hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Msxlによる骨格筋の脱分化と幹細胞化の分子機構の解明

私たちは,成体マウスの骨格筋にホメオボックス遺伝子Msxlを形質導入すると,筋線維に脱分化がもたらされ多数の単核細胞が生ずることを明らかにしている.単離した脱分化細胞は幹細胞マーカーのSca-1やCD34を発現しており,脂肪細胞や骨芽細胞に分化転換した.そこで本研究では,Msxlがどのような機構で脱分化と多能性の間葉系幹細胞状態を誘導するかを明らかにすることを目的とした.マウス骨格筋細胞C2C12の最終分化筋管細胞にMsxlを発現させると,核にBrdUの取り込みがみられ,S期に進行していることが示された.したがってMsxlを発現させた筋管細胞は細胞周期を回ることにより脱分化をすると考えられる.またTet-Offの系でMsxlを発現できるC2C12筋芽細胞株を樹立した.Msxlを発現させた後にその発現を遮断した細胞では,分化の多能性を獲得しており,脂肪細胞や骨芽細胞に容易に分化した.さらにRel(NF-kBの一つ)を発現させた細胞では,Relが核内に存在する場合にのみMsxlの発現が誘導された.したがってMsxlはRelの下流で発現が誘導されることが示された.SV40large T抗原の発現誘導により脱分化が誘導できる骨格筋細胞株C2SVTts11(C2SVT)において,large Tを発現させた筋芽細胞や筋管細胞では,複数の幹細胞マーカーおよびES細胞マーカーの発現量が増大していた.これらのうち少なくともCD34とNanogについては,発現量の増大は転写活性化を介してもたらされた.またlarge Tを発現させた後にその発現を遮断した細胞では,脂肪細胞や骨芽細胞への分化がみられた.以上のことから,large Tによる脱分化細胞も,Msxlによる脱分化細胞と同様に多能性の間葉系幹細胞状態になっており,分化の多能性を獲得していると考えられる.C2C12筋芽細胞や10T1/2細胞にM-Rasを過剰発現させると,骨芽細胞分化が誘導・促進され,Sca-1とCD34の発現が顕著に誘導された.またM-RasのRNAiにより,骨芽細胞分化が阻害された.したがってMsxlはM-Rasを介してSca-1やCD34を発現し,間葉系幹細胞状態を誘導する可能性が考えられる.さらにこれらの間葉系幹細胞はM-Rasの恒常的活性化により骨芽細胞に分化すると考えられる.最終分化をした細胞は再び分裂することはないと考えられていた.しかし私たちは,最終分化をして細胞融合により多核になったマウス培養骨格筋筋管細胞にSV40 large T抗原を発現させると,脱分化をして細胞分裂が起こることを明らかにして,それまでの概念を覆した.私たちはさらに,成体マウス骨格筋にAAVベクターを用いてホメオボックス遺伝子Msx1を発現させた場合にも,成熟筋細胞(筋線維)が脱分化して単核細胞が多数生ずることを示している.これらの単核細胞はMsx1の発現が低下した後に,再び分化して筋再生をした.これらの単核細胞を単離して骨格筋細胞の分化条件下で培養すると,再び分化して筋管細胞を形成した.一方,脂肪細胞や骨細胞の分化条件下で培養すると,それぞれ脂肪細胞と骨細胞に分化転換した.そこでMsx1による脱分化細胞が多能性幹細胞の状態になっている可能性を検討し,さらにその分子機構を解析した.脱分化細胞の集団では,骨格筋の幹細胞の一種である衛星細胞の集団と比較して,幹細胞マーカーのSca-1とCD34の発現量が顕著に上昇していることがフローサイトメトリーにより示された.これらのことから,脱分化細胞は衛星細胞とは異なる分化多能性をもつ幹細胞の状態になっている可能性が示された.さらにC2C12細胞にMsx1を発現させた場合にも,Sca-1の発現が上昇した.したがってMsx1がSca-1の発現を誘導していると考えられる.Msx1の発現はBMP4や複数のFGF(FGF2,4,8)により誘導されることが知られている.またニワトリ肢芽ではFGFによるMsx1の発現誘導は転写因子のNF-κB(Rel)を介してもたらされることが示されている.C2C12細胞にRelを過剰発現させると,核にRelが局在している細胞では内在性のMsx1の発現が検出された.この結果から,マウス骨格筋細胞においてもRelがMsx1の転写を誘導することによりその発現を引き起こしていると考えられる.したがって筋管細胞や筋線維においてRelを活性化するシグナルが生ずれば,脱分化が起こる可能性が考えられる.私たちは,成体マウスの骨格筋にホメオボックス遺伝子Msxlを形質導入すると,筋線維に脱分化がもたらされ多数の単核細胞が生ずることを明らかにしている.単離した脱分化細胞は幹細胞マーカーのSca-1やCD34を発現しており,脂肪細胞や骨芽細胞に分化転換した.そこで本研究では,Msxlがどのような機構で脱分化と多能性の間葉系幹細胞状態を誘導するかを明らかにすることを目的とした.マウス骨格筋細胞C2C12の最終分化筋管細胞にMsxlを発現させると,核にBrdUの取り込みがみられ,S期に進行していることが示された.

したがってMsxlを発現させた筋管細胞は細胞周期を回ることにより脱分化をすると考えられる.またTet-Offの系でMsxlを発現できるC2C12筋芽細胞株を樹立した.Msxlを発現させた後にその発現を遮断した細胞では,分化の多能性を獲得しており,脂肪細胞や骨芽細胞に容易に分化した.さらにRel(NF-kBの一つ)を発現させた細胞では,Relが核内に存在する場合にのみMsxlの発現が誘導された.したがってMsxlはRelの下流で発現が誘導されることが示された.SV40large T抗原の発現誘導により脱分化が誘導できる骨格筋細胞株C2SVTts11(C2SVT)において,large Tを発現させた筋芽細胞や筋管細胞では,複数の幹細胞マーカーおよびES細胞マーカーの発現量が増大していた.これらのうち少なくともCD34とNanogについては,発現量の増大は転写活性化を介してもたらされた.またlarge Tを発現させた後にその発現を遮断した細胞では,脂肪細胞や骨芽細胞への分化がみられた.以上のことから,large Tによる脱分化細胞も,Msxlによる脱分化細胞と同様に多能性の間葉系幹細胞状態になっており,分化の多能性を獲得していると考えられる.C2C12筋芽細胞や10T1/2細胞にM-Rasを過剰発現させると,骨芽細胞分化が誘導・促進され,Sca-1とCD34の発現が顕著に誘導された.またM-RasのRNAiにより,骨芽細胞分化が阻害された.したがってMsxlはM-Rasを介してSca-1やCD34を発現し,間葉系幹細胞状態を誘導する可能性が考えられる.さらにこれらの間葉系幹細胞はM-Rasの恒常的活性化により骨芽細胞に分化すると考えられる.
コンピュータの導入と科学的方法論の変化に関する歴史的・哲学的考察

