hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組換えハンタウイルス核蛋白を用いたRNPトランスフェクション系の確立

これまでに、私は蚕のバキュロウイルス系を用いて、ハンタウイルスの核蛋白を大量に発現するシステムを開発してきた.今回の研究では、この組換え蛋白を用いて、RNPトランスフェクション系を確立する事を目的とした.ハンタウイルス核蛋白を蚕のヘモリンフ中に発現させた場合、不溶性となる.この不溶性蛋白は、尿素及びグアニジン塩酸塩で可溶化され、特に尿素存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った場合、可溶性の蛋白として精製が可能である.しかしながら、この蛋白は消化を受け、フラグメント化されている場合が多い.これをさらに精製し、全長の核蛋白のみを精製するため、核蛋白に対するモノクローナル抗体を使ったAffinity精製を試みた.結果は収率は著しく低いものの、全長を含む核蛋白も精製が可能であった.しかしながら、これらの核蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて精製した場合、それぞれの抗体の認識部位によって精製されるフラグメントが異なる.このため、これらの抗体の一次構造上の認識部位を決定しておく必要が生じた.また、Derai et alは大腸菌による発現組換え蛋白がRNA結合能を保持していたことを報告している.このため、大腸菌の発現系を利用し、抗原部位の決定を試みた.結論は、比較的効率よく全長の組換え蛋白を精製できるモノクローナル抗体は、立体構造認識の一部の単クローン抗体と、N末端を認識する抗体であった.中央部を認識する抗体は、多くのフラグメントを結合したので、今回の目的には適さないことがわかった.ハンタウイルス持続感染Vero細胞は3世代までのPassageには支障がなかった.このウイルスは持続感染しやすく、細胞の増殖には影響がないようであり、持続感染株の樹立は容易であると考えられる.今年度の計画は、最終目標まで到達することはできなかったが、その準備は十分にできたと考えられる.これまでに、私は蚕のバキュロウイルス系を用いて、ハンタウイルスの核蛋白を大量に発現するシステムを開発してきた.今回の研究では、この組換え蛋白を用いて、RNPトランスフェクション系を確立する事を目的とした.ハンタウイルス核蛋白を蚕のヘモリンフ中に発現させた場合、不溶性となる.この不溶性蛋白は、尿素及びグアニジン塩酸塩で可溶化され、特に尿素存在下で陰イオン交換クロマトグラフィーを行った場合、可溶性の蛋白として精製が可能である.しかしながら、この蛋白は消化を受け、フラグメント化されている場合が多い.これをさらに精製し、全長の核蛋白のみを精製するため、核蛋白に対するモノクローナル抗体を使ったAffinity精製を試みた.結果は収率は著しく低いものの、全長を含む核蛋白も精製が可能であった.しかしながら、これらの核蛋白に対するモノクローナル抗体を用いて精製した場合、それぞれの抗体の認識部位によって精製されるフラグメントが異なる.このため、これらの抗体の一次構造上の認識部位を決定しておく必要が生じた.また、Derai et alは大腸菌による発現組換え蛋白がRNA結合能を保持していたことを報告している.このため、大腸菌の発現系を利用し、抗原部位の決定を試みた.結論は、比較的効率よく全長の組換え蛋白を精製できるモノクローナル抗体は、立体構造認識の一部の単クローン抗体と、N末端を認識する抗体であった.中央部を認識する抗体は、多くのフラグメントを結合したので、今回の目的には適さないことがわかった.ハンタウイルス持続感染Vero細胞は3世代までのPassageには支障がなかった.このウイルスは持続感染しやすく、細胞の増殖には影響がないようであり、持続感染株の樹立は容易であると考えられる.今年度の計画は、最終目標まで到達することはできなかったが、その準備は十分にできたと考えられる.
トレーサー内蔵ペレットによる粒子輸送・高速粒子・元素スペクトル同時計測

プラズマ中の任意の位置にトレーサーを局所的にデポジットできることやトレーサー粒子数が既知であることなどのトレーサー内蔵計測ペレットの特色を活かして、不純物輸送や高速粒子などを同時に計測することにより、プラズマの振る舞いや関連する物理の研究を進めた。特に原子番号の異なる粒子種依存性を同一プラズマにおいて、それぞれのトレーサーからの真空紫外光及び特性X線を一度に計測する原理検証実験にも成功した。(1)【研究の背景】磁場閉じ込め核融合研究では、燃焼プラズマの実現とその制御へ向けて、熱、粒子、そして高速粒子の輸送を理解することの重要性がますます高まってきている。これらが効率的な磁場核融合炉の設計に決定的な役割を果たす重要な要因となるからである。しかし、これらは未だもって十分に解明されたとは言えず、解明を目指した実験及び理論研究は世界的にも最も重要な課題の一つとなっている。(2)【研究の目的】核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(Large Helical Device : LHD)において、トレーサー内蔵ペレット入射を利用した粒子輸送、高速粒子及び元素スペクトルなどの同時計測によって、プラズマの振る舞いや関連する物理量を従来と比べて格段に高い精度で計測する手法を確立することが本研究の目的である。(3)【研究の内容】本研究において重要な要素であるトレーサー内蔵ペレットは、以下の特色を有する。i)プラズマ中のほぼ任意の位置に不純物トレーサーを局所的に注入することができる。ii)不純物トレーサー中の総原子数をトレーサー内蔵ペレット製作時に決めることができる。iii)不純物トレーサーとなる粒子種の選定はほぼ任意である。その常温型の外殻は、ポリスチレン(-CH(C_6H_5)CH_2-)であり、トレーサー内蔵固体ペレット(Tracer-Encapsulated Solid PELlet : TESPEL)と呼んでいる。高温プラズマ中に入射されたTESPELは、まずその外殻が昇華し、溶発する。溶発した粒子により、ペレットの周囲に低温・高密度の中性粒子からなる溶発雲が形成される。この時、プラズマ中の高エネルギーイオンが溶発雲中の中性粒子と荷電交換し、高速粒子としてプラズマ外に出てくる。この高速粒子を中性粒子分析器(Neutral Particle Analyzer : NPA)により測定することで、プラズマ中の高エネルギー粒子のエネルギースペクトルの空間分布を得ることができる。この計測手法を、ペレット荷電交換(Pellet Charge eXchange : PCX)計測という。ここで、TESPEL外殻中を起源とする溶発雲中の水素イオンの線スペクトルを測定することで、そのシュタルク拡がりから溶発雲中の電子密度が得られる。これを用いて、高エネルギー粒子の絶対量についての情報を得ることができる。TESPELの外殻が溶発し終わると、次に不純物トレーサーが昇華、溶発する。さらに電離した不純物トレーサーイオンからの線スペクトルを高空間分解能の分光システムで測定することで、不純物トレーサーの振舞いを観測できる。このように、トレーサー内蔵ペレットを用いることで、様々な物理量をほぼ同時に観測することができる。本研究では、不純物及び高速粒子などをトレーサー内蔵ペレット入射を用いた同時計測により高い精度で測定する手法を確立することを目指す。トレーサー内蔵ペレットの特色は、1)プラズマ中のほぼ任意の位置にトレーサーを局所的にデポジットできること、2)トレーサー粒子の総原子数をトレーサー内蔵ペレット製作時に前もって決定できること、3)トレーサー粒子種の選定がほぼ任意であることなどがある。本研究ではこのトレーサー内蔵ペレットを用いて、粒子輸送、高速粒子及び元素スペクトルなどを同時に計測することより、プラズマの振る舞いや関連する物理量を従来に比べて格段に高い精度で計測することを目的としている。平成19年度は、同時計測を構成する個々の計測が確実に動作するように、それぞれの整備に重点を置き、その確認を目的とした。負イオン中性粒子ビームを用いた荷電交換分光法によりトレーサー粒子の輸送特性を調べる目的で整備を進めていた軟X線分光器に、遠隔操作可能なクライオポンプによる差動排気システムを取り付けた。残念ながら、実験装置である大型ヘリカル装置の実験スケジュールとの兼ね合いにより、実際の実験に供することはまだできていないが、これにより軟X線領域での荷電交換分光計測を恒常的に実施できる準備が整った。プラズマ中の高速イオンとトレーサー内蔵固体ペレット(通称、TESPEL)の溶発雲中の中性粒子との相互作用を利用して、空間分解された高速イオンのエネルギー分布などを計測できるペレット荷電交換粒子計測においては、TESPEL入射毎に恒常的に実験データが取得されているのを確認した。同計測を更に柔軟に実施できるように、従来(約0.9mm以下)よりも大きなサイズ(約1.5mm以下)のTESPELを装填可能なTESPEL保持ディスクを他の経費により製作したので、来年度の実験からそれを使用し、更に幅広いパラメータ領域の実験データを蓄積する予定である。その他、干渉フィルターを用いた波長分解マルチ画像計測システムにおいても、実験データの蓄積が進んだ。

