hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バクテリアを用いた尿路結石溶解の試み

多くの尿路結石は体外衝撃波結石砕石術により結石を破砕することができるが、腎・尿管には多数の小結石が残る。また、5年以内に約50%の患者が尿路結石を再発することが知られている。さらに、長期間の体内カテーテル留置により尿中の結晶成分がカテーテル周囲に付着し、頻繁にカテーテルを閉塞させることが知られている。これらの結石の多くは溶解することが困難である。本研究では人に害のないバクテリアを用いて結石ならびにカテーテルに付着した結晶を体内において安全に溶解する方法を確立することを目的とした。結果:実験1.臨床的に人から摘出したカテーテルを一度滅菌したのち、バクテリアと一緒にヒト尿中にて培養しながら溶解をこころみた。2週間の培養にて結晶量の約50%が溶解されていた。実験2.ラットを用いた長期実験モデル(1ヶ月間)により膀胱、腎臓の組織障害、尿路感染症の程度を観察した。また、血液検査もおこなった。組織障害はほとんど認めず、血液学的にも異常所見を認めなかった。ラット膀胱内にバクテリアと同時に入れた結石のうち、燐酸カルシウム結石が最もよく溶解されていた。シュウ酸カルシウム結石もわずかながら溶解されていた。ただし、尿酸結石、燐酸アンモニウムマグネシウム結石においては溶解できず、逆に結石の増大化を認めた。回収した結石を走査電子顕微鏡で観察したところ、結石表面に存在するThibacillus thiooxidansを確認した。細菌は、結石を溶解し、結石表面より中にもぐりこんでいるように見えた。結石溶解はバクテリアが産生する硫酸によりおこなわれていたと考えられた。産生された硫酸は膀胱から体外に排泄されることにより,組織障害をきたさなかったと考える。以上より、一般の内服薬にて溶解不可能のカルシウム結石をこのバクテリアを用いて安全に溶解できることが判明した。1尿路結石溶解のための基礎的研究と組織障害の検討この実験に用いるバクテリア(チオバチルス)の増殖条件と結石溶解の程度を検討した。培養液におけるバクテリアの増殖速度は約3週間。約1ヶ月後のpHは1.94であった。さらに、実際に人から摘出された種々の結石成分(COD、COM、UA、CaP、MAP)を培養液中に入れて結石が溶解されたか否かを検討した。CaPはよく溶解され、COD、COMも溶解することが出来た。UA、MAPに関しては、溶解することが出来なかった。次に、バクテリアがヒト尿中で増殖するための条件としては、チオ硫酸ナトリウムが必要であることがわかった。また、チオ硫酸ナトリウムの濃度は、濃度依存性で、濃いほどバクテリアは増殖することがわかった。In vivoの実験として、6週齢のラットを用い、膀胱内に、ヒト尿路結石を移植した。In vitroの実験と同様に、CaPはよく溶解され、COD、COMも溶解することが出来た。ただし、この実験系では、バクテリアを1度しか移植しておらず、今後、その投与方法を検討していく予定である。我が国において尿路結石症の罹患率は年々増加傾向にある。多くの尿路結石は体外衝撃波結石砕石術により結石を破砕することができるが、腎・`尿管には多数の小結石が残る。

また、5年以内に約50%の患者が尿路結石を再発することが知られている。さらに、長期間の体内カテーテル留置により尿中の結晶成分がカテーテル周囲に付着し、頻繁にカテーテルを閉塞させることが知られている。これらの結石の多くは溶解することが困難である。本年度においては人に害のないバクテリアを用いて結石ならびにカテーテルに付着した結晶を体内において安全に溶解する方法を確立することを目的とする。実験1.臨床的に人から摘出したカテーテルを一度滅菌したのち、バクテリアと一緒にヒト尿中にて培養しながら溶解をこころみた。2週間の培養にて結晶量の約50%が溶解されていた。実験2.ラットを用いた長期実験モデル(1ケ月間)により膀胱、腎臓の組織障害、尿路感染症の程度を観察した。また、血液検査もおこなった。組織障害はほとんど認めず、血液学的にも異常所見を認めなかった。ラット膀胱内にバクテリアと同時に入れた結石のうち、燐酸カルシウム結石が最もよく溶解されていた。結石溶解はバクテリアが産生する硫酸によりおこなわれていたと考えられた。産生された硫酸は膀胱から体外に排泄されることにより、組織障害をきたさなかったと考える。以上より、臨床においても安全に用いることが可能であることが示唆された。昨年度までの実験によりバクテリア(チオバチルス)の増殖条件が判明し、またラットを用いた短期動物実験により尿路結石をこのバクテリアにより溶解できることが判明した。本年度はさらに臨床に役立つようにするため、カテーテルに付着した結晶の溶解方法、ラットを用いた長期実験モデルの作成を開発した。2週間の培養にて付着結石の約50%が溶解できた。燐酸カルシウム結晶はよく溶解できたが、燐酸アンモニウムマグネシウムの結晶は溶解できなかった。実験2.ラットを用いた長期実験モデルにより膀胱、腎臓の組織障害、尿路感染症の程度について検討した。腹腔内、腎臓および膀胱の組織学的検討では明らかな障害をみとめなかった。実験3.臨床的に摘出された結石をラットの膀胱内に入れ、細菌による溶解を試みた。チオバチルスの栄養源であるイオウはチオ硫酸ナトリウムの形で腹腔内に一日おきに投与した。1ヶ月の実験モデルにより燐酸カルシウム結石においてはほぼ完全に溶解できることが判明した。シュウ酸カルシウム結石もわずかながら溶解されていた。ただし、尿酸結石、燐酸アンモニウムマグネシウム結石においては溶解できず、逆に結石の増大化を認めた。回収した結石を走査電子顕微鏡で観察したところ、結石表面に存在するThibacillus thiooxidansを確認した。細菌は、結石を溶解し、結石表面より中にもぐりこんでいるように見えた。この最近は結石に付着し硫酸を排出しながら結石を溶解しているものと推測された。以上より、一般の内服薬にて溶解不可能のカルシウム結石をこのバクテリアを用いて安全に溶解できることが判明した。
競争環境下電力市場における価格決定要因に関する研究

