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プルーストの作中画家エルスチールの架空画面に関する総合的研究

平成12年度と13年度にわたり、プルーストの小説『失われた時を求めて』に現れた作中画家エルスチールの架空画面について、その成立過程を実証的かつ総合的に明らかにするのが本研究の目的であった。そのため、1.プルーストの作品と書簡に現れたエルスチールと絵画に関する情報を網羅的に蒐集した。2.これと平行して、19世紀末から20世紀初頭の絵画に関する専門書や美術雑誌・私的コレクションの実態、展覧会カタログなどの関連資料も調査・研究した。3.また、パリの国立図書館などにおいて作家の未発表草稿をふくむ調査を継続し、小説のなかにエルスチールの架空画面が定着した経緯を明らかにするよう努めた。4.1,2、3の資料を照合することにより、作家がいつ、いかなる機会に、どのようにエルスチールのモデルとなりうる画家の画と出会ったかを特定した。その結果、「ミス・サクリパン」のような肖像画の場合でも「カルクチュイ港」のような海の風景画の場合でも、エルスチールの架空画面では、マネ、ホイッスラー、ターナーなどの実在画家がモデルとして存在したこと、それら複数の異なる実在画面をモンタージュして架空画面が作成されたこと、その画面もオリジナルの画だけでなく、参照した著作や画集に収録されている図版に依拠している場合が多いことなどが明らかになった。5.以上のような作家の創作の実態については、研究発表の項に記した論文や、フランスでのプルースト・シンポジウムでの講演などで発表した。ただし架空画面を描写するプルーストの文体については、比喩の生成について問題の端緒を明らかにしたにとどまり、総合的な考察をまとめることはできなかった。今後の課題としたい。今後の課題としたい。プルーストの小説『失われた時を求めて』に現れた作中画家エルスチールの架空画面について、その成立過程を実証的かつ総合的に明らかにするのが本研究の目的である。実施計画にもとづき本年度は、『失われた時を求めて』と『プルースト書簡集』に現れたエルスチールと絵画に関する情報をできるかぎり網羅的に収集し、そのかたわら同時代の展覧会カタログなどの補助資料も調査・研究した。コンピューターを用いた絵画作品のデータベース化も試みた。さらに、それらの情報を総合することにより、作家がいつ、いかなる機会に、どのようにエルスチール作品のモデルとなる画家の画と出会ったかを特定する作業も進めた。その結果、ひとつの架空画面をつくりあげるのに、画家が複数の異なる実在の画をモンタージュしている実態が明らかになった。たとえばゲルマント公爵が所蔵するエルスチールの画についてはマネの『アスパラガスの束』やルノワールの『舟遊びをする人たちの昼食』が、「ミス・サクリパン」の肖像については、ヴァン・ザンのような歌手の写真をはじめ、ルノワールやマネやホイッスラーの画などが総合的に組み合わされている。プルーストは自由奔放な想像力にまかせて書くタイプの作家ではなく、綿密な資料調査にもとづいて小説を構成したのである。そのようにして定着した架空画面が小説のなかで果たしている役割についても、仮説作業として分析した。これらの作業はまだ準備段階にとどまっているが、調査結果の一部は「研究発表」の項に記したように公表することができた。プルーストの小説『失われた時を求めて』に現れた作中画家エルスチールの架空画面について、その成立過程を実証的かつ総合的に明らかにするのが本研究の目的であった。平成13年度は、前年度にひきつづき、プルーストの作品と書簡に現れたエルスチールと絵画に関する情報をできるかぎり網羅的に蒐集し、そのかたらわ同時代の関連資料も調査・研究した。また実施計画にもとづき、パリの国立図書館などにおいて作家の未発表草稿をふくむ調査を継続し、小説のなかにエルスチールの架空画面が定着した経緯を明らかにするよう努めた。

その結果、「ミス・サクリパン」のような肖像画の場合でも、「カルクチュイ港」のような海の風景画の場合でも、作家はひとつの架空画面をつくりあげるのに、複数の異なる実在画面をモンタージュしていること、その画面もオリジナルの画だけでなく、参照した著作や画集に収録されている図版に依拠している実態が明らかになった。作家のこのような資料調査にもとづく創作手法については、研究発表の項に記した論文や、フランスでのプルースト・シンポジウムなどでの講演として発表した。海の風景画については、ターナーに関する調査が完了したのをはじめ、マネやホイッスラーなど、論文にまとめるに至らなかった画家についても調査はかなり進展した。ただし架空画面を描写するプルーストの文体については、比喩の生成について問題の端緒を明らかにしたにとどまり、総合的な考察をまとめることはできなかった。今後の課題としたい。
受容体を標的にしたリガンドートキシン産生細胞をマイクロカプセル化した新規抗癌治療

