hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規アンチセンス法による抗炎症療法の基礎的検討

そのため、アンチセンスDNA以外の遺伝子レベルでの抗炎症療法の基礎的研究に展開した。その1つが、天然成分であるTripterygium wilfordii Hook F抽出物の研究である。これには、ステロイドと同様のシクロオキシゲナーゼ-2発現抑制作用が認められたが、この作用はステロイド受容体を介せず、またNF-κBやAP-1などの転写因子レベルではステロイドと作用が異なっていた。また別の検討で、ヒト滑膜細胞へのKi-ras遺伝子導入により、滑膜増殖作用に対するサイトカイン反応性を変化させたという成績を得ており、現在さらに詳細な検討を進めている。
磁気円二色性分光法による強磁性半導体の電子構造の解明

多様な磁性半導体薄膜を合成し、そのMCDスペクトルおよび光吸収スペクトルの系統的な測定から、磁性半導体の特異な電子状態の解明を行った。その結果、従来良く理解されていると考えられてきたII-VI族磁性半導体において異常なZeeman分裂の存在を明らかにするとともに、これらII-VI族磁性半導体と強磁性半導体(Ga,Mn)Asの比較検討から、(Ga,Mn)Asが本質的に不均質な物質であること、そしてそのバンド構造は大きなZeeman分裂を示すことを明らかにした。本研究の目的は(Ga,Mn)Asを中心とする強磁性半導体の電子構造を明らかにすることにある。この物質の合成以来すでに13年が経過し、この間、大量の論文が出版されてきたにもかかわらず、その電子構造はいまだ不明なままとなっている。本代表者が世界に先駆けて開発してきた磁気円二色性(MCD)分光法は、強磁性半導体の電子状態を探る最も強力な手法である。我々が2008年にPhysical ReviewLetters誌に報告した(Ga,Mn)AsのMCDスペクトルの解析結果は、世界的な強い反響を引き起こした。我々の結果は、従来知られていた(i)Zeeman分裂したsp半導体バンドに加えて、(ii)非常に幅広い不純物バンドの存在を示しており、不純物バンドの存在を無視したこれまでの電子構造モデルの根本的な見直しが必要なことを明確に示していたからである。我々の研究結果をどう理解すべきかに関しては、現在議論が論争に発展するほど活発化している。本研究はMCDスペクトルの更なる解析を行うことにより、磁性半導体の電子構造に関する統一的な理解を得ることを目的としている。平成20年度は、条件を種々変化させて成長した(Ga,Mn)As薄膜や、(Zn,Mn)Seなどの類似磁性半導体薄膜のMCDスペクトルを詳細に解析するとともに、理論家との議論を進めた。その結果、(Ga,Mn)Asには上記の(i)、(ii)の光学遷移に加えて、バンド端付近に非常に孤立的な第3の光学遷移が存在することが新たに判明した。(Ga,Mn)Asが強磁性を示す原因は、このような複雑な電子状態に密接に関連していることが示唆される。この第3の遷移が、励起子遷移であるか、または何らかの不純物遷移であるかはまだ不明である。この重要な発見を中心として、H21年度以降にはMCDスペクトルの解析をさらに進める予定である。強磁性半導体の典型物質である(Ga, Mn)Asは発見から10年以上が経過した現在も、その電子構造は明らかでない。本研究者が世界で初めて磁性半導体に適用した磁気円二色性(MCD)分光法は、磁性半導体の電子構造解明の有力な手段とみなされているが、低温成長で合成される非平衡物質である強磁性半導体には、通常の伝導バンドと価電子バンドに加えて、磁性イオンによる不純物バンド、そしてアンチサイトなどの多様な欠陥準位が存在するため、MCDスペクトルの解釈は簡単ではない。この点をめぐって、昨年、論文誌上で本研究者を中心とした論争が展開された。その論点は、(Ga, Mn)AsにおいてバンドはZeeman分裂するかどうかという根本的な問題であった。この論争に決着を付けるためには、(Ga, Mn)Asに限定せずに、多様な磁性半導体のMCDスペクトルを詳細に調べ、その電子構造とスペクトル形状の関係を明らかにする必要がある。この観点から、平成21年度は、(Ga, Mn)AsのMCDスペクトルに及ぼすアニール効果の評価と、(Ga, Mn)As以外の各種磁性半導体のMCDスペクトルの測定を行った。(Ga, Mn)Asのアニール効果に関しては、MCD測定に適したサファイア基板上の(Ga, Mn)As薄膜において、熱処理効による強磁性遷移温度Tcの向上を確認した。サファイア基板上での確認は初めてである。この(Ga, Mn)As薄膜を用いて、熱処理によるTcの向上が、3eV以下のMCDスペクトル形状の変化と対応することを見出した。またCdTeおよびZnTeをベースとする広範な磁性半導体のMCDスペクトルの詳細な測定も行った。これらのデータを用いて、現在、Model Dielectric Function法による解析を進めている。磁性半導体の最大の特長はスピンキャリアの間の相互作用であり、これはバンド構造のZeeman分裂として現れる。従来より多様な磁性半導体の研究が行われてきたが、そのバンド構造やスピンキャリア相互作用は十分には明確ではない。特に強磁性を示す(Ga,Mn)Asは、多くの関心を集めているが、この物質が初めて合成されてから14年経過した現在に至るも、その電子状態(p-d交換相互作用、フェルミ準位レベルなど)に関するコンセンサスは得られておらず、論争が続いている。本研究では、本代表者が開発してきた、磁気円二色性(MCD)分光法を用いて磁性半導体の電子状態を理解することを目指した。
膜電位感受性色素とCa指示薬の二重染色による交感神経節シナプス動態の光学的解析

膜電位感受性色素とCa指示薬の二重染色法を用いて、交感神経節におけるシナプス伝達の光学的計測による解析をおこなった。実験には、ウシガエル腰部交感神経節を用いた。膜電位感受性色素に対する染色性を向上させるため、コラゲナーゼを用いて結合組織を一部分解したうえで、メロシアニン・ロ-ダニン系色素NK2761により神経節を染色した。Ca指示薬としては、デキストランを結合させたケルシウム・グリーンを用い、低濃度のTriton X-100とともに、中枢側の交感神経幹に微量注入し、節前ニューロンに取り込ませた。膜電位の光学的測定には、波長700nmの吸光変化を測定し、細胞内Ca濃度は励起波長488nmによる波長510nm以上の蛍光強度変化で測定した。膜電位変化の光学的測定では、節前線維刺激により、2峰性ないし3峰性の光学的シグナルが得られ、第2、第3のピークは、クラ-レ投与、重金属イオンの投与、外液のカルシウムイオンの除去などの実験操作により抑制された。このことから第1のピークは節前ニューロンのシナプス前終末部の電位活動を反映しており、第2のピーク以降の成分は、シナプス伝達を受けた節後ニューロンの活動に由来するものであることが明らかとなった。細胞内Ca濃度変化に由来する光学的シグナルは、現段階ではまだS/N比が十分ではなく、系統的な解析をおこなうに至っていない。これは、色素の注入量が不足していることに起因しているもので、現在、さらに色素の注入条件などの検討を進めている。
電子ドープされたC60への分子状水素吸着機構の解明～新規な高効率水素吸蔵の実現～

