hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
巨大ボリュームデータの主メモリ外描画

本研究では,主メモリには到底乗らないような巨大ボリュームデータの描画法の開発を目的とする.本研究の基本的なアイディアは,巨大ボリュームデータをブロックに分割し,拡張DDA法を用いてブロックを整列することで逐次処理を実行する,というものである.しかし,描画に要するブロックデータが多いのであれば,ディスクからのブロック読込みコストが増大してしまう.そこで,ボリュームデータを多重解像度表現するとともに,効率良い枝刈り処理を組み合わせることで,ディスクからのブロック読込みを抑えて高速な描画処理を実現できると考えている.本研究期間内の課題は,「巨大ボリュームデータの多重解像度表現」,「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用した描画」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」,「超巨大データのための分散並列処理の検討」である.このうち,本年度は「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」を中心に研究を行った.多重解像度のブロックデータに分割されたボリュームデータの必要性を,視点との相対位置関係から判定することで,ボリュームデータの連続描画を実現している.前年度にSSDや最新のGPU利用を試みたところ,ハードウェアの性能に応じて,適応的に高速化を実現する手法の開発が必要であることが明らかになってきた.そこでブロックデータの優先度を固定長ビット列でなく可変長で扱う方法や,描画時間も含めて処理時間を計測してフレームレートを維持する方法などを検討し,一定の成果を挙げることに成功した.さらに,ブロックデータの解像度を調整する新たな手法を開発することで画質の向上も実現できた.本研究では,主メモリには到底乗らないような巨大ボリュームデータの描画方の開発を目的とする.本研究の基本的なアイディアは,巨大ボリュームデータをブロックに分割し,拡張DDA法を用いてブロックを整列することで逐次処理を実行する,というものである.しかし,描画に要するブロックデータが多いのであれば,ディスクからのブロック読込みコストが増大してしまう.そこで,ボリュームデータを多重解像度表現するとともに,効率良い枝刈り処理を組み合わせることで,ディスクからのブロック読込みを抑えて高速な描画処理を実現できると考えている.本研究期間内の課題は,「巨大ボリュームデータの多重解像度表現」,「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用して描画」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」,「超巨大データのための分散並列処理の検討」である.このうち,本年度は「巨大ボリュームデータの多重解像度表現」,「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用した描画」を中心に研究を行った.具体的には,ボリュームデータを多重解像度のブロックデータに分割し,視点との相対位置関係からブロックデータの要不要を判定するとともに,プロセスを描画用とブロックデータ管理用のスレッドに分割することで,ボリュームデータを連続描画することができるようになった.また,ボリューム描画法として,スプラッティング,レイキャスティング,ソリッドテクスチャスライシングなどの手法を比較検討した.本研究では,主メモリには到底乗らないような巨大ボリュームデータの描画法の開発を目的とする.本研究の基本的なアイディアは,巨大ボリュームデータをブロックに分割し,拡張DDA法を用いてブロックを整列することで逐次処理を実行する,というものである.しかし,描画に要するブロックデータが多いのであれば,ディスクからのブロック読込みコストが増大してしまう.そこで,ボリュームデータを多重解像度表現するとともに,効率良い枝刈り処理を組み合わせることで,ディスクからのブロック読込みを抑えて高速な描画処理を実現できると考えている.本研究期間内の課題は,「巨大ボリュームデータの多重解像度表現」,「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用した描画」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」,「超巨大データのための分散並列処理の検討」である.このうち,本年度は「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用した描画」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」を中心に研究を行った.多重解像度のブロックデータに分割されたボリュームデータの必要性を,視点との相対位置関係から判定するとともに,プロセスを描画用とブロックデータ管理用のスレッドに分割することで,ボリュームデータの連続描画を実現している.また高速化に大きな寄与が期待されるSSDや最新のGPU利用を試みたところ,一定の高速化に成功したが,それに合わせて描画用のウィンドウを大きくしようとすると,処理が不安定になることが確認された.そこでハードウェアの性能に応じて,適応的に高速化を実現する手法の開発が必要であることが明らかになってきた.本研究では,主メモリには到底乗らないような巨大ボリュームデータの描画法の開発を目的とする.本研究の基本的なアイディアは,巨大ボリュームデータをブロックに分割し,拡張DDA法を用いてブロックを整列することで逐次処理を実行する,というものである.しかし,描画に要するブロックデータが多いのであれば,ディスクからのブロック読込みコストが増大してしまう.そこで,ボリュームデータを多重解像度表現するとともに,効率良い枝刈り処理を組み合わせることで,ディスクからのブロック読込みを抑えて高速な描画処理を実現できると考えている.本研究期間内の課題は,「巨大ボリュームデータの多重解像度表現」,「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「マルチスレッドを利用した描画」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」,「超巨大データのための分散並列処理の検討」である.このうち,本年度は「ブロックデータの整列ならびに枝刈り」,「データサイズやバッファリングの調整」,「代用データによる描画と先行データ読込み」を中心に研究を行った.

多重解像度のブロックデータに分割されたボリュームデータの必要性を,視点との相対位置関係から判定することで,ボリュームデータの連続描画を実現している.前年度にSSDや最新のGPU利用を試みたところ,ハードウェアの性能に応じて,適応的に高速化を実現する手法の開発が必要であることが明らかになってきた.そこでブロックデータの優先度を固定長ビット列でなく可変長で扱う方法や,描画時間も含めて処理時間を計測してフレームレートを維持する方法などを検討し,一定の成果を挙げることに成功した.さらに,ブロックデータの解像度を調整する新たな手法を開発することで画質の向上も実現できた.
ES細胞から分化する表皮幹細胞の新しい同定法の確立

今回、我々はES細胞から表皮幹細胞を分化させ、その細胞の性質や機能を解析する研究を企画した。そこで、表皮幹細胞に相当する、未分化状態の細胞集団を得るために以下のような新しい方法を企画した。表皮幹細胞のマーカーと考えられるケラチンK19のプロモーターの下流に、K14とgreen fluorescence protein (GFP)を融合した遺伝子を構築する。その遺伝子を組み込んだES細胞を作成する。その細胞からembryoid bodyやES tumorを作成し、GFPの蛍光を持ち、かつ表皮幹細胞に特有のケラチンネットワークが認められた細胞を同定する。K19は表皮幹細胞のマーカーであるが、膵臓や肝臓などでも発現される。そこで、表皮特異的なK14の発現パターンをたよりに表皮幹細胞を見出す計画であった。今年度、融合蛋白発現コンストラクトを作成した。即ち、マウスケラチンK19遺伝子のプロモーターの塩基配列が報告されているので、一部をPCRにて増幅する。それをプローブとしてマウスのgenomic libraryをスクリーニングし、K19の発現を正確に再現できる長さ(約5kb)のプロモーターを含むクローンを単離した。マウス表皮細胞cDNAからマウスK14 cDNAをPCRにて増幅し、フレームを合わせてその下流にGFP遺伝子を繋ぐ。そして、その融合蛋白の遺伝子をK19プロモーター下流に加えた。できた遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミッドに挿入し、K19-K14-GFPを作成した。次に、ES細胞を未分化な状態で培養する。K19-K14-GFPをES細胞D3にelectroporation法にて導入し、ネオマイシン耐性遺伝子をたよりにG418にて、K19-K14-GFPが染色体に組み込まれた細胞を選択した。
A Comparative Study on Green Investment in Japan, Korea and China

