hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
へき地診療所における看護充実に向けた連携体制の構築

目的は、へき地診療所の看護充実に向け、へき地診療所とへき地医療拠点病院、看護系大学との連携体制の構築を図る。方法は拠点病院と診療所の交流支援の実態調査を行った。拠点病院からは情報交換等限られた交流で、診療所からは研修会や看護者派遣体制等への支援が求められた。へき地診療所の看護の充実には、診療所と拠点病院双方の人間関係作りの基、情報の開示や看護実践力の向上、組織体制の強化に取り組むこと。大学は、双方の連携体制の構築に向けネットワーク作りや情報(収集・調整・発信)コントロールの役割がある。本研究の目的は、へき地で生活する地域住民への健康支援の要となるへき地診療所(以下診療所)の看護の充実に向けて、診療所をサポート支援するへき地医療拠点病院(以下拠点病院)と、その調整役として本学看護学科(以下本学)との連携体制を構築することである。昨年度は、拠点病院の看護職を対象に、診療所との交流支援の実態について聞き取り調査を実施した。本年度は、その調査を基に診療所の看護職を対象に、拠点病院との交流支援の実態について、無記名アンケート調査を実施した。アンケート配布数は78名、回収数は51名であった。調査結果として、診療所と拠点病院との交流・支援の経験の有無では、経験がある8名(15.7%)、経験がない38名(74.5%)であった。交流・支援の体制を整える必要性については、インターネットを活用した情報交換ができる環境が整っている13名(25.5%)、環境を整える必要がある35名(68.6%)であった。診療所と拠点病院との間で看護に関する連絡会開催は、必要がある37名(72.5%)、必要がない10名(19.6%)であった。診療所と拠点病院との患者支援に関する情報交換会開催は、必要がある39名(76.5%)、必要がない11名(21.6%)であった。診療所勤務で困った時の相談体制を整える必要性では、必要がある39名(76.5%)、必要がない10名(19.6%)であった。診療所と拠点病院の交流支援が発展するために本学への役割期待では、とても期待する6名(11.8%)、期待する37名(72.5%)、期待しない4名(7.8%)であった。これらの結果を基に次年度は、診療所で必要とする支援内容と、拠点病院で可能となる支援内容の統合を図るため、連携調整役として本学が加わり、診療所への支援内容並びに方法を明らかにして連携体制の構築にむけてまとめることである。へき地で生活する住民への健康支援の要となるへき地診療所の看護の充実に向け、そのへき地診療所をサポート・支援する基幹となるへき地医療拠点病院と、その調整役として本学看護学科との連携体制を構築することを目的に、本年度はA県におけるへき地医療支援機構に記載されているへき地医療拠点病院の看護者に対して、今までへき地診療所の看護者と、どのような交流あるいは支援関係にあったのか、今後どのような交流支援が可能か、また本学看護学科への役割期待などについて、その内容や方策の実態を明らかにするために、聞き取り調査を看護者を対象に実施した。へき地医療拠点病院の看護者への聞き取り調査の結果、へき地診療所の看護者との交流・支援の実際は、【交流・支援があった】【交流・支援がなかった】の2つの内容に大別された。【交流・支援があった】と答えた内容は、(相談ごとへの支援、学習支援、看護師確保への支援、情報交換)などであった。【交流・支援がなかった】は、(管轄が異なること、患者の行き来がない、地理的に遠い)などであった。今後の支援の可能性については、(研修会や学習会への呼びかけなどの学習支援や、看護上の困りごとへの相談支援)などがみられた。また、大学への役割期待としては、(へき地診療所とへき地拠点病院の調整役や、教育・指導面で支援に関する要望)などが寄せられた。次年度は、へき地診療所の看護者が、看護を充実する上で必要な支援内容を把握するために、今までへき地医療拠点病院看護者に対して、どのような支援を依頼していたのか、また、今後どのような支援を依頼したいのかなどについて、それらの実態を明らかにするために、アンケート調査を行う。本研究の目的は、へき地診療所の医療・看護充実に向けて、へき地診療所(診療所)とへき地医療拠点病院(拠点病院)、地元看護系大学(大学)との連携体制の構築を図ることである。方法は拠点病院と診療所との交流支援の実態調査を12年目に行った。

拠点病院からは情報交換等限られた交流であり、診療所からは看護技術や看護の動向等の研修会、看護師不在時の看護者派遣体制等への支援が求められた。最終年度は12年目で得られた情報を基に、診療所の看護の充実に向け、診療所並びに拠点病院、大学がお互いの組織体制の中で持てる力を発揮する仕組みを整えたことである。その仕組み作りとしては、人的環境整備として診療所と拠点病院双方の人達の人間関係作りを行うこと。物理的環境整備として患者情報の交換や、看護実践力強化に向けた研修情報などの情報交換を行うこと。それには、診療所と拠点病院共に人的には豊かでなく、また距離的には離れている所が多いことから、情報交換ツールとなるインターネットなどの活用が有効であり、その環境整備を行うこと等が示された。そして、それらの体制作りには、大学として診療所と拠点病院との連携に向けたネットワーク作りを行い、それぞれの持つ情報を集約し調整・発信するなどコントロール基地として役割発揮の必要性が示された。診療所はへき地における医療・看護の要であり、地域住民が健康生活を維持する上でより良い看護を提供するには、診療所と拠点病院、並びに大学が有機的に連携体制を構築し役割発揮をすることで更なる看護の充実につながると考える。基礎看護学1年目はへき地医療拠点病院の看護者を対象に、へき地診療所との交流支援の実態について聞き取り調査を行い、2年目はその内容を基にへき地診療所の看護者に対してへき地医療拠点病院との交流支援の実態のアンケート調整を計画していた。その計画である調査が実施でき、3年目の計画に移行する目途ができた。へき地診療所の看護者への支援の要となるへき地医療拠点病院の看護者に対して、今日までへき地診療所の看護者に、どのような交流や支援がされていたのか、その実態を明らかにするため、看護責任者や相談担当者を対象に、予定の数の聞き取り調査が実施できた。現在、聞き取り調査で得られたデータを基に質的な分析を行っている段階にある。本年度は、へき地診療所で必要とする支援内容と、へき地医療拠点病院での支援内容の統合を図るため、連携調整役として本学看護学科が加わり、支援内容並びに方法を明らかにして連携体制を構築する。A県内のへき地医療拠点病院におけるへき地診療所の看護者との交流・支援の実態調査を基に、へき地診療所の看護者がへき地医療拠点病院の看護者に対して、交流や支援を希望する内容について調査するために、アンケート用紙を作成し実態調査を行う。そして、その内容を分析し、へき地拠点病院とへき地診療所の看護者との交流・支援に向けて必要な方策を検討する。平成24年度の調査結果をまとめ発表するとともに、必要な情報収集を行うための、研究者達の看護科学学会(大阪)への学会参加費や旅費である。また、本年度の研究計画であるへき地診療所看護者を対象としたアンケート調査を予定しており、そこに関わる郵送費並びに資料整理費などである。
犯罪への共同体再生型環境的アプローチの可能性と限界

