hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨軟部腫瘍の吸引細胞診における術前診断-in situ hybridization, in situ PCRを用いての検討-

これらのモデル実験をもとに臨床例への応用を検討している。1.骨軟部腫瘍の吸引細胞診骨軟部腫瘍は間葉系由来であるため、従来、腫瘍細胞と宿主由来の反応性に出現する間葉系の細胞とを明確に鑑別することは困難を伴うことが多かった。また、吸引細胞診では、組織の構築が失われており、細胞一個一個の解析が必要なため診断には熟練を要した。今回、我々はヒト培養細胞の異種移植モデルにおいて非放射性同位元素のジゴキシゲニンを用いたin situ hybridization法により、骨軟部腫瘍由来の腫瘍細胞と宿主由来の反応性細胞を細胞レベルで明確に区別する方法を確立した。通常の研究室で簡便に行うことができ、細胞一個一個のレベルまで判定できるこの手法は、吸引細胞診に画期的な変革をもたらすものと考えられる。2.骨軟部腫瘍の組織由来についての検討上述のin situ hybridization法により、骨軟部腫瘍のうち骨肉腫と悪性線維性組織球腫について、その組織由来について検討した。骨肉腫における骨形成細胞の由来を明らかにすることにより、骨肉腫の骨形成には3種類のタイプがあることを初めて明らかにした。また、悪性線維性組織球腫における組織球様細胞と多核巨細胞は、腫瘍細胞が産生するchemoattractant factorによって誘導される反応性細胞であることを遺伝子レベルではじめて明らかにした。滑膜肉腫、ユーイング肉腫には遺伝子の特異的な転座があることが知られている。我々は滑膜肉腫から新たな細胞株を作製し、この細胞株のcharactrizationを行っている。また、ユーイング肉腫から樹立された細胞株をヌードマウス皮下に移植し、ユーイング肉腫の腫瘍モデルを作製した。これらの腫瘍モデルを用いて、吸引採取した細胞のmRNA,DNAの至適保存条件、また、in situPCRに最適の標本作製方法について検討中である。
高齢者ための日常的な下肢動作を支援する福祉ロボットの研究開発

我々は、健常な高齢者を対象とした、起立から歩行、歩行から着座までの一連の下肢動作を補助する下肢動作支援ロボットの開発を研究目標とする。本研究では、開発するインターフェースシにより、起立、歩行、着座それぞれの動作に関して、使用者の下肢動作をモニタリングし、バランス補正することで下肢動作支援ロボットを用いる際の総合的な下肢動作補助モデルの構築を行うことを研究目的とする。提案モデルの有効性を確認するため、高齢者30名による検証実験を行い、このモデルを用いた歩行と起立着座の動作補助が可能であることを確かめた。今年度の目標は、「歩行・起立・着座の各動作(以下、下肢動作)を検出するインターフェースの研究開発」であった。目標に沿って、下肢動作の認識モデリング手法と観測装置を開発すると共に、インターフェースシステムの構築に関する研究を実施した。ここで、インターフェースの単純化及びプライバシーの配慮のために、測域センサによる動作間の距離情報のみを用いる条件を考え、インターフェースによる使用者の下肢動作を認識する二つのモデルを提案した。1)より効率的で自然な歩行支援を行うために、粒子フィルタを用いた歩行モデルを作成した。このモデルは歩行中の足位置を予測し、その予測した足位置に対して支援ロボットの駆動制御を行う手法である。2)起立着座動作時の相対距離を基に、起立着座のモデルを提案した。特に、起立着座の動作間もこのモデルにより表すことができた。提案モデルの有効性を確認するため、高齢者30名による検証実験を行い、同モデルを用いた歩行変位の観測及び起立着座の動作判別が可能であることを確かめた。また異なる身体条件の高齢者にも同様の手法により動作判別を行うことができ、汎用性の高さが検証された。そして、モデルから起立と着座の距離と時間には線形関係があると推測された。これにより、ロボットによる起立と着座に対して自然な制御を行うことが出来ると考えられる。特に、測域センサを使用し、カメラのような画像データを扱わないためプライバシーへの配慮が可能である。今年度の目標は、下肢動作における起立着座の観測モデルとこのモデルに基づいた動作モデルの研究を行った。まず、観測モデルは人体における起立着座の距離差に着目し、膝上部の距離の変化を測域センサで計測することによって起立着座を観測する。そしてこの距離データとグーデルマン関数を用いて観測モデルを構築する。このモデルでは体に触れないセンサを使用するため計測機器を装着せず、利便性が高まる。また、カメラのような画像処理を行わないためプライバシーを保護することが可能であり、少ないデータで起立着座の観測が可能である。そして高齢者の動作速度にあわせた連続的な起立着座の計測が可能である。動作モデルは、起立と着座の時間による変化部分である膝の動きに注目した。起立着座の運動は膝を中心とした膝から腰まで三次元の運動とみなすことが可能である。ここで起立着座矢状面の二次元円運動と近似化する。起立着座の円運動では動作の始まりにおいて徐々に加速し、動作の終わりにおいて徐々に減速していくと考えられる。そこでこの運動はエクスポーネンシャルとして表すことが可能ではないかと考えた。このような概念を基に提案されたモデルは、地面から腰の高さを数式で表すことと、起立着座動作のおよそ理想的な時間、速度を表すことが可能である。この起立着座モデルに基づいて下肢動作支援ロボットフレームの開発を行った。高齢者の残存機能を活かすために力補助ではなくバランス補助を行うロボットの開発を目標とした。さらに、起立着座時だけでなく車やベッドからの移動でも使用することができ、持ち運びができることからトイレなど狭い場所でも手軽く使用することができた。手すり部分の上下可動式にすることで起立と着座両方に対応することが可能であり、上下移動の速度を制御することで人によって異なる起立着座動作の速度に合わせた補助ができた。計画通りに実行できている。特に、当初の計画は「インターフェースの研究開発」に主眼をおいていたが、実際には認識モデリング手法に基づいた「歩行・起立・着座の各動作に関する新たなインターフェース」を提案することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。福祉ロボット次年度の目標は、「下肢動作支援ロボットの使用を前提とする下肢動作モデル研究と下肢動作支援ロボットのフレーム開発」である。目標に沿って、下肢動作の下肢動作モデリング手法と下肢動作支援ロボットを用いた安定なバランスの定義すると共に、下肢動作支援ロボットのフレーム開発および動作再現稼動部の開発に関する研究を実施を目指す。
多層格子数値シミュレーションを用いた連星系形成の研究

