hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホルモン抵抗性前立腺癌の成因と増殖における細胞内生存シグナル活性化に関する研究

【目的】前立腺癌細胞の生存と増殖には細胞内生存シグナルAkt/Protein kinase B(Akt)の活性化が極めて重要と考えられているがその詳細は不明である。血清除去および低テストステロン培地におけるPC3とLNCaPのAkt活性化とその意義について検討した。【方法】LNCaPをチャコール処理したテストステロン除去培地(CSS)で,PC3を無血清培地(S(-))で培養し,Akt寸活性化をantiphospho. Akt抗体(p-Akt-Ser473:New England biolab.)を用いたWesten blottingによって解析し,生存細胞数の測定とWST-1アッセイによる細胞増殖能の検討を行い,さらにヘキスト33342染色による細胞形態変化につき検討した。【結果】LNCaP-CSSは24時間でリン酸化Akt量が増加し,この状態は7日めも持続していた。PC3-S(-)は24時間でリン酸化Aktが著明に増加し,その後低下した。これらのAktリン酸化はPI3K阻害剤(LY294002)の添加によって著明に抑制された。LNCaP-CSSとPC3-S(-)にLY294002を添加することにより細胞数は著明に減少し,細胞増殖は抑制され,形態的にアポトーシス細胞の増加を認めた。【考察】LNCaPとPC3はそれぞれテストステロンあるいは細胞外因子に依存しないAkt活性化の系を有している。これらの結果より,Akt活性化が前立腺癌細胞におけるホルモン除去後の生存と増殖に促進的に作用していると推察され,Aktはホルモン抵抗性前立腺癌治療の標的分子となりうると考えられた。
逆解析とスマートレイヤを用いた能動型受動型電気ポテンシャルCT法による欠陥モニタ

機器・構造物の中のき裂・欠陥モニタ手法を構築するため,ピエゾ材料とプリント基板を組み合わせることによりスマートレイヤを構成した.このスマートレイヤを用いて,受動型電気ポテンシャルCT法ではピエゾフィルム上の電気ポテンシャル測定を行い,能動型電気ポテンシャルCT法では音響発信を行った.これらを組み合わせ,逆解析を援用することにより,き裂の大きさおよび位置を効率的に推定することができた.スマートレイヤ上の多数の電極に電圧を印加して超音波を送受信することにより,き裂の形状を推定することができた.機器・構造物の中のき裂・欠陥モニタ手法を構築するため,ピエゾ材料とプリント基板を組み合わせることによりスマートレイヤを構成した.このスマートレイヤを用いて,受動型電気ポテンシャルCT法ではピエゾフィルム上の電気ポテンシャル測定を行い,能動型電気ポテンシャルCT法では音響発信を行った.これらを組み合わせ,逆解析を援用することにより,き裂の大きさおよび位置を効率的に推定することができた.スマートレイヤ上の多数の電極に電圧を印加して超音波を送受信することにより,き裂の形状を推定することができた.本研究の目的は、機器・構造物のモニタのため、受動型電気ポテンシャルCT法と能動型電気ポテンシャルCT法を組み合わせ、受信と音響発信を行うことができるスマートレイヤを構成し、能動型・受動型電気ポテンシャルCT法による欠陥モニタ手法を確立することにある。具体的には、ピエゾフィルム上にマトリックス状の電極を有するスマートレイヤを作製し、物体が力学的負荷を受けるときにピエゾ効果により構造要素に受動的に表れる電気ポテンシャル分布を計測する。この分布に逆問題解析を適用し、欠陥を同定する。さらに、逆ピエゾ効果を利用してスマートレイヤに電圧を印加することにより能動的に超音波を発振させ、き裂や欠陥からの波をスマートレイヤで検出し、逆解析によりき裂や欠陥を同定する。さらに受動型・能動型手法を統合する逆解析手法を構築し、き裂・欠陥モニタリング手法を構築する。本年度の検討により、得られた結果を以下に示す。1.複合材料中に存在する複合はく離の同定に対し、受動型電気ポテンシャルCT法を適用した。複合材料中に非貫通欠陥があるときにピエゾフィルム上に表れる電気ポテンシャル分布を調べた。積層材の主軸方向が試験片の長手方向と異なる場合には、欠陥位置周辺のピエゾフィルムにおいて、大きな電気ポテンシャル分布が表れた。2.受動型・能動型併用電気ポテンシャルCT法に関する検討として、受動型と能動型がともに可能なピエゾフィルムを用いたスマートセンサ・アレイを構築した。スマートセンサ・アレイを用いて、超音波を発振し、その応答波を計測した。ピエゾフィルムの存在する試験片上面と直角の向きをもつき裂、および上面と平行なき裂に対して、センサ位置とき裂の相対位置が検出波形に与える影響と明らかにし、検出波形を用いたき裂の位置推定が可能であることを明らかにした。本研究の目的は、機器・構造物のモニタのため、受動型電気ポテンシャルCT法と能動型電気ポテンシャルCT法を組み合わせ、受信と音響発信を行うことができるスマートレイヤを構成し、能動型・受動型電気ポテンシャルCT法による欠陥モニタ手法を確立することにある。結果を以下に示す。1.PVDFフィルム、電極とリード線端子をエッチングにより形成したフレキシブルプリント基板を、き裂を有する試験片の上に積層したスマートレイヤを作製した。2.スマートレイヤを有する試験片に、力学的負荷がかかるときにスマートレイヤに受動的に表れる電気ポテンシャル分布を計測し、き裂を逆問題的に同定した。さらに、スマートレイヤに電圧を印加して能動的に超音波を発振させ、同時に反射波をスマートレイヤで検出し、欠陥を同定した。受動形手法は、き裂の長さと位置の推定には効果的だが、深さ推定には不向きであった。能動型手法は、深さの推定に有効であった。受動型、能動型手法の併用によりき裂の同定精度が向上した。3.スマートレイヤのある電極に電圧を印加して超音波を発生させ、その反射波を他の電極で受信する、多点送受信が可能であることを示した。多点間の超音波の伝達時間をもとにき裂や欠陥を同定する手法を提案し、この手法により、き裂の位置や長さのみならず形状が推定できることを示した。4.複合材料中に存在する複合はく離の同定に対する、受動型電気ポテンシャルCT法の適用に関するシミュレーションを行った。複合材料中の積層構成と欠陥深さがピエゾフィルム上に表れる電気ポテンシャル分布に及ぼす影響を調べた。本研究の目的は、機器・構造物のモニタのため、受動型電気ポテンシャルCT法と能動型電気ポテンシャルCT法を組み合わせ、受信と音響発信を行うことができるスマートレイヤを構成し、能動型・受動型電気ポテンシャルCT法によるき裂や欠陥をモニタする手法を確立することにある。得られた結果を以下に示す。1. PVDFフィルム、電極とリード線端子をエッチングにより形成したフレキシブルプリント基板を、き裂を有する試験片の上に積層したスマートレイヤを製作した。このスマートレイヤをき裂を有する試験片に貼付し、受動型・能動型電気ポテンシャルCT法の適用性に関する検討を行った。すなわち、スマートレイヤを貼り付けた試験片に、力学的負荷がかかるときにスマートレイヤに受動的に表れる電気ポテンシャル分布を計測し、さらに、スマートレイヤに電圧を印加して能動的に超音波を発振させ、同時に反射波をスマートレイヤで検出した。これらの結果を総合することにより、き裂の大きさおよび位置を効率的に推定することが可能であることがわかった。受動型と能動型の組合せの方法の影響を調べた。

