hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
弱い相互作用に基づく金属錯体の構造誘導と機能発現

酵素における活性中心近傍の分子環境の影響はその顕著な例である.しかし,相互作用には様々な様式があるため,ある機能に対して影響を及ぼす弱い相互作用を特定することは,一般に困難である.本研究では,錯体の構造と酸化還元挙動を中心に,これらに影響を与える弱い相互作用の様式とその効果を明らかにすることを目的として,特に錯体分子内での配位子側鎖基が関与する相互作用,錯体分子と他分子との会合体形成などについて追究してきた.本年度は,CH/π相互作用の研究に関連して,錯体における新しい弱い相互作用の存在を見出し,これを確立すべく実験事実を集積した.菌類からの銅酵素ラッカーゼのタイプ1銅部位は,異常に高い酸化還元電位を有し,銅(II)に接近してロイシン残基の側鎖アルキル基が存在する.そこで,銅(II)と接近したメチル基との間に何らかの相互作用の可能性があると考え,直鎖または分岐したアルキル基を側鎖に持つ3N型配位子を各種合成し,銅(II)錯体の合成,構造決定,スペクトルと酸化還元電位の測定を行った.この結果,適当な長さの分岐したアルキル基からのメチル基が結晶中で3-3.5Åにまで銅(II)に接近すること,このような構造を有する錯体は通常の錯体よりも高い酸化還元電位を示すことが判明した.金属イオンとメチル基C-Hの接近には,アゴスティック相互作用が知られているが,この相互作用はロジウム(III)のような電子不足の金属イオンと水素化物イオンとの結合と考えられている.本研究で見出されたCu(II)...H-Cの接近は,この相互作用とは異なるCH/π相互作用類似の水素結合と考えられ,さらにその詳細を検討している.本研究結果の一部は第55回錯体化学討論会(新潟,平成17年9月)において発表した.弱い相互作用は分子認識、タンパク質の3次構造保持、生体反応系の構築などに不可欠である。このことは、弱い相互作用が構造の誘導と機能発現の要因であることを示している。そこで、化学系を用いて弱い相互作用の様式と効果を明らかにすることを意図し、本研究を行った。平面型銅(II)錯体について、分子内芳香環スタッキングに及ぼす中心金属イオンの電子効果とスタックした芳香環相互の電子密度差の影響を、芳香環に様々な置換基を導入した三元銅(II)錯体の安定度定数から明らかにした。また、必須アミノ酸トリプトファンが有する芳香環であるインドール環を含むパラジウム(II)錯体について、インドール環の配位能を明らかにすると共に、インドール環同士のスタッキングが構造誘導因子となり、その有無によりsyn型とanti型錯体が生成することを見出した。菌類からの銅タンパク質ラッカーゼなどの平面的なType I鋼部位において、銅イオンに軸方向から接近するロイシンのアルキル基の存在が知られている。このことに注目して、平面構造を有する銅(II)、パラジウム(II)、白金(II)での側鎖アルキル基の挙動を結晶構造、NMRスペクトルから調べ、いずれの金属イオンについても、分岐したアルキル側鎖基が存在する場合には、そのメチル基が金属イオンに接近することを見出した。さらに、銅錯体ではこの接近により酸化還元電位が高電位側にシフトすることを明らかにし、Type I銅部位に見られるロイシンアルキル基接近の効果を論じた。この接近は金属イオン-アルキル基間での弱い水素結合と考えられる。
磁性薄膜の光制御とその評価手法の探索

高密度光磁気記録材料開発などの観点から、光照射により磁性、金属のスピン状態の可逆なスイッチングが可能な固体物質開発が盛んである。従来報告されている光磁性スイッチング現象の基本は、基底状態に光照射を行うことにより準安定状態を捕捉できるという、双安定性を示すものである。しかしながら、それらの準安定状態の捕捉の多くは極低温でのみ実現されるものであり、室温における磁性の光制御が求められているにも関わらず、新規な系の設計が難しく、設計指針が一般化されていなかった。そこで本研究では、そのための新たな設計指針の一つとして「光応答性を示す分子を利用した光磁性制御」を提示し、いくつかの光スイッチング可能なシステムを創製し、徐々にその性能を高めてきた。終盤では、磁性体ナノ微粒子の表面をフォトクロミック分子であるアゾ化合物で修飾することによって、室温にてその磁性を可逆に光スイッチングすることに成功し、なかでも、FePtナノ微粒子を用いた際には室温強磁性も実現しており、光記録材料などへの応用も期待できるようになってきた。また、逆ミセル法を用いた光制御型磁性ナノ微粒子の作製や、磁性金ナノ粒子を利用したシステムの構築など、新規な光磁性システムの創製にも成功した。光照射により磁気特性、金属のスピン状態のスイッチングが可能な固体物質の開発が盛んに行われており、このような光スイッチング機能発現のために、これまでにプルシアンブルー類似体を基本にした分子設計、分子間相互作用を利用できる配位子を用いる分子設計、などの戦略が用いられてきた。本研究では、そのような材料開発の新戦略の提示を目標としており、初めに二つの概念を提示し、その効果と可能性について検討したところ、それぞれにおいて成果を得た。高分子マトリックスとしてPMMA(ポリメタクリル酸メチル)を用い、CCl_4とフェロセン(Cp_2Fe)を含む高分子フィルムを作製した。この試料に、低温(8K)で紫外光照射を行うと、溶液中での光化学反応と同様に、CCl_4とCp_2Feの電荷移動遷移の励起による酸化反応が起こり、フェリシニウムイオンが生成する。ところがこの固相においては、光照射を続けると(10時間)、高スピン状態をとるCp_2Feの異性体を観測することに成功した。SQUIDによる磁化率測定を行ったところやはり光照射によるスピン量の増大が観測でき、この手法が新たな光誘起スピン転移実現の戦略として有効であることが示された。さらに、ミセル、脂質二分子膜、単分子膜などの組織化した有機分子自己集合体の光機能を利用して、無機磁性材料の磁気特性を制御するというような新規な光機能システムの構築に関する研究はまだ始まったばかりである。我々はその先駆けとして、アゾベンゼンを含むベシクル中にプルシアンブルー磁性体を複合し、光照射により可逆に磁気特性を制御することに成功している。この背景を利用し、アゾベンゼンのみでベシクルを形成する複合体を作製することにより、光による磁性のスイッチング幅をこの例の10倍にも増大させることや、スピロピランベシクルに酸化鉄微粒子を複合し、光照射により室温にて磁化を増大させることに成功した。さらに、アゾ基の高い配向性を利用した新規なシステムとして、層状の粘土を含むアゾベンゼンLB膜を作製し、やはりプルシアンブルー磁性体を複合した系の作製とその物性評価を試みた。その結果、低温において紫外・可視光照射を行うと、アゾ基のシス-トランス光異性化に伴って、2Kにおける磁化の減少-増大が観測され、この光スイッチング幅は、10%以上の高効率を示した。固体薄膜磁性材料で、光照射により磁気特性を制御できる機能をもつ材料開発を目指し、その評価とともに研究を展開してきた。そのような材料の開発設計指針として、本年度は「分子集合体を利用した光磁性制御」はじめいくつかの方法を提案し、それぞれについて磁性の光制御に成功した。はじめに、分子集合体を利用した設計としては、粘土鉱物を利用した高秩序構造をもつ光応答性磁性薄膜の作製、スピロピランベシクル中に磁性材料を複合したものの薄膜材料等を、設計、作製、評価を行った。