本研究では、日本・中国・韓国におけるグリーン投資による経済、雇用、環境への影響を評価することを目的とした。産業連関分析を用いて、日本の環境財・サービス産業(EGSS)におけるグリーン投資の経済と雇用に対する影響について評価した。また、中国多地域産業連関分析を用いて、再生可能エネルギーと効率改善目標の実施による環境・経済・雇用への影響評価を実施した。分析結果では、EGSSの高い乗数効果からは、日本の持続可能な経済成長の新たなエンジンとなるものと考えられる。中国において再生可能エネルギー政策の推進は、太陽光発電や風力発電産業に便益をもたらす一方で、化石燃料産業の犠牲を伴う。27年度が最終年度であるため、記入しない。環境経済・政策研究27年度が最終年度であるため、記入しない。
植物感染性線虫の感染に関わる分子機構の解析

植物感染性センチュウが、どのように植物に誘引され、感染を開始するかは、農業的にも重要な課題のひとつとなっているが、植物内生の化合物で、根などから拡散し、実際センチュウを誘引している候補は、いまだに挙げられていない。このような状況の中、シロイヌナズナ等の種子ムシゲルに線虫誘引活性があることを見いだした。しかし、種子ムシゲルと生きた種皮が同時に存在するときにのみセンチュウ誘引活性を示すことから、種子ムシゲル中の化合物を種皮が変換し、活性の有る誘引物質になると予想された。一方で、様々な種子のムシゲルにも誘引活性が有ることがわかったので、生きた種子なしで誘引活性を示すムシゲルサンプルを探索した。その結果、フラックス種子の種子ムシゲルは、単体で、種皮なしで、線虫誘引活性がある事を見いだした。そこで、フラックス種子の種子ムシゲルを大量に調整し、誘引物質の精製を行った。まず最初に、フラックス種子のムシゲル222mgを用いて、C18逆層カラムを用いたHPLCで分画した。つぎに、リサイクルHPLCを行った。Asahipak GS-310を用いて、F = 20 mm, h = 500 mm; T. Flow = 8mL/mmという条件で、水を溶媒に分画した。その後、メタノールで何度も洗浄した。ネタノールで洗浄しても水層に行かない事がわかった。また、NMR解析を行い、炭水化物が多いフラクションである事がわかった。以上の事などから、多糖であることが推定された。その後、糖の分析を行い、Fuc, Rha, Galが主成分である事がわかった。なかでも、RhaとGalの成分量がおおく、Rhamonogalactronan Iが主成分である事が予想された。このように、線虫誘引物質として、細胞壁成分のRG-Iが主成分として機能することが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。シロイヌナズナの種子を用いて、ルテニウムレット染色によるムシレーシの分泌の観察と線虫誘引試験を行った。ムシレージの主成分のペクチンは酸性多糖であるポリガラクツロン酸やラムノガラクツロナンからなり、ルテニウムレッド水溶液はポリガラクツロン酸やラムノガラクツロナンといった酸性多糖を染色する。そのため、ルテニウムレット染色によりムシレージか観察できない場合でも、ムシレージ中のペクチンが存在しないだけでムシレージ中の他の成分は存在している場合はある。まず、野生型であるColumbiaの種子を用いて、ルテニウムレット染色によるムシレーシの分泌の観察と線虫誘引試験を行った。Colの種子は、ルテニウムレット染色によりムシレージが観察でき、ムシレーシが周囲に分泌されてることがわかった。また、Colの種子を線虫行動観察用培地に置いて1日後に観察したところ、線虫が種子の周囲に誘引されていた。次に、ムシレージ関連遺伝子の欠損変異体の種子を用いて、ルテニウムレット染色によるムシレーシの分泌の観察と線虫誘引試験を行った。yipはトランスゴルジ体を介して細胞壁多糖類を分泌することができず、ムシレージが分泌されないことが知られており、gl2はMUM4/RHM2遺伝子の発現を正に制御することができず、ムシレージを合成できないことが知られている。また、echはyipと複合体を形成してトランスゴルジ体を介して細胞壁多糖類を分泌することができず、ムシレージが分泌されないことが知られている。ムシレージに線虫誘引物質が含まれているか確認するため、yipやgl2、echの種子を用いてムシレーシの分泌の観察と線虫誘引試験を行った。yipやgl2、echの種子はルテニウムレット染色によるムシレージの存在が確認できなかった。また、yipやgl2、echの種子ては線虫は種子の周囲に誘引されていなかった。我々は、ある植物種の種子ムシゲルにサツマイモネコブセンチュウの誘引活性があることを明らかにした。本研究結果は、これまでに無い新しい知見であり、農業被害をもたっらす植物感染性線虫の感染機構において、線虫行動を制御する分子機構に近づけたことを意味している。我々は、ある植物種の種子ムシゲルに線虫誘引活性があることを明らかにした。シロイヌナズナ等のアブラナ科やオオバコなどの種子ムシゲルには誘引活性が有るが、ハーブやサボテン類には無かったため、種特異的な成分が必要であると考えられる。また、シロイヌナズナの種子ムシゲルから線虫誘引物質の単離を目指す予定であったが、シロイヌナズナの種子ムシゲルは担体では誘引活性をもたず、生きた種皮とシロイヌナズナ種子ムシゲルを同時に混合したときにのみ線虫誘引活性を示す。このことは、種皮の酵素などによって、種子ムシゲルの成分が、真の線虫誘引物質に変換するなどの化学変化が必要であることを示唆している。そこで、様々な植物種を用いて種子ムシゲルと、その線虫誘引活性について調査した。その結果、フラックスシードのムシゲルに、強いサツマイモネコブセンチュウ誘引活性が有ることを明らかにした。次に、フラックス種子の種子ムシゲルの中の線虫誘引活性成分を明らかにするために、MPLCによる分画を行った。このMPLCによる分画は3回行った。