2.スマートレイヤ上の多数の電極に電圧を印加して超音波を発生させ、その反射波をスマートレイヤ上の多数の電極で受信した。これらの結果を総合することにより、垂直き裂や斜めき裂の位置や形状を推定することができた。3.複合材料中に存在する複合はく離の同定に対する、受動型電気ポテンシャルCT法の適用に関するシミュレーションを行った。複合材料中の複数はく離についても受動型電気ポテンシャルCT法により欠陥の大きさと位置が推定できることがわかった。
タンパク質の多量体形成と生体系の磁気感受との関係

本年度は,半年の研究機関であったが,多様な蛍光タグをつけたクリプトクロム類を発現させて,精製する準備を行った.HeLA細胞に,プラスミドを導入して,蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現実験を行った.発言した細胞は直接蛍光顕微鏡を用いてそのセル中に発現したクリプトクロムを見ることが出来た.さらにそれらに対する光照射により,セル内部において多量化する様子を蛍光のパターンから観測することが出来た.現在,これらの光化学反応の様相を蛍光顕微鏡を用いて観測する準備,青色光を照射し光化学反応に伴うC末端の構造変化を有効に引き起こす方法について,多角的に検討を行っている.同時進行でマイクロコイルとそれに電流を流して十分な磁場を発生させるシステム,これらの磁場の変化に対する蛍光強度の変化を高感度において観測するシステムの構築を行った.現在設計はほぼ完了しており,3Dプリンタによるサンプルホルダーや空気を避ける閉鎖系での実験の準備等を進めている.さらに,研究に向けてJSPS博士研究員であるLewis Antill博士が,蛍光顕微鏡に関するトレーニングを受け,何回かのテスト実験によりその方法を熟知するに至った,同時に今後のスピンラベルを用いた実験に向けて,電子スピン共鳴(ESR)装置についての知識を深めた.さらに合成したクリプトクロムの構造を有効に測定するための,ESRによる距離測定や核磁気共鳴による測定法等についても,数人のエキスパート研究者との研究連絡により知見を得,それらの測定に向けて,合成法との連携をとる事が出来つつある.本年度は,半年の研究機関であったが,多様な蛍光タグをつけたクリプトクロム類を発現させて,精製する準備を行った.HeLA細胞に,プラスミドを導入して,蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現実験を行った.発言した細胞は直接蛍光顕微鏡を用いてそのセル中に発現したクリプトクロムを見ることが出来た.これにより実験の準備はおおむね進展している.一方でスピンラベルに関する実験の準備はやや遅れているが,蛍光タグをつけたクリプトクロム合成が軌道に乗れば,さほど困難ではないと考えられる.同時進行で行う,蛍光顕微鏡システムの構築やセルホルダ等の設計はおおむね良好に進んでおり,3Dプリンタなどを用いての試作機が既に作られつつある.さらに磁場発生コイルの試作は既に行われており,理論通りの磁場を発生させることが出来,発熱量等も予想通りである.以上のことから考えて,ほぼ順調に進展していると考えられる.本年度を,本研究の中心的な期間と位置づけ,蛍光測定においては,1)クリプトクロムの合成,多種の蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現.2)それらの多量体形成についての,観測およびそれらの定量的な評価,3)多量体形成をモニターとした磁場効果の観測条件の検討,4)磁場効果の観測,までを行い公表可能なデータを得る事とする.一方で並行して1)スピンラベルを付けることの検討,2)光化学反応によるC末端の構造変化を観測する方法の確立,3)C末端の構造変化を踏まえた構造変化前と後のサンプルを,凍結する方法論の確立,4)それらをパルス電子スピン共鳴を用いて距離測定を行う.現在共通機器であるパルス電子スピン共鳴装置が故障して,これらの測定を行う事が,今現在困難ではあるが,分子科学研究所や他大学と協力してこれらの測定を行う事を予定している.そもそも,本研究機関の装置では予備実験を行う事しか予定されておらず,この故障は研究にはさほど影響しない.一方で過渡吸収による測定系の構築は極めて順調に進んでおり,他の研究に用いる目的で青色のパルスレーザも導入された.これにより比較的高濃度のクリプトクロムを生成することが出来れば,より高安定かつ高感度の過渡吸収測定及び,その磁場効果観測も可能で,目的である多量体形成との相関も研究することが可能となる為,研究がより太く推進できる事が期待される.本年度は,半年の研究機関であったが,多様な蛍光タグをつけたクリプトクロム類を発現させて,精製する準備を行った.HeLA細胞に,プラスミドを導入して,蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現実験を行った.発言した細胞は直接蛍光顕微鏡を用いてそのセル中に発現したクリプトクロムを見ることが出来た.さらにそれらに対する光照射により,セル内部において多量化する様子を蛍光のパターンから観測することが出来た.現在,これらの光化学反応の様相を蛍光顕微鏡を用いて観測する準備,青色光を照射し光化学反応に伴うC末端の構造変化を有効に引き起こす方法について,多角的に検討を行っている.同時進行でマイクロコイルとそれに電流を流して十分な磁場を発生させるシステム,これらの磁場の変化に対する蛍光強度の変化を高感度において観測するシステムの構築を行った.現在設計はほぼ完了しており,3Dプリンタによるサンプルホルダーや空気を避ける閉鎖系での実験の準備等を進めている.さらに,研究に向けてJSPS博士研究員であるLewis Antill博士が,蛍光顕微鏡に関するトレーニングを受け,何回かのテスト実験によりその方法を熟知するに至った,同時に今後のスピンラベルを用いた実験に向けて,電子スピン共鳴(ESR)装置についての知識を深めた.さらに合成したクリプトクロムの構造を有効に測定するための,ESRによる距離測定や核磁気共鳴による測定法等についても,数人のエキスパート研究者との研究連絡により知見を得,それらの測定に向けて,合成法との連携をとる事が出来つつある.本年度は,半年の研究機関であったが,多様な蛍光タグをつけたクリプトクロム類を発現させて,精製する準備を行った.HeLA細胞に,プラスミドを導入して,蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現実験を行った.

