hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中枢シナプスにおけるタキキニン伝達物質の不活性化機構に関する研究

中枢神経系においてシナプス間隙に放出されたタキキニン伝達物質の不活性化機構を解明するために、新生ラット脊髄標本を用いて、酵素的分解の可能性についてペプチダーゼの阻害薬の効果を電気生理学的および生化学的に検討した。1.新生ラットの摘出脊髄-末梢神経標本において末梢神経をC線維を賦活化する強さで電気刺激すると前根より緩徐な脱分極が得られる。この反応にはタキキニンが伝達物質として関与していることをすでに見いだしていたが、この反応はオピオイド受容体拮抗薬であるナロキソン適用により増強し、ペプチダーゼ阻害薬混合液(アクチノニン、アルファメニン、カプトプリル、ベスタチン、チオルファン)でさらに増強した。一方、ナロキソン存在下にタキキニン受容体の拮抗薬であるGR71251を適用するとこの緩徐な脱分極は減少し、ペプチダーゼ阻害薬混合液を加えても増強されなかった。また皮膚神経を条件刺激すると、約20秒間にわたり単シナプス反射が抑制されるが、この反応にもタキキニンが関与していると考えられるので同様に阻害剤の効果を検討したところ、ペプチダーゼ阻害薬混合液で抑制が増強された。2.新生ラット脊髄から調整した膜分画によって、タキキニンは分解され、阻害薬混合液はその分解を抑制した。さらに個々の阻害薬の中ではチオルファン、アクチノニン、カプトプリルが有効であった。3.生理学実験と同じ脊髄標本を用いて、カプサイシン刺激によりサブスタンスPを放出させ、エンザイムイムノアッセイ法で定量した。サブスタンスP放出量は阻害薬混合液によって増加した。以上の事実からタキキニン伝達物質の不活性化機構に酵素的分解が関与していることが示され、同時に伝達物質の同定基準の一つを満たす事によって、タキキニンがラット脊髄における伝達物質の一つであることが一層確実となった。
キセノン光線の星状神経節近傍照射が自律神経機能及び立位保持能力に及ぼす影響

1.目的昨年度の研究に引き続き、両側の星状神経節近傍へのキセノン光線照射(以下、Xe-SGI)が自律神経機能及び立位保持能力に及ぼす影響を検討することを目的としたが、本年度の研究では特にXe-SGI終了後の立位保持能力の経時的変化に注目した。2.対象と方法本研究への参加に同意の得られた健常者30名(男性22名、女性8名、年齢23.6±4.3歳)を対象として、温度を一定(25°C)に保った室内で安静仰臥位の対象者に10分間のXe-SGIを実施(以下、Xe-SGI条件)し、この間のRR間隔変動係数(以下、CVRR)と1分ごとの両側上下肢皮膚温を測定した。さらに、Xe-SGI終了直後から5分おきに20分後までの立位重心動揺(総軌跡長、矩形面積等)を開眼、閉眼の2条件で測定した。また、Xe-SGIを実施しない場合の10分間安静仰臥位(以下、control条件)でのCVRR及び両側上下肢皮膚温と立位重心動揺についてもXe-SGI条件の場合と同様に測定し、各測定項目の比較を行った。3.結果と考察、CVRRにっいては、Xe-SGI及びcontrol両条件ともに開始前と比較して終了後での有意な上昇を認めたが、上下肢皮膚温にっいては、control条件と比較してXe-SGI条件でより高い傾向を示した。一方、立位重心動揺については、開眼・閉眼条件ともにXe-SGI及びcontrol両条件終了後10分までは各測定パラメータとも概ね低下傾向を示したが、Xe-SGI及びcontrol両条件間での各測定パラメータに有意差は認められなかった。以上の結果から、Xe-SGIは、副交感神経系のより優位な状態を引き起こす可能性が示唆されたものの、立位保持能力については特異的な影響を引き起こさない可能性が示唆された。今後は、有疾患例を対象として、Xe-SGIの自律神経機能及び立位保持能力に及ぼす影響に関する臨床的な検討が必要と考えられる。1.目的本研究では、近年、薬剤注射による星状神経節ブロックに代わり利用される機会が増えているキセノン光線の星状神経節近傍照射が、自律神経機能及び立位保持能力に及ぼす影響を検討することを目的とした。2.対象と方法本研究への参加に同意の得られた健常者30名(男15名、女15名、年齢23.4±3.6歳)を対象として、温度を一定(25°C)に保った室内で安静仰臥位の対象者の両側星状神経節近傍にキセノン光線を10分間照射した。キセノン光線照射中は、1分ごとに両側上下肢末梢皮膚温と心拍数を測定し、キセノン光線照射終了直後に静止立位保持時の重心動揺(総軌跡長、単位時間当たり軌跡長、外周面積、矩形面積)を開眼、閉眼の2条件で測定した。また、両側星状神経節近傍にキセノン光線を照射しない場合の10分間安静仰臥位での両側上下肢末梢皮膚温及び心拍数と、10分間安静仰臥位直後の静止立位保持時の重心動揺についてもキセノン光線照射の場合と同様の方法で測定し、キセノン光線照射の有無による各測定項目の比較を行った。3.結果と考察両側上肢末梢皮膚温及び心拍数については、両側星状神経節近傍へのキセノン光線照射の有無に関わりなく明らかな変化は認められなかったが、両側下肢末梢皮膚温については、両側星状神経節近傍へのキセノン光線照射中にのみ有意な低下が認められた。一方、安静立位保持時の重心動揺については、閉眼条件では、両側星状神経節近傍へのキセノン光線照射の有無による明らかな変化は認められなかったが、開眼条件では、両側星状神経節近傍へのキセノン光線照射直後において総軌跡長及び単位時間当たり軌跡長に有意な増加が認められた。以上の結果は、キセノン光線の星状神経節近傍照射が、自律神経機能及び立位保持能力に影響を与える可能性を示唆している。今後、さらに詳細な検討を進める予定である。

3.結果と考察、CVRRにっいては、Xe-SGI及びcontrol両条件ともに開始前と比較して終了後での有意な上昇を認めたが、上下肢皮膚温にっいては、control条件と比較してXe-SGI条件でより高い傾向を示した。一方、立位重心動揺については、開眼・閉眼条件ともにXe-SGI及びcontrol両条件終了後10分までは各測定パラメータとも概ね低下傾向を示したが、Xe-SGI及びcontrol両条件間での各測定パラメータに有意差は認められなかった。以上の結果から、Xe-SGIは、副交感神経系のより優位な状態を引き起こす可能性が示唆されたものの、立位保持能力については特異的な影響を引き起こさない可能性が示唆された。今後は、有疾患例を対象として、Xe-SGIの自律神経機能及び立位保持能力に及ぼす影響に関する臨床的な検討が必要と考えられる。
磁気ビーズと集積化磁気センサを利用した細胞観測・順送り運搬システムに関する研究

