hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
保育学生の子どもへの視点と記述の変化：映像／文章素材による検討

保育者を目指す学生、特に座学のみで実習経験がない段階の学生にとって、情報量の多い保育現場で子どもに対する視点を獲得するのは容易ではない。本研究は、4年制大学の保育学生を対象とする。映像/文章素材で保育エピソードを提示し、これらの素材や実習経験によって「子どもの姿」のとらえ方(注目する点や記述内容)がどのように異なるのかを検討する。短期比較(最初の実習前/後)は質問紙調査による量的検討、長期比較(最初の実習前/複数回の全実習終了後)は個別面接による質的検討を行う。
金属内包カーボンナノカプセルの新規製造法とその生成過程の研究

本研究により、20-85Torrのヘリウム圧力下でアーク放電法により調製したランタンフラーレン煤にはある種の前駆体が含まれ、その熱処理により前駆体は融合し、ランタンカーバイド内包カーボンナノカプセルへと成長することが明らかになった。19年度はまず始めに、アーク放電煤を1000-2500°Cで熱処理する装置の準備を行った。2000°Cを超える熱処理を実行するには通常はかなりの困難を伴うが、ごく少量のサンプルを処理する目的に限定すれば、比較的簡単に実施が可能である。この目的達成のため、フラーレン煤製造用のアーク放電試験装置を直流抵抗加熱用に改造した。真空または不活性ガス雰囲気下、陽極炭素棒を陽極炭素ブロックに押し当てた状態で通電すると、炭素棒の電気抵抗により電極部材自身がジュール発熱し、電極中央部が白熱する。炭素電極のうち温度が比較的均一な20年度は、放電試験の陽極に"ランタン酸化物・黒鉛コンポジット"(2.0 at% La、金属内包フラーレン製造用として(株)東洋炭素より市販)を用いて、ヘリウム圧力範囲(15-100Torr)のなかで最も低圧の15Torrと、より高圧側の85Torr、並びに範囲外の150Torrと300Torrを選び、それぞれの場合についてアーク放電煤の調製試験と評価を行った。この結果、低圧のHe圧15Torrの場合は、ランタンがアーク放電煤中にナノレベルで均一に分散せずに局在化するため、He圧20-46Torrで生成した煤中で観察されたようなナノカプセル前駆体構造が全く見られず、さらにこの煤を熱処理してもランタンカーバイド内包ナノカプセルが生成しないことがわかった。He圧85Torrの場合は、同20-46Torrの場合とほぼ同様の煤が生成することがわかった。一方同300Torrの場合、ランタンはアーク放電煤中にナノレベルで均一に分散するが、これを触媒として単層カーボンナノチューブがアーク放電煤中に生成する傾向があることがわかった。またこの煤を熱処理しても、ランタンカーバイド内包ナノカプセルは生成しないことがわかった。同150Torrの場合は、85Torrと300Torrの中間的な結果を示した。以上の結果をまとめると、He圧20-85Torrの範囲で生成したランタン含有アーク放電煤は、真空下で熱処理を行うとランタンカーバイド内包カーボンナノカプセルが生成する性質を示すが、この範囲外で生成した煤は、この性質を示さないことが明らかになった。
フィトクロム結合蛋白質の探索に関する共同研究

フィトクロム結合蛋白質の探索を行うため、本研究ではまずシダ植物のフィトクロム遺伝子をAdiantum capillus-venerisから単離することから始めた。現在は3年間のプロジェクトのうちの2年間が終了した段階であり、フィトクロム結合蛋白質の探索までには至らなかったが、3種類の遺伝子のクローニングがほぼ完了し、つぎの段階まで進めることができたことで、本研究は順調に遂行されたと判断している。以下に各実験の詳細を述べる。フィトクロム遺伝子のクローニングとその機能シダ植物のフィトクロム遺伝子をAdiantum capillus-venerisから単離し、3種類の異なる遺伝子が存在することを明らかにした。そのうちの2種は従来高等植物から得られているものと類似した構造を有していたが、第3のものは従来のフィトクロム遺伝子とは非常に異なり、N末端側はフィトクロムの配列を保持していながら、C末端側は蛋白質燐酸化酵素の構造であった。この燐酸化酵素部分はACGグループの配列に類似しており、生理活性に必要なアミノ酸は各ドメイン中に保存されていた。またこの3種類ともに、m-RNAの発現が確認された。これらのフィトクロムcDNAをもとに酵母内で発現させた蛋白質に外来の色素(フィコシアノビリン)を導入し、光可逆性の確認や、その他の性質を解析中である。(Lagariasとの共同研究)Lhcb遺伝子の発現の光調節ホウライシダの胞子を吸水させたのち各種の光照射を行って発芽を誘導し、発芽にともなうLhcb遺伝子の発現状況をイチョウのLhcb遺伝子の一部をプローブにして検索した。その結果Lhcbは明らかな赤/近赤外光による光可逆性がみられ、シダ植物では始めてのフィトクロムによる遺伝子発現調節が明らかになった。また発芽阻害に働く青色光は単独の照射では全くLhcbの発現は起こらないが、赤色光の照射後に短時間照射した場合には、わずかではあるがLhcbの遺伝子発現が見られることが分かった。このことは発芽の過程が途中まで進行しているが、胞子の殻を破って発芽するところまでは到達できないことを意味している。(Silverthorneとの共同研究)コケの原糸体における分枝制御Ceratodonの原糸体細胞に赤色偏光を照射すると、偏光の振動面と平行な細胞壁の部分から新たな原糸体が分枝する現象を発見した。これは分枝がフィトクロム依存の現象であり、しかもフィトクロムが原形質膜の配向して存在することを意味している。さらに原糸体の葉緑体は青色光によって光定位運動をするが配向したフィトクロムによっては定位運動しないことが明らかになった。シダ原糸体では配向したフィトクロムが葉緑体運動に関与していることと対比して興味ある事実である。(Hartmannとの共同研究)フィトクロム結合蛋白質の探索を行うため、本研究ではまずシダ植物のフィトクロム遺伝子をAdiantum capillus-venerisから単離することから始めた。