発言した細胞は直接蛍光顕微鏡を用いてそのセル中に発現したクリプトクロムを見ることが出来た.これにより実験の準備はおおむね進展している.一方でスピンラベルに関する実験の準備はやや遅れているが,蛍光タグをつけたクリプトクロム合成が軌道に乗れば,さほど困難ではないと考えられる.同時進行で行う,蛍光顕微鏡システムの構築やセルホルダ等の設計はおおむね良好に進んでおり,3Dプリンタなどを用いての試作機が既に作られつつある.さらに磁場発生コイルの試作は既に行われており,理論通りの磁場を発生させることが出来,発熱量等も予想通りである.以上のことから考えて,ほぼ順調に進展していると考えられる.本年度を,本研究の中心的な期間と位置づけ,蛍光測定においては,1)クリプトクロムの合成,多種の蛍光タグをつけたクリプトクロムの発現.2)それらの多量体形成についての,観測およびそれらの定量的な評価,3)多量体形成をモニターとした磁場効果の観測条件の検討,4)磁場効果の観測,までを行い公表可能なデータを得る事とする.一方で並行して1)スピンラベルを付けることの検討,2)光化学反応によるC末端の構造変化を観測する方法の確立,3)C末端の構造変化を踏まえた構造変化前と後のサンプルを,凍結する方法論の確立,4)それらをパルス電子スピン共鳴を用いて距離測定を行う.現在共通機器であるパルス電子スピン共鳴装置が故障して,これらの測定を行う事が,今現在困難ではあるが,分子科学研究所や他大学と協力してこれらの測定を行う事を予定している.そもそも,本研究機関の装置では予備実験を行う事しか予定されておらず,この故障は研究にはさほど影響しない.一方で過渡吸収による測定系の構築は極めて順調に進んでおり,他の研究に用いる目的で青色のパルスレーザも導入された.これにより比較的高濃度のクリプトクロムを生成することが出来れば,より高安定かつ高感度の過渡吸収測定及び,その磁場効果観測も可能で,目的である多量体形成との相関も研究することが可能となる為,研究がより太く推進できる事が期待される.
補腎剤の抗酸化機序の解明による，プロオキシダントを用いた酸化ストレス治療の開拓

本研究では,代表的な補腎剤である牛車腎気丸を中心に,抗酸化活性の弱い補剤がどのように生体保護効果を示すかについて,1)動物モデルにおけるライブイメージング,2)ヒト血清抗酸化プロファイル変動,により解明することを目指している.動物モデルにおけるライブイメージングは血流動態の観察評価と活性酸素および一酸化窒素の発生の検出を行う.本年度は血流動態の観察評価に重点を置き,先ず実験観察条件の詳細な設定を行った.方法としてはマウス腹側部皮下血管を用い,皮下血管の血流変化をライブイメージング撮影し解析した.この方法と我々が過去に報告した他の漢方製剤での方法および結果との整合性を確認し,実験条件として適切なものを設定した.その後牛車腎気丸を用いた実際の測定検討を開始している.ヒト血清における抗酸化プロファイル変動は漢方製剤による治療を受ける患者を対象とする.本年度はまず実施に当たり当該施設倫理委員会に研究内容を申請し承認を得るとともにUMIN-CTRに登録を行い,実臨床での検討の準備を整えた.対象製剤は補腎剤である牛車腎気丸・八味地黄丸,及び柴胡加竜骨牡蛎湯・黄連解毒湯としており,これらの漢方治療を新たに開始する患者のうち同意を得られた方から検体採取を開始している.また我々が開発したMULTIS測定による酸化ストレス評価法につき,ヒト検体での安定性,妥当性を再確認し,測定方法のブラッシュアップを行った.加えてMULTIS法での評価結果を他の電子スピン共鳴法を基盤とした酸化ストレス評価法と比較検討し,その特徴ならびに妥当性を確立した.動物モデルにおけるライブイメージングは当初の予定より早く進行しており,本年度中にライブイメージングでの血流評価およびに,活性酸素および一酸化窒素の発生の検出に関する予備実験が修了できる見込みである.これにより来年度前半にほぼ修了できる予定である.ヒト血清における検討はほぼ当初予定通りの進行しており,来年度中期までに必要な検体数の測定が終了できる見込みである.しかし臨床研究の性質上対象製剤を使用する患者数に偏りが生じているため,一部の製剤では検体数が依然として不足している.しかしこの状況は今年度中に解消できる見込みである.上述のように,動物モデルにおけるライブイメージングでは,牛車腎気丸における血流動態の観察評価を今年度中に修了し,さらに年度内に一酸化窒素の発生の検出を行う予定である.活性酸素の検出は来年度を予定する.方法は平成30年度内に確立した.ヒト血清における抗酸化プロファイル変動については引き続き検体採取を進める.測定誤差を最小にするため,測定は検体数が一定数に達した時点で集中して行う予定である.方法論的な準備は平成30年度中に修了した.本研究では,代表的な補腎剤である牛車腎気丸を中心に,抗酸化活性の弱い補剤がどのように生体保護効果を示すかについて,1)動物モデルにおけるライブイメージング,2)ヒト血清抗酸化プロファイル変動,により解明することを目指している.動物モデルにおけるライブイメージングは血流動態の観察評価と活性酸素および一酸化窒素の発生の検出を行う.本年度は血流動態の観察評価に重点を置き,先ず実験観察条件の詳細な設定を行った.方法としてはマウス腹側部皮下血管を用い,皮下血管の血流変化をライブイメージング撮影し解析した.この方法と我々が過去に報告した他の漢方製剤での方法および結果との整合性を確認し,実験条件として適切なものを設定した.その後牛車腎気丸を用いた実際の測定検討を開始している.ヒト血清における抗酸化プロファイル変動は漢方製剤による治療を受ける患者を対象とする.本年度はまず実施に当たり当該施設倫理委員会に研究内容を申請し承認を得るとともにUMIN-CTRに登録を行い,実臨床での検討の準備を整えた.対象製剤は補腎剤である牛車腎気丸・八味地黄丸,及び柴胡加竜骨牡蛎湯・黄連解毒湯としており,これらの漢方治療を新たに開始する患者のうち同意を得られた方から検体採取を開始している.また我々が開発したMULTIS測定による酸化ストレス評価法につき,ヒト検体での安定性,妥当性を再確認し,測定方法のブラッシュアップを行った.加えてMULTIS法での評価結果を他の電子スピン共鳴法を基盤とした酸化ストレス評価法と比較検討し,その特徴ならびに妥当性を確立した.動物モデルにおけるライブイメージングは当初の予定より早く進行しており,本年度中にライブイメージングでの血流評価およびに,活性酸素および一酸化窒素の発生の検出に関する予備実験が修了できる見込みである.これにより来年度前半にほぼ修了できる予定である.ヒト血清における検討はほぼ当初予定通りの進行しており,来年度中期までに必要な検体数の測定が終了できる見込みである.しかし臨床研究の性質上対象製剤を使用する患者数に偏りが生じているため,一部の製剤では検体数が依然として不足している.しかしこの状況は今年度中に解消できる見込みである.上述のように,動物モデルにおけるライブイメージングでは,牛車腎気丸における血流動態の観察評価を今年度中に修了し,さらに年度内に一酸化窒素の発生の検出を行う予定である.活性酸素の検出は来年度を予定する.方法は平成30年度内に確立した.ヒト血清における抗酸化プロファイル変動については引き続き検体採取を進める.測定誤差を最小にするため,測定は検体数が一定数に達した時点で集中して行う予定である.方法論的な準備は平成30年度中に修了した.予定した物品費の金額の変更,為替変動等により差異が生じている.主たる研究方法として使用している電子スピン共鳴法の方法論的観点から招聘講演を要請され,旅費として使用した.
日本と東南アジアの互助ネットワークの民俗社会学的国際比較研究

