hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水源涵養林施業マニュアルの作成に関する研究

本年度の研究は、(1)について、前年度にひきつづき過去の水文資料のコンピュータへの入力、データベース化を進めた。特に精密な解析を指向した南谷小流域の流量データの処理を中心に行った。(2)について、本年は伐採前の最終年であり、土壌水分、水質ばかりでなくCO_2や土質強度に至るまで、多方面の観測・測定が行われた。そして、平成11年3月に処理流域の伐採が開始された。(3)について、ひきつづき全国の既往水文資料を収集し、地域ごとの洪水流出、基底流出の特性に関する解析が進められた。(4)について、ひきつづき「水源涵養と森林施業」を論ずる会議を4回にわたって開催し、森林整備指針の作成についての基本構想の深化を図った。本研究は、水源涵養機能を発揮する森林整備を気候、地質による地域別に、主要林分毎に提示することを目的としている。研究は、(1)東大愛知演習林の70年間にわたる水文資料の解析、(2)東大千葉演習林における対照流域試験の実施、(3)降雨流出から見た全国地域区分と水分特性の解析、(4)森林施業マニュアルの構築に向けたモデル開発、よりなる。本年度の研究は、(1)について、HyCyModelによって東大愛知演習林白坂流域の1930年から1995年の66年間の日雨量から日流量を再現し、流出特性の長期変化を明らかにした。また、この期間の、白坂流域の植生変化について航空写真によって明らかにした。(2)千葉演習林袋山沢試験流域では、1999年3月から5月にかけて70年生スギ、ヒノキ林が皆伐され、伐採に伴う流出量、水質、土砂流出量、土壌水分、土壌呼吸量等が継続的に測定された。(3)について、全国の既旺水文資料を収集し、洪水流出、規定流出特性に関する解析が進められた。また地域区分について、国土数値情報の標高、土地利用、気候値の各データセットを用いて区分が進めてれるとともに、最近100年間の森林面積の傾斜別の変遷が明らかにされた。(4)について、「水源涵養と森林施業」を論ずる会議を4回開催し、森林整備指針作成についての基本構想の深化を図った。研究は、(1)東大愛知演習林の70年間にわたる水文資料の解析、(2)東大千葉演習林における対照流域試験の実施、(3)降雨流出から見た全国地域区分と水文特性の解析、(4)森林施業マニュアルの構築に向けたモデル開発、よりなる。(1)について、HyCyModelによって東大愛知演習林白坂流域の1930年から1995年の66年間の日雨量から日流量を再現し、流出特性の長期変化を明らかにした。(3)について、全国の既往水文資料を収集し、洪水流出、規定流出特性に関する解析が進められた。また地域区分について、国土数値情報の標高、土地利用、気候値の各データセットを用いて区分が進められるとともに、最近100年間の森林面積の傾斜別の変遷が明らかにされた。(4)について、「水源涵養と森林施業」を論ずる会議を4回開催し、森林整備指針作成についての基本構想の深化を図り、指針として取りまとめた。
ナノギャップを用いた単一分子の伝導特性計測とセンサ応用

本研究は、有機トランジスタをナノ寸法まで微細化して高性能化し、大面積センサに応用する研究を推進することを目的している。これまでに、「有機半導体分子を用いたトランジスタをナノ寸法にまで微細化して、大面積センサに応用する」ため、ナノ印刷技術や張り合わせ法によって有機トランジスタを製造する方法に取り組んだ。特に、有機トランジスタの製造に当たっては、ソース・ドレインの微細化を低コストプロセスで実現するだけでなく、そのほかのゲート電極層、ゲート絶縁膜、有機半導体層などを低コストプロセスで成膜することが大切である。これまでに、筆者らはポリイミドの前駆体をポリエチレンナフタレートの上にスピンコートで塗布して、有機トランジスタのゲート絶縁膜とすることに成功している。また、ポリイミドの前駆体をインクジェットで塗布し、ゲート絶縁膜のパターニングに取り組んだ。インクジェット塗布時の周波数や印加電圧を最適化することによって、ポリイミド薄膜の平坦性や均一性を向上させた。また、電極層については、銀ナノ粒子をインクジェットで塗布して、ゲート電極に応用してきたが、同様の手法をソース・ドレイン電極に応用した。特に、インクジェット描画によるミクロン寸法の電極を利用することによって、チャネル長が1ミクロンかつ高移動度のペンタセン電界効果トランジスタの試作に成功した。多くのリソグラフィー技術は、既存の無機電子材料用に開発されたものであい、有機半導体の作製法とはコンパティビリティーが良くなく、レジスト、現像液、有機溶剤、紫外線露光などによって致命的なダメージがもたらされる。本研究では、シリコーンゴムを用いた張り合わせ法によってこのようなプロセス上の問題の多くが回避されることを示した。同様の手法を大幅に簡素化し、かつ高精細の印刷技術を利用して、チャネル長をナノ寸法まで微細化したので、報告する。この手法では、鋳型から模った凹凸のあるシリコーンゴムに金属を直接蒸着したものを電極に用いる。電極の間隔や領域はナノ寸法で制御することが可能である。この金属をコーティングしたシリコーンゴムと有機半導体の間の柔らかい機械的な接触が電気的インターコネクションを可能とする。接合プロセスは可逆的で、室温で行うことができ、また、圧力や粘着層などを必要としない。ただ単に、通常の張り合わせやウエハ融着の手法でできる。この手法は、化学的に壊れやすいもの、あるいはとても薄い材料における電荷輸送現象をナノメートル領域で調べるのに極めて有効なツールを提供する。本節では、有機半導体の薄膜の伝導特性をトランジスタ構造にて電極間隔250μmから150nmまでの広い範囲にわたって調べた。さらに、電極表面に形成された単分子膜の効果を調べた。トップコンタクトの有機トランジスタの特性を系統的に測定した結果、チャネル長でよくスケールされる様子が示された。スタンプの貼り合わせによる150nmのチャネル長のデバイスについて測定した結果、飽和電流は、ミクロンサイズのスケーリン測と比較して約1/5ほど小さい値になっている。また、on/off比は一桁劣化している。この原因の一部は、コンタクト部分の直列抵抗成分によるものであろう。また、一部は、短チャネル効果である。有機トランジスタが近年大変に注目を集め、活発に研究開発が進められている。有機トランジスタは、低温プロセスでプラスティック・フィルム上に形成できるため、軽量性、薄型化、可とう性、耐衝撃性に優れる。電子ペーパーをはじめとして曲げられるディスプレーの駆動回路には必要な技術である。さらに、印刷を利用すれば、大面積の集積回路の製造コストを抑えることができる。バーコードの代替として、無線タグを印刷で包装に直接作りつけることも夢ではない。実際に、インクジェットやマイクロ・コンタクト・プリンティングなど印刷で有機トランジスタが作製されている。印刷で作った有機トランジスタは、シリコンよりも単位面積あたりの製造コストが2桁以上安くなると試算される。面積が大きくなるほど、有機トランジスタの優位性が顕著になり、その持ち味が発揮される。代表者らは、有機半導体や導電性高分子など機能性ナノ分子材料を用い、シリコンやガリウム砒素などの無機半導体ではカバーしきれない新しいエレクトロニクス分野を開拓することを目標とした研究を推進した。特に、有機半導体をチャネル層とした有機トランジスタの微細化研究に取り組み、センサーへの応用を目指した。その結果、以下の研究成果を挙げることができた。

