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「現代の社会問題」を中核とした総合的学習の構想-社会系教科を中心として

本研究の目的は、現在の総合的な学習と人権教育の思潮を踏まえ、「現代の社会問題」を中核に据えた総合的学習のカリキュラムの編成と学習方法を構想することである。本研究の成果は、以下のとおりである。1.わが国の総合的学習の先導・先進校の授業プラン・実践報告・授業事例の収集と研究授業の分析2.90年代のドイツ基礎学校の総合的な学習に関するカリキュラムの収集・分析(1)従来の教科を存続させながら、現代の「中核問題」(価値、生活基盤、構造変化、平等、参加)に、各教科の「主要テーマ」と「学習領域」を関連づけ、基礎学校教育全体を「総合学習化」させている事例(シュレスヴィヒ・ホルシュタイン州)(2)教科外に、健康・性・メディア・平和・人権・環境教育などを含む「総合的学習」を設けている事例(ヘッセン州)(3)各学年に「総合的なテーマ」を設けている事例(バーデン・ヴュルテンベルク州)3.ドイツのW.クラフキの「時代に典型的な鍵問題」の教育構想(1)ノルトライン・ヴェストファーレン州の教育改革案(95年)に「鍵問題」構想が採用されていること(2)基礎学校連盟の新教科設置試案の枠組みに「鍵問題」が位置づけられていること(3)ヘッセン州の基礎学校学習指導要領の改訂(95年)の基本理念のひとつが「鍵問題」であること(4)「鍵問題」を「事実教授」「総合学習」の教材開発の概念的枠組みの主軸にしていること4.総合的学習の授業モデルの構築「人権」「福祉」「メディア」「まちづくり」を中核とする授業と博学連携による授業の構想本研究の目的は、現在の総合的な学習と人権教育の思潮を踏まえ、「現代の社会問題」を中核に据えた総合的学習のカリキュラムの編成と学習方法を構想することである。今年度の研究実績は、以下のとおりである。1.わが国の総合的学習の先導・先進校の授業プラン・実践報告・授業事例を収集し、また、研究授業を参観し、以下の視点から分析を試みた。(1)時間の名称(2)目標・ねらい・必要性(3)教科・領域との関係-カリキュラム構造(4)各学年の内容・単元と授業時数-系統性(5)授業方法・学習組織の特色(6)評価-学習の成果と課題(7)子ども・学校・地域の実態を踏まえた特色ある単元なお、総合的学習を類型化するための枠組みについては、来年度の課題である。2. 90年代のドイツ基礎学校の総合的な学習に関するカリキュラムの収集・分析を試みた。その結果、(1)従来の教科を存続させながら、現代の「中核問題」(価値、生活基盤、構造変化、平等、参加)に、各教科の「主要テーマ」と「学習領域」を関連づけ、基礎学校教育全体を「総合学習化」させている事例(シュレスヴィヒ・ホルシュタイン州)。(2)教科外に、健康・性・メディア・平和・人権・環境教育などを含む「総合的学習」を設けている事例(ヘッセン州)。(3)各学年に「総合的なテーマ」を設けている事例(バーデン・ヴュルテンベルク州)など多様であった。3.小・中学校教諭に研究協力者として委嘱し、研究協議会を開催中であり、来年度、総合的学習の授業モデル構築のための基本構想を検討する。1.わが国の総合的学習の先導・先進校の授業プラン・実践報告・授業事例の収集と研究授業の分析実践研究の取り組みを、つぎのように分けることができる。(1)「ゆとりの時間」や総合活動の長年の研究や実践を生かした総合学習プランの事例(横浜市立日技小、秋田大学教育文化学部附属小など)(2)教育課程の全体構造の見直しの過程から生み出された総合学習プランの事例(学芸大学附属大泉小、福岡教育大附属福岡中など)

(3)「総合的な学習の時間」の文部省研究開発校の事例(杉戸町立杉戸中、越谷市立越ヶ谷小など)2.ドイツのW.クラフキの「時代に典型的な鍵問題」の教育構想クラフキの教育構想はドイツの教育界に、以下のように受容されている。(1)ノルドライン・ヴェストファーレン州の教育改革案(95年)に「鍵問題」構想が採用されていること(2)基礎学校連盟の新教科設置試案の枠組みに「鍵問題」が位置づけられていること(3)ヘッセン州の基礎学校学習指導要領の改訂(95年)の基本理念のひとつが「鍵問題」であること(4)「鍵問題」を「事実教授」「総合学習」の教材開発の概念的枠組みの主軸にしていること3.総合的学習の授業モデルの構築「人権」「福祉」「メディア」「まちづくり」を中核とする授業と博学連携による授業を構想した。
気候変動に伴う種の損失を補償する機能的冗長性の存在可能性の検証（国際共同研究強化）

気候変動による,生態系への影響が懸念されている。気候変動に伴って生物多様性が影響を受けると、結果として生態系の機能性にも影響が波及することが考えられる。生態系に生じる極端現象としては,たとえば旱魃,火事,虫の大発生などが挙げられる。これらは社会的に災害となり得る一方で,自然界には普遍的に生じる事象である(「自然撹乱」と呼ばれる)。現在,生態系の撹乱イベントは,土地利用や気候の変化といった人為と自然要因の相互作用により複雑化している。本課題では,撹乱体制の変化によって生物多様性が変化・変性することにより,機能的役割とくに機能的冗長性が失われる可能性を検証する。そこで,ウィーン天然資源大学のDr. Rupert Seidlと協働して,「気候変動ー生態系改変ー多様性/冗長性変化」の相互関係の変化予測を行う。具体的には、生物多様性の変化予測を陸域生態系モデルにより構築する。さらに、森林撹乱-動態モデルを用いて,気候変動シナリオに応じた森林の多様性ー生産性の変化に撹乱の効果を加味したモデルを構築する。これにより,将来的な多様性の変化シナリオに基づく陸域生態系の機能性(炭素隔離など)の応答予測を行う。以上より,気候変動下における生態系の機能性と冗長性を担保し,緩和策と適応策に貢献する上での生物多様性の潜在的な役割を評価する。以上を実施するための確認や準備等を行った。研究候補地に適したパラメータの取得やモデルの詳細の確認などを昨年度より継続して行ってきた。さらに、理論的な進展のために、意見論文の作成も行った(2018年出版)。より発展的なテーマとしては、世界規模での撹乱ー陸域生態系変化のメタ解析も実施している(2018年出版)。内定年度:2015気候変動による,生態系への影響が懸念されている。すでに有している森林インベントリ(樹種組成や林齢などの情報)のデータを用いて、研究候補地のスクリーニングを行った。また、モデルのパラメータやモデル本体の構造の精査を行った。ワークショップ等にも参加し、モデルそのものについて、より議論を重ねてきた。さらに、理論的な進展のために、意見論文の作成も行った(投稿準備中)。より発展的なテーマとしては、世界規模での撹乱ー陸域生態系変化のメタ解析も実施している。当初計画以上の研究が2件進行している。

