hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中高年者の効果的運動処方のための神経工学的アプローチ

中高年者でも安心して個人個人にあわせた負荷設定や休息と運動の時間配分の設計を目的とし,手軽に筋持久力・筋力トレーニングでの疲労の計測が行えるユビキタスシステムの検証,さらに疲労の定量的評価を行った.筋疲労を定量評価するためには特定の筋のみの計測では無く,2関節筋・単関節筋,拮抗筋活動・共収縮活動に関わる筋を考慮した計測が必要であった.さらに疲労とは筋疲労のみではなく心肺機能などの自律神経活動からの評価も必要であった.中高年者でも安心して個人個人にあわせた負荷設定や休息と運動の時間配分の設計を目的とし,手軽に筋持久力・筋力トレーニングでの疲労の計測が行えるユビキタスシステムの検証,さらに疲労の定量的評価を行った.筋疲労を定量評価するためには特定の筋のみの計測では無く,2関節筋・単関節筋,拮抗筋活動・共収縮活動に関わる筋を考慮した計測が必要であった.さらに疲労とは筋疲労のみではなく心肺機能などの自律神経活動からの評価も必要であった.新たに神経工学的立場から中高年者でも安心して個人個人の体力の変化にあわせた負荷重量設定や休息と運動の時間配分を実現できる様にすることを目的に,ストローク毎やセット毎に計測・解析システムが行えるユビキタスシステムの構築と予備実験を行った.注目した指標は表面筋電図の評価指標及び自律神経系の評価指標である.特に,心拍変動に現れる呼吸性洞性不整脈に注目した.最初に,筋力測定装置で等尺性脚伸展運動の最大随意収縮(MVC)を計測し,次に,等尺性膝伸展運動を30%MVCの筋収縮レベルで維持し続ける実験で筋持久力を評価した.また,筋持久力測定時の継続時間にて,4秒に1回のチューブススクワット運動と1分毎に15Wの漸増負荷による自転車エルゴメータ運動を実施した.ここで,等尺性筋力測定によるMVCを被験者の体重で割った値を被験者の筋力,等尺性脚伸展運動の30%MVCにおける筋収縮レベルの運動維持時間を被験者の筋持久力とした.予備実験であるので,被験者は健康な成人男性5名(平均年齢22.0±0.7歳)とした.被験筋は,外側広筋,内側広筋,大腿二頭筋,前脛骨筋,腓腹筋内側頭である.同時に,関節ゴニオメータにて膝関節角度の変化を計測した.その結果,MVC時の筋力の高い被験者はスクワット運動でも筋疲労が現れにくく,筋持久力が高い被験者は低負荷かつ有酸素性の自転車エルゴメータ運動で筋疲労があまり進まず,安全な下肢トレーニングとして用いることができると考えられた.等尺性脚伸展運動から得られる筋力と筋持久力の2つのパラメータから運動プログラムの選択を数値的に実現できる可能性を示した.ここでは筋活動の指標のみを扱ったが,自転車エルゴメータ運動時の自律神経系の指標(呼吸性洞性不整脈)と筋活動との関係性は低かった.したがって,自律神経系の調整機能に関しては,筋活動以外の観点からの評価が必要であった神経工学的立場から中高年者でも安心して個人個人の体力の変化にあわせた負荷重量設定や休息と運動の時間配分を実現できるようにすることを目的に,ストローク毎やセット毎に計測・解析システムが行えるユビキタスシステムの検討を行った.この検討のために,スクワット運動実験とトレッドミル歩行実験を行った.スクワット運動実験は負荷を高めるためにチューブ負荷で行い,100ストロークを連続で実施した.トレッドミル歩行実験は,1.5km/hの速度で5種類の傾斜を設定して行い,ひとつのトライアルを10分とした.被験者は健康な成人男性10名(23.0±0.9歳)とした.被験筋は,外側広筋,大腿二頭筋,前脛骨筋,腓腹筋である.表面筋電図の振幅情報である整流化平均値(ARV)と,周波数情報である平均パワー周波数(MPF)を求め,運動中の筋活動状態の変化を調べた.スクワット運動では大腿二頭筋において,ストローク数の後半にARV,MPFの変化が見られた.しかし,トレッドミル歩行実験においてはMPFの顕著な変化がみられなかった.つまり,スクワット運動のような高負荷トレーニングではARV,MPFの推移から筋疲労による筋活動状態の変化を捉えることができるが,歩行トレーニングのような低負荷のトレーニングではその変化を捉えにくいことが分かった.これらのことから,中高年に対する運動処方において,高負荷のトレーニングは筋活動の変化に着目することで,個人に合わせた運動処方を提供できる可能性を示せた.しかし,中高年は膝関節への負担という面から,低負荷トレーニングが重要となる.このため,低負荷トレーニングにおいて,筋活動状態の変化を捉える指標を今後検討していく必要がある.
筆跡の画像データベースに基づく古代官営工房組織の研究

官営工房は、国家が生産手段と原材料を提供して生産を行い、製品を国家が独占する生産方式であり、技術力・生産力が低い奈良時代(710-784)にあっては重要な生産形態である。その組織のあり方、運営方法の解明は国家機構そのものの解明に連なる。本研究は百万塔を資料に、その工房の実態を明らかにしようとする。百万塔は藤原仲麻呂の反乱鎮圧を契機に製作した三重の木造小塔(764-770)であり、名は百万基という製作数に由来し、内部に最古の印刷物である陀羅尼経を収めることで名高い。その製作期間は僅か5年半。塔身、相輪と陀羅尼経を各百万製作する必要があり、大事業である。この工房の運営形態が復元できれば、古代の官営工房研究に大きく貢献するであろう。工房の復元には、工人の数や勤務実態を明らかにする必要がある。百万塔には日付や工人名の墨書が残る。これを手懸かりに、その工房規模や運営状態を復元しようとする。百万塔墨書は工房における製品の管理や、製作数の把握のために記したのであり、最終的に仕上げの白土によって消されている。墨書は癖字や略字が多い上に、製作から1,200年あまりの時を経て塔表面の風化が進み、文字の保存状態は必ずしもよくない。本研究では墨書画像DBの作成を行い、それとコンピュータソフトを用いて墨書の判別方法の検討を試みた。古代史の熟練研究者が経験と勘に頼ってきた判別を、機械で行うことが出来れば、他の文字類の判別にも有用であるし、能率もも向上しよう。ここでは「高次局所自己相関特徴」による判別を行い、木簡研究者4人の判別結果と照合した。その結果、2名はコンピュータの答えに近かった。以上は「高次局所自己相関特徴」方法が百万塔の墨書にも有効であることを示唆する。
東アジアの紛争後社会における「正義回復」とローカルリアリティに関する人類学的研究