2018年度は、これからの研究体制・研究課題の地固めを行う年度であった。環境的アプローチを整理するべく、2018年6月に慶応義塾大学の「市民生活の自由」研究会にて、「犯罪への環境的アプローチの意義とその多様性:「犯罪に強い社会の実現のための行動計画」を素材として」という研究報告を行った。日本の政策を検討しつつ、環境的アプローチの意義をまとめる報告であった。参加者に政策関係者の方々がおられ、彼らから貴重なコメントをいただき、今後の研究の方向性に大きな示唆をいただいた。研究体制を整えるべく、法哲学の基本的書物をはじめとして、犯罪学および都市論の書物をいくつか揃えることができた。「犯罪への共同体再生型環境的アプローチ」の最たる例は都市の再生であり、都市論の検討は必須である。社会を支える環境の在り方(都市の構造・インターネット空間のアーキテクチャ)を考察するサンスティーン『♯リパブリック』の書評を執筆し、「セレンディピティのアーキテクチャをいかにデザインするのか:自由と民主政の未来」(図書新聞3384号)を公刊した。日本法哲学会で「グローバル・ガバナンスにおける多元的な秩序形成の在り方とその意義」という研究報告を行い、多様なアクターが多様な場で秩序形成をしていく営みの分析を試みた。当初の計画と異なったのは、AI議論の急速な展開である。コンビニにおける予測的ポリシングにみられるように、犯罪予防のためのビッグデータの解析にAIが用いられつつあり、「犯罪への共同体再生型環境アプローチ」の具体化がAIにより支えられるようになっている。そこで、AIなどを扱った研究会やシンポジウムに積極的に参加した。犯罪予防の話にまでは及んでいないが、しかし、ガバナンス論の観点からAIの問題にアプローチする「AIガバナンスの法哲学」(法律時報2019年4月号)を公刊することができた。研究報告二本、書評一本、論文一本(ただし、論文の公刊日は2019年4月1日付)を公刊することができた(日本法哲学会における研究報告を論文としたものは、2019年秋に公刊予定である)。研究計画には、AIの話を含めていなかった。しかし、AIの急速な発展により、研究計画を変更・拡大せざるを得なかった。そこで、ロボット研究者・生物学者らと研究交流をし、さまざまな研究会やシンポジウムに参加することで議論の急速な発展にキャッチアップすることに努めることもでき、どのようにアプローチしていくのかの研究視点を設定することができた。本研究は、技術的・建築的環境(アーキテクチャと呼ばれる)を変えることによって犯罪を予防するアプローチ(環境的アプローチと呼ばれる)を研究することを主眼としている。2018年度の研究遂行中、イタリアのカリアリ大学の法哲学者Giuseppe Lorini先生の研究に接し、また、電子メールで意見交換を行った。彼の研究は、(そのような表現を用いていないが)環境的アプローチを主題とし、とりわけ、本研究計画が掲げた独自性の2点((i)規範意識へのアーキテクチャの影響、(ii)法概念論への新しい視角の提供)に密接に関係する。そこで、2019年度中にLorini先生のもとを訪問し、意見交換をしたいと考えている。次に、本研究に密接に関連するAIの問題に本研究との関連する形で一層取り組んでいく。理論的には、アーキテクチャによる規制と比較する形で、アルゴリズム的規制の問題を精力的に研究する、Birmingham大学のKaren Yeung教授が、現在進行形で論文を多く、公刊している(たとえば、2018年にRegulation & Governance誌に論文「Algorithmic Regulation」を公表)。彼女の研究はAIと環境的アプローチとをつなぐ重要な研究であり、この研究もキャッチアップしていきたい。また、日本のロボット研究者・自動運転車の研究者とのAIの問題を研究していく(2019年9月はじめにロボット学会のシンポジウムに登壇する予定)。また、インドの生物学者Binoy V.V(インドのBengaluruにある国際高等研究所所属)が主導するAI関連の学際研究に参画する予定である(さまざまな国からさまざまな分野の研究者が6人ほど集まり、2018年度より企画)。

コンビニにおける予測的ポリシングにみられるように、犯罪予防のためのビッグデータの解析にAIが用いられつつあり、「犯罪への共同体再生型環境アプローチ」の具体化がAIにより支えられるようになっている。そこで、AIなどを扱った研究会やシンポジウムに積極的に参加した。犯罪予防の話にまでは及んでいないが、しかし、ガバナンス論の観点からAIの問題にアプローチする「AIガバナンスの法哲学」(法律時報2019年4月号)を公刊することができた。研究報告二本、書評一本、論文一本(ただし、論文の公刊日は2019年4月1日付)を公刊することができた(日本法哲学会における研究報告を論文としたものは、2019年秋に公刊予定である)。研究計画には、AIの話を含めていなかった。しかし、AIの急速な発展により、研究計画を変更・拡大せざるを得なかった。そこで、ロボット研究者・生物学者らと研究交流をし、さまざまな研究会やシンポジウムに参加することで議論の急速な発展にキャッチアップすることに努めることもでき、どのようにアプローチしていくのかの研究視点を設定することができた。本研究は、技術的・建築的環境(アーキテクチャと呼ばれる)を変えることによって犯罪を予防するアプローチ(環境的アプローチと呼ばれる)を研究することを主眼としている。2018年度の研究遂行中、イタリアのカリアリ大学の法哲学者Giuseppe Lorini先生の研究に接し、また、電子メールで意見交換を行った。彼の研究は、(そのような表現を用いていないが)環境的アプローチを主題とし、とりわけ、本研究計画が掲げた独自性の2点((i)規範意識へのアーキテクチャの影響、(ii)法概念論への新しい視角の提供)に密接に関係する。そこで、2019年度中にLorini先生のもとを訪問し、意見交換をしたいと考えている。次に、本研究に密接に関連するAIの問題に本研究との関連する形で一層取り組んでいく。理論的には、アーキテクチャによる規制と比較する形で、アルゴリズム的規制の問題を精力的に研究する、Birmingham大学のKaren Yeung教授が、現在進行形で論文を多く、公刊している(たとえば、2018年にRegulation & Governance誌に論文「Algorithmic Regulation」を公表)。彼女の研究はAIと環境的アプローチとをつなぐ重要な研究であり、この研究もキャッチアップしていきたい。また、日本のロボット研究者・自動運転車の研究者とのAIの問題を研究していく(2019年9月はじめにロボット学会のシンポジウムに登壇する予定)。また、インドの生物学者Binoy V.V(インドのBengaluruにある国際高等研究所所属)が主導するAI関連の学際研究に参画する予定である(さまざまな国からさまざまな分野の研究者が6人ほど集まり、2018年度より企画)。次年度使用額は3689円である。年度末の出張旅費が予想より、かからなかったためである。次年度には、出張旅費の枠内で使用していく予定である。
細胞分裂に必須なFtsZタンパク質局在の分子機構

