hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
性ホルモンによる新規骨肉腫治療法の検討

骨肉腫の治療成績は1980年代以降大きな前進が見られていない。我々は(1)選択的エストロゲン受容体調節薬であるラロキシフェンが骨肉腫細胞株に対して抗腫瘍効果があること、(2)骨肉腫細胞をマウスに移植した実験系で、メスマウスがオスならびに卵巣除去マウスに比べて有意に生存率が高いことを明らかにした。本研究により、女性ホルモンが骨肉腫の進展を抑制する可能性が示され、骨肉腫に対する新規治療法の候補となりうると考えられた。本年度の研究予定は1:骨肉腫組織からの細胞株の樹立、2:細胞培養系における骨肉腫由来細胞の性ホルモン反応性の検討、3:骨肉腫症例における性ホルモン受容体発現と臨床像との相関の検討の3項目である。項目1については、当院倫理委員会の規定に従い、研究協力のインフォームドコンセントを得ることができた患者様の組織より骨肉腫細胞を分離し、3T3 methodを使用して細胞株を樹立中である。項目2についてはマウス骨肉腫由来の細胞株LM8ならびにヒト骨肉腫細胞株MG63およびSaOS2を用いて性ホルモン並びに性ホルモン関連物質に対する反応を検討した。性ホルモンとして17βエストラジオール、5αジヒドロテストステロンを使用し、性ホルモン関連物質として選択的エストロゲン受容体モジュレーターであるラロキシフェンを使用した。その結果、17βエストラジオールと5αジヒドロテストステロンは転移抑制能と化学療法剤の効果を増強する効果しか示さなかった。さらに、5αジヒドロテストステロンは腫瘍の局所侵入能を亢進させる可能性が示唆された。しかし、ラロキシフェンは転移抑制能並びに化学療法剤の増感効果に合わせて、腫瘍細胞の増殖ならびに局所侵入能も抑制した。以上のことから現段階においてラロキシフェンは、性ホルモンを標的とした骨肉腫治療薬の有望な候補の一つであるといえる。項目3についてはインフォームドコンセントが得られた患者様のデータをデータベース入力し、臨床情報を整備している状況である。データベースが完備し次第、解析に移る予定である。マウス転移モデルを用いた転移巣と原発巣における性ホルモン受容体発現と薬剤反応性の解析骨肉腫の予後を規定するのは多くの場合、局所の腫瘤ではなく、肺を中心とする主要臓器への遠隔転移である。ヌードマウスを用いた解析系においては局所進展のみで転移モデルが得られない可能性もあるため、Dunnマウス骨肉腫細胞株より樹立された肺転移変異株LM8(lung metastatic variant 8)(Int J Cancer, 76 (3) : 418-22, 1998)を用いたマウス転移モデルの解析を行った。この細胞株は均一なクローン細胞群ではなく、様々な性質を持つheterogenousな細胞集団である。この性質を利用して、皮下注射後に形成された肺転移巣と原発巣(皮下注射部)で性ホルモンと関連物質の投与に対する反応を確認した。また、原発巣と転移巣における性ホルモン受容体と関連分子の発現の差を検討することで、転移における性ホルモンの関与を明らかにする。これまでにLM8においてエストロゲン受容体α,β(ERα,β)の発現があることをRT-PCRにて確認した。また、雌雄のマウスに行った検討(15匹ずつ)では、雌マウス群の生存期間は雄マウス群よりも有意に長いことが確認され、この差は雌の卵巣切除によって消失することが確認された(未発表データ)。この結果はこれまでのヒト症例における男女間の予後・発症頻度などの性差を裏付けるものとなる可能性があると考えられる。生体内における性ホルモン反応性の検討・マウス転移モデルを用いた転移巣と原発巣における性ホルモン受容体発現と薬剤反応性の解析骨肉腫の予後を規定するのは原発の腫瘤ではなく、肺を中心とする主要臓器への遠隔転移である。ヌードマウスを用いた解析系においては局所進展の解析は可能だが、生命予後を規定する転移モデルが得られない可能性があるため、Dunnマウス骨肉腫細胞株より樹立された肺転移変異株LM8 (lung metastatic variant 8) (Int J Cancer, 76 (3) : 418-22, 1998)を用いたマウス転移モデルの解析を行った。LM8においてエストロゲン受容体α,βの発現があることをRT-PCRにて確認した後に、雌雄のマウスに対してLM8を接種し、原発巣(皮下注射部病変)と肺転移病変の進展と生命予後の解析を行った。この結果、雌マウス群の生存期間は雄マウス群よりも有意に長いことが確認された。さらに、この生存期間の差は雌の卵巣切除によって消失することが確認された。

この結果は、エストロゲンが生存期間の延長に直接寄与することを示すと考えられ、これまでのヒト症例における予後・発症頻度などの性差を裏付けるものとなる可能性があると考えられる(投稿準備中)。
グラミシジンS関連直鎖ペプチドのコンホ-メーション解析とその閉環反応について

抗菌性環状ペプチドGramicidin S (GS)の一次構造は同じ配列をもつペンタペプチドが2つ結合し閉環した環状デカペプチドcyclo(-D-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-)2である。最近、我々はOrn残基の側鎖に保護基を持たないペンタペプチド活性エステルの閉環反応によるGSの直接合成を報告した。すなわち、C一端にVal,Orn,Leu,D-Phe,Pro残基を持つ5種類のペンタペプチドスクシンイミドエステル(-ONSu)でただ一つD-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-ONSuのみが環状単量体であるsemi-GSと環状二量体であるGSをそれぞれ15%と38%の収率で生成する事また他のアミノ酸配列ではGSを全くせいせいしない事を見いだし報告した。そして、興味あることにこのGSを生成したアミノ酸配列はGSの菌体内での生合成におけるアミノ酸配列と同じであった。加えて、ペプチド1-4の閉環様式とコンホ-メーションの相関関係について研究するためにペプチド1-4に相当するエチルエステル1E-4Eのエタノール中のCDスペクトルならびにDMSO-d_6中のNMRスペクトル測定した。ペプチド4は58%の収率で選択的に[D-Val]-GS(環状単量体)を生成した。一方ペプチド2とペプチド3は様々な生成物を与えた。またエチルエステル1E-4Eのエタノール中のCDスペクトルならびにDMSO中のNMRスペクトルとペプチド1-4の閉環反応の間に良い相関関係を見いだした。今回の実験から、D-Phe-Pro配列によって保持されるN端のα-アミノ基の配置はペプチド1の二量化閉環反応によるGSの形成に必須であり、Val残基はその閉環反応様式に影響を与えることがわかった。加えて、ペプチド1-4の閉環様式とコンホ-メーションの相関関係について研究するためにペプチド1-4に相当するエチルエステル1E-4Eのエタノール中のCDスペクトルならびにDMSO中のNMRスペクトル測定した。すなわち、C-端にVal,Orn,Leu,D-Phe,Pro残基を持つ5種類のペンタペプチドスクシンイミドエステル(-ONSu)でただ一つD-Phe-Pro-Val-Orn-Leu-ONSuのみが環状単量体であるsemi-GSと環状二量体であるGSをそれぞれ15%と38%の収率で生成する事また他のアミノ酸配列ではGSを全くせいせいしない事を見いだし報告した。今回の実験からD-Phe-Pro配列によって保持されるN端のα-アミノ基の配置はペプチド1の二量化閉環反応によるGSの形成に必須であり、Val残基はその閉環反応様式に影響を与えることがわかった。
経路積分ー時間分割近似法で切り拓く経路空間上の解析

