hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カスケードによる東アジアのコンテナ航路網変化とゲートウェイ港湾の評価モデル開発

本研究は、アジア地域を中心とするコンテナ貨物量の増大、アジアや欧米などの基幹航路への超大型コンテナ船の投入、それに伴うカスケード現象による東アジア域内航路など他の航路でのコンテナ船の大型化、ハブ港湾整備などの輸送環境変化などを踏まえ、アジア域内を中心とするコンテナ船の大型化や航路網変化などについて、貨物量ODや国際海上コンテナ貨物の輸送経路、コンテナ航路網など、将来の我が国におけるコンテナ港湾の計画・整備にも活用できる評価ツールの開発を目指すものである。最終年度である平成30年度は、前年度に引き続き、アジアのコンテナ輸送に関わる港湾開発や航路に関わるデータの収集・分析を行うとともに、貿易額、ひいては海上コンテナ貨物輸送量にも大きな影響を及ぼすと考えられる米国と中国の貿易戦争が貿易・海運輸送にどのような影響を及ぼすかについてとりまとめた。さらに、世界の主要地域間のコンテナ貨物流動量や就航コンテナ船について、アジアー北米や,アジアー欧州、さらにはアジア域内の航路等について、投入船舶数、投入船型などが、輸送すべき貨物量や消席率との関わりでどのようになっているのかをマクロに分析し、将来の船の大型化や貨物量の増大などに伴って、アジアへの投入船,コンテナ航路網がどのように形成されるかをマクロに推計するモデルを検討した。これらの成果は、過年度のコンテナ貨物のOD量推計や我が国のコンテナ貨物の輸送経路選択に関わる貨物流動モデルの構築の成果とリンクし、コンテナ貨物のOD推計、それらも考慮したアジア航路へのコンテナ船の投入や航路網推計、さらにコンテナ航路のサービス水準(船型,頻度など)を国際海上コンテナ貨物流動モデルへ導入することにより、貨物流動予測が可能となる評価モデルとできた。本研究は、コンテナ船のカスケード現象による東アジア域内航路での大型化に焦点をあて、将来のコンテナ航路網予測モデル開発、それに対応して日本の港湾はどうあるべきかを評価できるコンテナ貨物流動モデル・日本のゲートウェイ港湾の評価モデルの構築を行い、将来の我が国の港湾配置のあり方を定量的に評価するものである。平成28年度は、アジア地域のコンテナ航路網に関わる資料として、コンテナ航路のサービス頻度、就航船舶、寄港地などについて、関連資料の収集や分析を進めた。また、今後大きな経済成長が見込まれ、アジア地域のコンテナ航路の形成に与える影響も大きいと想定される国・地域のひとつであるベトナム国について、ハノイ港のコンテナターミナルや航路の状況、船社のコンテナ航路への対応などについてヒアリングを行ったほか、ラクフェン地区で整備が進む大型コンテナターミナルについて、その整備状況や将来の展開計画などについて現地調査を行った。加えて、将来のコンテナ航路網の推計にあたっては、地域間のコンテナの貨物の流動量が必要となることから、世界のコンテナ航路の状況から、船の消席率などを勘案して、コンテナ貨物輸送量への変換などを行い主要地域間のコンテナ貨物の総流動ODの推計、さらには、その総流動ODから、積み替え貨物であるトランシップ貨物を除外して地域間のコンテナ貨物の真の輸送量である純流動ODを推計したほか、将来の地域別の経済成長率などを勘案して、将来の純流動OD貨物量を試算するなどした。本研究課題については、28年秋に交付決定を受けて、当初3年で実施予定であった内容を、2年半で実施すべく28年度も検討を進めたが、年度後半からの実施であったため、他の業務などとの関わりもあり、少し検討作業が、当初計画よりも遅れてしまった。本研究はコンテナ船のカスケード現象による東アジア域内航路での大型化に焦点をあて、将来のコンテナ航路網予測モデル開発、それに対応して日本の港湾はどうあるべきかを評価できるコンテナ貨物流動モデル・日本のゲートウェイ港湾の評価モデルの構築を行い、将来のわが国の港湾配置のあり方などの評価を行うものである。2年目にあたる平成29年度は、前年度に引き続きアジア域内のコンテナ航路やコンテナ港湾整備・計画などに関わる資料の収集整理を進め、特に、将来のコンテナターミナル整備において導入が進むと想定される自動化ターミナルに関する資料収集についても実施した。例えば、ハブ港湾・自動化ターミナルについては、シンガポールで現在のパシルパンジャン地区の西側に整備が進められているTaus地区の新ターミナル、平成29年12月に稼働した上海港洋山地区4期地区、拡張が続く釜山新港、自動化ターミナルが稼働する青島港などの情報収集についても行った。また、国際海上コンテナ流動のOD貨物量の将来予測についても、昨年度の検討結果も踏まえて、2030年の世界主要地域間(東アジア、中東・南アジア、欧州・地中海、北米、中南米、オセアニア、アフリカ)の流動量を純流動ベースで推計し、論文投稿などを行った。さらに、東アジア地域をはじめとする日本発着コンテナ貨物の流動モデルについては、アジア地域については9国・地域(中国北部・中部・南部、台湾、韓国、フィリピン、東南アジア北部・南部)とのモデルを、また北米貨物については、北米を24地域に区分しパナマ運河経由の東岸利用か、西海岸利用かを区分できるように考慮したモデルを、犠牲量モデルにより構築した。本研究課題については、28年秋に交付決定を受けて、当初3年で実施予定であった内容を2年半で終えるように実施しており、28年度のスタート遅れをまだ完全にリカバリーするには至っておらず、予定より少し遅れ気味である。29年度に遅れをとりもどすべく進めたが、年度途中に、研究代表者の人事異動などもあり、リカバリーしきれなかった部分が残った。

