hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発光タンパク質における短寿命励起分子の高効率発光発現機構の研究

発光クラゲは、緑色の発光を行なう。このクラゲは、生体内にイクオリンと呼ばれる発光に必要なエネルギーを生成する発光タンパク質を持っている。イクオリンは、発光基質と酸素およびタンパク質の複合体であり、カルシウムによる誘起により発光基質から一重項励起分子を高率よく形成し、このエネルギーがイクオリン外部に存在する緑色蛍光タンパク質(通称GFP)に効率良くForester型エネルギー移動する。この結果、本来イクオリンは青色の発光を示すが、クラゲは緑色発光を示す。これらのエネルギーが関与する過程は、効率良くおこり、極めて強度の高い発光が行なわれる。本研究では、このエネルギー移動機構を用いた発光をタンパク質のない条件で行なう新しい分析ツールの開発を検討した。クラゲが持っている発光基質分子を環状糖鎖に共有結合し、さらに赤色蛍光分子を共有結合した。この化合物の発光基質分子は、三重項酸素および活性酸素と反応し、一重項励起分子を効率良く生成するようにデザインされている。三重項酸素との反応により生成されたエネルギーは、赤色蛍光分子にエネルギー移動され、赤色の発光を示すことが確かめられた。それに対し、活性酸素との反応の場合には、赤色蛍光分子へのエネルギー移動が起こらず発光基質由来の青色の発光が生じた。ここで合成した化合物は、三重項酸素と活性酸素のシグナルを赤色と青色の異なった発光色にシグナル変換できる特性を有していることが明らかとなった。発光系を用いた活性酸素検出は、感度が良く被検体を破壊することなく非破壊的にモニタリングできることが利点である。しかし、三重項酸素によるバックグラウンド発光の発生が弱点であった。本研究で開発された化合物は、三重項酸素と活性酸素のシグナルを赤色と青色の異なった発行色にシグナル変換できるためこれまでも弱点を一掃できる。発光クラゲの生体内では、タンパク質-酸素-発光基質複合体により生成された励起エネルギーを緑色蛍光タンパク質に移動させ緑色発光を行なう。この際には、タンパク質-酸素-発光基質複合体より高効率的に一重項励起分子が生成され、効率的にエネルギー移動が行なわれている。この発光機構は、分析技術の開発を指向した人工発光システムの構築に応用できる。また、エネルギー移動効率とこのコンプレックス分子の存在状態との関係は明確でない。本研究では、エネルギー移動を用いた発光色の人為調節および短寿命分子によるエネルギー移動と分子状態との関係を解明するために、人工発光システムを構築し、その発光に関して検討した。発光タンパク質の発光における発光基質はタンパク質が無い状態での水溶液中では発光を示さない。これは、一重項励起効率および蛍光効率が極めて低いためである。そこで、環状糖鎖シクロデキストリンの3位に発光クラゲの発光基質同族体を結合させ、励起効率を向上されるとともに、これらの向上効果を低減させないように他のエネルギー受容分子である蛍光分子にエネルギー移動を起こさせる複合分子を設計し化学合成した。その結果、励起分子と蛍光分子の結合位置が発光効率に大きく影響を及ぼすことが判明し、これまでに、環状糖鎖を用いず直接励起分子と蛍光分子とを結合させた場合よりも25倍の発光効率を有する発光分子-環状糖分子-蛍光分子複合体の創製に成功した。さらに本化合物は、発光環境に影響されにくいものであり、今後、学術および産業において大いに貢献できるとものと示唆された。また、励起一重項分子とエネルギー受容分子との距離が長くなるように設計された励起分子-環状糖分子-蛍光分子複合体では、エネルギー移動はほとんど起こらず、約10Åの距離の差が、エネルギー移動効率に大きな影響を及ぼしていることが示された。

イクオリンは、発光基質と酸素およびタンパク質の複合体であり、カルシウムによる誘起により発光基質から一重項励起分子を高率よく形成し、このエネルギーがイクオリン外部に存在する緑色蛍光タンパク質(通称GFP)に効率良くForester型エネルギー移動する。この結果、本来イクオリンは青色の発光を示すが、クラゲは緑色発光を示す。これらのエネルギーが関与する過程は、効率良くおこり、極めて強度の高い発光が行なわれる。本研究では、このエネルギー移動機構を用いた発光をタンパク質のない条件で行なう新しい分析ツールの開発を検討した。クラゲが持っている発光基質分子を環状糖鎖に共有結合し、さらに赤色蛍光分子を共有結合した。この化合物の発光基質分子は、三重項酸素および活性酸素と反応し、一重項励起分子を効率良く生成するようにデザインされている。三重項酸素との反応により生成されたエネルギーは、赤色蛍光分子にエネルギー移動され、赤色の発光を示すことが確かめられた。それに対し、活性酸素との反応の場合には、赤色蛍光分子へのエネルギー移動が起こらず発光基質由来の青色の発光が生じた。ここで合成した化合物は、三重項酸素と活性酸素のシグナルを赤色と青色の異なった発光色にシグナル変換できる特性を有していることが明らかとなった。発光系を用いた活性酸素検出は、感度が良く被検体を破壊することなく非破壊的にモニタリングできることが利点である。しかし、三重項酸素によるバックグラウンド発光の発生が弱点であった。本研究で開発された化合物は、三重項酸素と活性酸素のシグナルを赤色と青色の異なった発光色にシグナル変換できるためこれまでの弱点を一掃できる。
太陽対流層大規模数値計算を用いた平均場パラメタ推定の精密化

