hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
パラミクソウイルスゲノムのcDNAからウイルスを回収する試み

負極性RNA型ウイルスであるパラミクソウイルスの遺伝子操作技法を開発することを目的として、センダイウイルス(HVJ)の全長cDNAを用いて感染性ウイルス粒子を回収する方法を検討してきた。HVJから精製したRNP(ゲノムRNAにヌクレオカプシド蛋白質NPが付着したもの)を細胞に導入し、そこにウイルスRNAポリメラーゼ(L遺伝子とP/C遺伝子の産物)を組み換えワクチニアウイルスで供給するだけで、効率良くウイルスが回収されることをすでに明かにしており、HVJゲノムcDNAを利用して細胞内でRNPを再形成させることができればウイルス回収が可能であると考える。まず、ゲノム5 ́端から正確に転写物が合成できるように上流にT7プロモーター配列を、ゲノム3 ́端で転写物が正確に切断されるように下流にデルタ型肝炎ウイルスのリボザイムの配列を結合させたHVJ全長cDNAを構築し、試験管内ではそのcDNAから目的の長さのRNAが合成されることを確認した。一方、組み換えワクチニアウイルスを利用して細胞内でNP、L、P/C蛋白質を発現させる際の発現の量や時期を検討したところ、NPやL蛋白質はそれぞれ過剰に発現させるとHVJ自身の増殖をむしろ抑制してしまうことを見いだした。しかし、発現プロモーターを改変したり、NP、P/C、L蛋白質が同時に発現している時にはHVJ増殖抑制がほとんど見られなかった。現在、HVJゲノムの転写、複製に最適な発現量を得るため、さらに詳細な検討を加えているが、各蛋白質の供給源として温度感受性変異株などヘルパーウイルスを使う系の検討も進めている。
終末期医療連携システムモデル構築を目指したACPプロセスシートの開発

本研究ではAdvance care planning(ACP)という考え方を取り入れ、先行研究において明らかにしている終末期患者を看取る家族のビリーフを含んだACPプロセスシートを開発することである。諸外国内外で実践されているACPに関する情報収集および文献検討を重ねた結果、本研究の特徴でもある患者および家族のビリーフを含んだACPプロセスシートの構成要素は、『あなたに訊いておきたいこと』『あなたが大切にしたいこと、していること』『正しい意思決定のための延命治療・最大限の治療の知識』『家族が考えている理想の看取り・考えていること』であり、これらの項で構成したACPプロセスシートを開発した。本研究の目的は、患者の意向を尊重しつつ、患者、家族、医療従事者が“最期の時"について話し合い、そのプロセスを共有することであるAdvance care planning(ACP)の考え方を取り入れ、終末期患者を看取る家族のビリーフを含んだACPプロセスシートを開発することが主な目的である。最終的には、そのACPプロセスシートの実現可能性を検証するとともに、プロセスシートを用いることによる終末期患者と家族への意思決定支援のための医療連携システムモデル構築への提案をめざしている。今年度の主な目的は、諸外国または国内で実際に行われているACPに関する情報収集をしつつ、比較検討し、患者および家族のビリーフを含んだACPプロセスシートを作成することであった。今年度の成果としては、文献検討と情報収集をした結果、諸外国においてACPは盛んに利用されている。しかしながら、我が国ではACPといいつつも、事前の意思表示やリビングウィルなどのアドバンスディレクティブや、蘇生処置の患者の意向を受けるDNARが主立っており、本人だけではなく、家族の意向を含んだACPプロセスシートを作成し、活用している状況は明確ではなかった。よって、家族の意向も含めたACPプロセスシートを作成することには意義があり、そのための構成要素がある程度明確になった。現在は、これらを用いてACPプロセスシートの開発準備が整った状況である。本来ならば、次の段階であるACPプロセスシートの実現可能性を探るところまで進んでいなければならない状況である。しかしながら、開発のための準備段階までしか進められていない。本研究の目的は、患者の意向を尊重しつつ、患者、家族、医療従事者が"最期の時"について話し合い、そのプロセスを共有することであるAdvance care planning(ACP)の考え方を取り入れ、終末期患者を看取る家族のビリーフを含んだACPプロセスシートを開発することが主な目的である。最終的には、そのACPプロセスシートの実現可能性を検証するとともに、プロセスシートを用いることによる終末期患者と家族への意思決定支援のための医療連携システムモデル構築への提案を目指している。今年度の主な目的は、家族の意向も含めたACPプロセスシートを作成するための構成要素がある程度明確になったため、これら構成要素を用いたACPプロセスシートを開発し、ACPプロセスシートの実現可能性を探りつつ、意思決定支援のための医療連携システムモデル構築の提案を同時進行で実施していくことであった。しかしながら、ACPプロセスシート作成のための構成要素が明確になり、開発準備が整った状況であるものの、ACPプロセスシートの完成版まではたどり着いていない状況である。本来ならば、研究最終年度を迎え、ACPプロセスシートが完成し、終末期医療連携システムモデルの提案ができていなければならない。近年、その人らしい最期を迎える備えとしてAdvance care planning(ACP)やEnding Noteが話題となっている。ACPは患者の意向を尊重しつつ、患者、家族、医療従事者が“最期の時"について話し合い、そのプロセスを共有することである。本研究では、ACPという考え方を取り入れ、先行研究において明らかにしている終末期患者を看取る家族のビリーフを含んだACPプロセスシートを開発することであった。研究目的を達成するために、前年度までは諸外国、または国内で実際に行われているACPに関する情報収集をしつつ、比較検討し、ACPの構成要素、活用状況、また終末期ケアにおける研究調査状況等、文献検討を重ね、本研究の特徴的なことでもある患者および家族のビリーフを含んだACPプロセスシート開発のための構成要素の抽出まで実施した。最終年度である今年度は、抽出された構成要素をもとに、患者および家族のビリーフを含んだACPプロセスシート(自分らしく生きるために家族とともに考えることー心づもりノートー)を開発した。構成内容は、『あなたに訊いておきたいこと』として、最期はどこでどのようにして過ごしたいか、現在の心配なこと、医師からの病状説明内容などについて、本人が記述できるように設定した。『あなたが大切にしたいこと、大切にしていることは何か?』では、あらかじめ項目を設定し、思いついたままチェックできるような内容にした。『延命治療・最大限の治療』として、実際に医療処置がどのように行われているのか知識を得ておくための項を挿入した。『家族が考えている理想の看取り・考えていること』の項を入れ、ここでは家族のビリーフを記載できるように設定した。作成したACPプロセスシートの内容について、専門職から意見を伺い、最終的な心づもりノートとして完成した。

