hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宿泊機能の集積過程と集客圏からみた東北地方の都市群システム

1本研究では,東北地方主要都市として12都市を選定した。12都市は,ホテル客室数と宿泊収容人員を指標とする都市階層区分の上位4階層までに区分された。最上位の第1階層には仙台,それに次ぐ第2階層には盛岡,秋田,郡山の3市,第3階層には青森,いわき,山形,八戸の4市,第4階層には福島,会津若松,弘前,酒田の4市がそれぞれ含まれる。2これら12都市の宿泊機能は,1970年代以降,ホテルの新規立地によって顕著な増加をみた。この増加は,旅館の廃業にともなう宿泊機能の減少を大幅に上回る規模であり,仙台をはじめとする上位階層の都市ほど,客室総数に占めるホテル客室数の割合が高まる。また,ホテルが鉄道駅から都心地域にかけて集中的に分布するのに対して,旅館は都心地域から減少が始まった結果,都心周辺部から周辺市街地に分散的に分布する傾向にある。3ホテルの増加は,当該都市の拠点性とその変化に関わりがある。広域中心都市である仙台では,1970年代前半に東北地方で最初のホテル増加期を経験した。以降,ホテルの立地にともなう宿泊機能の増加は今日に至るまで継続的である。このことは,盛岡におけるホテル増加期が,東北新幹線の開業に対応する1970年代末から1980年代初頭に限られていることと対照的である。同様に,近年の郡山および八戸におけるホテルの増加は,磐越自動車道全通と東北新幹線の八戸延伸計画など,高速交通網の再編がもたらすインパクトに起因する。すなわち,宿泊機能の量的・質的な変化は,当該都市を結節点とする業務・観光流動に関わる後背地の拡大過程の中で引き起こされ,地域的都市群システムの再編にともなうことが明らかになった。本研究の目的は,宿泊機能の集積過程と集客圏を指標として,東北地方の都市群システムとその再編過程を解明することである。平成9年度の研究内容と経過は以下のとおりである。1)対象とする東北地方15都市の宿泊機能のうち,従来の研究において発表したホテル営業の集積規模について,現地調査をとおして新規に確認し,とりわけ仙台と盛岡,秋田については,1970年代以降の集積過程を詳細に把握した。ホテル営業の集積規模と集積過程には,地域的都市システムと高速交通体系の変化が反映している。2)宿泊機能のうち,旅館営業の集積規模については,旅館組合名簿と現地調査による把握を試み,仙台と盛岡,秋田をはじめとする県庁所在都市に関するデータを収集した。1970年代以降の減少過程については,過去の住宅地図と現地調査をとおして,データの収集・整備・分析を続行している。都市における旅館営業の減少は共通にみられ,とくに市域中心部では,都市化・立体化の進行にともなう立地条件の変化に関連している。3)都市内部における宿泊機能の立地特性を検討するために,仙台都心部における土地利用調査を実施した。4)宿泊機能の集客圏については,仙台と盛岡,秋田から事例施設を選定し,聞き取り調査を実施した。この調査と分析は,おもに平成10年度の課題となる。東北地方の都市において,ホテル営業を主体とする宿泊機能の集積が進行するのは1970年代前半以降である。集積過程の時期的差異と動向には,東北地方における高速交通体系の整備が深く関係しており,業務・観光流動を束ねる広域的な結節点の変動が読み取れる。平成10年度には,業務・観光流動と東北地方都市群との関わりを集客圏および利用形態の側面に重点を置いて現地調査を続行する。
アクチビン-フォリスタチンシステム制御による新たな肝虚血再潅流障害対策の開発

【背景・目的】本研究による肝虚血再潅流障害のactivin、follistatinの関与についての解明と投与効果の検討は肝切除術・肝移植後の肝機能障害軽減に貢献し、新たな肝虚血再潅流障害に対する創薬を含めた戦略が開発できる。【方法・結果】1)門脈結紮術後再生肝の大量肝切除術に対する効果(アクチビンAによる評価)ラット門脈結紮術後再生肝と無処置の正常肝において大量肝切除術を施行したところ、RT-PCRにてactivin Aやそのレセプターの発現は術後後期において正常肝で有意に低く、肝再生停止機構が発現されず肝切除術に対する有用性はないことが示唆された。2)Follistatinの虚血再灌流傷害に対する効果肝左葉を30minクリッピング(肝温虚血)した後、肝右葉・尾状葉を切除する(30%肝切除)モデルを作成しFollistatinを投与したところ術後生存率の改善、real-time PCRによりactivin Aの抑制、炎症性サイトカイン(IL-6)の抑制効果を認め、アクチビンを抑制することで虚血再灌流障害を軽減する可能性が示唆された。3)Fluvastatinの虚血再灌流傷害に対する効果全肝虚血(30min)におけるfluvastatin投与効果について検討したところ、虚血再灌流後の肝障害の抑制効果を認めるとともに、real-time PCRにより炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β)、さらにeNOS、NOX4に対する効果を認め、類洞内皮細胞保護効果による虚血再灌流障害軽減効果を証明できた。4)Fluvastatinの肝再生(大量肝切除術)に対する効果大量肝切除術モデルを作成し、Fluvastatin投与効果について検討したところ、投与により肝再生の増強、肝類洞構造の維持、α-SMA発現が抑制され再生時における肝類洞構造の保持により肝障害を制御していることが示唆された。【まとめ】今回の研究によりactivinによる肝再生の評価、follistatinの投与による肝虚血再灌流障害制御の機序の開明、さらに他の薬剤でも肝虚血再灌流傷害に対する効果を検討し得た。背景・目的)肝虚血再潅流障害は術後肝障害発症の最も重要な因子の一つである。最近では心臓、腎臓に対する虚血再潅流障害をactivinが促進しfollistatin投与による組織保護効果が報告されているが、肝虚血再潅流障害におけるfollistatin-activin系の関与とその投与効果についての報告はいまだない。以上から肝虚血再潅流におけるactivin-follistatinsystemの関与について検討しactivin、follistatinの投与による障害軽減効果について検討する。方法・結果)・ラット肝虚血再灌流障害モデルの作成Wistar Rat 7週齢を用いて、全肝を30miniクリッピングするモデル(全肝温虚血モデル)、さらに肝左葉(左外側葉、左内側葉)を30minクリッピングした後、肝右葉・尾状葉を切除する(30%肝切除)モデル(部分肝温虚血モデル)を作成した。・フォリスタチン投与効果(部分肝温虚血モデル)投与群は再灌流直後、follistatin 1ug/bodyを投与しコントロール群と術後経時的に肝障害について検討した。

