hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
射影多様体のイニシャルイデアルと埋め込みの研究

射影多様体のCastelnuovo-Mumford regularityは,定義方程式,generic initial idealの生成元の次数,ヒルベルト関数などに関係する重要な不変量である.他方,regularityと多重割線の間には密接な関係があることが期待されている.本年度もこの観点から,射影多様体の埋め込みの幾何学的な性質である多重割線,多重割空間に重点をおいて研究を行った.余次元がe,既約なd次数,切断面種数gであり,irregurality qが0の非特異射影多様体の多重割線の交点数の上限は,d-e+1-gであることが昨年度までの結果からわかっているので,この上限を満たす射影多様体と割線を分類することを一つの目標に研究した.その結果,線形射影の言葉で,割線が存在するための特徴づけを与えた.これにより,g=1の場合の分類を,完全に記述することができた,さらに,この考察に基づいて,linearly normalな曲面には,割線は,2-secant lineか,曲面に含まれる直線以外にないこと,また,曲面上の点からの線形射影の像の上に,直線がどのようにできるかを観察することができた.これによって,q=0の射影曲面上のvery ample line bundle Lに対して,blowing-upされた曲面上のL(-E_1-...-E_m)の形のline bundleがいつ再びvery ample line bundleになるかの必要十分条件をblowing-upの中心点の配置の言葉で書き下すことができた.ただし,E_jは例外曲線を表す.これによって,切断種数g=2,3の射影曲面の分類のうちで,未確定であった曲面の分類を得た.これをもとに,g=2,3の曲面の多重割線を分類できることが期待できる.平行して行なった,一般の射影曲線のCastelnuovo-Mumford regularityのより厳密な評価の研究は,現在も継続中である.r次元射影空間の既約なd次数射影曲線Xに対する,Castelnuovo-Mumford regularityreg(X)は,定義方程式,generic initial idealの生成元の次数,ヒルベルト関数などに関係する重要な不変量であり,本研究までに,reg(X)はd-r+2以下であることが,また上限を満たすような曲線は,非特異な有理曲線であり(d-r+2)-secant lineを持つことが知られていた.これにより,次数が十分に大きければ,reg(X)=eのとき,e-secant lineを持つことが予想されていた.また,昨年度までに,p_aを曲線の算術種数,f:=min{p_a,r-2}とするとき,reg(X)はd-r+2-f以下であること,さらに,f:=r-1についてp_a≧r+2であってXが超楕円曲線でなければ,reg(X)はd-2r+3以下であることがわかっていた.今年度は,これと関係の深い,代数曲線や射影的代数多様体の多重割線について研究を行った.そして,上の昨年までの結果は,p_a=r-2の時には最良であるという結果が得られた.さらに,p_a>r-2について,最良であるかどうか,そうでなければ,最良な評価はどのようなものかを決定することは残された重要な問題である.これらの評価を与えるうえで,計算機による実験的な計算はたいへん重要であるが,本年度,この計算のために重要な役割を果たすsyzygyを求めるための簡易なアルゴリズムを作成した.先の代数曲線の多重割線の研究を下に,その他に,多重割線が存在するときの射影的代数多様体の構造に関して,また,3重割線を持つ空間曲線の構造に関してそれぞれ考察を行い,いくつかの結果が得られたが,これは現在進行中であり,さらに詳しい研究が今後の課題である.射影多様体のCastelnuovo-Mumford regularityは,定義方程式,generic initial idealの生成元の次数,ヒルベルト関数などに関係する重要な不変量である.他方,regularityと多重割線の間には密接な関係があることが期待されている.本年度は,この観点から,射影多様体の埋め込みの幾何学的な性質である多重割線,多重割空間に重点をおいて研究を行った.まず,射影代数曲線について,多重割線の交点数の上限について研究を行った.射影空間内の余次元がeの,既約なd次数射影曲線に対する,多重割線の長さの上限は,d-e+1であること,またより一般にk次元多重割空間と射影曲線の交点数の上限は,d-e+kであることが知られていた.ここでは,種数がgの射影曲線とk次元多重割空間の交点数の上限は,d-e+k-gであることを2通りの方法で示すことができた.一方は,幾何学的な考察とヒルベルト関数と種数の関係を使うものである.もう一方は,regularityとの関係を用いるもので,標数によらずに証明することができた.これに基づき,高次元の非特異な射影多様体についても、曲線の場合に帰着させることによって,同様の不等式を示すことができた.他方;特異点のある高次元の射影多様体の場合には,一般には曲線の場合に帰着させられるとは限らないので,曲線で得られた結果が一般の射影多様体について成立するかどうかは明らかではなかった.ここでは,別の方法を用いて,同様にd-e+kで押さえられることを示した.

平行して行なった,一般の射影曲線に対するCaste Inuovo-Mumford regularityをより厳密に評価しようとする研究については,現在も継続中である.射影多様体のCastelnuovo-Mumford regularityは,定義方程式,generic initial idealの生成元の次数,ヒルベルト関数などに関係する重要な不変量である.他方,regularityと多重割線の間には密接な関係があることが期待されている.本年度もこの観点から,射影多様体の埋め込みの幾何学的な性質である多重割線,多重割空間に重点をおいて研究を行った.余次元がe,既約なd次数,切断面種数gであり,irregurality qが0の非特異射影多様体の多重割線の交点数の上限は,d-e+1-gであることが昨年度までの結果からわかっているので,この上限を満たす射影多様体と割線を分類することを一つの目標に研究した.その結果,線形射影の言葉で,割線が存在するための特徴づけを与えた.これにより,g=1の場合の分類を,完全に記述することができた,さらに,この考察に基づいて,linearly normalな曲面には,割線は,2-secant lineか,曲面に含まれる直線以外にないこと,また,曲面上の点からの線形射影の像の上に,直線がどのようにできるかを観察することができた.これによって,q=0の射影曲面上のvery ample line bundle Lに対して,blowing-upされた曲面上のL(-E_1-...-E_m)の形のline bundleがいつ再びvery ample line bundleになるかの必要十分条件をblowing-upの中心点の配置の言葉で書き下すことができた.ただし,E_jは例外曲線を表す.これによって,切断種数g=2,3の射影曲面の分類のうちで,未確定であった曲面の分類を得た.これをもとに,g=2,3の曲面の多重割線を分類できることが期待できる.平行して行なった,一般の射影曲線のCastelnuovo-Mumford regularityのより厳密な評価の研究は,現在も継続中である.
センダイウイルスベクターを用いた脳微小血管構築を標的とする脳梗塞遺伝子治療の研究

