新たな知見が得られた。日本における若者のパラサイトからの脱却、子供をもつ世帯へのアフォーダルな住宅提供、増大しつつあるサービス付き高齢者住宅のレベル・アップと家賃負担の軽減、正規労働と非正規労働の労働市場の統合などの問題の解決に向けて、2013年度の「研究成果」をふまえ、欧米との比較研究をさらに深化させたい。日本では、民間借家への介入(居住水準、家賃へのコントロール、社会住宅とのバランスなど)が不十分なまま、終身雇用、年功賃金に依拠した男性稼ぎ手と、それを補完する家族(女性の専業主婦化)に対して、企業福祉の一環としての社宅、そして持家が普及していった。こうした「中軸」のあり方は、企業主義社会に参入できない状況のもとで借家住まいを余儀なくされている「周辺」の人々を包摂できない状況となっている。2012年度の「研究の成果」を踏まえ、こうした問題をさらに検討していきたい次年度、物品費に使用のため次年度、物品費に使用「該当なし」
歯周病細菌に対する血清抗体価測定法の標準化に関する調査研究

採血および検査方法の改善,標準化したデータベースの作成,臨床的に有効である根拠の探求を,基礎科学的問題,臨床的および社会的問題,産学官連携上の問題の観点から,6人の研究者が担当して,これらを組み合わせて9つの観点から検討した。大規模臨床研究を実施する体制を,日本歯周病学会でのWGを中心に産学官の連携が成り立つように作成した。なお,米国において口腔内細菌と歯周病の病状を虚血性心疾患の罹患と重症度の関連をみる大規模臨床研究を行っているノースカロライナ大学チャペルヒル校の状況を,研究体制の樹立のモデルとして用い,さらに,基礎的な研究を臨床研究に発展させて検査と治療法の開発を行っている国立衛生研究所顎顔面歯科部門(NIDCR)における研究の展開の仕方をモデルとして用いた。そのために,これらの施設において研修を受けた日本人研究者から資料収集を行い,研究遂行上の検討を行った。さらに,抗原調製と供給の方法,抗体価測定キット開発,測定データの集計と配信方法に関して,共同開発を行うことが可能な企業(4社)を検索して,コンソーシアム設立の準備を行った。これらの調整と相互の成果の報告のため,岡山大学において本研究班とコンソーシアム参加企業が集合して,班会議を開催した。この結果をもとに,研究代表者は,コンソーシアム参加企業の各社と,検査の実施上の技術的問題,データ解析の方法,検査の普及のための方策等,種々の問題点を検討した。さらに,臨床検査関連の各種学会において,歯周病細菌に対する血清IgG抗体価の測定とその応用に関する歯科領域でのこれまでの成果を公表して,本検査の実施に際しての臨床検査学分野での問題点を洗い出した。日本歯周病学会の研究委員会が主催する学会のワークショップにおいて途中までの成果を公表し,歯周病細菌に対する血清抗体価測定検査ために,本研究班を中心として基盤研究(A)を申請した。
末梢性顔面神経麻痺に対するステロイド鼓室内投与法の開発

臨床研究:末梢性顔面神経麻痺である、Bell麻痺とHunt's症候群と診断された患者20名に対し、経鼓膜的ステロイド鼓室内投与によるサルベージ治療を施行し、その効果と有害事象の検討を行った。対象:発症1週間以内で、Bell麻痺とHunt's症候群と診断され、ステロイド全身投与(計9日間)を行った後、顔面神経麻痺スコアが柳原法で2点以下(40点満点)あるいは誘発筋電図(ENoG)値が10%以下の患者20名方法:患側の鼓膜より鼓室内に23ゲージ針付シリンシでデキサメサゾン0.5mlを投与し、頭位変換を行い、約20分間一定の頭位を保持する治療を連日7回計7日間施行した。評価:上記ステロイド鼓室内投与治療施行後、1週間、1か月、3か月、6か月、1年で、測定した顔面神経スコアとEN0G値、SR(アブミ骨筋反射)、NET(筋電図)などで効果判定を行った。有害事象に関しては、血液検査ならびに鼓膜穿孔の残存の有無、聴力低下の有無を判定した。結論:Bell麻痺が16例、Hunt's症候群が4例で、Hunt's症候群の1例を除き、上記治療施行後、1週間以内に、20例中19例が顔面神経スコアあるいはEN0G値の値が、ステロイド全身投与施行後に行った時点の値より回復傾向を示した。また、19例中16例が半年後の顔面神経スコアで30点以上となり、本治療の有効性が確認できた。高濃度ステロイドの製造が昨年度できなかったため、当初予定していた動物実験ができなかった。高濃度ステロイドの製造は、某製薬企業に依頼しているが、現在目途が立っていない。一方、臨床試験に関しては、当初初年度には行わない予定であったが、動物実験の代わりとして、通常濃度のデキサメサゾンを使用して前倒しで行った。1.以下の実験計画1)、2)を行う1)鼓室内投与したステロイドが、顔面神経膝神経節周囲に到達するかどうかの基礎研究2)鼓室内投与したステロイドを顔面神経膝神経節周囲に到達させうる体位(頭位)の検討2.高濃度デキサメサゾンが完成次第、動物実験による内耳毒性の有無の実験を行う。3.臨床試験の継続臨床研究:末梢性顔面神経麻痺である、Bell麻痺とHunt's症候群と診断された患者20名に対し、経鼓膜的ステロイド鼓室内投与によるサルベージ治療を施行し、その効果と有害事象の検討を行った。3.臨床試験の継続当初予定していた、高濃度デキサメサゾンの製造ができなかったことから、動物実験ができなかったこと、学会発表とコンピュータの購入を行わなかったため。