これらの結果を基に次年度から同時計測実験を本格的に開始する。トレーサー内蔵ペレットの特色として、1)プラズマ中のほぼ任意の位置にトレーサーを局所的にデポジットできること、2)トレーサー粒子の総原子数をトレーサー内蔵ペレット製作時に前もって決定できること、3)トレーサー粒子種の選定がほぼ任意であることなどが挙げられる。本研究の目的は、このトレーサー内蔵ペレットを用いて、粒子輸送、高速粒子及び元素スペクトルなどを同時に計測することより、プラズマの振る舞いや関連する物理量を従来に比べて格段に高い精度で計測することである。平成20年度は,同時計測を達成するために必要な各種計測の整備を進めるとともに,核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(LHD)において,各種物理量の同時計測を試みた。鉄トレーサーを封入したトレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)をLHDプラズマに入射し,LHDプラズマにより溶発,イオン化した鉄トレーサーからの発光を調整した真空紫外分光器によって測定した。実験では,パラメータ掃引として,LHDプラズマの電子密度及び電子温度を変化させた。これにより様々な電子温度環境下での鉄多価イオンからの線スペクトルに関する情報を得ることができた。また同時に,その後の時間発展まで測定することで,様々な衝突度における鉄トレーサーイオンのプラズマ内輸送に関する情報も得ることができた。同様の実験をスズ及びタングステンをトレーサーとしたTESPELを用いて行っており,各元素における多価イオンからの線スペクトルやプラズマ内輸送に関する情報を得ることができた。この時,ほぼ全てのプラズマに対して,TESPELによる高速粒子計測(ペレット荷電交換粒子計測)を行っていたので,高速粒子に関する情報も得ることができている。それぞれの詳細については,現在解析を進めているところである。また,次年度に向けて,同時計測の利点を最大限に活かすことのできる実験条件について検討を進めた。平成21年度は,同時計測実験を更に本格化させるべく,多層膜反射鏡型軟X線分光器など必要な機器の整備・改善作業を進めた。また,同時計測の質的向上が期待できる不純物輸送計測の新しい試みも行った。具体的には,不純物輸送の(原子番号の異なる)粒子種依存性を一度に計測する手法である。これは,トレーサー内蔵固体ペレット(TESPEL)の特長を活かしてプラズマ中に同時に複数のトレーサーを入射し,それぞれの振る舞いを測定することを狙いとしている。
植物におけるセリン生合成制御の分子基盤解明

