hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌抑制遺伝子産物の分解亢進を介した細胞悪性化の分子機構

[研究目的]本研究では、癌抑制遺伝子産物の分解亢進による細胞悪性化機構の解明を目指す。特にRB経路を制御する癌抑制遺伝子産物RBタンパク質とCDK阻害タンパク質p27^<Kip1>の細胞内での分解機構を明らかにする。さらに、これらの癌抑制遺伝子産物の分解実行因子の発現亢進や、分解亢進に伴い発現が変化する細胞悪性化や予後不良のキー遺伝子を解明することを目指す。[方法と結果](1)RBタンパク質のユビキチン依存的分解機構:p53のユビキチンリガーゼであるMdm2がRBタンパク質に結合し、ユビキチン化することを見出した。興味深いことにMdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化しp107やp130はしなかった。また、癌抑制遺伝子産物ARFはRBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進し、プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2、Mdm2のsiRNAで分解が阻害されることがわかった。さらにヒトのMdm2が高発現している癌検体において、RBの発現量が低く、Mdm2によりRBの分解亢進が細胞癌化に寄与していることが判明した。(2)p27^<Kip1>の分解制御機構:予後不良の癌ではCDK阻害タンパクp27^<Kip1>の分解が亢進している。我々は肺癌でp27^<Kip1>のユビキチンリガーゼSkp2とCks1の発現が有意に高いことを見いだした。さらにCks1の細胞内存在量はユビキチン-プロテアソーム系によって制御されていることを証明した。Cks1の分解低下が癌におけるCks1の高発現の原因のひとつとなっている可能性が示唆された。特にRB経路を制御する癌抑制遺伝子産物RBタンパク質とCDJ阻害タンパク質p27^<Kip1>の細胞内での分解機構を明らかにする。[方法と結果](1)RBタンパク質のユビキチン化:RBタンパク質のユビキチン化を解析するためにin vivoおよびin vitroアッセイを構築した。この細胞内および再構成系でMdm2はRBタンパク質と結合してRBタンパク質を効率よくユビキチン化した。興味深いことにMdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化した。また、ARFはRBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進し、プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2で分解が阻害されることがわかった。さらにSaO2細胞を用いたRB経路の機能アッセイで、Mdm2によりRB経路が抑制されることが判明した。(2)p27^<Kip1>の分解制御機構:p27^<Kip1>の分解制御にかかわるリン酸化部位Ser10を含むN末端領域をBaitとしYeast Two-hybridスクリーニングを行った。その結果数種の結合タンパク質を黒にーングすることに成功した。今後はさらに機能解析を進める予定である。

特にRB経路を制御する癌抑制遺伝子産物RBタンパク質とCDK阻害タンパク質p27^<Kip1>の細胞内での分解機構を明らかにする。さらに、これらの癌抑制遺伝子産物の分解実行因子の発現亢進や、分解亢進に伴い発現が変化する細胞悪性化や予後不良のキー遺伝子を解明することを目指す。[方法と結果](1)RBタンパク質のユビキチン依存的分解機構:p53のユビキチンリガーゼであるMdm2がRBタンパク質に結合し、ユビキチン化することを見出した。興味深いことにMdm2はRBファミリーの中でRBタンパク質だけを特異的にユビキチン化しp107やp130はしなかった。また、癌抑制遺伝子産物ARFはRBタンパク質のユビキチン化を抑制した。細胞にMdm2を過剰発現するとRBタンパク質の分解速度が亢進し、プロテアソーム阻害剤やドミナントネガティブMdm2、Mdm2のsiRNAで分解が阻害されることがわかった。さらにヒトのMdm2が高発現している癌検体において、RBの発現量が低く、Mdm2によりRBの分解亢進が細胞癌化に寄与していることが判明した。(2)p27^<Kip1>の分解制御機構:予後不良の癌ではCDK阻害タンパクp27^<Kip1>の分解が亢進している。我々は肺癌でp27^<Kip1>のユビキチンリガーゼSkp2とCks1の発現が有意に高いことを見いだした。さらにCks1の細胞内存在量はユビキチン-プロテアソーム系によって制御されていることを証明した。Cks1の分解低下が癌におけるCks1の高発現の原因のひとつとなっている可能性が示唆された。
地域高齢者の主観的評価と客観的ライフスタイルとの関連

本研究では,周囲の環境と対象者と都市からの来訪者,あるいは次世代間での社会的関係に関する満足感を測定することができる生活の質(QOL)質問票を作成した。質問票の作成にあたり,対象地域内の一集落の居住者を対象とした聞き取り調査を実行した。その結果,対象者の生活実態と価値観を把握することができ, QOL質問票の質問項目に妥当性を持たせることができた。因子分析の結果,対象者のQOLが5つの要因から成り立っていることが明らかとなった。今後急激に増加する高齢者の健康を考える上で,生活への満足度(QOL)や生活活動指標(ADL)といった高齢者自身の主観的評価が重要である。本研究では,その主観的評価と生活活動や栄養状態と言った客観的指標との関連を通じて,高齢者の健康増進に寄与する一つのモデルケースを提示することを目的とした。対象は典型的な高齢化と過疎化が進む日本の中山間地として,生活環境がその地域の居住者に与える影響なども含めて考察することとした。本研究の結果が,今後の高齢者福祉を効率よく遂行する上での基礎資料となることを期待する。本年度研究計画初年度と言うこともあり,必要な機材の購入を行つた。身体計測に必要な身長計,体脂肪計などは現有設備を利用することとしたが,生活活動調査で用いる加速度計,行動調査で用いるGPS, GISについてはより精度の高いデータ収集のため新規に購入し,それらの機材・システム利用の習熟を図った。加えて,対象地域の調査協力者に調査に関する連絡調整を行う。対象者の活動パタンを考慮し,もっとも調査協力が得られやすいタイミングを検討したうえで,調査のタイミンダを検討した。さらに,これまで得られた情報から解析を行い,学会にて発表を行った。生活満足度に影響を与える項目として,生活活動指標が多く影響を与えていること,また,中山間地域のような環境によって生活に必要な能力が変化することが示唆され,今後保健福祉政策上も周辺環境を考慮する必要性が示された。なお,この発表において,多くの参加者よりアドバイスを受け,今後作成する質問票の構成を検討する上で参考となった。少子高齢化に加え過疎化が進行する中山間地域では,集落の機能を維持できず,コミュニティとしての役割を完全に果たせない,いわゆる限界集落への対応は,喫緊の課題である。健康日本21でも健康寿命の延伸が掲げられており,ただ寿命を延伸させるだけでなく,個人が満足感を持って日々生活することが重要である。健康寿命は個人と行政機関が協調して努力することによってさらなる延伸が可能であり,健康で自立した高齢者が,家族や地域社会において積極的に貢献することで,過疎化,高齢化の進む中山間地域においては特に重要な人的資源になりうる。健康寿命には運動能力,自活力,認知機能に加え,心理的状態,とくに主観的な生活への満足度(QOL)は重要な概念となっている。本研究では,典型的な過疎地域である山梨県の中山間地域に居住する住民を対象に,対象者自身の周辺環境に対する満足度,社会的関係のうち来訪者や世代間交流に関する満足度を測定することができるQOL質問票を作成し,その信頼性と妥当性を検討することを目的とした。今年度は得られた質問票データの解析を中心に行った。因子数を内容分析で得られたカテゴリ数と同じ5つで固定して因子分析(主因子法・プロマックス回転)を実施したところ,因子構造とその項目が解釈しにくくなったため,因子数を減らして因子分析を行った。最終的に因子数は解釈可能性などから,5因子構造が適当と判断した。この因子構造の信頼性はクロンバックのα係数によって,妥当性はQOL質問票の全体項目との相関を検討することで行われた。その結果,今回作成した質問票は信頼性,妥当性があり,これからの分析に信頼性を持たせることができることが確認された。本年度はこの内容について学会にて公表した。
ポストスターバースト銀河(E+A銀河)の物理的起源の解明

