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解糖系酵素異常における赤芽球アポトーシス亢進のメカニズムに関する研究

ピルビン酸キナーゼ(PK)異常症は赤血球(R)型PKアイソザイムの質的、量的異常のため赤血球寿命に短縮が生じる遺伝性溶血性貧血の一病型である。今まで本症の病因は脱核後の赤血球における代謝異常の結果、病的赤血球が網内系に捕捉されることによると考えられていた。今年度、頻回の輸血が必要な重症PK異常症症例について、脾臓における髄外造血および赤血球系前駆細胞の検討を行った結果、重症PK異常症において脾臓内CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMMが著明に増加していること、R型PKに変異を有する赤芽球系細胞にアポトーシスが惹起していることが明らかになった。これらの結果より、赤芽球の分化・成熟過程で発現が亢進するR型PKに変異が生じることで髄外造血が亢進するものの、赤芽球がアポトーシスに与り死滅することが明らかになった。このことからPK異常症における貧血の病態の一部が無効造血によることが示唆された。これらの候補遺伝子の発現レベルを修飾することがPK異常症を初めとする解糖系酵素異常症の根治療法となる可能性があると考えられた。CBA系マウス純系コロニー内に自然発生した溶血性貧血マウス(pk-1^<slc>)はヒトピルビン酸キナーゼ(PK)異常症のモデルマウスである。このマウスから樹立したフレンド細胞株SLC3は赤血球(R)型PK遺伝子の点突然変異を有し、継代中にアポトーシスを惹起することから、R-PKが赤芽球におけるアポトーシス抑制に関与していることが示唆されている。今年度はCBA系野生型マウスより樹立したフレンド細胞CBA2を用いて、RNA interference(RNAi)法によるR-PK遺伝子発現抑制がアポトーシスを誘発するかどうか検討を加えた。pSilencer1.0-U6ベクターにマウスR型PKmRNAのNo.390408までの19塩基対を標的とした二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、リポソーム法を用いてCBA2細胞への遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後48時間後からG418を400μg/mlを加えた培地に変更して、耐性を獲得した細胞を得た。RNAiによるマウスR-PK遺伝子発現の低下は、R型PKに特異的な抗PK抗体によるウェスタンブロット解析で確認した。R-PK発現が低下したフレンド細胞株には、1)細胞形態、2)DNAラダーの出現、3)SubG_0/G_1期細胞の増加などのパラメーターにより、アポトーシスの誘発が確認された。対照としてpIRES2EGFPを導入したCBA2細胞には上記の変化が観察されなかったため、これらのアポトーシス形質の獲得は、遺伝子導入操作による非特異的な現象ではなく、RNAiによるR-PK遺伝子発現の低下によるものと結論した。ピルビン酸キナーゼ(PK)異常症モデルマウス(Pk-1^<slc>)脾臓において、赤芽球の著明なアポトーシスが観察される。脾臓内での赤芽球アポトーシス亢進はヒトPK異常症症例にも認められたことより、PK異常症における貧血発症には網内系でアポトーシス赤芽球がマクロファージにより排除されることが関与していると考えられる。赤芽球アポトーシスの程度はPK異常症モデルマウス造血幹細胞への赤血球型PK(R-PK)遺伝子導入により減少し、溶血性貧血も改善する。これらの実験結果から、正常PK遺伝子導入によってアポトーシス誘発遺伝子の発現低下、あるいは抗アポトーシス遺伝子の発現上昇が起こったと考えた。今年度はPk-1^<slc>から樹立したフレンド細胞株SLC3に野生型R-PKcDNAを導入し、R-PKの過剰発現がアポトーシスをどう修飾するのか検討した。ヒトR-PKcDNAを発現ベクターpcDNA3.1により遺伝子導入を行った。G418による選択の結果、stable transfectantを得た。R-PK発現レベルは、RT-PCRおよびWestern法およびPK活性測定により実施した。細胞形態、DNAラダー、フローサイトメトリーを用いたSubG0/G1期細胞の各パラメーターでアポトーシスの判定をした。

細胞内R-PK活性が親株よりそれぞれ20、50%高い2つのサブライン、huRPK.loおよびhuRPK.hiを得た。トランスジーン発現量依存的にアポトーシス形質の低下が認められた。このことからR-PK遺伝子導入により、アポトーシス誘導分子の低下あるいは抑制分子の増加が起こったと考え、親株であるSLC3とhuRPK.loおよびhuRPK.hiとの間で発現遺伝子プロファイルを検討した。22690遺伝子について検討した結果、約7%の遺伝子について発現低下が認められた。一方、発現が有意に増加した遺伝子は全体の0.2%に過ぎなかった。発現が低下した遺伝子の中には、Bnip3/Nix、Blk/Bikなどのアポトーシス誘導分子が含まれており、それらの遺伝子産物がR-PK活性低下による赤芽球アポトーシスに関与している可能性が示唆された。
新しい癌診断・癌治療のターゲットとしてのテロメラーゼに関する基礎的研究

手術摘出後凍結保存された乳癌130腫瘍、胃癌70腫瘍、大腸癌94腫瘍、膵癌を用いて検討した。腫瘍からDNAを抽出し、既存の電気泳動装置を用いてサザン法にてテロメア長(Terminal restriction fragments)を測定したが、短縮例は27%に過長例は8%に検出された。また蛋白とRNAを含む抽出液を用いてTelomeric Repeat Amplification Protocol assay(TRAP assay)にてテロメラーゼ活性を測定した。非癌部組織では、胃及び腸管粘膜に活性を認め、粘膜凍結標本の管腔側からの連続切片で検討した結果、陰窩の底細胞(おそらくintestinal stem cells)のある部にテロメラーゼ活性を検出した。よって、非癌部に比べ癌部が活性が高い症例は、乳癌で95%,胃癌の85%,大腸癌の73%,膵癌の96%に検出された。さらに、nonisotopeで検出する系を用いると、PCR回数を31回から35回に増やし購入したUVサンプル解析装置を用いることでテロメラーゼ活性の検出感度は同程度で臨床応用可能と考えられた。凍結切片を作成し、in situ PCR法にて直接腫瘍内のテロメラーゼ発現の有無の検討を腹膜播種細胞、膵癌ブラッシング細胞で試みたが、テロメラーゼ活性を有する細胞と検出されない細胞が混在し、heterogenietyが存在し、細胞回転との関連が推察された。乳腺腫瘍の吸引細胞82検体、胃及び大腸の内視鏡で得られた38組織をnonisotopeのTRAP assayにて検討したが、細胞診組織診での悪性であった組織の83%が陽性で癌細胞の存在診断に有用と考えられた。上記検討した結果から、テロメラーゼ活性は癌細胞の存在診断に有用と考えられた。また、正常粘膜組織のテロメラーゼ活性の存在と癌組織の活性度を比較すると、全ての癌細胞で活性化されているわけでなく進行と伴に活性化した癌細胞が選択増殖してくると考えられ、進行癌がテロメラーゼをターゲットとした治療の良い適応であり、その際には正常粘膜、血液幹細胞などへの影響を念頭におくべきである。また、淡白とRNAを含む抽出液を用いてTelomeric Repeat Amplification Protocol assay (TRAP assay)にてテロメラーゼ活性を測定した。さらに、nonisotopeで検出する系を用いるとPCR回数を31回から35回に増やし購入したUVサンプル解析装置を用いることでテロメラーゼ活性の検出感度は同程度で臨床応用可能と考えられた。

