hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジュラ紀の化石をモデルとした地域の自然史資料の教材化に関する研究

南相馬市周辺に分布する相馬中村層群から産出した植物、アンモナイト、放散虫の化石についての情報を集約し、それらを基にした主に中学生向けの学習プログラムを作成することができた。このプログラムはパソコン及びタブレット端末で使用するデジタル教材で、メインメニューから「地層」「化石」「岩石」の項目を選び、そこからさらに詳しい内容について学習を進めていくものである。プログラムに使用した写真は、地元の地層とそこから発見された化石を撮影したものであり、それらについての研究成果もできる限りわかりやすくして載せている。プログラムの作成にあたっては、試行版の段階で地元の小中学校で理科を担当する先生方に利用してもらい改善点をあげてもらった。その後、それらの意見を参考により現場にあったプログラムを完成することができた。このプログラムの特徴は、最先端の研究成果をわかりやすく盛り込んでいることと、資料が地元のもので構成されていることである。このことにより、単に地層や化石の学習をするだけでなく、子どもたちが郷土の自然を理解し、それらを誇りに感じることができるようになることが期待できる。また、現場の先生からは、原発事故の影響により野外活動ができない南相馬市内の学校において、地層の観察などの授業を補うものとして利用できることを望んでいるとの意見をいただいた。このプログラムは他の地域で地元の資料を材料とした教材を作成する際のモデルとして利用されることも期待できる発展性ももっている。
薬剤による歯肉増殖症発生機序の解明と治療法の確立

ニファジピン(Ca拮抗剤)やサイクロスポリンAをはじめ、フェノバルビタールフェニトインなどによる歯肉増殖症は難治性かつ重要な歯周疾患の一つであるが、その発生機序は未だ解明されていない。そこでこれら種々薬剤による歯肉増殖症の発生機序の解明と治療法を確立することを本研究の目的とした。初年度は、ニフェジピンおよびジルチアゼムの投与により歯肉増殖症を来した3例の高血圧患者について、臨床的および病理学的検討を加えた。臨床的には、歯肉増殖症には慢性歯周炎の関与が示唆され、病理学的には固有層の線維芽細胞および血管周囲炎を伴った毛細血管の増殖が認められた。(日歯周誌36:498-502,1994)。さらに、実験動物(犬)を、スケーリングやルートプレーニングにより歯周疾患の認められないA群と、人工的に歯槽骨を削除し、さらに積極的にプラーク感染をさせて歯周疾患を認めるB群の計10頭の実験犬を作成したが、この過程は長期間を必要とした。その後、初年度中頃より本年度にかけてこれらA、B群の犬にCa拮抗剤:ニフェジピン(セパミッド)を投与し、薬剤による歯肉増殖症発症モデルを作成した。そこで、この歯肉増殖発症モデルを用い、血中ニフェジピン濃度測定と口腔清掃状態、ポケットの測定値診断、歯の動揺度、歯槽骨吸収程度、歯肉炎症度と歯肉増殖度との関係を検討した。さらに増殖歯肉の上皮、粘膜固有層、血管壁細胞、線維芽細胞などを細胞・組織学的に観察するとともに、IL-1、TNF、IFN-γ、IL-4とIGF-β、などの炎症に関与するサイトカインならびにICAM-1、VCAM-1、ELAM-1などの接着分子の発現の有無を検討している。ニフェジピン(Ca拮抗剤)やサイクロスポリンAをはじめ、フェノバルビタール、フェニトインなどによる歯肉増殖症は難治性かつ重要な歯周疾患の一つであるが、その発生機序は未だ解明されていない。そこで、これら種々薬剤による歯肉増殖症の発生機序の解明と治療法を確立することを目的とし、まず最初に、Ca拮抗剤による歯肉増殖疾患者歯肉の臨床的および病理学的検討を加え、臨床的には歯肉増殖発症には慢性歯周炎の関与が、病理学的には固有層の線維芽細胞および血管周囲炎を伴った毛細血管の増殖が認められることを報告した(日歯周誌36:489-502,1994)。また、新生Beagle犬10匹を2群に分け生後10カ月よりプラーク清掃後、3匹にPlaceboとして乳糖を、7匹にニフェジピンを飼料に混じて1日2回経口投与し歯肉増殖症発症モデル動物の作成を試みた。ニフェジピン投与量とその血中濃度とに固体差が生じてはいるが、血中高濃度を示す一部のBeagle犬に既に歯肉増殖を認めており、ニフェジピンによる歯肉増殖症発症動物モデル作成に成功した。そこで、これら作成されたモデル動物(Beagle犬)を用い、血中ニフェジピン濃度測定と口腔清掃状態、ポケットの測定値診断、歯の動揺度、歯槽骨吸収程度、歯肉炎症度と歯肉増殖度との関係および増殖歯肉の上皮、粘膜固有層、血管および血管壁、繊維芽細胞などの細胞・組織学的変化を光学および電子顕微鏡学的に検討すると共に生化学的にも検討中である。Ca拮抗剤(ニフェジピンなど)やサイクロスポリンAなどによる歯肉増殖症の発生機序は未だ解明されていない。

そこで、薬剤による歯肉増殖症の発生機序の解明と治療法を確立することを本研究の目的とした。昨年度はニフェジピンによる歯肉増殖症患者歯肉を、臨床的および病理学的に検討を加え、薬剤による歯肉増殖発症には慢性歯周炎の関与と、固有層の線維芽細胞および血管周囲炎を伴った毛細血管の増殖が認められることを報告した(日歯周誌36: 489-502, 1994)。本年度は実験動物(犬)をA群:歯周病疾患の認められない群、B群:歯周疾患がすでに存在する群の2群をまず作成した。A群として3頭のBeagle犬を用い、歯周組織の状態をできる限り健康な状態に近づけるため、超音波スケーラー、ハンドインストルメントを使用し、スケーリング、ルートプレーニングを繰り返し行った。また、犬用固形飼料は歯肉に付着し易いため、手用ハブラシでブラッシング(スクラビング法)も併せて行った。その結果、ポケットの深さは23mmになり、また歯肉の炎症もほぼ消失し健康な歯肉組織とみなされる状態となった。B群として、6頭の雑種犬を用い、人工的に歯槽骨の削除を行い、さらに積極的にプラークを感染させて歯周疾患を認める状態を作りだした。その結果、ポケットの深さは68mm、2級の分岐部病変も認められる状態を作成した。これらA、B群の犬にCa拮抗剤:ニフェジピン(セパミット^R)を投与し、血中ニフェジピン濃度測定と口腔清掃状態、ポケットの測定値診断、歯の動揺度、歯槽骨吸収程度、歯肉炎症度と歯肉増殖度との関係を検討した。さらに増殖歯肉の上皮、粘膜固有層、血管壁細胞、繊維芽細胞などを細胞・組織学的に観察するとともに、IL-1、TNF、IFN-γ、IL-4とTGF-βなどの炎症に関与するサイトカインならびにICAM-1、VCAM-1、ELAM-1などの接着分子の発現の有無を検討している。
ポリアミンの特異的役割を利用した制がん剤の開発に関する基礎的ならびに臨床的研究