ゲート絶縁膜や有機半導体層に検討を加え、クニャクニャと曲げられる有機トランジスタの作製技術を確立した。特に、自由に曲がるトランジスタとしては、世界最高の移動度(1.4cm2/Vs)を実現した。また、実際に半径2mmの棒に巻きつけても動作することを示した。本研究は、有機トランジスタをナノ寸法まで微細化して高性能化し、大面積センサーに応用する研究を推進する。昨年度までに、自由に曲がる有機トランジスタとしては世界最高の移動度(1.4cm^2/Vs)を実現し、大面積の圧力センサーを試作した。この大面積センサーの総面積が大きくなり、センサーセルの数が増えると、有機トランジスタの性能を大幅に向上する必要がある。そこで、本研究では、センサー用途に特化して、筆者らがこれまでに研究を進めてきたナノ印刷や張り合わせといった独自の低コスト製造手法を用いて、有機トランジスタの素子寸法をナノ寸法にまで微細化することを目標とする。本年度は、「有機半導体分子を用いたトランジスタをナノ寸法にまで微細化して、大面積センサーに応用する」ため、張り合わせ法によって有機トランジスタを製造する方法に取り組んだ。有機トランジスタの性能の向上には、デバイス寸法の微細化が重要である。これまでの研究によって、縦方向(厚み方向)の素子寸法については、200nmまで微細化することが出来るようになった。本年度は、横方向(チャネル)の微細を進める。まず、ソース・ドレイン電極として、蒸着によって形成された金、インクジェットによって形成された銀、スパッタによって形成された銅をもちい、電極のギャップを2.5ミクロンまで微細化した。その結果、移動度が0.3平方センチメートル/ボルト秒という良好なトランジスタを形成することに成功した。昨年度までに、「有機半導体分子を用いたトランジスタをナノ寸法にまで微細化して、大面積センサーに応用する」ため、張り合わせ法によって有機トランジスタを製造する方法に取り組んだ。昨年度までに取り組まれた研究では、電極は真空プロセスによって作製されているが、今後これらのプロセスの低コスト化には印刷プロセスが重要な役割を果たすことは言うまでもない。そこで、今年度は、有機トランジスタの電極層、絶縁膜層にはそれぞれ銀ナノ粒子、低温硬化型ポリイミド前駆体でパターニングを施すための要素技術の確立を目指した研究を推進した。まず、焼成温度に対する銀ナノ粒子の抵抗率を測定した。銀ナノ粒子をインクジェットによりフィルム基板上に塗布し、異なる焼成温度で1時間大気中にて焼成し、電極とした場合の体積抵抗率の測定を行った。測定は4端子法を用いて行ったところ、焼成温度180度で作製した銀電極は体積抵抗率が約5.1マイクロオームセンチメートルという値を示した。
CGHとin situ cytogeneticsによる未分化型胃癌の染色体解析

本研究では、手術摘出されたヒト未分化型胃癌でploidy解析を行い、DNA-diploidの腫瘍細胞にcomparative genomic hybridization(CGH)を適用し、未分化型胃癌の早期に起こるゲノムDNAの変化を明らかにしようとした。腫瘍細胞の十分なenrichmentが未分化型胃癌では困難であったことから、細胞単離の容易な食道癌を用いて、CGHによる染色体の初期変化の解析の方法論の確立するための検討を行った。まず、腫瘍病巣より採取しploidyを決定した多数箇所のサンプルから、DOP-PCRによる微量検体からの全ゲノム増幅、DOP-PCRによるプローブの蛍光標識条件のoptimization、DOP-PCRで作成した標識プローブによるCGHを行い、良好なCGHの結果を得ることができた。特にプローブの標識条件を割り出すのにかなりの試行錯誤を要した。次に、CGHのG/R比のshift distanceとploidy modeから、変化した染色体部分の絶対的コピー数を求め、そのデータをもとに、複数のゲノムの変化の時間的前後関係を推定するtemporal analysisの方法論を、培養細胞を用いて確立した(Okada et al., 2000)。その方法をin vivoの原発腫瘍の多数箇所のサンプルに応用し、個々の腫瘍に固有の染色体変化のsequenceを明らかにすることができた。具体的には、ゲノムの倍化より早い変化と倍化後の変化を識別することができた。この結果は現在投稿中である。(1)ploidy解析切片中のmetaphaseを測光する方法に、より精度を高める改良を加えた。改良の為の試行錯誤を行ったため、腫瘍のploidyマッピングは現在も進行中である。(2)腫瘍DNAのenrichmentとCGHの条件設定:間質成分の多い癌では、5μmの腫瘍組織切片からLaser microdissection(Olympus LM200)で抜き取った約500個の腫瘍細胞核からDNAを抽出した後、DOP-PCRで全ゲノムを増幅し、CGHを行った。そのさい、腫瘍および正常組織から抽出したDNAをともにPCRの過程で蛍光標識nucleotideにより直接標識するために、種々の蛍光色素を用いて試行錯誤を行い、FITCとTRITCの組み合わせで良好なCGHの結果を得ることができた。(3)Interphase karyotyping:ploidy解析、CGH、FISHを組み合わせてinterphaseの核から染色体のkaryotypingのための基礎的検討を行った。胃癌細胞株では、CGHのG/R比のbaselineからのシフトとploidy解析から、実際のコピー数を推定し、painting FISHで直接カウントしたコピー数と突き合わせたところ、よく一致した。このデータからDNAの倍加前の比較的初期の変化と倍加後の変化とを区別できることを明らかにした。そこで、食道癌の手術材料を用いて、同様にploidyとG/R比からの染色体数の推定を行った。そのさい一つの腫瘍から複数箇所のサンプリングを行い、その複数箇所のすべてにみられた染色体変化は、常にG/R比の変化が大きく、倍加前から存在していたことが推定されたものであった。このことからも、G/R比のshift distanceからコピー数を読むことができることが裏付けられた。現在、胃癌の手術材料でも検討中である。しかし、間質成分の多い未分化型胃癌では、Laser capture microdissectionによっても、間質細胞や炎症細胞の除去と腫瘍細胞の十分なenrichmentは困難を極めた。単離細胞のsuspensionを薄くスメアに引いてから腫瘍細胞をcaptureすることも試みたが、スメアではフィルムへの接着が悪く、更なる工夫が必要であることが分かった。そこで、研究期間中に、CGHによる染色体の初期変化の解析の方法論を確立するために、細胞単離の容易な食道癌を用いて基礎的な検討を行った。