諸外国内外で実践されているACPに関する情報収集および文献検討を重ねた結果、本研究の特徴でもある患者および家族のビリーフを含んだACPプロセスシートの構成要素は、『あなたに訊いておきたいこと』『あなたが大切にしたいこと、していること』『正しい意思決定のための延命治療・最大限の治療の知識』『家族が考えている理想の看取り・考えていること』であり、これらの項で構成したACPプロセスシートを開発した。ACPプロセスシート開発のための準備段階まできている。しかしながら、研究の進行としては遅れているため、このままでは研究実施計画を修正する必要がある。よって、ACPプロセスシートの実現可能性を検討しつつ、このプロセスシートを用いての意思決定支援のための医療連携システムモデル構築の提案を、専門職者のヒアリング調査から明確にしていくよう同時進行していく必要がある。ACPプロセスシート開発のための準備段階まで進み、完成まであともう一歩のところまできている。今後は、ACPプロセスシートの開発を完成させ、ACPプロセスシートの実現可能性を検討しつつ、このプロセスシートを用いての意思決定のための医療連携システムモデル構築の提案を、専門職者のヒアリング調査から明確にしていくよう同時進行していく必要がある。在宅ケア看護学文献検索・検討、文献整理をするにあたり、PCやPC周辺機器の購入、文献の取り寄せなどには経費を使用させていただいた。しかし、ACPプロセスシート活用の実現可能性までのヒアリング調査までは進められていないため、人件費・謝金や学会発表のための旅費を経費として使用できていない。文献検索・検討、文献整理をするにあたり、PCやPC周辺機器の購入、アルバイト雇用の経費として使用させていただいた。しかし、ACPプロセスシートの完成には至っていなく、ヒアリング調査までは進められていないため、謝金・学会発表のための旅費を経費として使用できていない。ACPプロセスシートの実現可能性を探るためのヒアリング調査をしての謝金や、分析における人件費、成果を公表するための学会発表への旅費、データ整理のための消耗品費として使用する予定である。ACPプロセスシートの実現可能性を探るためのヒアリング調査、それにともなう謝金や、分析における人件費、成果を公表するための学会発表への旅費、データ整理のための消耗品費として使用する予定である。
宇宙空間中の宇宙線伝播シミュレーションを用いた超高エネルギー宇宙線の起源の探究

本研究は超高エネルギー宇宙線の起源を探ることが目的である。超高エネルギー宇宙線は銀河系外起源だと考えられており、その宇宙線源から地球に飛来してくる。銀河系外空間・銀河内空間にはそれぞれ特徴的な構造をもった磁場が存在することが分かっている。宇宙線は荷電粒子であるため、これらの磁場でその軌跡を曲げられる。このため、宇宙線到来方向が宇宙線源の情報を失ってしまう可能性がある。そこで、私は銀河間・銀河内空間中の構造を持った磁場のモデルを用い、超高エネルギー宇宙線の到来方向と宇宙線源の位置のずれをシミュレーションを用いて調査した。この結果、6×10^<19>eV以上の宇宙線陽子は銀河間磁場の影響を受けても数度の角度スケールで宇宙線源と相関が見えるということ、銀河内磁場による曲がりは磁場の反転の有無により大きく異なり、曲がりの小さいモデルであれば数度スケールでの相関を失わないということが分かった。前者の結果はAuger観測所の結果報告より早く投稿されており、ソースらしき天体との数度スケールでの相関が見えたという結果を予言する形となった。次にAuger観測所の発表データを解析することで、6×10^<19>eV以上の宇宙線源の数密度が10^<-4>Mpc^<-3>程度であることを見積もり、これがより低エネルギーの(10^<19>eV以上)宇宙線の到来方向分布の等方性を説明できないことから、最高エネルギーに到達しない宇宙線を放射する別の宇宙線源がもう一桁多く存在する可能性を提示した。別の可能性として宇宙線生成が突発的である可能性があるが、この可能性の下に宇宙線伝搬を考えることで宇宙線生成レートに世界で初めて上限と下限を付けた。また、二次粒子であるニュートリノのフラックスを見積もり、それが宇宙線生成の歴史の情報を持っていることを示した。研究計画に基づき、超高エネルギー宇宙線の伝搬の様子が宇宙空間に存在する磁場によってどのような影響を受けるかについて考察した。宇宙に存在する物質は大構造を作っているが、磁場の構造もその構造に付随するはずである。そこで、観測されている物質の構造を反映する磁場のモデルを作成し、宇宙線の伝搬計算を行った。十分に理解されていない磁場の強さは観測に矛盾しない範囲でパラメータとした。伝搬の様子の違いは、宇宙線の到来方向分布として観測される。到来方向分布はそのソースの分布を決めれば、理論的には伝搬計算の結果から構築することができる。逆に考えると、観測で得られた到来方向分布を再現するようなソースの数と分布を探すことにより、超高エネルギー宇宙線のソースの情報が得られることになる。この観点から、宇宙線ソースの数密度が10^<-5>-10^<-6>Mpc^<-3>であることを求め、磁場の強さの不定性に付随する誤差は一桁程度であることを示した。しかし、現在までに観測された超高エネルギー宇宙線イベントの数が少ないため、この結果は不定性を持っている。そこで、将来の観測により観測イベント数が増えたときに、この不定性が小さくなり、今回のアプローチからより精度のよい情報が得られるかについて議論した。その結果、現在稼働中の観測装置が数年間で集めると期待されるイベント数でこの不定性が十分に小さくなり、今回のアプローチが有効であることが分かった。その結果より近い将来に最高エネルギーの宇宙線とその近傍ソースとのよい空間的相関が期待されることも示した。一方で、三年目に予定していたニュートリノをプローブとした宇宙線ソースの性質の探求について、予定より早く情報が集まったためこれについて議論し、ニュートリノがソースからの宇宙線スペクトルの形のプローブになることを指摘した。これらは国内外多くの学会、研究会で発表しており、現在論文執筆中である。本年度は、超高エネルギー宇宙線の到来方向ないしはその分布から、未知であるその宇宙線のソースの性質を探れるかどうかという点を中心に研究を行った。まずは、その到来方向分布の非等方性から銀河系近傍のソースの数を見積もり、それを超高エネルギー宇宙線のソースとして理論的に期待されているいくつかの天体群の数と比較することで、いくつかの特定の天体が主なソースである可能性を棄却した。また、銀河間空間に磁場があったとしても超高エネルギー宇宙線のソースとその到来方向との空間的相関がとれるはずだという理論予言を行い、具体的に現在稼働中の観測機器で5年程度観測すれば十分に近傍のソースが見えてくることを示した。このような空間的相関は生じないという主張も他の研究者からなされたが、2007年11月に発表されたオージェ観測所の観測結果により、銀河系近傍の活動銀河核と呼ばれるソース候補の天体群との位置相関が示され、本研究での予言が正しいことが示された。これを受けて本研究では考慮していなかった銀河内磁場の効果を議論し、現在最も尤もらしいと考えられている銀河磁場モデルにおいて、オージェ観測所が示した角度スケールでの空間的相関が見えてもよいということを示した。さらに、オージェ観測所が見ている南半球では銀河内磁場の効果が強く効いてきてしまう銀河中心を含むために、超高エネルギー宇宙線のソースと到来方向の相関をとるのであれば、北半球で観測することが有効であることを示した。

