hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヨーロッパ統合とグローバリゼーションをめぐる社会運動に関する研究

2004年9月にフランス・パリ市において、昨年度に引き続き、「もうひとつのグローバル化」を求める運動を構成する社会運動団体の担い手および、運動の中心的メンバーだけではなく、ホームレスや失業の当事者であり、運動に参加することで、住宅や職業を得ることを目的とする個人12人に対し、質的な聞き取り調査を行った。また、参与観察を行っていた「住宅への権利運動」が、西ヨーロッパとラテンアメリカ、アジアの運動団体と2003年以降形成している「持たざる者NO-VOX」のネットワークが、どのように国境を越えて形成・拡大しているかについて、参与観察の継続および聞き取り調査を行った。さらに運動団体が発行するニューズレターや映像資料の収集、および関連するフランスで発行された文献の収集を行った。国境を越える社会運動について、本調査で明らかになったのは、ミドルクラスが担い手である「グローバル市民社会」から排除される層が形成する社会運動が拡大しつつあり、排除社会という権力関係によって読み解くべき状況が生じつつある。新しい社会運動論が、社会運動の担い手を「未来を予言する人々」として位置づけるが、そうした概念から論じるなら、脱産業社会に特徴的とされてきた支配関係では理解できない異議申し立てが現れており、本研究では暫定的ながら、排除社会の誕生という仮説を立てるにいたった。調査の成果は、日本社会学会で発表した。またすでに研究論文としても発表している。データベースの作成過去のEUサミットにさいして展開された社会運動についての新聞・雑誌記事検索とデータベースを作成し、ヨーロッパの社会政策の変容と社会的ヨーロッパを求める社会運動の生起の関係について資料を作成した。社会調査2002年8月にフランスにおける社会運動団体と運動の担い手となっている個人に対する聞き取り調査と資料収集を行った。具体的には劣悪な住宅環境の改善をもとめる「住宅への権利」運動、失業者による運動、社会的排除に反対する「ヨーロッパ行進」について、個人が社会運動に関与するようになったきっかけを個人の貧困の経験などライフヒストリーとして聞き取り調査を行った。また、社会的ヨーロッパを求める運動が、移民労働者の権利を求める運動など関連する運動とどのようなつながりを形成しているかについても調査を行った。2003年1月にブラジルポルトアレグレ市で開催された世界社会フォーラムに参加し、社会的ヨーロッパを求める社会運動団体が、グローバリズムに反対する運動のなかにみずからをどのように位置付けているかについて聞き取り調査と資料収集による調査を行った。社会運動と国際機関の関係についても資料を収集した。成果報告グローバリゼーションと社会運動に関して、おもに理論的な側面から考察し、日本社会学会で成果報告を行った。また、貧困層を担い手とする社会運動、移民労働者という観点からの国際機関への異議申立てについては、論文執筆により、成果を報告した。2003年9月にフランスにおいて、「もうひとつのグローバル化を求める運動」を構成する社会運動団体の担い手に対してインタビュー調査を行った。対象は、住宅への権利を求める都市底辺層、失業者、移民労働者などグローバル化によりもたらされた貧困問題の当事者であり、かつ運動の担い手であるような個人とした。「反グローバリズム」運動は、一般に新しい社会運動など60年代以降に活性化した運動と、旧来の労働運動が動員対象を非正規雇用や移民労働者などに広げて再編した運動とされてきた。そうした側面を併せ持つ一方で、どちらのカテゴリーにもあてはまらない、新しい行為者の萌芽が聞き取り調査から明らかになった。これら新しい行為者による運動は、近代、あるいは国民国家の時代に特徴的な「大きな物語」を媒介しない。つまり、遂行中の行為と運動の目的の実現において、時間的ズレが解消されており、空間的・時間的に一致している。その意味で、脱近代の特徴を見いだすことができる。さらに11月に世界社会フォーラムの準備会議のひとつヨーロッパ社会フォーラムに参加し、聞き取り調査と資料収集を行った。ヨーロッパ社会フォーラムは第2回目の開催であるが、前回に引き続き5万人の参加者があり、ヨーロッパにおける反グローバリズム運動の広がりを把握する上で、実証的な資料を得た。これは補足調査にあたるが、9月の社会調査の結果から導き出された仮説の検証作業として有効なデータを得ることができた。研究成果は、すでに学会報告および研究論文として発表した。
腫瘍遺伝子の変異検出用超高感度分析システムの開発