本研究は癌細胞表面のレセプターを標的とする分子(=リガンド)に、強力な殺細胞効果のあるトキシンを融合させたもの(リガンド-トキシン)により高い抗癌治療効果を目指し研究を行ってきた。我々は多くの腫瘍細胞に高発現しているレセプターであるc-Metを標的として、そのリガンドであるHepatocyte Growth Factor (HGF)のc-Met結合部位(=NK1)に緑膿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin=PE)を結合させた新規抗癌蛋白(=NK1-PE)の作製を行ってきた。IL13-PEプラスミドを入手しNK1とIL13の配列を組み替えることによりpET24a-NK1-PEのコンストラクトを作製した。そのプラスミドを大腸菌(BL21 DE3 pLysS)に遺伝子導入しNK1-PE蛋白の発現を行った。通常の条件で蛋白の発現誘導を行った場合(37°C、発現誘導物質IPTG:1mM、3時間)、その発現量は決して高くなく不溶性の封入体を形成してしまった。この場合、収量が多くない上、変性、巻き戻しの過程で失う蛋白も多く正しく三次元構造をとった目的蛋白を十分量得るには至らなかった。一方、コントロールとしてC末端にヒスチジンタグ(His6)を融合させたNK1蛋白の作製も同時に行ってきた。現在、多くの蛋白を得るためにGSTタグなどを融合させることも考慮にいれ、可溶性に発現する誘導条件(温度、IPTG濃度、時間等)を検討している。今後は液体クロマトグラフィーにより目的蛋白を精製し、その殺細胞効果、腫瘍抑制効果を評価していく予定である。また、この蛋白の全身投与は非腫瘍細胞にも障害を来たす可能性があるためそのままでは臨床応用は難しいと考えられる。その防御策として治療薬分泌マイクロカプセルを作製し、腫瘍周囲に配置し局所でのみ治療効果を発揮させるシステムの開発を考える。本研究は癌表面のレセプターを標的とする分子(=リガンド)に、強力な殺細胞効果のあるトキシンを融合させたもの(=リガンドートキシン)により高い抗癌治療効果を目指すものである。本研究では、多くの腫瘍細胞表面に高発現しているレセプターであるc-Metを標的として、そのリガンドであるHGFのc-Met結合部位(=NK1)に緑膿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin=PE)を結合させた新規の抗癌融合蛋白(=NK1-PE)を開発する。H18年度に作成したpGEX-KGプラスミドにNK-1とPEのみを導入したコンストラクトを構築し発現・回収・精製を試みたが、全く収量が上がらず実験に使えるだけの量を回収することができなかった。そこでH19年度はGSTタグをつけたプラスミドを新たに作り直した。さらに、発現誘導物質(IPTG)を低い濃度(0.1mM)で添加し、室温で発現を誘導することにより可溶性で発現させました。バッチ法でグルタチオンセファロースに結合させ、そのままトロンビンによりGSTを切断して回収することで問題を改善し、十分量のタンパクを回収することが出来た。NK1-PEによる殺細胞効果をin vitroにて膵がん細胞(AsPc-1、BxPc-3、MiaPaca-2、SUIT-2)と線維芽細胞(MRC-5)にNK1-PEを添加し(0.1ng/ml100μg/ml)、72時間後に生死細胞の評価(Cell Counting Kit 8)を行った。当初、c-Metが高発現しているSUIT-2、AsPc-1で高い殺細胞効果が得られると考えていたが、今回行った結果は全く逆でc-Metが発現していないとされるMiaPaca-2や低発現のBxPc-3である程度の効果を確認することができた。この結果から作製したNK1-PEはc-Met以外の細胞表面上に発現している受容体に結合しPEの作用により死滅したのではないかと考えられる。しかし、その効果も現在報告されているIL4-PEなどと比べると1/1001/1000の効果でしかなく、今後はNK1-PEの結合している受容体に関して解析を進めていく予定である。本研究は癌表面のレセプターを標的とする会子(=リガンド)に、強力な殺細胞効果のあるトキシンを融合させたもの(=リガンドートキシン)により高い抗癌治療効果を目指した。本研究では、多くの腫瘍細胞表面に高発現しているレセプターであるc-Metを標的として、そのリガンドであるHGFのc-Met結合部位(=NK1)に緑膿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin=PE)を結合させた新規の抗癌融合蛋白(=NK1-PE)の開発を行った。H18年度に作成したpGEX-KGプラスミドにNK-1とPEのみを導入したコンス.トラクトを構築し発現・回収・精製を試みたが、全く収量が上がらず実験に使えるだけの量を回収することができなかった。
多階層生体機能を解明する汎用シミュレータのヘテロ計算による高速化

本領域では、生体機能の本質的理解のために、統合的多階層生体機能学推進のための基盤システムを構築し、汎用生体機能モデル記述言語PHML(Physiological hierarchy markup language)で記述した生体モデルを、シミュレータFlintを用いてシミュレーションしている。このシミュレーションは非常に多くの計算量を必要とするため、Flintの並列計算による高速化が重要である。本研究では、昨年度までにいくつかの並列計算機環境におけるFlintの並列計算を実現した。具体的には、グラフィックスプロセッサGPU、マルチコアCPU、PCクラスタ、およびスーパーコンピュータ「京」で稼働するトランスレータ(コンパイラ)方式のシミュレータを開発した。平成26年度は、GPUで動作するシミュレータに関して、より高速な並列計算の方法を確立した。シミュレーションに必要な計算を複数の部分に分割し、部分ごとに最適化したものを一つにマージすることで、全体をひとつとして最適化する従来手法と比較してGPUの利用効率を向上させた。その結果、たとえば約12万心筋細胞、約460万個の微分方程式を含む心室モデルのシミュレーションを、GPU Tesla K20mを用いて従来手法では約2時間を要するところを約1時間20分に短縮し、約1.45倍の高速化を達成した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本領域では,生体機能の本質的理解のために、統合的多階層生体機能学推進のための基盤システムを構築し,生体機能モデル記述言語PHML(Physiological hierarchy markup language)で記述した生体モデルを,シミュレータFlintでシミュレーションしている.このシミュレーションは非常に多くの計算量を必要とするので,Flintの並列計算による高速化が重要である.本研究では,ヘテロ計算でのFlint高速化技術の開発を目的とする.ここで,ヘテロ計算とは様々な並列計算機が混在する環境,具体的には,グラッフィクスプロセッサGPU,マルチコアCPU,PCクラスタ,さらには「京」などのスーパーコンピュータが混在する計算機環境を用いた計算である.平成25年度は,ヘテロ計算の基礎となる,GPU単体,マルチコアPC単体,スーパーコンピュータ「京」で稼働するトランスレータ(コンパイラ)方式のシミュレータを開発した.約12万心筋細胞,約460万個の微分方程式を含む心臓モデルFSKに関して実時間4秒間(0.005ミリ秒間隔で80万ステップ)のシミュレーションを次の性能で実行できる.スーパーコンピュータ京の場合,1コアで約6.6日,32コアで約4.8時間(台数効果約32倍),256コアで約1時間(台数効果約161倍)であり,良好な台数効果である.GPU Tesla K20mを1台装備のPCの場合,約2時間であり,これも実行性能がよい.このようなシミュレーションの高速化により,例えば心室筋細胞の膜電位ダイナミクスを再現する生体機能モデルの研究が加速し,薬物動態から心臓電気生理までの統合的にシミュレーションでき,新しい強心薬ベスナリノンの濃度に依存して心臓が正常な動きに戻ることの確認できている.本領域では、生体機能の本質的理解のために、統合的多階層生体機能学推進のための基盤システムを構築し、汎用生体機能モデル記述言語PHML(Physiological hierarchy markup language)で記述した生体モデルを、シミュレータFlintを用いてシミュレーションしている。本研究で開発した並列シミュレータが実際に使われており,ユーザグループから処理速度に関して良好な評価を得ている.「研究実績の概要」には,現在,本研究代表者が保持する最大規模の生体モデルのシミュレーション時間を示した.シミュレーションそのものは台数効果よく実行できているので,生体モデルが大規模なものを対象とする場合でも,実行効率よくシミュレーションできる可能性が高い.一方,シミュレーションコードの生成は約5時間を要する.シミュレーションの内容がグラフとして表現され,そのグラフが大規模になるからである.生体モデルの作成は試行錯誤するので,シミュレーションコードの生成時間は,生体機能の研究全体を考えるとボトルネックになる.したがって,シミュレーション実行だけでなく,シミュレーションコードの生成も並列処理で高速化することが重要である.
血管内皮細胞におけるトロンボモジュリン遺伝子の発現制御の研究

