hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経芽細胞種におけるアポトーシス・エンドヌクレアーゼの分子生物学的研究

昨年の研究で神経芽細胞腫(以下本症と略す)培養細胞株16種を入手し、アポトーシス誘導剤(アクチノマイシンD、アドリアマイシン、カンプトテシン)によるアポトーシス発現を検討した。その結果、本症培養細胞株は、アポトーシスのDNA断片化の観点より、大断片化すら誘発されない株、大断片化のみ起こる株、およびヌクレオソーム単位でのDNA断片化による典型的なladder structureを示す小断片化まで誘発される株の3種類に分類することが出来た。本年度はDNA大断片化を司るDNaseλに関して、本症培養細胞株TGW株(DNaseλ活性陽性)とGOTO株(同酵素活性陰性)を用いて比較検討することによって本酵素の同定研究を進めた。TGW株の細胞核を用いたautodigestionの系においてDNA大断片化のin vitroでの再現を目指したところ、約20kbのDNA断片の生成が確認され、細胞レベルで観察されるDNA大断片化がin vitroで再現できることが確認された。このautodigestionの系を用いて、DNA断片化を示さないGOTO株およびヌクレオソーム単位でのDNA断片化を示すSK-N-SH株について、in vitroにおけるDNA断片化の再現を検討した。その結果、いずれの株においても細胞レベルで観察されるDNAの状態が再現された。また、ヌクレオソーム単位でのDNA断片化を司るDNaseとしてDNaseγが報告されているが、本症培養細胞株の代表的な3株(TGW株、GOTO株、SK-N-SH株)におけるDNaseγの遺伝子解析を目的としたサザン、ノーザンブロッティング解析のために、各培養細胞株を凍結した。(1)神経芽細胞種(以下本症と略す)培養細胞株16株を入手し、アポトーシス誘導剤(アクチノマイシンD、アドリアマイシン、CPT11)によるアポトーシス発現を検討した。その結果、本症培養細胞株は、アポトーシスの観点より、大断片化すら誘発されない株、大断片化のみ起こる株、および典型的なladder structureを示す小断片化まで誘発される株、の3種類に分類できる可能性が示された。(2)DNA大断片化を司るDNaseλに関して、本症腫瘍細胞株TGW株(DNaseλ活性陽性)とGOTO株(同酵素活性陰性)を用いて比較検討することによって本酵素の同定研究を進めた。両培養細胞株をヌードマウス各10匹ずつの皮下に移植し、腫瘍組織塊を採取した。その際、1匹のヌードマウスの背部皮下4ケ所に接種し、径10mm大の半球状に増殖した時期(中心壊死のない時期)で摘出し、液体窒素中で急速凍結後に-80度Cで保存した。それぞれ、約30gの新鮮腫瘍組織が得られた。(3)ヌードマウス皮下移植継代3株(GOTO,TGW,SK-N-SH)に関して、皮下腫瘍が径5mm大に増殖した時点で担がんマウス(各群6匹)にアポトーシス誘導剤(アクチノマイシンD、アドリアマイシン、CPT11)をLD50の3分の1量腹腔内投与し、2日後に摘出・即凍結し、アポトーシス断片化の有無とその局在性検討の試料として保存した。(4)本症マス・スクリーニング症例の未治療凍結組織12検体、非マス症例の腫瘍凍結組織6検体を入手・保存した。次年度には、これらの臨床例の予後とアポトーシス発現の有無との関連を分析する。

本年度はDNA大断片化を司るDNaseλに関して、本症培養細胞株TGW株(DNaseλ活性陽性)とGOTO株(同酵素活性陰性)を用いて比較検討することによって本酵素の同定研究を進めた。TGW株の細胞核を用いたautodigestionの系においてDNA大断片化のin vitroでの再現を目指したところ、約20kbのDNA断片の生成が確認され、細胞レベルで観察されるDNA大断片化がin vitroで再現できることが確認された。このautodigestionの系を用いて、DNA断片化を示さないGOTO株およびヌクレオソーム単位でのDNA断片化を示すSK-N-SH株について、in vitroにおけるDNA断片化の再現を検討した。その結果、いずれの株においても細胞レベルで観察されるDNAの状態が再現された。また、ヌクレオソーム単位でのDNA断片化を司るDNaseとしてDNaseγが報告されているが、本症培養細胞株の代表的な3株(TGW株、GOTO株、SK-N-SH株)におけるDNaseγの遺伝子解析を目的としたサザン、ノーザンブロッティング解析のために、各培養細胞株を凍結した。
摂食時の唾液分泌調節機構に関する研究

摂食時の唾液分泌は、視床下部外側野(LH)の調節を受けていることが考えられる。顎下腺・舌下腺の副交感性の一次中枢である上唾液核(SSN)神経に対するLH局在の摂食促進ペプチドであるメラニン凝集ホルモン(MCH)の影響を調べた。SSN神経はMCH受容体を発現しておらず、またMCHに対して無応答であった。従って、LHによるSSN神経の調節は他の伝達物質、例えばオレキシンにより行われている可能性がある。1.電気生理学的実験(パッチクランプ法を用いた解析)顎下腺・舌下腺支配の上唾液核(SSN)ニューロンにおいて、メラニン凝集ホルモン(MCH)による膜電位応答をホールセルパッチクランプ法電流固定実験により分析した。SSNニューロンはMCH投与(100 pM)により脱分極するものがあったが、反応しないものもあった。MCHと同じく摂食中枢(視床下部外側野)に局在するオレキシンは、同じ用量でほとんどのSSNニューロンに対して発火または脱分極を起こした。今後は更に例数を増やしてMCHのSSNニューロンに対する影響を明らかにするとともに、その調節機構を明らかにしたい。ホールセルパッチクランプ法を用いた電気生理学的実験は、アンプの故障により前年度はほとんど実験をすることが出来なかったのでH27年度は、本実験を集中的に行った。多くのラット顎下腺・舌下腺支配の上唾液核(SSN)ニューロンは、膜電位を-70mVに固定し時のメラニン凝集ホルモン(MCH)投与(100 nM)に対して応答を示さなかった。応答を示したニューロンの応答でも非常に高い濃度(1 mM)のMCHに対して10 pA以下であった。一方、MCHと同じく摂食中枢(視床下部外側野)に局在するオレキシンは、100 nMの投与で多くのSSNニューロンを興奮させた。オレキシンのサブタイプはオレキシンAとBの2種類があるが、オレキシンAが効果的で、調べた約7割のニューロンにおいて内向き電流を発生し、また脱分極を示した。脱分極を示した約4-5割のニューロンは活動電位の発射を伴った。免疫組織化学的にSSNニューロンにおいてMCHに対する受容体(MCHR1とMCHR2)を検索した。MCHR1とMCHR2に対する免疫活性は現在のところ検出されていない(n=2)。例数を増やして結論しなければならないが、電気生理学的実験の結果も合わせて考えるとMCHに対する受容体はほとんど存在しないのかもしれない。従って、摂食中枢からSSNニューロンへのMCHを介する入力はほとんど無いかもしれない。対照的にSSNニューロンはオレキシンを介する興奮性入力(調節)を受けていることが示唆された。H26年度に、ホールセルパッチクランプ法を用いる実験でアンプの故障(修理不能)により急きょ購入(輸入)することになり、また免疫組織化学的実験に使う抗体も製造中という重なったトラブルのため計画がずれ込んだため。H27年度に引き続き、主にホールセルパッチクランプ法により電気生理学的および免疫組織化学的分析を行った。両実験ともに顎下腺・舌下腺支配のラット上唾液核(SSN)ニューロンは、蛍光標識により同定して実験を行った。成熟ラットSSNニューロンに発現するMCH受容体(MCHR1とMCHR2)を調べたところ、免疫活性は検出されなかった(n=4)。興奮性作用を調べるために幼弱ラットSSNニューロンの膜電位を-70 mVに保持し、テトロドトキシン存在下で1 mMメラニン凝集ホルモン(MCH)を投与した。その結果、内向き電流を示すニューロンは観察されず、またランプ波刺激(-110 mV-20 mV)に対してもコントロール応答(灌流液)と変化なかった(n=10)。一方、摂食促進作用を有する神経ペプチドには、MCHと同様に視床下部外側野(摂食中枢)にオレキシンが存在する。また視床下部の弓状核などには神経ペプチドY(NPY)が豊富に存在する。MCH投与を行った同じ記録ニューロンに対して、NPYは内向き電流は誘発しなかったがオレキシンは100 nMで大きな内向き電流を誘発した。またオレキシンはランプ波刺激に対して傾斜が大きくなった(入力抵抗の増大)。一部のSSNニューロンは抑制性作用を調べるために膜電位を0 mVに保持してMCHを投与したが、外向き電流は観察されなかった。これらの結果から、以下のことが考えられる(1)MCHはSSNニューロンに興奮性および抑制性応答ともに示さない。そしてこれらの電気生理学的結果は免疫組織化学的結果により支持された。(2)摂食により分泌される唾液は、オレキシン作働性あるいはグルタミン酸作働性神経によって調節されるのかもしれない。パッチクランプ実験に使用するアンプが修理不能となり新たなアンプを購入することになったが、輸入の為に時間が掛かった。その為SSNニューロンのMCHによる調節機構を十分に解析することが出来なかったから。実験装置や抗体は整っているので急いで実験を進めている。

