hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ネパール人小児の身体活動量および栄養素等摂取量が身体組成の変化に及ぼす影響

本研究は,発展途上国のネパール国において,生活形態の異なる都市と山岳地農村に居住する子どもの身体活動量と栄養素摂取量の実態を明らかにし,それらの差違が子どもの身体組成の変化に与える影響を明らかにすることを目的とした.測定は, 3歳から12歳までの都市小児409名と山岳地小児943名の計1, 352名を対象とし,人体計測,皮下脂肪厚,周径囲,身体組成,日常歩数および栄養素摂取状況を調査した.本研究の結果,日常の身体活動量および栄養素摂取量に有意な地域差が認められ,体重あたりの総消費熱量は山岳地,総摂取熱量は都市で高い値を示した.また,エネルギー収支差が除脂肪成分でなく体脂肪成分の顕著な差となって現れたことから,小児期からの望ましい運動習慣や食生活の形成が必要であることが示唆された.本研究は,発展途上国のネパール国において,生活形態の異なる都市と山岳地農村に居住する子どもの身体活動量と栄養素摂取量の実態を明らかにし,それらの差違が子どもの身体組成の変化に与える影響を明らかにすることを目的とした.測定は, 3歳から12歳までの都市小児409名と山岳地小児943名の計1, 352名を対象とし,人体計測,皮下脂肪厚,周径囲,身体組成,日常歩数および栄養素摂取状況を調査した.本研究の結果,日常の身体活動量および栄養素摂取量に有意な地域差が認められ,体重あたりの総消費熱量は山岳地,総摂取熱量は都市で高い値を示した.また,エネルギー収支差が除脂肪成分でなく体脂肪成分の顕著な差となって現れたことから,小児期からの望ましい運動習慣や食生活の形成が必要であることが示唆された.本研究の目的は、ネパール国丘陵地と都市における生活習慣の違いが、子どもの形態および身体組成の変化に与える影響を検討することである。平成21年度は、2歳から16歳までの丘陵地農村(Kotyang)の196名と都市(Kathmandu)の202名について、身長、体重、皮下脂肪厚7部位、生体電気インピーダンスの計測し、除脂肪量や体脂肪量などの身体組成を算出した。また3日間の歩数・消費カロリー、24時間心電図記録による日常生活中の心拍数、質問紙法による食餌調査および食餌内容調査を実施した。その結果、身長、体重、体格(BMI)および体脂肪成分(FMI)は、都市近郊地域より丘陵地小児の方が低い値であったが、除脂肪指数(FFMI)に関しては生活環境の違いによる差が認められなかった。10-14歳の平均歩数は18,052±2,778歩/日で、心拍数のデータから、日常生活中の運動強度は無気的な運動はほとんど認められず、心拍予備の3040%に相当する運動強度で生活していることが明らかになった。栄養素摂取量等の地域差に関しては現在分析中である。平成22年度は、3-17歳の丘陵地農村(Kotyang)の224名と都市近郊(Kathmandu)の198名の小児を対象に、身長、体重、皮下脂肪厚、生体電気インピーダンス値を測定し、体脂肪量や除脂肪量などの身体組成も併せて調査した。また、3日間の歩数、運動能力テスト、質問紙による食餌調査、足型および足底筋力の測定を実施した。その結果、身長、体重、体格(BMI)および皮下脂肪厚は、都市近郊より丘陵地小児で低い値を示した。10-12歳の丘陵地男子の平均歩数は、16,272±6,167歩/日、女子14,645±5,494歩/日であった。男子の歩数は両地域ともに同程度であったが、女子は都市近郊の方が約3割少ない値であった。生育環境の違いは、小児の身体の発育発達にも様々な影響を及ぼしていると考えられることから、現在、食事内容を含む小児の生活環境と形態および運動機能の発育発達の関連性について包括的に分析している。本年度は、平成21年度から平成22年度の調査項目の解析を行った。データは、3-18歳までの丘陵地(Kotyang村)小児約1,600名、都市部(Kathmandu、Bhadrakali地区)の約600名である。分析項目は、身長、体重、皮下脂肪厚7部位、周径囲7部位の計測値に加え、除脂肪量、体脂肪量などの身体組成である。また、歩数調査による身体活動量、質問紙法による食餌調査から算出した摂取エネルギー量についても検討した。主な結果は下記の通りである。1)丘陵地小児の身長、体重、体格(BMI)は、都市と比べて男女とも6歳以降で顕著に低い値を示した。2)体格差を考慮した身体組成をみると、除脂肪成分(FFMI)に地域差は認められなかった。3)体脂肪成分(FMI)は、男女とも丘陵地小児が低い値を示した。また、両地域の小児は、全年齢において、わが国の小児(福岡市)より顕著に低い値を示した。4)7-12歳の丘陵地小児の日常的歩数は、男子16,524歩/日、女子14,899歩/日、都市では男子13,312歩/日、女子10,903歩/日であり、両地域に3,000歩程度の地域差が示された。5)また、両地域の歩数は、わが国の農村部(東北地方)より3,5004,500歩、都市(東京都)より1,000歩程度高い値であった。

6)7-14歳小児の日常の摂取エネルギー量は、丘陵地8001,100kcal/日、都市1,300kcal/日程度であった。これら両地域の摂取エネルギー量は、わが国の5-7割程度であった。さらに、6)蛋白質、脂質、炭水化物の摂取率(PFCバランス)をみると、丘陵地9:25:65、都市14:40:45であった。丘陵地は、蛋白質の摂取率が極端に少なく、都市部は、脂質の摂取率が多い傾向が示された。現在も解析は継続中であるが、身体活動量や栄養素摂取状況などの生活環境の違いによって、子どもの発育発達は様々な影響を受けることが明らかとなりつつある。
耐故障飛行誘導制御に関する研究

