hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ粒子ベース人工転写因子を用いた弓矢リプログラミング法による心筋細胞の誘導

我々の目的は人工転写因子により遺伝子発現を制御し、弓矢リプログラミング法により臨床応用可能な心筋細胞の分化誘導を行うことである。SOX2の結合阻害を狙ったピロールイミダゾールポリアミド(PIP)はiPS細胞において中胚葉分化を促進し、さらにWntシグナル阻害剤との併用により拍動心筋細胞が得られた。また心筋細胞には多くのミトコンドリアが含まれていることから、ミトコンドリア標的PIPを開発した。さらに特定のタンパクドメインに結合できる化合物をPIPに導入することで、塩基配列依存的な遺伝転写活性化剤を報告した。これらはナノ粒子を用いた人工転写因子に応用することで、更なる機能向上が期待される。近年、心臓の主要な構成要素である心筋細胞の革新的再生法の開発が望まれている。細胞の運命を決定するのは転写ネットワークであるため、本研究ではSOX2のような転写因子を阻害することで遺伝子発現を直接制御する分子の開発を目指した。SOX2は多能性幹細胞から心臓中胚葉への分化に対して抑制的に働くことが知られる。本年度は、SOX2の結合DNA配列である5′-CTTTGTT-3′に選択的に結合する合成分子を設計した。網羅的遺伝子発現解析の結果、この合成分子はSOX2が司る遺伝子調節ネットワークをコントロールし、自発収縮する心筋細胞へと分化可能な中胚葉細胞を誘導することが明らかとなった。遺伝子発現を直接制御する既存の方法の多くは外来DNA配列の挿入リスクを有する。いくつかの小分子化合物が転写因子の活性を制御することが報告されているが、それらは特定の受容体-リガンド間の相互作用と酵素活性を調整し、DNA配列を認識するものではない。我々が今回開発した方法により、この問題を回避することができると考えられる。この研究結果について現在論文投稿準備中である。また合成転写因子の関連研究として異なる生物活性を有するエピジェネティック制御可能な合成転写因子についての原著論文2報報告した。また本研究課題のコンセプトであるnature-inspired smart biomaterials designに関する総説論文がBulletin of the Chemical Society of Japanにカバーアーティクルとして掲載された。その他、代表研究者はこれらの遺伝子スイッチに関する発表をバイッシュナフカレッジ(インド)で行い、Department of Biotechnology-Scientist of the Month(2016年8月)を受賞した。本研究課題の目的は、核酸のケミカルバイオロジーの知見に基づき人工的に合成した転写因子ミミックを用いて、未分化維持の抑制と心筋関連遺伝子調節ネットワークの活性化を段階的に誘起して細胞をリプログラミングすることである。プレリミナリー研究として、我々は合成リガンド分子のDNAへのアクセシビリティに対するヌクレオソーム構造の重要性を報告した(Chemistry- An European Journal)。また、体細胞と多能性幹細胞の両方において疾病治療に重要な遺伝子を活性化する分子を同定した。この成果はChemistry Openに掲載された。またDNA結合ドメインのスクリーニングの過程で転写因子SOX2を効果的に阻害する合成分子を同定し、この分子が未分化状態の維持を阻害し中胚葉関連遺伝子を活性化して心筋中胚葉を誘導することを見出した。誘導された中胚葉は自発収縮能を有する心筋細胞へと分化可能であった。他の転写因子のキー配列をターゲットにした合成転写因子を設計・合成し、心筋中胚葉から心筋細胞へと分化させることにも成功した。来年度前期には、これらの合成転写因子のみによる幹細胞から心筋細胞への誘導が可能になると見込んでいる。またこの結果を発表した際、アメリカのSalk Instituteとの共同研究を発足させた。さらにインドのマイソールで行われたIndian JSPSAlumni Associationのシンポジウムでの招待講演でも有意義な共同研究を構築することができた。今年度我々は、心筋細胞への分化に重要な転写因子を標的としたピロールイミダゾールポリアミドの開発に取り組み、計5報の論文を報告した。中でもSOX2のDNAへの結合を阻害するポリアミドによりiPS細胞から中胚葉への分化誘導に成功し、この成果をNucleic Acids Research誌に報告した。また成人の心筋細胞の多くが大量のミトコンドリアを含んでいる(>30%)ことから、心筋細胞の化合物による更なる制御を可能にするためにミトコンドリア標的遺伝子スイッチ“MITO-PIP"をJournal of American Chemical Society誌に報告した。これらに加えポリアミドによる転写制御の幅を広げるために、ブロモドメイン阻害剤やヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤をポリアミドに導入することにより、ゲノムの部位選択的にヒストンのアセチル化状態を切り替え、転写のON/OFFを可能にする遺伝子スイッチの開発に取り組んだ(Journal of the American Chemical SocietyとEuropean Journal of Medicinal Chemistryに報告)。これまでのproof-of-conceptな実験で示された我々の遺伝子スイッチの有用性が他の細胞分化にも有効であることを示すため、神経幹細胞から神経細胞への分化を促すポリアミドの開発にも成功している。これらの成果は8th World Congress on Targeting Mitochondriaでのkeynote talkも含むアメリカ、スイス、インドなど様々な国で報告し、その結果いくつかの共同研究が進行中である。また研究代表者はインドのBrilliant Publishing OrganizationからRising Star Award 2017の表彰を受けた。

また心筋細胞には多くのミトコンドリアが含まれていることから、ミトコンドリア標的PIPを開発した。さらに特定のタンパクドメインに結合できる化合物をPIPに導入することで、塩基配列依存的な遺伝転写活性化剤を報告した。これらはナノ粒子を用いた人工転写因子に応用することで、更なる機能向上が期待される。ヒト多能性幹細胞を心臓中胚葉へと分化させる合成転写因子の開発に基づき、現在我々はナノ粒子を用いた新たな合成転写因子(Nano-TF)の開発を目指している。DNA結合ドメインやエピジェネティック活性分子など、昨年度に評価を行った各種因子を磁気コアシェル型ナノ粒子に導入することで開発を行う。生物活性をもつNano-TFの作出に向けて化学構造の最適化を行い、体細胞と多能性幹細胞を用いた弓矢型リプログラミングにおける活性を評価する。Nano-TFの評価にはゲノム/エピゲノム解析も用いる予定である。解析から得られた結果に基づいて最適な細胞種を同定し、次世代型Nano-TFの開発に取り組む。予想される課題として、Nano-TFにおける構成因子の配置/割合/種類の影響が挙げられ、これらを最適化する研究が必要である。最終的に細胞の未分化維持を抑制するNano-TFと心筋細胞への分化を促進するNano-TF(cardiomyocyte-activating NANO-TF, CAN)を心筋細胞の創出に応用する。この心筋細胞をトランスクリプトーム解析や機能性試験を通して評価し、適切に分化が行われているかを確認する。Nano-TFは心筋細胞の再生医療において大きな価値を持ち、高いインパクトを持つオープンアクセスなジャーナルに投稿する予定である。得られた結果の効率的な周知のため、インドおよびアメリカの研究機関との共同研究を展開していく予定である。ケミカルバイオロジー少額のため次年度に繰越。物品費に合算して使用。
細胞分化のプログラミングと癌遺伝子