さらに、理論的な進展のために、意見論文の作成も行った(査読中)。より発展的なテーマとしては、世界規模での撹乱ー陸域生態系変化のメタ解析も実施している(査読中)。当初計画以上の研究が2件進行している。気候変動による,生態系への影響が懸念されている。気候変動に伴って生物多様性が影響を受けると、結果として生態系の機能性にも影響が波及することが考えられる。生態系に生じる極端現象としては,たとえば旱魃,火事,虫の大発生などが挙げられる。これらは社会的に災害となり得る一方で,自然界には普遍的に生じる事象である(「自然撹乱」と呼ばれる)。現在,生態系の撹乱イベントは,土地利用や気候の変化といった人為と自然要因の相互作用により複雑化している。本課題では,撹乱体制の変化によって生物多様性が変化・変性することにより,機能的役割とくに機能的冗長性が失われる可能性を検証する。そこで,ウィーン天然資源大学のDr. Rupert Seidlと協働して,「気候変動ー生態系改変ー多様性/冗長性変化」の相互関係の変化予測を行う。具体的には、生物多様性の変化予測を陸域生態系モデルにより構築する。さらに、森林撹乱-動態モデルを用いて,気候変動シナリオに応じた森林の多様性ー生産性の変化に撹乱の効果を加味したモデルを構築する。これにより,将来的な多様性の変化シナリオに基づく陸域生態系の機能性(炭素隔離など)の応答予測を行う。以上より,気候変動下における生態系の機能性と冗長性を担保し,緩和策と適応策に貢献する上での生物多様性の潜在的な役割を評価する。以上を実施するための確認や準備等を行った。研究候補地に適したパラメータの取得やモデルの詳細の確認などを昨年度より継続して行ってきた。さらに、理論的な進展のために、意見論文の作成も行った(2018年出版)。より発展的なテーマとしては、世界規模での撹乱ー陸域生態系変化のメタ解析も実施している(2018年出版)。今後もモデルの構築のための作業を継続する。投稿準備中の論文については、共著者と適宜議論を進め、今年度中の投稿を目指す。
UV-A特異的光センシングシステムの解明

植物は青色光,UV-A,およびUV-Bに応答してアントシアニンを合成する.カルコン合成酵素(CHS)はアントシアニン生合成経路の鍵酵素である.トマトではCHS1とCHS2の2種類が単離されており,カブからは今年度の研究により計6種類のCHSが単離できた.これらの発現を半定量RT-PCRまたはリアルタイムPCRにより調べた.野生型およびクリプトクロム1欠失突然変異体(cry1)のトマト,およびカブ'津田カブ'を暗黒下で発芽させ,青色光,UV-B,UV-A,またはUV-B+青を24時間照射した.トマトとカブのいずれでも,青により下胚軸上部に,UV-Aにより下胚軸中下部にアントシアニンが蓄積した.青を照射したとき,野生型トマトでは下胚軸上部のCHS1の発現が高く,cry1ではCHS1の発現はほとんど見られなかった.一方,CHS2は,野生型,cry1のいずれでもUV-Aを照射したときに下胚軸中下部で発現が見られた.このことは,クリプトクロムが光を感知した場合にはCHS1がはたらき,これとは別にUV-Aを感知してCHS2の発現を誘導する系が存在することを示した.カブにおいては,CHS1,CHS5がUV-Aにより,またCHS4がUV-B+青により下胚軸中下部で強い発現を示した.さらに,転写調節因子であるMYBファミリーのうちPAP1の発現は,青やUV-B+青では下胚軸上部で発現が誘導され,UV-A照射では下胚軸下部における発現が高まった.このようにPAP1の発現パターンはアントシアニン蓄積パターンとよく一致した.また,MYB12はUV-AおよびUV-B+青により,MYB111はUV-B+青により発現が誘導された.以上により異なる波長の光によるアントシアニン合成の誘導においては異なるCHSが働き,その調節にMYBが関与していることが推測された.アブラナ科植物、ナス科植物、キク科植物の数品種を用いて、芽生えの胚軸における遠赤色光、赤色光、青色光、可視光、紫外線(BL)の照射によるアントシアニン蓄積を調査した。カブ、キャベツ、カラシナ、ハクサイ、トマトでは、BLによって明らかなアントシアニンの蓄積が見られた。カブ、カラシナ、トマト、ナスでは、可視光によって明らかなアントシアニンの蓄積が見られた。しかし、青色光、赤色光、遠赤色光単独光ではアントシアニン蓄積は見られなかった。BLで顕著なアントシアニン蓄積参見られたカブ、キャベツ、カラシナ、トマトについては、紫外青色領域のより狭い範囲の波長に対する反応を調べた。いずれの植物の上胚軸でもBL、BL+青色光、UV-Aでアントシアニン蓄積が見られたが、UV-Bや青色単独では明らかなアントシアニン蓄積は見られなかった。キャベツ、トマトではBL+青色光によりBLまたは青単独照射よりも強いアントシアニン蓄積が見られ相互作用が認められた。また、カブ、キャベツではUV-B+青色光により青色またはUV-B単独照射より強いアントシアニン蓄積が見られ、UV-Bと青色光の相互作用が認められた。また,カブ下胚軸ではUV-A+UV-Bでは明らかな着色がみられたのに対して,UV-A単独ではアントシアニンの合成は誘導されなかった.以上の結果よりカブ、キャベツ、カラシナ、トマトのアントシアニン生合成を誘導する紫外青領域の光に関して(1)UV-A単独(カブ、キャベツ、カラシナ、トマト)、(2)UV-A+青色光(トマト)、(3)UV-B+青色光(キャベツ)、(4)UV-A+UV-B(カブ)の4種類の反応が存在することが示唆された。カブ芽生えに種々の波長の光を照射し,5分割した胚軸の各部位におけるアントシアニンの蓄積量を調べた.その結果,青色光を照射したものでは胚軸上部において最も高いアントシアニン蓄積が見られ,胚軸の下部になるに従ってアントシアニン蓄積量は著しく減少した.UV-A照射では,全体的にアントシアニン蓄積が見られたが,特に中胚軸において著しい着色が見られた.UV-B照射では,上胚軸において最も強くアントシアニンが蓄積し,胚軸下部に向かって蓄積量が減少した.また,UV-B+青色光では,胚軸の各部位で,それぞれの光を単独照射した場合のアントシアニン量の和の23倍のアントシアニン蓄積が見られた.照射する光の波長により異なる部位でアントシアニンの蓄積がみられたことから,紫外青領域の光によるアントシアニン生合成誘導には少なくとも,青色光単独照射による誘導,UV-A単独照射による誘導,UV-B単独照射による誘導,UV-Bと青色光の相互作用による誘導の4種類が存在することが明らかとなった.サザン解析により'津田カブ'にはカルコン合成酵素(CHS)が5コピー以上存在することが確認された.このうち,既に単離されているCHSの一つ(CHS1)に特異的なプローブを用いて,各波長の光によるCHS1の発現量を5分割した胚軸で調べた.その結果,青色光を照射した場合はいずれの部位でもCHS1の発現が見られなかったのに対し,UV-Aを照射した場合は,中胚軸で高い発現を示した.一方,光シグナル伝達系の最下流で働きCHSのプロモータに直接結合して発現制御することが示唆されているHY5遺伝子の発現は,青色光でもUV-Aでも誘導された.このことから,異なる光による異なる部位特異的なCHS発現誘導を制御するのはHY5以外の発現調節因子である可能性があった.植物は青色光,UV-A,およびUV-Bに応答してアントシアニンを合成する.

