hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自律神経による心機能制御の分子メカニズム

心臓に発現するアデニル酸シクラーゼサブタイプの生理的意義を、ノックアウト動物などの遺伝子操作、サブタイプ特異的作動薬などの薬理学的手法を用いて、心機能制御に及ぼす影響を中心に検討した。とくに近年になってcAMPシグナルの新しい下流蛋白として同定されたEpacと呼ばれる制御蛋白を中心にアデニル酸シクラーゼサブタイプとの連関を中心に検討した。本申請は、心機能の最大の制御メカニズムである自律神経調節の分子メカニズムの解明であり、交感神経刺激は心機能の最大の調節因子であることは数十年にわたって認識されてきたが、本研究によって、その分子メカニズムがcAMPによるシグナルネットワークの制御として解明されつつある。我々のこれまでの研究結果から、心臓型アデニル酸シクラーゼは末梢組織では心臓に選択的に発現すること、同酵素サブタイプの欠損によっても心機能の低下は見られないこと、しかるに圧負荷状態においては心機能維持に貢献することなどがわかっている。そこで慢性カテコラミン負荷状態における心機能の変化および心筋生存性に、同サブタイプの果たす役割を検討した。すでに予備実験の結果から、慢性カテコラミン負荷時においても、通常のマウスに見られる心機能低下がみられず、心筋細胞の生存性が保たれている可能性がある。この理由として、cAMPシグナル系のダウンレギュレーションメカニズムないし心筋細胞内のAkt等を中心とする細胞保護シグナルに心臓型サブタイプが役割を果たしている可能性がある。1.cAMPシグナルのダウンレギュレーションcAMPシグナルのダウンレギュレーションは過剰なカテコラミンシグナルに対する防御反応の一種であり、受容体レベルでの制御を中心とし、標的酵素レベルでの変化はすくないとされていた。心臓型アデニル酸シクラーゼ欠損動物の所見から、標的酵素レベルの変化が、心臓型については見られる可能性があり、心臓型欠損モデルと、過大発現モデルとの比較によって、心臓のカテコラミンシグナルのダウンレギュレーションにおけるアデニル酸シクラーゼサブタイプの果たす役割を実証した。2.心筋細胞の生存性Aktシグナルの調節は、細胞保護作用と関連するとされるが、cAMPシグナル自体がAkt系の調節に関与している可能性がある。そこで慢性カテコラミン負荷実験において、心臓型アデニル酸シクラーゼ欠損および過大発現モデルにおいて、それぞれどのようなAkt系のシグナル制御の上下変動が起こることを示した。3.心臓型アデニル酸シクラーゼの薬物制御これまでに解析された薬物以外に、心臓型アデニル酸シクラーゼの活性調節が可能な薬剤を検討した。本年度では、心臓におけるcAMPシグナルの変化が、心機能にどのような影響を及ぼすのかを、心臓に特異的に発現する5型アデニル酸シクラーゼの観点から検討した。心臓型アデニル酸シクラーゼは自律神経刺激によって酵素活性を上昇させ、cAMPを産生して心機能を制御するからである。我々は、当初の計画に沿って、アデニル酸シクラーゼ過大発現モデルにおける変化を検討した。5型ノックアウト動物において各種ストレス負荷に対して心筋保護作用があり、交感神経制御が低下するのなら、過大発現ではその反対が推測された。5型過大発現モデルでは、心機能の亢進が見られるとともに、カテコラミン刺激によって心筋アポップトーシスの亢進が観察され、当初の仮説である5型サブタイプの心機能制御における重要性が確認された。さらに重力刺激を変化させた場合に自律神経刺激の変化によって、心拍数変動に変化がおこることが知られているが、昨年までの実績において、5型サブタイプノックアウトにおいては、心拍数変動から推測した自律神経制御機構の低下が見られ、逆に過大発現モデルにおいては制御機構の亢進が見られた。そこで本年度においては5型サブタイプの選択的な作動薬を用いて、野生型マウスに投与した場合にも遺伝子操作を施したモデルと同様の変化が見られるかを検討した結果、我々の開発してきた5型サブタイプ選択的刺激剤で交感神経制御の亢進が、同阻害剤で低下が見られることが確認された。これらの結果から我々の仮説の正当性が証明された。
大腸癌細胞の生化学分子薬理学的特性の系統的解析とその理論に立脚した新治療法の開発

進行大腸癌に対する新しい治療戦略策定のため、in vitro,in vivo,臨床検体において系統的有機的に生化学分子薬理学的解析をすすめた。平成5年度は、5-fluorouracil(FU)獲得耐性株を用いてその耐性機序、耐性様式、耐性克服方法を研究した。獲得耐性ではFUの標的酵素thymidylate synthase(TS)の活性上昇がみられ、TSmRNA発現量増加が認められた。一方FUのRNA転入量は有意に増加していた。すなわち耐性獲得の過程において細胞性格が大きく変化し、RNA指向型細胞毒性に対しより感受性に変化したことが解明された。FU獲得耐性克服にはRNA障害指向戦略が示唆されたため、新しい葉酸代謝〓抗剤;Edatrexateを用いてEdatrexate→FUのsequentialなbiomodulation(BM)をヒト大腸癌株で研究した。IC〓レベルのごく低濃度のEdatrexate先行投与にてFU単独よりも殺細胞効果は23倍改善し、これはFUのRNAへの転入量が2倍増量していたことと関連しており獲得耐性克服の指標が得られた。IL-1,IL-2を用いてFU効果増強のBMも研究した。極めて低濃度のIL-2(100u/ml)を併用することにより2.79.7倍の効果増強が得られた。IL-2はTSの三元共有結合複合体の安定化増強作用を有することが示唆され、還元型葉酸代謝への作用も考えられた。IL-2の生化学的直接作用の解明へと発展させたい。FU耐性要因の分子薬理学的解明と新しい感受性試験の開発目的にてTS遺伝子の検出方法を確立した。獲得耐性株では18.7倍の耐性度を示し、TS活性上昇、TSmRNA発現増加(4倍)、ゲノムDNA中のTS遺伝子増幅は認められずmRNAへの転写レベル増大またはmRNAの安定性指向によるものと考えられた。臨床検体を用いて、上記各因子と臨床効果との関連性を解析中である。
創発化学の自己組織化的デザイン