またin vivo実験の予備実験も遂行していたので速やかに予定の計画に戻ることができると思われる。口腔機能の自律神経性調節機構に関する研究新たに購入したアンプは調子よく、まず十分解析できなかったMCHによるSSNニューロンの調節機構を解析する。免疫組織化学的実験も、使用予定だった抗体が製造中のため、年度内に納入することが出来なかったが、新年度早々に入手できそうなので遅れを取り戻すことが出来そうである。電気生理学的実験に使用する増幅装置が故障したために、予定していなかった増幅装置の購入により実験動物や試薬など消耗品に使う予算がやや不足しているので次年度に引き継ぎたい為。使用予定だった抗体が製造中だった為に年度内に納入することが出来ず、予定していた実験を遂行することが出来なかった為。実験動物や試薬などに使用する計画を立てている。その抗体は、H27年5月に納入される予定なので早々に実験を遂行する計画である。よって繰越金は速やかに使用される予定である。
多様なエネルギー資源の利用(連絡班)

本研究班は、石油に代る有力なエネルギー資源として、石炭、バイオマス、太陽熱、ウランに注目し、これら資源のクリーンで安全でかつ効率の良い利用技術の早急な開発を目的に、6つの研究班を組織して相互に緊密な連絡をとりながら強力に研究を遂行している。石炭変換用高活性・高選択性触媒の開発班では、石炭の低温ガス化、CO/H_2比調節用触媒の開発、合成ガスから高オクタン価ガソリン、ディーゼル軽油、C_1C_3混合アルコールを生産する触媒、ならびにメタノールをガソリンへ変換する新規触媒の開発に顕著な成果が得られた。石炭の新しいガス化プロセスの開発班では、石炭の迅速熱分解、超臨界ガス抽出において、石炭転化率、液状収率の大幅向上、選択性改善に成功した。さらに、噴流層型ガス化装置の開発、高温ガス化を可能とする要素技術の開発、高温乾式脱硫剤の開発に大きな成果が得られた。生物燃料直接醗酵菌の育種班では、バイオマスをエタノール等の液体燃料へ効率的に変換するために、糖化と醗酵を同時に行える微生物の育種を目ざして、数種の遺伝子・酵素のクローン化に成功した。リグニンの低分子化によるバイオマス変換前処理の研究班では、マイクロ波照射、加溶媒分解、担子菌による脱リグニン、爆砕、炭酸ガスレーザー照射等の種々の前処理法の開発、実用化の可能性が検討された。太陽熱エネルギーの資源化に関する研究班では、太陽熱とヒートポンプの複合システムおよび太陽熱利用乾燥システムについてソフトとハードの両面より検討され、システムの熱力学的解析、混合冷媒利用によるヒートポンプの高性能化、吸収式ヒートポンプの開発等がなされた。海水ウラン採取に関する研究班では、海水ウランを工業的に採取する技術の確立を目的に、耐久性のある吸着剤製法の確立、海流・波力を利用して接触効率を向上させる新規吸着装置の開発が推進された。
花粉分析による高時間解環境復元とその限界-長野深見池 年縞堆積物による性能評価