磁気ビーズと集積化磁気センサを用いることで、創薬やスクリーニングに適用可能な細胞観測・順送り運搬システムに関する研究を行った。磁気ビーズを駆動するための微細なコイルや、そのビーズを観測するための磁気センサを、集積回路技術により作製した。作製した磁気センサにより、磁気ビーズからの磁束を観測することができた。また、作製したコイルにより、磁気ビーズを運搬することができた。さらにコイルと磁気センサを2.4mm角の半導体チップ上に集積化し、細胞観測・順送り運搬システムを作製した。平成25年度には磁気センサの改良を主に行った。これまでの集積化磁気センサでは磁気センサ本体の微細化(1μm角)には成功していた。しかし、その周辺回路の微細化は行われておらず、磁気センサのピッチは20μmであった。この様に、磁気センサ本体が小さくてもピッチが大きいと、大きさが10μm以下の磁気ビーズを観測することは困難である。このため、周辺回路の微細化に関して検討を行った。また磁気ビーズの励磁用コイルに関するシミュレーションを行った。本研究で使用されている磁気センサには感度を良くするためにnチャネルMOSFETが使用されている。その読み出しにはバイアスの関係でpチャネルMOSFETが使用される。このpチャネルMOSFETは磁気センサの近くに配置されるためにウェル分離が必要となり、磁気センサのピッチを小さく出来ない原因である。そのため、4つの磁気センサのpチャネルMOSFETを、ウェルを共有する形で配置することでウェル分離のスペース削減を試みた。この集積化磁気センサを0.18μm標準CMOSプロセスで設計したところ、磁気センサのピッチを7μmにする事に成功した。また集積化磁気センサを試作し感度を測定したところ0.125mV/mTであった。この値はこれまでの研究で実現された感度0.105mV/mTと同等以上である事が確認できた。以上の様に周辺回路の配置を最適化することで10μm以下の磁気ビーズを観測するための集積化磁気センサの準備が終了した。合わせて励磁用コイルに関するシミュレーションを行った。設計した励磁用コイルは7μm角とした。その結果、励磁用コイルにより発生する事が出来る磁束は試作した磁気センサで検出出来る値よりも3桁以上小さい事がわかった。そのため、平成26年度はより大きな磁束を発生するためにコイルの大きさを再検討する。平成26年度はコイルの設計をおもに行った。平成25年度に設計した励磁用コイルは7μm角であった。その結果、励磁用コイルにより発生出来る磁束は試作した磁気センサで検出出来る値よりも3桁以上小さい事がわかった。そのため平成26年度は、励磁用コイルのサイズを大きくして磁束密度を増やすことを目標とした。また、その励磁用コイルと微細化した磁気センサを同じチップ上に製造することも目標とした。さらに、磁気ビーズの制御をするために必要な位置検出をするための信号処理法について検討した。まず磁気センサで検出ができる最小のサイズの励磁用コイルの検討を行った。シミュレーションには有限要素法ソフトウェアANSYSを用いた。既存の研究の結果をベースに励磁用の電流を10mAとして、それを流すことができる励磁用コイルを設計した。流す電流量を増やすためには、励磁用コイルの配線幅を広くする必要がある。10mAを流すためには配線幅を10μmにする必要がある。そこで、十分な磁束密度を確保するために、励磁用コイルの大きさの制限を一度無くし、発生する磁束の大きさを確認した。その結果、外形40μm角の励磁コイルによって8mTの磁束密度を発生できることが明らかとなった。これまでの研究により、この8mTの磁束密度は磁気センサで十分に観測出来る。さらに、この励磁用コイルと微細化した磁気センサを同じチップ上に製造した。続いて磁気ビーズの位置検出を行うための信号処理法について検討を行った。磁気ビーズを運搬するための制御時間が必要だと考えて、位置検出に許容される処理時間を1/1000秒以内として設計を行った。この処理には離散コサイン変換(DCT)と、ハードウェアにより高速な処理を実現するためのField Programmable Gate Array (FPGA)を用いた。その結果、±0.5画素以内の精度でかつ1/1000秒以内の処理時間で位置検出を実現出来た。平成27年度はまず、磁気ビーズの観測を行った。新しく設計した磁気センサにおいて、これまで通りの感度を得られたことを確認出来た。この磁気センサを元に磁気ビーズの観測実験を行った。その結果、帯磁した磁気ビーズの緩和時間の測定により磁気ビーズの観測を確認出来た。しかし、磁気ビーズからの磁束の測定値(2mV)に対して磁気センサからのノイズ(4mVp-p)が大きいため、追加の信号処理が必要となった。そのため、磁気センサで発生するこのノイズの発生原因と除去方法に関して検討を行った。その結果、磁気センサ内に使用されているソースフォロアのMOSFETで発生する1/fノイズが原因で有る事がわかった。このノイズを低減するためにMOSFETの面積を増やす等の試作を行ったが100倍以上の大面積化が必要となり、現行の6μm程度のセンサピッチに収めることは物理的に不可能であった。

そのため、1/fノイズの除去に有効なCDS(correlated double sampling:相関2重サンプリング)の導入を試みた。その結果、1/fノイズを600μV程度まで抑える事が可能であることが明らかとなった。続いて順送り制御に必要な位置検出方法の見直しを行った。これは磁気センサで発生していたノイズの低減が難しいため、ノイズを含む情報に対して位置検出を正しく出来るかを再評価する必要があったためである。その結果、平成26年度に実現した離散コサイン変換(DCT)による位置検出方法はノイズの影響を大きく受けることが確認され、方法の見直しをする必要が生じた。検討の結果、POC(Phase Only Correlation:位相限定相関法)が有効で有る事が明らかとなった。さらにLPF(Low Pass Filter)を用いる事で検出精度を向上した。その結果、検出信号のピーク値の40%の振幅のノイズを含む画像に関して、検出誤差±1画素を許容した場合の位置検出割合は99%以上であった。磁気ビーズと集積化磁気センサを用いることで、創薬やスクリーニングに適用可能な細胞観測・順送り運搬システムに関する研究を行った。磁気ビーズを駆動するための微細なコイルや、そのビーズを観測するための磁気センサを、集積回路技術により作製した。作製した磁気センサにより、磁気ビーズからの磁束を観測することができた。また、作製したコイルにより、磁気ビーズを運搬することができた。さらにコイルと磁気センサを2.4mm角の半導体チップ上に集積化し、細胞観測・順送り運搬システムを作製した。本研究の目的は「磁気ビーズのセンシング特性の向上」、「磁気ビーズの順送り運搬機構の実現」、「細胞の観測、順送り運搬システムの構築」を行い、10μm以下の細胞の観測と順送り運搬が可能であることを明らかにすることである。はじめに「磁気ビーズのセンシング特性の向上」を目的とした磁気センサの微細化に取り組んだ。その結果、これまでの研究では7μmであった磁気センサのピッチを15%小さくし6μmとした。また、これまでの研究で問題になっていたオフセット電圧のバラツキを抑制するための構造を採用した。計画では磁気ビーズの測定を行う予定であったが、励磁用コイルの開発が平成25年度に遅れたため、この様に磁気センサの改良を行った。続いて「磁気ビーズの順送り運搬機構の実現」のための準備として有限要素法を用いた励磁用コイルの検討を行った。有限要素法を用いた電磁場解析から、40μm角で設計した励磁用コイルでは十分な励磁用の磁場の発生が出来ることがわかった。これは平成26年度の研究実施計画通り進んでいる。さらに、「細胞の観測、順送り運搬システムの構築」を目的として、十分な演算速度をもつ位置検出システム用の信号処理回路をFPGAにより実現した。さらに、磁気センサと励磁用コイルのLSI上への試作を行った。これは平成26年度の研究実施計画より大幅に進んでいる。以上の様に集積化磁気センサの開発では計画よりややおくれ、その他のテーマでは順調、もしくは計画以上の成果が得られているため、総合的におおむね順調に進展していると判断する。集積回路工学おおむね順調に研究が進んでいるため、研究実施計画に従って研究を進める。
高次生物における１細胞内全遺伝子発現の網羅的１分子計測

