hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ユーザと製品のインタラクション分析のためのアクト・ユーザ法の開発

製品事故において「何故その時に(不合理と思われるような)行動をユーザがとったのか」という疑問に答えるために、ユーザの行動要因も含めた新しい再現実験の手法として、被験者が事例に基づくシナリオを元にユーザを演じきることで、行動のミッシングリンクを明らかにする「アクト・ユーザ法」の開発を目指した。研究は以下の3つに集約された。(1)アクション・シナリオの試作、(2)眼球運動に基づく行動時の認知状態の推定技術の検討、(3)ヒヤリ・ハット事例への展開。製品の使いやすさや、誤使用と製品事故との関係などを考察するには、「何故ユーザはそのように操作(行動)したのかを明らかにすることが重要である。誤使用状態も含めた製品使用中の認知的処理の客観的な指標として、眼球運動の軌跡データが利用できるか否かについて、自動車シミュレータ運転時の眼球運動座標データ(昨年度実施)をカオス分析することで検討した。自動車シミュレータ運転時を取り上げた理由は、自動車も製品の1つであることと、課題中の認知状態の制御についての先行の知見や経験が豊富であることであった。眼球運動データは、シミュレータのボンネットに設置した非接触で座標値を測定できる装置(faceLAB)によって採取した。被験者には先行車に追従しながら、先行車のブレーキランプが光ったらウィンカーレバーで反応する反応時間課題を課した。先行車のブレーキランプが光るタイミングは、先行研究のデータに基づき、最も予期がしづらく、また、注意力が持続しにくい時間間隔とした。約10分単位の運転を繰り返し、様々な覚醒度や注意力の状態となると予測される実験的課題を実施した。採取した2軸座標データを、カオス解析ソフト(既存だが、今回使用するPCの更新に伴い、ソフトのバージョンアップを実施)により分析し、リアプノフ指数などを指標とした検討を実施した。結果として、予想外の状況が起きた時(予期を裏切る状況の変化や他車の反応など)、判断の迷い時、(眠気とは関係なく)注意集中が落ちている時、覚醒低下時、などの場面で、眼球運動軌跡データのパターンわけができる可能性を見出した。製品事故における「なぜその行動をしたのか」という人間要因の発生の仕組みを解明することを目的に、人間要因も含めた事故再現実験の方法(アクト・ユーザ法)の開発を進めている。2012年度は実際の労働現場での実例に基づいた、現場での実験を計画した。協力してもらえる企業も見つかり、事故事例の分析等の準備が進んだところで、現場側の都合で実験が実施できないことになり、実験の実施を延期せざるを得ない状況となった。2013年度は新たな協力企業の模索に、時間がかかったこのような事態も踏まえて、大阪教育大学高橋誠教授に、研究内容や今後の視点についてのアドバイスを求めた。まずは、製品事故における人間行動を行動分析学的に分析し、製品事故防止策につなげようとするこれまでの研究について、概要を高橋教授に説明した。高橋教授からは、産業心理学、行動科学の観点から、製品事故を含めて「安全」は社会的背景を考えることが重要であること、例えば、犯罪(人間の故意の行動)には、格差社会など社会の問題も影響すること、それに対向するためのセキュリティーが今後は学問的な意義をもってくるのではという見解が示された。また、影響の時間軸を考慮すれば、安全と健康は切り離せない問題であること、およびこのような研究における研究倫理と利益相反などについて、議論し、示唆を得た。本研究では、実証実験を計画しているが、製品事故を含め、実際の使用者(作業者)による検証が有用であることを確認し、高橋教授にも協力してもらえる企業の紹介を依頼した。その後、協力してもらえる可能性のある企業がみつかり、その企業内での事故・トラブル事例から、再現実験にふさわしい事例として、配線の誤接続、誤切断を取り上げることして、社内報告書の記述より、事故内容を分析し、アクション・シナリオの作成をすすめている。「製品事故」への関心が高まっている。大きな事故後には再現実験が講評されるが、その分析は結果論的、工業試験的であり、対策は製品の改良と「危険な使用禁止」への注意喚起が主となっている。真の問題の解決には、何故ユーザが何故最終的に問題となる行動をしたか、を解明する必要がある。本研究では、ユーザ行動を解明するために、「アクト・ユーザ法(ユーザを演じる)」を提案し、その有用性を検証することを目的とする。本年度は、「アクト・ユーザ法(ユーザを演じる)」検討のために、実際の事故事例から再現実験のための「アクションシナリオ」を作成することに焦点をあてた。1.製品事故の情報収集:web上で公開されている、製品事故、労災事故などの事故情報を精査し、本研究目的に利用できる事例を収集した。利用のためには、製品や事故の結果のみならず、その前後の状況が詳細に記述されている事例が望ましいため、内容を見ながら選別し、当日の気象条件など、関連する情報についても検索し、シナリオ作成の素材データとした。

2.選別した事例にもとづくとアクションシナリオの作成:上記の条件を満たしている事例について、既存分析の結果(原因や対策)に拘らず、事象の発生にいたる時系列に沿って、「起承転結」に整理し、かつ環境と当事者のインタラクションを「随伴性ダイヤグラム」に則って作成し、行動再現実験のためのシナリオ(アクションシナリオ)の作成を進めた。現時点では、「DVDレコーダー」、「電気炊飯器」、「照明器具」、「オーブントースター」、「水槽用ヒーター」、「電気マット」、「シュレッダー」の使用事故の事例のアクションシナリオ(案)を策定している。3.製品使用時の行動の客観的測定の一つとして視線を記録する「視線追尾システム」を購入し、動作確認や試用を進めた。4.運転支援装置の評価方法を検討するための、シミュレータ運転課題プログラムを作成した。製品事故におけるユーザ行動について、「なぜその場面でそのように行動したか」という人間要因の発生の仕組みを解明することを目的に、人間要因も含めた事故再現実験の方法(アクト・ユーザ法)の開発を目指した。アクト・ユーザ法とは、事故事例から作成された「アクションシナリオ」に基づき、被験者がそのユーザを演じることで、「何故(不合理と思われる)行動をしたか」に関する要因を見つけ出す方法である。アクションシナリオは、事例の記述を起承転結構造と随伴性ダイヤグラムに基づき編集したものである。当初はこのように一般的な製品事故場面を想定して、アクションシナリオの作成を進めたが、一般事故事例は、その実態の情報が少なく、また様々な要因が関連しており再現実験が難しいことが判明した。そこで、研究の目的は不変であるが、企業における安全活動の1つに位置づけられる「ヒヤリ・ハット」事例(ニアミス)を新たなターゲットとした。ヒヤリ・ハット事例の利点は、企業内で対策に利用するために報告フォーマットが定められており、また事故寸前の事態であるために、その状況が素直に記述されている例が多いことである。ある企業(建設業)の安全衛生担当者の協力を得ることができ、その企業におけるヒヤリ・ハット事例(有効回答数172枚)のデータを年齢層別、屋内/屋外作業別、ヒヤリ・ハットの内容別に分析した。屋内/屋外作業に「転落・転倒」が共通した要因であったので、、作業者の心身機能等との関連をさらに分析した。その結果、作業のやりにくさ・バランスを崩した等の作業行動と、時間的切迫による感情・情動が行動の影響要因であることが示唆された。また行動の背景には危険感受性が深く関わっていることが示唆された。これらの行動の原理の解明(ヒヤリ・ハット再現実験の準備)と共に、解明された原理に基づく現場で出来る教育方法の検討を進めた。産業心理学、人間工学2012年度後半には、実際の製品を現実の状況に近い条件で使用させ、使用時の迷いや、間違った操作を再現させる実験を計画していた。新規に開発された携帯型データ提示装置(市販品)を開発している企業の協力も得て、実際の職場において実態を観察し、その結果に基づいた実験室における再現実験を実施することを計画していたが、当該製品の普及が予測より遅れ、実使用場面の実態データの収集が不十分で製品使用の「シナリオ」を作成するのには無理があることが判明した。
メダカ孵化酵素遺伝子の発現と孵化腺細胞の分化

