hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アントラセン-DNAコンジュゲートの光化学ライゲーションおよび遺伝子解析への応用

本研究では、アントラセンの光二量化を利用したDNAの光化学ライゲーションを検討している。これまでにアントラセン-DNAコンジュゲートを合成し、鋳型DNA存在下、光照射によって光二量体が生成することを示した。さらに、アントラセンの置換位置を9位から1位および2位に変えることによって、二量化効率が飛躍的に向上した。また、鋳型DNA中の一塩基変異を反応効率の差として検出することができた。そこで、本年度はシグナル増幅反応へ向けた基礎検討、光可逆的なライゲーションの検討を行った。【シグナル増幅反応へ向けた基礎検討】LCR(ligase chain reaction)のようにライゲーション反応を連鎖的に行い、遺伝情報を増幅することができれば、極微量のサンプルから遺伝子解析が可能である。そこで、大過剰のコンジュゲート存在下において、二本鎖の形成、ライゲーション、二本鎖の解離という温度サイクルを繰り返し、光二量体の増幅を試みた。鋳型DNAとコンジュゲートのモル比を1:50とし、温度サイクルを10サイクル行った。標的DNAがフルマッチである場合は、光二量体の増幅が見られた。しかし、鋳型DNAに一塩基変異が存在すると、光二量体の増幅は見られず、サンプル量が極微量である場合の遺伝子解析へ応用できる可能性を示した。【光可逆的なライゲーションの検討】アクリジンはアントラセンのように360nm付近の光を照射することによって[4+4]光環化反応がおこる。生成した光二量体は窒素原子を含むため、アントラセンの光二量体よりも長波長領域に吸収を持ち、可逆的にライゲーションを行うことができると考えられる。そこで、アクリジン-DNAコンジュゲートを合成した。鋳型DNA存在下、366nmの光照射によって光二量体が生成し、312nmの光照射によって、もとのコンジュゲートに戻ることを示した。本研究では、アントラセンの光二量化を利用した光化学ライゲーションを検討している。しかしながら、これまでに合成したコンジュゲートでは、光二量化効率が最大でも40%ほどである。そこで、アントラセンの1位または2位を誘導体化したDNAコンジュゲートを合成し、二量化効率に及ぼす置換位置の影響を検討した。さらに遺伝子解析法への応用を目的として一塩基変異検出条件を検討した。【二量化効率に及ぼす置換位置の影響】1,2-アントラセンカルボン酸を活性エステル化し、末端アミノ化DNAとのカップリング反応により、アントラセンーDNAコンジュゲート(1位置換体、2位置換体)を合成した。これらコンジュゲートが鋳型DNAと二本鎖を形成した状態で光照射を行ったところ、対応する光二量体が生成した。光二量化効率を比較したところ、1,2位置換体では二量化速度が格段に速く、照射時間1分でほぼ定量的に進行した。【一塩基変異検出条件の検討】これまでは比較的これまでに比較的短いコンジュゲートを用いて一塩基変異検出を行った。これは、変異がある場合とない場合での熱安定性の相対差を大きくして、コンジュゲートのon/offに基づくライゲーション効率の制御を目的としたためである。しかながら、この方法では極低濃度である場合に用いることができない。そこで、熱的に安定な長いコンジュゲート(15塩基)を用いて光照射を行い、局所的な構造の乱れが二量化効率に及ぼす影響について検討した。光照射後のHPLC結果より、変異が存在する場合には二量化効率が著しく低下した。一塩基変異によって生じた局所的な構造の乱れが二量化効率に影響を与えたと考えられ、これによって極低濃度における遺伝子解析への応用が期待できる。さらに、アントラセンの置換位置を9位から1位および2位に変えることによって、二量化速度および二量化効率が飛躍的に向上した。そこで、本年度は一塩基変異検出条件の検討、二本鎖構造以外を対象としたライゲーションを行った。【一塩基変異検出条件の検討】一つのホットスポットを含む抗がん剤代謝酵素チオプリンS-メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の27塩基を標的DNAとして用いた。これに対して相補的な7塩基と20塩基のコンジュゲートを合成した。コンジュゲートは1位置換体とした。これらコンジュゲートと標的DNA(野生型、変異型)が二本鎖を形成した状態で1分間の光照射を行った。光照射後はHPLCによる分析を行った。標的DNAが野生型である場合は光二量体が生成したが、変異型である場合はほとんど光二量体の生成が見られなかった。この結果より、わずか1分間の光照射で標的DNAが野生型か変異型かを見分けることができ、迅速な遺伝子解析法として応用できる可能性を示した。【二本鎖以外の構造を鋳型としたライゲーション】化学的ライゲーションは、酵素を用いないため、二本鎖以外の構造をライゲーションの対象とすることができる。そこで、2つの相補的な7塩基のDNAの末端にアントラセンを結合したコンジュゲートを合成し、二本鎖を形成した状態で光照射を行った。光照射後、HPLCによる分析を行った。

HPLCおよびMSによる分析の結果、光二量体が生成していることがわかった。同様にして、三本鎖上でのライゲーションも試みた。三本鎖を形成するコンジュゲートを合成し、光照射を行ったところ、光二量体の生成を確認した。本研究では、アントラセンの光二量化を利用したDNAの光化学ライゲーションを検討している。これまでにアントラセン-DNAコンジュゲートを合成し、鋳型DNA存在下、光照射によって光二量体が生成することを示した。さらに、アントラセンの置換位置を9位から1位および2位に変えることによって、二量化効率が飛躍的に向上した。また、鋳型DNA中の一塩基変異を反応効率の差として検出することができた。そこで、本年度はシグナル増幅反応へ向けた基礎検討、光可逆的なライゲーションの検討を行った。【シグナル増幅反応へ向けた基礎検討】LCR(ligase chain reaction)のようにライゲーション反応を連鎖的に行い、遺伝情報を増幅することができれば、極微量のサンプルから遺伝子解析が可能である。そこで、大過剰のコンジュゲート存在下において、二本鎖の形成、ライゲーション、二本鎖の解離という温度サイクルを繰り返し、光二量体の増幅を試みた。鋳型DNAとコンジュゲートのモル比を1:50とし、温度サイクルを10サイクル行った。標的DNAがフルマッチである場合は、光二量体の増幅が見られた。しかし、鋳型DNAに一塩基変異が存在すると、光二量体の増幅は見られず、サンプル量が極微量である場合の遺伝子解析へ応用できる可能性を示した。【光可逆的なライゲーションの検討】アクリジンはアントラセンのように360nm付近の光を照射することによって[4+4]光環化反応がおこる。生成した光二量体は窒素原子を含むため、アントラセンの光二量体よりも長波長領域に吸収を持ち、可逆的にライゲーションを行うことができると考えられる。そこで、アクリジン-DNAコンジュゲートを合成した。鋳型DNA存在下、366nmの光照射によって光二量体が生成し、312nmの光照射によって、もとのコンジュゲートに戻ることを示した。
体重心視覚フィードバックバランス練習の姿勢制御メカニズムへの効果の解明

