hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白脱リン酸化酵素阻害剤dysidiolideの不斉合成と活性構造の探索

新規セスタテルペンdysidiolideは細胞周期制御に関与する脱リン酸化酵素cdc25Aを特異的に阻害し細胞周期をG1/S,G2/Mの2箇所で停止させ、A-549ヒト肺癌細胞系、p388ネズミ白血病細胞系の増殖をそれぞれIC_<50>4.7μM、1.5μMで抑制する。cdc25Aは細胞周期のG1期からS期への移行に関与するcdk-サイクリンAコンプレックスとG2期からM期への移行に関与するcdc2-サイクリンBコンプレックスの15番目チロシン残基と14番目スレオニン残基のdualフォスファターゼで、脱リン酸化によりコンプレックスが活性化され細胞周期の進行を促進する。癌細胞ではこれら細胞周期進行を促進するG1,Mサイクリン、cdk、cdc2の異常発現が確認されており、これらコンプレックスを活性化するcdc25Aを特異的に阻害するdysidiolideは抗癌剤のリードとして極めて重要である。本研究の現在までの進捗状況は極めて順調であり、dysidiolideの国内初の不斉全合成に成功した。さらにその方法論に基づいて各種立体異性体をも合成し、dysidiolideよりも強力な新規cdc25A阻害剤の創出に成功した。その一方で、ビタミンD3骨格の活用にも積極的に取り組み、dysidiolideのヒドロキシブテノリド部分を単純な脂肪酸で置換したものにも強力なcdc25A阻害活性があることを見いだした。現在もより優れたcdc24A阻害剤の開発を目指し、ビタミンD骨格とヒドロキシブテノリドの融合による新たな化合物群の創成を精力的に行っている。cdc25Aは細胞周期のG1期からS期への移行に関与するcdk2-サイクリンAコンプレックスとG2期からM期への移行に関与するcdc2-サイクリンBコンプレックスの15番目チロシン残基と14番目スレオニン残基のdualフォスファターゼで、脱リン酸化によりコンプレックスが活性化され細胞周期の進行を促進する。癌細胞ではこれら細胞周期進行を促進するG1,Mサイクリン、cdk,cdc2の異常発現が確認されており、これらコンプレックスを活性化するcdc25Aを特異的に阻害するdysidiolideは抗癌剤のリードとして極めて重要である。現在までの本研究の進捗状況は極めて順調であり、本年度はdysidiolideの立体選択的不斉合成に向けて大きく前進することができた。すでに2-メチルシクロヘキサノンから数工程を経て、光学的に純粋なジエンの合成を完了し、クロトンアルデヒドとの分子間Diels-Alder反応より、所望の立体化学を有するオクタヒドロナフタレン骨格を有する付加体を主生成物として得ることに成功した。現在、本付加体をジメチルヒドラゾンとした後、リチウムジイソプロピルアミドにてα-リチオニトリルとし、別途不斉合成したフリルオキシランへの求核攻撃により、全炭素骨格の立体選択的構築ならびにdysidiolideの不斉全合成の完結へ向けて検討中である。Cdc25Aは細胞周期のG1期からS期への移行に関与する

cdk2-サイクリンAコンプレックスとG2期からM期への移行に関与するcdc2-サイクリンBコンプレックスの15番目チロシン残基と14番目スレオニン残基のdualフォスファターゼで、脱リン酸化によりコンプレックスが活性化され細胞周期の進行を促進する。癌細胞ではこれら細胞周期進行を促進するG1,Mサイクリン、cdk,cdc2の異常発現が確認されており、これらコンプレックスを活性化するcdc25Aを特異的に阻害するdysidiolideは抗癌剤のリードとして極めて重要である。現在までの本研究の進捗状況は極めて順調であり、本年度はdysidiolideの立体選択的不斉合成を完了した。2-メチルシクロヘキサノンから数工程を経て合成した光学的に純粋なジェンとクロトンアルデヒドとの分子間Diels-Alder反応より、所望の立体化学を有するオクタヒドロナフタレン骨格を有する付加体を主生成物として得た。続いて不斉4級炭素をアルデヒドエノレエートのメチル化により構築し、最終的に国内初のdysidiolideの不斉全合成を達成した。さらにその方法論に基づいて各種類縁体を合成し、dysidiolideよりも強力な新規cdc25A阻害剤の創出に成功した。新規セスタテルペンdysidiolideは細胞周期制御に関与する脱リン酸化酵素cdc25Aを特異的に阻害し細胞周期をG1/S,G2/Mの2箇所で停止させ、A-549ヒト肺癌細胞系、p388ネズミ白血病細胞系の増殖をそれぞれIC_<50>4.7μM、1.5μMで抑制する。cdc25Aは細胞周期のG1期からS期への移行に関与するcdk2-サイクリンAコンプレックスとG2期からM期への移行に関与するcdc2-サイクリンBコンプレックスの15番目チロシン残基と14番目スレオニン残基のdualフォスファターゼで、脱リン酸化によりコンプレックスが活性化され細胞周期の進行を促進する。本研究の現在までの進捗状況は極めて順調であり、dysidiolideの国内初の不斉全合成に成功した。さらにその方法論に基づいて各種立体異性体をも合成し、dysidiolideよりも強力な新規cdc25A阻害剤の創出に成功した。その一方で、ビタミンD3骨格の活用にも積極的に取り組み、dysidiolideのヒドロキシブテノリド部分を単純な脂肪酸で置換したものにも強力なcdc25A阻害活性があることを見いだした。現在もより優れたcdc24A阻害剤の開発を目指し、ビタミンD3骨格とヒドロキシブテノリドの融合による新たな化合物群の創成を精力的に行っている。
消化管粘膜におけるTrefoil peptideの発現に関する研究

1)胃潰瘍及び胃炎モデルの作成,大腸炎モデル及びその治癒過程の分析胃潰瘍に関してはラット胃に錯酸潰瘍を作成しその治癒過程を追跡した。大腸炎モデルはDSSによって作成中である。これら粘膜障害の治癒過程において免疫組織学的検討に加えTPの局在,産生細部及び細胞内局在を検討中である。粘膜中には、PCNA陽性細胞、EGFR陽性細胞がみられた。TPに関しては抗体を入手し免疫組織学的方法、蛍光抗体法、in situ hybridizationを用いてその発現を検討している。このため高解像度の光学顕微鏡が必要となり、これを購入した。2)培養細胞とその障害治癒過程観察モデルの作成胃粘膜及び結腸の単層培養細胞は我々の方法により確立した。これら単層培養細胞に我々の考案した方法により欠損部を作成し,その治癒過程を解析した。この際細胞増殖と細胞遊走を分離して検討することが重要でありこのモデルはその解析に適したものであった。この場合におけるTPの発現を組織学的及び生化学的方法を用いて解析しつつある。またEGF, TGF αなどの増殖因子のTP発現に対する影響を検討中である。3)蛋白レベルでの検討まずin vivoおよびin vitroでのTP蛋白の発現を免疫組織学的に検討した。4) mRNAレベルでの検討TPのmRNA発現に関しては,pS2 geneのcDNAをRT-PCRを用いて作成し,それをプローブとしてNorthern blottingにより検討中である。
メタロキノプロテイン活性部位の精密モデル化