深見池から12本の堆積物のコアを採取した。年縞は平均3%程度の欠損が認められた。バイオマイゼーションでの潜在自然植生の復元結果では植生の微妙な変化をとらえる事が可能であることがわかった。定量的気候復元では1年毎での復元は現実的でなく10年.20年程度のまとまりで行うのが適当である事がわかった。また、気温では秋と冬では良い結果が得られたが、春夏は精度が悪く、降水量に関しては微妙な変化はとらえられない事が判明した。本研究は,歴史記録の豊富に残っている江戸時代以降に形成された長野県下伊那郡にある深見池の年縞堆積物を利用し,年縞の年毎の動向を詳細に調べ,江戸時代から現在までの花粉分析を1年から10数年の極めて高い時間分解精度で分析して,環境史イベントや気候の復元を行う事を目的としている。22年度には年縞堆積物の花粉分析を含む各種分析での精度を確認するためのモデル地の深見池で堆積物を採取した。9月に長野県下伊那郡阿南町の深見池で、マッケラスコアラーを使って4mの連続コアを12本、採取した。また、最上層部は表層サンプラーで5本採取し、凍結保存した。コアの最深部は深見池が形成された1662年に到達していると考えられる。コアは花粉分析、可視吸光度、含水率、比重、無機、CNS、同位体、近赤外分光分析などの分析用に分けた。現在、年代を決定するために年縞のクロスデーティングを行い、最上層部を除く上部の50年分の年代がわかっている。この部分の花粉分析はすでに行っており、そのデータと歴史記録、気象記録の比較を行っている。また、定量的気候復元も行った。今後、できるだけ早い時点で1662年までの年代を決定し、花粉分析を行う予定である。花粉分析による定量的植生と気候復元のための基礎データの収集のため表層花粉のサンプルを採取も平行して行った。22年度はデータの少ない中部地方の44サンプルを採取し分析を始めている。また、これまで採取し、分析した44サンプルのデータを気候復元のための書式にして、これまで公開されていた日本の表層サンプルデータに追加し公表した。さらに、これまでに採取した冷温帯を中心とした表層花粉のサンプル、約80サンプルの分析も進行中である。22年度に採取した11本のコアの年縞堆積物の縞のカウント及び、年輪年代学を応用して年縞の連続性を調査した結果、2.92%の縞の欠如が確認された。そして、6月にイギリスで研究協力者と分析の方針の打ち合わせをした。また、22年度に行った花粉分析の結果の一部を米国セントルイスで開かれた植物学の合同大会で発表した。そして、年縞の年代の確実な2本のコアの上部(1920年から1980年)の花粉分析を行い、モダンアナログ法による気候復元を試み、気象データと比較した。年平均気温の復元では1年ごとの復元で気温の上昇、下降をある程度反映していうことがわかった。しかし、よく一致する部分とそうでない部分があり、さらに検討が必要である。気温は夏が低く、冬が高く復元される傾向にある。気象データのパターンには春夏より秋冬のほうがマッチする。降水量についてはどの年の復元も平均値に近く、復元はあまり良い結果とは言えない。降水量の復元には問題があるようである。また、記録にある米の不作の年とイネ科の花粉の流入量の比較を行ったが、深見池は長野県でも南部にあるため、長野県の作柄のデータとあわせて愛知県または静岡県のデータとの比較も検討する必要がありそうである。バイオマイゼーションと定量的気候復元の精度向上のために表層花粉試料を採取も行った。目標を上回る22地点での採取をした。22年度に採取したものの分析はほぼ終わらせているが、23年度分は現在分析中で、両方のデータを今後の定量的気候復元に反映させる予定である。深見池の12本のコアの年縞を比較し、下部の薄い層でも平均1cmあるにも関わらずコアにより欠損があることがわかった。湖沼全体に均一に堆積するのではなく、場所により堆積量が変化していた。平均すると年縞の3%程度の欠損が認められた。年縞堆積物でも3%程度の誤差があることを踏まえて復元結果を考察していくことが必要である。長野県の歴史記録によると、周辺では環境に関連した歴史的な出来事が多数記録されている。堆積物のイベント層と比較すると堆積物から復元出来る出来事は限られているが、少なくとも湖沼の周辺で起こった洪水や大地震などの出来事ははっきりと記録されていた。花粉分析結果では、周辺の植物を含む多くの花粉分類群が検出されていることから、周辺の植物相を反映したものであると言える。1900年代には植物相は大きく変化していなかった。

バイオマイゼーションでの潜在自然植生の復元結果を気象庁の観測データと比較すると、かなり微妙な気候の変化による植生変遷が反映されていた。湖の堆積物が周辺の植生の微妙な変化をとらえていたと言えるだろう。また、日本でのバイオマイゼーションの精度は非常によいことがわかった。定量的気候復元では、新たに分析した40地点の表層のデータを加え、気温と降水量の復元をし、比較した。降水量と春と夏の気温の復元が難しいことがわかった。その他は比較的よく復元される。しかしながら、1年毎の復元では、平均値は実測値に近い値に復元されるものの、相関が悪い。10年20年程度のまとまりで相関が良くなる。最近の傾向として、高分解能の分析がなされるようになってきているが、15年というような高分解の分析では実際の気候が反映されているかどうかはわからない。この結果はあくまで長野県深見池の花粉分析結果によるもので、他地域について同様のことが言えるかどうかは不明である。今後の検討が必要であろう。歴史記録年代軸の決定、焦点としている時代の花粉分析はほぼ終わっているが、表層花粉のデータの整理が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今まで知られていなかった年縞堆積物の採取地点による不連続性が明らかになり、その結果を踏まえて年代のはっきりしている部分での花粉分析結果が得られている。それを基に気候復元をして、どの程度の精度があるか実際の気象記録と比較検討中で、さらに詳しく分析を進め、花粉分析の精度を深見池を例にして、論文を国際誌に投稿する予定である。それにあたり、表層花粉データの分析・整理を早急に進める。また、歴史記録の1つとして、米の不作について検討を進めている。深見池の位置の関係上、長野のみでなく、東海地方の不作も花粉データには現れていることが解ってきた。東海地方の不作のデータも整理し、さらに検討の上、国際誌に発表する予定である。
大脳-赤核系による古典的条件反射の初期過程と後期過程

1.学習の初期及び後期の神経メカニズムを探究することを目的に、高等哺乳動物の限局された神経回路を用いた学習標本を確立した。2.学習標本はネコの赤核脊髄路を介する古典的条件付けである。大脳皮質から赤核への入力線維とノルアドレナリン・ニューロンの主要神経核である青斑核の刺激を組み合せることによって、大脳-赤核線維の刺激に対する前肢の屈曲応答を条件付けた。3.屈曲応答の潜時(8.2ミリ秒)は、大脳-赤核脊髄路の最短伝導時間に対応する。4.屈曲応答の獲得は、2つの刺激を120ミリ秒の間隔で組み合せたとき、約1週間の時間経過で成立し、その後20日間以上も保持される。どちらか一方の刺激のみ与えた場合には、条件応答は獲得されず、この条件付けが連合学習のカテゴリーに入ることを結論した。5.屈曲応答の獲得に並行して、大脳-赤核線維の刺激に対する赤核細胞の興奮性応答が上昇していることが、ユニット記録により示された。すなわち、赤核細胞の発火応答は、2つの刺激を組み合せて与えたネコで特異的に高く、一方の刺激のみ与えられていたネコでは、刺激を与えない群と同様の応答しか得られなかった。6.大脳-赤核線維の刺激に対する赤核細胞の興奮性応答の増強は、刺激開始から3ミリ秒以内の単シナプス性応答に現れた。このとき、赤核細胞の自発発火のレベルや、もう一つの興奮性入力である小脳中位核の刺激に対する応答に変化が見られないことから、条件付けによって大脳-赤核シナプスの伝達効率が上昇したと考えられる。7.カテコールアミンの合成酵素(チロシン水酸化酵素・ドーパミンβ水酸化酵素)やレクチン(PHA-L)を用いた免疫組織化学法により、青斑核から赤核への投射が示唆された。8.大脳皮質及び青斑核由来の伝達物質候補の赤核細胞に対する作用については脳切片法を用いて現在検討中であり、2入力の組み合せの初期過程の研究が期待される。
トキソプラズマ感染細胞におけるシャペロン、トランスポーターの抗原提示機能の解析