血清は各種肝機能検査を施行し肝臓は一部RNAを採取、また病理学的検査も行って以下の検討を現在行っている。・fluvastatin投与効果(全肝温虚血モデル)・因_蕎湯投与効果(全肝温虚血モデル)胆汁分泌・排泄促進作用を有する因_蕎湯の虚血前投与により肝逸脱酵素上昇の改善を認めた。今後の予定)・各種肝機能検査の比較・real time PCRや免疫染色を用いてactivin-follistatin発現の比較。またNO、ROS、各種サイトカイン、HO-1、HSP70についても比較検討する予定である。・肝移植モデルの作成同様の手技によって肝虚血再灌流障害について評価する予定である。【背景・目的】本研究による肝虚血再潅流障害のactivin、follistatinの関与についての解明と投与効果の検討は肝切除術・肝移植後の肝機能障害軽減に貢献し、新たな肝虚血再潅流障害に対する創薬を含めた戦略が開発できる。【方法・結果】1)門脈結紮術後再生肝の大量肝切除術に対する効果(アクチビンAによる評価)ラット門脈結紮術後再生肝と無処置の正常肝において大量肝切除術を施行したところ、RT-PCRにてactivin Aやそのレセプターの発現は術後後期において正常肝で有意に低く、肝再生停止機構が発現されず肝切除術に対する有用性はないことが示唆された。2)Follistatinの虚血再灌流傷害に対する効果肝左葉を30minクリッピング(肝温虚血)した後、肝右葉・尾状葉を切除する(30%肝切除)モデルを作成しFollistatinを投与したところ術後生存率の改善、real-time PCRによりactivin Aの抑制、炎症性サイトカイン(IL-6)の抑制効果を認め、アクチビンを抑制することで虚血再灌流障害を軽減する可能性が示唆された。3)Fluvastatinの虚血再灌流傷害に対する効果全肝虚血(3min)におけるfluvastatin投与効果について検討したところ、虚血再灌流後の肝障害の抑制効果を認めるとともに、real-time PCRにより炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-1β)、さらにeNOS、NOX4に対する効果を認め、類洞内皮細胞保護効果による虚血再灌流障害軽減効果を証明できた。4)Fluvastatinの肝再生(大量肝切除術)に対する効果大量肝切除術モデルを作成し、Fluvastatin投与効果について検討したところ、投与により肝再生の増強、肝類洞構造の維持、α-SMA発現が抑制され再生時における肝類洞構造保持により肝障害を制御している可能性が示唆された。【まとめ】今回の研究によりactivinによる肝再生の評価、follistatinの投与による肝虚血再灌流障害制御の機序の開明、さらに他の薬剤でも肝虚血再灌流傷害に対しる効果を検討し得た。
看護実践力の向上に向けた基礎看護技術修得のための支援ツ-ルの開発

本研究は,看護学生および新人看護師の看護実践力の向上に向けて,基礎看護技術を確実に修得するために,その支援ツールを開発し,有効性を検討することを目的とした.平成22年度は,基礎看護技術をリストアップし,支援ツールとして血圧測定および食事の援助のチェックリスト及びDVDを作成した.平成23年度は,看護学生29名に実際に活用してみたところ,支援ツールにより,不確実な知識や技術が修得できることがわかった.このことから,支援ツールは,看護実践力の向上に向けた取り組みとして効果をもたらすことが明らかになった.本研究は,看護学生および新人看護師の看護実践力の向上に向けて,基礎看護技術を確実に修得するために,その支援ツールを開発し,有効性を検討することを目的とした.平成22年度は,基礎看護技術をリストアップし,支援ツールとして血圧測定および食事の援助のチェックリスト及びDVDを作成した.平成23年度は,看護学生29名に実際に活用してみたところ,支援ツールにより,不確実な知識や技術が修得できることがわかった.このことから,支援ツールは,看護実践力の向上に向けた取り組みとして効果をもたらすことが明らかになった.本研究は、看護実践力の向上のために、看護学生および新入看護師のための基礎看護技術修得支援ツールを開発するものである。看護学生および新入職看護師が、この育成支援ツールを活用しながら看護教員の支援を受け、看護実践するうえで必要な基礎看護技術が円滑に修得できるようになることを目的とする。看護技術修得支援ツールとは、基礎看護技術チェックリスト及びDVDを示す。また、看護学生とは、領域別実習を終えた学生であり、新人看護師とは、入職後2年目までの看護師である。平成22年度は、看護学生および新入看護師へのインタビュー調査を実施し、看護するうえで最低限必要とする基礎看護技術の精選をした。看護学生および新人看護師が必要とする基礎看護技術は、1.血圧測定、食事の援助、清潔の援助、移乗、寝衣交換、排泄野援助などであった。その中の血圧測定と食事の援助を取り上げ、チェックリストの作成とDVDの撮影を試みた。チェックリストは、学生がDVDを使用する前後の看護技術の修得状況を確認するためのものである。DVDは、血圧測定と食事の援助の一連のプロセスを撮影したものである。平成23年度は、平成22年度に作成したチェックリストの再確認と、撮影したDVDのシナリオの作成や編集作業を行った後に、実際に研究協力者に支援ツールの活用を試みる。研究協力者に対しては、既に同意の得られている場合には、再度研究の趣旨や方法などを説明する。新たな協力者に対しては、研究の趣旨に関してや倫理的配慮の一連の事項一個人情報の保護や研究を拒否しても不利益にはなないこと、データは研究以外には使用しないことなど-を文章化し口頭でも説明する。研究代表者の所属する研究機関の研究倫理委員会の審議を受ける。本研究の目的は,看護実践力の向上に向けた基礎看護技術の修得支援ツールを開発することである.平成23年度は,平成22年度に基礎看護技術の支援ツールとして精選し,撮影した血圧測定と食事の援助のDVDの編集を行うとともにチェックリスト,支援ツールを使用しての評価表の見直しを行い,実際に使用してもらうことを計画した.具体的には以下のように行った.1.平成23年4月から10月迄は,計画に基づいて支援ツールの編集・見直しを行った.1)作成したDVDの編集は,映像と説明文章の一致性,ナレーションの速度,所要時間など,業者と連絡を取りながら全体的な見直しを行った.2)チェックリストと評価表は,研究開始時の作成分について,DVDの内容と一致しているか,評価し易い項目であるかを見直し,追加・修正を加えた.2.平成24年11月から平成24年3月迄は,実際に協力者に支援ツールを活用してもらった.1)支援ツールは,最低限必要とする基礎看護技術のなかでも特に協力者のニードが高かった血圧測定のDVDに焦点をあてた.2)DVDを使用する前後に血圧測定を行ってもらい,教員がチェックリストを用いて評価した.3)支援ツール活用しての評価を評価表に自由に記入してもらった.尚,研究代表者の所属変更に伴い,研究を遂行するにあたって新たな協力者の確保が必要となったために,純真学園大学の生命倫理委員会の承認を得た(平成23年度承認番号1).研究結果は,計画通りにその都度データ化している.本研究の目的は、看護実践能力の向上に向けて,看護学生および看護師が基礎看護技術を確実に修得できるようになるために,その支援ツールを開発し,有効性を検討することである.平成24年度は、平成23年度迄に開発した、チェックリストと評価用紙、DVDからなる血圧測定の基礎看護技術支援ツールの有効性を明らかにした。方法として、本研究の趣旨を理解し,協力の得られた私立系大学の看護学生29名に対して、支援ツールとして作成したDVDの中から,血圧測定に焦点をあて,DVD使用前後の技術の修得状況をチェックリストで確認した.また、使用してどうだったかをA4サイズの質問質用紙に自由に記述してもらった.チェックリストは,「知識の確認,実施前の確認事項,準備,実施(触診法・聴診法),記録・報告」の計38項目とし,出来る・出来ないの2件法とした.分析方法は,DVD使用前後の修得状況をT検定を用いた(有意水準5%).自由記述は,質的に分析した。