具体的には、「粘土・アゾベンゼン・プルシアンブルー複合膜」では、2Kにおいてアゾ化合物のシス-トランス光異性化に伴った高効率の磁性の変化(10%以上)を観測した。さらに、磁性の光スイッチングの室温での実現を目的として、磁性材料として酸化鉄微粒子を用いた系について検討した。スピロピランを用いる系では、室温で光照射により磁化を増大させることに成功した一方、アゾ化合物を用い、酸化鉄微粒子の表面電荷を利用した複合化粒子では、室温にてその磁気特性を可逆に制御することにも成功した。さらに、光により磁気特性制御が可能な新規な錯体として、鉄のシアノ錯体と希土類との複合化に着目した。このような3d-4f錯体は、単結晶を作製することも比較的容易であるため、構造に関する解釈が可能であった。作製した単結晶に低温で紫外光照射を行ったところ、45%の磁化率の増大が観測され、この準安定状態は、アニーリングすることにより基底状態に回復することが分かり、新規光応答性錯体設計に知見を与えた。固体薄膜磁性材料で、光照射により磁気特性を制御できる機能をもつ材料開発をめざし、その評価とともに研究を展開してきたが、昨年度まで「分子集合体を利用した光磁性制御」という新規な手法を用いてさまざまな光制御型磁性薄膜材料を創製してきた。なかでも、酸化鉄微粒子の表面に直接アゾ化合物を配位させた光応答性磁性ナノ微粒子を作製することにより、室温にてその磁気特性を可逆に制御することに成功した。本年度には、この光制御のメカニズム、アゾベンゼンの異性化による磁性への影響などの評価について詳細に検討し、その基礎的データを多く得た。実際に行った低温における磁性測定の結果や、さまざまなアゾ化合物を複合した場合のスイッチング効率などをふまえて、その原因やメカニズムについての知見を得た。本研究によって、磁性体金属の配位子場を光により変化させることにより、磁気的な相互作用にも影響を与え、磁化をスイツチできることなどが明らかになった。また、ナノスケールで精密制御されたプルシアンブルーナノ微粒子を逆ミセル法により作製し、どうような光応答性の付与も行った。この系においても光により磁性を可逆にスイッチすることに成功している。さらに、光異性化前後の双極子モーメントの差が大きなスピロピランを用いた類似のシステムの構築も行った。その結果、それに対応して、より大きな光磁化スイッチング現象を室温にて観測することにも成功した。光記録材料開発などの観点から、光照射により磁性、金属のスピン状態の可逆なスイッチングが可能な固体物質の開発が盛んに行われている。これまでに報告されている光磁性スイッチング現象の基本は、基底状態に光照射を行うことにより準安定状態を捕捉できるという、双安定性を示すものである。しかしながら、それらの準安定状態の捕捉は極低温でのみ実現されるものであり、室温における磁性の光制御が求められているにもかかわらず、新規な系の設計が難しく、設計指針が一般化されていない。そこで本研究では、これまで、新たな設計指針の一つとして「フォトクロミック分子を利用した光磁性制御」を提示し、いくつかの光スイッチング可能なシステムを創製してきた。本研究では、特に粘土-CoFeプロシアンブルー複合磁性超薄膜を作製し、光誘起磁化異方性の制御に成功したことや、酸化鉄ナノ微粒子の表面修飾によって光スイッチング磁性微粒子を作製し、室温における可逆な光磁性制御に成功した例などが特記すべき成果である。
ブタ糖尿病合併脂肪肝モデルの確立と積極的機械還流による虚血再灌流障害の克服

H30年度マイクロミニブタ2頭を購入し、高脂肪食5か月、途中一度、全身麻酔下で肝生検査を行い、軽度脂肪化を認めた。1頭にALP456mg/dl、総コレステロール281mg/dlの異常高値をも認めた。5か月目で、全身麻酔下で肝臓を摘出し、別途、評価ツールとして確立したex vivo臓器灌流装置により、自己血液を用いて、虚血再灌流障害の程度を検討した。1頭ずつではあるが、1頭を単純冷却保存、1頭を低温機械灌流保存にてその保存方法の違いを観察した。低温機械灌流保存装置も当施設で開発したもので、他の研究、例えば心停止ドナーからの肝臓の保存に使用し研究報告などしている実績のある装置である。まず低温機械灌流保存した脂肪肝は灌流液中、肝機能においてAST1480IU/L,LDH880IU/Lと正常肝よりも高値で障害肝のあることが判明した。また単純冷却保存と低温機械灌流保存との比較においては再灌流1時間まではAST,LDH,ALPともに優位に機関灌流保存は低値であった。すなわち、脂肪肝の保存方法においては機械灌流保存の有用性が示唆された。ここまでは予想される良い結果であり、本来は実験N数を増やすべきであったが、マイクロミニブタの購入費に加え特別注文の高脂肪食も高価であり、新たに研究費を獲得する事で終了した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。雑種ブタ10kgを購入し、高脂肪食、および高脂肪食に炭水化物(コーンスターチ)を混入させた食事で脂肪肝作製が可能かについて約30Kgまで観察した。約1か月にで血清コレステロール値は350400mg/dlとなりLDHも600900mg/dlとなり生化学的変化は見られた。しかしながらこれを肝生検してもグリコーゲン沈着が顕著で大きな脂肪滴は見られなかった。さらに膵臓全摘を行ったところ、グリコーゲン沈着は変わらないものの、血糖の条上昇油とともにLDH,コレステロール値は低下した。特徴:一般のこぶた餌(ノーサンウイニーBプロ)の粗脂肪3.5%、3,387 kcal/kgに比べ、高脂肪、高カロリー高脂肪食2D09101701にコーンスターチ添加D09101701餌に、コーンスターチ(炭水化物86%)を添加し、一般資料の炭水化物割合(57.5%)を超える程度にした特徴:高脂肪かつ炭水化物も豊富雑種ブタ10kgを購入し、高脂肪食、および高脂肪食に炭水化物(コーンスターチ)を混入させた食事で脂肪肝作製が可能かについて体重約30Kgまで観察した。さらに膵臓全摘を行ったところ、グリコーゲン沈着は変わらないものの、血糖の上昇とともにLDH,コレステロール値は低下した。過去の文献を参考にブタの種にを変えることを考えている。文献を参考にミニブタを購入予定である。飼料については昨年度と同等のものを考えている。5月までに2頭購入し、肝生検を行い、昨年度と同様の研究を進め、秋には臓器還流保存を行ってみる予定である。本研究計画は2年計画で進められており、かつミニブタは雑種ブタよりもはるかに高価である。
分子グラフティングによるアルブミン結合性ヒト型アダプタータンパク質の分子設計