区分的定数経路による時間分割近似法を用いて、変数係数高階放物型方程式に対応する相空間経路積分が数学的意味をもつ2つの一般的な汎関数の集合を与えた。より正確に言えば、各々の集合に属する任意の汎関数に対し、相空間経路積分の時間分割近似法は、位置経路の終点と運動量経路の始点に関して、広義一様収束する。また、不確定性原理に関わらないように基本的な汎関数を2つの集合に分けているため、各々の汎関数の集合は、和や積、経路に関する平行移動、経路に関する正則線形変換、経路に関する汎関数微分の演算に関して閉じている。このため、多くの相空間経路積分可能な汎関数を創ることができる。特に、何回でも汎関数微分できる。相空間型の場合、位置と運動量を同時に測定できない不確定性原理があり、しかも高階放物型の場合は位置と運動量が対称的でないため、使用する際には注意が必要であるが、この相空間経路積分において、時間に関する積分との順序交換定理、極限との順序交換定理に加え、経路に関する直交変換における不変性、運動量経路に関する平行移動における不変性、運動量経路に関する汎関数微分の部分積分など可能となる演算を示した。この結果は、Bulletin des Sciences Mathematiquesで2019年1月にwebで公開され2019年7月に出版予定である。また2018年10月16日に京都大学の数理解析研究所での研究集会「代数解析学の諸問題ー超局所解析及び漸近解析ー」でも講演した。さらに、日本数学会の雑誌「数学」の2018年4月号の論説で、シュレディンガー方程式に対応するLagrange型経路積分とHamilton型経路積分の時間分割近似法による私の理論を紹介した。本研究では時間分割近似法をシュレディンガー方程式に限らず様々な形の擬微分作用素に適用し、数学的存在だけの観点から様々な形の経路積分を構成し、経路空間上の解析の世界を切り拓くこと、また同時に、これまで私が定式化してきた経路積分の理論の整備と成果発表も進め、時間分割近似法を多方面から見直すことで様々な形の経路積分の構成に生かすことが目的である。今年度は、まず時間分割近似法を環状型で変数係数の高階放物型方程式に対する擬微分作用素に適用することから始めた。環状型で変数係数の高階放物型擬微分作用素に対応する相空間経路積分の時間分割近似法は、大きな次元の多重積分と多重無限和からなり、経路積分の存在を示すには、時間分割の幅をゼロに近づけた場合、この多重積分と多重無限和が収束することを示さなればならない。どこまで擬微分作用素を一般化できるかは今後考える必要があるが、典型的な環状型の擬微分作用素については、この時間分割近似法の多重積分と多重無限和を定数の次元乗でコントロールする方法を開発することができた。また、次年度以降、この多重積分と多重無限和を次元によらない定数でコントロールする方法を開発するための補題をいくつか用意できた。成果発表としては、5月に韓国の大田のNIMSでのワークショップ「Feynman integral with harmonic analysis and related topics」(後述)で、3月にドイツのポツダム大学でのワークショップ「Geometric and Singular Analysis」(後述)で高階放物型方程式に対応する相空間経路積分の理論について発表できた。研究計画の段階では、私がこれまで扱ってきたユークリッド型擬微分作用素に対する時間分割近似法が多重振動積分からなるのに対し、環状型擬微分作用素に対する時間分割近似法は多重積分と多重無限和からなる点が大きな違いで、この違いに注意すれば、これまでと同様の議論が進むと考えていた。しかし、計算を進めていくうちに、ユークリッド型擬微分作用素の表象が「微分」で定義されるのに対し、環状型擬微分作用素の表象は「微分」と「差分」で定義される点も大きな違いとなることがわかった。特に「微分」を「差分」に変えると、テイラー展開や部分積分といった根本的な公式まで変更する必要があり、何度も最初から計算をやり直すことになった。しかし、最初からやり直すと何故か議論がうまく進み、順調に進展している。ただ、調査や成果発表にあまり行けなかった点が残念である。経路積分はシュレディンガー方程式の解の表現として時間分割近似法で定義されたのが始まりである。研究代表者はこれまで擬微分作用素の理論で開発された手法を時間分割近似法に適用して、経路積分を定式化してきた。本研究課題は、様々な擬微分作用素に時間分割近似法を適用して、経路空間上の解析の世界を切り拓くこと、また同時に、これまで定式化してきた経路積分の理論の整備と成果発表を進め、見直すことで、様々な形の経路積分の構成に生かすことを目的とする。今年度は、前年度開発した環状型で変数係数の高階放物型擬微分作用素に対する時間分割近似法の多重積分を扱う方法を検討し、時間分割近似法を見直していくうちに、ユークリッド型で変数係数の高階放物型擬微分作用素に対する相空間経路積分の時間分割近似法が広義一様収束し、しかも経路に関する様々な演算に関して閉じる可能性のある汎関数の仮定に気づいた。計画段階では、高階放物型擬微分作用素の場合、広義一様収束を示す際の漸近展開のため尺度関数のオーダーが上がったり下がったりする仮定にする必要があり、収束するための仮定があまり多くの演算に関して閉じることは期待できないと思っていたため、この仮定に期待している。次年度は、この仮定で相空間経路積分を定義していき、この相空間経路積分で、どのような演算が可能かを検討していく予定である。

