hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メタボリック症候群の克服を目指した新規ナノメディシンの開発と有効性・安全性評価

近年、ナノマテリアルの医療応用による、ナノメディシンとも言うべき新たな治療戦略に注目が集まっている。その中でも、C60フラーレンは、圧倒的な抗酸化活性に起因する抗炎症作用を有しており、ナノメディシンの筆頭として注目されている。本研究では、独自のC60フラーレンを用いて、メタボリックシンドロームを標的とした、非侵襲的(経口投与)で、しかも安全かつ有効なナノメディシンを開発することを試みた。その結果、C60フラーレン誘導体の経口投与により、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の症状が改善し得ること、そのメカニズムとして、抗炎症作用が起因している可能性を明らかとした。近年、ナノメートルサイズの物質(ナノマテリアル)が新規開発され、工学・薬学・医学分野において、21世紀産業の根幹を担う素材として期待されている。特に、ドラッグデリバリーシステムへの応用による、ナノメディシンとも言うべき新たな治療戦略に注目が集まっている。その中でも、炭素原子60個が切頂二十面体構造に結合したC60フラーレンは、圧倒的な抗酸化活性に起因する抗炎症作用を有しており、ナノメディシンの筆頭として注目されている。一方で近年、肥満が体内に微弱な慢性炎症を惹起し、全身のインスリン抵抗性に引き続き、メタボリックシンドロームを次々と誘発することが示唆され、メタボリックシンドロームを慢性炎症疾患として捉える必要性が提唱されている。従って、強力な抗酸化剤、抗炎症剤が有効な治療薬になり得ると期待されているが、未だにメタボリックシンドロームに適用した報告は無いうえ、慢性炎症疾患として捉えた研究開発も乏しいのが現状である。そこで本研究では、申請者らの"C60フラーレンの慢性炎症疾患に対する非侵襲的治療戦略"に関する知見を発展させ、医用工学的に合成したC60フラーレン誘導体の構造活性相関を明確にしたうえで、安全性を精査すると共に、メタボリックシンドロームへの適用を図ることで、有効性と共に安全性をも高度に保証された「経口投与型ナノメディシン」の開発に先駆け挑戦するものである。平成24年度には、C60フラーレン誘導体のメタボリックシンドロームに対する治療効果を検討した。近年、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が、新たな疾患として注目されており、その治療戦略の開発に注目が集まっていることから、メタボリックシンドロームのモデルとして、NASHモデルマウスを用いて、C60フラーレン誘導体の治療効果を検討した。その結果、C60フラーレン誘導体の経口投与により、肝臓障害の有意な軽減、炎症の軽減など、優れた治療効果が観察された。そこで平成25年度には、C60フラーレン誘導体のNASHモデルマウスにおける治療効果をより詳細に検討すると共に、in vitroにおける検討も実施する。本研究では、メタボリックシンドロームを慢性炎症疾患として捉える新たな概念のもと、他に類のない抗酸化活性・抗炎症作用を有するなど、次世代医薬としての特性を備えた我が国発のC60フラーレンを駆使し、『メタボリックシンドロームに対する有効かつ安全なナノメディシン』を医用工学的に合成・開発しようとするものである。特に本研究は、C60フラーレンの構造活性相関を明確にし、有効性のみならず安全性が高度に保障されたナノメディシンを設計・創出するものであり、斬新性・独創性の高い不可欠な取組であると共に、緊急性にも優れた研究と言える。平成24年度には、パイロット研究ではあるものの、C60フラーレン誘導体の経口投与により、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルマウスにおいて、肝臓傷害の有意な軽減、炎症の軽減など、優れた治療効果を確認した。一方で、C60フラーレンの凝集物が、抗炎症作用どころか、逆に、炎症を惹起してしまう可能性も見出された。そこで平成25年度には、C60フラーレンの治療効果・安全性向上および品質担保の観点から、C60フラーレン誘導体の分散性向上に向けて取り組んだ。その結果、幾つかの分散試薬において、C60フラーレン誘導体の分散性を向上可能であることを明らかとした。さらに、C60フラーレン誘導体の抗炎症作用メカニズムを探求し、NASHモデルに対して治療効果を発揮したメカニズムをも追及した。平成26年度には、C60フラーレン誘導体のNASHモデルマウスにおける治療効果をより詳細に検討する予定である。本研究では、メタボリックシンドロームを慢性炎症疾患として捉える新たな概念のもと、他に類のない抗酸化活性・抗炎症活性を有するなど、次世代医薬としての特性を備えた我が国発のC60フラーレンを駆使し、「メタボリックシンドロームに対する有効かつ安全なナノメディシン」を医用工学的に合成・開発しようとするものである。特に本研究は、C60フラーレンの構造活性相関を明確にし、有効性のみならず安全性が高度に保証されたナノメディシンを設計・創出するものであり、斬新性・独創性の高い不可欠な取り組みであると共に、緊急性にも優れた研究といえる。平成24年度には、パイロット研究ではあるものの、C60フラーレン誘導体の経口投与により、非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおいて、肝臓傷害の有意な軽減、炎症の軽減など、優れた治療効果を確認した。平成25年度には、C60フラーレンの治療効果・安全性向上および品質担保の観点から、C60フラーレン誘導体の分散性向上に取り組んだ。さらに、C60フラーレン誘導体の抗炎症作用メカニズムを追及した。

