hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
各種メタンモノオキシゲナーゼの酵素特性とトリクロロエチレン分解能に関する研究

メタンを基質として培養した菌体をメタンの存在しない休止状態でトリクロロエチレンに連続的に作用させた結果、接触回数を重ねるにつれたトリクロロエチレン分解能の低下することが明かとなった。集積菌は、トリクロロエチレン以外の有機塩素系溶媒のうち、クロロホルムの分解に優れていたものの、テトラクロロエチレン、1,1,1トリクロロエタンを分解することはできなかった。この集積菌から、純粋分離を試み、6種類のコロニーを得たが、植え継ぐと生育速度が著しく低下し、以後の純化操作に進むことが困難であった。酵母エキスを0.1mg/Lの濃度で生育因子として生育培地に添加することと、その増殖は高まった。培地中のCu^<2+>濃度がトリクロロエチレン分解能を有するメタン資化性細菌の分離には特に重要で、トリクロロエチレン分解に有効な非特異的な酸化酵素であるsolubleメタンモノオキシゲザーゼを有するメタン資化性細菌の分離にはCu^<2+>濃度を1μM以下の低濃度で培養しなければならなかった。高いCu^<2+>濃度で分離したメタン資化性細菌を生育させると、トリクロロエチレンの分解に有用でない細胞膜に結合したparticulate型のメタンモノオキシゲナーゼを生産した。
難治性悪性腫瘍へ臨床応用可能な分子のメス:バイオナイフの開発

がんに対する標準治療の進歩により、治療成績は格段に向上したが、一方で一部の難治性悪性腫瘍は未だ予後不良である。悪性胸膜中皮腫(MPM)はその代表的疾患であり、胸腔を這うように進展し、その浸潤機構にはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ(uPA)が重要であることが知られている。我々は独自の組換えウイルス技術により、uPA選択性に腫瘍を殺傷する新規ウイルス(バイオナイフ)を構築し、その治療効果をヒトMPMマウス同所性モデルにより検討した。バイオナイフは異なる二種のヒト悪性中皮腫(MSTO-211H、H226)に対し有効であり、強力なアポトーシス誘導効果を示した。興味深いことにH226はuPA受容体(uPAR)の発現は認めるがuPAの発現は検出できないにも拘わらず、バイオナイフに感受性であり、バイオナイフの感染自身によりuPA発現が強力に誘導された。興味深いことに、この作用はNF-κB活性阻害剤およびRNAウイルスセンサーであるRIG-Iヘリカーゼのdominant negativeであるRIG-ICを発現するウイルスにより消失した。以上から、バイオナイフはuPA活性を標的にしているにも関わらず腫瘍細胞に必ずしもuPAが発現を要せず、がんが特異的に発現するuPARがあれば強い抗腫瘍効果を発揮することが明らかとなった。現在以上の知見をもとに、臨床試験用GMP製剤の準備を開始している。初年度は、主として治療系の確立を実施した。特に近い将来の臨床応用を前提として、「同所性モデルの作成」ならびに「臨床的に実施可能なバイオナイフ投与方法とそのレジメの確立」に徹底してこだわり、臨床的に十分な効果を発揮するために必要な情報を、小動物で得ることを目的とした。具体的には1.ヒトおよびマウス悪性中皮腫における同所性胸膜播種モデルの構築2.ヒトおよびマウス消化器がんにおける同所性腹膜播種モデルの構築を優先して実施した。その結果、モデルの構築、自然予後等の検討は完了。本年度の成果として、ヒト腫瘍においては顕著な治療効果が複数の動物モデルで得られることを確認した。現在、(1)単回投与と反復投与での治療効能の増強、に関する検討も終了。現在、(2)マウス腫瘍+immune competentの系において、バイオナイフの使用が抗腫瘍免疫に及ぼす影響について検討を開始している。既に消化器がんモデルにおいては、バイオナイフによる腫瘍の融解とバイオナイフそのもののアジュバント作用により、腫瘍そのものの消失だけでなく抗腫瘍免疫の成立を示唆するデータを得ており、この観点からも免疫学的検討を加える。最終年度である今年度は、前年度の前臨床試験において得られた知見、即ちバイオナイフが悪性中皮腫の治療において有効である理由、分子機序に関する詳細な検討を実施した。その結果、1)バイオナイフはuPAによる活性化を受けるが、腫瘍由来のuPAは必ずしも必要では無く、腫瘍が発現するuPA受容体(uPAR)が必須であることが明らかになった。2)バイオナイフが感染すること、そして膜融合を来すこと、それ自身で腫瘍由来のuPAが発現することが明らかとなった。この分子メカニズみを解析するため、センダイウイルスのゲノムセンサーでありRNAヘリカーゼでもあるRIG-Iのdominantnegative変異体(RIG-IC)を発現するバイオナイフを構築し、同様の実験を行うと、腫瘍由来uPAの発現は消失した。またRIG-Iの下流で活性化するNF-kB活性阻害薬を使用すると、同様にuPA発現は消失した。以上から、バイオナイフは感染そのものによりuPAR発現腫瘍細胞を強力に細胞死へ誘導することが明らかとなった。
アパレル水系洗浄プロセスへの大気圧プラズマ処理の導入