齧歯類の実験的脳虚血モデルを用い、脳虚血作製後の治療開始であっても、可溶性Flt-1の遺伝子導入が血管透過性亢進の著明な阻害作用を示し、脳浮腫ならびに脳梗塞を軽減することを明らかにした。また、国産の遺伝子導入ベクターであるセンダイウイルスベクターを用いた脳への遺伝子導入がアデノウイルスベクターと同様の有効性を示すことを認めた。脳虚血部位における微小血管構築の破綻と血管透過性亢進に対する保護作用が期待され、国産技術による臨床的な遺伝子治療の開発につながる成果が得られたと考えられる。脳梗塞に対する新規治療法としての遺伝子治療の可能性を探求する目的で、本邦でクローニングされ、血管新生ならびに神経再生作用を示す可能性を有し、治療遺伝子の候補として期待される新規成長因子ミッドカインを、アデノウイルスベクターを用いて高血圧自然発症ラットの脳虚血発症後の脳内に遺伝子導入した。脳虚血の作製には、当研究室で開発したクリプトンレーザー照射による血栓性中大脳動脈閉塞モデルを用い、脳梗塞の亜急性期において脳保護作用ならびに炎症・血管新生・神経再生に及ぼす影響を検討した。その結果、急性期のみならず亜急性期においても脳梗塞の縮小効果を示すことが認められた。また、炎症を惹起する懸念がないこと、血管新生作用は有しないが、neuroblastの梗塞巣への遊走促進が認められた。したがって、脳梗塞に対するミッドカインの作用として、抗アポトーシス作用に加えて神経再生を介する保護作用を有することが示唆され。脳梗塞遺伝子治療への有用性が示唆された。また、国産ベクターであり細胞質型RNAベクターとしてその発展が期待されているセンダイウイルスベクターを用い、標識遺伝子を脳虚血後に脳内に導入した。脳虚血後であっても良好な導入効率を示し、脳梗塞に対する遺伝子治療ベクターとしての有用性が示された。さらに血管系を介した遺伝子導入やex vivo導入による細胞療法などの有効性を検討しており、今後脳虚血部位における微小血管構築の破綻と血管透過性亢進に対する保護作用の可能性を検討し、国産技術による臨床的な遺伝子治療の開発を進める。脳梗塞に対する新規治療法としての遺伝子治療の可能性を探求する目的で、本邦でクローニングされ、我々がすでに脳梗塞における抗アポトーシス作用を報告した新規成長因子ミッドカインの脳梗塞の亜急性期における脳保護作用について詳細な検討を行った。その結果、亜急性期においても脳梗塞の縮小効果が急性期と同程度に認められた。また、梗塞巣への白血球やマクロファージなどの炎症反応浸潤を促進する作用は認められなかった。一方、神経再生に関しては、脳室下層における神経幹細胞の増殖への影響は認めないものの、神経前駆細胞の梗塞巣への遊走を有意に促進させることが認められ、脳梗塞治療における神経再生を介する保護作用が示唆された。また、国産ベクターであり細胞質型RNAベクターとしてその発展が期待されているセンダイウイルスベクターを用いて標識遺伝子を脳虚血後に脳内に導入し、脳虚血後であっても良好な導入効率を示すことから、脳梗塞に対する遺伝子治療ベクターとしての有用性が示された。また、我々がすでに脳梗塞急性期における血管透過性亢進の阻害作用を報告している可溶性Flt-1を、センダイウイルスベクターに組み込んで脳室内に導入し、アデノウイルスベクターによる導入と比較を行った。その結果、脳室内への可溶性Flt-1産生のピークはアデノウイルスベクターよりも長期にわたることが認められ、さらなる有効性が期特された。脳虚血部位における微小血管構築の破綻と血管透過性亢進に対する保護作用が期待され、国産技術による臨床的な遺伝子治療の開発につながる成果が得られたと考えられた。
過去数100年間の東アジア域におけるブラックカーボンの動態解明

秋田県一ノ目潟の湖底堆積物の分析から過去100年規模のブラックカーボン(BC)の沈着フラックスの推定を行い、全球化学輸送モデルとの比較を行った。東アジア域ではBCは非常に速い時定数で降水による除去を経験し得ることを見出し、モデル改良に資する結果を得た。一ノ目潟へ沈着するBCの88%は東アジア大陸に起源をもち、1950年代から2000年代までの間にゆるやかに年間沈着フラックスが増加していた。(57-136 mg/m2)同時期にの排出量推計においては、東アジア域のBC排出量が4倍以上の増加している。日本近海の海表面気温の上昇に伴う降水量の増加が、輸送効率を低下させていたことが要因として考えられる。秋田県一ノ目潟の湖底堆積物中のブラックカーボン(BC)の分析法の最適化のため、いくつかの前処理法の検討及び基礎実験を行った。堆積物中の炭酸除去のため、従来塩酸が使用されるが、燃焼により発生するBCは比表面積が大きく、容易に表面が酸化されるので、酢酸を用いた前処理に変更した。加熱処理により、有機炭素を除去する過程での温度条件の最適化を検討した。燃焼によるロスを減らすため、不活性ガス雰囲気下で加熱処理を施し、約800°C以上の高温にすることで、有機炭素がほぼ除去できることがわかった。過酸化水素処理後の熱分析により、一ノ目潟の試料では主として、比表面積の大きい燃焼由来の元素状炭素を検出していることが分かった。年縞別の試料の準備は、一ノ目潟のプロジェクト内との調整から遅れており、いくつかのテストサンプルについてのみ分析を行い、BC含有量のみトレンドを調べた。暫定的な値ではあるが、2000年代で0.33%であったのに対し、1980年代で0.09%、1950年代で0.06%と産業革命後にBCの含有量が増加している傾向をとらえることに成功した。モデルは当初全球気候モデルを使用する予定であったが、より一般的に使われており、モジュールなどの共有化が進む全球化学輸送GEOS-Chemに変更した。すでに10年スケールのシミュレーションについてはテストランを終え、本格使用の準備を終えた。比較可能な東アジア域のBCデータについては整備済みである。また、モデルで使用される湿性沈着の取り扱いについて、BCが一定の時定数で水溶性を獲得するパラメタリゼーションは全球モデルでよく使用されるが、東アジア域での再現性が悪いことがわかり、今後の検討材料が抽出できた。H27年度は1953年から2012年の試料に関して、分析を完了した。2000-2012年から1953-1956年にかけて、堆積物中ブラックカーボン(BC)濃度は0.5%から0.1%まで減少していた。排出インベントリ(Lamarque et al. 2010)で見られるような、増加傾向が顕著な1950年代以降の変化が明瞭にとらえられている。年縞別の試料の準備は、一ノ目潟のプロジェクト内との調整から依然として遅れており、1950年より以前にさかのぼる試料の切出しが完了していないが、重要な年代に関しては網羅できている。タービダイト層の分析から一ノ目潟の試料は部分的に地崩れの影響を受けていることが示唆された。慎重にデータの選別を行うことが必要であることが判明した。BC濃度が希少であることと、使用できる堆積物の量に限度があるため、同位体による起源解析が難しいことがわかってきた。しかしながら、分析の際に同時に定量される加熱により炭化する有機炭素の挙動から定性的に過去から近年に近づくにつれてバイオマス燃焼の寄与が小さくなっていることが分析の結果から示唆された。(この炭化する有機炭素はバイオマス燃焼時に大きな寄与を持つことで知られる。)全球化学輸送モデルGEOS-ChemのBCの疎水性粒子から親水性粒子への変質過程に新たにパラメタリゼーションを導入し、BCの長距離輸送をより適切にシミュレーションできるようモデルの精緻化を進めた。東アジア域のBC観測と比較を行い、季節変化などモデルの再現性が良好であることを確認した。また、タグ付きBCシミュレーション計算を行えるようモデルの改良を行い、BC濃度・沈着量の発生源別寄与を定量的に評価ができるようにした。当初目標どおり、H27年度までに過去から現在までの堆積物中のBC濃度が増加している傾向が明らかとなった。本計画外であるが、一ノ目潟のコア試料の管理進捗状況の問題から産業革命以前まで十分にさかのぼることはできなかったが、本計画の目的としては現状では大きな問題とはならない。また、H27年度に堆積物の同位体比分析を終える予定であったが、堆積物に対しての同位体比分析が現状では難しいことがわかり、方針を変える必要に迫られた。モデルに関しては、ほぼ順調に進展している。現代の大気ブラックカーボン(BC)に対してのみ放射性炭素同位体(14C)比の分析を適用する手法の開発に取り組んだ。大気エアロゾルにはBC以外の炭素分(有機炭素OC)も豊富に含まれており、分析中のコンタミの要因になる。しかしながら、その熱的特性により分離可能である。また、一部のOCは高分子量であり、熱的にも強い。そこで、2段階の前処理法を検討した。高分子量で熱的に強いOCが水に溶解しやすい性質を利用し、超純水により、抽出・除去を行った。この過程でのBCは100%の回収率である。