メダカ孵化酵素は、2種のプロテアーゼ(HCE LCE)による酵素系である。両酵素は、アミノ酸の一次構造が55%類似性があり、良く似たプロテアーゼであり両者共にアスタシンファミリーに属する。しかしながら、その遺伝子構造はまったく異なり、LCEは8つのエクソンを持つ単一コピー遺伝子であるが、HCEはエクソンを持たない多重遺伝子である。両遺伝子上流の塩基配列とその転写開始点を決定した。両遺伝子とも複数の転写開始点を持ち、その転写開始点の上流20-30bpのところにTATA boxがみられる。CG boxやCAATのコンセンサスシークエンスは見られない。また、HCE遺伝子間では上流域の塩基配列はよく保存されており、同様の発現調節制御をうけていると考えられる。一方、LCE遺伝子とHCE遺伝子の上流域を比較すると広範囲での塩基配列の類似性は見られない。しかしながら、両遺伝子は同期して孵化腺細胞で発現することから同様の調節機構により制御されていると考えられる。このことより、両遺伝子が共通のシス調節エレメントにより調節されていることが予想される。現在、両遺伝子の上流域とβガラクトシダーゼ遺伝子を用いてメダカ胚での遺伝子発現系を開発している。in situハイブリダイゼーション法を用いて孵化酵素遺伝子の発現を調べた。最初の孵化酵素遺伝子の発現は、後期のう胚期に胚盤葉下層(ハイポブラスト)の先端部の細胞群で見られる。その後、ポルスターと呼ばれる頭頂部の細胞集団を形成した後、その細胞集団はバラバラとなり胚体後部へ移動し、鰓弓(ブランキラルアーチ)に沿って局在する。その後、顎の形成に伴って最終の局在場所である咽頭内に位置する。孵化酵素遺伝子が発生初期に発現すること、孵化腺細胞が胚体先端部で分化しその後、胚体後部へ移動することなど興味深い知見を得た。また、孵化腺細胞の起源が最初に陥入する細胞つまり形成体由来であることが示唆され、孵化腺細胞の分化が、初期形態形成のプログラムに組み込まれていることが予想された。
動脈硬化発症と血管内皮細胞カベオラの特性変化に関する研究

1)細胞外カルシウム流入に関連するカベオラと細胞内カルシウムプールである小胞体の構造的関連について検討した。正常細胞ではカベオラは細胞辺縁部に点状に、小胞体は細胞質全域にネットワーク状に分布したが、コルセミド処理後には小胞体は細胞辺縁部から退縮して核周囲部に集中し、カベオラは退縮した小胞体標識の外縁に沿って分布した。カベオラの分布はコルセミド処理後にも残存した微小管とは相関しなかった。カベオリン-1とGFPの融合蛋白質により生きた細胞での分布変化を見ると、コルセミド処理後、GFP・カベオリン-1は細胞の最辺縁部から細胞中心部に向かって移動した。これらの結果は小胞体の分布変化に連動してカベオラが細胞膜上を移動することを示唆する。2)三量体G蛋白質のひとつであるGi_<2α>とカベオラの関係について定量的免疫電顕法によって追究した。急速凍結した細胞の凍結レプリカを金コロイド免疫電顕法によって標識すると、抗カベオリン-1抗体による標識はほとんど全てカベオラに一致して局在したが、抗Gi_<2α>抗体の標識はカベオラ以外にも多数分布し、カベオラ対非カベオラの分布密度比は約2.3倍程度であった。この値はこれまでの生化学的方法による結果よるも遥かに低い。この結果は、生化学的なカベオラ画分に濃縮される分子が必ずしも同じ濃縮度で細胞内のカベオラに濃縮していないことを示唆する。
インタラクション支援のための3次元物体のディジタル化