成果発表としては、10月に京都大学数理解析研究所と広島大学、11月にピアザ淡海、3月に名古屋大学の研究集会(後述)で偏微分方程式の研究者に、さらに2月にオランダのローレンツセンターでの物理の経路積分の研究集会(後述)で、物理の研究者に相空間経路積分の理論を紹介できた。計画段階では、変数係数の高階放物型擬微分作用素に対する相空間経路積分の場合、時間分割近似法の広義一様収束を示す際の漸近展開で尺度関数のオーダーが上がったり下がったりする必要があるため、時間分割近似法が広義一様収束する汎関数の仮定は、和や積の演算以外、あまり多くの演算が期待できないと思っていた。しかし、時間分割近似法が広義一様収束するだけではなく、経路に関する演算などに関しても閉じている可能性の高い汎関数の仮定に気づいた。不確定性原理と絡むため、左連続性や右連続性など細かい性質まで戻って慎重に証明して確認する必要はあるが、この仮定に期待していて、順調に進展していると思う。成果発表については、国内の偏微分方程式の研究集会で4回、さらに海外で物理研究者の経路積分の研究集会で、私の相空間経路は積分の理論を紹介することができ、満足している。ただ大学業務との関係で、8月に海外で研究活動ができなかった点が残念である。経路積分はファインマンがシュレディンガー方程式の解を時間分割近似法で定義したことに始まる。研究代表者は、これまでの研究で、経路積分の時間分割近似法に擬微分作用素の理論で開発された計算方法を適用することで、経路積分の定式化を行ってきた。本研究の目的は、逆にシュレディンガー方程式以外の擬微分作用素に、時間分割近似法を適用することで、様々な形の経路積分を構成すること、また同時に、研究代表者がこれまで定式化してきた経路積分の理論整備と成果発表を進め見直すことで様々な形の経路積分の構成に活かすことを目的とする。今年度は、前年度発見した変数係数の一般階放物型方程式の擬微分作用素に対する相空間経路積分の時間分割近似法が位置経路の終点と運動量経路の始点に関し広義一様収束し、和や積、位置経路や運動量経路に関する平行移動や正則変換、さらに汎関数微分の演算に関して閉じる汎関数の2つの集合を構成した。次年度は、この相空間経路積分において、位置経路や運動量経路の平行移動に関する性質、直交変換に関する性質、汎関数微分に関する部分積分などが、どこまで成立するかを調べる予定である。特に放物型方程式の場合、運動量の尺度関数のオーダーを考える必要があり位置と運動量の関係が対称的でないため、位置経路と運動量経路に関する相空間経路積分の性質が、シュレディンガー方程式の場合と少し異なると予想している。成果発表としては、8月にインドのタタ研究所の応用数学センターのセミナー、10月に京都大学数理解析研究所の研究集会、3月に早稲田大学の研究集会、ポルトガルのアヴェイロの研究集会で、私の経路積分の理論を紹介した。研究計画の段階では、変数係数の一般階放物型方程式の擬微分作用素に対する相空間経路積分の場合、時間分割近似法の広義一様収束を示す際、漸近展開で尺度関数のオーダーを下げる必要があり、また、位置と運動量を同時に測定できない不確定性原理も絡むため、時間分割近似法が広義一様収束する汎関数の集合は、あまり多くの演算が期待できないと予想していた。
連続繊維を用いた高強度軽量コンクリ-ト部材の付着割裂破壊に関する研究

1.研究目的連続繊維筋を鉄筋代替の補強材とするコンクリ-ト部材について,補強材とコンクリ-トとの間の付着性状を解明することが本研究の目的である。コンクリ-トには構造物軽量化のため,高強度軽量コンクリ-ト1種(設計基準強度Fc=360kgf/cm^2級)を用いた。主筋及び横補強筋に用いた繊維筋の種類はカ-ボン,アラミドが主で一部にガラスを用いた。一般の鉄筋コンクリ-ト(RC)との比較のため,一部主筋に異形鉄筋,コンクリ-トには上記と同程度の強度の普通コンクリ-トを用いた。2.実験幅×せい=20^<cm>×35^<cm>の片持梁形式の試験体(軽量29体,普通14体)の主筋(13φ程度,付着長30^<cm>)を引抜くことにより付着割裂破壊を生じさせた。また,併行して行った幅×せい=17.5^<cm>×27^<cm>,せん断スパン比2及び2.5の6体の連続繊維筋補強普通コンクリ-ト梁の逆対称荷重による実験結果との比較を行った。3.研究結果付着割裂強度を評価する方法は,RCの場合の既成の実験式をもとにし,コンクリ-トと横補強筋の寄与する分に分離する方式による式化で,主筋が上端と下端の場合の耐力比率と共に回帰解析により得られた。他の主な結果:軽量と普通コンクリ-ト負担分は同等であり,一般に横補強繊維筋は鉄筋の場合より低い。主筋が鉄筋の場合,横補強による効果の鉄筋換算の程度はヤング係数の鉄筋に対する比率の0.33乗であるが,主筋の隅筋と中筋の耐力への寄与比はRCと同様の約2:1であった。主筋が繊維筋の場合,コンクリ-ト負担分は繊維の形状,材質で変るが概してヤング係数が低い方が小さい。横補強による隅筋と中筋の耐力寄与比は約2:1.6と1に近づいた。逆対称荷重載荷梁はすべて付着割製破壊をしており,片持梁による実験結果から得られた付着余裕度で梁の最大耐力が予測できた。1.研究目的連続繊維に樹脂を含浸させた棒状体を、鉄筋代替の補強材として用いたコンクリ-ト部材について、補強材とコンクリ-トとの間の付着性状を解明することが本研究の目的である。構造物の軽量化と補強材の高い強度を考慮し、コンクリ-トとしては、高強度軽量コンクリ-ト1種(設計基準強度Fc=360kg/cm^2程度)を中心として用いる。2.試験体本年度は横補強筋にアラミド、炭素繊維筋、主筋に鉄筋を用い、主筋周辺の付着割裂破壊の研究に主眼を置いた。試験体は片持ばり形式で、断面は幅×せい=20cm×35cm、主筋付着長30cmで総計13体である。内訳は片側主筋(日13)3本及び4本の横補強なしのもの、主筋が4本で上記2種の繊維筋が横補強筋でせん断補強筋比が0.251.0%の4種、来年度以降の研究のためのアラミド主筋(12φ、組紐)3本及び4本の横補強なしのもの、及びアラミド主筋4本でせん断補強筋比0.5%のもの

