hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレス応答型転写因子Nrf2の新規生理機能の発見

この尿崩症を呈する原因として、水再吸収に重要なAQP2チャネルタンパク質の顕著な低下が観察された。また、腎尿細管特異的かつ誘導的にKeap1欠失を作成して調べたところ、胎児期からKeap1を欠失させた場合に、NEKOマウスと同様に腎性尿崩症を呈することがわかった。このことから、腎臓の発生時期からの過剰なNrf2活性化は腎性尿崩症を呈することが明らかになった。この成果をNature Communication誌に発表した。以上の研究成果は、胎児期・乳児期に環境汚染物質などの暴露によって過剰にNrf2が活性化した際に腎性尿崩症を発症する可能性を示唆しており、新しい腎性尿崩症の発症メカニズムを提案するものである。すなわち、これまで腎性尿崩症の原因として先天的なバソプレシン受容体やAQP2の変異が知られているが、後天的な環境刺激によっても腎性尿崩症を発症することが明らかになった。Nrf2は環境ストレスに応答して活性化する。Nrf2は通常Keap1により抑制されているが、Keap1を欠失した場合にはストレスがない状態でもNrf2は常に活性化する。Keap1欠失マウスは、食道閉塞による母乳摂取不全のため生後間もなく死亡してしまい、詳細に調べることが困難であった。そこで、食道におけるNrf2の発現を欠失することで、成獣まで生育できるKeap1欠失マウスを作製し、食道以外の全身組織でのNrf2過剰活性化による影響を検討した。その結果、腎臓発生期のNrf2活性化は尿崩症を呈することを発見した。今後、腎性尿崩症の発症機序の理解およびその治療や予防に役立つと期待される。計画通り、食道以外全身Nrf2欠失マウスの作製に成功し、期待通り生存可能なマウスになることを明らかにすることができた。また、恒常的Nrf2活性化による新規表現型を見出すことにも成功した。これまでの解析から腎臓の発生期にNrf2が活性化すると尿崩症を呈することがわかったが、その発症機序は未だ不明である。今後はこのメカニズム解明を目指し、論文に発表することを目指す。また、NEKOマウスの腎臓以外の表現型解析をさらに進める。医化学これまでの解析から、恒常的Nrf2活性化による新規表現型として腎臓の表現型を見出すことに成功した。今後、Nrf2活性化がなぜ腎臓の表現型が現れるのか明らかにするために、遺伝子発現解析や血液生化学の解析を行う。平成27年度にNEKOマウスの腎臓以外の組織の解析も進める予定だったが、十分な解析を行うことができなかったため、必要な試薬等の費用は次年度に行うことにしたため。H26年度に遺伝子発現解析を行う予定だったが、十分な解析を行うことができなかったため、この遺伝子発現解析に必要な試薬等の費用は次年度に行うことにしたため。NEKOマウスの腎臓以外の組織の表現型解析を行うために必要な試薬等を購入予定である。遺伝子発現解析を行うために必要な試薬等を購入予定である。
高解像度バイオイメージングを可能にするスケーラブル時間分解能センサ集積回路

本年度は、半導体集積回路製造プロセスの微細化に伴って解像度向上が可能(スケーラブル)なバイオセンサ集積回路の検討・立案を行った。解像度を向上させることによって、生命科学発展への貢献ならびに新規産業の創出が期待される。検討ならびに立案を行うとともに、今後の半導体製造プロセスの発展予測を踏まえたうえでの、スケーラブル性を理論的に検証した。新規開発の時間減衰回路を用いたログドメインのバイオセンサ集積回路に、4×4アレイの電極を組み合わせたアレイセンサを、65nm CMOSプロセスを用いて、設計・試作・評価を行った。アレイを構成するセンサセル回路においては、低面積での実装が可能なキャパシタ不要センサセル回路を用いた。キャパシタが不要であり、スケーリングが可能なトランジスタのみで構成されているため、スケーラブル性に富んだ回路構成である。また、時間減衰回路においてもスケーリングに適したデジタル回路を基にしており、スケーラブル性を有している。電極形成については、マスクプロセスにおけるアラインメントが不要で小型化が可能な自己整合型無電解金メッキ技術を用いて実施した。フェリシアン化カリウム/フェロシアン化カリウムの濃度比を変化させた溶液において酸化還元電位型バイオセンシングに基づいた電気化学実験による性能評価を実施したところ、フェリシアン化カリウム/フェロシアン化カリウムの濃度比に応じてパルス信号の出力(パルス幅)が変化しており、その結果が線形性を有していることを確認することに成功した。実際のアレイ型バイオセンサ集積回路を設計・試作・評価することに成功したため。また、スケーラブル性についての評価を実施することができたため。今後も引き続きスケーラブル性についての評価・理論構築を行っていく。スケーラブル性を活かしたアプリケーションについての検討も並行して行っていく。本年度の研究においては、半導体集積回路製造プロセスの微細化に伴って空間・数値解像度向上が可能(スケーラブル)なバイオセンサ集積回路を実現するための手法の提案ならびに実デバイス上での実証を行った。半導体集積回路製造プロセスを用いたバイオセンサ集積回路の空間・数値解像度向上を実現することで、生命科学の発展や医療技術の向上への貢献が見込まれる。スケーラブルなバイオセンサ集積回路のアーキテクチャとしてログドメインの時間デジタル変換回路技術の着想に至った。世界で初めて時間増幅率が1以下の時間差増幅回路(すなわち、時間差減衰回路)を提案して、その時間差減衰回路を繰り返し使用してログドメインを実現するサイクリック・時間減衰型ログドメイン時間分解能バイオセンサ集積回路アーキテクチャを実現した。バイオセンシングにおける基本となる化学反応式であるネルンストの式はログドメインであるため、バイオセンシングに最適な時間分解能型回路技術の開発に成功した。デジタル回路ベースでの実装が可能であるため、集積回路の微細化との親和性が高く、まさにスケーラビリティに優れた回路方式である。計算機上の回路シミュレーションで性能を確認するとともに、実際の半導体集積回路製造プロセスで実デバイス集積回路の試作を行い、評価を行った。半導体集積回路製造プロセスについては、社会実装を見据えて広く普及している半導体集積回路製造プロセスを選定した。回路シミュレーションでの検証後にマスクレイアウトまでを自ら実施した。評価を行ったところ、期待通りのログドメインでの出力が確認できた。回路シミュレーションとおおむね一致した評価結果が得られた。当初は計画していなかったログドメインの時間デジタル変換回路の回路アーキテクチャに着想し、その性能を確認・実証できたため。本年度の研究においては、半導体集積回路製造プロセスの微細化に伴って空間・数値解像度向上が可能(スケーラブル)なバイオセンサ集積回路を実現するための手法の改良ならびに実証を行った。昨年度の結果を踏まえて更なる性能向上ならびにその実デバイス上での実証を目指して研究を行った。半導体集積回路製造プロセスを用いたバイオセンサ集積回路の空間・数値解像度向上を実現することで、生命科学の発展や医療技術の向上への貢献が見込まれるため、更なる性能向上により、より顕著な貢献が期待できる。スケーラブルなバイオセンサ集積回路のアーキテクチャとしてログドメインの時間デジタル変換回路技術を昨年度において着想し、実デバイス上での実証に成功したが、さらなる性能向上を目指してセンサフロントエンドならびに電極部分との融合を実施した。昨年度は入力信号は電気信号であったが、今年度においては溶液を介してのバイオ信号での入力が可能となる電極部分を含めた技術の検証を行い、より実用に近いデバイスの作成を行った。センサフロントエンドとして、空間分解能の向上を目指してキャパシタのない電流モード型アナログ・時間変換回路を新たに提案して、空間分解能向上においてボトルネックとなっていたキャパシタの面積削減に成功した。キャパシタのような受動素子は微細化によって性能向上が見込めない(スケーラブルでない)要素回路であるため、キャパシタの無い回路構成を実現したことでセンサフロントエンド回路部分のスケーラビリティが飛躍的に向上した。初めに計算機上での回路シミュレーションで性能向上を確認した。回路動作を確認後に、実際の半導体集積回路製造プロセスで実デバイス集積回路の試作を行い、評価を行った。昨年度と同様、社会実装を見据えて広く普及している半導体集積回路製造プロセスを選定した。評価を行ったところ、信号出力が確認できた。当初においては、回路構成においてキャパシタの無いものは計画できていなかったが、新たな着想を得て新規の回路構成を実現できたため。