銀河系の星の大半は連星である。連星系形成のシナリオによると、連星は誕生したときから連星である。したがって、星の母体となる分子雲コアが重力収縮の過程で、複数の高密度ガス塊に分裂し、それぞれのガス塊が原始星の段階を経て主系列星へ進化し、最終的に連星系が形成されると考えられている。そこで、分子雲コアが重力収縮中に分裂して原始連星が形成する様子を、数値シミュレーションを用いて調べた。分子雲コアの大きさは0.1pc程度もある一方、形成する最初の星のコアの大きさは1AUしかない。このような広いダイナミックレンジをカバーするため、多層格子法を用いた。本研究では以下の2点に注目して、連星系形成の問題を調べた。1.先行研究の多くは、初期に非常に低温で分裂に対して不安定な分子雲コアを仮定していた。しかし、観測から示唆される分子雲コアはほぼ重力平衡状態にある。そこで、ほぼ平衡状態にある分子雲コアから出発して、分子雲コアが分裂する可能性を調べた。その結果、分子雲コアがゆっくり回転していれば、分裂することが明らかになった。さらに、分裂にはさまざまなタイプがあることが明らかになり、その中で衛星型分裂が最も主要な分裂のタイプであった。2.つぎに、星間磁場の効果に注目した。先行研究において、星間磁場を正しく考慮して連星系形成を調べたものはなく、本研究はパイオニアである。本研究の結果、星間磁場は磁気トルクにより角運動量を輸送し、分裂を抑制する。また磁気トルクはアウトフローと呼ばれる質量放出現象を引き起こす。しかし、磁場によって分裂は完全には抑制されず、星間磁場を考慮しても、高い連星頻度を説明することができる。恒星の過半数は連星で、恒星が誕生した時点で既に連星系を形成している。連星系形成の典型的なシナリオによると、分子雲コアが重力収縮する過程で、分裂し、それぞれの分裂片が質量降着して、連星系が形成すると考えられている。分子雲コアの重力収縮と分裂の問題は、ダイナミカルな現象なので、数値シミュレーションを用いた研究が必須である。ところが、分子雲コアの大きさは0.1pc程度もあり、分裂片の大きさは数AU程度しかない。したがって、分子雲コアの重力収縮と分裂を数値シミュレーションで計算するためには、非常に大きなダイナミックレンジが必要となる.そこで、大きなダイナミックレンジを得るため本研究では、多層格子法を用いた数値シミュレーションコードを開発した。多層格子法は、セルの大きさが異なる格子を入れ子状に配置し、広い領域を粗い格子で覆い、興味ある狭い領域を細かい格子で覆う。これにより、比較的少ない格子で大きなダイナミックレンジが得られる。我々が開発した多層格子法の特徴は数値流速が保存することである。最大の特徴は自己重力の解法である。自己重力コードでは、マルチグリッド法を多層格子法に拡張した。従来、流体の数値流速の保存に関しては注意されてきたが、我々の方法は自己重力の数値流速も保存する。これはガウスの法則を満たすことに対応する。また、計算時間が全セル数に比例する高速な方法である。このスキームについて、論文を執筆し、掲載された。また、この数値シミュレーションコードを用いて、連星系形成の数値シミュレーションを行いった。その結果を論文に投稿中である。
R^+/Cu^+およびR^+/Ag^+イオン交換によるガラスの新機能の創出

酸化物ガラス中のアルカリイオンの一部を他のアルカリイオンとこうかんすることにより、通常のガラス製造法では得られない種々の機能を付与させることを目的として、アルカリアルミノケイ酸塩ガラスについて、R^+/Na^+(R^+=Ag^+またはCu^+)のイオン交換を行い、誘起される構造変化と物性との関係について調査した。Na_2O-Al_2O_3-SiO_2系ガラスのCu^+/Na^+のイオン交換によって導入したCu^+は導入前と同じ1価で存在するが、その酸素配置数は交換が進むにつれて増大し、Cu^+に特有の2からCu^<2+>に特有の4に近づくことがXPS測定とEXAFS測定により明らかになり、Cu^+/Na^+イオン交換ガラスの高い電気伝導度やガラス転移点の低下はこのような酸素配位数の増大をもたらすガラス構造の変化と密接に関係しているものと推定された。一方Ag^+/Na^+のイオン交換によってAg^+を導入した場合には、^<29>Si MAS-NMRスペクトル測定および^<27>AlMAS-NMRスペクトル測定からはCu^+/Na^+のイオン交換におけるようなガラスの網目構造の著しい変化は認められなかったが、交換が進むにつれてIRおよびラマン散乱スペクトル測定における振動スペクトルのピークがシフトし、Ag^+イオンは非架橋酸素近傍のサイトがすべて占有された後、4配位のAl^<3+>イオンの電荷補償サイトを占めると推定された。これらの結果から、非架橋酸素を含まないガラスでのR^+/Na^+イオン交換によって高い電気伝導度が実現されることが明らかになった。酸化物ガラスに含まれるアルカリイオンの一部を他のアルカリイオンで置きかえることにより種々の機能を付与させることを目的として、アルカリアルミノ珪酸塩ガラスについて、R^+/Na^+(R^+=Ag^+またはCu^+)のイオン交換を行い、ガラス組成、特にR^+の種類及び量と、R^+:Al^<3+>比、イオン交換条件等と構造・物性変化の関係の調査、高電気伝導ガラス作製の最適条件の探索など、ガラス中のイオンの移動現象に基づく新機能材料開発に関する基礎研究を行った。その結果、20Na_2O-10Al_2O_3-70SiO_2(mol%)ガラス中のNa^+をCu^+と交換すると、ガラス転移点が大幅に低下するのみでなく、通常の傾向とは逆にガラスの熱膨張係数も減少し、電気伝導度は著しく増大することがわかった。^<29>SiMAS-NMRスペクトル測定および^<27>Al MAS-NMRスペクトル測定から、イオン交換に伴うこれらの物性変化は、電気陰性度の大きなCu^+の導入によって誘起されるガラスの網目構造変化と密接に関係しており、ガラス中の非架橋酸素が減少して網目を形成する為Si原子はQ^3ユニットからQ^4ユニットに変化し、またAl^<3+>イオンの配位数が4から6に変化することにより生じるものであると推定された。一方、Cu^+/Na^+に代えてAg^+/Na^+のイオン交換を行った場合にはガラスの網目構造の著しい変化は生じず、電気伝導度と伝導の活性化エネルギーに夫々最小および最大が現れる、いわゆる混合カチオン効果が認められた。これらの結果から、イオン交換によって得られるガラスは通常の溶融法によって得られる同一組成のガラスとは物性、構造とも明らかにことなり、更に詳細な検討を続けることで、新しい機能材料の創製が期待されると結論された。