数億年前まで活発に星生成を行なっていたものの突然星生成を停止したE+A(ポストスターバースト)銀河と呼ばれる銀河種族の物理的起源を解明するため、観測を行なって、銀河の中での星生成の停止に関するいくつかの知見を得た。多くの銀河が集まる銀河団環境では、低質量銀河がガスの引き剥がしによって星生成を停止している示唆が得られた。一方フィールドにおいては、1つの銀河の中で星生成部分とポストスターバースト部分が共存する銀河ペアの観測から定量的な議論を行なった。21年度はまず本研究に用いる解析環境の整備を行った。具体的には宇宙科学研究本部にRAIDディスクを構成、その中にスローンデジタルスカイサーベイの第7リリース(DR7)公開スペクトルデータをダウンロードした。そのデータを用いて、研究協力者である国立天文台・ハワイ大学の後藤氏の協力のもと、ポストスターバースト(E+A)銀河の特徴となるスペクトル構造の測定を行った。この結果、現在世界最大となるポストスターバースト銀河のカタログを構築できた。同時に、岡山観測所で取得した赤外線データを同環境に展開、解析を開始した。この際、八木は副次的に得られた手法を元に画像の位置を合わせる手法を改良した。また、山内は画像解析に用いる基礎的サブルーチンの整備も同時に行った。これらの副次的成果をADASS 2009で発表した。銀河周辺の環境、特に伴銀河に関する分光観測提案を各地望遠鏡に対し行ったが、我々の計画に対するいくつかの問題点が指摘され、今回は観測時間を得ることができなかった。指摘された事項を検討し2223年度に観測時間を得られるよう計画を抜本的に練り直す予定である。銀河周辺の淡い構造に関する研究は、研究協力者である後藤氏が成果を研究会で発表し、同時に今後のこの分野の展開に関する情報収集を行った。また、研究協力者である京都大学松林氏とともに一つの銀河の中でスターバーストとポストスターバーストが同居する特異な銀河の観測をすばる望遠鏡を用いて行なった。韓国の延世大学のYoon氏から、星生成の度合いがE+A銀河よりも弱い、星生成後銀河(RSF銀河)に関する共同研究の打診があった。我々の今まで行ってきた空間分解をした分光観測のノウハウを元に、Yoon氏の学生とともにこのような星生成を終了した銀河と、銀河中心核の活動の相関に関する観測提案をすばる望遠鏡に提出した。本22年度は21年度中に解析に着手していたいくつかのポストスターバースト(E+A)銀河の空間構造についての解析を進めた。一つは研究協力者とともに進めた、相互作用銀河の中でポストスターバーストとスターバーストが同居する特異な銀河の観測と解析である。また、もう一つは銀河周辺の淡い構造に関する研究の一環として、我々の近傍にあるかみのけ座銀河団内で見つかった電離水素ガスの研究をまとめた。これらの成果は共同研究として論文化され査読付論文として出版された。アーカイブデータとしては、スローンデジタルスカイサーベイの第8リリース(DR8)も公開されたため、この解析に着手した。第7リリースと比べいくつかの点で大きく異なった値を出していたため、その十分な吟味を行って統計的解析を開始するまでには至らなかった。観測提案に関しては、かみのけ座銀河団の電離水素ガスを伴ったポストスターバースト銀河の観測提案は受理され、22年度末から23年度頭にかけて観測を行った。また韓国の研究者との共同研究として進めている、星生成の度合いがポストスターバースト銀河よりも弱い、星生成後銀河(RSF銀河)に関する共同研究について、一つの銀河に関して、ケック望遠鏡を用いて、空間分解をした分光観測を実施しデータを取得した。これら進展があった一方で、赤外線データの解析についてはバックグラウンドパターンを差し引く技法で難航しており、周辺構造の解析を進めるまでには至らなかった。本年度の実施計画に記載した「密集領域でのE+A銀河の性質について」は、昨年度観測を行ったかみのけ座銀河団の電離水素ガスを伴ったポストスターバースト銀河に関して、本年度その成果が論文として出版された。このような銀河の外にある電離水素ガスに関連して、我々の銀河系の近傍でも電離水素ガスが輝線を発しているため、その励起機構に関する調査を行なった。具体的には、過去バルマー輝線が検出されている領域の周辺について狭帯域の撮像観測提案を木曽観測所に対して行った。この提案は採択され、本年度観測時間を得て実際に観測を行うことができた。観測結果を解析した結果、我々の銀河系の周辺での電離水素ガスの形状について新たなる知見を得ることができた。この結果について学会報告と論文発表を行なった。また、E+A銀河と中間赤外から遠赤外にかけての超過との関連に関しての研究については、巨大データベースとの照合が必要となる。このような照合作業を高速かつ効率的に行うためのアルゴリズムの開発と実装を進め、学会報告と論文発表を行なった。「弱い輝線を含んだE+A

サンプルの解析」については、昨年度取得したケック望遠鏡でのデータについて韓国の研究者を中心として解析を進め、このような銀河の中心付近では活動銀河核からの放射が銀河円盤中のガスも電離し、広がった成分となってしいるという示唆が得られた。この結果に関し論文を査読誌に投稿し受理された。
機能的劣性遺伝子単離を目指した新規スクリーニング法の開発