自己集合と散逸構造形成という2つの過程が協奏する場合には、単純な系であってもnmからmmにおよぶ階層的な秩序の創発を認めることができる。本課題では、熱力学的視点と実験の2つの観点から化学システムの創発に関する研究を行った。(1)系と環境との相互作用を取り入れた反応拡散数理モデルを用いて、熱力学的量と創発の関係について検討した。新たに定義された化学ポテンシャルを用いて計算されたエントロピー変化(エントロピー生成とエントロピー流の和)は、非平衡系の創発現象を熱力学的議論に適していることが示された。(2) C_<60>(nm)のトルエン溶液の脱ぬれによって巨大な対数ラセン(mm)が創発するモデル実験系をデザインした。この現象を記述する数理モデルを構築し、溶媒と溶質に求められる物性の抽出も行った。分子ナノシステムの創発化学における自己組織化の役割を明らかにする。すなわち、分子から分子ナノシステムへの創発と、分子ナノシステムの機能の創発、という2つの大きな学理的課題を体系化するための熱力学的基礎研究を行う。具体的には、エントロピー生成を基軸に据え、自己組織化を熱力学的立場から一元的に捉える学理の充実を図る。平行して、時空間的ゆらぎの下でのコロイド系の秩序化条件を実験的に探り、熱力学的議論と対照して、数理科学的アプローチの有用性と限界を意識した研究を展開する。可逆3分子反応を記述するr-GSモデル(U+2V⇔3V : CREST (20022007)で開発)を、本領域の研究目的に見合うように整備をすすめた。従来の非平衡系のシミュレーションでは、系の環境(外界)は変化しないという条件を課すのが一般的であったが、本研究は階層形成を主題とするところから、「系が存在することによる環境への影響」と、「環境を介した系自身へのフィードバック」が議論できる階層モデルの構築を先行させた。あわせて、パターン形成を非平衡熱力学的視点から定量的に議論するために、エシトロピー流およびシステム全体のエントロピー変化という熱力学的指標を新たに導入した。R-GSモデルに現れる、自己増殖系とチュ-リング構造形成系のパターン形成の2つについて、エントロピー生成を加えた3つの熱力学的指標の変化を計算した。自己増殖系では、パターンの発展とともに系のエントロピー生成は増加し、システム全体のエントロピーも増加した。これに対しチューリング構造形成系では、これらの熱力学的指標は全く逆の振る舞いを示した。これらのことから、系内のエントロピーを環境に捨てる場合でも、環境から系内にエントロピーが流入する場合でも、系内でパターン形成が起こる条件があることが示唆される。(2)外部摂動下におけるコロイド分散系の配列形成に関する実験については、測定・観測等の実験装置の整備を行った。(3)領域内連携に関しては、研究代表者訪問や班会議等を通じて役割の明確化を図るとともに、公募研究の準備を行った。(1)昨年度の成果を踏まえ、系と外部環境の相互作用の解析を行った。系の働きかけにより外部環境が揺らぎ、固定境界条件下では得られない特異なパターンが形成する条件があることが数理モデルを用いた研究によって示された。また、系と外部環境という階層間の相互作用をエントロピーの収支バランス(熱力学的視点)から定量的に議論するために、平衡状態にある物質ではなく非平衡条件下にある系の状態によって定義される新しい化学ポテンシャルの概念を導入した。(2)分子系の創発現象の例として、フラーレンC_<60>,C_<70>,C_<76>溶液を基板上で蒸発乾固させたときのパターン形成(脱ぬれ現象)に関する検討を開始した。フラーレン微結晶が形成する大域的な脱ぬれパターンとフラーレンの分子構造・脱ぬれ速度・基板表面構造等の諸因子との関係について基礎的な知見を得た。フラーレン微結晶のラセン状配列という興味深い現象も観測された。より大きな構造要素が関与する創発現象の例として、交流電場下におかれた球状および板状シリカコロイドのインピーダンス分散及び連珠配列形成に関する検討を行った。板状シリカコロイドの界面分極現象は球状シリカの場合よりも増強されることが示された。さらに、生体反応系の動的階層機能の化学モデルとして、ベローソフ・ジャボチンスキー反応パターンに対する共存ミセルの摂動効果についても検討を加えた。(3)階層形成におけるゆらぎの建設的な役割を明らかにするために、材料科学におけるコヒーレンス・レゾナンスの研究者との連携を開始した。

(1)昨年度に引き続き、系自身の働きかけにより外部環境が揺らぎ、かつ系自身にもその影響がフィードバックされるような、入れ子になった一次元反応拡散系について検討を進めた。3つの定常点をもつ反応拡散系では、系が安定定常点から不安定定常点に遷移しても、しばらくの間は不安定定常点が見かけ上安定に見えるという現象がしばしば観測される。この系の空間非一様性について分散をもとに解析を進めたところ、定常点が安定の時には分散は小さくなるが、不安定になると次第に大きくなり、いわゆる定常点の安定性に従っていることが確認された。この見掛けの安定性は、コヒーレンス・レゾナンスによる過渡的な創発現象である可能性が示唆された。なお、ゆらぎがさらに発達すると系はカオス的なパターンを示すようになるが、これは決定論的なゆらぎがカオスを誘起する興味深い創発現象である。(2)フラーレン微結晶によるラセン構造の創発について実験的検討を行った。当初発見されたラセン構造のサイズは数十ミクロンであったが、マイクロニードルなどを基板上に静置することにより、フラーレン微結晶の巨大ラセン配列(mm)の形成過程の直接観察に成功した。脱ぬれに伴い移動する三相線がメニスカス領域にはいると回転モードが発生し、脱ぬれがラセン状に進行した。基板に形成されたラセン構造はフラーレンの微結晶からなる対数ラセンで、動径方向に対し等比級数的な脱ぬれが生じていることを示している。この現象がメニスカス領域で起こることを踏まえ、等比級数的な脱ぬれパターンを形成するシンプルな数理モデルを構築した。(3)領域全体との連携として、実験研究者のラボ訪問や合同セミナーなどを行い、球状錯体の形成過程や分子デバイス機能とゆらぎとの相関についての議論をすすめた。本研究では、分子ナノシステムの創発化学における自己組織化の役割を明らかにするために、自己組織化を熱力学的立場から一元的に捉える学理の充実を図るとともに、時空間的ゆらぎの下でのコロイド系の秩序化条件を実験的に探る。本年度は以下の研究を行った。(1)理論:昨年度に引き続いてミニマルモデルである可逆3分子反応(r-GSモデル:U+2V⇔3V)を用いて、決定論的な内因性ゆらぎの創発現象における役割について以下の考察を行った。r-GSモデルで構成される反応拡散系では、系が定常点から不安定定常点に遷移しても系は直ちに不安定化せず、当面は安定なように見えるという現象がしばしば観測される。相空間における軌道のベクトル解析を行った結果、この擬安定状態は系と環境との相互作用に由来するものであることが示された。このことはまた、階層性を持つシステムでは、決定論的な内因性ゆらぎを積極的に利用する(環境と系の微弱な相互作用を制御する)ことにより、系単独では実現しえない状態を作る方法論を示唆するものと考えられる。なお、環境と系との相互作用はエントロピー流によって定量的に議論できる。(2)実験:フラーレン分子(C_<60>)やコロイド粒子の形状因子(球形、非球形)が巨視的構造の創発に及ぼす影響についてさらなる検討を進めた。C_<60>溶液の脱ぬれ系では、基板上にガラスビーズ等を置くことにより、C_<60>微結晶からなる対数ラセン配列形成という階層を超えた構造の創発が一層容易になった。さらに、溶媒蒸発ならびにスティック・スリップ・モーションを考慮に入れたメニスカスのダイナミクスを記述する数理モデルを構築した。
海産無脊椎動物からの抗カビ物質の探索

