hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境化学物質と紫外線の複合作用により生成する変異原の解析とその抑制法

ニコチン測定は、たばこ葉に超純水、2M NaOH及びn-ヘキサンを添加後振とう抽出し、n-ヘキサン溶液をガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)に供して行った。一方、TSNA測定は、たばこ葉にくえん酸-リン酸緩衝液を添加後振とう抽出し、抽出液を珪藻土カラムで処理後、高速液体クロマトグラフ/質量分析計(LC/MS/MS)に供して行った。先行販売2製品(MINT,BITTER)のたばこ葉中ニコチン量及びTSNA量は、1カートリッジあたり、MINTが5.49 mgと737 ng、BITTERが9.12 mgと1,180 ngとなり、両成分ともBITTERの方がMINTより1.6倍多く含まれていた。たばこの主流煙・副流煙に含まれるタール成分と紫外線との複合作用で新たに生じる変異原性について研究を進めている。タバコタールには多環芳香族炭化水素やニコチンなど生体内で代謝されて変異原性を示す物質が存在することはすでに報告されているが、我々は副流煙タールに近紫外光(UVA)照射することでこれまで知られていなかった変異原性が現れることを見いだした。そのメカニズムを明らかにすることを目的として研究を行っている。平成24年度は、タバコタールの捕集方法(国際標準モードのISO法とカナダ保健省が推奨しているHCI法)を変えて、採取したタールの変異原性の強さを比較した。さらにたばこの銘柄による違いについても比較検討した。メカニズム解析では、活性酸素種の関与を中心に調べた。H23年度において、ゲノムDNA中の8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)の生成量を定量することを試みたが、バックグランドの値が高く結論が得られなかった。H24年度はサンプル調製方法に工夫を加えて検討したが、8-OHdGの関与を証明できるデータは得られなかった。一方で、プラスミドDNAに対するDNA鎖切断活性を詳細に調べた。一本鎖DNA切断活性は認められたものの強い活性ではなく、副流煙タールに近紫外光(UVA)照射で生じる変異原性は、活性酸素種だけでなくその他の要因、おそらくDNAに付加体を作る作用があると判断した。タールサンプルの調製、変異原性の評価についての実験はほぼ予定通り終了している。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究実施計画に沿って、実験は予定通り終了している。おおむね順調にすすんでいるため、予定している実施計画に基づいて、本年度以降の実験を実施する予定である。実験の実施に関してはおおむね順調に経過しているが、DNA鎖切断などの生物活性メカニズムに関しての解析結果では、予想していたレベルの活性が見いだせなかった。そこで、計画を少し修正してタバコ煙中の成分の分析から有効な情報を得るべく、機器分析を中心に行う予定である。
ベント構造を利用する新しい高精度DNA/RNA検出法

本年度は、提案した二重分子識別原理に基づく新しい高精度DNA/RNA検出法の第一段階として、2-チオウラシル塩基をウラシル塩基の代わりに導入したRNAの化学合成をおこなった。この人工RNAの塩基識別能力を調べるために、相補鎖のRNAを合成し、ハイブリダイゼーション能力を示すTm値を測定した。同時に2-チオチミンを含むDNAを合成し、相補的なDNAやRNAとの2重らせんのTm値も測定し、その熱安定性を比較した。その結果、2-チオウラシル塩基や2-チオチミン塩基はRNA鎖に組み込まれたとき、最も精密な塩基識別能力を発揮することがわかった。また、RNA/RNA同士の2重らせんが最も安定になることも判明した。これらの知見を現在、RNAチップの合成を指向して研究を展開している。一方、電気化学的RNA検出法の開発のためマイナーグルーブバインダー分子をフェロセンに結合した分子の合成を検討した。フェロセンの2つの5員環にそれぞれDNAのマイナーグルーブに結合できるようにイミダゾールとピロール分子を連結させたものが、標的分子である。この分子を合成するために、まず、フェロセンジカルボン酸に選択的モノエステル化を行い、エステル化されていないカルボキシル基とマイナーグルーブバインダーの一本鎖を連結するため、もっとも有効なスペーサの検討をおこなった。その結果、グリシンスペーサーを用いるとフェロセン骨格とバイナーグルーブバインダー間に相互作用が起こり、分解しやすいことがわかった。そこで、現在、グリシンの代わりに少し鎖長が長いものをスペーサーとして用いることを検討している。
液晶場での高配向な元素配列に基づく常温強磁性体の実現

常温で駆動する次世代磁気デバイス開発に向け、磁場を取り去った後も残留磁化を示す`強磁性'を常温で発現する材料が重要である。我々は、新たな磁性体の開発に向け、高い磁性を示すランタノイド元素を複合した材料開発を行なっている。本研究では、自己組織化的に組み上がる液晶の秩序性を利用し、ランタノイド元素に高い配向秩序性を付与し、低エネルギープロセスで常温強磁性体を作製する新たな概念の確立に挑戦する。
中枢神経疾患動物モデルにおけるミクログリアのトランスクリプトーム解析

マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)急性期のミクログリアでトランスクリプトーム解析を行い,MHC分子などの炎症関連分子のほかに, I型インターフェロン誘導因子,脂質代謝関連分子などが上昇することを見いだした.骨髄未分化細胞とアストロサイトの共培養系を用いた実験で,アストロサイトが産生するIL-34がミクログリアの増殖と分化に重要な役割を果たすことを見いだした.中枢神経系の炎症におけるミクログリアのプリン受容体の役割を解析し,アデノシンA2A受容体が炎症の存在化で発現が上昇し,A1, A2A受容体の阻害薬投与により上清中へのIL-1βの分泌は増加した.2011年度の研究で,我々はinterleukin 34(IL-34)が中枢神経系におけるミクログリアの分化に重要であることを示した.ミクログリアの増殖にはマクロファージの成長因子であるM-CSFが重要であるが,M-CSFと受容体を共有する新規サイトカインIL-34もミクログリアを増殖させることが知られている.我々はアストロサイトとの共培養により骨髄細胞からミクログリアを誘導する培養系を用いて,IL-34がミクログリアの増殖だけでなくその分化にも重要であることを証明した.IL-34で誘導した細胞はよりミクログリアに近い形態を獲得した.IL-34は神経細胞とアストロサイトから産生されていた.2012年度はIL-34の機能について更なる検討を行った.アストロサイトとの共培養により骨髄細胞からミクログリアを誘導する培養系において,抗IL-34抗体の投与による中和効果を検討した.その結果抗IL-34抗体投与群ではIgG投与群と比較してりミクログリア様細胞への分化が有意に阻害された.IL-34の存在下で誘導したミクログリア様細胞とM-CSF存在下で誘導した細胞について,細胞表面マーカーの発現や貪食能を比較した.MHC class I分子,co-stimulatory molecule, F4/80, CD68, CD206の発現は両者の間で明らかな差を認めず,IL-34投与によりM1/M2シフトに相当するミクログリア形質の変化は認められなかった.またzymosanでコートされたマイクロビーズの貪食能についても差を認めなかった.またヒト末梢血から分離した単球をヒトアストロサイトと共培養した場合にもミクログリア様細胞が誘導され,この変化はIL-34の添加により促進された.ミクログリアの発生と分化に関与する新たな因子を同定するために,成体マウス脳よりミクログリアを単離してRNAを抽出し,トランスクリプトーム解析を行った.その結果,マクロファージと比較してミクログリア特異的に高発現する因子をいくつか見いだした.この中で,その機能が十分解明されておらず注目に値する因子として,EBF3を抽出した.EBF3は転写因子の一つであり,同じファミリーに属するEBF1はB細胞の成熟に必須の因子であることが知られている.EBF3に関しては中枢神経系の発生に関与することは知られているが,ミクログリアにおける機能については解明されていない.そこでマウスアストロサイト上で骨髄未分化細胞を共培養してミクログリアへ分化誘導する実験系を用いて,EBF3がミクログリアの分化へ及ぼす影響を調べた.共培養開始と同時にEBF3 siRNAを投与したところ,ミクログリアにおけるEBF3は1/4程度に抑制された.骨髄未分化細胞より誘導されるミクログリアはEBF3 siRNA投与により有意に増加した.表面マーカー解析からこれらの細胞はミクログリアとしての基本的な性質を保っており,M2マクロファージのマーカーであるCD206の発現がわずかに低下していたものの,多くの表面分子の発現に変化は認められなかった.またMOGペプチドによって誘導された実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のマウスで,ミクログリアにおけるEBF3の発現が上昇していた.そこでEAEにおけるEBF3の役割を明らかにするため,EAEを誘導したマウスにEBF3 siRNAをin vivoで投与して臨床症状を観察した.その結果,EBF3 siRNAを投与したマウスではEAEが重症化する傾向が認められた.しかしマウスから単離したミクログリアにおけるEBF3の発現は低下していなかった.マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)急性期のミクログリアでトランスクリプトーム解析を行い,MHC分子などの炎症関連分子のほかに, I型インターフェロン誘導因子,脂質代謝関連分子などが上昇することを見いだした.骨髄未分化細胞とアストロサイトの共培養系を用いた実験で,アストロサイトが産生するIL-34がミクログリアの増殖と分化に重要な役割を果たすことを見いだした.中枢神経系の炎症におけるミクログリアのプリン受容体の役割を解析し,アデノシンA2A受容体が炎症の存在化で発現が上昇し,A1, A2A受容体の阻害薬投与により上清中へのIL-1βの分泌は増加した.ミクログリアの活性化や分化に関与する因子を同定するため,マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行った.C57BL/6マウスに実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導し,急性期および回復期の脳・脊髄を採取した.これらからフローサイトメトリー法でミクログリアを単離し,RNAを抽出してマイクロアレイを行った.同様にcuprizone経口投与による脱髄モデルを誘導し,脳からミクログリアを単離した.これらを正常脳・脊髄のミクログリアと比較検討した.さらに脾臓および腹腔内のマクロファージを単離し,ミクログリアとの間の比較も行った.

その結果,EAEの脊髄ではMHC分子などの炎症関連分子のほかに,いくつかの共通の機能を持つ因子群の発現が上昇していた.これらにはI型インターフェロン誘導因子,脂質代謝関連分子などが含まれ,またいくつかの機能未知の分子も同定された.一方でマクロファージと比較してミクログリアで特異的に発現が高い因子もいくつか同定され,この中にも機能未知の分子が含まれていた.これらの結果は定量PCR法によっても裏付けられた.ミクログリアの増殖にはマクロファージの成長因子であるM-CSFが重要であるが,M-CSFと受容体を共有する新規サイトカインinterleukin 34(IL-34)もミクログリアを増殖させることが知られている.我々はアストロサイトとの共培養により骨髄細胞からミクログリアを誘導する培養系を用いて,IL-34がミクログリアの増殖だけでなくその分化にも重要であることを証明した.IL-34で誘導した細胞はよりミクログリアに近い形態と機能を獲得した.神経細胞とアストロサイトはIL-34を産生しており,IL-34が中枢神経系におけるミクログリアの分化に重要であることが示された.グリア伝達物質である細胞外のATPがミクログリアの遊走や突起の伸展を制御し,プリン受容体であるP2Y12, P2Y13受容体の発現がミクログリアで特異的に高いことが注目されている.しかしこれらの受容体がミクログリアの炎症とどのような関わりを持つかについては知られていない.不死化ミクログリア細胞株であるMG6細胞(独立行政法人農業生物資源研究所遺伝子組換え家畜研究センター木谷裕先生より,理研バイオリソースセンターを介して供与)ならびにマウス一次混合グリア培養より単離したミクログリアを用いた.これらの細胞をLPSおよびATPで刺激し,IL-1βの産生を解析した.またミクログリアにおけるプリン受容体,CD39, CD73の発現を解析した.ミクログリアをLPSとATPで刺激すると上清中へのIL-1β分泌が認められた.ATPと共にアデノシンA1, A2A受容体の阻害薬であるDPCPX, SCH-58261を投与すると,IL-1βmRNAの発現に変化は見られなかったが,上清中へのIL-1βの分泌は増加した.アデノシンA1, A2A受容体の刺激薬はIL-1βの産生に影響しなかった.従ってミクログリアにおいてアデノシンA1, A2A受容体を介するシグナルはインフラマソームの活性化を負に制御することによりIL-1βの分泌を調整していると考えられた.またLPS刺激はミクログリアにおけるアデノシンA2A受容体の発現を上昇させたが,A1受容体の発現に変化は見られなかった.さらにミクログリアはATPをADPに変換するCD39を発現していた.以上よりアデノシンA2A受容体は炎症の存在化で発現が上昇して,ATPの分解により生じたアデノシンの刺激により炎症を抑制する方向に働き,炎症の負のフィードバック機構として作用すると推定された.このようにミクログリアのプリン受容体は突起の伸展のみならず炎症の制御にも寄与しており,これらの機能を調整することは炎症性神経疾患や神経変性疾患の病態を考える上で重要である.神経免疫学
霊長類の発声の柔軟性:社会的状況の影響