本研究では、コンピュータの導入によって科学的方法に変化のみられた具体的な事例に関する歴史研究から、哲学的考察に進める手順をとった。まず、1940年代に行われていたパンチカード式計算機の天文学分野での科学計算への応用、また、医学分野におけるEBMの普及の課程、全国共同利用機関としての大型計算機センターで行われた初期の科学計算などを取り上げた。このうち、初期の科学計算に関してはウェブサイトにデータを公開した本研究では、コンピュータの導入によって科学的方法に変化のみられた具体的な事例に関する歴史研究から、哲学的考察に進める手順をとった。このうち、初期の科学計算に関してはウェブサイトにデータを公開した本年度の予定では、パンチカード式計算機とその科学における利用の実態について調査し、その方法論に関する世界初の教科書を書いたエッカートの方法論について研究を進めることとなっていた。これに関して、ミネソタ大学チャールズ・バベッジ・インスティテュートのアーカイブに残されているエッカート自身の草稿等の検討を進め、9月には、エッカートの方法論の成立過程に関する研究を行ってきたカナダの研究者Allan Olleyを迎えて京都大学において研究会を行い意見交換した。この方法論について、日本での伝播を跡づけようと試みたが、その資料は今のところ発見されていない。この件については引き続き資料調査を行う予定である。IBM社におけるこの方法論の普及活動に関しては、上記のミネソタ大学のアーカイブに残されていた資料の検討により、その過程がある程度解明されつつある。また、これに平行して行うことになっていたモンテカルロ法の開発とその普及のプロセスに関する研究については、普及のプロセスに関して、プリンストン高等研究所のアーカイブに残る気象学分野での利用に関する資料の検討を進めた。さらに、コンピュータの導入における方法論の変化に関して考察を進めた結果、医療分野でのコンピュータ導入とその方法論の変化について検討していくことに意義がありそうだという結論に達し、次年度の研究を医学分野に広げていくことにした。以上のとおり、本年度は調査研究と考察を進める予定であり、それを遂行した。これに関する研究発表は行われていないが、23年度以降には成果公開をしていく予定である。当該年度は、2011年秋にクリーブランドで行われた国際学会(Society for Social Studies of Science年次総会)で、研究計画で目標としていたとおり、EBM(Evidence Based Medicine)と呼ばれる科学的根拠に基づいた医療の方法論について、その手法の日本での定着過程に関するagendaのありようについての二件の学会発表を行った。具体的には、喜多論文で行った歴史的分析では、『今日の治療指針』というスタンダードな治療法を記した刊行物に記された内容を精査し、EBMの概念が各医療分野でいつ頃から導入され、どのように受け入れられていったかについてまとめた。その過程でイギリス型のEBMの他、アメリカ型のEBMからの影響も確認され、新しい手法が定着するまでの従来の価値観との妥協・共栄の方策が探られていたことを明らかにした。また、出口論文で展開した哲学的考察については、EBMという手法そのものがコンピュータ(特にデータベース)の導入と不可分であることに加えて、統計的手法そのものの妥当性が不問にされている傾向にあることを明らかにした。また、双方の論文ともLevels of Evidencesの妥当性について問うという視点を織り込んだ。この論点について、学会の場を活用して、内外の研究者と意見交換することができた。また、研究の過程であつめたデータの質的研究、および成果公開に資するツール(サーバに資料データを蓄積して、整理・分類等を行うアプリケーション)を開発して研究に活用することにした。このツールを引き続き活用して、最終年度の研究にも生かしてゆきたい。本年度は、理学・工学の諸分野での、コンピュータの導入による科学方法論の変化について、Michael Mahoneyのagenda概念を用いて考察を進めた。この成果については、これまでの国際学会等での発表内容と合わせて、シミュレーションの歴史と哲学についての書籍の形で、まとめることになった。またその考察の過程において、日本の国立大学に設置された共同利用機関である計算機センターにおいて、初期にどのような科学計算が行われ、それぞれの分野においてコンピュータの必要性が、当時どのように語られていたかの記録を資料化することの重要性が再認識された。大型計算機センターは、1964年4月の日本学術会議による勧告により設置が促されたものであるが、その設置の必要性に関して欧米の研究機関との「計算機ギャップ」による研究の立ち後れへの懸念が挙げられていた。こうした研究者の声は、例えば1965年から最初の共同利用施設として大型計算機センターを運営した、東京大学でとりまとめられた広報にその一部が残されている。そこで、本研究費で改良を進めてきた歴史的資料の整理を行うツールにより、東京大学大型計算機センターを利用していた研究者の研究課題の一覧を、同センター広報に載せられた研究課題、および成果報告よりデータ化した。このデータベースについては、研究成果の一部としてウェブ上に公開し、他の研究者の利用にも供することにした。さらに日本の初期の科学計算のありようと、研究分野の方法論の変化および情報学分野の発展過程への影響について、主にアメリカの事例と比較した。この内容については、国際学会等で発表する予定である。当初の提案時の予定と事例研究の対象が変わった部分もあるが、平成23年度に行うことにした医療分野の事例研究では、興味深い科学的方法論の定着過程に関する知見を得ることができた。

また、当初は特に予定していなかった質的研究を行うための研究ツールを開発して活用することによって、大幅に作業効率が上がったことにより、計画以上に進展している面もある。24年度が最終年度であるため、記入しない。科学研究費補助金申請時には、最終年度に学会発表を行うことを目標にするとしていたが、平成23年度に国際学会での発表の機会を作ることができたので、最終年度は成果を論文の形にまとめていくことに集中することとした。必要に応じて追加調査や研究会等を行いながら、論文をまとめてゆきたい。また、研究用ツールも続けて活用し、必要に応じて改良等を行い、成果公開にも活用したい。
食事についての間文化的哲学の研究

ハラルド・レムケ博士と研究代表者の小川侃はともに京都の料亭(左阿弥、平成17年9月7日)のフィールドワークを行った。その他にも二三の料亭でフィールドワークをおこない、料亭の雰囲気の全体がもつ味覚へのかかわりを探求した。基本的には雰囲気がカオス的なものであり、料亭のあらゆる現れるもののうちに溶け込んでいるということを現象学的に確認することができた。またハラルド・レムケは平成17年12月に京都大学三才学林で食事についての講演をおこなった。これらの成果をもって平成18年3月5日、6日に財団法人体質研究会、財団法人慢性疾患・リハビリテーション振興財団との共催で「いのちの科学プロジェクト3「美しさ・味わい・健康--哲学コロキウム「医食同源の哲学」を遂行した。そのときに本科学研究費を使用してニューヨーク州立大学バッファロー校ロドルフ・ガシェー教授とドイツ、エルフルト大学、ウイルヘルム・シュミット教授を招待して食事についての講演を行なってもらった。ロドルフ・ガシェーのテーマは「形式か形態か、カントにおける食べ物」であり、ウイルヘルム・シュミットのテーマは「食の論理」であった。ハラルド・レムケは「料理の道と禅の味」についてはなした。研究代表者の小川侃は「食事の感性学と快楽のカオス的多様性」についての研究成果を発表した。結論として健康は食にもとづくこと、しかも食事は美しい雰囲気の中で行われるべきであり、適当な食材のリサイクルと清潔さが不可欠である。食べることは本来は聖なる出来事であるとともに性欲と並んでもっとも人間的な現象であるということである。
ラットアナフィラキシーショック時の肝血管収縮に対する肝血管造影法による検討

