hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イエバエの性決定様式の異常と殺虫剤抵抗性に関する研究

イエバエの性決定様式はXY型であるとされていたが、1960年頃から異常な様式が知られるようになり、近年増加の傾向にあるとされているのでその実態を日本全国19地点で交配法により調べた。雄性決定因子MはY染色のほかに5対の常染色体のすべてから見つかり、また複数個のM因子に対し優位性を示す雌性決定因子Fが存在するなど、異常な性決定様式の増加が確認された。1986年東京都第3夢の島と栃木県芳賀町で彩集したイエバエに、各種有機燐剤に対する高い抵抗性が認められ、さらに芳賀町ではkdr遺伝子による高度のピレスロイド剤抵抗性も発達していた。関東地方の11のイエバエの集団についてkdr遺伝子を調べたところ、第3夢の島からは検出されなかったが、群馬県と栃木県の10の集団からは0.2ー1.0の頻度で見つかった。この事実は、kdr遺伝子が日本で広範囲にしかも高頻度で存在していることを示した最初のものである。栃木県芳賀町の2つの畜舎では、1986年10月から2年間にわたり、kdr遺伝子頻度の変化を追求した。頻度の上昇は明らかにピレスロイド剤の使用によるものであり、低下は周辺地域の頻度の低い集団からの移動によるものと推測された。室内で殺虫剤による選抜を行わずにイエバエを継代した実験では、第6代目までkdrの頻度は変化せず、ピレスロイド剤を散布しない環境でのkdr保有個体の適応度の低下は認められなかった。1986年に群馬県と栃木県で採集したイエバエの2つの集団では、異常な性決定因子Mとピレスロイド剤抵抗性遺伝子kdrとの間の連鎖不平衡は検出されなかった。殺虫剤抵抗性の発達を遅延させる方法を理論的に考察し、次の結果を得た。抵抗性遺伝子の頻度が低いときには、殺虫剤に触れたヘテロ接合体のほとんどが死ぬよう十分の量を散布し、また抵抗性機構の異なる2種以上の殺虫剤のモザイク散布などによる感受性個体の残存が有効である。イエバエの異常な性決定様式の増加とほぼ時を同じくして殺虫剤抵抗性が発達してきたので、両者の関連性の有無を確かめ、また集団の中での殺虫剤抵抗性遺伝子の増加を抑制する新しい方法を集団遺伝学的に研究し、さらにこれを実地に応用して検討し、これらの研究成果を基にして、防除が困難になりつつあるイエバエの有効な対策を樹立することを計画した。昭和61年度においては、まずイエバエの各地の集団につき【II^M】F系統およびaabys系統との交配実験により性決定様式の異常について調べた結果、正常な雄および雌は大変少なく、M因子が常染色体上に位置するものの増加が確認された。殺虫剤抵抗性については、有機燐剤のほかにピレスロイド剤に対する抵抗性が各地で問題になりつつあることを確認した。また、群馬県の牛舎で採集したイエバエのピレスロイド抵抗性にKdr遺伝子が関与していることを交配実験により確かめた。さらに群馬県および栃木県のイエバエ5集団につき、kdr遺伝子の頻度を交配実験により調べ、この遺伝子が急速なピレスロイド剤抵抗性の発達をもたらした原因であることを明らかにし得た。集団の中での殺虫剤抵抗性遺伝子の増加を抑制する新しい試みとしては、集団が小さくなった時に感受性化体を放飼する方法や、殺虫剤散布の際に無散布の小区域を設ける方法などの有効性を、集団遺伝学的にシムレーションにより確かめた。

以上により、イエバエの殺虫剤抵抗性の中でもとくにピレスロイド剤抵抗性が大きな問題となりつつある実態が明らかとなり、またピレスロイド剤抵抗性にはkdr遺伝子が重要であることがわかってきたので、今後はこのkdr遺伝子対策に重点をおいて研究を進めていきたい。また、kdr遺伝子の頻度の測定は、野外で採集した雄を一個体ずつkdrをホモに持つ系統の雌に交配して行っているが、これにはかなりの労力を要するので、より簡便な方法を開発して研究を進めたい。イエバエの異常な性決定様式の増加とほぼ時を同じくして殺虫剤抵抗性が発達してきたので,両者の関連性の有無を確かめ,またイエバエ集団の中での殺虫剤抗抵性遺伝子の増加を抑制する新しい方法を研究し,イエバエの有効な対策を樹立することを計画した.昭和61年度には,性決定様式に関して異常なイエバエの実態を調べ,また殺虫剤抵抗性の中でもとくにピレスロイド剤抵抗性が問題が大きいこと,これにはkdr遺伝子が関与していることを明らかにした.昭和62年度には栃木県芳賀郡芳賀町の6ヶ所の畜舎(それぞれ牛,豚,鶏を飼育)にて10月12日に採集したイエバエを飼育,次世代の雌成虫についてピレスロイド剤抵抗性の調査を実施した.方法はペルメトリンの局所微量滴下法により,識別薬量0.5mgにて死亡しないものをピレスロイド剤抵抗性遺伝子kdrをホモに持つ個体と考えた.この結果から求めたkdr遺伝子の頻度は0.19ー0.59で,畜舎により多少の差はあるが,芳賀町全体にわたりkdr遺伝子はかなり高頻度に分布していることがわかった.つぎに,ピレスロイド剤抵抗性遺伝子kdrの頻度消長におよぼす要因を明らかにするため,昭和61年10月から1年間計4回にわたり,芳賀町の2畜舎からイエバエを採集し,ペルメトリンの局所微量滴下法により抵抗性を調べた.その結果,畜舎へのピレスロイド剤の使用中止により,短期間のうちにkdr遺伝子の頻度が著しく低下することがわかった.この頻度低下の要因として,抵抗性のレベルの低い他のコロニーからのイエバエの移住,またはkdr遺伝子を持つ個体の適応度の低下によることが考えられる.次年度は本研究の最終年にあたるので,これまでの成果を基礎として,もっとも問題の大きいピレスロイド剤抵抗性の遺伝子頻度の制御方法を中心に,防除が因難になりつつあるイエバエの有効な対策を提示したい.1988年栃木県芳賀町の5つの畜舎でイエバエのピレスロイド剤抵抗性遺伝子kdrの頻度を、ペルメトリン識別薬量の局所施用法により調べた。kdr遺伝子はどの畜舎でも認められ、頻度は0.11-0.58であった。6、8、10月の3回調べた3つの畜舎では頻度は増減したが、増加は明らかにピレスロイド剤の散布によるもので、減少は頻度の低い周辺の集団からの移動によるものと推測された。実験室で殺虫剤による選抜を行わずにイエバエのコロニーを継代し、kdr遺伝子の頻度に変化が生じるかどうかを調べた。芳賀町の畜舎で異なる時期に採集したイエバエを混合してkdr遺伝子頻度0.93のコロニーを作り、これを継代してkdr遺伝子頻度を測定したが、第6代目まで頻度は変化せず、ピレスロイド剤を散布しない環境でのkdr保有個体の適応度の低下は認められなかった。ピレスロイド剤抵抗性は第3染色体上のkdr遺伝子によって強く影響されるのでピレスロイド剤抵抗性の発達したイエバエの野外集団において、第3染色体上の雄性決定因子Mとkdr遺伝子の連鎖不平衡の有無を調べた。ランダムに抽出した雄の第3染色体では、M因子を運んでいるか否かにかかわらず、kdr対立遺伝子の頻度はほぼ等しく、2つの遺伝子座の間には連鎖不平衡は検出できなかった。
腫瘍増殖と腫瘍由来細胞増殖因子