カルコン合成酵素(CHS)はアントシアニン生合成経路の鍵酵素である.トマトではCHS1とCHS2の2種類が単離されており,カブからは今年度の研究により計6種類のCHSが単離できた.これらの発現を半定量RT-PCRまたはリアルタイムPCRにより調べた.野生型およびクリプトクロム1欠失突然変異体(cry1)のトマト,およびカブ'津田カブ'を暗黒下で発芽させ,青色光,UV-B,UV-A,またはUV-B+青を24時間照射した.トマトとカブのいずれでも,青により下胚軸上部に,UV-Aにより下胚軸中下部にアントシアニンが蓄積した.青を照射したとき,野生型トマトでは下胚軸上部のCHS1の発現が高く,cry1ではCHS1の発現はほとんど見られなかった.一方,CHS2は,野生型,cry1のいずれでもUV-Aを照射したときに下胚軸中下部で発現が見られた.このことは,クリプトクロムが光を感知した場合にはCHS1がはたらき,これとは別にUV-Aを感知してCHS2の発現を誘導する系が存在することを示した.カブにおいては,CHS1,CHS5がUV-Aにより,またCHS4がUV-B+青により下胚軸中下部で強い発現を示した.さらに,転写調節因子であるMYBファミリーのうちPAP1の発現は,青やUV-B+青では下胚軸上部で発現が誘導され,UV-A照射では下胚軸下部における発現が高まった.このようにPAP1の発現パターンはアントシアニン蓄積パターンとよく一致した.また,MYB12はUV-AおよびUV-B+青により,MYB111はUV-B+青により発現が誘導された.以上により異なる波長の光によるアントシアニン合成の誘導においては異なるCHSが働き,その調節にMYBが関与していることが推測された.
マルチダイナミクスモデルによるデュアル情報表現メカニズムの研究

1.シナプス可塑性(STDP)の情報表現における役割前-後シナプス細胞の発火タイミングによってLTPやLTDを起こすSTDPの、情報表現における役割を明らかにするために、神経回路網モデルにSTDPを導入し、その挙動を解析した。入力は、ポワソン過程のスパイク系列から一定時間幅の時空間パターンを構成し、それを繰り返し入力した。その結果、多くの場合に非同期発火から同期発火を起こす変化が観察された。一旦同期発火が学習されると、他の時空間パターンの入力に対しては、同期発火はほとんど起こらない。これは、入力された特定の時空間パターンに対して、同期発火を起こすシナプス荷重の変化がSTDPによって行なわれたことを意味する。また、別の計算機実験によってスパイク系列の発生間隔に重要な情報が存在することを示唆する結果が得られた。以上より、時空間パターンから同期発火という情報表現への変換が、STDPによって獲得できると考えられる。2.ドーパミン系修飾物質の情報表現における役割ドーパミンの修飾物質系的な抑制効果と、介在細胞的な抑制効果との差を明らかにするために、PFCネットワークモデルに次の2つのモデルのどちらか一方を追加した2種類のPFC-VTA系モデルを構成し、違いを調べた:(1)PFCから入力を受けてPFCのIPSPを強めるDA細胞モデル;(2)PFCから入力を受けてPFCを脱分極させる大域的抑制細胞モデル。一方、平均発火率の空間パターンとシナプス荷重の構造との相関係数が高いことが知られている。ところが、(2)のモデルの場合にはこの相関係数が下がり、(1)の場合には下がらなかった。この結果は、もし平均発火率によって内部情報の想起をしているならば、(2)の直接的脱分極ではなく、(1)の修飾的な抑制による方法の方が、少ないスパイク数で情報を正しく効率的に想起できることを意味する。
金属・薬剤によるネオ・セルフの生成機構