本年度の研究は日本の互助慣行を南洋群島と比較し相違点と類似点を明らかにすることであるが、このため両国の互助関連の文献を精読し現地調査を行った。2018年8月にパラオ諸島(共和国)、2019年3月にポンペイ島(ミクロネシア連邦)の農村漁村で聞き取り(半構造化インタビュー)を実施した。互助慣行の移出入という点で日本が統治した南洋群島(カロリン諸島)を調査地として選定した。パラオとポンペイの互助慣行は日本同様近代化の過程で衰退しつつあるが、村落ではまだ伝統的な互助行為によるつながりや絆が見られる。特にパラオでは葬儀に際して故人の借金を親族のみならず地域住民が負担するという慣行(omengkad el blals)が行われ互助ネットワークが機能している。パラオの農村では日本のユイにあたる直接の言葉は見当たらないが、近い言葉にmengeraklがある。ポンペイではクミアイ(組合)という言葉で共同作業を行う。金銭的支援として小口金融のムシンがパラオとポンペイ両地域で普及しているが、これは日本人が伝えた無尽で利息を求めない相互扶助的な性格が強い。婚葬儀ではパラオはomadekで弔慰金を出し、ポンペイはsawasという言葉で喜怒哀楽をともにする。パラオではklaingeseu、ポンペイではsawaspeneという相互扶助の言葉があり、地域住民の一体感が維持されている。その一方で調査した農村では共有地が見られず共有意識は希薄である。パラオでは海岸の清掃で一部キンロウホウシ(勤労奉仕)、またポンペイでは既述したクミアイという言葉が使われ、日本的な互助慣行が浸透している。戦時下の強制労働の残滓とは言え、目上の人に対する礼儀や責任感の付与など日本の慣行が土着のそれに加わる二重構造として捉えられるものの、それらが同化することで形成された固有の互助ネットワークに基づくコミュニティが健在である。おおむね順調に推移しているが、現地調査は当初の予定どおりできたものの聞き取りの数が十分ではなかった。次年度以降マレーシアの互助慣行の研究とともに日本との比較研究を進める予定である。なお昨(平成29)年度の研究成果として、研究年度の調査研究を踏まえ翌(平成30)年度に論文を完成させたため本年度はタイの互助慣行について論文(平成30年10月刊行の本務校紀要)を刊行し、その成果を学会(平成30年9月の日本社会学会)で報告することができた。本年度研究の南洋群島(パラオ、ポンペイ)の互助慣行は大学の紀要論文(令和元年10月刊行)にまとめ学会(令和元年10月の日本社会学会)で報告する予定である。この南洋群島の研究成果もタイ同様に当該(令和元)年度ではなく、次(令和2)年度の論文刊行と学会発表となり半年のずれが生じる。なお東南アジアとは異なるが、当該年度の5月から6月にかけて元大学学長からの招待もあり、南インドのカルナータカ州ウドッピィ県の村落で互助慣行の調査を実施し論文(平成30年3月刊行の大学紀要)にまとめることができた。さらに互助慣行の関連論文として地域社会のケアシステムについての論文も執筆した(平成30年10月週刊『医学のあゆみ』)。令和元年度は日本とマレーシアの互助慣行について比較研究するが、8月と翌年3月に固有の互助行為と制度、日本の互助慣行の移出入について現地調査を予定している。その後は聞き取り(半構造化インタビュー)のまとめと日本での資料の精査を通して、マレーシアと日本の互助慣行の比較またその制度の普遍性と固有性について検討する。この研究成果は本務校紀要に投稿し学会(日本社会学会)で報告する。なお令和元年9月に互助慣行のうち、金銭に基づく相互扶助である小口金融(ROSCAS: Rotating Savings and Credit Associations)を取り上げ日本の頼母子とフィリピンのパルワガン、インドネシアのアリサン、タイのシェアとの比較について、経済社会学会で報告をする予定である。研究初年度の目標は日本とフィリピンの互助行為の比較及び互助制度の普遍性と固有性の検討であった。平成27(2015)年8月にはミンダナオ島のダバオを拠点に周辺の自治区(バランガイ)や農村、サマール島の漁村や山村、ルソン島のブラカン州とパンパンガ州の農村で、また28年3月にはルソン島北部のバギオを拠点に周辺の自治区や山村、同島南部のレガスピとピリ周辺の農村、パナイ島のイロイロを拠点に山村とギマラス島の漁村で聞き取り調査を実施した。その結果前半の調査では日本のユイ、モヤイ、テツダイという伝統的な互助慣行に相当する農作業に伴うスユアンやルソン、共同作業のトゥロンガンやマキパグビスク、冠婚葬祭の手助けであるツゥロングやタバング、また頼母子にあたるパルワガンやブボアイなどの言葉とその行為について知ることができた。後半の調査では同様にアルヨンやタバング、共同作業のマンビビダンやラバス、冠婚葬祭の手助けであるツゥロングやアブロイ、また頼母子に相当するパルワガンなどの言葉とその行為について日本と比較することができた。互助慣行の言葉はタガログ語やビサヤ語、カンカナエ語やイバロイ語など言語の違いを反映しているが、互酬的行為、再分配的行為、支援(援助)的行為の3分類に分けて互助慣行を捉えることができる。

