hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ガスや塵に隠された巨大ブラックホールのX線および可視光による研究

本研究の目的は、恒星質量ブラックホールから、数億光年の彼方の銀河たちの中心にある巨大ブラックホールまで、さまざまなブラックホールへの質量降着を理解することである。今年度はX線と可視光を用いた観測により、以下のように、大きな成果を挙げることができた。稼働中の「すざく」衛星を用いた観測的研究では、活動銀河核(銀河の中心にある巨大ブラックホールにガスが降着しているもの)のうち、濃いガスに隠されている数個の天体のデータを、理研や東大の研究者と共同で解析した。その結果、ブラックホールを包むガスが、ぶ厚いドーナツ状の分布をすると考えられる天体と、薄い円盤状に分布すると考えられる天体という、2種類があることを発見した。これまですべて活動銀河核は前者と考えられていたので、この結果は、従来の定説に大きな変更を迫るものである。南米チリにあるVery Large Telescopeと呼ばれる望遠鏡を用いた観測では、ブラックホール連星GX339-4から可視光で、1秒以下の速い変動を検出することに成功した。さらに同時に取得された米国RXTE衛星のX線データと比較したところ、可視光とX線の強度変動の間に、きわめて興味深い相関があることを発見した。X線は相対論的プラズマからの逆コンプトン放射、可視光は同じプラズマからのサイクロトロン放射かもしれない。現在、結果の物理的な意味を考察している。理研および英国の研究者と協力することにより、稼働中の「すざく」衛星に対し、2つの観測提案を行うことができた。観測対象は、濃いガスに隠されていると考えられる巨大ブラックホールで、「すざく」の優れた性能利用し、ガスを透過してくる硬X線を検出するものである。英国および米国の共同研究者の協力し、南米チリにあるVery Large Telescopeと呼ばれる光学望遠鏡に、観測時間を確保することができた。この観測の目的は、GX 339-4と呼ばれるブラックホール連星の、ひじょうに早い光変動を捉えようとするもので、可視光と同時にX線の情報も得る必要があるので、米国のRXTE衛星に対しても同じ天体の観測時間を申請している。G.Miniuttiらと協力し、ブラックホールの周辺で強い重力の効果により、光線が曲がるという一般相対論的効果を研究している。この効果は、X線スペクトルに無視できない効果をもつが、どこまで普遍的かまだ不明な点が多い。そこで本研究では、宇宙背景放射の性質から、逆にそうした「光線の曲がり」効果を受けている巨大ブラックホールがどの程度の割合で存在するか、制限をつけることを試みている。初期成果は、12月に京都で開催された「すざく」国際研究集会のさい、P.Gandhiによりポスター発表された。
小児固形がん患者に対して包括的な認知機能評価と支援を行い、QOL向上を目指す研究

小児固形がん治療を受け、退院した患者に“治癒後の良好なQuality Of Life:QOL"を提供する事を目的とし、そのためには精密な認知機能検査が不可欠であるとの観点より、主任研究者の施設で2019年4月までに5名に対して実施した。全例でWISC-IVが実施可能で、その他年齢に応じて追加検査を実施した。得られた結果をもとに入学予定校または原籍校に対するフィードバックを実施した。結果の一部は成育医療研究センターにおけるデータベースに保存した。順次、データ解析を進めている。また主任研究者は日本小児がん研究グループ(JCCG)の神経芽腫委員会や長期フォローアップ委員会の会議にて、日本の小児固形がん全体のデータベース作成にも関与しているため、協力施設をリクルート、拡充している。本研究の理解が得られた施設には漸次、進捗状況の説明と協力要請を行っている。本研究の主座である、実効性の評価、がんの種類によっての差異を把握するために網膜芽腫、神経芽腫、Wilms腫瘍をはじめとする多種類の小児がんに対する認知機能を行ない、また個々の患児にフィードバックを行っているが、実際に有効であったかは共同研究者らにより進められている。一方で、県内外でも患者家族へ認知機能を実施する事の必要性を説明している。大分県、また東京都にて講演し、具体的な方向性を示す事で家族や患児自身の理解が進み、学校などの社会生活への適応、ひいてはQOLが向上することの感触を得た。主任研究者は成育医療研究センターとの共同研究を開始し、データセンターや統計の専門家の協力を得ているが、共同研究者の移動や役職の変更により方向性に微調整が必要となったため全国展開がやや遅れている。全国展開のため、本研究の理解を更に広げ、また多施設共同研究施設を開始する予定である。一方で、主任研究者の施設・その近隣施設では対象患者に認知機能検査を実施して、就学時のフィードバック方法を構築する。主任研究者施設以外の施設への訪問指導や患者リクルートが乏しかったため、次年度以降に繰り越して実施する事とした。
化学療法抵抗性を有する転移性膀胱癌に対するエピジェネティックス治療確立

セカンドライン以降の十分な治療戦略が必要とされる尿路上皮癌に対し、転移性尿路上皮癌の化学療法抵抗性へのエピジェネティクスの関与を解明し、エピジェネティクス治療を用いた2次治療を開発する。DNAメチル化の減弱を起こすDNAメチル基転移酵素(DNMT)阻害剤である5-aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)による化学療法再感受性獲得の詳細な分子機構について解析を行い、patient derived xenograftモデルを用いて5-Aza-CdR・CDDP併用治療の安全性と有効性のPOCを確立し、5-Aza-CdRを用いた2次治療としての臨床試験を行う。
新規オレキシン転写制御因子の機能解析とナルコレプシーへの関与