本研究の目的は、20世紀中葉、東アジアの島嶼地域における戦争や虐殺を事例として、各々の紛争後社会がめざすべき救済措置や真実追究、和解実現のための「正義回復」への取り組みと、ローカル・コミュニティが創造・発揮してきた経験知の実践との比較検証による紛争研究の構築にある。その結果、紛争後社会における「負の歴史」の清算に有効とされてきた移行期正義論への批判を踏まえ、紛争後を生き抜く人びとのローカルな知と実践の潜在的可能性を提示することに寄与した。本研究の目的は、20世紀中葉、東アジア島嶼地域における紛争(とくに、済州4・3事件と沖縄戦、台湾二二八事件)を事例として、紛争後の社会がめざすべき被害者救済や真相糾明、そして和解実現のための「正義回復」への探究と、ローカル・コミュニティが創造・発揮してきた生活知の実践との比較による人類学的紛争研究の構築を目的とする。そのために、紛争後社会における「負の歴史」の清算に有効とされてきた「移行期正義」論への批判を踏まえ、紛争後を生き抜く人びとのローカルな知と実践の潜在的可能性を探る。平成27年度は、各国・各地域における「戦後補償」及び「過去清算」のプログラムとして死者たちが各々の国民国家レベルで「犠牲者(望ましい死者)」として位置づけられていくプロセスを検証することができた。具体的には、大量死の意味づけにおいて要求される体験の立証と記述にアプローチできる史料として「済州4・3犠牲者についての申立書」と「戦闘参加者についての申立書」、「台湾二二八受難者についての申立書」を収集しその記述内容を分析することができた。そのなかでもとくに、「申立書」の受理・審査を担当する「済州4・3委員会」(韓国・ソウル市)と「二二八事件紀念基金会」(台湾・台北市)の関係者にインタビュー調査を実施し、「申立書」の審査から通知まで、その後の異議申し立てや行政訴訟などについて詳細に聞くことができた。現地調査は、各地で開催された学会・研究会に合わせて行い、研究協力者からの支援を活用しつつ研究に要する費用を最小化することができた。予定していた済州道、大阪市、沖縄県、台北市での資料収集とインタビュー調査は順調に実施できたが、音声データの文字化や文献資料のDB化は当初の計画に比べてやや遅れが見られる。ただ一方で、研究の全体構想や進捗状況、成果に関しては当初の計画より多くの発表を行った。本研究では、研究対象を「1945年前後の東アジアにおける苛酷な紛争と大規模暴力を経験した島嶼地域」に設定し、「太平洋戦争」や大量殺戮といった諸紛争に巻き込まれるなかで、民間人に強いられた夥しい人命損失と人権蹂躙、共同体破壊の歴史を辿ることで、今日の東アジアの根幹を規定する問題を解明する可能性を模索してきた。とくに、1948年大韓民国誕生期に起きた「済州島4・3事件」の調査を中心に据え、そこで得た知見を踏まえて議論を拡張するための試みとして、第2次大戦における「沖縄戦」と解放後の台湾における「2・28事件」との比較研究を実施し、その成果を社会に発信してきた。具体的には、1.国民国家レベルでの「移行期」にみられる「死者の犠牲者化」のプロセスを検証し、2.紛争体験者及び遺族個々人(体験世代)の思いと実践についての人類学的な調査に基づいたミクロな分析を行い、「犠牲者」像を問い直した。さらに、3.「移行期」のメカニズムとローカルな知/実践との摩擦や交渉、折衷などのようなせめぎあいの過程を複合的に検討した。前年度の予備調査を踏まえ、紛争体験者及び遺族個々人の思いと実践についての人類学的な調査にもとづいたミクロな分析を行い、国民国家主導の清算実践を問い直すことを試みたい。そうすることで、ナショナルな領域における「正義回復」のメカニズムとローカルな知/実践との摩擦や交渉、折衷などのようなせめぎあいの様相を複合的に検討する。研究成果については、人類学を含む人文・社会科学系の学会・研究会での報告、論文発表を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。文化人類学、歴史社会学、東アジア研究28年度が最終年度であるため、記入しない。
セミインタクト細胞による、ＥＲＧＩＣでのプロインスリン逆行輸送の定量的可視化解析

申請者はマウス由来のインスリン分泌細胞(MIN6細胞)において、新規の小胞体-ゴルジ体中間区画(l-ERGIC)を発見した。L-ERGICには小胞体関連分解(ERAD)機構に関与する機能性タンパク質が濃縮しており、l-ERGICの膜内腔に存在する構造的に異常なタンパク質がそのオルガネラで分解されていることを明らかにした。さらに、小胞輸送制御因子であるRab2Aがl-ERGICに局在化し、ERADに関与する機能性タンパク質群の濃縮制御を通じて、l-ERGICにおけるERAD活性を調節していることが示唆された。また、Rab2A活性の制御因子として解糖系酵素GAPDHを同定した。MIN6細胞が高濃度グルコースに長時間さらされると、GAPDHがポリADPリボシル化されRab2Aから解離することによりRab2A活性が減少するというモデルを提唱できた。さらに、Rab2Aはl-ERGICの機能制御因子であるだけではなく、MIN6細胞におけるグルコース刺激依存的なインスリン分泌や小胞体ストレス下における細胞生存に深く関与していることも同時に示した。代表的な生活習慣病の一つである二型糖尿病は膵β細胞からのインスリン供給不全や膵β細胞死などを伴い、そのような機能不全が糖尿病の症状を悪化させる大きな原因であると考えられている。したがって、Rab2Aが二型糖尿病の症状(インスリン供給不全や易膵β細胞死)を改善するための標的分子になることが期待できる。26年度が最終年度であるため、記入しない。1、MIN6細胞におけるセミインタクト化の条件検討インスリン分泌細胞であるMIN6細胞に対して、連鎖球菌由来の毒素であるストレプトリジン0を作用させ、細胞膜特異的に孔をあける条件(濃度や作用時間など)を検討した。その結果、ストレプトリジン0による細胞毒性を最低限に抑え、かつ90%以上のMIN6細胞を再現性よくセミインタクト化することに成功した。セミインタクト化は本研究における最も重要な項目であるため、その最適条件を同定することができたのは本研究を推進するにあたり非常に意義がある。2、プロインスリンのC末端に融合させるtagの選択はじめに1-ERGICに凝集しているユビキチン化タンパク質がプロインスリンであることを示唆する更なる実験結果(1-ERGICに外来性ユビキチンとプロインスリンが共局在している、1-ERGICに凝集しているプロインスリンがユビキチン化様修飾を受けているなど)を得ることに成功した。さらに、1-ERGICにおけるプロインスリンの逆行輸送を可視化するため、現在C末端にtagを融合させたプロインスリン-tag (HA、HisあるいはFLAG)コンストラクトを作製中である。3、RFP-ERGIC53 (RFP-p58の代用)コンストラクトの作製L-ERGICを可視化するため、赤色蛍光タンパク質(RFP)を融合させた1-ERGICのマーカーであるERGIC53 (RFP-ERGIC53)コンストラクトを作製しようと試みている。現在、マウスの脳cDNAライブラリーからERGIC53cDNAを増幅させることができなかったが、次にマウスの精巣cDNAライブラリーからERGIC53cDNAを増幅することを予定している。MIN6細胞のセミインタクト化の条件検討に関して、予定よりも時間がかかってしまったため、いくつかの実験(交付申請書に記載した「研究の目的」における項目2および3)に関して若干の遅延が生じている。しかし、再現性の高いセミインタクト化条件を同定できたため、それを利用した実験(交付申請書に記載した「研究の目的」にわける項目4、5および6)を効率よく推進することができると思われる。まず、プロインスリン-tagコンストラクトを作製し、MIN6細胞内で発現させ1-ERGICに凝集していることを確認することが優先項目である。