高効率実用水素吸蔵材料の実現をめざし、電子ドープ(電子が添加)されたC_<60>等の有機半導体分子の幾何的形状、電子状態、水素吸着・脱離過程を計測した。その結果、Cu(111)表面上に吸着することで電子ドープされたC_<60>分子層において、室温で水素が一部解離吸着し、150°C程度への昇温で脱離することを明らかにした。この材料が水素吸蔵材料として有望であることを示している。さらに、Ru(0001)表面に吸着したグラフェン、アルカリ金属添加芳香族半導体分子層でも水素吸蔵の可能性を検討した。電子ドープしたフラーレンと水素分子の結合エネルギーが比較的大きく、水素吸蔵材料となり得ることが理論的に予測されている。我々は、超音速分子線散乱(MBS)法を応用して、電子がドープされることが知られているC60/Cu(111)表面に水素が室温で吸着し、わずかの昇温で脱離することを明らかにした。本研究は、MBS法とともに、走査トンネル顕微鏡(STM)観察、イオンによる弾性反跳粒子検出(ERDA)法、中性子反射率(NR)計測、光学歪みセンサー(MOS)計測を用いる事により、吸着の詳細を理解し、高効率水素吸蔵材料の設計指針を提案することを目的とする。今年度は、MBS法に、質量分析計による脱離種の計測を組み合わせ、C60/Cu(111)上吸着水素について詳細に検討した。脱離温度から概算された水素の吸着エネルギーは1eV程度と分子状吸着としては極めて大きかった。そこで試みた水素と重水素の共吸着での脱離種計測から、H2、D2分子と同程度の強度のHD分子の脱離が観測された。すなわち表面上の水素は高い割合で解離している。この系では、先の理論予測の場合に比べて大量の電子がドープされることから水素が解離にまで至ったものと推察される。この他、暴露量に対する吸着量、水素吸着の絶対量、脱離における同位体効果、水素の運動エネルギーによる吸着への影響等において、通常の吸着とは大きく異なる挙動が観測されている。次年度以降に詳細を明らかにしたい。また、表面の幾何的状態、電子的状態を原子スケール実空間で計測できるSTM法を用いて、多様な表面においてC60単分子層計測の経験を蓄積し、吸着水素を計測するための準備が完了した。一方、最表面以外にある水素を計測できるERDA法を、C60/Cu(111)表面に適用できるように装置改良を進めているが、今年度はアモルファスカーボン膜中における水素を高感度に計測できることを実証した。同じく膜内部の水素を計測するNR法は、高感度化を進め、この系に適用できるようになった。電子ドープしたフラーレンと水素分子の結合エネルギーが比較的大きく、電子ドープしたフラーレンは水素吸蔵材料となり得ることが理論的に予想されている。我々は、超音速分子線散乱(MBS)法を応用して、電子のドープされることが知られているC60/Cu(111)表面に水素が室温で吸着し、僅かの昇温で脱離することを明らかにした。本研究は、MBS法に加えて、走査トンネル顕微鏡(STM)観察、イオンによる弾性反跳粒子検出(ERDA)法、中性子反射率(NR)計測、光学歪みセンサー(MOS)計測を用いる事により、水素吸着の詳細を理解し、高性能水素吸蔵材料の設計指針を提案することを目的とする研究を実施した。平成24年度までに、MBS法と昇温脱離法を組み合わせることにより、C60/Cu(111)表面上の水素は解離吸着していること、基板からの電荷移動の大きい場合、金属表面上のグラフェン上でも可逆的に原子状水素が吸着することを明らかにした。これにより、水素の高効率吸着において、電子ドープされた有機半導体分子の物性が重要である事が明らかになった。平成25年度は、材料の自由度を高め、アルカリ添加により電子をドープした有機半導体低分子に注目し、その分子配置、電子状態を詳細に検討した。様々な有機半導体低分子、アルカリ金属について検討した結果、原子種、分子種による違いは本質的なものではなく、総じて有機半導体低分子は、分子配置を大きく変えながら電子状態を著しく変化させ、金属的になることが明らかになった。また、水素吸着により半導体結晶の格子歪みの変化を明確に観測した。以上のことから、幾何学的構造変化を通じて生じる電子的状態変化が大きく作用し、水素吸着の著しい促進がおこるものと結論づけることができる。今後、新たな実用水素吸蔵材料開発のため、理論的検討を含めた継続的、直接的検証が求められる。電子ドープしたフラーレンと水素分子の結合エネルギーが比較的大きく、水素吸蔵材料となり得ることが理論的に予想されている。

我々は、超音速分子線散乱(MBS)法を応用して、電子がドープされることが知られているC60/Cu(111)表面に水素が室温で吸着し、僅かの昇温で脱離することを明らかにした。本研究は、MBS法に加えて、走査トンネル顕微鏡(STM)観察、イオンによる弾性反跳粒子検出(ERDA)法、中性子反射率(NR)計測、光学歪みセンサー(MOS)計測を用いる事により、水素吸着の詳細を理解し、高性能水素吸蔵材料の設計指針を提案することを目的とする。昨年度は、MBS法と昇温脱離法を組み合わせることにより、C60/Cu(111)表面上に吸着した水素は解離吸着していることを明らかにした。本年度は、C60/Cu(111)表面から、他の類似の系、特に、単結晶金属表面に形成したグラフェンへの水素の吸着の系に拡張して、吸着の詳細を検討した。その結果、水素分子のままでは吸着しないものの、原子状水素を用いる事により、水素が室温で吸着し、600 Kへの昇温で脱離することを見いだした。この水素原子の吸着/脱離に際して、基板・グラフェン間の格子定数差に起因するモアレ構造には変化が無く、グラフェンの基本構造が維持されていることを示唆している。すなわち、構造の変化がなくても、電子状態の変調で水素原子の吸着が起こりうることを示している。水素吸着の機構を理解する上で重要な知見である。この他、MBS法以外の計測法の整備を進め、有機単分子膜とそこでの水素吸着の計測を可能にした。来年度は、金属上C60、金属上有機単分子層、グラフェンに関して、他の手法を組み合わせて吸着水素を計測し機構解明をめざす。昨年3月の東日本大震災で。弾性反跳粒子検出(ERDA)法、中性子反射率(NR)計測で用いる加速器および中性子施設が大きく損傷した。しかし、担当者等の努力によりほぼ予定通りの研究を遂行した。一方、吸着種の計測において予想外の特異な現象が観測されたため、その部分を詳細に検討する必要が生じた。これによって、高感度化を施した後に分子散乱の研究を十分に遂行することができなかった。しかし、今年度に十分な準備を行ったため、短期間で十分な成果が上がるものと期待される。25年度が最終年度であるため、記入しない。特に低温技術に関する超音速分子線源の高度化のための調整作業に想定以上の時間を要した。しかし、これを完了させた。また、23年の震災の影響もほぼ解消して、大型実験設備を利用した実験も可能になっている。本年度の研究によって、注目している水素吸着の状態が当初予想していた分子状吸着ではなく解離吸着であることが明らかになった。また、関連すると思われるが、従来知られている吸着とは異なる現象が多く観測され始めている。本研究においては、現象に対するメカニズムの理解が極めて重要である。当初予定していた研究に加えて、吸着の詳細検討を行うことにする。また、東日本大震災の影響が部分的には残るものの、最終的には十分な研究が行えるものと予想される。これによる研究内容の変更は行わない。当初の予定から遅れたものの、当初計画していた全ての測定手法が、本研究に対し適用可能な状態になった。最終年度に当たる今年度は、当初の予定に加え、昨年度に明らかになった知見を加えて研究計画を少し変更する。C60での実験に加えて、グラフェンに関して集中的に検討を行い、本研究の最終目的である、水素吸着機構解明を行い、有効な水素吸蔵材料の設計指針を提案する予定である。
肺動脈性肺高血圧患者の右心不全を予防することで予後を改善させる新しい治療法の開発

