hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
下行性疼痛抑制系における鎮痛機構について:性差および情動との係わりについて

レセプターのラット脳内での分布、さらにMet-,Leu-エンケファリンなど内因性オピオイドのラット脳内での分布を、雌雄について調べ比較してみたが、薬剤などの投与を行っていない場合には、明らかな性差は、現在のところ認めなかった。これらが、RVMやPAGに薬物を投与した際に、行動生理学的結果と同様な性差を認めるかどうにかついて、研究を続けているところである。前年度,SDラットにおけるテイルフリックテストを用いて急性痛に関する研究を行い,μオピオイドアゴニストである[D-Ara2,N-Me-Phe4,Gly-ol5]-Enkephalin(DAMGO)およびκオピオイドアゴニストであるU69598を下行性疼痛抑制系の中の延髄吻側腹内側領域(RVM)や中脳水道灰白質(PAG)へ投与したときに雌雄における疼痛反応の違いを認めた.また,雌雄において薬剤を投与しないときのμオピオイド受容体(MOR)やMet-,Leu-Enkなどの脳内の分布を免疫組織化学的に調べて差が認められないことを認めた.今回,実際に急性実験でのDAMGOおよびU69598を投与後の脳内でのこれらの分布を調べたが,明らかな性差を認めることはできなかった.また,μオピオイド作動薬,κオピオイド作動薬でみられたテイルフリックテストでの雌雄の反応の差は,ノシセプチン(OFQ)やδオピオイド作動薬では,はっきりとは認められなかった.カナビノイド受容体作動薬(WIN55,212-2)は下行性疼痛抑制系に投与した際に鎮痛効果を雄のラットではテイルフリックテストにおいて認めたため,現在雌において研究中である.また,現在,雄のLong Evansラットを用いて,正常ラットおよび慢性疼痛モデルとして坐骨神経紋扼ラットを作成し,conditioned place preference (CPP)法を用いて,DAMGOやWIN55,212-2を投与した場合にpreferenceを示すかどうか,また慢性的にこれらの薬剤を投与したときに耐性が生じるか,免疫組織化学的に脳内での特に下行性疼痛抑制系や脳内報酬系でのMORやenkephalineなどの分布がどのように変化するかについて調べている.さらに雌のラットを用いて同様の研究を行い雌雄に性差が見られるか研究予定である.急性実験においては,オピオイドの種類によって,また投与量によって,テイルフリックテストを用いた疼痛反応において雌雄の差が認められることをこれまでに示した.これらのオピオイド作動薬を投与したとき,脳内でのオピオイド受容体の分布に関しては,性差は認められなかった.また,これらの受容体は,下行性疼痛抑制系の中の延髄服吻側腹内側領域(RVM)や中脳水道灰白質(PAG)においては,密には認められず,側坐核,扁桃核,線条体などに多く認められた.これらは,オピオイドに対する疼痛反応と脳内報酬系との関連を示唆していると思われる.また,サブスタンスPの分布については,雌雄ともに,RVMでは,axon varicosityをもった非常に繊細な神経線維が豊富にみとめられ,PAGにおいてはRVMほど豊富ではないが,やはり非常に細い神経線維が認められた.しかし,CGRPに関しては,下行性疼痛抑制系の中のRVMおよびPAGにおいては,神経線維はまばらにしか認められなかった.SPの疼痛反応における雌雄差は,明らかには認められなかった.雌雄のLong Evans
多方言音声合成のための地理情報を利用した音韻・アクセントモデリングに関する研究

(1)音声・雑音生成過程の同時推定に基づく高品質音声合成アルゴリズム:一般家庭の収録音声を対象に,雑音生成過程と音声生成過程(音声合成)の同時推定を試みた.まず,空調音などの定常性雑音を対象に,その生成統計量を効率よく推定する敵対的学習アルゴリズムに基づく雑音生成モデルを導入した.本研究成果は,国際会議APSIPAで発表した.(2)地理情報を利用した多方言音韻・アクセントモデリング:音声合成を行うためには,入力テキストの言語情報と,出力音声の音韻・アクセント情報を対応付ける必要がある.日本共通語の場合,各単語とその音韻・アクセント情報を対応付ける辞書データが豊富に存在するため,音声合成が可能となる.しかしながら,日本語方言の場合,そのような辞書データが存在するケースはまれである.また,日本共通語に登場しない方言独自の未知語が存在する.これらの問題に対して,phoneme-/prosody-aware subwordembeddingに基づく教師無し方言音韻・アクセント推定アルゴリズムを提案した.subwordとは,近年,深層学習に基づく機械翻訳の分野で提案された技術であり,単語と文字の中間的な分割区分により未知語を減少させる枠組みである.このアイディアを方言音声合成に導入し,subwordから音韻・アクセント情報を推定する統計モデルについて研究した.また,複数方言の情報を一括でモデリングするため,方言地理情報からその音韻・アクセントを回帰的に推定する統計モデルを提案した.本研究成果は,国際会議APSIPAで発表した.計画書通り進行している.本年度は,日本語方言の知見を活かした音声合成法を提案した.今後は,汎用性を高めるために,知見を利用しない音声合成法を研究する.(1)音声・雑音生成過程の同時推定に基づく高品質音声合成アルゴリズム:一般家庭の収録音声を対象に,雑音生成過程と音声生成過程(音声合成)の同時推定を試みた.まず,空調音などの定常性雑音を対象に,その生成統計量を効率よく推定する敵対的学習アルゴリズムに基づく雑音生成モデルを導入した.本研究成果は,国際会議APSIPAで発表した.(2)地理情報を利用した多方言音韻・アクセントモデリング:音声合成を行うためには,入力テキストの言語情報と,出力音声の音韻・アクセント情報を対応付ける必要がある.日本共通語の場合,各単語とその音韻・アクセント情報を対応付ける辞書データが豊富に存在するため,音声合成が可能となる.しかしながら,日本語方言の場合,そのような辞書データが存在するケースはまれである.また,日本共通語に登場しない方言独自の未知語が存在する.これらの問題に対して,phoneme-/prosody-aware subwordembeddingに基づく教師無し方言音韻・アクセント推定アルゴリズムを提案した.subwordとは,近年,深層学習に基づく機械翻訳の分野で提案された技術であり,単語と文字の中間的な分割区分により未知語を減少させる枠組みである.このアイディアを方言音声合成に導入し,subwordから音韻・アクセント情報を推定する統計モデルについて研究した.また,複数方言の情報を一括でモデリングするため,方言地理情報からその音韻・アクセントを回帰的に推定する統計モデルを提案した.本研究成果は,国際会議APSIPAで発表した.計画書通り進行している.本年度は,日本語方言の知見を活かした音声合成法を提案した.今後は,汎用性を高めるために,知見を利用しない音声合成法を研究する.今年度中に予定していた国際会議発表を次年度に変更したため,使用額に変更が生じた.差額は,次年度中に旅費に利用する.
Ali18変異による炎症発生機構の分子、細胞、個体レベルでの解析