JAXA実験用航空機の故障により飛行試験が2017年度中に実施できなくなり、2018年度に計画を延長した。結局、故障の修理はできなかったため、飛行試験の代わりに、JAXA実験用航空機を地上においてHardware in the Loop試験を実施し、これまで構築した耐故障飛行制御の試験を実施した。また、東京大学におけるフライトシミュレーターを用いて、パイロットが介在した場合の適応制御則の特性に関してもデータを収集し、適応制御側が故障時のパイロットワークロードを軽減できることを実証した。また、実際の旅客機で採用されているCスター制御則のパラメータを構造化H無限大制御によって設計し、適応制御則と連携させた耐交渉飛行制御則の研究も行い、学会発表の準備を行った。実時間に障害物を回避する飛行経路の生成に関しては、不確かさを伴った実時間最適経路生成のシミュレーション評価を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。耐故障飛行制御に関しては、機体重心が突然後方に移動して機体が墜落した事故もあり、こうした事態を単純適応制御によって安定化できるかどうかを検証した。飛行中に重心位置が後方に移動すると縦の操縦が不安定になるが、単純適応制御によりフィードバックゲインを自動調整することで安定化が可能であることをシミュレーションによって確認した後、JAXA実験用航空機による飛行実証を実施した。飛行試験では実際に重心を後方に移動させることは困難なため、操舵信号に伝達関数を作用させることで飛行特性を変化させ、模擬的に重心位置が後方に移動したことを実現した。シミュレーションと同様に単純適応制御による安定化が可能なことを飛行実証し、学会発表を行った。また、耐故障飛行制御の研究に関する最新情報を入手するために,世界各国から参加者が集まる「29th Congress of the International Council of the Aeronautical Sciences」に参加し、飛行制御に関する発表を中心に聴講した。その結果,耐故障制御としてニューラルネットワークや適応制御が有望であることが確認された。今後の、耐故障飛行制御の研究に関する国際共同研究提案に向けた調整を目的にBristol大学のAndres Marcos Senior Lecturerを訪問し、提案内容について調整を行った。実時間飛行軌道生成に関しては、飛行軌道前方に強度に不確定性を含む突風領域があると仮定し、それを回避する最適軌道を求める数値計算法を研究した。その結果、幾つかの例とともにその効果を確認した。耐故障飛行制御に関しては、前年度実施した重心移動時の安定化制御に関して、Simple Adaptive Control (SAC)内にPID制御を組み込むことでより安定した制御が可能であることを確認し、地上試験の後、JAXA実験用航空機により飛行試験を行った。試験の結果は良好で学会発表を行い、論文投稿中である。今年度新たな取り組みは、エルロン、ラダーによるロール、ヨー角の2入力2出力のSACを構成し、1)エルロンの舵効きが20%に低下した場合のバンク保持、2)ラダーの舵効きが20%に低下した場合のヨーレート保持、の2ケースに関して耐故障飛行制御の飛行実験を実施し,数値シミュレーションと同様の性能が得られ,提案耐故障飛行制御の有効性が実環境下で確認された。結果は米国の航空宇宙学会に発表した。実時間飛行軌道生成に関しては、JAXA開発中の航空機搭載型レーザライダーは雲がない状況でも風速の測定を行うことができるが,高々10km先を観測することが限界であり,観測頻度・空間精度は限られ,測定に不確実性が含まれている.従来,ライダーから得られた情報から最適突風回避経路を求める問題は解かれているが,本研究では,ライダーの観測に伴う不確実性をモデル化し,そのうえで不確実性を考慮した回避経路最適化問題を実時間で解く手法に関する研究を行い、数値シミュレーションによる妥当性を検証した。欧州との共同研究の準備を進めており、H28年度から具体的に、耐故障飛行制御、実時間軌道生成に関して欧州研究者との共同研究が実施できる見込みになった。耐故障飛行制御に関しては、前年度実施した飛行試験結果を海外論文誌に投稿し、査読後アクセプトされ、掲載待ちの状態である。さらに、本年度はエルロンの舵角速度が飽和した場合の故障を想定し、適応ゲインが過大にならないように制限する調整側の適用を考案しシミュレーションにより良好な結果を得た。本年はこうした作業に注力したため、当初2016年度に予定していた飛行試験は,実施せず、2017年度に実施する予定であり,そのために,基金分を繰り越している。実時間飛行軌道生成に関しては、JAXA開発中の航空機搭載型レーザライダーによる晴天乱気流の捕獲データに合わせて,機上の計算機で飛行を回避すべき領域を求め,飛行状態に合わせて時々刻々,最適回避軌道を計算することに成功した。本件に関しても、シミュレーション計算による手法の確立に注力したため、当初2016年度に予定していた飛行試験は,実施せず、2017年度に実施する予定であり,そのために,基金分を繰り越している。飛行試験の実施が遅れているが、シミュレーション検討は予定以上に進み、欧州研究者との研究交流もスタートし全体としては順調に進展している。

また、実際の旅客機で採用されているCスター制御則のパラメータを構造化H無限大制御によって設計し、適応制御則と連携させた耐交渉飛行制御則の研究も行い、学会発表の準備を行った。実時間に障害物を回避する飛行経路の生成に関しては、不確かさを伴った実時間最適経路生成のシミュレーション評価を行った。耐故障飛行制御に関しては投稿論文が掲載された。前年度に実したエルロンの舵角速度が飽和した際の制御則を飛行試験により実施を予定したが、飛行試験を予定したJAXA実験用航空機の不具合により飛行試験を延期することにし、計画の繰り越し申請を行った。航空機が飛行中に回避すべき領域を避ける経路をリアルタイムに求める最適軌道計算アルゴリズムの一般化をはかり,実時間最適制御アルゴリズムの確立を行った。飛行実証に関しては、飛行試験を予定したJAXA実験用航空機の不具合により飛行試験を延期することにし、計画の繰り越し申請を行った。実験用航空機の故障はフライトコントローラーの不具合によるもので、製造元の米国に送り、原因調査および修理の可能性を調査中である。飛行試験を予定したJAXA実験用航空機の不具合により飛行試験を延期することにし、計画の繰り越し申請を行った。重心移動により不安定化した航空機の適応制御による安定化の飛行実証は世界的にも例のない成果であり、国際共同研究を実施する動きを生み出せた。航空機開発の中心である欧米との情報交換は当初の計画であったが、共同研究の提案にまで踏み込めたのは計画以上の進展である欧州との連携により、具体的な事故・故障ケースを設定し、それぞれの制御手法の比較検討を実施する予定。耐故障飛行制御に関してはJAXA実験用航空機を、実時間飛行軌道生成に関しては欧州の無人機を用いて飛行実証を計画する。欧州との研究交流が実現し、H29年度から具体的に、耐故障飛行制御、実時間軌道生成に関して欧州研究者との意見交換が実施できることとなった。飛行試験の結果を比較しあうことで、さたに一層の研究進展が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。実験用航空機の修理が完了するのを待って飛行試験を実施する。耐故障飛行制御に関しては、これまでの1入力1出力での単純適応制御を多入力多出力系に拡張する。故障例としては垂直尾翼の破損を想定し、ラダー、エルロンの同時制御を検討し、試行試験を実施する。欧州との共同研究案を策定し、具体的な計画立案を行う。実時間飛行軌道生成に関しては、JAXA実験用航空機での飛行実証に備え、今年度準備を進め、可能であれば予備飛行試験を実施する。欧州での研究打ち合わせを次年度に実施するため。JAXA実験用航空機による飛行試験を実施できなかったため、また、海外との研究会議を実施する予定のため。
自由行動マウスの生体各組織の遺伝子発現を長期間追跡定量するプログラムの開発

