hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎臓に高発現するウロン酸回路の酸化還元酵素に関する研究 ―浸透圧調節と薬物代謝における役割および糖尿病合併症の発症との関連性―

本研究は、ウロン酸回路の新しい役割を明らかにするため、この代謝系の3酵素の構造、性状、分布を検討し、得られた知見を以下に要約する。1.L-キシルロース還元酵素(XR):ヒト、モルモット、ハムスター、ラットおよびマウスのL-キシルロース還元酵素のcDNAを単離し、各リコンビナント酵素を大腸菌の系で発現・精製し、性状を明らかにした。本酵素はshort-chaindehydrogenase/reductaseファミリーに属し、ジアセチル還元酵素と同一であり、種々の薬物のケトンや異物のジカルボニル化合物を還元した。本酵素は上記の動物組織に広く分布し、肝臓と腎臓に高発現し、ラットとマウスの腎では尿細管上皮細胞の刷子縁膜に局在した。ヒトXRを結晶化、X線解析により、サブユニット内のジスルフイッド結合をもつ4次構造を明らかにした。部位特異的変異法により、触媒反応および基質結合に関わる8残基を同定した。動物のXRが低温失活する構造的要因も明らかにした。ブチル酸などの本酵素の特異的な拮抗阻害剤を見出し、結晶構造に基づいたコンピュターモデリングにより候補阻害剤の誘導体を設計し、XR過剰発現細胞で細胞内移行性も試験した。XR遺伝子過剰発現マウスおよびノックアウトマウスを作製し、その生理的変化を観察した。2.キシリトール脱水素酵素(XDH):XDHも動物組織に広く分布し、肝臓と腎臓に高発現していた。モルモットのXDHは、medium-chain dehydrogenase/reductaseファミリーに属するソルビトール脱水素酵素と同定され、細胞質とミトコンドリアのXDHも同一酵素であることが示唆された。いくつかの芳香族アルコールが本酵素の基質となった。3.グロン酸脱水素酵素(GDH):GDHもモルモットとウサギの組織に広く分布し、肝臓と腎臓に高発現していた。精製したウサギGDHのアミノ酸配列分析から、本酵素は3-hydroxyacyl CoA dehydrogenaseファミリーに属する2量体酵素であることが示唆された。本酵素は糖以外のジカルボニル化合物のいくつかも基質とした。本研究は、ウロン酸回路の新しい役割を明らかにするため、この代謝系の酵素の構造、性状、分布、誘導を検討し、得られた知見を以下に要約する。1.酵素化学的研究(1)ウロン酸回路の酸化還元酵素のcDNA単離、性状解析および組織分布:ヒト、モルモット、ハムスター、ラットおよびマウスのL-キシルロース還元酵素(XR)のcDNAを単離し、各リコンビナント酵素を大腸菌の系で発現・精製し、性状を明らかにした。本酵素はSDR(short-chain dehydrogenase/reductase)ファミリーに属し、従来別種の酵素と考えられていたジアセチル還元酵素およびヒト副睾丸タンパクP34Hと同一であり、ブチル酸が特異的な拮抗阻害剤であることを認めた。本酵素が生体成分のイサチンも還元することを認めたが、ヒト肝と腎ではイサチン還元の主酵素とは異なった。なお、グロン酸脱水素酵素とキシリトール脱水素酵素のcDNA単離に至っていないので、両酵素の検討は次年度に行う。

(2)XRの構造・機能相関研究:ヒトXRの結晶を得て、X線解析により高次構造を決定中である。部位特異的変異法により、触媒反応および基質結合に関わる8残基を同定した。2.培養細胞を用いた高グルコース、薬物および浸透圧による酵素誘導の検討ヒト由来細胞を用いて、高グルコース、高浸透圧、薬物投与による、XRのmRNAの発現変動を調べたが、有意な変化が認められなかった。3.トランスジェニック細胞とマウスおよびそのノックアウトモデルの検定XRを過剰発現するウシ腎尿細管細胞、XR遺伝子のトランスジェニックマウスを作製し、本酵素活性・タンパクおよび生体成分(イサチンとグルコース)の代謝が著しく亢進することを確認した。ノックアウトマウスについては、現在、その生化学的変化を確認中である。本研究は、ウロン酸回路の新しい役割を明らかにするため、この代謝系の酵素の構造、性状、分布、誘導を検討し、得られた知見を以下に要約する。1.ヒトのL-キシルロース還元酵素(XR)の構造・機能相関研究:(1)ヒトXRのX線結晶構造解析により、新規な3次構造を明らかにした。(2)動物のXRが低温失活するのに対してヒトXRのみが低温で安定である構造的要因は、グルタミン酸238とトリプトファン242によるサブユニット会合に重要なの塩結合の安定化であることが判明した。(3)ヒトXRが他の動物の酵素より基質に対して低いKm値を示す構造的要因の1つはサブユニット内のジスルフィッド結合が原因であることが明らかになった。2.特異的かつ強力なXR阻害剤の創製:ヒトXRと阻害剤の複合体の結晶構造は解析中である。結晶構造に基づき、コンピュターモデリングにより、候補阻害剤の誘導体を設計した。しかし、現在、まだ細胞透過性も良い阻害剤は見出せていない。3.糖尿病合併症の新発症機構:XR遺伝子過剰発現マウスはノックアウトマウスに比べて、繁殖能が低下していることが判明し、その原因を究明中であり、高血糖における検討に至らなかった。4.キシリトール脱水素酵素とグロン酸脱水素酵素の構造および性状解析:モルモットのキシリトール脱水素酵素はソルビトール脱水素酵素と同定された。モルモットとウサギのグロン酸脱水素酵素の一次構造は新規であるが、3-hydroxyacyl CoA dehydrogenaseファミリーに属することが示唆された。5.薬物代謝における役割:XRは種々の薬物のケトンや異物のジカルボニル化合物を還元した。キシリトール脱水素酵素はいくつかの芳香族アルコール類を酸化し、グロン酸脱水素酵素も糖以外の化合物のいくつかを基質にした。
移植用の高機能細胞凝集体の調製