各1体である。コンクリ-トの圧縮強度は435kg/cm^2、補強筋のヤング係数は、鉄筋1.94、アラミド繊維0.63、炭素繊維1.0(各×10^6kg/cm^2)であった。加力は主筋の一方向単調引張荷重で行い、破壊形式は付着割裂破壊で主筋が引き抜けた。なお、本実験の模様は平成元年12月22日のNHKTVモ-ニングワイドで放映された。3.実験結果1)横補強筋がない場合、付着割裂強度はアラミド主筋の場合が鉄筋主筋の場合の約0.63倍であった。この差には主筋のヤング係数、表面形状と処理法、付着長などが関与するものと考えられる。2)日本建築学会のRC造終局強度型耐震設計指針の耐力式によって検討した結果、コンクリ-トを普通コンクリ-ト、補強筋を鉄筋とみなして、付着割裂強度をコンクリ-トと横補強筋による寄与分に分け、前者を指針式で評価した場合、後者はばらつきはあるが鉄筋に対する横補強筋のヤング係数比の0.62乗の補正係数により実験結果がまとめられる。1.概要前年度と同一形状の片持ばり(幅×せい=20cm×35cm)形式の試験体を用い,主筋の引抜きによる付着割裂破壊辰験を行つた。主筋の付着長は30cmで主筋径の23倍程度である。主筋に異形鉄筋を用いたものは4体で,内横補強筋のないもの,横補強筋がガラス,カ-ボン,アラミド各1体である。主筋がアラミド繊維筋(組織状砂付)のものは5体で,内横補繊強筋のないもの3体(横補強筋比0.5,1.0,1.5%)である。主筋がカ-ボン繊維筋(組織状砂付)のものは5体で,内横補強筋のないもの2体(主筋本数が異る)横補強筋がカ-ボン繊維筋(閉鎖形,横補強筋比0.5,1.0,1.5%)のもの3体である。主筋,横補強筋がカ-ボン繊維で立体格子にしたものが2体(横補強筋比0.5,1.0%)ある。以上の試験体のコンクリ-トは設計基準強度Fc=360kg/cm^2の高強度軽量コンクリ-ト1種であり,他に同強度の普通コンクリ-トによる試験体も3体用いた。本年度は加力装置にアクチエ-タを用いた(前年度は油圧ジャッキ)ので,横補強筋を用いた場合を除いて,最大荷重以降の変形まで測定できた。なお,繊維筋は連続繊維筋である。2.実験結果鉄筋代替材についての付着割裂破壊の研究は他にはないので,鉄筋の場合の既成の諸式の形を借りて実験結果の整理を行っている。現在までに得られた結果では,横補強筋のない場合は主筋のヤング係数が低い方が付着割裂強度は低い,横補強筋の効果は量が多い程大きいが鉄筋換算程は大きくない,横補強筋が直接かかっている主筋とかかってない主筋とでは付着能力は前者の方が大である,等である。本研究と併行して普通コンクリ-ト主体の研究も行っており,それらの結果もあわせ,来年度にわたり詳しく解析を進めて行く予定である。1.概要本年度は過去2年度にわたって行った。、連続繊維筋を鉄筋代替の補強材としたコンクリ-ト部材についての片持梁方式による付着割裂実験結果を整理し、研究成果をまとめた。なお,本研究でコンクリ-トとして構造物の軽量化のため対象とした高強度軽量コンクリ-ト1種と比較するため,併行して行った同程度の強度の普通コンクリ-トによる同一形状の試験体による実験結果と,完全な部材としてせん断スパレ比2.0と2.5の逆対称荷重載荷梁の実験結果との照合を行うことにした。連続繊維筋は主筋と横補強筋に用い,その種類はカ-ボン,アラミド,一部ガラスであり,比較のため一部の主筋に異形鉄筋を用いている。試験体の總数は片持梁は軽量コンクリ-ト29体,普通コンクリ-ト14体の計43体,梁試験体は普通コンクリ-ト6体である。2.研究結果付着割裂強度を評価する方法は,RC^*の場合の既成の実験式をもとにし,コンクリ-トと横補強筋の寄与する分に分離する方式による式化で,主筋が上端と下端の場合の耐力比率と共に回帰解析により得られた。他の主な結果:軽量と普通コンクリ-ト負担分は同等であり,一般に横補強繊維筋は鉄筋の場合より低い。
ソフトリソグラフィーを駆使したメカノバイオロジーの研究

本研究では、私たちの体の"力"を感じるメカニズムの解明に向けて研究を行ってきた。具体的には、細胞の伸展刺激や薬物刺激に対する応答解析のための方法論をソフトリソグラフィーという微細加工技術に着目して開発し、これを用いて刺激応答の解析を行ってきた。また、高速原子間力顕微鏡という液中で分子の動きを観察する方法により、高い時間空間分解能で分子動態の観察を行い、体内における分子動態を解明してきた。【PDMS平面パッチ・ストレッチシステムの構築】平面パッチ電極をソフトリソグラフィー法を用いてPDMS上に作成する。この方法は原理的に数十nmから数μmまでの穴を数百μm厚PDMS膜に開口させることが出来る。本年度は実際に1μm程度の穴を200μm厚PDMS膜に開けることに成功した(アスペクトレシオ=200、特許申請中)。実際にストレッチしたときの開口径変化の測定を行った。単一機械受容チャネル電流を観察するため、この膜を既開発済みのストレッチシステムと組合せ本年度購入したパッチクランプアンプにて平面パッチ・ストレッチシステムを構築し始めたところである。【PDMS平面パッチ膜細胞質側のAFMによる観測】平面パッチクランプ法の最大のメリットは従来法では不可能だった細胞膜裏側に直接AFMでアプローチできる点である。細胞底面膜残存標本を作製し共焦点レーザー顕微鏡および高速AFMで観察した。共焦点レーザー顕微鏡観察によりSAKCAおよびTRPV2チャネル抗体にてドット状のシグナルを認め、またcortical actinも観察することができた。更に、本年度購入した高速AFMにて上記細胞底面膜残存標本に数十nm程度のドット状構造物および、数nmの線維状構造物を数フレーム/秒で観察することができた。これらは共焦点レーザー顕微鏡にて観察されたcortical actinおよび膜蛋白に相当するものと考えられ同定実験を計画している。プロジェクトの最終目標である「PDMS平面パッチ・ストレッチシステムの開発」とこれを用いた機械受容チャネルの活性化機構の解明に向けシステムの各要素技術の開発、および新規機械受容候補チャネルの分子細胞生物学的解析に取り組んだ.システム化のための要素技術では,高速AFMを用いた細胞膜裏打ち観察のための試料調製,機器設定条件の最適化を行い,細胞膜の骨格を形成すると考えられる繊維状タンパク質のナノメーターオーダーでの可視化に成功した.従来法のように観察可能な分子種が限定される蛍光染色や真空下での観察ではなく,生のタンパク質一分子の挙動を可視化可能にした.また,機械受容の候補チャネルの詳細な解析を進めた結果,伸展刺激に対して細胞内カルシウムイオン濃度上昇が認められ,新規の機械刺激感受性チャネルであることが特定されつつある.今後は開発を進めてきた要素技術を組み合わせ,要素毎に動作検証,性能評価の後トータルシステムに仕上げていく.これを用いて伸展時のチャネル及び周辺分子の構造変化観察,さらにチャネル電流の同時計測へと進めていく.最終的には新規開発システムにて我々の発見したチャネル分子の解析を行い,チャネル一分子の構造変化,及びチャネル電流の同時計測により新たな知見の導出を目指す.また,チャネル周辺の細胞骨格タンパクの役割についても分子細胞生物学的に解析を進め,機械受容チャネルの作用機序を解明していく.ヒトの体は外界からの様々なメカニカルストレス(機械刺激)をうけ、これに適切に応答しながら生命活動を維持しているが、その分子レベルでのメカニズムは十分には解明されていない。本研究プロジェクトでは「PDMS(polydimethylsiloxane)平面パッチ・ストレッチシステムの開発」を行い、さらにこれを用いた機械受容チャネルの活性化機構の解明を目指している。PDMSを用いたソフトリソグラフィーを基盤とする各種要素技術をシステム化することで、機械受容チャネルに関する新知見の獲得を目指す。本年度は特に,(1)システム化のための各種要素技術の開発,及び(2)細胞の伸展刺激応答の解析を行った。1.システムの中核をなすPDMS平面パッチ電極の開発を推進した。細胞膜断片に伸展刺激を負荷しながら活性化されるチャネル電流を計測できるよう、直径数ミクロンの貫通穴を再現性高く作製するための技術を構築した。従来のガラス電極では不可能であった、伸展刺激を負荷しながらチャネル電流の計測することが可能になる。2.マイクロコンタクトプリンティング法を用いて細胞を一定形状に播種し、単一方向の伸展負荷に対する応答を評価することで定量的評価が可能になった。次年度は、PDMS平面パッチ電極を用いて機械受容チャネル電流を計測していく。また、これまでに別途開発を進めてきた高速原子間力顕微鏡(AFM)と一体化した計測システムへと発展させ、これを用いて機械刺激受容機構を解明していく。ヒトの体は外界からの様々なメカニカルストレス(機械刺激)をうけ、これに適切に応答しながら生命活動を維持しているが、その分子レベルでのメカニズムは十分には解明されていない。本研究プロジェクトでは、PDMS(polydimethylsiloxane)を用いたソフトリソグラフィーを基盤として、細胞への伸展刺激の付与とその応答計測に必要な各種要素技術を作製し、それをシステム化することにより機械受容チャネル分子の作用機序の解明を目指す。本年度は、これまでに開発を進めてきたシステム化の中核となるPDMS