Na_2O-Al_2O_3-SiO_2系ガラスのCu^+/Na^+のイオン交換によって導入したCu^+は導入前と同じ1価で存在するが、その酸素配置数は交換が進むにつれて増大し、Cu^+に特有の2からCu^<2+>に特有の4に近づくことがXPS測定とEXAFS測定により明らかになり、Cu^+/Na^+イオン交換ガラスの高い電気伝導度やガラス転移点の低下はこのような酸素配位数の増大をもたらすガラス構造の変化と密接に関係しているものと推定された。一方Ag^+/Na^+のイオン交換によってAg^+を導入した場合には、^<29>SiMAS-NMRスペクトル測定および^<27>Al MAS-NMRスペクトル測定からはCu^+/Na^+のイオン交換におけるようなガラスの網目構造の著しい変化は認められなかったが、交換が進むにつれてIRおよびラマン散乱スペクトル測定における振動スペクトルのピークがシフトし、Ag^+イオンは非架橋酸素近傍のサイトがすべて占有された後、4配位のAl^<3+>イオンの電荷補償サイトを占めると推定された。これらの結果から、非架橋酸素を含まないガラスでのR^+/Na^+イオン交換によって高い電気伝導度が実現されることが明らかになった。
時空間地震動のリアルタイム予測に関する研究

本研究は、地震発生と同時に地震動の記録を内外挿して地震動の地域的分布を推定するための補間法(条件付確率場)の開発をした。その際、地震波動場の性質や地盤条件の場所的な分布は、これらの情報に介在する不確実性とその支配方程式を評価することでアルゴリズムの中に含めることができた。このアルゴリズムは、確率場が線形・非線形あるいは定常・非定常によらず適用可能で工学的に応用性に富むものである。先ず、条件付確率場の理論を用いて地震センサーの最適配置を求めるための評価手法を開発している。ここでは正規確率場から発展して一般的非正規確率場における、観測値を条件とする推定理論並びに効率的なシミュレーション法を導き、補間に関する基本的な問題を解決している。最大地動は対数正規分布に適合することが知られているので、特に対数正規分布の補間は詳細にわたり検討し、正規、対数正規の両確率場については、シンプル、ユニバーサルおよびベイズ補間の関係を総合的に分析している。開発した手法は単に補間問題に有効であるだけでなく、システムモデルと組み合わせることにより実際面で役立つシステム応答の事後評価にも用いることができる。以上の理論を用いると、地震波動のリアルタイム予測が可能となる。そして、時々刻々得られる複数地点の記録を用いた未観測地点での時系列地震動のリアルタイム予測の方法を提案した。不整形地盤における波動伝播特性の力学特性をハイブリッドに利用することで,不確定性を低減し,現象により接近できるような条件付き確率場に関する理論研究を進行させた.その際,不整形地盤中の物性値および波動方程式により,拡張カルマンフィルタに対する状態方程式および観測方程式を定式化して,観測値の情報をもとに,非観測点における物性値および物理現象を推定できることを示した.ここで,物性値に関する事前情報を有効に利用することで,安定した推定結果が得られることを確認した.平均値,相互相関関数および一部観測値が与えられたガウス性条件付き確率場に対して,観測データに含まれるノイズの影響を考慮した補間理論を構築した.また,時空間確率場の動的信頼性理論に関する研究に着手した。実現象は,非定常・非均一または非ガウス性確率場としてのモデル化が必要であり,上記理論研究とともに,具体的に事前情報としての確率場のモデルをいかに決定するかということが重要である.つまり実際に観測された地震記録のデータベースから確率場のモデルを構築する必要がある.その際必要となる、有限個のサンプルデータから母集団を推定するための理論およびデータ収集作業を行った。地震動モニタリング波形を用いて、異なる地点間の相互スペクトル(あるいは相互相関関数)の特性式とそのモデルパラメータをオンラインリアルタイム方式で同定するために、確率論的内挿法を考案した。従来の研究では地震動情報のオンライン処理が中心であった.一方、本研究では、地震発生と同時に、得られた地震動モニタリングの記録を主な情報源として、地盤や地震波動場の事前情報を更新するとともに、オンラインによる地震波動場の補間理論の構築を行った。そのため、リアルタイムの災害制御や意思決定に大いに役立つことが期待される.また、地震動時空間確率場において、地震波動がある閾値を超過する確率を求めるための理論開発を行った.初めに確率場の線形補間の手法を用いて正規性条件付確率場における閾値超過理論の検証を行い、地震波動伝播現象の支配方程式等を組み込んだ非線形システムおよび非ガウス性確率場の超過確率問題の理論開発を行った.本手法は、動的信頼性問題に適用可能となる.時空間確率場における、観測点の最適配置計画に関する研究を行った。確率場における情報量を確率エントロピー関数を用いて表現し、対象とする物理現象を推定するために、観測により得られる確率場の最適な条件を誘導し、有限な観測点をどこに設置すれば最良の情報を入手可能となるかという問題に対して検討した.本研究は、地震発生と同時に地震動の記録を内外挿して地震動の地域的分布を推定するための補間法(条件付確率場)の開発をした。

このアルゴリズムは、確率場が線形・非線形あるいは定常・非定常によらず適用可能で工学的に応用性に富むものである。先ず、条件付確率場の理論を用いて地震センサーの最適配置を求めるための評価手法を開発している。ここでは正規確率場から発展して一般的非正規確率場における、観測値を条件とする推定理論並びに効率的なシミュレーション法を導き、補間に関する基本的な問題を解決している。最大地動は対数正規分布に適合することが知られているので、特に対数正規分布の補間は詳細にわたり検討し、正規、対数正規の両確率場については、シンプル、ユニバーサルおよびベイズ補間の関係を総合的に分析している。開発した手法は単に補間問題に有効であるだけでなく、システムモデルと組み合わせることにより実際面で役立つシステム応答の事後評価にも用いることができる。以上の理論を用いると、地震波動ノリアルタイム予測が可能となる。そして、時々刻々得られる複数地点の記録を用いた未観測地点での時系列地震動のリアルタイム予測の方法を提案した。
癌細胞の細胞周期離脱・再進入を標的とした治療法開発のためのＧ０癌細胞モデルの作成