トロンボモジュリン(thrombomodulin,TM)遺伝子について、我々の研究の実験結果から、5′側上流域にプロモーター活性に重要な種々のエレメント(Sp1,CAATボックス)が存在して、実際に機能していることが明らかにした。今回、cAMP反応エレメント(cAMP responsive element,CRE)に対する3′非翻訳領域(3′UT)の役割を遺伝子レベルで検討した。CAT(chloramphenicol acetyltransferase)遺伝子をレポーターとして、TM遺伝子のプロモーターを含むコンストラクトpTM-374CATにTM遺伝子の3′UTを挿入した。トランスフェクションはヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)にリポフェクチンによる方法で行った。CREを含むコンストラクトではcAMPの添加によりCAT活性の増加がみられ、CREを欠くコンストラクトでは反応はみられなかった。これらの結果から+2092にcAMP反応エレメントが存在し、cAMPの添加により転写の活性が増加することが確認された。また、ゲルシフトアッセイでは+2092を含む合成オリゴヌクレオチドを用いると、cAMPで処理した細胞から抽出した核蛋白が結合することが明らかになった。これらのことより3′非翻訳領域に存在するcAMP反応エレメントがTMの発現に重要であることが明らかになった。また、ポリA付加部位より下流の領域が負の転写活性を有することも明らかになった。
パントテン酸キナーゼによる古細菌の細胞内コエンザイムA調節機構の解明

好熱好酸性古細菌由来コエンザイムA生合成経路の鍵酵素であるパントテン酸キナーゼ遺伝子(coaA)の同定に成功した。本酵素は大腸菌に代表される原核I型CoaAに属するが、原核I型CoaAの最も特徴的な性質であるCoAによる最終生産物阻害を受けなかった。したがって、本酵素が分布するThermoplasmatales目古細菌のCoA生合成経路はCoaAでは調節されていないことが明らかとなった。本研究の長期的な最終目標は全生物の細胞内コエンザイムA濃度の調節機構を解明することである。5段階から構成されるコエンザイムA生合成系は、通常初発反応を触媒するパントテン酸キナーゼによって調節されており、真性細菌で3つのタイプ、真核生物で1つのタイプの存在が報告されている。しかしながら、古細菌ではパントテン酸キナーゼが未だに見つかっておらず、古細菌のコエンザイムA調節機構はブラックボックスのまま残されていた。そこで、研究代表者は古細菌パントテン酸キナーゼ遺伝子の探索研究を計画した。平成19年度は、パントテン酸キナーゼ遺伝子に変異があるために30°Cでは生育できるが37°Cでは生育できないという性質を持つ大腸菌のパントテン酸キナーゼ温度感受性変異株を用いた生育相補テストおよびタンパク質の相同性/モチーフ検索などバイオインフォマティクス的手法を用いた解析によって、古細菌パントテン酸キナーゼ遺伝子のクローニングを行った。DNA供与体としては、メタン生成古細菌、高度好塩古細菌、および好熱性古細菌のゲノムDNAを使用した。その結果、好熱性古細菌のゲノムDNA上にパントテン酸キナーゼの候補遺伝子を見出した。しかしながら、本遺伝子を持つプラスミドは37°Cでの大腸菌パントテン酸キナーゼ温度感受性変異株の生育相補に対して偽陽性で、不明瞭な点が残された。そこで、現在は本遺伝子産物の大腸菌での大量発現系を構築し、組換えタンパク質の酵素活性からパントテン酸キナーゼ遺伝子の同定を試みている。また、生物活性からの同定も重要であるため、並行して、本遺伝子を高コピーのクローニングプラスミドに連結し、大腸菌パントテン酸キナーゼ温度感受性変異株での生育相補テストも試験している。今年度は、平成19年度に好熱好酸性古細菌Picrophilus torridusのゲノムDNA上に見出されたパントテン酸キナーゼ候補遺伝子、PTO0232の解析を行った。まず、PTO0232遺伝子をpUC118のlacプロモーターの下流に挿入後、大腸菌のパントテン酸キナーゼ温度感受性変異株(ts9株)に形質転換し、本形質転換体の生育相補試験を行った。本菌株はパントテン酸キナーゼ遺伝子に変異があり、30°Cでは生育できるが37°Cでは生育できないという性質を持っている。その結果、PTO0232遺伝子はts9株の37°Cでの生育を明らかに相補することが分かった。そこで次次にPTO0232の発現プラスミドをpET-28a(+)を用いて構築し、大腸菌で組換えPTO0232を発現させ、電気泳動的に均一に精製した。精製酵素の酵素学的諸性質を解析したところ、PTO0232は至適温度を55°Cおよび至適pHを5にそれぞれ持つパントテン酸キナーゼであることが分かった。本酵素は大腸菌のパントテン酸キナーゼ(EcCoaA)に代表される原核型Iに属するが、PTO0232はEcCoaAで観察されるCoAあるいはアシル-CoAによる最終生産物阻害を全く受けなかった。反応動力学などその他の諸性質に関しては、現在、解析中であり、P. torridus以外の古細菌からのクローニングも併せて行っている。本研究の最終目標は全生物の細胞内コエンザイムA(CoA)濃度の調節機構を解明することであるが、本申請では古細菌のCoA生合成経路に焦点を絞った。CoA生合成経路は一般に初発反応を触媒するパントテン酸キナーゼ(CoaA)によって調節されているが、古細菌では未だに見つかっておらず、古細菌のCoA生合成経路の調節機構は不明のまま残されていた。

そこで、好熱好酸性古細菌Picrophilus torridusのCoaA遺伝子(PTO0232遺伝子)のクローニング、大腸菌での発現を行い、平成20年度までに1)Thermoplasmatales目に属する好熱好酸性古細菌は大腸菌のCoaAに代表される原核I型CoaAを持つこと、2)原核I型に属するが、CoAあるいはアシル-CoAによる最終生産物阻害を受けないこと、3)生育環境に一致して、至適温度およびpHはそれぞれ55°Cおよび5に持つことを明らかにした。今年度は、前年度に引き続きPTO0232の酵素学的諸性質の解明、そしてメタン生成古細菌のCoaA遺伝子のクローニングを行った。PTO0232の性質では1)ATP以外のヌクレオチド三リン酸も広く認識すること、2)Mg^<2+>以外にMn^<2+>あるいはCo^<2+>なども幅広く受け入れること、3)パントテン酸に対するKmは621μMで、他のCoaAと比較すると非常に大きな値を示すことを明らかにした。これらの解析結果は好熱好酸性古細菌が属するThermoplasmatales目に特化していたため、メタン生成古細菌由来CoaAのクローニングも開始し、メタン生成古細菌では4'-ホスホパントテン酸の生成過程が異なり、パントイン酸のリン酸化の後、β-アラニンが縮合して4'-ホスホパントテン酸が生成することが分かった。これらの反応を触媒する酵素の諸性質に関しては、現在、解析中である。
言語聴覚士養成教育におけるモデル・コア・カリキュラムの構築