平面パッチ電極によるイオンチャネル電流の測定に重点を置いて研究を推進した。機械刺激受容チャネルを動的に解析するためには、細胞膜断片に伸展刺激を付与しながらチャネル電流を測定する必要がある。そのため、ゴム弾性を持つPDMS平面パッチ電極により細胞膜のチャネル分子に伸展刺激を与えながら電流計測する手法を検討し、試作機を構築した。パッチ電極に細胞を接着したところ、電極-細胞間は適切に密着されていることが確認でき、さらにイオンチャネル様の電流が観測された。一方、伸展に伴い電極形状が拡大していることが電子顕微鏡観察によって確認でき、細胞に定量的な伸展刺激を与えることができるようになった。今後は、測定条件を変えてデータを取得し、伸展刺激によるチャネル活性化機構を解析していく。本研究により、従来のガラス電極では不可能であった、定量的な伸展刺激を付与しながらチャネル電流の計測することが可能になりつつある。これまでに別途開発を進めてきた高速原子間力顕微鏡(AFM)と一体化した計測システムへと発展させ、「PDMS平面パッチ・ストレッチシステム」を構築することで機械刺激受容機構を解明していきたい。ヒトの体は外界からの様々なメカニカルストレス(機械刺激)をうけ、適切に応答しながら生命活動を維持しているが、その分子レベルでのメカニズムは十分には解明されていない。本研究プロジェクトでは、PDMS(polydimethylsiloxane)を用いたソフトリソグラフィーを基盤技術として、細胞への伸展刺激の付与とその応答計測に必要な各種要素技術を開発し、それをシステム化することにより機械受容メカニズムの解明を目指して研究を展開してきた。高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、大腸菌の機械受容チャネルMscLの野生型と変異株を比較検討することにより、イオンチャネルの開閉の作用機序の解明を目指した。精製したMscLの構造を高速AFMにより比較検討することで、閉状態及び開状態のチャネルの構造を従来のような真空下ではなく、生きた状態として捉えられるようになった。PDMSによるマイクロフルーディクスの応用技術として、単一細胞の高い空間時間分解での化学刺激に対する応答解析を可能とする系を構築し、刺激応答解析を行った。
訂正方略活用についての人工内耳装用児と聴児の比較

音声会話を継続するためには人工内耳(CI)装用児においても聞き返しや確認等の訂正方略が必要である。そこで,CI児の訂正方略が聴児よりも多いか少ないかを明らかにし、さらに訂正方略に関係する言語力を明らかにした。方法は、学齢CI児と聴児を対象に、検査者との自由会話中に低親密語や説明省略した発話を投入し訂正方略活用数を調べた。さらに訂正方略と言語力(語彙理解力、構文理解力、構文産生力、語連想力)との関係を調べた。その結果CI児の訂正方略活用は個人差があり、聴児との量的な差は確認できなかった。CI児の訂正方略は構文産生力と語連想力と強く関係した。これらの言語力の育成が必要であることが示唆された。<はじめに>高度難聴児が人工内耳を装用し音声会話でコミュニケーションするケースが増加しているが、人工内耳装用児(CI児)の音声会話では会話が継続できないコミュニケーションブレイクダウン(以下、ブレイクダウン)が多いことを報告した。会話継続には聞き返しや確かめなどの訂正方略が一般的に有効であるとされているがCI児の訂正方略について十分に検討されていなかった。そこで、音声会話中のCI児の訂正方略活用状況を明らかにし訂正方略活用指導に有用な示唆を得ることを目的とした。<方法>対象は6-8歳のCI児6名と同年齢聴児8名である。手続きは、訂正方略を活用させるために話題転換、低親密語使用、説明省略を会話中に実験的に行いブレイクダウンを誘発した。そして、訂正方略をCI児と聴児間で比較し、話題転換、低親密語使用、説明省略のブレイクダウン誘発に対して活用された訂正方略型を検討した。<結果>訂正方略活用についてCI児と聴児間の差は確認できなかった。CI児の個人差が大きかった。ブレイクダウン誘発要因別に活用された訂正方略型は、話題転換では聴児もCI児も復唱型訂正方略が用いられる傾向にあった。低親密語では聴児は疑問詞型訂正方略を用いており、CI児は疑問詞型訂正方略と復唱型訂正方略が同程度であった。説明省略では聴児は情報追加型訂正方略が多くCI児は疑問詞型訂正方略が多かった。<考察>CI児は話題転換や低親密語の会話では聴児と同様の訂正方略活用によって会話継続していると考えられた。しかし、説明省略の状態においては「何?」と疑問詞型訂正方略で尋ねることはできているが、聴児のように相手の発話から推測したことを述べる情報追加型訂正方略を活用することは乏しく相手の発話意図推測と確認が困難であると推察された。この情報追加型訂正方略活用に関係する言語力を明らかにし、指導につなげる必要がある。(目的)人工内耳を装用していても、聴取しにくさがあるため、聞き返しや確かめなどの訂正方略を活用して会話継続する必要がある。そこで、人工内耳装用児(CI児)の訂正方略における低学年と高学年における差の有無を明らかにした。さらに、訂正方略に関係する言語力を明らかにした。(方法)対象は、高学年CI児と低学年CI児とコントロール群の聴児である。手続きは、15分間の自由会話中に低手がかり発話(話題転換と低親密語と説明省略のある発話)を投入し訂正方略を活用させた。会話は検査者と対象児の1対1で実施し、録音を基ににスクリプトを作成した。低手がかり発話に対する対象児の訂正方略は聞き返し方略、繰り返し方略、確認方略に分類し、カウントした。また、CI児の言語力として語彙理解力、構文理解力、構文産生力、語連想力を求めた。そして、訂正方略活用数を高学年群と低学年群間、コントロール群間で比較した。また、CI児については訂正方略活用数と言語力との関係を分析した(結果)訂正方略は高学年CI児は低学年CI児よりも増える傾向にあったが、個人差が大きく、有意差は確認できなかった。高学年CI児とコントロール群間の有意な差はなかった。訂正方略の内容では、高学年CI児では聞き返し方略と確認方略が低学年CI児よりも増える傾向にあった。CI児の訂正方略と関係する言語力は構文産生力と語連想力であった。(考察)CI児は低学年から高学年にかけて訂正方略を活用できるようになっていくと考えられた。中でも聞き返し方略が増えていることから自分の聞こえなさを自覚し補おうとする姿勢が育っていくと推察された。

