hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料の探索

本研究では、異常ネルンスト効果は温度勾配によって発生したスピン流の逆スピンホール効果であるという仮説に基づいて、室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料の探索を行った。具体的には、高い磁気異方性を示すFePtに代表されるL10型規則合金と高いスピン分極率を有するハーフメタルホイスラー合金に着目した。これらの材料の異常ネルンスト効果およびスピンゼーベック効果を測定してその結果を系統的に整理することにより、2つの効果の関係を明らかにし、室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料創製の指針を得た。本研究では、異常ネルンスト効果は温度勾配によって発生したスピン流の逆スピンホール効果であるという仮説に基づいて、室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料の探索を行う。具体的には、高い磁気異方性を示すFePtに代表されるL1_0型規則合金と高いスピン分極率を有するハーフメタルホイスラー合金に着目し、物質依存性を系統的に研究する。最終的には、室温で巨大な異常ネルンスト効果を実現するための材料創製の指針を得ることを目標とする。今年度は、まず異常ネルンスト効果を定量的に評価する装置を作製した。垂直磁化を有する薄膜の膜面垂直方向に磁化を印加することができる電磁石を準備し、マイクロプローブを複数設置し、薄膜表面にタングステン探針を接触させる装置を作製した。同時に、薄膜の一端にヒータを備え付け、両端間に熱勾配を発生させることにより、熱流を印加する機構を作製した。この装置を用いてL1_0型FePt薄膜の異常ネルンスト効果を室温で測定したところ、起電力を確認することができた。その電圧の大きさは熱勾配の大きさに比例して増加することを確認し、異常ネルンスト効果に起因した起電力であることが分かった。また、異常ネルンスト効果のFePt膜厚依存性を調べたところ、膜厚1040nmの範囲ではその大きさはほとんど変化しないことが分かった。これらの結果は、室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料の探索に向けた知見となるものである。今年度は、L1_0型FeNi薄膜の磁気異方性エネルギー依存性を調べた。FeNi薄膜作製時の基板温度を変化させることにより、磁気異方性エネルギーを3×10^6erg/cc3×10^7erg/cc程度変化させた。これらの薄膜の異常ネルンスト効果を測定したところ、磁気異方性エネルギーの増加に従って異常ネルンスト電圧の大きさは減少することが分かった。この結果は、異常ネルンスト効果の発現にスピン波が寄与していることを示唆している。また、高いスピン分極率を有するハーフメタルホイスラー合金材料「Co_2MnSi」薄膜における熱流磁気効果を系統的に調べた。面内磁化膜であるCo_2MnSiの片端にPtバーを取り付け、磁化と同方向に熱勾配を印加したところ、Ptバーの両端間に、スピンゼーベック効果に加えて付加的な電圧を観測した。これは、膜面垂直方向に生じた熱勾配によって生じた異常ネルンスト効果に起因する電圧であることが分かった。同様な効果をパーマロイ薄膜においても確認することができた。これらの結果から、室温で巨大な異常ネルンスト効果を示す材料の探索に向けた指針を示すことができた。
帯電系のための新規分子動力学法の開発と有機熱電変換材料への応用

本研究では、高分子電解質溶液系(帯電系)の分子動力学(MD:Molecular Dynamics)法を新たに開発し、これを用いて高分子電解質の溶液構造に及ぼすイオン拡散・凝縮・伝導などの効果を詳細に調べることで、近年注目される熱電変換材料の知的基盤の構築を目指す。平成29年度は高速・高精度な帯電系のMD法として期待されるLIPS/FFT法(平成28年度に本研究にて開発された、Linear-combination-based Isotropic Periodic Sum(LIPS)法と高速フーリエ変換(FFT)を組み合わせた新規の分子間相互作用計算手法)を用いて、高分子電解質溶液系のシンプルなモデル系となる水-ヘキサデカン界面系にイオンを添加した帯電系の自由エネルギー計算を行った。LIPS/FFT法はこれまで技術的に困難であった帯電系の自由エネルギーを正しく見積もることに世界で初めて成功した。高分子電解質水溶液系のような巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するためには、全原子および粗視化MDとの合理的な連携が不可欠であるが、その接続法はいまだ確立されていない。そこで、基本的な高分子溶融体について、全原子MDと低レベル粗視化MD、および高レベル粗視化MDのマルチスケール接続を試みた。高分子物性のうち代表的ないくつかの物性は良好に相互接続できることを示した。以上の知見は、高分子電解質溶液系のMDを実行するための重要な手がかりとなった。LIPS/FFT法とpH一定のMD法との組み合わせについて開発・検証を進める。また、巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するために、全原子および粗視化MDのマルチスケール接続法の開発・検証を進める。本研究では、高分子電解質溶液系(帯電系)の分子動力学(MD: Molecular Dynamics)法を新たに開発し、これを用いて高分子電解質の溶液構造に及ぼすイオン拡散・凝縮・伝導などの効果を詳細に調べることで、近年注目される熱電変換材料の知的基盤の構築を目指す。平成28年度は帯電系のMD法として期待されるLIPS(Linear-combination-based Isotropic Periodic Sum)法の高速化・高精度化に関して主にふたつのアプローチを試みた。ひとつはLIPS法に高速フーリエ変換(FFT)を組み込んだLIPS/FFT法の開発である。この手法を典型的な全原子分子系(すべての原子を取り扱う系)である水バルク系に適用し、その計算速度・精度を検証した。これにより、全原子MDにおいて十分な高速化・高精度化が達成される目処が立った。もうひとつはLIPS法と粗視化モデル(原子団を粗視化粒子に置き換えることで計算量を削減するモデル)の併用である。この手法を粗視化双性イオン膜系(リン脂質系)に適用し、その計算速度・精度を検証した。これにより、粗視化MDにおいて十分な高速化・高精度化が達成されることを確認した。高分子電解質溶液系のような巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するためには、全原子および粗視化MDとの合理的な連携が不可欠であるが、その接続法は確立されていない。そこで、基本的な高分子であるポリエチレンの溶融体について、両者を用いたマルチスケール接続を試みた。接続に必要な最小限のパラメータを特定し、粗視化MDの時間・空間スケールを合理的に定量化することができた。また、両者の乖離が発生する特徴的な時間・空間スケールを特定することができた。LIPS/FFT法の開発、およびLIPS法と粗視化モデルの併用に一定の目処が立ったため。本研究では、高分子電解質溶液系(帯電系)の分子動力学(MD: Molecular Simulation)法を新たに開発し、これを用いて高分子電解質の溶液構造に及ぼすイオン拡散・凝縮・伝導などの効果を詳細に調べることで、近年注目される熱電変換材料の知的基盤の構築を目指す。平成29年度は主に、高速・高精度な帯電系MD法としてLIPS/FFT(Linear-combination-based Isotropic Periodic Sum/Fast Fourier Transform)法を完成させ、これを広く一般に認知された高速なMD計算プログラムへと実装した。LIPS/FFT法は代表的な帯電・非帯電系において高い計算速度・精度を達成することが示された。また、LIPS/FFT法とpH一定のMD法(CpHMD)との組み合わせ(LIPS/FFT-CpHMD)について開発を行い、その完成の目処が立った。さらに、高分子電解質溶液系のような巨大分子系の大規模構造を長時間にわたり追跡するための手法として、粗視化MD(原子団の詳細な化学情報を削り、粗視化粒子に置き換えることで計算量を低減するMD)の活用を目指し、全原子MDの定量的な情報を損なうことなく粗視化MDに活用する手段の構築に取り組んだ。これらの研究・開発から得られた知見は、高速・高精度な高分子電解質溶液系のMDを実現するための重要な足掛かりとなった。LIPS/FFTの実装を予定通りに完了したため。また、LIPS/FFT-CpHMDの開発に一定の目処が立ったため。

