hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
翻訳後修飾酵素による拮抗したジベレリン信号伝達制御

GAは、DELLAの分解を介して、GAF1複合体をアクチベーターからリプレッサーに変換することで、標的遺伝子の発現を調節している。本研究課題において、植物体内におけるGAF1の翻訳後修飾の有無を検討するため、mycタグを付加したGAF1タンパク質発現する形質転換植物を作製した。myc抗体を用いたウェスタンブロット解析、Phos-tagゲルを用いた解析などより、特定のバンドシフトが検出されることからGAF1タンパク質が植物体内でリン酸化修飾を受けている可能性が示された。GAF1内のリン酸化予想部位に変異を導入した変異型GAF1を発現する形質転換植物を作製し、リン酸化の有無を検証した。詳細なアミノ酸置換の解析より、GAF1タンパク質はリン酸化されること、リン酸化部位が複数存在することを明らかにした。さらに、GAF1に結合する新たな因子を同定した。新たな相互作用因子は、DELLA-GAF1の転写活性化に対し促進的な影響を示すことが明らかになった。これらの因子の結合部位や、どのようにして、DELLA-GAF1の転写活性化能への影響を検証している。GAF1内に存在する、リン酸化予想部位にアミノ酸置換を導入しリン酸化部位を同定した。その結果、GAF1のリン酸化部位は複数存在することが明らかとなった。また、新たな相互作用因子の機能を調べる為、DELLA-GAF1の転写活性化能に着目して解析を行ったところ新たな相互作用因子によりDELLA-GAF1の転写活性化能が強くなることが明らかとなった。同定したGAF1のリン酸化修飾部位に変異を導入し、リン酸化されない変異型GAF1及び、リン酸化を模した変異型GAF1を発現する形質転換体を作製し、GAF1のリン酸化修飾部位の生理学的意義を検証する。また、GAF1複合体はコアクチベーターであるDELLAタンパク質、コリプレッサーであるTPRと相互作用し、その機能がGAにより変換されることを明らかにしてきたが、新たに同定した相互作用因子の結合がDELLA-GAF1複合体に及ぼす影響を検証する。新たな相互作用因子を導入することによって、DELLA-GAF1の転写活性化能が増大する原因として、新しい因子自体が強い転写活性化能を有している可能性や、DELLA-GAF1の相互作用を促進する可能性などが考えられる。相互作用因子が、どのようにしてDELLA-GAF1の転写活性化能を強化できるのかを検証する。また、同定したGAF1のリン酸化修飾部位に変異を導入し、リン酸化されない変異型GAF1及び、リン酸化を模した変異型GAF1を発現する形質転換体を作製し、GAF1のリン酸化修飾部位の生理学的意義を検証する。本年度は、当該年度の所用額をほぼ予定通り使用した。約2万円の未使用分は、相当額の購入予定の試薬等が無かったため次年度の物品費として使用予定。H31年度は、申請者は、大学院生とともに研究を進める。
マイクロバイオームを用いた遷延性難治性皮膚潰瘍に対する新規治療法の開発

ヒト角化細胞に対して直前に表皮ブドウ球菌を添加した後に黄色ブドウ球菌で刺激したところ、炎症性サイトカインの産生が抑制された。マウスの耳介に死菌による皮下膿瘍を作製したところ、黄色ブドウ球菌による皮下膿瘍では膿瘍内の炎症細胞の細胞質内に核内タンパクの一つであるHigh Mobility Group Box 1(以下HMGB1)が強陽性発現していたのに対し、表皮ブドウ球菌による皮下膿瘍では発現がみられなかった。dsRNAであるpoly(I:C)を用いてヒHMGB1の還元型であるreduced-HMGB1を前投与することで、poly(I:C)による炎症誘導効果を抑制することが明らかとなった。1.正常角化細胞の単層培養細胞に対する創傷治癒モデルの検討を行った。培養細胞がサブコンフルエントの状態でscraperでdish中央部に1cm幅の細胞剥離を作成して創傷治癒モデルとし、これに表皮ブドウ球菌(死菌)、黄色ブドウ球菌(死菌)、LTA、LPS、抗菌ペプチドであるLL37を添加して、培養細胞の修復(剥離した部分への移動)を経時的に観察するとともに、細胞内外の炎症性サイトカインの動きをqRT-PCR、ELISAにより解析を行った。その結果、黄色ブドウ球菌刺激による炎症性サイトカインの誘導が、常在菌である表皮ブドウ球菌におり抑制がみられた。表皮ブドウ球菌はds-RNAがTLR3を介した炎症を抑える働きがあるとの報告もあり、生菌や他の刺激物質を用いてさらなる検討を行う予定。また、この創傷治癒モデルにおける細胞遊走能に関しては、核内タンパクであるHMGB1の重要性が多方面から報告されており、我々も他のサイトカインと同様HMGB1の解析を行ったところ、角化細胞においてもさまざまな刺激によりHMGB1が細胞外に放出されることを確認した。2.三次元培養表皮(LSE)による創傷治癒モデルの検討培養細胞の結果をうけて、まずはLSEの正常の状態における表皮ブドウ球菌(死菌)、黄色ブドウ球菌、LTA、LPSによる炎症性サイトカインの解析を行ったところ、単層培養表皮で得られたような炎症性サイトカインの動きはみられなかった。これはLSEではより正常に近い表皮の構築があるため、特に角層の存在により刺激が回避されている可能性がある。現在三次元培養表の創傷治癒モデルを作成し、同様な刺激実験を行っている。正常角化細胞に対する検討は予定通り進行し、一定の評価を得た。現在それを踏まえて三次元培養表皮にたいする刺激実験を継続しており、当初の予定通り次年度にかけてLSEに対する詳細な解析を行っていく予定。単層培養細胞の創傷治癒モデルにおいてHMGB1が深く関連することが示唆されたため、今後さらに角化細胞におけるHMGB1の役割についても検討していく。本研究では、遷延性皮膚潰瘍における病原菌叢をいかにコントロールするかという点に着目し、既存の抗菌物質ではなく、皮膚の常在菌(片利共生生物)と抗菌ペプチド群による相乗効果を用いて、病原菌増殖抑制効果と抗炎症効果の両者を保持した遷延性(難治性)皮膚潰瘍に対する新規局所療法の開発を試みる。本年度は単層表皮細胞と三次元培養皮膚を用いて、皮膚常在菌である表皮ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌などが惹起する炎症性サイトカインの誘導を抑制することが明らかとなった。これに抗菌ペプチドであるCathelicidinを組み合わせたレシピを作成し、マウスの背部に作成した炎症モデルや創傷遅延モデルに対して塗布実験を行った。また創傷治癒遅延モデルにおいて、破壊または壊死した細胞から流出する核内タンパクであるHMGB1が、他の炎症性サイトカインやDNAまたはRNAなどと結合してさらに炎症性サイトカインを誘導することが明らかとなり、またこのHMGB1由来のABoxが抗HMGB1効果をもつことから、その抗炎症効果により創傷治癒モデルにおける炎症性サイトカインのコントロールを試みている。また、上記の局所療法に加えて過剰な炎症反応を抑制することでさらなる創傷促進モデルの作成を試みている。今後の研究課題として抗菌ペプタイドと表皮ブドウ球菌由来のLTAとの組み合わせの軟膏のレシピを開発し、その毒性について検討することと、Aboxとの組み合わせで新しい局所治療の開発を行う。正常人角化細胞を用いた単層培養細胞、三次元培養表皮(Living skin equivalent; LSEにおける創傷遅延効果並びに遅延回復効果の実験を継続した。Toll like receptor 2(TLR2)のLigandである表皮ブドウ球菌死菌、黄色ブドウ球菌死菌、D-アラニン含有LTA、抗菌ペプチドを組み合わせたもので刺激し、反応後の単層培養細胞およびLSEを回収し、凍結標本を作製後、HE染色にて細胞組織形態を観察した。さらに、proinflammatory cytokineであるIL-8, IL-6, IL-1β, TNF-α, IFNβ、IL-33などの免疫組織化学染色を行ったところ、皮膚常在菌である表皮ブドウ球菌死菌がpoly(I:C)により誘導された炎症性サイトカインを抑制し、さらにLL37との組み合わせにより創傷治癒を促進すると考えられた。次にマウスモデルにおいて、スコッチテープでマウス背部表皮の角層を除去し、上記刺激物質を塗布する実験でも同様に表皮ブドウ球菌死菌が炎症性サイトカインの誘導を抑制することを確認した。