キノプロテインは今から約10年程前に発見された新しい補酵素PQQ(ピロロキノリンキノン)を含む酸化還元酵素の総称として用いられた。しかし、その後の活発な研究の結果、PQQ以外のキノン系補酵素が幾つか発見され、現在ではそれらも含めたキノン系補酵素を有する酵素群の総称として用いられるようになった。キノプロテインは哺乳動物から植物、微生物に至る広い範囲にその存在が確認されており、生体内において主にアルコール、アミン、アミノ酸、アルデヒド、糖類などの代謝過程に深く関与していることが知られている。なかでもアルコネル脱水素酵素やアミン酸化酵素はその活性部位に金属が含まれており、メタロキノプロテインとして位置付けられているが、それらの機能や役割については不明な点が多く残されている。そこで本研究では、このメタロキノプロテインに着目し、その活性部位の精密モデル化を試みると共に、金属の果たしている役割や金属と補酵素の相互作用の解明を目的として種々検討した。酵素活性部位に存在する補酵素と金属の相互作用を調べる目的で前年度より合成してきたピロロキノリンキノンのカルボン酸誘導体を用い、種々の金属に対する配位位置や配位力について詳細に検討を加えた。特にアルコール脱水素酵素の活性部位に含まれているカルシウムやその同族体であるマグネシウムに対する配位挙動を調べ、錯体の単離・同定を行なった。さらに各種錯体の物性(電子移動過程や酸-塩基相互作用)や化学的性質を調べ、金属の種類やその配位位置と反応性との間の相関関係を明かにした。以上の結果を基にして、酵素系における金属-補酵素間の相互作用について考察を加えると共に、効率的電子伝達触媒開発のための分子設計を行った。また、新規な補欠分子を有するガラクトース酸化酵素の活性中心モデル銅錯体の合成にも成功した。
「狂歌」を端緒とした近世後期の地域文化形成に関する研究

本研究は、「狂歌」に関わる人々が江戸期の地域文化の形成に果たした役割を多角的に検証するものであり、狂歌人に代表される広義の「学問者」の「知」の構造を思想史的・文芸社会史的に考察することを目的とした。「狂歌」を特筆したのは1「狂歌」が様々な書物等を前提とした幅広い教養の上に立って作成されていたからであり2全国的なネットワークを通じて狂歌人が地域に多様な人的・物的資源をもたらしており地域文化形成への貢献度が高いからである。こうした「狂歌」や狂歌人についての検証から導出された知見は、江戸期の地域文化の再評価のみならず、現今の地域社会再編成の潮流に文化面での視座を提供するものである。本研究は、「狂歌」に関わる人々が江戸期の地域文化の形成に果たした役割を多角的に検証するものであり、狂歌人に代表される広義の「学問者」の「知」の構造を思想史的に考察することを目的とする。「狂歌」を特筆するのは、119世紀に享受層を拡大させた「狂歌」が歌学関連書のみならず儒書や和漢の歴史書・地理書などの知見をフル活用できる幅広い教養の上に立って作成されていたからであり、2「連」と呼ばれる全国的なネットワークを通じて狂歌人は地域に多様な人的・物的資源をもたらしており、「狂歌」の地域文化形成への貢献度が高いからである。さらには近代の地域文化の土壌を用意したとすら見える。こうした「狂歌」や狂歌人の地域における役割への検証から導出される知見・文化情報は、江戸期に展開した地域文化の再評価のみならず、現今の地域社会再編成の潮流に文化面での視座を提供するものである。研究の第2年度である平成25年度は、本研究の今後の調査の指針を得ることが可能な地域を選択し調査に赴くとともに海外を含む「狂歌」関連資料の調査、必要な基礎文献の整備に努めることに主眼を置いた。具体的には、(1)新潟県上越市直江津地区、山形県天童市を重点地区に定め調査を行った。(2)イタリア・ベネチア市、オーストリア・ウィーン市、オランダ・ライデン市に赴き、日本関係資料を閲覧し、狂歌関連資料を確認した。また、福岡市九州大学における文献調査を行った。(3)諸種の「狂歌本」の原本・複写本を入手し、嘉永・安政期における「連」の再編成の問題を整理し論文を作成し発表した。本年度は、研究目的・研究実施計画に則った研究を実現したと言えよう。研究の初年度である平成24年度は、本研究の今後の調査の指針を得ることが可能な地域を選択し調査に赴くとともに海外を含む「狂歌」関連資料の調査、必要な基礎文献の整備に努めることに主眼を置いた。具体的には、(1)新潟県上越市の直江津地区と神田地区を重点地区に定め、調査を行った。(2)イタリア・ローマ市に赴き、日本文化関連資料を閲覧し、狂歌関連資料を確認した。(3)諸種の「狂歌本」と複写物を入手し、天保期における「連」の再編成の問題と、狂歌作者としての「遊女」との観点から資料を整理し、論文を作成し発表した。本年度は、研究目的・研究実施計画に則った着実な研究であったと言えよう。「狂歌」を特筆するのは、119世紀に享受層を拡大させた「狂歌」が歌学関連書のみならず儒書や和漢の歴史書・地理書などの知見を全面的に活用できる広範な教養の上に立って作成されていたからであり、2「連」と呼ばれる全国的なネットワークを通じて狂歌人は地域に多様な人的・物的資源をもたらしており、「狂歌」の地域文化形成への貢献度が高いからである。こうした「狂歌」や狂歌人の地域における役割への検証から導出される知見・文化情報は、江戸期に展開した地域文化の再評価ばかりではなく、現今の地域社会再編成の潮流に文化面での視座を提供するものである。

