hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ブタ胚の体外発生およびCD44の発現に及ぼすグリコサミノグリカンの影響

1)体外成熟-体外受精(IVM-IVF)ブタ胚の発生およびCD44タンパクの発現に及ぼす種々のグリコサミノグリカン(GAGs)の影響ヒアルロン酸,コンドロイチン硫酸A,デルマタン硫酸あるいはへパリンをそれぞれ0.5mg/m添加した発生培地中でIVM-IVFブタ卵子を体外培養し,2細胞期,4細胞期,桑実期および胚盤胞期へと発生した胚のCD44タンパク発現をウエスタンブロット法で調べた。その結果,いずれのGAGs添加区においてもCD44タンパクの発現は,4細胞期および桑実期胚で高い傾向を示した。また,ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸A添加区における桑実期胚のCD44タンパク発現は他のGAGs添加区および無添加区に比べて高かった。ヒアルロシ酸およびコンドロイチン硫酸AがIVM-IVFブタ卵子の胚盤胞への発生を促進することを昨年度の本研究において明らかにしたが,それらの促進作用はCD44の発現と関連すると考えられた。2) IVM-IVFブタ胚の発生に伴うC[)44タンパク局在性の変化ブタ胚の発生とCD44タンパク発現の関連性について明らかにすることを目的とした。1)でCD44タンパク発現が高かったヒアルロン酸添加区で得られた2細胞期,4細胞期および桑実期へと発生した胚を定法によって切片を作成した。現在,金コロイド法を用いて各発生段階にあるIVM-IVFブタ胚におけるCD44タンパクの局在性の変化について検討中である。1.ブタ胚のCD44タンパク検出系の確立抗ヒト、マウス、ラットおよびウサギCD44抗体を用いてウエスタンブロット法を行った。その結果,ブタCD44検出系として抗マウスCD44抗体が有効であることが知られた。2.ブタ胚の発生に及ぼす種々のグリコサミノグリカンの影響体外成熟-体外受精ブタ卵子の胚盤胞への発生に及ぼす4種のグリコサミノグリカンの影響を調べた。0.5mg/mlヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸A,デルマタン硫酸あるいはヘパリンを添加したWhitten′s培地中で,体外成熟-体外受精ブタ卵子を6日間培養した。培養2日後,いずれの培地においても2128%の胚が正常に卵割し,24細胞期へと発生した。培養6日後,ヒアルロン酸添加区では14%が胚盤胞へと発生し,デルマタン硫酸添加区(5%)およびヘパリン添加区(2%)に比べて有意に高い値を示した。しかし,コンドロイチン硫酸A添加区(11%)との間には差は認められなかった。ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸Aを添加した発生培地において最も高い胚盤胞への発生が認められたことから,体外成熟-体外受精ブタ卵子の胚盤胞への発生におけるヒアルロン酸あるいはコンドロイチン硫酸Aの至適濃度を調べた。0,0.05,0.1,0.5あるいは1mg/mlヒアルロン酸あるいはコンドロイチン硫酸Aを添加したWhitten′s培地中で,体外成熟-体外受精ブタ卵子を6日間培養した。その結果,胚盤胞への発生率は,0.5mg/mlヒアルロン酸添加区(17%)および0.1あるいは0.5mg/mlコンドロイチン硫酸A添加区(10あるいは9%)において最も高い値を示した。以上の結果から,ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸Aは体外成熟-体外受精ブタ卵子の胚盤胞への発生を促進することが明らかとなった。
硝化グラニュールを用いた窒素含有廃水の高効率処理技術の開発

前年度までの結果を踏まえて、硝化グラニュール内で優占化しているNitrosomonas mobitisマイクロクラスターの物理的強固さに関与するタンパク質の同定を行った。N. mobilisを2L×5フラスコのスケールで純粋培養を行った。培養液中には肉眼でも確認可能な大きさの細胞集塊が確認された。N. mobilisと同じアンモニア酸化細菌であるNitrosomonas europaeaの純粋株も並行して培養を行っていたのだが、興味深いことにN. europaeaでは細胞集塊は確認されなかった。純粋培養したN. mobiltsを採取し、孔径5μmのフィルターでシングルセルとマイクロコロニーを分離した。分離の精度はフローサイトメーターを用いて確認した。分離したシングルセルおよびマイクロコロニーからそれぞれ全タンパクを抽出した。まず、それぞれのタンパクをSDS-PAGEで解析を行ったところ、100kDa付近および25kDa付近にマイクロコロニー特有のバンドが見られた。同じ純粋株であっても形態の差異が発現タンパクの差異にもなっていることがわかった。これまでの結果より、予想通り、マイクロコロニーに特有なタンパク質が存在する事が明らかになった。さらにタンパク分離の精度を高めるために二次元電気泳動(2D-PAGE)を行った。その結果、マイクロコロニーに特有のバンドが複数確認された。これらのタンパク質の中にマイクロコロニーの物理的強固さに関与するものが含まれていると予想している。当初の予想通りに、N. mobilisマイクロクラスター特有のタンパク質が検出された。N. mobilisマイクロクラスター特有のタンパク質のバンドを解析する。得られた遺伝子を大腸菌あるいはN. mobilisに形質転換し、機能を確認する。硝化細菌グラニュールの複合微生物系からタンパク質を抽出し、細菌細胞間接着に関わるタンパク質の探索を行った。しかしながら複合微生物系サンプルからのタンパク質のバンドは非常に多岐にわたり、差異をひとつずつ解析することは事実上不可能であると判断した。そこで、硝化グラニュール形成メカニズム解明の第一段階として、硝化グラニュール形成に寄与する事が示唆されているアンモニア酸化細菌(AOB)であるNitrosomonas mobilisの純菌株の取得を試みた。N. mobilisの分離培養に関して、多くのAOBがそうであるように、N. mobilisも難培養性細菌であることが知られている。そこで、Fluorescence activated cell sorting(FACS)を用いた難培養性細菌の新規分離培養手法に着目した。本手法を用いてN. mobilisの単離を行った。具体的には、硝化グラニュールを超音波ホモジナイザーにより軽く分散後、孔径35μmのフィルターを通過した細菌含液をFACS解析に供した。FACSでは解析対象の大きさを示す前方散乱光(FSC)を指標としてN. mobilisの分取を行った。その結果、比較的粒径の大きいものが分取される分画のサンプルで、N. mobilisが分離されていることが示唆された。N. mobilisの分離培養の成功に近づいたことは、グラニュール形成メカニズムの直接的な要因を見いだす可能性が飛躍的に高まる重要な進展であると考えられる。直径400μm程度の硝化グラニュールを採取し、Propidium Iodide(PI)およびfluorescein isothiocyanate(FITC)の蛍光試薬を用いて、核酸およびタンパクをそれぞれ染色した。その結果、硝化グラニュールはタンパクによって覆われているのに対し、硝化グラニュール以外の分散状態の細菌はタンパクに覆われていないことがわかった。さらにタンパク分解酵素(プロテアーゼ)で硝化グラニュールを処理した結果、硝化グラニュール表面のタンパクの消失が確認された。プロテアーゼ処理前および後の硝化グラニュールに超音波により物理的な破砕を行うと、プロテアーゼ処理後のサンプルは分散することがわかった。また、近年、細胞外DNA(eDNA)が細菌間の接着に寄与しているという報告が相次いでいる。そこで、硝化グラニュールをPIおよび[7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one)](DDAO)の蛍光試薬を用いて、核酸およびeDNAをそれぞれ染色した。しかし、硝化グラニュール表面にeDNAの存在は認められなかった。また、DNA分解酵素であるDNaseで硝化グラニュールを処理したサンプルは、硝化グラニュールの分散が確認されなかった。以上より硝化グラニュールの物理的な強固さは、硝化グラニュール表面に存在するタンパクによるもの、ということが明らかになった。