初年度と次年度までに,床反力計シグナルから質量中心位置(COG)と足圧中心点(COP)を同時に視覚的にフィードバックする練習方法が,従来のCOP単独フィードバック練習や視覚フィードバックなし練習よりも優れていることが明らかとなった.この結果より,静的立位バランスにおいて,できるだけCOPと体重心(COM)が近づくような練習方法が効果があることが示された.しかしながら,動的バランス課題(例えば,片脚立位時の体重移動時の動作)においては,むしろCOPとCOMを大きく調節する能力が重要であることが示唆されている.また,COPとCOMの位置関係は疾患や加齢,発達過程により変化することも報告されている.対象者,あるいは動作課題に合わせた視覚フィードバック練習の刺激を修正する必要が考えられた.小児期における早期からのバランス練習や動作を経験する重要性が着目されてきていることから,COPとCOMの同時フィードバック練習の刺激提示方法を検討するために,小児期のCOPとCOMの位置関係の発達過程を検証することとした.最終年度では,3-10歳までの小児50名を対象に,片脚立位課題中のCOPとCOMの位置関係の発達過程を明らかにすることとした.COPとCOM間の距離は,体重移動の際の重心を加速させる相では,単調的に発達せず,5-8歳児では過剰に反応することが明らかとなった.一方,片脚立位を保持する相では,単調的に漸減し,低年齢児ではCOPをCOMに近づけて制御することが困難であることが明らかとなった.本研究により,小児期においては,発達時期に合わせて刺激内容を調整する必要性が示唆される.また,動的バランス課題においては,COPとCOMの位置関係を適切に調整するような,例えば,近づけるだけでなく,離すことも取り入れた刺激提示が有効なバランス練習となる可能性が示唆される.近年の超高齢社会において転倒予防プログラムの考案は緊要な問題である.最近の研究により,従来利用されてきた足圧中心点(COP)をリアルタイムに視覚的にフィードバックしたバランス練習では,バランス能力改善に不充分であることが明らかになってきている.本研究の目的は,新たに考案したCOPと体重心(COG)を同時にリアルタイムで視覚的にフィードバックするバランス練習の姿勢安定性への効果を調べることである.本研究により,COPとCOG同時フィードバック練習の効果を示すことができれば,転倒予防やバランス能力を改善させるための新たな理学療法介入の一助となり臨床応用に発展することが期待される.本年度では,COPとCOGの同時フィードバック練習の静的立位安定性への効果を検証するため,健常成人を対象に,対象者をCOPフィードバック群とCOPとCOG同時フィードバック群の2群に割り当て,効果を比較した.三次元動作解析装置および床反力計を用いて,COGとCOPを算出した.その結果,COPとCOG同時フィードバック練習は,COGの動揺速度を有意に減少させ,また,COG動揺に対するCOP位置の偏りも有意に減少させることが明らかとなった.さらに,COGに対するCOP位置の偏りとCOGの動揺速度には有意な正の相関が認められた.本研究により,COPとCOGの同時フィードバック練習は,COGに対してCOPを適切に調整する能力を向上させ,重心動揺を減少させることが示された.しかしながら,この練習が,静的立位バランス以外においても効果があるのか,高齢者などのバランス能力の低下した対象に対しても効果が認められるのかは不明である.今後,適用範囲を示していく必要性が挙げられる.当初の研究計画どおりに,初年度では健常成人を対象に,足圧中心点(COP)と体重心(COG)の同時視覚フィードバックの静的立位バランスへの効果を検証することを目的として研究を行った.従来利用されているCOPのみをフィードバックする練習と,COPとCOGの同時フィードバック練習の効果を比較した結果,COPとCOG同時フィードバック練習は静的バランス能力向上に有効であることが明らかとなった.昨年度では,新たに考案した体重心(COG)と足圧中心(COP)を同時に視覚フィードバックする練習と,従来使用されていたCOPを視覚的にフィードバックする練習との効果を比較し,同時視覚フィードバック練習の方が姿勢安定性に効果があることを示した.本年度では,同時フィードバックの効果範囲をさらに解明すべく,フィードバックを設けない対照群を追加し,静的バランスへの姿勢安定性の有効性の効果範囲を検証した.COGとCOPの同時フィードバック群,COPフィードバック群,フィードバックなし群の3群を比較し,効果範囲の検証を行った.姿勢安定性の効果指標として,動揺範囲,動揺速度,およびCOGに対するCOPの偏り(COG-COP間距離)を算出した.純粋に揺れを抑えるように意識をするフィードバックなし群やCOPフィードバック群と比較して,COGの動揺速度の減少,COGに対するCOPの偏りの減少が認められた.さらに,フィードバックなし群と比較して,同時フィードバック群は,COGの動揺範囲が減少することが明らかになった.COGとCOPの同時視覚フィードバック練習は,静止立位時の姿勢安定性を高める練習として効果的であることが示唆された.