哺乳類細胞の場合、劣性遺伝子を単離したい時、多くの遺伝子がdiploidで存在することが障害になる。このため、既にchicken chromosomeのcetromere,telomere周辺の遺伝子配列は決定されているので、相同組換えを利用してある特定のchromosome(chickenには5本存在する)の長腕、短腕を、特異的にdeletionすることが可能である。従って先ず、この方法を用いて部分的haploid DT40 B細胞を作成することを試みた。chicken常染色体は5本からなっており、その4番染色体と5番染色体は種々の遺伝子座位が詳細に決定されている。従ってこの染色体をモデルにcentromere,telomere近傍の遺伝子座位を組替え領域に用いて大きな遺伝子deletion targeting vectorを構築した。Targeting vectorをDT40細胞にtransfectionして、targettingが生じたかをSouthern blottingにより検定した。4番、5番とも短腕のdeletionは比較的容易に単離することができたが、いずれも長腕の場合は頻度は低かった。このことは、長腕の場合はdeletionする領域が長いため、又は、クロマチン等構造的に相同組換えを生じる酵素系がaccessしづらいためではないかと考えられる。
触圧感覚受容器官としてのモグラのアイマ-器官の神経解剖学・細胞化学的研究

ヒミズモグラは、昆虫やミミズの体表に吻の先端で触れてから摂食する。この吻の先端にEimer器官が密集しておりこれに三叉神経第2枝の眼窩下神経が感覚線維を多数送っている。このEimer器官の生体機能及びそれを構成する3種の神経終末の役割を解析するために超微細構造と酵素活性の局在の検索を行った。主な結果を示す。(Eimer器官の超微細構造)Eimer器官基底部のMarkel細胞の為足様突起は基底方向に伸び、微細線維構造が縦走する。またEimer器官の芯構造を縦走する神経線維において、有棘層と顆粒層細胞に突出する棚状終末に小胞が密集し、単純小胞の多くは直径が70-80nm、有芯小胞の多くは90-100nmであった。知覚終末における小胞の研究は未知の部分が多く、今後の研究課題となる。主な結果を示す。
ナノ電子プロープを用いた革新的3次元局所結晶構造解析法の開発とリラクサーへの応用

本年度は、まず、現有の精密結晶構造解析用エネルギーフィルター透過型電子顕微鏡JEM-2010FEFに、新たに高感度電子線用CMOSカメラを導入し、STEM-CBEDシステムを構築した。回折強度の角度分解能とデータ取得時間が従来に比べ大幅に向上し、3次元局所構造解析のためのデータ取得が可能なシステムを構築することができた。合わせて大容量STEM-CBEDデータ処理のためのプログラム開発を行った。また、3次元ナノ局所結晶構造解析プログラムの開発に取り組んだ。電子回折ではシュレーディンガー方程式を解く多重散乱計算が必須であり大きな計算時間を要する。これに加えて、STEM-CBED法により得られる大量のCBED図形の解析ではさらに多くの計算量が必要となる。このため、多層neural networkを利用した多重散乱計算の予測機の作成を試みた。これまでわれわれが開発してきた、収束電子回折図形の多重散乱計算コードMBFITを用いて教師データを多数作成し、多層neural networkによる機械学習を行って予測機を得て、良好な性能が得られることを示した。これにより収束電子回折図形の計算時間を大幅に短縮することに成功した。合わせてMBFITコードに試料深さ方向の局所構造変化を記述する多重散乱モデルの実装を進めている。さらに、不均一構造を持つリラクサーの局所構造解析の最初のステップとして、3次元リラクサーに比べて不規則構造のパラメーター数が少ない1軸性リラクサー物質のSTEM-CBED実験に着手した。また、リラクサー的誘電性を示す(Sr,Ba)2Nb2O7についてSTEM-CBED法を用いて局所構造を調べ、この物質が従来リラクサーで予想されるナノ局所構造を有しないことを明らかにした。まず、新たな3次元STEM-CBEDシステムの構築を行い、大幅な感度向上および取得時間短縮を実現した。また、3次元ナノ局所結晶構造解析ソフトウェアの開発において、最も重要な基盤となる、多層neural networkによる機械学習の多重散乱計算への適用を行い、予測機として良好な性能を示すことを示した。これらにより、これまでにない大量のデータ解析を必要とするSTEM-CBEDデータの定量解析が実現しつつある。さらに、リラクサーのSTEM-CBED実験に着手している。まず、前年度に構築した3次元STEM-CBEDシステムの最適化に継続して取り組み、大容量データ処理の効率化をはかる。3次元ナノ局所結晶構造解析ソフトウェアの開発として、畳み込みneural networkなど異なる構造を持つ多層ニューラルネットワーク利用の検討およびデータ解析用の周辺プログラムの整備を図る。また、新たな試みとして、多層neural networkの逆問題解法への適用に取り組む。これが実現すれば結晶構造解析における初期モデルが不要となり、モデルフリーの構造解析が可能となる。開発した実験システムおよび解析ソフトウェアを用いて、不均一構造を持つリラクサーのリラクサーの局所構造解析に取り組む。前年度に、不規則構造のパラメーター数が少ない一次元リラクサーの解析に着手しているが、本年度はより複雑なPb(MnNb)O3系のリラクサーの解析に取り組む。分極ナノ領域(Polar nano region: PNR)の検出および分布を調べる。さらに、電場印加によるリラクサーのナノ局所構造変化の解析に着手する。2軸傾斜電場印加試料ホルダーを導入し、電場印加可能なTEM試料作製を行う。電場印加前後でのナノ局所構造変化の解析を試みる。

さらに、リラクサーのSTEM-CBED実験に着手している。まず、前年度に構築した3次元STEM-CBEDシステムの最適化に継続して取り組み、大容量データ処理の効率化をはかる。3次元ナノ局所結晶構造解析ソフトウェアの開発として、畳み込みneural networkなど異なる構造を持つ多層ニューラルネットワーク利用の検討およびデータ解析用の周辺プログラムの整備を図る。また、新たな試みとして、多層neural networkの逆問題解法への適用に取り組む。これが実現すれば結晶構造解析における初期モデルが不要となり、モデルフリーの構造解析が可能となる。開発した実験システムおよび解析ソフトウェアを用いて、不均一構造を持つリラクサーのリラクサーの局所構造解析に取り組む。前年度に、不規則構造のパラメーター数が少ない一次元リラクサーの解析に着手しているが、本年度はより複雑なPb(MnNb)O3系のリラクサーの解析に取り組む。分極ナノ領域(Polar nano region: PNR)の検出および分布を調べる。さらに、電場印加によるリラクサーのナノ局所構造変化の解析に着手する。2軸傾斜電場印加試料ホルダーを導入し、電場印加可能なTEM試料作製を行う。電場印加前後でのナノ局所構造変化の解析を試みる。
新聞記事の要約のためのテンプレートの自動抽出に関する研究