さらに原糸体の葉緑体は青色光によって光定位運動をするが配向したフィトクロムによっては定位運動しないことが明らかになった。シダ原糸体では配向したフィトクロムが葉緑体運動に関与していることと対比して興味ある事実である。(Hartmannとの共同研究)本年度は各グループは自己の材料についてのフィトクロム遺伝子のアミノ酸配列の解明に重点をおき、解析を行った。また相互協力による技術・知識の交換を行った。我々はホウライシダ(Adiantum capillus-veneris)遺伝子ライブラリーから、以前に解読したcDNAをプローブとして、新たに3種類のフィトクロム遺伝子を単離し、現在解読中である。その内の一つは、M末端は従来のフィトクロムの配列と共通であるが、C末端側は今までに一つだけコケで報告されているのもに類似の構造、すなわち蛋白質燐酸化酵素の作用ドメインを有していた。このことはフィトクロムの作用機作解析に非常に有効、かつ興味深いものである。また、アメリカのグループは藻類(Mesotaenium)のフィトクロムが六種類存在していること、その内少なくとも二つはアミノ酸配列がほとんど一致していることを明らかにした。ドイツのグループもコケ(Ceratodon)のフィトクロムのアミノ酸解析の結果従来知られていたものとは異なる従来型のフィトクロムの存在を明らかにした。単離した遺伝子の機構を明らかにするため、その遺伝子を相同組み替えの技術を使用して細胞内で破壊する方法、すなわちホモロガスリコンビネイションの可能性を追求した。シダでは35Sプロモーターに標識遺伝子としてGus遺伝子を接続したものを金粒子とともに細胞内に打ち込みその発現様式を確かめた。この結果遺伝子の細胞内導入が可能であることが分かった。一方、ドイツのグループはコケの相同組み換えに成功し、実用化にむけて研究をしており、日独の研究者交換により我々はその技術を学ぶことができた。またアメリカのグループは酵母を使用して、フィトクロム結合蛋白質の探索を行っており、我々も研究者派遣による相互乗り入れの結果、共同研究者としてその技術を修得した。フィトクロム遺伝子のクローニングとその機能シダ植物のフィトクロム遺伝子をAdiantum capillus-venerisから単離し、3種類の異なる遺伝子が存在することを明らかにした。そのうちの2種は従来高等植物から得られているものと類似した構造を有していたが、第3のものは従来のフィトクロム遺伝子とは非常に異なり、N末端側はフィトクロムの配列を保持していながらC末端側は蛋白質燐酸化酸素の構造であった。またこの3種類とともに、m-RNAの発現が確認された。これらのフィトクロムcDNAをもとに酵母内で発現させた蛋白質の性質を解析中である(Lagariasとの共同研究)Lhcb遺伝子の発現の光調節ホウライシダの胞子を吸水させたのち各種の光照射を行って発芽を誘導し、発芽にともなうLhcb遺伝子の発現状況をイチョウのLhcb遺伝子の一部をプローブして検索した。その結果、シダ植物では始めてのフィトクロムによる遺伝子発現調節が明らかになった。また発芽阻害に働く青色光も、赤色光の照射後に短時間照射した場合、胞子発芽は起こらなくとも、実際には青色光によってわずかに遺伝子の発現が見られることが分かった。(Silverthorneとの共同研究)
衝撃ひずみ負荷による軸索損傷と神経細胞間情報伝達の機能的解析

交通事故,コンタクトスポーツ,転倒等による頭部外傷は脳神経損傷を引き起こす.脳表の大脳皮質と脳底部の脳幹を連絡している軸索が,回転加速度に伴う引張り応力により断裂または損傷し,神経情報伝達が阻害されることが原因である.本研究では,引張応力により生じる神経組織の衝撃ひずみが神経細胞間の情報伝達にどのような影響を与えるかを検討するため,培養したラット脳神経細胞に引張ひずみを負荷し,軸索輸送物質であるアミロイド前駆体タンパク質を免疫蛍光染色した結果,軸索損傷により軸索輸送障害を引き起こし,細胞間情報伝達に影響を及ぼす可能性がある閾値は,ひずみ1522%,ひずみ速度2127/sであることを示した.外傷性脳損傷であるびまん性軸索損傷(Diffuse axonal injury: DAI)は,頭部に衝撃力が加わり,強制的な回転加速度により脳組織が変形し,神経軸索に引張応力が負荷されることで生じる病態である.本研究では,衝撃引張ひずみ負荷により誘発された軸索損傷と神経細胞間の情報伝達機能の関係を明らかにする.25年度は,DAI患者の脳内に多く発現が認められているβアミロイド前駆体タンパク質(beta-amyloid precursor protein: β-APP)に着目した.軸索輸送物質であるβ-APPは,引張損傷後の軸索膨張部位に蓄積し軸索輸送機能を低下させる.また,軸索球と呼ばれる軸索断裂部位への蓄積は,輸送機能の停止を引き起こす.頭部外傷時の脳組織変形による神経細胞の引張挙動を模擬可能な衝撃引張ひずみ負荷装置を用い,引張後の神経軸索のβ-APP蓄積を観察することで軸索損傷を定量的に評価した.本装置は,単軸引張が可能なPDMS(polydimethylsiloxane)製チャンバーに引張荷重を加えることで,チャンバー内に培養した神経細胞にひずみを負荷する.引張速度と引張変位を独立に制御することで,様々なひずみとひずみ速度を組み合わせることが可能である.ラット大脳皮質由来初代培養神経細胞に4種類の衝撃ひずみ(ひずみ[%]/ひずみ速度[/s]: 10/11, 15/21, 22/27, 30/38)を負荷し,負荷後3時間経過した神経細胞のβ-APPを免疫染色および蛍光観察した.軸索輸送が低下した神経細胞を軸索膨張にβ-APPが蓄積した細胞数で,軸索輸送が停止した神経細胞を軸索球にβ-APPが蓄積した細胞数で定量化した.その結果,ひずみ22%,ひずみ速度27 /s以上において軸索輸送障害を起こした細胞の割合,軸索球を持つ細胞の割合が共に有意に増加した.よって,神経細胞間の情報伝達機能を低下もしくは停止させる軸索損傷の閾値が,ひずみ1522%,ひずみ速度2127/sに存在することを示した.交通事故,コンタクトスポーツ,転倒等による頭部外傷は脳神経損傷を引き起こす.脳表の大脳皮質と脳底部の脳幹を連絡している軸索が,回転加速度に伴う引張り応力により断裂または損傷し,神経情報伝達が阻害されることが原因である.本研究では,引張応力により生じる神経組織の衝撃ひずみが神経細胞間の情報伝達にどのような影響を与えるかを検討するため,培養したラット脳神経細胞に引張ひずみを負荷し,軸索輸送物質であるアミロイド前駆体タンパク質を免疫蛍光染色した結果,軸索損傷により軸索輸送障害を引き起こし,細胞間情報伝達に影響を及ぼす可能性がある閾値は,ひずみ1522%,ひずみ速度2127/sであることを示した.頭部外傷による脳組織への衝撃ひずみは,脳神経細胞間を連絡する軸索に損傷を与え,神経情報伝達を阻害する.本研究では,衝撃ひずみ負荷により誘発された軸索損傷と神経細胞間の情報伝達機能の関係を明らかにする.複数の神経細胞を対象に,細胞体の配置と軸索の伸長方向を制御することで,1細胞単位での神経ネットワークを形成し,衝撃ひずみ負荷により損傷した軸索が,神経細胞間を機能的に連絡しているかどうかを定量的に解析する.本年度は,微細加工技術を用いた軸索伸長方向制御と衝撃負荷方向の違いによる軸索損傷評価を実施した.神経細胞を播種するための培養穴(φ6mm)と細胞体から伸長する軸索を直線的に配向させるためのマイクロトンネル(幅50μm,高さ50μm,長さ2mm×20本)を加工したPDMS(Polydimethylsiloxane)を用い,0°,45°,90°に配向させた軸索に対して単軸引張(ひずみ22%,ひずみ速度27/s)を負荷した.引張前,引張5分後から24時間後まで同一の細胞を観察し,軸索の断裂,膨張,退縮,消失といった形態変化を評価した.引張後の断裂は,引張方向に対して0°(平行)もしくは90°(垂直)に配向させた軸索に多く観察された.しかし,90°に配向させた軸索は,引張後の膨張が1時間以内の一過性の増加だったのに対し,0°に配向させた軸索は引張24時間後まで膨張数が増加した.これらの結果より,軸索の長軸方向と円周方向で神経損傷の異方性があることが示唆された.