太陽の対流層を占めている乱流について、準直接計算から平均的な角運動量効果を取り出す方法を提案し、磁場のある場合ない場合について、角運動量輸送効果の違いを見積もった。乱流から平均場効果を取り出そうとするとき、平均場の勾配によらない部分(ラムダ効果)、勾配に夜部分(乱流粘性)があるために、その場での乱流状態を解析したとしても、その二つを分離することはできない。太陽内部の大規模な流れの予想を行うためには、ラムダ効果・乱流粘性を別個に見積もることが必須であるために、その推定が本研究の目的である。本研究の当初計画では、磁場生成の平均的な効果を見積もるためにテスト場法を用いて角運動量輸送効果についても見積もる予定であったが、研究を進めるうちに、速度場に対してはテスト場法は有効でないということがわかった。テスト場法では、新たな平均場を挿入し、そこから得られた新しい擾乱磁場と、もともとある擾乱速度場の相関をもとめることで平均的効果を測定する。しかし、新しい速度場を挿入し、そこから擾乱速度場を求めると、もともとある速度場とは一致しないために角運動量輸送への平均効果を見積もることが難しくなってしまうのだ。そこで、平均場の時間発展を追うことでラムダ効果と乱流粘性を切り分ける方法を新規に提案し、その方法を実行した。初年度は、磁場のない場合、さらに低解像度の計算について上記の手法を実行し、ラムダ効果と乱流粘性を見積もった。2年目には、高解像度の磁場生成乱流計算を実行し、磁場のあるとき、ないときについて、ラムダ効果・乱流粘性の変化を調査した。すると、磁場のない時には高緯度では極向きに運ばれていた角運動量が、磁場のあるときにはほぼ全領域で赤道方向に運ばれることがわかった。これは、磁場生成に対する正のフィードバックであり、磁場生成に関する重要な発見となった。29年度が最終年度であるため、記入しない。太陽の乱流から角運動量パラメタを取り出す方法を新しく提案し、その実用性をテストした。太陽活動予測のためには、大規模な流れを予測することが必要不可欠である。そのためには平均場モデルを用いることが有用であるが、平均場モデルには乱流パラメタを仮定しなければいけないという強い制約がある。そこで、本研究では太陽対流層乱流の直接計算から乱流パラメタを推定するという目的を立てた。当初の方針では、磁場の乱流パラメタを推定するために広く使われているテスト場法を角運動量輸送に対して実施することを考えていたが、流れ場の乱流パラメタに対しては、テスト場法はうまく行かないことがすぐに明らかになった。そこで、平均場(差動回転)の時間発展が情報を持っていることに着目し、平均場と乱流の相関の時間発展をフィッティングすることで、乱流パラメタを導出することを提案した。その仮説の検証のために簡単な太陽乱流を磁場なしで計算した。その計算に提案した手法を適用することで、乱流パラメタを導出した。まず、フィッティング結果を見ると、非常に誤差の小さな状況で実行できており、仮説の妥当性を示している。また、乱流パラメタについてであるが、角運動量輸送については、これまでにトポロジーに議論から創造されていたものとほぼ同じものが導出された。また乱流粘性については、水平方向にはこれまでに予想されたものが得られたが、動径方向には乱流はほとんど粘性的に働いていないことがわかった。動径方向には、熱対流はほぼ直線的に移流しており、拡散的な動きではないことがわかった。当初の予定であった、テスト場法を使えなかったことは誤算であった。これは、テスト場法では新たな平均場を用意して、擾乱の磁場を計算するのに対して、速度場への乱流パラメタの場合は、新しく計算した速度場ともとからある速度場の切り分けが困難なためにうまくいかなかったのである。その代わりに、時間発展から乱流パラメタの情報を得ることができたのは大きな収穫であった。普段は、差動回転ができるまでの時間発展は情報として捨ててしまっているが、それをすくい上げることで、有益な情報を理解することができた。この手法であれば、方程式は決定しなければいけないパラメタ以上に存在するので、手法の妥当性の検証までができるという利点がある。乱流直接計算を利用した本妥当性の検証もすでに終わっておりその意味では計画通りに進んでいるということができる。

テスト場法では、新たな平均場を挿入し、そこから得られた新しい擾乱磁場と、もともとある擾乱速度場の相関をもとめることで平均的効果を測定する。しかし、新しい速度場を挿入し、そこから擾乱速度場を求めると、もともとある速度場とは一致しないために角運動量輸送への平均効果を見積もることが難しくなってしまうのだ。そこで、平均場の時間発展を追うことでラムダ効果と乱流粘性を切り分ける方法を新規に提案し、その方法を実行した。初年度は、磁場のない場合、さらに低解像度の計算について上記の手法を実行し、ラムダ効果と乱流粘性を見積もった。2年目には、高解像度の磁場生成乱流計算を実行し、磁場のあるとき、ないときについて、ラムダ効果・乱流粘性の変化を調査した。すると、磁場のない時には高緯度では極向きに運ばれていた角運動量が、磁場のあるときにはほぼ全領域で赤道方向に運ばれることがわかった。これは、磁場生成に対する正のフィードバックであり、磁場生成に関する重要な発見となった。2016年度までに乱流から乱流パラメタを導出する手法は確立したので、2017年度では、より高解像度の場合、磁場のある場合について、乱流パラメタを導出したいと考えている。高解像度化では、小スケールの乱流が回転の影響をあまり受けないために、角運動量輸送の性質が大きく変わることが予想される。また、磁場を含めた場合にはローレンツ力により乱流の抑制が起こるために、角運動量輸送が変わる。これは大規模な磁場がほとんどなかったと考えられるマウンダー極小期時に角運動量輸送がどのように変化したのかを知るためのステップともなる。また、共同研究者とも相談し、得られた乱流パラメタから実際に平均場計算を行うと、乱流直接計算で得られたものが得られるかを検証したいと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
新生児ラット脳幹脊髄標本を用いた中枢.呼吸機構に対する麻酔薬の作用

0-4日齢ラットの脳幹脊髄標本をエーテル麻酔下で摘出し、水温25-26°C、pH7.35-7.45(ラジオメーター社製、CDM80)に保った灌流槽内に固定する。マイクロマニュピュレーター(成茂社製、MX-2型)を用い、延髄腹側部及び頚髄C4より呼吸性神経活動を記録した。増幅器を介した信号は、コンピューター及び高感度プリンター(丸紅ハイテック社製、Primera)にて記録された。吸入麻酔薬ハロタンにより濃度依存性に呼吸性活動の抑制が認められた。呼吸パラメーターのうち、呼吸回数と、換気量の調節については、ガンマアミノ酪酸受容体の関与が示唆されたが、吸気時間については認められなかった。灌流液中の炭酸ガス分圧および、pHを変えることにより、延髄での中枢性化学受容器としての性質が示されたが、低濃度のハロタンは、この機構をある程度保つことが示された。
小脳における各種神経細胞の個性獲得の分子機構

