hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＳＴＭを用いた固液界面での協同的組織化の解析に基づくアミロイド形成初期過程の解明

本年度はアミロイド形成メカニズムの解明に向けた基礎的知見を得るために、前年度に確立した、走査トンネル顕微鏡(STM)を用いた固液界面における協同性評価手法を用いて、(1)水素結合を持たない分子系、(2)ペプチド鎖を導入した分子系における配列形成挙動の評価を行った。第一の研究では、芳香環コア部の大きさや、水素結合の有無が二次元界面における自己組織化プロセスに与える影響について検討を行った。異なる数のフェニル基を芳香環コアとして導入したエステル誘導体のオクタン酸/HOPG界面での吸着プロセスを核生成-伸長モデルを用いて解析することで、伸長過程における吸着エネルギーが、コア構造中のフェニル基の数が増加するにつれて負に増加することを見出した。さらにエステル誘導体は水素結合を有しないにも関わらず高い協同性を示したことから、二次元自己組織化プロセスにおける高い協同性は必ずしも水素結合の有無に依存しないことが明らかとなった。第二の研究では、より生体分子に近い相互作用についての知見を得るために、ペプチド鎖を導入したフォトクロミック分子ジアリールエテン(DAE)を用いた検討を行った。オクタン酸/HOPG界面でのSTM観察の結果、オリゴペプチド鎖に加えて長鎖アルキル基を持つDAE誘導体について、ペプチド鎖が逆平行βシート状に水素結合を形成した配列が認められた。核生成-伸長モデルでの定量的な解析により、ペプチド鎖を導入したDAEは高い協同性を示すと共に、ペプチド鎖導入による配列安定化効果が非常に大きいことを見出した。興味深い結果として、形成した配列中でDAEコアは光異性化可能なコンフォメーションをとることが明らかになった。本研究のβシート形成を用いた安定な配列形成手法は、配列分子の吸脱着速度を抑制し、単一分子の光スイッチングを観察するためのアプローチとしても展開が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はアミロイド形成メカニズムの解明に向けた基礎的知見を得るために、走査トンネル顕微鏡(STM)を用いた固液界面における協同性評価手法が分子設計の微細な変化を検出できる高感度な手法であることの実証を行った。具体的には、水素結合の強さや向きを変えたモデル分子を設計・合成し、多方向の分子間相互作用が分子配列の形成濃度や配列形状・サイズに与える影響に関して検討を行った。芳香環コアと長鎖アルキルの間にアミド基もしくはウレア基を持つ棒状化合物2種類に対して、さらにヒドロキシ基を芳香環コア末端に導入した化合物2種類、アルキル鎖末端に導入した化合物2種類の計6種類のモデル化合物を合成した。化合物のオクタン酸/グラファイト界面での配列形成をSTMで観察した結果、アミド誘導体と比較して、ウレア誘導体は顕著に小さな配列ドメインを形成することが認められた。被覆率の濃度依存性を固液界面における核生成-伸長モデルを用いて評価したところ、ウレア誘導体はアミド誘導体に対して核生成平衡定数が非常に大きく、配列サイズには核生成プロセスが大きく影響していることが示唆された。またモデル解析によって得られた熱力学パラメータより、ヒドロキシ基1個当たりの配列安定化の寄与を定量化でき、本研究での固液界面における協同性評価手法の高感度性が示された。さらに、芳香環コア末端にヒドロキシ基を導入したウレア誘導体のみが、アスペクト比が約10の異方的なドメインを形成した。詳細な検討により、異方的ドメイン成長はウレア基とヒドロキシ基による多方向の水素結合ネットワーク形成に由来することが示唆された。以上、固液界面での配列形成において多方向の分子間相互作用を適切に設計することで、配列の形状やサイズを制御することができるという興味深い知見を得ることができ、アメリカ化学会のLangmuir誌に報告した。本研究者は、平成29年度、固液界面での協同的組織化に関してSTMを用いた解析を行うことで、分子構造の違いが配列形成挙動に与える影響について新たな知見を得ることに成功した。本研究は学術論文として発表を行い、現在は新たな実験系の検討を進めているため更なる研究の発展が期待される。特筆すべきは、国内・国際学会への積極的な成果発表を行い、第15回ホスト-ゲスト・超分子化学シンポジウム、第49回構造有機化学若手の会夏の学校、2017年光化学討論会、日本化学会第98春季年会において最優秀賞2件を含む5件の発表賞を獲得した点である。以上より、研究がおおむね順調に進展していると評価できる。

オクタン酸/HOPG界面でのSTM観察の結果、オリゴペプチド鎖に加えて長鎖アルキル基を持つDAE誘導体について、ペプチド鎖が逆平行βシート状に水素結合を形成した配列が認められた。核生成-伸長モデルでの定量的な解析により、ペプチド鎖を導入したDAEは高い協同性を示すと共に、ペプチド鎖導入による配列安定化効果が非常に大きいことを見出した。興味深い結果として、形成した配列中でDAEコアは光異性化可能なコンフォメーションをとることが明らかになった。本研究のβシート形成を用いた安定な配列形成手法は、配列分子の吸脱着速度を抑制し、単一分子の光スイッチングを観察するためのアプローチとしても展開が期待される。より生体分子に近い相互作用についての知見を得るために、オリゴペプチド鎖をフォトクロミック分子であるジアリールエテン(DAE)に導入し、その固液界面における自己組織化について検討を行っている。合成したDAEは固液界面での配列形成と、溶液中での会合挙動の両方を示す特徴的な系であることが認められ、今後その詳細や光異性化を用いた基板上での1分子識別について検討を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。京都大学工学研究科松田研究室ホームページ
石油代替バイオエタノールの有効利用に向けた水/エタノール高速分離技術の開発

ポリカチオンとしてポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド(PDDA)を用いて、交互積層法により単分散シリカ粒子(10μm:宇部日東化成)表面に、全フッ化スルホン酸高分子(Nafion)を積層した。積層に用いたNafionとポリカチオン溶液は、それぞれMeOH:H_20=9:1(v/v)および0.5MNaC1溶液を用いて10mg/mLの濃度に調製した。積層膜の重量測定には、水晶振動子微量天秤(QCM)を用いた。ゼータ電位測定より、単分散シリカ粒子表面にポリカチオン(プラスに帯電)およびNafion(マイナスに帯電)が交互に積層可能であることを確認した。QCMによる重量測定結果より、Nafionの積層量は1.1μg/cm^2と求められた。得られた重量および密度(1.63g/cm^2)より求めた1層当たりのNafion層の厚みは2.1nmと極めて薄いものが得られた。Nafionで修飾した粒子上に所定量の水滴を滴下したところ、静的接触角は160°以上となり、極めて高い機水性の得られることがわかった。得られた疎水化粒子をアクリル管内に充填して注水すると、水は全く浸透しない一方でエタノールは瞬時に浸透することがわかった。一方で、粒子表面をポリスチレンスルホン酸(マイナスに帯電)で被覆した場合には、親水性に変化することがわかり、本研究目的である水/エタノール高速分離に必要なシリカ粒子の親水・疎水化技術を確立した。
抗菌薬併用下における細菌類の特殊な薬剤耐性化