これまでの結果より、予想通り、マイクロコロニーに特有なタンパク質が存在する事が明らかになった。さらにタンパク分離の精度を高めるために二次元電気泳動(2D-PAGE)を行った。その結果、マイクロコロニーに特有のバンドが複数確認された。これらのタンパク質の中にマイクロコロニーの物理的強固さに関与するものが含まれていると予想している。複合微生物系での解析から、純菌株を分離培養して解析する方向に転換した。純菌株での解析では複合微生物系よりも、より直接的なデータを得る事が出来る。対象とした細菌は難培養性であったが、共同研究先の新規手法によって純菌株の分離培養に概ね成功している。分離培養の成功はこの研究計画全体を成功へと強く導く非常に大きな成果である。研究計画立案当初は、硝化グラニュールの物理的強度はタンパクの寄与による、というのは状況証拠による仮説の段階であった。今年度の成果によりこれが立証され、今後のタンパク同定への道筋がついた。当初の予想通りに、N. mobilisマイクロクラスター特有のタンパク質が検出された。得られた純菌株を用いて、まずはgenome解析を行い、細菌細胞間接着に関与している遺伝子を探索する。見いだした遺伝子をクローニングし大腸菌に形質転換する。大腸菌にクラスター形成能が付与されることを確認して、本遺伝子をクラスター形成因子、すなわちグラニュール形成因子と断定する。また、genome情報は、必要に応じて行うその後のproteomeの情報プラットフォームとなる。昨年度に引き続き、硝化グラニュールの形成に寄与していると考えられているNitrosomonas mobilisの単離も並行して行っている。今後は、硝化グラニュール(複合系)およびNitrosomonas mobilis(純菌系)の両者で、膜タンパクのプロテオーム解析を行い、硝化グラニュールの物理的な強固さに寄与するタンパクの同定を行う。N. mobilisマイクロクラスター特有のタンパク質のバンドを解析する。得られた遺伝子を大腸菌あるいはN. mobilisに形質転換し、機能を確認する。
非平衡中間体を経由する高分子結晶化と高次構造制御

種々の高分子系について、その結晶化過程に生成する非平衡中間体の構造、生成過程、さらにはそれら中間体からの結晶化について、小角.広角X線散乱、小角.広角中性子散乱、光散乱等を用いて調べた。その結果、相互作用の強いポリアミドでの結晶化誘導期の構造形成にはメルトメモリー効果が大きく関与することを明らかにした。流動結晶化においてはシシケバブ前駆体が結晶を含むことをマイクロビームX線により始めて明らかにするとともに、シシケバブ生成に対する分子量効果を詳細に調べ、シシケバブ生成機構の詳細を示した。さらに、アイソタクチックポリプロピレンのメゾ相からの結晶化について、昇温速度を広い範囲で変化させることにより、巨大単結晶形成法を示した。これらは、非平衡中間体を経由する結晶化機構についての新たな知見をももたらすと同時に新たな高分子構造制御への道を開くものである。高分子材料は金属材料、セラミック材料とならび3大材料の一つであり、我々の身の回りにはなくてはならない材料である。高分子は大きく結晶性高分子と非晶性高分子に分類でき、ともに材料としての特性があり重要である。特に、結晶性高分子の場合はそのナノメートルからマイクロメートルスケールの高次構造が物性に大きく影響を及ぼすことが知られており、その制御は該当分野の大きな課題である。我々は結晶性高分子のみならず非晶性高分子の構造形成について、非常に広い空間スケールでその構造形成について調べ、高分子結晶化過程において、結晶化誘導期におけるスピノーダル分解型構造形成に代表される「非平衡中間相」を経由する新たな結晶化機構が存在することを見いだした。本申請では、種々の非平衡中間相を経由する結晶化機構を系統的に明らかにし、高分子結晶化における新たなパラダイムを示す。同時にこのような結晶化ルートを用いて、結晶化以前の非晶構造を「非平衡中間相」により制御し、新たな高分子結晶高次構造制御方法を開拓することを目的とする。平成20年度は、種々の結晶化過程で出現する非平衡中間相について、量子ビームを中心に用いた精密構造解析による研究を推進した。一つは、ナイロンなど水素結合による強い相互作用を示す系での結晶化誘導期に生成する非平衡中間相について調べ、強い相互作用のため融点以上でももとの構造を強く保持し、それが結晶化の前駆体として働きマイクロメートルの構造形成に強く影響を及ぼすことを明らかにした。この構造は生成するナイロンの透明性を強く支配しており、実用的な面からも非常に大きな意味を持つと考え、今後高温でも生き残る非平衡中間体を制御できる手段を明らかにする予定である。2つ目は、流動誘起非平衡中間相に関するもので、特にアイソタクチックポリスチレンについて研究を進め、融点よりもはるかに高い温でも流動に誘起され中間相が生成し、冷却した際にはそれが結晶核として働き、結晶配向構造を大きく支配することを示した。ここでできる構造は太さが数ミクロンから数十ミクロンであり、長さは数百ミクロン以上にもおよぶ巨大なものである。現在、現象としてはかなり明らかになってきたが、その生成機構や安定化機構に付いて不明な点多く、来年度はその解明が主体となる予定である。さらには、共同研究者である西田准教授を中心にしてポリブチレン-2,6-ナフタレートに関して新たな安定な非平衡中間相を発見したことである。本研究はまだ始まったばかりであるが、以前から研究を進めているアイソタクチックポリプロピレンのメゾ相同様に、本中間相を経由した結晶化においてはこれまでにない特異なモルフォロジーが予想でき、種々の温度条件を探索しながら新たな物性をもつ結晶モルフォロジーの発見に努める。本研究では、高分子材料の物性向上と機能化を目的として、種々の非平衡中間相を経由する結晶化機構を系統的に明らかにし、同時にこのような結晶化ルートを用いて、結晶化以前の非晶構造を「非平衡中間相」により制御し、新たな高分子結晶高次構造制御方法を開拓することを目的としている。本年度の成果としては、強い水素結合を有するポリアミド系の結晶構造における,メルト状態の構造記憶効果について調べ、水素結合を通して刷り込まれた過去の構造記憶は平衡融点以上の高温で溶融しても非常に長時間残ることが明らかになった。この現象を利用すると重合直後に記憶を埋め込むことにより、その後の構造生成のルートをを初期に与えることができ、新たな構造制御の方法になり得ることが示された。また、流動に誘起される中間体生成の研究では、平衡融点以上において通常の方法では観察できない配向構造が存在することが明らかになった。この構造は、適切なクエンチをすることにより高次構造の前駆体(鋳型)として働くことも明らかになった。