1PLAGL1のオレキシンニューロンでの発現頻度に変化の見られた高脂肪食群に関して定量PCRをおこない、実際のオレキシンとPLAGL1の遺伝子発現にも変化があることを確認した。2レポーターアッセイをおこない、オレキシン遺伝子上流発現制御領域のPLAGL1への反応性を確認し、PLAGL1結合motifを欠損させることによりその反応性が消失することを確認した。Chip-PCRの結果と合わせて、このPLAGL1結合配列を介してPLAGL1がオレキシンの転写制御をおこなっていることが考えられた。3胎生14日と胎生18日のマウス胎児視床下部でのPLAGL1のオレキシンニューロンでの発現頻度を検討した結果、胎生18日での有意な増加を認め、胎生期オレキシン発現へのPLAGL1の関与が示唆された。4子宮内電気穿孔法によるPLAGL1過剰発現マウスを作成し、その視床下部での発現変化を検討した。過剰発現によるPLAGL1、オレキシンの有意な増加を認めた。さらに、オレキシンニューロン近傍に存在するMCH、オレキシンニューロンに共発現するダイノルフィン、オレキシンニューロンと直接相互作用するTRH、オキシトシンの有意な発現変化を確認した。結論として、本研究はオレキシン転写調節におけるPLAGL1の関与を明らかにした。しかしながら、PLAGL1発現は視床下部の他の領域においても観察される。したがって、PLAGL1がオレキシン発現に直接または間接的に影響を与えるかどうかを明らかにするために、Plagl1コンディショナルノックアウトマウスおよびオレキシンプロモーター-Creマウスとのクロスハイブリダイゼーションを用いたさらなる検討が必要である。A)Plagl1/PLAGL1発現時期・局在とオレキシンニューロンへの共存の確認:胎生13日でのPLAGL1とオレキシンとの共存を二重蛍光抗体法により確認した。その共存は胎生15日ならびに18日においても確認した。18日においてもオレキシンニューロンは移動中のニューロン様な細長い形態を有していた。ISHにより胎生期視床下部でのPlagl1発現を確認したが、オレキシン抗体との二重染色はまだセットアップできていない。また、浮遊切片による染色も試みたが、脳室の大きさから切片がバラバラになってしまい胎児浮遊切片での染色は断念した。成獣視床下部オレキシンニューロンへのPLAGL1の共存を明暗、断眠、飢餓、高脂肪食にて検討し、各条件下での共存頻度の変化を観察した。また、ある条件下においてPLAGL1の細胞内局在の変化を観察した。B)子宮内電気穿孔法を用いたPlagl1過剰発現マウスの作成とオレキシン機能への関与の検討:電気穿孔装置の導入が遅れ、現在セットアップ中である。C)Plagl1ノックアウトマウスを用いたオレキシンニューロン機能の解析:マウスの選定が終わり、現在目的のマウスを導入中である。PLAGL1のオレキシンとの局在に関しては大きく進捗したが、遺伝子改変マウスの導入が遅れており、やや遅れているとした。1成獣マウスにおいて明暗サイクル、断眠、高脂肪食1ヶ月、絶食1日、絶食2日の影響を検討し、オレキシンニューロン数ならびに共存するPLAGL1数と頻度を測定した。すべての条件においてPLAGL1陽性頻度の変化を観察した。ただし各群N4であるため、統計的なパワーは足りないと考えられる。また、断眠によりPLAGL1が核内で偏在することも見出した。これは断眠によりヘテロクロマチン部位にPLAGL1が局在するためを考えられた。2in slicoにてオレキシン遺伝子座上流配列に候補PLAGL1結合配列を見出した。そこでPLAGL1抗体とマウス視床下部組織を用いたクロマチン免疫沈降法をおこない、オレキシン上流配列候補PLAGL1結合配列近傍PrimerにてPCRによるバンドが得られた。このことからオレキシン上流配列候補PLAGL1結合配列へPLAGL1が結合していると考えられた。3胎生18日マウス視床下部において新たにPLAGL1の細胞膜裏打ち様の染色像を得た。この意義はまだ謎である。また、オレキシン遺伝子発現とそのタンパク発現時期との間にタイムラグがあることを見出した。何らかの翻訳抑制因子の関与が示唆される。4子宮内電気穿孔法を立ち上げ、胎児視床下部へのPlagl1過剰発現による影響を検討した。組織学的にオレキシンニューロン数の増加を認めたが、バックグラウンドが高く血管との判別が困難なため、定量PCRをおこない、Plagl1導入個体においてオレキシン発現上昇を認めた。5現在、これらをまとめ投稿中である。当初、最終年度での投稿を予定していたが、思った以上に進展し、本年度に投稿までたどり着いたため。3胎生14日と胎生18日のマウス胎児視床下部でのPLAGL

1のオレキシンニューロンでの発現頻度を検討した結果、胎生18日での有意な増加を認め、胎生期オレキシン発現へのPLAGL1の関与が示唆された。4子宮内電気穿孔法によるPLAGL1過剰発現マウスを作成し、その視床下部での発現変化を検討した。過剰発現によるPLAGL1、オレキシンの有意な増加を認めた。さらに、オレキシンニューロン近傍に存在するMCH、オレキシンニューロンに共発現するダイノルフィン、オレキシンニューロンと直接相互作用するTRH、オキシトシンの有意な発現変化を確認した。結論として、本研究はオレキシン転写調節におけるPLAGL1の関与を明らかにした。しかしながら、PLAGL1発現は視床下部の他の領域においても観察される。したがって、PLAGL1がオレキシン発現に直接または間接的に影響を与えるかどうかを明らかにするために、Plagl1コンディショナルノックアウトマウスおよびオレキシンプロモーター-Creマウスとのクロスハイブリダイゼーションを用いたさらなる検討が必要である。○ISHと免疫組織化学による二重染色の立ち上げ○子宮内電気穿孔法のセットアップ○ノックアウトマウスの導入○他の候補の共存の確認○ナルコレプシーへの関与の検討1明暗サイクル、断眠、高脂肪食1ヶ月、絶食1日、絶食2日の影響を定量的な手法により解析する。2今後、レポータアッセイ等により発現変化を検討するとともに、結合配列以外の位置でのPrimerによりChipネガティブコントロール実験を行ない、サポートデータとする。3細かく胎齢を検討し、PLAGL1局在を観察していく。4直接的か間接的かを検討する意味で、他の視床下部遺伝子群の発現変化を検討する。初年度計画していた遺伝子改変マウスの導入がまだ途中であるため、その経費が次年度使用額となった。(理由)導入予定であったエレクトロポレーターが別基金により導入されたため、使用しなかった。(使用計画)直接な関与を示すため、いくつかの遺伝子改変マウスが必要となるため、その導入費に充てる。当初の予定通り、遺伝子改変マウスの導入に充てる
ダイアモンド表面における単原子金属層高温超伝導体の創出