伊豆諸島,伊豆半島,紀伊半島,薩南諸島および琉球諸島で,海綿動物を中心に,海産無脊椎動物93種を採集し,それぞれを熱メタノールで抽出後,脂溶性および水溶性画分を調製して,各画分のMortierella ramannianus, Candida albicansおよびPenicillium chrysogenumに対する抗カビ性をペーパーディスク法で調べた.その結果,海綿動物が活性の出現頻度と強さの点で,抗カビ物質の探索対象として最も有望と判断された.また,脂溶生画分に活性がみられる検体が多かったが,海綿動物では水溶性画分にも活性が認められたものが割合多かった.なお,海綿以外にはあまり有望そうな種類はみられなかった.上記スクリ-ニングで浮かび上がった活性種のうち、まず腔腸動物ヤギ類類のトゲナシヤギAcalycigorgia inermisから活性物質の分離を試みた。すなわち、生試料をエタノ-ルで抽出後、溶媒分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィ-およびHPLCにより精製して、acalycixeniolideA(1__)とB(2__)と命名した2つの抗カビ物質を得た。これらの構造は主に機器分析により珍しいノルジテルペンと判明した。次に、八丈島産海綿Petrosia 5pから、petrosynal(3__)と命名した特異なC_30-ポリアセチレンアルコ-ルを単離して、絶対構造まで明らかにすることができた。四国の佐多岬、日振島、沖ノ島などで、海綿、腔腸および原索動物を主体に50種余を採集し、常法に従って水溶性および脂溶性画分を調製した。各画分につき、Candida albicans, Matierelia ramannianusおよびPencillium Crysogenumに対する抗カビ活性をペーパーディスク法で調べた。その結果、前年度と同様に、海綿動物が活性の出現頻度と強さの点で、抗カビ物質の探索対象として最も有望と判断された。なお、脂溶性画分に活性を示すものが多かったが、水溶性画分にもいくつか活性を示したものがあった。上記スクリーニングで浮かび上がった活性種のうち、まず腔腸動物ヤギ類のAcalycigorgia sp.から活性物質の単離を試みたところ、3つの活性成分、ginamallene (1__),acalycixeniolida B'(2__)およびC(3__)を得ることができた。これらの化学構造は主にNMR分析によって行った。次に紀伊半島産海綿Mycale sp.から活性物質の単離を試み、3つの活性物質mycalolideA-C(4__-6__)を得て、その構造をトリスオキサゾールを含む特異なマクロリドと決定することができた。
均一な熱浴中での方向性のあるブラウン運動の発現

ロッドの形状をした高分子の溶液中での一次元ブラウン運動を研究した。その高分子の両端をそれぞれプラス端、マイナス端と呼ぶことにする。その高分子はその長軸に方向の運動に対して溶媒から反対方向の摩擦力を受ける。プラス端方向への運動に対する摩擦係数がマイナス端方向への運動に対するそれより小さければ、時間が経てば、プラス端方向へ徐々に動いて行くように直感的に思われる。マクロな物体では摩擦係数の差を利用してランダムな力によって一方向に動くものはいくらでも存在する。本研究の目的は、このような一方向へのブラウン運動がミクロな世界でも起こるかどうかを明らかにすることである。長い高分子として、ミオシンサブフラグメント1(S-1)でデコレートされたアクチンフィラメントを用いた。S-1はアクチンフィラメントの長軸に対して約45°の角度で結合する。従って、この複合体はその長軸に沿って非対称性をもつ。この複合体の一次元運動を実現するために、溶媒中にメチルセルロースを加えた。この複合体を蛍光顕微鏡下で可視化するために、アクチンを蛍光色素で染色した。また、アクチンの極性を可視化するために、そのB端側はP端側を異なる蛍光色素で染色するか、同じ色素で異なる度合いに染色した。ブラウン運動をその運動方向とアクチンの極性との関連を含めて観察することができた。アクチン-S-1複合体はほぼ一次元で運動した。しかしながら、この複合体の重心位置を精度良く測定することが困難であった。これは、この複合体が柔らかく、その全長にわたって対物レンズの焦点面にあることが稀であることによる。そのようなことがたまに起こっても、数秒後には焦点面からずれていってしまった。ともかく、得られたデータを解析したが、どちらの方向に優位な運動が起こっているかどうかを、この測定精度内では検出できなかった。フィラメントを硬くするために、トロポミオシンを加えたり、アクチンを化学処理した。確かに硬くはなったが、やはり長い時間焦点面内に留まることは稀であった。結論として、3次元で物体を追跡できる装置が必要である。このような装置を近い将来開発する。長い棒状高分子として筋肉のアクチン分子の線形重合体であるアクチンフィラメントを利用した。アクチン分子を蛍光色素で染色して蛍光顕微鏡下で可視化した。アクチンフィラメントの前後を区別するために、3種の方法を試みた。いずれも、アクチン分子のフィラメントへの重合が一方向に起こる性質を利用した。(a)1種の蛍光色素で染色するが、染色されたアクチン分子の密度にフィラメントの前後で差をつける。(b)フィラメントの前後を異なる色素で染色する。(c)フィラメントの一端に非常に強い蛍光を出すフィコビリ蛋白を結合させ、フィラメントの全体を1種の蛍光色素で染色する。(b)、(c)の場合には、蛍光顕微鏡内にある2種のフィルタ-ボックスにXー軸ステ-ジを連結して、コンピュ-タコントロ-ルにより、励起及び蛍光のフィルタ-を一緒に切り替えられるように工夫をした。これらの方法でフィラメントの前後を区別することができた。フィラメントをメチルセルロ-スの溶液に分散させて、ブラウン運動がフィラメントの長軸に沿って優先的に起こるようにした。

メチルセルロ-スのネットワ-クの中で、フィラメントの長軸方向の摩擦係数に異方性をもたせるために、ミオシンSー1をフィラメントに結合させた。Sー1はフィラメントの長軸に対し45度の角度で結合する。このように調製したサンプルのブラウン運動の観察を開始した。一番の困難は、ブラウン運動によりフィラメントが対物レンズの焦点面から外れていって、追跡できなくなってしまうことである。できるだけフィラメントがXーY平面内に留まるように、いくつかの工夫を現在試みている。理論については、具体的結論はまだ得られていないが、現在進行中である。溶液中にある長い棒状高分子が一次元のブラウン運動をするとき、その長軸のプラス方向の溶媒に対する摩擦係数がマイナスのそれより小さい場合、平均としてプラス方向に運動していくように直感的に思われる。マクロな世界では、摩擦係数の差のためにランダムな力によって方向性のある運動が実際に起こる。ミクロな世界でもこのようなことが起こり得るかどうかを調べる目的で実験及び理論的考察を行って来た。棒状高分子として、アクチン分子の線形重合体であるアクチンフィラメントがミオシンのサブフラグメント(Sー1)と結合したものを用いた。Sー1はアクチンの長軸に対し約45度に結合するので、これは非対象な構造をもつ。長軸方向の一次元運動を実現するために、溶媒にメチルセルロ-スを加えた。アクチンは蛍光染色され、蛍光顕微鏡下で観察された。アクチンフィラメントの極性を知るために、そのP端側とB端側の約半分づつを異なる蛍光色素で染色するか、もしくは、ひとつの蛍光色素で染色度を変えて染色した。以上の実験系の調製は成功し、Sー1・アクチンフィラメントのブラウン運動の様子がその極性と運動の向きとの関係も含めて観察された。確かにほぼ一次元的なブラウン運動が起こる事が確認された。しかしながら、その一次元内での向きの優位性は実験精度内でいまのところ見られない。アクチンフィラメントが全長にわたって対物レンズの焦点面内に観察の始めからあることが稀にしかないこと、またアクチンフィラメントが柔らかくその端の部分が対物レンズの焦点面からずれて行ってしまうことにより、フィラメントの重心位置の測定に誤差が生じてしまった。すなわち、全体の長さが見かけ上揺らいでしまって、ブラウン運動による真の重心位置の変化を正しく評価することが困難であった。フィラメントを硬くできればこの困難を一部克服できるかもしれない。理論的考察はまだ十分でない。
新規シリサイド半導体の熱電物性の探索