すなわち、これらの前駆体構造の制御とクエンチによる生成物の関係を定量的に明らかにすることにより、新たな高次構造制御のルートが開拓できると期待できる。さらに、アイソタクチックポリプロピレン(iPP)やポリ(ブチレン-2,6-ナフタレート)において生成するメゾ相については、作成の条件とメゾ相のミクロンスケールの構造との相関を明らかにした。メゾ相からの結晶化過程での構造形成においては、昇温速度が大きく構造に影響を与えることが明らかになり、その詳細の解明が新たな高次構造形成のルーチになり得ることが示された。結晶性高分子の場合はそのナノメートルからマイクロメートルスケールの高次構造が物性に大きく影響を及ぼすことが知られており、その制御は該当分野の大きな課題である。本申請では、種々の非平衡中間相を経由する結晶化機構を系統的に明らかにし、高分子結晶化における新たなパラダイムを示すと同時にこのような結晶化ルートを用いて、結晶化以前の非晶構造を「非平衡中間相」により制御し、新たな高分子結晶高次構造制御方法を開拓している。平成22年度においては、中性子散乱に供する試料の作成が間に合わず、経費の繰り越しを行ない試料の作成を行なった。しかしながら、平成23年3月11日に起こった東日本大震災の影響で日本における2つの中性子散乱施設(J-PARC/MLFおよびJRR-3)も大きく被災し、残念ながら中性子散乱実験は実施できなかった。これは、今後研究室の発展的テーマとして継続する。しかし、ながら放射光X線のマイクロビームを用いた流動誘起結晶化における中間体の研究においては、大きな進展があった。すなわち、融点以上の高温において、μmスケールの流動誘起結晶の前駆体が生成することは以前に我々の研究室で明らかにしば、その内部構造をマイクロビームを用いて調べることにより、非常に微量ながら大きな配向結晶が存在することが明らかになった。さらに、この配向結晶は融点以下の温度にクエンチすることによりシシケバブの生成の核となることが示された。このことは、シシと考えられている伸張鎖結晶が実は流動が働かなくとも、前駆体が存在すれば自発的に成長することを示唆しており、これまで全くのミステリーであった流動誘起結晶化機構の解明の糸口を示すもものであり、大きな発見である。本申請では、種々の非平衡中間相を経由する結晶化機構を系統的に明らかにし、高分子結晶化における新たなパラダイムを示す。同時にこのような結晶化ルートを用いて、結晶化以前の非晶構造を「非平衡中間相」により制御し、新たな高分子結晶高次構造制御方法を開拓している。本年度の大きな進展は、水素結合による相互作用の強いポリアミドで、非常に強いメモリー効果について調べ、その効果の定量的把握を行なったことである。その結果、ポリアミド-6では、平衡融点以上の高温において長時間(数時間)アニールしてもそのメモリー効果が消去されることはなく、アニールの途中過程において様々な非晶中間状態が存在することが示唆された。さらに、成形加工過程で重要となるせん断流動のメモリー効果についても定量的に調べた結果、μmからnm二おける距離スケールにおいては配向が残ることはなかったが、結晶化速度に対するメモリー効果は大きく残り、非常に局所的なスケールでの強固な配向効果が残りそれに対応する新たな非晶中間状態が存在することが強く示唆された。
細胞骨格ダイナミクスに基づく分子輸送制御システムの解明と革新的癌創薬への新展開

前立腺癌を含む各種癌疾患に対する新規治療法の開発は癌治療の分野で喫緊の課題であり、学術的に新しい切り口での癌創薬が求められている。本研究では、前立腺癌の悪性進展とAndrogen不応性のKeyとなるシグナル分子群の細胞内輸送における知見を踏まえ、癌細胞を中心とする各種細胞において、REIC/Dkk-3、SGTA、Tctex-1、Dyneinモーター、Dynaminおよび細胞骨格因子が関わる細胞内分子輸送システムの制御機構を解明する。本研究では、前立腺癌の悪性進展とAndrogen不応性のKeyとなるシグナル分子群の細胞内輸送における独自の観点から、REIC/Dkk-3、SGTA、Tctex-1、Dyneinモーター、Dynaminおよび細胞骨格因子が関わる細胞内分子輸送システムの制御機構を解明する。また、この独自戦略に基づき新規治療標的タンパク質群を同定、前立腺癌およびその他癌種に対する革新的な癌創薬へと発展させる。アンドロゲン療法抵抗性前立腺がんという臨床的にも大切な分野での治療法の開発に繋がる可能性が示唆されており、その成果が期待される研究である。他の固形癌への波及効果も期待出来る。更には細胞内輸送に関する細胞生物学への発展に繋がることが期待され、細胞生物学的な意義も認められる。
近代日本の計量関係実物資料の成立過程の研究