次世代型バイオ医薬品として開発が進んでいるフラグメント抗体等の低分子化タンパク質の薬物動態改善に寄与する汎用技術の確立を目指して、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合するヒト型アダプタータンパク質を分子グラフティング法で合理的にデザインし、合成した人工タンパク質の機能と構造に関するin vitro分子特性を評価した。その結果、13-15残基の置換にも関わらず二次構造が変異導入前と同様であること、血中安定性向上に必要なHSA結合親和性および結合特異性を獲得していることなどを明らかにした。これは、当該分子が低分子化バイオ医薬品の薬物動態改善ための有望なツールとなりうることを示すものである。本研究は、低分子化タンパク質の薬物動態改善に寄与する汎用技術の提供を目指して、ヒト血清アルブミン(HSA)に特異的に結合するヒト型アダプタータンパク質を開発し、その機能と構造に関するin vitro分子特性を解析することを目的とする。平成26年度は、以下の3項目を実施した。(1)「複合体結晶構造データの解析とヒトタンパク質スキャホールドの選定」では、ヒトタンパク質のみからなる構造データセットをつくり、GAモジュールのHSA結合界面の主鎖構造座標をクエリーとして類似の部分構造を有するヒトタンパク質を検索し、構造類似度を指標に複数のヒトタンパク質をスキャホールドとして選定した。(2)「移植残基の選別とアダプタータンパク質の設計」では、複合体結晶構造データとPISAシステムを利用して、GAモジュールのHSA接触残基を特定し、さらに接触面積や水素結合数などを指標に各接触残基の機能重要度を順位付けした。GAモジュールと上記で選定したスキャホールドを重ねあわせ、HSA接触残基の位置に対応するヒトタンパク質の残基の情報を収集した。変異に伴うヒトタンパク質の立体構造の不安定化を回避するため、上記の情報を総合した置換適切度を順位付けした。以上の機能重要度、置換適切度、衝突危険度を総合的に判定し、ヒト型アダプタータンパク質のアミノ酸配列を決定した。(3)「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」では、設計した複数のアダプタータンパク質、および比較対象となる天然型ヒトタンパク質(ネガコン)、GAモジュール(ポジコン)を遺伝子組換え技術で合成した。遺伝子を市販の高発現ベクターに挿入し、大腸菌を形質転換した。培養溶菌後の可溶性画分から目的物を回収し、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーで高純度に精製した。平成27年度は、以下の3項目を実施した。(3)「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」では、前年度の構築した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換した。精製品は、SDS-PAGEと質量分析法で同定した。(4)「アダプタータンパク質のHSA結合活性の測定」では、設計したアダプタータンパク質が目的とするHSA結合活性を獲得していることを表面プラズモン共鳴(SPR)法で確認した。HSAをアミンカップリングでセンサーチップに固定化して、濃度の異なる試料溶液をインジェクトし、各々の解離常数を求めた。(5)「アダプタータンパク質の構造安定性の測定」では、アダプタータンパク質が正しくフォールドし、元の天然型ヒトタンパク質と同等な立体構造を形成していることを円偏光二色性(CD)法で確認した。また、その構造安定性も同機で定量的に評価した。平成26年度の研究実施計画として予定していた「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」のうち、前年度未遂であった部分を実施した。また、平成27年度の研究実施計画として予定していた「アダプタータンパク質のHSA結合活性の測定」、「アダプタータンパク質の構造安定性の測定」の2項目を計画通り実施した。親和性を獲得した変異体の合成など、良好な成果が得られている。平成26、27年度は、(1)「複合体結晶構造データの解析とヒトタンパク質スキャホールドの選定」、(2)「移植残基の選別とアダプタータンパク質の設計」、(3)「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」、(4)「アダプタータンパク質のHSA結合活性の測定」、(5)「アダプタータンパク質の構造安定性の測定」を実施した。平成28年度は、以下の2項目を実施した。(6)「アダプタータンパク質のHSA結合特異性の測定」では、アダプタータンパク質のHSA結合活性が選択的であることを表面プラズモン共鳴(SPR)法で確認した。アダプタータンパク質がGAモジュールとHSAの結合を濃度依存的に阻害することから、アダプタータンパク質がGAモジュールと同一の結合サイトを認識していることが明らかになった。(7)「アダプタータンパク質の相互作用熱力学解析」では、SPR法測定を異なる温度で行って、結合のエンタルピー変化、エントロピー変化、結合比熱変化を定量的に評価した。その結果、アダプタータンパク質とHSAの結合は、エンタルピードリブンで、かつエントロピー的にも好ましい相互作用となっていることを明らかにした。以上を含む期間全体を通じたin vitro分子特性解析の結果は、目標としたヒト型アダプタータンパク質の開発に成功したことを示すものである。

また、本研究を通じて、構造バイオインフォマティクスの活用が分子グラフティング法の高度化に有効であることを実証することができた。次世代型バイオ医薬品として開発が進んでいるフラグメント抗体等の低分子化タンパク質の薬物動態改善に寄与する汎用技術の確立を目指して、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合するヒト型アダプタータンパク質を分子グラフティング法で合理的にデザインし、合成した人工タンパク質の機能と構造に関するin vitro分子特性を評価した。その結果、13-15残基の置換にも関わらず二次構造が変異導入前と同様であること、血中安定性向上に必要なHSA結合親和性および結合特異性を獲得していることなどを明らかにした。これは、当該分子が低分子化バイオ医薬品の薬物動態改善ための有望なツールとなりうることを示すものである。平成24年度の研究実施計画として予定していた、「複合体結晶構造データの解析とヒトタンパク質スキャホールドの選定」、「移植残基の選別とアダプタータンパク質の設計」の2項目をほぼ遅滞なく達成した。「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」に関しては、計画時に予定していた博士研究員が他所へ転出したため、計画内容の一部を組み替えて実施した。平成28年度は、「アダプタータンパク質のHSA結合特異性の測定」と「アダプタータンパク質の相互作用熱力学解析」を行い、全期として当初計画の完遂を目指す。ケミカルバイオロジー平成24年度の研究実施計画のうちの未達部分に関しては繰り延べるものの、全期としては当初計画の完遂を目指す。具体的には、平成25年度は、「アダプタータンパク質および比較対象タンパク質の合成と精製」の未達部分、および当初計画分の「アダプタータンパク質のHSA結合活性の測定」と「アダプタータンパク質の構造安定性の測定」を行う。雇用を予定していた博士研究員が他所に転出したため人件費に未使用分が生じたため。研究計画を組み替えて現員で可能な課題を先行し、その他の課題に関しては新たな研究員を採用して実施する予定。研究計画を組み替えて現員で可能な課題を先行し、繰り延べた課題に関しては新たな研究員を採用したうえ実施する予定。
uudd相のスピン・ダイナミックス