本課題は、臨床現場にて問題となっている多剤耐性菌の出現を抑制するための効果的な抗菌薬併用療法の確立を目指し、実験進化的手法(ストレス強度を段階的に上げながら植え継ぎ培養を行い、ストレス耐性生物に進化させる手法)を用いて、どのような抗菌薬の組み合わせにおいて耐性化が抑制されるのか、その逆に耐性化が促進されてしまうのか解析した。さらには、得られた薬剤耐性菌のゲノム変異解析を行うことでその分子機構の解明にも取り組んだ。大腸菌を対象にタンパク質合成阻害剤であるアミカシン(AMK)およびクロラムフェニコール(CP)、DNA複製阻害剤のエノキサシン(ENX)の併用条件に加え、それぞれを単独で添加した進化実験も実施した。ちなみに代表者らの先行研究により、AMK&CPは耐性獲得間のトレードオフ、つまりAMK耐性株はCPに対して非常に弱くなってしまい、逆にCP耐性株はAMKに対して非常に弱くなってしまう現象を示し、AMKとENXも同様のトレードオフを、CPとENXはそのような耐性間のトレードオフを示さない組み合わせである。この進化実験を約1ヶ月間実施したところ、耐性間のトレードオフの関係にあるAMK&CP、AMK&ENX併用下においては大腸菌の薬剤耐性化が抑制されていた。この結果は、耐性間のトレードオフの関係にある抗菌薬を併用することで細菌類の耐性化を抑制することが可能であることを示している。また、耐性間のトレードオフの関係にないCP&ENXの併用下では、それぞれの抗菌薬を単独にて添加した実験進化に比してその耐性能を上昇させる耐性化の促進が観察された。そこで耐性化が促進されてしまう機構の解明を行うためにゲノム変異解析を行ったところ、ENX添加によるSOS応答の誘導により耐性化が促進されていることが示唆された。これらの成果は、多様な病原菌に対する抗菌薬併用療法の効果を予測するにあたり、非常に有用な知見となりうる。27年度が最終年度であるため、記入しない。
両親媒性包接化合物サイクリックビスデスモシドの生物薬剤学的有用性の解析

植物から抽出したサイクリックビスデスモシド(T-1)は両親媒性で環状構造を有しており、シクロデキストリン(CD)と同様に、包接化合物としての利用が期待できる。本研究では、水虫の経口投与治療薬として用いられているイトラコナゾールを用い、イトラコナゾールの消化管吸収に及ぼす影響をT-1とハイドロキシプロピルーβ-CD (HP-β-CD)間で比較。T-1の溶解度改善は約9倍強いものの、吸収促進作用は劣ることが分かった。その理由として、T1は消化管内で代謝されることが認められたが、化学構造を変えることにより、安定性や脂溶性を変えることは可能であると期待される。サイクリックビスデスモシド(CB, tubeimoside I、II、III)とは、中国産ウリ科生薬土貝母から得られる大環状構造を有する配糖体である。環状構造を有する化合物として、グルコースからなるシクロデキストリン類(CD)が知られており、プロスタグランディンなど難水溶性薬物の溶解補助剤として臨床にも用いられている。CDは水のみに溶解し、CDと薬物の複合体も水溶性であることから、CD-薬物複合体自身の生体膜透過性は期待できない。一方、CBは水にもアルコールにも溶ける両新媒性の包接化合物であることから、CD-薬物複合体自体が生体膜透過性を有することが期待される。本研究は、CBの難水溶性薬物に対する溶解補助剤としての有用性を検討し、さらにCB-薬物複合体の生物薬剤学的あるいはDDS製剤としての有用性について評価するものである。薬物としては、難水溶性薬物でありかつ爪水虫の治療薬として知られているグリセオフルビン、およびイトラコナゾールを用いて経皮適用製剤としての有用性について検討する。現在、たとえば、0.5% tubeimoside Iはグリセオフルビン単独と比較して6.4倍、0.5% tubeimoside IIは9.1倍、0.5% tubeimoside IIIは5.8倍グリセオフルビンの溶解度を改善するという知見を得ている。また、ラット皮膚を用いたin vitro経皮吸収実験において、グリセオフルビン単独(コントロール)や、3%γ-CD+ 5% EtOHではグリセオフルビンの皮膚吸収は検出されないが、5% tubeimosides II+ 5% EtOHの処方により、グリセオフルビンの皮膚吸収が認められている。今後、tubeimosides IIを中心に、さらなる検討を行う予定である。1サイクリックビスデスモシド(T-1)による難水溶性化合物の溶解度改善に関し、経口爪水虫治療薬として用いられているイトラコナゾール(IC)をモデル化合物として用い検討した。ICと40%ヒドロキシプロピルーβーシクロデキストリン(HP-β-CD)の包接複合体の水溶液、即ちイトリゾール内服液1% (200 mgIC/40%HP-β-CD/20 mL)が臨床に用いられている。包接化合物10%濃度において比較したところ、T-1包接複合体はHP-β-CD包接複合体に比べ、8.6倍高い溶解度を示した。2IC/T-1包接複合体の溶液あるいは懸濁液を用い、ICの直腸吸収、消化管吸収、および静注投与後の組織分布に及ぼす影響についてラットを用い検討した。コントロールには、IC/HP-β-CD包接複合体を用いた。(直腸吸収(溶液)):ICのT-1包接複合体は、HP-β-CD包接複合体に比べ、投与後60分まで、高いIC血漿中濃度を示した。60分後以降は、両者間に差は認められなかった。(消化管吸収(溶液、懸濁液)):経口投与後4時間のIC血漿中濃度推移を測定したところ、T-1包接複合体の溶液および懸濁液は、HP-β-CD包接複合体に比べ、若干低い血漿中濃度を示した。(静注投与後の組織分布):静注投与4時間の血漿中濃度と、4時間後の肺、肝、腎、皮膚の組織内濃度を比較したところ、T-1包接複合体とHP-β-CD包接複合体間で、有意な差は認められなかった。以上、直腸投与ではIC/T-1包接複合体の方が、HP-β-CD包接複合体に比べ、投与初期において若干高い膜透過性を示した。消化管ではHP-β-CD包接複合体の方がT-1包接複合体に比べ高い膜透過性を示し、静注投与後の組織分布では、両包接複合体間に差は認められなかった。これらより、植物から抽出した両親媒性の包接化合物であるサイクリックビスデスモシド(T-1)は難水溶性薬物イトラコナゾールの溶解度を著しく上昇させ、医薬品に使用されている包接化合物HP-β-CDと比較して8.6倍高い値を示した。イトラコナゾール懸濁液にT-1を添加しラットに経口投与した場合、生理食塩水懸濁液投与に比べ有意に高い血中濃度を示したが、HP-β-CD添加に比べるとその効果は低かった。T-1を消化管loop内に投与した場合、60分後には50%以上が消失した。T-1の安定性について検討したところ、pH7.4緩衝液中では安定であるが、酸性条件下で分解し、消化管膜内において酵素的にも代謝されることが認められた。