1.実物資料(i)長さ計熱膨張率測定器を設計試作し,明治初期の折衷尺,量地尺について実測し,17×10^<-6>/°Cの妥当な値を得た(日本初の実測結果).(ii)質量(1)幕末渡来のオランダ系,(2)明治期の貫系,(3)昭和初期のキログラム系,それぞれの分銅群および(4)江戸期・後藤家の基準分銅群の質量を精密に実測し,系列としての不確かさを検証した.また,後藤家の基準分銅群の一部については分銅の体積も実測し,密度を算出した.(iii)体積昨年度は京枡の基準枡「御本枡」について実測を行ったが,今年度は「御本枡」以外の京枡および特徴ある地域(高田藩,藤堂藩,紀州,甲州,沖縄など)の枡の内容積を実測した.(1)京枡については昨年度より更なる考察を加えることが出来た.昨年度は当時枡作製に使われた物差し1尺の長さを考察したが,実測した古尺の精度を考えると,それぞれの枡の縦と横の長さの違いは枡作製時の誤差と考えられるという結論に達し,「御本枡」については枡に刻まれた寸法通りに作られ,それ以外の京枡においては内容積を一定にするために深さが調整されたものと考えられる.(2)地方の1升枡については実測した殆どの枡の内容積が京枡と変わらないように作られていた.枡の縦と横の長さについても考察を進めた.(3)沖縄の粟を測る1合枡は普通の1合枡と違って縦と横の長さが大きく,深さが浅い特殊な枡であった.2.地域研究沖縄北海道およびフランス(i)沖縄につき先年度に聴取した歴史情報の考察を進めた.(ii)北海道の開拓期以来の計量制度の変遷を実地に調査した.(iii)先年度の成果に加えてパリ天文台,マルセイユ博物館の文書および実物を点検し,メートル法計量の起原に関し新知見を得た.3.文献研究北海道大学附属図書館と北海道開拓記念館で,幕末・明治期の文献を閲覧し,複写した.維新期・開拓期の計量の思想・実技の情報を得た.1.実物資料(i)長さ計熱膨張率測定器を設計試作し,明治初期の折衷尺,量地尺について実測し,17×10^<-6>/°Cの妥当な値を得た(日本初の実測結果).(ii)質量(1)幕末渡来のオランダ系,(2)明治期の貫系,(3)昭和初期のキログラム系,それぞれの分銅群および(4)江戸期・後藤家の基準分銅群の質量を精密に実測し,系列としての不確かさを検証した.また,後藤家の基準分銅群の一部については分銅の体積も実測し,密度を算出した.(iii)体積昨年度は京枡の基準枡「御本枡」について実測を行ったが,今年度は「御本枡」以外の京枡および特徴ある地域(高田藩,藤堂藩,紀州,甲州,沖縄など)の枡の内容積を実測した.(1)京枡については昨年度より更なる考察を加えることが出来た.昨年度は当時枡作製に使われた物差し1尺の長さを考察したが,実測した古尺の精度を考えると,それぞれの枡の縦と横の長さの違いは枡作製時の誤差と考えられるという結論に達し,「御本枡」については枡に刻まれた寸法通りに作られ,それ以外の京枡においては内容積を一定にするために深さが調整されたものと考えられる.(2)地方の1升枡については実測した殆どの枡の内容積が京枡と変わらないように作られていた.枡の縦と横の長さについても考察を進めた.(3)沖縄の粟を測る1合枡は普通の1合枡と違って縦と横の長さが大きく,深さが浅い特殊な枡であった.2.地域研究沖縄北海道およびフランス(i)沖縄につき先年度に聴取した歴史情報の考察を進めた.(ii)北海道の開拓期以来の計量制度の変遷を実地に調査した.(iii)先年度の成果に加えてパリ天文台,マルセイユ博物館の文書および実物を点検し,メートル法計量の起原に関し新知見を得た.3.文献研究北海道大学附属図書館と北海道開拓記念館で,幕末・明治期の文献を閲覧し,複写した.維新期・開拓期の計量の思想・実技の情報を得た.1、研究の目的:近代日本の計量関係実物資料の調査を行い、これらの実物資料を実測することから文献上の記載との間に脈絡を付ける。そして尺貫法からメートル法に至る経緯を探る。2、研究経過:8月に科学博物館新宿分館に三次元測定器(30cmまで0.5μmの細かさで測定可能)を搬入・設置した。秋に科学博物館保管の大蔵省度量衡改正掛(明治3年)蒐集の古尺群を測定し、暮に伊能忠敬記念館から借用した忠敬使用の尺度2本を慎重に測定した。11月15年2月四日市秤乃館、駿府はかり資料館および九州地方9つの博物館を調査し、多数の古尺、古枡を点検、重要な実物を借用し、現在測定中である。

三次元測定器の調整に万全を期し、古尺を精密かつ慎重に測定したため、古枡測定は予備段階に留まった。1月メートル法についてフランスへ調査に行った。3、古尺の測定結果:明治初期の基準尺として代表される、内田五観所蔵の享保尺(吉明)、木匠尺(規行)、又四郎尺(規周)、折衷尺(規行)および伊能尺2本の20°Cでの実測結果。伊能尺では、無銘尺:303.40mm、田中製尺:303.33mmの値を得た。伊能尺は1909年に測定されており、それと較べて田中製尺はやや違った値を示した。無銘尺は基準線から目盛られているが、田中製尺は端面から目盛られ、かつ端面のエッジはすり減っていた。今回の測定では田中製尺は端面から目盛ってある最初の1寸を除き、9寸の全長を測定し、1尺の長さを割り出した。内田五観所蔵の享保尺:303.68mm、木匠尺:302.44mm、又四郎尺:302.61mm、折衷尺:303.11mmと、納得できる値を得た。内田によれば、伊能忠敬は全国測量に際し、享保尺と又四郎尺とを折衷して折衷尺を作り、測量の基準尺として用いたという。しかし、実測によれば、伊能尺は折衷尺からずれた値を示している。これだけから伊能尺が折衷尺でないと判定できない。他の角度からの調査も必要と考える。1.研究の目的:近代日本の計量関係実物資料の調査を行い,これらの実物資料を実測することから文献上の記載との間に脈絡をつける.そして尺貫法からメートル法に至る経緯を探る.2.研究経過:本年度は,昨年度に四日市秤乃館,静岡駿府はかり資料館および九州地方6つの博物館から借用した多数の古尺および古枡を実測した.8月に音響式体積計を科学博物館新宿分館に設置した.現在整備し,試用中である.2004年1月に京都歴史資料館に行き,京枡の基準となる原器(御本枡)を調査した.今年度後半には,これまで計量史学会,科学博物館で調査した計量器のデータを補訂編集し,刊行した.3.古尺および古枡の測定結果:(1)秤乃館の竹製の念仏尺.この念仏尺には狭間隔の目盛りと広間隔の目盛りの2通りの目盛りが刻まれていた.実測の結果,狭間隔の目盛り1尺は曲尺相当の値(折衷尺に近い値)を示し,広間隔の目盛りは其の鯨尺の値を示していた.そして広間隔の目盛は駿府はかり資料館所蔵の念仏尺とほぼ同じ値を示していた.従来は曲尺相当の物差しが念仏尺と言われてきたが,その鯨尺もまた念仏尺と呼ばれていることがわかった.(2)武雄歴史資料館所蔵のビーカーは4進法の目盛が施されており,幕末期にオランダから輸入されたものである.この目盛がどの国の単位に由来したものか文献との対比による推定が進められた.(3)古枡については九州地方の博物館から借用された古枡と科学博物館保管の古枡を測定した.方4寸9分,深さ2寸7分の京枡もいくつか見られたが,大半は明治以降の度制が敷かれた後の枡であった.枡の基準となる1升枡について京枡と判明できるものは4例あった.それらの容積は実測の結果,1776.101812cm^3の範囲でばらついていた.これらの容積は京枡の基準枡と較べると1例以外は小さな値であった.1.本年度研究経過:(1)メートル法の基礎となった子午線に関わる古典書、Mechain etDelambre : Base dusystememetrique decimal. Paris(1806-10)を購入。西田が渡仏して、メートル法の基礎となったドランブルとメッシェンの子午線測定に関わる調査を行った。(2)京都市歴史資料館から京枡の基準枡、御本枡1升を借用し、実測した。沖縄県立博物館、四日市秤乃館、福井市立郷土歴史博物館等の古枡、古尺を実測した。(3)古分銅の質量測定のため、メトラーの電子天秤(マスコンパレーター)を購入。科学博物館新宿分館へ設置。(4)オランダ古典書:Schouwtoneel der Natuur(プリーシュ:「自然の景観」の蘭訳)を購入。温度計に関する項目を高田が閲読し、江戸時代後期、平賀源内が温度計を製作したときに使われた液体はアルコールであると推論した。2.研究成果:(1)西田の調査
糖鎖バイオマーカーを組み合わせた非侵襲的診断法の確立

