hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫の概潮汐リズムをもたらす分子および神経機構

マングローブスズの成虫は約12.5時間周期の明瞭な概潮汐活動リズムを示し、それに加えて昼間の活動を抑制する概日リズムを示す。前者では水没刺激が、後者では明暗サイクルが同調因子になっている。昨年度、マングローブスズの概日時計遺伝子periodをクローニングし、その一部配列に相当する2本鎖RNAを合成し、成虫に注射することによってperiod遺伝子の発現抑制(RNA干渉法)を行った。その結果、概潮汐活動リズムの発現およびその自由継続周期には影響はなかったが、それを修飾する概日リズムが消え、主観的明期と主観的暗期の活動量の違いがみられなくなった。本年度は、前年度と同じ24時間周期の明暗サイクルのもとで飼育して2本鎖RNAを注射後全暗に移すという実験条件で例数を増やすとともに、データ解析方法を検討して、概日成分の有無を判定する方法をより客観的なものとした。さらに、概潮汐リズム周期の2倍から離れた23時間周期の明暗サイクルのもとで2本鎖RNAを注射してそのままの条件におくことによって、より概日成分と概潮汐成分を区別しやすい実験方法を考案した。それらの結果は、マングローブスズの概潮汐リズムは、period遺伝子の関係する概日リズムとは異なる分子機構によりもたらされていることを強く支持している。これはこれまで未知であった概潮汐リズムの分子機構に関する知見であり、今後概日リズムと概潮汐リズムの進化を考えるための足掛かりとなる成果である。(1)マングローブスズの成虫を沖縄県宜野座村のマングローブ林において採集した。(2)マングローブスズ成虫の歩行活動リズムを長期間にわたって記録するシステムを構築し、野外で採集した成虫および実験室で飼育した成虫の活動リズムを、明暗サイクルのもとおよび全暗条件で記録した。その結果、約12.5時間周期の明瞭な概潮汐活動リズムがみられ、これは明暗のサイクルには同調しなかった。しかし、明暗サイクルの下では、明期の活動が抑制された。しかも、この活動抑制は、光による直接の抑制だけでは説明がつかず、主観的明期の活動を抑制する概日リズムがあることが明らかになった。(3)マングローブスズにおける概日時計遺伝子period遺伝子をクローニングし、その塩基配列の一部を決定した。(4)このperiod遺伝子の一部配列に相当する2本鎖RNAを合成し、成虫に注射することによってperiod遺伝子の発現抑制(RNA干渉法)を行った結果、概潮汐活動リズムの発現およびその自由継続周期には影響はなかったが、それを修飾する概日リズム成分が消え、主観的明期と主観的暗期の活動量の違いがみられなくなることがわかった。対照として生理食塩水を注射したものや大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子の2本鎖RNAを注射したものでは効果はなく、概潮汐リズムおよび、概日リズムが残った。以上より、マングローブスズの概潮汐リズムは、period遺伝子の関係する概日リズムとは異なる分子機構によりもたらされると考えられる。
受精を司るＪｕｎｏ－Ｉｚｕｍｏ１複合体の構造解析

本研究では哺乳類の受精における膜融合を担う卵子側の因子であるJunoと、精子側の因子であるIzumo1の細胞外ドメインについて、X線結晶構造解析によって複合体の立体構造を決定し、JunoによるIzumo1認識メカニズムを解明することを目的とする。本年度はマウス由来JunoおよびIzumo1につい結晶化スクリーニングを行った。本研究員はマウス由来のJunoおよびIzumo1について、ショウジョウバエ由来S2細胞を用いたJunoおよびIzumo1の発現系の構築に成功している。これにより1 Lの培養上清から高純度に精製されたマウス由来のJunoおよびIzumo1をそれぞれ1 mg以上得ることに成功した。得られた精製Junoと精製Izumo1を1:1の比率で混合し、結晶化スクリーニングを行ったが現在までに結晶は得られていない。2016年にNatureに発表されたOhtoらによる論文、およびAydinらによる論文によると、ヒト由来のJunoおよびIzumo1はゲル濾過カラムクロマトグラフィー上で結合し、複合体に由来するピークを形成することがわかっている。一方、本研究において使用しているマウスに由来するJunoおよびIzumo1は、混合してゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけると複合体に由来するピークは得られなかった。そのため今後はマウス由来のJunoおよびIzumo1の複合体の結晶を得るためには、二者の結合を等温滴定カロリメトリー(ITC)や表面プラズモン共鳴(SPR)などにより定量し、その度合いをヒト由来JunoおよびIzumo1の結合強度と比較する必要があると考えられる。十分な結合が確認できなかった場合には、結晶化に用いるタンパク質の濃度の検討や、タンパク質表面のリジン残基のメチル化などにより、結晶構造解析にむけて結晶化を促進するための処理を行う必要がある。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では哺乳類において受精を司るタンパク質について、X線結晶構造解析によってタンパク質複合体の立体構造を決定し、その認識のメカニズムを解明することを目的とする。本年度は哺乳類由来Junoの細胞外ドメインおよびIzumo1の細胞外ドメインについて複数のタンパク質発現系の検討と構築、また結晶化スクリーニングを行った。それぞれにタンパク質についてバキュロウイルスによるタンパク質の大量発現系であるSf9細胞を用いた発現が可能であることを見出した。さらに大腸菌発現系および哺乳類細胞発現系を検討し、いずれの系からも目的タンパク質が発現可能であることを見出した。大量培養・発現を行ったのち、それぞれのタンパク質について結晶化に適した高純度に精製することに成功し、得られた精製産物を混合して結晶化することにより、タンパク質複合体の結晶化スクリーニングを行った。現在はより結晶化に適したタンパク質を得るためそれぞれのタンパク質について発現コンストラクトの改良を行い、またより効率的な結晶化スクリーニングを行うため、発現量の向上を目的とし、さらなる発現系の検討を行っている。さらに申請者は本年度までの研究でコリン特異的ホスホジエステラーゼであるマウス由来Enpp6のX線結晶構造を決定し、Enpp6が脊椎動物に保存されたコリン結合ポケット構造によりコリンを特異的に認識することを明らかにした。本研究成果はScientific Reports誌に掲載された。Juno-Izumo1複合体についてはJunoおよびIzumo1の発現系を確立し、結晶化を行ったため、計画通りに進展している。加えて現在までに進めてきたEnpp6のX線結晶構造解析を完了し、論文として発表したため、計画以上の進展があった。本研究では、哺乳類の受精における膜融合を担う卵子側の因子であるJunoと、精子側の因子であるIzumo1の細胞外ドメインについて、X線結晶構造解析によって複合体の立体構造を決定し、JunoによるIzumo1認識の分子メカニズムを解明することを目的とする。昨年度までに使用していたタンパク質発現系では、大規模な結晶化スクリーニングに必要な量のタンパク質を得ることができていなかった。そこで本年度はJunoとIzumo1それぞれについて、ショウジョウバエ由来S2細胞発現系を用いて安定発現株の樹立を成功させることで、結晶化に用いるのに十分な量のタンパク質を精製することを可能にした。得られた細胞株を用いて、大量培養・および精製を行い、細胞培養上清をNiアフィニティーカラム・イオン交換カラム・ゲル濾過カラムを用いて高純度に精製する系を確立した。これにより高純度に精製されたJunoおよびIzumo1を、1 Lの細胞培養上清からそれぞれ1 mg以上得ることに成功した。これは結晶化スクリーニングを行うのに十分な量である。得られた精製Junoと精製Izumo1を1:1の比率で混合し、これを複合体の結晶を得るための結晶化スクリーニングを行った。しかし現在までに結晶は得られていない。今後はさらなる結晶化スクリーニングを行うことによりJuno-Izumo1複合体の結晶を得て、これを用いてJuno-Izumo1複合体の結晶構造を決定する。これまで問題であった目的タンパク質の収量の改善のため、目的タンパク質の発現系および精製系を確立することができた。得られた精製タンパク質を用いて結晶化スクリーニングを行うことができたことから、本研究員の構造解析は本年度で大きく進展した。以上のことから、本研究は本年度に順調に進展したと判断する。