凍結切片を作成し、in situ PCR法にて直接腫瘍内のテロメラーゼ発現の有無の検討を腹膜播種細胞、膵癌ブラッシング細胞で試みたが、テロメラーゼ活性を有する細胞と検出されない細胞が混在し、heterogenietyが存在し、細胞回転との関連が推察された。乳腺腫瘍の吸引細胞82検体、胃及び大腸の内視鏡で得られた38組織をnonisotopeのTRAP assayにて検討したが、細胞診組織診での悪性であった組織の83%が陽性で癌細胞の存在診断に有用と考えられた。上記検討した結果から、テロメラーゼ活性は癌細胞の存在診断に有用と考えられた。また、正常粘膜組織のテロメラーゼ活性の存在と癌組織の活性度を比較すると、全ての癌細胞で活性化されているわけではなく進行と伴に活性化した癌細胞が選択増殖してくると考えられ、進行癌がテロメラーゼをターゲットとした治療の良い適応であり、その際には正常粘膜、血液幹細胞などへの影響を念頭におくべきである。
超高精度熱量測定による配向分子集合体の混和性の研究

サーマルアクティビィティモニターにより、非イオン性界面活性剤であるテトラおよびトリエチレングリコールモノオクチルエーテルと水との混合熱を、活性剤の重量モル濃度と温度の関数として精密に測定した。超高感度である測定装置の感度及び測定精度を十分に満足する結果が得られた。界面活性剤混合系の熱量測定は現在進行中であるが、以下にこれまで得られた測定結果と熱力学的解析からの情報の内の幾つかを述べる。1.混合熱が活性剤濃度と温度の関数として精密に測定された。得られた値は負であり、活性濃度の増加及び温度の低下にともないその絶対値は大きくなった。臨界ミセル濃度(CMC)近傍を境に混合熱の濃度依存症に大きな変化が観測された。2.モノマーおよびミセルの微分溶解熱が精度良く計算された。活性剤の純液体状態からの溶解は発熱的であり水中でのミセル形成は吸熱的であった。また分子間相互作用を反映して温度依存性が顕著あった。3.測定が高精度でなされたことにより、これまで計算されていなかった活性剤の溶解に伴う水の部分モルエンタルピーを計算することができた。これにより水の立場からみるとミセル形成は発熱的であることやミセル中での親水雰囲気での水和に関する情報が得られた。以上の結果の他に、これまでなされていない水/油界面形成熱および吸着熱の直接測定が進行中である。購入したサーマルアクティビィティモニターは、超高感度のために僅かな実験条件の違い等に大きく影響され、ノイズの除去やブランクテストの必要性など高レベルの実験技術が要求された。このモニターの超高精度機能を十分に引き出すために、測定用滴定セルの装着、取り外し、回転攪拌などの操作技術の熟知と会得、回転攪拌プロペラの装着、シリンジポンプの取付けと注入容量調節方法の検討、測定時及び測定解析時に利用されるプログラムの内容、静的及び動的キャリブレーションおよびフィルター解析ソフトの妥当性の検討等を行なった。次に熱測定の実験系として良く研究されている水/エタノール系の混合熱を25°Cにおいてエタノールの組成の関数として測定した。これにより混合熱測定に関しては十分な精度があることを確認された。更に、表面張力の温度依存性の実験と熱力学的解析によりミセル形成熟が計算されている水-非イオン性界面活性剤系あるいは水-臭化ドデシルトリメチルアンモニウム系の混合熱を測定した。後者の系について25°Cにおける配向分子集合体の一つであるミセル形成のエンタルピーは負であることが示された。サーマルアクティビィティモニターにより、非イオン性界面活性剤であるテトラエチレングリコールモノオクチルエーテルと水との混合熱を、活性剤の重量モル濃度と温度の関数として精密に測定した。測定装置が超高感度であるために最適実験条件の設定に多くの時間を要したが、測定装置の感度及び測定精度を十分に満足する結果が得られるようになった。以下にその測定結果と熱力学的解析により得られた情報の内の幾つかを述べる。1.混合熱は負であり、活性剤濃度の増加及び温度の低下にともないその絶対値は大きくなった。この系の臨界ミセル濃度(CMC)と思われる濃度近傍を境に混合熱の濃度依存性に大きな変化が観測された。2.混合熱の濃度による変化が最大である濃度をCMCと定めた。CMCは温度の上昇により低下した。3.測定結果の熱力学的解析により、液体状態にある純界面活性剤がモノマーとして溶解するとき及びミセルとして溶解するときのエンタルピー変化が計算された。25°Cにおいて活性剤1モルあたり前者の値は約-38kJ、後者は約-20kJであった。この結果は活性剤と水とは強く相互作用することおよび相互作用は活性剤の溶存状態に大きく依存していること示している。4.ミセルが形成のエンタルピーは約18kJであることが示された。

今回得られたミセル形成のエンタルピーおよびその温度依存性は、表面張力測定により得られた結果と近いことが示された。サーマルアクティビィティモニターにより、非イオン性界面活性剤であるテトラおよびトリエチレングリコールモノオクチルエーテルと水との混合熱を、活性剤の重量モル濃度と温度の関数として精密に測定した。超高感度である測定装置の感度及び測定精度を十分に満足する結果が得られた。界面活性剤混合系の熱量測定は現在進行中であるが、以下にこれまで得られた測定結果と熱力学的解析からの情報の内の幾つかを述べる。1.混合熱が活性剤濃度と温度の関数として精密に測定された。得られた値は負であり、活性剤濃度の増加及び温度の低下にともないその絶対値は大きくなった。臨界ミセル濃度(CMC)近傍を境に混合熱の濃度依存性に大きな変化が観測された。2.モノマーおよびミセルの微分溶解熱が精度良く計算された。活性剤の純液体状態からの溶解は発熱的であり水中でのミセル形成は吸熱的であった。また分子間相互作用を反映して温度依存性が顕著であった。3.測定が高精度でなされたことにより、これまで計算されていなかった活性剤の溶解に伴う水の部分モルエンタルピーを計算することができた。これにより水の立場からみるとミセル形成は発熱的であることやミセル中での親水雰囲気での水和に関する情報が得られた。以上の結果の他に、これまでなされていない水/油界面形成熱および吸着熱の直接測定が進行中である。
線維芽細胞β受容体シグナリングの心臓老化における病態的意義の解明