研究室で開発してきた糖鎖バイオマーカー、フコシル化ハプトグロビンの測定を、これまではレクチンー抗体ELISA法で行ってきた。独創的なスクリーニング法によって、フコシル化ハプトグロビンそのものに対する糖鎖抗体の樹立に成功し、がんバイオマーカーとしての有用性と膵がんの肝転移組織でフコシル化ハプトグロビンが多く産生していることを見出した(Oncotarget 9, 2018)。フコシル化ハプトグロビンが異常低値であるがん患者が10%程度存在することに気づき、ハプトグロビンの遺伝子型を調べたところ、Hpt1-1ではフコシル化ハプトグロビンを測定できないことがわかった。Hpt1-1を除いた場合、フコシル化ハプトグロビンのバイオマーカーとしての有用性が高くなることを、ROC解析によって証明した(Clin. Chim.Acta 487, 2018)。膵がん患者の膵液中にEnterococcus Feacalisが高頻度で存在することを発見し、実際の膵がん組織でこの細菌が存在すること、膵疾患患者においてこの細菌の外膜多糖(CPS)に対する抗体が増加していることを証明した(BBRC 506, 2018)。慢性膵炎や膵がんの病態進展に、細菌感染が関与することを示唆する論文で、発表した学生が大学内の優秀論文賞に選出された。がんにおける糖鎖異常は、細胞内の膜タンパク輸送の異常に関連していることを以前から仮説として考えている。Rab11のKO細胞では一部のタンパクの糖鎖構造が大きく変化し、最近Rab11の結合する新規タンパクRELCH/KIAA1468の同定と生物学的機能解析に成功した(J Cell Biol. 217, 2018)。他分野融合研究として、前立腺癌のバイオマーカーPSA糖鎖異常の検出系を共同開発したり、マウス内耳の糖鎖構造の解析を行った(Sci Report in press)。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、糖鎖解析技術を用いて、消化器疾患を中心に糖鎖バイオマーカーを開発し、非侵襲的な診断法を開発することを目的とする。また単一のマーカーだけではなく画像診断も含めた、組み合わせにより診断効率をあげることを目指す。まず慢性膵炎の新しい糖鎖バイオマーカーとして、PhoSL Hptを見出し、論文にアクセプトされた(Ueda et al, Pancreatology 2016)。このデータをもとに、人間ドックにおける潜在性慢性膵炎の抽出を検討している。現在の慢性膵炎診断のガイドラインでは、生化学検査(アミラーゼやリパーゼなど)はグレードCにとどまり、他の糖鎖マーカー、さらには画像検査を含めた総合的な評価が必要と考えられる。フコシル化ハプトグロビンやフコシル化Mac-2bpに対する糖鎖抗体を作成し、そのCharacterizeを行った。特許の関係で詳細は記載できないが、抗体の中には免疫染色に使うことができるものもあり、これまで行ってきた研究の仮説を実証できるツールとして期待される。前立腺がん患者の尿中PhoSL反応性PSAが、組織学的に進行した症例では有意に低下し、前立腺生検を行うか否かを決定できる指標となる可能性が有る。以上の結果を論文に公表した(Fujita et al, Oncotarget 2016)。慢性膵炎の診断ツールとして、成果には書ききれないほどの新しいマーカーを発見した。膵臓の生検ができない本疾患において、複数のバイオマーカーを組み合わせることは重要と考えられ、今後AI技術の進歩により革新的な診断法につながる可能性がある。NAFLDの診断においても、あまりにも多くの患者がいる脂肪肝に対して肝生検を行うのは不可能で、バイオマーカーによる診断は必須と思われる。我々が開発した糖鎖バイオマーカーは、世界的に報告されているどのマーカーよりも優れていて、今後実際の診断まーかーとして保険収載まで期待できる。マウスMac-2bpのELISA kitは、すでに企業から販売されるようになった。今後、様々なNASHの治療薬が開発されると思われるが、動物実験で薬剤の有用性を経時的に評価できる重要なツールとして期待できよう。最後の尿中PhoSL反応性PSAに関する研究は、現在人間ドックで最も問題となる不必要な前立腺がんの精密検査(生検)を回避できる新規バイオマーカーとして期待される。初年度にもかかわらず、本研究課題に関する論文が3本以上書けたことは、研究が順調に進んでいることを示す。現在まで膵がんやNASHの糖鎖バイオマーカーとしてフコシル化ハプトグロビンの研究を行っている。フコシル化ハプトグロビンを検出する方法として、AALもしくはPhoSLとハプトグロビン抗体を用いたレクチンー抗体ELISAを用いてきた。しかし、PhoSLの場合はアッセイ系の感度が少し低い傾向にあった。そこで、PhoSLレクチンの特徴を生かし、尿素を入れたアッセイ系で再検討すると、膵がん診断のマーカーとしての感度が上昇した(Glycoconjugate J)。糖鎖マーカーの1つフコシル化Fetuin Aが、胆管がんのバイオマーカーとなることを海外のグループとの共同研究によって発表した。(Proteomics Clin. Appl.)膵臓の脂肪沈着が、膵星細胞の再活性化を誘導し、膵臓の慢性炎症と線維化進展に関与することを、ヒト膵臓組織の病理学的な解析と細胞実験の結果から証明した(Pancreas)。