本研究では哺乳類の受精における膜融合を担う卵子側の因子であるJunoと、精子側の因子であるIzumo1の細胞外ドメインについて、X線結晶構造解析によって複合体の立体構造を決定し、JunoによるIzumo1認識メカニズムを解明することを目的とする。本年度はマウス由来JunoおよびIzumo1につい結晶化スクリーニングを行った。本研究員はマウス由来のJunoおよびIzumo1について、ショウジョウバエ由来S2細胞を用いたJunoおよびIzumo1の発現系の構築に成功している。これにより1 Lの培養上清から高純度に精製されたマウス由来のJunoおよびIzumo1をそれぞれ1 mg以上得ることに成功した。得られた精製Junoと精製Izumo1を1:1の比率で混合し、結晶化スクリーニングを行ったが現在までに結晶は得られていない。2016年にNatureに発表されたOhtoらによる論文、およびAydinらによる論文によると、ヒト由来のJunoおよびIzumo1はゲル濾過カラムクロマトグラフィー上で結合し、複合体に由来するピークを形成することがわかっている。一方、本研究において使用しているマウスに由来するJunoおよびIzumo1は、混合してゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけると複合体に由来するピークは得られなかった。そのため今後はマウス由来のJunoおよびIzumo1の複合体の結晶を得るためには、二者の結合を等温滴定カロリメトリー(ITC)や表面プラズモン共鳴(SPR)などにより定量し、その度合いをヒト由来JunoおよびIzumo1の結合強度と比較する必要があると考えられる。十分な結合が確認できなかった場合には、結晶化に用いるタンパク質の濃度の検討や、タンパク質表面のリジン残基のメチル化などにより、結晶構造解析にむけて結晶化を促進するための処理を行う必要がある。これまでに構築した複数の発現系を用いてタンパク質を調製し、結晶化・構造解析を行う。さらなる結晶化スクリーニングを行うことにより目的タンパク質の複合体の結晶を得て、これを用いて複合体の結晶構造を決定する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
超イオン導電体におけるイオンダインミックスのホ-ルバ-ニングによる研究

1.プロ-プイオンとしてEu^<3+>を微量ド-ブしたCeO_2ーY_2O_3について、基底状態^7Foから^5Doへの遷移に対応する吸収遷移について、サイト選択励起下の発光スペクトル、励起スペクトル、Y濃度依存性などを詳しく調べた。その結果、3価イオンのサイトは、Ce系では、vacancyを伴わないサイト、最隣接に1個のvacancyを伴うサイト、第二隣接にvacancyを伴うサイトに分類された。Zr系では、vacancyを伴わないサイト、最隣接に1個及び2個のvacancyを伴うサイトに分類された。2.種々のY濃度を持つYSZに、Eu^<3+>をド-ブした試料について、FLNの測定を行なった結果、9mol%YSZにおけ均一幅は、80Kから室温の範囲で、T^<2.6>に比例することが分かった。これはEu^<3+>をド-プした多くのガラスで見られている、T^2依存性に近い。一方、不均一幅はY濃度とともに急速に増加して行く。周波数多重メモリ-の材料として重要なパラメ-タ-であるR=(不均一幅/均一幅)を評価してみると、20Kでは19mol%で最大値5000となり、この系が、メモリ-や時間領域ホログラムの材料として、有望であることが示された。3.YSZ(Y_2O_3 10mol%)に1mol%のPr^<3+>をド-ブした系において、^3H_4ー^1D_2に対応する6115A吸収帯に25K以下で、永続的ホ-ルが生じることを見いだした。また、ホ-ル幅は、4.2Kにおいて0.35GHzであり、4.2Kから20Kの範囲でT^<1.3>に比例するという結果が得られたが、これは、均一幅がTLS(two level system)との相互作用で決まっていることを示唆している。特に、上の2,3は、高分解能分光を初めてYSZに初めて適用したものであり、この系のミクロな研究の出発点になると同時に、時間領域ホログラムの素材としての応用の可能性を示したものと考えられる。本年度は、試料の作製、評価、測定装置の組み立て調整を中心に研究を進め、また一部の試料については、発光の励起スペクトルの測定、ホ-ルバ-ニングの予備実験を行なった。銀ハライド系の超イオン導電ガラスについては、AgI、Ag_2O、B_2O_3を原料とし、種々の成分比における最適の作製条件を調べ、二三の光学的測定が可能な良質の試料を得ることが出来た。ガレ-トについては、十分に大きな単結晶を育成する事に成功し、希土類イオンの置換を試みている。さらに、ジルコニア系の試料については、キセノンア-クイメ-ジ炉を用いて、Pr^<3+>、Eu^<3+>などのイオンをド-プしたものを作製した。Euをド-プしたYSZの系に関しては、エキシマ-レ-ザ-励起色素レ-ザ-を用いて、数種類のモル比の試料についてサイト選択励起発光スペクトルの測定を行ない、少なくとも3種類の異なるEuイオンサイトが存在することを明らかにした。また、そのサイトの比率は、Yイオンの濃度に依存して複雑に変化するという興味深い結果を得た。