本研究は、幹細胞(アクセプター細胞)の分化環境を提供する細胞(ドナー細胞)を作製し、三次元的共培養でアクセプター細胞の分化・形態を制御し、ドナー細胞を除去して移植用の高機能細胞凝集体を調製することを目指した。アクセプター細胞の前処理やドナー細胞の選択・加工(種々の因子の強制発現)は予定通りに完成し、共培養によるアクセプター細胞の分化誘導も確認できたが、ドナー細胞の完全除去は困難を極めた。そこで、ドナー細胞が提供する因子をアクセプター細胞に発現調節可能な形で直接導入し、それを用いて高機能のアクセプター細胞集合体(心筋、表皮、軟骨、乳腺上皮)を調製した。本研究では、まず、幹細胞の分化環境を提供する細胞(ドナー細胞)を作製し、次に、ドナー細胞と三次元的に共培養を行った幹細胞(アクセプター細胞)の分化・形態の制御を試み、最終的にドナー細胞を除去しアクセプター細胞由来の高機能細胞凝集体を純化することを目標にしている。平成25年度は、アクセプター細胞として、霊長類ES細胞や胎生未分化癌細胞を採り上げて、単離・追跡用の加工を行い、細胞密度に依存した分化挙動の追跡や、平成24年度に遺伝子改変を進めたドナー細胞との共培養等による分化制御を行った。1.分化誘導後に蛍光を発するように、未分化なES細胞では機能抑制されるCMVプロモーターに蛍光タンパクGFPの遺伝子を連結したものを薬剤耐性遺伝子と共に霊長類ES細胞に導入し、これを各種の胎児から調製したドナー細胞と混合後、ペレット状態(細胞集合体)で培養を行った。その結果、マウス胎児の肺や小腸由来のドナーによってES細胞は蛍光を発すると共にドナーに由来する組織類似の形態を呈するようになった。2.他のアクセプター細胞として、分化誘導法が確立しているマウス胚性癌細胞P19CL6細胞を理研細胞バンクから入手し、薬剤耐性遺伝子とミオシンプロモーターにGFPを連結した遺伝子を導入し心筋分化に伴って蛍光を発する様加工した。これらの細胞は、ある種のドナー細胞(繊維芽細胞由来のもの)と直接接触させることにより劇的に分化が促進することがわかった。3.薬剤処理によってドナー細胞/アクセプター細胞共培養中でアクセプター細胞が選択的に生存することが確認されたものの、死滅し断片化したドナー細胞をアクセプター細胞から完全に取り除くことは困難であった。そこで、直接接触によりアクセプター細胞の分化を誘導するドナー細胞表面分子から分化誘導因子の候補タンパクを選択し、それを直接アクセプター細胞に導入する系を構築した。本研究では、まず、幹細胞の分化環境を提供する細胞(ドナー細胞)の精密な分化ならびに形態制御を行い、次に、ドナー細胞と三次元的に共培養を行った幹細胞(アクセプター細胞)の分化・形態の制御を試み、最終的に、ドナー細胞を除去しアクセプター細胞由来の高機能細胞凝集体を純化することを目標にしている。平成24年度は、ドナー細胞の選択ならびに、エピモルフィンやそのファミリー分子の発現操作を通じて、細胞凝集体としてドナー細胞が提供し得る微小環境の創製・解析を行った。具体的には以下の通り。1.マウス胎児の種々のステージの未分化な諸器官を取り上げ、多孔性膜上での器官培養で正常発生を行わせたものと、構成細胞を単離後2次元で培養したもの、ならびに再度人工的に凝集体として多孔質膜上で培養したものについて形態ならびに分化マーカーを比較した。その結果、尾芽の体節由来の未分化な硬節細胞が3次元の状態(器官・再集合体)でのみ特殊な分化環境を作り出し自らの機能・形態分化を促進させることを見出した。また、この系で、インスリンやIGFの作用により機能分化を、また、細胞外エピモルフィンやBMPの作用により形態分化を促す環境が作り出せることが判明した。また、2.モデル細胞として胎児奇形腫F9細胞を凝集体作成前・後にエピモルフィンファミリー分子のsyntaxin4を細胞表面に発現誘導することで、細胞形態の著しい変化と細胞分化が誘導された(内胚葉性上皮への分化誘導を促す環境が創製できた)。さらに、色素細胞中で同ファミリー分子のsyntaxin3を発現調節(強制発現と遺伝子ノックダウン)することでも、細胞形態ならびに有色メラノソームの分泌挙動の調節が可能になった(癌細胞の分化機能を調節する環境の創製)。本研究では、まず、幹細胞(アクセプター細胞)の分化環境を提供する細胞(ドナー細胞)を作製し、次に、ドナー細胞と三次元的に共培養を行ったアクセプター細胞の分化・形態の制御を試み、最終的にドナー細胞を除去しアクセプター細胞由来の高機能細胞凝集体を純化することを目標にした。

これまでに、アクセプター細胞の前処理(分化により蛍光を発する、薬剤耐性遺伝子の導入)やドナー細胞の選択・加工(種々の因子の強制発現)、さらには、共培養によるアクセプター細胞の分化誘導も確認できたが、昨年度にドナー細胞の完全除去が困難であることが判明した。そこで、平成26年度はマウスiPS細胞やEC細胞にドナー細胞が供給する分化誘導因子の遺伝子を直接導入し、テトラサイクリンによる発現誘導系を利用してアクセプター細胞の集合体をドナー細胞なしに分化誘導させた。1.Syntaxin1はiPS/ES細胞が神経系へ分化するのに伴って発現し、神経機能や形態に影響を与える。そこで、まずiPS細胞にこの発現プラスミド、もしくはノックダウンコンストラクトを導入し、導入遺伝子を発現させずにSFEBq法でその細胞集合体の神経系への分化を促した。その後、テトラサイクリン添加量の調節でsyntaxin1の発現を人工的に調節したところ、グリア細胞への分化を抑え、ニューロンへの分化を促進する条件が抽出できた。2.平成25年度に作製したP19CL6-MLC-GFPは、ドナー細胞が産生するエピモルフィンにより心筋細胞への分化が加速されることが分かった。そこで、シグナルペプチドを付加して効率的に細胞外へ呈示するように加工したエピモルフィン遺伝子をアデノウイルスによってP19CL6-MLC-GFPの集合体に導入した。その結果、このアクセプター細胞は高効率で(通常のDMSOによる効率の20倍)心筋に分化することが分かった。細胞生物学、再生医学平成25年度は、アクセプター細胞の調製とドナー細胞との3次元共培養による分化誘導を行い、分化したアクセプター細胞の選択回収の予備実験を計画していたが、以下の結果により計画は達成できたと考えられる。まず、1)アクセプター細胞として霊長類ES細胞とマウス胚性癌細胞P19CL6を採り上げ、これに薬剤耐性遺伝子を発現させ、さらに、分化に伴って蛍光を発するよう加工したものが調製できた(それぞれをアクセプター細胞AおよびBと呼ぶ)。次に、2)アクセプター細胞A(霊長類ES細胞)とマウス胎児の各種組織から摘出したドナー細胞を混合し、細胞ペレットとして気層/液相境界面でインキュベートする3次元共培養系で、アクセプター細胞Aの形態・機能分化の大まかな調節が可能になった。さらに、3)アクセプター細胞B(胚性癌細胞P19CL6)とドナー細胞(様々な遺伝子加工し異なる分化誘導環境を提供できるようにした各種の株細胞:平成24年度に調製)を共培養することで、アクセプターB細胞の顕著な分化促進を行えるものが見つかった。ただし、一方で、分化誘導後の薬剤処理でドナー細胞は死滅するものの、分化したアクセプター細胞集合体からドナー由来の死細胞断片を完全に取り除くことが困難であることが分かった。そこで、アクセプター細胞に直接接触することで分化を加速するドナー細胞に着目し、その細胞表面分子からアクセプター細胞の分化促進機能を担う分子を選び出した。その中には、我々が当初から注目していたエピモルフィンやそのファミリー分子が含まれることが判明したので、現在、それらの分子を直接アクセプター細胞の表面に発現させることでアクセプター細胞間の接触で分化誘導を促す系を構築中である。平成24年度は、ドナー細胞(マウス胎児細胞、各種前駆細胞)に、従来から知られている分化誘導に加えエピモルフィンやそのファミリー分子の発現操作を行い、細胞凝集体としてのドナー細胞凝集体の培養系を確立するとともに、系が提供する微小環境の解析・最適化を行う予定であったが、以下により当初の計画は予定通り達成できたと考えられる。
自然エネルギーを利用した無線LANアンテナを用いた災害時情報伝達の研究

