hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
回転水槽実験を用いた台風コア領域構造の力学に関する研究

本研究では、まず、これまで難しかった回転水槽実験で発生する水面運動の定量化と、運動パターンを定量的に分類する解析手法と定義を提案した。粒子画像流速測定法により運動場の定量化を行い、運動エネルギーを算出した。この運動エネルギーを用いた定義により、すべての実験の運動パターンを客観的に分類した。今後は、まだ成功していない回転水槽実験を用いた台風コア領域の再現を目指し、本研究での手法を適応して台風の非軸対称構造の形成メカニズム解明を行う。本研究は、台風構造を模擬する実験条件で行う回転水槽実験を用いて、台風中心付近の構造変形メカニズムを力学的に解明することを目的としている。2つの課題を設定していて、課題1は回転水槽実験のなかで1つの浮遊粒子を3次元的に追跡すること、課題2は感度実験を行うことである。初年度の前半は、回転水槽実験装置の整備や、実験環境の構築に多くの時間と研究費を費やした。サーモグラフィーの選定には、複数の業者からデモンストレーションをしていただき、本研究に最も適したものを購入した。粒子追跡の解析に用いるPIV(Particle Image Velocimetry)ソフトの本研究への導入も行った。実験整備については概ね順調である。新しく整備した画像処理ソフトを本研究に適応・検証するために、まずは台風構造の実験条件ではなく、一般的な実験条件で課題2を進めた。感度実験として、温度差・回転速度・水深など実験条件を変えた水槽実験を約100回以上実施した。そして、それらの結果をPIV解析ソフトを用いて定量化を行った。この新技術を用いることで、これまで分からなかった回転水槽実験の定量的な理解や複雑な波動の考察ができるようになった。これらの結果は、2013年度秋季日本気象学会で発表を行い、多くの研究者から問い合わせやご助言を頂いた。そして、次年度の前半でそれらの結果を整理して学術論文に提出できるように準備している。さらに、これらの室内実験や数値シミュレーションの初期的な結果を、2014年度春季日本気象学会にて研究発表を予定している。また、本研究代表者がコンビーナとなり、2014年度秋季日本気象学会では、「回転水槽実験」のスペシャルセッションが開催されることになった。以上のように、研究実績は着実に出ている。本研究は、台風構造を模擬する条件の回転水槽実験を行い、台風中心の構造変形メカニズムを力学的に解明することを目的としている。研究計画では2つの課題を設定しているが、前年度に行った課題2から多くの実験結果が出ているため、最終年度はまず課題2の成果を整理し、そのデータ解析と科学論文の作成に集中した。課題2では、昨年度までに行った約500回の実験すべてに対して、後述する新しい解析方法を用いて分類した。この研究により、これまで目視で行われてきた実験結果の分類に対して、定量的な定義に基づく客観的な分類が成功した。その結果を科学論文としてまとめ、日本気象学会誌天気に投稿している。さらに、課題2の副次的な成果として、複雑な水面運動のパターンも含めた全ての実験結果について定量的に同定・分類できる手法を開発した。まず、粒子画像流速測定法(PIV)を用いて水面の運動場を定量化し、得られた運動量からもとまる全運動エネルギー、渦運動エネルギーを算出する。さらに、波数分解からもとまる波数別渦運動エネルギーの割合を示すことで、どのような運動パターンが卓越しているかを定量的に分類する。この手法開発の研究を整理し、日本流体力学会の科学雑誌「ながれマルチメディア」に投稿し、11月に受理された。2014年度秋季日本気象学会では、本研究代表者がコンビーナの一人となり、回転水槽実験に関するスペシャルセッションを立ち上げて実施した。セッションは盛況で、多くの参加者から本研究の講演に対してご助言等を頂くことができた。以上のように、本研究の成果は、科学雑誌や学会で発表をしていて、研究実績は着実に積まれている。課題1の台風構造の再現実験もすでに良い結果が出ているため、今後はその実験成果を整理することに時間を費やし、学会などで発表する予定である。気象学回転水槽実験の装置の環境整備は概ね順調である。そして、課題2の回転水槽実験の感度実験研究は、実験設定は台風構造を模擬したものではないが、約100回以上も実施している。サーモグラフィーやPIV解析ソフトの導入により得られる定量的なデータは、過去の回転水槽実験だけでは得られなかった新たな結果を出している。この結果をまとめて2013年度秋季日本気象学会で発表を行ったところ、大きな反響があった。回転水槽実験を用いてきた研究者だけでなく、授業教材として利用している教育者からも、優れた教材に成る可能性を示唆して頂いた。すでに出ている実験結果を整理し、日本気象学会誌「天気」に学術論文として提出できるように執筆中である。また、2014年度秋季日本気象学会のスペシャルセッション「回転水槽実験」で行うことが決まり、本研究代表者がコンビーナとして準備を進めることになった。一方、課題1に関しては、1粒子追跡解析での導入が遅れている。

予定していた1粒子追跡実験に用いる蛍光塗料マイクロカプセルが、実験を試みてもうまく機能しないという問題が起きている。その原因を追求しているところであるが、新たに購入をすることも検討している。全体として、課題1にやや遅れがあるものの、課題2は予想以上に結果がでていて、研究達成度は高いと考えられる。今後は、課題1の問題について急ぎ対策をとりながら、課題2の結果の整理をさらに進めていく。研究期間2年目は、課題1の研究を中心に進める。1粒子追跡実験の整備を急ぎ行う。1粒子追跡実験に用いる蛍光塗料マイクロカプセルがうまく機能しない原因を追求しながら、新たな購入も検討する。蛍光塗料マイクロカプセルは水槽実験の浮遊粒子となるため、それを3次元的に追跡することで、流体内部の二次循環を観察する。課題2も、課題1と平行して遂行する。これまでは、新しく整備した画像処理ソフトを適応・検証させるための予備実験として、台風構造を模擬する実験条件ではなく、従来の実験条件を何度も繰り返してきた。今後は、台風構造に合わせた実験条件で回転水槽実験を繰り返す。まず、台風壁雲の非軸対称構造に対応した結果を得る。そして、実験設定を変えた実験結果を蓄積し、再現される傾圧不安定波動の発生・変形と実験設定の関係をレジームダイアグラムにまとめる。その感度実験は、23ヶ月をかけて100回程度を予定している。これらの研究成果は、すべて学術論文にまとめる。まず、すでに初年度で得られている実験結果をまとめて、日本気象学会誌「天気」への投稿を行う。2年目で得られた実験結果も、学術論文にまとめて投稿できるように準備をする。さらに、2014年度春季気象学会でも、本研究の成果の発表が決まっている。また、2014年度秋季日本気象学会では、「回転水槽実験」のスペシャルセッションが予定されており、コンビーナとして準備している。予定通り研究費を使用しているが、完全にゼロになるまでは購入しなかった。回転水槽実験に必要となる備品の購入を計画している。室内実験の備品は、既存の故障した装置から利用できるパーツはそのまま利用するなど、コストを抑えた購入を計画している。1粒子追跡実験に用いる蛍光塗料マイクロカプセルは、原因によっては、新たな購入する。また、膨大なデータから、PIVソフトにより定量化計算をさせるコンピュータの購入を考えている。そして、研究成果を蓄積するためのデータストレージも随時購入をする。現在の高感度カメラだと、実験結果に影響が出る不具合が見つかったため、新たな撮影用カメラを購入する。そして、研究結果を発表するために、学会参加と科学論文雑誌の投稿に研究費を使用する。
映像に記録された女性像に関する文化人類学的研究