次にマウス背部皮膚に5mmの皮膚潰瘍を作り、そこに黄色ブドウ球菌を添加したのち、遷延治癒改善因子(表皮ブドウ球菌死菌、D-アラニン含有LTA、LPS)を添加した外用剤を作成し、これを塗布、経時的なphenotypeの変化を観察したところ、36時間の時点で表皮ブドウ球菌死菌群に若干の改善がみられた。単層培養細胞より得られたレシピでは単層培養細胞ではll37の濃度は5uMを越えると細胞毒性がみられた)から表皮ブドウ球威筋死菌と抗菌ペプチドを組み合わせた軟膏を作り、相乗的な創傷治癒促進効果が得られるかどうか検証したところ、現時点では明らかなphenotypeの変化は認めていない。ヒト角化細胞に対して黄色ブドウ球菌の死菌で刺激実験を行ったところ、IFNβ、ILー1βなどの各種炎症性サイトカインの産生がみられたが、直前に表皮ブドウ球菌による刺激を行ったところ、黄色ブドウ球菌による炎症性サイトカインの産生が抑制された。次にマウスの耳介に死菌による皮下膿瘍を作製したところ、黄色ブドウ球菌による皮下膿瘍では膿瘍内の炎症細胞の細胞質内に核内タンパクの一つであるHigh Mobility Group Box 1(以下HMGB1)が強陽性発現していたのに対し、表皮ブドウ球菌による皮下膿瘍では発現がみられなかった。この結果から表皮ブドウ球菌はHMGB1の細胞内および細胞外への誘導を抑制することで炎症反応を抑制すると推測し、HMGB1を用いた抗炎症効果の実験を行った。細菌膜タンパクの一種であるLTAやLPS,およびdsRNAであるpoly(I:C)を用いてヒト角化細胞に炎症性サイトカインを誘導させ、細胞外からHMGB1が炎症作用に対してどのように反応するか調べたところ、HMGB1の還元型であるreduced-HMGB1を前投与することで、poly(I:C)による炎症誘導効果を抑制することが明らかとなった。また、さらにpoly(I:C)の細胞内シグナル系においては、NF-kB経路とIRF3経路を抑制しており、MAPK経路は抑制されていなかった。HMGB1は細胞外に放出されると容易に酸化されてDisulfide-HMGB1に変化するとされるが、このDisulfide-HMGB1を用いて同様の実験を行ったところ、抑制効果はみられず、むしろ炎症効果を増幅する作用がみられた。以上のことからHMGB1はその酸化還元型により、角化細胞における炎症反応に対して抑制効果および増幅効果を持つことが明らかとなった。ヒト角化細胞に対して直前に表皮ブドウ球菌を添加した後に黄色ブドウ球菌で刺激したところ、炎症性サイトカインの産生が抑制された。マウスの耳介に死菌による皮下膿瘍を作製したところ、黄色ブドウ球菌による皮下膿瘍では膿瘍内の炎症細胞の細胞質内に核内タンパクの一つであるHigh Mobility Group Box 1(以下HMGB1)が強陽性発現していたのに対し、表皮ブドウ球菌による皮下膿瘍では発現がみられなかった。dsRNAであるpoly(I:C)を用いてヒHMGB1の還元型であるreduced-HMGB1を前投与することで、poly(I:C)による炎症誘導効果を抑制することが明らかとなった。1.HMGB1を中心としたサイトカインの細胞内外の動きを、細胞免疫染色や3D超解像度顕微鏡システムを用いて解析してく。2.LSEの創傷治癒モデルの作成と、より正常に近い早朝治癒過程におけるサイトカインの動きを検証する。3.ノックアウト
ヘムオキシゲナーゼの動脈硬化進展抑制の機序の解明

血管壁で内因的に誘導されるHO-1が動脈硬化形成を抑制する作用があることをLDLレセプターノックアウトマウスモデルおよびWatanabe高脂血症ウサギを用いて明らかにし、各々、Circulation誌およびCirculation Research誌に報告した。正常血管においてはHO-1の発現は全く認められなかったが、高コレステロール食負荷後に形成された動脈硬化血管でHO-1が著明に誘導されていた。興味深いことにHO-1局在は酸化LDLと非常に一致しており、生体内でもHO-1が敢化脂質により誘導を受けることを強く示唆する所見と考えられた。HOの阻害により動脈硬化が進展すること、HOの誘導によりこれが抑制されることを観察できた。また、HOの阻害により血中および血管壁での脂質過酸化の促進が観察され、ヘム分解系のHOが抗酸化系としての機能も有していることが判明した。現在までの研究成果については本年度、日本動脈硬化学会および米国心臓学会においても報告した。また、血管内皮において酸化LDLによって誘導されるHO-1の機能を検討したところ、HO-1が催炎症性の遺伝子群を抑制し、内皮型NO合成酵素の発現を保持することなども明らかになってきている。現在、HOノックアウトマウスをApoEおよびLDLレセプター欠損マウスと交配しダブルノックアウトの解析やHO活性を変化させたときの血管壁での遺伝子の変化を網羅的にマイクロアレーによる検討を行っている。HO-1がLDLレセプターノックアウトマウスにおける動脈硬化形成に与える影響を明らかにした(Circulation Research:2001,in press)。LDLレセプターノックアウトマウスに高脂肪食を負荷し動脈硬化巣を形成させた。この間、HO-1の誘導剤としてhemin(H群),hemin+desferrioxamine(HD群)、阻害剤としてSn-protoporphyrin IX(S群)を投与し、コントール群(C群)には生食を投与した。HO-1の発現が動脈硬化巣における血管内皮細胞、マクロファージ、血管平滑筋細胞に認めれられた。これに対し、正常血管にはHO-1の発現は全く認められなかった。高コレステロール食負荷後に形成された動脈硬化巣においてHO阻害群ではHO誘導群に比較し有意に大きな動脈硬化巣が形成された。HO-1の阻害により血中脂質過酸化の促進が観察された。これらの結果は実際にHO-1が内因的な抗動脈硬化因子として働いている可能性をin vivoで初めて示唆したものである。現在、HO-1の抗動脈硬化作用の分子機序の解析、HOおよびLDL-レセプターダブルノックアウトマウスの動脈硬化への影響の解析を進めている。現在までの研究成果についてはHOと動脈硬化というテーマで欧州心臓病会議や国際ポルフィリンシンポジウムにて公表し後者の内容に関しては総説がPorphyrins誌に掲載の予定である。興味深いことにHO-1局在は酸化LDLと非常に一致しており、生体内でもHO-1が酸化脂質により誘導を受けることを強く示唆する所見と考えられた。現在までの研究成果については本年度、日本動脈硬化学会および米国心臓学会において報告した。