その結果、フリーズドライ下サンプル固体において、フラクション37と1316があって、線虫誘引活性はフラクション37のほうが強そうである事がわかった。このことから、引き続き、フラクション37について、精製を進め、線虫誘引物質の単離を目指す。次の精製ステップとしては、HPLC逆相クロマトグラフィーを検討しているところである。我々は、ある植物種の種子ムシゲルに線虫誘引活性があることを明らかにした。シロイヌナズナ等のアブラナ科やオオバコなどの種子ムシゲルには誘引活性が有るが、ハーブやサボテン類には無い。そこで、様々な植物種を用いて種子ムシゲルと、その線虫誘引活性について調査した。その結果、フラックスシードのムシゲルに、強いサツマイモネコブセンチュウ誘引活性が有ることを明らかにした。当初、シロイヌナズナの種子ムシゲルから線虫誘引物質の単離を目指す予定であったが、シロイヌナズナの種子ムシゲルは担体では誘引活性をもたず、生きた種皮とシロイヌナズナ種子ムシゲルを同時に混合したときにのみ線虫誘引活性を示す。このことは、種皮の酵素などによって、種子ムシゲルの成分が、真の線虫誘引物質に変換するなどの化学変化が必要であることを示唆している。植物感染性センチュウが、どのように植物に誘引され、感染を開始するかは、農業的にも重要な課題のひとつとなっているが、植物内生の化合物で、根などから拡散し、実際センチュウを誘引している候補は、いまだに挙げられていない。このような状況の中、シロイヌナズナ等の種子ムシゲルに線虫誘引活性があることを見いだした。しかし、種子ムシゲルと生きた種皮が同時に存在するときにのみセンチュウ誘引活性を示すことから、種子ムシゲル中の化合物を種皮が変換し、活性の有る誘引物質になると予想された。一方で、様々な種子のムシゲルにも誘引活性が有ることがわかったので、生きた種子なしで誘引活性を示すムシゲルサンプルを探索した。その結果、フラックス種子の種子ムシゲルは、単体で、種皮なしで、線虫誘引活性がある事を見いだした。そこで、フラックス種子の種子ムシゲルを大量に調整し、誘引物質の精製を行った。まず最初に、フラックス種子のムシゲル222mgを用いて、C18逆層カラムを用いたHPLCで分画した。つぎに、リサイクルHPLCを行った。Asahipak GS-310を用いて、F = 20 mm, h = 500 mm; T. Flow = 8mL/mmという条件で、水を溶媒に分画した。その後、メタノールで何度も洗浄した。ネタノールで洗浄しても水層に行かない事がわかった。また、NMR解析を行い、炭水化物が多いフラクションである事がわかった。以上の事などから、多糖であることが推定された。その後、糖の分析を行い、Fuc, Rha, Galが主成分である事がわかった。なかでも、RhaとGalの成分量がおおく、Rhamonogalactronan Iが主成分である事が予想された。このように、線虫誘引物質として、細胞壁成分のRG-Iが主成分として機能することが示唆された。様々なムシゲル突然変異体や、各種植物を用いて、サツマイモネコブセンチュウ誘引活性の高い種子ムシゲルをつくる植物や、ムシゲルをつくらない植物、サツマイモネコブセンチュウの種子への誘引活性の異なる植物などを明らかにし、さらには、種子ムシゲルの精製と単離にむかいたいと考えている。
高等教育の第2次大衆化による地域社会の構造変動に関する研究

産業別就業者比率が高く、かつ大卒就業者の比率が高いという点で、大卒就業者数の増加に大きな影響を与えてきたのがサービス業である。サービス業従事者数の増加が大きかった地域では、就業者数の拡大のみならず大卒者比率の上昇も顕著であった。一方でサービス業従事者数の増加が相対的に小さかった地域では学歴構成の上昇も大きくなく、大卒者の新規参入に困難があったことがうかがわれる。さらに後者の地域では、特に若年者の参入が少なく、大卒の若年者にとって労働市場への参入の容易さが地域によって異なるとともに、そうした背景が地域間の就業構造の差異を拡大していることが指摘できる。平成20年度には、主に地域別若年労働市場の構造変動を把握するためのデータ収集、およびその基礎的分析を行った。データについては、地域別・年齢階級別就業者数が把握可能である国勢調査の数値を中心に収集を行っている。また、それらのデータを用いた分析においては、時系列的に労働市場の構造変動を捉えるための検討を行っている。産業別就業者比率が高く、かつ大卒就業者の比率が高いという点で、大卒就業者がもっとも多いサービス業に注目した分析では、以下の知見が得られた。1970年から2000年までの学歴別就業構造を概観してみると、大卒就業者比率はほぼ一定のペースで上昇を続けているものの、就業者数そのものは90年から2000年の期間でほぼ停滞に近く、学歴代替による大卒就業者の増加が顕著に生じていたと考えられる。また同時にこの期間には、都道府県別の大卒就業者比率の地域差が拡大しており、学歴代替が地域別に異なる様相で進行していたことがうかがえる。そこで、地域別にサービス業従事者の就業構造について、学歴や年齢に注目してその推移を検討してみると、産業の規模拡大(就業者数の増加)、学歴構成の上昇(大卒就業者数の増加)といういずれの要因においてもサービス業従事者の増加が相対的に少なかった地域で特に若年者の参入も少なかったという変化が生じており、いわば大卒の若年者にとっての二重の障壁が地域間の就業構造の差異を拡大させている可能性が指摘できる。平成21年度には、主に地域別労働市場の構造変動を把握するためのデータ収集と集計・分析作業を行った。大卒就業者の増加にもっとも大きな影響を与えていると考えられるのはサービス業である。他の産業と比較して高い大卒者比率を維持していることに加え、就業者数が減少を続けている産業もある一方で、サービス業ではその数が維持もしくは拡大しているため、就業者全体に占める占有率も1970年以降に急激な拡大を遂げている。1970年から2000年までの期間におけるサービス業の就業構造に注目してみると、特に90年から2000年の期間に都道府県間の大卒就業者比率の差が拡大している。1970年以降、大卒就業者比率はほぼ一定のペースで上昇を続けているものの、就業者数そのものは90年から2000年の期間でほぼ停滞している。このことは、この期間に学歴代替による大卒就業者の増加が顕著に生じていたことを示すが、大卒就業者数の増加の様子には地域による差異が存在している。サービス業従事者数の増加が大きかった地域では、就業者数そのものの拡大に加え、大卒就業者比率の上昇も顕著であった。しかし、サービス業従事者数の増加が相対的に小さかった地域では、学歴構成の上昇もそれほど大きくなく、大卒就業者の新規参入が困難であったことがうかがわれる。就業者の年齢別にこれらのことを検討すると、後者の地域では、特に若年者の参入が少なかったことが明らかとなった。大卒の若年者にとって労働市場への参入の容易さが地域によって異なっているとともに、そうした背景がさらに地域間の就業構造の差異を拡大していることが指摘できる。平成22年度には、地域別労働市場の構造変動を把握するためのデータ収集と分析作業を継続して行うとともに、特に地場産業従事者の高学歴化についての聞き取り調査を実施した。サービス業が他の産業と比較して高い大卒者比率を維持していることに加え、就業者数そのものも拡大していることから、大卒就業者の量的な増加にもっとも大きな影響を与えていることに変わりはない。その一方で、ケーススタディとして当該年度に訪問調査を実施したのはいわゆる地場産業と呼ばれる製造業である。地場産業は、就業者数から見ると小規模ではあるものの、それぞれの地域において古くから存在し、地域社会を特徴づける重要な要素のひとつである。古くから存在することに加え、中核を担うのが技能者であることなどから、地場産業従事者の養成に高等教育機関が積極的に関わることは少なかった。しかし近年、高等教育機関の量的拡大や就業者全体の高学歴化の進行、高等教育機関と地域との連携が推進されてきていることなどにより、地場産業に技能職者として入職する大卒者も増えつつある。