PAHマウスおよびShamマウスにCaリーク抑制薬ダントロレンを経口投与し、右室圧を測定、心筋細胞のサイズ測定、Caトランジェント観察、固定してanti-CaM,anti-GRK5, anti-HDAC4,5, anti-p-HDAC4,5の抗体にて免疫染色を行った。その結果ダントロレンの経口投与は肺動脈圧に影響を与えなかった。ダントロレンの経口投与群では心筋細胞サイズの縮小を認め、肥大が抑制されていた。さらにRyR結合CaMの減少も抑制されていた。このことからダントロレンがRyRからのCaMの解離を抑制することで、肥大を抑制した可能性が示唆された。PAHモデルマウスの作成:文献的考察に加えて試行錯誤の結果、MCTを20日毎にWTマウスに腹腔内投与し安定したPAHモデルマウスの作成が可能となった。このマウスでは肺動脈周囲の炎症に加えて右室肥大を認めた。実験では心体重比は有意に増加し、Millarカテーテルにて測定した右室圧は有意に高値であった。PAH(WT)マウスへのCaリーク抑制薬による介入:PAHマウスおよびShamマウスにCaリーク抑制薬ダントロレンを経口投与し、1Millarカテーテルを用いて右室圧を測定、心エコーでの右室径、右室機能計測、組織学的検索を行う。さらに心筋細胞を単離し、2固定してanti-CaM, anti-GRK5, anti-HDAC4,5, anti-p-HDAC4,5の抗体にて免疫染色を行った。またShamマウスにおいてはET-1による刺激後、経時的に固定し同様の免疫染色を行った。1.マウスにおける肺高血圧モデルは作成が困難とされているが、安定してモデルマウスが作成できている。2.ダントロレン投与により右室肥大の抑制が確認できている。さらに心筋細胞を単離し、2心筋細胞のサイズ測定、Caトランジェント観察、固定してanti-CaM, anti-GRK5, anti-HDAC4,5, anti-p-HDAC4,5の抗体にて免疫染色を行った。にもかかわらず、ダントロレンの経口投与群では心筋細胞サイズの縮小を認め、肥大が抑制されていた。このことからダントロレンがRYRからのCaMの解離を抑制することで、肥大を抑制した可能性が示唆された。PAH(WT)マウスへのCaM-GRK5連関への介入:Shamマウス、PAH(WT)マウスにおいて単離初代培養心筋細胞においてGRK5のGeneSilencerを用い、shRNAのレンチウイルスによるtransfectionにてGRK5をknock downした際のCaMのtranslocation、肥大シグナルを解析する。GRK5のknock downにてCaMのtranslocationが抑制されれば、申請者の作業仮説であるGRK5によるCaMの核内への移送が証明される。さらにGRK5のCaM結合部位と同じアミノ酸配列を有するペプチドをタンパク導入キットBioPORTERを用いて細胞内に導入することによりCaMのGRK5への結合を競合阻害すると、ET1による肥大シグナルが抑制できるか否かを検討する。さらにGRK5のkinase活性の特異的阻害薬Amlexanoxの肥大シグナルへの影響も検討することによりGRK5はCaMの運搬のみを行うのかGRK5自身がHDACのリン酸化に関与するのかを検討する。循環器内科学
ラット肝発癌過程における細胞膜抗原の変化ー単クローン性抗体による解析ー

発癌過程における正常細胞膜蛋白の抗原性の変化を解析するために、われわれの作製した正常ラット肝細胞膜蛋白に対する単クローン性抗体(HAMA)を用いて検討した。化学発癌剤(3′-Me-DAB,2-AAF,DEN)及び部分肝切除による発癌モデルを用い、発癌過程において前癌病変として注目されている過形成結節を含め各段階におけるHAM・4抗原発現の変化を酵素抗体法を用い組織化学的に解析し、また細胞性ラジオイムノアッセイにより抗原量の変化も判定量的に測定した。過形成結節では拡張した毛細胆管面に一見正常肝より強く染色されるが、ラジオイムノアッセイでの抗原量は変化を認めなかった。しかし後期の過形成結節では結節内の一部の細胞で膜抗原が減弱あるいは消失した結節がいくつか認められた。肝癌組織では、高分化型索状肝癌で残存し、中分化型では点在するのみで、未分化あるいは充果性肝癌では消失していた。このことは、発癌過程では前癌状態においてすでに過形成結節細胞が分化度の異なる癌細胞へと方向づけられている可能性を示唆しており、癌の分化度と前癌病変との関連を解析する上で今後有用と考えられた。胎児および新生児肝におけるHAM4抗原の存在様式についても同様に検討した。胎齢18日より染色上もラジオイムノアッセイでも明瞭に確認され、次第に増強し生後も減弱することなく生後4週齢で成熟肝と同様となった。このことより、この膜蛋白は肝細胞の分化に関与している蛋白であると推測される。HAM4抗原は、ラット肝細胞膜の糖蛋白で、分子量は110KDaであった。その局在は5ーGTPと類似しているが、発現様式は大きく異なる。またこの糖蛋白はラット腎の近位尿細管にも存在し、その分子量は肝よりもやや大きい。今後そのアミリ酸配列を解析し、前癌細胞の膜変化の機序を知るのに有用と考えられる。発癌過程における正常細胞膜蛋白の抗原性の変化を解析するために,われわれの作製した正常ラット肝細胞膜蛋白に対する単クローン性抗体(HAM・4)を用いて検討した.化学発癌剤(3′-Me-DAB, 2-AAF, DEN)及び部分肝切除による発癌モデルを用い,発癌過程において前癌病変として注目されている過形成結節を含め各段階におけるHAM・4抗原発現の変化を酵素抗体法を用い組織化学的に解析し,また細胞性ラジオイムノアッセイにより抗原量の変化も半定量的に測定した.過形成結節では拡張した毛細胆管面に一見正常肝より強く染色されるが,ラジオイムノアッセイでの抗原量は変化を認めなかった.しかし後期の過形成結節では結節内の一部の細胞で膜抗原が減弱あるいは消失した結節がいくつか認められた.肝癌組織では,高分化型索状肝癌で残存し,中分化型では点在するのみで,未分化あるいは充実性肝癌では消失していた.このことは,発癌過程では前癌状態においてすでに過形成結節細胞が分化度の異なる癌細胞へと方向づけられている可能性を示唆しており,癌の分化度と前癌病変との関連を解析する上で今後有用と考えられた.胎児および新生児肝におけるHAM4抗原の存在様式についても同様に検討した.胎齢18日より染色上もラジオイムノアッセイでも明瞭に確認され,次第に増強し生後も減弱することなく生後4週齢で成熟肝と同様となった.