島の山間部では収穫のとき労力提供したグループで私有地の果物を共有地(コモンズ)のように均等に分配する仕組みも見られる。またかつての日本のように共有地として活用するモヤイ島の制度が島嶼国家のフィリピンにもあることを想定していたが、この種の仕組みは聞き取りをした限りなかった。しかし制度としてではなく個人の生活のために無人島を活用することはある。いずれも近代化に伴い互助慣行は衰退しつつあるが、地方の山村や小さな島ではまだ伝統的な支え合いのしきたりが守られている。おおむね順調に推移しているが、現地調査は当初の予定どおりできたものの、日本での資料収集が十分ではなかった。次年度以降インドネシアの互助慣行の研究と共に日本との比較研究を進める予定である。今後はフィリピンの互助慣行について論文(本務校紀要『社会学部論叢』への投稿)をまとめる予定である。なお研究成果は当該年度ではなく、次年度の論文掲載となり半年のずれが生じる。平成28年度の目標は日本とインドネシアの互助行為及び制度の比較検討であった。8月には東ジャワのマドゥーラ島の農村と漁村、シドアルジョの農村、マランの農村で、また29年3月にはバリ島のギャニャール県を中心に農村と漁村、クルンクン県の漁村、タバナン県の農村で聞き取り調査をした。その結果前半の調査では日本の共同作業に相当するググル・グヌン(gugur gunung)やケリア・バクティ(keria bakti)、冠婚葬祭の手助けではメンバンツゥ(membantu)やメノロン(menolong)、また小口金融の頼母子にあたるアリサン(arisan)の言葉とその行為について知ることができた。後半の調査では同様に日本のユイに相当するサリン・ツルンガン(saling tulungan)、冠婚葬祭の手助けでメディロカン(medelokan)やメアバン・アバン(meaban-aban)、アリサンについて日本と比較した。おおむね互酬、再分配、支援(援助)の3分類に分けて互助行為を捉えることができる。一般に東ジャワではゴトン・ヨロン、バリ島ではサリン・ツルンガンやサリン・メトゥルガン(saling metulungan)という相互扶助の言葉が使われる。末端の行政組織としてRT(Rukun Tetangga)とRW(Rukun Warga)があるが、日本の隣組の遺制でもあるRTが近隣互助組織としてゴトン・ヨロンの単位とされる。なおイスラム教では救貧税として義務的な性格(制度喜捨)が強いザカート(zakat)、ヒンズー教では自由意志による寺に寄付するプニア(punia)があり、不特定多数の貧困者を対象にした互助行為が見られる。近代化に伴い互助慣行は衰退しつつあるが、地方の農村や島ではまだ守られている。この点アリサンはコーランが禁じていることもあるが利息がつかない仕組みで共済と親睦の目的でされている。おおむね順調に推移しているが、現地調査は当初の予定どおりできたものの日本での資料収集が十分ではなかった。次年度以降タイの互助慣行の研究とともにあわせて日本との比較研究を進める予定である。なお昨年度の研究成果として、フィリピンの互助慣行について論文(本務校紀要)と学会(日本社会学会)で報告することができた。また関連する互助ネットワークに着目した東日本大震災に関わる調査内容を国際学会でセッション・オーガナイザーを勤め発表した(ThirdISA (International Sociological Association) Forum of Sociology)。
肝細胞癌サブクラス分類が悪性度を反映する機序の解明と診断への応用

本研究では肝細胞癌サブクラス分類における悪性度の差の解明と診断への応用という目的に向け、(1)シグナル伝達異常に関する分子機構の解明、(2)浸潤転移能に関与するEMT関連分子の発現と悪性度との関連を検討し、さらに(1)(2)の結果を関連付けて(3)新たなサブクラス分類の構築に向けた臨床病理学的有用性の検討を行う。該年度(平成30年度)においては、シグナル伝達異常に関する分子機構を解明するため、前年度に行った肝細胞癌パネルでのERK/pERKの免疫化学染色の結果を検討し、臨床病理学的因子との関連を検討した。またウエスタンブロットでERKリン酸化状態を確認した肝細胞癌細胞株8種のセルブロック切片でのERK分子およびリン酸化ERK分子(pERK)免疫化学染色結果を評価した。さらに新たなサブクラス分類の構築に向けた臨床病理学的有用性の検討に向け、前年度に行った肝癌パネルでのEVG(Elastica van Gieson)染色、銀染色、マロリー染色標本の評価(腫瘍線維化評価(%)、間質との関連等)、デジタルスライド化した標本での線維化定量評価を肝細胞癌サブクラス分類に関連付けた結果と線維化を含む臨床病理学的因子との関連、データや予後を含む臨床情報との相関解析を行った。さらに該当年度は、浸潤転移能に関与するEMT関連分子の発現と悪性度との関連を評価するため、EMT関連分子のホルマリン固定パラフィン包埋切片での免疫組織化学的発現解析を行った。今後さらに上記の結果をまとめ、既存の肝細胞癌サブクラス分類と比較し、悪性度を反映する機序を検討していく予定である。前年度はやや評価や標本の準備等に時間を有していたが、本年は従来予定していた予定通り進行している。引き続き今年度の計画を持続し、検討する。最終的に、各群を分けるうえでの必要最低限のマーカーまたは因子を可能な限り絞り込み、さらにサブクラス分類の構築を高精度とすることを目標とする。また実用的な臨床応用への可能性を探る。本研究では肝細胞癌サブクラス分類における悪性度の差の解明と診断への応用という目的に向け、(1)シグナル伝達異常に関する分子機構の解明、(2)浸潤転移能に関与するEMT関連分子の発現と悪性度との関連を検討し、さらに(1)(2)の結果を関連付けた(3)新たなサブクラス分類の構築に向けた臨床病理学的有用性の検討を行う。当該年度(平成29年度)においては、シグナル伝達異常に関する分子機構を解明するため、ERK分子に着目し、ERK/pERKの免疫染色を行うため、抗体の特異性確認を行った。具体的には、まず肝細胞癌標本を用いて、ERK/pERKの免疫化学染色の条件検討を行った。その後、肝細胞癌細胞株8種に対し、ERKリン酸化阻害剤を用いて、ERKリン酸化状態を確認(ウエスタンブロット)し、ERK分子およびリン酸化ERK分子(pERK)に対する抗体を用い、セルブロックから作成した切片に対して免疫化学染色を行った。また肝細胞癌パネルの標本でも免疫化学染色を行った。さらに新たなサブクラス分類の構築に向けた臨床病理学的有用性の検討に向け、肝癌パネルで構造判定や線維化測定に用いるHE染色および線維を評価するEVG(Elastica van Gieson)染色、銀染色、マロリー染色標本を作製、顕微鏡観察を用いて腫瘍内線維化評価(%)、線維の増生様式や間質との関連を検討した。また標本をデジタルスライド化し、線維化定量を行った。予定よりも肝細胞癌細胞株、肝細胞癌パネルにおける染色および線維化の評価に時間がかかり、進捗が遅れている。(1)ERK/pERK抗体を用い肝細胞癌パネルを染色する。

核内染色とpERK染色の感度を検討し、ERK活性化の評価を行う。またERK活性化に関与する既知の因子(HGF,EGF等)を用い、肝細胞癌細胞株における細胞増殖効果を検討する。またウェスタンブロット法を用いてERKリン酸化を検討する。(2)浸潤転移能に関与するEMT関連分子の発現と悪性度との関連を検討するため、TGF-βとEMTの関連を調べる。具体的にはEMT関連分子発現プラスミドを肝癌細胞株に導入することにより、EMT関連分子を強制発現させ、細胞形態および運動能の変化を検討することを予定している。またEMT関連分子のsiRNAを合成し肝癌細胞株に導入することにより、EMT関連分子の発現を抑制させ、細胞形態および運動能の変化を検討する。同時にEMT関連分子と転移・再発の関連の検討のため、選択したEMT関連分子の肝細胞癌切除検体における免疫組織化学的発現を検討する。(3)新たなサブクラス分類の構築に向けた臨床病理学的有用性の検討に向けては、上記(1)(2)の結果を鑑み、肝細胞癌パネルにおける結果を既存の肝細胞癌サブクラス分類と比較検討し、サブクラスの悪性度を反映する機序を検討する。肝細胞癌サブクラス分類に関連付けた結果と線維化を含む臨床病理学的因子との関連、検査データや予後を含む臨床情報との相関解析を行う。引き続き今年度の計画を持続し、検討する。最終的に、各群を分けるうえでの必要最低限のマーカーまたは因子を可能な限り絞り込み、さらにサブクラス分類の構築を高精度とすることを目標とする。また実用的な臨床応用への可能性を探る。予定よりも肝細胞癌株と肝細胞癌パネルの染色結果の評価に時間が有したため、細胞株を使用した実験や免疫化学組織染色に予定していた経費の使用が少なくなった。顕微鏡やパソコンでのデジタルデータを使用しての検討、解析が多かったため、次年度使用への繰り越しが生じた。
血中の内因性因子による皮膚の老化病態の解析と、その可逆性について