Bドープp-BaSi2膜をスパッタ法で石英基板上に基板温度470°Cで堆積した。B濃度が1cc当たり10の21乗のとき、室温で抵抗率は0.005Ωcmまで下がった。しかし、熱電応用のためには、抵抗率をさらに下げる必要があると考え、基板温度をさらに昇温できるよう別のスパッタ装置に移行した。しかし、BaSi2ターゲットと基板間の距離が7cmから20cmへと大きくなったことで、スパッタ膜のSi/Ba比がストイキオメトリーからズレた。この現象はArに対するBaとSiの質量差に起因する散乱の影響で説明できた。Ar圧力を3.0Paと高めに設定することで、600度でBaSi2膜の形成に成功した。BaSi2は、資源が豊富なBaとSiで構成される半導体であり、これまでの研究から、分子線エピタキシー法において、n型およびp型ともに1cc当たり10の20乗に達する高いキャリア密度を実証してきた。また、第一原理計算からも大きな熱起電力を期待できることが分かっている。しかし、申請者の知る限り、BaSi2を使って熱電素子を目指した研究は行われていない。本研究では、不純物を1cc当たり10の19乗以上の高濃度にドーピングしたn-BaSi2膜及びp-BaSi2膜をスパッタ法でガラス基板上に堆積し、これらのゼーベック係数、電気伝導率、熱伝導率等の基礎物性を測定して熱電材料の性能指数を求め、熱電素子を作る前段階として、BaSi2の熱電材料としてのポテンシャルを明確にすることを目的とする。H26年度は、Bドープp型BaSi2膜をRFスパッタ法にて石英基板上に堆積し、作製した膜の電気特性および熱電特性を評価した。堆積時の基板温度は470°Cで、BaSi2ターゲット上の一部にBシートを置いて、BがBaおよびSiと同時にスパッタされるようにした。その結果、B濃度が1cc当たり10の21乗のp型BaSi2膜の形成(厚さ1μm)に成功し、室温で抵抗率は0.005Ωcmまで下がった。同じ作製方法でSbドープBaSi2膜の形成も可能と考えられる。しかし、作製したBドープp型BaSi2膜の熱電特性を評価したところ、試料温度が500°Cを超えると電気特性の測定ができなくなった。これはBaSi2膜にクラックが生じたためであることが分かった。クラックの原因は、基板に使っている石英よりもBaSi2の線熱膨張係数が約30倍も大きいことが原因と考えられる。H27年度は、線熱膨張係数の大きな基板を用いる必要がある。H26年度は、BaSi2ターゲットの一部にBシートを置いて、BがBaおよびSiと同時にスパッタされるようにして、Bドープp型BaSi2膜をスパッタ法にて石英基板上に堆積した。堆積時の基板温度は470°Cで、室温で抵抗率は0.005Ωcmまで下がったが、熱電応用のためには、抵抗率をさらに1桁下げる必要があった。抵抗率を下げるにはドープしたBの活性化率向上が不可欠と考えた。このため、H27年度は基板温度をさらに高温まで昇温できるようH26年度と別のスパッタ装置に移行し、さらに、ヒーター部を改造してランプ加熱により600°Cまで基板温度を昇温できるようにした。実験ではBaSi2とほぼ同じ線熱膨張係数をもつCaF2(111)基板を用いた。当初、すぐにBaSi2膜が形成できると考えていたが、装置を変えたことでBaSi2ターゲットと基板間の距離が7cmから20cmへと大きくなり、Ar圧力が0.1 Paで作製した試料はスパッタ膜のSi/Ba比がストイキオメトリーから大きくSiリッチ側にズレた。一方、スパッタ時のAr圧力を高くするにつれ、膜の組成比がターゲットの組成比に近づいた。このターゲットとの組成比のずれは二つの要因から起きたと考えられる。第一に、Baのスパッタ率がSiに比べ非常に小さいためである。第二にプロセスガスのArに対するBaとSiの質量差に起因する散乱の影響である。スパッタされた粒子の平均自由行程は圧力に反比例する。また、Ba原子とSi原子の質量数はAr原子に比べ、それぞれ約3.5倍、0.7倍である。このためAr圧力の増加に伴い、Arに比べ軽いSiが衝突による散乱の影響を大きく受け、膜内の組成比が変化したと考えた。Ar圧力を3.0Paと高めに設定することで、基板温度600度でBaSi2膜の形成に成功した。H26年度は、Bのドープ量を変えたBaSi2膜を作製し、室温から800Kまでの温度領域で熱電特性を評価することを目的とした。

これに対し、B濃度を1cc当たり、10の19乗から21乗の範囲で変えたp型BaSi2膜を形成することができた。抵抗率は、B濃度に応じて低下し、室温で0.005Ωcmまで下げることに成功した。高温時にBaSi2膜にクラックが入ったことで、熱電物性が当初計画通りには評価できていないため、やや遅れていると考えている。この問題は、潜熱膨張係数が大きな基板を用いることで解決できる。半導体電子工学H27年度は、熱電特性評価に必要な500°C以上の高温でもBaSi2膜にクラックが入らないよう、BaSi2とほぼ同じ線熱膨張係数をもち、且つ、電気伝導度の小さい基板を用いる必要がある。このような基板として絶縁体CaF2を用いる計画である。特に、CaF(111)は、Si(111)面とほぼ同じ格子定数をもつ絶縁体である。BaSi2膜はSi(111)面上に高配向して成長するため、CaF2(111)膜上でも、高配向膜の形成が期待される。H26年度と同じ手法を用いて、まず、Bドープp型BaSi2膜を形成し、熱電特性を評価する。並行して、SbドープBaSi2膜を形成して熱電特性を評価し、BaSi2膜の熱電材料としてのポテンシャルを明確にする。H27年度は、従来のBaSi2単一ターゲットを用いる方法から、BaリッチBaSi2ターゲットとSiターゲットの2元同時スパッタを行い、Si/Ba比により、電気特性および熱電特性がどのように変化するのかも調べる計画である。
レドックス感受性TRPチャネル群の炎症性細胞遊走における意義の分子医学的解明