本研究では「遺伝子発現追跡定量装置」システムと生体移植小型センサーを同時に使用することで生体のあらゆる組織の遺伝子発現および活動がリアルタイムで解析可能にするプログラムおよび計測システムを構築することを目的とする。本年度は遺伝子発現追跡定量装置と組織密着型センサーのシステムとプログラムを融合した自由行動下マウスの生体体表および深部の遺伝子発現機能解析システムの構築を試みた。組織密着型センサーからの遺伝子発現を検出するシグナルを携帯型PMTおよびケージ設置型PMTに送るようマウス飼育ケージを構築した。複数マウス飼育ケージからマウス生体内遺伝子発現、温度、湿度、光強度をリアルタイムに計測し長期間の生体機能解析が可能となった。また各飼育ケージで光刺激などの外界環境をプログラムで変化させ刺激に応じた行動変化も長期間の自動計測が可能となった。生体深部の複数組織の長期間の遺伝子発現解析も上記プログラムと連動して計測が可能となった。今後, 1個体レベルで生体深部複数組織の時計遺伝子発現リズムが外界環境の変化にともないどのように変化していくかリアルタイムに計測するプログラムを構築していく予定である。生体深部を長期間計測する飼育ケージシステムが完成し複数マウスの遺伝子発現解析が同時に行えるようになり研究は順調に進展している。1個体レベルで生体深部複数組織の時計遺伝子発現リズムが外界環境の変化にともないどのように変化していくかリアルタイムに計測するプログラムを構築していく。複数台の計測機器および計測ケージをもちいて長期間計測した時の測定機器および計測ケージの安定性を確認する。データ解析法においては長期間計測における計測時のノイズ除去や長期間遺伝子発現リズムを解析時の発現ピーク時刻の同定方法などを確立していく。
ガングリオシド依存性タンパクリン酸化酵素の構造と機能の解析

本研究は、ガングリオシドの持つ神経栄養因子様活性と深い関わりがあると考えられているガングリオシド依存性の膜タンパクリン酸化を分子レベルで解析することが目的である。まず、ラット脳・膜画分において、単分子状態にあると考えられる低濃度のガングリオシドが、タンパク質リン酸化に対して調節作用を持つか否かを検討した。その結果以下の点を明らかにした。1.分子量72kDaの膜タンパク質(72kDa)のリン酸化が、今まで報告されているよりはるかに低濃度のガングリオシドGQ1b(80nM)により活性調節を受けることを明らにした。2.GQ1bは、72kDaへのリン酸の取り込みを昂進したばかりではなく、脱リン酸化に対しても促進的な作用を示した。GQ1bは、ATPase活性には影響を及ぼさなかったことから、GQ1bがリン酸化酵素、脱リン酸化酵素の双方に影響を与えるという可能性の他に、リン酸化基質としての72kDaそのものと関与するという可能性も考えられる。次に、リン酸化基質・酵素・ガングリオシドを膜上で再構成をして解析をすることが重要であると考え、第一ステップとして、当該リン酸化基質である72KDaの可溶化ならびに単離精製法を確立し、遺伝子のクローニングにより一次構造を明らかにすることを目標とした。その結果、本年度の研究目標はほぼ達成された。今後は次のステップとして、72KDaの大量発現系を確立すること、あるいはリン酸化部位近傍のペプチド断片を合成すること、などにより当該"基質"を調製し、これを用いて(リン酸化)酵素側の単離精製を開始することが必要でてある。この系の分子的機作を解明していくことは、ガングリオシドの持つ神経機能に対する作用を解明する一つのモデルとなることが期待される。今年度は、ラット脳・膜画分において、単分子状態にあると考えられる低濃度のガングリオシドが、タンパク質リン酸化に対して調節作用を持つか否かを検討した。その結果、若干の知見を得たので報告する。1.分子量72kDaの膜タンパク質(72kDa)のリン酸化が、今まで報告されているよりはるかに低濃度のガングリオシドGQ1b(80nM)により活性調節を受けることを明らかにした。GQ1bの臨界ミセル濃度は明らかではないが、より疎水性の強いGT1bの臨界ミセル濃度が10^<-6>Mあたりであることより、今回我々が用いたGQ1bの大部分は単分子状態で存在することが予想される。現在までに報告されたものは、総てミセルとしてのガングリオシドを用いたものであり、その点、性格を異にする。3.電気泳動による分子量から、現在までに報告されている脳のリン酸化タンパクの中で、72kDaはシナプシンIIaとも考えられる。しかし、幾つか検討した結果、この可能性は否定された。おそらく、今まで報告されていないものであると考えられる。この系の分子的機作を解明していくことは、ガングリオシドの持つ神経機能に対する作用を解析する一つのモデルとなることが期待される。

そのためには、リン酸化基質・酵素・ガングリオシドを膜上で再構成をして解析をすることが重要である。そこで、本年度は、まず当該リン酸化基質である72KDaの可溶化ならびに単離精製法を確立し、遺伝子のクローニングにより一次構造を明らかにすることを目標とした。その結果、本年度の研究目標はほぼ達成された。すなわち、ラット脳P2-P3画分から、CHAPS(終濃度2%)で80-90%の72KDaを可溶化することが出来た。さらに、膜画分から当該タンパク質をOHAPSで可溶化後、DEAEセファロース、オクチルセルファロース、ヘパリン5PWの各クロマトグラフィーとG3000SWのゲルロ過により、電気泳動上単一バンドになるまで精製する方法を確立した。次いで、当該タンパク質の二つのリジルエンドペプチダーゼ断片の部分アミノ酸配列を明らかにした。RT-PCR法を用いて、この二つのアミノ酸配列を含む遺伝子断片を得、これをプローブとして、ラット脳のcDNAライブラリーからスクリーニングし、翻訳領域全長を含むと考えられるクローンを六つ得た。今後は次のステップとして、大量発現系を確立すること、あるいはリン酸化部位近傍のペプチド断片を合成すること、などにより当該“基質"を調製し、これを用いて(リン酸化)酵素側の単離精製を開始する。
高等植物ミトコンドリアゲノム形質転換系の確立