超高齢化社会を迎え老化の抑制による健康寿命の延長は喫緊の課題である。加齢に伴う心肺系の機能低下は健康寿命短縮の三大原因の一つであり、中でも心機能低下は非高齢者の場合と異なるaging-related cardiomyopathyという特有の病態であると認識されつつある。我々はこれまでの研究で、β2アドレナリン受容体の遺伝子欠失マウスを用いて、その心病態における役割を検討し、心臓の線維芽細胞のβ2アドレナリン受容体がパラクライン作用を介して心肥大や心臓の線維化を制御している事を報告してきた。老化の促進要因として慢性的に炎症が持続する炎症老化(inflammaging)の概念が注目されている。特に老化細胞が炎症性サイトカインを分泌するSenescence-associated secreted phenotypeと呼ばれる現象が注目されている。これと関連して我々は、β2アドレナリン受容体欠失マウスより採取した心線維芽細胞を用いた予備実験より、心線維芽細胞がカテコラミン刺激により炎症性サイトカインを産生する事を見出した。今回の研究において、「心線維芽細胞における交感神経ー炎症連関が慢性炎症持続の基盤となり、aging-related cardiomyopathyを形成する」とする仮説を検証した。方法としてaging-related cardiomyopathyの表現型を、β2ARノックアウトマウス(KO)を用いて検討した。その結果、予想に反して、β2ARKOは、コントロールと比較して寿命の短縮を認めた。一方、心収縮能に有意差を認めなかったが、拡張能の指標は、有意に低下していた。心肥大、β2ARKOにおいて悪化する傾向もあったが、有意差を認めなかった。以上の結果は、当初の仮説と異なり、β2ARがARCに対して拡張能を介して保護的に作用している可能性を示している。今年度において、以下の解析が終了した事より、順調に推移していると考える。(1)生存曲線の解析:雄性のβ2アドレナリン受容体遺伝子欠失マウス(β2ARKO;24匹)とコントロールマウス(34匹)において、生存率を検討した。その結果、予想に反してβ2ARKOは、コントロールマウスと比較して25月齢までにおける生存率の低下を認めた。(2)心エコーによる心機能解析(収縮能・拡張能):25月齢における心エコー解析を施行した。心収縮性の指標であるfractional shorteningやejection fractionにおいては、両群に有意差を認めなかった。一方で、左室の拡張能の指標である僧帽弁血流のE/A ratioやdeceleration timeは、β2ARKOにおいて有意に低下していた。以上の結果より、β2ARKOは、収縮能の低下より拡張能の低下が有意な心機能の低下を呈する事が明らかとなった。(3)心肥大解析:加齢に伴う心肥大について、25月齢と8週齢のマウスにおいて検討した。その結果、心肥大の指標である心重量/体重比(HW/BW)及び心重量/脛骨長比に、25月齢と8週齢のそれぞれの群間で有意な差を認めなかった。また、心室肥大の指標である心室重量/体重比(VW/BW)は、4群間のマウスの間で差を認めなかった。心肥大の分子マーカーであるANF、α-SKA、BNPの遺伝子発現を評価したreal-time PCRの結果より、ノックアウトの老化マウスは野生型マウスと比較して、ANFの有意な上昇を認めた。しかしながら、α-SKA,BNPは老化マウスにおいて、両群間に有意な差を認めなかった。以上の結果、β2アドレナリン受容体は加齢に伴う心肥大に、直接的に関与しないと考えられる。本年度の研究において、β2アドレナリン受容体欠失に伴い寿命が短縮した。この結果はβ2アドレナリン受容体を活性化させる事により、寿命を延長する可能性がある事が示唆される。β2アドレナリン受容体アゴニストは、気管支喘息に対する治療として貼付剤が一般的に使用されている。また、骨にも存在することが報告されており、骨粗鬆症モデルにおけるパラトルモンの刺激による骨塩量の増加に必要である事が報告されている。本研究より、心臓においても拡張能の維持を介してaging-related cardiomyopathyを抑制する事が明らかとなった。この事は、β2アドレナリン受容体アゴニストが、抗老化薬へ応用できる可能性を示している。今後、さらに、老化β2アドレナリン受容体遺伝子欠失マウスにおいて、線維化の変化・Senescence-associated secreted phenotype (SASP)および他の重要臓器の機能変化について解析し、寿命とβ2アドレナリン受容体との関連について詳細に検討する。さらに、野生型老化マウスに、β2アドレナリン受容体アゴニストを投与することにより、寿命が延長するかどうかを明らかにする。寿命の延長が確認できれば、現在使用されているβ2アドレナリン受容体アゴニストの貼付剤が、健康寿命を延長させる治療への展開を目指す。平成29年度は、研究計画1)と2)に関して、以下の結果を得た。尚、配分経費を鑑み、研究計画3)の遂行は、平成30年度以降に繰り越した。研究計画1)線維芽細胞におけるβ2アドレナリン受容体(β2AR)の心臓老化における役割の解明。(結果1)β2ARノックアウトマウス(β2AR-/-)とコントロール(β2AR+/+)の心臓から心線維芽細胞(CF)を単離し、増殖、遊走を検討した。その結果、β2AR-/-由来のCFは増殖能/遊走能が抑制されていた。