大腸菌において潜在的に細胞分裂の場所となりうるのは、細胞の両極および中央の少なくとも三箇所であり、そこへのFtsZの局在が分裂に必須であると考えられる。本研究では、FtsZの正常な局在に必須な因子が存在すると考え、このような因子の同定をFtsZとの結合能を指標にして、酵母2ハイブリッドシステムを用いて網羅的にスクリーニングを行なった。その結果以下の知見が得られた。1.FtsZとGal4 DNA結合ドメインの融合タンパク質を酵母に導入すると、これだけでレボーターの発現が見られた。このことは本研究のスクリーニングの過程ではレポーター発現の阻害剤添加が必要となることを意味する。2.上の制約にも関わらず、本実験系において、細胞分裂阻害因子として知られるSulAとFtsZタンパク質と直接相互作用することが示された。しかしながら、FtsZ間の相互作用は本実験系では検出することができなかった。この結果はFtsZはGTP依存的にフィラメントを形成するが、このような性質のタンパク質間相互作用を検出するのは2ハイブリッドシステムでは困難であることを示唆している。3.FtsZと相互作用するタンパク質のスクリーニングにより有意な結合能を持つクローンを得ることはできなかった。これは、先に述べた実験系における技術的制約から来たものであると思われる。
脳軟膜における微小循環血流と酸素代謝の可視化解析および人工血液研究への応用

人工酸素運搬体の実現は昨今の献血事情や保存性,血液型による制限や感染の危険性を勘案するとその実現は急務であると考える.本研究では微小循環動態の変化に伴って変化する脳細胞の酸素代謝を時系列的に評価するために,血流解析および微小血管内酸素分圧計測を行い,さらにミトコンドリア内TCA回路で産生される補酵素NADHの紫外吸光特性に着目し,組織酸素代謝レベルのイメージングを試みた.Wistar系雄性ラットを2群に分け,細静脈酸素分圧計測群と脳表NADH蛍光計測群とした.右大腿動静脈および左大腿動脈を確保し,左頭頂骨にclosed cranial windowを作製した.微小循環血流は赤血球をFITC標識することで可視化した.脳皮質NADH蛍光は370nmの紫外光を断続的に照射し,λ>420nmの蛍光を画像として取得すると共に連続的に輝度解析した.実験は大腿動脈より脱血して血圧を40mmHgまで低下させ,その状態を10分間維持し,その後自己血液を輸血することで蘇生させた.脱血による血圧の低下に伴って血流速度および微小血管内酸素分圧は著明に低下し,相反的にNADH蛍光輝度がおよそ20%上昇した.また,返血蘇生によって各パラメータはbaselineへ回復した.以上より,脳虚血による微小循環血流障害,微小血管内酸素分圧の低下,脳組織における好気性酸素代謝レベルの低下といった一連のプロセスを同一固体において連続的かつ定量的に評価することが可能になった.本計測システムは局所微小循環動態および酸素代謝の解析,人工酸素運搬体の評価等に有用であると結論できる.脳神経細胞は虚血侵襲に脆弱であり,全脳あるいは局所脳虚血モデル実験では虚血前後における微小循環動態の解析に加え,局所酸素分圧の情報が重要となる.本研究では微小循環動態の変化に伴って変化する脳細胞の酸素代謝を時系列的に評価するために,血流解析および微小血管内酸素分圧計測を行い,さらにミトコンドリア内TCA回路で産生される補酵素NADHの紫外吸光特性に着目し,組織酸素代謝レベルのイメージングを試みた.Wistar系雄性ラットを2群に分け,細静脈酸素分圧計測群と脳表NADH蛍光計測群とした.右大腿動静脈および左大腿動脈を確保し,左頭頂骨にclosed cranial windowを作製した.微小循環血流は赤血球をFITC標識することで可視化した.脳皮質NADH蛍光は370nmの紫外光を断続的に照射し,λ>420nmの蛍光を画像として取得すると共に連続的に輝度解析した.実験は大腿動脈より脱血して血圧を40mmHgまで低下させ,その状態を10分間維持し,その後自己血液を輸血することで蘇生させた.脱血による血圧の低下に伴って血流速度および微小血管内酸素分圧は著明に低下し,相反的にNADH蛍光輝度がおよそ20%上昇した.また,返血蘇生によって各パラメータはbaselineへ回復した.以上より,脳虚血による微小循環血流障害,微小血管内酸素分圧の低下,脳組織における好気性酸素代謝レベルの低下といった一連のプロセスを同一固体において連続的かつ定量的に評価することが可能になった.本計測システムは局所微小循環動態および酸素代謝の解析,人工酸素運搬体の評価等に有用であると結論できる.人工酸素運搬体の実現は昨今の献血事情や保存性,血液型による制限や感染の危険性を勘案するとその実現は急務であると考える.本研究では微小循環動態の変化に伴って変化する脳細胞の酸素代謝を時系列的に評価するために,血流解析および微小血管内酸素分圧計測を行い,さらにミトコンドリア内TCA回路で産生される補酵素NADHの紫外吸光特性に着目し,組織酸素代謝レベルのイメージングを試みた.Wistar系雄性ラットを2群に分け,細静脈酸素分圧計測群と脳表NADH蛍光計測群とした.右大腿動静脈および左大腿動脈を確保し,左頭頂骨にclosed cranial windowを作製した.微小循環血流は赤血球をFITC標識することで可視化した.脳皮質NADH蛍光は370nmの紫外光を断続的に照射し,λ>420nmの蛍光を画像として取得すると共に連続的に輝度解析した.実験は大腿動脈より脱血して血圧を40mmHgまで低下させ,その状態を10分間維持し,その後自己血液を輸血することで蘇生させた.脱血による血圧の低下に伴って血流速度および微小血管内酸素分圧は著明に低下し,相反的にNADH蛍光輝度がおよそ20%上昇した.また,返血蘇生によって各パラメータはbaselineへ回復した.以上より,脳虚血による微小循環血流障害,微小血管内酸素分圧の低下,脳組織における好気性酸素代謝レベルの低下といった一連のプロセスを同一固体において連続的かつ定量的に評価することが可能になった.本計測システムは局所微小循環動態および酸素代謝の解析,人工酸素運搬体の評価等に有用であると結論できる.
ユーラシア大陸内陸部多民族におけるベーチェット病関連遺伝子の解析