電気事業が規制緩和され、世界諸地域で電力市場が開かれている。本研究では、電力前日市場の市場価格データに対し、24時間前の電力市場価格や電力需要などを説明変数とする回帰式による分析と、カオス性解析を行い、その解析結果を元に、電力価格の決定要因や世界諸地域の市場間での相違などに関する検討を行った。まず昨今の原油高騰の影響を明らかにするために、電力需要・1日前の電力平均価格・WTI先物価格を説明変数とする回帰式を構成し検討した結果、原油価格が高騰し始めた2004年11月頃から05年後半にかけて、原油価格の影響が大きいことを明らかにした。また、電力需要は季節変動することから、1年間をピーク、オフピークの4期聞に分けた回帰式を構成し、Chow検定により構造変化を起こす時点を明らかにした。さらに、米国東部のNew England電力市場の冬ピーク期は強い冷え込みのために当てはまりが良くない傾向にあるため、新たに気温や気温関数を説明変数に加えることで、回帰式の当てはまりが改善されることを示した。しかし、このような自己回帰過程では、誤差項の系列相関や不均一分散が考えられるため、Cochran-Orcutt法でモデルの推定に非線形最小二乗法を用いて推定し、さらに、Newey-Westの修正を適用して、誤差項の系列相関や不均一分散に対し頑健なt値を計算し直した。この結果、説明変数の有意性を誤差項の系列相関や不均一分散を考慮しない場合には過大評価していたが、有意性そのものには問題がないことを確認した。最後に、日本卸電力取引所JEPXのシステムプライスに対し、非線形解析であるカオス解析も試み、埋め込み、フラクタル次元、リアプノフ指数などを算定した。その結果、現時点ではカオス性の具体的な存在は証明できないものの、その存在可能性を示す結果を得ることができた。本研究は、電気事業が自由化された諸地域の電力前日市場の価格データに対し、市場価格と電力需要などを説明変数とする回帰分析を行い、その結果を基に電力市場の価格決定要因と異なる市場間での相違について検討するものである。今年度は主に、強制プール市場と、プールとともに相対取引も平行して行っている市場を比較した。前者の例としてオーストラリアのNEM市場を、後者の例として米国のPJM市場とNew England市場、スペインのOMEL市場を取り上げ、それぞれの市場を比較検討した。その結果、春秋のオフピーク期の価格決定構造は、市場設計の違いに拠らず、本研究で用いた市場価格と電力需要を説明変数とする簡単な回帰式で十分表現できるが、需要が逼迫するピーク期においては市場設計の違いから価格構造に違いが現れることが明らかとなった。ところで、2005年夏頃から世界的な原油価格の高騰という外的要因が発生し、価格決定要因の解析に支障となっている。そのため、本研究では、電力価格決定要因を以下の2通りの解析を試みた。一つは、原油高と外的要因以前の定常的な価格決定要因を解析するために、2004年以前の米国New England電力市場データを解析対象とした。ピーク期の回帰式の当てはまりを改善するために、回帰式の説明変数として市場価格と需要の他に温度や不快指数など気象要因を説明変数に追加した。特に、ある基準温度以下でのみ値をもつコールド温度を導入することで、冬ピーク期の回帰式を改善することができた。また一つは、原油高の影響を確認するために、2005年のNew England電力市場価格に対しWTI原油先物価格を説明変数とする回帰式を構成し、Chow検定を用いて構造変化の有無を調べた。その結果、2005年9月頃までは電力価格と原油価格はともに高騰していたが、原油価格が一旦沈静化した9月以降、電力価格だけが高止まりしていることを明らかにした。

本研究では、電気事業が自由化された諸地域に開設されている電力前日市場で実際に取引された電力価格データに対し、前日の電力価格や電力需要などを説明変数とする回帰式による分析やその他の解析手法を用いて、その解析結果を基に、電力市場の価格決定要因や各市場における相違などに関する検討を行っている。本年度は特に、電力需要は季節的変動が大きいことから,季節毎に区分された回帰式の構成を試みた。そのために、1年を夏・冬のピーク期と春・秋のオフピーク期に分け、1年間を4期間にどの時点で分けることができるかについて、Chow検定などを用いて検証した。その結果、解析対象とした米国東部のNew England市場、PJM市場、豪州NEMMCO市場について、どの市場も毎年ほぼ同じ時点で市場価格に構造変化が生じていることを確認した。また、米国東部の冬ピーク期に関しては、前日の電力価格と電力需要だけを説明変数とする回帰式では当てはまりが悪いことから、新たに「コールド温度」という気温に関する説明変数を導入することで、決定係数の改善が可能であることを示した。さらに、2005年夏頃から世界的な原油価格の高騰という外的要因が発生しているため、燃料価格である原油価格の影響を考察し、電力前日市場の電力価格を被説明変数、電力需要・1日前の電力価格・WTI先物価格(原油価格)を説明変数とする回帰式を構成し、検討を行っている。また、時系列データである日本卸電力取引所JEPXの電力市場価格を対象にカオス性に関する検証を行い、埋め込み次元、構造性、フラクタル次元、リアプノフ指数を算定したところ、カオス性の存在は確認できないもののその存在を否定することはできない結果が得られている。今後、埋め込み条件の導出法やカオス特徴量解析法の見直し、また、各種の回帰分析結果とも照らし合わせ、電力市場価格の決定構造をさらに明らかにしたい。電気事業が規制緩和され、世界諸地域で電力市場が開かれている。本研究では、電力前日市場の市場価格データに対し、24時間前の電力市場価格や電力需要などを説明変数とする回帰式による分析と、カオス性解析を行っている。その解析を元に、電力価格の決定要因や世界諸地域の市場間での相違などに関する検討を行っている。自己回帰過程では誤差項の系列相関や不均一分散が考えられるため、今年度はまず、説明変数の有意性について再検証した。誤差項の系列相関モデルを、Cochran-Orcutt流の方法(Cochran-Orcutt法でモデルの推定に非線形最小二乗法を用いる手法)を用いて推定し、さらに、このような誤差項の系列相関や不均一分散が存在する場合のt値を計算するために、Newey-Westの修正を適用する。この結果、説明変数の有意性について、誤差項の系列相関や不均一分散を考慮しない場合には有意性を過大評価していたが、有意性そのものには問題ないことを確認した。以上の再検証の後、米国東部のNew England市場について回帰分析を行った結果、オフピーク期は24時間前の電力市場価格が価格の決定要因として年々影響を増しているのに対し、ピーク期は市場価格が高い場合には需要が価格の決定要因として大きく作用することが分かった。
深海底におけるメタンハイドレート堆積層の生産時安定性及び生産効 率の評価