平成29年度は高速・高精度な帯電系のMD法として期待されるLIPS/FFT法(平成28年度に本研究にて開発された、Linear-combination-based Isotropic Periodic Sum(LIPS)法と高速フーリエ変換(FFT)を組み合わせた新規の分子間相互作用計算手法)を用いて、高分子電解質溶液系のシンプルなモデル系となる水-ヘキサデカン界面系にイオンを添加した帯電系の自由エネルギー計算を行った。LIPS/FFT法はこれまで技術的に困難であった帯電系の自由エネルギーを正しく見積もることに世界で初めて成功した。高分子電解質水溶液系のような巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するためには、全原子および粗視化MDとの合理的な連携が不可欠であるが、その接続法はいまだ確立されていない。そこで、基本的な高分子溶融体について、全原子MDと低レベル粗視化MD、および高レベル粗視化MDのマルチスケール接続を試みた。高分子物性のうち代表的ないくつかの物性は良好に相互接続できることを示した。以上の知見は、高分子電解質溶液系のMDを実行するための重要な手がかりとなった。今後はLIPS/FFT法を広く一般に認知された高速なMD計算プログラムへと実装し、代表的な非帯電系および基本的な帯電系において計算速度・精度を既存手法と比較することにより、その有効性を明確に示す。同様に、LIPSと粗視化モデルとの併用についても検証を進める。次に、これらの手法とpH一定のMD法との組み合わせを検証する。また、巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するために、全原子および粗視化MDのマルチスケール接続法を開発、検証する。LIPS/FFT-CpHMDの確立を目指し、基本的なpH一定系においてその計算速度・精度を既存手法と比較し、LIPS/FFT-CpHMDの有効性を示す。また、LIPS/FFT-CpHMDを広く一般に認知された高速なMD計算プログラムへと実装する。さらに、高分子電解質溶液系に対する適用を目指す。巨大分子系の大規模構造を長時間にわたり追跡するために、全原子MDと粗視化MDの連携を目指した手法開発を引き続き行う。LIPS/FFT法とpH一定のMD法との組み合わせについて開発・検証を進める。また、巨大分子系の長時間挙動を定量的に追跡するために、全原子および粗視化MDのマルチスケール接続法の開発・検証を進める。
高齢者福祉施設を対象としたエネルギー消費構造の把握と省エネルギー手法の検討

本研究では,実在の高齢者福祉施設2施設を対象として,電力・ガスのエネルギー消費量や給水・給湯量,室内温熱環境の測定を行うと共に,施設職員や入所者に対するアンケート調査等を実施し,これらの分析を通して,これまでデータの蓄積が少ない同種施設に関する基礎的資料を整理し,施設の運用,管理上の問題点を抽出した。続いて,特に介護入浴に着目し,多様な入浴形態がとられる複数の浴槽を対象に,給水・給湯量に関する詳細な測定と併せて,実際の入浴行為に調査員が立ち会う観察調査を実施した。本研究で得られた成果を以下に示す。1)エネルギー消費量の分析では,施設職員の省エネルギー的な判断による,空調期間における換気用の外気処理エアコンの間欠運転や,床暖房の停止によって,室内環境悪化の可能性を指摘した。2)室内温熱環境の分析では,上記省エネ運転による室内環境の悪化を確認すると共に,ケア入所者が倹約のため自室の冷暖房を使用しないことから,共用空間と自室とで大温度差に曝されている事実を示した。3)給水・給湯量の分析では,1人あたり給湯量が病院施設とほぼ同等であること,給湯量の約1/2を浴室系統が占めるが,実際の入浴時の使用に比べ,湯張や清掃等の使用量が多いこと,さらに循環浴槽の保温用消費熱量が,それら浴室系給湯の消費熱量と同等かそれ以上であることを示した。4)介護入浴に関する詳細測定では,対象とした各浴槽の中で,1人あたり使用湯量が機械浴槽で最も多く,要介護度の高い高齢者の入浴のため,機器の保温や湯温の調整などを行うためであることを示した。5)循環浴槽の消費熱量に占める浴槽保温熱量が多いことに着目し,浴槽の使用スケジュール変更によるエネルギー消費削減の方途を検討し,給水温度や浴槽断熱などの諸条件によって最適利用方法は異なるものの,実際の施設を例に,スケジュール変更による熱量削減の可能性について確認した。本研究は,実在の高齢者福祉施設を対象として,特に空調系統,給湯系統に着目して,電力・ガス消費量や水使用量の系統的,連続的な測定を行うとともに,並行して主要室の温熱環境の測定や,各種設備機器の使用状況,入所者や職員の施設内での行動実態について,ヒアリングや観察などによって調査することにより,入所者の生活水準や介護レベルを維持した上で,エネルギー消費量の削減を可能とする施設運用や機器使用の方法について検討することを目的としている。初年度は,これまで進めてきた対象施設における実測調査の結果について,より詳細な検討を行い,各施設の現状における問題点を抽出した。また,その結果をふまえ,必要と考えられる追加測定を実施した。具体的な内容は以下のとおりである。1)これまで調査・測定を進めてきた広島県北の2施設について,施設全体のエネルギー消費量についての比較・検討を行うとともに,特に給湯系統に着目して,給湯システムの効率など性能評価を行った。また,入所者に対するヒアリング調査に基づいて,高齢者がいかなる温熱環境に曝露されているかを追跡し,施設の室内環境制御における問題点を明らかにした。2)2施設中1施設については,冬季の施設全体エネルギー消費量の値に問題があったため,データの補足を意図した再調査を実施した。期間は2006年2月10日より3月3日であり,併せて施設内の主要公共スペースでの温熱環境調査を実施した。3)2施設の問題点をふまえ,新たな施設を選定し,調査・測定を実施する必要性について検討を進めた。施設の概要や保有設備機器,系統別エネルギー消費量や給水・給湯量の測定可能性を考慮するとともに,特に介護浴やリフト浴などの入浴時における使用水量・湯量について,測定計画を含めて検討した。