銀河系外空間・銀河内空間にはそれぞれ特徴的な構造をもった磁場が存在することが分かっている。宇宙線は荷電粒子であるため、これらの磁場でその軌跡を曲げられる。このため、宇宙線到来方向が宇宙線源の情報を失ってしまう可能性がある。そこで、私は銀河間・銀河内空間中の構造を持った磁場のモデルを用い、超高エネルギー宇宙線の到来方向と宇宙線源の位置のずれをシミュレーションを用いて調査した。この結果、6×10^<19>eV以上の宇宙線陽子は銀河間磁場の影響を受けても数度の角度スケールで宇宙線源と相関が見えるということ、銀河内磁場による曲がりは磁場の反転の有無により大きく異なり、曲がりの小さいモデルであれば数度スケールでの相関を失わないということが分かった。前者の結果はAuger観測所の結果報告より早く投稿されており、ソースらしき天体との数度スケールでの相関が見えたという結果を予言する形となった。次にAuger観測所の発表データを解析することで、6×10^<19>eV以上の宇宙線源の数密度が10^<-4>Mpc^<-3>程度であることを見積もり、これがより低エネルギーの(10^<19>eV以上)宇宙線の到来方向分布の等方性を説明できないことから、最高エネルギーに到達しない宇宙線を放射する別の宇宙線源がもう一桁多く存在する可能性を提示した。別の可能性として宇宙線生成が突発的である可能性があるが、この可能性の下に宇宙線伝搬を考えることで宇宙線生成レートに世界で初めて上限と下限を付けた。また、二次粒子であるニュートリノのフラックスを見積もり、それが宇宙線生成の歴史の情報を持っていることを示した。
看取りのパンフレットを用いた終末期在宅ケアモデルの開発

終末期患者と家族の生活の質を高めるためには,患者と家族への死の準備教育が不可欠である。近年,死に対する準備教育の教材の一つとして,看取りのパンフレットが開発されている。看取りのパンフレットを有効に活用することで,患者と家族の生活の質を高めるケアの提供が可能になると考える。そこで本研究では,看取りのパンフレットの具体的で効果的な活用法を明らかにし,看取りのパンフレットを用いた終末期在宅ケアモデルを開発することを目的とする。2018年度には,全国の訪問看護ステーションの中の2,000箇所の管理者に郵送式質問紙調査を行い,431箇所から回答を得た。そのうち2018年度に新規に開始した7箇所を除く424箇所を対象に分析した。看取りのパンフレットを使用しているステーションは221箇所(52.1%),使用していないステーションは203箇所(47.9%)であった。看取りのパンフレットを使用しているステーション221箇所のうち,がん患者の家族に対しては210箇所(95.0%),がん患者以外の家族に対しては170箇所(76.9%)のステーションがパンフレットを使用していた。看取りのパンフレットを使用している訪問看護ステーションにおいて,がん患者の家族とがん以外の患者の家族に対する「パンフレットの使用頻度」「家族に渡す際に考慮すること」「看取りのパンフレットを渡す時期の決定方法」「渡す際についての決定の困難の程度」「渡す時期」がほとんど類似していたが,一部異なる点も見られた。現在,それらの相違点の理由を踏まえた看取りのパンフレットの効果的な使用方法を検討するために,質的研究のインタビュー内容を研究者間で協議している。1回収率を上げるために,回答期間を延長するとともに,可能な範囲で依頼施設へ再度連絡を取ったこと2質問紙調査の回答結果の信頼性を高めるために,研究者間で回答内容を十分に検討した後,分析を行ったことにより,計画遂行が遅れている。質問紙調査結果を対象者に開示するとともに,看取りのパンフレット使用方法に関する訪問看護師や看護職以外へのインタビュー調査について倫理審査委員会から承認を得た後,インタビュー調査を実施する。効果的なパンフレット活用法を明らかにすることで,患者と家族が限られた時間の思考を“不安"から“いかに過ごすか"にシフトさせるケアが可能になる。初年度は,これまでに研究者が文献レビューをもとに作成したパンフレット使用方法の決定の際の考慮点リストをもとに,がん患者と非がん患者に使用する際の相違点を明らかにできるように調整し,研究者間で内容・表現方法・回答形式について検討を重ねた。また,2017年11月末に更新された社団法人全国訪問看護事業協会の訪問看護ステーション正会員リストから,2,000箇所を無作為抽出した。その際,災害等で質問紙調査自体が負担となる可能性が高いと考えられた施設が調査対象施設候補として含まれていないかを確認し,含まれている場合はその施設を除外して,残った施設から無作為抽出を繰り返して再調整した。対象者が回答しやすい時期を考慮して,質問紙調査実施時期を調整するとともに,2018年度からの介護保険の改定に伴う調査項目の変更について検討した。そして,研究計画および実施に関して,所属機関の倫理審査委員会に申請して承認を得た。最新のデータベースをもとに対象施設の選定をすることに加え,質問紙を洗練することに時間を要した。また,回収率低下を避けるために,調査時期の検討を行った。

1回収率を上げるために,回答期間を延長するとともに,可能な範囲で依頼施設へ再度連絡を取ったこと2質問紙調査の回答結果の信頼性を高めるために,研究者間で回答内容を十分に検討した後,分析を行ったことにより,計画遂行が遅れている。質問紙調査を実施する。質問紙調査結果を分析した後,看取りのパンフレット使用方法に関する訪問看護師へのインタビュー調査について倫理審査委員会への申請し,承認後に,インタビュー調査にとりかかる予定である。質問紙調査結果を対象者に開示するとともに,看取りのパンフレット使用方法に関する訪問看護師や看護職以外へのインタビュー調査について倫理審査委員会から承認を得た後,インタビュー調査を実施する。前年度に実施する予定であった質問紙調査,調査結果の分析,インタビューガイド調査の計画・実施をする予定である。そのため,調査紙および返信用封筒の印刷費,調査紙の郵送費,データ入力等にかかる人件費・謝金などに研究費を使用する。また,質問紙調査の成果発表費用およびインタビュー調査での旅費に研究費を使用する予定である。前年度に実施する予定であった対象者への質問紙調査結果報告とインタビューを実施する予定である。そのため次年度は,質問紙調査結果の対象施設への報告書の郵送,インタビュー調査に関する旅費,データ入力などに研究費を使用する。
臓器細胞への遺伝子直接導入法による細胞極性形成機構の解析