本研究では、高次生物における遺伝子発現の確率的ダイナミクスの理解を目指して、単一細胞における1分子レベルでの遺伝子発現の挙動をリアルタイムに、かつハイスループットに解析するシステムの開発を行った。その実現のため、単一細胞の全体積における単一分子計測をハイスループットに行うための新規ライトシート顕微鏡を開発した(特願2013-79956)。加えて、1分子レベルでのmRNA・タンパク質発現を測定するためのプローブ技術の開発を行った。開発した技術を用いてモデル生物(出芽酵母)の複数遺伝子における発現プロファイルを計測し、遺伝子発現反応の共通様式を明らかにした。本研究では、高次生物(酵母、ヒト細胞)において1つ1つの細胞の個性が生まれるメカニズムの解明を目指している。我々はこれまでに、原核生物である大腸菌を用いて、1細胞レベルでのタンパク質の発現を1分子レベルで、かつリアルタイムで定量化するシステムを開発し、細胞毎の遺伝子発現のばらつきが生まれるメカニズムを明らかにした(Taniguchi et al., Science, 2010)。しかしながら、真核生物のタンパク質の発現メカニズムは、より複雑である。特に、真核細胞には核が存在するため、mRNAの核外輸送など、様々なプロセスがタンパク質の発現に関与している。我々は真核細胞における遺伝子発現のばらつきのメカニズムを明らかにするため、中途産物であるmRNAの発現を、最終産物であるタンパク質の発現と同時に、リアルタイムかつ1分子レベルで捉えるシステムの開発を目指した。mRNAを可視化するため、我々はウィルスのキャプシドタンパク質の一つであるPP7タンパク質を利用した。PP7は特定の配列のmRNA分子に結合できる性質を持っている。PP7を蛍光タンパク質と融合させた状態で発現させておき、一方で、注目する遺伝子の転写領域にPP7の結合配列をタンデムに繰り返したものを挿入しておけば、mRNAの発現と同時に多数のPP7が集まって強い蛍光スポットを生じるため、その数をカウントすればmRNAの計測を行える。我々は実験系のテストのために、大腸菌にこのシステムを組み込んで、mRNAとタンパク質の同時発現計測を行った。計測からmRNAの分解時間は数分と求まり、タグ配列挿入の有無で分解時間は変わらないことが分かった。また、mRNAの発現と同期して、複数のタンパク質が突発的に発現する様子が観察された。現在は解析を行って1細胞内の転写と翻訳の相関性を定量化するとともに、酵母・ヒト細胞へのシステムの導入を進めている。我々はこれまでに、原核生物である大腸菌を用いて、1細胞レベルでのタンパク質の発現を1分子レベルで、かつリアルタイムで定量化するシステムを開発してきた(Taniguchi et al., Science, 2010)。しかしながら、このシステムをそのまま高次生物に応用できるかというと、実はそうではない。高次生物には厚みがあるため、一般的に用いられる広視野型の蛍光顕微鏡で観察した際には焦点面外からの高い背景光が発生するためである。我々はこの問題を解決するため、高次生物のタンパク質発現計測に適した蛍光顕微鏡システムを開発した。厚みがある細胞でも低い背景光で観察できる顕微鏡にシート照明顕微鏡があるが、一般的にこの顕微鏡は、生物試料をゲル中に埋めなければ観察が行えないため、ライブセル観察を行うのが難しいという欠点があった。我々は、光学系を改良することにより、一般的に細胞観察に用いられるシャーレ上の細胞に対してでもシート照明による観察を適用することができる、新しいシート照明顕微鏡を開発した。我々は実験系のテストのために、複数の生物試料に対して観察を行った。まず酵母に光励起型の蛍光タンパク質であるmEos3.1を発現させ、微弱なUV励起光を用いて観察を行ったところ、蛍光タンパク質1分子による明瞭な蛍光スポットを観察することができた。さらに、微小管・ヒストンと蛍光タンパク質を融合させた線虫株の初期胚の観察を行い、実際にゲル中でなく水溶液中でも胚発生の様子が観察できることを確認した。一方で、蛍光ビーズを計測してシート照明の厚みを測定したところ、2.5ミクロンと求められ、十分に背景光が低くなっていることが確認できた。現在、本システムを用いて酵母・動物細胞における遺伝子発現定量計測を行うための準備を進めている。本研究では、高次生物(酵母、ヒト細胞)において1つ1つの細胞の遺伝子発現特性を1分子レベルで、かつ全遺伝子レベルで調べるシステムの開発を目指している。前年までの研究により、細胞内で発現しているタンパク質を1分子レベルでイメージングするライトシート型蛍光顕微鏡システムの開発を行ってきた(PCT/JP2014/059883)。本年度においては、膨大な数の遺伝子を一挙に解析できるハイスループット測定システムの開発、並びに培養条件下で細胞の測定を行うための温度チャンバーの導入を行った。ハイスループット化を行うにあたり、代表者はレーザー加工機を用いてマルチウェルデバイスを設計・構築し、結果、数十遺伝子の発現動態を逐次的に解析する実験系を構築することに成功した。さらに温度調節チャンバーの導入により、高次生物の遺伝子発現の確率的ダイナミクスをリアルタイムに測定できるようになった。代表者はさらに、モデル生物である出芽酵母の十数個の遺伝子をピックアップし、これらの発現過程を開発したシステムを用いて追跡することで、遺伝子発現ノイズの生成ルールとメカニズムを調べた。タンパク質の発現測定は、蛍光タンパク質であるVenusの配列をゲノムDNA内の注目する遺伝子のコード領域に挿入し、タンパク質発現と同期して行われる蛍光タンパク質の発現を顕微鏡で捉えることにより行った。