平成24年に発足した一般社団法人日本言語聴覚士協会の「言語聴覚士養成教育モデル・コア・カリキュラム」諮問委員会で、研究代表者と研究協力者12人は平成26年から28年にかけて3年間で18回の委員会を開催し、「言語聴覚士養成教育ガイドラインとモデル・コア・カリキュラム」の骨子となる枠組みを作成した。学会等で発表し多くの言語聴覚士の意見を参考に修正を繰り返し、完成に至った。また、専門分野における科目の具体的な教育目標と到達目標を考案し、現役の言語聴覚士の意見を収集し修正した。専門基礎分野は試案を作成したレベルで完成まで至っていない。さらに、全カリキュラムの整合性の検証が残っている。1コアカリキュラム委員会を6回開催した。会議では言語聴覚障害学の5つの専門領域におけるミニマムエッセンシャルズならびに、モデルコアカリキュラムの枠組みが検討された。また、教育ガイドラインの内容が決定された。2言語聴覚士養成校、臨床実習施設へ臨床実習とモデルコアカリキュラムに関するアンケートを実施し、集計した。アンケート結果を6月の言語聴覚学会で演題として2題発表した。同学会における教員交流会でコアカリについて講演した。さらに、アンケート結果を8月の全国リハビリテーション学校協会教育研修会で演題として2題発表した。1平成27年度言語聴覚学会における教員交流会で研究代表者らが「言語聴覚士養成教育におけるモデル・コア・カリキュラム」と題し講演した。その後、養成校教員の意見を聴取し、本委員会の案を討議した。また、特別企画で研究協力者らが「言語聴覚士養成教育におけるモデル・コア・カリキュラム委員会の経過報告」と題し講演した。その後、養成校教員の意見を聴取した。2平成27年度全国リハビリテーション学校協会教育研修会のシンポジウムで研究代表者が「言語聴覚士養成教育におけるモデル・コア・カリキュラムの構築」と題して講演した。3研究代表者らは11月にコロラドで開催されたASHAに参加し、諸外国の教育状況に関する情報を収集した。41年間に6回の委員会を開催し、以下のことが決定した。言語聴覚士養成教育ガイドラインは目次を完成させ、執筆者を平成28年8月までに決定する。モデル・コア・カリキュラムにおける専門領域の骨子を慎重に協議を重ね、委員間ではほぼコンセンサスを得たので、臨床実習と専門領域以外のカリキュラムを分担して執筆することが確認され、平成28年5月以降分担者を決め、作成する。当初の予定では、モデル・コア・カリキュラムの第1次案が完成し、平成28年度にはモデル校にお願いし、第1次案カリキュラムの有効性を検討する予定であった。しかし、モデル・コア・カリキュラムの骨子に時間をかけ慎重に協議したため、厚生労働省が規定する全科目のカリキュラムが完成していない。モデル・コア・カリキュラムの骨子は、言語聴覚学会や全国リハビリテーション学校協会教育研修会で広報し、討論を重ねたため、多くの言語聴覚士、養成校教員の意見を反映させたものとなり、内容的にはより良いものになったと考えている。「研究の目的」現在の言語聴覚士養成教育は厚生労働省の定める言語聴覚士学校養成所指定規則(平成10年制定)で規定されている。この内容は学習すべき科目と単位数の指定しかなく、具体的な教育内容は教員の裁量に任されているため、養成校による教育レベルに差が生じている。その結果、国家試験合格率、臨床実習指導における到達レベルの決定等、養成教育上の問題が生じている。また、社会状況の変化や学生の質の低下など、平成10年に制定された教育内容で対応できているとはいいがたい状況があり見直しが必要である。そのために、教育ガイドラインを設定し教育内容の根本となるモデル・コア・カリキュラム(以下コア・カリ)の作成が必要である。本研究は言語聴覚士養成教育の指針となる教育ガイドラインとコア・カリを作成し、多くの言語聴覚士の意見を反映させて構築することである。「研究実施計画」研究1年目には計画通り、言語聴覚士養成教育の問題点を明らかにするために、養成校教員と現役の言語聴覚士にアンケートを実施した。その結果、教育ガイドラインに必要な内容を把握できた。研究2年目には予定通り、教育ガイドラインとコア・カリの骨子である教育内容の枠組みを作成し、学会で発表し現役の言語聴覚士の意見を徴収し修正を加えた。研究3年目にはコア・カリの細目を決定し、具体的な教育目標と到達目標を作成する予定であった。しかし、基礎専門領域の科目別教育目標と到達目標が試案どまりで完成まで至らなかった。平成24年に発足した一般社団法人日本言語聴覚士協会の「言語聴覚士養成教育モデル・コア・カリキュラム」諮問委員会を、平成26年から28年まで3年間でのべ18回開催した。今後、言語聴覚士の意見を反映しつつ、基礎専門領域のコア・カリを完成させ、また、全科目のカリキュラム例を作成し、現実的に実施可能かを検討する必要が課題として残った。

平成26年度はアンケートを実施しまとめることを計画していた。計画通り実施し、集計でき、2つの学会で報告することができた。27年度に実施する予定であったアンケートの回答内容を参考に、モデルコアカリキュラムの枠組みを検討するところまで進行している。前々年、前年と1年に6回の委員会で活動していたが、進行が遅いので、全員での活動は6回であるが、役割分担をしそれに従い会議の回数を増やし、決議を進めることした。具体的には研究代表者が副委員長として会の進行をまとめていたが、研究内容が多岐にわたって項目が増えたため、副委員長をさらに増やし、役割を分担した。また、事務処理が円滑に進むように事務局を設定した。現在、専門領域のコアカリ案が完成しているので、基礎領域と臨床実習領域の分担を決め進める。また、全てのモデル・コア・カリキュラム(案)が完成すると、教育ガイドラインに着手する予定である。言語聴覚士の養成教育、言語発達障害学27年度はモデルコアカリキュラムの骨子を作成するために、内外の情報を収集する。11月にアメリカコロラドで開催されるASHAに研究代表者(内山)と研究協力者(城間)が参加し、諸外国の教員や留学中の日本人の学生に会う予定である。平成26年度と同様、コアカリキュラム委員会を6回開催する予定で日程を決定した。これまでの活動内容をリハビリ関係者に報告するために、6月の言語聴覚学会で1題報告する。全国リハビリテーション学校協会教育研修会で研究代表者が専門教育のあり方としてシンポジウムで講演する。情報収集のためアメリカへ行く予定であったが、科研費採択が決定した時点で行き先を決めることが困難であった。そのため、27年度(次年度)へ計画を延期し、その金額を27年度で使用したい。最終年度は予定していた、シンポジウムを取りやめ、モデル・コア・カリキュラムを完成させるため、6回の委員会と4回の副委員長会議を行い、委員の交通費に使用する。アイルランドで行われる国際音声言語医学会に城間委員と研究代表者の内山が参加するための交通費、宿泊費、参加費に使用する。アメリカコロラド出張2人50万×2人
クレイク・オブライエン型輪郭線によるエーレンシュタイン錯視とハーマン・本川錯視