研究目的:我が国においては、豪雨災害対策総合政策委員会(平成16年11月設置)や大規模降雨災害対策検討会(平成17年10月設置)において、避難に資する情報提供の充実等について提言されている。そこで本砺究は既存の情報基盤であるテレビ・ラジオ以外の新たな手段を用いた情報伝達によって、災害情報を迅速・確実・的確に、かつ双方向に伝達する情報基盤のあり方を研究するものである。新たな情報提供手段としては、被災者や要援護者が使用している無線LAN対応ノートパソコン、携帯用ゲーム機などを想定し、それらを対象とした既存の電力線などに頼らない、独自のネットワークの構築が可能な太陽光や風力などを利用したエネルギー自立型無線LANアクセスポイントの研究開発を行う。研究方法:実験装置の構成は、動力源に12V出力の太陽光発電パネルのみを搭載し、電力の一時蓄積先としてDC-DCコンバータ搭載の充電式ポータブルバッテリーを使用した。この動力源に接続した無線LANアクセスポイントを中継器(リピーター)として使用し有線LANに接続されたアクセスポイントと情報端末間の無線通信を行った。研究成果:無線通信にお小そは自然エネルギーを動力源としても商用電源を使用した場合と変わらない結果を得ることができた。しかし、動力源を太陽光のみに頼るため、曇天や夜間などの太陽光発電パネルの発電効率が落ちる状況下で連続した情報の送受信を行った場合は、充電式ポータブルバッテリーの電力が低下し、数時間後には無線LANアクセスポイントの動作は停止した。送受信距離を長くするために無線出力を大きくしたり、通信規格を高速にした揚合はその傾向が顕著であった。また、装置の設置場所は見晴らしの開けた場所のほうが発電量も増え、送受信可能な距離も伸びる傾向にあった。
家業意識が投資意識及び事業継承に及ぼす影響に関する国際比較研究

本研究の目的は、「家業」なしは「家業意識」の解明であった。この二つの概念は東アジアにおける商店経営と家族関係を考える上で。重要なキーワードであった。とりわけ、日韓両国中心に、家業意識、事業継承、投資について国際比較研究を行うことによって、日本商業の特徴を明らかにした。また、事業継承・家業意識が流通政策とどのような関連性を持つのかを検討した。すなわち、事業継承・家業意識との有無が流通政策の有効性に問うことになることを議論した。本研究が取り組んでいる主な概念は、「家業」、「事業継承」、そして「投資」である。その概念解明は、東アジアにおける商店経営と家族との関係を考えるうえで重要である。そう考える2つの理由は、第1に、商店に対する商人が持つ「家業意識」はその商店を「事業として継承する意識」に影響を与えるからである。第2に、同じく「家業」は、その商人が行うさまざまな投資活動の程度やタイプ(出店、不動産、商店街)にも影響を与えると考えるからである。最終的に、この家業・事業継承・投資の概念間の関係を明らかにすることが本研究の主な課題になる。2013年度においては、前半には東アジア諸国(韓国、中国、台湾)でのフィールドワークの実施、後半には、初年度の理論研究、2年目のフィールドワークを踏まえたうえで、実証研究に向けた研究を行った。この実証研究が形でまとめた論文が柳到亨・横山斉理「東アジアの卸売商業集積における家業意識についての国際比較」和歌山大学経済学会『経済理論』第375号49-67頁である。この研究では、東アジア(日本・中国・韓国・台湾)中小規模の卸商業集積を対象に、そこでビジネスを行う商業者の経営者意識や家業意識について考察を行った。東アジアを対象とする質問票調査からえられたデータを整理し、各国の商業の状況を詳しく述べている。続いて、2013年12月14-15日に開催された日本商業学会第4回全国研究報告会にて、「日韓比較でみる小売商業の事業継承」という題名で発表した。特に、本研究の全体計画において中核概念として位置付けている「事業継承」を理論的・実践的含意を述べた。そう考える2つの理由は、第1に、商店に対する商人が持つ「家業意識」はその商店を「事業として継承する意識」に影響を与えると考えるからである。第2に、同じく、家業は、その商人が行うさまざまな投資活動の程度やタイプ(出店、不動産、商店街等)にも影響を与えると考えるからである。最終的に、この家業・事業継承・投資の概念間の関係を明らかにすることが本研究の主な課題となる。2012年度においては、第1段階として、大きく次の2点について理論研究を行った。すなわち、1日本の商業者が大切にしれきた家業という概念についての理論研究、そして2事業継承に関する理論研究である。このような理論研究と同時進行で、日本と韓国でフィールドワーク(視察およびヒアリング調査)を行い、実証研究の形でまとめた書籍を出版した。『小売商業の事業継承ー日韓比較でみる商人家族』(2013)、柳到亨、白桃書房である。日韓の小売商業における事業継承の意識や現実の違いに着目し、日本の「事業継承」に研究の焦点をあてて、事業継承意志を高揚させるメカニズムを日韓小売商業者の視点から理解し、「後継者難」という商業問題を理論的および実証的に解明したものである。『小売商業の事業継承ー日韓比較でみる商人家族』では、研究全体の計画において大事な概念、すなわち、家業、事業継承、そして投資のうち、中核概念と位置付けている「事業継承」という概念を理論的・実証的に解明した。日本商業学会においても学術的財産として評価されることを期待している。まず、本研究の目的は「家業」ないしは「家業意識」の概念解明である。この二つの概念は、東アジアにおける商店経営と家族との関係を考える上で、重要なキーワードとなる。最終年度にあたる平成26年度においては、日韓の両国を中心に、「家業意識」・「事業継承」・「投資」についての国際比較研究を行うことによって、日本の商業の特徴を明らかにした。さらに、これらの商業の基礎概念と商業政策研究との関連性について明らかにした。最終年度の実績は以下の三つである。二つ目は、本研究のフィールドワーク調査地でもある韓国の商店街(ソウル市トケビ市場)を事例研究したことである。主な研究対象である商店街の組織的活動の成功要因を対外的視点を意識した「投資」に関連づけ、商業集積内での商業者間の相互作用を明らかにした。三つ目は、「事業継承」・「家業意識」・「投資」が流通政策とのどのような関連性を持つのかを韓国の商業事例を結び付けながら、伝統的商業集積の問題性および課題を明らかにした。