このことより,この膜蛋白は肝細胞の分化に関与している蛋白であると推測される.局在は似ているがγ-GTPとは発現様式も分子量も異なる事より,肝細胞の索状構造の解析及び前癌病変での発癌機序を知る上で今後も有用な膜蛋白に対する抗体と考えられる.発癌過程における正常細胞膜蛋白の抗原性の変化を解析するために、われわれの作製した正常ラット肝細胞膜蛋白に対する単クローン性抗体(HAM・4)を用いて検討した。化学発癌モデルを用い、発癌過程において前癌病変として注目されている過形成結節を含め各段階におけるHAM・4抗原発現の変化を酵素抗体法を用い組織学的に解析した。過形成結節では拡張した毛細胆管面に一見正常肝より強く染色されるが、後期の過形成結節では結節内の一部の細胞で膜抗原が滅弱あるいは消失した結節を認めた。肝癌組織では、高分化型索状肝癌で残存し、中分化型では点在するのみで、未分化あるいは充実性肝癌では消失していた。このことは、発癌過程では前癌状態においてすでに週形成結節細胞が分化度の異なる癌細胞へと方向づけられている可能性を示唆しており、癌の分化度と前癌病変との関連を解析する上で有用と思われる。HAM・4抗原は、ラット肝細胞膜の糖蛋白を、分子量は11OKDaであった。その局在はrGTPと類似しているが、発現様式は大きく異なる。またこの糖蛋白はラット肝の近位尿細管にも存在し、その分子量は肝よりもやや大きい。今後そのアミノ酸配列を解析し、前癌細胞の膜変化の機序を知るのに有用と考えられる。
胚性幹細胞における自己複製機構の解析

マウスES細胞は多分化能を維持したまま自己複製する幹細胞株である。本研究では、Eed(エピジェネティクス制御因子)、Baf53a(クロマチンリモデリング因子)、およびLRH-1(細胞周期制御因子)の機能解析や、転写因子ネットワーク(Oct3/4、Dax1、Esrrbの相関関係やGliなど)の解析を行った。これらの因子に着目した分子生物学的解析を通して、ES細胞が自己複製する分子メカニズムの一端を明らかにした。胚性幹細胞(ES細胞)の自己複製制御機構を明らかにする目的で、エピジェティクス、クロマチン・リモデリング、細胞周期の3つの観点から解析を行った。エピジェネティックスについては、エピジェティクス因子であるEedを欠損したES細胞に観察される分化関連遺伝子の発現が、転写因子であるSox2の強制発現によって抑制されることを見出した。さらにこの分子機構を詳細に解析したところ、Sox2の強制発現はEed欠損によって起きるピストンH3のK27のメチル化低下には何ら影響を与えないのに対して、ヒストンのアセチル化の低下に対しては強い抑制作用を示し、アセチル化の上昇が未分化特異的遺伝子の発現促進を介して分化関連遺伝子の発現抑制へとつながっているという可能性を見出した。これらの結果は、ES細胞においては分化関連遺伝子の発現抑制よりも、未分化特異的遺伝子の発現促進を介して自己複製を維持している可能性を示唆している。またEedとSox2が互いの発現を正に制御するポジティブなフィードバックループを形成することによって、転写因子ネットワークとエピジェネティックス・ネットワークの間でのクロストークを可能としていることも明らかにした。一方、クロマチン・リモデリングに関しては、ES細胞の自己複製におけるリモデリング分子Baf53aの役割を検討するために、ターゲティングベクターを作製し、相同組み換えによる遺伝子破壊ES細胞を樹立している途中である。現在、片アリルが破壊された株の樹立に成功し、反対側のアリルの破壊を試みている。細胞周期に関しては、転写因子LRH1が細胞周期関連分子サイクリンEの発現調節を介してES細胞の増殖を正に制御していることを見出し、さらにサイクリンEがLRH1の直接の標的分子ではなく、LRH1とサイクリンEの間にE2Fファミリー分子が介在している可能性も見出した。胚性幹細胞(ES細胞)の自己複製制御機構を解明する目的で、「エピジェネティクス制御機構の解析」、「クロマチン・リモデリング複合体の解析」及び「細胞周期制御機構の解析」の3つのテーマを遂行した。STAT3の下流で機能するエピジェネティクス制御因子であるEedの解析は、予想以上に早く研究が進展したため、本年度は、STAT3やその下流の因子群で形成される転写因子ネットワークの解析を進めた。STAT3とOct3/4の下流因子であり、核内ホルモン受容体に属する因子であるDax1と相互作用する因子を、酵母twohybridスクリーニングをした。その結果、転写因子Esrrbを同定し、Dax1、EsrrbおよびOct3/4の三者がES細胞でregulatorynetworkを形成していることを見出した。一方、「クロマチン・リモデリング複合体の解析」では、複合体の構成因子であるBaf53aに着目している。Baf53aはOct3/4と結合する可能性を見出していたことから、両者の相互作用領域を決定した。その結果、Baf53aはOct3/4のPOUドメインに、Oct3/4はN末端側やC末端側問わずBaf53aのあらゆる領域に結合しうることを見出した。さらに、遺伝子破壊実験を試みており、Baf53a遺伝子の片アリルの破壊は完了し、テトラサイクリン発現誘導型Baf53a+/-ES細胞を樹立した。さらに「細胞周期制御機構の解析」では、CyclinE1の遺伝子発現制御機構の解明に取り組んだ。CyclinE1遺伝子のプロモーター領域にはE2F結合配列が存在し、実際にE2F1がこの領域に作用し発現制御に関わっていることを明らかにした。さらにこのE2F1は、転写因子LRH1によって発現制御されていることを突き止め、ES細胞におけるLIR1→E2F1多→Cyclin E1の経路があることが判明した。またGO期からS期の再入に関与する転写因子GABPalphaにおいて、Cre-LoxPシステムを用いた遺伝子破壊ES細胞を樹立した。マウス初期胚より樹立された胚性幹細胞(ES細胞)は、培地にサイトカインLIF(白血病阻害因子)を添加しておくことで、多分化能を維持したまま自己複製する幹細胞株である。マウスES細胞ではLIFの下流で機能する転写因子群がネットワークを形成し、自己複製を制御している。最近の研究から、エピジェネティックな制御やクロマチン構造の変化、細胞増殖制御機構なども重要な役割を担っていることが分かってきた。本年度は、ES細胞における転写因子ネットワークや細胞増殖制御機構の解析を遂行した。転写因子ネットワークの解析としてDax1に着目している。Dax1と相互作用する因子として、Esrrbを酵母two-hybrid法により同定した。