YSZと同じ結晶構造を持った酸素イオン伝導体であるCeO_2について、特に、Y_2O_3濃度の低い領域での振舞いを調べる目的で、上記と同様の測定を行った。その結果、4-5種類の異なったEu^<3+>イオンサイトが見いだされた。これらのサイトの差は、酸素イオンの配位の違いに起因していると考えられ、詳しいモデルについて検討中である(以上は、東北大学グル-プとの共同研究である)。ホ-ルバ-ニングについては、狭帯域CWリング色素レ-ザ-を用いてHe温度における実験を開始したところである。未だ、ホ-ルの生成は確認されていないが、製作した装置が、ホ-ルの観測に十分な感度、周波数分解能を有することが分かった。1.プロ-ブイオンとしてEu^<3+>を微量ド-プしたCeO_2ーY_2O_3、ZrO_2ーY_2O_3について、基底状態^7F_0から^5D_0への遷移に対応する吸収遷移について、サイト選択励起下の発光スペクトル、励起スペクトル、Y濃度依存性などを詳しく調べた。その結果、3価イオンのサイトは、Ce系では、vacancyを伴わないサイト、最隣接に1個のvacancyを伴うサイト、第二隣接にvacancyを伴うサイトに分類された。Zr系では、vacancyを伴わないサイト、最隣接に1個及び2個のvacancyを伴うサイトに分類された。2.種々のY濃度を持つYSZに、Eu^<3+>をド-プした試料について、FLNの測定を行なった結果、9mol%YSZにおける均一幅は、80Kから室温の範囲で、T^<2.6>に比例することが分かった。これは、Eu^<3+>をド-プした多くのガラスで見られている、T^2依存性に近い。一方、不均一幅はY濃度とともに急速に増加して行く。周波数多重メモリ-の材料として重要なパラメ-タ-であるR=(不均一幅/均一幅)を評価してみると、20Kでは19mol%で最大値5000となり、この系が、メモリ-や時間領域ホログラムの材料として、有望であることが示された。3.YSZ(Y_2O_310mol%)に1mol%のPr^<3+>をド-プした系において、^3H_4ー^1D_2に対応する6115Aの吸収帯に25K以下で、永続的ホ-ルが生じることを見いだした。また、ホ-ル幅は、4.2Kにおいて0.35GHzであり、4.2Kから20Kの範囲でT^<1.3>に比例するという結果が得られたが、これは、均一幅がTLS(two level system)との相互作用で決まっていることを示唆している。特に、上の2,3は、高分解能分光を初めてYSZに初めて適用したものであり、この系のミクロな研究の出発点になると同時に、時間領域ホログラムの素材としての応用の可能性を示したものと考えられる。
卵巣癌に対する S100A4 を標的とした新しい治療薬の開発

卵巣癌におけるS100A4発現亢進は、S100A4遺伝子のpromoterからintron領域の-4から+248領域に存在するHypoxia Response Elementが重要であり、低酸素環境がS100A4発現亢進に影響していると考えられる。次に10000種化合物を含む化合物ライブラリーを用い、S100A4遺伝子の転写抑制作用が強い化合物を見出すスクリーニングを行い、これまでに6種の化合物が有意にS100A4転写活性を抑制することを見出した。これらは新たな分子標的薬の候補化合物と考えられた。我々はこれまで卵巣癌の播種性転移の過程を微小環境の観点から検討してきた結果S100A4発現は卵巣癌播種性転移にきわめて重要なシグナルを司ることが判明した。このことから、卵巣癌患者の予後を向上のために、本研究ではS100A4発現亢進機序の解明、およびS100A4を抑制する治療法を開発することを目的とする。卵巣癌細胞におけるS100A4発現増強機序の解明するため、S100A4遺伝子のpromoterおよび第一イントロンを含む様々なコンストラクトを作成しPGL4 vectorに組み込み、卵巣癌細胞における低酸素下での転写活性をレポーターアッセイで検討した。これまでに行ったレポーターアッセイではS100A4遺伝子のpromoterからintron領域の-45から+248領域が転写に重要であり、低酸素下で転写活性が亢進するとともに浸潤能が亢進した。同領域内には2個のHypoxia Response Element(以下HRE)が存在するため、HIF-1αとの結合をCHIP assayにて検討したところHRE1とHIF-1αの結合が低酸素下で増強するという結果が得られている。このことからS100A4の発現亢進に細胞のおかれた微小環境が影響していることが有力となっている。さらに、S100A4発現抑制物質の探索するために、S100A4プロモーター下にLuciferaseを発現するレポータープラスミドpGL4/Neo/S100A4,を作成し、安定発現クローンA2780-LS100を樹立した。樹立した細胞株を用いてS100A4転写抑制作用が最も強い薬剤のスクリーニングを行っている。我々はこれまで卵巣癌の播種性転移の過程を微小環境の観点から検討しS100A4発現は卵巣癌播種性転移にきわめて重要なシグナルを司ることを見出した。このことから、本研究では、S100A4発現亢進機序の解明、およびS100A4を抑制する治療法を開発することを目的とする。S100A4発現亢進機序としては、これまでの検討から、S100A4遺伝子のpromoterからintron領域の-45から+248領域が転写に重要であり、低酸素下で転写活性が亢進するとともに浸潤能が亢進すること、同領域内に存在する2個のHypoxia Response Element(以下HRE)のうちHRE1とHIF-1αの結合が低酸素下で増強することから、S100A4の発現亢進に細胞のおかれた微小環境が影響していると考えられる。次にS100A4発現を抑制する治療法開発にむけ、平成23年度は、S100A4発現抑制物質の探索を開始した。このために、S100A4プロモーター下にLuciferaseを発現するレポータープラスミドpGL4/Neo/S100A4を作成し、安定発現クローンA2780-LS100を樹立した。樹立した細胞株を用いて10000種化合物を含む化合物ライブラリー(DIVERSet,Chembridge社)を用い、S100A4転写抑制作用が最も強い薬剤のスクリーニング行った。検証実験も行った結果、これまでに6種の薬剤が有意にS100A4転写活性を抑制することを見出した。S100

A4発現亢進機序としては、これまでの検討から、S100A4遺伝子のpromoterからintron領域の-45から+248領域が転写に重要であり、低酸素下で転写活性が亢進するとともに浸潤能が亢進すること、同領域内に存在する2個のHypoxia Response Element(以下HRE)のうちHRE1とHIF-1αの結合が低酸素下で増強することから、S100A4の発現亢進に細胞のおかれた微小環境が影響していると考えられる。次にS100A4発現を抑制する治療法開発にむけ、平成23年度からは、S100A4発現抑制物質の探索を開始した。このために、S100A4プロモーター下にLuciferaseを発現するレポータープラスミドpGL4/Neo/S100A4を作成し、安定発現クローンA2780-LS100を樹立した。樹立した細胞株を用いて10000種化合物を含む化合物ライブラリー(DIVERSet, Chembridge社)を用い、S100A4転写抑制作用が最も強い化合物のスクリーニング行った。検証実験も行った結果、これまでに6種の化合物が有意にS100A4転写活性を抑制することを見出した。S100A4発現機序において低酸素環境がepigeneticな変化を誘導しながら発現を増強することを見出した。また、S100A4発現抑制物質の候補も抽出でき、概ね当初の計画の通りに研究が進行している。成果報告できるほどではないが、同定した物質のin vivoでの抗腫瘍効果検討も進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、同定したS100A4発現抑制薬剤が、実際に複数の卵巣癌細胞株でS100A4発現を抑制するか確認していく。また、in vitroにおける同定した薬剤の抗腫瘍効果、浸潤抑制作用等について検討する。さらにマウス腹腔内播種モデルを用いて、同定した薬剤の抗腫瘍効果や安全性の検討を進める。さらに抗がん剤など他の薬剤との併用効果も確認する。研究遂行上、現時点で大きな問題は特にない。
中東地域におけるイスラム運動の展開とネットワーク

