hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病前駆細胞の増殖分化とc-kit

最初に、c-kitは骨髄性白血病細胞に特異的な発現をしており、SCF刺激で増殖が促進されることを確認した。白血病細胞の表面形質とc-kit発現の関連を検討した結果、c-kitの発現量が系統特異的抗原の発現に関連していることが示唆された。さらに、一部の細胞分化誘導物質がc-kitの発現を転写後調整することも判明しているが、白血病細胞上のc-kitにSCFが結合すると、c-kitの自己リン酸化が生じ、PI3-kinaseやPLC-γを経由して情報が伝達されることを深く検討した。また、ヒトmast cell由来のHMC-1細胞株で報告されているSCF非依存性のc-kitリン酸化が、一部の白血病症例で観察された。以上のことは、第4回アジア太平洋病理学会シンポジウム(平成7年5月、北京)と第57回日本血液学会総会シンポジウム(平成7年6月、名古屋)において発表した。続いて、G-CSF受容体も骨髄性白血病細胞に発現しており、G-CSF刺激で増殖が促進されるが、正常幹細胞と異なり細胞分化は誘導されない症例が多い。G-CSF受容体の細胞内領域には増殖関連部位と分化関連部位が別個に存在するため、白血病細胞においてここに構造異常が存在する可能性がある。我々は先天性好中球減少症患者のG-CSF受容体で点突然変異を証明している。多数例の白血病症例でG-CSF受容体遺伝子の構造異常をNonRI-SSCP法を用いてスクリーニングしたところ、複数例で異常バンドを認めた。これらの症例において、現在、遺伝子配列を検索中である。以上のことは第1回福岡国際医学シンポジウム(平成7年11月、福岡)にて発表した。
ＧＩＳ・ＧＰＲを用いた前方後円墳の三次元復原と設計原理の考古学的研究

本研究の目的は、前方後円墳のデジタル三次元測量を通して墳丘企画論の新たな方法を確立すること、GISを用いて古墳時代後期から終末期の地域社会のネットワークの分析を行うことである。上記の目的の中でも、墳丘企画の方法論を重点的に研究しており、一年に一基、前方後円墳の測量調査を実施している。平成29年度は茨城県小美玉市に所在する舟塚古墳のデジタル三次元測量調査とGPR探査を実施した。舟塚古墳はこれまでに明治大学による発掘調査と測量調査が行われている。そしてその成果から、墳丘企画・埴輪について、大阪府高槻市に所在する同時期の大王墓:今城塚古墳との関連性が指摘されている。また、古墳が所在する霞ケ浦北岸の高浜入り地域の後期大型墳の動向を考える上で重要視されてきた古墳でもある。調査は平成30年2月1日20日に行い、トータルステーションとレイアウトナビゲーターを用いて墳丘上にランダムに点群を測距(約44,000点)し、三次元情報を取得した。調査終了後、前年度までに実施した千葉県山武市旭ノ岡古墳と香取市三ノ分目大塚山古墳、そして舟塚古墳を合わせて、報告書:『前方後円墳の三次元復原と設計原理の考古学的研究ー旭ノ岡古墳・三ノ分目大塚山古墳・舟塚古墳の測量調査報告書ー』を刊行した。なお、この報告書は、3基の前方後円墳の測量調査報告のみとした。各古墳の分析や比較は今後の論文で執筆予定である。地域社会のネットワーク分析については、利根川下流南岸地域についての基礎情報の収集を終了させ、データのとりまとめに入った。以上のように、前方後円墳の測量調査及び古墳時代の社会論に迫るためのデータの蓄積と分析、分析結果の比較を行うことができた。中でも、3年間で行ってきた前方後円墳の測量調査について、報告書を刊行できた点は大きな成果である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、1三次元測量・GPR(レーダー)探査・GIS(地理情報システム)を用いて墳丘規格論の新たな方法論を確立すること、2古墳時代後期から終末期の香取海周辺地域を主なフィールドとして、内海を介した交流ネットワークを解明すること、3墳丘規格の視点で古墳時代後期から終末期における地域社会の構成原理とその変遷を明らかにすることを目的としている。27年度は香取海周辺地域の中でも特に武射地域(現在の山武郡)に集中して作業を進めた。具体的には、千葉県山武市旭ノ岡古墳の測量調査と武射地域の古墳・集落に関するGISデータの蓄積・解析である。なお、今後他地域と比較していく上で、以前からフィールドワークを行っている武射地域は、方法論の確立を含めて中心となる地域である。そのため、当該地域の様相をより詳細に検討するため、芝山町山田・宝馬188号墳出土形象埴輪の整理作業を行い、遺物の面でも基礎資料を蓄積した。収集したデータを用いて墳丘の築造状況や規格の共通性・埴輪の流通経路の分析行い、古墳時代後期から終末期にかけての墳丘の系譜関係・集団の編成原理を考察した。考察の結果、古墳時代後期に存在した複数の地域が、古墳時代終末期・古代に向けて1地域へ集約されていく様子を多角的に提示することができた。旭ノ岡古墳に関しては以前から相似関係が指摘されている墳丘があり、それらの設計原理の詳細な比較検討は28年度に行う予定である。また、印波地域に所在する大型墳の三次元レーザースキャン・GPR探査を行ったほか、香取海周辺地域の列島内での相対化を新たな課題として宮崎県や愛知県での野外調査を実施できたため、28年度の研究へ向けた基礎資料の蓄積も行うことができた。27年度は前方後円墳2基について、トータルステーションを用いたデジタル測量と香取海周辺地域の古墳・集落のGISデータ収集を行う予定であった。しかし測量調査においては想定よりも時間を要してしまい、1基のみの実施となった。一方で、測量調査を実施した旭ノ古墳に関しては非常に高い精度でデータを作成できたほか、印波地域においては3次元レーザースキャンを使用した大型墳の調査を実施することができたため、想定よりも多くの基礎資料を得ることができた。また、GISを用いた武射地域の分析では、遺構・遺物の両面から地域社会を考察し、地理情報分析を加えることで交流の様相をより具体的に示すことができた。そして、香取海周辺地域を列島内で相対化し、古墳時代後期から終末期にかけての地域社会の動向を捉えるという課題のもと、各地で野外調査を行うことができた。本研究の目的は、古墳のデジタル測量を通じて墳丘企画論の新たな方法論を確立と、GISを用いたネットワーク分析による、古墳時代後期から終末期における地域社会の構成原理とその変遷を明らかにすることである。平成28年度は、対象とする地域の中でも利根川下流南岸地域と印波地域に集中して研究を進めた。具体的には、利根川下流南岸地域では、昨年度実施できていなかった千葉県香取市三之分目大塚山古墳の測量調査を2月に実施した。三ノ分目大塚山古墳は当地域の画期となる前方後円墳であり、大王墓や周辺地域の大型墳との類似性も指摘されてきた前方後円墳である。よって、当古墳の分析は、大王墓との比較も射程に入れた分析となる予定である。印波地域では、古墳情報の悉皆的な収集によるデータベースの作成と、墳丘・埴輪・埋葬施設の石材に着目したGISを用いた地域間ネットワークの分析を行った。