具体的には、腫瘍病巣より採取しploidyを決定した多数箇所のサンプルから、DOP-PCRによる微量検体からの全ゲノム増幅、DOP-PCRによるプローブの蛍光標識条件のoptimization、DOP-PCRで作成した標識プローブによるCGHを行い、良好なCGHの結果を得ることができた。特にプローブの標識条件を割り出すのにかなりの試行錯誤を要した。CGHのG/R比のshift dis-tanceとploidy modeから,変化した染色体部分の絶対的コピー数を求め、そのデータをもとに、複数のゲノムの変化の時間的前後関係を推定するtemporal analysisの方法論は、培養細胞を用いて確立した(Okada et al.,2000)が、本研究によって、それをin vivoの原発腫瘍の多数箇所のサンプルに応用し、個々の腫瘍に固有の染色体変化のsequenceを明らかにすることができた。この結果は現在投稿中である。
光二量化型ポリクラウンエーテルの合成とその応用

アルカリ金属カチオンに対して,すぐれた捕捉能や選択性を有する高分子材料を得ることを目的として標記ポリマーを合成し,そのカチオン捕捉能を検討するとともに,イオンクロマトグラフィー用充填剤への応用を検討した.1.クラウンエーテル部とケイ皮酸エステル部を同一分子中に有するアクリル型モノマーを合成し,ラジカル重合により光二量化型ポリクラウンエーテルを合成した.これらポリマーを適当なテンプレートカチオン共存下で紫外光照射し,ケイ皮酸エステル部を二量化することにより隣接クラウンエーテルの相対配置を固定すると,アルカリカチオン,特にサイズの大きいカチオンに対する捕捉能は著しく増大することを見い出した.2.同一ポリマー鎖中に環サイズの異なる2種類のクラウンエーテルを有する光二量化型ポリマーを合成し,そのアルカリカチオン捕捉能を検討した.環サイズの異なるクラウンエーテルを含むポリマーのカチオン捕捉における選択性は,単一の環サイズのクラウンエーテルを有するポリマーを, 2種類ブレンドしたものとは異なるものが存在することを明らかにした.3.非環状オキシエチレン(グライム)鎖を有する光二量化型ポリマーを合成し,そのカチオン捕捉能を検討した.本ポリマーのアルカリ金属カチオン捕捉能および選択性は,オキシエチレン鎖長に大きく依存した.クラウンエーテル部を有する同タイプのポリマーと比較すると,そのカチオン捕捉能は劣るものの,テンプレートカチオン共存下で光二量化反応を行うことにより,そのカチオン捕捉能を増大させることができた.4.18-クラウンー6部を有する光二量化型ポリマーを充填剤とする,イオンクロマトグラフィーでは,アルカリ金属カチオンのみならずハロゲンイオンや硫酸イオン,硝酸イオンあるいはチオシアン酸イオンなどのアニオンをも分離することができた.アルカリ金属カチオンに対して,すぐれた捕捉能や選択性を有する高分子材料を得ることを目的として標記ポリマーを合成し,そのカチオン捕捉能を検討するとともに,イオンクロマトグラフィー用充填剤への応用を検討した.1.クラウンエーテル部とケイ皮酸エステル部を同一分子中に有するアクリル型モノマーを合成し,ラジカル重合により光二量化型ポリクラウンエーテルを合成した.これらポリマーを適当なテンプレートカチオン共存下で紫外光照射し,ケイ皮酸エステル部を二量化することにより隣接クラウンエーテルの相対配置を固定すると,アルカリカチオン,特にサイズの大きいカチオンに対する捕捉能は著しく増大することを見い出した.2.同一ポリマー鎖中に環サイズの異なる2種類のクラウンエーテルを有する光二量化型ポリマーを合成し,そのアルカリカチオン捕捉能を検討した.環サイズの異なるクラウンエーテルを含むポリマーのカチオン捕捉における選択性は,単一の環サイズのクラウンエーテルを有するポリマーを, 2種類ブレンドしたものとは異なるものが存在することを明らかにした.3.非環状オキシエチレン(グライム)鎖を有する光二量化型ポリマーを合成し,そのカチオン捕捉能を検討した.本ポリマーのアルカリ金属カチオン捕捉能および選択性は,オキシエチレン鎖長に大きく依存した.クラウンエーテル部を有する同タイプのポリマーと比較すると,そのカチオン捕捉能は劣るものの,テンプレートカチオン共存下で光二量化反応を行うことにより,そのカチオン捕捉能を増大させることができた.4.18-クラウンー6部を有する光二量化型ポリマーを充填剤とする,イオンクロマトグラフィーでは,アルカリ金属カチオンのみならずハロゲンイオンや硫酸イオン,硝酸イオンあるいはチオシアン酸イオンなどのアニオンをも分離することができた.1.カチオン結合サイトとしてのクラウンエーテル部と、光二量化基としてのケイ皮酸エステル部とを有する、ビニルエーテル型モノマーを合成し、このもののカチオン重合あるいは、クラウンエーテルの環サイズが異なる2種類のモノマーのカチオン共重合により、目的の光二量化型ポリクラウンエーテルを得た。クラウンエーテルの環サイズは、12、15および18員環のものを合成した。本ポリマー中のケイ皮酸エステル部分の光二量化反応の量子収率におよぼすアルカリ金属塩の効果、およびTHF中でのポリマー存在下でのアルカリ金属ピクラートの八maXの測定から、環サイズの異なる2種類のクラウンエーテルを有するポリマーのカチオン捕捉形態は、単一の環サイズのクラウンエーテルを有するポリマーのそれとは異なることが分った。また、アルカリ金属ピクラートの液一液抽出法を用いて評価したカチオン捕捉については、同一ポリマー鎖中に環サイズの異なる2種類のクラウンエーテルを有するものでは、単一の環サイズのクラウンエーテルを有するポリマーを2種類ブレンドしたものとは、異なるカチオン捕捉能および選択性を示した。また、適当なアルカリカチオン共存下で光二量化反応を行うことにより、これらポリマーのカチオン捕捉能を著しく増大させることができた。2.カチオン結合サイトとしての種々の鎖長の非環状オキシエチレン鎖(グライム鎖)と、ケイ皮酸エステル部を有するMMA型モノマーを合成し、このもののラジカル重合により、光二量化型ポリベンゾジグライムを得た。これらポリマーのカチオン捕捉能および選択性は、グライム鎖長に大きく依存した。クラウンエーテルを有する同タイプのポリマーと比較すると、そのカチオン捕捉能は劣るものの、鋳型カチオン共存下で光二量化反応を行うことによりカチオン捕捉能を増大させることができた。
腱損傷の早期修復を目指して トランスレーショナルリサーチ