これまで行ってきた炎症性腸疾患の病態進展における糖鎖の役割と、糖鎖解析技術を用いた新しい膵がんのワクチン治療に関する研究を総説としてまとめた(J Biochemistry)。これまでの糖鎖バイオマーカーのアッセイ系で、少し問題となっている課題を解決することができた。通常のタンパク質は尿素で変性するが、PhoSLは酸や温度にも強いレクチンである。この特徴を生かして、PhoSL ELISAを改良できた点は非常に大きい。M2BPGiは、肝臓の線維化マーカーとして保険適応されている。確かにC型慢性肝炎の非侵襲的線維化バイオマーカーとしては非常に優れているが、NAFLDにおいてはその値がかなり低値をしめす。むしろ糖鎖変異体でないMac-2bpタンパクそのものを評価したほうが、早期のNAFLD診断には重要であることを示した意義は大きい。健診受信者の脂肪肝患者で20%以上が、既に線維化進展が始まっているという結果は驚くべきものだった。NAFLD病態は非常に複雑で多岐に及ぶと言われているが、逆にMac-2bpのような単一バイオマーカーで評価したほうが、シンプルでよりわかりやすいのかもしれない。フェツインAは、10年以上前に私たちの研究室でフコシル化標的タンパクとして見つかったものである。そのフェツインAが胆管がんのバイオマーカーとなるということを海外のグループが証明した意義は大きい。こうした新しい糖鎖バイオマーカーの発見や評価だけでなく、これまでの糖鎖関連の病態生理に関する研究が総説として世に輩出できたことに満足している。研究室で開発してきた糖鎖バイオマーカー、フコシル化ハプトグロビンの測定を、これまではレクチンー抗体ELISA法で行ってきた。独創的なスクリーニング法によって、フコシル化ハプトグロビンそのものに対する糖鎖抗体の樹立に成功し、がんバイオマーカーとしての有用性と膵がんの肝転移組織でフコシル化ハプトグロビンが多く産生していることを見出した(Oncotarget 9, 2018)。フコシル化ハプトグロビンが異常低値であるがん患者が10%程度存在することに気づき、ハプトグロビンの遺伝子型を調べたところ、Hpt1-1ではフコシル化ハプトグロビンを測定できないことがわかった。Hpt1-1を除いた場合、フコシル化ハプトグロビンのバイオマーカーとしての有用性が高くなることを、ROC解析によって証明した(Clin. Chim.Acta 487, 2018)。膵がん患者の膵液中にEnterococcus Feacalisが高頻度で存在することを発見し、実際の膵がん組織でこの細菌が存在すること、膵疾患患者においてこの細菌の外膜多糖(CPS)に対する抗体が増加していることを証明した(BBRC 506, 2018)。慢性膵炎や膵がんの病態進展に、細菌感染が関与することを示唆する論文で、発表した学生が大学内の優秀論文賞に選出された。がんにおける糖鎖異常は、細胞内の膜タンパク輸送の異常に関連していることを以前から仮説として考えている。Rab11のKO細胞では一部のタンパクの糖鎖構造が大きく変化し、最近Rab11の結合する新規タンパクRELCH/KIAA1468の同定と生物学的機能解析に成功した(J Cell Biol. 217, 2018)。
聴覚野における和音・不協和音識別のメカニズム

和音とは基音(F0)の整数倍の倍音の組み合わせからなり、和音を聴くと、その中にF0が含まれていない場合でもF0を知覚するので、F0応答を手掛かりに和音の識別メカニズムを探索することができる。我々はマウス聴覚野のF0に対する応答を経頭蓋フラビン蛋白蛍光イメージングによって可視化した。さらにこのF0応答の生ずるメカニズムを解析したところ経験依存的に形成された皮質内回路の働きによるものであることが判った。マウス大脳皮質の経頭蓋フラビン蛋白蛍光イメージングで聴覚野の音に対する応答を解析すると、音の高さに応じて応答する部位が異なるTonotopic Mapが確認された。20kHzの音と25kHzの音のように比較的簡単な周波数比で表せる和音を聞かせると、応答が5kHz(20kHzと25kHzの最大公約数)に対応する部位まで広がった。しかし、19kHz+26kHzのように簡単な比で表せない不協和音の場合は応答部位が低周波数側に広がる現象は生じなかった。我々は、聴覚野内の20kHzと25kHzに応ずるニューロン群が経験依存的に形成された皮質内結合を介して5kHzに相当する領域を駆動すると考えている。即ち、動物の鳴き声など自然界に存在する音は、基本周波数とその整数倍の周波数からなることが多いので、至適周波数が整数比で表される一連のニューロンは同期して発火する確率が高く、その結果として経験依存的な結合が形成され得る。この仮説を検証するため、20kHzと25kHzの聴覚野領域をフラビン蛋白の退色を利用して経頭蓋的に光不活化した。このとき5kHzを直接聞かせたときの聴覚野の応答は抑圧されないが、20kHzと25kHzの音を同時に聞かせたときの5kHzの脳部位の応答が消失した。この結果は皮質内神経回路によって5kHzの領域が駆動されていることを示唆している。さらに19kHz+26kHz+5kHzの混合音に曝して飼育したマウスでは、19kHz+26kHzの不協和音で5kHzの領域も応答するようになった。以上の結果から、同時に活動する聴覚野ニューロン間に経験依存的に皮質内回路が形成され、これを介して20kHz+25kHzの音によって5kHzの領域が駆動されたと思われる。ハーモニーは周波数の比が比較的単純な集合音を聴いたときの感覚だが、このとき周波数の最大公約数FOに対する知覚も生ずる。FOに対する知覚は聴覚野のTonotopic Mapを利用すると客観的に記録できるので、このFO応答を手掛かりに和音と不協和音の識別メカニズムを探ろうというのが、本研究の目的である。昨年度までの研究で、実際にFO応答をマウス大脳皮質の経頭蓋フラビン蛋白蛍光イメージングで記録することに成功した。また、このFO応答が聴覚野において経験依存的に形成される皮質内回路に依って生ずるとう結果を得ることができた。しかし、従来の研究では、FO応答は波形のうなりによって生ずるのではないかという考え方がある。即ち20kHの音と25kHの音を重ね合わせると5kHzに相当するうなりが生じ、このうなりを検出することでFO応答が生まれるとするのである。しかし、5kHzに相当するうなりを検出するためには200μsの時間間隔で繰り返される波形の周期性を検出しなければならず、そのため数マイクロ秒程度の時間分解能を有する波形解析器が必要となる。そのような速い波形解析器が通常の神経回路によって作られるとは考えにくい。さらに積極的にFO応答がうなりを検出することによって生ずるという可能性を否定するために、モザイク音を用いた実験を行った。即ち20kHzの音と25kHzの音をモザイク状に組み合わせ、重なりによるうなりが生じないようにしてマウスに聴かせた。この時、モザイクの粗さが十数ミリ秒以下になるとFO応答が出現した。このようにモザイク音でもFO応答が出現するということは、うなりによってFO応答が出現するという従来の考え方では説明出来ず、経験依存的に形成される皮質内回路によってFO応答が出現するという我々の仮説を支持するものである。自然界には、動物の鳴き声など、音の高さが変化する振動数変調(FM)音が多い。これらFM音を識別することは、動物にとって大きな意味を持つ。しかし聴覚野がFM音をどのように情報処理するかは良くわかっていない。本研究ではこの問題を解析するため、マウス大脳聴覚野活動を経頭蓋フラビン蛋白蛍光イメージングにより記録・解析した。純音に対する聴覚野の応答は一次聴覚野(Al)と前聴覚野(AAF)において周波数特異的なマップを示すことが知られている。FM音は高い音から低い音まで様々な高さの音を含むので、これを単に提示したのみでは、このAlとAAFのマップを含む聴覚野の広い領域が活性化されてしまう。そこで、特殊な刺激法を開発し、音の高さや強さを変化させずにFM変調の方向性のみを変化させた時の蛍光変化を記録し、聴覚野のどこがFM変調の方向性に応ずるのかを解析した。