有効な制がん剤としてのポリアミン合成阻害剤を開発するため、3年計画の最終年度に当たる本年度は以下の成果を得た。1.ポリアミンの役割:高度好熱菌の長鎖ポリアミンは通常のポリアミンに比してDNA安定化作用が強く、このことからDNA安定化がポリアミンの生理作用のひとつであることが支持された(大島)。小腸粘膜の分化にはプトレツシンが、マクロフアージの融合にはスペルミジンが必須の役割を果たすことが示された(須田)。2.代謝と調節:オルニチン脱炭酸酵素の調節が遺伝子転写、翻訳、および酵素分解の過程でなされ、分解調節には阻害蛋白質アンチザイムが関与することを確かめた(林)。スペルミジン合成酵素を純化し、抗体を得た(鮫島)。3.がんの病態とポリアミン:高感度ポリアミン分析法を開発し、がん組織および担がん生体におけるポリアミン代謝の特殊性を検討した(永津、松崎、大橋、森沢、大沢)。また、ポリアミン代謝に対する発がんプロモーターの効果を解析した(藤木)。4.ポリアミン合成阻害剤の開発と抗腫瘍効果:系統的検索によって、4-メチルシクロヘキシアミンなどのスペルミジン合成酵素阻害剤を開発し、さらにいくつかのスペルミン合成酵素阻害剤を作製した(鮫島)。これらの阻害剤の抗腫瘍効果は現在検討中である。メチルチオアデノシンホスホリラーゼ阻害剤として開発したジフルオロメチルチオアデノシンががん細胞の浸潤を顕著に抑制することをインビトロの系で確かめた(井上)。多種のS-アデノシルメチオニン脱炭素酵素阻害剤を系統的に検索し、メチルグリオキサルビスシクロペンチルアミジノヒドラゾンがスペルミジンおよびスペルミン合成酵素をも阻害し、制がん効果を有することを確かめた(中島)。また、ジフルオロメチルオルニチンが腫瘍血管造成(鈴木)と転移(大沢)を抑えること、他制がん剤と相乗効果を示すこと(五十嵐、大沢、高見)を確かめた。
増殖静止期の核恒常性維持に関与するユビキチン・プロテアソーム経路因子の解明

分裂酵母をモデル生物として増殖静止期の細胞生存維持におけるタンパク質分解の重要性を研究した。ユビキチン/プロテアソーム系とオートファジーという細胞内の主要なタンパク質分解システムは、有害な酸化ストレスの蓄積から、静止期特異的に細胞を協調して守っている事がわかった。酸化ストレスの蓄積は核やミトコンドリアに顕著であり、これらの細胞内小器官の質的な維持にタンパク質分解系が深く関わっていることが予想される。本研究を開始する前に、静止期におけるプロテアソームの失活が、核の異常な膨潤と変形を引き起こして致死的となることが明らかとなっていた。この結果を踏まえて、平成20年度は以下の解析をおこなった。1.ユビキチン化タンパク質を精製、同定する手法の立ち上げヒスチジンタグを付加したユビキチンとFLAGタグを付加したユビキチンを染色体上から発現する分裂酵母株を作成した。Niビーズと抗FLAG抗体による二段階のアフィニティー精製をおこない、簡便にポリユビキチン化されたタンパク質を精製することができた。今後は、細胞の各画分から精製することを検討したい。2.プロテオーム、メタボロームによる網羅的解析野生株とのプロテオームの比較から、静止期のプロテアソーム失活がミトコンドリアタンパク質の減少を引き起こす事がわかった。変異体で増量したタンパク質には酸化ストレスで発現誘導されるものが多く含まれていた。メタボローム解析により静止期のプロテアソーム失活がグルタチオンとエルゴチオネインという抗酸化作用を持つ代謝物の蓄積をもたらす事がわかった。3.酸化ストレス蓄積4.ミトコンドリアの大規模な分解静止期プロテアソーム変異体ではミトコンドリアがオートファジー依存的に分解されていることが明らかとなった。ミトコンドリア分解を阻害すると酸化ストレスの異常な蓄積を伴う細胞死を引き起こした。以上の結果から、酸化ストレスの蓄積によっておこる染色体や核構造物の障害が、プロテアソーム失活時の核異常表現型の原因である可能性がある。プロテアソーム失活による核内の酸化ストレス防御系破綻が引き金となり、蓄積された酸化ストレスがミトコンドリアを障害して連鎖的に酸化ストレス産生が亢進するという可能性が考えられる。分裂酵母をモデル生物として、細胞周期静止期(GO期)におけるユビキチン/プロテアソーム経路の必須機能、特に核恒常性維持における機能に関して探求した。これまでの研究から、静止期においてプロテアソームを阻害すると、(1)核内構造の顕著な異常、(2)細胞質と核への酸化ストレスの蓄積、(3)ミトコンドリアの顕著な減少、という興味深い表現型をともなって致死となる。これらのうち(1)と(2)は静止期においてプロテアソーム系が核の恒常性維持に関わっている事を示唆するものであって、また、細胞増殖期では認められない表現型である事から、静止期細胞の長期生存の維持におけるタンパク質分解系の必須機能の解明への糸口となると思われた。また、(3)のミトコンドリアの減少という興味深い現象は、ミトコンドリアがエネルギー生産の中心であり、その副産物として酸化ストレスを発生するオルガネラであることを考えると、(2)の酸化ストレスの蓄積と深い関連がある事が予想された。静止期におけるミトコンドリアの大規模な減少はオートファジーによるものであり、ミトコンドリア分解の阻害は静止期細胞の生存期間を著しく減少させた。プロテアソームの失活はミトコンドリアのなんらかの異常を引き起こすと考えられる。そのような条件では酸化ストレス産生が充進するため、ミトコンドリアをオートファジーによって処理し、致死的な酸化ストレスの蓄積を防止する機構が存在するらしい。プロテアソームの異常がミトコンドリアの異常を引き起こす原因が重要であって今後の課題と言える。ミトコンドリアそのものに直接プロテアソーム系が作用しているというのが最も単純な仮説であるが、プロテアソームによる核の恒常性の維持がミトコンドリアの正常な機能を保つ為に重要となる可能性も十分に考えられる。
食品に含有・付着している無機ナノ粒子の実態とばく露量推定に関する研究

優れた元素識別能力と検出下限値を有する誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)に単一粒子計測(sp)モードを適用することで、食品に含有/付着したナノ粒子(NPs)の実態とばく露量推定を以下の項目から行う。マーケットバスケット方式による食品に含有/付着のNPsの実態調査の結果を踏まえて、モンテカルロシミュレーションによる食品由来のNPsのばく露量推定を行う。
ディフィシル菌の感染様式の解明