ダイアモンドはフォノン周波数が非常に高いため、高い転移温度を有する超伝導の発現が理論的に予想されている。ダイアモンド清浄表面上に単原子金属層を成長させ、超伝導特性を発現させることを目的として研究を行った。平成25年度は引き続き、ダイアモンド薄膜のCVD成長条件およびSTM観測条件の最適化を行った。ダイアモンド単結晶基板上にマイクロ波CVD法を用いて平滑で高品位なホウ素ドープダイヤモンドを成膜した。試料を1000°Cに加熱しながら1×10^<-4>Pa程度の酸素を導入したところ、(100)結晶軸方向に沿った長方形型のテラス構造を観測することに成功した。これにより、有機汚染物の酸化および除去によって、清浄表面に近い状態が得られたことが確認できた。一方、ダイアモンド型の結晶構造をもつシリコン基板表面上で、インジウム原子層の成長と低温での電気伝導測定を行った。シリコン(111)表面を超高真空中で清浄化し、インジウムを一原子層程度300°Cで成長させた。クライオスタットの改造により、電気伝導測定によって得られる超伝導転移温度は約3.0Kであることがわかった。これは低温STM測定によって知られていた転移温度とほぼ一致する。また、有機分子である銅フタロシアニンを1分子層程度この表面に吸着させ、配列させたところ、転移温度が0.13K程度上昇することがわかった。これは、銅フタロシアニンからインジウム原子層に電荷移動が起こり、キャリアがドーピングされたためであると考えられる。シリコン表面上金属原子層の超伝導に関しては、進展があったが、ダイヤモンド表面の研究については遅れている。ダイヤモンド表面の調製方法の確立が急務である。今後は、ダイアモンド清浄表面の調製方法を確立し、さらにインジウムなどの金属を単原子層レベルで成長させる。走査トンネル顕微鏡で局所的な超伝導ギャップを観察し、電気伝導測定を行うことで、直接的に超伝導転移を観測することを目標としたい。ダイアモンド清浄表面上に単原子金属層を成長させ、超伝導特性を発現させることを目的として研究を行う。平成24年度はまず、ダイアモンド薄膜のCVD成長条件の最適化を行った。表面は水素終端されており、電気抵抗の温度依存性は、温度の低下に伴い緩やかに抵抗が上昇する傾向を示し、STM測定や通電加熱も可能な抵抗値領域となった。平行してダイアモンド薄膜の表面清浄化とSTM観察を行った。試料は(100)面を有し、1019cm^<-3>程度のホウ素ドーピングによって室温での抵抗率が5Ωcmにまで下げられているものを用いた。まず超高真空環境下で1400°Cまで試料を加熱してSTM観察を行ったところ、数nm程度の多数のグレインが集積したような表面が得られたが、ダイアモンド表面に特有の構造は見られなかった。ラマン分光によって表面組成を調べたところ、ダイアモンドに特有のDバンドに由来する強いピークが観測され、グラファイトによるGバンドピークは観測されなかったことから、高温加熱による表面変性は生じていないことを確認した。大気中から試料表面に付着した有機汚染物が清浄表面を得られない原因であると考え、試料を1000°Cに加熱しながら1x10^<-4>Pa程度の酸素を導入したところ、(100)結晶軸方向に沿った長方形型のテラス構造を観測することに成功した。これは有機汚染物の酸化および除去によって、清浄表面に近い状態が得られたためであると考えられる。ダイアモンド薄膜の成長条件を最適化することに成功した。また、ほぼ清浄と考えられるダイアモンド表面を調製することに成功したため、今後の実験に道筋をつけることができた。

シリコン表面上金属原子層の超伝導に関しては、進展があったが、ダイヤモンド表面の研究については遅れている。ダイヤモンド表面の調製方法の確立が急務である。今後は、ダイアモンド清浄表面にインジウムなどの金属を単原子層レベルで成長させ、その構造および超伝導特性を明らかにする。また、高濃度ボロンドープを行ったダイアモンド基板に対しても、走査トンネル顕微鏡で局所的な超伝導ギャップを観察することで、理論的に予測されている高い転移温度の可能性を調査する。今後は、ダイアモンド清浄表面の調製方法を確立し、さらにインジウムなどの金属を単原子層レベルで成長させる。走査トンネル顕微鏡で局所的な超伝導ギャップを観察し、電気伝導測定を行うことで、直接的に超伝導転移を観測することを目標としたい。
巨核球及び赤芽球分化成熱のシグナル伝達

先ずMAPキナーゼの赤血球分化における役割を調べた。p38とJNKの活性化が赤芽球分化に必要であることを見出したが(Blood92,1859,1998).環境ストレスにおいてもp38とJNKが活性化されアポトーシスが誘導されることが知られていた。本研究では特定条件下でストレスをかけても赤芽球分化が誘導されることを見出した。アポトーシスと細胞分化においては同じMAPキナーゼが活性化されるが、ストレスの強度や時間等の条件の違いによってアポトーシスも細胞分化も誘導できた。アポトーシスと細胞分化の決定はERKとp38/JNKの活性化のバランスと、p38/JNKの活性化の時間の違いによって決定されていることが判明した(Blood印刷中)。またEpo刺激によってJNKを活性化するHPKlキナーゼが活性化しHSlがリン酸化されることを見出した(Blood印刷中)。赤血球分化でのSTAT5の関与を証明した(B1ood92,1104,1998)。さらにEpoで赤芽球分化が誘導できる細胞株を用いてDD法で、誘導発現する新規遺伝子群を多数単離した。その中でMycに結合する新規転写因子Eig-1を見出し、強制誘導発現するだけで赤芽球分化が誘導できた。この因子は細胞増殖を抑制し細胞分化ヘスイッチする因子であると考えられた。さらに巨核球からの血小板放出に関わるシグナル因子を同定し、NFE2ノックアウトマウスから下流で働く新規因子を複数単離し解析している。
緑藻の配偶子形成における制御機構の解析

1.Acetabularia calyculus,Acetabularia ryukyuehsis,Acetabularia acetabulumの三種のカサノリを用いて配偶子形成過程の核および細胞質の動態と、これにかかわる環境制御要因の研究をおこなった。核挙動はDAP1によるDNA蛍光染色法を用い、細胞質の動態は抗α-チューブリンによる間接蛍光抗体法を用いて観察した。今までは電顕切片による以外に配偶子形成課程を探る方法はなかったが本研究では上記の方法により核と細胞質の動態が明らかになった。一方、生態観察と室内培養条件のコントロールから配偶子形成を制御する光,温度条件を解析した。これらの制御因子と核・細胞質挙動とのかかわりあいを研究した。CAP-RAY内で核は均等分布し、一核を中心として微小管リングが形成され細胞質はシストに分割される。シスト内核分裂は核数38で停止し休眠する。15°CDarKで休眠が解除され配偶子形成へと進行する。本研究は生理学,形態学,生態学の接点を求めておこなわれた。2.群体性緑藻ゴニウムの有性生殖に関する外的および内的制御の研究をおこなった。(1)群体構成細胞数が16でクローン増殖後も安定した新しいクローンを分離した。(2)配偶子形成には培地の窒素源の欠乏と光要求が制御因子であった。(3)増殖に要求される酢酸およびCaは有性生殖の初期過程である配偶子形成並びに性的凝集反応には必要ではない。しかし接合子形成へと生殖過程が進行すると酢酸とCaの要求性が認められることは、これらの要求性は性の過程でかわるものと考えられる。(4)ヘテロタリック株間での交配接合子から発芽した【F_1】株に高い頻度でホモタリック株が出現するという性様式の変換現象を見出した。この性の様式の変換は染色体の倍化によるのではなく減数分裂時の染色体の組み換えによって起ったと考えられる。
樹木細根のフェノロジー：枯死プロセスの解明とその定量評価