そして、昨年度分析した武射地域と今年度行った印波地域の地域社会の在り方を比較し、6世紀7世紀における地域統合の多様性を認識した。ただし、地域社会の分析は進んでいるものの、現象の整理にとどまっている部分があるため、古代史の視点を取り入れた解釈が必要になっている。また、茨城県内や栃木県内での踏査や古墳の発掘調査にも参加し、研究で対象としている地域の理解の相対化を進めた。なお今年度は、昨年度までに行った調査のうち、千葉県山武市旭ノ岡古墳の測量調査、市川市法皇塚古墳・弘法寺古墳のGPR探査についてはすでに雑誌に投稿しており、平成29年度中に公表される予定であり、成田市船塚古墳の調査成果については千葉県立房総風土記の丘考古学講座で講演した。野外調査による墳丘の情報収集と、報告書の精査による室内での情報収集・分析を並行して進められているほか、他地域での調査に参加しており、情報収集・分析の面では比較的順調に進展している。また、実施した調査に関しても雑誌等で成果報告し、一般社会・学会の双方に情報発信できている。特に、墳丘の測量調査や地域分析の方法論の確立に関しては、順調に進捗していると言える。ただし、研究の深化により、熟考を必要とする項目が増加し、論文の執筆が遅れているため。本研究の目的は、前方後円墳のデジタル三次元測量を通して墳丘企画論の新たな方法を確立すること、GISを用いて古墳時代後期から終末期の地域社会のネットワークの分析を行うことである。上記の目的の中でも、墳丘企画の方法論を重点的に研究しており、一年に一基、前方後円墳の測量調査を実施している。平成29年度は茨城県小美玉市に所在する舟塚古墳のデジタル三次元測量調査とGPR探査を実施した。舟塚古墳はこれまでに明治大学による発掘調査と測量調査が行われている。そしてその成果から、墳丘企画・埴輪について、大阪府高槻市に所在する同時期の大王墓:今城塚古墳との関連性が指摘されている。また、古墳が所在する霞ケ浦北岸の高浜入り地域の後期大型墳の動向を考える上で重要視されてきた古墳でもある。調査は平成30年2月1日20日に行い、トータルステーションとレイアウトナビゲーターを用いて墳丘上にランダムに点群を測距(約44,000点)し、三次元情報を取得した。調査終了後、前年度までに実施した千葉県山武市旭ノ岡古墳と香取市三ノ分目大塚山古墳、そして舟塚古墳を合わせて、報告書:『前方後円墳の三次元復原と設計原理の考古学的研究ー旭ノ岡古墳・三ノ分目大塚山古墳・舟塚古墳の測量調査報告書ー』を刊行した。なお、この報告書は、3基の前方後円墳の測量調査報告のみとした。各古墳の分析や比較は今後の論文で執筆予定である。地域社会のネットワーク分析については、利根川下流南岸地域についての基礎情報の収集を終了させ、データのとりまとめに入った。以上のように、前方後円墳の測量調査及び古墳時代の社会論に迫るためのデータの蓄積と分析、分析結果の比較を行うことができた。中でも、3年間で行ってきた前方後円墳の測量調査について、報告書を刊行できた点は大きな成果である。28年度は前年度に引き続き、野外調査と室内でのデータ収集を行う。測量調査では、前年度に実施できなかった大型墳の測量調査を実施し、データ収集・解析に関しては、印波地域や利根川下流南岸地域のデータ収集及び解析を完了させる。
オンライン熱分解－高速液体クロマトグラフィー直結システムの開発

熱分解ガスクロマトグラフィー(Py-GC)は、不溶不融の三次元の架橋構造を含むあらゆる形態の高分子試料について、前処理をほとんど必要とせず、0.011mg程度の微量で測定ができる等の優れた特徴を持っている。しかしながら、分離部にGCを用いているため、分子量や沸点、極性などがかなり大きな試料分解物は、高分子の構造解析を行う上で重要であるにも関わらず、観測することが困難である。そこで本研究では、これらの問題を解決するため、Py-GCの分離部をGCから高速液体クロマトグラフ(HPLC)に置き換え、熱分解装置とHPLCをオンライン接続したPy-HPLC直結システムの開発を行った。ポリマーの解析に広く用いられている熱分解ガスクロマトグラフィー(Py-GC)では、熱分解により生じた分解物の内、GC分離の段階で気相状態として存在できる、分子量、沸点、及び極性などが比較的低い揮発性分解物を分析対象としている。一方、それらが高い難揮発性分解物については、GC分離の段階で気相状態として存在し得ないため、たとえ生成したとしても解析できないという問題があった。こうした難揮発性分解物の解析を可能にするためには、分析部をGCから高速液体クロマトグラフィー(HPLC)へ置き換えることが解決策の一つとして考えられる。本研究ではまず、熱分解-HPLC直結システム開発のための基礎検討として、ポリマー試料としてHPLCの紫外・可視検出器で検出可能な芳香族環を有するポリブチレンテレフタレート(PBT)を熱分解し、生成物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI-MS)などにより詳細に解析することによって、どのような分解成分をHPLCの測定対象とすべきかを明らかにすることを試みた。熱分解生成物をHPLCで測定するには溶液化する必要があるため、500°Cにおけるポリマー試料の熱分解により生成した分解物を一旦冷却捕集し、その後テトラヒドロフランなどの溶媒に溶解、回収して溶液化をはかった。回収されたPBTの熱分解生成物のMALDI-MSスペクトル上には、Py-GCでは一般に観測できないm/z500以上の領域に、PBTの繰り返し単位を多く含む生成物のピークがはっきり観測された。次にこれらの分解物をHPLCで分析するための条件の検討を行った。アセトニトリル(ACN)/水=80/20(v/v)を移動相として、一般的な逆相系カラムを用いて測定を行ったところ、熱分解GCでは検出できない生成物を一部観測することができた。今後は、MALDI-MSで測定されたm/z=500以上の分解物を含め、すべての分解物生成物の分析を目指して、測定条件をさらに検討する必要がある。この他、熱分解装置とHPLCをオンライン接続するためのインターフェイスの設計も並行して行った。この目的に対して、熱分解装置内での試料の熱分解と生成物の捕集、および捕集した分解物を溶液化してHPLCへ導入するまでの操作をオンラインで行うことのできるインターフェイスを、平成24年度に具体的に設計・試作した。ポリブチレンテレフタレート(PBT)などを試料として、このインターフェイスにより試料の熱分解、分解物の捕集、溶解を行い、回収された熱分解生成物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI-MS)などにより解析した結果、GCでは測定できないかなり分子量の大きな分解物が生成・回収されていることを確認できた。平成25年度は、このインターフェイスを本来の目的であるHPLCシステムに実際に直結し、オンラインPy-HPLCシステムの構築を図った。このシステムを用いて、PBTおよびポリフェニレンエーテル(PPE)のオンラインPy-HPLC測定を行った結果、PBTでは二塩基酸の高極性および高分子量成分を含む複数の分解物のピークが観測され、それらを分離、検出することができた。また、PPEでも高分子量分解物を分離、検出することができた。さらに、LC-MS測定により、MALDI-MSでは分離、分析できなかった異性体も観測することができた。