さらに、Caco-2細胞を用いた検討により、サイクリックビスデスモシドは細胞毒性を示すこと、及び、毒性を示さない低濃度において、T-1自身がCaco-2細胞膜を透過すること、さらに水溶性化合物のCaco-2細胞間隙からの膜透過を有意に上昇させることが認められた。これらの検討により、両親媒性包接化合物であるサイクリックビスデスモシドT-1は、現在臨床で用いられている可溶化能の高いHP-β-CDに比べても、さらに優れた溶解促進作用を有すこと、しかし消化管内安定性が低く、HP-β-CDと比較してイトラコナゾールの消化管吸収の促進効果は低いことが認められた。但し、低濃度において、細胞間隙経路の薬物輸送を上昇させることから、直腸投与等においては、難吸収性水溶性薬物の直腸吸収を改善できるものと期待される。その他、難水溶性薬物との包接複合体を作成しなくても、包接化合物と薬物を同時に経口投与することにより、難水溶性薬物の消化管吸収が有意に改善されることが認められた。これらの知見は、消化管吸収の改善あるいは薬ー食相互作用という観点からも臨床上有用な知見と考えられる。植物から抽出したサイクリックビスデスモシド(T-1)は両親媒性で環状構造を有しており、シクロデキストリン(CD)と同様に、包接化合物としての利用が期待できる。本研究では、水虫の経口投与治療薬として用いられているイトラコナゾールを用い、イトラコナゾールの消化管吸収に及ぼす影響をT-1とハイドロキシプロピルーβ-CD (HP-β-CD)間で比較。T-1の溶解度改善は約9倍強いものの、吸収促進作用は劣ることが分かった。その理由として、T1は消化管内で代謝されることが認められたが、化学構造を変えることにより、安定性や脂溶性を変えることは可能であると期待される。進捗状況は「やや遅れている」状況である。サイクリックビスデスモシドとは、土貝母から単離された配糖体オレアナン系トリテルペンのビスデスモシドで、糖鎖がエステル結合したことによって架橋された大環状構造を有している。本研究では、単離された配糖体のうち主にtubeimoside I (T-1)を用い検討している。T-1は、水やアルコールにとける両親媒性の性質を有しており、従来から用いられている水溶性のみの包接化合物である種々シクロデキストリン誘導体とは明らかに異なった物理的作用や生物学的作用を示すものと期待される。本検討において、添加濃度10%で比較した場合、Tー1は、溶解促進作用の強いことが知られているヒドロキシプロピルーβーシクロデキストリン(HP-β-CD)に比べても、難水溶性化合物イトラコナゾールの溶解度を8.6倍促進した。この知見に基づき、T-1複合体の生物薬剤学的応用に関する検討を進めたが、直腸投与において初期吸収速度の若干の改善が認められたが、経口投与および静注投与後の組織分布においては、HP-β-CD包接誘導体とほぼ同等かあるいは若干低い結果となった。サイクリックビスデスモシドはその構造の中に、疎水性部分と親水性部分を併せ持つ化合物であり、包接作用に加え、界面活性剤としても作用することが予想される。イトラコナゾールはBiopharmaceutics Classfication System (BCS)のClass IIに分類される化合物であり、難水溶性ではあるが、溶解すれば、その脂溶性は高く膜透過性も良好であることが知られている。そのような薬物に対し、もしT-1の作用が包接複合体の生成ではなく、界面活性剤としての作用が主であるならば、ミセルの形成による見かけのサイズが大きくなり、脂溶性分子の膜透過性は抑制されることが予想される。経口投与の結果が、予期に反し、若干低下したのは、T-1によるミセル形成による可能性が考えられる。
希土類キラル金属磁性体の磁気構造の元素置換による制御

キラル磁性体RNi_3_X_9_(R:希土類元素、X=Al, Ga)の磁気相互作用の制御ついて研究を進めた。遷移金属元素NiをCoあるいはCuで置き換えることにより磁気相互作用が調節できることを希土類元素がDyおよびErの場合について検証し、これまでにわかっていたYbの場合と同様に可能であることを明らかとした。これらの成果については、日本物理学会をはじめ、いくつかの国際会議で発表を行った。特にDyNi_3_Ga9_に_ついては、Co置換により大きく磁気秩序を抑制することが可能であることがわかった。複雑な磁気相はNiをCoで数十%置換することで、ひとつを除いて消失する。これにより、一つだけのキラル磁気状態を発現できていないかどうかの検証を進めている。YbNi_3_Al9_ではCu置換により磁気相互作用を大きくすることができるが、DyNi_3_Ga9_では、Cu置換は難しいこともわかってきた。この物質の磁気秩序における高温相の性質を顕在化させることが本研究の動機のひとつであることから、今後、結晶育成条件や置換する元素を変えるなど突破口を模索する。また、置換する以前の状態について、YbNi_3_Al9_についてはFIB試料(マイクロメートルの大きさに加工した試料)を用いた輸送現象の特性を測定し、他のキラル磁性体との比較をおこなった。YbNi_3_Ga9_については圧力による磁気相互作用の制御を行い、高圧力下における磁気相図を構築した。DyNi_3_Ga9_については超音波測定を行い、詳細な磁気相図の構築と転移の次数、数多くの磁気相が存在する理由の解明を進めた。元素置換した試料の合成が進み、また、期待通りの磁気相互作用の変化が観測され、キラル磁性の元素置換による制御の研究は順調に進展している。また、置換前の電子状態の物性も進めることができた。当初計画では磁気相互作用を強調する効果についても研究を進める予定であったが、相互作用を強くする元素置換については十分な濃度をドープすることが難しいことがわかってきた。この点については計画どおりに進んでおらず、解決方法を模索する必要がある。キラル結晶構造をもつDyNi_3_Ga9_について、元素置換効果の研究を推進する。特にCo置換について詳細な測定を行う。またCu置換を有効に行うために、育成条件の追求や共置換効果などの検証を進める。1年目の研究により、この物質については約50%までのCo置換が可能であり、複数あった磁気相がひとつに変えることができることがわかった。また、磁気秩序温度は10Kから3.3Kまで抑制するに至った。これは本研究の目的である元素置換による磁気相互作用の調整に至った実例となる。今後、反対称磁気相互作用がどのように変化しているかを明らかとし、キラル磁気構造の制御へとつなげていく。そのために次年度は結晶育成条件を精査し、Co濃度の制御が適切におこなう。また磁気相図のCo濃度による変化を明らかとする。さらに、基底状態における反対称スピン軌道相互作用への置換効果を臨界磁場の測定を介して測定する。この観測結果を通して、希土類金属間化合物における対称および反対称磁気相互作用の制御に関する考察を行い、知見を得る。磁気相互作用を強くするCu置換についても研究を行いたいが、置換することが難しいことがわかった。結晶育成条件の見直しや共置換することで導入できないかなど、これまで検討していない条件について研究を行う。