歯周病病態形成におけるインターロイキン３３関与の解明

LPS誘導性マウス歯周炎モデルにおいてIL33欠損マウスを用いてIL33の歯周炎病態誘導における役割の解析を行った。野生型マウスへの歯肉LPS注射によって歯肉内IL33mRNA発現の上昇を認めた。歯肉LPS注射によって歯肉内IL1bやTNFaのmRNA発現の上昇が認められ、IL33KOマウスでは野生型と比較してそれらが有意に高かった。また、LPS歯肉注射により誘導される歯槽骨吸収は、IL33KOマウスでは野生型マウスより有意に大きかった。これらの結果からIL33は歯周炎における早期の炎症誘導および慢性炎症によって誘導される歯槽骨吸収の両方に対して保護的に機能していることが示唆された。In vitroにおける各種細胞からのIL-33産生メカニズムの解析および、LPS誘導性マウス歯周炎モデルにおいてIL-33欠損マウスを用いてIL-33の歯周炎病態誘導における役割の解析を行った。腹腔マクロファージおよびマウス口腔扁平上皮癌細胞株NRS1細胞をE.coli由来LPSによって刺激を行いIL-33発現をmRNAおよびタンパクレベルで解析した。LPS刺激によって腹腔マクロファージおよびマウス口腔扁平上皮癌細胞株NRS1細胞はともにIL-33発現の増強を認めた。LPS刺激によって腹腔マクロファージおよびマウス口腔扁平上皮癌細胞株NRS1細胞では共にIL-33のタンパクレベルの発現が増強されたが、培養上清中にIL-33は検出されなかった。しかしながら、これら細胞にネクローシスを誘導すると培養上清中にIL-33が検出できた。さらに、培養上清中のIL-33濃度はネクローシス誘導前にLPSを行うことにより増強された。野生型マウスへのLPSの歯肉内注射によって歯肉組織におけるIL-33mRNA発現の増強がIL-1やTNFなどの炎症性サイトカインmRNA発現の増強とともに認められた。野生型マウスと比較してIL-33欠損マウスではLPS歯肉内注射による歯肉組織中のIL-1やTNF発現が高かった。これらの結果から歯周病病態誘導過程においてIL-33はマクロファージや上皮細胞から産生され、その病態誘導に保護的に関与している可能性が示唆された。歯周病病態形成におけるIL-33の関与を調べるために、上皮細胞におけるIL-33発現を解析した。C3H/Heマウス由来口腔扁平上皮癌細胞株NRS-1細胞にLPS刺激を行い、IL-33 mRNAおよびタンパク発現を解析した。LPS刺激後4時間でIL-33mRNA発現の増強が認められた。また、LPS刺激後24時間で細胞内にIL-33タンパク発現の増強が認められた。このことは歯周病原性細菌由来のLPSによって口腔上皮細胞からIL-33が産生され、歯周病病態形成に関わることを示唆する結果である。マクロファージではIL-33は細胞内で産生された後、ネクローシスが誘導された時に細胞外に放出される。実際に口腔上皮細胞でも同様のメカニズムでIL-33が細胞外に放出されるかNRS-1細胞を用いてELISA法で解析を行った。NRS-1細胞ではLSP刺激によって細胞内に高いIL-33発現が誘導されるものの、IL-33は細胞外に放出されなかった。またLPS刺激後にNRS-1細胞にネクローシスを誘導させるとIL-33が細胞外に放出された。この結果は口腔上皮細胞もマクロファージ同様に、ネクローシスが誘導されることによってIL-33を細胞外に放出することを示すものであり、歯周病病変部においてネクローシスが誘導された上皮細胞からIL-33が放出され、病態形成に関与する可能性を示唆するものである。次に、IL-33がLPS誘導性マウス歯周病モデルにおいてどのように関与しているか、IL-33欠損マウスを用いて解析を行った。LPSを歯肉内注射後24時間後の歯肉組織内における炎症性サイトカインIL-1aおよびTNFa発現量は野生型と比較して少なかった。この結果はIL-33が歯周病病変部、特に歯肉組織における炎症性サイトカイン発現を増強させる機能を持つことを示唆するものである本研究における本年度の計画概要はマウス歯周組織におけるLPS依存的にIL-33発現が増強する細胞の同定と、歯周病マウスモデルを用いて歯周病病態形成へのIL-33による関与を検討する(平成24-25年度)であった。本年度はLPS依存的にIL-33発現が増強する細胞として口腔上皮細胞を明らかにすることができた。

さらにIL-33欠損マウスを用いたLPS誘導性歯周病マウスモデルによって、IL-33がLPSに誘導する炎症性サイトカイン発現を増強する役割があることを示すことができた。今後の研究方針として重要なことはヒト歯周病病態形成におけるIL-33の関与の解析である。次年度は、ヒト歯周組織におけるLPSまたは歯周病原細菌依存的にIL-33発現・放出が増強される細胞の同定および放出機構の解析および歯周病患者歯周組織および歯肉溝浸出中のIL-33発現または濃度を解析によるIL-33のヒト歯周病病態形成への関与を評価する。具体的にはヒト歯周組織におけるLPS刺激または歯周病原細菌株TDC60によってIL-33発現が増強する細胞を同定する。前年度のマウスを用いた実験結果を踏まえて、ヒト培養細胞(細胞株を含む)を用いて、ヒト歯周組織におけるIL-33産生細胞の同定および放出メカニズムの解析を行う。また、歯周疾患炎症部位におけるIL-33発現量を解析する。該当なし
