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閉鎖系養液栽培における水耕キュウリの生育抑制物質の蓄積と微生物利用による除去

水耕キュウリは生育後半の収量が低下するために多く栽培されていない.その原因として培養液中の溶存酸素不足と考えられてきたが,まだ明らかになっていない.そこで,本研究者はキュウリ根から滲出する生育抑制物質すなわちアレロパシー物質に注目をした.その後,その主な抑制物質として,2,4-Dichlorobenzoic acidを同定し,キュウリにてバイオアッセイ,水耕で確認を行った.抑制物質によって引き起こされる収量低下すなわち自家中毒を回避する方法として,培養液の交換や活性炭添加が考えられたが,それらは実用に適さない.そこで,抑制物質を分解する分解菌の利用が考えられた.まず,培養液に添加された2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌がキュウリの栄養生長に及ぼす効果について検討した.その結果,培養液に2,4-Dichlorobenzoic acidを添加するとキュウリの栄養生長は抑制されたが,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの生育抑制は回復した.また,抑制物質である2,4-Dichlorobenzoic acidがキュウリの生殖成長すなわち収量(収穫果実数)に及ぼす影響について検討し,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの収穫果実数低下の回復がみられるかどうか検討した.その結果,培養液に2,4-Dichlorobenzoic acidを高濃度(10μmol/liter)添加したにもかかわらず,分解菌懸濁液を添加すると収穫果実数の回復がみられた.また,キュウリ自身の根から滲出される生育抑制物質に対して分解菌が効果を及ぼすかどうか検討した.その結果,生殖成長期に2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると,キュウリの収穫果実数低下の回復がみられた.ただ,懸濁液を培養液に添加するタイミングについて検討が必要だと考えられた.また,以上の研究成果を2002年8月にトロント(カナダ)で行われた第26回国際園芸学会で口頭発表する機会が与えられ,その際外国研究者から多くのアドバイスをもらった.次ぎに,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れるタイミングについて検討を重ねた.その結果,キュウリ根から2,4-Dichlorobenzoic acidが滲出される生殖成長期に分解菌を培養液に添加した場合に顕著な効果がみられた.栄養成長期から分解菌を培養液に添加すると,たとえ生殖成長期に再び添加しても大きな効果は認められなかった.分解菌が効果を発揮する添加のタイミングについて今後とも検討が求められた.以上より,キュウリの自家中毒回避法として,微生物利用が考えられた.水耕キュウリは生育後半の収量が低下するために多く栽培されていない.その原因として培養液中の溶存酸素不足と考えられてきたが,まだ明らかになっていない.そこで,本研究者はキュウリ根から滲出する生育抑制物質すなわちアレロパシー物質に注目をした.その後,その主な抑制物質として,2,4-Dichlorobenzoic acidを同定し,キュウリにてバイオアッセイ,水耕で確認を行った.抑制物質によって引き起こされる収量低下すなわち自家中毒を回避する方法として,培養液の交換や活性炭添加が考えられたが,それらは実用に適さない.そこで,抑制物質を分解する分解菌の利用が考えられた.まず,培養液に添加された2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌がキュウリの栄養生長に及ぼす効果について検討した.その結果,培養液に2,4-Dichlorobenzoic acidを添加するとキュウリの栄養生長は抑制されたが,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの生育抑制は回復した.また,抑制物質である2,4-Dichlorobenzoic acidがキュウリの生殖成長すなわち収量(収穫果実数)に及ぼす影響について検討し,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの収穫果実数低下の回復がみられるかどうか検討した.その結果,培養液に2,4-Dichlorobenzoic acidを高濃度(10μmol/liter)添加したにもかかわらず,分解菌懸濁液を添加すると収穫果実数の回復がみられた.また,キュウリ自身の根から滲出される生育抑制物質に対して分解菌が効果を及ぼすかどうか検討した.その結果,生殖成長期に2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると,キュウリの収穫果実数低下の回復がみられた.ただ,懸濁液を培養液に添加するタイミングについて検討が必要だと考えられた.また,以上の研究成果を2002年8月にトロント(カナダ)で行われた第26回国際園芸学会で口頭発表する機会が与えられ,その際外国研究者から多くのアドバイスをもらった.次ぎに,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れるタイミングについて検討を重ねた.その結果,キュウリ根から2,4-Dichlorobenzoic acidが滲出される生殖成長期に分解菌を培養液に添加した場合に顕著な効果がみられた.栄養成長期から分解菌を培養液に添加すると,たとえ生殖成長期に再び添加しても大きな効果は認められなかった.分解菌が効果を発揮する添加のタイミングについて今後とも検討が求められた.以上より,キュウリの自家中毒回避法として,微生物利用が考えられた.閉鎖系養液栽培では,培養排液による環境汚染を防ぐために培養液を循環して再利用することが考えられている.

その場合,培養液中に肥料分や病原菌を除去することは可能であるが,植物の根から出る生育抑制物質(アレロパシー物質)の除去は困難である.本研究者は,キュウリの養液栽培における生育後半の収量低下が根からのしん出物によるアレロパシーであることを明らかにし,その原因物質として2,4-Dichlorobenzoic acidなどを使用済み活性炭から抽出,同定した.また,活性炭や接ぎ木による自家中毒の回避法を見いだした.しかし,活性炭を使用した場合,培養液中の鉄源となるキレート鉄が吸着されたり,使用済み活性炭の処理にも課題が残る.一方,培養液中に植物の生育抑制物質のひとつであるフェノール物質を消費する微生物が発見されている.そこで,フェノール物質を消費する微生物を利用して,生育抑制物質の除去法について検討した.以上より,キュウリの自家中毒の回避方法として,活性炭や接ぎ木の他に微生物の利用が考えられた.来年度は,キュウリの栄養生長すなわち収量に及ぼす効果について検討を重ねる予定である.以上より,キュウリの自家中毒回避法として,微生物利用が考えられた.今後(来年度以降)は,キュウリ自身の根から滲出される生育抑制物質に対して分解菌が効果を及ぼすかどうか検詩する予定である.本年度(平成14年度)は,キュウリ自身の根から滲出される生育抑制物質に対して分解菌が効果を及ぼすかどうか検討した.その結果,生殖成長期に2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると,キュウリの収穫果実数低下の回復がみられた.ただ,懸濁液を培養液に添加するタイミングについて検討が必要だと考えられた.また,以上の研究成果を2002年8月にトロント(カナダ)で行われた第26回国際園芸学会で口頭発表する機会が与えられ,その際外国研究者から多くのアドバイスをもらった.以上より,キュウリの自家中毒回避法として,微生物利用が考えられた.来年度は,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れるタイミングについて検討を重ね,本研究のまとめをしていきたい.前年度まで(平成1214年度)の研究では,培養液に添加された2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌がキュウリの栄養生長に及ぼす効果について検討した.その結果,培養液に2,4-Dichlorobenzoic acidを添加するとキュウリの栄養生長は抑制されたが,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの生育抑制は回復した.また,抑制物質である2,4-Dichlorobenzoic acidがキュウリの生殖成長すなわち収量(収穫果実数)に及ぼす影響について検討し,2,4-Dichlorobenzoic acid分解菌懸濁液を培養液に入れると2,4-Dichlorobenzoic acidは分解されてキュウリの収穫果実数低下の回復がみられるかどうか検討した.
ウイルスの複製・移行に関与する宿主タンパク質の構造と機能