マウスAli18系統は、リン酸化酵素遺伝子の変異が原因となって炎症性関節炎を引き起こす。しかし、どのような分子機構で炎症が発生するかは不明であった。Ali18マウスとマスト細胞を欠損するW/Wvマウスとを交配させて二重変異マウスの解析を行ったところ、関節炎が完全に抑制されていた。このことから、Ali18変異によるマスト細胞を介した炎症発生機構の一端が明らかとなった。Ali18変異マウス系統では、関節を含む四肢末端部に炎症性の発赤と腫脹が発生する。現在までに、positional candidate cloningによって候補領域内のリン酸化酵素の触媒部位にミスセンス変異が検出された。現在までにこの遺伝子が関節炎に関与するという報告はなく、炎症発生の細胞動態や分子メカニズムは未知のままである。本研究では、Ali18変異の炎症発症機構を分子レベル、細胞レベル、個体レベルで総合的に理解して治療薬開発などの応用へと結び付けることを目的とした。本年度は、分子レベルの解析において野生型とAli18変異タンパクのリン酸化活性の比較を行った。哺乳類培養細胞における発現ベクターに、野生型およびAli18変異を含むの目的タンパクの全長のPCRクローニングを行った。挿入部はシーケンシングにより確認した。この発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、リン酸化活性の比較を行った。トランスフェクションを行っていない細胞では目的のリン酸化活性は検出されなかったが、導入細胞ではリン酸化活性が検出された。しかし、野生型と変異タンパクの間では大きなリン酸化活性の変化は認められなかった。また、この原因遺伝子が発現する骨髄よりタンパクを調整して、野生型と変異マウスでの活性を比較したが大きな差は認められなかった。現在、タグ付きタンパクの精製を行っており、これによりさらに精度を高くして活性測定を行う予定である。細胞レベルでの解析では、マスト細胞を欠損するW/W^vマウスとの交配で関節炎が全く発症しないことが明らかになった。そこで、変異マウスよりマスト細胞を培養して解析を行っている。また、個体レベルの解析では、原因遺伝子座のBACクローンを解析中である。前述の発現ベクターに挿入したコンストラクトでのトランスジェニックマウス作製についても検討を行っている。Ali18マウスは、化学変異原で誘発された変異系統で関節を含む四肢末端部に炎症性の発赤と腫脹が発生する。現在までに、候補領域内のリン酸化酵素をコードする遺伝子の触媒部位付近にミスセンス変異が検出された。本研究では.、Ali18変異の炎症発症機構を分子レベル、細胞レベル、個体レベルで総合的に理解して治療薬開発などの応用へと結び付けることを目的とした。昨年度までの研究で、野生型またはAli18変異タンパクの発現ベクターを哺乳類培養細胞へ遺伝子導入し、リン酸化活性の比較を行った。その結果、野生型と変異タンパクの間ではリン酸化活性の大きな変化は認められなかった。そこで今年度は、GSTタグとの融合タンパクとして大腸菌で発現させてタンパク精製を行っている。同じファミリーに属するリン酸化酵素では、同方法により活性を測定に成功した報告がある。タンパク精製により精度を高くして、標的となる合成ペプチドを用いて活性測定を行っている。細胞レベルでの解析では、Ali18変異系統とマスト細胞を欠損するW/W^Vマウスとの交配で関節炎が全く発症しないことが明らかになった。このことからマスト細胞のはたらきが炎症発生に重要であることが明らかになった。しかし、変異マウス骨髄よりマスト細胞を培養して解析を行ったところ、特に異常は認められなかった。培養により認められるマスト細胞は粘膜型であり、組織型マスト細胞に異常がある可能性も考えられる。そのため、培養したマスト細胞をW/W^Vマウスに移植して組織型へ分化させる実験を準備中である。また、個体レベルの解析では、原因遺伝子座のBACクローンを複数購入して、それぞれのクローンの解析を行った。現在、それらを用いてコンストラクションを行っている。化学変異原ENUで誘発された優性変異系統であるAli18マウスは、離乳後に関節を含む四肢末端部に炎症性の発赤と腫脹が発症することから自己炎症性症候群モデルと考えられている。Ali18のポジショナルクローニングによって、リン酸化酵素をコードする遺伝子の触媒部位付近にミスセンス変異が検出された。昨年度までの研究で、分子レベルの解析では原因遺伝子産物をGSTタグで標識して大腸菌で発現させ、タンパク精製を行った。しかしながら、対照として用いた同じファミリーに属する別のリン酸化酵素では活性測定に成功したものの、目的のリン酸化酵素は大腸菌ではタンパクが分解してしまうことがわかった。このことから、大腸菌における強制発現システムでの目的タンパクの精製は不可能であることが明らかになった。そこで、FLAGタグ標識したタンパクを培養細胞で発現させて精製することに変更して実験を行っている。

また細胞レベルでは、Ali18変異とマスト細胞を欠損するW/Wv変異の二重変異マウス関節炎が全く発症しないことが示されたものの、変異マウス骨髄よりマスト細胞を培養して解析した結果、マスト細胞の活性化や顆粒放出などに異常は認められなかった。このことから、現在、培養マスト細胞に変異タンパクを強制発現させるコンストラクトを導入し、そのマスト細胞活性化能をアッセイする実験を行うとともに、この導入細胞をW/Wvマウスに移植して炎症症状の発症を確認している。さらに個体レベルの解析では、原因遺伝子の組織特異的エンハンサーが明らかとなったので、このエンハンサーを利用して原因遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製するためのコンストラクションを行っている。分子レベル、細胞レベル、個体レベルにおいて達成目標を立てたが、分子レベルと細胞レベルでは順調に結果が出てきている。しかし、個体レベルに関しては、BACトランスジェニックマウス用のトランスジーンのコンストラクションが遅れている。このため、やや遅れていると判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。精製タンパクの酵素活性測定については、現在までにタンパク精製を終了して基質となる合成ペプチドも入手しており準備は整っている。しかし、酵素活性測定の最適条件の検討などに時間がかかる可能性がある。また、マスト細胞の移植には、移植を行う宿主マウスの遺伝的背景をAli18マウスと同じにする必要がある。このため、8世代程度の戻し交配が必要である。スピードコンジェニックという世代数を短縮する方法もあるが、労力が必要である。BACの修飾においては、BAC recombineering技術を用いて行う予定である。この技術を用いるのにMTAが必要である可能性があり、早急に確認を取る予定である。
昆虫の概日リズムに関与する光受容体の同定と作用スペクトルの測定〜その生態的意義〜