活性酸素種は炎症の重要な制御因子である。今回、H2O2が炎症性細胞マクロファージにおいてTRPM2によるCa2+流入を惹起し、CXCL8産生を介した好中球の浸潤による炎症反応の調節を担うことを示した。今回、TRPA1が「O2センサー」として機能することも見出した。迷走神経においてTRPA1は高O2濃度及び低O2濃度を感知し呼吸機能を調節することがわかった。即ち、TRPA1はO2の分圧を鋭敏に感知し、組織へのO2供給を制御する仕組みを制御すると考えられる。TRPM2が活性酸素種(reactive oxygenspecies : ROS)を感知、活性化開口する、レドックス感受性Ca^<2+>透過型チャネルを形成する(Hara, Mol.Cell,2002年;2月号fbatured article)。また、TRPC1、TRPC4、及びTRPC5チャネルが、PLC活性化だけでなく、システイン残基酸化修飾により一酸化窒素(NO)やROSを感知して活性化開口し、Ca^<2+>を流入させる(Yoshida, Nature Chem.Biol.,2006)。このように、高レッドクス感受性を示すTRPチャネル群が細胞死との関連において研究されてきたが、生理的意義は依然として不明であり、解明が待たれていた。特に、TRPM2は単球、好中球、Tリンパ球、神経細胞等に豊富に発現しており、それらにおける生理的役割は不明であった。そこで、ROSシグナルとCa^<2+>シグナルとの直接連関を担うTRPM2チャネルによる、「炎症」におけるCXCケモカイン産生の制御機構とその意義の解明の解明を行った。まず、ヒトU937単球株in vitro培養系を主として用い、単球のROS依存性CXCL8(=IL-8)産生における、Ca^<2+>シグナルとレドックス感受性MAPキナーゼーNFkBシグナル経路のTRPM2による制御機構を明らかした。また、作製に成功したTRPM2ノックアウトマウスのin vivo炎症モデルである潰瘍性大腸炎等)を用い、CXCL2(=MIP-2)依存性の好中球浸潤における、TRPM2の役割をつきとめた。単球/マクロファージにおいて、活性酸素種により活性化されたTRPM2が活性酸素種によるケモカイン産生誘導に必須であることを明らかにした。また、炎症部位のマクロファージにおけるTRPM2依存的なケモカインの産生が好中球の炎症部位への浸潤を惹起し、炎症の増悪を引き起こしていることが明らかになった。本研究でTRPM2が単球/マクロファージにおいてケモカイン産生を引き起こし、好中球の浸潤を介して炎症を悪化させるメディエーターとして機能していることを明らかにした。侵害性冷刺激によって活性化されるチャネルとして見出されたヒトTRPA1がNO、過酸化水素、プロトン、そして15-deoxy-Δ12, 14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2)などといった様々な炎症性物質によっても活性化されることを明らかにした。ヒトTRPA1においてはマウスTRPA1のCys415、Cys422およびCys622に相当するCys414、Cys421およびCys621が存在するが、15d-PGJ2による活性化にはCys421およびCys621が重要である。ビオチン化15d-PGJ2を用いて15d-PGJ2の結合サイトを同定したところ、Cys621に強く15d-PGJ2が結合していることを我々は明らかにした。また興味深いことに、NOまたは過酸化水素によるヒトTRPA1の活性化にはCys421、Cys641およびCys665が、そしてプロトンによる活性化にはCys421がそれぞれ重要なシステイン残基であり、アゴニスト間で修飾するシステイン残基が異なることを示した。化学反応を行うための場であるTRPA1の立体構造が、アゴニストの特定なシステイン残基の修飾に影響を与えていることが考えられる。TRPM2の局在性を詳細に調べることにより、形質膜だけでなく細胞内膜にもゾンザイすることが明らかになった。特に、リソソームからのCa^<2+>放出を制御することにより、膵ベータ細胞の細胞死を制御することが明らかになった。細胞外からのCa^<2+>流入との連関を調べていくことが、本TRPM2の役割の完全な理解のためには重要である。(Lange et al., Science Signal.)TRPM7はMg^<2+>やCa^<2+>等の流入を制御することにより生理機能を果たすことが着目されてきたが、今回、TRPM7をin vivoノックダウンすることにより、マウス脳において、虚血時に活性化開口し細胞外から主としてNa^+を流入させることにより、神経細胞死を惹起させる役割が明らかとなった。

また、興味深いことに長期増強などのシナプス可塑性にも関与することがわかった。(Sun etal.,Nature Neurosci.)大腸炎とは異なる炎症病態への知見の拡大に成功した。動脈結紮による心筋梗塞-再還流モデルをTRPM2KOマウスに適用し、活性酸素種が深く関与する心筋細胞死へのTRPM2チャネルへの関与を用い調べた。野生型マウスに比較すると、本TRPM2ノックアウトマウスにおいては、顕著な心筋細胞死の減少が見られ、炎症性細胞の中でも、好中球浸潤の抑制が重要であることがわかってきた。ランゲルドルフ環流下、好中球を添加し心筋組織中への浸潤を調べたところ、特に、好中球の心血管への接着能の減少がこの表現型に大きな影響を与えていることが明らかとなった。ここで好中球の遊走因子として働くのはロイコトリエンB4であることも明らかとなった。また、TRPM2チャネルはCa^<2+>流入だけでなくリソソームからのCa^<2+>放出にも関与することが分かってきた。この過程は、マクロファージの細胞死の調節に関与することがわかったが、樹状細胞における分布を考慮するとそこでの重要性の方が高いことが予想される。この知見は、TRPM2の新たな機能的側面を示すものである。さらに、ストア依存性Ca^<2+>チャネルを形成するOraiタンパク質のシステイン残基の酸化修飾について我々の開発した活性ジスルフィドプローブを用いて解析したところ、特定のシステイン残基が酸化修飾をうけることもわかった。酸化修飾はチャネル活性はOraiによるストア依存性Ca^<2+>チャネル活性を減じることから、酸化修飾が免疫細胞の酸化ストレスを介した選択機構に関与していることが示唆された。異なった酸化力(酸化還元電位)を示す活性ジスルフィドを多数用意し、それらを添加した際のTRPチャネル活性を評価することで「酸化還元電位」と「TRPチャネル活性」との相関を調べた。その結果、酸化感受性TRPチャネルはそれぞれ固有の酸化感受性活性化の閾値をもつことが明らかになった。中でもTRPA1は最も高い酸化感受性を示し、その活性化閾値はO_2の酸化還元電位よりも低く、TRPA1のO_2に対する応答性が予見された。実際にTRPA1を発現させた細胞に高O_2溶液を添加してみると、TRPA1を介した陽イオン電流が観察された。また、Cys点変異体の機能的評価及びラベリング実験により、高O_2によるTRPA1の活性化には細胞質領域に存在するCys633とCys856の酸化が重要であることを見出した。さらに、TRPA1は驚くべきO_2に対する応答性を示した。即ち、N_2ガスを通気させた低O_2溶液がTRPA1を介した陽イオン電流を活性化したのである。TRPA1のO_2に対する容量-反応関係は逆ベル型を示し、極小の反応を引き起こすO_2分圧は137mmHgと、通常の大気圧におけるO_2分圧(152mmHg)より低い値であった。ところで、TRPA1のアミノ末端領域にはプロリン(Pro)
流体方程式における自発的流れパターン形成　――　解の特異性と大規模流動現象