こうした大卒者の間では、高等教育機関での学習経験や専門知識が職務内容に一定の効果を有していると評価されており、大学等で学んだ学問的知識を背景としながら、職務遂行に必要な知識やスキルの一般化が進められている。しかしそれらはこれまで従事者の勘や経験として個人に蓄積される性格が強いもので、すべての過程の言語化や数値化には限界があることが指摘されている。研究機関や高等教育機関などとの組織的な連携のみならず、大卒者の入職により伝統的な地場産業にも様々な面で変化が進みつつあるが、小規模な事業所が多く、継続的に大卒者を雇用することが難しいことに加え、担うべき職務が肉体労働を含むなど多岐に渡り、大卒者にとって魅力的な職業とみなされない場合が多い、などが地場産業における高学歴化の制約条件となっている。
幹細胞低酸素ニッチに着目した軟骨膜片からの長期形態維持性軟骨移植材料の開発

<目的>耳介軟骨再生医療における重要課題である長期形態維持性の確保を目標に、軟骨膜血管新生と低酸素ニッチに着目した耳介軟骨膜幹細胞からの軟骨再生過程の解明のため家兎耳介軟骨を用い研究を計画した。<方法>1)in vivoで軟骨膜の血管新生と軟骨膜からの軟骨再生過程の観察、軟骨欠損の大きさによる再生過程の違いの検討:当初左右耳介に各2カ所(1羽で計4カ所)、軟骨膜を温存して皮膚・軟骨膜を弁状に挙上し、10×10mm、15×15mmの2種類の軟骨欠損を作成。しかしこのモデルでは、処置後1ヵ月での軟骨再生観察前に処置部位の全層壊死が生じることが多く、観察不能であった。各耳介での2か所の欠損作成による血流障害が原因と考え、左右耳介に各1カ所(1羽で計2カ所)に欠損部を作成するモデルに変更した。2)軟骨膜幹細胞を含む軟骨膜のex vivoでの培養系を用い、軟骨膜幹細胞の低酸素ニッチと低酸素誘導性因子(HIF)の関連を同定:まず困難であった薄い家兎耳介から耳介軟骨を含まずに軟骨膜を採取する手技を剥離子などの道具を工夫することにより確立した。<結果>1)処置後1ヵ月で軟骨再生を観察できるin vivoでの耳介軟骨膜温存・軟骨再生モデルを確立した。今後は軟骨再生の際に軟骨膜内に生じる血管新生が軟骨膜幹細胞の静止・活性化の動態制御機構のニッチ因子として作用するか、血管新生阻害剤(抗VEGFヒト化モノクローナル抗体)と血管新生刺激剤(bFGF)の投与を行い、HIFに着目して関与する因子の同定を行っていく予定である。2)4羽連続して、1のin vivoの実験系で採取した耳介軟骨側に軟骨膜が含まれていないことを組織学的に確認し、軟骨膜幹細胞を温存した軟骨膜のex vivoでの培養実験を開始した。同組織培養系で軟骨再生を認めれば、培養酸素濃度の変化によるHIFの発現について検討していく予定である。bFGF刺激による軟骨膜血管新生と低酸素ニッチに着目した耳介軟骨膜からの軟骨再生過程の解明を目指した。そのための予備的実験として、まず日本白色家兎の耳介を用い以下を行った。1. in vivoで軟骨膜における血管新生と軟骨膜からの軟骨再生過程の観察:1耳介に2カ所(1羽で計4カ所)、軟骨膜を温存して弁状に皮膚を挙上し、10×10mm、15×15mmの2種類の軟骨欠損を作成。軟骨膜からの軟骨再生過程を検討した。処置後2ヵ月でsacrificeして、組織を観察したが、全く軟骨膜と思われた組織からの軟骨再生を認めなかった。これまで我々の研究グループから得られた知見に照らして、軟骨膜が温存されていれば2ヵ月で軟骨新生が得られないことはないため、軟骨側に軟骨膜や軟骨前駆/幹細胞が存在した状態で摘出したと考え、軟骨膜を生体側に温存するよう手技を改めて新たなモデルを作成しているところである。2. 1の家兎をsacrificeした際に実験部位以外の耳介から軟骨膜と思われる組織のみを採取してDulbeco modified Eagle medium/Ham's F12、10%heat incubated fetal calf serum加培地で3,7,14,21日まで培養しex vivoで組織培養を行い、組織の生存は確認できたが、1.同様に軟骨の再生は認めなかった。これも軟骨膜と思われた組織には軟骨膜や軟骨前駆/幹細胞が存在していない手技的な問題と考え、新たなモデルを作成して検討しているところである。1、2で得られた組織から低酸素維持性因子としてHIF-1α,HIF-2αなどの免疫染色による組織学的検討やRT-PCRによる遺伝子発現を検討する予定であったが、想定以上に家兎耳介からある程度の以上大きさで選択的に軟骨前駆細胞/幹細胞を含む軟骨膜を採取することが難しく、基本的な手技の確立に時間を要している。bFGF刺激による軟骨膜血管新生と低酸素ニッチに着目した耳介軟骨膜からの軟骨再生過程の解明のため日本白色家兎の耳介を用い以下を行った。前年軟骨膜と思われた組織から軟骨の再生は認められず、軟骨膜や軟骨前駆/幹細胞が存在していない手技的な問題と考え、器材を工夫し、剥離手法などを改善を図った。処置後2ヵ月でsacrificeして組織を観察したところ、一部の検体で軟骨膜組織からの軟骨新生が確認された。軟骨膜を生体側に温存するような手技は、まだ不十分であるが改善できた。前年1.同様に本培養系実験で軟骨膜と思われた組織から軟骨の新生がみられなかったが、軟骨膜剥離、採取の手技に改善を認めたことから継続して検討していく予定である。実験1、2で得られた組織から低酸素維持性因子としてHIF-1α,HIF-2αなどの免疫染色による組織学的検討やRT-PCRによる遺伝子発現を検討する予定であるが、選択的に軟骨前駆細胞/幹細胞を含む軟骨膜を採取する基本的な手技の確立に時間を要している。またマルチガスインキュベーターの故障により2の培養系実験が遅延した。