深海底よりメタンハイドレート(以下:MH)生産時の地盤の安定性を評価するために供試体の観察が可能な低温高圧平面ひずみ三軸試験装置を開発し,MH胚胎砂のせん断試験およびMH分解実験を行った.その結果MH飽和率の増加による顕著な初期剛性および強度の増加が認められた.また観察窓からMH胚胎砂のせん断帯の発生が観察された.さらに,MH胚胎土の構成モデルをFEM解析に取り入れ,MH分解実験と同様の条件で解析を行い,解析結果の精度を検証した.(1)恒温、高圧平面ひずみ三軸試験装置を作成し、深海底条件で砂中にメタンハイドレートを生成する。(2)種々の温度、背圧条件でせん断試験を行い、グローバルな変形・強度を調べるとともに、観察窓から局所的変形挙動を調べる。(3)メタンハイドレート生産時を再現するために減圧法により、メタンハイドレートを分解し、それに伴う局所的地盤変形および温度変化を調べる。(4)これらの挙動を解析的に再現する。深海底よりメタンハイドレート(以下:MH)生産時の地盤の安定性を評価するために供試体の観察が可能な低温高圧平面ひずみ三軸試験装置を開発し,MH胚胎砂のせん断試験およびMH分解実験を行った.その結果MH飽和率の増加による顕著な初期剛性および強度の増加が認められた.また観察窓からMH胚胎砂のせん断帯の発生が観察された.さらに,MH胚胎土の構成モデルをFEM解析に取り入れ,MH分解実験と同様の条件で解析を行い,解析結果の精度を検証した.南海トラフなどに存在しているメタンハイドレートは,間隙充填型と呼ばれ,土粒子が堆積してできる間隙を埋めるように存在し,個々の土粒子をメタンハイドレートで固定するセメンテーション的な役割も担っている.そのため,メタンガスは,実地盤中でメタンハイドレートを分解し,取り出されることになる.本研究では,メタンハイドレートが分解されることに焦点を当て,分解されることによって,地盤がどのように変形するのか,分解されたメタンガスがどのように地盤中を移動するのかを実験的・解析的に明らかにし,地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価に役立てる.地盤の変形やメタンガスの移動がどうなるかが,非常に重要になってくるため,本研究において,メタンハイドレート堆積地盤が可視化できる模型実験装置を開発することとする.開発する模型実験装置を用いて,地盤の局所的な変形やメタンガスの浸透性について理解する.更には,模型実験で観察された挙動を表現しうるFEM解析コードを開発し,実際の生産に伴う地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価に適用する.開発した平面ひずみ型模型実験装置を用いて,実験装置の妥当性を検証する目的で砂に対して検討を行った.その結果が,従来の研究成果と同等と思われる実験結果が得られた.この結果を踏まえて,供試体中にメタンハイドレートを生成させ,実験を実施していく.模型実験と平行して,土-水-ガスー熱連成のFEM解析コードを開発した.そして,本解析コードを用いて南海トラフを対象とした生産井付近の変形挙動の評価を行った.その結果,減圧に伴いメタンハイドレートが分解し,地盤の力学強度が低下する.そのため,生産井周辺では圧密が進行すると共にせん断変形が生じ,ひずみが集中することが明らかとなった.本研究では,メタンハイドレートが分解されることに焦点を当て,分解されることによって,地盤がどのように変形するのか,分解されたメタンガスがどのように地盤中を移動するのかを実験的・解析的に明らかにし,地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価に役立てる.地盤の変形やメタンガスの移動がどうなるかが,非常に重要になってくるため,本研究において,メタンハイドレート堆積地盤が可視化できる模型実験装置を開発した.その開発した模型実験装置において実験を行い,一般的な力学挙動を取得できること,PIV画像解析手法を適用することにより,画像により局所変形が捉えられることを明らかにした.また,画像解析から,MH堆積土の方が豊浦砂よりもひずみの局所化が早いひずみレベルから生じていることが確認された.せん断帯が発生しない箇所は供試体全体と同様な収縮傾向を示す一方,せん断帯付近ではせん断帯の形成とともに体積膨張が顕著に起こることが確認された.これらのことから,体積膨張により透気性が高まり,メタンガスの移動が起こりやすくなる.この現象がMHの生産井付近で発生すると生産効率の上昇につながることが考えられる一方,メタンガスの漏洩のリスクが高まることも示唆された.開発したFEM解析コードを用いて,MH生産時に想定される地盤の長期の変形予測を行った.その結果,減圧源付近で収縮挙動が著しく,坑井直上の地盤沈下が最も大きいことが明らかとなった.さらに,MH堆積層と上部堆積層との境界面に最も大きなせん断ひずみが発生することが確認された.本研究より,減圧法の適用によるMH濃集層の変形は減圧源の違いによって大きく異なることが示唆された.本研究は,深海底地盤中のメタンハイドレートが分解されて開発されることに焦点を当て,分解されることによって,地盤がどのように変形するのか,分解されたメタンガスがどのように地盤中を移動するのかを実験的・解析的に明らかにし,地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価に役立てることを目的としている.

地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価については,地盤の変形やメタンガスが地盤中をどのように移動するかが,非常に重要になってくるため,本研究において,実地盤環境下を再現したメタンハイドレート堆積地盤が可視化できる模型実験装置を開発した.その開発した模型実験装置において実験を行い,一般的な力学挙動を取得できること,PIV画像解析手法を適用することにより,画像によりせん断変形中の局所変形が捉えられることを明らかにした.減圧法を模擬した分解実験より,初期せん断をホストサンドの破壊線を超えて与えた場合,メタンハイドレートの分解により,水圧の回復すなわち,有効応力の減少により,破壊に至ることが確認された.その際に発生するひずみの局所化は,圧縮試験の際と類似していることが確認された.圧縮試験の画像解析から,MH堆積土の方が豊浦砂よりもひずみの局所化が早いひずみレベルから生じていることが確認された.せん断帯が発生しない箇所は供試体全体と同様な収縮傾向を示す一方,せん断帯付近ではせん断帯の形成とともに体積膨張が顕著に起こることが確認された.これらの現象は,メタンハイドレートの分解実験時にも確認され,局所的な変形においても分解試験の現象は,圧縮試験の現象と類似していることが確認された.これらのことから,体積膨張により透気性が高まり,メタンガスの移動が起こりやすくなる.この現象がMHの生産井付近で発生すると生産効率の上昇につながることが考えられる一方,メタンガスの漏洩のリスクが高まることも示唆された.本研究は,深海底地盤中のメタンハイドレートが分解されて開発されることに焦点を当て,分解によって,地盤がどのように変形するのかを実験的・解析的に明らかにし,地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価を行うことを目的としている.地盤の安定性やメタンガスの生産性の評価については,地盤の変形やメタンガスが地盤中をどのように移動するかが,非常に重要になってくるため,本研究において,実地盤環境下を再現したメタンハイドレート堆積地盤が可視化できる模型実験装置を開発した.その開発した模型実験装置において実験を行い,一般的な力学挙動を取得できること,PIV画像解析手法を適用することにより,画像によりせん断変形中の局所変形が捉えられることを明らかにした.減圧法を模擬した分解実験より,初期せん断をホストサンドの破壊線を超えて与えた場合,MHの分解後の水圧の回復すなわち,有効応力の減少により,破壊に至ることが確認された.その際に発生するひずみの局所化は,圧縮試験の際と類似していることが確認された.せん断帯が発生しない箇所は供試体全体と同様な収縮傾向を示す一方,せん断帯付近では体積膨張が顕著に起こることが確認された.細粒分を含んだ模擬試料を用いた分解実験より,減圧側と蓮側の間で圧力差が生じることが確認された.これは,細粒分を含んだ模擬試料の透水性が低いことによるものと考えられ,実地盤においても,同様の圧力差が生じ,減圧箇所から変形が進行するものと考えられる.これらのことから,総合的に,圧力伝播の進展に伴うMHの分解とそれによる変形の進行,また,せん断的な破壊による局所的な変形などが複雑に発生し,ある部分では,体積膨張により透気性が高まり,メタンガスの移動が起こりやすくなる.
心筋症における心不全関連遺伝子の解析