ハプテンとして機能する金属や薬剤などの分子においては、通常のペプチドに対するT細胞の認識とは異なった反応をとることが知られている。しかし、その実態は不明である。本研究では、金属・薬剤のネオ・セルフ生成機構を解明するため、金属などハプテンに特異的なT細胞受容体を解析して、その情報を集積する。そして、その情報をもとに、ハプテンによって修飾された抗原ペプチド-MHC複合体が、T細胞受容体にどのように認識されるかを明らかにすることを目指している。金属アレルギーは、T細胞依存性の疾患であるため、特異的T細胞受容体を決定するのに適した疾患と考えられる。昨年度までにマウス金属アレルギーモデルで、MHC class Iが重要であること、そして、そのTCRの特定を行った。今年度は、遺伝子改変マウスを作成するなどして、マウス金属アレルギーモデルにおいてパラジウムに反応するTCRの解析を行った。パラジウム溶液をマウスに免疫し、耳介あるいは足蹠に再度パラジウム溶液を接種することにより金属アレルギーを誘導した。TCRα鎖のみの遺伝子導入マウスを用いて研究を遂行したが、予想通り、野生型に比べ強いアレルギーを引き起こすことができた。また、in vitro培養系において、既知のペプチド+MHCを認識する蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにて蛍光強度を測定したところ、金属溶液を加えることにより、この抗体の蛍光強度が減弱することを見い出した。今後、この実験系を用いて、ネオ・セルフの分子機構を追究していく予定である。TCRα鎖遺伝子導入マウスを用いて解析したが、予想通り、野生型に比べ強いアレルギーを引き起こすことができた。このことは、前年度までに特定したTCRが真のTCRであったことを意味する。また、in vitro培養系において、既知のペプチドをMHC上に提示させる実験において、ペプチド+MHCを認識する蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにて蛍光強度を測定した。このIn vitro培養系に金属溶液を加える場合と加えない場合において、この抗体の蛍光強度が変化することを見い出した。この結果は、ネオ・セルフの分子機構の解明の糸口になり得る結果であり、今後の研究の良いモデルとなると期待される。これまでの研究を基盤にネオ・セルフとして提示されると考えられるハプテン修飾された、MHC+ペプチドについて、in vitro培養系を用いて免疫学的・生化学的研究を進めていく。具体的には、既知のペプチド+MHCを認識する蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーにて蛍光強度を測定する実験系を発展させる。パラジウムなど金属溶液を加え、この抗体の蛍光強度が減弱することについて、ペプチドが変化しているのか、ペプチド+MHCの構造が変化しているのか、MHCが変化しているのかについて、詳細に研究を進める。また、MHCの型で場合分けをして、H-2KあるいはH-2DのどちらのMHCが金属イオンの影響を受けやすいのか、遺伝子改変マウスを用いるなどして研究を行う。さらに、金属特異的TCRを培養細胞株に遺伝子導入したT細胞受容体遺伝子導入細胞株を作製する。この細胞株を用いてin vitro培養系において金属溶液を添加した状態で抗原提示細胞とともに培養して、T細胞受容体からのシグナルの有無を、IFNなどのサイトカインを指標に検証する。これまで、金属や薬剤など、ハプテンとして機能する分子においては、通常のペプチドに対するT細胞の認識とは異なった反応をとることが知られているが、その実態は不明である。本研究では、金属・薬剤のネオ・セルフ生成機構の解明として、5年間の計画研究において、金属などハプテンに特異的なT細胞受容体の情報をもとに、ハプテンによって修飾された抗原ペプチド-MHC複合体が、T細胞受容体にどのように認識されるかを明らかにすることを目指している。金属アレルギーは、T細胞依存性の疾患であるため、特異的T細胞受容体を決定するのに適した疾患である。今年度は、実験動物を用いて金属アレルギーを誘導して、金属特異的に反応するT細胞受容体を決定することを目的に研究を行った。歯科金属が生体金属材料として頻用されているために、歯科金属で使用されているパラジウムを金属として使用した。マウスよりリンパ球を単離して、total RNAを抽出、cDNA合成を行った。T細胞受容体を特定するためには、PCR法での遺伝子増幅が必要である。しかし、遺伝子増幅の際にバイアス(偏り)がかかってしまうと、特異的T細胞受容体を特定できない可能性が高い。そこで、遺伝子を非バイアスで増幅する方法を開発してT細胞受容体の特定を試みた。この方法により、パラジウム特異的T細胞受容体の候補を絞り込むことができた。歯科金属として広く用いられているパラジウムに着目して、マウス金属アレルギーモデルを用い解析した。本年度は、リンパ球から、total RNAを抽出、cDNA合成後に、PCR増幅する際に、遺伝子を非バイアスで増幅する方法の開発に成功し、パラジウム特異的T細胞受容体の候補を絞り込むことができた。金属や薬剤など、ハプテンとして機能する分子においては、通常のペプチドに対するT細胞の認識とは異なった反応をとることが知られているが、その実態は不明である。本研究では、金属・薬剤のネオ・セルフ生成機構の解明として、5年間の計画研究において、金属などハプテンに特異的なT細胞受容体の情報をもとに、ハプテンによって修飾された抗原ペプチド-

MHC複合体が、T細胞受容体にどのように認識されるかを明らかにすることを目指している。金属アレルギーは、T細胞依存性の疾患であるため、特異的T細胞受容体を決定するのに適した疾患である。今年度は、マウス金属アレルギーモデルにおいてパラジウムに反応するTCRの解析を行った。パラジウム溶液をマウスに免疫し、耳介あるいは足蹠に再度パラジウム溶液を接種することにより金属アレルギーを誘導した。マウスよりリンパ球を単離して、total RNAを抽出、cDNA合成を行った。TCRはα鎖、β鎖があり、パラジウム溶液接種による金属アレルギー発症群では、特定のTCRが有意に反応した。このTCRが認識するMHCを調べるため、MHC class Iまたはclass IIの発現が欠損したマウスを用いて金属アレルギーの発症ならびに、パラジウムに反応するTCRの解析を行った。また、TCRの中で抗原と結合し変異に富むことが知られているCDR3について、パラジウムに反応するTCRのCDR3コンセンサス配列を決定することにも成功した。このように順調に研究を遂行することができた。マウス金属アレルギーモデルでパラジウム特異的TCRの解析をした。本年度は、パラジウム溶液接種による金属アレルギー発症群では、特定のTCRが有意に反応することを発見した。また、このTCRが認識するMHCを調べるため、MHC class Iまたはclass IIの発現が欠損したマウスを用いて金属アレルギーの発症ならびに、パラジウムに反応するTCRの解析を行った。さらに、TCRの中で抗原と結合し変異に富むことが知られているCDR3について、パラジウムに反応するTCRのCDR3コンセンサス配列を決定することにも成功した。以上のことより、ネオ・セルフの解明のために前進したといえる。ハプテンとして機能する金属や薬剤などの分子においては、通常のペプチドに対するT細胞の認識とは異なった反応をとることが知られている。しかし、その実態は不明である。本研究では、金属・薬剤のネオ・セルフ生成機構を解明するため、金属などハプテンに特異的なT細胞受容体を解析して、その情報を集積する。そして、その情報をもとに、ハプテンによって修飾された抗原ペプチド-MHC複合体が、T細胞受容体にどのように認識されるかを明らかにすることを目指している。金属アレルギーは、T細胞依存性の疾患であるため、特異的T細胞受容体を決定するのに適した疾患と考えられる。昨年度までにマウス金属アレルギーモデルで、MHC class Iが重要であること、そして、そのTCRの特定を行った。今年度は、遺伝子改変マウスを作成するなどして、マウス金属アレルギーモデルにおいてパラジウムに反応するTCRの解析を行った。TCRα鎖のみの遺伝子導入
液体窒素およびドライアイスを用いないマウス胚と精子の保存および輸送法の新規開発