本研究では、中東地域に見られるイスラム運動とイスラム回帰現象を、人の移動、文化の移動など、国境を超えるグローバル・リージョナルな動きと関連させて3つの点を検討した。第1に、イスラム運動は、若年層の就業機会の縮小と高学歴化など、社会経済的な問題に密接にかかわるだけでなく、文化の移動、それにかかわる宗教指導者や住民の移動によって大きな影響を受けた。宗教指導者は、知識を求めて中東地域の中で古くからそして現在でも移動しており、シ-ア派の宗教指導者の例に見られるように、親族ネットワークを通じて移動し、流入地やあるいは流出に戻ってその地域のイスラム運動を促進した。文化の移動を支えたもうひとつの層は、レバノンに見られるように、古くは職を求めてカイロから西アフリカ、あるいは、ラテンアメリカまで流出し、最近では国際労働移動によって中東地域に移動して帰国した青年たちであった。移動を支えた二つの集団に注目して移動とネットワークに注目した。第2に、中東地域を越えたイスラム諸国においてイスラム回帰現象が発生し、それ以外にも、アフリカ、ラテンアメリカ、アジア地域においても宗教化現象、あるいは、伝統志向現象が強まっている。ここでは、もっとも社会学的な視点、階層変化、とくに、伝統的な中間層と新中間層の量的な関係を、世界の主要国のデータ・統計数値を用いて整理した。発展がもたらす新中間層とその過程のおいて力を弱める旧中間層は、イスラム回帰現象や他の地域における伝統主義や宗教化との関係を見たいためである。第3に、イスラム回帰現象や自文化志向現象を文化に密着して基層の点から検討していくために、第三世界の諸国における一連の現象を、コミュニティレベルでの宗教活動など、ビデオやテレビが伝える映像データを、文字データだけでなくできるだけ整理しておく必要がある。このために、映像データなどの収集も試みた。イスラム運動とネットワークに関して、本年度は、第一に、移動のうちでも国内移動に注目してセンサス・データを整理した。革命後のイランでは、76-86年の時期に首都ではなく、地方都市において人口増加が著しい(9.6%)。こうした状況のなかで、イラン西部におけるマイノリティ・エスニック集団が居住する地域と首都テヘラン間の移動、テヘラン→同地域、逆に、同地域→テヘランに注目した。地域レベルでの移動の実態を、一国の移動に加えて検討した。同時に、トルコにおける東部後進地域と西部先進工業地域イスタンブル地域間の、地域間の移動も検討した。また、アラブ地域ではイラクについて、地域レベルでの移動をセンサスの限られたデータをもとに整理した。成果の一部は、国立民族博物館における1月の会議で報告した。第二に、イスラム運動に関しては、パレスチナ問題に関わるレバノンを対象に、キリスト教マロン派、スンニ派、シ-ア派など、エスニック集団ごとに故地と首都レバノン(居住地区レベル)間の移動、さらにそれぞれのエスニック集団ごとに国家を超える移動、19世紀後半にマロン派はエジプト、その後アメリカやラテンアメリカに大量に移動した。これに対してシ-ア派は、19世紀末には西アフリカなどに移動していた。1960年代末からはレバノン国内の好景気などのためにアフリカから還流したが、国内では確立されたエリートにはなれず、シ-ア派イスラム運動の担い手に資金的な援助をした。イスラム運動を支えたシ-ア派に注目し、移動とイスラム化の関連を検討した。移動データの図化などを、さらに進める予定である。
唾液腺がんの免疫組織学的特徴及び特異的遺伝子変化の探索

唾液腺腺癌の中には唾液腺導管癌と免疫組織学的に類似したアンドロゲン陽性唾液腺腺癌が存在し予後不良であった。また、AR陰性唾液腺腺癌はAR陽性唾液腺腺癌及び唾液腺導管癌とは全く異なる免疫組織学的特徴を有し、遺伝子学的特徴も全く異なる疾患であることが見いだされた。また、アンドロゲン陽性唾液腺腺癌はHER2陽性例が多く、唾液腺導管癌と共に今後はこうアンドロゲン療法や抗HER2療法の対象として治療開発を行えることが見いだされた。さらには、唾液腺腺癌の中にはflt3やRETのような既存の分子標的薬で治療可能な遺伝子変異が存在することも判明し今後症例数を増やして検討を進める。唾液腺腺癌(ANOS)15例における以下の平成26年度計画である2項目の検討1.免疫組織学的検討特に我々が唾液腺導管癌(SDC)との相同性に注目している免疫染色においては、ANOS 15例に対してアンドロゲン受容体、GCDFP、EGFR、HER-2などの免疫染色を当初の計画通りに行い評価は終了した。2.SDCとANOSとの比較検討既に染色済みのSDC 15例での免疫染色との比較検討を予定通り行った。この結果、ANOSの染色パターンとSDCの染色パターンは類似点と相違点の抽出が行えた。さらに、HER-2に関しては免疫染色だけではなく、HER-2(FISH)による追加検討も行っている。現時点で得られた結果からは、当初の予想通りSDCとANOSの免疫組織学的相同性が示唆される知見も得られており、それに対応する臨床データからの検討も引き続き行っていく予定である。以上より、順調に免疫組織学的検討及び臨床データ上の検討も進捗したため、平成26年度の成果部分での論文化を目指すと共に、平成27年度の計画である網羅的な遺伝子異常検索のために唾液腺癌未染色標本を用いたDNA抽出手技の確立に取り掛かっている。平成27年度は、前年度の唾液腺導管癌(SDC 15例)及び唾液腺腺癌(ANOS 15例)について予定通り免疫組織化学的検討は終了していたため、それぞれの検体からのDNA抽出および次世代シークエンサー(NGS)を用いた網羅的遺伝子解析に取り掛かった。しかし、SDC及びANOSの未染色標本からのDNA抽出作業が困難を極めた。このため、平成27年度中にDNA抽出作業及びNGSの実施体制を見直すこととした。具体的には、これまでもDNA抽出作業などについて相談・研修させて頂いていた、本分野で非常に実績のある近畿大学医学部ゲノム生物学教室との連携を開始した。まず、当院で作成したSDC及びANOSの未染色標本を用いたDNA抽出及びNGS解析を近畿大学医学部ゲノム生物学教室に解析を依頼することとした。本作業を近畿大学医学部ゲノム生物学教室において実施して頂くにあたり、近畿大学医学部遺伝子倫理審査委員会において本解析を行うことについて平成28年2月25日付けで本件の承認が得られた。平成27年度は、DNA抽出及び次世代シークエンサー(NGS)を用いた網羅的遺伝子解析まで行う予定であった。しかし、前述の通り当研究室でのDNA抽出ができず、NGS解析も行えなかった。このため、本研究分野で実績のある近畿大学医学部ゲノム生物学教室において、DNA抽出及びNGS解析を行うことを依頼した。それに当たって近畿大学医学部遺伝子倫理審査委員会で審査頂き、平成28年2月25日付けで本件の承認が得られた。唾液腺がんは稀な腫瘍であり、さらに30種類以上の組織型が存在し、形態学的診断が非常に困難であることでも知られている。また、疾患特異的な遺伝子異常に関する知見にも乏しい。以上のような理由から、唾液腺がんの診断方法や治療方法は確立していない。このため、当院における唾液腺がんデータベースを利用し、特に予後が不良な唾液腺導管癌と唾液腺腺癌に着目し、免疫組織化学的特徴と特徴的遺伝子変化の検討を行った。まず免疫組織化学的染色(IHC)による検討を唾液腺導管癌15例と唾液腺腺癌15例について行った。これにより唾液腺導管癌(15例)とアンドロゲン受容体(AR)陽性唾液腺腺癌(9例)の染色パターンは類似しており、臨床的にもAR陽性唾液腺腺癌はAR陰性唾液腺腺癌(6例)よりも予後不良であることが判明した。また、HER2(IHC)とHER2-FISHのconcordanceについては既報の胃がんや乳がんと同様であった。次世代シークエンサーによる遺伝子解析を行った。合計57遺伝子の解析を、唾液腺導管癌10例と唾液腺腺癌10例について行った。この結果からは先述のIHCによる腫瘍細胞のタンパク発現パターンと、次世代シークエンサーで判明した遺伝子変化は必ずしも一致しないことが見いだされた。その一方で、既存の分子標的薬の治療標的となりうる遺伝子変化も新たに発見された。以上のことから、今後さらに症例数を増やして検討を行う価値がある結果と考えられ、再現性と一定の頻度が確認されれば、今回判明した標的とそれに対応する分子標的薬による医師主導治験を立ち上げることを検討する。