具体的には、韓国商業集積の主役である中小商人の意識の中に存在する「家業意識」および「事業継承」の無さが、商業政策の有効性を問う結果になったことを述べた。商業論・流通論儒教圏に属している東アジア諸国(日本・中国・韓国・台湾)において家族従業(商店経営と家族の存在が重要視される従業形態)は共通した特徴を持っているという前提で本研究が始まった。しかしながら、東アジア諸国における理論や現地調査を重なることによって、共通点と異質点が存在することが分かった。2012年には、「事業継承」という概念から日本・韓国両国を国際比較調査、分析したが、2013年には、「家業意識」という概念から東アジア(日本・中国・韓国・台湾)の4か国を国際比較調査分析を行った。この実証分析の結果により、より日本商業の特殊性を理解する独創的な研究として位置付けることができる。儒教圏に属している東アジア諸国(日本、韓国、台湾、中国)において家族従業ないしは、より一般化していうと商店経営と家族との関係は、共通した特徴を持っているのではないかという研究当初の暗黙的な前提があった。しかし、東アジア諸国に関する研究を進むことにつれて、共通することはもちろんだが、異なる点もあることが分かった。比較的に類似した文化圏とみられる東アジア諸国においても、同質性のなかに異質性が入り交っているというのは考えてみれば当然のことかもしれない。問題はないが同質でなにが異質なのか、その点を明らかにすることであった。昨年の成果を通じて、「家族と商業」との関係、「商業と事業継承(家族)」との関係についての理解は一層深まったと考えている。2012年度の研究成果は、本研究が取り組むべき課題「家業」ないしは「家業意識」概念についての理論的背景を探ることの一環であった。「家業」ないしは「家業意識」は、東アジアにおける商店経営と家族との関係を考えるうえでひとつのカギとなる概念である。商店に対する商人が持つ「家業意識」はその商店を「事業として継承する意識」に影響を与えるからである。これらの論理的な経験的妥当性は、『小売商業の事業継承』(2013)にて示されている通りである。2012年度の研究成果によって得られた本研究の学術的重要性は、「事業継承」、「家業意識」について、日本・韓国両国を国際比較調査分析を行うことにより、日本商業の特殊性を理解する独創的研究として位置付けられるという点である。2014年度は、「家業」、「事業継承」、「投資」理論研究と同時進行で、東アジア諸国(日本・中国・韓国・台湾)でのフィールドワーク調査で得られたデータを解釈することとともに、質問調査票に基づいた統計的分析を通じて、主な3つの概念化(家業・事業継承・投資)の関係に対する理論化を目指す。2013年度は、「家業」、「事業継承」、「投資」理論研究と同時進行で、東アジア諸国(日本、韓国、台湾、中国)でフィールドワークをおこない、その結果に基づきながら理論的研究をさらに深耕する。該当なし
中国語における連続構造の研究

これまで、中国語の複雑な「文」がどのように形成されているか、明らかになっていないのは、欧米の研究手法を中国語に当てはめているからである。中国語にうまく当てはまらないとするならば、それは欧米言語の分析を基準としているからである。本研究では中国語が持つ「論理」に着目することによって、「文とは何か」を巡る問題の一般理論への寄与を目指す。言語における「文」とは一般的に「ひとつのまとまった考えを表すもの」とされる。現代の書き言葉では「句点から句点まで」が「一つの文」と通常は見なされる。しかし中国語の物語文では、読点・句点による区切り方が日本語や英語などの言語と相当に異なっている。区切り方が異なるということは、「文」の観念、すなわち中国語において「ひとまとり」の観念が日本語や英語とは異なるということである。本研究では、中国語の「文」、つまり「ひとつのまとまった考え」とはどのように構成されているのかを、日本語や英語と比較の上で明らかにする。本年度では、まず「中国語書き言葉における「文」論序説」(『人文研究』2019)で問題の設定について詳しく議論した。そして、句点から句点までを「一つの文」とするならば、中国語の小説言語では次のような特徴があることを確認した。1欧米言語や日本語では「一文」にできないものが読点でつながっていってしまう2読点でも句点でもよい場合が多い3複文の論理的関係がよくわからない4従属節が比較的独立している。さらに、「現代中国語における時間軸に沿って継起的に起こる出来事と連続構造」(『お茶の水女子大学中国文学会報』、2019年)では、時間軸に沿って継起的に起こる出来事の表し方について見た。このようなケースでは中国語は動詞句を単純に連続させていく形式を日本語などに比べて好む。また連続して起こる動作、状態変化は「一つの文」にまとめられることが多い。この際、主語が同じでも、何度も切り替わっても問題ない。中国語における節の連鎖は、これまで主に行われてきたような論理的意味関係からの分析では限界があり、独自の分析を考える必要があるが、よく観察してみれば中国語としては合理的なしかたでまとまりを作っていることが判明した。本年度の研究においては、中国語において「一つの文」がどのように出来上がっているのか、ほぼ概要が明らかになった。後は、文章としてまとめ、発表することを残すのみとなっている。すでに目標として設定した研究の大筋はつかめており、本年度においてはそれを文書化し、発表の準備を整える。出版社と協議し、成果の発表を準備する。
直流電流による両側半球二重刺激法を用いたヒトの運動関連領野の可塑的機能変化の誘導