この解析の結果、出芽酵母におけるノイズ生成の法則性が見えてきており、現在大腸菌との比較実験、並びに数理モデルを用いた解析を進めている。本年度においては、高次生物における遺伝子発現の確率的ダイナミクスのモデル化を目指して、1分子レベルでのタンパク質発現の挙動をリアルタイムで捉える測定システムの開発を行った。前年までの研究により、細胞内で発現しているタンパク質を1分子レベルでイメージングするライトシート型蛍光顕微鏡システムの開発、並びにマルチウェルを用いて膨大な数の遺伝子を一挙に解析できるハイスループットシステムの導入を行ってきた。本システムを用いてリアルタイム計測を行うには、一定時間ごとに各ウェルを巡回してタイムラプス観測を行う必要があるが、常に観察試料とライトシート光、観察対物レンズの間には熱ドリフトが生じており、定期的にこれらの位置関係の自動修正を行う必要があることが判明した。そこで代表者はライトシート光を構成する対物レンズと観察対物レンズの座標を3次元的に制御する機構を導入し、さらにこれらの位置ずれを対物レンズの座標にフィードバックさせる機構を導入した。また、培養条件下での細胞の測定を行うための温度チャンバーを対物レンズ系と干渉しないようにさらに導入することで、熱ドリフトの影響を最小化し、長時間の測定を安定して行うことができるようになった。代表者はさらに、開発したシステムを用いて出芽酵母の十数個の遺伝子におけるタンパク質発現の動態を追跡した。結果、多くの遺伝子において複数個のタンパク質の発現が一挙に起こるバースト現象が観察され、各細胞におけるタンパク質の発現量はヘテロになっていることが確認された。これに対し、mRNAの発現量は各細胞で一様になっていることが別実験で観察されたことから、翻訳過程のゆらぎが全体のヘテロ性をコントロールしていることが分かってきた。現在バースト発現の法則性とメカニズムについてさらに解析を進めており、結果から真核細胞特有のノイズ制御機構を明らかにする予定である。本研究では、高次生物における遺伝子発現の確率的ダイナミクスの理解を目指して、単一細胞における1分子レベルでの遺伝子発現の挙動をリアルタイムに、かつハイスループットに解析するシステムの開発を行った。その実現のため、単一細胞の全体積における単一分子計測をハイスループットに行うための新規ライトシート顕微鏡を開発した(特願2013-79956)。加えて、1分子レベルでのmRNA・タンパク質発現を測定するためのプローブ技術の開発を行った。開発した技術を用いてモデル生物(出芽酵母)の複数遺伝子における発現プロファイルを計測し、遺伝子発現反応の共通様式を明らかにした。計画では細胞内における遺伝子発現量のカウントのみを行う予定であったが、本年度の開発で温度チャンバーの導入に成功し、遺伝子発現量のダイナミクスを追跡できるようになったため。27年度が最終年度であるため、記入しない。
大規模臨床データを用いたアジア欧米間心不全診療実態の解明と国際リスクモデルの開発

1入院心不全レジストリを用いた日英Pilot比較研究本邦:慶應義塾大学など東京都内4施設から構成される急性心不全の疾患レジストリ(738例)。英国:Hull大学関連2施設から構成される心不全データベース。急性心不全入院例(197症例)。両国で患者背景、予後の比較を行った。英国症例は虚血性心疾患、糖尿病、慢性閉塞性肺疾患など併存疾患の罹患率が日本人と比較しても有意に高く、心不全の重症度も高い。180日までの死亡率も本邦と比較して約23倍であることが明らかとなった。これらレジストリから保存血を用いて心不全の代表的予後予測バイオマーカーであるN末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-pro BNP)を測定した。NT-pro BNPで両国心不全症例を5分位に層別化した結果、両国心不全症例においてNT-pro BNPは同様の予後予測能を持つことが明らかとなった。2中規模入院心不全レジストリを用いた日英間比較研究本邦:1で用いたレジストリと本邦循環器ナショナルセンターである国立循環器病研究センターの急性心不全疾患レジストリの合同プロジェクト(3781症例)。英国:Hull大学とKing's Collge London関連病院3施設から構成される急性心不全レジストリ合同プロジェクト(894症例)。上記日英間レジストリをデータベース統合し、現在までに報告されている入院心不全の予後予測因子に関する系統レヴューを行い、予測力の高い因子を優先して死亡をアウトカムとした背景因子の調整を統計学的に行ったところ、英国心不全症例は日本人と比較して有意に死亡率が高いことが明らかとなった。さらに米国急性心不全コホートで作成され、妥当性が検証済みの5つの予後予測モデルの妥当性を検証したところ、本邦心不全症例では英国症例と比較して予測モデルの当てはまりが悪く、死亡率を有意に過大評価することが明らかとなった。研究開始1年時点で中規模心不全レジストリまでを用いて、日英間心不全像の相違、そして欧米人のデータから作成された予後予測モデルの日本人(アジア人)に対する当てはまりが十分でないことまで明らかにした。結果、英文原著論文を計3編国際学術誌に発表することが出来、当初の計画以上に進捗している。ナショナルビッグデータを用いた日英米台間心不全比較研究を行う。
ヒト間葉系幹細胞の分離・同定とIn vivo組織修復機能の解明