癌遺伝子は、細胞の増殖の制御にのみ働くのでなく、細胞の分化のプログラミングの段階で大きな役割をもつことが考えられる。本研究では、種々の特色ある分化系を用いて、機能、局在性の異なるいくつかの癌遺伝子の分化のプログラミングに果す役割を解明することを目標としている。帯刀(研究代表者)は、マウス赤白血病細胞の分化誘導において、cーycが著名な発現変化をすることに注目し、人為操作可能な形でcーmyc遺伝子を導入し、強制的発現と分化の関係を解析した。その結果、cーmycは、この細胞の分化の決定の段階で、その発現量に依存して分化の頻度を決めることを明らかにした。また、cーmyc遺伝子の変異株の解析から、cーMycの癌化と分化の抑制に働く機能ドメインが異なることを示した。大石班員は、同様の分化系において、分化誘導に関与する細胞内因子(DFーI,DFーII)がチロシンリン酸化により制御を受けていることを示し、チロシンリン酸化阻害剤が分化誘導に効果を表すことを示した。石井班員は、cーMybが、転写因子として遺伝子上の特異的配列を認識して結合することを示すとともに、cーMybの機能ドメインが3つに分割できることを示した。野田班員は、ras遺伝子が、褐色細胞腫PC12の神経細胞分化誘導を起すこと、そのときのシグナル伝達機構を解析した。他の班員も、それぞれの特有の細胞分化系における癌遺伝子の働きを分子レベルで解析し、分化のプログラミングと直接癌遺伝子が結びつくことを示している。
重粒子線の脳腫瘍に対する治療効果比とラジカル反応に関する基礎的研究

本研究では、高LET重糧子線により脳腫瘍周辺に生じるラジカルを化学的に減少させることで周辺組織の放射線傷害を防ぎ、悪性脳腫瘍を高LET粒子線の直接作用にて効率良く治療することを目的とした。まず、エックス線と炭素線を用いて水溶液中に生じるヒドオキシルラジカル(・OH)をElectron spin Resonance(ESR)を用いて定量化した.その結果、・OHの産生量は、照射線量依存性に増加し、またLETが上昇するにつれて徐々に減少することが明らかになった。しかし、LETが20,40,60,80 and 90keV/μmでは、それぞれX線の86,78,73,69および70%存在することが示され、予想よりも高い値となった。さらに、DNA照射後の酸化産物である8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)を定量化して、ラジカル消去剤3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one(エダラボン)によるラジカル消去効果を検討した。エックス線照射後に生じる8-OHdGは線量依存性に増加した。また、炭素線照射後の8-OHdGのレベルはLETが高くなるにつれて減少し、LETが80keV/μmではエックス線の約40%となった。そこへエダラボンを添加するとその濃度依存性に8-OHdGの産生量が抑制さることが明らかになった。以上の結果から、重粒子線照射においても特に低LET領域では水溶液中に・OHが産生されておりその間接効果は無視できないことが示され、その間接効果をエダラボンにて抑制できれば粒子線の直接作用をより強調した照射が可能となることが示唆された。本研究では、高LET重粒子線におけるラジカル反応を解析し、腫瘍周辺に生じるラジカルを消去することで放射線傷害を防いで、腫瘍を重粒子線の直接作用にて効率良く治療することを目的としている。今年度においては、まず、エックス線と炭素線を用いてLETの異なる複数の点で、水溶液中に生じるヒドオキシルラジカル(・OH)をElectron Spin Resonance (ESR)を用いて定量化した。さらに、DNA照射後の酸化産物である8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)を定量化するとともに、ラジカル消去剤3-methy-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one(エダラボン)によるラジカル消去効果を検討した。まず、水溶液中に生じるヒドロキシルラジカル(・OH)の産生量は、照射線量依存性に増加するとともに、LETが上昇するにつれて減少することを明らかにした。LETが20keV/micronの炭素線はエックス線の約80%の・OHを産生し、LET 100keV/micronでは60%まで低下することが明らかになった。次に、鮭精子DNAを1mg/mlの濃度に溶解し、各種放射線照射後にDNAの酸化産物である8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG)をHPLCにて定量化した。その結果、まず、エックス線照射後に生じる8-OHdGの量は、10Gyまでは線量依存性に増加することが明かになった。また、炭素線照射後にも8-OHdGのレベルは上昇したが、LETが高くなるとその量は次第に減少しLETが80keV/μmではエックス線の約40%であった。さらに、エダラボンを加えると8-OHdGの産生量は抑制され、その抑制効果はエダラボンの濃度に依存していた。また、10μMダラボンの8-OHdG産生抑制効果は、エックス線照射後に最も高く、LETが上昇するにつれて減少した。悪性神経膠腫は、従来の放射線治療に対して感受性が低く予後不良であったために、高LET粒子線の効果に期待が集まっている。

これまで、高LET粒子線の細胞に対する生物学的効果は、DNAに対する粒子の直接作用に因るところが大きく、DNA周辺に存在する水分子の解裂により生じるヒドロキシルラジカル(【overhead dot】OH)などを介した間接作用は極めて小さいと考えられてきた。そこで、本研究では、炭素イオン線が水溶液中に生成する【overhead dot】OHを定量化し、その生物学的効果に対する役割を推測した。照射により水分子から生成される【overhead dot】OHを補足するために、5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide (DMPO)を細胞培養液、重水、エタノールに添加しておき、炭素イオン線(2090keV/μm)またはX線を照射した。照射終了から10分後に、生成された【overhead dot】OHをelectron spin resonance (ESR)で定量化した。その結果、X線・炭素イオン線照射後に水が解裂して生じた【overhead dot】OHはDMPOに捕捉され、そのESRシグナルが得られることが確認された。これらのシグナルの解析から、炭素イオン線照射後の【overhead dot】OH生成量は、吸収線量に比例することが示された。また、LET値が20、40、60、80、90keV/μmのときに産生される【overhead dot】OHは、X線照射時の、それぞれ64,58,52,49,50%となり、【overhead dot】OHの産生量はLET値に対して対数関数的に減少することが初めて明らかにされた。炭素イオン線の入射領域では、X線の60%以上の【overhead dot】OHが生じていることがわかり、今後の粒子線を用いた治療にも重要な知見が得られた。
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子ペプチド積載機構の分子進化の解明