倫理的配慮として,本研究は研究代表者の所属する機関の倫理委員会の審査を受けた.分析の結果、DVD使用前後の基礎看護技術修得状況では,できた項目は使用前27項目、使用後37項目であった(<.01).項目別では「知識の確認,実施の共通事項及び触診」に差がみられた(p<.01).自由記述では全員が役立ったと認識し,【復習の機会】【技術修得を通して自己に直面】【DVD作成に対する肯定的評価】【DVD使用の効果】に、改善して欲しい内容は,【ナレーションの量やスピード】【イラストの挿入】【見やすい文字や色遣い】【内容の構成】に分類できた.触診法は使用頻度が少ないために、支援ツールで確認できたと考えられる。このように、基礎看護技術の修得に向けた支援ツールの有効性が明らかになった。今後、改善点を活かし、他の基礎看護技術についても引き続き支援ツールを作成する必要がある。支援ツールとしてのDVDを作成し,編集作業を終え,実際に研究協力者が活用するまでに時間がかかったが,新たな協力者を得るために生命倫理委員会の承認を得て,実際に協力者も確保でき,おおむね順調に進展している.24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の今後の推進方策は,データ化した結果を分析し,論文作成をすることと,報告書を作成することである.また,看護系の学術集会で成果を発表したいと考えている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
硝子体内展開をするドーナツ状薬剤徐放シートの作製

目的を達成するためにまず三層構造の展開可能なシートの作製を行った。何回か試みたが、当初の方法と少し異なるが以下の方法が現時点では最も効率よく展開できると考えられる。PEGDM、TEGDM溶液、試薬代わりとしてFluoresceinを混合した溶液を用い、サイズは内径9mmで外形が13mmとする。1:スライドガラス上に目的のデバイスサイズに合わせてカットしたスペーサーをスペーサーとスライドガラスの間に空気がなるべく入らないように注意して載せる。2:PEGDM、TEGDM、蛍光試薬を混合した溶液をスペーサー内に滴下し、スライドガラスを用いてスペーサーを挟み込み、内に空気が入らないように注意しながらクリップでスライドガラス両端を押さえこむ(溶液がスペーサーを十分に満たしているか確認)。3:UVで架橋するが強度80%、60秒間が現時点では最適。4:シートにクラックが入らないように注意しながら、スライドガラスを剥がす。5:ガード層、及び、放出制御層の溶液をスライドガラス上に滴下し、チップで薄く広げる。6:スピンコーター(1000rpm、加速時間10秒、最大速度回転時間15秒)でシート状にする。7:上記シートで薬剤層を挟み込み、クリップでスライドガラスを押さえる。8:UV架橋(放出層側、ガード層側共に強度80%、60秒間)。9:ガード層側のスライドガラスを剥がした後、デバイスをスライドガラスから剥がす。この方法で作製したシートは仮の射出器である眼内レンズ挿入装置で射出できた。上記で作成したシートは一時的に使用した眼内レンズ挿入用のデバイスで排出することが確認できた。現在蛍光色素の溶出を確認中である。1年目としては十分に目的が達成できたと考えられる。上記で作成したシートから蛍光色素の溶出確認後に実薬の溶出も検討する。これと並行して上記で作成したシートを基盤に、tensionの違う2つのシートが薬剤徐放層を挟み込んで連続する3層になるように作製する。これは当初予定していた第一段階のシートの展開にあたるところになる。その後90%以上が水分の硝子体内に、注射針あるいは代用物で注入し、眼内最周辺部直径に合わせた円形シートの展開を行う。これはin vitroでの展開でまず確認するが、ウサギ以上の動物モデルの硝子体内で実際の展開を確認する。
アーベル多様体に関する有限性とガロア表現の分類について

特殊な性質を持つアーベル多様体の個数の有限性に関する予想の一つである『Rasmussen-Tamagawa』予想を研究し、特別な場合に進展を与えた。より正確には、ガロア表現の法l表現から元の表現の情報がどの程度復元できるかを研究し、一定の成果を挙げた。これにより、特別な場合の予想のある種の一般化が正しいことが従う。一方で、ガロア表現を分類するLiu加群を研究し、その基本的な線形代数的性質を研究した。また、ねじれクリスタリン表現に関する「充満忠実性定理」を証明した。これはKisinにより2006年に示されたBreuil予想と呼ばれるもののねじれ表現類似である。本研究は,Liu加群と呼ばれるガロア表現を分類する加群に関しての性質を調べ上げ,ガロア表現の性質を調べることに応用することが狙いの中の一つだった.今年度の研究では,主にねじれLiu加群の成す圏の,圏としての性質を調べた.まず,ねじれLiu加群の成す圏は,Liu加群の高さを十分小さいものに限った場合にはアーベル圏となるが,十分大きい高さを持つLiu加群まで含めた場合,一般にはアーベル圏にならないことを確認した.更に,異なるLiu加群が同じガロア表現を与える場合があることを確認することができた.これは本研究の課題名にもあるガロア表現の分類という観点からは,単純な意味でのLiu加群を考えるだけでは不十分であることを意味している.そこでこのような事態を省くために,Liu加群の中で「極大なもの」,「極小なもの」という概念を定義し,極大なLiu加群あるいは極小なLiu加群に限れば,異なるLiu加群は異なるガロア表現を与えるということを示すことができた.また,極大なLiu加群,極小な-Liu加群に限ればそれらの成す圏はアーベル圏になることも確認できた.さらに,極大の概念と極小の概念はCartier双対により結びつくことまで確認できた.研究においては,このような極大極小理論を与えるために,エタールLiu加群と呼ばれる新しい概念を定義した.これは多くの数学者たちによって非常によく研究されている,Fontaineによって1970年代に与えられていた理論の,Liu加群側での類似といえるものとなっている.上述の理論は,ねじれLiu加群に付随するガロア表現を線形代数的に考察する際に役に立つことも分かった.本研究は,Liu加群と呼ばれるガロア表現を分類する加群に関しての性質を調べ上げ,ガロア表現の性質を調べることに応用することが狙いの中の一つだった.今年度の研究では,主にねじれクリスタリン表現とねじれLiu加群の対応について考察した.最も大きな成果としては,2006年にM. Kisinによって証明されたクリスタリン表現の充満忠実性定理(Breuil予想と呼ばれていた)のねじれクリスタリン類似を証明できたことにある.これにより,ねじれクリスタリン表現という一般には考察の難しい対象たちの成す圏の圏論的性質が,非常に簡単な線形代数の成す圏で捉えることができるようになったことになる.また,与えられたLiu加群がクリスタリン表現に対応するための必要条件をGee-Liu-Savittが与えていたのだが,それが十分条件でもあることを証明した.これにより,クリスタリン表現とLiu加群との対応が完全に判明したことになる.一方で,本研究のもうひとつのテーマであるアーベル多様体の個数の有限性予想である「Rasmussen-Tamagawa予想」についても研究を進めた.九州大学の田口雄一郎氏との共同研究として,二つのp進表現の法p表現が合同であるときに元の表現の性質がどの程度復元できるかという問題に対して一定の成果を得ることができた.この結果によりRasmussen-Tamagawa予想の非常に特殊な場合が直ちに従うことがわかる.本研究はアーベル多様体に関する有限性予想とガロア表現の分類問題の二つが主なテーマだった.前者に関しては大きな進展が得られなかったが,後者に関しては想定以上の結果が得られている.したがって(2)が妥当であると判断される.24年度が最終年度であるため、記入しない。まずはアーベル多様体の個数の有限性予想であるRasmussen-Tamagawa予想に取り掛かりたい.初めにアーベル多様体が1次元の場合,次に一般次元の場合の順序で取り掛かる.同時に,今年度得られたLiu加群に関する結果をガロア表現の考察へと応用する.具体的には法p表現がいつcrystalline表現に持ち上がるかといった問題を考えることとする.Liu加群を用いればこのような問題が線形代数的に考察できることがすでに確認できている.24年度が最終年度であるため、記入しない。
口唇裂口蓋裂に対する新しい治療法の確立-in vitro hybrid人工骨を用いた基礎的研究-