1.心筋症の家系調査ならびに試料収集北陸地方を中心に心筋症の調査を行ない、新たに関連の認められない肥大型心筋症発端者患者23名、拡張型心筋症8名を見い出し、総計肥大型心筋症399家系、拡張型心筋症135家系を同定した。これらの新規患者に関して、計画実施案に従ってインフォームド・コンセントを得た後、家族に関する聞き取り調査、発端者ならびに家族の心電図、心臓超音波検査、遺伝子診断用採血(EDTA血10ml)を実施した。2.病因遣伝子の検索心筋症発端者患者に関し、末梢血白血球からgenomic DNAを抽出し、心筋βミオシン重鎖遺伝子、ミオシン結合蛋白C遺伝子、心筋トロポニンT遺伝子、心筋トロポニンI遺伝子の検索をPCR-SSCP法にてスクリーニングを行った。さらに、SSCPにて異常バンドが認められたものに対してはABI社製オートシーケンサーまたはSequencing-High(TOYOBO社製)を用いてDNA配列を調査しRFLP法にて確認を行った。3.AT1受容体遺伝子変異の検索上記遺伝子検索で病因遺伝子が同定されたもののうち、20歳以上の86名(心筋βミオシン重鎖遺伝子13名、ミオシン結合蛋白C遺伝子28名、心筋トロポニンT遺伝子16名、心筋トロポニンI遺伝子29名)を対象として、AT1受容体遺伝子A/C1166多型の検討を行った。その結果、A/C多型でA/A多型に比して心機能が低下していることが判明した。現在さらに計画実施案に従って他の遺伝子変異の有無ついて検討中である。4.情報の収集米国心臓病学会ならびに国内の心筋症ならびに遺伝子関連学会に出席し、心不全ならびに心筋症関連遺伝子に関する情報の収集を行った。
メタTOMに基づくTOM行動の情報処理:大人はなぜ子どもの嘘を見抜けないのか

本研究の目的は、大人が子どもの心の理解をどのようにするのかを明らかにすることであった。特に、以下の点について検討した。(1)TOM行動の認識における男女差があるのか。(2)TOM行動に認識における母親の育児不安や情緒不安がどのように影響するのか。(3)母親の母性とTOM行動に関係があるのか。(4)顔のどの部位で気持ちを読み取ろうとするのかを検討した。その結果、TOM行動の認識については、男性に比べ女性のほうが優れること、育児不安が心の推測に強く影響すること、母性愛の低い母親に比べ、母性愛の高い母親ほど子どもの心のサインを認識することが明らかになった。子ども数などの育児経験は、子どもの気持ちを推測する行動に影響することが認められなかった。本年度の研究では、TOM行動の認識における男女差について検討した。その結果、TOM行動の認識については、男性に比べ女性のほうが優れることが明らかになった。また、目や表情など顔の部位について、男性よりも女性のほうが優れることが認められた。他方、耳の部位については、女性に比べ男性の方がTOM行動の認識に優れることが示された。これらの結果は、TOM行動における認識について男性と女性の差は、身体のどの部位から心を推測する情報処理に差が見られることを示唆している。また、TOM行動に認識における母親の育児不安や情緒不安がどのように影響するのかを検討した。その結果、母親は目、表情、話し方を手がかりとして心の状態を推測していることが明らかになった。特に、育児不安が心の推測に強く影響することが示された。また、異なる年齢の男児と女児を持つ母親について差が見られることも明らかになった。母親の特徴として、目、表情、話し方が、鼻・耳に比べてTOMの認識が優れていた。また、表情や話し方のように、情報量の多い身体部位における情報の変化に基づいて、他者の心の状態を推測することが母親にとって容易であることも明らかになった。また、情緒不安との関係においては、目・表情・話し方が、耳と鼻に比べ有意に高かった。低情緒不安群では、目・表情・話し方が耳よりも優位に高かった。これらの結果は、TOM行動を認識の過程において、育児不安や情緒不安が影響していることを示唆している。また、このことは、母親の不安が強くなることによって、母親の子どもの心の状態の認識にネガティブな影響を与えることを示唆している。本研究では、母親の心の理論(TOM)、母親が子どもの気持ちを推測するメカニズムについて検討した。特に、母親のどのような要因が子どもの気持ちの推測に影響するのかを調べようとした。要因としては、母親の母性、子どもの数など育児経験、育児不安を取り上げ、それらの要因と母親の心の理論との関係を調べた。これらの要因を分析することにより、母親の心の理論(TOM)のメカニズムを明らかにしようとした。まず、母親の母性と心の理論との関係の関係について調べた。母親の母性については、子どもの気持ちを推測する行動に影響することが認められた。母性愛の低い母親に比べ、母性愛の高い母親ほど子どもの心のサインを認識することが明らかになった。特に、その傾向は顔の静情報よりも顔の動情報で認められた。次に、養育した子どもの数と心の理論の関係について調べた。すなわち、子どもの数が多いほど子どもの心の状態を推測することが認められなかった。さらに、母親の育児不安と心の理論との関係について調べた。育児不安は子どもの気持ちを推測する行動に影響することが認められ、育児不安の高い母親の方が子どもの嘘を認識することが認められた。母親は子どもの目、表情、話し方を手がかりとして子どもの嘘を認識することが認められた。これらの結果は、TOMを活性化するメカニズムに子どもの数のような育児経験よりも、母性や不安のように母親の心理的要因が重要であることを示唆している。子どもを育てた経験が子どもの心の状態を推測するのにどのように影響するのかを検討した。子どもを初めて育てる母親に比べ、子どもを多く育てている母親の方が、子どもの行動から子どもの心の状態をより適切に推測しようとするのではないかと予想した。母親に子どもの心のサイン認識尺度テストを提示した。子どもの心のサイン認識では、子どもが悲しいと感じているときの母親が子どもの心の状態を、子どもの行動から推測できるのかを評価した。

その結果、母親は子どもの心の状態を推測する際に、子どもの目、口、表情、歩き方、話し方の情報を有意に多く使うことが認められた。子どもの数が、一人か二人以上かによって、子どもの心の推測に有意差は見られなかった。また、母親の育児不安が男児と女児の嘘の認識を妨げるのかについて検討した。そのために、母親の育児不安テストと心のサイン認識尺度テストを実施した。認識尺度テストでは、子どもが嘘をついているときに、母親が子どもの心の状態を、子どもの行動から推測できるのかを評価した。その結果、育児不安が高いほど、子どもの心の状態についての認識が高いことが明らかになった。しかし、子どもが男児であるか女児であるかについては、有意な差が認められなかった。また、母親は、鼻や耳など動くことが少ない「静部位」よりも目や口、眉毛など動くことが可能な顔の部位である「動部位」を手掛かりにして、'子どもの心の状態を推測していることが示唆された。
蛋白質の可溶化のためのデザイン手法の開発