3-ホスホグリセリン酸脱水素酵素(PGDH)はセリン生合成を担うリン酸化経路において、代謝調節の鍵酵素である。これまで植物に由来するPGDHは活性制御機構が未解明であった。本研究ではシロイヌナズナ、イネ及びヒメツリガネゴケ由来PGDHの酵素活性がセリンによる活性阻害のみならず、ホモシステインやメチオニン、アラニン、バリン、ホモセリンによって活性促進を受けることをはじめて明らかにした。また、PGDHの各アミノ酸に対する用量反応解析から、ホモシステインが最も低濃度で作用することを明らかにした。本研究は、植物のL-serine生合成を担うリン酸化経路とその代謝制御における分子基盤解明を目的とする。以下、平成26年度の研究内容と結果及び進行状況について述べる。研究内容;(1)制御の鍵酵素3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PGDH)の大腸菌組換え酵素を用いた活性制御機構の解明,(2)シロイヌナズナにおけるPGDH遺伝子発現制御機構の解明,(3)シロイヌナズナにおけるリン酸化経路に関わる酵素遺伝子群の細胞内局在解析,(4)シロイヌナズナにおけるPGDH遺伝子の一重変異体作成結果及び進行状況;(1)シロイヌナズナ及びイネに由来する3つのPGDHアイソザイムにおいてL-serineによる活性阻害に加え、L-methionineやL-homocysteine、L-homoserine、L-alanine、L-valineによる活性促進を見出した。また、アミノ酸添加時のヒル係数及び50%効果濃度の解析から、上記アミノ酸がPGDHの酵素活性制御におけるアロステリックエフェクターであるとの確証を得た。さらに、変異酵素実験から、上記アミノ酸の作用部位が異なる可能性を明らかにした。(2)野生株(Col-0株)のL-serine添加生育条件下におけるPGDH遺伝子の発現量をRT-PCRにより解析した。その結果、非添加時と比較して発現量に有意差は観察されず、L-serine依存的な発現制御は存在しないと結論した。(3)蛍光タンパク質の凝集により解析ができず、現在、発現系の再構築を行っている。(4)T-DNAが挿入されたホモラインの選抜を行い、2つのPGDH遺伝子の一重変異体を取得した。残る1つのPGDH遺伝子は、一重変異体が胚性致死となるため、ヘテロラインの生育においてL-serine栄養相補条件下でのホモラインの確立を目指したものの、一重変異体を取得することはできなかった。本研究は、植物のL-serine生合成を担うリン酸化経路とその代謝制御機構における分子基盤解明を目的とする。以下、平成27年度の研究内容と結果及び進行状況について報告する。研究内容;(1)代謝制御の鍵酵素3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(PGDH)の活性制御機構解明,(2)シロイヌナズナにおけるPGDH遺伝子変異株を用いたフィードバック制御機構の生理学的役割の解明結果及び進行状況;(1)シロイヌナズナ由来PGDHアイソザイム(AtPGDH1、AtPGDH2及びAtPGDH3)の変異酵素に関して詳細な解析を行った。2種類のキメラ酵素(アミノ酸による制御を受けるAtPGDH1及び制御を受けないAtPGDH2のC末端を交換した変異酵素)に対して、昨年度明らかにしたエフェクターアミノ酸の影響をヒルの式によって解析した。その結果、L-serineによる協奏的な活性阻害は、PGDHのC末端のみに依存することを明らかにした。また、L-valineやL-homoserineに関しても同様の結果を得たが、活性促進の最大効果は野生型酵素よりも大幅に低下した。一方、L-homocysteine、L-alanine及びL-methionineによる活性促進は、その最大効果が野生型酵素よりも大幅に低下したものの、C末端のみならずN末端も寄与することを明らかにした。(2)昨年度構築したAtPGDH2とAtPGDH3のホモノックアウト株の掛け合わせを行い、二重変異株を構築した。現在ジェノタイピングによる選抜を行っている。一方、ホモノックアウト株が胚性致死となるAtPGDH1の変異株については、シロイヌナズナの内在性マイクロRNAによる発現抑制株の取得が報告されたため、同様の発現抑制株構築を行った。研究内容(1)に関して、シロイヌナズナ由来PGDHの生化学実験は、当初目的とした以上の解析結果を取得することができた。平成27年度に、がん細胞由来PGDHに関して、その基質特異性に関する新しい知見が報告された。本研究では当初予定していなかったものの、シロイヌナズナ由来PGDHに関して基質特異性を調べた。結果、がん細胞由来PGDHとは異なり、その基質特異性は極めて厳密であることを明らかにした。従って、シロイヌナズナ由来PGDHの生化学実験に関しては、当初予定していたよりも大幅に成果を上げることができたと考える。またイネ由来PGDHに関しては、すでに基本的な酵素学的諸性質(ミカエリス定数や最大反応速度、至適pHなど)やアミノ酸添加による影響は解析が終了しており、今後、ヒルの式による解析を行う。ヒメツリガネゴケやオオムギに関しては、現在、発現系の構築を行っており、本年度中に一連の生化学実験を完了させる予定である。一方、研究内容(2)に関しては、当初リン酸化経路に関わる遺伝子群の細胞内局在解析を予定していたが、これらの知見に関しては、すでに既報となった。従って、PGDH遺伝子変異株の作成に注力することにした。

遺伝子破壊株及び遺伝子発現抑制株に関しては順調に構築が完了しており、本年度中にこれらは破壊株や発現抑制株を用いたキメラ遺伝子(研究内容1の生化学実験において取得した結果)による相補実験が完了する予定である。以上の状況を総括して、研究計画の変更を伴ったものの、おおむね順調に進展していると評価する。本研究は、植物のセリン生合成を担うリン酸化経路と、その代謝制御機構における分子基盤解明を目的として研究を行った。これまでに、シロイヌナズナにおいてリン酸化経路の代謝制御における鍵酵素と考えられる3-ホスホグリセリン酸脱水素酵素(PGDH)の活性が、既知のセリンによる阻害のみならず、アラニンやバリン、ホモセリン、メチオニン、ホモシステインによって促進されることを発見した。また、これらエフェクターアミノ酸の中でホモシステインが最も低濃度で作用することを明らかにした。本年度は、イネ由来PGDH及びヒメツリガネゴケ由来PGDHの酵素活性制御について検討した。その結果、これらはシロイヌナズナ由来PGDHと同様の活性制御を受けることを見出した。一方、エフェクターアミノ酸のPGDHにおける結合部位の解明を目的として、その部位特異的変異酵素のエフェクターアミノ酸に対する応答を検討し、結合に重要なアミノ酸残基を同定した。このことから、植物のリン酸化経路の制御はこれまで考えられていた以上に複雑であり、植物においてセリンが関与する細胞プロセスは、発見したPGDHの活性調節機構によって制御されている可能性を見出した。本研究ではさらに、各アイソザイムの役割、さらには発見した酵素活性制御機構の生理学的意義をシロイヌナズナにおいて解明することを目指した。当初、本実験はPGDH遺伝子破壊株の生理学実験のみで完結する予定であったが、セリンが多様な細胞プロセスに関わることに鑑み、将来より詳細な解析を可能とする生理学的基盤の構築に注力した。その結果、PGDH遺伝子破壊株に加え、発現抑制株及び過剰発現株を構築することができた。今後、これらシロイヌナズナのPGDH遺伝子変異株の解析を通じて、PGDHの新規活性制御機構と各アイソザムの生理学的機能についてより詳細に検討する予定である。3-ホスホグリセリン酸脱水素酵素(PGDH)はセリン生合成を担うリン酸化経路において、代謝調節の鍵酵素である。これまで植物に由来するPGDHは活性制御機構が未解明であった。本研究ではシロイヌナズナ、イネ及びヒメツリガネゴケ由来PGDHの酵素活性がセリンによる活性阻害のみならず、ホモシステインやメチオニン、アラニン、バリン、ホモセリンによって活性促進を受けることをはじめて明らかにした。また、PGDHの各アミノ酸に対する用量反応解析から、ホモシステインが最も低濃度で作用することを明らかにした。研究内容(1)に関する生化学的実験は当初の計画を変更した。これまで、組換え酵素のアフィニティ精製をヒスチジンダグにより行っていたが、より純度の高い組換え酵素の取得を目的として異なるアフィニティタグを付加する発現系へ変更した。
潰瘍性大腸炎におけるACFの発癌マーカーとしての意義とその遺伝子解析