本研究の目的は、抗原注入された麻酔下のラットで、アナフィラキシーにおける肝静脈収縮の部位を特定することであった。血管造影および組織学的検討により肝門脈収縮は直径420μmまでの広範囲にわたり生じることが示唆された。そして、門脈小静脈では特に70μm未満の血管において強く収縮が生じていることを示した。本研究により門脈圧の上昇はより大きな血管よりも70μm以下の小静脈の収縮により生じていることが分かった。ラットにおける小静脈の収縮機構は、門脈の70μm以下に存在する小静脈括約筋が収縮による門脈圧上昇に寄与していると考えられる。ラットやイヌのアナフィラキシーショックに肝血管収縮がみられることが知られている。さらに、その肝血管収縮による門脈圧上昇が血圧低下に関与することがラットのアナフィラキシーで報告されている。ラットではその肝血管収縮部位は類洞より門脈側であることが報告されているが、その門脈における正確な部位は不明である。そこで麻酔下ラットのアナフィラキシー低血圧において門脈造影および組織学的に門脈の収縮部位を特定することを試みた。特に血管造影では肝血管の全体像がわかるがその識別限界は150μmであり、それ以下の血管像は解析できない、そこで組織学的検討で110μm以下の血管像を解析した。本研究により420μmまでの門脈血管が収縮するが、70μm以下の細静脈の収縮による血管抵抗の上昇が大きいことが推察されるためラットアナフィラキシーでの門脈圧の上昇は主として70μm以下の細静脈の収縮による生じていることが示唆された。ラットにおいて強力な血管収縮物質であるendothelin-1は40μmから80μmの門脈細静脈が特異的に収縮して門脈圧上昇を惹起することが報告されており、本研究結果と類似している。これらからラットの門脈の収縮機構は、門脈細静脈の7080μm以下に存在し、あたかも括約筋機構のように振る舞い、それらは体循環の主要な血管抵抗部位である細動脈に相当することが示唆された。一方、イヌにおいてアナフィラキシー時の肝血管収縮部位は類洞後の肝静脈に存在することが報告されており、種差の存在も考慮しなければならない。また、ヒトではアナフィラキシー時に肝血管収縮の検討はなく、種差とともに今後の検討が必要である。ラットにおけるアナフィラキシーショック時に生じる肝血行動態の評価を血管造影法を用いて評価を行った。コントロール群およびアナフィラキシー群のラットを麻酔下に、門脈圧および体血圧をモニタリングする手術を施行した。この状態で、基準となる血管造影を施行後、アナフィラキシーショックを惹起させた後の血管造影を撮影した。コントロール群においては、アナフィラキシー群において門脈圧が最高点に達する平均時間を算出し、血管造影を施行した。血管造影により得られた画像をフィルムに出力し、基準となる血管造影像よりアナフィラキシーショック時の血管変化を幾何学的に変化率を算出した。加えて、組織学的な評価のため、アナフィラキシー群およびコントロール群のラットより肝臓を摘出し、ホルマリンに固定後に切片を作成、組織標本も作成を行った。今後、詳細な評価および追加実験が必要となるが、現在までの実験結果では、ラットにおけるアナフィラキシーショック時には末梢門脈の著明な狭小化が生じる事により、門脈血流量が減少し、有効血液循環量の低下が生じていることを画像上にて得ることができた。さらに、組織学的な評価を加える事により血管造影による組織分解能を超えたレベルの血管動態を評価を可能とし、組織学的にも末梢門脈の収縮が示唆される所見を得ることができた。このことにより、人体では評価が困難であったアナフィラキシーショック時における低血圧のメカニズムを解明する事に繋がると考えている。メカニズムが解明される事で、アナフィラキシーショックの発現および治療をより詳細に行うことが可能となる。現在、動物実験はほぼ終了している状態であり、実験の結果は実験開始前に予測された所見が得られている。さらなる検討を加えて、追加実験を行い更なるメカニズムの解明を行う予定である。現在得られている画像所見および組織学的所見を詳細に検討を行う必要がある。血管造影にて得られた画像の評価には様々な方法があり、報告されている評価方法を試行し、最良の評価法を行う必要性がある。さらに、組織学的な評価を行うことで、血管造影にて得られた所見との相互関係を検討する必要性がある。これらによって得られた所見より検討の結果を学会発表および論文投稿により発信する予定である。該当なし
量子ホワイトノイズの非線形理論と非ガウス拡張

伊藤解析に代表される確率解析は、ランダム現象の数理解析において中心的な役割を演じるなど理論・応用の両面で大きな発展を遂げてきた。この伝統的な枠組みでは、ブラウン運動B(t)の汎関数を無限次元微積分学の立場から解析するのに対して、本研究ではブラウン運動をさらに分解(時間微分+量子分解)して得られる「量子ホワイトノイズ」を理論の出発点とする。量子ホワイトノイズの超関数的側面から「非線形理論」が、代数的側面から「非ガウス拡張」が自然に定式化される。この観点から従来理論を拡張する理論体系を構築するのが目的であった。個別的な共同研究に加えて、ワークショップの開催、サマースクールの共催、国際会議の参画、多数の研究発表を行った。研究項目と概略は以下の通りである。(1)非線形ホワイトノイズ方程式:量子ホワイトノイズを基礎とする作用素論を発展させた。シンボルの新しい特徴づけ定理、作用素微分を追究した。(2)複素ホワイトノイズ:フーリエ・ガウス変換のユニタリ性、量子ホワイトノイズの2乗に関連する部分ユニタリ性が見出された。ホワイトノイズ方程式への応用を議論した。(3)レヴィラプラシアンとホワイトノイズの高次べき:付随する確率過程を構成し、熱型方程式を通して両者の関連を調べた。(4)相互作用フォック空間:グラフの漸近的スペクトル解析において組織的な応用を完成させ、一般化のために多変数直交多項式論の見直しを始めた。自由確率論の諸概念との関連を調べた。(5)非ガウス型確率過程:多変数相互作用フォック空間を通して応用を探った。(6)無限次元調和解析への応用:量子分解法を用いて、無限対称群の漸近的表現論を研究した。(7)量子系の物理への応用:散逸系を記述する量子確率微分方程式・乱流における統計性・グラフ上のボーズ・アインシュタイン凝縮などを接点として物理学者との研究交流を推進した。伊藤解析に代表される伝統的な確率解析の枠組みではブラウン運動B(t)が基礎になるが、本研究の出発点はブラウン運動をさらに分解(量子分解+時間微分)して得られる「量子ホワイトノイズ」である。その超関数的な側面からは「非線形理論」を、代数的な側面からは「非ガウス拡張」をテーマとして浮かび上がらせ、その数理を探求することが研究目標である。そのために、個別的な共同研究に加えて、課題探索のためのワークショップの開催や国際会議などにおける研究発表を行った。具体的な項目と研究概略は以下の通り。(1)非線形ホワイトノイズ方程式:量子ホワイトノイズを基礎とする作用素論を発展させ、解の正則性を調べた。特に、新しい作用素微分を導入し、応用として、量子マルチンゲールの表現における積分核を導く公式を得た。(2)複素ホワイトノイズによる特徴づけ定理:シーガル・バーグマン写像を用いて、非核型空間におけるS変換と作用素シンボルの特徴づけ定理を証明した。(3)レヴィラプラシアンとホワイトノイズの高次べき:レヴィラプラシアンに付随する熱方程式から確率過程を構成し、その非可換拡張を研究している。(4)多モード相互作用フォック空間と非ガウス型確率過程の量子分解:グラフのスペクトル解析に関連する相互作用フォック空間と直交多項式を研究している。グラフの構造と独立性の諸概念の関係を見出し、量子中心極限定理のモデルを構成した。(5)無限次元調和解析への応用:量子ホワイトノイズによる作用素展開定理を精密化し、無限次元群のユニタリー表現の既約性の証明への応用を検討している。(6)量子系の物理への応用:散逸系を記述する量子確率微分方程式の構造を非平衡統計力学の手法を用いて解析した。