即ち一定の範囲で周波数が上昇する切れ切れのFM音を幾つか重ね合わせ、周波数毎の音圧がほぼ一定でありながらFM変調方向が上昇(下降)から下降(上昇)へとステップ状に変化する音刺激を与えた。このとき、AAFの内側かつAlの前方の限局した領域に蛍光応答を認めた。この領域はまた、FM音を提示したときに最も短い潜時で蛍光応答が出現する領域でもあった。このAAFの内側かつAlの前方の領域は、これまで超音波に特異的に応ずる部分であると言われてきたが、少なくとも我々が実験に用いたC57BL6系統のマウスのこの部分は超音波に対して明確な応答を示さなかった。従って、少なくともC57BL6系統のマウスではこの領域がFM音の処理に特化した領域である可能性がある。
上皮ケラチノサイトにおけるクロマチン制御転写因子FoxO1の役割

我々は上皮ケラチノサイトにおけるクロマチン制御転写因子FoxO1の役割を明らかにするため、テトラサイクリン誘導性FoxO1発現上皮ケラチノサイト(Tet-On Ty1-FoxO1細胞)を作製し、網羅的な遺伝子発現解析によりFoxO1依存的な発現変動遺伝子を同定した。さらに口腔がん細胞を薬剤(3-deazaneplanocin A)処理することにより、FoxO1がタンパクレベルで減少することを見出した。本研究の目的は、クロマチン制御転写因子FoxO1が上皮ケラチノサイトにおける遺伝子発現および細胞特性の発揮にどのような働きをしているのか、その分子メカニズムを明らかにすることである。とくにFoxO1標的遺伝子領域クロマチンのエピジェネティック制御メカニズムに着目した解析をおこない「FoxO1がクロマチン構造調節を介して上皮ケラチノサイトの細胞特性を制御する」のではないかという仮説を検証する。本年度は研究実施計画に従って、以下の実験をおこなった。1. FoxO1発現量を変化させた上皮ケラチノサイトの作製:上皮ケラチノサイト株Pam212を用いてFoxO1に対するsiRNAのトランスフェクションによりFoxO1ノックダウン細胞、そしてFoxO1発現レトロウイルス導入により恒常的なFoxO1過剰発現細胞を作製した。それぞれの細胞におけるFoxO1発現レベルはReal-time PCRおよびウエスタンブロットにて確認した。2.上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1標的遺伝子の同定:コントロール細胞、FoxO1ノックダウン細胞からRNAを抽出、さらにDNAマイクロアレイ解析をおこない網羅的に遺伝子発現変化を比較検討した。DNAマイクロアレイ解析により見出された発現変動遺伝子について詳細な解析を進めたところ、siRNAのオフターゲット効果による影響が大きいことが確認された。そのため、FoxO1により直接的に制御される標的遺伝子の同定まで至っていない状況であるが、今後さらに、FoxO1依存的な遺伝子発現変化の解析を続けることにより、FoxO1標的遺伝子を同定する予定である。本研究の目的は、上皮ケラチノサイトにおいてクロマチン制御転写因子FoxO1が遺伝子発現および細胞特性の発揮にどのような働きをしているのか、その分子メカニズムを明らかにすることである。とくにクロマチン修飾とその構造調節を介したエピジェネティックな制御メカニズムに着目して、FoxO1により制御される遺伝子発現および細胞特性について検討する。本年度はこれまでに実施した研究の結果を踏まえて、以下の実験をおこなった。1.テトラサイクリン発現誘導システムを用いたテトラサイクリン誘導性FoxO1発現上皮ケラチノサイト(Tet-On Ty1-FoxO1細胞)の作製:Ty1タグを付加したFoxO1をテトラサイクリン誘導性に発現させるコンストラクトを構築したのち、組換えレトロウイルスにて上皮ケラチノサイト株Pam212のゲノムに組み込んだ。さらに薬剤耐性による選択と限界希釈法にて遺伝子導入された細胞をクローン化した。樹立細胞(Tet-On Ty1-FoxO1細胞)においてドキシサイクリン(テトラサイクリン系薬剤)処理によりTy1-FoxO1が発現誘導されることをウエスタンブロット、免疫染色およびルシフェラーゼアッセイにて確認した。2.上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1標的遺伝子の同定:コントロールまたはドキシサイクリン処理したTet-On Ty1-FoxO1細胞からtotal RNAを抽出、さらにDNAマイクロアレイ解析をおこない網羅的に遺伝子発現変化を比較検討した。今後さらに、DNAマイクロアレイ解析により見出された発現変動遺伝子群のクロマチン修飾状態を解析して、FoxO1依存的なクロマチン制御について検討する。本研究の目的は、上皮ケラチノサイトにおいてクロマチン制御転写因子FoxO1が遺伝子発現の調節さらに細胞機能の発現にどのような役割を担っているのか、その分子メカニズムを明らかにすることである。これまでにテトラサイクリン誘導性FoxO1発現上皮ケラチノサイト(Tet-On Ty1-FoxO1細胞)を作製し、研究計画を進めてきた。最終年度は、以下の実験をおこなった。1上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1依存的な遺伝子発現変化について:未処理とドキシサイクリン処理したTet-On Ty1-FoxO1細胞からtotal RNAを抽出した。DNAマイクロアレイにより網羅的に遺伝子発現変化を調べたところ、発現上昇(2倍以上)および発現低下(50%以下)したものが約500スポット検出された。さらにqRT-PCRにより発現変動について定量解析した。2FoxO1結合クロマチン領域の解析:発現が変化した遺伝子のゲノム配列上にFoxO1結合配列が存在するのかin silico解析をおこない、FoxO1結合候補領域を抽出した。さらにin vivoにおけるFoxO1結合をクロマチン免疫沈降法にて確認した。3TGF-βシグナルとのクロストークについて: FoxO1標的遺伝子のなかにTGF-βシグナルと協力的に発現調節されるものが確認された。4FoxO1発現と細胞機能の変化について:FoxO1発現が細胞増殖や細胞遊走能に与える影響について、未処理とドキシサイクリン処理したTet-On Ty1-FoxO1細胞を用いて検討したが、ほとんど差は認められなかった。5上皮ケラチノサイトに由来する口腔がん細胞におけるFoxO1について:口腔がん細胞株に対して3-deazaneplanocin A (DZNep)が悪性形質を抑制すること、またFoxO1をタンパクレベルで低下させることを見出した。

