hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然突然変異の起源とその制御機構

生物は自然突然変異率を一定の低い値に保つためのきわめて精緻な機構を持っている。哺乳動物細胞におけるその機構の実体を分子レベルで明らかにし、遺伝子破壊マウスなどを作製してその機構の生物学的意義を明確にするのが本研究の目的である。自然突然変異の原因の1つとして、生体内の代謝過程で生じる活性酸素によるDNAおよびその前駆体ヌクレオチドの酸化が注目されており、その過程に関与するMTH1遺伝子をとりあげた。MTH1のホモローグは細菌からヒトまで存在しており、大腸菌の欠損株(mutT^.)は高い頻度で自然突然変異を生じることが知られている。そこでMTH1のcDNAおよび遺伝子をヒトとマウスから分離し、その構造とタンパク質産物の活性を明らかにした。このタンパクはdGTPの酸化によって生じる8-oxo-dGTPを8-oxo-dGMPに分解する活性をもっており、それによって誤塩基対合によって突然変異が生じるのを防いでいる。遺伝子ターゲティングによってMTH1^+となった細胞株を樹立したが、その株の自然突然変異率は正常株より高く、さらにMTH1^+のマウスでは自然状態での飼育中に各種の臓器に癌が生じるのが観察された。それとは別にアルキル塩基の修復に関与するMGMT遺伝子についても欠損細胞及び欠損マウスをつくって解析した。MGMT^+の細胞株は正常細胞に比べて明らかにアルキル化剤に対する感受性が高く、高頻度で突然変異を生じた。MGMT^+マウスは比較的低濃度のアルキル化剤の投与によって肝と肺に腫瘍が生じることが認められた。MGMT^+にミスマッチ修復遺伝子欠損を加えることによって、アルキル化剤の致死作用に対しては抵抗性となるが、発癌はよく起こるという現象が見つかり、細胞死と突然変異・発癌の関連について重要な示唆が与えられた。生物は自然突然変異率を一定の低い他に保つためのきわめて精緻な機構をもっているが、哺乳動物細胞におけるその機構の実体を明らかにするのが本研究の目的である。本年度はDNA合成の基質となるヌクレオチドの酸化によって起こる自然突然変異を抑える機構を中心に研究を進めた。DNA合成の基質の1であるdGTPは細胞内で酸化されて8-oxo-dGTPとなるが、これはアデニンと対合することによってDNAにとりこまれるためにトランスバ-ジョン変異を引き起こす。8-oxo-dGTPを8-oxo-dGMPに特異的に分解する酵素をヒトの細胞から精製し、そのアミノ酸配列に基づいてcDNAをクローニングした。cDNAをプローブとしてヒトの遺伝子DNAを分離し解析したところ、MTHIと命名したヒトの遺伝子は約9kbの長さで少なくとも5ケのエキソンから構成していることが明らかになった。またその断片の一部をプローブとして解析した結果、この遺伝子は第7染色体の短腕の先端部7p22に位置することがわかった。ヒト集団におけるこの遺伝子の異常と発癌の関連などを明らかにするための解析系を確立し、いくつかの変異を見出した。またこの遺伝子の異常が自然突然変異や発癌にいかに影響するかを実験的に検討するために、この遺伝子を欠くマウスの作製を行った。マウスからcDNAおよび遺伝子を分離し、その-部を用いてターゲティングベクタ一を構築し、ES細胞の遺伝子を破壊するとともにそれからマウスを育成することに成功した。生物は自然突然変異率を一定の低い値に保つための極めて精緻な機構をもっている。本研究の目的は、哺乳動物細胞で機能している突然変異抑制機構を明らかにすることである。本年度は突然異抑制に働いていると考えられる2種類の酵素、O^6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼと8-oxo-dGTPaseの遺伝子欠損マウスの作製と解析を中心に研究を進めた。

我々が作製したO^6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼの遺伝子欠損マウス(MGMT^<-/->)は独立に樹立した2系統ともアルキル化剤に対して高い感受性を示した。正常マウスが100%生存できる条件下(MNU50mg/kg腹腔内1回投与)でMGMT^<-/->マウスは投与後17日以内にすべて死亡した。平行して得られたMGMT^<-/->の細胞株もアルキル化剤に対する感受性が約100倍上昇しており、哺乳動物においてこの酵素がアルキル化剤によるつ突然変異抑制のみならず致死の抑制にも重要な役割を果たしていることを明らかにできた。今後、自然発がんや薬剤による発がんの頻度をMGMT^<-/->マウスと正常マウスで比較することによって、この酵素が発がん抑制に果たす役割を明らかにしたいと考えている。一方で8-oxo-dGTPaseの遺伝子欠損マウス(MTH1^<-/->)の作製にも成功し、現在コロニーを拡大中である。DNA中の8-oxo-dGの代謝、修復には複数のシステムが働いており、これらの新しい遺伝子の検索も平行して行なっている。また医学的見地から、これらの遺伝子に異常を持つ個体のヒト集団中の検索をPCR-SSCP等を用いて行っている。生物は自然突然変異率を一定の低い値に保つためのきわめて精緻な機構を持っている。哺乳動物細胞におけるその機構の実体を分子レベルで明らかにし、遺伝子破壊マウスなどを作製してその機構の生物学的意義を明確にするのが本研究の目的である。自然突然変異の原因の1つとして、生体内の代謝過程で生じる活性酸素によるDNAおよびその前駆体ヌクレオチドの酸化が注目されており、その過程に関与するMTH1遺伝子をとりあげた。MTH1のホモローグは細菌からヒトまで存在しており、大腸菌の欠損株(mutT^-)は高い頻度で自然突然変異を生じることが知られている。そこでMTH1のcDNAおよび遺伝子をヒトとマウスから分離し、その構造とタンパク質産物の活性を明らかにした。このタンパクはdGTPの酸化によって生じる8-oxo-dGTPを8-oxo-dGMPに分解する活性をもっており、それによって誤塩基対合によって突然変異が生じるのを防いでいる。遺伝子ターゲティングによってMTH1^<-1->となった細胞株を樹立したが、その株の自然突然変異率は正常株より高く、さらにMTH1^<-1->のマウスでは自然状態での飼育中に各種の臓器に癌が生じるのが観察された。それとは別にアルキル化塩基の修復に関与するMGMT遺伝子についても欠損細胞及び欠損マウスをつくって解析した。MGMT^<-1->の細胞株は正常細胞に比べて明らかにアルキル化剤に対する感受性が高く、高頻度で突然変異を生じた。MGMT^<-1->マウスは比較的低濃度のアルキル化剤の投与によって肝と肺に腫瘍が生じることが認められた。MGMT^<-1->にミスマッチ修復
近赤外光を用いた末梢静脈可視化システムにおける基礎研究