しかしながら,今回フィードバックした体重心データは,床反力データを用いて仮想した変数であったため,実際の身体運動を反映しきれていない可能性が考えられた.また,姿勢安定性への効果についても,仮想していたよりも効果が小さかったことから,身体ランドマークの動きを捉える三次元データから算出した体重心をフィードバックする必要があると考えられた.昨年度,新たに考案したフィードバック練習の静止立位時の姿勢安定性への効果を示した.本年度では,姿勢安定性への効果範囲をより詳細に検討していくこと,動的バランスへの効果を示すことを計画していた.対照群を新たに設け,練習方法の違いによる効果の差異がより明確になったものの,その効果は仮想していたよりも小さかった.床反力データから仮想的に算出した体重心を使用したことが影響した可能性が考えられ,研究計画を一部修正し,三次元データから算出した体重心をフィードバックするためのシステムの構築が必要となった.システムに必要なハードウェアやソフトウェアの準備に時間を要し,当初計画より若干の遅れが生じている.初年度と次年度までに,床反力計シグナルから質量中心位置(COG)と足圧中心点(COP)を同時に視覚的にフィードバックする練習方法が,従来のCOP単独フィードバック練習や視覚フィードバックなし練習よりも優れていることが明らかとなった.この結果より,静的立位バランスにおいて,できるだけCOPと体重心(COM)が近づくような練習方法が効果があることが示された.しかしながら,動的バランス課題(例えば,片脚立位時の体重移動時の動作)においては,むしろCOPとCOMを大きく調節する能力が重要であることが示唆されている.また,COPとCOMの位置関係は疾患や加齢,発達過程により変化することも報告されている.対象者,あるいは動作課題に合わせた視覚フィードバック練習の刺激を修正する必要が考えられた.小児期における早期からのバランス練習や動作を経験する重要性が着目されてきていることから,COPとCOMの同時フィードバック練習の刺激提示方法を検討するために,小児期のCOPとCOMの位置関係の発達過程を検証することとした.最終年度では,3-10歳までの小児50名を対象に,片脚立位課題中のCOPとCOMの位置関係の発達過程を明らかにすることとした.COPとCOM間の距離は,体重移動の際の重心を加速させる相では,単調的に発達せず,5-8歳児では過剰に反応することが明らかとなった.一方,片脚立位を保持する相では,単調的に漸減し,低年齢児ではCOPをCOMに近づけて制御することが困難であることが明らかとなった.本研究により,小児期においては,発達時期に合わせて刺激内容を調整する必要性が示唆される.また,動的バランス課題においては,COPとCOMの位置関係を適切に調整するような,例えば,近づけるだけでなく,離すことも取り入れた刺激提示が有効なバランス練習となる可能性が示唆される.今後,動的バランスへの効果も検証し,本研究の効果の適用範囲を示していく必要性が挙げられた.そのために,研究期間2年目は,随意的な前後身体移動課題や不安定なバランスマット上での立位課題といった不安定性が高く動的バランスを必要とする課題で効果の検証を行っていく.また,床反力計から得られる体重心の仮想値(COG)では、COPと類似した動きとなり、動作中の対象の姿勢アライメントを十分に反映できないこともわかってきている。ゆえに、三次元データから算出される体重心(COM)をフィードバックするシステムの構築とその効果の検証も進めていく。三次元データからリアルタイムに体重心を算出しフィードバックするシステムの構築を進めている.システムができ次第,種々のフィードバック練習群のデータと比較し,静止立位時の安定性への効果を示していく.
バイオインフォマティクスによるウイルス性心筋炎予後判定・治療に寄与する分子の同定

心筋炎は剖検例の約1割とも報告される突然死の有力原因疾患である。ウイルス感染が主な起因であり、進行は3病期に分けられるが、病原ウイルスと病期により治療法が異なる。そのため判別マーカー、特に患者の負担が少ない血中代替マーカーが求められている。また病期進行は症例毎に異なり、この違いはウイルス側と宿主側の要因により生じる。我々が確立したウイルス性心筋炎モデルはマウス系統により病期進行が異なり、その心筋・血液の網羅的遺伝子発現データを用いてバイオインフォマティクス解析を行うことにより、病期判別可能な血中代替マーカーと病期進行を左右する因子を明らかにし、病期進行を食い止める治療法の開発に繋げたい。
植物細胞における微小管生成・ダイナミクス制御機構の解明

最終年である本年は以下のことを行った。1間期のヒメツリガネゴケにおける微小管生成は、枝分かれ、切断、細胞質からの生成の3種に分類された。切断はほとんど観察されなかったが、枝分かれ、細胞質からの微小管生成は同じくらいの頻度で観察され、枝分かれの角度も様々であった。これは、シロイヌナズナやタバコ培養細胞で知られている、40度の枝分かれが大部分であるという報告とは異なっている。この結果は細胞種によって主要な微小管生成機構が異なる可能性も示唆しており、大変興味深い。2これまでの知見から微小管の生成に関わることが予想される4因子(γ-tubulin, XMAP215, augmin, katanin)のRNAi株又はノックアウト株を作製した。取得した株を用いて微小管の再形成にかかる時間を測定したところ、γ-tubulinのRNAiにより微小管の生成が遅れた。そこで、内在性のすべてのγ-tubulinに蛍光タンパク質タグを付加した株を作製した。微小管再形成過程においてγ-tubulinは大部分の微小管生成起点と共局在したが、すべての微小管生成起点に局在するわけではなかった。さらに、通常培養の条件ではγ-tubulinをRNAiしても微小管生成頻度に顕著な差は認められなかった。以上の結果は、ヒメツリガネゴケにはこれまで知られている既存の微小管依存的な機構とは異なる、γ-tubulin依存的な機構が存在し、中心的な役割を果たしている事を示唆してしているだけでなく、γ-tubulinに依存しない機構の存在も示唆している。これらの結果をまとめ、The Plant Cellに発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。RNAiは遺伝子の機能を理解する上で強力な手段であり、動物細胞では高解像度での顕微鏡観察を組み合わせた大規模なRNAiスクリーニングにより特定の細胞内イベントに関わる遺伝子が網羅的に同定された。一方、植物細胞では高解像度での顕微鏡観察とRNAiを容易に組み合わせられる系が存在しなかった。我々は高解像度での生細胞観察が容易であり、ゲノム配列が解読されているヒメツリガネゴケを用いて誘導型RNAi系の確立を試みた。9個の遺伝子についてRNAiを試し、そのすべてにおいて誘導的にRNAiが効くことを確かめた。これにより、植物細胞においても大規模RNAiスクリーニングを行える基盤が確立した。この結果を『ThePlant Cell』に発表した。次に確立した誘導型RNAi系を用いて微小管の生成・ダイナミクス制御機構の解明を目指した。微小管は細胞内において非常にダイナミックであり、細胞分裂や細胞の成長などさまざまな細胞内機能に必須である。しかし主要な微小管形成中心である中心体がない多くの植物細胞ではどのように微小管が生み出されているのかはほとんど分かっていない。私は全反射顕微鏡を用いることにより細胞表層付近のダイナミックな微小管の動きを捉えることに成功した。さらに微小管阻害剤を用いて微小管を壊した後、薬剤を除去することにより、微小管生成過程を捉えることにも成功した。また、動物細胞や酵母を用いた研究から明らかにされている、微小管ダイナミクス制御遺伝子のホモログを標的とする誘導型RNAiコンストラクトおよび遺伝子破壊コンストラクトを作製し、形質転換体を得た。今後これらの形質転換体を用いてさらに研究を進めたい。植物細胞を用いて微小管生成機構を調べることで、植物に独自の、又は動植物で保存された新たな微小管生成機構が見いだされる可能性がある。本年はこれまでに確立した誘導型RNAi系と微小管1本1本のダイナミクスを可視化できる系を用いて、微小管生成に関わる因子のスクリーニングおよび微小管生成が起こる場所の探索を行った。微小管生成に関わると予想される5個の因子をそれぞれRNAiし、微小管生成速度を比較した。微小管生成速度の比較は、微小管阻害剤により細胞内のすべての微小管を脱重合させた後、再形成される微小管の数を測ることで行った。その結果、γ-チューブリンをRNAiしたときにのみ、微小管生成が大幅に遅れた。また、生成する微小管の大部分において、微小管生成箇所とγ-チューブリンの局在が一致したことから、γ-チューブリンが間期においても微小管生成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。次に、微小管生成がどこで起こるのかを調べるために、5つの主要なオルガネラを蛍光ラベルした株を作製した。この株を用いて、微小管再形成実験を行い、微小管の生成箇所とそれぞれのオルガネラの場所を比較した。細胞質内のランダムな位置から形成している様子が観察されたことから、少なくとも、ヒメツリガネゴケにおいて微小管は特定のオルガネラから生成されているわけではないことが明らかとなった。