本研究は、アジア地域を中心とするコンテナ貨物量の増大、アジアや欧米などの基幹航路への超大型コンテナ船の投入、それに伴うカスケード現象による東アジア域内航路など他の航路でのコンテナ船の大型化、ハブ港湾整備などの輸送環境変化などを踏まえ、アジア域内を中心とするコンテナ船の大型化や航路網変化などについて、貨物量ODや国際海上コンテナ貨物の輸送経路、コンテナ航路網など、将来の我が国におけるコンテナ港湾の計画・整備にも活用できる評価ツールの開発を目指すものである。最終年度である平成30年度は、前年度に引き続き、アジアのコンテナ輸送に関わる港湾開発や航路に関わるデータの収集・分析を行うとともに、貿易額、ひいては海上コンテナ貨物輸送量にも大きな影響を及ぼすと考えられる米国と中国の貿易戦争が貿易・海運輸送にどのような影響を及ぼすかについてとりまとめた。さらに、世界の主要地域間のコンテナ貨物流動量や就航コンテナ船について、アジアー北米や,アジアー欧州、さらにはアジア域内の航路等について、投入船舶数、投入船型などが、輸送すべき貨物量や消席率との関わりでどのようになっているのかをマクロに分析し、将来の船の大型化や貨物量の増大などに伴って、アジアへの投入船,コンテナ航路網がどのように形成されるかをマクロに推計するモデルを検討した。これらの成果は、過年度のコンテナ貨物のOD量推計や我が国のコンテナ貨物の輸送経路選択に関わる貨物流動モデルの構築の成果とリンクし、コンテナ貨物のOD推計、それらも考慮したアジア航路へのコンテナ船の投入や航路網推計、さらにコンテナ航路のサービス水準(船型,頻度など)を国際海上コンテナ貨物流動モデルへ導入することにより、貨物流動予測が可能となる評価モデルとできた。今後は、28年度の作業の遅れなども取り戻し、カスケード効果などによりアジア地域へのコンテナの配船がどのようになるか、将来のアジア地域の貨物純流動ODがどのようになるかなどについて、28年度の検討結果も活用して、検討を進める。平成30年度は、本研究課題の最終年度にあたることから、これまでの進捗の遅れなども取り戻すべく、研究代表者・分担者間でこれまで以上に密に連携・連絡調整などを行い、残っている研究課題の推進をする。本研究課題は、28年秋に交付決定を受けて28年度後半から研究業務に着手したため、他の業務などとの関わりもあり、少し検討作業が予定よりも遅れてしまった。このため、物品購入や出張旅費など等において発生した残額については、次年度に使用することとなった。(理由)本年度の研究課題は、28年度秋に交付決定をうけて28年度後半から研究着手したため、3年間の当初計画を2年半で実施すべく29年度も務めたが、多少の検討の遅れもあり、データ購入や学会出張など等が一部できなかったこともあり、繰り越しが生じた。(使用計画)繰り越し金約6万円については、30年度の予算とあわせて、計画的、効率的に執行する予定である。平成29年度の経費とあわせて、効率的に執行する予定である。この「世界の国際海上コンテナ流動OD量の中長期見通しの試算」については、平成28年度にとりまとめ、土木学会海洋開発シンポジウム(H29年6月予定)に投稿。
新規ペプチド、ニューロメジンSおよびUの生体時計と摂食機構の調節に関する研究

2005年に新たなペプチドとして同定されたニューロメジンSあるいはその関連ペプチドのニューロメジンUにおける新たな生理機能の探索を行った。その結果、これらのニューロメジンS/Uが様々な知覚情報のメディエーターとして作用し、オキシトシンの分泌を制御していること、あるいは摂食抑制ホルモンであるレプチンの下流で摂食を制御していることが判明した。またニューロメジンSのノックアウトマウスでは心拍数が減少しており、自律神経系を介した循環器系への作用も推測された。ニューロメジンUおよびSの中枢投与が循環器系に及ぼす影響【目的】ニューロメジンU(NMU)及びニューロメジンS(NMS)は近年、オーファン受容体であるFM-3/GPR6、FM-4/TGR-1の内因性リガンドとして同定されたペプチドであり、NMUが中枢・脊髄および腸管に広く分布するのに対し、NMSは視床下部の視交叉上核にかなり限局して存在する。我々はこれまでに、両ペプチドには共通して摂食抑制作用、生体時計調節作用、抗利尿作用あるいは射乳作用があることを報告したが、いずれの作用においても両者の作用持続時間に有意な差が認められた。今回、これらのペプチドの中枢投与が心拍数や血圧などの循環器系へどのような影響を及ぼすかについてその作用時間を含めて検討した。【方法】慢性的に側脳室カニューレを装着した成熟雄ラットに、これらのペプチドを単一投与し、心拍数及び血圧を非観血的に測定した。また、ニューロメジンSのKOマウスにおいて心拍数及び血圧を測定した。【結果】NMU及びNMSの中枢への単一投与は、心拍数および血圧の有意な増加を誘起した。NMU投与では投与後10分で心拍数は有意に増加し、その後元に戻る経過を示したのに対し、NMS投与では数時間に及ぶ持続的な増加を誘起した。また、NMS KOマウスはワイルドマウスに比べ、心拍数が有意に低下していたが、血圧には有意差はなかった。【考察】以前NMUの単一投与が血圧を増加させることを報じたが、今回の実験によりNMUとNMSいずれもが心拍数や血圧に対して促進作用を有することが判明した。一方NMS KOマウスでは有意な心拍数の低下が認められ、NMUとNMSの投与結果と一致したことから、これらが循環器系に対して生理学的役割を果たしていると推測された。21年度は走行運動と摂食行動にどのような関係があるのか?という課題について検討した。実験では走行運動と摂食行動の関係について、ラット(成熟雄SDラット)の毎日の走行運動可能時間を24時間から3時間に制限したときに摂食量はどのように変化するのか、逆に毎日の給餌量を制限した場合や高カロリー食を給餌した場合に走行運動量はどのように変化するのかを輪廻し付きのケージを用いて調べた。ラットを輪廻し付きのケージで飼育し、毎日の走行可能時間を3時間から24時間に増加させた場合、有意な摂食量の低下が認められた。逆に毎日の走行可能時間を24時間から3時間に制限させた場合には、摂食量は有意に増加した。一方で毎日の給餌量を制限し摂食量を減じると給餌制限期間でのみ走行運動量の有意な増加がみられ、高脂肪食を給餌すると、給餌前に比較して走行運動量は有意に減少した。ニューロメジンUとSの中枢投与は走行運動を促進し、摂食を低下させた。次に、摂食量と走行運動の関係を肥満動物で検討した。その結果、肥満動物では肥満を発症する以前から過食が起こり、これによって走行運動が抑制されていることが判明した。また肥満動物にニューロメジンUおよびSを投与しても走行運動の抑制は解除できなかった。以上の結果より、ラットにおいて「走行運動と摂食行動の間には、走行運動が抑制されると摂食は亢進し、逆に走行運動が増加すると摂食は抑制される。」という、いわば相反的共役の関係が存在することが判明した。またニューロメジンはこの相反的抑制機構に作用していると推測された。一方、肥満動物ではこの相反的共役の破綻が起こっていること、この状況ではニューロメジンの効果が認められないことが示唆された。主に視交叉上核(生体時計部)に限局して発現しているペプチド、ニューロメジンS(NMS)はニューロメジンU(NMU)とN端8個のアミノ酸が相同性を有し、NMUと同じ受容体(NMUR1,NMUR2)に作用するが、NMUとは別の染色体上にコードされている。これまでに、生体時計調節、摂食抑制、抗利尿あるいは射乳促進などの作用を明らかにしたが、いずれもNMUよりも顕著に強い作用を示した。以前NMUの中枢投与が体温を著しく上昇させることを報じたが、体温には日内リズムが存在することから視交叉上核のNMSの関与はNMUとは異なる可能性がある。そこで、両者の体温への影響を比較検討した。