次年度は,3)の結果を受けて具体的な測定を行い,これまでの分析結果を併せて,高齢者福祉施設のエネルギー消費構造について明らかにする。本研究は,実在の高齢者福祉施設を対象として,特に空調系統,給湯系統に着目して,電力・ガス消費量や水使用量の系統的,連続的な測定を行うとともに,並行して主要室の温熱環境の測定や,各種設備機器の使用状況,入所者や職員の施設内での行動実態について,ヒアリングや観察などによって調査することにより,入所者の生活水準や介護レベルを維持した上で,エネルギー消費量の削減を可能とする施設運用や機器使用の方法について検討することを目的としている。初年度は,これまで進めてきた対象施設における実測調査の結果について,より詳細な検討を行い,各施設の現状における問題点を抽出した。平成18年度は,その結果をふまえ,特に高齢者福祉施設の介護入浴に着目し,給水・給湯量に関する詳細な測定を,夏期,中間期,冬期に実施した。具体的な内容は以下のとおりである。1)新たに広島県福山市の高齢者福祉施設(特別養護者人ホーム)を対象として,特に当該施設の浴室を複数箇所選定し,給水・給湯量や給水・給湯温度を連続的に測定するための機器を設置し,季節を変えて各1週間の詳細測定を行った。その際には調査員が立ち会い,介護入浴における介助者,高齢者の行為と湯の使用が対応するように配慮した。2)1)に合わせて,施設職員である入浴介助者と実際に入浴する高齢者の双方に対してアンケート調査を実施し,入浴時における機器の使い方や現在の入浴方法における問題点等を抽出すると共に,1)との関連について検討を行った。3)1),2)を受けて,対象施設における介護入浴時の湯の使用実態を明らかにすると共に,初年度で実施した広島県北の2施設における入浴に関する給水・給湯量やエネルギー消費量との比鋲を行った。
Ｋ中間子稀崩壊事象を用いた新物理の探索

現在の物質優勢宇宙の説明には、素粒子物理における標準理論を超えた新たな物理(新物理)の寄与が必要である。申請者はK中間子の稀崩壊事象を通して新物理の探索を進めている。注目しているK中間子の稀崩壊事象は崩壊分岐比が小さく抑えらており新物理に感度が高い。一方で新物理の寄与の発見には高統計が必要で、また実験の背景事象を低く抑える必要がある。KOTO実験はK中間子稀崩壊探索を通して素粒子標準模型を超える新物理の探索を目的とした実験であり、茨城県東海村に位置する大強度陽子加速器(J-PARC)で行われている。KOTO実験は2018年6月に物理ランを行なった。1ヶ月に渡る長期のビームタイムでは安定したデータ取得が必須である。安定したデータ取得のため申請者が中心となり検出器の動作確認や較正、読み出し機器の調整を随時行い安定性を担保した。解析面では2016年から2018年にKOTO実験が取得したデータを申請者が主導して解析している。2016年から2018年に取得したデータで目的であるK中間子稀崩壊モードの探索感度を0.82×10-9と求めた。また2015年のKOTO実験の物理結果と合わせることで探索感度が0.50×10-9となり、世界最高感度となることを示した。さらにKOTO実験の主要な背景事象についても見積もりを進めた。主要な背景事象評価に用いているコントロールサンプルの純度をシミュレーションにより評価した。その結果を考慮することで背景事象見積もり数を2倍程度改善させた。以上の解析結果を2019年3月に行われた日本物理学会第74回年次大会にて報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。現在の物質優勢宇宙を説明するには、素粒子物理における標準理論を超えた新たな物理(新物理)の寄与が必要である。本研究はK中間子の稀崩壊事象を通して新物理の探索を行っている。注目している崩壊は崩壊分岐比が小さく抑えらているため新物理に感度が高い。本研究は大強度陽子加速器施設(J-PARC)にてKOTO実験を通して進めている。2017年4,5,6月と2018年1,2月に物理ランを行った。実験遂行には安定的にデータを取得することが必須であるため、物理ラン中は検出器の較正を随時行い、検出器の操作の安定性を担保した。データ解析においては2016年度以降にKOTO実験が取得したデータを私が主導して解析している。オフライン解析では検出器の補正や取得したデータの整理を行い物理解析に使うデータの質を向上させた。また再構成可能なKL崩壊のサンプルを用いることでシミュレーションとデータを比較しデータをよく理解できていることを示した。この結果、2016,2017年のデータから信号事象が1イベント観測される実験感度を1.3×10-9と見積もった。これは新物理発見が期待されうる領域を超える感度である。2018年1,2月の物理ラン、2018年6月に予定されている物理ランも含めて解析することで、信号事象が観測されない場合でも崩壊分岐比の上限値が新物理領域を90%の信頼度で超えることが可能であると示した。おおむね本研究に必要な物理データを平成29年度中に取得することができた。また平成30年度に予定されている物理ランのデータを含めることで本研究の目標に到達可能なことを示せた。本研究における背景事象の解析も主要となる背景事象について理解を進めることができた。予定されている物理ランを成功させる。

そのために検出器等のモニターを随時行う。背景事象の理解、見積もりを進め定量的に評価する。特に本研究の主要な背景事象となっている中性子由来の背景事象について、実験感度を落とさずに背景事象を削減する方法を確立する。K中間子の稀崩壊探索により新物理が発見されればその結果を、されない場合でも上限値を90%の信頼領域で与え、新物理領域に制限をつける。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
脂肪組織リモデリングと脂肪毒性の分子機構の解明