本年度の研究によって得られた知見を以下に記す。(1)遺伝子銃を用いたシロイヌナズナ巨大化ミトコンドリアに対する遺伝子導入処理前年度に作出に成功した巨大化ミトコンドリアを持つシロイヌナズナ成葉に対して、遺伝子銃を用いたミトコンドリアへの遺伝子導入を試みた。遺伝子導入処理には、ミトコンドリアatp6遺伝子発現調節領域によるGFP遺伝子の発現誘導を想定したベクターを用いて行った。しかし、ミトコンドリア内において導入遺伝子の発現を検出することは出来なかった。この結果を受けて、その原因の追究と技術的な改善を達成する為、以下の研究を行った。(2)巨大化ミトコンドリア内における核様体構造の解析ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。SyberGreen 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、23倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。そこで本研究では、レーザーマイクロインジェクション法によるこの卵細胞ミトコンドリアへの直接的な遺伝子導入を目指し、まず卵細胞ミトコンドリアを特異的に可視化した形質転換シロイヌナズナ系統を作製した。ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。ミトコンドリアは、植物細胞内において呼吸によるエネルギー生産を担う、農業上非常に重要な役割を果たす細胞内小器官である。このミトコンドリアゲノム上に存在する遺伝子の形質転換は将来の植物育種上欠かせない技術となるはずだが、高等植物においては未だその成功例がない。これまでオルガネラゲノムの形質転換は、主にパーティクルガン(遺伝子銃)を用いた方法が行われてきた。しかし、高等植物ミトコンドリアはそのサイズが小さいことが一因となり、この方法を用いたミトコンドリア内への遺伝子導入が不可能であった可能性が考えられる。本研究では、高等植物ミトコンドリアを拡大し、これにパーティクルガンを用いて遺伝子を導入するというアプローチによってミトコンドリアゲノムを形質転換することが目的である。本年度の研究実施計画に沿って行われた研究により得られた知見を以下に記す。1.巨大化ミトコンドリアを持つタバコ培養細胞系統の確立本研究では、タバコ培養細胞におけるミトコンドリア分裂を人為的に制御することにより、通常の35倍に拡大されたミトコンドリアを持つ細胞系統を作出した。2.ミトコンドリアゲノムに目的遺伝子を導入するためのベクター構築ミトコンドリアゲノム形質転換体選抜マーカーとして、呼吸阻害剤アンチマイシン耐性となる改変型タバコapocytochrome b(cob)遺伝子を利用した遺伝子導入用ベクターを構築した。3.形質転換体選抜に用いる薬剤濃度の検討タバコ培養細胞を用いた生育・生存検定により、10μMのアンチマイシンと1mMのサリチルヒドロキサム酸を同時に用いることで、細胞の生育・生存が完全に阻害されることを明らかにした。今後は、巨大化ミトコンドリアを持つタバコ培養細胞に対し、実際にパーティクルガンを用いた遺伝子導入処理を行い、上記の条件によりミトコンドリア形質転換体を選抜する予定である。(1)パーティクルガンを用いた、巨大化ミトコンドリアに対する遺伝子導入処理前年度に得られた巨大化ミトコンドリアを持つタバコ培養細胞に対して、前年度作製した遺伝子導入用のベクターを用い、パーティクルガンを用いた遺伝子導入処理を試みた。遺伝子導入に用いる金粒子の直径は100nm1.6μm、また遺伝子導入時のHeガス圧は1100ps-1800psiの範囲で実際の操作を行った。

その後、前年度の知見より得た条件により、形質転換体の選抜を試みた。その結果、数十個のコロニーが得たが、偽陽性であることが判明した。これを踏まえ、以下の実験を行った。(2)超巨大化ミトコンドリアを持つ植物体の作出新たに通常の10倍程度にまでミトコンドリアが拡大するタバコ培養細胞系統を選抜した。また、シロイヌナズナミトコンドリア分裂を支配する分子DRP3のT-DNA挿入変異体を作製し、細胞内にほぼひと繋がりとなった超網状ミトコンドリアを持つ植物を作製することに成功した。(3)自立複製起点を持つ遺伝子導入用ベクターの作製導入に成功した形質転換用ベクターがミトコンドリア内で自立的に複製されることを目的とし、イネChinsura Boro IIのミトコンドリア内に存在するフラスミド様DNA「B1」に知られる複製起点をクローニングし、前年度作製したベクターに導入した。(4)シロイヌナズナミトコンドリアゲノム形質転換用ベクターの作製シロイヌナズナゲノム中に存在するatp6遺伝子のプロモーター、ターミネーターを利用した形質転換用ベクターを作製した。(5)形質転換体選抜に用いる薬剤条件の再検討より厳しい条件での選抜を目的として、形質転換体選抜に用いる薬剤条件の再検討を行った。その結果、これまでの選抜条件にミキソチアゾールを併用することで、効率の良い選抜が可能になることを見出した。本年度の研究によって得られた知見を以下に記す。(1)遺伝子銃を用いたシロイヌナズナ巨大化ミトコンドリアに対する遺伝子導入処理前年度に作出に成功した巨大化ミトコンドリアを持つシロイヌナズナ成葉に対して、遺伝子銃を用いたミトコンドリアへの遺伝子導入を試みた。遺伝子導入処理には、ミトコンドリアatp6遺伝子発現調節領域によるGFP遺伝子の発現誘導を想定したベクターを用いて行った。しかし、ミトコンドリア内において導入遺伝子の発現を検出することは出来なかった。この結果を受けて、その原因の追究と技術的な改善を達成する為、以下の研究を行った。(2)巨大化ミトコンドリア内における核様体構造の解析ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。SyberGreen 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、23倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。
対象モデルの概念に基づく階層的知識表現と推論制御の研究