樹木の細根は、葉のように短いサイクルで発生と枯死を繰り返すとされているが、このライフサイクルにおいて、最も不明瞭な部分が衰退から枯死への過程である。そこで本研究では、細根の動きを土壌中でモニタリングしながら枯死を誘導することで、細根の枯死過程を解明することを目的とした。さらに地上部のフェノロジーや土壌環境を同時に計測することで、細根の枯死を支配する要因を特定し、枯死根の定量評価を試みる。そのために次の4つの実験に着手した。1枯死に伴う細根の形質の変化は何か?2細根の枯死はどう定義されるか?3細根の枯死はいつ、どのくらい発生するか?4細根の枯死を引き起こす要因は何か?実験1と2では、アクリルポットを用いたストレス実験によって細根の枯死を誘導し、形態や生理状態の変化を求める。ストレスとしては、乾燥処理、踏圧処理を検討する。本年度はポットの設置準備とストレス処理の開始を行った。また枯死判定の予備実験を実施した。実験3と4では、フィールド実験を通して枯死の発生パターンを生態系レベルで評価する。また、枯死の制御要因として土壌物理環境、地上部フェノロジーの影響を調べる。本年度はフィールド実験としてスキャナを使った細根動態をモニタリングする準備を行った。そのために必要な物品の手配や試験地の選定、実験計画の立案、マニュアル開発と測定準備などを主に行った。また、スキャナ法で枯死根をモニタリングするための方法論や枯死根採取のための方法論についての研究成果を公表した。スキャナ法についてはトレーニングコースを開催し、方法の統一化を図った。本年度の研究計画は順調であると判断される。各テーマの進捗状況は下記のとおりである。実験1・2カラマツの苗木を用いたポット実験の準備を行った。実験は苫小牧演習林で行うこと年、苗木やポットなどの資材の購入と植栽を実施した。ポットは根系の変化を撮影できるように透明のアクリルで作成し、スキャナ面と同等のサイズとした。処理区のポットでは土壌を圧縮し、通気環境を悪化させた。また、森林総合研究所の東北支所において細根採取を行い、枯死判定実験を行った。その結果、従来の判定法である見た目評価には大きなばらつきがあり、今後はより客観的な指標を模索する必要性が指摘された。実験3・4国内のカラマツ人工林とヒノキ人工林において土壌中の細根の挙動をするためのスキャナボックスを埋設した。本年度はそのために、北海道、盛岡、長野、名古屋などの候補試験地を訪問した。この際、スキャナボックスのデザイン設計、埋設手順書を作成した。さらにミーティングを通して、対象樹種、処理の方法、繰り返し設定、測定項目、作業分担などを話し合い、実験計画の詳細について決定した。また、取得するデータについて、スキャナ画像の取得頻度、根系のサンプリング、化学分析、土壌環境の計測、地上部モニタリング項目などを打ち合わせし、それらのデータの取得方法を話し合った。各測定項目について、測器のメンテや新規購入などを行った。スキャナ法や枯死根採取法について、得られた成果を根研究会、森林学会、生態学会などで発表した。さらに画像解析手法を基準化するためにトレーニングコースを生態学会において約5日間に渡り、開催した。今後の研究として以下を予定している。実験1・2アクリルポットを用いたストレス実験については、昨年度から行っている踏圧ストレスを与えた苗木の育成を引き続き行う。さらに、踏圧ストレスを受けた根系と受けていない根系枯死過程を画像取得によりモニタリングし、形態や色情報を用いて枯死根の形質変化を調べる。枯死判定実験については、従来、行われてきた枯死基準に基づく枯死根の判定の個人差と、枯死根の化学性、物理性の評価を再度行う。昨年の予備実験より、枯死根判定には大きな個人差が生じていることが判明したことから、今年は地上部切断により人為的に作成した枯死根の化学分析、形態分析を行い、枯死根の定義づけに結び付けられるようにする。実験3・4フィールドでの枯死根発生モニタリングについては、昨年、国内のカラマツとヒノキ人工林において埋設したスキャナボックスを用いて、土壌中の細根の挙動のモニタリングを開始する。モニタリングは月1度の頻度を予定している。本年度はスキャナから枯死根を抽出するための基準作りや、枯死根の発生時期の評価方法を検討する。また、細根の枯死根発生要因などを検討するために、土壌物理環境、地上部フェノロジーのデータを同時に取得できるように準備する。物理環境としては、地温と土壌水分、フェノロジーデータとしては肥大成長と落葉量を検討する。さらにガラスビーズを用いて枯死根を直接取得する手法を検討し、根の枯死過程を評価する方法論の開発を引き続き、実施する予定としている。1枯死に伴う細根の形質の変化は何か?2細根の枯死はどう定義されるか?3細根の枯死はいつ、どのくらい発生するか?

4細根の枯死を引き起こす要因は何か?実験1と2では、アクリルポットを用いたストレス実験によって細根の枯死を誘導し、形態や生理状態の変化を求める。ストレスとしては、乾燥処理、踏圧処理を検討する。本年度はポットの設置準備とストレス処理の開始を行った。また枯死判定の予備実験を実施した。実験3と4では、フィールド実験を通して枯死の発生パターンを生態系レベルで評価する。また、枯死の制御要因として土壌物理環境、地上部フェノロジーの影響を調べる。本年度はフィールド実験としてスキャナを使った細根動態をモニタリングする準備を行った。そのために必要な物品の手配や試験地の選定、実験計画の立案、マニュアル開発と測定準備などを主に行った。また、スキャナ法で枯死根をモニタリングするための方法論や枯死根採取のための方法論についての研究成果を公表した。スキャナ法についてはトレーニングコースを開催し、方法の統一化を図った。本年度の研究計画は順調であると判断される。各テーマの進捗状況は下記のとおりである。実験1・2カラマツの苗木を用いたポット実験の準備を行った。実験は苫小牧演習林で行うこと年、苗木やポットなどの資材の購入と植栽を実施した。ポットは根系の変化を撮影できるように透明のアクリルで作成し、スキャナ面と同等のサイズとした。処理区のポットでは土壌を圧縮し、通気環境を悪化させた。また、森林総合研究所の東北支所において細根採取を行い、枯死判定実験を行った。その結果、従来の判定法である見た目評価には大きなばらつきがあり、今後はより客観的な指標を模索する必要性が指摘された。実験3・4国内のカラマツ人工林とヒノキ人工林において土壌中の細根の挙動をするためのスキャナボックスを埋設した。本年度はそのために、北海道、盛岡、長野、名古屋などの候補試験地を訪問した。この際、スキャナボックスのデザイン設計、埋設手順書を作成した。さらにミーティングを通して、対象樹種、処理の方法、繰り返し設定、測定項目、作業分担などを話し合い、実験計画の詳細について決定した。また、取得するデータについて、スキャナ画像の取得頻度、根系のサンプリング、化学分析、土壌環境の計測、地上部モニタリング項目などを打ち合わせし、それらのデータの取得方法を話し合った。各測定項目について、測器のメンテや新規購入などを行った。スキャナ法や枯死根採取法について、得られた成果を根研究会、森林学会、生態学会などで発表した。さらに画像解析手法を基準化するためにトレーニングコースを生態学会において約5日間に渡り、開催した。今後の研究として以下を予定している。実験1・2アクリルポットを用いたストレス実験については、昨年度から行っている踏圧ストレスを与えた苗木の育成を引き続き行う。さらに、踏圧ストレスを受けた根系と受けていない根系枯死過程を画像取得によりモニタリングし、形態や色情報を用いて枯死根の形質変化を調べる。枯死判定実験については、従来、行われてきた枯死基準に基づく枯死根の判定の個人差と、枯死根の化学性、物理性の評価を再度行う。
流通青果物の品質変化予測システム