メタボリックシンドロームの基盤病態として慢性炎症が注目されており、肥満の脂肪組織における脂肪細胞とマクロファージの相互作用が脂肪組織機能(アディポサイトカイン産生調節や中性脂肪蓄積)の障害を介して全身の糖脂質代謝異常に繋がる。本研究では、脂肪細胞の肥大化や脂肪組織マクロファージの活性化に関する新たな分子機構が明らかになり、メタボリックシンドロームの新しい治療戦略の創出に資すると考えられる。肥満の脂肪組織では脂肪細胞の肥大とともに血管新生やマクロファージ浸潤、炎症性変化がもたらされ、「脂肪組織リモデリング」とも言うべきダイナミックな変化をきたしている。脂肪組織リモデリングの主要病態の一つである脂肪組織へのマクロファージ浸潤にはMCP-1/CCR2系が重要であると考えられているが、単球遊走の分子機構には不明な点が多い。本研究では、細胞遊走を遊走速度と方向性に分けて解析することが可能なリアルタイム細胞動体測定装置TAXIScanを用いて、脂肪組織由来液性因子に対する細胞遊走能を検討した。マウス骨髄単核球細胞は、脂肪組織の培養上清に対して著明な走化性を示したが、CCR2拮抗剤であるプロパゲルマニウムの添加により抑制された。CCR2を強制発現させたヒトTリンパ球系Jurkat細胞も同様に、脂肪組織培養上清に対して強い走化性を示したが、プロパゲルマニウムの添加により抑制された。このとき、プロパゲルマニウムは、細胞遊走速度には影響を及ぼさず、方向性のみを阻害した。高脂肪食を負荷したKKA^yマウス、あるいはob/obマウスにプロパゲルマニウムを経口投与したところ、いずれのマウスにおいても非投与群と比較して、脂肪組織へのマクロファージ浸潤が有意に抑制された。骨髄移植法により作製した骨髄細胞特異的CCR2欠損ob/obマウスは、対照ob/obマウスと比較して、脂肪組織へのマクロファージ浸潤が有意に抑制された。本研究により、骨髄細胞のCCR2が、脂肪組織由来液性因子に対する細胞遊走の方向決定において重要であることが明らかになり、肥満の脂肪組織へのマクロファージ浸潤において骨髄細胞のCCR2を介した細胞遊走の質的変化が関与する可能性が示唆された。細胞遊走の質的な評価により、肥満の病態形成における走化性因子の新たな役割が明らかになる可能性が期待された。1)ヘパリン結合上皮成長因子様増殖因子(HB-EGF)は膜蛋白質として生合成され、切断酵素により切断されて細胞より放出される。本研究では、肥満マウスでは脂肪組織においてのみHB-EGF mRNA発現が増加することを確認した。次に、アルカリフォスファターゼ融合HB-EGFを安定発現する3T3-L1脂肪細胞を作出し、HB-EGF放出の検出系を確立した。インスリンあるいはリコンビナントHB-EGFは分化脂肪細胞においてHB-EGF放出を誘導した。メタロプロテアーゼ阻害剤を用いた検討により、インスリン誘導性HB-EGF放出の少なくとも一部はADAM17によることが示唆された。切断酵素によるHB-EGF放出の分子機構の解明は、内分泌細胞としての脂肪細胞の生物学に新しい洞察をもたらすと考えられる(Obesity 2010 Jan 28.[Epub ahead of print])。2)肥満の脂肪組織におけるMAPK phosphatase-1(MKP-1)の機能的意義を明らかにするために、脂肪細胞においてMKP-1を過剰発現するトランスジェニックマウス(MKP-1Tg)を作製した。このマウスの脂肪組織では野生型マウス(WT)と比較してMKP-1タンパク質発現が増加しており、MAPキナーゼの活性低下が認められた。標準食飼育下では、MKP-1TgとWTの体重と随時血糖に有意差は認められなかった。高脂肪食負荷では、MKP-1TgとWTには経時的な体重増加、随時あるいは空腹時血糖には有意差はなかったが、血中インスリン濃度はMKP-1Tgにおいて低値を示した。インスリン負荷試験において、MKP-1TgではMKP-1の発現量依存的に高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性の改善が認められた。以上より、MKP-1Tgでは肥満により誘導される脂肪組織の炎症性変化とインスリン抵抗性の改善が認められた。1)脂肪細胞の増殖・分化・肥大化の分子機構の解明:昨年度に作製した脂肪細胞特異的MAPK phosphatase-1(MKP-1)トランスジェニックマウス(MKP-1Tg)の解析を行った。MKP-1Tgは、高脂肪食負荷により対照野生型マウスと同程度の体重増加を認めたが、インスリン抵抗性が有意に軽減した。主要なインスリン標的臓器におけるAktリン酸化を検討したところ、肝臓におけるインスリンシグナルの改善を認めた。MKP-1Tgの脂肪組織では、高脂肪食負荷によるMAPKリン酸化が抑制された。3T3-L1培養脂肪細胞にMKP-1を過剰発現することにより、TNFα誘導性脂肪分解が有意に抑制された。通常食飼育下では、genotype間に糖脂質代謝の差を認めなかった。

以上より、脂肪細胞においてMKP-1は、過剰な中性脂肪の体内分布を制御することにより、全身の糖脂質代謝調節に働くことが示唆された。2)マクロファージにおいて飽和脂肪酸により誘導される炎症性変化の分子機構の解明:我々は既に、肥満の脂肪組織では肥大化した脂肪細胞より放出された飽和脂肪酸がマクロファージに発現するTLR4を活性化して炎症性サイトカイン産生を誘導することを証明し、これが脂肪組織リモデリングの基盤病態になることを明らかにした。一方、マクロファージにおいて、TLR4の活性化による炎症性サイトカイン産生に細胞内Ca濃度の上昇が必要であることが知られている。我々は、非選択的transient receptor potential(TRP)Vチャネル阻害剤がLPS誘導性炎症性サイトカイン産生を強力に抑制することを見出した。マクロファージに発現するTRPファミリーはTRPV2のみであり、TRPV2をノックダウンすることにより、LPS刺激による細胞内Ca濃度の上昇と炎症性サイトカイン産生が有意に抑制された。以上より、TLR4の新しい細胞内シグナル伝達経路が明らかとなり、炎症制御の標的となる可能性が示唆された。
ペルオキシソームの生合成初期過程の解明

細胞内小器官ペルオキシソームは近年多くの重要な代謝機能の解明やその障害は遺伝性の致死的疾患をもたらすことから、プロテイントラフィック分子機構解明のモデル系としても広く研究されている。私たちはペルオキシソームの形成機構やその障害機構の解明に向けて,多くのペルオキシソーム欠損性CHO(Chiniese Hamster Ovay)細胞変異株を分離し,相補遺伝子(PEX)の単離とその転写・翻訳産物(ペルオキシン)の機能ならびにZellweger症侯群を代表とするペルオキシソーム形成異常症の原因遺伝子解明を目的として研究を行っている。そのなかでペルオキシンPex3p,Pex16p,Pex19pはペルオキシソーム膜のアセンブリーに必須であり、それらの機能不全はペルオキシソーム欠損症を引き起こすことを先に発表している。ガエディ博士はペルオキシソーム膜形成機構の解明へ向け、pex3 CHO変異細胞およびPex3pを用いて膜タンパク質Pex3pの局在化シグナルを同定した(投稿準備中)。一方、先に分離、報告している2型局在化シグナル(PTS2)レセプター遺伝子PEX7の異常CHO変異細胞を用いて、Pex7pの機能とその変異を生化学的に検討した結果、変異Pex7pはPTS2およびPTS2タンパク質-Pex7p複合体の輸送を担うPTS1レセプターPex5pのアイソフォームであるPex5pLとの結合能を失っていることを明らかにした。またより蛍光高度の強いEnhanced GFP(EGFP)を用いて、新規なCHOpex変異細胞の分離も試み、新たな表現型を示すpex2変異細胞ZPEG309を単離した。
造血における骨髄ストローマ細胞および幹細胞の細胞骨格蛋白の役割とその機能解析