従来から抄録や要約に関する様々な研究がおこなわれているが,これらの多くは,主に一つの記事(文書)の内容を要約することに重点を置いているため,新聞やニュースのような一つのイベントに対して複数の記事が存在するテキストに適用した場合,複数の記事によって表される情報(時間的なイベントの変化など)をうまく要約することができないという問題がある.そこで、ある話題の記事に対して重要と考えられる項目をあらかじめテンプレートとして用意しておき、それを用いて抽出した各記事のデータから要約を作り出すことが考えられる.このような考え方をもとにした要約処理の研究はなされつつあるが、現段階では,テンプレートの作成は話題ごとに人手によっておこなわれている.本研究では,新聞記事を対象とし,要約のためのテンプレートを,ある話題に関する記事集合から自動的に抽出することを目的とする.本研究で提案するテンプレートの自動抽出手法では,テンプレートの形式を、「動詞+格要素(その格に望ましい意味カテゴリ名を含む)」の意味的に類似した集合という形で表し,「話題で重要な表現=話題に固有な表現」という仮定のもとに,対象の話題の記事の出現頻度とランダムに集めたサンプル記事の出現頻度をもとに計算した重要度という値を用いてテンプレートを抽出する.本手法を、日本経済新聞の4つの話題(地震,交通事故,火災,記者会見)に適用し,作成したテンプレートを用いて実験をおこなった結果,話題で重要と考えられるテンプレートが抽出され,本テンプレートを,ある話題において重要でない記事を取り除くフィルタ的な利用が可能であることが確認した.従来から抄録や要約に関する様々な研究がおこなわれているが,これらの多くは,主に一つの記事(文書)の内容を要約することに重点を置いているため,新聞やニュースのような一つのイベントに対して複数の記事が存在するテキストに適用した場合,複数の記事によって表される情報(時間的なイベントの変化など)をうまく要約することができないという問題がある.そこで、ある話題の記事に対して重要と考えられる項目をあらかじめテンプレートとして用意しておき、それを用いて抽出した各記事のデータから要約を作り出すことが考えられる.このような考え方をもとにした要約処理の研究はなされつつあるが、現段階では,テンプレートの作成は話題ごとに人手によっておこなわれている.本研究では,新聞記事を対象とし,要約のためのテンプレートを,ある話題に関する記事集合から自動的に抽出することを目的とする.本研究で提案するテンプレートの自動抽出手法では,テンプレートの形式を、「動詞+格要素(その格に望ましい意味カテゴリ名を含む)」の意味的に類似した集合という形で表し,「話題で重要な表現=話題に固有な表現」という仮定のもとに,対象の話題の記事の出現頻度とランダムに集めたサンプル記事の出現頻度をもとに計算した重要度という値を用いてテンプレートを抽出する.本手法を、日本経済新聞の4つの話題(地震,交通事故,火災,記者会見)に適用し,作成したテンプレートを用いて実験をおこなった結果,話題で重要と考えられるテンプレートが抽出され,本テンプレートを,ある話題において重要でない記事を取り除くフィルタ的な利用が可能であることが確認した.
潰瘍性大腸炎における発癌マーカーとしてのACFとその遺伝子解析

1.目的本研究では、多数の潰瘍性大腸炎(UC)患者を対象に拡大内視鏡を用いてaberrant crypt foci(ACF)を観察し、UC患者におけるACFの発癌におけるバイオマーカーとしての有用性を解析するとともに、その遺伝子解析を行った。2.方法と結果(1)UC患者におけるACFの解析:20人のUC患者を対象に、既報に従い拡大内視鏡を用いて下部直腸領域のACFの観察を行った。その結果、健常人のACF数は平均1.2±1.3個であったのに対し、UC患者では8.7±3.7個と増加していた。(2)UC患者のACF数と各種背景因子との関係UC患者のdysplasiaまたは癌を有する者と有しない者について、ACF数、性差、年齢、発症年齢、罹病期間、罹患部位の相関性について検討した。その結果、ACF数と罹病期間との関係を検討したところ、罹病期間が長くなるほどACF数が増加し、両者の間には正の相関性が認められた。特に、dysplasiaや癌を合併した症例ではACF数が多かった。ACF数と性差、年齢、発症年齢、罹患部位との間にはいずれも相関性は認められなかった。UC患者のACF及びdysplasiaにおけるAPC及びβ-cateninの発現を免疫蛍光二重染色で解析したところ、いずれも異常を認められなかった。UC患者のACF及びdysplasiaにおけるK-ras変異の有無をTwo-step PCR RFLP法により検討したところ、前者ではわずか13%に変異を認めたが後者では変異を認めなかった。p53の異常発現はdysplasiaにおいて75%に認めたが、ACFでは認めなかった。(1)p16遺伝子のメチル化p16のメチル化の有無をmethylation specific PCR法にて検討した。UC患者のACFとdysplasiaでは、いずれも高率にp16のメチル化を認めた。(2)UC患者におけるACFのmicroarrayを用いた解析Affimetrix社のDNA microarrayを用いて解析し、現在clusteringを行っている。3.結論UC患者におけるACFの観察は、UC合併癌のサーベイランスに有用であることが示唆された。1.目的本研究では、多数の潰瘍性大腸炎(UC)患者を対象にaberrant crypt foci(ACF)を観察し、UC患者の発癌におけるバイオマーカーとしての有用性を解析するとともに、その遺伝子解析を行った。2.方法と結果(1)UC患者におけるACFの解析16人の緩解期のUC患者を対象に、既報に従い拡大内視鏡を用いてACFの陽性率、数を検討した。その結果、UC患者のACFの陽性率は94%で、健常人の28%よりも有意に高かった。UC患者のACF数は平均7.5個で健常人(1.5個)より有意に多く、特に、dysplasiaや癌を合併した症例では多かった。(2)UC患者のACF数と背景因子との関係ACF数と罹病期間との罹病期間との間には有意な相関性が認められた。罹患部位、性差、初発年齢とACF数との間には相関性は認められなかった。