肝臓とは異なる細胞内輸送系を持つと考えられている膵臓を用いて、膜蛋白質である糖輸送体GLUTの局在を検討した。膵臓は、肝臓に比べてエレクトロポレーション時の組織へのダメージが大きいので、導入の条件をGFPゴンストラクトの導入をモデル系としてさらに改良した。糖輸送体のなかでも、GLUT4は細胞内の核上部の細胞質にひろく分布した。微分干渉像と比較すると、チモーゲン顆粒のある部位に相当し、顆粒膜へのターゲッティングが示唆された。アミラーゼ等との蛍光多重染色を試みたが、断定的な結果は得られなかった。そこで、ポストエンベッディング酵素抗体免疫電顕法を用いてオルガネラレベルで観察し、分泌顆粒にあるのを示した。即ち、生体内で調節性分泌をおこなう高度に分化した外分泌細胞にGLUT4を発現させると分泌顆粒膜に保持されるのが明らかになった。こは心臓のANP分泌細胞で、GLUT4が顆粒膜へターゲティングされるのと類似の機構が働くためと推定された。これは、GLUT4の細胞内局在が、一般的に調節性分泌経路へのターゲティングによるであろうことを示唆している。さらに糖輸送体よりは構造の簡単な膜蛋白である水チャネル(アクアポリン)についても、生体エレクトロポレーション法により、ラット肝臓、膵臓へ導入してその局在を検討中である。緑の蛍光を発するグリーンフルオレッセンスプロテイン(GFP)をMDCK細胞やCHO細胞にリポフェクション法により導入しその発現を蛍光顕微鏡下に確認した.発現したGPFは細胞内に局在していた.次に生体内の臓器への遺伝子導入のために,ピンセット型電極を備えたエレクトロポレーション装置を用いてラットの臓器への遺伝子導入を試みた.導入した遺伝子の発現を確認するためにはGPFを用いた.ラットを麻酔下に開腹し,肝臓をピンセット型電極で挟み込み,その間にDNA溶液を注射し,同時に様々な条件で電気パルスを与えた.このようにしてGPFを導入した肝臓のスライスを通常の蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡で観察しGPFの局在分布と発現強度を定量的に観察した.さらに電気パルス処理によって壊死した細胞を同じ標本を用いて観察した.導入効率は電気パルス数を増すと増加するが飽和した.一方細胞の損傷は電気パルス数を増すと増加した.電圧を上げるとは導入効率は最初増加するがその後低下し,最適電圧が存在した.さらに注入するDNA量を増やすと導入効率は向上した.このような方法により,最小の組織細胞損傷のもとに最も効率よく遺伝子導入がはかれる条件を肝臓で確立した.腎臓についても同様の方法で検討を加えている.肝への糖輸送体遺伝子の導入,発現実験には,GLUT1,GLUT3,GLUT4,GLUT5,SGLT1についておこない,レーザー共焦点顕微鏡により局在を検討した.GLUT1は肝細胞の類洞側細胞膜(基底側壁部細胞膜)に局在した.GLUT4は細胞質中に散在性に局在した.GLUT3とGLUT5は肝細胞膜全周にわたって分布したが,特に毛細胆管細胞膜(頂部細胞膜)に濃縮する傾向がみられた.SGLT1は毛細胆管細胞膜に局在した.これらの点をさらに確認するために二種の遺伝子を同一の細胞に導入して共発現させ,その局在の違いを検討した.GLUT1/GLUT4,GLUT3/GLUT4,GLUT1/GLTUT3,GLUT1/GLUT5等の発現結果と比較すると,基底側壁部蛋白のGLUT1では同様だったが,頂部細胞膜蛋白のGLUT3やGLUT5では頂部が多いものの基底側壁部にも分布した.これはトランスサイトシスによる頂部蛋白のトラフィッキングを示唆している.さらにラット肝臓でほぼ確立したエレクトロポレーション法の条件を準用して,ラット腎臓へ遺伝子導入をおこない,GFP発現をマーカーとしてのその効率を検討した.腎臓では血流の違いのためか,確実に導入遺伝子の発現を得る条件は未だ見出していない.腎臓と並行して極性を持った臓器細胞からなる膵臓への遺伝子導入を試みている.

肝臓の肝細胞へのインビボエレクトロポレーション法によるグリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子や糖輸送体遺伝子の導入をひきつづきおこない,その分布局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した.さらに同じ消化管上皮細胞ではあるが,肝細胞とは頂部細胞膜,基底側壁部細胞膜の形態が大きく異なり,またこれらの膜ドメインへの蛋白質のトラフィッキングも異なると推定されている膵臓の腺房上皮細胞(外分泌部)への糖輸送体遺伝子の導入も試みた.ラットを麻酔下に開腹し,脾臓の近くの膵臓を円盤状の電極をつけたピンセットではさみこみ,糖輸送体遺伝子のプラスミドをその間の組織に注入した直後に電気パルスを加えてインビボエレクトロポレーションをおこなった.まずグリーンフルオレッセントへプロテインを導入し,複数個の外分泌細胞からなる腺房の形態が保たれた状態で,グリーンフルオレッセントプロテインの発現がみられるのを確認した.ついで,促進拡散型糖輸送体GLUT1, GLUT3, GLUT4, GLUT5遺伝子をグリーンフルオレッセントプロテインとともにコトランスフェクションし,その局在を検討した.その結果,GLUT3,GLUT5は頂部細胞膜に,GLUT1は基底側壁部細胞膜に局在した.一方GLUT4は細胞質中にとどまるのが観察された.以上の結果は,膵臓では,肝臓に比べて上皮細胞の膜ドメインへの膜蛋白の局在が厳密に制御されているのを示している.肝臓とは異なる細胞内輸送系を持つと考えられている膵臓を用いて、膜蛋白質である糖輸送体GLUTの局在を検討した。膵臓は、肝臓に比べてエレクトロポレーション時の組織へのダメージが大きいので、導入の条件をGFPコンストラクトの導入をモデル系としてさらに改良した。糖輸送体のなかでも、GLUT4は細胞内の核上部の細胞質にひろく分布した。微分干渉像と比較すると、チモーゲン顆粒のある部位に相当し、顆粒膜へのターゲッティングが示唆された。アミラーゼ等との蛍光多重染色を試みたが、断定的な結果は得られなかった。そこで、ポストエンベッディング酵素抗体免疫電顕法を用いてオルガネラレベルで観察し、分泌顆粒にあるのを示した。即ち、生体内で調節性分泌をおこなう高度に分化した外分泌細胞にGLUT4を発現させると分泌顆粒膜に保持されるのが明らかになった。こは心臓のANP分泌細胞で、GLUT4が顆粒膜へターゲティングされるのと類似の機構が働くためと推定された。これは、GLUT4の細胞内局在が、一般的に調節性分泌経路へのターゲティングによるであろうことを示唆している。さらに糖輸送体よりは構造の簡単な膜蛋白である水チャンネル(アクアポリン)についても、生体エレクトロポレーション法により、ラット肝臓、膵臓へ導入してその局在を検討中である。
上皮-間葉変換を誘導する転写因子スネイルによる細胞骨格変化と転移の制御機構