また、アンドロゲン陽性唾液腺腺癌はHER2陽性例が多く、唾液腺導管癌と共に今後はこうアンドロゲン療法や抗HER2療法の対象として治療開発を行えることが見いだされた。さらには、唾液腺腺癌の中にはflt3やRETのような既存の分子標的薬で治療可能な遺伝子変異が存在することも判明し今後症例数を増やして検討を進める。平成26年度に予定していた、唾液腺腺癌(ANOS)15例における免疫組織学的検討は終了し、既存の唾液腺導管癌(SDC)との比較検討が完了した。この結果から、やはりANOSとSDCに共通する病因が存在する可能性が示唆される研究結果であった。このため、平成27年度以降に行う特異的遺伝子変化の検討に移行する価値があると判断した。ただし、平成26年度後半から取り組んでいる唾液腺癌組織からの遺伝子抽出作業がやや難航していることと、平成26年度の成果の論文化作業は継続中であるため、順次達成できるように研究を進めていく予定である。平成27年度は上述の通り、研究実施体制の再整備を行い、近畿大学医学部ゲノム生物学教室においてDNA抽出までは終了した。今後は、依頼したペア検体を用いたNGS解析の結果が判明次第、既に終了しているSDC及びANOSの免疫組織化学的染色結果とを分析し、SDC及びANOSに共通する遺伝子変化を見出せるように研究を進めていく予定である。頭頸部がん平成27年度には、平成26年度の成果を基に、唾液腺導管癌および唾液腺腺癌(NOS)に特徴的な遺伝子変化を見出す研究を行っておく。これにあたり、平成26年度後半よりFFPE検体からのDNA抽出作業を開始しているが、唾液腺癌に特有の問題もしくは使用しているDNA抽出キットやプロトコールの問題が存在するためか、現時点ではDNAの収量が不十分な状況である。今後、使用するFFPE検体量を増やす、DNA抽出プロトコールの見直しなどの対策を行い、円滑に網羅的遺伝子検索を行えるように準備を進める。実績報告に記載したとおり、平成27年度に終了予定であったNGS解析を行えなかったことが次年度使用額が生じた理由です。先行研究である唾液腺導管癌の免疫染色委託費用を平成25年度に支払っており、平成26年度は免疫染色用抗体及びテスト用のDNA抽出キットの支出のみで済んだ。このため、差額である630,315円は平成27年度に使用することになった。このため、平成28年度は27年度に行う予定であった、近畿大学医学部ゲノム生物学教室においてNGS解析を行うのに必要な実験器具や試薬の購入に主に使用すると共に、最終解析の報告に必要な予算として用います。平成27年度はやや難渋しているDNA抽出作業に加えて、本研究の主目的である唾液腺癌に特徴的な遺伝子変化を見出すための網羅的解析を行う。このため、それに伴う物品費及び委託費用が必要となり、これに充てる予定である。
虚血脳での脳軟膜動脈における側副血行路発達機序の解明

マウス一側総頸動脈閉塞後の中大脳動脈・前大脳動脈、中大脳動脈・後大脳動脈潅流境界領域における脳軟膜動脈吻合の発達を、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の投与により促進できないかどうかを検討した。マウス一側総頸動脈閉塞2週間後では、脳軟膜動脈吻合の発達が明らかに観察されるが、1週間後には一部の動物で吻合血管の発達が見られるものの有意ではなかった。マウス一側総頸動脈閉塞による低潅流負荷翌日よりGM-CSF20μg/kgを隔日で7日後まで投与した(CCA-GMCSF群)。対照群として一側総頸動脈閉塞後生理食塩水を投与した群(CCA-Saline群)、総頸動脈閉塞の代わりに偽手術を行いGM-CSFを投与した群(Sham-GMCSF群)、生理食塩水を投与した群(Sham-Saline群)を用いた。脳軟膜動脈吻合の発達程度は、深ネンブタール麻酔下に開胸し、左心室より墨汁ロラテックズビーズを投与し、脳表面の吻合血管の本数、サイズを評価した。脳軟膜動脈の血管径は、Sham-Saline群24.4±4.5μm、Sham-GMCSF群25.4±5.8μm,CCA-Saline群25.9±8.1μmに比しCCA-GMCSF群では32.0±8.8μmと有意な拡張が観察された。次にGM-CSF投与により促進される吻合血管が機能的に有効かどうかを明らかにするため、同側中大脳動脈永久閉塞による梗塞サイズを縮小するかどうかを検討した。一側総頸動脈閉塞または偽手術1週間後に同側中大脳動脈を永久閉塞し24時間後にTTC染色で評価したところ、Sham-Saline群51.9±11.1mm^3、Sham-GMCSF群52.0±15.0mm^3,CCA-Saline群48.0±14.8mm^3に比しCCA-GMCSF群では35.4±12.2mm^3と有意な梗塞サイズ縮小効果が観察された。以上の結果よりGM-CSF投与は慢性低潅流負荷により脳軟膜動脈吻合血管にずり応力がかかる状況下で、脳軟膜動脈吻合の発達を促進し、中大脳動脈永久閉塞後の脳梗塞サイズを縮小することが明らかになった。マウス-側総頸動脈閉塞後の中大脳動脈・前大脳動脈潅流境界領域における脳軟膜動脈吻合の発達程度を経時的に観察した。総頸動脈閉塞1週間後より、吻合血管の口径は増大を示し、2週間後、1ヶ月後には半数以上の動物で明らかな吻合の発達を認めた。しかし。吻合血管数の変化は観察されなかった。またラットにおいても同様な検討を開始し、脳血流自動調節能曲線への影響を検討した。ラット総頸動脈閉塞2週間後に同側の中大脳動脈を閉塞すると、無処置群に比し血流低下度の改善、有意な神経症状の改善、梗塞体積の縮小を観察した。