検討ならびに立案を行うとともに、今後の半導体製造プロセスの発展予測を踏まえたうえでの、スケーラブル性を理論的に検証した。新規開発の時間減衰回路を用いたログドメインのバイオセンサ集積回路に、4×4アレイの電極を組み合わせたアレイセンサを、65nm CMOSプロセスを用いて、設計・試作・評価を行った。アレイを構成するセンサセル回路においては、低面積での実装が可能なキャパシタ不要センサセル回路を用いた。キャパシタが不要であり、スケーリングが可能なトランジスタのみで構成されているため、スケーラブル性に富んだ回路構成である。また、時間減衰回路においてもスケーリングに適したデジタル回路を基にしており、スケーラブル性を有している。電極形成については、マスクプロセスにおけるアラインメントが不要で小型化が可能な自己整合型無電解金メッキ技術を用いて実施した。フェリシアン化カリウム/フェロシアン化カリウムの濃度比を変化させた溶液において酸化還元電位型バイオセンシングに基づいた電気化学実験による性能評価を実施したところ、フェリシアン化カリウム/フェロシアン化カリウムの濃度比に応じてパルス信号の出力(パルス幅)が変化しており、その結果が線形性を有していることを確認することに成功した。実際のアレイ型バイオセンサ集積回路を設計・試作・評価することに成功したため。また、スケーラブル性についての評価を実施することができたため。さらに研究開発を加速するべく、新たな回路方式についての検討を行っていく。更なる性能向上を進めるとともに、学術的な貢献も目指して集積回路設計理論の体系としてまとめてゆきたい。今後も引き続きスケーラブル性についての評価・理論構築を行っていく。スケーラブル性を活かしたアプリケーションについての検討も並行して行っていく。
miRNAプロファイリング・プロテオミクス解析による網羅的発がん評価モデルの構築

遺伝子発現制御機能を有するタンパクをコードしていない22塩基以下の一本鎖RNAであるマイクロRNA(miRNA)のプロファイリングおよび制御されるタンパク質のプロテオミクス解析により、発がん過程を網羅的に把握し、新規発がん予防法開発に応用できるモデル構築を最終目的として行った。ヒト皮膚由来細胞を用い、紫外線により誘発されるダメージ解析を行い、細胞死やDNA修復関連miRNAを中心にプロファイリングを行った。平成21年度においては、紫外線(UV-B)により誘発されるダメージ(突然変異・アポトーシス)の評価方法を確立し、併せて、DNA修復関連遺伝子(ミスマッチ修復群:hMLH1、hMSH2、hMSH3、hMSH6、hPMS2)、酸化ダメージ修復関連遺伝子(hOGG1)発現への影響について調べた。チャイニーズハムスター由来V79細胞について、UV-B照射量に応じて突然変異が誘発され、アポトーシス試験では、100J/m^2において最も強くアポトーシスが誘発された。また、ヒト由来(HaCaTおよびCS2AW)細胞においても、同様にUV-B照射(100J/m^2)によりアポトーシスが誘発され、各DNA修復関連遺伝子発現量がup-regulateされていたことから、DNA修復系が誘導されていることが示唆された。特に、deletions/insertionsを認識するhMSH2およびhMSH3が強くup-regulateされ、また酸化ダメージ修復に関連するOGGIもup-regulateされていた。さらに、照射した細胞から抽出したゲノムDNAを用い、メチル化への影響評価を行っている。また、実施計画に基づいて、カスパーゼ酵素群の活性をELISA法により解析中で、今後フローサイトメーターを用いて測定する。これらのデータは、miRNAプロファイリングやプロテオミクス解析と総合的に解析する基礎データとして重要である。miRNAプロファイリングを行うため、smallRNAの濃縮を開始している。本研究は、遺伝子発現制御機能性マイクロRNA(miRNA)のプロファイリングおよび制御されるタンパク質のプロテオミクス解析を行うことにより、発がん過程を網羅的に把握し、新規発がん予防法開発に応用できるモデル構築を目的として行っている。平成22年度においては、ヒト正常ケラチノサイト由来HaCaTおよびCS2AW細胞を用いた実験において、紫外線によりアポトーシス経路に関連する遺伝子の発現パターンの変化が確認された。カスパーゼ関連経路および非関連経路のいずれにおいても、アポトーシスを誘発する遺伝子群が活性化している結果を得た。紫外線照射量が強すぎると、アポトーシスは誘発されない結果を得た。また、発がん抑制作用が報告されている物質で処理したところ、物質によって影響を受ける遺伝子が異なることが確認された。これらの遺伝子群に関しては、タンパク産生についても解析を終えている。さらに、DNA fragmentation assay法を用いてアポトーシスへの影響を評価した。現在、同様に曝露した細胞から抽出・濃縮したsmall RNAについて、miRNAプロファイリング解析を行っている。また、ヒト正常ケラチノサイト由来細胞(HNEK)、乳腺上皮細胞(HMEC)、線維芽細胞(NHDF)および前立腺細胞(PrEC)について、まず紫外線に曝露して適度な照射量について条件を決定し、同様の解析を行うべく実験を開始している。平成23年度においては、ヒトケラチノサイト由来HaCaTを中心に、紫外線により誘発されるアポトーシス関連シグナル伝達についての解析を進めた。アポトーシス関連シグナルのうち、P53依存的な経路の構成因子であり、アポトーシスに対して抑制的に働くbcl-2が遺伝子発現、タンパク産生ともに紫外線により増加し、caspase関連経路のうちアポトーシス誘発的に働くcaspase-3ないしcaspase-9の遺伝子発現およびタンパク産生が抑制されている結果を得た。細胞により、紫外線の強度への感度が変わり、紫外線照射量が強すぎると、アポトーシスは誘発されない結果を得た。また、発がん抑制作用が報告されている物質で処理したところ、物質により、低い紫外線量ではアポトーシスが誘発され、一定量以上の強度では、ネクローシスが起こっている可能性を示唆する結果も得た。現在、アポトーシスに関与していることが報告されているmiRNAへの影響について、紫外線に曝露した細胞から抽出・濃縮したsmall RNAを用い、miRNAプロファイリング解析を行っている。また、ヒト正常ケラチノサイト由来細胞(HNEK)、乳腺上皮細胞(HMEC)、線維芽細胞(NHDF)および前立腺細胞(PrEC)について、まず紫外線に曝露して適度な照射量について条件を決定し、同様の解析を行っている。
プロスタノイド受容体クラスターによる生体調節の全貌解明と医薬応用