青果物の呼吸作用,蒸散作用,包装資材のガス透過性,流通環境の温湿度データに基づき、包装内ガス濃度および積算呼吸量と積算水分損失量を計算するための数学モデルとシミュレーション・プログラムを作成し、実験により計算結果を検証した。一方、カンキツを対象にして、9種の温・湿度条件下における糖および酸の含有量と果実硬度の変化を測定し、糖および酸含有量と積算CO_2排出量の関係、相対果実硬度と質量減少率の関係を求め、品質変化予測システムの妥当性を確認した。本研究は,流通手段や経路など様々な流通条件に対応した青果物の品質変化を予測するシステムを構築し,品質保持,品質保障,品質に関わる情報提供,また流通の合理化などに資することを目的としている。すなわち,青果物の呼吸モデルと蒸散モデル,包装資材のガス透過性,および流通時の温湿度データに基づき,流通中における青果物の積算呼吸量と積算水分損失量を計算し,積算呼吸量ならびに積算水分損失量と品質変化との関係を確立することと併せて,品質低下を予測するシステムを開発しようとする。一定時間間隔で記録された外気の温湿度データをもとに,包装内の酸素,二酸化炭素,窒素,水蒸気の体積変化および積算呼吸量と積算水分損失量を計算する拡散・準定常計算のシミュレーション・プログラムを作成した。また,プログラムによる計算結果を検証するため,温湿度を変化させた一定規模の室内実験により,包装資材内の酸素,二酸化炭素,窒素および水蒸気濃度の変化およびカンキツの水分損失量を測定した。これらの結果は良好で,次のステップ(拡散・対流・準定常計算)に進行し研究を完成させるために重要な意義を持っている。現在,論文として公表するための準備を進めている。一方,シミュレーションにより計算される積算呼吸量および積算水分損失量と品質変化との関係を確立するため,カンキツ(ウンシュウミカン,清見タンゴール)を対象に実験を実施した。すなわち,温度を一定にした保冷庫において,デシケータと飽和塩水溶液による温湿度が一定の環境を設定し,カンキツの積算呼吸量と糖および酸含有量との関係,積算水分損失量と果実硬度との関係を測定した。これらの結果は,現在分析中であるが,平成21年6月の学会で発表する予定である。本研究は,青果物の呼吸モデルと蒸散モデル,包装資材のガス透過性,および流通時の温湿度データに基づいて,流通中における青果物の積算呼吸量と積算水分損失量を計算し,積算呼吸量ならびに積算水分損失量と品質変化との関係から,品質低下を予測するシステムを開発しようとするものである。一定時間間隔で記録された外気の温湿度データをもとに,包装内の酸素,二酸化炭素,窒素,水蒸気の体積変化および積算呼吸量と積算水分損失量を計算する拡散・準定常計算のシミュレーション・プログラムと実験による検証結果を平成20年6月の学会で発表した。また,本プログラムにおける有孔部の有効ガス透過度を補正し,拡散・対流・準定常計算のプログラムに発展させた。現在は論文の執筆中である。また,カンキツ(ウンシュウミカン,清見タンゴール)における実験期間中の糖,酸含有量,果実硬度の変化と,これらの指標と積算呼吸量および積算水分損失量との関係について平成21年6月の学会で発表した。一方,シミュレーションにより計算される積算呼吸量および積算水分損失量と品質変化との関係を他のカンキツにも拡大するため,イヨカンを対象に実験を実施した。すなわち,9種類の温・湿度条件下における1ヶ月間の糖および酸含有量の変化と果実硬度の変化を測定し,積算呼吸量と糖および酸含有量の関係,また積算水分損失量と果実硬度との関係を調べた。この結果は現在分析中であるが,これまでのウンシュウミカンと清見タンゴールにおける実験結果と併せて,積算呼吸量と積算水分損失量との関係を詳細に検討し,平成22年9月の学会で発表する予定である。本研究は,青果物の呼吸モデルと蒸散モデル,包装資材のガス透過性,および流通時の温湿度データに基づき,流通中における青果物の積算呼吸量と積算水分損失量を計算し,積算呼吸量ならびに積算水分損失量と品質変化との関係から,品質低下を予測するシステムを開発しようとする。9種類の温・湿度条件下における1ヶ月間の糖および酸含有量の変化と果実硬度の変化を測定し,積算呼吸量と糖および酸含有量との関係,また積算水分損失量と果実硬度との関係を3種類のカンキツ(ウンシュウミカン,清見タンゴール,イヨカン)において整理し,平成22年9月の学会で発表した。この3種類のカンキツにおいては,積算CO2排出量から糖合計値(グルコース,スクロース,フラクトース)とクエン酸含有量の変化を推定することができた。また,水分損失による質量減少率から相対果実硬度の変化を推定することができた。この結果は論文として公表する準備を進めている。一方,従来の呼吸モデルを,青果物組織内のガス濃度を変数とする呼吸モデルに発展させるための実験を清見タンゴールで実施し,一部の結果を平成22年9月の学会で発表した。

また,清見タンゴールを利用した貯蔵実験の結果に,一定時間間隔で記録された外気の温湿度データをもとに,包装内の酸素,二酸化炭素,窒素,水蒸気の体積変化および積算呼吸量と積算水分損失量を計算する拡散・対流・準定常計算のシミュレーション・プログラムを適用し,糖度およびクエン酸含有量の変化を推定した。この実験の一部は,現在論文として投稿(査読)中である。
ヒト食道癌におけるＴ－ｒｅｇ、Ｔｈ１７細胞の遊走・分化と病態進行の検討