概日時計の基本的な挙動を観察するさい、神経系の活動に基礎を置く事象を指標にする場合には、出来るだけ神経活動として低位のものを用いる必要がある。我々は、ショウジョウバエの歩行活動を採択したが、各種の光走性などの光に対する直接の反応や光活動性、そして概日リズムによる活動性の変化などの、混在する行動によって時計の実態は曖昧になる。そのため、通常は連続暗黒下でフリ-ランニング時のみに観察可能な概日リズムによる活動性の変化のみを刺激の強度を換えLD下で観察する事を試みた。まず、LD下でもっとも活動性が低下している時期に15分の光照射を与える。この光強度が充分強ければ、(1)光照射中歩行活動(光活動性と思われる)が誘起され、(2)さらに歩行活動に位相のずれが起こる。光を弱くしていくと位相のずれを起こさなくなっても光照射中歩行活動は誘発される。これら二つの反応の閾値が異なることから光受容器官が異なる事が示唆される。鼓舞器官として古来単眼が挙げられているので単眼のみがあって複眼のない突然変異体(ey^<2m>)を用い実験を行なった。光活動性が維持される事が予測されたが予測に反して位相のずれが起こる光強度でも光照射中に歩行活動は起こらなかった。このことにより1)概日時計の光受容器官は複眼ではない。2)光活動性は複眼による。と言う事が第一作業仮説として結論された。さらに、複眼も単眼もない突然変異体を用いて位相のずれのみが起こる事を確認し、概日時計の光受容器官は、通常の視覚系ではないことが結論された。このときの歩行活動は単一のフラクタル指数で特徴づけられることから、LD下の歩行活動はランダムである事が推論され、目的をもった行動ではなく、神経系の非特異的な活性の変化による可能性が指摘される。合目的かどうかは、今後の研究に待たねばならないが、ショウジョウバエの運動が必ずしも情報を持った行動であるわけではない事が結論された。計時機構における最も有効な制御因子としての光の受容体については、無脊推動物ではその実体はもちろん、光受容体の作用スペクトルなど基本的な特性についても明らかにされていない。本研究ではシヨウジヨウバエの視覚系突然変異体を用いて歩行活動リズムに対する光の効果を、種々の異なる波長や強度、および光周期とその位相を変化させて観察した。野生型のシヨウジヨウバエを12L:12Dの明暗サイクルに同調させた後、恒暗下で1日1回、白色パルス光で大きな位相反応の起こる位相時間(本研究では最大位相遅延の起こるCT16をもちいた。)に白色光の代りに一定波長、強度の単色光を与える。位相のずれ(phase shift)の起こる光強度の域値を各波長で求めたところ、約500nmの波長附近に最大感度があることがわかった。これは複眼では主要な視細胞である周辺視細胞R1-6または中心視細胞の一つR8とさほど異ならないが、紫外受容細胞R7とは大きく掛け離れていた。一方パルス光で与えた15分間に同期して、歩行活動は一時的に顕著に増大するが、この活動の変化には必ずしもその後の位相変化が伴わないことがわかった。複眼と3個の単眼の一方、あるいはその両者を欠除する

突然変異体を用いてこれを調べたところ、複眼がこのパルス光に対して反応する主要な受容器であることが明らかになった。これらの結果は計時機構の光入力に対して従来考えられていたのと異なり、視覚系が何らかの形で関与する可能性を示唆している。概日時計の基本的な挙動を観察するさい、神経系の活動に基礎を置く事象を指標にする場合には、出来るだけ神経活動として低位のものを用いる必要がある。我々は、ショウジョウバエの歩行活動を採択したが、各種の光走性などの光に対する直接の反応や光活動性、そして概日リズムによる活動性の変化などの、混在する行動によって時計の実態は曖昧になる。そのため、通常は連続暗黒下でフリ-ランニング時のみに観察可能な概日リズムによる活動性の変化のみを刺激の強度を変えLD下で観察する事を試みた。まず、LD下でもっとも活動性が低下している時期に15分の光照射を与える。この光強度が充分強ければ、(1)光照射中歩行活動(光活動性と思われる)が誘起され、(2)さらに歩行活動に位相のずれが起こる。光を弱くしていくと位相のずれを起こさなくなっても光照射中歩行活動は誘発される。これら二つの反応の闘値が異なることから光受容器官が異なる事が示唆される。鼓舞器官として古来単眼が挙げられているので単眼のみがあって複眼のない突然変異体(ey^m)を用い実験を行なった。光活動性が維持される事が予測されたが予測に反して位相のずれが起こる光強度でも光照射中に歩行活動は起こらなかった。この事により1)概日時計の光受容器官は複眼ではない。2)光活動性は複眼による。と言う事が第一作業仮説として結論された。さらに、複眼も単眼もない突然変異体を用いて位相のずれのみが起こる事を確認し、概日時計の光受容器官は、通常の視覚系ではないことが結論された。このときの歩行活動は単一のフラクタル指数で特徴づけられることから、LD下の歩行活動はランダムである事が推論され、目的をもった行動ではなく、神経系の非特異的な活性の変化による可能性が指摘される。合目的かどうかは、今後の研究に待たねばならないが、ショウジョウバエの運動が必ずしも情報を持った行動であるわけではない事が結論された。
植物油を用いて養殖可能な脂肪酸代謝酵素遺伝子導入海産魚系統の作出