その後、セミインタクトMIN6細胞において1-ERGICにおけるプロインスリン-tagの凝集キネティクスを、蛍光強度を指標に作成することを目標とする。
反応性成分を含む溶液中の弾性膜構造物群による熱物質輸送に関する数値的研究

生体膜による物質輸送の定量的な予測は医療応用に関連して重要である。本研究では、流体と柔軟膜の相互作用問題に加えて濃度拡散、化学反応を扱うことができる計算手法の開発を目的とした。生体膜は流体力により容易に変形し、かつ、特定の物質のみを透過させる選択的透過性を有している。このような移動境界上に透過流束に関する条件を与える問題は難しく、未だその数値計算技術は発展途上である。本研究では膜の移動・大変形を取り扱うために膜形状に沿わない流体格子を用いた手法(界面非適合格子法)が有効であると考え、界面非適合格子法による手法の構築を行った。また、物質の膜透過に関して、膜表裏の圧力差と濃度差によって膜を透過する物質流束が生じるモデルを採用した。膜形状に沿わない流体格子で、流体変数(濃度、圧力、速度勾配)の不連続を考慮するために膜表裏の不連続量を組み込んだ有限要素離散式を提案した。この離散化法により、ひとつの流体要素内にシャープな不連続が再現可能となっている。さらに、その不連続量を陰的に扱うことにより、溶質の透過と不透過の両方の性質を示す膜を再現できる手法となっている。溶媒の透過と不透過に関しては検証問題によって提案手法の妥当性を確認し、既存の手法と比べることにより提案手法の優位性を示した。本研究では開発した手法は界面非適合格子法の枠組みで構築されており,柔軟な膜や複数の膜に対する扱いが容易であるといった特長を有する.さらに,溶媒・溶質の透過と不透過の両方を同じ計算アルゴリズムで扱うことのできる汎用性の高さを備えている.当初の計画予定である、化学反応の取り扱いおよび赤血球による物質輸送問題への適用までの研究遂行には至らなかったが、そのベースとなる手法を開発することはできた。26年度が最終年度であるため、記入しない。赤血球の酸素輸送に見られる流体・膜・物質輸送の相互作用問題に対する連成解析手法の開発を目的に,非適合格子の枠組みの中で生体膜の透過・不透過性を統一的に扱うことが可能な手法の開発を行った。ここで、非適合格子とは膜を解析する格子と流れ場を解析する格子を独立に生成し、両格子形状が適合していない格子を意味する。膜が十分薄い場合には、膜の中立面から成る2次元的な構造物としてモデリングされる。そのため、物質濃度の空間分布は膜の表裏で急激な変化を伴う。従来の研究では、膜表裏の不連続を鈍らした手法や、ある一定の不連続分布を持った手法が開発されていた。しかし、膜を透過する物質流束が膜表裏の物質濃度の不連続量の関数になっている場合にはその不連続をシャープかつ動的に捉える必要があると考えられる。現在までに提案された多くの透過式は膜表裏での不連続量の関数となっている。本研究では、離散化式に膜表裏における不連続量を組み込むことで膜表裏のシャープな不連続を表現できる有限要素法の定式化を行った。本手法の利点としては、透過・不透過の両方の膜に対して適用が可能であること、非適合格子による定式化を行っているため膜の形状や個数の制限が低いことが挙げられる。既存の提案手法では、透過・不透過の膜に対してどちらか一方に対する手法開発となっている。赤血球などの生体膜は特定の物質のみを透過させる選択的透過性を有しており、透過・不透過の両方に対して同じ定式化ができることの意義は、誤差の評価の観点から大きいといえる。また、本手法は任意形状、複数の膜を扱うことができることから、赤血球の酸素輸送の数値解析に対しての適用性は高いといえる。本手法による計算結果の妥当性については、1次元、2次元の物質拡散問題に適用することで確認を行った。現在、移動・変形する膜に対しての膜透過に対する定式化を行い、その妥当性を確認している段階である。

本研究では開発した手法は界面非適合格子法の枠組みで構築されており,柔軟な膜や複数の膜に対する扱いが容易であるといった特長を有する.さらに,溶媒・溶質の透過と不透過の両方を同じ計算アルゴリズムで扱うことのできる汎用性の高さを備えている.当初の計画予定である、化学反応の取り扱いおよび赤血球による物質輸送問題への適用までの研究遂行には至らなかったが、そのベースとなる手法を開発することはできた。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画では現段階で流体-膜の相互作用問題に対する計算手法と膜を介した濃度拡散の手法を連成すると記述したが、現状では膜を介した濃度拡散の手法に対して検証を行っている段階のため。流体構造連成解析手法についても膜透過に対する手法と同様の考えを用いて定式化を行う。開発した流体構造連成解析手法と膜を介した濃度拡散に対する手法を連成させ、赤血球の酸素輸送にみられる流体・膜・物質輸送を統一的に扱える手法の開発をする。
磁性材料被覆気相成長炭素繊維の精密配向制御による機能性接着界面の創製