大腸癌患者の薬物療法を適切に実施するためには、KRAS遺伝子の変異検出を簡便かつ高感度に検出できる分析システムの開発が重要である。リガーゼ検出反応(Ligase detection reaction, LDR)は、特異的に遺伝子変異を検出できる分子生物学的手法であり、通常、変異部位由来のオリゴヌクレオチド(LDR生成物)をマイクロチップ或いはキャピラリーゲル電気泳動で検出する。LDR生成物の検出にHPLCの適用が可能であれば、LDRの汎用性の向上に有利である。本年度は、ボロンドープダイヤモンド(BDD)電極を用いた電気化学検出HPLCを開発し、LDR生成物の検出へ展開することとした。LDR生成物の電気化学検出HPLCは、カラムにモノリス型のODS、移動相にトリエチルアンモニウム酢酸とアセトニトリル(TEAAとACN)の混液、3電極式のアンペロメトリー型電解セル(作用電極はBDD電極、参照電極はAg/AgCl、対極はステンレススチール)を用いて構築した。LDR生成物の分離分析を行うためにHPLC条件の最適化を行ったところ、TEAAとACNの混合比は9:1(v/v)、印加電位は+1.8 V vs. Ag/AgCl、流速は25 μL/min、カラム温度は5°Cを選定した。KRAS遺伝子のエクソン1のG12Vの変異に由来するLDR生成物を電気化学検出HPLCに注入してクロマトグラムを測定したところ、20 min付近にブロードなピークとして観察できた。このピーク高さは、38.4 nAであり、LDR生成物と濃度依存性を示した。従来、LDR生成物の検出に利用されるマイクロチップ電気泳動と対比したところ、本法は、検出のための蛍光標識プライマーの作製が不要、分析装置が一般的という観点から、操作性と汎用性に優れると考えられた。大腸癌のテーラーメード医療のために、腫瘍遺伝子であるKRASの変異検出を簡便かつ適切に実施できる分析システムの開発が期待されている。特異的に遺伝子変異を検出できる分子生物学的手法として、リガーゼ検出反応(LDR)がある。LDRで生成する変異部位由来のオリゴヌクレオチド(LDR生成物)の検出にHPLCの適用が図れれば、LDRの汎用性の向上に有利である。本研究では、オリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法を組み込んだHPLCを開発し、変異検出用超高感度分析システムを開発する。トロロックスの酸化前置波測定に基づく核酸塩基の電気化学検出法の開発を行った。アデニンなどの核酸塩基が共存するトロロックス溶液の電解酸化時のボルタモグラムには酸化前置波が出現し、その波高は核酸塩基の濃度に比例することを見出した。さらに、核酸塩基及びオリゴヌクレオチドが直接電解酸化によって電気化学的に検出できることを明らかにするために、ボロンドープダイヤモンド電極を用いたボルタンメトリーを行った。アデニン由来の明瞭な酸化波は+1.4 Vに観察できた。36、37、44-merのオリゴヌクレオチドに由来する酸化波は+1.4 V1.5 Vの範囲に出現し、いずれの酸化波も明瞭な波形を示した。これらの電気化学検出法は、HPLCの検出部として利用できることがわかった。KRAS遺伝子コドン12.2に存在しうる3種類の点突然変異をそれぞれ検出するためのLDR用プライマーを設計した。LDR実施後の試料溶液について変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、G12D、G12A、G12Vの変異部位に由来する43、50、57-merのオリゴヌクレオチドが検出でき、設計したプライマーが正確に変異部位を認識していることが明らかとなった。HPLCで分析するためのLDR生成物の調製方法を確立できた。本年度は、当初計画していたオリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法として、トロロックスの酸化前置波測定による方法とボロンドープダイヤモンド電極を用いた直接電解酸化による方法の開発に成功した。さらにKRAS遺伝子コドン12.2に存在しうる3種類の点突然変異をそれぞれ検出するためのLDR用プライマーの設計も成功し、G12D、G12A、G12Vの変異部位に由来するオリゴヌクレオチドをそれぞれ検出できた。本年度に実施したオリゴヌクレオチドの新規電気化学検出法の開発とLDR用プライマーの設計は、本研究成功の鍵となる成果である。1)オリゴヌクレオチドの電気化学検出HPLCシステムの開発:トロロックスの酸化前置波測定あるいはボロンドープダイヤモンド電極を用いた直接電解酸化に基づきオリゴヌクレオチドを高感度に検出できる電気化学検出HPLCシステムを構築する。KRAS遺伝子の点突然変異部位に由来するオリゴヌクレオチドの分離分析を行うためのHPLC条件の最適化を行う。2)遺伝子変異検出用分析システムの性能評価: KRAS遺伝子の変異検出法としての感度を評価する。すなわち、野生型と変異型のKRAS遺伝子の割合を変えた混液に対して、平成24年度に確立したLDRを実施し、変異部位由来のLDR生成物が本システムにより検出できることを明らかにする。さらに、LDRから電気化学検出HPLCシステムによる測定に至るまで、再現性に関する分析法バリデーションを実施し、遺伝子変異検出用分析システムとしての性能を評価するとともに改良を重ねる。3)従来法との比較

実験:従来、LDR法においてオリゴヌクレオチドの検出に用いられるキャピラリーゲル電気泳動法は、感度に優れた分析手法であるが、問題点として光学系の検出部を用いた装置は大型かつ高価、変異場所ごとに蛍光標識プライマーを作製するため高コスト、などが挙げられる。そこで、開発したオリゴヌクレオチドの電気化学検出HPLCシステムがキャピラリーゲル電気泳動法と比較して、実用性、汎用性、動作性について優れ、広範な医療機関への装置導入を考慮したときに有利であること示すために比較実験を実施する。該当なし
血液脳関門を介した物質輸送制御を基盤にする中枢系医薬品探策の新戦略

血液脳関門を介した異物排泄機構を克服するためのドラッグデザイン確立のために、ligand-basedなアプローチにより血液脳関門に発現する異物排泄トランスポーターの基質認識特性を明らかにすることを目的とした。ホモロジーモデリングにより、Oat3の立体構造を予測した。構築した立体モデルでは、過去の変異体解析により基質認識に重要であることが示唆されていたアミノ酸が比較的近い領域に集積することが明らかになった。更に、前年度ligand-basedなアプローチにより確立したファーマコファオアモデルをこの領域に配置したところ、各ファーマコフォアと相互作用することが予想されるアミノ酸クラスターと変異体解析の結果が一致したことから、推定した立体モデルは妥当なものと考える。Oat3について、血液脳脊髄液関門を介した解析を進め、Oat3はp-アミノ馬尿酸やベンジルペニシリンの他、除草剤の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸の脳脊髄液からの排出にも関与していることを見出した。更に、カチオン性薬物であるが、シメチジンやラニチジンなどH_2受容体拮抗薬の脳脊髄液からの排出にもOat3が関与していることを見出した。これらの化合物のMEPを計算すると、H_2受容体拮抗薬の分子構造の中にもマイナス電荷が局在している領域がある。この領域がH_2受容体拮抗薬とOat3との相互作用に必要であることが示唆された。ラットとヒト遺伝子で基質選択性を比較すると、OAT3についてはラット-ヒト間で輸送活性が異なる基質もあることを見出し、化合物によっては輸送活性に種差があることを見出しており、化合物によっては動物実験の結果を直接ヒトに外挿することが難しいことを明らかにしている。水溶性有機アニオンの排泄に働くラットならびにヒトOAT1ならびに3の基質選択性について、LLC-PK1細胞ならびにHEK293細胞を宿主として遺伝子発現系を構築し、基質情報を集めるとともに、基質の官能基を物理化学特性を表すpharmacophoreにより置換し、その3次元構造の重ね合わせを行った。その結果、基質間に共通の物理化学特性の立体配座が存在することを明らかにした。この情報は、今後OAT1ないしOAT3を対象としたドラッグデザインに有用である。また、OAT3と対を成す排泄側のトランスポーターとして、マウスRSTが血液脳関門に発現していることを見出した。極性細胞(LLC-PK1細胞)にOat3とともに共発現させ、経細胞輸送を定量化した。その結果、RSTを共発現させることで、始めてbenzylpenicillinなどの有機アニオンのベクトル輸送が達成されることから、RSTはOat3と共益して血液脳関門を介した異物くみ出し機構として働いていることが示唆された。血液脳関門に発現するABCトランスポーターとして、BCRPの遺伝子発現系を構築した。遺伝子発現系から調製した膜ベシクルを用いて、基質選択性の解明を試みた。その結果、広範な化合物を基質としており、一部Oat3と基質選択性も重複しており、RSTと並んでOat3と対をなす排泄側のトランスポーターであることが示唆された。