我々は、膵癌細胞の増殖が低酸素環境で抑制されること、またHedgehogシグナルが低酸素環境で活性化することを見出し、G0/G1期からの細胞周期への再進入にHedgehogシグナルが関与する可能性を見出した。次に長期低酸素耐性膵癌細胞株を樹立し、再酸素化させる方法で、癌細胞がG0/G1期から細胞周期へ再進入する機序の1つとして、Hedgehogシグナル系、特にSmo分子が関与する可能性をIn vitro及びIn vivoの実験系で確認した。臨床がん組織におけるがん細胞の多くは、G0あるいはG1期にあり、これが細胞周期依存性の従来の抗がん剤に対しがん細胞が低感受性であり抗腫瘍効果が得にくい原因の一つである。これを克服する治療法開発のために、G0細胞を樹立し、細胞周期からの離脱と再進入の機序を解析することが当初の目的である。23年度に引き続き24年度も、G0期細胞株の樹立は成功しなかったが、24年度は、本研究の最終目的である「がん細胞の細胞周期離脱・再進入を標的とした治療法開発」にヒントを与える以下のような知見を得た。1腫瘍局所の低酸素環境により膵がん細胞は、G0/G1期へ集積する傾向を示すが、Smoの活性化を通して細胞周期を維持しようとする。したがって、Smoの発現を抑制すると膵がん細胞はG0/G1期へ集束する(23年度からの継続実験:Cancer Science 2012)。2このSmo活性化による細胞周期維持はGli1発現経路を通らない(いわゆる古典的Hedgehog/Gli1シグナル系ではない)。3また、我々が本研究中に樹立した長期低酸素耐性膵がん株(2株)においては、Smoが活性化しており、Smo発現をノックダウンすることにより増殖能は低下し、G0/G1へ集積する。4一方、再酸素化するとSmoが高活性化し、細胞周期進行が加速され、親細胞株より増殖能が亢進する(投稿準備中)。以上の結果より、腫瘍局所の低酸素環境にある腫瘍細胞はSmoの活性化を通して細胞周期を進行させており、Smoの活性化が誘導されなかった細胞はG0/G1期に入る可能性が示された。また、再酸素化がSmoの活性化を通してG0/G1期の癌細胞の細胞周期への再進入を誘導する可能性も示された。すなわち、Smoががん細胞の細胞周期離脱・再進入に関与している可能性が初めて示された。臨床癌の多くはG0あるいはG1期にあり分裂は停止した状態にある。このことが細胞周期依存性の抗癌剤へ対する抵抗性機序となっている。一方、手術などの刺激によりG0期の細胞が細胞周期へ再進入し急激な細胞増殖を起こすことにより一気に病期が進行する症例に遭遇する。したがって、G0期癌細胞株を樹立し、細胞周期からの離脱と再進入の機序を解析し、新たな癌治療法を開発することが本研究の目的である。平成25年度は、1上記長期低酸素耐性膵癌細胞株(2株)を用いて、低酸素環境によるG0/G1期細胞が細胞周期へ再進入する機序の一つとしてSmoの活性化が関与している可能性をin vitroおよびin vivoの系により解析し、一部支持するデータを報告した(Cancer Science,2014)。2現在、低酸素環境におけるSmo活性化の機序をDNAマイクロアレイ解析を中心に解析中である。本研究を通して、1癌組織の低酸素環境が細胞周期をG0/G1期へと集積させること、2この際にHedgehogシグナル系の起動蛋白であるSmoが活性化されること、3さらにこのSmoの活性化をsiRNA等でノックダウンするとほぼ細胞周期が停止し、4再酸素によりSmoを再活性化することにより細胞増殖能が回復することなどの新知見を見出し、癌局所における細胞周期の制御にSmoが関与するという新たな仮説が生まれた。現在、この仮説を証明するために、低酸素によるSmo発現制御の機序を解析中であり、結果として「Smo蛋白の機能阻害ではなく遺伝子レベルでのSmo発現抑制による腫瘍制御」という新たな研究テーマが誕生した。現在の分子標的薬剤を含む抗癌剤開発は、癌の旺盛な増殖機序を標的として進められているが、癌組織を構成する癌細胞の多くは、増殖を低下させたり停止した状態にある。したがって、本研究の目的は、新たな視点に立った癌治療法開発領域を創成する目的で、「癌細胞の離脱および再進入の機序を解析するための長期生存G0期癌細胞モデルを作成」することである。以下、本年度の計画にそって成果を記載する。1)In vitro G0細胞作製:膵癌細胞を標的細胞とし、細胞周期進行に働いている遺伝子を中心に、ノックダウンする系により、G0/G1で細胞周期が停止する細胞を作成する。結果:膵癌細胞を中心に、種々の増殖シグナル系、形態形成シグナル系およびがん微小環境を中心にG0/G1停止長期生存可能な細胞株樹立を試み、次の二つの興味ある結果を得た。

1)Notchシグナル構成分子の一つであるPresenilin2(PS2)のノックダウンにより細胞周期がアポトーシスを誘導せずにG0/G1期に停止する。結果として、PS2ノックダウン膵癌細胞はG2M期作用薬剤の感受性を著しく低下させる。この現象は他の膵がん細胞にても再現された。2)同様に、膵癌細胞を低酸素環境(1%CO2)に置くと増殖スピードが低下し、Hedgehogシグナル構成分子の一つであるSmoの活性化が同時に誘導される。Smo発現をノックダウンすることで細胞周期がG0/G1へ集積し、S期感受性薬剤に抵抗性になる。これは、現在臨床試験にあるHedgehogシグナル阻害剤開発において注意すべき新情報である。2)In vivo G0細胞モデルの作成:作成した候補G0細胞を免疫不全マウスに移植し、次の三つのモデル作成を試みる。結果:上記2つの細胞の株化を試みているが、移植可能な細胞株樹立に難渋しており移植実験は実施不能の状態である。当初の研究計画は、G0細胞を樹立し、細胞周期からの離脱と再進入の機序を解析することであり、23年度の成果を基に、PSやNotch遺伝子をノックダウンすることでG0細胞株の樹立を試み続けたが、細胞株樹立には成功しなかった。しかし、23年度に見出した低酸素環境下での細胞周期進行にHedgehogシグナル系、特に、Smoが関与しているという新知見をもとに、24年度は、長期低酸素耐性株を樹立し、Smoの関与をさらに支持する成果を得た。さらに、再酸素化により、Smoの発現上昇により細胞周期の進行が加速されることを確認した。すなわち、低酸素環境においては、Smoの発現低下により細胞周期進行が低下(G0/G1期への集積)し、再酸素化によりSmo発現上昇を通して細胞周期進行が亢進する可能性を見出した(投稿準備中)。この成果は、研究計画とはやや次元の異なるものだと言わざるを得ないが、本研究の最終目的である「がん細胞の細胞周期離脱・再進入を標的とした治療法開発」に結びつく新知見であり、この新知見の一部は免疫不全マウスへの膵がん細胞移植の系でも確認された。以上のように、最終目標に向かって研究は進行しているが、G0細胞株の樹立に成功していないという点で、やや遅れていると評価せざるを得ない。上述のように、研究計画の柱は2つであるが、1)In vitro G0細胞作製に関しては、二つのシグナル経路(Notchシグナル経路およびHedgehogシグナル経路)と候補分子(PS2とSmo)を見つけだすことができた。しかし、これらはノックダウン手技により再現可能な現象であり、マウス移植実験が可能な長期安定ノックダウン細胞株作成に難渋しており、2)In vivo G0細胞モデルの作成に関する計画が全く進行しない状況である。これらを総合的に判断すると、最終目標を考えると達成度は低いと判断せざるを得ない。上述のように、G0細胞の樹立は非常に困難を極めている。しかし、1低酸素状態での細胞周期を進行させるためにHedgehogシグナル系が働いていることを示唆する新知見を得た。2さらに、本研究中に低酸素耐性膵がん細胞株(G0/G1優位)を2株樹立した。
神経結合の特異性はどのように決まるのか?-単一細胞ジーンチップによるアプローチ-