近年,計算機スピードの高速化,センサの高度化などにより3次元形状情報をもつデータが利用しやすくなってきて,実世界の3次元物体のモデルへのニーズ高まっている.本研究では,3次元モデルを介した人間と情報機器,人間と人間インタラクションの実現を目指し,その基盤技術の開発を目的として研究を行った.対象の安全なモデルを得るためには,複数の方向から得たデータを組み合わせてモデルを生成する必要がある.このとき,データを得た視点の位置と姿勢をデータ自身から推定する位置合わせが不可欠である.本研究では,高精度な自動位置合わせ実現のための基盤アルゴリズムについて研究を行った.自動位置合わせの従来手法では,いかに局所的な形状をうまく記述する不変特徴量を求めるかが重視されていたが,不変特徴量は微分量であるために頑健な計算が難しく対象の形状とセンサの視点に依存する.また,視点間で対象の同じ部分を計測している計測点を対応付ける必要があるが,対応付けの組合せ数が膨大であるため,大域解が得られる手法は少ない.これに対し本研究では,対応付けの問題を離散最適化問題として定式化し,整数計画法を応用することにより,すべての可能な対応付けの組合せの中から最適解を得る巌密解法を提案し,特徴量を必要としない自動位置合わせを実現した.また,形状の計測誤差の影響を軽減し,形状の大局的な構造をうまく捉えて高速に処理を行うための球を用いた形状表現とそれを用いた高速なモデリングアルゴリズム,3次元形状モデルの検索アルゴリズムについても開発を行った.近年,3次元形状情報をもつデータが利用しやすくなってきて,色情報だけでなくその立体的な形状を有するデータのニーズが高まっている.そこで,本研究では,3次元形状情報と色情報を同時に有するデータを介した人間と情報機器,人間と人間インタラクションの実現を目指し,その基盤技術の開発を目的としている.H17年度は,以下の2項目について研究を行った.1.3次元部分形状と色情報の同時計測システムの構築対象物体の部分的な3次元形状と色情報を同時に計測するシステムを構築した.3次元スキャナと高性能ディジタルカメラを購入し,相互の位置関係や向きを簡単にキャリブレーションを行うことのできる計測システムを構築した.2.自動・高精度位置合わせアルゴリズムの開発複数の方向から得たデータを組み合わせて対象物体の3次元形状を獲得するためには,データを得た視点の位置と姿勢をデータ自身から推定する位置合わせが必要である.今年度は,位置合わせを自動化するために,グラフカーネルアルゴリズムに基づく大域収束する位置合わせ手法を提案した.本手法では,既存の手法とは異なった発想に基づき,自動位置合わせのための計測点の対応付けの問題をグラフ上での離散最適化問題として定式化した.すなわち,個々の対応付けの類似性を独立に評価することによって探索するのではなく,組合せの整合性を評価し,整合する対応付けの組合せをできるだけ多く見つけるというアプローチである.これにより,局所解に陥ることなく大域に最適な計測点の対応付けの組み合わせを一意に求めることが可能となった.近年,3次元形状情報をもつデータが利用しやすくなってきて,色情報だけでなくその立体的な形状を有するデータのニーズが高まっている..そこで。一本研究では,3次元形状情報と色情報を同時に有するデータを介した人間と情報機器,人間と人間インタラクションの実現を目指し,その基盤技術の開発を目的としている.対象の完全なモデルを得るためには,複数の方向から得たデータを組み合わせてモデルを生成する必要がある.このとき,データを得た視点の位置と姿勢をデータ自身から推定する位置合わせが不可欠である.今年度は,高精度な自動位置合わせ実現のための基盤アルゴリズムについて研究を行った。まず,複数特徴量を扱うことができる大域収束する位置合わせアルゴリズムの開発を行った.位置合わせを自動化するために,グラフカーネルアルゴリズムに基づく.大域収束する位置合わせ手法とその拡張手法を提案した.提案手法は,既存の手法とは異なった発想に基づき,、自動位置合わせのための計測点の対応付けの問題をグラフ上での離散最適化問題として定式化した.これにより,局所解に陥ることなく大域に最適な計測点の対応付けの組み合わせを一意に求めることが可能となった.さらに,これを複数の特徴量について同時に評価するアルゴリズムを提案し,頑健な位置合わせを実現した.次に,自動的な位置合わせを実現し,形状特徴だけでなく反射特性も同時に獲得するための特徴量について検計した.まず.複数の特徴量を物体の反射特性を獲得するために、物体の色情報を利用した位置合わせ手法を提案した.また,頑健な位置合わせを実現するための幾何学的整合性を評価するための特徴量について検討した.さらに,解像度を疎から密へと階層的に変化させることで,大域収束性を保証する手法を提案した.近年,計算機スピードの高速化,センサの高度化などにより3次元形状情報をもつデータが利用しやすくなってきて,実世界の3次元物体のモデルへのニーズ高まっている.

本研究では,3次元モデルを介した人間と情報機器,人間と人間インタラクションの実現を目指し,その基盤技術の開発を目的として研究を行った.対象の安全なモデルを得るためには,複数の方向から得たデータを組み合わせてモデルを生成する必要がある.このとき,データを得た視点の位置と姿勢をデータ自身から推定する位置合わせが不可欠である.本研究では,高精度な自動位置合わせ実現のための基盤アルゴリズムについて研究を行った.自動位置合わせの従来手法では,いかに局所的な形状をうまく記述する不変特徴量を求めるかが重視されていたが,不変特徴量は微分量であるために頑健な計算が難しく対象の形状とセンサの視点に依存する.また,視点間で対象の同じ部分を計測している計測点を対応付ける必要があるが,対応付けの組合せ数が膨大であるため,大域解が得られる手法は少ない.これに対し本研究では,対応付けの問題を離散最適化問題として定式化し,整数計画法を応用することにより,すべての可能な対応付けの組合せの中から最適解を得る巌密解法を提案し,特徴量を必要としない自動位置合わせを実現した.また,形状の計測誤差の影響を軽減し,形状の大局的な構造をうまく捉えて高速に処理を行うための球を用いた形状表現とそれを用いた高速なモデリングアルゴリズム,3次元形状モデルの検索アルゴリズムについても開発を行った.
咬合変化に伴う顎関節腔内圧の変動と関節軟骨基質成分の動態との関連について

顎関節は,咀嚼筋の収縮と咬合荷重により恒常的に機械的負荷を受けている.したがって,咬合異常は顎関節への過剰な負荷を引き起こし,関節の形態異常や機能障害の発症に大きく関与していると考えられてきた.本研究の目的は,実験的に咬合変化を惹起させたときの顎関節腔内圧の変動を観察し,顎関節軟骨層における組織変化との関連について検討することである。実験動物は,成熟期のビーグル犬を用いた。咬合変化を付与した実験群として,(1)下顎臼歯を抜歯した咬合低下群,(2)咬合床を装着した咬合挙上群,(3)骨延長器による下顎骨延長群の3群を設けた.対照群は無処置とした。顎関節腔内圧の測定法は、全身麻酔下にカテーテルを上関節腔内に留置し,圧トランスジュサーを接続し,観血的動脈血圧測定システムを用いて,顎安静時,術者による徒手的な最大開口時,噛みしめ時を想定した顎間固定時の波形を記録した。各群の顎関節腔内圧を1カ月,3カ月,6カ月と経時的に測定した.実験終了後,4%パラホルムアルデヒドを用いて潅流固定し,左右顎関節部を採取し,パラフィン包埋し,組織学的および免疫組織化学的に観察した.その結果、対照群の顎関節腔内圧は,顎安静時を基準とした際,徒手的開口に応じて陰圧を示し,徒手力を開放すると顎安静時の内圧に復位し,顎間固定により持続的な陽圧を示した。顎間固定時の内圧は,対照群よりも咬合低下群が高く,咬合挙上群が低く,下顎骨延長群が高くなる傾向を示した。組織学的には,咬合低下群と下顎骨延長群で,顎関節軟骨層における厚径の減少が観察され,咬合あるいは咀嚼時における顎関節腔内圧の上昇との関連が推測された.しかし,軟骨の細胞外基質成分に対する抗体を用いた免疫染色では,非特異的反応が強く,軟骨基質成分への影響について明らかにすることはできなかった。本研究の目的は、実験的に垂直的な咬合変化を惹起させたときに生ずる顎関節腔内圧の変動を解析し、関節軟骨基質成分の免疫組織化学的動態との関連性について検討することである。これまで、犬顎関節腔内圧を測定した報告は全く認められなかったことから、本年度における実験目的は、犬顎関節腔内圧の測定方法を確立することである。実験動物は、成熟期のビ-グル犬を用いた。実験群として下顎臼歯を抜歯あるいは削合した咬合低下群と咬合挙上副子を作製した咬合挙上群を設けた。一方、対照群は無処置とした。実験期間中、固形飼料を用い同一条件下で実験動物を飼育した。顎関節腔内圧の測定方法は、全身麻酔下に実験動物の上関節腔穿刺を行い、20Gテフロンカテーテルを腔内に留置した。次に、圧トランスジュサ-を接続し、観血的動脈血圧測定システムを用いて、関節腔内圧の波形を記録した。内圧測定の記録は、全ての実験動物において全身麻酔下の顎安静時、術者による徒手的な最大開口時、顎間固定による咬合時とした。その結果、顎安静時の顎関節腔内圧は軽度の陰圧を示した。徒手的開口に応じて一時的に陽圧を示し、徒手力を開放すると顎安静時の陰圧にゆっくりと復位した。顎間固定により強固に閉口させると持続的な陽圧を示した。この顎間固定時の顎関節腔内圧は、咬合低下群が対照群より高く、咬合挙上群が対照群より低くなる傾向が見られた。今後、各群の顎関節腔内圧を経時的に測定することで、垂直的咬合変化が顎関節腔内圧に及ぼす影響を明らかにする予定である。また、顎関節腔内圧測定の実験終了後に潅流固定し、左右顎関節部を採取し、免疫組織学的に観察することで、顎関節腔内圧と軟骨変性との関連を検討する予定である。各群の顎関節腔内圧を1カ月,3カ月,6カ月と経時的に測定した.実験終了後,4%パラホルムアルデヒドを用いて潅流固定し,左右顎関節部を採取し,パラフィン包埋し,組織学的および免疫組織化学的に観察した.