更に、前年度ligand-basedなアプローチにより確立したファーマコファオアモデルをこの領域に配置したところ、各ファーマコフォアと相互作用することが予想されるアミノ酸クラスターと変異体解析の結果が一致したことから、推定した立体モデルは妥当なものと考える。Oat3について、血液脳脊髄液関門を介した解析を進め、Oat3はp-アミノ馬尿酸やベンジルペニシリンの他、除草剤の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸の脳脊髄液からの排出にも関与していることを見出した。更に、カチオン性薬物であるが、シメチジンやラニチジンなどH_2受容体拮抗薬の脳脊髄液からの排出にもOat3が関与していることを見出した。これらの化合物のMEPを計算すると、H_2受容体拮抗薬の分子構造の中にもマイナス電荷が局在している領域がある。この領域がH_2受容体拮抗薬とOat3との相互作用に必要であることが示唆された。ラットとヒト遺伝子で基質選択性を比較すると、OAT3についてはラット-ヒト間で輸送活性が異なる基質もあることを見出し、化合物によっては輸送活性に種差があることを見出しており、化合物によっては動物実験の結果を直接ヒトに外挿することが難しいことを明らかにしている。
分子生物学的見地からの白血病寛解状態の生物学的意義

白血病の化学療法は大きな進歩を示しているが再発は臨床上、最大の難問である。この対策のひとつとして、近年、開発されたreverse trancriptase polymerase chain reaction(RTーPCR)法は微量残存白血病(MRD)の解析を可能とした。本研究では、腫瘍特異性をもつbcrーabl mRNAを標的として、RTーPCR法を使って、MRDを骨髄移植の臨床症例について検討した。化療にて寛解となったph^<1+>ーALL(ph^1陽性急性リンパ性白血病)の骨髄移植15例のうち、3例の再発状態移植例及び未検の2例を除いた10例では、移植前のPCRの成績は、血液学的寛解状態であるにもかかわらず、8例はPCR(+)、2例はPCR(ー)であった。移植后は、再発状態での移植3例を含めて、13例のうち1例のみPCR(+)であった。その后の数カ月間隔でのPCR follow upにて、6例がPCR(+)となり、molecular relapseとなった。これらの症例はその后、約2ヶ月で全例hematological relapseをきたした。一方、移植后6ヶ月を越え、PCR(ー)を呈する症例には一例の再発も認めなかった。このことはph^<1+>ーALLではPCR follow upがまさしくMRDの存在を示し、clinical relapseの早期発見に大いに寄与するものと思われる。PCR(ー)が、真にMRDの不在を意味しうることか否かは多数例の更なる検討が必要と思われる。他方、慢性骨髄性白血病に関してはPCRの結果と臨床的再発とは相関する傾向は必ずしも認められず早急な結論は困難であり、多数例の継続的追求が必要である。いずれにしろ、本研究でのPCR follow upは疾患の病態の解析、治療体系の再考にも大いに貢献するものと思われる。
認知症高齢者の特性にもとづいたアクティビティケアの 睡眠・覚醒パターンへの効果

本研究は、認知症高齢者の睡眠・覚醒パターンの実態を明らかにするとともに、認知症の特性にもとづいたアクティビティケアを実施し、効果を検証することを目的とした。療養型医療施設に入所中であった認知症高齢者を対象にした調査の結果、入所生活への順応が睡眠・覚醒パターンに好影響を与える可能性が示唆された。また、対象者の興味や関心のある事柄にもとづいたアクティビティケアを実施したところ、昼間の睡眠時間や夜間中途覚醒時間の短縮を認めた。認知症高齢者の睡眠障害への対応は高齢者ケア領域における重要な課題となっている。本研究の目的は、認知症高齢者の睡眠・覚醒パターンの詳細な実態を明らかにするとともに、認知症高齢者の特性にもとづいたアクティビティケアの実施および効果の検証を行うことである。平成22年度は、療養型医療施設1施設の認知症専門棟に入所中であった高齢者のうち、睡眠薬を服用していない、病状が安定しアクティビティケアへの参加が可能である、意識レベルが維持され、睡眠中あるいは覚醒中であることの判別が容易であるなどの条件を満たした9名を対象に、7日間の睡眠・覚醒パターンの実態を調査し、うち1名には、実態調査後に1日1時間のアクティビティケアを7日間連続して実施し、介入効果を検討した。実態調査の結果、対象者の総睡眠時間は9.5±1.0時間、夜間最長睡眠持続時間は6.7±1.6時間、夜間覚醒時間は0.8±0.7時間、昼間睡眠時間は0.7±0.4時間であった。全ての睡眠指標に男女差はなく、相関分析の結果、入所からの経過日数、BI、N-ADL、HDS-R、CDR、CMAI、NMスケールの値が睡眠指標の関連要因としてあげられた。重回帰分析の結果、総睡眠時間ではN-ADL、CMAI、HDS-R、夜間最長睡眠持続時間および夜間覚醒時間では入所からの経過日数、昼間睡眠時間ではN-ADLとの間に有意な関連性が認められ、なかでも、入所からの経過日数が多いほど夜間覚醒時間が短かった等の結果から、入所生活への順応が睡眠・覚醒パターンに好影響を与える可能性が示唆された。この結果は、本年9月に開催される日本認知症ケア学会で発表する予定である。アクティビティケアによる介入効果の結果については現在分析中である。平成23年度はさらに対象者を増やした実態調査を行うとともに、認知症の特性とアクティビティケアの効果との関連について検討する予定である。平成23年度は、平成22年度に実施した調査結果の学会発表および論文作成を行うとともに、さらに介入期間を延長した事例検討を実施した。学会発表では、療養型医療施設1施設の認知症専門棟に入所中であった認知症高齢者9名を対象とした睡眠・覚醒パターンの実態調査を第12回日本認知症ケア学会に発表し、平成23年度石崎賞を受賞した。また、9名のうち1名について個別アクティビティケアを実施した結果を日本看護技術学会第10回学術集会において発表した。この個別アクティビティケアでは、夜間中途覚醒時間の平均が1.7時間から0,3時間へと有意な減少を認めた(p<0.05)。平成23年度に新たに実施した介入研究では、92歳の超高齢事例を対象とし、睡眠・覚醒パターンと排泄パターンの両面からの検討を行った。対象者の生活背景にもとづいたアクティビティケアを14日間行い、実施前のコントロール期14日間と比較したところ、昼間の睡眠が減少した。また排尿パターンでは、尿意の訴えの総数が昼間・夜間ともに減少し、尿意がありかつ実際に排尿があった割合が高くなった。尿意の訴えの間隔は、コントロール期の平均が73.2分、介入期の平均が80.7分で、有意に延長した(p=0.05)。以上2つの介入研究の結果は、学術誌に投稿中である。また、実態調査の結果については、現在論文作成中である。認知症高齢者の睡眠障害への対応は、高齢者ケア領域における重要な課題となっている。平成24年度は、平成22年度および23年度に実施した調査の結果発表を行うとともに、化粧療法を用いた新たな介入研究を実施した。学会発表では、生活習慣記録機ライフコーダを用いた要介護高齢者の睡眠測定の有用性について検討した結果を、第71回日本公衆衛生学会総会で発表した。対象者9名中6名について、ライフコーダを用いて得られた睡眠時間が睡眠日誌から求めた睡眠時間を上回り、そのうち5名に有意差を認めた(p<0.05)。