本研究は、軽量高強度、配向制御応答性をもつハイブリッドナノフィラーであるNi被覆気相成長炭素繊維を作製し、それを高分子中に分散させ磁場による精密配向制御の基盤技術を確立し、界面接着強度向上の検討をおこなった。また、連続磁場配向プロセッシングの装置を開発しその連続プロセスで配向制御されたサンプルを作成した。さらに、他の磁性被覆ナノフィラーにも応用し、ハイブリッドナノフィラーのさらなる展開の重要性を明らかにした。本研究は、軽量高強度、配向制御応答性、力学的アンカリング性をもつ「ハイブリッドナノフィラーの作製」と、それを高分子中に分散させ「磁場による精密配向制御」の基盤技術を確立することを目的としている。これを発展させ「力学的強度向上と破壊の予測」ができる「機能性接着界面創製」を目指す。作製したNi-VGCFをUV硬化型エポキシ中に分散させ、フィルム(約80μm)の厚み方向に磁場(本研究費にて購入)を印加しその後UV硬化しフィルムとし、配向挙動を観察した。Ni-VGCF3wt%添加をすることで、連結配向構造が誘起されたことにより厚み方向で体積固有電気抵抗値9.8×10^5Ω・cmを示した。また、同様に面内方向に磁場を印加しその配向挙動を観察した。従来出来なかった磁場による連結した配向制御を短時間で達成できることを明らかにした。作製した異なるNi厚みを有するNi-VGCFを、元素分析から平均表面厚みを換算した。これらをそれぞれシリコンオイル中(粘度1,10Pas)に分散させ、1本の配向速度挙動を観察し、約100倍速度が速くなることを実証した。平均厚みが13nmか31nmかの差はあまりみられず、わずか13nmで飛躍的に速度が速まった。配向の基礎材料パラメータである異方性磁化率を算出し、逆に、磁場配向時間を予測した。回転配向時間を定量的に明らかにして、必要な磁場のプロセス時間を予測した。本年は、連続プロセスを用いた基盤技術確立と、新しいハイブリッドナノフィラーの作製の基盤技術確立を目指した。連続で磁場印加できるプロセス装置を準備作製した。これを用いて、バッチプロセスで行った場合との比較検討などをはじめた。Ni-VGCFをUV硬化型エポキシ中に分散させ、フィルム(約80μm)の厚み方向に磁場(本研究費にて購入)を印加しその後UV硬化しフィルム(厚み80μm程度)とし、配向挙動を観察した。従来出来なかった連続プロセスによる磁場の印加により連結した配向制御を短時間で達成できることを明らかにした。また、強磁性体としてNi以外にフェライトを用いて検討を行った。フェライトを用いたハイブリッドナノフィラーを様々な方法にて作製し、まず高分子マトリックス中に孤立分散できる最適なフェライトを用いたハイブリッドナノフィラーの作製方法を探索検討した。これをもちいて、UV硬化型エポキシ中にフェライトを用いたハイブリッドナノフィラーを孤立分散させ、その後、磁場により連結された構造を有するUV硬化しフィルム(厚み80μm程度)を作製できることを明らかにした。本年は、フェライトを用いたハイブリッドナノフィラーを様々な方法にて作製し、まず高分子マトリックス中に孤立分散できる最適なフェライトを用いたハイブリッドナノフィラーの作製方法を探索検討した。この中でフェライトとナノフィラーとの単純ブレンドによる複合フィラー作製、また、ナノフィラーを分散させた系内にてin-situでフェライト作製をおこなうin-situ複合フィラー作製等の検討を行った。in-situ複合フィラー作製が表面被覆には効果的・効率的な手法であることを明らかにした。またフェライトの作製条件を最適化することで、極少量でそのフェライトが効果的に付着被覆した複合ナノフィラーを作製できることを明らかにした。本手法が反磁性ナノフィラーの作製に一般化できることを他のVGCF以外の反磁性ナノフィラーにおいても実証した。
食道癌テーラーメード治療に向けた血中遊離DNA中の変異遺伝子診断法の開発

食道癌において、原発腫瘍組織から抽出したDNAを次世代シークエンス解析を行い、腫瘍特異的な変異遺伝子を同定し、digital PCRを使用して血中遊離DNA中の当該変異遺伝子であるcirculating tumor DNA(ctDNA)を定量・モニタリングすることが可能であった。また、ctDNAは治療前後においてCT検査で見られた腫瘍量の変化を反映する変動をしていた。ctDNA研究に必要な採血管において、BCT採血管、CPT採血管の両方を組み合わせて使用することで、効率よく研究できることが分かった。担癌患者の血中遊離DNA中には癌細胞由来のDNA (ctDNA)が存在し、ctDNAは症例特異性から優れた癌の診断マーカーとして期待される。NGSを用いたctDNA解析について教室で行った大腸癌に対する先行研究では、ctDNAは非常に微量でありNGSでは解析困難なことが明らかとなり、「1原発巣腫瘍組織におけるNGSを用いた遺伝子変異スクリーニング→2血中遊離DNAにおける当該遺伝子変異のdigital PCRによる定量・モニタリング」システムを構築した。本申請課題では、このシステムを用いより悪性度の高い食道癌の治療経過・follow中のctDNA定量モニタリングを行い、その診断能・有用性について既存の検査法と比較検討する。現在、20例の食道癌症例がエントリーされた。原発巣変異解析は独自にデザインした31遺伝子を標的とする食道癌panel (SCC panel)にて解析し、平均8.1個の変異が検出されている。SCC panelは、食道癌の変異スクリーニングに非常に有効であることが示された。化学療法著効例ではNFE2L2/KEAP1遺伝子の変異がないことなども確認できており、本Panelによる原発巣変異解析のみでもある程度治療感受性予測に有効な可能性がある。症例数を増やし検討を重ねる予定である。検出された症例特異的変異に対するPrimer/Probeを設計しdigital PCRにてctDNAの変動を確認中である。Stage I/II症例ではctDNAは検出されなかったが、Stage III/IVでは全例検出可能で治療奏功例では全例治療後のctDNAの低下が確認可能であった。そのた、化学療法後Stable disease (SD)およびProgressive disease (PD)症例では、ほぼ画像所見と一致したctDNA変化が確認された。次世代シークエンサー(NGS)を用いた癌ゲノム解析により個々の症例で病巣に集積する多数の遺伝子変異を同定できるようになった。食道扁平上皮癌の変異を効率的に検出しうる31遺伝子を標的とした食道癌パネル(SCC panel)を作成し、食道癌25例の原発巣の次世代シークエンサー(NGS)解析で1腫瘍に平均9個の変異が検出可能であった。治療経過中の患者血漿の集積は当初は従来の血漿分離採血管では採血後2時間以内の遠心操作が必要で時間的制約が大きかったが、採血後2週間まで血漿DNAを安定して保存可能なBCT採血管(Streck社)を採用し大幅に改善した。健常人および食道癌患者治療前後の血液検体を用いた従来採血管とBCT採血管の比較検討を行いBCTの有用性を示した。血漿中の腫瘍細胞由来DNA (ctDNA)の検出にはdigital PCR (dPCR)システムを用いて行った。現在ctDNA解析にはNGSあるいはdPCRが用いられている。NGSでは複数の遺伝子領域を検索可能であるが解析にコストや時間を要する欠点があり、逆にdPCRは解析は数時間で低コストでモリタリングに向いているが1解析で解析可能な変異が1数個に限定される欠点がある。したがってdPCRを用いたctDNA解析はKRAS, BRAF, EGFRなどのhotspot変異に関する報告が多いが、われわれのシステムは症例特異的変異についてProbeをデザインするものであり汎用性が高い。原発巣で検出された複数の変異のうち、同一症例では変異アリル頻度(Mutant allele frequency: MAF)の高い変異程ctDNAの検出頻度および血漿中ctDNAのMAFも高値を示した。したがって原発巣のMAFが10%以上の変異について1症例13個の症例特異的変異を用いてdPCR解析を施行した。Stage II以上では全例治療前ctDNAが陽性であり、治療効果や再発に応じてctDNAが変動することを明らかにした。