現在、HOノックアウトマウスをApoEおよびLDLレセプター欠損マウスと交配しダブルノックアウトの解析やHO活性を変化させたときの血管壁での遺伝子の変化を網羅的にマイクロアレーによる検討を行っている。
看護師を対象とした地域連携研修デザインのためのアクションリサーチ

中山間地域では、地域住民、病院看護管理職、セラピスト、特別養護老人ホーム看護師、研究者の計16名(メンバーの途中辞退により当初より人数減)で、地域連携研修プログラムの開発から、研修の実施・評価までを行った。プログラムは「コミュニティを学ぶ」「地域資源を学ぶ」「院内連携を学ぶ」で構成し、病院若手看護師7名を対象に実施した。プログラム評価は、1本プログラムをより効果的なものに改善・発展するための形成的評価、2プログラムのメリット・価値を評価する総括的評価、3アウトカム評価およびロッシの5段階評価を用いた総合的な評価の3側面から実施した。また、CBPRのプロセスを、1「高齢者のその人らしい暮らし」に対する思いは変容するか、2地域包括ケアシステム構築の実現に向けて集団の意識やつながりは変容するかという2点に対して、参加者である看護管理職のエンパワーメントの視点から分析を行った。看護管理職は、住民や共に働く専門職との協働実践の中で、人々の暮らしを支える看護とは何かを問われ、自らに問い、表現を試みた。その豊かな臨床経験と看護への真摯な思いは、そこに関わる人々を巻き込み、意識変容をもたした。このような相互作用から得られた経験は、看護管理職のエンパワーメントを高め、病院看護の役割拡大に向けた活動へと進展する。都市部B市では、地域包括支援センター保健師、訪問看護師、病院看護師、特別養護老人ホーム事務長、研究者の6名で地域の課題を明確にするための活動を行った。そして、メンバーと共に学会発表を行った(「看護師を対象とした地域連携研修デザインプロジェクトCBPRの実践報告」第59回日本社会医学会総会)。本研究は、地域住民と看護管理職、地域で活動する専門職、研究者が対話を重ねてデザインする「地域連携研修プログラム」及び、地域連携研修プログラムをデザインするプロセスそのものを成果物としている、兵庫県A町においては、地域連携研修プログラムの開発・実施・評価という一連の流れを通して得られたデータを2つの視点から分析を終えている。具体的には、第1の分析は、アウトカム評価として協働してデザインした地域連携研修の評価、第2の日分析としてプロセス評価は、2つの問いを掲げて個並びに集団(コミュニティ)の分析である。都市部B市の活動については、地域連携における課題を明確にするための活動を行い、課題を共有することが出来た。現在は、そのデータの整理を行っている。2地区の活動を分析するとともに、2地区の比較から、1当該研究領域に関するCBPRの課題の明確化、2地域連携研修プログラムデザインにおけるCBPRの有用性を明らかにすることを試みる。また、この2地域での比較を行いながら、「地域における協働・連携活動におけるリーダーシップ」についての概念整理を行う予定にしている。今年度は、CBPRの第1段階である地域連携研修プログラム開発に取り組んだ。プログラム作成は、中山間地域と都市部の2地域で実施中。中山間地域での成果は次の通りである。メンバーは、住民、看護師、理学療法士・作業療法士の計22名で構成される。まず初めに、マインドマップを用いて地域の課題を明確にした。次に、地域の課題であり目標となる「地域リハビリテーション」をキーコンセプトに、地域連携研修の開発に取り組んだ(第58回日本社会医学会総会にて報告)。開発された研修は、地域中核病院看護部の院内教育プログラムに組み込み、平成30年度9月に実施予定である。また、メンバーに住民が加わりディスカッションすることで、「自分の健康は自分で守る思いが大切」と住民が運動教室を開催していること、「コミュニティ活動の地域格差」など、病院の中では見えない地域の現状を共有することができた。今後、住民と共に実施する効果を明らかにしていきたい。CBPRとは参加型アクションリサーチであり、その実践の仕方によって、結果が大きく変わる可能性がある。中山間地域でのアクションから得れたCBPR実践への課題をふまえ、都市部で研究組織を立ち上げた。都市部ではACPをキーコンセプトに、地域連携研修をデザインしていく。2地域での実践は、地域の実情に合わせた地域連携研修への示唆、さらに、我が国におけるCBPR実践についての特徴を示すことができると考える。視察:先駆的な取り組みとして、京都府綾部市コミュニティナースの視察をおこなった。この視察は、中山間地域と都市部との合同開催とし、コミュニティ活動に関する情報交換の機会を提供した。2017年2018年は、研究チームを組織し、地域連携研修プログラムデザインを計画で上げている。中山間地域では、概ね研修プログラムの開発を終えている。当初は1地域での実施を計画していたが、地域と話し合いを重ね、都市部でも開催することとした。都市部は2017年11月に研究チームを組織したため、本研究計画からは若干遅れた進度となっている。日本文化における看護師リーダーシップの概念分析は、平成30年度に実施する。