1.RNA複製酵素と結合するタバコの翻訳伸長因子eEF1Aおよびリングフィンガータンパク質PHF15について、それらの発現抑制あるいは過剰発現によるTMV RNAの蓄積量を解析した結果、前者はTMV RNA複製酵素複合体の重要な1構成成分であることが明らかにされた。一方、後者はTMVの増殖を阻害する植物側の抵抗性機構に関与していることが示された。2.移行タンパク質(MP)と結合するタバコのコシャペロンタンパク質NtDnaJ-3およびこのNtDnaJ-3に結合する転写制御タンパク質NtKN1について、それらの発現抑制あるいは過剰発現によるTMV MPの蓄積量を解析した結果、両者ともにMPの安定的蓄積と細胞間移行の促進に関与していることが示された。4.2分節性プラス鎖RNAゲノムを持つムギ類萎縮ウイルスのRNA複製複合体の分離精製を試みた。5'および3'非翻訳領域の間にp152およびp211複製酵素遺伝子を持つ変異型Rep RNA1をオオムギ葉肉プロトプラストに接種した。複製Rep RNA1およびp152/p211翻訳産物を継時的に検出したところ、Rep RNA1複製量は接種9時間後に最大に達したが、p152/p211翻訳産物は24時間後まで増え続けた。接種12時間後までのp152/p211はP1可溶性画分とS15可溶性画分から検出されたが、24時間後には大半がP1不溶性画分から検出された。従って、Rep RNA1接種プロトプラスト内では感染初期に膜結合性の可溶性複製酵素によってRNAが複製し、感染後期のp152/p211複合体は不溶性で複製酵素活性を持たないものと推察された。RNA複製複合体内のp152:p211比はおよそ4:1程度だった。1.タバコモザイクウイルス(TMV)RNA複製酵素のM、H、P各ドメイン間の相互作用を酵母two-hybrid法によって解析したが、いずれの組み合わせでも陽性の結果が得られなかった。そこで、同じく酵母two-hybrid法により各ドメインと結合する宿主タンパク質をタバコのcDNAライブラリーから探索したところ、Hドメインではプロテインカイネースなど3種のタンパク質、Pドメインでは機能不明な1種のタンパク質が検出された。2.カンキツタターリーフウイルス(CTLV)ゲノムのORF2について、35Sプロモータの下流にORF2-GFPをつないだコンストラクトおよびこれに種々の点突然変異を導入したクローンを植物細胞に導入してその移行動態を調べた結果、ORF2は細胞間移行および全身移行に関与しているタンパク質をコードしていることが示された。また、ORF1にコードされるポリタンパク質にはRNA複製酵素や外被タンパク質(CP)の配列が含まれているが、northern解析によりCPのサブゲノムRNA(sgRNA)が検出されたこと、CPの翻訳開始コドンを欠失させるとCPの発現とウイルスの移行が認められなくなったことから、CPはsgRNAより翻訳され、全身移行にも関与しているものと推定された。3.チオレドキシンhを発現する形質転換タバコ植物(TRXhタバコ)では約10kDaのF-dextranは高頻度で細胞間移行するのに対して、20-40kDaのF-dextranは移行頻度が低いことから、TRXhタバコでの原形質連絡の透過性はTMV移行タンパク質を発現する形質転換体と同程度であることが示された。また、TRXhタバコにGFPを発現する各種組み換えTMVを感染させたところ、野生型の移行タンパク質とGFPの融合タンパク質を発現するウイルスでは移行速度が低下するのに対して、変異型の移行タンパク質を持つ組み換えTMVでは移行の頻度が高まる場合と差がない場合があった。

一方、イネ篩管液中にはrRNA、tRNA、および各種mRNAの断片が存在することを明らかにした。1.TMV RNA複製酵素のヘリカーゼ(H)ドメインと結合する宿主タンパク質アルギニンデカルポキシラーゼ(ADC)について、そのHドメイン相互の結合に対する作用を酵母three-hybrid法を用いて解析したところ、ADCはこの結合を強く阻害することが示された。以上から、ADCは宿主の防衛分子のひとつでTMVRNA複製酵素のヘテロダイマー形成を阻害する可能性が示唆された。2.ASGVのORF1にコードされるRdRpがフレームシフトを介して発現していることを、以下によって証明した。すなわち、35Sプロモーター下流に、ASGVのフレームシフトに関与すると推定されるステムループ(SL)構造が変化しないような塩基置換変異を導入した配列を挿入し、さらにその下流の-1フレームにGFPを挿入したコンストラクトを構築し、bombardmentにより植物細胞に導入したところ、GFPの蛍光が観察された。また、-1フレームシフトした場合にその直後に存在するASGVの直列に並んだ終止コドンを同時に改変したASGV変異株は、野生株に比べて感染率が低下することが示された。3.PVX-BSの感染性cDNAクローンにっいて、そのpoly A配列を除去するとともに、po1y A signal様配列に変異を導入したクローン、3'UTRのSLC全体に種々の変異を導入したクローン、SLCの大部分を欠損させたクローンを作製し、その感染性を調べたところ、いずれのクローンも感染性を示し、後代ウイルスのpoly Aが修復されていた。以上の結果から、SLCはpoly A修復に関与していないことが示された。4.チオレドキシンhと相互作用して原形質連絡の透過性を高めるタンパク質を検索するために、イネチオレドキシンhおよび変異型のチオレドキシンhを大腸菌内でGSTとの融合タンパク質として発現させ、フルオロセインにより蛍光標識した後、これらの細胞間移行能をマイクロインジェクションによって確認した。1.TMV移行タンパク質(MP)と結合する宿主タンパク質を、タバコcDNAライブラリーから酵母two-hybrid法によって探索したところ、コシャペロンであるDnaJ様タンパク質NtDnaJ-t3が単離された。一方、NtDnaJ-t3と結合する宿主タンパク質としてKnotted 1様タンパク質NtKN1が単離された。以上、NtDnaJ-t3がMPおよびこれと類似の移行機能を有すると推定されるNtKN1にともに結合することから、NtDnaJ-t3がTMVの細胞間移行に何らかの重要な働きをしている可能性が示唆された。2.ASGVのORF1のvariableregionに終止コドンを導入した変異株は感染性を維持したことから、ASGVの感染にはORF1全長のポリプロテインは必須ではないことが明らかになった。また、ゲノムcDNAからin vitro転写したRNAを用いてin vitro翻訳によりフレームシフトの検証を行った結果、全長分子量のタンパク質、およびステムループ(SL)付近で翻訳を終えたタンパク質がそれぞれ検出された。
海運・流通から見た土佐一条氏の学際的研究