これは、シロイヌナズナやタバコ培養細胞で知られている、40度の枝分かれが大部分であるという報告とは異なっている。この結果は細胞種によって主要な微小管生成機構が異なる可能性も示唆しており、大変興味深い。2これまでの知見から微小管の生成に関わることが予想される4因子(γ-tubulin, XMAP215, augmin, katanin)のRNAi株又はノックアウト株を作製した。取得した株を用いて微小管の再形成にかかる時間を測定したところ、γ-tubulinのRNAiにより微小管の生成が遅れた。そこで、内在性のすべてのγ-tubulinに蛍光タンパク質タグを付加した株を作製した。微小管再形成過程においてγ-tubulinは大部分の微小管生成起点と共局在したが、すべての微小管生成起点に局在するわけではなかった。さらに、通常培養の条件ではγ-tubulinをRNAiしても微小管生成頻度に顕著な差は認められなかった。以上の結果は、ヒメツリガネゴケにはこれまで知られている既存の微小管依存的な機構とは異なる、γ-tubulin依存的な機構が存在し、中心的な役割を果たしている事を示唆してしているだけでなく、γ-tubulinに依存しない機構の存在も示唆している。これらの結果をまとめ、The Plant Cellに発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り1本1本の微小管ダイナミクスを追える条件を決定することが出来た。また、動物細胞や酵母を用いた研究から明らかにされている、微小管ダイナミクス制御遺伝子のホモログを標的とする誘導型RNAiコンストラクトおよび遺伝子破壊コンストラクトを作製し、形質転換体を得ている。当初の計画通り、進化上保存された微小管生成因子の同定と解析を行うことができた。微小管生成に重点を置いて研究を進めた結果、微小管生成には少なくとも3パターンの微小管生成機構があることが明らかとなった。現在までに微小管のダイナミクスだけでなく、微小管の生成過程を捉えることにも成功した。そこで今後は微小管生成機構に重点をおいて研究を進めていく。微小管生成に関わることが予想される遺伝子についてRNAiノックダウン株を作製する予定だが、形質転換体の作製には3ヶ月要する。この時間をすでに作製している微小管ダイナミクス制御因子のRNAiノックダウン株および遺伝子破壊株の表現型の解析に当てることで効率的に実験を進めたい。現在までに、進化上保存された微小管生成因子の同定と解析を行うことができた。今後は、微小管生成の様式を調べる。現在共同研究により、微小管生成過程のシミュレーション進めている。これにより、微小管生成の新たなモデルを提唱できる可能性がある。
イオウやリンを含む分子の内殻励起によるスピン禁制状態の研究

光電子スペクトルには分子軌道からの一電子イオン化に相当する主線の他にshake-up等のサテライトも多く観測される。イオウやリンの2p内殻励起ではスピン軌道分裂が12eV程度と大きいのでスピン軌道相互作用によって基底状態が一重項であっても内殻励起状態では一重項に三重項が混ざる。このような内殻励起状態を中間状態とした共鳴光電子スペクトルでは、通常の二重項のイオン化状態に加え、スピン禁制の四重項のイオン化状態が観測され得る。これまでにイオウを含む分子のなかでCS_2についてこのようなスピン禁制状態が見つかっている。今回、OCS分子のイオウの2p_<3/2>→4π^*共鳴で共鳴光電子スペクトルを測定したところ、Bバンド(^2Σ)とCバンド(^2Σ)の間に3つのサテライトが観測された。これをab initio計算の結果をもとに解析したところ、これらのサテライトは、束縛エネルギーの低いほうから順にそれぞれshake-up電子が4π^*軌道にある3つの開殻を持つ状態、^4Π、^2Π,と^2Φshakeup-likeサテライトであると同定できた。更に、サテライトのエネルギーだけではなく、強度についての知見を得るために、Auger様二電子脱励起過程に関与する二電子の交換相互作用を評価することで、中間状態からの遷移行列要素を解析的な手法で求めた。また、内殻励起状態からの脱励起過程のうち光電子スペクトルでは、調べる事の出来ない内殻励起状態そのものについては、窒素とアセチレンの内殻-Rydberg領域の高分解能角度分解イオン収量スペクトルを測定し内殻軌道の交換相互作用によるgerade-ungerade分裂と、Rydberg状態と価電子状態の混合による振電相互作用の詳細を明らかにした。以上の結果は、それぞれ、下記のリストの論文で発表した。光電子スペクトルには電子相関や緩和の効果により、分子軌道からの一電子イオン化に相当する主線の他にshake-up等のサテライトも多く観測される。イオウやリンの2p励起ではスピン軌道分裂が12eV程度と大きいのでスピン軌道相互作用によって基底状態が一重項であっても内殻励起状態では一重項に三重項が混ざる。このような内殻励起状態を中間状態とした共鳴光電子スペクトルにはスピン禁制の四重項の価電子イオン化状態が観測され得る。[1]今回、OCS分子のイオウの2p_<3/2>→4π^*共鳴で共鳴光電子スペクトルを測定したところ、光電子スペクトルの価電子イオン化状態のBバンド(^2Σ)とCバンド(^2Σ)の間に3つのサテライトが観測された。これをab initio計算の結果をもとに解析したところ、これらのサテライトは、束縛エネルギーの低いほうから順にそれぞれshake-up電子が4π^*軌道にある3つの開殻を持つ状態、^4П、^2П,と^2ΦShakeup-likeサテライトに同定できた。スピン禁制の^4П状態は、直接イオン化では禁制であるが、イオウの2p電子が4π^*軌道に励起された中間状態における強いスピン軌道相互作用によって中間状態に一重項と三重項が混ざるため許容になる。更に、サテライトのエネルギーだけではなく、強度についての知見を得るために、イオウの2p電子が4π^*軌道に励起された中間状態からのAuger様2電子脱励起過程のMatrix elementを解析的な手法で求めた。以上の結果について本研究者は、電子分光の国際会議International Conference on Electronic Spectroscopy and Structure (ICESS-9,2003年7月スウェーデンのウプサラ大学)とThe 2nd Workshop on Advanced Spectroscopy of Organic Materials for Electronic Applications (ASOMEA II,2003年10月湘南国際村)で発表した。