各月齢のマウスの皮膚をRNAマイクロアレーにより検討するとともに、高齢マウスと若年マウスの並立結合マウスの皮膚での遺伝子発現を網羅的に比較することで、皮膚の老化を体解析した。最初期遺伝子群の発現が、高齢・超高齢と加齢するに伴い発現が亢進しており、パラビオーシスにおける血清因子の移入により若年マウスにも誘導されることを確認した。AP-1結合蛋白の各遺伝子群とともに、PTGS2遺伝子の発現が、加齢とともに強く亢進していた。何らかの血清因子が表皮角化細胞へ作用し、COX2やカスパーゼ1の誘導により、微小な慢性炎症が皮膚に持続する事で、皮膚のダメージから老化へとの連続することが理解された。ヒトやマウスなどの哺乳類の老化を促進する因子として、特に皮膚に代表される外界に接する臓器においては、外来性の環境因子による老化(外因性老化)について盛んに議論されてきた。特に紫外線、赤外線やタバコによる皮膚老化、アンチエージングへの対策は、亜熱帯地方に位置する沖縄では公衆衛生学上の課題であり、これら電磁波暴露による遺伝子発現の変化や、真皮の間質成分の変性については、広く解析されてきた。本研究課題は、これまで詳細に解析されてきた紫外線など外来性の環境因子による皮膚の老化(外因性老化)とは異なる、ヒトの皮膚の老化因子としての、血液中のトランスファー可能な因子(内因性老化因子)の探索と、その老化作用の解析を目的とする。加齢したヒトの皮膚において、何が外的因子による老化病態であり、何か内因性因子による老化現象であるのかを、世代間の並体結合マウスを作製し、その皮膚の変化を網羅的RNAマイクロアレー比較で抽出し、高齢マウスやヒト高齢者の皮膚での蛋白発現変化として比較解析することで、内因性の皮膚の老化現象の本質、さらには可逆性な老化現象の存在の可能性を明らかにしたい。この外因性因子の影響の少ない中枢神経や筋肉における加齢による機能低下、器質的変化に関しては、最近は内因性・血液中のトランスファー可能な老化因子(内因性老化)の存在と、その原因物質の探索が注目されている。高齢マウスの血清を若年マウスへ静注することで、短期記憶を形成する海馬神経の細胞と樹状突起が減少し、実際に迷路記憶で観察される短期記憶が低下した。筋組織においても、高齢マウスの血清の添加により筋肉量の低下と細胞数が減少している。平成27年度は、並立結合による血行循環を共有するマウスを作成する準備を進めた。現在、国内の実験動物販売業者より搬入可能なマウスは、月齢8月-10月のマウスが購入可能な最高齢であり、高齢マウス、中年マウスを、マイクロアレーの統計学的な解析で有意となるマウス数を確保できるように、大学内の動物実験施設での飼育を続けた。動物実験施設での飼育期間中に若年マウスを用いて、並体結合術の技術を習得すると共に、コントロールとしてのこの若年マウス施術間の皮膚をサンプリングし、施術のない若年マウスの皮膚とマイクロアレーで発現比較することで、並体結合により影響を受ける遺伝子をコントロールとするための皮膚組織を採取し準備した。さらに生後24月まで高齢化したマウスを老化マウスとして順次、6-8週齢の若年マウスと順次、並体結合術を開始した。並立結合による循環系の接合は、FACSによる血中の白血球マーカーの違いによる各接合マウスに関して確認した。本研究課題は、これまで詳細に解析されてきた紫外線など外来性の環境因子による皮膚の老化(外因性老化)とは異なる、ヒトやマウスの皮膚の老化因子としての、血液中に流れるトランスファー可能な因子(内因性老化因子)の探索と、その老化作用の解析を目的とする。加齢したヒトの皮膚において、何が外的因子による老化病態であり、何か内因性因子による老化現象であるのかを、世代間の並体結合マウスを作製し、その皮膚の変化を網羅的なRNAマイクロアレー比較で抽出し、高齢マウスやヒト高齢者の皮膚での蛋白発現変化として比較解析することで、内因性の皮膚の老化現象の本質、さらには可逆性な老化現象の存在の可能性を明らかにしたい。紫外線や酸化物質など外因性加齢因子の影響の少ない中枢神経や筋肉における加齢による機能低下や器質的変化に関しては、最近は内因性・血液中のトランスファー可能な老化因子(内因性老化)の存在と、その原因物質の探索が注目されている。筋組織においても、高齢マウスの血清の添加により筋肉量の低下と細胞数が減少することが知られている。平成28年度は、前年度の飼育し、順調に加齢したマウス個体群を使用し始めた。1歳6ヶ月から2歳を越えたマウスを飼育し、6-12週の若年マウスと、皮膚の遺伝子発現を網羅的に解析した。並体結合マウスを作製し、施術4週間後に各種サンプル採取を行い、皮膚RNAのマイクロアレーによる解析を行った。