本年度の研究においては,主として明と暗のEhrenstein錯視における相互打消し効果を検討した. 8名の被験者による実験の概要は次の通りであった.一様灰色面上(輝度18mL,反射率39%)に8本の黒線分(反射率2%)を線端を離して(視角で47′, 1°34′そして2°22′)放射状に配置すると線端間の中心領域に円盤状の明のEhrenstein錯視が生起し,同様に白線分(反射率73%)を配置すると暗のEhrenstein錯視が生起した.そして,明および暗のEhrenstein錯視が生起するとき, Ehrensteinパターンの中心領域と背景領域の明るさは統制条件としての一様灰色面に比べて低下した.そして,線端間距離を拡大していくと8本の白線分による暗の錯視は弱まり, 8本の黒線分による明の錯視は逆に強まることが明らかになった.即ち,線端間距離を拡大すると,黒線分であれ白線分であれ,その背景領域の明るさはほぼ一定であり,中心領域の明るさが一様灰色面の見えの明るさに近付いた.一方,明と暗のEhrenstein錯視が相互に打ち消されるかどうかを検討するために, 4本の黒線分と4本の白線分を交互に放射状に配置して(以下,これらのパターンを黒白複合パターンと呼ぶ),中心領域と背景領域の見えの明るさを測定し,一様灰色面の明るさと比較した.その結果,全ての距離条件で,背景領域の明るさは一様灰色面よりも暗く,黒白複合パターンにおけるEhrenstein錯視の強さは黒線だけによる明と白線だけによる暗のEhrenstein錯視の中間であった.この結果は,明と暗のEhrenstein錯視が相互に打ち消し合っていることを意味する.また,黒白複合パターンにおいて垂直・水平に配置された線分の方が斜方向に配置された線分よりも強い錯視を誘導し,錯視の強さは線分の方向にも依存することが明らかになった.以上の結果は,輝度に依存する興奮と抑制および輝度差に依存する非拮抗型抑制によって生起するものと思われる.本年度の研究においては,主として明と暗のEhrenstein錯視における相互打消し効果を検討した. 8名の被験者による実験の概要は次の通りであった.一様灰色面上(輝度18mL,反射率39%)に8本の黒線分(反射率2%)を線端を離して(視角で47′, 1°34′そして2°22′)放射状に配置すると線端間の中心領域に円盤状の明のEhrenstein錯視が生起し,同様に白線分(反射率73%)を配置すると暗のEhrenstein錯視が生起した.そして,明および暗のEhrenstein錯視が生起するとき, Ehrensteinパターンの中心領域と背景領域の明るさは統制条件としての一様灰色面に比べて低下した.そして,線端間距離を拡大していくと8本の白線分による暗の錯視は弱まり, 8本の黒線分による明の錯視は逆に強まることが明らかになった.即ち,線端間距離を拡大すると,黒線分であれ白線分であれ,その背景領域の明るさはほぼ一定であり,中心領域の明るさが一様灰色面の見えの明るさに近付いた.一方,明と暗のEhrenstein錯視が相互に打ち消されるかどうかを検討するために, 4本の黒線分と4本の白線分を交互に放射状に配置して(以下,これらのパターンを黒白複合パターンと呼ぶ),中心領域と背景領域の見えの明るさを測定し,一様灰色面の明るさと比較した.その結果,全ての距離条件で,背景領域の明るさは一様灰色面よりも暗く,黒白複合パターンにおけるEhrenstein錯視の強さは黒線だけによる明と白線だけによる暗のEhrenstein錯視の中間であった.この結果は,明と暗のEhrenstein錯視が相互に打ち消し合っていることを意味する.また,黒白複合パターンにおいて垂直・水平に配置された線分の方が斜方向に配置された線分よりも強い錯視を誘導し,錯視の強さは線分の方向にも依存することが明らかになった.以上の結果は,輝度に依存する興奮と抑制および輝度差に依存する非拮抗型抑制によって生起するものと思われる.
鋼製橋脚-地盤連成系のPushover解析による耐震性能評価モデルの構築

本年度は,橋脚システム全体の地震時挙動の把握を目的とした,前年度に行われた簡易解析手法の有用性を検証するために,解析結果の精度を評価する必要がある.そこで,橋脚システムを2次元問題としてとらえ,地盤部分に平面ひずみ要素を適用し,地盤材料の動的非線形性を考慮した動的解析を行った.ここでは,鋼製橋脚部分に過去の研究により精度の確認されている解析モデルを用いることにより,精度の高い解析を行う.この解析を行うには,要素数が非常に多いことから,前年度より準備を進めたワークステーションを活用した.以下に,得られた成果と問題点をあげ,今後のさらなる研究の必要性を述べる.(1)FEMモデルによる固有値解析を実施したところ,等価1自由度モデルへの適用性を示唆するパラメータである有効質量比において,十分適用可能である数値が得られた.しかし,地盤部分の材料定数を数例で行ったのみであり,特に多層地盤などで軟弱な層が含まれる場合などでは,適用性を検討する必要がある.(2)FEM解析によって,構造物基礎に入射する加速度が,構造物がない場合の同位置における応答加速度に比べて約70%に減少することが得られた.これは,構造物-地盤の動的相互作用によるものである.本年度では,この点に着目した検討を行い,Pushover解析につなげる段階を完備するに至った.(3)橋梁システムとして,多径間の橋梁を考えた場合,上記の加速度減少は,各橋脚についても生じることが分かったが,その減少の程度は橋脚によって異なり,この種のパラメトリック解析を必要とする.本年度までに得られた知見としては,以上であるが,さらにパラメトリック解析を必要とし,特に地盤物性値も含めてどのパラメータが敏感であるかを見極める必要がある.本年度は,橋脚-基礎-地盤連成系のPushover解析用モデルの構築に先立ち,まず,基礎および地盤の効果を精緻に表現する解析モデルの構築を行った.解析モデルとしては,地盤の効果を考慮しないモデル,地盤の効果をばねで表現したモデル,地盤の効果を平面ひずみ要素を用いて2次元的に表現したモデルを用いた,これらの比較から得られた成果の概要は以下に示すとおりである.1.地盤の効果をばねで表現した場合の橋脚の地震時応答値は,地盤の効果を考慮しないものと比べて,ほとんど差がない.2.地盤ばねを用いた場合と平面ひずみ要素を用いた場合とでは,橋脚の応答値にほとんど差異はないため,地盤ばねのばね定数は妥当といえる.ただし,平面ひずみ要素を用いた場合が弾性解析時に一致するため,地盤の非線形性を考慮した地盤ばねの表現が必要となる.3.地盤の効果を精緻に表した場合には,地盤の効果を考慮しない場合に比べて,橋脚の地震時応答値は,減少する傾向にあるが,等価線形化された地盤物性値から算出される全体系の固有周期が,橋脚の固有周期に近接している場合には,非常に複雑な挙動を示す.なお,本年度では,地盤物性を等価線形化手法で表現しているため,地盤物性の簡易推定となっているため,次年度には地盤物性に材料非線形を含めた,より精緻な解析を行うことによって,その挙動の差異を確認する必要がある.また,これらを含めて,簡易推定法として有用なPushover解析手法を適用した成果をあげる必要がある.本年度は,橋脚システム全体の地震時挙動の把握を目的とした,前年度に行われた簡易解析手法の有用性を検証するために,解析結果の精度を評価する必要がある.そこで,橋脚システムを2次元問題としてとらえ,地盤部分に平面ひずみ要素を適用し,地盤材料の動的非線形性を考慮した動的解析を行った.ここでは,鋼製橋脚部分に過去の研究により精度の確認されている解析モデルを用いることにより,精度の高い解析を行う.この解析を行うには,要素数が非常に多いことから,前年度より準備を進めたワークステーションを活用した.以下に,得られた成果と問題点をあげ,今後のさらなる研究の必要性を述べる.(1)FEMモデルによる固有値解析を実施したところ,等価1自由度モデルへの適用性を示唆するパラメータである有効質量比において,十分適用可能である数値が得られた.しかし,地盤部分の材料定数を数例で行ったのみであり,特に多層地盤などで軟弱な層が含まれる場合などでは,適用性を検討する必要がある.(2)FEM解析によって,構造物基礎に入射する加速度が,構造物がない場合の同位置における応答加速度に比べて約70%に減少することが得られた.これは,構造物-地盤の動的相互作用によるものである.本年度では,この点に着目した検討を行い,Pushover解析につなげる段階を完備するに至った.(3)橋梁システムとして,多径間の橋梁を考えた場合,上記の加速度減少は,各橋脚についても生じることが分かったが,その減少の程度は橋脚によって異なり,この種のパラメトリック解析を必要とする.本年度までに得られた知見としては,以上であるが,さらにパラメトリック解析を必要とし,特に地盤物性値も含めてどのパラメータが敏感であるかを見極める必要がある.
PAR-aPKCによるmRNAの局在化と翻訳制御機構の解明