本研究の目的は、失敗する可能性の高い目視困難な末梢静脈を可視化する装置開発を最終目的に、近赤外光を用いた静脈透視技術と画像処理技術の課題を解決することである。これらの共通課題は深層静脈の可視化である。静脈透視技術について可視性に影響する光源とカメラと皮膚の位置関係、ナローバンドの効果、偏光フィルターの角度について検討した。その結果、これらの角度等により静脈の見え方は違いがあり最適値付近が明らかになった。画像処理技術の改良によってこれまでのプロトタイプより静脈可視化率が向上した。静脈の深さではなくコントラストの向上が功を奏した。臨床の意見を基に穿刺に有用な画像処理技術も向上した。本研究の目的は、危険性の高い末梢静脈穿刺を安全・確実に実施するために、目視困難な静脈を可視化する技術開発である。申請者らはこれまで光を透視原理に用い、臨床技術に適応する基本透視システムを明らかにした。だが、未だ十分とはいえない可視化性能について、1静脈の透視技術、2画像処理技術の課題を解決することを研究計画とする。この技術は、申請者らが確立した目視困難静脈の計測手法と評価方法を用いて性能を評価する。1静脈透視技術の設計目視困難静脈の90%を可視化するため、深層静脈の(約5-7mm)静脈透視技術方法を確立する。申請者らは、静脈の深さに適応する光の波長域については実験より選択できている。今回は、静脈の可視性に影響すると考えられる入射光(光源)と受光(カメラ)の位置関係について比較検討する。ヘモグロビンの吸光を受けた散乱光はかなり弱い。そのため入射光の量を増加する必要があるが、ハレーションの発生や周囲組織の散乱光も強くなり、見える静脈が見えなくなる可能性がある。これについては入射光の増加について、光源のLEDの個数だけでなく、パルス駆動、偏光フィルターの設置、角度の適合性を検討する。2画像処理プログラムの開発透視画像の解析・処理によって静脈の深さ情報を表示する。これに向け、静脈の深さ表示が可能な理論の適合を検討する。申請者らは、目視困難な静脈の深層静脈(約5-7mm)では画像処理が不可欠であることを、これまでの実験結果から確信している。利用可能な理論として差分解析法、ハエトリグモの主眼の奥行き知覚メカニズム(Nagata 2012)を提案している。差分解析法は予備的に検討しているが、実用性は低かった。その理由は、幾つかの光波長で撮像した画像の情報量に差異が少なかったことによる。これは深層静脈を可視化することで実用性が高まると考えられる。1とともに理論の適合性を検討する。本研究の目的は、危険性の高い目視困難な末梢静脈を穿刺する技術向上のために、目視困難な静脈を可視化する基礎技術を開発することである。本研究計画では、これまで目視困難静脈の70%を可視化した試作機器を基に、90%を可視化する静脈透視技術方法を確立するハードウェアシステム、画像処理プログラムを開発することとした。また、獲得した画像から深さ静脈を可視化する画像処理プログラムを開発し、臨床適合性を評価することとした。当該年度は主に画像処理プログラムの開発により健常者でのプレテストから(Kimori, et al. 2014)、臨床での高齢者の目視困難な静脈を約85-90%可視化することを検証している。これは既存機器の可視化率、約50-60%より有意に高く、可視化性能は優れているといえる。しかし、未だ可視化が十分とはいえない深層静脈について基本システムの見直し、画像処理プログラムの再検討を継続している。この調査から得られた画像から深さ情報を得る画像処理プログラムは成功にいたっていない。これは臨床の目視困難静脈の深さ範囲が非常に限られていたこと、深層静脈の可視化性能が不十分だったことが影響する。先ずは、確実に深層静脈を可視化する技術を優先する必要があると考え、技術改善を進めている。本研究の目的は危険性の高い末梢静脈穿刺を安全・確実に実施するために、目視困難な静脈を可視化する技術開発である。静脈を可視化する原理に近赤外光を用い、1静脈の透視技術、2画像処理技術の課題解決に取り組んだ。静脈の透視技術について、目視困難な深層静脈(皮下5-7mm)の可視化が目標である。十分に検討されていなかった光源と皮膚との距離、角度、偏光フィルターの設置と角度について違いがあるかを検討した。これらは距離や角度によって静脈の見え方が異なることがわかり、距離は約30cm、光源と皮膚は垂直、偏光フィルターの角度は45度が最適値付近であることがわかった。しかし、課題として、静脈の見えやすさに違いはあるものの静脈の深さまでの違いには及ばなかった。また臨床適応性を包含してはいない。例えば病室には太陽光の影響を受ける可能性がある。深さに影響する光波長域は先行研究等から選択していたが、詳細・厳密には検討されていない。今後の課題である。画像処理技術は、コントラストの強調技術により高齢者の目視困難静脈を約90%可視化した。また、臨床の意見を基に現在の穿刺技術を妨げない有用な画像獲得に向け、可視光画像と近赤外光画像をオーバーレイする手法を開発した。

画像処理技術の進展により目視困難静脈の90%を可視化したものの、残りの10%は本当に臨床ニーズの高い、目視困難な深層静脈と考えられる。深層静脈を可視化するには画像処理だけでは限界がある。未だ十分詳細が検討されず最適値がわかっていない光波長域の課題解決が必要である。本研究の目的は、失敗する可能性の高い目視困難な末梢静脈を可視化する装置開発を最終目的に、近赤外光を用いた静脈透視技術と画像処理技術の課題を解決することである。これらの共通課題は深層静脈の可視化である。静脈透視技術について可視性に影響する光源とカメラと皮膚の位置関係、ナローバンドの効果、偏光フィルターの角度について検討した。その結果、これらの角度等により静脈の見え方は違いがあり最適値付近が明らかになった。画像処理技術の改良によってこれまでのプロトタイプより静脈可視化率が向上した。静脈の深さではなくコントラストの向上が功を奏した。臨床の意見を基に穿刺に有用な画像処理技術も向上した。本研究計画の目標は、目視困難静脈の90%以上を可視化する静脈透視技術方法を確立するハードウェアシステム、画像処理プログラムを開発することとしている。約85%の可視化率を持つ試作機器の開発には至ったものの、未だ深層静脈の可視化が十分とはいえない。5%不足する可視化性能に臨床ニーズが高いと考えられる。この対策としてハードウェアシステムを再度見直すこととした。具体的には、効果が期待できる材料、および使用における最適値を決定するため、あらたに材料を購入することとした。しかし、在庫不足や性能不足のため材料の入手が遅れた。これにより基礎実験も遅れることになった。従って補助期間延長を申請し研究期間延長を得て目標達成を目指すこととした。基礎看護学技術本研究が目指す静脈可視化性能の向上に注意しなければならないことがある。それは機器の操作性である。臨床に普及する機器にするためには静脈可視化性能以外に、病室で簡便に使用できる機器が必要となる。そのため静脈を透視する基本システムの材料の配置については特に臨床使用を意識しなければならない。この点を踏まえて、残存している基礎実験としてハードウェアシステムを構築する。深層静脈を可視化することは容易ではなく、研究者ら以外からも知見を得て、機器を改良していく必要がある。このため、実験結果を学会に発表する。得られた知見は追加実験として実施していく。そして、機器の改良後は臨床評価していくこととする。その際、機器を安定させ安全に使用するために企業に試作機器の作成を依頼する。1目視困難静脈が走行するのは深さ7mm以内だが、現在は4-5mm程度の可視化性能となっている。深さ5-7mmの静脈を可視化するために偏光フィルターを用いて過剰反射を回避しながら光量を増加させること、光源の波長域を狭帯域にするためのフィルターを使用し検証中である。だが偏光フィルターに反射型偏光フィルターは実用性が低く使用できないことがわかった。2画像処理技術は、近赤外光透視画像の静脈に強調処理を加え、さらに静脈深度を反映した静脈画像へと加工し静脈像を可視化できることとを目指し、ノイズ処理も包含しながら人の眼では確認しにくい近赤外光透視画像を静脈がみえる画像へと検討し続けている。さらに穿刺部位から目を離さずに静脈像を観察しながらハンズフリーで穿刺可能であることも臨床では期待されている。
近世日本の「重商主義」思想研究-西欧「重商主義」概念・導入上の再検討