大気圧プラズマを用いて被洗物の前処理を行い,洗浄性を向上させることを試みた.人工汚染布を用いた結果から,疎水性の大きい繊維や汚れではプラズマ処理により汚れの除去が促進され,再付着が抑制される結果が得られた.さらに布の損傷がなく,殺菌効果があるという結果を得た。次に、PETのフィルム,メッシュおよび布を用い,ステアリン酸汚れを付着させた.顕微鏡画像処理法と表面反射率法で汚れの除去率を求めたところ、いずれも洗浄前にプラズマ処理を行うと汚れの脱離が促進されるという結果を得た.さらに,水晶振動子法を用いて付着重量を求める方法で洗浄性評価を行い、プラズマ処理効果を確認した。水系洗浄の前処理として非平衡大気圧プラズマジェットを利用する試みについて、洗浄効果や衣服への影響について実用化を視野に入れて実験的検証を行った。モデル汚れとしてカーボンブラック、オレイン酸またはステアリン酸を各種繊維からなる平織布に付着させて人工汚染布を作製し,大気圧プラズマジェット処理を行った。各種洗浄水溶液中に人工汚染布と原白布を入れ、機械力無、または機械力(超音波および振とう)を与えて洗浄を行った。洗浄前後の布の表面反射率を測定して汚れの脱離性と再付着性を評価した。これらのビーカーを用いた洗浄実験に加えて,実用系での効果を調べるため, ISO標準ドラム型洗浄機を用いた洗浄実験も行った.いずれの洗浄条件でも疎水性の大きい繊維や汚れでは、洗浄前のプラズマ処理により汚れの除去が促進され,再付着が抑制される結果が得られた.この原因はプラズマ処理により繊維表面や汚れが親水化され,洗浄媒体である水にぬれやすくなって洗浄が有利になったためと考えられる.また,布に菌を付着させたのちプラズマ処理を行い,生菌数を調べる方法で殺菌効果を検討したところ、滅菌作用が確認され,洗浄前のプラズマ照射は汚れ除去とともに菌の繁殖や臭いの発生を抑えて,衣服の清潔を維持できることが示唆された.さらに,プラズマジェット処理による布の損傷の有無を調べるため,処理前後の表面反射スペクトルや引張強伸度を測定したところ、布の損傷は殆どなかった。また、原白布を染色してプラズマ照射を行ったが、変退色は認められなかった。以上の結果から、水洗濯の前処理としての大気圧プラズマ処理の実用化が期待される。水系洗浄の前処理として,気相中での処理が可能な非平衡大気圧プラズマジェット利用することを検討した.プラズマ前処理の洗浄効果を調べるために,まず,ポリエステルフィルムにステアリン酸汚れを付着させ,顕微鏡画像処理法によりフィルムに付着した汚れを二値化する方法で,洗浄前後の汚れ量を求めて洗浄性を評価した.洗浄前のプラズマ処理により,水,アルカリ水溶液および界面活性剤水溶液,いずれの洗浄液中でも汚れ除去が促進される傾向が認められた.次に,ステアリン酸汚れをポリエステル布に付着させて人工汚染布を作製し、洗浄前後の表面反射率変化から洗浄性評価を行ったところ、洗浄前のプラズマ処理によりステアリン酸汚れの除去が促進され,再付着が抑制される結果が得られた.ポリエステル布の洗浄性向上はステアリン酸汚れのみならず,オレイン酸汚れやカーボンブラック汚れでも確認された.プラズマ処理前後のポリエステルおよびステアリン酸膜に対する水の接触角を測定した結果,いずれもプラズマ処理後のほうが小さく、表面親水化が起こっていることが確認された.このことから,プラズマ処理により汚れや基質が親水化され,洗浄媒体である水にぬれやすくなって洗浄が有利になったと考えられる.さらに,布に黄色ぶどう状球菌を付着させ,プラズマ処理前後の生菌数を調べたところ,プラズマによる殺菌効果が確認された。洗浄前の被洗物のプラズマ処理により,汚れ除去とともに菌の繁殖や臭いの発生を抑えて衣服の清潔を維持できる可能性が示唆された.モデル汚れとしてカーボンブラック、オレイン酸またはステアリン酸を各種平織布に付着させて人工汚染布を作製し,大気圧プラズマジェット処理を行った。各種洗浄水溶液中で人工汚染布と原白布を洗浄し、表面反射率法により汚れの脱離性と再付着性を評価した。さらに、実用系での効果があるかどうかを調べるため, ISO標準ドラム型洗浄機を用いた洗浄実験も行った。いずれの場合も疎水性の大きい繊維や汚れでは洗浄前のプラズマ処理により汚れの除去が促進され,再付着が抑制される傾向が認められた。この効果はプラズマ処理により繊維表面や汚れが親水化され,洗浄媒体である水にぬれやすくなったためと考えられる。また,プラズマ処理による殺菌効果、布の損傷や変退色がないことが確認され,洗浄前のプラズマ照射は汚れ除去とともに菌の繁殖や臭いの発生を抑えて,衣服の清潔を維持できることが示唆された。次に、形態の異なる高分子基質の前処理としての利用の観点から、PETのフィルム,メッシュおよび布を用い,油汚れのモデルであるステアリン酸を付着させた.

プラズマ照射を行った後,洗浄液中に垂直に浸漬し,磁気撹拌子を用いて5分間の撹拌洗浄を行った。フィルムでは,洗浄前後の顕微鏡画像を撮影し,画像処理ソフトを用いた二値化処理により汚れ量を抽出する方法で汚れの除去率を求めた。メッシュおよび布では,ステアリン酸に色素を混合し,最大吸収波長でのクベルカムンク関数K/Sから汚れの除去率を算出した。その結果,いずれの洗浄性評価法でも洗浄前にプラズマ処理を行うと汚れの脱離が促進されるという結果が得られた。さらに,水晶振動子上にPET膜を作成し,付着したステアリン酸の洗浄前後の質量変化を追跡してプラズマ処理効果を調べた。その結果,洗浄前のプラズマ処理が汚れ除去を促進させることが確認された。被服学各種布を用いた実用系試験でも水系洗浄の前処理としてのプラズマ処理効果が確認できた.さらに抗菌試験やプラズマ処理による布の損傷評価も行い、水系洗浄の前処理としてのプラズマ処理の有効性が示された.研究成果は既に学会発表を終え、さらに学術雑誌に論文として掲載されており、洗浄実験データの集積と解析、公表が順調に遂行している.モデル系や人工汚染布を用いたポリエステル表面の洗浄性評価がほぼ完了し,水系洗浄の前処理としてのプラズマ処理効果が確認できた.また,プラズマ処理による汚れや繊維の親水化が確認された.このように,洗浄実験データの集積と解析が順調に遂行している.水系洗浄の前処理としての大気圧プラズマ処理の有効性をさらに検証するために、ナノレベルで汚れの付着重量の測定が可能な水晶振動子を用いてモデル洗浄系を構築し、洗浄実験を行う。水晶振動子へのモデル油汚れの付着は分子レベルで配向制御が可能なラングミュアーブロジェット法で行う。基質への汚れの付着前後、プラズマ処理前後および洗浄前後の水晶振動子の周波数から汚れの付着重量を定量して洗浄性を評価し、プラズマ処理効果の信頼性を確立する。ポリエステル以外の布を用いて人工汚染布を作成し,プラズマ処理の洗浄効果を調べる.また、水晶振動子を用いてモデル洗浄系を作製し、洗浄前後の汚れ重量を定量する方法で、プラズマ処理効果をより明らかにする.プラズマ殺菌への処理時の熱の影響を明らかにするために,カビに対する効果を調べる.さらに,プラズマジェット処理による布の損傷の有無を調べるため,処理前後の布の黄変や引張強伸度,並びに染色堅牢度を測定する.平成25年度は海外調査・および成果発表のための旅費枠(スペイン・7泊)を計上していたが、別の経費で出張旅費を捻出したため、未使用額が発生した。前年度の未使用額を合わせてモデル洗浄系を構築するための水晶振動子計測システムのバージョンアップをはかる。すなわち、汚れ付着量をより精度よく追跡するため、粘弾性変化を測定して周波数変化を補正するオプションを導入する。平成24年度は海外調査のための旅費枠を計上していたが、海外出張を見送ったので未使用額が発生した。前年度の未使用額を合わせてモデル洗浄系を構築するための水晶振動子計測システムを購入する.洗浄実験および布の損傷試験を行うための布,試薬,ガラス器具を購入する.抗菌性試験は依頼試験とし,そのための検査料に使用する.研究成果発表のための学会出張費(国内2回)および論文別刷代に使用する.
抗体に代わるナノバイオデバイス構築に適した高選択性分子認識ペプチドの開発