研究の3年次にあたる平成26年度は、現地調査後の成果を史料的に裏付ける作業を行うとともに、海外に流出した狂歌資料の発見に努め、画像を含む基礎資料の確保にも時間を割いた。具体的には、(1)新潟県上越市の直江津地区における狂歌人の遺跡の調査を行い、当地出身の江戸狂歌人の資料を入手した。(2)フランスパリの図書館・美術館の書物と絵画資料の調査を行い、広範な日本文化関連資料を閲覧し、狂歌関連資料を大量に含む「摺物帖」の存在を確認し、画像を資料として収めた。(3)諸種の「狂歌本」と複写物を入手し、主に天保期における「連」の再編成の問題と狂歌作者としての「遊女」との観点から資料を整理した。本年度は、研究目的・研究実施計画に則った着実な研究を行うことができた。本研究は、「狂歌」に関わる人々が江戸期の地域文化の形成に果たした役割を多角的に検証するものであり、狂歌人に代表される広義の「学問者」の「知」の構造を思想史的に考察することを目的とする。「狂歌」を特筆するのは、119世紀に享受層を拡大させた「狂歌」が歌学関連書のみならず儒書や和漢の歴史書・地理書などの知見をフル活用できる幅広い教養の上に立って作成されていたからであり、2「連」と呼ばれる全国的なネットワークを通じて狂歌人は地域に多様な人的・物的資源をもたらしており、「狂歌」の地域文化形成への貢献度が高いからである。さらには近代の地域文化の土壌を用意したとすら見える。こうした「狂歌」や狂歌人の地域における役割への検証から導出される知見・文化情報は、江戸期に展開した地域文化の再評価のみならず、現今の地域社会再編成の潮流に文化面での視座を提供するものである。研究の最終年度である平成27年度は、本研究の成果をまとめ、成果を公開すべく地域を選択し調査に赴くとともに海外において「狂歌」研究の意義を発信し、また関係資料の再調査と今後の研究に供すべく必要な文献の整備に努めることも行った。具体的には、(1)宮城県大崎市での調査と報告会の開催を行った。(2)イタリア・ヴェネチア市に赴き、日本文化関連資料を閲覧するとともに、ヴェネチア大学において公開講演を行った。(3)諸種の「狂歌本」と複写物を入手し、天保期における「連」の再編成の問題と「連」の構成員と深い関わりを持った歌川広重の問題を調査・検討し、書物・出版の専門研究会において研究発表を行った。本年度も、研究目的・研究実施計画に則った着実な研究であり、「狂歌」研究の公開性を高めることもできたと言っても過言ではない。本研究は、「狂歌」に関わる人々が江戸期の地域文化の形成に果たした役割を多角的に検証するものであり、狂歌人に代表される広義の「学問者」の「知」の構造を思想史的・文芸社会史的に考察することを目的とした。「狂歌」を特筆したのは1「狂歌」が様々な書物等を前提とした幅広い教養の上に立って作成されていたからであり2全国的なネットワークを通じて狂歌人が地域に多様な人的・物的資源をもたらしており地域文化形成への貢献度が高いからである。こうした「狂歌」や狂歌人についての検証から導出された知見は、江戸期の地域文化の再評価のみならず、現今の地域社会再編成の潮流に文化面での視座を提供するものである。実施計画に沿った調査を国内・国外で行い、事前に保持している資料を活用した研究報告を行うことができた。また、調査への協力者を確保することができた。以上から、本年度の研究は順調な達成をみたと判断される。文芸社会史平成27年度は、本研究課題の取りまとめの年であり、史料調査の継続はもちろんのこと、前掲の調査による成果を足がかりとして調査の対象の拡大を図りたい。その地域として設定するのは、国内においては福島県いわき市周辺、群馬県館林市周辺、栃木県栃木市周辺である。また、国外の調査は昨年度に引き続きフランスパリ市の図書館・博物館・美術館である。文献史料(狂歌本)の調査先としては九州大学附属図書館富田文庫を引き続き設定する。
抗菌性と骨形成能を併せ持つ人工骨開発のための新規感染モデルの構築

近年の医療業界では、人工骨や人工関節などのインプラント材が広く普及しているが、それらの使用後の術後感染症(SSI)は重篤な合併症の1つであり、大きな問題となっている。本研究では、優れた骨形成能に加えて、感染症を予防できる「優れた骨形成能と抗菌性を併せ持つ多機能型人工骨」開発する。より具体的には、人工骨として実績のある水酸アパタイト(HAp)およびリン酸三カルシウム(TCP)をベースとして、その結晶構造に骨形成促進作用をもつケイ素や亜鉛ともに、抗菌性を持つ銀を同時に置換固溶させることにより多機能型人工骨を創製する。また、SIIを想定した骨芽細胞と細菌を併用した抗菌性材料の評価技術も確立する。
特殊微生物・酵素による生ゴミの新迅速処理法の開発と機能性飼料への資源リサイクル

食習慣の多様化と日本経済の急激な膨張が食料資源の消費を激増させたことにともない生じてきた「生ゴミ」の急激な増加は、食資源の浪費や環境汚染にも深刻な問題を投げかけている。このため、生ゴミを迅速に処理し、有効利用する方法が模索されている。本研究は生ゴミをリサイクルし再資源化をめざすことを究極の目的とするものである。実験系を単純化するために、生ゴミとして新鮮な「オカラ」を用いた。これに、東南アジアで有名な発酵食品テンペを作るために用いられているRhizopus oligospolusを培養し、これが産生する酵素群の作用によって、生ゴミの資質向上をめざした。新鮮なおからには、一日で10の8乗個の一般細菌が増殖するので、これを抑制するために酢酸でpHを5付近に調整しR.oligospolus(テンペ菌)を接種すると、CMCアーゼ、キシラナーゼやアミラーゼなどが生産され、Bacillus subtilisなどの一般細菌に対する抗菌性が生じた。これをバイオリサイタ-で熱風処理し、迅速に粉末化した。これを市販の中離用配合飼料に10%添加し、9週令の産卵鶏雄に3週間給与して飼養試験を行った結果、飼料接種量はやや減少する傾向にあった。すなわち、最終体重は10%添加の場合は、市販飼料のみを与えた対照区に比べ95.8%であった。R.oligospolusを接種しないオカラを同様に給餌した場合は93.1%となったことから、オカラにテンペ菌を接種して飼料化すると、体重増加が期待できることが判明した。テンペ菌を接種したオカラの添加量を20%に増加した場合の体重増は93.8%となり、対照区の91.3%に比べてやはりテンペ菌の効果が認められた。オカラは粗タンパク質含量も高く粗繊維含量も高いが可溶性無窒素物割合が著しく低いため、繊維利用能の高い反芻家畜の飼料としての利用面が期待できる。結果及び考察:オカラを基本とした生ゴミ培地には、R.oligospolusが45°Cまでの中温でわずか1日で最もよく生育しCMCase、キシラナーゼ、α-Amylase、Glucoamylaseを生産し、B.subtilisに対する抗菌作用があることがわかった。B.stearothemophilis、L.delbruckiiはオカラ+酒粕、オカラ+糖化粕の処理培地に50°C以上の高温で生育することが確認されたが上記の酵素生産量が低い上に、培地のpHが下がらないことから乳酸の生成量も低いことがわかった。高温で生育し、セルラーゼ活性が高いと言われるT.fuscaや高温で生育可能なカビであるT.lanuginosusについては、生ゴミ培地に対する生育が悪く、培地組成の検討が必要であることがわかった。一方、F.sp AK、B.subtilis N-4の植物病原性のカビに対する生育阻止については菌の生育によって阻止円を確認したが、菌体を除いた培養抽出液によりカビの生育を阻止するかは現在実験中である。また、オカラでは12時間で10^7個/g、24時間で10^8個/gの一般細菌数が増加するため、種菌の接種時期は集荷後、数時間でなければならないことが予測された。そして、培地のpHを下げることや酒粕や糖化粕の添加によって、雑菌の増殖は抑えられた。しかし、pHを下げたオカラ培地では、R.oligospolusの酵素生産量が低下してしまった。