口唇裂口蓋裂に対する総合治療一環として、自家腸骨海綿骨移植術を施す患者が増加している。最近我々は、顎裂部への新鮮自家腸骨海綿骨移植術の予後に影響を与える因子について検討した結果、術前の正面頭部X線規格写真を用いて算出した顎裂/鼻腔比、および術後3ヵ月時のCTを用いて算出する皮質骨残存度は、二次骨移植の予後を評価する上で有用なパラメータとなる可能性を報告した。しかし、実際の臨床ではこの条件を満たす症例ばかりではなく、口唇裂口蓋裂に対する新しい治療浩開発の必要性を痛感し、人工骨を移植材料として応用することの可能性を検討した。まず始めに、ウサギ骨髄間質細胞を各種サイトカイン(FGF-2あるいはBMP-2、4、7)含有コラーゲンスポンジ内でin vitro三次元培養を行い、FGF-2含浸コラーゲンスポンジでは培養開始4週間後には顕著な石灰化物の形成が認められることを明らかにした。さらに、ウサギ頭蓋骨に形成した実験的骨欠損(直径7mmの円形欠損)部の修復を目的に、周囲の骨膜を伸展し移植床を形成した後、実験群にはFGF-2含浸コラーゲンスポンジを、対照群には生理食塩水含浸コラーゲンスポンジを用い、ウサギ大腿骨より採取した骨髄間質細胞画分をコラーゲンスポンジ中に注入し移植を行った。経時的に撮影したsoft X-ray写真の不透過性をNIHimageソフトにて解析し、in vivo,における骨形成能について検討した結果、実験群は対照群に比較して明らかに周囲骨組織との一体化が早期に生じていた。従って本研究で用いた方法は、口唇裂口蓋裂に対する新しい治療法として臨床応用につながる可能性が考えられた。口唇裂口蓋裂に対する総合治療の一環として、自家腸骨海綿骨移植術を施す患者が増加してきた。最近我々は、顎裂部への新鮮自家腸骨海綿骨移植術の予後に影響を与える因子について検討した結果、移植時年齢に関しては低年齢(8歳以下)、顎裂幅に関しては48mm以下の状態で行った移植術が予後良好であることを報告したが、実際の臨床ではこの条件を満たす症例ばかりではなく、新しい治療方法の開発の必要性を痛感した。本研究は、口唇裂口蓋裂に対する新しい治療方法として、人工骨応用の可能性における基礎研究を目的とするものである。本年度は、10wt%濃度の酸性ゼラチン水溶液にグルタルアルデヒドを加え4°C、12時間の条件でゼラチンを化学架橋した。架橋ハイドロゲルを直径6mm、厚さ2mmのディスク状に形成した後、100mMのグリシン水溶液にて未反応グルタルアルデヒドを不活性化し、その後、蒸留水にて数回洗浄し、凍結乾燥することによって架橋ゼラチンハイドロゲルを得た。エチレンオキシドガスで滅菌した凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルディスクの上に、種々の濃度のサイトカイン(FGF-2あるいはBMP-2,4,7)を滴下し、4°C、12時間静置することによりサイトカインを浸み込ませ、サイトカイン含浸コラーゲンスポンジを作成し実験群とした。対照群には生理食塩水含浸コラーゲンスポンジを用い、ウサギ大腿骨より採取した骨髄間質細胞画分をコラーゲンスポンジ中に注入し三次元・培養を開始した。経時的に撮影したsoft X-ray写真の不透過性をNIHimageソフトを用いて解析し、in vitroにおける骨形成能について検討した結果、対照群に比べてFGF-2(100ng/ml)群では、培養開始4週間後より顕著な石灰化物の形成が認められたが、BMP-4,7群には認められなかった。口唇裂口蓋裂に対する総合治療の一環として、自家腸骨海綿骨移植術を施す患者が増加している。

最近我々は、顎裂部への新鮮自家腸骨海綿骨移植術の予後に影響を与える因子について検討した結果、術前の正面頭部X線規格写真を用いて算出した顎裂/鼻腔比、および術後3ヵ月時のCTを用いて算出する皮質骨残存度は、二次骨移植の予後を評価する上で有用なパラメータとなる可能性を報告した。しかし、実際の臨床ではこの条件を満たす症例ばかりではなく、口唇裂口蓋裂に対する新しい治療法開発の必要性を痛感し、人工骨を移植材料として応用することの可能性を検討した。昨年度は、ウサギ骨髄間質細胞を各種サイトカイン(FGF-2あるいはBMP-2、4、7)含有コラーゲンスポンジ内でin vitro三次元培養を行い、FGF-2含浸コラーゲンスポンジでは培養開始4週間後には顕著な石灰化物の形成が認められることを明らかにした。本年度は、ウサギ頭蓋骨に形成した実験的骨欠損(直径7mmの円形欠損)部の修復を目的に、周囲の骨膜を伸展し移植床を形成した後、実験群にはFGF-2含浸コラーゲンスポンジを、対照群には生理食塩水含浸コラーゲンスポンジを用い、ウサギ大腿骨より採取した骨髄間質細胞画分をコラーゲンスポンジ中に注入し移植を行った。経時的に撮影したsoft X-ray写真の不透過性をNIHimageソフトにて解析し、in vivoにおける骨形成能について検討した結果、実験群は対照群に比較して明らかに周囲骨組織との一体化が早期に生じていた。従って本研究で用いた方法は、口唇裂口蓋裂に対する新しい治療法として臨床応用につながる可能性が考えられた。
妊娠率向上を目指したウシ内在性レトロウイルスの機能解析