本研究は、土佐国幡多荘が四国随一の貿易陶磁器出土地である点に着目し、その荘園領主一条氏による海外貿易の可能性を探り、合わせて中世日本における幡多地域の歴史的な役割について考察した。その基本的な作業として、一条氏の外戚となった加久見氏の屋敷跡の発掘調査を実施し、建物跡や中国産陶磁器や国産の陶器・土器など多数の遺物を検出、土佐でも有数の存在であったことを確認した。加久見氏屋敷跡は、城跡や菩提寺・家臣団屋敷などを伴う小世界の中心であり、川を媒介に港湾・港町とも直結する海の領主の本拠に相応しいものであった。一条氏は、こうした海の領主たちを広く組織し、海上における彼らの日常的な活動を取り込むことによって、広域的な交易活動に参画していた。一条氏は実際に唐船を建造しており、しばしば舶来品を朝廷や京都の一条氏へ贈るなど、海外貿易に関与していた様子を明確に示している。畿内の一角からブランド石材で作られた多数の石造物が搬入されていたことも明らかになってきた。幡多地域で多量の中国産等の陶磁器類が出土するのも、一条氏の広域的な交易活動によるものと考えてよさそうである。また、一条氏は、防長の大内氏、豊後の大友氏、日向の伊東氏と婚姻関係を結び、豊後水道から瀬戸内海にかけての航路の安全を確保し、この航路を頻繁に使用していた様子も確認できる。さらに本願寺や紀州の雑賀門徒とも結んで紀淡海峡から太平洋を通って幡多や九州へ通じる航路も確保していた。土佐国幡多荘は、瀬戸内海・豊後水道ルートと太平洋ルートとが合流するところに位置しているが、それによってこの地域の海運上の位置が決定的に高まることになった。一条氏が幡多荘を重視したのはこのような理由によるものであった。本年度は、土佐一条氏最大の支柱であった加久見氏の本拠地の発掘調査を行った。居館や家臣団屋敷があると推定した加久見城・加久見上城の間の谷では遺構を確認できなかったが、加久見上城の南麓から家臣団屋敷と見られる建物跡の一部、15世紀後半の貿易陶磁器の破片やカワラケ片を検出した。また、加久見城の西麓から加久見氏居館の付属施設の一部と見られる遺構や、一括投棄された多量のカワラケ片を検出し、さらに加久見上城の西麓から、礎石・柱穴や多数の石仏・石塔が確認され、加久見氏の氏寺泉慶院跡である可能性が高まった。まだ加久見氏居館の本体を検出してはいないが、加久見氏の城を中心として居館・家臣団屋敷群・寺社群が存在したことが明らかになってきた。発掘調査と並行して港湾調査も行った。現在、加久見城跡の西側を南流する加久見川の流れは、近世前半の改修によって造られた流路であり、それ以前は加久見盆地の中央部から居館推定地の前面を流れていたこと、加久見川はこの地域屈指の港湾越浦に流れ込んでおり、近世以降、越浦の3分の2が干潟化したが、それ以前は奥深い湾になっており、加久見川を遡った船がたやすく加久見氏の居館付近まで到達した可能性が高いことなども分かってきた。さらに文献史料の読み込みから、加久見氏が越浦ばかりか中浜・清水・三崎など周辺の良港をも掌握していたこと判明し、加久見氏が水軍として土佐一条氏の対外交易において重要な役割を演じていた様子が浮かび上がりつつある。

また、土佐一条氏が豊後の大友氏や日向の伊東氏と婚姻関係を結んでいたこと、「臼杵全」知行地が宿毛湾頭に存在するなど、豊後水道を挟んだ四国西岸と九州東岸との密接な交流の様子も明らかになりつつある。昨年度の調査で所在地が判明した土佐一条氏の外戚加久見氏館跡の発掘調査を実施した。調査面積は狭かったが、15世紀代の加久見氏館の一部と見られる石列や貿易陶磁器・土師質土器を検出し、さらにその下の層から1314世紀代のピット群や貿易陶磁器・土師質土器などを検出した。取り分け大量に出土した土師質土器は、ここが加久志見氏の居館跡であることを決定づけた。大型建物の存在をうかがわせる1314世紀代の遺溝は、「金剛福寺文書」に見える「以南村預所」跡であった可能性が高く、土佐清水市域を中心とした幡多郡以南村の中心が13世紀以来この地にあり、その上に加久見氏が登場してくることが判明した。また、13世紀末の楠葉型瓦器碗が出土し、一条氏に加えて北条時宗もこの地に関わっていたことが明らかとなった。発掘調査に加えて昨年度からの港湾調査を続行した結果、幡多郡の要港清水津の一部をなす越浦と加久見氏館跡とが、加久見川の舟運を媒介として直結していたことが判明し、加久見氏を水軍と見た予想を裏付けることができた。また、土佐清水市域の石塔調査では、加久見周辺に兵庫県六甲で産出する花崗岩製の五輪塔がかなり分布することが判明し、加久見氏や以南村預所が兵庫津と特別の関係を有していた可能性が高まった。その他、四万十市(旧中村市)郊外の香山寺跡(金剛福寺と一体的関係を持つ)の踏査を行い、中腹より少し上にある14世紀初頭の銘を持つ碑や、1516世紀代と見られる遺物・遺構を確認し、一条氏の盛衰と香山寺・金剛福寺との盛衰とが深い関係にあることが見えてきた。今年度は、土佐清水市教育委員会の加久見氏居館跡の発掘調査をサポートすることによって、その成果を共有するとともに、加久見氏菩提寺香仏寺跡を中心に濃密に分布する花崗岩製中世石造物の調査を実施し、この地域が中四国で最も濃密な分布地域であることを確認した。文献史料によって、御影石の産出地六甲とその積出港と見られる兵庫は、一条氏の荘園摂津国福原荘に属し、加久見氏の本拠加久見も同じく一条氏領幡多荘以南村の中心であったことが確認され、一条氏や加久見氏が御影石の流通に何らかの関わりを有していたことが明らかになってきた。御影石製石造物の分布調査と港湾調査を兼ねて実施したところ、港湾やその近辺など海岸部ほど分布密度が高く、その輸送が主として海運によるものであったことが明らかになった。加久見氏の本拠も加久見川を媒介として、越・清水という港湾都市・集落と一体的な関係にあり、以南村南岸部の港湾群を広く抑える加久見氏は、紛れもなく海の領主」であった。土佐一条氏は、加久見氏ら幡多荘沿岸部に多数存在する「海の領主」の組織者となり、豊後水道・瀬戸内海を越えた南の海の世界に乗り出す基盤を獲得したのであった。実際、16世紀前半には、一条房冬が本願寺・和泉堺の商人らと連携して、「唐船」を建造した事実があり、本願寺や京一条氏に「唐物」を贈っているのも、広域的な交易活動の成果の一端を示すものであった。四国の中でも、幡多と南予の宇和郡が最も高密度な貿易陶磁器出土地であるのは、土佐一条氏の活発な海運政策によるところが大きかったということができよう。
多彩な発光微生物蛍光タンパク質による酸化ストレスの光シグナリング及びイメージング