ポリコーム遺伝子群による造血幹細胞の自己複製制御機構の研究

先駆的な再生医療である造血幹細胞移植療法の開発によって従来致死であった白血病も根治することが可能になった。しかし、幹細胞の機能を維持する分子基盤についての理解が進んでいないことが再生医療の更なる発展の最大の障壁となっている。幹細胞はその頻度が低いことや検出が容易でないことから解析が遅れていた。本研究ではポリコーム遺伝子群(PcG)に注目し、PcGの遺伝子欠損マウスを作製することによって造血幹細胞を支持する分子基盤を解析するための新たな手がかりを得ることを試みた。ポリコーム遺伝子群(PcG)はショウジョウバエの遺伝学的解析から発見されたが、ヒストンコードを介してクロマチンの高次構造を制御することにより一度設定された転写状態を維持する機能を有し、発生制御において重要な役割を果たしていることが知られている。高等哺乳動物におけるPcGの相同遺伝子を見つけ、ノックアウトマウスを作製し解析することによって、PcGの機能がショウジョウバエから高等哺乳動物まで広く保存されていることを明らかにしてきた。そしてさらに自己複製能を含めた造血幹細胞の活性維持にPcGが重要な機能を果たしていることを初めて明らかにした。最近になりPcGは造血幹細胞にだけでなく、神経幹細胞や神経提細胞、さらには白血病幹細胞の活性を維持する機能も有していることが他の研究室から報告され、PcGが高等哺乳動物における幹細胞機能の維持に関っていることが予測される。PcGによる幹細胞制御の分子基盤に関してはPcGがP16 CDKインヒビターやP19ARFをコードしているink4A遺伝子座の発現を抑制することによって細胞老化を防ぎ、活性を維持していることが報告されている。しかし、本研究によってPcGはDNA複製のライセンス化因子Cdt1の抑制因子Gemininと複合体を構成し、PcGが直接DNAの複製制御を介して幹細胞の活性維持に関っているという新たな側面が存在することが解った。今後さらにGeminin-Cdt1がどのような分子基盤によって幹細胞の活性制御に関っているかについて詳細な解析を試みる予定である。造血幹細胞は、10種類以上の成熟血球を産生するとともに、自らが自己複製することによって生涯に渡って枯渇することなく成熟血球を供給し続ける。造血幹細胞を利用した造血幹細胞移植療法は、白血病をはじめとして今までは不治の病と考えられていた疾患に対して驚異的な治療成果を挙げ始めている。しかし、造血幹細胞の需要の増大とは裏腹に少子化等によってHLAの適合したドナーの確保が難しいことも多い。そこで、造血幹細胞をex vivoで増幅する技術の開発が待たれるが、現在のところ造血幹細胞を制御する分子基盤については十分に理解されていない。本研究では、クロマチンの高次構造を制御することによって転写の維持を担っているポリコーム遺伝子群rae28に着目し、遺伝子欠損マウスを作製し解析することによってポリコーム遺伝子群が自己複製する造血幹細胞の活性制御に関っていることをはじめて明らかにした。さらに、rae28を含んだポリコーム遺伝子群複合体がDNAの複製開始制御を担うCdt1の阻害因子Gemininと結合し、細胞増殖制御に関っていることを新たに見つけた。これらの解析結果から造血幹細胞の活性を制御する分子基盤の解明に道が開かれることが期待される。
大気圧プラズマのケロイド・肥厚性瘢痕に与える影響に関する基礎的研究

ケロイドや肥厚性瘢痕は、拘縮・疼痛や醜状など患者の負担は大きく、また治療難渋する症例も少なくなく、新たな治療法の開発が期待されている。近年、大気圧プラズマ研究の進歩により、細胞増殖・分化などに対する様々な影響が報告され始めた。その中で、筋線維芽細胞への分化やその増殖を、大気圧プラズマが制御できないか、という着想に至った。本研究では、1大気圧プラズマのラジカル分布パターン解析、2大気圧プラズマの皮膚創傷治癒関連細胞に与える影響の解析、3ケロイド・肥厚性瘢痕動物モデルで、大気圧プラズマによる発症・進展予防や治療の効果検討を行い、大気圧プラズマによるケロイド・肥厚性瘢痕に与える影響について検討する。
特発性大腿骨頭壊死症に対する動物モデル及び疫学調査を用いた病態解析

