hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ波放電型イオンエンジンの磁場制御による性能変化の解明

マイクロ波放電型イオンエンジンは、円筒形の放電室とその外周に設置された円柱型永久磁石、放電室開放部(下流)に設置した2枚の静電グリッドおよび放電室内にマイクロ波を導入するアンテナで構成されている。放電室内部には外周部の永久磁石により磁場が生成されており、マイクロ波の交流電界と外部磁場による電子サイクロトロン共鳴(ECR)により放電室内の電子は加熱(加速)され、推進剤がプラズマ化される。このプラズマ内の正イオンを前面の2枚の静電グリッドを用いて引き出し、噴出することにより推力を生成する。従って、このイオンエンジンの性能は、放電室内部のプラズマ形状に大きく影響され、プラズマ形状は放電室内外の永久磁石による背景磁場の配位で決定される。本研究室では、固定磁石に囲まれた放電室の内部に可動磁石を設けることで背景磁場を動的に変化させ、イオンエンジンのプラズマ点火性能と引出しイオン性能を向上させる研究を進めている。先の研究では、軸方向に移動可能な可動磁石を有するマイクロ波放電型イオンエンジンを開発したが、プラズマの点火性能は向上出来たが、引き出しイオン電流を増加させる為のプラズマ形状を完全には実現出来ない結果となった。そこで、背景磁場を2次元可動型磁石で変化させ、最適なプラズマ形状を形成し、かつ、プラズマの点火性能を維持しながらイオン引出し性能を改善した高性能のイオンエンジンを開発することを目標に研究を進めている。本年度は、前年度に設計した5cm級の軸方向と半径方向に可動磁石を有する2次元可変磁場型のイオンエンジンの製作を完了し、プラズマ生成およびイオン引出しに成功した。イオン引出し電流が、半径方向の磁石移動により増加する傾向が見られた。また、推進剤利用効率の向上を考慮して六角錐型放電室の外壁を移動する可変磁石を有するイオンエンジンを製作しプラズマ生成に成功した。本年度は、直交移動磁石による可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンの製作を完了した。イオンエンジンの放電室外周部の背景磁場生成用磁石に加えて、円筒型放電室の軸方向と半径方向に移動できる6個の永久磁石を放電室内部に配置した構造である。磁石移動のアクチュエータの制御プログラムおよびデータ収集システムの設計製作も完遂し、イオン引出し実験を実施した。プラズマ点火に成功し、引出しイオンの電流値が磁石の半径移動とともに増加する傾向が観察された。更に実験データを蓄積し、放電室内の磁場形状による性能の評価を進める。上記イオンエンジンの放電室は円筒形であるが、推進剤の放電室内での数密度は、容積が小さくなる円錐型の放電室が有利である。一方、磁場変化については、軸方向と半径方向の磁石移動が独立で無くなる欠点があるが、磁石移動が、斜面方向の一軸であり構造が簡単になる利点がある。このタイプの磁場可変型イオンエンジンでは、試作を完了しプラズマ生成に至った。性能向上のためには上記の直交移動磁石による可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンのデータ収集が重要である。今後、直交移動磁石による可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンの実験、データ収集を進めて行く予定である。なお、これら2タイプの可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンの構造および実験データについて、一部学会で報告した。令和元年度は、平成30年度に製作を完了した直行可動磁石を用いて背景磁場を変化させることが出来るマイクロ波放電型イオンエンジンの研究を、以下の方策にて推進する。研究遂行は、主に研究代表者および学部学生4名にて実施する。(1)イオンエンジンのイオンビーム引出しによる性能試験:作製した可動磁石を有するマイクロ波放電型イオンエンジンを真空容器内に設置し、性能データを一部収集した。更にデータを蓄積し、評価を行う。(2)可動磁石を有するイオンエンジンの改良:性能データを基に機器の改造を行なう。磁場の向きによる性能変化については、実験データとして収集する予定である。(3)成果をまとめ国内外の学会で発表する。マイクロ波放電型イオンエンジンは、放電室内の背景磁場内で生成維持されるプラズマからイオンを静電グリッドで引き出し放出することにより推力を発生する。従って、本タイプのイオンエンジンの性能は、放電室内部のプラズマ形状に大きく影響される。このプラズマ形状は放電室内外に配置した永久磁石による背景磁場の形状で決定される。また、本エンジンは、プラズマ生成にホットカソードなどの消耗する電極を使用しておらず、プラズマ生成のためにはマイクロ波放出用アンテナを使用しており、長寿命である利点を有している。プラズマ生成には、マイクロ波と背景磁場によるECR(電子サイクロトロン共鳴)を利用しており、ECR領域の磁界中にマイクロ波で強電場を生成し、電子を加速し推進剤をイオン化することによりプラズマを点火する。これまで、このイオンエンジンのプラズマ点火性能と引出しイオン性能の向上のために背景磁場を動的に変化させる研究を進めてきた。研究上の問題となったのが、1次元可動磁石では理想的プラズマ形状の展開を完全には実現出来ないことであった。そこで、背景磁場を2次元可動型磁石で変化させ、最適なプラズマ形状を形成し、点火性能を維持しながらイオン引出し性能を改善した高性能のイオンエンジンを開発することを目標として研究を進めている。本年度は、これまでの研究において設計した5cm級の一次元可動磁石型マイクロ波放電型イオンエンジンをベースとして2次元可変磁場型のイオンエンジンの設計を行った。イオンエンジンの放電室外周部の背景磁場生成用磁石に加えて、円筒型放電室の軸方向と半径方向に可動する磁石を放電質内部に配置したイオンエンジンの構造を決定し、磁石移動機構の試作を行った。また、効率向上を考慮して円錐型放電室の外壁を移動する可変磁石を有するイオンエンジンを設計して内部磁場形状の数値計算を行った。