一方、それらが高い難揮発性分解物については、GC分離の段階で気相状態として存在し得ないため、たとえ生成したとしても解析できないという問題があった。こうした難揮発性分解物の解析を可能にするためには、分析部をGCから高速液体クロマトグラフィー(HPLC)へ置き換えることが解決策の一つとして考えられる。この目的に対して、平成24年度は、熱分解装置内での試料の熱分解と生成物の捕集、および捕集した分解物を溶液化してHPLCへ導入するまでの操作をオンラインで行うことのできるインターフェイスを、具体的に設計・試作した。このインターフェイスでは、熱分解加熱炉の下部にステンレス製二重構造の分解物の捕集部を設けており、この部分にポリマーの分解物を冷却捕集する。その後、分解物が捕集された内管を所定の位置に移動させることにより、加熱炉からのガス流路を遮断して、新たに溶媒通液用流路に接続する。そののち、内管内に溶媒を通液することにより、捕集されていた分解物を溶解回収する。具体的に、ポリブチレンテレフタレートなどを試料として、このインターフェイスにより試料の熱分解、分解物の捕集、溶解を行い、回収された熱分解生成物をマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法などにより解析した結果、GCでは測定できないかなり分子量の大きな分解物が生成・回収されていることを確認できた。当初の基本システムの設計上に大きな問題があることが、検証の結果明らかになったため、システム設計の大幅な見直しを行ってきた結果、システムの試作を行うには至らなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で開発するシステムの心臓部であり、開発の成否のカギを握る、ポリマーの熱分解生成物を、気相状態から液相状態へとオンラインで変換するためのインターフェイスを設計・試作し、その基本動作を確認したところ、ほぼ狙い通り生成物の捕集・回収ができることが確認された。こうしたことから、最終的なシステム構築に向かって、順調に進んでいると判断した。これまでに行ってきた、オンライン熱分解HPLCシステムの基本設計に基づいて、実際に装置を試作しその基本性能を検証する。ここでは、代表的なポリマー試料を実際に測定することによって装置の特性を確認し、解決すべき課題を明確にしつつ、適切な対策を講じることによって完成度を高めていく。具体的には、従来の熱分解GCでは限界がはっきり示唆されている試料、例えば紫外線硬化樹脂の反応熱分解による架橋ネットワーク構造解析などに適用し、解析能力を評価する。最終年度にあたる平成25年度は、いよいよ熱分解部とHPLCとの間を、24年度に開発したインターフェイルを介して直結し、熱分解HPLCシステムを確立する。その基本動作は、具体的なポリマー試料を本装置に導入することにより確認しつつ、必要な改善・改良を進めて本システムの完成度を高めていく。
縮約類似度行列を用いた大規模文書データに対するスペクトラルクラスタリング

本研究では大規模文書クラスタリングにスペクトラルクラスタリングを用いる手法を開発した。基本的には大規模データをk-meansで予め小規模クラスタに分割し、そこから信頼度の高いデータを抽出し、それらデータに対して類似度行列を作る。作成された類似度行列は縮約されているので、スペクトラルクラスタリングが実行できる。クラスタリングの更なる精度向上のために、精緻な名詞間距離の測定法や、文書間の距離学習法の開発も行った。本研究の目的は、大規模な文書データ集合をスペクトラルクラスタリングによってクラスタリングするための手法を提案することである。提案手法は以下の4つ処理からなる。(1)大規模データを小規模クラスタに分割する、(2)小規模クラスタをクラスタリングする、(3)各クラスタからのCommitteeを作成する、(4)Committee群から縮約類似度行列を作成する。平成20年度は、本研究の中心となる(3)と(4)に対して重点的に取り組んだ。具体的には、既存のデータセットの各データが小規模クラスタの代表点だと考える。これによって(1)の処理が仮想的に行えたと見なせる。次に既存のデータセットをk-meansでクラスタリングすることで(2)の処理結果も得ることができた。(3)に関しては2つのアプローチを試みた。1つは各クラスタに対してその重心を求め、クラスタ内の各データとその重心までの距離を測り、この距離に基づいてCommitteeを作成するアプローチである。距離によってCommitteeに属するか属さないかを判定するが、その際の閾値の設定が問題である。この設定には様々な統計的手法を取り入れることで適切な閾値を設定した。もう1つのアプローチは各クラスタのデータを訓練データと考えて、帰納学習の手法を用いて分類器を作成し、その分類器によってCommitteeを作成するアプローチである。具体的にはそのクラスタに真に属する確率を調べ、ある確率以上のデータを選出することでCommitteeを作成した。学習手法としてはNaive Bayesを利用した。これは文書データに対して親和性が高い、分類器学習の計算コストが低い、分類器は確率を算出できるなどの点で、本手法に適していると考えたからである。成果としては国際会議3件、研究会5件の論文発表を行った。平成20年度までに、ほぼシステムは完成した。平成21年度は精度の改善を目的に名詞間距離の測定手法の研究に取り組んだ。主に2つの観点から研究を行った。1つはシソーラスIDを主要語義に絞ることである。名詞間距離の測定を行う際には、通常、名詞のシソーラスIDを利用する。ただし多くの名詞は多義語であるため、不要なシソーラスIDが付与される。正しい語義のシソーラスIDを推定することは難しいため、ここでは名詞の主要語義を予め調べでおき、主要語義以外のIDを利用しない手法を開発した。もう1つは名詞をベクトルで表現する手法を開発した。名詞をベクトル化することで、シソーラスを利用するよりも細かな距離設定が可能である。ベクトル化する際には次元の設定、次元の値の算出が問題だが、ここではWebディレクトリを利用することでそれらの問題に対処した。最後に名詞間距離を精度よく測ることで、文書クラスタリングの精度が向上することを示した。成果と年次大会に4件の論文発表を行った。本研究では以下に分割できる。(1)大規模データを小規模クラスタに分割する方法、(2)小規模クラスタのクラスタリング方法、(3)各クラスタからのCommitteeの作成方法、(4)Committee群からの縮約類似度行列の作成方法。平成20年度は(3)と(4)、平成21年度は(1)と(2)に取り組んだ。その結果、本研究の目的を達成することができた。平成22年度は残された課題の解決と、最終的な手法の評価を行った。残された課題として、文書間距離の設定がある。文書クラスタリングの場合、クラスタリング手法よりも文書間距離の設定が精度に影響する。ここでは2つのアプローチを試した。1つはWebディレクトリを用いて名詞間距離を精緻に求め、それらを利用して文書間距離をより適切に設定する手法であり、もう1つは少量の教師データを与える手法である。後者の手法では、複数のペアの文書間が同じカテゴリに属する文書かどうかのラベルを与え、それを教師データとすることで、文書間の距離をクラスタリングにとって最適になるように学習する距離学習の手法を利用した。