その結果、対照群の顎関節腔内圧は,顎安静時を基準とした際,徒手的開口に応じて陰圧を示し,徒手力を開放すると顎安静時の内圧に復位し,顎間固定により持続的な陽圧を示した。顎間固定時の内圧は,対照群よりも咬合低下群が高く,咬合挙上群が低く,下顎骨延長群が高くなる傾向を示した。組織学的には,咬合低下群と下顎骨延長群で,顎関節軟骨層における厚径の減少が観察され,咬合あるいは咀嚼時における顎関節腔内圧の上昇との関連が推測された.しかし,軟骨の細胞外基質成分に対する抗体を用いた免疫染色では,非特異的反応が強く,軟骨基質成分への影響について明らかにすることはできなかった。
細胞分化の制御におけるCキナ-ゼとrasp21類似GTP結合蛋白質の作用機構

種々の動物細胞の分化過程にc-fos遺伝子の発現が重要な役割を果たしていることが知られている。また、c-fos遺伝子の発現は、Cキナ-ゼやrasp21などの細胞内情報伝達系によって制御されていると考えられている。しかし、Cキナ-ゼや、c-fos遺伝子の分化過程における作用機構はなお解明されていない。私共は本研究で、構成的に活性化されるCキナ-ゼやAキナ-ゼのcDNAを構築して、活性型Cキナ-ゼやAキナ-ゼによるc-fos遺伝子の発現系を確立し、NIH/3T3細胞においてCキナ-ゼがSREを、Aキナ-ゼがCREを介してc-fos遺伝子の発現を促進することを明らかにした。また、rasp21やraf遺伝子産物はCキナ-ゼやAキナ-ゼとは非依存的にSREを介してc-fos遺伝子の発現を促進することも明らかにした。他方、私共はすでにrasp21に類似した新しいGTP結合蛋白質(G蛋白質)であるsmgp21とsmgp25の精製と構造決定に成功している。これらの、低分子量G蛋白質にはGDP結合型の不活性型とGTP結合型の活性型があり、不活性型と活性型の転換を制御する蛋白質が存在すると考えられる。rasp21にはそのGTPase活性を促進し、その結果GTP結合型とGDP結合型に転換する。GTPase活性促進蛋白質(GAP)が存在することが報告されているが、私共はrasp21に対するGAPを見出した。さらに、smgp25に対する新しい種類の活性調節蛋白質であるGDP解離抑制蛋白質(GDI)を均一蛋白質に精製し、そのcDNAを単離して一次構造を決定した。以上の結果、低分子量G蛋白質はGAPとGDIにより不活性型と活性型との転換が調節され、その活性が制御されていることが明らかとなった。今後、これらのG蛋白質やその制御蛋白質とCキナ-ゼなどの細胞内情報伝達系との関連についても解析を進めていく予定である。以上、本年度は予想以上の研究成果を達成することができた。
SOEC用格子欠陥型プロトン伝導体の開発