体重300400gのWistar雄ラットの側脳室に慢性的ステンレスカニューレを装着した。回復後に明期と暗期の両方で1nmolのNMSとNMUを側脳室に投与し、赤外線サーモグラフィにより背中(肩甲骨上部)の体温を経時的に測定した。明期での投与ではNMSとNMUの両者ともに約1度の体温上昇が見られ計測終了時(60分)まで上昇は維持された。一方、暗期の投与でも上昇作用が見られたが、終始圧倒的にNMUの効果が強く現れNMSとNMUの効果には有意差が生じた。NMSにも体温上昇作用があることが確認された。しかし、NMUが暗期に体温を著しく上昇させたのに対し、NMSにはそのような強い作用は認めなかった。NMUの方が強い作用を示したのは初めてであり、両者には異なる作用の関与が推測される。以上の結果、ニューロメジンSは生体時計を通して体温の調節に重要な役割を演じている可能性が示唆された。
レーザによる電気機器内部磁束の遠隔計測法の技術開発

本研究では、電力機器内部磁束の遠隔測定の実現を目指し研究を実施した結果、レーザを用いた遠隔計測システムの構成技術とそれに用いる電磁光学材料の合成技術を開発することが出来た。その第1の遠隔計測システムでは、これを構成するレーザー回路構成と、適用する電磁光学結晶の透過率やベルデ係数等の特性を考慮して、最適なレーザ波長と結晶厚みを決める設計方法を確立することができた。この設計法にしたがって、超電導マグネット内部の高磁界や送電線周囲の弱磁界を遠隔測定できる計測システムを試作し、既存技術であるガウスメータによる測定結果と比較して、同程度の計測精度が得られることを検証できた。さらにこの計測法をもちいて送電線の電流をレーザにより計測する光CTを開発した。この光CTの使用する周囲環境の変化、特にレーザと結晶素子の温度特性,結晶素子のレーザ入射光特性、光CTの振動特性を測定し、その実用実用化のための基礎データを得た。さらに、この光CTを用い九州電力(株)の模擬送電線にて3層短絡電流等の各種故障試験を実施し、電流値を測定し定常電流から故障電流までの広いダイナミックレンジでの測定を行い良好な結果を得た。この光CT測定技術はその結晶素子を置き換えることにより電力機器の内部磁束の遠隔測定に適用できる。第2の材料では、レーザ蒸着法を用いて、弱磁界計測を対象にした電磁光学結晶を合成した。その結果、実用化されている結晶に比べ、ベルデ係数感度が大きく光CTの材料としてビスマス置換鉄ガーネット(Bi:YIG)を合成できた。レーザ蒸着法はターゲット-基板間距離、酸素圧力、基板温度といった複雑な成膜パラメータがある。本研究ではこれらを系統的に調べX線回折やSEM観察で評価することで、Bi_1Y_2Fe_5O_<12>薄膜の生成条件を絞り込むことができた。合成した結晶薄膜のベルデ係数、吸収係数を測定した結果では、薄膜の結晶性や材料の組成とレーザ波長やベルデ係数が強い関係にあることが分かり、送電線電流の光CT計測法に適用する電磁光学結晶の最適合成方法の見通しを得た。送電線保護リレー用の電流と電圧をレーザ計測する可能性を調査・研究して、これまで次のような成果を得ることができた。(1)電磁界機能材料の合成除冷法によりファラデー素子やポッケルス素子やレーザアブレーション用のターゲットを生成する装置(電気炉、材料整形装置、焼結装置)を購入した。なお、九州大学と電中研の共同研究で、レーザアブレーションによるBSO、YIGなどの結晶膜を作成した。(2)光素子の基本特性の測定光CT装置を設計し3相分を試作し、装置の構成や材料基本特性を測定する為2Tの常温マグネットを設計し購入した。本装置と九州電力の4T超電導マグネットや九州大学の誘雷装置と簡易電界発生装置を用いて、BSO,BGO,YIG、鉛ガラスなどの光機能材料の電界磁界中での偏光特性を測定し、次の点を明らかにした。●リレー用電圧計測は2桁のダイナミックレンジと5次高調波程度の波形測定精度が要求される。この測定はBSO、BGOが適しており、今後はこれらの素子の測定試験を行う。●リレー用電流計測は3桁のダイナミックレンジと5次高調波程度の波形測定精度が要求される。この測定はYIGが適している。

●発電器内部の高磁界測定には、4Tまで線形特性が得られるBSO結晶が適している。(3) kA級光CTの試作と試験低磁界で偏光するYIG素子と半導体レーザを組み合わせたkA級光CTを試作した。これを用い九州電力の短絡試験設備で突発短絡電流を測定し次の点を明らかにした。●3LS,2LS故障の数サイクル後にヒューズの溶断状況が判別できるまでの突発短絡電流波形を測定することができた(第5次高調波以上と考えられる)。●短絡電流ピーク値は同時に測定した現用CT値一致し3kA級の測定ができた。本研究は発電機や送電線などの電力機器内部の磁束をレーザと電磁光学結晶(光結晶)により遠隔計測して、電力系統の新しい計測監視制御システムに適用することを目的としており、次のような研究を実施した。1.平成10年度は、20年間の国内外の光による電磁界計測の文献調査を行い、光磁束計測が実用化していない理由を明らかにした。2.さらにYIG(イットリューム鉄等方結晶)を用いて、超電導と常電導マグネット内部の4T(テスラ)までの高い磁束密度を計測し、レーザによる磁束計測方法の基本設計に必要なデータを実験で得た。3.平成11年度は、送電線周辺の10mT(ミリテスラ)級の低い磁束密度を計測し、送電線の電流を間接計測する光変成器(光CT)を開発した。4.これは、半導体レーザ、光結晶による計測素子、偏光子、検光子を同一光軸上に配置した光CTで、素子に加わる磁束密度の大きさにより偏光角度が変わるファラデー効果を検出して電流を測定するものである。5.計測素子は浮遊体溶融法(FZ法)とレーザ蒸着法(PLD法)により作成し、その透過性やファラデー効果の大きさを比較して特性のよいFZ法結晶を採用した。6.この結果CeやBiをドープしたCeYIGやBiYIG結晶が送電線の電流計測に適していることを明らかにした。7.製作した光CTを用いて九州電力丸田発電所と七隈試験センターの送電線での現地試験で突発短絡電流や常時電流を計測し、現用の電流計測方法と比較した結果、十分実用性があることを明らかに出来た。8.これらの結果を九州大学総合理工学研究科技術報告書や国の内外の学会に発表した。本研究では、電力機器内部磁束の遠隔測定の実現を目指し研究を実施した結果、レーザを用いた遠隔計測システムの構成技術とそれに用いる電磁光学材料の合成技術を開発することが出来た。その第1の遠隔計測システムでは、これを構成するレーザー回路構成と、適用する電磁光学結晶の透過率やベルデ係数等の特性を考慮して、最適なレーザ波長と結晶厚みを決める設計方法を確立することができた。この設計法にしたがって、超電導マグネット内部の高磁界や送電線周囲の弱磁界を遠隔測定できる計測システムを試作し、既存技術であるガウスメータによる測定結果と比較して、同程度の計測精度が得られることを検証できた。さらにこの計測法をもちいて送電線の電流をレーザにより計測する光CTを開発した。この光CTは、使用する周囲環境の変化、特にレーザと結晶素子の温度特性,結晶素子のレーザ入射光特性、光CTの振動特性を測定し、その実用実用化のための基礎データを得た。さらに、この光CTを用い九州電力(株)の模擬送電線にて3層短絡電流等の各種故障試験を実施し、電流値を測定し定常電流から故障電流までの広いダイナミックレンジでの測定を行い良好な結果を得た。
体内無線電力伝送システムの開発