昨年度の研究に加え、さらに健常成人の1集団(33名、20-29歳)を対象に、4ヶ月間隔で合計3回に渡りディフィシル菌(Clostridium difficile)の保有状況を検索した。分離菌株をPCRリボタイピング、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法を用いて解析することにより、保有状況の特性を検討し、さらにディフィシル菌陽性者と陰性者の腸内細菌叢を比較した。1.ディフィシル菌の保有状況:被験者延べ99人中9人(9.1%)においてディアイシル菌の保有が認められた。各検討時期の保有率は3回共9.1%であり、昨年度の2集団とほぼ同じ保有率であった。保有者は4名であり、2名は3回共陽性、1名は2回陽性、1名は1回陽性を示した。2.ディフィシル菌保有状況の特性:4名から分離した9菌株について遺伝学的解析を行ったところ、4名中3名からの分離菌株が同一の遺伝子タイプを示したが、複数回分離された被験者において、分離された菌株の遺伝子タイプは変化していた。3.腸内細菌叢の比較:昨年度の集団の被験者も含めて、ディフィシル菌の陽性者(12名)、陰性者(12名)を対象に腸内細菌叢の比較を行ったところ、ディフィシル菌陽性者は陰性者に比べて糞便中のEnterococcus属の菌数が有意に多かった。以上の結果は健常成人におけるディフィシル菌の消化管保有は多くの場合一過性であるが、恒常的保有者も存在すること、ディフィシル菌の存在とEnterococcus属の存在との間には相互作用が存在する可能性を示唆している。健常成人の2集団、集団A(85名,9-30歳)および集団B(60名,21-65歳)を対象に、4ヶ月間隔で合計3回に渡りディフィシル菌(Clostridium difficile)の保有状況を検索し、分離菌株をPCRリボタイピングおよびパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法を用いて解析することにより、保有状況の特性を検討した。1.ディフィシル菌の保有状況:被験者延べ435人中延べ26名(6.0%)においてディフィシル菌の保有が認められた。また、集団Aおよび集団Bにおける各検討時期の保有率は各々2.47.1%,5.010.0%であった。集団Aにおける保有者は7名であり、2名は3回共に陽性、2名は2回陽性、3名は1回のみ陽性を示した。一方、集団Bにおける保有者は9名であり、1名は3回共に陽性、2名は2回陽性、6名は1回のみ陽性を示した。2.ディフィシル菌保有状況の特性:1検体につき最高5分離菌株について毒素産生性およびPCRリボタイプを検討した結果、同一検体からの分離菌株の毒素産生性およびPCRリボタイプはいずれの検体においても同一であった。従って1検体につき1分離菌株、合計26菌株をPFGE解析に供した。集団Aにおける陽性者7名からの分離菌株のPCRリボタイプ・PFGEタイプは各固体において異なっていた。一方、集団Bにおいては陽性者9名中3名からの分離菌株、および2名からの分離菌株が各々同一のPCRリボタイプ・PFGEタイプを示した。3回共に陽性の3名中1名についてはいずれの時期の分離菌株も同一のPCRリボタイプ・PFGEタイプを示した。残り2名については連続する2回の時期の分離菌株が同一のCRリボタイプ・PFGEタイプを示した。2回陽性者については4名中1名のみが陽性時期における分離株は同一のPCRリボタイプ・PFGEタイプを示した。

昨年度の研究に加え、さらに健常成人の1集団(33名、20-29歳)を対象に、4ヶ月間隔で合計3回に渡りディフィシル菌(Clostridium difficile)の保有状況を検索した。分離菌株をPCRリボタイピング、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法を用いて解析することにより、保有状況の特性を検討し、さらにディフィシル菌陽性者と陰性者の腸内細菌叢を比較した。1.ディフィシル菌の保有状況:被験者延べ99人中9人(9.1%)においてディフィシル菌の保有が認められた。各検討時期の保有率は3回共9.1%であり、昨年度の2集団とほぼ同じ保有率であった。保有者は4名であり、2名は3回共陽性、1名は2回陽性、1名は1回陽性を示した。2.ディフィシル菌保有状況の特性:4名から分離した9菌株について遺伝学的解析を行ったところ、4名中3名からの分離菌株が同一の遺伝子タイプを示したが、複数回分離された被験者において、分離された菌株の遺伝子タイプは変化していた。3.腸内細菌叢の比較:昨年度の集団の被験者も含めて、ディフィシル菌の陽性者(12名)、陰性者(12名)を対象に腸内細菌叢の比較を行ったところ、ディフィシル菌陽性者は陰性者に比べて糞便中のEnterococcus属の菌数が有意に多かった。以上の結果は健常成人におけるディフィシル菌の消化管保有は多くの場合一過性であるが、恒常的保有者も存在すること、ディフィシル菌の存在とEnterococcus属の存在との間には相互作用が存在する可能性を示唆している。
長期耐久性を有するセメント材料の開発

本研究課題では、長期間供用しても充分に耐久的で、竣工時と同程度あるいはそれ以上の耐久性を持続可能なコンクリートの製造が可能となる材料あるいは配合条件を提案することを目的とした。平成15年度においては、平成14年度に試作したセメント6種類(通常の普通ポルトランドセメントならびに高ビーライト系の2種類のセメントクリンカーを、比表面積で3500、2500および2000cm^2/gレベルの3水準に粉砕して製造したもの)を対象とし、水セメント比を変化させてモルタル硬化体を作製し、強度発現性状と六価クロムの溶出挙動について検討を行った。このほか、比表面積で600、1200、2000cm^2/gおよび3500cm^2/gレベルの4水準に粉砕して製造したセメントを用いた硬化モルタルの強度特性に関する調査を実施し、以下の知見を得た。(1)比表面積で600、1200および2000cm^2/gレベルのセメントを用いた硬化モルタルの圧縮強度の発現は、水中養生期間5年後も増加傾向にあり、市販セメントよりも高い強度を示した。この結果から、比表面積の小さい粗粒セメントは、現在市販されているセメントよりも長期的な強度発現において優位性を有していることが示唆された。(2)粗粒セメントの使用方法として、異なる比表面積のセメントを混合することにより、モルタル硬化体の初期強度発現性の遅延を補完できる可能性が見出された。(3)試作セメントの強度発現は極めて緩やかであり、その原因は市販セメントよりも小さい比表面積にある。したがって、粗粒セメントの耐久性上の優位性を示すには、今後も継続して実験を実施する必要がある。なお、継続実験の必要性は六価クロム溶出に関する検討についても同様である。本研究課題は,長期供用ににおいても充分に耐久的で,当初と同程度あるいはそれ以上の耐久性を持続可能なコンクリートの製造が可能となる材料あるいは配合条件を提案することを目的とした。また,耐久性の目安としては,コンクリートからのカルシウムイオンの溶出に対して充分な抵抗力があることと,長期にわたって所定の強度特性を有することを評価項目とした。平成14年度においては,長期にわたってカルシウムイオンを持続的に供給できるようなセメント系材料として,市販セメントの粒径よりも大きな粒径のセメント(以下,粗粒セメント)を新たに開発し,実験的に使用する計画とした。このため,通常の普通ポルトランドセメントならびに高ビーライト系の2種類のセメントクリンカーを製造し,比表面積で3500,2500および2000cm^2/gレベルとなるよう3水準に粉砕した試作セメントを製造した。また,水セメント比を30%としたセメントペーストを作製し,水和の進行程度を表す結合水量を測定することとした。さらに,水セメント比を50%としたセメントモルタル(JIS R 5201準拠)を作製して,圧縮および曲げ強度の発現状況ならびにモルタルによる結合水量の検討を行っている。これらの試験体は養生期間中であり,現在のところ,極めて少ない試験結果しか得られていないため,今後,具体的な考察を進めてゆく予定である。なお,セメント硬化体が長期にわたって水等に接触することで,六価クロムをはじめとする微量成分が溶出するとの指摘があるため,平成15年度においては,六価クロムの溶出に関する検討項目を追加する予定である。
第一次視覚野における両眼視差情報の処理伝達回路の解明