また、内殻励起状態からの脱励起過程のうち光電子スペクトルでは、調べる事の出来ない内殻励起状態そのものについては、窒素とアセチレンの内殻-Rydberg領域の高分解能角度分解イオン収量スペクトルを測定し内殻軌道の交換相互作用によるgerade-ungerade分裂と、Rydberg状態と価電子状態の混合による振電相互作用の詳細を明らかにした。以上の結果は、それぞれ、下記のリストの論文で発表した。
経頭蓋磁気刺激による大脳皮質内の抑制機構への影響

対象・方法:1)健常成人17名(男性10名、女性7名、24-42歳)とした。対象群を低頻度閾値上刺激群(0.2Hz,閾値の1.2倍刺激、100回)、低頻度閾値下刺激群(0.8Hz,閾値の0.9倍刺激、250回)、コントロール群の3群とした。運動野(M1)と前頭前野(Fz)の部位に安静座位にて凹面円形コイルを用い低頻度反復経頭蓋磁気刺激を施行した。2)パーキンソン病患者2名(対象者1;56歳、Yahr2,対象2;72歳、Yahr3)とした。前頭前野(Fz)の部位に安静座位にて凹面円形コイルを用い閾値の1.2倍、0.2Hz、100回の低頻度反復経頭蓋磁気刺激を施行した。刺激前後に1)及び2)ともMEP(8波形)、CSP(10波形)及びF波(32回刺激後得られた波形)を導出し、CSPの潜時、F波の振幅などの変化を比較検討した。波形の導出は右短母指外転筋より行い、MEPは閾値の1.2倍、CSPは筋電図バイオフィードバックを用い最大筋活動の15%の随意収縮下に閾値の1.2倍刺激で導出した。結果:1)3群とも閾値、MEP振幅・面積、F波振幅の変化はなかった。Ml刺激では低頻度・閾値下刺激(閾値の0.9倍、0.8Hz)、Fz刺激では低頻度・閾値上刺激(閾値の1.2倍、0.2Hz)においてCSP潜時の有意な延長(P<0.05,P<0.01)を認めた。2)パーキンソン病患者では1名にCSPの潜時の有意な延長を認めた。閾値、MEP振幅、F波振幅の変化は認めなかった。結論:今回の条件下での反復経頭蓋磁気刺激において、健常成人では前頭前野(Fz)の部位での低頻度・閾値上刺激群及び運動野(M1)の部位での低頻度・閾値下刺激群で大脳皮質内の抑制機構が働くことが示唆された。パーキンソン病患者では前頭前野(Fz)の部位での低頻度・閾値上刺激において大脳皮質内の抑制機構が働くことが示唆された。今年度は健常者を対象とした研究を開始した。現在,対象6名で運動野(M1)と前頭前野(Fz)に日をかえて凹面円形コイルを用い閾値の1.2倍、0.2Hz、100回の低頻度反復経頭蓋磁気刺激を施行。刺激前後にMEP、CSP及びF波を導出し、CSPの潜時、F波の振幅などの変化を比較検討した。

波形の導出は右短母指外転筋より行い、MEPは安静時にて閾値の1.2倍、CSPは筋電図バイオフィードバックを用い最大筋活動の15%の随意収縮を行い、閾値の1.2倍刺激で導出した。結果としてはM1刺激とFz刺激の双方で刺激前後のF波の振幅に有意差は認めなかった。M1刺激とFz刺激ではそれぞれ4名にCSPの潜時の延長を認めたが、Fz刺激では3名により有意な潜時の延長(p<0.01)を認めた。今回の条件下での反復経頭蓋磁気刺激では、M1刺激に比べ、Fz刺激のほうがより大脳皮質内の抑制機構が働くことが示唆された。なお,今回の刺激条件下での脳波モニタリングによる安全性の確認は先行研究にて行っており,検討しなかった。さらに,対象者を増やして検討予定である。本研究成果は第42回日本リハビリテーション医学会学術集会で発表を予定している。この結果をふまえて、健常者群は反復経頭蓋磁気刺激の刺激強度、頻度、部位、導出条件及び脳波モニタリングによる安全性の確認を再検討し、データー収集・解析予定。また、疾患群(パーキンソン病,脳血管障害)に関しても随時、データー収集・解析を行う予定。対象者15名(健常成人)。方法:運動野(M1)と前頭前野(Fz)の部位に安静座位にて凹面円形コイルを用い閾値の1.2倍、0.2Hz、100回の低頻度反復経頭蓋磁気刺激を施行。刺激前後にMEP、CSP及びF波を導出し、CSPの潜時、F波の振幅などの変化を比較検討した。波形の導出は右短母指外転筋より行い、MEPは閾値の1.2倍、CSPは筋電図バイオフィードバックを用い最大筋活動の15%の随意収縮下に閾値の1.2倍刺激で導出した。結果:M1刺激とFz刺激の双方で刺激前後のF波の振幅に有意差は認めなかった。M1刺激では1名、Fz刺激では7名にCSP潜時の有意な延長(p<0.01)を認めた。今回の条件下ではM1刺激に比べ、Fz刺激がより大脳皮質内の抑制機構が働くことが示唆された(第42回日本リハビリテーション医学会学術集会で発表)。対象者17名(健常成人)。上記方法にて閾値の0.9倍、0.8Hz、250回の低頻度反復経頭蓋磁気刺激を加えて検討。結果:閾値、MEP振幅・面積、F波振幅の変化はなかった。M1刺激では低頻度・閾値下刺激(閾値の0.9倍、0.8Hz)、Fz刺激では低頻度・閾値上刺激(閾値の1.2倍、0.2Hz)においてCSP潜時の有意な延長(p<0.05,p<0.01)を認めた。2条件での大脳皮質内の抑制機構が働くことが示唆された(第4回国際神経リハビリテーション学会にて発表)。パーキンソン病患者2名。上記方法にて前頭前野(Fz)の蔀位に閾値の1.2倍、0.2Hz、100回の低頻度反復経頭蓋磁気刺激を施行。1名にCSPの潜時の有意な潜時の延長(p<0.05)を認めた。閾値、MEP振幅、F波振幅の変化は認めなかった。
脳脊髄液を介した中枢神経系の体系的な神経再生メカニズムの解明