発光細菌由来黄色蛍光タンパク質(Y1-yellow)及び青色蛍光タンパク質(Y1-blue)をコードする遺伝子の真核細胞発現系を構築すると共に、発現蛍光タンパクによる酸化ストレスの生細胞イメージング法を確立した。真核細胞モデルとして出芽酵母を用いた。ミトコンドリアシグナル配列を融合したY1-yellow遺伝子により、同サイト局在的発現系の構築を実現すると共に、Y1-yellow蛍光に基づいてミトコンドリアの動態や活性酸素種を可視化できることを実証した。他方、細胞空間の広域で放射されるY1-blue蛍光により、内在的なアポトーシスシグナルとなるミトコンドリアサイトクロムcの可視化を達成した。(1)発光微生物Aliivibriofischeri Y1由来レドックス性蛍光タンパク質Y1-YFP及びY1-BFPをコードする遺伝子の安定な大腸菌発現系を構築すると共に、組換え体Y1-YFP及びY1-BFPの大量調製法と精製法を確立した。次にY1-YFP及びY1-BFPコード遺伝子発現系を用いて、種々の酸化ストレスと大腸菌生細胞蛍光挙動との関係を詳しく調べ、次の結果を得た;1)酸化ストレスが惹起される高酸素分圧の条件下、二種類の形質転換大腸菌は共に酸素濃度の増減に応答して蛍光強度の増幅と減衰を繰り返えした;2)呼吸阻害剤の存在下において、一時的な蛍光強度の増大がみられた。他方、酸素消去剤処理により大腸菌から迅速に蛍光能が失われた;3)形質転換大腸菌はFe^<3+>イオンを摂取することによって一時的に迅速に蛍光強度を増大させ、その後時間の経過と共に蛍光強度は変動した;4)特に細胞膜近傍でY1-YFP蛍光の顕著な強度変化が観測された。(2) Y1-YFPコード遺伝子の酵母発現系を構築した。過酸化水素及或はFe^<3+>イオンで処理した形質転換酵母の蛍光イメージから、酵母生細胞内においてもY1-YFP蛍光は活性酸素種の生成と消滅と関連して変化することを観測した。(1)及び(2)で得られた結果を総合すると、生細胞の蛍光挙動が呼吸活性と密接に関連していること、細胞内で生成したスーパーオキシドイオン、過酸化水素及びヒドロキシラジカルなどとY1-YFP及びY1-BFPが酸化還元相互作用すること、細胞内における酸化型(蛍光性)と還元型(無蛍光性)との濃度比に依存した蛍光挙動が観測されること、さらに酸化型と還元型の濃度変化が、活性酸素種の種類、量、動態及び細胞内時空分布に依存して起こるものと考えられた。一連の結果は酸化ストレスの光シグナリングとイメージングの研究において重要な結果として評価される。(1) 21年度に検討したシャトルベクター系(pYES2/CT)に基づく発光微生物由来蛍光タンパク質(Y1-BFP及びY1-YFP)の酵母(Saccharomyces cerevisiae)発現系に改良を加えた。特にY1-YFPが酵母細胞内の活性酸素種の生成消滅に起因して蛍光挙動を顕著に変化(蛍光性(酸化能が高い活性酸素種の関与時)-無蛍光性間で変化)する好適な機能を有することを確認した。また呼吸阻害剤などの吸収によりY1-YFP蛍光挙動に変動が観測されることから、発現したY1-YFPはミトコンドリア近傍で機能を示すものと期待される。ミトコンドリア近傍で生じる活性酸素種あるいは活性酸素種に起因する酸化ストレスはアポトーシスなど重要な細胞内ネットワークの起点となることから、得られた成果は意義深いものと考えられる。しかしながら、活性酸素種及びこれらと関連する酸化ストレスのより効果的なイメージングを達成するために、高度に安定したY1-BFP及びY1-YFPの酵母発現系の構築の完成が課題として残った。(2) Y1-BFP及びY1-YFPを発現した大腸菌コロニーを多細胞集団として捉え、蛍光挙動に及ぼす酸素濃度の効果を調べた結果、酸素濃度の増減に対応して、それぞれの系においてコロニーの蛍光強度が顕著に増減することを観測した。得られた結果は酸素負荷に依存して細胞内で生成消滅する活性酸素種あるいは酸化ストレスを細胞集団レベルで観測し得る可能性を示唆するものであり意義深い。(3)細胞内酸素の直接検出及び酸素呼吸と関連する酸化ストレスの生物発光イメージングを目指して、微生物ルシフェラーゼ及び反応基質アルデヒドの合成酵素をコードする遺伝子群(lux遺伝子)の構築を試みた。lux遺伝子による大腸菌あるいは酵母の形質転換及び発現系の評価を23年度に行う。発光細菌由来黄色蛍光タンパク質(Y1-YFP)及び青色蛍光タンパク質(Y1-BFP)をコードする遺伝子の真核細胞発現系及び発現蛍光タンパクによるミトコンドリアの動態の蛍光イメージング(FI)法を新規に構築した。真核細胞として出芽酵母を用いた。発現系の構築には蛍光タンパク質コード遺伝子をクローニングしたpYES2/CTをシャトルベクターとする手法を用いた。

さらにミトコンドリアシグナル配列を有するY1-YFPの発現系を構築した。免疫染色法等により、Y1-YFP黄色蛍光はミトコンドリアで局在的に観測されることを確認した。呼吸阻害剤、脱共役剤、酸化剤、還元剤等による処理を行なった酵母のFIから、Y1-YFP蛍光が、ミトコンドリアの動態(局在性、形状、活性の時間過程)及びミトコンドリアにおける活性酸素種(ROS)の生成消滅を明瞭に反映することを明らかにした。他方、発現Yl-BFPは液胞以外の細胞空間全体に広く分布して存在すること、また細胞齢が若い細胞など代謝活性が高い状態において明るいY1-BFP蛍光を放射することが分かった。さらに、呼吸阻害時や呼吸鎖においてROSの大量発生を誘発する鉄(III)イオンの摂取によって、Y1-BFP蛍光が顕著に強くなること、及びROSの大量発生の結果、ミトコンドリア近傍において局所的にY1-BFP蛍光が消光されることを見いだした。この特異的な蛍光消光は、ROSの発生後に大量に放出されたサイトクロム(cyt)cとY1-BFPとの相互作用によるものと考えられた。一連の結果は、Y1-YFP蛍光及びY1-BFP蛍光が、ミトコンドリアの動態の可視化と共に、内因性アポトーシスのトリガーとなるミトコンドリアcytcの可視化に有用であることを強く示唆するものである。これらの研究成果は学術的に意義深いだけでなく、ライフサイエンスに大きく貢献するものと期待される。
昆虫神経ホルモンの細胞内シグナル伝達の分化メカニズム