1.1mk以下の超低温度、約35気圧の融解圧の下で、bcc固体^3Heは核スピン秩序相に入る。この核スピン反強磁性秩序相はuudd相(up-up-down-down相)といわれている。本研究では、NMR法を用いて、このような特異な系でのスピン緩和機構、非線型なスピンの運動、カオス的なスピンの運動、等そのスピン・ダイナミックスを実験的、理論的に研究することを目的としている。2.単結晶固体^3Heを作ることは簡単である。更に、uudd相の単磁区の試料の生成を試みたが(電場、磁場、エピ生長、等)、不成功であった。3.一様性のよい静磁場と制御された磁場勾配を作るため、電流シムを持った超伝導磁気シ-ルド用円筒付きの超伝導マグネットを試作した。4.この超伝導マグネットを用いて、「NMRイメ-ジング」の実験をおこない、磁区に大きさを調べた。磁区は予想外に大きく、大きさ数mm^3の単結晶の試料が僅か数個の磁区に分かれていた。5.この実験の際、核スピン系が秩序相に相移転した時磁歪により結晶が歪み、双晶を作っていると考えられる証拠を見い出した。6.CWNMR法を用いて、線幅の外部磁場依存性、温度依存性を測定して、スピン系の緩和を調べた。また、理論的に「3マグノン過程」と「4マグノン過程」による線幅の計算をおこなった。この計算結果は実験結果を非常にうまく説明する。uudd相の反強磁性共鳴(NMR)の緩和の機構は「多マグノン過程」によることが明確になった。7.CWNMRの実験に手間取り、以前に実験していた非線型スピン・ダイナミックスに関する実験は、新しい着想はあるのだが、未だ再開するに至っていない。1.1mK以下の超低温度,約35気圧の融解圧の下で,bcc固体^3Heは核スピン秩序状態に入る.この核スピン反強磁性秩序相はuudd相(upーupーdownーdown)といわれている.本研究では,NMR法を用いて,この特異な系のスピン・ダイナミックスを実験的に調べ,このような系でのスピン緩和機構,非線型なスピンの運動,カオス的なスピンの運動そしてスピン波の生成機構等を明らかにすることを目的とする.2.1mK以下の超低温度を得るための核断熱消磁装置を改良し整備した.最低温度は0.4mK,試料への入熱は4nW程度で,一度断熱消磁をおこなえば,約1週間連続して実験ができる.又,NMR用の一様な靜磁場を生成するために,電流シム付きの超伝導マグネットを試作した.その均一度は,今の所,電流シムを調整しても2×10^<-4>程度である.3.本研究では,単磁区の試料を作り得るかどうかが最大のポイントである.試料空間に,先のとがった金属を入れこれに高電圧を加え,電場によって単結晶を作ることを試みたが成功していない.從って,以前と同じく,パルス的に熱を加えて結晶を作っている.今回は以前と異り,結晶中に銅線はない.実験の結果,単結晶は簡単に作ることができるが,常に3種類の磁区があり,今の所,単磁区の試料の作成に成功していない.4.cwNMR法を用いて,正確に共鳴線の形,共鳴線の線幅を測定した.サンプルセル内の圧力変動に対応して試料の温度が1μK程度変動し,それに伴って共鳴線の位置が変動していることが伴った.更に精密な測定をおこなうためには,圧力の安定化を試みる必要がある.

5.共鳴線の線幅の外部磁場依存性を測定した.その実験結果は,我々の理論グループが以前に提案したLeggettーTakagi型の緩和項によって説明されるように思われる.1.1mk以下の超低温度、約35気圧の融解圧の下で、bcc固体_3Heは核スピン秩序相に入る。この核スピン反強磁性秩序相はuudd相(up-up-down-down相)といわれている。本研究では、NMR法を用いて、この特異な系のスピン・ダイナミックスを実験的・理論的に調べ、このような系でのスピン緩和機構、非線型なスピンの運動、カオス的なスピンの運動、一様な才差運動の不安定性等を明らかにすることを目的とする。2.昨年度に引き続き、NMR用の高均一度を持つ静磁場を生成するための「電流シム付き超伝導マグネット」の改良をおこなった。均一度は約1桁向上し、電流シムを調整して、4×10^<-5>程度である。3.昨度度に引き続き、「単磁区」をもったuudd相固体^3He単結晶の作成を試みているが、未だ成功していない。しかし、最近、NMRイメージングの手法を用いて試料の磁区の大きさを推定することに成功した。すなわち、一様な静磁場に一様な磁場勾配をX,Y,およびZ軸方向に重畳して、NMR共鳴線の中心のシフトと幅の変化を測定した。その結果を解析して、大きさ数mm^3の試料で磁区はたかだか数個程度にしかわかれていないこと、そして1つの磁区はその1辺の大きさが1mm程度であることがわかった。4.共鳴線の線幅の外部磁場依存性を測定した。その結果を、Leggett-Takagi型の緩和過程から予想される線幅の理論式と比較した。実験結果を理論式にフィットさせることができ、その緩和のパラメータは強い温度依存性を持っていることが明らかとなった。5.理論面では、uudd相のスピン・ダイナミックスを記述するOCF方程式の数値解析をおこない、カオス的な運動の側面を明らかにした。1.1mK以下の超低温度、約35気圧の融解圧の下で、bcc固体^5Heは核スピン秩序相に入る。この核スピン支磁磁性秩序相はuudd相(up-up-down-down相)といわれている。本研究では、NMR法を用いて、この特異な系のスピン・ダイナミックスを実験的・理論的に調べ、このような系でのスピン緩和機構、非線型なスピンの運動、カオス的なスピンの運動、一様なスピンの才差運動の不安定性、等を明らかにすることを目的とする。2.昨年度に引き続き、uudd相固体^3He単結晶の反強磁性共鳴につき、その線幅の外部磁場依存性と温度依存性を精密に測定した。この反強磁性共鳴では、共鳴周波数の上のブランチと下のブランチに分れているが、下のブランチの共鳴について、その緩和における3-マグノン過程の存在が明らかとなった。即ち、線幅の温度依存性を測定すると、3-マグノン過程の選択則を満足する範囲で線幅が急激に広くなった。3.理論的に3-マグノン過程および4-マグノン過程による反強磁性共鳴の線幅の計算をおこなった。その結果によれば、現在迄の我々のデ-タはこのような多マグノン過程として満足に説明される。4.引き続き、外側に超伝導同筒による磁気シ-ルドを持った高均一度小型超伝導マグネットの製作を試みている。磁場補正用、磁場勾配印加用に電流シムをつけているが、この磁場に及ぼす超伝導磁気シ-ルドの影響を計算する大型計算機用のプログラムを開発した。5.科学研究費補助金の交付を受けるのは本年度迄であるが、尚引き続き、関連テ-マを含めて本研究を推定して行く予定である。
口蓋突起挙上に着目した口蓋裂発症機序の解明