次に燃焼を助ける酸素のない純ヘリウム環境下において870°Cまで加熱して、OCを取り除き、残存したもののみをBCとした。この過程は高温にしたことにより、一部のBCが消失するため、回収率は70%であった。東京都心や横須賀で採取した試料にこの手法を適用し、14C比の分析を行ったところ、BCの12-36%が現代炭素由来であることがわかった。この結果は、都市近郊であるので大部分が化石燃料であることが予想されたことと整合的であり、良好な結果を得たと考えられる。全球化学輸送モデルGEOS-Chemを用いて、BCの発生源の種類(人為起源とバイオマス燃焼起源)で区別し、且つアジア域を詳細に領域分けしたタグ付きトレーサー機能を付加した。時間的な制約もあり、長期計算はできなかったが、長崎県福江島で観測された現代のBC濃度と比較し、モデルが季節変化を概ね再現できていることを確認し、降水除去のパラメタリゼーションが適切であったことがわかった。また、タグ付きトレーサー機能の検証のため、東アジア起源など主要な発生源からのBCの輸送経路を調べるとともに、様々な輸送先への発生源別寄与の評価を行った。秋田県一ノ目潟の湖底堆積物の分析から過去100年規模のブラックカーボン(BC)の沈着フラックスの推定を行い、全球化学輸送モデルとの比較を行った。東アジア域ではBCは非常に速い時定数で降水による除去を経験し得ることを見出し、モデル改良に資する結果を得た。一ノ目潟へ沈着するBCの88%は東アジア大陸に起源をもち、1950年代から2000年代までの間にゆるやかに年間沈着フラックスが増加していた。(57-136 mg/m2)同時期にの排出量推計においては、東アジア域のBC排出量が4倍以上の増加している。日本近海の海表面気温の上昇に伴う降水量の増加が、輸送効率を低下させていたことが要因として考えられる。現状では、いわゆる年縞別の試料を切り出せていないため、正確にBC含有量から沈着フラックスへの換算ができていない。しかしながら、BC含有量の定量法の目途はついているので、試料の準備ができ次第、トレンドを完成できる。また、検討した前処理は同位体分析に向けた前処理も兼ねているため、遅れはあるものの比較的スムーズに起源解析を進めることができると考えられる。モデルの変更に伴い、当初予定していたエミッション検証や降水量シミュレーションの検証は未達である。どちらもこの研究の重要な鍵であるので、引き続き注意深く行っていく必要がある。世界で唯一の貴重な試料であるので、試料の準備のでき次第継続して分析を行いできる限り過去にまでさかのぼった経年変動を取得する。同位体比分析に関しては、まずは試料量を調節しやすい現世のエアロゾルで有機炭素とブラックカーボンを分離して、同位体分析を行うことを検討している。フィルターにろ過捕集されたエアロゾルを加熱分離するセットアップを作成し、将来的な堆積物試料への適用に向けた準備を行う。改良したGEOS-Chemを用いて長期計算を行いBC沈着フラックスの長期トレンドとの比較を行い経年変化の要因を調べる。タグ付きBCシミュレーションによって東アジア域のBC濃度・沈着量の長期変動に対する様々な発生源からの寄与を定量的に評価する。
三角格子反強磁性体における量子スピン液体状態の内部構造のＮＭＲによる研究