平成5年度における研究としては、同年度「科学研究費補助金」申請の際に提出した「平成5年度研究計画」のほぼ80%を消化した。具体的には、1.二宮尊徳に関する調査と研究会報告・論文執筆、2.イギリス「重商主義」についての解釈論の研究(邦訳)、3.学会報告(経済学史学会)の三点である。その内容は次のようである。1.二宮尊徳関係:(1)調査・史料収集;【.encircled1.】栃木県二宮町(桜町陣屋跡・二宮神社)、【.encircled2.】今市市(報徳文庫・報徳仕法地・二宮神社)、【.encircled3.】小田原報徳資料館・尊徳記念館、(2)研究会報告;尊徳『三才報徳金毛録』(報徳理論)についての報告(国学院大学「芝蘭会」10月)、(3)同『三才報徳金毛録』についての論文執筆(「研究発表欄」を参照)。3.学会報告:「経済学史学会」第57回大会報告(金沢大学・11月);報告課題「近世日本の経済思想と『重商主義』-概念導入上の問題と検討-(科学研究費申請「研究課題」と同一課題)【同学会では、過去5年間にわたる報告者の近世日本の「重商主」思想研究(日本的「外国貿易型『重商主義』思想研究)をもとに、上述したJ.Vinerの「重商主義」論を紹介し、Vinerの多様な解釈を導入・応用しつつ、二宮尊徳を代表例とする「日本的・農業型『重商主義』」論を提示した。】なお、その他、近世日本「重商主義」思想に関する研究史の整理をおこなった(400字×90枚)。
微分方程式および関連分野の研究

偏微分方程式論の研究とその関連分野の研究がすすめられ、下記の成果が得られた。1松村、梶谷、若林、柴田等の偏微分方程式論グループでは非線型双曲型方程式系に対するCaucky問題の可解性、線型偏微分方程式に対するcaucky間題の実解析解の大局的可解性、一般化されたハミルトン流を双曲型初期値問題の解の特異性、双曲型方程式のGeurey族における可解性と解の特異性、非線型波動方程式に体する初期-境界値混合問題の適切性の解明がなされた。2村松を中心とするグループでは擬微分作用素の有界性の研究でBesor空間の理論を応用することにより、シンボルに対する正則性の仮定を改良した。また平良は拡散過程と境界値問題に関する著者自身の仕事を含め解説する書物を執筆した。3神田、笠原等確率論グループでは確率変数の和に対する極限定理の解明がなされた。4渡辺を中心とするグループでは解析的超曲面の弧立正規特異点の多重種数の研究を行い、それを求める公式を得た。5高橋、中川久、伊藤等によるグループでは極小部分多様体、Yang-Mill接続の幾何学的構造、調和写像の解明がなされた。6児玉、中川良、保科、金戸等によるグループではshape理論、位相空間論、次元論の研究がすすめられ、積空間の正規性等についての結果を得た。
注射薬に対する薬剤情報提供文書用いた服薬指導の有用性評価

○研究目的:入院中に抗がん剤の注射薬を処方されている患者に対して、薬剤情報提供資料を用いて薬剤師が説明することが、患者・家族・薬学教育にとって有用かどうかを検討することを目的とした。○研究方法:抗がん剤の注射薬を処方されている患者に対して薬剤情報提供資料を用いて服薬指導をおこない、以下の点について患者・医療従事者・実習生・新人薬剤師に対しアンケートを行い検討する。1.患者の理解度・満足度がシステム導入でどのように変化するか。2.実習生や新人薬剤師の教育に対する有用性。薬剤情報提供文書は、さまざまな化学療法のレジメンに対応して作成する。出力文書には写真や表などを多用し、患者にとって理解しやすいものとする。また効果や副作用などの患者へ提供する情報については、書籍や論文、製薬企業などからの情報をもとに作成し、それについて当該医師や看護師らと十分協議し、情報の吟味と更新を定期的に行うこととする。これら紙媒体での説明に加え、ノート型パーソナルコンピュータを患者のところへ持参し、作成した動画やスライドショーを用いた場合と比較する。○研究成果:薬剤情報提供文書(紙媒体)は、白血病4種、悪性リンパ腫4種、多発性骨髄腫3種、大腸がん3種、胃がん1種、食道がん1種、膵がん1種の計17種類のレジメンについて作成することができた。また動画を含んだスライドショーは白血病1種、悪性リンパ腫1種、大腸癌2種の計4種類について作成した。研究期間中、これらの資料を使用して服薬指導を行った患者数は6名であり、また実習隼や新人薬剤師に資料を用いて服薬指導を行う機会を設けることができず、統計的な調査は不可能であった。今年度は資料作成でほとんどの時間を費やしてしまったため、今後はこれらを用いて引き続き有用性の検討を行っていく。
ブタ正常肺および家兎腫瘍肺モデルのラジオ波凝固時における組織内温度分布の測定