これまでの研究の成果と現在の方向性。1 bFGFの徐放化モノナイロン糸(ゼラチンコートしてグルタールアルデヒド架橋した)を作成し、腱縫合へ用いた(DDSを高めるための工夫)。2 FGF溶液(400μg/ml)では、腱表面の細胞成分の高いepitenonを中心に細胞増殖と、腱縫合部への遊走の促進がおこり、内因性bFGF発現も少なくとも縫合3週では増加している、6週でのタンパク量は増加しておらず、詳細は現在さらに検討している。縫合3週で腱の破断張力は有意に増加した。これらはFGF溶液高濃度(2000μg/ml)で作用がキャンセルされる(濃度が高すぎると作用しない?または異なる効果?)。3今後の方向性:FGF溶液(400μg/ml)糸で腱を縫合すると、腱表面の細胞成分の高いepitenonを中心に細胞増殖がおこることと、皮質骨と腱断端が強固に接合される点から、現在はinter-lacingsutureと腱移植、骨-腱接合部の4層構造の再現に応用し、良好な結果を得ています。これらの成果は腱の修復についてはJHS Amに報告し、骨-腱接合部の4層構造の再現については、現在再投稿準備中ですこれまでの研究の成果と現在の方向性。これらの成果は腱の修復についてはJHS Amに報告し、骨-腱接合部の4層構造の再現については、現在再投稿準備中です
セキュリティを考慮したIPv6ユビキタス環境の構築手法に関する研究

1.IPv6対応情報コンセントシステムの実装と評価無線LANインタフェースを有する小型PC上に情報コンセントシステムのプロトタイプの実装を行っている。現時点では認証機能は省略しているが、移動検知が認証のトリガーとなるため、追加の実装は容易である。IPv6の特徴であるIPsecやEnd-to-Endのシームレスな通信を阻害する恐れがあることから、当初ブリッジ動作による実装の検討を行ったが、情報コンセントシステム上でのアドレス管理やMAT(Mobile IP with Address Translation)との親和性を再検討した結果、ルータ動作による実装が適しているとの結論に至っている。2.ユビキタス環境の構築手法の検討組織内ネットワークなどの単一の管理ポリシーに基づいて管理されているネットワークにおいて、端末に改変を加えることなく、移動透過な通信を行うことができる情報コンセントシステムの検討、および実験環境の構築を行った。現在は、情報コンセントシステムのプロトタイプシステムの実装を行っており、研究室レベルでの動作を確認している。具体的には、移動透過性実現のためのアドレス変換を行う複数の情報コンセントシステムが互いに協調してアドレス変換テーブルを共有し、それぞれの配下の端末に単一のアドレス空間をサービスする。これにより端末が移動して、接続する情報コンセントシステムが変更されても、端末自身のアドレスは変化しないため、通信を継続することができる。3.移動透過性実現の可能性の検討本研究が対象とする組織内ネットワークでの利用において必要とされる、移動透過に関する機能や利用条件、適用規模などについての検討を行った。組織内ネットワークの規模であれば、ひとつの大きなL2ベースの情報コンセントネットワークで移動透過性を実現できる可能性がある。しかし、未使用アドレス空間に対するARPリクエストはブロードキャストストームを引き起こす可能性があることなどから、本研究で実現を検討しているL3ベースでの移動透過性の必要性を確認した。1.IPv6対応情報コンセントシステムの開発情報コンセントシステムをIPv6に対応させる際、従来の情報コンセントが行っているパケットフィルタとNATを併用する方法では、IPv6の特徴であるIPsecやEnd-to-Endのシームレスな通信を阻害する恐れがあるため、ブリッジ動作をする方式の検討を行った。ただしMACアドレスによるホスト識別だけでは(MACアドレスの詐称などに対して)不十分であるため、引き続き検討が必要である。2.ユビキタス環境の構築手法の検討組織内ネットワークなどの単一の管理ポリシーに基づいて管理されているネットワークにおいて、端末に改変を加えることなく、移動透過な通信を行うことができる情報コンセントシステムの検討を行った。現在は、プロトタイプシステムの実装を行っている。具体的な機能としては、ルータおよび移動透過性実現のためのアドレス変換(MAT)動作を行う複数の情報コンセントシステムが互いに協調することでアドレス変換テーブルを共有し、それぞれの配下の端末には同一のアドレス空間をサービスする。それによって配下の端末が移動して、接続する情報コンセントシステムが変更されても、端末自身のアドレスは変化しないため、通信を継続することができる。3.移動透過性の必要性の検討本研究が対象とする、組織内ネットワークでの利用において必要とされる移動透過に関する機能の充実度(切り替え速度など)や利用条件、適用規模などについての検討を行っている。L2ベースで構築されている組織内ネットワークを対象とする場合、必ずしもL3ベースでの移動透過性を実現する必要はないとも考えられるが、広域なL2ネットワークに多数の端末が存在する場合の挙動についてはさらに検討を行う必要がある。平成17年度の研究成果からブリッジ動作による実装の検討を行ったが、情報コンセントシステム上でのアドレス管理やMAT(Mobile IP with Address Translation)との親和性を再検討した結果、ルータ動作による実装が適しているとの結論に至っている。

2.ユビキタス環境の構築広島大学の公式無線LAN情報コンセントネットワーク上に、互いに一部がオーバーラップしているIPv6ネットワークを構築した。それぞれのネットワークに本研究で開発している移動透過性実現のためのアドレス変換機能を付加した情報コンセントシステムを設置するが、開発の遅れから現時点では移動透過性の検証までには至っていない。ただし研究室レベルでは、既存端末からみてゲートウェイとなる情報コンセントシステムのローカル側インタフェースは、すべて同一のMACアドレスとIPアドレスを使用する方式のため、移動に際して既存端末の設定変更を行う必要がない。3.移動透過性実現の可能性の検討本研究では組織内ネットワークを研究対象とし、L3べ一スでの移動透過性の実現を検討している。組織内ネットワークの規模であれば、ひとつの大きなL2ベースの情報コンセントネットワークで移動透過性を実現できる可能性がある。しかし、未使用アドレス空間に対するARPリクエストはブロードキャストストームを引き起こす可能性があることなどから、本研究で実現を検討しているL3ベースでの移動透過性の必要性を確認した。
脳保護戦略におけるレミフェンタニルの効果およびそのメカニズム