線形波動を伴う流体系としてβ面上および回転球面上の二次元非圧縮流体系を対象として,ジェット流形成過程の詳細について理論的および数値的に調べた.このようなジェット流は木星などの惑星系でも見られるがその生成機構は未だ明確ではない.ここではジェット流への運動量輸送に着目し,波動入射に伴うジェット流形成過程について,弱非線形段階の記述を元に擬運動量の評価による加速量の定量的記述を目指し,ジェット流の線形安定性問題における連続モードの漸近表示を用いてジェット加速量を与える理論的表式を得た.またこの表式を,完全な非線形相互作用を含む数値計算を実行することによって,よい一致を確認した.本研究は,地球科学や宇宙科学で見られるジェット流の自発的形成現象を念頭に,これらの現象を支配する流体方程式を対象として,解の漸近的性質に着目し,1.大規模ジェット流の流れパターン形成に対し波動解の特異性に基づく定量的理論を構成すること,および,2.この理論的枠組みを代表的な大規模流れパターンの形成に適用し,高精度数値実験による比較検証を行うことを目的としている.平成24年度は,波動解の非線形相互作用によるジェット流形成過程を記述する理論的枠組みを整備した.最も典型的な流体系として,Charney-Hasegawa-Mima(CHM)方程式に支配されるβ面上の2次元非発散流体系を考えた.ここで念頭におくのは,乱流状態におけるジェット流の形成現象である.この現象の特徴として,乱流場ではあるが波動乱流系の特徴として弱非線形近似が良い精度で成り立つこと,すなわち流れ場を平均流と撹乱に分解したとき撹乱の低次の非線形性を考慮することによってジェット流形成過程がよく再現される性質がある.平成24年度は低次の非線形性を基にした枠組みによる定式化をβ面のCHM方程式系において実行した.その結果,擬運動量方程式の積分形方程式に,流れの安定性の一般固有値問題の連続固有値に属する固有関数の遠方における漸近形を用いることで,線形波の反射係数とジェット流加速の関係式を導いた.また併せてCHM方程式の時間発展の高精度数値計算スキームを作成し,理論結果と数値結果を比較し理論の妥当性の部分的検証を行った.さらにこれらの関係式と数値計算を用いて,ジェット流形成の定量的予測のための理論的枠組みの構築を進めているこれまでに,β面上の2次元非発散流体系について,波動解の非線形相互作用によるジェット流形成過程を記述する理論的枠組みを整備した.この系は波動乱流系であり,弱非線形近似が比較的良い精度で成り立つ特徴があるため,低次の非線形性を考慮することによってジェット流形成過程をよく再現できることが期待される.そこで,低次の非線形性を基にした枠組みによる定式化をβ面のCHM方程式系において実行し,積分された擬運動量方程式に,流れの安定性の一般固有値問題の連続固有値に属する固有関数の遠方における漸近形を用いることで,線形波の反射係数とジェット流加速の関係式を導いた.今年度は以上の理論的準備のもとにCHM方程式の時間発展の高精度数値計算スキームを作成し,線形波動が「波と平均流の相互作用」を通じて大規模流れパターンを形成する過程について数値計算を実行した.その結果,ロスビー波による波束型攪乱がシア流域に入射する際,波と平均流が臨界層を通じて相互作用することによって,波から平均流へと運動量が輸送される過程を再現することに成功した.一方,上述の関係式は平面波の反射率と透過率を基本情報としてシア流の生成率を与えるものであり,準単色波である波束への適用が必ずしも良い近似とは限らない可能性がある.これは,要素平面波の波数による臨界層の位置や運動量輸送率の相違によって,波束の反射と透過の記述に誤差を生じる恐れがあるためである.実際,準単色波の反射率と搬送波の反射率には差が見られたため,あらためて波束の反射から求めなおした反射率を用いることによって,数値実験結果と上述の理論式の間に良い一致が得られた.本研究では,β面上の2次元非発散流体系について,波動解の非線形相互作用によるジェット流形成過程を扱っている.この系は線形波動解が存在する系であり,弱非線形近似が比較的良い精度で成り立ちジェット流形成過程をよく再現できると期待される.本研究ではまず,β面のCHM方程式系において波動と流れの相互作用を研究した.波動の擬運動量方程式は,擬運動量とジェット流の低次相互作用を記述するが,このためには波動についての詳細なデータが必要であり,概念的記述には役立つもののジェット流の加速・形成現象の実際的な定量的評価に用いるのは不適当である.そこで本研究ではこの擬運動量方程式を時間と空間に関して積分した方程式を用いた.この方程式の利点は,波動解については遠方場の情報のみによって,ジェット流の最終加速量を与えることである.ここでさらに,波動解の遠方場は,ジェット流の安定性固有値問題の連続固有値の固有関数の構造,特に反射係数と透過係数によって与えられることに注意すると,ジェット加速量を固有値問題の解の構造と関係づけることができる.通常安定性問題において重要な不安定固有関数は遠方で指数的に減衰するため,本研究において重要なのは,中立固有関数の遠方の構造となる.以上の理論的結果に基づき,本研究では波動によるジェット流加速の数値計算を実行し,理論と数値結果の比較を行った.定量的