本研究は、映像表現をコミュニケーション論の問題系ととらえ「映像に記録された女性像」を主題に文化人類学の視座から討究した。以下の成果を得た。(1)生活改善運動を記録した映像資料を再考し、映像に描きだされた女性の社会進出の実像と虚像を社会的政治的構造の視点を加えて解明した。(2)民族誌映像に表現されたジェンダー観を考察し、映像民族誌に関する理論と映像解析の方法を提唱した。(3)女性を描いたアニメーション映像の普遍的理解と個別的理解の議論をとおして映像のグローバル化と民族性についての知見をえた。以下の成果を得た。「生活改善運動における女性の地位と役割に係る映像記録(亘課題)」については、開発人類学的な視点から資料収集・解析を行い以下の成果をえた。群馬、鹿児島、青森、山形で記録された生活改善活動に係る映像フィルム資料などを発掘し入手した。資料の予備的解析は、開発人類学的な視点から農村社会の女性の地位と役割、対社会的意識の変化を中心に行った。その成果の一部を、本プロジェクトの研究会(11月)で、またこれら映像資料の教育的活用に関する報告を「日本映像民俗学の会(3月)」沖縄大会でおこなった。牛島課題は、バリ島の女性祈祷師を撮影し、その映像を本人が検証する民族誌映像作品Balinese Trance Seance(1980)、Jero on Jero:A Balinese Trance Seance Observed(1981)、とエチオピアの女性の生き方を記録したDuka's Dilemmaの日本語版テキストの制作を完了し、その一部を「映像民俗学の会、東京研究会(12月)」で発表した。これらの研究をとおして得られた知見は、当該社会の女性に対する期待に焦点を絞ったジェンダー論として議論した(「日本映像民俗学の会(3月)」沖縄大会で発表)。森田課題では、日本、チェコのアニメーションで表現される女性イメージを、女性の容姿と衣装、動き(仕草や立ち振る舞い)、音(イメージサウンド)を動作にかかわる基礎的な資料を収集した。それらをもとに民族芸術論の視点から比較研究のあり方を議論した。その過程を本プロジェクトの研究会(2月)で議論した。群馬、鹿児島で実施したフィールドワークによって生活改善活動に係る映像フィルム資料などを発掘し、根本資料としての検証を行い、研究会(11月)で報告した。前年度より収集した資料は、資料集としてCD2枚にまとめ、開発人類学的な視点から農村社会の女性の地位と役割、対社会的意識の変化を中心に解析を行った。その成果は、研究会(2月)で、またこれら映像資料の教育的活用に関する議論を「日本映像民俗学の会(3月)」金沢大会のシンポジュウムでとりあげた。「民族誌映画に表現された女性像の映像人類学的解析(牛島課題)」は、マサイ女性の日常を記録した民族誌映像作品Masai Women (1974)、The Women's Olamal: The Organization of a Massai Fergility Ceremony (1985)の日本語版テキストの制作を完了し、その一部を「映像民俗学の会、東京研究会(12月)」で発表した。これらの研究をとおして得られた知見は、当該社会の女性に対する社会的期待に焦点を絞ったジェンダー論として議論した(研究会11月、2月)。「日本、チェコ、カナダのアニメーションにおける女性像に係る民族芸術学的解析(森田課題)」では、日本、チェコのアニメーションで表現される女性イメージを、女性の容姿と衣装、動き(仕草や立ち振る舞い)、カラーイメージ、サウンドイメージにかかわる基礎的な資料の収集をした。その過程を本プロジェクトの研究会(11月)で議論した。「生活改善運動における女性の地位と役割に係る映像記録(亘課題)」については、開発人類学的な視点から資料収集・検証・解析を行い以下の成果をえた。第二次世界大戦を契機に日本の農村が「民主主義」の標語のもとに展開した生活改善運動で利活用された映像資料(映画、スライド)が、農村の近代化をどのような意図をもって語ってきたか、およびそこに見る映像表現の虚像と実像を「農業・農民・農村」の系から明らかにした。その成果の一部は、公開研究会(6月)で公開した。本研究でこれまで収集した資料は「生活改善運動映像資料」としてDVDにまとめた。これら映像資料の教育的活用は、大学の講義および青年海外協力隊の技術補完研修(3・6・9・12月)で開発人類学の視点から資料として利活用した。

「日本、チェコ、カナダのアニメーションにおける女性像に係る民族芸術学的解析(森田課題)」は、チェコの人形アニメーションに見る女性像をアニメーション制作者の視点から解析し、その表現の本質は民族的でありそれは政治的であることと同義としてとらえた。そしてこの時代のチェコのアニメーション作家の表現する女性像の本質は民俗性の追求にほかならないことを指摘した。以上、本研究の3課題は研究会(2月)で区切りの議論が加えられた。その成果は報告書(web版を含む)として取りまとめられた。
水田生態系における人為的環境変動・撹乱に対するホウネンエビ集団の生活史進化