次に一側総頸動脈閉塞下の慢性低潅流状況下での、脳軟膜動脈の適応状況を血圧低下に対する脳血流応答反応から観察した。無処置ラット、総頸動脈閉塞30分後、総頸動脈閉塞2週間後に、人工呼吸管理下に脳血流をレーザドプラ血流計で観察しつつ、脱血により血圧を下降させ、脳血流量がベースラインの10%以上低下した時点を脳血流自動調節能下限域と定めた。コントロール動物での脳血流自動調節下限域は63mmHgであったが、総頸動脈閉塞直後の30分では78mmHgと右方シフトを示した。しかし総頸動脈閉塞2週間後には63mmHgとコントロールと同様の値に回復していた。すなわち総頸動脈閉塞2週間の間に脳軟膜血管が適応現象を発現し、血圧低下に対する脳血流防御能を回復したものと考えられる。以上の結果より、マウス、ラット両モデルにおいて、一側総頸動脈閉塞下における慢性低灌流状況下では、脳軟膜動脈レベルでの吻合が増強され、中大脳動脈閉塞に際する虚血侵襲を軽減する事が明らかになった。マウス一側総頚動脈閉塞による慢性低潅流状態において、脳軟膜動脈吻合での側副血行路発達に及ぼす顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の効果を検討した。GM-CSFは骨髄よりの単核球を動員し、下肢虚血モデルでは血管閉塞部位より遠位での側副血行路を拡大することが報告されている。マウス一側総頚動脈閉塞後、GM-CSF20μg/kgまたは生理食塩水を隔日に皮下注射し投与した。血管閉塞1週間後に、深ネンブタール麻酔下に開胸し経心臓的に墨汁加ラテックスビーズを注入した後、脳を取り出し脳表面での脳軟膜動脈吻合のサイズを観察した。対象として偽手術後にGM-CSFまたは生理食塩水を隔日に1週間投与したマウスを用いた。偽手術群ではGM-CSF投与と生理食塩水投与群との間に脳軟膜動脈吻合血管径に差が見られなかったが、総頚動脈閉塞1週間後のマウスでは生理食塩水投与群に比べGM-CSF投与群で有意な血管径の拡大が観察された。次にマウス一側総頚動脈閉塞1週間後に、同側中大脳動脈を永久閉塞し作成される梗塞サイズに対するGM-CSFの効果を検討した。中大脳動脈閉塞1週間後に脳を取り出し1mm厚の冠状切片を作成しTTC染色により梗塞体積を算出した。偽手術群ではGM-CSF投与と生理食塩水投与群との間に脳梗塞容積に差が見られなかったが、総頚動脈閉塞1週間後のマウスでは生理食塩水投与群に比べGM-CSF投与群で有意な梗塞体積の縮小が観察された。以上の研究結果より、慢性低潅流状態でGM-CSFは脳軟膜動脈吻合での側副血行路の発達を促進し、中大脳動脈閉塞による脳梗塞サイズを縮小する作用がある事が示された。
コンディショナル変異導入マウスを用いたNMDA受容体の情報伝達機構の研究

個体を用いる遺伝子機能解析は遺伝子ノックアウト法により急速に進歩したが、従来の方法にはノックアウトマウスの致死や重度発達異常により適切な時期の個体を得られないなど問題点が多い。また標的分子へのアミノ酸置換により機能を変換する方法も求められている。我々はこれの問題の解決のため独自の方法で「マウス個体の特定組織・特定時期で標的分子にアミノ酸置換により機能を変換する方法(コンディショナル変異導入法)」を開発し、特定細胞群においてNMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)を活性化させるNMDARアミノ酸置換マウスを作成した。当該マウスではNMDAR異常活性化を示し、四肢のClaspingreflex異常時の神経学的所見を認めた。当該マウスの脳の各部位でアミノ酸置換型への組換えが検出され、組換え細胞は神経細胞であることを確認した。(1)当該マウスのNMDAR異常活性化を手がかりに神経学的所見を引き出す仕組みを明らかにするため、ならびにNMDAR異常活性化を抑制する薬物の探索のため、NMDARの作働性薬・拮抗薬・ドーパミン受容体の作働性薬・拮抗薬・またはパーキンソン病治療薬を投与し抑制効果を検定した。そのうち、NMDA受容体非拮抗的阻害薬にて神経症状が完全にかつ可逆的に抑制されることが明らかになった。(2)NMDARのアミノ酸置換型分子の発現解析・機能解析のためのアミノ酸置換部位に対する特異抗体を得るため、アミノ酸置換部位の合成ペプチドを抗原としてポリクロナル抗体を作成し、当該部位に対する抗体を得た。正常型配列と置換型配列を識別する特異性は検討中である。(3)田中寅彦博士(研究分担者)は、ファージディスプレイ人工抗体樹立法によりNMDARアミノ酸置換部位に対する人工抗体の作成を進めてきた。まず、適切な人工抗体確立には配列多様性が1x10^9以上の大規模ファージディスプレイラリーの作成が必須であるため、高い配列多様性を持つファージライブラリーの短時間で効率的に作製する方法を独自に開発した。すでに本ライブラリーから高アフィニティーの人口抗体を確立しており、NMDARのアミノ酸置換部位に対する人工抗体作成を進める。コンデイショナル変異導入法によりNMDA受容体異常活性化を導入したマウスを用いて下記を行った。(1)変異型分子に対する特異抗体の作成:NMDA受容体のアミノ酸置換による変異型分子の発現解析・機能解析には、アミノ酸置換部位に対する特異抗体の作製が必須である。NMDA受容体のアミノ酸置換部位のペプチドを合成し、ウサギポリクロナル抗本を作成したところ、膜貫通部位に対する抗体が得られた。しかし正常型アミノ酸配列と変異型アミノ酸配列を区別する特異性は不十分であった。分担研究者の田中博士は同一のペプチドを用いてファージディスプレイ人工抗体の作成を行うため、まず、人工抗体ファージライブラリーの作製法を開発した。今後、NMDA受容体のアミノ酸置換部位に対する抗体作製を進める。(2)NMDA受容体アミノ酸置換マウスの形態学的解析:当該マウスは神経症状を示し、その責任部位候補を検索するため大脳皮質・海馬・線条体の形態を観察した。当該マウスの脳湿重量は対照マウスに比べが低いことがわかった。各部位の構造変化は検討中である。