当初計画では磁気相互作用を強調する効果についても研究を進める予定であったが、相互作用を強くする元素置換については十分な濃度をドープすることが難しいことがわかってきた。この点については計画どおりに進んでおらず、解決方法を模索する必要がある。キラル結晶構造をもつDyNi_3_Ga9_について、元素置換効果の研究を推進する。特にCo置換について詳細な測定を行う。またCu置換を有効に行うために、育成条件の追求や共置換効果などの検証を進める。1年目の研究により、この物質については約50%までのCo置換が可能であり、複数あった磁気相がひとつに変えることができることがわかった。また、磁気秩序温度は10Kから3.3Kまで抑制するに至った。これは本研究の目的である元素置換による磁気相互作用の調整に至った実例となる。今後、反対称磁気相互作用がどのように変化しているかを明らかとし、キラル磁気構造の制御へとつなげていく。そのために次年度は結晶育成条件を精査し、Co濃度の制御が適切におこなう。また磁気相図のCo濃度による変化を明らかとする。さらに、基底状態における反対称スピン軌道相互作用への置換効果を臨界磁場の測定を介して測定する。この観測結果を通して、希土類金属間化合物における対称および反対称磁気相互作用の制御に関する考察を行い、知見を得る。磁気相互作用を強くするCu置換についても研究を行いたいが、置換することが難しいことがわかった。結晶育成条件の見直しや共置換することで導入できないかなど、これまで検討していない条件について研究を行う。旅費として使用予定であったが、不足が生じたため、次年度使用額とした。総額の1%程度であり、問題ないと考えている。次年度予算に合算して旅費として用いる予定である。
波長可変真空紫外レ-ザ-による半導体光励起プロセスの基礎反応過程の研究

レ-ザ-光の混合によって発生させた真空紫外レ-ザ-を利用して、半導体光プロセスに関係する光反応の分子機構を探ぐること、および、半導体表面の電子構造の解明のために顯微光電子分光法を開発し、表面反応機構の実体を明らかにする。1.真空紫外レ-ザ-光で、光解離した水素原子を検出するために121nm附近のレ-ザ-光の発生を試み、成功した。NH_3の光解離で生成したH原子のスペクトルをとり、そのドップラ-効果を観測し、その運動エネルギ-を決定することができた。2.シランの水銀光増感反応によるアモルファスS:生成の分子機構を探ぐるために、水銀シランのvan der Waals錯体の光化学反応の分光測定を行った。Hg原子の励起状態の電子配置は、6S6pであるが、6p電子のπ軌道とシラン分子の方向がδ型の配置をとる場合とπ型の配置の二つがあり得るが、π型配置のみが反応へ導くことが示された。反応生成物のうち、シリレンラジカルおよびHgHは検出されなかった。シリルを経由する機構を示唆している。3.YAGレ-ザ-の9倍波を固体表面に集光し、発生する光電子のエネルギ-分析を飛行時間分析器で行う装置を試作し、ほゞ完成した。真空紫外光は、10.48eVで、その固体表面上のスポットサイズは、3.5μmφである。固体表面を走査し、光電子の画像表示が可能となっている。この装置によって、銅111面の光電子スペクトルと非結晶面のスペクトルの比較を行い、フェルミ準位に近い所に非結晶バンドを見いだし、これを指標として銅表面のミクロ結晶像の分布を観測することに成功した。今後は、吸着分子の集合状態の観測に応用する予定である。
第三セクターに代わる地域振興策(PFI)に関する研究

地域振興目的で官民共同出資して設立された第三セクターは、官の公共性と民の経営ノウハウを兼ね備えた組織として期待されていた。しかし、第三セクターの経営は、必ずしも当初期待されたとおりには運営されていない場合が多い。その理由は、官の公共性と民の営利性という相反する出資目的に根本的原因がある。また、第三セクターは、そもそも公共性が高いが収益性の乏しい事業を運営していることから、継続的に官から直接的・間接的に資金援助等が得られたため、経営側のモラルハザードの問題も大きい。近年、問題を抱えている第三セクターに対して資金援助等を行ってきた国・地方自治体の財政状況が悪化したことにより、経営的に問題のある第三セクターの見直しが全国的に進められている。しかし、民間活力の高い都市部はともかく、民間活力の少ない農山村においては、第三セクターを活用した地域振興策は一定の成果を上げてきたことは否定できない。そこで、第三セクター以外の地域振興策を模索する必要性がある。このような状況において、第三セクターに代わる新たな民間活用施策として、イギリスで考案され一定の成果を上げているPFIがある。PFI(Private Finance Initiative)は、1992年にイギリスで誕生した新しい社会資本整備手法であり、我が国においても透明かつ効率の良い仕組みとして期待されている。このような期待のもとに、PFIに関する研究が日本においても盛んになってきている。しかし、現在行われているPFIに関する研究の大部分は、民間活力が高い大都市圏、すくなくとも地方中核都市が中心であり、農山村におけるPFIに関する研究はほとんどなされていないのが実態である。そこで、本研究は、現在PFI研究の日の目が当たっていない農山村における公共サービスの提供方法としてのPFIについて研究を実施したものである。研究目的を達成するために、本年度は地域振興目的で設立された第三セクターの功罪に関する資料収集とその分析を行った。また、第三セクターを活用した公共サービスの提供方法に代わる政策と期待されているPFIについて研究を実施した。具体的には、第三セクターについては、資料収集とその分析を実施したPFIについては、国内の事例に関する資料収集とその分析を行った。そして、PFIの考え方の発祥地であるイギリスにおいて、資料収集及びPFI事例の実地調査を行った。本年度における研究成果としては、中山間地域における公共サービスの提供方法として第三セクターの活用は功罪が認められることが指摘できた。また、PFIに関する研究においては、イギリスの調査結果により、日本とイギリスでは社会風土の違いから、イギリスで成功したPFIをそのまま導入することは無理があると思われた。本研究目的である中山間地域におけるPFIの活用については、イギリスにおいても事例が見あたらなかった。しかし、イギリスにおけるPFIの事例調査から、PFIの問題点がかなり浮き彫りになってきた。指摘された問題点は、コンサルタント費用が従来の公共サービスコストに比較して高額であること、PFI事業の受託民間業者が利益追求を優先しすぎ公共性がないがしろにされる可能性があること等であった。これらの問題点は、日本においても該当すると考えられ、今後日本がPFIを導入するに当たっての留意事項となると思われる。本年度は、前年度の研究結果を基にして、中山間地域におけるPFIの研究を引き続き実施した。具体的には、都市部で実施または計画されている事例及び中山間地域で実施または計画されている事例について文献調査を行った。特に重要と判断される事例については実地調査を行った。さらには、PFIの考え方をイギリスから導入し、成果をあげている国を選択し、文献調査を行った。特に重要と判断される事例については実施調査を行った。選択した国はオーストラリアである。本年度における研究成果としては、以下のことが挙げられる。中山間地域におけるPFI活用する場合の問題点としては、次の4点が指摘できる。