伝統的な確率解析の枠組みではブラウン運動B(t)が基礎になるが、本研究の出発点はブラウン運動をさらに分解(量子分解+時間微分)して得られる「量子ホワイトノイズ」にある。量子ホワイトノイズは超関数を用いて定式化され、その「非線形理論」を構築することで従来の範疇では扱うことのできない確率微分方程式を扱う。また、量子成分の非可換性に注目し、代数的構造を追究することで「非ガウス拡張」を発展させる。今年度は、個別的な共同研究に加えて、課題探索のためのワークショップの開催や国際会議などにおける研究発表を行った。具体的な項目と研究概略は以下の通り。(1)非線形ホワイトノイズ方程式:量子ホワイトノイズを基礎とする作用素論を発展させた。特に、新しく導入された作用素微分の性質を調べ、量子マルチンゲールの表現定理への応用を議論した。(2)複素ホワイトノイズ:シーガル・バーグマン空間を中心に、核型性を用いることなくS変換と作用素シンボルの特徴づけ定理を証明した。(3)レヴィラプラシアンとホワイトノイズの高次べき:異なる計量に基づくレヴィラプラシアンを導入し、熱方程式の解の性質を調べた。(4)多モード相互作用フォック空間と非ガウス型確率過程の量子分解:大きなグラフの漸近的スペクトル解析において新しい極限分布を見出した。さらに複雑なグラフにアプローチするため多変数直交多項式論の見直しを始めた。(5)無限次元調和解析への応用:量子ホワイトノイズによる作用素展開定理をベクトル値の場合に拡張し、無限次元群のユニタリ表現論への応用を検討している。(6)物理への応用:散逸系を記述する量子確率微分方程式・乱流における統計性・グラフ上のボーズ・アインシュタイン凝縮などを接点として物理学者との研究交流を推進した。伊藤解析に代表される確率解析は、ランダム現象の数理解析において中心的な役割を演じるなど理論・応用の両面で大きな発展を遂げてきた。この伝統的な枠組みでは、ブラウン運動B(t)の汎関数を無限次元微積分学の立場から解析するのに対して、本研究ではブラウン運動をさらに分解(時間微分+量子分解)して得られる「量子ホワイトノイズ」を理論の出発点とする。量子ホワイトノイズの超関数的側面から「非線形理論」が、代数的側面から「非ガウス拡張」が自然に定式化される。この観点から従来理論を拡張する理論体系を構築するのが目的であった。具体的な項目と概略は以下の通りである。特に、新しく導入された作用素微分を追究した。(2)複素ホワイトノイズ:部分ユニタリ性という新しく見出された性質をめぐってホワイトノイズ方程式への応用を議論した。(3)レヴィラプラシアンとホワイトノイズの高次べき:熱型の方程式を通して両者の関連を調べた。(4)非ガウス型確率変数の量子分解とその応用:
エピジェネティクス因子による代謝プログラミングとエネルギー恒常性の研究