小脳をモデル系として、神経幹細胞アイデンティティの時空間制御機構について調べた。小脳菱脳唇の神経幹細胞ではAtoh1が、小脳脳室帯の神経幹細胞ではPtf1aが発現し、その部位での空間アイデンティティを規定することで、それぞれ興奮性神経細胞と抑制性神経細胞を生み出す形質を与えられているということを明らかにした。また、小脳脳室帯の神経幹細胞は、最初にプルキンエ細胞産生神経幹細胞であったものが、その後抑制性インターニューロン産生型神経幹細胞へと形質を変えることを見いだした。その過程では、転写因子Olig2とGsx1が関与することも見いだした。異なる時期の神経幹細胞を異なる時期のマウス小脳に移植する我々の実験により、小脳原基には二種類の神経幹細胞プールがあることがわかった。一つはプルキンエ細胞(PJC)を生み出す幹細胞プールであり、もう一つはPax2陽性抑制性介在神経細胞(Pax2 IN)を生み出す幹細胞プールである。後者からは、移植の時期と場所によって、ゴルジ、星状、バスケット細胞が生み出される。我々は、E12での発生途上の小脳原基のPtflaを発現する領域の中に、さらにOlig2およびGsh1という転写因子を発現するサブドメインがあることを見いだした。さらに、それぞれの遺伝子にGFPをノックインしたマウスを用いて、遺伝学的短期的リニエージ解析を行ったところ、Olig2陽性神経幹細胞からはプルキンエ細胞が、Gsh1陽性神経幹細胞からはPax2陽性介在神経細胞が選択的に生み出されるということを明らかにした。また中期的リニエージ解析により、Olig2陽性の神経幹細胞が発生と共に次第にGsh1陽性の神経幹細胞へと形質を変えるということ、すなわち「プルキンエ細胞(PJC)産生神経幹細胞」から「Pax2 IN産生神経幹細胞」への「時間形質の遷移」が起こっていることを明らかにした。また、Gsh1をPtfla領域全てで異所性に発現するトランスジェニックマウス(Neph3-Gsh1)において、プルキンエ細胞の産生が大きく減少しPax2 INの産生が増加すること、さらに子宮内エレクトロポレション法でOlig2を異所性に強制発現させるとPax2 INの産生が抑制されることを観察した。また、Olig1/2ダブルノックアウトマウスでは、プルキンエ細胞が激減し、Pax2 INが激増していた。以上から、Olig2およびGsh1がそれぞれ「PJC産生幹細胞」および「Pax2 IN産生幹細胞」の時間形質を決定していることが示唆された。我々は、Atoh1およびPtf1aにそれぞれ相互にPtf1aおよびAtoh1をノックインしたマウス系統を作製し、Atoh1およびPtf1aがそれぞれ脳室帯と菱脳唇に異所性に発現するようにした。その結果、前者のマウスでは脳室帯から興奮性神経細胞が生まれ、後者では菱脳唇から抑制性神経細胞が生まれた。すなわち、Atoh1およびPtf1aが、それぞれ興奮性神経細胞および抑制性神経細胞を生み出すのに十分であるということが証明された。この結果は、Journal of Neuroscience誌に掲載された(2014)。次に、我々は、E12での発生途上の小脳原基のPtf1aを発現する領域の中に、さらにOlig2およびGsx1(Gsh1)という転写因子を発現するサブドメインがあることを見いだした。さらに、遺伝学的短期的リニエージ解析を行ったところ、Olig2陽性神経幹細胞からはプルキンエ細胞が、Gsx1陽性神経幹細胞からはPax2陽性介在神経細胞が選択的に生み出されるということを明らかにした。また中期的リニエージ解析により、「プルキンエ細胞(PJC)産生神経幹細胞」から「Pax2 IN産生神経幹細胞」への「時間形質の遷移」が起こっていることを明らかにした。また、Gsx1をPtf1a領域全てで異所性に発現するトランスジェニックマウスにおいて、プルキンエ細胞の産生が大きく減少しPax2 INの産生が増加すること、Olig2 KOマウスでも同様な表現型が見られること、Gsx1 KOマウスでは逆の表現型が見られることがわかった。以上から、Olig2およびGsx1が「PJC産生幹細胞」から「Pax2 IN産生幹細胞」の時間的形質変化を抑制および加速していることが示唆された。この結果は、Nature Communications誌に掲載された(2014)。

また中期的リニエージ解析により、「プルキンエ細胞(PJC)産生神経幹細胞」から「Pax2 IN産生神経幹細胞」への「時間形質の遷移」が起こっていることを明らかにした。遺伝子改変マウスの表現系から、Olig2およびGsx1が「PJC産生幹細胞」から「Pax2 IN産生幹細胞」の時間的形質変化を抑制および加速していることが示唆された。この結果は、Nature Communications誌に掲載された(2014)。また、興奮性神経細胞を生み出す菱脳唇の時間形質の遷移を司る転写因子のスクリーニングにより、候補分子が複数取られた。前年度までに小脳抑制性神経細胞の発生を司る分子機構については、ある程度明らかにできたが、興奮性神経細胞については未解明の部分が多い。そこで、本年度は興奮性神経細胞のうちの大部分を占める顆粒細胞の発生について調べた。我々は、転写因子Meis1がすべての顆粒細胞前駆細胞(GCPs)および顆粒細胞(GCs)で、すなわり顆粒細胞発生にすべてのステージで発現することを見いだした。そしてノックアウトマウスの解析から、この転写因子が、GCPsの増殖と分化の両方に、さらにGCsの内側への細胞移動とT字型の軸索形成に関与することを見いだした。小脳顆粒細胞の発生においては転写因子Pax6が重要な働きをすると示唆されてきているが、Meis1はPax6ゲノムに直接結合し、その転写を活性化させることがわかった。in vitroおよびin vivoの解析によって、Meis1の顆粒細胞発生における多様な機能は、Pax6の転写活性化を介して行われるものと、そうでないものの二種類があることもわかった。小脳をモデル系として、神経幹細胞アイデンティティの時空間制御機構について調べた。小脳菱脳唇の神経幹細胞ではAtoh1が、小脳脳室帯の神経幹細胞ではPtf1aが発現し、その部位での空間アイデンティティを規定することで、それぞれ興奮性神経細胞と抑制性神経細胞を生み出す形質を与えられているということを明らかにした。また、小脳脳室帯の神経幹細胞は、最初にプルキンエ細胞産生神経幹細胞であったものが、その後抑制性インターニューロン産生型神経幹細胞へと形質を変えることを見いだした。その過程では、転写因子Olig2とGsx1が関与することも見いだした。小脳の抑制性神経細胞は複数種類あるが、それらが生み分けられるしくみについて、幹細胞の空間形質および時間形質という視点からおおむね明らかにできた。前者は、Journal of Neuroscience誌に掲載され、後者はNature Communications誌に掲載された。また、これら二つの成果は、様々なメディアで取り上げられた。以上から、研究は順調に進んでいると考えられる。しかし、興奮性神経細胞を生み出す神経幹細胞の時間形質については、完全に明らかにするとこまでは至らなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学抑制性神経細胞系の解析はおおむね完了したので、今後は興奮性神経細胞系の解析に重点をおいていきたい。特に、細胞周期の停止と神経細胞分化のメカニズムを明らかにするために、興奮性神経細胞である小脳顆粒細胞前駆細胞(GCPs)の系をモデルに研究を行う。
ヴァーチャルリアリティシステムを導入した医療安全教育プログラムの開発

医療機関において最重要課題の一つである医療安全について、看護師養成課程の期間からリスク感性を高めるため、バーチャルリアリティー(以下、VR)動画を用いた効果を検証する。本研究は、医療現場や看護学生が臨地実習で遭遇する医療事故やヒヤリハット場面のVR動画を製作する。従来の医療安全教育で用いられてきたイラスト、ビデオ映像と、VR映像の危険箇所の抽出、その要因やその後の展開の状況を分析する。VR動画視聴時の眼球運動を測定し、リスクポイントを発見することが出来るかを解析し、VR動画を視聴した看護学生のリスク感性がどのように習得されていくのかを分析する。
ウンカの長距離飛翔における脂質代謝に関する研究