これまでの検討で、今回作成した食道癌パネル(SCC panel)は、食道癌の変異スクリーニングに非常に有効であることが示された。症例ごとの変異数とStageには相関は見られていないが、化学療法著効例ではNFE2L2/KEAP1遺伝子の変異がないことなども確認できており、本Panelによる原発巣変異解析のみでもある程度治療感受性予測に有効な可能性がある。症例数を増やし検討を重ねる予定である。Digital PCRによるctDNA解析についても、施設に機器はまだ有していないが他施設の機器を借用しながら解析を進めている。当施設でサンプル・反応液準備、移動後の他施設でのPCRで、問題なく結果の得られる時間・実験条件の確認後、実際の臨床検体での解析を行い上記結果を得ている。今後さらに多くの変異でctDNA検索を行い、またfollow中の臨床的な再発・再増大とctDNAの変動を比較検討していく。また、一般的な血漿分離採血管では、患者より血液検体を採取した後2時間以内の遠心操作が必要であったが、保存中に有核細胞の破壊を防止することが可能なBCT cell free DNA採血管を採用し、5日間程度までは安定に血漿中遊離DNAが採取可能なことも明らかにした。本年のアメリカ癌学会で報告したが、現在論文作成中である。消化器外科学、分子生物学1,076円の残額が生じたが、同額で購入可能な喫緊に必要な物品・試薬はないため、次年度使用とした。消耗品等の一部として使用予定である。
日長感受性に関連するGLP遺伝子の発現機構の解析

日長感受性は花成現象などの生活環を制御する基本的な性質である。GLP(germin-likeprotein)遺伝子は、申請者等が日長感受性を反映した転写調節を受けることを示した植物界で最初の遺伝子であり、日長感受の分子機構を調べる手がかりになるものと考えている。本研究では1分子機構を調べる目的に最適な長日植物シロイヌナズナと、最も鋭敏な短日植物であるアサガオからGLP遺伝子を単離して、発現調節機構を比較することを目的とした。昨年度クローン化したシロイヌナズナのAtGLPl, 2のmRNAの蓄積は、明期開始から16時間目を中心とする暗期型のサーカディアン・リズム変動を示し、昼型のリズムを示すAtCABl,2と好対照であることが示された。AtGLPl,2のプロモーター配列について調べた結果、光制御性の遺伝子に共通するGATA配列、G-box様配列、CCA1結合配列等の存在が示された。中でもAtGLPl,2に共通する逆向きのGATA配列は、AtCABl,2遺伝子に共通する正方向のGATA配列と好対照を示しており、発現時刻の昼・夜の違いを制御する可能性を示唆しており興味深い。現在、この配列の機能解析を目的としてルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子とのプロモーター融合遺伝子の形質転換を行っている。現在、種子の選択中である。一方、アサガオのPnGLPのゲノム遺伝子を核ゲノムライブラリーよりクローン化に成功した。Southernで確認した3つの核ゲノム領域を解析中であるが、2つはレトロトランスポゾン様の偽遺伝子であり、1つが機能する遺伝子(PnGLP)であることがほぼ確認できた。現在、PnGLPのプロモーター配列の解析を進めている。今後、アサガオ、シロイヌナズナのプロモーター領域の機能を含めた総合的な比較解析を行い、日長感受性の分子機構へとさらに迫りたい。日長感受性は花成規象などの植物の生活環を制御する基本的な性質である。申請者がアサガオから短日性花成誘導機構と平行関係にあるタンパク質として報告したGLP(germin-like protein)の遺伝子は、光周性花成の2大モデル植物であるアサガオ(短日性)とシロガラシ(長日性)において、各々の日長感受性を反映した転写調節を受けることが判明した植物界で最初の遺伝子であり、日長感受の分子機構を調べる手がかりになることが期待される。本研究では、分子機構を調べる目的に最適な長日植物シロイヌナズナと、最も鋭敏な短日植物であるアサガオからGLP遺伝子を単離して、発現調節機構を比較することを目的とした。今年度は、アサガオのPnGLPとシロガラシのSaGLPのアミノ酸配列の相同部位からPCR用のprimerを作成してシロイヌナズナからAtGLP1、AtGLP2の2種の遺伝子を単離した。ゲノミック・サザンの結果等からシロイヌナズナにおけるPnGLPとSaGLPの相同遺伝子はこの2種の各1コピーのみであることが示され、遺伝子マッピングの結果、AtGLP1は第1染色体下腕、AtGLP2は第5染色体の上腕に位置することが判った。花成関連のQTLが一致する可能性が示されたが、同じ座位には突然変異体の報告例は無かった。2つの遺伝子がアミノ酸配列で64%一致し、発現様式が似ていることから、互いに相補するためとも推察された(印刷中)。ノーザン法によって葉におけるmRNA量を解析した結果、AtGLP1,2のmRNAは共に明期開始から16時間目を中心として増加・減少する日周変動を示すことが判った。この変動は連続明条件では持続するサーカディアンリズムを示すが、連続暗条件では停止し、短日植物(アサガオ)とは正反対の様式を示す興味深い結果となった。
産業博物館を軸とした産業観光のモデル化について