スネイルを発現させた細胞では細胞の接着、離脱、再接着が亢進する。すなわちフィブロネクチンのような細胞外基質への接着やインテグリンαvβ3のリガンドであるオステオポンチンに対する遊走活性が亢進する。スネイルはラミニン5やその受容体のインテグリンα3、α6β4の発現を低下させた。これらの結果はスネイルがインテグリンなどの発現を変化させることにより細胞の離脱、遊走、再接着を誘導することを示唆した。発生の初期には胚は上皮細胞のみから構成されてシートを形成しているが、上皮細胞は上皮-間充織転換を経て移動能をもつ間葉細胞に変わり体中を移動する。そして目的の場所に到達するとそこで細胞が増殖し種々の器官を形成するようになる。スネイル(snail)はジンクフィンガー型の転写抑制因子であり、この上皮-間葉変換を誘導する機能をもつ。snailは細胞-細胞間の接着因子であるE-カドヘリンの転写を抑制することにより癌の進行、転移に寄与していると報告されてきた。我々はsnailがアクチンをはじめとする細胞骨格タンパクや細胞外基質、インテグリンの発現調節作用を介して転移を制御するのではないかと考え解析を行った。まずスネイルを発現させた細胞では細胞の基質からの脱離が亢進していることを見い出した。またMDCKなどの上皮細胞は非常に強く基質と結合しトリプシン処理しても剥離しにくいことが知られているが、スネイルを発現させると顕著に脱離しやすくなった。これはトランスウエルを用いて確認しており、細胞間接着因子Eカドヘリンの発現低下によるためではない。一方ある種の基質に対する接着は亢進しており、これはRGDペプチドで阻害された。細胞外マトリックスタンパクであるラミニン5やその受容体であるインテグリンα3、6、β4の発現が低下している一方、フィブロネクチン、ビメンチンやインテグリンインテグリンα5、αVの発現は上昇していた。さらにインテグリンαVβ3の骨に存在するリガンドであるオステオポンチンへの遊走は亢進していた。スネイルは細胞外基質、インテグリンの発現調節作用を介して、細胞の接着、脱離、遊走を制御していると考えられる。スネイルを発現させたMDCK細胞やA431細胞は細胞外基質との接着が弱まりトリプシン処理による細胞の離脱が顕著に亢進していた。一方フィプロネクチンや血清を塗布した培養プレートに対する接着は顕著に早まっていた。このことよりスネイルを発現させたMDCK細胞やA431細胞では細胞外基質タンパクやそれに対する受容体であるインテグリンの発現が変化したのではないかと考え解析した。その結果ラミニン5、インテグリンα3、α6、β4の発現が顕著に低下していることがわかった。しかしながらラミニン5のα3鎖あるいはγ鎖だけをsiRNAで欠損させても細胞離脱の亢進はみられなかった。一方、フィブロネクチンやビトロネクチンに対する受容体として働くインテグリンαv、α5の発現は亢進していた。この接着亢進はRGDペプチドによって阻害された。スネイルを発現させたMDCK細胞はまたオステオポンチンなど骨芽細胞が産生する細胞外基質に対する遊走活性が亢進していた。これはインテグリンαVβ3に対する中和抗体で抑制された。これらの結果はJBC283,23514-23523,2008に報告するとともに日本癌学会でも発表した。今年度の研究目的として「スネイル発現細胞は親株細胞に比べ細胞密度が低い状態で定常状態となりそのあと死に始めるがその細胞数を規定する分子機構は何か調べる」をあげた。これについて実施した研究成果ではスネイル発現MDCK細胞(MDCK/snail)は低濃度のグルコース(5.5mM)含有のDMEM培地で培養した場合48時間後から死に始めることを見出した。コントロールMDCK(MDCK/neo)では細胞死はおこらない。この細胞死は高濃度のグルコースを添加することにより回避できた。MDCK/snail細胞のグルコース消費や解糖系酵素の活性が亢進しているわけではなかった。一方MDCK/snail細胞のATP産生は顕著に低下していた。酸素消費はコントロール細胞に比べ低下しておりTCA回路、電子伝達系の酵素の活性も低下していた。その分子機構の解析を試みた。まずTCA回路、電子伝達系酵素の発現をRT-PCRで網羅的に調べたがMDCK/neo細胞,MDCK/snail細胞で差はみられなかった。次に活性酸素の産生を調べた。が、ミトコンドリア、細胞質における活性酸素の消費には差がなかった。また活性酸素を人工的に誘導した場合にもその産生量に差はなかった。TCA回路の酵素活性を低下させるものとして亜鉛が上げられる。細胞内亜鉛含量はMDCK/snail細胞で高く亜鉛のトランスポーターであるZnT3,ZnT8,ZIP8の発現が亢進していた。

意義、重要性としてMDCK/snail細胞は低濃度グルコースの条件で離脱することを示した。すなわちグルコース濃度の変化が接着、離脱と連関する可能性があることを示唆する。
都市域建物を対象としたＣＦＤに基づく耐風設計のイノベーション