いくつかの距離学習手法を比較実験し、最大マージン化最近傍法が本タスクにおいて最も効果があることを確認した。またこの距離学習の手法の有効性を語義識別問題により確認した。最終的には、大規模データをk-meansにより小規模クラスタに分割し、各クラスタの重心と最も近いデータからCommitteeを作成し、いくつかのCommittee間に同じカテゴリかどうかのラベルを与え、そこからCommittee間の距離を最大マージン化最近傍法により学習し、それを基に縮約類似度行列を作成した。その行列を利用してスペクトラルクラスタリングを行い、当初の大規模データのクラスタリングが行えた。結果は、直接k-meansでクラスタリングを行うよりも精度が向上した。
リボソーム生合成を制御する脱ユビキチン化酵素USP36の増殖因子による活性調節

私はこれまでに、脱ユビキチン(Ub)化酵素USP36が核小体でヌクレオフォスミン(NPM)、フィブリラリン(FBL)などのタンパク質を脱Ub化して安定化することによりリボソーム生合成を正に制御していること(Endo et al, J. Cell Sci. 2009)、またUSP36がNPMを介して核小体に局在していること(Endo et al, J. Biol. Chem. 2009)を解明した。さらにUSP36機能阻害により細胞の増殖が抑制されたことから、USP36によるリボソーム生合成の制御の重要性が示唆された。しかし、どのような状況においてUSP36が活性化されてリボソームの生合成レベルを上昇させるのか、その活性制御機構は不明であり、USP36の活性制御の分子機構とその生物学的意義の解明を目的として本研究を行っている。これまでにUSP36が細胞分裂期(M期)特異的に未同定の翻訳後修飾をうけることを見出している。そこで、平成23年度はUSP36がうける翻訳後修飾の意義を明らかにすることを中心とし、USP36と細胞周期との関わりを解明することを目的に研究を行った。結果として、USP36の翻訳後修飾部位はUSP36の671-800a.aの領域内に存在することが示された。また、USP36へのタンパク質修飾は、リン酸化やユビキチン化などではない可能性が示唆されており、未だに同定されていない。USP36の制御機構は未だに全く解明されていないのが現状であり、さらなる解析が期待される。一方で、USP36の機能阻害が細胞増殖を抑制することや、ある種のがん細胞でUSP36のタンパク質発現が上昇していることが報告されている。このことはUSP36が細胞増殖を制御する重要な因子であり、USP36の細胞内機能とがんが関わっている可能性を示唆しており、非常に興味深い。[研究概要]私はこれまでに、脱ユビキチン(Ub)化酵素USP36が核小体でヌクレオフォスミン(NPM)、フィブリラリン(FBL)などのタンパク質を脱Ub化して安定化することによりリボソーム生合成を正に制御していること(Endo et al. J.Cell Sci. 2009)、またUSP36がNPMを介して核小体に局在していること(Endo et al. J,Biol. Chem. 2009)を解明した。しかし、USP36の活性制御機構は不明であり、USP36の活性制御の分子機構とその生物学的意義の解明を目的として本研究を行っている。これまでに網羅的なリン酸化プロテオーム解析の結果から、EGFあるいはインスリン刺激によりUSP36の特定のSer残基のリン酸化が上昇することが示されている。そこで平成22年度では、USP36とリン酸化制御の関連を調べた。[平成22年度の研究結果]1.EGF/グルコース/血清刺激による細胞内USP36のリン酸化レベルへの影響生化学的な実験を行い、細胞外刺激によるUSP36のリン酸化レベルの変動を調べた結果、刺激前後で細胞内USP36のリン酸化レベルに顕著な差は検出されなかった。2.リン酸化によるUSP36の脱Ub化酵素活性への影響網羅的なリン酸化プロテオーム解析の結果から、リン酸化修飾をうける可能性が高いSer残基をAla残基に置換したUSP36の変異体を作製し、in vitroで変異型USP36と野生型USP36のそれぞれの脱Ub化酵素活性を人工基質を用いて測定、比較した。その結果、両者の脱Ub化酵素活性に差は検出されなかった。

USP36の制御機構は未だに全く解明されていないのが現状であり、さらなる解析が期待される。一方で、USP36の機能阻害が細胞増殖を抑制することや、ある種のがん細胞でUSP36のタンパク質発現が上昇していることが報告されている。このことはUSP36が細胞増殖を制御する重要な因子であり、USP36の細胞内機能とがんが関わっている可能性を示唆しており、非常に興味深い。
パルス中性子源を活用した量子機能発現機構に関する融合研究

