hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複素ニューラルネットワークを用いた多足歩行運動モデルによる環境適応機構の実現

運動制御のモデル化として、主に以下の4つを行った。1.振動子結合系による多足歩行モデルを構築し、結合様式に応じた各歩容の安定を解析した。2.神経振動子を実現するための基礎論として、一般的に神経振動子によく使われる2ニューロン系を対象として、そのネットワークがどのような能力を有しているかを理論的に解析した。特に、平衡点の状態空間での位置と定性的な性質について理論的に解析し、不安定焦点が実現できる平衡点の位置を明らかにした。またそれに基づき、所望の位置に所望の性質をもった平衡点を持つ2ニューロン系の実現法を提案した。3.ヒトの静止立位姿勢制御に対して、スティフネス制御仮説に代わる仮説を提案し検討した。従来の制御仮説では、ヒトの静止立位は足関節筋の高剛性およびアキレス腱の高剛性により硬く固定されることで漸近安定化されており、脳神経系による神経制御の役割は重要視されて来なかった。新たな仮説として、脳神経系は姿勢の微小変化に対し、予測的に、間欠的あるいはオンオフ的に姿勢制御に介入すると考える。系の状態を平衡立位付近の有界領域に閉じ込めることで立位を維持するとするこの仮説では、立位姿勢の動揺は、制御メカニズムを反映した帰結となる。4.カイコガの前運動中枢の神経回路モデルを構築するために、運動指令発現の主要な情報伝達経路を同定し、それを検証するためのシミュレータを作成した。カイコガは、フェロモン源定位行動として典型的な行動パターンをとるが、その運動指令を生成する前運動中枢のモデルを最新の実験データから構成的に構築した。個別ニューロンの位置・形態・結合領域・刺激受容後の生理応答等の実験データに基づき、運動指令発現の主要な情報伝達経路を探索した。同時に、各ニューロンの膜電位方程式に基づくシミュレータに対して、実験的知見と、抑制後リバウンドや神経修飾物質の効果を入れ、ダイナミクスを検証した。本研究では,振動性ニューロンからなるネットワークを用いて多足歩行運動モデルの構築と解析を実施する.研究初年度に当たる平成18年度には,以下を実施した.振動子結合系を用いて多脚歩行のCPG(central pattern generator)をモデル化した.各振動子は,高次運動中枢から運動制御入力を受けて,各脚の周期運動を制御するもので、本課題では,複素変数で表されるニューロンモデルにより各振動子をモデル化し,その相互結合系である複素Hopfieldネットワークによって脊髄CPGをモデル化した.複素Hopfieldネットワークのうち,その位相についてのダイナミクスが位相振動子結合系となるものを用いることで、CPGにおける位相ダイナミクスの解明を目指し,以下を確認した.1.二脚歩行に対して,一対の振動子系を用いてCPGをモデル化し,高次中枢からの制御入力に相当する一定入力の強度に応じた,歩容のパターンを解析した.数値計算により,左右脚への入力強度差に応じていくつかの特徴的なパターンが確認された.それらは,Fitzhugh-Nagumoモデルを用いたより複雑なCPGにおいて見られた結果と一致するが,それはまた,パーキンソン病による不規則な肢間協調の臨床データとも合致することが報告されている.確認されたパターンは,対称な逆位相,非対称な一定位相差および振動数引込みの破れの各パターンだが,それらはHopfieldネットワークのエネルギー関数の存在条件や,位相振動子系の引込み条件から理解でき,制御入力による振動数の変調が本質的であることが分かった.2.四脚歩行に対して,四つの同一振動子を単純な対称性で結合してCPGをモデル化した.C_2対称性をもつ環状結合を与えた系について,パラメータ空間におけるウォーク,バウンド,プロンク,トロットやペースの各歩容の存在範囲を確認した.運動制御のモデル化として、主に以下の4つを行った。

同時に、各ニューロンの膜電位方程式に基づくシミュレータに対して、実験的知見と、抑制後リバウンドや神経修飾物質の効果を入れ、ダイナミクスを検証した。
近代日本の地域社会における幼稚園教育の社会的機能-茨城県土浦幼稚園を事例として-

本研究では、近代日本の地域社会における幼稚園教育の社会的機能について、茨城県土浦幼稚園を事例として検討を行った。土浦幼稚園は1885(明治18)年に設立され、今日まで120年余り地域の幼稚園として命脈を保ってきた公立幼稚園であり、同園には文書資料はもとより、幼稚園の教材・教具類などの実物資料が数多く残されている。そこで、まず資料(計429点)の整理と目録作成を行い、つぎに入園綴や退園届、保育証授与簿などをもとに「土浦幼稚園園児データベース」作成して、利用層についての数量的分析を行い、明治期から大正期にかけての土浦幼稚園の実態と同園が地域社会において果たした社会的機能を総合的に検証した。研究成果は以下の通りである。1)近代日本における幼稚園導入・普及の社会的文脈について、1892年の幼稚園調査を用いて全国的動向の把握を行った。そして、当時の幼稚園が「教育の質」と「社会的開放性」と「財政上の要因」をめぐって複雑なトリレンマ(三すくみ)の状態にあったこと、そのなかで、土浦幼稚園は公費支出と保育料の低額化によって財政上の要因と社会的開放性の問題を解決して、そのトリレンマを処理していたことを明らかにした。2)土浦幼稚園の設立とその後の展開過程について検討し、土浦幼稚園がおもに商業者の支持を得て設立・維持され、小学校との関係を持ちながら、就学準備教育機関として機能していたことを明らかにした。3)「土浦幼稚園園児データベース」をもとに、利用層の数量的分析を行い、女子の就園率の高さ、通園圏の狭さ、在園期間等から、土浦町では幼稚園が小学校就学前の教育機関として男女によらず必要であるという認識が一定程度広まっていたこと、そして、そこでは学歴獲得や社会的地位達成とは別の文脈で、幼稚園の就園そのものに意味を見出す利用がなされていたことなど、土浦幼稚園の実際を利用者の側から明らかにした。1.土浦幼稚園園児のデータ・ベース化土浦幼稚園・小学校に関する資料調査を集中的に行った。入園日・在園期間・保育料・生年月日・族籍・授与者名簿等、約2500名のデータ・ベースを作成した。その上で、明治・大正期の土浦幼稚園所蔵の入園・退園記録から、各年度の幼児の入園時期・期間、通園地域等のデータを組み入れ、幼稚園の支持層の社会階層を分析するための基礎的な資料を用意した。(なお、調査にあたり、土浦市教育委員会・小学校・幼稚園に個人情報の機密保持について万全を期す旨、確約した調査依頼書を提出し、承諾を得た。)また、それをより深化させるために、土浦地域の政治・文化的な状況の把握を目的に、明治・大正・昭和期の地域資料を発掘し、周辺地域の幼稚園の調査をおこなった。2.土浦小学校等の資料調査1の成果をもとに、土浦幼稚園児の進路データの追跡のために、土浦小学校入学後の児童の状況・進路について土浦小学校所蔵の学籍簿と照合したデータ・ベースを作成した。3.幼稚園の実物資料の総合的な調査幼稚園の恩物・掛図をはじめとする教具および図書・写真など、実物資料の総合的な調査を、土浦市立博物館学芸員の指導協力のもと、幼稚園の保護者とともにおこない、目録を作成した。以上の作業により、地域社会に幼稚園教育が果たした役割を明らかにするための基本資料の収集、およびデータ・ベースがほぼ完成した。また、今年度の成果をふまえ、設立120年をむかえた土浦幼稚園の記念式典(2005年11月19日)において、湯川が「土浦幼稚園の誕生と120年の歩み」と題する記念講演をおこなった。