正常ブタ肺を用いた実験結果では,展開型電極針の内側は腫瘍凝固に必要な高温に達した。一方,電極針の外側では温度の上昇は不十分であった。従って,腫瘍壊死を確実に得るためには,展開した針の内側に腫瘍を位置させて焼灼を行うことが望ましい。展開針内であっても,温度分布が不均一なために焼け残しが生じる恐れがある。それを防ぐために,腫瘍の同じ部位を2回繰り返して焼灼したり,電極針を前後させて重ね焼きを行う工夫が必要である。ブタ6匹の正常肺に対し、温度測定を行った。全身麻酔の後、まず皮膚を穿刺した後、CT画像でモニターしながら電極のLeVeen針を肺内に進めた。電極先端が肺実質内に達したことを確認の後針を展開した。次いで、先端に温度センサーを有する細径のカテーテル型デジタル温度計を、同様にCT画像でモニターしながら経皮的に肺内に刺入した。デジタル温度計は4本使用し、2本は展開した電極針の内側に、もう2本は展開の外側に刺入し、CTで電極と温度計の距離を計測した。この後ラジオ波を通電し、通電中の組織内温度をリアルタイムに4本同時に測定した。ラジオ波通電は、組織焼灼の目安となるロールオフに達するまで行った。この際、ラジオ波発生装置をコンピューターに接続し、RFA施行中のラジオ波出力と回路のインピーダンスの経時的な変化を、リアルタイムでデータ収集した。データ収集用のソフトウェアは、我々が独自に開発したソフトウェアを使用した。デジタル温度計のデータも同時にコンピューターにて収集し、数値とグラフの両方の値を得た。1週後にブタをと殺して焼灼した肺組織を取り出し、組織観察を目的に固定標本を作製した。今年度は3cm径のLeVeen針を用い、ブタ1匹で両下肺野の2カ所から計12個のデータを得た。またCT画像のDICOMデータも収集した。現在、これらのデータの照合と組織を観察中である。興味ある知見が得られており、成績がまとまり次第中間成績として発表予定である。前年度に施行したブタ正常肺のLeVeen針によるラジオ波凝固療法中の温度測定結果をまとめ,解析検討を行った。その結果,展開針の内側の測定点では60°C以上の温度に達した。展開針の外側の測定点ではいずれも53°C以下であった。展開針の内側では蛋白質の変成に必要な55°C以上を達成しており,抗腫瘍効果を得る可能性が期待される。一方0展開針の外側では温度上昇は少なく,本療法では高熱の範囲が限局的であり,周囲肺実質に損傷は少ないと予想される。上記の結果を,オーストリアのウィーン市で開催されたEuropean Congress of Radiology(欧州放射線学会総会)2010で報告した。本学会は放射線医学の領域で世界最高レベルの学術発表大会であり,世界中の研究者が最新の成果を発表する場である。ここで発表し,意見交換できたことは今後の研究に有益であった。動物実験は,VX2腫瘍を肺に植え付けた家兎に対し2cm径のLeVeen針を用いて腫瘍のラジオ波凝固療法を行った。ただ対象肺が想定以上に小さく,2cm径のLeVeen針であっても適所への刺入が難しく,加えて温度計の刺入はさらに困難であった。そのため,有意な実験成績を得ることができなかった。そこで,家兎を大柄の種類に変更したり手技の熟練などの改善により,結果を得る目処をつけることができた。今年度は引き続き腫瘍実験を重ね0目的とする成果を得るとともに学会発表,論文投稿を予定している。前々年度,前年度に施行したブタ正常肺のLeVeen針によるラジオ波凝固療法中の温度測定とその解析検討結果から,展開針の内側では蛋白凝固に必要な60°C以上の温度上昇を達成していると考えられた。そこで腫瘍壊死効果を実証する目的で,本年はVX2腫瘍を肺に植え付けた家兎を対象に腫瘍実験を行った。家兎5匹に対し,動物専用CTを用いたCTガイド下で展開径2cmのLeVeen針にて腫瘍を穿刺し,その近傍に光ファイバー温度センサーを刺入を試みた。しかし標的腫瘍が1cm以下と小さいため穿刺が想定以上に困難で,かつ肺自体も小さかったこと,ブタに比べて家兎は脆弱ですぐに気胸を惹起し,穿刺を繰り返すうちに死亡してしまい実験の継続に難渋した。そこでそれ以上の動物実験はいったん中止し,臨床応用の機会を待つこととした。目的とした肺腫瘍ではなかったが,泌尿器科の協力のもとに腎腫瘤に対するRFAと光ファイバー温度センサー2本による温度測定の臨床応用を行うことができた。実施に当たっては院内倫理委員会の承認と患者からインフォームドコンセントを取得した。展開径3cmのLeVeen針でRFAを行った結果,展開径の内側で温度は約60度の達した。

RFA中の出力と温度データをリアルタイムにコンピュータに記録しており,今後解析を行う予定である。なお,手技中に熱感の訴えがあった他に術中,術後に問題となる合併症を認めなかった。臨床経過は現在追跡中であり年度内の発表に間に合わなかったが,結果がまとまり次第報告する。
低緯度電離圏不規則構造のレーダー・イメージング観測

インドネシアにおいてVHFレーダーを用いて電離圏E及びF領域の沿磁力線不規則構造(Field-Aligned Irregularity;FAI)の連続観測を行い、FAI発生頻度の地方時、季節及び太陽活動度依存性や伝搬特性、ドリフト速度などの統計的性質を明らかにした。特に、これまで研究されてこなかった、低太陽活動期に発生する真夜中過ぎFAIの特性を明らかにし、その生成機構がプラズマバブルおよび中規模伝搬性電離圏優乱に起因し得ることを示した。赤道域に位置するインドネシア・スマトラ島のコトタバンにおいて、VHFレーダーによる電離圏沿磁力線不規則構造(FAI)の連続観測を実施した。さらに、2009年8月には、受信専用装置を追加し、FAIのレーダー・イメージング観測を可能にした。また、コトタバンに設置された赤道大気レーダーや光学観測装置、GPS受信装置で得られた観測データも活用し、FAIについて以下の新しい知見を得た。1. VHFレーダーによって観測されたF領域FAIは、プラズマバブルに伴うものだけでなく、5-8月の真夜中過ぎに発生するものも存在することが明らかになった。真夜中過ぎのFAIは、中緯度で観測されるF領域FAIと類似した特徴をもつ。しかし、中緯度におけるFAIは、中規模伝搬性電離圏擾乱(MSTID)を伴うが、コトタバンにおける光学観測やGPSによる全電子数観測では、このようなMSTIDは見られず、FAI生成機構に関してさらなる研究が必要である。2. E領域FAIについて統計解析を行い、その発生頻度には半日周期変動が見られることを明らかにした。FAIのドップラー速度は、エコー領域上部においては背景のExBドリフトの方向に一致するが、エコー領域下部では反対方向であり、東西成分は昼に東向き、夜間は西向きの傾向が見られた。3. EARを用い、昼間の高度150km付近に発生する"150kmエコー"とよばれる現象の統計解析を行い、(1)150kmエコーの発生高度は11月で高くなること、(2)エコー発生高度の時間変化の大きさは4月、11月で小さくなること、(3)エコー強度は西向きビームよりも東向きビームで観測した方が強く、この特徴は季節によらず一年中そんざいすることを明らかにした。1.インドネシア・スマトラ島コトタバンの京都大学赤道大気レーダー(EAR)サイトにおいて、送信周波数30.8MHzのVHFレーダーを用いたF領域沿磁力線不規則構造(FAI)の連続観測を継続して行うとともに、2009年に設置した5チャンネル受信専用装置を用いてFAIのレーダー・イメージング観測を行い、FAIの微細構造を明らかにした。また、EARによるFAIの周波数領域イメージング観測を行うための予備観測を実施し、受信機間の位相を調整することによりイメージング観測が可能であることを確認した。2.F領域FAIの連続観測から、従来から知られているものとは異なり、5-8月の真夜中過ぎにFAIの発生頻度が高いことを明らかにし、このFAIが低太陽活動期に特有の現象であることを明らかにした。情報通信研究機構のイオゾンデ観測データを統計解析し、5-8月の真夜中にF層高度の一時的な上昇があることを明らかにした。この結果より、F層上昇時にプラズマバブルが発生し、それに伴って真夜中過ぎFAIが発生していると考えられる。このF層上昇の原因として、東向き電場による上向きExBドリフトと真夜中付近の中性大気温度上層に伴う南北風の影響とが考えられる。3.真夜中過ぎFAIと米国のC/NOFS衛星で観測された電子密度及びプラズマ・ドリフト速度データを比較し、FAI発生領域において電子密度が減少し、ドリフト速度が上向きであることを明らかにした。この結果は、真夜中過ぎFAIがプラズマバブルに起因するものであることを示唆する。しかし、FAI発生領域が電子密度減少領域の西側に一致することなど、日没時に発生するプラズマバブルやFAIとは異なる性質をもつことも明らかになった。インドネシア・スマトラ島コトタバンの京都大学赤道大気レーダー(EAR)サイトにおいて、送信周波数30.8MHzのVHFレーダーを用いたE領域及びF領域沿磁力線不規則構造(FAI)の連続観測を継続して行うとともに、2009年に設置した5チャンネル受信専用装置を用いてFAIのレーダー・イメージング観測を行い、FAIの微細構造を明らかにした。得られた研究成果は、以下の通りである。1.F領域FAIの連続観測から、従来から知られているFAIとは異なり、5-8月の真夜中過ぎにFAIの発生頻度が高いことを明らかにし、このFAIの多くが西向きに伝搬することを統計的に明らかにした。また。この真夜中過ぎFAIの発生頻度は、太陽活動度に対して顕著な逆相関を示すことを明らかにした。さらに、情報通信研究機構のイオゾンデ観測データを統計解析し、5-8月の真夜中にF層高度の一時的な上昇があることを明らかにした。