本課題では細胞表面抗原マーカーを指標にフローサイトメーターによる幹細胞の分離を行い、骨髄から取り出したばかりの新鮮な間葉系幹細胞を対象とした、in vivoにおける生着能および分化能を明らかにすることを目的とした。(1)ヒト骨髄細胞を対象として間葉系幹細胞に特異的な表面抗原のスクリーニングを行い、数種類の抗原マーカーを報告した。また、スクリーニングで得られた分離マーカーの比較検討を行った結果、フローサイトメーターにて分離した細胞群中の6個に1個という高頻度で線維芽細胞コロニー形成能を示し、長時間(2ヶ月以上)の培養によりEx vivo増幅が可能であった新規のマーカーを同定した。また増幅後に得られた細胞は、間葉系幹細胞の特徴の一つでもある骨・軟骨・脂肪への分化能を示した。(ヒト間葉系幹細胞濃縮方法:特許出願平成19年9月6日)(2)間葉系幹細胞を特異的に認識するマーカーを元に、分離した間葉系幹細胞をNOGマウスに移植した。NOGマウス中に移植細胞(ヒト細胞)の存在が確認され、5ヶ月以上にわたり生存が確認された。また、間葉系幹細胞にレンチウイルスを用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を導入することが可能であった。移植した細胞の発光を指標に高感度CCDカメラによってin vivoでの間葉系幹細胞を観察することができた。この技術の開発により、体内のヒト間葉系幹細胞の動態、または可視化を行うことが可能となり、慢性疾患に対する間葉系幹細胞を用いた細胞療法の有効性・安全性について基礎的な解析ができると考えられる。CD271・CDI33共陽性分画の細胞を限界希釈法により培養したところ、約6回の継代を経て、1.5ヶ月培養可能であった。また、間葉系への分化能を調べたところ、骨・軟骨・脂肪への分化能を有していることを確認した。CD271・CD133共陽性分画を二次元培養したのち、ニューロスフェア培養方法(bFGF・EGF・B27添加培地・低接着プレート)にて培養後、浮遊細胞塊を形成した。その細胞塊を対象として分化誘導を行ったところ、神経マーカーであるTUJ1やグリアマーカーのGFAP、また平滑筋マーカーであるαSMAの発現が確認された。以上の結果からCD271・CD133共陽性分画は間葉系組織への分化能だけでなく、胚葉を超えた分化能力をもっている可能性が示唆された。骨髄のほかに間葉系幹細胞が含まれているとの報告がある末梢血や臍帯血を、上記4つの抗体を用いて解析を行った。GCSF投与後のヒト末梢血中、ヒト臍帯血にCD271・CD133共陽性分画が存在し、それらの細胞は、継代可能で骨・脂肪・軟骨への分化能を示した。臍帯血中での間葉系幹細胞の頻度は非常に低く、血球細胞が多量に混在しているため、実際にそのまま細胞を利用する事は難しいが、FACSを用いて間葉系幹細胞の純度を高めておけば、細胞治療として利用可能な細胞供給源となりうる。
強いHIV-1増殖抑制能を持つHIV-1特異的細胞傷害性T細胞に関する研究

本研究では、日本人HIV-1サブタイプB感染者401人について、HIV-1特異的CD8陽性T細胞の反応を網羅的に解析することで、HIV-1増殖抑制能を持つCD8陽性T細胞の同定を試みた。その結果、HIV-1感染制御に関与した13個のHIV-1エピトープ特異的CD8陽性T細胞の同定に成功した。さらに、これら13エピトープのうち、9エピトープはHIV-1サブタイプB感染者において保存されており、3エピトープは特異的T細胞によってcross-recognitionされることが判明し、これら12エピトープはAIDSワクチンの抗原としてきわめて有用であることが示唆された。アフリカ、欧米のHIV-1感染者では、HIV-1特異的細胞傷害性T細胞(CTL)のコホート解析の結果から、Gagタンパク質に対する反応がHIV-1の増殖抑制に大きく影響することが知られているが、日本ではこのような網羅的なHIV-1特異的CTL応答の解析が行われていない。そこで我々は、日本人HIV-1感染者でのHIV-1感染の制御に関わるHIV-1エピトープ特異的CTLを同定するため、401人の無治療慢性HIV-1感染者について、Gag、Pol、Nef領域を網羅している11アミノ酸オーバーラップHIV-1ペプチドのカクテルへのCTL反応、HLA拘束分子、ウイルス量あるいはCD4T細胞数との関係を調査した。その結果、低いウイルス量ならびに高いCD4T細胞数と有意な相関を示すHLA拘束性のカクテルへの反応を23種類見つけ出した。また、それらのカクテルに含まれる最適なエピトープペプチドの同定を試みた結果、8種類のHLAに拘束された19個のCTLエピトープの同定に成功した。同定したエピトープ特異的CTLが日本人HIV-1感染者でのHIV-1感染のコントロールに重要であるかを再評価するため、393人のHIV-1感染者におけるエピトープ特異的CTL反応をELISPOTassayによって解析した。その結果、5種類のHLAに拘束される8個のGagエピトープおよび5個のPolエピトープに特異的なCTLが低いウイルス量ならびに高いCD4T細胞数と強く相関していることが明らかとなった。これらのCTLによるin vitroでのHIV-1増殖抑制能の解析を行った結果、いずれのCTLも強いHIV-1増殖抑制能を有することが判明した。以上の結果から、これら13個のエピトープ特異的CTLは、慢性日本人HIV-1感染者におけるHIV-1増殖抑制に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。そこで本研究では、白人や黒人のエイズ進行遅延と強く関係しているHLA-B*57およびHLA-B*27がほとんど見られない日本人HIV-1感染者401人について、HIV-1特異的CD8陽性T細胞の反応を網羅的に解析することで、HIV-1コントロールに関与するCD8陽性T細胞の同定を試みた。その結果、平成25年度において、5種類のHLA(HLA-B*52:01、-B*67:01、-A*02:06、-B*40:02、-B*40:06)に拘束される13個のCTLエピトープに特異的なCTLが低い血漿中ウイルス量ならびに高いCD4陽性T細胞数と強く相関していることが明らかとなった。平成26年度では、どのHLA拘束性のエピトープ特異的CTLが日本人感染者においてHIV-1コントロールに強く関与しているか明らかにするため、それぞれのHLAに拘束されるCTL反応と血漿中ウイルス量の関係について調べた。その結果、HLA-B*52:01拘束性およびHLA-B*67:01拘束性のCTLが低いウイルス量と強く関連していることが判明した。さらに、13個のCTLエピトープのアミノ酸シークエンスについて解析した結果、9個のエピトープはclade B感染者において保存されていることが判明した。また、4個の保存されていないエピトープのうち3個のエピトープは特異的T細胞にcross-recognitionされることが明らかとなった。以上の結果、これら12個のエピトープはAIDSワクチンの抗原としてきわめて有用であることが示唆された。感染症内科学、ウイルス学アフリカ、欧米のHIV-1感染者に見られるHIV-1特異的CTLのコホート解析の結果、HIV-1 Gagタンパク質に対するCTL反応がHIV-増殖抑制能と有意に相関していることが示された。しかしながら、このようなコホート解析は日本ではまだ行われていない。