わが国とドイツの代表的な産業観光地を調査し、それぞれの地域の観光資源の特徴とその魅力、観光振興への取り組みなどについて分析した。特に福岡県と愛媛県については県内の全産業博物館の現況と課題をまとめ、産業博物館を軸とした産業観光の活性化策を提案した。またドイツ・ルール地域については、計3回の現地調査の結果から、同地において産業遺産観光が成功した理由を明らかにした。その他の主な調査地は、国内が北海道函館市、ドイツがフェルクリンゲン製鉄所とその周辺、ゴスラーとランメルスベルク鉱山、クラウスタール=ツェラーフェルト、ヴォルフスブルク、シュトゥットガルト、デッサウであった。平成24年度は国内の調査を実施せず、ドイツ連邦共和国ルール地域の2回目の調査とこれまでに収集した文献・資料の分析に集中した。ルールの主な調査対象は、産業博物館10箇所(LVR産業博物館オーバーハウゼン、同聖アントニー製鉄所、レックリングハウゼン変電所/電気と生活博物館、LWL産業博物館ヘンリヒェンブルク船舶昇降機、同ツォレルン炭坑、同ハノーファー炭坑、ヘッシュ博物館、ビール博物館、ドイツ仕事の世界展示館、ドイツ鉱業博物館)、産業遺産を活用した観光施設6箇所(オーバーハウゼン・ガスタンク、オスターフェルト庭園、ノルトシュテルン公園、エーヴァルト炭坑跡、ハンザコークス工場跡、ボーフム・センチュリーホール)、旧労働者居住区1箇所(アイゼンハイム)であった。ルール再生の起爆剤となったエムシャーパーク国際建築博覧会が終了して10年以上が経つが、産業遺産の保存・活用に向けた整備は続けられており、この地域の観光地としての付加価値はますます高まりつつあるように思われた。中でも産業博物館の充実度には目を瞠るものがあり、また産業遺産を活用した多彩なイベントの開催など、リピーターを増やす工夫も随所にみられた。反面、展示館や事務所として再活用できない建造物は年々劣化が進むので、これらをどう維持・補修していくかが今後の課題になると思われた。この点については現地でいくつかインタビューを行なったが、いずれも明確な回答は得られなかった。研究成果の公開については、前年度までに調査を終えた愛媛県の産業博物館について論文(査読有)を執筆するとともに、愛知大学経営学会ワークショップにおいて「産業博物館と産業観光」と題する口頭発表を行なった。平成25年度は、ドイツ連邦共和国の産業遺産、産業博物館の調査とこれまでに収集した文献、資料の分析を行なった。2013年現在、ドイツにはユネスコの世界遺産が計38件あり、うち3件(エッセンのツォルフェライン炭鉱業遺産群、ランメルスベルク鉱山とゴスラーの歴史地区とオーバーハルツ水利管理システム、フェルクリンゲン製鉄所)がユネスコ世界遺産ドイツ協会により「産業文化」というテーマに分類されている。これらはいずれも鉱山、製鉄に関係しており、ドイツの産業遺産の特色が見て取れる。前年度までの調査はツォルフェライン炭鉱業遺産群を中心とするルール地域に焦点を当ててきたが、今年度は他の2件(オーバーハルツを除く)も調査対象とした。産業観光のモデルとして見た場合、フェルクリンゲン製鉄所のあるザールラントはルールと似た性格を持つ。すなわち、同製鉄所を中心に石炭・製鉄関係の産業遺産(ノインキルヒェン等)や博物館(ランズヴァイラー=レーデン等)が点在し、産業観光地として広域でのブランド化が可能である。現時点ではルールに比べ全体の整備状況は遅れているが、個々の観光資源としての価値は大きいので、今後の発展が期待される。一方、ランメルスベルク鉱山とゴスラーの歴史地区は、産業観光と歴史観光の組み合わせモデルとして注目される。わが国では(伝統工芸等を除き)産業観光を単体でテーマ化する事例が多いが、異なる観光資源と組み合わせることによって地域の魅力をより重層的にアピールすることができる。研究成果の公開については、愛媛県の産業博物館について論文(日本感性工学会論文誌12巻2号、査読有)を発表するとともに、日本観光学会第104回大会において「ドイツ・ルール地域の産業観光振興策」と題する口頭発表を行なった。平成23年度は、北海道函館市・北斗市、愛媛県新居浜市・今治市・内子町、ドイツ連邦共和国ルール地域(デュースブルク市、ミュルハイム・アン・デア・ルール市、エッセン市、ハッティンゲン市)及びケルン市の産業観光施設について、その規模、展示内容、展示方法、広報、アクセスなどに関する調査を行なった。展示形態による内訳は、屋内型の博物館14箇所、屋外型の展示施設4箇所、両者を併設した施設4箇所である。調査対象とした施設のうち国内で最も注目されたのは、新居浜市の別子銅山関連の施設であった。市内には銅山の遺構や関連の資料を展示する施設が3箇所(マイントピア別子、広瀬歴史記念館、別子銅山記念館)あり、それぞれに特色のある展示を行なっていた。ただ各施設を結ぶ交通手段に配慮が見られないため、集客面での相乗効果が十分に得られていないのではないかと思われた。

ルール地域については、主要な産業遺跡の組み合わせ(炭坑、製鉄工場、積み出し港)が福岡県の事例と類似しており、両者の比較研究の必要性が認識された。また大規模な工場の遺構をほぼそのままの形で保存・活用する手法(デュースブルク・ノルト景観公園、ツォルフェライン炭鉱遺産群、LWL産業博物館ヘンリッヒスヒュッテ・ハッティンゲン)はわが国には見られないものであり、今後の産業観光施設のあり方を考えるうえで大いに参考になった。研究成果の公開については、前年度に口頭発表した福岡県の産業博物館と産業観光に関する研究を論文にまとめ、日本感性工学会論文誌(10巻4号、査読有)に発表した。そのほか基礎的な研究については、博物館学、観光学、産業史、産業遺産などに関する書籍を購入し、次年度の調査のための予備研究を行なった。平成26年度は本研究の最終年度であったため、これまで取りこぼしてきたドイツの産業遺産、産業博物館の調査に重点を置いた。主な調査地は、1クラウスタール=ツェラーフェルト、2シュトゥットガルト、3デッサウであった。1は、2010年にゴスラーの歴史地区とランメルスベルク鉱山に連結される形でユネスコの世界文化遺産に登録されたオーバーハルツ水利管理システムの拠点となる町である。山中にある広大なシステムを個人で見て回ることは難しいので、この町からガイドツアーが出ている。ツアーの内容は自然観光と一体化したもので、産業観光の新たなモデルとして注目される。町の中心部には見学可能な立坑2基と鉱山博物館もあり、ゴスラー地区との結びつきを強化すれば一層の発展が期待できる。2は、西南ドイツの中核都市である。世界的に有名な自動車博物館2館(メルセデス・ベンツ博物館、ポルシェ博物館)の他、G・ダイムラーゆかりの展示施設、市電やワインの博物館など、産業観光の資源も豊富である。今後の課題としては、恵まれた資源を機能的に結びつける観光ルートの開発が挙げられる。3は、1996年にヴァイマールとともにユネスコの世界文化遺産に登録されたバウハウス関連遺産群の所在地である。バウハウスの遺産はさすがに見事であるが、そもそもこの地にバウハウスが誘致されたのは、ここがユンカースに代表される航空・機械工業の集積地だったからである。市内には現在もH・ユンカース技術博物館があるが、バウハウスとの連携が見られず、貴重な観光資源を十分に生かしきれていない。今後の発展に期待したい。研究成果の公開については、ルール地域の産業遺産観光について論文(日本観光学会誌第55号、査読有)を発表するとともに、日本観光学会第105回大会において「ドイツ・デュースブルク市の産業観光振興策」と題する口頭発表を行った。観光学ルール地域の産業遺産の規模が当初の想定より大きかったため、調査にやや時間がかかっているが、それ以外はほぼ計画通りに進められている。今年度は国内の調査ができなかったが、ドイツの産業遺産、産業博物館の調査は順調に進んでおり、新たな知見が得られつつある。東日本大震災のため、東北地方の調査を一時延期するなど調査計画を一部変更せざるをえなくなったが、それ以外はほぼ計画通りに進められた。
マウス生殖細胞におけるゲノムインプリンティング再構築機構関連遺伝子の探索