我が国の3大ぶどう膜炎原因疾患はベーチェット病、サルコイドーシス、フォークト-小柳-原田病である。とりわけベーチェット病は若年者に多発し、失明率が高い難病である。しかし、北米や南米、北欧、サハラ以南のアフリカには見られず、もっぱらユーラシアの北緯30°から45°の古代シルクロード沿いに多発する。本研究計画は(1)ユーラシア大陸内陸部にも本病患者が存在するか、(2)いるとすればその臨床症状は本邦のそれと類似しているのか、(3)疾患関連遺伝子は同じか、などが大きな柱である。研究実績としては研究計画に則って各国の主要医療機関および政府機関と連携して現地へ赴いた。(1)ロシア、カザフスタン、キルギスタン、モンゴル、ネパール等を調査した。アゼルバイジャン人、アルメニア人、チェチェン人、ダゲスタン人、ロシア人、カザフスタン人、モンゴル人の患者の存在を確認した。(2)その臨床症状は我が国の患者とよく類似していた。特にモンゴルには多数の患者が存在することが確認された。(3)疾患関連遺伝子では最も関連が強いHLA-B51は諸外国の患者でもみられた。ただし、これまで対象諸国の一般健常者における同遺伝子の保有率調査がされておらず、現時点で明らかではないため、疾患関連遺伝子の保有率が健常者と正確に比較できない。現在関連遺伝子の解析を進めている。最終年度は大使館の協力も得てネパールとキルギスタン(2度目)を訪問した。医療機関、医育機関などを調査した。現地で新たな国際共同研究の申し込みがあり、本研究は今後さらに参加国が広がっていくものと考える。ベーチェット病は重篤な眼炎症・ぶどう膜炎を繰り返し、しばしば失明に至る。2010年には日本チーム(申請者ら)によるゲノムワイド関連解析で、疾患関連遺伝子が解明された(Nat Genet, 2010)。本病は古代のシルクロード沿いに多発地域が偏在しているが、旧ソ連圏では未知である。本研究の目的は、これまでの空白地域である、カフカス地方、中央アジア諸民族を中心にベーチェット病臨床像と遺伝子多型を検討し、あわせて東アジア、地中海周辺諸民族とは異なる独自のチュルク(トルコ)系民族における遺伝子背景についても詳細に検討することである。平成28年度の研究で、HLA-B51のベーチェット病眼症状に対する寄与度がシルクロードを東へ向かうほど強くなることを明らかにした。本研究計画を通じて、さらにに以下の4つの課題に答えたい。1.カフカス地方および中央アジア諸民族にどの程度ベーチェット病が存在するか?3. HLA-B*51はこれまで各民族の患者に共通している。それはこの地域でも同じなのか?4.我々のGWAS研究ではHLA Class I領域以外に3つの極めて相関の強い多型が明らかになった。中央アジアでもこの3つの多型が疾患関連遺伝子として共通しているのか?これらの点についてほぼ計画通りの進捗があった。研究計画に則り、平成28年度は以下の成果を得た。(1)モンゴル国立医科大学眼科(ウランバートル)と共同研究を行い、現地を訪れて調査した。現地の医療状況を確認した後に患者を診察して、確定診断および現地医師への診療助言を行なった。同国でベーチェット病患者存在することが確認でき、その臨床像を記録した。さらに唾液検体を採取した。現在DNA抽出を終了し、解析中である。その後も引き続き検体を継続して収集中である。(2)カザフスタン北部の国立アスタナ眼科病院と共同研究を進めた。14例のベーチェット病患者を確認し、その臨床像を整理・検討した。DNAの抽出とタイピングを行い、現在解析中である。(3)患者DNAのHLA classIタイピングを行った。シルクロード他地域の研究と同様、患者群でHLA-B*51およびA*26保有者がみられた。(4)いずれの地域で採取した唾液検体も常温で保存・輸送されたが、必要量のDNAが期待通り抽出できた。今後も電力事情や交通事情が良好ではない地域と今後も共同研究を進めるにあたり、計画は順調に進捗している状況である。本病は古代のシルクロード沿いに多発地域が偏在しているが、ユーラシア大陸内陸部では未知である。ダゲスタン、カザフスタン、モンゴルとの共同研究を進め、その臨床像と臨床検体を収集した。日本人患者からも臨床検体を収集した。以前は血液を検体としていたが、これらの地域では血液採取やその速やかな冷蔵運搬が困難であり、DNAがしばしば破損していた。今回は唾液を採取して常温で保存・運搬する手法を用いており、唾液内に脱落した本人の頬粘膜細胞からDNAを抽出、あわせて口腔内細菌叢の解析も行っている。現在ほぼ順調に、ユーラシアでの臨床像、疾患関連遺伝子の保有頻度、口腔内環境などの類似点と相違点の解析が進んでいる。これまでに、ロシアのダゲスタン、チェチェン、アルメニア、チェチェンに患者がみられること、カザフスタン、モンゴルにもみられることを確認した。

それぞれから口腔内検体(唾液)を採取・収集しており、遺伝子背景と口腔内環境を解析中である。研究計画に則り、平成29年度は以下の成果を得た。(1)カザフスタン国立研究所との共同研究でカザフスタン人のベーチェット病の臨床像を確認した。現在英文原著として発表準備中である。(2)モンゴル国立医科大学との共同研究でモンゴル人のベーチェット病臨床像を検討した。一般モンゴル人におけるHLA-B51遺伝子保有率に関する過去の論文を現地で見つけることが出来た。患者との保有比率を解析して発表する予定である。(3)モンゴル人の唾液検体を追加採取した。(4)日本人ベーチェット病患者の口腔内細菌叢と血液中自己抗体を検討した。我が国の3大ぶどう膜炎原因疾患はベーチェット病、サルコイドーシス、フォークト-小柳-原田病である。とりわけベーチェット病は若年者に多発し、失明率が高い難病である。しかし、北米や南米、北欧、サハラ以南のアフリカには見られず、もっぱらユーラシアの北緯30°から45°の古代シルクロード沿いに多発する。本研究計画は(1)ユーラシア大陸内陸部にも本病患者が存在するか、(2)いるとすればその臨床症状は本邦のそれと類似しているのか、(3)疾患関連遺伝子は同じか、などが大きな柱である。研究実績としては研究計画に則って各国の主要医療機関および政府機関と連携して現地へ赴いた。(1)ロシア、カザフスタン、キルギスタン、モンゴル、ネパール等を調査した。アゼルバイジャン人、アルメニア人、チェチェン人、ダゲスタン人、ロシア人、カザフスタン人、モンゴル人の患者の存在を確認した。(2)その臨床症状は我が国の患者とよく類似していた。特にモンゴルには多数の患者が存在することが確認された。(3)疾患関連遺伝子では最も関連が強いHLA-B51は諸外国の患者でもみられた。ただし、これまで対象諸国の一般健常者における同遺伝子の保有率調査がされておらず、現時点で明らかではないため、疾患関連遺伝子の保有率が健常者と正確に比較できない。現在関連遺伝子の解析を進めている。最終年度は大使館の協力も得てネパールとキルギスタン(2度目)を訪問した。医療機関、医育機関などを調査した。現地で新たな国際共同研究の申し込みがあり、本研究は今後さらに参加国が広がっていくものと考える。平成29年度は以下の研究を進めたい。(1)昨年度のモンゴル国調査は首都ウランバートルとその周辺地域にとどまったが、同国は周辺に広大な草原地帯があり、遊牧民が散在している。今年度は周辺地域住民を対象に調査を行う。可能であれば同国医師に本病の啓発活動も行う。(2)カザフスタン共和国でみられた患者で、本病の臨床像と抽出したDNAのタイピング結果を照らし合わせ、その特徴を検討する。(3)ロシア・ダゲスタン共和国の患者検体を回収した。HLAの抽出と解析を行う。同じカフカス地方のチェチェン共和国で同様の調査が可能か検討する。(4)ロシア・シベリア地方南部もシルクロード地域と言える。
内因性ベンゾジアビピンの解明,同定とその生物活性の解明