また、HLAを含む遺伝的背景の違いから、日本人では異なる免疫反応が起きていると考えられる。本研究では、401人の無治療慢性日本人HIV-1感染者におけるHIV-1特異的CTL反応の解析を行い、5種類のアジア特有のHLAに拘束される13個のエピトープ特異的CTLが、日本人の慢性HIV-1感染者においてHIV-1のコントロールと強く関連していることを明らかにした。また、これらのCTLはin vitroにおいて非常に強いHIV-1増殖抑制能を示し、in vivoにおいて効果的にHIV-1増殖を抑制していると考えられた。以上の知見は、日本でのHIV-1予防・治療ワクチンの開発ならびにエイズの病態解析にきわめて有用であると考えられる。したがって、現在までに実施した研究は、本研究の目的の達成に向けて、おおむね順調に進展している。増殖抑制能の高いCTL反応が起こると、HIV-1はエピトープ内で変異を起こしてCTLが感染細胞を認識できなくなり、変異したウイルスが体内に蓄積することが知られている(Goulder PJ, et al, Nat Med, 1997, 3:212)。そこで、日本人HIV-1感染者において同定したエピトープ内のアミノ酸シークエンスを調査し、HLA拘束分子を持つ人と持たない人の間でエピトープ内変異の頻度について統計解析を行う。HLA拘束分子を持つ人において有意に高い頻度の変異が見つかった場合、変異エピトープペプチドの作製を行い、コンセンサスあるいは変異エピトープペプチドを段階希釈して結合させたC1R細胞に対するエピトープ特異的CTLクローンのIFN-γ産生能を細胞内染色法で検出することで、それぞれの間で抗原認識能に差があるかを明らかにし、変異がCTLによって選択された逃避変異であるか判断する。逃避変異はHIV-1の増殖機能に影響を与え、また、そのような変異ウイルスがその変異に関わるHLAアリルを持たない人に感染した場合、コンセンサス配列のウイルスに戻ることが知られている(Leslie AJ, et al, Nat Med, 2004, 10:282)。そこで、逃避変異が見つかった場合、変異ウイルスを作製し、これらを健常人から分離したCD4T細胞に感染させ、コンセンサス配列ウイルスとの増殖能の比較を行う。
性決定遺伝子を標的とする害虫防除法の開発

オス特異的RNA結合蛋白質MSP55は、Bmdsxの性特異的スプライシング制御因子BmPSIと相互作用する。この相互作用の意味を明らかにするため、RNAゲルシフトアッセイを行った結果、MSP55はBmPSIがRNAから解離する割合を低下させることでBmPSIの標的RNAに対する結合能を増加させることが判明した。このRNA結合能の増強には、MSP55のKHドメインが不可欠であることを突き止めた。本研究の目的は、蛾類昆虫の性決定機構を明らかにし、蛾類昆虫の性決定遺伝子を標的とした害虫防除法を開発することにある。このため本研究では、カイコの性決定遺伝子であるBmdsxの性特異的スプライシング制御因子の同定を目指したいくつかの実験計画を立てている。平成20年度は、Badsxの性特異的スプライシング制御に関わる性特異的因子の同定を試みた。Bmdsxのオス型のスプライシングに必須のシスエレメントCE1をリガンドに用いたaffinity chromatographyを行い、CE1に結合する性特異的因子を探索した結果、オス特異的に存在する分子量約55kDaのタンパク質を精製することが出来た。このオス特異的タンパク質(仮称MSP55)の内部アミノ酸配列を解析した結果、既にBmdsxの性特異的スプライシング制御因子の1つとして同定されているBmPSIと同様、RNA結合ドメインとして知られるKhomology(KH)ドメインを4つ持つことがわかった。MSP55をコードする遺伝子はZ染色体に座乗しており、様々な組織においてオス特異的に発現していることがRT-PCRの結果明らかとなった。RNAiによってオス細胞(NIAS-Bm-M1細胞)におけるMSP55の発現を抑制すると、Bmdsxのメス型のスプライシング産物の量が増加することがわかった。また、リコンビナントMSP55を用いたRNAゲルシフトアッセイの結果、MSP55はCE1に特異的に結合することが確認された。抗BmPSI抗体を用いた免疫沈降実験の結果、MSP55はBmPSIと共に共沈することがわかうた。以上の実験結果より、MSP55はBmPSIと相互作用し、CE1に結合することでBmdsxのオス型のスプライシングを制御していると予想された。昨年度は、Bmdsxのオス型のスプライシングに必須のシスエレメントであるCE1に結合する因子として新たに同定されたMSP55について報告した。MSP55をコードする遺伝子はZ染色体に座乗しており、様々な組織においてオス特異的に発現する。また、MSP55はBmdsxの性特異的スプライシング制御因子の1つであるBmPSIと相互作用する。本年度は、MSP55の欠失変異型タンパク質を用いたGST-pull dowm解析により、MSP55とBmPSIの相互作用にはMSP55のもつ4つのKHドメインが重要であることをまず明らかにすることが出来た。その後、この相互作用の機能的な意味を明らかにするため、CE1 RNAをプローブに用いたRNAゲルシフトアッセイを行った。その結果、MSP55はBmPSIのCE1 RNAに対する結合活性を増加させることが明らかとなった。また、KHドメインを欠いた変異型MSP55を供試した場合はBmPSI・CE1 RNA結合活性の増加がみられなくなることもわかった。BmPSI・CE1 RNA解離試験を行った結果、MSP55非存在下では反応開始後1分以内に大半のBmPSIがRNAから解離してしまうが、MSP55存在下では反応開始後10分を経過した時点でも60%を越えるBmPSIがRNAに結合した状態にあることが確認された。以上の結果から、オス特有の因子であるMSP55がBmPSIとCE1の結合を安定化し、Bmdsxのオス型のスプライシングを促進していると考えられる。本研究では、カイコの性決定遺伝子であるBmdsxの性特異的スプライシング制御因子の同定を目指したいくつかの実験計画を立てている。キイロショウジョウバエのtra2はメス分化に必須の遺伝子であり、dsxのメス型のスプライシングを誘導する。一方、Bmtra2はキイロショウジョウバエのtra2のホモログとして同定された遺伝子であるが、その機能については明らかにされていない。そこで、本研究ではBmtra2がBmdsxの性特異的スプライシングに関与するか否かを調べることにした。雌雄の培養細胞でBmtra2の発現をRNAiによってノックダウンし、RNAを回収後RT-PCRを行うことよってBmdsxのスプライシングパターンを確認した結果、雌雄ともにBmdsxのスプライシングに影響はなかった。しかし、メスの細胞にキイロショウジョウバエのdsx

ミニ遺伝子を導入した実験から、Bmtra2はdsxのメス型のスプライシングを誘導する働きを持つことが分かった。蛹化01日目のメスの蛹にBmtra2のdsRNAを注射したところ、その個体は内部・外部生殖器に異常は見られず、正常に交尾・産卵したが、孵化率はコントロールよりも、10μg注射した場合は約50%低下し、20μg注射した場合は約90%低下した。以上の結果は、Bmtra2はキイロショウジョウバエのdsxのメス型のスプライシングを誘導できるにもかかわらず、カイコのdsxのスプライシングには関与していないことを示唆している。また、Bmtra2はカイコの胚発生に必要な遺伝子であると考えられる。
血栓塞栓症予防法としての心房細動へのmaze手術の意義(術前後の血液凝固線溶系と活性化血小板接着分子測定による検討)