水素社会実現のため、中温域で高いプロトン伝導性を示す物質探索として、格子欠陥型ペロブスカイト化合物の合成とその組成分析を行った。従来の格子欠陥型ペロブスカイト化合物は水素源となる水素ガスや水蒸気を供給することによりプロトン伝導性を示すが、本試料系では試料に内包された水の効果により、水素源の供給せずに中温域で高いプロトン伝導性を示した。また、化学組成の分析により、ペロブスカイト相に3種類の水が関与しており、中温域で高いプロトン伝導性を示すことがわかった。1.新規プロトン伝導体の合成結晶構造解析およびTEM観察のため、より高密度に焼結した試料の合成が必要となり、固相反応法を用いた試料の緻密化を狙ったが、合成条件を工夫しても大幅な相対密度(焼結密度)の向上は得られなかった。そこで、次に液相合成法によるこれらの組成を有する試料合成を試みた。その中でも水熱合成法を用いた場合、前駆体粉末の著しい粒成長抑制が観察された。更なる粒子成長抑制のため、ポリビニルピロリドン(PVP)を混合し、試料をコロイド化することによる微粒子化を狙ったが、残念ながらポリビニルピロリドンの有無による粒子径の変化は観測されなかった。次に、低温合成を視野に入れ、有機物と金属を100度以下で混合し、錯体を形成させることで粒子径の制御を試みた。現在、有機物としてエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸およびグリシンを用いた場合を検討し、前駆体の合成に成功している。2.中温域における電気伝導性の向上組成制御による高プロトン伝導性材料の合成は固相反応法により実施し、Ba2(Zn, M)2O5 (M=Nb, Ta, W)において更にBaサイトに3価の陽イオンであるLaやNdを置換固溶することにより伝導度の向上が確認された。特にAサイトにLaを置換固溶し、MイオンがNbまたはWにおいてより高い電気伝導性を示すことが明らかとなった。更に独自の手法である誘電測定を用いた欠陥とプロトンおよび吸蔵水の緩和現象から、加湿雰囲気において充電電流成分の大幅な増大が観測され、吸蔵水は電極ー電解質界面に多く存在するまたは移動度が大きいことが予想された。中温度域まで水を吸蔵し、その水が550°C以下で主にプロトンとして伝導に寄与する新しい酸素欠陥型ペロブスカイト関連化合物の合成に成功している。これらの機能性を最大限に発揮させるため、新しい湿式法による合成をペロブスカイト関連化合物において試みた。合成は有機物に金属を配位させた中間体を液相合成し、その溶媒は加熱蒸発、エバポレーション、凍結乾燥の3種で除去することにより前駆体を合成した。前駆体は低温焼成により未反応の有機物を除去し、その後、再度より高温で焼成することによって、有機物を除去した。生成した粉末をペレット状に一軸加圧および静水圧加圧によって成形し、高温で焼結させた。生成物を固相合成法と比較すると、金属酸化物の反応性の向上と、焼結体の相対密度が大幅に増加する結果が得られた。また、有機物として、低分子と高分子およびポリマーの重合後を変化させたものを用いて比較実験も行っている。相対密度の増加は電気伝導度の向上へつながることが期待されたが、残念ながら液相合成による著しい電気伝導度の向上は観測されなかった。湿式合成法は固相反応法と比較して試料が均一かつ緻密に合成できているにもかかわらず、結果として物性(特に電気伝導度)の大幅な変化を見出せなかった主な原因として、固相合成法と液相合成法による生成物の組成変化に起因すると考えられる。液相合成法は上記のように固相法と比較して利点が多く挙げられる一方、組成制御が困難な場合が確認されており、本実験の結果も同であると考えられる。申請者が発見した新奇プロトン伝導体は水を試料中に含むことにより、中温域において高いプロトン伝導体を示す。この特性を向上させることおよびそのメカニズムの解明が応用への糸口になると考えられる。そこで、従来の固相反応法よりも均一な試料合成が可能な液相状態での合成を試みた。一般的に用いられる錯体合成法は、構成元素が水に難溶のため適当でない。そこで、低温かつ高圧下で合成可能な水熱合成による試料合成を試みた。反応容器内に種々の原料を入れ、180°Cで1224時間反応させた。結果として、目的相も得られたが、未反応な原料との混相であることがわかった。単一相の合成には原料の選定および反応条件の最適化に時間を要するため、現在実施中である。液相法と同時に、固相反応においても試料を高純度化することを目的とした。異なる酸素欠陥量の単一相試料について水が内包されているのか検討を行うため、組成をδ= 00.5の範囲で変化させ、各組成について高純度試料を得られるよう検討した。焼成温度と焼成雰囲気の検討により、大気中の水分が水酸化物の不純物生成を引き起こしていることが判明した。また、不純物生成にはパウダーベッドも影響していることが明らかになった。また、独自の分析法として、熱天秤(TG)とガスクロマトグラフ(GC)を組み合わせて熱挙動と脱離ガスを調べる環境を整え、試料組成の決定を試みた。高純度試料で重量減少と水の脱離が観測されたことから、ペロブスカイト相に水が内包されていることが判明した。

段階的に水の脱離が起きていることから、表面物理吸着、表面化学吸着、水酸化物の3つの形態で内包されていると考えられる。組成が明らかになることにより、水の量とプロトン伝導性との関係が明らかになれば、更なる電気伝導度の上昇や新規プロトン伝導体の開発・材料設計に役立つことが期待される。水素社会実現のため、中温域で高いプロトン伝導性を示す物質探索として、格子欠陥型ペロブスカイト化合物の合成とその組成分析を行った。従来の格子欠陥型ペロブスカイト化合物は水素源となる水素ガスや水蒸気を供給することによりプロトン伝導性を示すが、本試料系では試料に内包された水の効果により、水素源の供給せずに中温域で高いプロトン伝導性を示した。また、化学組成の分析により、ペロブスカイト相に3種類の水が関与しており、中温域で高いプロトン伝導性を示すことがわかった。新規プロトン伝導体の合成に関して、液相合成法による合成については、計画以上の新たなアプローチを構築できたため、評価できると考えている。しかし、その成果が直接電気伝導度の向上へは繋がっていない結果が得られたため、「やや遅れている」と評価した。詳細は以下の通りである。新しい湿式合成法により、ナノ構造を有する前駆体が得られたため、焼結体は固相法よりも大幅に高密度である結果が得られた。イオン伝導体のおける電気伝導度と相対密度の関係は、一般的に(特殊な場合を除いて)比例傾向にあるため、湿式合成法により電気伝導度の向上が期待された。しかしながら、結果として電気伝導度は大幅には向上しなかった。この原因としては、生成物の仕込み組成からのずれが最大の原因であると考えられるため、改善の余地がある。上記のように、新しい合成法に注力してきたにも関わらず、結果としてそれが物性には直接的に影響を及ぼさなかったため、全体的な研究計画としてはやや満足する結果は得られたかったと判断した。固体イオニクス1.新しいプロトン伝導体が水素生成のための有用な電解質であることを証明するためには、広い水素および酸素分圧下においても使用可能であることを確認する必要がある。そのため、種々の雰囲気化における電気伝導度測定を行い、それらが各々どのようなキャリアーを有するか、明確にする必要がある。今後、直流四端子法による水素酸素存在下の電気伝導度測定を行い、試料の応用発展の可能性を明らかにする。2.水の急増が特徴的であるため、その吸収・放出条件に付いて、詳細に検討し、その応答性を更に向上させる工夫が求められると考えている。まず、熱重量分析を用いて、一定温度(中温度域)において、ガス雰囲気を切り替えることにより、ガスの吸蔵および脱離過程について詳細に調べる。それらが、温度や合成法および組成変化に対してどのように影響を及ぼすのか、明確にする。2.中温域における電気伝導性の向上については、組成制御および誘電測定が完了し、解析もほぼできている状況から、当初の計画以上に進展していると考えている。しかしながら、1.新規プロトン伝導体の合成については、一定の合成成果は得られているものの、液相合成に関しては最終的な合成物をまだTEM等で評価出来ておらず、一部当初の研究計画よりもやや遅れているともいえる状況にある。従って、これら2項目の総合評価により、1.に関しては今後挽回可能であるという見込みも含め、おおむね順調に進展していると判断する。昨年度の予算使用については、概ね予定金額と一致している。しかし、一昨年度の予算使用が計画よりも差が生じた分については、昨年度に執行していないため、次年度使用額が生じた。
非アーベル的な位相的捩れと岩澤多項式の精密化