有機三角格子スピン液体物質EtMe3Sb[Pd(dmit)2]2の単結晶に対し、超低温域および加圧下のNMR測定を行った。その結果、低圧で生じるモット相境界において非常に遅い電荷揺動を持つ特異な電子状態を発見し、スピン液体状態において電荷自由度と乱雑性が重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、新たな希土類三角格子量子スピン反強磁性体CeZn3P3とYbCuGeを見いだした。CeZn3P3では量子揺らぎを反映した磁気相が実現していること、YbCuGeでは秩序相で核スピン横緩和率が増大し続けることを観測し、秩序相においても量子揺らぎが重要な役割を果たしていることを明らかにした。本研究の対象物質である有機量子スピン液体物質EtMe_3Sb[Pd(dmit)_2]_2において、スピン液体状態が実現するのは、この物質がモット転移点近傍に位置しているためであると理論的に指摘されてきている。当該年度は2重構造圧力セルを用いた圧力下の核磁気共鳴(NMR)測定を行い、この物質の圧力下における^<13>C-NMRスペクトル、スピン・格子緩和率1/T_1、スピン・スピン緩和率1/T_2を測定し、モット転移時の電子状態の解明に成功した。その結果、モット転移は約56kbarの間で実現することを見出した。さらに、圧力-温度相図上で反強磁性秩序の出現する領域は無く、スピン液体状態がモット転移直前まで実現していることを明らかにした。また、1/71はMHz領域のスピンダイナミクスを、1/T2はkHz領域のダイナミクスを反映するが、モット転移直後の電子液体相においてこの両者の振る舞いが大きく異なる異常な振る舞いを発見した。MHz領域のダイナミクスは、通常の金属状態で期待されるコリンハ的振る舞いを示し、温度に比例して温度低下と共に減少していくが、その一方でkHz領域のダイナミクスは低温に向けて増大していくことを見出した。すなわち、この系におけるスピン液体状態から電子液体状態への移行時において、異常に遅いダイナミクスが顕著に増大することを意味している。このような振る舞いは通常のモット転移では起こりえず、この物質の特異性を反映しているものと考えられる。本研究対象物質である有機量子スピン液体物質EtMe3Sb[Pd(dmit)2]2において、前年度発見した圧力下での遅い電荷ダイナミクスを解明するために、本年度は13C-NMR核スピン緩和率T1-1とT2-1を15kbarまでの圧力下で測定し、この遅い揺らぎの圧力、温度依存性を明らかにした。その結果、遅い電荷揺らぎは金属-Mott絶縁体相境界で特異的に大きくなり、この系の相境界においては通常の1次Mott転移とは大きく様相が異なり、Mott絶縁体と金属状態が非常にゆっくりと揺らぐ電子状態が実現していることが強く示唆される。この結果は、常圧におけるスピン液体状態において、純粋なスピン自由度のみではなく電子自由度も重要な役割を果たしている可能性、ないしは乱雑性が電子状態・スピン状態に重要な役割を与えている可能性を示唆している。一方、f電子系については新たな量子スピンフラストレート物質であるYbCuGeを見いだした。Ising的異方性を持つ三角格子反強磁性体であるこの物質はTN = 4K以下で反強磁性秩序を持つが、近藤効果のようなf電子系特有の異常がないにも関わらず、TNでのエントロピーがRln2の25%と非常に小さい。Cu-NMR実験により、秩序化した磁気モーメントはかなり縮んでおり、TNで臨界発散がなく、秩序相でT2-1は低温に向かって増大していくことを明らかにした。これらの結果は秩序相に低エネルギーの揺らぎが残り、量子性の効果が強いことを示唆している。一方、XY型三角格子反強磁性体であるCeZn3P3については、理論から予想される磁気相図が実現していることを見いだし、量子揺らぎが重要であることを明らかにした。これらの物質では、結晶場分裂によって実現した基底状態が有効スピン1/2の量子スピン系として振る舞っており、このような物質が希土類化合物に広く存在することを本研究によって明らかにした。(1)スピン液体状態を発現する有機三角格子量子スピン物質EtMe3Sb[Pd(dmit)2]2について、平成25年度に、加圧下においてモット転移が起こるとき非常に遅い揺らぎが存在することを核スピン緩和率によって観測した。しかし、この揺らぎが電子系起源である確定的な証拠は得られておらず、分子運動等に起因する可能性も残されていた。平成26年度は、EtMe3Sb[Pd(dmit)2]2ならびに参照物質EtMe3P[Pd(dmit)2]

2の1H-NMR測定を行い、この遅い揺らぎが分子運動によるものでなく、確かに電子系によるものであることを見出した。この発見はこの系のスピン液体状態において電荷自由度と乱雑性が重要な役割を果たしていることを結論づけるものであり、スピン液体の理解の方向性を示すものである。(2)量子スピン三角格子反強磁性体である希土類化合物YbCuGeについても、Cu-NMR実験を行い、秩序相で横緩和率1/T2が低温に向かって増大していく現象をさらに詳細に観測し、ローレンツ型横緩和率1/T2Lとガウス型横緩和率1/T2Gの分離に成功した。1/T2Lは電子スピン揺動に起因する緩和率であり、磁気秩序相でkHz帯域の非常に遅い揺らぎが残存していることを明らかにした。この現象はいくつかのフラストレート磁性体で観測されているものの統一的理解はまだなく、フラストレーション効果を理解する上で重要な結果である。一方、1/T2Gは転移温度の2倍程度の温度から転移温度に向かって増大することが観測された。これはスピン相関の高温からの発達に伴う伝導電子の磁化率χ(q)の変化が核スピン間相互作用を変化させていることによることを明らかにした。このような1/T2Lと1/T2Gの分離は一般に難しいが、この物質はスピン揺らぎを観測する上で非常に有利であることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。低温磁性物理学26年度が最終年度であるため、記入しない。スピン液体波動関数の解明には至っていないものの、本研究対象物質において圧力下における特異ダイナミクスを発見した。この点はスピン液体を理解する上で重要な知見であると考えられる。本研究課題の直接の目的は三角格子有機量子スピン液体物質EtMe3Sb[Pd(dmit)2]2におけるスピン液体状態の解明である。昨年度に、圧力下において特異な遅い電荷ダイナミクスの兆候が見いだされたため、本年度はこのダイナミクスの追及に注力した。その結果、この系のMott相境界においては通常の1次Mott転移とは大きく様相が異なり、Mott絶縁体と金属状態が非常にゆっくりと揺らぐ電子状態が実現していることが見いだされた。スピン液体実現においてはMott絶縁体性がどのようなものであるかという点が重要であると近年盛んに理論・実験両サイドから議論が進んでいるが、この結果により本物質のMott絶縁体性の特異さを浮き彫りにした。この結果はスピン液体波動関数の直接的解明ではないが、このスピン液体状態において電荷自由度とrandomnessが重要な役割を果たしていることを示しており、スピン液体状態理解の上で非常に重要な発見である。希土類化合物における量子スピン系の典型例であるCeZn3P3について、磁気相図と各相における磁気構造を決定し、秩序相における量子揺らぎの重要性を明らかにした。また、新たに見いだしたYbCuGeは量子揺らぎによって秩序相における磁気モーメントが縮んでおり、量子スピン液体と反強磁性秩序の境界近くにあると考えられる。以上のように希土類化合物においても量子揺らぎが重要な役割を果たす場合があることを明らかにし、当初の研究目的は達成されつつある。
マウス日和見感染症起因微生物４種を同時に検出する技術研究