本研究では動物の中枢神経に存在する筈と理論的に予測されている物質で、中枢神経にあるベンゾジアゼピン受容体に選択的に結合するものを探索し、その物質の本体を明らかにせんとした。先ず目的物を分離したとして、それがベンゾジアゼピン受容体に結合するか否かを確認するために、ベンゾジアゼピン受容体分画をマウス脳から調整した。この分画に放射性トリチウムで標識したflunitrazepamを6nM結合させ、別に中枢神経から分離した内因性ベンゾジアゼピンリガンド分画を作用させ、放射性flunitrazepamの置換活性を測ることにより、内因性ベンゾジアゼピンリガンドの量と存在を知ることのできる系を完成させた。1)ウシ脳から内因性ベンゾジアピンリガンドの検索ウシの大脳皮質を磨り潰し、アセトン・メタノ-ルで抽出したが、目的リガンドは確認できたものの、充分量とれなかった。2)ウシ脊髄からの内因性リガンドの分離ウシ脊髄のホモジネ-トからゲル濾過法などを駆使して内因性リガンドの分離を試みたところ、フラクション47ー49に高い受容体結合親和性を有する物質を確認した。このフラクションに含まれる内因性ベンゾジアゼピンリガンドは分子量1000以下の物質で、少なくとも過去に報告されているジアゼパム、デスメチルジアゼパム、βーカルボリンメチルエステルのいずれでもないリガンドであることが薄層クロマトグラフィ-で確認された。ウシ脊髄から分離した内因性ベンゾジアゼピンリガンドは5種以上存在すること、ペプチドではないことが確認できた。3)サル脳およびヒト血漿から内因性リガンドの分離サル脳およびヒト血漿からウシ脊髄と類似の方法で内因性ベンゾジアゼピンリガンドを検出せんとしたが失敗した。本研究はベンゾジアゼピン受容体の内因性リガンドを探索することを目的とする。本年度は牛の脳、背髄、ヒト血漿、サル脳より目的の内因性リガンドの分離を試みた。ベンゾジアゼピンリガンドの検出には、総てマウス脳より調製したベンゾジアゼピン受容体の神経膜標本に対する(3H)Flunitrazepam(FNP)の結合解離能を指標にして行った。1)牛脳よりベンゾジアゼピンの内因性リガンドの探索牛脳から大脳皮質を採取し、これをメタノ-ルと共にホモジナイズし、ホモジネ-トからゲル濾過などでFNP結合解離物質の精製を試み、1mg/mlの濃度で50%FNP結合を解離するまでリガンドを濃縮したが、脂質などの妨害のためそれ以上には濃縮できなかった。2)ヒト血漿とサル脳中から、FNP結合解離物質は検出できたが、その濃縮は十分できなかった。3)牛背髄より内因性リガンドの探索牛背髄を1モル酢酸で抽出して抽出液を活性炭に吸着させた。このフラクションをゲル濾過法を用いて分画してFNP結合解離能の強い分画を得た。しかし、この分画は量的には著しく少なく、目的のリガンドを同定するに至っていない。しかし、この分画は過去に報告され、われわれの実験でも確認したジアゼパムやデスメチルジアゼパムとは異なるリガンド物質を含むことが明らかにされた。今後は大量の牛背髄を用いれば、目的とする新しいベンゾジアゼピン受容体の内因性リガンドを単離することが可能という見込みが本年度の研究結果から得られた。この10数年、抗不安、鎮痛などの薬物として使用されているベンゾジアゼピンは中枢系で活性発現するために脳に受容体、及び内因性のリガンドがモルヒネと同様に存在している可能性が研究されてきた。

現在までに、内因性リガンドの候補はRRA法、またはRIA法を指標として、ベンゾジアゼピン抗体などを担体としたカラム操作を駆使して、脳より数多く単離され報告されてきた。即ち、分子量1万以上のDBI(ジアゼバムバンデングインヒビタ-)、ノルダゼパム、およびβーカルボリン誘導体などである。これらはベンゾジアゼピン受容体への親和性、生体で塩素原子を含む化合物が生合成出来るかなど問題点が考えられた。一方、ジアゼパム類が野菜などにも存在していることも明らかにされてきた。更に、胆臓性脳疾患の体液中に高濃度のベンゾジアゼピン類が含まれて様々な病気との関係が問題となってき、本体の構造、作用機構などの解明することに急務となってきた。本研究はハムゲン原子を含まず、ベゾジアゼピン様作用を有するペプタイドが脳、脊随に存在しているのか、RAA法を指標として独自の研究を開始した。本年度はウシ脊随50Kgより2M酢で抽出し、Anberite XADー4,Carbon,Sephadex LH20,HPLなどの7段階のカラム操作でベンジアゼピン様物質を精製することを試みた。逆相西担体をもちいたHPLCの溶出パタ-ンより、内因性リガンドの候補は多様な活性ピ-クが観測された。現在、分子量1000以下で熱などに安定、水に可溶なペップチド性物質が3製分真の内因性物質の候補として存在していることをゲルろ過などのカラム操作で突き止めた。本物質の究明は複雑な脳な究明に測り知れない貢献をするものと期待される。
小胞体関連分解の分子機構