我々はトキソプラズマ原虫に代表される細胞内寄生原虫感染における感染細胞内の抗原提示機構について研究を進めており、今までに1)トキソプラズマ感染細胞がトキソプラズマ抗原を細胞内で抗原処理しMHCクラスIあるいはクラスII分子結合オリゴペプチド抗原として感染細胞特異的CD8^+CTL、CD4^+増殖性T細胞、CD4^+CTLに抗原提示することを明らかにし、2)トキソプラズマ感染細胞特異的CTLが認識するMHCクラスI分子結合オリゴペプチド(T細胞エピトープ)のアミノ酸解析に成功し、表面プラズモンレゾナンスにより合成トキソプラズマSAGlベプチド289-297が感染細胞特異的CD4^+CTLに強い抗原性を示すT細胞エピトープであることを報告した(Biochem.Biophys.Res.Commun.236:257-61,1997)。本研究ではさらに、感染細胞内抗原処理・提示機能分子である分子シャペロン、トランスポーターの抗原処理・提示機能の解析を進め、3)細胞内蛋白質のフォールディング、オリゴマー形成、分子の膜貫通・移動などの抗原提示機序に不可欠であり、且つその分子構造がMHCクラスI分子に酷似する分子シャペロンである熱ショック蛋白質HSP70がトキソプラズマ感染宿主細胞における抗原提示機能分子として存在し、トキソプラズマ感染ヒトメラノーマから得たHSP70が感染細胞特異的CTLのエピトープとなることを明らかにした(Microbiol.Immunol.41:553-561,1997)。又さらに、トキソプラズマ表面抗原や抗原提示機能分子による抗原提示細胞の抗原提示能修飾により誘導される細胞性免疫反応を介したワクチン開発を目的として、トキソプラズマ主要表面抗原SAGl遺伝子をマウスTAPトランスポーター欠損腫瘍細胞株RMA.Sに遺伝子導入した。RMA.Sは強力な抗原提示能をもち、このSAGl遺伝子導入抗原提示細胞株でマウスに免疫することにより、トキソプラズマ感染細胞特異的細胞性免疫が誘導されトキソプラズマ強毒株(RH株)感染に対するex-vivoワクチン効果が得られることを明らかにし報告した(9^<th> International Congress of Parasitology Tada,I.et.al.(eds)Monduzzi Editore,p69-75,1998;Microbiol.Immunol.43(1),87-91.1999)。我々はトキソプラズマ感染細胞のトキソプラズマ抗原提示機構について研究を進めており、今迄にトキソプラズマ感染細胞がトキソプラズ抗原を細胞内で抗原処理し、MHCクラスIあるいはクラスII分子結合オリゴペプチド抗原として感染細胞特異的CD8^+細胞傷害性T細胞(CTL)、CD4^+増殖性T細胞、或いはCD4^+CTLに抗原提示することを明らかにして来た。本年度は更に、表面プラズモンレゾナンスにより、HLA-A2分子への9-mer合成トキソプラズマSAG1抗原ペプチドの結合性を解析し、HLA-A2分子に強い結合性を示したSAG1 289-297ペプチドが感染細胞特異的CD8^+CTLに対し強い抗原性を示すT細胞エピトープであることを明らかにして報告した(Biochem. Biophysi.Res.Commun.236:257-261,1997)。

また、以上の研究背景を基に、細胞内蛋白質のフォールディング、オリゴマー形成や、分子の膜貫通・移動などの抗原提示機序に不可欠な分子群と考えられる分子シャベロンの解析を進め、トキソプラズマ感染ヒトメラノーマから得た熱ショック蛋白質H_<SC>70が感染細胞特異的CTLのエピトープとなることを報告した(Microbiol.Immunol.41:553,1997)。現在、トキソプラズマ感染宿主細胞内における抗原提示分子としてのシャベロントランスポーターの抗原処理・提示機能の分子論的解析を目的としてT_<ap>トランスポーター欠損変異細胞株RMA.SとWild株にヒト及びトキソプラズマH_<sp>70(H_<sc>70)遺伝子を導入し、H_<sp>70(H_<sc>70)抗原提示能の比較解析を進めている。既にリコンビナント・ヒトH_<sc>70、ヒトH_<sc>70に対するモノクローナル抗体、およびリコンビナント・トキソプラズマH_<sp>70を作製済みである。RSA.Sは強い抗原提示能をもち、遺伝子導入抗原提示細胞株による細胞性免疫反応誘導を目的としたワクチン開発を考えている。マラリアやAIDSを始め細胞内寄生体感染症に対するワクチン開発(防御免疫の誘導)は世界的に困難をきわめている。我々はトキソプラズマ原虫に代表される細胞内寄生原虫感染における感染細胞内の抗原提示機構及びT細胞エピトープの解析について研究を進め、1)トキソプラズマ感染細胞がトキソプラズマ抗原を細胞内で抗原処理し、MHC分子結合オリゴペプチドとして感染細胞特異的CD4^+CD8^-あるいはCD4^-CD8^+CTLに抗原提示することを明らかにし、2)感染細胞特異的CTLが認識するMHCクラスI分子結合オリゴペプチド(T細胞エピトープ)のアミノ酸解析に成功し、表面プラズモンレゾナンスにより合成トキソプラズマSAG1ペプチド289-297が感染細胞特異的CD8+CTLに強い抗原性を示すT細胞エピトープであることを報告した。さらに、3)細胞内蛋白質のフォールディング、オリゴマー形成、分子の膜貫通・移動などの抗原提示機序に不可欠であり、且つその分子構造がMHCクラス1分子に酷似する分子シャペロンの解析から、熱ショック蛋白質HSP70がトキソプラズマ感染宿主細胞における抗原提示機能分子として存在し、トキソプラズマ感染ヒトメラノーマから得たHSP70が感染細胞特異的CTLエピトープとなることを明らかにした。本年度はさらに、感染細胞内抗原処理・提示機能分子である分子シャペロン、トランスポーターの抗原処理・提示機能の解析および抗原提示機能分子修飾により誘導される細胞性免疫反応を介したワクチン開発を目的として、トキソプラズマ主要表面抗原SAG1遺伝子をマウスTAPトランスポーター欠損腫瘍細胞株RMA.Sに遺伝子導入した。RMA.Sは強力な抗原提示能をもち、このSAG1遺伝子導入抗原提示細胞株でマウスに免疫することにより、トキソプラズマ感染細胞特異的細胞性免疫が誘導されトキソプラズマ強毒株(RH株)感染に対するex-vivo
微量フェンタニルによるモルヒネ耐性形成の抑制の誘導