腫瘍細胞による細胞増殖因子、阻害因子の産生に注目して、これらの腫瘍増殖における役割を解明すべく研究してきた。我々は既にトリ肉腫ウィルスで腫瘍化したラット細胞77N1が新しいタイプのtransforming growthfactor(TGF)を産生していることを見出し、これを精製単離してTGFγ2と名づけその構造・作用機構について研究した。本年度腫瘍化株77N1とその正常親株NRKを用いてそれぞれにおけるTGFγ2の発現を調べた所、NRKも細胞内にはTGFγ2を合成しているが細胞外への分泌は腫瘍化株に限られること、腫瘍化株の細胞内、細胞外型TGFγ2を比較した所、免疫学的およびSDS-PAGEでの分子量は共通であるものの中性緩衝液中では異なる荷電・分子量を示すことが判明した。即ちTGFγ2は細胞外へ放出されるに伴なって何らかの分子修飾を受けていることが示唆され、この修飾機構と細胞腫瘍化との関連を追求中である。TGFγ2産生細胞である77N1は同時にこれに対する阻害因子をも産生していることが判明し本年度これを部分精製して、sarcoma growthinhibitor(SGI)と名づけ作用様式について検討を加えた。この因子は酸性側に等電点を持つ分子量20K程度の蛋白質でTGFγ2によってBALB3T3に誘導されたDNA合成、TGFγ2およびTGFβによって誘導された軟寒天内コロニー形成のいずれも阻害した。しかし血清、EGFによって誘導されるDNA合成は阻害しないのでTGFに特異的な阻害因子であることが示唆された。SGIは誘導されたコロニー形成のみでなく腫瘍細胞による自発的コロニー形成をも阻害することが判明した。マウスおよびラット由来の7株の腫瘍細胞のうち2株は20μg/mlの濃度まで影響をうけなかったが他の5株(77N1を含む)のコロニー形成は抑制をうけ220μg/mlでほぼ完全に阻害された。SGIは今後腫瘍増殖抑制物質としてのみならず腫瘍細胞の増殖調節機構を探る試薬としての活用も期待される。
条件付運動学習における大脳皮質-基底核ループの役割

我々は、日常の様々な状況において、その場に応じた適切な運動を選択し遂行している。適切な運動の選択と遂行は、経験を通して適切な運動の選択を学習することにより可能となっている。このような条件付運動学習の神経機構について、我々はサルを用いた電気生理学的な実験を行い、大脳基底核の出力部の淡蒼球内節の神経細胞が学習関連活動を示すことを明らかにした。大脳基底核と大脳皮質とは、関連する領域がループ回路を形成し、連関して働くと考えられている。そこで、本研究では、この条件付運動学習課題を遂行中に、サル大脳皮質前頭連合野から神経細胞活動を計測し神経細胞活動と課題との関連を解析した。前頭連合野は、機能が異なると考えられる複数の領域に分けられる。その中で、神経解剖学的な研究により、淡蒼球内節の背内側部から入力を受けることが示されている、大脳皮質内側面のArea 9mを記録部位とした。実験には数ヶ月間の訓練により条件付運動学習課題を正しく遂行できるようになったサルを用いた。前頭連合野Area 9mでは、手がかり刺激に応答する神経細胞活動が記録された。手がかり刺激に対する応答は、刺激が新奇であるか既知であるかにより変化した。一群の神経細胞は、新奇の手がかり刺激に選択的に応答した。すなわち、既知の手がかり刺激のみが呈示される対照条件では応答がみられず、学習条件でも既知の手がかり刺激には応答せず、新奇の手がかり刺激のみに応答した。別群の神経細胞は、既知の手がかり刺激に選択的に応答した。すなわち、対照条件では既知の手がかり刺激に応答し、学習条件でも新奇の手がかり刺激には応答せず、既知の手がかり刺激のみに応答した。これらの結果は、条件付運動学習を成立させるために重要な手がかり刺激が新奇であるか既知であるかに関する情報が、前頭連合野Area 9mで処理されている、あるいは表現されていることを示唆する。条件付運動学習課題の課題制御システムを整備し、サルの訓練を開始した。課題制御のために、サルの眼前に視覚刺激呈示用のモニターを、手元に反応用の(押す、引く、回すことのできる)マニプレーターを配置した。課題では、モニターの中央に手がかりとなる図形を呈示し、数秒間の遅延期間後に、トリガー刺激を与える。動物が、呈示されていた手がかり刺激に基づいて、マニプレーターを押す、引く、あるいは回すのうち、適切な運動を行うと報酬を与える。通常の対照条件では、丸、三角、四角を手がかり刺激として呈示し、それぞれ押す、引く、回すを適切な反応とした。訓練によりこれらの視覚刺激と運動との結びつきについて、95%以上の試行で正しく反応できるようになった。続く学習条件では、一つの手がかりを新しい図形と入れ替え、この図形に対しては入れ替えた元の図形に対する反応を正反応とした。訓練により、動物は新しい刺激が呈示されても反応を試みるという課題のルールを学習でき、試行錯誤するうちに、正しい運動を連続して遂行できるようになった。ただし、繰り替えし正解するまでの試行数は、3回から50回以上とばらつきがある。また、複数の単一神経細胞活動を同時記録するためのセットアップを行った。本研究では、複数(4ないし8本)の金属電極を同時に一つの領域に刺入し、それぞれの電極を別々に駆動して、各電極から単一神経細胞を記録する。このような多点電極記録に必要な電極ポジショニング・システムは自作した。他のサルでの予備的な記録実験で、大脳皮質前頭連合野と大脳基底核線条体から、それぞれ複数の単一神経細胞活動を数時間にわたり、安定して記録することができた。