古典的MHCクラスII分子は、有顎脊椎動物の獲得免疫系において、Tリンパ球への主として外来ペプチド抗原の提示という重要な機能を有していることが知られている。この古典的MHCクラスII分子へのペプチド抗原結合を細胞内で非常に効率的に行うシステムがDM分子を中心としたペプチド積載システムである。本研究では、分子進化上の要と考えられる動物種を用いて、このシステムに関わるクラスII遺伝子を単離し、詳細な解析を行った。本研究では最適な肉鰭類として肺魚を対象に選び、肺魚のMHCクラスII遺伝子の単離・解析を試みた。得られた肺魚MHCクラスII候補遺伝子の総合的な解析を進め、研究結果を総括した。古典的MHCクラスII分子は、有顎脊椎動物の獲得免疫系において、Tリンパ球への主として外来ペプチド抗原の提示という重要な機能を有している。本研究では分子進化上の要と考えられる動物種を用いて、このシステムに関わるクラスII遺伝子を単離し詳細な解析を行う。シーラカンスと同じ肉鰭類の肺魚がより四足類に近い事が報告されており、本研究では最適な肉鰭類として肺魚を対象に選んだ。肺魚は大別してオーストラリア、南アメリカそしてアフリカ産の数種が存在するが、本研究ではアフリカ産の肺魚を入手して実験に用いた。研究方法としては、研究実施計画に記した様に、DMシステムにおいて重要な相互作用領域に関わる古典的MHCクラスIIα鎖とDMクラスIIα鎖の2者について、その両方向からキーとなるアミノ酸残基の保存性または遺伝子そのものの存在に関して詳細な検討を行う。肺魚のMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。肺魚の組織よりcDNAを作成し、RACE法によりMHCクラスII遺伝子を単離・解析する。RACE法に用いる遺伝子特異的プライマーは、四足動物及び他の硬骨並びに軟骨魚類のMHCクラスII遺伝子単離の場合を参考にして設定する。5'RACE、3'RACEの反応を行い、cDNAの全長を明らかにする。現在、得られた肺魚MHCクラスII遺伝子の詳細な解析を進めている。また、本研究において分子進化上重要と考えられる動物種として、四足動物のサラマンダーを加えることとした。同じ両生類のカエルからは、DM分子をコードする遺伝子が発見されている。肉鰭類及び両生類動物グループ類縁の本研究で重要な生物種のデータを増やすことにより、研究をより強力に進展させることができると考えられる。本研究では、分子進化上の要と考えられる動物種を用いて、このシステムに関わるクラスII遺伝子を単離し、詳細な解析を行う。肺魚は大別して、オーストラリア、南アメリカそしてアフリカ産の数種が存在するが、平成26年度よりアフリカ産の肺魚を入手して実験に用いている。平成27年度も前年度に引き続き、肺魚のMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。肺魚の組織より得られたmRNAを基に、RACE法によりMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。5'RACE、3'RACEの反応を行い、cDNAの全長を明らかにする手法は前年度と同様である。前年度に引き続き、得られた肺魚MHCクラスII遺伝子の詳細な解析を進めている。また、前年度から本研究において分子進化上重要と考えられる動物種として、四足動物のサラマンダーを加えている。サラマンダーからも、MHCクラスII遺伝子の単離・解析を行っている。研究実施計画に記した様に、前年度は肉鰭類で四足動物に最も近いと考えられている肺魚を入手し、分子生物学的実験のスタートを切り、今年度は解析をさらに進展させた。また、当初の研究実施計画には記していないが、前年度に本研究をさらに進展させる上で重要と考えられた四足動物のサラマンダーも入手し、本年度は実際の分子生物学的実験を開始した。肺魚からは、MHCクラスII遺伝子の単離を試み、前年度に引き続き、いくつかの候補遺伝子を得ることができており、さらに解析を進めている。おおむね順調に研究が進展していると判断される。サラマンダーからもMHCクラスII遺伝子の単離を試みているが、こちらも前年度に引き続き、いくつかの候補遺伝子を得ることができ、解析を進めている。

本研究では、分子進化上の要と考えられる動物種を用いて、このシステムに関わるクラスII遺伝子を単離し、詳細な解析を行う。シーラカンスと同じ肉鰭類の肺魚がより四足類に近い事が報告されており、本研究では最適な肉鰭類として肺魚を対象に選んだ。肺魚は大別して、オーストラリア、南アメリカそしてアフリカ産の数種が存在するが、本研究ではアフリカ産の肺魚を入手して実験に用いている。研究方法としては、研究実施計画に記した様に、DMシステムにおいて重要な相互作用領域に関わる古典的MHCクラスIIα鎖とDMクラスIIα鎖の2者について、その両方向からキーとなるアミノ酸残基の保存性または遺伝子そのものの存在に関して詳細な検討を行う。平成28年度は、前年度までの実験に引き続き、さらに肺魚のMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。肺魚の組織より得られたmRNAを基に、RACE法、RT-PCR法等によりMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。前年度までの解析に引き続き、得られた肺魚MHCクラスII遺伝子の詳細な解析を進めている。また、本研究において分子進化上重要と考えられる動物種として加えた四足動物のサラマンダーからも、MHCクラスII遺伝子の単離・解析を行い、得られた遺伝子配列について他のMHC遺伝子群との比較解析を実施している。肺魚からは、前年度までに引き続き、MHCクラスII遺伝子の単離を試み、複数の候補遺伝子を得て詳細な解析を進めている。また、本研究をさらに進展させる上で重要と考えられ途中から導入した四足動物のサラマンダーからもMHCクラスII遺伝子の複数の候補遺伝子を得て詳細な解析を進めている。おおむね順調に研究が進展していると判断される。古典的MHCクラスII分子は、有顎脊椎動物の獲得免疫系において、Tリンパ球への主として外来ペプチド抗原の提示という重要な機能を有していることが知られている。この古典的MHCクラスII分子へのペプチド抗原結合を細胞内で非常に効率的に行うシステムがDM分子を中心としたペプチド積載システムである。本年度は、前年度までの実験に引き続き、さらに肺魚のMHCクラスII遺伝子の単離・解析を行った。前年度までの解析と合わせ、得られた肺魚MHCクラスII遺伝子の総合的な解析を進めた。
ミュータンスレンサ球菌の乳幼児口腔内への初期付着と定着に関する分子生物学的研究