海外から毎年6・7月、日本へ飛来すると考えられているウンカの数、飛来源を確定するため、次の3研究を行なった。(1)脂質分析による飛来セジロウンカの判別。東シナ海上(31^〓N・126^〓E)と日本各県農試で、1986、1987年67月に採集したウンカの乾体重、脂肪、脂肪酸を計測し、3要因について判別関数を計算比較した。その結果、長崎農試、各県農試で最終された各標本12匹当たり平均4.24.5匹が新規飛来虫(飛来後3日以内)と判別された。新規飛来虫は時間的、地域的に列島上空に不連続線が停滞した時に集中した。また東シナ海個体群の脂肪含量は採集時期により変動幅があり、飛来源の多様性を示唆した。(2)Ca、Mg含量測定による飛来セジロウンカの判別。ウンカは飛翔中、絶食によりCa、Mg含量を減少する。この知見に基づいて、1986年6月、1987年6・7月、東シナ海上の気象観測船(31^〓N、126^〓E)、日本各地で採集したウンカの乾体重と、Ca、Mg含量を原子吸光法で測定し、判別関数を求めて両者を比較した結果、各地の採集標本のなかに東シナ海群に属する個体、即ち新規飛来個体(飛来後24時間以内)が存在し、天気図上の不連続線付近に集中した。また東シナ海個体群をクラスター分析した結果、各計量値が小さい1986年採集のAクループと大きい1987年採集のBグループとに分けられ飛来源の遠近を示唆した。(3)東南アジア諸国におけるトビイロウンカの各種酵素アイソザイムの解析(予備研究)。ウンカの生化学的な地域差を調査し、飛来ウンカのそれと対比して飛来源を確定する事を目的とした。東南アジアから採集した6系統について、全タンパク、9種酵素を平板ポリアクリルアミド等電点電気泳動法分離比較した結果、malic enzymeとesterasesで、遠方のインドネシア、マレーシア個体群と、飛来源と見なされているフィリピン、台湾個体群で明らかなバンドの有無に違いが見られた。1.室内飛翔実験,セジロウンカ雌を虫ピンに付着し風洞内で07時間飛翔させた所,生乾体重,トリグリセリド(TG)含量, Ca, Mg含量は飛翔によって著しく減少した.但し同程度の生体重減少は非飛翔絶食個体にも見られた.2.東支那海採集の個体群.

気象観測定点(31°N, 126°E)で1984-6-29, 1985-7-19, 1986-6-29, 1987-7-7, -10, -11に採集したセジロウンカ雌115匹の乾体重を計った所, 1987年の個体は前3年の個体より著しく大きかった.前3年には採集時,不連続線が華中(上海附近)から九州にのび,風向から飛来源は遠く中国中南部附近と推定した.一方1987年の採集日には沖縄南方に台風が近づき,ウンカは近くの沖縄附近から飛来した可能性がある.全個体について,体密度, TG脂肪酸含量,又は体密度, Ca, Mg含量についてクラスター分析を行った結果,前3年と1987-7-7の個体群は同一クラスターに, 1987-7-10, 11日の個体群は3つのクラスターにわかれた.3.長崎農試での採集個体群. 1986-6-17から19までの17日間と1987-6-2から7-20までの12日間に予察灯で採集した個体の体密度,両脂質含量,又は体密度, Ca, Mg含量をパラメータとし,東支那海採集個体(飛来個体)のそれらについて判別関数を計算比較し,飛来個体の有無を調べた.その結果,脂質分析による新規飛来数(飛来後1日以内の個体)は,各12匹の中1日平均4匹(09匹)であり,一方Ca, Mg含量による飛来直後個体数は1日平均3匹(08匹)であった.飛来率は不連続線の停滞と時間的によく一致した.4.25都道府県における飛来数. 1986, 1987年採集個体について3)と同様な分析の結果,各12匹分析中平均24匹の新規飛来が全国的に存在した. 5.以上の結果から飛来時期,規模(率)について解明できた.今後,中国,東南アジア,日本各地から採集のウンカの各種酵素アイソザイムの分析比較により,飛来源が解明出来ると思われる.海外から毎年6・7月、日本へ飛来すると考えられているウンカの数、飛来源を確定するため、次の3研究を行った。(1)脂質分析による飛来セジロウンカの判別。東シナ海上(31°N、126°E)と日本各県農試で、1986、1987年67月に採集したウンカの乾体重、脂肪、脂肪酸を計測し、3要因について判別関数を計算比較した。その結果、長崎農試、各県農試で採集された各標本12匹当たり平均4.24.5匹が新規飛来虫(飛来後3日以内)と判別された。新規飛来虫は時間的、地域的に列島上空に不連結線が停滞した時に集中した。また東シナ海個体群の脂肪含量は採集時期により変動幅があり、飛来源の多様性を示唆した。(2)Ca,Mg含量測定による飛来セジロウンカの判別。ウンカは飛翔中、絶食によりCa、Mg含量を減少する。この知見に基づいて1986年6月、1987年6、7月東シナ海上の気象観測船(31°N、126°E)、日本各地で採集したウンカの乾体重と、Ca、Mg含量を原子吸光法で測定し、判別関数を求めて2両者を比較した結果、各地の採集標本のなかに東シナ海群に属する個体、即ち新規飛来個体(飛来後24時間以内)が存在し、天気図上の不連続線付近に集中した。また東シナ海個体群をクラスター分析した結果、各軽量値が小さい1986年採集のAグループと大きい1987年採集のBグループとに分けられ飛来源の遠近を示唆した。(3)東南アジア諸国におけるドビイロウンカの各種酵素アイソザイムの解析(予備研究)。ウイカの生化学的な地域差を調査し、飛来ウンカのそれと対比して飛来源を確定する事を目的とした。東南アジアが採集した6系統について、全タンパク、9種酵素を平板ポリアクリルアミド等電点電気泳動法で分離比較した結果、malic enzymeとesterasesで、遠方のインドネシア、マレーシア個体群と、飛来源と見なされているフィリピン、台湾個体群で明らかなバンドの有無に違いが見られた。
骨髄腫SP細胞で特異的に異常発現するmicroRNAの同定