1年分の診療報酬データベースから、全身麻酔下脳動脈瘤クリッピング手術でレミフェンタニル+フェンタニル使用症例2,693例とフェンタニルのみ使用した症例1,809例を抽出したところ、レミフェンタニル使用群が有意に在院死亡が低く(odds比0.52, p<0.001)、予後を改善している可能性が考えられた。ラットの開頭侵襲モデルの検討から、レミフェンタニルは、手術侵襲に伴う白血球の動員に抑制的に働いていることが示唆された。白血球の活性に強い影響力を持つサイトカインGM-CSFの活性測定方法として、GM-CSF自己抗体の定量ELISA、臨床サンプルのGM-CSF生物活性測定法を標準化した。本邦の大規模データベースを用いた後ろ向き解析で、レミフェンタニル使用群(レ群)とフェンタニル単独使用群(フ群)とで、開頭脳腫瘍摘出術後の早期予後を比較したところ、レ群がフ群と比較して、術後の在院死亡率が有意に低く(1.5vs3.0%,オッズ比0.47(95%信頼区間0.25-0.91;P=0.025))、また在院日数も有意に少ない(17vs19日、ハザード比1.19(95%信頼区間1.08.1.30,P<0.001))との結果が得られ、英文学術雑誌に投稿、採用された(J Anesth.26, 711-20, 2012)。さらに、脳動脈瘤クリッピング術を受けた患者でも、レ群が在院死亡が有意に低いことが示され、レミフェンタニル使用と、良好な予後とが関連する可能性が示唆された。本結果も、現在英文誌に投稿中である。ラットを用いた脳虚血モデル作成は、Splague-Dawleyラットを用いて、以下の3モデル;(1)椎骨動脈結紮後頸動脈を一時クランプする全脳虚血モデル、(2)開頭中大脳動脈クランプモデル、(3)中大脳動脈焼灼モデルを検討した。梗塞範囲を決定しやすい点、手技的に安定して再現性が期待される点、臨床開頭手術により近い点から、(3)を第一候補とし、安定したモデル作成の準備を継続している。侵襲時の炎症指標のパラメータとして、末梢血液中の好中球表面上にある接着因子であるCD11bの発現量およびその刺激に対する変化率をフローサイトメトリーで観察する方法は、我々が独自に開発したもの(American thoracic society annual meeting 2012)であるが、マウス、ヒト全血による検討で安定した結果が得られてきている。細胞内シグナルの検討に用いる細胞株は未だ適切なものを同定出来ていない。BV-2の他に、CRL-10742、あるいはNeuro-2aを今後検討に加える予定である。本邦の大規模データベースを用いた後ろ向き解析で、レミフェンタニル使用群(レ群)とフェンタニル単独使用群(フ群)とで、Propensity score matched解析を用いて両群の背景因子を均一化して行った結果、開頭脳動脈瘤クリッピング術後の早期予後を比較したところ、レ群がフ群と比較して、術後の在院死亡率が有意に低く(4.2 vs 7.7 %, P<0.001)、レミフェンタニル使用が、オッズ比0.52(95% confidence interval 0.37-0.74, p<0.001)で術後死亡率を下げる独立因子であることが判明した。またこの傾向は、術前の意識レベルが低下している患者集団でも同様に認められ、レミフェンタニルが、術前から虚血性ダメージを受けている脳に対しても良好に作用する可能性が示唆された。本研究結果は、英文学術雑誌に投稿、採用された(J Neurosurg Anesth. 2014, Feb 5, Epub ahead of print)。ラットを用いた脳虚血モデル作成は、Splague-Dawleyラットを用いて、当初計画した3モデルのうち、3の中大脳動脈焼灼モデルを採用、検討したが、中大脳動脈支配領域の個体差によるばらつきが顕著で、開頭、硬膜切開まで行う、開頭ストレスモデルで、炎症性メディエータの検討をする方向へ変換した。侵襲時の炎症指標のパラメータとして、末梢血液中の好中球表面上にある接着因子であるCD11bの発現量をフローサイトメトリーで観察しているが、レミフェンタニル使用群では、術直後より迅速にCD11b値が上昇し、早期に低下する傾向を見せており、より早く炎症が収束する可能性を示唆している。引き続き安定的な結果を得るべく条件検討を進めている。低酸素環境を安定的に作る準備を進めつつ、引き続き検討を進める。好中球の機能検査として、サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する好中球の反応性を全血で検討する方法を開発したものを、標準化した内容を英文誌に投稿、採択、掲載された。またこの方法を用いたGM-CSF製剤の機能評価を他の動物種で行った結果も論文化され、英文誌に採択、掲載された。前年度より継続してラットを用いた開頭手術モデルによる炎症反応の推移を確認した。昨年度モデルの改良を試み、中大脳動脈焼灼による脳梗塞作成モデルから、開頭、硬膜切開までを行う開頭ストレスモデルを作成した。その結果安定した結果が得られるようになった。コントロール群10匹、レミフェンタニル群9匹で比較した。