人体埋込型医療機器への電力伝送を目的としている。カプセル内視鏡への電力伝送には,画像伝送に使用されている433MHz帯が優位であり,人体腹部の組織の中で,筋肉,小腸,脂肪が他の組織に比べ電力伝送に大きく影響を与え模擬が不可欠であることが判明した。フレキシブル基板を用いた体内アンテナの提案を行い所望の特性が得られた。皮下に埋込む固定型センサへについては,5.8GHzでのシステム設計,実験を行った結果,人体防護指針を順守しても,マイコンを駆動できる電力が送信できることを確認した。人体埋込型医療機器への電力伝送を目的に研究をしている。はじめに,カプセル内視鏡への電力伝送を検討した。電力伝送に使用する周波数の検討を行った結果,現在カプセル内視鏡の画像伝送に使用されている周波数の433MHzと315MHz,他に使用可能な13.56MHz,920MHz,2.45GHzなどと伝送損失,アンテナの小形化などの観点で比較した結果,画像伝送に使用している周波数と同じ433MHz帯が優れており,この周波数で検討していくことにした。検討していく周波数帯が決定したので,人体組織の電気定数の調査を腹部を中心に20以上の組織で行い完了した。カプセル内視鏡の電力伝送時に影響を与える組織を選定した結果,小腸の電気定数は,筋肉の電気定数と差が大きく,カプセル内視鏡と密着しているため,受信アンテナの反射係数に大きく影響し,脂肪の電気定数は,全身に分布しているため計算結果に大きく影響する。以上より,カプセル内視鏡が小腸に位置する場合では,筋肉,小腸および脂肪の組織が特に影響が大きく,模擬する必要があると結果を得た。体外の電力伝送用送電アンテナとカプセル内視鏡内の受電アンテナの基本設計を行い,伝送効率等のシミュレーションを行った。伝送効率は人体組織による損失により数%程度と低いもの,カプセル内視鏡を駆動するのに必要な電力が確保できそうな目途が立った。人体埋込型医療機器への電力伝送を目的に研究をしている.昨年まで行っていたカプセル内視鏡への電力伝送の他に,皮下に埋め込んだ固定型医療センサへの電力伝送の検討も新たに行った.皮下に埋め込んだ固定型医療センサへの電力伝送については,外部の装置を小形化することも重要であるため,昨年では検討していなかった5.8GHzでの回線設計,電磁界シミュレーションおよび実験を行った.その結果,人体防護指針を順守した送信電力の場合でも,マイコンなどを駆動するのに必要な電力が送信できることが分かった.カプセル内視鏡への電力伝送については,カプセル内視鏡内のアンテナの改良,電力伝送の効率を上げるためのカプセルの位置推定技術の検討,人体外部アンテナの検討を行った.まず,カプセル内視鏡内のアンテナとして,ヘリカルアンテナの検討を行ってきたが,特性の向上を図るためには,μmでの製作精度の向上や安定性が必要なことから,フレキシブル基板を用いたアンテナの設計,回析を行った.所望の特性が得られることが分かったため,来年度は試作実験を行う予定である.次に,電力伝送のためのカプセル内視鏡の位置推定は,リアルタイム性が必要とある.画像の位置特定には遺伝的アルゴリズムなどを用いた方法が提案されているが,時間がかかる.位置と深さ,外部アンテナの送信角度特性などを基に近似曲線を用い,カプセルの3次元位置推定を行うアルゴリズムを提案した.昨年度の報告で今後の研究方策として挙げた事項,μmオーダーの設計精度のための課題,電力伝送をるためにカプセルの位置推定,小腸ファントムの開発,カプセル内視鏡以外の体内電力伝送などは,今年度検討を行った.個々の要素技術にはまだ残された課題があるが,要素技術の設計はほぼ完了した.皮下埋込型医療機器に関しては,シミュレーションで設計した内部・外部アンテナが,人体の層構造を模したファントムで機能していることを実験により確認できており,今後は具体的なアプリケーションとしての課題などが残されている.カプセル内視鏡の位置推定に関しては,外部アンテナの配置や人体組織による位置精度のゆらぎなど検証する課題が残されており,検討していく予定である.カプセル内視鏡内のアンテナについては,アンテナ内に組み込まれるカメラや電子回路の影響について検証する必要が残されており,この評価方法も検討していく予定である.カプセル内視鏡への電力伝送では,昨年度よりアンテナの製作精度の向上,特性の安定化のため,フレキシブル基板を用いたアンテナの設計を行ってきた.今年度は数値計算により所望の特性が実現可能なアンテナデザインができた.さらにフレキシブル基板を用いた試作を行い,小腸や筋肉を模擬した複数組織人体ファントムの製作を行った.これらを用いて,アンテナ特性の実証実験を行った.その結果,適切な配置を実現すれば,所望のアンテナ特性が得られることが確認できた.その反面,3Dプリンタで作成したカプセル内視鏡のカバーの製作精度や空気が混じるなど材料特性の問題やカバーとアンテナ間の距離のセンシティブさなどの課題も判明した.また,効率の良い電力伝送を実現するために,カプセル内視鏡の位置をもとに体外に配置する複数の送電アンテナを制御するシステムを開発する必要がある.そのため刻々と移動するカプセル内視鏡のリアルタイム位置推定アルゴリズムの初期検討を行った.人体内は複数の組織があり腸には空気が入っている.また,従来の位相を用いて位置推定するにはデバイスのコストがかかるため,人体内の異なる組織でも減衰量が大して変わらないことを利用し,受信信号電力の強度に拠って位置推定を行うアルゴリズムの検討を行っている.