今年度は、ヤマメ鎖長延長酵素2遺伝子導入ニベ系統の稚魚期の魚を用いてDHA欠乏餌料による給餌試験を行った。その結果、この系統の稚魚は餌中にDHAが含まれていないと正常に発育しないことが明らかとなった。この結果に合わせて、ニベ内在性の不飽和化酵素が遺伝子導入魚で増加していたTPAをDHAの前駆物質であるTHAに代謝できないこと、また、TPAを主に代謝可能な脂肪酸代謝酵素が見つかっていないことからも、増加したTPAをDHAへと代謝させることは困難であることが考えられた。そこで、本年度はΔ4活性を保持する不飽和化酵素に着目した。Δ4不飽和化酵素はTPAと同じく遺伝子導入魚で増加していたDPAを直接DHAへと転換可能である酵素で、この酵素を用いればTPAおよびTHAを介さずにDHAを効率的に合成させることが可能になると考えられる。Δ4不飽和化酵素は近年、植物食性魚のシモフリアイゴから単離されている。そこで、この情報を元に近縁種であるアイゴから不飽和化酵素遺伝子を単離した。単離した酵素の活性を酵母発現系を用いて解析した。その結果、この酵素もシモフリアイゴの酵素と同様にΔ4活性を保持していることが明らかとなった。この遺伝子と発現量の異なる肝臓発現プロモーター3種を組み合わせたコンストラクトを作製し、ニベ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。現在は、得られた雄親魚から得られた精液よりゲノムDNAを鋳型として、アイゴの遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによりスクリーニング作業を行っている。最終年度にあたり、前年度までに得られていた成果をオーストラリア・ブリスベンにて行われた10th International Marine Biotechnology Conferenceにて口頭発表し、さらに投稿論文としてまとめたものをJournal of Biotechnology誌に公表した。ヤマメelov12遺伝子の導入のみではDHAの増加は望めないということを、内在性の酵素の活性および給餌試験から明らかにすることが出来たが、アイゴムΔ不飽和化酵素遺伝子導入魚の系統化が困難であった。そのため、発現量の異なるプロモーターを使用したコンストラクトを作製し系統化を試みているところである。しかし、将来的にDHAを効率的に合成可能な系統を樹立できる可能性は非常に高いと予測される。今後もまずは上述のアイゴの脂肪酸代謝酵素を導入した系統の作出を行う。続いて、それら系統とこれまでに得たヤマメelovl2遺伝子導入系統との交配によるダブルトランスジェニック系統の作出を目指す。その後、魚油を段階的に減らし、代替油脂源として植物油を用いた試験飼料を作製し、給餌試験を行う。また将来的には、ニベを用いて得られたデータを元に、他の水産上有用海産魚(ヒラメ、マダイ)等においても同様の遺伝子を導入し、実際にEPA・DHAを自ら合成し、餌飼料中に要求しない系統を作出可能か検討する。今年度は、まずこれまでの研究により得られた肝臓高発現プロモーターおよび各種脂肪酸代謝酵素を結合した遺伝子を合計6種類構築し、ニベ受精卵への遺伝子導入を行った。導入した遺伝子は交付申請書に記載したヤマメおよびアイゴの遺伝子である。各系統それぞれ100尾程度の親魚世代(P1世代)を作製し、成熟サイズまで養成した。続いて,生殖細胞系列に導入した遺伝子が組み込まれた個体を選抜し,野生型個体と交配する事でF1世代を作出した。これらの方法により、現在までに合計4系統の脂肪酸代謝酵素遺伝子導入ニベ系統を確立している。続いて得られたF1世代を飼育し、外来遺伝子を保持する個体同士を交配することでF2世代を作出した。得られたF2世代において,導入した脂肪酸代謝酵素遺伝子が肝臓で強発現しているか調べた。その結果、肝臓で目的の脂肪酸代謝酵素遺伝子を強く発現している系統は4系統のうち1系統のみであった。その他の系統では、非常に弱い発現であった。次に各系統の肝臓の脂肪酸分析を行った。その結果、野生型の個体と比較して脂肪酸組成に有意な差が現れた系統は,導入した遺伝子が肝臓で高発現していた1系統のみであった。しかし,この系統においては野生型と比べて2倍以上も大きく脂肪酸組成が異なっており,この戦略により肝臓で導入した遺伝子を高発現している系統を得ることができれば,当初の目的を達成できるという事が強く示唆された。また,本実験は市販の配合飼料を給餌して行った結果であり,実際に特定の脂肪酸を制限した試験飼料による飼育試験を行えば,生残率や成長率も含め,より明瞭な結果が得られると予測される。さらに,現在遺伝子導入を行っている系統やこれから得られる新たな系統と上記の系統を交配し組み合わせる事で,必須脂肪酸を自ら合成可能な系統を作出できると考えられる。上記の成果を平成23年度日本水産学会秋季大会にて発表した。今年度は、まずこれまでの研究により得られているヤマメ鎖長延長酵素2遺伝子導入ニベ系統の各組織を用いたより詳細な脂肪酸分析を行った。この系統においては肝臓の分析により野生型の個体と比較して脂肪酸組成に有意な差異が認められているが、その他の組織においても、野生型では検出されていない脂肪酸(TPA)の検出が認められた。また、総脂質をリン脂質と中性脂質に分画し、それぞれの脂肪酸組成を分析したところ、DHAの多くががリン脂質に存在していたのに対し、TPAはそのほとんどが中性脂質に存在しており、両者の機能的な差異が示唆された。