本申請は、ウシ着床期周辺胚に発現する内在性レトロウイルスを探索し、胎盤形成に有用な内在性レトロウイルス遺伝子の機能解析をすることを目的とした。その結果、ウシ胎盤に高発現するBERV-K3を見出した。BERV-K3は胎盤形成に必要な古典的WNTシグナルにより、その発現が誘導されることが明らかとなった。また、X染色体やY染色体に存在する内在性レトロウイルスも見出し、これらは着床前のウシ胚に特異的に発現していることを明らかにした。これらの研究成果は、ウシの妊娠過程において内在性レトロウイルスの関与を示す重要な発見となり、新たな高受胎胚の選別のための候補因子となりうる可能性があることが分かった。本研究は、ウシ着床周辺期胚で発現する内在性レトロウイルス(BERV)の機能を解析することを目的とする。先の科研費(若手研究B: 25850183)において見出したBERVの1つについてさらに解析を進めた結果、LTR/ERVKファミリーに属するLTRを持つため、BERV-K3と命名した。BERV-K3は、着床前の胚トロホブラスト細胞には発現が認められず、着床以降の胚トロホブラスト細胞に発現が認められ、妊娠45日で発現が最高に達し、妊娠150日のCotyledonでも発現が認められた。このことからBERV-K3は、胎盤形成・胎盤機能維持に深く関与する因子であると考えられた。BERV-K3は、non-coding RNA(ncRNA)に入り込む形で遺伝子上に存在していることが新たに分かり、現在ncRNAとの関係を検討しているところである。またBERV-K3は、着床後の胚のみならず、肝細胞などにも発現しており、これら組織と胚における機能とに共通項があるのか否か検討している。HIVなどのレトロウイルスは、multivesicular endosomeの中で出芽し、エクソソームの放出経路を利用して放出される。つまりBERVの機能の1つにエクソソームの形成・放出があるのではないかと考えている。その検討に先駆け、妊娠子宮腔内にエクソソームが存在するか否かヒツジ子宮灌流液を用いて解析を行った。その結果、子宮由来のエクソソームだけでなく、インターフェロンタウを内包した胚由来のエクソソームが子宮腔内に存在した。そこで現在、エクソソームの形成過程にBERVが関わっているか否かをウシ胚由来細胞CT-1などを使用して検討している。本研究の申請時の実施計画では、平成27年度はレトロエレメントの機能解析と発現制御機構の解明であった。各BERVのシークエンス解析に少し遅れが出ている。BERVの機能解析は、解明できていないが、可能性のある機能として胎盤形成・機能維持やエクソソーム形成に関与していると考えている。その前段階として、子宮腔内のエクソソームの存在を確認し、現在投稿中である。また、BERV-K3に関しては、申請時当初予測できなかったlncRNAとの関連性が明らかとなりつつあり、その解析を行っているところである。したがって、現在までの進捗状況は概ね順調であると考えている。本研究の目的は、ウシ着床周辺期胚で発現する内在性レトロウイルス(ERV)の機能を解明することである。本年度は、昨年度申請者が見出した新規ウシ特異的内在性レトロウイルスBERV-K3に関して、その発現誘導機構を解析した。BERV-K3は、着床前の胚トロホブラスト細胞にはほとんど発現が認められず、着床以降の胚トロホブラスト細胞に発現が認められ、妊娠45日で発現がピークに達し、妊娠150日のCotyledonでも発現が認められる。そこで着床後の胚で発現する転写因子群を次世代シークエンサーより精査した。それと同時に5'LTRの配列から結合しうる転写因子群をピックアップし、次世代シークエンサーの解析結果とマッチングさせた。その結果、WNT/TCFシグナルの結合サイトが見つかった。そこで、BERV-K3の発現が見られないウシトロホブラスト細胞株であるCT-1細胞ならびにF3細胞にWNT/TCF7アゴニストを処置し、BERV-K3が誘導されるか確認したところ、BERV-K3が誘導されることが明らかとなった。また、恒常的にBERV-K3を発現している各組織でのTCF7の発現も確認することができた。このことから、BERV-K3は、古典的WNTシグナルによって誘導される因子であることが明らかになった。以上の結果をまとめ、現在投稿準備中である。また、WNTシグナルが深く係る着床期胚の上皮間葉移行(EMT)に関する研究についても投稿準備中である。本研究の申請時の実施計画では、平成28年度はレトロエレメントの発現制御機構の解明であった。BERV-K3に関しては、古典的WNTシグナルにより発現調節が行われていることを明らかにしたため、実施計画通りに進められている。現在、得られた結果をまとめ、投稿準備中である。また、WNTシグナルが深く係るEMTに関しても良好な結果が得られており、こちらも投稿準備中である。哺乳類は原基となる胎生機能を基盤に新たな遺伝子を獲得し、既存の遺伝子の機能を置換させ、種特異的な胎盤形態となっていった。その新たな遺伝子とは、進化の過程で感染し、内在化したレトロウイルス由来の遺伝子であると考えた。