この結果から、腰部の身体活動を利用して要介護高齢者の睡眠を評価した場合には、覚醒時に動きの少ない場合に「睡眠」と判定される可能性を考慮すべきであることが示唆された。平成24年度に新たに実施した介入研究では、認知症女性4名に化粧を実施したところ、コントロール期と比較して認知機能およびADLの改善、対人交流時間の増加、朝の覚醒時刻の安定化などの効果が認められた。この結果は、平成25年6月に開催されるThe 20th IAGG World Congress of Gerontology and Geriatricsで発表する予定である。論文では、平成23年度に実施した介入研究を認知症ケア事例ジャーナルに発表した。また、平成22年度に実施した介入研究が、日本認知症ケア学会誌に掲載される予定となっている。当初の目標数の対象者は得られなかったものの、平成22年度の実態調査で有用な結果を得ることができた。また、アクティビティケアによる介入においても、好ましい結果が認められ、効果の検証が進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。アクティビティケアを高齢者看護・介護領域に普及させるためには、現場に即した方法で行う必要がある。具体的には、実施のためのマンパワーを少なく、効果は持続する方法を模索しなければならない。平成24年度の介入では、この点を中心に、方法の選択を行う予定である。
低温環境における過渡的温熱感の評価とその温熱環境設計への適用

人体の皮膚温変動に関して線形近似を適用して過渡的温熱感を評価するための基礎的実験を行った。はじめに、被験者の平均皮膚温に関するインディシャルレスポンスを得るために、環境温をステップ状に変化させる実験を行った。これは被験者自体が温度の異なる二室間を速やかに移動することにより実現した。ここで得られたインディシャルレスポンスは、二項の指数項で近似でき、0.1時間及び3時間を夫々の近似的時定数として得た。ついで、今回の研究の主テーマである、線形近似した理論解の有効性を検証するために、2種類の室温変動状態におかれた被験者の皮膚温実測と理論的予測値との対応を試みた。実験をおこなった室温の状態は、次のようである。a.室温上昇中の室内へ入室した時の被験者の皮膚温変化b.室温の上下変動時の皮膚温変化いずれの実験においても、皮膚温の理論予測値は実測値と概ね一致しており線形近似の有効性がほぼ確認された。しかし、過渡的温熱感は皮膚温のみでは特定できず気温に直接反応する傾向もみられ、今後の課題として残された。さて前者は、部屋の使用開始時にどの程度まで室温が上昇していれば寒さによる不快を感じないか、という暖房開始時の状態を想定したものである。部屋の使用開始時に1718°C程度のレベルに達していれば、ほとんど不快を感じないであろうとの一応の結論が得られた。使用開始時までに設定室温まで上昇させるのが従来の考え方であり、この方法では放熱器の容量が極端に大きく算定される難点があった。今回の結果と室温変動理論の両者を総合して、上記問題を克服し得る合理的設計方法を現在検討中である。
新規素材（RCP）を使用した皮下膵島移植法の樹立～皮下膵島移植の臨床応用に向けて

本研究の目的は、重症1型糖尿病の根治療法において、リスクが高い従来の経門脈的膵島移植に代わる低侵襲な皮下膵島移植の開発である。我々はbFGF(basic fibroblast growth factor)を使用したデバイスを作成し、皮下膵島移植の生着率向上に血管新生の重要性を示した。さらに我々は新規素材であるI型コラーゲン様リコンビナントペプチド(cellnest&reg;;以下RCP)を用いて安全で効果的な皮下血管床構築法を確立することにより、従来の経門脈移植と同等の皮下膵島移植の生着率向上を実現し、皮下膵島移植の成功の鍵は皮下膵島移植の最適微小環境作成を促進するような素材(以下皮下デバイス)が重要であると考え、RCP皮下デバイスの皮下膵島移植時における血管新生の評価と、さらに生着率向上に関与する血管新生細胞外マトリックス(ECM)の同定とメカニズムの解明を試みている。本研究では、マウスを用いて1RCP皮下デバイスにおける皮下膵島移植時の血管新生の評価と、2上記膵島移植時の生着率向上に関与すると考えられるECMを同定しそのメカニズムを解明することを目的とする。1RCP皮下デバイスにおける血管新生の証明: RCP皮下デバイスを留置後摘出し、同種同系膵島を移植、血管新生の免疫染色による定量分析を行い、bFGFデバイス群と比較する。また、皮下に移植した膵島の血管新生を特殊なチャンバー(dorsal skinfold chamber)を使用し、二光子顕微鏡を用いてより詳細な血管新生機序を求める。2RCPまたはbFGF皮下デバイスにおけるECMの証明:1と同様のマウスで免疫染色でECM (ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コラーゲンI、III、IV)の存在を定性で確認し、差があればLaser microdissection(LMD 7000)を使用して定量的に解析する。1RCP皮下デバイスにおける血管新生の証明:以前に行った実験で、bFGFを使用したデバイス群とコントロール群での新生血管の評価では、bFGF群では、有意に高値を示した。しかし、RCP群について新生血管の評価を行ったところ、膵島内の新生血管の数は少数で、コントロール群と有意な差を認めなかった。今回、治癒結果の非常に良好なRCPデバイスやある程度の治癒を得たbFGF0群(bFGFを含まないデバイスを使用した群)において、免染にて新生血管が少ないという事実は、皮下における膵島生着には血管新生以外の何か別の重要な機序を介していることを示唆している可能性があると思われる。一つの候補として考え得るのは、コラーゲンやヘパラン硫酸、フィブロネクチンといったECMの発現増強あるいは補充である。膵島分離作業中に、破壊された膵島周囲のECMが失われ膵島の機能が損なわれるという報告やフィブロネクチンの発現増強を介して幹細胞の生存を延長させたという報告から、デバイスの異物反応によって引き起こされる炎症により誘導・補充されるECMによってより膵島生着が促進する可能性もあると考えた。2RCPまたはbFGF皮下デバイスにおけるECMの証明:1の結果を受け、シャム群、bFGFデバイス群、RCP短期留置群、RCP長期留置群において、皮下に移植した膵島周囲のECM発現における免疫染色(定性)を行った。現在までに終了しているのはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンIVの定性評価と統計解析である。ラミニンに関しては明らかな有意差を認めず、フィブロネクチンに関してはbFGF群とRCP長期留置群において有意に発現が高く、ビトロネクチンに関しては、はbFGF群の発現が有意に高くRCP長期留置群が高い傾向を示し、コラーゲンIVに関してはbFGF群が有意に高い発現を示した。今後の課題として、1RCP皮下デバイスにおける血管新生の証明:これまでの実験で、治癒結果の非常に良好なRCPデバイス群において、有意に高値を示したbFGF群とは対照的に、免染にて新生血管が少ないという事実はの機序解明の一つの手段として、皮下に移植した膵島の血管新生を特殊なチャンバー(DSC: dorsal skinfold chamber)を使用し、生存動物の体内で起きている現象を観察できる二光子顕微鏡を用いて免染では評価できなかった血管新生機序を求める予定であった。しかしチャンバーの作成と膵島生着が手技的に困難であり、実現に至っていない。2RCPまたはbFGF皮下デバイスにおけるECMの証明:免疫染色でECM (ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コラーゲンI、III、IV)の存在を定性で確認し、差があればLaser microdissection(LMD 7000)を使用して定量的に解析する予定であるが、免疫染色では、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コラーゲンIVの定性解析は終了したものの、ヘパラン硫酸、コラーゲンI、IIIについてはまだ終了していない。また、定性で有意差があったフィブロネクチンとビトロネクチンに関しては定量解析も行いたいが実現に至っていない。以上を今後の課題とし、引き続き、研究を遂行する予定である。