EsrrbはDax1のLXXLLモチーフに結合し、一方Dax1はEsrrbの転写活性化領域とリガンド結合領域に結合した。これにより、Dax1はEsrrbの転写活性化能を抑制的に制御することを見出した。Dax1、Esrrb、Oct3/4の三者間の相関関係を解析したところ、競合的に複合体を形成しており、Dax1はEsrrbもしくはOct3/4に結合することで、その機能を阻害している可能性を見出した。細胞増殖制御機構の解析としてLRH-1を解析した。この因子をノックダウンすると、サイクリンE1とE2F1の発現量の低下と増殖能の低下が観察された。またE2F6の過剰発現によってE2F1の機能を阻害すると、サイクリンE1 mRNAの発現量やサイクリンE1プロモーターの活性の低下が観察され、そのプロモーター活性はE2F1の過剰発現によって上昇した。さらに、ビオチンDNA-プルダウンアッセイやクロマチン免疫沈降法から、E2F1がサイクリンE1プロモーターに結合していることを示した。「エピジェネティクス制御機構の解析」、「クロマチン・リモデリング複合体の解析」及び「細胞周期制御機構の解析」の3テーマからは、それぞれ新しい知見が見出されており、今後も継続的に解析を続けることで大きく発展が見込まれることから、現段階でおおむね順調に進展していると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。Baf53a遺伝子に関しては、片アリルの遺伝子破壊が成功しているので、今後両アリルを破壊し、自己複製への影響を解析する。またGABPalpha遺伝子に関しては、遺伝子破壊時におけるES細胞の表現型は観察されたものの、その詳細な分子メカニズムの解明には至っていない。今後、その分子メカニズムを明らかにする予定である。ES細胞におけるLRH1→E2Fl→CyclinE1の経路は、分子生物学的手法(Luciferase assayやChIP assayなど)を利用し、分子経路の詳細を解明する予定である。
ヒトｉＰＳ細胞由来小腸上皮細胞を用いた創薬、医学研究の基盤構築

小腸上皮は胚性内胚葉に由来し食品や薬物を吸収、代謝する組織であるため薬物開発においては重要である。小腸のモデル細胞としてヒト結腸癌由来細胞株、Caco2細胞が用いられている。Caco2細胞はin vitroで小腸様細胞に分化するため薬物吸収試験に用いられている。しかしCaco2細胞は薬物代謝酵素の発現が低く、また研究室間で細胞の性質が異なるため、より正常な小腸上皮に近いモデル細胞が必要となってくる。ヒトiPS細胞は広く普及しており、入手や樹立も容易に行える。また様々な低コストな化合物を用いた分化誘導方法の構築も期待されることから、ヒトiPS細胞を用いた小腸上皮細胞への分化誘導法の構築を目的に実験を行った。平成26年度は、安価な分化誘導方法の構築を行った。分化誘導法はOgaki et al., 2013に則して行った。胚性内胚葉の分化にはActivinシグナルが重要であることが知られている。一般的に世界中の研究者はヒト多能性幹細胞から胚性内胚葉の分化誘導には100 ng/mlのActivinを用いる。本研究で溶媒として用いられるDimethyl Sulfoxide (DMSO)が、ヒトiPS細胞からActivinを用いた胚性内胚葉の分化を促進し、Activinの使用濃度を6.25 ng/mlまでコストダウンすることを見出した。6.25 ng/mlのActivinと0.8%のDMSOを組み合わせることにより、90%以上の細胞がSOX17陽性の胚性内胚葉に分化した。作用機序としては、DMSOが細胞増殖の抑制を引き起こし、Activinシグナルが増強されていた。その結果、胚性内胚葉分化を促進されていたことが示唆されたまたこの胚性内胚葉は小腸上皮細胞分化誘導低分子化合物であるBIOとDAPTの添加により、薬物代謝酵素・トランスポーターも発現する腸細胞様細胞に分化誘導できたことが示唆された翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
デジタルカオス暗号システム

本研究の主題は、i.i.d.(independent and identically distributed;独立同分布)2値系列を鍵系列とするストリーム暗号システムの構築である。既に、本研究代表者はその基本システムとして、日本および米国において特許申請を行い現在公開(各々、特願平8-99985,特願平7-274292、US Patent No.08/734,919)している。その基本システムは、実数値のカオス軌道を生成するカオス生成器(写像)と実数値・2値関数変換を行うための2値関数生成器とからなる。本年度の研究成果の主要結果は次の2点である。1.カオス実数値系列(無限アルファベット系列)から有限アルファベット系列を生成するための量子化関数を2値関数からP【greater than or equal】2値関数や実数値関数へ一般化した場合でも二つの条件EDP,CSPが重要な役割を果たすこと及び,カオス実数値系列の独立性の必要十分条件等を"Proceedings of the IEEE"(裏面の第一論文)に纏め広く公表した。2.従来上記カオス生成器としての写像は専ら、区分的線形写像や多項式型写像に限定されていたが、Jacobi楕円関数やWeierstrass型楕円関数に基づく有理関数型写像にも拡張できることを明らかにした。このことは、Jacobi楕円関数やWeierstrass楕円関数で定義される有理関数型写像から生成される実数値の独立性の検討およびi.i.d.2値系列生成法の高精度の実装法の開発等により、従来の多項式型写像の実装時での問題点の解決可能性を指摘している。特に、複素力学系の典型例を与えている後者と有限体理論に基づく楕円曲線暗号との関連を明らかにする必要があることも併せて意味している。ストリーム暗号システムにおいて理想的な2値の鍵ストリーム系列とは,情報理論でしばしば仮定される独立同分布(以下,i.i.d.(independent and indentically distributed)と略称する)の系列,すなわちベルヌイ試行であり,この具体的生成法の開発がストリーム暗号システムの構築の根幹の問題である.本研究代表者は,既に,カオスを呈するあるクラスの一次元非線形エルゴード写像が,多種類のi.i.d.カオス2値系列を生成し得ることを理論的に明らかにした.このクラスに含まれるよく知られた写像として,区分線形の2進写像,テント写像,多項式のロジスティック写像,p(p=2,3,・・・)次多項式のChebychev写像が挙げられる.本研究では,p次Chebyshev多項式写像を特別な場合として含む,より広い有理関数型写像のクラスを与えた.この写像は,Jacobiの楕円関数,en関数から派生したものであり,Jacobi-Chebyshev有理写像と命名した.本研究の主題は、i.i.d.(independent and identically distributed ;独立同分布)2値系列を鍵系列とするストリーム暗号システムの構築である。既に、本研究代表者はその基本システムとして、日本および米国において特許申請を行い現在公開(各々、特願平8-99985,特願平7-274292、US Patent No. 08/734,919)している。1.既に研究代表者らが、i.i.d.2値系列が生成できるための条件は、カオス写像の不変密度(実数値の定常分布、測度)の均等分布性(EDP : Equidistributivity property)と2値関数の一定和性(CSP : Constant Summation Property)であることを明らかにしていたが、この2条件が2値系列の遅れ時間に関する無相関性の十分条件であることを明らかにした。