神経細胞の標的特異性がどのようにしてコードされているのかは、神経科学における未解決問題のひとつである。我々はこの問題の総括的理解をめざし、異なる運動神経細胞によりそれぞれ支配されているショウジョウバエの隣り合った2つの筋肉、筋肉12及び筋肉13間で発現に差異のある遺伝子を、単一細胞レベルでのDNAマイクロアレイにより同定した。同定した候補分子のなかには、標的認識過程に直接関与する可能性のある膜局在型または分泌型タンパク質が多数含まれていた。そのうちのひとつWnt4は、哺乳動物まで保存されているWntファミリーに属する分泌蛋白質で、筋肉13においてより多く発現していた。Wnt4の機能欠失変異体では、筋肉12の神経終末が小さくなる一方、筋肉13では神経終末が大きくなっていた。逆に、Wnt4を筋肉12において異所発現させると、この運動神経の筋肉12上での終末形成が阻害された。以上の結果は、Wnt4が筋肉13に発現し、筋肉12に投射すべき運動神経細胞に対し阻害的に働きかけることにより、それらが正しい標的細胞(筋肉13ではなく筋肉12)と結合するよう制御していることを示唆している。この結果は非標的細胞上の阻害分子の働きが、標的特異性の決定に必須の役割を果たしていることを示した初めての例である。さらに、異所発現による機能獲得型の表現系の解析から、Beat-IIIc, Glutactin、Sulfatase1等、筋肉13において発現する他の5つの標的分子の候補についても、標的認識過程において、阻害的な働きをもつことが示唆された。以上の結果は、阻害効果を介して標的特異性を決定するような標的分子が、ひとつの標的細胞上に多数存在することを示すものである。ショウジョウバエの神経筋結合系は、半体節あたり約40の運動神経細胞が30本の筋肉を支配するシンプルな系で、個々の細胞は同定が可能であり、その結合様式についても明らかにされている。本研究ではこの系を利用して神経の標的認識に関わる分子を網羅的に同定することを試みた。標的認識に働く分子は個々の標的筋肉細胞間で発現様式が異なると考えられるため、異なる運動神経細胞RP1及びRP5によりそれぞれ支配されている二つの筋肉、筋肉13及び筋肉12で発現量の違う遺伝子を網羅的に同定することを目的とした。まず胚を解剖し、顕微鏡下でマイクロピペットを用いて筋肉12及び筋肉13を200個ずつ(約20個体分)単離し、RNAを抽出し、逆転写及び転写反応によるRNAの増幅でGeneChip解析に用いるのに十分量のcRNAを得た。ショウジョウバエ・ゲノムの全遺伝子がスポットされているAffymetrix社のGeneChipとハイブリダイゼーションを行い、発現量の違いを調べた結果、2つの筋肉間で2倍以上の差をもって発現する遺伝子を多数同定することに成功した(候補遺伝子とよぶ)。候補遺伝子の多くのものについて、胚のin situハイブリダイゼーションや定量的PCRにより、筋肉間での発現差異を確認した。候補遺伝子について、ゲノム情報を紹介した結果、軸索誘導に関連したモーチフをもつ、膜タンパク質や分泌蛋白質がいくつか含まれていた。現在、これら分子について、異所発現やRNAi阻害法による機能解析を推進している。本研究の目的は、神経軸索が標的領域に達した後、いかにして特定の細胞を標的として認識するのかを明らかにすることである。このため、昨年度計画において、ジーンチップ法を用い、ゲノムレベルで、標的細胞を特徴づける遺伝子を系統的に同定した。本年度は、同定した遺伝子の機能を調べるため、トランスジェニック系統の作製を行い、機能獲得型の表現系について解析した。昨年度計画において、ショウジョウバエの異なる運動神経細胞RP1及びRP5によりそれぞれ支配されている二つの筋肉、筋肉13及び筋肉12間で発現量の違う遺伝子を網羅的に同定した。

これらのうち特に、軸索誘導に関連したモーチフをもつ、膜タンパク質や分泌蛋白質、13個について、異所発現トランスジェニック系統の作製を行った。このためまず、ESTクローンを利用するか、RT-PCR法を用いて完全長cDNAのクローニングを行った。得られた完全長cDNAをUAS配列下流に結合し、胚に注入することにより、形質転換体を単離した。得られたUAS系統と24B-GAL4系統とを掛け合わせることにより、筋肉全体で強制発現を誘導した。その結果、本来13番の筋肉で発現する6つの遺伝子について、シナプス形成のパターンに異常を見いだした。具体的には、筋肉12上でのシナプス形成が抑制され、終末の大きさが正常に比べ有意に小さくなっていた。一方、筋肉13でのシナプス形成には影響がなかった。このことは、これら遺伝子が通常筋肉13に発現し、筋肉12を支配する運動神経に対し、抑制的あるいは反発的な作用をし、シナプスを形成させないように働いている可能性を示唆するものである。標的認識分子として機能し得るような分子を、単一の筋肉においてこのように多数同定した例は過去になく、今後さらにこれら分子の機能を詳細に解析することにより、標的認識機構について重要な知見が得られると期待される。本研究の目的は、神経軸索が標的領域に達した後、いかにして特定の細胞を標的として認識するのかを明らかにすることである。昨年度までの計画において、ジーンチップを用い、ショウジョウバエの異なる運動神経細胞RP1及びRP5によりそれぞれ支配されている隣り合った二つの筋肉、M13及びM12間で発現差異のある遺伝子を網羅的に同定することに成功した。さらに、筋肉全体での強制発現により、本来M13で発現する6つの遺伝子について、その異所発現がRP5のシナプス形成を特異的に阻害することを見いだした。このことは、これら遺伝子が通常M13に発現し、M12を支配する運動神経RP5に対し、阻害的あるいは反発的な作用をし、シナプスを形成させないように働いている可能性を示唆するものである。この可能性をさらに検証するため、本年度はこれら遺伝子の機能欠失の影響の解析を試みた。このため、既存のミュータントや二重鎖RNA干渉法を用いた解析を行い、Wnt4とsulfataseについて運動神経走行異常の表現系を見いだした。特にWnt4の表現系が興味深かったので詳細な解析を進めた。Wnt4はWNTファミリーに属する分泌蛋白質WNT4である。WNTファミリーは最近軸索誘導に関与することが示されている。Wnt4の機能欠失体では、本来M12のみを支配するべき運動神経RP5がM13ともシナプス結合していた。この結果から、RP5は本来M12、M13どちらともシナプス形成できるが、M13上のWnt4から阻害的な働きかけを受けることにより、M13を避け、M12とのみ結合するようになると考えられる。上記の機能獲得型の表現系とあわせ、Wnt4は阻害的な働きを通じ標的特性決定に関わることが強く示唆された。
ペリオドンタルメディスン病因論の新展開-口腔細菌による腸内細菌叢攪乱説の樹立-