抗体分子は、従来、優れた分子認識分子として医薬・診断薬・研究用試薬等の多方面で利用されているが、ナノテクノロジーに用いられている各種素材との適合性に課題があり、代わりとなる分子認識分子の開発が望まれている。本研究は、優れた分子認識能を有するペプチドをデザインする戦略の確立を目指した。具体的には、人工的に複数のジスルフィド架橋を組込むことで立体構造を安定化させペプチドの分子認識能を向上させることを試みた。平成25年度には進化分子工学的技術であるcDNAディスプレイ法を用いてアミノ基認識ジスルフィドリッチペプチド(DRP)の取得に成功している。平成26年度はアミノ基認識DRP内のジスルフィド架橋により形成されるループ領域をランダム化した二次ライブラリを作製し、cDNAディスプレイ法を用いて元の配列とは全く異なる新規アミノ基認識DRP配列の取得に成功した。この結果は、進化分子工学的にde novoデザインされた分子認識DRPをスキャフォールドとして利用できる可能性を示唆するものと考えている。また、ラクダ科動物由来の重鎖抗体の認識機能部位を取り出したVHH抗体も熱安定性が極めて高くナノテクノロジーへの適合性に優れていると考え、cDNAディスプレイ法を用いてデザインすることを試みた。その結果、低分子化合物であるアンピシリンに結合するVHH抗体を試験管内で人工的にデザインすることに成功した。加えて、基盤技術であるcDNAディスプレイ法による分子認識分子のデザインを更に効率化するために、分子認識DRPのプルダウンアッセイ法並びに候補配列の取得と結合評価の両目的に利用可能な新規ピューロマイシン・リンカーを開発した。これらの成果により、ナノテクノロジーとの適合性が良い多様な分子認識分子の開発が促進され、革新的なナノバイオデバイスの開発につながることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、ナノテクノロジーに用いられている各種材料に適したペプチドによる認識機能分子の開発を目標とした。特に人工的に架橋構造を組込んだペプチドを認識機能分子として利用したいと考え、抗体では作製が困難な低分子化合物を認識する架橋構造含有ペプチドの創製を目指した。具体的には、進化工学的技術であるcDNAディスプレイ法を用いて、複数のジスルフィド架橋を有するペプチドライブラリから低分子化合物(ビオチン)を認識するペプチドの取得を試みた。その過程で当初の予想とは異なりさらに分子量が小さい官能基(アミノ基)を認識する30アミノ酸からなるペプチドの取得に成功した。ペプチドによるアミノ基のような官能基の認識は世界でも類がなく、引き続き解析を進めた。分子認識能を有するジスルフィド架橋の組合せを解析した結果、Cys3-Cys11、Cys25-Cys28にてジスルフィド架橋しているペプチドのみがアミノ基に結合することが判明した。さらにアミノ基修飾された多様な固相表面上に結合することからアミノ基を認識していることが明確にとなった。また、システインをアラニン置換するとアミノ基認識能が失われることから、二組のジスルフィド架橋がアミノ基認識に必須であることが明らかとなった。さらに円二色性測定により二組のジスルフィド架橋が二次構造形成を促進していることが判明した。本ペプチドはl^<st>Cys-2^<nd>Cys、3^<rd>Cys-4^<th>Cysというジスルフィド架橋パターンを有する機能ペプチドの初の創出例である。また、従来ペプチドによる官能基認識は報告されておらず、本成果は架橋構造の組込みによりペプチドの分子識別能を拡張できることを示唆している。ペプチドを抗体に代わる認識機能分子として利用する際に分子認識能の拡張は重要であり、本成果はこの分野の発展に寄与した。

26年度が最終年度であるため、記入しない。cDNAディスプレイ法を用いて複数のジスルフィド結合を有する低分子認識ペプチドの取得に成功し、ジスルフィド結合と機能の関連についても解析が終了しているため。当初の計画通り、親和性の測定とNMRによるアミノ基認織メカニズムの解析を進めたいと考えている。一方で、当初の計画では、NMR解析と並行して変異体ライブラリを作製し進化工学的手法による親和性の向上を試みる予定であったが、アミノ基という極めて小さい分子と相互作用するペプチドに対して完全ランダムに変異を加え進化を試みることは効率的でないと判断した。あらかじめNMR解析により分子認識メカニズムを把握したうえで変異を加える箇所等を検討し、変異体ライブラリの作製に取り組みたいと考えている。
日本における第四紀以降のイノシシの形態に基づく形態変化と系統分類

昨年度に続いて、奈良文化財研究所が所蔵する全国の報告書から、哺乳動物遺存体(特にイノシシとシカ)が出土している縄文時代の遺跡を抽出し、縄文時代のイノシシの年代別分布を文献調査した。総計6000件以上の報告書を調査し、動物遺存体の報告がされている1000件以上の文献の概要をデータベース化した。同一遺跡でも層準や地区によってイノシシやシカの出土状況が異なることがある。このようなことが把握できるように、今年度はさらに、同一遺跡内でもイノシシやシカの出土の年代ごとの有無が確認できるデータベースを構築した。昨年度同様、出土動物や出土層準、年代の確認作業は、報告書によっては明確に記載されていないことも多く、調査に時間がかかり、現在も進行中である。このようなことから、形態変化の研究まで進んでいないが、縄文時代の各時期におけるイノシシの分布の変遷が、徐々に明らかになりつつある。明確ではないが、縄文時代早期または前期から晩期にかけて、北陸や東北地方北部までイノシシの分布が拡大したようで、温暖化による環境変化との関係が考えられる。また、研究者との議論の中で、東北地方を中心に積雪地帯にイノシシが分布しなくなるのは近世になってからのことであるがわかった。人類の活動と関連するかどうかは、形態的に検討できていないのでまだ未確認である。今後、さらに正確な情報を更正・蓄積し、情報処理することによって、日本の全国的なイノシシの分布や、シカなど他の狩猟獣との出土比率を考察することで、イノシシの自然分布の変遷、家畜化の問題などを論じていく上で、重要な基礎データとなる。また、目的の遺跡を検索して、効率よく調査できるデータベースとして利用可能で、このデータベースをインターネット上に公開し、ほかの研究者にでも効率的に情報が更新できるよう、現在計画している。
置換基導入によるポルフィリン環の歪みの制御