平成26年度には、C60フラーレン誘導体を投与した際、生体への炎症刺激に対して抑制的に作用するかを検討した。その結果、一部のサイトカインに対しては抑制的に作用することが見出された。一方で、影響を与えないサイトカインも存在した。今後、C60フラーレン誘導体がどういったサイトカインの産生に影響を与えることで、肥満およびメタボリックシンドロームに対して効果をもたらしているかを検討する予定である。本研究では、メタボリックシンドロームを慢性炎症疾患として捉える新たな概念のもと、他に類のない抗酸化活性・抗炎症活性を有するなど、次世代医薬としての特性を備えた我が国発のC60フラーレンを駆使し、「メタボリックシンドロームに対する有効かつ安全なナノメディシン」を医用工学的に合成・開発しようとするものである。特に本研究は、C60フラーレンの構造活性相関を明確にし、有効性のみならず安全性が高度に保証されたナノメディシンを設計・創出するものである。平成24年度には、C60フラーレン誘導体の経口投与により、非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスにおいて、肝臓傷害の有意な軽減、炎症の軽減など、優れた治療効果を確認した。平成25年度には、C60フラーレン誘導体の治療効果・安全性向上および品質担保の観点から、C60フラーレン誘導体の分散性向上に取り組んだ。その結果、幾つかの分散試薬において、C60フラーレン誘導体の分散性を向上可能であることを明らかとした。平成26年度には、C60フラーレン誘導体を生体に投与した際の、炎症抑制効果について検証した。平成27年度には、C60フラーレン誘導体の抗炎症作用のメカニズム解明を図り、抗酸化作用のみならず、炎症性蛋白質の翻訳阻害を介して抗炎症作用を発揮し得る可能性を見出した。以上の結果から、C60フラーレン誘導体は、炎症性サイトカインの産生抑制を介することで、メタボリックシンドロームに対する治療薬になり得る可能性が示された。近年、ナノマテリアルの医療応用による、ナノメディシンとも言うべき新たな治療戦略に注目が集まっている。その中でも、C60フラーレンは、圧倒的な抗酸化活性に起因する抗炎症作用を有しており、ナノメディシンの筆頭として注目されている。本研究では、独自のC60フラーレンを用いて、メタボリックシンドロームを標的とした、非侵襲的(経口投与)で、しかも安全かつ有効なナノメディシンを開発することを試みた。その結果、C60フラーレン誘導体の経口投与により、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の症状が改善し得ること、そのメカニズムとして、抗炎症作用が起因している可能性を明らかとした。C60フラーレン誘導体のメタボリックシンドロームへの効果について、長期間での検討を実施できていない点、および、詳細なメカニズムを解明できていない点から、当初の予定より若干遅れているものと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。ナノ医薬最終年度である平成27年度には、C60フラーレン誘導体のメタボリックシンドロームへの効果を短期モデルのみでなく、長期モデルにおいても検討する予定である。また、メカニズム解明に向けた取り組みも鋭意進める。
腸管粘膜免疫制御と上皮再生の特殊機構解明を基盤とした慢性大腸疾患新規治療法の開発

本研究は我々の研究組織が独自に見いだした腸管粘膜局所におけるIL-7/IL-7レセプターを介した免疫調節機構の考え方を導入し、未だ解明されていない腸粘膜上皮細胞の由来、粘膜局所リンパ球の増殖・分化機構、上皮細胞と粘膜リンパ球の相互作用等、生体防御機構としてのヒト腸管粘膜免疫を明らかとし、腸管局所免疫調節および組織再生誘導の両者を統合した独自の知見に基づく慢性大腸炎新規治療開発を目指す萌芽的研究であった。当該の2年間、当初計画に沿った研究を遂行し、着実に一定の成果が得られた。その概要は、1)上皮によるIL-7産生が大腸炎発症に関わる可能性を示し、IL-7レセプター高発現リンパ球が慢性大腸炎の治療標的となる可能性を示した(Am J Physiol,2005,in press)。2)腸管上皮細胞における転写因子IRF-1/IRF-2によるIL-7産生機構を初めて示し、IRF機能の人為的制御が慢性大腸炎治療法として有効である可能性を示した(Mol Cell Biol 2004)。3)腸管上皮細胞においてIRF-1が免疫プロテアソーム構成分子発現に関わり、杯細胞に強く発現する事実と併せ、杯細胞が特異な免疫調節機能を担う可能性を示した(FEBS Lett,2005,in press)。4)腸管上皮再生をレスキューする機構として、骨髄由来細胞が特に分泌型上皮細胞(杯細胞など)へ分化する事を新たに見出し、3)の結果とあわせて、今後の上皮再生医療、中でも分化系列特異的再生誘導療法に繋がる知見を得た(Gastroenterology,2005,in press)。以上、本研究の4つのプロジェクトにより、腸管粘膜免疫調節および組織再生誘導の両者を統合した今後の新しい慢性大腸炎・食物アレルギーに対する抑制戦略、腸管再生医療に道を開く意義深い研究成果が得られたと評価される。本研究は我々の研究組織が独自に見いだした腸管粘膜局所におけるIL-7/IL-7レセプターを介した免疫調節機構の考え方を導入し、未だ解明されていない腸粘膜上皮細胞の由来、粘膜局所リンパ球の増殖・分化機構、上皮細胞と粘膜リンパ球の相互作用等、生体防御機構としてのヒト腸管粘膜免疫を明らかとし、その結果腸管免疫機構の特殊性を利用した新規治療法の開発まで視野に入れた萌芽的研究である。過去の研究とは全く出発点を変え、腸管免疫機構の破綻により発症すると考えられる慢性大腸炎、骨髄移植後移植片対宿主反応等における病態解明及び免疫異常の追究を行い、逆に正常の腸管免疫組織の発生・分化、免疫制御機構を追究する新しい試みを行なった。本年度の研究では、1)男性ドナーより骨髄移植を受けた女性レシピエントの腸管上皮生検組織を用いて、Y性染色体がレシピエントの腸管上皮細胞に検出されることを示し、ヒト骨髄由来細胞が腸管上皮細胞に分化することおよび分化が内分泌系上皮細胞に偏向し、progenitor細胞を介していること明らかとした(Gastroenterology投稿中)、2)IL-7レセプター高発現粘膜内T細胞に対し、IL-7が単独での細胞増殖・生存をもたらし、更にIL-7投与により腸炎モデルが増悪し、抗IL-7受容体抗体で抑制されることを示し、IL-7/IL-7受容体シグナル調節の慢性大腸炎に対する治療効果を明らかとした(J Immunol投稿中)、という大きな研究の進展があった。IL-7/IL-

7レセプターに関する独自の視点を集合させる次年度以降の研究により、腸管粘膜免疫制御機構の特殊性を利用した新しい慢性大腸炎・食物アレルギーに対する抑制戦略、再生医療が実用化されると考えている。本研究では腸管局所免疫調節および組織再生誘導の両者を統合した独自の知見に基づく慢性大腸炎新規治療開発を目指すものである。本年度も当初計画に沿った研究を遂行し一定の成果が得られた。IL-7が特に慢性大腸炎局所の粘膜リンパ球に強い増殖活性をもつことを見出した。また、IL-7がマウスで大腸炎を悪化させ、逆に抗IL-7レセプター抗体が大腸炎を改善させることから上皮によるIL-7産生が大腸炎発症に関わる可能性を示すとともに、IL-7レセプター高発現リンパ球が炎症性腸疾患の治療標的となる可能性を示した(Am J Physiol,2005,in press)。また現在、炎症局所リンパ球のIL-7依存性増殖が正常リンパ球と異なる細胞内シグナルを介するとの知見を見出し、解析を継続中である。腸管上皮細胞を用いヒトでのIL-7産生機構を初めて詳細に示し、a)IL-7遺伝子上流のIRF-Eを介する転写因子IRF-1/IRF-2による転写調節が重要であること、b)IRF-2は構成的、一方IRF-1は刺激依存性の各々独立したIL-7誘導因子であること、c)ヒト大腸上皮にIRF-1/IRF-2が特徴的局在をもち発現することなどを示し(Mol Cell Biol 2004)、IRF機能の人為的制御が慢性大腸炎治療法として有効である可能性を示すものとして一定の評価が得られた。現在さらに、腸管上皮におけるIRF蛋白標的遺伝子群の網羅的解析、ならびに上皮細胞分化とリンクしたIRF蛋白機能の詳細な解析を継続中である。腸管上皮再生をレスキューする機構として骨髄細胞の腸管上皮への分化が重要との独自の知見を発展させ、a)骨髄細胞が実際に腸管上皮機能細胞へ分化すること、b)骨髄細胞は未熟な上皮細胞として上皮修復にも関わること、さらに、c)これら骨髄由来細胞は特に分泌型上皮細胞(杯細胞など)への分化傾向を有することを新たに報告した(Gastroenterology,2005,in press)。これら成績は、今後の上皮再生医療、中でも分化系列特異的再生誘導療法につながるものと期待される。
ナタマメ属とアリとの相互関係に関する進化生態学的研究