マウス海馬神経細胞における樹状突起スパインの形態維持に、PAR1bが機能することを初めて解明した。PAR1bは樹状突起に局在し、成熟後の神経細胞においてノックダウン(KD)を行うと、スパインの形態がフィロポディア様に変化した。さらに、PAR1bのKDにより微小管ダイナミクスが低下しており、アクチン重合に関わるp140Capのスパイン内の局在が異常になっていた。以上の結果から、PAR1bは微小管のダイナミクスを制御することで、スパインの維持に関わると結論づけた。現在までにmRNAの輸送、局在に関わることが知られるFMRPが樹状突起スパインの形態異常を引き起こすということ(Comery TA et al., 1997)、mRNAの翻訳制御に関わるmicroRNAによりスパインの大きさが制御を受けるということなどが示されており(Schratt GM et al., 2006)、mRNAの局在化がスパインの形態形成、維持に密接に関与していることが明らかとなってきている。そこで、PAR-aPKCシステムとmRNAの局在化との関連性を調べるために、PAR-aPKCシステム関連因子のノックダウンによるスパインの形態への影響を指標としたスクリーニングを行った。その結果、aPKCによりその活性が抑制されることが知られ、微小管の安定性に関わることが知られるPAR-1bキナーゼのノックダウンにより、成熟後の海馬神経細胞において、スパインがフィロポディア様に変化することが明らかとなった。シナプス前終末との共染色などからも、この構造変化はスパインの形態維持の異常によるものであることが示唆される。また、免疫染色法により成熟神経細胞におけるPAR-1bの局在を観察したところ、樹状突起と、とりわけ樹状突起スパインに強い局在を観察することができた。成熟神経細胞におけるPAR-1bの生理機能、局在に関しては現在まで未解明のままであり、本研究によりPAR-1bの新しい生理機能の側面が明らかとなることが期待される。現在、PAR-1bによるスパイン形態の維持のメカニズムとして、(1)mRNAの局在化の制御によるもの(2)翻訳制御複合体の制御によるもの(3)微小管のダイナミクスの制御によるもの、という仮説を立てて検証を行っている。我々は、細胞の極性化の制御因子であるPAR-aPKC複合体が、神経細胞においてmRNA及び翻訳装置の局在化を担う可能性を検証することを目的として、本研究を開始した。現在までにmRNAの局在化がスパインの形態形成、維持に密接に関与することが明らかとなっている。そこで、PAR-aPKCシステムとmRNAの局在化との関連性を調べるために、海馬神経細胞のスパインの形態への影響を指標としたノックダウンのスクリーニングを行った。その結果、aPKCによりその活性が抑制されることが知られ、微小管の安定性に関わるPAR1bのノックダウンにより、スパインがフィロポディア様に変化することが明らかとなった。シナプス前終末との共染色などから、この構造変化はスパインの維持の異常によるものであり、さらに免疫染色法による解析で、PAR1bは通常、樹状突起、とりわけスパインに強い局在を示すことが明らかとなった。しかしながら、PAR1bによるmRNA、翻訳装置の局在化に対する作用、或いは分子間相互作用などを見出すことは出来なかった。近年になり、微小管ダイナミクスによってアクチン骨格系の再編成を担うp140Capのスパイン内の局在化が制御され、そのことによりスパインの形態が維持されることが示されている(Jaworski J et al., Neuron 61, 85-100, 2009)。そこで我々は、PARlbの微小管制御因子という側面に着目し、PAR1bノックダウンによる微小管ダイナミクスへの影響を解析することにした。EB3-GFPを用いて神経細胞における微小管の挙動を解析してみると、予期した通り、PAR1bノックダウンでは微小管のダイナミクスが低下し、GFP-p140Capのスパイン内の局在が顕著に抑制されることを見出した。以上の結果から、PAR1bは微小管のダイナミクスを制御することで、スパインの形態維持に関わると結論した。
ベトナムにおけるG6PD欠損症の分子疫学的調査