巨大な蛋白質や複合蛋白質の機能構造を知るために、(1)蛋白質の部分構造を安定に切り出す手法と、(2)その部分構造を可溶化させる方法が要求されており、これらの手法の確立が必要である。蛋白質の部分構造を切り出して可溶化させるためのデザイン手法を開発すること、さらにデザインされた部分構造が可溶であり安定な構造を形成することを検証することを目的に研究を行った。生物進化の過程では、ドメインやモジュールの融合がしばしば起きている。逆転写酵素におけるドメイン融合に際して、ドメイン接触部位では最低4個という数少ない適応的なアミノ酸置換が必要であったことを示した。これはそのまま、逆転写酵素からRNaseHドメインを切り離して、このドメインを可溶化するためのデザイン手法を与えている。本年度は(1)RNAポリメラーゼ中に存在するバルナーゼ様ドメインの可溶化をデザインし、化学合成を行った。可溶化には、進化的アミノ酸置換情報をもとにアミノ酸を置換する手法を確立した。この手法は、立体構造が未知の蛋白質に広く使える利点がある。(2)モジュールを欠失させたミニバルナーゼをデザインし、そのモデルの分子動力学計算を行って、可溶性と構造安定性を評価した。評価したモデルを化学合成し、CDとNMRの測定を行った結果、モジュール1個分(26残基)を欠いているにも関わらず、水に溶け、親蛋白質バルナーゼの立体構造に近い構造をとっていることがわかった。本研究を通して、可溶化の手法として、アミノ酸置換を取り入れる進化的手法とモジュール単位で切り出しを行う手法を開発し、分子動力計算と自由エネルギー評価に基礎をおいてデザインし巨大な蛋白質や複合蛋白質の機能構造を知るために、(1)蛋白質の部分構造を安定に切り出す手法と、(2)その部分構造を可溶化させる方法が要求されており、これらの手法の確立が必要である。本研究を通して、可溶化の手法として、アミノ酸置換を取り入れる進化的手法とモジュール単位で切り出しを行う手法を開発し、分子動力計算と自由エネルギー評価に基礎をおいてデザインし生命現象の基本となる機能には、蛋白質の複合体や蛋白質とRNAとの複合体が重要な役割を果たしてる。安定な構造を持つ部分構造が可溶化できれば、NMRやX線結晶解析を用いて、蛋白質部分の立体構造を決定することができるだけでなく、蛋白質の部分構造の機能、さらに蛋白質全体の機能をアサインすることができる。巨大な蛋白質や複合した蛋白質の機能構造を知るために、蛋白質の部分構造を切り出して可溶化させるためのデザイン手法を開発すること、さらにデザインされた部分構造が可溶性であり安定な構造を形成することを検証することを目的に研究を行った。本年度はRNAポリメラーゼ中に存在するバルナーゼ様ドメインの可溶化をデザインする予定であったが、予定を変更して、まず自然界で実際に行われたドメイン融合を解析し、その逆過程として可溶化手法を学ぶことからスタートした。生物進化の過程では、ドメインやモジュールの融合がしばしば起きた。逆転写酵素はRNaseHドメインと他のドメインとが融合した形である。逆転写酵素の立体構造と単独ドメイン型であるRNaseHIの立体構造が決定されている。融合型RNaseHドメインとの相同グループと単独型RNaseHIドメインとの相同グループのそれぞれにおいて、アミノ酸置換パターンをしらべ、両者の比較を行って、ドメイン接触部分での適応的アミノ酸置換の種類と位置を推定できた。その結果、ドメイン接触部位で最低14個の適応的なアミノ酸置換が必要であったことか示された。これはそのまま、逆転写酵素からRNaseHドメインを切り離して、可溶化するためのデザイン手法を与えたことになった。巨大な蛋白質や複合蛋白質の機能構造を知るため、(1)蛋白質の部分構造を安定に切り出す手法と、(2)その部分構造を可溶化させる方法が要求されており、これらの手法の確立が必要である。

生物進化の過程では、ドメインやモジュールの融合がしばしば起きている。逆転写酵素におけるドメイン融合に際して、ドメイン接触部位では最低4個という数少ない適応的なアミノ酸置換が必要であったことを示した。これはそのまま、逆転写酵素からRNaseHドメインを切り離して、このドメインを可溶化するためのデザイン手法を与えている。本年度は(1)RNAポリメラーゼ中に存在するバルナーゼ様ドメインの可溶化をデザインし、化学合成を行った。可溶化には、進化的アミノ酸置換情報をもとにアミノ酸を置換する手法を確立した。この手法は、立体構造が未知の蛋白質に広く使える利点がある。(2)モジュールを欠失させたミニバルナーゼをデザインし、そのモデルの分子動力学計算を行って、可溶性と構造安定性を評価した。評価したモデルを化学合成し、CDとNMRの測定を行った結果、モジュール1個分(26残基)を欠いているにも関わらず、水に溶け、親蛋白質バルナーゼの立体構造に近い構造をとっていることがわかった。本研究を通して、可溶化の手法として、アミノ酸置換を取り入れる進化的手法とモジュール単位で切り出しを行う手法を開発し、分子動力計算と自由エネルギー評価に基礎をおいてデザインした蛋白質の可溶性と安定構造を検証できた。
特徴対応異種画像統合法を用いた個人特定法医画像診断法の開発