そこで、ウシ着床周辺期胚を用いてトランスクリプトーム解析を行い、着床周辺期の胚において発現するウシ内在性レトロウイルス(BERV)を以下の条件下で探索した。1オープンリーディングフレームが少なくとも100個のアミノ酸をコードするあるいは少なくとも1つの膜貫通ドメインをもつBERV由来の塩基配列だと考えられる遺伝子、2トランスクリプトーム解析に用いたウシ胚(妊娠17、20および22日)のうち、少なくとも2日において発現する遺伝子を抽出した。その結果、着床周辺期胚で発現する10種のBERVを見出した。そのうち、胎盤形成に重要なWNTシグナルによって誘導されるBERVを世界で初めて同定し、BERV-K3と命名した。BERV-K3は、哺乳類が進化の過程で胎盤を獲得するにあたり新たにゲノムに挿入されたPEG10と同様にCCHC型ジンクフィンガードメインを有するGag/Pol由来であった。BERV-K3は着床後の胎盤形成期胚に特異的に発現するだけでなく、腎や腸管、肝臓、皮膚といった組織においても発現していた。BERV-K3の機能解析を検討したが、本申請期間内ではBERV-K3の機能を解明することができなかった。また別のBERVとして、第6染色体に存在し、着床前の胚特異的に発現する遺伝子を見出した。このBERVもまたGag/Pol由来であった。このBERVに関しても、本申請期間内では機能を明らかにすることができなかった。本研究成果により、ウシ胚および胎盤に発現するBERVを見出すことができた。そして、これらBERVがウシ特有の妊娠形態の一端を担うことが予想された。本申請は、ウシ着床期周辺胚に発現する内在性レトロウイルスを探索し、胎盤形成に有用な内在性レトロウイルス遺伝子の機能解析をすることを目的とした。その結果、ウシ胎盤に高発現するBERV-K3を見出した。BERV-K3は胎盤形成に必要な古典的WNTシグナルにより、その発現が誘導されることが明らかとなった。また、X染色体やY染色体に存在する内在性レトロウイルスも見出し、これらは着床前のウシ胚に特異的に発現していることを明らかにした。これらの研究成果は、ウシの妊娠過程において内在性レトロウイルスの関与を示す重要な発見となり、新たな高受胎胚の選別のための候補因子となりうる可能性があることが分かった。比較的解析が進んでいるBERV-K3に関しては、lncRNAとの関係を明らかにし、それらを制御する共通のLong terminal repeat(LTR)に着目して解析を進めていく。具体的には、BERV-K3の5'側および3'側LTRのクローニングを行い、プロモーター活性化機構を解析し、BERV-K3の発現調節機構を解明する。また他のBERVに関してもBERV-K3と同様に進めていく予定である。その際siRNA、CRISPR/Cas9などを使用し、BERVのノックダウン/ノックアウトを作成ウシ、エクソソームの形成を含めた機能解析を行っていく。BERV-K3に関しては、未だ明らかに出来ていない機能に関して解析を進めていく。また、BERV-K3はlncRNAのイントロン部分に存在しているため、このlncRNAとの関係を明らかにしていく。育種繁殖学476円と少額であり必要な物品等購入できないため、次年度に繰越をした。次年度は当申請課題の最終年度となり、最終年度に解析予定の研究に費用がかかると見込んだため、次年度使用額として計上しました。
Rasシグナル伝達経路の研究

Rasタンパク質は、細胞増殖、細胞形態、細胞の生存等に関連したシグナル伝達に重要な役割を果たしている、しかし、生体での生理的機能については明らかでなく、我々は3種類すべてのras遺伝子ノックアウトマウスを作製し、その解析を始めた。増殖因子刺激に対する細胞内シグナル伝達でのRasタンパク質の重要性からは予想されなかったことであるが、H-ras(-/-)マウス、N-ras(-/-)マウスおよび2重欠損マウスは見かけ上、正常に発生、発達し、明らかな解剖学的異常は見いだされなかった。ところが、H-ras(-/-)マウスの中枢神経系では、グルタミン酸受容体の一種であるNMDAチャンネルのチロシンリン酸化の亢進による活性化、および海馬長期増強の上昇が起こっていた。またRasタンパク質がEGF, FGFなどを初めとする成長因子の受容体を介するほかに、NMDAからのシグナルも伝達していることを明らかにした。このようにRasタンパク質は、発生途上もしくは成体で、様々な外界からの刺激に応答する際に重要な働きをしていることが強く示唆された。一方では、K-rasノックアウトマウスで、心筋細胞の増殖異常や前角ニューロンの細胞死等が起こり、従来から考えらていた細胞増殖や細胞の生存へのRasの関与を裏付ける結果も得た。これまで確立された培養細胞株を用いた実験は、多くの細胞で見られる最大公約数的なRasの機能を明らかとしてきたが、rasノックアウトマウスの解析から、我々は細胞外からの刺激に対する細胞内情報伝達経路の集約点の一つであるRasの機能について、発生の時期、特定の臓器、特定Q細胞で、個別のシグナルに対して検討し、海馬の神経細胞では、NMDA受容体から、p38を通り、さらにその下流にRasが位置しており、p38の死のシグナルをRasの生存シグナルで細胞死を止めていることが示された。Rasタンパク質は、細胞増殖、細胞死、細胞の生存等のシグナル伝達に重要な役割を果している。しかし、生体での生理的機能については明らかでなく、Rasを介する生体でのシグナル伝達の役割を明らかにするために、我々は3種類すべてのras遺伝子ノックアウトマウスを作製した。その結果、H-ras(-/-)マウス、N-ras(-/-)マウスおよび2重欠損マウスは見かけ上、正常に発生、発達し、明らかな解剖学的異常は見いだされなかった。ところが、H-ras(-/-)マウスの中枢神経系では、グルタミン酸受容体の一種であるNMDAチャンネルのチロシンリン酸化の亢進による活性化、および海馬長期増強の上昇が起こっていることを見いだした。これらは、Rasタンパク質が脳内でのグルタミン酸からの刺激を伝達していると考えられた。また、一方では、K-rasノックアウトマウスで、心筋細胞の増殖異常や前角ニューロンの細胞死等が起こり、従来から考えらていた細胞増殖や細胞の生存へのRasの関与を裏付けられた。さらに、3種あるRasの機能的な違いを検討するため、我々は遺伝学的解析をさらに進め、N-ras(-/-)K-ras(+/-)で生まれてきたマウスでは、乳糜腹水と小腸にリンパ浮腫を認めた。この異常は多くの遺伝子型のras変異マウスに認められ、3種あるどの正常ras遺伝子のアリルの数が減ってもこの表現型の発生頻度、症状が強くなることから、我々は初めて、3種のrasが共同して働く場を見つけることができ、3種のRasの機能的な重複であることを示した。また、ヒトH-ras遺伝子の導入により、H-ras(-/-)N-ras(-/-)K-ras(-/-)

マウスの発生異常を全て救うことができ、3種のRasの発生段階での機能重複を確認した。Rasタンパク質は、細胞増殖、細胞形態、細胞の生存等に関連したシグナル伝達に重要な役割を果たしている。しかし、生体での生理的機能については明らかでなく、我々は3種類すべてのras遺伝子ノックアウトマウスを作製し、その解析を始めた。増殖因子刺激に対する細胞内シグナル伝達でのRasタンパク質の重要性からは予想されなかったことであるが、H-ras(-/-)マウス、N-ras(-/-)マウスおよび2重欠損マウスは見かけ上、正常に発生、発達し、明らかな解剖学的異常は見いだされなかった。ところが、H-ras(-/-)マウスの中枢神経系では、グルタミン酸受容体の一種であるNMDAチャンネルのチロシンリン酸化の亢進による活性化、および海馬長期増強の上昇が起こっていた。またRasタンパク質がEGF, FGFなどを初めとする成長因子の受容体を介するほかに、NMDAからのシグナルも伝達していることを明らかにした。このようにRasタンパク質は、発生途上もしくは成体で、様々な外界からの刺激に応答する際に重要な働きをしていることが強く示唆された。方ではK-rasノックアウトマウスで、心筋細胞の増殖異常や前角ニューロンの細胞死等が起こり、従来から考えらていた細胞増殖や細胞の生存へのRasの関与を裏付ける結果も得た。これまで確立された培養細胞株を用いた実験は、多くの細胞で見られる最大公約数的なRasの機能を明らかとしてきたが、rasノックアウトマウスの解析から、我々は細胞外からの刺激に対する細胞内情報伝達経路の集約点の一つであるRasの機能について、発生の時期、特定の臓器、特定の細胞で、個別のシグナルに対して検討し、海馬の神経細胞で、はNMDA受容体から、p38を通り、さらにその下流にRasが位置しており、p38の死のシグナルをRasの生存シグナルで細胞死を止めていることが示された。
虚血性心疾患患者の社会的孤立構造モデルの検討