本研究では、マーモセットの発声行動に影響を与える要因について、個体間の関係性の面から検討した。視認性の有無と音声返答の有無を操作した3種類の異なる隔離場面におけるSeparation callの音響的特徴の差異について検討したところ、異なる種類の音響パラメータごとに異なる時間的変化パターンがみられた。発声頻度と音量については、ペア個体と隔離された直後に急激な上昇がみられ、続いて徐々に減少した。マーモセットはSeparation callを交換することで、はぐれた相手と再会を促していると考えられている。相手とはぐれた直後であれば、相手はまだ近くにいることが予想される。そのような場面において大きな声でたくさん発声することは、相手と再会するのに効果的であると考えられる。しかし、はぐれてからしばらく経っていれば、相手はより遠くに行っている可能性が高い。そのような場面では、ある程度の頻度で発声を繰り返すことの方が、再会の機会を増やすのに効果的であろう。一方で音声の持続時間に関しては、相手からの音声応答がある条件の方がない条件よりも一貫して短かった。相手から返事がある場合に音声を短くすることは、音声交換において相手の音声との重複を避けることに役立つと考えられる。これらのことから、マーモセットが社会的状況に応じて音響特性を調節していることがわかった。また、異なる種類の音響パラメータを別々に調節していることも明らかとなり、このことで社会的状況における音声伝達の効率性を上げていることが示唆された。本研究では、マーモセットの発声行動にに影響を与える要因について、個体間の関係性の面から検討した。まず始めに、ペア個体との隔離、視認性の有無、音声返答の有無の影響について検討した。マーモセットはペア個体と隔離されると頻繁にSeparation callを発した。ペア個体の視認性がない場合でも、音声返答がある場合は発声頻度の上昇は見られず、音声返答がない場合は発声頻度が上昇した。このことから、音声返答の有無はSeparation callの発声頻度に強く影響することが示唆された。今後は各条件間の音響的特徴の差などについて調べていく予定である。次に、Separation callとしてのPheeと、Proximity callとしてのTrillの2種類の音声を隠されたスピーカーから再生し、被験体の発声行動を記録した。被験体の発声のタイミングを測定したところ、刺激が再生されてから被験体が最初に発声するまでの経過時間は、被験体が連続して発声したときの発声間インターバルよりも短かった。これは、マーモセットの音声交換に"返事をする場合は一定の期間内に返事をし、もし返事がなかった場合にはその一定期間が過ぎてから発声を繰り返す"という時間的なルールがあることを示唆している。また、PheeとTrillにおける時間的なルールは質的には似ていたが、量的には異なっていた。これは、マーモセットが相手との距離の違いに応じて発声のタイミングを調節していることを示唆している。これらの結果は、ヒトの言語に見られる可塑性がサルの発声にもみられることを示す手がかりになりうるだろうと考えている。
魚類増養殖における集団遺伝情報データベースの構築と保全シミュレーション研究

魚類増養殖事業においては、採卵用の親魚数が少ない上、仔稚魚の生残率が著しく高いので、結果として大量の近縁種苗を作出する事になる。このように人工種苗の大量生産において避け難い遺伝子のランダムドリフト、近交弱勢、無意識的選択などの遺伝的変化は野生集団に修復不可能な遺伝的撹乱と損傷などの影響を与えることが予測される。本研究では、養殖対象種および放流事業対象種などの種苗生産過程で生じる遺伝学的諸問題を解決するため、遺伝資源の利用と保全の立場から、それら魚類集団の遺伝的管理法の開発を目指した。具体的には、(1)高感度DNAマーカーを開発使用すること、(2)集団遺伝情報を集積し、データベース構築すること、(3)集団遺伝情報の汎用性の高い迅速処理技術およびシミュレーション法を開発すること、(4)増養殖に関して遺伝資源の保全とその適正利用に関する管理指針の策定することなどの研究課題を設定し、それぞれに関する成果を得た。研究対象として、養殖対象種、放流事業対象種、希少種、実験魚の代表種を選定し、核DNAの遺伝子型およびミトコンドリアDNAの配列多型データを集積し、それぞれの標本群の遺伝的多様性レベルを評価した。一方、使用するマーカーの感度の高さに起因する情報処理の煩雑さを解消するため、各標本について得られた遺伝子型のデータベース化につとめ、コンピューターによる集団遺伝情報の迅速処理技術およびシミュレーション法の開発を試みた。また、サクラマス、セブンラインバルブ、ホシガレイおよびマツカワにおいては、少数親魚による種苗生産において予測される遺伝的多様性の低下および近交係数の上昇、次世代における集団遺伝学的パラメーター推定のための人工種苗シュミレーションソフトを開発し、遺伝的多様性の低下防止および絶滅危惧種の遺伝的修復に関する非近縁個体選択交配シュミレーションを実施するとともに、遺伝的多様性保全マニュアルを提案した。本研究では、1)養殖対象種として、スズキおよびホシスズキ、中国産の4大家魚の一つであるハクレン、フィリピン産のテラピア諸品種、ニシキゴイ、2)放流事業対象種として、ホシガレイ、サクラ、マス、アユ、3)希少種として、マツカワ、サツキマス、オヤニラミ、メコンオオナマズ、揚子江のエンツユイ(サッカーの一種)、4)実験魚として、グッピーおよびギンブナなどを供試魚と定め、研究材料とし複数の標本集団を収集した。次に、これらの標本から核DNAおよびミトコンドリアDNAを抽出し、それらを鋳型として、PCR法によりDNAサンプルを調整した。メコンオオナマズ、サクラマス、スズキ、マツカワ、オヤニラミ、などについては、プライマー情報がDNAデータベースに公表されたものがないので、東北大学の研究室において独自にプライマーの開発を実施し、有効なマーカーの作出に成功した。また、遺伝的多型についてはマイクロサテライトDNA多型およびミトコンドリアDNA配列多型を検出し、それぞれの標本群の遺伝的多様性の指標を推定した。養殖魚や放流種苗については遺伝学的諸問題の解決のため、種苗生産に用いる親魚集団のサイズおよび近交レベルの推定を試み、種苗生産現場で生起している集団遺伝学的諸現象の実態を把握することができた。また、サクラマスおよびマツカワにおいては、少数親魚による種苗生産において予測される遺伝的多様性の低下および近交係数の上昇、次世代における集団遺伝学的パラメータを推定するとともに、遺伝的多様性の低下防止および絶滅危倶種の遺伝的修復に関するシミュレーションを実施し新たな知見を得た。