また、CBPRのプロセスを、1「高齢者のその人らしい暮らし」に対する思いは変容するか、2地域包括ケアシステム構築の実現に向けて集団の意識やつながりは変容するかという2点に対して、参加者である看護管理職のエンパワーメントの視点から分析を行った。看護管理職は、住民や共に働く専門職との協働実践の中で、人々の暮らしを支える看護とは何かを問われ、自らに問い、表現を試みた。その豊かな臨床経験と看護への真摯な思いは、そこに関わる人々を巻き込み、意識変容をもたした。このような相互作用から得られた経験は、看護管理職のエンパワーメントを高め、病院看護の役割拡大に向けた活動へと進展する。都市部B市では、地域包括支援センター保健師、訪問看護師、病院看護師、特別養護老人ホーム事務長、研究者の6名で地域の課題を明確にするための活動を行った。そして、メンバーと共に学会発表を行った(「看護師を対象とした地域連携研修デザインプロジェクトCBPRの実践報告」第59回日本社会医学会総会)。本研究は、地域住民と看護管理職、地域で活動する専門職、研究者が対話を重ねてデザインする「地域連携研修プログラム」及び、地域連携研修プログラムをデザインするプロセスそのものを成果物としている、兵庫県A町においては、地域連携研修プログラムの開発・実施・評価という一連の流れを通して得られたデータを2つの視点から分析を終えている。具体的には、第1の分析は、アウトカム評価として協働してデザインした地域連携研修の評価、第2の日分析としてプロセス評価は、2つの問いを掲げて個並びに集団(コミュニティ)の分析である。都市部B市の活動については、地域連携における課題を明確にするための活動を行い、課題を共有することが出来た。現在は、そのデータの整理を行っている。(1)中山間地域での地域連携研修の実施・評価:若手の病院看護師を対象とした研修を実施する。メンバーはマネジメント研修講師、評価を担う。今後は、行政や他の専門職も巻き込み、コミュニティの醸成を図る予定にしている。(2)都市部での地域連携研修プログラム開発:ACPをキーコンセプトに研修をデザインする。住民・専門職がACPについて本音で語り合うために、まず、コミュニケーションの視点から環境を整えるていく。(3)社会への発信:メンバーと共に社会への報告を行う。中山間地域・都市部共に、メンバー全員で学会報告を行う事は、日程調整を含め、かなり難しいと予測される。そこで、中山間地域、都市部、および2017年度に実施した京都府綾部市のコミュニティナースの3者での交流会を検討する。2地区の活動を分析するとともに、2地区の比較から、1当該研究領域に関するCBPRの課題の明確化、2地域連携研修プログラムデザインにおけるCBPRの有用性を明らかにすることを試みる。また、この2地域での比較を行いながら、「地域における協働・連携活動におけるリーダーシップ」についての概念整理を行う予定にしている。研究メンバーの意向により、2018年度は交流会を開催する予定にしている。
多国籍企業の知識吸収能力と海外子会社の知識吸収能力の対応関係についての比較研究

平成15年までの研究活動を通じて、収集したデータ、および、中間の研究報告通じて行った議論から得られた知見に基づいて、平成16年11月に関西学院大学で行われた国際ビジネス研究学会において、「多国籍企業の知識移転における移転能力と吸収能力の関係について」というタイトルで、研究報告を行った。加えて、12月にスロベニアのリブリュアナ大学で行われたヨーロッパ国際ビジネス研究学会(EIBA)のポスターセッションにおいて研究報告を行った。報告のタイトルは、"A strategy for the knowledgefrom Japanese multinational enterprises toUK manufacturing subsidiaries"であり、どうタイトルで、そのフルペーパーが学会のCD=ROMに収録されている。同報告は、EIBAの2004年度のBest Poster Prizeを受賞した。14年度・15年度に行った質問票による郵送調査(「在英日系製造業企業に関する調査」および、「在日外資系製造業企業に関する調査」)から得られたデータに基づいて、上記の報告は行われた。これらの調査においては,まず、親会社の移転能力と海外子会社の吸収能力を調査データから抽出した。移転能力は3因子、吸収能力は5因子が抽出された。抽出された各因子と移転の結果についての相関関係を求めた。この結果としては、「生産技術」および、「モデルチェンジに伴った知識」の移転に関しては、マザー工場・海外工場の移転能力と吸収能力がともに機能し、移転が実現される。その一方で、「開発技術」、「個々の従業員の個人的なスキルアップ」や「企業文化」の移転においては、海外工場の吸収能力が、マザー工場の移転能力よりも重要になることが明らかになった。当該研究課題を実施するために、「海外技術移転活動に関する調査票」を作成した。この調査票は、海外子会社の視点から国際技術移転の様子や本国の親会社との関係について質問したものである。質問項目としては、「当該工場の技術移転に対する態度」「本国工場の名称」「本国工場のサポート体制」「当該工場の現在の実力」「当該工場の従業員の到達水準」「本国工場から派遣される従業員の水準」「技術移転の成果」「当該工場の到達度」「当該工場の権限」「移転される技術の水準」そして、「当該工場の財務状態」である。次に、この「海外技術移転活動に関する調査票」を英語に翻訳した。この日本語版の調査票と英語版の調査票を、同時に、在英日系企業のうち、英国で製造活動を行っている企業、200社に対して、送付した。うち、54社から有効な回答を受け取った。この調査票の各項目は、統計処理が可能な形で記入できるようになっており、現在、データの入力を行い、統計処理を進めている。いくつかのワークショップに出向き、この調査結果を報告し、国際経営分野やテクノロジーマネジメントの専門家と意見交換をし、データの解釈について議論を行った。また、この調査に対応する形で、比較研究を可能にするために、同じ調査票を用いて、日本において工場を所有する外資系企業408社に送付するための準備をしている。質問票の準備、封筒の準備、返信用封筒の準備を終え、4月後半に質問票を各企業宛に送付する予定にしている。今後の予定としては、4月後半に質問票を郵送し、6月中に質問票の回収を終える予定である。8月中に、データの集計を行い、結果の報告を11月に多国籍企業研究会において報告することが決まっており、12月のヨーロッパ国際経営学会での報告にも、アプライする予定である。平成14年度に、イギリスにおいて、日系製造業子会社に対する質問表による調査を行った。平成15年度は、これを受けて、日本において、外資系製造業企業に対する質問表調査を行った。これら二つの調査結果を多国籍企業研究会西部部会において報告し、他の多国籍企業の研究者との意見交換を行った。平成15年度の活動の詳細は次のとおりである。5月に、日本において製造活動をしていると目される外資系製造業企業548社に、郵送で質問表を送付した。このうち、79社、14.4%から回答を得た。平成14年度の調査であられた59社のサンプルと、15年度の調査で得たサンプルから、日系外資系企業と、在日外資系企業という2つのサンプル群を得た。この二つのサンプル群の比較分析を中心に統計分析をおこなった。統計分析の結果、在英日系企業が、在日外資系企業と比較して、形式知化されていない知識、もしくは、形式知化が難しい知識を移転していることが明らかになった。また、日系企業のほうが、マザー工場の機能を積極的に活用し、マザー工場から派遣されている人材において暗黙知を多く所有するタイプの従業員を海外工場に派遣する傾向が強いことが明らかになった。この統計分析の成果を、多国籍企業研究会の西部部会において、報告し、多国籍企業の研究者と議論した。研究会の議論では、日系企業と外資系企業の工場技術水準の違いが問題となった。つまり、海外工場の技術水準が上がれば、マザー工場からの技術移転が少なくなるのではないかという課題が見えてきた。同時に、本社が海外工場に課す戦略的意味合いの違いが、二つのサンプル群の値の違いを生じさせているのではないかという指摘も得た。これらの指摘は、今後のデータの再分析の中で活かしていく予定である。最後に、平成16年度については,これら2つの調査から得られたデータを再分析し、調査報告をまとめ、国際学会もしくは海外の学会で報告していく予定である。