(4)受容体作働性薬・拮抗薬による、神経症状の抑制効果の検定:当該マウスの神経症状に関連する情報伝達系の理解、ならびに抑制効果のある薬物の探索のため、NMDA受容体またはドーパミン受容体の作働性薬・拮抗薬、またはパーキンソン病治療薬を投与し、抑制効果を検定した。そのうち、NMDA受容体非拮抗的阻害薬にて神経症状が完全に抑制されることが明らかになった。(5)特定神経細胞へのNMDA受容体変異導入マウスの作製:黒質線条体あるいは大脳皮質特異的に、Cre-loxP組換えにより変異を導入するため、当該部位にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウスを用いて、特定細胞への変異導入マウスを作成した。今後、変異導入部位と神経症状との関連を観察する。個体を用いる遺伝子機能解析は遺伝子ノックアウト法により急速に進歩したが、従来の方法にはノックアウトマウスの致死や重度発達異常により適切な時期の個体を得られないなど問題点が多い。また標的分子へのアミノ酸置換により機能を変換する方法も求められている。我々はこれの問題の解決のため独自の方法で「マウス個体の特定組織・特定時期で標的分子にアミノ酸置換により機能を変換する方法(コンディショナル変異導入法)」を開発し、特定細胞群においてNMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)を活性化させるNMDARアミノ酸置換マウスを作成した。当該マウスではNMDAR異常活性化を示し、四肢のClaspingreflex異常等の神経学的所見を認めた。当該マウスの脳の各部位でアミノ酸置換型への組換えが検出され、組換え細胞は神経細胞であることを確認した。(1)当該マウスのNMDAR異常活性化を手がかりに神経学的所見を引き起す仕組みを明らかにするため、ならびにNMDAR異常活性化を抑制する薬物の探索のため、NMDARの作働性薬・拮抗薬、ドーパミン受容体の作働性薬・拮抗薬、またはパーキンソン病治療薬を投与し抑制効果を検定した。そのうち、NMDA受容体非拮抗的阻害薬にて神経症状が完全にかつ可逆的に抑制されることが明らかになった。(2)NMDARのアミノ酸置換型分子の発現解析・機能解析のためのアミノ酸置換部位に対する特異抗体を得るため、アミノ酸置換部位の合成ペプチドを抗原としてポリクロナル抗体を作成し、当該部位に対する抗体を得た。正常型配列と置換型配列を識別する特異性は検討中である。(3)田中寅彦博士(研究分担者)は、ファージディスプレイ人工抗体樹立法によりNMDARアミノ酸置換部位に対する人工抗体の作成を進めてきた。まず、適切な人工抗体確立には配列多様性が1x10^9以上の大規模ファージディスプレイライブラリーの作成が必須であるため、高い配列多様性を持つファージライブラリーを短期間で効率的に作製する方法を独自に開発した。すでに本ライブラリーから高アフィニティーの人工抗体を確立しており、NMDARのアミノ酸置換部位に対する人工抗体作成を進める。
排出トランスポーター機能変動による胆汁うっ滞発症機構の解析

肝細胞胆管側膜上に発現されるmultidrugresistance associated protein2(MRP2/ABCC2)は、胆汁酸非依存的な胆汁生成に関与し、その遺伝的欠損は胆汁うっ滞・黄疸を伴うDubin-Johnson症候群の発症原因となる。一方、後天的な種々の要因により胆汁うっ滞が惹起されるが、その機構として、MRP2/ABCC2の病態刺激による内在化が考えられる。本研究では、病態時におけるMRP2/ABCC2の内在化を明らかとし、局在変動に伴う胆汁うっ滞発症という機構を提唱した。さらに、遺伝的多型変異を有するMRP2/ABCC2分子の機能について検討を加え、分子自体の機能は正常であっても、膜局在性が変動することにより病態が発症する可能性を示唆することができた。一方、肝病態時には、MRP2/ABCC2の機能を補償すべく、血管側膜にMRP3/ABCC3が発現誘導される。ここで、MRP3/ABCC3の排出機能によっても、胆汁うっ滞の病状の程度が影響を受けうることから、ヒトMRP3/ABCC3の機能について検討を加えた。そして本排出型トランスポーターが、MRP2/ABCC2基質のほか、bile salt export pump(BSEP/ABCB11)の基質となる一価胆汁酸をも基質とすることを見出し、肝還流実験の結果とあわせて、MRP3/ABCC3を胆汁うっ滞時のレスキュー蛋白として位置付けることができた。MRP3/ABCC3の誘導の程度が、胆汁うっ滞時の病態の程度に影響を与える可能性が示唆された。胆汁うっ滞を発症および防御機構について、特にABCトランスポーターに着目した検討を進めた。硫酸抱合型胆汁酸などの多剤耐性関連蛋白2(MRP2/ABCC2)基質は、MRP2により胆汁中へと排泄された後に、胆汁側から胆汁酸排出トランスポーター(BSEP)機能をtrans-inhibitionし、胆汁うっ滞を惹起するという仮説が提唱されている。この仮説についてin vivo実験により検討を加えた。すなわち、正常ラットおよびMRP2欠損ラット(Eisai hyperbilirubinemic rat)に硫酸抱合型胆汁酸を投与したところ、正常ラットにおいてはBSEP機能が低下したのに対して、MRP2ではBSEP機能低下は観察されなかった。これらin vivo結果は、MRP2基質によりBSEP機能がtrans-inhibitionされることを示唆するものと考えられた。一方、MRP3は肝細胞血管側膜上に発現され、ラットにおいては胆汁酸をも基質とすることから、胆汁うっ滞・黄疸等の病変に対して防御的に働くものと考えられる。その観点から、ヒトにおけるMRP3の機能解析を行った。その結果、種々リガンドに対する輸送能力の順位は、ラットMRP3と同等であることが示された。しかしながら、ラットで良好な基質となるtaurocholateは、ヒトでは有意に輸送されず、一方ヒトではglycocholateが良好な気質となる等、種差が存在することが示された。病態において濃度が上昇し、細胞毒性の高いことが知られている疎水性胆汁酸が、本実験系においてMRP3機能を阻害したことから、これらの胆汁酸もMRP3基質となりうる可能性も考えられた。また、ラットを用いた肝潅流実験の結果、MRP3の発現量と、血管側膜を介した胆汁酸の排出能力の間には良好な相関が観察され、病態肝からの胆汁酸排出・肝細胞保護におけるMRP3の役割の定量化に成功した。Multidrugresistance associated protein 2 (MRP2/ABCC2)は、肝細胞胆管側膜上に発現され、ビリルビングルクロン酸抱合体などの胆汁排泄に関与する。その欠損は高ビリルビン血症を呈するDubin-Johnson症候群の発症につながる。