水田に生息する甲殻類ホウネンエビBranchinella kugenumaensis(Ishikawa)の生活史形質において,前年度までの研究で明らかにされた表現型多型(長期繁殖型と短期繁殖型)が生じる原因が,遺伝によるのか環境によるのかを実験的に明らかにするためには,大前提として供試個体を容易に入手する必要がある。そこで本研究ではまず、香川県木田郡三木町を流れる河川(吉田川、新川、鴨部川)の流域においてホウネンエビ長期繁殖型の発生が見られるかどうかを探索した。また表現型多型の生じる原因を明らかにするためには、これまで困難とされてきたコントロールされた環境条件下で個体を飼育することが必要である。そのため本研究では半野外条件および恒温室内での飼育技術の確立を試みた。野外の調査地においてホウネンエビの発生が確認できたのはM3地点(吉田川上流足田打)のみであった。M3での個体の成長は短期繁殖型のものと類似しており、河川上流部で長期繁殖型個体の発生を確認することはできなかった。しかし半野外環境下での飼育において、M1地点(吉田川上流朝倉)の土壌から長期繁殖型と思われる個体の発生が確認出来た。恒温室内での実験ではN20地点(琴電農学部前駅南西)の土壌を用いた。これは野外網室での半野外飼育の結果としてN20個体はM1やM3など山間部の個体と比べて環境順応能力が高いと考えられたからである。大型のプラスティックトレイ(924×610×200mm、容量79リットル)に水田土壌を入れ、水道水を加えて攪拌し、網室内に放置して自然の日射と温度変化に曝すだけで土壌中のホウネンエビ卵を孵化・成長・繁殖させることができた。またトレイの底に土壌を入れた状態であれば恒温室(27°C、16L8D)内で人工照明を当てた状態でもホウネンエビを飼育することができた。光条件(ライト1灯と2灯)と水質条件(ハイポネクス添加、乾燥酵母添加および無添加対照区)をコントロールした飼育実験で発生消長を調べたところ、ライトの照度と水質の違い、および雌雄の性差についていずれも体サイズにおける有意差を生じさせることができた。ライトは2灯が1灯よりも成体の体長を大幅に促し、また酵母添加区、ハイポネックス添加区、対照区の順でわずかずつ体長が大きかった。また雌は雄よりもわずかに大型であった。本実験を通して、水中に土壌を残すという半人工条件とはいえ、これまでは困難とされてきたホウネンエビを飼育することに成功した。この結果、今後季節的要因にとらわれることなくホウネンエビを周年累代飼育することが可能となった。またその際、ライトの照射および酵母・ハイポネックスの添加を行うことは成長を促進する上で有効である。京都市左京区岩倉川源流部と香川県木田郡二木町の琴電農学部前駅南側にある水田で野外調査を行った.京都では山間地の31カ所の田んぼを,また香川では住宅地の30カ所の田んぼを調査ステーションとして選び,注排水のスケジュールやホウネンエビの発生消長,採集された成体のサイズや蔵卵数を調査した.京都の調査地ではステーション間でホウネンエビの成体サイズに大きな変異が見られ,それが場所ごとの水の持続期間の長短に対応していることが観察された.水の存在期間が長い田んぼでは,ホウネンエビは小型の成体に達した後産卵を続けながらさらに大型に成長する「長期繁殖型」が,水の存在期間が短い田んぼでは大型にならずに小型成体のまま短時間で繁殖を終了・死亡する「短期繁殖型」が発生した.もし小型成体の時期において成長と繁殖の間にトレードオフが存在するならば,長期繁殖型個体が小型成体であった時期には同サイズの短期繁殖型個体よりも卵生産量が少ないと予測される.体長と蔵卵数の関係を調べたところこの予測を支持する結果が得られた.ホウネンエビの表現型変異はそれぞれの田んぼで局所的に異なる自然選択を受けて適応的に進化したものと思われる.一方香川の調査地では田んぼの水入れ時期は場所ごとに大きく異なったが,それに対応するような一貫した表現型変異を見出すことはできなかった.ステーション間よりもステーション内での変異が大きく,しかし全体としてみると京都の調査地でいう「短期繁殖型」の範疇に入るものと思われた.このことは降雨の少ない香川では用水路が水門を閉められてため池のような状態となり,各ステーションから排水された水が混じり合ってから再びポンプで吸い上げられて戻されるため,ステーション間の遺伝子流動が大きく,また京都よりも不確実性の高い環境であるために特定の遺伝子型が局所的適応を果たすごとが妨げられているからだと考えられる.水田に生息する甲殻類ホウネンエビBranchinella kugenumaensis(Ishikawa)の生活史形質において,前年度までの研究で明らかにされた表現型多型(長期繁殖型と短期繁殖型)が生じる原因が,遺伝によるのか環境によるのかを実験的に明らかにするためには,大前提として供試個体を容易に入手する必要がある。

野外の調査地においてホウネンエビの発生が確認できたのはM3地点(吉田川上流足田打)のみであった。M3での個体の成長は短期繁殖型のものと類似しており、河川上流部で長期繁殖型個体の発生を確認することはできなかった。しかし半野外環境下での飼育において、M1地点(吉田川上流朝倉)の土壌から長期繁殖型と思われる個体の発生が確認出来た。恒温室内での実験ではN20地点(琴電農学部前駅南西)の土壌を用いた。これは野外網室での半野外飼育の結果としてN20個体はM1やM3など山間部の個体と比べて環境順応能力が高いと考えられたからである。大型のプラスティックトレイ(924×610×200mm、容量79リットル)に水田土壌を入れ、水道水を加えて攪拌し、網室内に放置して自然の日射と温度変化に曝すだけで土壌中のホウネンエビ卵を孵化・成長・繁殖させることができた。またトレイの底に土壌を入れた状態であれば恒温室(27°C、16L8D)内で人工照明を当てた状態でもホウネンエビを飼育することができた。光条件(ライト1灯と2灯)と水質条件(ハイポネクス添加、乾燥酵母添加および無添加対照区)をコントロールした飼育実験で発生消長を調べたところ、ライトの照度と水質の違い、および雌雄の性差についていずれも体サイズにおける有意差を生じさせることができた。ライトは2灯が1灯よりも成体の体長を大幅に促し、また酵母添加区、ハイポネックス添加区、対照区の順でわずかずつ体長が大きかった。また雌は雄よりもわずかに大型であった。本実験を通して、水中に土壌を残すという半人工条件とはいえ、これまでは困難とされてきたホウネンエビを飼育することに成功した。この結果、今後季節的要因にとらわれることなくホウネンエビを周年累代飼育することが可能となった。またその際、ライトの照射および酵母・ハイポネックスの添加を行うことは成長を促進する上で有効である。
口腔扁平上皮癌における白金製剤感受性と浸潤能との関連