なお、種菌を接種せずにバイオリサイター処理した物質は、鶏やマウスに対して嗜好性が確認された。食習慣の多様化と日本経済の急激な膨張が食料資源の消費を激増させたことにともない生じてきた「生ゴミ」の急激な増加は、食資源の浪費や環境汚染にも深刻な問題を投げかけている。このため、生ゴミを迅速に処理し、有効利用する方法が模索されている。本研究は生ゴミをリサイクルし再資源化をめざすことを究極の目的とするものである。実験系を単純化するために、生ゴミとして新鮮な「オカラ」を用いた。これに、東南アジアで有名な発酵食品テンペを作るために用いられているRhizopus oligospolusを培養し、これが産生する酵素群の作用によって、生ゴミの資質向上をめざした。新鮮なおからには、一日で10の8乗個の一般細菌が増殖するので、これを抑制するために酢酸でpHを5付近に調整しR.oligospolus(テンペ菌)を接種すると、CMCアーゼ、キシラナーゼやアミラーゼなどが生産され、Bacillus subtilisなどの一般細菌に対する抗菌性が生じた。これをバイオリサイタ-で熱風処理し、迅速に粉末化した。これを市販の中雛用配合飼料に10%添加し、9週令の産卵鶏雄に3週間給与して飼養試験を行った結果、飼料接種量はやや減少する傾向にあった。すなわち、最終体重は10%添加の場合は、市販飼料のみを与えた対照区に比べ95.8%であった。R.oligospolusを接種しないオカラを同様に給餌した場合は93.1%となったことから、オカラにテンペ菌を接種して飼料化すると、体重増加が期待できることが判明した。テンペ菌を接種したオカラの添加量を20%に増加した場合の体重増は93.8%となり、対照区の91.3%に比べてやはりテンペ菌の効果が認められた。オカラは粗タンパク質含量も高く粗繊維含量も高いが可溶性無窒素物割合が著しく低いため、繊維利用能の高い反芻家畜の飼料としての利用面が期待できる。
海馬学習機能の性的二型性の成立機序に関する研究

餌の形状が性特異的に海馬の担う高次機能に影響することを調べるために、出生直後にテストステロンプロピオネート(TP, 100 μg)を処置して雌性ラットを雄性化した。離乳直後から、対照群としては通常の餌で飼育し、実験群は柔らかい餌で飼育した。7ー8週の成熟に達してから実験に用いた。ラットは思春期に膣開口せず、雄性化していることが示唆された。全ての動物は受動的回避学習をしてから用いた。受動的回避学習として、暗い部屋に移動した時にドアを閉めて床のグリッドから電気ショック(0.8 mA、2秒)を与えた。30分後に再び明るい部屋に入れ、暗い部屋に移動するまでの時間を計測した。その30分後に以下の実験を行った。1Y迷路実験は3つの通路からなり、一つの選択肢にラットを置き、自由に通路を探索させ、5分間の自発的交替行動(spontaneous alternation)を算出た。その結果、有意ではないが、柔らかい餌で飼育した群は、alternationが高い、すなわち、海馬高次機能が良い傾向を示した。2Rectification index(RI)の測定は、スライス切片をホールセルモードのパッチクランプ膜電位固定法を用いた。シェーファー線維を刺激し、記録は海馬CA1から行った。膜電位-60 mVにした時のEPSCを+40 mVのEPSCで割った値、RIは、柔らかい餌で飼育した群が高い傾向を示したが有意ではなかった。3Long-term Potentiation(LTP)実験は膜電位を-60 mVに固定して、テタヌス刺激はpaired刺激で、0 mVの脱分極刺激と、3 Hz 90秒間の電気刺激を同時に行った。その結果、通常の餌で飼育したラットはLTPが誘導される傾向を示した。以上より、雌性ラットを雄性化すると海馬高次機能が上昇し餌の形状も海馬の機能に影響を与えている可能性が示唆された。実験の順番を来年度と今年度を入れ替えたが、それにより、雌性を雄性化すると海馬機能が上昇し、また、餌の形状が雄性も影響を与えている可能性さ示唆され、新知見が明らかとなった。餌の形状の海馬高次機能に対する影響が、脳の性分化の影響を受けるのか受けないのか、明確にする実験が必要となり、つまり、可能性として、雄性でも餌の形状が海馬高次機能に影響を及ぼす可能性があり、また、行動上の変化と電気生理学的なデータが若干乖離してる可能性もある。これまで、餌の形状は雄性ラットの行動を調節する海馬高次機能に影響を及ぼさないと考えていたが、基礎データとして雄の海馬の餌の形状が与える影響を電気生理学的に解析することが必要と思われる。また、雌性ラットを雄性化した場合も、もう少しnを足す必要性が感じられる。雌性のエストロゲンは、海馬の担う空間学習機能に対して負の作用があることを、我々は、行動学、形態、機能(電気生理)学の観点から明らかにしてきた。一方、餌の固さは、雌性特異的に作用する。具体的には、柔らかい餌で飼育すると海馬空間学習機能に対して雌性特異的に、逆に正の作用のあることを報告してきた。今年度からの3年間でこの雌性特異的な作用機序について明らかにすることを目的としている。初年度は、本年度の結果を左右する昨年度までにやり残した海馬LTP実験とAMPA/NMDA比の実験を中心に進めた。2種類の異なった海馬空間学習を負荷して、単一の場合と、2つの学習をあわせて負荷することにより、海馬機能を評価した。また、エストロゲンの作用、餌の固さの作用をあわせて検証した。その結果、行動学的には、単一の学習の場合は、エストロゲンの濃度が低いことが正の作用につながり、エストロゲンの濃度が高い場合は、餌の固さの正の作用が顕著になること、餌の固さの正の作用はエストロゲンの負の作用に優ることが推測された。電気生理学的には、LTP実験、AMPA/NMDA比から見た場合は、同じように、餌の固さの正の作用がエストロゲンの負の作用に優ることが推測された。また、rectification indexの実験からもこの仮説を支持している。電気生理学の実験でやり残しがあるのと、行動学の実験で一部完遂していない解析があるため。