(3)UC患者におけるACFの病理組織学的解析非UCのACFに比べてリンパ球浸潤が多く、各腺管は大小不揃いであり、各細胞の核は腫大し、角張っており、クロマチンの増生が認められた。2-step-PCR法によりK-ras変異を検討したところ、UC患者のACFの陽性率はわずか20%であり、非UC患者のACF(78%)より有意に低かった。APCのC末端に対するポリクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行い、APC変異を検討したところ、いずれも変異は認められず、非UCのACFと同様であった。ACFにおけるp53の免疫組織染色を行ったところ、p53の蓄積は認められなかった。3.結論UC患者のACFを観察することは、UC合併癌のサーベイランスに有用である可能性が示唆された。UCのACFではK-ras変異の陽性率が低く、APC変異、p53の蓄積も認められず、今後マイクロアレイを用いた遺伝子解析を行う予定である。1.目的本研究では、多数の潰瘍性大腸炎(UC)患者を対象にaberrant crypt foci(ACF)を観察し、UC患者の発癌におけるバイオマーカーとしての有用性を解析するとともに、その遺伝子解析を行った。2.方法と結果(1)UC患者におけるACFの解析20人のUC患者を対象に、既報に従い拡大内視鏡を用いて下部直腸領域のACFの視察を行った。その結果、健常人のACF数は平均1.5個であったのに対し、dysplasiaを伴わないUCではACF様病変数は平均6.6個と多く、dysplasiaを伴うUCでは平均13.6個とさらに増加していた。(2)多変量解析によるUC発癌の危険因子の解析UC患者のdysplasiaまたは癌を有する者と有しない者について、ACF数、性差、年齢、発症年齢、罹病期間、罹患部位の多変量解析を行った。その結果、ACF数(5個以上)と罹病期間が有意な危険因子であることが示された。UC患者のACFにおけるAPC変異の有無をtruncation assayにより検討したところ、いずれもtruncated bandは認められなかった。Two-step PCR RFLP法により、K-ras変異の有無を検討したところ、UC患者のACFではわずか15%に変異が認められた。p53遺伝子のExon6,7,8,9についてSSCP法により変異の有無を検討したが、いずれも変異は否められなかった。(4)p16遺伝子のメチル化p16のメチル化の有無をmethylation specific PCR法にて検討した。UC患者のACFとdysplasiaでは、いずれも高率にp16のメチル化を認めた。(5)UC患者におけるACFのmicroarrayを用いた解析Affimetrix社のDNA microarrayを用いて解析し、現在clusteringを行っている。3.結論UC患者におけるACFの観察は、UC合併癌のサーベイランスに有用であることが示唆された。
血管内皮増殖抑制遺伝子導入型再狭窄予防ステントの開発

従来endothelial progenitor cell(以下EPCs)はヒト末梢血から単離されていたが、大量の血液が必要(200-300mL)で継続的な採取が困難、細胞表面抗原での分離が必要で手順が煩雑、増殖能が乏しいなどの問題点があり、多彩な動物実験への応用に限界があった。本研究ではそれらの問題点を以下の方法で克服した、すなわち(1)末梢血ではなく骨髄細胞より培養(2)表面抗原での分離なしに骨髄細胞をEPCsのみが増殖するような特殊な条件下で培養(3)全身麻酔下にrat大腿骨より骨髄を摘出する方法を考案。以上の3点によって得られた利点としては、(1)骨髄細胞を利用することで必要量が減少しかつ増殖が容易となったためratやmouseのEPCsを用いての実験が可能となった(2)手順が簡略化されまた表面抗原で選別をかけたものよりも増殖能が高かった(3)従来はヒト末梢血由来EPCsを利用して動物実験を行なっていたため免疫抑制剤の使用が必須であったが、本法を用いex vivoでのEPCs培養を可能としたため、より臨床に近い方法での移植、すなわち自家移植への道を開くことができた。(1)は他の論文でも同様の方法が提示されていたが、(2)に関して従来は機能的評価(アセチル化LDL取込み能およびレクチン染色)、免疫染色(von Willebrand factor)のみがなされていたが、本研究で初めてimmunoblotting法(Tie-2,Flk-1,vWFなど)を用いて蛋白レベルでの緻密な評価を行なった。また(3)は同様の方法を用いての論文は報告されておらず、本研究の独自の方法である。現在行なっていることは、(1)ratのcarotid balloon injury modelを一定の精度で作成できるようにtrainingおよび手技を検討、(2)同方法で得ることができたEPCsの投与経路(経動脈、経静脈、局所投与)での集積率の差を評価、の2つである。その後、動物での再狭窄予防効果を検討する。本研究はステント留置術後の血管内皮の過増殖による血管の再狭窄を防ぐ手段を開発し、かつその臨床応用を目指すものである。実際の方法としては、まず最近同定された成人末梢血中に存在する内皮細胞前駆細胞の培養方法を確立することから始める。具体的にはヒト成人末梢血から単核球細胞を単離しVEGFやSCFを含む種々の内皮細胞培地にて培養し、蛍光免疫染色法やPCRを用いて血管内皮細胞であることを確認する。また培地の添加物の他fibronectinやlamininでのcoatingなど様々な条件下で培養を行い、最適条件を模索、細胞性質の経時的変化を検討する。次に生体におけるこれら細胞の動態を検索する。具体的にはラット頸動脈のバルーン拡張による傷害モデルを作成し、Cys Aで免疫抑制した状態で蛍光染色またはadenovirusにてLacZを発現させたこれら細胞を移植し傷害部位への生着率や再狭窄抑制効果について探る。最終的にはこれら細胞でコートしたステントを作成し、成人の腎動脈に留置し、その血管の状況((1)血管内皮の厚さ(2)血管内皮における炎症の程度(3)生着血管内皮細胞の由来)を検討する。以上が概略ではあるが、血管内皮前駆細胞自体を遺伝的に修飾してin vivoに投与する方法も考えられる。具体的にはVEGFなどを発現させた同細胞を投与し細胞集積効率の差や生着細胞の内訳を検討することである。現時点のデータではfibronectin coating dishでのVEGFを含む培地での培養が最善であり、SCFは増殖程度にそれほど影響を与えなかった。また蛍光免疫染色法で明確なUEA-1、acLDLによる染色を認めた。ヒト末梢血およびrat/mouse骨髄細胞より内皮前駆細胞(endothelial progenitor cells以下EPC)を単離した。lymphocytesを豊富に含む分画をFicoll-Paque Plusを用いてbuffy coatとして取り出しVEGFを含む特定培地を使用しfibronectinで被覆したculturedish上で約10日間培養する事でEPCを得た。DiI標識acLDL取込みによる機能的評価およびFITC標識lectin結合にて同細胞が内皮細胞の性質を持つ事を確認した。現在実験中であるが今後vWF, CD34などでの免疫組織学的染色を行う事、およびWestern blottingにてFlk-1およびTie-2の発現を確認する事を予定している。rat頸動脈内皮損傷モデルratの頸動脈内皮損傷モデルを作成した。全身麻酔下にratの頸動脈を露出、遮断した状態で外頸動脈より逆行性にballoon catheterを挿入、balloonをinflationしたまま総頸動脈内を計三回等距離だけ移動し均等に頸動脈血管内皮を損傷した。損傷したratに対してEPCを静脈・動脈・腹腔注射の各経路にて投与した。今後損傷頸動脈の経時的変化の組織学的評価、各投与方法でのEPCの定着程度およびそれに伴う組織学的変化の評価、定着した場合の頸動脈の機能的評価などを行う予定である。これらにより再狭窄予防効果があればステントまたはステントグラフトに内皮前駆細胞を付着させて実験を進める。