その結果,簡易人体モデルにおいて位置推定精度4cm以内,80%の位置で2cm以内を達成できることが数値計算によって分かった.人体埋込型医療機器への電力伝送を目的としている。カプセル内視鏡への電力伝送には,画像伝送に使用されている433MHz帯が優位であり,人体腹部の組織の中で,筋肉,小腸,脂肪が他の組織に比べ電力伝送に大きく影響を与え模擬が不可欠であることが判明した。フレキシブル基板を用いた体内アンテナの提案を行い所望の特性が得られた。皮下に埋込む固定型センサへについては,5.8GHzでのシステム設計,実験を行った結果,人体防護指針を順守しても,マイコンを駆動できる電力が送信できることを確認した。初年度予定していた課題として,1.周波数(430MHz,920MHz, 2.45GHz)において簡易な人体モデルを用いた無線電力伝送のシステム設計を行い,周波数の選定,2.体外用アンテナはアレーアンテナとし,腹部の大きさやカプセル内視鏡が移動する範囲などを勘案して,アレーアンテナの素子数,間隔を決定,3.人体の組織構造,皮膚,脂肪,筋肉,腸,必要に応じて他の組織も含めた模擬した人体モデルの構築,4.モデルの構築と平行して,生体適合性のある材料の調査を行い体内及び体外用のアンテナとして使用可能な材料の選定,5.小形の体内用アンテナの開発の5項目を挙げていた。1.周波数の選定は433MHz帯で検討を進めて行くことが決定し,完了。2.体外用アレーアンテナの素子はほぼ検討を終了したが,素子間隔などは引き続き検討が必要である。3.人体モデルの構築はシステムに影響を与える組織の同定などが完了し,簡易モデルの構築が完了している。4.生体適合性のある材料については,幾つかの候補を選定したが,他にも使用可能な材料がないか引き続き調査を行っていく。5.体内用小形アンテナの開発は,2つのモデルを提案した。カプセルの向きに依存しないアンテナを提案しているが,さらに伝送効率の高いアンテナを引き続き検討していく予定である。来年度は最終年度にあたるため,要素技術を組み合わせたシステムとしての評価を行う計画である.システム評価として,フレキシブル基板を用いたアンテナを外注試作し,それを3Dプリンタで作製したカプセルに入れて,筋肉や小腸を模したファントム内での電力伝送評価を行う予定である.カプセル内視鏡の位置推定に関しては,従来カプセル内視鏡の画像伝送に使用している外部アンテナ配置で,電力伝送に必要な位置精度が達成できるのか,湾曲した腹部でも適応可能かかど検証していく予定である.カプセル内視鏡内に組み込まれるカメラや電子回路の影響については,シミュレーションによる検証を行っていく予定である.以上の研究成果を国際会議及び国内学会で発表するとともに,学術論文の執筆を行う.アンテナ工学前年度に行った,体内無線電力伝送のシステム設計を基に,選定した周波数で実現する体内及び体外用アンテナ開発を行う。カプセル内視鏡は体内では移動と共に向きが大きく変わるため,安定して無線電力伝送および通信ができるアンテナを設計する必要がある。そのためには体外用アンテナは平面円偏波アンテナである必要がある。カプセルが回転しても受信できるように,体内用アンテナは軸対称のアンテナにする必要がある。
スフィンゴリピドーシスの病因病態解析の基礎的研究

スフィンゴリピドーシスの病因病態解析の一つとして、リゾスフィンゴリピドの蓄積とその細胞毒性の観点から研究が試みられた。人工的にスフィンゴ脂質より作製したリゾスフィンゴリピド、例えば、ガラクトサイコシン,グルコサイコシン,スフィンゴシルホスフォリルコリンを5020μg/グルコサイコシン,スフィンゴシルホスフォリルコリンを5020μg/mlの濃度で、3×【10^6】ケのglioma-cellU-251の培養細胞に添加すると、細胞崩壊は短時間で見られるが、低濃度では培養細胞の増殖は低下するが、ガラクトサイコシンとグルコサイコシンは細胞のβ-ガラクトシダーゼやβ-グルコシダーゼによって糖とスフィンゴシン塩基に分解され、糖はそのまゝ細胞により作用され、また、スフィンゴシン塩基はリン酸化液,リガーゼによってリン酸エタノールアミンと脂肪アルデヒドに分解され、リン脂質合成に利用されることが分かった。一方、スフィンゴシルホスフォリルコリンはスフィンゴシン塩基とホスフォリルコリンに分解されることなく、そのまゝアシル化されてスフィンゴミエリンとなった。使用したスフィンゴシルホスフォリルコリンはerythro型とthreo型の異性体からなったので、生成されたスフィンゴミエリンも両型の異性体からなり、erythro型は細胞膜に利用され、threo型は培地に放出された。なお、スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリナーゼによってセラミドとリン酸コリンに分解され再利用された。以上の結果より、β-ガラクトシダーゼ欠損Krabbe病やβ-グルコシダーゼ欠損Gaucher病では、ガラクトサイコシンやグルコサイコシンの増量による病因病態の可能性が示唆されたが、スフィンゴミエリナーゼ欠損Niemann-Pick病の病因はスフィンゴシルホスフォリルコリンの増量によるものではないことが明らかにされた。
富士火山の火砕流堆積物の発生・堆積機構に関する研究

富士山ではこれまで防災対策を行う上で重要な現象である火砕流堆積物が重要視されてこなかった.本研究では富士火山における玄武岩質火砕流の特徴を明らかにし,その発生および流動堆積機構を解明することを目的として,東北山麓を中心に野外調査をおこない,東京大学地震研究所所有の北東麓掘削のボーリングコアの解析を行った.また玄武岩質安山岩質の火山である開聞岳や十勝岳の野外調査を行った.その結果,富士火山北東麓には複数の火砕流堆積物が存在し,ボーリングコア中にも確認された.これらの火砕流は火砕流堆積物中に含まれる炭化木片の年代測定の結果,約3500年前から1500年前に噴出したものである.またこれらの火砕流は少なくとも特徴的な2つのタイプの岩相をもつ.一つは本質物質に富み,一般的な火砕流堆積物に比べ細粒物に乏しい岩相を示し,もう一方は外来岩片を多く含み,本質物質がパン皮状ないしカリフラワー状の形状を示す.このような岩相を示す火砕流は開聞岳や十勝岳でも確認された.このような火砕流の岩相および堆積構造や粒度組成は,一般的な火砕流として認識されている安山岩質から流紋岩質の噴煙柱崩壊型(北海道駒ヶ岳など)や溶岩ドーム崩壊型(雲仙普賢岳など)の火砕流堆積物と異なり,玄武岩質玄武岩質安山岩質の火山で特有の火砕流であると考えられる.またこれらの堆積物の岩相および堆積構造の観察,粒度組成分析などからこれらの発生プロセスは急斜面にできたスコリア丘もしくはスパター丘が崩壊して火砕流になったものと急斜面にマグマが貫入した時に山体が部分的に崩壊し発生したものであると推定される.今年度は富士火山の北から北東山麓を中心に詳細な野外調査を行った。野外調査では火砕流堆積物の堆積構造,構成物,岩石の産状,岩相の変化を詳細に記載し,同一給源および噴火から噴出した火砕流堆積物を対比した.またそれらの火砕流堆積物の追跡調査を行うことにより分布,規模を明らかにした。その結果火砕流は少なくとも特徴的な2つのタイプの岩相を示すことを確認した.一つ目のタイプの火砕流堆積物は比較的発砲の良いスコリアから構成され,外来岩片が少なく,細粒物に乏しい特徴を持つ.特に沢の上流部において球形火山弾ないし,含芯火山弾を特徴的に含み,溶結している部分もある.最下部には淘汰の良い火砕サージ堆積物が確認できる.もう一方のタイプの火砕流堆積物は本質物質が緻密からやや発砲した岩片から構成され,紡錘状火山弾を含み,外来岩片を多く含む特徴を持つ.それぞれの火砕流堆積物に含まれる本質物質はカンラン石玄武岩であり,SiO2が5152wt%である.両火砕流の本質物質の全岩主成分化学組成および微量元素組成は明らかな組成差を示さない.前者のタイプの火砕流堆積物はバイモーダルな粒度分布を示し,一般的な安山岩から流紋岩質の火砕流堆積物に比べ細粒物に乏しい特徴を持つ.火砕流と同時期の降下火砕物や溶岩が認められず,分布が谷沿いに限られること,火砕丘によく見られる球形火山弾や含芯火山弾を特徴的に含むことなどから「火砕丘の部分崩壊」などの一般的な安山岩質から流紋岩質の火砕流とは異なる発生・堆積機構である可能性が高い.また後者の方は外来岩片が多量に含まれることから,小規模な山体崩壊である可能性が高い.富士山ではこれまで防災対策を行う上で重要な現象である火砕流堆積物が重要視されてこなかった.本研究では富士火山における玄武岩質火砕流の特徴を明らかにし,その発生および流動堆積機構を解明することを目的として,東北山麓を中心に野外調査をおこない,東京大学地震研究所所有の北東麓掘削のボーリングコアの解析を行った.また玄武岩質安山岩質の火山である開聞岳や十勝岳の野外調査を行った.その結果,富士火山北東麓には複数の火砕流堆積物が存在し,ボーリングコア中にも確認された.これらの火砕流は火砕流堆積物中に含まれる炭化木片の年代測定の結果,約3500年前から1500年前に噴出したものである.またこれらの火砕流は少なくとも特徴的な2つのタイプの岩相をもつ.一つは本質物質に富み,一般的な火砕流堆積物に比べ細粒物に乏しい岩相を示し,もう一方は外来岩片を多く含み,本質物質がパン皮状ないしカリフラワー状の形状を示す.このような岩相を示す火砕流は開聞岳や十勝岳でも確認された.このような火砕流の岩相および堆積構造や粒度組成は,一般的な火砕流として認識されている安山岩質から流紋岩質の噴煙柱崩壊型(北海道駒ヶ岳など)や溶岩ドーム崩壊型(雲仙普賢岳など)の火砕流堆積物と異なり,玄武岩質玄武岩質安山岩質の火山で特有の火砕流であると考えられる.またこれらの堆積物の岩相および堆積構造の観察,粒度組成分析などからこれらの発生プロセスは急斜面にできたスコリア丘もしくはスパター丘が崩壊して火砕流になったものと急斜面にマグマが貫入した時に山体が部分的に崩壊し発生したものであると推定される.
eNOSトランスジェニックマウスを用いた男性不妊に対する新たな治療法の開発