また、確認方略が増加したことから相手の発話から推測した内容を相手に伝えて確かめることができるようになっていくと考えられた。訂正方略活用を促すためには構文産生力と語連想力を指導する必要性が示唆された。計画通り実験が進んでいる.しかし、結果において個人差が大きくCI児と聴児間の訂正方略活用数についての有意差が確認できなかった。そこで症例数を増やすために実験機会を5月中に再設定しているところである。しかし、CI児の言語コミュニケーションに関する全国規模の研究においても個人による差が大きかったことが報告されているため訂正方略活用についても同様の結果であることも予測される。もし語彙力や構文力のような個人の言語要因が訂正方略活用に大きく影響し個人差となっているのであれば、関係する言語要因を明らかにする必要がある。また、訂正方略獲得時期に個人差があるとすれば、年齢が上のCI児の訂正方略活用を調べることで明らかにすることができると考えられた。そこで、1訂正方略活用における低学年CI児と高学年のCI児の比較、2訂正方略活用と言語力との関係について検討することとし、4-5月中に9-11歳のCI児童との実験機会を設けることにした。25年度が最終年度であるため、記入しない。会話継続には相手の発話内容や意図を推測し確かめる情報追加型訂正方略が会話継続に有効であるとされるが、CI児の活用は乏しかった。しかし、活用できているCI児がいたことから言語力との関係が推察された。言語力には語彙力や構文力等さらに受容と表出の側面があるため、どのような言語力と関係するのかを明らかにし、訂正方略指導につなげる必要があった。また、指導に際しては、音声会話における訂正方略活用実態を評価する必要があるが、評価方法が十分に検討されていなかった。そこで本研究で用いてきたブレイクダウンを誘発したときの訂正方略活用と通常会話中での訂正方略活用が相関することを確かめ、訂正方略評価方法を確立する必要があった。そこで、本研究では、第1の目的としてCI児の訂正方略活用と言語力との関係を明らかにすることにした。第2の目的として訂正方略活用の評価方法を検討することにし、2つの研究を計画した。<研究1>人工内耳装用児の訂正方略と関係する言語力について:訂正方略活用に関係する言語力を明らかにする。言語力として語彙理解力、文理解力、文表出力、語流暢性と確認型訂正方略活用との関係を明らかにする。<研究2>人工内耳装用児の訂正方略評価方法の作成:コミュニケーションブレイクダウン誘発会話と通常会話における訂正方略活用の違いを検討し、訂正方略評価方法を作成する。手続きは、研究1では5-11歳のCI児15名を対象とし、訂正方略と各言語力との関係を検討する。さらに低学年CI児群と高学年CI児群の訂正方略活用について比較する。研究2では、10名のCI児を対象にブレイクダウンを誘発した会話と日常会話における訂正方略活用数の関係を検討する。また、指導における評価方法を作成する視点からCI児の訂正方略活用だけでなく、活用した訂正方略が対象児と検査者間における会話継続効果についても検討する。
老化に関る遺伝子・klothoの分子機能の研究

Klothoマウスの分離と原因遺伝子:klothoの同定を基盤として、Klotho蛋白の機能の解析を行い、以下の結果をえた。(1)Klotho蛋白には立体構造、結合糖鎖、翻訳後プロセッシングの違いによる4つのタイプがあり、それらはER,Golgiに存在する細胞内タイプ、細胞膜タイプ、細胞外ドメインの中央でプロセスされる分泌型short Form(mKL1よりなる)、膜貫通ドメインでプロセスされる全長に近い分泌型Long Form(mKL1,mKL2を含む)からなる。これらは結合糖鎖や立体構造が異なっており、それぞれを優先的に認識するモノクローナル抗体を作成した。(2)分泌型を高感度に認識する抗体を用いて、Klotho蛋白が血清中に存在することを証明した。(3)Klotho蛋白は活性中心の構造に変異があるとはいえ、構造的にはβ-Glucosidaseに相同性があることから、酵素活性の有無を追求してきたが、糖鎖切断活性を強く支持する結果が得られた。Klotho蛋白は少なくもターゲット分子の糖鎖を修飾対象、あるいは認識対象の一部としていると推定される。(4)Klotho遺伝子座にlacZ遺伝子をノックインしたマウスの解析により、Klotho遺伝子は腎尿細管、脳の脈絡膜、副甲状腺ホルモンを産生する副甲状腺の主細胞で強く発現することを見いだした。(5)Klothoを発現する尿細管細胞ではカルシウムホメオスタシスに関連する重要な遺伝子がそろって発現しており、更に、Klotho変異マウスではカルシウム制御の鍵となる遺伝子の発現変異が観察された。これらの結果はKlotho発現細胞、及び、Klotho蛋白のカルシウムホメオスタシス制御における重要性を強く示唆している。(6)蛋白の全体構造、β-Glucosidase活性中心の構造比較から、klotho遺伝子のホモログ、β-klotho遺伝子を同定した。β-klotho遺伝子は膵臓、肝臓、白色、褐色脂肪細胞で比較的高い発現が確認されている。また、ノックアウトマウスの作成、モノクローナル抗体を作成した。挿入突然変異によって早期老化症状を呈するトランスジェニックマウス系統を樹立し、原因遺伝子をKlothoと名付けた。Klotho遺伝子は新規の1型膜蛋白質をコードしており、細胞外の配列はβ-glucosidaseに相同性をもつ2つのドメインより構成されており、N端側のドメインをmKLl、C端側のドメインをmKL2と名付けた。発現は腎臓で高く、弱い発現が中枢神経系で観察され、肺、骨、胃壁、皮膚などの激しい変異が観察される組織での発現は認められなかった。ヒト相同遺伝子の解析により同様の1型膜蛋白質、及びスプライシングの制御により分泌型蛋白質をコードするmRNAを同定した。外来のKlotho CDNAを発現するトランスジェニックマウスを作成し、突然変異マウスと掛け合わせによるレスキュー実験により、Klotho遺伝子が原因遺伝子であること、klotho遺伝子の変異により多彩な変異症状がもたらされることが示された。Klotho蛋白にはβ-glucosidase酵素活性を示すデータは得られておらず、酵素活性をもつかどうかは不明である。抗体を用いてKlotho蛋白の存在様式を解析したところ、腎臓の膜成分から全長型とC端側のドメイン(mKL2)に相当する分子が同定され、全長型を高発現したマウス血中よりN端側のドメイン(mKLl)に相当する分子が同定された。