幼稚園の性格を地域社会との関係から分析するために、総合的な資料調査を行い、これまでの調査結果を検討・整理した。1、土浦市の行政文書をはじめとする周辺部の総合的な資料調査幼稚園入園者の親の社会階層・職業・経済状況の変遷などを総合的に分析するために、関連資料(土浦市の社会的・文化的状況等を含め、行政文書をはじめとする周辺部の郷土資料の発掘など)の収集を行なった。2、土浦幼稚園の所蔵資料の整理と目録作成研究協力者土浦市立博物館学芸員宮本礼子とともに同幼稚園の教具・文書・写真等の総合的な調査を実施し、目録を作成し、解題をつけた。その成果は、宮本が土浦市史資料目録に発表した。また、土浦市立博物館の展示改修にともない、常設展示に同幼稚園の歴史的意義を反映させた。3、土浦幼稚園と同時期に設立した幼稚園の調査茨城県および、明治10年代前期設立された長野県松本幼稚園・栃木県桐生幼稚園の調査をおこなった。前者は、明治期の恩物を中心とする教具の調査をはじめて実施し、土浦幼稚園のとの関連性に、教材・教具の側から考察する基礎的基盤を形成した。また後者は、内部資料の収集をおこない、土浦幼稚園設立時期に関連する明治前期の資料を発掘することができた。4、分析考察及び研究成果の公表これまでの調査結果を整理・検討し、地域社会における幼稚園教育の機能を分析し、各自研究成果の一部を発表した。
植物の成長制御に関わる水の機能化処理システムの開発研究

1.開発した粒状セラミックス(平均粒径1.2mm)は変異荷電を有しており、水中で機械的に流動させ、摩擦や衝突作用を生じさせることにより水の電気化学的反応が大いに期待できる。流動処理実験の結果、pHは処理時間の増加に伴い直線的に上昇し、セラミックスの作用によるpHの上昇は0.01(5分処理)0.06(60分)であった。また酸化還元反応速度も大であり、循環処理直後のセラミックスの作用によるORPの増加量は76mv(5分)150mv(60分)であった。また処理経過後ORP値は減少し、250mv前後で安定した。2.イオンクロマトグラフ法による水中のイオン定量分析の結果、水処理により、春期はカチオンの減少・アニオンの増加に対し、夏期はカチオンの増加・アニオンの減少、冬期はカチオン・アニオンともに増加となり、原水(水道水)に比べ年間にわたるイオンの溶出濃度は安定する傾向を示した。3.水の構造変化との関連を調べるため、水中における懸濁質に対し原水と処理水を供試して凝集作用の違いについて比較した。凝集剤にPAC、懸濁物にカオリンを用いた結果、処理水ではフロックが現れ易くなり、不溶化したアルミニウムの架橋作用を助け凝集効果は高められた。4.簡易なシーケンス制御法として、タイムスイッチ、リレー回路、タイマで構成し水耕液循環用ポンプを作動させた。外部からの水供給は、タイマが一定時間経過後にタイムアップし、水供給用電磁バルブを作動させた。5.水処理装置を組み入れたコマツナの生育・収量は処理区>対照区であった。さらに葉色濃度は間欠給液区>連続給液区であった。以上のことから、NFT周年栽培においては連続給液方式を基本とするが、間欠給液方式の採用による適切な水分ストレスを与えることで良品質かつ安定した生産が可能となることが示唆された。1.流動処理装置:開発した粒状セラミックス(平均粒径1.2mm)を供試して流動処理実験を行った。本セラミックスは変異荷電を有しており、水中で機械的に流動させ、摩擦や衝突作用を生じさせることにより水の電気化学的反応が大いに期待できる。そこで流動処理装置は観察できるよう透明塩ビ製とした。充填層(直径4.3cm、高さ18.5cmの円筒形)の上下をステンレス製のメッシュで仕切り、この中に一定量の粒状セラミックスを投入して、下方から上方へ水流を与えることによりセラミックスを流動させるようにした。充填層内を通過した水は水槽内にフィードバックさせる循環方式であるが、流量はバルブで調整できるようにした。基礎実験の結果、流量は10l/min時にセラミックス投入量300g以内であれば膨張比1.5で安定流動することが判明した。2.流動処理効果:pHは処理時間の増加に伴い直線的に上昇し、セラミックスの作用によるpHの上昇は0.0l(5分処理)0.06(60分)であった。3.発芽勢に及ぼす要因効果:小松菜種子を供試して、25°Cのインキュベータ内での発芽試験の結果、F検定による分散分析では処理直後の水には発芽勢に大きな差は見られない。しかし、10時間静置させた処理水には差が生じ、150g