口唇裂・口蓋裂は最も頻度の高い先天異常の一つであるがその原因はいまだに解明されていない。口蓋裂患者の口蓋は短く、口蓋裂発症には口蓋突起形成不全や挙上障害といった口蓋間葉における異常が深く関与しているのではないかと考え、口蓋突起挙上に関与する遺伝子を解明するため口蓋突起挙上時期の口蓋間葉における網羅的遺伝子発現解析を行った。Cell adhesion、Reguration of cell proliferation等の遺伝子群が発現上昇しており、FGFシグナル関連分子も口蓋突起挙上前後で特異的に発現上昇していたことから、口蓋突起挙上にFGFシグナル関連分子が深く関与していることが示唆された。口唇裂・口蓋裂は口唇、歯槽部、口蓋などの口腔顎顔面領域に裂を生じる先天異常である。口唇裂治療は乳児期の口唇形成術で終了するのに対し、口蓋裂治療は幼児期の口蓋形成術より学童期の言語治療および矯正治療まで一貫した長期にわたる治療が必要である。現在の治療の主体は外科的治療であり、未だに根本的解決法が存在しない。その原因の一つとして口蓋裂発生時の分子メカニズムが解明されていないことが挙げられる。過去に我々はSprouty2が口蓋形成時に重要な役割を果たし口蓋間葉細胞に作用して口蓋挙上に関与していることを解明した。しかしながらSprouty2はどのような分子シグナリングを介して口蓋癒合に関与しているのか、口蓋裂発生の分子メカニズムの解明はいまだ不十分である。そこで、口蓋癒合に関与する遺伝子のスクリーニングを行うため網羅的遺伝子発現解析を行った。野生型マウスの癒合前口蓋および癒合後口蓋を用いて、口蓋組織より採取したRNAを用いてDNAマイクロアレイを行った。クラスタリング施行後、口蓋突起挙上前後で発現増加した遺伝子群のGeneontology解析を行ったところ、Cell adhesion、Reguration of cell proliferation等の遺伝子群が発現上昇していた。さらに、口蓋由来間葉細胞において、FGFシグナルを介したMAPK (pERK1/2)はsiRNASprouty2群にて増強されるが、EGF刺激下においては変化しないことを発見した。マイクロアレイによる解析においてもFGFシグナリングが口蓋癒合時に特徴的に働いているという知見を得た。以上の結果より、口蓋形成期の間葉細胞においてSprouty2がFGFシグナリングを特異的に抑制し、MAPKの調整を行っている可能性が示唆された。2.標的遺伝子の設定:口蓋突起挙上時期に特異的に発現する遺伝子のうち、口蓋突起挙上前後で発現量の変動が大きい複数の遺伝子を標的遺伝子として設定した。FGFシグナル下流に存在する転写因子などの分子にターゲットを絞っている。3.標的遺伝子の口蓋における発現量確認:定量的real-time PCRにて口蓋癒合時期のターゲット遺伝子のmRNAレベルでの発現量確認を行った。標的遺伝子候補が複数あり、絞り込みに時間を要したため。・標的遺伝子の機能阻害実験ターゲット遺伝子の口蓋間葉細胞における役割について検討するため、ターゲット遺伝子のsiRNAを添加して細胞培養を行い、細胞増殖実験、TUNEL染色、アネキシンV染色などにより口蓋突起挙上への関与が報告されている細胞増殖やアポトーシスの観点から観察する。・標的遺伝子KOマウスの表現型解析標的遺伝子の口蓋癒合への直接的な関与が示唆される場合はKOマウスの口蓋表現型を解析する。主にマウス購入費、細胞増殖実験や口蓋器官培養に必要な試薬類に使用する予定である。
高温超伝導体を用いたエチレンプロピレンゴム絶縁モデルケーブルの試作

1.研究目的本研究においては、代表者らが推進してきた世界的にもユニークな押出しプラスチック絶縁超伝導ケーブルに最近その性能向上の著しい高温超伝導体の適用を試み、その特性を評価することを目的とする2.研究成果の概要現在、活発に開発の進められているビスマス系の高温超伝導体に的を絞り、テープ状に加工された導体を安定化用の銅パイプ上に適用して約1メートルのモデルケーブルの導体とした。その導体上にエチレンプロピレンゴム(EPR)絶縁を施し、銅パイプ内部を液体窒素で冷却して通電及び課電の実験を行い、以下のような成果を得た。(1)30cm長の銀シースに包含されたビスマス系高温超伝導体を18本並べ導体として取り入れたモデルケーブルにおいて直流臨界電流を測定した。電流値そのものは未だ十分とは云えないが、EPR絶縁を被せた状態で液体窒素温度まで冷却したときの電流値の低下は少ないことが判った。(2)EPR電気絶縁は、半導電層を含めて銀シース導体上にモールドされているが、繰り返し行った液体窒素温度までの冷却においても機械的な障害は発生じなかった。(3)モデルケーブルとしての誘電正接(tanδ)は、外部導体として採用したSZワイヤーと絶縁部との接触が良好であったので、液体窒素温度において0.2x10^<-5>と極めて低い値であった。また、tanδの電圧依存性も大きくないことが判った。(4)モデルケーブルは、20kV_<rms>の電圧印加においても部分放電の発生を見なかったが、これは、液体窒素温度でのクラックなどの発生がなかったことを示している。(5)EPRの極低温におけるトリーイング発生電圧は充填材の添加にも拘らず室温における値の3倍にも達しており優れていることが判った。
ノンコーディングRNA機能による種特異性獲得の分子基盤解明