これらの観測結果をもとに、モデル計算を行い、F層が上昇するにともなってRayleigh-Taylor不安定の成長率が大きくなりプラズマバブルが発生したことが真夜中過ぎFAIの生成原因であると考えられることを示した。2.VHFレーダーによって観測されたE領域FAIの発生頻度及びドップラー速度の統計解析を行った。その結果、E領域FAIの発生頻度は、顕著な半日周期変動を示すことが明らかになった。この結果より、半日周期の大気潮汐波がスポラディックE層の生成に強く関与しており、E領域FAIはスポラディックE層に伴って発生していると考えられる。また、FAIエコーのドップラー速度は、高度約94km以上電離圏電場によるExBドリフトの方向に一致するが、約94km以下では中性大気風速の影響を強く受けていることが明らかになった。
新規細胞運命追跡法を用いたメモリーCD8T細胞分化機構の解明

近年、メモリーCD8陽性T細胞には局在、遊走能、機能の異なる細胞が多く存在し、きわめて不均一な集団であることが明らかにされたが、その分化の機構についてはいまだ不明な点が多く残されている。本研究では、一部のKLRG1陽性のエフェクターCD8陽性T細胞はKLRG1を一時的に発現したのち消失し、高い細胞障害活性および増殖能をもつさまざまな種類のメモリーCD8陽性T細胞へと分化することを見い出した。本研究により、エフェクターCD8陽性T細胞はこれまで考えられていた以上に高い分化の可塑性をもち、この可塑性がメモリーCD8陽性T細胞の多様性や長期的な生体防御応答の形成に貢献することが明らかにされた。ワクチン接種や病原体感染・排除後に形成されるメモリーT細胞は免疫記憶の成立に中心的な役割を果たすが、その形成機構は未だ明らかにされていない。我々はメモリーCD8 T細胞の分化機構を解明する目的で、CD8 T細胞の活性化・増殖に伴い発現する「終末分化」マーカーとして知られるKLRG1(Killer cell Lectin-like Receptor G1)遺伝子に注目し、KLRG1を発現した細胞を遺伝学的に標識・運命追跡できる実験系を確立した。さらに、リステリア細菌感染モデルにおいて細胞運命追跡法を用いることにより、KLRG1発現を消失した新たなメモリーCD8 T細胞集団(exKLRG1細胞)を同定した。exKLRG1細胞はリステリア細菌感染後5日目頃より出現し、10日目頃にピークを示し、長期間生存可能な能力を有するセントラルメモリー、エフェクターメモリー、及び、組織潜在型メモリーCD8 T細胞へと分化できることが明らかとなった。一方で、KLRG1を発現し続けている細胞のほとんどはエフェクターメモリー細胞であり、組織潜在型メモリーCD8 T細胞集団内には確認できなかった。エフェクターCD8 T細胞の解析により、exKLRG1はKLRG1を発現し続けている細胞やKLRG1を一度も発現していない細胞と比べ、T-bet、Blimp1や、Ki67といったエフェクターT細胞の分化や増殖に関連した分子を中程度に発現していた。この結果と一致して、メモリーexKLRG1細胞は高い細胞障害活性能を維持していることが分かった。以上の結果、KLRG1+ CD8 T細胞は可塑性を有し、エフェクターCD8T細胞の分化段階で抗原や炎症性サイトカインに中程度に反応した細胞がexKLRG1細胞となり、全てのメモリーCD8 T細胞サブセットへと分化することで免疫記憶の成立に関与していることが示唆された。KLRG1を発現した細胞を遺伝学的に標識・運命追跡できる実験系を確立し、KLRG1+ CD8 T細胞は可塑性を有し、高い細胞障害活性能を有する長期間生存可能なメモリーCD8 T細胞へと分化できる、という仮説を確認できた。メモリーCD8陽性T細胞は病原体の感染やがんに対する生体防御において必須の役割をはたす。これまで、非常に強い抗原の刺激をうけたエフェクターCD8陽性T細胞はKLRG1を発現し、かぎられたメモリーCD8陽性T細胞への分化能しかもたないと考えられていた。本研究において、我々は、一部のKLRG1陽性のエフェクターCD8陽性T細胞はKLRG1を一時的に発現したのち消失し、高い細胞障害活性および増殖能をもつさまざまな種類のメモリーCD8陽性T細胞へと分化することを見い出し、KLRG1を発現した経験はあるがその発現を消失した細胞をexKLRG1細胞と名づけた。exKLRG1細胞の分化は転写因子Bach2に依存し、肺におけるインフルエンザの感染や皮膚がんに対し高い生体防御能をもつ多彩な機能を兼ね備えた細胞の集団であることが明らかにされた。以上の結果、エフェクターCD8陽性T細胞はこれまで考えられていた以上に高い分化の可塑性をもち、この可塑性がメモリーCD8陽性T細胞の多様性や長期的な生体防御応答の形成に貢献することが明らかにされた。今後は、exKLRG1細胞の前駆細胞や分化機構を同定し、さらに細胞移入実験によりexKLRG1細胞の機能を詳細に解析することで、KLRG1+ CD8 T細胞の可塑性がどのようにメモリーCD8 T細胞の機能的多様性に影響を与えるのかについて解析していく。免疫学
タンパク質膜透過装紙SecA-SecYE複合体の構造解析