また,軸索の退縮,消失に関しては全ての条件において同程度であったが,その理由として,本実験において神経細胞に負荷したひずみの大きさと速度が,軸索の断裂や膨張といった1次損傷は引き起こすが,軸索の退縮や消失といった2次損傷には至らない軸索損傷条件だったことが考えられる.当初の計画通り,本年度は,微細加工技術を用いた軸索伸長方向制御と衝撃負荷方向の違いによる軸索損傷評価を実施した.フォトリソグラフィ技術やモールディング技術を習得し,高精度で再現性の高いマイクロトンネルを作成することができるようになった.また,マイクロトンネル内へ軸索が伸長する割合や,軸索伸長後のマイクロトンネル剥離による細胞生存率といった基礎検討も実施済みであり,本実験手法の再現性,有効性についても十分に検討した.次年度は,衝撃ひずみによる軸索損傷と情報伝達機能の関係を明らかにする.マイクロトンネルを用いてネットワーク形成させたラット大脳皮質神経細胞に単軸引張を負荷し,ひずみの大きさ,速度,作用方向の違いと軸索の損傷程度について検討する.軸索損傷の評価には,顕微鏡観察による軸索の形態変化に加え,免疫染色法によるβ-アミロイド前駆体タンパク質(β-APP)の観察や電気生理学的手法による神経活動電位の計測を実施する.β-APPは頭部外傷後の軸索損傷マーカーとして知られている.また,神経細胞内の活動電位の移動(伝導)や神経細胞間の活動電位の移動(伝達)を細胞外電位記録により評価する.今年度は,細胞培養が効率良く進んだため,脳神経細胞や培養試薬の購入回数が当初計画より少なくなり,直接経費の未使用額が発生した.次年度は,脳神経細胞や培養試薬,軸索やアミロイド前駆体タンパク質を可視化するための抗体や蛍光試薬,培養チャンバーやマイクロトンネルを作成するためのPDMSに使用する.また神経活動電位計測に必要なアンプや電極プローブに使用する.
オゾンマイクロバブルと省エネ型嫌気好気法による食品加工廃棄物からのエネルギー創出

本研究では、飲食店や食品加工の厨房施設において、産業廃棄物として処理・処分されてきたグリストラップ内の油脂排水をオゾンマイクロバブルで生物分解し易い物質に分解させ、それを省エネ型嫌気好気法によってメタンエネルギーへと再資源化するシステムを提案した。省エネ型嫌気好気法の室内連続実験を行った結果、処理水質は原水の高負荷での濃度変動にも関わらず低濃度で安定した水質を維持することができたが、冬期の処理水温の低下は処理水質に著しい影響を及ぼすことが確認された。また、メタンガスの回収性能については、比較的高負荷時で80%程度の実用利用可能な高いメタン分圧を維持することができた。本申請の研究は、飲食店や食品加工の厨房施設において、産業廃棄物として処理・処分されてきたグリストラップ内の堆積油脂を、オゾンマイクロバブルで生物分解し易い物質に分解させ、それを省エネ型嫌気好気法によってメタンエネルギーへと再資源化するシステムを提案し、その有効性及び実用性を実験的に検討するものである。この研究の成果は、食品加工廃棄物からのエネルギー再資源化技術の開発、循環型社会への転換、地球温暖化防止対策に大いに貢献でき、技術的かつ社会的な意義は高いといえる。平成27年度は、グリストラップ堆積油脂を省エネ型嫌気好気法によって再資源化を検討する前段階として、オゾンマイクロバブル室内実験装置を製作して、油脂を効果的に嫌気処理し易い物質に変換するための諸条件を明らかにすることを目的とした。オゾンガスは紫外線ランプ式発生機で生成させ、そのオゾン含有空気をマイクロバブルにして100Lの試料が入った密閉ポリタンクに供給した。マイクロバブルは気液せん断式によって発生させ、オゾン濃度は紫外線吸収式オゾン濃度計で測定した。試料は高知工業高等専門学校学生食堂の厨房施設に設けられたグリストラップに堆積した油脂を使用し、時間経過に対して、pH、有機物(CODcr)濃度、油脂(n-ヘキサン抽出物質)濃度、各種高級脂肪酸の濃度を分析した。回分実験の結果、マイクロバブルでオゾンを供給すると、オゾン供給しない場合と比較して明らかな油脂濃度及び高級脂肪酸濃度の減少を確認することができた。また、処理温度の上昇による油脂の分解性の向上も期待できることが示唆された。現在までの成果として、油脂分解へのオゾンマイクロバブルの効果は確認することができた。しかし、オゾンマイクロバブル室内実験装置の製作や油脂の分析条件の検討などに時間を要したことで、その効果的なオゾン濃度や処理温度を見つけるところまで行うことができていない。現在、条件を変えて回分実験を繰り返し、データの再現性を確認しているところであり、28年度前半には検討を終える予定である。本申請の研究は、飲食店や食品加工の厨房施設において、産業廃棄物として処理・処分されてきたグリストラップ内の油脂排水をオゾンマイクロバブルで生物分解し易い物質に分解させ、それを省エネ型嫌気好気法によってメタンエネルギーへと再資源化するシステムを提案するものである。平成27年度は、グリストラップ油脂排水を省エネ型嫌気好気法によって再資源化を検討する前段階として、オゾンマイクロバブル室内実験装置を製作して、油脂を効果的に嫌気処理し易い物質に変換するための諸条件を明らかにした。オゾンガスは紫外線ランプ式発生機で生成させ、そのオゾン含有空気をマイクロバブルにして排水が入った密閉ポリタンクに供給した。排水は高知工業高等専門学校学生食堂の厨房施設に設けられたグリストラップから採取したものを使用し、時間経過に対して水質分析を行った。その結果、マイクロバブルでオゾンを供給すると、明らかな油脂濃度及び高級脂肪酸濃度の減少を確認することができ、処理温度の上昇による油脂の分解性の向上も期待できることを確認した。平成28年度は、2槽直列式UASB反応槽とDHS反応槽を組み合わせた省エネ型嫌気好気法の室内実験装置を製作した。1槽目UASB槽では油脂及び高級脂肪酸の分解、2槽目UASB槽では低級脂肪酸を分解してメタン生成を行い、後段のDHS槽では処理水を安定的に清澄化させるシステムである。オゾンマイクロバブルで前処理した油脂排水を原水タンクに投入し、苛性ソーダでpH調整後、原水ポンプによりUASB反応槽に供給した。UASB槽内の水温は流入水を温水循環装置で加温することで調節した。原水及び各反応槽の処理水は定期的に採水し、pH、SS、BOD、CODcr、n-ヘキサン抽出物質などの水質分析を行い、流入負荷に対する処理水質やメタン生成状況などを確認した。オゾンマイクロバブルは油脂分解に効果があることを確認し、それにより前処理された排水を使用して省エネ型嫌気好気法の室内装置によって連続処理実験を継続中である。現在までの成果として、UASB反応槽を30°C程度に維持し、CODcr容積負荷を23kg/m&sup3;・日まで徐々に増加させたが、DHS処理水は排水基準を十分に満足する良好な水質が得られている。また、UASB反応槽のメタンガス量はCODcr容積負荷に応じて増加し、メタン含有率は5060%の値を確認した。この連続実験の実施と合わせて、排水中に含まれる油脂及び高級脂肪酸の嫌気分解性を促進させる条件をバイアル実験によって確認する予定であったが、使用する汚泥が量的に不足していたため実験に着手できていない。今後、汚泥が確保でき次第検討を始める予定である。