投入量区(発芽勢3%)<100g投入量区(3.5%)<200g投入量区(86%)であり、200g投入量区で最も高い発芽勢を示した。このことは、静置させることによりORP値が安定することと関係があると思われる。さらに200g投入量区では1回処理(ワンパス)でも発芽勢の向上効果が認められた。1.四季にわたるイオン分析イオンクロマトグラフ法による水中のイオン定量分析の結果、水処理により、春期はカチオンの減少・アニオンの増加に対し、夏期はカチオンの増加・アニオンの減少、冬期はカチオン・アニオンともに増加で、いずれも原水(水道水)に比べCa^<2+>、Cl^-を含め、全イオン量は2213092×10^<-7>mol/l増加した。2.苗の比較夏期と冬期におけるコマツナ苗を比較すると、夏期の平均根長では原水区8.6mmに対し処理区17.6mm、苗長では原水区13.7mm、処理区17.1mmとなり、それぞれ両区に統計的差が見られた。一方冬期では苗長に差はなかったが、双葉は原水区8.0mmに対し処理区10.8mmとなり差が生じた。3.凝集効果水の構造変化との関連を調べるため、水中における懸濁質に対し原水と処理水を供試して凝集作用の違いについて比較検討することとし、凝集剤にはPACと懸濁物にはカオリンを用いた。その結果、濁度除去率を向上させる上で、pHの範囲により最適なPAC注入率が存在した。すなわち、pHがアルカリ側に移行するにつれ、PAC注入率の増加に伴い濁度除去率は向上する傾向を示し、pH<7.5では濁度除去率のピーク値はPAC注入率5ppmで、処理区18.1%、原水区17.4%であった。また7.5≦pH≦8.0では濁度除去率のピーク値はPAC注入率10ppmで、36.1%(処理区)、28.1%(原水区)に向上した。8.0<pH≦8.5ではPAC注入率15ppmで濁度除去率のピーク値は処理区で最大(49.9%、原水区42.6%)を示した。概して、原水区に比べ処理区では、より少ないPAC注入率で濁度除去率が向上した。このことは凝集剤の添加によりカオリン粒子の電荷が中和され、凝集や沈降が生じるが、とくに処理水では電気化学的反応によりフロックが現れ易くなり、不溶化したアルミニウムの架橋作用を助けていることから、凝集効果は高められるといえる。1.水処理装置の作動制御水処理装置には内部のセラミックスの目詰まり防止のため、エアポンプと水中ポンプを設置し、これらは養液タンク内で常時作動させるようにした。2.シーケンス制御法間欠給液方式の検討簡易な制御法として、タイムスイッチ、リレー回路、タイマで構成し、タイムスイッチがオンで水耕液循環用ポンプを作動させた。タイマの設定は、栽培ベッド長11m、高低差1/80の実地栽培ベッド上の養液がタンク内にフィードバックされる時間を考慮して決定した。外部からの水供給は、遅延回路によりタイマが一定時間経過後にタイムアップし、水供給用電磁バルブを作動させた。養液タンク内にはフロートレススイッチ(レベルスイッチ)を取り付け、一定の水位に達すると水供給用電磁バルブは閉じるシステムとした。3.野菜葉色の色情報品質指標として葉の緑色濃度全体の情報を把握するため、収穫直後の葉をイメージスキャナを用い、TWAINインターフェイスを介してパソコンに取り込み、葉画像上のピクセルカラー値をGREENのヒストグラムで表示した。これを葉緑素計と対応させたところ、両者の数値は良好な相関関係であることを確認した。
側抑制相互作用のあるニュ-ロン系の自己組織化

抑制性の伝達物質GABAの阻害剤Bicucullineの作用により、大脳皮質における方位選択性を示すニュ-ロンの出力特性が等方的に変化することが神経生理学的な実験から知られている。これは抑制性のシナプス結合が方位選択性の発現に重要な役割を果していることを意味する。従って我々は、抑制性のシナプス結合の学習によって方位選択性の自己組織化が行なわれる様なモデルを提案する。このモデルは3層からなり第1層は入力層、第2層は介在ニュ-ロン層、第3層は側抑制相互作用のある出力層である。入力層と出力層、入力層と介在ニュ-ロン層は興奮性シナプスで結合しており,介在ニュ-ロンへのシナプスではHebbruleによる学習が行なわれる。介在ニュ-ロンと出力ニュ-ロンは抑制性シナプスで結合している。更に出力層での方位選択性ニュ-ロン群の過剰発火を防ぐために出力層の方位選択性ニュ-ロンの膜電位の上昇に応じて抑制結合を強化する効果を導入した。このモデルで2次元の傾きパタ-ンの入力に対して、2次元の方位選択ニュ-ロン層の自己組織化の問題として学習方程式の平衡解を入力パタ-ンのアンサンブル平均の近似で、コンピュ-タ・シミュレ-ションで求めた。その結果、抑制結合の学習により方位選択性の自己組織化を2次元のニュ-ロン系で実現させることに成功した。他方、運動方向性の認識についての研究も行なった。猿に対する神経生理学的な実験で、視覚神経を刺激すると一次視覚野のニュ-ロンからある時間遅れを伴ったいくつかの信号が検出される。我々は神経回路の2層モデルにおいて直接的な経路の他に時間遅れを持った別の経路を併せ待つ神経回路網モデルを提案した。種々の方向に運動する棒状のパタ-ンを入力して、この神経回路モデルにHebb学習を行なわせることにより、側抑制相互作用のあるニュ-ロン系で運動方向選択性の自己組織化がおこることを示すことが出来た。
分散ソフトウェア開発を支援する構成管理システムの生成系に関する研究

本研究の目的は、地球規模で分散したソフトウェア開発を支援する、構成管理システムの構成法を明らかにすることである。これまでの調査・研究により、このようなソフトウェア開発には、分散した各拠点ごとの方針で構成管理システムを運用し、拠点間の分散・協調形態に応じて、必要な成果物や変更履歴を共有する運用形態が適していることが明らかになった。本年度は最初に、昨年度CVS (Concurrent Versions System)のプロキシ・サーバとして実装した、拡張可能な構成管理システムのオブジェクト指向フレームワークの再設計を行った。新しいフレームワークではInterceptorアーキテクチャ・パターンを採用し、拡張機能がプロキシ・サーバの状態遷移に割り込み、データの流れと制御の流れの両者を変更することを可能にした。これにより拡張性の幅が広がり、構成管理システムに組み込み可能な支援機能のバリエーションが広がった。次に、拠点間の分散・協調関係を反映可能なリポジトリの分散機構を、構成管理システムに組み込まずに分離した形で実現する研究を行った。この研究ではリポジトリの分散機構を、1)他拠点の構成管理システムのリポジトリの任意の部分を組み合わせて、自拠点のリポジトリを構築できる細粒度複製、2)リポジトリ間の関係を追跡する協調支援データベース、3)リポジトリに加えられた変更を拠点間で交換する4つの操作により実現した。これにより、異なる運用方針を持つ拠点間で、必要な分散・協調形態を実現できることを明らかにした。結果として、地球規模に分散したソフトウェア開発を支援する構成管理システムは、上記の拡張可能な構成管理システムと、細粒度複製を基にしたリポジトリ分散機構の適切な組み合わせにより実現できることが明らかになった。本年度は、まず、この開発形態の典型例であるオープンソースソフトウェアの開発プロジェクトの構成管理の実態について調査を行い、中間成果物の公開方法と構成管理のプロセスの二つの観点で整理したものを発表した。その過程で、構成管理システムのログ情報を分析するツールの研究・開発を行い発表した。次に、その開発形態を支援する構成管理システムの生成系を、CVS (Concurrent Versions System)のプロキシ・サーバとして実現する手法を研究し、その中間成果を発表した。この研究では、プロジェクトに応じた構成管理システムを生成するための、三階層からなるアプリケーション・フレームワークのうち、基本ライブラリ層を既存のCVSにゆだね、その上に構成管理フレームワーク層を実現している。拡張フレームワーク層については、アクセス管理機構に関するものを設計・実装し、ACL (Access Control List)とRBAC (Role Based Access Control)という異なる二つのアクセル管理構構を持つ構成管理システムの生成例を示した。実施計画では、拡張フレームワーク層としてリポジトリ分散機構に関するものに取り組む予定であった。しかし、調査・研究を進めた結果、リポジトリ分散機構はそれ自身大きな研究課題であるとの認識にいたり、その過程で得られた知見を発表予定である。この発表では、複製と同期を基本機構としてリポジトリの分散を実現し、複製・同期の方針を任意に設定可能な複製管理機構をもって、さまざまな分散形態に対応するアプローチについて述べる。
白血病におけるkpm(Lats2)発現異常の分子病態