(1)厳しい財政事情により、新規の公共事業を控えざるを得ない自治体が多い。(2)PFI事業により公共施設等の整備を行うために設定される債務負担行為は、その支出のうち施設整備費や用地取得費に相当するものは、公債費に準ずるものとして公債費負担比率に算入されることになっている。そのため、PFI導入によりVFMが見込まれたものとしても、既に公債費負担比率が高く、起債制限比率を超える自治体では事業の実施は困難である。(3)PFIに関する専門知識・人材の不足がしている。(4)PFIの手続きが複雑である。(5)PF1事業に対する補助金の交付基準が明確でない、などが示唆された。また、公共サービスを民間が提供することに、中山間地域では都市部以上に地域住民に抵抗があると思われた。このため、中山間地域におけるPF1活用は、この地域住民の考え方自体の変化が必要である。地域振興目的で官民共同出資して設立された第三セクターは、官の公共性と民の経宮ノウハウを兼ね備えた組織として期待されていた。しかし、第三セクターの経営は、必ずしも当初期待されたとおりには運営されていない場合が多い。その理由は、官の公共性と民の営利性という相反する出資目的に根本的原因がある。また、第三セクターは、そもそも公共性が高いが収益性の乏しい事業を運営していることから、継続的に官から直接的・間接的に資金援助等が得られたため、経営側のモラルハザードの問題も大きい。近年、問題を抱えている第三セクターに対して資金援助等を行ってきた国・地方自治体の財政状況が悪化したことにより、経営的に問題のある第三セクターの見直しが全国的に進められている。しかし、民間活力の高い都市部はともかく、民間活力の少ない農山村においては、第三セクターを活用した地域振興策は一定の成果を上げてきたことは否定できない。そこで、第三セクター以外の地域振興策を模索する必要性がある。このような状況において、第三セクターに代わる新たな民間活用施策として、イギリスで考案され一定の成果を上げているPFIがある。PFI(Private Finance Initiative)は、1992年にイギリスで誕生した新しい社会資本整備手法であり、我が国においても透明かつ効率の良い仕組みとして期待されている。このような期待のもとに、PFIに関する研究が日本においても盛んになってきている。しかし、現在行われているPFIに関する研究の大部分は、民間活力が高い大都市圏、すくなくとも地方中核都市が中心であり、農山村におけるPFIに関する研究はほとんどなされていないのが実態である。そこで、本研究は、現在PFII研究の日の目が当たっていない農山村における公共サービスの提供方法としてのPFIについて研究を実施したものである。
多レベルの学習機能を有する音声対話システムの研究

音声対話システムは、音声認識・自然言語理解・対話管理・文生成・音声合成などを要素技術として構成される。本研究では、音声対話システムの家庭用ロボットなどへの応用を念頭に置き、少数の対話データから音響レベル・言語レベル・対話レベルなどの多レベルの学習が行えるアーキテクチャを考案し、それぞれのレベルにおける特定少数のユーザへの適応技術の実現と、それらの統合方式の検討を行った。本研究は、音響モデル・言語モデル・意味解析規則・対話戦略・ユーザモデル・文生成など、音声対話システムにおける様々な知識源をユーザに適応させる手法の開発を目的として行った。本年度は各モジュールでカスタマイズ可能な音声対話システムのフレームワークを実装し、音響・言語モデルのログからの学習を実現した。また、あるレベルの学習結果を他のレベルの学習に利用する方式の検討を行った。1.学習可能なフレームワークに関しては、情報処理学会試行標準ワーキンググループの提案するアーキテクチャに基づいて実装を行った。2.各モジュールでの学習機能の実現については、以下のとおりである。(1)音響モデル:対話の進行に伴って収集される音声ログを適応用データとして、隠れマルコフモデル構築ツールキットHTKを用いて、MLLRによる話者適応を行い、認識率の向上を確認した。(2)言語モデル:新聞記事モデルから生成したコーパスと、認識結果ログ(文法を用いたものとディクテーションを用いたものの両方)を重み付きで結合したものから言語モデルを学習することによって、認識率が向上することを確認した。3.他のレベルの情報の利用法については、意味解析にオントロジーを用いた場合に、その出現頻度に応じて言語モデルのパラメータを変化させる方式や、対話処理におけるユーザに適応した主導権の選択に応じて、出現するユーザ発話に適した意味解析規則・言語モデルのチューニングについて、その実現方法を示した。本年度はユーザモデルに対応した出力形式の決定手法と、ユーザの利用状況に合わせた言語モデルの適応方式の検討を行った。1.ユーザモデルに対応した出力形式の決定手法に関しては、動的なユーザモデルの参照メカニズムを検討した。インタラクションを通じて、ユーザの利用可能な(またはより優先的な)モダリティを決定し、そのモダリティを用いる際の端末状況に応じて、マルチモーダル情報の出力を行う手法を開発した。情報の選択は、コンテンツからの静的な優先度と使用状況による動的な優先度を統合した基準に基づく。この手法を、情報処理学会試行標準ワーキンググループの提案するアーキテクチャに基づいて実装を行った。結果として、PC,PDA,携帯電話の各端末用のコンテンツの適切度を被験者実験で評価し、大旨良好な結果を得た。2.ユーザの利用状況に合わせた言語モデルの適応については、ビデオコンテンツ鑑賞時の質問応答機能をタスクとして選択し、これまでの質問内容に基づいてWebを検索することで関連ページを取得し、そこから言語モデルの適応を行う手法を開発した。結果として、複数のコンテンツ(伝統技能鑑賞ビデオおよび料理手順の説明ビデオ)に対して、ベースラインからの単語認識率の向上を確認した。
睡眠・覚醒相後退障害に対する認知行動的アプローチに基づく治療プログラムの構築

若年層における睡眠時間の短縮,夜型化傾向が著しいわが国において,睡眠相の後退に対する有効な治療法および予防的アプローチの構築は喫緊の課題である。特に,慣習上あるいは社会的に許容される睡眠時間帯より通常2時間以上相対的に後退する睡眠・覚醒相後退障害は児童・思春期に好発し,夜間の睡眠問題だけでなく二次的な問題をも含めた生活上の支障度が極めて大きい疾患である。しかしながら,現在の治療法は生活指導を基盤とする対症療法に限られ,特に若年患者とその家族の抱える負担感は大きい。本研究では,これらの問題に対して従来の時間生物学的治療に心理社会的支援を加えた治療プログラムを構築しその有用性の検証を行う。
小腸内の消化管ホルモン(CCK)放出因子の同定と作用機序の解明