齲蝕原因菌であるmutans streptococci(MS)は,一般に歯の萌出後に定着することが成書に述べられているが,その詳細な時期については報告が少ない。今回我々は低年令児を対象として長期にわたりMSの検出を行ない定着時期に関して検討した。また3家族の4年間におけるMSの経年的分布変化を検討した。対象は広島大学医学部附属病院に附設されている授乳所の園児および卒園児で,04歳までの35名(男児22名,女児13名)について毎月,歯垢あるいは唾液を歯ブラシを使い採取し,buffered glycerol-saline solutionに懸濁し,60μlをBacitracin添加Mitis Salivalius寒天培地に播種して37°C,48時間嫌気培養を行なってMSに特徴的なコロニーの検出を調べた。MSの同定にはマンニトール発酵試験および不溶性グルカン合成試験を用いた。同時に口腔内の歯牙萌出程度を診査し,MSの定着との関係を調べた。さらにMSの伝播の由来を確かめるために,承諾を得られた両親からもMSを検出し染色体DNA fingerprintを行なって,各小児の保有するMS菌株の由来を検討した。35名のうち,期間内にMSの初期定着をみたのは20名でその平均年齢は,24.5か月(2歳0か月)であった。初期定着後は,次第に口腔内のMS量は増加した。また上顎乳前歯部に歯間空隙のない被験児は,初期定着年齢が平均1歳7か月と空隙のある被験児の平均2歳3か月に比べ早期にMS定着を認めた。さらに初期定着したMSの由来は,両親以外が多かったが,両親由来の場合は,親のMS量が多い傾向が認められた。さらに,3家族13名のMSの分布を4年前と比較したところ,4年前と同じ分布を示したのは1名,同じ菌株を有していたのは7名,全て異なったのは5名であった。親子ともにMSの分布は経年的に変化するものの,それは家族内での伝播に依存する様式をとることが多いと推測された。本学託児所の乳幼児名の口腔内より毎月一度,歯垢および唾液を採取し,mutans streptococci(ミュータンス菌)を選択培地であるMSB寒天培地,BHI培地を用いて分離し,ミュータンス菌を同定した。ミュータンス菌の同定試験には,マンニトール発酵試験を用いた。さらに歯牙の萌出状態を観察し,菌の初期定着と歯牙萌出との関係を調べた。現在資料を採取し13ヶ月経過したが,その中間結果として以下のことが明らかになった。1.現時点では3歳児で3/7名,2歳児で2/4名,1歳児で3/9名,0歳児で0/5名にミュータンス菌の口腔内定着を認めた。また,歯牙の萌出前にはミュータンス菌は定着しておらず,さらに歯牙が萌出してもミュータンス菌の初期定着には個人差があることが示唆された。2.3組の兄弟のうち,2組は兄弟ともミュータンス菌を保持し,1組は兄弟とも保持しておらず,ミュータンス菌伝播,初期定着において小児の生育環境の影響が左右していることが考えられた。3.さらに被検乳幼児の父母のミュータンス菌の検出を行った結果,ミュータンス菌を保持していた乳幼児8名のうち,調べた父母会員の口腔内に多数のミュータンス菌を認めた。

現在,被検者からのミュータンス菌の検出を続けるとともにこれらの分離したミュータンス菌株のDNA fingerprintを行って菌株の同定,由来を明らかにし家族内の伝播関係に関わる因子を調べている。齲蝕原因菌であるmutans streptococci(MS)は,一般に歯の萌出後に定着することが成書に述べられているが,その詳細な時期については報告が少ない。今回我々は低年令児を対象として長期にわたりMSの検出を行ない定着時期に関して検討した。また3家族の4年間におけるMSの経年的分布変化を検討した。対象は広島大学医学部附属病院に附設されている授乳所の園児および卒園児で,04歳までの35名(男児22名,女児13名)について毎月,歯垢あるいは唾液を歯ブラシを使い採取し,buffered glycerol-sa1ine so1utionに懸濁し,60μlをBacitracin添加Mitis Salivalius寒天培地に播種して37°C,48時間嫌気培養を行なってMSに特徴的なコロニーの検出を調べた。MSの同定にはマンニトール発酵試験および不溶性グルカン合成試験を用いた。同時に口腔内の歯牙萌出程度を診査し,MSの定着との関係を調べた。さらにMSの伝播の由来を確かめるために,承諾を得られた両親からもMSを検出し染色体DNA fingerprintを行なって,各小児の保有するMS菌株の由来を検討した。35名のうち,期間内にMSの初期定着をみたのは20名でその平均年齢は,24.5か月(2歳0か月)であった。初期定着後は,次第に口腔内のMS量は増加した。また上顎乳前歯部に歯間空隙のない被験児は,初期定着年齢が平均1歳7か月と空隙のある被験児の平均2歳3か月に比べ早期にMS定着を認めた。さらに初期定着したMSの由来は,両親以外が多かったが,両親由来の場合は,親のMS量が多い傾向が認められた。さらに,3家族13名のMSの分布を4年前と比較したところ,4年前と同じ分布を示したのは1名,同じ菌株を有していたのは7名,全て異なったのは5名であった。親子ともにMSの分布は経年的に変化するものの,それは家族内での伝播に依存する様式をとることが多いと推測された。
ゲノム損傷応答とクロマチンリモデリング機構の可視化解析