本年度は、2次元可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンの設計を行った。イオンエンジンの放電室外周部の背景磁場生成用磁石に加えて、円筒型放電室の軸方向と半径方向に可動する磁石を放電質内部に配置したイオンエンジンの構造を決定し、磁石移動機構の試作を行った。これを組込み、2次元可変磁場型イオンエンジンを作製しプラズマ生成実験を行う予定であった。2次元可動磁石の移動機構の移動精度が出ておらず、再設計と試作の繰り返しに時間を要し、実験装置の完成が遅れている。早急に完成し、実験結果を蓄積したい。現在設計、製作中のイオンエンジンの放電室は円筒形であるが、推進剤の放電室内での密度を考慮した場合、容積が小さくなる円錐型の放電室が有利である。一方、磁場変化については、軸方向と半径方向の磁石移動が独立で無くなる欠点がある。しかしながら磁石移動が、斜面方向の一軸で良いから構造が簡単になる利点を有している。そこで、このタイプの2次元磁場可変型イオンエンジンの設計も試みている。基礎データとして磁石移動による背景磁場の変化を数値計算で求めた。円筒型放電室のイオンエンジンの製作、実験を重点的に進めながら、円錐型放電室についても設計データを蓄積する予定である。なお、2次元可変磁場型マイクロ波放電型イオンエンジンの内部磁場配位の変化について、一部学会で報告した。マイクロ波放電型イオンエンジンは、イオン引出し用静電グリッド、プラズマ生成部となる円筒または円錐型の放電室、推進剤導入器、放電室内でのプラズマ生成維持のための背景磁場生成用永久磁石、放電室内へのマイクロ波導入アンテナより構成される。永久磁石は放電室の外周部に設置されており、生成磁界と導入したマイクロ波によるECR(電子サイクロトロン共鳴)で、マイクロ波周波数で決定される磁界のECR領域でサイクロトロン運動をする電子をマイクロ波の電界で加速し、推進剤を電離することによりプラズマを生成する。静電グリッドでプラズマからイオンを引き出し放出し推力を発生する。従って、このイオンエンジンの性能は、放電室内部のプラズマ形状に大きく影響され、プラズマ形状は放電室内外の永久磁石による背景磁場の配位で決定される。本研究室では、可動磁石を放電室に設けることで背景磁場を動的に変化させ、イオンエンジンのプラズマ点火性能と引出しイオン性能を向上させる研究を進めてきた。研究上の問題となったのが、軸方向の1次元可動磁石ではプラズマの点火性能は向上出来たが、引き出しイオン電流を増加させる為のプラズマ形状を完全には実現出来ないことであった。そこで、背景磁場を2次元可動型磁石で変化させ、最適なプラズマ形状を形成し、かつ、プラズマの点火性能を維持しながらイオン引出し性能を改善した高性能のイオンエンジンを開発することを目標に研究を進めている。
ヒト非小細胞肺癌におけるiNOS発現と血管新生との相関

一酸化窒素(以下NO)はガス状のラジカルであり、生体内で様々の生理作用がある。癌においてもアポトーシスの誘導などによる腫瘍増殖抑制と局所低酸素による微小血管新生による腫瘍増殖促進の異なる役割を果たしていることが報告されているが、まだ一定の見解がなされていない。そこでヒト癌におけるNOの作用を解明するため一酸化窒素合成酵素(以下iNOS)発現細胞を作成し以下の実験を行った。iNOS遺伝子を哺乳動物発現用プラスミドベクターに組み込み、これをヒト癌細胞株(Colo205,HT-29,LS174T,SW480)に導入し、iNOS発現細胞を作成した。iNOSの発現は、酵素活性をRI method、NADPH diaphorase染色にて確認し、mRNAの解析はライトサイクラーで行った。このiNOS高発現細胞を用い、NOが細胞周期とアポトーシスにどのように影響を与えるかを検討した。以上の実験から、iNOS高発現細胞で、細胞増殖の抑制が見られたが、アポトーシスはどの細胞株にも認めなかった。CIP/Kip familyのp21,p27,p53の検討で、p27のみ発現を認め、p27はcontrolに比し、iNOS高発現株で強発現していた。定量的PCRでの検討で、p27はcontrolに比し、iNOS高発現株で高い傾向にあった。α-カテニン、β-カテニンに発現の差は見られなかった。iNOS高発現株で、細胞増殖の抑制を認めた。この作用には細胞周期を調節する因子であるp27が関与しており、NO暴露によりp27が高発現し、細胞周期を停止させることが示唆された。今後、さらなる検討を加え、NOの細胞周期に与える役割を明らかにする予定である。一酸化窒素(nitric oxide,NO)はガス状のラジカルであり,生体内で様々の生理作用がある。癌においてもアポトーシスの誘導などによる腫瘍増殖抑制と局所低酸素による微小血管新生による腫瘍増殖促進の異なる役割を果たしていることが報告されているが,まだ一定の見解がなされていない。そこでヒト癌におけるNOの作用を解明するため一酸化窒素合成酵素発現細胞(inducible nitric oxide synthase,iNOS)を作成し以下の実験を行った。平成12年度はこの実験で得られた野生株ヒト癌細胞,コントロールベクター導入ヒト癌細胞,iNOS高発現細胞,iNOS低発現細胞を用い,培養系での腫瘍増殖能,アポトース,細胞周期の差異,動物実験系でマウス皮下に腫瘍を移植し,腫瘍増殖能,腫瘍血管新生などの変化について検討する予定である。一方,当科の外科切除標本を用い,腫瘍内微小血管新生とiNOS発現との相関や,アポトーシス,癌遺伝子の発現との相関について検討を行い,NOの腫瘍増殖における役割を明らかにしていく予定である。
卵母細胞発現系を用いた嗅細胞の匂い受容機構の研究