タンパク質が膜を越える反応は、全ての生物で見られる普遍的な生命現象であり、そのメカニズムの解明は、細胞生物学の最も基本的かつ重要な研究課題の1つといえる。タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャネル」を介して起こる。進化的に保存された膜内在性タンパク質からなるSecYE/Sec61複合体が中心的な役割を果たしているが、その実体は不明である。本研究は、膜透過駆動モーターSecAとSecYEとの複合体の分子レベルの高次構造を明らかにし、タンパク質の膜透過の機構を分子レベルで明らかにすることを最終的な目的として、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質を材料にX線結晶構造解析を進めた。昨年までにTSecA, TSecYEの発現・精製系は構築済みであり、TsecAについては、2.8Å分解能で立体構造を明らかにしている。TsecYEも6Å分解能のデータセットは得られていたものの、分子レベルの構造決定には、更なる結晶の質の改良が必要であった。そこで、今年は、TSecYEに対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、そのFabフラグメントとTSecYE複合体共結晶の構造解析を試みた。TSecYEと安定に複合体を形成できるモノクローナル抗体株の樹立・Fab化にも成功した。調製したFabがTSecYEと安定な複合体を形成する事は、ゲルろ過等の実験から確認した。このTSecYE-Fab複合体を用いく結晶化を進め、既にとある条件で共結晶を得ている。現在、結晶化条件の最適化を進めている。上記のプロジェクトと平行して、膜透過装置と複合体を形成し、機能制御を行っているSecDFタンパク質の精製結晶化も進め、TSecDFの3次元結晶を得て、予備的X線データの取得も終了している。現在は、モデルの精密化を進めている、近々世界に先駆けて立体構造が報告できるものと期待している。タンパク質が膜を超える反応は、全ての生物で見られる普遍的な生命現象であり、そのメカニズムの解明は、細胞生物学の最も基本的かつ、重要な研究課題の1つといえる。タンパク質膜透過反応は、膜透過「チャンネル」を介して起こる。生物間で保存された膜内在性タンパク質からなるSecYE/Sec61が中心的な役割を果たしているが、その実体は不明である。本研究は、SecA-SecYE複合体の高次構造を明らかにすることを目的として、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質を、構造解析の材料として用いている。既存のTSecYE複合体の大量発現精製系を用いて、サンプル調製に成功した。幾つかの条件で構造解析に適した結晶も得られており、6Å分解能のデータセットの取得に成功している。TSecYE-TSecA複合体の構造解析には、SecYEとSecAの安定な複合体を形成させることが必要となる。一方で、通常のTSecYE複合体は、溶液中では、TSecAとの安定な相互作用は確認できない。そこで、SecY分子2つをタンデムにつないだSecYY-E_2複合体を構築したところ、可溶化条件下においてもSecAとの安定な複合体形成が確認できた。TSecYE-TSecA複合体構造解析の手がかりが得られた。タンパク質が膜を越える反応は、全ての生物で見られる普遍的な生命現象でありそのメカニズムの解明は、細胞生物学の最も基本的かつ重要な研究課題の1つといえる。

本研究は、膜透過駆動モーターSecAとSecYEとの複合体の分子レベルの高次構造を明らかにし、タンパク質の膜透過の機構を分子レベルで明らかにすることを最終的な目的として、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のタンパク質を材料にX線結晶構造解析を進めた。昨年までにTSecA, TSecYEの発現・精製系は構築済みであり、TSecAについては、2.8Å分解能で立体構造を明らかにしている。TSecYEも6Å分解能のデータセットは得られていたものの、分子レベルの構造決定には、更なる結晶の質の改良が必要であった。そこで、今年は、TSecYEに対する特異的なモノクローナル抗体を作製し、そのFabフラグメントとTSecYE複合体共結晶の構造解析を試みた。TSecYEと安定に複合体を形成できるモノクローナル抗体株の樹立・Fab化にも成功した。調製したFabがTSecYEと安定な複合体を形成する事は、ゲルろ過等の実験から確認した。このTSecYE-Fab複合体を用いて結晶化を進め、既にとある条件で共結晶を得ている。現在、結晶化条件の最適化を進めている。上記のプロジェクトと平行して、膜透過装置と複合体を形成し、機能制御を行っているSecDFタンパク質の精製結晶化も進め、TSecDFの3次元結晶を得て、予備的X線データの取得も終了している。現在は、モデルの精密化を進めている、近々世界に先駆けて立体構造が報告できるものと期待している。
300℃以上の温度差で稼働するpistonlessスターリングヒートポンプの開発