プロスタノイドは、細胞膜リン脂質に由来する生理活性脂質であり、アスピリン様薬物の標的物質として知られるが、その生体調節作用の全貌や作用機序は必ずしも明らかでない。本研究で研究代表者は、プロスタノイドが機能的に近い複数受容体が相補って働くのではないかと考えて解析した結果、プロスタノイドが排卵・受精や分娩などの生理プロセス、発熱や炎症などの病態プロセスにも関与することを見出し、さらに作用発現の分子機序を解明した。プロスタグランジン(PG)類の生体作用は、アスピリンの標的としてよく認識されているにも関わらず、いまだ未知の機能が隠されており、既知作用についてもその分子メカニズムは不明であった。PGの作用は、各PGに特異的な受容体によって介達されるが、研究代表者はこれまで、PG受容体欠損マウスを作成・解析することで、PGの病態・生理作用に関わる責任受容体を同定してきた。そこで本研究では、PG受容体の分子進化クラスターから捉え、各クラスター内受容体欠損マウスを作成し、その表現型を解析するとともに、微細組織発現プロファイル解析法を用いて、PG作用発現の分子機構の解明を試みた。以下に20年度の成果を示す。(1)発熱-EP3受容体視索前野EP3発現ニューロンの解析から、PGE2による発熱応答時には視索前野のGABA-A受容体蛋白の発現が低下すること、PGE2のこの作用はEP3受容体とGi/o蛋白を介することを見出し、PGE2による発熱作用は、GABAの脱抑制を介する可能性を示唆した。(2)受精-EP2受容体EP2欠損卵丘細胞の解析から、EP2はケモカイン産生を抑制することで受精を促進することを見出した。またケモカインは卵丘マトリクス(ECM)を強化して排卵の際には卵を保護するが、受精時には精子による卵丘ECM分解を阻害することを発見した。従って、PGE2はケモカインとともに卵丘ECMを動的に調節することで、受精を助長することが判った。(3)分娩におけるCa2+動員系PG受容体クラスターの役割EP1/EP3/FP受容体欠損マウスは、FP欠損による黄体退縮不全に加えて、PGによる子宮収縮の消失と分娩の開始と進行に障害を示すことを見出した。プロスタグランジン(PG)類の生体作用には、いまだ未知の機能が存在し、既知作用についてもその分子メカニズムは不明であった。そこで本研究では、シグナル伝達系を同じくする複数のPG受容体を同時に解析しPGの新規作用を探索するとともに、作用発現の分子機構の解明を試みた。以下に21年度の成果を示す。1.炎症惹起・免疫増強-EP2/EP4受容体...(1)EP2/EP4受容体がPl-3キナーゼ活性化を介してTh1分化を増強すること、(2)EP2/EP4受容体がE-pacを介してTh17エクスパンジヨンを増強すること、さらにEP4受容体がPKAを介して樹状細胞からのlL-23産生を増強することを発見し、これらの作用が接触性皮膚炎や多発性硬化症などの炎症性疾患の発症・進展に重要な役割を果たすことを示した。2.受精-EP2受容体...EP2欠損マウスから回収した卵丘細胞を解析した結果、PGE2-EP2シグナルはケモカイン産生を抑制することで受精を促進すること、ケモカインは卵丘マトリクス(ECM)を強化して卵を保護する一方、受精時には精子侵入を阻害することを発見した。さらにケモカインによる卵丘マトリクス強化の分子機構として、卵丘細胞のCCR1/2受容体を介してRhoA/ROCK/アクトミオシン経路を介してインテグリンを活性化し、これが卵丘ECM中のマトリクス蛋白のアセンブリーを促進することを見出した。3. EP3受容体によるcAMP産生増強の分子機構...EP3受容体は、多くの細胞でGiを介してcAMP産生を抑制するが、ある種の細胞ではGqと共役し細胞内Ca2+動員とCaMキナーゼを介してアデニル酸シクラーゼ活性化を増強すること、さらにこのEP3の作用は、caveolin-1を構成タンパク質とするlipid raft依存的に引き起こされることを見出した。1)Ca共役型受容体クラスター:FP受容体欠損マウスでは、黄体退縮不全により分娩が消失するが、卵巣切除により分娩が回復する。ところが、卵巣切除による分娩は、インドメタシンで遅延しPG投与で回復したことから、FP以外のCa共役PG受容体が分娩誘導に寄与することが示唆された。そこで研究代表者は、Ca共役型PG受容体クラスターの欠損マウスを作成し、その卵巣切除による分娩を調べたところ、本マウスはFP欠損マウスに比して分娩が顕著に遅延し、胎児は全て死亡した。従って、Ca共役型PG受容体は、正常分娩時の子宮収縮に必須の役割を果たすことが判明した。

2)cAMP共役型受容体クラスター:排卵・受精時の卵丘におけるPG受容体シグナルの役割を検討するため、野生型ならびにEP2受容体欠損マウスの卵丘細胞の遺伝子発現プロファイルを経時的に解析したところ、EP2欠損卵丘では、COX-2やEP4の発現が顕著に低下することを見出した。従って、卵丘細胞では、COX2-PG-受容体-cAMP経路のポジティブフィードバック機構が存在し、排卵を促進する可能性が示唆された。3)PG受容体クラスターの種間保存性:zebrafishにおける機能的なプロスタノイド受容体cDNAを単離・同定した。プロスタノイド受容体は、哺乳類でcAMP共役型とCa共役型クラスター各4種類の計8種類存在するが、zebrafishでは、各クラスター6種類ずつの計12種類の受容体として存在することを見出した。従って、魚類では多種類のプロスタノイド受容体が哺乳類よりもさらに細分化された機能を発揮すると考えられた。
褐藻遊走細胞の光運動反応に関わる光センサー候補物質の構造研究