昨年度、雌の卵子を用いたスクリーニングから、Pegl,Peg3,Rasgrf1の各DMRにおいてそれぞれ異常値を示すG3個体が1個体づつ検出された。そして遺伝性を確認すべく、同リターの複数のG3雄マウスを用いて、他系統(DBA/2J)雌との戻し交配個体の産生を行い、得られるG5個体について異常値の検出されたインプリント遺伝子DMRのメチル化レベルの測定を行った。しかし、異常表現型は全てのラインについて再現することができず、遺伝性は確認できなかった。一方、雄の精子を用いたスクリーニングからは、13個体においてメチル化の異常が検出された。そのうちの7個体は、H19,rasgrf1遺伝子のDMRでメチル化異常が検出されたひとつの家系に由来する個体たちであった。そこで、このラインについて、G1と他系統(DBA/2J)雌との戻し交配個体の生産を行い、得られたG3個体についてメチル化レベルの測定を行った。その結果、複数個体でH19,rasgrf1遺伝子のDMRでメチル化異常が検出され、遺伝性が確認された。また、既知のゲノムインプリンティング遺伝子のノックアウトマウスで観察される精子形成異常も、本ラインの多くのメチル化異常個体で観察された。現在この原因遺伝子の同定に向けて、染色体マッピングを進めている。将来、この原因遺伝子が判明することにより、少なくとも雄での精子形成過程におけるメチル化獲得のメカニズムの解明に大きく貢献することができると期待される。本年度は、30個体のC57BL/6J系統雄個体にENU投与を行い、同系統との交配により得られたG1世代雄30個体と同C57BL/6J系統雌個体との交配により、G2世代雌個体を各G1雄当たり4個体得た。さらにG1世代とG2世代のマウスを交配して各G1当たり平均59個体(雌29/雄30)のG3世代を生産した。過排卵処理を施した23から30日齢のG3世代雌886個体について、卵管膨大部より卵子を採取し、ヒアロニダーゼ処理さらにプロテインアーゼ処理を行い、体細胞である卵丘細胞の除去を行った。次に当研究室で確立した極少数の細胞から複数のインプリント遺伝子内DMR(differential methylated region)のメチル化レベルを定量的に測定する方法により、各G3個体より得られた数十の卵子ゲノムの6つのインプリント遺伝子内DMD(H19 A領域,H19 B領域,Rasgrf1,Peg1,Peg3,Lit1)のメチル化レベルの測定を行った。正常マウス(C57BL/6J系統)卵子を用いて作成した各インプリント遺伝子DMR内のメチル化レベルの基準値と比較した結果、Peg1,Peg3,Rasgrf1の各DMRにおいてそれぞれ異常値を示すG3個体が1個体ずつ検出された。現在、これらの異常マウスと同リターの複数のG3雄マウスを用いて、他系統(DBA/2J)雌との戻し交配個体の産生を行っている。来年度、得られるG5個体について異常値の検出されたインプリント遺伝子DMRのメチル化レベルの測定を行い、遺伝性の確認さらに、遺伝性がある場合、染色体マッピングを行う予定である。
HOX遺伝子群による骨格構造形成の制御機構の解析

Hox Cクラスターに属する遺伝子間での機能的協調の存在がこれまでの我々の研究から示唆されておりこれをさらに詳細に解析するためにHox Cクラスター全体を欠損したマウスの作製を行った。Hox Cクラスターを欠損させるためCre-loxPシステムを利用した。すなわちHox Cクラスターの両端にloxP配列を相同組み換えにより導入し、得られた細胞にCreリコンビナーゼを作用させることにより、loxP配列に挟まれたHox Cクラスターの遺伝子全体を欠損させることを試みた。Hox Cクラスターの両端にあるHoxc-4遺伝子とHoxc-13遺伝子の位置にloxP配列を挿入するために、2種類のベクターを構築した。CreリコンビナーゼによるloxP配列間での組み換えの効率はloxP配列間の距離が大きくなるほど低下すると考えられている。約100kbの距離での組み換え効率がどの程度であるのかは予測することが困難であったが、相当に低いものになると予想された。このためloxP配列間での組み換えが起こったときにのみピューロマイシン耐性になるような工夫を施した。これらのベクターを相同組み換え法を用いてES細胞に導入し二重変異細胞を得た。この細胞にCreリコンビナーゼの発現ベクターを導入し一過的に発現させ、ピューロマイシンによる選択を行いloxP間で組み換えを起こした細胞を得た。詳しい解析の結果この細胞では確かにHox Cクラスターが欠損していることが確認された。この細胞を用いキメラマウスを作製し、キメラマウスよりHox Cクラスターヘテロ変異マウスを得た。ヘテロ変異マウスは外見上正常であり、これらを交配しホモ変異マウスの作製を行っている。以上述べたように、Hox Cクラスター欠損マウスの作製及び染色体上の長大な領域を操作する技術の確立について目標を達成した。
我が国における知能の日常的概念の同定とその計測方法に関する研究