頭皮上に設置した電極から流れる微弱な直流電流が,頭蓋骨を通過し,電極直下の興奮性が変化する.これは経頭蓋直流電流刺激(tDCS)と呼ばれ,一次運動野(M1)の興奮性を高めるには陽極を標的半球M1に,陰極電極は対側半球M1に設置する両側同時刺激(Dual-tDCS)が有効であった.しかしながら視覚刺激処理過程を含む上肢巧緻動作の精度向上には,必ずしもDual-tDCSが優れているとは限らないことが示唆された.また,頭皮上に強力なネオマグ永久磁石を設置する経頭蓋静磁場刺激(tSMS)は,ヒトの感覚情報処理過程を非侵襲的に変化させる有効な脳刺激ツールであることを明らかにした.頭皮上に設置した電極から流れる微弱な直流電流が,頭蓋骨を通過し,電極直下の興奮性が変化する.これは,経頭蓋直流電流刺激(Transclanialdirect current stimulation:tDCS)と呼ばれ,2000年のNitscheとPaulusの報告以来,非侵襲的な脳機能の探索ツールとしてばかりでなく,様々な中枢神経系疾患患者の治療にも使用されている.一般的にtDCSでは,陽極(陰極)刺激の場合,陰極(陽)電極は対側前額部に設置される.これは,この部位からの同側または対側M1に対する直接投射がないことから,陽極(陰極)電極直下の興奮性にほぼ影響を及ぼさない基準電極としての位置に適しているからである.一方,脳卒中維持期の患者に対して病側半球に陽極電極を,非病側半球に陰極電極を設置して両側半球を同時に刺激するtDCS(Dual-tDCS)による運動機能回復効果は,従来の一側半球に対するtDCS(Uni-tDCS)より高いと報告されて以来(Lindenberg et al, 2010),脳卒中リハビリテーションにおけるスタンダードな電極設置モンタージュとして注目を集めている.初年度における本研究では,健常被験者の一次運動野(M1)に対するUni-tDCSとDual-tDCSとの刺激効果を比較した.12名の被験者を対象に,Uni-tDCS(左M1に陽極,右前額部に陰極),Dual-tDCS(左M1に陽極,右M1に陰極)ならびにSham-tDCSを行った.刺激強度は2 mA,刺激時間は10分間とした.左M1への経頭蓋磁気刺激により生じる運動誘発電位(MEP)振幅は,Dual-tDCS条件においてのみ,刺激前に対する刺激後の有意な上昇が認められた.健常被験者においても,Dual-tDCSのM1に対する興奮性促通効果はUni-tDCSより強いことが示唆された.【目的】一次運動野または補足運動野に対するtSMSにより一次体性感覚野の興奮性の視標である感覚誘発電位(SEP)の振幅が変化するか否かを検証すること,更にはtSMSに使用するNdFeB磁石の磁束密度は距離に依存してどの程度減衰するのかを計測することを本研究の目的とした.【方法】14名の健常成人を対象とし,M1またはSMAに対するtSMS及びSham刺激を15分間行い,刺激前,刺激終了直後,5分後,10分後にSEPを記録した.SEPは右正中神経刺激(3.3 Hz, 300回)により誘発し,記録電極はC3'及びF3に設置した.NdFeb磁石表面から5 mmごとに40 mmまでの磁束密度を記録した.【結果】M1にtSMSを行った条件では,C3'から記録されたSEP成分の内,P25とN33の振幅が刺激直後において有意に低下した.一方SMAに対するtSMSでは,全てのSEP成分に何ら影響を及ぼさなかった.NdFeb磁石の磁束密度は,ヒトの頭皮から皮質までの距離,20-30 mmにおいて110-190 mTであった.【考察】本研究結果より,一次体性感覚野の興奮性を非侵襲的に変化させる脳刺激ツールとして,tSMSは有効である可能性が示唆された.生体のイオンチャネルの機能低下を惹起するには100-150 mTの静磁場が必要とされており,大脳縦裂内面に位置する補足運動野には,この異方性反磁場効果が及ばなかったと推察した.頭皮上に設置した電極から流れる微弱な直流電流が,頭蓋骨を通過し,電極直下の興奮性が変化する.これは,経頭蓋直流電流刺激(tDCS)と呼ばれ,非侵襲的な脳機能の探索ツールとしてばかりでなく,様々な中枢神経系疾患患者の治療にも使用されている.一般的にtDCSでは,陽極(陰極)刺激の場合,陰極(陽)電極は対側前額部に設置される.これは,この部位からの同側または対側M1に対する直接投射がないことから,陽極(陰極)電極直下の興奮性にほぼ影響を及ぼさない基準電極としての位置に適しているからである.

一方,脳卒中患者に対して病側半球に陽極電極を,非病側半球に陰極電極を設置して両側半球を同時に刺激するtDCS(Dual-tDCS)による運動機能回復効果は,従来の一側半球に対するtDCS(Uni-tDCS)より高いと報告されて以来,新たな電極設置モンタージュとして注目を集めている.本研究最終年度では,非利き手による視標追跡描円課題の精度における改善効果は,従来型片側半球tDCSより,近年注目されている両側半球tDCSの方が優れているのか否かを検証した.14名の右利き健常成人被験者がtDCS前後に非利き手である左手で視標追跡描円課題を行い,その前後の課題遂行精度を比較した.tDCSは,右M1陽極ー左M1陰極刺激(Dual-tDCS),右M1陽極ー左前額部陰極刺激(Uni-tDCS),Sham-tDCSの3条件とした.逸脱した運動の指標であるX,Y,Z方向の加速度スペクトル和はSingle-tDCS条件においてのみ,それぞれ有意に減少した.シークエンス・タッピング課題や二点弁別課題におけるDual-tDCSの優位性を示す先行研究とは異なる結果を示した.視覚刺激処理過程を含む上肢巧緻動作の精度向上には,必ずしもDual-tDCSが優れているとは限らないことが示唆された.頭皮上に設置した電極から流れる微弱な直流電流が,頭蓋骨を通過し,電極直下の興奮性が変化する.これは経頭蓋直流電流刺激(tDCS)と呼ばれ,一次運動野(M1)の興奮性を高めるには陽極を標的半球M1に,陰極電極は対側半球M1に設置する両側同時刺激(Dual-tDCS)が有効であった.しかしながら視覚刺激処理過程を含む上肢巧緻動作の精度向上には,必ずしもDual-tDCSが優れているとは限らないことが示唆された.また,頭皮上に強力なネオマグ永久磁石を設置する経頭蓋静磁場刺激(tSMS)は,ヒトの感覚情報処理過程を非侵襲的に変化させる有効な脳刺激ツールであることを明らかにした.当初の予定では,複数のtDCSパラダイムごとに,短潜時皮質内抑制及び促通,大脳半球間抑制,一次体性感覚野の興奮性,短潜時抑制などを網羅的に評価する予定であった.しかし,実験環境の整備に時間を要し,現段階では皮質脊髄路の興奮性と一次体性感覚野の興奮性の変化を評価し終えたまでである.リハビリテーション医工学両側半球一次運動野へのDual-tDCSが手指巧緻運動,触圧覚閾値に及ぼす影響に関する実験を行う.当初の初年度の研究では,各条件におけるtDCSの効果について,短潜時皮質内抑制・皮質内促通,大脳半球間抑制,一次体性感覚野の興奮性,皮質感覚運動野間抑制などを指標として,皮質運動関連領野における興奮性の変化を網羅的に評価する予定であった.しかし,実験環境の整備に時間を要し,運動誘発電位を指標とした皮質脊髄路の興奮性の評価のみにとどまった.ほぼ予定通りに予算額を使用したが,僅かに不足し9,877円の残額が生じた.不可避な誤差範囲の金額と考えている.研究計画時に目標とした,健常被験者の一次運動野(M1)に対するUni-tDCSとDual-tDCSとの刺激効果の比較を,上述の皮質運動関連領野における興奮性の変化を指標として実施する.これと同時に,次年度目標である「両側半球一次運動野へのDual-tDCSが手指巧緻運動,触圧覚閾値及び2点識別感覚機能に及ぼす影響」に関する実験を行う.その他(消耗品など)に充当する.ほぼ予定通りに予算額を使用したが,その他(消耗品など)の使用額がわずかに不足し11,573円の残額が生じた.不可避な誤差範囲の金額と考えている.次年度のその他(消耗品など)の費用に充当する.
縄文時代のクリ材利用とクリ林再生管理に関する考古生態学的研究