セルトリ細胞においてIL-1β刺激はJNK経路を介してiNOS発現を亢進させ、NOを生成する。これらの経路の概念は精巣内病態における新たな治療戦略上において重要な一部であり、セルトリ細胞におけるサイトカイン制御機構の解明は精子形成障害の治療に貴重な情報を与えることが期待される。また停留精巣モデルによる精細胞のアポトーシスは血管内皮型一酸化窒素合成酵素強発現マウスにおいて増加したことより、熱ストレスや酸化ストレスに関連する精子形成障害においてeNOSを制御することが有効な治療法になりうる可能性が示唆された。精子形成におけるNOの役割と男性不妊患者に対する新しい治療法開発のために、本年度は精細胞の分離とIn vitroでホルモン、cAMP、Growth factorおよびサイトカインなどの精細胞への影響について検討した。8週齢のラットあるいはマウス精巣よりElutriatorによる分画法を用い、Pachytene spermatocyte(精母細胞の初期段階)とRound spermatid(円形精子細胞)を分離し、無血清培養液で培養し、各実験を行った。はじめに各種ホルモン(FSH, hCG)、cAMP inducer(Forskolin)、Growth Factor(TNFαなど)やサイトカイン(IL-1α,IL-1β,IL-6など)により刺激し、精細胞から産生されるNO量をGriess法にて測定した。さらに、NOおよびNOS阻害剤の精細胞への影響の検討するためNO generatorとしてSodium nitroprusside、あるいはNOの産生を誘導したGrowth Factorおよびサイトカインを添加し、精細胞における各NO Synthase(iNOS, eNOS, nNOS)の蛋白レベル、mRNAレベルでの発現、Viability、アポトーシスならびにアポトーシス関連遺伝子の発現について検討した。また、NOS阻害剤(L-NMMA)を添加した場合の影響についても同様に検討を加えた。さらに、In vivoでNOの精細胞への影響を検討するためeNOSトランスジェニックマウスを作成した。C57BL/6雄マウスにendothelium-specific preproendothelin-1プロモーターを用いて、内皮細胞にbovine eNOSの発現を亢進させる(Ohashi et al, J Clin Invest, 1998)。そのマウスを交配させ、4週齢の時点で尾からDNAを抽出し、PCR法により、transgeneを調べheterozygousトランスジェニックマウスとwild typeマウスをそれぞれeNOS-Tg群、WT群とした。さらに、eNOS-Tg群では、数匹のマウスの精巣を摘出し、Western blotting法にて精巣内でのeNOSの発現の亢進を確認した。本年度は、eNOSトランスジェニックマウスを用いて精子形成に対するNOの影響について主にIn vivoで検討を行った。1トランスジェニックマウスの作成In vivoでNOの精細胞への影響を検討するためeNOSトランスジェニックマウスを作成した。C57BL/6雄マウスにendothelium-specific preproendothelin-1プロモーターを用いて、内皮細胞にbovine eNOSの発現を亢進させた。2精子形成障害モデルの作成WT群で停留精巣モデルを作成した。作成方法は、以前われわれが報告した方法を用いた。エーテル麻酔下にマウスの下腹部を約2cm切開し、精巣を陰嚢から腹腔内に移動させ、鼠径輪を閉じることにより停留精巣モデルを作成した。約2週間で精細胞は障害され、精祖細胞とセルトリ細胞のみとなった。その間の精子形成障害過程を観察し、本実験系において精子形成障害過程を比較検討する上で適切と考えられる観察ポイントを検討した。具体的には、停留精巣作成後数日ごとにマウスを屠殺し精巣を摘出し、精子形成状態について病理組織学的検討を行った。3病理組織学的検討病理組織学的検討は、H-E染色あるいはPAS染色を行い、精細管中のセルトリ細胞ならびに精細胞(精祖細胞、精母細胞、精子細胞)の数を精細管あたりでカウントし、セルトリ細胞と各精細胞数との比で停留精巣後の精子形成状態を検討した。平成20年度における研究成果は以下のとおりである。術後3、5、7日目での精巣重量比(停留精巣側/陰嚢側)の平均値はそれぞれWT群で0.81、0.59、0.42、eNOS Tg群では0.62、0.44、0.33とeNOS-Tg群で有意に減少が見られた。

セルトリ細胞数あたりの精細胞数は、精粗細胞において、両群における有意な差は認めなかった。一方、精母細胞と精子細胞においては術後3日目よりeNOS-Tg群で有意に細胞数の減少が見られた。セルトリ細胞数あたりの精細胞のアポトーシス数は、eNOS-Tg群で術後3日目において有意に増加した。これらの結果より、停留精巣モデルにおいてeNOSがアポトーシスを促進させ、NOによる精子形成過程での障害はmeiosisの段階で起こることが示唆された。熱ストレスや酸化ストレスに関連する精子形成障害においてeNOSを制御することが有効な治療法になりうる可能性が示唆された。
生体情報伝達の長期的(可塑的)過程に関与する環状GMPの役割の細胞内分子機構