マウス凍結胚・精子の-40°Cと-20°Cでの液体窒素やドライアイスを用いない簡易保管法の条件を確立した。また-537°Cの各温度での保管が可能な条件および方法を確立した。特に7日間冷蔵保管した受精卵および5日間の冷蔵保管中に宅配便輸送を行った受精卵からそれぞれ産子の作出に成功した。本技術により、マウスや凍結胚を欧米へ輸送する際の費用(20-30万円)が1/101/20に削減可能となった。更に発展的な研究として、精子の凍結感受性に関わる候補遺伝子を選抜することに成功した。以上より、凍結保存の機構解析および冷凍・冷蔵輸送の実用化への新技術を確立できた。マウス受精卵や精子の凍結保存技術は家畜やヒトに応用されてきたが、液体窒素もしくはドライアイスがなければ細胞内の氷晶形成や保存液による細胞毒性、細胞代謝の維持等によって冷凍温度での保存は不可能と考えられている。我々は-70°C0°Cの温度域での受精卵および精子の安定的な保存を目指して検討を行った。1.受精卵:体外受精によって得られた2細胞期胚を極度に高浸透圧のガラス化液内で保存した後に、アルミニウムバッグに収納し、-80、-40、-20°Cの各温度で一定期間保持してから回収して生存率を確認したところ、-80°Cでは1週間以上、-40°Cでは1日前後、-20°Cでは1時間以上の保存が可能であることが分かった。更にガラス化液に氷晶形成の抑制物質や高分子を配合した場合や、保存に用いる胚の発育段階を様々に設定、保存容器を変えて冷却・加温速度の影響などを詳細に検討した。中でも高分子等による氷晶形成抑制効果には改善がみられたことから、更に効果的な保存液の開発に有効であろうと考えられた。2.精子:一般的に広く用いられている保存液で凍結された精子では、-80°Cのディープフリーザーに7日間保存しても受精率は75%と高かった。-40°Cに1時間保存した場合でも40%、24時間では22%の受精率が得られ、7日間でも4%の卵子を受精させることが可能であった。更に保存液へ高分子等を添加して改善を進めているところである。受精卵と精子共に-40°Cで1日前後であれば保存できる可能性が示されたことから、寒剤と氷を利用した保管および輸送が実現できる可能性が示唆された。これらの技術は家畜やヒトおよび細胞への外挿、緊急災害時やフィールドワークおよび発展途上の国々など液体窒素が入手困難な状況でも応用可能と考えられ、様々な用途に発展する可能性を有する。初年度の研究により、凍結保存した受精卵および精子を-40°Cで一定期間保管することが可能となった。このような成績は報告例がなく、本研究によって初めて成し遂げられた結果である。しかしながら、その保存可能な期間は約1日間であり、実際の輸送実験に用いるには保存期間の延長が可能なプロトコールの作成が重要となる。現在までに種々の条件検討を試みてきたところ、受精卵および精子の保存の成績が突出して良い場合が見受けられた。追試を行うと成績が変動して再現が困難なケースが見られたことから、不安定さを生み出している要因の調査を行っている。もしこの要因が特定できれば、世界中で用いられている現在の方法よりも優れた凍結保存方法が開発できると考えている。初年度の実験のみではこれら新規プロトコールの決定には至らなかったことから、「やや遅れている」を選択した。しかしながら、特に凍結胚の-40°C保存の成功は、将来的に簡易輸送が期待できる成果として、2016年7月にアメリカ(サンディエゴ)で開催されるアメリカ繁殖生物学会での発表を予定している。マウス受精卵や精子の凍結保存技術は家畜やヒトに応用されてきたが、液体窒素もしくはドライアイスがなければ細胞内の氷晶形成や保存液による細胞への毒性等により冷凍温度での保存は不可能と考えられている。我々は-70°C0°C、更に0°C37°Cの温度域での受精卵および精子の安定的な保存を目指して検討を行った。1.受精卵:体外受精によって得られたマウス胚を各種凍結溶液等と共に凍結チューブに封入後、-80、-40、-20°Cの各温度で保存を試みた。一般的な凍結液ではこれらの温度で生存できないが、我々が開発した高浸透圧ガラス化溶液を用いることで、-80°Cでは1週間以上、-40°Cでは数時間から1日、-20°Cでは数10分から1時間程度の保存が可能であり、これらの温度域での簡易輸送が可能と考えられた(2016年アメリカ繁殖学会で発表)。また冷蔵温度では、幾つかの環境要因を改善することで57日間の保存が可能となった。従来は23日の保存でも発生能の低下がみられたが、本実験ではガラス化保存-回収胚を5日間冷蔵保存しても生存率99%、胚盤胞への発生率71%と格段に安定した冷蔵保存法を開発できた。2.精子:一般的な凍結保存液を用いた場合、-80°Cでは少なくとも7日間の保存が可能であった。-40°Cでも5-7日間の保存ができ、一時的な保管や輸送の可能性が期待されるが、その受精率は低く、保存方法の改善が必須と考えられた。そして2016年に行った保存液の改良実験により、1971年に開発された従来法よりも高い受精率が得られたことから、新規凍結保存法のプロトコール確立の取り組みを進めている。

これらの技術はマウスのみならず、家畜やヒトおよび細胞への外挿、緊急災害時やフィールドワークおよび発展途上の国々など液体窒素やドライアイスが入手困難な状況でも応用可能と考えられ、様々な用途に発展する可能性を有する。我々が開発した高浸透圧ガラス化溶液を用いることで、マウス胚を-40°Cや-20°Cでも短時間であれば保存および簡易輸送できると考えられた。また種々の条件検討により、ガラス化保存後に回収した胚を冷蔵温度で約1週間保存できることが分かってきた。冷蔵温度で安全かつ安価に輸送が可能と考えられることから、更なる条件設定およびプロトコール確立を現在進めている。一方で、従来の精子凍結方法でも数日間ならば-40°Cでの保存が可能であることが確認できた。しかし、回収された精子の生存性や運動性および受精率が低いことから、一般的に普及するためには改善が必要であった。そこで様々な凍結条件や凍結液の組成の改良を試みたところ、ゴールデンスタンダードと考えられている従来法よりも高い運動性や受精率を得ることができた。だがその成績は不安定なことから、更に改良が必要と考えられる。輸送実験が進められていない事から、本区分においてやや遅れているを選択した。平成27-28年度に、マウス受精卵と精子の冷凍温度域(-70°C-20°C)での保存方法について検討を重ねてきた。細胞内の氷晶形成および保存液による毒性を最小限に抑制する事で、1日程度の国内輸送であれば可能と考えられる条件を設定できた。一方で平成28年度より冷蔵温度での受精卵と精子の長期保存法の検討を以下のように進めた。1.受精卵:特許取得の可能性があり詳細は公開できないが、修正KSOM培養液を用い、幾つかの環境要因を改善することで7日間の冷蔵温度での保存が可能となった。従来は23日の保存でも発生能の低下がみられたが、本実験ではガラス化保存-回収胚を7日間冷蔵保存しても生存率86%、胚盤胞への発生率47%と格段に安定した方法を開発できた。更に輸送実験後に回収した胚から産子への発生能を確認できた。2.精子:精巣上体組織を様々な液体中で冷蔵保存し、精子活性の比較を行った。3日間の冷蔵テストでは組織冷蔵保存液にエチレングリコールを10%混合した溶液で最も生存精子率が高く、体外受精により58%と高い受精率が得られた。また、精子の凍結保存に対する感受性が大きく異なるC57BL/6JとDBA/2J系統およびそれらの交雑系統を用いて、量的形質遺伝子座解析により、凍結保存に関わるゲノム領域を推定することができた。更に精巣での発現の有無および2系統間でのアミノ酸配列に多型が認められたことから、Abl2とNlrp3を候補遺伝子として検出できた。これらの技術や知見はマウスのみならず、家畜やヒトおよび細胞への外挿、緊急災害時やフィールドワークおよび発展途上の国々など液体窒素やドライアイスが入手困難な状況でも応用可能と考えられ、様々な用途に発展する可能性を有する。マウス凍結胚・精子の-40°Cと-20°Cでの液体窒素やドライアイスを用いない簡易保管法の条件を確立した。また-537°Cの各温度での保管が可能な条件および方法を確立した。特に7日間冷蔵保管した受精卵および5日間の冷蔵保管中に宅配便輸送を行った受精卵からそれぞれ産子の作出に成功した。本技術により、マウスや凍結胚を欧米へ輸送する際の費用(20-30万円)が1/101/20に削減可能となった。更に発展的な研究として、精子の凍結感受性に関わる候補遺伝子を選抜することに成功した。
ｉＰＳ細胞由来樹状細胞／癌幹細胞融合ワクチンを用いた新規的癌免疫療法の開発