本研究は、災害や事件・事故における損傷の激しい遺体の身元確認において、迅速かつ高精度で個人を特定し得る法医放射線画像診断法開発である。骨の描出に優れた「X線画像診断」と「死後画像診断(Ai)」の連携に着眼し、身元確認困難な遺体の個人特定を検討した。死後胸部CTと生前胸部X線の画像fusionによる個人特定能を検討した。その結果、生前胸部単純X線写真と死後CTからの胸部RaySum画像の融合による個人特定、少数候補者への絞り込みの実現可能性が示唆された。さらに本法による個人特定は画像特徴量解析を駆使することで高精度・高速判別を達成するAI診断への応用への基盤研究を計画することになった。1.胸部X線単純写真正面像(以下胸部X線)を撮影し、胸部CTを撮影した2040歳代の17人の患者画像を対象とした。胸部CTの骨陰影をもとに作成したvolume rendering正面像(以下CT-VR像)を作成し、画像診断医3人にそのCT-VR像を提示し、胸部X線17画像から視覚的に一致する画像を抽出させ、個人特定率を算出した。また同時に診断補助のマーカーとなった画像所見も解析した。視覚診断にて、胸部X線3候補まで絞り込めたのは7588%であり、5865%で個人を特定することが可能であった。また、視覚診断において診断補助のマーカーとなった画像所見は肋骨の形状や走行、胸郭の形状などであった。2.死後胸部CTと生前胸部X線の画像fusionによる個人特定能を検討した。成人15人の死後CT及び死亡1年以上前の胸部X線を用いた。画像ワークステーション(シナプスVINCENT)の2D-fusion機能を用いて気管分岐部、両側肺尖部、気管分岐部レベルでの両側胸郭内側縁を基準点とし、死後CT胸部冠状断縦隔条件と生前胸部X線を融合した。死後CTと生前X線の組み合わせ225通り、基準点が前3者の場合(3点法)と全5点の場合(5点法)の計450通りの融合像を作成し、平均誤差距離(mm)を求め評価した。その結果、3点法では4.13±2.99(対本人Cx-P)、5.61±3.08(対他人Cx-P)(p>0.05)、5点法で4.70±2.57(対本人Cx-P)、6.77±2.73(対他人Cx-P)(p<0.005)であり、5点法fusion法は、死後胸部CTと生前胸部X線による個人特定に期待ができると考えられた。しかも、骨陰影を画像マーカーとした場合が個人特定に有用であることが示唆された。画像ワークステーションを用いて死後CT画像と生前の胸部X線単純写真の比較検討は予定どおり実施できた。個人特定には胸部の骨陰影が重要であることが示唆された。平成27年度後半に特徴的画像マーカーのさらなる特定と、画像の保存→画像ワークステーションへのデータ転送→画像マーカーのコンピューター処理の検討を開始したが、研究代表者が放射線医学総合研究所に異動したため、研究実施体制の確立と再開に時間を費やさざるをえなかった。その分、研究予定が「やや遅れている」状況となった。しかし、平成27年度終盤より研究再開できており、平成28年度には所期の予定どおりの研究が遂行できるものと考える。本研究は、災害や事件・事故における損傷の激しい遺体の身元確認において、迅速かつ高精度で個人を特定し得る「法医放射線画像コンピューター支援システム」の構築・整備を最終目標とするものである。VINCENTの2D-fusion機能を用いて気管分岐部、両側肺尖部、気管分岐部レベルでの両側胸郭内側縁を基準点とし、死後CT胸部冠状断縦隔条件と生前胸部X線を融合した。その結果、5点法fusion法は、死後胸部CTと生前胸部X線による個人特定に期待ができる。しかし胸部X線は透視投影であり、CTは平行投影である。この投影方法の違いによる個人特定能への影響を検討する必要があるため検証を行った。その結果、背側部肋骨の拡大率は、平行投影<前後方向透視投影<後前方向透視投影の関係にあった。CTを後前方向透視投影(通常の胸部X線)により近い前後方向透視投影に処理して個人特定能を検討したが、明らかな向上は見られなかったが、CTを後前方向透視投影にした場合に、個人特定能が向上する可能性は見出された。本法による個人特定は、我が国が直面する大震災や津波災害・山火事・噴火災害や重大事件・事故時において遺族の精神的負担軽減や財政的課題にも大いに寄与すると期待される。画像ワークステーションを用いた死後CT画像と胸部X線写真の比較検討は順調に実施できた。胸部の骨陰影が重要であるとともに、肋骨の位置、肋骨間、胸郭の形が重要であることがわかった。その成果は国際英文雑誌に発表することができた。

研究代表者が異動のため研究実施再開に時間を要したが、論文発表もでき、所期の研究が継続できつつある。本研究は、災害や事件・事故における損傷の激しい遺体の身元確認において、迅速かつ高精度で個人を特定し得る「法医放射線画像コンピューター支援システム」の構築・整備を最終目標とするものである。骨の描出に優れた「X線画像診断」と「死後画像診断(Ai)」の連携に着眼し、身元確認困難な遺体の個人特定を検討した。死後胸部CTと生前胸部X線の画像fusionによる個人特定能を検討した。死後CT及び死亡1年以上前の胸部X線を用いた。VINCENTの2D-fusion機能を用いて気管分岐部、両側肺尖部、気管分岐部レベルでの両側胸郭内側縁を基準点とし、死後CT胸部冠状断縦隔条件と生前胸部X線を融合した。死後CTと生前X線の組み合わせ225通り、基準点が前3者の場合(3点法)と全5点の場合(5点法)の計450通りの融合像を作成し、平均誤差距離(mm)を求め評価した。その結果、5点法fusion法は、死後胸部CTと生前胸部X線による個人特定に期待ができる。次にX線写真とCTの投影方法の違いによる個人特定能への影響を検討する必要があるため検証を行った。その結果、背側部肋骨の拡大率は、平行投影<前後方向透視投影<後前方向透視投影の関係にあった。CTを後前方向透視投影(通常の胸部X線)により近い前後方向透視投影に処理して個人特定能を検討したが、明らかな向上は見られなかった。一方、CTを後前方向透視投影にした場合に個人特定能が向上する可能性は見出された。以上より生前胸部単純X線写真と死後CTからの胸部RaySum画像の融合による個人特定、少数候補者への絞り込みの実現可能性が示唆された。さらに本法による個人特定を画像特徴量解析を駆使することで高精度・高速判別を達成するAI診断への応用への基盤研究を計画することになった。我が国が直面する大震災や津波災害・山火事・噴火災害や重大事件・事故時において遺族の精神的負担軽減や財政的課題にも大いに寄与すると期待される。本研究は、災害や事件・事故における損傷の激しい遺体の身元確認において、迅速かつ高精度で個人を特定し得る法医放射線画像診断法開発である。その結果、生前胸部単純X線写真と死後CTからの胸部RaySum画像の融合による個人特定、少数候補者への絞り込みの実現可能性が示唆された。さらに本法による個人特定は画像特徴量解析を駆使することで高精度・高速判別を達成するAI診断への応用への基盤研究を計画することになった。平成27年度の研究成果により、骨陰影に着目した個人特定法確立という具体的目標ができた。研究代表者は放射線医学総合研究所に異動したものの、研究実施体制は再開できており、宮崎大学の分担研究者との連携も十分とれている。研究試料や画像ワークステーション装置は整備できており、研究費の一部を宮崎大学での研究実施費用に計上することで、所期の研究計画通り実施できるものと考える。画像ワークステーションを用いた死後CT画像と胸部X線写真の比較検討から、骨陰性に着目した個人特定法確立という目標ができた。今後は画像ワークステーションを駆使し、画像の保存→画像ワークステーションへのデータ転送→画像マーカーのコンピューター処理→特徴的画像
慢性酸化ストレスによる中枢ミネラルコルチコイド受容体の非ゲノム作用への影響