1.種々の歪みを持つポルフィリン(ヘキサフェニルポルフィリン、2種のオクタフェニルポルフィリン及びデカフェニルポルフィリン)を混合縮合法により合成した。また選択的にヘキサフェニルポルフィリンまたはデカフェニルポルフィリンを高収率で合成する方法も確立した。この研究結果に関しては、現在論文投稿準備中である。2.1で合成したポルフィリンの分光学的性質の溶媒効果をUV-visibleスペクトルにより調べた。この結果、フェニル基の増加とともにポルフィリン環の歪みが増大していくことが推測された。3.これらのポルフィリンの亜鉛錯体への、ピリジン結合反応を検討した結果、ポルフィリン環の歪みの増大とともにピリジンが結合しやすくなっていくことが判った。この結果を錯体化学討論会(福岡)および薬学会年会(仙台)で発表することができた。4.筆者はドデカフェニルポルフィリンの異常に速い金属導入反応を見い出している。この反応をこれらのポルフィリンについて調べた結果、ポルフィリン環の歪みの増大とともに著しく反応速度が増大することがわかった。この結果は薬学会年会(金沢)で発表する予定である。5.これらのポルフィリンの亜鉛錯体の酸化還元電位を調べた結果、ポルフィリン環の歪みの増大とともに酸化電位のみ正にシフトすることがわかった。この結果も薬学会年会(金沢)で発表する予定である。
非平衡可積分統計力学模型の研究

今年度は、まずこれまでの研究で得られた結果を発展させる研究を行った。q-TASEPと呼ばれる確率粒子系の定常状態の揺らぎを調べる研究を一般化し、確率的高スピン6頂点模型の定常状態の揺らぎを調べる研究を進め、論文にまとめた(現在論文投稿中)。確率的高スピン6頂点模型は、近年のKPZ普遍性に関係する多くの模型を含む一般的なモデルとなっており、本成果は、高い一般性を持つ結果であると言える。また、2017年にレター論文を出版した、対称排他過程における着目粒子の位置の大偏差を決定する研究を深め、任意の時刻における粒子の位置に対する積分表示を得ることに成功し、論文にまとめた。大偏差の決定も、レター論文執筆時より明快な形で行うことができるようになった。昨年度行った2成分排他過程のカレント揺らぎに関する研究を深める研究も進めている。当初の想定より技術的に困難な部分があることが判明し時間がかかっている面はあるが、近いうちに解決し、論文を完成させる予定である。最初の研究においては、ランダム初期条件を採用していたが、交代型初期条件に対する研究も進めつつある。今年度は、量子系に対する非平衡揺らぎの性質を調べる研究も進めてきた。その成果の一つとして、XXモデルと呼ばれる量子スピン鎖のモデルに対し、初期条件をdomain wall型と呼ばれるものにとった場合の原点でのスピン流の揺らぎが、ランダム行列理論を用いて記述できることを示した。さらに、得られた表式に対し漸近解析を行うことにより、スピン流の大偏差関数を決定することに成功した。先行研究において、平均や分散の振る舞いは調べられていたが、このように揺らぎ全体を決定する研究はこれまで無かったため、価値のある研究であるといえる。それ以外にも、境界において粒子の出入りのあるモデルの性質も調べつつある。本研究においては、可解非平衡粒子模型の揺らぎに関する研究を一般化することが大きな目的であったが、いくつかの方向性において、一定の成果が得られている。まず、KPZ普遍性クラスに属する系の揺らぎを決定する研究の一般化、発展として、今年度までに、定常的な状況にある確率的6頂点模型の揺らぎの決定という結果まで得ることができた。確率的6頂点模型は、KPZ普遍性クラスに属する多くの系を特別な場合として含む一般性の高いモデルであり、そのモデルに対して揺らぎを決定できたということは、同時に他の多くのモデル系に対しても同様な結果が得られることを、ほぼ含んでいる(「ほぼ」というのは、厳密には極限操作が含まれるのでその正当化は必要な場合があるということである)。ただ、平坦型を代表とする他の初期条件や、他の境界条件の場合にも、同様の一般性をもった結果を得ることまでは達成されていない。これまで培われた手法を用いて、KPZ普遍性とは異なる性質を示す対称排他過程の揺らぎを大偏差のレベルで決定することも、本研究の目的の一つであったが、それは定常状態の場合には達成することができた。ただ、他の初期条件の場合に対する結果はまだ得られておらず、またマクロ揺らぎ理論とよばれるより一般性のある理論との関係をつけるところまでは出来ていない。多成分系への拡張も本研究の目的であったが、特別な場合には成功し、進展は十分あったとも言えるが、他の初期条件やモデルにどの程度拡張可能であるかは未知のままであり、不十分な面も残っている。さらに、量子系における非平衡揺らぎを検討することも本研究の目的の一つであったが、まずはXXモデルという特殊な場合ではあるが、一つ成果を得ることができ、進展はあったと言える。ただその一般性に関しては、これからの研究において明らかとしてゆく必要がある。本研究は、当初は平成30年度が最終年度の予定であったが、いくつか完成しきれていない点が残っているため、2019年度に延長することとした。特に多成分系の揺らぎに関する研究においては、平成30年度開始時点では、平成30年度中に、最初に出版したレター論文を発展させる形での本論文を完成させる予定であったが、当初の想定より技術的に困難な部分があることが判明したり、他の研究の方を優先する時期が長くなったため、年度中の完成には至らなかった。2019年度はまずはこの研究を進める。技術的な困難については、現在種々の観点から計算、検討を加えた結果、解決の方向性が見えつつある状況である。これまでの知識、経験を総動員して問題を解決し、論文の完成を期すこととしたい。他にも、KPZ系の他の初期条件の場合の研究や、対称排他過程の揺らぎ、量子系に対する揺らぎの研究においても、少しずつ現在進展が見られつつある状況であり、2019年度中にさらなる成果が得られるよう努めたい。また、本研究においてこれまで得られた研究成果を発表する機会をなるべく多く作ることも行う予定である。例えば、2019年7月には、統計物理学国際会議がブエノスアイレス(アルゼンチン)で開催されるので、そこで本研究のおける成果の発表を行うことを予定している。O'Connell-Yorモデルと呼ばれる有限温度での方向性のあるポリマーの問題を考察し、分配関数の母関数に関して、ランダム行列理論と類似の行列式構造が存在することを見出した。これまでの研究において、ゼロ温度においてはランダム行列的な構造が存在することが知られていたが、有限温度の場合はこれまでマクドナルド多項式を用いるなどより複雑な手法のみ適用されており、今回の発見で解析がより容易となる。