交感神経節シナプス前神経終末から固有の伝達物質としてアセチルコリン(ACh)が放出され、節細胞はそれに応答してシナプス電位を発生するが、そのうちAChのムスカリン性受容体を介する特別に時間経過の長い(数秒以上)興奮性シナプス電位(Slow EPSP)は、その経過の長さから神経系の活動を長時間促進的に維持する可塑的機能を持つものとして注目される。slow EPSP発生の膜機序は複雑で、数種の機序が重複して起こる多重型のものであるとの理解が近年定着しており、その背景に環状GMP(cGMP)を含む数種の第二次細胞内伝達系が関与する可能性が古くから指摘されていた。我々はムスカリン性刺激によりcGMPが神経節で著明に増加する事、cGMPが節細胞に持続性の脱分極を起こす事、cGMP依存性蛋白キナーゼ(Gキナーゼ)の活性が神経節に存在する事、Gキナーゼの特異的基質として分子量87Kの酸性蛋白が神経節に存在する事、などを本研究の過程で発見した。87Kの蛋白は抗体を用いた免疫学的手法により、脳で確認された神経系に遍在するMARCKSと呼ばれる蛋白と同一である事も本研究により確かめられ、Slow EPSPへの関与その他、その機能的役割の解明が将来に待たれる。MARCKSは元々Cキナーゼの特異的基質として提唱されたもので、恐らく複数の蛋白キナーゼの基質となり得る異なった被燐酸化部位を持ち、この蛋白を介して複数の第二次伝達系のクロストークの可能性も浮上している。交感神経節細胞を一次培養系として維持する事は古くから行なわれたが、本研究では培養中に隣接の細胞間に新たなシナプスが高頻度で形成される事が判った。この実験系を用いて伝達物質の開口放出に関する細胞内機能分子(特に蛋白)の役割の解明が進み、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)が非筋性ミオシンIIの軽鎖を燐酸化する過程がAChの放出に不可欠である事を見出した。さらに放出に関与する他の蛋白の機能解析が進んでいる。神経生化学的研究:哺乳動物上頸交感神経節において,ムスカリン性受容体刺激により数種の内在性基質蛋白の燐酸化が見られるが,そのうち最も顕著なものは分子量87K・等電点4.5の蛋白であった。この蛋白の燐酸化は,他にホルボールエステル,環状GMPの作用によっても起こる事が確認された。ウシ脳から抽出された特異的な神経蛋白であるMARCKSの抗体と反応する事から,この蛋白はMARCKSと同一であり,交感神経節でMARCKSの存在が初めて証明された。このMARCKS蛋白は細胞内骨格関連蛋白と考えられており,その杙能は細胞外からの情報到達によって起こる様々の細胞応答(物質分泌・イオンチャネル制御など)を仲介するものと考えられている。これらの細胞応答発現に際して,CキナーゼやGキナーゼによるMARCKS蛋白の燐酸化が関与する可能性が高まり,この過程の分子レベルでの追求に道が拓かれた。電気生理業的研究:交感神経節細胞を単離・一次培養して,培養皿中でシナプスを新たに形成させる事に成功した。ガラス吸引電極により神経節細胞からシナプス応答を電気的に記録し,また電極中に填めた生体活性物質(抗体など)を細胞内に注入する微細技術による研究も進行しつつある。

これにより,様々な細胞内骨格関連蛋白が伝達物質放出に関与している可能性が示された。細胞外から来る様々の生体情報が,受容体→細胞内骨格を介してシナプス活動を調節する杙序の解明を今後の目標としている。ウサギ交感神経節(SCG)中には、ムスカリン性刺激により特異的に燐酸化を受ける蛋白質(等電点4.2-4.6)が存在する。本年度はこれが近年脳で注目されているMARCKS蛋白と同一である事を、MARCKSのモノクローナル抗体を用いて同定した。MARCKSは蛋白キナーゼC(PKC)の特異的な細胞内基質として知られている。実際にSCGでも、Phorbol dibutyrateなどPKCの活性化剤によってこの蛋白の燐酸化が促進される。ところがこの蛋白はcGMP,IBMXなどによっても燐酸化され、フォトアフィニテイ・ラベル法によりcGMPに高い親和性を持つ蛋白(cGMP依存性蛋白キナーゼ,GK)の存在も別に証明された事から、SCG中にGKを介するMARCKSの燐酸化経路が存在する事が強く示唆され、これがPKCを介する経路と協調的に働いて、ムスカリン性応答を形成している可能性が示された。さらにMARCKSの被燐酸化ドメイン中のsite1-3のペプチドを合成し、両キナーゼに対する基質特異性を調べた。その結果、site-2はPKCに特異的であり、site-1はGKにもCaMキナーゼ-IIにも同程度の特異性を示した。このようにMARCKSはPKCと他の蛋白キナーゼの協調的な作用(クロストーク)の接点であり、この性質によりムスカリン性応答の根幹を形成している可能性を提示した。今後年度には、MARCKSの抗体を電気生理学的実験に活用して、ムスカリン性応答への関与を直接的に調べる予定である。交感神経節シナプス前神経終末から国有の伝達物資としてアセチルコリン(ACh)が放出され、節細胞はそれに応答してシナプス電位を発生するが、そのうちAChのムスカリン性受容体を介する特別に時間経過の長い(数秒以上)興奮性シナプス電位(Solw EPSP)は、その経過の長さから神経系の活動を長時間促進的に維持する可塑的機能を持つものとして注目される。Slow EPSP発生の膜機序は複雑で、数種の機序が重複して起こる多重型のものであるとの理解が近年定着しており、その背景に環状GMP(cGMP)を含む数種の第二次細胞内伝達系が関与する可能性が古くから指摘されていた。我々はムスカリン性刺激によりcGMPが神経節で著明に増加する事、cGMPが節細胞に持続性の脱分極を起こす事、cGMP依存性蛋白キナーゼ(Gキナーゼ)の活性が神経節に存在する事、Gキナーゼの特異的基質として分子量87Kの酸性蛋白が神経節に存在する事、などを本研究の過程で発見した。87Kの蛋白は抗体を用いた免疫学的手法により、脳で確認された神経系に遍在するMARCKSと呼ばれる蛋白と同一である事も本研究により確かめられ、slow EPSPへの関与その他、その機能的役割の解明が将来に待たれる。MARCKSは元々Cキナーゼの特異的基質として提唱されたもので、恐らく複数の蛋白キナーゼの基質となり得る異なった被燐酸化部位を持ち、この蛋白質を介して複数の第二次伝達系のクロストークの可能性も浮上している。交感神経節細胞を一次培養系として維持する事は古くから行なわれたが、本研究では培養中に隣接の細胞間に新たなシナプスが高頻度で形成される事が判った。この実験系を用いて伝達物質の開口放出に関する細胞内機能分子(特に蛋白)の役割の解明が進み、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)が非筋性ミオシンIIの軽鎖を燐酸化する過程がAChの放出に不可欠である事を見出した。さらに放出に関与する他の蛋白の機能解析が進んでいる。
酵素転移反応を利用した高感度糖鎖構造解析法に関する研究