特発性大腿骨頭壊死症の病態および修復に関して、動物モデル及び疫学調査等を用いて、基礎的、臨床的研究を行った。基礎的研究として、ステロイド性骨壊死家兎モデルを用いて、ステロイドの投与経路によって薬物体内動態およびステロイド性骨壊死の発生頻度がどのように変化するについて検討を行った。臨床におけるステロイド投与法と、モデルにおける投与法は相違点があるものの、その詳細や薬物動態についてはこれまで検討されていなかった。雄日本白色家兎に対して、経静脈、経口、経筋肉内の3種の経路でステロイド剤を投与し、骨壊死発生率および血中薬物動態、血液学的変化を検討した結果、ステロイド性骨壊死発生の危険因子として、ごく短期間の高ステロイド濃度を引き起こす投与法より、一定期間一定濃度を維持する投与法がより強く関与している可能性が示唆された。臨床的研究として、記述疫学調査によって特発性大腿骨頭壊死症の詳細な記述疫学調査を行った。福岡県では過去3年間に新規認定患者は339人であり、発生率は年間10万人あたり2.26人であった。誘因はステロイドあり31%、アルコールあり37%、両方あり6%、両方なし25%であった。治療法では約半数で手術が行われており、人工関節手術が最も多かった。ステロイド性骨壊死では平均41mgの投与量、4.6年の投与期間であった。アルコール性壊死では1日あたり平均2.7合、約25年の飲酒歴であった。記述疫学結果をまとめ特発性大腿骨頭壊死症調査研究班会議にて報告した。さらに平成25年8月からは、米国テキサス州に渡航し、Texas Scottish Rite Hospital for Childrenにて、大腿骨頭壊死の病態に関する基礎的な研究を開始した。小児における大腿骨頭壊死疾患としてPerthes病が知られているが、当施設では未成熟豚を使用したPerthes病モデルを用いて、骨壊死のどのような組織変化が滑膜炎、関節炎を引き起こすかにかについて分子生物学的な検討を行っている。特発性大腿骨頭壊死症および類似する疾患について、研究課題に沿って動物モデルおよび疫学的手法を用いて、基礎的、臨床的研究を遂行している。基礎的には動物モデルを用いて臨床的知見の基礎的裏付けを行い、臨床的には特発性大腿骨頭壊死症の疫学的指標の報告ならびに記述疫学調査を行った。結果の一部について国際学会ならびに国内学会で発表した。また8月からは米国にて分子生物学的な観点から本研究課題に関する詳細な研究を継続している。研究課題に関しては一定の結果を得ており、今後まとめた結果を国際学会および英文雑誌にて発表予定である。また、8月からは米国Texas Scottish Rite Hospital for Childrenに研究拠点を移し、これまで未解明であった骨頭壊死に起因する滑膜炎のメカニズムおよびその役割について分子生物学的観点から研究を開始している。骨壊死発生後に滑膜炎を惹起する重要なメカニズムとして、壊死に陥った細胞から放出されるDamage associatedmolecular patterns (DAMPs)に注目しており、マクロファージ様滑膜細胞を介したInnate immunesystemが病態に深く関与し、滑膜増生および炎症性サイトカインの増加を引き起こしているという仮説のものと研究を継続している。特発性大腿骨頭壊死症および類似する疾患に関して、動物モデルおよび疫学的手法を用いて、基礎的、臨床的研究を行った。基礎的研究として、ステロイド性家兎モデルでは成熟度がステロイド性骨壊死発生率に影響を及ぼすことを動物実験によって確認した。未成熟家兎は成熟家兎と比較して骨壊死発生率が有意に低く、その関連要因としてステロイド代謝酵素であるCYP3A発現量が異なること、血管拡張因子であるNO産生量が異なることを確認した。これらの結果は、臨床的に小児ではステロイド性骨壊死発生が稀である知見の基礎的裏付けとなる重要な結果であると考えられた。臨床的研究として、難治性疾患克服研究事業における臨床調査個人票を用いて、日本の一般人口における特発性大腿骨頭壊死症の発生率が年間人口10万人あたり2.51人であることを報告した。一般人口における本症の発生率は世界的にも初めての報告であり、今後本症の重要な疫学的指標になると考えられた。また、同手法を用いて本症の詳細な疫学的指標(誘因、病期、病型、手術法等)について検討を行った結果を報告した。さらに二次性変形性股関節症を来たす疾患として、特発性大腿骨頭壊死症、急速破壊型股関節症、発育性臼蓋形成不全に注目し、股関節液を用いて骨代謝および軟骨代謝マーカーを比較検討した。両代謝マーカーとも有意に異なっており、疾患の病態や進行過程の違いを示唆する結果であると考えられ、世界的に稀な重要な報告であると考えられた。また大腿骨頭壊死症に類似する疾患である一過性大腿骨頭萎縮症について股関節形態の特徴を評価した。本症患者では臼蓋後捻、大腿骨頭頚部前方隆起の指標が高頻度に認められ、病変部位は臼蓋縁に接する軟骨下領域に限局していた。これらの結果から本症では骨頭臼蓋縁間のメカニカルストレスの増加が発生病態に関与している可能性が示唆された。