海外共同研究者のDao博士(ベトナム国立自然科学技術センター・生物工学研究所副所長)を中心とした研究グループと我々による共同研究でG6PD欠損症の新生児の濾紙血によるG6PD欠損症のマススクリーニングが軌道に乗り、Hanoi市内の新生児から5,899検体の濾紙血を収集した。これらをホルマザン法で検索した結果、陽生率は3.1%であった。この値は我々がフィリピンで行った結果とほぼ等しい。しかし、Hanoi近郊のHoa Binhの全域では18%と高値で、これをHoa Binhに在住するMuong族に限ると32%と高い頻度で検出されることが明らかになった。インフォームド・コンセントを得た上で、北部ベトナム(Hanoi, Hoa Binh)、中部ベトナム(Khanh Hoa, Hue)、南部ベトナム(Ho Chi Minh City)の各地域から遺伝子検索用の検体として137検体が今期間中に収集できた。これらにはKinh族、Muong族、Katu族、Thai族、Raclei族およびTay族が含まれていた。これらの遺伝子検索の結果、Gaoha, Chatham, Chinese 5, Viangchan, Union, Canton,およびKaipingの7種のVariantが検出された(検出率72.3%)。種族別にみるとMuong族ではUnionがKatu族ではViangchanが多かった。また、Kinh族では、Viangchan、CantonとKaipingがほぼ同程度に認められた。他の種族では例数が少なく、それらの傾向を窺い知れなかった。高頻度に欠損症が検出される地域においては女性からヘテロ型が高頻度に検出されただけでなくホモ型あるいは2種の異なったVariantを有する検体が含まれていた。ベトナムの近隣諸国であるインドネシア、マレーシア、シンガポール、フィリピンおよびタイで我々が行ったG6PD欠損症の分布パターンと対比した場合、ベトナムで今期の遺伝子検索で検出された7種のVariantはこれらの諸国で普通に認められるVariantであった。しかし、ベトナムの検体について我々の開発したMPTP法でのVariantの検出率が低かっただけでなく、Mahidol, MediterraneanおよびVanua Lavaが検出されなかったことが特徴的であった。本研究で得られた我々の研究結果は「ベトナムにおけるG6PD欠損症の分子疫学的調査」に更なる研究課題を残すこととなった。我々の本年度の目標はベトナムにおける調査地点の決定とその方法の確認作業および予備的検索の3点であった。共同研究者のベトナム国立自然科学技術センター生物工学研究所のDao副所長は、同研究所、ハノイ大学、国立マラリア・寄生虫研究所の主要スタッフの本研究課題への全面協力のための手配を終えた。そこで、ハノイ近郊から得られた検体についてスクリーニング法の確認を行った。彼女らの従来法は、試薬を湿らせ乾燥した濾紙に生血の検体をとり一定時間後、紫外線照射した時の蛍光強度を測定する簡易法である。この方法の現地での適用には種々の困難が予想されるので、我々が開発しフィリピンで成功しているホルマザン寒天ゲル拡散法の有用性の理解を得ることに力を注いだ。その結果、検体と関連事項の収集だけを現地で実施し、実際の測定操作は研究所で集中して行う本研究課題の特長が理解された。

2001年度の78月に本格的に資材を提供し、ホルマザン法でマススクリーニングを行うことで一致した。次年度はベトナム北部の村としてハノイ近郊のPhu Tha、Hoa Binhの二つの村とラオス国境に近く山岳少数民族が生活しているLai Chau、Son La二つの村のそれぞれの保健センター・医務局と密接に連絡をとり、調査を敢行する予定を立てた。特に、Lai Chau、Son Laはマラリア汚染地域にあり、G6PD欠損症患者の出現頻度が高いことが予想される。マラリアの感染状況、患者の臨床所見、家族調査等の綿密な聴き取り調査を同時に行うことによって、興味ある結果が得られることを期待している。ベトナム生物工学研究所、ハノイ大学医学部、国立小児科病院、マラリア研究所と「ベトナムにおけるG6PD欠損症の分子疫学的調査」に関する共同研究を開始して2年を経過した。2年目の平成13年度には共同研究協力者のDao氏の研究室に在籍する2名の大学院生が中心となって研究を進め、検体の収集とマススクリーニングが順調に進展している。マススクリーニング法はフィリピンで施行している我々の方法とは若干異なるが大差ない結果を得ている。当初、現地スタッフでMPTP分析までを実施することを本年度の目標としたが、未だ安定したMPTP分析結果が得られないのが残念である。ハノイ北西部に位置するホアビン村はG6PD欠損症の罹患率が高いとの速報が既にある。実際、通常地域では5%以下であるが当地で収集した検体は約10%と高率を示した。ベトナムのG6PD欠損症は我々の開発したMPTP法でほぼ80%がその変異種が判明する。他の20%については本研究課題で購入したDNAシーケンサで検索している。これらの判明率は我々が以前行ったフィリピン、マレーシア、シンガポール、インドネシアの結果とほぼ同率である。G6PD欠損症の変異種の分布は国ごと、地域ごとに特徴が認められるが、現在までの分析結果ではベトナムのそれはフィリピンに近い。来年度が最終年度となるので検索地域を拡げるために検体収集に更なる意欲をもって臨み、システマチックな検索体制を確立・強化したい。本研究開始当初から実施計画していた新生児の濾紙血によるG6PD欠損症のマススクリーニングが軌道に乗りつつある。Hanoi市内の新生児から5,899検体を収集しホルマザン法で検索した結果、陽性率は3.1%であった。この結果は、ベトナムの「新生児におけるG6PD欠損症のマススクリーニング」の始めてのまとまった結果である。この値は我々がフィリピンで行った結果にほぼ等しい。しかし、Hanoi近郊のHoa Binhでは18%と高値で、Muong族に高い頻度で検出される事が既に判明している。
膜裏打ちタンパクの制御による臓器特異的ながん多剤耐性の非働化