マウス口腔から代表的な歯周病原細菌であるP. gingivalisを投与すると、脂肪組織、肝臓、および腸管組織に炎症性の変化が生じ、インスリン抵抗性が誘導されることが明らかになった。P. gingivalis投与により腸内細菌叢が変化するとともに、腸管のバリア機能が低下し、血液中の細菌内毒素量が増加することが明らかになったことから、歯周病原細菌による腸内細菌叢の撹乱がその原因と考えられた。今回の結果は歯周病と全身疾患の関連の因果関係を説明するのに合理的な生物学的分子基盤を提供する。多くの観察研究により歯周疾患と全身疾患の関連が明らかにされているものの、因果関係を含む詳細については依然不明な点が多々残されている。本研究ではこの飲み込まれた口腔細菌により腸内細菌叢が撹乱され、メタボリックシンドロームと関連する変化が起こるのではないかという仮説のもと解析を行い、因果関係の解明を目指す。本年度は、6週齢のC57BL/6マウスにP. gingivalisの生菌を投与し、実験的歯周炎モデルを作成した。感染終了後糖負荷試験、インスリン負荷試験を行った。また、回腸より内要物を取り出し、16SrDNAに対するPCRを行ったのち、PCR産物を次世代シークエンサー(にてハイスループットに配列決定し、得られた配列データをもとに、相同性解析を行い各読み取り配列の由来生物種を同定した。さらに脂肪組織、肝臓における遺伝子発現解析を行った。その結果、ヒト歯周病原細菌であるP. gingivalis投与により耐糖能異常が生じすることが明らかになった。さらにこの変化は脂肪組織、肝臓における炎症反応の誘導と関連していることが明らかになった。回腸由来内容物の解析から腸内細菌叢においてBacteroidesの比率が上昇し、Firmicutesの比率が低下する変化が生じていたが、これは投与したP. gingivalisが腸内に定着・増殖して起こったものではないことが明らかになった。小腸においてタイトジャンクションタンパクの遺伝子発現が低下し、血中の内毒素量が増加していたことから、P. ginigivalis投与により腸管の透過性が亢進し、その結果生じる内毒素血症により耐糖能異常が誘導されることが示唆された。C57BL/6マウス口腔からP. gingivalis W83株を1週間に2回、5週間投与し、グルコース負荷試験、インスリン負荷試験を行うと同時に精巣上体脂肪組織、肝臓の炎症性変化、遺伝子発現変動について解析した。さらに糖代謝、炎症と腸内細菌の変化を明らかにするために、回腸細菌菌叢を16S sRNA遺伝子を網羅的に解析した。その結果、P. gingivalis投与により、耐糖能異常とインスリン抵抗性が誘導されることが明らかになった。この変化は脂肪組織におけるインスリン抵抗性関連遺伝子発現の上昇、インスリン感受性関連遺伝子の発現低下が関連していることが示された。TNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症性サイトカイン遺伝子発現は有意に上昇していた。脂肪組織における炎症はインスリン抵抗性を誘導することが知られている。一方、インスリン感受性に関連するPPAR-α及びγ、CTRP9、IRS-1遺伝子の発現が有意に低下していた。肝臓においてもTNF-α、IL-6遺伝子発現の上昇が認められた。さらに、脂肪蓄積に関与する遺伝子発現の上昇と平衡して脂肪滴の蓄積が認められた。また、PPARγ、IRS-1遺伝子発現の低下も認められた。P. gingivalis口腔投与に伴って腸内細菌叢はバクテロイデス門の比率が増加し、フィルミキューテス門の比率が低下した。OUT解析によりバクテロシデス目に属する細菌群の比率が上昇していることが明らかになった。P. gingivalisの消化管内での消長を明らかにするために1回投与後に空腸、回腸、大腸内容物について解析したところ、投与後16時間では大腸内からもほとんど検出できなかった。これらの結果は投与したP. gingivalisはと腸管内に定着・増殖することなく、腸内細菌叢を変動させることが明らかになった。歯周病学平成25年度に予定していた当初計画についてはほぼ全て施行し、期待以上の結果が得られた。また、平成26年度予定の脂肪組織、肝臓の遺伝子発現解析も25年度に完了し、Scientific Reports誌に論文が受理された。平成25年度に明らかになった結果がP. gingivalisという歯周病原細菌に特異的な変化かどうかを明らかにするため、その他の歯周病原細菌(Prevotella intermedia)についても同様の実験を行うとともに、in vitroにおいてこれら細菌の腸上皮細胞に及ぼす影響を解析する予定である。実験計画の見直しによりマウスの購入・飼育費用が抑えられたこと、並びに発表予定していた国際学会を変更し、25年度の外国旅費の支出が無くなったため。26年度予定の学会に加えて、研究打ち合わせのために海外渡航を予定している。また、追加の実験のためのマウス購入費用に充てる。
溶血性尿毒症症候群に合併する急性脳症の発症におけるグリア細胞の研究