ラットに対し、片腎摘出および8%塩分負荷を行い全身および脳内の酸化ストレスを亢進させるモデルを作成した。その海馬スライスを用い、CA1領域のアルドステロンによるfieldEPSPsの増強が慢性酸化ストレスモデルにより減弱することを確認した。また別のスライス、HEK293細胞を用い酸化ストレスにより、細胞質分画のミネラロコルチコイド受容体発現は変わらないものの、膜ミネラロコルチコイド受容体の発現が減弱することを明らかにした。片腎摘出・塩分負荷モデルにおいて、脳内酸化ストレスが亢進し、それによりミネラルコルチコイドシグナルに変化を認めることが明らかとなった。しかし、脳内ミネラルコルチコイド受容体の発現調整が何によって行われているか(酸化ストレスによるミネラルコルチコイド受容体発現の変化が何によって規定されているのか)が、明らかとなっておらず、少しモデルを検討して行う予定である。同時に妊娠時のストレスで児に高血圧を呈するラットでも検討を行っており、このモデルに関しても脳内ミネラルコルチコイド受容体が変化することをとらえており、脳内ミネラルコルチコイド受容体シグナルが塩分感受性高血圧の一旦を担うものと考えている。このため視床下部特異的ミネラルコルチコイド受容体KOマウスを作成し、塩分負荷時の血圧変動も検討予定である。研究成果に関しては途中であるが、日本高血圧学会、国際高血圧学会(2012年10月および2014年6月)で発表済みあるいは予定である。高血圧・慢性酸化ストレスモデルである片腎摘出、塩分負荷ラットにおいても脳内酸化ストレスが増加していることをNADPHoxidaseコンポーネントの増加および、酸化ストレス増加の確認を4HNEおよび3Nitro Tyrosineで確認を行った。さらに酸化ストレスの増大がミネラルコルチコイド作用の非ゲノム作用が消失することをシナプス電位を測定することにより確認し、酸化ストレス除去剤あるいはアンギオテンシン受容体阻害剤で戻ることを確認した。この際膜のミネラルコルチコイド受容体が細胞内へシフトしていることを確認したが、酸化ストレスがどのようにミネラルコルチコイド受容体の発現制御をおこなっているかは不明であった。当該年度でさらに行う予定でった、脳室内への酸化ストレス除去あるいは、エピジェティック操作による血圧への変動に関しては、5'アザチオプリン投与による血圧上昇を認めているが、5'アザチオプリン投与によるミネラルコルチコイド受容体の発現量の変化などに関してはまだ未検討である。今後ミネラルコルチコイド作用に関して、海馬における非ゲノム作用にとどまらず、レニンアンギオテンシン系システムとからめ、脳内でのミネラルコルチコイド作用およびアンギオテンシン系のエピゲノムが血圧に与える影響に関して来年度はシフトしていく予定である。慢性酸化ストレスのミネラロコルチコイド受容体の非ゲノム作用に対する影響を検討するために、生後3週零SDラットに片腎摘出および8%塩分食塩負荷を行った。脳内酸化ストレスレベルを4HNEおよびnitrotyrosine量をウェスタンブロッティング法により評価したところ、片腎摘出+塩分負荷群において発現の増加を認め、酸化ストレスが増加していることが確かめられた。介入群として、ARB(アンギオテンシン受容体ブロッカー)、ヒドララジンという降圧薬を用いて血圧、脳内酸化ストレスレベルを評価した。血圧はARB,ヒドララジンともに同程度まで低下していたが、脳内酸化ストレスはARBで有意に低下していた。この状態での海馬CA1におけるfield EPSPsのアルドステロン投与による変化を検討したところ、塩分負荷群、塩分負荷+ヒドララジン群においてfEPSPsの上昇が消失した。ミネラロコルチコイド受容体の非ゲノム作用が消失する原因を検討するため、海馬スライスおよびHEK293を用い、酸化ストレスを加えた際の膜のミネラロコルチコイド受容体の発現量を検討した。すると酸化ストレスにより細胞質のミネラロコルチコイド受容体発現に変化は認められないものの、膜のミネラロコルチコイド受容体の発現低下がみられた。海馬においてミネラロコルチコイド受容体の非ゲノム作用は記憶の獲得に重要であることがすでに分かっており、慢性の酸化ストレスは、膜のミネラロコルチコイド受容体の発現を低下させることによって消失させていることが明らかとなった。高血圧2012年4月5日に出産をし、産休・育休を取得したこと、また2012年10月に所属が変更となり、異なるテーマをもつ大学院生の指導を行う必要があったことから、実験が一時中断となってしまい、その分の遅れが生じている。2012年4月5日に出産したこと(出産による受給延期の申請期限まで入院中であったため、書類を提出できず)、また10月に勤務先を異動したことによる。また血圧測定のためにテレメトリーを使用する予定であったが、その故障により、すでに用意してあったラットを用いることができず、再度ラットを用意することになったため遅延を余儀なくされた。ミネラルコルチコイド受容体の脳内での修飾を検討するために、異なるモデル(妊娠時ストレスによる高血圧発症モデル)での脳内ミネラルコルチコイド受容体発現変化を明らかとしたため、ミネラルコルチコイド受容体発現へのエピジェネティック修飾を検討する予定である。

また脳内ミネラルコルチコイド受容体ノックアウトマウスでの塩分感受性高血圧発症・脳内酸化ストレスの検討を行う予定である。テレメトリーシステムを新規移動先で購入予定(他の研究費より)であり、移動先で引き続き実験を行える環境が整いつつある。実験助手および大学院生の手助けを得ることができたため、マンパワーに関しては今年度より充実する予定である。また自身のエフォート率も昨年よりあがる予定である。民間助成金を花王より1,000,000円支給されたことや、前述より産休・育休・異動により実験計画が遅れていることによる。今後研究を精力的に行っていくことで使用していく。産休・育休分の進行の遅れを取り戻せない場合には、1年期間の延長を行うことも考慮する予定である。次年度はラットおよびマウスの新規購入に関して10万円程度、Primerの購入に関して30万円程度、抗体に関して20万程度、およびメチル化DNA抽出およびアレイに関して60万円程度と合わせて120万程度を予定している。さらに周辺の消耗品に関して10-20万程度を予定している。今年度実験が遅れてしまったために注文しなかった注文品などを今年度注文する予定である。
涙液脂質の網羅的分析によるドライアイの病態解析と治療法の開発