平成27年度は、グリストラップ油脂排水を省エネ型嫌気好気法によって再資源化を検討する前段階として、オゾンマイクロバブル室内実験装置を製作して油脂の分解実験を行った。その結果、マイクロバブルでオゾンを供給すると、明らかな油脂濃度及び高級脂肪酸濃度の減少を確認することができ、処理温度の上昇による油脂の分解性の向上も期待できることを確認した。平成28年度は、2槽直列式UASB反応槽とDHS反応槽を組み合わせた省エネ型嫌気好気法の室内実験装置を製作し、反応槽内微生物の馴致運転を行った。1槽目UASB槽では油脂及び高級脂肪酸の分解、2槽目UASB槽では低級脂肪酸を分解してメタン生成を行い、後段のDHS槽では処理水を安定的に清澄化させるシステムである。平成29年度は、省エネ型嫌気好気法の室内連続実験を行い、処理水質とメタン生成状況について検討した。処理水質は原水の高負荷での濃度変動にも関わらず低濃度で安定した水質を維持することができ、嫌気処理水中には高級脂肪酸はほとんど検出されず、非常に良好な処理性能が確認されたが、冬期の処理水温の低下は処理水質に著しい影響を及ぼすことも確認した。メタンガスの回収性能については、比較的高負荷時で80%程度の実用利用可能な高いメタン分圧を維持することができた。以上より、本研究において厨房油脂排水に生物学的処理法を適用したメタンエネルギー回収技術の基本性能を確認することができた。今後は水温低下時における効率的な運転方法の検討を継続していくことで実用性をさらに高めていくことが課題である。本研究では、飲食店や食品加工の厨房施設において、産業廃棄物として処理・処分されてきたグリストラップ内の油脂排水をオゾンマイクロバブルで生物分解し易い物質に分解させ、それを省エネ型嫌気好気法によってメタンエネルギーへと再資源化するシステムを提案した。省エネ型嫌気好気法の室内連続実験を行った結果、処理水質は原水の高負荷での濃度変動にも関わらず低濃度で安定した水質を維持することができたが、冬期の処理水温の低下は処理水質に著しい影響を及ぼすことが確認された。また、メタンガスの回収性能については、比較的高負荷時で80%程度の実用利用可能な高いメタン分圧を維持することができた。これまでの申請者の研究では、油脂や高級脂肪酸の成分や濃度が高いと嫌気性微生物に阻害影響を与えることが確認されている。平成28年度は、試料に含まれる油脂及び高級脂肪酸の嫌気分解性を促進させる条件をバイアル実験によって確認を行う。バイアル実験には122mLのバイアル瓶を使用し、適量の無機塩類、pH緩衝剤、還元剤が入った培地に油脂で培養した嫌気性汚泥とテスト基質を投入する。気相部を窒素ガスで置換後、ブチルゴム栓で密栓する。所定温度に設定した恒温槽に入れて連続振とう培養を行い、経過時間毎に培養液を採取して油脂、高級脂肪酸、低級脂肪酸の濃度を分析して、各々の条件(テスト基質の種類や濃度、培養温度など)における分解速度を確認する。このバイアル実験による検討を行う一方で、省エネ型嫌気好気法の室内連続実験装置の製作を行っていく。
初期中世アイルランドの法と社会-法律文書編纂の経緯と法・裁判システムの実態の解明