本年度は、ラットの髄腔内にブプレノルフィンと鎮痛効果もμオピオイド受容体(MOR)の細胞内陥入も引き起こさない微量の[D-Ala^2,N-MePhe^4,Gly^5-ol]enkephalin(DAMGO)を混合投与することにより、ブプレノルフィンの鎮痛効果およびMOR細胞内陥入の増強効果の有無について検討した。まず、ブプレノルフィン単独投与における鎮痛効果とMOR細胞内陥入を検討した。鎮痛効果はtail flick(TF)テストおよびhot plate(HP)テストで評価したところ、TFテストでは2、4、10μg、HPテストでは10μgで鎮痛効果を認めた。また、MOR細胞内陥入に関しては昨年度同様抗MOR抗体を用いた免疫組織化学染色法を用いて評価した。これまでin vivoでのブプレノルフィンによるMOR細胞内陥入の検討は報告されていないが、今回鎮痛効果を発揮するいずれの用量でも有意なMOR細胞内陥入は観察されなかった。このことから、ブプレノルフィンはMOR細胞内陥入を起こさずに鎮痛効果を発揮するという点において、モルヒネと同様の性質を有することが明らかとなった。なおブプレノルフィンと混合投与するDAMGOの用量は、昨年度モルヒネとの混合投与に用いた用量である5ngとした。ブプレノルフィン2μgとDAMGO 5ngを混合投与したところ、ブプレノルフィンによる鎮痛効果の増強を認めた。現在この条件下でのMOR細胞内陥入について検討中である。微量フェンタニルとモルヒネの投与による鎮痛効果及びμオピオイド受容体(MOR)の細胞内陥入に対する影響(急性効果)を検討するために、ラットを用いてまずモルヒネ及びフェンタニルの鎮痛効果、受容体陥入数に対する用量反応曲線を作成し、フェンタニルの鎮痛効果及び受容体陥入を起こさない用量(微量フェンタニル)を決定した。次にモルヒネと微量フェンタニルの混合投与群の鎮痛効果、受容体陥入数をモルヒネ単独投与群、微量フェンタニル単独投与群と比較し、混合投与による鎮痛効果増強と受容体陥入数の関係を検討した。なお、薬剤は髄空内投与とし、鎮痛効果はホットプレートテストを用いた。受容体陥入は抗MOR抗体を用いて免疫組織化学染色した脊髄後角を共焦点顕微鏡で観察した。その結果、モルヒネと微量フェンタニルの混合投与群では、鎮痛効果、受容体陥入数ともモルヒネ単独投与群および、微量フェンタニル単独投与群に比べ著明な増加が認められた。さらに、フェンタニルよりも受容体陥入を引き起こす能力の強い[D-Ala^2,N-MePhe^4,Gly^5-ol]enkephalin(DAMGO)においても、鎮痛効果及び受容体陥入を起こさない用量の微量DAMGO群を作成し、モルヒネ単独群と混合投与したところ、フェンタニルの場合と同様の結果を得た。以上のことから、受容体陥入数の増加によりモルヒネの鎮痛効果は増強することが示唆された。微量フェンタニルとモルヒネの慢性投与時の耐性形成に対する影響(慢性効果)については、現在検討中である。しかし、モルヒネとの混合投与の際に鎮痛効果、受容体陥入数の増加の程度が大きかったDAMGOについては、慢性投与の際、モルヒネとの混合投与による耐性形成抑制効果が認められるが、受容体陥入の程度とは明らかな相関関係は認められないという知見を得ている。
プロセシングの違いによるピルビン酸キナーゼアイソザイムのmRNAの生成とその調節

高等動物のピルビン酸キナーゼ(PK)はL型、R型、【M_1】型、【M_2】型の4種のアイソザイムが存在し、組織特異的に発現している。これらのうち、LとR型、【M_1】と【M_2】型のmRNAはそれぞれ同じ遺伝子(L遺伝子とM遺伝子)から転写され、プロセシングの違いなどにより組織特異的に生成されるものと考えられている。このことを実証するため、これまで【M_1】型と【M_2】型のcDNAやM遺伝子のクローンを単離してその構造を解析し、【M_1】と【M_2】型のmRNAは3'端側の翻訳配列が160塩基程異なる以外は同一の配列を有すること、及び両型に固有の配列はM遺伝子中にそれぞれ1個のエクソンとして隣接して存在することを明らかにした。今年度はM遺伝子の全構造を解明するために、単離したクローンの塩基配列を調べ、5'非翻訳部分を除し全エクソン/イントロン構造を明らかにした。5'非翻訳配列は単離してある遺伝子のクローン中には存在しなかったので、現在、他のライブラリーから検索中である。次に、【M_1】型に固有のcDNA部分をプローブとして、【M_2】型しか発現していないAH130肝癌細胞の核RNAをノーザン分析した結果、成熟型よりも大きなRNA種に放射活性が検出された。【M_1】型と【M_2】型mRNAの5'端が同一であることを考えると、これらの結果は両mRNAが同一転写産物のスプライシングの違いで生じることを強く示唆する。一方、L型とR型についてはL型とcDNAの配列をすでに明らかにしていたので、R型のcDNAをクローン化し、さらにL遺伝子のクローンを単離して、その塩基配列を調べた。その結果、R型とL型のmRNAは翻訳配列を含む5'端の配列のみが異なること、これらの固有の配列はそれぞれ1個のエクソンとしてL遺伝子に存在しており、両mRNAは転写開始点の違いで産生されることが明らかになった。
植物細胞由来の糖鎖修飾酵素を糖鎖工学へ応用利用するための基礎研究

銀杏種子,大豆種子,トマト果実より精製或いは部分精製したendo-b-GlcNAc-aseは,いずれも至適pHを67の間に有し,分子量はゲルろ過により64kDaであった。昨年度精製の完了したエンドウ種子由来のendo-β-GlcNAc-aseの分子量が42kDaであったことから,エンドウ種子中にも64kDaの分子種が存在する可能性が考えられる。植物細胞由来のendo-β-GlcNAc-aseはいずれも,α1-2マンノース残基を有するオリゴマンノース型糖鎖のGlcNAcb1-4GlcNAc間を効率良く加水分解したが,α1-2マンノース残基を有さないオリゴマンノース型糖鎖に対する加水分解速度は3050%程度であった。また,いずれの植物endo-β-GlcNAc-aseもキシロース及びフコース含有の複合型糖鎖には活性を示さなかった。この結果は植物細胞由来のendo-β-GlcNAc-aseの活性発現において,酵素サブサイトとal-2マンノース残基との相互作用が加水分解反応速度を制御している可能性を示唆している。一方,大豆種子由来のPNGaseは分子量約94kDa,至適pHは56であった。オリゴマンノース型糖鎖,キシロース及びフコース含有の複合型糖鎖を有する糖ペプチドいずれにも作用し,糖鎖をペプチド鎖からアミダーゼ活性により遊離した。オリゴマンノース型糖鎖含有ペプチドを基質として用い,endo-β-GlcNAc-aseとPNGaseを共に含む粗酵素液(大豆種子)を作用させたところ,GlcNAc-peptideのみが検出されたことより,植物細胞中ではオリゴマンノース型糖鎖の遊離にはendo-β-GlcNAc-aseが関与していることが考えられた。更に,エンドウ胚軸,タケノコ中に存在する遊離アスパラギン結合型糖鎖を精製後それらの構造解析を行ったところ,endo-β-GlcNAc-aseにより遊離したと考えられる数種のオリゴマンノース型糖鎖とPNGaseにより遊離したと考えられる複合型糖鎖が確認された。銀杏種子,大豆種子,トマト果実より精製或は部分精製したendo-b-GlcNAc-aseは,いずれも至適pHを67の間に有し,分子量はゲルろ過により64kDaであった。植物細胞由来のendo-b-GlcNAc-aseはいずれも,α1-2マンノース残基を有するオリゴマンノース型糖鎖のGlcNAcβ1-4GlcNAc間を効率良く加水分解したが,α1-2マンノース残基を有さないオリゴマンノース型糖鎖に対する加水分解速度は3050%程度であった。この結果は植物細胞由来のendo-β-GlcNAc-aseの活性発現において,酵素サブサイトとα1-2マンノース残基との相互作用が加水分解反応速度を制御している可能性を示唆している。