臨床におけるステロイド投与法と、モデルにおける投与法は相違点があるものの、その詳細や薬物動態についてはこれまで検討されていなかった。雄日本白色家兎に対して、経静脈、経口、経筋肉内の3種の経路でステロイド剤を投与し、骨壊死発生率および血中薬物動態、血液学的変化を検討した結果、ステロイド性骨壊死発生の危険因子として、ごく短期間の高ステロイド濃度を引き起こす投与法より、一定期間一定濃度を維持する投与法がより強く関与している可能性が示唆された。臨床的研究として、記述疫学調査によって特発性大腿骨頭壊死症の詳細な記述疫学調査を行った。福岡県では過去3年間に新規認定患者は339人であり、発生率は年間10万人あたり2.26人であった。誘因はステロイドあり31%、アルコールあり37%、両方あり6%、両方なし25%であった。治療法では約半数で手術が行われており、人工関節手術が最も多かった。ステロイド性骨壊死では平均41mgの投与量、4.6年の投与期間であった。アルコール性壊死では1日あたり平均2.7合、約25年の飲酒歴であった。記述疫学結果をまとめ特発性大腿骨頭壊死症調査研究班会議にて報告した。さらに平成25年8月からは、米国テキサス州に渡航し、Texas Scottish Rite Hospital for Childrenにて、大腿骨頭壊死の病態に関する基礎的な研究を開始した。小児における大腿骨頭壊死疾患としてPerthes病が知られているが、当施設では未成熟豚を使用したPerthes病モデルを用いて、骨壊死のどのような組織変化が滑膜炎、関節炎を引き起こすかにかについて分子生物学的な検討を行っている。特発性大腿骨頭壊死症および類似する疾患について、研究課題に沿って動物モデルおよび疫学的手法を用いて、基礎的、臨床的研究を遂行している。基礎的には動物モデルを用いて臨床的知見の基礎的裏付けを行い、臨床的には特発性大腿骨頭壊死症の疫学的指標の報告ならびに記述疫学調査を行った。また二次性変形性股関節症を引き起こす股関節疾患の関節液を用いて骨代謝および軟骨代謝について比較検討を行い、さらに類似する疾患である一過性大腿骨頭萎縮症についての画像学的評価を行った。結果は国際学会ならびに国内学会で発表した。結果の一部について国際学会ならびに国内学会で発表した。また8月からは米国にて分子生物学的な観点から本研究課題に関する詳細な研究を継続している。特発性大腿骨頭壊死症および類似する疾患について、引き続き動物モテル、疫学的手法、臨床サンプルを用いて、基礎的、臨床的研究を遂行する予定である。ステロイド性骨壊死はステロイドの多様な作用によって生じる多因子疾患であると推測されているが、近年ステロイド性骨壊死家兎モデルを用いた動物実験において血管攣縮(Vasospasm)の関与が報告されている。
精巣の低温環境に適応した遺伝子発現機構とその異常の臨床的意義に関する研究

精巣では、生殖細胞が活発に細胞分裂、形態変化を行っている。本研究は、精巣のおかれた低温環境下での遺伝子発現制御機構を明らかにし、その変化の持つ臨床的意義を解明することを目的とした。1.32度で転写の亢進する遺伝子群の検索DNAマイクロアレーとノーザン解析法により、32度で発現亢進するヒト遺伝子を複数同定した。ストレス感受性に対する影響を検討中である。2.低温ショック蛋白質Cirp遺伝子の発現を制御する低温応答転写因子のクローニングCirp遺伝子の軽度低温応答エレメントmild cold response elementを同定した。この制御領域に結合する転写因子を検討中である。3.32度で翻訳の亢進する遺伝子群の同定と翻訳亢進機序の解析Cirp mRNAの5'UTR中に32度での翻訳を促進させる配列を同定した。4.32度で細胞増殖を促進する遺伝子の同定32度で活発に増殖するマウス3T3線維芽細胞の変異株を作成した。この細胞は低温に対する耐性を示した。この細胞を利用し解析を進める予定である。5.ヒト細胞株及び臨床例での解析マウス3T3線維芽細胞に抗がん剤や高浸透圧他いろいろなストレスを加え、32度という温度が一般的にいろいろな機序でストレス抵抗性を与えることを発見した。3T3線維芽細胞にTNFαストレスを加えた時にも、32度環境がストレス抵抗性を与えることを見出した。さらに、Cirp遺伝子ノックアウトマウス由来の細胞株を作成し、32度におけるストレス抵抗性の一部がCirpの発現誘導とそれによるErkの活性化によることを明らかにした。今後さらに軽度低温に応答する転写因子、翻訳を促進する機構などの基礎的な研究や臨床例の解析をすすめ、軽度低温環境の持つ生物学的な意味も明らかにしていきたい。一般に低温環境下では、細胞増殖、遺伝子発現ともに低下するのが普通であり、精巣内の細胞がどのような機序でその低温環境に適応しているのかは不明である。本研究では、精巣のおかれた低温環境下での遺伝子発現制御機序を明らかにし、その変化の臨床的意義を解析する。1.ヒト細胞株2種を37度と32度で培養し、DNAマイクロアレーを用いて32度で発現の亢進する遺伝子候補群を得た。変化の大きな10遺伝子について、さらにnorthern blottingとRT-PCRで解析したところ、5遺伝子で低温での発現亢進が確認された。2.CIRP遺伝子の軽度低温応答エレメントmild cold response elementを同定し、1-2塩基を置換していくことにより、コアとなる4塩基が重要であることを示した。制御領域に結合する転写因子を、酵母の1ハイブリッド法により同定を試みたが、バックグラウンドが高く、条件を再検討中である。なお、制御領域をGFP遺伝子につないだものを細胞に導入し、GFP発現誘導を指標として発現クローニングにより低温応答に関与する遺伝子群を同定できる系を作成した。3.2次元ゲル電気泳動により、32度で発現の亢進する蛋白の同定を試みたが、候補蛋白の抗体によるwestern blottingで発現増加を確認できなかった。4.CIRPの5'UTRをルシフェラーゼレポーター遺伝子につないでトランスフェクションにより細胞に発現させ、32度で翻訳を促進する配列を同定した。5.マウス3T3線維芽細胞に抗がん剤や高浸透圧他いろいろなストレスを加え、32度という温度が一般的にいろいろなレベルでストレス耐性を与える可能性を発見した(投稿中)。