本計画では、大強度パルス中性子源の建設が世界的に進む中で、我が国が将来先導することが期待される表面・界面の精密構造研究、グリーンマテリアルの機能発現機構研究、非一様系の構造とダイナミクス研究、水素結合を基調とする生体分子ネットワーク研究、強相関物質の物性発現機構の研究を深化させ、新しい研究方向を確立させた。また、医学や考古学のような全く新しい分野での中性子利用の可能性を示すことに成功した。これに加えて、世界のパルス中性子施設と協力してパルス中性子科学技術の革新を行い、多くの基盤技術や解析手法を実現させ、これらを用いた新しい中性子実験装置の提案に至った。本研究費の交付期間は、中性子科学にとってエポックメイキングな期間である。長年の懸案である中性子強度不足を一挙に解決する1MW級パルス中性子源が、世界の三ケ所(日米英)に建設されようとしている。パルス中性子時代の幕開けであり、世界的な協力によって、中性子科学の革新を計る時である。このような時代の到来に向けて、本研究は、日英科学技術協力事業等の国際協力の枠組みを利用して、世界の既存のパルス中性子施設と協力して、技術開発を推進し「パルス中性子科学技術の革新」を計る。他方、この時代は、中性子科学における厳しい世界的競争の幕開けでもある。本研究は、日本唯一のパルス中性子施設KENSの中性子強度を大きく凌駕する英米の既存パルス中性子施設を利用し、さらに、上述の開発技術を付加することによって、日本が将来先導すべき新しい中性子科学の創成を目指して中性子散乱実験を推進し、パルス中性子時代のスタート時をリードすることを目的とする。パルス中性子科学技術の革新を計るために、新型パルス中性子偏極装置、高空間分解能中性子検出器、高分解能中性子速度分別装置、視覚的解析ソフトウェア等の開発研究を推進するものであるが、その中で、平成16年度は特に、中性子偏極装置の開発に重点をおいて技術開発を推進した。また、日本が将来先導すべき新しい中性子科学の創成を目指して、表面・界面量子組織構造の多次元精密構造解析、グリーンプロダクトの量子組織構造と機能発現機構の解明、非一様系における量子組織構造とダイナミックス研究、水素結合を基調とする生体分子ネットワーク研究、酸化物高温超伝導機構の解明等の基礎研究を、主にKENSと英国のISIS施設を用いて、パルス中性子散乱実験により推進した。研究組織内の緊密な連携のためにテレビ会議システムを導入した。本研究費の交付期間には、1MW級パルス中性子源が世界の三ケ所(日米英)に建設される。世界的な協力によって、中性子科学の革新を計る時である。このような時代の到来に向けて、本研究は、日英科学技術協力事業等の国際協力の枠組みを利用して、世界の既存のパルス中性子施設と協力して、技術開発を推進し、パルス中性子科学技術の革新を計るとともに、我が国が将来先導すべき新しい中性子科学の創成を目指して中性子散乱実験を推進し、パルス中性子時代のスタート時を主導することを目的としている。今年度は、パルス中性子科学技術開発においては、特に、高分解能検出器、単色化チョッパー、偏極装置の開発をすすめた。また、国際協力の枠組みを強化するために、これまでの日英科学技術協力事業に加えて、米国のロスアラモス国立研究所及びアルゴンヌ国立研究所のそれぞれのパルス中性子施設と新たに研究協定を締結し、両施設で中性子散乱実験を開始した。表面・界面量子組織構造の多次元精密構造解析、グリーンマテリアルの発現機構の解明、非一様系における量子組織構造とダイナミクス研究、水素結合を基調とする生体分子ネットワーク研究、強相関物質の超構造とダイナミクスの研究の5分野の基礎研究を推進しているが、それぞれの分野において、高分子超薄膜のダイナミクス、セメントの生成過程、フラクタル磁性体のダイナミクス、蛋白質の形態変化に起因する疾病の診断、銅酸化物高温超伝導体の異常不純物効果についての研究が進展した。また、国立歴史民族博物館との協力により、中性子を用いた考古学研究を開始した。8月と3月に研究会を開催し、展開している研究について議論をすすめ、特に3月の研究会では外国の関係施設からの参加を得て、本研究における国際協力について議論を深めた。本研究は国際協力関係の強化により国内外のパルス中性子施設を用いた科学研究を推進して新しいパルス中性子科学を創成するとともに、その実現に向けた先端的技術開発をすすめるものであり、(1)海外研究施設との共同研究の推進、(2)中性子科学の刷新、(3)中性子技術の高度化、(4)異分野との共同研究による新しい中性子科学の創成を基軸として研究を推進している。8月と3月に研究会を開催し、展開している研究について議論を深めた。(1)外国のパルス中性子施設との協力関係を強化して実験研究を推進し、3月の研究会では外国施設からの参加を得て、国際協力について議論を深めた。

(2)表面・界面量子組織構造の多次元精密構造解析、グリーンマテリアルの発現機構の解明、非一様系における量子組織構造とダイナミクス研究、水素結合を基調とする生体分子ネットワーク研究、強相関物質の超構造とダイナミクスの研究の5分野の基礎研究を推進しているが、それぞれの分野において、脂質一塩混合系多層膜や高分子薄膜の構造とダイナミクス、水素エネルギー材料やプロトン導電体等の構造と機能、フラクトンの動的構造因子の決定、金属ガラスの局所構造、溶液構造、水素結合の振動モード、多電子系を対象にした経路積分理論、電子ドープ領域の高温超伝導体、マルチギャップ超伝導体等についての研究がすすめられた。(3)挿入デバイスとしてのフェルミチョッパー開発、集光デバイス等の光学素子開発、収束型小角散乱技術へ向けたモノクロメータ等の開発、ITを用いた実験支援システムとしてコラボラトリー機能の開発、検出器開発がすすめられた。(4)異分野との共同研究をすすめた。考古学では、種々の縄文土器等の中性子回折実験を行ない、また、同一試料に対して岩石学的な胎土分析も行ない、両者の結果の比較を行なった。医学では、白内障及びアルツハイマー病の関連蛋白質の異常構造を調べた。本研究は国際協力関係の強化により国内外のパルス中性子施設を用いた科学研究を推進して新しいパルス中性子科学を創成するとともに、その実現に向けた先端的技術開発をすすめるものであり、(1)海外研究施設との共同研究の推進、(2)中性子科学の刷新、(3)中性子技術の高度化、(4)異分野との共同研究による新しい中性子科学の創成を基軸として研究を以下のように推進した。11月に研究会を開催し、展開している研究について議論を深めた。(1)外国のパルス中性子施設との協力関係を強化して実験研究を推進した。(2)高分子薄膜中におけるナノフィラー分布構造、双性イオン型ポリマーブラシの水溶液界面構造及び感温性濃厚ポリマーブラシの膨潤・潤滑特性の解明をすすめた。水素エネルギー材料やプロトン導電体等の結晶構造と機能についての研究を行なった。全固体リチウム系超イオン伝導体のガラスの非平衡結晶化によって新たに発現した超イオン伝導機構の解明を試みた。中性子小角散乱データからRMC法を用いて超臨界流体の臨界点近傍での密度ゆらぎの可視化に成功した。強相関電子系を扱う経路積分理論においてフェルミオン負符号問題を解決する計算手法を開発した。軌道秩序状態によって誘起されるスピンパイエルス転移の研究、p波超伝導体の強磁性揺らぎや銅酸化物超伝導体の異常磁気励起及びフォノン異常についての研究を推進した。(3)小型集束型小角散乱装置のために、回転楕円体ミラーの開発と湾曲型Si完全結晶を用いたモノクロメーターの開発を行なった。中性子用フレネルレンズの集束効果を確認した。フェルミチョッパーの回転制御技術を進展させた。(4)考古学では、土器の岩石薄片試料からの中性子回折パターンを定量解析するために、鉱物モデルの構築をすすめた。医学では、白内障の発症原因となるクリスタリンの異常凝集過程を紫外線照射の関係において明らかにした。
2004年12月スマトラ島沖地震津波災害の全体像の解明