ネコ第一次視覚野(17野、18野に相当する)における両眼視差情報の伝達機構を解明するために、これらの領野の細胞の両眼視差応答を数多く記録し、これまでに以下の成果を得た。(1)これまで、輝度特徴(表面の明るさが周りと異なる特徴)の両眼視差情報を伝達する細胞は数多く発見されてきたが、輝度以外の特徴の両眼視差情報を伝える細胞の存在については不明であった。われわれは今回、18野の1群の細胞が、模様特徴(表面の模様が周りと異なる特徴)の両眼視差を伝達していることを発見した。これらの細胞は、輝度特徴にたいしても、よく似た視差情報を伝達しており、手がかりに依存せずに、両眼視差情報を伝達する役割を果たしていることがわかった。この成果は、2006年度にJ.Neuroscience誌に受理され、まもなく刊行される。また、2003年度の視覚科学フォーラム(大阪)、日本神経科学学会(名古屋)および、北米神経科学学会(New Orleans)で報告をおこない、さらに、2004年度のオーストラリア神経科学会シンポジウム(Melbourne)にて招待講演を行った。(2)昨年、輝度特徴および模様特徴に両方に両眼視差感受性を示す細胞が、どのような受容野機構で、そのような感受性を獲得しているのかを検討した。その結果、これらの細胞は、左右両眼において、形のよく似た輝度特徴と模様特徴を検出するための受容野を持っており、左右の受容野で検出した信号を線形に足し合わせることによって、2種類の特徴にたいし、よく似た両眼視差選択性を示すことがわかった。この成果は、2005年度の日本神経科学学会(横浜)および、北米神経科学学会(Washington)で報告をおこなった。この成果は現在、論文執筆中である。(3)両眼視差情報を伝達するためのネットワーク特性を解明するために、機能的に結合した細胞ペアから活動を記録し、それらの視差応答プロファイル(両眼性受容野構造)を詳細に比較することを試みているが、機能的結合を有する細胞数の不足のため、まだ十分な成果を出すにはいたっていない。しかし、今後も、このような細胞ペアからの記録を試み、さらに検討を続ける予定である。われわれは両目でものをみるとき、片方の目を閉じているときよりも、はっきりとした奥行きのある3次元世界を知覚している。これは、われわれが、ものの左右眼での見えのずれ、すなわち「両眼視差」(以下、視差、と略す)を手がかりとして、ものの立体構造を脳で再構築できるためと考えられている。この両眼立体視の脳機構には、多くの視覚研究者が関心を持ち、これまで、脳の様々な部位で、両眼視差にたいする単一ニューロンの反応が測定されてきた(1)。しかしながら、視差にたいする細胞応答が、どのような神経回路で作り上げられるのかについては、不明な点や議論されている点が多い(2)。この一因として、これまでに、視差情報を伝達するために結合した2つの細胞ペアの応答の活動が、同時に測定されたことがないことがあげられる。本研究では、視差が初めて検出される大脳皮質部位、第一次視覚野(V1)に焦点を当て、機能的に結合した細胞ペアから活動を記録し、それらの視差応答プロファイル(両眼性受容野構造)を詳細に比較することで、視差情報が伝達される神経ネットワークの解明に挑む。当初、備品として購入予定であったThomas社の多電記録システムは、配付された交付金では購入できず、その代替として、多電電極および、増幅器、コンピューターを個別に購入し、セットアップを現在行っている。このため、目的である多電記録にはいたっていないが、すでに大脳皮質V1野およびV2野の両眼視差感受性細胞からの単一神経細胞外記録はこの1年間十分行った。その過程で、V1野ではなく、V2野に、これまでに報告されていない新規の両眼視差感受性細胞が存在することを発見し、すでに2003年度の日本神経科学学会および、北米神経科学学会で報告をおこなった。今後は、多数細胞からの記録に挑むと同時に、この新たに発見した細胞の性質のより詳細な解析も行う。この成果は、すでに2003年度の日本神経科学学会および、北米神経科学学会で報告をおこない、現在、論文執筆している。その結果、これらの細胞は、左右両眼において、形のよく似た輝度特徴と模様

特徴を検出するための受容野を持っており、左右の受容野で検出した信号を線形に足し合わせることによって、2種類の特徴にたいし、よく似た両眼視差選択性を示すことがわかった。この成果は、2005年度の日本神経科学学会および、北米神経科学学会で報告を行う予定である。(3)両眼視差情報を伝達するためのネットワーク特性を解明するために、機能的に結合した細胞ペアから活動を記録し、それらの視差応答プロファイル(両眼性受容野構造)を詳細に比較することを試みているが、機能的結合を有する細胞数の不足のため、まだ十分な成果を出すにはいたっていない。しかし、今後も、このような細胞ペアからの記録を試み、さらに検討を続ける予定である。ネコ第一次視覚野(17野、18野に相当する)における両眼視差情報の伝達機構を解明するために、これらの領野の細胞の両眼視差応答を数多く記録し、これまでに以下の成果を得た。(1)これまで、輝度特徴(表面の明るさが周りと異なる特徴)の両眼視差情報を伝達する細胞は数多く発見されてきたが、輝度以外の特徴の両眼視差情報を伝える細胞の存在については不明であった。われわれは今回、18野の1群の細胞が、模様特徴(表面の模様が周りと異なる特徴)の両眼視差を伝達していることを発見した。これらの細胞は、輝度特徴にたいしても、よく似た視差情報を伝達しており、手がかりに依存せずに、両眼視差情報を伝達する役割を果たしていることがわかった。この成果は、2006年度にJ.Neuroscience誌に受理され、まもなく刊行される。また、2003年度の視覚科学フォーラム(大阪)、日本神経科学学会(名古屋)および、北米神経科学学会(New Orleans)で報告をおこない、さらに、2004年度のオーストラリア神経科学会シンポジウム(Melbourne)にて招待講演を行った。(2)昨年、輝度特徴および模様特徴に両方に両眼視差感受性を示す細胞が、どのような受容野機構で、そのような感受性を獲得しているのかを検討した。その結果、これらの細胞は、左右両眼において、形のよく似た輝度特徴と模様特徴を検出するための受容野を持っており、左右の受容野で検出した信号を線形に足し合わせることによって、2種類の特徴にたいし、よく似た両眼視差選択性を示すことがわかった。この成果は、2005年度の日本神経科学学会(横浜)および、北米神経科学学会(Washington)で報告をおこなった。この成果は現在、論文執筆中である。
糖鎖の密度傾斜固定化による細胞機能制御