さらに我々は新規素材であるI型コラーゲン様リコンビナントペプチド(cellnest&reg;;以下RCP)を用いて安全で効果的な皮下血管床構築法を確立することにより、従来の経門脈移植と同等の皮下膵島移植の生着率向上を実現し、皮下膵島移植の成功の鍵は皮下膵島移植の最適微小環境作成を促進するような素材(以下皮下デバイス)が重要であると考え、RCP皮下デバイスの皮下膵島移植時における血管新生の評価と、さらに生着率向上に関与する血管新生細胞外マトリックス(ECM)の同定とメカニズムの解明を試みている。本研究では、マウスを用いて1RCP皮下デバイスにおける皮下膵島移植時の血管新生の評価と、2上記膵島移植時の生着率向上に関与すると考えられるECMを同定しそのメカニズムを解明することを目的とする。1RCP皮下デバイスにおける血管新生の証明: RCP皮下デバイスを留置後摘出し、同種同系膵島を移植、血管新生の免疫染色による定量分析を行い、bFGFデバイス群と比較する。また、皮下に移植した膵島の血管新生を特殊なチャンバー(dorsal skinfold chamber)を使用し、二光子顕微鏡を用いてより詳細な血管新生機序を求める。2RCPまたはbFGF皮下デバイスにおけるECMの証明:1と同様のマウスで免疫染色でECM (ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸、コラーゲンI、III、IV)の存在を定性で確認し、差があればLaser microdissection(LMD 7000)を使用して定量的に解析する。1RCP皮下デバイスにおける血管新生の証明:以前に行った実験で、bFGFを使用したデバイス群とコントロール群での新生血管の評価では、bFGF群では、有意に高値を示した。しかし、RCP群について新生血管の評価を行ったところ、膵島内の新生血管の数は少数で、コントロール群と有意な差を認めなかった。今回、治癒結果の非常に良好なRCPデバイスやある程度の治癒を得たbFGF0群(bFGFを含まないデバイスを使用した群)において、免染にて新生血管が少ないという事実は、皮下における膵島生着には血管新生以外の何か別の重要な機序を介していることを示唆している可能性があると思われる。一つの候補として考え得るのは、コラーゲンやヘパラン硫酸、フィブロネクチンといったECMの発現増強あるいは補充である。膵島分離作業中に、破壊された膵島周囲のECMが失われ膵島の機能が損なわれるという報告やフィブロネクチンの発現増強を介して幹細胞の生存を延長させたという報告から、デバイスの異物反応によって引き起こされる炎症により誘導・補充されるECMによってより膵島生着が促進する可能性もあると考えた。2RCPまたはbFGF皮下デバイスにおけるECMの証明:1の結果を受け、シャム群、bFGFデバイス群、RCP短期留置群、RCP長期留置群において、皮下に移植した膵島周囲のECM発現における免疫染色(定性)を行った。現在までに終了しているのはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンIVの定性評価と統計解析である。ラミニンに関しては明らかな有意差を認めず、フィブロネクチンに関してはbFGF群とRCP長期留置群において有意に発現が高く、ビトロネクチンに関しては、はbFGF群の発現が有意に高くRCP長期留置群が高い傾向を示し、コラーゲンIVに関してはbFGF群が有意に高い発現を示した。
特異的Ｔ細胞同定によるフォークト・小柳・原田病の診断法の確立