溶血性尿毒症症候群(HUS)は,腸管出血性大腸菌から産生される志賀毒素(Stx)が,発症に関与している.HUSに合併する急性脳症(HUS脳症)は死亡率が高く,しかもその病態生理は未だに不明である.HUS脳症の発症機序で,Stxによる大脳血管内皮細胞障害が考慮されているが,グリア細胞(アストロサイト)の役割についての報告は少ない.本研究で,我々はStxによるヒトアストロサイトの免疫反応について検討した.Stx receptor(Gb3)は,培養ヒトアストロサイトで発現しており,炎症性サイトカイン(特に,IL-1β)により,その発現が増強したことが示された.またSt2刺激により,ケモカイン(IL-8,MCP-1)のmRNA発現増加と産生増加が示され,特にIL-8は,Stx2とIL-1βの同時刺激でさらに発現は増加した.今回の研究結果から,Stxによるヒトアストロサイトの免疫反応は,ケモカイン産生に関与し,HUS脳症の発症機序に関与する可能性が示された.溶血性尿毒症症候群(HUS)は,腸管出血性大腸菌から産生される志賀毒素(Stx)が,発症に関与している.HUSに合併する急性脳症(HUS脳症)は死亡率が高く,しかもその病態生理は未だに不明である.HUS脳症の発症機序で,Stxによる大脳血管内皮細胞障害が考慮されているが,グリア細胞(アストロサイト)の役割についての報告は少ない.本研究で,我々はStxによるヒトアストロサイトの免疫反応について検討した.Stx receptor(Gb3)は,培養ヒトアストロサイトで発現しており,炎症性サイトカイン(特に,IL-1β)により,その発現が増強したことが示された.またSt2刺激により,ケモカイン(IL-8,MCP-1)のmRNA発現増加と産生増加が示され,特にIL-8は,Stx2とIL-1βの同時刺激でさらに発現は増加した.今回の研究結果から,Stxによるヒトアストロサイトの免疫反応は,ケモカイン産生に関与し,HUS脳症の発症機序に関与する可能性が示された.本研究では、志賀毒素(Stx)産生型腸管出血性大腸菌感染による溶血性尿毒性症候群(HUS)に伴う急性脳症(HUS脳症)の発症機序に関する基礎的研究を、グリア細胞を用いて行う。(1)Stx刺激による正常ヒトアストロサイトでのIL-8、MCP-1などのケモカイン発現と、ケモカインが白血球付着・移行能やGb3発現能に与える影響を検討.(2)同細胞培養系で、抗IL-8抗体、抗MCP-1抗体の抗ケモカイン抗体を用いて、白血球付着・移行能やGb3発現能とStxの関与を検討.(3)Stxがケモカイン発現に関与する転写因子NF-κBに与える影響を検討.準備段階で、臍帯静脈血管内皮細胞の培養系を確立し、Stxで刺激された培養液をELISA法で測定してIL-8、MCP-1などケモカインの上昇を確認した。現在、ヒトアストロサイト細胞でStxや大腸菌LPSを添加して、ケモカインの上昇をELISA法により検討を行っている。また経時的にtotal RNAも抽出しており、今後ノーザンブロット法にも利用していく予定である。さらにNF-κBについてもELISA法により検討している。また、アストロサイト細胞をStxで刺激し、グリオーシスの誘導が起こらないかをglial fibrillary acidic protein(GFAP)抗体を用いて、免疫組織染色法で検討している。本研究では、志賀毒素(Stx)産生型腸管出血性大腸菌感染による溶血性尿毒性症候群に伴う急性脳症(HUS脳症)の発症機序に関するグリア細胞の役割について基礎的研究を行う。(目的)Stx刺激による正常ヒトアストロサイト細胞でのIL-8,MCP-1などのケモカイン発現と、ケモカインが白血球付着・移行能やGb3発現能に与える影響を検討する。同細胞培養系で、抗IL-8抗体、抗MCP-1抗体の抗ケモカイン抗体を用いて、白血球付着・移行能やGb3発現能とStxの関与を検討する。阻害物質を使用してケモカインやGb3の発現抑制について検討する。またStxがケモカイン発現に関与する転写因子NF-κBに与える影響についても検討する。(結果)準備段階で、臍帯静脈血管内皮細胞の培養系を確立し、Stxで刺激された培養液をELISA法で測定してIL-8、MCP-1などケモカインの上昇を確認した。Stxで刺激されたヒトアストロサイト細胞で、IL-8, MCP-1, RANTESの誘導をELISAやreal-time PCRで確認し、Stxの有無での有意差を認めた。大腸菌LPSの添加でもケモカイン発現誘導を認めたが、両者を同時に添加しても、StxのみとStx+LPSの比較では有意な差は認めなかった。real-time PCRを用いて、ケモカインの誘導を確認し、デキサメサゾンやMAPkinaseなどの阻害物質でケモカインが抑制されるかを検討中である。StxによるGb3の発現も、抗体を使用して免疫染色や蛍光染色を行うことでヒトアストロサイトでの発現を確認した。デキサメサゾンなどの阻害物質でGb3の発現が抑制されるかを検討している。またNF-κBについてもStxの刺激で誘導されるかをまずELISA法により検討中である。

本研究では、志賀毒素(Stx)産生型腸管出血性大腸菌感染による溶血性尿毒性症候群に伴う急性脳症(HUS脳症)の発症機序に関するグリア細胞の役割について基礎的研究を行う。(目的)Stx刺激による正常ヒトアストロサイト細胞でのIL-8,MCP-1などのケモカイン発現とStx-reseptor(Gb3)発現能に与える影響を検討した。(結果)1.正常ヒトアストロサイト細胞におけるGb3の発現:Gb3/CD77抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、Gb3の発現を確認した。2.炎症性サイトカイン(IL-1β,TNF-α)刺激によるGb3の発現:10^<-6>MのIL-1β刺激で、Gb3の発現は免疫染色で増強することを示した。3. IL-1β,TNF-α刺激で、Gb3関連酵素(Ga1T6)mRNA発現誘導の確認:IL-1β刺激8時間後に、GalT6 mRNAの発現はコントロールに比べて有意に上昇していた(P<0.05)。4. Stx刺激によるヒトアストロサイト細胞でのケモカイン産生:Stxで24-48時間刺激されたヒトアストロサイト細胞で、IL-8,MCP-1のケモカインがELISA法で測定し有意に上昇していた。5. Stx刺激によるヒトアストロサイト細胞でのケモカインmRNAの誘導:10^<-10>10^<-9>Mの濃度に調整したStxで8時間、24時間刺激してmRNAを採取し、real-time PCRでIL-8,MCP-1のmRNA発現を確認した。IL-8でコントロールに比べて256倍の有意な上昇を認めた。MCP-1も10^<-9>Mで11倍の上昇を認めた。6. StxとIL-1βの両方刺激でのIL-8mRNAの発現:Stx単独よりもStx+IL-1βの方が4倍IL-8 mRNAの発現は上昇していた.(考察)HUS脳症の発症について、志賀毒素(Stx)がヒトアストロサイトに関与する免疫反応を検討した。ヒト大脳血管内皮細胞以外にもアストロサイトにもGb3が発現しており、またIL-1βにより発現することが判明した。本実験は、Stxによる内皮細胞障害で脳血液関門が破綻し、Stxが流入した時にグリア細胞であるアストロサイトもStxに反応し、ケモカイン産生が誘導されることで、脳内での炎症の増強に関与し、HUS脳症発症の機序に関与することが示唆された。
乳腺腫瘍における定量的FISH法によるテロメア長の測定と良悪性鑑別への臨床応用