ラットの膵液中より抽出されたアミノ酸61コよりなるモニターペプチドは、麻酔下のラットにおいて、コレチストキニン(CCK)を放出させ、膵外分泌を亢進させることが報告されている。今回無麻酔ラットにおいて同様の作用が認められることを証明した。その後、このモニターペプチドは、2種の膵分泌性トリープシシインヒビター(PSTI-61-56)のうちのひとつと同一のものであることがわかった。そこで、構造の1部類似したヒトのPSTI,2種のラットPSTIについて、さらに検討したところ、モニターペプチド(PSTI-61)にのみこのCCK放出作用が存在することがわかった。一般の動物には通常PSTIは一種類しか存在しない。ラットにのみなぜ、2種存在するのかは不明であるが、モニターペプチドが、PSTIとしての作用はもとよりCCK放出制御が主な役割であるとするなら、ラット以外の動物(ヒトもふくめ)にも膵液中にモニターペプチド様作用を有するPSTIではない物質が存在している可能性は十分考えられる。これは、今後の課題である。次に膵外分泌を、する物質の1つとして、最近発見されたパンクレアスタチンが、膵内外分泌両方を抑制することを報告した。パンクレアスタチンはブタ、ウシ、ヒト、ラットなどで少しずつアミノ酸構造が異なっている。すでにいずれのパンクレアスタチンもラット膵に対しては同じように働くことを確認し報告した。小腸より分泌されると考えられるCCK放出因子については、膵液を十二指腸より除いたさい、7日目に十二指腸内CCK含有量が最低になることから、膵液胆汁を回腸へBypassし1週間後にラットをト殺して、十二指腸内膜を採取し、Sephadex G-50で分離した。その結果分子量6000前後と思われる部位にCCK放出作用が存在することが判明した。今後さらに抽出、同定の予定である。
実時間領域の場の理論、弦理論の記述に向けた解析接続手法の開発

今年度は、本研究の目的である場の理論の実時間ダイナミクスの理解を進めるため、昨年作成した格子ゲージ理論に基づいたphase shift計算アルゴリズムをもとに、実際の散乱現象について解析を行った。この研究から、まず私が本研究で作成したアルゴリズムの系統的な振る舞いが理解されるとともに、アイソスピン1のチャンネル計算の結果からHAL QCD法に基づいてはじめてρメソンが存在する兆候をつかむことができた。まず1つ目に得られた結果である、今回開発したアルゴリズムの系統的な振る舞いについてであるが、この点について詳細な研究を行い、この系統的振る舞いが散乱位相差に忠実なnon-local potentialをderivative expansionを用いてlocal potentialに近似しているために生じてきた振る舞いであり、高次項まで考えて非局所ポテンシャルを展開することにより通常のHAL QCD法で計算した結果と一致することを示した。この統計的振る舞いに対する理解のもと、アイソスピン1のππ散乱にρメソンの存在を示す結果をHAL QCD法に基づいた計算で初めて示した。また、得られたポテンシャルを用いてpoleをBreit-Wignerのようなフィットに依らずに直接探索し、second Riemann sheetにpoleが存在することを示した。本研究はHAL QCD法が共鳴状態を捉えられることを示した初の研究であり、HAL QCD法に基づいた一連の解析手法が共鳴状態の物理量を計算する上で有用であることを初めて実証出来た点で非常に有用な研究である。これらの研究結果は、本研究の主目的である、実時間の場の理論のダイナミクス、特にメソン間相互作用について格子ゲージ理論に基づいて計算する新しい手法を開発することができたことを示しており、学会に大きなインパクトを与える結果である。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、本課題の目的である数値計算によるゲージ理論の実時間ダイナミクスの理解を進めるため自分は二つの手法を用いた研究を進めた。一つがゲージ/重力対応に基づいたゲージ理論の実時間ダイナミクスの数値計算である。本年の研究では古典弦の実時間発展を数値計算によって再現し、AdS5×T11上の古典弦のカオス的振る舞いはNear Penrose limitでも残ることも示した。これは、カオス的な振る舞いが古典弦に広く存在していることを示唆する結果であり、ゲージ/重力対応によれば対応する強結合ゲージ理論にカオス的な時間発展が存在することを意味する。これは今まで研究があまりなされてこなかった超弦理論の非可積分な領域の振る舞いを数値計算によって明らかにした新しい研究で、ゲージ理論の振る舞いの理解に向けて極めて有意な結果であったと考えている。私はこの研究の中でリャプノフ指数を計算するコードを独力で開発し、本研究の進展に中心的な役割を果たすことができた。また、もう一つのアプローチとして、私は格子ゲージ理論に基づいたゲージ理論の数値計算についても研究を進めている。こちらは、今年度は計算コードの開発を主に行った。特に現在力を入れているのは、格子計算の統計精度を上げる計算手法の実装である。これに取り組む理由は、本課題の挑戦として格子ゲージ理論における解析接続手法の開発を目指しているが、その際に十分な統計精度が必要となるからである。とくに、私は現在all-to-allの伝搬関数の計算を可能にし、統計精度を向上させる手法の開発に取り組んでいる。こちらの研究も解析を行う段階まで来ており、当初申請したスケジュールで研究を進められている。今年度中に弦の古典的な運動に生じるカオス的な時間発展についての解析で査読論文を2本書き、その内容について国内外の研究会で発表も行うことができた。また、格子ゲージ理論に関するプログラム作成も順調に進められており、今後その解析を進めることで研究課題をより進めることができると考えている。今年度は、本研究の目的である場の理論の実時間ダイナミクスの理解を進めるために、格子ゲージ理論に基づいたphase shift計算アルゴリズムの開発を主に行った。昨年度の研究により、クォークに対してLapH smearingを行うコードを作成できており、それを利用することでall-to-all伝搬関数を計算することが可能になった。本年度はまずこのコードの高速化に取り組み、十分に局所化されたメソンのソース演算子を作ることができた。現在はこの演算子を用いてHAL QCD法に従ってメソン間の相互作用ポテンシャルを計算し、phase shiftや共鳴状態の質量、崩壊幅を導出する研究を行っている。この研究で本年度得られた成果はHAL QCD法で求められたポテンシャルの演算子依存性についての理解である。従来のHAL QCD法ではソース演算子にWallソース、シンク演算子にポイントシンクを用いて計算していた。しかし、本研究で用いる演算子の組み合わせはともにLapH smearingされた演算子である。したがって、系統的に従来のポテンシャルと異なる振る舞いをすることが予想され、正しくphase shiftなどの物理量を計算できるか調べる必要があった。それに対して本年度の研究により、leading order termのみではphase shiftが正しく計算されないが、next-to-leading order termまで計算に含めることにより正しくphase shiftを計算できることを明らかにした。これはHAL QCD法の導出からも予想される結果ではあるが、今まで明らかに数値計算で示されたことは無く、非常に興味深い結果であるといえる。Phase shiftを計算できるコードの開発が今年度の研究によって完了し、実際にいくつかのチャンネルに対して質量や崩壊幅を計算できる段階まで到達したことが大きな理由である。