その結果、有意ではないが、柔らかい餌で飼育した群は、alternationが高い、すなわち、海馬高次機能が良い傾向を示した。2Rectification index(RI)の測定は、スライス切片をホールセルモードのパッチクランプ膜電位固定法を用いた。シェーファー線維を刺激し、記録は海馬CA1から行った。膜電位-60 mVにした時のEPSCを+40 mVのEPSCで割った値、RIは、柔らかい餌で飼育した群が高い傾向を示したが有意ではなかった。3Long-term Potentiation(LTP)実験は膜電位を-60 mVに固定して、テタヌス刺激はpaired刺激で、0 mVの脱分極刺激と、3 Hz 90秒間の電気刺激を同時に行った。その結果、通常の餌で飼育したラットはLTPが誘導される傾向を示した。以上より、雌性ラットを雄性化すると海馬高次機能が上昇し餌の形状も海馬の機能に影響を与えている可能性が示唆された。実験の順番を来年度と今年度を入れ替えたが、それにより、雌性を雄性化すると海馬機能が上昇し、また、餌の形状が雄性も影響を与えている可能性さ示唆され、新知見が明らかとなった。昨年度の電気生理学および行動学の実験を完遂して、新年度は、エストロゲン受容体αとエストロゲン受容体βにそれぞれ特異的なアゴニストを用いた実験を行う予定である。餌の形状の海馬高次機能に対する影響が、脳の性分化の影響を受けるのか受けないのか、明確にする実験が必要となり、つまり、可能性として、雄性でも餌の形状が海馬高次機能に影響を及ぼす可能性があり、また、行動上の変化と電気生理学的なデータが若干乖離してる可能性もある。これまで、餌の形状は雄性ラットの行動を調節する海馬高次機能に影響を及ぼさないと考えていたが、基礎データとして雄の海馬の餌の形状が与える影響を電気生理学的に解析することが必要と思われる。また、雌性ラットを雄性化した場合も、もう少しnを足す必要性が感じられる。今年度は、実験のやり残しがあったことと、消耗品のストックを使用したため、見かけ上、あまり消耗品を使ってないように見えるが、その分、新年度に大量に必要なため。今年度は顕微鏡の光源が故障し、本実験においては必須となるので共同購入したが消耗品代を節約に努めたため、次年度使用額、すなわち、若干の余剰金が生じた。新年度は、最終年度となり、ステロイドのアゴニストなど高額な薬品代も多く、動物などの購入代とあいまって、問題なく消費されると考えている。また、パッチクランプ用の薬品代に充てるつもりである。
in silico 膵β細胞およびα細胞の機能的統合モデルの構築

本年度は、in silico膵島細胞機能調節モデルの構築に関連して、様々な薬剤(治療薬)の膵島細胞機能に与える影響に関して並列的に検討した。その中で、日常の糖尿病治療で広く用いられているインスリン分泌促進薬に関して、膵β細胞に及ぼす影響に関して3種類の代表的インスリン分泌促進薬を用いて、膵β細胞KATPチャネル機能への影響、VDCC機能への影響、インスリン含有量およびインスリンプロモータ活性などに及ぼす影響を各薬剤で並列検討を行った(Diabetes Res Clin Pract.2007(in press))。さらにニューキノロン系抗生剤の1つであるガチフロキサシンに関して、同様に、膵島細胞を用いた分泌実験、膵β細胞MTPチャネル機能への影響、VDCCへの影響、インスリン含有量およびインスリンプロモータ活性などに及ぼす影響を検討し、同剤による副作用である高血糖と低血糖の発現メカニズムを明らかにした(Eur J Pharmacol;553:67-72,2006)。更に平成17年度までの実験経過を踏まえて、異種及び同種膵島細胞間(β細胞-β細胞間、β細胞-α細胞間)の電気伝導度を、細胞の隣接性を保持した状態(膵島叉は膵島細胞集団状態)および細胞を分散させ単一細胞にした状態で、ダブルパッチクランプシステムを用いて計測し、データの集積を行った。また、インスリン分泌促進薬刺激による膜電位変化の測定を、上記同様、細胞の隣接性を保持した状態および単一細胞にした状態で、膜電位をホールセル記録法にて測定し、両者を比較・検討した。現在、上記蓄積データを用いて、膵島細胞内の同種および異種細胞間のインスリン分泌に係わる相互作用を検討・解析中である。生体内での膵島細胞(α、β、δ細胞)は、各々独立して活動を行っているのではなく、細胞間で種々なイオン流通性、高い細胞間電気伝動性および互いのホルモンによるパラクリン的調節を受けながら、膵島全体としてのホルモン分泌調節を行っている。膵島モデルを構築する上で、個々の細胞モデルを構築することに加え、上述の様な相互作用因子による各細胞間の協調的統合メカニズムを検討し、モデルに組入れていく作業は必須である。これらを踏まえて、各膵島細胞の各種刺激に対する特性を、同一条件且つ再構成系等を用いて極力単純化された条件下で、並列的に比較検討(薬理特性のカタログ化)を進めている。本年度は、細胞間のイオン流通性および細胞間電気伝導性の検討に必要なダブルパッチクランプシステムの構築、細胞種の同定のためのRT-PCR法の条件決定、および各種刺激による単一細胞(α、β、δ細胞)からの分泌現象を評価するための膜容量測定システム(本研究費にて購入)をセットアップした。また、各種インスリン分泌促進薬(glibenclamide, tolbutamide, gliclazide, glimepiride, nateglinide等)の膵β細胞インスリン分泌能について、濃度一反応曲線を作成した。最終的なin silico膵島細胞の機能的統合モデルの構築を目指し、SU薬による血糖降下作用を評価でき、血糖とインスリンにフィードバックの関係があるモデル(神戸モデル)構築を進めている。本年度は、in silico膵β細胞インスリン分泌調節モデルの構築に関連して、膵島細胞に発現する電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)の新たな機能的発現調節因子RGK-proteinならびにVDCC活性調節関連因子Cdk5を同定し、多様な膵島細胞VDCC調節機構の一端を明らかにした。グルコースおよびインスリン分泌促進薬刺激による膵β細胞インスリン分泌において、ATP感受性K^+(K_<ATP>)チャネルを介する経路は主要な経路であり、この経路の鍵となる分子としてK_<ATP>チャネルおよびVDCCがある。膵島細胞VDCC活性は多様な調節因子(三量体G蛋白質、proteinkinase、calmodulinなど)により調節され得ることが報告されてきた。今回我々は、低分子量G蛋白質に属するRGK-protein(kir/Gem, Rad, Rem)が、VDCCβサブユニット結合抑制により、膵β細胞膜面へのVDCC機能的発現を抑制することを見いだした(Biochem J. 390(1):67-75,2005、J Cell Sci. 118:1923-34,2005、J Biol Chem. 280(10):9308-12,2005)。また、serine-threonine kinaseの一つであるCdk5の活性抑制により、SNARE proteinのVDCCとの結合調節を介してVDCC活性を増強することを明らかにし、これらの蛋白質が糖尿病治療薬(インスリン分泌促進薬)の標的因子となり得ることを示した(Nature Med. 11(10):1104-8,2005)。これらの知見は、今後、インスリン分泌障害発症機序の解明および新規糖尿病治療薬(インスリン分泌促進薬)の創薬上の標的候補因子に繋がる可能性がある。

さらにニューキノロン系抗生剤の1つであるガチフロキサシンに関して、同様に、膵島細胞を用いた分泌実験、膵β細胞MTPチャネル機能への影響、VDCCへの影響、インスリン含有量およびインスリンプロモータ活性などに及ぼす影響を検討し、同剤による副作用である高血糖と低血糖の発現メカニズムを明らかにした(Eur J Pharmacol;553:67-72,2006)。更に平成17年度までの実験経過を踏まえて、異種及び同種膵島細胞間(β細胞-β細胞間、β細胞-α細胞間)の電気伝導度を、細胞の隣接性を保持した状態(膵島叉は膵島細胞集団状態)および細胞を分散させ単一細胞にした状態で、ダブルパッチクランプシステムを用いて計測し、データの集積を行った。また、インスリン分泌促進薬刺激による膜電位変化の測定を、上記同様、細胞の隣接性を保持した状態および単一細胞にした状態で、膜電位をホールセル記録法にて測定し、両者を比較・検討した。現在、上記蓄積データを用いて、膵島細胞内の同種および異種細胞間のインスリン分泌に係わる相互作用を検討・解析中である。
外部環境変化応答能をもつ大環状分子群の創製