更に、カオス実数値系列(無限アルファベット系列)から有限アルファベット系列を生成するための量子化関数を2値関数からP【greater than or equal】2値関数や実数値関数へ一般化した場合でも二つの条件EDP, CSPが重要な役割を果たすこと及び,カオス実数値系列の独立性の必要十分条件等をsurvey paperとして纏めた。2.従来上記カオス生成器としての写像は専ら、区分的線形写像や多項式型写像に限定されていたが、Jacobi楕円関数やWeierstrass型楕円関数に基づく有理関数型写像にも拡張できることを明らかにした。特に、前者のタイプの有理関数は有名なChebyshev多項式写像の有理関数版であること及び、後者のそれは従来の実数値関数から複素関数への一般化となり、複素力学系や暗号分野における楕円暗号との関連を研究調査しなければならないことを指摘した。本研究の主題は、i.i.d.(independent and identically distributed;独立同分布)2値系列を鍵系列とするストリーム暗号システムの構築である。既に、本研究代表者はその基本システムとして、日本および米国において特許申請を行い現在公開(各々、特願平8-99985,特願平7-274292、US Patent No.08/734,919)している。その基本システムは、実数値のカオス軌道を生成するカオス生成器(写像)と実数値・2値関数変換を行うための2値関数生成器とからなる。本年度の研究成果の主要結果は次の2点である。1.カオス実数値系列(無限アルファベット系列)から有限アルファベット系列を生成するための量子化関数を2値関数からp【greater than or equal】2値関数や実数値関数へ一般化した場合でも二つの条件EDP, CSPが重要な役割を果たすこと及び,カオス実数値系列の独立性の必要十分条件等を"Proceedings of the IEEE"(裏面の第一論文)に纏め広く公表した。このことは、Jacobi楕円関数やWeierstrass楕円関数で定義される有理関数型写像から生成される実数値の独立性の検討およびi.i.d.2値系列生成法の高精度の実装法の開発等により、従来の多項式型写像の実装時での問題点の解決可能性を指摘している。特に、複素力学系の典型例を与えている後者と有限体理論に基づく楕円曲線暗号との関連を明らかにする必要があることも併せて意味している。
垂直配向単層カーボンナノチュープ膜面上への蒸着と接着方法の研究

研究目的:単層カーボンナノチューブが有する高熱伝導性を利用し、電子部品・機器等の冷却性能向上が期待できると着想した。こうした背景から本研究は、(VA-SWNT膜)にうすく貴金属を蒸着してから、還元雰囲気中で、伝熱ブロック面と蒸着膜面との間に最適なロウ付け材料を選定し、アニールしながら(VA-SWNT膜)を接合すれば、強固に(VA-SWNT膜)接着を実現できると考え、最適な条件を実験的に明らかにすることを目的とした。研究方法:アニール用実験装置を試作し、試料をチャンバー内部に母材I(伝熱ブロック)と母材II(金蒸着VA-SWNT膜+石英基板)の間に(ロウ付材料)を挟みこみ、石英円筒管の中央にセットし、アルゴンガスを流しながら還元雰囲気中において、400°C900°Cの範囲でアニール温度を各種設定した。試料の加熱には、昇温速度が速く、温度コントロールが簡単にできる石英カーボンヒーター(QCHヒーター:スパイラル型)を石英円筒管の外側に設置し、設定温度±3°Cで10分間程度維持した。なお温度は、チャンバー上方よりシース熱電対を挿入して試料直上で測定した。10分間維持した後は、石英カーボンヒーターをOFFにし、室温まで放置した。研究成果:目的の伝熱ブロックに金蒸着した(VA-SWNT膜)だけを接合する事に成功した。顕微鏡写真で観察したところ、(VA-SWNT膜)、銀ろう,銅伝熱ブロックが、お互いしっかり接合していた。この(VA-SWNT膜)を接着した伝熱ブロックを利用して、伝熱特性実験を行なうことができた。
脳血管障害後のリハビリテーション介入効果の分子学的研究