また、トランスジェニックマウス、アデノウイルス発現ベクターを用いたレスキュー実験によりKlotho蛋白は腎臓で発現しなくても機能すること、膜型Klotho蛋白の中央にKKRKからなるプロセスされると推定される配列があることから、mKLlはプロセスされて細胞外に分泌され、機能していることが示唆された。現在、ヒト分泌型蛋白によってレスキューできるかどうかを解析している。相互作用する分子の解析にために、タグをもつキメラ蛋白を大量に調製して、結合組織、細胞を検討している。Klotho蛋白の機能解析を進め、以下の結果を得た。(1)膜型、および分泌型Klotho蛋白が存在することが示唆された。(2)ウイルスベクターにより発現した膜型、分泌型Klotho蛋白が変異表現型をレスキューできることが示され、分泌型も機能をもつことが示唆された。(3)新しい抗体が得られ、Klothoに結合する蛋白の解析法を開発し、結合分子を解析中である。(4)nullノックアウトマウス、ノックインマウスを作成し、その変異表現型を解析した。更に本実験により発現細胞の分離やKlotho発現細胞の性質を調べるための新たな実験系が得られた。(5)Klotho遺伝子の発現制御機構の解析はin vitro系が利用できないために困難に直面しているが、ヒト腎不全患者でのKlotho遺伝子の顕著な発現以下を確認し、臨床応用への道を開いた。ノックインマウスから発現細胞をソーテイングすること、Neo耐性で分離することが可能であることから、これらの系を利用することに発現制御システムの解析が進展するものと期待している。(6)長期的な研究テーマである老化疾患の発症に関連する遺伝子カスケード、遺伝子素因の解析についても、DNAアレイの利用と解析が進み、また掛け合わせ実験より発症に関連する遺伝子素因の存在が示唆されるなど、基盤となるデータが得られた。(7)Klotho蛋白の酵素活性を含めてKlotho蛋白の性質や特性が明らかになりつつあり、各種の変異導入蛋白の作製、新たな基質の用意など、蛋白機能についてより詳細な解析を可能とするシステムを作りつつある。これまでの成果により新たな実験システムの構築が可能となっており、また、解決すべき問題点も明瞭となっていていることから、さらなる発展が期待される状況にあると判断している。Klothoマウスと原因遺伝子:klothoの解析を行い、以下の結果をえた。(1)Klotho蛋白には立体構造、結合糖鎖、翻訳後プロセッシングの違いによる4つのタイプがあり、それらはER,Golgiに存在する細胞内タイプ、細胞膜タイプ、細胞外ドメインの中央でプロセスされる分泌型short Form(mKL1よりなる)、膜貫通ドメインでプロセスされる全長に近い分泌型Long Form(mKL1,mKL2を含む)からなる。これらは結合糖鎖や立体構造が異なっており、それぞれを優先的に認識するモノクローナル抗体を作成した。(2)分泌型を高感度に認識する抗体を用いて、Klotho蛋白が血清中に存在することを証明した。
日本と中国の急傾斜地における土地利用と果樹栽培に関する比較研究

本研究の目的は,愛媛大学と西南農業大学を中心に研究者が相互訪問し,現地急傾斜地カンキツ園の実態調査の基づいて,これまでの研究成果も合わせて,セミナー形式で発表し,合理的な肥培管理法を追求することにあった。研究業績の概要は次のとおりである。急傾斜地カンキツ園にあっては草生栽培の重要性が指摘された。草生栽培には(1)草の根による土壌物理性の改善(2)表層土壌の侵食防止(3)腐植源としての有機物補給(4)VA菌根菌など有用微生物の繁殖などが期待できる。たとえば,稲ワラなどの有機物の確保が難しい園では草の働きを積極的に活用することが大切である。このような草種は下層土を改良するだけでなく地上部は枯れて腐植源となる。またバヒアグラスの根にはVA菌根菌もよく寄生し繁殖する。その結果,バヒアグラスの根の周辺にあるカラタチの根にもよく寄生するようになる。VA菌根菌はリン酸の肥効を高めることが判明しており,カンキツの根にとっては有用菌なのである。これまでに草生栽培用として導入された草種はほとんどが北欧原産のものであった。したがって,3月下旬から4月にかけて生長が盛んになり,カンキツ樹との間で要素の吸収をめぐって競合があった。カンキツ樹にとって,春枝は高収量を確保するには非常に重要である。草種の導入によって春枝の伸長や充実が抑えられるとすれば草生栽培の意義を失う。一方,南方原産のバヒアグラスのような牧草は冬季から5月上旬まではほとんど枯れた状態で,春季におけるカンキツ樹と草との要素吸収の競合は起きない。ただし,夏季には北欧型の牧草が高温のために生長が衰えるのに対して南方型牧草はよく繁殖するので除草剤による生長抑制が必要となる。しかし草を完全に枯死させるのが目的でなく,部分的に草の生長を抑えることができればよいわけで,除草剤の使用も少なくてすむ。以上のとおり,急傾斜地カンキツ栽培にあっては,草の持つ諸特性をうまく利用した土壌管理法が有効であることの結論を得た。次に,土壌の物理構造改善のための有機物施用についての研究成果が発表された。すなわち,有機物施用土壌からはメタン,エタン,エチレン,プロパン,プロピレンおよびiso_-およびn_-ブタンなどが発生しているこが判明した。特にエチレンは0.5ppm以上になるとカンキツ根の生長を阻害することが指摘された。また主要なエチレン発生物質は,脂質特にグリコール脂質やステロール脂質に糖が結合した脂質であった。ヒノキ樹皮などには縮合型タンニンが含有されており,未熟バーク堆肥として使用するとカラタチの生育を著しく阻害する。このとき,あらかじめ0.1%の生石灰および0.1%の消石灰液に樹皮を浸漬しておくと,生長阻害作用が著しく減じることが明かとなった。また,炭はVA菌根菌の繁殖を高めることや,未成熟の有機物施用による生育阻害も軽減させる効果もある。この原因としては炭が抑制物質やエチレンなどの阻害ガスをよく吸着する特性と関係があることも判明した。果樹の病害抵抗性に関与するリグニン生成についても,知見が発表された。病原菌の感染,切断傷害および高温度ストレスを受けた植物組織ではこれらの刺激によって生じる“ある因子"の働きによって,最初から遺伝的に不活性型で細胞壁に結合した型で存在する糖ペプチドが遊離され,遊離した糖ペプチドは外果からのストレスによって,組織内に生成されるエチレンの働きによって初めてその機能を発揮する。糖ペプチドの分子量は約数千と推定されるので,糖ペプチド自体が細胞膜を通過して,直接遺伝子を含んでいる細胞核に作用するとは考えられない。したがって,糖ペプチドは一度細胞膜に作用して,そこから何らかの第2次メッセンジャーを介して,あらかじめ植物細胞にセットされて存在するPAL(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)や塩基性イソペルオキシターゼなどのリグニン生合成系をスイッチオンし,酵素蛋白質のde novo合成を引き起こして,最終的にグアヤシル型のリグニンを細胞壁に蓄積する。木化細胞壁は病原菌の侵入および菌糸伸展を阻止するものと考えられるとの見解が発表された。