栄養等の環境因子が代謝プログラミングを引き起こし、細胞機能や表現型を作り出す仕組みを解明することを目的として研究を行った。特にヒストン脱メチル化酵素LSD1及びLSD2の代謝制御における役割とその分子基盤に焦点を当てて研究を行った。LSD1が骨格筋の線維型決定に寄与すること、がん細胞代謝と腫瘍形成に寄与すること、LSD2が脂質ストレスからの肝細胞保護に関わることを明らかにした。また、LSD1/LSD2の補酵素である細胞内FAD変動を明らかにした。これらの成果から、LSD1とLSD2が環境ストレスをエピゲノム変換に結びつける重要分子であることが明らかとなった。栄養環境が細胞・組織の代謝プログラミングを惹起する過程をエピジェネティクスの観点から明らかにすることを目的として、ヒストン脱メチル化酵素LSD1の機能を分子レベル、細胞レベルで解析した。1. LSD1による遺伝子発現制御におけるFAD合成系の役割の解析細胞内代謝補酵素であるFADの合成量・様式がLSD1によるエピゲノム形成にどのように作用しうるかを検討した。生化学的解析や細胞染色法を用いてFAD合成酵素群が核内を含む細胞内の様々な部位で観察された。一方で、ペプチドタグを融合させたFAD合成酵素を細胞に強制発現させたところ、内因性タンパク質とは異なる局在を示したことから、その局在は能動的にコントロールされている可能性が示唆された。また、細胞内FAD量を安定的に定量する方法を確立した。この方法を用いて外部環境に応じて細胞内FAD量がどのように変化するか検討したところ、脂肪酸暴露によるFAD量増加は認められたが、その他の栄養・ホルモン刺激下では増減は認められなかった。2.骨格筋細胞分化・エピゲノム形成におけるLSD1機能の解析LSD1が骨格筋細胞の代謝特性形成にどのように関与するかを検討した。LSD1阻害下でマウス骨格筋由来細胞C2C12に筋分化刺激を施すと、特徴的な代謝特性をもつ筋管が形成された。また、この代謝特性と一致する代謝関連遺伝子発現変化やヒストン修飾の変化が観察された。これらのことから、LSD1は骨格筋の代謝戦略策定に関わる重要因子である可能性が示唆された。これらの成果は、細胞が外部環境を認識して細胞内部の代謝環境を作り替える機構を理解する上で重要な知見であると考えられる。本課題において、環境変動に応じた代謝プログラム転換を司るエピジェネティクス機構の解明を目的とした研究を行っている。今年度は、ヒストン脱メチル化酵素であるLSD1及びLSD2の分子機能解析を実施した。1.がん細胞のエネルギー代謝転換におけるLSD1の役割肝がん細胞において、LSD1が解糖系を活性化し、ミトコンドリア呼吸を抑制することによりがん細胞固有の代謝戦略である好気的解糖を維持していることを明らかにした。LSD1はヒストンH3K4脱メチル化を介してミトコンドリア代謝関連遺伝子を抑制すると同時に、転写因子HIF-1αを安定化することにより解糖系遺伝子発現を活性化していた。さらに、マウスを用いた腫瘍細胞移植試験においてLSD1は肝がん細胞の生着に重要であることを突き止めた。これらの成果はLSD1が統合的ながん代謝制御因子であることを示唆している(Sakamoto et al. Cancer Res. 2015)。2. LSD2による肝細胞における脂質代謝制御トランスクリプトーム、エピゲノム及びメタボローム解析を駆使して、LSD2が肝細胞の脂質代謝量を適正に維持していることを明らかにした。このようなLSD2の働きは、脂質輸送や代謝に関わる多数の遺伝子発現をH3K4脱メチル化を介して抑制していることとリンクしていた。これらの遺伝子制御において、LSD2はストレス応答性転写因子であるc-Junと協働していることを突き止めた。また、LSD2は過剰な脂質負荷による肝細胞障害を抑制することがわかった。これらの点から、LSD2は肝細胞の脂質代謝を適正に保ち、脂肪毒性から保護している可能性が示唆された(Nagaoka et al. Mol. Cell. Biol. 2015)。環境に応じたエネルギー代謝の可塑性を生み出すエピジェネティクス機構を解明することを目的として、ヒストン脱メチル化酵素LSD1の機能解析に取り組んだ。H.27年度は、LSD1による骨格筋代謝制御のエピジェネティクス機構について検討した。骨格筋は、運動持久性が高くミトコンドリア呼吸によるエネルギー産生が活発な遅筋線維と強度が高く解糖系に特化したエネルギー合成を行う速筋線維によって構成される。両者は運動、栄養、ホルモン等の外的刺激に応じて変化する可能性が示されており、エピジェネティックな可塑性によって制御されていることが示唆されるが、その分子機序はわかっていない。そこで、この点を解明する目的で、LSD1の骨格筋線維形成と代謝型形成における役割を検討した。マウス骨格筋由来C2C12筋芽細胞の分化過程において、LSD1阻害剤S2101処理したところ、ミトコンドリア好気呼吸及び遅筋線維関連遺伝子が発現上昇を示した。これらの遺伝子座において、LSD1の脱メチル化標的であるメチル化ヒストンH3K4がLSD1阻害により亢進していた。また、LSD1阻害下で細胞内代謝を計測したところ、好気呼吸の活性化及びグルコース依存性ATP産生の低下が認められた。これらのことから、LSD1は、遅筋線維形成・好気的代謝をエピジェネティックに抑制することで、速筋線維形成と解糖系シフトを統合的に促進していることが示唆された。

次にLSD1による筋線維・代謝遺伝子制御がどのような環境因子によって規定されるかを検討した結果、LSD1のタンパク質発現量が代謝ホルモン刺激によって変動することがわかった。これらのことから、LSD1は、生体内の栄養・代謝環境に応答して速筋線維形成をエピジェネティックに誘導することが示唆された。栄養等の環境因子が代謝プログラミングを引き起こし、細胞機能や表現型を作り出す仕組みを解明することを目的として研究を行った。特にヒストン脱メチル化酵素LSD1及びLSD2の代謝制御における役割とその分子基盤に焦点を当てて研究を行った。LSD1が骨格筋の線維型決定に寄与すること、がん細胞代謝と腫瘍形成に寄与すること、LSD2が脂質ストレスからの肝細胞保護に関わることを明らかにした。また、LSD1/LSD2の補酵素である細胞内FAD変動を明らかにした。これらの成果から、LSD1とLSD2が環境ストレスをエピゲノム変換に結びつける重要分子であることが明らかとなった。実績の概要で示したとおり、当初目標としていた、LSD1及び2を介した環境依存性エピゲノム制御と代謝転換との関係について、その一端を明らかにすることができた。特にLSD1及び2による代謝遺伝子制御の全体像を明らかにすると共に、環境依存的に両分子と機能的に相互作用する転写因子を同定することができた。また、昨年度までにLSD1による骨格筋代謝制御についても明らかにしている点や、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)合成酵素の細胞内挙動を検討した点を踏まえて、概ね順調に進捗していると考えられる。エピジェネティクス本年度までに、栄養環境や細胞特性に応じてLSD1及びLSD2が多様な代謝遺伝子制御を行っていることを明らかにした。現在までの進捗状況を踏まえて、今後の研究では、環境に応じたこれらエピゲノム制御の分子機構の詳細を解明したい。具体的には、栄養・代謝センシングを司るホルモンのシグナル伝達経路とLSD1及び2がどのように関係するかを検討する。特に、骨格筋分化や代謝転換におけるホルモンシグナルとエピジェネティクス機構の相互作用に焦点を当てて研究を進める。また、遺伝子改変マウス等を用いて、LSD1の骨格筋代謝転換における役割を検討する。LSD1及び2は補酵素としてFADを要する。次年度は、核内におけるFAD合成とエピゲノム制御を結ぶ分子機構を解明する目的で、FAD合成酵素であるRFKの結合タンパク質の同定をプロテオミクス解析により試みる。これにより、FAD合成とLSD1及び2機能の直接的関係が解明できると共に、新たなFAD依存性エピゲノム制御機構の発見にも繋がるものと期待している。骨格筋におけるLSD1の機能解析は予定通り進捗している。LSD1阻害下における遺伝子発現・代謝変化を多角的に解析することができた。細胞内FAD量を安定的に定量出来るようになったので、様々な生物材料を用いてFAD量が生理条件下でどのように変化するかを評価する。また、FAD合成酵素が外部環境に応じてどのような細胞内挙動を示すかを観察する。これらの知見を踏まえて、当初平成26年度に計画していた環境依存性LSD1分子機能の解析を遂行する。
アスパラガス属固有種ハマタマボウキの罹病現象の究明と保護対策の確立