わが国における日常的知能概念を検討するために、二年度にわたって調査・実験・観察等を実施した。その結果、次のようなことが明らかになった。1.日常的知能概念には文化差があり、わが国の大学生の場合は記憶力や学業成績が重視されるのに対して、米国の大学生の場合には独創性や意志などが重視されることが示された。2.中学生における日常的知能概念を検討した結果、中学生の場合にも大学生や成人と同様な性差が存在することが示された。3.乳幼児期の知的・情緒的発達を研究するための手段として、子どもが母親の感情を洞察する能力を測定するためのテストを開発し、3歳児から5歳児に実施して結果を分析した。4.成人を対象として、ディスプレイ上の記号照合からなる視覚検索実験を実施し、非機能的知的応答が生じることを見出した。今後は、これらの研究成果を公表するとともに、各研究の問題点をさらに検討していく予定である。本年度は,日常的知能概念の測定に関する基礎的な文献資料の収集を行なうとともに,この概念をより明確化するための実験・行動観察・質問紙調査等を実施した.その概要は,次のとおりである.1.小学生および中学生,高校生を対象として「頭がよい子」とはどのような子か,また「頭のよい人(成人)」とはどのような人か,などについて,自由記述形式で回答を求めた.この予備研究の結果を基にして,児童期および前期青年期における日常的知能概念を明確化するための質問紙を構成した.2.知能概念の発達的変化を検討するために,小学校4年生および6年生を対象に質問紙調査を実施した.その結果,日常的知能概念に性差が見出され,特に女子において社会的知能の要因が発達にともない重みを増すことが示された.3.コンピュータ・プログラミング(ロゴ)における問題解決過程の観察を行ない,従来の学校教育ではあまり注目されていなかった「理解のしかた」の多様性が見出された.4.アタッチメントの発達に及ぼす,母親の感情認知に関するテスト(「洞察力テスト」)を開発した.このテストを3歳児5歳児に実施し,その結果を既製の知能テストや母親の養育態度とあわせて分析した.5.反応時間と探索行動に関連する問題解決過程において,各種のメンタルモデル・擬人モデル等)を利用することにより,課題状況に関する理解が促進されることが示された.本年度は、日常的知能概念をより明確にするために、実験、行動観察質問紙調査を実施した。1.1)知能が高いか否かの判断に関連するtraitを32あつめ、英訳した。2)上のリストの各項目について、それの個人への該当度スケールを作製した。3)日本の大学生100名、米国の大学生78名を対象に「知能の高い者」「知能のあまり高くない者」それぞれへの上の諸項目の該当度の判断を求めた。4)上の結果について日米差、性差を検討し、日本での記憶力、学業成績、米国で独創性、意志などが知能についての判断がかかわる傾向の強いことを見出した。2.コンピューター画面上の記号称号からなる視覚探索課題を成人被験者に課し、課題条件に応じて自発的かつ柔軟な探索方略の変更(非機機的知的応答)が生じることを確認した。3.母親の感情を洞察する能力を測定するためのテストを作成し、3歳児、4歳児、5歳児に実施して発達テストとして使用できるか否かを検討するとともに、知能との関連も検討した。4.中学生の日常的知能概念を検討するための質問紙調査を実施し、社会的適応性に関する性差を確認した。
NACドメイン転写因子へテロ複合体の生物学的役割

NACドメイン転写因子であるVNI2は、他のNACドメイン転写因子であるVND7と結合することで、VND7の転写活性を阻害し、道管形成を抑制することが明らかとなっている。また、発現パターンの解析より、VNI2は道管形成以外の役割も有している推測された。VNI2のさらなる機能の解析を行うことを目的として、相互作用因子の探索を行ったところ、30ものNACドメイン転写因子が単離された。昨年度までに、VNI2と相互作用因子として単離されたNACドメイン転写因子であるATAFに着目して解析を行ったところ、ATAF2は老化の鍵遺伝子であるORE1の発現を正に制御することを明らかにした。また、野生型と比較してataf2変異体は老化が遅延するのに対し、ATAF2過剰発現体は老化が促進されることを明らかにした。そこで、今年度は老化に関与する遺伝子群の発現パターンについて検証を行った。その結果、ATAF2はORE1以外にも老化を促進するAtNAPやANAC046, ORS1などの発現を促進することが明らかとなった。また、興味深いことに老化の進行を抑制するJUB1やVNI2についてもATAF2は発現を誘導することが明らかとなった。特に、JUB1は暗条件下で誘導される老化過程でATAF2により著しく発現が制御されることが明らかとなり、これらの結果は、ATAF2が様々なシグナルに応じて老化の進行を制御しうることを示唆している。VNI2と、ATAF2との作用機構を明らかにするために、変異体の解析を行った。vni2変異体では、老化の進行が促進される表現型を示すのに対して、vni2 ataf2二重変異体では、その促進効果が緩和されることが明らかとなった。これは、VNI2の老化を抑える働きはATAF2の存在に依存することを強く示唆している。NACドメイン転写因子であるVNI2は、同じくNACドメイン転写因子であるVND7と相互作用する因子として単離された。詳細な解析の結果、VNI2はVND7と結合することで、VND7の転写活性を阻害することが明らかとなっている。このVNI2のさらなる作用機構を解明することを目的として、酵母2ハイブリッド法によるスクリーニングを行った結果、30種ものNACドメイン転写因子が同定された。今年度はまず、単離した30のNACドメイン転写因子の転写活性能を検証するために、GAL4-BDを融合させた転写因子を、調整したプロトプラスに一過的発現させた。その結果、5つの転写活性化因子と6つの転写抑制因子が存在することが明らかとなった。また、単離されたNACドメイン転写因子とVNI2との二重変異体を多数作出した。その中で、ある相互作用因子単独変異体は塩ストレス耐性を示したのに対して、vni2単独変異体、およびvni2との二重変異体では、そのような耐性形質は観察されなかった。このことから、この相互作用因子はVNI2依存的に塩ストレスに応答することが示唆された。また、vni2変異体、および相互作用因子変異体背景に、それぞれ相互作用因子、VNI2過剰発現用コンストラクトを導入した形質転換体を作出している。VNI2と相互作用する因子として、NACドメイン転写因子の他に、BTBドメインを有するBMP3が単離された。BTBドメインファミリーはCUL3やRBX1と複合体を形成することで、ユビキチンE3ライゲースとして機能する。BPMはシロイヌナズナ中6遺伝子存在するのに対し、CUL3は2遺伝子のみである。そこで、BPMの機能が低下した植物体として、cul3二重変異体を作出した。これらは、矮性や花成遅延などの表現型を示す。これらcul3二重変異体で表れる表現型がVNI2依存的か検証するため、cul3 vni2三重変異体についても作出した。計画調書で記載していた、多重変異体や、過剰発現体の作出は全ての組合せではないものの、優先順位の高いものについては概ね完成している。今後は、それら植物体を用いて、解析を行うこととなる。そのための条件検討についても進めており、次年度において作用機構に迫る実験データが得られるものと期待している。詳細な解析の結果、VNI2はVND7と結合することで、VND7の転写活性を阻害し、道管形成を抑制する働きをもつことが明らかとなっている。このVNI2のさらなる機能を解明することを目的として、酵母2ハイブリッド法によるスクリーニングを行った結果、30種類ものNACドメイン転写因子が単離された。今年度は、ストレス応答に関与することが知られているNAC転写因子に着目して、作用機構を解析した。その結果、まず、VNI2はそのNAC転写因子の転写活性を阻害することが、一過的発現解析により明らかとなった。また、vni2変異体は暗所処理による老化誘導が促進されたのに対して、相互作用するNACドメイン転写因子の変異体では抑制されるといった正反対の表現型を示すことが明らかとなった。そこで二重変異体を作出したところ、二つの変異体を相加したような表現型を示した。これは、対象としたNACドメイン転写因子と高い相同性を持つ遺伝子もVNI2による制御を受けている可能性を示唆している。VNI2と相互作用する因子として、BTBドメインを有するBPM3も単離されている。