骨髄腫のSPと非SP細胞を純化し網羅的なmiRNA/遺伝子発現解析を行いSPと非SP(以下MP)での発現比較を行った。SPとMPは、明らかに性質が異なることからmiRNAおよび遺伝子発現差があると考えられた。骨髄腫細胞株からSP細胞を抽出しmiRNAの発現量を比較したところ、miRNA-181ファミリーでSPとMP間の発現差を見いだした。miR-181の標的蛋白としてBmi-1が同定され、EZH2発現上昇→miR-181発現低下→Bmi-1発現上昇→Pten or Bim発現低下→Bcl2発現上昇が明らかにされた。本研究は、骨髄腫の細胞株と臨床検体を用いて、side population(SP)分画をセルソーターで採取し骨髄腫SP細胞のがん幹細胞としての性質を詳しく調べた上で、SP細胞に特徴的に発現するmicroRNA(以下miRNA)を同定する。さらに、SPにおけるmiRNAの機能解析と標的遺伝子・蛋白の同定を行い、治療標的ともなり得る標的分子を同定する。20検体(現在解析中)と骨髄腫14細胞株のSPと非SP細胞を純化し網羅的なmiRNA/遺伝子発現解析を行い、SPと非SP(以下MP)での発現比較を行う。同定されたmiRNAに対する機能解析を中心に行う。miR-181の標的蛋白としてBmi-1が考えられる(RPMI 8226細胞株では、EZH2発現上昇→miR-181発現低下→Bmi-1発現上昇→Pten or Bim発現低下→Bcl2発現上昇という機序を明らかにした。また、以下の研究を行った。標的となりうる遺伝子Bmi1のsiRNAを設計しtetracycline off systemにより発現調整ができるvectorを細胞株に導入した。そしてNOGマウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnul mouse)に、標的遺伝子のsiRNAのレンチウィルスベクターを組み込んだ腫瘍細胞株または臨床検体細胞を経皮下的に移植して腫瘍を発症させた後、tetracycline(5g/l)水を同マウスに投与してsiBmi1を発現させ、SP細胞への腫瘍抑制効果を検討した。結果、腫瘍の縮小効果が認められた。本研究では骨髄腫の臨床検体と細胞株に対して、薬剤排出機能が亢進し、かつ、がん幹細胞が多く含まれるとされるside population(SP)分画と非SP分画からRNAを抽出して、網羅的なmiRNA発現解析を行うことによりSP細胞で異常発現するmiRNAを同定し、治療標的となりえるmiRNAの同定を目指した。臨床検体20検体と骨髄腫14細胞株のSPと非SP細胞を純化し網羅的なmiRNA/遺伝子発現解析を行い、SPと非SP(以下MP)での発現比較を行った。骨髄腫臨床検体では、CD138で標識した細胞からSP細胞を純化し、RNAを抽出し、遺伝子網羅的発現解析を行った。その際の遺伝子発現の比較はCD138陽性のSPとMP細胞分画である。骨髄腫細胞株の実験SPとMPは、明らかに性質が異なることからmiRNAおよび遺伝子発現差があると考えられた。4骨髄腫細胞株からSP細胞を抽出しMP細胞との間で30 miRNAにつき発現量を比較したところ、miRNA-181でSPとMP間の発現差を見いだした。また、標的となりうるmiR-181を設計しtetracycline off systemにより発現調整ができるvectorを細胞株に導入した。そしてNOGマウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnul mouse)に、標的遺伝子のmiRNAレトロまたはレンチウィルスベクターを組み込んだ腫瘍細胞株または臨床検体細胞を経皮下的に移植して腫瘍を発症させた後、tetracycline(5g/l)水を同マウスに投与してmiR-181を発現させ、SP細胞への腫瘍抑制効果を検討し、miR-181強制発現による腫瘍退縮効果を認めた。また、MGUS,無症候性骨髄腫、症候性骨髄腫、そして、再発難治性骨髄腫といった病態の進行に伴ってmiR-181のSPにおける発現変化が経時的に発現が低下することを見出した。現在、成果をまとめている。計画通りに実験が進んでいる。血液内科学遺伝子発現解析でSP特異的に発現する細胞表面抗原が判明すれば、抗体を作成し生体内での骨髄幹細胞の同定をも目指す。網羅的遺伝子解析がすでになされており、現在解析中である。例えば前ページ図のmiR-181の標的蛋白としてBmi-1が考えられる(RPMI 8226細胞株では、EZH2発現上昇→miR-181発現低下→Bmi-1発現上昇→Pten or Bim発現低下→Bcl2発現上昇という機序を明らかにしている)。

標的となりうる遺伝子のsiRNAやmiRNAを設計しtetracycline off systemにより発現調整ができるvectorを細胞株に導入する。そしてNOGマウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnul mouse)に、標的遺伝子のsiRNA/miRNAレトロまたはレンチウィルスベクターを組み込んだ腫瘍細胞株または臨床検体細胞を経皮下的に移植して腫瘍を発症させた後、tetracycline(5g/l)水を同マウスに投与してsiRNA/miRNAを発現させ、SP細胞への腫瘍抑制効果を検討する。効果が認められた場合、それはmiRNAの本質的な標的蛋白である。遺伝子発現解析でSP特異的に発現する細胞表面抗原が判明すれば、抗体を作成し生体内での骨髄幹細胞の同定をも目指す。
ポーランド・ロマン主義亡命文学における祖国の「受難」のイメージとその同時代的受容