フナの嗅粘膜より抽出したmRNAをゼノパス卵母細胞に発現させ、各種アミノ酸およびプロスタグラジンF_2αで刺激をおこなうと、非常にゆっくりとした時間経過の内向きの膜電流が誘起された。この内向きの電流はCl^ーイオンによるものであり、恐らくIP_3を介したものだと推定された。しかしながら、匂い分子によってmRNA注入卵に誘起される膜電流は最大のものでも数十nAしかなくcDNAのクロ-ニングには不十分であった。これは、匂い受容分子の多くがcAMP系を介した細胞内情報伝達系とカップルしており、IP_3系を介しているものはその一部にすぎないためだと考えられる。上記の結果より、本年度は嗅細胞の軸索から直接入力を受けている嗅球のニュ-ロンの匂い応答様式を調べることにより、嗅細胞の匂い受容機構を調べることにした。ウレタン麻酔したウサギの嗅球の個々のニュ-ロンからスパイクを記録し、各種の脂肪酸の匂いで嗅粘膜中の嗅細胞を刺激した。その結果(1)脂肪酸の匂いに応答するニュ-ロンは嗅球の前背側部の内側に集中していた。(2)個々のニュ-ロンは脂肪酸のうち特定の範囲の「長さ」もしくは「大きさ」の側鎖をもつものに選択的に応答した。上記の結果は、(1)脂肪酸の匂いに対する受容分子を発現している嗅細胞は、その軸索を嗅球の前背側部の内側へと選択的に投射していること、および(2)個々の嗅細胞は、各種の脂肪酸の匂い分子を、その側鎖の構造により識別し、嗅球のニュ-ロンに伝達していること等を示唆している。これらの実験結果は、匂い分子の構造と、嗅覚系の細胞の応答選択性および空間配置との間に明確な対応関係があることを示した最初のもので、嗅覚神経系における匂いの分子識別機構解明への重要な第1ステップが得られたと考えられる。匂い受容分子をゼノバス卵母細胞に発現させる目的でフナの嗅粘膜(嗅受容細胞を多く含んでいる)よりmRNAを抽出し、ガラス微小管を用いて卵母細胞に圧注入した。2448時間後にmRNA注入卵を膜電位固定し、魚の匂い分子である各種アミノ酸を用いて刺激し、誘起される膜電流を測定した。この結果、ロイシン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸(各々1mM)の刺激により数十nAの内向き電流が誘起されるのが観測された。また、フナにおける嗅覚系を介するフェロモンであるプロスタグランジンF2α(20μM)を溶液中に投与すると外向きに引き続いて内向きの電流が記録された。各種アミノ酸および、プロスタグランジンF2αで誘起される内向きの電流は、ゆっくりとした時間経過をもつものであり、何らかの細胞内セカンドメッセンジャ-系を介しているものと考えられ、現在その系がどのようなものかを決定する実験をおこなっている。匂い分子によってmRNA注入卵に誘起される内向き電流は、数十nAであり、細胞内情報伝達系の解析やcDNAのクロ-ニングには、不十分である。現在より効率のよい発現を目指して、各種条件の検討を行っている。また、上記の実験と並行して、嗅粘膜よりmRNAを抽出し、これを用いてcDNAのライブラリ-を作成した。このcDNAのライブラリ-より、匂い分子受容体が持つと予想される構造に対するオリゴヌクレオチドプロ-ブを用いて、匂い分子受容タンパク質のcDNAの単離を目指す実験を始めた。
陸上植物における葉緑体型ペプチドグリカン合成系遺伝子の進化に関する研究

細菌のペプチドグリカン(PG)合成遺伝子群の中で、MurE相同遺伝子は全ての陸上植物に保存され、葉緑体分裂と葉緑体分化に機能していた。これまで陸上植物の進化において、シダ植物から種子植物が登場する過程で、葉緑体分裂から葉緑体分化へと機能分化したと予測されていたが、ヒメツリガネゴケや裸子植物を用いた研究で、葉緑体分化型のMurEは少なくともコケ植物が分岐した時点で既に登場し、葉緑体分裂型MurEも裸子植物まで存在している可能性が推測された。また葉緑体分裂型MurEと葉緑体分化型MurEの機能に重要な変異箇所を絞ることができた。コケ植物ではペプチドグリカン(PG)合成系遺伝子が全て保存され葉緑体分裂に関与するが、シロイヌナズナではPG合成系遺伝子は4種類しか保存されておらず葉緑体分裂に関与しないが、合成系遺伝子の一つMurEは、色素体の遺伝子発現に関与し機能転換していることを我々は見出した。それでは、葉緑体進化の過程で、PG合成系遺伝子だったMurEがいつ機能転換したのであろうか?本研究では、コケ植物と被子植物の間に位置する裸子植物カラマツのMurE遺伝子であるLgMurEについて機能解析を行った。LgMurEは、シロイヌナズナMurE (AtMurE)同様に、細菌MurEドメインのN末端側に、機能未知の約250aaの配列が融合した構造をしている。GFPとの融合遺伝子を作成し、LgMurEの局在解析を行ったところ、葉緑体に移行することを確認した。LgMurE全長配列を、ヒメツリガネゴケ(Pp)MurE遺伝子破壊株に導入したところ、AtMurEを導入した時と同様に、巨大葉緑体の表現型は相補されなかった。またLgMurEのN末端側機能未知配列の後ろにPpMurEのMurEドメインを繋いだ融合遺伝子を、PpMurE遺伝子破壊株に導入したところ、表現型は相補された。このことから、LgMurE遺伝子はAtMurE遺伝子同様に、機能転換している可能性が高いことと、LgMurE遺伝子のN末端側配列は、PG合成に機能するPpMurEドメインの働きを阻害せず、LgMurEの機能転換はN末端側の付加によるものではなく、LgMurEのMurEドメインそのものに変異が起きることによって生じたと考えられた。一方、ヒメツリガネゴケゲノムの中に、もう一つMurE遺伝子(PpMurE2)が保存されていることが明らかになった。PpMurE2は、AtMurEやLgMurEと同様に、N末端側に機能未知ドメインをもつ構造をしている。PpMurE2の遺伝子破壊株を作成したが、現在までにPpMurE遺伝子破壊株で観察されるような巨大葉緑体の表現型を示していない。H27年度は、主にヒメツリガネゴケPpMurE遺伝子破壊株を用いた、MurE遺伝子の遺伝子相補解析を行った。LgMurE遺伝子の結果については、概ね予想通りであったが、これまで機能未知のN末端の配列が付加していることにより、遺伝子の機能転換が生じていると予想していたが、そうではなくMurEドメイン内の点突然変異によって機能転換が生じている可能性があることが判明した。PpMurE2遺伝子の解析は、現在遺伝子破壊株を単離したところであり、まだ詳細な表現型解析を行えていない。今後、PpMurE2の機能を明らかにする実験をすすめていく。また計画では、H27年度はDdl遺伝子や、シダ植物イヌカタヒバについても解析を行う予定であったが、進めることができなかった。ヒメツリガネゴケゲノムには、細菌が持つペプチドグリカン(PG)合成系遺伝子の全てが保存され、PGは葉緑体分裂に関与するが、被子植物シロイヌナズナには4種類の遺伝子しか保存されていない。本研究ではその1つであるMurE遺伝子に注目した。ヒメツリガネゴケMurE(PpMurE)はPG合成におけるアミノ酸リガーゼとして機能するが、シロイヌナズナのMurE(AtMurE)は、色素体の転写装置であるPEP複合体に含まれ、遺伝子発現を調節する。それでは、葉緑体進化の過程で、PG合成に寄与していたMurEはいつ機能転換したのであろうか?本研究では、コケ植物と被子植物の間に位置する裸子植物カラマツとオウシュウトウヒについて着目した。オウシュウトウヒはゲノムが公開されており、PG合成系遺伝子群を全てもっていた。遺伝子機能相補解析を行ったところ、カラマツMurE(LgMurE)をAtMurEタグラインに導入すると、葉緑体の異常形態が相補されたが、PpMurEを導入しても相補されなかった。またPpMurE KOラインに、AtMurE、LgMurEを導入しても、巨大葉緑体の形態は相補されなかった。一方、AtMurE、LgMurEには細菌MurEやPpMurEにはないN末端に機能未知のドメインが存在する。LgMurEのN末端ドメインにPpMurEのMurEドメインを融合させた遺伝子を、ヒメツリガネゴケに導入したところ、表現型が相補された。裸子植物のゲノムには全PG合成系遺伝子が存在しているのにも関わらず、LgMurEはPGを合成するヒメツリガネゴケで機能せず、シロイヌナズナで機能するという結果を得た。