1.慢性心房細動症例104例に対し,基礎心疾患手術にMaze手術を併せて行った.病院死亡は4例であったが,いずれの死因もMaze手術との因果関係はなく,また術後出血のための再開胸を2例に要した以外,重篤な合併症は認めていない.2.手術生存100例の遠隔期(平均5年)における基本調律の内訳は,洞調律68%,心房細動24%,洞機能不全8%と,昨年度の報告より洞調律維持率が減少していた.3. Maze手術後に回復した洞調律例で,ホルター心電図により心拍変動を検討すると,術後早期では口内変動が消失していたが約1年後には改善傾向を示し,さらに約2年後には有意に改善をみた.症候限界性の運動負荷によっても,術後早期には心拍応答の著しい低下をきたすが経時的に改善傾向を示した.4.心エコー図上,調律回復後には多くの症例で心房収縮能が観察され,さらに術後経時的に改善傾向を示した.5. Maze手術前後の血液凝固系の推移の検討で、手術後早期にはD-ダイマー,アンチトロンビンIII複合体が増加傾向にあるものの,約1年後には減少傾向を示し,さらに約2年後には有意に減少をみた,また,活性化血小板接着分子P-Selectinは,手術前後に有意な変化を示さなかった.6.生活の質(QOL)に関するアンケート調査で,約1年後には向上する傾向を示し,さらに約2年後には有意に向上していた.7.今年度までの遠隔期の血栓塞栓症は,洞調律群で1例(1.5%),心房細動群で2例(8,3%)であった.しかしながら,心房細動群の2例では,抗凝固療法が不十分であった可能性があり,人工弁関連の合併症と思われた.引き続き,長期の遠隔成績の追跡調査を行う必要がある.1.慢性心房細動症例104例に対し,基礎心疾患手術にMaze手術を併せて行った.病院死亡は4例であったが,いずれの死因もMaze手術との因果関係はなく,また術後出血のための再開胸を2例に要した以外,重篤な合併症は認めていない.さらに詳細に,Maze手術を同時手術として付加することの安全性を検討しても,同一疾患(僧帽弁閉鎖不全症)に対する同一手術(弁形成術)例を対象にした場合,体外循環時間と大動脈遮断時間が30分程度延長するが,特に手術の危険性が増大することはないと結論できた.手術生存100例の遠隔期における基本調律の内訳は,洞調律73%,心房細動21%,洞機能不全6%であった.3.Maze手術による洞調律回復のための術前予測因子として,心房の電気的活動度を表す心電図上のf波高(通常V1誘導)と,心房筋の伸展の度合いを計測する心エコー図上の左房径が臨床上有用であった.4.Maze手術後に回復した洞調律例で,ホルター心電図により心拍変動を検討すると,術後早期では日内変動が消失していたが約1年後には改善傾向を示した.症候限界性の運動負荷によっても,術後早期には心拍応答の著しい低下をきたすが経時的に改善傾向を示した.5.心エコー図上,調律回復後には多くの症例で心房収縮能が観察され,さらに術後経時的に改善傾向を示した.しかし,左房能動駆出分画は,術前より洞調律を基本調律としている対象群と比較した場合,安静時および負荷時のいずれもMaze併用群で著しく低下していた.Maze手術前後の血液凝固系の推移の検討で,手術後早期にはD-ダイマー,アンチトロンビンIII複合体が増加傾向にあるものの,慢性期には有意に減少をみた.また,活性化血小板接着分子P-selectinは,手術前後に有意な変化を示さなかった.1.慢性心房細動症例104例に対し,基礎心疾患手術にMaze手術を併せて行った.病院死亡は4例であったが,いずれの死因もMaze手術との因果関係はなく,また術後出血のための再開胸を2例に要した以外,重篤な合併症は認めていない.2.手術生存100例の遠隔期(平均5年)における基本調律の内訳は,洞調律68%,心房細動24%,洞機能不全8%と,昨年度の報告より洞調律維持率が減少していた.3. Maze手術後に回復した洞調律例で,ホルター心電図により心拍変動を検討すると,術後早期では口内変動が消失していたが約1年後には改善傾向を示し,さらに約2年後には有意に改善をみた.症候限界性の運動負荷によっても,術後早期には心拍応答の著しい低下をきたすが経時的に改善傾向を示した.4.心エコー図上,調律回復後には多くの症例で心房収縮能が観察され,さらに術後経時的に改善傾向を示した.5. Maze手術前後の血液凝固系の推移の検討で、手術後早期にはD-ダイマー,アンチトロンビンIII複合体が増加傾向にあるものの,約1年後には減少傾向を示し,さらに約2年後には有意に減少をみた,また,活性化血小板接着分子P-Selectinは,手術前後に有意な変化を示さなかった.6.生活の質(QOL)に関するアンケート調査で,約1年後には向上する傾向を示し,さらに約2年後には有意に向上していた.

7.今年度までの遠隔期の血栓塞栓症は,洞調律群で1例(1.5%),心房細動群で2例(8,3%)であった.しかしながら,心房細動群の2例では,抗凝固療法が不十分であった可能性があり,人工弁関連の合併症と思われた.引き続き,長期の遠隔成績の追跡調査を行う必要がある.
国際商事仲裁の実態研究