本研究の大きな目標は、より多くの場の理論に対して実時間でのダイナミクスを計算できるフォーマリズムを構成することであるが、phase shiftは散乱について実時間のダイナミクスに関する情報を持っているため、これを計算できることは本研究課題の解決に大きく貢献すると思われる。特に、2017年に入って以降はアイソスピン1のππ散乱のチャンネルに対してphase shiftの計算を行っており、ρメソン共鳴状態のシグナルを見つけることができた。これは格子QCDで計算するのは非常に難しいとされてきた部分であり、これに対するアプローチがHAL QCD法によって可能であることを示唆する結果を得られたのは研究課題にとって非常に大きな進歩である。また、本年度は、超弦理論の古典的振る舞いに現れるカオス的振る舞いについてカリフォルニア大学サンタバーバラ校のDavid Berenstein教授と共同研究を進め、SU(2)行列の非常にシンプルな構造をした行列模型においてもカオス的振る舞いが現れること及びゲージ/重力対応から期待される関係式を満たすことを示した。今回用いたモデルは、最も簡単なブラックホールの模型であり、このような単純化されたモデルでも本質的に同じ性質を持っていると示せたことは、近年活発に研究されている非線形な振る舞いのゲージ理論、重力理論への影響を調べるための扱いやすいトイモデルを提供できたことになり、非常に意味のある結果であると思われる。このように、海外との共同研究においても積極的に進め、大きな成果を上げることができた。今年度は、本研究の目的である場の理論の実時間ダイナミクスの理解を進めるため、昨年作成した格子ゲージ理論に基づいたphase shift計算アルゴリズムをもとに、実際の散乱現象について解析を行った。この研究から、まず私が本研究で作成したアルゴリズムの系統的な振る舞いが理解されるとともに、アイソスピン1のチャンネル計算の結果からHAL QCD法に基づいてはじめてρメソンが存在する兆候をつかむことができた。まず1つ目に得られた結果である、今回開発したアルゴリズムの系統的な振る舞いについてであるが、この点について詳細な研究を行い、この系統的振る舞いが散乱位相差に忠実なnon-local potentialをderivative expansionを用いてlocal potentialに近似しているために生じてきた振る舞いであり、高次項まで考えて非局所ポテンシャルを展開することにより通常のHAL QCD法で計算した結果と一致することを示した。この統計的振る舞いに対する理解のもと、アイソスピン1のππ散乱にρメソンの存在を示す結果をHAL QCD法に基づいた計算で初めて示した。また、得られたポテンシャルを用いてpoleをBreit-Wignerのようなフィットに依らずに直接探索し、second Riemann sheetにpoleが存在することを示した。
癌幹細胞性に着目した簡素な尿路上皮癌の分子サブタイプ分類の作成

近年、国外の複数施設から網羅的ケノム解析に基づく膀胱尿路上皮癌の分子サブタイプ分類が提唱され、予後と化学療法治療効果との関連性が報告されている。今後乳癌と同様、尿路上皮癌(UC)の分子サブタイプ分類が治療方針決定に応用されることが予想される。本研究は、癌の治療耐性と浸潤・転移能に関連する癌幹細胞性に着目し、癌幹細胞マーカーを含む可及的少数分子の免疫組織染色の組合せによる予後と治療抵抗性を反映する、簡素で実用的なUCの分子サブタイプ分類を作成することを目的とする。H30年度は、癌幹細胞性の観点から興味深い尿路上皮由来の癌肉腫症例について幹細胞および分化マーカーの発現解析を実施し報告した。当該症例は、腎盂・尿管・膀胱に多発する、何れの病変も横紋筋肉腫への特異な分化を示す尿路上皮癌由来の癌肉腫であった。典型的な尿路上皮癌成分は同癌分化マーカーであるGATA3と分化能の保持に関わるp63の発現を示し、横紋筋肉腫成分は横紋筋マーカーであるmyogeninの強発現を示したが、両成分は幹細胞マーカーであるSOX2発現を示さなかった。一方、両成分の移行域に存在する腫瘍細胞はGATA3, p63, myogeninを発現せず、SOX2を強発現した。これらの幹細胞性の高い腫瘍細胞から尿路上皮癌と横紋筋肉腫が分化・形成された可能性が示唆された。尿路上皮癌の癌肉腫への分化に癌幹細胞が関与する可能性が示唆された。癌幹細胞性の情報を含む分子サブタイプ分類作成においてSOX2は候補マーカーの1つとして有用であるかもしれない。その他、H29年度得られた膀胱癌の分子サブタイプ分類と化学放射線療法後の予後との関連についての知見を基に、筋層浸潤性膀胱尿路上皮癌に対する化学放射線療法による膀胱温存療法の治療効果および予後を予測するバイオマーカーに関する総説を報告した。分子サブタイプ分類と膀胱尿路上皮癌化学療法後の予後との関連は示されたが、幹細胞マーカーを含む簡素な分子サブタイプ分類の作成には至っておらず、来年度以降で推進する計画である。近年、国外の複数施設から網羅的ゲノム解析に基づく膀胱尿路上皮癌の分子サブタイプ分類が提唱され、予後と化学療法治療効果との関連性が報告されている。乳癌では4種類の分子の免疫組織染色による簡素な分子サブタイプ分類が実用化されているが、UCでは未だ提示されていない。本研究では、作成した分子サブタイプ分類のUC患者の治療方針決定における有用性も評価する。H29年度で、筋層浸潤性膀胱癌に対する化学放射線療法の治療効果と分子サブタイプとの関連を探索的に検討した。分子サブタイプの分類法として、既存のもので最も簡便なLund classificationを使用した。その結果、urobasal type (URO)は有意に化学放射線療法の近接効果が不良であり、genomically unstable (GU)およびsquamous cell cancer-like (SCCL)では良好であるという知見を得た。一方、生命予後は何れのサブタイプでも同等であった。過去の報告によると、GUとSCCLは膀胱全摘除を施行した筋層浸潤性膀胱癌において予後不良グループと報告されている。今回得られた知見からは、GU/SCCLに対し化学放射線療法を行うと良好な治療効果が得られ、予後改善効果があることを示唆するものと考えられる。新知見は得られたが、分担研究者の転出および分担研究者の変更のため、本課題研究費を運用しての本格的研究始動はなされていない。