結果は,入射波束の構成にかなり敏感に依存することを示しており,理論結果と数値結果の比較は注意を要するため,本年度は前年度に引き続いて反射係数などの評価法について検討し小振幅の波動に対しては数値実験結果と理論結果の間に概ね良い一致を得た.非線形性の増加する場合の評価についての研究は進行中である.本研究ではβ面のCHM方程式系において波動と流れの非線形相互作用を調べている.概念的には,波動の運動量とジェット流の低次相互作用を記述する際には波動の擬運動量方程式を用いることが便利であるが,実際にこれを実行するためには波動についての詳細なデータが必要であり,概念的記述を越えてジェット流の加速・形成現象の実際的な定量的評価に用いるには不適当な面が多い.そこで本研究ではこの擬運動量方程式を時間と空間に関して積分した方程式を用いて現象の評価を実行する.この方程式の最も大きな利点は,波動解については遠方場の情報のみによって,ジェット流の最終加速量が与えられることである.またさらに,波動解の遠方場の漸近形が,ジェット流の線形安定性固有値問題の連続固有値の固有関数の構造,特に反射係数と透過係数によって特徴づけられることに注意すると,ジェット加速量を固有値問題の解の構造と関係づけることができる.以上の理論的結果に基づいて,本研究では波動によるジェット流加速に関して,理論と数値結果の比較を行うため,昨年度に引き続いて数値計算を実行した.数値結果は,小振幅の波動に対しては数値実験結果と理論結果の間に良い一致を得ており,上記の理論がジェット流加速の記述に適当な枠組みとなることを示している.これに対し,入射波束の振幅が増大し強い非線形効果が含まれる場合は,ジェット流加速が入射波束の形状,特に波束の拡がりや周波数構成などに敏感に依存する数値結果を得ている.上記の理論は弱非線形効果に関するものであり,このような強非線形領域は理論の枠外の現象であるが,さらに弱非線形理論からのズレを特徴づけることを目的に数値計算を継続している.本研究は,地球科学や宇宙科学の領域で見られるジェット流の自発的形成について,波動乱流中のジェット形成の基本過程の研究を目的としている.この過程は,定性的には流れの安定性理論の中で攪乱方程式の特異点問題として扱われ,運動量フラックスが特異点前後において変化することから,運動量が波から流れに輸送される過程と考えられる.このような過程の定量的記述は本研究で初めて扱うもので,安定性固有値問題の連続スペクトルに伴う固有関数の遠方の漸近形,特に波動の反射係数と透過係数を用いて運動量輸送量を与えることを企図している.本研究では,擬運動量方程式の積分によって,ジェット流加速と安定性問題の固有関数の漸近形を関係づける式の導出に成功し,その結果を数値解析によって検証している.これまでに入射波束の弱非線形段階について数値結果と理論的予測と良い一致を得ている.さらに強非線形領域の入射波束の場合にジェット流加速の特徴を調べるための計算を進めている.これらは本計画に沿った順調な進展である.本年度はβ面のCHM方程式系において波動と流れの非線形相互作用を調べた.本研究ではこれまでに擬運動量方程式を時間と空間に関して積分した方程式を用いて,ジェットの総加速量の表式を理論的に導出し,それを用いて数値的評価を実行した.この表式によると,ジェットの最終総加速量は,波動の遠方場の漸近形によって与えられる.波動解の漸近形は,ジェット流の線形安定性固有値問題の連続固有値の固有関数の構造,特に反射係数と透過係数によって特徴づけられることから,ジェット加速量は固有値問題と関係づけられる.そこで
黄体の機能制御における糖脂質とガレクチンの役割

黄体は、妊娠の成立と維持に必須なプロゲステロンを産生する組織で、排卵後の卵胞より形成される。妊娠が成立しない場合、ヒトの黄体は1週間ほどプロゲステロンを産生したのち、自発的に退行する。一方、妊娠が成立すると、胎盤より産生されるホルモン(hCG)の作用により、黄体は妊娠初期の数か月間機能を維持する。多くの動物で黄体の退行は子宮より産生されるプロスタグランジンF(PGF)により制御されるが、ヒト黄体の退行メカニズムは不明であった。本研究は、黄体細胞膜上のスフィンゴ糖脂質の質的・量的変化が、ヒトのみならずマウスやウシの黄体の退行メカニズムに関与することを明らかにした。黄体は排卵後の卵胞より形成され、妊娠の成立と維持に必須なプロジェステロンを産生する一時的な内分泌組織である。ヒトでは排卵後1週間ほど盛んにプロジェステロンを産生するが、妊娠が成立しない場合は速やかに退行する。黄体の機能は脳下垂体より産生される黄体形成ホルモン(LH)と胎盤より産生されるヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)により維持される。LHとhCGは黄体細胞上に存在する共通のレセプター(LHCGR)に結合し、cAMP/PKA経路を活性化することにより、プロジェステロンと黄体機能維持に働くプロスタグランジンE(PGE)産生を刺激する。我々はこれまでの研究により、beta-galactoseを認識するレクチンであるgalectin-1が機能黄体に強く発現しており、galectin-1と糖鎖の相互作用の低下がヒト黄体の退行に関与する可能性を示した。galectin-1は、脂質ラフトの構成成分であるGM1ガングリオシドに結合することが知られており、LH/hCGおよびLHCGR上の糖鎖と相互作用するとともにLHCGRを脂質ラフト上に留めて、シグナル伝達をサポートすると予想される。本研究ではLHCGRのシグナル伝達にgalectin-1と糖鎖との相互作用がどのように関与するかを明らかにすることを目的とした。ガレクチンと糖鎖との結合を阻害するため、ガレクチンの阻害糖であるラクトース、N型糖鎖を除去したhCG、および、グリコシルセラミド合成阻害薬(D-PDMP)を培養ヒト黄体化顆粒層細胞に投与してLHCGR刺激により変動する遺伝子の発現を調べた。いずれの処置によいても、LHCGR刺激により増強するプロジェステロンおよびPGE産生に関与する遺伝子の発現が減少していた。これらの結果は、galectin-1がLHCGRのシグナル伝達に重要な役割を果たすことを示唆する。黄体は妊娠の成立と維持に必須なプロゲステロンを産生する一時的な内分泌組織で、排卵後の卵胞壁細胞より形成される。ヒトでは排卵後1週間ほど盛んにプロゲステロンを産生するが、妊娠が成立しない場合は速やかに退行する。ヒト黄体の機能は、脳下垂体より産生される黄体形成ホルモン(LH)と胎盤より産生されるヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)により維持される。LHとhCGは黄体細胞に発現する共通のレセプター(LHCGR)に結合し、cAMP/PKA経路を活性化することにより、プロゲステロンと黄体機能維持に働くパラクライン因子・プロスタグランジンE(PGE)産生を刺激する。我々はbeta型結合したガラクトースを認識するレクチン(galectin-1とgalectin-3)が黄体機能に密接して発現変動することを明らかにした。特に、機能黄体に発現するgalectin-1は黄体細胞膜上のガングリオシドGM1、LHCGRおよびLH/hCG上の糖鎖と相互作用して、LHCGRのcAMP/PKAを介したシグナル伝達をサポートすると予想される。本研究では、LHCGRのシグナル伝達にgalectin-1と糖鎖との相互作用がどのように関与するかを明らかにすることを目的とした。培養黄体化顆粒層細胞に、1ガレクチンと糖鎖との結合を阻害するラクトース、2N型糖鎖を切断したhCG、3N型糖鎖合成阻害薬(swainsonine)、4グリコシルセラミド合成阻害薬(D-PDMP)を投与して、LHCGR刺激により変動する遺伝子を解析した。いずれの処置によってもLHCGR刺激により増強するプロゲステロンおよびPGE産生能が低下しており、galectin-1と糖鎖との相互作用がLHCGRのシグナル伝達に重要であることが示唆された。申請書に記載した計画書の通り、実験を遂行することができた。初年度の結果と合わせて、現在論文を作製中である。黄体は排卵後の卵胞より形成され、妊娠の成立と維持に必須なプロゲステロンを産生する一時的な内分泌組織である。ヒトでは、排卵後1週間ほど盛んにプロゲステロンを産生するが、妊娠が成立しない場合は速やかに退行する。黄体の機能は脳下垂体より産生される黄体化ホルモン(LH)と胎盤より産生されるヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)により維持される。LHとhCGは、黄体細胞に存在する共通のレセプター(LHCGR)に結合し、cAMP/PKA経路を活性化することにより、プロゲステロンと黄体機能維持に働くプロスタグランジンE(PGE)産生を刺激する。