本研究では排熱を利用して,熱力学的に高品位な熱を作り出すことが可能なヒートポンプの開発を行った.開発したヒートポンプは二つの特徴を有している.一つは仕事から熱へのエネルギー変換を可動部なしで実行できる点であり,もう一つは多様な温度域の熱を作り出せる点にある.実験の結果,低温熱源を室温とした場合,380°Cを実現し,150°Cでの成績係数は1.1であった.また,同じ構造の装置を冷凍機として動かした場合(高温熱浴を室温とした場合),最低到達温度は-50°Cで0°Cでの成績係数は0.8となった.本年度はループ管と共鳴管で構成された熱音響ヒートポンプを設計・製作し,さらに加熱可能温度と成績係数(加熱量/入力(音響)仕事)を測定した.100°C以上での加熱量測定のため,油を熱媒として使用した.(なお,油を循環させるポンプの利用限界より,150°Cまでの加熱量を測定した.)測定の結果,製作した熱音響ヒートポンプは300°C以上の温度差を作り出すことが可能であることが分かった.また,高温熱浴の温度が150°Cの時,成績係数が1.1となった.また,高温熱浴温度が100°Cから150°Cまで変化しても,成績係数は0.1程度しか低下しなかったため,200°C以上の温度でも有用な加熱量が得られることが分かった.このような大きな温度差(300°C以上)を生み出す熱音響ヒートポンプの開発は世界初であり,100°C以上の温度での成績係数測定も本研究で世界で初めて実施された.これら研究成果の一部は投稿論文に発表し,また国際・国内会議においても発表を行った.低温熱源の温度を変化させた場合の実験も行った.(上記実験では低温熱源として1020°Cの冷却水を利用.)その結果,低温熱源温度を20°Cから80°Cに上昇させると,150°Cでの成績係数が0.1程度上昇した.これにより,低温熱源と高温熱浴の温度の差にヒートポンプの性能が依存することが示され,排熱を低温熱源として利用し,排熱の温度を上昇させる熱音響ヒートポンプの可能性が示された.本研究では排熱を利用して,熱力学的に高品位な熱を作り出すことが可能なヒートポンプの開発を行った.開発したヒートポンプは二つの特徴を有している.一つは仕事から熱へのエネルギー変換を可動部なしで実行できる点であり,もう一つは多様な温度域の熱を作り出せる点にある.実験の結果,低温熱源を室温とした場合,380°Cを実現し,150°Cでの成績係数は1.1であった.また,同じ構造の装置を冷凍機として動かした場合(高温熱浴を室温とした場合),最低到達温度は-50°Cで0°Cでの成績係数は0.8となった.本年度は熱音響スターリングヒートポンプを制作しテストした。制作した装置はループ状の管、直管、およびリニアモーターで構成されている。ループ状の管内にはステンレス製のメッシュを積層して制作した蓄熱器が挿入されている。ループ管および直管には5気圧の窒素が内封されている。リニアモータは直管の端につながれ、直管のもう一端はループ間につながれている。リニアモータを用いてループ管内に音波を入力すると蓄熱器の両端に温度差ができた。装置内の圧力場流速場を測定することで、温度差ができた理由は、蓄熱器内の流体がスターリングサイクルを経験したためであることが分かった。さらに、30W程度のパワーを持つ音波を入力したとき、蓄熱器の高温端の温度は370°Cまで上昇した。これは低温端の温度より300°C以上高い。したがって、本年度の研究により音波を用いたスターリングヒートポンプが実現でき、さらに300°C以上の温度を実現できることが分かった。さらに、下記の蓄熱器のモデルを用いた数値計算を行い、実験結果との比較を行った。上記の実験と並行して、ステンレスメッシュを積層して制作した蓄熱器の実験によるモデル化も行った。具体的には蓄熱器に音波を通過させ、通過前と通過後の音波の振幅比、位相差を測定し、蓄熱器の等価流路径を見積もった。また、この等価流路径の蓄熱器両端の温度差依存性も見積もった。実験の結果、複雑な流路を持つ蓄熱器も円管の束にモデル化できることが分かった。研究計画では本年度は蓄熱器のモデル化およびモデルの妥当性の検討を行う予定であった。これに対して、実績はモデル化を達成し、さらにそのモデルを用いた数値計算と実機(熱音響スターリングヒートポンプ)の性能の比較を行い、よい一致を得たため。計画通り、本年度は数値計算による装置の再設計を行い、さらに100°C以上の温度における加熱性能の測定を行う。また、蓄熱器低温端の温度を300°Cとして、600°Cが実現できるかどうかの確認を行う。
抗体依存性感染増強現象を利用したアジュバントの開発

ウイルス感染症の対策として、ワクチン接種による予防が最も一般的であり効果が期待される。ワクチンは生ワクチンと不活化ワクチンに分類されるが、生ワクチンは安全性の問題、不活化ワクチンは免疫原性の弱さの問題が、それぞれ短所として挙げられ、双方の短所を克服した安全で効果的なワクチンの開発は困難である。特に、生ワクチンは短期間で作出することが不可能であるため、発生頻度が増している新興感染症に対して迅速に対応するためには、不活化ワクチンの効率的な開発および接種法の改良が求められる。本研究では、ウイルス感染に広く認められる抗体依存性感染増強現象(ADE)に着目した。この現象は、ウイルスが抗体を利用してマクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞に効率よく感染するためのメカニズムであると考えられている。本研究では、この抗体の特性を利用して抗原提示細胞に目的の不活化ワクチン抗原を効率よく取り込ませるための手法を開発し、液性免疫および細胞性免疫の両方を誘導する安全なアジュバントとしての抗体の可能性を探る。不活化ウイルス抗原として、ショ糖密度勾配遠心によって精製したエボラウイルスのウイルス様粒子をウイルス表面糖蛋白質に特異的なADE抗体、中和抗体およびどちらの活性も示さないモノクローナル抗体とそれぞれ混合し、マウスの皮下または腹腔内接種して、経時的に血清中の抗体応答を解析し、異なる性質を持つこれらの抗体の間に差が認められるか否かを解析したが、明らかな差は認められなかった。不活化ワクチンを用いて強い免疫応答を誘導するために免疫賦活剤(アジュバント)がしばしば利用されるが、毒性・安全性の問題から実用化されているアジュバントは少ない。本研究は、ウイルス感染に広く認められる抗体依存性感染増強現象(ADE)に着目し、マクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞に効率よく取り込ませるための手法を開発し、液性免疫および細胞性免疫の両方を誘導する安全なアジュバントとしての抗体の可能性を探るものである。不活化ウイルス抗原として、エボラウイルスのウイルス様粒子(VLP)を作出した。このVLPは、表面にウイルス糖蛋白質GPをもち、粒子の内側はVP40蛋白質によって内張りされた粒子である。このVLPをGP特異的ADE抗体、中和抗体およびどちらの活性も示さないモノクローナル抗体(いずれもGP特異的抗体)とそれぞれ混合し、マウスの皮下または腹腔内に接種して、経時的に抗体応答をELISAで解析した。ウイルス抗原と共に接種した抗GP抗体が血中に残存している可能性があるので、新たに産生されるVP40に対する特異抗体のみを検出するために、VP40のみを含むVLPを抗原に用いたELISA法を確立した。ADE抗体、中和抗体およびどちらの活性も示さないモノクローナル抗体を用いた場合でも、VP40に対する抗体応答に顕著な差は認められなかつた。濃度と接種頻度の検討が必要であることが示唆された。また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(H3亜型)に対するモノクローナル抗体を多数作出した。これら抗体を用いた実験系の確立に着手した。
針葉樹仮道管分化におけるサイトカイニンの役割の解明