本研究では、新しい理念に基づく耐風設計法の具体的な手段としてのCFDに着目し、CFDならではの特徴を活かした新しい耐風設計法を構築することをめざした。研究項目は、まずは、CFD技術を活用して、実際の建築物件を対象にCFDでの風荷重予測精度と設計上必要な精度の関係を明らかにした。続いて、台風などの気象イベントを想定しながら、都市域での局所的な強風域を評価することで耐風設計用風速データを提示した。建設地点の周囲の環境を配慮し、LESによる建物への強風作用の詳細解析から、CFDに基づく耐風設計を実施する上での各種境界処理などに関する必要技術を開発・提供した。本年度得られた成果は以下の通りである。(1)風荷重評価を実施する上でのCFD技術の課題に関する整理・検討角柱状建物を対象としたLESを実施し、ピーク風圧に流入変動風のパワースペクトル形状が影響する事を示した。また、RANSの結果からLESの流入境界条件を作成する方法についても検討を行った。(2)実用化のための既存計算コードの改良-LES簡易モデルと計算負荷低減技術の提示LESとレイノルズ型アサンプルモデルのハイブリッドモデルを用いる簡易モデルについて検討した。このモデルでは地物や建物表面の凹凸をメッシュで再現する必要がなくなり、解析負荷が低減する。高さ5m相当の樹木で覆われた地表を吹送する強風を本モデルで再現し、風速プロファイルや乱流特性を再現した。さらに、気象モデルを用いたLESへの流入変動風生成方法の基礎的な検討を実施し、LESへ流入したときの乱流特性の変化について検討した。(3)各種乱流境界層の流速変動場に関する乱流特性の把握都市域や、樹木に覆われた地覆に対する乱流境界層の非定常解析を実施し、その乱れ強さやレイノルズ応力プロファイルなどの乱流特性量について整理した。(4)都市地表被覆状況による粗度レベル評価と都市キャノピー内の風の空間構造の把握GISデータを用いて建物形状を再現したLES計算から、建物高さにばらつきがある市街地では、最高建物高さと粗度密度λの高さ方向の分布が、ベキ指数に影響を与えている事を示した。(5)大気境界層下での密集都市域の強風に関する高精度LESの実施高層建築物が密集している都市域での強風の時空間構造を、高解像度の都市モデルを作成の上、高精度のLESを実施し、計算結果を分析して解明した。本年度は、キャノピー内風特性の観測データを整理し、LES(Large Eddy Simulation)計算値との比較から計算精度を確認するとともに、周辺市街地の複雑形態に対する風の特性を解明した。(1)風観測データの整理と気象モデル予測値との対応の吟味風観測データを整理し、気象モデルWRFあるいはWRF-LESによる予測値との対応から、気象モデルの接地境界層における予測精度の限界と、LESの必要性を確認した。また、WRF-LESの解析結果から建築スケールのLESへ接続する方法を検討した。(2)他の計算モデルから得た鉛直プロファイルを用いる流入変動風の生成法の提案広域の市街地や大規模地形による接近流への影響ができるよう、比較的計算負荷の小さいRANSで全体の気流分布を求めた上で、着目する建物周辺気流のみLESで解析を行って風荷重を評価すること方法を提案した。RANSによって得られた乱流統計量に見合った流入変動風を、LESの境界で与える必要があり、ここではその方法として比較的新しいSEM法を用いた。(3)各種乱流境界層のPIVデータに基づく流入風の設定と地形の影響評価PIVデータベースに基づき、各種地表被覆状態に対するCFDのための流入風を作成した。境界層タイプの乱流構造を検証するために、その基本モデルである地形の影響評価を行った。(4)種々の粗度レベル上およびキャノピー内の風の空間構造の把握都市細密データ・GISデータを用いて再現した都市モデル上空で発達する気流分布のLESによる計算結果を用いて、建ぺい率、粗度密度、建物高さなどの各種粗度パラメータと、都市キャノピーの三次元空間での風の構造との関連性を解明した。また、都市の地表粗度評価へのLESの適用性を示した。(5)周辺市街地の形態変化と風の特性の変化のLES計算に基づく把握東京丸の内地区を対象にここ10年間の市街地の形態変化を把握し、それぞれの形態でのLESを実施し、風の特性への影響を解明した。本研究の目的は、流体計算技術(CFD)を用いた建物の耐風設計に対して、提示された設計の結果の安全性を確保するため、CFDの計算精度を保証するための課題とその解決法を明らかにすることである。

本年度は、密集都市域のLES (Large eddy Simulation)を想定して流入変動風を作成し、ある特定の建物を対象にして、風圧力、風力、振動応答をLESで計算し、風洞実験データおよび観測データと比較し、必要計算解像度などの計算条件を明らかにし、さらにLES計算結果による耐風設計を実施し、計画を前倒しにほぼ達成するにいたった。気象モデルに基づく演繹型流入変動風の生成と観測データとの比較を行った。気象モデル(Wrf + wrf-LES)から得られた風速・気温の鉛直プロファイルを条件として、気象スケールと建築スケールでのエネルギー移行まで考慮したLESで大気境界層型流入変動風を生成し、スペクトル成分の特性まで比較することで変動風としての妥当性を検証した。RANSによって得られた乱流統計量を与条件に、SEMを活用することで流入変動風を生成し、都市キャノピー内部の建築構造物に作用する風圧力・風力のLES解析を行い、キャノピー内での建築構造物の外力の詳細を明らかにした。複雑な形態を有する建築物に作用する風圧、風力の風洞実験および非構造格子重合LESを実施し、空力関連のデータを高精度に得るためのLESの計算領域とその境界条件、格子解像度などの計算条件を整理した。高層建物密集域での都市キャノピー内高層建物を対象に、特定の観測日に対応する流入変動風を用いることで、LES計算を実施し、観測された各種振動応答データの再現性に関する計算精度を検証した。さらにLESに基づく実建物を対象とした風荷重評価を実施し、耐風設計にCFDを用いる場合の妥当性および要求精度を検討した。計算の並列化効率が格段に向上し、計算結果が得られる時間がかなり短縮された。また、複雑な形態を表現するための非構造格子に基づく解析法の導入が早く終了し、計算モデルにおける格子解像度の向上が効率的に行えるようになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、CFDの適用も耐風設計の実用段階に入る。市街地の風の乱流場に対する解析において十分な精度であることが確認されたことから、さらに密集都市域のLESを想定して流入変動風を作成し、ある特定の建物を対象にして、風圧力、風力、振動応答をLESで計算し、風洞実験データおよび観測データと比較から必要計算解像度などの適切な計算条件を明らかにする。また、LES計算結果に基づき、従来型の耐風設計を試みる。
FRTPのスタンピング成形における樹脂・繊維流動挙動の解明