研究課題の目的である初期中世アイルランドにおける法律文書編纂過程および裁判システムの解明のために、これまでフィリ(fili)、教会聖職者らの役割、世俗裁判と教会裁判の関係について研究を進めてきたが、本年度は主に以下の研究を行った。昨年度から引き続き、判決人(brithem)および弁護人など関連の職業について考察を行った。その際には、未翻訳・未編纂史料を重点的に読み進めた。さらに法文書以外の傍証史料(主として年代記)についても網羅的に検討した。その考察の一端は英語論文としてまとめることができた。また、世俗支配者の裁判における役割についても史料の分析と考察を進めた。昨年、一昨年からの研究内容と合わせて、初期中世アイルランドの裁判やその他の紛争解決に携わった各種の人々に関する個別の検討を終えた。その上で、これまでの成果をもとに、訴訟に携わった人々の関係やそれぞれの固有の役割、世俗裁判と教会裁判の関係、そのなかでもとりわけ世俗の裁判のシステムの全容についての考察を行った。ほぼ同時代のブリテン島や西ヨーロッパとの比較も加味しつつ、アイルランドにおける政治社会情勢の特徴との関連についても分析を行うことで、初期中世アイルランドの裁判や紛争解決制度の特質について、新しい像を提示する展望が開けた。本年度内には公刊の機会を得なかったが、早急に内容をまとめ成果の発表を行いたい。研究課題の目的である初期中世アイルランドにおける法律文書編纂過程および裁判システムの解明の研究の最初の段階として、本年度は主に以下の研究を行った。1.主要な法律文書テキストの翻訳作業大量の法律文書の中から、特に文書編纂過程および裁判制度に関する史料となるものを選び、精読・翻訳を行なった。主なものは『クリース・ガヴラハ』、『ウラケフト・ベグ』、『ウラケフト・ナ・リアル』、『コールス・ベスグニ』、『アダムナーン法』である。その中で特に『アダムナーン法』は、教会裁判制度と世俗の裁判制度の関係を考察するため、またより広く当時の教会と社会の関係を考える上でも非常に重要な史料であり、翻訳に詳細な訳註および解説を付して、共著論文として発表した。その際、法律テキスト部分の翻訳および註を全面的に分担した。2.7、8世紀アイルランドの裁判制度における世俗裁判と教会裁判の関係に関する研究教会および世俗の裁判権の関係は、この時期のアイルランドにおける大きな研究課題であり、本研究課題の中でも重要な位置を占める。翻訳を行なった史料に基づいて、7、8世紀のアイルランドにおいて既存の世俗裁判権・法と教会の裁判権・教会法がどのような関係におかれていたか、またどのような関係であるべきだと考えられていたのかを考察した。大きな問題であり、結論を得るには至っていないが、経過報告として2004年10月日本ケルト学会年次大会において研究発表を行なった。この問題に関しては、今後、教会側の史料についても、さらに考察を深めることが必要である。3.初期中世アイルランドの記述文化についての考察研究課題を進めるために、前提として行なわなければならない研究である。アイルランドの文字文化、記述文化はキリスト教教会の影響を受けて6世紀以降始まり、7世紀に本格化する。法律文書もこの初期の記述文化隆盛期に書かれた。比較的歴史の浅い文字文化であり、また教会の影響が色濃いなかで、世俗の法律文書がどのような経緯で、どのような人間によって編纂されたのかを考察するためには、初期の記述文化の考察が不可欠だからである。初期中世のヨーロッパ大陸やアングロ・サクソン時代のイングランド等とも比較しつつ、人材・内容・記述スタイルや目的などの諸側面についてアイルランドの記述文化の特徴を探った。その成果を日本ケルト学会の連続コロキウム「外来文化受容と土着記述分化の成立」の一貫として報告した。4.ダブリンにおける史料収集と学会参加アイルランドのトリニティ・カレッジ図書館で法律関係の史料収集を行ない、また現地研究者から研究課題について助言を得た。また現地の中世史学会に参加し、最新の研究成果を知ることができた。研究課題である初期中世アイルランドにおける法律文書編纂過程および裁判システムの解明のための研究の一環として、本年度は主に以下の研究を行った。1.史料研究前年度に引き続き、古アイルランド語法律文書特の文書編纂過程および裁判制度に関する史料を中心に、精査と翻訳作業を行った。主な文書として、『ブレサ・ネヴェド』『クリース・ガヴラハ』『カーン・ポードリグ』『カーン・ウシルヴェ』、そのほか断片史料等がある。本年度は、カーンと呼ばれる一連の教会法令についても集中的に調査を行った。また、研究の中心的課題ではないが、古アイルランド法を含む中世法律史料の翻訳をめぐる諸問題についての報告と問題提起を、日本ケルト学会研究会(2006年1月)において行った。2.7、8世紀アイルランドの裁判制度における世俗裁判と教会裁判の関係に関する研究教会および世俗の裁判権の関係は、この時期のアイルランドにおける大きな問題であり、本研究課題の中でも重要な位置を占める。昨年に引き続きこの問題の考察を行ったが、本年度は特にカーン史料を用いて、教会・教会法と世俗の政治権力や社会との関係を探った。その成果の一端を、日本アイルランド協会歴史研究会の研究会(2005年7月)および西洋中世の教会と社会研究会において、それぞれ異なる史料と問題観点から報告した。3.7、8世紀アイルランドにおける判決人裁判・紛争解決に関わった様々な人のうち、最も専門的職業として法に携わった世俗の判決人について、史料をまとめ考察する作業を行った。

更に、判決人以外の関係者、即ち、世俗権力者、教会、フィリ(詩人)等との関係についても考察を進めている。本年度内には報告等には至らなかったが、引き続き来年度の課題としたい。4.史料収集と学会参加2005年11月にダブリン高等研究所主催の学会への参加および現地での資料収集を予定していたが、大変遺憾ながら、直前に脚の筋断裂を負ったため渡航することを得なかった。その分の予算を図書の購入に当てさせていただいた。研究課題の目的である初期中世アイルランドにおける法律文書編纂過程および裁判システムの解明のために、これまでフィリ(fili)、教会聖職者らの役割、世俗裁判と教会裁判の関係について研究を進めてきたが、本年度は主に以下の研究を行った。昨年度から引き続き、判決人(brithem)および弁護人など関連の職業について考察を行った。その際には、未翻訳・未編纂史料を重点的に読み進めた。さらに法文書以外の傍証史料(主として年代記)についても網羅的に検討した。その考察の一端は英語論文としてまとめることができた。また、世俗支配者の裁判における役割についても史料の分析と考察を進めた。昨年、一昨年からの研究内容と合わせて、初期中世アイルランドの裁判やその他の紛争解決に携わった各種の人々に関する個別の検討を終えた。その上で、これまでの成果をもとに、訴訟に携わった人々の関係やそれぞれの固有の役割、世俗裁判と教会裁判の関係、そのなかでもとりわけ世俗の裁判のシステムの全容についての考察を行った。ほぼ同時代のブリテン島や西ヨーロッパとの比較も加味しつつ、アイルランドにおける政治社会情勢の特徴との関連についても分析を行うことで、初期中世アイルランドの裁判や紛争解決制度の特質について、新しい像を提示する展望が開けた。本年度内には公刊の機会を得なかったが、早急に内容をまとめ成果の発表を行いたい。
食物アレルギーにおける食物アレルゲンを発現する乳酸菌ワクチン研究