2004年12月に発生し,インド洋全体に死者・行方不明者29万人以上という甚大な被害を及ぼしたスマトラ島沖地震津波災害の全貌解明のため,現地調査および衛星画像による被害把握,数値シミュレーションによる津波伝播特性の解析,激甚被災地における行政対応,被災者の津波意識に関する聞き取り調査を行った.津波発生直後からインド(本土,アンダマン諸島),スリランカ,タイ,インドネシアスマトラ島,モルディブにおいて現地調査を行った結果,アンダマン諸島での地震による地盤変動と津波の来襲(2m前後)、スリランカで平均5-6mの津波、タイのインド洋沿岸で平均5m程度、震源付近のスマトラ島では30mを越える大津波が来襲していたことが分かった.また,スマトラ島バンダアチェ市街地に残らされた津波の浸水痕跡から津波の流況を推定した.津波伝播の数値シミュレーション,衛星データの分析から,津波の波源域を推定した結果,インド・ビルマプレートの境界において長さ900キロメートル,幅150キロメートルの断層運動が津波発生に寄与していたことが分かった.ただし、余震域全体は津波波源よりもさらに北に延びており、断層運動全体のうちの津波発生に寄与した変動成分の解明には、インドやミャンマーなどの津波波源から北にある地域における津波高さを考慮しながら、さらなる分析が必要である。また,津波数値シミュレーションの結果とインド洋沿岸諸国の人口統計メッシュデータを統合し,津波の影響人口を求めた結果,約4メートル以上の津波に対して影響を受ける人口が約30万人と推定された.2004年12月に発生し,インド洋全体に死者・行方不明者29万人以上という甚大な被害を及ぼしたスマトラ島沖地震津波災害の全貌解明のため,現地調査および衛星画像による被害把握,数値シミュレーションによる津波伝播特性の解析,激甚被災地における行政対応,被災者の津波意識に関する聞き取り調査を行った.津波発生直後からインド(本土,アンダマン諸島),スリランカ,タイ,インドネシアスマトラ島,モルディブにおいて現地調査を行った結果,アンダマン諸島での地震による地盤変動と津波の来襲(2m前後)、スリランカで平均5-6mの津波、タイのインド洋沿岸で平均5m程度、震源付近のスマトラ島では30mを越える大津波が来襲していたことが分かった.また,スマトラ島バンダアチェ市街地に残らされた津波の浸水痕跡から津波の流況を推定した.津波伝播の数値シミュレーション,衛星データの分析から,津波の波源域を推定した結果,インド・ビルマプレートの境界において長さ900キロメートル,幅150キロメートルの断層運動が津波発生に寄与していたことが分かった.ただし、余震域全体は津波波源よりもさらに北に延びており、断層運動全体のうちの津波発生に寄与した変動成分の解明には、インドやミャンマーなどの津波波源から北にある地域における津波高さを考慮しながら、さらなる分析が必要である。また,津波数値シミュレーションの結果とインド洋沿岸諸国の人口統計メッシュデータを統合し,津波の影響人口を求めた結果,約4メートル以上の津波に対して影響を受ける人口が約30万人と推定された.
膵ラ島移植の為のラ島単離培養の研究

前年度に引き続き、重症慢性膵炎および広範囲膵切除に伴なう糖尿病インスリン治療の困難な若年者糖尿病に対する治療としての膵ラ島移植の基礎的検討を行った。前年度までは、ヒト雑種成犬を用いての研究であったが、本年度はそれに加え小動物のラットのラ島分離、移植もおこなった。(1)膵ラ島の単離について、従来の膵細切とcollagenaseやclipaseを使用しラ島を採取する方法と1.basket-collagenase-Parcollによる方法を比較検討した。前者は後者に比しラ島に与える障害がより軽く、外分泌組織との分離能に優れていることが明らかとなった。このことはラット膵を用いた検討でも同様であった。しかし収率および方法の繁雑この面で臨床応用にあたっては依然として問題が残ると考えられた。(2)膵ラ島の培養では、膵ラ島細胞機能の面からみるとイヌ、ラットラ島は1ケ月間は新鮮ラ島と同等の分泌機能を保示することが確認された。(3)イヌを用いた培養ラ島の同種移植実験(Donor犬により得た膵よりラ島を採取し、数日間培養後のラ島を膵全摘したrecpient犬の各部位に種々の量移植し、血糖制御効果・拒絶反応の検索)から、前述の培養条件下でラ島は移植後も十分機能し得た。Viabilityの高いラ島の短時間大量採取と移植に伴なうラ島組織の抗原性の問題が膵ラ島移植において大きな問題である。特に移植のfirst stepであるviabilityの高いラ島の短時間大量採取の問題はラット等の小動物と異なりヒトや犬などの大動物では容易でない。そこでヒト及び雑種成犬を用いたラ島自己移植実験を計画し、(1)膵全摘犬を作成し、摘出膵よりラ島細胞を採取し、数日間の培養後、培養ラ島組織のviabilityを検討し、同一犬の部位(門脈内,肝,脾への注入,大網内への埋入,腎被膜下,腹腔内への散布等)に移植し、各々の血糖制御効果を検討、(2)膵ラ島の単離について(3)膵ラ島の培養について検討を加えた。(2)については従来の膵を細切しcollagenaseやclipaseを使用しラ島を採取する方法に比し、kbasket-collagenase-Parcollによる方法は(A)ラ島に与える障害の点(B)外分泌組織との分離の点で優れていることが判明した。しかし収率および方法の繁雑さの点で臨床応用にあたっては問題が残ると考えられた。(3)については、ラ島細胞機能の保示の点では培養条件(Dulbecio-modi fied Eagle培地37°C)により犬単離ラ島は少なくとも1ケ月間は新鮮単離ラ島と同等の分泌機能を保示することが確認された。しかし、培養下におけるラ島細胞の抗原性の修飾,変化については今後の検討課題が多いと考えられた。(1)については、培養ラ島の移植臓器の選択,移植量,投与経路のいずれも充分な検討ができず、今後の研究課題として残された。重症慢性膵炎及び広範囲膵切除に伴う糖尿病,インスリン治療の困難な若年者糖尿病に対する治療としての膵ラ島移植の基礎的検討を行った.前年度に引き続いてヒト及び頻種成犬を用いたラ島移植実験を計画した.即ち1.イヌを用いた培養ラ島の同種移植実験(Don or犬より得た膵よりラ島を採取し,数日培養後のラ島を,膵全摘したrecipient犬の各部位に種々の量移植し,血糖制御効果,拒絶五応状況の検索)又内脈内への移植に際してラ島浮遊液の濃度,内脈内注入及び注入速度に伴なうrecipient犬の血行動態の変化,〓膵ラ島の単離・培養について検討を加えた.従来の研究で明らかにした如く,膵を細切し, collajenaseを使用し,ラ島を採取する方法に比し小Basket-collajerase-Darcollによる方法はラ島に与える障害・外分泌組織との分離の点で優れていることを確認したが,収率の向上は望めなかった.1.についてはラ島細胞機能の保示は培養条件により1ケ月間は新鮮単離ラ島と同様な分泌機能を保示することが明らかとなったが,内脈内注入に伴なう血行動態の変化については短期的な観察のみにおわった.短期的には影響は軽微なものと考えられた.前年度に引き続き、重症慢性膵炎および広範囲膵切除に伴なう糖尿病インスリン治療の困難な若年者糖尿病に対する治療としての膵ラ島移植の基礎的検討を行った。