(結果2)β2AR-/-とβ2AR+/+の生存率を16月齢まで検討した。β2AR-/-では26匹中4匹の死亡を認めたのに対しβ2AR+/+のマウスは、21匹中1匹の死亡を認めた。現在のところ、2群間に生存率に関して統計学的に有意な差を認めていない。また、予備的な検討として、先行的に観察しているβ2AR-/-は、26かヶ月以内に80%の死亡を認めた。(結果3)加齢マウスにおけるランゲンドルフ法を用いた詳細な心機能の解析系を構築した。(結果4)β2ARKOの圧負荷における心肥大反応を、大動脈縮窄術を用いて検討し、有意な差を認めなかった。研究計画2)加齢における線維芽細胞β受容体下流シグナリング活性化モデルの心病態解析について:(結果5)線維芽細胞特異的PKAcα過剰発現マウス(TG)の心機能を、12月齢まで解析し、心収縮能に関して有意な差を認めなかった。(結果6)TGにおける生理的な肥大を検討した。その結果、有意な差を認めなかった。(結果7)TGにおいて、マイクロアレイ解析を施行し、炎症と心肥大の双方に関与しているIL-18の遺伝子発現が上昇している事を明らかにした。(結果8)TGより単離したCFの機能について検討した。増殖能、遊走能については、TG由来のCFが有意に上昇していた。平成29年度は、多くの動物実験と細胞実験を行い、配分された経費内で可能な研究計画を概ね完了できたと考えている。その理由は以下のとおりである。第一の理由は、論文化に向けて、ノックアウトマウスとコントロールを用いた生存率の検討が進んでいる事である。また、加齢マウスにおけるランゲンドルフを用いた心機能の解析系が確立できた点が挙げられる。これにより、次年度の解析により、研究計画1)の主要な目的であるβ2受容体のAging-related cardiomyopathyにおける役割の同定が、十分可能となる。第二の理由は、ネガティブな結果であったが、2種類に遺伝子改変マウスにおいて、論文化に必要な圧負荷および生理的肥大の検討に関する実験が終了した事である。時間と労力を要するこれらの実験が終了している事より、概ね研究計画が順調に推移していると考える。第三の理由は、単離した心線維芽細胞を用いた実験が終了した事である。かかる実験においては、β2ARKOマウスと過剰発現マウスより単離した心線維芽細胞においていずれも、増殖と遊走に関してポジティブな結果が得られている。さらに、想定していた以上の結果として、PKAcαを過剰発現した心線維芽細胞が、肥大を誘導する因子を分泌している事を示唆する結果を得ている。第四の理由は、目的の一つである心線維芽細胞より分泌される心筋細胞肥大を誘導する分子の候補が同定された事である。以上の、4点を鑑み進捗状況を「おおむね順調に進展している」と考える。超高齢化社会を迎え老化の抑制による健康寿命の延長は喫緊の課題である。
高密度励起による高利得化及びと高非線形材料を用いた超短パルスレーザーの研究

幅広い分野で応用が期待されている超短パルスレーザーであるが,効率が低く,大型・複雑・高価という問題がある。そこで,小型化かつ単純化,低価格化が容易な半導体レーザーを励起光源とする超短パルスレーザーの高効率・高出力・広帯域化・短パルス化を行うための要素技術を構築した。まず,高密度励起を用いた高利得化により,半導体レーザーを励起光源に用いても,量子限界に近い効率を実現できることを明らかにした。さらに,高利得化および高非線形性を用いた超短パルスレーザーの理論を構築することにより,利得帯域を凌駕する発振スペクトルおよび超短パルス出力を,高効率かつ高出力に実現できることが明らかになった。1)レーザーの高効率化及び高出力化理論の構築まず,連続波レーザーの高出力化に伴う熱光学歪補償技術を確立するため,レーザー発振時の熱光学歪の測定技術を開発した。また,高出力化に伴うスロープ効率の低下を抑制するため,高密度励起による結合効率の向上,熱光学歪の最適補償によるモードマッチング効率の向上などの手法を開発した。発振閾値の低減に関しては,励起光のモード体積の低減,熱複屈折損失の補償,冷却効率の向上による準4準位レーザー損失の低減手法を開発した。次に,上記で確立した補償技術を高繰り返しパルスレーザーに導入し,高密度励起による高繰り返しレーザーの安定化,高効率化及び高出力化を行う理論を開発した。最後に,上記の理論を元にして,高利得化及び高非線形性を用いたレーザー内部の線形波動伝搬の理論を構築した。時間及び空間併せて4次元の波動伝搬を,レーザー内部の空間モード制限により時間+空間1次元(縦モード)と空間2次元(横モード)に分離し,高非線形性に伴う光学歪を補償し,高出力化,高効率化,広帯域化及び短パルス化する理論を構築した。2)小型化・単純化可能な高効率連続波レーザーの高出力化上記の理論を元に半導体レーザー励起連続波レーザーを開発し,実験結果を理論と設計に相互に反映させることにより,効率77%,出力1.27 Wの出力特性を実現した。これらの成果により,高出力化によるスロープ効率の低下,発振閾値の上昇の抑制するための基本的な理論の構築に成功した。前年度に構築した理論を用いて、連続波動作時の高効率化、短パルス化および広帯域化に関する理論解析を行った。高効率化の条件を調べ、前年度に達成した効率および出力に対して、さらなる高効率化および高出力化の実験を行うために必要な条件を導出した。高効率化に関しては、利得媒質の熱光学歪および励起光源の収差を積極的に活用することにより、前年度に達成した効率よりもさらに高い効率および出力を達成できることが明らかになった。また、超短パルス化に関しては、利得媒質および非線形媒質への集光強度を集光径および出力鏡反射率の調整により変化させ、これに対するパルス幅・形状およびスペクトル幅・形状の依存性を調べた。これまでの実験結果では、2次分散をマイナスにした通常のモード同期では、出力パルス幅はほぼ出力スペクトルのフーリエ限界パルス幅に一致していた。これに対して、自己位相変調のみを取り入れた理論では、非線形効果を強めるに従い、出力スペクトルは拡がり、それとともに出力パルス幅も狭くなる点は実験結果と同じであるが、出力パルス幅は出力スペクトルのフーリエ限界パスル幅より広くなる点が実験結果と異なることが明らかとなった。幅広い分野で応用が期待されている超短パルスレーザーであるが,高効率化・高出力化理論の未確立,発振・可変スペクトルの狭帯域化に起因する超短パルス化の限界のために,効率が低く,大型・複雑・高価な装置となっている。そこで,本研究では,超短パルスレーザーの高効率化,高出力化,広帯域化及び短パルス化を行うための要素技術を構築した。高効率化及び高出力化理論の構築に関しては,以下の取り組みを行った。まず,共振器及び熱光学歪の収差を活用したモード制御により,高出力化に伴う熱光学歪に起因するモードマッチング効率の低下を抑制する手法を開発した。加えて高利得化による結合効率の向上により,スロープ効率を高め,高効率化を行う手法を確立した。利得媒質の熱光学歪及び励起光源の収差を積極的に活用することにより,これまでに達成できた効率よりもさらに高い,量子限界に極めて近い効率を達成できることが明らかになった。広帯域化及び超短パルス化に関しては,高利得化及びレーザー共振器内部の高非線形性を用いたレーザー内部の線形波動伝搬の理論を構築した。時間及び空間併せて4次元の波動伝搬を,縦モード及び横モードに分離し,高非線形性に伴う光学歪を補償し,高出力化及び高効率化,広帯域化及び短パルス化する理論を構築した。上記の理論を元に,集光強度,高速化飽和吸収体の飽和強度及び可飽和損失を変化させて,これに対するパルス及びスペクトル出力の変化を調べた。非線形効果を強めるに従い,出力スペクトルが拡大し,出力パルスが狭くなる傾向は実験と定性的に一致した。一方,分散に関しては,非線形効果が強いとき,2次までの分散の制御では出力パルスが出力スペクトルのフーリエ限界よりも倍以上のオーダーで拡大するが,4次までを含む高次分散の最適化を行えば,約1.1倍にまで近づけることが可能となり,実験結果とも定量的に一致することが明らかとなった。