最終年度は本研究の主要な関心である預言者詩人の社会の教導的役割に焦点を当て、文学と大亡命の政治との関係について研究を進めた。受難者としてのポーランドという強固なセルフイメージを形成することとなった文化史上の重要作品として1832年のミツキェーヴィチの『祖霊祭第三部』と『ポーランド民族とポーランド巡礼の書』が知られる。本研究では同年にミツキェーヴィチが発表した声明文で述べられたキリスト教の『殉教録』を模した受難録作成計画を分析し、新たな視点から上記二作を捉えなおした。この時期のミツキェーヴィチが集団的記憶における民族史の受難化を体系的に進めていたことを明らかにした。また当時の受難に関わる政治思想は特に過激で翌年末にはすでに考えを改めていたにもかかわらず、声明文含め32年に書かれた詩人の言葉が現在も政治的に利用されている状況を明らかにしたことも重要な成果である。アダム・ミツキェーヴィチ大学とフライブルク大学共催の国際学会で報告し、ミツキェーヴィチ研究者はじめ20世紀ポーランド文学研究者らと意見交換を行った。さらに、ポーランド語論文に纏めた。上記の結果を踏まえ前年度に進めたモフナツキ研究を論文に纏め直し発表した。さらに1832年のミツキェーヴィチの文学・政治活動の亡命社会おける影響、反響について研究を進めた。詩人のパリ登場前後に見られた受難のモチーフを比較するため、レレヴェルの「国民委員会」と最大の左翼グループ「ポーランド民主協会」の政治文書を精査した。その結果、詩人登場以前に書かれた文書にも受難を肯定的に捉え摂理主義的な表現が現れるものの、受難と理想の将来をメシアニズム的な因果関係で結びつける表現は見られなかった。「民主協会」は詩人が形成した受難のイメージを彼らの理念に合わせ修正、利用しており、受難の言説が政治理念にかかわらず広く大亡命の社会で機能していたことを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ポーランドのロマン主義文学は、三国分割下、支配国ロシアに対する十一月蜂起(1830)とその失敗、大亡命を経て、ポーランド語圏における祖国独立運動の中心的役割を担うものとなった。十一月蜂起以後、亡命地で書かれた文学には、ポーランド・メシアニズムが色濃く表れ始める。本研究は、1830、40年代、民族の指導者的立場にあったとされる預言者詩人が描いたポーランドの「受難」のイメージとその受容状況を同時代のテクストから明らかにし、詩人の社会的役割を解明することを試みるものである。初年度は、ポーランド・メシアニズムに関する基礎的文献を読み込みつつ、ポーランド語テクストの読解に取り組んだ。特にポーランド・メシアニズムの発展史に関する学びを深めたことで、本研究を進める上での有用な知見が得られた。文学におけるポーランド・メシアニズムは、聖書から霊感を得たスピリチュアリズム概念であり、啓蒙期以降西欧で支配的であった、絶対的理性の範疇の中で世界を概念化するという傾向と対峙する。このように反哲学的性格を持つポーランド・メシアニズム理念の概念化は1830年前後に集中的に試みられた。さらに、ポーランド・メシアニズムは、ユダヤ・メシアニズムからキリスト教への発展の流れと似て、はじめ共同体イデオロギーという形をとるが、各段階を経て、初期の政治的民族的傾向を失うという経過をたどった。以上二点に鑑み、当初予定していたように作家別に研究を進めるのではなく、時系列で作品分析を進めることが有効と考え、1830年代のミツキェーヴィチ、クラシンスキ作品を中心に、先行研究を参照しながら読解を進めた。また、海外渡航時にはポーランドの研究者との交流を積極的に行った。現地の研究者から本研究に関する貴重な助言を受けながら、ワルシャワ国立図書館等でポーランド・メシアニズムに関する文学・哲学分野の基礎的資料や最新の研究資料を収集した。ポーランド・メシアニズムに関する基礎研究や各作品の先行研究を読み込んだことで、研究分野の理解を深め、研究方法を改善することができた。昨夏の海外渡航でポーランド、ポズナン市のアダム・ミツキェーヴィチ大学副学長と同大学ポーランド文献学研究所のロマン主義文学研究者と面談し、平成29年度から同大学で研究活動を行うための許可を得ることができた。ポーランド・メシアニズムに関する研究はポーランド国内を中心に行われており、本研究を遂行する上で、ポーランドの研究者からの助言、指導は不可欠であると考えているため、在外研究の機会を得たことは大きな進展であった。また、文献収集も計画的に進めることができた。本年度はポーランドでの在外研究の機会を活用し、研究を国際的水準に高めることに努めた。特に、ロマン主義亡命文学の専門家であるアダム・ミツキェーヴィチ大学のズビグニェフ・プシホドニャク教授とは緊密な議論を重ね、方法論の面において検討・改善を行った。具体的には、迫害のシステムに関するジラール等の文化人類学分野の研究を参照しながら、このモチーフの語彙領域を調査し、まとめた。また、大亡命をテクストから成る多層的空間として捉える点で、本研究は文学社会学との親和性も高いと考え、ブルデューが提唱した「文学の場」、「可能性の空間」の概念についての理解を深めた。以上のような学際的観点から、ミツキェーヴィチ、モフナツキ、クラシンスキ、スウォヴァツキ、ニェムツェーヴィチ、ガシンスキ、ヴィトフィツキ、ザレスキ等の著作から多様な受難のイメージを収集し、論文にまとめた。

アダム・ミツキェーヴィチ大学ロマン主義文学研究室会議において発表を行い、現地の専門家らに研究意義が認められたことは本年度の大きな成果であった。さらに本年度は、亡命初期にミツキェーヴィチと並ぶ重要な文芸評論家、政治活動家であったモフナツキの著作を網羅的に調査した。メシアニズムに反対したモフナツキがキリスト教の概念を用いずに受難のイメージを描いたという意外性、その成立背景をミツキェーヴィチとの比較から考察した。これについてもポーランド語論文にまとめ、同会議で発表した。その他、2017年10月にアダム・ミツキェーヴィチ大学で行われたロルフ・フィグト教授記念学会の運営に秘書として携わったことは貴重な経験であった。また6月にはクラクフで行われたポーランド文学国際翻訳者会議、11月にはトルンで行われたクラシンスキ全集出版記念学会、12月にはワルシャワ大学が主催したロマン主義関係の学会に参加し、国内外の様々な研究者と知り合い、意見交換を行った。本研究では亡命文学の多様なジャンルのテクスト(文学作品、政治的文書、雑誌記事等)を俯瞰的に分析することを目的としているが、今年度はポーランド人研究者らとの専門的議論を通し、特徴的な受難像の収集という観点から、博士論文で扱う予定のテクストを概ね選定することができた。また研究課題をその背景、方法論の面から検討を重ね、専門性を高めることに努めた。これを、ポーランド人のロマン主義文学研究者らに発表し、本研究の重要性・意義を認められたことは大きな成果であった。また、7月にはポーランド人亡命者が滞在したフランスの諸都市で現地調査を行い、これを踏まえモフナツキ作品における受難のイメージについてポーランド語論文にまとめたこと、それが現地の研究者に高く評価されたことも重要な成果であったと考える。加えて、様々なポーランド・ロマン主義関係の学会に積極的に参加し、知見を広めた。図書館等における文献調査も計画的に進めることができた。最終年度は本研究の主要な関心である預言者詩人の社会の教導的役割に焦点を当て、文学と大亡命の政治との関係について研究を進めた。受難者としてのポーランドという強固なセルフイメージを形成することとなった文化史上の重要作品として1832年のミツキェーヴィチの『祖霊祭第三部』と『ポーランド民族とポーランド巡礼の書』が知られる。本研究では同年にミツキェーヴィチが発表した声明文で述べられたキリスト教の『殉教録』を模した受難録作成計画を分析し、新たな視点から上記二作を捉えなおした。この時期のミツキェーヴィチが集団的記憶における民族史の受難化を体系的に進めていたことを明らかにした。また当時の受難に関わる政治思想は特に過激で翌年末にはすでに考えを改めていたにもかかわらず、声明文含め32年に書かれた詩人の言葉が現在も政治的に利用されている状況を明らかにしたことも重要な成果である。アダム・ミツキェーヴィチ大学とフライブルク大学共催の国際学会で報告し、ミツキェーヴィチ研究者はじめ20世紀ポーランド文学研究者らと意見交換を行った。さらに、ポーランド語論文に纏めた。上記の結果を踏まえ前年度に進めたモフナツキ研究を論文に纏め直し発表した。さらに1832年のミツキェーヴィチの文学・政治活動の亡命社会おける影響、反響について研究を進めた。
Missouri州Hannibalの1854年の電子版地図の再構築