例えば、今回の行列式構造が得られると、母関数がフレドホルム行列式で書けることや、さらにその積分核が直交する関数の積の和の形にかけることがすぐにわかり、各々の関数の漸近解析を行うことにより、系の普遍的な性質を議論する事ができる。導出は、ゲルファントーツェトリンに類似するより自由度の大きな系を導入することにより行った。現在同様な議論や手法をより一般の系に適用すべく研究を行っている。またSU(1,1)を変形した量子群に関係する模型の構成を行った。適当な極限を取ることで、KMPモデルと呼ばれる確率的熱輸送の模型の非対称版が含まれていることを見出した。KMPモデルは、双対性などを用いてかなり詳しく解析の出来るモデルであることが知られている。今回構成した非対称版も、その構成法から双対性を持つ事がわかるので、それらを用いて性質を調べて行く事が可能であると期待される。他にも、対称排他過程における粒子の拡散の大偏差を決定することや、2成分排他過程の揺らぎの問題等についての検討も進めている。当初の課題であったO'Connell-Yorポリマーと呼ばれる有限温度ポリマーの問題に対して、その行列式構造の理解を深め論文発表にまで至ったのは、順調に研究が進展した点といえる。最初はポリマーの分配関数の母関数にランダム行列理論と同様の行列式表示が存在する事に気づいたことから出発した研究であったが、その後Gelfand-Tsetlinパターン上のダイナミクスを用いると見通し良く導出できることがわかったり、ゼロ温度において反射的な相互作用を持つブラウン運動粒子系の有限温度版を新たに得る事が出来るなど、いくつかの成果が得られた。また、これらの解析で重要な役割を果たしている双対性を適用することにより、KMPモデルとしてよく知られた熱伝導模型の非対称版を構成し、その性質をいくつか議論するという成果も得られた。一方で、有限温度ポリマーの行列式構造に関する議論をより一般のモデルに適用する試みには、いくつかの困難が現れ、現在その解決に向け研究を進めている状況である。これまでのところ、少し別の議論を用いることにより、より一般の有限温度ポリマーや関連する多粒子確率過程モデルに関する母関数に対する新しい表式を得ることに成功した。現在その表式を用いてどのようなことがさらに可能となるか検討している段階である。これらの問題に対する理解を深めるという目的もあり、対称排他過程や多成分系の揺らぎに関する研究も同時に進めている状況である。今年度は、1次元排他過程における粒子の位置の揺らぎに関する研究を中心に行った。まず、q-TASEPと呼ばれる完全非対称単純排他過程の一種においても、同様の初期条件、特に定常的な初期条件の場合に粒子の位置の揺らぎについて研究を行った。これまでも原点より左側の格子点が全て埋まっている初期条件においては粒子の位置の揺らぎについて調べられていたが、原点より左側に粒子がランダムに存在する場合はモーメントが発散するという困難があったため未解決であった。この問題をモーメントを直接使わない新たな方法を開発して解決した。現在論文を投稿中である。また、対称単純排他過程において、原点より左側には密度r-、右側には密度r+で粒子がランダムにいる初期条件の場合に、原点から出発する粒子の位置の揺らぎについて調べた。
DNAマイクロアレイを応用した多項目遺伝子情報に基づく口腔癌の個性診断法の開発

ゲノム情報を基盤に疾患の新しい診断、治療、予防法の開発が推進されており、基礎研究で得られた成果を臨床医学に展開する「トランスレーションリサーチ」に多大な期待が寄せられている。私たちは、ゲノム一次構造変化の探索と新規ゲノム異常を標的にした疾患遺伝子の同定アプローチを体系化し、これを実践し、複数の癌や遺伝疾患の関連遺伝子を発見してきている。例えば、食道扁平上皮癌(ESC)では高頻度11q22増幅の標的遺伝子がアポトーシスインヒビターのIAPファミリーの一員であるcIAP1であることを同定し、さらに子宮頚癌においてもcIAP1増幅を高頻度を検出し、子宮頚癌の局所再発において新しいバイオマーカーとなることを見出した。次に、ESC細胞株で14q12-13領域に高頻度の増幅を見出し,5個の既知遺伝子(BnZ1A, SRP54,NFKBIA, MBIP, HNF3A)と2個の未知遺伝子が標的であることを明らかにした。また、ESC細胞株で検出された18p11.3増幅の標的遺伝子が、c-yes, Thymidylate synthase (TS), TGIFの3遺伝子であることを明らかにした。これらの成果は口腔扁平上皮癌の分子病態を知る上でも極めて高い価値を有する。加えて、構想より5年を経てBAC/PACクローンを搭載した高精度・高密度アレイを構築した。これは約0.7Mbの解像度とヒト全ゲノムの約1/3をカバーする世界的にも最高精度のツールであり、癌の病態解明の糸口となる潜在的ゲノム構造異常の検出に威力を発揮するものと期待されている。また、口腔癌の個性診断のためのDNAチップの作製を短時間に行うことが可能となる。さらにこのチップを用いて、個々の癌における遺伝情報に基づいた至適治療法の選択や予後の推定を実用化することが期待できる。口腔外科領域の癌におけるゲノム変化を体系的・網羅的に検索し異常の検出された領域から癌関連遺伝子を単離・同定すると共に,新規に作製するゲノムDNAマイクロアレイを用いてこれらの異常と臨床病理学的データとの関連を体系的に解析することで,多項目遺伝情報に基づく口腔領域の「癌の個性診断法」を確立することを目的として研究を推進し,以下の成果を得た。1.口腔,咽頭,食道領域の癌におけるゲノム異常の探索と検出された異常領域からの癌関連遺伝子異常を同定・単離するため,細胞株あるいは臨床検体よりDNA等の解析材料を抽出するとともに,臨床・病理学的データの収集を開始している。2.これらの材料を対象にCGH法・FISH法にて解析することにより複数の新しい遺伝子増幅領域が検出された。これらの領域から,既知ならびに新規の増幅の標的となる癌関連遺伝子(例えば食道扁平上皮癌における1q32増幅領域内のATF3やCENPF,あるいは9p23増幅領域内のGASClやNF1Bなど)が単離でき,さらに他の領域でも解析を進めている。一部については遺伝子の機能解析も行っている。3.網羅的かつ高精度にゲノムDNAコピー数の変化を検出するCGH法を基盤にした高密度・高感度のゲノムDNAマイクロアレイの開発に着手した。UCSF癌研究所Gray博士との共同研究により,既製のマイクロアレイを用いた方法より優れた,1コピーの変化をも検出できるシステムが実現可能であることを確認した。ゲノムワイドな遺伝子異常のスクリーニングに実用可能な高密度ゲノムDNAマイクロアレイの作製を進めている。