本研究ではそれらの問題点を以下の方法で克服した、すなわち(1)末梢血ではなく骨髄細胞より培養(2)表面抗原での分離なしに骨髄細胞をEPCsのみが増殖するような特殊な条件下で培養(3)全身麻酔下にrat大腿骨より骨髄を摘出する方法を考案。以上の3点によって得られた利点としては、(1)骨髄細胞を利用することで必要量が減少しかつ増殖が容易となったためratやmouseのEPCsを用いての実験が可能となった(2)手順が簡略化されまた表面抗原で選別をかけたものよりも増殖能が高かった(3)従来はヒト末梢血由来EPCsを利用して動物実験を行なっていたため免疫抑制剤の使用が必須であったが、本法を用いex vivoでのEPCs培養を可能としたため、より臨床に近い方法での移植、すなわち自家移植への道を開くことができた。(1)は他の論文でも同様の方法が提示されていたが、(2)に関して従来は機能的評価(アセチル化LDL取込み能およびレクチン染色)、免疫染色(von Willebrand factor)のみがなされていたが、本研究で初めてimmunoblotting法(Tie-2,Flk-1,vWFなど)を用いて蛋白レベルでの緻密な評価を行なった。また(3)は同様の方法を用いての論文は報告されておらず、本研究の独自の方法である。現在行なっていることは、(1)ratのcarotid balloon injury modelを一定の精度で作成できるようにtrainingおよび手技を検討、(2)同方法で得ることができたEPCsの投与経路(経動脈、経静脈、局所投与)での集積率の差を評価、の2つである。その後、動物での再狭窄予防効果を検討する。
抑制と抗抑制によるエピゲノム動態制御機構の解明

(i)「新奇DNA脱メチル化の分子機構理解」トランスポゾンVANDAL21のコードするタンパク質の一つVANC21は、配列特異的なDNAメチル化喪失と転写脱抑制を引き起こす(Fu et al 2013 EMBO J)。ChIP-seq(クロマチン免疫沈降に続く塩基配列決定)によって、このタンパク質のゲノム中での分布を調べることで、その標的配列を見出した(Hosaka et al 2018 Nat Commun)。また、この標的配列がタンデムリピート形成することで同調して速く進化することを示した。現在は、この結合動態を再構成系で調べるとともに、VANCと相互作用する宿主タンパク質をいくつか同定し、その機能解析を進めている。また、VANCによる抗抑制に関与する宿主因子を知るための順遺伝学的解析を進めている。(ii)「ヘテロクロマチン制御様式と個体発生への影響の理解」転写される遺伝子から抑制修飾を除く活性を持つ抗抑制タンパク質IBM1の変異による発生異常をサプレスする変異としてH3K4me1の脱メチル化酵素遺伝子であるLDL2を同定した。また、これらの変異体を用いたこれまでの結果から、遺伝子内のH3K4me1がクロマチン動態に重要であることがわかった(Inagaki et al 2017 EMBO J)。また、LDL2のパラログの中には、異なる標的特異性と表現型を持つものがあり、これらの変異体のエピゲノム解析と遺伝学的解析によってその生物学意義を明らかにしつつある(Ishihara et al 2019 Nat Commun、および未発表結果)。また、ibm1変異体における発生異常が、免疫応答経路を介していることを見出しており、すでに候補の鍵因子を同定している(未発表)。この経路の因子の変異体のエピゲノム解析結果などを含め、その全貌を明らかにしたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。「ヘテロクロマチン制御様式と発生への影響の理解」クロマチンリモデリング因子DDM1の変異下では、ヘテロクロマチンにおいてDNAメチル化が低下する、一方、少数の配列で逆にDNAメチル化が上昇し、これがいくつかの発生異常を誘発することを報告している(EMBO J 2007, Plant J 2012)。ゲノムワイドのDNAメチル化解析を行い、このようなDNAメチル化の誘発される配列を数百同定した。これらの配列は、DNA脱メチル化酵素遺伝子IBM1の標的とは異なるが、下流にヘテロクロマチン配列を持つ傾向があった。興味深いことに、野生型の背景でもddm1変異由来の染色体を持つ個体では、DNAメチル化の上昇がトランスに誘発され、ゲノムワイドでヘテロクロマチン量を補正する負のフィードバップ機構の存在が示唆された(PLOS Genetics, in press)。「新奇DNA脱メチル化の分子機構理解」DNA脱メチル化効果を持つタンパク質VANCは、末端の逆位反復配列の崩れたDNAからトランスポゾンの解析を進める中で見いだした新奇因子である(Fu et al 2013 EMBO J)。VANCを発現させると、一群のトランスポゾンで全長にわたる脱メチル化が誘発される。標的トランスポゾンに対してVANCは大きな効果を持つが、興味深いことに、この効果は特異的で、配列の類似した一群のトランスポゾンのみで観察される。一方、VANCと構造の似た因子は末端逆位配列の崩れたトランスポゾンに広く分布する。そこで、VANCでは影響を受けないトランスポゾンの持つ類似因子4種類をシロイヌナズナで発現させた。その結果、そのうちの1つで特異的転写脱抑制が観察された。これらの形質転換系統すべてでゲノムワイドのDNAメチル化解析とRNA解析を準備している。「ヘテロクロマチン制御様式と発生への影響の理解」多くの真核生物に保存された抑制クロマチンの目印であるヒストンH3の第9リジンのメチル化(H3K9me)が異所的に蓄積するシロイヌナズナの変異体ibm1では、さまざまな発生異常が誘発される。H3K9meの下流で働く因子を知るため、H3K9meはかわらず発生異常をサプレスする変異体を選抜し、H3K4脱メチル化酵素遺伝子を同定した。ibm1変異体でH3K9meが上昇し発現が低下する遺伝子の多くでH3K4meが低下すること、またこのサプレッサー変異では、ibm1による発現やH3K4meへの影響がなくなることから、H3K9meがH3K4meの脱メチル化を介して発現や発生の異常を引き起こしていることがわかった(Inagaki et al論文投稿中)。一方、VANCと構造の似た因子は末端逆位配列の崩れたトランスポゾンにに広く分布する。