【目的】本研究では、多数の潰瘍性大腸炎(UC)患者を対象にaberrant crypt foci(ACF)を観察し、UC患者の発癌におけるバイオマーカーとしての有用性を解析するとともに、その遺伝子解析を行った。【方法と結果】(1)ACFの観察ACFは、既報に従い直腸にメチレンブルーを散布し、拡大内視鏡を用いて観察した。UC患者28人を対象とした。その結果、非UC患者のACFに比べて個々のクリプトが不鮮明に染色されるACFが1例を除く27例に観察された。dysplasiaを伴わないUCではACF様病変数は平均6.6個と多く、dysplasiaを伴うUCでは平均13.6個とさらに増加していた。(2)ACFとUC患者の各背景因子との解析UC患者のdysplasiaを有する者と有しない者について、ACF数、性差、年齢、発症年齢、罹病期間、罹患部位の相関性を単変量解析により検討したところ、罹病期間とACF数に有意な相関を認めた。同様に、多変量解析でも認めた。(3)UC患者のACFにおけるAPC及びK-rasの解析APCのC末端に対する抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、いずれのACFも染色陽性であり、APC変位は認められなかった。Two-step PCR RFLP法により、K-ras変異の有無を検討したところ、UC患者のACFではわずか15%に変異が認められた。(4)UC患者のACFにおけるp53変位及び遺伝子不安定性(MSI)の解析P53遺伝子のExon6,7,8,9についてSSCP法により変異の有無を検討したが、いずれも変異は認められなかった。同様に、PCR-SSCP法により、MSIを検討したが、いずれも異常を認めなかった。(5)p16遺伝子のメチル化p16のメチル化の有無をmethylation specific PCR法にて検討した。UC患者のACFとdysplasiaでは、いずれも高率にp16のメチル化を認めた。【結論】UC患者のACFは、dysplasia、ひいては癌を発見するための有用なバイオマーカーになりうることが示唆された。また、ACFは、p16のメチル化により形成され、p53変異が加わることにより、dysplasiaに進展することが示唆された。1.目的潰瘍性大腸炎(以下UC)患者におけるaberrant crypt foci(ACF)の陽性率、数などを解析し、発癌のバイオマーカーとしての有用性を検討する。また、ACFの遺伝子解析を行い、その前癌病変としての意義を検討する。2.方法と結果(1)UC患者におけるACFの観察と病理組織学的解析潰瘍性大腸炎患者を対象に、既報(N Engl J Med,1998)に従い拡大内視鏡を用いてACFを観察したところ、非UC患者のACFに比べてメチレンブルーに淡く染まるACFが観察された。病理組織学的には、核の腫大、disorientationなどを呈する、いわゆるdysplastic ACFが大部分であった。

ACFの個数は、健常人では平均1.5個であったのに対し、dysplasiaを伴わないUC患者では平均5.7個と多く、dysplasiaを有するUC患者では平均12.9個とさらに増加していた。(2)UC患者におけるACF, dysplasia,癌におけるhypermethylationの解析UC患者のACF、dysplasia及び癌におけるp16,ARF, CSPG2,ER(estrogen receptor)などの遺伝子のメチル化の有無をBisulfite法により検討したところ、いずれにおいても5075%と高率にメチル化が認められた。2-step PCR RFLP法によりK-ras遺伝子を検討したところ、いずれにも陽性率は20%以下であった。Truncation assayによりAPC変異の有無を検討したところ、いずれも変異は認められなかった。β-cateninの免疫組織染色を行ったが、いずれもその蓄積は認められなかった。SSCP法により、ACF,dysplasia,癌のp53変異を検討したところ、それぞれ0%,60%,50%であった。3.結論UC患者のACFでは、p16などのメチル化が高率に認められた。Dysplasiaを有するUC患者では、ACF数が有意に多く、発癌のバイオマーカーになりうることが示唆された。【目的】本研究では、多数の潰瘍性大腸炎(UC)患者を対象にaberrant crypt foci (ACF)を観察し、UC患者の発癌におけるバイオマーカーとしての有用性を解析するとともに、その遺伝子解析を行った。【方法と結果】(1)ACFは、既報に従い直腸にメチレンブルーを散布し、拡大内視鏡を用いて観察した。UC患者28人を対象とした。その結果、非UC患者のACFに比べて個々のクリプトが不鮮明に染色されるACFが1例を除く27例に観察された。dysplasiaを伴わないUCではACF様病変数は平均6.6個と多く、dysplasiaを伴うUCでは平均13.6個とさらに増加していた。(2)ACFとUC患者の各背景因子との解析UC患者のdysplasiaを有する者と有しない者について、ACF数、性差、年齢、発症年齢、罹病期間、罹患部位の相関性を単変量解析により検討したところ、罹病期間とACF数に有意な相関を認めた。同様に、多変量解析でも認めた。(3)UC患者のACFにおけるAPC及びK-rasの解析APCのC末端に対する抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、いずれのACFも染色陽性であり、APC変位は認められなかった。Two-step PCR RFLP法により、K-ras変異の有無を検討したところ、UC患者のACFではわずか15%に変異が認められた。(4)UC患者のACFにおけるp53変位及び遺伝子不安定性(MSI)の解析P53遺伝子のExon6,7,8,9についてSSCP法により変異の有無を検討したが、いずれも変異は認められなかった。同様に、PCR-SSCP法により、MSIを検討したが、いずれも異常を認めなかった。(5)p16遺伝子のメチル化p16のメチル化の有無をmethylation specific PCR法にて検討した。UC患者のACFとdysplasiaでは、いずれも高率にp16のメチル化を認めた。【結論】
イネ穂の分枝を決定する分子機構の解析

本研究では、イネの分枝パターン決定に主要な役割を果たすと考えられるLAX遺伝子および小花梗形成に必須の遺伝子であるFZP(F__-riz__-zy P__-anicle)を単離する。これら遺伝子の解析は、イネ育種のみではなく、植物の形態形成の基礎研究という観点からも重要である。本年度は以下の成果が得られた。LAX遺伝子の単離・lax1-2変異体が分離するF2集団を育成した。・169個体の変異体の連鎖解析から、LAX遺伝子が第1染色体長腕部140.2CMと142.2CMの間に存在することが明らかとなった。これらの変異体のうち、140.2CMのマーカーにおいて組み換えが見られるものは9個体、142.2CMのマーカーでは2個体であった。また、141.6CMのマーカーでは組み換え個体は得られなかった。・さらに約500個体の突然変異体を用いた連鎖解析を開始した。・LAX近傍の遺伝子配列情報をもとに、141.6CM周辺のdCAPSマーカーの作成を進めている。FZP遺伝子の単離・トランスポゾンの挿入により引き起こされたfzp変異体2系統(fzp2-M、fzp2-K)において、ゲノムへの挿入と表現型が完全に連鎖していることを3世代、67個体で確認した。・トウモロコシ由来AC挿入個体(fzp2-M)から、Acフランキング配列を単離した。・fzp2-K系統ではfzp2-MにおいてAcが挿入されている部位から22bp離れた場所に、LINEタイプのレトロトランスポゾンが挿入されていた。・FZP2遺伝子は新規な遺伝子であると予想された。
上皮誘導における細胞接着およびシグナル伝達関連因子カテニンの役割