一方、両成分の移行域に存在する腫瘍細胞はGATA3, p63, myogeninを発現せず、SOX2を強発現した。これらの幹細胞性の高い腫瘍細胞から尿路上皮癌と横紋筋肉腫が分化・形成された可能性が示唆された。尿路上皮癌の癌肉腫への分化に癌幹細胞が関与する可能性が示唆された。癌幹細胞性の情報を含む分子サブタイプ分類作成においてSOX2は候補マーカーの1つとして有用であるかもしれない。その他、H29年度得られた膀胱癌の分子サブタイプ分類と化学放射線療法後の予後との関連についての知見を基に、筋層浸潤性膀胱尿路上皮癌に対する化学放射線療法による膀胱温存療法の治療効果および予後を予測するバイオマーカーに関する総説を報告した。H30年度より本課題の本格開始および課題研究費の運用を予定している。分子サブタイプ分類と膀胱尿路上皮癌化学療法後の予後との関連は示されたが、幹細胞マーカーを含む簡素な分子サブタイプ分類の作成には至っておらず、来年度以降で推進する計画である。分担研究者の転出と変更に伴い本課題研究の本格始動がなされていない状態である。H30年度より当初の計画通りの本格始動を予定している。初年度に分担研究者の転出と変更に伴い、研究開始に1年の遅延が生じたため。それに伴い、本年度も予算の執行は遅延する見込みである。
ヒトｉＰＳ細胞を用いた喉頭組織再生に関する研究

in vitroにおいるiPS細胞の声帯上皮への分化誘導技術の開発:ゲルへのEGFなどの増殖因子添加や声帯由来線維芽細胞との共培養によりiPS細胞の分化を誘導し、上皮形成を図り、得られた組織片の組織像、蛋白質や遺伝子の発現に関して評価を行い発現が確認された。in vivoにおいるiPS細胞の損傷声帯への移植技術開発:ラットの声帯にiPS細胞をInjectableなゲルとともに移植し、声帯におけるiPS細胞の生着・生存が確認された。EGFを加えたモデルを移植した損傷声帯において、声帯瘢痕の形成が抑制される傾向が確認された。ヒトiPS細胞を用いた喉頭組織再生の可能性を示すことに成功した。喉頭組織の再生に有用な移植材料、および移植細胞・組織の実用化に向けて研究を行う。生体適合性のInjectableなゲルを骨格とし細胞の進入・生着に適した足場材料(スキャフォールド)を作製、研究する。次に、実際のヒト声帯の損傷後の再生促進を意図し、ヒトiPS細胞の培養法を確立する。ヒトiPS細胞から分化誘導した声帯上皮細胞を免疫染色や遺伝子解析により評価し、喉頭上皮組織を再生する技術を開発する。今年度の実績、成果1iPS細胞の培養:ヒトiPS細胞の樹立を世界で初めて成功させたウイスコンシン大学および、京都大学より使用承諾を受け理化学研究所バイオリソースセンターより購入した。iPS細胞をフィーダー細胞上またはフィーダー細胞フリーでの状態で培養し、最も実験に適した培養方法を確認した。その結果、十分量のストックを確保に成功した。2足場材料の開発:上皮再生を行う上で最適な条件を探索し、生体適合性のInjectableなゲルを作製した。3iPS細胞の声帯上皮への分化誘導技術の開発:純化したiPS細胞をゲル内に包埋し、三次元培養方法を確立した。三次元培養方法以外にも、単層培養や声帯由来の線維芽細胞等と共培養して培養皿上でも、分化誘導し、比較検討を試みた。ゲルへのEGFなどの増殖因子添加などによりiPS細胞の分化を誘導し上皮形成を図った。得られた組織片の組織像、蛋白質や遺伝子の発現に関して評価を行い発現が確認された。本研究では喉頭再生に有用な移植細胞の実用化に向けて、Injectableなゲルを骨格とし細胞の進入・生着に適した足場材料(スキャフォールド)を作製、研究する。次に喉頭組織の再生促進を意図し、iPS細胞の培養法を確立する。更にマウスiPS細胞から分化誘導した気管上皮様細胞の分化誘導に成功した結果を踏まえ、より臨床応用に近づけるため、ヒトiPS細胞から分化誘導した上皮細胞・組織を免疫染色や遺伝子解析により評価し、喉頭組織を再生する技術を開発する。今年度の実績、成果動物声帯に対して手術的な損傷を作成後、足場材料やヒトiPS細胞を声帯へ移植し、再生効果を評価:全身麻酔下に免疫不全ラットに対して、専用の開口器を装着後、内視鏡を用いて声帯を確認しながら、声帯損傷モデルを作成した。前年度の実験・実績により得られた細胞や足場材料を、単独またはそれぞれを組み合わせて、損傷部及び正常声帯に移植した。数週間の、観察期間ののちに安楽死を施し、喉頭を摘出した。損傷部位におけるiPS細胞の生着および分化増殖と正常組織での細胞の分化増殖を比較した。パラフィン切片を作製後、必要に応じHE染色、EVG染色、アルシアンブルー染色等の、各種染色(免疫染色を含む)を行った。各組織の特徴となるタンパク質や、コラーゲン、エラスチン等の発現や分布を観察した。組織学的評価:通常の光学顕微鏡のほか、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡を用いて各細胞モデルについて再生部位の経時的組織学的変化を観察・評価した。綿密に研究計画を立てたため、当初の予定通り順調に進展している。喉頭組織の再生に有用な移植材料、および移植細胞・組織の実用化に向けて研究を行った。生体適合性のInjectableなゲルを骨格とし細胞の進入・生着に適した足場材料(スキャフォールド)を作製、研究した。声帯の損傷後の再生促進を意図し、ヒトiPS細胞の培養法を確立した。マウスiPS細胞から分化誘導した軟骨細胞を含むスキャフォールドを気管欠損実験動物モデルに移植し、気管軟骨組織および上皮様組織の作製に我々は成功しているが、ヒトiPS細胞から分化誘導した声帯上皮細胞を免疫染色や遺伝子解析により評価し、喉頭上皮組織を再生する技術を開発した。今年度の実績、成果全身麻酔下に免疫不全ラットの喉頭を露出させ、声帯損傷モデルを作成した。in vitroの実験成果により得られた細胞と足場材料を損傷部及び正常声帯に移植し、損傷部位におけるiPS細胞の生着および分化増殖と正常組織での細胞の分化増殖を比較した。観察期間ののちに安楽死を施し、喉頭を摘出した。声帯の細胞移植部位の組織像、蛋白質の発現に関して、移植されていない正常部位とで比較し評価を行った。具体的には後述する項目について観察を行った。声帯における細胞の生着の有無。周囲組織との適合性の確認(H-E染色)、上皮組織の再生の有無、瘢痕組織の有無および組織における予防効果。(トリクローム染色、EVG染色)。腫瘍形成の評価ーiPS細胞を移植された際に腫瘍が形成されることが報告されており、腫瘍形成の割合、大きさ、病理学的解析。