食道癌の微小環境におけるT-regとTh17細胞の関与を明らかにするため、T-regの動態について検討した。その結果、T-regが酸化ストレスに抵抗性があり、癌微小環境における酸化ストレスの抑制が、腫瘍免疫の成立に極めて重要であることを明らかにした。また、癌の免疫治療においてnegative factorであるT-regとpositive factorであるconventional T cellの比率を後者に多く持ってゆくためには、癌微小環境の中での過酸化水素を除去する必要があることが明らかになった。この結果は、新たな治療戦略となり得る。本研究の目標は食道癌腫瘍部におけるCD4陽性T細胞のサブセットであるTh1/Th2/T-reg/Th17の比率を、病期が進行するとT-regが増加し、Th17細胞は減少するという仮説とともに、それらの細胞が腫瘍周囲に存在するためには、ある種のケモカインが関与しているという仮説を基盤として、食道癌の微小環境におけるこれらの細胞の関与を明らかにし、その制御を試みるものである。そこで25年度は癌の微小環境という点に注目しT-regの動態について検討した。研究代表者は、これまですでにいくつかの研究により、癌微小環境にT-regが存在することを明らかにしてきた。またT-regが酸化ストレスに対して通常のT細胞に比較して感受性が低い、すなわち酸化ストレスに抵抗性であることが、癌の免疫回避のひとつの機序ではないかという仮説を提唱してきた。今回、この仮説を証明することにした。そこで切除した食道癌の新鮮組織からT-regを分離し、フローサイトメトリー解析により、T-regの過酸化水素H(2)O(2)産生能と、アポトーシス誘導の程度を検討した。その結果、癌の進行ととともに腫瘍に浸潤するT-regの数は増加し、過酸化水素H(2)O(2)産生能も活性化した。またアポトーシスの程度は通常のT細胞に比較してより弱いものであった。興味深いことに過酸化水素H(2)O(2)産生量と通常のT細胞のアポトーシスの程度が相関したが、T-regのアポトーシスの程度とは相関しなかった。すなわちT-regが酸化ストレスに対して通常のT細胞に比較して感受性が低い、つまり酸化ストレスに抵抗性であることが明らかになった。この結果は癌微小環境における酸化ストレスの抑制が腫瘍免疫の成立に極めて重要であること示している。1.食道手術切除検体からTILとIELを採取しT-reg/Th17細胞の割合を測定する実験では、全症例で正常粘膜に比べ腫瘍部でT-reg/Th17細胞がともに増加していることが確認できた。StageごとのT-reg/Th17細胞比を検討すると、StageIと比較しStageIIの2例とStageIIIの2例ではT-regが増加してTh17細胞が減少している傾向が確認できた。しかし、残りのStageII/IIIの3例では、T-reg/Th17細胞比がStageIとあまり変わらず、細胞数も比較的少なかった。これが術前化学療法によるものかどうかは不明であり、今後術前化学療法の治療効果と合わせて検討が必要と思われる。2.PCRを用いて組織内のFoxp3 m-RNAおよびRORγt m-RNAを測定する実験では、1の実験と照合させたがStageIも含め半数以上の症例で一致しなかった。これは細胞膜表面のタンパク発現と遺伝子発現の不一致によるものと考えられる。3.免疫染色法を用いて食道癌切除標本内のT-regとTh17細胞数を測定する実験は1と同様の結果が得られた。4.末梢血からT-regを分離し、CCL17/CCL22の存在下で遊走することを確認する実験では患者5症例、健常者5症例について検討を行い、参考文献と同様にCCL17/CCL22がT-regの遊走因子であることが確認できた。5.末梢血からTh17細胞を分離し、ケモカインの存在下で遊走することを確認する実験では4と同様の実験方法で、ケモカインMCP-1とI-309に関し実験を行ったがTh17細胞の遊走は確認できなかった。引き続き他のケモカインンに関し実験を行う必要がある。CD4陽性T細胞のサブセットである制御性T細胞(regulatory-T cell :Treg)は、癌の微小環境において、免疫抑制的に働くことが明らかになってきた。生体ではエネルギー代謝の際、細胞内に過酸化水素が発生する。エネルギー代謝の亢進している癌細胞からは、多量の過酸化水素が産生されている。過酸化水素は活性酸素の一種であり細胞障害性を有している。したがって、過酸化水素が制御性T細胞を含むT細胞に障害を与えている可能性がある。一方、制御性T細胞が癌微小環境において増加していることが知られているが、このことは、制御性T細胞の過酸化水素に対する感受性が低いことを示唆する。

そこで、平成26年度は、この癌微小環境の中で過酸化水素と制御性T細胞の関連を検討した。方法は、ヒト食道癌組織を用いフローサイトメトリーと免疫染色で、過酸化水素の産生量と制御性T細胞のアポトーシスの程度を観察した。結果として、腫瘍浸潤制御性T細胞の数と過酸化水素の産生量は、病態の進行とともに増加していた。制御性T細胞のアポトーシスの程度は、その他のT細胞(conventional T cell)に比較して軽度であり、さらにconventional T cellのアポトーシスの程度は過酸化水素の産生量と正の相関関係を示したが、制御性T細胞のアポトーシスは過酸化水素の産生量とは関係しなかった。これらの結果から制御性T細胞はconventional T cellに比較して、癌腫が産生する過酸化水素に対して感受性が極めて低いことが明らかになった。この結果から、癌の免疫治療においてnegative factorである制御性T細胞とpositive factorであるconventional T cellの比率を後者に多く持ってゆくためには、癌微小環境の中での過酸化水素を除去する必要があり、新たな治療戦略となり得る。食道外科学研究成果でも記述したが、食道癌組織からのT-regならびにTh17細胞の分離とその癌周囲微小環境での比率、その比率を測定するのに、申請時はPCRを用いて、Foxp3 m-RNAとRORγt m-RNAの良によって検討する予定にしていたが、フローサイトメトリーと免疫染色による測定が簡便で有用であることが明らかになったので、初期の研究は当初の計画以上に進捗した。そこで、ケモカインであるCCL17/CCL27を使用した、T-regの遊走を確認した。この結果はすでに胃癌で癌微小環境下にあるCCL17/CCL27とT-regの遊走ではなく集積の程度が相関していることから確実と考えていたが、ボイデンチェンバーを使用したchemotaxis chamber assayでのT-regの遊走の確認では、T-regの遊走はほとんど確認されなかった。これは今回報告者が検討したCCケモカイン以外のケモカイン、たとえば好中球を遊走させる活性を有し、血管新生作用を持つCXCケモカイン、細胞遊走活性を有すると同時に接着分子としても働いているCX3Cケモカインなどのケモカインの作用が不可欠であることも考えられた。そこでこれらのケモカインの必要性を検証しなければならず、多くの時間を要したため平成25年度の研究の進捗に影響を及ぼした。結果CCケモカインのみでT-reg ,Th17細胞の遊走はCCケモカインの濃度調整により確認することができた。一方、平成26年度の計画は平成25年度で得られた成果をより多数例で検討し、食道癌の臨床病理学的所見と対比するものであり、症例の集積が順調に進めば研究は順調に進捗してゆくと考えている。食道手術切除検体からTILとIELを採取しT-reg/Th17細胞の割合を測定し、全症例で正常粘膜に比べ腫瘍部でT-reg/Th17細胞がともに増加していることが確認できた。
学習障害児の教育指導困難性と神経学的・神経心理学的基盤に関する研究