原田病患者で疾患特異的に増加するT細胞クローンがあるか、T細胞受容体相補性決定領域3のアミノ酸配列から検討を行った。治療前原田病17例中13例の末梢血CD4陽性T細胞で共通のクローン認められた。原田病以外のぶどう膜炎、治療後ではこれは認められなかった。このクローンを検出する定量PCRを実施したところ、原田病14例中8例(2010までには発症症例)で検出されたが、2011年以降に発症した症例では検出されなかった。今後は他のCDR3クロノタイプの検討を進める必要がある。この結果は2015年日本眼科学会総会で報告した。平成23年度に急性期原田病患者の末梢血中CD4陽性T細胞からmRNAを抽出し、逆転写反応後cDNAをテンプレートとして29種類のVβ特異的プライマーを用いたPCR法により、Genescanで特徴のある増加パターンを示すVβ鎖遺伝子を検出し、このVβ遺伝子を発現するCD4陽性T細胞レパートリー内に、CDR3領域の特異性(クロノタイプ)で頻度の高いクローンAが見つけた。平成24年度にクローンAと異なるVβ遺伝子を発現するCD4陽性T細胞レパートリーを検討したとこる、急性期原田病患者11例中7例にCDR3領域の特異性でクローンBを見つけた。治療後の4例中4例でもこのクローンは認められ、クローンAとは存在意義の異なるものと推測される。クローンAが原田病の病勢の強い時に特異的に増加しているものである事を裏付け研究を遂行中である。現在、治療後患者12名の解析を進めており、結果の出ている10名ではクローンAは認められなかった。クローンAの原田病での特異性を証明するため、原田病以外の非感染性ぶどう膜炎で同様の検討を行う承認を、平成24年度に本院の倫理委員会で得た。現在、原田病以外の非感染性ぶどう膜炎患者5名の解析中である。クローンAが原田病診断につなげられるものか裏付ける成果がでてきており、意義は大きい。急性期原田病の患者末梢血で増加しているCD4陽性T細胞のクローンの検討をT細胞受容体の相補性決定領域3(CDR3:最も多様性に富む領域)を解析することで行っており、24年度までにVKH患者で認められる事の多いクローンAが見つかった。25年度はこの確認実験を主体に行っている。対照として原田病でないぶどう膜炎患者3例で同様な方法で検討したところクローンAは認められなかった。クローンAの定量的検定のためReal-time PCRを実施したところ、原田病15例中9例、治療後10例中0例、原田病以外のぶどう膜炎5例中0例でクローンAのmRNAが確認された。急性期原田病17人とその治療後9人の末梢血の解析が進んでいる。急性期原田病患者の末梢血中CD4陽性T細胞からmRNAを抽出し、逆転写反応後cDNAをテンプレートとして29種類のVβ特異的プライマーを用いたPCR法により、Genescanで特徴のある増加パターンを示すVβ鎖遺伝子を検出した。このVβ遺伝子を発現するCD4陽性T細胞レパートリー内に、CDR3領域の特異性(クロノタイプ)で頻度の高いクローンAが見つかった。このクローンAは、17人中15人のCD4陽性T細胞レパートリーに存在していたが、治療後9人の患者では検出されなかった。これまで抗原特異的T細胞を解析するには、in vitroで抗原刺激し,増殖したT細胞cloneやT細胞株を樹立して解析する手法が用いられてきた。この方法では人為的に抗原刺激の操作が加わる事で、この条件で増殖しやすいT細胞のみの解析となり、疾患の病因となる抗原特異的T細胞の検出には適さない面がある。今回、抗原刺激などの操作を加えず、原田病急性期患者の末梢血中CD4陽性T細胞からmRNAを抽出し、GenescanによるCDR3クロノタイプを解析することで、増加しているクローンAが見つかった。このクローンは治療後に検出されなくなり、原田病発症に関わる抗原特異的ヘルパーT細胞であることが示唆される。今後、この結果は原田病の診断法・発症機転解明につなげられる。また、特定の免疫疾患で増えているT細胞クローンの検出方法として応用できる可能性がある。VBのレパートリーを増やしTCRのCDR3のシークエンスを確認する方法を検討を行い、マルチプレックスPCRとdegenerated primerを使用する方法で検討ができている。現在、正常コントロールの末梢血を使用しCDR3のシークエンスの結果がでてきている。眼科急性期原田病患者17人とその治療後の患者12人、原田病以外の非感染性ぶどう膜炎患者5名の解析が進んでいる。

現在、急性期原田病患者で認められたクローンAに対する抗体を作成中である。抗体作成に時間を要しており、研究が計画よりやや遅れている。この抗体により患者リンパ球に占めるクローンAの割合の検討が可能となる。また、患者の単核球からクローンAを抽出し、T細胞受容体のα鎖の遺伝子配列を調べ、クローンAと同じT細胞受容体を発現する細胞を作成できる。この細胞を利用して抗原ペプチドの検討を進める。最近に実施した原田病患者末梢単核球の検討でクローンAが確認されず、セルソーティングでの抽出ができない状態である。また、T細胞受容体の相補性決定領域3のシークエンス解析の精度が下がり、この修正を行ったためやや遅れた。急性期原田病患者17人とその治療後の患者9人の末梢血CD4陽性ヘルパーT細胞のT細胞クロノタイプを比較検討することにより、発症直後に患者間で共有する同一T細胞Vβ鎖CDR3構造を有するクローンAを見つけた。患者によるクローンAの出現頻度を調べることで原田病の診断法の確立をはかることができ、クローンAの認識する抗原を調べることで原田病発症機転の研究に進展できる。平成25年度はクローンAの原田病活動期での特異性の検討に重点を置き、原田病の治療後と原田病以外の患者の検討をすすめる。同時に、原田病の診断ツールとしてクローンAの特異性の簡便な検出方法を検討する。患者単核球のFACSとそのDNAからのreal time PCRでクローンAを検出できるか検討する。クローンAと同じT細胞受容体を発現する細胞を作成にも着手する。本年度は実験助手が加わり、研究を遂行している。クローンAが原田病に特異的なものかを充分に確認した上で、その抗原ペプチド同定をすすめる。最近に実施した原田病患者末梢単核球の検討でクローンAが確認されなかったことより、クローンAとCDR3の配列を共有するクローンが認められないか検討を拡げている。今回検出したクローンAのT細胞受容体を有するCD4陽性T細胞をin vitroで培養し、その抗原特異性、Vα鎖を確定する。このT細胞クローンよりRNAを抽出し、T細胞に対するマイクロアレイを用いて疾患特異的発現遺伝子を選別する。同定したVα鎖、Vβ鎖を発現ベクターに構成し、TCRネガティブT細胞株(Jurkat-)に導入する。この細胞株に対して、ランダムペプチドライブラリーまたはメラノサイト特異的抗原ライブラリーを用いたスクリーニングで、反応する抗原ペプチドを同定する。さらにHLAクラスII拘束分子、サイトカイン産生能を検討し、疾患形成との関連を考察する。原田病治療後と原田病以外の非感染性ぶどう膜炎患者のCDR3のアミノ酸配列の解析と、クローンAに対する抗体の作成、患者単核球のFACSとそのDNAからのreal time PCRでのクローンAの検出、クローンAのVα鎖のDNA配列の決定、Vβ鎖とともに発現ベクターに構成し、TCRネガティブT細胞株(Jurkat-)への導入に研究費を使用する予定である。T細胞受容体の相補性決定領域3のシークエンス解析の精度が下がり、この修正を行ったため実験がやや遅れた。
目撃者遂行型調査の効果の検討