オボアルブミン(OVA)産生遺伝子組換え乳酸菌をマウス経口投与後、OVAとアラムの腹腔内投与を行った。しかし、乳酸菌のOVA産生能の低いため、OVA特異的IgEの抑制は認められなかった。OVAとこの乳酸菌を混合して経口投与すると、OVA特異的IgEの抑制効果は10μgから強い抑制が認められた。この結果によって、混合投与するだけでも強い抑制が認められることが分かった。食物アレルギーのイヌにおいて約10%が卵白粗抗原IgE陽性さらにその中の75%はOVAに陽性を示した。本研究によって、アレルゲンと乳酸菌の混合投与によるイヌの食物アレルギーの治療法が確立できる可能が示唆された。H27年度は作製したオボアルブミン(OVA)産生遺伝子組換え乳酸菌(OVA産生乳酸菌)をマウス投与して、産生されたOVAがマウスに抗原として認識されているか検討を行った。最初にOVA産生乳酸菌(50億個)をBalb/cマウス胃内投与(9日間6回投与)後、16日目、28日目にOVA(10ug)とアラム・アジュバント(2mg)の腹くう内投与(2回)を行った。また、14日目、35日目に血清を採取してOVA産生乳酸菌群と非投与群においてOVA特異的IgE,IgG1,IgG2a,IgAを測定したが有意な差は認められなかった。また、38日目にOVAを投与によるアナフィラキシー反応の誘導試験を行ったところ、OVA産生乳酸菌群のアナフィラキシー反応の軽減の傾向は認められたが、有意な差は投与群および非投与群の間で認められなかった。同時にマウスから脾臓細胞を採取してOVA特異的なTreg細胞の誘導を調べてところ、有意な差は投与群および非投与群の間で認められなかった。H27年度においてOVA産生乳酸菌を作製し、予備的実験としてマウスでの投与実験を行った。特異的IgE産生抑制やアナフィラキシー反応の軽減においてOVA産生乳酸菌投与群と非投与群と有意差がなかった。マウスに投与した乳酸菌数は50億個と十分量であることから、この原因としてOVA産生乳酸菌のOVAの発現量が不十分と考えられた。すなわち、乳酸菌にOVA遺伝子などの遺伝子を乳酸菌に挿入してそれぞれタンパクを発現できる技術等は確立できたが、経口投与でも十分にそのタンパクが免疫系に認識できるほどの量を発現できなかったと思われる。H28年度は経口接種において免疫系に認識されるOVA(オボアルブミン)量を検討するため、3週間にわたってOVAタンパクと乳酸菌を経口投与後、OVAとアラム・アジュバントのマウスの腹くう内投与を2回行って有効なOVA量の検討を行った。経口投与したOVA量は1μgから10mgであった。最終的なOVAとアラム・アジュバントの腹くう内投与1週間後にマウスから採血を行い、OVA特異的IgEの測定をELISA法で行った。OVA特異的IgEの抑制効果は用量依存的な抑制が見られ、10μgのOVA経口投与した群でもOVA特異的IgE抗体の抑制が認められた。この結果によって、OVA発現乳酸菌ワクチンにおいて、10μg以上のOVAの含有量が必要と考えられた。また、H28年度は食物アレルギーを示す82頭のイヌにおけるOVAに対するIgE抗体の反応性をELISA法を用いて検討した。最初に一般的な食物アレルゲンである卵白の粗抗原に対するIgE抗体を測定したところ、82頭中8頭(9.8%)が陽性を示した。さらにこの粗抗原に対するIgE陽性の8頭においてOVA特異的IgE抗体が存在するか調べたところ、8頭中6頭(75.0%)はOVAに陽性を示した。上記のELISA法で得られた結果の検証のため、ウェスタンブロット法を行った。ウェスタンブロットにおいてもOVA特異的IgE抗体が検出された。この結果によって、OVAがイヌの主要な卵白精製抗原だということが示唆された。H28年度において経口接種において免疫系に認識されるOVA(オボアルブミン)量を検討するため、OVAタンパクと乳酸菌を経口投与後、OVAとアラム・アジュバントのマウスの腹くう内投与を有効なOVA量の検討を行った。現在、OVA発現乳酸菌ワクチン中に含まれるOVA量はngレベルでμgレベルには達していない。また、OVA発現乳酸菌ワクチンを自然発症の食物アレルギー犬に臨床応用を検討するための基礎的検討としてアレルギー犬の血清中のOVA特異IgE抗体の測定を行った。食物アレルギー犬82頭中8頭でOVA特異IgE抗体が検出された。今後、これらの自然発症の食物アレルギー犬での研究の可能性が開かれたオボアルブミン(OVA)産生遺伝子組換え乳酸菌(OVA産生乳酸菌:分泌型乳酸菌)をマウス経口投与後、OVAとアラムの腹腔内投与を行った。しかし、OVA産生乳酸菌群と非投与群においてOVA特異的IgEに有意な差は認められなかった。最終年度はOVA産生能の高い乳酸菌の作成を試みた。OVAを菌相表面に表現させる結合型OVA産生乳酸菌を作成したが、十分な産生が得られなかった。また、分泌型乳酸菌も新しく作成したが十分な産生能を有する乳酸菌が作成できなかった。経口投与のOVA量を検討するため、OVAタンパクと乳酸菌を混合して経口投与後、OVAとアラムのマウス腹腔内投与を行って有効なOVA量の検討を行った。OVA

特異的IgEの抑制効果は1μgから見られ、10μgから強い抑制が認められた。この結果によって、混合投与するだけでも強い抑制が認められることが分かった。近年、ヒトの食物アレルギーにおいて、安全な量を経口投与することにより、アレルギーを緩和する方法が主流になってきた。本研究によって、少量の原因アレルゲンとこの乳酸菌を同時に経口投与することにより、症状の緩和を行える可能性が示唆された。イヌの食物アレルギーにおいて除去療法が主体で、詳細な免疫学的研究が行われていなかった。食物アレルギーのイヌにおける原因アレルゲンの診断として卵とOVA特異IgE反応性を検討した。約10%が卵白粗抗原IgE陽性さらにその中の75%はOVAに陽性を示した。この研究成果は2016年に論文として発行した。さらに他のアレルゲン特異IgE反応性について検討し、約20%に魚特異IgEおよび約30%に牛乳魚特異IgEが存在することが分かり、現在、投稿準備中である。本研究によって、様々な特異IgE抗体を調べ、アレルゲンと乳酸菌の投与による食物アレルギーに対する治療法が獣医学領域において確立できる可能が示唆された。オボアルブミン(OVA)産生遺伝子組換え乳酸菌をマウス経口投与後、OVAとアラムの腹腔内投与を行った。しかし、乳酸菌のOVA産生能の低いため、OVA特異的IgEの抑制は認められなかった。OVAとこの乳酸菌を混合して経口投与すると、OVA特異的IgEの抑制効果は10μgから強い抑制が認められた。食物アレルギーのイヌにおいて約10%が卵白粗抗原IgE陽性さらにその中の75%はOVAに陽性を示した。本研究によって、アレルゲンと乳酸菌の混合投与によるイヌの食物アレルギーの治療法が確立できる可能が示唆された。H28年度では本研究で行う実験で経口接種において免疫系に認識されるOVA量を検討するため、OVAタンパクと乳酸菌を投与後、OVAとアラム・アジュバントの腹くう内投与を行って有効なOVA量を決定する。さらに上述の実験において推定されたOVAの発現量を目安にOVA産生遺伝子組換え乳酸菌の作製をやり直す予定である。作製し直したOVA産生遺伝子組換え乳酸菌を使用してOVAのT細胞エピトープを発現するトランスジニックマウス(DO11.10)での実験を行う。H29年度では1回の投与量で10μg以上のOVA発現量を目安にOVA産生遺伝子組換え乳酸菌の作製をやり直す予定である。さらに並行して大腸菌でOVA組み換え体を作製してそのOVAを乳酸菌の表面に結合させるOVA結合乳酸菌ワクチンの作製も併せて行う予定である。この方法であれば、十分量(10μg以上)のOVAを乳酸菌に結合させたワクチンが比較的簡単に作製できると考えられる。また、本研究において、初めて自然発症の食物アレルギー犬においてOVAがアレルゲンになっていることが明らかになった。OVAと乳酸菌を組み合わせた食物アレルギーワクチンにおける臨床応用に可能性も開かれた。本年度もさらに食物アレルギー犬におけるOVAの反応性を詳しく解析する予定である。
ピルビン酸合有フォスフォノ糖脂質の機能と構造に関する研究