小胞体関連分解の分子機構について、多くの新しい知見を得た。まずEDEMという新規因子を発見し、これがカルネキシンの下流にあって、ミスフォールドしたタンパク質の糖鎖を認識して分解へまわす機構を提唱した。EDEMは小胞体ストレスで発現誘導され、IRE1-XBP1経路で誘導される初めての因子であることも明らかになった。EDEMの分子機構をさらに研究する過程で、EDEM結合因子として新規小胞体還元因子をも同定し、研究はさらに発展することになった。サイトゾルにおけるポリグルタミン(polyQ)タンパク質の凝集は神経変性疾患などにおいて重要な関わりを持つが、その凝集阻止にサイトゾルシャペロニンCCTが関与していることを示した。CCTはβシートを持つタンパク質のフォールディングを助けるが、その認識部位を明らかにし、さらにβシートに富むpolyQタンパク質の凝集を直接結合することによって阻害できることを示した。特に、FCSなどの比較的新しい方法を用いて、CCTがpolyQタンパク質のオリゴマー形成を阻止しているらしいことも明らかにし、凝集阻止機構を考える上で大切な知見となった。永田らが発見したコラーゲン特異的分子シャペロンHsp47についても、ノックアウト細胞を用いた解析から、Hsp47がコラーゲンの三本らせん構造形成に必須であることを明らかにしたほか、分泌されたコラーゲンが線維形成をできないことを示し、繊維化疾患の治療ターゲットとしてHsp47が有望であるという確証を得た。分泌タンパク質や膜タンパク質など、小胞体において合成されるタンパク質は、正しくフォールディングされて機能を獲得したものだけが、分泌経路に乗って、下流へ輸送され、正しい構造を獲得できなかったものは、品質管理機構によって適正に処理される。小胞体品質管理機構には、正しいフォールディングを促進するproductive foldingが行われる他に、もし変性タンパク質が蓄積されると、1)分子シャペロンを合成誘導して、変性タンパク質の再生を促す、2)作つても変性タンパク質ができてしまう状況下では、多くのタンパク質の翻訳を停止して、変性タンパク質の量を減少させる、3)変性したタンパク質を分解処理する、4)アポトーシスによって、変性タンパク質を生じるような細胞ごと死滅させる、という4つの戦略を備えている。当研究室では小胞体関連分解を通じて、新生タンパク質の品質管理機構に関わる新規タンパク質EDEMの機能解析を進めている。EDEMは小胞体膜に局在するタンパク質であり、Mannose8型糖鎖を特異的に認識すると考えられている。EDEMを導入すると、分解されるべき基質タンパク質(われわれの実験系ではα1アンチトリプシンの変異体)の分解が促進され、この分解がプロテアソームによって担われていることを明らかにした。本年度は、EDEMが、小胞体の別の分子シャペロンカルネキシンと相互作用することを示し、その結合がカルネキシンの膜貫通ドメインを介していることを明らかにした。さらに、正しくフォールディングできず、分解されるべき基質は、まずカルネキシンと相互作用し、カルネキシン上でフォールディングを試みるが、それでも正しくフォールディングできない場合は、カルネキシンからEDEMへ受け渡され、その後、トランスロコンを通してサイトゾルへ逆輸送され、プロテアソームで分解されることを明らかにした。小胞体品質管理機構には、正しいフォールディングを促進するproductive foldingが行われる他に、もし変性タンパク質が蓄積されると、1)分子シャペロンを合成誘導して、変性タンパク質の再生を促す、2)作っても変性タンパク質ができてしまう状況下では、多くのタンパク質の翻訳を停止して、変性タンパク質の量を減少させる、3)変性したタンパク質を分解処理する、4)アポトーシスによって、変性タンパク質を生じるような細胞ごと死滅させる、という4つの戦略を備えている。

EDEMを導入すると、分解されるべき基質タンパク質(われわれの実験系ではα1アンチトリプシンの変異体)の分解が促進され、この分解がプロテアソームによって担われていることを明らかにした。本年度は、EDEMが、分解の促進だけでなく、変性タンパク質を分解可能な状態に維持することによって、トランスロコンを通過しやすくするいわゆるシャペロン機能を持っていることを明らかにした。また、EDEMの機能ホモローグであり、かつ小胞体内腔タンパク質であるsoluble EDEMを新たにクローニングし、solEDEMもEDEMと同様、小胞体関連分解の促進を行うことを明らかにした。小胞体関連分解(ERAD)および小胞体におけるproductive foldingがテーマである。ERADに関しては、Man8レクチン様因子EDEMを発見し、その役割に関する研究を行っている。EDEMはミスフォールドしたタンパク質のERADを促進するが、正しくフォールドしたタンパク質には相互作用せず、また分解にも、分泌にも影響を与えないことを明らかにした。すなわちEDEMは正しくフォールドしたものとミスフォールドしたものとを見分けて、分解にまわすか、正しい分泌経路にまわすかを決定する因子である可能性がある。またEDEMがミスフォールドした基質(α1-antitrypsin null HongKong, NHK)のジスルフィド結合による2量体形成を抑えることも明らかにし、EDEMが分子シャペロン様の機能を持つことを発見した。さらにEDEMのホモローグを2種類見つけ機能解析を進めている。1つは小胞体内可溶性のホモローグsolEDEMであり、いま1つは小胞体膜タンパク質と考えられるEDEM3である。現在までのところ、solEDEMはEDEMと同様の機能をもち、しかし、その組織分布がEDEMとは大きく異なっていることを明らかにしている。Productive foldingのモデルとして、HSP47によるコラーゲンのフォールディングについて解析を進めている。HSP47をノックアウトすると少なくともI型およびIV型コラーゲンの3本鎖形成に異常が起こり、コラーゲン繊維および基底膜形成に障害が起こることを明らかにした。HSP47を欠損しても、他の基底膜成分は集合しているので、HSP47欠損によってIV型コラーゲンが基底膜に正しくincorporateされず、基底膜様構造の強度が不足することによって、胎生11日目前後の激しい形態形成時に耐えられず、基底膜の断裂を伴って、マウスは死に至るものと思われる。ERADに関しては、Man 8レクチン様因子EDEMを発見し、その役割に関する研究を行っている。
各種修飾ヒドロパーオキシド誘導体の合成とその抗マラリア活性に関する研究