本研究の目的は、正確な目撃記憶をできる限り早い段階で獲得するために英国で開発されたSelf-Administered Interviewの日本語版(目撃者遂行型調査)を作成し、その効果を検討するものである。目撃者遂行型調査は、調査紙内の質問に目撃者自身が記述により回答を行う質問紙形式になっている。27年度は2つの実験を行った。実験1では、目撃者遂行型調査に含まれる質問の方法、および目撃者遂行型調査の特徴である「記述」が記憶の保持に及ぼす効果を検討した。実験参加者は、犯罪ビデオの視聴直後、ビデオの内容について目撃者遂行型調査に記述(記述群)、目撃者遂行型調査に含まれる質問を使った面接による口頭での供述(供述群)、自由再生による口頭での供述(自由再生群)のいずれかを行った。1週間後、すべての参加者が自由再生で供述を行った。結果は、記述群と供述群の参加者は、自由再生群の参加者よりも多くの記憶を想起した。また、記憶の保持については、記述群の参加者は、供述群の参加者よりも多くの記憶を保持していた。本実験により、記憶の想起・保持における目撃者遂行型調査の教示および記述の効果が示された。目撃者遂行型調査には目撃現場をスケッチで描写するセクションが含まれている。26年度の研究で、スケッチによる記憶の想起の効果が示されたこと受け、実験2では、認知スタイルの個人差を測定する言語型ー視覚型質問紙を用いて、目撃者遂行型調査の効果の個人差を検討した。実験参加者は言語型ー視覚型質問紙に回答した後、犯罪ビデオを視聴した。そしてビデオの内容について目撃者遂行型調査に記述した。結果は、スケッチによる報告は、言語型より視覚型が多かった一方、スケッチ以外の報告では両者に差はみられなかった。本研究より、目撃者遂行型調査による記憶の想起は、認知スタイルが視覚型の場合により効果的である可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、正確な目撃記憶をできる限り早い段階で獲得するために英国で開発されたSelf-Administered Interview(SAI)の日本語版(目撃者遂行型調査)を作成し、その効果を検討するものである。平成26年度は、目撃者遂行型調査の作成および大学生を対象にした実験を行った。初めに、目撃記憶の研究者2名によってSAIの日本語翻訳を行い、目撃者遂行型調査を作成した。第1実験として大学生180名を対象に実験を行った。実験参加者は、犯罪ビデオの視聴直後または1週間後に、ビデオの内容について目撃者遂行型調査、認知面接(記憶促進のテクニックを用いた面接法)、または自由再生により供述を行った。結果は、直後・1週間後のいずれにおいても、目撃者遂行型調査による記憶成績は、他の方法による記憶成績より高かった。しかし、目撃者遂行型調査による記憶の再生では他の方法による再生と比較して、正しい記憶とともに、間違った記憶の想起も多かった。これは、英国で行われたオリジナル実験の結果を再現するものとなった。第1実験終了後、目撃者遂行型調査内の日本語の見直しを検討するため、さらにもう1名の心理学研究者がSAIの日本語翻訳を行った。合計3名で翻訳を行ったものをまとめた後、さらにその日本語の文章を目撃者遂行型調査を知らない研究者が英語に翻訳をする作業を行った。これらを通して、オリジナルSAIの再現性を図った。その後、研究実施計画の第2実験を開始した。第2実験では、実験参加者は犯罪ビデオの視聴直後と1週間後の2回、目撃記憶の再生を行う。視聴直後は、目撃者遂行型調査を含む3種類のいずれかの方法で目撃供述を行い、1週間後はすべての実験参加者が自由再生によって供述を行う。それにより、目撃者遂行型調査による記憶の持ち越し効果を検討する。現在、本実験は続行中で、データ収集段階である。

そしてビデオの内容について目撃者遂行型調査に記述した。結果は、スケッチによる報告は、言語型より視覚型が多かった一方、スケッチ以外の報告では両者に差はみられなかった。本研究より、目撃者遂行型調査による記憶の想起は、認知スタイルが視覚型の場合により効果的である可能性が示唆された。2カ年計画で調査紙の翻訳と3つの実験を計画していた。現在、当初の計画通り第2実験まで進んでおり、おおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、現在大学生を対象に行っている第2実験を完了させた後、一般成人を対象にした第3実験の実施を計画している。第3実験の終了後、昨年度・今年度のすべてのデータを集約して、大学生と一般成人の相違点等の検討を行う。それらを通して、目撃者遂行型調査が日本の捜査で活用されるために必要と考えられる実験計画を立案する。
インフルエンザウイルスの流行状況把握とヒト上部気道への適応メカニズム解析