1。ピルビン酸含有フォスフォノ糖脂質、FGLーIIa,FGLーVの構造ー私共の過去の研究は、アメフラシ神経から分離されたフォスフォノ糖脂質FGLーIIbは非防元末端糖として、ピロビン酸を結合したガラクト-スを有し、FGLーIIbに対して作成した抗血清は、薄層板上、FGLーIIa,FGLーVを含む数種の糖脂質と反応することを明らかにした。(1)FGLーVの構造ーアメフラシ神経組織のアセトン粉末100gから、主としてシリカゲルクロマト法により16.6mgの純粋なFGLーVを得た。呈色分析、アミノ酸分析、ガスクロマト分析、メチル化分析、negative ionFABーMS, AA1BBHーNMR等によってその構造は下図の如く決定された。(2)FGLーIIaの構造ーアセトン粉末100gから2.5mgの純粋なFGLーIIaを得た。FGLーVにほぼ準じて分析し、下図の如く構造を決定した。2.ピルビン酸含有フォスフォノ糖脂質の組織分布に関する研究ー抗FGLーIIb抗体はアメフラシ組織のうち、神経線椎束のみを染める。染め出されるのは軸索周囲小型細胞の膜か、周囲結合織で、兔疫電顕で確認中である。3.ピルビン酸含有フォスフォノ糖脂質の機能に関する研究ー本脂質群の構造および分布の特異性から、突起伸展に対する関与を明らかにするため、(1)アメフラシ単離神経細胞からの突起伸展、(2)継代培養ニュ-ロンからの突起伸展および(3)神経節に連絡する神経線椎束からの突起伸展に対する本脂質群の効果を検べた。現在迄(3)の実験系において僅かに効果が認められたが、更に確証を得るために実験を継続する計画である。1。私共の従来の糖脂質特に神経系糖脂質についての研究は、生物学的に特に神経生物学的に重要な機能を営んでいると想像されている酸性糖脂質ガングリオシドは、人類に至る新口動物の系統には存在するが昆虫に至る旧口動物の系統には存在しないこと、旧口動物の中で、記憶等の神経生物学的研究に頻用されるAplysiaの神経組織には30種以上のフォスフォノ糖脂質が含まれていること、それ等糖脂質の基本骨格はGalNAcαl→3Galβl→4Glcβl→lCeramideで、Galの2-OHにfucoseあるいはgalactoseで側鎖結合をし、少くも3種の稀な構造を持った糖が非還元末端糖としてGalNAcに結合していること、更に13ケの2-アミノエチルフォスフォン酸が糖鎖に結合していることを明らかにした。本研究が対象としたのは非還元末端糖として3,4-0-(l-carboxyethylidene)galactoseを有する一群のフォスフォノ糖脂質で、この一群の糖脂質は、私共がFGL-IIbと命名した3,4-0-(l-carboxyethylidene)Galβ→3GalNAcαl→3[Fucαl→2](2-aminoethylphosphonyl→6)Galβl→4Glcβl→1lceramideに対する兎抗血清(ポリクロ-ナル)と反応するもので、FGL-IIbの他、FGL-I,FGL-IIa,FGL-V,F-9等が含まれる。FGL-IIbは、そのカルボキシル基を化学的に修飾することによって抗血清との反応が失われることから、上記の糖脂質はすべて同一非還元末端を有するものと考えられた。

分析の結果、FGL-IIaは3,4-0-(l-carboxyethylidene)Galβl→3GalNAcαl→3[6′-O-(2-aminoethylphosphonyl)Galαl→2]Galβl→4Glcβl→lCer.,FGL-Vは3,4-0-(1-carboxyethylidene)Galβl→3GalNAcαl→3[6′-0-(2-aminoethylphosphonyl)Galαl→2](2-aminoethylphosphonyl→6)Galβl→4Glcβl→lCer.の構造を持つことを明らかにした。更に、これ等ピルビン酸結合ガラクト-スを非還元末端に持つ糖脂質がAplysiaの神経線維束中、神経軸索を囲む小型細胞あるいは軸索間の細胞間隙に存在することを免疫組織学的方法で明らかにすることが出来た。1.ピルビン酸含有フオスフオノ糖脂質の構造に関する研究ー私共はガングリオシドを持たない旧口動物の系統のうち、海産腹足軟体動物アメフラシ特に神経組織中に、アミノフオスフオノ化合物を持つスフィンゴ糖脂質が多数含まれていることを見付けた。更に最近この中にピルビン酸を含むものがあることを見付けその構造を明らかにすることが出来た。FGLーIIb:3,4ーOー(1ーcarboxyethylidene)Galβ1→3GalNAcα1→3[Fucα1→2](2ーaminoethylphosphonyl→6)Galβ1→4Glcβ1→lceramide;FGLーIIa:3,4ーOー(1ーcarboxyethylidene)Galβ1→3GalNAcα1→3[6'ーOー(2ーaminoethylphosphonyl)Galα1→2]Galβ1→4Glcβ1→1cer.;FGLーVは3,4ーOー(1ーcalboxyethylidene)Galβ1→3GalNAcα1→3[6'ーOー(2ーaminoethylphosphonyl)Galα1→2](2ーaminoethylーphosphonyl→6)Galβ1→4Glcβ1→1cer.更に^1HーNMRの結果ピルビン酸はガラクト-スに対しSー型で、3,4位の水酸基と結合していることが明らかになった。2.ピルビン酸含有フオスフオノ糖脂質の組織分布に関する研究ーFGLーIIbに対し家兎に作成した抗血清は、本糖脂質群のピルビン酸を認識する。アメフラシの組織では神経線維束のみが強く染まる。目下免疫電顕により、正確な本糖脂質群の細胞及び細胞下分布の確認を試みている。3.ピルビン酸含有フオスフオノ糖脂質の機能に関する研究ー本脂質群の構造と分布の特異性とから、その生物活性として神経突起伸展、或いは神経束形成への関与が考えられる。3種の培養系(アメフラシ単離神経細胞、継代培養ニュ-ロン、神経節)を用い本脂質群の効果を検べた。神経節の系で僅かに効果が認められたが、確証を得るために更に実験を継続する計画である。
海産真核性微生物を宿主とするウイルスの多様性と進化生態に関する研究