社会的孤立感は、年齢の高い者、女性、配偶者がいない者、無職の者で高く、PCI・CABG両方の治療経験を持つ者、胸痛発作を頻繁に体験している者ほど高かった。構造モデルでは、虚血性心疾患の特徴でもある[胸痛・発作]が[生活への影響]を自覚させ、病気が良くならないという[病気の回復]の不確かさにもつながっていた。さらに[病気の回復]に対する不確かさは[生活への影響]と社会的孤立を促進させていた。また、社会的孤立感は心理反応として[不安]と[混乱]をもたらし,最終的には[抑うつ]を生じさせるという構造が明らかとなった。本研究では虚血性心疾患患者の「社会的孤立」に着目し、その構成要素を明らかにするとともに、関連要因を含めた構造モデルの構築を目指している。21年度は社会的孤立の実態を把握し、構成要素を確認するため、虚血性心疾患(心筋梗塞・狭心症)の治療を継続している患者6名(男性5名、女性1名)を対象に「病気になってから自覚する生活状況の変化」について半構成的インタビューを行った。「病気になってからの社会活動や人間関係の変化」として、発症当時に仕事を有していた者は「仕事内容を変更する、変更させられる」といった職業上の役割変化を体験していた。また、趣味や近所づきあいについては「変化はない」としながらも、「発作が起こらないように」「無理はしないように」という考えや不安が念頭にあり、実際的な活動範囲の縮小には至らないが、心理的な(見えない)制約・規制として常に存在していることが明らかになった。「変化に伴う気分・感情の変化」としては「病気だからしょうがない」とあきらめを示す一方で、発症まで築きあげてきた社会的役割や責任を全うすることが出来ない「焦り」や「不本意」という感情も伴っていた。変化の受け入れには「職場の人間関係」や「家族の理解」があり、ソーシャルサポートの重要性が示唆された。次年度はさらに対象数を増やして、社会的孤立の構成要素および関連要因の整理を進めていくとともに社会的孤立・先行要因・心理反応を加えた概念枠組みを構築し、質問紙原案の作成を行う予定である。本研究は虚血性心疾患患者の「社会的孤立」の構成要素と関連要因を明らかにした上で、社会的孤立の先行要因(原因)と心理反応(結果)を含めた「虚血性心疾患患者の社会的孤立に関する構造モデル」を作成し、その妥当性を検討することを目的としている。22年度は、インタビューデータから抽出した「社会的孤立」の構成要素を元に、概念枠組みを修正しながら、具体的な質問項目の作成・精選を行った。概念枠組みは【社会的孤立】を中心として、影響要因としての【先行要因】、結果として【心理的アウトカム】という大枠で構成された。【先行要因】としては"年齢""性別""職業""家族構成""治療方法""罹病期間"という「個人特性」および"病気の認知""主観的な体調""生活への影響についての自覚""病気の不確かさ"などの「病の受け止め」であり、【社会的孤立】は"活動の縮小""ネットワークの縮小"という「量的側面」、"対人関係の変化""役割喪失""サポート不足"という「質的側面」、および"不本意""不満""寂しさ"という「感情的側面」の3要素となった。また、【心理的アウトカム】としては"緊張""抑うつ""怒り""活気""疲労""混乱"の全般的な気分状態を評価として用いることにした。23年度は、以上の変数に「社会的孤立」の基準関連妥当性を測定するための尺度を加えた質問紙を作成し、虚血性心疾患患者約300名を対象として調査を行う予定である。23年度は、アイテムプールを整理し、3下位尺度9要素43項目の「病者の社会的孤立感尺度(原案)」を作成した。回答形式は5段階評定を用いて「違う(1点)」「やや違う(2点)」,「どちらともいえない(3点)」「ややそうだ(4点)」「そうだ(5点)」とし、得点が高いほど「社会的孤立」の状況にあることを示す尺度とした。外来通院中の虚血性心疾患患者を対象とした質問紙調査を実施し(配布数352、回収数300・回収率85.2%)、3分の1以上の項目で無回答のある10ケースを除いた290名のデータを用いて、尺度の信頼性・妥当性の検証を行った。項目分析によって各質問項目の回答分布

・総得点への寄与を確認後、探索的因子分析(一般化最小二乗法・プロマックス回転)により、最終的に18項目3因子構造からなる「病者の社会的孤立感尺度」を作成した.各因子のCronbach's α係数は,第1因子(関係変化)0.90、第2因子(活動抑制)0.89、第3因子(陰性感情)0.90、尺度全体では0.94と高い内的整合性が認められ、Spearman-Brownの係数は0.96,Guttman係数は0.95と尺度としての基準を満たしているため,社会的孤立感の測定尺度として活用できると判断した。また、Ando, Osada & Kodama Lone liness Scale(AOK孤独感尺度)との併存的妥当性も確認できた。平成24年度は、各尺度得点(病者の社会的孤立感尺度,病気の不確かさ尺度,POMS)に欠損値がない222名(男性183名,女性39名)を対象とし、社会的孤立の先行要因(原因)と心理反応(結果)を含めた「虚血性心疾患患者の社会的孤立に関する構造モデル」を作成し、その妥当性を検証した。社会的孤立感は、年齢の高い者、女性、配偶者がいない者、無職の者で高く、PCI・CABG両方の治療経験を持つ者、胸痛発作を頻繁に体験している者ほど高かった。また、病気が重症であると感じる者、現在の体調が悪い者、病気による生活への影響を強く感じている者、病気の不確かさを高く認知している者ほど社会的孤立感が高く、病気の不確かさの下位尺度では[病気の回復]と[生活予測]が社会的孤立に有意な影響を与えていた。最終的に採択した構造モデルにおいて、先行要因は[胸痛・発作]を起点として[生活への影響](パス係数.48)と[病気の回復](パス係数.38)へ有意なパスが向いており、さらに[生活への影響](パス係数.31)と[病気の回復](パス係数.50)からは社会的孤立感に向けた正のパスが確認できた。また、社会的孤立感からは[不安](パス係数.41)と[混乱](パス係数.19)にパスが向かい、[不安](パス係数.76)と[混乱](パス係数.26)からは[抑うつ]に向けた有意な正のパスが確認できた。なお、最終モデルのχ2検定は(χ2=16.9,p=.077)、適合度指数はCFI=.990、GFI=.979、AGFI=.941と、いずれもモデル適合度の基準を満たしていた。23年度は研究の第3段階として社会的孤立の測定に用いる尺度の開発を進め、「病者の社会的孤立感尺度」を作成できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は当初の計画通り研究を進める予定である。
糖鎖結合性タンパク質の分子認識/反応機構に関する分子基盤の構築