口腔扁平上皮癌における白金製剤の細胞内輸送能とその感受性との関連を調べることを目的に、がん浸潤様式(山本・小浜分類の由来)の由来が明確な口腔扁平上皮癌8種および病理組織切片を用いて実験に供した。In vivoにおける高度浸潤癌ではATP7B発現が強く、予後不良であり、in vitroではATP7B発現がCDDP排出により細胞内CDDP蓄積量を減少させ、CDDP抵抗性に関与していることが示唆された。口腔扁平上皮癌における白金製剤の細胞内輸送能とその感受性との関連を調べることを目的に,がん浸潤様式(山本・小浜分類)の由来が明確な口腔扁平上皮癌8種(HSC-2,HSC-4,OSC-20,OBS-01,OSC-19,OTC-04、HOC313,TSU)をin vitro系の実験に供した。次の系統的研究を行ったので,下記する。)研究1.抗癌剤シスプラチン(CDDP)感受性の比較研究2.CDDP暴露し,がん細胞内に蓄積したCDDP濃度の計測研究1の結果,高度浸潤癌由来細胞株(HOC313,TSU)では,CDDP感受性を低く認めた。次に研究2のCDDP細胞内蓄積量を計測すると,高度浸潤癌由来細胞では,細胞に蓄積したCDDP量が低かった。この実験結果は,細胞内に蓄積したCDDP量が低いほどCDDPの感受性が低いことを示唆しており,合理的に考えられる。研究3では,CTR1,ATP7Bの発現を半定量RT-PCRおよびWestern blotting法を用いて,比較検討した。その結果,CTR1の発現は有意な差を認めなかったが,一方ATP7Bの発現に関しては,高度浸潤癌由来細胞においてその発現が強く,低度浸潤癌由来細胞株でその発現が低く認められた。これらのことより,高度浸潤癌由来細胞株では,低度浸潤癌由来細胞株に比べてCDDPを細胞外に排出するATP7Bが強く働き,CDDP細胞内蓄積量も減少した結果,CDDP低度感受性になったと考えられた。ATP7Bは口腔扁平上皮癌のCDDP感受性マーカーとして利用できる可能性があり,治療方針に寄与すると考える。また今後はさらに,ATP7Bの耐性メカニズムをさらに解明し,治療に応用できるように研究を進めべきである。口腔扁平上皮癌における白金製剤の細胞内輸送能とその感受性との関連を調べることを目的に、がん浸潤様式(山本・小浜分類)の由来が明確な口腔扁平上皮癌8種(HSC-2, HSC-4, OSC-20, OBC-01, OSC-19, OTC-04, HOC313, TSU)および病理組織切片を用いて実験に供した。次の系統的研究を行ったので、下記する。研究1.口腔扁平上皮癌一次症例患者より得られた病理組織切片を対象として、シスプラチン(CDDP)の排出に関わるトランスポーターATP7Bの免液染色を行い、臨床病理学的因子との相関を検討した。研究2. CDDP長期間暴露しながら継体培養することでCDDP耐性株を作製し、各トランスポーター発現に変化を検討した。研究3. ATP7BのsiRNA導入を行い、これまでの抑制実験を行った。研究1の結果、高度浸潤癌症例群では、低度浸潤癌症例群に比べてCDDP排出に関わるとされているATP7Bの発現が強く認められた。研究3では、ATP7B siRNA導入細胞株では、親株に比べてCDDP細胞内蓄積量も高く、CDDP感受性も高く認められた。上記をまとめると、in vivoにおける高度浸潤癌ではATP7B発現が強く、予後が不良であり、in vitroではATP7B発現が,CDDP排出により細胞内CDDP蓄積量を減少させ、CDDP抵抗性に関与していることが示唆された。ATP7Bは口腔扁平上皮癌のCDDP感受性マーカーとして治療方針に寄与すると考える。今後は、ATP7Bの耐性メカニズムをさらに解明し、治療に応用できるように研究を進めるべきである。
植物の生体防御にはたすポリアミンの分子基盤の解明

植物においてもポリアミンは、細胞分裂が盛んな細胞や生殖細胞に多く含まれることから、細胞分裂、成長そして分化等のプロセスで機能するとされてきた。ポリアミン合成系遺伝子の発現は、塩や乾燥といった非生物的ストレスや非病原性微生物の感染時に誘導されることから、ポリアミンはこうした環境ストレスに対する生体防御においても機能することが示唆されていた。研究実施者は、テトラアミンであるスペルミンとサーモスペルミンを合成できない変異体が塩や乾燥ストレスに高感受性となること、また細胞間隙に蓄積したスペルミンが病原菌感染時特異的遺伝子群の発現を誘導するシグナル分子として機能すること、を示してきた。本研究で、テトラアミンの2成分を迅速に定量的に分離する手法を確立し、スペルミンが上記ストレス時の防御に機能することを明らかにした。また、シロイヌナズナ植物体内でこれら2つのテトラアミンの合成部位が区分けされているかについても、各合成酵素遺伝子のプロモーター解析から示した。上述のスペルミンシグナル伝達経路には、ポリアミンの分解に関わるポリアミン酸化酵素が関与することが薬理的手法により示唆されていた。そこで、シロイヌナズナに5種類あるポリアミン酸化酵素遺伝子の発現パターン、このうちの4種類の組換え酵素のポリアミン基質の特異性等についても明らかにした。従来、植物のポリアミン酸化酵素は末端代謝系と呼ばれる反応を触媒すると考えられていたが、シロイヌナズナのポリアミン酸化酵素は、いずれも動物細胞と同じ逆変換代謝系の反応を触媒することを示した。単子葉植物のイネには、7種類のポリアミン酸化酵素遺伝子が存在するが、このうち少なくとも3種類の遺伝子産物は、シロイヌナズナと同じく逆変換代謝系の反応を触媒することを明らかにした。イネは、末端代謝系を触媒する酵素の存在が示唆されており、この点についても検討を進めている。スペルミン合成酵素遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナとスペルミン合成酵素遺伝子を欠損しているシロイヌナズナを用いて、熱ショック応答反応においても重要な役割を担っていることを示した(論文投稿中)。スペルミンは、小胞体ストレス応答反応における鍵遺伝子のひとつbZIP60の発現を誘起することを報告してきたが、本研究によりIRE1がもつRNase活性を高め、bZIP60転写物をスプライシングし、活性型のbZIP60タンパク質の産生をもたらす事も示した(投稿準備中)。外部から加えたサーモスペルミンは、スペルミン応答遺伝子群のほぼ全てを誘導する活性を持ち、シロイヌナズナでのキュウリモザイクウイルスの増殖を著しく抑制する活性を持つことも明らかにした。この発見は、ポリアミン骨格をもつ化合物が新たな植物成長化学調節物質となる可能性を示唆するものである。植物の環境適応におけるポリアミンの役割を分子遺伝学的に明らかにしてきた。シロイヌナズナのスペルミン合成

酵素遺伝子は、spermine synthse(SPMS)とacaulis5(ACL5)の二つと考えられてきたが、後者のACL5遺伝子はスペルミンの異性体サーモスペルミンを合成する酵素遺伝子であることが明らかになった事より、これら二つのポリアミンの高効率な分離・定量法の確立を行った(Naka et al. in press)。シロイヌナズナに非病原力をもつキュウリモザイクウイルス(CMV)との組み合わせの実験系を用いて、宿主植物が抵抗性反応を起こしている際に発現が誘導される遺伝子群の網羅的な解析を、Super-SAGE法で行った。こうした遺伝子の大半がスペルミンを外部から与えた時にも誘導されること、その遺伝子群を誘導する能力はスペルミン特異的であり他のポリアミンでは起こらないこと、を示した。従って、シロイヌナズナにも著者らがタバコで提唱してきたスペルミンシグナル伝達系が存在することが、強く示唆された(Sagor et al. 2009 ; Mitsuya et al.2009)。このスペルミンシグナル系が成立するためには、スペルミンが分解されることによって生じる過酸化水素が重要な役割を果たすと考えられる。そこで、シロイヌナズナに存在する5種のポリアミン酸化酵素遺伝子(AtPAO1,AtPAO2,AtPAO3,AtPAO4,AtPAO5)について網羅的な解析を行った。これら5種のPAO遺伝子の組織的な発現部位の違い、成育に伴う時間的・空間的発現部位についても解析を行った。さらに、遺伝子産物の基質認識の特異性についても明らかにした(Takahashi et al.投稿中)。申請者が提唱している「スペルミン情報伝達経路」では,病原菌の攻撃を受けた植物宿主が当該病原菌に対し抵抗性を持ち,自己の細胞の一部を殺したり,防御遺伝子群を活性化させる場合に,ポリアミン合成系の終産物であるスペルミンがポリアミン酸化酵素(polyamine oxidase, PAOと略)により分解されて発生するH2O2が重要な役割を持つと考えている.この考察はPAOの阻害剤を用いた実験に依っている.より直接的証拠を示すために,シロイヌナズナの全PAO遺伝子5種をクローニングし,組換えPAO酵素の基質特異性等の特徴付けを行った.又これら5種のPAOの細胞内局在性を明らかにし,論文として報告した(Takahashi et al. 2010).また,PAOについては単子葉植物の代表的モデル植物であるイネの7種のクローニングを進めている.これまでに2つの異なる生育ステージでいずれも高発現していた3種のクローニングを終え,これらいずれもがパーオキシゾームに局在することを明らかにし,論文として報告した(Ono et al. in press).さらに,スペルミン情報伝達経路が起動するにはミトコンドリアの不活性化が必須である.種々の知見から動物細胞のアポトーシスの際にミトコンドリア外膜の主要タンパク質であるVoltage-dependent anion channel (VDAC)と内膜の主要タンパク質であるAdenine
遺伝子変異を検出するDNAバイオセンサの開発