本研究は知的問題解決の対象となるシステム等のモデル、すなわち対象モデルを知識ベースの一部として持つことにより、表層知識のみによる知識ベース・システムの能力上の制約を解決することを最終的目標としている。この目標を実現するために必要な課題、すなわち、概念的枠組みの確立、モデル表現、推論制御、実験用知識表現言語および環境、およびケース・スタディ等に関して、研究を進めている。本年行った研究は、構造体としてのシステムをフレーム型知識表現形式の枠組みの中で対象モデルとして表現する方法、フレーム型知識表現言語ZEROの拡張および目本語化、などである。以下に概要を述べる。いわゆる深層知識を用いる分析型意思決定問題やCADに代表される設計型意思決定問題においては、概念対象あるいは物理的対象を対象モデルとして表現し操作する機能が不可欠である。対象モデルでは、システムの構造と機能が厳密に表現できる必要があり、しかも効率的でなければならない。我々はこれまでの研究から、フレーム型知識表現形式が対象モデルの表現および操作に向いているという見通しを得た。ところが具体的に設計しようとすると必ずしも容易ではなく、工夫もしくは拡張が必要であることが明らかとなった。第一の点は、全体一部分関係がインヘリタンスと整合しないこと、第二の点は、要素間の結合関係を表現しようとすると複雑なフレーム間ネットワークになってしまうという点である。これを解決するために、システムの基本対象を抽象-具体関係として階層化し、構成要素に関しては、現在注目している対象をフレームとし、その対象の一つ下位の構成要素およびそれらの構造関係を一つにまとめて一フレームで表現するという方法を採用した。この方法によれば、複雑な構造体をもつシステムの対象モデルが、比較的体系的に表現できそうである。また、ZEROを日本語化し、PROLOGを組み込んで強化した。以下に概要を述べる。
TV会議を利用した双方向遠隔地教育向けCAIシステムの開発研究

現在、遠隔授業を支援するものとしては、衛星通信の利用やインターネットの活用、さらにISDN回線を利用した形態が提案され、一部実施に向けた実験も行われている。しかし、これらはいずれも高等教育機関に於ける遠隔授業であり、集合講義を対象としている。本システムは、このような遠隔授業の場を初等、中等教育における個別対応の授業システムに適応することを目的としている。研究期間内に次のような作業を行ってきた。1.室内のネットワークパソコンに、TV会議システム、遠隔操作可能なカメラ当を設置し基本的な動作を確認した。2.動作範囲を学内のネットワーク間に拡大し、カメラの遠隔制御、映像伝送の遅延、音声伝送の遅延、映像と音声の同期等について確認を行った。3.被写体の種類(黒板、ホワイトボード、OHP,液晶プロジェクター、TV映像)の映像伝送における解像度の実験を行った。4.本システムを利用する際に必要な各種のソフトウェアの自動立ち上げ、及び操作の説明のために、利用ガイド教材を作成した。したがって、本教材を学習する過程で自動的に本システムの利用が可能になる。5.以上の結果を踏まえ、学外との予備実験を、近接の大学の設備を借用し行った。以上の開発研究の成果として、本システムをインターネットを介することによって、日本国内における離島,山閑地における本校、分校間、複式学級、その他に病院などにおける長期療養者、特殊学級の場におけるクラス(教室)と個人を結んだ、リアルタイムでの遠隔授業を支援するシステムが安価で、手軽に実現することが可能になった。インターネットのTV会議は最近の技術の進展を踏まえ、比較的に安価でしかも簡単にパソコンに設置することが可能になってきついる。本研究は,このような技術動向を捉え,我が国の離島、山間地における複式学級や各種施設、病院等と本校とのリアルタイムでの学習を支援するシステムを構築することを目的に,2年計画で進めている。初年度の本年度においては次のような作業を行ってきた。1.インターネット上での映像/音声の送受を可能にした。TV会議システムの一部の機能を組み込むことによって、教師(教室)-学習者間のリアルタイムでの状況の展開が可能になった。2.カメラの双方向での制御を可能にした。CCDカメラの双方向での制御を行うことによって,あたかも教室にいて授業に参加しているような臨場感とクラスメイトなど、教室の状況を確認できる。これらはいずれも研究室内での実験であったが、次年度には他の研究機関との連携を考えている。次年度は、本年度の実績に基づきより使いやすくするためのインターフェースの整備と評価及びマルチメディア対応の学習教材の作成に関した開発を行う。さらに、本システムを本人の代理として教室内の自責にセットし,本人が遠隔地で操作し,授業を受けると言った代理生徒としての利用の仕方も検討したい。これは、現在問題になっている登校拒否児や各種施設での児童・生徒にたいする有効な学習支援の手段とも言える。4.本システムを利用する際に必要な各種のソフトウエアの自動立ち上げ、及び操作の説明のために、利用ガイド教材を作成した。

5.以上の結果を踏まえ、学外との予備実験を、近接の大学の設備を借用し行った。以上の開発研究の成果として、本システムをインターネットを介することによって、日本国内における離島,山閑地における本校、分校間、複式学級、その他に病院などにおける長期療養者、特殊学級の場におけるクラス(教室)と個人を結んだ、リアルタイムでの遠隔授業を支援するシステムが安価で、手軽に実現することが可能になった。
環境アセスメント制度の機能とその改革に関する研究

本年度、当班は、「環境悪化のメカニズムとしての社会的ジレンマ」について、引き続き理論的検討を展開するとともに、事例研究として原子力関係諸施設の建設問題について調査を行ない、ジレンマ論の観点から、今日の開発問題における利害対立の構造と合意形成の困難さの根拠について社会学的な分析を試みた。今日の環境問題の困難さの根拠は、第一に、ミクロ的には、社会的ジレンマのメカニズムを通して、「通常の個人」の日常的行為が環境破壊を促進していること、第二に、マクロ的な社会構造、が「ワンウェイ消費型」「隔離依存型」生態系という特徴を持つ点にある。社会的ジレンマ現象の論理的核心は集合財をめぐる「合理性の背理」である。これは、原型としての「共有地モデル」において単純な姿で示されるが、より複雑な姿を示す諸段階として、「市場による加速」を特徴とする「捕鯨モデル」、「構造化された選択肢」を特徴とする「自動車排ガスモデル」、「受益圏と受苦圏の分離」を特徴とする「新幹線公害モデル」を提示できる。青森県むつ小川原地区における核燃サイクル施設建設問題を代表事例として検討してみると、今日の原子力関連諸施設の建設問題をめぐる地域紛争は、一定のマクロ的な生態学的構造により、社会的合意形成が困難化されている。それは、物質循環については「ワンウェイ消費型」の構造であり、「中心部」(大都市部や先進社会)と「周辺部」(農村部や第三世界)の空間的関係については、「隔離依存型」の構造である。その反対概念は「循環再生型」「自給型」社会である。「隔離依存型」生態系構造のもとで、社会的ジレンマが加速され、ワンウェイ消費型の社会となっているところに、原子力政策の推進の根拠と、それをめぐる社会的合意形成の困難さの根拠がある。
生活習慣病の心血管疾患病態における酸化ストレスの関与に関する研究