我が国の食用アスパラガス病害の90%以上は植物病原菌による病害で、中でも、アスパラガス茎枯病は一旦罹病するとその根絶は極めて困難であるにも関わらず、食用アスパラガス種内には病気に強い品種が見つかっていない。アスパラガスでは耐病性品種の育成が強く望まれているが、本植物は多年生で交雑しにくく、品種育成には多大な年数がかかり、かつ、アスパラガス品種内には耐病性形質が存在しないなど、耐病性品種育種のハードルは極めて高い。申請者らの研究チームは、日本産アスパラガス植物の一種であるハマタマボウキと食用アスパラガスとの交雑種が、茎枯病に耐性があることを世界で初めて明らかにした。ハマタマボウキは、日本固有種の一種で九州北部沿岸のみに自生する希少種であるため、生息域は限定的で非常に狭く、本植物の病害記載が存在しないことから、病害に強い植物であると認識されていた。しかし、近年の申請者の現地調査では、罹病化したハマタマボウキを発見しており、これまでの病気に強いという認識を覆す結果を得ている。また、ハマタマボウキ自生地近隣は、九州の食用アスパラガスの大生産地であることから、アスパラガス属植物間の相互感染による新規病害の発生や病害の進展化、希少種の生息域の減少が懸念される。さらに、ハマタマボウキの持つ耐病性のポテンシャルから、育種研究を目的とした乱獲や国外への流出が耐病性品種の育種の障害となる可能性が示唆される。そこで、本年度は、ハマタマボウキの自生環境特性の解明を目的に、現地の成育調査を実施し、自然感染した複数の罹病植物個体の存在を多数確認するとともに、その一部を研究室に持ち帰り、病害発生の実態解明を試みた。繁殖地である九州北部沿岸域の砂浜を採集し、ガラス温室において現地で採種したハマタマボウキの種子を砂地に播種し、ハマタマボウキの育苗を試みた。また、対象区として、アスパラガスの栽培用土壌(野菜の栽培土)にも同様にハマタマボウキの種子を播種し、育苗を行った。その結果、ハマタマボウキは砂地および野菜栽培土いずれの土壌においても栽培が可能であることを見いだした。これらの結果は、ハマタマボウキは必ずしも砂地での繁殖が必要不可欠ではなく、砂地以外の普通の土壌でも繁殖が可能であることを示しているにもかかわらず、ハマタマボウキの繁殖地が砂浜のみであることを考えると、現在の自生地は、他の植物の侵入が困難な砂浜地までハマタマボウキの生育地が後退した結果である可能性が示された。また、自然感染個体から原因となる病原菌を分離し、接種試験を行った結果、罹病化の原因菌として、Phomopsis asparagi, Diaporthe unshuensis, Neopestalitiopsis spp., Alternaria spp., Fusarium acuminatum,およびF. tricinctumの植物病原糸状菌類が確認された。これらの病原糸状菌のうち、P. asparagiはアスパラガス茎枯病の原因菌であるとともに、Alternaria属菌はアスパラガス斑点病の原因菌であることから、ハマタマボウキと食用アスパラガス両方に感染できる可能性が示唆された。また、これらの糸状菌以外の病原菌については、食用アスパラガスへの病害の報告はないため、今後、ハマタマボウキから分離された病原糸状菌の食用アスパラガスへの病原性の可能性について調査する必要があると思われる。さらに、自然発病罹病個体からは本属菌以外の糸状菌も複数種類分離されており、これらの糸状菌の病原性の可能性についても解明する必要がある。現在、ハマタマボウキの自生地の調査が福岡県および佐賀県で実施しており、長崎県や熊本県、山口県などでの実地調査が必要であるため、次年度においては、さらなるハマタマボウキの自生地の調査を実施する。可能であれば、九州北部沿岸域の長崎県の諸島群や韓国に面している地域についても、ハマタマボウキのようなアスパラガス属植物が自生している可能性があるため、調査地を拡大して自生環境の特性を調査する予定である。繁殖地の土壌環境(土質、物理化学性、土壌栄養・肥料、土壌構造、土壌微生物群)および繁殖地の気象条件(気温・地温・降水量)について調査し、ハマタマボウキの栽培繁殖に適した圃場環境を構築する。さらに、繁殖環境の調査結果に基づき、ハマタマボウキの栽培に適した栽培繁殖環境を構築する。主に栽培土壌(砂質培土、園芸用培土、農業培土等)、肥料(リン酸、カリウム、窒素、微量要素)、灌水条件や日照条件などの条件について検討する。調査地の範囲を拡大するとともに、自生地において、被害個体の有無を調査し、罹病個体をサンプリングして、罹病化の原因となっている病原菌の特定を実施する。昨年度に判明した5属菌以外の病原菌について接種試験を通じて病原性を確認し、罹病化の原因菌を特定する。P. asparagiやAlternaria属菌については、食用アスパラガスから分離した菌株との生理的性質や分子遺伝学的性質を比較することによって、これらの病原菌類の多様性解析と他のハマタマボウキ分離菌の食用アスパラガスや他の野菜類に対する病原性試験を実施する。また、ハマタマボウキ自生地の根圏土壌に生息する微生物を選抜し、ハマタマボウキ分離菌と対峙培養させることにより、病原菌の生育を抑制・拮抗する微生物をスクリーニングする。これらの微生物を生物的防除資材として利用するための栽培試験を実施して、病害抑止技術を確立する。

我が国の食用アスパラガス病害の90%以上は植物病原菌による病害で、中でも、アスパラガス茎枯病は一旦罹病するとその根絶は極めて困難であるにも関わらず、食用アスパラガス種内には病気に強い品種が見つかっていない。アスパラガスでは耐病性品種の育成が強く望まれているが、本植物は多年生で交雑しにくく、品種育成には多大な年数がかかり、かつ、アスパラガス品種内には耐病性形質が存在しないなど、耐病性品種育種のハードルは極めて高い。申請者らの研究チームは、日本産アスパラガス植物の一種であるハマタマボウキと食用アスパラガスとの交雑種が、茎枯病に耐性があることを世界で初めて明らかにした。ハマタマボウキは、日本固有種の一種で九州北部沿岸のみに自生する希少種であるため、生息域は限定的で非常に狭く、本植物の病害記載が存在しないことから、病害に強い植物であると認識されていた。しかし、近年の申請者の現地調査では、罹病化したハマタマボウキを発見しており、これまでの病気に強いという認識を覆す結果を得ている。また、ハマタマボウキ自生地近隣は、九州の食用アスパラガスの大生産地であることから、アスパラガス属植物間の相互感染による新規病害の発生や病害の進展化、希少種の生息域の減少が懸念される。さらに、ハマタマボウキの持つ耐病性のポテンシャルから、育種研究を目的とした乱獲や国外への流出が耐病性品種の育種の障害となる可能性が示唆される。そこで、本年度は、ハマタマボウキの自生環境特性の解明を目的に、現地の成育調査を実施し、自然感染した複数の罹病植物個体の存在を多数確認するとともに、その一部を研究室に持ち帰り、病害発生の実態解明を試みた。繁殖地である九州北部沿岸域の砂浜を採集し、ガラス温室において現地で採種したハマタマボウキの種子を砂地に播種し、ハマタマボウキの育苗を試みた。また、対象区として、アスパラガスの栽培用土壌(野菜の栽培土)にも同様にハマタマボウキの種子を播種し、育苗を行った。その結果、ハマタマボウキは砂地および野菜栽培土いずれの土壌においても栽培が可能であることを見いだした。これらの結果は、ハマタマボウキは必ずしも砂地での繁殖が必要不可欠ではなく、砂地以外の普通の土壌でも繁殖が可能であることを示しているにもかかわらず、ハマタマボウキの繁殖地が砂浜のみであることを考えると、現在の自生地は、他の植物の侵入が困難な砂浜地までハマタマボウキの生育地が後退した結果である可能性が示された。また、自然感染個体から原因となる病原菌を分離し、接種試験を行った結果、罹病化の原因菌として、Phomopsis asparagi, Diaporthe unshuensis, Neopestalitiopsis spp., Alternaria spp., Fusarium acuminatum,およびF. tricinctumの植物病原糸状菌類が確認された。これらの病原糸状菌のうち、P. asparagiはアスパラガス茎枯病の原因菌であるとともに、Alternaria属菌はアスパラガス斑点病の原因菌であることから、ハマタマボウキと食用アスパラガス両方に感染できる可能性が示唆された。また、これらの糸状菌以外の病原菌については、食用アスパラガスへの病害の報告はないため、今後、ハマタマボウキから分離された病原糸状菌の食用アスパラガスへの病原性の可能性について調査する必要があると思われる。さらに、自然発病罹病個体からは本属菌以外の糸状菌も複数種類分離されており、これらの糸状菌の病原性の可能性についても解明する必要がある。
ヘミングウェイの冷戦期ヨーロッパにおける受容