またヒメツリガネゴケには、AtMurEやLgMurEに類似したN末端に機能未知ドメインを持つPpMurE2が保存されていることを示した。PpMurE2を遺伝子破壊しても、異常な表現型は観察されていない。H28年度は、カラマツMurE(LgMurE)の局在解析並びに、ヒメツリガネゴケMurE(PpMurE)KOラインを用いた遺伝子相補解析を行った。GFP融合遺伝子を用いたLgMurEの局在解析については、葉緑体移行シグナルをGFPに融合させると、葉緑体に局在化することが示されたが、全長LgMurEと融合させると、葉緑体局在は観察されなかった。このため、現在、Mycタグ融合LgMurE導入形質転換体を作製し、免疫抗体染色により局在解析を行おうとしている。遺伝子相補解析については、LgMurEはPpMurEの機能を相補せず、AtMurEやLgMurEに存在するN末端の機能未知ドメインを除いた遺伝子を導入しても、相補は見られなかった。またAtMurEやLgMurEに存在するN末端の機能未知ドメインにPpMurEのMurEドメインを付加した遺伝子を導入すると相補が観察されたことから、MurEドメインに変異が入ることにより、MurEの機能分化が生じたものと推測された。本来の予定であれば、コケ植物と裸子植物の間に位置するシダ植物イヌカタヒバのMurEや、またシロイヌナズナがもつ別のPG合成系相同遺伝子であるDdlについても解析を行う予定であったが、局在解析と遺伝子組換え植物の作製に時間が掛かってしまったことから、進めることができなかった。細菌のPG合成系遺伝子の1つであるMurE遺伝子は、ヒメツリガネゴケ葉緑体PG合成に関与し葉緑体分裂に必須である。一方、シロイヌナズナにはAtMurE遺伝子は存在するものの、全てのPG合成系相同遺伝子は保存されていない。AtMurEは色素体の転写装置であるPEP複合体に含まれ、葉緑体の遺伝子発現を調節することが示され、MurEは緑色植物の進化の過程で機能分化したと考えていた。また最近、我々はヒメツリガネゴケの新たなMurEを見いだし、PpMurE2と命名した。PpMurE2の機能を調べるため、遺伝子破壊株を作成したが、PpMurE1変異体のような巨大葉緑体は出現しなかった。またPpMurE2によりPpMurE1変異体の表現型は相補されなかったことから、PpMurE1とPpMurE2は異なる機能を持つことが推測された。PpMurE2もAtMurEと同様に、MurEドメインのN末端側に機能未知(FU)領域をもつことから、PpMurE2とAtMurEの機能が相同であるかを調べたところ、AtMurEタグラインが示すアルビノ表現型が相補されたことから、PpMurE2はAtMurEと同様に、葉緑体転写装置の一部として機能することが推測された。しかし、PpMurE2変異体ではAtMurEタグラインのようなアルビノ表現型は観察されなかった。MurEは緑色植物において、広く保存されているが、それではいつ葉緑体分裂から葉緑体分化へと機能転換が生じたのであろうか?それを明らかにするために、裸子植物をもちいて機能相補解析を行った。カラマツ(Lg)MurEはPpMurEを相補できず、AtMurEを相補可能であったが、オウシュウトウヒ(Pa)MurEはPpMurEを相補可能であった。同じ裸子植物のMurEでもLgMurEは葉緑体分化機能を、PaMurEは葉緑体分裂機能をもつという興味深い結果を得た。細菌のペプチドグリカン(PG)合成遺伝子群の中で、MurE相同遺伝子は全ての陸上植物に保存され、葉緑体分裂と葉緑体分化に機能していた。
ポリリン酸を用いた歯周病治療用人工歯根膜の開発

人工歯根膜開発の基礎研究としてポリリン酸ナトリウムの骨芽細胞に対する作用についてMC3T3-E1細胞を用いて検討した.ポリリン酸による各種骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現誘導では,ポリリン酸処理した細胞ではオステオポンチン,オステオカルシン両遺伝子の発現が誘導され,その発現量は処理後12日目,25日目でそれぞれ最大となった.この結果より,ポリリン酸がこれらの骨芽細胞分化マーカーの発現に関与していることがわかった.アリザリンレッド染色及びvon Kossa染色による細胞石灰化と石灰化結節の観察では,ポリリン酸処理を行わなかった細胞及びリン酸処理した細胞では染色像が観察されなかったのに対し,ポリリン酸処理した細胞では顕著なアリザリンレッド染色像が観察され,染色の程度はβ-グリセロフォスフェート(β-GP)とアスコルビン酸(AA)で処理を行った細胞と比較しても強かった,またvon Kossa染色でもポリリン酸処理を行った細胞で石灰化結節が観察され,ポリリン酸により細胞石灰化が誘導されていることが確認できた.ポリリン酸によるアルカリホスファターゼ活性の誘導では,ポリリン酸処理した細胞ではアルカリホスファターゼ活性が誘導された.β-GPとAAで処理を行った場合と比較するとその活性は若干低くなったが,このことからポリリン酸処理を行った細胞ではアルカリホスファターゼ活性に依存したリン酸供給経路の他に別のリン酸供給経路を持つ可能性が考えられた。以上の結果より、ポリリン酸がMC3T3-E1細胞の石灰化に大きく関わっているということが明らかとなった。ポリリン酸の骨再生効果に関して1、培養細胞を用いた評価骨芽細胞様のcell line MC-3T3 E1を用いて、ポリリン酸の骨分化誘導効果について検討した結果、ポリリン酸処理群はコントロールであるオルトリン酸、及び無処理の細胞群と比較して顕著な骨分化誘導促進をしめした。骨分化の指標として、アルカリフォスファターゼ(ALP)活性の経時的変化、コッサ染色、アリザリンレッド染色を行い、ポリリン酸処理によるALP活性の上昇(処理後10日目以降)、処理後20日間での顕著な石灰化が観察された。また、処理した細胞のポリリン酸代謝酵素活性を調べたところ、ポリリン酸で11日間処理した細胞で、Endopolyphosphatase及びExopolyphosphatase活性の顕著な上昇が見られた。骨分化の陽性コントロールである、β-グリセロリン酸処理群や陰性コントロールであるオルトリン酸処理群では、上記のようなポリリン酸代謝活性の上昇は全く見られなかった。このことから、ポリリン酸を主成分とする人工歯根膜は歯槽骨の再生を促進する効果があると考えられる。また、人工歯根膜以外にも骨再生材料としての応用が可能であることもわかった。2、ラットを用いた歯周組織再生効果の確認ラットを用いて、外科的に歯周組織を破壊し、破壊部位にポリリン酸処理を行って歯周組織再生の様子を観察した。ポリリン酸処理したものでは顕著な組織再生が観察され、処理後4週間以前の早い時期においてすでに歯槽骨の再生が観察された。また同時にポリリン酸処理により患部の炎症も抑えられることがわかった。ラットを用いたin vivoの実験結果も培養細胞での結果を裏付けるものであり、ポリリン酸が人工歯根膜もしくは骨再生材料としてかなり有望な物質であることが確認できた。ポリリン酸を主成分とした人工歯根膜作製のための条件検討1、骨再生効果の鎖長依存性骨芽細胞由来MC-3T3 E1を用いたin vitroの実験において、ポリリン酸による骨再生効果が鎖長35以上のもので顕著に見られることが確認された。骨芽細胞由来ではないNIH3T3を用いて同様の実験をおこなっても、ポリリン酸による細胞の石灰化は全く観察されなかった。また、ラットを用いた歯槽骨再生実験においても、鎖長35以上のもので、歯槽骨の増加が確認された。