発生過程における上皮形成は厳密な時間的・空間的の制御の元に行われるが、その分子機構については未だ不明の点が多い。本研究ではこの上皮組織の形成過程をF9細胞の上皮への分化系を用いて明らかにすることを目的としている。特に細胞間接着において重要な役割を果たすカテニン分子群が上皮組織の分化・構築において果たす役割に注目する。その際、F9細胞の上皮分化系というin vitro系を用い、標的組み換えなどの実験系を取り入れることが本研究の特色となっている。本年度は1)αカテニン欠損F9細胞の作成と2)βカテニンの安定化機構の解析、を進めた。αカテニンが上皮形成で果たす役割を解析するため、標的組み換えの技術を用いてαカテニン欠損F9細胞を作成した。さらにαカテニン欠損細胞にαカテニンを再発現させることにも成功した。驚いたことにαカテニン欠損細胞も元の細胞とは少し性質が異なるがいわゆるカドヘリン依存性の細胞接着性を示した。今後αカテニンを含まないE型カドヘリン-βカテニン複合体のみの接着能についての解析の必要性がある。上皮形成について予備的実験を行ったところαカテニン欠損細胞は上皮組織を構築できないことが分かった。βカテニンの安定化機構を知るため様々な部位に欠失や変異を持つ変異型βカテニンを作成し、カドヘリン活性を持たないマウスL細胞に導入した。正常なβカテニンはL細胞内で安定に存在し得ないが、βカテニンの分析に必須と考えられるGSK-3β認識部位を欠失又は変異した分子は安定に発現できることが分かった。さらに、そのような変異分子は自分自身が安定に発現するだけでなく、内在性の野生型βカテニンも安定化させることが分かった。
HIV感染者合併脳心血管疾患におけるｖWFとADAMTS13の関与

ヒト免疫不全ウイルス(Human immunodeficiency virus;HIV)感染患者では非感染者と比較し心血管疾患(cardiovascular disease;CVD)の発症の頻度が高く、若年で心筋梗塞が認められる。頸部血管超音波検査を用いた動脈硬化病変の検索をHIV感染患者50名の評価を行い、50歳以上の患者の半数で動脈硬化病変を認め、また、40代の3人に1人、30代の患者の1名で動脈硬化性病変が認められ、若年HIV感染患者での動脈硬化の頻度の高さが示唆された。動脈硬化と相関する因子を検討した結果、以前報告したように喫煙、糖代謝異常およびvon Willebrand因子(vWF)抗原高値が危険因子として同定された。評価を行ったすべての症例より同意を得て、血漿およびDNA抽出用の末梢血単核球を経時的に採取を行い、未治療患者において同様にクエン酸血漿および末梢血単核球を採取した。27名の患者(未治療患者10名を含む)でADAMTS抗原活性を検討したところ、ADAMTS13抗原活性に関して抗レトロウイルス治療(ART)施行患者と未治療者では有意差を認めなかったが、ADAMTS13抗原活性/ADAMTS13阻害因子活性を検討したところ、動脈硬化を有さない患者は動脈硬化を有する症例および未治療患者と比較し高値である傾向にあった。頚部血管超音波検査を施行した35名の患者におけるvWFマルチマー解析で、動脈硬化を有する患者において、610量体以上のマルチマーの割合が統計学的有意差をもって増加していることが明らかになった。また、CD4数が200/μL未満の患者において統計学的有意差をもってvWF抗原値が経過中に高値となった。現在、HIVプロウイルス量測定法を開発し、vWF抗原やvWFマルチマーとの関連や動脈硬化との関連に関して検討を行っている。平成30年度までの研究計画として、1HIV感染患者の血漿・血清採取、2HIV感染患者のDNA採取、3AMTS13抗原量および活性の測定、4抗ADAMTS13自己抗体の測定、5vWF抗原量およびマルチマー解析、6HIV RNAの数コピー同定法の確立、7HIVプロウイルス量の測定法の確立と解析、8心血管疾患合併症例と非合併症例の詳細な検討、9動脈硬化症例での詳細な検討、10NOD/SCID miceを用いたエイズマウスモデルにおけるADAMTS13抗原量および活性、抗ADAMTS13自己抗体およびvWF抗原量およびvWFマルチマーの検討、11他の血液内皮マーカーの検討挙げている。HIV感染患者から同意を得て、血漿および細胞採取は順調に進んでいる。また、vWFマルチマー解析は終了し、頚部血管超音波検査を施行した35名の患者において、動脈硬化を有する患者において、610量体以上のマルチマーの割合が統計学的有意差をもって増加していることが明らかになった(P=0.0225)。さらに今年度はvWF抗原高値症例での臨床的特徴を明らかにし、ART開始時のCD4数が200/μL未満の患者において統計学的有意差をもってvWF抗原値が経過中に高値であることを明らかにした(P<0.01)。今年度はHIVプロウイルスについて検討を開始し、さらには多くのHIVプロウイルスは経過中に欠損や変異が入るため、複製能を有するウイルスを産生するプロウイルスの存在を同定するためにほぼ全長のプロウイルスを同定するアッセイ系を確立し、数症例ではあるがART開始前から、治療後の複製能を有する完全長プロウイルスの推移を観察している。総プロウイルスと複製能を有するHIVを産生可能な完全長のプロウイルスを同定・比較し、vWF抗原やvWFマルチマーとの関連や、動脈硬化症例での検討を行っている。ADAMTS13抗原量、ADAMTS13阻害因子活性測定症例数を増やすとともに、一般的にHIVの残存プロウイルス量は治療期間およびCD4陽性リンパ球数の最低値との相関が報告されており、また、ART開始時のCD4数が200/μL未満の患者において統計学的有意差をもってvWF抗原値が経過中に高値であることが明らかになり、今後は各症例での残存プロウイルス、とくに複製能を有するウイルスを産生可能なプロウイルスとvWF抗原値や動脈硬化との関連性に関する検討をさらに進める。また、現在、推奨されている早期のART開始のCVD予防への効果について検討する。また、血管内皮の機能を推定するバイオマーカーとして高感度CRP、Lp-PLA2、PTX3や新規バイオマーカーとしてmicroRNA(miRNA)が報告されており検討を開始する。さらには、HIV RNAの数コピー同定法を確立し、低レベルのHIV-1 RNAが検出される症例と全く検出されない症例での、vWF抗原量・活性、ADAMTS13抗原量、抗ADAMTS13抗体およびvWFマルチマー量の比較を行い、持続的な低レベルのウイルスによる影響に関して検討する。ヒト免疫不全ウイルス(Human immunodeficiency virus;HIV)感染患者では非感染者と比較し心血管疾患(cardiovascular disease;CVD)の発症の頻度は高く、若年で心筋梗塞が認められる。今年度は頸部血管超音波検査を用いた動脈硬化病変の検索を継続し、現在まで50名評価を行った結果、50歳以上の患者の半数で動脈硬化病変を認め、また、40代の3人に1人、30代の患者の1名で動脈硬化性病変が認められ、若年HIV感染患者での動脈硬化の危険性に高さが示唆された。再度動脈硬化と相関する因子を検討した結果、以前報告したように喫煙、糖代謝異常およびvWF抗原高値が危険因子として同定された。