なお、上記の成果は平成25年日本水産学会春季大会にて口頭発表した。TPAはEPAからDHAが合成される際の中間産物であるが、この系統においてはDHAには非遺伝子導入個体と遺伝子導入個体間に有意な差異が認められなかったため、TPA以下の反応経路がニベでは機能していないか、あるいは非常に弱い可能性が考えられた。そこで、酵母発現系を用いて、ニベ内在性の不飽和化酵素の活性を調べた。その結果、ニベの不飽和化酵素はTPAを代謝可能であることが明らかとなった。ゆえに、ヤマメElov12遺伝子導入ニベにおけるTPAの蓄積はニベ内在性不飽和化酵素遺伝子の発現が弱いか、あるいは生体内で活性が著しく低いことが原因であると予測された。そこで、DHAの合成を可能にするために、新たな活性をもつ遺伝子を導入する必要があると考えられた。そこで、植物食性海産魚であるアイゴから、新規不飽和化酵素遺伝子を2種類単離し、その遺伝子と肝臓高発現プロモーターを組み合わせたコンストラクトを作製し、ニベ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。現在は、得られた雄親魚から得られた精液よりゲノムDNAを鋳型として、アイゴの遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによりスクリーニング作業を行っている。今年度は、ヤマメ鎖長延長酵素2遺伝子導入ニベ系統の稚魚期の魚を用いてDHA欠乏餌料による給餌試験を行った。その結果、この系統の稚魚は餌中にDHAが含まれていないと正常に発育しないことが明らかとなった。この結果に合わせて、ニベ内在性の不飽和化酵素が遺伝子導入魚で増加していたTPAをDHAの前駆物質であるTHAに代謝できないこと、また、TPAを主に代謝可能な脂肪酸代謝酵素が見つかっていないことからも、増加したTPAをDHAへと代謝させることは困難であることが考えられた。そこで、本年度はΔ4活性を保持する不飽和化酵素に着目した。Δ4不飽和化酵素はTPAと同じく遺伝子導入魚で増加していたDPAを直接DHAへと転換可能である酵素で、この酵素を用いればTPAおよびTHAを介さずにDHAを効率的に合成させることが可能になると考えられる。Δ4不飽和化酵素は近年、植物食性魚のシモフリアイゴから単離されている。そこで、この情報を元に近縁種であるアイゴから不飽和化酵素遺伝子を単離した。単離した酵素の活性を酵母発現系を用いて解析した。その結果、この酵素もシモフリアイゴの酵素と同様にΔ4活性を保持していることが明らかとなった。この遺伝子と発現量の異なる肝臓発現プロモーター3種を組み合わせたコンストラクトを作製し、ニベ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。最終年度にあたり、前年度までに得られていた成果をオーストラリア・ブリスベンにて行われた10th International Marine Biotechnology Conferenceにて口頭発表し、さらに投稿論文としてまとめたものをJournal of Biotechnology誌に公表した。
霊長類の異種交雑にともなう遺伝的変化の研究

和歌山県の有田川北部の大池遊園地域周辺で生じたタイワンザルとニホンザルの交雑群の遺伝子構成を核遺伝子、Y染色体遺伝子、ミトコンドリア遺伝子を標識に調査した。この結果、近隣の在来ニホンザル生息地から移入したオス個体とタイワンザルのメスの間で繁殖力をもつ子孫が生まれ、移入種群中では急速にニホンザル遺伝子の頻度が増加していることが明らかになった。また、生息群を離れて他所へ移住するオスを介したタイワンザル遺伝子の分布拡大について、Y染色体遺伝子変異を利用したモニタリング方法を確立し、紀伊半島の野生ニホンザル生息地の調査に応用した。この結果、和歌山県の外部まで移入種の遺伝子が拡大しているという証拠は得られなかった。さらに、交雑状況を評価するのに有効な核遺伝子標識として新たにnatural resistance-associated macrophage protein1(NRAMP1)遺伝子の変異を実用化することに成功した。また、交雑評価に関するAFLP(制限酵素断片長多型)の有効性についても検討をおこない予備的な成果を得た。房総半島南端に出現したマカク外来種の野生群の生息状況と遺伝子特性を調査したところ、少なくともこの地にアカゲザルが侵入していることが明らかになった。丘陵地域に生息する在来ニホンザルとの交雑の有無を調査,分析した結果、交雑は10年以上に及んでいるとの証拠を得た。また、交雑状況は正逆の両方向に進んでおり、交雑の場所は移入種が定着した房総半島先端部だけでなく在来種が生息する丘陵部でも生じていることが示唆された。移入種の分布拡大をさらに比較研究する目的で、もともとニホンザルが生息しない伊豆大島に侵入し拡大しているタイワンザルを調査した。ミトコンドリア遺伝子変異の分析から、島内での分布拡大の経緯が明らかになり、短期間で急速に分布域を拡大していることが示唆された。和歌山県、青森県、千葉県、静岡県、東京都に導入されているマカカ属外来種の生息実態および遺伝的特性について、調査をおこなった。和歌山県ではタイワンザル交雑群の生息状況を調査し、2年前の結果と比較した。また、導入地域からのオスの拡散をモニターする方法として、Y染色体上のTSPY遺伝子多型を種判別標識として利用するシステムを確立した。これを利用して、隣県地域を調査した結果、オスの拡散が広域には及んでいないとの結果を得た。一方、和歌山県内では、有田川以南の金屋町で捕殺された個体の遺伝子調査により、ニホンザルとの境界領域付近まで交雑個体のオスが進出していることを確認した。青森県下北半島、静岡県大根島、東京都伊豆大島に導入されたタイワンザルについては、糞から抽出したDNAによりミトコンドリア遺伝子が各地点に特異なタイプであることを確認し、今後の集団調査の基礎を固めることができた。伊豆大島タイワンザル群には2種類のミトコンドリア遺伝子タイプが検出され、これらは群分裂を介した島内の生息域拡大をモニターする道具として利用できることが明らかになった。さらに、千葉県房総半島の白浜町に生息する外来種群については、ミトコンドリア遺伝子分析による種判別から、当該種がアカゲザルであるとの証拠を得た。国外の霊長類については、マダガスカルにおけるチャイロキツネザルの亜種交雑について現地調査と遺伝子分析をおこなった。ミトコンドリア遺伝子では明瞭に2亜種が区別でき、核型分析の結果と総合すると、調査地でかなり亜種交雑が進行しているとの証拠を得た。和歌山県に生息するタイワンザルとニホンザルの交雑群について生息実態調査を行った。この結果、少なくとも3群約250頭が生息すると推定した。また、発信機装着で一時捕獲した個体から血液を採取し、遺伝子分析を行った。