オリゴマンノース型糖鎖含有ペプチドを基質として用い,endo-β-GlcNAc-aseとPNGaseを共に含む粗酵素液(大豆種子)を作用させたところ,GlcNAc-peptideのみが検出されたことより,植物細胞中ではオリゴマンノース型糖鎖の遊離にはendo-β-GlcNAc-aseが関与していることが考えられた。更に,エンドウ胚軸,タケノコ中に存在する遊離アスパラギン結合型糖鎖を精製後それらの構造解析を行ったところ,endo-β-GlcNAc-aseにより遊離したと考えられる数種のオルゴマンノース型糖鎖とPNGaseにより遊離したと考えられる複合型糖鎖が確認された。
多座配位型ジピリンー典型元素錯体の合成および自在構造変換と機能発現

高い光安定性と優れた発光特性をもち、バイオイメージングの蛍光標識剤やレーザー色素、電気化学発光素子、太陽電池などへの応用が期待される有機分子の合成およびその特性についての基礎的研究を行った。特にジピリンと呼ばれる分子にケイ素、ゲルマニウム、スズなど、様々な元素を導入することで、これまでにない優れた特性を持つ分子を数多く合成した。さらにホウ素錯体にチオフェンを導入した鎖状ホウ素錯体や、大環状ホウ素錯体を設計・合成し、新しい発光性素子となる分子を開発した。チオフェンをジピリンのα位に導入した化合物、およびその類縁体となるチオフェン環をスペーサーとするジピリンの二量体、三量体の合成を行った。またこれらのホウ素錯体への変換にも成功した。得られた化合物の同定はNMR、元素分析、Uv-visスペクトル、蛍光スペクトル、質量スペクトルによって行った。これらの化合物は長波長領域に吸収および発光を有し、二量体、三量体では発光が近赤外領域にまで達した。このようにチオフェン環の導入が長波長化に非常に有用であることがわかった。またその量子収率は近赤外領域の発光としてはかなり高く、バイオイメージングや太陽電池への応用においても有用性が期待できる化合物であることも明らかとなった。またリボン状典型元素錯体の前駆体となる配位子の合成についても予備的な検討を行い、得られることがわかったので、引き続き最適条件を検討している。またジピリンの典型元素錯体の基本物性を明らかにするために、ジピリン部位にフェノール部位を導入した分子を各種合成し、そのゲルマニウム錯体、チタン錯体などを合成してその構造及び光学特性を明らかにした。特にゲルマニウム錯体では安定に超原子価化合物である5価のゲルマノールが生成することを見いだした。この分子はケイ素錯体の場合のように、脱水反応によりゲルモキサンへと変換可能であり、大きく光学特性が変化することも明らかにした。特にこれらの錯体は相当するケイ素錯体よりもさらに長波長側に吸収および発光を示すことがわかった。ジピリンホウ素錯体はその優れた光学特性から幅広い分野で非常に注目されているが、基本となるBODIPY以外の誘導体や、その他の錯体については非常に報告例が少ない。そこで本研究ではジピリン典型元素錯体群を合成し、中心元素の特徴を活かした構造規制あるいは構造変換による新規な機能の発現や機能のオンーオフが可能な新機軸の分子系を構築することを目的に検討を行った。ジピリン類を各種スペーサーで連結し、外部刺激で光学特性が変化する化合物として、初年度から検討を行っているスペーサーとしてチオフェンを中心とした複素環を導入したN2X2型ジピリン配位子と相当するホウ素錯体を種々合成した。このチオフェンBODIPYの基本骨格を2つ、3つと連結すると非常に効果的に発光が長波長にシフトし、2量体でも十分に近赤外領域に達する発光を示すことを明らかにした。さらに発光量子収率はこの波長領域としては最高水準の値であることを見出した。外部因子応答性については今後検討を行う。次に、N2O2型ジピリンのチタン錯体を合成したところ、チタン原子同士が酸素架橋した二量体として単離された。このチタン二量体は無蛍光であったが、チタン二量体に塩基を加えると、単量体に解離し、それに伴って赤外/近赤外領域に蛍光が見られた。一方、単量体に酸を添加すると再び二量体へと戻った。このようにジピリンチタン錯体は、酸・塩基に応答して単量体・二量体間で構造変化し、この変化に伴って蛍光特性が制御できることを明らかにした。高効率な発光特性や光安定性などからジピリンのホウ素錯体のBODIPYは近年非常に注目を集めており、多様な分野で盛んに研究が行われている。本研究では、ジピリンの典型元素錯体群を中心に合成し、中心元素の特徴を生かした構造規制あるいは外部刺激で光学特性が変化する化合物など、前年度までの研究を継続して目的の達成を図った。特に本年度はジピリンのN2O2型チタン錯体を合成し、その性質について明らかにした。この錯体は二量体と単量体との相互変換が可能で、塩基存在下では単量体、酸を加えると二量体となる。またこのとき光学特性も大きく変化することを明らかにした。特に二量体の構造については単結晶X線結晶構造解析により明らかにした。また中心元素がリンとなるN2O2型ジピリン錯体を合成しようと試みたところ、目的のリン錯体は得られず、興味深い双性イオン型の化合物が得られた。この分子はN2O2型ジピリン配位子の二つの酸素原子とリン原子が結合した分子で、塩基の添加により脱プロトン化でき、また酸の添加によりもとの双性イオンに戻すことができた。