3年間の研究期間において、ヨーロッパでの調査を行った結果、本研究課題であるアーネスト・ヘミングウェイのヨーロッパ各国における受容をかなりの程度明らかにすることができた。とりわけファシスト政権がヨーロッパの中で例外的に存続していたスペイン、近年ナショナリズムの盛り上がりを見せるフランス、イタリアにおいて、かつてヨーロッパにおいて政治的に深く関わったヘミングウェイの現在の受容を調査することは、国家と文学者との関係を深く理解するのに有用であると考えられる。3年間の研究課題の初年度として、本年度は主に国内の学会発表を中心に研究を進めた。まずは前半に研究の中心であるヘミングウェイと関連するF・スコット・フィッツジェラルドの『夜はやさし』需要に焦点を当て、論文を完成させた。これは『英文学研究』に採用され、各所で評価された。10月には日本アメリカ文学会全国大会(京都大学、京都府京都市)でシンポジウムを主催し、そこで現段階でのヘミングウェイに関して研究成果を公開した。12月には日本アメリカ文学会北海道支部(北海学園大学、北海道札幌市)において特別講演を行い、ここでも本研究成果の一部を公表した。本年度はシンポジウムや特別講演などの要請が重なったため、当初予定していた海外渡航はできなかったが、その分国内の研究者との意見交換を活発に行い、現段階での研究成果も広く公表することができたという点で、特に研究計画の遅れはなかったといえる。来年度に予定通りサバティカルを取得できたので、本年度に予定していたスペインでの調査は十分可能である。概要にも書いたとおり、多少の予定の変更はあったが、次年度の予定と入れ替えることで十分な研究成果を上げ、かつ着実に研究成果の公表を行ってきたといえる。3年間の研究の2年目として、ヨーロッパでの実施調査を中心に研究を行った。本年度はサバティカルを取得し、1年間フランスに滞在したために、フランスを中心にヨーロッパ主要国でのヘミングウェイの受容を調査することができた。6月には前年度に達成できなかったスペインへの調査旅行を行った。その後7月に再度スペインに、8月にイギリス、10月にイタリア、オーストリア、ドイツ、オランダ、ベルギーなどを調査した。3年目の研究の総まとめに向けて十分な成果ができた。概要に書いたとおり、現地調査を十分にすることで、必要な資料が全て揃った状態であり、科研最終年度のまとめに向けて十分な成果を上げることができた。2016年度の海外調査による研究成果に基づき、3年間の本研究課題をまとめ、公表することができた。1年間を通じて年度末に出版する本研究課題の研究成果をまとめた著書の執筆を行った。また11月には日本ヘミングウェイ協会において学会発表を行い、研究成果の一部を公表し、同分野の研究者に著書出版に向けてのさまざまな示唆をもらった。年度末には3年間の研究成果を著書の形で公表した。昨年度の海外渡航ができなかったため、今年度はスペインでの調査を行う予定である。すでに渡航の準備は進んでおり、すべての予定が組み上がっている状態である。昨年度に前倒して勧めた研究も多いので、今年度は余裕があれば更に次年度の予定を前倒して進めていくことも視野に入れている。概ね予定通りに進んでいるので、これまでの2年間の研究成果をまとめ、書籍の形で年度末までに研究成果を発表できるよう論文を書いていく予定である。アメリカ文学海外渡航が28年度に延期になったため、研究計画を変更することになったため。27年度に行うことのできなかった海外での調査にあてる予定である。
胚発生における根端メリステムのパターン形成機構

シロイヌナズナRKD4遺伝子の欠損変異体では、胚におけるパターン形成に異常が見られ、高頻度に根端メリステムを欠失する。RDK4はRWP-RK推定転写因子ファミリーに属し、実際に、RKD4とGFPの融合タンパク質が核に局在し、アミノ末端側の領域が転写活性化能をもつことからも、転写因子として機能すると推定される。本年度はRKD4の下流因子を同定するため、DEX依存的にRKD4を過剰発現するライン(indRKD4ox)のを作製し、マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行った。本来、RKD4は胚特異的に発現し実生では発現しない。従ってDEX処理したindRKD4oxの実生では、RKD4の下流因子の発現が異所的に活性化していることが期待された。そこで、indRKD4oxにおいて異所的に発現している76個の遺伝子を選抜し、それらの本来の発現パターンを、公開されているデータベースから抽出してクラスタリングした。その結果、32個の遺伝子は、RKD4と同様に初期胚で優先的に発現していることが明らかとなった。一方、中期や後期胚に特異的な遺伝子は活性化されないことも明らかになった。また、indRKD4oxの実生を数日間DEX処理すると、実生全体がカルス様の細胞塊に転換し、これをDEXを含まない寒天培地に移したところ、多数の不定胚が形成された。これらの結果より、RKD4が初期胚特異的な遺伝子の発現を活性化し、胚発生のプログラムを開始させる重要な制御因子であることが明らかとなった。シロイヌナズナRKD4遺伝子の欠損変異体(rkd4)では、胚におけるパターン形成に異常が見られ、高頻度に根端メリステムを欠失する。これまでの解析により、RKD4がオーキシンに依存したパターン形成機構の上流で機能することが示唆されている。本研究は、胚発生におけるRKD4タンパク質の機能を明らかにすることを目的とする。RKD4は転写因子と推定されるが、それを支持する実験データは報告されていない。RKD4の細胞内局在を調べるために、RKD4:GFP融合タンパク質をRKD4プロモーターの制御化で発現させたが、rkd4の表現型は相補されるもののGFP蛍光は観察されなかった。RKD4:GFPを植物体の根や胚で過剰発現する形質転換体においても、やはりGFP蛍光は観察されなかった。一方、RKD4:GFPをタマネギの表皮細胞やシロイヌナズナの培養細胞で一過的に発現させると、核においてGFP蛍光が観察された。また、RKD4の様々な領域とGAL4のDNA結合ドメインとの融合タンパク質を酵母で発現させ、レポーター遺伝子の発現を調べた結果、RKD4のアミノ末端側に転写活性化能があることが明らかとなった。これらの結果は、RKD4が当初の推定通り、転写活性化因子として機能することを支持する。また、RKD4タンパク質の不安定性や翻訳効率の低さも示唆される。RKD4の下流因子を同定するため、rkd4変異体と野生型植物の胚珠からRNAを抽出し、マイクロアレイにより転写プロファイルを比較した。またDEX誘導型RKD4過剰発現体を用いて、短時間の誘導後の転写プロファイルをコントロールと比較した。その結果、いくつかの転写因子の他、オーキシン生合成酵素をコードする遺伝子などが下流因子の候補として同定された。
TRP遺伝子を標的とした呼吸器疾患治療の開発