輸送機器の軽量化材料として有望な繊維強化熱可塑性樹脂(FRTP)は,その機械的特性が繊維状態によって大きく変化する。ここで,繊維状態は成形時の樹脂流動に大きく影響を受けるが,成形中の金型内部を直接観察できないため不明な点が多い。本研究では,FRTPのスタンピング成形中における樹脂や繊維の流動挙動を明らかにすることを目的に,その可視化手法の開発を行った。その結果,透明ガラス型を用いることで,成形中のFRTPの流動挙動の可視化に成功し,樹脂や繊維の流動挙動を明らかにした。本研究は、次世代の軽量化材料として有望なFRTP(Fiber Reinforced Thermoplastic、熱可塑性樹脂複合材料)において、スタンピング成形時の樹脂および繊維の流動挙動の可視化とその場観察、プロセス因子の解明を目的としている。初年度(H26年度)は、スタンピング成形の基礎的な知見を得るために、単純な平板成形をターゲットとし、成形の可視化とその場観察システムの構築を目指した。具体的には、透明ガラス型の設計と、その場観察システムの開発、そして、これらの設置方法や加圧方法の検討である。その場観察システムでは、デジタル画像の連続収集と、成形中の荷重やストロークデータの収集、ならびに、これらのデータの同期を行う計測機器の構築および制御プログラム開発を行った。その結果、FRTPの平板成形中の可視化およびその場観察に成功した。ポリプロピレンとガラス連続繊維からなる複合材料を対象に成形実験を行った場合、金型から接した表面では、樹脂および繊維は固着して移動しないが、材料内部から溶融した樹脂がはみ出る様に広がって行く挙動が明らかになった。そして、初期形状が四角であっても、成形中に円形に変化していくこともわかった。これらの挙動は、ガラス繊維が複合されていないポリプロピレン単体で行った実験と似た挙動であったが、複合材料では、一部にほとんど樹脂が流動しない特異的な挙動を示すことがあった。この挙動を示した場所は、X線CTを用いた試料内部の繊維状態観察の結果、通常よりも繊維が多く絡みあった場所であった。H27年度は、スタンピング成形の基礎的な知見を得るために、H26年度に構築した可視化とその場観察システムのブラッシュアップと次年度に向けた実験環境の検討を行った。具体的には、可視化実験中に映り込む各種装置の反射像の除去とX線透過下での実験の可否である。可視化実験によって得た映像は、定量的な評価のために画像処理を行う場合、実験機器の映り込みにより,困難が生じていた。このため、画像クオリティの向上を目指し、光源周りを再検討し、その場観察システムのブラッシュアップを行った。その結果、赤色光源を用いることにより、画像二値化処理の際のコントラストを向上させることに成功した。また、光源とカメラの両方に偏光フィルターを用いることで、照明や金型部品などからの映り込みを大幅に減らすことができた。また、成形中の繊維の流動を可視化するためには、X線透過下での実験が必要となるが、X線装置の利用は事前検討を十分に行う必要がある。利用予定の装置と金型方案などを検討した結果、装置の改修費用が高額になることが予想された。そのため、繊維流動の可視化は、すでに開発した可視化システムを応用したモデル実験を実施することにした。H27年度は、H26年度に構築したその場観察システムのブラッシュアップと、H28度に実施予定のX線観察下での実験の事前検討を行った。可視化実験によって得た映像は、目視では問題無く樹脂の流動挙動を確認できるが、定量的な評価のために画像解析を行う場合、撮影用のカメラや照明装置、金型部品などが映り込み、障害となって自動で画像解析が行えない。手動で行うことも出来るが、一回の実験で数十枚の画像を解析する必要があるため非常に手間がかかる。このため、根本的な画像クオリティの向上と自動画像解析システムの開発を行う必要がある。そこで、光源や偏光フィルターに着目し、その場観察システムのブラッシュアップを行った。成形中の繊維の流動を可視化するためには、X線透過下での実験が必要となるが、X線装置はその危険性から慎重に取り扱う必要があり、事前検討を十分に行う必要がある。検討した装置はX線CT装置であり、X線は側方から照射される。その場観察のためには、現状の成形治具を90度回転させる必要がある。また、樹脂成形は温度に敏感であるため加熱装置を組み込む必要があるが、X線装置の仕様上、型の設置や配線には大幅な改修が必要となり、費用が高額になると予想された。そのため、繊維流動の可視化は、可視化システムを応用して金属繊維と透明な樹脂を用いたモデル実験を行う方が有効であると判断した。以上のように、可視化システムの構築とブラッシュアップは概ね順調に進んでいる。

しかしながら、ブラッシュアップに注力した結果、平板以外の形状の成形は型設計の段階であるため、継続的に研究を行う予定である。本研究は、次世代の軽量化材料として有望なFRTP(Fiber Reinforced Thermoplastic、熱可塑性樹脂複合材料)において、スタンピング成形時の樹脂および繊維の流動挙動の可視化とその場観察、プロセス因子の解明を目的としている。H28年度は、前年度までに開発した成形中の樹脂流動可視化システムを利用および拡張した、スタンピング成形における三次元樹脂流動の可視化実験を行った。また、前年に検討したX線下での繊維流動の可視化を踏まえ、可視光下での繊維流動のモデル実験を行った。樹脂成形において、部材の強度や剛性を確保するために、平板やハット部材にリブを成形することが多い。そこで、前年度まで実施した平板の可視化手法を拡張し、平板とリブの同時成形を行った。この際、樹脂は平板が広がる方向と、リブが立ち上がる方向へ流入する三次元の流動挙動を示すことになる。そのため、平板の底部とリブの側方の2箇所にそれぞれデジタルカメラを設置して流動挙動を可視化した。その結果、樹脂は、最初は平板が広がるように成形され、成形の後期になるとリブ部へ流入する様子が観察できた。スタンピング成形中の繊維の流動挙動を明らかにするために、透明な樹脂と銅繊維からなるモデル材を作成し、平板成形実験と繊維流動の可視化を行った。モデル材として銅繊維を樹脂中に様々に配置して成形を行った結果、樹脂の流動によって繊維の移動や回転、曲がりなどの挙動が可視化することが可能となった。輸送機器の軽量化材料として有望な繊維強化熱可塑性樹脂(FRTP)は,その機械的特性が繊維状態によって大きく変化する。ここで,繊維状態は成形時の樹脂流動に大きく影響を受けるが,成形中の金型内部を直接観察できないため不明な点が多い。本研究では,FRTPのスタンピング成形中における樹脂や繊維の流動挙動を明らかにすることを目的に,その可視化手法の開発を行った。その結果,透明ガラス型を用いることで,成形中のFRTPの流動挙動の可視化に成功し,樹脂や繊維の流動挙動を明らかにした。初年度に計画した「ガラス型を用いた樹脂流動のその場観察システムの構築」では、ガラス型の設計と、その場観察システムの構築の二つに分けることが出来る。まず、成形の可視化のためには、一般的に使用している金型では内部が見えないため、透明な型が必要であり、耐熱性から脆性材料のガラスを型として用いる必要がある。そのため、金属と異なる型の取り扱いに苦労し、スタンピング成形時には、型の細かな欠けや、大割れなどがしばしば起きた。この課題は、問題が生じた実験条件を検証する中で、成形時の面圧が均等になるような手だてを取ることで解決できた。その場観察システムの構築では、画像および試験機からの信号を取得する機器選定の際に、柔軟性の高いシステム構築を目指した結果、当初計画で備品購入を考えていたPXIシステムから変更し、高速な通信インターフェイスを備えたノートPCと、CCDカメラ、高速データ収集器をそれぞれ購入し、連携させることで実現すること目指した。そして、これらを連携させるプログラムを開発することで、その場観察システムとして用いることが出来た。
C型インフルエンザウイルスのイオンチャネル蛋白CM2の増殖と病原性における役割