(3)イヌを用いた培養ラ島の同種移植実験(Donor犬により得た膵よりラ島を採取し、数日間培養後のラ島を膵全摘したrecpient犬の各部位に種々の量移植し、血糖制御効果・拒絶反応の検索)から、前述の培養条件下でラ島は移植後も十分機能し得た。
注意欠陥/多動性障害児に対応した条件性弁別課題プログラムの開発

本年度は,予備研究より得た新たな知見を先行研究と比較検討することによって,さらに当該プログラムの精度を上げることを検討した。前年度に,当該プログラム実施の際に,プログラム運用とは別に,刺激の配列や構成について「注意欠陥」を助長させてしまうという要因の除去の検討を行った。本年度は,があることが,最新の研究知見によって示唆されるようになった。そのため,「注意欠陥」を助長・抑制するような強化スケジュールの検討(立命館人間科学研究,7号,159-170頁),さらに「多動」を助長・抑制する強化スケジュールの検討(立命館人間科学研究,8号,55-66頁)を行った。その比較検討の後,当該プログラムの修正を行った。まず,大学生を対象にプログラムの修正や動作確認を実施後,注意に問題があるとされる知的障害生徒に1名に対して,試験的な運用を試みた。その対象生徒は,実際に平仮名の獲得支援を標的目標として,予備的研究を実施した。その結果,週1回1時間のプログラム実施を3ヵ月継続することで,平仮名2文字で構成される3単語を獲得させることに成功した。以上,3カ年の検討により,当該プログラムの基本的構造は確立できたと考えられる。しかしながら,汎用性のあるプログラムという段階にまで至らなかった。今後は,より多くの対象者に対する適用を行い,さらなる調整を検討する必要があると言えよう。本年度は,1)当該プログラム(コンピュータ上で作動する汎用性の高いもの)のプログラミングとその調整,2)近隣小学校での対象児(ADHD)の選定を実施した。当該プログラムは,Director8.5(インタラクティブなプレゼンテーション・ソフト;マクロメディア社製)によって作成された。ユーザ・インタフェイスは,幼児に対してもプログラムを利用できるようにタッチパネルに対応したものとした。プログラムの制御は全てパソコン上で実施できるようなプログラミングを行った。対象児の反応に対して,視覚的なフィードバックだけでなく,聴覚的なフィードバックを付加できるようなものとした。さらに,対象児の記録は正誤だけでなぐ反応潜時も自動的に測定できるようにプログラミングを行った。研究実施の初年度終了時点では,大学生を対象にプログラムの修正や動作確認を実施している段階である。対象児の選定は,1)ADHDという診断を医療機関から受けている,2)小学校低学年の児童,3)ADHDの二次的障害である,強固な攻撃行動などが少ない児童,という基準を設定した。実際の対象児童の選定のため,近隣の通常小学校へ複数校訪問し,観察を行った。ただし,3)の条件を満たすものが少なく攻撃行動などの問題行動の軽減、担任教師へのコンサルテーションを先に取り組む必要があった。研究実施の初年度終了時点においても、上述の作業を継続実施中であるという段階である。次年度は,当該対象児の選定,及び当該対象児に対するプログラムの適用とその評価(予備実験)を実施する予定である。本年度は,1)当該プログラム(コンピュータ上で作動する汎用性の高いもの)に対するプログラムの試験的運用,2)プログラムの使用による援助に関する予備研究,3)ADHDに関する実験的知見に関する集約と批判的検証について実施した。当該プログラム実施の際に,プログラム運用とは別に,刺激の配列や構成について「注意欠陥」を助長させてしまう要因があることが,最新の研究知見によって示唆されるようになった。そのため,「注意」という概念を行動分析学的に再検討して,注意欠陥を助長しないような刺激の配列や構成,さらには呈示方法があることを整理し,ADHDに対してどのように応用可能であるかを検討した(立命館人間科学研究,6号,81-91頁)。当該プログラムは,大学生を対象にプログラムの修正や動作確認を実施後,注意に問題があるとされる知的障害生徒2名に対して,試験的な運用を試みた。その対象生徒のうち,1名については,実際に平仮名の獲得支援を標的目標として,予備的研究を実施した。その結果,週1回1時間のプログラム実施を3カ月継続することで,平仮名4文字を獲得させることに成功した(その当該生徒は既に中学3年生であり,小学校期に既に平仮名の習得が不可能であると学校から判断されていた)。さらに,その予備実験において,先に検討した刺激配列や構成を応用したが,それだけでは不十分であったことが明確になった。その新たな配慮事項とは,対象生徒の標的反応に対するヒントのフェイドアウトとフィードバックの頻度の関係であった。来年度は,その予備研究より得た新たな知見を先行研究と比較検討することによって,さらに当該プログラムの精度を上げることを予定している。

その結果,週1回1時間のプログラム実施を3ヵ月継続することで,平仮名2文字で構成される3単語を獲得させることに成功した。以上,3カ年の検討により,当該プログラムの基本的構造は確立できたと考えられる。しかしながら,汎用性のあるプログラムという段階にまで至らなかった。今後は,より多くの対象者に対する適用を行い,さらなる調整を検討する必要があると言えよう。
完全抗体をスーパー抗体酵素に変える革新的技術の開発