1)現在の二次林にどれだけのクリが存在するか:昨年までの結果に,宮城県鳴子町の東北大学農学研究科付属農場での調査結果を加え,胸高断面積合計は22.358.6m^2/ha,平均38.7m^2/ha,直径10cm以上のクリが296533本/haという値が得られた.2)二次林をどのように管理,利用すればクリは再生するか:前年度設置した石斧およびチェーンソウによる皆伐区での1年後の萌芽情況を調査し,クリの萌芽再生はチェーンソウ区で56%,石斧区で54%とほとんど変わりがないこと,実生苗の発生はチェーンソウ区で1350本/ha,石斧区で450本/haで大きく異なった数字の上では大きく違うが,実験区が少ないため検証できないことから,新たな実験区をふやした.3)クリの実の生産量愛知県小原村でクリ2124本について実の生産量(落下量)を4年間にわたり測定した.その結果,1)それぞれの木の落果数は個体差が大きく、また同じ木でも年によって大きく変動すること,(2)実1個あたりの平均重量は個体により、また年により異なっていること,(3)調査木の実の生産量(重量)の年ごとの変動は全く同調していない,ことが分かった4)現生の自然林および遺跡出土のクリの遺伝的多様性の解析:クリの遺伝的多様性解析のため,多型性の高いSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーの開発をおこなった.このマーカーを用いて,青森市内,津軽半島,下北半島,北海道小樽市,松前町,南茅部町の集団間の比較を行った結果,1)それぞれの集団では高い遺伝的多様性を保持していること,2)下北と津軽の集団間の遺伝的類似度が特に高いこと,3)津軽,下北,青森市,南茅部の集団では近い遺伝的関係にあること,が示唆された.1)現在の二次林にどれだけのクリが存在するか:昨年までの結果に,宮城県鳴子町の東北大学農学研究科付属農場での調査結果を加え,胸高断面積合計は22.358.6m^2/ha,平均38.7m^2/ha,直径10cm以上のクリが296533本/haという値が得られた.2)二次林をどのように管理,利用すればクリは再生するか:前年度設置した石斧およびチェーンソウによる皆伐区での1年後の萌芽情況を調査し,クリの萌芽再生はチェーンソウ区で56%,石斧区で54%とほとんど変わりがないこと,実生苗の発生はチェーンソウ区で1350本/ha,石斧区で450本/haで大きく異なった数字の上では大きく違うが,実験区が少ないため検証できないことから,新たな実験区をふやした.3)クリの実の生産量愛知県小原村でクリ2124本について実の生産量(落下量)を4年間にわたり測定した.その結果,1)それぞれの木の落果数は個体差が大きく、また同じ木でも年によって大きく変動すること,(2)実1個あたりの平均重量は個体により、また年により異なっていること,(3)調査木の実の生産量(重量)の年ごとの変動は全く同調していない,ことが分かった4)現生の自然林および遺跡出土のクリの遺伝的多様性の解析:クリの遺伝的多様性解析のため,多型性の高いSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーの開発をおこなった.このマーカーを用いて,青森市内,津軽半島,下北半島,北海道小樽市,松前町,南茅部町の集団間の比較を行った結果,1)それぞれの集団では高い遺伝的多様性を保持していること,2)下北と津軽の集団間の遺伝的類似度が特に高いこと,3)津軽,下北,青森市,南茅部の集団では近い遺伝的関係にあること,が示唆された.縄文時代における主要な食糧源としてのクリの実の収穫と,重要な木材資源としてのクリ材の伐採という互いに矛盾する利用が継続的にいかに可能であったのかを明らかにするために,次の3項目を調査した.1)現在の二次林にどれだけのクリが存在するか,2)その二次林をどのように管理,利用すればクリが再生するか,3)現生の自然林及び遺跡出土のクリの遺伝的多様性.1)現在の二次林のクリ現存量:青森県田子町,岩手県二戸町付近でクリを比較的多く含むと見られる雑木林(二次林)でクリは1ha当たり336本,その中で竪穴住居の建築などに使われると考えられる直径10cm以上のものは286本あることが分かった.2)クリの再生皆伐した雑木林のクリの萠芽再生:株当たり平均萠芽本数8.1本,平均高さ1.54m.石斧による抜き切りクリの萠芽再生:株当たり平均萠芽本数1.7本,萠芽枝の最大長31cm.チェーンソウによる抜き切りクリの萠芽再生:株当たり平均萠芽本数15本,平均高77cm.以上の結果では石斧による伐採では萠芽再生が困難なことが予測されたが未だデータが不十分である.3)クリの遺伝的多様性現生野生集団のクリ(中国クリも含む)の遺伝的多様性,栽培クリの遺伝的多様性を調べるために,全国および中国,朝鮮半島からクリの試料を集める一方,マーカーとなる遺伝子領域の探索,実験手法の開発を研究協力者に依頼して行った結果,SSR(simple Sequence Repeat)マーカー開発の目処がついた.