Missouri州Hannibalの、1854年出版の地図と、1869年出版の地図と相互に参照しながら、作品との関係を論ずる研究論文「ホリデイの丘は怪しい:『トム・ソーヤの冒険』の闇の部分」(『就実英学論集』第35号、2018年1月発行、1943ページ)を刊行した。この中では、Mark Twainが十代の頃からHannibalを二つの面から描いていたことを実証した。ひとつは、標準的な英語で表現された美化された町であり、もうひとつは、実際に使われている言語で語られた町の暗部の実態である。Twainは、新聞記者としては美化された町の姿を肯定しつつも、新しく移住してきた移民や下層民が居住するホリデイの丘の麓部分に強く関心を示している。作家の卵としてのTwainが描いたHannibalを詳しく論じた。詳細な現地調査とHannibalの地図を利用したTwainの作品理解とその公開という目的は充分達成された。この地図の調査を通じて、Missouri州Hannibalの周辺に在住する研究者数名と知り合い、地図を中心に意見交換を続けている。Twainが小心者であり、冒険などしなかったと伝えられていることや、Mississippi河では泳いだはずがないこと、ほとんど目立たない少年で会ったことも分かった。こうした情報が『マーク・トウェイン完全なる自伝』(東京:柏書房、201318年、全三巻)の翻訳の際に非常に有益であった。1854年の地図は、現在当該研究者の個人のウェブサイトを通じて公開している。この点で所期の目的は達成されたが、Mark Twainを生み出した町の総合的な研究は緒についたところである。今後もHannibal研究を継続し、より包括的なTwainのHannibal研究を公開し続ける。1853年6月にミズーリ州ハニバルの家を出奔したマーク・トウェインが知っていたハニバルに一番近い地図が1854年に出版された地図である。この地図に関して、ミズーリ州ハニバルで、2015年7月23日から25日にかけて開催された国際学会、Mark Twain Conference in Hannibal, Missouriにおいて、"The 1854 Map of Hannibal and Mark Twain"と題する学会発表を行った。その内容は、1854年のミズーリ州ハニバルの地図を詳細に読むと、マーク・トウェインの書いた『トム・ソーヤの冒険』(The Adventures of Tom Sawyer)の新たな読み方が生まれてくることを示した。例えば、1854年にこの町には"African Church"が町の西側の丘の中腹にあった。このことは、町の北側の丘が「上流」の人々の居住区になり、西側の丘は非白人の居住区だったことを示している。J. Hurley HagoogとRoberta Hagoodによる歴史書The Storty of Hannibalによると、この西側の丘は「黒人街」であり、奴隷州であるミズーリ州に住む自由黒人はこの区域に住んでいたことが分かる。そして、何より重要なことは、『トム・ソーヤの冒険』にこの地域のことは書かれていない。つまり、マーク・トウェインはこの地区に近づかなかったか、この地区のことを知らなかった可能性がある。トウェインは、黒人奴隷が白人の子供の友人だったと書いているが、そうでない黒人たちもいた可能性がある。1854年出版のミズーリ州ハニバルの地図はマーク・トウェイン研究にとって極めて重要な資料である。この1854年のミズーリ州ハニバルの地図の重要性が、学会発表によって、世界中の何人かのマーク・トウェイン研究者に認識された。また、地元の歴史研究者の集まりのFriends of Historical Hannibalを通じて、この地図に興味をもつ数人の地元住民と情報交換を複数回行った。これにより、19世紀半ばの住民は、ミシシッピ河の水を直接飲んでいたことや、複数の弁護士が住んでいても法律問題はほとんど起きなかったことなど、1850年頃の町の息遣いを感得できた。今後もハニバルの生活に根差した研究を展開する。さらに、将来的に『マーク・トウェインと地図』(Mark Twain on Maps、仮題)という論文集を作成する可能性も見えてきた。つまり、具体的に論文を執筆してくれる研究者や地元住民と信頼関係の構築ができた。口約束だが、この企画であれば出版すると、Hannibal Free Public Libraryと約束している。地元歴史研究者やマーク・トウェイン研究者、地元図書館と、緊密に連絡を取りながら、この方向で進みたい。『マーク・トウェインはこう読め』(東京:柏書房、2016年10月刊行、423ページ)の第四章「故郷を喪失して」と第五章「ハニバルのものかたり」の基礎資料として、1854年出版のハニバル市の地図を活用した。具体的には、マーク・トウェインが少年時代によく知っていた部分はどこで、どの部分を想像力で書いたかをある程度特定できた。さらに、想像力で書いた部分の描かれ方と、記憶をもとに描いた部分の文章の微妙な相違も論じた。また、平成28年度は個人的で抽象的な業績の達成となった。ハニバルという町がマーク・トウェインにとってどのような意味を持ったのかをこの書籍で論じた。この書籍は専門家でも一般読者でも理解できるように書いたものであり、電子媒体の持つ、不特定多数の読者への情報提供をある程度達成できた。

この業績は電子化されておらず、出版社の了解を得ながら、部分的にでも電子媒体で公開し、より多くの研究者の利用に供したい。論文の執筆依頼をしていた米国の研究者たちがそれぞれの理由で執筆できないという、予定外の事態が出来しているが、それぞれの研究者はこの地図に関心を持ち続けているので、研究を継続する。その際、他の町の地図をできる限り収集し、19世紀半ばの米国中西部の地図の特徴を明確にするなどの、共時的視点をも導入する予定である。同時に、ハニバルの1869年の地図との詳細な比較検討をしながら、微視的で通時的な研究を、現地での調査に合わせて行う。その結果を飼料として公にする。当初の予定には含まれていなかった論文集の出版が困難になった。欲張りすぎたことは否めない。1854年のミズーリ州ハニバルの地図という特殊なテーマであるため、論文寄稿予定者が難渋したと推測する。地図を読むことは進んでおり、地図に書き込むことも準備が終了しつつある。2016年8月に就実大学で開催された日本地図学会に参加し、電子地図を作製できる企業も見つかり、企業からの忠告も受けながら、現地の写真と現地に残る地図の写真を撮ることになる。当該年度にMissouri州Hannibalを、科研費と個人研究費を利用し、2度訪問し、調査し、1854年の地図の正確な、原寸大の複写を入手した。1854年の地図はもともと全域版と部分版の2種類あり、今回はその全域版の原寸大の複写を入手した。これにより、原寸大のHannibal市全域地図の復刻が可能となった。一方、Mark Twainの『トム・ソーヤの冒険』などの作品の精読により、TwainがHannibalを舞台とした作品を書く際に、具体的事実を重視した事が分かった。当初予想していたよりも事実を重視していた。これは、1853年にTwainがHannibalを出奔以後にも、Hannibalに関する情報をかなり詳しく提供され続けていたことを意味する。他方、特に人物の創造に関して、事実とはかなり異なる部分があり、この部分の検証が必要となっている。つまり、小説中の登場人物のモデルとなった人物が実はどのような人物だったかを検証する必要が生じている。典型的な例は、『トム・ソーヤの冒険』のインジャン・ジョーと、そのモデルになったジョー・ダグラスの間の乖離である。19世紀後半のMissouri州Hannibal周辺地域の地図を入手し、比較検討を行った。その結果、一部の町よりもHannibalが美しく地図に描かれていることが分かった。この時代の多くの地図が入植者を募集するためのものであったことを考慮すると、Hannibalがより理想的に描かれていた事がわかる。これを根拠に、西部の理想化は実証しにくいが、西部の開発途上の市町村を、鉄道などの近代文明と農村的雰囲気の共存する理想郷として表現したいという願望があったと言える。Twainはこうのような願望と、真実を伝えたいという芸術家としての欲求を持っていた。その整合しにくい二つの望みが、彼の作品の地図と登場人物の創造に表現されている。全域版の地図の原寸大の複写を入手したことで、これを電子版に書き直すこと、その地図のすべての細部を電子化することが可能になった。
血管内皮前駆細胞と抗癌剤を用いた新しいハイブリッド癌治療法の開発