黄色植物の光運動反応に関わる新規の光センサー(青色光受容体)の候補となっている遊走細胞の後鞭毛に局在する緑色蛍光物質(フラビンタンパク質)の単離と構造解析を褐藻カヤモノリScytosiphonlomentariaを用いて行った。単離鞭毛分画を用いてフラビンタンパク質の最適可溶化条件を検討したところ,凍結融解後にBis-Tris緩衝液(pH6.5)に溶出させた場合が最も効率が良かった。フラビンタンパク質を含む可溶分画を,限外ろ過で濃縮し陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製した。0.1M NaClで溶出する画分に、フラビン蛍光が顕著に検出され、蛍光スペクトルと電気泳動のパターンを比較した結果、フラビン結合タンパク質の候補として41kDaのタンパク質が有力になった。次に、イオン交換精製した分画をゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製したところ、フラビン蛍光分画に41kDaタンパク質が主要バンドとして検出された。この41kDaタンパク質をプロテインシーケンスしたところ、N末端がブロツクされていた。そこで、V8プロテアーゼを用いたゲル内消化により、いくつかのペプチド断片を得てアミノ酸配列を解析した。その結果、20残基程度のアミノ酸配列が判明した。この配列は、ある種の細菌由来のフラビンタンパク質(機能未解明)に部分的に類似していた。フラビンの化学種については、イオン交換で精製した41kDaタンパク質を含む分画を熱処理で可溶化した試料について、薄層クロマトグラフィーにより分析した。Rf値から41kDaタンパク質の結合フラビンはFMN (flavin mononucleotide)とほぼ一致した。現在、精製法の改良、精製標品の分光解析、遺伝子のクローニングを進めている。褐藻遊走細胞の走光性光センサーの候補となっている鞭毛局在の蛍光物質の単離と構造解析を行った。褐藻遊走細胞はミドリムシ藻と同様にUV励起により鞭毛関連の構造体から緑色蛍光を発する。しかし、両者の系統性は大きく隔たっているので、同じ光センサーが機能している可能性は低い。ミドリムシ藻では光センサー分子が単離され,フラビン結合とアデニル酸シクラーゼのドメインを2組づつ持つ105kDと90kDの相同性の高いサブユニットが同定された。精製タンパク質のアデニル酸シクラーゼ活性は、青色光により上昇する(Iseki et a1.2002)。[蛍光色率の同定]ミドリムシ藻のUV励起蛍光は530nmに,褐藻カヤモノリ遊走細胞は510nmに極大を示し、両者で異なる色素分子の関与を示唆した。Yamano et al.(1996)の解析では、カヤモノリ藻体のメタノール抽出物に4',5'-cyclicFMNが検出され、鞭毛蛍光との関連が議論されている。ミドリムシ藻の色素FADは検出されない。藻体成熟部からメタノールで色素を抽出し,水-酢酸エチルで分配した水層を集め、HP-20カラムクロマトで分離した。2つの蛍光画分が得られ、RTと蛍光からフラビン化合物と判明したが、コンタミの糖鎖のシグナルが強く、NMRによる分子種の同定は困難であった。現在、精製法の改良と遊走細胞からの抽出を進めている。[蛋白質の同定]褐藻を冷暗所で成熟処理した後、遊走細胞を放出させた。濾過,遠心分画により珪藻などを除いた後、Vortex処理と遠心で鞭毛粗画分を得た。蛍光顕微鏡での観察では、intactな構造と緑色蛍光を保持した単離鞭毛が確認された。鞭毛を界面活性剤で可溶化し、遠心と硫安分画で精製を行ったところ、50kDのペプチドが光センサー蛋白質の候補になっている。今後,褐藻特有の粘液物質の除去が課題である。
蛋白ホスファターゼ1βを介する不全心筋内リン酸化制御異常の解明と治療応用

蛋白ホスファターゼ1(PP1)は心筋細胞内において、筋小胞体Ca^<2+>制御に関わる重要な脱リン酸化酵素の一つである。不全心では、細胞内PP1活性が異常に亢進し、筋小胞体(SR)Ca^<2+>制御の鍵となる蛋白ホスホランバン(PLN)のSer16/Thr17を脱リン酸化してしまう。PLNの脱リン酸化は筋小胞体Ca^<2+>ATPase活性の抑制を惹起してしまうため、PP1活性亢進は、結果的に不全心での心機能悪化の要因となる。したがって、PP1は心不全の治療の標的として有望である。PP1には3つのアイソフォームが存在し、それぞれ別々の遺伝子でコードされる。3つのアイソフォーム間の相同性は約85-90%である。いままで、三つのアイソフォームごとの心筋細胞内での生理的役割は不明であった。そこで、本研究では心筋細胞におけるPP1各アイソフォームの役割を調べた。方法:PP1 isoform(α,β,γ)に対し特異的に発現を抑制するアデノウイルスによるshort hairpin RNAiベクターを作成し、8週齢ラットの単離成獣心筋細胞に感染した。感染48-72時間後にRNAiの効果を検討した。結果:アデノウイルス感染48時間後にはmRNAは対照群の10-25%に抑制された。72時間後には蛋白レベルでもPP1α,β,γの発現レベルが著明に減少していた。PP1α,β,γのRNAiはそれぞれ、対照ベクターに比べ強い心筋細胞収縮、Ca^<2+>トランジエントを示したが、なかでもPP1βRNAiは最も強い収縮増強作用を示した。収縮増強のメカニズムとしてPP1βRNAiはSer-16、Thr-17部位のPLNリン酸化を著明に亢進させた。考察:心筋細胞においてはPP1の3つのアイソフォームのうち、PP1βがもっともPLNの脱リン酸化に関与しており、細胞収縮・拡張性の制御を司っていると考えられた。この結果は以前の我々や他の研究グループの解析において、不全心でPP1蛋白アイソフォームのうちPP1βの発現亢進が著しく、PLNのリン酸化低下がみられるという臨床的治験ともよく一致する所見であった。今後は、不全心において亢進しているPP1β活性を是正する分子標的の同定、つまり筋小胞体におけるPP1βのアダプター蛋白の同定を行う予定である。不全心筋で上昇している蛋白ホスファターゼ1活性(PP1)を補正したときに、心不全の進行が抑制されるかどうか、心筋症ハムスター高効率遺伝子導入モデルを用いて検討した。心筋症ハムスターでは心不全を発症する28週齢においてSRを含むマイクロソームにおけるPP1 Catalytic Subunit (PP1C)の蛋白発現が亢進しPP1上昇のメカニズムであると考えられた。In hibitor-2 (INH-2)遺伝子導入は、筋小胞体を含む分画であるマイクロソームでPP1Cの蛋白発現量を減少させ、PP1活性を抑制する作用を示した。