口腔外科領域の癌におけるゲノム変化を体系的・網羅的に検出し、異常の見出された領域から癌関連遺伝子を単離・同定するとともに、新規に作製するゲノムDNAマイクロアレイを用いてこれら異常の検出の効率化を図り、また異常の見られた領域や遺伝子と臨床病理学的データとの関連を体系的に解析することで、多項目遺伝情報に基づく口腔領域癌の個性診断法を確立することを目的として研究を推進し、以下の成果を得た。1.口腔・咽頭・食道領域の癌の細胞株ならびに臨床検体の収集とDNA等の解析材料の抽出、およびこれらの臨床病理学的データの収集とデータベース化を継続して行っている。2.これらの検体を用いたゲノムDNAコピー数異常の解析により見出された新規増幅領域から複数の既知あるいは未知の癌関連標的遺伝子を単離・同定した。これには、3q26増幅領域のSNO、EVI1、11q21-23増幅領域のcLAP1、14q12-21増幅領域のHNF3β、18p11.3増幅領域のHEC、TGIF、など多数の遺伝子が含まれ、一部に関しては機能解析を行い癌細胞の悪性形質獲得の機序を明らかにした。3.基礎技術開発を進めてきたゲノムDNAマイクロアレイについては、試作レベルのアレイの作製を進め、実際の検体においてゲノムコピー数の変化を検出できることをCGH法、FISH法と比較して確認した。約200の癌関連遺伝子をスポットしたアレイにについては30種類の食道扁平上皮癌細胞株を気象対象に実際の解析を行い、homozygou seletionなどCGHでは検出不能であった異常の検出が可能であることを示すとともに、癌細胞のゲノム変化によるクラスタリングの可能性を明らかにしている。さらに現在、これらの結果をもとにゲノムワイドにスクリーニング可能な3000個以上のスポットからなるアレイ、あるいは約500の癌関連遺伝子をスポットしたアレイを作製している。口腔領域腫瘍を含む固形腫瘍の病型特異的ゲノム異常の探索を目的に、総計860以上のサンプルでCGH法によるゲノムコピー数異常解析を行った。その結果、いくつかの新規増幅領域を見出し、さらに標的遺伝子を明らかにした。食道扁平上皮癌の新規11q22増幅の標的がアポトーシス阻害に働くcIAP1であり、本遺伝子は子宮頚癌(CVC)においても増幅異常を起こし、CVC放射線単独治療例において、cIAP1核染色性と局所再発、生存率間で有意な相関を確認した。(P=0.023,P=0.0017)また、本遺伝子はHead&Neck tumorにおいても高い頻度で増幅・発現亢進を認め、口腔領域腫瘍の悪性化に関与する癌関連遺伝子であることを明らかにした。肺小細胞癌(SCLC)において5pl3増幅を高頻度に検出し、その標的がユビキチン・リガーゼE3の基質認識分子SKP2であることを明らかにした。SKP2発現抑制はDNA合成の抑制のみならず、細胞アポトーシスを惹起することを証明し、SKP2ならびにその周辺に働く分子が格好の標的治療の候補になる可能性を示した。SKP2増幅/機能亢進は肺非小細胞癌(NSCLC)でも高頻度に起きていることを明らかにしており、肺癌におけるSKP2を分子標的とした新たな治療戦略に期待できる。また、腫瘍ゲノムコピー数の網羅的・高精度解析をめざし、高密度CGHアレイを開発した。すでに800個の癌関連遺伝子を張り付けた「癌の個性診断」用high through-put CGHアレイを作製し、口腔癌をはじめとする種々の病型の腫瘍で基礎データを収集しつつある。
ギガヘルツ動作を可能にする酸化亜鉛トランジスタの開発

ギガヘルツ帯で動作する酸化亜鉛系トランジスタを開発した。単結晶ZnO/ZnMgOヘテロ構造を利用したMIS-FETを試作し,高周波特性を測定し,電流利得の遮断周波数を測定し,1.7GHzとギガヘルツ動作が可能なことを立証した。また,静特性と高周波特性の関係を明らかにし,スパッタ成膜による酸化亜鉛系トランジスタでも同等の高速動作が可能なことを示した。酸化亜鉛系トランジスタの高速性を評価するため,分子線結晶成長(MBE)法により作製した単結晶ZnO/ZnMgOヘテロ構造を利用してFETを作製し,高周波特性を評価したヘテロ構造の室温での電子移動度と濃度はそれぞれ,180cm^2/Vsおよび1×10^<13>cm^<-2>であった.FETの構造は従来から高い静特性が得られるヘテロMIS構造を採用し,In/Auの合金層を用いたオーミック電極および高誘電率のHfO_2をゲート絶縁膜に用いたゲート電極を形成し,ゲート長1μmおよび2μmの素子を作製したゲート長1μmの素子の伝達コンダクタンスは23mS/mmと高い値を示し,最大ドレイン電流は約6mAであったこの素子の高周波特性を評価し,電流利得および電力利得の遮断周波数f_T, f_<max>を測定したその結果,f_Tとして1.75GHzを得ることに成功した.今後は,MBE法以外の工業的な方法で成膜した薄膜をチャネル層としたトランジスタを作製し,同様の評価を行うとともに,その高性能化を目指す初年度に単結晶ヘテロ接合を利用したZn0/ZnMgO HFETの高周波特性を評価し,電流利得の遮断周波数が1.75GHzとギガヘルツ動作が得られることを明らかにした。この値は,静特性を評価して得られる,伝達コンダクタンスおよび素子形状から算出されるゲート容量から求めた値によく一致していることを確認した。したがって,高い高周波特性を実現するためには,高い伝達コンダクタンスを得ることが重要であることが分かる。そこで,今年度は,単結晶薄膜ではなく,実用性の高いマグネトロンスパッタ法により成膜したinZnO薄膜(In添加量が10wt%)をチャネル層としたTFTを作製し,熱処理条件(雰囲気,温度,時間)を検討することで,HFET構造に近い特性が得られることが分かった。さらに,素子構造にも検討を加え,HFETに匹敵する性能を実現することに成功した。さらに,溶液法のひとつである,ゾルゲル法を使ったTFTの高性能化にも取り組み,チャネル層の伝導度を上げ,伝達コンダクタンスの増大を図り,インジウム添加の検討を行った。さらに焼結時間の検討も行った。インジウム濃度を5%,10%と増加させることで薄膜の抵抗値が大幅に低下することに伴い,伝達コンダクタンスが大幅に改善し,インジウムを添加しないものに比べて,2桁程度の改善が得られ,他の方法で作製されたTFTに遜色のない特性が得られることが明らかになった。サファイア基板上に分子線結晶成長法で成膜した単結晶ZnO/ZnMgOヘテロ接合を利用して作製したギガヘルツ領域に遮断周波数をもつトランジスタは,ゲート長1 umで,伝達コンダクタンスが数十mS/mmであった.この静特性から予測される遮断周波数が,高周波特性を測定して得た遮断周波数の実測値に一致することから,トランジスタの高周波特性を評価することなく,静特性だけを評価して,高周波特性を推定することができる.そこで,今年度はスパッタ法やレーザアブレーション法でガラスやプラスチック基板上に形成した酸化亜鉛系薄膜をチャネルとしたトランジスタを作製し,その静特性を評価することによって,高周波特性を推定することを試みた.スパッタ法やレーザアブレーション法を使って作製した酸化亜鉛トランジスタは,上記の単結晶へテロ接合を用いたトランジスタとは異なり,ガラスやプラスチック基板上に基板加熱を行うことなく成膜できることが大きな特長である.素子構造をバックゲート型にするための,プロセス検討を行いトランジスタを作製した.その結果,作製した素子は,単結晶へテロ構造を利用した素子と同程度以上の静特性を有することを示すことがわかった.したがって,これらのトランジスタもギガヘルツ領域に遮断周波数を持つものと考えられる.この結果は,酸化亜鉛トランジスタの高速性を示す,非常に重要な結果である.酸化亜鉛をはじめとする酸化物半導体は,プラスチックなどのフレキシブル基板上にも形成することができるため,そのような基板上にも非常に高性能なトランジスタを形成できることが明らかになったことは,今後のデバイス応用上非常に重要な知見が得られたと結論することができる。単結晶ヘテロ構造を利用した素子のさらなる高性能化を達成することはできなかったが,マグネトロンスパッタ法に加えて,溶液法でも大幅に性能向上を実現することができ,インビジブルエレクトロニクスに適用するための作製プロセスとしての有用性を確認することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度開発した,マグネトロンスパッタ法,ゾルゲル法によるTFTのさらなる高性能化を進めるとともに,静特性だけではなく,高周波特性を評価し,ギガヘルツ動作の検証を行う。
ストレスと栄養が脳機能に及ぼす影響:作用機序に基づいた複合要因リスク評価の試み