前年度まで、MutSタンパク質の大腸菌での発現系の確立に成功し、大腸菌により大量に発現したMutSタンパク質を金電極表面に固定化し、全種類のミスマッチDNAおよび一塩基欠失DNAの検出に成功した。各々ミスマッチに対するMutS固定化金電極センサーの応答は異なり、本研究で提案するMutSタンパク質固定化電極を用いて変異検出が可能であることが示された。そこで本年度は前年度で構築したMutSタンパク質固定化電極のセンサーとしての性質についてもっと詳細な検討を行った。具体的にはMutSタンパク質固定化電極の検出感度およびタンパク質固定化量の評価を行った。まず60bpのGTミスマッチを用いて検出限度について調べた結果、ピコモルまで検出が可能であることが明らかとなった。イオンチャネルセンサによる測定においては比較的に高感度で、実用化が可能であることが示された。また水晶振動子マイクロバランス法(QCM)によって、水晶振動子上の金表面に固定化したMutSの量を測定することで、電極表面に固定化されたMutSタンパク質の量を推測した。QCMによりMutSタンパク質が金電極表面に約0.25pmol/cm^2固定化されていることが明らかとなった。さらに変異DNAを添加すると、変異DNAが0.09pmol/cm^2結合された。MutSタンパク質と変異DNAは2.8:1の比率で結合されていて、これはMutSタンパク質は二重体形成により変異DNAを捕捉する報告と一致した。また今回の結果からMutSタンパク質は金電極表面の約27%覆われていることが判明し、これからタンパク質の固定化量などを最適化することにより、本センサーのさらなる感度の向上が期待できる。著者は既に転写因子Oct-1のDNA結合領域POUドメインを電極に固定化しオクタマー配列をターゲットとするDNAセンサの構築に成功した。本年度では、これらの研究成果を踏まえて、遺伝子診断及び遺伝子治療への展開を図るべく、生体内の遺伝子修復系で働くMutS蛋白質の変異遺伝子に対する高認識能を利用した新しい遺伝子センサの開発を目指した。まず、遺伝子工学を駆使することによってMutSタンパク質のN末端に連続した10固のヒスチジン残基(His-tag)を遺伝子レベルで導入し、これを大腸菌を用いて大量に合成した。このHis-tag部位を使用してNi(II)-NTA誘導体との三次元複合体を形成させることによりタンパク質を活性を保った状態で金電極上に固定化できる。タンパク質の発現においてインクリュージョンボディとしてしばしば発現される問題が存在し、このために大腸菌組み換え発現系でも最も強力なシステムであるpETシステムを用いて発現用大腸菌株BL21(DE)pLysSによりMutSの発現を行った。それに、ネイティブフォールディング状態のMutSを発現するには発現する温度およびタンパク質発現誘導剤の濃度などに大きく影響される。詳細の検討の結果、27°Cで、タンパク質発現誘導剤IPTG濃度が50μMという非常に穏やかな状態で発現したとき、MutSを活性を保った状態で発現できることが明らかとなった。発現したMutSタンパク質の変異認識能をまず正常型および変異型のDNAを溶液中で結合させ、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法により確認した。その結果、変異があるDNAが存在する場合にはMutSタンパク質と複合体の形成により泳動がフリーのMutS及び正常型DNAか存在する場合より、大きく遅れるバンドが確認され、MutSが変異遺伝子を識別できることが確認できた。発現したMutSを導入したHis-tagでNTA-Ni錯体を介して金電極上に固定化し、36merのGTミスマッチ及び一塩基欠失二重鎖DNAとコントロール実験として正常型DNAを用いて変異認識能を確認した結果、正常型DNAに対しては全く応答がないのに対して、GTミスマッチおよび一塩基欠失DNAの場合には大きな応答が得られた。そこで本年度は前年度で構築したMutSたんぱく質固定化電極のセンサーとしての性能についてもっと詳細な検討を行なった。まず、全種類のミスマッチDNAについて調べた結果、GT>CG>AC、AG、AA>TT、CT>CC>CGという結果が得られた。この結果はMutSとミスマッチDNAとの結合定数と一致し、本センサーの遺伝子診断への応用できることが明らかとなった。次に、本センサーの長さ依存性について調べた。電気的シグナルはMutSタンパク質に認識されて結合したDNAと測定系に共存しているレドックスマーカーとの静電的反発に起因する。そのため、DNAが長いほうがシグナルの応答が大きいと考えられる。一方、今後PCRなどの技術と提携することも考え、もっと長いDNA鎖の検出が望ましい。そこで実際48mer、60merのGTミスマッチ、一塩基欠失DNAを用いて測定した結果、両方とも60mer>46mer>36merという結果が得られた。しかし、48merと60merの差はさほど大きくなった。今年度においては、その原因の解明、及び検出限度、タンパク質の固定化量などを明らかにする予定である。

まず60bpのGTミスマッチを用いて検出限度について調べた結果、ピコモルまで検出が可能であることが明らかとなった。イオンチャネルセンサによる測定においては比較的に高感度で、実用化が可能であることが示された。また水晶振動子マイクロバランス法(QCM)によって、水晶振動子上の金表面に固定化したMutSの量を測定することで、電極表面に固定化されたMutSタンパク質の量を推測した。QCMによりMutSタンパク質が金電極表面に約0.25pmol/cm^2固定化されていることが明らかとなった。さらに変異DNAを添加すると、変異DNAが0.09pmol/cm^2結合された。MutSタンパク質と変異DNAは2.8:1の比率で結合されていて、これはMutSタンパク質は二重体形成により変異DNAを捕捉する報告と一致した。また今回の結果からMutSタンパク質は金電極表面の約27%覆われていることが判明し、これからタンパク質の固定化量などを最適化することにより、本センサーのさらなる感度の向上が期待できる。
高周期14族元素連結型機能性デンドリマーの合成と物性の解明