術前の血液検査で、白血球数が10000/ul以上の、何らかの炎症が疑われる症例を除外し、コントロール群8匹、レミフェンタニル群8匹で解析を行った。麻酔終了後、覚醒抜管に要する時間に群間で差は見られなかった。全個体生存し、全個体について神経学的問題も認められなかった。末梢血白血球数:コントロール群では、開頭手術開始30分後の白血球数が、5/8で上昇した一方、レミフェンタニル群では、6/7で低下した(Chi-square test, p<0.049)。また、術後1-2日では、コントロール群の白血球数(中央値、IQR)が、12650,9575-14675に対してレミフェンタニル群が10950, 9250-1180と低い傾向を認めた。術後6日以降では群間の差を認めなかった。術直後、あるいは1ー2日後の早期の炎症反応変化をレミフェンタニル使用により抑えている可能性が示唆された。パイロット研究では、好中球の細胞表面に発現している接着因子CD11bの発現量がレミフェンタニル群で早期に低下する結果が認められていたが、今回の結果では群間に有意な差は見いだせなかった。ラットの再現性のある開頭手術侵襲モデルとして、当初予定していた中大脳動脈焼灼術から、全身麻酔下、人工呼吸下での開頭、硬膜開放手術モデルを採用した。本方法ではラットの生存が得られ、術後継続した観察、採血が可能となる。術中は体温を37±0.5°C、平均血圧を80-100mmHgかつ動脈血液ガスでPaCO2を36-44mmHg以内に維持するよう麻酔管理を行った。イソフルラン+生食群(NS群;n=8)とイソフルラン+レミフェンタニル群(Remi群:レミフェンタニル60μg/kg/hr持続投与;n=7)で比較したところ、術中の使用イソフルラン濃度は、NS群3.1±0.2に対して有意に低かった(2.3±0.3, p<0.0001)。また開頭手術前後で末梢血白血球数は、NS群で5/8が上昇したのに対し、Remi群は6/7で減少した(p<0.05)。しかし一方で血清中のTNFαやIFNγはRemi群で高い傾向が認められた。その後の経過では有意な差を認めず、ラットの生命予後はいずれも良好であった。侵襲初期の白血球動員に際してはレミフェンタニルが抑制的に働いている可能性が示唆された。TNFαは、一般的に創傷治癒促進作用が知られており、本モデルのような生命危機の少ない、いわゆる手術的清潔外傷モデルでは、良好な予後に寄与している可能性もあり、解釈は難しい。高度侵襲に暴露されている時に、白血球機能が抑制される可能性が示唆される報告があり、手術侵襲時に起こることを想定される免役抑制反応を、レミフェンタニルが防止している可能性があり、白血球の活性化度や、刺激に対する反応性などを引き続き調査する必要があると考えられた。1年分の診療報酬データベースから、全身麻酔下脳動脈瘤クリッピング手術でレミフェンタニル+フェンタニル使用症例2,693例とフェンタニルのみ使用した症例1,809例を抽出したところ、レミフェンタニル使用群が有意に在院死亡が低く(odds比0.52, p<0.001)、予後を改善している可能性が考えられた。ラットの開頭侵襲モデルの検討から、レミフェンタニルは、手術侵襲に伴う白血球の動員に抑制的に働いていることが示唆された。白血球の活性に強い影響力を持つサイトカインGM-CSFの活性測定方法として、GM-CSF自己抗体の定量ELISA、臨床サンプルのGM-CSF生物活性測定法を標準化した。動物モデルの確立に時間を要している。
多層カーボンナノチューブの合成制御と低温低次元電気伝導

本研究は、多層カーボンナノチューブ(MWNT)における本質的な伝導様式の差異を詳細に調べ、その原因の解明と「朝永・ラッティンジャー液体(TLL)モデル」の適用の可否について検討を行うことを目的としている。本研究の最終的な結論としては、通電加工法を用いることにより、精密ではないが、多層CNTの層数制御が可能であることがわかった。そこで、これまで行ってきた、加工雰囲気・破壊の進行・電気伝導特性変化がどのように相関するのかを再検討した。常温・大気中では破壊がランダムに進行し、最外層から同心円状に破壊が進行するモデルが成り立ち難いということが明らかになった。さらに、高温領域での伝導度の温度変化に現れるベキ乗則と低温領域での微分コンダクタンスのバイアス依存性に現れるベキ乗則は、加工前は両方共にベキが0.4程度でほぼ一致しており、いわゆるTLL的な伝導が起こっているのに対し、通電加工後は伝導度の減少とともに両方のベキが増大し、値に差が出てくることがわかった。そしてさらに通電加工を進めると、バリアブルレンジホッピング(VRH)的な伝導へと変化することがわかった。これは大気中での通電により発熱した状態で酸素との反応による破壊が進行し、その際に生じた格子欠陥が電気伝導を支配していることを意味しており、層数の厳密な制御には適さない条件であると結論づけた。一方で雰囲気制御を確かめるため、高真空中(10^<-6>Torr程度)および液体窒素中にて通電破壊を行った場合は、層の破壊が一箇所で比較的秩序をもって進行し、最外層から同心円状に破壊が進行することがわかった。これは精密なMWNTの層数制御ができる事を意味しており、低層数MWNTを得るには有望な加工条件であることがわかった。しかしこの方法で通電加工を行った場合でも、加工を進めるとVRH的な伝導が観測され、厳密な意味では低層数部分だけでの伝導特性を分離して議論する必要があるという結論に至った。本研究では、直流アーク放電法を用いて合成した多層カーボンナノチューブ(以下MWCNT)の合成制御・精製およびその次の段階であるデバイス応用に向けた基礎電気伝導特性を中心に詳しく研究を行った。初年度は、多量の不純物が含まれているMWCNTの合成・精製制御を行うため、酸素雰囲気中で500°C・50hの条件で加熱精製し、以前よりも効率よく不純物を除去することに成功した。これらの精製制御の結果を確認するため、ESR測定を行い、不純物となるアモルファスカーボン等の除去の様子を詳細に調べた。その結果、MWCNTの伝導電子系のESRを追跡することにより、精製の過程を探ることができた。この結果は平成13年10月開催の国際会議(CNT10)にて発表を行った。また、上記のようにして得られたMWCNTに対し,フォトリソグラフィー技術を用いることで電極の接続を行い,低温電気伝導の観測を可能にした。電気伝導測定は低温4.2Kから室温300Kまで、本研究費で導入の低温プローバーにて行っている。その結果、MWCNTの温度依存はべき乗則の振舞いを示し、1次元伝導である朝永-ラッティンジャー理論と比較することができ、その低次元伝導について詳細に議論することができた。この結果についてもCNT10にて報告を行った。