さらに、多点電極記録法により得られるデータについて、各神経細胞間の関連を明らかにする新たな解析法の開発を進めている。我々は、日常の様々な状況において、その場に応じた適切な運動を選択し遂行している。適切な運動の選択と遂行は、経験を通して適切な運動の選択を学習することにより可能となっている。このような条件付運動学習の神経機構について、我々はサルを用いた電気生理学的な実験を行い、大脳基底核の出力部の淡蒼球内節の神経細胞が学習関連活動を示すことを明らかにした。大脳基底核と大脳皮質とは、関連する領域がループ回路を形成し、連関して働くと考えられている。そこで、本研究では、この条件付運動学習課題を遂行中に、サル大脳皮質前頭連合野から神経細胞活動を計測し神経細胞活動と課題との関連を解析した。前頭連合野は、機能が異なると考えられる複数の領域に分けられる。その中で、神経解剖学的な研究により、淡蒼球内節の背内側部から入力を受けることが示されている、大脳皮質内側面のArea 9mを記録部位とした。実験には前年度の訓練により条件付運動学習課題を正しく遂行できるようになったサルを用いた。前頭連合野Area 9mでは、手がかり刺激に応答する神経細胞活動が記録された。手がかり刺激に対する応答は、刺激が新奇であるか既知であるかにより変化した。一群の神経細胞は、新奇の手がかり刺激に選択的に応答した。すなわち、既知の手がかり刺激のみが呈示される対照条件では応答がみられず、学習条件でも既知の手がかり刺激には応答せず、新奇の手がかり刺激のみに応答した。別群の神経細胞は、既知の手がかり刺激に選択的に応答した。すなわち、対照条件では既知の手がかり刺激に応答し、学習条件でも新奇の手がかり刺激には応答せず、既知の手がかり刺激のみに応答した。これらの結果は、条件付運動学習を成立させるために重要な手がかり刺激が新奇であるか既知であるかに関する情報が、前頭連合野Area 9mで処理されている、あるいは表現されていることを示唆する。
ATRA治療時の白血病細胞におけるJak-STAT pathway活性化の意義

平成12年度実績報告書にてNB4,HL60細胞株においてフルダラビン(F-AraA)がPML及びPML-RARαの発現を抑制することを述べた。しかしIFNとATRAでの刺激後の相乗抑制効果では有意な結果が得られなかった。F-AraAはDNA合成阻害剤であり、白血病細胞株ではDNA障害作用によりアポトーシスを誘導するとされ,また紫外線(UV)刺激によるDNA損傷時にはテロメラーゼ活性が上昇することが知られている。これらのことからF-AraAによるDNA障害とテロメラーゼ活性上昇の関連が推定されたため平成13年度は以下の検討を追加した。2種の急性骨髄性白血病細胞株(NB4,HL60)をF-AraA刺激しTRAP法にてテロメラーゼ活性の変動を検討した。対照にはUV照射した細胞を用いた。HL60では無刺激にて高いテロメラーゼ活性を認めた。NB4ではF-AraA濃度依存性にテロメラーゼ活性の上昇を認め、さらにRT-PCR法にてhTERT mRNAの発現レベルはF-AraA刺激後に上昇していた。しかしF-AraA刺激後のテロメア長の変化をサザン法を用いて観察したがテロメア長に変化を認めなかった。このことからDNA障害をうけた細胞では転写レベルでテロメラーゼ活性が調節されている可能性が示唆された。(上記検討結果は2001年9月日本癌学会総会で発表した。)HL-60,NB4を天然型IFN-α(1000u/ml)で刺激し3,6,12,24時間後のPML-RARαおよびPML mRNAの発現状態をRT-PCR法を用いて検討した。結果、両細胞株においてPML mRNAはIFN-α刺激後6時間後をピークとした明白な発現の誘導を認めた。しかしNB4におけるPML-RARα.mRNAはIFN-α刺激前より中等度に発現しており刺激後12時間においても約1.5倍程度のごく弱い発現増強のみ認めた。このことからPMLおよびPML-RARαmRNAの転写調節は同じ塩基配列のプロモーターを有していても異なる発現調節を受けていることが示唆された。2)FludarabineによるJAK-STAT pathwayの抑制JAK-STAT pathwayのターゲットであるtypeI IFN誘導遺伝子であるPMLはF-AraA刺激後24時間の時点で発現が消失し、PML-RARαmRNAの発現の変化も同様であった。しかしIFNとの同時刺激ではPML,PML-RARαmRNAの発現は増強し、かつ刺激後3時間が最強であった。今後apoptosisとの関連等につき検討を予定している。)
域圏論の視点による中国古代地域社会像の構築

1)2018年夏に現地調査を挙行した.主たるフィールドとしている中国甘粛省の河西地域において,敦煌市博物館・玉門市博物館・金昌市博物館・張掖市(粛州区)博物館において,公開中の喪葬文物の実見・撮影に従事した.その結果,玉門市博物館・張掖市博物館では,新たな画像磚をはじめとする多くの文物の存在を確認できた.とくに玉門市博物館では,墓自体の詳細は不詳ながら,未知の画像磚墓の存在が確認できた.これにより,東は民楽県から西は敦煌市に至る河西地域の西部では,ほぼ全部の市県で画像磚墓が築造されたことが明らかになった.また従来,画像磚墓の存在が知られていなかった張掖市でも,早い時期に線刻の画像磚が作製されていたらしいことが博物館に展示中の磚から判明した.と同時に,後漢型鎮墓瓶の存在も確認できた.このほか,金昌市博物館では,一部紹介されている画像磚の全体像を把握することができた.ただ盗掘品の可能性が高く,出土地は金昌市域以外である可能性が高い.なお玉門市では,喪葬文物が出土した清泉郷や花海鎮を巡検した.2)これらの成果は,2018年10月に開催された研究打合せ会で総括を済ませ,現在研究代表者が編集中の『河西魏晋墓出土磚画・壁画索引』(今年度刊行予定)に反映させる予定である.また研究代表者と研究分担者の町田が編集中の論集『磚画・壁画からみた魏晋時代の河西』(現在校正中)に寄稿しているプロジェクトのメンバーの個別論文にも一部取り込まれている.3)2018年度も含め,今までの研究活動で獲得することができた個別的な知見は,研究代表者の個人ブログ(http://sekio516.exblog.jp)で断続的に発信中である.主たるフィールドにしている河西地域の主要な博物館は全て閲覧することができ,またそれにより新たな知見を得ることができたため,この評価を下した.本研究課題は2019年度が最終年度であるため,小規模な補充調査を行なう以外は,成果の取りまとめに入る.1)現在編集中の『河西魏晋墓出土磚画・壁画索引』をはじめ,『河西出土鎮墓瓶集成』など河西地域出土の喪葬文物およびその関連文物の索引・集成の刊行に向けた準備を加速化させる.2)プロジェクトメンバーの研究成果を集めた論集『喪葬文物からみた魏晋時代の河西地域』の執筆準備に着手する.3)1)・2)のために,プロジェクトの母体になった西北出土文献研究会を開催し,喪葬文物のうち,文字資料の読解を進めると同時に,プロジェクト外の研究者を招聘して研究発表を企画する.本研究計画は,具体的なフィールドを設定し,そこにおける調査活動を通じて研究題目に掲げた課題の解明を目ざしている.初年度は,2016年8月に,河西地域の各地の遺跡を巡検し,さらに博物館の閲覧調査を実施した.具体的には,敦煌佛爺廟の画像磚墓,酒泉丁家閘5号墓と西涼王陵などの遺跡,敦煌市博物館,嘉峪関長城博物館,酒泉粛州区博物館,高台県博物館,甘粛省文物考古研究所,および甘粛省博物館などの博物館である.これにより,河西地域の一般的な状況を把握することができた.これを踏まえて,2017年3月に高台県博物館を再訪し,展示中の文物を対象とした悉皆的な閲覧調査を敢行し,博物館関係者に聞き取り調査を行なった上で,県内のおもだった遺跡(駱駝城址・許三湾城址とその周辺の古墓群など)の巡検を行なった.さらに河西地域との比較を目的として,祁連山脈により河西と隔てられている青海地域の画像磚を調べるために青海省博物館の參觀も行なった.高台県博物館を再訪したのは,高台県の古墓からは,画像磚の他にも,簡牘・帛書・鎮墓瓶・木板画・帛画といった各種の文物が出土しており,多様かつ多数の喪葬文物に恵まれていることが最大の理由である.また木製品や紋様陶器などにも見るべきものがあることがわかった.ただし,発掘報告書が未刊であるため,これらの多くは具体的な年代を特定できないばかりか,出土墓さえ不明確なものがほとんどというのが現実である.喪葬文物の組合せを復元しない限り,課題の解明は望めない.そのために関連する情報やデータを収集・整理することに注力中で,その成果は可及的速やかに公表する予定である.また高台県以外の,敦煌や酒泉・嘉峪関についても,あらためて可能な範囲で喪葬文物に関する情報やデータを収集・整理を進める予定である.当初より主たるフィールドに予定していた河西地域の主要な遺跡や博物館を訪問することができ,またその中で高台県に焦点を絞ることができたことは自己評価できる.また科研のメンバーによる研究報告を公表することを目的として,西北出土文献研究会を立ち上げ,第1回例会を開催することができた(2017年2月11日,於桜美林大学淵野辺キャンパス,關尾「河西地域の魏晉・〈五胡〉時代文物に関する近年の諸成果について」).今後も継続して開催し,報告を随時用意できるようにしたい.