デンドリマーは単一の分子量を有する新しいタイプの巨大分子であり、その分子構造や機能性に興味を集めている。今回デンドリマーの発光特性に関する研究を行い、分岐したケイ素-ケイ素鎖からの発光期校を解明し、二重蛍光という興味深い知見を得ることに成功した。ポリシランデンドリマー1Gの77Kにおける3-メチルペンタン剛性マトリックス中での時間分解発光スペクトルを測定したところ、紫外域(350nm)と可視領域(460m)に二つの発光帯が観測された。前者の発光は直鎖Si-Si構造を有するポリシランに、後者の発光は分岐Si-Si鎖を有するポリシランに類似のものである。紫外域の発光は、パルス励起後の遅延時間の増加とともに減少し、20nsでは可視域のブロードな発光のみとなった。このような二重発光的な挙動は,他のポリシランデンドリマーOGおよび2Gにおいても観測された。このような発光の立ち上がりは、可視発光サイトへの励起エネルギー移動を示唆するものである。これはポリシランデンドリマーの直鎖Si-Si構造に局在した励起状態が、分子内エネルギー移動によって分岐Si-Si鎖近傍の励起状態となる過程に対応づけられる。しかし,OGのようなSi連鎖の短い分子においても二重発光挙動が観測されたことから、紫外発光サイトと可視発光サイトとの間のエネルギー障壁は大きくなく、両者の励起状態間でのエネルギー移動がランダムホッピング的に容易に起こり得ることが予想される。以上の結果から、ポリシランデンドリマー1Gの励起状態間のエネルギー障壁は0.92kcal/mol、無輻射失活過程のエネルギー障壁は3.17kcal/molと算出できた。本研究により、これまで不明瞭であった直鎖状ポリシランの可視部発光スペクトルの起源を特定する事ができた。今回デンドリマー末端にフェニル基を有する第一世代デンドリマーおよびペルメチル置換第一世代デンドリマーのX線結晶構造解析に成功した。また、デンドリマー表面にヒドロキシル基の導入を検討し、官能性デンドリマーの合成にも成功した。第一世代ペルメチル置換およびフェニル置換デンドリマーの分子構造では、Si-Si結合長は末端よりも中心の方が長く、Si-Si-Si結合角はスペーサーであるSiMe_2周りで大きくなっている(av.114.6。)。ケイ素鎖の立体配座にゴーシュ型は見られず、アンチ型およびオルソゴナル型で構成されている。特に、後者のデンドリマー表面付近ではエクリプス型が見られ興味深い。さらに、末端のフェニル基は中心メチル基を覆うような構造をしていおり、中心メチル基のNMRシグナルがフェニル基によって遮蔽され高磁場シフトして観測される。一方、デンドリマーの表面修飾では、ヒドロキシル基の保護基であるベンジル基を有するベンジルオキシヘキシル基を全てのデンドリマー末端に導入することに成功し、保護された官能性デンドリマーを無色油状物として収率33%で合成した。得られたデンドリマーに、パラジウム-炭素を触媒とする接触水素化を行ったところ、表面にヒドロキシル基を有する第一世代デンドリマーを無色油状物として収率40%で単離することができた。得られた官能性デンドリマーは、表面にヒドロキシル基が6個存在するため、非極性溶媒には全く溶けないが極性溶媒に対しては極めて高い溶解性を示すなどの特異な性質を有する。
高分子鎖を閉じ込めたマイクロエマルションのネマチック-ゲル相転移

本申請研究では、球状マイクロエマルション(ME)に高分子を閉じ込める複合系において、閉じ込めた高分子の会合状態を制御することで発現する液晶-ゲル転移の詳細を明らかにすることを目的とした。平成18年度では小角中性子散乱(SANS)実験より、膜の棒-ネットワーク転移において約26°C以下で安定なネットワーク構造が形成されている事が明らかになった。そこで平成19年度では、棒-ネットワーク転移を巨視的な観点から追うために線形領域での振動ずりによる粘弾性測定を行った。線形領域における振動ずりでの粘弾性測定において、パーコレーション転移の定義によるゲル化点では、貯蔵弾性率G'と損失弾性率G''が角周波数ωに対してG'(ω)^∝G''(ω)^∝ω^Δとなることが報告されている。実際のゼラチン水溶液のΔの値は試料の成分や濃度によってばらつきがあるが、Δ=0.460.81を示すと報告されており、MEにゼラチンを閉じ込めた系でのΔを求めたところ、29°CでG'とG''のべきが等しくなり、ΔはΔ≒0.64で、ゼラチン水溶液の値と同等の値になった。この結果、ME+ゼラチン系での系全体のゾル-ゲル転移が29°Cで始まる事がわかった。また前年のSANS実験結果より完全に膜構造が安定化するのが26°Cであったため、29°C以下では内包されたゼラチンの架橋が進行し、膜構造に影響を与えていると考えられる。一方ゼラチン水溶液のゼラチンの架橋は37°C以下で起こる事がわかっている。これら各階層での転移温度(ゾル-ゲル、棒-ネットワーク)の結果を併せて、閉じ込められたゼラチンの架橋が、マイクロエマルション同士の衝突による動的なパーコレーションをピン留めする役割を果たす事で、系全体にソルーゲル転移および膜の棒-ネットワーク転移を引き起こしていると考察した。本申請研究では、球状マイクロエマルションに高分子を閉じ込める複合系において、閉じ込めた高分子の会合状態を制御することで発現する液晶-ゲル転移の詳細を明らかにすることを目的としている。平成18年度では、球状マイクロエマルションに会合性高分子を閉じ込め、その会合温度前後で観測される構造変化を追跡した。具体的に研究対象となる系は、イオン性界面活性剤;Aeroso1-OT、水、イソオクタンを用い、会合性高分子としてはゼラチンを採用した。1-1)会合温度前後の膜構造変化における詳細構造は、小角中性子散乱法を用いて追跡した。得られた散乱曲線を会合温度前では回転楕円体で、また会合温度後の構造については共連続構造であるTeubner-Streyモデルを用いて解析したところ、いずれも良く合う事がわかつた。これより、膜内に閉じ込めたゼラチンの会合の有無により、膜構造は棒状から共連続状に転移する事が明らかとなった。1-2)系全体のゾルからゲルへの転移過程を粘弾性測定で追跡し、系のゲル化点を観測した。線形領域に於ける貯蔵弾性率(G')および損失弾産率(G'')の関係は、会合前のゾル状態ではG''>G'、系が完全にゲルとなった状態ではG''<G'となることが判明し、G'=G''の温度をゲル化温度;Tgと決めた。バルクにおけるゼラチンのTgは約30°Cであったが、ゼラチンを膜内に閉じ込めた系全体のTgは約26.5°Cであり、ゲル化点が低温側にシフトする事がわかった。このTgの変化に関しては、平成19年度に詳細に検討する予定である。
宿主共生におけるヒト腸管常在菌バクテロイデスの莢膜相変異の役割