調査した4個体のうち1個体が1代目、残りが2代以上の交雑個体であることが判明した。現在は群捕獲の準備が進んでおり、次年度には生息地から捕獲個体を除去する。捕獲する個体から試料を採取し、これまでに開発した分析方法をもとに、当初計画に沿って異種交雑による遺伝的変化を総合的に分析する予定である。一方、今年度も和歌山県周辺部へのオスの分散をモニターするため、奈良県、滋賀県、三重県で血液、糞の試料を採取してタイワンザル遺伝子の検索を継続した。この結果、隣県地域への遺伝子浸透の証拠は得られていない。千葉県房総半島先端に生息する移入種群と丘陵部に生息するニホンザルについてミトコンドリア遺伝子と血液タンパク質の変異を分析し、結果を口頭発表した。Y染色体遺伝子も分析し、移入種がアカゲザルであることを確認した。なお、これまでの結果では交雑の証拠は得られていない。東京都伊豆大島に生息する移入種について糞試料を用いてミトコンドリア遺伝子配列を解読し、タイワンザルであることを確認した。島内には複数のハプロタイプが存在し、分布拡大の経緯の推定が可能である。この結果は論文として投稿中である。青森県下北半島で個人飼育されるタイワンザルの群れとニホンザルの交雑状況を調査するため、大間付近から35個体の試料を採取し遺伝子分析を行った。この結果、タイワンザルに特異的な遺伝子は確認されなかった。上記の集団調査とともに、技術開発としてマイクロサテライト遺伝子変異の効率的な検索を可能にする実験条件の検討を行った。マルチキャピラリー解析装置を用いて、多検体の多座位を同時分析する条件を決めることができた。和歌山県に生息するタイワンザルとニホンザルの交雑群より約170個体の試料を採取し遺伝子分析を行った。種を判別するのに有効な核遺伝子を探索した結果、natural resistance-associated macrophage protein 1(NRAMP1)遺伝子のintron 5領域内の塩基置換多型を発見した。この核遺伝子標識と血液タンパク質の遺伝子型解析から、調査群では急速に交雑が進行していることが明らかになった。また,交雑状況に関してAFLP分析の有効性を評価するために基礎的な実験をおこなった。さらに、ミトコンドリア遺伝子とY染色体遺伝子の分析から、交雑は野生化したタイワンザルの群れに在来のニホンザルのオスが移入して進んでいることを証明した。移入種生息域の拡大を検討するため、伊豆大島に生息する移入種を調査した。島内各所から糞試料を採取しミトコンドリア遺伝子を分析して、当該種はタイワンザルであること、起点となった飼育施設から2方向に拡大が進んだことを明らかにした。この分析結果をまとめ論文として公表した。千葉県房総半島では先端の白浜町で野生化した外来種の群れが確認されている。この群れと丘陵地帯に生息する在来のニホンザルが交雑しているかは不明であった。この可能性を調査するために血液タンパク質とミトコンドリア遺伝子を分析した。丘陵地域のニホンザルでは交雑の証拠は認められなかった。
身振りと延滞模倣の縦断的発達研究

平成8年度の重点研究「認知・言語の成立」の科研費による研究として、以下の3つのことを行った。(1)乳児Uの生後2年目・3年目のビデオ記録テープを逐語的に文字記録化する作業を引き続いて行った。この作業のために人件費を用いた。本年度は、重点「認知・言語」による研究の4年目にあたり、研究の総括年度にあたる。よって、この4年間に整理した観察データを総合して、「身振りと延滞模倣の縦断的発達」を新たな理論的パースペクティヴに置く理論的総括的研究を行った。日誌的な観察データから解明した′′ふり′′の発達や象徴能力の発達を、「ファンタジ-と現実」の認識の問題として広く理論的に位置づけ、「一人二役の会話」の観察データや「空想の遊びともだち」の諸研究や、「サンタクロース」に対する(筆者の)調査研究をも包括するスケールで、理論構成する総括的研究を行った。その成果が、単著『ファンタジ-と現実』(1996、金子書房)である。これはオリジナリティのあるユニークな′′ふり′′理論・シンボル論である。(2)この4年間観察を継続してきた就学前の自閉症の子どもたちの′′ふり′′の諸データを踏まえた上で、上述の書物『ファンタジ-と現実』の内容に自閉症論を新たに加味して理論的に書き改めたのが論文「乳児期の′′ふり′′の発達と心の理解」(心理学評論、1997.4月発刊の予定)である。(3)これまでの4年間の科研費で一部整理のついてきた筆者の日誌データを活用して、「身振りと延滞模倣の発達」に関する研究を、より広い「ファンタジ-と認識」の問題として深化させていくためのステップとして「子どもの夢」についての研究も行った。これは、今回の重点研究をさらに今後の研究へと発展させていくための媒介的研究である。その成果が単著『子どもと夢』(1996、岩波書店)である。
精子形成における新規抗酸化酵素ペルオキシレドキシン4の役割の解明

精子形成細胞は様々な刺激によりApoptosisが、引き起こされることが知られているが、メカニズムについてはいまだ完全には解明されていない。マウスでは下腹部を熱ストレス(42°C・15min)に曝すことにより短時間内にApoptosisが起こることから、極早期にApoptosis経路が活性化されていることが考えられた。熱処理後のマウス精巣について、Apoptosis誘導因子であるシトクロームc(Cyt c)をウエスタンブロット解析したところ、熱処理後1時間でミコトンドリアから細胞質へと流出していることが分った。一方、肝がん細胞由来のHepG2細胞では熱処理によるCytcの流出は認めなかった。肝・精巣より単離したミトコンドリアの比較では、熱感受性に違いは認められなかったことから、細胞質因子に違いがあると考えられた。xanthine oxidase反応の結果発生するsuperoxideがミトコンドリアからのCytc放申を起こす可能性を考え、allopurinol(xanthine oxidase inhibitor)を投与したのち熱処理を加えた。その結果、投与群でApoptosisが有意に抑えられ、Cyt cの放出も抑制された。このことから、熱処置により産生されたsuperoxideがCyt cを放出させる原因の一つになっていると考えられた。以上の結果から、熱ストレスを受けた精子形成細胞では、細胞質よりミトコンドリアにApoptosis誘導シグナルが伝わること、さらにallopurinolを用いた検討から、superoxideを中心とする活性酸素種がこのApoptosis誘導シグナルとしての役割を果たしている可能性が示唆された。停留精巣は新生男児に見られる発達異常で、不妊や悪性腫瘍の原因となる。また、高熱や拘束といった各種ストレスが精巣における精子形成傷害をもたらす。熱付加や炎症はいずれも酸化ストレスをも引き起こすが、その際に生じる活性酸素種が精子形成細胞にアポトーシスを起こす直接の原因と考えられる。生体には活性酸素種を除去する様々な防御系が備わっており、抗酸化酵素はその中心的な役割を果たしている。今回研究対象とするPrx4は、新規抗酸化酵素で分泌シグナルを有するため細胞外で働くと考えられる。しかし精巣では分泌シグナルが切断されない前駆体として存在する。この前駆体の出現が精子形成時と一致することや形態学的解析から、精子形成への関与を想定して検討を進めている。停留精巣モデルマウスにおけるPrx4の発現を調べたところ、モデルマウスでは分泌型の発現量には大きな変動は見られなかったが、前駆体Prx4のみが選択的に消失した。この結果は前駆体型Prx4が精子細胞の形態変化に関わるとする仮説を支持する。精巣は本来、身体の他の部分に比べて数度低い陰嚢内にあり、この低温環境が精子形成に必須である。停留精巣では腹腔にとどまることによって精巣は通常よりも高温条件に曝され、それが原因で精子形成障害が起る。その際の作用因子については明らかにされていないが、本結果から前駆体Prx4のプロセッシングを行う酵素活性の亢進が示唆される。精子形成細胞の精子への分化は培養系では未だ成功していないため、それに関わる遺伝子の機能解析は非常に遅れている。Prx4の機能についてはまったく未解明であり、精子形成へのかかわりを直接証明するには遺伝子改変マウスの作成が必要である。現在遺伝子改変を目的として、必要なプラスミドコンストラクトの作成を行っている。
安定な原子核とエキゾチックな原子核に対するランダムなハミルトニアン