中大脳動脈領域の脳梗塞モデルラットを作成し、骨格筋の中枢神経障害後の経時的形態学的変化と、中枢神経障害後の骨格筋に対する低中強度の定期的な運動介入効果の影響について比較・検討した。運動機能や神経学的評価において4週後で運動群が非運動群に比べ有意な改善を示した。筋質重量は、両群術後7日まで減少したがその後回復し、運動の有無による筋湿重量に有意な差はみられなかった。また、両群ともに、麻痺側・反対側ともに有意な差はみられなかった。H/E所見では、非運動群の麻痺側3日後と14日横断面積はタイプII繊維が有意に小さく術7日後まで減少し、その後回復を示した。本研究では、リハビリテーションの視点から、リハビリテーション介入が脳血管障害後の脳の可塑性を促せるのか、脳血管障害後のMidkine(MK)の機能および神経脱落に対する神経栄養因子MKの働きについて検討するとともに、他の神経栄養因子との相互関係を検証し、神経栄養因子が神経細胞死や神経修復にどのように働いているのか検討することを目的とする。これまでの先行研究により、脳梗塞作成後、早期から運動介入を行うと神経栄養因子Midkineの発現が高まり、行動学的・神経外科的に回復が良好であった。これらの結果を踏まえ、Midkineノックアウトマウスで脳梗塞を作成し、回復にどのような影響を与えるのか検討する。脳梗塞後の梗塞周辺部の修復・回復過程を検証することを目的に、SDラットをもちいて実験的脳梗塞を作製し、継時的に損傷周辺部の組織を観察した。脳梗塞は、塞栓糸を用いて左中大脳動脈に挿入し、60分の閉塞を行った後に再灌流した。このモデルは、人の脳梗塞病態に一番近いモデルとされ、世界的に脳梗塞実験で用いられているモデルである。脳組織は、継時的に脱血還流後に摘出し形態学用と分子生物学用にわけた。パラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。タンパクは抽出後、すべてのサンプルが同量となるようにサンプルを作製し、ウエスタンブロッドを行った。実験モデルの作製も安定して順調に行え、サンプルもパラフィン切片、タンパクと検証できるレベルまで作成できているため。中枢神経障害後の機能回復を検証するために、ヒトの脳梗塞の発症機序に一番近いとされている中大脳動脈一時閉塞モデルを使用した。このモデルは、一側の内頚動脈より塞栓糸を挿入し、中大脳動脈起始部を一時的に閉塞するものである。本研究室では、一定の割合(一日後3540%、一週間後2530%)の脳梗塞をこのモデルを使用して作成することが可能である。脳梗塞作成後、動物の活動性が運動群と非運動群でどのような差があるのか検討した。運動群と非運動群、両群ともに脳梗塞直後は脳浮腫の影響もあり、活動性が低下し餌食量も減少し、結果体重も一時的に減少したが、その後脳浮腫の改善とともに、活動量も増し、体重も増加した。運動群と非運動群の両群間に、有意な差はなかった。棒上歩行による動作評価では、脳梗塞作成後約5日後までは脳浮腫の影響も大きく、運動群・非運動群ともに活動性は低い状態であった。しかし、脳浮腫が改善してくる1週間後から、徐々に活動性があがり、とくに運動群では非運動群と比較して、脳梗塞作成28日後には有意に運動能力が改善した。それは、早期からトレッドミル運動で両四肢の協調運動を促通しており、その影響が脳梗塞後の運動回復にも良好の効果を及ぼしたと示唆できる。現在、ミッドカインノックアウトマウスを飼育しているが、遺伝子スクリーニングがうまく検出できずに、採取したRNAの抽出を再検討しているところである。サンプル数が足りないグループがあるので、モデルを作成しサンプルを作成するとともに、サンプル解析も進めていく。理学療法学遺伝子スクリーニングが順調に行い、マウスの遺伝子タイプ判別が可能になれば、ワイルドタイプのマウスとホモタイプのマウスで脳梗塞を作成し、修復過程を検討していく。初年度にタンパク抽出がうまくできずに、当初の予定より実験の進行が滞り、その分の予算が次年度にまわったためノックアウトマウスの遺伝子解析が予定よりも大幅に遅れているため、当初の研究計画予定よりも遅れているため、動物のモデル作製費用や実験試薬の消耗品代を次年度へ繰り越した。当初の申請通り、消耗品を中心とした実験を遂行する上での試薬購入費等に使用するRNA抽出レベルを上げ、まずはマウスの遺伝子タイプを判別させることは何よりである。遺伝子タイプの判別が行えれば、マウスの脳梗塞モデルは過去に作製経験があり、技術も習得しているため、実験の円滑な遂行が可能である。
ムラの場、ハカの場-GISを利用した古墳時代集落・古墳の立地選択の研究-

本年は最終年度として、活動のまとめをおこない、また、古墳・集落の立地についての検討をおこなった。昨年度測量をおこなった岡山県上房郡北房町才田古墳群の成果を基本に、デジタイザによる標高データの入力をおこない、馬諏図の作成をおこなった。これにより、古墳の形状をより立体的に把握することが可能になった。今後は、古墳築造の工法などの検討も含め、発掘調査を実施することが必要になると考えるが、研究を継続する上での基本図として重要なものになると考えられる。また、古墳立地と地質との関係を検討する為、GISを用いて、オーバレイをおこなった。この点からは、古墳が、礫岩が中心となる地質区分の部分とその周辺に集中することが伺え、立地選択において地質条件が勘案されていた可能性が指摘できる。数値地図から傾斜度を算出し、古墳分布とオーバレイをおこなった結果では、平坦面よりも傾斜面に集中する傾向にあり、集落や生産基盤としての利用が可能な平坦地を造要域としては選択していないようである。しかし、大阪平野や岡山南部平野においては古墳時代中期以降平担面にも造墓がみられ、利用可能な地形の制約を強く受けていたことが想定できる。これらの成果は研究会で公表したほか、現在準備中の定東塚・西塚古墳の調査報告書等で公表していく予定である。古墳時代の集団・社会のあり方を土地利用という観点より考察することを目的として、考古学研究に地理情報システム(GIS)を導入し、空間分析の手法を応用することを目的に検討を行なった。研究の初年度にあたる本年度は、基礎的なデータの収集・分析を主眼に置いた作業をすすめ、ソフトウェアの習熟,フィールドワークによるデータ収集を行なった。フィールドは、研究代表者がかねてより発掘調査等を行なってきた岡山県上房郡北房町中津井地区を中心に古墳・横穴の分布調査を行ない、写真・略図作成等の基礎的な作業を行なった。また、分布調査中に、その重要性が認識された才田1号墳とその周辺にある2・3号墳の測量を土地所有者の協力により実施した。これらの成果については平成10年度刊行予定の定東塚・西塚発掘調査報告書等によって公表をしていくことを考えている。
アスパラギン酸アミノ基転移酵素のサブユニット相互作用と機能発現の相関