本年度は,海底泥中ウイルスの多様性を探ることを目的とし,底泥試料中からのウイルスRNAの抽出条件の最適化を行った。底泥中には様々な夾雑物が混入しており,RNA抽出後の逆転写反応等の酵素反応が阻害される可能性があることから,バッファーを添加し,上清中にウイルス粒子を遊離させ,夾雑物の影響をできる限り軽減するよう工夫した。また,様々なRNA抽出試薬を比較検討し,最終的に最適な抽出法の確立に成功した。一方,渦鞭毛藻類ヘテロカプサに感染するRNAウイルスHcRNAVはコートタンパク質のアミノ酸配列の一部(4箇所)に変異集中領域が存在し,同領域の変異がHcRNAV種内の感染特異性に関与していることが示されている。今日までに,HcRNAVは宿主に対する感染特異性から2つのタイプ(HcRNAV34系群,HcRNAV109系群)に,宿主であるヘテロカプサはHcRNAVに対する感受性特異性から、以下の4タイプの存在が明らかとなっている:1)HcRNAV34感受性タイプ,2)HcRNAV109感受性タイプ,3)HcRNAV34弱感受性タイプ[05HC05タイプ],4)HcRNAV抵抗性タイプ[05HC06タイプ]。本年度は,新たに05HC05,05HC06タイプそれぞれを溶藻するタイプのHcRNAV株の分離を試みるとともに,上述の変異集中領域の解析によりHcRNAV種内の多様性の解析を試みた。その結果,4タイプのH. circularisquamaそれぞれに対して顕著な溶藻能を示すウイルス株が分離されたことから,HcRNAVには従来知られていたHcRNAV34系群,109系群以外に05HC05,05HC06に対する溶藻能を持つ系群がそれぞれ存在することが明らかとなった。また,各ウイルス株について予想される変異集中領域を比較したところ,05HC05溶藻系群はHcRNAV34系群と完全に一致した。このことから,両系群における溶藻性の違いは複製過程にある可能性が示唆された。一方,05HC06溶藻系群の配列は概ねHcRNAV34系群と一致したが,数箇所に特異的なアミノ酸置換が確認された。また,HcRNAV34系群とされてきた株の一部には,05HC06溶藻系群と全く同じ変異を持つ株が存在した。これらの事実は,HcRNAV34系群および同系群に近縁な05HC05タイプ,05HC06タイプ,ならびにそれらに感受性を持つ宿主系群との間の複雑な関係性を示唆しており,HcRNAVの感染特異性決定機構の解明に新たな課題を提示することとなった。近年の研究から海洋環境中にはきわめて多様なウイルスが存在することが明らかにされつつあり、これらのウイルスの一部は海底泥中に保存されていることが知られている。この海底泥中に保存されているウイルスの多様性を探る行う事を目的とし、本年度はその基礎構築を行った。まず、海底堆積物(ロングコア)の層別切り分けを最適化し、層別サンプルの保存を行った。コアサンプラーの構造上、ロングコアの周囲には表層泥のコンタミネーションが起こっていることを考慮し、ロングコアの中心部のみを切り出すよう工夫した。次に、既知ウイルスの配列から、ウイルス特異的primerセットの作製、増幅試験をおこなった。珪藻(RsRNAV)、ラフィド藻(HaRNAV)、および無色原生生物ラビリンチュラ類(SssRNAV)など、不等毛類と呼ばれる生物に感染するRNAウイルスは、比較的近縁であることから、これらのウイルスのRNA依存的RNAポリメラーゼをターゲットとする縮重primerセットを作製し、RT-PCRによるゲノムRNA対する増幅試験を行い、成功した。一方、渦鞭毛藻類ヘテロカプサに感染するRNAウイルスHcRNAVは未だ近縁なウイルスが見つかっていないため、上述のものとは別にprimerセットを設計しRT-PCRによるゲノムRNA対する増幅試験を行い、成功した。現在、底泥からの核酸抽出条件の検討を行い、最適化を行っている。次年度においては、DNAウイルスに対するprimerセットの作製および増幅試験を行うと共に、底泥サンプルからの環境ゲノム配列の獲得・解析を進めていく予定である。一方、新規ウイルスの探索、性状解析では、ラビリンチュラ類に感染する新規dsDNAウイルスThDNAVの性状解析を行い、形態的特性、増殖特性を明らかにした。その結果、ウイルスは、既知のウイルスとは大きく異なる形状をしていることを明らかにした。また、以前に単離解析を行ったラビリンチュラ類感染性RNAウイルス(SssRNAV)とは異なる宿主域を持っていること、また両者は出現時期、期間に違いが見られることから、生態学的に異なる役割を持つことが推察された。この成果については、現在論文投稿準備中である。次年度においても、新規ウイルスの探索・性状解析を試みていく。

一方,渦鞭毛藻類ヘテロカプサに感染するRNAウイルスHcRNAVはコートタンパク質のアミノ酸配列の一部(4箇所)に変異集中領域が存在し,同領域の変異がHcRNAV種内の感染特異性に関与していることが示されている。今日までに,HcRNAVは宿主に対する感染特異性から2つのタイプ(HcRNAV34系群,HcRNAV109系群)に,宿主であるヘテロカプサはHcRNAVに対する感受性特異性から、以下の4タイプの存在が明らかとなっている:1)HcRNAV34感受性タイプ,2)HcRNAV109感受性タイプ,3)HcRNAV34弱感受性タイプ[05HC05タイプ],4)HcRNAV抵抗性タイプ[05HC06タイプ]。本年度は,新たに05HC05,05HC06タイプそれぞれを溶藻するタイプのHcRNAV株の分離を試みるとともに,上述の変異集中領域の解析によりHcRNAV種内の多様性の解析を試みた。その結果,4タイプのH. circularisquamaそれぞれに対して顕著な溶藻能を示すウイルス株が分離されたことから,HcRNAVには従来知られていたHcRNAV34系群,109系群以外に05HC05,05HC06に対する溶藻能を持つ系群がそれぞれ存在することが明らかとなった。また,各ウイルス株について予想される変異集中領域を比較したところ,05HC05溶藻系群はHcRNAV34系群と完全に一致した。このことから,両系群における溶藻性の違いは複製過程にある可能性が示唆された。一方,05HC06溶藻系群の配列は概ねHcRNAV34系群と一致したが,数箇所に特異的なアミノ酸置換が確認された。また,HcRNAV34系群とされてきた株の一部には,05HC06溶藻系群と全く同じ変異を持つ株が存在した。これらの事実は,HcRNAV34系群および同系群に近縁な05HC05タイプ,05HC06タイプ,ならびにそれらに感受性を持つ宿主系群との間の複雑な関係性を示唆しており,HcRNAVの感染特異性決定機構の解明に新たな課題を提示することとなった。
グロッソプテリスとその関連群の生殖器官構造の解明

オーストラリア産のグロッソプテリス有組織化石は現在入手可能な材料として最良のものであるが、保存状態には不満が残った。また、非常に固い珪化化石であるため、作業に多大な時間がかかった。以上の制約にもかかわらず、徳に雌性生殖器官については、発生段階を追った復元がほぼ完成した。独特の雌性生殖器官は大胞子の上面に位置する多数の胚珠で特徴づけられる。珠心とそこに形成される大配偶体及び卵の発達段階が胚珠の発達を経時適に追うための指標となった。大配偶体は自由核分裂の後形成され、ついで卵細胞を造卵器内に形成する。受粉以前の胚珠は縦におれ曲がった大胞子葉に包まれて保護されている。大胞子葉は受粉後種子が形成されるころになると左右に広がり、種子散布を容易にする。グロッソプテリスの胚珠最外層には網状に分枝した毛が観察されることがあったが、その発達段階、構造、機能は不明であった。本研究で、毛は大配偶体完成時までに胚珠下表皮層が浮き上がるようにして形成される網目状の多細胞構造であること受粉後に分解消失することがはっきりした。また、毛の間隙には花粉が高頻度で見られることから、毛が受粉機構にかかわる可能性が高くなった。今後グロッソプテリスの受粉機構解明に結び付けたい。関連群との比較のために重要と思われる生殖器官の付着様式は、枝に付着した化石が得られず、今後の課題として残った。並行して研究を行った、北海道産の白亜紀裸子植物及び被子植物については、今後も随時記載と比較を行う必要がある。本年度はナンヨウスギ科の1種について生殖器官、栄養器官を含めた全体像の復元をしたこと、被子植物の雌性生殖器官を新たに記載したこと、マツ科の材数種を記載したことが主な成果である。