Kpm(Lats2)は、セリン・スレオニンキナーゼで、Hippoシグナル伝達経路の中核分子の一つである。われわれは、様々な白血病におけるkpm(Lats2)の発現を調べ、難治性白血病においてkpm(Lats2)の発現が低下していることを見いだした。白血病細胞株のkpm(Lats2)をノックダウンすると抗がん剤に抵抗性となった。抗がん剤によるDNA傷害後のp73の核内安定化とその下流のPUMAおよびp21の発現誘導にはKpm(Lats2)による転写補助因子YAP2の127番セリンのリン酸化が必要であることを明らかにした。したがって、Kpm(Lats2)の低発現は治療抵抗性の一つの要因となると考えられる。我々は、real-timePCR法によって様々な造血器腫瘍におけるkpm/Lats2の発現量を定量し、代表的な治療抵抗性腫瘍であるATLおよびNK cell leukemia/lymphomaでkpm/Lats2の発現低下を認めた。kpm/Lats2の発現低下による白血病細胞の性状変化を調べるために、siRNA発現レトロウイルスベクターを用いてKG-laとATL由来T細胞株ED-40515の2つの白血病細胞株よりkpm/Lats2をknock down(KD)した亜株を作成した。これらの細胞はコントロールベクターを導入した細胞に比較して、抗Fas抗体、adriamycin、etoposideに対して明らかな抵抗性を示した。Kpm/Lats2-KD細胞の詳細な解析により、これらの細胞では抗がん剤によるDNA傷害後のp73の核内集積とそれに続くPUMAとp21の発現誘導が起こらないことが判明した。ChIPアッセイでも、kpm/Lats2-KD細胞ではDNA傷害後のp73のPUMA遺伝子プロモーター領域への結合が低下していた。また、p73、kpm/Lats2、およびYorkieのヒト相同体であるYAP2の293T細胞への一過性発現系で、キナーゼ活性をもつ野生型Kpm/Lats2とYAP2を共存させるとp73の蛋白量が増加したが、キナーゼ活性欠失Kpm/Lats2またはアミノ酸127番のセリンをアラニンに置換したYAP2ではその効果が殆ど認められなかった。ChIPアッセイにおいて、コントロール細胞ではDNA傷害後のPUMAプロモーター領域へのp73の結合が認められたのに対して、Kpm/Lats2ノックダウン細胞では認められなかった。以上の結果から、抗がん剤によるDNA傷害後のp73の核内安定化とその下流のPUMAおよびp21の発現誘導にはKpm/Lats2によるYAP2の127番セリンのリン酸化が必要であり、Kpm/Lats2の発現低下が治療抵抗性の一因となることが明らかとなった。白血病細胞におけるkpm発現異常の解析様々な白血病細胞株、新鮮白血病・リンパ腫細胞におけるkpm(Lats2)mRNAの発現量をquantitative PCR法で定量化し、白血病の種類および悪性度とこれらの分子の発現低下との関連性を調べた。その結果、難治性リンパ系腫瘍のATLとNK白血病リンパ腫では殆ど例外なくそれぞれ正常のCD4+T細胞とNK細胞に比較してkpmの発現が著明に減少していて、難治性の症例ほど低い傾向が見られた。一方、AMLでは非白血病骨髄細胞(様々な系列、分化段階の細胞が混在)に比べてkpmの発現がむしろ増加している傾向が見られた。以上の結果から、kpmの発現低下はリンパ性腫瘍の治療抵抗性と相関することが確認された。線虫におけるkpm(warts)相同遺伝子産物と相互作用する分子の同定2008年4月に研究代表者が京都大学医学部から立命館大学生命科学部へ転出したことに伴い、ヒト検体を用いた実験の継続が困難となった。そのため、材料の準備や実験操作の点で利便性の高いC.elegansをモデル動物に選んでHippo経路の基本構造を明らかにする研究を開始した。これまでに、kpm(warts)の相同遺伝子wts-1を単離し、酵母発現ベクターに組み込み、Yeast two-hybridシステムを用いて線虫cDNAライブラリ(理研および名古屋大学生命理学研究科松本研より入手)からwts-1と相互作用する分子のスクリーニングを行った。現在、得られたいくつかの候補クローンについて解析を進めている。(1) C.elegansのWarts相同体(wts-1)と相互作用する分子の探索C.elegansのWarts相同体であるwts-1のkinase domainを欠損させた変異型(wts-1ΔKD)をbaitとしてyeast two hybrideシステムを用いてスクリーニングを実施し、16個のprey候補を得て、そこからこれまでに10個の独立したクローンを単離した。

現在、その中でE3ユビキチンリガーゼであるNHL-1について一過性発現系での共免疫沈降による相互作用の確認実験および、個体レベルでの相互作用および発現型の機能的関連性についてのepistasis解析を行っている。(2) C.elegansにおけるRASSF相同体T24F1.3と相互作用する分子の探索DNA傷害性ストレスによって活性化されるATMがRASSF1Aをリン酸化して、MST2とLats1の活性化とp73の安定化を引き起こすことが報告され(Curr Biol 19:2020-2025, 2009)、がん細胞の遺伝子の不安定化にRASSF1Aの欠損とともにHippo経路が関与することが示唆されている。そこで、C.elegansの唯一のRASSF相同体であるT24F1.3をbaitとしてyeast two hybridシステムを用いてスクリーニングを行い、これまでに30個の候補遺伝子を同定した。その中で、F11E6.7 (Rif1)、Rab-1、Rab-39などを有力候補と見なして、一過性発現系での共免疫沈降による相互作用の確認実験および、個体レベルでの相互作用および発現型の機能的関連性についてのepistasis解析を行っている。
らせん描写課題を用いた振戦疾患病態評価・リハビリテーションシステムの開発