1)本研究計画は,域圏論の視点から,中国古代の地域社会像を構築するために,河西地域(現・甘粛省の西部)を主たるフィールドとして喪葬文化圏を措定することを目ざしている.2017年度は,河西地域からの漢族の移動により成立したトゥルファンやクチャ(現・新疆ウイグル自治区)を対象とし,両地の喪葬文化の出土資料を現地で実見することを主眼とした.訪問先は,新疆ウイグル自治区博物館(ウルムチ),新疆文物考古研究所(同),トゥルファン市博物館(トゥルファン),アスターナ古墓群(同),クチャ博物館(クチャ),クチャ雕磚墓出土地(同)などであった.2)ウルムチとトゥルファンの博物館においては,高昌郡時代のトゥルファンにおける喪葬文化を象徴する随葬衣物疏をはじめ,各種の出土資料を諸博物館で実見した.さらに新疆文物考古研究所においては,楼蘭の喪葬文化を象徴する棺を実見することができた.その特異な画像の分析を進めている.またクチャでは,河西地域に属す敦煌の雕磚の系譜を引く雕磚墓が出土した現地を訪問し,出土地とその範囲を確認した.またクチャにおける今後の遺構・遺物の整理予定についても,情報を収集することができた.3)前年度の調査結果については,甘粛省の高台県域の古墓群とそこから出土した各種の喪葬文物(画像磚・木板画・墓券・随葬衣物疏・柩銘・鎮墓瓶・木製品など,高台県博物館の所蔵品を中心とした)に関する情報やデータを収集し,その整理を行った.結果については,すでに文章化して,抽印やPDFを配布中である.中国における出土文物の管理が厳重になっており,ウルムチやトゥルファンでは撮影や計測などを含めた十分な調査を行なうことができなかった.またクチャでは博物館の建造・整備計画が遅延しており,目的を果たせなかった.1)2018年夏に現地調査を挙行した.主たるフィールドとしている中国甘粛省の河西地域において,敦煌市博物館・玉門市博物館・金昌市博物館・張掖市(粛州区)博物館において,公開中の喪葬文物の実見・撮影に従事した.その結果,玉門市博物館・張掖市博物館では,新たな画像磚をはじめとする多くの文物の存在を確認できた.とくに玉門市博物館では,墓自体の詳細は不詳ながら,未知の画像磚墓の存在が確認できた.これにより,東は民楽県から西は敦煌市に至る河西地域の西部では,ほぼ全部の市県で画像磚墓が築造されたことが明らかになった.また従来,画像磚墓の存在が知られていなかった張掖市でも,早い時期に線刻の画像磚が作製されていたらしいことが博物館に展示中の磚から判明した.と同時に,後漢型鎮墓瓶の存在も確認できた.このほか,金昌市博物館では,一部紹介されている画像磚の全体像を把握することができた.ただ盗掘品の可能性が高く,出土地は金昌市域以外である可能性が高い.なお玉門市では,喪葬文物が出土した清泉郷や花海鎮を巡検した.2)これらの成果は,2018年10月に開催された研究打合せ会で総括を済ませ,現在研究代表者が編集中の『河西魏晋墓出土磚画・壁画索引』(今年度刊行予定)に反映させる予定である.また研究代表者と研究分担者の町田が編集中の論集『磚画・壁画からみた魏晋時代の河西』(現在校正中)に寄稿しているプロジェクトのメンバーの個別論文にも一部取り込まれている.
メタファーの新しい理論的分析の試みと20世紀ドイツ文学-認知心理学・現代システム論の見知から-

本研究の目的は、古典的修辞学の隠喩論の視点を再検討しつつ、メタファーという現象を現代の新しい理論から捉え直すことによって、その現代的な意味を考察すること、ならびに20世紀のドイツ文学を中心に具体的な事例研究をすることにあった。メタファーにおける意味の「ずれ」というものを基本的な観点としながら、アリストテレスからリクールに至る古典的理論および現代ドイツ文学・美学における隠喩現象の再整理を進める一方,これらが認知理論,コンピュータにおける情報処理技術,オートポイエーシス等のシステム論などの現代諸理論の文脈においていかなる意味と可能性を持つのかについての研究を進めた。その結果、各分担者の研究領域において様々な観点から多くの成果が得られるに至った。まず,古典的な隠喩論の文脈からいえば,中性から現代に至る新たな隠喩史としての光/自然のトポス論,リクールの隠喩論における意味の生成機能と字義という概念装置の有効性批判,ムジルやプルーストに見られる比喩表現の新たな境界設定の可能性,ベンヤミンのアレゴリー論のメタファー機能からの読み直し等、また20世紀美学の隠喩現象については,ダダイズムの隠喩的意味生成論、美術における隠喩,寓意,アレゴリーという技法の新たな関係性の解析等、最後に現代諸理論との直接的な関係性の研究成果として,ルーマンの社会システム論における意味概念とメタファー機能の同一性の分析,認知過程における隠喩的転義機能の重要性、コンピュータにおけるメタファー的記号処理過程の分析、デリダの新しい記号論における隠喩の両義佳の解読,ハーバマスのコミュニケーション理論における合意形成とメタファーの役割等を挙げることができる。なおこれらの研究は研究成果報告論集『メタファー-現代の諸理論からの考察』としてまとめられているので,詳細はそちらを参照されたい。今年度は研究計画に従い、メタファーという現象の生成メカニズムを現代的かつ包括的な理論的枠組によって捉え直してみる作業を中心に研究が進められた。まず、1)現代システム理論の観点からいえば、メタファーの生成メカニズムがオートポイエシス・システムにおける自己制作プロセスと多くの点で類似性があることが確認された。すなわち、従来レトリックの分野で「自己比喩」あるいは「意味の創出的作用」と呼ばれてきたものが、オートポイエシスにおけるシステム要素の自己産出ネットワークの構造からかなりの程度説明可能である、という知見である。また、これと関連して、フッサールの現象学やデリダのテクスト論等も、異なる術語を用いてはいても、同様の問題意識を共有していることも明らかにされた。一方、2)認知科学的視点からの研究においては、人工知能やコンピュータにおけるメタファー現象の処理過程の基礎的な検討により、インターフェイスあるいはコミュニケーションとしてのメタファー機能という可能性が浮上してきている。これは従来のメタファー=転義という概念装置に根本的な変更を迫る知見ともなりえるもので、次年度、より詳細な検証が予定されている。また、上記の新しい理論的研究に加えて、従来のメタファー研究の系譜(ヴァインリヒ、ビアズリ-、リク-ル、レヴィン、佐藤信夫、等)にも再検討が加えられ、新たな理論的な枠組での読み換え作業が進行中であり、その成果は次年度以降にまとめられる予定である。今年度は研究計画に従い、昨年度に行われたメタファーという現象の生成メカニズムを現代的かつ包括的な理論的枠組によって捉え直してみるという作業の成果をもとにして、具体的なテクストについての研究が進められた。扱われたテクストは今世紀初頭から現代の文学テクスト・批評テクストを中心にしながらきわめて多岐に渡ったが、その成果の主なものをここにまとめておく。1)ブルーストにおける隠揃喩と換喩:この今世紀を代表する′