本研究では免疫不全マウスを用いた実験を障害すると考えられる主要な日和見感染症起因微生物であり、感染マウスの糞便に排出される黄色ブドウ球菌、マウス肝炎ウイルス(MHV)、マウスノロウイルス(MNV)、肺パスツレラを単一の方法で同時に検出を可能にすることを目的として等温遺伝子増幅法(LAMP法)の開発を行った。MHVとMNVに対しては62°C90分の反応で検出する逆転写LAMP法をそれぞれ完成させた。また、黄色ブドウ球菌に対しては薬剤耐性能と消毒薬耐性能も同時に判別する3つのLAMP法を完成している。肺パスツレラを検出するLAMP法は特異プライマーの設計ができておらず、検討継続中である。マウスノロウイルス(MNV)はカリシウイルス科ノロウイルス属のRNAウイルスで、遺伝子配列の異なる多数の株がGenBankに登録されている。そこで、プライマーはGenBankに登録された全長あるいはほぼ全長の71株のMNV間でよく保存されている領域、MNV-1遺伝子の4854から5161塩基間でプライマーを設計した。その際、7箇所のプライマー領域は少なくとも3'末端側5塩基には変異を含まないことを条件とした。このプライマーセットを用いたRT-LAMP法は62°C60分間の反応で、既存の標準RT-PCR法の17.8倍の検出感度を示した。実用評価として国内の独立した4マウス飼育施設から収集したマウス糞便115例よりRNAを抽出し、RT-LAMP法とRT-PCR法によるMNVの検出を行った。その結果、RT-LAMP法では56例、RT-PCR法では50例がMNV陽性であった。また、RT-PCR法と比較したRT-LAMP法の特異性は100%であった。実験操作はRT-PCR法に比べてRT-LAMP法が簡便であり、専用の遺伝子増幅装置も必要としない。反応の判定は反応液の色(陽性:水色;陰性:青紫色)で行うことができる。以上のことから、RT-LAMP法はMNV感染診断においてRT-PCR法に代わる標準技術になり得ることが期待される。マウス糞便から対象となる微生物(ウイルス、細菌)を同時に検出する方法について、マウス糞便はPBSで膨潤させて滅菌爪楊枝で破砕して溶解し、5000 x g, 10分間の遠心で上清(ウイルス画分)と固形物(細菌画分)に分離し、上清をウイルスRNA抽出キット、固形物を糞便DNA抽出キットによるゲノム調製に用いた。そして、マウス糞便(2ー3粒;0.1ー0.2g)よりマウス肝炎ウイルス(MHV)、MNV、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を同時並行して検出できることを確認した。遺伝子改変技術により作出された免疫疾患モデル動物を含む免疫不全動物は、日和見感染微生物によっても傷害を受けるため、免疫正常動物に比べて厳格なSPF管理が必要になる。本研究では主要な日和見感染症起因微生物であり感染動物の糞便に排出される黄色ブドウ球菌、マウス肝炎ウイルス(MHV)、マウスノロウイルス(MNV)、肺パスツレラを単一の方法で同時に診断を可能にすることを目的として等温遺伝子増幅法であるLAMP法に独自の目視判定法を組み合わせた比色LAMP法の開発を行った。最終年度では肺パスツレラを検出するための比色LAMP法の研究を行った。肺パスツレラにはJawetzとHeylの2つの生物型があり、これらを区別して検出できるPCR法が報告されている。LAMPプライマーはこれらを判別できるように16S rRNA遺伝子を標的として設計し、PCR法によって2型に判別された菌体から抽出したゲノムを用いて評価した結果、100%の精度で2つの生物型に分類することができた。肺パスツレラには多くの近縁種が存在するため、16S rRNA遺伝子配列の相同性の高い近縁種ゲノムの当該領域を合成して比色LAMP法で区別できるか確認した。しかし、肺パスツレラと区別できない近縁種が存在した。本研究は期間内に完了することができず、継続して検討する予定である。本研究ではMHVとMNVをそれぞれ62°C90分の反応で検出する比色RT-LAMP法を完成させて学術誌へ発表した。また、MHVを検出するためのLAMPプライマー配列は特許出願を行った。黄色ブドウ球菌を検出するLAMP法は本研究申請以降開始前に学術誌へ発表しており、本研究対象とした4種の微生物の内、3種を比色LAMP法により検出する方法を確立した。マウス肝炎ウイルスはマウス飼育管理上問題になる主要病原微生物の一つで、ウイルスの侵入した繁殖コロニーでは持続的な同居感染が起こる。

そのため、マウスコロニーから排除すべき病原微生物であるが、その一般的な検査は簡便であるものの精度が劣る血清学的方法(ELISA,蛍光抗体法)が採用されている。そして、検査精度が高いものの操作が面倒な逆転写合成酵素連鎖反応(RT-PCR)は普及していない。そこで、RT-PCR法に比べて操作が簡便なために普及が期待される遺伝子診断法:RT-LAMP法のマウス肝炎ウイルス検出への応用開発を行った。マウス肝炎ウイルスは遺伝子変異が多く、多数の血清型が知られていることから、GenBankを利用して株間の遺伝子配列比較を行い、5'末端にプライマー設計に適した配列を見い出した。設計したプライマーの特異性はマウス肝炎ウイルス:17株、ラットコロナウイルス:6株、非齧歯動物を宿主とするコロナウイルス:9株を用いて確認した。RT-LAMP法の検出感度は既報のRT-PCR法に比べて3.2倍優れたが、既報のnested RT-PCR法に比べて32倍劣った。実用評価は微生物管理が行われていないマウス糞便サンプル:69例を用いて行った結果、nested RT-PCR法との比較により検出感度は85.7%(6/7)、特異性は98.6%(68/69)であった。検出感度と特異性ではRT-LAMP法はnested RT-PCR法より劣ったが、操作の簡便性、診断の迅速性、遺伝子増幅産物による検査環境の汚染リスクがないことを考慮すると、実用上はnested RT-PCR法に比べてはるかに優れていると考える。本研究ではマウスに対する4種の日和見感染起因微生物(黄色ブドウ球菌、肺パスツレラ、MNV、MHV)を同時に検出する方法をLAMP法で確立することを目的としている。これまでに黄色ブドウ球菌を検出するLAMP法とMHVを検出するRT-LAMP法を確立してマウス糞便からの検出に応用できること、従来法(培養法またはRT-PCR法)の代用法として利用できることを明らかにして国内の学術集会、国際専門誌で発表した。また、MNVを検出するRT-LAMP法はGenBankに登録されたゲノムを網羅的に検出できるプライマーを設計し、国内分離株による検出感度評価と従来法(RT-PCR法)との検出精度比較、マウス糞便からのウイルス検出へ応用できることを確認して第154回日本獣医学会学術集会で発表している。本課題研究期間の2/3を終了した時点で3種の微生物についてLAMP法の構築を完了していることから、研究進捗はおおむね順調に進展していると判断する。当初はMHVとMNVについて、ゲノム抽出工程を省略できる免疫捕捉法構築のためのモノクローナル抗体作出を計画していた。しかし、細菌(DNA)とウイルス(RNA)を同時に検出するための工程において、免疫捕捉法はサンプル量(マウス糞便量)を多く必要とし、糞便中の核酸合成酵素阻害物を十分に除去できない、全体的には核酸抽出法よりも工数が増えることが明らかになった。そこで、モノクローナル抗体作出と免疫捕捉法の構築は研究計画より除外した。本研究申請時には、4種の日和見感染起因微生物の迅速診断法としての等温核酸増幅法開発を課題とした。そのうちの一つである黄色ブドウ球菌の検出法は、薬剤耐性・消毒薬耐性黄色ブドウ球菌を判別する目的で独自に設計したプライマー(2011年2月にJ. Microiol. Methods誌上で発表)がマウス糞便からの黄色ブドウ球菌検出においても有用であることを明らかにした。そのため、研究目標の4分の1は達成している。
ミジンコに対する化学物質の複合影響メカニズムの解明：遺伝子発現解析の活用