らせん描写課題を用いた振戦疾患病態評価・リハビリテーションシステムの開発の目的で以下の研究を行なった。1アルキメデス螺旋(以下[螺旋])を用いた振戦疾患病態評価システムの開発各種振戦疾患の病熊評価を目的に、螺旋描写課題を用いた振戦疾患病態の定量評価システムを開発した。本システムは、タブレットPC、3軸型加速度計により被験者の螺旋描写中の描写図形および上肢振戦加速度を計測し、定量的に評価するものである。平成18年度に試作したシステムに、課題作成提示、時系列ペン座標集録、筆跡表示の有無を追加し、パーキンソン病(PD)、本態性振戦疾患(ET)患者を対象に計測を行った。その結果、筆記加速度実効値とPDのYahrの重症度分類との間に高い相関がみられ、病態評価システムとしての有用性がみられた。また、筆跡の有無が描写時の加速度、図形に影響を与えることがわかり、病態評価及びバイオフィードバック(BF)システム構築のための知見が得られた。2振戦疾患リハビリテーションシステムの開発PD、ETの振戦を患者自身が随意的に抑制することを目的としてBFを用いた振戦抑制訓練システムを開発した。平成18年度に行なった座位安静時振戦抑制の短期BF訓練の結果を踏まえ、6ヶ月間の長期BF訓練を実施した。BF訓練の結果では、個人差が大きくBF群として有意にその効果を確認することはできなかったが、個々の被験者についてみてみると振戦加速度実効値が下がる傾向も見られ、訓練方法等を検討することにより効果的な振戦抑制BF訓練システムとなる可能性がみられた。さらに、被験者の中には、本システムを使用することによって普段認識していなかった振戦の制御について気付くことができた人もおり、訓練システムによる二次的な効果を得ることができた。らせん描写課題を用いた振戦疾患病態評価・リハビリテーションシステムの開発の目的で以下の研究を行った。1アルキメデス螺旋(以下[螺旋])を用いた振戦疾患病態評価システムの開発各種振戦疾患の病態評価を目的に、螺旋描写課題を用いた振戦疾患病態の定量評価システムを開発した。本システムを用い、パーキンソン病(PD)、本態性振戦疾患(ET)患者を対象に計測を行い、その結果、極座標分散からPDの固縮症状、ETの振戦症状を定量評価できる可能性が示唆された。2振戦疾患リハビリテーションシステムの開発PD、ETの振戦を患者自身が随意的に抑制することを目的として、バイオフィードバック(BF)を用いた振戦抑制訓練システムを開発した。平成18年度は、PD患者を対象に座位安静時の安静時振戦の抑制について研究した。被験者は無作為にBF群とコントロール群に分けた。BF群では、被験者の上肢拇指基部に3軸型加速度計を装着し、振戦の加速度実行値(RMS)に対応した音圧の純音をヘッドホンより聴取させつつ、その音圧が下がるように訓練を行った。コントロール群では、ヘッドホンからのフィードバックなしで、同様の訓練を行った。訓練は1分間を3回とし、各階毎に1分間の休憩をとった。訓練の前後に安静時の振戦加速度を計測し、訓練後に振戦抑制方法が獲得できたかをRMSの比により評価した。本研究の結果、BF群において、振戦RMSの比が有意に低下し、訓練校かが確認された。平成19年度は、本研究にてわかった病態評価、訓練システムの課題について取り組み、さらに筋電図解析等を用いて固縮・振戦症状との関係を検討するとともに、抑制訓練については長期間における訓練・評価について研究を行う。
脊髄でのニコチンによる疼痛緩和機序の解明

タバコに含まれるアルカロイド成分であるニコチンを実験動物に髄腔内投与すると、鎮痛効果を認めることが約70年前より知られている。しかしながら、このニコチンによる鎮痛作用機序は、明らかでない。そこで、脊髄におけるニコチンの鎮痛作用機序を検討するためラットより横断スライス標本を作成した。作成したスライス標本の後角細胞(後角第II層と第V層)よりパッチクランプ記録を行い電気生理学的にニコチンの作用を検討した。ニコチン投与により、脊髄後角より記録したsIPSC (spontaneous inhibitory post-synaptic current;抑制性後シナプス後電流)は、その頻度を増した。つまり、ニコチンは、脊髄での主な抑制性伝達物質であるGABAまたはグリシンの開口放出の増強をもたらした。この増強作用はニコチン受容体のアンタゴニストであるメカミラミンで完全に拮抗されたことにより、抑制性ニューロンに分布するニコチン受容体を介してのGABAまたはグリシン放出の賦活作用であることが分かった。これらの応答は脊髄後角第II層・V層の両方のニューロンで記録された。ニコチン受容体はαとβサブユニットの5量体で形成され様々なサブタイプを持つ、そこで脊髄後角におけるニコチン受容体サブタイプが脊髄より上位の中枢でよく観られるサブタイプと同様であるかどうかを知るために中枢に多いといわれるα4β2またはα7サブタイプに特異的に反応するアゴニストを投与したところ、後角第II層ではこれら両アゴニストに対する応答は観られなかったが、第V層では、これらのアゴニストによってsIPSCの頻度が増強した。更にII層・V層の細胞そのもの(inter-neuron)に発現するニコチン受容体を検討するために同じアゴニストを投与したところ、V層のニューロンがα4β2タイプのアゴニストのみに反応し内向き電流を発生させた。II層のニューロンはα4β2とα7タイプのアゴニストのいずれにも応答しなかった。そこで、末梢神経側に多く発現するといわれているα3β4タイプのアゴニストを投与したところ後角第II層でsIPSCの頻度の増強を起こすとともに内向き電流も認めた。以上より、脊髄後角第II層とV層におけるGABAニューロンやグリシンニューロンに発現するニコチン受容体のサブタイプが異なることを電気生理学的に認めた。痛みを修飾する抑制性ニューロンに特異的に発現するニコチン受容体を明らかにできれば、将来、疼痛緩和薬として寄与する可能性が示唆される。約70年前より行動学的研究でニコチンが痛覚抑制作用を持つということが示唆されてきた。しかしながら、この抑制作用の詳細な機序は明らかでない。そこで、痛覚に深く関与する脊髄後角でのニコチンによる修飾作用がどのようにして起こるのかを検討した。ラット脊髄より脊髄スライス標本を作成し、酸素化した人工脳脊髄液を潅流することにより脊髄の神経細胞を生かした状態にしin-vitroで脊髄後角細胞にブラインドパッチクランプ方を用いることにより抑制性伝達の電気的な応答の記録が行えるようにした。脊髄での抑制性電流応答としてはGABAやグリシンといった伝達物質や受容体の反応を介する抑制性後シナプス電流(IPSC : Inhibitory Post-synaptic Current)をAxopatch200Bというアンプを用いて可視化できるようにした。本研究ではGABAやグリシンといった抑制性伝達物質が神経性ニコチン受容体によりどの様に修飾されるかを観察するため、ニコチン受容体作動薬を記録下の脊髄スライスに投与しその反応を観た。100μMのニコチンを投与すると、浅層の脊髄後角第II層、深層の第V層の両層にてspontaneousu IPSCの頻度の増加、つまりは、GABAまたはグリシンの放出の増加を認めた。これらニコチンによる抑制性伝達物質の賦活作用はニコチン受容体の拮抗薬であるメカミラミンで完全に拮抗された。これらのことより、神経性ニコチン受容体はGABAやグリシンを含有するニューロンに発現し抑制性伝達物質の開口分泌を増強させることが確認できた。