精巣では、生殖系列の細胞が活発に体細胞分裂、減数分裂、成熟精子への形態変化を行っており、厳密な遺伝子発現のコントロールがなされている。しかし、低温環境下では一般に細胞増殖、遺伝子発現ともに低下するのが普通であり、精巣内の体細胞、生殖細胞がどのような機序でその低温環境に適応しているのかは不明である。本研究では、精巣のおかれた低温環境下での遺伝子発現制御機序を明らかにし、さらにその変化の臨床的意義を解析することを目的とした。1.DNAマイクロアレーとノーザン解析により32度で発現の亢進するヒト遺伝子数種を得た。それぞれの遺伝子を細胞で高発現あるいは発現抑制して、ストレス耐性の変化を検討中である。3.新たに同定した32度で発現の亢進する遺伝子mRNAの5`UTR中に、32度で翻訳を亢進させる可能性のある配列を発見した。4.32度で活発に増殖するマウス3T3線維芽細胞の変異株を作成した。5.3T3線維芽細胞にTNFαストレスを加えた時に、32度環境がストレス抵抗性を与えることをみいだした。さらに、Cirp遺伝子ノックアウトマウス由来の細胞株を作成し、32度におけるストレス抵抗性の一部がCirpの発現誘導とそれによるErkの活性化によることを明らかにした。今後さらに軽度低温に応答する転写因子、翻訳を促進する機構などの基礎的な研究だけではなく、軽度低温で活性化される分子全般につき臨床的な意義まで明らかにしていきたい。
ラットのアキレス腱修復に及ぼす鍼通電刺激の影響

本研究はアキレス腱断裂をはじめとした腱の損傷に対する鍼通電刺激の影響について調査することを目的に、アキレス腱断裂モデルラットを用いて組織学的および力学的検討を行った。その結果、腱断裂後早期からの継続した鍼通電刺激は、修復過程早期において腱修復部に細胞増殖と成長因子の増加を惹起し、早い段階での力学的強度の獲得に有益である可能性が示された。また、修復が完了した時期の腱の力学的強度をも高めることから、腱の再断裂の予防に寄与する可能性が示唆された。本研究は、腱修復過程に及ぼす鍼通電刺激の影響について調査することを目的として、ラットのアキレス腱断裂処置後モデルを用いて調査した。モデル作成に際しては、断裂部の状況に個体差が生じることを避けるため、アキレス腱の修復に影響を及ぼす下腿三頭筋の収縮が起こらないように足関節を完全底屈位で固定し、腱を鋭的に切断した後は端々縫合を行わずに閉創した。モデルを作成後、無作為に鍼通電刺激群、鍼群、無処置群の3群に分けた。そして、鍼通電刺激群は、軽度麻酔拘束下にアキレス腱断裂部の内外側に先端部が腱断裂部に接触するようにそれぞれ鍼を刺入し、内側部を陰極、外側部を陽極として間欠的直流鍼通電刺激をモデル作成日の翌日から各評価日まで連日行った。鍼群は、鍼通電刺激群と同一部位への鍼の刺入のみ行った。無処置群は、麻酔拘束処置のみとした。評価として、モデル作成後3日、7日、10日に修復腱を採取して標本作製後、HE染色により細胞の局在を観察した。さらに、腱の修復に関与するサイトカイン(TGF-β1、b-FGF)に対する免疫組織化学染色を行い、それぞれの発現量について確認した。その結果、モデル作成後3日においては、鍼通電刺激群ではTGF-β1陽性細胞の有意な増加とb-FGF陽性細胞の増加傾向を認め、続くモデル作成後7日においては、同群でTGF-β1およびb-FGF陽性細胞の有意な増加とともに、全細胞数の有意な増加が確認された。そして、モデル作成後10日においては、鍼通電刺激群で全細胞数およびb-FGF陽性細胞の有意な増加を認めた。これらのことから、腱断裂後早期において鍼通電刺激を行うことにより、修復に関わる成長因子の発現に促進的に作用し、それに続き、線維芽細胞をはじめとする細胞の活性化を促すことが示唆された。本研究の結果は、医学雑誌に投稿、掲載された。また、医学会において研究内容の一部を発表した。本研究は、発生頻度の高い腱断裂に対する鍼治療の臨床応用を目指し、腱修復過程に及ぼす鍼通電刺激の影響について調査することを目的として、ラットのアキレス腱断裂処置後モデルを用いて調査した。モデル作製後、無作為に鍼通電刺激群、鍼群、無処置群の3群に分けた。研究期間は2014年度2015年度の2年間として、2014年度は、組織学的影響について検討するため、細胞の局在を観察するとともに、腱の修復に関与するサイトカインの発現量を観察した。その結果、腱断裂後早期(モデル作製後3日、7日、10日)において鍼通電刺激が腱修復部の細胞増殖と成長因子の発現増加をもたらすことを確認した。これらのことから、腱断裂後早期において鍼通電刺激を行うことにより、修復に関わる成長因子の発現に促進的に作用し、細胞の活性化を促すことが示唆された。