心不全症状が発現している心筋症ハムスターに高効率心筋遺伝子導入法でINH-2を導入し、心機能・心不全の経過を観察した。遺伝子導入1週間後、明らかに左心室内径が縮小し、%FSでは経時的な低下が抑制され、心不全進行における左室リモデリングを正常化した。3ヶ月間の長期経過では生命予後も改善し、膜分画におけるPP1の阻害は心不全治療の有望なターゲットであることが示唆された。(Yamada et al. FASEB J 2006)。INH-2心筋内遺伝子導入にみられた、PP1阻害効果が化学物質によるPP1阻害で得られるかどうか検討した。選択的PP1阻害剤であるtautomycin (TT), tautomycetin (TC)を使って単離培養心筋細胞に対するPP1阻害の影響を細胞収縮性、細胞内Ca2+トランジエント、細胞生存率に関して調査した。TT/TCは、細胞収縮率、Ca^<2+>ハンドリングの改善効果はIMH-2遺伝子導入と同様にあるものの、長時間の培養ではCa^<2+>非依存性の細胞死を起こすことが判明した。INH-2による心不全改善効果はPP1の化学的阻害では単純には再現できないことが判明した(日本循環器学会70th総会で発表)。PP1 Catalytic Subunitのisoform特異的なノックダウンベクターに関しては、現在ウイルス作成が完了しており、今後、その生理学的効果について研究を進める予定である。蛋白ボスファターゼ1(PP1)は心筋細胞内において、筋小胞体Ca^<2+>制御に関わる重要な脱リン酸化酵素の一つである。不全心では、細胞内PP1活性が異常に元進し、筋小胞体(SR) Ca^<2+>制御の鍵となる蛋白ホスホランバン(PLN)のSer16/Thr17を脱リン酸化してしまう。PLNの脱リン酸化は筋小胞体Ca^<2+>ATPase活性の抑制を惹起してしまうため、PP1活性亢進は、結果的に不全心での心機能悪化の要因となる。したがって、PP1は心不全の治療の標的として有望である。PP1には3つのアイソフォームが存在し、それぞれ別々の遺伝子でコードされる。3つのアイソフォーム間の相同性は約85-90%である。いままで、三つのアイソフォームごとの心筋細胞内での生理的役割は不明であった。そこで、本研究では心筋細胞におけるPP1各アイソフォームの役割を調べた。方法:PP1 isoform (α,β,γ)に対し特異的に発現を抑制するアデノウイルスによるshort hairpin RNAiベクターを作成し、8週齢ラットの単離成獣心筋細胞に感染した。感染48-72時間後にRNAiの効果を検討した。結果:アデノウイルス感染48時間後にはmRNAは対照群の10-25%に抑制された。72時間後には蛋白レベルでもPP1α,β,γの発現レベルが著明に減少していた。PP1α,β,γのRNAiはそれぞれ、対照ベクターに比べ強い心筋細胞収縮、Ca^<2+>トランジエントを示レたが、なかでもPP1βRNAiは最も強い収縮増強作用を示した。収縮増強のメカニズムとしてPP1βRNAiはSer-16、Thr-17部位のPLNリン酸化を著明に元進させた。考察:心筋細胞においてはPP1の3つのアイソフォームのうち、PP1βがもっともPLNの脱リン酸化に関与しており、細胞収縮・拡張性の制御を司っていると考えられた。
汎用遺伝子診断システムを用いた先天性代謝異常症マススクリーニング法の確立

本研究の目的は汎用性をもち、大量の検体処理能力を有する遺伝子変異検出システムの開発を行ない、それを用いた遺伝子診断によるマススクリーニング法を確立することであった。当初、遺伝子変異検出には、ミニ・シークエンス法とELISAによる検出を組み合わせたものを用い、呈色反応によって判定を行なう予定であった。しかしながら、研究進行中に蛍光色素を用いた新しいPCR産物定量法が報告されたため、この手法を取り入れてさらに新しい遺伝子変異検出方法を考案した。この手法を、Fluorogenic allele specific amplification(FASA)法と命名した。本法では、遺伝子変異の有無の判定にいたるまで、その全過程を96穴マイクロタイタ-プレートのフォーマットで行なうことができ、大量検体の自動処理が可能である。一方、このシステムを応用するにふさわしい先天性代謝異常症の遺伝子変異として、日本人糖原病Ia型症例にきわめて頻度の高い遺伝子変異g727tを同定することができた。このg727tに対してFASA法を用いたところ、容易にホモ接合子、ヘテロ接合子、正常の鑑別を行うことができた。糖原病Ia型では、小児期に低血糖などの症状を示さずに経過し、成人後に腎不全や肝癌で発見される症例が相次いで報告されており、早期発見、早期治療がきわめて重要であると思われる。今後、本研究で開発された遺伝子診断システムを用いることによって、糖原病Ia型のマススクリーニングを施行することが可能である。また、他の遺伝性疾患に対してもこの汎用遺伝子診断システムは有用と考えられる。本研究は、汎用性をもち、大量の検体処理能力を有する遺伝子変異検出システムの開発を行ない、それを用いた遺伝子診断によるマススクリーニング法を確立することを目的とする。今年度は、ミニ・シークエンス法にELISAによる呈色反応を組み合わせた手法を用い、検査検体からのDNA抽出、遺伝子増幅、変異検出反応、判定にいたる詳細な検討を行った。一方、この遺伝子変異検出システムを応用するにふさわしい遺伝子変異の同定をあわせて行った。遺伝子変異の解析を行った疾患は糖原病Ia型で、その結果、4種類の点変異を見いだした。このうち2種類はアミノ酸の置換を伴い、1種類は終止コドンを生じ、残る1変異は、塩基置換によってmRNAのスプライシング異常をひきおこすものであった。このスプライシング異常を伴う遺伝子変異は、日本人患者の70%以上に認められるcommon mutationであった。糖原病Ia型では、小児期には低血糖などの症状を示さずに経過し、成人後に腎不全や肝癌で発見される症例が相次いで報告されており、早期発見と早期治療が望まれている。これまで、糖原病Ia型の診断には、肝生検によって酵素活性を測定することが必要であった。したがって、この遺伝子変異をスクリーニングすることによって、早期発見と早期治療に役立てることは、臨床的に重要な課題であり、汎用遺伝子診断システムの対象疾患としてふさわしいと考えられる。しかしながら、研究進行中に蛍光色素を用いた新しいPCR産物定量法がABI社から報告されたため、この手法を取り入れてさらに新しい遺伝子変異検出方法を考案し、Fluorogenic allele specific amplification(FASA)法と命名した。本法では、検査検体からのDNA抽出、遺伝子増幅、変異の有無の判定にいたるまで、その全過程を96穴マイクロタイタ-プレートのフォーマットで行なうもので、全自動化が可能である。このシステムを用いて、日本人糖原病Ia型症例にきわめて頻度の高い遺伝子変異g727tの検出を検討した。その結果、対象とした23症例全例の患者においてg727tを検出することができた。また、ホモ接合子とヘテロ接合子の鑑別も行うことができた。糖原病