<目的>耳介軟骨再生医療における重要課題である長期形態維持性の確保を目標に、軟骨膜血管新生と低酸素ニッチに着目した耳介軟骨膜幹細胞からの軟骨再生過程の解明のため家兎耳介軟骨を用い研究を計画した。<方法>1)in vivoで軟骨膜の血管新生と軟骨膜からの軟骨再生過程の観察、軟骨欠損の大きさによる再生過程の違いの検討:当初左右耳介に各2カ所(1羽で計4カ所)、軟骨膜を温存して皮膚・軟骨膜を弁状に挙上し、10×10mm、15×15mmの2種類の軟骨欠損を作成。しかしこのモデルでは、処置後1ヵ月での軟骨再生観察前に処置部位の全層壊死が生じることが多く、観察不能であった。各耳介での2か所の欠損作成による血流障害が原因と考え、左右耳介に各1カ所(1羽で計2カ所)に欠損部を作成するモデルに変更した。2)軟骨膜幹細胞を含む軟骨膜のex vivoでの培養系を用い、軟骨膜幹細胞の低酸素ニッチと低酸素誘導性因子(HIF)の関連を同定:まず困難であった薄い家兎耳介から耳介軟骨を含まずに軟骨膜を採取する手技を剥離子などの道具を工夫することにより確立した。<結果>1)処置後1ヵ月で軟骨再生を観察できるin vivoでの耳介軟骨膜温存・軟骨再生モデルを確立した。今後は軟骨再生の際に軟骨膜内に生じる血管新生が軟骨膜幹細胞の静止・活性化の動態制御機構のニッチ因子として作用するか、血管新生阻害剤(抗VEGFヒト化モノクローナル抗体)と血管新生刺激剤(bFGF)の投与を行い、HIFに着目して関与する因子の同定を行っていく予定である。2)4羽連続して、1のin vivoの実験系で採取した耳介軟骨側に軟骨膜が含まれていないことを組織学的に確認し、軟骨膜幹細胞を温存した軟骨膜のex vivoでの培養実験を開始した。同組織培養系で軟骨再生を認めれば、培養酸素濃度の変化によるHIFの発現について検討していく予定である。非選択的に軟骨を部分的に含むような軟骨膜採取の方法を確立して、予定通りの実験系の推進を目指す。軟骨膜、軟骨幹幹細胞/前駆細胞/含むような軟骨膜採取の方法を確立し、予定通りの実験系の推進を目指す。モデル動物の作成について手技的な工夫を行っている段階で予算の執行も停滞している。マルチガスインキュベーターの故障により培養系実験が遅滞した。インキュベーターをH29年度新規購入して、今後計画通りの実験を進めていく予定である。軟骨から軟骨膜を剥離する深度を変える程度の工夫で、モデル動物の作成は達成できると考えられるため、次年度で予定通りの実験を行う。
枯れ葉剤等汚染物質が先天異常児発現におよぼす影響に関する調査―遺伝子解析技術を応用して―-Epidemiological Investigation of Environmental Pollution-

研究代表者の夏目長門は平成9年4月26日5月1日まで6日間、12月1日16日まで16日間、また、研究分担者の平原史樹は平成9年12月2日8日まで7日間、香月武は平成9年12月5日15日までの11日間、現地において調査を行った。これらの渡航費用はそれぞれ他の政府機関より助成を受けている。その間、オーラルマキシロセンターの先天異常の実態調査を行うと共に、血液サンプルの採取を行った。その成果の一部を第8回国際口蓋裂学会(平成9年9月7日12日於:シンガポール)にて発表した。先天異常モニタリングのシステムの導入の確立のため、また、研究結果の解析のため平成10年2月15日3月27日までの期間、ベトナム側からダクティン氏が来日した研究代表者の夏目長門は平成9年4月26日5月1日まで6日間、12月1日16日まで16日間、また、研究分担者の平原史樹は平成9年12月2日8日まで7日間、香月武は平成9年12月5日15日までの11日間、現地において調査を行った。先天異常モニタリングのシステムの導入の確立のため、また、研究結果の解析のため平成10年2月15日3月27日までの期間、ベトナム側からダクティン氏が来日した
自動走行ロボットによる下水管形状計測技術の確立