Bacteroides fragilis YCH46株のゲノム上にはDNA逆位によってON/ OFF制御される計7箇所の莢膜生合成遺伝子領域が存在する。しかし、現時点では7種類の莢膜多糖のそれぞれがどのような組み合わせで発現制御されているのか、さらには腸管内でのどのような外的刺激・環境変化によって発現制御されるかは不明である。各locusの発現パターンは、理論的には2^7=128通りの組み合わせパターンが考えられるにもかかわらず、in vitroの培養系ではPS3領域のプロモーターのみがONになるクローンが全体の12%も占めた。また、B. fragilisPS3欠失株単独定着マウスでは野生株定着マウスと比べて小腸粘膜固有層におけるCD4^+ IL-4^+細胞数が約1/ 4に減少していた。1.mpi欠失変異株ライブラリーの作製現存するBacteroides fragilis Δmpi株(PS3およびPS6のプロモーターON向き)に完全長のmpi遺伝子をクローニングしたpVALmpiを導入することでmpi遺伝子をtransに相補した。得られたΔmpi(pVALmpi)株を非選択培地で経代培養することによってプラスミドの除去を行った。その結果、薬剤感受性クローンが1111株得られた。全てのΔmpi株についてMultiplex PCR法を用いてPS1、PS3、PS4、PS5、PS6.PS8およびPS9のプロモーターの向きを確認したところ、理論的には2^7=128通りの組み合わせパターンが考えられるにもかかわらず、ある一定の発現パターンへの偏りが認められた。特に、PS3領域のプロモーターのみがONになるクローンが全体の12%も占めた。また、PS3領域がOFFの場合は必ずPS8領域はONになった。一方、PS8領域がOFFの場合は必ずPS3領域はONであった。2.mpi欠失変異株のmRNA発現パターン得られたΔmpi株をGAM培地にて対数増殖期中期まで培養しtotal RNAを抽出した後、莢膜生合成遺伝子の転写発現パターンを定量的PCR法によって検討した。その結果、Δmpi No.820株(PS8のみプロモーターON向き)およびΔmpi No.805株(PS3のみプロモーターON向き)においては野生株と比較してプロモーターの向き通りの発現パターンを示した。ところが、Δmpi No.644株(PS8のみプロモーターOFF向き)ではPS8領域以外のPS1、PS3、PS4、PS5、PS6、およびPS9領域のプロモーターの向きはONで固定されているにも関わらずPS3,PS5,PS6領域の転写レベルは野生株と同等かそれ以下であった。また、Δmpi No.638株(PS3のみプロモーターOFF向き)でも、PS3領域以外のpS領域のプロモーターの向きはONで固定されているにも関わらず、野生株よりも転写レベルの上昇が認められたのはPS4とPS8領域だけであった。以上の結果より、莢膜の発現はMpiによるプロモーター領域のDNA逆位だけで制御されているのではなく、より複雑な制御メカニズムが存在することが示唆された。1.Bacteroides fragilis YCH46株のゲノム上にはDNA逆位によってON/OFF制御される計7箇所の莢膜生合成遺伝子領域が存在する。各locusの発現パターンは、理論的には2^7=128通りの組み合わせパターンが存在するにも関わらず、in vitroの培養系ではPS3領域のプロモーターのみがONになるクローンが全体の12%も占める。そこで、当菌株内で優先的に発現されると考えられるPS3に対する宿主腸管免疫系の反応を検討した。Balb/c無菌マウスにB.fragilis野生株あるいはPS3欠失株をそれぞれ1ヶ月間単独定着させた後、小腸・大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、CD4^+細胞のIFN-γ、IL-17、IL-10、IL-4の発現をフローサイトメーターで解析した。その結果、小腸粘膜固有層ではCD4^+IFN-γ^+細胞CD4^+IL-17^+細胞CD4^+IL-10^+細胞については、両菌株間で差は認められなかったが、CD4^+IL-4^+細胞数は野生株定着マウスと比べてPS3欠失株定着マウスで約1/4に減少していたまた、大腸粘膜固有層におけるCD4^+IL-4^+細胞数もPS3欠失株定着マウスで減少する傾向が認められた。さらに、小腸粘膜固有層におけるCD8α細胞が野生株定着マウスと比べてPS3欠失株定着マウスで約4倍増加していた。2.Balb/c無菌マウスにB.fragilis野生株あるいはPS3欠失株をそれぞれ1ヶ月間単独定着させた後、小腸上皮細胞間リンパ球を単離し、CD8αα細胞数をフローサイトメーターで解析した。
母体脳の刺激による胎仔脳ニューロン興奮性の長期変化の分子機構

私たちは、前年度において、in vivo whole cell recordingの方法を用いてラット胎仔脳の上丘ニューロンの電気活動を記録することができるようになった。本年度では、母体脳刺激による胎仔上丘ニューロンに対する影響を検討するための基礎実験として、主としてin vivo whole cell recordingを用いて上丘ニューロンの膜特性のデータを取った。さらに、このデータをもとに、母体視床下部刺激による胎仔上丘ニューロンの膜特性の変化について一部検討することができた。現在までに得られている結果は、以下のようである。1)妊娠後期のラットをウレタン麻酔し、膵帯で母体とつながった胎仔の上丘ニューロンに対してin vivo whole cell recordingを行った。2)胎仔上丘ニューロンの静止膜電位は、46-60mVであった。3)脱分極パルスによって誘発される活動電位の振幅は、31-48mVであった。活動電位の振幅の1/2の高さで測定した活動電位の幅は、8-25ミリ秒であった。4)母体の視床下部刺激後、活動電位の振幅は約15%増加し、活動電位の幅は約26%減少した。5)以上より、胎仔上丘ニューロンの膜特性は、母体視床下部刺激によって未熟型から成熟型に移行する可能性が示唆された。ウレタン痲酔(1.3/kg,i.p.)下で、妊娠ラット(20日目)は帝王切開を行い、露出した胎仔の頭部を固定した。胎仔の頭蓋骨を剥離し、大脳皮質の一部を露出した。ついで、whole cell recordingのためのガラス電極(先端の内径、1-2μm,電気抵抗、3-7MΩ)の内部を持続的に陽圧(50mmHg)にしながら、脳表面から脳幹腹側に向かって刺入した。電流クランプのもとで、本年度設備費で購入したアイソレーターを介して矩形波電流パルス(1Hz,0.05-0.2nA,30msec)を与え、電気抵抗の変化を観察しながら、電極先端を神経細胞膜に密着させ、ついでギガシールをするため減圧を行った。その後、細胞膜を負の電流パルス(15nA,1-10msec)で破壊しwhole cell recordingを実行した。本実験では、完全なギガシールに至らなかったが、静止電位の浅い記録を得ることができた。検索した胎仔脳幹神経細胞の65個中14個に対してwhole cell recordingを行なった。これらの記録には本年度設備費で購入したレコーダーとデータレコーダーを使用した。胎仔脳神経細胞の活動電位のdurationは長く(4-10msec)、また顕著な後過分極電位は見られなかった。このうち5個の神経細胞にたいして母体の視床下部電気刺激(1mA,20Hz,0.1msec)を3分間行い、活動電位の変化を観察した。その結果、母体刺激の30-120秒後から胎仔神経細胞の活動電位の振幅は発火頻度の減少とともに徐々に増加した。さらにそのとき後過分極様電位の出現が観察された。刺激終了後もこの反応は持続した。今後、パッチクランプ技術をさらに修練するとともに例数を増やし、長期抑制をひきおこす要因について詳細に研究していくことが必須である。1)妊娠後期のラットをウレタン麻酔し、睛帯で母体とつながった胎仔の上丘ニューロンに対してin vivo whole cell recordingを行った。