またいずれの鎖長のポリリン酸においても、ポリリン酸塗布部の炎症抑制効果がみられ、ポリリン酸が炎症の抑制にも効果があることが示唆された。2、骨再生効果に関する最適濃度の解析骨分化を指標にして1と同じ実験系でin vitroにおけるポリリン酸の最適濃度の評価を行った。その結果、0.5mM以上で骨分化の促進が見られた。ラットを用いた歯槽骨再生の評価実験においては、100mM以上で効果が確認されており、現在100mM以下での効果について検証中である。3、ポリリン酸によってその発現が誘導される遺伝子のクローニングMC-3T3 E1をポリリン酸及びリン酸で処理した細胞よりRNAを精製し、cDNAを合成してサブトラクションを行った。その結果、フィブロネクチン、コンドロモジュリンI等の遺伝子の発現が誘導されていることが判明した。また、ポリリン酸により発現誘導もしくは発現抑制される未知遺伝子もいくつかクローン化された。2.ラット歯周病モデルに,鎖長の異なる三種類のポリリン酸(鎖長13-18・35・75)を用いて,ラットの歯周組織再生に対する作用を比較検討した結果,鎖長75のポリリン酸塗布群において著明に骨形成が観察され,鎖長が長いほど骨形成量が増加する傾向がみられた。3.ポリリン酸(鎖長75)の濃度差(0.1%,0.3%,1%,3%,10%)による歯周組織再生に対する作用を比較検討した。ポリリン酸の骨形成は,0.1%,0.3%で著明に骨形成量が増加したのに対して,10%塗布群での増加はみられなかった。4.イヌ歯周病モデルに,鎖長65のポリリン酸を塗布し,歯周組織再生についてコントロール群と比較検討した結果,ポリリン酸塗布群の標本において顕著なセメント質再生が確認された。本研究の結果より,ポリリン酸が歯周病菌の増殖抑制を示すとともに,ポリリン酸の鎖長と含有する濃度が,新生骨形成量を左右することが明らかとなった。人工歯根膜開発の基礎研究としてポリリン酸ナトリウムの骨芽細胞に対する作用についてMC3T3-E1細胞を用いて検討した.ポリリン酸による各種骨芽細胞分化マーカー遺伝子の発現誘導では,ポリリン酸処理した細胞ではオステオポンチン,オステオカルシン両遺伝子の発現が誘導され,その発現量は処理後12日目,25日目でそれぞれ最大となった.この結果より、ポリリン酸がこれらの骨芽細胞分化マーカーの発現に関与していることがわかった.アリザリンレッド染色及びvon Kossa染色による細胞石灰化と石灰化結節の観察では,ポリリン酸処理を行わなかった細胞及びリン酸処理した細胞では染色像が観察されなかったのに対し,ポリリン酸処理した細胞では顕著なアリザリンレッド染色像が観察され,染色の程度はβ-グリセロフォスフェート(β-GP)とアスコルビン酸(AA)で処理を行った細胞と比較しても強かった,またvon Kossa染色でもポリリン酸処理を行った細胞で石灰化結節が観察され,ポリリン酸により細胞石灰化が誘導されていることが確認できた.ポリリン酸によるアルカリホスファターゼ活性の誘導では,ポリリン酸処理した細胞ではアルカリホスファターゼ活性が誘導された.β-GPとAAで処理を行った場合と比較するとその活性は若干低くなったが,このことからポリリン酸処理を行った細胞ではアルカリホスファターゼ活性に依存したリン酸供給経路の他に別のリン酸供給経路を持つ可能性が考えられた。
契約内容確定プロセスの動態的考察-機能的視点に基づく契約法理論の現代化のために-