また、評価を行ったすべての症例より同意を得て、血漿およびDNA抽出用の末梢血単核球を採取することができた。さらには、未治療患者において、同様にクエン酸血漿および末梢血単核球を採取した。得られた血漿を用いて、27名の患者(未治療患者10名を含む)でADAMTS抗原活性を検討したところ、ADAMTS13抗原活性に関して抗レトロウイルス治療(ART)施行患者と未治療者では有意差を認めなかったが、ADAMTS13抗原活性/ADAMTS13阻害因子活性を検討したところ、動脈硬化を有さない患者は動脈硬化を有する症例および未治療患者と比較し高値である傾向にあった。また、現在まで33名の患者(未治療患者7名を含む)でvon Willebrand因子(vWF)マルチマー解析を施行しており、今後、さらに検討症例数を増やし、未治療症例やART施行下の症例での検討や、動脈硬化の有無によるマルチマーパターンの相違に関して詳細に解析する予定である。平成28年度の研究計画として、1HIV感染患者血漿の採取、2HIV感染患者のDNA採取、3ADAMTS13抗原量および活性の測定、4抗ADAMTS13自己抗体測定および5vWF抗原量およびvWFマルチマー解析の5項目を挙げており、HIV感染患者の血漿採取とDNA採取に関しては順調に採取することができた。また、頸部血管超音波検査に関して、検討症例数を50症例まで増やすことができたため、研究結果の精度・信頼性の向上に寄与するものと考えられ、動脈硬化の危険因子を再検討した結果、喫煙、糖代謝異常およびvWF抗原高値が再度同定された。また、ADAMTS13抗原活性に関し、現在まで27名での測定を終了しており、ADAMTS13抗原活性およびADAMTS13阻害因子活性とHIV感染自身の影響や動脈硬化との関係性に関してある程度の検討を行うことができている。今後、検討症例数の増加や、同一症例における経時的な抗原量の変化等を検討予定である。更には、ADAMTS13の基質であるVWFのマルチマー解析を本年度は33名(未治療者7名を含む)で行い、現在、詳細については解析中であるが、ラージマルチマー分画の増加と動脈硬化やHIV RNA量との関連について明らかになりつつある。ヒト免疫不全ウイルス(Human immunodeficiency virus;HIV)感染患者では非感染者と比較し心血管疾患(cardiovascular disease;CVD)の発症の頻度が高く、若年で心筋梗塞が認められる。頸部血管超音波検査を用いた動脈硬化病変の検索を現在までHIV感染患者50名の評価を行い、50歳以上の患者の半数で動脈硬化病変を認め、また、40代の3人に1人、30代の患者の1名で動脈硬化性病変が認められ、若年HIV感染患者での動脈硬化の頻度の高さが示唆された。動脈硬化と相関する因子を検討した結果、以前報告したように喫煙、糖代謝異常およびvon Willebrand因子(vWF)抗原高値が危険因子として同定された。評価を行ったすべての症例より同意を得て、血漿およびDNA抽出用の末梢血単核球を経時的に採取を行い、さらには、未治療患者において同様にクエン酸血漿および末梢血単核球を採取した。
情報弱者むけユニバーサル・デザイン具体化のための基礎的研究

本研究においては、多様な形態のコミュニケーションから疎外された情報弱者のありかたを可能なかぎり網羅的に記述し、その社会的包摂のために必要なユニバーサルデザイン、ユニバーサルサービスの様態を、社会学、社会言語学、障害学、教育学、言語政策学などの角度から多面的にあきらかにした。具体的には、知的障害者、聴覚障害者、視覚障害者、発達障害者、ニューカマーなど、コミュニケーション/言語上、不利な立場におかれるひとびとがおかれている状況がその対象とされた。2013年度は、研究計画にしたがい、研究代表者、分担者、連携研究者、研究協力者が各自担当の研究を実施し、その成果にもとづき、公開の研究会を開催した。初年度は、情報保障にかかわる各論点の再整理と洗い出しがその主要課題である。研究の過程と成果の一部は、第11回情報保障研究会(2013年7月20日(土)13:0017:00/中京大学名古屋校舎)および、第12回情報保障研究会(2014年3月29日30日/愛知県立女性センターウィルあいち)で共有をはかった。これらの研究会は公開で実施され、日程はウェブサイト上で保存されている(http://www.geocities.jp/syakaigengogaku/zk.htm)。また、2013年11月に、研究成果をもりこんだ『社会言語学』第13号(2013)を査読誌として発行した。その内容は、ウェブサイト(http://www.geocities.jp/syakaigengogaku/syakaigengogaku2013.html)で閲覧可能である。本年度も研究計画に従い、下記を実施した。・2015年7月5日第15回情報保障研究会(愛知県立大学サテライトキャンパス)を公開の研究会として開催し、研究分担者・協力者7名、その他2名の報告を得た。報告論題は以下のとおりである。http://www.geocities.jp/syakaigengogaku/2015-7.htm・2016年3月31日3年間の研究成果の報告書として、『社会言語学』別冊II(2016)を発行し、ひろく無償頒布をおこなった。研究計画にそって、共同研究を展開できたため。社会学今後も当初の研究計画にそって研究を実施する予定である。実績一覧に見えるように、研究グループメンバー各自による新規の研究成果が順調にだされており、共同研究の成果があがっていると考えられるため。理由は以下の二点である。予定されていた研究会の規模・準備のうち、出費に関して想定どおり進まない部分があった。また別の研究グループとの協働により、出費の節約が可能になった。当初の研究計画にしたがって進める予定である。最終年度である今年度に開催する研究報告会(7月および3月)と、年度末の研究成果報告書の発行・頒布に充当する計画である。主として、研究会開催に要する費用が流動的であるために、予定額との間に差が生じた。今年度開催される研究会および打ち合わせ会議のための旅費・開催費用に充当する計画である。
機械刺激が誘導する新規植物免疫系の解析

植物のトライコーム(毛状突起)が雨を危険信号として感知し、感染回避のために疾病防御応答を誘導することを明らかにしたが、その遺伝子発現制御機構は明らかになっていない。葉面に対する機械刺激によって細胞内にCa2+流入が生じることから、Ca2+を介した遺伝子発現制御機構の詳細を明らかにする。また、シロイヌナズナの葉面に機械刺激を予め負荷しておくと、抵抗性反応が強化されるプライミング効果が認められた。そこで、本研究では、クロマチン修飾に関わる因子を介した遺伝子発現制御に着目し、プライミング制御に関わる分子機構について解明することを目的としている。
メスバウアー発光分光によるクラッドへのコバルトの吸着機構の解明