2015年度は、力学的影響について調査するため、腱断裂後早期(モデル作製後10日)および長期経過後(モデル作製後90日)における修復腱の最大破断強度を測定した。その結果、何れの評価日においても鍼通電刺激群で有意に高い力学的強度を示したことから、鍼通電刺激は、断裂後早期における力学的強度の再獲得のみならず、長期経過後における修復腱の力学的強度にも好影響を及ぼし、腱の再断裂の予防に寄与する可能性が考えられた。2年間の成果から、鍼通電刺激は腱修復に対して短期的にも長期的にも有益な可能性が考えられたが、鍼通電刺激の至適条件やその時期については今後の詳細な検討が必要である。本研究ではアキレス腱断裂処置後モデルラットを用いて、腱修復過程に及ぼす鍼通電刺激の影響について調査するため、修復促進効果の有無を確認する指標として、組織学的および力学的評価を行う計画を立てた。

概ね2年間で行う研究として、平成26年度は組織学的な観点から検討することを目的に、組織の形態、細胞の局在、それに成長因子の発現について観察し、その上で、平成27年度は、修復腱の力学的強度を測定する見込みである。このような研究計画を立てた理由は、鍼通電刺激の効果を捉えるには先ず、腱修復部において組織学的に如何なる変化が起こっているのか確認し、その変化が臨床的に価値のあるものとなるか、つまり、修復腱の力学的強度の再獲得に繋がるか否かについて検証する必要性を考えたためである。組織的な変化が、腱の機能的変化に直結してこそ、介入の有用性を唱えることができる。そのためには、組織学的、力学的両面からの検討が必須と考える。平成26年度に予定していた組織学的評価に関しては、評価項目、評価日については若干変更したものの、凡そ計画通り遂行した。そして、腱断裂後早期において断裂部への直流鍼通電刺激を行うことにより、腱修復に関わる成長因子の発現や線維芽細胞をはじめとする細胞活性を促進する可能性を見出した。運動器平成27年度に予定している力学的評価に関しては、当初、モデル作成後早期のみの観察を計画していたが、腱癒合が完了した時点、即ちモデル作成後90日の評価を加える。断裂後早い段階で腱癒合が得られれば、長期間固定することによって生じる周囲組織との癒着による関節拘縮などの合併症を予防することが可能となり、十分に有意な成果であると言える。それに加えて、長期経過後の力学的強度にも好影響を与えることが確認できれば、再断裂に対する予防の一助となる可能性も期待でき、さらなる臨床的価値が生まれる。これらの結果を年度内にまとめ、医学会雑誌への投稿を目指す。
尋常性天疱瘡の分子病態・シグナル伝達解明とデスモソームの制御機構

天疱瘡ではELISA法による抗体価のモニタリングが治療効果判定に実用化されている。現行ELISA法の精度を上げるためにEDTA-ELISA法で非立体構造に結合する抗体を測定し、現行ELISA法との差を立体構造抗体価とすることにより、より病勢を反映した検査法に改良した。本法は臨床症状との相関がより優れていた。寛解期の高抗体価症例抗体の病因性を推定するためにも有用である。他、病因性抗体を培養細胞に添加後、プロテオーム解析を行った。病因性抗体による棘融解誘導経路を解明したい。本疾患の自己抗体の病因エピトープや水疱形成機序を解明することは新しい治療法の開発につながる可能性がある。難治な自己免疫性水疱症である天疱瘡病因病態を解明する.新規の病因性シグナル伝達経路を見いだすためのプロテオーム解析.病因性モノクロナル抗体(AK23)と非病因性モノクロナル抗体(AK20)作用下で発現分解するタンパク分子の検討をプロトマップ法で行った.方法:培養表皮細胞を病因性モノクロナル抗体(mAb)AK23と非病因性mAbAK20で刺激後可溶化し、1Dゲルで分離後分子量ごとにゲルを切り出し、消化後LC-MS/MSでプロテオーム解析を行った.得られたタンパクのデータは1500種に及び,コントロールに対して病因性抗体および非病因性抗体処理後に有意に差がみられた分子がそれぞ40ー50種類見いだされた.その分子は多岐に渡っており,細胞接着分子,細胞外マトリクス関連分子,核内タンパクなどであった.次年度では,これらの分子の発現を実際に病理組織標本や培養系で局在と発現を確認する.臨床症状と血清デスモグレイン3抗体価が逆相関する症例における病態解析.症例の抗体エピトープと病変部のデスモソーム構成分子の発現解析を行った.結果抗体価が低くても天疱瘡に特徴的な病態が観察された症例があり,抗体価以外に病因性を規定する要因があることが明らかになった.尋常性天疱瘡と増殖性天疱瘡(天疱瘡の亜型)の病態解析.尋常性天疱瘡と増殖性天疱瘡の病変部組織の免疫染色と,患者血清よりIgG分画を精製し培養細胞に添加して得られたサンプルを用いて,ウエスタンブロッティングを行い,細胞増殖に関わる伝達経路(Src, AKT, EGF等)を解析した.結果増殖性天疱瘡の病変部位でEGFRの発現の亢進があり,増殖性天疱瘡IgG刺激後の培養細胞でEGFRのリン酸化が亢進していた.今後,両疾患の違い比較する中で,病因がデスモグレイン3抗体,もしくは他の抗体分子や免疫担当細胞の関与について検討を加える予定である.