本研究では、ナタマメ属植物3種間の交雑集団の解析および交雑集団とアリとの共生関係について明らかにすることを目的として研究を行った。マイクロサテライト遺伝子マーカーの開発と雑種集団の検出10のマイクロサテライト遺伝子座を開発し、7つのプライマーを用いて本州から琉球列島にかけて33集団417個体について解析を行った。3種間の交雑集団の解析はソフトウェアNEWHYBRIDSを使用した。解析の結果、本州九州の集団では低い頻度でハマナタマメとナガミハマナタマメの交雑個体が分散し、琉球列島ではハマナタマメとナガミハマナタマメが広範囲で交雑を起こしていることが考えられた。また、沖縄島、石垣島のタカナタマメはハマナタマメと交雑を起こしていることが明らかになった。交雑種とのアリとの相互関係四国(L×R1)、沖縄本島(L×R2,C×L1,C×L×R1)、石垣島(C×L2,C×L3,C×L4)の7つの調査地を設定し(C:タカナタマメ、L:ハマナタマメ、R:ナガミハマナタマメを示し、×はそれぞれの種間の交雑を示す)、花の数やアリの数の記録を行った。また、アリの排除実験を行い、花や果実への防御効果を明らかにした。調査の結果、雑種個体では花の数が多い傾向が見られた。しかし、花外蜜に集まるアリの数や防御効果は、アリの種類や果実へのアリの営巣の有無によって違いが見られた。そのため、雑種形成はアリとの共生関係に影響を与えず、防衛効果は設立した環境下に生息するアリの種類や営巣状況によって影響されると考えられた。しかし、果実生産が多かったという結果から、タカナタマメとハマナタマメの交雑によってタカナタマメに本来なかった花数や花序数が増加が起こりポリネータを多く引き寄せることができ、繁殖成功度を高めた可能性が考えられた。本研究ではナタマメ属植物のハマナタマメとタカナタマメの交雑集団におけるアリとの共生関係の変化を明らかにすることを目的として行っている。マイクロサテライトマーカーの開発ハマナタマメとタカナタマメの交雑集団の遺伝的構造を解析するために必要となる、マイクロサテライト遺伝子マーカーの開発を行った。マグネットビーズ濃縮法とコンパウンドマイクロサテライトプライマーを使用し、9つのマイクロサテライト遺伝子座を増幅するプライマーセットを開発した。開発したマイクロサテライト遺伝子座について、石垣島のタカナタマメ16個体、宮崎日南のハマナタマメ30個体の遺伝子型の決定を行った。9遺伝子座の平均対立遺伝子数はタカナタマメで9.2、ハマナタマメで5.4であった。平均のヘテロ接合体の期待値はタカナタマメで0.762、ハマナタマメで0.605であった。2つの遺伝子座(cana10とcanaGT6)で連鎖不平衡が検出されたが、それ以外の遺伝子座は独立していることが明らかになった。開発した遺伝子マーカーは両種の種間雑種の解析に有用であると考えられる。現在、対立遺伝子数が多くフラグメント泳動イメージが鮮明な6つの遺伝子座について37集団508個体の遺伝子型の決定を行っている。形態の解析上記の集団について、花17形質、葉7形質、果実8形質について形態の測定を行った。さらに種子については形態以外に比重の測定も行った。今後、計測したデータについて多変量解析を行い、遺伝的解析と合わせて2種の交雑現象の解明を行う予定である。
歯科インプラントの生物学的安定に関する検索

歯科インプラント成功の絶対的な基準として骨結合の獲得があげられる。これは歯科インプラントが顎骨と直接接する状態で治癒することを示すものであるが、インプラントを埋入するために骨の切削を行うと周辺の骨に異常が生じることについてはあまり注目されていない。本研究はインプラント埋入時に傷害を受けた骨の動態を探るものであり、従来の研究とは異なる視点からインプラント周囲骨を組織学的に検索したものである。歯科インプラントは現代の欠損補綴に欠くことのできない治療方法となりつつある。従来、インプラント治療の成功には、オッセオインテグレーションの獲得が絶対要件と考えられてきたが、この定義はどちらかと言えば臨床的なものであり、科学的な明確さを欠くことが指摘されてきた。本研究はインプラントの臨床を支えるオッセオインテグレーションを再度検討すると共に、これまでとは全く異なる視点からインプラント周囲の生体組織反応を検索するものである。すでに、オッセオインテグレーションを獲得した後にもインプラントの周囲に骨窩洞形成時に侵襲を受けたことに起因して生じる空虚な骨小腔を含む既存骨が存在することが明らかにされている。初年度に当たる平成19年度は、このような既存骨が正常な骨組織に代謝されるまでに要する期間について調査し、同時に傷害を受けた既存骨の代謝動態についても観察を行った。その結果、インプラント周囲が正常な骨組織に置き換わるまでにはオッセオインテグレーションの獲得に必要な治癒期間よりもはるかに長い期間が必要になることが判明した(実験動物=ラット、オッセオインテグレーション獲得までに1ケ月、傷害された既存骨が正常な骨組織に代謝されるまでに3ケ月の期間が必要)。この結果を受けて平成20年度では傷害された骨の代謝動態をさらに詳細に観察し、研究の総括として歯科インプラントの成功基準について科学的見地から考察を加える予定である。本研究は未だ臨床先行の傾向が強い歯科インプラントについて、生体内(顎骨)に埋め込まれたインプラントが生物学的に安定する時期を検索する目的で行ったものである。平成19年度において、インプラントが臨床的に安定したと思われる時期(本実験モデルでは1カ月後)には埋入手術によって生じた障害を受けた領域がインプラント周囲の顎骨に残存しており、これらが代謝・置換されるまでにはさらに治癒期間(3ヵ月)を要することを明らかにした。これを受けて平成20年度には障害を受けた領域の代謝動態を骨形成系・吸収系のマーカを用いた酵素組織化学的(アルカリフォスファターゼ、酒石酸耐性アシッドフォスファターゼ活性)、骨基質タンパクに関する免疫組織化学的(オステオポンチン、ボーンシアロプロテイン、I型コラーゲン)手法を用いて検索した。その結果、いずれのマーカにおいてもインプラント埋入後12カ月の間に強い陽性反応が認められ、3ヶ月後以降は比較的弱い反応がみられることがわかった。また、インプラント周囲骨の吸収・形成に関してよりダイナミックに観察することを目的として行った骨ラベリングでは一定の期間内に形成される新生骨の量はインプラント埋入3ヶ月後以降で安定し、正常な顎骨組織と同等になることが示された。さらに、インプラント周囲骨のEPMA元素分析を行ったところ、骨組織に最も多く含まれるカルシウム、リンの濃度は術後2.5カ月で一様となり、その後上昇することがわかった。以上の結果より、歯科インプラントが生物学的に安定する時期について貴重な考察を加えることができた。
大腸がんパラフィン包埋検体でのCGH法を用いた新規遺伝子スクリーニング