平成15年までの研究活動を通じて、収集したデータ、および、中間の研究報告通じて行った議論から得られた知見に基づいて、平成16年11月に関西学院大学で行われた国際ビジネス研究学会において、「多国籍企業の知識移転における移転能力と吸収能力の関係について」というタイトルで、研究報告を行った。加えて、12月にスロベニアのリブリュアナ大学で行われたヨーロッパ国際ビジネス研究学会(EIBA)のポスターセッションにおいて研究報告を行った。報告のタイトルは、"A strategy for the knowledgefrom Japanese multinational enterprises toUK manufacturing subsidiaries"であり、どうタイトルで、そのフルペーパーが学会のCD=ROMに収録されている。同報告は、EIBAの2004年度のBest Poster Prizeを受賞した。14年度・15年度に行った質問票による郵送調査(「在英日系製造業企業に関する調査」および、「在日外資系製造業企業に関する調査」)から得られたデータに基づいて、上記の報告は行われた。これらの調査においては,まず、親会社の移転能力と海外子会社の吸収能力を調査データから抽出した。移転能力は3因子、吸収能力は5因子が抽出された。抽出された各因子と移転の結果についての相関関係を求めた。この結果としては、「生産技術」および、「モデルチェンジに伴った知識」の移転に関しては、マザー工場・海外工場の移転能力と吸収能力がともに機能し、移転が実現される。その一方で、「開発技術」、「個々の従業員の個人的なスキルアップ」や「企業文化」の移転においては、海外工場の吸収能力が、マザー工場の移転能力よりも重要になることが明らかになった。
プロバイオティクス由来抗腫瘍活性物質を応用した新規膵癌治療薬開発の基盤研究

プロバイオティクスはヒトに食経験があり、基礎研究で抗癌作用を発揮することが示唆されていることから安全性の高い癌治療への応用が期待されてきた。しかし、生菌体を用いた場合、菌の培養条件の差や宿主の腸内細菌叢の個体差などのため、臨床的な抗癌作用は証明されていない。本研究では、1難治性癌である膵癌に対する菌由来抗腫瘍活物質を同定し、2菌由来物質を介した新しい癌制御メカニズムを解明することで、新規膵癌治療薬開発へ向けた基盤的成果を得る。
歯科治療時における嘔吐反射を抑制する新しいリラクセーション法の臨床応用

嘔吐反射の緩和に有効な介入方法を検討するため、視覚素材(ビデオ)、聴覚素材(音楽)、触覚素材(経穴とストレスボール)、嗅覚刺激(アロマ)介入時の嘔吐反射指標を測定し、プラセボ群と比較するための予備的研究を行った。被験者6名の予備的研究では、視覚刺激にポジティブ動画とネガティブ動画を用いたが、嘔吐反射評価指標に刺激前後での有意差は認められなかった。聴覚刺激では、被験者の好む音楽を用いたところ、6名中2名で嘔吐反射評価指標にやや変化がみられたものの、他の4名では刺激前後での有意差は認められなかった。一方、触覚刺激(ストレスボール)と嗅覚刺激(アロマ)では、刺激前と比較して刺激後の嘔吐反射評価指標に有意な変化が認められた。また、嘔吐反射に関する質問票として使用するGagging Assessment Scale日本語版の作成と妥当性を検討し、嘔吐反射の自己評価スケールとして使用することとした。当初の研究計画では平成29年度は嘔吐反射の計測方法を確立し、嘔吐反射の緩和に最も有効な介入方法を検証する予定であったが、介入方法に嗅覚刺激と触覚刺激(ストレスボール)を加えることとし、平成30年度はその条件等を予備的研究で検討していたため、本来の計画からやや遅れている。平成31年度は介入の種類と条件を決定し、今まで確立してきた研究方法で被験者を募り計測を行っていく。コントロール、素材による介入、プラセボによる介入、ポジティブコントロールの4群で比較検討し、嘔吐反射への介入効果を評価する。研究結果は国内と海外の学会で発表する。嘔吐反射を軽減する方法とその効果を検証するためには、個別の患者の嘔吐反射を的確かつ客観的に評価することが重要である。平成29年度ではまず嘔吐反射発現の評価指標の信頼性について検討をした。本研究の趣旨を十分に説明し同意を得られた健康な成人21名(男性11名、女性10名)を対象とし、規格化された排唾管を被験者の上顎中切歯部から咽頭部に向け、口蓋に沿わせて徐々に挿入した。被験者が嘔吐感を感じた時点での排唾管の挿入距離を測定し、嘔吐反射評価指標とした。モニタリングとして心拍数(HR)と皮膚電気反応(GSR)の計測を行い、嘔吐反射誘発時の変化を評価した。さらに嘔吐反射発現の程度を定量化するためにVisual Analog Scale(VAS)を用いて嘔吐反射を感じた時の不快感を定量化した。被験者21名に対して1名の測定者が同一条件下で2回の測定を行い測定者内信頼性を級内相関係数(ICC)にて評価し、その結果1回目と2回目のICCは測定者内において高い信頼性が得られた。また被験者21名に対して測定者2名が同一条件下で測定を行い、ICCにて評価し、測定者間においても高い信頼性が得られた。さらに測定値間の相関係数においても測定者間で有意な正の相関がみられたものの、嘔吐反射評価指標とVAS値には有意な相関は認められなかった。一方、測定時のモニタリングではHR、GSRとも嘔吐反射の評価後に有意に増加した。以上よりこの計測方法は嘔吐反射を評価する上で信頼性および再現性の高い方法であることが示された。当初の実験計画では平成29年度は嘔吐反射の計測方法を確立し、嘔吐反射の緩和に最も有効な介入方法を検証する予定であったが、介入のひとつに嗅覚を加えることとし、その条件等を予備実験で検討していたため、本来の計画からやや遅れている。平成30年度は介入のひとつに嗅覚を加え、確立した実験方法で被験者を募り計測を行っていく。得られた結果はコントロール、素材による介入、プラセボによる介入、ポジティブコントロールの4群で比較検討し、嘔吐反射への介入効果を評価する。平成29年度に物品費として計上していたデータ解析システムは、既存のものを使用したため当該年度での支出がなかった。