使用したマウスは、若年マウスと高齢マウスで、若年マウスー高齢マウス、コントロールとして若年マウスー若年マウス、高齢マウスー高齢マウスで並体結合術を行った。統計的な有意性が得られるように、最低、6組の接合体を準備した。通常の加齢の現象のコントロールとして接合施術していない若年マウス、高齢マウス、超高齢マウス(24カ月齢)を用いた。循環系の共有はフローサイトメトリーにより血液中の白血球表面マーカーの違いで確認し、全ての並体結合マウスで循環の共有を確認した。施術4週間後に皮膚、血液、さらに各種のマウス臓器を採取し、解析に使用すると共に、次の機会へ冷凍保存した。採取した皮膚からトータルRNAを抽出し、全てのRNA検体をマイクロアレーにより解析を行ったところ、並体結合術を施術されていない若年マウスでは、施術されていない高齢マウス、超高齢マウスと比較して、early response gene遺伝子群の発現が弱い、あるいは加齢により、これら早期対応遺伝子群の遺伝子発現が誘導されていた。また、高齢マウスと結合させた若年マウスでも、これらのearly response gene遺伝子群の発現が増加していた。若年マウス同士で結合させた若年マウスでは、施術されていない若年マウスと比較して、優位な遺伝子発現の違いは見られなかった。本研究課題は、ヒトやマウスの皮膚の老化因子としての血液中に流れるトランスファー可能な内因性老化因子の探索と、その老化作用の解析を目的とした。1歳6ヶ月から2歳を越えたマウスを飼育し、6-12週の若年マウス、さらに並体結合マウスを作製し、皮膚RNAのマイクロアレーによる発現解析を行った。実際の高齢マウス、高齢なヒトの皮膚において、これらearly response geneに規定される遺伝子群を発現上昇の有無でグルーピングし、どの様な細胞外刺激が皮膚でのearly response geneの亢進をもたらすのか考察し、幾つかのサイトカインの候補を考えた。各月齢のマウスの皮膚をRNAマイクロアレーにより検討するとともに、高齢マウスと若年マウスの並立結合マウスの皮膚での遺伝子発現を網羅的に比較することで、皮膚の老化を体解析した。最初期遺伝子群の発現が、高齢・超高齢と加齢するに伴い発現が亢進しており、パラビオーシスにおける血清因子の移入により若年マウスにも誘導されることを確認した。AP-1結合蛋白の各遺伝子群とともに、PTGS2遺伝子の発現が、加齢とともに強く亢進していた。何らかの血清因子が表皮角化細胞へ作用し、COX2やカスパーゼ1の誘導により、微小な慢性炎症が皮膚に持続する事で、皮膚のダメージから老化へとの連続することが理解された。
上皮性歯胚,唇溝堤,上・下顎突起移行部にみられるアポトーシスの比較検討

細胞に自在する高度に制御された生理過程である自壊機構であるアポトーシスが発生途上でも見られる.しかし、その意味するところは今だ不明であるので、上・下顎隆起移行部、上皮性歯胚、唇溝堤でのアポトーシスの出現の波、局在、さらに、死んだ細胞の運命、細胞死の出現した部位のその後の変化を、特に、染色体DNAの断片化をもってアポトーシスとする指標も加えて、形態的に類似しているアポトーシスのこれらの組織での関わりを組織化学的に比較検討を試みた.胎生9日19日のマウス胎仔と生後0日の新産仔を用い、4%パラフォルムアルデハイド液にて潅流固定し、パラフィン、凍結包理した.GavrieliらのTUNEL法(1992)により、パラフィン切片をラベルし、DAB反応させた.また、凍結切片から電顕試料を作成した.結果は胎生9日から前頭隆起と下顎隆起の移行部から上顎隆起が形成され、隆起の移行部の多層の上皮にアポトーシスが形成期間を通じて観察された.マウス歯胚は胎生12日から形成が始まり、その歯堤、歯胚上皮、特に、胎生15日の杯状期エナメル結節内にアポトーシスが著明に観察された.また、胎生14日の切歯歯胚の唇溝堤にアポトーシスがみられた.上・下顎移行部でのアポトーシスはkerrらのいうように、細胞がDNAの断片化をおこし、隣接細胞から遊離し、細分化され、隣接細胞などに取り込まれていたが、上皮性歯胚、唇溝堤でのアポトーシスでは、核の濃縮から始まり、遊離し、細分化されず小体状で隣接上皮細胞に取り込まれ、しかも、DNA断片化が観察されたのは、アポトティック小体が隣接細胞に取り込まれてからと思われる.唇溝堤、歯胚ではアポトーシスの出現した後の領域の上皮が分化することから、細胞分化に関係すると思われるが、移行部での違いなどは今後、apoptosis関連タンパク質に対する抗体などを用いて、アポトーシスの開始の兆候などをも調べ、アポトーシスの意味するところを追求する.細胞に自在する高度に制御された生理過程である自壊機構であるアポトーシスが発生途上でも見られる.しかし、その意味するところは今だ不明であるので、上・下顎隆起移行部、上皮性歯胚、唇溝堤でのアポトーシスの出現の波、局在、さらに、死んだ細胞の運命、細胞死の出現した部位のその後の変化を、特に、染色体DNAの断片化をもってアポトーシスとする指標も加えて、形態的に類似しているアポトーシスのこれらの組織での関わりを組織化学的に比較検討を試みた.胎生9日19日のマウス胎仔と生後0日の新産仔を用い、4%パラフォルムアルデハイド液にて潅流固定し、パラフィン、凍結包理した.GavrieliらのTUNEL法(1992)により、パラフィン切片をラベルし、DAB反応させた.また、凍結切片から電顕試料を作成した.結果は胎生9日から前頭隆起と下顎隆起の移行部から上顎隆起が形成され、隆起の移行部の多層の上皮にアポトーシスが形成期間を通じて観察された.マウス歯胚は胎生12日から形成が始まり、その歯堤、歯胚上皮、特に、胎生15日の杯状期エナメル結節内にアポトーシスが著明に観察された.また、胎生14日の切歯歯胚の唇溝堤にアポトーシスがみられた.上・下顎移行部でのアポトーシスはkerrらのいうように、細胞がDNAの断片化をおこし、隣接細胞から遊離し、細分化され、隣接細胞などに取り込まれていたが、上皮性歯胚、唇溝堤でのアポトーシスでは、核の濃縮から始まり、遊離し、細分化されず小体状で隣接上皮細胞に取り込まれ、しかも、DNA断片化が観察されたのは、アポトティック小体が隣接細胞に取り込まれてからと思われる.唇溝堤、歯胚ではアポトーシスの出現した後の領域の上皮が分化することから、細胞分化に関係すると思われるが、移行部での違いなどは今後、apoptosis関連タンパク質に対する抗体などを用いて、アポトーシスの開始の兆候などをも調べ、アポトーシスの意味するところを追求する.
神経栄養因子と上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体制御による末梢神経再生