(1)血液細胞分化に伴って起こるミオシンのアイソフォーム発現パターンの変換と機能変化について、モノクロナル抗体およびcDNAプローブを作製したが、ストローマ細胞のミオシンの形質変換を有意には認めることができなかった。(2)ミオシンの脱リン酸化酵素のcatalytic subunitを精製し、そのMcAbを作ったが、すべてIgMでありimmunoblottingでworkしなかった。そこでnon-catalytic unitも含む酵素を精製し、免疫し、IgG/McAbを6clone得た。これらMcAbは、catalyticおよびnon-catalyticを各々認識するものを含んでいて現在検討中。ストローマ細胞をある細胞周期に同期させ、(脱)リン酸化ミオシン及び(脱)リン酸化酵素の局在をしることで、細胞分裂との関わりを詳細に検討する予定である。gizzardミオシンの脱リン酸化酵素に対するMcAbを作成し、10cloneを得た。すべてIgMであるが、高titerのMAPP3を用い、ELISAをassay方法として、現在ヒト血小板およびHELより脱リン酸化酵素のを精製を試みている。最近、我々は、寒冷曝露時における血小板形態変化が、このMLC20のリン酸化、脱リン酸化のbalanceで説明しうることを示した。すなわち、MLC20の脱リン酸化酵素のみがQ10が5.2と大きく、他の酵素のそれ(約3.0)と比べ温度低下による酵素活性の抑制が大きいことが、非刺激であっても、単に温度を37°Cから4°Cへ低下させるだけで、細胞内Ca^<2+>の上昇なくしてMLC20がリン酸化され、形態変化が起こる主要な原因であることを証明した。(3)サイトカインの骨髄巨核球細胞突起惹起の力価は、IL6>ILF≧SCF>>IL3の順であった。一方、ストローマ細胞との共培養では、IL-6の容量依存曲線をあきらかにshiftさせた。これらのことは、ストローマ細胞より何等かのサイトカインが分泌されていること、また、細胞間の接触によるsignal transductionの寄与が考えられた。【1】血液細胞分化に伴って起こるミオシンのアイソフォムー発現パターンの変換と機能変化の解明:非筋細胞および平滑筋ミオシン重鎖のアイソフォームに特異的なペプタイドに対するモノクロナル抗体を作製した(12 clones)。また、ミオシンのアイソフォームのcDNAクローンを用た特異的オリゴプローブおよびDNAプローブの作製した。しかし、分化誘導前後の白血病細胞株(HEL)のmRNAにつき、RT-PCRがまだ不成功に終わっている。【2】ストローマ細胞のミオシンの形質変換:ストローマ細胞株(ヒトHFL,HUC-Fm)にヒトサイトカイン遺伝子をレトロウイルスvectorを用いて遺伝子導入をこころみた。ストローマ細胞株へのIL6遺伝子をレトロウイルスvectorなどいくつかの手技を用いて遺伝子導入を試みているが、再現性の面で問題が残る。【3】骨髄幹細胞の変異ミオシンの解析:我々が既に得ているgizzard平滑筋ミオシンの重鎖と軽鎖のcDNAを用い、ヒト健康人骨髄細胞cDNA libraryよりヒト血液細胞のミオシン重鎖および軽鎖のcDNAをクローニングを試みた。ヒト健康人骨髄細胞cDNA libraryは作成中だが良質のものが取れない。ヒト血液細胞のミオシン重鎖、軽鎖のcDNAをクローニングは、6年度の課題である。【4】血液細胞ミオシンのリン酸化および脱リン酸化の生理的意義の解明:

gizzardミオシンの脱リン酸化酵素(Dr.Ikebe,CWRUより供与)に対するMcAbを作成し、10 cloneを得た。すべてIgMであるが、高titerのMAPP3を用い、ELISAをassay方法として、現在ヒト血小板およびHELより脱リン酸化酵素のを精製を試みている。ストローマ細胞は、造血細胞との接触と各種サイトカイン分泌を介して造血の微小環境を造りあげている。このストローマ細胞細胞と幹細胞の接触に伴う情報伝達と細胞骨格蛋白の分布再構成の存在が推測される。本年は、3項目について研究を行った。(1)ストローマ細胞の細胞骨格蛋白の機能発現調節の解明。3種のストローマ細胞株について、各種サイトカイン刺激の有無、接着の有無、confluentか分裂期かの違いにより、細胞より精製したミオシンのリン酸化のレベル、重鎖のリン酸化の有無を検討した。(2)ストローマ細胞への変異ミオシンの導入と機能解明。ミオシン軽鎖のcloningは成功したが、そのmutagenesisを行う段階でどうしてもうまく変異cDNAを得ることができない。(3)ストローマ細胞ミオシンのリン酸化、脱リン酸化反応の生理的意義と分化に伴うリン酸化パターンの変化の解明。ミオシンの脱リン酸化酵素のcatalytic subunitを精製し、そのMcAbを作ったが、すべてIgMでありimmunoblottingでworkしなかった。そこでnon-catalytic unitも含む酵素を精製し、免疫し、IgG/McAbを6clone得た。これらMcAbは、catalyticおよびnon-catalyticを各々認識するものを含んでおり、今後immunostainingにより細胞質内の局在を検出てきる。ストローマ細胞をある細胞周期に同期させ、(脱)リン酸化ミオシン及び(脱)リン酸化酵素の局在をしることで、細胞分裂との関わりを詳細に検討する。
ヒト化マウスを利用した高放射線障害治癒効果をもつ間葉系幹細胞の模索