当初は「抗体を抗体酵素化する」という目標を達成するために、抗体酵素の活性サイトの構造決定をすすめ、得られた知見を元に「抗体の抗体酵素化」を進める計画であった。しかしながら、抗体タンパクの構造多様性問題の解決が必須であることが明らかとなり、精製過程で構造均一化処理を施す方法と、抗体工学的手法の2つの柱で検討を進めてきた。(1)精製過程で構造均一化処理を施す方法1構造安定化と酵素活性:昨年までに見出した構造均一化処理を施すと、精製方法によらず抗体軽鎖構造の均一化が可能であることが分かった。しかしながら、精製方法によって酵素活性に違いが認められたことから、精製の最適化を進めた。2抗体軽鎖の酵素化:上記検討により、軽鎖クローンの特徴を明確に捉えることが可能となった。構造に寄与すると考えられる1残基の違いが酵素活性の有無に繋がる例を見出したことから、酵素活性を示さないクローンに対してこの変異を導入した。この変異導入により、本クローンは酵素活性を示し、本課題の目標であった抗体の酵素化に成功した。(2)抗体工学的手法による構造均一化:構造多様性の原因となるFc領域をヘリックス構造に置き換えたコンストラクトを作製し、大量発現・精製・結晶化条件の検討を進めて2クローンのX線結晶構造の決定に成功した。一つは基本ユニットをホモダイマー化させたもので、2.6オングストローム分解能を得た。その構造は挿入したヘリックス構造を欠く極めて特徴的な4量体であった。他方は「軽鎖」と「結晶化用モデル用の重鎖」とをヘテロダイマー化したものである。(3)免疫複合体としての結晶化と構造決定:本項目については共結晶化が出来ていない。この原因は軽鎖クローンと抗原や基質との親和性が低く、共結晶化に十分な濃度を与えることが出来ない点にあると考えられた。現在、親和性を元にクローンの再選定を進めている。研究実績の概要に記載したように、軽鎖タンパクの構造多様性は想定を上回ったことから、結晶化のための技術的なアプローチを進めると同時に、構造多様性を与える本質的な要因を追求し、Fcドメインが原因であることを明らかにした。これは、免疫機構における抗体の役割を考える上では非常に興味深い知見であるが、構造決定においては根本的な問題である。Fcドメインを外した可変領域ドメイン単独では疎水性が強く、精製・結晶化は困難であった。そこで、Fcドメインを他の形に置き換えることを目的とした抗体工学的手法による結晶化の検討を進めると同時に、Fcドメインの構造多様化を防いで構造を均一化させる方法の検討を行った。後者においては、昨年度までに構造均一化法を確立したが、最も重要な点は、「酵素活性を発揮する構造への均一化」であることから、精製方法の違いによる影響を精査し、最適化を行った。これにより個々のクローン特性が明確になると同時に、高い機能を引き出すことが出来た。また、酵素活性サイトの構築には関与していないと推定される1残基の違いが酵素活性の有無に反映される重要な知見を得た。この知見を元にした変異導入により、本課題の目的である「抗体軽鎖の酵素化」に成功した。一方、結晶化が困難なため、構造学的な視点によるメカニズムの解析は遅れている。本目標を達成するためには、基質(抗原・阻害剤)との複合体としての結晶化が必要であるが、現在までのところ成功していない。軽鎖タンパクと基質(抗原・阻害剤)との親和性にあることが分かってきた。そこで、基質(抗原)の用意が可能なクローンについて速度論的な解析や親和性測定を進め、共結晶化を行うクローンの再選定に着手している。以上のように、抗体の酵素化には成功したものの、構造ベースのアプローチがやや遅れていることから、課題全体としては「おおむね計画通りに進行している」と判断した。(1)アミノ酸配列と酵素活性の関係:今年度成功した抗体を酵素化するための1残基変異を複数の軽鎖クローンに対して試す。このアミノ酸残基は、酵素活性サイトを構築するものではなく、構造に関与すると推定され、従来着目していたものとは異なるsubgroupについても適用出来る可能製が示唆された。そこで、ヒト型においてはsubgroupの範囲を広げて、適用範囲を調べる。また、本課題で酵素化を目指しているInfA15抗体(マウス型モノクローナル抗体)は、今年度酵素化に成功したヒト型軽鎖の相同性が高く、この1残基変異により酵素化出来る可能製が高いことから、変異体作製と酵素活性評価を行う。これらの検討により、この方法が適用できる軽鎖クローンの範囲を明確化する。(2)X線結晶構造解析による基質認識および酵素活性分子機構の解明:免疫複合体(あるいは基質複合体)としての構造解析においては、軽鎖との親和性が高いクローンの選択が重要であることが明らかになった。最適化した精製方法によるスクリーニングで見出したクローンの一つが、一般的な軽鎖クローンよりも12桁強い親和性を持つことが分かったことから、このクローンを使った基質複合体の結晶化を優先的に進める。また、他のクローンについても、抗原や基質に対する親和性を調べ、その結果をもとに優先順位を決めて免疫複合体の結晶化と構造決定を進める。(3)各種クローンのin vitro活性試験:酵素化した軽鎖クローンや、抗体工学的手法による改変により構造を決定したクローンについて、がん細胞傷害性試験やインフルエンザウイルスに対する感性抑制試験などを行い、機能を定量的に評価する。

今年度は本プロジェクトの初年度で有り、計画書に述べた様に、InfA-15抗体(インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)に対するマウス型モノクローナル抗体)の構造決定を目的として、大腸菌を用いた大量発現と高純度精製、結晶化の検討から着手した。InfA-15抗体の軽鎖(InfA-15L)の発現では、第一段階のNi-NTAクロマトでは目標通り上手く精製と大量取得できた。しかしながら、第二段階の陽イオンクロマトではピーク分離が悪く通常法では無理と判断した。そこで219番目のシステインをアラニンに置換した変異体を作成し(InfA-15L_C219A)、精製方法の検討を行った結果、単量体として純品を精製する方法を確立することができた。その標品を大量に準備し、ターゲットとなるペプチド(GMVDGWYG)を合成して、InfA-15L_C219Aと混合後、結晶化ロボットを用いて1サンプルあたり約1,000種類の条件での初期結晶化スクリーニングを実施したところ、結晶を得る事ができた。現在、X線回折実験に取り組んでいる。これと並行して、抗原ペプチドの用意が可能な別の抗体酵素クローンついても、結晶化を行うための実験に取り組んでいる。100数十種類のヒト型抗体酵素候補クローンについて標的となる複数の抗原(あるいは基質)を分解するかのスクリーニングを行った結果、これらを分解する(核酸分解活性やペプチダーゼ活性を有すると思われる)有望クローン数種類を見出した。現在、これらクローンのcharacterizationと付加していた、His-tagを外して結晶化をしやすくするサンプルの合成、さらには、その化学的あるいは生化学的性質の解析に取り組んでいる。本研究課題と並行して進めている「抗体酵素クローンの精製方法と構造多様性に関する検討」から、抗体タンパクには構造多様性があり、本研究で取り扱っている抗体酵素も例外ではないことが明らかになってきた。本研究で最初に取り扱うInfA-15抗体についても、ScFvの発現と精製を試みたが、代表者らが取り扱ってきた軽鎖タンパクよりも取り扱いは困難でることが分かった。そこで、大量発現と精製、構造均一化についてノウハウのある軽鎖タンパクの結晶化より着手することとし、これについては、InfA-15抗体軽鎖変異体に抗原ペプチドを取り込ませることで結晶化の目処が立った。本クローンについて、他の形態(重鎖やScFvなど)での大量・高純度精製を進めることは出来なかったが、InfA-15抗体に導入する酵素活性サイトの構造決定に向けた検討は、前倒しで進めることが出来た。ペプチドや核酸・合成基質を用いる新たなスクリーニングにより、構造決定に有用と思われる複数のクローンを見出すことが出来た。結晶化のためのtagの取り外しなどを計画的に進めており、研究テーマ全体としては「おおむね順調に進展している」と判断した。「抗体を抗体酵素化する」という目標を達成するために、本年度は高い活性を示す抗体酵素の抽出と構造決定に注力する計画であった。昨年度までの知見を基に検討項目を増やした結果、「抗体の抗体酵素化」に向けた重要な手掛かりを得ることが出来た。(1)軽鎖クローンの構造安定性:軽鎖クローンの構造均一化法を確立し、発現・精製していたが、保存中の構造変化が示唆された。