1)強行法規に基づく請求の仲裁とその問題点の検討、2)日本企業の仲裁事件担当者および仲裁人との面談、3)欧米諸国の仲裁・ADRの実態研究、を行った。具体的には、裁判所と同じ救済を仲裁人が与えうるかを考察した、「仲裁人の懲罰賠償権限」(国際開発研究フォーラム)、First Options Chicago v.Kaplan,115 S.Ct.1920(1995)の判例研究を「紛争の仲裁可能性を決定する権限」(商事法務)として発表、米国預託証券(ADR)紛争の仲裁を考察するため、Batchelder v.Kawamoto事件判決を商事法研究会(神戸)で報告後、「ADR保持者による株主代表訴訟の原告適格」を商事法務に発表。スイス仲裁事件、EC競争法と仲裁に関して、元スイス仲裁協会会長のブレッシング博士に質問状を送付し、東京で回答とコメントを頂く、後者のベネトン事件報告を4月に大阪で行う予定。1999年4月脱稿の「仲裁と消費者保護ー米国における最新の傾向からー」が『佐々木先生追悼論集』信山社・所収)として2000年5月刊行予定。ライセンス協会ADRワーキング・グループ(東京)で「欧米のADR最新事情」を報告、JCAジャーナル1999年6月号から2000年3月号まで、連合王国・フランス・スイス・米国の順に最新事情を発表した。1999年10月のロンドン、12月のニューヨークにおける仲裁・ADRの現地調査を「欧米のADR最新事情」に反映させた。日本の仲裁機関の統計資料・最新事情の英文メモを用意したところ、日本からの情報が少ないとのことで、関心を持たれ、この分野における日本発英文情報の必要性を感じる。国際仲裁人(東京・名古屋)から話を聞き、国際商業会議所国内委員会・国際商事仲裁協会(東京・大阪)・知的財産研究所・東京/京都/大阪/神戸の各大学等での資料収集・研究打合せを行った。2)については、守秘義務の問題もあるため、当事者名を伏せた形で発表を考えている。更に助成が得られれば、ドイツ・ベルギー・イタリア・スウェーデン等のADR機関と仲裁・ADRの実態研究を行うと同時に、できるだけ早い時期に、今までの研究を「国際商事仲裁の法と実態ー仲裁可能性をめぐってー」として纏める所存である。平成10年度は、1)米国での強行法規に基づく請求の仲裁とその問題点の検討2)日本企業が関係した仲裁事件について企業担当者との面談、3)仲裁人との面談および質問、を行った。具体的には、1)「仲裁可能性を決定するのは、仲裁人か裁判官か」を判断したFirst Options Chicago v.Kaplan 115 S.Ct.1920(1995)の判例報告を神戸で行い、反トラスト法関連判例報告を2度大阪で、知的所有権の仲裁可能性に関する報告を箱根で行った。消費者仲裁の判例報告を「通信販売でパソコンと共に配達された契約書中の仲裁契約の有効性」のタイトルで公正取引に発表し、製品の保証責任を規律する連邦法と仲裁との関係を検討した。また、米国における近時の仲裁の動きとして、労働関係仲裁と消費者仲裁のあり方に言及した。2)企業担当者との面談は、富士通、半導体製造メーカー、自動車メーカーの法務担当者と行った。

他に電動工具、半導体関連、自動車メーカーの担当者にも面談依頼を行ったが、企業秘密と言うことで、面談は実現しなかった。これらは、仲裁関連レポート(Mealey′s International arbitration Report)などから、仲裁に至る経過とその結果を拾い上げ、検討する予定である。3)複数の国際仲裁人(東京・名古屋)から仲裁経験談を聞き、国際商事仲裁協会(東京)及び大阪・名古屋事務所、ICC国内委員会(東京)、工業所有権仲裁センターにおいて、最新の仲裁動向と疑問点をうかがうことができた。資料の収集は、東京大学、神戸大学、国際商事仲裁協会等で行った。発表論文として、「仲裁人の懲罰賠償権限」(国際開発研究フォーラム1999年3月)がある。平成11年度は、1)強行法規に基づく請求の仲裁とその問題点の検討、2)企業の仲裁事件担当者および仲裁人との面談、3)欧米諸国の仲裁・ADRの実態研究、を行った。具体的には、First Options Chicago v.Kaplan,115 S.Ct.1920(1995)の判例研究を「紛争の仲裁可能性を決定する権限」(商事法務)を発表、米国預託証券(ADR)紛争の仲裁を考察するため、ホンダのADR保持者による株主代表訴訟を扱った米国連邦第二巡回区控訴裁判所の判決Batchelder v.Kawamotoを商事法研究会(神戸)で報告後、判例研究を商事法務に発表。スイスの仲裁事件、EC競争法と仲裁に関して、元スイス仲裁協会会長のブレッシング博士に質問状を送付し、東京でその回答とコメントを聞く、後者のベネトン事件報告を4月に大阪で行う予定。1999年4月脱稿の「仲裁と消費者保護-米国における最新の傾向から-」が『佐々木先生追悼論文集』信山社・所収)として2000年5月刊行予定。ライセンス協会ADRワーキング・グループ(東京)で「欧米のADR最新事情」を報告、JCAジャーナル1999年6月号から2000年3月号まで、連合王国・フランス・スイス・米国の順に最新事情を発表した。1999年10月のロンドン、12月のニューヨーク、での仲裁・ADRの現地調査を「欧米のADR最新事情」に反映させた。日本の仲裁機関の統計資料・最新事情の英文メモを用意し面談に臨んだところ、日本からの情報が少ないとのことで、関心を持たれ、面談の導入がスムースであった。国際仲裁人(東京・名古屋)から話を聞き、国際商業会議所国内委員会・国際商事仲裁協会(東京・大阪)・知的財産研究所・東京/京都/大阪/神戸の各大学等での賃料収集・研究打合せを行った。更に助成が、得られれば、ドイツ・ベルギー・イタリア・スウェーデン等のADR機関と仲裁・ADRの実態研究を行いたい。また、できるだけ早い時期に、今までの研究を纏める所存である。
イヌの骨髄細胞から分化した肝臓細胞の性状および機能解析に関する研究

現在、ラットの造血幹細胞や間葉系細胞といった骨髄由来の細胞集団に肝細胞増殖因子(HGF)を添加し培養すると、肝細胞が分化することが報告されている。こうした報告を基に骨髄細胞から肝臓細胞への分化を検討してきたところ、イヌの骨髄細胞にHGFなどを添加し培養すると、培養28日目に「肝臓細胞の形態を有する細胞」が多数認められたばかりでなく、アルブミンのm-RNAの発現やサイトケラチン8蛋白の産生といった肝臓細胞の性状をもつ細胞が分化誘導された。したがって、今後この細胞集団の性状をより詳細に解析し、実験動物への移植を試みて実際に肝臓細胞として機能し、肝臓機能の改善効果が認められるか解析する必要があると思われる。本研究では、以下の項目について検討している。1)各種肝臓および骨髄細胞に特異的な表面抗原マーカーを用いた性状解析骨髄細胞から肝臓細胞へと分化・成熟させた細胞集団の性状を詳細に解析するため、フローサイトメトリーおよび免疫染色によって、HGF受容体(c-Met)、α-フェトプロティン、c-Kit、CD29、CD45f、TER119といった各種肝臓細胞に存在すると考えられているマーカーを用いてその性状を詳細に解析している。現在は、条件設定中で次年度以降も引き続き検討する予定である。2)培養細胞の肝臓細胞への分化能の検討培養した細胞について、肝臓細胞のコロニーフォーミングアッセイを行って、得られた細胞集団が肝臓の成熟細胞へ分化能を有するのか、in vitroで検討する。これら細胞から多数のコロニーが産生されることが明らかとなれば、抗アルブミン抗体による免疫染色やPAS染色等を用いて肝臓の成熟細胞であることを確認する。現在、肝臓へと分化させた細胞がPAS染色に陽性になり、糖代謝能を有することを明らかにしている。3)実験動物を用いた肝臓の再生能の改善効果の検討現在、肝障害モデル動物を作製し、実際に移植を行える体制を整えつつある。