若年女性に比べて、閉経女性では、心理ストレスColor Word Testの負荷後、回復期に高血圧と血中HNE上昇が持続していた。エストロゲン補充ラットに比べ、卵巣摘出ラットでは、心理ストレスであるケージ交換後、血中NTと血圧の上昇度が高かった。また、高血圧自然発症ラット(SHR)では、トレッドミル運動負荷によって25週時の高血圧発症と血中・大動脈中のNT・HNE上昇が抑制された。これらの結果より、酸化ストレスが閉経後の心血管疾患や高血圧の病態に寄与していることがわかった。卵巣摘出ラットでは、内臓脂肪が増加し、インスリン抵抗性が亢進し、かつ腸間膜血管血管内皮一酸化窒素産生酵素(eNOS)の発現が低下しており、卵巣摘出ラットがメタボリック症候群のモデルであることを見出した。2)HNEとNTの炎症病態における寄与に関する研究リポ多糖(LPS)投与ラットの血中HNEは、単球NADP oxidase由来の活性酸素により上昇した。また、LPS投与後、腸管粘膜の形質細胞がHNE修飾を受け多量体化したIgAを分泌していた。さらに、肝臓で小胞体のCYPやNADPH oxidase等に由来する活性酸素がGRP78のHNE修飾と限定分解に寄与していた。3)虚血・再灌流心筋のコネクシン43(Cx43)の増加と病変に関する研究ラット冠動脈結紮モデルでCx43発現が上昇し、Gap Junction(GJ)を介して再灌流早期に収縮帯の伝播や心筋梗塞の拡大に寄与する。胎児培養心筋でも、Cx43が一過性に上昇しヘミチャネルを介したCa^<2+>流入が細胞内Ca^<2+>過剰と細胞死を誘導した。1.早期感染症動物モデルにおける過酸化脂質4-Hydroxynonenal (HNE)の発生源と生理的意義について1)ラットにリポ多糖(LPS)を腹腔内投与し、腸管粘膜のHNE生成を検討した。投与20分のピークに一致して、腸管の単球のHNEが濃染し、その後、IgAとともに腸管粘膜全般に拡散した。分泌されたIgAは、HNEで修飾されており、大腸菌に対する試験管内のIgA殺菌能はHNE修飾により低下していた(Kimura et al Free Rad Biol Med)。2)ラットを卵巣摘出した群とエストロゲン補充をした群を比較すると、血中HNEは前者が高く、心理ストレス負荷後の回復期に上昇していた。卵巣摘出群は、インスリン抵抗性、および内臓肥満を示していることより、閉経後女性のメタボリック症候群のモデルとなることが確認された(投稿中)。2.虚血心筋障害、およびその保護に関する研究4)ラット冠動脈結紮による虚血モデルにおいて、IP、およびp38MAP kinase阻害剤は、TNF-α分泌によるミトコンドリアの障害を抑制することを明らかにした(Kimura H et al. Life Sci)。3.ヒト事例におけるHNE測定5)急性冠症候群患者は、安定狭心症患者に比べて、血中HNEが上昇していることを明らかにした。また、心筋梗塞患者の血中HNEが上昇しており、回復とともに正常化することを見出した。現在、疾患群、対照群の症例を集めている。6)基礎疾患のない中年と若年の女性の血中HNEを測定した。中年女性が高い傾向を示し、カラーワードテストによる心理ストレス負荷後の回復期に上昇を認め、同様に拡張期血圧が持続的に上昇していた。身体ストレスには、このような効果はなかった。真理ストレスによる血圧上昇に酸化ストレスが寄与している可能性が示唆された。さらなる検討を予定している。若年女性に比べて,閉経女性では,心理ストレスColor Word Testの負荷後,回復期に高血圧と血中HNE上昇が持続していた。

エストロゲン補充ラットに比べ,卵巣摘出ラットでは,心理ストレスであるケージ交換後,血中NTと血圧の上昇度が高かった。また,高血圧自然発症ラット(SHR)では,トレッドミル運動負荷によって25週時の高血圧発症と血中,大動脈中のNT・HNE上昇が抑制された。これらの結果より,酸化ストレスが閉経後の心血管疾患や高血圧の病態に寄与していることがわかった。卵巣摘出ラットでは,内臓脂肪が増加し,インスリン抵抗性が亢進し,かつ腸間膜血管血管内皮一酸化窒素産生酵素(eNOS)の発現が低下しており,卵巣摘出ラットがメタボリック症候群のモデルであることを見出した。2.HNEとNTの炎症病態における寄与に関する研究リボ多糖(LPS)投与ラットの血中HNEは,単球NADP oxidase由来の活性酸素により上昇した。また,LPS投与後,腸管粘膜の形質細胞がHNE修飾を受け多量体化したIgAを分泌していた。さらに,肝臓で小胞体のCYPやNADPH oxidase等に由来する活性酸素がGRP78のHNE修飾と限定分解に寄与していた。3.虚血・再灌流心筋のコネクシン43(Cx43)の増加と病変に関する研究ラット冠動脈結紮モデルでCx43発現が上昇し,Gap Junction(GJ)を介して再灌流早期に収縮帯の伝播や心筋梗塞の拡大に寄与する。胎児培養心筋でも,Cx43が一過性に上昇しヘミチャネルを介したCa^<2+>流入が細胞内Ca^<2+>過剰と細胞死を誘導した
タグラグビーの競技性に着目したゲーム様相分析