本研究課題では、環状分子に対し、外部環境に応答して優先的コンフォメーションを大きく変える部分構造を組み込むことにより、外部環境の変化や外部刺激に応じて環の内部の大きさが大きく変化する大環状分子群の創成を行った。第二級アミド(トランス型)と第三級アミド(シス型)の構造の違いにより、N-アルキル化によって構造を変える環状分子、またアゾベンゼン骨格を用い、光によって構造を変える環状分子を合成した。それぞれNMR測定、あるいはX線結晶構造解析により構造の変化を観測した。本年度は、環境応答部位として光によるcis/trans異性を示すアゾ基をもっ環状芳香族アミドの合成、ならびに新規環構造の構築を目的としてマクマリーカップリングを用いた大環状オレフィンの合成について検討した。ジアゾ基をもつ環状芳香族アミドの合成について、まず両端にニトロ基をもつN-メチルベンズアニリドをモノマーとし、ニトロ基同士同士の還元的カップリングを試みたが、目的の環状化合物は得られなかった。次にtrans-アゾベンゼン骨格をもつメチルアミノカルボン酸をモノマーとし、Ph3PC12を縮合剤として反応を行ったところ、環化体の混合物が得られた。このうち環状三量体、環状四量体を単離してそれぞれX線結晶解析を行うことができた。環状四量体は結晶中やや折れ曲がった構造をとっており、これが一直線上に並びチャンネル構造を形成していた。マクマリーカップリングを用いた大環状オレフィンの合成について、まず1,4-ジアセチルベンゼンをモノマーとし、一段階で環構造を得る条件について検討した。その結果、四塩化チタン、亜鉛の系において原料に対しそれぞれ10当量、20当量を用いると最も高い収率で環状三量体が得られることがわかった。次に芳香環に2つ以上のアシル基をもつさまざまな化合物をモノマーとしてマクマリーカップリングを行い、ビフェニル骨格、p-テルフェニル骨格、m-テルフェニル骨格、ジフェニルメタン骨格をもつ環状オレフィンを得た。このうちビフェニル骨格およびp-テルフェニル骨格をもつ環化体では環状三量体、またm-テルフェニル骨格、ジフェニルメタン骨格をもつ環化体では環状二量体についてX線結晶構造解析を行い、その構造を明らかにした。本年度に得られた知見は、次年度に行う「環境応答部位をもっさまざまな官能基をもつ環状化合物群の合成」に繋がる成果である。本年度は、金属配位能をもつリンカー、並びに水素結合可能部位としての第二級アミドをもつ環状芳香族アミドの合成について検討した。1.金属配位能をもつ大環状分子の合成金属配位部位として、エーテル酸素をもつ環状化合物の合成を行った。ジフェニルエーテル骨格をもつN-アルキルアミノカルボン酸をモノマーとし、Ph3PC12を用いて縮合を行ったところ、主に環状二量体と環状四量体を主生成物として得た。N-上のアルキル基としては、エチル基、4-メトキシベンジル基、3,4-ジメトキシベンジル基を用い、縮合反応を行った混合物をGPCを用いて分離した。得られた環状アミドのうち結晶化したものについて単結晶X線解析を行ったところ、メトキシベンジル基をもつ環状二量体、エチル基をもつ環状二量体と四量体について、疑似チャンネル構造が見られた。2.第二級アミド結合をもつ大環状分子の合成上記に1で得られたp-メトキシベンジル基をもつ環状アミドについて、種々の条件下p-メトキシベンジル基の脱保護による第二級アミドの合成を試みたが、脱保護に至らなかった。3,4-ジメトキシベンジル体について、引き続き検討を行う。また、脱保護後の分子の極性を考慮し、リンカーとして脂溶性の高いシクロヘキサン環(1,1-ジフェニルシクロヘキサン骨格)をもつ環状アミドの合成を行った。3.合成した大環状化合物の機能評価これまでに得られた環状化合物について、種々の結晶化条件にて結晶化を行ったところ、ジアゾ基をもつ環状芳香族アミドを始め、いくつかの化合物に溶媒分子を含むチャンネル構造の形成が見られた。しかし、現在のところ分子の吸脱着等の機能評価には至っていない。環境応答性官能基をもつ環状化合物の合成と機能評価とを合わせ、次年度継続して評価を行う。光や温度、水素イオン濃度や金属イオン濃度などの変化に対して構造を変化させる分子は、外部環境応答能をもつ機能性材料としてだけでなく、ドラッグデリバリーシステムにおける薬物包接および放出に関わる部分構造に応用することが可能である。本研究課題では、小分子に対する包接能をもつ大環状分子に対し、外部環境に応答し優先的コンフォメーションを大きく変える部分構造を組み込むことにより、取り込んだ小分子を外部環境の変化に応じて効率よく放出する機能をもつ大環状分子群の創成を目指した。今回、アルキル基を有する第三級アミドと4-メトキシベンジル基を有する第三級アミドが交互に結合した大環状ヘキサアミドを、芳香族アミドの立体配座を利用した構造変換による環境応答型材料として合成した。

さらに4-メトキシベンジル基を脱保護することで、シス型配座を優先する第三級アミドが第二級アミドに変換し、トランス型配座を優先することで構造変換が起こることを確認した。すなわち、単結晶X線構造解析より、第三級アミドからなる大環状ヘキサアミドは折りたたまった構造を、第二級アミドと第三級アミドが交互に結合した大環状ヘキサアミドは大きなキャビティを有した構造をしていることが明らかとなった。一方、アゾベンゼン骨格をもつ大環状芳香族アミドを合成し、光応答型材料の開発を行なった。アゾベンゼン骨格をもつアミノカルボン酸誘導体をパネル構造として用い、環化縮合反応によって共有結合性の環状化合物を構築した。得られた三量体、四量体、六量体をそれぞれGPCによって単離し、単結晶X線構造解析によって構造を明らかにした。光照射前の三量体は三角型の環状構造をもち、空孔内部にヘキサン分子を結晶溶媒として取り込んでいた。また四量体はくさび形構造をもち、空孔内にクロロホルム分子を取り込んでいた。
部分環の組に対する相対エントロピーと自己同型写像から生じる不変量