また、本研究では、研究対象魚種をグローバルな視点で選定しアジアの育種遺伝研究者との共同研究を進めるため、DNAマーカー検出技術の伝授をはかりながら遺伝的多様性研究を包括的に実施することを目指している。このため、2003年10月14日から19日にかけて、東北大学大学院農学研究科においてDNA多型解析に関するワークショップおよびDNA多型検出技術研修会を実施し、本研究の意義について共通理解を得ることができた。今年度は、1)養殖対象種として、中国産の4大家魚の一つであるハクレン、ニシキゴイ、2)放流事業対象種として、ホシガレイ、サクラマス、アユ、3)希少種として、イトウ、マツカワ、オヤニラミ、メコンオオナマズ、セブンラインバルブス、4)実験魚として、グッピーなどを供試魚としてデータを集積した。次に、これらの標本から核DNAおよびミトコンドリアDNAを抽出し、それらを鋳型として、PCR法によりDNAサンプルを調整した。イトウ、メコンオオナマズ、サクラマス、スズキ、などについては、東北大学の研究室において独自にプライマーの開発を実施し、プライマー情報をDNAデータベース(DDBJ)に登録した。また、遺伝的多型についてはマイクロサテライトDNA多型およびミトコンドリアDNA配列多型を検出し、それぞれの標本群の遺伝的多様性のレベルを推定した。放流用種苗については遺伝学的諸問題の解決のため、種苗生産に用いる親魚集団のサイズおよび近交レベルの推定を試み、種苗生産現場で生起している集団遺伝学的諸現象の実態を把握することができた。一方、使用するマーカーの感度の高さに起因する情報処理の煩雑さを解消するため、各標本について得られた遺伝子型のデータベース化につとめ、コンピューターによる集団遺伝情報の迅速処理技術およびシミュレーション法の開発を試みた。また、サクラマス、ホシガレイおよびマツカワにおいては、少数親魚による種苗生産において予測される遺伝的多様性の低下および近交係数の上昇、次世代における集団遺伝学的パラメータを推定するとともに、遺伝的多様性の低下防止および絶滅危惧種の遺伝的修復に関するシミュレーションを実施し新たな知見を得た。また、本研究では、研究対象魚種をグローバルな視点で選定しアジアの育種遺伝研究者との共同研究を進めるため、DNAマーカー検出技術の伝授をはかりながら遺伝的多様性研究を包括的に実施することとし、2004年12,月14日には、東北大学大学院農学研究科においてDNA多型解析に関するワークショップおよびDNA多型検出技術研修会を実施し、本研究の意義について共通理解を得ることができた。昨年度に引き続き、1)養殖対象種として、中国産の4大家魚の一つであるハクレン2)放流事業対象種として、ホシガレイ、サクラマス、アユ、3)希少種として、マツカワ、メコンオオナマズ、セブンラインバルブ、4)実験魚として、グッピーなどを供試魚としてデータを集積した。希少種のメコンオオナマズ、イトウについては、東北大学の研究室において独自にプライマーの開発を実施し、プライマー情報をDNAデータベース(DDBJ)に登録した。
日本人健常男性における飲酒と喫煙の血圧、腎機能に与える影響

飲酒がヒトの高血圧の重要な原因であることはよく知られているが、その腎機能への影響については明らかでない。一方、喫煙は種々の腎疾患のよく知られた憎悪因子であるが、喫煙が血圧へ与える影響については十分確定されておらず、喫煙は悪性高血圧患者での血圧上昇因子の一つとされる一方で、多くの疫学調査では喫煙者の血圧はむしろ低いことも示されている。本研究は、中年健常男性労働者において、飲酒、喫煙がその腎機能に及ぼす影響と、そのことの高血圧、腎障害への関与について明らかにしようとしたものである。中年男性の飲酒者、喫煙者ではともに血清クレアチニンの濃度が低かった。特に喫煙量の増加とCockcroft and Gaultの式から推定された腎糸球体濾過量の増大とが有意の関連性を示した。このことから、喫煙が全身および腎の循環動態に大きな影響を与え、腎糸球体濾過量を増大させることで尿中クレアチニン排泄が増大し、血清クレアチニン濃度が低下を示すと考えられた。さらに、喫煙者での腎糸球体濾過量の増大は全身血圧の上昇と有意な直線的相関関係を示した。これは喫煙者でのきわめて特徴的な所見である。喫煙者での糸球体濾過量の増大には、喫煙による直接的影響とともに、血清インスリンの上昇も関与している可能性もあると考えられた。また、喫煙による糸球体濾過量の増大と血圧上昇とがあいまって、尿中アルブミン排泄量の増大に関与していることが示唆された。一方、飲酒者も低い血清クレアチニン濃度を示すが、飲酒量の糸球体濾過量増大への影響は有意でなく、その生物学的な意味は大きくないと考えられた。これらの結果から、喫煙は循環動態に大きな影響を与え、腎糸球体濾過量の増大させる一方で全身血圧上昇をもたらし、それが喫煙者での腎障害の発生に深く関わっている可能性があると考えられた。平成17年度の研究目的は、健常中年男性労働者での横断研究により、飲酒と喫煙とがそれぞれ単独に、また相互に関連して血圧や腎機能に与える影響を明らかにすることであった。電子部品製造工場で平成17年10月に行われた職場定期健康診断を利用して、約800名の男性労働者に生活習慣アンケート調査と身体計測、血圧測定、採血、採尿を行った。得られた血液、尿試料を保存するために超低音フリーザーを1台、丸文通商より購入した(物品費)。血清クレアチニン濃度を含む血液検査は(株)SRLに委託し、結果を得ている。尿の総蛋白量、ミクロアルブミン、beta2ミクログロブリン濃度の測定は(財)石川県予防医学協会に委託し、同じく結果を得た。それらの委託には「その他」の経費から支出した。現在、尿中NAGおよびカドミウム濃度について、教室の本多が測定をすすめている。その際の試薬類および文具類などの物品を「消耗品」の経費より支出した。それらの分析結果が出次第、アンケート調査結果とともに電子ファイルとしてコンピュータ入力を行った。これまでに測定、データ入力が終了した800人の成人男性についての健康診断成績の内、飲酒、喫煙量と血圧および血清クレアチニンから算定される推定クレアチニン・クリアランス値の関係を解析した。その結果、以下のような成績が得られた。1)飲酒量の増加は血圧値の上昇と強く関連し、喫煙量の増加は血圧値の低下と弱いながら有意の関連性を示し、従来の報告と一致した。2)飲酒量および喫煙量の増大がいずれも血清クレアチニンの低下および推定クレアチニン・クリアランス値の増大と関連した。

この集団では飲酒量、喫煙量のいずれもBMIと有意の関連を示さなかったので、飲酒者や喫煙者の血清クレアチニン低値は筋肉量減少によるクレアチニン生成低下でなく、クレアチンニン尿中排泄増加、すなわちクレアチニン・クリアランスの増大を反映したものと考えられた。3)重回帰分析の結果、血清クレアチニン低下とクレアチニン・クリアランス上昇は喫煙量と空腹時の血清インスリン値にもっとも強く関連することが示された。4)喫煙者においては、クレアチニン・クリアランスの増加が血圧値の上昇と有意の関連性を示したが、非喫煙者ではそのような関連性は明らかでなかった。今後、クレアチニン・クリアランスの増加を示す喫煙者での血圧上昇に、腎糸球体でのhyperfiltrationが関与しているかどうかを解明する予定である。前回(2005年)の被験者800人のうち、645人(80.6%)が今回(2007)の健康診断を受診し、再検討が可能であった。前回同様、飲酒、喫煙量の調査と、血圧、血糖、血清インスリン、血清クレアチニン値(SRL(株)に測定を委託)に加え、尿中アルブミン濃度の測定(石川県予防医学協会に委託)を行い、パラメータ相互の関連性について統計解析を行った。以下に主要な成績を示す。1)飲酒、喫煙量は各パラメータと基本的に前回同様の結果を示した。すなわち、血圧とはそれぞれ弱い正相関と負相関を示し、血清クレアチニンとは強い負相関、推定クレアチニン・クリアランスとは正相関を示した。2)尿中アルブミン濃度は血圧およびクレアチニン・クリアランスの上昇と有意な正相関を示したが、飲酒、喫煙量とは有意の関連性が見られなかった。3)前回同様、喫煙者でのクレアチニン・クリアランスの増加は血圧の上昇と関連していたが、同時に尿中アルブミン濃度の増加も認められた。4)以上より、一般に疫学研究では喫煙者の血圧は低めと報告されているが、喫煙量が多いと腎糸球体での濾過が増加してhyperfiltrationの状態になり、それによりかえって血圧も上昇することがあると考えられた。したがって、多量な喫煙は血圧上昇要因と考えられる。足かけ3年の観察では血圧、血清クレアチニンに大きな変化は見られず、今回は縦断的な観察による考察はできなかった。
パーキンソン病モデルラットにおける疼痛感覚異常の解明