物語作者の創作の中核には、記憶をテクストとして定着させるためのシステムとしての比喩的な言語連鎖(要素の自己産出)という方法論が見られるが、その比喩の形式は、隠喩という通時的な系列と換喩という共時的な系列とが巧妙に組み合わされたものであることが明らかになった。2)ベンヤミンにおけるアレゴリーとシンボル:一方、現代の批評テクストの先駆けとなったベンヤミンのエッセイ群には、独自の歴史哲学に基づいたアレゴリーとシンボルの交差が見られるが、それらが方法論としてはメタファーとメトニミーの交差という言語的なシステムとパラレルな関係にあることが認められた.3)また、そのほかにも、ランスマイヤー、村上春樹等の同時代の作家の物語、あるいはキーファ一等の芸術家の作品、さらには先端コンピュータ技術におけるオブジェクト指向という現象などにも、システム論を中心とする新しいメタファ一論との相関関係が認められるのではないかという知見を得ることができた.これらのテーマは本研究課題の最終年度である来年度において、論文としてまとめられ、公刊される予定である。本年は最終年度として、隠喩に関する古典的諸理論の再検討および主に20世紀ドイツ文学・美学における隠喩現象の再整理を進める一方、これらが認知理論、コンピュータにおける情報処理技術、オートポイエーシス等のシステム論、コミュニケーション合理性などの現代諸理論の文脈においていかなる意味と可能性を持つかについての研究を進めた。その結果、各分担者の研究領域において様々な観点から多くの成果が得られるに至った。まず、古典的な隠喩論の見直しという文脈からいえば、中世から現代に至る新たな隠喩史としての光/自然のトポス論、リクールの隠喩論における意味の生成機能と字義という概念装置の有効性に対する批判、ムジルやプルーストに見られる比喩表現の新たな境界設定の可能性、ベンヤミンのアレゴリー論のメタファー機能からの読み直しなどが挙げられる。また、20世紀美学の隠喩表現については、ダダイズムの隠喩的意味生成論からの再評価、美術における隠喩、寓意、アレゴリーという技法の新たな関係性の解析などがおこなわれた。最後に現代諸理論と隠喩との直接的な関係性の研究成果として、ルーマンの社会システム論における意味概念とメタファー機能の同一性の分析、人間の認知過程における隠喩的転義機能の重要性の解明、コンピュータにおけるメタファー的記号処理過程とインターフェイスの分析、デリダの新しい記号論における隠喩の両義性の解読、ハーバマスのコミュニケーション理論における合意形成とメタファーの役割などを挙げることができる。なおこれらの研究は研究成果報告論集『メタファー-現代の諸理論からの考察』としてまとめられているので、詳細はそちらを参照されたい。
卵成熟課程におけるXdazlの機能

(1)卵成熟過程でXdazl蛋白質はリン酸化される。Xdazl蛋白質のアミノ酸配列中には、MAPキナーゼの認識配列が存在することから、リン酸化がMAPキナーゼによるものか否かを確かめた。MAPキナーゼカスケードの上流に位置する、Mekを特異的な阻害剤U0126で阻害した後、プロゲステロンにより卵成熟を誘導したところ、活性型のMAPキナーゼは存在しないにも関わらず、Xdazl蛋白質のリン酸化が起きた。従って、Xdazl蛋白質の卵成熟過程におけるリン酸化は、MAPキナーゼによるものではないとの結論を得た。現在、卵成熟過程で活性化する他のリン酸化酵素の影響を検討している。(2)Xdazl蛋白質は、cdc25 mRNAと結合し、その翻訳を制御していると考えられている。ツメガエルcdc25には、3種のサブタイプ(cdc25A、cdc25B、cdc25C)の存在が知られているが、Xdazl蛋白質がそのいずれと結合するのかを明らかにするため、それらの3'-UTRをプローブにしてUV-crosslinkingを行った。その結果、Xdazl蛋白質は、cdc25Aの3'-UTRと強い結合をし、cdc25B3'-UTRとは結合せず、cdc25C3'-UTRとは、弱い結合力を持つことが分かった。また、Xdazl蛋白質はXdazl mRNAの3'-UTRとも強い結合を示した。更に、他のmRNAとの結合を調べるため、抗Xdazl抗体を用い、卵抽出液からXdazl蛋白質-mRNA複合体の免疫沈降を試みた。回収したmRNAをテンプレートにして、種々のプライマーでRT-PCRを行ったところ、cdc25は検出されず、wee1が検出された。卵母細胞中でXdazl蛋白質がwee1 mRNAの翻訳調節に関与しているとの報告はこれまでには無く、現在さらなる解析を進めている。1.以下の2つの手法を用いて、Xdazl蛋白質が結合するRNAの特定を目指した。(1)SELEX法による、in vitroでのRNA選別ランダムな25塩基の配列を持つRNAプールを合成し、GSTタグの付いたXdazl組換え蛋白質(GST-Xdazl)と反応させた。GSTタグを利用してGST-Xdazl蛋白質とRNAの複合体を反応液から回収し、結合しているRNAを抽出、cDNAに逆転写してPCRで増幅した。増幅したcDNAは次のサイクルのRNA合成の鋳型として用い、RNAの選別を繰り返した。7サイクルの選別を行った後、得られたcDNAの塩基配列を決定し、Xdazl蛋白質が結合するRNAに共通の塩基配列を決定した。(2)免疫沈降法による、ツメガエル卵細胞からのmRNAの精製抗Xdazl抗体を用いた免疫沈降法により、ツメガエル卵母細胞からXdazl蛋白質に結合しているRNAを直接回収し、クローニングした。得られたcDNA断片の塩基配列をデータベース検索し、ターゲットとなるmRNAの候補を幾つかに絞り込んだ。現在、候補としてあげたmRNAと、Xdazl蛋白質との結合可能の有無を、UV-crosslink法で確認する作業を進めている。更に、変異を入れたmRNAに対する結合能の変化を調べ、Xdazl蛋白質のターゲットとなるmRNAの特定を目指す。2.成熟卵型のXdazl蛋白質(分子量40kDa)を脱リン酸化処理すると、未成熟卵型と同じ37kDaに戻った。また、未成熟卵型のXdazl蛋白質を脱リン酸化処理しても、移動度に変化は無かった。従って、卵成熟に伴うXdazl蛋白質の修飾は、リン酸化による。現在、RNA結合力に及ぼすリン酸化の影響をin vitroの系で調べている。