近年の環境保健問題一般に共通する傾向として,複数の環境要因が相加的に作用して単一の健康障害を惹き起こすことがあげられる.本研究の目的は,このような複数の環境要因の相対的重要性を評価するためのアプローチを開発することである.脳機能の障害は,高齢化の進行する現在,ますます重要性を増しつつあると考えられる上,最近話題になっている多くの化学物質が何らかの形で脳機能にも影響を及ぼすことを考えると,複合要因を考えるモデルとして好適であると思われる.本研究では,環境要因による脳機能障害のモデルとして,ストレスによる海馬機能障害の系と,セレン欠乏---線条体機能障害の系を用いた.前者については,同じく海馬を障害することが明らかになってきたトリメチルスズへの曝露との複合作用を中心に後者については合成コルチコステロイドとの複合作用を解析することにより,栄養-ストレス系という2つの異なる系の相互作用を検討した.また,これらのモデルの検討に入る前段階で検討したマンガンによる線条体障害の行動学的検討ならびに細胞外グルタチオンの測定についても予備的検討を行い,それぞれに興味深い結果を示したので,併せて本報告に含めた.本研究の結果,海馬障害系においては,トリメチルスズによる障害が副腎摘出でむしろ増強され,グルココルチコイド投与で障害が抑制されるという従来の予想に反する結果を得た.線条体系では,離乳後のセレン欠乏で神経行動機能に影響が起こりえることを初めて示すことができたが,デキサメタゾンを用いたストレスとの複合曝露では,相互作用を認めなかった.脳線条体の微小透析を用いて酸化ストレス・レドックス制御との関連が深い細胞外グルタチオンを定量し,過酸化水素あるいは鉄キレーターが影響を及ぼすことを明らかにした.近年の環境保健問題一般に共通する傾向として,複数の環境要因が相加的に作用して単一の健康障害を惹き起こすことがあげられる.本研究の目的は,このような複数の環境要因の相対的重要性を評価するためのアプローチを開発することである.脳機能の障害は,高齢化の進行する現在,ますます重要性を増しつつあると考えられる上,最近話題になっている多くの化学物質が何らかの形で脳機能にも影響を及ぼすことを考えると,複合要因を考えるモデルとして好適であると思われる.本研究では,環境要因による脳機能障害のモデルとして,ストレスによる海馬機能障害の系と,セレン欠乏---線条体機能障害の系を用いた.前者については,同じく海馬を障害することが明らかになってきたトリメチルスズへの曝露との複合作用を中心に後者については合成コルチコステロイドとの複合作用を解析することにより,栄養-ストレス系という2つの異なる系の相互作用を検討した.また,これらのモデルの検討に入る前段階で検討したマンガンによる線条体障害の行動学的検討ならびに細胞外グルタチオンの測定についても予備的検討を行い,それぞれに興味深い結果を示したので,併せて本報告に含めた.本研究の結果,海馬障害系においては,トリメチルスズによる障害が副腎摘出でむしろ増強され,グルココルチコイド投与で障害が抑制されるという従来の予想に反する結果を得た.線条体系では,離乳後のセレン欠乏で神経行動機能に影響が起こりえることを初めて示すことができたが,デキサメタゾンを用いたストレスとの複合曝露では,相互作用を認めなかった.脳線条体の微小透析を用いて酸化ストレス・レドックス制御との関連が深い細胞外グルタチオンを定量し,過酸化水素あるいは鉄キレーターが影響を及ぼすことを明らかにした.本年度は脳機能障害モデルとして、有機スズ(海馬障害)およびマンガン(線条体障害)投与動物を用い、機能障害指標の測定条件検討を行ない、測定方法を確立することを目標とした。1)動物にトリメチル錫を単回投与し、14日後に海馬傷害の程度をグリア繊維性酸性蛋白(GFAP)の免疫組織科学分析によって評価した。従来知られていた通り、トリメチル錫化合物による海馬特異的な傷害を観察することができた。また、障害程度は副腎皮質切除によって増悪し、コルチコステロンあるいはデキサメゾン慢性投与によって軽減するとの新たな知見も得られた。2)片側線条体にマンガンを微量投与したマウスについて、14日および70日後にドパミン系の作動薬であるアポモルフィンを投与し、誘発される傷害反対側への回転行動をビデオに撮影して解析した。その結果、マンガン投与量に依存した回転行動が観察され、それは70日後により顕著であった。さらに、線条体の免疫組織科学によってドパミン含有細胞の特異的な傷害を観察した。オープンフィールド試験については、アポモルフィン投与条件を検討した。4)線条体における細胞外グルタチオン(GSH)を微少透析で測定する方法について条件を確立し、細胞外成分を撹乱した場合の反応を観察、細胞外GSHが鉄によって消費されていること、また細胞外Ca^<2+>の動向にも影響されることを示唆するデータを得た。5)ストレスとの関連について注目されている脂肪で産生・分泌されるホルモンであるレプチンについて、その血清中濃度のELISAキットによる測定条件を検討した。ストレスの影響としては昨年度に引き続き,有機スズによる海馬障害について,栄養の偏りの影響としては,セレン欠乏による酸化ストレスと関連すると考えられるドパミン伝達系の障害について検討を行った.1.ストレスによる脳・神経系への影響を検討する目的で、ラットに海馬を特異的に傷害するトリメチル錫化合物を投与し,海馬錐体細胞層のアポトーシスをTUNEL法により観察,これを副腎摘出による結果と比較した.