片側および両側パーキンソン病(PD)モデルラットにおける口腔領域の痛覚異常を検討した。片側または両側の内側前脳束に6-hydroxydopamineを注入し、PDラットを作製した。PDラットの左側上口唇にホルマリン溶液を注射し、疼痛関連行動と三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)に発現するc-Fos陽性細胞数を数えた。内側前脳束に生理食塩水を投与したコントロールラットと比較した。疼痛関連行動は、片側PDモデルラットではコントロールラットと比べ有意に増加したが、両側モデルでは差はなかった。しかし、Vcでのc-Fos陽性細胞数は、PDラットで増加した。PDモデルラットは痛覚過敏状態にあることが判明した。平成24年度は、両側パーキンソン病(PD)モデルラットを作製し、片側モデルで観察された疼痛関連行動(PRB)と三叉神経脊髄路核(Vc)におけるc-Fos発言の結果と比較することにより、三叉神経領域における疼痛感覚異常の特徴を明らかにしようと試みた。片側PDモデルラットにおいては、破壊側の上口唇にホルマリン注射を行うと、PRBの増加とVcにおけるc-Fos発現の増加が認められたが、反対側にホルマリン注射を行った場合、PRBの抑制が観察されたのにかかわらず、c-Fosの変化がなかった。これらの結果は同側における痛覚過敏と反対側における運動機能障害の関与を示唆するものであり、その確認を行うことを目的とした。しかし、両側PDモデルラットの作製には極めて困難を伴った。まず、6-OHDAを片側の内側前脳束に投与することにより片側PDモデルラットを作製し、メタンフェタミンによる誘起回転によりその効果を確かめた後、反対側の内側前脳束に6-OHDAを投与する方法で両側PDモデルラットの作製を試みた。しかしラットをPRBの観察するまでの期間、生存させることができなかった。さらに、6-OHDAを両側の内側前脳束に一回で投与することにより黒質細胞を破壊し両側PDモデルラット作製を試みたが、同様に、PRBの観察を行うまでの期間、生存させることができなかった。そこで現在、両側PDモデルラットでのPRB及びc-Fos観察は中断し、当初計画していた片側PDモデルラットの痛覚過敏状態にPD治療薬であるレボドパの影響を検討している。1.ホルマリンテストによる炎症性疼痛に対する行動学的反応の検討:内側前脳束に6-hydroxydopamine(6-OHDA)を注入し、両側のドーパミン神経細胞を破壊したパーキンソン病(PD)モデルラットの左側上口唇にホルマリン溶液を注射し、炎症性疼痛に対する疼痛関連行動(顔面こすり運動)の観察を行った。4%ホルマリン溶液50&microlを上口唇に皮下注射し、5分ごとに90分間、疼痛関連行動の回数を測定した。2.炎症性疼痛に対する免疫組織学的反応の検討:PDモデルラットの上口唇へのホルマリン注射2時間後に灌流固定を行った。その後脳を取り出し、三叉神経脊髄路核尾側亜核の凍結切片を作製し、c-Fosに対する免疫組織学的染色を行った。切片の三叉神経脊髄路核尾側亜核内に認められるc-Fos陽性細胞数を顕微鏡にて計測した。また、線条体と黒質の凍結切片を作製し、tyrosinehydroxylaseに対する免疫組織学的染色を行った。3.結果:実験に用いた、内側前脳束に6-OHDAを注入したラットでは、両側の黒質と線条体においてtyrosinehydroxylase免疫反応性の著明な低下が認められた。一方、内側前脳束に生理食塩水を注入したコントロール群のラットでは、黒質と線条体においてtyrosinehydroxylase免疫反応性の低下は認められなかった。6-OHDAを内側前脳束に注入した群と、内側前脳束に生理食塩水を注入したコントロールラットにおいて、疼痛関連行動の回数に有意な差は認められなかった。三叉神経脊髄路核尾側亜核内のc-Fos陽性細胞数は、6-OHDAを内側前脳束に注入した群と生理食塩水を注入した群との間で有意な差は認められなかったが、6-OHDAを注入した群で増加傾向が認められた。1.方法:内側前脳束に6-OHDAを投与し、片側のドーパミン神経細胞を破壊したパーキンソン病(PD)モデルラットの上口唇にホルマリンを注射し、炎症性疼痛に対するPRB(顔面こすり運動)の観察を行った。また、ホルマリン注射10分後および2時間後に脳の灌流固定を行い、三叉神経脊髄路核尾側亜核(Vc)内に認められるpERKおよびc-Fosに対する免疫陽性細胞数を計測した。以下の4群に分けて行った。