作用素環Mの二つの部分環の組{A,B}に対して、コンヌ・スターマー相対エントロピーの修正版エントロピーであるh(A,B)を導入し、h(A,B)の値を通して、AとBの間の関係を解析した。具体的な例としては、Mが行列環、A,Bが共に極大部分環の時のh(A,B)の値を決定し、h(A,B)が最大である為の必要十分条件は、AとBが直交すること等を示した。これらの結果を、更に、Mが連続有限型因子環で、AとBが共に同じ有限指数の部分因子環の場合等にも拡張した。ジョーンズにより、重視されている指数2の部分因子環の場合には、行列環の極大部分環の時の場合に完全に相当する結果が、成立することも示した。作用素環Mの二つの部分作用素環AとBの間の隔たりを測る量として、Connes-Stormerの相対工ントロピーH(A|B)の概念を少し修正することにより、研究代表者は、条件付相対工ントロピーh(A|B)の概念を導入した。修正を加えたのは、以下の理由による。Mが非可換作用素環の最も基本的な代表例であるn次正方行列のなす環であるとき、可換作用素環の最も基本的な代表例である極大可換部分環の組{A、B}を考えると、Bは常に、Mのあるユニタリー作用素uにより引き起こされるMの自己同型写像θを用いてB=θ(A)という形式で、現される。このときH(A|θ(A))はθのエントロピー的情報を正しく、反映できないことの例をPetz達が挙げている。研究代表者の考えるθのエントロピー的情報とは何か。Sommers等が定義したuから生じるunisrochastic行列b(u)に対するエントロピーH(b(u))であると考える。改めて定義した概念h(A|B)は、関係式h(A|θ(A))=H(b(u))をみたすことが、証明できたことにより、目的の第一段階を達したことになる。更に、h(A|B)が、取りうる値のうちでの最大値をとるためのAとBの位置関係は、幾何的な感覚のもとでの、直交関係に相当することを示すことが、出来た。なお、これらの結果は、作用素環Mの上のトレースと呼ばれる関数に関するものであり、一般的な関数φに対しては、φに関する条件付相対エントロピーh_φ(A|B)を定義し、Sommers等による重みλ付きエントロピーH_λ(b(u))との妥当な関係式を、λと、φの固有値リストとを対応されることにより、示すことが出来た。研究分担者の岡安類は、上記の関係式を、必ずしも有限次元ではない有限型von Neumann環Mを対象として、Mの射影作用素の族によって生成される二組の可換部分作用素環AとBに対するh(A|B)と、射影作用素の値の分布状況に関する議論に発展させた結果を得た。昨年度は、作用素環Mの二つの部分環A,Bに対する条件付相対エントロピーh(A|B)を導入し、特に、Mが、最も基本的な作用素環である行列環で、A,Bがその極大可換部分環であるときに焦点を絞り、A,Bの間の条件付相対エントロピーh(A|B)は、Bがユニタリー行列uを通してuAu*と表されるという事実を用いて、最近数理物理で注目されているuから導かれるunistochastic行列に対するエントロピーと一致するという結果を得た。本年度は、対象となる行列環Mを連続型有限因子環とし、極大可換部分環A,Bを部因子環に置き換えて、昨年度の議論を発展させた。そのとき、unistochastic行列の役割を果たすのは、Mの内部自己同型写像であると見做して、内部自己同型写像θに対して、θと部分因子環Nに密接に結びついた量として、H(θ;N)の概念を、unistochastic行列に対するエントロピーを念頭において導入し、部分因子環Nとθ(N)に対して、h(N|θ(N))とH(θ;N)との、関係について、研究した。Jonesの指数理論において、最も基本的な役割を果たす部分因子環は外部自己同型写像のなす有限群の固定点環として、表れる。言い換えると、元の環Mは、Nの有限外部自己同型写像群Gによる接合積として、表される。このとき、Mの内部自己同型写像θに関して、Nとθ(N)との関係は、群Gの要素を添え字とし、要素が環の元である一種の行列環的な状況にあると、考えるとができる。

このようなNとθ(N)に、対して、その関係が、"もっとも、離れた"位置関係にある状態を、H(θ;N)とh(N|θ(N))との値を用いて決定した。それは、両者の値が、一致して、群Gの濃度に等しいときである。1.当研究に於いて、導入した作用素環Mの部分環の組{A,B}に対する相対エントロピーh(A|B)は、AとBとの間の関係を測る量である。この量h(A|B)の基本的性質を調べ上げると共に、その応用として、下記の事実を得た。2.平面幾何において、長さがnの二辺AとBとが与えられた時に、AとBとがなす菱形の面積をS(A,B)とすると、S(A,B)の値の集合は、閉区間[0,n^2]でありS(A,B)=n^2となる必要十分条件は、二辺AとBが直交事である。3.2で記した状況に相当する事実を、作用素環Mの部分環の組{A,B}に対する相対エントロピーh(A|B)に対して証明した。この時、h(AlB)がS(A,B)の役割を果たす。「辺の長さが等しい」に相当するのは、「互いに同型な部分環の組」と置き換える事が出来る。4.要素が複素数のn次正方行列全体M_nは、最も基本的な作用素環である。前年度までにM_nの極大可換部分環の組{A,B}に対して、2に相当する事実が3で記した考察の下で、成立することを示した。5.本年度は、4での事実が、M_nの互いに同型な部分因子環の組{A,B}に対しても、成立する事を示すと共に、II_1型因子Mの指数2の部分因子環の組に対しても、成立することを、自己同型写像に対する不変量を用いて、証明した。
呼吸器悪性腫瘍における循環腫瘍細胞(CTC)検出法の開発