科研費で購入した振とう式オートクレーブを用い,102°Cの水溶液中にて,γ-Fe_2O_3O_4クラッドへのコバルトイオンの吸着に及ぼすマグネシウム,カルシウム,ストロンチウム,亜鉛などの前処理イオンの効果を調べた。また,コバルトイオン吸着の際に,放射性^<57>Coを同時に添加した試料を作成し,コバルトの吸着状態をメスバウアー発光分光にて調べた。その結果,以下のことが明かとなった。(1)バルクにおいて八面体選択性が高いマグネシウムイオンで前処理後コバルトイオンをクラッド表面に付着すると、マグネシウムイオンはクラッド表面の八面体位置に吸着されるので、八面体位置を好むコバルトとクラッドとの反応が阻害されることがメスバウアー発光分光の結果わかった。(2)バルクにおいて四面体選択性が高いカルシウムやストロンチウムイオンで前処理後,コバルトイオンをクラッド表面に付着するとコバルトは八面体位置にのみ吸着されることもメスバウアー発光分光の結果わかった。(3)バルクにおいて四面体選択性が最も高い亜鉛イオンで前処理後,コバルトイオンをクラッド表面に付着した場合,亜鉛イオンはクラッド表面の四面体位置に吸着され,クラッド表面でのコバルトフェライト生成が最も容易であろうと推定したが,その予測に反し,実験結果は前処理を行わない場合と同一であった。この事実はクラッドに対する溶液への亜鉛イオンの分配比が小さいことで説明できることが明かとなった。軽水炉で生成するクラッドの多くは、その結晶構造がスピネル型のフエライトである。このフエライトにおいては、構成イオン種が四面体、八面体のどちらのサイトを選択するかの目安となるバルクでのイオンのサイト選択性に関し、かなりのデータが蓄積されている。そこで、バルクにおけるイオンのサイト選択性を表面の吸着サイトへ適用しようと試み、γ-Fe_2O_3への^<57>Coの吸着に及ぼすマグネシウム、カルシウム、亜鉛などの前処理イオンの効果を購入のメスバウアー低温発光分光装置にて調べた。その結果、予め、八面体選択性が高いマグネシウムで前処理後、八面体選択性が高いコバルトを添加するとクラッド表面でのコバルトフエライト生成が抑えられることを見い出した。一方、四面体選択性が高いカルシウムで前処理するとコバルトフエライトの生成が容易となることも明かとなった。そこで、この四面体と八面体に関するバルクでのサイト選択性が表面における吸着サイト選択性に適用できるか否かを、四面体選択性が最も高い亜鉛イオンについて実験を行ったが、前処理のない時と同一の結果で、予測に反した。この原因は亜鉛のクラッドへの吸着がコバルトと比べて弱い点にあることが、亜鉛イオンの固液間における分配比の測定から明かとなった。今後は、さらに多くのイオンに関する吸着実験から、バルクにおけるイオンのサイト選択性と表面の吸着サイトとの関係について、より不変的な規則を見いだしたい。また、これらのデータをもとにクラッドへのコバルトの吸着機構を明かにし、放射能蓄積に対する低減化対策を提案したい。本年度購入した振とう式オートクレーブを用い、100°Cの水溶液中にて、γ-Fe_2O_3とFe_3O_4クラッドへのコバルトイオンの吸着に及ぼすマグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、亜鉛などの前処理イオン効果を調べた結果、以下のことが明かとなった。(1)クラッドのバルクにおいて八面体選択性が高いマグネシウムイオンで前処理後、コバルトイオンをクラッド表面に付着すると、マグネシウムイオンはクラッド表面の八面体位置に吸着されるので、八面体位置を好むコバルトとクラッドとの反応が阻害され、コバルトフエライトの生成が抑えられることがメスバウアー発光分光の結果わかった。(2)クラッドのバルクにおいて四面体選択性が高いカルシウムやストロンチウムイオンで前処理後、コバルトイオンをクラッド表面に付着すると、コバルトは八面体位置にのみ吸着されるので、クラッド表面でのコバルトフエライトの生成が容易であることもメスバウアー発光分光の結果わかった。

(3)クラッドのバルクにおいて四面体選択性が最も高い亜鉛イオンで前処理後、コバルトイオンをクラッド表面に付着すると、亜鉛イオンはクラッド表面の四面体位置に吸着され、クラッド表面でのコバルトフエライト生成が最も容易であろうと推定したが、その予測に反し、実験結果は前処理を行わない場合と同一であった。この事実は固体クラッドに対する溶液への亜鉛イオンの分配比が小さいことで説明出来ることが明かとなった。
長鎖ポリエーテル基により包み囲まれた遷移金属触媒中心による反応集積化

本研究の目的は,高度に配位的に不飽和で,通常は極めて短寿命活性種である触媒中心を長鎖ポリエーテルで包み囲むことにより安定化し,かつ酸化的付加,金属交換,還元的脱離など一連の触媒素反応をその制御空間の中で高度に集積化し効率化することにより,極めて高活性,高選択的,高効率的な触媒反応を開発することにある。平成23年度においては,ポリエーテルの鎖長が,これまでに我々が開発した配位子と比較して約3倍に長い配位子を合成し,その鎖長伸張が集積化度に与える影響を検討した。昨年度と同様の塩化アリールを基質として用いたパラジウム触媒による鈴木-宮浦カップリング反応をモデル反応として検討を行った。その結果,長鎖ポリエーテルを導入した配位子が温和な条件で効率良く反応を進行させることが明らかになった。一方で,短い鎖を有する配位子を用いた触媒反応ではその反応効率が劇的に低下した.さらに,ホスフィン配位子以外のカルベン配位子を用いた反応集積化学も検討した.予備的知見ではあるが,長い鎖を導入したカルベン配位子を有するパラジウム触媒系では,塩化アリールを用いる鈴木-宮浦カップリング反応が室温で進行することを見出した。本年度の研究は、交付申請書に記載した計画通り概ね順調に進行し、新しい配位子の開発とその触媒反応への応用に関する研究成果が得られたため.現在得られた成果は,既存の反応の効率を大きく改善する結果であった.今後は,長い鎖をもつ触媒系が高い活性を示した要因を明らかにすると共に,より挑戦的な課題として,新しい配位子よる新しい触媒反応の開発を進める必要があると考えている.配位子に導入したエチレングリコール鎖の鎖長の影響を調べるため、4-クロロトルエンとフェニルボロン酸を基質とした鈴木-宮浦カップリング反応を検討した。反応は配位子の影響を強く受け,最も長い鎖を有するPEG750を配位子とした際には高収率で反応が進行した。一方、鎖のより短いPEG550では中程度(63%)の収率に低下した。さらにより鎖長が短いTEGでは22%という低収率に留まり、エチレングリコール鎖をもたないMeOを用いるとほとんど反応は進行しなかった。また、エチレングリコール鎖を持たない配位子にPEG750と同程度の長さの鎖を有する化合物PEG750DMEを添加剤として加えても反応は全く進行しなかった。これらの結果から、高い活性を発現するためには長鎖が必要であること、さらにこの長鎖エチレングリコールが配位子に固定されている必要があることが分かった。本研究で用いた鎖長の異なる配位子(TEG,PEG550,PEG750)間で大きな活性の差が生じた理由についてより詳細に考察するため、これらの配位子について,ONIOM計算による構造の最適化を行った。その結果,これらの配位子においては,エチレングリコール鎖がパラジウム中心を覆うような構造が安定であることがわかった。さらに用いたPEG鎖により覆われた体積が大きく異なっていた。実際にこれらの最適化構造についてConnolly溶媒除外体積を求めたところ、それぞれ1771 Å^3(TEG), 4289 Å^3(PEG550), 5903Å^3(PEG750)であった。反応においては,触媒中心を長鎖エーテル基で包み覆うことにより,極めて特異な触媒環境を構築することに成功した。このような触媒においては配位子が一つだけ配位した極めて配位的に不飽和な触媒環境を発生させることができ,極めて高い触媒活性が実現したものと考えられる。本年度の研究は、交付申請書に記載した計画通り概ね順調に進行し、新しい配位子の開発とその触媒反応への応用に関する研究成果が得られたため.現在得られた成果は,既存の反応の効率を大きく改善する結果であった.今後は,長い鎖をもつ触媒系が高い活性を示した要因を明らかにすると共に,より挑戦的な課題として,新しい配位子よる新しい触媒反応の開発を進める必要があると考えている.
天疱瘡モデルマウスを用いたB細胞の組織特異的抗原に対する自己寛容獲得機構の解明