回収したmRNAをテンプレートにして、種々のプライマーでRT-PCRを行ったところ、cdc25は検出されず、wee1が検出された。卵母細胞中でXdazl蛋白質がwee1 mRNAの翻訳調節に関与しているとの報告はこれまでには無く、現在さらなる解析を進めている。
カテコラミン誘発多形性心室頻拍患者より検出した新規TRPM4遺伝子異常の検討

カテコラミン誘発性多形性心室頻拍は、交感神経緊張時に心室頻拍・細動を引き起こし、突然死の原因となる遺伝性疾患である。同疾患と診断された5歳男児より新規TRPM4遺伝子異常を検出し、電気生理学的機能解析を施行し、遺伝子変異によるTRPM4電流の変化を検討した。その結果、細胞内カルシウムイオンが1μMでは電流の変化を認めなかったが、10μMでは低下を認めた。また、細胞膜でのチャネル発現量を比較したが、遺伝子変異のよる変化を認めなかった。これらの結果より、電流変化の原因として、遺伝子変異によりカルシウムイオン感受性が変化している可能性が考えられた。カテコラミン誘発多形性心室頻拍(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia、CPVT)は、交感神経緊張時に2方向性もしくは多形性心室頻拍が誘発され、心室細動に移行し、失神や突然死の原因となる致死的な疾患であり、特に小児期の突然死の原因として重要な疾患の1つである。CPVTと診断された患者の遺伝子解析より、TRPM4遺伝子異常を検出し、同遺伝子異常によるTRPM4電流の変化について研究した。症例は、5歳男児で、涕泣した際に多形性心室頻拍を認められ、遺伝子解析の結果、TRPM4遺伝子異常を検出された。TRPM4チャネルは6回膜貫通型であるが、患者より検出された遺伝子異常は第6番目の膜貫通領域に存在する。まず、他の研究施設よりTRPM4のプラスミドを入手し、ミュータジェネシスを施行し、CPVT患者より検出したTRPM4変異遺伝子のプラスミドを作成した。次に、Human Embryonic Kidney cell (HEK細胞)にTRPM4のプラスミドをトランスフェクションし、TRPM4チャネルを発現させ、ホールセル・パッチクランプ法にを用いた電気生理学的機能解析により、TRPM4電流を観察した。その結果、変異遺伝子のヘテロ、ホモ強制発現系のいずれにおいても、正常TRPM4と比較してTRPM4電流量の減少を認められ、この変異遺伝子はdominant negative効果を示すと考えられた。この結果について学会発表を準備しており、この電流変化のメカニズム、表現系への影響について解析を進めている。TRPM4のプラスミドを入手し、ミュータジェネシスによる変異プラスミドを作成できた。その後、ホールセル・パッチクランプ法にてTRPM4電流を記録できており、TRPM4遺伝子変異において電流変化を認め、CPVTの原因となっている可能性が考えられた。その原因解明や薬剤での変化など、検討を進めており、おおむね順調と考えられた。また、患者と患者の家族より、患者由来iPS細胞樹立について同意を得られていないため、疾患特異的iPSを用いた研究は不可能であった。カテコラミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)は、小児期の突然死の原因となる疾患の一つである。同疾患と診断された5歳男児の遺伝子スクリーニングにより検出した新規TRPM4遺伝子変異について検討した。HEK細胞にTRPM4チャネルを発現させ、ホールセル・パッチクランプ法を用いて、コントロールと変異のTRPM4電流を比較したところ、変異では電流量の減少を認めた。そのため、この電流変化の機序、表現型に与える影響について検討することとした。まず、電流減少の機序について検討した。その原因として、細胞膜でのTRPM4チャネル発現量が減少している可能性が考えられたため、HEK細胞にTRPM4を発現させ、ビオチン標識し、ウェスタンブロットを施行したところ、チャネル発現量はコントロールと変異において有意差を認めなかった。また、TRPM4チャネルは、カルシウム感受性が知られており、遺伝子異常によりカルシウム感受性が変化している可能性が考えられたため、インサイド-アウト法によるパッチクランプを施行したところ、コントロールと変異において有意差を認めなかった。これらの結果より、この変異による電流の原因として、細胞膜のチャネル量の変化、カルシウム感受性の変化は否定的であることが判明した。次に、TRPM4遺伝子変異と表現型との関連について研究することとした。患者の表現型はCPVTであるため、HEK細胞にTRPM4チャネルを発現させ、ホールセル・パッチクランプ法を用いてイソプロテレノールによるTRPM4電流の変化について比較、検討する方針としており、この実験は現在進行中である。これらの結果が整い次第、論文投稿する予定である。ホールセル・パッチクランプ法での解析により、TRPM4遺伝子変異によりTRPM4電流の減少を認めた。その原因として、TRPM4チャネルのコンダクタンスの低下や、細胞内カルシウムイオンに対する感受性の低下などが考えられたため、ホールセル・パッチクランプ法と同様に、HEK細胞にTRPM4のプラスミドをトランスフェクションし、インサイド-アウト・パッチクランプ法を用いることにより、そのメカニズムの解明を計画している。

また、CPVT患者においてTRPM4遺伝子異常を検出したため、TRPM4電流のカテコラミンによる影響を評価する必要があると判断し、TRPM4の正常、もしくは、変異遺伝子を強制発現させたHEK細胞を用いて、イソプロテレノールによるTRPM4電流変化を検討する予定である。疾患特異的iPS細胞由来心筋細胞を用いた研究が不可能であったため、シミュレーションを用いて、TRPM4電流変化による表現系への影響を評価できないか検討している。内科系臨床医学患者由来の疾患特異的iPS細胞を樹立し、心筋細胞に分化誘導し、解析することを予定していたが、患者や家族の同意が得られず、その研究ができなくなったため、未使用額か生じたと考えられる。細胞膜へのチャネルの発現量の検討、細胞培養、パッチクランプに用いる試薬など物品費への使用を予定している。また、成果発表のための旅費、論文関連費用(英語校閲費、投稿料、別刷り代)として用いることも予定している。
漢方薬の脳機能改善作用の解析-神経新生やエピジェネティクス制御を指標とした解析