大腸がんにおける遺伝子解析が報告されているが、その発生・進展がすべて解明されてはいない。そこで我々は遺伝子・染色体分析法であるComparative Genomic Hybridization法(CGH法)を用いて大腸がんの発生・進展に関わる遺伝子異常を検索した。1)昨年度までにCGH法は従来、抽出されたDNAが高分子であることが必須とされていたため、我々も新鮮材料で検討した。また、新鮮材料では検索対象に限界があったためパラフィン包埋検体を用いたCGH法の確立を試みた。方法としては微量に存在している高分子DNAを蛋白分解酵素であるProtenaseKの頻回投与により抽出しさらにDOP-PCR法を用い十分な核酸量を採取する新しいCGH法を確立し、新鮮凍結材料での検討と同様な異常をパラフィン包埋検体でも確認した。2)上記結果を応用し本年度は凍結およびパラフィン包埋いずれもが存在する検体をコントロールとしてパラフィン包埋下でのCGH法の最適条件の設定を様々な状態のパラフィン包埋検体を含めて改善の上検討した。3)臨床病理学的因子について整理した大腸がんパラフィン包埋症例22例に対して1)2)の結果をもとに確立したCGH法を施行し従来発見されたいなかった新規異常部位を含め染色体1,2,8,11,15番でのDNAの増幅と5,6,7,9,15,18,19番でのDNAの減少を検出し、米国消化器病学会に発表した。近年、大腸がんにおける遺伝子異常が報告されているが、その発生・進展がすべて解明された訳ではない。そこで我々近年開発された遺伝子・染色体分析法であるComparative Genomic Hybridization法(CGH法)を用いて大腸がんにおける発生・進展に関わる遺伝子異常を検索した。1) CGH法は本来抽出されたDNAが高分子DNAが必須とされていたため、我々も検体は新鮮凍結材料を用いて検討し、染色体1番、2番、8番、11番、15番にはDNAの増加、5番、6番、7番、9番、15番、18番、19番にはDNAの減少を確認した。しかし、検体数に限りがある点等の問題から検索対象に限界がある。そこで日常病理診断にもちいているホルマリン固定標本を用いたCGH法の確率を試みた。2)固定標本中に残存する高分子DNAは蛋白分解酵素であるProtenaseKの連続投与により抽出可能であった。また、この微量な高分子状態のDNAを5'、3'両末端に天然に存在する4塩基で可能な組み合わせからなるランダム・ヘキサマー配列を含むプライマーで増幅するDOP-PCR法を用いて十分な核酸量をする方法を確立し、ホルマリン固定大腸がん標本からCGH法を数例で施行し新鮮凍結材料で確認したと同様な異常を確認した。今後は、更なる症例の検討と精度を追求する予定である。
薬剤耐性の無い核酸系逆転写阻害薬開発に向けた新たな戦略

抗HIV治療薬さらにはB型肝炎の治療薬として多くの核酸誘導体が服用されている。これらの核酸誘導体が効かない薬剤耐性ウイルスの出現が問題となる。本研究では薬剤耐性を持つ逆転写阻害核酸薬の設計に向けた新たな戦略の開発を目指した。具体的にはウイルスRNA鋳型鎖とプライマーDNA鎖間に共有結合が形成させることで、薬剤耐性機構であるヌクレオチド除去反応が進行しても、従来の核酸誘導体とは異なり、ウイルスRNA鋳型鎖状に修飾塩基が残り逆転写反応が完全に停止することを期待した。その結果、架橋反応2本鎖DNAはHIV-1逆転写酵素を補足することによりHIV-1逆転写酵素を阻害できることがわかった。核酸誘導体は抗がん剤、抗ウイルス薬など様々な薬剤として臨床応用されている。中でも抗HIV治療薬さらにはB型肝炎の治療薬として多くの核酸誘導体が服用されている。HIV及びB型肝炎の治療薬は長期投与が必要となるため、これらの核酸誘導体が効かない薬剤耐性ウイルスの出現が問題となる。これらの治療薬開発には薬剤耐性の克服が必要とされるが、現在のところ薬剤耐性機構に抵抗性を持たせる合理的な創薬指針はまだない。本研究では、薬剤耐性を持つ逆転写阻害核酸薬の開発に向けた新たな戦略の開発を目指した。具体的にはウイルスRNA鋳型鎖とプライマーDNA鎖間に不可逆的な共有結合を形成する核酸誘導体を用いた、耐性機構を克服した新規逆転写酵素阻害を提案した。すなわちウイルスRNA鋳型鎖とプライマーDNA鎖間に共有結合が形成された後、薬剤耐性機構であるヌクレオチド除去反応が進行しても、従来の核酸誘導体とは異なり、ウイルスRNA鋳型鎖上に修飾塩基が残り逆転写反応が完全に停止することを期待した。本年度はまず3`末端に架橋反応性核酸である2-amino-6-vinylpurineを導入したオリゴDNAを合成し、その反応性を評価した。その結果、このオリゴは標的モデルDNAのチミンに対して、中性条件下効率的に反応することがわかった。従来、2-amino-6-vinylpurineはオリゴDNA中では酸性条件下、シトシンに対して反応することを報告していたが、今回、3'末端に導入することで中性条件下チミンと反応したことは非常に興味深い。次にHIV-1逆転写酵素のヌクレオチド除去反応効率について検討した。しかし、HIV-1逆転写酵素とdATP及びマグネシウムを加えたコントロール2本鎖DNAを用いた系においてもHIV-1逆転写酵素による除去反応の進行は観測されなかった。今後、種々条件検討する必要があると考えている。昨年度までの検討で中性条件下において、容易に架橋2本鎖DNAを調整できたことは、予想外によい結果であると考えている。しかし、コントロール2本鎖DNAでもHIV-1逆転写酵素による除去反応の進行が観測されなかったことは当初予期していなかったことであり、今後解決する必要がある点である。一方、架橋2本鎖を用いたHIV-1逆転写酵素の伸長反応を検討した結果、予想外の結果が得られた。まず、AVPを含むプライマー(5'TTGTAGCACCATCCAAAGGTCT-AVP3')と鋳型DNA(5'TCGAACATCGTGGTAGGTTTCCAGA- T - TTTTTCAGAC -FAM3')を用いて、架橋2本鎖を調整した。この架橋2本鎖を用いてHIV-1逆転写酵素によるプライマー伸長反応について検討した結果、dATPを用いて伸長反応を行った際には約5塩基伸長した位置にバンドが観測された。しかし、dATPとdGTPを用いた系ではdATPのみを用いたよりも短い位置にもバンドが観測された。さらに4種類のdNTPを用いた系でも2種類のdATPとdGTPを用いた系と同じ位置にバンドが観測された。これらの結果から架橋2本鎖は、HIV-1逆転写酵素により認識されある程度は伸長反応が進行するものの、途中でプライマー伸長反応が阻害されることがわかった。この性質は当初予測しなかった結果であり非常に興味深い。今後さらに検討する予定である。本年度は架橋反応2本鎖DNAを用いたデコイ様機能を利用したHIV-1逆転写酵素の阻害について検討した。その結果、架橋反応2本鎖DNAはHIV-1逆転写酵素を捕捉する、すなわちデコイ様機能によりHIV-1逆転写酵素を阻害できることがわかった。現在までに、このような考え方に基づくHIV-