ヒト特異的NBPF ncRNAは核内構造体に局在し、ヒト特異的リピートクラスターのイントロン領域に由来する。まずスプライシング阻害剤を用いて、NBPF ncRNAが前駆体RNAからスプライシングで切り出されたイントロンに由来することが明らかにした。次にNBPF ncRNAを核内RNAノックダウン法で機能阻害し、次世代シーケンサーのRNA-seq解析を実施したところ、近傍のNOTCH2NLの発現を活性化していることが明らかになった。またNBPF ncRNAがRNA抽出過程で、著しい難溶性を示すことを発見し、それが核内構造体RNAであるNEAT1と共通の性質であることが明らかになった。本研究は、細胞核内で構造体形成を担うRNA分子の研究から派生したものである。まずヒト一番染色体の複数箇所に大規模なリピートクラスターを形成しているNBPF遺伝子由来の転写物が、核内構造体様のfociを形成していることを発見し、その役割の解明を目指している。NBPF遺伝子には、2つのエクソンと1つのイントロンからなる基本ユニットが繰返し存在しており、霊長類の進化途上で最も顕著に増幅した領域として報告されている。このNBPF遺伝子から転写されたRNAは、スプライシングを受けてタンパク質に翻訳されるmRNAを産生することが知られているが、本研究で注目しているRNAは、そのイントロン領域から産生されるncRNAである。これらのncRNAをRNA環状化を介した末端決定法によって調べたところ、スプライシングによって切り取られたイントロンRNAが核内fociに蓄積していることが明らかになった。一方、このイントロン領域のクロマチン修飾情報を見ると、この部分はエンハンサーのマークとしてよく知られているヒストンH3Me1が繰返しピークを作っていることが明らかになった。こうしたことから、NBPFイントロンから産生されたncRNAが核内foci中でエンハンサー様の機能を担っていることが予想された。そこで本年度は、この仮説を確かめるためにNBPFイントロンRNAを特異的にノックダウンする条件を検討した。さらにそうして得られたノックダウン株からRNAを抽出して次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を実施し、NBPFイントロンRNAによって発現制御を受けている遺伝子を探索しようとしている。本研究は、ヒトにおいて種特異的にリピート増幅したNBPF遺伝子由来のノンコーディングRNA(lncRNA)が、核内で特異的な構造体様のfociを形成していることから由来している。前年度までにこのlncRNAのエンハンサーとして活性の有無を調べるために核内RNAノックダウンによって、このlncRNAレベルを著しく低下させた細胞での遺伝子発現プロファイルを次世代シーケンサーによるRNA-seq法によって検討した。その結果、NBPF遺伝子クラスター近傍のNOTCH2NL遺伝子の発現が著しく低下することが明らかになった。しかしながら、当初期待されたようなグローバルな遺伝子発現プロファイルの著しい変化は認められなかった。一方で、lncRNAを骨格として形成される核内構造体には、パラスペックルが知られているが、その骨格となるNEAT1 lncRNAとNBPFlncRNAにはどのような共通性があるのかを調べたところ、いずれのRNAも通常のRNA抽出試薬による精製過程で完全な抽出が困難であることが明らかになった。さらに、こうしたRNAの難溶性は、物理的な処理を細胞抽出液に加えることによってリカバリーできることが明らかになった。これは核内でタンパク質と共に不溶性の構造体を形成していることに起因する可能性がある。実際に、構造体形成に関わるFUSというRNA結合タンパク質が難溶性の獲得に必要であり、FUSはプリオン様ドメインを介してヒドロゲル様の凝集体を形成し、このドメインが構造体形成に必須なことを西オーストラリア大との共同研究で明らかにした。こうした難溶性は、核内で構造体を形成しているlncRNAの共通した特徴である可能性があり、今後新しい構造構築lncRNAの探索のために有効な特徴である可能性が浮上した。本年はエンハンサー様機能を有すると考えられるNBPFイントロン由来のncRNAの末端を正確にマッピングすること、さらにRNAーFISHによって検出される核内fociをより明確に検出できる条件を至適化すること、さらにNBPFイントロン由来のncRNAを特異的にノックダウンする条件を至適化すること、さらにノックダウン細胞由来のRNAを用いて、次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を実施し、発現が変動する遺伝子を同定することを実施した。その結果、核内fociで検出されているRNAは、スプライシングによって切り出されたイントロン配列そのものが蓄積したものであること、さらに化学修飾を施した複数のキメラオリゴヌクレオチドによる核内ノックダウンによって、NBPFイントロンRNAを特異的にノックダウンすることに成功した。さらにIllumina次世代シーケンサーによって、コントロール細胞とNBPFイントロンncRNAのノックダウン細胞のRNAを用いてRNA-seq解析を実施する直前まで到達している。

こうしたことから、NBPFイントロンRNAの解析に関する当初の予定に即した一定の進展があったと判断できる。分子生物学次年度では次世代シーケンサーによるRNA-seqを実施し、そこで得られたデータを精査し、NBPFイントロンRNAによって発現制御されている遺伝子を同定する。さらにその標的遺伝子の発現をヒトとその他の霊長類、さらには他の哺乳類動物種間で比較し、NBPFの増幅の度合いとの相関を検討する。一方でNBPFイントロンの効率的な過剰発現系を整備して、エンハンサーとしてRNA機能についても検討する。本年度はこれまで既存の化学修飾オリゴヌクレオチドを用いたノックダウン条件の至適化などを行い、さらに次世代シーケンサー解析に向けたサンプル調整に終始していたため、ほとんど研究費を使用することなく研究を遂行することができたため。これは次年度に実施する次世代シーケンサー解析には、データ解析も含めて多額の外注費を計上する必要があることによる。前年度に調整したNBPFイントロンncRNAのノックダウンの影響を次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を実施し、そのデータを基にこのncRNAの種特異的な機能を明らかにしていく。
ニュ-ラルネットによる化学プロセスの制御

近年,化学プロセスは高効率化,さらには製品の高品質化が要求されるため精緻な制御が望まれている。しかし,多くの化学プロセスは非線形であり,さらに動特性が未知な場合も多い。人の脳の神経回路をモデル化したニュ-ラルネットが様々な分野で注目されている。このニュ-ラルネットは関数を近似する能力があり,そのためこれを制御器として用いることも出来る。そこで本研究ではニュ-ラルネットによる化学プロセスの制御問題への適用可能性につて,数値シミュレ-ションおよび実験によって検討した。本研究で採用したプロセス化学プロセスの特徴的な性質を有している代表的なプロセスである(1)レベル制御系(非線形),(2)レベルと温度制御系(干渉がある),(3)pH制御系(高い非線形性がある)について検討した。はじめにニュ-ラルネット制御器による制御性能を調べるため,これらのプロセスを記述する数学モデルを作成し,これを用いて,数値シミュレ-ションを行った。その結果(1)および(2)の制御系については満足できる結果が得られた。特に(2)の場合でも干渉の影響をほとんど打ち消すことが可能であった。しかし(3)のpH制御系は非線形格が特に強く,あまり良い性能を得ることは出来なかった。これについてはさらに検討を要する。次にパ-ソナルコンピュ-タ上にニュ-ラルネットを構築し,(1)および(2)の場合について実験的に検討を行った。実装置ではシミュレ-ションのモデルには考慮されていない制御弁の動特性,配管による輸送遅れあるいは放熱の影響などが存在しているが,実験結果はシミュレ-ションの場合と同様満足のできるものであった。(2)の制御系は干渉系であるが,この場合でも干渉の影響はごくわずかにおさえられた。また外乱に対してもニュ-ラルネットは学習機能により,適応的に制御することが認かめられた。
赤血球産生における造血巣の組織形態的な特性と分子相互作用