また、ゲノムワイドのDNAメチル化解析の結果、これをコードするトランスポゾンに特異的な低メチル化誘発された。それぞれのトランスポゾンのコードする抗抑制因子が、それぞれ異なる配列に対して特異的な低メチル化と転写脱抑制を行うことが明らかとなった(Hosaka et al論文投稿準備中)。上述のように研究は計画どおりに進展している。これに加えてさらに、ibm1による発生異常をサプレスする変異から同定された遺伝子はジーンファミリーを作っており、そのそれぞれのメンバーによるヒストン修飾の変化を調べたところ、予想外の特異性を持つ因子が複数みつかった。この予想外の展開は、個体発生のみならず、環境応答におけるヒストン修飾の機能とも関連しており、今後、さらに研究を発展させられると期待している。ヒストンH3の第9リジンのメチル化(H3K9me)は多くの真核生物で抑制クロマチンの目印として働き、トランスポゾンなどの反復配列を抑制することが知られている。不思議なことにH3K9meは、プロモーターだけでなく、転写が抑制された配列の内部にも分布する。シロイヌナズナの変異体ibm1 (increase in BONSAI methylation 1)では、遺伝子内部にH3K9meが蓄積するとともに、発生異常が誘発される。この発生異常をサプレスする変異体を調べることで、遺伝子内部のクロマチン動態の意義にアプローチした。まず、このサプレッサー変異の原因遺伝子は、ヒストンH3リジン4の脱メチル化酵素をコードするLDL2だった。この変異体およびH3K9メチル化酵素の変異体を用いた遺伝解析とエピゲノム解析によって、遺伝子内部のH3K9meは、遺伝子内部のH3K4me1(モノメチル化)の脱メチル化を介してトランスポゾンの転写抑制を行っていることを見出した(Inagaki et al 2017 EMBO J)。H3K4me1は動物ではエンハンサーに特徴的な修飾として知られているが、遺伝子内H3K4me1は、ほとんど注目されていない。本研究は、この修飾が多くのトランスポゾンの抑制を仲介することを示した。また、この発生異常誘発の鍵となっている遺伝子を見出し、これが病原体応答を仲介する経路であることを見出した(論文未発表)。これらの解析とも組み合わせることで、遺伝子内修飾の生物学的意味についての理解を今後大きく進められると考える。また、トランスポゾンVANDAL21のコードするタンパク質の一つVANC21は、VANDAL21コピーに特異的なDNAメチル化喪失と転写脱抑制を引き起こす(図)(Fu et al 2013 EMBO J)。この機構の理解に向けた結果を得た。ヘテロクロマチン制御様式と個体発生への影響の理解を目指し以下の研究を行った。不思議なことにH3K9meは、プロモーターだけでなく転写が抑制された配列の内部にも分布する。シロイヌナズナの変異体
医療用途を指向したレーザーポインタサイズのイオン銃開発および細胞付着・活性評価

従来のイオン注入装置は大型・高額であり、また高真空中でのイオン注入が前提とされ、これらがイオン注入法の応用範囲を限定していると考えられる。本研究では将来の医療応用を念頭に、イオン銃をレーザーポインタサイズまで小型化し、さらに大気圧下でイオン注入を行い、細胞接着性や活性評価を目的としている。昨年度までに先鋭化した各種イオン伝導性ガラスに電界印加することで、室温付近の大気圧下でH+, Ag+およびCu+イオン放出を確認した。本年度は研究タイトルであるレーザーポインタサイズの試作機を作製して、イオン放出を確認した。ガラス板にAg+イオンを大気圧下で照射後に黄色ブドウ球菌(菌株名: S.aureus)に対する殺菌効果を調べた(未処理基板とAg+イオン照射基板それぞれ4枚ずつ用意して試験を実施)。24時間後の生菌数が未処理基板(生菌数平均460,標準偏差112)と比べてAg+イオン照射した基板の生菌数平均は315(標準偏差57)に減少していた。同様に市販のハイドロキシアパタイト焼結体にAg+イオンを照射後のミュータンス菌(虫歯の関連菌)の生菌数を調べたところ、Ag+イオン照射による生菌数の減少傾向を確認した。またこれまでAg+イオン放出時間は数分程度と短い問題点があったが、ガラス先端を加温することで15分程度まで改善した。現在のところ絶縁性基板に対するイオン照射量のその場計測が行えていないため、今後は正確なイオン照射量と殺菌効果に関する定量評価を実施する。また大気圧でのイオン照射であり、空気中分子との反応性などの評価などを今後進める予定である。材料中にイオンが注入されると、電気特性や化学的性質が著しく変化し、また近年では生細胞へのイオン注入による細胞の活化なども報告されている。一般にイオン注入は大型の加速器などを必要とし、また真空下で実施されることから水分を多く含む細胞・組織は真空下で失活する問題があった。電界は先鋭化先端に集中することから、電子銃と同様にイオン伝導性の高い電解質を先鋭化して電界印加することで、目的イオンの電界放出が可能であると着想した。以前の研究において、H+伝導性を示すガラスを溶融法で作製・先鋭化してエミッタとして利用することで、当該ガラスのTg点(460°C)以上の温度かつ高真空中でのH+放出を実証した。本研究では室温の大気圧でH+注入可能な超小型イオン銃を作製して、生細胞等へのH+注入効果を調べることを目的とする。本年度は室温付近で高いH+伝導性を示す先鋭化ガラスをゾル-ゲル法を用いて作製した。先端の曲率半径は60μm程度と見積もられ、平滑面と比較して電界強度は160倍程向上したと見積もられた。ガラスロッドの後端部にPt/C電極を燃料電池を参考に作製し、またPt/C電極近傍に水素ガス(4%H2-96%Ar)を供給して、引抜電極とPt/C電極間に高電界を印加した。数100 V/cm程度からH+放出に伴うイオン電流が観測され、また一定電圧で保持したところ1時間以上安定にイオン電流を観測した。Pt/C電極場でH2→2H+ + 2e-の反応が生じ、連続的にH+がガラスに供給されていることを実証した。またポリアニリンに対するイオン照射前後の構造変化をラマン分光法より調べ、H+付加反応が生じていることを確認した。ラマンマッピングの解析より、被照射範囲は1mm2程度と見積もられた。またヨウ化銀系ガラスを用いてAg+イオン放出を同様に確認した。本研究における実証すべき重要な技術要素は、室温・大気圧下での局所H+注入技術の確立である。そのためには室温付近で高いプロトン伝導性を示す材料を先鋭化して、電界放出しやすい構造を作製する必要がある。初年度にこの点について電解質の選定と形状制御を精力的に進めた結果、当初計画通りに室温・大気圧で1 mm2の範囲にH+注入可能であることを実証した。ただし当該ガラスエミッターは水を吸着することで室温付近でも高いプロトン伝導性を発現することから、放出イオンはH+:H2Oと水分子を伴った形であると予想され、実際にどのような質量のイオンが放出されているか調べることは今後重要になる。材料中にイオンが注入されると物理的、化学的及び電気的性質が著しく変化し、また近年では癌細胞の死滅や、逆に必要細胞の接着数・生存数の増加など、イオン注入技術が細胞工学や医療分野においても非常に注目されている。しかし従来のイオン注入装置は大型・高額であり、また高真空中でのイオン注入が前提とされ、これらがイオン注入法の応用範囲を限定していると考えられる。昨年までに室温付近で高いプロトン伝導性を示す先鋭化ガラスをゾル-ゲル法で作製し、また全長10 cm程度のイオン銃に組み込んで大気圧下でのH+放出を明らかにした。本年度は超イオン伝導性ガラスとして知られるヨウ化銀およびヨウ化銅系ガラスを同様に先鋭化して電界放出を試みたところ、ターゲット基板にそれぞれAg, Cuナノ粒子析出を確認した。イオン電流計測時にピコアンメーターからターゲットに供給される電子によってCu+, Ag+イオンが還元したと考えられる。