本研究は涙液試料から成分解析を行い、ドライアイの疾患マーカーを同定することを目的とした。液体クロマトグラフィを用いて網羅的な涙液分析を行った結果、涙液減少型ドライアイ患者では涙液中シアル酸濃度が低下していること、ドライアイ治療薬によって増加することが示され、シアル酸がドライアイの疾患マーカーとなると考えられた。一方、ソフトレンズ装用によるドライアイでは涙液中シアル酸の低下を認めず、角膜上皮の膜型ムチン減少が主な病態であることも示唆された。涙液中のシアル酸測定は、ドライアイのサブタイプ分類や病態解析、治療効果の判定にも有用である可能性が示された。ドライアイの病態解析や新しい治療法の開発には、涙液成分の詳細な分析が重要と考えられる。本研究では、濾紙で採取した涙液試料から液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて涙液成分解析を行った。涙液成分解析によって疾患マーカーや治療の標的分子を同定することで、ドライアイの新しい治療法に発展させていくことを目的とする。本年度はドライアイの新しい治療薬であるジクアホソルナトリウム(DQS)点眼液を投与した前後の涙液試料を用いて、涙液蛋白の網羅的解析と可溶性ムチンの指標としてシアル酸の測定を行った。涙液蛋白の解析は総蛋白、分泌型IgA、Lactoferrin、Lipocalin-1、Lysozymeとムチンの指標としてMUC5ACを比色法、ELISAまたはHPLCで定量した。シアル酸の測定はムチンから遊離させたシアル酸をDMB試薬で蛍光標識してHPLCで検出することで行った。正常者10例でのDQS単回点眼では、sIgA濃度の減少以外には、点眼前後で涙液蛋白成分に有意の変化はなかったが、シアル酸濃度は点眼前の133±43 μg/mLから点眼後5分で165±33 μg/mLと一過性の増加が見られた。ドライアイ患者25例に対する4週間のDQS点眼治療前後では、涙液蛋白ではいずれの測定値にも変化はみられなかったが、シアル酸濃度は点眼前の49±40 μg/mLから点眼後に77±93 μg/mLとDQS点眼後に有意に増加していた。したが、15分以降は両者とも点眼前と変化が見られなくなった。涙液中シアル酸濃度はドライアイ患者では低下しており、ムチン異常がドライアイの病態に関与していること、シアル酸濃度はDQS点眼によって増加することが示された。以上からドライアイの病態を示す涙液マーカーとしてシアル酸が良い指標となる可能性があると考えられた。本研究では、涙液試料から液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて涙液成分解析を行い、疾患マーカーや治療の標的分子を同定することで、ドライアイの病態解析を行った。本年度はソフトコンタクトレンズ(SCL)装用者のドライアイに対する2種類の治療薬、レバミピド(MC)とジクアホソル(DQS)の効果を臨床所見、膜型ムチンの蛍光強度、涙液中の蛋白・分泌型ムチンの分析から検討した。MC点眼ではSCL装用者16例を対象とし、2週間の試験期間で評価を行った。膜型ムチンの指標としてフルオレセイン標識レクチン(F-WGA)点眼後の角膜蛍光強度を用いた。シルマー試験紙で採取した涙液試料から涙液蛋白と分泌型ムチンの指標であるシアル酸をHPLCで測定した。MCの点眼前後で臨床所見の有意な変化はなかったが、F-WGAの有意な増加がみられた。涙液蛋白ではsIgAが有意に増加し、シアル酸にも増加傾向がみられたが、他は有意な変化を示さなかった。DQS点眼ではSCL装用者12例を対象とし、4週間の試験期間で評価を行った。DQS点眼前後の臨床所見では涙液層破壊時間(BUT)と角結膜染色スコアが有意に改善したが、シルマー値に変化はなかった。F-WGAには有意な増加がみられたが、涙液分析ではシアル酸、涙液蛋白などに有意な変化はみられなかった。ドライアイ治療薬であるMCやDQSの点眼後にはF-WGAの有意な増加がみられ、SCL装用者に対するドライアイ治療薬の点眼は、膜型ムチンを増加することで治療上有用である可能性が示された。また涙液減少型ドライアイでは涙液中のシアル酸濃度の低下が見られたが、SCL装用者では低下を認めなかった。サブタイプの病態の違いを示す涙液マーカーとしてシアル酸が良い指標となる可能性があると考えられた。ドライアイの病態解析や新しい治療法の開発のためには、涙液成分の詳細で網羅的な分析が重要と考えられる。

本研究では、ミクロ液体クロマトグラフィ(HPLC)とエレクトロスプレー質量分析計(ESI-MS)を用いて、濾紙で採取した涙液試料から蛋白、脂質の網羅的解析を行う。ドライアイ患者の涙液成分の網羅的解析によって病態形成に関与している涙液中の分子をスクリーニングし、疾患マーカーや治療の標的分子を同定することで、ドライアイの新しい治療法に発展させていくことを目的とする。本年度は正常者とドライアイの重症型であるシェーグレン症候群患者の涙液を用いて、涙液蛋白の網羅的解析とシアル酸の測定を行った。涙液蛋白の解析ではトリプシン消化を行った後にHPLCとESI-MSで分離・分析を行い、Mascotソフトウエアを用いて同定されたペプチドから候補蛋白を半定量的にリストアップした。正常者、シェーグレン症候群患者のいずれからも100程度の蛋白を検出することができた。両者を比較するとシェーグレン症候群患者涙液ではlipocalinやlactotransferrin, lysozymeなど涙液主要蛋白が減少する一方で、Protein S100-A9とMacrophage migration inhibitory factorが増加していることが明らかとなった。Protein S100-A9はマイボーム腺機能不全で増加が報告されており、ドライアイの疾患マーカーとなる可能性があると考えられた。また、シアル酸の測定はムチンから遊離させたシアル酸をDMB試薬で蛍光標識してHPLCで検出することで行った。正常者での涙液中シアル酸濃度は200nmol/mL程度であったのに対し、シェーグレン症候群患者涙液では100-130nmol/mL程度と低下がみられ、ムチン異常がドライアイの病態に関与していることが示唆された。涙液成分の網羅的な分析として、前年度にHPLCとESI-MSを用いたプロテオーム解析を行い、シェーグレン症候群患者涙液で上昇する蛋白成分としてProtein S100-A9とMacrophage migration inhibitory factorの2つを同定した。しかし、多数例で検討するためのELISA法による測定が確立できておらず、多数例での結果確認ができていない。測定方法を確立して、上記の2つの蛋白分子がドライアイの疾患マーカーとなりうるか検討を進める必要がある。正常者、ドライアイ患者でジクアホソルナトリウム(DQS)点眼液の投与前後の涙液試料を用いて涙液蛋白の網羅的解析とシアル酸の測定をHPLCで行った結果、涙液の主要な蛋白には大きな濃度変化がみられない一方で、シアル酸濃度はドライアイ患者では低下しており、DQS点眼治療によって増加することが示された。シアル酸は涙液の安定性に寄与する重要な因子と考えられている可溶性ムチン由来であり、ドライアイの病態を示す涙液マーカーとしてシアル酸が良い指標となる可能性があると考えられた。今後、症例数を増やして分析を進めて行きたい。涙液成分の網羅的な分析として、蛋白に関してはHPLCとESI-MSを用いた方法を確立し、シェーグレン症候群患者涙液で上昇する蛋白成分としてProtein S100-A9とMacrophage migration inhibitoryfactorの2つを同定することができた。今後、ELISA法などを用いて多数例で結果を確認していく必要がある。また、候補分子の機能解析なども行い、病態との関連を検討する必要がある。涙液の安定性に寄与する重要な因子と考えられている可溶性ムチンに関しては、シアル酸を指標とした分析方法が有用である可能性を示すことができた。