哺乳類エリスロポエチン(EPO)とその受容体(EPOR)の相同分子が両生類アフリカツメガエル成体肝臓に発現する。ツメガエルEPOと哺乳類EPOとの配列相同性は38%と低い。そこで両生類で初めてin vitro赤芽球コロニー形成アッセイを確立し,EPO-EPOR系がツメガエルの肝臓で赤血球造血を傍分泌刺激する機能をもち,また,両生類造血組織における赤血球前駆細胞の存在を初めて証明した。貧血血清中にはEPO活性が存在した。低温環境下では新生赤血球の血液循環移行が抑制されて貧血が誘導された。ツメガエルは造血制御・生理を解析するためのすぐれたモデルとなる。本研究では,生物の血球産生(造血)の姿を調べ,造血器官(造血器,造血巣)と血球細胞の機能,形態,特性や,血球産生の分子基盤を明らかし,さらに末梢血球数の維持と調節に関わる未知の制御機構を探索することを目指している。本研究期間では,特に無尾両生類アフリカツメガエル成体の造血巣(主に肝臓)における赤血球系細胞の成熟の過程と,それらの細胞が血液循環に移行するまでの組織空間内の局在と形態の変化を細胞組織化学的に追跡し,赤血球産生制御の特性を明らかにすることを目標としている。[第1年度]では,ツメガエルの造血解析を実現させる血球関連分子の取得を実施した。この結果,幾つかの重要な分子を同定,クローニング,発現することができた。例えばErythropoietin(EPO)とその受容体の遺伝子配列を明らかにし,大腸菌発現によって遺伝子組換え体を得ることができた(日本血液学会等)。この分子の抗体の調製に着手した。また,EPOは,ほ乳類とは異なり,糖鎖の付加が無いため,その発現臓器である肝臓において赤血球前駆細胞の増殖・分化刺激はパラクラインによるという仮説の下,肝臓における赤血球造血の解析を進めることができた(日本動物学会等)。さらに,低温におけるツメガエル汎血球減少症(特に貧血)は,赤血球産生の低下というよりも,造血器である肝臓から赤血球前駆細胞が血液循環に移行する機構を抑制するためであることが示唆された。この知見は赤血球造血に関する全く新しい現象であり,国際実験血液学会における発表に対して,受賞2件を頂くなどの成果を産むことができた。現在,第二年度に向けて,これらの現象の機序を分子レベル,個体レベルで追跡する実験環境を準備している。[第2年度]では,細胞組織細胞化学的な造血巣の情報の獲得とともに,生物学的機能の解析を推し進めた。まず,溶血性貧血,瀉血性貧血,低温暴露貧血ツメガエルモデルを確立した。溶血性あるいは瀉血性貧血を誘導した個体に核酸アナログBrdUを投与し、貧血に応答して肝臓で増殖する血球細胞を検出した(日本動物学会)。各モデルで諸因子の発現変動を調べた。特に先行したErythropoietin(EPO)を例に挙げると,まずRT-PCRでEPOは肺に強発現,また,赤血球前駆細胞が存在する肝臓,脾臓でも発現が高く,貧血の進行とともに発現量は変動した。ヒトやマウスとは異なり,肝臓には赤血球前駆細胞が存在しており,世界で初めて非哺乳動物をモデルに傍分泌刺激によって肝臓でEPOが赤血球産生を刺激することを明らかにし,誌上発表を果たした(Nogawa-Kosakaら,Exp.Hematol., 2010)。肺におけるEPO高発現も哺乳類における知見からは意外であった。そこでリアルタイムPCRでEPO発現量を精査した。内在性対照遺伝子としてGAPDH、β-Actin、RPL13Aを比較評価したところ、GAPDHは溶血性貧血で発現が上昇する傾向があり,複数臓器間で比較定量する場合は,RPL13Aが対照として適切(臓器間の発現差が小さい)であった。RPL13Aを対照にし,正常個体の臓器間発現量を精査した結果,やはり肺が最も高く,肝臓と脾臓ではその1/70,1/800であった。一方,貧血個体では脾臓のEPO発現が最も上昇し23倍にもなった。従って臓器間・生物種間でEPOの分子機能と発現制御が多様性を示す可能性がある。栓球造血や白血球造血についても具体的な検討・報告を進め(日本動物学会,国際実験血液学会,日本血液学会など),ツメガエルは未知の制御系探求にとって極めて興味深いモデルであることが認知されつつある。[第3年度]は,組織微小環境の比較とin vivo赤血球数調節機構の解析を進めた。

ツメガエルのErythropoietin (EPO:x1EPO)には,血液循環に必須と考えられてきたN型糖鎖の付加が無い。そのため赤血球産生臓器(肝臓)におけるEPO-EPO受容体(EPOR)傍分泌系の存在が考えられた。一方,哺乳類EPOと,x1EPOのアミノ酸配列一致率は,ヒトEPOとで38%,マウスEPOとで36%と低く,x1EPOがヒトやマウスのEPOのオルソログとは結論しえなかった,そこで両生類で初めてin vitro赤芽球コロニー培養法を確立し,大腸菌発現組換えx1EPOと貧血血液中成分の赤血球前駆細胞増殖分化促進活性を明らかにした。さらに組換えEPO(5μg)を正常成体ツメガエルにin vivo心投与し経過観察したところ,生理活性を示す血中濃度が維持され,肝臓内の赤血球の産生・分化は促進された。しかし末梢成熟赤血球数増多は見られず,逆に減少した。また低温環境暴露ツメガエルでは,汎血球減少に伴う赤血球破壊亢進が見られ,低温下1日目で約30%の循環赤血球数が減少した。この時,肺と肝臓でmRNA発現量はむしろ上昇し,肝臓内の新生赤血球数は増加した。組織精査より,低温下の赤血球数低値維持は新生赤血球が肝臓内に貯留され、循環血に放出されないことが判明した。以上より低酸素刺激により発現亢進するヒトやマウスのEPOとは異なり,ツメガエルは未知のEPO発現制御系をもつ可能性を示す。本年度,x1EPOやx1EPORをそれぞれ認識するモノクローナル抗体の作出に成功し,造血組織の免疫化学的検索や,抗体のin vivo投与などの検討に着手した。赤血球造血以外にも,栓球造血,白血球造血の解析が進んでおり,血液幹細胞から特定の血球を生み出す制御系の探索も現実に視野内に入ってきた。
ヒト樹状細胞活性化因子TSLPを用いた新規腫瘍特異的免疫療法の開発