本研究では、培養シュワン細胞を用いてEGFR阻害薬(EGFRI)の働きを解析し、ラット腓骨神経切断モデルで腓骨神経切断端を脛骨神経に端側吻合する(ETS)縫合を用い、EGFRIの末梢神経再生における有用性を検討した。EGFRIの使用により、培養シュワン細胞の増殖活性と栄養因子の発現増加が観察された。さらにETS神経縫合後のEGFRI局所投与によって再生ミエリン数の増加と神経機能の早期改善が得られた。本研究結果によって末梢神経再生において神経縫合部へのEGFR阻害薬の局所投与が早期機能回復に有用であることが示された。in vitro:成ラット坐骨神経から得た培養シュワン細胞に対し、EGFR阻害薬(EGFRI群)と溶媒(対照群)を培養液中に添加し増殖活性検出試薬を用いて細胞増殖の変化を解析した。また、培養シュワン細胞からRNAを抽出しRT-PCR法でBDNF、GDNF、VEGFのmRNAの発現量を比較した。その結果、対照群と比較してEGFRI群では、シュワン細胞数の有意な増加と、BDNF・GDNF・VEGF発現が増加していたことが明らかとなった。in vivo:成ラットの腓骨神経切断3週後に断端を脛骨神経に端側(ETS)縫合した。縫合後、EGFR阻害薬あるいは溶媒を一週間局所投与する群を作製した。縫合後8週まで経時的に足趾運動評価(PFI)と知覚評価、縫合した腓骨神経組織を適宜採取しミエリン染色を行い比較・解析した。その結果、ETS縫合後は両群ともPFIの改善が得られていたが、EGFR阻害薬投与群では、患側足趾の拘縮が少なく縫合後早期からPFIの計測が可能であった。縫合後4週では、EGFR阻害薬投与群で運動機能の改善を認め、知覚機能も改善していた。ミエリン組織標本を用いた解析では、EGFR阻害薬投与群においてETS後4週で再生ミエリン数の有意な増加が観察された。EGFR阻害薬の局所投与によって縫合部位にシュワン細胞が誘導されて再生ミエリン数が増加し機能回復が促進されたと推測される。in vitroデータもEGFR阻害薬がシュワン細胞の活性を促進していると思われる。ただし、神経軸索に対する影響についての検討が不十分で損傷軸索あるいは再生軸索でのEGFおよびEGFRの発現を解析する必要があると考えている。最終年度は、後根神経節(DRG)の軸索伸長効果に対するEGFR阻害薬の効果について解析した。成ラットから単離した腰部DRGにEGFR阻害薬あるいは溶媒を添加してコラーゲン担体上で10日間培養した。その結果、DRGから担体内を伸長する軸索の長さはEGFR阻害薬群で長い傾向にあったが、両群で有意差を認めなかった。前回結果と合わせるとEGFR阻害薬は末梢神経に対し軸索伸長効果よりもシュワン細胞の活性促進に作用し栄養因子の発現増強によって神経再生を促進させる効果を有する可能性が示唆された。動物実験は、前年度行ったETSモデルを作製してサンプル数を追加した。前回同様に縫合後2週からEGFR阻害薬投与群で有意に運動機能改善を認め、知覚機能も改善傾向であった。しかし、縫合後6週以上観察すると対照群とEGFR阻害薬投与群で運動、知覚機能に有意差が認められなくなった。このことは変性した腓骨神経切断端を脛骨神経に縫合しているにもかかわらず、縫合後一定期間を経ると神経再生が急速に起こるためと推測している。筋収縮には少数の運動神経線維が与えられれば良く、ETS縫合後6週は機能回復に十分な期間であったと考えられた。より神経再生が困難な環境下でEGFR阻害薬投与実験を検討する必要があった。本研究成果をまとめると末梢神経損傷環境ではEGFの発現が増強し、シュワン細胞にはEGFRの発現が増加するようになる。そのような環境で神経縫合を行いEGFR阻害薬を加えると縫合部位でのシュワン細胞の増殖活性とBDNF、GDNF,VEGF活性が増加する。増加したシュワン細胞は、末梢神経再生に必要なミエリン形成を促進し、軸索再生に寄与しているものと推測される。よって末梢神経縫合後のEGFR阻害薬局所投与が神経機能回復を促進させる可能性が示唆された。本結果は、すでに学会報告を行い、追加データをまとめて論文作成を進めている。本研究初年度は、1) in vivoモデルを用いて神経損傷後の損傷遠位部での上皮成長因子(EGF)と受容体(EGFR)の発現パターンを分子生物学的手法で定量化し、2)末梢神経損傷・再建モデルの作製を行い、神経再建後の経時的な運動・知覚機能について解析した。

ラット坐骨神経遠位部を展開し腓骨神経を露出させ分岐部で切断し、腓骨神経断端を近傍の筋層に埋めて3週間後に同部を摘出してリアルタイムPCR法を用いて解析した。EGFおよびEGFR mRNAは正常腓骨神経組織での発現はわずかで切断後3週経過した組織では正常組織と比較してそれぞれ約3倍、1.3倍の発現増加を認めた。このことは、神経切断に伴い変性が進行しEGFおよびEGFRが過剰に発現している状況で分子機構は明らかではないが、EGFR阻害薬による治療効果が見込まれる結果と考えている。今後、EGFRの発現がどの細胞(シュワン細胞、マクロファージ、繊維芽細胞)で発現しているのか解析を進める予定である。次に腓骨神経切断3週で遠位断端を脛骨神経に縫合するモデル(端側吻合)と切断直後に縫合する(一次縫合)モデルを作製し、運動・知覚検査を経時的に行いモデル間での比較を行った。運動機能は、一次縫合群のほうが早期に回復するが、端側吻合であっても縫合後4週経過すると運動機能は徐々に回復し、最終的に一次縫合群の運動機能スコアと同じになった。知覚機能検査では、端側吻合群の場合、切断から3週経過しており縫合前から足底の知覚過敏が観察された。しかし、縫合から8週経過すると知覚過敏状態は改善されることが分かった。次年度は、端側吻合モデルを利用してEGFR阻害薬を用いることでより早期の運動機能回復と知覚過敏状態の改善を指標として研究を進める予定である。また、EGFRの役割についても詳細に明らかにしていく予定である。本年度は、EGFR阻害薬の効果についてin vitroとin vivo両方で解析し、EGFR阻害薬がシュワン細胞に影響を与えていることが明らかになった。よっておおむね順調に進展していると考えている。ただし、損傷神経軸索に対するEGFR阻害薬の影響についての検討はされておらず、次年度の研究課題と考えている。また、in vivoデータでEGFR阻害薬の局所投与によって再生ミエリン数の増加が明らかとなったが、ミエリン増殖、分化に必要なBDNF、NT-3の発現パターンについても明らかにする必要があると考えている。この解析データによっては、EGFR阻害薬に神経栄養因子を追加した併用投与も今後の検討課題になり得ると思われる。治療効果の判定には、研究計画にあるように電気生理学的評価が有効な手法であることから次年度では経時的に誘発筋電図を計測し、伝導速度や電位を解析することでより詳細に研究を進めていく予定である。本研究初年度は、1)末梢神経損傷後の安定した神経再建(端側縫合)モデルの作製と組織評価、2)神経損傷時および神経再建(端側縫合)後におけるEGFRの役割について解明することであった。初年度は、腓骨神経切断後、脛骨への端側縫合を行い経時的な運動・知覚機能検査で神経機能回復を確認し、安定した末梢神経再生モデルを作製することができた。さらに脛骨神経が端側吻合することで過敏状態になることが明らかとなった。しかし、組織学的評価は不十分な状況で次年度に解析する必要がある。分子生物学的解析では、神経損傷時にEGF、EGFRの発現が増加していたことから神経変性時に重要な分子であることが明らかとなり来年度へのEGFR阻害薬の有効性を示す基礎データになり得る。EGFR阻害薬がシュワン細胞に影響を与えることは明らかとなったが、平成23年・24年で行った実験結果について追加確認作業をしていく必要がある。