難治な自己免疫性水疱症である天疱瘡の診断治療に直結する病因病態を解明する.自己抗体の病因性をより鋭敏に反映する検査法の改変抗体価がcutoff値以下でも典型的な天疱瘡の臨床症状を呈する症例について、キット測定時の血清希釈倍率を検討した。また、その病因性についてpipetting assayにて検討した。臨床的に寛解中に検出される抗体について、EDTA-ELISA法にてエピトープの解析を行い、症例を蓄積した。増殖性天疱瘡血清からIgGおよびIgA分画を生成し、培養細胞に添加し細胞増殖が亢進することを確認した。さらに、AKT,EGFR系のシグナルを検討した。結果増殖性天疱瘡IgG型3例、IgA1例で検討したが、これらの症例に共通して変化がみられ、コントロールIgGとの差が明らかな経路が見いだせなかった。引き続き検討中である。4.プロテオミクスによる解析方法:培養表皮細胞を病因性モノクロナル抗体(mAb)AK23と非病因性mAbAK20で刺激後可溶化し、1Dゲルで分離後分子量ごとにゲルを切り出し、消化後LC-MS/MSでプロテオーム解析を行った。抗体刺激を加えなかったものに比べ、AK23IgG添加では48種、AK20IgG添加では37種のタンパク質で有意に発現の差を認めた。AK23IgG添加で有意に発現の差がみられたものは、細胞の分化・増殖や、DNA/RNA、タンパク質の生合成や修飾、細胞の骨格や極性、代謝や酸化ストレス、各種細胞小器官に関与するものであった。実際本研究において今までに有意に発現の差がみられたタンパク質の種類は多岐にわたっていた。これらの更に詳しい解析を行っていくことで新たなシグナル伝達や反応経路を見いだすことが可能になると思われる。Westernblottingや免疫染色法等を用いて尋常性天疱瘡の更なる機能解析に繋げたい。難治な自己免疫性水疱症である天疱瘡の診断治療に直結する病因病態を解明する.

1.自己抗体の病因性をより鋭敏に反映する検査法の開発.現在市場で販売されているデスモグレイン(Dsg)3ELISAキットプレートを0.05mM EDTA処理しDsg3の立体構造を破壊し、ELISA法を施行する。その値を以下の公式にて計算値として立体構造Dsg3抗体価を得る。従来法Dsg3ELISA値ーEDTA処理ELISA値=立体構造Dsg3抗体価成果(1)得られた値の信頼性を検討した。EC1-3に結合する抗体を検出することができることを明らかにした。(2)病因性との関連性をvitroと患者の臨床症状と比較検討した。より病因性の高い抗体価を検出することができることが明らかになった。(3)疾患での違い。尋常性天疱瘡には使えるが落葉状天疱瘡には適応できないことが明らかになった。2.皮膚組織で生じる棘融解と炎症病態形成機序の解明.平成24年度の課題であるが、実験系を確立した。アッセイを行う前段階までの準備が完了した。3.表皮細胞内の天疱瘡病態シグナル伝達系の解明を行う.抗Dsg3抗体のエピトープの違い。AK23IgG→デスモソームの立体的な接着を阻害するがDsg3の消失を誘導しない抗体AK23IgM→デスモソームの立体的接着を阻害しないがDsg3の消失を誘導する抗体の二種類がある。これまでの報告ではAK23IgGは病因性があり、IgMは病因性がないと報告されている。しかし、我々はDsg3の消失が天疱瘡病態の中心的な役割をしていると考えている。この相違点、Dsg3欠損デスモソームを誘導できる抗体の病因性があるか?作用機序は?を解析する。その結果、病態がさらに解明され、より病態に密着した正確な診断、治療選択や効果判定を行うことが可能になる.プロテオーム解析を2回に渡り検討し,候補分子を見いだすことができた.発現や局在の変動を見いだすことは最終年度に終了することは技術的に可能である.病因性抗体,非病因性抗体の検討については,EDTA ELISA法を確立し,臨床症例で検討し論文化した.例外的な症例についてより詳細な検討を行い完了した.今後論文化予定.尋常性天疱瘡の病因シグナルの候補の一つにEGF受容体が見いだされていたが,真偽については統一した見解が得られていなかった.天疱瘡の亜型で,天疱瘡と同様に抗デスモグレイン3抗体を有する増殖性天疱瘡の検体を入手することができたので,尋常性天疱瘡と比較検討できた.まだ完全にデータがでておらず,確定的な結論に至ってはいないが,実験は順調に進んでおり,尋常性天疱瘡におけるEGF受容体経路の重要性を増速性天疱瘡と比較検討することによって明らかにすることが近い将来可能と予想している.(1) EDTA処理抗DsgELISAキットの評価○基礎研究:新規の検査法であり、検出される抗体価の正確なドメインの絞り込みと病因性に関する生化学的な検討。完了しBr J Dermatol. 2012に受理された。○臨床研究:実際の臨床症例で、臨床経過と重症度との関連性を証明した。投稿中。(2)棘融解形成機序デスモソームのDsg3とデスモソームに組み込まれていないDsg3に異なる結合性をもつIgM型、IgG型Dsg3抗体を用いてDsg3欠損デスモソーム形成機序を検討する。天疱瘡患者IgGを表皮細胞に作用させサイトカイン産生能を検討する。