実験計画に従い、(1)2,5-ジメチルフラン及び2-メチルフランを各種アルコール中で光増感酸素化を行い、得られた対応するヒドロパーオキシド誘導体をパーオキシエステル及びパーオキシエーテルとして隠蔽した化合物を合成した。また、構造活性相関の観点から、(2)アルキル側鎖に水酸基をもつフラン誘導体の光増感酸素化によるジオキサスピロ型のヒドロパーオキシド誘導体の合成を行なった際、生理活性ジオキサスピロ型天然物の共通合成シントン、2-oxo-1,6-dioxaspiro[4,4]non-3-eneの効率よい合成法を開発した。一方、(3)サントニン1から変換合成したパーオキシド誘導体とC_1-ユニットから新規トリオキサン型化合物を合成した。1の化学変換の過程で、(4)3-hydroxy-santoninのC_3位OH基の酸化的1,3-転移による2、3のセスキテルペン化合物の単行程合成に成功した。また、(5)3-hydroxy-1,2-dihydrosantoninの酸触媒下の脱水反応を検討し、セスキテルペンラクトン、dihydrocostunolideの合成中間体の新合成ルートを開拓した。(6)上述した各型のヒドロパーオキシド及びその誘導体についてPlasmodium bergheiに対するin vivoでの抗マラリア活性を検討した。その結果、(7)サントニン由来のヒドロパーオキシドの一つと2,3のフランのヒドロパーオキシエステル誘導体に抗マラリア活性を認めた。従って、"トリオキサン型でないヒドロパーオキシド隠蔽化合物の抗マラリア活性の存在"を仮定した本実験計画当初の作業仮設をある程度実証できた。(1)平成6年度の研究実施計画に従い、サントニン(1)から誘導合成した2を光増感酸素化反応に付してヒドロパーオキシド誘導体3(R=0C0Ph)を合成後、酸性条件下、メチルオルトホルメートと反応させ目的とする新規なトリオキサン型化合物4を得た。(2)各種アルコールの存在下、2、5-ジメチルフラン及び2-メチルフランを光増感酸素化反応に付しヒドロパーオキシド誘導体5a(R_1=CH_3 or H , R_2=CH_3, R_3=H, R_4=alky1)を合成した。続いて5aのヒドロパーオキシ基をパーオキシエステル及びパーオキシエーテルとして隠ぺいした化合物、5b及び5cを数種合成した。(3)以上合成した化合物についてその抗マラリア作用の検定を行った。現在のところ6、7に殺マラリア原虫作用が認められている。(4)抗マラリア作用の検定と平行してこの系統の化合物の効果の判定に適したスクリーニング法を種々検討し比較的短時間に効果の判定が可能な方法を確立した。前年度同様、2, 5-ジメチルフラン及び2-メチルフランのアルコール中での光増感酸素化により得られるフランのヒドロパーオキシド誘導体をパーオキシエステル及びパーオキシエステルとして隠蔽した化合物を合成し、抗マラリア活性の検定を行なった。また、構造活性相関の観点から、アルキル側鎖に水酸基をもつフラン誘導体とその光増感酸素化によるジオキシサスピロ型のヒドロパーオキシド誘導体の合成を行なった。この過程で各種の生理活性ジオキサスピロ型天然物の共通合成シントン、2-oxo-1,6-dioxaspiro[4, 4]non-3-eneの効率よい合成法を確立できた。一方、サントニン(1)から新規トリオキサン型化合物を誘導合成するため1の化学変換を行なったが、その際、(1) 1のDIBAL還元体、3-hydroxy-santoninの酸化剤による1, 3-oxidative rearrangementを利用した2、3の簡単なセスキテルペン化合物の単行程合成に成功した。また、(2) 1から誘導される

3-hydroxy-1, 2-dihydrosantoninのTsOH酸触媒存在下での脱水反応を検討し、セスキテルペンラクトン、dihydrocostunolideやtauremisinの合成前駆体の単行程合成法を開拓し、これらの形式的合成を達成した。
熱中症における血管内皮障害とその治療法の探索

熱中症では重症化すると重症敗血症にきわめて類似した病態を呈するため敗血症と同様、微小循環と血管内皮グリコカリックス(以下GCX)が障害されると推測される。主に集中治療室で使用されるデクスメデトミジン(以下DEX)はα2アドレナリン受容体に作用する鎮静薬で、ラット敗血症モデルにおいてDEXには抗炎症作用があり予後を改善することが報告されている。2018年度は熱中症において血管内皮GCXの障害が敗血症などと同様に起こっているかを確認し、続いてDEXの投与(5 mcg/kg/h)が血管内皮の障害に対して有用であるかを明確にすることとした。気温40°C、相対湿度60%に維持した自作の加温・加湿装置にWistarラットを全身麻酔後にsettingを行なった。大腿動脈収縮期圧が80 mmHg未満になった時点を熱中症の発症、10 mmHg未満になった時点を死亡と定義した。研究1)DEXによる生存率の影響は加温・加湿装置投入から2時間までの観察とした。sham群、熱中症群、sham+DEX群、熱中症+DEX群の4群(各群n=6 )として観察を行なったところDEXを投与された熱中症群では有意に生存率が高かった(89% vs 22%, p=0.004 )。研究2)GCXの評価と炎症反応・血管内皮障害の評価として熱中症を発症した時点でラットの心臓を摘出し、透過型電子顕微鏡でGCXの観察を行った。群はsham群、熱中症群、熱中症+DEX群の3群(各群n=6 )として心臓摘出の直前に採血を行い、GCXの障害の崩壊マーカーとなるシンデカンー1の測定をELISA法で行った。その結果、シンデカンー1は0.6±1.3, 9.7±5.9, 2.1±3.4 ng/ml(SHAM群,熱中症群、熱中症+DEX群の順、p=0.013)でDEX投与による血管内皮障害が抑制されたことが示された。DEXの効果が確かめられたことから今後新たにそのメカニズムについて解明したい。これまでの研究では主に現象に注目してその成果を確認できたが、なぜDEXの投与が効果的であるかは不明である。DEXはα2作動薬として働くほかα7ニコチン型アセチルコリン受容体にも作用することが知られている。これらの受容体に拮抗薬を用いることによりさらなる効果及びメカニズムの解明につなげたい。今後の研究として腸管絨毛の微小循環を評価するため全身麻酔下のラットに蛍光色素で標識した赤血球を投与する。ラットを気温40°C、相対湿度60%の環境で、熱中症を発症した時点で、ラットを装置から取り出し、回腸を体外に露出して、共焦点蛍光顕微鏡を用いて腸管絨毛血流を観察する。熱中症に対するデクスメデトミジン(以下DEX)の有効性の評価には同様の実験をDEX投与下で行い、血管内皮GCXの評価とサイトカイン・凝固因子の測定、生存時間の評価、腸管絨毛の微小循環の評価を行い、熱中症におけるDEXの有効性を再評価する。熱中症モデルラットにDEXを5 mcg/kg/hで投与する。DEX投与期間は、加温・加湿装置投入時点から実験終了までとする。最後に熱中症におけるDEXの作用機序の検討は同様の実験をDEXの投与に加えてα受容体の拮抗薬であるヨヒンビンもしくはα7ニコチン型アセチルコリン受容体を遮断するαブンガロトキシンの投与下で行う。血管内皮GCXの評価とサイトカイン・凝固因子の測定、生存時間の評価、腸管絨毛の微小循環の評価を行い、熱中症におけるデクスメデトミジンの作用機序の検討を行う。熱中症モデルのラットにDEX 5 mcg/kg/hの持続投与に加えてヨヒンビンを0.2 mg/kgの単回投与を行う。また、αブンガロトキシンの投与では熱中症モデルラットにDEX 5 mcg/kg/hの持続投与に加えてαブンガロトキシンを1 mcg/kgの単回投与を行う。αブンガロトキシンの投与は加温・加湿装置投入の15分前に行う。