原子核の基底状態では本質的に対相互作用が古くから重要であることが知られており、原子核は最も小さな"超伝導物質"と考えられている。対相互作用が重要であるという最も顕著な証拠は、中性子・陽子がそれぞれ偶数である偶々核で一つの例外もなく基底状態のスピンが0であることである。ところで、最近の非常に面白い数値実験として、相互作用に強い対相関相互作用を使わず、ランダムな相互作用を用いても、多くの場合基底状態のスピンが0になることが示された。このことを理解するため、この研究では主に単一粒子軌道模型を用いて、現象の再現とその原因を調べた。その結果として、ある特定の相互作用が強い場合は基底状態のスピンが0になることを確認した。そのような相互作用を特定するためには、その相互作用を多粒子系で対角化し、そのときスピンが0になるエネルギーが一番低くなれば特定できる。すなわち、ランダムな相互作用を用いたとき、スピンが0になる確率は、独立な相互作用の数に比べ、スピンが0になる特定の相互作用の数の割合で決まる。スピンが0になる確率が大きいということは、このような特定の相互作用の数が他のスピンに比べて大きいことを意味する。以上のことを、我々はフェルミオン系のみならずボソン系でも確かめた。いくつかのボソン系ではスピンが0になる確率がゼロになる"反例"も論理的に見つけることができ、これも我々の解析が正しいことを示している。また、ランダムなハミルトニアンを用いたときの平均のエネルギーの振る舞いについても考察し、このエネルギーが回転レベルをなすことを統計理論を用いて正当化した。
ショウジョウバエ生殖幹細胞ニッチ形成機構の解明

本研究の目的は、ショウジョウバエの生殖幹細胞を維持する幹細胞ニッチの形成機構を解明することである。これにより、幹細胞システムの成立機構を理解することができると考えられる。そこで本研究では、現在までに私たちが同定したニッチ形成に関与する遺伝子(sevenless (sev)、NotchおよびEgfr)等の機能解析を行ってきた。その結果、Notchはニッチ形成を誘導していること、さらに、sevおよびEgfrがニッチ形成を阻害していることが明らかとなった。このように、ニッチ形成は拮抗した性質をもつ遺伝子の働きにより、一定した数になるようコントロールされていることが明らかとなってきた。本研究の目的は、ショウジョウバエの生殖幹細胞を維持する幹細胞ニッチ(ハブ細胞)の形成機構を解明することである。本研究は、先に申請者らにより同定されたハブ細胞形成に関与するsevenless(sev)およびNotchシグナル伝達の詳細な機能解析を行う。Notchシグナル伝達が雄胚生殖巣内のどこで活性化するのかを解析したところ、雄胚生殖巣全体の体細胞活性化することが明らかとなった。次に、ハブ細胞形成におけるNotchシグナル伝達の機能を調べた。その結果、Notch突然変異胚においてハブ前駆細胞の数が減少すること、さらに胚生殖巣の体細胞全体で常時活性型Notchを強制発現させると、ハブ前駆細胞が異所的に形成されることが明らかった。以上の結果から、Notchは雄胚生殖巣の体細胞全体でハブ前駆細胞の形成を誘導していると結論づけられる。Nothcは様々な発生過程において、sev下流のRas/MAPKカスケード拮抗して働くことが知られている。これまで申請者らにより、後半部の体細胞において、sevがハブ前駆細胞の形成を阻害することが示されている。雄胚生殖巣内において、Nothchシグナル伝達とsevシグナル伝達は拮抗して働くことが予想される。今後、Notchとsevの関係を明らかにしていくことが必要である。雄胚生殖巣において、ハブ前駆細胞は前半部の体細胞にのみ形成される。しかし、どのようにして形成されるのか、その分子機構は不明であった。本研究の成果から、Notchが胚生殖巣全体でハブ形成を誘導するが、sevが後半部でハブ形成を阻害することで、ハブ前駆細胞は前半部に限局して形成されることが明らかとなってきた。ショウジョウバエの生殖幹細胞を維持する幹細胞ニッチ(ハブ細胞)の形成機構を明らかにするために、sevおよびNotchシグナル伝達の機能解析を行ってきた。その結果、Notchシグナル伝達が形成されて間もない胚生殖巣において、ハブ細胞の形成を胚生殖巣全体で、誘導していることが明らかとなった。一方、sevは胚生殖巣の後半部において、ハブ細胞の形成を阻害していること、さらに、Egfrが胚生殖巣の後半部において、ハブ細胞の形成を阻害していることが明らかとなった。このように、ハブ細胞は拮抗した性質をもつシグナル伝達の働きにより、一定した数になるようコントロールされていると結論づけられる。ハブ細胞の数が適正に制御されることで、適切な数の生殖幹細胞が規定されるものと考えられる。では、なぜこのようなシステムにより、ハブ細胞の形成は調節されているのだろうか。興味深いことに、ハブ細胞の形成を阻害するsevおよびEgfrシグナル伝達のリガンドは始源生殖細胞で発現することが明らかとなった。すなわち、ハブ細胞の形成を阻害するシグナルは始源生殖細胞から出されている。したがって、胚生殖巣に取り込まれる始源生殖細胞の数が少ないとき、ハブ細胞の数は増加することが予想される。これについて検討した結果、始源生殖細胞の数が少ないとき、ハブ細胞の数は増加して観察された。さらに、ハブ細胞数(ニッチサイズ)の増加により、始源生殖細胞は少ないながらもより生殖幹細胞に分化しやすくなることが明らかとなった。以上のことから、始源生殖細胞の数に依存して、ハブ細胞数(ニッチサイズ)を調節するシステムは、生殖幹細胞を確保するという、重要な役割を果たしていると考えられる。
化学放射線療法が食道癌微小転移に及ぼす影響についての研究