BMSCとの共培養で、CPECのNGF, VEGF, HGF, IGF-1, FGF-2のmRNAが増加したが、有意差なかった。LPS加の培養液でのBMSCとの共培養では、IGF-1 FGF-2に明らかな増加が見られた。real-time PCRで、NGFはBMSCとの共培養で明らかに増加し、HGFはmono-layered BMSCとの共培養の時のみ増加した、VEGFは大きな変化はなかった。次ぎに、タンパク質の発現量では、NGFは、共培養でそれぞれの単独培養の合算値より高い値を示し、共培養による影響が明らかであった。VEGFは、共培養による増加はなかった。骨髄間質細胞と脈絡叢上皮細胞のトランスウエルを介した共培養系を確立した。この系を用いて、骨随間質細胞と共培養のした脈絡叢上皮細胞の遺伝子変化をDNAマイクロアレイによって網羅的に解析した。その結果、炎症系を含めていくつかのpathwayに関する分子の変動が見られた。これらの分子について、現在検索中である。前年度に確立した、トランズウェルを用いた骨髄間質細胞と脈絡叢上皮細胞の非接触的な共培養系を用いて、骨髄間質細胞存在下で発現が誘導される脈絡叢上皮細胞由来の神経修復に有効な因子を検索した。脊髄損傷時の炎症モデルとしては、LPSを添加した系を用いた。(1)前年度の研究によって明らかになった、骨髄間質細胞と共培養したときに遺伝子レベルでの発現が増加する神経栄養因子について、ELISA法によってタンパク質レベルでの発現を解析した。その結果、タンパク質レベルでも発現が増加している因子の一つがNGFであることがわかった。(2)前年度に解析していなかったいくつかの神経栄養因子について、RT-PCR法によって同様に骨髄間質細胞の共培養による発現の変動を解析した。その結果、LPS刺激による炎症モデルにおいて、骨髄間質細胞共培養時に発現が増加する因子の他に、減少する因子があることもわかってきた。これらの因子について、神経修復との関連を現在検討中である。1.骨髄間質細胞(BMSC )の共培養による脈絡叢上皮細胞(CPEC)のmRNA発現量の変化。有意差はないものの、以下の分子に発現量の増加傾向を見た。即ち、神経栄養因子(NGF),血管内皮細胞増殖因子(VEGF),肝細胞増殖因子(HGF),インシュリン様増殖因子I (IGF-I),および線維細胞増殖因子II (FGF-2)。次に、脊髄損傷時の炎症モデルとして、lipopolysaccharide (LPS)を添加した系でBMSCとの共培養の影響を調べた。その結果、共培養でIGF-I, FGF-2に有意な増加が見られ、逆にIGF-IIは減少した。神経再生に関連するNGF, VEGF, HGFについて、共培養でNGFでは増加傾向、HGFでは減少傾向が見られた。これらについて、定量性の高いreal-time PCRで発現変化を解析した。LPS存在下でのCPEC単培養とBMSCとの共培養とを比較すると、NGFとHGFのmRNAは単培養で増加し、NGFは共培養でさらに増加した。VEGFの発現量は、単培養では変化はなかったが、共培養で増加した。即ち、LPS存在下で、NGF、HGFの発現量は増加し、VEGFは横ばいだが、共培養によってNGFとVEGFはさらに増加した。2.共培養による脈絡叢上皮細胞のタンパク質の発現量の変化。LPS刺激の系において、BMSCとの共培養でmRNAの増加が見られたNGFとVEGFについて調べた。NGFの発現量は、LPS刺激の下で、CPEC単独培養で増加し、BMSCとの共培養ではさらに顕著な増加が見られ、単培養の和よりも明らかに高値で、共培養による影響が明らかであった。VEGFはLPS刺激の下で、単培養で発現増加を示し、共培養での増加はBMSCの発現量との和のレベルであった。従って、共培養による増加はなかったと考えられる。LPSを培地に添加することで、培養系での炎症モデルを確立できた。そのことにより、炎症時に骨髄間質細胞が存在することで発現が誘導される脈絡叢上皮細胞の因子を検索することができた。また、ELISA法に適した抗体が入手できたので、タンパク質レベルでの発現の変動もみることができた。医歯薬学総合生物(1) DNAマイクロアレイの結果から、神経栄養因子以外の分子で発現に変動のあったものの中で、神経修復と直接もしくは間接的に関連のありそうな候補を検索する。(2)培養系で発現が変動した因子が、in vivoでも変動しているのかを、骨髄間質細胞を移植したときの脈絡叢組織の解析により明らかにする。

当初の計画以上に進展している。理由;共培養の系が良く確立されて、早期に実験が始められた。DNAマイクロアレイのデータが期待より早期に得られた。いくつかの神経栄養因子の変化が得られた。実験条件の検討などで本実験の回数が予定より少なかったため。(1)DNAマイクロアレイのデータの解析を精力的に行う。その中から、最も適当と考えられる分子群について、Western blot, Real-time PCR等を用いて、蛋白レベルでの変動を検索する。(2)骨髄間質細胞との共培養あるいは単独培養において、脈絡叢上皮細胞の低酸素状態、lipopolysaaccharide(LPS)、あるいはその両者による侵襲に対する反応を明らかにする。(3)DNAレベルでの検索から始めて、蛋白レベルでの検索をすることによって、より具体的な分子の効果と相互関係を明らかにする。平成27年度は最終年度でもあり、精力的に本実験を行い所期の目的を達成する。良い反応を示す抗体が見当たらず、検索中のため購入が遅れた。適当と思われる抗体が見つかり手に入るので、それを購入して研究を進める。
電気二重層相互作用の起源をあらためて問い質す

本申請者らは、電解質溶液中で積層した荷電二重膜において、電気二重層相互作用がGouyーChapmanやDebyeーHuckelが100年ほど前に提唱したのとは全く異なる機序で働くことを発見した(M. Hishida et al., Phys. Rev. E, 2017)。しかし、過去の理論の問題点や新しい理論の適用可能範囲などはいまだ不明確である。電気二重層相互作用はソフトマター間の相互作用でも最も重要なものの一つであり、コロイド化学や生物学などにも広く関係するため、その起源の精査は必要不可欠かつ急務の課題である。そこで、本研究では本成果に立脚し、電気二重層相互作用の起源をあらためて問い質し、新たな理論体系を構築することを目指して研究を行っている。2018年度は、まず申請者らの新規理論の適用可能範囲を実験的に調べるために、球状コロイドを用いて平衡のコロイド間距離の測定を行った。実験はX線小角散乱を高エネルギー加速器研究機構のPhoton Factoryで行った。構造因子を求めるために、全体の散乱強度および形状因子を実験的に求め、それらから構造因子を算出した。その結果、これまで荷電性膜同士で見られていた添加副イオンの価数依存性が球状コロイドでも観測することができた。このことは、球状コロイドの凝集系でも過去の理論が適用できないことを意味している。価数依存性も膜系で見られたものと同じであり、我々が新しく提唱しているモデルで予想される順と同じとなった。新規理論の適用範囲を求めるために、種々の系で実験を行うことは必須であり、最も基本的な系である球状コロイド系でうまく平衡コロイド間距離を求めることができたことは重要で、研究が計画通り進んでいるといえる。今後も計画通り、計算機実験との比較や理論的な考察など行っていく予定である。今年度は、研究計画通りに研究が進んだ。そのため、今後もこれまでの計画通りに研究を進めていく。具体的には、研究分担者と協力して計算機実験を行い、我々の実験結果との比較を行う。とくに計算機実験ではコロイド濃度が無限に低い条件でしか計算できないために、実験でもコロイドの濃度依存性について調べていく。また、過去の理論と我々のモデルの齟齬がどこにあるのかを調べる。具体的にはDLVO理論とGibbs-Donnan平衡との関係性を調べる。
薬物治療の最適化：ホルモン自己抗体陽性者における臨床検査の再評価