また、平成29年度では実験で採用する介入の種類の検討をしたので、平成30年度では新たな機器を購入しその介入効果を検討する予定である。さらに実験にあたり協力者への謝金、国内および海外での学会発表に使用する予定である。研究計画が当初予定よりやや遅れているため次年度使用額が生じている。平成31年度では予備的研究の結果を踏まえてデータの収集を進めてゆき、助成金は被験者への謝金および研究成果の発表と論文投稿に使用する予定である。
腰椎変性辷り症の発症要因:女性例におけるエストロゲン受容体遺伝子多型の検討

1996年10月から1997年11月の間に当科ならびに関連施設を受診した女性の腰椎変性すべり症患者47例(3586歳、平均63.1歳)を対象とした。すべりの程度は3mm以上とし股関節に著しい病変を認めるものは除外した。ER遺伝子多型の解析は末梢白血球よりゲノムDNAを抽出、PCRでイントロン1からエクソン2を含むDNA断片を増幅、PCR産物はPvuII、XbaIの2種類の制限酵素でRFLP解析を行った。PvuII、XbaIで切断されない対立遺伝子をそれぞれP、X、切断される対立遺伝子をp、xで示した。ER遺伝子型はPP,Pp,pp,XX,Xx,xx,PPXX,PPXx,PPxx,PpXx,Ppxx,ppxx等の組み合わせで表記する。コントロールとして350名の健常女性(2087歳、平均43.5歳)についても同様に解析を行った。結果は各ER遺伝子型における腰椎変性すべり症のodds比(odds ratio:OR)、95%信頼区間(confidence interval:CI)を計算した。ER遺伝子型PPxxは腰椎変性すべり症の危険因子となる傾向を認めた(OR=2.66,95%CI=0.92-7.69,P=0.071)。近年、ER遺伝子多型とホルモン依存性疾患、変形性関節症、骨粗鬆症との関連が報告されている。腰椎変性すべり症患者に女性が多い理由について、Rosenbergは性周期に伴う腰椎支持靭帯の弛緩が原因でないかと推察している。さらにMatsunagaらは全身関節の弛緩性を調査し、変性すべり症患者の群で対照群より弛緩性が大きかったと報告している。エストロゲンがその病態に関与しER遺伝子多型が腰椎変性すべり症の新しい遺伝子マーカーとなり得る可能性を示唆している。当科で加療した腰椎変性辷り症のなかで女性患者80名を対象とした。コントロールとして健常女性350名に関しても同様の調査を行った。エストロゲン受容体遺伝子多型の解析はKobayashiら(1996)の方法で行った。即ち末梢白血球よりゲノムDNAを抽出、PCRでエストロゲン受容体遺伝子のイントロン1からエクソン2を含むDNA断片を増幅、PCR産物はPvu II,Xba Iの2種類の制限酵素でRFLP解析を行った。Pvu II,Xba Iで切断されない対立遺伝子をそれぞれP,X,切断される対立遺伝子をp,x,で示し、エストロゲン遺伝子型はPP,Pp,pp,XX,Xx,xx,PPXX,PPXx,PPxx.PpXx,Ppxx,ppxx等の組み合わせで表記した。各遺伝子型における腰椎変性辷り症の相対危険度を、ロジスティック回帰モデルを用いて計算した。結果は70才以下の群(n=54)でエストロゲン受容体遺伝子PPxxは腰椎変性すべり症の危険因子となる傾向を認めた(odds ratio 2.79,95% confidence interval 1.03-7.54,p=0.043)。本症の発症機序に関してはいまだ不明な点が多いが諸家の報告を見ると解剖学的な局所形態の異常に注目したものと全身因子の一つとしての性内分泌環境に注目したものなどがある。腰椎変性辷り症患者に女性が多い理由について、Rosenbergは性周期に伴う腰椎支持靭帯の弛緩が原因でないかと推察しており、今田らは閉経、卵巣摘出による女性ホルモンの低下が傍脊柱靭帯や関節包の弛緩を誘発し局所形態因子と重なって変性辷りを呈するのではないかと述べている。今回の結果より女性の腰椎変性すべり症にエストロゲン受容体遺伝子多型が関連する可能性が示された。本研究の内容は第13回日本整形外科学会基礎学術集会および第27回日本脊椎外科学会にて発表した。本年も引き続き腰椎変性辷り症患者のエストロゲン受容体遺伝子多型の調査を続ける予定である。

腰椎変性すべり症患者に女性が多い理由について、Rosenbergは性周期に伴う腰椎支持靭帯の弛緩が原因でないかと推察している。さらにMatsunagaらは全身関節の弛緩性を調査し、変性すべり症患者の群で対照群より弛緩性が大きかったと報告している。エストロゲンがその病態に関与しER遺伝子多型が腰椎変性すべり症の新しい遺伝子マーカーとなり得る可能性を示唆している。
新規ワクチン戦略のための長寿命型抗体産生細胞の誘導法の開発