フェロモン腺におけるカイコPBANの外部シグナルは膜表面レセプターに伝えられた後、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入、カルモジュリン、カルシニューリンを介し、ボンビコール生合成の最終酵素であるアシルCoAレダクターゼを活性化することで細胞内シグナル伝達が完了する。そこで、PBANによって調節されるボンビコール産生のメカニズムを分子および細胞レベルから解析した。まず、ボンビコール産生細胞の細胞質に存在する油滴状顆粒に着目し、その成分をアセトンに浸出させた後、HPLCで分離し、各ピークをFAB-MSで構造解析したところ、ボンビコール前駆体のC16:1,C16:2の脂肪酸およびオレイン酸、リノール酸、リノレン酸を構成脂肪酸とする様々な分子種からなるトリアシルグリセロールであることが明らかとなった。したがって、この顆粒はボンビコール前駆体の細胞内貯蔵物として機能するものと考えられた。そこで、この顆粒の形成過程を電顕で詳細に検討した結果、ボンビコール産生細胞では羽化1日前に基底膜から大規模な物質の流入が起こり、それに伴って顆粒が形成されることがわかった。顆粒の構成脂肪酸が必須脂肪酸を含むことから、これらの脂肪酸を持つ何らかのグリセライドが基底膜より流入し、denovoで作られたボンビコール前駆体を取り込むことで油滴状顆粒が形成されるものと推察された。また、ボンビコール産生に関与する機能分子としてフェロモン腺cDNAライブラリーよりアシルCoA結合タンパク質、アシルCoAデサチュラーゼ、カルシニューリン遺伝子をクローニングし、ノーザン分析を行ったところ、これらの遺伝子は油滴状顆粒形成時の羽化1日前に大量に発現されることが明らかになった。したがって、ボンビコール産生細胞ではボンビコールの産生に向けて羽化1日前にダイナミックな変化が一斉に起こるものと考えられた。
建築許可制度の日独比較法研究

第一に、大規模小売商業施設の設置に関して改正された建設法典2条2項や34条を検討した。国土整備の目標は伝統的には自治体の権利を設定しないとされてきたが、隣接ゲマインデに対して衡量原則に比して法的により強固な法的地位を設定する考え方が一部の判例に取り入れられ、計画による克服の原則と同様に、計画裁量の統制の多様化を導いている。具体の建築許可手続(34条による場合)において自治体の行政能力の限界に鑑みる見解があり、2条2項改正と相俟って土地利用の抑制的方向での規制が強化されている。第二に、土地利用秩序の個別的な実現手段である建築許可手続における裁量の民間化・手続簡素化の中での変容を公私協働論に焦点を当てて検討した。行政手続法改正論議では公私協働に相応しい手法に対する法的規律が今日的な課題となっているからである。即ち、一方で、法治主義的観点からの結合禁止法理による私人への不当な負担の抑制、他方で「違法=無効」という枠組みやその背後にある公行政遂行に際しての私益への不信感が従来見られたが、公私協働を進めるべく行政主体・私人に手続上の責務・義務を課す方向の提案が見られる。また、公私協働が癒着に陥ることを防ぐために行政契約の場合でも第三者の法的地位が、行政主体の負い続ける保証的責任を具体化すべく情報権や契約不履行時の介入権が従来以上に強調されている。公私協働契約に対する法的規律は、利害の輻輳する状況では行政行為手法が用いられる場合にも妥当すると考えられる。第三に、日本法との比較研究として、既成市街地の市街地像を参加手続の中で具体化する点は簡単に触れるに留まった。手続簡素化の流れに関連して、指定検査確認機関の交付した建築確認を周辺住民が争う場合の当該機関の法的地位について検討した。手数料を収入とする私的利益を追求する独立の法主体を審査請求に際して下級行政機関同様の地位に置くことの問題を指摘した。研究対象であるドイツの土地利用秩序の個別的な実現手段である建築許可・その手続について、建築監督手続の緩和・迅速化の立法傾向の下での建築許可制度の変容に焦点を当てることで、建築許可及びその手続における考慮事項、手続における多様な主体の参加、相隣上の紛争解決としての争訟に与える影響を研究した。研究の中心的課題である建築許可・手続における考慮事項について、緩和・迅速化の立法はいずれもその縮減を図っている。即ち、建築秩序法領域における技術的な規定への適合性に係る建築監督行政庁による審査が許可手続から外され、それに対応して、建築許可の法効力の一つである確認的効力の及ぶ客観的範囲も限定されている。しかし、隣人保護規範性を有する規範に顕著であるが、相隣関係の調整をする機能を有する規範への適合性の審査が許可手続から外される場合には、それを代替する私人による審査が慎重に構成される必要がある。また、相隣関係を調整する規範で裁量判断を含むものへの適合性が建築監督行政庁によって審査されないことは、建築物の適法性の判断に係る責任を建築主に過剰に負わせることになる。相隣法への影響として、確認的効力の及ぶ客観的範囲の限定の結果、公法上の救済手段として許可取消訴訟に代わって建築中止命令・除却命令等の発令を求める義務づけ訴訟が必要になるが、後者における行政裁量の存在の結果として、公法上の救済が従前より困難になる。それを解決するために除却命令等の事後介入に際しての行政裁量の裁判的統制や収縮が問題になっている。なお、建設法典31条・34条に示される建設計画法上の建築物の許容性の要件について今年度十分に検討できなかった部分は次年度に行う。昨年に引き続き、土地利用秩序の個別的な実現手段である建築許可・その手続について研究を進めたが、特に、建築監督手続の緩和・迅速化の立法傾向の下での建築監督行政庁の各種の活動に係る裁量及び民間化への限界に焦点を当てた。建築監督行政庁は鑑定機関の鑑定を求め得るが、この裁量的授権の行使は、建築監督行政庁に固有の人員による迅速な判断の可能性や鑑定機関に活用に伴う費用負担により限界が引かれる。相隣法への影響として、事前監督手続の緩和が事後監督の緩和をも意味するかという問題があり、近時、「意図された裁量」という概念がドイツで説かれている。法律により一定の決定を行うことが通常事例として意図されており、例外事例に限りその逸脱が許されるという。しかし、裁量行使の本質が具体・個別の利益状況における衡量にあるから、裁量行使の指針である法律の規範内容の実現・貫徹の強化を理由にする裁量行使の一般的な抑制は妥当でない。建設法典2004年改正法により大親模小売商業施設に対する建設計画法が変化した。「国土整備の目標」は、従来の通説によれば、広域的な国家による計画でありゲマインデの計画高権に属さず、ゲマインデはこれを自らの権利を根拠づけるものとして援用できなかったが、2条2項の改正によりゲマインデによる援用が可能とされた。34条3項の改正は連担建設地域における大規模小売商業施設の個別具体の許容性についてかかる施設の「遠隔効果(Fernwirkung)」の審査を明文化した。理論的には国土整備における中心地構想の建設管理計画と個別具体段階の許可における考慮のあり方が、また実践上は相隣法類似の第三者保護性の程度や遠隔効果の審査に係るコスト等の負担が問題になっている。