腫瘍抗原特異的T細胞のin vitroでの増殖誘導法の確立を目指して、thymic stromal lymphopoietin (TSLP)によるT細胞の増殖誘導機構の解析を平成18年度に引き続き行なった。TSLPにより活性化されたDC (TSLP-DC)では共刺激分子であるOX40リガンドとOX40の発現がともに誘導され、それらの発現がTSLP-DCによるT細胞の増殖誘導に必要であることが明らかとなった。一方、TSLPとToll様受容体(TLR)リガンドにて刺激したDCでは、IL-23の発現が誘導され、その活性化したDCによって、IL-17産生T細胞への分化誘導がおこることも明らかとなった。また、TSLP-DCと自家CD8T細胞の共培養にIL-7を添加すると、増殖誘導が増強され、セントラルメモリーCD8T細胞への分化誘導が促進された。以上から、IL-7添加下での腫瘍抗原ペプチドパルスTSLP-DCまたはOX40リガンド+MHC発現細胞による腫瘍抗原特異的CD8T細胞の増殖誘導が有望と考えられた。一方、私達は、ヒトTSLPがDC活性化を介してT細胞の分化誘導に重要な役割を果たしていること報告してきたが、まずヒトCD4T細胞において、naiveなT細胞では、TSLPに対する機能的な受容体を発現していないが、T細胞受容体刺激にてTSLP受容体がCD4T細胞に発現誘導され、T細胞の増殖が増強されることを明らかにした。そして、ヒトCD8T細胞においても同様に、T細胞受容体刺激にてTSLP受容体が発現誘導されることを明らかにした。この誘導はCD4T細胞と比較し一過性でありT細胞受容体刺激の強度に依存して生じた。TSLP受容体を発現したCD8T細胞は、TSLPの添加によりDCを介さずとも、抗CD3抗体+抗CD28抗体刺激下において、その増殖誘導が増強された。CMV既感染のHLA-A2402陽性ドナー血単球由来のDCにCMV特異的pp65ペプチドをパルスした場合、IL-2添加と比較して、TSLPを添加することで、非特異的なCD8T細胞の増殖誘導が抑制され、CMV特異的CD8T細胞の増殖を優位に誘導できることが明らかとなり、腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍抗原特異的CD8T細胞の増殖にも応用できる可能性が示唆された。1.腫瘍抗原特異的T細胞のin vitroでの増殖誘導法の確立を目指して、新規の樹状細胞(DC)活性化因子thymicstromal lymphopoietin(TSLP)により活性化されたDC(TSLP-DC)によるT細胞の増殖誘導機構の解析を行い、マイクロアレイ解析からTSLP-DCでは共刺激分子であるOX40-LigandとOX40の発現がともに誘導されることを見いだした。TSLP-DCとT細胞との共培養系にその中和抗体を加えると、naiveなT細胞のみならず、メモリーT細胞の増殖誘導も阻害され、OX40-LigandとOX40の相互作用が、TSLP-DCによるT細胞の増殖誘導において重要であることが明らかとなった。2.TSLP-DCはin vitroでの自家CD8T細胞との共培養にて、外来抗原がなくとも添加するDCの数依存的に自家CD8T細胞の増殖を誘導した。TSLP-DCとの共培養にて、セントラルメモリーCD8T細胞の増殖のみならず、NaiveなCD8T細胞も増殖し、セントラルメモリーT細胞に分化した。3.CD8T細胞の増殖因子である、IL-7, IL-15を単独または同時にTSLP-DCと自家CD8T細胞の共培養に添加すると、増殖誘導が増強され、IL-7添加時のみセントラルメモリーCD8T細胞への分化誘導が促進された。4.一方、TSLPとTLRリガンドにて刺激したDCは、IL-12のみならず、IL-23の発現が誘導された。この共刺激下では活性化DCによって、Th1型サイトカイン産生T細胞への分化誘導のみならず、IL-17産生T細胞への分化誘導もおこることが明らかとなった。5.CMV既感染のHLA-A2402陽性ドナー血由来のDCにCMV特異的pp65ペプチドをパルスした場合、IL-7に加えTSLPを添加することで、従来の単球由来のDCと比較して、CMV特異的CD8T細胞の増殖を強く誘導でき、腫瘍抗原WT1ペプチドを用いた腫瘍抗原特異的CD8T細胞の増殖にも応用できる可能性が示唆された。以上から、IL-7添加下での腫瘍抗原ペプチドパルスTSLP-DCまたはOX40リガンド+MHC発現細胞による腫瘍抗原

特異的CD8T細胞の増殖誘導が有望と考えられた。一方、私達は、ヒトTSLPがDC活性化を介してT細胞の分化誘導に重要な役割を果たしていること報告してきたが、まずヒトCD4T細胞において、naiveなT細胞では、TSLPに対する機能的な受容体を発現していないが、T細胞受容体刺激にてTSLP受容体がCD4T細胞に発現誘導され、T細胞の増殖が増強されることを明らかにした。そして、ヒトCD8T細胞においても同様に、T細胞受容体刺激にてTSLP受容体が発現誘導されることを明らかにした。この誘導はCD4T細胞と比較し一過性でありT細胞受容体刺激の強度に依存して生じた。TSLP受容体を発現したCD8T細胞は、TSLPの添加によりDCを介さずとも、抗CD3抗体+抗CD28抗体刺激下において、その増殖誘導が増強された。CMV既感染のHLA-A2402陽性ドナー血単球由来のDCにCMV特異的pp65ペプチドをパルスした場合、IL-2添加と比較して、TSLPを添加することで、非特異的なCD8T細胞の増殖誘導が抑制され、CMV特異的CD8T細胞の増殖を優位に誘導できることが明らかとなり、腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍抗原特異的CD8T細胞の増殖にも応用できる可能性が示唆された。
酵母のヒ-トショック遺伝子発現の制御因子

細胞が高温にさらされると特定の蛋白質群(ヒ-トショック蛋白質)の合成が誘導される。この現象はヒ-トショック応答と呼ばれ原核生物細胞から高等真核生物細胞にいたるまでひろく観察される。私は、酵母Saccharomyces cerevisiaeのヒ-トショック応答を制御する因子を以下のように遺伝学的な方法を用いて解明してきた。1酵母Saccharomycescerevisiae野生株から、酵母のレトロトランスポゾンであるTy elementにより遺伝子破壊されたために高温感受性を示すようになったhit変異株を4個分離した。2.それらのうちの1つhitl変異株においてはTy elementの挿入により、第10番染色体にコ-ドされている分子量約74kDaのヒ-トショック蛋白質合成を制御するアルギニンのマイナ-コドンであるAGGを認識するtRNAと、酵母の高温での成育に必須な分子量約19kDaのzincfingerモチ-フを有する蛋白質が欠失していることを明らかにした。これらの結果は以下のことを示すものである。1.tRNA遺伝子がヒ-トショック蛋白質合成に関わっていること。またヒ-トショック蛋白質合成が個別に制御されていること。2.19kDaのzincfinger蛋白質が高温での成育に必須であり、ヒ-トショック後に他の遺伝子発現制御に関わっているらしい。