また、このような3端子あるいは4端子における測定ではMWCNTの抵抗と電極との接触抵抗とを分離して解析を行うことができ、従来の2端子で行ってきた結果よりも精密にその電気特性を調べることができた。さらに、デバイス応用のためにFET構造によるゲート電圧特性についても研究を行い、今回のMWCNTの伝導キャリアーはp型であることがわかった。以上に加えて、多層の一部を電気的に破壊する試みについても実験を行い、破壊に関する基礎的な結果を得ることができた。これらの成果は、2002年春の物理学会等で発表の予定である。本研究は,単層および多層カーボンナノチューブ(CNT)における本質的な伝導様式の差異を詳細に調べ,その原因の解明と「朝永・ラッティンジャー(TL)液体モデル」の適用の可否について検討を行うことを目的としている.そのため,本年度は,以下の実験を中心に研究を行った.1.加熱精製おけるCNTの物性変化アーク放電法で作製したCNTは,陰極堆積物中にアモルファスカーボン等の不純物とともに得られるため,酸素中での加熱精製が必要となる.本研究では昨年度より引き続き,ESR測定による加熱精製時間経過における不純物の除去の様子と,CNTにおけるg値やスピン帯磁率の変化を,室温から100Kまでの精密測定により詳細に調べた.これらの成果は,国際会議{LT23(広島)とNanoMES2003(アリゾナ)}にて報告した.2.CNTと金属電極との接触抵抗の低減CNTにおける本質的な伝導特性の評価を行うためには,CNTと金属電極との良好な接触特性が必要となる.特に,CNTの電気伝導特性にみられる「TL的」振る舞いは,CNTと電極との接触部分で起こっているとの報告もあり接触抵抗の低減は不可欠となる.そこで電極材料としてチタンを用い,CNTとの接触を確保した後に,本研究費で導入した卓上ランプ加熱装置にて,Ar・H_2混合ガス雰囲気中で700°C・1分間の高速熱アニールを行い,接触部分をカーバイト化させることにより,2端子測定の電気抵抗値を1桁以上低減することに成功した.3.通電破壊によるCNTの層数制御と伝導特性の変化高バイアス電圧印加での通電によってCNTの外層を破壊していく方法に着目し,それによる層数制御ならびに伝導特性変化を試みた.バイアス電圧を上げていくと,3V程度から電流値の階段状の減少が観測され,各段での1-V特性ならびに抵抗値の温度変化を調べた.TL液体モデルで説明される温度とバイアス変化による抵抗値変化のベキ乗は,破壊前には等しいのに対し,破壊が進むに従い互いにずれてきて,さらに破壊を進めると,温度変化によるベキ乗則がホッピング伝導的へと変化することが明らかとなった.これらの成果は日本物理学会と応用物理学会にて報告した.本研究は、単層および多層カーボンナノチューブ(MWNT)における本質的な伝導様式の差異を詳細に調べ、その原因の解明と「朝永・ラッティンジャー(TL)液体モデル」の適用の可否について検討を行うことを目的としている。本年度は本研究の最終年度であるので、多層CNTの層数制御に対する総仕上げの意味で研究を行った。これまで行ってきた通電加工法について、加工雰囲気・破壊の進行・電気伝導特性変化がどのように相関するのかを再検討した。常温・大気中では破壊がランダムに進行し、最外層から同心円状に破壊が進行するモデルが成り立ち難いということが明らかになった。さらに、高温領域での伝導度の温度変化に現れるベキ乗
ダイオキシンの毒性発現に関与する遺伝子の検索

平成12年度においては、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化におけるTCDDの阻害作用機序を明らかにする目的でTCDDによる3T3-L1細胞の分化抑制作用に関連した細胞内情報伝達ならびに遺伝子発現の変化を検討した。3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化誘導は常法に従い行った。Rbタンパク質ならびに関連タンパク質の検出はウエスタンブロッティング法により行った。TCDD処理による遺伝子発現の変化はPCR-サブトラクション法(Clontech)を用いて行い、得られたクローンの発現量の再確認はリバースノーザン法を用いて行った。MAPKならびにJNK活性の測定は免疫沈降後行った。コントロール細胞において分化誘導剤添加48時間後に細胞増殖(clonal expansion)が観られたが、この際10nM TCDDを添加することにより細胞増殖は観察されず、その後の分化も抑制された。そこで分化誘導剤添加24時間後にTCDDを暴露し48時間後にRNAを抽出してサブトラクション法により検討した。その結果TCDDによる分化抑制にともない発現量が変化し、かつTCDDが毒性を示さない条件下(分化誘導剤添加78時間以降におけるTCDDの暴露)では変化を示さないクローンを単離した。またTCDD処理により脂肪細胞分化にともなうRBタンパク質のリン酸化ならびにp107のdown-regulationが阻害された。さらにp42/p44MAP kinase活性を測定したところTCDD処理により活性の上昇が認められた。平成11年度においては、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化におけるTCDDの阻害作用機序を明らかにする目的で脂肪細胞分化におけるいくつかの制御因子に対するTCDDの影響およびAhレセプター(AhR)の関与を検討した。その結果TCDDは脂肪細胞分化のみならずその過程におけるclonal expansionをも阻害した。さらに一連のTCDDの作用におけるAhRの関与を検討する目的で、AhRを過剰に発現した細胞クローンおよびアンチセンスRNAを用いてAhR量を減少させた細胞クローンを作成した。これら細胞クローンの細胞増殖速度を測定したところ、AhR量に比例して増殖の遅れが観察され、先に示されたTCDDによるclonal expansionの阻害がAhRを介したものであることが示唆された。さらにこれら細胞クローンの脂肪細胞への分化能を検討したところ、AhR量に依存して分化の程度は減少した。すなわち、AhRを過剰に発現した細胞はコントロール細胞に比較して低い分化能を示し、AhR量を減少させた細胞クローンではコントロール細胞に比較して高い分化能を示した。また、AhR過剰発現細胞においては脂肪細胞分化に重要な役割を果たす転写因子であるC/EBPαおよびPPARγ2の発現の低下が認められ、その一方でAhR量を減少させた細胞においてはこれら因子の発現の増加が認められた。以上の結果よりTCDDの脂肪細胞分化阻害作用はAhRを介してのclonal expansionの阻害および脂肪細胞分化特異的な転写因子の発現の抑制によることが示唆された。
二重のリン酸化によるｂＺＩＰ型転写因子ＦＤの機能調節を介した花成制御

フロリゲンであるFTは葉から茎頂へと輸送された後、FDと複合体を形成することで花成を促進する。これまでにFDとFTの複合体形成はリン酸化依存的であること、カルシウム依存性のタンパク質キナーゼであるCDPKがFDをリン酸化して複合体形成を制御する有力な候補であることを示してきた。本年度は昨年度に取得した2つの候補CDPK、CPK6とCPK33についてさらなる解析を進めた。変異体の花成遅延表現型が軽微であることから花形成のマスター制御因子であるLEAFY (LFY)との遺伝学的相互作用を検討した。cpk33 lfy二重変異体を作成し、表現型を観察したところ、若干軽微ではあるものの、ft lfyあるいはfd lfy二重変異体と類似した表現型を示した。また表現型などの解析から、CPK6、CPK33以外のCDPKもFD T282のリン酸化に関与する可能性が考えられたため、リン酸化活性を喪失する変異を加えたCPK33(CPK33KD)を発現させることで、内生のFD T282をリン酸化するCDPKを優性的に阻害することを計画した。実際にCPK33KDがリン酸化活性を喪失していること、FDとの結合能を維持していることを確認した後、FDプロモーターの制御下でCPK33KDを発現する形質転換体を作成した。この形質転換体の花成時期を調べたところ、長日条件において顕著な花成遅延表現型を示すことが明らかとなった。本研究によって得られた結果はCPK33がFD T282をリン酸化することでフロリゲンFTとの複合体形成を制御していることを示唆している。これら得られた成果に関して学術論文として公表した。一部の内容は未発表であり、これに関しても学術論文として公表するべく投稿の準備を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は昨年度までに行った、局在観察スクリーニングにより得られた核と細胞質に局在するCDPKについて以下の解析を進めた。核に蛍光が見られたCDPKの組換えタンパク質を作成し、基質であるFDのリン酸化される残基T282を含むC末端ペプチドを基質としてin vitroリン酸化活性を行い、絞り込みを行った。その結果、3つのCDPKが効率よくFDT282をリン酸化することがわかった。これら3つに関して、FDとの直接的な結合を調べるために、pull down実験を行ったところ2つのCDPKが直接的にFDと結合した。そこでこれらCDPKのT-DNA挿入変異体を取得し、その表現系を観察した。変異体を長日条件において育成した場合には顕著な花成遅延表現系は見られなかった。FDとの結合が見られた2つのCDPKについて二重変異体を交配により作出し、その表現系を調べたが、やはり長日条件において、花成遅延表現系は見られなかった。そこで、3週間短日条件において育成し、その後4日間の長日条件で育成することで、花成誘導を行い、誘導処理の後、再度短日条件において育成することで、花成表現系を評価した。その結果、軽微ながら変異体では花成遅延表現系が認められた。また蛍光タンパク質をレポーターに用いた発現・局在観察から、茎頂において蛍光が観察でき、その蛍光は核に見られた。これらの結果から、今回同定に成功したCDPKがFDのリン酸化を担う中心的な因子であると考えられる。現在、これらの成果について公表するべく、論文の投稿準備中である。