ニコチン受容体はαとβサブユニットの5量体で形成され様々なサブタイプを持つ、そこで脊髄後角におけるニコチン受容体サブタイプが脊髄より上位の中枢でよく観られるサブタイプと同様であるかどうかを知るために中枢に多いといわれるα4β2またはα7サブタイプに特異的に反応するアゴニストを投与したところ、後角第II層ではこれら両アゴニストに対する応答は観られなかったが、第V層では、これらのアゴニストによってsIPSCの頻度が増強した。更にII層・V層の細胞そのもの(inter-neuron)に発現するニコチン受容体を検討するために同じアゴニストを投与したところ、V層のニューロンがα4β2タイプのアゴニストのみに反応し内向き電流を発生させた。II層のニューロンはα4β2とα7タイプのアゴニストのいずれにも応答しなかった。そこで、末梢神経側に多く発現するといわれているα3β4タイプのアゴニストを投与したところ後角第II層でsIPSCの頻度の増強を起こすとともに内向き電流も認めた。以上より、脊髄後角第II層とV層におけるGABAニューロンやグリシンニューロンに発現するニコチン受容体のサブタイプが異なることを電気生理学的に認めた。痛みを修飾する抑制性ニューロンに特異的に発現するニコチン受容体を明らかにできれば、将来、疼痛緩和薬として寄与する可能性が示唆される。
気道粘膜への好酸球浸潤における気道収縮時のshear stressの関与について

本研究における課題であったin vitroにおけるヒト好酸球実験にて以下の新たな知見を得ている。1.ヒト好酸球のfiltrationによる活性化について健常人より採取した血液より、多核白血球を分離精製し10%FBSを含んだRMPI1640にて1x10^6cell/mlに調整した。その後、気管支粘膜部の毛細血管と同等の直径を持った直径5μmのpolycarbonate製のfilterに分離白血球を1or3ml/minの速度にてfiltrationを行った。その後flowcytemetryを用いてCD11bの発現をCD16-negative(好酸球)およびCD16-positive(好中球)の分画に分けて測定した。その結果、1ml/miのfiltrationにより好中球および好酸球膜表面上のCD11bの発現の有意な増加が認められた。この増加をPAF10^<-7>MもしくはfMLP10^<-7>MによるCD11bの発現量と比較した場合、好酸球のfiltrationによるCD11bの発現量はPAF10^<-7>MもしくはfMLP10^<-7>Mによる発現量の40%程度であるに対し、好中球では10%程度であった。この事より、好酸球においては、好中球に比較し、shear stressといった物理的な因子による活性化を生じやすいものと考えられた。更に、この増加は細胞外Ca^<2+>-freeにては認められず、L-type Ca^<2+>channel blockerであるniffedipineにより有意に抑制された結果より、好酸球のfiltrationによるCD11bの発現増加には、L-type Ca^<2+>channelを介した細胞外Ca^<2+>の流入が重要であると考えられた。以上、好中球に比較し、好酸球はfiltrationといったshear stressの様な物理的因子によって活性化しうる可能性が本研究により示された。2今後の研究filtrationによる好酸球活性化の機序についてPAFの関与等につき検討を行う予定である。本研究における課題であったモルモットを用いたin vivoの実験系、およびin vitroにおけるヒト好酸球実験にて以下の新たな知見を得ている。1モルモットの気管支収縮における好酸球浸潤についてHartley系雄モルモットにて、右迷走神経に電気刺激を行い、右気管支のみを収縮させた後、形態学的検討を行った。その結果、収縮させていない気管支(左肺の気管支)と比較し収縮した気管支(右肺の気管支)にて、粘膜部に有意に好酸球の集積増加が認められ、外膜部では逆に有意に好酸球の集積の低下が、認められた。この好酸球の粘膜部への集積増加は、形態学的な気管支収縮度と有意な正の相関関係が認められた。さらに、この現象における迷走神経の神経末端から電気刺激により放出されると考えられる化学伝達物質の影響を調べるために、cholinoceptor antagonistであるatropineを1mg/kgを前投与し、同様に右迷走神経刺激を行い形態学的な検討を行った。その結果、迷走神経刺激による気管支の収縮は認められず、また粘膜部への好酸球の集積増加も認められなかった。以上の結果より気管支収縮による粘膜部のshear stressによって好酸球は気管支粘膜部に集積すると考えられた。2ヒト好酸球のfiltrationによる活性化について健常人より採取した血液より、多核白血球を分離精製し10%FBSを含んだRMPI1640にて1x10^6cell/mlに調整した。その後、気管支粘膜部の毛細血管と同等の直径を持った直径5μmのfilterに分離白血球を1or3ml/minの速度にてfiltrationを行い、flowcytemetryを用いてCD11bの発現をCD16-negative(好酸球)およびCD16-positive(好中球)の分画に分けて測定した。その結果、1ml/miのfiltrationにより好中球および好酸球膜表面上のCD11bの発現の有意な増加が認められ、その増加率は好酸球が好中球に比較して有意に高かった。また、この増加は細胞外Ca^<2+>-freeにては認められなかった。以上の結果より、好酸球は毛細血管を通過するときのshearstressにより活性化する可能性が示された。3今後の研究今後、in vivoにおいては電子顕微鏡を用いた気管支粘膜部における好酸球集積の特定位置の同定を行う予定である。また、in vitroにおいては、filtrationによる好酸球活性化の機序について検討を行う予定である。この増加をPAF10^<-7>MもしくはfMLP10^<-7>

MによるCD11bの発現量と比較した場合、好酸球のfiltrationによるCD11bの発現量はPAF10^<-7>MもしくはfMLP10^<-7>Mによる発現量の40%程度であるに対し、好中球では10%程度であった。この事より、好酸球においては、好中球に比較し、shear stressといった物理的な因子による活性化を生じやすいものと考えられた。更に、この増加は細胞外Ca^<2+>-freeにては認められず、L-type Ca^<2+>channel blockerであるniffedipineにより有意に抑制された結果より、好酸球のfiltrationによるCD11bの発現増加には、L-type Ca^<2+>channelを介した細胞外Ca^<2+>の流入が重要であると考えられた。以上、好中球に比較し、好酸球はfiltrationといったshear stressの様な物理的因子によって活性化しうる可能性が本研究により示された。2今後の研究filtrationによる好酸球活性化の機序についてPAFの関与等につき検討を行う予定である。
発酵乳の抗変異原性に関する研究