本研究では,種々の糖鎖分子を密度傾斜をつけて固定化した材料を合成し,in vitroでの細胞との相互作用を検討した.バイオシグナル分子を密度傾斜をつけて固定化した例はこれまでなく,固定化密度と細胞応答との関係が定量的に明らかになれば,今後の材料設計への重要な指針が得られるようになると推測される.ここでは,光リソグラフ法により,ヘパラン硫酸,ヒアルロン酸といった糖鎖分子を密度傾斜をつけてパターン状に固定化した基板上で細胞を培養し,成長・分化・運動などの細胞機能制御の可能性を検討した.まず,固定化したい糖鎖分子に,アジドフェニル基(光照射によって開裂してナイトレンを生じる)を結合した.得られた誘導体をポリスチレン基板に塗布した後,紫外光を照射した.このとき,フォトマスクで基板表面を覆い,光照射領域だけに反応を起こさせ,糖鎖分子をフォトマスクのパターンにしたがって固定化した.最初に,細胞スケールより大きいパターン(100μm)を形成させた材料上で各種細胞を培養した.バイオシグナル分子の固定化領域と未固定化領域における細胞の応答の様子から,バイオシグナル分子が固定化されても細胞に刺激を伝達できることが明らかとなった.次に,細胞スケールより小さいパターン(2μm)上で細胞を培養し,蛍光抗体顕微鏡法によりシグナル伝達を観察した.さらに,固定化密度に傾斜をかけた材料上で細胞を培養し,細胞への情報伝達に最小限必要な固定化量を明らかにし,バイオシグナル分子による細胞への刺激応答性の定量的な関係が得られた.本研究では,種々の糖鎖分子を密度傾斜をつけて固定化した材料を合成し,in vitroでの細胞との相互作用を検討した.バイオシグナル分子を密度傾斜をつけて固定化した例はこれまでなく,固定化密度と細胞応答との関係が定量的に明らかになれば,今後の材料設計への重要な指針が得られるようになると推測される.ここでは,光リソグラフ法により,ヘパラン硫酸,ヒアルロン酸といった糖鎖分子を密度傾斜をつけてパターン状に固定化した基板上で細胞を培養し,成長・分化・運動などの細胞機能制御の可能性を検討した.まず,固定化したい糖鎖分子に,アジドフェニル基(光照射によって開裂してナイトレンを生じる)を結合した.得られた誘導体をポリスチレン基板に塗布した後,紫外光を照射した.このとき,フォトマスクで基板表面を覆い,光照射領域だけに反応を起こさせ,糖鎖分子をフォトマスクのパターンにしたがって固定化した.最初に,細胞スケールより大きいパターン(100μm)を形成させた材料上で各種細胞を培養した.バイオシグナル分子の固定化領域と未固定化領域における細胞の応答の様子から,バイオシグナル分子が固定化されても細胞に刺激を伝達できることが明らかとなった.次に,細胞スケールより小さいパターン(2μm)上で細胞を培養し,蛍光抗体顕微鏡法によりシグナル伝達を観察した.さらに,固定化密度に傾斜をかけた材料上で細胞を培養し,細胞への情報伝達に最小限必要な固定化量を明らかにし,バイオシグナル分子による細胞への刺激応答性の定量的な関係が得られた.
カイコ脂肪体細胞における外来遺伝子発現系の確立

昆虫の体液タンパク質は脂肪体という組織において幼虫期に合成されている。カイコの体液タンパク質のうち貯蔵タンパク質SP1、SP2および主要体液タンパク質の遺伝子はすでにクロ-ニングが完了しており、それらの構造および発現様式がかなり明らかになりつつある。本研究では、これらの遺伝子を脂肪体細胞に再導入し、in vitroでの遺伝子発現の調節機構を解明する実験系の開発に主眼を置いてきた。この実験系を確立する上で最も重要な問題は、脂肪体細胞のプライマリ-カルチャ-の条件を決定することである。5齢幼虫2日目の個体より脂肪体を摘出した生理食塩水で洗浄後、トリプシンで消化し脂肪体細胞を単離した。その後培養液Tc10で単離脂肪体細胞の培養を試みた。その結果、トリプシン5mg/mlで30分消化後、出来るだけ機械的ショックを少なくして細胞を単離することが重要であると判明した。現在この条件で単離した脂肪体細胞は単離後24時間で約70%の生存率で示し、単離時のタンパク質合成能を失うことなく約2週間培養を続けることが可能となった。この脂肪体のプライマリ-カルチャ-細胞はシャ-レ表面に強固にはりつき、細胞をシャ-レからはがす際、機械的処理を行うと生存率がかなり低下する。またトリプシン処理を行い細胞を遊離させても生存率の低下が見られた。このような細胞を用いて赤血球ゴ-ストと細胞融合を行ったが、ほとんどの細胞が死滅してしまうことが判明した。そこで当初の予定を変更し、DEAE-デキストラン法およびリポソ-ム法を用いた形質転換実験を行った。現在、これらの方法の実験条件の検討を行っているが、形質転換の際の培養液の組成が外来DNAの細胞への取込みに大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。この条件が決定ししだい、体液タンパク質遺伝子のトランジェントな発現を解析する予定である。
メタボロミクスを基盤とした植物硫黄同化系の解析