下水管の管軸方向のロボット走行距離を計測するために地面に接するローラを取り付けエンコーダにより走行距離を読み取る装置を設置した.レーザスキャナから得られる断面形状データに計測された走行距離を組み合わせ,下水管の三次元形状を復元した.ロボットの光源として,赤色レーザ,緑色レーザおよびLED光源装置を用いた.これらの光源の点滅を,CCDカメラのビデオ信号と同期させ,それぞれの光源が投光されている時の画像を時系列的に切り出すことにより分離させることを行った.ロボットの管軸に対する傾きは,投光する2つのレーザリング軌跡のずれから検出すると共に,重力方向に対するロボットの傾きを傾斜角センサの信号をもとに検出することを試みた.2つのリングレーザ軌跡のずれから算出した管軸に対するロボット本体の傾きを計測データに考慮し,三次元的に再構築することを実現した.しかしながら,ロボット本体の地軸に対する傾きを検出するために設けた傾斜角センサは本体の各速度を検出するタイプであるため,振動などの外乱に弱く今後の課題となる.また,下水管1断面当たり約200点の計測データを数mm間隔で取り込むため,データ量が膨大になる.画像の取り込みと共に2値化およびレーザ中心線算出を行うことでデータサイズを縮小することを行った.計測精度を向上するには,カメラとレーザ投光部の間隔を広げる必要があるが,間隔を広げるとロボットが長くなるので径が小さい下水管を走行させる場合に不都合が生じる.最適な計測を行うために,カメラとレーザ投光部の間隔と計測誤差の関係を検証した.また,検査の実用化を考え,形状計測と共に下水管表面のテクスチャーを撮影し,復元された三次元形状にマッピングするアルゴリズムを追加することで,数値結果のみならず管の状態を視覚的にも把握できる仕様とした.下水管軸に対して垂直方向にレーザ光を投光し,管内面で反射する光をCCDで撮影することで下水管形状を計測するシステムを試作した.平行な2平面のレーザを照射することで,管軸を正確に検出し,走行ロボットが傾いている場合にも管軸に垂直な断面形状を計測できる.高速回転用中空軸モータの中空軸にビームスプリッタと合わせ鏡を固定し,これを高速に回転させることで2平行レーザを投光するシステムとした.このレーザ投光器を管内に挿入し,管内面にレーザ軌跡を投光する.二つのレーザ軌跡は位相を180度ずらし,画像処理によって分離できるようにした.カメラの露光時間が30分の一秒の場合,900RPMでモータを回転させると2本のレーザ光によって2つの半円が管内面に描かれる.カメラの撮影時のモータ回転角をパソコンで読み取ることで,2つのレーザ軌跡の区別を行った.また,画像データを実座標データに変換するためのキャリブレーションアルゴリズムを検討した.回転する中空軸モータから投光されるレーザ平面上に目盛り板を重ね.目盛り板の画像をCCDカメラでコンピュータに取り込む.マウスでコンピュータディスプレイ上に表示された目盛りをクリックすることでカメラ座標とワールド座標の組み合わせを入力する.カメラ座標とワールド座標の関係をマトリックス表記し,カメラ座標とワールド座標の組み合わせを代入し,関係式を導き出すことでキャリブレーションを実施するアルゴリズムを製作した.また,レーザ平面上の様々な位置において各計測点の精度評価を行い,誤差は1mm以内となることを確認した.管軸に対して,ロボット本体が傾いている場合には,計測される断面は楕円になる.そこで,撮影される楕円軌跡上の各線分で接線を求め,接線の傾きが等しい点どうしを直線で結ぶ.これらの直線は楕円の中心を通ることを利用して,中心候補の投票によって中心を算出するアルゴリズムを開発した.また,軌跡が下水管の凹凸によって部分的に撮影されない場合,その欠損が中心位置の検出にどのように影響するかの実験を行い,近似円として解析することで欠損の影響はほとんど無いことを確認した.ロボットが傾いている場合,撮影される2つの円軌跡がずれ,この2つの円軌跡の中心座標のずれから,管軸に対するロボット本体の傾きを算出するアルゴリズムを開発し,0.4mm以下の誤差で計測できることを確認した.200mmから800mmの管径を想定しており,大きい径の下水管を計測する場合には広角レンズを使用する必要がある.広角レンズを使用する場合には,画像の周辺部にレンズ歪みを生じるために正確に計測するためにはレンズ歪みを修正する必要がある.レンズ歪みの補正方法としては一般的にはTsaiが提案した補正方法が利用されているが,さらに精度を高めるために,画像を細かく分割し局所毎に異なるパラメータでキャリブレーションと歪み補正を行う方法を試みた.これにより,広角レンズによる歪みを大幅に削減できることを確認した.検出される計測点は,ロボットの移動開始を原点とした三次元位置として検出される.数百万点以上の計測点の状態を検討できるようにディスプレイ上に視覚的に表現するアルゴリズムを開発した.また,計測点をコンピュータモニタ上に三次元的に表現する方法と管軸を中心とした展開図を自動的に作成するアルゴリズムを開発した.下水管の管軸方向のロボット走行距離を計測するために地面に接するローラを取り付けエンコーダにより走行距離を読み取る装置を設置した.レーザスキャナから得られる断面形状データに計測された走行距離を組み合わせ,下水管の三次元形状を復元した.ロボットの光源として,赤色レーザ,緑色レーザおよびLED光源装置を用いた.これらの光源の点滅を,CCDカメラのビデオ信号と同期させ,それぞれの光源が投光されている時の画像を時系列的に切り出すことにより分離させることを行った.

ロボットの管軸に対する傾きは,投光する2つのレーザリング軌跡のずれから検出すると共に,重力方向に対するロボットの傾きを傾斜角センサの信号をもとに検出することを試みた.2つのリングレーザ軌跡のずれから算出した管軸に対するロボット本体の傾きを計測データに考慮し,三次元的に再構築することを実現した.しかしながら,ロボット本体の地軸に対する傾きを検出するために設けた傾斜角センサは本体の各速度を検出するタイプであるため,振動などの外乱に弱く今後の課題となる.また,下水管1断面当たり約200点の計測データを数mm間隔で取り込むため,データ量が膨大になる.画像の取り込みと共に2値化およびレーザ中心線算出を行うことでデータサイズを縮小することを行った.計測精度を向上するには,カメラとレーザ投光部の間隔を広げる必要があるが,間隔を広げるとロボットが長くなるので径が小さい下水管を走行させる場合に不都合が生じる.最適な計測を行うために,カメラとレーザ投光部の間隔と計測誤差の関係を検証した.また,検査の実用化を考え,形状計測と共に下水管表面のテクスチャーを撮影し,復元された三次元形状にマッピングするアルゴリズムを追加することで,数値結果のみならず管の状態を視覚的にも把握できる仕様とした.
高齢敗血症ラットを用いた回復後認知機能低下の研究

敗血症は、標準的治療の向上・普及に伴い、その救命率も高くなっている。一方、生存退院した敗血症患者は、特に高齢患者で認知機能障害が生じ,生活の質低下に関連していることが報告されている。敗血症後認知機能障害の詳細な機序は明らかでなく、確立した治療法も存在しないが、近年、脳内神経炎症の重要性が注目されている。双極性感情障害の治療薬である塩化リチウムは、抗脳内神経炎作用および抗アルツハイマー病効果の報告があるが、敗血症後認知機能障害に対する有効性は検討されていない。本研究では高齢ラットを用いて敗血症後認知機能障害に塩化リチウムの与える影響を検討する。
磁気ナノ微粒子の優れたイオン化支援機能の探求と質量分析イメージングへの応用