sham群、熱中症群、sham+DEX群、熱中症+DEX群の4群(各群n=6 )として観察を行なったところDEXを投与された熱中症群では有意に生存率が高かった(89% vs 22%, p=0.004 )。研究2)GCXの評価と炎症反応・血管内皮障害の評価として熱中症を発症した時点でラットの心臓を摘出し、透過型電子顕微鏡でGCXの観察を行った。群はsham群、熱中症群、熱中症+DEX群の3群(各群n=6 )として心臓摘出の直前に採血を行い、GCXの障害の崩壊マーカーとなるシンデカンー1の測定をELISA法で行った。その結果、シンデカンー1は0.6±1.3, 9.7±5.9, 2.1±3.4 ng/ml(SHAM群,熱中症群、熱中症+DEX群の順、p=0.013)でDEX投与による血管内皮障害が抑制されたことが示された。DEXの効果が確かめられたことから今後新たにそのメカニズムについて解明したい。これまでの研究では主に現象に注目してその成果を確認できたが、なぜDEXの投与が効果的であるかは不明である。DEXはα2作動薬として働くほかα7ニコチン型アセチルコリン受容体にも作用することが知られている。これらの受容体に拮抗薬を用いることによりさらなる効果及びメカニズムの解明につなげたい。今後の研究として腸管絨毛の微小循環を評価するため全身麻酔下のラットに蛍光色素で標識した赤血球を投与する。ラットを気温40°C、相対湿度60%の環境で、熱中症を発症した時点で、ラットを装置から取り出し、回腸を体外に露出して、共焦点蛍光顕微鏡を用いて腸管絨毛血流を観察する。熱中症に対するデクスメデトミジン(以下DEX)の有効性の評価には同様の実験をDEX投与下で行い、血管内皮GCXの評価とサイトカイン・凝固因子の測定、生存時間の評価、腸管絨毛の微小循環の評価を行い、熱中症におけるDEXの有効性を再評価する。熱中症モデルラットにDEXを5 mcg/kg/hで投与する。DEX投与期間は、加温・加湿装置投入時点から実験終了までとする。最後に熱中症におけるDEXの作用機序の検討は同様の実験をDEXの投与に加えてα受容体の拮抗薬であるヨヒンビンもしくはα7ニコチン型アセチルコリン受容体を遮断するαブンガロトキシンの投与下で行う。血管内皮GCXの評価とサイトカイン・凝固因子の測定、生存時間の評価、腸管絨毛の微小循環の評価を行い、熱中症におけるデクスメデトミジンの作用機序の検討を行う。熱中症モデルのラットにDEX 5 mcg/kg/hの持続投与に加えてヨヒンビンを0.2 mg/kgの単回投与を行う。また、αブンガロトキシンの投与では熱中症モデルラットにDEX 5 mcg/kg/hの持続投与に加えてαブンガロトキシンを1 mcg/kgの単回投与を行う。αブンガロトキシンの投与は加温・加湿装置投入の15分前に行う。海外の研究者と交流する予定が変更になったため金額が過小となったが、次年度に計画を持ち越すためお願いしたい
トラフグ性決定遺伝子の遺伝学的同定とその応用

家畜などの経済動物の性統御には性決定遺伝子の情報が利用されている。水産分野においても性統御は重要なテーマであるが、性決定遺伝子が同定された例は研究開始時にはなかった。本研究では重要水産生物であるトラフグを材料として、性決定遺伝子の探索をおこなった。その結果、Amhr2遺伝子上にある一塩基多型がトラフグの性を決定していることを見出した。次に、この情報を利用して、迅速な性判別法を開発した。さらに、マーカーアシスト選抜により、トラフグの全雄作製に成功した。動物の性決定遺伝子は典型的な有用遺伝子であるが、水産分野では遺伝子本体の同定例がなかった。本研究では、水産魚類では初めてとなる性決定遺伝子の解明に迫る。1.トラフグの性決定遺伝子本体の遺伝学的な同定。関連解析の材料とするため、野生トラフグを採取した。これらの性決定遺伝子座周辺における連鎖不平衡の構造を解析したところ、その連鎖不平衡ブロックが著しく短いことを見出した。性決定遺伝子座を含むゲノム領域に、高密度に一塩基多型座マーカーを開発し、遺伝子型と性の表現型との関連を野生個体について調べたところ、抗ミュラー管ホルモンII型受容体(Amhr2)をコードする遺伝子内にオス特異的な一塩基多型を見出した。オスまたはメスに特異的な他の変異サイトは存在しないため、このDNA配列変異が性決定の責任変異であると考えられた。理論的には可能と考えられていたものの、このような性決定遺伝子(変異)の実例はこれまでなかった。大多数の変温脊椎動物動物の性決定遺伝子は未だ不明であるが、その中には、フグと同様に、性染色体のごく僅かな塩基差により性が決まっている種が多数あるのではないかと推測した。2.性決定遺伝子(Amhr2)の発現時期の特定。卵巣と精巣が形態的な分化を示さない時期から経時的にサンプリングを行い、XX型およびXY型個体におけるAmhr2の発現を調べた。その結果、Amhr2は形態分化以前から発現を開始し、Y染色体由来のmRNAがオスの生殖巣原器で発現していること、X染色体由来のmRNAはオスとメスの生殖巣原器で発現していることが分かった。3.Amhr2の機能解析。まず、Amhr2のY型アリル配列(約15kb)をクローン化して、それらの全塩基配列を決定した。このクローンをトラフグの受精卵に顕微注入した。トランスジーンを次世代へ伝達する個体を選び出すため、顕微注入したフグの飼育を継続している。4.性決定遺伝子応用法の確立。マーカーアシスト選抜を用いて、YY型の選抜と育成をおこなった。これの精子をXX型の卵と受精させて得られた子供を育成して生殖巣を調べた。その結果、すべての子供が雄であることが分かった。トラフグの精巣は、食品としての価値が高いが、これまで、全オス作出法は確立していなかった。本研究により、性決定遺伝子の同定という基礎研究の成果が応用的成果に結びついた。昨年までの研究により、トラフグの性はAmhr2遺伝子上の一塩基多型により決定されている可能性が強く示された。今年度は、Amhr2遺伝子に主な焦点を絞って以下の解析をおこなった。発現解析:卵巣と精巣が形態的な分化を示さない時期から経時的にサンプリングを行い、Amhr2の発現を、in situ hybridization法により調べた。その結果、Amhr2は形態分化以前から、生殖細胞を取り囲む一部の体細胞で発現しており、形態的分化が明瞭となってからも強く発現していた。Y染色体由来のmRNAとX染色体由来のmRNAの総量を測定したところ、雌雄間の差は認められなかった。従って、雌雄間の表現型の差は、主に一塩基置換に起因するタンパク質の機能差によってもたらされていると考えられた。遺伝子機能の証明:Amhr2のY型アリル配列をトラフグの受精卵に顕微注入して飼育した。トランスジーンを次世代へ伝達する個体の作出に成功した。トランスジーンによる機能獲得実験を完成させるべく、飼育を継続している。性決定遺伝子応用法:野生魚における雌雄判別マーカーを開発するため、性決定SNPとその周辺のSNP座の連鎖不平衡解析を行った。その結果、性決定SNPは野生個体の性と絶対連鎖不平衡にあることが示された。次に、このSNP座周辺の情報を利用することやゲノムDNA抽出方法を改良することで、以前より迅速に判が判定できる方法を開発した。性転換:上記の雌雄判別法を用いて、人工育成集団における性転換体出現の可能性について検討した。その結果、一部の人工育成集団内には、性転換体が高頻度で出現することがわかった。放流魚に性転換体が多く含まることは望ましくない。本研究で確立した性判別法は、適切な放流稚魚の作出に寄与すると考えられる。