これまで長期生存型抗体産生細胞の形成過程におけるI型IFNシグナルの役割についてウイルス抗原応答時からのB細胞応答を追跡した結果、I型IFNレセプター欠損マウスでは長期生存型抗体産生細胞の前駆体となる胚中心B細胞応答はクラススイッチの指向性が異なっていたが、その形成度合、つまり細胞の絶対数や細胞増殖等に大きな違いは認められなかった。更に末梢リンパ組織において感染初期に形成される抗体産生細胞数に関しても野生型とI型IFNレセプター欠損マウスではほぼ同等であった。このことから、I型IFNシグナル欠損マウスにおいて感染後期に著減する原因として骨髄ニッシェへの遊走過程、もしくはこのニッシェにおける長命型抗体産生細胞の維持過程に問題があることが推察された。このため、ウイルス感染後、骨髄におけるウイルス特異的抗体産生細胞数を経時的に追った。その結果、感染初期においては抗体産生細胞の骨髄への遊走割合は野生型とI型IFNシグナル欠損マウスでそれ程大きな違いはないものの、I型IFN欠損マウスでは感染後期になるに従い経時的に骨髄における長期生存型抗体産生細胞数が減少することが明らかとなった。このことから、I型IFNシグナルが長期生存型抗体産生細胞の骨髄ニッシェにおける生存維持過程に関与することが強く示唆された。長期生存型抗体産生細胞の維持機構には抗体産生細胞が骨髄ニッシェにおいてストローマ細胞や好酸球、また巨核球などから供給されるIL-6, APRIL等のシグナル因子が必須であることが報告されていることから、I型IFNシグナル欠損によってこれらの因子に影響がないかどうか、つまりI型IFNシグナル欠損による長期抗体産生細胞の著減がB細胞内因性か外因性のどちらのI型IFNシグナルによるのかを明らかにする必要がある。I型IFNレセプター欠損マウスとインフルエンザウイルスHA特異的B細胞抗原受容体マウスとの繁殖が順調に進まなかったため、I型IFNシグナルの長期生存型抗体産生細胞への維持過程への影響におけるB細胞内因性、外因性を判断する実験が進んでいない。今後、このI型IFNシグナル欠損マウスにおける長期生存型抗体産生細胞の生存維持への影響がB細胞内因性のI型IFNシグナルによるのか、その他の細胞のI型IFNシグナルが間接的に影響しているのかを明らかにするために、I型IFNレセプター欠損インフルエンザウイルス特異的B細胞抗原受容体ノックインマウス由来のB細胞の養子移植を行い、これらのB細胞のウイルス感染後の抗体産生細胞への分化過程、骨髄での維持過程を追跡する。また、昨年度立ち上げたレンチウイルスベクターを用いた初代培養系B細胞への遺伝子導入法によって、導入遺伝子による長期生存型抗体産生細胞の形成維持への影響を追跡できるかどうかをポジティブコントロールとなる遺伝子群(Mcl1, IL6R, ZBTB20, Irf4等)を導入することで検証し、サブトラクション遺伝子ライブラリーからの候補遺伝子スクリーニングの基盤技術の確認を行う。平成29年度においてI型IFNシグナルが長期生存型抗体産生細胞の形成にどのように関わるかを調べるために、長期生存型抗体産生細胞の形成過程に必須である胚中心反応がI型IFNレセプター欠損マウスにおいて正常に誘導されているかどうかをインフルエンザウイルス感染後のウイルス特異的B細胞の挙動を指標に解析した。その結果、I型IFNR欠損マウスにおいては胚中心応答のIgGサブクラスがIgG2cからIgG1型へシフトしている一方で、胚中心B細胞の絶対数、細胞増殖率、また初期に形成される抗体産生細胞数は野生型と比較して大きな違いは認められなかった。このことは、長期生存型抗体産生細胞の形成過程の中でも感染初期の誘導期ではI型IFNシグナルは大きく貢献してはいないことを示している。一方で、感染後期における骨髄中の長期生存型抗体産生細胞数はI型IFNシグナル欠損マウスで著減していることから、抗体産生細胞から長期生存型抗体産生細胞への分化、骨髄ニッシェへの遊走過程、もしくは形成後の維持過程においてI型IFNシグナルが関与している事が示唆された。次年度では、これらの可能性を検証するとともに、I型IFNシグナル下流の責任細胞、また遺伝子群を同定する。更に本年度では本研究計画の後半において実験の核となる、in vivo fate mappingシステムを応用した遺伝子のスクリーニング法の実験系の立ち上げを行い、これに使用するレンチウイルスベクターの構築、培養細胞系、初代培養系における遺伝子導入の至適化、及び遺伝子導入B細胞のマウス移入後のfate mapping系を確立した。当初、I型IFNシグナル欠損によって長期生存型抗体産生細胞の形成に関わるB細胞の胚中心応答が強く関わると想定していたが、実際にはその後の分化、維持過程が強く関わっている可能性を示唆する結果であった。このため当初予定していた実験の方向性を変更し、ウイルス感染後に形成された抗体産生細胞から長期生存型へスイッチする次の過程を追うfate mappingを行うこととした。

このことから、I型IFNシグナル欠損マウスにおいて感染後期に著減する原因として骨髄ニッシェへの遊走過程、もしくはこのニッシェにおける長命型抗体産生細胞の維持過程に問題があることが推察された。このため、ウイルス感染後、骨髄におけるウイルス特異的抗体産生細胞数を経時的に追った。その結果、感染初期においては抗体産生細胞の骨髄への遊走割合は野生型とI型IFNシグナル欠損マウスでそれ程大きな違いはないものの、I型IFN欠損マウスでは感染後期になるに従い経時的に骨髄における長期生存型抗体産生細胞数が減少することが明らかとなった。このことから、I型IFNシグナルが長期生存型抗体産生細胞の骨髄ニッシェにおける生存維持過程に関与することが強く示唆された。長期生存型抗体産生細胞の維持機構には抗体産生細胞が骨髄ニッシェにおいてストローマ細胞や好酸球、また巨核球などから供給されるIL-6, APRIL等のシグナル因子が必須であることが報告されていることから、I型IFNシグナル欠損によってこれらの因子に影響がないかどうか、つまりI型IFNシグナル欠損による長期抗体産生細胞の著減がB細胞内因性か外因性のどちらのI型IFNシグナルによるのかを明らかにする必要がある。I型IFNレセプター欠損マウスとインフルエンザウイルスHA特異的B細胞抗原受容体マウスとの繁殖が順調に進まなかったため、I型IFNシグナルの長期生存型抗体産生細胞への維持過程への影響におけるB細胞内因性、外因性を判断する実験が進んでいない。次年度は胚中心応答後に形成された抗体産生細胞のfate mappingを行い、I型IFNシグナル欠損による遺伝子発現パターンの違いをRNA seqにより比較解析し細胞遊走、長期生存型抗体産生細胞に特徴的な遺伝子発現パターンの解析を進める。またI型IFNシグナルから長期生存型抗体産生細胞分化促進に至る責任細胞の同定を養子免疫細胞移植により進めていく。今後、このI型IFNシグナル欠損マウスにおける長期生存型抗体産生細胞の生存維持への影響がB細胞内因性のI型IFNシグナルによるのか、その他の細胞のI型IFNシグナルが間接的に影響しているのかを明らかにするために、I型IFNレセプター欠損インフルエンザウイルス特異的B細胞抗原受容体ノックインマウス由来のB細胞の養子移植を行い、これらのB細胞のウイルス感染後の抗体産生細胞への分化過程、骨髄での維持過程を追跡する。また、昨年度立ち上げたレンチウイルスベクターを用いた初代培養系B細胞への遺伝子導入法によって、導入遺伝子による長期生存型抗体産生細胞の形成維持への影響を追跡できるかどうかをポジティブコントロールとなる遺伝子群(Mcl1, IL6R, ZBTB20, Irf4等)を導入することで検証し、サブトラクション遺伝子ライブラリーからの候補遺伝子スクリーニングの基盤技術の確認を行う。平成29年度においては当初計画していたコンディショナルノックアウトマウス導入に関わる費用が次年度にずれ込んだため、当初計画よりも支出が減少した。
大腸菌の遺伝子水平伝播の新機構解明と普遍性検証