我々は腫瘍抗原遺伝子(TAA)導入iPS細胞由来DCs(iPSDCs)を分化誘導し、従来の骨髄細胞由来DCs(BMDCs)と比較し、その抗腫瘍効果を検討した。【方法】マウスiPS細胞からTAA遺伝子導入DCsを分化誘導し、抗原提示細胞としての機能を比較検討した。抗腫瘍効果については、51Cr-release assayおよび皮下腫瘍モデルで評価した。【結果】TAA遺伝子導入iPSDCsは、BMDCsと同等の抗原提示細胞としての機能を認め、抗腫瘍効果においても同等であった。【結語】iPSDCsはBMDCsと同等の機能、抗腫瘍効果を認め、今後、臨床応用の可能性が期待できると考える。本研究は、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(DC)をiPS細胞から誘導し、それと癌幹細胞を融合させ、樹状細胞表面に未知、既知の特異的抗原を提示させ、効率的に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を活性化することにより、癌幹細胞に対する癌ワクチンを作成し、強力でかつ特異的な癌治療を構築することを目的にしている。昨年度は、マウスiPS細胞からDCを誘導した。ただ、癌幹細胞の同定に難渋し、以下の様に、一部、研究計画を変更し、実験を遂行した。1.マウスiPS細胞由来DCの機能解析:細胞表面にCD11b、CD80、CD86、MHCクラスI、MHCクラスIIの発現を確認し、骨髄由来DCと比較して発現に差がないことを確認した。2.iPS細胞由来DC、骨髄由来DCを用いたサイトカイン分泌(IL-12,IFN-γ)の検討:ELISAで測定し、共に成熟DCにおいて高い分泌能を認めることを確認した。3.DCの遊走能の検討:iPS細胞由来DC、骨髄由来DCのケモカインレセプターCCR7の発現をフローサイトメトリーにて解析し、共に成熟DCにて未熟DCと比較して高い発現を認めた。また、PHK-26で染色した成熟DC(iPS細胞由来DC、骨髄由来DC)をマウスの下腹部の皮下に投与し、鼠径リンパ節への遊走能を検討し、共にcontrolと比較して強く遊走されることを確認した。したがって、iPS細胞由来DCは、骨髄由来DCと同等の機能を有することを確認できた。4.腫瘍抗原gp100発現アデノウイルスベクターの作成:C57BL/6マウス由来のB16 melanomacell lineの腫瘍抗原であるgp100を発現するアデノウイルスベクターを作成し、DCに遠沈法を用いて導入し、その発現効率を確認した。今後、作成した遺伝子導入iPS由来DCの抗腫瘍効果を検討予定である。本年度は、腫瘍抗原遺伝子gp100発現iPS細胞由来樹状細胞を用いた抗腫瘍効果の検討を行い、iPS細胞由来樹状細胞(iPSDCs)と骨髄由来樹状細胞(BMDCs)の抗腫瘍効果の比較を行った。具体的には、CTL(cytotoxic T lymphocyte)の誘導、マウス皮下腫瘍モデルの検討を行った。具体的実験は以下の通りである。1. gp100遺伝子導入iPSDCsワクチンによる特異的CTLsの誘導と誘導されたCTLの解析:2.マウス皮下腫瘍モデルに対するgp100発現iPS由来樹状細胞の抗腫瘍効果に関する検討:gp100陽性のB16細胞をマウスに皮下投与し、5日目にiPSDCs-AxCAgp100、BMDCs-AxCAgp100をそれぞれマウス皮下に投与し、経時的に腫瘍サイズを計測した。その結果、iPSDCs-AxCAgp100群とBMDCs-AxCAgp100群において、コントロール群に比べ、有意に高い腫瘍増殖抑制効果を認め、これら2群間には差は認めなかった。当初の予定であった大腸癌幹細胞の同定、分離には非常に難渋し、同定することができなかった。しかし、以上の結果により、iPS細胞由来樹状細胞を用いた癌免疫療法の有用性が証明でき、今後、臨床応用の可能性が期待できると考える。本研究は、強力な抗原提示能を有する樹状細胞(iPS細胞から誘導)と癌幹細胞を融合させ、樹状細胞表面に未知、既知の特異的抗原を提示させ、効率的に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を活性化することにより、癌幹細胞に対する癌ワクチンを作成し、強力でかつ特異的な癌治療を構築することを目的にして開始した。本年度の研究実績は以下の通りである。1.マウスiPS細胞から樹状細胞(DC)の分化・誘導:マウスiPS細胞を使用し、OP9細胞(正常なM-CSF遺伝子を欠損したop/opマウスに由来する骨髄ストローマ細胞株)をフィーダー細胞として用いてDCへの分化を誘導した。

まず、維持培養中のiPS細胞を単層培養しているOP9細胞の上へ播種し、5-6日間培養し、次に、分化した細胞を培養プレートから回収し、新たに準備したOP9細胞上でGM-CSFの存在下で5-6日間培養した。この細胞をさらにGM-CSFの存在下で培養を続け、3-7日目頃より不規則な樹状突起を有する浮遊性の細胞が出現し、それを回収し、これをさらにTNF-α、IL-4、抗CD40刺激抗体、LPS等で刺激し、著明な樹状突起を有した成熟DCを作製した。2.マウスiPS細胞由来DCの解析:作製したDCに対し、アロT細胞を刺激して増殖誘導する活性(MLR刺激活性)を行い、また、細胞表面にCD11b、CD80、CD86、MHCクラスI、MHCクラスIIの発現を確認した。3. Balb/cマウスより大腸癌幹細胞の同定、分離:Balb/cマウスより大腸癌幹細胞の同定,、分離を行い、回収した細胞を用いてマウス大腸癌幹細胞の造腫瘍能の検討を行ったが、コントロール群と差がなく、実験系を再検討中である。本年度は、iPS細胞由来樹状細胞の解析を十分に行い、内因性の骨髄由来樹状細胞と同等の機能を有することを確認できた。しかし、当初の予定である大腸癌幹細胞の同定、分離に難渋し、一部、計画を変更、追加し、腫瘍抗原遺伝子gp100発現iPS細胞由来樹状細胞を作成し実験を遂行したため、当初の研究計画まで達しなかった。本年度はマウスiPS細胞から樹状細胞(DC)の分化・誘導に予想外の時間を費やすことになり、また、大腸癌幹細胞の同定、分離が進まなかったため、当初の計画目標、つまり抗腫瘍効果の検討;CTL(cytotoxic T lymphocyte)の誘導、マウス皮下腫瘍モデルの検討にまでは達しなかった。今後、まず、腫瘍抗原遺伝子gp100発現iPS細胞由来樹状細胞を用いた抗腫瘍効果の検討を行い、iPS細胞由来樹状細胞と骨髄由来樹状細胞の抗腫瘍効果の比較を行う。具体的には、CTL(cytotoxic T lymphocyte)の誘導、マウス皮下腫瘍モデルの検討を行う。この結果により、iPS細胞由来樹状細胞を用いた癌免疫治療の臨床応用の可能性が期待できると考える。同時に、引き続き、大腸癌幹細胞の同定、分離を行う。具体的計画は以下の通りである。1.腫瘍抗原gp100発現iPS由来樹状細胞接種C57BL/6マウスにおけるCTLの誘導能と誘導されたCTLの解析.2.マウス皮下腫瘍モデルに対するgp100発現iPS由来樹状細胞の抗腫瘍効果に関する検討.3. C57BL/6マウスより大腸癌幹細胞の同定.4.マウス大腸癌幹細胞とマウスiPS細胞由来樹状細胞の融合.5.iPS由来樹状細胞/癌幹細胞融合細胞(iPS-DC/CSC-FC)接種Balb/cマウスにおけるCTLの誘導能と誘導されたCTLの解析.6.マウス皮下腫瘍モデルに対するiPS-DC/CSC-FCの抗腫瘍効果に関する検討今後、まず、大腸癌幹細胞の同定、分離が急務である。至適な培養条件を再検討し、幹細胞を作成する。また、マウス大腸癌幹細胞とマウスiPS細胞由来樹状細胞の融合についても、最も効率的で、効果的に抗原を発現する条件を検討する。
適正製造規範に適合する簡易精製が可能な次世代AAVベクターの開発 その２