昭和60年度科学研究費補助金を得てヒトおよび各種動物の糞便が変異原性を有し、またL.bulgaricus,S.thermophilus,S.lactisおよびS.faecalisの単用もしくは併用により製造した発酵乳がAF2,4NQ0,Trp-P1といった直接変異原物質の変異原性を減弱させることを認めた。これらの事実に基づき本年度はAmes株TA98およびTA100から造成したストレプトマイシン耐性株をマーカー菌として下記の研究を行なった。」1.ヒトおよび各種動物糞エキスの変異原性に対する発酵乳の減弱効果イヌ,ネコ,サル,ウサギ,ブタ,ヒトの新鮮糞より水抽水液を得た。これらの抽出液はいずれも変異原性を示した。これら糞便エキスの変異原性は上記乳酸菌単用によって製造した発酵乳により著しく減少することを認めた。2.乳酸菌菌体による抗変異原性ヒト腸管菌叢中代表的な腸球菌であるS.faecalisの洗浄菌体ならびに細胞壁によるAF2,MNNGならびに4NQ0に対する抗変異原性を調べた。その結果S.faecalis6株の洗浄菌体ならびに細胞壁に顕著な抗変異原性が認められた。さらに、イヌ,ネコの新鮮糞から調製した変異原性に示す水エキスに対してもS.faecalisの洗浄菌体ならびに細胞壁は抗変異原性を示すことが明らかとなった。これらの現象は乳酸菌の生菌のみがヒト腸管にあって優れた生理的効果を示すとする從来の認識を覆すもので、菌体の生死にかかわらず変異原性物質さらには癌原物質を細胞壁に吸着させ便として排泄させることを窺わせるもので本研究で得た結果の中で最も興味深く、また乳酸菌の生理的効果を知る上で重要な知見である。3.今後の研究の展開上記1および2で得た知見に基づき、発酵乳ならびに乳酸菌菌体(特に細胞壁)のinvivoでの研究をすすめたい。
各種サイトカインの頭頚部偏平上皮癌培養細胞に対する増殖および表面分子の検索

頭頚部偏平上皮癌培養細胞株(SCCHN)に対する、サイトカインの作用を検索する目的に、Tumor Necrosis Factor α(TNF-α)およびInterferon γ(IFN-γ)の細胞増殖抑制効果のin vitroでの観察と、その抑止効果の作用機序の解明をNTT assay法にて検索した。さらに細胞表面の、TNF-αレセプターおよびFas抗原の発現、そしてTUNEL法によるDNAの断片化の観察によるアポートシス細胞の証明をflow cytometryにて観察しアポートシス細胞の存在を証明した。続いてSCCHNに対するNKおよびIL-2活性化NK細胞の効果とIL-2遺伝子をSCCHNに導入しin vivoおよびin vitroでの変化を観察した。SCCHNに対しNK細胞は細胞障害性を示さなかったが、A-NKは強い細胞障害性を示した。SCCHNは8症例の偏平上皮癌から樹立したが、その感受性は個々に異なっていた。IL-2遺伝子を導入されたSCCHNは1年間に亘ってIL-2の分泌が測定された。IL-2遺伝子を導入したSCCHNは非遺伝子導入細胞に比べ、その培養上清がNK細胞とマクロファージを活性化することをFACScanを用いた表面分子の検索で観察した。nude mouseモデルでは、親株は時間依存性に28日まえ皮下腫瘍を形成したが、IL-2遺伝子導入細胞では8-14日で腫瘍は消失した。また、SCCHNの表面分子をFACScanにて観察した。個々の細胞によってMHCclassIの発現と予後に関連が認められたが、class II, ICAM-I等の接着分子の発現には相関は認められなかった。はじめに:本年度はヒト頭頚部扁平上皮癌培養細胞株に対する、サイトカインであるTumor Necrosis Factor(TNF-α)およびInterferonγ(IFN-γ)の細胞増殖抑制効果のin vitoroでの観察と、その抑制効果の作用機序の解明を主眼に実験を行った。材料および方法:ヒト頭頚部扁平上皮癌培養細胞株のPCI51およびPCI52を用い、TNF-αおよびIFN-γの細胞増殖抑制効果をMTT assay法にて検索した。さらにヒト頭頚部扁平上皮癌培養細胞表面のTNF-αレセプターおよびFas抗原の発現、そしてTUNEL法によるDNAの断片化の観察によるアポトーシス細胞の証明をflow cytometryにて観察することにより、細胞増殖抑制効果の作用機序の解明を行った。結果:TNF-αおよびIFN-γは単独投与でPCI51およびPCI52に抗増殖効果を持ち、さらに併用で相乗的な結果を示した。PCI51において、細胞表面のTNF-αレセプターの発現がTNF-αおよびIFN-γは単独投与2時間後に検出され、さらにFas抗原の発現が4、7、14時間後に観察された。また、TUNEL法によるDNAの断片化の証明が、TNF-αおよびIFN-γは投与24時間後に観察され、アポトーシス細胞の存在が証明された。結論:TNF-αおよびIFN-γはヒト頭頚部扁平上皮癌培養細胞株に対して細胞増殖抑制効果を示し、細胞によりその感受性の違いが観察された。細胞増殖抑制効果の作用機序としてTNF-αレセプターを介するシグナル伝達機構の存在が示唆された。Fas抗原を介するアポトーシス的細胞死に対するシグナル伝達機構の存在とアポトーシス細胞の証明により、TNF-αおよびIFN-γがヒト頭頚部扁平上皮癌培養細胞をアポトーシスへ誘導することが示唆された。以上の研究成果を第97回日本耳鼻咽喉科学会総会および第20回日本頭頚部腫瘍学会総会にて講演し、DOKKYO JORNAL OF MEDICAL SCIENCESに掲載予定である。はじめに:本年度は頭頸部扁平上皮癌培養細胞(SCCHN)にIL-2遺伝子をretroviral vectorを用いて導入し、そのIL-

2遺伝子導入SCCHNの免疫特性とnude mouse内での腫瘍増殖を検討した。方法:SCCHNにretroviral DFG-hlL-2-NeoR vector(9.95kb)を用いて、IL-2遺伝子導入を試み、細胞上清中のサイトカイン産生能(IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-12,TNF-α,GM-CSF)また、IL-2の産生をELISAにて1年間に渡って測定した。また上清と培養疫を1:1にて末梢単核球と3日間培養し、その表面マーカーの変化をFACScanにて検索した。また、IL-2遺伝子導入SCCHNの増殖変化を知るために、VTR連続記録を行い、細胞分裂の様子を観察した。さらにIL-2遺伝子導入したSCCHNと親株細胞をnude mouseの皮下に注入し増殖を観察した。結果:IL-2産生遺伝子を導入されたSCCHNは1年間に渡ってその上清中にIL-2が測定された。一方、通常認められるIL-6の産生がpalental cellより低下していた。その他のサイトカイン産生は認められなかった。単核球の表面マーカーの変化では、HLA classII,IL-2 recepterのα,β,γのすべてが新鮮細胞に比べその表質の上昇を認めた。nude mouseモデルでは、親株は時間依存性に皮下腫瘍を形成したが、IL-2遺伝子導入細胞では短期間に腫瘍は完全消失した。以上の結果より、IL-2産生遺伝子を導入されたSCCHNより産生される物質は、免疫エフェクター細胞の活性化を促することがin vitroおよびin vivoにおいて証明された。以上の結果は第16回耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会にて報告し、現在投稿準備中である。昨年我々は頭頸部扁平上皮癌培養細胞(SCCHN)に対するNKおよびIL-2活性化NK細胞の効果とIL-2遺伝子をSCCHNに導入しin vivoおよび石in vitroでの変化を観察報告した。(方法)末梢血より分離された単核球より抗体法にて得られたNK細胞と、これにIL-2(6,000IU/ml)を加え2週間培養し活性化したIL-2 activated NK(A-NK)のSCCHNに対する抗腫瘍性を、4時間クロム遊離試験にて測定した。SCCHNにretroviral DFG-hIL-2-NeoR vector(9.95kb)を用いてIL-2遺伝子導入を試み、IL-2の産生をELISAにて1年間に亘って測定した。非遺伝子導入細胞とIL-2遺伝子導入細胞の培養上清と末梢血単核球を培養し、その表面抗原の変化を検索した。また、このIL-2遺伝子導入したSCCHNと親株細胞をnude mouseの皮下に注入し増殖を観察した。(結果) SCCHNに対しNK細胞は細胞障害性を示さなかったが、A-NKは強い細胞障害性を示した。SCCHNは同じ扁平上皮癌から樹立したが、その感受性は個々に異なっていた。IL-2遺伝子を導入されたSCCHNは1年間に亘ってIL-2の分泌が測定された。IL-
エピジェネティクス調節を介した新規レチノイン酸作用機構の解明と応用