本研究は、自己反応性の細胞が存在するにもかかわらず末梢の抗原に対する自己寛容がどのように維持されるかを明らかにすることを目的として行われた。特にB細胞において末梢の抗原に対する自己寛容がどのようにして成立するかを明らかにすることを最重要課題とした。この目的のために、我々はこれまでに作製してきた尋常性天庖瘡モデルマウスを利用した。すなわち尋常性天庖瘡の抗原であるデスモグレイン3(DSG3)のKOマウスにリコンビナントDSG3を免疫し,そのマウスの脾臓細胞をrag-2 KOマウス(T細胞やB細胞を持たない免疫不全マウスであるがDSG3は発現する)に移植し,自己抗体(抗DSG3抗体)の生産を持続的に行うしマウスを作製した。このモデルマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞融合を行うことによってハイブリドーマを作製し、抗マウスDSG3抗体を生産するハイブリドーマを選別した。その中の一つのハイブリドーマが分泌する抗体のH鎖とL鎖の両方の可変領域のcDNAを得、この可変領域を持つ抗体を生産するトランスジェニックマウスを作製した。作製されたトランスジェニックマウスにおいては、抗DSG3抗体を発現するB細胞は骨髄においても末梢においても検出され、除去されている証拠は得られなかった。これらの事実は抗DSG3抗体を発現するB細胞がいわゆるネガティブセレクションの対象となって除去されていないことを示す。今後は、このマウスを用い、除去されていない自己反応性の細胞がどのようにして活性化されるのか、換言すれば自己寛容の破綻がどのようにして起こるのかを明らかにすることを目指す予定である。本研究の成果は自己免疫疾患の発症機序の理解に大きく貢献すると期待され、その応用範囲も広くさらに将来的には自己免疫疾患の治療法の開発にも貢献する意義深いものであると信じている。我々は尋常性天庖瘡の抗原であるデスモグレイン3(DSG3)のKOマウスにリコンビナントDSG3を免疫し、抗DSG3抗体が生産されることを確認した後、そのマウスの脾臓細胞をrag-2KOマウス(T細胞やB細胞を持たない免疫不全マウスであるがDSG3は発現する)に移植することにより、尋常性天庖瘡モデルマウスを作製することに成功した。このモデルを用いて、T細胞とB細胞のいずれの自己寛容の破綻が尋常性天庖瘡の発症に重要であるかを明らかにするために、野生型マウスやDSG3KOマウスのT細胞と野生型マウスやDSG3KOマウスのB細胞を様々な組み合わせで混合した後にrag-2KOマウスに移植し、その後の抗DSG3抗体の生産を検討した。その結果、T細胞とB細胞の両方がDSG3KOマウス由来の場合にのみ自己抗体の生産が見られ尋常性天庖瘡の症状が出現した。したがって、T細胞、B細胞の両方において自己寛容が破綻することが発症に必要であることが示唆された。さらに、B細胞の自己寛容の分子機構を明らかにするために、上記のモデルマウスの脾臓細胞から抗DSG3単クローン抗体を分泌するハイブリドーマAK7(IgG1、κ)を樹立した。AK7由来のH鎖とL鎖のcDNAを単離し、過去にトランスジェニックマウスの作製に用いられた抗体遺伝子のV領域を抗DSG3抗体のものと変換し、常法にしたがってトランスジェニックマウスを作製した。現在このマウスのB細胞分化過程や機能を解析中である。

特にB細胞において末梢の抗原に対する自己寛容がどのようにして成立するかを明らかにすることを量重要課題とした。この目的のために、我々はこれまでに作製してきた尋常性天庖瘡モデルマウスを利用した。すなわち尋常性天庖瘡の抗原であるデスモグレイン3(DSG3)のKOマウスにリコンビナントDSG3を免疫し,そのマウスの脾臓細胞をrag-2KOマウス(T細胞やB細胞を持たない免疫不全マウスであるがDSG3は発現する)に移植し,自己抗体(抗DSG3抗体)の生産を持続的に行うしマウスを作製した。このモデルマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞の細胞融合を行うことによってハイブリドーマを作製し、抗マウスDSG3抗体を生産するハイプリドーマを選別した。その中の一つのハイブリドーマが分泌する抗体のH鎖とL鎖の両方の可変領域のcDNAを得、この可変領域を持つ抗体を生産するトランスジェニックマウスを作製した。作製されたトランスジェニックマウスにおいては、抗DSG3抗体を発現するB細胞は骨髄においても末梢においても検出され、除去されている証拠は得られなかった。これらの事実は抗DSG3抗体を発現するB細胞がいわゆるネガティプセレクションの対象となって除去されていないことを示す。今後は、このマウスを用い、除去されていない自己反応性の細胞がどのようにして活性化されるのか、換言すれば自己寛容の破綻がどのようにして起こるのかを明らかにすることを目指す予定である。本研究の成果は自己免疫疾患の発症機序の理解に大きく貢献すると期待され、その応用範囲も広くさらに将来的には自己免疫疾患の治療法の開発にも貢献する意義深いものであると信じている。