1逆転写酵素阻害法は報告例がなく、非常に新しい方法論であると考えている。さらにまったく新しい化合物として、核酸結合蛋白に対して、アルキル化する新規架橋反応剤についても検討をおこなった。その結果、モデル蛋白質を用いた検討において、効率来なアルキル化反応が進行することを明らかにした。抗HIV治療薬さらにはB型肝炎の治療薬として多くの核酸誘導体が服用されている。これらの核酸誘導体が効かない薬剤耐性ウイルスの出現が問題となる。本研究では薬剤耐性を持つ逆転写阻害核酸薬の設計に向けた新たな戦略の開発を目指した。具体的にはウイルスRNA鋳型鎖とプライマーDNA鎖間に共有結合が形成させることで、薬剤耐性機構であるヌクレオチド除去反応が進行しても、従来の核酸誘導体とは異なり、ウイルスRNA鋳型鎖状に修飾塩基が残り逆転写反応が完全に停止することを期待した。その結果、架橋反応2本鎖DNAはHIV-1逆転写酵素を補足することによりHIV-1逆転写酵素を阻害できることがわかった。平成28年度は下記の点について検討する。1)HIV-1逆転写酵素による除去反応の条件検討:昨年度までの検討においてコントロールDNAを用いた場合にも除去反応は進行しなかった。この原因として、用いた酵素反応条件において除去反応が阻害された可能性が考えられる。今年度はまず、コントロールでHIV-1逆転写酵素による除去反応が進行する条件を検索し、架橋反応2本鎖を用いた除去反応についても検討する予定である。2)架橋反応2本鎖DNAを用いたデコイ様機能を利用したHIV-1逆転写酵素の阻害:昨年度までの検討において架橋反応2本鎖DNAはHIV-1逆転写酵素により認識されるが伸長反応は途中で阻害することがわかった。この結果に基づき、今年度は架橋反応2本鎖DNAを用いてHIV-1逆転写酵素を捕捉する、すなわちデコイ様機能によりことで、HIV-1逆転写酵素を阻害できる可能性について検討する。現在までに、このような考え方に基づくHIV-1逆転写酵素阻害法は報告例がなく、非常に新しい方法論であると考えている。核酸化学、ケミカルバイオロジー前年度においてHIV-1逆転写酵素による除去反応の進行が観測されなかったため、その検討に使用する予定であった金額が残金として残った。モデル反応では標的としてDNAを用いていたが、実際はRNAを購入する予定であったが、RNAを用いた実験は行っていないので、その購入を予定した金額が残金となっている。昨年度の検討により、架橋2本鎖DNAがHIV-1逆転写酵素の伸長反応を阻害することがわかったので、本年度はRNAをテンプレートとしたHIV-1逆転写酵素の伸長反応を検討する予定である。この研究にはRNAの購入費用、及びHIV-1逆転写酵素の購入が必要であるため、それに使用する予定である。
エナメル質形成の統御機構に関する生化学的研究

エナメル質は咬合咀嚼の機能を生涯にわたって維持する目的のために、生体内で最も硬い組織である。この形成の過程で、エナメル芽細胞によりまずAmelogeninとEnamelinとからなるタンパク質性基質が合成分泌され、その中で、アパタイト結晶の析出と成長が進行し、最終的に有機基質は除去されて、大きく、方向性の揃った結晶をもつエナメル質が完成する。このようなエナメル質の形成ならびに成熟機構に関する変化を知る目的で、多種の研究方法をを用いて研究を行った結果、以下の成果を得た。(1)ラットエナメル質形成におけるAmelogeninの合成と分解。In situ hybridization法と免疫組織化学によりエナメル質形成過程におけるAmelogeninの合成時期と吸収時期を調べた。その結果、AmelogninはPreameloblastの時期から合成され始め、基質形成機に最大の合成を行い、その後徐々に合成量を減じ、early maturationの時期まで合成していることがわかった。免疫組織化学ではより遅い時期のruffle-ended ameloblastまで反応が見られているがこれはエナメル質基質に分泌されていたAmelogeninが吸収されているものとわかった。寒天ゲル中の石灰化におけるAmelogeninとEnamelinの影響について検討したところ、Amelogenin添加とEnamelin添加により石灰化の様子が異なっていた。Enamelin添加ではAmelogeninよりもシャープな石灰化バンドが観察され、結晶のサイズも25倍大きく、石灰化の核形成に何らかの積極的な役割をしていることが示唆された。(3)マウスAmelogenin染色体DNAのクローニングマウスgenomic libraryよりウシAmelogenin cDNAを用いてマウスAmelogenin遺伝子をクローニングし、その構造を調べた。その結果、マウスAmelogeniもヒトやウシと同様に7つのエキソンからなることがわかった。現在、プロモーター領域を分離して発現を検討中である。このようなエナメル質の形成ならびに成熟機構に関する変化を知る目的で、多種の研究方法を用いて研究を行った結果、以下の成果を得た。(1)エナメル基質中のAmelogenin性ペプチドの精製と同定ウシ幼若エナメル質を用い、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動法を利用して精製されたAmelogenin由来ペプチド、タンパク質のアミノ酸配列を決定した。(2)エナメル基質中のタンパク分解酵素の精製と作用機序に関する研究エナメル基質中にはAmelogenin分子を加水分解する酵素の存在が確かめられた。この分解酵素を抽出精製し、酵素学的特徴を機能を明らかにした。pH指示薬によりウシ幼若エナメル質の酸性および中性部分にわけて分離採取し、各部位に存在する無機質、タンパク質、酸性、中性プロテアーゼなどの性質を明らかにした。(3)酵素によるAmelogenin分解産物の精製とアミノ酸配列の決定ウシ幼若エナメル質より酸性プロテアーゼを抽出純化し、おなじウシ幼若エナメル質から分離精製したフルサイズのAmelogeninを基質として作用させると、N末端部のアミノ酸45個からなる「チロシンに富むペプチド」が遊離することが確かめられた。このようなエナメル質形成ならびに成熟機構に関する変化を知る目的で、多種の研究方法を用いて研究を行った結果、以下の成果が得られた。(1)エナメル基質中のタンパク分解酵素の精製と作用機序に関する研究エナメル基質中にはAmelogenin分子を加水分解する酵素の存在が確かめらた。pH指示薬によりウシ幼若エナメル質の酸性および中性部分にわけて分離採取し、各部位に存在する無機質、タンパク質、酸性、中性プロテアーゼなどの性質を明らかにすることができた。(2)酵素によるAmelogenin分解産物の精製とアミノ酸配列の決定ウシ幼若エナメル質より酸性プロテアーゼを抽出純化し、おなじウシ幼若エナメル質から分離精製したフルサイズのAmelogeninを基質として作用させると、ペプチドが遊離するが、この配列からN末端部のアミノ酸45個のものであることが確かめられた。(3)性染色体上のAmelogenin遺伝子の同定法の開発Amelogeninの遺伝子は、ヒトでXおよびY染色体に存在することが明らかになったが、微量の試料で、簡便にこれらの遺伝子を検出する方法を開発し、性鑑別に応用できることを明かにした。