本年度の研究においては、情報提供義務違反によって契約の相手方に生じた信頼を契約内容へと取り込むという形の救済につき、これを承認する解釈論の展開されている欧州での議論に対して分析を加えた。このような分析として、具体的には、昨年度から研究を続けてきたフランス法における情報提供義務論に関してまとめた論文を公表するとともに、新たに欧州における私法調和の過程でなされるに至った情報提供義務に関する議論についても分析を加え、これについても論文を公表した。今年度に主として行った欧州での私法調和のための議論についての研究においては、欧州での私法調和のための作業が、EUの立法権限を通じた「上から」の調和と、私的な学術グループによる私法統一の原案策定を通じた「下から」の調和という2方向からの分析が可能であることから、前者に対応する問題として、具体的にどのような形で情報提供義務が欧州私法へと導入されているのかを確認したうえで、後者に対応する問題として学術グループによる議論の中で情報提供義務及びその違反に対する救済がどのように議論されてきたのかを分析した上で、これらの分析を基礎としながら、欧州での私法調和の作業の中で情報提供義務と契約解釈とを接続させるような救済が提唱されたことの根拠について検討を加えた。このような検討を通じて、本年度の研究により、具体的には次の点を明らかにすることができた。第一に、「上から」の私法調和では情報提供義務違反に対する救済内容は明確にされてこなかった。第二に、これに対して「下から」の私法調和においては、物品の契約適合性に関する既存のルールを情報提供義務に関するルールとして読み替えることで情報提供義務違反に対する救済内容を具体化する試みが行われてきたということができた。第三に、情報提供義務と契約解釈とを接続させる救済が欧州で提案された根拠は、そこでの議論が消費者法を視野に入れたものであった点やこの救済がそこでの議論で中心的な役割を果たす商品取引における契約内容に関する情報提供義務違反に対する救済として適切なものであった点に求めることができた.平成22年度の研究では、わが国の従来の議論において契約解釈論と情報提供義務論が断絶されてきたことを確認し、その要因を分析した上で、それにより生じる問題について検討を行い、その成果を論文として公表した。研究の具体的な内容を要約すると以下のとおりである。次に、かかる断絶の要因としては双方の議論に内在的な要因及びこれらの接合により生じる体系的な問題が存在する。具体的には次のとおりである。まず、前者に関しては、一方で契約解釈論においては契約解釈の基準についての議論が十分になされてこなかったことが、他方で情報提供義務論においては、裁判例の影響や契約内容についての固定的な理解、情報提供義務を補充的なものとして捉える理解がこの要因として挙げられる。そして、後者に関していうと、契約解釈と情報提供義務の接合により生じる契約解釈と詐欺や錯誤に関する規定の関係の不明確化がこの要因であると考えられる。最後に、かかる断絶により生じる問題とは、情報提供義務違反によって相手方に生じた信頼を契約内容に取り込むことが困難となるため、かかる義務違反による被害者の救済及びその加害者への制裁が不十分なものとなるというものである。以上が平成22年度の研究の成果であるが、かかる断絶により生じる問題の解決のためには、契約解釈論と情報提供義務論との接合を図る必要があり、この作業のためには契約解釈と情報提供義務の関係について欧州でなされている議論について検討を加えることが重要であることが明らかとなった。今年度の研究では、昨年度までに明らかにした契約締結過程の情報提供義務及び契約の解釈に関するわが国の議論状況についての知見を基礎に、フランス法を対象として、契約締結過程における情報提供義務違反に対する救済として相手方の信頼の契約内容化を承認するという見解の基礎の探求を行った。具体的には、フランスでの議論に見られる上記のような見解が、保険契約に関連した情報提供義務違反が問題とされた事案について下されたフランスの裁判例上の救済を基礎とに展開されているものであることから、かかる裁判例の分析を通じて、相手方の信頼を契約内容化するという救済がいかなる事案において有効な救済となると考えられているのかについて検討を試みた。なおかかる検討の前提として、昨年度の研究においては十分に検討することのできなかった、わが国における保険契約に関連する情報提供義務についての議論についても分析を行っている。かかる検討により明らかにすることができたのは以下のことである。始めに、わが国における保険契約に関連する情報提供義務論においても、昨年度に確認したものとはやや異なる形ではあるが情報提供義務論と契約解釈論との断絶を見て取ることができた。次に、フランスの判例の分析からは、契約締結過程における情報提供義務違反に対して認められている相手方の信頼の契約内容化という救済が、契約の内容自体についての情報提供が求められており、かかる情報の不提供により相手方が信頼した契約の内容が実現可能なものである場合において、特に有効な救済となるものであるといえることを明らかにすることができた。そして、かかる救済の承認に当たっては、フランスでの情報提供義務論及び民事責任論のわが国の議論に対する特殊性が一定の役割を果たしているものであることも明らかとなった。以上の、検討の成果は既に論文の形でまとめてあり、翌年度中の公表を計画している。

このような分析として、具体的には、昨年度から研究を続けてきたフランス法における情報提供義務論に関してまとめた論文を公表するとともに、新たに欧州における私法調和の過程でなされるに至った情報提供義務に関する議論についても分析を加え、これについても論文を公表した。今年度に主として行った欧州での私法調和のための議論についての研究においては、欧州での私法調和のための作業が、EUの立法権限を通じた「上から」の調和と、私的な学術グループによる私法統一の原案策定を通じた「下から」の調和という2方向からの分析が可能であることから、前者に対応する問題として、具体的にどのような形で情報提供義務が欧州私法へと導入されているのかを確認したうえで、後者に対応する問題として学術グループによる議論の中で情報提供義務及びその違反に対する救済がどのように議論されてきたのかを分析した上で、これらの分析を基礎としながら、欧州での私法調和の作業の中で情報提供義務と契約解釈とを接続させるような救済が提唱されたことの根拠について検討を加えた。このような検討を通じて、本年度の研究により、具体的には次の点を明らかにすることができた。第一に、「上から」の私法調和では情報提供義務違反に対する救済内容は明確にされてこなかった。第二に、これに対して「下から」の私法調和においては、物品の契約適合性に関する既存のルールを情報提供義務に関するルールとして読み替えることで情報提供義務違反に対する救済内容を具体化する試みが行われてきたということができた。第三に、情報提供義務と契約解釈とを接続させる救済が欧州で提案された根拠は、そこでの議論が消費者法を視野に入れたものであった点やこの救済がそこでの議論で中心的な役割を果たす商品取引における契約内容に関する情報提供義務違反に対する救済として適切なものであった点に求めることができた.契約内容の確定プロセスを動態的に把握するという本研究の目的を実現するためには、契約締結過程でなされた当事者の交渉態度等を契約解釈における評価の対象に組み込むという見解の基礎について検討を加えることが不可欠であるが、今年度の研究において係る基礎についてフランス法の議論を参照しつつ明らかにすることができたため。今後の研究においては、これまでに獲得することができた知見を基礎として、欧州における私法調和のための議論において現れている情報提供義務についての新たな理解について検討を加えることで、契約締結過程における情報提供義務違反に対して相手方の信頼の契約内容化という救済を認めることの意義についてさらなる検討を加え、その後、かかる私法調和のための議論についてのドイツ法上の議論における受容について分析を加えることで、かかる救済の一般化の可能性を探り、これらの検討を踏まえて、かかる救済をわが国における契約内容の確定法理の中に位置づけることを試みたいと考えている。
変異コネキシン発現ベクターを用いた臓器レベルでの細胞間コミュニケーションの阻害