3次元球面内の結び目の補空間の幾何学的構造は、その基本群により決定され、その群は結び目群と呼ばれる。特に、補空間が体積有限の双曲構造を有するとき、結び目群はクライン群と呼ばれ、2行2列の複素特殊線型群の離散部分となり、幾何学的あるいは整数論的における重要な研究対象である。本研究では、結び目を平面に投影して表して、交叉を一カ所入れ替えたときの結び目群の変化と、補空間が双曲構造を持つときその双曲構造の変化を調べた。また、Alexander多項式と合同ゼータ関数の類似を追求した。リーマン球面から3点を除いて得られる図形Mの基本群Pの群環を、簡約イデアルにより完備化して得られる非可換代数は2変数の完備自由代数と同型になり、その同型写像は、Magnus展開と呼ばれる。最も標準的なMagnus展開の係数は、Foxの自由微分により計算きれることが知られている。平成22年度の研究では、M上の微分形式を逐次積分することにより得られるMagnus展開の係数は、オイラーの多重ゼータ値により表されることを明らかにした。また、さらにこれをリーマン球面からn点を除いて得られる図形(nは3以上)Nの基本群Qについて一般化し、N上の微分形式を逐次積分することにより得られるMagnus展開の係数は、多重ディリクレL関数の特殊値により表されることを示した。さらに、群GがQに同型として作用しているとき、Qの降中心列を用いてGに減少フィルトレーションG(i)が導入される(Johnsonフィルトレーション)。このとき、次数付き商G(i)/G(i+1)から、Nの1次ホモロジー群のテンソル積への準同型(Johnson準同型)が定義されることが知られている。我々は一般にG(i)/G(i+k)から、(n-1)変数の完備自由代数を係数とする形式的乗法群への商への捻れ準同型を定義し、その係数を多重ディリクレL関数の特殊値を用いて表した。(我々の結果をk=1に適用すると、Johnson準同型が得られる)結び目群と有理数体のGalois群との比較研究を進めていくうちに、楕円曲線のL不変量と色つきJones不変量との類似に気がついた。今年度はその考察に基づき、楕円曲線に伴うL関数の性質について、以下の新しい予想を定式化することができた。「有理数に係数を持つ二つの楕円曲線EとFが、5以上の素数で同じ型の通常還元を持つとき、Eにともなうp-進L関数のs=0での位数から複素解析的なL関数のs=1を引いた数は、Fのそれに等しいであろう」。この予想は、Mazur-Tate-Teitelbaum予想に含まれるが、逆に我々の予想から彼らの予想を導くことができる。したがって、両者は同値であるが、さらに我々の予想からBirchとSwinnerton-Dyerによる「楕円曲線のL関数のs=1での位数は、そのMordell-Wei1群の階数に等しいであろう」を導くこともできる。我々の予想を証明するために、通常のゼータ関数に対して岩澤理論を展開し、複素解析的なL関数とp-進L関数を比較する理論を確立しようと試みた。もしこの理論が完全に確立されれば、我々の予想が証明され、その結果BirchとSwinnerton-Dyer予想ならびにMazur-Tate-Teitelbaum予想が正しいことがわかる。しかし、残念ながら未だ問題が残っている。それは我々の(構築中の)理論から、ある仮定を満たす楕円曲線のL不変量はすべて等しいという結論が導かれてしまうが、それは強すぎる帰結である。したがって、理論に修正を加えなければならないというのが現状である。本研究は、3次元球面内の結び目Kについて、その結び目群(すなわち補集合X(K)の基本群)と、結び目の量子不変量との関係を調べることを目標に掲げている。X(K)が有限体積の完備双曲構造を持つときに、結び目群からSL_2(C)への表現のモデュライR(K)の規約成分のうち、展開写像を用いて定義されるモノドロミー表現を含む成分は代数曲線となることがNeumann-Zagierにより知られている。我々はこの曲線にパラメトライズされる表現たちを、ペリフェラル群に制限して得られる表現の集合P(K)を調べることを目的とする。P(K)の各元について、Kのメリディアンとロンギチュードでの値をとり、その固有値を並べることにより複素平面内の代数曲線が得られるが、これをZ曲線とよぶ。Z曲線と結び目不変量との関係を探る基本的なアイデアは、次のとおりである。一般に結び目は、交叉の入れ替えにより自明な結び目に変形されるが、量子不変量は、その定義から交叉の入れ替えでどう変わるかを追うことは可能である。我々はZ曲線の交叉の入れ替えによる変化をとらえようと試みた。

双曲結び目Kの一つの交叉を入れ替えて得られる結び目をK'とする。我々が本年度得た結果は、以下の通りである。(1)KとK'の結び目群の関係を調べた。(2)(1)の結果を用いて、Kの結び目群からSL_2への規約表現が与えられたとき、K'の結び目群の指数2の正規部分群からSL_2への規約表現を構成した。これより、Z(K)とZ(K')の関係が明らかになりつつある。(3)Z曲線の整数論的な性質を調べた。Z曲線のヤコビ多様体Jが虚数乗法を持つとする。定義からJの自己準同型環はCM体Fの整数環となるが、還元する素数pがどのような条件を満たせばC(K)をpで還元して得られる曲線の有理点の個数が最大となるかを、pのFにおける分解の様子で述べた。本研究の目的は、3次元球面内に存在する結び目の補空間の基本群(以下結び目群と呼ぶ)と、その結び目に対して定義される色つきJones不変量との関係を明確にすることである。Rを有理数を係数とするLaurent多項式f(q)から成る可換環とする。一般に、3次元多様体Xに含まれるリンクのアイソトピー類を基底として有理数体Q上定義された線型空間に、skein関係式を用いて、R上の加群の構造が入ることが判る。これをS(X)と表し、Xのskein加群と呼ぶ。YをXの3次元部分多様体とすると、S(Y)からS(X)への準同型が定まることが知られているので、3次元球面内の結び目Kの管状近傍をN(K)で表すと、S(N(K))から3次元球面のskein加群Rへの線型関数が得られる。これをJones汎関数と呼ぶことにする。Jones汎関数には非可換トーラスCが自然に作用するが、Jを消す元から成るCのイデアルI(K)とCuller-Shalen-Thurstonによる定義されたA曲線の定義イデアルを比較することが課題であった。A曲線は複素2次元空間内の代数曲線であるため、その定義イデアルは2変数多項式環に含まれる。一方I(K)は非可換環トーラスCに含まれるため、Cと2変数多項式環を関連付けなければならない。我々は有理数体上の群環Q[N](Nは自然数全体を表す)と一変数多項式環Q[q]が同型であることに着目し、CとQ[N]上の一変数微分環の間の同型を構成した。この結果に基づき、D加群の理論を用いてI(K)にfiltrationを入れることができるが、これについてのgraded商を取ることにより、Q[q]上の2変数多項式環に含まれるイデアルE(K)(いわゆる特性イデアル)が得られる。我々は、q=1としたとき、これはA曲線の定義イデアルに等しいと予想する。3次元球面内の結び目Kを平面図に表して、その一つの交叉を入れ替えて得られる結び目をLとする。このときKあるいはLのA多項式を、それぞれC(K)あるいはC(L)と表して、C(K)とC(L)の関係を調べることを目標とした。それに対して得られた結果は、以下のとおりである。KとLの結び目群から、2行2列の複素行列群への一般的な表現は、ともに規約であると仮定する。我々はWirtinger表示から、KとLの結び目群を生成元と関係式により表し、交叉の前後により生成元と関係式がどのように変化するかを明らかにした。A多項式は結び目群から2行2列の複素特殊線型群への表現の、ペリフェラル群への制限表現のモデュライ(代数曲線となることが知られている)であるため、交叉の前後でKおよびLのペリフェラル群の変化を調べれば良い。
光化学系2酸素発生系PsbPタンパク質の分子進化と光合成機能における役割の解明