培養ヒト気道平滑筋細胞において、STIM1/Orai1活性化がストア作動型Ca^2+チャネルを介したCa^2+流入を引き起こすことにより細胞遊走能を制御することを見出した。一方、cAMPは気道平滑筋細胞において、Ca^2+シグナルとは逆に細胞増殖ならびに細胞遊走能に対して抑制的に働くことを見出した。過剰な細胞内Ca^2+濃度上昇が肺構成細胞に作用し細胞機能変化を生じることにより、気管支喘息やCOPDの病態悪化に関与する可能性が示唆される。肺炎症性疾患・気管支喘息の病態形成におけるTRPチャネルをはじめとするCa^<2+>チャネルの役割を検討した。培養ヒト気道平滑筋細胞を用いた実験で、筋小胞体Ca^<2+>ストアのCa^<2+>含有量を感知する分子STIM-1をこの細胞が発現していることを見出した。更に、STIM-1siRNAを細胞に導入した実験で、STIM-1が筋小胞体Ca^<2+>ストアにより活性化されるCa^<2+>チャネルを介したCa^<2+>流入を制御していることを見出した。このことから、気管支喘息における気道平滑筋収縮、気道平滑筋細胞増殖において、STIM-1の活性化が関与している可能性が推測された。培養ヒト肺微小血管内皮細胞を用いた実験では、prostaglandin E_2(PGE_2)刺激および繰り返しのストレッチ刺激がIL-8産生を亢進することを見出した。これらの反応はARDSの肺炎症病態に関与すると推測される。本細胞にはTRP-V2, V4, C6などのTRP発現を認めたが、これらIL-8産生はTRPチャネル阻害剤Gd^<3+>,rutheniumredなどでは抑制されず、p38 MAP-kinase阻害により抑制されたことから、TRPチャネル非依存性にp38 MAP-kinaseにより制御されていることを見出した。以上の知見から、気道平滑筋細胞の多くの機能はCa^<2+>チャネルによって制御されており、TRP遺伝子が細胞内シグナルの活性化を介して気管支喘息の病態形成に関与している可能性が推測される。肺微小血管内皮細胞機能におけるTRPチャネルの意義、ARDSの病態生理における役割については更なる研究課題である。喘息、肺炎症性疾患の病態形成におけるTRPチャネルをはじめとするCa^<2+>チャネル、Ca^2シグナルの役割を検討した。培養ヒト気道平滑筋細胞を用いた実験で、筋小胞体Ca^<2+.ストアのCa^<2+>含有量を感知する分子STIM1および、Ca^<2+>チャネル分子Orai1をこの細胞が発現していることを見出した。更に、STIM1およびOrai1に対するsiRNAを細胞に導入した実験で、両者が筋小胞体Ca^<2+>ストアにより活性化されるCa^<2+>チャネルを介したCa^<2+>流入(ストア作動型Ca^<2+>流入)を制御していることを見出した。更に、これらSTM1,Orai1分子が血小板由来成長因子(PDGF)刺激によって誘導される平滑筋細胞遊走能ならびに細胞増殖能を制御していることを見出した。このことから、気管支喘息の病態における気道リモデリングにSTIM1,Orai1が関与している可能性が推測された。培養ヒト肺微小血管内皮細胞を用いた実験では、TRP-V2,V4,M7などのメカニカルストレスとの関連が報告されている複数のTRP遺伝子発現を確認した。繰り返しの細胞伸展(ストレッチ)刺激、低浸透圧、細胞骨格変化、ずり応力などのメカニカルストレスが細胞からのATP放出を亢進することを見出した。細胞外ATPは多様な作用を有するが、ARDSの肺炎症病態に関与する可能性も推測されており、TRPチャネルとATP放出の関連について検討中である。本研究ではCa2+シグナルの制御が気道収縮・リモデリング、肺気道炎症に与える影響とその機序について明らかにし、喘息、COPD、肺炎症性疾患の病態解明につなげることを目的とした。培養ヒト気道平滑筋細胞を用いた実験において、Ca2+関連分子であるSTIM1/Orai1活性化がストア作動型Ca2+チャネルを介したCa2+流入を引き起こすことにより細胞遊走能を制御することを見出した。一方、細胞内cAMP上昇は気道平滑筋細胞において、Ca2+シグナルとは逆に細胞増殖ならびに細胞遊走能に対して抑制的に働くことを見出した。特にプロスタグランジンE2受容体に着目した研究を行い、EP2受容体とEP4受容体の刺激がcAMP上昇を引き起こし、気道平滑筋に対して保護的に作用する反面、EP3受容体刺激は細胞内Ca2+濃度上昇を伴って気道平滑筋細胞遊走を促進することを見出した。以上の研究結果から、過剰な細胞内Ca2+濃度上昇が肺構成細胞に作用し細胞機能変化を生じることにより、気管支喘息やCOPDの病態悪化に関与する可能性が示唆される。

気道平滑筋細胞のカルシウムシグナルについての研究において、TRP遺伝子およびSTIM1/Orai1による制御機構の検討中である。STIM1の細胞遊走能の制御機構について見出し、現在論文投稿中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続きSTIM1/Orai1による気道平滑筋細胞機能の制御機構、特にサイトカイン産生、平滑筋収縮機構について検討する。卵白アルブミン感作マウス喘息モデルにおける、肺および気道におけるTRP遺伝子、STIM1/Orai1遺伝子の発現変化を検討するとともに、喘息病態への関与について追及する。更に、TRP遺伝子がその候補分子である気道平滑筋細胞、肺血管内皮細胞におけるメカニカルストレス感受性カルシウムチャネルの同定を行う。