昨年度に引き続き、ミジンコの繁殖影響に対し相乗作用が誘導される化学物質の組み合わせ条件の探索を行った。昨年度も検討したPAHsは、魚類等においてはAhR受容体経由で毒性が発現し、CYP1A1によって代謝されるため、CYP1A1の阻害剤であるα-ナフトフラボン(ANF)との組み合わせで相乗作用が生じると考えられている(Billiard et al., 2006; Hodson et al., 2007; )。そこでPAHsのフェナントレンおよびピレンに対し、ANFを組み合わせて等効果線図を作成したところ、相加または相殺傾向が示された。同様に、ゼブラフィッシュの胚仔魚期短期毒性試験において相乗作用を示したβ-ナフトフラボン(BNF、CYP1A1誘導)とANFの組み合わせについても、2物質のTU=各濃度/EC50(50%影響濃度)の和が1になるように、TU換算で、3/4:1/4、1/2:1/2、1/4:3/4と異なる濃度比で2物質を混合して曝露したところ、相加作用に基づく予測値とほぼ一致し、相乗作用は示されなかった。次に医薬品について、CYPによる代謝とその阻害の組み合わせから、解熱鎮痛剤のイブプロフェン(CYP2C9で代謝)と抗菌剤のスルファメトキサゾール(CYP2C9を阻害)を混合ばく露し、等効果線図を作成したところ相乗作用は示されなかった(相殺傾向)。同様に抗炎症薬のデキサメタゾン(CYP3A4で代謝)とケトコナゾール(CYP3A4を阻害)の組み合わせで相乗作用を期待したが、予備検討では相加傾向を示した。ミジンコが持つCYPの種類は脊椎動物等とは異なり、その機能の類似性は完全に解明されていないことから、期待される効果が得られなかったと考えられる。既存文献に基づき、作用機序から相乗作用が懸念される2種の化学物質を様々に組み合わせてミジンコ繁殖試験を実施したが、明確な相乗作用が示されなかったため。また、年度開始以降に発生した業務により、当初予定していたエフォートを割くことができなかったため。これまでミジンコ繁殖試験において相乗作用を確認している1銅とカドミウム、2ピレスロイド系農薬のシハロトリンとPBOの組み合わせを対象に、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析と、機能未知の遺伝子を含めた発現遺伝子によるパスウェイ構築などのバイオインフォマティクス手法の検討を進める。次世代シーケンサーは外注とする。ミジンコの繁殖影響に対し相乗作用が誘導される化学物質の組み合わせ条件を抽出し、そのときの遺伝子発現情報を得るため、まず既存文献のレビューによりミジンコに対し相乗作用が報告されている化学物質の組み合わせを探索した。金属類同士の組み合わせについて、カドミウムに対し銅と亜鉛をそれぞれ混合してニセネコゼミジンコ繁殖試験を実施し、等効果線図を作成したところ、カドミウムと亜鉛は相殺作用を示したが、カドミウムと銅は相乗作用を示した。しかし、金属類の場合、生物リガンドとの結合の競合による見かけ上の相乗作用であり、生物取込量でみると複合影響が説明できる可能性がある。次に、多環芳香族炭化水素(PAHs)のフェナントレンと、金属類(銅、カドミウム、ニッケル)の組み合わせによる相乗作用が報告されていることから、同じPAHsのピレンと銅の組み合わせによるミジンコ繁殖試験を実施した。等効果線図を作成するための予備試験として、2物質のTU=各濃度/EC50(50%影響濃度)の和が1になるように、TU換算で、3/4:1/4、1/2:1/2、1/4:3/4と異なる濃度比で2物質を混合し、各単独物質と同時に試験した。2物質が相乗作用を示す場合は阻害率50%以上を示すことが期待されたが、阻害率は50%前後であり、同時に実施した単独試験で得られたEC50を用いて補正した結果、やや相殺よりの結果であることが分かった。次の候補としてPAHsの代謝にCYP酵素が関与していることから、CYPを阻害するとされる、ピペニルブトキシド(PBO)を組み合わせて同様に予備試験を行ったが、明確な相乗作用は示されなかった。単独試験時と比べて、各物質のEC50が大きく異なり、組み合わせの条件の想定から外れてしまったことも原因の1つとして考えられ、毒性値の再現性の確保が今後の課題である。既存文献に基づき、作用機序から相乗作用が懸念される2種の化学物質を組み合わせてミジンコ繁殖試験を実施したが、候補としていた多環芳香族炭化水素と金属類の組み合わせによって明確な相乗作用が示されなかったため。