ギャップ結合は,隣接する細胞の細胞質を直接連絡するチャネル構造で,その中を通過する物質を介する細胞間コミュニケーションによって種々の細胞機能を制御している。近年ギャップ結合蛋白質コネキシン遺伝子の突然変異によって生じるヒト遺伝性疾患(ギャップ結合チャネル病)の存在が明らかにされてきた。しかし,どのような機序でギャップ結合の異常が病態を発生させるかは不明である。本研究では心臓で発現している主要ギャップ結合蛋白であるコネキシン43の130-137番目のアミノ酸を欠損させた変異コネキシンとenhanced green fluorescent protein(EGFP)との融合遺伝子を作成し内因性コネキシン43の機能をドミナントネガティブに阻害することによって細胞間コミュニケーションを抑制する新しいシステムの樹立に成功した。このシスチムを用いることにより,細胞におけるギャップ結合タンパク質の局在と同時に.細胞間コミュニケーションや細胞内カルシウムイオンの動態を可視化し解析することが可能となった。このドミナントネガティブ変異コネキシン遺伝子発現ベクターを初代培養ラット新生仔心筋細胞に導入することによって,変異コネキシンは,心筋細胞間の細胞間コミュニケーションを阻害するだけではなく,心筋細胞同士の細胞内カルシウムトランジェントの同調を高率に阻害することを明かにした。このことにより心臓におけるギャップ結合細胞間コミュニケーションの阻害が,不整脈や収縮不全などの心機能異常を起こす可能性が示唆された。本研究の目的は,ギャップ結合による細胞間コミュニケーション阻害が臓器レベルでどのような病態を発生させるかを明らかにすることである。我々は,ギャップ結合蛋白コネキシン(Cx)のうち,野生型のCx43遺伝子や細胞内ループを欠損させた変異型のCx43とGFPとの融合蛋白発現プラスミドベクターをそれぞれ作成し、まず、これらの発現ベクターを培養細胞で発現させたときの効果を検討した。野生型及び変異型Cx43-GFP発現ベクターを内因性コネキシンの発現がなく、ギャップ結合細胞間コミュニケーション能を欠くHeLa細胞や、内因性にCx43を発現しギャップ結合細胞間コミュニケーション能の高いラットIAR20細胞やラット新生仔初代培養心筋細胞に導入した。野生型Cx43-GFPは、HeLa細胞細胞間コミュニケーション能を回復させた。一方、変異Cx43-GFPは、IAR20細胞やラット新生仔初代培養心筋細胞の内因性コネキシンによる細胞間コミュニケーションをドミナントネガティブに抑制した。さらに、変異Cx43発現心筋細胞では、野生型Cx43発現心筋細胞と比べ、隣接する心筋細胞との細胞内カルシウムトランジェントの同期が有意に抑制される事が分かった。本研究では心臓で発現している主要ギャップ結合蛋白であるコネキシン43の130-137番目のアミノ酸を欠損させた変異コネキシンとenhanced green fluorescent protein (EGFP)との融合遺伝子を作成し,内因性コネキシン43の機能をドミナントネガティブに阻害することによって細胞間コミュニケーションを抑制する新しいシステムの樹立に成功した。このシステムを用いることにより,細胞におけるギャップ結合タンパク質の局在と同時に,細胞間コミュニケーションや細胞内カルシウムイオンの動態を可視化し解析することが可能となった。
都市計画の基礎としての都市生態系の総合的研究

都市は人間が作り生活するところであるが、これは自然生態系を基礎にその人為化による都市生態系を作ることでもある。この都市化によって、都市はその周辺地域を含めて人間と環境に大きな影響を及ぼしてきた。したがって、都市は生活の利便性の追求からだけではなく、快適さを併せた人間の生物的側面にとってもナチュラルなものとすべきである。そこで、都市生態系が全体としてナチュラルになるような都市を総合的な立場から描き出し、これを都市計画の基礎となるように、研究の目的を設定した。都市の機能・構造のより総合的な理解と把握には、社会経済的にも人間生活を成り立たせるうえで、いわゆる専門の領域を越えての新な議論や方法論を必要とし、検討会や個別的な意見・資料の交換によって、一定の認識を共有するようにした。これにのっとり、各研究分担者は、既存のデータの新な視点からの見直しと検討を行い、補足や新しいデータを得るためのフィールドワーク等を、千葉県千葉・市原地区に集中させ、併せて比較対照の他都市を一部とりあげて行った。都市化の指標としての植生の変化は、都市問比較だけでなく、地域内比較が可能な方法を作り実施し、多くの資料を得た。また従来対象とされることの少かった家畜動物のイヌ・ネコ研究では、二次野生化による自然生態系の損乱因に加えて、都市生態系の主構成要素たる人間との特別な心理的関係が生じつゝあることが判った。水消費量を軸としたアプローチ、近郊農村での都市建設の影響研究からは、都市的生活様式に段階的変化があり、また建設される都市の経済力による影響が、その大きさによって全く異る作用をする点が明らかとなった。以上の都市のもつ多面性と、そこでの居住者を、いくつかの基本的要素に組みなおし、都市モデルの作製を行ない、これについての議論を行い、以後の課題を得た。成果は和文,英文の報告書にまとめた。
前立腺組織におけるテストステロン5の還元酵素の異常に関する研究

前立腺肥大症では、間質細胞に存在するテストステロン5α還元酵素type2が主要な役割を果しており、上皮細胞は5α還元酵素type1のみを有することが知られている。そこで正常前立腺および前立腺肥大症における5α還元酵素mRNAの発現を比較検討した。正常前立腺組織3例および前立腺肥大症組織17例を用いて、reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)法によりtype1およびtype2 5α還元酵素の発現を調べた。正常前立腺および前立腺肥大症の全例で、正常型のtype1およびtype2 5α還元酵素mRNAが検出された。さらに、検索した前立腺肥大症17例全例において、エクソン2を欠いた変異型type1 5α還元酵素mRNAを検出した。また、前立腺肥大症6例において、エクソン3、4を欠失した変異型type25α還元酵素mRNAを見いだした。これらはエクソンスキッピングによるスプライシング異常に起因すると思われた。これらtype1およびtype2変異型mRNAより、各々135および193アミノ酸からなる短いタンパクが生成されると推測された。酵素活性のkineticdataの結果などより前立腺肥大症間質での5α還元酵素のVmax、Kmの増加が観察されており、間質・上皮とも細胞内DHT濃度は一定に保たれていることを考え合わせると、前立腺肥大症間質は不完全な活性を代償しDHTを保つために5α還元酵素含量を増すという仮説と矛盾しない。これらの変異型5α還元酵素mRNAの生物学的意義は現在のところ不明であり、今後の研究の課題である。
網膜機能障害における血液網膜関門クレアチン輸送担体発現変動機構