[目的]学習障害(以下LD)など比較的軽度の神経発達障害の児は,就学後不適応が顕在化する場合が多い,、学齢期用スクリーニング手法は十分に確立されていない。また,LDの概念はいまだに概念が明確ではなく,基盤となる神経障害の解明も十分ではないため,学習や生活指導の困難な児童に対してダストボックス的な診断名として用いられがちである。そこで神経学的微徴候と神経心理学的評価を組み合わせた学齢期の微細神経発達障害スクリーニング検査試案(Minor Neurological Sign検査(MNS))を構成し,教育場面での指導困難性と児の神経学的・神経心理学的障害とを同時に調査しその関連を検討した。[対象]小学校2校の普通学級在籍1・2学年全児童の内,精神遅滞児1名を除く283名。[方法]MNSは総計22項目の検査試案を実施し,スクリーニング基準はその内15項目について10パーセンタイル値未満が2項目以上の条件を採用した。別個の調査は(1)教師の訴え:担任教師により学習や生活指導上困難な児が任意に選択された。(2)LD児スクリーニング調査:担任教師によりLD児の講堂チェックリストが記入された。[結果]教師が行動の指導困難を訴えた児は13名で,この内MNS低遂行児出現率46.2%であった。一方教師が行動と学習の両方の指導困難を訴えた字は児は17名でMNS低遂行出現率は88.2%であった。またLD危険児は7名でMNS低遂行85.7%であった。カイ2乗検定の結果,MNSと教師の訴え,及びMNSとLD児スクリーニング調査は危険率0.1%以下で有意な関連性が認められた。[結論]教師は指導困難の理由として児の怠業や養育内容の問題を挙げていたが,行動や学習の問題の多くは微細神経発達障害の因子が大きい可能性が明らかになった。
ホスホリパーゼA_2の触媒機構と阻害剤による阻害機構の解明

PLA_2基質アナログであるカルボン酸アミド型,オキサゾリジノン型,およびスルホン酸アミド型基質アナログとI型およびII型に属する種々のPLA_2との結合におよぼすCa^<2+>とpHの影響を調べた結果,オキサゾリジノン型基質アナログでは真の基質と同様の結果が得られた.しかし,カルボン酸アミド型とスルホン酸アミド型基質アナログでは真の基質と異なる結果が得られた.これは,カルボン酸アミド型やスルホン酸アミド型基質アナログでは,アナログ分子中のアミド基がPLA_2の触媒基であるHis48と水素結合を形成するが,真の基質やオキサゾリジノン型基質アナログにはアミド基が存在しないため触媒基His48との水素結合が形成されないことによる結果と考えられた。以上の結果から,カルボン酸アミド型やスルホン酸アミド型基質アナログの場合とは異なり,オキサゾリジノン型基質アナログとPLA_2の結合様式は真の基質の場合とよく似ていることが示唆された.また,マノアライドアナログは,Lys残基を修飾することでPLA_2を不活性化する.PLA_2分子内には,触媒部位と界面認識部位の2つの酵素活性に重要な部位が存在する.そこで,マノアライドアナログによるPLA_2の不活性化に関与する部位について調べた結果,ウシ膵臓PLA_2は界面認識部位に存在する56位のLys残基の修飾が関与し,ウミヘビ毒,ハブ毒,クサリヘビ毒PLA_2では触媒部位の69位のLys残基に加え,上記の2つ以外の部位が不活性化に影響することがわかった.一方,マムシ毒PLA_2の不活性化には上記の2つの部位は関与しないことが明らかとなった.このように,マノアライドアナログによるPLA_2の不活性化には触媒部位と界面認識部位以外のLys残基の修飾も関与することが考えられた.これは,触媒部位の裏側などに存在するLys残基がマノアライドアナログによって修飾され,PLA_2の立体構造を変化させた効果によることが推測される.PLA_2基質アナログであるカルボン酸アミド型,オキサゾリジノン型,およびスルホン酸アミド型基質アナログとI型およびII型に属する種々のPLA_2との結合におよぼすCa^<2+>とpHの影響を調べた結果,オキサゾリジノン型基質アナログでは真の基質と同様の結果が得られた.しかし,カルボン酸アミド型とスルホン酸アミド型基質アナログでは真の基質と異なる結果が得られた.これは,カルボン酸アミド型やスルホン酸アミド型基質アナログでは,アナログ分子中のアミド基がPLA_2の触媒基であるHis48と水素結合を形成するが,真の基質やオキサゾリジノン型基質アナログにはアミド基が存在しないため触媒基His48との水素結合が形成されないことによる結果と考えられた。以上の結果から,カルボン酸アミド型やスルホン酸アミド型基質アナログの場合とは異なり,オキサゾリジノン型基質アナログとPLA_2の結合様式は真の基質の場合とよく似ていることが示唆された.また,マノアライドアナログは,Lys残基を修飾することでPLA_2を不活性化する.PLA_2分子内には,触媒部位と界面認識部位の2つの酵素活性に重要な部位が存在する.そこで,マノアライドアナログによるPLA_2の不活性化に関与する部位について調べた結果,ウシ膵臓PLA_2は界面認識部位に存在する56位のLys残基の修飾が関与し,ウミヘビ毒,ハブ毒,クサリヘビ毒PLA_2では触媒部位の69位のLys残基に加え,上記の2つ以外の部位が不活性化に影響することがわかった.一方,マムシ毒PLA_2の不活性化には上記の2つの部位は関与しないことが明らかとなった.このように,マノアライドアナログによるPLA_2の不活性化には触媒部位と界面認識部位以外のLys残基の修飾も関与することが考えられた.これは,触媒部位の裏側などに存在するLys残基がマノアライドアナログによって修飾され,PLA_2の立体構造を変化させた効果によることが推測される.PLA_2の可逆的な阻害剤であるカルボン酸アミド型基質アナログとI型およびII型に属する種々のPLA_2との結合におよぼすCa^<2+>とpHの影響を調べた結果,真の基質を用いた場合とは違った結果が得られた。これはカルボン酸アミド型基質アナログとPLA_2との結合において,基質アナログ分子中のアミド結合の水素原子がPLA_2の触媒基であるHis48のN-1位の窒素原子と水素結合するためであると考えられた。そこで次に,アミド結合の水素原子が存在しない基質アナログとして,オキサゾリジノン型基質アナログを合成し,同様の実験を行ったところ,真に基質を用いた場合とほぼ同様の結果が得られた。以上の結果から,カルボン酸アミド型基質アナログの場合とは異なり、オキサゾリジノン型基質アナログとPLA_2の結合様式は真の基質の場合とよく似ていることが示唆された。一方、PLA_2の不可逆的な阻害剤であるマノアライドアナログによる種々のPLA_2の不活性化を調べた結果,I型に属するウシ膵臓PLA_2については酵素の界面認識部位に存在する56番目のLysが修飾されることを明らかにした。また,単分子分散状レシチンを基質に用いた場合,マノアライドアナログによって酵素活性が低下するPLA_2と低下しないPLA_2があった。