その結果,それぞれ単独の処理では海馬錐体細胞層にアポトーシスが生じ,その部位には明確な違いがみられた。両方の処理では相乗的な効果を認めた.2.慢性の栄養の偏りによる脳・神経機能への影響としては,セレン欠乏動物における神経行動機能の評価を試みた.評価にはオープンフィールド行動および運動-感覚機能の協調を見るためのロタロッド試験を用いた.5系統のマウスを用いて検討したところ,C57BL系は他の系統に比べ,いずれの指標においてもセレン欠乏に敏感に反応することが判明した.この結果は,今後効率的に実験を進める上で有用であるとともに,遺伝的な背景による環境要因影響の修飾という方向への発展性も示唆した.これらセレン欠乏としたマウスについてドパミン細胞の免疫組織染色を行った.予備的に少数例を検討した結果では,欠乏群と対照群との間に大きな差は認められなかった.来年度は他の神経タンパクへの影響,酸化ストレス指標との関連も考慮して,ストレスと栄養欠乏に同時曝露する条件での検討を実施する.本年度は、ストレスの影響としては過去2年次に引き続き,有機スズによる海馬障害についての実験を行い,また,ストレス+栄養欠乏という複合曝露のモデル実験系として,合成副腎皮質ホルモンであるデキサメタゾン投与をストレスの,セレン欠乏を栄養欠乏のそれぞれモデル因子として実験をおこなった.1.有機スズによる海馬障害モデル.トリメチルスズは,海馬に神経細胞の脱落を主とした障害を引き起こすが,これは副腎摘出で増悪し,副腎皮質ホルモン投与で抑制される.細胞死の機序からこの現象を解明するため,海馬領域におけるトリメチルスズによるアポトーシスをTUNEL法によって検討した.その結果,トリメチルスズ投与によって海馬にアポトーシスが起こり,これが副腎摘出で増悪,グルココルチコイド投与で抑制されることを見出した.2.複合曝露モデル.対照餌およびSe欠乏餌で8から9週間飼育したマウスにデキサメタゾン(1.0mg/kg)を3日問連続投与した後,以下の機能試験を実施した.デキサメタゾンの投与は,Sapolskyらの慢性ストレスモデルで用いられている量を採用しており,3日間で若干の体重減少をきたす量であった.なお,昨年度の検討によって近交系の中で最もSe欠乏に対する感受性の高かったC57B1系を用いた.オープンフィールド試験:活動性・情動性をテストしているとされる行動試験で,昨年度の検討においてはSe欠乏によって活動性が高まることがC57BLをはじめとする複数系統において観察された.本年度の検討では,Se欠乏による活動亢進を確認することができなかったが,デキサメタゾン(DEX)投与でやや活動が減少する傾向を認めた.一方でDEX投与によって,オープンフィールド活動はやや抑制された.また,Se欠乏動物の肝・脳について,イソプロスタンを用いて酸化ストレスの亢進を評価した.
蛋白質工学的手法により作製した蛋白質-多糖複合体の新規食品機能と構造

本研究者はこれまでに蛋白質とタンパク質糖を化学的に結合させると蛋白質の耐熱性や乳化性などが著しく改変され、新規な食品機能を発現するようになることを報告してきた。本研究者は、この機能改変の分子機構を解明することを目的として、蛋白質工学的手法により、卵白リゾチームをモデルとして、酵母発現系で多糖化することに成功しているので、この系を用いて研究を行った。リゾチームcDNAを部位指定変異により活性中心から離れた分子表面(49位および19位)にN型糖鎖認識配列Asn-X-Thrを導入するように改変し、これを酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、培養液に分泌したグリコシル化リゾチームをカチオン交換樹脂(CM-トヨバ-ル)に吸着させ、分離精製を行った。こうして得られたリゾチームはマンノース残基が約300個付加した多糖化リゾチームであった。この多糖化リゾチームを用いて単-多糖類複合体の高機能化(食品機能として重要な高乳化能)の分子機構を調べあ。その結果、結合糖鎖長および糖鎖のタンパク質との結合数が機能に大きく影響することが明らかになた。また、多糖鎖を蛋白質から遊離させると機能が著しく低下することが示され、蛋白質と多糖の結合が機能発現に必須であることが確認された。これらの分子レベルでの情報は蛋白質-多糖複合体の分子設計に重要な情報を提供している。本研究では、酵母発現系で異種遺伝子リゾチームを多糖化したリゾチームを用いて、蛋白質-多糖複合体の高機能化の機構を調べた。本年度は酵母発現系により、糖鎖長の異なるオリゴまたはポリマンノシル化リゾチームを作製し、糖鎖長の機能に及ぼす影響を調べた。これまでに、リゾチームの19位、49位へのN-グリコシル化に成功しているので、N-グリコシル化の数および部位の機能に及ぼす影響を調べ、次のような結果が得られた。(1)リゾチームcDNAを部位指定変異により活性中心から離れた分子表面(49位および19位)にN型糖鎖認識配列Asn-XC-Thrを導入するように改変し、これを酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、培養液に分泌したグリコシル化リゾチームをカチオン交換樹脂に吸着させ、分離精製を行った。酵母の大量培養の培養条件(pH,温度など)をコントロールすることにより、糖鎖の長さの異なるオリゴマンノシル化リゾチームとポリマンノシル化リゾチームを優先的に分泌させ、これらの性質を調べた。多糖化リゾチームは多量に分泌するが、オリゴ体は少量しか分泌しなかった。(3)こうして作製した種々のサイズの多糖化リゾチーム、異なる部位に多糖化したもの、一箇所あるいは二箇所に多糖化したリゾチームの耐熱性、乳化性を調べたところ、これらの機能と多糖化との関連が明らかになった。すなわち、糖鎖が長くなるほど、また二箇所に多糖化したものが最も優れた機能を示した。本研究者はこれまでに蛋白質と多糖を化学的に結合させると蛋白質の耐熱性や乳化性などが著しく改変され、新規な食品機能を発現するようになることを報告してきた。リゾチームcDNAを部位指定変異により活性中心から離れた分子表面(49位および19位)にN型糖鎖認識配列Asn-X-Thrを導入するように改変し、これを酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、培養液に分泌したグリコシル化リゾチームをカチオン交換樹脂(CM-トヨパール)に吸着させ、分離精製を行った。

こうして得られたリゾチームはマンノース残基が約300個付加した多糖化リゾチームであった。この多糖化リゾチームを用いて蛋白質-多糖類複合体の高機能化(食品機能として重要な高乳化能)の分子機構を調べた。その結果、結合糖鎖長および糖類のタンパク質との結合数が機能に大きく影響することが明らかになった。また、多糖類を蛋白質から遊離させると機能が著しく低下することが示され、蛋白質と多糖の結合が機能発現に必須であることが確認された。これらの分子レベルでの情報は蛋白質-多糖複合体の分子設計に重要な情報を提供している。さらに、この研究の過程で蛋白質の多糖化がその抗原構造の低減化に有効であることが示され、現在検討中である。