第一に、大規模小売商業施設の設置に関して改正された建設法典2条2項や34条を検討した。国土整備の目標は伝統的には自治体の権利を設定しないとされてきたが、隣接ゲマインデに対して衡量原則に比して法的により強固な法的地位を設定する考え方が一部の判例に取り入れられ、計画による克服の原則と同様に、計画裁量の統制の多様化を導いている。具体の建築許可手続(34条による場合)において自治体の行政能力の限界に鑑みる見解があり、2条2項改正と相俟って土地利用の抑制的方向での規制が強化されている。第二に、土地利用秩序の個別的な実現手段である建築許可手続における裁量の民間化・手続簡素化の中での変容を公私協働論に焦点を当てて検討した。行政手続法改正論議では公私協働に相応しい手法に対する法的規律が今日的な課題となっているからである。即ち、一方で、法治主義的観点からの結合禁止法理による私人への不当な負担の抑制、他方で「違法=無効」という枠組みやその背後にある公行政遂行に際しての私益への不信感が従来見られたが、公私協働を進めるべく行政主体・私人に手続上の責務・義務を課す方向の提案が見られる。また、公私協働が癒着に陥ることを防ぐために行政契約の場合でも第三者の法的地位が、行政主体の負い続ける保証的責任を具体化すべく情報権や契約不履行時の介入権が従来以上に強調されている。公私協働契約に対する法的規律は、利害の輻輳する状況では行政行為手法が用いられる場合にも妥当すると考えられる。第三に、日本法との比較研究として、既成市街地の市街地像を参加手続の中で具体化する点は簡単に触れるに留まった。手続簡素化の流れに関連して、指定検査確認機関の交付した建築確認を周辺住民が争う場合の当該機関の法的地位について検討した。手数料を収入とする私的利益を追求する独立の法主体を審査請求に際して下級行政機関同様の地位に置くことの問題を指摘した。
誘電共鳴を用いた自由電子レ-ザ-の研究

自由電子レ-ザ-の発振波長を短波長化するため、ウィグラ-と電子ビ-ムが相互作用する共振器中にガスを封入すルことを試みている。封入ガスの原子状態の選択により、原子もしくはイオンの遷移と自由電子レ-ザ-放射光が共鳴的に相互作用するよう選択出来ることを明らかにした。共鳴がない場合とある場合との発振波長の相違を電子ビ-ムと放射光との相互作用における共鳴条件から求めた。その結果によると、非共鳴のガス封入では、可視光での発振の場合、数torr以上のガス圧で波長が約1/2となる。しかし、この場合、電子ビ-ムは封入ガスにより散乱され、質が低下する。誘電共鳴を利用すると0.1torr程度のガス圧で波長を1/2以下にする可能性があることを数値解析により明らかにした。パルスパワ-を用いる自由電子レ-ザ-の実験において高出力炭酸ガスレ-ザ-光を電磁波ウィグラ-とする放射光が観測された。この実験で、電子ビ-ムのエネルギ-を変えたとき、連続的に変化するスペクトル成分と、固定された線スペクトルとなる成分が存在することが明らかにされた。通常の自由電子レ-ザ-の共鳴条件を用いると80009000Aの波長となるが、封入ガス(炭素原子)との共鳴により発生するスペクトル線は約5000Aとなっており1/1.61/1.8の短波長化になっていた。この実験デ-タの解析により誘電共鳴が自由電子レ-ザ-の短波長に極めて有効であることが明らかにされた。一般に、誘電共鳴近傍では分散と同時に吸収も伴うため、共鳴相互作用と自由電子レ-ザ-放射の方程式を結合し、その動作解析をおこなった。その結果より、封入ガスの種類と電子ビ-ムエネルギ-の選択についての方策が明らかになった。自由電子レ-ザ-の発振波長を短波長化するため、ウィグラ-と電子ビ-ムが相互作用する共振器中にガスを封入しることを試みている。封入ガスの原子状態の選択により、原子もしくはイオンの遷移と自由電子レ-ザ-放射光が共鳴的に相互作用するよう選択できることを明らかにした。共鳴がない場合とある場合との発振波長の相違を電子ビ-ム放射光との相互作用における共鳴条件から求めた。その結果によると非共鳴のガス封入では、可視光での発振の場合、数torr以上のガス圧で波長が約1/2となる。パルスパワ-を用いる自由電子レ-ザ-の実験において、高出力炭酸ガスレ-ザ-光を電磁波ウィグラ-とする放射光が観測された。通常の自由電子レ-ザ-の共鳴条件を用いると80009000Aの波長となるが、封入ガス(炭素原子)との共鳴により発生するスペクトル線は約5000Aとなっており、1/1.61/1.8の短波長化になっていた。この実験デ-タの解析により、誘電共鳴が自由電子レ-ザ-の短波長に極めて有効であることが明らかにされた。
'地域の文化'に即した生活習慣病予防の保健指導方法-都市部と農村部の比較より-