タンパク質と糖鎖の分子認識/相互作用は様々な生体機能の発現において重要であるが、複雑な糖鎖構造を認識するレクチンの分子メカニズム、そして糖鎖を基質として反応する酵素反応機構に関しては、分子レベルの理解で依然として不明な点が多々残されている。本課題では糖鎖認識系の一例としてノロウィルスキャプシドタンパク質を題材として、独自のQM/MM計算を基礎にした複合シミュレーション技術を適用することで、ターゲット糖鎖である血液型糖鎖抗原との糖鎖認識機構を詳細に解析して、血液型糖鎖との親和性を決める分子論的要因を理論計算から明らかにした。またバイオマス分解酵素と反応基質との相互作用解析も並行して実施した。タンパク質と糖鎖との相互作用は生体内の様々な分子認識過程で重要な役割を果たすが、複雑な糖鎖構造とそれを認識する糖鎖結合性タンパク質(レクチン)の糖鎖認識機構の詳細は、依然として不明な点が多々残されており、糖鎖結合を介した基質認識とウィルス感染メカニズムの関連に関しては、更なる研究が期待されている。本研究では、近年初めて複合体の結晶構造が報告されたノロウィルスキャプシドタンパク質を対象として、独自のQM/MM計算を中心とした複合シミュレーション技術を適用することで、ウィルス由来のキャプシドタンパク質と各種血液型糖鎖との相互作用を詳細に解析し、キャプシドタンパク質における各種糖鎖との親和性の差異を決定する分子論的要因を解明するための研究を実行した。各種の糖鎖抗原との糖鎖認識パターンを系統的に解析するため、分子モデリング構造の出発点としては、天然型キャプシドタンパク質とルイスb抗原複合体との結合構造を基準にとり、この構造を基準として、各複合体構造の分子モデリング、相互作用エネルギー成分の解析、結合自由エネルギーの評価をそれぞれ実行した。構造解析実験から得られたデータを直接利用し、QM/MM計算による構造最適化から糖鎖結合サイトの詳細を解析したが、天然型キャプシドタンパク質と変異型タンパク質の間では明確な構造論的差異が確認できず、実験から示唆される糖鎖親和性の変化が説明できなかった。そこで次に、糖鎖結合を定義する自由エネルギー面をシミュレーションで決定し、かつ結合自由エネルギーを直接計算することで、アミノ酸変異が糖鎖親和性に与える影響を定量的に解析した。この結果、糖鎖認識におけるタンパク質と糖鎖の親和性に関しては、糖鎖結合サイト周辺での水和構造の影響が大きいことが明らかになり、キャプシドタンパク質との相互作用だけからは、糖鎖との親和性を評価することが困難であることがわかった。タンパク質と糖鎖との相互作用は生体内の種々の分子認識・酵素反応過程で重要であるが、複雑な構造とそれを認識する糖鎖結合性タンパク質(レクチン)の糖鎖認識機構の詳細は、依然として不明な点が多く残されている。本課題ではウィルスキャプシドタンパク質などの糖鎖認識系、および糖鎖を基質とする酵素反応系を取り上げて、独自のQM/MM計算を中心とした複合シミュレーション技術を適用することで、弱い相互作用で反応する分子の基質認識および化学反応機構の原理を明らかにする。糖鎖認識系のターゲットとしてはノロウィルスキャプシドタンパク質を取り上げて、実験構造を基礎に複合体の分子モデルを構築し、糖鎖認識の差異を生み出す分子機構を理論計算から解析した。複雑な糖鎖構造間の結合自由エネルギーを直接評価することは難しいと考えられるので、まずは糖鎖構造を典型的な糖鎖に固定して、アミノ酸変異が分子認識に及ぼす影響を自由エネルギー変化から解析する手法を考察し、結合サイトの構造パラメータと結合エネルギーの相関を解析した。本研究の重要な成果として、アミノ酸変異が及ぼすタンパク質と糖鎖の相互作用変化の程度よりも、局所的な構造変化に起因した溶媒和の変化の寄与が大きく、タンパク質側との相互作用をいくら精密に解析しても、溶媒和環境の適切な評価ができなければ糖鎖結合の強弱が予想できないことを明らかにした。さらに自由エネルギー計算の問題点として、内部自由度が大きく比較的大きな基質が結合した場合の結合エネルギー変化を見積もること自身が容易ではなく、手法に伴う計算誤差と結合自由エネルギー差がほぼ同じオーダーで出てくるため、効率的な自由エネルギー計算手法の再検討が必要だと考えている。糖鎖構造を固定して一アミノ酸変化が糖鎖結合に与えるエネルギー変化を自由エネルギー計算から評価すること自体はすでに完了しており、必要なデータ解析、エネルギー差の見積もりも終了している。またこれとは別に、糖鎖構造自体を変化させたキャプシドタンパク質複合体のモデル化、QM/MM計算による構造精密化とエネルギー解析、複合体の分子動力学計算も並行して進んでいるので、計算科学研究自体としては、およそ当初計画通りに進行していると考えている。ただ一番の問題は、研究実績の概要でも記載したように、計算から見積もられる自由エネルギー変化が非常に小さい値であり、計算手法に伴う誤差から切り離すことが難しいことと、また特に、比較となるべく実験データが現状ではほとんど存在しないために、結果の検証が計算ベースに頼らざるを得ない点にある。計算結果の検証のために、糖鎖の分子力場パラメータを数パターン用意して結合自由エネルギー計算を何度も繰り返し、計算結果の信頼性を何度も検証したために論文発表用のデータを揃えるのに随分と時間を要してしまった。この点を考慮して、表題の達成度の自己評価とした。タンパク質と糖鎖間の分子認識/相互作用は様々な生体機能にて重要な役割を果たすが、複雑な糖鎖構造と結合するレクチンの分子メカニズム、および糖鎖を基質とする酵素反応に関しては、分子レベルの反応機構で依然として不明な点が多く残されている。本研究課題ではタンパク質の糖鎖認識および酵素反応を取り上げて、独自のQM/MM計算技術を基礎にした複合シミュレーション手法を適用し、弱い相互作用を基礎としたタンパク質の糖鎖認識、それに続く酵素反応機構の分子メカニズムを解明することが目的である。