ガラス基板にAg+イオンを照射して細胞(HeLa)接着数を評価したところ、24時間後に30%程度、また48時間の細胞数が未処理のものと比較して180%増大した。現在のところ表面電荷(ゼータ電位)に大きな変化などは見られず、接着細胞数とイオン照射との関係をより詳細に調べる必要がある。また一方で先鋭化の程度によって同じ組成のガラスでも著しく放出されるイオン電流値が変化することも明らかとなり、先鋭化先端加工の再現性も重要な課題である。10-5 Paの真空中でリン酸銀ガラスからのAg+イオン放出では、イオン電流と電圧の関係は電子銃からの熱電子放出と同じショットキーモデルで表され、一方、ヨウ化物ガラスを用いた大気圧下でのイオン放出は空間電荷限界電流モデルで表されるなど、真空度やガラス組成によってイオン放出メカニズムも異なることが明らかとなった。また計画通りに細胞を利用した実験を実施して、細胞付着数の増加を確認した。近年Ag+イオンによる同様の細胞数増加効果も報告されており、イオン照射と細胞活性の関係についてさらに詳細を調べる。従来のイオン注入装置は大型・高額であり、また高真空中でのイオン注入が前提とされ、これらがイオン注入法の応用範囲を限定していると考えられる。本研究では将来の医療応用を念頭に、イオン銃をレーザーポインタサイズまで小型化し、さらに大気圧下でイオン注入を行い、細胞接着性や活性評価を目的としている。昨年度までに先鋭化した各種イオン伝導性ガラスに電界印加することで、室温付近の大気圧下でH+, Ag+およびCu+イオン放出を確認した。本年度は研究タイトルであるレーザーポインタサイズの試作機を作製して、イオン放出を確認した。ガラス板にAg+イオンを大気圧下で照射後に黄色ブドウ球菌(菌株名: S.aureus)に対する殺菌効果を調べた(未処理基板とAg+イオン照射基板それぞれ4枚ずつ用意して試験を実施)。24時間後の生菌数が未処理基板(生菌数平均460,標準偏差112)と比べてAg+イオン照射した基板の生菌数平均は315(標準偏差57)に減少していた。同様に市販のハイドロキシアパタイト焼結体にAg+イオンを照射後のミュータンス菌(虫歯の関連菌)の生菌数を調べたところ、Ag+イオン照射による生菌数の減少傾向を確認した。またこれまでAg+イオン放出時間は数分程度と短い問題点があったが、ガラス先端を加温することで15分程度まで改善した。現在のところ絶縁性基板に対するイオン照射量のその場計測が行えていないため、今後は正確なイオン照射量と殺菌効果に関する定量評価を実施する。また大気圧でのイオン照射であり、空気中分子との反応性などの評価などを今後進める予定である。共同研究者と生体材料に対するH+照射と細胞接着性の関係、および細胞やタンパク質などへの直接H+注入の効果を検討する。また当初はH+イオンのみを扱う計画であったが、Ag+イオンも同様に放出され、Ag+イオンについては抗菌性に注目してAg+イオン注入効果についても調べる予定である。室温・大気圧での局所H+注入技術として幅広い応用が期待される。Ag+イオン照射の場合には、照射量をさらに増やすことで抗菌性の発現も期待される。各種イオンについて、照射量のより正確な定量化と細胞接着数(細胞生存数)の変化についてより詳細を明らかにする。計画どおり細胞およびタンパク質などへの直接イオン注入も分担者と共同で実施する。
多様体上の諸構造と不変量

多様体の古典的不変量であるオイラー・ポアンカレ標数に関するホップ予想は、リーマン多様体の曲率とオイラー・ポアンカレ標数との関係を述べたものであるが、これに関しコンパクト局所対称空間の場合に、第1種と第2種の曲率作用素のトレースとスカラー曲率の間にある種の不等式が成り立てばオイラーポアンカレ標数が正になることが証明された。また特性類に重要な調和形式に関して、E^5の中の向き付け可能な完備極小超曲面が安定ならば、L^2調和P形式(0【less than or equal】P【less than or equal】4)は0となることが示された。これはBernstein予想に関するds Carmo-Pengの2次元での結果の4次元版である。Reictemeister torsionは3次元多様体の重要な不変量であるが、多くの具体的多様体に対して計算された。又色々な不変量を導くFloerホモロジーに使われるLagrange部分多様体の新しい例が非自明バンドルの接続のmoduliを用いて構成されたが、その応用は今後の課題である。3次元多様体の葉層構造の不変量として最初に発見されたGodbillon-Vey不変量が位相不変かという問題は未解決であるが、C^1不変であるというRalyの結果が高次の不変量にも拡張された。又C^<1+2>,P.L,葉層の場合に種々に拡張されたdiscreteGodbillon-Vey不変量を計算するためのsurgery公式も作られた。2次元曲面上のS^1foloatedバンドルの存在の条件は曲面のオイラー数とバンドルのオイラー特性類に関するMilnor-Woodの不等式で与えられるが、低空間を3次元多様体にした場合が考察され、一般的には、微分可能性が影響することが示され、微妙な問題であることがわかった。