本研究によって得られた結果はCPK33がFD T282をリン酸化することでフロリゲンFTとの複合体形成を制御していることを示唆している。これら得られた成果に関して学術論文として公表した。一部の内容は未発表であり、これに関しても学術論文として公表するべく投稿の準備を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。FDをリン酸化することでFTとの複合体形成を制御するCDPKについて同定を終えた。また遺伝学的解析も順調に進行しているため。一方で、質量分析計を用いたFDのリン酸化部位の同定はできなかった。これらの結果を総合的に判断して、順調に進行していると判断した。FDをリン酸化するタンパク質キナーゼの同定を終えたので、その活性化機構の理解を目標に研究を進める。具体的には、茎頂分裂組織におけるカルシウム動態を調べる。また、リン酸化に伴う機能制御機構を明らかにするために、引き続きリン酸化模倣型・脱リン酸化模倣型の変異型FDを発現する形質転換体とfdlfy二重変異体を用いた遺伝学的解析を進める。
グアニル酸シクラーゼの遺伝子構造とその活性調節機構の解析

多くの神経伝達物質が中枢神経系においてサイクリックGMPを顕著に増大させること、網膜での光受容の過程でサイクリックGMPが直接陽イオンチャンネルの開閉を制御していることなどから、神経系においてサイクリックGMPがセカンドメッセンジャーとして機能していると考えられる。しかし、その合成調節機構はよくわかっていない。我々はサイクリックGMPの合成調節機構の解明を目的として、その合成酵素であるグアニル酸シクラーゼのcDNAクローニングを行った。本酵素は82KDaと70KDaの2つの異なるサブユニット構造をとっている。精製標品から得られた部分アミノ酸配列をもとに合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして、ラット肺cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、グアニル酸シクラーゼの70KDaサブユニットに対するcDNAを得ることに成功した。このcDNAの塩基配列からアミノ酸配列を推定したところ、精製標品から得られていた部分アミノ酸配列けすべて含んでおり、また推定分子量も約70KDaであった。このcDNAを発現ベクターに組み込み培養細胞に発現させたところ、抗体と反応する蛋白が産生されていたにもかかわらずグアニル酸シクラーゼの酵素活性は検出できなかった。このことから、70KDaサブユニットは、酵素活性の調節サブユニットである可能性が考えられた。現在、もう一方のサブユニットである82KDaサブユニットについてもcDNAクローニングを試みており、両サブユニットのcDNAを用いての発現実験を行う予定である。サイクリックGMPの合成調節機構の解明を目的として,その反応を担っているグアニル酸シクラーゼの構造と機能を明らかにすべく,今年度は可溶性グアニル酸シクラーゼのcDNAクローニングを行った.可溶性グアニル酸シクラーゼは,分子量82kDaと70kDaの二つのサブユニットから成ることがすでに明らかにされている.そこでそれぞれのサブユニットの部分アミノ酸配列,および特異的単クローン抗体により,ラット肺のλgt10およびλgt11cDNAライブラリーをスクリーニングし, 82kDaサブユニットに対して8個, 70kDaサブユニットに対して4個の陽性グローンを得た.70kDaサブユニットに対するクローンのうちの1個は,塩基配列を決定したところ,すでに決められている部分アミノ酸配列を含んでおり,このクローン(7α-36)が70kDaサブユニットに対するcDNAであることが明らかになった.Northernブロットの結果, 70kDaサブユニットは,肺や大脳に多く存在し, mRNAは約3.3kbの大きさであることがわかった.得られているクローン(7α-36)は,約1.7kbであり,解析の結果C末端部分の一部を欠いていると考えられた.そこでライブラリーを再スクリーニングして, C末端部分を含むと思われる新たなクローンが16個得られた.現在その構造解析を行っている.一方82kDaサブユニットに対するクローンはクロスハイブリダイゼーションの結果, 3グループに分類されることがわかっており,現在その塩基配列中に,すでに決定されている部分アミノ酸配列が含まれているかどうか解析中である.今後サブユニットの全構造が明らかになった時点で,発現系に組み込むことによりそれぞれのサブユニットの機能と活性調節機構を明らかにしていく予定である.多くの神経伝達物質が中枢神経系においてサイクリックGMPを顕著に増大させること、網膜での光受容の過程でサイクリックGMPが直接陽イオンチャンネルの開閉を制御していることなどから、神経系においてサイクリックGMPがセカンドメッセンジャーとして機能していると考えられる。しかしその合成調節機構はよくわかっていない。精製標品から得られた部分アミノ酸配列をもとに合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてラット肺cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、グアニル酸シクラーゼの70KDaのサブユニットに対するcDNAを得ることに成功した。このcDNAの塩基配列からアミノ酸配列を推定したところ、精製標品から得られていた部分アミノ酸配列をすべて含んでおり、また推定分子量も約70KDaであった。このcDNAを発現ベクターに組み込み培養細胞に発現させたところ、抗体と反応する蛋白が産生されていたにもかかわらず、グアニル酸シクラーゼの酵素活性は検出できなかった。

このことから、70KDaサブユニットは、酵素活性の調節サブユニットである可能性が考えられた。現在、もう一方のサブユニットである82KDaサブユニットについてもcDNAクローニングを試みており、両サブユニットのcDNAを用いての発現実験を行う予定である。