本研究は、超免疫不全マウス(NOG)にヒト造血幹細胞(HSC)とヒト間葉系幹細胞(MSC)を共移植することによりヒトの造血環境を再現したヒト化マウス(huNOG)を作製し、MSCによりもたらされる組織幹細胞への放射線障害治癒効果を評価するためのマウスモデルを構築することを目的とする。平成30年度、かねてより生着率の悪さが課題となっているヒト骨髄単核細胞(BM-MNC)由来のHSC(CD34陽性)、及びMSC(CD271陽性)のNOGマウス骨髄内への移植について再度検討するため、移植後2週間目にマウスのサンプリング調査を行った。FACS解析の結果、骨髄内にヒト造血細胞が生存している事が確認出来たが、末梢血中、脾臓、肝臓では明確なヒト造血細胞集団を認めなかった。またHSC単独で移植を行った個体よりもHSCとMSCの共移植を行った個体の方が、ヒト造血細胞数が顕著に低かったことから、ヒト造血微小環境を構築すると期待されたMSCの共移植が、むしろHSCの生着に負に作用している可能性を示唆するものであった。他方で、より治癒効果の高い細胞特性を有するMSCを選別・作出する課題の一環として進めていたヒトiPS細胞からの誘導間葉系幹細胞(iMSC)の作製については、安定した形質を維持できている細胞株を用いてin vitroにおける放射線障害防護効果を検証した。その中で特に、HSCへの放射線照射を行った後、各MSCの培養上清から精製したエキソソームをコロニーアッセイ用の培養液に添加することで造血幹細胞への影響を評価する実験では、iMSC由来のエキソソームが、過去に照射細胞の生存率を向上する事が報告されている組織由来MSCや不死化MSC株由来のエキソソームと同様に造血幹細胞の生存率を向上させ得ることを示した。現在、他の実験結果と合わせてiMSCの放射線障害防護効果について取りまとめを行っている。本研究では、はじめに超免疫不全マウス(NOG)にヒト造血幹細胞(HSC)とヒト間葉系幹細胞(MSC)を共移植することによりヒトの造血環境を再現したヒト化マウス(huNOG)において、MSCによりもたらされる複数の組織損傷治癒効果を、特に高線量の放射線が骨髄や腸管、皮膚といった組織の幹細胞に与える障害を中心に、どの程度改善できるのかを評価するためのマウスモデルを構築することを目指した。平成28年度には、従来の方法に沿って単一ドナー由来ヒト骨髄単核細胞(BM-MNC)から単離したHSC(CD34陽性)とMSC(CD271陽性)をNOGマウスの下肢大腿骨内に注入し、3ヶ月間末梢血中のヒト造血細胞をFACS解析により追跡した。通常ヒト造血細胞の生着が認められる個体では3ヶ月後にはCD19陽性細胞の出現等の兆候が見られることが多いが、末梢血中のヒト造血細胞のキメリズムは期待するようには上がっていなかった。そこで各組織のサンプリングを行い、FACSと免疫組織染色法により調査を行ったところ、脾臓、及び骨髄内にはヒト細胞が生存していることを確認した。このことから、より早期にヒト造血細胞の生着を確認する方法を検討することが課題となった。一方で、より治癒効果の高い細胞特性を有するMSCを選別・作出する課題の一環として、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターのセルバンクよりご提供頂いたヒトiPS細胞7株から、既存の方法を用いて誘導間葉系幹細胞(iMSC)への分化誘導を試みた。誘導後、一般的なMSC培養条件において良好に継代することができた細胞株を、表面抗体を指標としたFACS解析により確認したところ7株中6株からiMSCとして有望な株を得ることができた。現在、主にin vitroにおいて放射線障害に対する防護効果の有効性を組織由来のMSCとの比較から検証している。計画では、本年度中にhuNOGマウスを用いた放射線障害評価モデルを確立し、MSCのHSCに対する放射線障害防護・治癒効果を検証する予定であった。しかし、照射実験を行うだけのhuNOGが揃わず課題を残している。一方で、次年度計画を前倒しして、ヒトiPS細胞からiMSCを分化誘導させることに成功し、iMSCの放射線障害に対する防護機序をin vitroで検証するための準備が整った。本研究は、超免疫不全マウス(NOG)にヒト造血幹細胞(HSC)とヒト間葉系幹細胞(MSC)を共移植することによりヒトの造血環境を再現したヒト化マウス(huNOG)において、MSCによりもたらされる複数の組織損傷治癒効果を評価するためのマウスモデルを構築することを目的とする。平成29年度には、課題となっているNOGマウスでのヒト骨髄単核細胞(BM-MNC)由来のHSC(CD34陽性)とMSC(CD271陽性)の生着率を上げるための検討を行った。しかし、現在までのところマウスの下肢大腿骨内にHSCとMSCを直接注入することによる、6ヶ月長期のヒト造血細胞の生着は認められなかった。またFACS解析の結果からは骨随以外の臓器についてもヒト細胞は少数か、若しくはほとんど認められない。移植した細胞の造血能力はコロニーアッセイにより確認しており、移植した細胞数から考えても予想される生着率からは著しく低いものとなっている。また、移植マウスの大腿骨において、対象マウスに比べ、むしろ細胞数が減っていることが示唆されたため、移植方法の根本的な見直しが求められた。

他方、より治癒効果の高い細胞特性を有するMSCを選別・作出する課題の一環として、ヒトiPS細胞から誘導間葉系幹細胞(iMSC)への分化誘導の検討を続けた。複数の誘導法を試みた結果、7株中6株をiMSCとして分化させることが出来た、特に2株はいずれの条件においても、効率良くiMSCへと分化し、安定した形質まま良好に継代できることが分かった。対して7株中1株は誘導直後にはFACS解析によりiMSCとしての表現系を示したが、継代することはできなかった。現在、引き続きin vitroにおいて放射線障害に対する防護効果の有効性を複数のヒト組織由来のMSCとの比較から検証している。計画では、本年度までにhuNOGマウスを用いた放射線障害評価モデルを確立し、MSCのHSCに対する放射線障害防護・治癒効果を検証している予定であった。しかし、依然として照射実験を行うだけのhuNOGを揃える事が出来ず、in vitro実験に支障が出ている。そのため、放射線障害に対する防護機序を検討する方法は、主にヒトiPS細胞から誘導されたiMSCを用いたin vitro実験となっている。本研究は、超免疫不全マウス(NOG)にヒト造血幹細胞(HSC)とヒト間葉系幹細胞(MSC)を共移植することによりヒトの造血環境を再現したヒト化マウス(huNOG)を作製し、MSCによりもたらされる組織幹細胞への放射線障害治癒効果を評価するためのマウスモデルを構築することを目的とする。平成30年度、かねてより生着率の悪さが課題となっているヒト骨髄単核細胞(BM-MNC)由来のHSC(CD34陽性)、及びMSC(CD271陽性)のNOGマウス骨髄内への移植について再度検討するため、移植後2週間目にマウスのサンプリング調査を行った。FACS解析の結果、骨髄内にヒト造血細胞が生存している事が確認出来たが、末梢血中、脾臓、肝臓では明確なヒト造血細胞集団を認めなかった。またHSC単独で移植を行った個体よりもHSCとMSCの共移植を行った個体の方が、ヒト造血細胞数が顕著に低かったことから、ヒト造血微小環境を構築すると期待されたMSCの共移植が、むしろHSCの生着に負に作用している可能性を示唆するものであった。他方で、より治癒効果の高い細胞特性を有するMSCを選別・作出する課題の一環として進めていたヒトiPS細胞からの誘導間葉系幹細胞(iMSC)の作製については、安定した形質を維持できている細胞株を用いてin vitroにおける放射線障害防護効果を検証した。その中で特に、HSCへの放射線照射を行った後、各MSCの培養上清から精製したエキソソームをコロニーアッセイ用の培養液に添加することで造血幹細胞への影響を評価する実験では、iMSC由来のエキソソームが、過去に照射細胞の生存率を向上する事が報告されている組織由来MSCや不死化MSC株由来のエキソソームと同様に造血幹細胞の生存率を向上させ得ることを示した。現在、他の実験結果と合わせてiMSCの放射線障害防護効果について取りまとめを行っている。市販の単一ドナーMNCから得られるHSC、及びMSC(培養により3継代まで増幅)では、現行の実験スケールを大きくすることが難しいため、複数ドナー由来のHSC、及びMSCを使用することも含め、huNOGの安定生産を目指した改善を行う。その上で平成29年度には、ヒトの造血環境を持つhuNOGマウスへのγ線照射実験を行い、骨髄内のヒトHSCへの影響を評価する。
子宮内膜症において発現が増強しているmiR-100の意義に関する研究