真核生物のDNAはヒストンなどの核蛋白質と複合体を形成しクロマチンの構造を取っていて、修復に伴うクロマチンの構造変化はほとんど分かっていません、最近ヒト細胞内での損傷に伴うクロマチン関連因子SNF2H(ATP加水分解を介してヌクレオソンム移動されるモータ),ACF1(SNF2Hと複合体作り、ヒストンの結合因子)、WSTF(同じくSNF2Hと複合体作り、神経系疾患Williams-Beuren syndromeの原因遺伝子)もレーザーによって作ったDNA損傷に集積ことを見つけました。修復に伴うクロマチンの構造変化に関わるこれらの蛋白質はSNF2Hは持っているSLIDEドメインに依存して損傷位に集積し、クロマチンの構造変化に関わることを明らかにした。さらに、siRNAによってこれらのクロマチンリモデリング因子を細胞ないで抑えると、細胞は様々なDNA損傷に対して非常に高い感受性を示した。Comet assayにより、クロマチンリモデリング因子の機能を抑えると、DNA修復は遅れていたことが示された。さらに、修復に重要な蛋白質KU70,KU80,DNAリガーゼIVの損傷部位へのアクセスはsiRNAによって影響された。このように、クロマチンリモデリング因子は損傷に応答し、そらに、DNA修復に影響を与えることを発見し、現在論文作成中です。私たちは細胞の中で起きている損傷応答プロセスをさらに解析するために、細胞の核の一部にレーザーを当てて、塩基損傷からDNA単鎖切断、二本鎖切断を細胞核の一部に作る方法を開発しました。XPA-UVDE及びレーザーのシステムを用いて、細胞の核の一部にのみ紫外線やレーザーを当てることで、塩基損傷、DNA単鎖切断、二本鎖切断などを局所的に自由に作れるようになりました。この実験系を用いて、様々の修復蛋白質、例えばBLM, RAD18,APTX, POLQ, PLAFは損傷現場にやってきたことを共同研究で見つけました。これからの蛋白質はどのように修復現場にやってきて、どのような損傷にやってくることを解析した結果、RAD18は紫外線DNA単鎖切断に、PLAFはDNA単鎖切断と二本鎖切断に、POLQは塩基損傷に、BLMは二本鎖切断に応答することを明らかにした。真核生物のDNAはヒストンなどの核蛋白質と複合体を形成しクロマチンの構造を取っていて、修復に伴うクロマチンの構造変化はほとんど分かっていません、最近ヒト細胞内での損傷に伴うクロマチン関連因子SNF2H(ATP加水分解を介してヌクレオソンム移動されるモータ),ACF1(SNF2Hと複合体作り、ピストンの結合因子)、WSTF(同じくSNF2Hと複合体作り、神経系疾患Williams-Beuren syndromeの原因遺伝子)もレーザーによって作ったDNA損傷に集積ことを見つけました。修復に伴うクロマチンの構造変化に関わるこれらの蛋白質は何に依存して、どのように損傷に応答するかを調べていますの動態を解析し、実際の細胞で起きる損傷応答を時系列で明らかにしています。
在宅における肺がん患者に対する呼吸困難ケアの実践促進要因

肺がん患者の呼吸困難は、約7割に発症するケアニーズの高い症状である一で、メカニズムや標準的治療法が確立されていない最も対応に難渋する症状の一つである。近年、在宅療養を希望する人が増加する中、在宅における症状緩和は重要な課題であり、病院内だけでなく在宅においても継続した質の呼吸困難ケア実践が望まれている。本研究は、訪問看護師の肺がん患者に対する呼吸困難ケア実践能力及び必要な教育内容を明らかにするために、肺がん患者に対する呼吸困難ケア実践と影響要因を明らかにすることを目的として実施した。1.平成27年度の実施内容訪問看護におけるがん患者に対する看護介入の現状に関する文献検討を行った。その結果、訪問看護師のがん患者に対する症状マネジメントや看取りに関する能力が十分に育成されておらず、今後の在宅看護推進を目指して訪問看護師の教育システムを構築することの必要性が明らかとなった。一方で、訪問看護におけるがん看護は平成26年に機能強化型訪問看護ステーションの設置等の体制転換期であり、現場の状況が施設によって異なることが示唆された。そのため、本調査実施前に、平成26年度に実施した全国の呼吸器内科・緩和ケア病棟を対象とした調査結果と共に、実際の訪問看護施設から現状をインタビュー等で情報収集し、質問紙の精度を上げる必要があることが明らかとなった。2.今後の展望平成27年度の実践内容結果を踏まえて、訪問看護におけるがん患者に対する看護介入の現状に関する情報収集を行い、質問紙の精度を上げて平成28-29年度に本調査の実施を予定している。本研究は平成27-29年度の3箇年で実施予定であったが、研究代表者の所属施設退職に伴い、平成27年度をもって本助成を辞退した。しかし、本研究テーマは今後増加傾向にある在宅がん患者が苦痛なく療養生活を送るために重要な研究と考えるため、研究遂行は継続する。
複数の神経活生物質の同一神経細胞内共存の意義に関する研究

I)運動ニューロンにおける共存骨各筋を支配する運動ニューロンはアセチルコリン(Ach)とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の両者を含有することは我々によって見い出されたがその意義については不明であったが本研究によりCGRPは(1)Achの筋収縮作用を増強する作用を有すること、(2)その作用は独自のCGRPリセプターを介すること(3)収縮増強は筋肉のCAMPの増加にわることを明らかとし共存のメカニズムに関する概要を明らかとした。後根神経節細胞がP物質(SP)とCGRPをまた後角細胞がSPとエンケファリン(EnK)を含有することは我々により明らかとされた。痛覚刺激により後根神経節細胞内のSP前駆体mRNAが著しく増加することと、また後角細胞ではEnKの前駆体mRNAが同様の変化を示すことから、痛覚伝達においては後根では共存する神経活性物質のうちSPが、また後角細胞ではEnKがより義的に関与することが示され、同一細胞に共存する物質でも機能的差異が存在することが明らかとなった。III)三者以上の神経活性物質の同一細胞内共存について脚傍核においてSP、CGRP及びニューロテンシン(NT)の三者を含有し扁桃体に投射するニューロンを見い出した。SPがニューロキニンA(NKA)と同じ前駆体にユードされてやり、この細胞では四者が発現する可能性がある。また孤束核でもカテコールアミン、コレシストキニン、NTの三者を含有する細胞を見い出し、今後は三者以上共存の意義を明らかにする必要がある。その為にも神経活性物質の作用部位、リセプター局在の検討が必要であり我々は免疫組織化学によりβアドレノリセプター、グリシンリセプターの局在を明らかとし現在遺伝子発現につき検討中である。昭和60年度に我々は骨格筋支配神経においてアセチルコリン(Ach)とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)が同一神経内に共存し、CGRPはAchの筋収縮作用を増強する働きを有することを証明すると共に、CGRPのこの作用はAchリセプターを介するものではなくCGRP独自のリセプターを介する可能性を示唆した。本年度はこの実績に基づきCGRPのAch作用増強効果のメカニズムについて検討した。本研究ではDDYマウスの横隔膜をそのモデルとして用いた。横隔膜を1μMCGRPとIncubationすると1分以内にCAMP量が1.8倍に増加しこの効果は少なくとも10分は継続した。次に10nMから1μMまでの種々の濃度のCGRPと共に横隔膜をIncubationすると用量依存性にcAMP量が増加し、1μM CGRPではcAMP量は266%増加したがなおplateauには達しなかった。一方CGMP量に関しては1μM量のCGRPを用いても有意な変化は認められなかった。次にphosphodiesteraseの阻害剤であるテオフィリン、リパベリン及び【R_O】20-1724の投与効果がcAMP量を指標として検討した。これらの薬物はいづれもcAMP量を増加させたが【R_O】20-1724投与による効果(約6.6倍)が最も著明であった。上記薬物存在下で0.1μMCGRPを投与すると薬物単独投与に比し、またCGRP単独投与に比しcAMP量は著しく増加した。またβ-Adrenergic系を介するcAMP量の増加と横紋筋収縮も報告されている。しかし、プロプラノール存在下でもCGRPはcAMP量を著しく増加させCGRPのcAMP増量効果はβ-Adrenergic系を介するものでないことが明らかとなった。また我々は本研究で横隔膜においてCGRPの特異的結合を認めている。