そこで,小型化かつ単純化,低価格化が容易な半導体レーザーを励起光源とする超短パルスレーザーの高効率・高出力・広帯域化・短パルス化を行うための要素技術を構築した。まず,高密度励起を用いた高利得化により,半導体レーザーを励起光源に用いても,量子限界に近い効率を実現できることを明らかにした。さらに,高利得化および高非線形性を用いた超短パルスレーザーの理論を構築することにより,利得帯域を凌駕する発振スペクトルおよび超短パルス出力を,高効率かつ高出力に実現できることが明らかになった。まず、高繰り返しパルス動作に関して、ポッケルスセルドライバーが故障したため、実験を行うことができなかった。また、超短パルス化に関して、出力パルスを出力スペクトルのフーリエ限界にまで狭める条件を導出することができなかった。光量子エレクトロニクス高繰り返しパルス動作実験に関しては、ポッケルスセルドライバーの修理が完了したため、今年度に実験を行う予定である。また、出力パルス幅が出力スペクトルのフーリエ限界パルス幅程度にまで狭くならない点に関しては、2分散、3次分散、4次分散に対するパルス幅・形状およびスペクトル幅・形状の依存性を調べ、理由を明らかにする予定である。まず,理論の構築に関しては,連続波から超短パルスレーザーを含む基本となる理論の構築に成功している。付随した成果として,レーザー発振時の光学歪の測定手法も開発することに成功している。また,実験に関しては,効率77%,出力1.27Wの特性を得ており,目標の効率をほぼ実現している。出力に関しては目標にはまだ達していないが,励起光源の改善により高出力化は容易であると考えられる。よって,おおむね順調に進展していると考えている。ポッケルスセルドライバーの故障などの理由により物品の購入及び納入が遅れたためである。今年度:前年度に加えて,新たに下記のテーマについて研究を行う。3)高繰り返し・高効率パルスレーザーの高出力化前年度の成果を元に高繰り返しパルスレーザーの開発を行い,実験と理論・設計へのフィードバックにより,高利得化による安定化,高効率化及び高出力化の要素技術を確立する。まず,高繰り返し化(100 kHz)に伴うパルス出力の不安定性を高利得化により解決する。次に,高出力化に伴う損失を補償し,高効率化,高出力化を実現する。次年度:これまでに加え,下記テーマの研究を行う。4)超短パルスレーザーの高効率化,高出力化,広帯域化及び短パルス化これまでの成果を元に超短パルスレーザーの開発を行い,実験と理論・設計へのフィードバックを重ね,高利得化と高非線形性による高効率化,高出力化,広帯域化及び超短パルス化の各要素技術を明らかにするとともに,小型化及び単純化が可能となる超短パルスレーザー開発手法を確立する。ポッケルスセルドライバーの修理はすでに完了しており,すぐに利用する予定である。必要としていた光学素子の納入が間に合わなかったためである。費用は少額であり、すぐに使う予定である。
エピジェネティックスを軸とした骨・軟骨再生医療開発への分子基盤の確立