子宮内膜症において発現異常を認めるマイクロRNAについて検討するため、正常子宮内膜間質細胞と子宮内膜症間質細胞におけるマイクロRNAの発現プロファイルをmiRNA microarrayを用いて網羅的に解析した。その結果、卵巣子宮内膜症性嚢胞間質細胞においてmiR-100、miR-132、miR181a、miR-210の発現が亢進していることが分かった。assay、invssion assayでは、miR-100の強制発現により、正常子宮内膜間質細胞の遊走能、浸潤能は亢進した。子宮内膜症間質細胞におけるmiR-100の発現亢進は、遊走能や浸潤能を増強することにより、子宮内膜症に特徴的な形質の獲得に関与していることが示唆された。現在、予定していた実験の大部分が終了し、期待していた結果が得られている。その結果を基に、論文の作成に取り掛かっている。現在、論文を作成中である。これまでの研究から、正常子宮内膜間質細胞に比べ、卵巣子宮内膜症性嚢胞間質細胞におけるmiR-100の発現は亢進していることが分かっている。本研究では、卵巣子宮内膜症性嚢胞間質細胞におけるmiR-100の発現亢進の意義について検討した。miR-100の強制発現により、正常子宮内膜間質細胞のSMARCD1 mRNA及び蛋白の発現は低下し、MMP1 mRNAおよび活性型MMP1の発現は亢進した。次に、予想されるMMP1の機能として、遊走能や浸潤能などの細胞運動を制御することが予想されるため、wound healing assay、invssion assayを行った。miR-100の強制発現により、正常子宮内膜間質細胞の遊走能、浸潤能は亢進した。子宮内膜症間質細胞におけるmiR-100の発現亢進は、遊走能や浸潤能の亢進をはじめとする子宮内膜症に特徴的な形質の獲得に関与していることが示唆された。次に、予想されるMMP1の機能から、遊走能や浸潤能などの細胞運動を制御すると推測した。Wound healing assay、invssion assayを行ったところ、miR-100の強制発現により、正常子宮内膜間質細胞の遊走能、浸潤能は亢進した。以上のように、当初の計画通りに検討を行い、成果を上げることができている。その結果、正常子宮内膜間質細胞に比べ、卵巣子宮内膜症性嚢胞間質細胞におけるmiR-100、miR-132、miR181a、miR-210の発現が亢進していることが分かった。これまでの検討から抽出されたMMP1に着目し、MMP1の阻害薬の治療効果を検討する。これまでの検討から抽出されたMMP1に着目し、MMP1の阻害薬の治療効果について検討を始めたところである。実験が当初の予定より順調に進んだため、物品費が当初の見込みより少なくなった。翌年度の物品費の一部として使用する予定である。
甲殻類廃棄物の有用資源化リサイクルシステムの構築を目指した微生物の機能育種

[基礎研究]P. fukuinensisによるキチンデアセチラーゼの分泌の確認。P. fukuinensisによるキチンデアセチラーゼ分泌を確認するため、菌体培養上清におけるキチンデアセチラーゼ活性測定を行い、活性を確認した。現在、キチンデアセチラーゼの詳細な解析のため、濃縮、精製を現在行っている。その際、高い収率を得るために、以下の点を検討している。・誘導物質としてグリコールキチンを培地中に加えることで分泌誘導を行う。・濃縮時にプロテアーゼインヒビターの影響を受けるため、加えるプロテアーゼインヒビターを検討する。以上の方法で、キチンデアセチラーゼの性質決定を行い、存在を明らかにすることを目的として現在研究を進めている。[応用研究]P. fukuinensis由来キトサナーゼの分解様式改変による高機能変異体の取得。P. fukuinensis由来のキトサナーゼの基質結合に関わるアミノ酸残基(4ヶ所)に変異導入を行うことで構築した変異体ライブラリーにおいて、基質分解様式の確認をHPLCにて行った。変異体ライブラリーにおいて、親株の分解性と比較した際に、ポリマーは分解するが、高い生理活性を示す反応中間体の分解能は低下するような高機能変異体の取得に成功した。本研究において当初の計画の通り、基質結合および分解に重要なアミノ酸残基の相関を明らかにし、この結果を元に分解様式の改変を狙った変異導入を行うことで、有用生理活性物質を選択的に生成する高機能変異体を取得するという一連の流れを示すことができた。今後、本データを応用することで基質結合様式改変のためのストラテジー構築を行っていく予定である。[基礎研究]P. fukuinensisによるキチンデアセチラーゼの分泌確認。(1)「P. fukuinensisによるキチンデアセチラーゼの分泌を確認するため、菌体培養上清におけるキチンデアセチラーゼ活性測定を行ったが、現状で活性は確認できていない。このため、現在、以下に示す方法で培養上清中におけるキチンデアセチラーゼの存在を検討している。・誘導物質として数種類の糖類を培地中に加えることで分泌を確認する。・分泌されている場合であっても量が少ない可能性があるため、培養上清の濃縮を行うことで分泌を確認する。(2)P. fukuinensisのゲノム上において、キトサナーゼ配列の上流にN-アセチルトランスフェラーゼ様配列の存在を確認した。この配列によりコードされるタンパク質がキチンデアセチラーゼとして機能している可能性が考えられるため、この配列のクローニングを行い、タンパク質として発現させることで活性の確認と存在意義の検討を行っている。P. fukuinensis由来のキトサナーゼの基質結合に関わるアミノ酸残基(4ヶ所)に変異導入を行い、変異体ライブラリーの構築が完了した。さらに、構築した変異体ライブラリーにおける基質分解様式をHPLCにて分析を行った。変異体間で親株との生成物の違いを確認した結果、活性を完全に失う変異体に加えて、当初予測していなかった分解性が促進される変異体を取得することに成功した。得られたデータから、基質結合および、分解に重要なアミノ酸残基の相関についての知見を得ることができたため、分解様式の改変を狙った変異導入を行っていくことが可能となり、当初の計画通り、有用生理活性物質を選択的に生成する高機能変異体の取得を行っていく。
好アルカリ性細菌のNa^+チャネル欠損によって生じる走化性異常の分子機構の解明