本研究では、申請者が最近発見した大腸菌の新規な遺伝子水平伝播現象(細胞間形質転換)の詳細と普遍性を明らかにすることを目的とした。その結果、1) DNase感受性の細胞間形質転換は、いくつかの天然株間でも起こること、2)ある種の天然株間での細胞間形質転換はファージ非依存性の機構で行われること、3)ある特定の実験室株が関わる高頻度の細胞間形質転換には、ある種のファージとその関連タンパク質の働きで引き起こされるDNase感受性の形質転換機構が働くこと、などを発見した。これらにより、本現象の機構解明と大腸菌種内での普遍性検証を行うことができた。環境中の大腸菌は、遺伝子水平伝播により数々の病原性や薬剤耐性を獲得し、それ自身が食中毒の原因菌となったり、また他菌への遺伝子供与源ともなっている。申請者は近年、大腸菌の共培養時に非接合性プラスミドの水平伝播が低頻度ながら起こる新現象を発見し、その解析を行ってきた。その結果、本現象は、1細胞外タンパク質性因子およびプラスミド上の特定DNA配列(約88bp)が促進的に働くこと、2ゲノムワイドスクリーニングから特定された数十の遺伝子が促進/抑制に関与すること、など大腸菌の既知の遺伝子水平伝播機構では報告のない特徴を示すことが明らかとなってきた。本研究では、この現象の詳細メカニズムと普遍性をさらに解明することを目的とする。本年度は以下の計画を実施した。計画1:特定の大腸菌株が産生する本現象の促進タンパク質因子の作用機構に関して、因子を含む培養上清を用いた実験により標的細胞が主にDNA供給細胞側であることを明らかにした。計画2:伝播プラスミド上に存在する場合に本現象を促進する働きを示すDNA配列の機構解明に関して、当該配列への結合タンパク質の有無を調べる実験に着手した。現在は各種の条件検討を遂行中である。計画3:野生株大腸菌(ECOR株)での本現象発生の検証に関して、ECOR72株の水平伝播実験を行うための基本性質を解析し、天然プラスミドや溶原性ファージの保有状況と抗生物質耐性の検証、一部の天然プラスミドおよび保有ファージの配列解析、形質転換能の分析、などを行った。その結果、本現象は、1細胞外タンパク質性因子およびプラスミド上の特定DNA配列(約88bp)が促進的に働くこと、2ゲノムワイドスクリーニングから特定された数十の遺伝子が促進/抑制に関与すること、など大腸菌の既知の遺伝子水平伝播機構では報告のないユニークな特徴を示すことが明らかとなってきた。(計画1:タンパク質性促進因子の実体解明)特定の大腸菌株が産生している本現象の促進タンパク質因子の実体に関し、計画2との関連で、タンパク質精製に取り組んだ。またこれまで主に使用してきたプラスミドとは異なるプラスミドを用いて本現象に関わる遺伝子群のゲノムワイドスクリーニングを行った。(計画2:促進DNA配列の機能解明)伝播するプラスミド上に存在することで本現象を促進する働きを示す88bpのDNA配列への結合タンパク質の精製に着手した。具体的には、各種クロマトグラフィーとゲルシフトアッセイの組み合わせにより、条件検討を実施し、粗精製の段階に進んだ。(計画3:野生株大腸菌での本現象発生の検証)野生株大腸菌(ECOR株)での本現象発生の検証に関して、ECOR72株を用いた各種水平伝播実験を行った。その結果、いくつかの株で培養上清を介した人工プラスミドおよび天然保有プラスミドの転移現象を見出した。また天然でありうる環境要因下でのECOR株の遺伝子水平伝播に関する基本性質の解析の一つとして、ECOR株の淡水中の形質転換能に関して解析を行った。計画1:タンパク質性促進因子の実体解明と作用機構の解明:特定の大腸菌株が産生している本現象の促進タンパク質因子の実体に関し、ある程度の絞り込みを行った。またその候補因子の促進機構に関して、既知の各種特徴との整合性を検証した。計画2:促進DNA配列の機能解明:昨年度に引き続き、伝播するプラスミド上に存在することで本現象を促進する働きを示す88bpのDNA配列への結合タンパク質の精製に取り組んだ。具体的には、各種クロマトグラフィー、メンブレンフィルタを用いた精製、ゲルシフトアッセイによる結合検証により、より良い精製条件の検討を実施した。

計画3:野生株大腸菌(ECOR株)での本現象発生の検証に関して、前年度までに自然形質転換能が高い株として選択した株を用いて、天然環境を模した条件下、特に温度条件の影響に関して解析を行った。またそれらの株を含めたECOR株間での天然プラスミドの水平伝播とそのDNase感受性の解析を行った。その結果、本研究の発端となった細胞間形質転換現象が天然の大腸菌株でも起こることが実証された。当初計画に概ね沿った範囲で遂行出来ているため。環境中の大腸菌は、遺伝子水平伝播により数々の病原性や薬剤耐性を獲得し、それ自身が食中毒の原因菌となったり、また他菌への遺伝子供与源ともなっている。申請者は近年、大腸菌の共培養時に非接合性プラスミドの水平伝播が低頻度ながら起こる新現象を発見し、その解析を行ってきた。その結果、本現象は、1細胞外タンパク質性因子およびプラスミド上の特定DNA配列(約88bp)が促進的に働くこと、2ゲノムワイドスクリーニングから特定された数十の遺伝子が促進/抑制に関与すること、など大腸菌の既知の遺伝子水平伝播機構では報告のないユニークな特徴を示すことが明らかとなってきた。本研究では、この現象の詳細メカニズムと普遍性をさらに解明することを目的とする。本年度は以下の計画を実施した。計画1:タンパク質性促進因子の実体解明と作用機構の解明:特定の大腸菌株が産生している本現象の促進タンパク質因子の実体に関し、ある種のファージおよびその関連タンパク質の関与の可能性を見出し実証した。またその作用機構に関して、これまでに関与を明らかにした大腸菌遺伝子群がそのファージ関与の機構でも働くことを実証した。計画2:促進DNA配列の機能解明:上記計画1でのファージ依存性機構および下記計画3でのファージ非依存性機構の双方で、この促進配列が働くことを示した。計画3:野生株大腸菌での本現象発生の検証野生株大腸菌(ECOR株)での本現象発生の検証に関して、前年度までに細胞間形質転換能が高い株として選択した株の組合わせを用いて、培養上清を介した伝播の可能性に関して解析を行った。その結果、上清のみを介する系でもDNase感受性の細胞間形質転換が起こることを実証し、また遺伝子供与株あるいは受容株として能力が高い株をそれぞれ同定した。さらに天然株では、ファージが関与しない細胞間形質転機構が存在することも示唆された。本研究では、申請者が最近発見した大腸菌の新規な遺伝子水平伝播現象(細胞間形質転換)の詳細と普遍性を明らかにすることを目的とした。その結果、1) DNase感受性の細胞間形質転換は、いくつかの天然株間でも起こること、2)ある種の天然株間での細胞間形質転換はファージ非依存性の機構で行われること、3)ある特定の実験室株が関わる高頻度の細胞間形質転換には、ある種のファージとその関連タンパク質の働きで引き起こされるDNase感受性の形質転換機構が働くこと、などを発見した。これらにより、本現象の機構解明と大腸菌種内での普遍性検証を行うことができた。当初計画に概ね沿った範囲で遂行できているため。現在までの進行状況をベースに当初計画に準じて推進していく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。