Ia型では、小児期に低血糖などの症例を示さずに経過し、成人後に腎不全や肝癌で発見される症例が相次いで報告されており、早期発見、早期治療がきわめて重要であると思われる。今後、本研究で開発された遺伝子診断システムを用いることによって、糖原病Ia型のマススクリーニングを施行することも可能である。さらに、他の遺伝子性疾患に対してもこの汎用遺伝子診断システムは有用と考えられる。
人工心肺回路を応用した蘇生肺移植に関する研究

人工心肺回路を用いて移植前に肺を評価することが心臓死肺移植において有用とされているが、そのシステム自体の安全性は十分に研究されていない。今回我々は人工心肺回路を用いた肺グラフト評価システムが移植後に肺へ及ぼす影響について大動物実験で検討した。室温で放置することによる温虚血障害を有する肺と有しない肺いずれかを用いて心臓死肺移植することを想定した実験を行い、人工心肺回路を用いた肺評価システムは移植後に致命的な影響を与えることなく施行可能であることを示した。長時間体外において人工心肺回路での肺灌流を行うとグラフト肺の障害が起こりうるが,その機序については十分に検討されていない。我々は,人工心肺回路で肺灌流を行った際の灌流液中の炎症性サイトカインの変動と肺機能について検討した。実験方法は、心停止直後のブタの心肺ブロックを摘出し,人工心肺回路で還流したが、還流後2時間を越えると,肺へのダメージを表す、肺水腫が出現し始めた。さらに還流を続け、最終的なモデルでは12時間灌流した.灌流液にはSteen solutionを使用した。1時間おきに灌流液を採取し,IL-8を測定した。また,送血管と脱血管の血液ガスを測定して酸素化能を評価した。【結果】全例12時間の灌流が可能であった.IL-8、およびTNF-alphaは還流開始2時間目より著明に上昇した。(IL-8:2時間:2774±1784,6時間5842±1829,12時間5860±1652)9時間までは良好な酸素化能を維持したが、その後は肺水腫により酸素化能は低下した。【結論】ex-vivo回路での肺の灌流により灌流液中のproinflammatoryサイトカインであるIL-8およびTNF-alphaは上昇し、それにともない還流グラフト機能も損なわれていった。このことから,灌流液中のサイトカインは肺障害を惹起する原因と考えられ、更なる研究、つまりサイトカイン吸着膜を用いてサイトカインを抑制することで、肺水腫の無い安全な体外式肺還流が実現できると考えられた。1.研究の背景:長時間体外において人工心肺回路での肺灌流を行うとグラフト肺の障害が起こりうるが,その機序については十分に検討されていない。2.研究の目的:前年度の研究で、人工心肺回路で肺灌流を行った際の灌流液中の炎症性サイトカインの有意な上昇を認めたため、サイトカインを含む老廃物質吸着能の高いPMMA膜を用いたCHDFの有用性について検討した。3.研究の内容,方法:実際にダメージを受けた肺(2時間温虚血)を用い、その蘇生効果を検証した。平成20年度の実験の結果特定されたパラメーターに対し、肺の代謝により枯渇した物質(例:グルコース・インスリン等)を還流液中に投与した上で、サイトカインを含む老廃物質吸着能の高いPMMA膜を用いたCHDF(血液吸着群)及び還流液交換(還流液交換群)を行うことで、肺蘇生に必要な還流環境を整え、再還流6時間後に片肺移植し移植後肺機能を測定し、従来のEx-vivo evaluation用の回路(コントロール群)と比較検討した。3群はランダムに割り当て実験した。4.研究の結果:PMMA膜を用いたCHDF(血液吸着群)では、回路還流液および肺実質中のサイトカインは有意に減少した。そして、膜の吸着能力の限界となる3時間を超えると徐々にサイトカインは上昇した。片肺移植による肺機能測定では、血液吸着群ではコント「ロール群に比べ良好な傾向を示したが,統計学的有意差は認めなかった。本研究から、人工心肺回路で肺灌流を行う際、灌流液中の炎症性サイトカインを吸着膜にて抑制することが可能であり、肺障害軽減に有用であるが、還流中はサイトカイン以外にも肺機能に影響する因子が存在ことを示唆した。体外循環による肺機能測定、肺蘇生が可能になれば心停止後のドナーからの移植が可能となり、臓器不足解消に対し大きな貢献となる。今回我々は人工心肺回路を用いた肺グラフト評価システムが移埴後に肺へ及ぼす影響について大動物実験で検討した。移植後2時間までの早期の移植後グラフト機能は、人工心肺回路を用いた肺グラフト評価システムを使用した群で低下を認めるが、移植後3時間以降で回復した。

DCDシナリオにおいてex vivo(+)群でex vivo(-)群と比較して有意な肺胞間の間質肥厚を認めたが、肺乾湿重量比、MPO活性では両群に有意差は認めなかった。海外で行われているシステムと同様の心臓死肺移植における人工心肺回路を用いた肺グラフト評価はグラフトに致命的な障害を与えることなく施行可能であった。国内においても同様のシステムを用いた心臓死肺移植を行うことで、障害された可能性のある肺、特に心臓死ドナーからのドナープールの拡大が期待できる。
視床-大脳皮質神経回路における感覚情報の変換機構

感覚入力(視覚・聴覚・体性感覚等)は、視床で中継され大脳皮質へ送られるが、"視床は単たる中継なのか、それとも何らかの情報処理を行っているのか"、という疑問に対する明確な解答は実験的には得られていない。一つの仮説として、"視床は感覚情報を大脳皮質が受け取りやすい形に変換する"といわれている。本研究計画では、その神経ネットワークレベルの仮説を、細胞・シナプスレベルで実証することを目的とし、解析システムの開発と病態の解析の両面から研究を進めた。ダイナミッククランプ法とは、神経回路の一部を人工的神経回路に置き換える手法であり、神経回路の機能解析ツールとして最近注目されている。視床神経細胞群の同期性神経発火の発生機構を明らかにするため、4細胞(3つの視床リレー細胞と1つの網様核細胞)からの同時記録にダイナミッククランプ法による人工シナプス電流を組み合わせ、視床ハイブリッド神経回路を構築した。この実験系を用いることにより、視床リレー細胞間の神経発火の同期性が、シナプス電流やシナプス配線の異常によってどのように修飾されるのか、検証することが可能になった。遺伝子変異マウスtotteringは、P/Q型電位依存性カルシウムチャネルに点変異を持ち、欠神てんかん脳波を呈することが知られている。欠神てんかん発作の責任病巣は、視床-大脳皮質神経回路であると考えられている。我々はこれまで、視床から大脳皮質へのフィードフォワード抑制電流が激しく減弱していることを報告してきた。今年度において、この抑制電流の減弱が大脳皮質神経細胞において長期にわたる脱分極を引き起こすことを明らかにした。加えて、この抑制電流の減弱は体性感覚野では観察されるが、聴覚野では観察されないことも明らかとなった。
特徴抽出フィルターの可塑性