糖鎖は核酸、タンパク質に次ぐ第3生命鎖と言われ、生体内で重要な役割を演じており、ポストゲノムを担う重要なターゲットとなっている。現在のところ、準結合型糖鎖解析法としてはピリジルアミノ(PA)化法が最も広く用いられているが、化学的標識法であり、蛍光標識された部位の糖は、その構造を保持していない。本研究では、カビのMucor hiemalis由来の酵素Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)が、酔結合型糖鎖のN, N'-ジアセチルキトビオース(GlcNAc-GlcNAc)部分のグリコシド結合を加水分解すると同時にGlcNAc残基を有する受容体に転移させる酵素であることに着目し、糖鎖構造を保持したまま高感度に分析できる酔結合型糖鎖解析法の確立を目的とした。アミノ基標識化蛍光試薬とGlcNAc-Asnとの縮合反応を行い、蛍光プローブを導入した数種類の蛍光受容体を新規合成した。次いで、Disialo-Asn糖鎖を供与体とし、Endo-Mによる糖転移率を測定することにより、数種の優れた蛍光受容体等を見出した。次いでsol-gel反応を利用し、Endo-Mを多孔質体に固定化し、Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)で分離後Time-of-FlightMassSpectrometry(TOF-MS)により糖鎖分析を行った。オボアルブミンをプロナーゼEで消化し、遊離した糖鎖混合物をEndo-M固定化多孔質体による転移反応後分離検出を行った結果、4種類の蛍光標識体を転移生成物として検出した。更に高分離、高選択的な糖鎖分析を目指し、二次元(2D)セミミクロLC-TOF-MSシステムの開発を行った。一次元側の分離にAmide-80 HILICカラム、二次元側の分離にはODS逆相カラム、標識糖鎖の捕集には陰イオン交換カラムを用い、捕集、濃縮、分離、検出をオンラインで行った。本法の応用として、オボアルブミン糖ペプチド混合物を使用しEndo-Mによる転移反応を行い、2D-LC-TOF-MSで分離検出を行った結果、オボアルブミン中の糖鎖10種類を検出できた。また、高分離能で微量分析が可能なキャピラリー電気泳動-質量分析計(CE-TOF-MS)による糖鎖分離分析法の開発を行った。本法は酵素End-Mの働きを利用し、糖ペプチドを蛍光誘導体化後、本来の糖鎖構造を保持したまま高感度、高分離、高選択的に検出することができ、酔結合型糖鎖解析の一手段となるものと期待される。糖鎖は核酸、タンパク質に次ぐ第3の鎖と言われ、生体内で重要な役割を演じている。

その中でもN-結合型糖鎖は細胞の表面層に存在し、細胞の癌化や転移、造血機能などに深く関与しており、機能解明のため簡便な分離検出法の開発が強く求められている。そこで本研究では、糖タンパク質から切り出された糖鎖に酵素Endo-Mの糖転移反応を利用し、蛍光誘導体化を行い、糖鎖を傷つけることなく構造を保持したまま分析する方法の確立を目的とした。また本法による実試料への応用も合わせて検討した。本法は酵素Endo-Mの働きを利用し、糖タンパク質や糖ペプチドから糖鎖の切り出し、蛍光誘導体化を行い、糖鎖を傷つけることなく構造を保持したまま短時間で分離することができた。得られた糖鎖転移生成物はESI-MSやTOF-MS等により容易に構造解析ができるため、本法は糖鎖解析法の一手段となるものと期待される。糖鎖は核酸、タンパク質に次ぐ第3生命鎖と言われ、生体内で重要な役割を演じており、ポストゲノムを担う重要なターゲットとなっている。現在のところ、N-結合型糖鎖解析法としてはピリジルアミノ(PA)化法が最も広く用いられているが、化学的標識法であり、蛍光標識された部位の糖は、その構造を保持していない。本研究では、カビのMucor hiemalis由来の酵素Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)が、N-結合型糖鎖のN,N'-ジアセチルキトビオース(GlcNAc-GlcNAc)部分のグリコシド結合を加水分解すると同時にGlcNAc残基を有する受容体に転移させる酵素であることに着目し、糖鎖構造を保持したまま高感度分析が可能なN-結合型糖鎖解析法の確立を目的とした。昨年度は、アミノ基標識化蛍光試薬とGlcNAc-Asnとの縮合反応を行い、蛍光プローブを導入した数種類の蛍光受容体を新規合成した。次いで、Disialo-Asn糖鎖を供与体とし、Endo-Mによる糖転移率を測定することにより、数種の優れた蛍光受容体等を見出した。最も転移率の高かった蛍光受容体NDA-Asn-GlcNAcとプロナーゼEで消化したオボアルブミン糖ペプチドの反応を行い、数種の糖鎖構造をUPLC-TOF-MSにより確認した。今年度は、更に高分離、高選択的に糖鎖分析を可能とするため二次元セミミクロLC-TOF-MS(2D-LC-TOF-MS)システムの開発を試みた。開発した2D-LC-TOF-MSは一次元側の分離にAmide-80 HILICカラム、二次元側の分離にODS逆相カラム、捕集にはShim-pack IC-A3陰イオン交換トラップカラムを用い、捕集、濃縮、分離、検出をオンラインで行った。本システムの応用としてオボアルブミン糖ペプチドの混合物を使用しEndo-Mによる転移反応を行い、2D-LC-TOF-MSで分離検出を行った。その結果、オボアルブミン中の糖鎖と考えられる10種類の糖鎖をポジティブ・ネガティブ両モードで二価イオンとして検出することができた。
サラホトキシン遺伝子の構造解析と前駆体タンパクの発現

イスラエルのヘビ、Atractaspis engaddensis毒腺からmRNAを抽出し、対応するcDNAライブラリ-(8×10^4プラ-ク)を作成したが、サラホトキシンのアミノ酸配列に基き作成した26mer合成プロ-ブとハイブリするプラ-クはなかった。挿入されたCDNAの長さが概して短かったことから、イスラエルから毒腺空輸する途中で無視できない程のmRNAの分解が起こり、コ-ド領域から3'末端のポリA配列までを含む長いmRNAが消失してしまったためと考えられる。そこで実験の主眼をペプチド合成や化学修飾により、サラホトキシンの種々の誘導体を調製し、その性質の比較から構造・活性相関を論ずることに切り替えた。その結果、C末端Trp残基は心臓毒性、血管収縮活性及びエンドセリン受容体への結合能にとって極めて重要であり、Trp欠失ペプチドには上記いずれの活性も殆ど残存しないこと、13位Tyr残基は血管収縮活性にはある程度関与するが、毒性及び受容体結合能にはさほど関与しないこと、2位Ser、4位Lys、6位Met残基はいずれの活性にもあまり関与しないが、N末α-アミノ基と9位Lys残基は各活性に重要であることがわかった。現在、9位Lys残基の役割を解明すべく9位置換体サラホトキシンを合成中である。又、4位Lys残基が活性に重要でないことを利用して、そのビオチン化誘導体を合成し、ビオチン-アビジン結合を介して樹脂に結合させたアフィニティ-カラムを調製し、受容体精製への応用を検討中である。