植物の硫黄同化・システイン生合成経路は、複数の酵素ステップからなり、各酵素ステップには複数のアイソザイムが関与している。モデル植物シロイヌナズナの場合、硫黄同化の最初のステップを触媒するATPスルフリラーゼ(ATPS)については4つ、種々の硫酸化代謝物の生合成における硫酸イオン供与体として利用される3'-ホスホアデノシン5'-ホスホ硫酸(PAPS)を生成するAPSキナーゼは4つ、また、セリンとアセチルCoAから、システインの前駆体となるO-アセチルセリン(OAS)を生成するセリンアセチル転移酵素(Serat)には5つ、硫化物イオンとOASからシステインを合成するシステイン合成酵素(Bsas)には9つのアイソフォームが存在している。我々はこれまでに、これら冬酵素アイソフォーム遺伝子にT-DNAが挿入されたノックアウト変異体の単離に成功し、遺伝子発現解析及び代組物分析を行うことにより、各アイソフォーム遺伝子のシステイン生合成系における異なった役割を明らかにしつつある。今回、冬Bsas遺伝子の役割を解析するために、各アイソフォームのT-DNA挿入ノックアウトシロイヌナズナについて、その活性や代謝物を網羅的に解析した。その結果、Bsas1のノックアウト体について最もシステイン合成酵素活性が減少し、システイン量も減少したことから、9つのBsasアイソフォームのなかで、Bsas1がシステイン生合成に最も関与しているアイソフォームであることが明らかとなった。またBsasのもう一つの反応であるβ-シアノアラニン合成に関しては、Bsas3のノックアウト体で最も活性が減少することから、Bsas3の関与が示唆された。セリンアセチル転移酵素(SATase)はセリンとアセチルCoAからO-アセチルセリンを生合成する酵素であり、その活性がシステインによりフィードバック阻害を受けることなどから植物の硫黄同化、システイン生合成に重要な役割を果たしていると考えられる。ゲノム解析が終わったことによりシロイヌナズナには5つのSATaseアイソフォーム(Serat1;1,2;1,2;2,3;1,3;2)が存在することが明らかとなっている。しかしながらこれらアイソフォームの個々の役割については詳細な研究はなされていない。そこでこれらアイソフォーム遺伝子にT-DNAが挿入された挿入変異株を入手し、これら変異体について、遺伝子発現や代謝物蓄積量を解析した。その結果、それぞれの挿入変異株において、遺伝子発現や代謝物蓄積のパターンが異なったことから、シロイヌナズナに存在する5つのSATaseアイソフォームはそれぞれ異なった役割を果たしていることが明らかになった。さらにDNAチップを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、各SATaseアイソフォーム遺伝子をノックアウトしたことによる硫黄同化系関連遺伝子の発現に対する影響は少ないことが明らかになった。今後さらに詳細に結果を解析する予定である。さらにGC/MSを用いた代謝物のメタボローム解析の結果、Serat2;1をノックアウトした変異体が多くの代謝物蓄積量に対して最も影響をあたえていることが示唆された。今後、これらトランスクリプトーム解析の結果とメタボローム解析の結果を融合することにより、各SATaseアイソフォームの役割について、より詳細な解析が可能になると考えられる。モデル植物シロイヌナズナの場合、硫黄同化の最初のステップを触媒するATPスルフリラーゼ(ATPS)については4つの、また、セリンとアセチルCoAから、システインの前駆体となるO-アセチルセリンを生成するセリンアセチル転移酵素(Serat)には5つのアイソフォームが存在している。我々はこれまでに、各ATPS,あるいは、Seratアイソフォーム遺伝子にT-DNAが挿入されたノックアウト変異体を単離し、遺伝子発現解析及び代謝物分析を行うことにより、各アイソフォーム遺伝子のシステイン生合成系における異なった役割を明らかにしようと試みている。今回、各Serat遺伝子の役割をさらに詳細に解析するため、細胞質、葉緑体、ミトコンドリアにそれぞれ局在している主要なアイソフォームSerat1;1、Serat2;1、Serat2;2の各変異体を交配した二重変異体(serat1;1serat2;1, serat1;1serat2;2, serat2;1serat2;2)を作出した。serat2;1serat2;2二重変異体の解析において、Serat3;2遺伝子の発現量の増加や、OAS、システイン、グルタチオン蓄積量の著しい減少が観察された。このような結果は、serat2;1またはserat2;2単独変異体では観察されなかった事から、Serat2;1及びSerat2;2は互いに機能を相補していることが示唆された。またこのように複数のアイソザイムが関与する反応系でメタボロミクス解析などを行うためには、1つの酵素遺伝子のみではなく、二重、三重といった複数の遺伝子を破壊した変異体を用いることが必要であると示唆された。

我々はこれまでに、これら冬酵素アイソフォーム遺伝子にT-DNAが挿入されたノックアウト変異体の単離に成功し、遺伝子発現解析及び代組物分析を行うことにより、各アイソフォーム遺伝子のシステイン生合成系における異なった役割を明らかにしつつある。今回、冬Bsas遺伝子の役割を解析するために、各アイソフォームのT-DNA挿入ノックアウトシロイヌナズナについて、その活性や代謝物を網羅的に解析した。その結果、Bsas1のノックアウト体について最もシステイン合成酵素活性が減少し、システイン量も減少したことから、9つのBsasアイソフォームのなかで、Bsas1がシステイン生合成に最も関与しているアイソフォームであることが明らかとなった。またBsasのもう一つの反応であるβ-シアノアラニン合成に関しては、Bsas3のノックアウト体で最も活性が減少することから、Bsas3の関与が示唆された。
効果的ハイパーサーミアと高機能高周波電源の開発に関する研究

本年度においては主に高周波電源(高周波発振回路)の高出力化とハイパーサーミア治療時の治療部位ならびにその周辺の温度分布について検討を行った。まず,静電誘導トランジスタ(SIT)を用いた高周波電源の高出力化を目的として,SITを多重接続したダブルプッシュプル型の電源(発振回路)を試作した。その結果,本電源のベースとなる単一プッシュプル型回路と同様,(2)出力は入力電圧に比例して増加する,(2)SITを用いた回路の出力電力は電源電圧で制御可能である,(3)SITの多重接続により高出力化が可能である,こと等を実験により検証した。つぎに,生体加温時(治療時)に重要となる生体内の温度分布について有限要素法による解析を行い,高温の発熱体1個の使用よりも,適切に温度設定した発熱体を複数個使用し,これらを治療部位を取り囲むように配置することによって,効果的な加温が行えること等,発熱体の配置方法や発熱体温度の設定方法について解析的に明らかにした。これらの結果は通常のハイパーサーミアのみならず,近年注目を集めているアプレーションセラピーに関しても有用な所見を与えるものと考えられる。また,血流の影響を考慮した場合についても検討を加え,発熱体の配置場所や方法と血液の流れる方向を適切に選択することにより熱損傷を抑えた加温が可能である等の見通しを得た。なお,本研究の成果の一部は平成16年東北地区若手研究者研究発表会(講演番号:YS-2-23)において発表した。3極管真空管と同じ非飽和特性を有するSIT(静電誘導トランジスタ),ならびに,通常のバイポーラトランジスタを用いた高周波発振回路の2種類の高周波電源を試作した。両試作回路は次のような特徴を有する。(1)抵抗,コンデンサ,コイル,半導体デバイスで構成される単一プッシュプル回路である。(2)回路を構成する素子数が少ないため,保守も容易である。(3)半導体デバイスはスイッチング動作をするため正弦波は得られにくいものの,効率が高いことが予想される。これら2種類の試作回路に関してハイパーサーミア用電源としての可能性について検討を行った結果,以下の事項を明らかにした。バイポーラトランジスタにおいては,(1)出力が電源電圧の増加に対し,飽和傾向を示す。(2)効率は最大で75%程度であり,出力の増加と共に効率は低下する。一方,SITを用いた回路では,(1)出力は入力電圧に比例して増加する。(2)SITを用いた回路の出力電力は電源電圧で制御可能である。(3)周波数15MHzの高周波発振が得られる。(4)SIT×1で最大数ワットの出力が得られる。SITを用いた試作電源装置はハイパーサーミア用電源として充分期待できると思われるが,今後,回路定数と出力,効率の関係等について,シミュレーションと実験の両面から検討する必要がある。さらに,励磁コイル・アプリケータと高周波電源を組み合わせた場合の特性,発熱体の配置方法と加温領域の推定・算定等についてもさらに検討し,高機能な電源の開発を行う必要がある。なお,本研究の成果は,平成14年度電気関係学会東北支部連合大会(講演番号:1G-10)において発表した。
製塩土器の科学的解析