1.昨年度までの解析から、PsbPのN末端1014残基の間に光化学系IIの活性化に重要な残基が存在すると考えられていた。そこで引続き、N末端914残基を段階的に欠く組換えPsbPと、塩処理によってPsbPを取り除いた単離光化学系II標品を用いたin vitro PSII活性再構成実験による詳細な解析を行った。その結果,十分量の塩素イオン存在下において、11、13、及び、14残基目のリジン残基の欠損に伴って、活性回復能が段階的に低下することを認めた。13残基を欠損したPsbPは若干の活性回復能を示したが、14残基目のリジン残基を欠くPsbPは、光化学系IIに対する結合能を電気泳動で確認できるものの、活性回復能力を全く示さなかった。PsbPのN末端10-15残基部分は結晶構造中では決まった構造をとらない柔軟な領域である事が判明している。従って、この柔軟なN端構造内に存在する塩基性リジン残基が光化学系IIとの相互作用を介して、水分解酸素発生反応に必要なCa^<2+>の保持に重要な働きをしていることが判明した。なお、野生型PsbPと欠損型PsbPとの競合実験を行ったところ、欠損型PsbPは光化学系IIに対する親和性が大きく低下していた。シアノバクテリアにおいて原核型PsbPはN末端の修飾を介して膜脂質にアンカーされている事が推定されている。本研究の結果は、真核型PsbPにおいてもN末端部分が光化学系IIとの相互作用に重要な役割を持つことを示しており、両者においてN末端配列を介した相互作用の重要性が進化的に保存されている事が明らかとなった。2.原核型PsbPと真核型PsbPの一構造、及び、推定される立体構造の比較解析から、N-末端側のドメインが分子進化の過程で変化し、各々の機能分化が生じた可能性が示唆された。3.突然変異体を用いたシロイヌナズナPsbPドメインタンパク質群の機能解析において、少なくとも一部のタンパク質が光合成電子伝達に関わる事を示唆するデータを得た。1.PsbPタンパク質の三次元立体構造を1.6Åの分解能まで精密化し、得られた構造に基づいてシアノバクテリアの表在タンパク質との比較を行い、それに関する論文発表を行った。2.PsbPの立体構造に基づいて、欠失変異、アミノ酸置換変異を持つ組換えPsbPを作成し、それらの機能をin vitroの再構成実験によって解析した。その結果、結晶構造中では安定な構造をとらないN末端の15アミノ酸残基が、PsbPのイオン保持活性に必須であることを明らかにした。また、PsbPの立体構造に特徴的に認められた、塩基性のパッチを形成するアミノ酸残基の一つである160番目のリジンをアラニンに置換した変異体を解析した結果、光化学系IIの反応中心に対する結合能が低下している事が示唆された。従ってPsbPの塩基性パッチが、光化学系IIとの結合に重要である事が示唆された。3.PsbPの立体構造に基づいて、PsbPドメインタンパク質の立体構造のホモロジーモデリングを試みた。その結果、シアノシアノバクテリアと高等植物で共通して存在するPsbPドメインタンパク質に関しては比較的良い構造モデルが得られ、アミノ酸配列の相同性が低いにもかかわらず立体構造上の類似性が示唆された。4.RNA干渉法によってPsbPの発現が抑制された形質転換タバコの確立と、その生化学的解析を行った。この形質転換タバコにおける光化学系IIタンパク質の蓄積をウエスタン分析によって解析した結果、PsbPの発現が極端に低下している事を確認する一方で、光化学系IIの反応中心であるD1タンパク質や、PsbPと直接相互作用していることが考えられているPsb0タンパク質の量は、それ程低下していない事を確認した。一方でクロロフィル蛍光の分析結果から、このPsbP欠損タバコは常に光障害を受け易い事が示唆された。1.昨年度の研究からPsbPのイオン保持活性に必須である事が明らかとなっているN末端15アミノ酸残基に関して、今年度は新たにN末端の9から15残基を欠損する組換えPsbPタンパク質を順次、大腸菌で発現させて精製し、その機能をin vitro光化学系II(PSII)再構成実験によって解析した。まず、N末端15残基を欠くPsbPが安定した立体構造を保持していることを、プロテアーゼ処理に対する耐性の比較から確認し、N末端15残基までの欠損がPsbPのタンパク質高次構造に影響を及ぼさない事を明らかにした。次にPSII再構成実験の結果から、N末端の13残基を欠損するとPsbPのイオン保持活性、特にカルシウムイオン保持活性が失われる事を明らかにした。一方で、N末端の9から12残基の欠損ではPsbPのカルシウムイオン保持活性は保たれるが、その塩素イオン保持活性が顕著に失われることを明らかにした。PsbPのPSIIに対する結合に関しては、全てのN末端欠損型PsbPにおいてその結合能が保たれていることを確認した。2.PsbPの発現をRNAiによって抑えた形質転換タバコの解析を進め、そのPsbP欠損タバコにおいては活性酸素が発生しやすい事、また暗所においてマンガンクラスターが著しく不安定化することを見出した。一方でPsbQ欠損タバコにおいては目立った形質は観察されなかった。従って、高等植物においてはPsbPが生体内で植物の生存に必要不可欠な役割を果たしていることを明確にした。