レチノイン酸(RA)は生体内で重要な作用を示すことから、癌、生活習慣病等の予防・治療の観点から注目されている。本研究では核内受容体とは別のRA作用機構であるレチノイル化(RAによる蛋白質修飾)についてヒト白血病細胞を用いて検討を行った。先ず、新規レチノイル化蛋白質としてアクチン重合を制御するRhoGDIを同定した。また、レチノイル化プロテインキナーゼA (PKA)の生理的役割解明の検討を行い、RA処理によりPKAが安定化し核内移動すること、RAがヒストン分子の動態(リン酸化等の蛋白質修飾)を変化させること、新規RA機構解明には他のPKA核内基質の同定が必須であることが判明した。生命の維持に重要な作用を示すレチノイン酸(RA)は、ヒト前骨髄性白血病細胞(HL60細胞)に対し強力な細胞分化誘導能を持つことから、現在急性前骨髄球性白血病患者の治療に使われている。本研究ではRA作用の核内受容体とは別の作用機構として、cAMP依存性リン酸化酵素(PKA)等のシグナル分子およびヒストン等の核内タンパク質へのレチノイル化反応(RAによる翻訳後タンパク質修飾)があることを証明し、RAのエピジェネティクス制御作用という新しい概念を提唱することにある。本年度は、cAMP-PKAと同様に、ホルモン等の細胞外シグナルの増幅、分配、応答に関わる細胞内新規レチノイル化シグナル分子を検出・同定する、核内レチノイル化PKAによる核内タンパク質のリン酸化を調べ、RA処理後PKAにより新たにリン酸化される新規核内リン酸化タンパク質を検出・同定する、並びに、各ヒストン修飾へのRAの影響を調べることを検討した。先ず、RA処理したHL60細胞から調製した抽出画分中のタンパク質をMono Qカラムで分離し、溶出画分のタンパク質を一次元電気泳動により分離後、RA抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、既に同定されているタンパク質とは異なる挙動を示す新たなレチノイル化タンパク質を検出することができた。現在、二次元電気泳動法によりタンパク質を分離・検出し、同定を行っている。また、RA処理したHL60細胞から核を単離し、抽出した核内タンパク質を二次元電気泳動により分離後、抗リン酸化-PKA基質抗体と抗RA核内受容体抗体を用いて免疫染色を行った。近接するタンパク質が染色されたことから、受容体のリン酸化に関わる可能性が示唆されたが、さらなる検証を必要とする。さらにヒストンの修飾にRAが与える影響を解析するため、HL60細胞からクローニングしたヒストンのcDNAの3'末端にFLAG配列を付加し、これをCMVプロモーター下流に導入した発現プラスミドを構築することができた。ビタミンAの活性型であるビタミンA酸(レチノイン酸、RA)は、生命の維持に欠かせない重要な作用を示す。RAはヒト前骨髄性白血病細胞(HL60細胞)を顆粒球様細胞に分化誘導させることから、現在急性前骨髄球性白血病患者の治療に使われている。本研究ではRAの核内受容体を介さない作用機構に着目し、cAMP依存性リン酸化酵素(PKA)等のシグナル分子及びヒストン等の核内分子へのRAによる翻訳後蛋白質修飾を解明し、RAによるエピジェネティクス制御という新しい概念を提唱することにある。今年度はRAによるHL60細胞の分化誘導に伴うヒストン蛋白質(H2A、H2B、H3、H4)の変化及びRA処理により変化する細胞タンパク質について検討を行った。先ず、未処理、RA処理したHL60細胞から調製した抽出画分中のタンパク質をMono Qカラムで分離しヒストンの粗精製を行った。各抗ヒストン抗体を用いて免疫染色を行い、溶出フラクションを確認したところ、全てのヒストンはボイドフラクションに検出された。次に、このフラクションに対しMono Sカラムを行いヒストンを確認したところ、異なる位置に各ヒストンが検出された。また、RA処理細胞ヒストンは未処理細胞ヒストンとは異なる位置に溶出した。以上の結果から、RA処理によってヒストン修飾に変化が生じた可能性が示唆された。また、RA処理したHL60細胞中のGAPDH蛋白質の発現変動を検討したところ、Lysis Bufferの組成によりGAPDH蛋白質の抽出率に差異が生じ、pIに変化が見られたことから、RA処理によりGAPDHが翻訳後修飾を受ける可能性が考えられた。今後再確認を行い修飾変化を同定していく。以上、RA処理により異なる細胞内挙動を示す蛋白質を見出し、レチノイル化、リン酸化といった修飾が変化した可能性を示唆した。この変化が細胞分化をもたらすかを今後検討していきたい。蛋白質を扱うので時間を要するが、現在のところまでは、ほぼ計画通りに進んでいる。各種修飾蛋白質等の同定に時間と労力と費用を要しているが、辛抱強く研究を行い、着実に確かな結果を出していく予定である。レチノイン酸(RA)は、ビタミンAの活性型であり、生命維持・病気予防において多岐にわたる重要な作用を示す。RAがヒト前骨髄性白血病細胞(HL60細胞)に対し強力な細胞分化誘導能を持つことから、現在急性前骨髄球性白血病患者の治療に使われている。本研究ではRA核内受容体とは別の作用機構として、cAMP依存性リン酸化酵素(PKA)等のシグナル分子およびヒストン等の核内タンパク質へのレチノイル化反応(RAによる翻訳後タンパク質修飾)があることを証明し、RAのエピジェネティクス制御作用という新しい概念を提唱することにある。