1.研究目的感覚中枢の特徴抽出回路は、発達期の一定の時期(臨界期)に可塑的に形成され、入力に応じて動作特性を変えることが知られている。本研究はこの特徴抽出回路における可塑性発現のメカニズム解明を目的とする。2.研究経過津本班員は、視覚野からのアミノ酸の骨出をpush-pull cannulaeと高速液体クロマトグラフィー法を使用して調べた。外側膝状体(LGN)由来の求心線維終末よりグルタミン酸が放出されることを見い出した。外山班員は、新生仔ラットの皮質視覚野にラット胎仔のLGNを移植し、如何なる神経回路が形成されるかを調べた。その結果、LGN細胞が宿主視覚野に軸索を投射すること及び宿主視覚野からの投射線維も移植LGN細胞と正常なシナプス結合を形成することを明らかにした。根岸班員は、コイ網膜で、神経毒を使って神経網膜細胞を破壊するとその後色素上皮細胞または外網状層内に存在する桿体前駆細胞が分裂を開始し神経性網膜を形成することを見い出した。伊藤班員は免疫組織化学法を使いコレシストキニン、P物質等のペプチド含有ニューロンがラットの上丘からLGNへ投射することを発見した。岩村班員は、無麻酔サルで第1次体性感覚野(SI領域)にムシモールを微量注入した結果起こる手指運動異常を詳細に解析した。これらの結果からSI領域は触運動の習熟に密接に関与していることを示唆する結果を得た。3.考察本年度は視覚系、前庭系、聴覚系、嗅覚系回路網の形成期及び発達期における特異的結合能の存在や異所性シナプスの一時的出現、さらには可塑性に関する興奮性アミノ酸の役割等の重要な発現があった。また、他の感覚系においても可塑性研究の基礎となる重要なデータが得られた。さらい、工学モデルによる特徴抽出回路の構成・動作原理の理解も進展した。以上、特徴抽出回路網の可塑性のメカニズムに関する研究には格段の進歩があった。
従来捨てていた測定結果を用いた量子暗号の鍵レートの向上

従来の量子鍵配送プロトコルでは、プロトコル中で得られる測定結果の一部のみを利用することが多い。本研究では、すべての測定結果を用いることで量子通信路の推定をより正確に行い、鍵レートを向上させることを目指した。キュービットが有限個の単一光子BB84プロトコルと、キュービットが十分多い場合の単一光子B92プロトコルについて前述のアプローチで通信路推定方法を見直し安全性解析をやりなおし、鍵レートが向上することを確認し、それぞれ学術雑誌と国際会議で発表した。平成22年度は、既に申請者が提案していた、従来捨てていた測定結果を用いた通信路推定手法を、推定に用いる標本の大きさが有限である場合に従来手法とくらべて性能が向上するかどうか明らかにした。具体的にはBB84プロトコルをdepolarizing通信路およびamplitude damping通信路において用いた場合に、depolarizing通信路では提案手法が従来手法に劣るものの、amplitude damping通信路では標本の大きさが1000万のときに提案手法は従来手法よりも10%程度高い鍵レートを達成することを確認した。提案手法は、鍵レートを算出するために従来手法とは異なり凸最適化問題を解く必要があるが、この凸最適化問題をバリア法で解くために必要な計算量を実際にプログラムを作成して確認した。最適化の計算は、13変数のニュートン方程式を100回程度解くだけで済み、実用上まったく問題ない計算量であることがわかった。また、従来手法と同じ測定結果だけを用いる通信路推定において、区間推定の方法を変更することによって、鍵レートを向上できることも明らかにした。これらの結果をJournal of Physics Aの2010年12月号にて報告した。駄子鍵配送プロトコルの手順の中に秘密増幅と呼ばれる段階がある。これは、秘密増幅ではランダムに選んだハッシュ関数によって一部の情報が盗聴者に漏洩した秘密情報を短くし、盗聴者にまったくわからないより短い秘密情報を生成する。ここで用いられるハッシュ関数は、CarterとWagmanによって1979年に提案されたtwo-universalハッシュ関数と呼ばれる関数族で、この関数族からランダムに関数を選んだときに異なる値が同一の関数値を持つ確率が完全なランダム関数のそれ以下になるという性質を持つ。このハッシュ関数を用いた秘密増幅の考え方を近年注目が高まっている情報理論的セキュリティの分野に適用し、研究成果を3件の国際会議で発表した。具体的には、盗聴通信路に関する以下のような成果を得た。盗聴通信路とは、正規送信者Aliceが正規受信者Bobに雑音を有する通信路を介して誤りなく秘密情報を伝送しつつ、同じく雑音を有する通信路を介してAliceの送信信号を傍受している盗聴者Eveには秘密情報がわからないように、Aliceの符号化器とBobの復号器を構成する問題である。Eveに秘密情報がわからないようにするために、従来の盗聴通信路符号化ではAliceが送信信号にダミー乱数を挿入していた。ダミー乱数の挿入は伝送速度の低下をもたらし望ましくない。この問題に対し山本らは秘密情報と独立な複数の別の秘密情報を一括して送信信号に符号化し、各々の秘密情報が別の秘密情報に対してダミー乱数の役割を果たし、各々の秘密情報がEveにわからならなくなるsecure multiplex codingを提案した。しかしながら、山本らは複数の秘密情報の組についてEveに漏洩する情報量は見積もっていなかった。この漏洩情報量について、量子鍵配送プロトコルの安全性証明の中核である秘密増幅定理を用いて、新たな評価値を得た。平成25年度は前年度に行った、B92量子暗号プロトコルの安全に取り出せる鍵レートををRennerによる安全性解析手法を用いて解析しなおして、従来の解析よりも高い鍵レートを達成できることを明らかにした研究を2014 IEEE International Symposium on Information Theoryで発表した。その研究はキュービット数が無限であると仮定した漸近的な解析であったが、25年度は有限のキュービット長で安全に取り出せる鍵レートを解析するために、研究代表者が以前行ったBB84量子暗号プロトコルにおいて有限キュービット長での鍵レート解析手法を、B92プロトコルに適用するためにどのように改変すればいいか解明した。実際の鍵レートの算出には数値計算が必要だがそれは25年度には終わっておらず、26年度に完遂する。また、25年度は、Tomamicchelらによる単一光子BB84プロトコルの有限キュービットでの鍵レートの解析における区間推定手順を改良して、同一条件下でより長い鍵を安全に取り出せることを明らかにし、QCrypt 2013で発表し、IEICE Communications Express誌に雑誌論文として発表した。2012年度は、BB84量子鍵配送プロトコルにおいて送信キュービット数が有限であるときの林・鶴丸の安全性解析を改善し、同一条件下で得られる秘密鍵長を増加させた。具体的には、林らはキュービットに生じた位相誤りの数を区間推定する際に、誤り数が従う超幾何分布の裾確率を厳密に数値計算せず上界を代わりに用いて、安全に取り出せる秘密鍵長を算出していた。