前者(主にII型)は単分子分散状基質が相互作用するとされる69番目のアミノ酸残基がLysであるのに対し,後者(主にI型)はTyrであることから,この部分のLysも修飾されることが予想された。さらに,II型PLA_2については基質アナログによって触媒部位と界面認識部位を保護した後でさえ,マノアライドアナログによって修飾され,酵素活性が低下したことから,II型PLA_2では触媒部位や界面認識部位以外に存在するLysが修飾されても酵素活性が低下することが示唆された。リン脂質の2位の脂肪酸エステル結合をアミド結合に置換したカルボン酸アミド型基質アナログとPLA_2の結合は,pHを酸性にすると弱められるが,ホスホン酸エステル結合に置換した遷移状態型基質アナログは,pHを酸性にすると強められる.この違いは,それぞれの基質アナログとPLA_2の結合に,触媒基His 48のプロトン化状態が影響するためである.そこで,これら2つの基質アナログの特性を同時に備え持つ基質アナログとしてリン脂質の2位をスルホン酸アミド結合に置換した基質アナログを合成し,PLA_2に対する結合を調べた.その結果,この基質アナログは,中性pHにおいて,カルボン酸アミド型基質アナログより5倍程度結合定数が低かった.しかし,His 48がプロトン化するような酸性pHでは,中性pHと同程度の結合定数であった.このように,スルホン酸アミド型基質アナログは,広いpH領域で有効にPLA_2と結合することが明らかになった.一方,マノアライドアナログは,Lys残基を修飾することでPLA_2を不活性化する.PLA_2分子内には,触媒作用を行う触媒部位と,基質ミセルを認識する界面認識部位が酵素活性に重要な役割を担っていいる.そこで,どちらの部位がマノアライドアナログによるPLA_2の不活性化に関与するのかを調べた結果,膵臓およびコブラ毒PLA_2では界面認識部位のLys残基の修飾が関与し,ウミヘビ毒,ハブ毒,クサリヘビ毒PLA_2では触媒部位に加え,上記の2つ以外の部位が不活性化に影響することがわかった.一方,マムシ毒PLA_2の不活性化には上記の2つの部位は関与しないことが明らかとなった.このように,マノアライドアナログによるPLA_2の不活性化には触媒部位や界面認識部位以外のLys残基の修飾も関与することが考えられた.これは,触媒部位の裏側などに存在するLys残基がマノアライドアナログによって修飾され,PLA_2の立体構造を変化させた効果によることが推測される.
心筋虚血再灌流障害による細胞死のメカニズムにおける揮発性麻酔薬の効用の解明

セボフルランポストコンディショニングはオートファジーを誘導し,梗塞サイズを減少させた.セボフルラン投与群でみられたLC3-II/I発現の増強は3MAの投与により消失した.また再灌流120分でセボフルラン投与群ではオートファゴゾーム形成が有意に認められ,3MAの投与でその形成は抑制された.セボフルランポストコンディショニングの心筋保護効果にはオートファジーの誘導が必要であることが示唆された.モルモットのLangendorff灌流心を用い,30分間虚血,120分間再灌流を行った.これを対照群(CTL:n=8)とし,セボフルラン(1MAC;2%)を虚血再潅流直後に2分間又は再灌流中通して投与した群(POST,POST-L:n=8),オートファジー阻害剤である3MAを虚血10分前より再灌流中通してCTL, POST群に投与した群(CTL+3MA,POST+3MA,n=6)の5群を作製した.それぞれ左心室圧(LVDP),左室終末拡張期圧(LVEDP),冠灌流量,心筋梗塞サイズ(IS; TTC染色)を各群間で比較した.また,全群再灌流10分又は120分後に心筋を採取し,Western blotによりオートファジー関連蛋白であるLC3I, LC3IIの発現について検討した(n=4).また,同様に再灌流後の心筋を採取し,電子顕微鏡にてオートファゴゾーム形成の評価も行った.SPCはオートファジーを誘導し,ISを減少させた.この保護効果はオートファジー抑制剤3MAの投与によって消失した.SPCの心筋保護効果にはオートファジーの誘導が必要であることが示唆された.セボフルランポストコンディショニングはオートファジーを誘導し,梗塞サイズを減少させた.セボフルラン投与群でみられたLC3-II/I発現の増強は3MAの投与により消失した.また再灌流120分でセボフルラン投与群ではオートファゴゾーム形成が有意に認められ,3MAの投与でその形成は抑制された.セボフルランポストコンディショニングの心筋保護効果にはオートファジーの誘導が必要であることが示唆された.モルモットのLangendorff灌流心を用い,30分間虚血,120分間再灌流を行った.これを対照群(CTL:n=8)とし,セボフルラン(1MAC;2%)を虚血再潅流直後に2分間又は再灌流中通して投与した群(POST,POST-L:n=8),オートファジー阻害剤である3MAを虚血10分前より再灌流中通してCTL, POST群に投与した群(CTL+3MA,POST+3MA,n=6)の5群を作製した.それぞれ左心室圧(LVDP),左室終末拡張期圧(LVEDP),冠灌流量,心筋梗塞サイズ(IS; TTC染色)を各群間で比較した.また,全群再灌流10分又は120分後に心筋を採取し,Western blotによりオートファジー関連蛋白であるLC3I, LC3IIの発現について検討した(n=4).虚血再灌流後,POST,POST-LはCTLに比べてLVDPは有意に高値で,LVEDPは有意に低値であった.梗塞サイズはPOST,POST-LではCTLに対し有意に減少した.POST,POST-LにおけるLC3-II/Iの発現は再灌流10分では全群で有意差は認めなかったが,再灌流120分でCTLよりも有意に増加していた.POST,POST-LでみられたLC3-II/I発現の増強は3MAの投与により消失した.セボフルランによるポストコンディショニング効果はオートファジーを誘導し,梗塞サイズを減少させた.この保護効果はオートファジー抑制剤3MAの投与によって消失した.セボフルランによるポストコンディショニング効果の心筋保護効果にはオートファジーの誘導が必要であることが示唆された.おおむね順調に進展しており、現在の達成度は75%である。平成23年度に得られたwestern blotのデータが心筋細胞由来であることを確認するために採取した単離心筋細胞を用いオートファジー関連蛋白であるcathepsin B, Beclin-1, LC3-II/LC3-Iの発現を検討する。また、電子顕微鏡によりオートファゴゾームとアポトーシス細胞の特徴とされる細胞の萎縮、核クロマチン凝集、細胞内小器官の形態学的性状などの超微構造を群間で比較検討する。Hartley系クリーンモルモットを使用して虚血再灌流実験や心筋細胞分離を行う。本研究計画では年150ー180匹必要と考えられる。購入後、約2ヶ月飼育するため餌代も必要となる。その他、灌流液作成のための試薬およびシグナル伝達物質の阻害薬と発現を調べるためのwestern blot用の抗体、transfection, cell isolation用の試薬などの購入が必要となる。