高病原性H5N1鳥インフルエンザウイルスが、ヒトで効率よく増殖することに関与する新規ウイルス因子を明らかし、更に、インドネシアにおける高病原性インフルエンザウイルス流行状況把握を目的として、インドネシアの家禽からウイルスを分離し解析を行った。分離ウイルスは、全てH5N1であり、それ以外の亜型ウイルスは確認されなかった。性状解析の結果、ヒト呼吸器上皮細胞での効率のよい増殖性やマウスでの高病原性に関与するPB2遺伝子の変異やウイルス熱安定性に関与するHA遺伝子変異を新たに見出した。この成績は、今後、パンデミックを起こしうるウイルスのリスク評価やパンデミックに対する事前策に有用な情報であると考える。本研究の目的の1つは、インドネシアの家禽や豚で流行しているインフルエンザウイルスの流行状況把握を行い、更に分離ウイルスの性状解析を行うことでパンデミックのリスク評価を行うことである。その目的達成のため、申請者は、インドネシアを訪問し、インドネシア・アイルランガ大学のNidom博士らの協力のもと、インドネシア国内のH5N1ウイルスの流行地域を始めとする様々な地域の養鶏場や小規模農場に赴き、鶏やウズラなどの家禽などから検体(咽頭ぬぐい液等)採取を実施した。採取した検体は、Nidom博士らが以前、採取していた検体と共に、東大・医科研・ウイルス感染分野に輸入し、発育鶏卵を用いてウイルス分離を試みた。その結果、2013年の検体から4株、2014年2015年の検体から7株のH5N1インフルエンザウイルスが分離された。なお、H7N9やH5N6亜型等のウイルスは分離されなかった。遺伝子解析の結果、2013年の4株は同日に同じ地域で採取された検体から分離されたが、2株は発生当初からインドネシアで保持されてきたクレード2.1.3に属する株であり、他の2株は、2012年にベトナムから流入したと考えられるクレード2.3.2に属する株であった。つまり、現在、インドネシアでは、異なるクレードのウイルスが混在して流行していることが明らかになった。そのため、クレード2.1.3とクレード2.3.2のウイルスが同一宿主に感染することで遺伝子交雑が起こり、新たな性状を持つリアソータントウイルスが出現する可能性が考えられる。2014年2015年の7株について、全遺伝子を解析した結果、いずれもすべてのセグメントがクレード2.3.2株由来の遺伝子であり、遺伝子交雑は確認されなかった。なお、いずれの株においても、レセプター特異性や薬剤感受性への影響が報告されている変異は生じていなかった。今後は、分離したウイルスの培養細胞での増殖性や実験動物における病原性を解析する予定である。平成27年度の実施計画にある、「インドネシアにおける検体採取・ウイルス分離および分離ウイルスの遺伝子解析」は実施できているものの、分離ウイルスの性状解析は現在、実施中であり、まだ結果が得られていないため、やや遅れていると判断した。申請者は、インドネシアを訪問し、インドネシア・アイルランガ大学のNidom博士らの協力のもと、インドネシア国内のH5N1ウイルスの流行地域を始めとする様々な地域の養鶏場や小規模農場、生鳥市場に赴き、鶏などの家禽から検体採取を実施した。検体は、東大・医科研・ウイルス感染分野に輸入し、発育鶏卵を用いてウイルス分離を試みたところ、家禽が大量に死亡していた農場のみならず、症状のなかった生鳥市場の家禽から採取した検体からもH5N1ウイルスが分離された。ウイルス膜表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)遺伝子の系統樹解析を行ったところ、全て2012年にベトナムから流入したと考えられているクレード2.3.2.1dに属していた。アミノ酸変異を調べたところ、インドネシアに流入した2012年当初の株と比較して、主要抗原部位である、HA蛋白質のヘッド領域に複数の変異が見られたことから、抗原性が変化している可能性が示唆された。次に、鶏由来細胞およびヒトの呼吸器上皮細胞における増殖性を調べたところ、株間での増殖性の差は小さく、鶏由来細胞ではいずれも10の8乗程度と高い増殖性を示し、また、ヒトの呼吸器上皮細胞では10の5乗程度まで増殖した。更に、マウスにおける病原性を比較解析したところ、10の3乗PFU/animalにてウイルスを摂取したマウスの致死率は、ほとんどの株において100%であったが、一部、PB2遺伝子がユニークな株では、致死率が25%であり、低い病原性を示した。PB2遺伝子が病原性に大きく関与することが予想され、今後、詳細を明らかにする予定である。また、クレード2.3.2.1dウイルス間で増殖性を比べたところ、近年のウイルスは、ヒト細胞で高い増殖性を示す株が多いことから、今後、詳細にヒトへの適応性に関する解析を進める必要があると考えられる。平成28年度の実施計画にある、「インドネシアにおける検体採取・ウイルス分離および分離ウイルスの遺伝子解析、性状解析」については、おおむね計画通りに進んでいるものの、その他の部分については解析が遅れており、全体としては遅れていると評価する。申請者は、インドネシアを訪問し、インドネシア・アイルランガ大学のNidom博士らの協力のもと、ジャワ島およびカリマンタン島のH5N1ウイルスの流行地域およびその周辺の養鶏場や小規模農場、生鳥市場に赴き、鶏やカモなどの家禽から検体採取を実施した。約1700の検体を、東大・医科研・ウイルス感染分野に輸入した。

現在までに分離されているウイルスは、これまでの分離結果と同様に、いずれもクレードclade2.3.2.1に属するH5N1高病原性鳥インフルエンザウイルスであり、2004年以降流行を続けてきた従来のclade2.1.3ウイルスは分離されなかった。このことから、インドネシアでは現在も、クレードclade2.3.2.1のウイルスが主に流行しているものと推測される。2016年の採取検体から分離した一部のH5N1ウイルスのHAタンパク質のレセプター結合部位周辺に複数の変異が見られた。そこで、レセプター結合試験により結合特異性を調べたところ、レセプター特異性に変化はなく、鳥型レセプターとの結合のみ検出され、ヒト型レセプターとの結合は検出されなかった。clade2.1.3のウイルスは、株によりヒト呼吸器上皮細胞における増殖性にばらつきがあった。そこで、効率の良い増殖に関与する因子の特定を試みたところ、ウイルスのポリメラーゼ複合体のPB2タンパク質における変異が主に関与しており、とりわけ低温において、その関与は大きいことを明らかにした。そこで低温におけるポリメラーゼ活性を調べたところ、既存のPB2-627K,701N, 591Kのように活性を顕著に上昇することはなかった。ヒトへの適応メカニズムの1つとして、上部気道で増殖するために低温で効率よく増殖することが重要であると考えられており、今回見出した変異は、未解明のメカニズムにてヒトでの効率のよい増殖に関与する可能性が示唆された。高病原性H5N1鳥インフルエンザウイルスが、ヒトで効率よく増殖することに関与する新規ウイルス因子を明らかし、更に、インドネシアにおける高病原性インフルエンザウイルス流行状況把握を目的として、インドネシアの家禽からウイルスを分離し解析を行った。分離ウイルスは、全てH5N1であり、それ以外の亜型ウイルスは確認されなかった。性状解析の結果、ヒト呼吸器上皮細胞での効率のよい増殖性やマウスでの高病原性に関与するPB2遺伝子の変異やウイルス熱安定性に関与するHA遺伝子変異を新たに見出した。この成績は、今後、パンデミックを起こしうるウイルスのリスク評価やパンデミックに対する事前策に有用な情報であると考える。平成27年度に分離したウイルスについての培養細胞における増殖性解析およびマウスを用いた病原性解析は平成28年度上半期には終了する予定である。また、平成28年度以降も、引き続きインドネシアを訪問し、流行地域にて検体採取活動等を実施する予定である。2016年、3月にもインドネシアにて検体採取を実施しており、採取した検体は、平成29年度に輸入を行い、ウイルス分離・性状解析を実施する予定である。さらに、引き続きインドネシアを訪問し、流行地域にて検体採取活動等を実施する予定である。ウイルス学