近年、再生医療におけるエピジェネティックスの重要性が注目されているが、骨・軟骨細胞分化のエピジェネティックスは不明な点が多く残されている。本研究では、様々な遺伝子スクリーニングシステムを用いて骨・軟骨細胞分化のエピジェネティック制御因子の探索を行い、その生物学的役割の解明を行った。その結果、骨・軟骨細胞分化に重要なIhh-Gli2シグナルを制御する転写因子としてFoxc1およびFoxc2を同定し、骨格形成におけるその重要性を明らかにした。これらの研究結果は、骨・軟骨再生療法の開発に貢献することが期待される。平成25年度は骨芽細胞分化および軟骨細胞分化に関与するエピジェネティック因子探索のためのクローニングシステムの確立と遺伝子クローニングを行った。骨芽細胞および軟骨細胞への分化能を有する未分化間葉系細胞株C3H10T1/2細胞、ならびにC3H10T1/2細胞と同じ間葉系細胞であるが骨芽細胞および軟骨細胞へと分化しない線維芽細胞株NIH3T3細胞を用いて遺伝子発現プロファイリングを行った。その結果、C3H10T1/2細胞に高発現する転写因子、すなわち骨芽細胞および軟骨細胞分化に関与する遺伝子を複数見出した。また、軟骨細胞のみを改変型緑色蛍光たんぱく質Venusでラベルした軟骨細胞のレポーターマウスを作製し、FACSを用いた軟骨細胞の分離と遺伝子発現解析を行った。さらに、C3H10T1/2細胞にアデノウィルスシステムを用いて軟骨細胞分化に必須の転写因子Sox5,Sox6およびSox9を過剰発現させ、軟骨細胞分化に伴って発現誘導される遺伝子の網羅的解析を行った。これら3つの遺伝子クローニング法により、軟骨細胞分化に関与すると推測される候補遺伝子を複数クローニングした。これら候補遺伝子の中から、コントロールに比較して軟骨細胞において発現の倍率が高かった遺伝子群から順番に上位10個を選出した。さらに、軟骨組織における遺伝子発現の特異性を、リアルタイムPCR、免疫染色およびIn Situハイブリダイゼーション法により検討を行った結果、軟骨細胞に高発現する転写因子およびエピゲノム因子を同定することに成功した。平成27年度は、軟骨細胞を蛍光タンパクでラベリングしたマウスから軟骨細胞を分離し、FACSによるセルソーティングを利用した軟骨細胞特異的遺伝子の発現プロファイリングを行った結果クローニングされた転写因子Foxc1の役割を中心に解析を行った。その結果、Foxc1は軟骨組織に強く発現し、骨・軟骨組織形成に重要な副甲状腺ホルモン関連タンパク(PTHrP)の発現を直接制御していることを見出した。さらに、Foxc1はCol10a1、Gli1およびPtch1などの骨・軟骨におけるIhh標的遺伝子の発現も協調的にその発現を促進した。その分子メカニズムとしてインディアンヘッジホッグのシグナル伝達分子Gli2のDNA結合能を増加させることにより骨格形成過程におけるIhhシグナルを制御していることが明らかとなった。Foxc1遺伝子の自然発症変異マウス(chマウス)、重篤な骨格形成異常を示し、さらにchマウス由来の初代軟骨細胞ではIhhシグナルとその標的遺伝子の発現が減弱していた。また骨格や歯の形成異常を示すAxenfeld-Rieger症候群の原因となる病的FOXC1変異(F112S)の機能解析を行った結果、F112S変異はIhhシグナルとの協調作用が顕著に抑制されていることが見出された。Foxファミリーに属する転写因子の多くはクロマチン構造を緩めることが知られていることから、Foxc1はエピジェネティクにIhhシグナルを制御することにより骨・軟骨形成を制御している可能性が示唆される。平成27年度はエピジェネテクス制御機構の一つであるDNAメチル化に注目し、軟骨細胞分化におけるDNAメチル化変動遺伝子の検討を行った。ヒト軟骨細胞と皮膚線維芽細胞をLONZA社より購入しゲノムDNAを回収した。EZ DNA Methylation Kit (ZYMO RESEARCH社)を用いて、バイサルファイト変換し、DNA増幅、断片化を行った後、HumanMethylation450 BeadChipにハイブリダイゼーションさせ、45万以上のメチル化サイトのゲノムワイドな検索を行った。その結果、軟骨細胞においてDNAメチル化が亢進しているCpGサイトが31769か所、DNAメチル化が低下しているCpGサイトが47682か所存在していた。DNAメチル化の変化が遺伝子発現の変化とリンクするか否かを検討するために同じ皮膚線維芽細胞および軟骨細胞からRNAを採取し、マイクロアレイ解析を行い、DNAメチル化解析との統合解析を行った。その結果、軟骨細胞において遺伝子発現が増加し、DNAメチル化が低下している遺伝子上流1000bp以内のCpGサイトを7410個同定した。これらCpGサイト近傍の遺伝子にはSox9、Col2a1、アグリカンなど軟骨細胞のマーカー遺伝子も含まれており、軟骨細胞のエピジェネティクス制御に関与する遺伝子のクローニングが行われたと考えられる。平成27年度は軟骨細胞と皮膚線維芽細胞のDNAメチル化解析および遺伝子発現解析を行い、これらの結果を統合的に解析することにより、軟骨細胞分化のエピジェティック制御に関与する遺伝子の同定が可能となった。したがって、研究はおおむね順調に進展していると判断した。平成28年度はDNAメチル化アレイにより明らかとなった軟骨細胞に重要な遺伝子の機能解析を行った。DNAメチル化解析とマイクロアレイ解析の統合解析の結果、軟骨細胞で遺伝子発現が上昇し、なおかつDNAメチル化が減少している遺伝子としてFOXC1およびFOXC2がクローニングされた。

FOXC1は軟骨細胞で約16倍の発現増加が見られ、chr6:1604606-1615866(3'UTR;1stExon)に存在するCpGアイランドのメチル化が顕著に減少していた。一方、FOXC2は軟骨細胞で約14倍の発現増加が、そしてchr16:86599355-86602649(3'UTR;1stExon)存在するCpGアイランドのメチル化が顕著に減少していた。したがって、これらの遺伝子は軟骨細胞分化においてエピジェネティックに制御されていると考えられる。Foxc1に関しては平成26年度に検討を行っているため、平成28年度はFoxc2の役割について検討を行った。Foxc2は軟骨細胞に発現しているが、Foxc1と異なり腎臓に最も高い発現が認められた。初代培養軟骨細胞にFoxc2を過剰発現させるとPTHrP,Col10a1の発現増加が認められた。また、Gli2と協調してインディアンヘッジホッグ(Ihh)の標的遺伝子である、PTHrP,Ptch1およびGli1の発現を増加させたが、その相乗効果はFoxc1に比較して弱かった。以上の結果より、軟骨細胞分化過程においてDNAメチル化が減少することによりFoxc2の発現が上昇し、Ihhシグナルを増加させることに軟骨形成を制御していることが明らかとなった。近年、再生医療におけるエピジェネティックスの重要性が注目されているが、骨・軟骨細胞分化のエピジェネティックスは不明な点が多く残されている。本研究では、様々な遺伝子スクリーニングシステムを用いて骨・軟骨細胞分化のエピジェネティック制御因子の探索を行い、その生物学的役割の解明を行った。その結果、骨・軟骨細胞分化に重要なIhh-Gli2シグナルを制御する転写因子としてFoxc1およびFoxc2を同定し、骨格形成におけるその重要性を明らかにした。これらの研究結果は、骨・軟骨再生療法の開発に貢献することが期待される。本年度は昨年度までに複数のアプローチでクローニングされた遺伝子の中で、軟骨細胞特異的に改良型GFP遺伝子を発現させたマウスとセルソーティングを用いた解析で同定した転写因子Foxc1に着目し解析を行った。生化学的解析、Foxc1遺伝子変異マウスおよびAxenfeld-Rieger症候群で観察される病的変異の機能解析により、骨・軟骨形成のエピジェネティク制御におけるFoxc1の重要性を明らかにすることができた。本研究結果はNature Communications誌に投稿し受理された。したがって、本研究は当初の計画以上に進展していると評価できる。平成28年度は、DNAメチル化-遺伝子発現の統合解析によって明らかとなった遺伝子の中から、軟骨細胞分化を制御する転写因子の候補遺伝子を絞り込み、その機能解析を行っていく予定である。まず、胎生期マウス成長板軟骨における候補遺伝子の発現を、免疫染色法ならびにIn Situ Hybridization法により検討する。
高機能バイオベースプラスチックの実用化に向けた新戦略