農村部及び都市部における地域の文化に即した生活習慣病予防の保健指導方法を調査した結果、次の点が共通して得られた。客観的な資料・調査・地域外からの助言や日常業務での住民の語り・実体験等から、歴史・経済活動の影響を受けたり地域を構築していく意識や活動の様子を把握する。それらを話題に上げて指導対象者の生活における有無と変化の様子を把握したり、予防の必要性を判断したり、価値観に結び付けて動機づけていく。1.研究成果の具体的内容千葉県内3町及び群馬県内1町において、61事例の生活習慣病予防の個別保健指導を参加観察した。保健指導後1ヶ月から6ヶ月後に生活習慣もしくは体重・腹囲に改善が見られた事例について、保健指導で保健師が意図した事柄、文化を考慮した保健指導方法を質的帰納的に分析した。その結果、次の知見が得られた。(1)指導対象者本人へ向けられた意図自己の築いてきた生活や親から引き継いだ価値感が生活習慣病の一因となり得ても、それを否定されているのではないという安心感が得られ、変化に伴う痛みに向き合うことができる。(2)指導対象者の家族へ向けた意図家族(親世代・子世代・配偶者)への気遣いを汲み、心理的抵抗や生活への負担が少なく生活習慣を改善できる方法を考えることができる。(3)地域の変化を意図首長の方針や農村部の強い近隣とのつながりを活かして、個の変化を通じた地域全体の価値観・生活習慣の変化を目指し、そのことによりさらにこの生活の充実を目指す。2.意義・重要性農村部の熟練した保健師は、特定保健指導という政策的な取り組みを活用して、高齢者、要介護者、障害者、子どもが一緒に生活している地域全体の健康の底上げを意図していた。個別保健指導をアウトソーシングする自治体が増える中、自治体が政策的に取り組んでいる健康作りなど、ポピュレーションアプローチと表裏一体となった個別援助であることを示し、アウトソーシングをする場合に質の確保ができる。1.研究成果の具体的内容1)調査対象:千葉県内2市において、5名の保健師による生活習慣病予防の個別保健指導を参加観察した。5名とも特定保健指導のみを担当する部署に配属され、母子保健や介護予防等の地区活動は担当していなかった。2)分析方法と対象事例の選定:保健指導後2週間から6ヶ月後に生活習慣もしくは体重・腹囲に改善が見られた事例について、保健指導で保健師が意図した事柄、文化を考慮した保健指導方法を質的帰納的に分析した。また、調査対象保健師5名へ行動変容に成功した事例について保健指導で考慮した地域の文化の把握方法・内容及び指導の留意点を聞き取った。3)分析結果:(1)地域の文化の把握方法:地区活動で把握してきた情報を想起する、指導対象者の話から把握する、指導対象者宅へ訪問する際に観察したり地域の住民の話を聞く、通勤途上や休日に保健師自身が商店を利用して観察したり話を聞く。(2)地域の文化の内容:交通・住環境・治安に合わせた生活、商業・漁業・農業地区毎に共通する生活時間・食生活・価値観、年代や職業に共通する家庭や地域とのつながり、等(3)地域の文化を考慮した保健指導方法・会社員・商業・農業・漁業等、本人や家族の職業に共通する生活を問いかけて現状を把握する。・本人や家族の職業や年代に共通する生活の目標を問いかけて健康管理との優先度を把握する。・本人と家族の生活の目標に結び付けて健康管理を勧める。・職業や年代に共通する生活状況に変更が少ない方法を検討する。・交通・住環境・治安に合わせて安全な運動方法を検討する。2.意義・重要性都市部の保健師は、ハイリスク者を対象とした個別の特定保健指導のみを担当する部署に配属されていたため、従来の保健師活動のように地域に出向くことは少なくなり地域全体を把握することが困難になっていた。そのため、特定保健指導を担当する部署に配属される以前に保健部門で地区活動をしていたころに把握した地域の文化を想起したり、対象者から直接聞きだすこと等が、対象者の生活を把握したり実行可能な方法を検討することに有効だった。保健部門等のポピュレーションアプローチも担当する部署と連携し、相互に地域の文化を共有する場を設けることでハイリスクアプローチとポピュレーションアプローチが有機的に連携し効果的な予防活動を推進できると考える。1.研究成果の具体的内容1)方法(1)日本地域看護学会第13回学術集会ラウンドテーブルで、農村部における5つの先行研究の知見を統合して得られた「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導ガイドライン試案(農村部)」を提示し、16名の参加者より、「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導ガイドライン試案-農村部における研究知見の統合より-」に対する意見を聴取した。

(2)先駆的に地域の文化を考慮した生活習慣病予防に取り組む1町2市で、「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導方法」を調査し、筆者らの農村部における5つの先行研究の知見を統合して得られた「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導ガイドライン試案(農村部)」及び、平成21年度調査により明らかになった「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導方法(都市部)」に照合した。(3)(1)及び(2)で確認した、「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導ガイドライン試案(農村部)」及び「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導方法(都市部)」を比較し、「地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導ガイドライン」及び、農村部と都市部の特徴について検討した。2)分析結果(1)地域の文化を考慮した生活習慣病予防の保健指導方法は、以下の共通する項目と特徴が得られた。〈地域の文化の把握方法〉a客観的な資料・調査・地域外からの助言、b日常業務での住民の語り・実体験、等〈地域の文化の内容〉A歴史・経済活動の影響を受け変化する家庭・労働生活・健康管理とそれらへの価値観等〈地域の文化を考慮した保健指導〉・住民同士や保健師との関係性に合わせて指導を開始する等。(2)農村部・都市部の特徴〈地域の文化の把握方法〉農村部は地域外からの助言が、都市部はキーインフォマントや地元メディアの活用が特徴的だった。〈地域の文化の内容〉農村部は歴史を踏まえてた緩やかな変化、他世代の関係性、保守と変容が、都市部は、多様な職業・家族、流動的で速い変化、地元を作る意識が特徴的だった。〈地域の文化を考慮した保健指導〉農村部は開かれた導入が、都市部は慎重な導入が必要であった。2.意義・重要性生活習慣病予防の指導方法は様々な方法が開発されているが、対象者の価値観や社会規範へ働きかける者は少ない。地域の文化に影響を受けて育まれる生活習慣や価値観・規範を把握して指導に生かす方法は、個人の行動変容のみならず地域全体の変化をもたらすと考える。
造血系転写因子によるマスト細胞分化決定機構の解明

本研究は、血球系転写因子によるマスト細胞の分化制御機構を解明することを目的としている。前年度は、条件付Gata1ノックアウトマウスを用いた解析により、GATA1は分化したマスト細胞の形質維持に必須ではないことを明らかにした。一方、マウス骨髄マスト細胞(BMMC)では細胞分化とともにGATA2の発現が増加することから、GATA1の機能欠失をGATA2が代償している可能性が考えられた。今年度は、この可能性を検証するために更に解析を進めた。野生型BMMCを用いたChIP解析では、保存されたGATA配列を有するマスト細胞特異的な遺伝子のプロモーター領域に、GATA1とGATA2の両方が結合していた。また、siRNAでGATA2の発現を抑制すると、GATA2を正常に発現している細胞では見られなかった、GATA1欠失によるマスト細胞特異的な遺伝子発現の低下が観察された。さらに、GATA2のDNA結合ドメインを誘導的に欠失するマウスからBMMCを作成し、GATA2の機能欠失解析を行ったところ、BMMCは、GATA2の機能欠失によりマスト細胞のマーカーであるc-KitとFceRIaの発現を消失し、未熟な骨髄球系細胞に特徴的なGr1やMac1を発現する細胞へと系列転換した。細胞の形態も明らかに変化し、マスト細胞に特徴的な顆粒が失われていた。GATA2機能欠失BMMCでは、GATA1の発現増加はみられず、Scl、PU.1、Runx1などの血球系転写因子の発現も変化しなかったが、野生型BMMCには発現していないC/EBPalphaの発現が著しく増加していた。これらの結果から、GATA2は、GATA1と協調してマスト細胞特異的な遺伝子の発現を制御するのみならず、C/EBPalphaの発現を抑制することにより他の骨髄球系細胞への分化を抑制してマスト細胞の形質を維持していると考えられた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、マスト細胞分化における造血系転写因子の役割を明らかにすることを目的とする。今年度は、マスト細胞に発現する他の転写因子との相互作用がよく知られているGATA1に注目し「条件付Gata1ノックアウトマウス」を用いてGATA1がマスト細胞の形成に必須であるか否かを明らかにする課題に取り組んだ。以前の研究から、GATA1はマスト細胞への分化決定には必須ではないが、その後の成熟・最終分化を制御すると考えられていた。ところが今回Gata1を完全に欠失させたマウスの皮下・腹腔の組織マスト細胞の分布を調べたところ、野生型との相違が観察されなかった。また、このマウスの骨髄細胞をIL-3,SCF存在下で培養したところ、野生型と同様の性状を示す骨髄マスト細胞(BMMC)が得られた。また、野生型BMMCの培養経過を追ってGata1とGata2のmRNA量を定量したところ、GATA2は他のマスト細胞分化マーカーとともにその発現が増加したが、GATA1の発現量は赤血球と比較して低いレベルのまま変化しなかった。赤血球においてGATA1とGATA2は分化段階特異的にお互いの発現を制御することがよく知られているが、BMMCや培養マスト細胞株(RBL-2H3)においてGATA1・GATA2の発現量を変化させても、相互の発現制御を示唆する結果は得られなかった。一方、Gata1ノックアウトマウスの骨髄細胞をメチルセルロースコロニーアッセイで解析したところ、マスト細胞のみから構成される大型のコロニーが多数観察された。これらの結果から、GATA1はマスト細胞前駆細胞の増殖を負に制御している可能性があるが、これまでの報告とは異なり分化したマスト細胞の形質維持には必須ではないことが示唆された。これらの結果から、GATA2は、GATA1と協調してマスト細胞特異的な遺伝子の発現を制御するのみならず、C/