がんの微小転移の検出とその制御は、がん治療成績向上に必須である。我々は、末梢血液中に存在する微量のがん細胞(循環腫瘍細胞CTC)の高感度検出系の開発に取り組み、任意の補足用抗体を結合しうるマイクロ流路システム(CTC-chip)を開発した。本研究では、臨床検体を用いたCTC検出のためのCTC-chipの最適化と呼吸器悪性腫瘍における臨床応用の可能性につき検討を行った。まず、CTC-chipに用いる細胞補足抗体の濃度等の条件最適化を行い、肺癌細胞補足のための抗EpCAM抗体や悪性中皮腫細胞補足のための抗Podoplanin抗体を結合し高感度補足可能なシステムを構築した。本システムを用いて実際の肺癌や悪性胸膜中皮腫患者から採取した末梢血液を用いて循環腫瘍細胞の検出を行ったところ、既存の標準的循環腫瘍細胞検出システムである"CellSearch"と比較して有意に高感度な検出が可能であることが示された。悪性胸膜中皮腫については更に詳細な検討を行い、1)循環腫瘍細胞が腫瘍進行度の補助手段として有用であり、2)循環腫瘍細胞が根治切除の可否の判定に有用なバイオマーカーとなりうること、3)循環腫瘍細胞陽性例は予後不良であること、等が示された。更に、EpCAMやPodoplaninを発現しない腫瘍細胞の補足・検出のため、様々な補足抗体を用いた基礎検討を重ね、抗EGFR抗体による補足などが有用な手段であることも示唆された。また補足した循環腫瘍細胞の分子生物学的特性の解析に関する基礎検討を行った。その結果、CTC-chip上でのPD-L1等の免疫染色検出系を樹立し、今後の臨床応用に向けた検討を行う予定である。補足した腫瘍細胞の遺伝子変異については、EGFR等の一部の遺伝子変異の検出が可能であったが、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析は十分に行なえず今後の更なる検討が必要である。血液中を循環する「循環腫瘍細胞(CTC)」は微小転移の指標として臨床的有用性が期待されるが、我々の胸部悪性腫瘍での臨床研究において既存のCTC検出システム(CellSearch)では感度不足であることが示された。そこで、より高感度なCTC検出系の開発に取り組み、任意の捕捉抗体を結合可能なマイクロ流路チップシステム(CTC-chip)を独自に開発し基礎実験でその有用性を示した。本研究では、新開発のCTC-chipを用いて呼吸器悪性腫瘍(肺癌や胸膜中皮腫等)におけるCTCの臨床的有用性を検討すると同時に、癌幹細胞分離や上皮間葉移行(EMT)等の癌の遠隔転移成立に関わる基礎的検討を行う。また、正常細胞と腫瘍細胞の誘電特性の相違を利用した誘電泳動による腫瘍細胞分離法を応用した更に高感度な新規CTC分離システム開発にも着手し、胸部悪性腫瘍において臨床応用可能なCTC検出系の開発を目的とする。本年度は、新規CTC検出系としてのCTC-chipについて基礎的な性能の検討を行った。CTC-chipは癌細胞の表面抗原に反応する抗体(通常は上皮由来の癌細胞に強発現するEpCAMに対する抗体)を結合した無数のマイクロポストの間に血液を流すことにより、血液中に微量に存在する癌細胞を捕捉するシステムである。新開発CTC-chipの特長は、マイクロポスト表面が反応性に富むため、任意の捕捉用抗体を容易に結合させることができる点である。したがって、まず肺癌や中皮腫細胞の表面に発現している抗原を、それぞれの細胞株や手術で切除された組織を用いて確認した。その結果得られたEpCAMを含む複数の標的について、細胞捕捉に用いる抗体とそのCTC-chipへの結合条件を、肺癌/中皮腫細胞株をPBSあるいは血液に混合したCTCモデルからの細胞回収率により評価し、至適条件の検討を行った。肺癌と胸膜中皮腫では発現している細胞表面抗原が異なるため、それぞれに応じた捕捉抗体を用いた検討が必要であるが、それぞれの条件についてCTCモデルでの検討が進んでいる。血液中を循環する「循環腫瘍細胞(CTC)」は微小転移の指標としてだけでなく早期発見や治療のモニタリングにも有用性が期待される。本研究では原発性肺癌及び悪性胸膜中皮腫などの呼吸器悪性腫瘍における新しい高感度CTC捕捉・検出システムとして、ポリマー製CTC-chipについて検討を行っている。本研究ではこれまで、健常人血液に肺癌や中皮腫細胞を添加したCTCモデルを用いて標的細胞捕捉性能の評価を行い、従来の標準法であるCellSearchで検出できなかったEpCAM陰性の中皮腫細胞についても抗Podoplanin抗体などを用いて全血中から効率よく細胞を分離可能であることを示した。また、CTC-chipに抗体を結合させる場合の条件について最適化を行った。本年度は、更にCTCモデルとして検討する細胞株の種類を増やし、捕捉性能の検討を進めた。肺癌細胞では主に抗EpCAM抗体を用いて、中皮腫細胞株では主に抗Podoplanin抗体細胞捕捉可能であったが、一部捕捉率が不十分なものがあり、これについてはEpCAM以外の標的について検討した。続いて捕捉した細胞の検出方法について検討を行った。

具体的には抗EpCAM抗体及び抗Podoplanin抗体により捕捉された細胞をCTC-chip上で固定し、サイトケラチン、CD45、Hoechstにより、「サイトケラチン陽性(上皮性の細胞)でCD45陰性(白血球でなく)、サイトケラチン陽性領域にHoechestで染色される核を内包する」ものをCTCとして定義し、この定義により肺癌及び中皮腫細胞それぞれで妥当に検出可能であることを基礎的検討により確認した。同様の方法で肺癌・中皮腫患者の血液を用いた検討を進めている。肺癌、中皮腫の「CTCモデル」を用いた捕捉、検出についての基礎検討により、CTC-chipによるCTC捕捉と検出における至適条件が決定した。この条件で臨床検体での検討を進めている。がんの微小転移の検出とその制御は、がん治療成績向上に必須である。我々は、末梢血液中に存在する微量のがん細胞(循環腫瘍細胞CTC)の高感度検出系の開発に取り組み、任意の補足用抗体を結合しうるマイクロ流路システム(CTC-chip)を開発した。本研究では、臨床検体を用いたCTC検出のためのCTC-chipの最適化と呼吸器悪性腫瘍における臨床応用の可能性につき検討を行った。まず、CTC-chipに用いる細胞補足抗体の濃度等の条件最適化を行い、肺癌細胞補足のための抗EpCAM抗体や悪性中皮腫細胞補足のための抗Podoplanin抗体を結合し高感度補足可能なシステムを構築した。本システムを用いて実際の肺癌や悪性胸膜中皮腫患者から採取した末梢血液を用いて循環腫瘍細胞の検出を行ったところ、既存の標準的循環腫瘍細胞検出システムである"CellSearch"と比較して有意に高感度な検出が可能であることが示された。悪性胸膜中皮腫については更に詳細な検討を行い、1)循環腫瘍細胞が腫瘍進行度の補助手段として有用であり、2)循環腫瘍細胞が根治切除の可否の判定に有用なバイオマーカーとなりうること、3)循環腫瘍細胞陽性例は予後不良であること、等が示された。更に、EpCAMやPodoplaninを発現しない腫瘍細胞の補足・検出のため、様々な補足抗体を用いた基礎検討を重ね、抗EGFR抗体による補足などが有用な手段であることも示唆された。また補足した循環腫瘍細胞の分子生物学的特性の解析に関する基礎検討を行った。その結果、CTC-chip上でのPD-L1等の免疫染色検出系を樹立し、今後の臨床応用に向けた検討を行う予定である。補足した腫瘍細胞の遺伝子変異については、EGFR等の一部の遺伝子変異の検出が可能であったが、次世代シークエンサーを用いた網羅的解析は十分に行なえず今後の更なる検討が必要である。今後は捕捉した細胞の検出に関する条件の確認を行い、臨床検体でのCTC捕捉・検出を進め、得られた検出結果と臨床病理学的因子(進行度/病期、病理組織型や分化度等)、予後や抗癌剤の治療効果等との相関を解析する。また、分離されたCTCからDNA/RNAを抽出してEGFR遺伝子変異およびALK融合遺伝子の検出を試み、原発部位との比較によりその妥当性を検証する。更にchip上での追加免疫染色により捕捉されたCTCの特徴を明らかにする。尚、CTC検出に関して十分な感度が期待できない場合にはCTC-chipと磁気ビーズの組み合わせやサイズ分離、誘電泳動によるCTC分離へ研究の主体移行を検討する。肺癌及び悪性胸膜中皮腫患者検体におけるCTC検出を進め、得られた結果と臨床病理学的因子(進行度/病期、病理組織型や分化度等)、予後や治療効果等との相関を解析する。