潜在性甲状腺機能低下症患者の約0.5%にマクロTSH血症が存在することを明らかにした。通常のTSHの分子量28kDaに対し、マクロTSHは150kDa以上を示す。大部分がIgGに結合したTSHであり、FRTL5を用いた検討でマクロTSHの生物活性は低かった。市販の3種類TSHアッセイシステムもマクロTSHを認識した。マクロプロラクチンのnon-IgGタイプは、最も交叉反応しにくいアーキテクトシステムでも60%が認識された。インスリン抗体はグラルギンとアスパルト使用糖尿病患者で多く認められた。患者に最適の薬物治療を行うため、ホルモン自己抗体の存在を調べて血中ホルモン値を再検討する必要がある。「薬物治療の最適化:ホルモン自己抗体陽性者における臨床検査の再評価」甲状腺ホルモンが正常であるにもかかわらずTSHが高値を示す病態は潜在性甲状腺機能低下症と呼ばれている。今回、潜在性甲状腺機能低下症おけるマクロTSH血症の頻度について検討した。【方法】甲状腺ホルモンが正常値でTSHが高値である680例(年齢64.5±19.2歳、男性296名、女性384名)、甲状腺ホルモンが低値でTSHが高値である顕性甲状腺機能低下症38例(年齢65.6±16.1歳、男性14名、女性24名)について検討した。マクロTSH血症のスクリーニングは終濃度12.5%のポリエチレングリコール(PEG)法で、確認はゲル濾過法で行った。【成績】コントロールである顕性甲状腺機能低下症例におけるPEGによるTSHの沈降率は58.0 ±11.4%であり、ゲル濾過上TSHはすべて分子量28kDa付近に溶出された。甲状腺ホルモン値が正常でTSHが高値であった680症例中、TSHの沈降率が70%以上を示した症例についてゲル濾過による検討を行った。ゲル濾過上、分子量150kDa以上にもTSHが溶出されるマクロTSH血症例が7例(1.03%)存在した。マクロTSH血症患者7名のTSH値は11.3-716μU/mlであったが、free TSH値は全例正常範囲内であった。【結論】マクロTSH血症の頻度はマクロプロラクチン血症(高PRL血症の1020%)よりは低いが、潜在性甲状腺機能低下症の鑑別診断の一つとして重要と考えられた。上記内容を第87回日本内分泌学会にて発表した。【目的】マクロTSH(甲状腺刺激ホルモン)はTSHがIgGと結合した100kDa以上の大分子TSHであり、クリアランスの低下から高TSH血症をきたす。血中TSH値は甲状腺ホルモンによる薬物治療方針の決定に極めて重要であり、今回マクロTSHの病態生理を明らかにすることを目的とした。【方法】潜在性甲状腺機能低下症患者1467人(女性599人、男性868人、年齢64.5±17.8歳)を対象に、ポリエチレングリコール(PEG)法でマクロTSHをスクリーニングし、ゲル濾過法にてマクロTSH血症の確定診断を行った。マクロTSH陽性検体について、FRTL-5ラット甲状腺細胞を用いたTSH生物活性などを用い、マクロTSHの性質を検討した。【結果】1467人中20人(1.36%)にマクロTSH血症が認められた。20人中16人のマクロTSHはTSH-IgG複合体であり、HAMA(抗ヒトマウス抗体)による干渉が5人で認められた。血清の希釈直線はTSHスタンダードとほぼ平行であり、希釈試験からマクロTSHの存在は推測出来なかった。酸処理および繰り返す凍結融解操作でTSHはIgGから解離し、また血清のマクロTSH分画(IgG分画)とTSHのインキュベートにより新たにマクロTSHが生成された。FRTL-5ラット甲状腺細胞を用いたTSHバイオアッセイで、マクロTSHの生物活性は低いことが明らかとなった。【考察】TSHが10μU/ml以上の潜在性甲状腺機能低下症ではPEGによるスクリーニングを実施し、TSHのPEG沈降率が90%以上の症例ではゲル濾過によってマクロTSHを確認することが推奨される。マクロTSHの生物活性は低いことから、血清の遊離TSH値が正常であれば薬物治療は不要と考えられた。平成27年度は、神戸中央市民病院との共同研究で、潜在性高TSH血症の原因であるマクロTSH血症の頻度とその病態について検討した。血清TSH値の測定は、甲状腺機能を最も鋭敏に反映する検査として、新生児クレチン症のスクリーニングなどに広く用いられている。甲状腺ホルモン補充療法の必要性は血清TSH値によって判断されるため、生物活性が低いマクロTSH血症を見落とすと患者は不要な治療を一生涯続けることになる。本研究で、マクロTSH血症の頻度は潜在性甲状腺機能低下症患者1901人中15人(0.78%)であることが明らかとなった。マクロTSHの多くはIgG結合型TSHであり、TSHに対する自己抗体とTSHの免疫複合体である可能性が示唆された。本研究における血清TSH値の測定は、Fitzgerald社のanti-TSH beta monoclonal antibodiesを用いて研究室で作成したサンドイッチ酵素免疫測定法(EIA)を使用している。