さらに以前我々はCGRP効果かAchリセプターを介するものでないことも明らかとしている。したがって、CGRPの筋収縮作用は横紋筋のCGRPリセプターと結合しAdenylate cyclaseを活性化しcAMP量を増加させることにより発現するものと考えられる。(1)三種ペプチド共存システムの同定ラット脚傍核を用いて行った.脚傍核のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有細胞を含み扁桃体中心核に投射することは既に我々が報告してきた.今回我々は脚傍核より扁桃体中心核に投射するサブスタンスP(SP)ややニューロテンシン(NT)含有細胞の存在を証明し,かつCGRP, SP, NTを含有する細胞が存在することを明らかとした.即ち脚傍核においてSP, NT細胞を同定し,脚傍核を破壊すると扁桃体中心核のSP, NTは激減する.さらに扁桃体中心核に逆行性トレーサを注入すると脚傍核においてトレーサとSP抗体,或いはNT抗体で同時に標識される細胞が出現した.次にCGRPとSP, NTとSPの二重染色を施行するとこの両者を各々含在する細胞が認められた.さらにCGRPとSPを二重染色し共存細胞を同定後,連続切断でNTとの共存を検討した結果この三者を同時に含む細胞が同定された.従来より二種の神経活性物質の共存について多数その例が集められているが三種の異なるペプチドの共存例についての報告はなくこの例が最初である.最近アミンと2種のペプチド或いはアミノ酸,アミンペプチドなどの三者共存例も示されており,三種以上の活性物質が同一細胞に共存することが普偏的なものと考えうるデータを今回得られた.(2)共存のメカニズムの検討神経活性物質の共存のメカニズムの検討の為それらのmRNAの可視化を試みた.例としてエンケファリンとSPを用いた.In situ hybrization法により扁桃体のエンケファリンのmRNAが胎生の早期より多量に産生されること,また後根神経節のSPのmRNAが痛み刺激により増加することを見い出した.この方法の開発により今後SP,エンケファリン共在細胞においてそのメカニズムの解析への道を開いた.(1)後根神経節のサブスタンスP(SP)及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の意義について昭和62年度、我々は痛覚モデル動物を用い、同動物後根神経節SPの前駆体mRNAが増加していることを見い出しSPが侵害刺激に関与していることを証明した。本年度はSPと同一細胞内に共存するCGRPについて検討を加えたがSPほどの変化は認められず、CGRPは侵害刺激に関与するにしてもSPほど緊密な関連は有しないものと思われる。またラットにおいて後根神経節細胞の中枢枝を切断してもSP及びCGRPの前駆体mRNAには変化が認められなかったが知覚を受容しその情報を中枢に伝える末梢枝を切断するとSP、CGRPの前駆体mRNAは著減した。このことは知覚神経節ニューロンの神経ペプチド動態は末梢枝の情報により大きな影響を受けていることを示す。(2)リセプター局在についてβアドレノリセプタ(AdR)の脳内分布を免疫組織化学を用いて検討した。AdRは脳内に幅広く分布し主として細胞体、樹状突起に反応物が現られる。下垂体でもAdR陽性細胞が存在するがACTH抗体との二重染色によりACTH細胞がAdRを有することが明らかとなりACTH分泌にAdRを介するカテコルアミン調節が存在することが証明された。
精密有機合成を基盤とする生物活性アルカロイド合成と創薬リード分子の創製

1.ルテニウムカルベン錯体新規環化異性化反応の開発と天然物合成Grubbsにより開発されたルテニウムカルベン錯体をビニロキシトリメチルシランと反応させると新たな錯体が調製された。本錯体は、末端二重結合の選択的異性化、α,ω-ジエンの環化異性化反応を触媒することを見いだした。本反応における置換機構化を精査し、環化遷移状態における置換基と触媒の相互作用を明らかとした。本反応を用いて抗菌・抗カビ作用を有するフィスチロシンとして提唱された構造を合成した。しかし、提唱された構造の機器データは天然物から得られた機器データと一致せず、提出構造が間違っていたことが判明した。天然物サンプルおよびスペクトルデータも入手できないことから構造解明のためには再単離が必要となった。2.コプシアアルカロイド、ラピディレクタムの合成研究ラピディレクタムはマレー産Kopsia lapidilektaの茎および葉から得られた5環性インドールアルカロイドであり、その生物活性は不明である。これまで全合成研究は無かった。閉環メタセシス反応によりピロロアゾシン骨格を構築の後、我々が開発した二重結合の異性化を伴うHeck型反応を用いて、4環性中間体を合成した。置換基の立体科学の反転、およびインドール3位へのアシル基の導入を行った。いずれの反応も高い立体選択性が観測され、また、立体選択性の発現には中心8員環構造のコンポメーションの制御が重要であることが示唆された。3.フランーイミニウムカチオン環化反応を開発し、マンザミンAの骨格合成に応用した。1)天然型光学活性ナカドマリンAの不斉全合成ナカドマリンAはマンザミン関連アルカロイドの一つであり、我々のグループにより世界初の非天然型光学異性体の合成が達成されている。天然型異性体の全合成を目指し全く別ルートによる合成研究を行った。光学活性N-スルホニルジヒドロピペリジノンとシロキシジエンのDiels-Alder反応により得られたヒドロイソキノリン中間体の大量合成法の確立に成功した。得られたヒドロイソキノリン中間体を分子内求核反応によりピロリジン環形成を行い更に環縮小、フラン環形成をへて光学活性ナカドマリンA中心骨格を合成した。我々の開発したラセミ体合成経路に従い、閉環メタセシスを用いて8員環および15員環形成を行い、全合成を達成した。また、閉環メタセシスにおいて末端三重結合をコバルト錯体として保護することが可能であることを見いだした。2)マンザミンAの合成研究抗腫瘍性、抗マラリア活性より注目されるマンザミンAの全合成研究をおこった。活性発現に必要な構造解明を視野に入れ、全合成を計画した。1)に示したヒドロイソキノリン中間体を用いてピロリジン環形成、B環への官能基の導入、更に13員環の構築に成功した。残る8員環形成をへて合成前駆体イルシナールAの合成を行いマンザミンAに誘導する予定である。また、フランイミニウム環化反応により、マンザミンAのABC環骨格が効率よく構築できることを見いだした。更にB環にC1ユニットを導入し中心骨格に必要な官能基をすべて導入することができた。本経路を用いるマンザミンAの別途合成も検討中である。3)ルテニウムカルベン錯体を用いる新反応の開発Grubbsにより開発されたルテニウムカルベン錯体をビニロキシトリメチルシランと反応させると新たな錯体が調製された。本反応を用いて新規インドール合成法を開発した。