本申請は安全で、感染効率の高いAAVベクター(rAAV)を、無血清細胞培養液を用いた異種成分不含(Xenogeneic Free)培養システムを用いて、適正製造規範に適合させるために超遠心分離を行うことなく、簡易精製の可能なrAAVの作成系の確立を目的としています。簡易精製方法の基盤技術として、超遠心分離操作を含まないrAAV1、rAAV8および9の精製法を確立し、国内外の学会で発表してきました。rAAV9精製法を異なったウイルスゲノムを有するウイルス、ss-および. ds-ウイルスゲノムを持つrAAV 9、異なったGOI等の精製を更に行い、それぞれが再現性良く、総力価が10E+14ベクターゲノム程度のrAAV9ベクターを得ること確認しました。これらの最終精製分画のrAAV9をネガティブ染色し、電子顕微鏡観察により質的均一性を検討したところ、中空粒子の混入は5%以下という良好な結果を得ました。しかし、本申請の昨年度経費より消耗備品類を購入させて頂いた分析用超遠心機analytical ultracentrifugation (AUC)により、この最終精製分画を分析したところ、完全長のウイルスゲノムを含むもの他に、ベクターゲノムを欠く空の粒子、断片化されたまたは不完全なベクターゲノムを含む多数の異なるウイルス種を含む粒子の集合体であることが示唆され、これらの結果をMol Ther Methods Clin Dev 11:180-190, 2018にほうこくしました。また、空の粒子、断片化されたまたは不完全なベクターゲノムを含む粒子の含有率は、ss-および. ds-ウイルスゲノムの構造、ゲノム遺伝子の塩基配列に依存しているような傾向がみられました。これらの結果を踏まえて、本課題を達成するためには、不純物の少ないウイルス作成法の再検討を行う必要あると考えます。安全で、感染効率の高いAAVベクター(rAAV)を大量調製するため、無血清細胞培養液を用いた異種成分不含(Xenogeneic Free)培養システムを用いてrAAVを作成し、超遠心分離を行わない簡易精製の可能なrAAV作成系の確立を目的としている。無血清細胞培養液として、組成が明らかな無タンパク質培地のchemically-defined Medium (CD培地)を使用し、ヒト由来培養細胞へプラスミドを遺伝子導入し、CD培地に組換えウイルスを分泌させる方法でAAVベクターを作成する異種成分不含システムを確立計画である。既に報告している超遠心分離操作を含まないrAAV 1および9の簡易精製方法を基盤技術として用い、rAAV 1または9パッケージングプラスミドに他の血清亜型のパッケージングプラスミドを混合比率を変えながら添加することにより、新たな宿主域を持ったハイブリッドrAAV1および9の作成を試みる予定でありました。しかし交付内定を頂いたのが平成28年10月21日でしたので、本申請に用いる基幹技術であるクロマトグラフィーのみでrAAV9を精製する方法をブラシュアップ中でした。精製の再現性、異なったウイルスゲノムを有するウイルス、ss-および. ds-ウイルスゲノムを持つrAAV 9等の精製を更に行い、それぞれが再現性良く、総力価が10E+14ベクターゲノム程度のrAAV9ベクターを得ること確認しました。次年は第二世代(7-8型、10型)のAAVパッケージングプラスミドを9型パッケージングプラスミドに種々の比率で混合添加することにより、表面荷電をあまり変更せずに、陰イオン交換樹脂に結合出来る形体の混合キャプシドを持つハイブリッドAAVベクターを作成・精製することを目標とします。新たな宿主域を持ったハイブリッドrAAV9の作成を試みる予定です。科研費の交付内定を頂いたのが平成28年10月21日でしたので基幹技術となる“クロマトグラフィー技術のみで臨床応用可能な高品質なrAAV9ベクター精製法の検討"を行っていました。rAAV1および9の作製・粗精製法はともに共通で、3種のプラスミドをヒト由来のHEK293EB(遺伝子改変高rAAV産生)細胞に無血清培地内で遺伝子導入し、5日後に培養上清を回収し、限外濾過濃縮、硫酸アンモニウム(硫安)沈殿法にて粗精製を行ないます。硫安沈殿分画を陰イオン交換カラムに負荷し、カラムに吸着せずに流出する条件を探し出し、最終的にゲル濾過クロマトグラフィーで精製するという方法を確立しました。ウイルスゲノムとしてegfp、luciferase、およびウイルスゲノム構造がss-またはds-であるもの等を用いてこの方法で精製したところ、ウイルスゲノム配列に非依存性、ゲノム構造にも非依存性で、それぞれが再現性良く、総力価が10E+14ウイルスゲノム以上のrAAV9ベクターを大学実験室レベルの培養施設で調製できました。最終精製標品はin vitroの培養細胞で遺伝子発現能力を示し、SDS-PAGE,抗AAVキャプシド・モノクロナル抗体を用いたウェスタンブロットからも、キャプシドタンパク質以外の夾雑タンパク質がほとんどないことも確認いたしました。遺伝子導入効率を低下させると考えられている中空粒子の混入率を電子顕微鏡観察から算出すると、どれも5%以下と、高純度に再現性をもって大量精製できる精製方法であることを確認しました。この成果を国際学術誌に現在投稿中で学会では既に報告しています。このウイルスゲノムに関わりなく高純度で、中空粒子の混入がほとんど無いrAAV9を精製できる方法を用いて、新たな宿主域を持ったハイブリッドrAAV9ベクターの作成を試みる予定です。