我々は、これまでの研究により、beta型結合したガラクトースを認識するガレクチンのうち、galectin-1が機能黄体に強く発現し、galectin-1と糖鎖との相互作用がヒト黄体の機能維持に重要であることを報告してきた。しかし、galectin-1のリガンド複合糖質は不明である。本研究では、galectin-1のリガンド複合糖質として、糖脂質をターゲットとし、黄体機能制御におけるガレクチンと糖脂質の役割を明らかにすることを目的とする。ヒト黄体では糖脂質合成酵素が発現しており、培養黄体化顆粒層細胞(LGCs)をhCGで刺激すると糖脂質合成酵素の発現が顕著に増加した。糖脂質合成の阻害薬(D-PDMP)をLGCsに作用させると、黄体細胞からのプロゲステロンおよびPGE産生能が低下した。また、ガングリオシドGM3は、hCG刺激によるcAMP/PKA経路の活性化を阻害した。また、ウシの培養黄体細胞においてもD-PDMPの投与により、黄体退行因子であるPGFの作用が変化することが明らかとなった。これらの研究成果は、ヒトやウシの黄体の機能制御には糖脂質(特にガングリオシド)が重要であることを示唆する。黄体は、妊娠の成立と維持に必須なプロゲステロンを産生する組織で、排卵後の卵胞より形成される。妊娠が成立しない場合、ヒトの黄体は1週間ほどプロゲステロンを産生したのち、自発的に退行する。一方、妊娠が成立すると、胎盤より産生されるホルモン(hCG)の作用により、黄体は妊娠初期の数か月間機能を維持する。多くの動物で黄体の退行は子宮より産生されるプロスタグランジンF(PGF)により制御されるが、ヒト黄体の退行メカニズムは不明であった。本研究は、黄体細胞膜上のスフィンゴ糖脂質の質的・量的変化が、ヒトのみならずマウスやウシの黄体の退行メカニズムに関与することを明らかにした。北海道大学病院婦人科より提供をうけた卵胞液より、ヒト黄体化顆粒層細胞を培養し、実験を行っているが、初代培養の細胞であり、分裂増殖しないため、実験に必要な細胞数を集めるのに時間を要している。培養実験は当初予定していた実験のおよそ半分が終了した段階であるため、1年目の研究計画ではやや遅れがみられる。培養実験を遂行するかわりに2年目に遂行予定であったマウス黄体組織における糖脂質関連遺伝子の発現解析を先に行った。よって、研究はおおむね順調に進展していると判断した。引き続きヒト黄体化顆粒層細胞の培養実験を継続して行うとともに、ウシ黄体細胞の培養実験を開始する。組織学(形態学)引き続きヒト黄体化顆粒層細胞の培養実験を継続して行うとともに、株化された黄体細胞様細胞(KGN細胞)の導入を考えている。KGN細胞を用いることでよりスムーズに実験が進められるようになると予想されるが、黄体細胞と同じ性質をもつ細胞ではないため、注意深く性質をチェックする必要がある。今年度に投稿した論文の投稿料と別刷り印刷費の請求書がまだ届いておらず、その分の金額を残して次年度への繰り越しとした。繰り越しした金額は支払予定の論文投稿料と別刷り印刷費用に充てるため、次年度の使用計画に大きな変更は生じない。
内分泌かく乱物質の甲状腺・副腎・性腺の内分泌機能に及ぼす影響

本研究では、現在環境中内分泌かく乱物質として最も注目されている2種類のフタル酸化合物である「ビスフェノールA」と「オクチルフェノール」および大豆中に含まれる天然の植物性エストロジェンであり、甲状腺機能低下の作用も指摘されている「ゲニスタイン」を用いて、雌雄ラットの生殖機能に及ぼす影響を精査した。その結果、ビスフェノールAは、雄ラットに対しては、精子数減少、テストステロン分泌低下などの明らかな精巣機能低下作用のあることが判明したが、雌ラットに対する作用は雄と同量の用量では認められなかった。一方、オクチルフェノールは、ビスフェノールAに比べてエストロジェン様作用が強く、雄ラットに対してはビスフェノールAと同様な精巣機能抑制作用が認められた。雌ラットに対しても、オクチルフェノール投与により成熟ラットでは、膣スメヤーが連続発情像を示した。また、同様の用量を幼若時に投与すると、膣開口が早まり、膣スメヤー像は連続発情像を示した。これらの現象を内分泌学的に検討した結果、オクチルフェノールを幼若時に投与するエストロジェン様作用により、性中枢の不可逆的な雄性化を誘導する事実を明らかにした。次に、ゲニスタインの作用については、各種生理的機能が遺伝的に均一化され、わずかな作用を検出することが可能な実験動物として育成分離されたシャトルボックス高回避(HAA)および低回避(LAA)系ラットを用いて解析した。その結果、ゲニスタインの経乳汁曝露は、LAAに対しては発育を抑制し、雌雄の春機発動を遅延させ、HAAに対しては、オープンフィールドにおける活動性を亢進させ、抗体産生能を抑制する事実を明らかにした。これらの指標は、いずれもそれぞれの系統に特徴的な変化がさらに増強されて現れたものであり、種々の整理機能に明瞭な系統差の見られるHAA系およびLAA系を用いることで、ゲニスタインに代表されるエストロジェンの経乳汁的作用がより明瞭になることが示され、同系統は、環境中化学物質の有するエストロジェン活性が視床下部・下垂体・甲状腺・副腎・性腺系に及ぼす影響を研究する上で有用なモデル動物になると考えられた。本年度は、ビスフェノールA(BFA)を成熟雄ラットに投与し、精巣機能への影響を詳細に検討した。<方法>ウィスター系成熟雄ラットに、BFA 1mgを1日1回1週間投与し、以下の項目について検討した。(1)血中黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、プロラクチン、テストステロンおよびインヒビン濃度、(2)下垂体中LH、FSHおよびプロラクチン含有量、(3)精巣中テストステロンおよびインヒビン含有量、(4)精巣中の精子数、並びに(5)BFA投与ラットにヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)を投与して精巣からのテストステロン、エストラジオールおよびプロジェステロンの分泌反応性の検討。<結果>現在までに得られた結果は、以下のごとくである。(1)血中LHおよびプロラクチン濃度が、有意に上昇したがFSH濃度には差が認められなかった。(2)下垂体中LH、FSH、プロラクチンのいずれも増加する傾向を示したが有意差は認められなかった。(3)血中テストステロン濃度が低下したがインヒビン濃度は対照群と差が認められなかった。(4)精巣中テストステロン含有量は、対照群と差が認められなかったが、インヒビン含有量は低下した。(5)精巣中精子数は、有意に低下した。