1)ルテニウムカルベン錯体新規環化異性化反応の開発と天然物合成Grubbsにより開発されたルテニウムカルベン錯体をビニロキシトリメチルシランと反応させると新たな錯体が調製された。本錯体は、末端二重結合の選択的異性化、α,ω-ジエンの環化異性化反応を触媒することを見いだした。本反応における置換機構化を精査し、環化遷移状態における置換基と触媒の相互作用を明らかとした。本反応を用いて抗菌・抗カビ作用を有するフィスチロシンとして提唱された構造を合成した。しかし、提唱された構造の機器データは天然物から得られた機器データと一致せず、提出構造が間違っていたことが判明した。天然物サンプルおよびスペクトルデータも入手できないことから構造解明のためには再単離が必要となった。2)コプシアアルカロイド、ラピディレクタムの合成研究ラピディレクタムはマレー産Kopsia lapidilektaの茎および葉から得られた5環性インドールアルカロイドであり、その生物活性は不明である。これまで全合成研究は無かった。閉環メタセシス反応によりピロロアゾシン骨格を構築の後、我々が開発した二重結合の異性化を伴うHeck型反応を用いて、4環性中間体を合成した。置換基の立体科学の反転、およびインドール3位へのアシル基の導入を行った。いずれの反応も高い立体選択性が観測され、また、立体選択性の発現には中心8員環構造のコンホメーションの制御が重要であることが示唆された。6員環形成の後天然物に導く予定である。1.光学活性相関移動触媒を用いるアラニン誘導体の不斉マイケル反応及び不斉アルキル化反応を検討し、中程度の不斉収率ではあるが不斉四級炭素の構築に成功した。生成したマイケル付加体は容易に環化し、新たなピロリドン形成反応の開発に成功した(Heterocycles,2006)。またアラニン誘導体のイミン保護基を調整する事により、同条件で1,3-双極子付加反応が進行する事を見いだした。2.ジアゾエステルは有機塩基存在下アルデヒドと反応しアルドール型付加生成物を与える(Tet.Lett.2004)。本年度は得られたジアゾエステルの選択的な還元条件を探索し、効率良くヒドラゾノエステル及びヒドラジノエステルへ変換する事に成功した(Tetrahedron,2006)。ジアゾエステルとの反応をオルト-ヨードベンズアルデヒドと行った後、同様な変換にて得られたヒドラゾノエステルをN, N'-ジメチルジアミノエタン存在下、銅触媒による芳香族分子内アミノ化反応に付すと6員環形成が生じ高収率でシンノリン-3-カルボン酸エステル誘導体が得られた。一方、ヒドラジノエステルは末端窒素原子をアシル化した後、芳香族アミノ化反応に付すと5員環形成反応が進行しN-アシルアミノインドリン誘導体が生成した。シンノリン、及びN-アミノインドリンはいずれも医薬品や天然物の骨格として見いだされており、それらの新合成法の開発が期待される。3.Grubbs錯体をビニルオキシトリメチルシランと反応させると、これまで効率の良い合成法が確立されていなかったヘテロ環状カルベン配位子を有するルテニウムヒドリド錯体が高純度・高収率にて合成される事を見いだした。さらに、得られたルテニウムヒドリド錯体が二重結合の選択的異性化及び環化異性化反応を触媒する事を見いだし、多置換インドール及びインドリン合成に応用した(JOC,2006)。
エンド開裂による異性化を基盤とした生理活性糖鎖合成研究