本研究では、磁気ナノ微粒子を用いて、従来では検出不可能であった質量領域におけるイオン化を実現させるとともに、質量分析スペクトルの高分解能化をはかることを目的としている。最終的にはすい臓がん細胞の高解像度の質量分析イメージングを実現し、がんの原因となる物質とその分布を明らかにし、新たな病理分析方法を提案するつもりである。上記目標を踏まえて、1.磁気微粒子の作製、2.検体の選定、3.イオン化支援機能の確認、4.質量分析スペクトルの解析を順次進めていった。磁気微粒子には鉄の酸化物を主体として、一部の鉄イオンをニッケルイオンに置換したNiFe2O4(ニッケルフェライト)系の微粒子を新たにマトリックスとして作製した。検体としては、標準的な試薬であるアスピリンやコルヒチンを選んだ。マトリックスの粒径を3ー10 nm程度に制御したところ、小さい径のものが、より検出能力があることが明らかになった。さらにアミノ基を修飾すると、よりイオン化支援機能が向上することもわかった。また吸光度測定と粒度分布測定を行うことでイオン化支援機能の検出感度との相関を考察してみた。アミノ基を修飾したのち、フーリエ変換赤外線分光(FTーIR)測定よりN Hの振動のピークを確認することができ、アミノ基の修飾が成功していることがわかった。粒度分布計での分析によると、アミノ基修飾後は、水中の分散性も向上していた。昨年度までに、アモルファスSiO2に内包されたTiO2ナノ微粒子を作製し、この微粒子が薬剤等の比較的低分子の検体を、イオン化することが可能なことが明らかになった。さらに、微粒子を覆うSiO2の層の厚みの違いにより、イオン化支援能が変化することも新たにわかった。しかしながら、より高分子の検体をイオン化し、検出することができれば、糖や脂質など、より幅広い情報を得ることができる。そこで、金属部分のチタン(Ti)の部分を、鉄(Fe),ニッケル(Ni)に変化させることを試み、さらにイオン化支援機能を向上させることを予想して、微粒子の表面に官能基を修飾する方法を取り入れた。作製試料はアモルファスSiO2に内包されたNiFe2O3,ニッケルフェライトであり、この物質について、吸光度や分散性、さらに放射光を用いて局所構造の分析も行いイオン化支援機能との関係を解明していくことができた。微粒子の粒径も3-9 nmに制御することができ、その依存性も観察することができた。薬剤のコルヒチンを検出したところ、小さい粒径の3nmのものが高いイオン化支援機能を持つことが明らかになった。さらにこれらの微粒子にアミノ基を修飾することを考えた。結果からはアミノ基を修飾することで、単体より5倍以上のS/N比を持つ、非常に優位な検出が可能になることを見出した。C-N結合が重要な役割を果たしている可能性もあり、イオン化のメカニズム解明に一歩前進できたといえる。3d遷移金属を含む鉄酸化物のナノ微粒子は、イオン化支援機能を持つことがわかり、さらにアミノ基を修飾するとその機能が向上することが、今回の研究で明らかになった。アミノ基の構造が重要と考えられるため、検体側にN-Hを持つ物質を選んでその質量分析スペクトルを追っていくこともメカニズム解明の助けになると考えている。また最終的にはすい臓がんを分析したいと考えているため、すい癌に特異的なタンパクを微粒子に修飾する試みも進行中である。富山大学医学部のすい癌専門の研究者とよりコンタクトをとり、議論しながら進めていきたい。本研究では磁気ナノ微粒子を用いて、従来では検出不可能であった質量領域におけるイオン化を実現させるとともに、質量分析スペクトルの高分解能化をはかる。さらにはすい臓がん細胞の高解像度の質量分析イメージングを実現し、がんの原因となる物質とその分布を明らかにし、新たな病理分析方法を提案する。優れたイオン化支援機能を持つ磁気ナノ微粒子を開発し、高分解能で革新的な生体組織の分析と分布を同時に実現する。当該年度には、イオン化支援機能を持つ磁気ナノ微粒子を作製するために、先行研究で見いたした鉄の酸化物に他元素をドープすることを試みた。3d遷移金属のドープではあまり効率のよい結果が得られなかったため、光触媒にヒントを得てチタン酸化物TiO2にアミノ基を修飾した機能性ナノ微粒子の作製に取り組んだ。その結果、粒径約3nm程度の単相のアナターゼ型TiO2であることが確認された。本微粒子のイオン化支援機能を確かめるため、検体として薬剤であるアスピリン(MW=180.2)、コルヒチン(MW=399.4)を選んだ。そしてマトリックスとして作製したナノ微粒子と市販のマトリックスCHCA(α-cyano-4-hydroxycinnanic acid)を用いて質量分析(MS)スペクトルを比較した。その結果、全ての検体のMS測定の結果より、従来のマトリックスではMSスペクトルの検出が出来ず、今回開発したSiO2包含TiO2ナノ微粒子とアミノ基を修飾したものではMSスペクトルを得ることができた。マトリックスを加えない場合は、検体は検出できなかった。さらに、SiO2を除去したものではMSスペクトルが得られないことがわかった。このことから、イオン化支援機能はSiO2層が関係していることが新たに明らかになった。初年度はイオン化支援機能の高い、磁気ナノ微粒子を用いた質量分析用マトリックスを開発することを目的とした。

これまでに鉄酸化物系微粒子にガンマAPTESを修飾して機能化することで、イオン化支援能が向上した実績があったため、鉄(Fe)以外の3d遷移金属を用いて同様の、あるいはそれ以上の効果が現れることを期待し、微粒子の作製を試みた。しかしながら、予想と反して、あまり顕著な効果が得られないことがわかった。そこで、光触媒にヒントを得てチタン酸化物を用いることを考えた。これまでの製法を応用し、金属塩化物の金属部分をチタンに選び、湿式混合を行い、アモルファスSiO2に内包されたTiO2ナノ微粒子を新たに開発することができた。そして、この微粒子が薬剤等の比較的低分子の検体を、イオン化することが可能なことを見出した。さらに、微粒子を覆うSiO2の層の厚みの違いにより、イオン化支援能が変化することも新たに発見した。イオン化のメカニズムは未だ明らかになっておらず、多角的な思考と分析が必要だと思われるが、未知の領域を開拓する意義が大きく興味深い。本研究では、磁気ナノ微粒子を用いて、従来では検出不可能であった質量領域におけるイオン化を実現させるとともに、質量分析スペクトルの高分解能化をはかることを目的としている。最終的にはすい臓がん細胞の高解像度の質量分析イメージングを実現し、がんの原因となる物質とその分布を明らかにし、新たな病理分析方法を提案するつもりである。上記目標を踏まえて、1.磁気微粒子の作製、2.検体の選定、3.イオン化支援機能の確認、4.質量分析スペクトルの解析を順次進めていった。磁気微粒子には鉄の酸化物を主体として、一部の鉄イオンをニッケルイオンに置換したNiFe2O4(ニッケルフェライト)系の微粒子を新たにマトリックスとして作製した。検体としては、標準的な試薬であるアスピリンやコルヒチンを選んだ。マトリックスの粒径を3ー10 nm程度に制御したところ、小さい径のものが、より検出能力があることが明らかになった。さらにアミノ基を修飾すると、よりイオン化支援機能が向上することもわかった。また吸光度測定と粒度分布測定を行うことでイオン化支援機能の検出感度との相関を考察してみた。アミノ基を修飾したのち、フーリエ変換赤外線分光(FTーIR)測定よりN Hの振動のピークを確認することができ、アミノ基の修飾が成功していることがわかった。粒度分布計での分析によると、アミノ基修飾後は、水中の分散性も向上していた。昨年度までに、アモルファスSiO2に内包されたTiO2ナノ微粒子を作製し、この微粒子が薬剤等の比較的低分子の検体を、イオン化することが可能なことが明らかになった。さらに、微粒子を覆うSiO2の層の厚みの違いにより、イオン化支援能が変化することも新たにわかった。しかしながら、より高分子の検体をイオン化し、検出することができれば、糖や脂質など、より幅広い情報を得ることができる。そこで、金属部分のチタン(Ti)の部分を、鉄(Fe),ニッケル(Ni)に変化させることを試み、さらにイオン化支援機能を向上させることを予想して、微粒子の表面に官能基を修飾する方法を取り入れた。作製試料はアモルファスSiO2に内包されたNiFe2O3,ニッケルフェライトであり、この物質について、吸光度や分散性、さらに放射光を用いて局所構造の分析も行いイオン化支援機能との関係を解明していくことができた。
内在性レトロトランスポゾンを用いたミヤコグサの遺伝子タギング系の開発