植物資源から得られるバイオベースポリマーであるポリ乳酸(PLA)はS体(PLLA)とR体(PDLA)の混合によってPLLAより50°C高い融点を示すステレオコンプレックス型結晶(sc)を形成し、PLLAでは不可能だった構造部材への応用も期待されているが、成形可能な分子量範囲(kw>100k)ではsc形成が不完全になるという課題が残されている。これまでに、直接重縮合でそれぞれ合成した中分子量のPLLAとPDLAの溶融混合物の固相系後重縮合によって、ブロック間の近接効果のためscを形成しやすいS体とR体のマルチブロック共重合体(sb-PLA)の合成ルートを検討したが、溶融混合によってsc化させると固相重合での鎖延長効果が低くなることが確認された。本研究では、上記の固相重縮合法を展開し、PLLA/PDLA粉末混合物を固相重縮合させて高分子量体(km>150k)を合成することに成功した。反応直後の生成物はホモポリマーとほぼ同様の性質を示したが、一度溶融処理することでscの単独形成が確認された。種々の構造解析の結果、主要なホモポリマー領域で鎖成長が起こり、粉末間の部分融着によって生成したsc領域/境界領域でブロック化やエステル交換反応が主として進行するため、生成物はラセミ配列を含む高分子量のホモポリマーと中重合度のsb-PLAのポリマーアロイであると結論付けられた。特にホモポリマー鎖中のラセミ配列とsb-PLAの存在が溶融後のscの単独形成のキーとなっており、固相重合前に熱処理(140-160°C)することで部分融着量を調節し、ポリマー構造とsc形成能を制御できることも見出した。本手法により、高重合度の完全sc化PLAがone-potで合成することが可能となった。また、高分子量PLLAと低分子量PDLAの溶融混合物の固相重縮合によっても高分子量sc化PLAが合成された。
ブラックホール合体における降着流ダイナミクスと放射特性の研究

(1)ブラックホールのペア、バイナリーブラックホールへのガス降着流を、質量、連星系軌道の離心率、円盤面の傾き角を変えて計算し、放射特性を明らかにした。(2)バイナリーブラックホールモデルに基づきシミュレーションを実行して輝線プロファイルを計算し、観測の非対称なダブルピーク・プロファイルを再現した。(3)ブラックホール合体時に予想される超臨界降着流の大規模輻射磁気流体シミュレーションを実行し、クランピーアウトフローの証拠を見いだした。銀河同士の合体に伴い、中心の巨大ブラックホール同士も合体して大きくなったことが示唆されている。それが正しければ、合体前のブラックホールのペア、バイナリーブラックホールの形成は必然であるが、未だ観測的証拠は無い。本研究の目的は、バイナリーブラックホールにおけるガス降着過程を計算し、特有な電磁波放射変動特性を明らかにすることにより、ブラックホール成長を観測的に検証するための方法論を確立することにある。初年度は以下の4テーマに取り組んだ。1.質量比が大きなバイナリーブラックホールと外周円盤の相互作用等質量バイナリーブラックホールの計算を元に、質量が大きくことなるバイナリーブラックホール系のシミュレーションを開始した。予備的結果として等質量の場合とは異なる光度曲線が得られた。2.活動銀河中心核における非対称なダブルピーク広輝線を説明する理論モデルの構築奇妙なダブルピーク輝線プロファイルを、バイナリーブラックホールの潮汐ポテンシャル中の輝線放射ガス雲の運動で説明するモデルをたてた。現在、シミュレーションを実行中である。3.バイナリーブラックホールを取り巻くガス円盤の重力波による同定合体前のブラックホールは強い重力波を放射する。その放射特性に、バイナリーブラックホールの存在が影響を与えることを見いだし、その効果を定量的に明らかにした。論文執筆中である。4.超大光度X線源(ULX)のバイナリーブラックホールモデルの構築未だ正体が不明の明るいブラックホール天体ULXの起源を説明する新モデルとして、100太陽質量程度の2ブラックホールからなる系を考え、その絶対光度と光度変化を説明することに成功した。本研究の目的は、バイナリーブラックホーに特有な電磁波放射変動特性を明らかにすることにより、ブラックホール成長を観測的に検証するための方法論を確立することにある。2年度は、以下の4テーマに取り組んだ。1.バイナリーブラックホールのガスダイナミクス計算:バイナリーブラックホールを取り巻く円盤からのガス降着流を、二ブラックホールの質量比、連星系軌道の離心率、軌道面と円盤面の角度の3つのパラメータを変えてシミュレーションした。予想に反し、バイナリーブラックホールの光度曲線に、大きなバライエティがあることがわかった。現在、結果を論文をまとめつつ、粒子数を増やした再計算が進行中である。2.活動銀河中心核における非対称なダブルピーク広輝線を説明する理論モデルの構築:奇妙なダブルピーク輝線プロファイルを、バイナリーブラックホールの潮汐ポテンシャル中の輝線放射ガス雲の運動で説明するモデルをたてシミュレーションを実行した。予想通り、非対称なプロファイルおよびその時間変動を再現することに成功した。論文執筆中である。3.バイナリーブラックホールを取り巻くガス円盤の探査:合体前のブラックホールは強い重力波を放射する。その放射特性に、バイナリーブラックホールの存在が影響を与えることを見いだし、その効果を定量的に明らかにし、論文を投稿した。4.放射特性の計算:ブラックホール降着流からの放射スペクトルを、未解明の超臨界降着のレジームについて、輻射磁気流体シミュレーションおよびモンテカルロ法により調べ、論文報告をした。最終年度は、以下の3テーマに取り組んだ。1.バイナリーブラックホールのガスダイナミクス:バイナリーブラックホールへのガス降着流を、質量、連星系軌道の離心率、軌道面と円盤面の角度の3パラメータを変えてシミュレーションし、バイナリーブラックホールの光度曲線のパラメータ依存性を明らかにした。結果は論文にまとめて投稿した。レフェリーレポートを得て、いくつかのモデルを再計算し、再投稿した結果、受理された。2.バイナリーブラックホールを取り巻くガス円盤の探査:合体前のブラックホールは強い重力波を放射する。その放射特性に、バイナリーブラックホールの存在が影響を与えることを見いだし、その効果を定量的に明らかにし論文を投稿した。レフェリーレポートをうけて、さらに計算を進め、再投稿し、受理された。3.クランピーアウトフローの計算:ブラックホール降着流からのクランピーアウトフローについて、未解明の超臨界降着のレジームについて、今までにない大規模な輻射磁気流体シミュレーションを実行し、その特性を調べて論文にまとめ投稿した。

クランプをつくる物理機構として、レーリー・テーラー不安定と輻射流体不安定の両方が効いていることを予想したが確認までは至らなかった。そのため、降着流部分をのぞき、中心から強烈な輻射がふいてガスアウトフローを駆動するという、よりシンプルな状況を仮定し、輻射流体シミュレーションを実行した。結果は解析中である。優秀な研究員および大学院生の働きにより、計画通りのシミュレーションをほぼ実行したうえ、論文執筆および関連した話題の議論も進行中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。継続して、粒子数を増やし、精度をあげたシミュレーションを行う。また、輻射過程および輻射スペクトルの精密計算を続行する。並行して論文執筆を進める。
薬剤耐性菌出現回避のための遺伝子治療法の開発