我が国で最も広く使用されているエクルーシス、ケンタウルス、アーキテクトのTSHアッセイシステムがマクロTSHを認識する程度を、比較検討した。アーキテクトが最もマクロTSHを認識しにくかったが、それでも60%の症例でマクロTSHと交叉反応を示した。この結果は、現在マクロTSHと交叉反応せず、生物活性のある真のTSHのみを反映するTSHアッセイシステムが存在しないことを意味している。したがって、甲状腺機能低下症患者において甲状腺ホルモン補充療法を行う前には、ポリエチレングリコール(PEG)法によるマクロTSHのスクリーニングとゲル濾過法による確定診断を行う必要があると考えられた。潜在性甲状腺機能低下症患者の約0.5%にマクロTSH血症が存在することを明らかにした。通常のTSHの分子量28kDaに対し、マクロTSHは150kDa以上を示す。大部分がIgGに結合したTSHであり、FRTL5を用いた検討でマクロTSHの生物活性は低かった。市販の3種類TSHアッセイシステムもマクロTSHを認識した。マクロプロラクチンのnon-IgGタイプは、最も交叉反応しにくいアーキテクトシステムでも60%が認識された。インスリン抗体はグラルギンとアスパルト使用糖尿病患者で多く認められた。患者に最適の薬物治療を行うため、ホルモン自己抗体の存在を調べて血中ホルモン値を再検討する必要がある。症例数を増やし、更にマクロTSHの生物活性も含めた病態解析も行うことができた。マクロTSH血症に伴う高TSH血症では、薬物治療が不要であることの確かなエビデンスを得ることができた。内分泌学(GH, PRL, TSH)、薬物治療学マクロTSH血症の病態をさらに詳細に検討する。マクロTSHの分子量が異なる患者が存在することから、マクロTSHは単一の病態ではなく複数の病態が関与している可能性がある。アイソトープを用いた結合実験で自己抗体の親和性と最大結合能を調べる。また、アフィニティーカラムを用いて抗体のサブタイプを調べ、自己抗体産生の原因について検討する。TSHの超高感度酵素免疫測定法(EIA)が確立され、大量の臨床検体をスクリーニング出来る様になったため。1.マクロTSH血症の病因を更に明らかにする。TSHの生物活性のアッセイ系を確立しマクロTSHの生物活性を免疫活性と比較検討する。2.マクロプロラクチン血症のスクリーニング検査を広く日本全国に呼びかけ、誤診による患者の不利益を避ける。2014年度発行の「最新医学」に、本研究室で無償でスクリーニングする旨を掲載した。3.インスリン自己抗体陽性患者における最適化インスリン決定のためのin vitroスクリーニング系を確立する。4.卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)に対する超高感度酵素免疫測定法を確立し、マクロFSH、マクロLH血症の存在の有無を検討する。
蛍光基質を用いた細胞内プロテオリシスの可視化解析

本研究では,細胞内プロテオリシスをリアルタイムで可視化検出しうる新規蛍光基質の開発,およびその細胞内イメージングを試みた.その結果,以下の実績を得た.(1)カスパーゼ1を標的とした新規プロテオリシス可視化試薬の開発カスパーゼ1は細胞死における情報伝達において,重要な役割を担うとされる細胞内プロテアーゼであり,その生体内における活性を可視化解析することは非常に意義深い.ここでは,カスパーゼ1の活性を可視化する試薬として,ペプチド鎖のN,C両端をtetramethylrhodaminおよびacryrodanで2重蛍光標識し,両蛍光基間で,FRET(Fluorescent Resonance Energy Transfer)がおこるようにデザインした新規基質を作製した.本基質は,カスパーゼ1の活性を受けて蛍光を発するので,その特異的な検出が可能である.また,Kmが14μMと親和性も高い.さらに,マイクロインジェクション等の煩雑な操作によらなくても容易に細胞内に導入可能である.これらの点で本基質はカスパーゼ1活性可視化試薬として極めて高性能であるといえる.(2)グルタミン酸刺激下のラット海馬スライス培養におけるカスパーゼ1活性の可視化ラット海馬は,グルタミン酸刺激により細胞死が誘導されることが知られている.本研究では上記の新規基質を用いてこの過程におけるカスパーゼ1活性の増減,局在の経時変化を解析した.グルタミン酸刺激後,一定時間経過後のラット海馬スライス培養に基質を導入し,蛍光顕微鏡で観察したところ,カスパーゼ1活性は,時間をおって増大し,15時間後にピークを迎えその後減少した.また活性は海馬CA1,CA2領域に局在していた(現在論文投稿準備中).本研究では,細胞内プロテオリシスをリアルタイムで可視化検出しうる新規蛍光基質の開発,およびその細胞内イメージングを試みた.その結果,以下の実績を得た.コラゲナーゼによる切断を受けて,蛍光スペクトルが変化する,新規蛍光基質の作製を行った.この基質は,基質ペプチドの両端をそれぞれ蛍光ラベルしたもので,両者の蛍光基間の距離がプロテオリシスをうけた場合に増大し,FRETが消失することを利用したものである.このような二重蛍光基質の作製は従来複雑な有機合成化学の技術と設備が必要であったが,本研究では,ペプチド合成および蛍光ラベルを固相で行う新規合成法を試み,任意の蛍光基をペプチド鎖の任意の場所に簡便に導入することに成功した.この合成基質はin vitroでコラゲナーゼの基質となり,蛍光スペクトルが若干変化することが確認されたが,細胞内での可視化試薬としては蛍光変化が不十分であると考えられる.現在,基質構造の最適化を進行中である.(2)アクリロダン標識基質の作製アクリロダンは,周囲の誘電率により蛍光スペクトルを変化させる蛍光基である.ここでは,カスパーゼ1をモデルとし,アクリロダンを切断部位近傍に導入した基質ペプチドを作製した.この基質については現在,in vivo,in vitro両面でその有効性を検討中である.(3)プロテオリシス可視化試薬の細胞内導入法の検討各種蛍光ペプチド試薬の細胞内導入の条件を検討した.これらの試薬は培養細胞の表面に直接溶液を添加することで,効率よく細胞内に導入された.また,この細胞を蛍光顕微鏡および画像解析装置で観察したところ,基質の局在が確認された.現在,プロテオリシスの進行と基質変化の様子を解析中である.本研究では,細胞内プロテオリシスをリアルタイムで可視化検出しうる新規蛍光基質の開発,およびその細胞内イメージングを試みた.その結果,以下の実績を得た.(1)カスパーゼ1を標的とした新規プロテオリシス可視化試薬の開発カスパーゼ1は細胞死における情報伝達において,重要な役割を担うとされる細胞内プロテアーゼであり,その生体内における活性を可視化解析することは非常に意義深い.ここでは,カスパーゼ1の活性を可視化する試薬として,ペプチド鎖のN,C両端をtetramethylrhodaminおよびacryrodanで2重蛍光標識し,両蛍光基間で,FRET(Fluorescent Resonance Energy Transfer)がおこるようにデザインした新規基質を作製した.本基質は,カスパーゼ1の活性を受けて蛍光を発するので,その特異的な検出が可能である.また,Kmが14μMと親和性も高い.さらに,マイクロインジェクション等の煩雑な操作によらなくても容易に細胞内に導入可能である.これらの点で本基質はカスパーゼ1活性可視化試薬として極めて高性能であるといえる.(2)グルタミン酸刺激下のラット海馬スライス培養におけるカスパーゼ1活性の可視化ラット海馬は,グルタミン酸刺激により細胞死が誘導されることが知られている.本研究では上記の新規基質を用いてこの過程におけるカスパーゼ1活性の増減,局在の経時変化を解析した.グルタミン酸刺激後,一定時間経過後のラット海馬スライス培養に基質を導入し,蛍光顕微鏡で観察したところ,カスパーゼ1活性は,時間をおって増大し,15時間後にピークを迎えその後減少した.また活性は海馬CA1,CA2領域に局在していた(現在論文投稿準備中).