この研究では、早・晩材形成機構を解明するため、スギ木部形成におけるサイトカイニンの役割について知見を蓄積する。まず、内生植物ホルモンの組織ごとの分布を解析するために、クライオスタットでの手技の改良に加えて、各種植物ホルモン定量における抽出精製方法およびLC/MS条件の最適化をおこなった。その結果、厚さ30μmの切片35枚ごとに内生植物ホルモンの組織内分布を明らかにできる方法を確立できた。開発した方法で、早材形成中のスギ形成層付近と晩材形成中のスギ形成層付近の内生植物ホルモンの組織内分布を調べた。晩材形成中では、オーキシンは、スウェーデンの研究チームが報告したように、形成層にピークがあり師部側や木部側に離れにつれて激減した。活性型サトカイニンであるゼアチンは、形成層と師部にわずかに存在した。不活性型のサイトカニンであるゼアチンリボシドは、木部に大きなピークが存在した。一方で、早材形成中のスギ樹幹では、オーキシンのピークは形成層にあるものの、晩材形成中試料に比べると最大値が小さく、師部側、木部側へ離れるにつれて緩やかに減少した。ゼアチンは、大きなピークが木部側に存在し、ゼアチンリボシドは、小さなピークが師部側に存在した。すなわち、早材形成中には活性型が木部に、晩材形成中は不活性型が木部に存在した。早材形成は活性型サイトカニン投与によって誘導され、オーキシン投与によって阻害されることをすでに報告した。この研究で得られた早・晩材形成中の植物ホルモンの組織内分布は、投与実験の結果を支持するものであった。さらに、開発した方法では、サンプル数が多くなると圧力上昇によるカラムの寿命低下が顕著となった。そこで、移動層としてアセトニトリル、理論段数と耐久性のバランスが取れたカラムを組み合わせることで、多数のサンプルの分析において、精度が高く安定した分析ができることがわかった。平成28年度は、各種植物ホルモンの組織内分布を明らかにすることを目的とした。スギ品種であるオビアカ2本の試験木から高さ2mおよび5m部の試料を選び、木部形成の様子を観察したところ、7月22日において晩材形成が始まっていた。植物ホルモンの局在解析を可能にするために、クライオスタットでの連続凍結切片の作成手技の改良に加えて、各種植物ホルモン定量における抽出液、精製方法およびLC/MSの条件設定の最適化をおこなった。その結果、切片5枚(150μm)ごとに内生植物ホルモンの組織内分布を明らかにできる一連の分析方法を確立することができた。その結果、晩材形成中のオビアカの各種植物ホルモンの組織な分布が明らかになった。すなわち、IAAは既往の研究のとおり、形成層に局在しており、木部および師部側に向かうにつれて減少した。ABAは形成層には局在せず、師部と木部に存在した。サイトカイニンでは活性型であるtZおよびiPは、微量ながら師部と形成層に存在した。その一方で、それぞれの前駆物質である不活性型のtZRおよびiPRは木部に局在が認められ、モデル植物にみられるように根で合成され蒸散流によって木部を移動しているのかもしれない。GA3およびGA7は検出されなかった。GA1は師部にわずかながら存在した。その一方で、GA4およびその前駆物質で不活性型のジベレリンであるGA9は師部、形成層、木部にかけて均等に分布していた。各種内生植物ホルモン量を、凍結切片単位で分析する一連の方法を確立できたため、おおむね順調に進展していると判断した。針葉樹の早・晩材形成の仕組みを解明するために、植物ホルモンのうち、サイトカニンの働きに着目した。昨年度開発した連続凍結切片での植物ホルモン定量方法を用いて、早材形成中のスギ形成層付近と晩材形成中のスギ形成層付近の内生植物ホルモンの組織内分布を調べた。晩材形成中のスギ樹幹において、オーキシンは、スウェーデンの研究チームが報告したように、形成層にピークがあり師部側や木部側に離れにつれて激減した。一方で、不活性型のサイトカニンであるゼアチンリボシドは、木部に大きなピークが存在した。早材形成中のスギ樹幹では、オーキシンのピークは形成層にあるものの、晩材形成中試料に比べると最大値が小さく、師部側、木部側へ離れるにつれて緩やかに減少した。活性型サトカイニンであるゼアチンは、大きなピークが木部側に存在し、不活性型サイトカイニンであるゼアチンリボシドは、小さなピークが師部側に存在した。もう1つの活性型サイトカイニンであるイソペンテニルアデニンとその不活性型サイトカイニンであるイソペンテニルアデノシンでも同様の傾向、すなわち、早材形成中には活性型が木部に、晩材形成中は不活性型が木部に存在した。植物ホルモン投与実験によって、早材形成は活性型サイトカニンによって誘導され、オーキシンによってこの働きが阻害されることをすでに報告した。今年度得られた早・晩材形成中の植物ホルモンの組織内分布は、投与実験の結果を支持するものであった。スギ苗木を用いたポット実験をおこない、土壌中の水分量、根の発達、樹幹の木部形成および内生植物ホルモン量との関係を調べる実験を行った。

予想通り、土壌中の水分量によって、根の形成および木部形成に違いが見られた。植物ホルモンの定量は、植物試料に含まれる含有量が少なく分析装置に高い性能が求められる。とくに、サイトカイニンは含有量が少なくオーキシンに比べ定量が難しい。また、針葉樹形成層付近の植物ホルモンの定量に用いる分析用試料は、長さ2-3cmの立方体程度の大きさが一般的である。今年度は、仮道管形成における植物ホルモンの役割を詳細に検討するため、外樹皮から、内樹皮、形成層、分化中木部、木部までの範囲で、どこにどの植物ホルモンが存在しているのかの解明にチャレンジした。すなわち、凍結ミクロトームで連続切片を作成し、切片ごとの植物ホルモン定量にチャレンジした。困難が予想された凍結切片での植物ホルモン定量に成功し、サイトカイニンが早・晩材材形に関与するとする仮説を支持する知見を得ることができた。スギ苗木を用いたポット実験で、土壌中の水分量、根の形成および樹幹の木部形成について知見を得た。これらの成果からおおむね順調に進展しているとした。この研究では、早・晩材形成機構を解明するため、スギ木部形成におけるサイトカイニンの役割について知見を蓄積する。まず、内生植物ホルモンの組織ごとの分布を解析するために、クライオスタットでの手技の改良に加えて、各種植物ホルモン定量における抽出精製方法およびLC/MS条件の最適化をおこなった。その結果、厚さ30μmの切片35枚ごとに内生植物ホルモンの組織内分布を明らかにできる方法を確立できた。開発した方法で、早材形成中のスギ形成層付近と晩材形成中のスギ形成層付近の内生植物ホルモンの組織内分布を調べた。晩材形成中では、オーキシンは、スウェーデンの研究チームが報告したように、形成層にピークがあり師部側や木部側に離れにつれて激減した。活性型サトカイニンであるゼアチンは、形成層と師部にわずかに存在した。不活性型のサイトカニンであるゼアチンリボシドは、木部に大きなピークが存在した。一方で、早材形成中のスギ樹幹では、オーキシンのピークは形成層にあるものの、晩材形成中試料に比べると最大値が小さく、師部側、木部側へ離れるにつれて緩やかに減少した。ゼアチンは、大きなピークが木部側に存在し、ゼアチンリボシドは、小さなピークが師部側に存在した。すなわち、早材形成中には活性型が木部に、晩材形成中は不活性型が木部に存在した。早材形成は活性型サイトカニン投与によって誘導され、オーキシン投与によって阻害されることをすでに報告した。この研究で得られた早・晩材形成中の植物ホルモンの組織内分布は、投与実験の結果を支持するものであった。さらに、開発した方法では、サンプル数が多くなると圧力上昇によるカラムの寿命低下が顕著となった。そこで、移動層としてアセトニトリル、理論段数と耐久性のバランスが取れたカラムを組み合わせることで、多数のサンプルの分析において、精度が高く安定した分析ができることがわかった。確立した分析方法を用いて、多数の試料を分析して知見を蓄積する。特に、早材形成と晩材形成との比較をおこなう。さらに、苗木を用いた土壌水分の影響を調べる研究の準備を進める。今後は、新たに開発した連続凍結切片での植物ホルモン定量方法を用いて、平成29年度で得られたデータの蓄積をおこない、信頼性の高いデータを基づき、早・晩材形成を議論する。