我々は、超幾何分布の裾確率の数値計算を高速に行う手続きを新たに提案し、それを用いて安全に取り出せる秘密鍵長を計算する手続きを提案し、提案手法と林らの従来法により得られる秘密鍵長を比較し、提案手法の有効性を確認した。この成果は2012年9月にシンガポールで開かれたQCRYPT 2012で発表した。また、B92量子鍵配送プロトコルにおいて安全に取り出せる秘密鍵長を算出する際、従来は精巧に工夫された不等式を巧妙に操作して数値を求めていた。2012年度は安全に取り出せる秘密鍵長を、プロトコル実行中に得られた測定結果を与えうる量子通信路の凸集合上の凸関数として表現できることを明らかにした。この知見により秘密鍵長を通常の凸最適化アルゴリズムを適用して算出することが可能になった。これらの知見を利用して凸最適化により秘密鍵長を数値計算し、従来法による秘密鍵長と比較をした。その結果量子分極通信路において従来は分極レート4.2までしか秘密鍵を共有できなかったが、提案手法では6.5まで秘密鍵の共有を可能にすることを明らかにした。これは大幅な改善である。この成果は2013年7月にトルコイスタンブールで開かれる2013IEEE International Symposium on Information Theoryで発表予定である。量子暗号の手法を別の分野に適用すると有用な研究成果を得られることに気づきその可能性を探求していたので25年度が最終年度であるため、記入しない。だいたい予定どおり進んでいる。当初の研究計画に記載されているB92量子鍵配送プロトコルの改善を平成24年度は行う25年度が最終年度であるため、記入しない。2014年度はB92プロトコルについて前年度の研究成果をキュービット数が有限である場合に適用できるように拡張し、また従来捨てられていた測定結果も考慮に入れて秘密鍵長を算出できるように拡張する。
上部消化管に発現するクラスIVアルコール脱水素酵素の食道癌の発症機序における意義

ニトロソベンズアミン代謝におけるクラスIVアルコール脱水素酵素(クラスIV ADH)の役割を検討し食道癌の発症機序の一側面を明らかにする目的で研究を開始した。食餌中に含まれるニトロソベンズアミンは食道のミクロゾームで中間代謝物に代謝され、その中間代謝物はニトロベンズアルデヒドに代謝される一方、強い発癌性を示すN-メチル-N-α-アセトキシベンジルニトロソアミンにも転換される。また亜鉛欠乏がヒトにおいては食道癌発症の一因であることが疫学的に推測されている。クラスIV ADHは食道における活性が高く、ニトロベンズアルデヒドに高い親和性を示し、亜鉛要求性の酵素である。そこで食道のクラスIV ADH活性に及ぼす亜鉛欠乏の影響を検討した。体重150gのウィスター系雄性ラットを用い、亜鉛欠乏食または50ppmの亜鉛を添加した対照食で6週間飼育した。飼育後両群より食道粘膜を採取し、クラスIV ADH活性を測定した。その結果両群の血清中の亜鉛濃度は対照群に比し亜鉛欠乏群で有意に低く(490±242 μg/dl vs 127±15μg/dl : p=0.004)、またクラスIV ADH活性も対照群に比し亜鉛欠乏群で有意に低かった(11.3±3.2nM NADH酸化/min/mg vs 6.4±1.6nM NADH酸化/min/mg : p=0.03)。以上の検討より亜鉛欠乏は食道粘膜のクラスIV ADH活性を減弱させ、そのことにより食道粘膜におけるニトロベンズアルデヒドの代謝が障害され、ニトロソベンズアミンからN-メチル-N-α-アセトキシベンジルニトロソアミンへの形成を促進させる可能性が推測された。(研究代表者は上記研究内容を第83回日本消化器学会総会で発表した。)現在亜鉛欠乏ラットおよび対照群をニトロソベンズアミン食で飼育中であり、両群における食道癌の発症率および食道組織中のN-メチル-N-α-アセトキシベンジルニトロソアミン量を今後比較検討していく予定である。
小中学校のインクルーシブ体育の課題分析及び課題解決のための事例集の作成

[目的]本研究では地域の通常学級で体育授業担当教員が障害児の在籍する体育授業をどのように展開し(インクルーシブ体育),どのようなことを指導上の課題として捉えているかを整理するとともに,指導場面における課題整理のマニュアルと適切な指導や配慮についての事例集を試作することを目的とした。[結果等]都内23区から任意に抽出した小学校400校の教員を対象に実施したアンケート調査の結果(有効回答175、回収率43.8%)から、以下のことが明らかになった。回答者した小学校教員の約70%が通常学級の体育授業で障害児を指導した経験を有していた。その内45%が肢体不自由児の指導経験があり、その他の障害では知的障害児と発達障害児の指導経験であった。指導にあたっては、障害の状態に応じてルール、道具、距離の変更や特別な役割を考えるなどの配慮がなされていることが明らかとなった。これらの教員の9割以上が障害児の指導に難しさを感じ、特に障害状態の把握、障害に応じた配慮や工夫の仕方、評価の仕方を課題として挙げていた。これらの課題に対する解決方法として、特別支援学校の体育教員への教育相談や支援を期待する回答が多く(93%)、特別支援学校が蓄積した教科指導に関する知見が必要とされていることが示唆された。課題整理マニュアルは、授業参加において児童生徒の実態のとらえ方と目標設定の仕方をA4用紙1枚で作成した。指導や配慮についての事例集は、陸上競技、水泳、球技(サッカー、ポートボール)、表現運動、マット運動、縄跳びなどの内容について作成した。これらのマニュアルと事例集は今年度実施した小学校体育授業の支援活動において活用した。おおむね、授業担当の教員から有効との評価を受けたが、ケースよって修正が必要な部分があり、今後の課題が明らかにされた。