今後これを用いて,品種及び自然集団の解析が可能となる.一方,葉緑体DNAでは中国グリと日本グリの間には多くの変異が見つかり,この両者は比較的容易に識別できるが,日本グリ内では探索した領域ではわずかしか変異が見つからなかった.ミトコンドリアDNAでは中国クリ,日本グリとも変異は全く見つからなかった.昨年度に引き続き,次の3項目について研究を推進した.1)現在の二次林にどれだけのクリが存在するか:これまでの調査結果から,クリの本数(胸高直径10cm以上)は150(8160)16450本(平均318本)/ha,胸高断面積で3.3(8160)1626.4(平均12.1)m^2/haという値が得られた.ただ,この値は大きくぶれており,まだ調査区数が不足している.2)二次林をどのように管理,利用すればクリは再生するか:クリ抜き伐り区で引き続き萌芽再生状態を観察した結果,前年より萌芽再生枝が減っており,抜き伐りしたものでは伐採方法の如何に関わらずクリは消滅する可能性が強くなった.一方,チェーンソウでの皆伐は現在,一般に行われているので,伐採後スギの植樹や刈り払いなどが行われていない場所を探し,調査区をもうけた.それらの区では萌芽再生は盛んで,しかも実生の発生も認められ,伐採によりクリが増える可能性が見えてきた.そこで,伐採に方法に違いで萌芽再生が異なるかどうかを見るため,東北大学農学研究科付属川渡農場(宮城県鳴子町)で,石斧およびチェーンソウによる皆伐区(10×10m)をそれぞれ3区ずつ設け,石斧およびチェーンソウによる伐採を行った.これの萌芽再生については継続観察中である.3)現生の自然林および遺跡出土のクリの遺伝的多様性の解析:野生および栽培化されたクリの遺伝的多様性を評価するため,(AG)/(CT)の反復配列をターゲットとしてSSRマーカーの開発を行った.完全な(AG)の反復を持つものが14個,(AG)と(GT)の複合型の反復を持つものが1個,(AG)の反復の途中にAやGの中断の塩基が存在するものが1個,合計16個のSSRマーカーを作成した。来年度は引き続きマーカーの開発を進めるとともに、開発したマーカーを用いて各地のクリ集団およびクリ植物遺体の解析を行う.1現在の二次林にどれだけのクリが存在するか:昨年までの結果に,宮城県鳴子町の東北大学農学研究科付属農場での調査結果を加え,胸高断面積合計は22.358.6m^2/ha,平均38.7m^2/ha,直径10cm以上のクリが296533本/haという値が得られた.2二次林をどのように管理,利用すればクリは再生するか:前年度設置した石斧およびチェーンソウによる皆伐区での1年後の萌芽情況を調査し,クリの萌芽再生はチェーンソウ区で56%,石斧区で54%とほとんど変わりがないこと,実生苗の発生はチェーンソウ区で1350本/ha,石斧区で450本/haで大きく異なった数字の上では大きく違うが実験区が少ないため検証できないことから,新たな実験区をふやした.3クリの実の生産量愛知県小原村でクリ2124本について実の生産量(落下量)を4年間にわたり測定した.その結果,(1)それぞれの木の落果数は個体差が大きく、また同じ木でも年によって大きく変動すること,(2)実1個あたりの平均重量は個体により、また年により異なっていること,(3)調査木の実の生産量(重量)の年ごとの変動は全く同調していない,ことが分かった4現生の自然林および遺跡出土のクリの遺伝的多様性の解析:クリの遺伝的多様性解析のため,多型性の高いSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーの開発をおこなった.
ノンコリニア型強磁性金属に現れる特異な異常ホール効果の起源の解明

ノンコリニアな磁気構造をもつ強磁性金属に現れる,異常ホール効果の特異な振る舞いの起源について,CrTe_<1-x>Sb_x系を用いて研究を進めてきた。CrTe_<1-x>Sb_xはコリニアな強磁性または反強磁性構造にオーダーした後,さらに低温でキャントした磁気構造へと転移する。焼結体試料で測定されたホール抵抗率ρHには,コリニアな強磁性構造への転移温度以下で符号変化を含む非単調な温度依存性が観測されており,キャント構造への転移との関連が示唆された。期間中の成果は次のとおりである。1.x=0.30.5の焼結体試料を用い,室温から10Kまで電気抵抗率ρを測定した。x=0.3と0.4の試料については,キャント構造へと転移を起こす温度付近にρの温度依存性の勾配に小さな変化が観測された。測定したすべての試料について,ρは低温に向かって単調に減少する金属的な温度依存性を示し,ホール抵抗率PHで見られたような複雑な温度依存性は観測されなかった。ρHで観測された複雑な温度変化は,非対角伝導率σ_<xy>の温度依存性を反映したものである可能性が高い。2.主にx=0,3,0.4の組成について単結晶作成を試み,ほぼ成長条件を特定した。しかし現在までのところ,磁気輸送特性の測定に耐えうる良質の単結晶は得られておらず,さらに条件を追い込む必要がある。3.x=0。3,0.4の粉末試料を用い中性子回折実験を行った。100反射強度から見積もられる強磁性モーメントMの大きさの温度依存性には,キャント構造への転移温度付近で顕著な変化はなく,ρHの複雑な温度依存性はMの温度依存性によるものではないと考えられる。この結果を用いてモデル計算を実施するプログラム開発を行った。キャント磁気構造で非対角伝導σ_<xy>を計算できる段階まで到達しておらず,実験で得られた特徴的な変化を再現できるかは,さらに研究を進めて確認する必要がある。3.x=0。焼結体試料で測定されたホール抵抗率ρ_Hには,コリニアな強磁性構造への転移温度以下で符号変化を含む非単調な温度依存性が観測されており,キャント構造への転移との関連が示唆される。本年度の研究成果は次のとおりである。1.x=0.30.5の焼結体試料を用い,室温から低温10Kまで電気抵抗率ρを測定した。測定したすべての試料について,ρは低温に向かって単調に減少する金属的な温度依存性を示し,ホール抵抗率ρ_Hで見られたような複雑な温度依存性は観測されなかった。

焼結体の実験なので断言はできないが,ρ_Hで観測された複雑な温度変化は,電気抵抗率ρではなく,非対角伝導率σ_<xy>の温度依存性を反映したものである可能性が高い。2.x=0.3,0.4の粉末試料を用い中性子回折実験を行った。磁気ブラッグ反射の温度依存性は,従来報告されている磁気相図とほぼコンシステントである。100反射強度から見積もられる強磁性モーメントMの大きさの温度依存性には,キャント構造への転移温度付近で顕著な変化はなく,ρ_Hの複雑な温度依存性はMの温度依存性によるものではないと考えられる。さらに解析を進め,磁気モーメントの大きさとキャント角の温度依存性を用いて,モデル計算を実施する。3.主にx=0.3,0.4の組成について単結晶作成を試み,ほぼ成長条件を特定した。来年度は良質の単結晶を作成し磁気輸送特性の測定を行う。ノンコリニアな磁気構造をもつ強磁性金属に現れる,異常ホール効果の特異な振る舞いの起源について,CrTe_<1-x>Sb_x系を用いて研究を進めてきた。CrTe_<1-x>Sb_xはコリニアな強磁性または反強磁性構造にオーダーした後,さらに低温でキャントした磁気構造へと転移する。焼結体試料で測定されたホール抵抗率ρ_Hには,コリニアな強磁性構造への転移温度以下で符号変化を含む非単調な温度依存性が観測されており,キャント構造への転移との関連が示唆される。x=0.3,0.4の粉末試料を用いての,中性子回折実験や磁気輸送測定の研究から,ρ_Hの複雑な温度依存性は強磁性モーメントの大きさMや電気抵抗率ρの温度依存性によるものではなく,非対角伝導率σ_<xy>の温度依存性を反映したものである可能性が高いことが分かった。その成果を踏まえ,本年度は次の研究を進めた。1.主にx=0.3,0.4の組成について,磁気輸送特性の測定に耐えうる良質で大型の単結晶の作成を行った。しかしながら,現在までのところ十分な質の単結晶が得られておらず,さらに条件を追い込む必要がある。2.x=0.3,0.4の試料の粉末中性子回折実験の結果を詳しく解析し,磁気モーメントの大きさMとキャント角の温度依存性を明らかにした。さらに現在その結果を用いたモデル計算を実施するためのプログラムを開発中である。まずコリニアな磁気構造について非対角伝導率σ_<xy>を計算できる段階まで到達したが,キャント構造に変化したときに実験で得られたような特徴的な変化を再現できるかは,さらに研究を進めて確認する必要がある。
緑内障性網膜視神経障害とグルタミン酸誘発細胞死との関連についての神経生理学的検討