われわれは本邦で初めて、Q-FISH in Tissue section法を用いて、乳腺組織におけるテロメア長解析に成功した。蛍光標識したテロメア塩基配列特異的PNAプローブを用いて、テロメア長を蛍光光度(光量)として得た。従来のテロメア長測定法であるサザンプロット法と異なり、組織切片上で組織構築を保ったまま解析可能であり、細胞種類ごとの計測が可能となった。われわれはセントロメアプローブの光度を内因性コントロールとし、定量化した。セントロメアの光度は、細胞ごとに一定である。そしてテロメア長をテロメア/セントロメア蛍光光度比TCR(Telomere-Centromere Ratio)として表わした。多くの乳癌細胞においてテロメア短縮を認め、乳腺組織構成細胞ごとのテロメア長の違いを発見した。テロメア長は、線維芽細胞>乳癌細胞であり、非癌部乳管上皮では、筋上皮細胞>腺上皮細胞であった。以上の結果より、多くの浸潤性乳管癌症例で組織Q-FISH法を用い、テロメア短縮を証明した。非癌部腺上皮細胞のテロメア短縮から組織学的に正常な部分に、染色体不安定性をもった細胞の存在が示唆された。従来のテロメア長測定法であるサザンブロット法と異なり、組織切片上で組織構築を保ったまま解析可能であり、細胞種類ごとの計測が可能となった。そしてテロメア長をテロメア/セントロメア蛍光光度比TCR(Telomere-Centromere Ratio)として表した。この結果を、平成18年7月、第14回日本乳癌学会総会にて「組織Q-FISH法による乳癌組織におけるテロメア長測定」として、および平成18年9月、第65回日本癌学会総会にて「組織Q-FISH法による乳癌組織各細胞のテロメア長解析」として学会発表を行った。さらに現在、英文論文を投稿中である。
聴覚音声学と音韻構造の相互関係

聴覚・音響音声学的な事実と音韻論的構造との相互関係を理解するために、広範囲の言語事例を使い、言語横断的比較の手法を用いながら、聴覚実験や音響分析によって新知見をもたらした。さらにその新知見を音韻構造との関連で解釈した。解釈の過程で、音韻素性理論に聴覚・音響的特性をどう位置づけるかという理論的問題を探求するための、多くの具体的手がかりを得ることができた。それと同時に、このプロジェクトで蓄積した、聴覚音声学的な新手法と新知見を用いて、言語学習の過程における第2言語(L2)の発音の諸問題に取り組み、実り多い議論を発展させることができた。本研究はつぎの2点を目指している。(1)言語横断的手法を用いて、従来の研究では扱われなかった多様な言語の広範囲にわたる音範疇を対象として、聴覚・音響音声学的調査を実施し、音韻構造に関わる多くの聴覚・音響音声学的な新知見をもたらす。(2)もたらされた豊富な新資料に基づき、音韻構造と聴覚・音響音声学的事実がいかなる関係にあるかという問題に実証的に取り組み、2つの方向をもつ学問的貢献を目指す:ひとつは、(1)音韻特徴(素性)理論の中に聴覚・音響音声学的知見をどのように位置づけるかという理論的問題に具体的解答を提案することであり、もう一つは、(2)言語学習の理論と実践に、実証的な聴覚音声学的知見を、どのように組み入れるかを考察することである。まずはじめに、個別言語担当者は音韻構造担当者と打ち合わせをしながら、各言語の音韻構造に関する重要側面(音素体系と弁別特徴のほかに音韻規則と音韻制限)を明らかにする初期報告を作成した。5月中旬に東京外国語大学で研究組織全体の会合を開き、上記報告書にもとづく情報交換と討議を行って第1回目現地調査で実施する資料収集の枠組みを決定した。また、組織メンバーの年間の日程調整をしながら、今年度のスケジュールについて討議した。インドネシア語、バリ語、韓国語、グイ語、日本語方言に関して、調査対象とする音範疇の刺激音源録音のための適格話者獲得と、録音実施と、来年度以降聴覚実験に協力してくれる現地研究協力機関との具体的な実験予定の協議を行った。聴覚実験担当者は、学生アルバイトの補助をうけながら、刺激音源の編集をして、来年度以降使用する聴覚実験用刺激音セットおよび実験回答を作成した。聴覚実験を実施した言語は、ラオ語(声調)、インドネシア語・バリ語(母音)、韓国語(破裂音)、ロシア語(破擦音と摩擦音)、イタリア語(アクセント)である。また、刺激音作成と同時進行で、母音および声調を使う実験のために、実験プログラム担当者(望月)と共同で、E-Primeを用いた反応時間測定を含む実験のプログラムを完成した。さらに、実験結果データ集計のための入力テンプレートの準備を、資料集計担当者(降幡)と共同で開始した。上記の5言語のうちラオ語と韓国語、ロシア語、イタリア語に関する実験調査の結果は、基礎研究的ならびに応用研究的な初期報告として、それぞれ音声学会と外国語教育学会で研究発表を行った。以上の実験調査および現地調査の展開に平行して、母音のフォルマント計測値を、ヘルツだけでなくより聴覚に近似の距離を布置できるような非線的スケールをもちいたグラフへの布置が可能になるソフトを設計し試用を始めた。今年度は、本研究課題の実証的側面での取組みとして、琉球語宮古多良間方言の母音体系とそれに関連する歴史的音変化【研究協力者青井担当】、スンダ語(7母音)【研究分担者降幡担当】やバリ語(6母音)【連携研究者原担当】の母音体系、上海語の声調サンディー【研究協力者高橋担当】とラオ語の音声的声調変異【研究協力者柳村担当】、グイ語(コイサン)の語根の音素配列論および声調と「表意音」【研究代表者中川担当】を射程として、それぞれの調査目的と調査段階に応じた、音響的分析および聴覚音声学実験、音韻構造的な調査・分析を実施した。これらの結果、音響的・聴覚的な事実と音韻構造的特徴の関係にかかわる多くの新知見をもたらされ、その成果の一部は、国内外の学会発表および複数の学術論文として公開することができた。これまでに蓄積してきた新資料に基づき、音韻構造と聴覚音声学的事実がいかなる関係にあるかという問題を探求しながら、音韻特徴理論の中に聴覚音声学的知見をどのように位置づけることが可能かの討議を開始した【中川、柳村、高橋、青井担当】。また、これらに加えて、本研究課題の応用研究的側面にも着手し、2010年度に開催する予定の発音学習に関わる公開シンポジウムの準備【研究分担者佐野担当】も進め、その過程で、外国語教育学会での研究発表【研究分担者鈴木担当】という成果も生み出された。さらに、シンポジウムで取り扱う事例研究として、日本語母語話者によるインドネシア語発音【原担当】とカンボジア語【研究分担者上田