同様に、ゼブラフィッシュの胚仔魚期短期毒性試験において相乗作用を示したβ-ナフトフラボン(BNF、CYP1A1誘導)とANFの組み合わせについても、2物質のTU=各濃度/EC50(50%影響濃度)の和が1になるように、TU換算で、3/4:1/4、1/2:1/2、1/4:3/4と異なる濃度比で2物質を混合して曝露したところ、相加作用に基づく予測値とほぼ一致し、相乗作用は示されなかった。次に医薬品について、CYPによる代謝とその阻害の組み合わせから、解熱鎮痛剤のイブプロフェン(CYP2C9で代謝)と抗菌剤のスルファメトキサゾール(CYP2C9を阻害)を混合ばく露し、等効果線図を作成したところ相乗作用は示されなかった(相殺傾向)。同様に抗炎症薬のデキサメタゾン(CYP3A4で代謝)とケトコナゾール(CYP3A4を阻害)の組み合わせで相乗作用を期待したが、予備検討では相加傾向を示した。ミジンコが持つCYPの種類は脊椎動物等とは異なり、その機能の類似性は完全に解明されていないことから、期待される効果が得られなかったと考えられる。既存文献に基づき、作用機序から相乗作用が懸念される2種の化学物質を様々に組み合わせてミジンコ繁殖試験を実施したが、明確な相乗作用が示されなかったため。また、年度開始以降に発生した業務により、当初予定していたエフォートを割くことができなかったため。毒性作用機序から相乗作用を示すと考えられる組み合わせの探索を継続するが、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析と、機能未知の遺伝子を含めた発現遺伝子によるパスウェイ構築などのバイオインフォマティクス手法の検討を進める。試験化学物質群として、これまでの実験により、ミジンコ繁殖影響に対し相乗作用を示した組み合わせ(銅とカドミウム、ピレスロイド系農薬と共力剤のPBO)を用いる。次世代シーケンサーを用いた実験については、Beckman Coulterの自動分注装置等も活用しながら迅速に進める。バイオインフォマティクス解析については、専門家であるLiverpool大のPhillipp Antczak博士と相談しながら適切な解析を行う。これまでミジンコ繁殖試験において相乗作用を確認している1銅とカドミウム、2ピレスロイド系農薬のシハロトリンとPBOの組み合わせを対象に、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析と、機能未知の遺伝子を含めた発現遺伝子によるパスウェイ構築などのバイオインフォマティクス手法の検討を進める。次世代シーケンサーは外注とする。次世代シーケンサー用のキットが高額であるが、その実験の実施を次年度に繰り越したため。また、予定していたマイクロアレイデータ解析用ソフトウェアGeneSpring GX(65万円)の購入を取りやめ、無料の解析ソフトウェアや他の研究室が所有している解析ソフトウェアを活用することにしたため。高額な次世代シーケンサー用の消耗品の購入を想定していたが、次世代シーケンサーの実施まで研究が進捗しなかったため。来年度は次世代シーケンサーの外注費や研究協力者への謝金支払いに充てる予定である。
脳機能変化の解明:脳解剖・機能画像による評価法確立と臨床応用

簡単なタスク施行時の脳活動を刺激として、神経血管連動(neurovascular coupiing)異常を定量化することにより、慢性期脳血管障害における血行動態異常重症度の評価が可能であることを示した。また、neurovascular couplingが一定であることを前提として行われる通常解析法では、虚血患者において正確な脳賦活域の評価が出来ないこと、このような場合でもhemodynamic response function(HRF)を想定しない解析法では、賦活域の同定が出来ること、但し虚血患者では酸素代謝率は保たれていても、血流増加分が少なくこれが酸素摂取率増大で補われているため、信号変化率はもはや神経活動の大きさを反映しないこと、neurovascular coupling異常の背景には安静時および賦活に伴う血流増加分の低減があり、(平均通過時間の延長と酸素摂取率増加を伴って)HRFの変形・遅延が起こることを示した。これは、(1)臨床患者のfMRIにおける正確な脳機能評価には、blood-oxygen-level-dependent(BOLD)反応の生理学的背景とこれの病的変化を理解した適切な実験、解析、解釈が必須であることを示すものである。同時に、(2)通常、臨床にて放射線被曝や造影剤、拡張剤等の外因性物質を用いて行われている慢性期脳血管障害における血行動態異常重症度、循環・代謝代償性反応(autoregulationないし循環予備能低下、酸素摂取率の増加)の評価を、脳神経活動を内因性血管拡張刺激として、BOLD反応の異常を評価することにより、完全に非侵襲的に行うことができるということを示すものである。
前立腺癌に対する遺伝子治療製剤としての、EBV/polyplexの開発

前立腺癌に対して有効な非ウイルス性遺伝子治療法を開発するために、Epstein-Barr Virus (EBV)に基づくEBNA1とoriPを含むプラスミドベクーに対し、カチオニクポリマーやカチオニックリピッドを結合させた複合体を作製した。SCIDマウスに移植したPC-3より得られた腫瘍内に、EBV-プラスミドとpoly-amidoamine dendrimerの複合体を注射すると、腫瘍内にマーカー遺伝子の発現がみられ、その発現レベルは通常のプラスミドベクターとdendrimerの複合体を注入したものよりも8倍高かった。ほとんどの前立腺癌細胞はその表面にアポトシースシグナル分子であるFas(Apo-1/CD95)を発現しているため、遺伝子治療としてFas ligand (FasL)を前立腺癌細胞に導入した。FasL遺伝子を含むEBV-プラスミドであるpGEG.FasLを用いて、in vitroで遺伝子導入を行うと、前立腺癌細胞に対して有意な細胞障害活性がみられ、アポトシースを引き起こしていた。前立腺癌の異種移植による腫瘍中にpGEG.FasLを注入すると有意な腫瘍増殖の抑制がえられ、TUNEL染色と電子顕微鏡によって腫瘍細胞にはアポトーシスがみられた。ラット前立腺癌移植腫瘍に対して、pGEG.FasL投与にシスプラチンの全身投与を併用すると、腫瘍の成長はより著明に抑制され、ラットの生存の延長がみられた。EBVプラスミドとcationic macromoleculeの複合体を用いたFasL遺伝子導入は、遺伝子治療として前立腺癌に対する実際的な治療戦略になる可能性が示唆された。PC-3とLNCaPにEBV-プラスミドベクターと種々のcationic polymer、lipidを用いて遺伝子導入し、発現効率や発現期間を詳細に検討した結果、至適導入条件を決定した。特にLNCaPに関しては、従来の報告に比し,著しく高い導入効率を得ることに成功した。またマーカー遺伝子組み込みEBV-プラスミドベクターを用いて、in vivoの導入条件の検討も行い、微量注入ポンプを用いた効率的な新しい遺伝子導入法を確立した。in vitvoおよびin vivoにおいてFas-リガンド遺伝子をEBV-プラスミドベクターを用いて遺伝子導入した結果、有意な抗腫瘍効果および増殖抑制効果を得た。また,その効果がFasを介したアポトーシスによるものであることを、TUNEL法や電子顕微鏡などを用いて確認した。今後ベクターの基本構築を、米国において毒性および安全性に関する評価が終了し、すでに臨床への使用が認可されているInvivoGen社の"pGT"タイプへ変更する。さらに細胞毒性に関する1,200の遺伝子発現の変化を確認できるマクロアレイである"Toxicology Array 1.2(CLONTEC社)"などを使用して、われわれの開発したEBV-プラスミドベクターに関する、最終的な安全性の評価を行う。同時にFas-リガンド遺伝子治療の安全性をより高めるため、前立腺特異的に遺伝子が発現するように、従来のCAGプロモーターに代わりPSAプロモーターを用いた新規EBV-プラスミドベクターを開発し、その有用性について多面的な評価を行う。Cisplatin、etoposideなどの抗癌剤の併用療法により、EBV/polyplexによる遺伝子治療の効果増強が可能か検討する、などを行なう予定である。前立腺癌に対して有効な非ウイルス性遺伝子治療法を開発するために、Epstein-Barr Virus (EBV)に基づきEBNA1とoriPを含有するプラスミドベクーに対し、カチオニクポリマーやカチオニックリピッドを結合させた複合体を作製した。SCIDマウスに移植したPC-3より得られた腫瘍内に、EBV-プラスミドとpoly-amidoamine dendrimerの複合体を注射すると、腫瘍細胞にマーカー遺伝子の発現がみられ、その発現レベルは通常のプラスミドベクターとdendrimerの複合体を注入したものよりも8倍高かった。ほとんどの前立腺癌細胞はその表面にアポトシースシグナル分子であるFas(Apo-1/CD95)を発現しているため、遺伝子治療としてFas ligand (FasL)の前立腺癌細胞への導入を行った。FasL