したがって,3月下旬から4月にかけて生長が盛んになり,カンキツ樹との間で要素の吸収をめぐって競合があった。カンキツ樹にとって,春枝は高収量を確保するには非常に重要である。草種の導入によって春枝の伸長や充実が抑えられるとすれば草生栽培の意義を失う。一方,南方原産のバヒアグラスのような牧草は冬季から5月上旬まではほとんど枯れた状態で,春季におけるカンキツ樹と草との要素吸収の競合は起きない。ただし,夏季には北欧型の牧草が高温のために生長が衰えるのに対して南方型牧草はよく繁殖するので除草剤による生長抑制が必要となる。しかし草を完全に枯死させるのが目的でなく,部分的に草の生長を抑えることができればよいわけで,除草剤の使用も少なくてすむ。以上のとおり,急傾斜地カンキツ栽培にあっては,草の持つ諸特性をうまく利用した土壌管理法が有効であることの結論を得た。次に,土壌の物理構造改善のための有機物施用についての研究成果が発表された。すなわち,有機物施用土壌からはメタン,エタン,エチレン,プロパン,プロピレンおよびiso_-およびn_-ブタンなどが発生しているこが判明した。特にエチレンは0.5ppm以上になるとカンキツ根の生長を阻害することが指摘された。また主要なエチレン発生物質は,脂質特にグリコール脂質やステロール脂質に糖が結合した脂質であった。ヒノキ樹皮などには縮合型タンニンが含有されており,未熟バーク堆肥として使用するとカラタチの生育を著しく阻害する。このとき,あらかじめ0.1%の生石灰および0.1%の消石灰液に樹皮を浸漬しておくと,生長阻害作用が著しく減じることが明かとなった。また,炭はVA菌根菌の繁殖を高めることや,未成熟の有機物施用による生育阻害も軽減させる効果もある。この原因としては炭が抑制物質やエチレンなどの阻害ガスをよく吸着する特性と関係があることも判明した。果樹の病害抵抗性に関与するリグニン生成についても,知見が発表された。病原菌の感染,切断傷害および高温度ストレスを受けた植物組織ではこれらの刺激によって生じる“ある因子"の働きによって,最初から遺伝的に不活性型で細胞壁に結合した型で存在する糖ペプチドが遊離され,遊離した糖ペプチドは外果からのストレスによって,組織内に生成されるエチレンの働きによって初めてその機能を発揮する。糖ペプチドの分子量は約数千と推定されるので,糖ペプチド自体が細胞膜を通過して,直接遺伝子を含んでいる細胞核に作用するとは考えられない。したがって,糖ペプチドは一度細胞膜に作用して,そこから何らかの第2次メッセンジャーを介して,あらかじめ植物細胞にセットされて存在するPAL(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ)や塩基性イソペルオキシターゼなどのリグニン生合成系をスイッチオンし,酵素蛋白質のde novo合成を引き起こして,最終的にグアヤシル型のリグニンを細胞壁に蓄積する。木化細胞壁は病原菌の侵入および菌糸伸展を阻止するものと考えられるとの見解が発表された。本研究の目的は愛媛大学と西南農業大学の果樹園芸学を中心とした学術交流を通じて急斜地果樹園の栽培合理化の方途を探り、かつ、わが国には導入されていないカンキツの遺伝資源を可能な限り導入することであった。西南農業大学側からの招聘研究者李道高教授及び閻玉章副教授についてはまず、松山市周辺の急傾斜地カンキツ園を案内し、その実態を把握した上で、愛媛大学農学部でセミナ-を開催し、研究分担者一同が十分に意見交換できるように努めた。
チタニア粒子と生体触媒(酵素)の複合によるCO_2固定化システムの構築

1.複合システム(試作機)の有効性:静電成膜法により作成した多孔質セラミック膜で互いに遮光分離された光触媒(チタニア粒子)と生体触媒(酵素)の複合システムを組み上げ、その有効性をテストした。その結果、チタニア粒子表面上でUVによって生成されたMV2_+はセラミック膜のポアを経由して遮光分離された生体触媒に輸送されることが確認され、本研究の提案が有効であることが確認された。2.TiO2微粒子の調製:当初の予定とは異なり、TiO2微粒子の調製はシリカの微粒子(3μm程度)の表面にゾルゲル法でチタニア粒子をコーティングすることで調製した。シリカ微粒子表面に堆積したチタニア超微粒子を、焼成温度をコントロールして調製することにより、光触媒機能が高い結晶形(アナターゼ)の微粒子を得ることが出来た。3.複数の生体触媒(FDH、DAH、NADH)のコンプレックス固定化酵素の作成:静電微粒化法で試みたが、1mm以下のこれ以下固定化酵素粒子を作成するには各酵素の混合比を微妙に関連することがわかった。CO_2を人工的に固定する新しい方法の一つとして生体触媒(酵素)と光触媒粒子を組み合わせた複合反応システムを考案した。CO_2固定用酵素として採用した蟻酸脱水素酵素(FDH)は通常(HCCOH→CO_2+2H^+)の反応を触媒する。しかし、NADHの過剰存在下ではこの逆反応を触媒するとので、(CO_2+2H^+→HCOOH)の反応により、CO_2を蟻酸に転換できると期待した。そこで、NADHの過剰状態を作り出すのにはメチルビオロゲンの還元型MV^<2+>を犠牲剤としたリポアミド脱水素酵素(DAH)の逆反応を利用した。また、MV^<2+>の還元にはTiO2粒子の光触媒反応を利用した。DAHとFDHによる逆反応は、目論み通りNADH,MV^<2+>過剰条件下でそれぞれうまく進行するが確認できた。さらに、その定量的検討結果からDAHとFDHの最適酵素比を速度論的に解析し、その妥当性を実験的に確認した。また、MV^<2+>は水を犠牲剤とした光触媒反応で効率よく還元できることが確認できた。