P-glycoprotein (P-gp)などの排出系トランスポーター群は細胞内に取り込まれた薬物の多くを細胞外に排出し、がん多剤耐性の主要な因子として機能している。本研究結果から、排出系トランスポーター群の輸送機能は各種足場タンパクによって臓器特異的に調節されていることが示された。また、肺がんのように、複数種の排出系トランスポーターが同一の足場タンパクにて調節される組織が存在することが示された。したがって、ある種のがん組織においては特定の足場タンパクの機能を抑制することで、がん多剤耐性に関わる排出系トランスポーターの網羅的な非働化が可能となることが示唆された。P-糖タンパク質(P-gp)は薬物の排出を調節しており、多剤耐性に寄与している。27年度では消化管がん細胞のP-gpの輸送機能が、radixinと呼ばれる足場タンパクによって調節されている一方で、腎臓がん細胞のP-gpはezrin、radixin、moesin(ERM)いずれの足場タンパクによっても機能調節されていないことを報告した。ヒト消化管がん由来細胞(Caco-2細胞)およびヒト腎臓がん由来細胞(Caki-1細胞)においても、ヒト肝臓がん細胞やマウス消化管と同様、P-gpの輸送機能にERMタンパクが関与しているか否かを検討した。P-gpの輸送機能は、siRNAを用いて各ERMタンパクの遺伝子発現を抑制し、P-gpの基質薬物であるrhodamine123(Rho123)の細胞内蓄積量の変化から評価した。その結果、Caco-2細胞においてはradixinの遺伝子発現を抑制したときのみ細胞内蓄積量が増加し、P-gpの機能低下が示唆された。さらに、受動拡散マーカーであるエバンスブルーを用いて検討したところ、ERMの遺伝子抑制は細胞膜透過性に変化を与えていないことが示された。これらのことから、radixinはP-gpの輸送機能をダイレクトに調節している一方で遺伝子発現には関与していないことが示唆され、以前に我々が報告している正常なマウス消化管の結果と一致した。また、ezrinおよびmoesinの遺伝子抑制は、いずれもRho123の細胞内蓄積量を変化させなかったため、P-gpの輸送機能の調節には関与していないと考えられた。加えて、Caki-1細胞におけるP-gpの輸送機能は、ERMいずれの遺伝子抑制によっても変化しなかった。正常マウスの結果および報告と照らし合わせると、正常とがんではP-gpの機能調節因子に違いはないものの、組織によって異なっていることが示唆された。27年度では、ヒトがん細胞のP-gp輸送機能とERMによる機能調節を確認するため、1各種排出系トランスポーター(TP)の輸送機能が見られるヒトがん細胞の選抜、2膜裏打ちタンパクによるTPsの機能調節を検討することを達成目標としていた。まず1に対して、ヒト消化管がん由来細胞としてCaco-2細胞、ヒト腎臓がん由来細胞としてCaki-1細胞を用いてP-gpの輸送機能を評価したところ、十分に機能していることを確認した。この他にもヒト乳がん由来細胞(MCF-7)を用いたが、P-gpの発現が低く輸送機能が十分に評価できなかった。MCF-7に関しては、抗がん薬であるドキソルビシンを長期かつ段階的に濃度を上げて添加することで、P-gpが高発現した耐性株を樹立できることが報告されている。そこで、同様の方法による薬剤耐性株の樹立を開始しており、既に報告されている最大濃度の2/5に相当する200 nMにおいても増加しうる、薬剤耐性株が得られてきている。また、P-gp以外のがん多剤耐性に寄与する排出系トランスポーターであるBreast cancer resistance protein (BCRP)やMultidrug resistance associated protein (MRPs)もCaco-2で輸送機能を有しているのかを検討しており、次年度には排出系トランスポーターに関する一連の結果を公表できるものと考えている。次に、これらの細胞を用いた2の検討に関してCaco-2細胞のP-gp輸送機能においては、radixinのみが関与していた一方で、ヒト腎臓がん由来細胞においては、ezrin、radixin、moesinのいずれもP-gpの輸送機能の調節には関与していなかったことを明らかにした。以上より、当初の予定の1および2の検討は、おおむね順調に進展していると考えている。がん細胞はepithelial-to-mesenchymal transition (EMT)化によって、高い浸潤性を示すとともに転移を起こす。このとき、抗がん薬に対する耐性や悪性度をも亢進させるため、EMT化は特に肺がん患者の予後に大きく影響する。EMT化を誘導する転写因子のひとつとして、Snailと呼ばれるタンパク質に着目して検討を行なったところ、Snailを過剰発現させた肺がん細胞においてはP-gpの輸送機能が亢進し、その結果として抗がん薬に対する耐性が高まることを明らかにした。さらにこのとき、膜タンパク質の機能を調節する分子であるcaveolinが、脱リン酸化されていた。以上のことから、リン酸化したcaveolinの減少によってP-gpの機能抑制が解除され、P-gpの輸送機能が亢進したものと考えられた。また、BCRPの輸送機能調節において、ヒト消化管がん由来細胞ではERMいずれも関与していなかったが、ヒト腎臓がん由来細胞においては、Radixinが調節因子として機能していた。また、MRPにおいては上記消化管がん細胞ではRadixinが関与しているとする報告があるものの、BCRPにおいてはERMいずれも関与していなかった。したがって、これまでの我々の報告も併せて考察すると、BCRPとMRPいずれも組織によって調節因子が異なっていることが考えられた。

28年度では、足場タンパクの調節によってヒトがん細胞の多剤耐性を網羅的に抑制できるかを明らかにするため、1EzrinおよびMoesinによるトランスポーターの機能調節(Radixinによる調節が確認されなかった細胞)、2担がんマウスにおけるERM阻害の有用性、3トランスポーターの輸送機能発現におけるリン酸化シグナル因子RhoA/ROCKの関与を明らかにすることを計画とした。1ヒト腎臓がん由来細胞としてCaki-1細胞、ヒト消化管がん由来細胞としてCaco-2細胞を用いて各種排出系トランスポーターの遺伝子発現抑制実験を行ない、適切な条件を得た。本条件を用いてBCRPおよびMRPの輸送機能をそれぞれの基質薬物を用いて評価したところ、Caki-1細胞ではRadixinの発現を抑制したときにBCRPの機能低下が確認された。一方、MRPはERMいずれによっても調節されていなかった。さらに、Caco-2細胞においてはMRPの機能調節にRadixinが関与しているとする報告があるものの、BCRPの機能調節にはERMいずれも関与していなかった。以上より、Caco-2細胞のMRPとP-gpはいずれもRadixinによって調節されていたことから、消化管がんの治療においてRadixinの機能抑制薬を用いることで、薬剤耐性に関わる複数の排出系のトランスポーターを同時に抑制でき、様々な抗がん薬あるいはそれらを組み合わせた治療の有用性を高めることができるものと考えられた。2担がんマウスの作製は十分な成功率に至り、ヌードマウスを用いて検討を行なう段階である。3P-gpの機能調節に抗がん薬の苦味受容体を介したRhoA/ROCKなどのリン酸化シグナルが関与しているという知見を得ている。したがって、当初の予定は、おおむね順調に進展していると考えている。P-glycoprotein (P-gp)やBreast cancer resistance protein (BCRP)およびMultidrug resistance associated protein (MRPs)は薬物を細胞外へ排出することで、がん細胞の多剤耐性に関与している。29年度では肺がんおよび消化管、腎臓がんそれぞれの細胞における各種トランスポーターの機能調節因子を同定するための検討を行なった。その結果、肺がん細胞においては、足場タンパク(ERMタンパク)のうちEzrinおよびMoesinの発現を抑制したときにP-gpおよびBCRPの輸送機能が低下した。同様に他の組織におけるBCRPについて検討したところ、腎臓がん細胞においてはRadixinが関与しているものの、消化管がん細胞ではいずれの足場タンパクの関与も認められなかった。研究期間全体を通じてP-gp、BCRPおよびMRPsの輸送機能は、各種足場タンパクによって臓器特異的に調節されていることが考えられた。さらに、例えば肺がんのように同一がん組織内に存在する複数の種類のトランスポーターが、同一の足場タンパクで調節されることが示された。