PLGAを基質としたピラルビシンを抱合するナノ粒子(封入率2.17μg/mg・平均粒子径890nm)を作製した。ピラルビシン抱合(PrbPLGA群)あるいは薬剤非抱合ナノ粒子(PLGA群)を培養血管内皮前駆細胞(EPC)に取り込ませた後、細胞遊走能と増殖能を評価したが有意な差はそれぞれの機能で認めなかった。そして、これらナノ粒子抱合EPCを担癌マウス(骨肉腫細胞MG83による皮下腫瘍モデル)に対して移植実験を行ったところ、対照群(生理食塩水投与群)に比べ、PLGA群> prPLGA群の順で有意な腫瘍縮小効果が得られた。1.血管内皮前駆細胞(EPC)への包合に適切な加水分解性ナノパーティクルの選定EPCに包合させる微小粒子としてゼラチンマイクロスフェア及びPLGAナノ粒子の取込率を検討した。結果、ゼラチンマイクロスフェアは粒子径を10um以下に調整することが困難であったため、EPCに包合させることがほとんど不可能であった。一方、PLGAナノ粒子においては、粒子径が十分に小さくEPCへの抱合には問題は認められなかった。また、PLGAは100ug/mlの濃度が最も効率良く包合させることが出来、PLGAとアセチル化LDL蛋白を10ug/mlの濃度で事前に共培養しておくことにより、EPCへのPLGAの取込率が飛躍的に向上した。2.適切な抗癌剤の選定今後の実験に用いる数種類の癌細胞株(マウス及びヒト肺癌・肝癌・膵癌細胞)に対して複数の抗癌剤(ゲムシタビン・シスプラチン・5-FU・カルモフール・パクリタキセル)の癌細胞増殖抑制効果を確認したところ、カルモフール(2ug/ml以上)とパクリタキセル(5ng/ml以上)の2種類の薬剤はどの細胞株に対しても比較的低濃度で安定した効果が認められた。よって、今後の実験においてはこの2種類の抗癌剤を使用することに決定した。いずれの抗癌剤も脂溶性薬剤であるため、PLGAとの親和性には問題はない者と思われる。3.加水分解性ナノ粒子からの抗癌薬剤徐放化の最適化本年度は、上記実験結果を得るために時間を要したため、本研究目的のための実験は試行できなかった。よって、次年度に行う予定。1.加水分解性抗癌薬剤徐放化ナノ粒子作成パクリタキセル徐放化PLGAナノ粒子を作成(連携研究者による)した。パクリタキセル/PLGA封入効率26%・封入率8.8ug/mg(PLGA)・サイズ直径163±64nmの物性を示す粒子の作成に成功。2.パクリタキセル徐放化加水分解性PLGAナノ粒子包合EPC作成と細胞機能評価。PLGA単独と同じように、上記物性を示すパクリタキセル徐放化PLGAナノ粒子もEPCに包合させることが可能であった。パクリタキセル徐放化PLGAナノ粒子(PTX/PLGA)-EPC自体の細胞機能を評価したところ、予想に反してEPC単独やPLGA-EPCに比べ、PTX/PLGA-EPCの方が細胞増殖能及び細胞遊走能ともに高い傾向を示す結果となった。また、培養開始2週間後の細胞アポトーシス率に関しては、いずれのEPCにおいても大きな差は認めなかった。3.パクリタキセル徐放化加水分解性PLGAナノ粒子包合EPCのマウス移植方法の検討in vivo実験でマウス皮下腫瘍モデルに対して、PTX/PLGA-EPC移植治療実験を行うにあたり細胞移植経路の検討を行った。検討した細胞移植方法は、(1)経静脈的全身投与(尾静脈経由)、(2)経静脈的全身投与(右心室経由)、(3)経静脈的全身投与(左心室経由)、(4)腫瘍周囲皮下注入投与であり、腫瘍内に集積したDiI-PLGA-EPCを細胞移植24時間後に組織学的に解析した。現在解析中であり、(1)(2)(3)(4)の中で、どの投与法が最適であるかという結果については次年度の結果と合わせて報告予定。PLGA抱合EPC移植後の腫瘍集積性の検討を(1)経静脈的全身投与(尾静脈経由)、(2)経静脈的全身投与(右心室経由)、(3)経動脈的全身投与(左心室経由)、(4)腫瘍周囲皮下注入投与で行った。腫瘍内に集積したDiI-PLGA-EPCを細胞移植24時間後に組織学的に解析したところ、腫瘍への集積率順は(3)>(1)=(2)>(4)であったが、他臓器(肝臓・脾臓)への集積率順も同じく、(3)>(1)=(2)>(4)であった。

その他、前年度の実験結果からナノ粒子化したパクリタキセルがEPC抱合後、予想に反してEPCの遊走能や増殖能を上昇させる結果となり、「パクリタキセルPLGAナノ粒子抱合EPC移植後の腫瘍縮小効果の検討」を行うにあたり、EPC抱合後の抗癌剤による抗腫瘍効果についても疑問視せざるを得ない結果となった。従って、本年度では抗腫瘍効果が最も強力とされているテラルビシンを新たな薬剤として徐放化ナノ粒子を作製した。テラルビシン徐放化PLGAナノ粒子(TerPLGA)は、封入効率26%・封入率2.17μg/mg(PLGA)・平均サイズ直径890nmの物性を示すものを作製することが出来た。PLGA単独の場合と同じように、上記物性を示すTerPLGAもEPCに包合させることが可能であった。骨肉腫腫瘍細胞(MG63)を(1)EPC単独、(2)EPC+PLGA、(3)EPC+TerPLGAとそれぞれ共培養し、14日後に細胞増殖能を確認したところ、(3)群でのみ有意な腫瘍細胞増殖抑制が確認された。上記3群で、ヌードマウスMG63皮下腫瘍モデルを用いて腫瘍縮小効果について確認したところ、(3)>(2)=(1)の順に縮小効果が認められた。今後、さらに摘出腫瘍組織を用いた免疫組織化学的解析及び分子生物学的解析により、EPC+TerPLGA移植による腫瘍縮小効果のメカニズムを探索していく予定である。