本研究では、加味温胆湯、帰脾湯など古くから神経・精神疾患に臨床応用されてきた漢方処方の薬効を、精神疾患モデル動物を用いて行動薬理学的な手法により確認するとともに、薬効発現機序の科学的な分子基盤をエピジェネティクスや神経新生(ニューロジェネシス)の制御機構などに注目して解析おこなった。行動薬理学的解析から、慢性マイルドストレス負荷やコルチコステロン投与によるうつ様行動に対して、加味温胆湯、加味帰脾湯、オンジエキスの投与が改善作用を有することを明らかとした。またオンジエキスを投与したマウス海馬において、GDNF発現増強や神経樹状突起スパイン数の増加が観察された。平成26年度は環境ストレス負荷マウスや長期隔離飼育マウスなどの精神疾患モデルマウスを用いて行動薬理学的手法により加味温胆湯の薬効を動物実験レベルで確認を行った。また作用の分子基盤の解析については、神経新生への影響を免疫組織化学的手法により検討を行った。環境ストレス(傾斜ゲージストレス、汚物ゲージストレス、振盪ストレス)を負荷した動物に加味温胆湯(1g/kg)を10日間投与し、うつ様行動を強制水泳試験における無動時間を指標に検討を行った。その結果、加味温胆湯の投与は、SNRIであるミルナシプランと同様にストレスにより延長した無動時間を有意に短縮した。またチミジンアナログであるBrdUの取り込みを指標に加味温胆湯投与後の神経系前駆細胞の挙動を解析したところ、ストレス負荷マウスやコルチコステロン負荷マウスで観察されるBrdU取り込み細胞の減少は、加味温胆湯投与群では有意に抑制されていた。またこれらの精神疾患モデル動物で観察される新生ニューロン数の減少に関して、BrdU取り込み細胞と成熟ニューロンのマーカーであるNeuNや未熟ニューロンのマーカーであるDoublecortinなどとの免疫多重染色により解析を行ったところ、加味温胆湯投与群で新生ニューロン数の有意な増加が観察された。一方、SNRIであるミルナシプランのの投与では、新生ニューロン数の増加は観察されなかった。また長期隔離飼育マウスで出現する精神異常行動に関して、エンカウンター刺激による他動行動を指標に検討したところ、加味温胆湯の投与により有意な改善作用が認められた。昨年度の結果から、環境ストレス(傾斜ゲージストレス、汚物ゲージストレス、振盪ストレス)やコルチコステロンを負荷したマウスへの加味温胆湯の経口投与が、強制水泳試験におけるうつ様行動や海馬歯状回における神経新生の異常を改善することを明らかとした。今年度は、神経新生やうつとの関連性が示唆されている脳由来神経栄養因子(BDNF)のmRNA発現量を指標に加味温胆湯及び構成生薬の1つである遠志の作用解析を行った。また加味温胆湯と同様に遠志を構成生薬として含有する帰脾湯の作用も合わせて検討した。コルチコステロン(20 or 40 mg/kg)を2週間皮下投与したマウスでは、海馬におけるBDNF mRNA発現量の有意な減少が観察された。一方、加味温胆湯、帰脾湯、及び遠志エキスを経口投与したマウスにおいては、BDNF mRNA発現量は対照群と同等レベルまで回復した。また帰脾湯投与動物の海馬歯状回における神経新生を評価したところ、帰脾湯投与群においてコルチコステロンによる神経新生の低下が明らかに減弱された。一方、遠志エキスの投与は神経新生には影響を及ぼさなかった。また隔離飼育マウスで認められる多動反応に対して加味温胆湯の投与が改善効果を示したが、多動反応の発現に関連が深いと推測される背側縫線核のGABAB1a mRNAの発現には変化は認められなかった。昨年度の検討から、神経新生促進作用、抗うつ様作用を加味温胆湯が有することを見いだしたが、これの制御への関連性が示唆されるBDNFの発現が加味温胆湯投与動物の海馬で増加していることを明らかに出来た。隔離動物を用いた解析では、加味温胆湯のエピジェネティクスへの作用を解析する予定であったが、GABAB1Aの発現に変化が認められなかったため、投与量、投与期間などを再考することにした。コルチコンステロン慢性投与による海馬歯状回の神経新生の減少に対する帰脾湯エキス、およびオンジエキスの作用について解析したところ、帰脾湯投与群において神経新生の回復が認められた。一方、オンジエキスの投与は、コルチコステロンによる神経新生の減弱に影響を及ぼさなかった。コルチコンステロン投与マウスの海馬歯状回ではスパイン数の減少が観察されたが、オンジエキスの投与はこれを回復させたが帰脾湯投与群では変化は認められなかった。。前年度の解析から、コルチコステロン投与動物において海馬でのBDNF mRNA発現量が減少すること、またその減少が加味温胆湯の投与により回復する現象を見出した。今年度は帰脾湯や構成生薬のオンジの投与で同様のBDNF mRNA発現効果が得られるか検証するとともに、GDNF,NGF, VEGF, IGF, FGF2,及びNT-3など神経新生の調節に重要とされる因子についても発現解析を行った。GDNF, FGF2, VEGFのmRNA発現は、2週間のコルチコステロンの反復投与により有意に減少した。またBDNF, NGF, IGF1, NT-3のmRNA発現は減少傾向がみられた。帰脾湯の投与は、いずれの因子のmRNA発現量にも影響を及ぼさなかったが、オンジ投与動物の海馬においてGDNF