このようなエナメル質の形成ならびに成熟機構に関する変化を知る目的で、多種の研究方法をを用いて研究を行った結果、以下の成果を得た。(1)ラットエナメル質形成におけるAmelogeninの合成と分解。In situ hybridization法と免疫組織化学によりエナメル質形成過程におけるAmelogeninの合成時期と吸収時期を調べた。その結果、AmelogninはPreameloblastの時期から合成され始め、基質形成機に最大の合成を行い、その後徐々に合成量を減じ、early maturationの時期まで合成していることがわかった。免疫組織化学ではより遅い時期のruffle-ended ameloblastまで反応が見られているがこれはエナメル質基質に分泌されていたAmelogeninが吸収されているものとわかった。寒天ゲル中の石灰化におけるAmelogeninとEnamelinの影響について検討したところ、Amelogenin添加とEnamelin添加により石灰化の様子が異なっていた。Enamelin添加ではAmelogeninよりもシャープな石灰化バンドが観察され、結晶のサイズも25倍大きく、石灰化の核形成に何らかの積極的な役割をしていることが示唆された。(3)マウスAmelogenin染色体DNAのクローニングマウスgenomic libraryよりウシAmelogenin cDNAを用いてマウスAmelogenin遺伝子をクローニングし、その構造を調べた。その結果、マウスAmelogeniもヒトやウシと同様に7つのエキソンからなることがわかった。現在、プロモーター領域を分離して発現を検討中である。
リン酸化タンパク結合分子Pin1を分子プローブとした前立腺癌予後因子の網羅的探索

Pin1はタンパク質のリン酸化部位に結合し、立体構造を変化させることにより基質蛋白質の機能を調節する新しいタイプの酵素である。われわれを含めた最近の研究でPin1は前立腺癌を含めた多くの癌で細胞の癌化に深く関与することが示唆されているが、Pin1の結合するリン酸化タンパクの方がより直接的に前立癌の形質発現に関わり、予後因子、治療標的になりうると考えた。そこで、われわれはPin1を分子プローブとして前立腺癌に特異的に発現しているリン酸化タンパクを網羅的に解析し、それに基づいた病態の解明、新規予後因子、治療法の開発を目的として研究を行った。疾患特異的にリン酸化されPin1により機能調節を受けるタンパク質について以下のことが明らかになった。前立腺癌特異的に、リン酸化結合タンパク質Pin1に結合するタンパク質をスクリーニングした。前立腺癌特異的にリン酸化されPin1と結合する未知の蛋白が複数見出された。それらをマイクロダイセクションとRT-PCR解析し、PINBP1は、正常前立腺組織と比較して前立腺癌組織において有意にその発現が上昇していたことがあきらかになった。また、PINBP1の発現の高い前立腺癌では発現の低い癌と比較して、手術後の再発率が有意に高いことが明らかになった。前立腺癌細胞株においてsiRNAを用いて当該タンパク質の発現を抑制すると、細胞の増殖が顕著に抑制され、細胞の老化が認められた。現在、このタンパク質を特許申請準備中である。その他、Pin1とリン酸化タンパク質との結合を研究する中で以下のことを明らかにした。1 RelA/P65は前立腺癌においてリン酸化されPin1と結合する。そのRelAリン酸化が前立腺癌の転移と関係があることを明らかにし、抗リン酸化RelA抗体による免疫染色所見により、前立腺癌骨転移を予測できることが明らかになった。このことをあらたな前立腺癌予後判定因子として特許申請中である。2脳腫瘍、特に膠細胞腫においてPin1の高発現がみられ、Pin1と脳腫瘍の生物学的態度との間の関連があきらかになった。3 Pin1はリン酸化Daxxタンパク質との結合し、Daxxのユビキチン化を促進し、アポトーシスに対し促進的であることがあきらかになった。ペプチジルプロリルイソメラーゼPin1が癌治療のための分子標的として機能するかどうかをさらに正確に検定するため以下のことを行った。1 Pin1高発現性前立腺がん細胞株PC3,LNCaPにPin1に特異的なsiRNAをレトロウイルスベクターを用いて定常的に発現させることにより、Pin1発現が抑制され細胞増殖、浸潤転移能、血管形成、コロニー形成能、ヌードマウス内での腫瘍形成能すべてが抑制された。しかし、正常線維芽細胞ではPin1-siRNAによる増殖抑制は認められなかった。このことからPin1は細胞発癌だけでなく、細胞の悪性化に直接寄与し、また、癌治療におけるPin1が最適な分子標的である可能性が示された。。2 Pin1を分子プローブとして用いたリン酸化プロテオミクス解析による癌化または悪性化に関わる責任分子の網羅的検索をを行なった。前立腺癌組織および細胞株からPin1に特異的に結合するリン酸化タンパク質をGST-pull down法にて回収し、ESI-Q-TOF-MSを用いてPin1結合タンパク質の同定をした。その結果、前立腺癌で特異的にPin1に結合するリン酸化