本研究はクレアチン輸送変動メカニズムの解明を目的として解析を行った。昨年度は作成したmycHisタグを付けたクレアチン輸送担体(Creatine transporter, CRT)安定発現細胞株HEK293(CRTmycHis/HEK)細胞を用いて、クレアチン添加した細胞培地中でプレインキュベーションすることで(クレアチン処理)減少する[^<14>C]クレアチン取り込みは、細胞膜上に発現するCRTの減少によるものであることが示唆された。そこで本年度は、ビオチン-アビチン処理により細胞膜タンパク質を調製し、ウエスタンブロット解析により1時間クレアチン処理での細胞膜上に局在するCRTmycHisの変化を解析した。その結果、total lysateにおいてはクレアチン処理、未処理共に変化はなかった。しかしながら、細胞膜タンパク質画分においては、クレアチン処理によりCRTmycHisを示すバンドは有意に濃くなった。さらに、超遠心法を用いて調製したcrudemembrane画分を用いた解析においても同様の結果が得られた。このことから、クレアチン処理により、細胞膜上に局在するCRTmycHisが増加することが示唆された。この結果は[^<14>C]クレアチン取り込みで得られた結果とは異なる結果であった。本年度は、さらにプロテインキナーゼCを介したクレアチン輸送変動メカニズムにも着目して解析を行った。本解析では細胞にHEK293(CRTmycHis/HEK)細胞、プロテインキナーゼC活性化剤にphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)をそれぞれ用いた。[^<14>C]クレアチン取り込みはPMA処理時間および処理濃度依存性が示され、1時間,500nM PMA処理では、未処理と比較して49.0%減少した。さらに、[^<14>C]クレアチン取り込みの濃度依存性解析の結果、1時間,500nM PMA処理条件下では未処理と比較してKm値は変化がなく、Vmaxは38.0%減少した。さらに、1時間,500nM PMA処理条件下で調製したサンプルを用いてウエスタンブロット解析を行った結果、total lysateではPMA処理、未処理共にCRTmycHis発現量に変化はなかった。しかしながら、ビオチン-アビジン処理により調製した細胞膜タンパク質画分においては未処理と比較して1時間,500nM PMA処理において22.9%減少した。以上の解析結果から、PMA処理により細胞膜上に局在するCRTが減少することで、[^<14>C]クレアチン取り込みが減少することが示唆された。本研究は細胞外クレアチン濃度増加によるクレアチン輸送変動のメカニズムの解明を目的とし、本年度はクレアチン輸送担体(Creatine transporter, CRT)安定発現細胞株を作成し、細胞外クレアチン濃度増加時におけるクレアチン輸送能変動解析を行うこととした。最初にCRT発現ベクターとして、pcDNA3.1/CRTmycHis,pcDNA4/Xpress CRTおよびpCMV/mycCRTの三種類を構築し、宿主細胞にはHEK293細胞を用いてCRT安定発現細胞株を作成した。XpressCRTおよびmycCRT発現細胞ではmock細胞と比較して[^<14>C]クレアチン取り込みは有意に増加したが、各タグに対する抗体を用いたWestern blot解析ではCRTタンパク質を検出できなかった。CRTmycHisを安定発現させたHEK293(CRTmycHis/HEK)細胞では、取り込み時間1minで[^<14>C]クレアチン取り込みはmock細胞と比較して約25倍有意に増加した。また、CRTmycHis/HEK細胞への[^<14>C]クレアチン取り込みは濃度依存性を示し、そのMichaelis-Menten定数(Km)は237μMであった。この値はrat CRTのKm報告値29-500μMに近似した。さらに、biotin-avidin反応を利用して調製した細胞膜タンパク質を抗myc抗体を用いてWestern blot解析した結果、約70kDaにバンドを検出した。また抗myc抗体を用いた免疫染色により、CRTmycHisの大部分が細胞膜上に局在していることが示された。このことから、作成したCRTmycHis/HEK細胞において、CRTmycHisは細胞膜上に発現し、機能していることが示された。そこで、次にこの細胞を用いてクレアチン添加した細胞培地中でプレインキュベーションし(クレアチン処理)、[^<14>C]クレアチン取り込み解析を行った。その結果、[^<14>C]クレアチン取り込みはクレアチン処理時間および処理濃度依存性が示され、1hr,1mMクレアチン処理では、未処理と比較して54.7%減少した。さらに、[^<14>C]クレアチン取り込みの濃度依存性解析の結果、1hr,1mMクレアチン処理条件下では未処理と比較してKm値は変化がなく、Vは43.4%減少した。このことから、クレアチン処理による[^<14>C]クレアチン取り込みの変化は、細胞膜上に発現するCRTの減少によるものであることが示唆された。昨年度は作成したmycHisタグを付けたクレアチン輸送担体(Creatine transporter, CRT)安定発現細胞株HEK293(CRTmycHis/HEK)細胞を用いて、クレアチン添加した細胞培地中でプレインキュベーションすることで(クレアチン処理)減少する[^<14>C]

クレアチン取り込みは、細胞膜上に発現するCRTの減少によるものであることが示唆された。そこで本年度は、ビオチン-アビチン処理により細胞膜タンパク質を調製し、ウエスタンブロット解析により1時間クレアチン処理での細胞膜上に局在するCRTmycHisの変化を解析した。その結果、total lysateにおいてはクレアチン処理、未処理共に変化はなかった。しかしながら、細胞膜タンパク質画分においては、クレアチン処理によりCRTmycHisを示すバンドは有意に濃くなった。さらに、超遠心法を用いて調製したcrudemembrane画分を用いた解析においても同様の結果が得られた。このことから、クレアチン処理により、細胞膜上に局在するCRTmycHisが増加することが示唆された。この結果は[^<14>C]クレアチン取り込みで得られた結果とは異なる結果であった。本年度は、さらにプロテインキナーゼCを介したクレアチン輸送変動メカニズムにも着目して解析を行った。本解析では細胞にHEK293(CRTmycHis/HEK)細胞、プロテインキナーゼC活性化剤にphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)をそれぞれ用いた。[^<14>C]クレアチン取り込みはPMA処理時間および処理濃度依存性が示され、1時間,500nM PMA処理では、未処理と比較して49.0%減少した。さらに、[^<14>C]クレアチン取り込みの濃度依存性解析の結果、1時間,500nM PMA処理条件下では未処理と比較してKm値は変化がなく、Vmaxは38.0%減少した。さらに、1時間,500nM PMA処理条件下で調製したサンプルを用いてウエスタンブロット解析を行った結果、total lysateではPMA処理、未処理共にCRTmycHis発現量に変化はなかった。しかしながら、ビオチン-アビジン処理により調製した細胞膜タンパク質画分においては未処理と比較して1時間,500nM PMA処理において22.9%減少した。以上の解析結果から、PMA処理により細胞膜上に局在するCRTが減少することで、[^<14>C]クレアチン取り込みが減少することが示唆された。