発現量の有意な回復が観察された。GDNFmRNA発現増強作用を有するオンジ中の有効成分を明らかとするため、オンジエキスの分画をおこない、培養アストロサイトへの作用を指標に解析を行った。その結果、サポニンを多く含む画分において、最も強いGDNF発現増強作用が観察された。本研究では、加味温胆湯、帰脾湯など古くから神経・精神疾患に臨床応用されてきた漢方処方の薬効を、精神疾患モデル動物を用いて行動薬理学的な手法により確認するとともに、薬効発現機序の科学的な分子基盤をエピジェネティクスや神経新生(ニューロジェネシス)の制御機構などに注目して解析おこなった。行動薬理学的解析から、慢性マイルドストレス負荷やコルチコステロン投与によるうつ様行動に対して、加味温胆湯、加味帰脾湯、オンジエキスの投与が改善作用を有することを明らかとした。またオンジエキスを投与したマウス海馬において、GDNF発現増強や神経樹状突起スパイン数の増加が観察された。今年度は既に予備的検討で薬理活性を見出していた加味温胆湯の作用について行動薬理学的検討を中心に再現性の確認を行ったが、概ね期待通りの結果を得ることが出来た。本検討では、多動行動をに対する抑制作用が既に報告されている抑肝散という漢方処方についても検討を行い、加味温胆湯の作用との比較を行う予定であったが、抑肝散は我々が用いた隔離飼育動物に対しては改善作用を示さなかったことから、来年度以降の研究対象からは外すことにした。基本的に平成27年度の実験計画の延長線上の研究を行うが、エピジェネティクス制御に及ぼす漢方薬の作用解析に注力する。具体的には、海馬、視床下部、大脳皮質前頭前野、背側縫線核において、DNAメチル化酵素やヒストンアセチル化酵素などのエピジェネティクス関連分子の発現をreal-time PCR法、ウエスタンブロット法などにより網羅的に解析を行う。また、異常行動との関連性が指摘される遺伝子群のピロモーター領域を単離し、そのメチル化の度合をバイサルファイトシークエンス法により解析を行う。これらの解析を西洋薬の作用と比較することで、漢方薬と西洋薬の作用の差別化を図る。天然物薬理学基本的に平成26年度の実験計画の延長線上の研究を行うが、エピジェネティクス制御に及ぼす漢方薬の作用の解析に着手する。環境ストレスの負荷や長期隔離飼育により出現する精神異常行動にエピジェネティクスが関与するかどうかを明らかとするとともに、加味温胆湯の治療効果との関連性について評価を行う。具体的には、海馬、視床下部、大脳皮質前頭前野、背側縫線核において、DNAメチル化酵素やヒストン脱アセチル化酵素などのエピジェネティクス関連分子の発現をreal-time PCR法、ウェスタンブロット法などにより網羅的に解析を行う。また、異常行動との関連性が指摘される遺伝子群のプロモーター領域を単離し、そのメチル化の度合いをバイサルファイトシーケンス法により解析を行う。エピジェネティクス解析において期待していた結果が得られなかったため、シークエンス費用が想定額より少なかった。今年度は、ほぼ計画通り研究が遂行したため研究費の使用額も概ね想定通りであったが、次年度以降に始めるエピジェネティクス解析に必要な額を確保するために若干の研究費を翌年度以降にまわした。
変異aprataxin cDNA導入培養ラット末梢神経における軸索障害

Friedrich失調症に類似し小脳萎縮、末梢神経障害、眼球運動失行、低アルブミン血症を示す疾患(EOCA-HA)をKoeingらとの共同研究で原因遺伝子aprataxinを同定した。EOCA-HAの3家系6例全てにaprataxin遺伝子変異689insTをhomozygoteに見いだした。今回見いだされたaprataxin遺伝子変異689insTが末梢神経の発生過程で軸索変性への関与を培養神経系を用いてaprataxin遺伝子および蛋白発現を解析した。689insT変異aprataxin cDNAの作製はPCRによるsite-directed mutagenesis法を用い689insT変異aprataxin cDNAを作製した。組み換えアデノウイルス作製はGrahamらの系を用い野生型と689insT変異apratxin cDNAが挿人されたアデノウイルベクターを得た。ラット培養神経細胞の作製は、胎生16日の胎児ラットの後根神経節を用いた。髄鞘形成は坑Po抗体を用いてavidin-biotin-peroxidase法にて確認した。培養神経細胞に689insT変異aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスと野生型aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスを感染させ、髄鞘形成、軸索を免疫組織化学および電顕を用いて形態学的に解析した。結果:野生型aprataxin cDNA導入神経と変異aprataxin cDNA導入神経との間に軸索のsprouting、髄鞘形成には、差を認めなかった。電顕所見では、髄鞘の形成異常および軸索の変性所見は、両者に認めなかった。少なくとも、末梢神経の初代培養では、変異aprataxin遺伝子が末梢神経障害を示唆する所見は認めなかった。EOCA-HAの症例は4および5歳頃から小脳失調が出現し徐々に増悪し歩行不能になる。20歳頃より、末鞘神経障害を示唆する遠位筋群の筋力低下と筋萎縮、知覚が出現し進行する。その病理過程は軸索変性である。今回、用いた神経培養は初代培養より、神経発生早期の段階では異常を認めなかった。今後、変異aprataxin cDNAを導入したtransgenic mouseを作製して、成熟した神経の段階での変性所見の有無の解析が必要である。Friedrich失調症に類似し小脳萎縮、末梢神経障害、眼球運動失行、低アルブミン血症を示す疾患をKoeingらとの共同研究で原因遺伝子aprataxinを同定した。EOCA-HA6例全てにaprataxin遺伝子変異689insTをhomozygoteに見いだした。今回見いだされたaprataxin遺伝子変異689insTが末梢神経の発生過程で軸索変性への関与を培養神経系を用いてaprataxin遺伝子および蛋白発現を解析することを目的とした。689insT変異aprataxin cDNAの作製はPCRによるsite-directed mutagenesis法を用い689insT変異aprataxin cDNAを得た。組み換えアデノウイルス作製はGrahamらの系を用い野生型と689insT変異apratxin cDNAが挿入されたアデノウイルベクターを得た。ラット培養神経細胞の作製は、胎生16日の胎児ラツトの後根神経節を用いた。

培養神経細胞に689insT変異aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスと野生型aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスを感染させ、培養神経細胞の軸索の微細構造は電顕を用いて解析し、抗aprataxin抗体を用いた免疫組織化学とwestern blotにてaprataxin蛋白の発現を解析する。Friedrich失調症に類似し小脳萎縮、末梢神経障害、眼球運動失行、低アルブミン血症を示す疾患(EOCA-HA)をKoeingらとの共同研究で原因遺伝子aprataxinを同定した。EOCA-HAの3家系6例全てにaprataxin遺伝子変異689insTをhomozygoteに見いだした。今回見いだされたaprataxin遺伝子変異689insTが末梢神経の発生過程で軸索変性への関与を培養神経系を用いてaprataxin遺伝子および蛋白発現を解析した。689insT変異aparataxin cDNAの作製はPCRによるsite-directed mutagenesis法を用い689insT変異aprataxincDNAを作製した。組み換えアデノウイルス作製はGrahamらの系を用い野生型と689insT変異apratxin cDNAが挿入されたアデノウイルベクターを得た。ラツト培養神経細胞の作製は、胎生16日の胎児ラツトの後根神経節を用いた。髄鞘形成は坑Po抗体を用いてavidin-biotin-peroxidase法にて確認した。培養神経細胞に689insT変異aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスと野生型aprataxin cDNAを組み込んだアデノウイルスを感染させ、髄鞘形成、軸索を免疫組織化学および電顕を用いて形態学的に解析した。結果:野生型aprataxin cDNA導入神経と変異aprataxin cDNA導入神経との間に軸索のsprouting、髄鞘形成には、差を認めなかつた。電顕所見では、髄鞘の形成異常および軸索の変性所見は、両者に認めなかつた。少なくとも、末梢神経の初代培養では、変異aprataxin遺伝子が末梢神経障害を示唆する所見は認めなかった。EOCA-HAの症例は4および5歳頃から小脳失調が出現し徐々に増悪し歩行不能になる。20歳頃より、末鞘神経障害を示唆する遠位筋群の筋力低下と筋萎縮、知覚が出現し進行する。その病理過程は軸索変性である。今回、用いた神経培養は初代培養より、神経発生早期の段階では異常を認めなかつた。今後、変異aprataxin cDNAを導入したtransgenic mouseを作製して、成熟した神経の段階での変性所見の有無の解析が必要である。