(1)6-OHDA-ipsi:左側内側前脳束に6-OHDAを投与し、左側上口唇にホルマリンを注射、(2)saline-ipsi:左側内側前脳束に生食を投与し、左側上口唇にホルマリンを注射、(3)6-OHDA-contra:左側内側前脳束に6-OHDAを投与し、右側上口唇にホルマリンを注射、(4)saline-contra:左側内側前脳束に生食を投与し、右側上口唇にホルマリンを注射2.結果:6-OHDA-contra群のPRBの回数はsaline-contra群比較して、第1相(0-5分間)で有意に少なかった。特にホルマリン注射側と同側の前肢のみを使ったPRBの回数が第1相、第2相(10-90分)でsaline-contra群に対して有意に減少した。6-OHDA-ipsi群のPRBは第2相でsaline-ipsi群と比べ有意に増加した。特にホルマリン注射側と同側の前肢のみを使った顔面こすり行動の回数が増加した。Vc内のc-Fos陽性細胞数は、6-OHDA-ipsi群で増加が認められ、6-OHDA-contra群では有意な変化は認められなかった。またVc内のpERK陽性細胞数に、各群で差は認められなかった。3.考察:6-OHDA投与側の上口唇は痛覚過敏状態にあることが示された。一方、6-OHDA-contra群で認められた第1相におけるPRBの回数の減少は、動作の障害によるものと考えられた。(理由)両側PDモデルラットを作製し、以前検討した片側PDモデルラットでの結果と比較する予定であったが、両側PDモデルラットを確立することができなかった。2つの方法で両側PDモデルラットの作製に試みたが、PRBの観察を行うまでの期間、生存させることができなかった。両側の破壊が生体に対し重大な影響を及ぼすためと考えられる。そこで両側PDモデルラットでのPRB及びc-Fos観察は中断し、現在は当初計画していた実験目的の一つである、片側PDモデルラットの痛覚過敏状態に対する、PD治療薬であるレボドパの影響を検討中である。平成23年度の計画に従い、以下の2点を明らかにした。(1)PDモデルラットにおける疼痛感覚異常の特徴として、片側モデルにおいては、疼痛関連行動とpERKおよびc-Fosの結果の乖離(6-OHDA-contra群においてPRBの減少が観察されたのにかかわらず、pERKおよびc-Fosの変化がなかったこと)がみられた。これは黒質線条体系の破壊により、それとは反対側に運動障害が起こるためと推測された。(2)PDモデルラットでは痛覚過敏状態が誘発されるが、そのメカニズムの仮説として、6-OHDA投与による黒質線条体の破壊により、下行性抑制系が影響されるためと仮定した。しかし、6-OHDAによる黒質線条体系の破壊は、ホルマリンテスト時の中脳中心灰白質(PAG)におけるc-Fos発現に影響しないことが判明した。以上のように計画された研究を実施し、一定の結果を得ることができたので、研究はおおむね順調に進展しているといえる。片側PDモデルラットを作製し、PD治療薬であるレボドパを投与後にPRBを観察し、片側PDモデルラットの痛覚過敏状態にレボドパがどのように作用するか検討する。また、選択的セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤や、ドパミンD1またはD2受容体作動薬についても同様にその効果を検証する。
肥満遺伝子産物レプチンのカルシウム代謝調節作用の解析

肥満遺伝子産物レプチンの骨代謝及びカルシウム代謝への影響を検索した。前年度、正常なレプチンの存在しないob/obマウスを用いた実験により、カルシウム調節ホルモンである活性型ビタミンD(1α,25-dihydroxyvitamin D_3 [1α,25(OH)_2D_3])の合成をレプチンが抑制することを見出した。本年度の研究では、このレプチンの作用がLong formのレプチン受容体(OB-Rb)を介したものであるかを検索した。OB-Rbを欠如しているdb/dbマウスにレプチンを腹腔内投与した。血清中の1α,25(OH)_2D_3レベルはob/obマウスと同様db/dbマウスでも上昇してたが、レプチンを投与しても変化はなかった。腎臓での1α-水酸化酵素(CYP27B1)の遺伝子発現及び酵素活性も、db/dbマウスで上昇していた。しかし、レプチンを投与してもこの上昇は維持されていた。腎臓での24-水酸化酵素(CYP24)の遺伝子発現は、db/dbマウスで上昇していた。レプチン投与によりCYP24の発現はさらに上昇傾向を示した。以上のことから、レプチンの活性型ビタミンD合成調節は、OB-Rbを介していることが示唆された。そこで、腎臓におけるレプチンの直接作用をより詳細に解析するために、マウス由来初代培養腎上皮細胞の培養系を確立し、レプチンの効果を検索した。ob/obマウスを用いてレプチンの骨への影響を検索した。DEXAを用いた骨密度測定を行ったところ、大腿骨の骨密度はob/obマウスで減少していた。ob/obマウスではLean群に比べ、成長板の肥厚、海綿骨の減少、骨髄腔の脂肪滴などがみられた。血中ALP活性はob/obマウスで顕著に上昇していた。また、血中のTRAP活性もob/obマウスで上昇していた。尿中Dpdは、ob/obマウスで上昇傾向が認められた。以上のことから、レプチンはカルシウム代謝のみならず、骨代謝にも影響を与えていることが示唆された。カルシウム調節ホルモンである活性型ビタミンD(1,25-dihydroxyvitamin D_3[1,25(OH)_2D_3])の合成に肥満遺伝子産物レプチンが影響を与えるかどうかに着目した。レプチン欠乏のob/obマウスの血中1,25(OH)_2D_3のレベルは顕著に増加していた。血中カルシウム、リン濃度も上昇していた。腎での1,25(OH)_2D_3合成酵素(1α-水酸化酵素)の遺伝子発現量及び酵素活性レベルはob/obマウスで有意に上昇していた。本研究では、ob/obマウスにレプチンを投与したときのカルシウム代謝、ビタミンD代謝への影響について検討した。ob/obマウスにレプチン4mg/kgb.w.を2日間腹腔内投与すると、血中カルシウム濃度は低下した。血中1,25(OH)_2D_3濃度はコントロール群のレベル近くまで減少した。また、血中PTHレベルは、コントロール群とob/obマウスとの間に差はなかったが、ob/obマウスへのレプチン投与により著しく上昇した。次に、1,25(OH)_2D_3合成と分解に関与する腎臓での1α-水酸化酵素及び24-水酸化酵素(ビタミンD分解酵素)の発現を検索した。ob/obマウスで顕著に上昇していた1α-水酸化酵素の発現は、レプチン投与により、遺伝子及び酵素活性レベルにおいて有意に低下した。24-水酸化酵素の発現もob/obマウスで上昇していたが、レプチン投与により遺伝子発現及び酵素活性において有意に低下した。腎におけるレプチンの直接作用を、より詳細に解析する為に、マウス腎近位尿細管細胞の初代培養系を確立した。まず、この初代培養系におけるレプチン受容体(Ob-Rb (long form of the leptin receptor))の発現を検索したところ、遺伝子発現が認められた。レプチンを添加したところ、1α-水酸化酵素の遺伝子発現は減少傾向を示した。

以上のことから、レプチンの活性型ビタミンD合成調節は、OB-Rbを介していることが示唆された。そこで、腎臓におけるレプチンの直接作用をより詳細に解析するために、マウス由来初代培養腎上皮細胞の培養系を確立し、レプチンの効果を検索した。ob/obマウスを用いてレプチンの骨への影響を検索した。DEXAを用いた骨密度測定を行ったところ、大腿骨の骨密度はob/obマウスで減少していた。ob/obマウスではLean群に比べ、成長板の肥厚、海綿骨の減少、骨髄腔の脂肪滴などがみられた。血中ALP活性はob/obマウスで顕著に上昇していた。また、血中のTRAP活性もob/obマウスで上昇していた。尿中Dpdは、ob/obマウスで上昇傾向が認められた。以上のことから、レプチンはカルシウム代謝のみならず、骨代謝にも影響を与えていることが示唆された。
バイオイメージングのためのチロシンリン酸化プローブの開発