本研究の目的は、タグラグビーのゲーム様相を分析、検証することである。小学生を対象に行われているタグラグビーのゲーム様相を詳細に分析することにより、タグラグビーの競技特性を明らかにできると考えている。明らかになった競技特性が、タグラグビーのコーチングへの補助資料と成りうる考えている。また、競技上の問題点を抽出し、タグラグビーの競技的な安定性を促すルール改正などを提案することができると考えている。平成30年度においては、研究の実施計画にのっとり、前年度同様の小学生タグラグビー大会の3大会を撮影することができた。撮影した大会は、「サントリーカップ」宮城県予選(平成30年12月1日)、東北地区予選(平成31年2月3日)、全国大会本選(平成31年2月16日、17日)の3大会である。また、前年度、前々年度に撮影した全国大会映像をゲーム分析ソフト「Sports Code Pro」を使用して、分析を行った。タグラグビーの攻撃方法等についてのシーン分類仕分けを行い、そこから得られた知見をまとめて、平成31年4月に発行される日本ラグビー学会学会誌「ラグビーフォーラム」に投稿論文として掲載予定である。今後、3年間で撮影された試合映像の分析をすすめることで、タグラグビーの攻撃方法、守備方法等の競技特性がさらに明らかにすることが可能であると考えられ、そこから得られた知見を、学会発表、論文投稿等の方法で発表していく予定である。明らかになった競技特性から、タグラグビーのコーチングへの補助が可能であると考えている。また、競技上の問題点を抽出し、タグラグビーの競技的安定性を促すルール改正などを提案することができると考えている。平成28年度においては、研究実施計画にのっとり、小学生タグラグビーチームの練習、試合のビデオ撮影を行い、基礎データの収集に努めた。また、撮影協力者により、他のタグラグビーチームの試合映像も収集が可能となった。小学生タグラグビーの全国大会である「サントリーカップ」の宮城県予選(平成28年12月10日)、東北ブロック予選(平成29年1月29日)、全国大会本選(平成29年2月18日、19日)の3会場において、タグラグビーの試合のビデオ撮影を行ない、データを収集することができた。現在は、タグラグビーの試合映像をゲーム分析ソフト「Sports Code Pro」を使用して、攻撃シーンの分類仕分け等を行っている。抽出された攻撃シーンを集積し、数値化や統計処理等を行い、タグラグビーにおいて有効な攻撃方法の分類を行う予定である。また、研究成果の発表に備え、「日本ラグビー学会」とうの学会に参加し、他研究者と意見交換を行った。研究実施計画にのっとり、予定していた3つの試合会場で、タグラグビーの試合をビデオ撮影できたこと。撮影協力者により、他の試合のビデオ映像も入手できたこと。また、学会発表のために、日本ラグビー学会へ参加できたことなどが理由である。明らかになった競技特性から、タグラグビーのコーチングへの補助が出来ると考えている。また、競技上の問題点を抽出し、タグラグビーの競技安定性を促すルール改正などを提案することができると考えている。平成29年度においては、研究の実施計画にのっとり、小学生タグラグビー大会の3大会を撮影することができた。撮影した試合は、「サントリーカップ」の宮城県予選(平成29年12月2日)、東北地区予選(平成30年2月4日)、全国大会本選(平成30年2月17日、18日)の3大会である。前年度(平成28年度)に撮影した大会映像をゲーム分析ソフト「Sports Code Pro」を使用して、タグラグビー攻撃方法等についてシーンの分類仕分けを行なった。そこから得られた知見をまとめて、平成30年3月に発行された日本ラグビー学会学会誌「ラグビーフォーラム」に投稿論文として発表をおこなった。また、平成29年度に撮影されたデータを含めて、今後、研究を重ねることで、より正確なデータをえられることになり、タグラグビーの競技特性等をさらに明らかにできると考えている。よって、今年度においても昨年同様のデータの集約、分析をすすめることで、タグラグビーの攻撃方法、守備方法等の特徴を明らかにし、得られた知見を、学会発表、論文投稿等の方法で発表していく予定である。研究実施計画にのっとり、予定していた3大会の試合会場で、タグラグビーの試合をビデオ撮影できている。また、学会発表準備のため、日本ラグビー学会へ参加することができ、また、日本ラグビー学会誌に投稿論文として発表を行うことができた。

撮影した大会は、「サントリーカップ」宮城県予選(平成30年12月1日)、東北地区予選(平成31年2月3日)、全国大会本選(平成31年2月16日、17日)の3大会である。また、前年度、前々年度に撮影した全国大会映像をゲーム分析ソフト「Sports Code Pro」を使用して、分析を行った。タグラグビーの攻撃方法等についてのシーン分類仕分けを行い、そこから得られた知見をまとめて、平成31年4月に発行される日本ラグビー学会学会誌「ラグビーフォーラム」に投稿論文として掲載予定である。今後、3年間で撮影された試合映像の分析をすすめることで、タグラグビーの攻撃方法、守備方法等の競技特性がさらに明らかにすることが可能であると考えられ、そこから得られた知見を、学会発表、論文投稿等の方法で発表していく予定である。撮影された試合映像をもとに、タグラグビーの攻撃方法を分類し、分析を行う。得られた知見を元に、タグラグビーにおける攻撃方法の有効性、また防御方法などについて開発、提案を行っていく。また、競技種目としてのルール上の問題点などを洗い出し、ルール改正につなげる提案等を学会発表、論文発表を通じて行っていく。昨年度同様、撮影された試合映像をもとに、タグラグビーの攻撃方法、守備方法について分析を行う。タグラグビーの試合開催時期が年度末に近く、分析に予定していた人件費の支出が無く、試合映像撮影においても人件費が必要とならなかった為。(理由)分析について専門性が高く、適した雇用者が存在しなかったため人件費の支出が無く、試合映像撮影についても人件費が必要とならなかったため。(使用計画)平成28年度分・平成29年度分のデータを分析するための専門性を有した雇用者を雇用し、2年分のデータ分析のための人件費等に充当する。平成28年度分の試合映像の分析に、平成29年度分経費を使用しなければならないため、平成29年度の人件費、謝金に充当する予定である。
高温性プロピオン酸酸化細菌におけるコハク酸酸化からの水素生成機構の生化学的解明