【目的】近年,進行食道癌に対して化学放射線療法(CRT)を加えた集学的治療がなされるようになり,予後の改善が期待されている。CRTはそのすぐれた局所効果により切除不能と判断されていた症例が切除可能となり,長期生存が得られることも多い。しかし,一方では,術後短期間に再発し,死亡する症例も少なくない。このような症例は手術時にすでに微小転移が存在していた可能性が示唆される。そこでわれわれは,食道癌における微小転移の存在を分子生物学的手法で検索し,CRTが微小転移に及ぼす影響を検討した。【対象と方法】2001年1月から2004年12月までの間に入院の上,CRTを施行した初発食道癌患者55症例を対象とした。CRTの前後,手術後に末梢血を採取し,RT-nested PCR法を用いてCEA mRNAの発現を検索,末梢血浮遊癌細胞の検出を行い,微小転移を検討した。【結果】55例中,29例(52.7%)においてCEAmRNAの発現が検出された。臨床病理学的因子別の検討ではリンパ節転移度とStageと有意に相関した。CRT前後の変化をみるとCRT後,CEA mRNAの発現は23例(41.8%)に減少した。33例で手術を施行したが,6例(18.2%)でCEA mRNAの発現は変化した。再発との関係を見ると再発例にCEA mRNAの発現が多く認められた。予後との関係では,CEA mRNAの発現が認められた症例の予後が有意に不良であった。【考察】食道癌患者におけるCEA mRNAの発現の検索による末梢血浮遊癌細胞の検出は癌の進行度と有意に相関し,CRTや手術など治療により変化することがわかった。さらに,治療後の末梢血浮遊癌細胞の存在は,再発や予後に関連を認めた。このことから末梢血浮遊癌細胞の検出は食道癌治療後の癌遺残の判定に有効と考えられ,CRT後の追加手術決定や治療後の追加治療決定の有用な判断材料になるものと思われた。近年,高度進行食道癌に対して化学放射線療法(CRT)を加えた集学的治療がなされるようになり,予後の改善が期待されている。化学放射線療法はそのすぐれた局所効果によりdownstagingをもたらし,切除不能と考えられた症例が切除可能となることも少なくなく,切除例の中には長期生存が得られる症例も認められる。しかし,一方では術後短期間に遠隔転移をきたし,死亡することもある。このような短期間に再発する症例は,治癒切除を施行し得たと考えられても,実際は手術時にすでにリンパ節や遠隔臓器に微小転移が存在していた可能性がある。そこでわれわれは,高度進行食道癌における微小転移の存在を分子生物学的手法で検索し,化学放射線療法が微小転移に及ぼす影響について検討することとした。平成14年度は,関西医大附属病院第2外科に入院となり,化学放射線療法の対象となった食道癌患者の内,15例でCRT前後,手術前後の末梢血の採取,および手術時の標本の採取を行なった。保存した末梢血からtotal RNAを抽出し,CEA mRNAの検出を行ったところ,CRT前の血液では15例中9例で陽性を示したが,CRT後は1例を除き,陰性化した。

この結果はCRTの治療効果とは必ずしも一致しなかったが,CRT後も陽性であった1例は術後早期に血行性転移をきたした。まだ症例数は少ないので今後のさらなる検討が必要であるが,CRTは癌の局所制御以外に微小転移も抑制することが確認され,さらにCEA mRNAの検出は少なくともCRT後の癌遺残の評価に有用である可能性が示唆された。現在,症例を重ね,検討中であり,他の遺伝子の発現や手術前後の変化についても検討中である。近年,高度進行食道癌に対して化学放射線療法(CRT)を加えた集学的治療がなされるようになり,予後の改善が期待されている。化学放射線療法はそのすぐれた局所効果によりdownstagingをもたらし,切除不能と考えられた症例が切除可能となることも少なくなく,切除例の中には長期生存が得られる症例も認められる。しかし,一方では術後短期間に遠隔転移をきたし,死亡することもある。このような短期間に再発する症例は,治癒切除を施行し得たと考えられても,実際は手術時にすでにリンパ節や遠隔臓器に微小転移が存在していた可能性がある。そこでわれわれは,高度進行食道癌における微小転移の存在を分子生物学的手法で検索し,化学放射線療法が微小転移に及ぼす影響について検討することとした。平成15年度は,関西医大附属病院外科に入院となり,化学放射線療法の対象となった食道癌患者の内,10例でCRT前後,手術前後の末梢血の採取,および手術時の標本の採取を行なった。現在まで採取した25例において保存した末梢血からtotal RNAを抽出し,CEA mRNAの検出を行ったところ,CRT前の血液では25例中14例で陽性を示したが,.CRT後は3例を除き,陰性化した。この結果はCRTの治療効果とは必ずしも一致しなかったが,CRT後も陽性であった3例中1例は術後早期に血行性転移をきたした。他の2例は経過観察中であるが,現在のところ再発の徴候はない。今後も症例を重ね,検討を続ける必要があるが,CRTは癌の局所制御以外に微小転移も抑制することが確認され,さらにCEA mRNAの検出は少なくともCRT後の癌遣残の評価に有用である可能性も示唆される。今後も症例を重ね,検討を続ける予定であり,他の遺伝子の発現や手術前後の変化についても検討中する。そこでわれわれは,高度進行食道癌における微小転移の存在を分子生物学的手法で検索し,化学放射線療法が微小転移に及ぼす影響について検討した。平成16年度は,関西医大附属病院外科に入院となり,化学放射線療法の対象となった食道癌患者の内,8例でCRT前後,手術前後の末梢血の採取,および手術時の標本の採取を行なった。現在まで採取した33例において保存した末梢血からtotal RNAを抽出し,CEA mRNAの検出を行ったところ,CRT前の血液では33例中19例で陽性を示したが,CRT後は5例を除き,陰性化した。この結果はCRTの治療効果とは必ずしも一致しなかったが,CRT後も陽性であった5例中2例は術後早期に血行性転移をきたした。