Cyan fluorescent protein(CFP)及びyellow fluorescent protein(YFP)を用いて蛍光共鳴エネルギー遷移(fluorescent resonance energy transfer, FRET)を利用したチロシンリン酸化検出プローブを作製した。CFPとYFPの間にGrb2/Ash由来のsrc homology(SH)2ドメイン、Shcの被リン酸化チロシンを含む領域21残基をつないだ融合タンパク質(CFP-Ash-Shc-YFP)はShc部分がチロシンリン酸化されるとコンフォメーションが変化し、その結果FRET効率が変化する。この融合タンパク質をHeLa細胞に発現させ、バナジウムでチロシンリン酸化を元進させた。抗GFP抗体、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウェスタンブロットより、融合タンパク質が細胞内に発現しており、バナジウム刺激に伴ってチロシン残基がリン酸化されていることが確認された。またこの融合タンパク質は、433nmの励起により475nm、527nmに極大を持つ蛍光スペクトルを示し、チロシンリン酸化によってFRET効率が変化(475nmの蛍光の上昇、527nmの蛍光の減少)した。意図した通り、チロシンリン酸化を蛍光変化として捕らえることに成功した。Ash-Shc間のリンカー部分の長さを変化させてチロシンリン酸化検出能力を検討したところ、大きな蛍光変化を示すためにはある程度の長さのリンカーが必要であることが示された。SH2ドメインとリン酸化チロシンが分子内結合する際の立体障害を軽減するため、リンカー部分に柔軟性が必要なためと考えられる。EFGSGSGSGSG、EFCSRRYRGPGISSSSPAGという配列をリンカーとして用いた時に良好な結果を得た。2種類の蛍光タンパク質cran fluorescent protein (CFP)及びyellow fluorescent protein (YFP)、チロシンリン酸化されるペプチド、そのリン酸化されたチロシンを認識して結合するsrc homology (SH)2ドメインとを用い、fluorescence resonance energy transfer (FRET)を利用した、チロシンリン酸化可視化のための蛍光プローブをデザイン、開発した。CFP-SH2-チロシンペプチド-YFPという融合タンパク質をデザインした。このタンパク質のチロシンペプチド部分がチロシンリン酸化されると、SH2ドメインと分子内結合してコンフォーメーション変化を起こす。その結果CFP、YFPの相対的な位置が変化し、FRET効率が変化する。この蛍光変化によりチロシンリン酸化を測定することが出来ると考えられる。SH2としてGrb2/Ash、チロシンペプチドとしてShcの一部(21残基)を用い、pECFP-Cベクター(clontech)を骨格として融合タンパク質発現プラスミドを作製した。これをリポフェクション法によりHeLa細胞に遺伝子導入して融合タンパク質を発現させ、抽出、粗精製した後、CFPの励起波長である433nmで励起した時の蛍光を測定した。融合タンパク質はCFP、YFPの蛍光波長である475nm、527nmにピークをもつスペクトルを示した。バナジウム刺激によりチロシンリン酸化を亢進させると、475nmと527nmの蛍光強度比が変化した。これはFRET効率の変化を示しており、このプローブが意図した通りチロシンリン酸化反応を捉えていることを示す。DFP、SH2、ペプチド、YFP各部分の間をつなぐリンカーを変化させて蛍光強度比変化量の増大を試みたところ、1015%程度の変化を示すプローブが得られた。
増殖因子による小腸粘膜細胞の分化と増殖の解析

本研究では、ラット小腸陰窩細胞より確立されたIEC-6を用いて、in vitroにおける小腸細胞の増殖と分化についての検討を中心に研究を進めた。IEC-6細胞の増殖については、表皮増殖因子(EGF)、インスリン、および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)とインターロイキンならびにマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の作用について検討した。最も強力な増殖作用を示したEGFの増殖シグナルについては、細胞内タンパク質のチロシンリン酸化と細胞内遊離カルシウム濃度の変化について検討し報告した。さらに、本研究では、吸収上皮に発現するアルカリフォスファターゼとスクラーゼの誘導を指標として、TGF-βとレチノイン酸によるIEC-6細胞の分化の検討も行った。IEC-6細胞は、RAR-αとγレセプターを発現していた。低血清培地で培養したIEC-6細胞にレチノイン酸を添加すると、RAR-αのmRNA量は減少するのに対して、RAR-γmRNAは明らかにその発現量を増加した。RAR-βは、レチノイン酸の添加に関わらずそのmRNAは検出できなかった。レチノイン酸はアルカリフォスファターゼとスクラーゼを誘導した。これら酵素の誘導は、ノーザンブロット法ならびにウエスタンブロット法によりそれぞれのmRNAと酵素蛋白質を解析して確認した。一方、TGF-βは、スクラーゼのみ誘導した。これらの結果より、レチノイン酸は、TGF-βと異なる経路でIEC-6細胞の分化の誘導を引き起こすことが示唆され、その作用には、RAR-γが関与する可能性が示唆された。本研究では、ほとんど手をつけられていない小腸上皮細胞の分化について検討し、非常に興味深い知見が得られた。
カスタムアバットメントの形態が上部構造体の強度に与える影響に関する研究

口腔内で安全に機能を営め,審美的にも優れたインプラント補綴を行うために,その礎となるアバットメントの離脱などが惹起される原因を三次元有限要素法によるシミュレーションから解析を行った.その結果,ジョイントタイプの異なる2種類(エクスターナルジョイント型,インターナルジョイント型)について,エクスターナルジョイント型が,インターナルジョイント型よりも狭い範囲に約1.2倍の応)集中があることが分かった.口腔内で安全に機能を営め,審美的にも優れたインプラント補綴を行うために,その礎となるアバットメントの離脱などが惹起される原因を三次元有限要素法によるシミュレーションから解析を行った.その結果,ジョイントタイプの異なる2種類(エクスターナルジョイント型,インターナルジョイント型)について,エクスターナルジョイント型が,インターナルジョイント型よりも狭い範囲に約1.2倍の応)集中があることが分かった.本研究の目的は,口腔内で咬合などの機能を安全に営み,患者の美的感覚をも満足させる理想的な強度と審美性を有するインプラント補綴による上部構造体を製作するための礎となり得る最適なカスタムアバットメントの形態を検討し,提示することである.それは,申請者らが最終的な目標と考えている口腔内での金属イオンの溶出やガルバニ腐食を防止する目的からインプラント補綴の構成要素(フィクスチャー,アバットメント,そして上部構造体など)を単一の合金で製作する独自のインプラントシステムの開発に不可欠なプロセスと考えられる.その際に使用する金属がチタンおよびチタン合金に限定されることから,この金属に起因する問題点の解決が必要であり,申請者がこれまでに取り組んできた研究課題である.今年度は,そのうちの最大の課題と考えられた切削性の向上の解決に取り組み,チタン合金(Ti-20%Ag)を試作して,歯科用CAD/CAM(computer-aided design/computer-aided manufacturing)の加工プログラムを調整し,その有用性について,第6回国際歯科チタンシンポジウムなどの3学会において発表を行った.また,インプラント補綴にとってのアバットメントの理想的形態を解析するための三次元応力解析モデルを構築するには,それぞれ固有の特徴を持つ数多くのインプラントシステムを把握し,フィクスチャーへのネジの結合様式やアバットメントの形態的特徴などを整理・検討する必要がある.今年度は,その作業を行い三次元応力解析モデルのデザイニングの検討を行った.今日,歯科インプラント補綴は,欠損修復の方法としての優先順位が義歯と入替わるとされる程の有力な選択肢となっている.この補綴方法は,インプラント体(フィクスチャー)にアバットメントをスクリューにより固定し,セラミックス修復物などの上部構造体を被覆させる方法である.しかし,長期間の臨床観察が行われるにしたがって,スクリューの緩みやそれに起因した修復物の破折などの事例が報告されるようになっている.このような現状から,口腔内で安心して咬合や発音などの機能を営め,審美的にも優れたインプラント補綴を行うために,その礎となる最適なアバットメントの形態を三次元有限要素法によるシュミレーションから応力解析を行い検討するのが本研究の目的である.現在,発売されている約20種類のインプラントシステムは,インプラント体とアバットメントの結合方式から, 1)エクスターナルジョイント型(インプラントトップの外側にナット状の回転防止機構を有するタイプ)と2)インターナルジョイント型(インプラント体内部に回転防止機構を有するタイプ)に大きく分類される.そこで離脱などの現象が惹起される原因を探るため,ジョイントタイプの異なる2種類の形態での線形静解析を行い,それぞれの応力分布の比較を行った.その結果,いずれのタイプでもジョイントネジの弾性部分に応力が発生しており,特にタップ部分に応力が集中していることが分かった.また,エクスターナルジョイント型が,インターナルジョイント型よりも狭い範囲に応力が集中し,ジョイントネジ部分に発生する応力は,インターナルジョイント型の約1.3倍であることが分かった.したがって,ジョイント部分の応力分布傾向と一般的な応力分布は,一様になることが理想と考えられることから,インターナルジョイント型の優位性が示唆された.
細胞極性確立とmRNA局在のin vivo イメージング