タンパク質を数十種類同定した。その一部を下記に示す。(括弧内:Accession no.)現在スクリーニングの幅を広げ、ホルモン依存性や骨転移などの悪性化形質に関わる候補分子を約100種類同定する予定である。また上記のうちRNA polymerase IIはすでにPin1と結合することが知られており(Xu et al., Genes Dev.17(22):2765-76,2003)、このことは本手法および研究プロジェクトの妥当性および有効性を示唆するものである。現在これらのタンパク質の前立腺癌における発現、リン酸化、および病態との関連について、培養細胞および臨床検体を用いて検討中である。Pin1はタンパク質のリン酸化部位に結合し、立体構造を変化させることにより基質蛋白質の機能を調節する新しいタイプの酵素である。われわれを含めた最近の研究でPin1は前立腺癌を含めた多くの癌で細胞の癌化に深く関与することが示唆されているが、Pin1の結合するリン酸化タンパクの方がより直接的に前立癌の形質発現に関わり、予後因子、治療標的になりうると考えた。そこで、われわれはPin1を分子プローブとして前立腺癌に特異的に発現しているリン酸化タンパクを網羅的に解析し、それに基づいた病態の解明、新規予後因子、治療法の開発を目的として研究を行った。疾患特異的にリン酸化されPh11により機能調節を受けるタンパク質について以下のことが明らかになった。前立腺癌特異的に、リン酸化結合タンパク質Pin1に結合するタンパク質をスクリーニングした。前立腺癌特異的にリン酸化されPin1と結合する未知の蛋白が複数見出された。それらをマイクロダイセクションとRT-PCR解析し、PINBP1は、正常前立腺組織と比較して前立腺癌組織において有意にその発現が上昇していたことがあきらかになった。また、PINBP1の発現の高い前立腺癌では発現の低い癌と比較して、手術後の再発率が有意に高いことが明らかになった。前立腺癌細胞株においてsiRNAを用いて当該タンパク質の発現を抑制すると、細胞の増殖が顕著に抑制され、細胞の老化が認められた。現在、このタンパク質を特許申請準備中である。その他、Pin1とリン酸化タンパク質との結合を研究する中で以下のことを明らかにした。1 RelA/P65は前立腺癌においてリン酸化されPin1と結合する。そのRe1Aリン酸化が前立腺癌の転移と関係があることを明らかにし、抗リン酸化Re1A抗体による免疫染色所見により、前立腺癌骨転移を予測できることが明らかになった。このことをあらたな前立腺癌予後判定因子として特許申請中である。2脳腫瘍、特に膠細胞腫においてPin1の高発現がみられ、Ph11と脳腫瘍の生物学的態度との間の関連があきらかになった。3 Pin1はリン酸化Daxxタンパク質との結合し、Daxxのユビキチン化を介した分解を促進し、アポトーシスに対し抑制的であることがあきらかになった。
海外基地の再配置とそのメカニズムに関する研究

本研究の成果は、今日の在日米軍基地システムの基本的骨格を形成した1960年代から70年代初頭における米国の政策決定過程を一次史料に基づいて明らかにしたことにある。そこでは従来、支配的であった戦略論的な視角を補足する要素として、基地を受け入れる側(政府、自治体)の政治的受容性の問題を前景化させただけでなく、基地の再編政策の帰結に作用する歴史の偶発性やアクター間の非線形的な相互作用の問題を明らかにした。それらの研究成果は、学術論文2件、学術書(共著)1件、そして学会報告1件として公表した。本研究は米国の海外基地が一旦設置された後の動態メカニズムを明らかにしようとするものである。具体的には、1960年代後半から70年代前半にかけて、すなわち沖縄返還交渉と同時並行的に行われていた日本本土の基地再編プロセス(関東に所在する基地の整理・統合を謳った「関東計画」の決定と実行の過程)を取り扱うものである。1年目である2014年度においては、1960年代後半から70年代前半までの、米国側の政策決定過程を明らかにするための一次史料の収集を行った。得られた史料をもとに、1968年の日本本土における基地の再編計画の策定過程を明らかにした。成果は、学会誌である『国際安全保障』2014年12月号に、論文「在日米軍基地再編を巡る米国の認識とその過程ー起点としての1968年」が掲載された。本研究は米国の海外基地が一旦設置されたあとの、動態(整理統合・再編)の過程を分析するものである。具体的には、1960年代後半から70年代前半にかけて行われた在日米軍基地の再編過程を考察している。平成27年度は、1969年に焦点を絞り、日本本土の基地再編の動きと、それと同時並行的に行われていた沖縄の施政権返還に向けた日米協議の問題について、一次資料を用いて分析を行った。浮かび上がってきたのは、本土と沖縄の基地の相互作用の問題であり、今日の在沖縄海兵隊の在りようを形成した、米国側の官僚政治的展開であった。その結果をまとめたものを共著書として2016年5月に出版予定である。当初の予定通り、在日米軍基地の再編過程を追跡できている。しかしながら、米国側の史料を中心に分析を行っているため、日本側の政策決定過程の分析については作業に遅れが生じている。その一方で、当初の計画では想定できていなかった、沖縄の基地問題との関連性を新たに見出すことができ、そのことが本研究課題全体に良い影響をもたらしている。共著書として成果を公表できたのも良い影響の一つの表れである。その意味では、おおむね順調に進展しているといえる。本研究では、1960年代後半から70年代前半にかけて実施された米国の在日米軍基地再編にかかる政策決定過程とそのメカニズムの解明を試み、次のような成果を得た。まず、米国側の政策決定過程については、それが戦略や予算制約のみならず、軍の組織防衛力学、ないし日本側の基地に対する受容性に対する認識が影響を与えることを明らかにし、それを学会誌にて発表した。(川名晋史「在日米軍基地再編を巡る米国の認識とその過程」『国際安全保障』第42巻、第3号、2014年12月、16ー30頁)。なお、同研究がもたらした成果は『沖縄タイムス』の第1面にて報じられた。また、最終年度においては、研究の成果として学術書(共著)を出版するとともに、2件の報告を行った。学術書は、屋良朝博、川名晋史、齊藤考祐、野添文彬、山本章子『沖縄と海兵隊ー駐留の歴史的展開』(旬報社、2016年6月)の第2章「1960年代の海兵隊『撤退』計画にみる普天間の輪郭」がそれにあたる。そこでは、1960年代から70年代初頭にかけて実施された在日米軍基地システムの再編プロセスのなかで、沖縄の普天間基地の機能強化が開始されたことを、一次史料に基づいて明らかにした。なお、同書の書評が『沖縄タイムス』、『琉球新報』に掲載された。また、同研究内容については、2016年9月21日行われた一般公開シンポジウム「ボーダースタディーズから読む日米関係」(於北海道大学スラブ・ユーラシアセンター)において報告(1960年代の海兵隊『撤退』計画にみる普天間の輪郭」)を行った。さらに、10月1日に行われた日本政治学会研究大会(於立命館大学)では、「沖縄における基地集合の偏移と時間性」と題した報告を行い、本研究の成果の一部、すなわち在日米軍基地再編プロセスがもらたした基地の自己強化圧力のメカニズムを示した。当初は、日本側と米国側の双方の政策決定過程を整理する予定であったが、米国側の史料が予定よりも集まったため、前倒しで米国側の政策決定過程に関する論文を執筆した。