アノマー炭素と環内酸素の間の結合が切断されるエンド開裂反応は極めて珍しい反応様式である。2位アミノ基と3位水酸基をカーバメート基で保護することによりエンド開裂反応が容易におこることを見出した。エンド開裂反応により生じる鎖状カチオンを還元やFreidel-Crafts反応により捕捉することにより、その存在を明らかにした。また、カーバメート基窒素原子上置換基効果を検討し、アセチル基の場合、完全に異性化することを見出した。これまでのグリコシド結合形成時にアノマー位の立体を決定するグリコシル化反応と異なり、複数の既存のグリコシド結合の1,2-trans体を1,2-cis体に変換可能であった。昨年度化学合成した1,2-transグルサミンテトラサッカライドの保護基を適宜除去し、N-アセチル2,3-transカーバメート基を導入した。弱いルイス酸条件により、N-アセチル2,3-transカーバメート基を持つアミノ糖4つのアノマー位の立体化学を一挙に1,2-cis体へと変換できることを示した。Fischerによるグリコシル化反応の開発以来、これまで、糖受容体と糖供与体とのグリコシル化反応によるグリコシド結合生成時にアノマー位の立体化学が決定されてきたが、本手法では、既存の複数のグリコシド結合の立体化学を一挙に変換することが可能となる。加えて、1,2-cisアミノグリコシド結合は、生理活性糖鎖によく見出される構造であるが、その立体選択的構築は通常のグリコシル化結合ではいまだ困難である。本異性化反応では、完全な1,2-cis体に異性化することが可能であり、有機合成化学的にも有用性が高い。ヘパリン前駆体であるヘパロサンも1,2-cisアミノグリコシド結合を含む。昨年度合成した1,2-trans結合を持つグルコースとグルコサミンの繰り返し4糖についても、N-アセチル2,3-transカーバメート基を導入後、異性化を行った。また、副次的な課題として、特異な性質を持つ新規保護基を見出した。一般的な保護基は、より強い条件において脱保護が可能となるが、スルホニルカーバメート基窒素上のプロトンの酸性度を利用して、弱い塩基性条件において除去可能で、強い塩基性条件で安定である水酸基への保護基を開発した。中性条件において導入可能である。幅広い基質に適用可能であり、汎用されている水酸基保護基との相補性についても確認した。本研究の目的は、申請者が見出したエンド開裂反応を基盤として、合成が容易である1,2-transアミノ糖の複数のグリコシド結合を温和な酸性条件において、合成が困難である1,2-cisアミノ糖へと一挙に異性化する手法として、エンド開裂反応の合成的な有用性を示すことにある。合成目的糖鎖は、機能性、生理活性を持つ1,2-cisアミノ糖を構成糖として含む。本年度は、原料となる複数の1,2-transアミノグリコシド結合を含む保護されたオリゴ糖2種を有機合成化学的に合成した。ひとつは、β1,4-結合したグルコサミン4糖オリゴマーである。これは、異性化後には、新規オリゴ糖として様々な機能が期待される。もうひとつは、グルコサミンとグルコースがβ1,4-結合した4糖である。これは、異性化後、抗血液凝固作用を持つヘパリン骨格となる。基質の検討中に、2,3-transカーバメート基を持つβ体のフッ化糖、チオグリコシドは、糖供与体として機能する一方で、α体のフッ化糖、チオグリコシドは既存の手法では、ほとんど活性化されないことを明らかにした。この過程において、フッ化糖の活性化方法を検討を行い、フッ化糖の新しい活性化方法を開発した。これまで、向山、鈴木らによりフッ化糖の活性化方法が開発されてきたが、複数の試薬や、使用直前に活性化したモレキュラーシーブが必要であるなど、テクニカルな面においての面倒さが存在した。今回、空気中で取り扱いができるHf(OTf)4がフッ化糖の活性化に非常に有効的に働くことを見出した。前々年度、前年度に合成した1,2-trans結合したヘパロサン前駆体4糖のグルコサミン部分のフタルイミド基を除去し、トリホスゲンによりN-アセチル2,3-transカーバメート基を導入した。その後、ルイス酸処理を行うことにより、アミノグリコシドを1,2-cis体への異性化反応を行った。2カ所のアミノグリコシドのアノマー結合が完全に1,2-cisグリコシドへと異性化した。さらに保護基の変換、除去を行い、ヘパロサン合成を進めた。エンド開裂反応により、グルコサミンからなるオリゴ糖の複数のアノマー位の1,2-trans結合を1,2-cis結合へと一度に異性化反応を行うことができることを前年度に明らかにした。グルコサミンが4位にβ-結合した糖鎖高分子キトサンは、甲殻類の殻から得られ、枯渇することのない安価な糖鎖資源である。セルロースとアミロースは、構成する単糖ユニットの構造(グルコース)、結合位置が同じであるにもかかわらず、アノマー位の立体配置が異なることから、高分子の物理化学的性質が異なる。α結合したグルコサミン高分子は知られておらず、2-アミノ-2-デオキシグルコサミンがβ1,4-結合したキトサンをα結合に異性化させると、新しい機能を持つ糖鎖高分子を創製できると期待される。

そこで、難容性であるキトサンにN-アセチル2,3-transカーバメート基を導入する試みを行い、反応条件を検討した。これまで、アノマー位立体化学の制御は、糖供与体と糖受容体との間のグリコシド結合形成時に逐一なされてきた。しかし、本研究課題において開発したエンド開裂反応を用いた異性化反応を用いれば、既存の複数のアノマー位の立体化学を一挙に変換することが可能となる。これまで開発されてきた反応ではこのような化学変換は行うことができず、エンド開裂反応の合成化学的有用性を示すことが可能となる。昨年度までに化学合成したキトサン4糖を用いて、一気に4カ所のアノマー位の立体化学を完全にα体へと変換することができることを示した。本年度は、より分子量の大きい天然から単離されるキトサンを基質として、本反応の応用範囲を拡大することを目的とした。セルロースとアミロースは、同じ糖ユニットのグルコースからなり、グルコースユニット結合位置も同じ(1-4結合)であるが、アノマー位の立体化学が異なるため、高分子の物性は大きく異なる。天然に存在するグルコサミンがβ1,4-結合している糖鎖高分子であるキトサンをエンド開裂反応を経由する異性化反応により異性化させることができれば、グルコサミンがα1,4-結合している、アミロースの2位水酸基をすべてアミノ基に変換した糖鎖高分子となる。本糖鎖高分子はキトサンと異なる物性を持つことが予想され、様々な化学修飾も可能であり、様々な応用も期待される。高分子量のキトサンのN-フタロイル化反応、6位水酸基の保護、カーバメート基の導入について、効率的な分子変換と構造解析の方法論を目的として反応条件の検討を行った。アノマー炭素と環内酸素の間の結合が切断されるエンド開裂反応は極めて珍しい反応様式である。2位アミノ基と3位水酸基をカーバメート基で保護することによりエンド開裂反応が容易におこることを見出した。エンド開裂反応により生じる鎖状カチオンを還元やFreidel-Crafts反応により捕捉することにより、その存在を明らかにした。また、カーバメート基窒素原子上置換基効果を検討し、アセチル基の場合、完全に異性化することを見出した。これまでのグリコシド結合形成時にアノマー位の立体を決定するグリコシル化反応と異なり、複数の既存のグリコシド結合の1,2-trans体を1,2-cis体に変換可能であった。これまでのグリコシル化反応とは異なるメカニズム、活性種を経る反応を見出し、理論的な反応機構解明とともに、有機合成化学においての有用性を示すことができた。通常のグリコシル化反応では、アノマー位の立体化学を結合形成時に逐一制御するが、本研究課題においては既存のグリコシド結合の立体化学を一挙に変換することができる画期的手法を開発した。通常のグリコシル化反応においては、アノマー炭素と環外酸素の間の結合が切断(エキソ開裂)された環状カチオンに求核剤を反応させて、グリコシドを形成してきた。本研究課題では、2,3-transカーバメート基、カーボネート基を導入するとアノマー炭素と環内酸素の間の結合が切断(エンド開裂反応)され、鎖状カチオンを生じる。この鎖状カチオンの存在は、立体電子効果の知見から議論されたこともあったが、本課題では、ピラノシドを基質として、還元や分子内•分子間Friedel-Crafts反応により捕捉することにより証明した。カーバメート基置換基上の置換基効果を系統的に検討することにより、特にカーバメート基、アシル基の場合に速やかに異性化反応がおこることを見出した。