本研究では、細胞極性の分子レベルでの研究が最も進んでいる出芽酵母を用いて、mRNAや細胞極性決定因子の局在のin vivoイメージングの系を確立し、その系を用いてmRNAの細胞内局在の分子機構機構および細胞極性の確立や維持に関与する因子のmRNA局在における機能を明らかにする。また、動物細胞から酵母相同遺伝子を機能的に分離することにより、動物細胞におけるmRNAの局在機構およびその細胞極性との関連を明らかにする。さらに、動物細胞において細胞極性の形成に重要な役割を果たす細胞間接着の形成機構について解析する。本年度は、酵母および培養細胞を用いた細胞極性、非対称分裂、mRNAの局在、細胞間接着形成の機構の解析から、以下の結果を得た。(1)NucleaseドメインをもつMkt1がPbp1と複合体を形成して、HO mRNAの3'非翻訳領域を介して、HO遺伝子の発現を正に制御することを明らかにした。(2)ASH1 mRNAの娘細胞の先端への局在に必要なShe4が、ASH1 mRNAを輸送するMyo4モータータンパク質のシャペロンであることを明らかにした。(3)上皮細胞における細胞間接着形成時において、接着分子ネクチン-3が、運動している細胞の先端部に局在するネクチン様分子Nec1-5とヘテロな接着を形成し、この接着がアドヘレンスジャンクション形成の初期に機能することを見出した。(4)上皮細胞のアドヘレンスジャンクションにおいて、アドヘレンスジャンクション形成における2つの細胞間接着機構、ネクチン-アファディン系とカドヘリン-カテニン系を連結する因子ADIP,LMO7を見出した。このように、本年度の研究は予想以上に進展し、当初の目的を達成することができた。出芽酵母は、出芽により増殖し細胞分裂により大きさおよび性質の異なる2つの細胞(大きい方を母細胞、小さい方を娘細胞と呼ぶ)に分かれる。ASH1タンパク質をコードするmRNAは、細胞分裂時に娘細胞の先端(distal tip)に局在し、これがASH1タンパク質の娘細胞特異的局在を保証している。ASH1は接合型変換を触媒するHO遺伝子発現の負の制御因子である。ASH1 mRNAの局在にはmRNAの3′非翻訳領域、ミオシンをコードするMYO4遺伝子、アクチンの制御因子と考えられているBMI1遺伝子が必要であることが明らかになっている。ASH1 mRNAの娘細胞の先端への局在を、生きた酵母細胞中で観察するため、U1A-GFP融合タンパク質とU1A結合部位をASH1に導入したU1Asite-ASH1遺伝子の発現プラスミドを構築した。これらを用いて、細胞分裂時におけるASH1 mRNAの娘細胞の先端への局在を、生きた酵母細胞中で観察することに成功した。またこの系を用いて、ASH1 mRNAと共局在するRNA結合タンパク質Yb1032wを見いだした。さらに、RNA結合モチーフをもつMpt5タンパク質が、HO遺伝子のmRNA3′非翻訳領域に結合し、HO遺伝子の発現を抑制することを見いだした。mpt5変異株では野生型株では起きないHO遺伝子の発現が起きることから、Mpt5がHO遺伝子の母細胞特異的発現、すなわち酵母の非対称分裂の制御に関与することが明らかとなった。今後、これらのRNA結合タンパク質と、ミオシン、アクチン等の細胞骨格系との相互作用を検討する予定である。出芽酵母は、出芽により増殖し、細胞分裂により、大きさおよび性質の異なる2つの細胞(大きい方を母細胞、小さい方を娘細胞と呼ぶ)に分かれる。Ash1タンパク質をコードするmRNAは、細胞分裂時に娘細胞の先端(distal tip)に局在し、これがAsh1タンパク質の娘細胞特異的局在を保証している。Ash1は接合型変換を触媒するHO遺伝子発現の負の制御因子である。ASH1 mRNAの局在にはmRNAの3′非翻訳領域、タイプVミオシンMyo4、アクチンの制御因子Bni1が必要であることが明らかになっている。この系を用いて、ASH1 mRNAと共局在するRNA結合タンパク質Yb1032wを見いだした。また、HO遺伝子の母細胞特異的発現が不能になる変異株をスクリーニングすることにより、ASH1 mRNAの局所的翻訳に関与する因子Mkt1を分離した。mpt5変異株では野生型株では起きないHO遺伝子の発現が起きる。以上の結果から、HO遺伝子の母細胞特異的発現には、娘細胞特異的に局在する転写因子Ash1よる転写開始での制御に加え、Mpt5によるHO mRNAの転写後の段階での制御も必要であることが明かとなった。今後は、Yb1032w,Mpt5などのRNA結合タンパク質と、ミオシン、アクチン等の細胞骨格系との相互作用を検討する予定である。出芽酵母は出芽により増殖し、細胞分裂により大きさおよび性質の異なる2つの細胞、母細胞と娘細胞を生じる。ASH1 mRNAは、細胞分裂時に娘細胞の先端に局在し、これがAsh1タンパク質の娘細胞特異的局在を保証している。