その反面、日本側の政策決定過程に関する研究に遅れが生じた。今後、研究の焦点は、1969年から70年代前半の時期に移っていく。収集した史料を整理し、当該年代における在日米軍基地再編をめぐる日米協議、米国側の政策決定過程を明らかにしていく。その成果を学会報告か、あるいは論文にまとめて発表したい。国際関係論引き続き、米国側の政策決定過程、具体的には1969年以降のものを調査・研究していく。また、遅れが生じている日本側のそれについても、同時に進めていく。当初の計画よりも、図書にかかる費用が少なかった。その理由としては、1次史料の分析が中心となったためであり、2次資料に依拠する必要性が低下したためである。次年度使用額が生じた理由は、海外調査にかかる海外旅費が生じなかったためである。次年度使用額については、研究をまとめるための文献レビューのための図書の購入に充てたい。また、必要に応じて国内旅費に使用する可能性もある。翌年度においては、海外調査が計画上、必須となるため次年度使用額とあわせて充実した海外調査を行う予定である。
培養象牙芽細胞を用いた象牙質形成の臨床応用に関する基礎的研究

平成14年度報告今年度は象牙芽細胞の培養系を確立するために、ウシ歯胚より細胞採取を試みた。ウシ歯胚は成牛の永久歯胚を採取し、象牙芽細胞の発生源である歯乳頭を切り出し、細菌性コラゲナーゼによる酵素消化で歯乳頭細胞の分離培養を行った。得られた歯乳頭細胞の遺伝子発現をRT-PCR法で調べた結果、これらの細胞はdentin siloprotein(DSP), bone siloprotein(BSP), osteocalsin(OC)を発現していない、未分化な細胞集団である事が確認された。次に歯乳頭細胞をdexametazon、β-glycerophosphate、ascorbic acidを添加した分化誘導培地を用いて、象牙芽細胞への分化誘導を試みたところ、期待に反して歯乳頭細胞は反応せず、未分化状態を維持していることが考えられた。そこで歯乳頭細胞を免疫不全症マウスの皮下へ移植実験を行い、生体内にて分化誘導を試みた。その結果、移植後一ヶ月で歯乳頭細胞は骨様硬組織の形成能力を有する事が確認されたが、象牙質様硬組織の形成は観察されなかった。これらの結果より、歯乳頭細胞に存在する未分化細胞集団は骨様石灰化物の産生可能な骨芽細胞前駆体の特性も有しており、単独で移植すると骨芽細胞に分化すること考えられた。従って、歯乳頭細胞から象牙芽細胞への分化のためには、発生期歯胚で見られる、上皮ー間葉系の相互作用を実験的に再現させることが重要であることが予測された。修復象牙質の細胞学的メカニズムを明かにするために、著者らが確立したウシ象牙芽細胞の培養系を用い、種々のサイトカイン(IL-I, TNF-α, PGE_2, IGF-I, TGF-β, PTH)がメディエイターとして象牙芽細胞に働いた結果、象牙質が形成されるという作業仮説を証明する実験を行った。休止状態と思われる培養3ヶ月の象牙芽細胞に、IL-I, TNF-α, PGE_2, IGF-I, TGF-β, PTHをそれぞれ12時間処理し、さらに24時間培養後に細胞を回収した。さらに、全RNAを抽出しRT-PCR法により石灰化の指標となるタンパク質の発現を調べた結果以下の知見を得た。オステオカルシンの発現は、IL-IおよびIGF-I刺激により誘導され、BSPは、IL-I, PGE_2およびIGF-I刺激により誘導された。また、IGF-Iは、PGE_2, IL-I刺激により誘導されるという結果となった。以上のことから、長期培養によりタンパク合成能の低化したウシ培養象牙芽細胞は、サイトカインにより刺激され、増殖因子やマトリックスタンパクの合成を再開することが示唆された。また、骨および象牙質におけるビスフォスフォネートの直接的石灰化促進作用を明らかにするために、まずノジュール形成をしたmouse bonemarrowを用いそれぞれの濃度のビスフォスフォネートを添加、培養後、上記と同様にRT-PCR法により石灰化の指標となるタンパク質の発現を検索している。
解剖例の薬毒物検査における鎖骨下静脈血試料の有用性についての検討

薬毒物検査は法医実務において重要な検査項目の一つであり,血中濃度測定は必須である。血中濃度測定の試料としては,胃に近い心臓血はアルコールなどを経口的に摂取すると,死後胃内の薬毒物が周囲に拡散し,実際の血中濃度よりも高値を示してしまうため,胃から遠い大腿静脈血を選択するのが一般的である。しかしながら,大腿静脈血を採取するには手間がかかり,状況によっては充分量が得られない場合がある。そこで,鎖骨下静脈血が薬毒物濃度測定に適しているか否かを検討した。期間中に実施された法医解剖例のうち,ガスクロマトグラフを用いた気化平衡法によって血中からエタノールが検出された5例(男性4女性1,年齢40-72(平均59)歳,死後経過時間28-57(平均45)時間)について,心臓血,大腿静脈血,鎖骨下静脈血中のエタノール濃度を比較した。一般的にいわれているように大腿静脈血は心臓血に比して低い濃度(濃度比の平均0.91)を示した。一方,鎖骨下静脈血は大腿静脈血に比して僅かに高いが(濃度比の平均1.07),心臓血と比較すれば同程度に低い濃度(濃度比の平均0.93)を示した。心臓マッサージ実施例,腐敗例がなく,それらの鎖骨下静脈血の濃度に及ぼす影響については検討できなかった。以上の結果から,鎖骨下静脈血は解剖学的に心臓や胃に近いが,エタノールの死後拡散の影響がなく,大腿静脈血と同様に死後の血中エタノール濃度測定に有用である可能性が示唆された。本研究の成果は,解剖においては大腿静脈血に加えて末梢静脈血採取の部位が増え,死体検案の現場においては外表からも穿刺しやすいため,いずれの場面でも濃度測定に適した有用な試料が得られやすくなると考えられる。今後,事例を増やすことで,今回検討できなかった心臓マッサージ等の影響についての検討や,アルコール以外の薬毒物の濃度についても検討したいと考えている。