またその際、大きく光学特性が変化することを見いだし、実際にバイオイメージングへの応用も可能であることを明らかにした。さらに、ジピリンが三分子連結した環状三量体を合成し、そのホウ素錯体の合成にも成功した。この分子はその空孔で第二級アンモニウムイオンを取り込み、ロタキサン型のホストーゲストコンプレックスを形成することを各種分光学的手法により明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。超分子化学26年度が最終年度であるため、記入しない。合成を計画した配位子を種々得ることに成功しただけでなく、それぞれのホウ素錯体なども高収率で得ることができた。また今後の研究に不可欠である各種ジピリン-典型元素錯体の構造や光学特性についても明らかにすることができた。このように次年度の研究推進に有用な知見を多数得ることができたため。チオフェンBODIPYをオリゴマー化することで、バイオイメージングや太陽電池、またOLEDにも応用可能な高い量子収率をもつ発光性分子を開発することができた。さらにこれまで例のないジピリンTi錯体の合成についても成功し、新しい反応性や光学特性を明らかにした。以上の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。基礎的な知見が相当数得られたので、さらに他の構造モチーフをもつジピリン類を合成するとともに、得られた典型元素錯体の集積化と物性変換に向けての検討を行い、目的の達成を図る。これまでの研究を継続し、鎖状タイプのジピリン類としては、芳香環スペーサーでつないだN2X2型ジピリン配位子などの合成、およびその典型元素錯体(B, Si, Ge, Sn, Al, Ti)の合成を行い、その発光特性や構造変換による物性制御について検討する。その他、スペーサー周りの自由回転がより簡単に起こり、外部因子によってその構造と光学特性が変化すると期待されるN2X2型ジピリン配位子については昨年度いくつか合成に成功しているので、それらの各種典型元素錯体の合成を行い、光学特性を明らかにする。さらに、より剛直なスペーサーをもち、自由回転が完全に抑えられたジピリン誘導体およびその典型元素錯体の合成も引き続き検討し、それらの錯体の光学特性や分子集積能についても検討を加え、本研究の目的の達成を図る。当該助成金(429,500円)については、3月末に日本化学会春季年会参加のための旅費として既に執行済みであり事務手続き上、支払いが4月となったものである。当該助成金(68,180円)については、3月末の出張旅費として既に執行済みであるが、事務手続き上、未払いになっているため。4月中には支払いがなされるので問題ない。
エピジェネティクス発現調節機構の破錠に基づく自閉症病態の解明

レット症候群は自閉症やてんかんなどを主徴とする進行性の精神・神経疾患である。この疾患の原因としてMECP2遺伝子変異であることが明らかになっているが、自閉症病態の解明に結びつく標的遺伝子は見つかっていない。本研究で我々はマイクロアレイを用いた網羅的解析により、新たなMeCP2標的分子として3つのシナプス関連遺伝子(LIN7A、PCDHB1、PCDH7)を同定した。これらの分子の発現調節異常を介したシナプス機能異常が自閉症病態に関与することが示唆された。レット症候群の原因がメチル化DNA結合蛋白質であるMeCP2(methyl CpG binding protein 2)の異常であることが明らかにされた。MeCP2は生後の脳発達期から発現が増加し、遺伝子発現調節を行う重要な転写因子である。これまでにMeCP2の標的遺伝子の探索は多数行われており、約20種の遺伝子が報告されているが、依然としてこれまでに報告された標的分子と自閉症病態との関連は不明のままである。一方で、自閉症疾患を始めとした神経発達障害がシナプス形成や機能異常と関連していることが報告されており、「自閉症のシナプス仮説」が提唱されている。自閉症の原因としてシナプス間の細胞接着に関わる分子やシナプスの足場蛋白受容体などさまざまなシナプス関連分子の発現・機能異常が報告されている。しかしながら、「MeCP2標的遺伝子の発現異常」と「シナプス形成・機能異常」を結び付ける自閉症の分子メカニズムはほとんどわかっていない。われわれはクロマチン免疫沈降法を用いた網羅的なMeCP2結合部位の探索を行い、シナプス形成に関与する新規MeCP2標的遺伝子を同定することを目的とした。その結果、最近、新たなMeCP2標的シナプス関連分子であるLIN7A、PCDHB1、PCDH7を同定した。レポーターアッセイやMECP2ノックダウンによる遺伝子発現解析から、従来報告されているメカニズムと同様にPCDHB1及びPCDH7はMeCP2により遺伝子発現が抑制されていることがわかった。一方で、LIN7AはMeCP2によって遺伝子発現が促進されることを明らかにした。この発見は近年、MeCP2はプロモーター領域のメチル化DNAに結合し遺伝子発現を抑制するだけでなく、促進にも作用するという報告と一致し、MeCP2による遺伝子発現が促進される具体的な遺伝子として初めての発見である。これまでにMeCP2の標的遺伝子の探索は多数行われているが、依然としてこれまでに報告された標的分子と自閉症病態との関連は不明のままである。本研究の目的は、MeCP2を介した遺伝子の発現調節分子メカニズム及びLin7aの発現異常とシナプス機能低下の関連性を明らかにする事である。1.具体的内容(1)MeCP2の標的遺伝子としてLIN7A, PCDHB1及びPCDH7を見出した。(2)MeCP2によりPCDHB1及びPCDH7は発現抑制に、LIN7Aは発現促進に働くことを明らかにした。(3)Mecp2ノックアウトマウスにおいてPCDHB1及びPCDH7の異常な発現上昇がみられた。(4)レット症候群患者死後脳においてPCDHB1の発現上昇がみられた。2.意義・重要性MeCP2標的として新たに見出した上記の3つの遺伝子はシナプス形成・機能に重要な分子であることから、MeCP2の異常によるシナプス関連遺伝子の発現異常とシナプス機能異常との関連が示唆され、「自閉症のシナプス仮説」を裏付ける新たな発見として大変意義がある。我々が見出した3つの標的遺伝子のうちPCDHB1及びPCDH7について詳細な発現調節メカニズムの解析を行い、論文に受理された。もう1つのLIN7Aについては現在、発現調節メカニズムの解析を行っており、今後は当初の計画通りノックアウトマウスやiPS細胞を用いて機能解析を行う予定である。Lin7aの機能異常とレット症候群の病態との関連を明らかにするため以下のような解析を行う。(1)Mecp2ノックアウトマウスを用いて初代培養神経細胞及びスライス切片を作製し、抗Lin7a抗体による免疫染色、ウエスタンブロッティングを行なう。(2)初代培養神経細胞及び神経分化誘導したiPS細胞を用いて、Ca蛍光指示薬であるFura-2を細胞に負荷し、カルシウムイメージング法にて活動電位、グルタミン酸刺激による神経活動の計測を行なう。さらに生後57日齢マウスの脳より海馬スライスを作製し、シナプス伝達機能をカルシウムイメージング法にて活動電位、NMDA電流等の神経活動の計測を行なう。(3)Mecp

2ノックアウトマウスにメチル化基質である葉酸やSAMを腹腔内投与し、自閉症症状の改善を行動学解析(オープンフィールド、社会性相互作用)、上記(2)のような電気生理学解析を行なう。今年度購入した染色体クロマチン免疫沈降法専用細胞破砕装置が計上した金額よりも40万円ほど安く購入できたため、次年度への繰り越し研究費が生じた。次年度に繰り越した研究費はMecp2ノックアウトマウスの購入・運搬費に充てる予定である。また次年度の研究費は機器・消耗品類・旅費については当初の計画通りに使用する予定である。
ウイルス感染が歯の形成異常を引き起こすメカニズムの解明