C型インフルエンザウイルスの増殖におけるイオンチャネル蛋白CM2の役割について以下の知見を得た。CM2を欠損するとウイルス様粒子(VLP)へのレポーター遺伝子の取り込みが1/3に減少する成績から、CM2がVLPへのゲノムの取り込みに関与することが明らかになった。野生型VLPの感染細胞では脱殻で細胞質に放出されたレポーター遺伝子の核内移行が見られたが、CM2欠損VLPでは認められず、CM2が脱殻に必要であることが明らかになった。C型インフルエンザウイルスの増殖におけるCM2の役割を以下のように解析した。すでに我々は、C型のNP遺伝子の非翻訳領域を末端にもっレポーター遺伝子(GFP遺伝子)を組み込んだRNA発現用ベクターを、9種類のウイルス蛋白発現用ベクターと共に293T細胞にcotransfectionして、レポーター遺伝子がpackagingされたウイルス様粒子を作製する系を確立している。この系からCM2蛋白発現用ベクターを除き、transfection後48時間めの上清から精製したCM2欠損ウイルス様粒子をHMV-II細胞に感染させるとレポーター遺伝子の発現量がCM2存在時に比べ約1/30に減少した。従ってウイルス増殖にCM2は必要であることが明らかになった。精製したCM2欠損ウイルス様粒子の赤血球凝集価と蛋白量がCM2存在下と同等だったこと及び電顕での粒子の形態はCM2の存否で違いは認められなかった成績から、CM2は粒子形成には必須ではないことが明らかになった。しかしCM2欠損ウイルス様粒子からRNAを抽出し、real time RT-PCRでレポーター遺伝子量を定量したところ、CM2存在時に比べ約1/3に減少していた。従ってイオンチャネル蛋白CM2は遺伝子の取り込みに関与していると示唆された。CM2非存在下の遺伝子発現量の低下(約1/30)は遺伝子の取り込みの低下(約1/3)だけでは説明しきれないので、増殖の別の過程にもCM2が関与していることが強く示唆された。現在、どの過程にCM2が働いているのか更に解析中である。すでに我々は、C型のNP遺伝子の非翻訳領域を末端にもつレポーター遺伝子(GFP遺伝子)を組み込んだRNA発現用ベクターを、9種類のウイルス蛋白発現用ベクターと共に293T細胞にcotransfectionし、レポーター遺伝子がpackagingされたウイルス様粒子を作製する系を確立している。この系からCM2蛋白発現用ベクターを除き、transfection後48時間めの上清から精製したCM2欠損ウイルス様粒子をHMV-II細胞に感染させ、以下の成績を得た。CM2欠損ウイルス様粒子の細胞への吸着と侵入をFACSで解析したが、野生型と差は認められなかった。膜融合活性を溶血を指標に解析したが、CM2の存否で差はなかった。以上からCM2はウイルスの細胞への吸着、侵入には関与しないこと、さらに膜融合能にも影響しないので、侵入後のエンドソーム膜とエンベロープの膜融合にも影響を与えないと推測された。次に、ウイルス様粒子の感染細胞を感染2時間後に核と細胞質に分画し、核画分のレポーター遺伝子量をreal time PCRで定量することにより、脱殻が完了したレポーター遺伝子が核内へ移行したかを検討した。CM2をもつウイルス様粒子の場合は、感染直後に比べ感染2時間後で有意に核内のレポーター遺伝子量の有意な増加が検出され、脱殻が完了することが確認された。しかし、CM2欠損ウイルス様粒子の感染細胞では感染2時間後に核内のレポーター遺伝子量の有意な増加が検出されず、CM2が脱殻に必要であることが明らかになった。本年度は、CM2分子のどの領域がウイルス遺伝子のウイルス粒子への取り込みに関与しているのかを明らかにすることを目的にした。まず初めにC末端から種々の長さの欠失変異を細胞質領域に導入したCM2の蛋白発現用ベクターをウイルス様粒子産生系に用いた場合に、レポーター遺伝子の取り込み効率が低下するか、産生されたウイルス様粒子中のレポーター遺伝子量をreal time PCRで定量することで明らかにする。さらにCM2のイオンチャネル活性を担うと推測される膜貫通ドメインをチャネル活性のないHE糖蛋白のものと置換したCM2変異体C-HE-Cを作製し、同様の実験を行う。効率を低下させた変異の領域が遺伝子の取り込みに関与すると推測される。上記の計画を遂行するためには、各CM2変異体の発現量が同等になる条件を決定し、さらに細胞膜まで輸送されるCM2量が同等であるかを検討する必要がある。まず一過性発現ベクターpME18SにCM2のN末端側にFLAG tagを持つ全長のCM2遺伝子を組み込み、これを鋳型にしてCM2の細胞質領域にC末端側から種々の長さの欠失変異を導入した。これらのプラスミドをCOS-1細胞にtransfectionし、Western blotで解析したが、ほぼ同等の発現量だった。さらに蛍光抗体法でも発現に有意な差はなく、細胞膜にもシグナルが見られ、細胞膜までの輸送にC末端側の33アミノ酸は必須ではないと推測された。

また野生型CM2とC-HE-Cの発現量にも差は認められず、蛍光抗体法でC-HE-Cは細胞表面まで輸送されていることが示唆され、膜貫通ドメインが細胞内輸送においてHE蛋白の同ドメインと置換されうることが示唆された。今後は、これらのCM2変異体発現時に形成されるウイルス様粒子へのレポーター遺伝子の取り込み効率をreal time PCRで解析する。