EBPalphaの発現を抑制することにより他の骨髄球系細胞への分化を抑制してマスト細胞の形質を維持していると考えられた。24年度が最終年度であるため、記入しない。マスト細胞でのGATA1の役割について、研究開始前に考えられていたのとは異なる興味深い結果が得られたため。また、その結果に基づいて、申請時には予定していなかったGATA2の機能欠失解析とGATA1/GATA2ダブルノックアウト細胞の解析に着手し、その準備が順調に進んでいるため。マスト細胞でのGATA1の役割については、これまでの報告とは異なる結果が得られているので、実験条件の相違などを十分に考察したうえで、研究発表を行う。また、GATA1欠失により発現量が変化したいくつかの遺伝子について、マスト細胞の生理機能との関連を更に精査する。上述したように、今後は、マスト細胞におけるGATA2の機能欠失解析とGATA1/GATA2ダブルノックアウト細胞の解析を計画している。研究遂行上の問題点は特になく、準備は順調に進んでいる。
Si－3次元フォノニック結晶が熱電特性に与える影響

レーザー照射によりレジスト内に形成する3次元的な干渉パターンを利用して作製する3次元周期的ナノ構造体をレジスト膜内に形成し、それをテンプレートとして液体半導体前駆体を空隙に充填したあとレジストテンプレートを除去することで半導体の3次元周期的ナノ構造体の形成を実施する。充填する液体材料として、ZnO及びシリコンを利用した。液体半導体前駆体を充填後、レジストテンプレートを除去する際、これまで利用していたレジストSU-8は、400度以上の熱処理が必要となっていた。この熱処理により、充填した半導体の結晶性等の変化が懸念されたことから、高温熱処理ではなく、溶液による低温プロセスでレジストを除去する手法を開発した。SU-8と同じネガ型レジストであるKMPRを用いて、SU-8と同様のプロセスで3次元周期的ナノ構造の形成を試みた。KMPRの粘度調整、プリベーク温度・時間、レーザー照射時間、ポストベーク温度・時間、現像時間を調整することで、SU-8と同様な3次元周期的ナノ構造をレジスト内に作製することに成功した。縦方向の空隙間隔となるTalbot距離は、レジストの屈折率により変わるが、観察された差が、SU-8およびKMPRの屈折率の差と一致していることも判明し、理論的にも適切に形成できていることが確認された。更に、KMPRを溶液処理による除去だけでなく熱処理によっても除去できることも確認し、除去処理後の残留物質がSU-8よりも少ないことを確認した。これにより、様々な液体前駆体から作る半導体に対して3次元周期的ナノ構造の形成が検討できるようになった。液体材料の導入後のレジスト除去熱処理により、導入した半導体の結晶性が制御できなくなる懸念があったが、本検討により半導体の結晶性や電気的特性制御がより容易になり、今後充填するZnOやSiの熱電特性への影響をより詳細に検討できるようになった。Siの充填プロセスの改良も進んた。前年度は綺麗にレジスト内の空隙に液体Siを導入することができていなかったが、脱泡処理の導入によりレジスト内の空隙に液体Siを導入することが可能となった。ZnOやSiによる3次元周期的ナノ構造体の形成を進める。ZnOやSiの液体前駆体の充填プロセスを早急に確立し、その熱伝導率、電気導電率の計測を行う。試料面積もこれら計測を行うのに必要な2×2cm角程度のものが用意できるようになっている。これにより、本研究の目的である、周期的ナノ構造が熱電特性に与える影響を明らかにすることができる。ZnOの前駆体をスピンコートでテンプレート上に塗布し、脱泡処理を複数回繰り返し、その後、410度で焼成することで、ZnOの固化及びテンプレートであるSU-8の除去を実施した。プロセス最適化の結果、円筒型ZnO(縦500nm、横200nm、シェル厚み80nm)の3次元周期的ナノ構造体が形成できることが明らかとなった。また、410度焼成プロセスでSU-8は十分除去できることが分かった。テンプレートのナノ構造体サイズ分布と、ZnOを充填しテンプレートを除去したZnO-3次元周期的ナノ構造体のサイズ分布を比較したところ、約16%の収縮が縦横均等に発生していることが判明した。液体シリコンにおいては、本材料での薄膜形成に利用されるLiquid vapor deposition法を用いて充填を試みた。400度で成膜する必要があるため、レジストであるSU-8が変形してしまい、レジスト内に形成したナノ構造体が崩れ、ナノ構造体内へのシリコン材料の充填が困難であることが判明した。その後、液体シリコンをテンプレートに直接滴下し、400度で焼成したところ部分的ではあるがナノ構造体へのシリコン充填が確認され、本手法の更なる最適化によりナノ構造体へのシリコン充填可能性が示唆された。ZnOによる3次元周期的ナノ構造体は実現している。作製したナノ構造体のサイズ分布解析も行い、テンプレートから約16%収縮していることが判明するなど、本プロセスの特徴も抽出できている。液体シリコンを利用したプロセスにおいても部分的にではあるがテンプレートへの充填が確認されており、今後のプロセス改良でシリコンでの3次元周期的ナノ構造体の形成も実現できると思われる。