本申請は安全で、感染効率の高いAAVベクター(rAAV)を無血清細胞培養液を用いた異種成分不含(Xenogeneic Free)培養システムを用いて、適正製造規範に適合させるために超遠心分離を行うことなく、簡易精製の可能なrAAVの作成系の確立を目指します。簡易精製方法の基盤技術として、超遠心分離操作を含まないrAAV1および9に加えて、rAAV8の精製法も確立し、発表しました。rAAV1、rAAV9およびrAAV8のパッケージングプラスミドに他の血清亜型のパッケージングプラスミドの混合比率を変えながら添加することにより、新たな宿主域を持ったハイブリッドrAAV1、rAAV9およびrAAV8の作成を試みることが可能となりました。2種類の大量培養装置を用いて、ヒト胎児腎細胞由来のHEK293EB細胞より、rAAV1の作成を試みました。0.53m2の固定庄に細胞接着させる循環型バイオリアクターに5 x 10E+8 cellsを播種し、8 x 10E+13 vgのrAAV1が得られましたが、Wave型の培養装置ではマイクロキャリアに充分量の細胞の接着は出来ませんでした。平成29年1月にrAAVの質的均一性を検討するため、分析用超遠心機analytical ultracentrifugation (AUC)を導入し、本申請の経費よりに必要な消耗備品類を購入致しました。電顕で中空粒子の混入が少ないと思われていたこれまでの精製rAAV1および9ベクターを解析したところ、完全長のウイルスゲノムを含むもの他に、ベクターゲノムを欠く空の粒子、断片化されたまたは不完全なベクターゲノムを含む多数の異なるウイルス種を含む集合体であること確認しました。これらの結果を踏まえて、不純物の少ないウイルス作成法の更なる検討を行う必要あると考えます。Brenda Burnhamらはanalytical ultracentrifugation (AUC)を用いて、従来の作成方法で調製されたrAAV標品には、完全長のウイルスゲノムを含む発現が可能なウイルス粒子があまり存在せず、ウイルスゲノムを含まない中空粒子や断片化された不完全なベクターゲノムを含む発現が不可能であると思われる粒子等、多数の異なるウイルス粒子を含む集合体であること報告しています(Human Gene Therapy Methods, 26 ( 6) 228-242, 2015.)。電子顕微鏡のネガティブ染色像で中空粒子の混入が少ないと思われていた我々の精製rAAV1およびrAAV9ベクターを解析したところ、完全長のウイルスゲノムを含む粒子の存在比率は既報のもの比べ高値でした。しかし、ベクターゲノムを欠く中空粒子、断片化された、または不完全なベクターゲノムを含む粒子の存在も確認しました。これらの存在はrAAV標品の遺伝子導入効率を低下させる原因と考えられているため、ウイルスゲノムとしてegfp、luciferase等、およびウイルスゲノム構造がsingle strandまたはdouble strandであるもの等をそれぞれ作成し、それらの完全長のウイルスゲノムを含む粒子の存在比率等を比較検討しました。電子顕微鏡像による中空粒子の存在比率と、AUCによる完全長のウイルスゲノムを含む粒子の存在比率には明らかに矛盾が生じておりました。
アムールランド文化とアイヌ物質文化形成に関する言語・生態人類学的研究

本研究は、1995-2001年にロシアの6ヶ所の博物館において実施したアイヌ物質文化調査に基づく発展的研究である。特に、サハリンアイヌ文化については、アムールランド、すなわち、サハリン・アムール川流域、の諸民族文化を考慮に入れなければ、理解しがたいことがいっそう明らかになった。本調査ではアイヌ文化とのかかわりを解明することを究極の目的とし、a)アムールランドでの現地調査、b)現地の先住民自身との共同研究、c)ロシアおよび西欧の博物館所蔵のアムールランド関係資料の状況調査を目標として、次のような調査研究を行った。1.基本的に、ロシア極東、アムール川下流のブラーヴァ村(ウリチ)、中流のナイヒン村(ナーナイ)、コンドン村(ナーナイ)において言語学、生態学、民族学的な調査を行った。加えて、ナイヒン村及び沿海州のクラースヌィ・ヤル村(ウデゲ)において言語学的な調査を繰返し行った。2.平成17年3月にはアムール現地の博物館関係者と共にペテルブルグの「ロシア民族学博物館」などにおいて先住民文化の資料を共同調査した。現状における先住民文化研究にとって、この試みは有益であった。3.オランダ、ドイツ、デンマークの民族学博物館において、アムールランド関連の所蔵資料の調査を行った。しかしながら、各博物館における専門家の不在のために、ヨーロッパにおけるアムールランド研究はほとんど停滞していることが判明した。4.アイヌ文化とのかかわりで、具体的に魚皮衣について調査研究を試み、各地の博物館、資料館においてサンプルを実見した。これは今後の研究に新たな糸口となろう。5.具体的な成果として、ウリチ語、ナーナイ語、ウデゲ語の言語学・ナーナイの口承文芸関係の出版を行った。また、現地の版画家との共同によりウリチ語・ロシア語による説話集を刊行した。これは「消滅の危機」状況にある先住民の言語状況を勘案してのことである。1)研究の目的アムールランドの諸民族のうちのトゥングー系諸族の物質文化について現地調査を行い、それを踏まえてアイヌの物質文化形成に関する研究の深化を図る。2)研究の方法アムール川地域の先住民ナーナイ、ウリチ、ウデゲのもとで生活環境の生態学的な条件及び生活用具、食生活、衣料、儀礼にかかわる民具について調査し、映像として記録する。得られた情報資料をもとに歴史的にアムールランドの諸民族と密接なかかわりをもつアイヌの物質文化を含めた「アムールランド文化」の全体像と地域的な特性を明らかにすることをめざす。3)本年度の調査・研究*2004年9月アムール中下流域のウリチの集落(ブラーヴァ)およびナーナイの集落(ナイヒン)においてサケ漁を中心として民族学的な調査、植物学的な調査および言語学的な調査研究を行った。*その成果報告を11月に北海道立アイヌ民族文化研究センターにおいて、1995-2001年のロシアにおけるアイヌ民族資料調査の参加者に公開した。*2005年3月に風間伸次郎は言語調査のためウデゲのクラースヌイ・ヤール村、ナーナイのナイヒン村へ出かけ、また、同じトゥングース語系のエヴェン語の調査をマガダンにおいて実施した。*2005年3月に荻原眞子と古原敏弘(研究協力者北海道立アイヌ民族文化研究センター・研究課長)はライデン民族学博物館(オランダ)、ライプツィッヒ民族学博物館(ドイツ)、ベルリン民族学博物館(ドイツ)においてアムール・サハリン地域の諸民族の所蔵資料を調査した。