遺伝子を含むEBV-プラスミドであるpGEG. FasLを用いて、in vitroで遺伝子導入を行うと、前立腺癌細胞に対して有意な細胞障害活性がみられ、アポトシースが引き起こされていた。前立腺癌の異種移植による腫瘍中にpGEG. FasLを注入すると有意な腫瘍増殖の抑制がえられ、TUNEL染色と電子顕微鏡によって腫瘍細胞にはアポトーシスがみられた。EBVプラスミドとcationic macromoleculeの複合体を用いたFasL遺伝子導入は、遺伝子治療として前立腺癌に対する臨床応用の可能性が示唆された。
コレステロール胆石症の成因におけるコレステロール結晶形成促進蛋白の意義

コレステロール(以下、cho)胆石症の成因をめぐっては、胆汁におけるcho結晶形成の異常が成因の核心であるが、その原因は不明であった。最近、胆石患者の胆汁中にcho結晶形成を促進する複数の糖蛋白(cho結晶形成促進蛋白)が報告され、胆石形成の要因として国内外より注目されている。我々は、新たなcho結晶形成促進蛋白を精製し、α_1-acid glycoproteinと同定し得た。しかし、これらの促進蛋白を同時に比較した検討はなく、胆石生成における臨床的意義も定かではない。そこで本研究では、1)α_1-acid glycoproteinを含む複数の胆汁蛋白のcho結晶形成促進活性をin vitroで比較するとともに、2)各種の胆石、非胆石患者における胆嚢胆汁のα_1-acid glycoproteinを定量し、催石性の指標であるcho結晶析出時間と比較することにより、これらcho結晶形成促進蛋白の胆石生成における意義を探求した。その結果、これまでに報告されたcho結晶形成促進蛋白のうち、α_1-acid glycoproteinと免疫グロブリンは生理的濃度においてcho結晶形成促進活性を示すことが明らかになった。また、胆汁中α_1-acid glycoprotein濃度は、単発cho石や色素石例では上昇がみられない一方、多発cho石例において特異的に上昇しており、cho結晶析出時間と負の相関が認められた。以上より、胆汁中α_1-acid glycoproteinは、特に多発cho石発生の病態に深く関与している胆石形成の体質的因子であることが明らかになった。最近、コレステロール(以下、cho)結晶の形成を促進する複数の糖蛋白(以下、促進蛋白)の存在が胆汁中に報告され、cho胆石の形成要因として国際的にも注目されている。本研究では、これら複数の促進蛋白の胆石形成における臨床的意義を明らかにすることを目的とした。研究初年度にあたる本年度は、抗体親和性カラムを用いて、ヒト胆嚢胆汁より、α_1-acid glycoprotein、免疫グロブリン(IgM,IgA,IgG)、phospholipase C、aminopeptidase Nの6つの促進蛋白を同時に単離精製することに成功した。単離した各糖蛋白の胆嚢胆汁における生理的濃度をcho過飽和人工胆汁に添加し、それらの促進活性を比較した。また、ヒト胆嚢胆汁から分離した強い促進活性を示すCon A結合分画を上記の各抗体親和性カラムにかけ、上記各糖蛋白を吸収除去した試料(吸収試料)を調整、これら吸収試料と未吸収のCon A結合分画の促進活性を比較することにより、各糖蛋白のcho結晶形成促進糖蛋白としての相対的重要性を検討した。その結果、1)免疫グロブリンおよびα_1-acid glycoproteinは、生理的濃度においてcho結晶形成を促進し、促進活性はIgM>α_1-acid glycoprotein=IgA>IgGの順に強いこと、2)一方、phospholipase Cおよびaminopeptidase Nは、生理的濃度において促進活性を示さないこと、3)胆汁Con A結合分画の促進活性は、phospholipase C、aminopeptidase Nおよび免疫グロブリンによっては規定されず、α_1-acid glycoproteinにより規定されていること、が新たに判明した。このように、これまで複数の研究グループにより別個に同定された種々のcho結晶形成促進蛋白を、同時に精製し、それらを比較した成績はこれまでになく、本研究により得られた新たな知見である。また、胆汁中α_1-acid glycoproteinに対するEnzyme-linked immunosolbent assay(ELISA)法を開発中である。最近、コレステロール(以下、cho)結晶の形成を促進する複数の糖蛋白(以下、促進蛋白)の存在が胆汁中に報告され、cho胆石形成の要因として国際的にも注目されている。本研究では、これらの促進蛋白の胆石形成における臨床的意義を明らかにすることを目的とした。

すでに昨年度、これまでに報告された複数の胆汁蛋白のcho結晶形成促進活性をin vitroで比較した結果、生理的濃度ではα_1-acid glycoproteinと免疫グロブリンのみが、cho結晶形成促進活性を示すことを明らかにした。そこで、最終年度の本年度は、特異抗体を用いてα_1-acid glycoproteinに対するEnzyme-linked immunosolbent assay(ELISA)法の開発に取り組み、これに成功した。本法を用いて、各種の胆石患者および胆石非合併患者の胆嚢胆汁中のα_1-acid glycoproteinの定量を行なった。さらに、各胆汁試料を37°Cにてインキュベッションし、偏光顕微鏡にて経時的にcho結晶の形成を観察することにより、cho結晶析出時間を求め、胆汁中α_1-acid glycoprotein濃度と対比した。その結果、胆汁中α_1-acid glycoprotein濃度は、単発cho石例や色素石例では上昇がみられない一方、多発cho石例において特異的に上昇していることが明らかとなった。また、胆汁中のα_1-acid glycoprotein濃度とcho結晶析出時間には、負の相関が認められた。以上より、胆汁中α_1-acid glycoproteinは、特に多発cho石発生の病態に深く関与している胆石形成の体質的因子であることが明らかになった。