塩は水溶性である為、古代土器には塩が残らないと考えられてきた。しかし、我々は水に溶け出さずに土器マトリックス内に強く保持されている塩化物イオン(Cl^-)が残留する事を明らかにし、フッ化物イオンと置換することによりCl^-を土器から抽出できる手法を実験製塩土器を使って確立することができた。また、この手法が古代製塩土器の同定に応用できることを示した。さらに、古代から行われていた製塩手法である素水法(単純に海水を加熱濃縮)と藻塩法(藻を使って作った灌水を濃縮)を識別する為に、海水中及び藻に生息する珪藻に含まれているステロール類を調べる事が有効であることを、実験製塩土器を用いて明らかにした。人間の営みに欠かすことができない塩を得る為に古代人が使用していた製塩土器を科学的に検討する為に下記を行う。(1)製塩土器に製塩過程を示唆する化学物質が残留する可能性を実験製塩土器を用いて検討する。(1)海水中に微量含まれている海洋性脂質、特にステロール類が検出・同定・定量できるかの検討。(2)海洋性脂質の種類から製塩方法が識別できるかの検討。(3)塩の主成分の一つである塩化物イオンの残留の可能性を検討する為の分析方法の開発。(2)実験製塩土器を用いて確立した分析手法を古代土器に応用し、考古学的知見と合わせて古代の製塩土器を科学的に解析する。古代から現代にいたるまで、製塩は日本の重要な文化の一つである。最古の方法は土器を使って海水を加熱濃縮する手法で、縄文時代から塩田が広まる平安時代まで、全国各地の遺跡から大きさも形も異なる様々な製塩土器が出土している。これまで化学的な製塩土器の同定方法が望まれていたが、塩は水に良く溶ける為、土器から塩を直接検出することは難しいと考えられる。我々は、海水中に含まれている微量成分が海水を濃縮する製塩過程で土器の胎土内部に捕獲され残留する可能性があると考え、本年度は実験製塩土器を用いて、海水中に微量溶解しているステロール類が製塩土器に残留する可能性を検討した。今回用いた実験製塩土器は海水を単純に繰り返し加熱濃縮する「素水法」で製塩した土器である。ガスクロマトグラフィー使って分析した結果、主に動物に多く含まれるコレステロール主に植物由来のスチグマステロール、β-シトステロール、カンペステロールの他にフコステロールが検出された。これらは海水中に含まれているステロール類の典型に対応する。フコステロールは褐藻に多く含まれる特異的なステロールであり、これまでに我々が分析した関東武蔵野台地から出土した縄文土器からは検出されていない。従って、フコステロールが製塩土器のバイオマーカになる可能性が明らかになった。今年度はまた、乾燥ホンダワラを海水に浸し、乾燥させる事を繰り返して塩分を濃縮させた鹹水を用いた「藻塩法」で製塩した実験製塩土器を入手した。今後「藻塩法」製塩土器の胎土に残留するステロール類を分析し、「素水法」製塩土器と比較することにより、製塩方法の違いと残留ステロール類との関連を検討する予定である。我々はこれまでに、製塩土器の化学的同定方法として海水中に微量溶けているステロール類が、土器で海水を繰り返し加熱濃縮して塩を結晶化する製塩過程で土器のマトリックスに保持され、製塩のマーカーになりうる事を、実際に製塩を行った実験製塩土器を使って明らかにしてきた。製塩土器の同定には塩の存在が指標になる。しかし塩(主成分は塩化ナトリウム)は水によく溶ける為、これまで土器に残留しないと考えられてきた。本年度は土器が持つイオン交換能に着目し、塩由来の塩化物イオンが製塩土器内に保持される可能性を、実験製塩土器を使って検討した。土器片から、まず雨や地下水などに溶け出す可能性のある塩化物イオンを予め蒸留水中で超音波抽出し除去した後、土器を粉砕して表面積を大きくし、蒸留水で除去可能な塩化物イオンを検出できなくなるまで再度超音波抽出して除去した。次に土器胎土の主成分であるシリケートと親和性の高いフッ化物溶液で再度超音波抽出すると、新たに塩化物イオンが検出できることがわかった。つまり、自然界で雨や地下水などにより土器から流出あるいは土器に侵入した塩化物イオンを蒸留水に溶け出した塩化物イオンとすると、その他により強く土器内部に保持され、水だけでは容易に溶け出さない塩化物イオンが残留すること、その塩化物イオンはフッ化物溶液を用いれば回収できることが明らかになったわけである。塩化物イオンの検出には塩化物イオン電極(検出範囲:1-35000mg/LCI-)を用いた。