プロピオン酸酸化細菌Pelotomaculum thermopropionicumのプロピオン酸からの水素生成に必要な因子を探るため、まず、P. thermopropionicumをプロピオン酸を基質として培地で保温したところ水素生成が確認された。この水素生成は、CCCP、DCCD、そしてTTFAの添加により阻害されたことから、膜電位、ATP合成酵素、そしてキノンの水素生成反応への関与が示唆された。この反応に様々な補酵素の添加が与える影響は確認できなかった。一方、P. thermopropionicum細胞内に存在すると考えられる二つのコハク酸脱水素酵素SDH1(膜タイプ)とSDH2(細胞質タイプ)の特徴解析を行うため、培養した細胞から得た細胞質画分と膜画分のコハク酸脱水素活性を測定したところ、両画分において活性が確認されたが、その活性は膜が10倍以上高かった。基質親和性やpH領域に大きな差は見られなかった。また、膜画分ではQ1還元活性が見られたが、細胞質画分では検出されなかった。それぞれの画分のNADHを電子供与体とするコハク酸還元活性を測定したところ、細胞質画分のみにその活性が確認された。これらのことから、SDH1は膜に存在する主なコハク酸脱水素酵素であり、SDH2は細胞質に存在しコハク酸酸化活性を有するがフマル酸還元酵素として機能している可能性が示唆された。これらSDHのさらなる機能解析のため、SDH1および2の全サプユニット遺伝子を大腸菌SDHと同様のプロモーター下流に連結したプラスミドを構築し大腸菌に導入したが、SDH活性は検出されなかった。ただ、単一サブユニットでのタンパク質の発現は確認された。このことから、大腸菌においてP. thermopropionicumのサブユニット構造を持つ酵素を機能的に発現させるにはさらなる工夫が必要であることが示唆された。今年度は1)コハク酸酸化の膜電位要求性の細胞での確認、2)反応に必要な補因子の探索、3)膜小胞や反転膜小胞による解析、4-1)コハク酸脱水素酵素(SDH)の解析の実施を計画し、3)以外の項目は研究を実施した。さらに、4-3)大腸菌を利用したSDHの発現と解析に前倒しで着手した。1)では、SI株が単独の菌体でプロピオン酸から水素を放出することを確認したのち、その状態において膜電位を消失させるCCCPによってプロピオン酸からの水素放出が抑制されることを示した。さらに、SI株の膜電位が非常に低いながらもCCCPによって影響される可能性を示唆した。2)では、SI株によるプロピオン酸からの水素放出をいくつかの補酵素の添加によって促進することが出来る可能性を示唆した。ただ、促進効果の再現が低いことから丁寧な検証を進める必要がある。4-1)では、SI株を培養した菌体を破砕後、超遠心により膜を分離した画分を用いて、SDH1及びSDH2の解析を実施した。まずコハク酸酸化活性が膜画分のみならず可溶性画分にも存在することを示した。さらに膜画分は電子受容体であるQ1の還元を行えたことから、SDH1はキノン還元活性及びキノン結合ドメインがあることが示唆された。一方、可溶性画分ではQ1還元活性が見られず、SDH2はキノン結合ドメインがないことが示唆された。また、Native-PAGEでの活性染色により、膜画分と可溶性画分で異なる分子量での活性が確認された。一方、NADHを電子供与体とするフマル酸還元活性が可溶性画分で確認されたことから、SDH2はフマル酸レダクターゼとしての機能を有する可能性が示唆された。4-3)では、遺伝子を発現させる大腸菌の選定とプラスミドの構築を試みたが、まだ完成には至っていない。昨年度の計画の進捗状況は、1)、2)、及び4-1)をほぼ実施した。3)の実施は出来なかったが、研究計画4-3)を前倒しで実施し始めていることから、概ね計画通りに進んでいると考えている。平成29年度は前年度に引き続き、2)反応に必要な補因子の探索、4-1)コハク酸脱水素酵素(SDH)の解析を実施した。また新たに、4-3)大腸菌を利用したSDHの発現と解析及び5-2)他の菌株を利用したHYDの発現と解析も実施した。成果としては、SI株のSDH1及びSDH2の機能的特徴を見出そうと試みたところ、SDH1がSI株においてコハク酸脱水素酵素として機能していること、また、プロピオン酸からの水素放出にはSDH1が関与することが示された。これら一連の解析の結果、プロピオン酸酸化時のコハク酸酸化経路はほぼ特定できていると考えている。さらに、どの培養条件でSDH1及びSDH2が高発現しているのかを確認したところ、SDH1は基質がピルビン酸の時の対数増殖期、SDH2は基質がフマル酸の時の対数増殖期に高い可能性が示唆された。しかしながら、プロピオン酸からの水素放出への補酵素の添加は明確な効果が確認出来なかった。そして、大腸菌でのSDHの発現は、大腸菌のSDH破壊株にSI株のSDH1及びSDH2をオペロンとして含むプラスミドを構築して導入した。

ほぼ同様に構築したプラスミドによる大腸菌SDH発現での機能補完は確認できたが、SI株のSDH活性及び機能的補完は確認できなかった。また、大腸菌でのSI株のヒドロゲナーゼ(HYD)の発現を目指し、大腸菌にある3つのヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を全て破壊した株の構築を完了した。平成29年度は、1)コハク酸酸化の膜電位要求性の細胞での確認, 2)反応に必要な補因子の探索, 4-1)コハク酸脱水素酵素(SDH)の解析をほぼ完了させた。さらに、4-3)大腸菌を利用したSDHの発現と解析と5-2)他の菌株を利用したHYDの発現と解析を実施し、大腸菌においてSDHの機能解析を実施できる道筋をつけた。ただ、3)膜小胞や反転膜小胞による解析や、4-2)で計画していた精製を行って機能解析をすることは実施できていない。特に、5-1)で計画していたHYDの機能解析を行うための解析系の構築を急ぐ必要がある。プロピオン酸酸化細菌Pelotomaculum thermopropionicumのプロピオン酸からの水素生成に必要な因子を探るため、まず、P. thermopropionicumをプロピオン酸を基質として培地で保温したところ水素生成が確認された。この水素生成は、CCCP、DCCD、そしてTTFAの添加により阻害されたことから、膜電位、ATP合成酵素、そしてキノンの水素生成反応への関与が示唆された。この反応に様々な補酵素の添加が与える影響は確認できなかった。一方、P. thermopropionicum細胞内に存在すると考えられる二つのコハク酸脱水素酵素SDH1(膜タイプ)とSDH2(細胞質タイプ)の特徴解析を行うため、培養した細胞から得た細胞質画分と膜画分のコハク酸脱水素活性を測定したところ、両画分において活性が確認されたが、その活性は膜が10倍以上高かった。基質親和性やpH領域に大きな差は見られなかった。また、膜画分ではQ1還元活性が見られたが、細胞質画分では検出されなかった。それぞれの画分のNADHを電子供与体とするコハク酸還元活性を測定したところ、細胞質画分のみにその活性が確認された。これらのことから、SDH1は膜に存在する主なコハク酸脱水素酵素であり、SDH2は細胞質に存在しコハク酸酸化活性を有するがフマル酸還元酵素として機能している可能性が示唆された。これらSDHのさらなる機能解析のため、SDH1および2の全サプユニット遺伝子を大腸菌SDHと同様のプロモーター下流に連結したプラスミドを構築し大腸菌に導入したが、SDH活性は検出されなかった。ただ、単一サブユニットでのタンパク質の発現は確認された。このことから、大腸菌においてP. thermopropionicumのサブユニット構造を持つ酵素を機能的に発現させるにはさらなる工夫が必要であることが示唆された。現在のところ、次年度は申請時に計画した研究内容を実施していく予定である。特にSDHを含むSI株の遺伝子を大腸菌で発現させる系の構築を精力的に実施したい。遺伝子を発現させる菌株の選定をさらに行いながら、SI株の遺伝子を機能的に発現可能な系とプラスミドの構築を目指す。一方、SDH酵素の精製や反転膜小胞による解析を可能にするために、SI株細胞の大量培養と保存を行いSI株の酵素の精製を行うための基盤を構築する。そして、酸素感受性を示すと予想されるヒドロゲナーゼの機能解析を行うための生化学的及び異種発現に関する情報の収集と実験系の構築を早期に開始する予定である。