さらに口腔がん細胞を薬剤(3-deazaneplanocin A)処理することにより、FoxO1がタンパクレベルで減少することを見出した。昨年度は予想外の問題により、研究計画がやや遅れることになった。本年度はTet-On Ty1-FoxO1細胞の樹立、網羅的な遺伝子発現変動解析など、おおむね順調に進めることができた。しかしながら、当初の研究計画よりやや遅れている状況である。歯科薬理学FoxO1結合クロマチン領域のヒストン修飾および転写因子複合体について解析を進め、FoxO1を介したクロマチン制御メカニズムを明らかにする。さらに上皮ケラチノサイトの細胞特性に対するFoxO1の役割に関する実験計画を実施する。とくにin vitro分化誘導やサイトカインシグナル応答に対するFoxO1の影響について解析する予定である。FoxO1ノックダウン細胞を用いて網羅的な遺伝子発現解析をおこなったが、オフターゲット効果の影響などにより上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1標的遺伝子を同定できなかったため、本年度の実験計画よりやや遅れている状況である。しかし現在までの進捗状況としては、まだ当初の計画よりやや遅れている。そのため次年度使用額が生じることとなった。現在、テトラサイクリン発現誘導システムを用いてFoxO1の発現を任意に誘導することのできる上皮ケラチノサイト株の作製に着手している。今後、この細胞を使用して非誘導時とFoxO1発現誘導時の遺伝子発現変化を網羅的に解析することで、上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1標的遺伝子の同定をおこない、さらにFoxO1結合クロマチン領域の探索など、次年度の研究実施計画を推し進めていく予定である。次年度使用額と請求した助成金は、次年度におこなう予定であるFoxO1結合クロマチン領域のヒストン修飾および転写因子複合体解析、また本来の次年度実験計画である上皮ケラチノサイトの細胞特性に対するFoxO1の役割に関する解析などをおこなう経費として使用する計画である。本年度は、上皮ケラチノサイトにおけるFoxO1標的遺伝子を同定する実験において予想外の問題(siRNAのオフターゲット効果の影響)があり、当初の計画よりやや遅れることとなった。そのため次年度使用額が生じる状況となった。次年度使用額と請求した助成金は、次年度におこなう予定であるテトラサイクリン発現誘導システムを用いたFoxO1発現細胞の樹立とFoxO1標的遺伝子の同定、また本来の次年度実験計画であるFoxO1結合クロマチン領域の探索やクロマチン修飾解析などをおこなう経費として使用する計画である。
中国語北方方言における韻律構造の変化過程

中国の声調の分布について地図を作製し、声調変化の様相を考察した。音声的声調分布の地図では、最小1から最大14もの声調数が比較的なだらかに、北から南へと連続的に分布する様子がわかるが、音韻的声調数の場合、長江下流域に多く声調数の少ない方言が分布する。また、欧米や中国においてはあまりかえりみられない橋本萬太郎(1978年)の中国語言語類型地理論について、最近の言語地理学的研究を用いて検証し、橋本の議論が現在でも意義のあることを示し、その上で文献調査に基づき中国語の韻律構造が北から南へと連続的に変化し、北部の方言ほど単語の音節数の多くなることを示した。また、r化の形成が遅れて進行している山西省のr化語彙の頻度を地図化し、その拡散の過程を考察した。山西内部におけるr化の分布は、主に北部・中部・南部の三地域に分かれ、それらの地域の境界付近にはr化語彙を持たない地域が分布している。それぞれの語彙には関連性も見られ、互いに関連を持ちながらr化語彙が増加していることがわかった。また、軽声化語彙の生起頻度について全国地図を描き、北方方言ほど軽声化割合が高く、南方方言では低く、北方方言でも山西や雲南で軽声化の進行が遅れることを示した。軽声化の進行する地域の周辺では変調頻度の高い方言が分布し、両者の関連が示唆されるが、山西方言を例に考察を深めた。山西の北部と南部では軽声化が進むが、中部では軽声が見られない地域があり、中部の周辺では後字連読変調が見られ、軽声の分布と地理的相補分布をなすことを発見した。このことは、軽声の前段階として後字連読変調が位置付けられることを示す。山西省には多種多様な後字変調類型が存在するが、変調から軽声にいたる過程の多様性が理解された。さらに、リズムの指標となるPVI分析を漢語方言に適用するため陝西・江西・山西・江蘇などの方言調査を行い、その結果をまとめている。言語地理学的研究については、本年度は軽声・r化・声調体系・語頭子音等の中国全土における分布状況を調査するため、『漢語方言詞彙』『普通話基礎方言基本詞彙集』などをもとにデータ入力と分析を行った。本調査は現在論文として投稿する準備を進めている。さらに地域を限定してより詳細な言語変化を観察するために、山西省を対象とした地点密度を高めた調査を行った。中国内部の調査と並行して、中国語方言と周辺言語との関連を調査するため、東京外国語大学で進行中のアジア全域を研究対象とした共同研究課題「アジア地理言語学研究」(代表者:遠藤光暁)の会合に出席、発表を行った。さらに5月にはプノンペンにおいて開催された第三回国際アジア地理言語学会において、中国語の「太陽」を示す語の全国分布と近隣言語との関連に関する発表を行った(Some notes on "sun" in Sinitic)。次年度八月に行われる会合にも出席・発表の予定であるが、そのテーマは声調・アクセントとなっており、東アジアにおける韻律の地理的分布状況や中国語と周辺言語の関連がより一層明らかになるものと期待される。音響音声学的調査については、現代漢語方言音庫の分析を進め、実地調査のための調査票の作成や、調査地域の選定・予備的調査などを行った。8月には山西省において軽声についての臨地調査を行った。さらに、以前より調査を行ってきた長治近隣の連読変調に関する新知見をまとめた論文を執筆し、現在投稿準備を進めている。当初3月にも山西省において調査をする予定であったが、勤務先が京都から東京に移ることに伴う業務のために3月にまとまった時間をとることができなくなり断念した。その埋め合わせとして地図化作業の割合を増やしたため、言語地理学的研究の進度が予定よりも早まった。言語地理学的研究においては、今年度は昨年データを入力した軽声・児化・声調体系等について分析を加えた。児化は山西省を中心とした頻度地図を作製し、山西省内で児化が伝播する過程を考察した。声調体系については音声的声調数の地図と音韻的声調数の地図を作製したが、音声的声調数の地図では既存の地図の二倍以上の地点密度の地図を作製し、方言間の連続性がより明瞭な形で示された。音韻的声調数の地図は今まで描かれたことはなかったが、声調の体系性を考察する上で不可欠のものであり、近隣言語との連続性を考察する上でも意義がある。音声的声調数の地図と音韻的声調数の地図の比較では呉語や湘語といった長江中流域方言における違いが明瞭に示された。これらの地図は、研究会や学会等において発表し、さらに補充入力などを行った。方言調査おいては、北方方言の例として運城・西安・成都・開封・楊州方言の調査を行い、対照のための南方方言の例として温州・瑞安・汾宜方言の調査を行った。西安方言ではインフォーマントに恵まれたため世代差調査に着手する事ができた。また、方言音声資料(現代漢語方言音庫および調査資料)について、praatを用いたアノテーションを行い、音韻・音響分析やPVI分析に着手した。その他、韻律研究の類型地理論的研究の現代的な意義や現在の課題を明らかにするために、先行研究を整理した上で、特に橋本萬太郎の学説について、WALSや漢語方言地図集、漢語方言解釈地図等を踏まえた検討を行った。