ウイルス感染により生じるマウスの切歯の形成障害において、全身の炎症の関連に焦点をあてた。新生時期のマウスに、5x10^4 PFUのマウスサイトメガロウイルス(MCMV) Smith株を腹腔内接種し経時的に顎骨を摘出し、切歯の表面をSEMにて観察した。ウイルス感染急性期に相当する部位での形成障害が認められたので、4週齢のマウスを用いてウイルス感染後のサイトカインをマイクロアレイ法にて調べ、IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ,MCP-1、TPO、VEGF、IL-4、IL-5、IL-6の変動が認められた。次に、炎症性の反応としてHDC活性を指標にし、その動態と炎症性サイトカインの動態を検討した。4週齢マウスにMCMVを腹腔接種し、経時的に採取した各臓器のHDC活性とサイトカインを測定した。脾臓と肝臓では、HDC活性の上昇時にウイルスが分離された。HDC活性の上昇する時期は臓器毎に異なっていた。サイトカインの動態は、脾臓ではVEGFとTNF-αが有意に減少した。肝臓では、IL-12、TNF-α、IL-6が有意に上昇した。肺では、IL-12の上昇とIL-6の減少が認められた。IFN-γは13日目から上昇した。歯の形成の一時期にサイトカインがかかわることが報告されている。HDC活性の結果からも、ウイルス感染後には宿主の炎症反応が大であり、10日以上経過しても多臓器組織に炎症性反応が継続していることが確認された。各臓器での炎症反応もウイルスの病原性に関わり、産性される炎症性サイトカインやケモカインはウイルスの増殖や排除にかかわっていることが示唆される。HDC活性上昇によるヒスタミンは、血流動態の変化をおこし、血管透過性充進させるが、マウスの歯の形成時には歯槽血管の役割が大きい。よって、ウイルス感染後の全身的な炎症が、歯の形成にも影響を与えていることが示された。ヘルペス科ウイルスは、多くが乳幼児期に感染し、口腔内に典型的な口内炎を生じさせ、歯科領域では重要なウイルスである。胎生期や周産期のヒトサイトメガロウイルス感染が、歯の形成不全を起こすことは報告されているが、マウスを用いた動物実験において確認した。しかし、そのメカニズムが十分に解明されたとはいいがたい。本年度は、歯の形成時期においてウイルス感染初期に解明の焦点をあて、宿主の免疫学的な背景を解明することを目的に実験を行った。(1)出生48時間以内のマウスに、5x10^5 PFUのマウスサイトメガロウイルス(MCMV)Smith株を腹腔内接種した。経時的に、還流固定後、上顎骨ならびに下顎骨を摘出し、薄切標本を作製した。肉眼より3週目から5週目にかけて、下顎切歯には明瞭な着色が確認された。(2)4週齢マウスの腹腔に、同ウイルス量を腹腔接種し、経時的に屠殺して、上下顎骨、臓器を摘出した。臓器は、ホモジナイズ後遠心分離し、上清中のサイトカインの発現をマイクロアレイ法にて観察した。脾臟においては、IL-2を除いたサイトカインの動態はほとんど認めらなかったが、大脳では、感染初期から、IL-10、IL-17、IFN-γ、MCP-1,TPO、VEGFのサイトカインの変動が認められた。

感染4日目には、上記に加え、IL-4、IL-5、IL-6の上昇も認められた。歯の形成の一時期にIL-6などのサイトカインがかかわっていることが報告されている。本実験において、臓器におけるサイトカインの発現の結果から、感染後には宿主の反応が大であり、10日以上経過しても組織には特に脳に炎症性反応が継続していること、すなわち、感染から歯の萌出する時期までの間ずっと炎症性反応が生じていることが明確になり、歯の形成にも影響を与えていると推察される。ヘルペス科ウイルスは、多くが乳幼児期に感染し、口腔内に典型的な口内炎を生じさせ、歯科領域では重要なウイルスである。マウスにおいてサイトメガロウイルス感染による歯の形成不全を起こすこと報告し、マイクロアレイにて感染後の炎症性サイトカインの変動をスクリーニングを行った。本年度は、(1)マウス切歯の形成不全部の状態を3-D顕微鏡での観察ならびに、(2)炎症性の反応としてHDC活性の動態を検討した。方法と結果:1)出生48時間以内のマウスに、5x10^5 PFUのマウスサイトメガロウイルス(MCMV)Smith株を腹腔内接種し、経時的に、還流固定後、上顎骨ならびに下顎骨を摘出し、切歯の表面を3--D顕微鏡にて観察した。感染の2-3週後の切歯では、粗悪なエナメル質が切歯の表面1/3にかけて認められた。同部位のエナメル-象牙境の乱れが確認された。2)4週齢マウスの腹腔に、同ウイルス量を腹腔接種し、経時的に屠殺し摘出した臓器のHDC活性とサイトカインの動態を検討した。その結果、脾臓と肝臓では、HDC活性の上昇時にウイルスが分離された。HDC活性の上昇する時期は臓器毎に異なっていた。サイトカインの動態について、脾臓ではVEGFが9.13日目で減少、TNF-αは513日目で減少した。肝臓では、IL12、TNF-α、IL-6が有意に上昇した。肺では、IL-12の上昇、IL-6の減少が認められた。IFN-γは9日目までは減少していたが、13日目で上昇が認められた。歯の形成の一時期にサイトカインがかかわっていることが報告されている。本実験において、臓器の炎症の指標としてHDC活性の結果からも、ウイルス感染後には宿主の反応が大であり、10日以上経過しても組織には炎症性反応が継続していることが確認された。比較として行ったHSV-1を口腔に感染させた実験では、感染後多臓器でHDC活性が変動すること確かめられた。各臓器での炎症反応もウイルスの病原性に関わり、産性される炎症性サイトカインやケモカインはウイルスの増殖や排除にかかわっていることが示唆され、歯の形成にも影響を与えている。
癌免疫療法における樹状細胞の免疫応答賦活に関与する遺伝子プロファイルの網羅的解析

【研究の目的】自己がん組織に存在する未知の免疫賦活物質が、樹状細胞内のどのような遺伝子を介してCTL誘導に作用しているか調べる。【研究の内容】1自己がん組織と人工抗原WT1を作用させて作製し、WT1特異的CTLを誘導した樹状細胞(2例)。2人工抗原WT1のみを作用させて作製し、WT1特異的CTLを誘導できた樹状細胞(3例)。3人工抗原WT1のみを作用させて作製し、WT1特異的CTLを誘導できなかった樹状細胞(3例)。の3群(計8サンプル)に関して、Gene Chip®3' Expression Array解析により遺伝子発現の網羅的解析を行った。【結果】群23に比較して群1において著明に発現増強していた(Signal log ratio≧2)タンパク質コード遺伝子は、TNFSF18(Tumor necrosis factor superfamily, member 18)のみであった。【意義・重要性】TNFSF18は、抗原提示細胞に発現していることが知られている。これまでのマウスに関する実験では、がん細胞上のTNFSF18が制御性T細胞の機能を抑制する一方で、CD8陽性T細胞のエフェクター機能を増加させ抗がん作用を増強させていることが明らかになっている。しかし、二次リンパ組織内では樹状細胞上のTNFSF18とT細胞との相互作用は軽微であると報告されており、また皮膚などの末梢組織中での相互作用については明らかになっていない。今回の発見は、自己がん組織中の未知の免疫賦活物質が、樹状細胞のTNFSF18発現を増加させ、そのことが樹状細胞のCD8陽性細胞への抗原提示をより効率的にするという新しいメカニズムを示唆している。今後、樹状細胞上のTNFSF18を介した効率的なCTL誘導機序のさらなる解明を行う予定である。