我々は平成7年度に培養網膜神経細胞におけるグルタミン酸毒性が,イノシトールリン脂質代謝系の活性化により毒性の増強され,また,アデニル酸シクラーゼ系を活性化すると毒性を抑制することをPKC関連物質,または血管作動性腸管ペプチド(VIP)を用いて確認した。平成8年度は,それらの知見をふまえ,網膜におけるグルタミン酸誘発神経細胞死のメカニズムを検討するために,カルシウム蛍光指示薬であるfura-2を用いて,培養網膜神経細胞内のカルシウムイオン動態を検討した。グルタミン酸により細胞内カルシウムイオン濃度の一過性上昇が認められた。それに対するPKC関連物質,またはVIPの影響を検討したところ,両物質はグルタミン酸による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に影響を与えなかった。また,パッチクランプ法を用い,グルタミン酸誘発内向き電流に対するPKC関連物質またはVIPの影響を検討したところ,両物質は内向き電流に影響しなかった。以上のことから両物質のグルタミン酸神経毒性に対する影響は,グルタミン酸によって引き起こされる細胞内カルシウムイオンの過剰が生じた後の細胞の恒常性の破綻を抑制または促進することによると考えられた。さらに我々は,網膜のグルタミン酸毒性を抑制する環境として低pH(アシドーシス)を新たに発見した。すなわち細胞外環境をpH7.4から,pH6.0-7.0の低pHにすると,グルタミン酸毒性が抑制される。さらに,パッチクランプ法を用いてグルタミン酸受容体のサブタイプで神経毒性に重要な役割を演じているN-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体を介した内向き電流に対する低pHの影響を検討したところ,低pHはNMDA受容体を介した内向き電流を,ほぼ完全に抑制した。よって,低pHによるグルタミン酸毒性の抑制効果は,グルタミン酸受容体の活性化を抑制することによるものと結論した。我々の用いた培養網膜神経細胞は,グルタミン酸(1mM)の短時間(10分間)曝露により,時間とともに増強する神経細胞死を生じる。この培養網膜神経細胞のグルタミン酸による遅延性細胞死が,プロテインキナーゼCの阻害薬により抑制され,プロテインキナーゼC活性化薬により増強されることがわかった。また,カルシウム蛍光指示薬を用いた検討により,プロテインキナーゼC活性化薬は,グルタミン酸によるカルシウムイオンの神経細胞内流入を増強した。このことから,プロテインキナーゼCの活性化がグルタミン酸誘発遅延性神経細胞死に促進的に関与しており,この機序は,グルタミン酸による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を,さらに増強することによると考えられた。以上のようにイノシトールリン脂質代謝系は,グルタミン酸毒性に対して促進的に働くことが示唆されたが,それに加え血管作動性腸管ペプチド(VIP)を用いて,アデニル酸シクラーゼ系が,グルタミン酸による遅発性神経細胞死に関与するか否かについて検討した。VIPは,網膜でアデニル酸シクラーゼ系を刺激し,サイクリックAMPを上昇させることが知られているが,グルタミン酸と同時にVIPを培養網膜に処置した場合,神経細胞死を抑制することが新らたにわかった。また,今までの報告と同様に,我々の培養系でアデニル酸シクラーゼの活性化薬であるフォルスコリンがグルタミン酸誘発神経細胞死に対して保護作用を示したことから,VIPは,アデニル酸シクラーゼ系を活性化することにより,神経細胞死に対して保護作用を発揮するものと考えられた。以上のように,網膜神経細胞のグルタミン酸による遅発性神経細胞死には,いくつかの細胞内情報伝達系が密接に関与していることがわかった。網膜におけるグルタミン酸誘発神経細胞死のメカニズムを検討するために,カルシウム蛍光指示薬であるfura-2を用いて,培養網膜神経細胞内のカルシウムイオン動態を検討した。

それに対するPKC関連物質,またはVIPの影響を検討したところ,両物質はグルタミン酸による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に影響を与えなかった。また,パッチクランプ法を用い,グルタミン酸誘発内向き電流に対するPKC関連物質またはVIPの影響を検討したところ,両物質は内向き電流に影響しなかった。以上のことから両物質のグルタミン酸神経毒性に対する影響は,グルタミン酸によって引き起こされる細胞内カルシウムイオンの過剰が生じた後の細胞の恒常性の破綻を抑制または促進することによると考えられた。さらに我々は,網膜のグルタミン酸毒性を抑制する環境として低pH(アシドーシス)を新たに発見した。すなわち細胞外環境をpH7.4から,pH6.0-7.0の低pHにすると,グルタミン酸毒性が抑制される。さらに,パッチクランプ法を用いてグルタミン酸受容体のサブタイプで神経毒性に重要な役割を演じているN-methyl-D-aspartate (NMDA)受容体を介した内向き電流に対する低pHの環境を検討したところ,低pHはNMDA受容体を介した内向き電流を,ほぼ完全に抑制した。よって,低pHによるグルタミン酸毒性の抑制効果は,グルタミン酸受容体の活性化を抑制することによるものと結論した。
ニトロcGMPのがん幹細胞制御における機能と分子機構の解明

一酸化窒素NOのセカンドメッセンジャーであるニトロcGMPは、2008年に発見されてから徐々にその機能などが明らかにされてきているが、未だ不明な点が多い。上皮細胞や脂肪細胞など様々な細胞に存在することが報告されていたが、幹細胞に関してはこれまで明らかにされていなかった。そこで本年度は、造血細胞を対象としてこの分子の細胞内レベルの評価を行った。マウスの骨髄から細胞を回収し、抗体染色後セルソーターによりLineage-positiveのグループ(Lin+;分化した細胞が多く含まれる細胞群)とLineage-negativeのグループ(Linー;未分化細胞が多く含まれる細胞群)とに分けて回収した。回収後細胞を固定化し、透過化処理した後にニトロcGMP認識抗体でさらに染色をし、フローサイトメトリーによって各細胞群のニトロcGMPレベルを評価した。すると、Linー細胞よりもLin+細胞の方が、よりニトロcGMPレベルが高いという結果が得られた。未分化な造血幹細胞では、活性酸素(ROS)が低く抑えられていることが知られており、NOとROSの下流で生成するニトロcGMPも、結果として低く抑えられているものと推測される。今後、ニトロcGMPと幹細胞性との関連性の検証として、in vitroでのコロニー形成能や移植後の造血能の評価を行い、幹細胞中のニトロcGMPレベルを変動させた場合に幹細胞機能に影響が見られるかどうか、明らかにしていきたい。