4)母体の視床下部刺激後、活動電位の振幅は約15%増加し、活動電位の幅は約26%減少した。5)以上より、胎仔上丘ニューロンの膜特性は、母体視床下部刺激によって未熟型から成熟型に移行する可能性が示唆された。
ペプチドチップ高度化にむけた高機能ペプチド捕捉分子群の創製

低コスト・汎用性のあるペプチドチップの創製を目標にして、タンパク質の構造特性、機能特性や微生物・細胞特性をハイスループットに解析するペプチドチップ開発のために、ファージ提示法や糖結合型ペプチドなどを駆使して高機能化ペプチド捕捉剤分子群を創製する基盤研究を実施した。ファージ提示法による高機能ペプチド捕捉分子群の開発、ファージ提示ペプチドチップの開発、糖結合ペプチド捕捉剤の設計・合成、および細胞相互作用するペプチド捕捉剤分子群の開発において所定の成果を得た。1.有用なペプチド性捕捉分子群の開発:ペプチド提示ファージ法による合成より多様な種類のペプチド群を創製するために、遺伝子のライブラリから探索していく分子生物学的手法による方法を導入した。M13ファージを用いたペプチド提示ファージ法により、βループ構造を有するデザインペプチド群を合成する方法を確立し、10^6個レベルのペプチドライブラリを構築した。2.ファージ提示ペプチドチップの創製:抗体結合ペプチド提示したファージをそのまま固定化する方法を種々検討し、抗体検出におけるファージペプチドチップ作製のための基盤構築を達成した。3.糖結合ペプチド捕捉剤の設計・合成:糖結合タンパク質を標的とした、単糖ペプチド捕捉分子を化学合成法により、約20種類設計合成し、これをチップ化するために必要なデザイン糖ペプチドとタンパク質との相互作用を詳細に解析した結果、特異的に強く結合するペプチドを獲得した。4.糖結合ペプチドナノ粒子捕捉剤の設計・合成:上記3の研究と関連して、単糖ペプチドを金ナノ粒子に結合させた捕捉剤を5種設計合成する研究を新たに追加して、合成法を確立した。5.細胞相互作用するペプチド捕捉剤分子群の開発:細胞解析チップが細胞の機能解析やガン細胞検査などにむけて注目されている。ペプチドチップの有用性を格段に向上させるために、細胞と相互作用し、細胞機能を解析できる機能化ペプチド捕捉剤分子群200種を設計合成した。細胞との相互作用を解析できるペプチドチップとしての有用性を評価するために、細胞毒性活性や細胞挿入活性評価システムの構築に成功した。1.ペプチド提示ファージ法による有用ペプチド捕捉分子群合成:より多様な種類のペプチド群を創製するために、遺伝子のライブラリから探索していく分子生物学的手法による方法を導入した。M13ファージを用いたペプチド提示ファージ法により、平成22年度にβループ構造を有するデザインペプチド群を合成する方法を確立した。これを用いて106乗107乗個レベルのペプチドライブラリを構築し、抗がん剤の標的タンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素に対してスクリーニングを行い、酵素ポケットに特異的に結合するβループペプチドリガンド群を獲得した。2.糖結合ペプチドナノ粒子捕捉剤の設計・合成:単糖ペプチドを金ナノ粒子に結合させた捕捉剤を多種設計合成する研究を新たに追加した。15種類の単糖ペプチド群を設計・合成し、40nmの金ナノ粒子(GNP)と複合化した、単糖ペプチド-GNP捕捉剤を合成した。単糖ペプチド-GNP群は、標的糖結合タンパク質をGNPの集合化を利用した目視検査を可能とし、また単糖ペプチド単体と比べて、1000倍以上の強い結合性を示した。3.細胞相互作用するペプチド捕捉分子群の開発:細胞解析チップが細胞の機能解析やガン細胞検査などにむけて注目されている。平成22年度に、ペプチドチップの有用性を格段に向上させるために、細胞と相互作用し、細胞機能を解析できる機能化ペプチド捕捉剤分子群200種を設計合成した。これらのリガンドを用いて、細胞との相互作用を解析できるペプチドチップとしての有用性を評価するために、構築した細胞毒性活性や細胞挿入活性評価システムにおいて、優れた性能を有するペプチド捕捉剤を獲得した。また、ペプチドの配列のわずかな違いにより細胞毒性活性や細胞挿入活性が大きく異なることを見出した。ペプチドチップ開発のために、以下のようにファージ提示法や糖結合型ペプチドなどを駆使して高機能化ペプチド捕捉剤分子群を創製する。1.ペプチド提示ファージ法による有用ペプチド捕捉分子群合成:平成22-23年度に確立したペプチド提示ファージ法による、βループ構造を有するデザインペプチド群の構築研究に基づき、種々のタンパク質をターゲットにした捕捉剤ペプチド群の創製を実施した。抗がん剤の標的タンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素や細胞表層レセプターに特異的に結合するβループペプチドリガンド群の獲得に成功した。2.新たな糖結合ペプチド捕捉剤の設計・合成:化学修飾反応と組み合わせた新規のペプチドファージ提示法の開発に成功し、研究期間を延長し、糖関連タンパク質を特異的認識ターゲットとする糖修飾ペプチドリガンド群の構築に成功した。3.細胞相互作用するペプチド捕捉剤分子群の開発:細胞解析チップが細胞の機能解析やガン細胞検査などにむけて注目されている。ペプチドチップの有用性を格段に向上させるために、細胞と相互作用し、細胞機能を解析できる機能化ペプチド捕捉剤分子群候補200種を平成22年度設計合成した。細胞との相互作用を解析できるペプチドチップとしての有用性を評価するために、これらペプチド群の細胞毒性活性や細胞挿入活性評価システム構築に成功した。