我々は、健常人より調製したゲノムサンプルの解析を進め、MRP2における新規変異を解析した。これら変異体の機能について検討を加えるため、ヒトMRP2の機能発現系を構築した。実験にはTet-off adenovirus系を用いた。ウイルスをブタ腎尿細管上皮細胞由来のLLC-PK1細胞に感染させ、調製した膜ベシクルを用いた実験により、いずれの変異型のMRP2蛋白も、MRP2蛋白分子当たりの輸送活性は正常型に比べて低下しないことが示された。一方、共焦点レーザー顕微鏡で発現部位について検討したところ、正常型および高頻度で観察されるSNPs体はapical膜に局在していたのに対し、低頻度で観察される変異体は細胞内にも局在していた。この低頻度変異はMRP2の輸送に必要なヌクレオチド結合領域に存在していること、さらにはアリル頻度がDubin-Johnson症候群発症頻度と同等であることから、この遺伝子疾患の候補変異であるものと推察された。このように、蛋白質分子自体の輸送機能が正常であっても、局在が変化することにより、in vivoにおける機能が変動し、疾患(胆汁うっ滞症)を発症する可能性がMRP2について初めて示された。さらに、肝細胞血管側膜に発現するMRP3の機能変動によっても、胆汁うっ滞により惹起される病態の程度が影響を受けることを示唆することができた。
薬物ターゲティングシステムの機能性評価法の確立と製剤特性-機能相関の体系化

近年、薬物の体内挙動の制御を目的として、各種のDrug Delivery Systemの開発が活発に進められているが、なかでも薬物の体内分布過程を制御し、特定の標的部位に送達させるとともに作用部位以外の臓器への移行を回避することにより、薬物適用の最適化を図ろうとするいわゆる標的指向化(ターゲティング)の試みは、薬物治療の理想像を実現するものとして大きな注目を集めている。これを実現するための方法として、各種製剤学的技術を用いて優れた体内挙動特性を有する運搬システムが開発されているが、これらの研究の大部分は、標的指向化の視点からは試行錯誤的あるいは経験主義的に行われており、運搬体システムの設計、開発の基礎となる学問体系は今だ確立されていない。そこで本研究では、(1)標的指向化の評価解析法の確立、(2)運搬体システムの体内挙動特性の系統的整理、(3)標的指向化の方法論確立、の3点にわたって研究を展開した。標的指向化の評価解析法として、クリアランスの概念を基礎とし、マウスを用いて各種運搬体システムの全身動態特性を速度論的に解析する系を確立しその有用性を確認した。また、臓器および細胞レベルでの標的指向性を評価する方法として各種臓器潅流実験系および培養細胞を用いた実験系を確立した。以上の実験系を用いて、各種高分子あるいは微粒子性運搬体システムの体内動態を系統的に検討した結果、分子サイズや電荷等の物理化学的性質との関連を明らかにすることができた。「標的指向化(分布挙動制御技術)」のサイエンスとしての確立を図った。さらに以上の知見に基づき、抗酸化酵素superoxide dismutaseや高脂血症治療薬vitamin K5等のタ-ケティングシステムを開発することができた。近年、薬物適用の最適化を目的として、薬物の体内挙動を制御し標的作用部位に選択的に伝達させる薬物ターゲティングが注目を集めている。中でも、優れた体内挙動特性を有する運搬体システムを各種製剤技術を利用して開発する試みが活発に行われているが、これらの大部分は試行錯誤的、経験主義的に進められ、運搬体システムの設計、開発の基盤となる学問体系は未だ確立されていない。そこで本研究では、標的指向の方法論の確立を最終目的として、(1)標的指向化の評価解析法の確立、(2)運搬体システムの製剤特性と体内挙動特性の関連の系統的整理の2つの方向から検討を行った。標的指向化の評価解析法として、クリアランスの概念を基礎とし、マウスを用いて各種運搬体システムの全身動態特性を速度論的に解析する系を確立してその有用性を確認した。また、臓器レベルでの標的指向性を評価する方法として、肝臓、腎臓、固形腫瘍などに対する臓器潅流実験系を確立し、併せて生理学的速度論の考えに基づいて臓器レベルと全身レベルの情報の結合を実現した。こうして確立した実験系を用い、各種高分子薬物運搬システムの体内動態特性を系統的に検討した結果、分子サイズや電荷と動態の関連が明らかになり、またその標的指向性を臓器レベルの動態パラメータを用いて定量的に比較検討することが可能となった。さらに以上の知見に基づき、活性酸素除去剤スパーオキサイドジスムターゼの肝臓、腎臓ターゲティングシステムを開発し、その治療効果を確認した。今後、リポソーム、マイクロエマルション、マイクロスフェアー等の微粒子性製剤について、同様の検討を進める予定である。

これを実現するための方法として、各種製剤学的技術を用いて優れた体内挙動特性を有する運搬システムが開発されているが、これらの研究の大部分は、標的指向化の視点からは試行錯誤的あるいは経験主義的に行われており、運搬体システムの設計、開発の基礎となる学問体系は今だ確立されていない。そこで本研究では、(1)標的指向化の評価解析法の確立、(2)運搬体システムの体内挙動特性の系統的整理、(3)標的指向化の方法論確立、の3点にわたって研究を展開した。標的指向化の評価解析法として、クリアランスの概念を基礎とし、マウスを用いて各種運搬体システムの全身動態特性を速度論的に解析する系を確立しその有用性を確認した。また、臓器および細胞レベルでの標的指向性を評価する方法として各種臓器潅流実験系および培養細胞を用いた実験系を確立した。以上の実験系を用いて、各種高分子あるいは微粒子性運搬体システムの体内動態を系統的に検討した結果、分子サイズや電荷等の物理化学的性質との関連を明らかにすることができた。「標的指向化(分布挙動制御技術)」のサイエンスとしての確立を図った。さらに以上の知見に基づき、抗酸化酵素superoxide dismutaseや高脂血症治療薬vitamin K5等のターゲティングシステムを開発することができた。