本研究の最終目的は、耐性菌を出現させない感染症治療法の開発である。現在、細菌感染に対する治療は抗生物質に頼らざるを得ないが、すべての抗生物質は菌に対する有害作用を基本としている。そのため、使用している薬剤への耐性遺伝子を何らかの方法で獲得した菌が存在すれば、その菌のみが増殖し、結果として耐性菌を蔓延させてしまっている。本研究では、細菌を殺さないまま無毒化することで、原理的に耐性菌の発生しない治療を開発することを目指している。具体的にはベロ毒素を産生する大腸菌0157を無毒化することで、通常の無害な大腸菌に変換させることを最初の目標とした。昨年度の研究で、ベロ毒素のアンチセンスRNA(ベロ毒素を作るmRNAの機能を阻害するRNA)を10種類設計し、それぞれのアンチセンスRNAを産生する遺伝子を持つプラスミドを作製した。本年度は、これらプラスミドの大腸菌0157への導入効率を高めるため、プラスミドをバクテリオファージの内部にパッケージングし実験に用いた。ベロ毒素産生性大腸菌0157の培養液に、作製したバクテリオファージを添加した。作製したバクテリオファージは本来のファージ遺伝子を保有しておらず、大腸菌内で増殖出来ないため、大腸菌の培養中、継続的にバクテリオファージを添加し続けた。12時間培養後に毒素産生能の変化を観察した結果、最大で約70%の毒素産生低下が認められた。一般に、ベロ毒素による症状の改善には1/10以上の毒素量低下が必要とされているため、70%の低下では動物実験を行っても有意な結果は得られないと判断し、より高効率に毒素産生を阻害するようアンチセンスRNAの再設計を行っている。1.アンチセンス産生プラスミドの作成ベロ毒素I型およびII型(VT1、VT2)遺伝子の一部をPCR法で増幅した。pUC118プラスミドのlacZ遺伝子ターミネーターから下流を増幅し、上記増幅した遺伝子を逆方向にライゲーションさせた。電気泳動により、正しくライゲーションされたバンドのみを切り出して精製後、毒素遺伝子3'側とpUCプラスミドのlacZプロモーター領域3'直下のプライマーを用いたPCRを行い、ターミネーターに逆方向にライゲーションした遺伝子を、ターミネーターと一緒に増幅した。pUC118プラスミドのlacZ遺伝子プロモーター部位と、ファージ組み込み領域(IG)を含む部分をPCRで増幅し、プロモーター下流に、上記ターミネーターを結合させた逆方向のベロ毒素遺伝子を結合させた。電気泳動により、正しくライゲーションされたバンドのみを切り出して精製後、このDNAを再度PCRで増幅してライゲーションし、ベロ毒素アンチセンスRNAを産生する環状プラスミドDNAを作成した。一連の遺伝子構築により、この最終段階のPCRで使用するプライマーの位置で、任意の長さのアンチセンスRNAが産生されるよう操作することが可能となった。また、これまでの操作はすべてin vitroで行い、大腸菌への組み込み操作は行わなかった。2.大腸菌の選定北海道内の複数の研究施設に、VT1あるいはVT2のいずれかを産生し、F'プラスミドを持つ菌株の検索を依頼した。260株の大腸菌を検査し、条件に該当する6株が選択された。
少年の手続参加権保障の観点からみた少年司法制度の比較研究

本年度も昨年度から引続き、少年司法における少年の手続参加権保障の観点からの比較研究を行った。本年度は、昨年度においてティーンコートについての基礎的調査および文献研究の一部を終えたので、その成果を、山口直化編著『ティーンコート--少年が少年を立ち直らせる裁判』(1999年12月)として編集・出版した。本書は、ティーンコートの概要、理念および目的(第1章)、わが国におけるティーンコート導入の可否と課題(第2・3章)、様々な研究者によるティーンコートの評価(第4章)およびティーンコート運営マニュアル(第5章)をおさめた包括的研究書である。少年の手続参加の視点を考える新しい少年司法制度のあり方を模索する書である。さらに同観点からの研究として国際人権法の研究も行った。まず、1昨年6月に国連子どもの権利委員会によってなされた勧告についての共同研究を行った。特に少年司法の部分について、いかにして手続参加の観点を含めた改革を成し遂げるべきであるかを論じた。これについては、「少年司法一-急務とされる国際人権基準に基づいた少年司法改革」DCI日本支部編『子ども期の回復』として著わした。また、同様の観点からわが国の少年法「改正」を批判した。これについては、「国際人権基準に反する『改正』法案」団藤重光地著『ちょっと待って少年法「改正」』として著わした。さらに、同様の観点からみた少年事件での被害者間題を論じた。これについては、「少年事件と被害者の権利」田島泰彦他編『少年事件報道と法』として著わした。また同じく国際人権法の観点からの子どもの保護、特に子どもが犯罪の被害者となることを防ぐための条約の研究にも着手した。これに関連する業績としては、「越境組織犯罪対策に関する国連会議とわが国の組織犯罪対策法案」『季刊・刑事弁護/19号』を残した。本研究は少年司法における少年の手続参加権保障の観点からの比較法研究であるが、まず第一に、本年度は、手続参加権という概念が少年司法に特有の適正手続保障の中核をなすということを明らかにした。これは、昨年5月に国連子どもの権利委員会で行われた子どもの権利条約のわが国の実施状況審査を傍聴することでも確認できた。なお、これらについては論文として公表している。第二に、比較法研究の対象であるニュージーランドの家族集団会議およびアメリカ合衆国のティーンコートに関する文献研究を行った。特に、ティーンコートについては、全米レベルでその推進に力を注いでいる全米プロベーションパロール協会(AmericanProbation Parole Association)および全米法律家協会(American Bar Association)のトレーシー氏およびポーラ氏の論稿を翻訳した。これについては後掲拙著に収録される。第三に、ケンタッキー州およびカリフォルニア州の実際のティーンコートを見学して、それを運営しているコーディネーター、裁判官、弁護士、そしてボランティア学生等にインタビューして、その実態を調査した。その一部についても、同様に後掲拙著に収録される。第四に、ティーンコートという少年の手続参加の観点を意識した新しい制度をわが国導入する可能性があるのかをその手続的側面を中心に検討した。さらに、導入した場合の教育効果、犯罪抑止効果等について、特に法的なレベルからどのような評価が可能であるかを検討した。これらについても、後掲拙著に収録される。最後に、1999年7月頃に、拙(編)著『ティーンコート』(現代人文社)が発刊されるが、ここでは、弁護士、家族法学者、教育学者等の参加を得て、ティーンコートを多角的かつ包括的に分析検討して、わが国における新しい少年非行防止策の導入の可能性について記している。