本研究では、好アルカリ性細菌Bacillus pseudofirmus OF4株のべん毛形成と運動特性の解析、電位駆動型Naチャネル欠損によって生じる走化性異常の分子機構の解明を目的とした。この機構を解明することで、好アルカリ性細菌のNa^+サイクルと走化性の関係が明らかになるのではないかと期待された。まず、OF4株のべん毛形成と運動特性の解析を行った。同時に以前に取得した軟寒天培地上での運動性向上株と野生株とのさまざまな条件での運動性の比較を行った。次に、これらの結果を基にOF4株の電位駆動型Naチャネル欠損によって生じる走化性の異常がどのような分子機構よって起こるのか解明することを目的とした。OF4株の中性環境での運動性が低下する理由は、べん毛の発現が抑制されるからではなく、中性環境下ではNa^+駆動型のべん毛モーターがH^+により競合阻害を受けているという可能性や、中性環境下における電気化学的ポテンシャル.の低さが影響している可能性が考えられた。一般に、pH7付近まで生育が可能な好アルカリ性細菌は、生育においてアルカリ性よりも中性環境下でより多くのNa^+を要求する性質があり、べん毛モーターにもこれが当てはまるのではないかと示唆された。運動性向上株の高粘性液体培地やアルカリ性軟寒天培地上での運動性の向上には、べん毛の本数の増加による複数のべん毛が束になった構造(バンドル構造)を形成したことが起因していると考えられた。また、Na_vBPとMcpXが細胞の極で共局在していること、Na_vBP欠損株の走化性異常はMcpXの脱局在化が寄与している可能性が示唆された。桿菌においてMCPは細胞の極に局在化することが知られているが、膜電位駆動型チャネルが極に局在しているという報告例はこれまでになく、新規性の高い発見である。微生物の電位駆動型イオンチャネルは、哺乳類のイオンチャネルの構造解析に役立っており、この結果は好アルカリ性細菌の研究だけでなく、イオンチャネルの研究においても役立つことが期待される。2004年に好アルカリ性細菌Bacillus pseudofirmus OF4株(以下OF4株と省略)の膜電位開閉型NaチャネルNa_vBPがクローニングされ、その欠損株の構築、生理的機能が調べられた。その結果、Na_vBP欠損株は高アルカリ性環境での細胞内pH調節能が低下すること以外にタンブリングの頻度が上昇し、誘引物質や忌避物質に対して野生株と反対の反応を示すことが明らかになった。しかし、この走化性異常の原因は解明されていない。そこで、本研究では、この走化性異常の分子機構を解明することを目的とした。まず、Na_vBPが走化性に関与する蛋白質のどれかと相互作用することが考えられた。メチル基受容走化性蛋白質(MCPs)は、枯草菌などの多く桿菌において細胞の極に局在しており、走化性レセプターとして働く。MCPからのシグナルはいくつかの走化性シグナル伝達蛋白質を経て、べん毛モーターに伝わり、運動を制御する。これらのうちMCPが細胞の極においてNa_vBPと相互作用するのではないかと考えた。そこでNa_vBP抗体と枯草菌のMcpB抗体を用いて免疫蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡観察によりNa_vBPとMcpBの細胞内局在を調べた。

その結果、野生株では、Na_vBPとMcpBが細胞の極で共局在していることがわかった。また、Na_vBP欠損株では、McpBの発現量はほぼ変わらないものの、その局在性は低下していた。これらの結果より、Na_vBP欠損株の走化性異常にMcpBの脱局在化が寄与している可能性が示唆された。また、大腸菌ではcheA、cheWを欠損させるとMCPの極への局在性が低下することが知られていたので、OF4株のcheAW破壊株を構築し、Na_vBPとMcpBの細胞内局在を調べた。その結果、cheAW破壊株ではNa_vBPとMcpBの両方の局在性が低下していた。以上の結果から、Na_vBPとMcpBは極へ局在性において相互に依存していると考えられた。2004年に好アルカリ性細菌Bacillus pseudofirmus OF4株(以下OF4株と省略)の膜電位開閉型NaチャネルNa_vBPがクローニングされ、その欠損株の構築、生理的機能が調べられた。その結果、Na_vBP欠損株は高アルカリ性環境での細胞内pH調節能が低下すること以外にタンブリングの頻度が上昇し、誘引物質や忌避物質に対して野生株と反対の反応を示すことが明らかになった。しかし、この走化性異常の原因は解明されていない。2006年度は、OF4株とその運動性向上株のべん毛の形成およびフラジェリンの発現と培養pHとの関係に着目して基礎データの取得を行った。フラジェリン蛋白質の発現はpHに依存していなかった。また、培養pH7.510.3においてOF4株の野生株は約1本、運動性向上株は約23本のべん毛が観察された。pH10における運動性向上株の細胞外フラジェリン量は野生株の約3.9倍であった。次に様々なpH、Na^+濃度、粘性条件下における運動性の解析を行った。アルカリ複合培地で培養した野生株の液体培地中での遊泳速度を測定したところ、10mMNa^+を含むpH8以下の培地では運動性を示さなかった。しかし、高Na^+濃度の培地ではpH7でも運動性が観察された。pH8からpH11における遊泳速度は、Na^+濃度230mMまではNa^+濃度の対数的増加に伴い直線的に増加した。pH7ではNa^+濃度230mM以上でも遊泳速度が増加した。野生株の最適遊泳速度は、pH10、Na^+濃度230mMであった。また、運動性向上株の運動性は、通常の液体培地中では野生株とそれほど変わらなかったが、PVPなどの増粘性物質を含む液体培地や寒天濃度0.3%のアルカリ性軟寒天培地上では野生株よりも明らかに高い運動性を示した。2004年に好アルカリ性細菌Bacillus pseudofirmusOF4株(以下OF4株と省略)の膜電位開閉型NaチャネルNa_vBPがクローニングされ、その欠損株の構築、生理的機能が調べられた。2007年度は、好アルカリ性細菌B.pseudofirmusOF4株において電位駆動型NaチャネルNa_vBPと推定上の走化性レセプターMcpXの関係について明らかにしたことをまとめると以下のようになる。推定上の走化性