本研究ではミヤコグサ内在のレトロトランスポゾンLORE1,2を用い、ミヤコグサで遺伝子タギング系を確立する事を目的としている。昨年度に、DNAのシトシンメチル化を制御する遺伝子の発現を低下させたミヤコグサの形質転換体においてLORE1が転移していたことを受け、更なる解析を行った。その結果、組織培養を経て再分化させた植物体の後代の集団において、LORE1の活性化が確率論的に生じていることがが分かった。つまり、LORE1の活性化は組織培養を介して誘導でき、活性化に外来遺伝子の導入は必須ではなく、非形質転換体においてもLORE1の転移を誘導できる事が分かった。活性化されたLORE1の転移様式を解析した。再分化当代個体のゲノムにおけるLORE1のコピー数増加はこれまでに認められておらず、したがって培養期間中にはLORE1の転移は生じないか、その頻度はきわめて低いと考えられた。一方で、LORE1の新規転移コピーは再分化当代の自殖後代において高頻度に検出された。この事から、LORE1が転移する場は植物体であることが分かった。転移は配偶体的に起きており、この事は、独立の転移挿入数を多く蓄積する必要がある遺伝子タギング系の確立にとって、LORE1が非常に適している事を示す。以上、人為的なLORE1の誘導に成功した事により、LORE1を利用したミヤコグサの遺伝子タギング系確立が実現可能となった。ミヤコグサ遺伝子タギング系は、植物の新しい分子生物学的研究基盤として、またマメ科植物の農学的研究を加速するツールとして、その利用が期待できる。ミヤコグサ内在のレトロトランスポゾンLORE1,2を用いて遺伝子タギングを行うことを目的としている。平成18年度は、詳細が分かっていなかったLORE2について分子的特徴づけを行った。また、LORE1,2の転移誘導に関する解析を行った。実験系統Gifuの2つの共生変異体において、それぞれの原因遺伝子にLORE2の挿入が見られた。解析の結果、これら2コピーのLORE2間には多型が存在し、独立のコピーであることがわかった。このうち1つは、少なくとも数万年間不活性だったLORE2コピーに由来する転移であることが分かった。実験系統MG20の液体培養細胞において、Gifuに比べLORE2の転写活性が高いことが分かり、MG20では培養によりLORE2の転移を誘導できる可能性が示唆された。LORE1,2を強転写させることによる転移誘導を試みた。35Sプロモータのエンハンサー領域をLORE1,2それぞれの5'上流に連結したコンストラクトを作製し、シロイヌナズナとミヤコグサに導入したが、形質転換体の次世代における転移はこれまでのところ観察されていない。その原因として、さらに高い転写が転移に必要な可能性が考えられた。そこで、エンハンサー4個をタンデムに連結したものをLORE1,2の5'上流につないだコンストラクトを作製した。このコンストラクトを現在シロイヌナズナに導入している。LORE1a(転移活性を持つLORE1のネイティブコピー)のメチル化状態が、野生型系統(WT)とLORE1の転移が以前に生じた系統との間で異なっていた。このことから、WTにおいてLORE1がシトシンメチル化を介したエピジェネティックな不活化を受けている可能性が示唆された。実際、受け入れ研究室において見いだされたイネのシトシン低メチル化変異体において、内在のレトロトランスポゾンTos17の転移が観察されている。そこでこの変異体におけるTos17の転移様式等を解析した。今後ミヤコグサで、ゲノムメチル化を維持する遺伝子のRNAi形質転換体の解析を行うが、そこから得られる知見を考察する上でイネから得た情報を利用する。ミヤコグサ内在のレトロトランスポゾンLORE1,2を用い、ミヤコグサの遺伝子タギング系を確立する事を最終目的とし、研究を行っている。レトロトランスポゾンの転写は、その転移に必須である。逆に、宿主ゲノム側はレトロトランスポゾンの転写を抑制する事により、その転移頻度を低く抑えていると考えられる。シトシンメチル化等によるエピジェネティックなサイレンシング機構の大きな意義のひとつが、トランスポゾンの転写・転移抑制であることが明らかにされつつある。メチル化阻害剤の処理によりゲノムワイドなシトシンメチル化低下を誘導したミヤコグサの培養細胞において、LORE1,2の転写量が僅かながら上昇したため、LORE1,2もメチル化による不活性化を受けていると考えられた。そこで、ゲノムDNAのメチル化維持に関与していると考えられる遺伝子のRNAi形質転換体をミヤコグサで作製したところ、ゲノムのシトシンメチル化の低下とLORE1の転移を誘導することに成功した。現在、ミヤコグサの遺伝子タギング系確立に向け、LORE1の転移様式やメチル化状態などの基礎的データの収集を行う一方、タギング系の汎用性を向上させるべく、非形質転換体におけるLORE1転移誘導を試みている。トランスポゾンは宿主ゲノム中で時間とともに転移活性を失っていくと考えられるが、トランスポゾンの寿命についての実験的データはほとんど無い。ミヤコグサのLORE2の中に、転移活性を持つ非常に古い(60万年前の)コピーがあることを見いだしたので、これについて論文を投稿中である。

また、トランスポゾンに富むゲノム構造を持つイネにおいて、トランスポゾンを標的としたシトシンメチル化が、遺伝子の発現制御にも大きな意義を持つ事を明らかにし、現在論文を準備中である。本研究ではミヤコグサ内在のレトロトランスポゾンLORE1,2を用い、ミヤコグサで遺伝子タギング系を確立する事を目的としている。昨年度に、DNAのシトシンメチル化を制御する遺伝子の発現を低下させたミヤコグサの形質転換体においてLORE1が転移していたことを受け、更なる解析を行った。その結果、組織培養を経て再分化させた植物体の後代の集団において、LORE1の活性化が確率論的に生じていることがが分かった。つまり、LORE1の活性化は組織培養を介して誘導でき、活性化に外来遺伝子の導入は必須ではなく、非形質転換体においてもLORE1の転移を誘導できる事が分かった。活性化されたLORE1の転移様式を解析した。再分化当代個体のゲノムにおけるLORE1のコピー数増加はこれまでに認められておらず、したがって培養期間中にはLORE1の転移は生じないか、その頻度はきわめて低いと考えられた。一方で、LORE1の新規転移コピーは再分化当代の自殖後代において高頻度に検出された。この事から、LORE1が転移する場は植物体であることが分かった。転移は配偶体的に起きており、この事は、独立の転移挿入数を多く蓄積する必要がある遺伝子タギング系の確立にとって、LORE1が非常に適している事を示す。以上、人為的なLORE1の誘導に成功した事により、LORE1を利用したミヤコグサの遺伝子タギング系確立が実現可能となった。ミヤコグサ遺伝子タギング系は、植物の新しい分子生物学的研究基盤として、またマメ科植物の農学的研究を加速するツールとして、その利用が期待できる。