塩化物イオン電極は安価で誰でも簡単に扱う事ができる。従って、これまでに報告されている製塩土器の科学分析に用いられた、高価で扱いに技術を必要とし、しかも感度が%単位のエネルギー分散型走査電子顕微鏡(1)よりはるかに優れた分析方法であると言えよう。塩は人間の生活に欠かすことのできない重要なミネラルである。日本では、縄文時代から土器を使って海水を濃縮し塩を取り出す手法が用いられているが、塩(主成分は塩化ナトリウム)は水に良く溶けるため、製塩土器には塩の生産過程を反映する化学物質は残らないと考えられてきた。しかし、我々は平成19年度に、海水を繰り返し濃縮する「素水法」で塩を析出させた実験製塩土器から海水中に微量存在するステロール類が濃縮・残存し、特に褐色藻に多く含まれているフコステロールの存在が海水由来を示唆する事、また平成20年度には同じ実験製塩土器を使って、塩化ナトリウムの成分である塩化物イオンの一部が水には溶け出さない状態で胎土内に残存し、フッ化アンモニウム水溶液で抽出できる事を示してきた。本年度は藻を使って予め塩分を濃縮させた鹹水を使った、より高効率の「藻塩法」で製塩した実験製塩土器の胎土内に吸着・残存するステロール類を分析し、素水法実験製塩土器と比較することで、これらの異なった製塩手法がステロール分析から識別できるかを検討した。塩の生産方法は生産量、人口、流通などとも深く関連しているため、製塩技術の同定は古代のダイナミックな人間活動を知る上で貴重な資料となるからである。その結果、藻塩法実験製塩土器から、褐色藻に多く含まれているフコステロール以外にも全ステロール類の約25%をしめる多量のブラシカステロールを検出した。ブラシカステロールは珪藻に特異的な化学物質で素水法製塩土器からは検出されていない。珪藻は海藻に付着生息する為、多量のブラシカステロールの存在は海藻を使用したことを強く示唆している。従って、製塩土器に残存するステロール類、特にフコステロールやブラシカステロール等、海藻や珪藻由来のステロール類を分析する事で、製塩土器か否か、また素水法と藻塩法の製塩手法が識別できると考えられる。これまでに確立された塩化物イオン分析の手法を使って広島県安芸郡蒲刈町沖浦遺跡出土土器の塩化物イオン分析を行った。試料は考古学者が分類した4から6世紀にかけての1.製塩土器、2.非製塩土器、3.未使用の製塩土器、を使用した。その結果、水に流出せず強く土器胎土に保持された塩化物イオンが遺跡出土土器からも検出され、本手法が古代土器に適応できる事が明らかになった。回収された総塩化物イオン量の平均値は製塩土器で0.581±0.291mgCl^-g^<-1>pottery(最高値:1.487±0.011mgCl^-g^<-1>pottery、最低値:0.061±0.008mgCl^-g^<-1>pottery、n=11)、非製塩土器で0.040±0.034mgCl^-g^<-1>pottery(最高値:0.118±0.020mgCl^-g^<-1>pottery、最低値:検出限界(0.02mgCl^-g^<-1>pottery)以下,n=8)、未使用製塩土器は0.025±0.010mgCl^-g^<-1>pottery(最高値:0.054mgCl^-g^<-1>pottery、最低値:検出限界以下,n=4)であった。平均値を比較すると、製塩土器と非製塩土器との間に優位差(P<0.001)があり、強く保持された総塩化物イオン量を測定する事で製塩土器を他の土器と識別することができることが明らかになった。
アルツハイマー病変形成を促進する新たなモデルマウスの開発

本研究は、脳の老年性変化を人為的に促進することでアルツハイマー病変の形成を加速化させ、より早期かつ効率的にアルツハイマー病の研究を進めることが可能となる新たな遺伝子改変マウスの開発を目的とするものである。昨年度の研究成果により、軸索輸送モーター蛋白質Dyneinを特異的に認識するガイドRNA(Dynein-sgRNA)を発現する遺伝子改変マウスの開発に成功した。そこで今年度は、CRISPER/Cas9システムによってガイドRNA選択的ノックアウトが可能になるCas9マウスと、Cre/loxPシステム下でCas9を発現するLSL-Cas9マウス、タモキシフェン誘導時かつ神経細胞特異的にCreを発現するマウス(SynI-CreERT2)をそれぞれ導入してDynein-sgRNAマウス等と交配させ、系統化を行った。まず、Cas9マウスとの交配によって胎生期から全身性でDyneinのノックダウンが生じた場合は産仔が得られなかったため(Dyneinは細胞分裂に必要なため、期待通りの結果)、Dynein-sgRNAがin vivoで正常に作動することが確認された。そこで、Dynein-sgRNAマウスとLSL-Cas9マウスを交配させ、得られた産仔をさらにSynI-CreERT2マウスと交配させることで、計画通りに最終段階の遺伝子改変マウスの産仔が得られた。今後は、同マウスが成熟齢に達した後、タモキシフェンを投与して神経細胞特異的にDyneinのノックダウンを誘導して、脳の老年性変化が再現されることを検証する予定である。予定通り、タモキシフェン誘導時かつ神経細胞特異的にDynein-sgRNAを発現する遺伝子改変マウスの産仔獲得に至った。今後は、実際にタモキシフェン誘導を行って脳の老年性変化が再現されるか否かを検証する予定である。次年度は、得られた遺伝子改変マウスにタモキシフェンを投与して実際に脳内でDyneinがノックアウトされていることを確認し、脳の老年性変化(例:エンドソームの肥大化病変や神経突起の肥大化、神経活動の低下など)が再現されるか否かを検証する予定である。本研究は、アルツハイマー病変の形成を加速化させ、より効率的にアルツハイマー病の研究を進めることが可能となる新たな遺伝子改変マウスの開発を目的としている。これまでの研究成果により、軸索輸送モーター蛋白Dyneinの機能低下はβアミロイド蛋白の蓄積を誘導すること、そしてDynamitin/p50の過剰発現はDynein-Dynactin複合体の正常な形成を阻害してDyneinの輸送機能を障害することが明らかになっている。そこで、テトラサイクリン依存性にDynamitin/p50を過剰発現する遺伝子コンストラクトを作製し、神経系培養細胞に遺伝子導入してその効果を確認したところ、テトラサイクリン非存在下でも導入遺伝子が若干発現してしまうことが確認され、実際にマウスを作成した際にも同様の効果が生じる危険性が確認された。そこで、テトラサイクリンに比べて制御性が高いとされるタモキシフェン誘導システムと最新の発生工学技術であるCRSPER-Cas9のシステムを応用して、Dyneinそのものをターゲットとしたコンディショナルノックアウトマウスを開発することに方針を切り替えた。まず、Dyneinを特異的に認識するガイドRNA(Dynein-sgRNA)を複数構築し、その効果を神経系培養細胞を用いて確認した。次に、最も効果の高かったsgRNAをU6プロモーター下流に組み込んだ遺伝子コンストラクトを作成してマウスの受精卵にインジェクションしたところ、Dynein-sgRNAを発現する遺伝子改変マウスを3系統得ることができた。Dyneinの輸送機能を人為的に障害するためのシステム変更を行ったが(Dynamitin/p50の過剰発現をやめ、Dyneinそのものをコンディショナルノックアウトする)、当初の予定通り、新たな遺伝子改変マウスの第1段階作成には成功した。

次年度は、実際にsgRNAと共役してDynein遺伝子をノックアウトするためのCas9、およびCas9がタモキシフェン誘導下において神経細胞特異的に発現するシステムを用いた遺伝子改変マウスの作成に着手し、目的とする新規遺伝子改変マウスの開発計画を促進する予定である。尚、今年度の成果によって3系統のDynein-sgRNA発現マウスを確立したため、まずは最も発現量の高い系統を選択して以後の研究計画を進めていく予定である。次年度は、得られた遺伝子改変マウスにタモキシフェンを投与して実際に脳内でDyneinがノックアウトされていることを確認し、脳の老年性変化(例:エンドソームの肥大化病変や神経突起の肥大化、神経活動の低下など)が再現されるか否かを検証する予定である。