ブタ細胞質局存アスパラギン酸アミノ基転移酵素(cAspAT)は、強固な二量体構造をとり、各サブユニットは、大小の2つのドメインから構成されている。大ドメインに存在するintersubunit surfaceでの相互作用やアミノ基末端側小ドメインの411残基と隣接するサブユニットの大ドメインとの相互作用により二量体構造が保持されていることが、X線結晶解析により明らかにされている。また、それぞれの活性中心が他のサブユニットのアミノ酸残基の関与により構成されていることから、本酵素の活性発現には二量体構造が必須と考えられている。本研究では、大ドメイン間におけるイオン結合を構成するアミノ酸残基や、アミノ基末端部での相互作用に関与するアミノ酸残基群に、遺伝子操作法を適用し、特定部位にアミノ酸置換と欠失をもつ変異酵素を系統的に作成することにより、天然では得難い単量体標品を調製し、その標品の諸性質の検討と野性型二量体酵素との比較により酵素の全体構造と機能の関連を知ると共に、本酵素の機能発現の分子機構を解明しようとした。大ドメイン間サブユニット相互作用に関与すると想定されるHis68を同じ正電荷を持つLysや疎水性のIleに置換した結果、この残基の持つ正電荷が相互作用に必須であり、またIleに置換して酵素の安定性が低下することから酵素構造の維持に重要な役割をはたしていることが指摘された。アミノ基末端部の欠失のみでは単量体に解離しないが、構造安定性が低下する事実が判明したので、His68をIleに置換した変異酵素のアミノ基末端部を欠失させたところ、単量体への解離を観察した。しかし、構造安定性も同時に失われたため触媒機能の有無の詳細な検討を行うに到らなかった。ブタ細胞質局在アスパラギン酸アミノ基転移酵素(cAspAT)は、強固な二量体構造をとり、各サブユニットは、Large及びSmallの2つのDomainから構成されている。Large domainに存在するIntersubunit surface間での相互作用、N末端側Smalldomainの411残基と隣接サブユニットのLarge domainとの相互作用による二量体構造が保持されていることが、X線結晶解析により明かにされている。単量体への解離定数は10^<-9>以下と推定されている。また、それぞれの活性中心が他方のサブユニットのアミノ酸残基の関与により構成されていることより、本酵素の活性発現には二量体構造が必須と考えられている。本研究では、Large domain間におけるイオン結合を構成するアミノ酸残基や、N末端部での相互作用に関与するアミノ酸残基群に、遺伝子操作法を適用し、特定部位にアミク酸置換と欠失をもつ変異酵素を系統的に作成し、その標品の諸性質の検討と二量体酵素との比較により酵素の全体構造と機能の関連を知ると共に、本酵素の機能発現の分子機構を解明しようとしている。本酵素の活性発現に必須とされる二量体構造を保持するため、他方のサブユニットとの相互作用の一部を分担していると考えられるN末端領域を、5,6,7,8,9,10残基と削除し、その酵素の熱安定性、プロテア-ゼに対する感受性や触媒活性の変化を観察した。サブユニット間相互作用に重要と想定されるイオン結合を構成する残基群の一つ、His68を種々のアミノ酸に変異した酵素を作成し、構造安定性、活性変化を観察した。NMRによるダフ酵素のHis領域の観察結果とlleに変異させた酵素のスペクトルの比較により、野生型酵素で最も低磁場に観察され、pHとともに化学シフトの変化を示さない一つのHisピ-クが、変異酵素では消失していることを見いだした。ブタ細胞質局在アスパラギン酸アミノ基転移酵素(cAspAT)は、強固な二量体構造をとり、各サブユニットは、大小の2つのドメインから構成されている。

大ドメインに存在するintersubunit surfaceでの相互作用やアミノ基末端側小ドメインの411残基と隣接するサブユニットの大ドメインとの相互作用により二量体構造が保持されていることが、X線結晶解析により明らかにされている。また、それぞれの活性中心が他のサブユニットのアミノ酸残基の関与により構成されていることから、本酵素の活性発現には二量体構造が必須と考えられている。本研究では、大ドメイン間におけるイオン結合を構成するアミノ酸残基や、アミノ基末端部での相互作用に関与するアミノ酸残基群に、遺伝子操作法を適用し、特定部位にアミノ酸置換と欠失をもつ変異酵素を系統的に作成し、その標品の諸性質の検討と野性型二量体酵素との比較により酵素の全体構造と機能の関連を知ると共に、本酵素の機能発現の分子機構を解明しようとした。大ドメイン間サブユニット相互作用に関与すると想定されるHis68を同じ正電荷を持つLysや疎水性のIleに置換した結果、この残基の持つ正電荷が相互作用に必須であり、またIleに置換した酵素の安定性が低下することから酵素構造の維持に重要な役割をはたしていることが指摘された。前年度の研究でアミノ基末端部の欠失のみでは単量体に解離しないが、構造安定性が低下する事実が判明したので、His68をIleに置換した変異酵素のアミノ基末端部を欠失させたところ、単量体への解離を観察した。しかし、構造安定性も同時に失われたため触媒機能の有無の詳細な検討を行うに到らなかった。
牛タイレリア病のワクチンによる予防

1.スポロゾイト(SP)合成ワクチン。SPの精製法について検討を進めたが、実験に使用できる十分な量が得られなかった。予備試験として、得られたSPに対する抗血清を作製して、メロゾイト(Mz)と抗原性を比較した。その結果SPの主要抗原蛋白は78と74KD、Mzは42と32KDであり、これらの抗原はSPとMzの両方の抗血清と反応することから共通抗原と考えられた。そこでMzに対して感染防御能を持つ32KDのMz抗原を認識するモノクロ-ナル抗体(MAb)を3頭の子牛に時期を変えて投与し、SP攻撃による感染防御試験を実施した。その結果、Mz寄生赤血球の発現と寄生率のピ-クが対照牛に比較して遅れる傾向がみられ、臨床症状も軽減されることが明らかとなった。しかしこのMAbはSPに対する抑制効果は認められず、今後もSPを中和するMAbの作出を続ける予定である。2.メロゾイト合成ワクチン。MzのMAb(32KD)はMzの増殖をほぼ完全に阻止できたので、Mzに対する合成ワクチンの作製を進め現在までにCDNAライブラリ-を作製した。BabesiaやPlasmodium原虫のように抗原性の変異を起こし、株間で抗原性が著しく異っているとこのワクチンは無効と考えられる。そこで株間のantigen diversityを検討するためにMzのDNAプロ-ブを作製した。3.抗イデオタイプワクチン。MzのMAbパラト-プに対するモノクロ-ナル抗イデオタイプ抗体が22株得られた。この抗体の免疫グロブリンサブクラスはIgG_1であった。IFAによるinternal imageの検出を試みたところ3株に特異蛍光を認めた。これを牛に投与するとMz抗体が誘導された。4.T.sergenti実験感染牛の細胞性免疫応答。原虫血症がピ-クになる前にMφの活性が一過性に上昇し、原虫血症のピ-クに一致してT-cellの分裂・増殖が促進され、遅れてNK活性が上昇した。T-cellから放出されるリンオカインによるMφの活性が発症阻止の主体と考えられた。1.スポロゾイトの合成ワクチン:感染ダニのスポロゾイト(SP)の発現率は成ダニより若ダニが高率であり、感染若ダニは飼育温度を25°Cから37°Cに上げると吸血刺激がなくてもSPが成熟し感染力をもつようになった。モノクローナル抗体(MAb)作製のためには、さらにSP抗原を精製し、アッセイ系を確立する必要がある。現在メロゾイト(Me)のMAbとSPのポリクローナル抗体を用いてMeとSPの抗原性を解析中である。もし共通抗原があり、Me抗体でSPの感染を防止できれば抗原の得やすいMeが利用できる。そこでDNAの組み換えによってMeのDNAプローブを作製し、これを診断に応用すると同時にSPのDNAとの反応性を検討した結果、2個のMeプローブのうち1個はSPと反応した。2.抗イデオタイプワクチン:Meの32kd MAbがMeの膜抗原に由来するものであることを免疫電顕法で確認した。さらにこの抗体によるMeの感染防御試験を4頭の実験牛を用いて実施した結果MeにMAbを感作して接種した牛は感染が完全に阻止され、牛にMeのMAbを投与してMeを接種した場合でも増殖が著しく抑制され、MAbの発病抑制効果が明らかにされた。