3.シロイヌナズナのリソースから、PsbPドメインタンパク質群をコードする遺伝子に変異を持つ突然変異植物体の入手を行い、その解析を進めた。1.昨年度までの解析から、PsbPのN末端1014残基の間に光化学系IIの活性化に重要な残基が存在すると考えられていた。そこで引続き、N末端914残基を段階的に欠く組換えPsbPと、塩処理によってPsbPを取り除いた単離光化学系II標品を用いたin vitro PSII活性再構成実験による詳細な解析を行った。その結果,十分量の塩素イオン存在下において、11、13、及び、14残基目のリジン残基の欠損に伴って、活性回復能が段階的に低下することを認めた。13残基を欠損したPsbPは若干の活性回復能を示したが、14残基目のリジン残基を欠くPsbPは、光化学系IIに対する結合能を電気泳動で確認できるものの、活性回復能力を全く示さなかった。PsbPのN末端10-15残基部分は結晶構造中では決まった構造をとらない柔軟な領域である事が判明している。従って、この柔軟なN端構造内に存在する塩基性リジン残基が光化学系IIとの相互作用を介して、水分解酸素発生反応に必要なCa^<2+>の保持に重要な働きをしていることが判明した。なお、野生型PsbPと欠損型PsbPとの競合実験を行ったところ、欠損型PsbPは光化学系IIに対する親和性が大きく低下していた。シアノバクテリアにおいて原核型PsbPはN末端の修飾を介して膜脂質にアンカーされている事が推定されている。本研究の結果は、真核型PsbPにおいてもN末端部分が光化学系IIとの相互作用に重要な役割を持つことを示しており、両者においてN末端配列を介した相互作用の重要性が進化的に保存されている事が明らかとなった。2.原核型PsbPと真核型PsbPの一構造、及び、推定される立体構造の比較解析から、N-末端側のドメインが分子進化の過程で変化し、各々の機能分化が生じた可能性が示唆された。3.突然変異体を用いたシロイヌナズナPsbPドメインタンパク質群の機能解析において、少なくとも一部のタンパク質が光合成電子伝達に関わる事を示唆するデータを得た。
インフルエンザRNAポリメラーゼ全体構造の解明

これまで、NPを含むvRNPの構造解析にネガティブ染色法と汎用小型電顕を使用して挑んできたが、本年度研究遂行中に本計画に直接影響する大きな報告があった。フランスのグループから、2014年12月にコウモリ由来のインフルエンザA型RNAポリメラーゼの結晶構造と、ヒトB型インフルエンザRNAポリメラーゼの結晶構造が連報でNature誌に報告されたのである。ヒトA型インフルエンザRNAポリメラーゼが如何にして転写と複製というデュアルな機能を発揮しているかを解明するのが本研究の目標である。この点から、ホモログではあるが、そのために非常に有用な情報が報告されたことになり、それに合わせて研究計画を変更した。NPを除いたPA,PB1,PB2からなる三者複合体を使い、RNA合成反応開始後の転写状態の構造を求めることにした。その根拠は、以下の通りである。フランスのグループが解明した結晶構造は、RNA合成開始の前段階を示唆するものだった。さらに、彼らは、2種の結晶構造を比較することで、RNA合成が行われるためには、大きなコンフォメーションの変化が必須だと予測した。この仮説を証明し、さらにその詳細な機構を明らかにするため、最新の電子直接検出器を備えたクライオ電子顕微鏡を使用することにした。NPを除いた三者複合体で、天然の強いポリメラーゼ活性を持つ試料もタイムリーに筑波大川口敦史博士が精製に成功し、これを使用することにした。本年度10月から代表者が属する研究所で当該クライオ電顕が稼働を始め、代表者は導入・改良・運営・管理を行っているため、有効に利用できたものの、稼働までに時間がかかってしまい、そのデータ取得で当該年度は終了した。一方で、染色を用いた小型汎用電顕による解析で、コンフォメーション変化を示唆する全準備段階的な結果が得られた26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度、まず、Science領域代表の筑波大永田研究室より提供されたインフルエンザPR8株(Puerto Rico/8/1394)のRibonucleoprotein(RNP)の観察を行った。2%酢酸ウランを用いてネガティブ染色試料を作製し、加速電圧80kV、表示倍率8万倍にて画像の取得を行った。受け取った試料溶液を100mMTris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 5mM MgCl2,1mM DTTの希釈溶液で、1/2,1/4,1/8/,1/16と希釈し、それぞれについて観察を行った。先年、本申請の後に米国より報告されたNature,84,1731,2012およびNature,84,1734,2012の二報において提示されていたRNP複合体と全体として矛盾のない構造が観察された。しかし、得られた電顕像から、グリセロールによる染色の妨害が認められ、試料調整の余地が判明した。RNPの構造自体は、これまでの報告通り、屈曲したヘテロな構造をしていた。これ以外に画像の背景には、解離したと思われる、構成タンパク質の密度が多く観察された。これらからも、試料調整の再考を必要とした結果となった。また、本年度後期には、こうした不均一構造自体が機能と相関がある可能性があるため、2次元のハイブリッドアプローチによる解析を目指し、ソフトウェア、プログラムを含む環境の構築を行った。本計画として、当初より遅れている。これは、事前予測よりも厳しい途中結果のよるものであり、具体的には以下の理由によるものである。

通常、当研究室では、単分散性と試料の均一性が向上することから、経験的にいかなる精製されたタンパク質もネガティブ染色直前にゲル濾過クロマトグラフィーを行っている。これは、本試料のようにネガティブ染色像を劣化させてしまうグリセロールが多量に含まれている場合も有効である。しかし、RNPを構成しているRNA依存RNAポリメラーゼは、PA,PB1,PB2の三つのサブユニットからなる分子量約250kDaの複合体であり、さらにこれにウイルスゲノム結合タンパク質NP(56kDa)の多量体が鎖状に結合しており、巨大な超分子体である。これらは通常のゲル濾過カラム用担体では排除体積相当に溶出してしまい、目的を達せするのが困難である。このため濃度の濃いグリセロールの入った原液を使用せざるおえず、単粒子解析に最適とはいいがたい電顕像しか得られなかったため、画像解析へと進むことができず、計画から遅れた。1.転写活性状態の構造解析インフルエンザウイルスの複製反応はプライマー非依存的に完全長の複製産物を合成するが、転写反応はプライマー依存的に合成され、3'末端では鋳型上をスリップしてポリA鎖を付加する。よって、転写反応時のウイルスポリメラーゼおよびその鋳型は、複製時とは異なる構造をとることが予想される。そこで、プライマーを加え、転写反応を起こさせた状態でvRNP複合体の電子顕微鏡観察を行うことを目標とする。これらは全て、永田恭介研究室(筑波大)の川口敦史助教との共同実験として行う。また、精製した段階のvRNPについても、RNAポリメラーゼが結合している末端だけでなく、全体構造について、申請らが開発した2-Dハイブリッド解析を行うことで、vRNP全体のフレキシビリティ定量化を試みる。2.領域内共同研究領域会議を通じで生じた共同研究を行っていく。これには、H25年度末に申請者の属する研究所に導入された新型の第二世代電子直接検出カメラを備えたクライオ電子顕微鏡を積極的に使用することで対応していく。