hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
妊娠期,及び養育・早期における母親の養育力強化のための家族援助モデルの開発

平成17年度遊びと参加者交流及び講話で構成した"妊娠期からの親準備教室"を本学発達科学部開催地域活性化プロジェクトの協賛プログラムとして3回開催した。初妊婦と夫及びボランチィア学生のべ16名の参加者が得られ地域における教室開催方法やプログラム内容の検討ができた。平成18年度試作版"(日本語版)妊娠期、及び育児早期における母親の養育力予測アセスメント・ツール(AT-MCRC)"を作成した。その開発過程を"Working Version of Assessment Tool for Mothers' Child-Rearing Competence during Pregnancy and Postpartum Period: the AT-Pg-/Post-MCCR)"として本学科英文紀要で発表した。親準備教室については大学病院内で開催しながら開催方法の再検討や内容の精選化を進めた。平成19年度前掲同名演題を第8回国際家族看護学会で発表した。また、研究計画に従って遊びと参加者交流及び生命科学、発達心理学及び臨床心理学を応用した講話など内容を精選した親準備教室親準備を開催して試作版妊娠期AT-MCCRによって測定した。今期課題「"妊娠期、及び養育・早期における母親の養育力強化のための家族援助モデル"の開発」として実施した親準備教室及び試作した養育力予測アセスメント・ツールAT-Pg-/Post-MCCRはやや不安傾向が高くまたそのことを自覚している妊婦や夫には一定の有用性が示唆された。従ってAT-Pg-/Post-MCCRが地域保健福祉センターや医療施設でのスクリーニングとして有効になるように内容や信頼性及び妥当性をさらに検討する必要がある。今後の展望としてAT-MCRCによるスクリーニングに始まる親準備教育システム化を視野に入れて実践的検討を重ねたい。本学発達科学部と共同で地域において初妊婦とその夫を対象とした、"妊娠期からの親準備教室"をのべ5回開催して、プログラム内容を検討した。基本プログラムとして、パウダービーズクッションを用いた、赤ちゃんイメージ作り、小麦年度を用いた粘土ごっこ、そして、絵本読み聞かせごっこなどの遊びを通した、参加者同士の交流、及び、専門家による講和で構成した。プログラムの効果評価の指標として、前期科研期間に開発した、"妊娠期、及び育児・早期における母親の養育力予測アセスメント・ツール"、及びSTAIを用いて、参加前後での比較を試みた。しかし、必ずしも参加者の参加状況が計画通りには進まないなどの状況となり、結果的に来年度に本格実施するうえでの貴重な示唆を得た。また、"妊娠期、及び育児・早期における母親の養育力予測アセスメント・ツール"については、再度分析方法を検討し、より高い信頼性・妥当性を維持しながら、項目数を減らしてコンパクト化し、用いやすいツールに改定を進めている。前年度は、本学が主催している地域における子育て支援活動の一環として初妊婦とその夫を対象とした、"妊娠期からの親準備教室"を延べ5回開催して、プログラム内容を検討した。基本プログラムとして、パウダービーズクッションを用いた、赤ちゃんイメージ作り、小麦粘土を用いた粘土ごっこ、そして、絵本読み聞かせごっこなどの遊びを通した、参加者同士の交流、及び、専門家による講和で構成した。プログラムの効果評価の指標には、平成16年度に終了した科学研究費補助金を受けて開発した、"妊娠期、及び育児早期における母親の養育力予測アセスメント・ツール"を改訂したもの及びSTAIを用いた。来期は、この試作版アセスメント・ツールについて信頼性・妥当性の検証を臨床的に重ねてゆく予定である。また、本アセスメント・ツールを用いて集団教育としての親準備教室プログラム内容、及び個別相談の効果を本ツールにより再評価する。今期は研究計画に従って集団教育としての親準備教室を実施して親準備アセスメントツールを使用した。<方法>参加者募集方法は、HP及び地域保健福祉センター及び病院での掲示とした。教室は2回1クールとして小麦粘土などの遊びと交流及び講話で構成した。

講話内容は「生命誕生-胎児からのメッセージ-」「親準備としての自己点検-エゴグラムを用いたアプローチ-」など生命科学、発達心理学及び臨床心理学を応用した内容で構成した。教室参加後対象者には前期に作成した試作版"(日本語版)妊娠期、及び育児早期における母親の養育力予測アセスメント・ツール"に自宅で記入して郵送いただいた。査定結果についてはレーダーチャートとして示して"強み"によって"弱み"を充填していくように対象者らにアドバイスを加えてフィードバックした。結果として親準備教室参加者は妊婦(6名)と一部その夫(5名)であった。受講者の感想として今までにない教室であったと概ね好評であった。うち5組の参加者には講話内容に沿って東大式エゴグラム(TEG)を用いて自我状態を測定した。個別相談は不安傾向が高かった5人の妊婦に対して要望に応じてカウンセリングとして実施したため試作版アセスメント・ツールを用いることは不可能であった。結論として今回実施した親準備教室及び試作した養育力予測アセスメント・ツールはやや不安傾向が高くまたそのことを自覚している妊婦や夫には一定の有用性が示唆された。従って今後、地域保健福祉センターや医療施設でスクリーニングなどを経て不安傾向の高い対象者の紹介を受けて本プログラムを実施するシステム化が必要と考える。
動的再構成可能プロセッサを用いたユビキタスネットワークシステムの開発

本研究では,ユビキタスネットワークシステム用無線通信装置の設計手法の一つとして,マルチコンテキスト動的再構成可能プロセッサやNetwork-on-chip(NoC)を用いて,同一仕様から様々なネットワークQoSに動的に適応できる回路を設計・開発する方法を考案すると共に、提案手法に基づく回路合成システムを試作した.提案する手法では,実時間システムの検証法の一つであるパラメトリックモデル検査法を用いて,対象とするネットワークシステムの動作仕様が指定されたネットワークQoS(動作の時間制約や,送受信データサイズ,周期などのQoSパラメータ)を満足するためのパラメータ間の関係を条件式の形で導出する.次に,導出された条件式と使用する動的再構成可能プロセッサの外部仕様から,その条件式を満たすプロセッサの選択やマルチコンテキストへのタスクの自動割り当てを行うとともに,対象とするネットワークQoS(およびその変動幅)に応じたタスクスケジューラを機械的に生成する.また,Network-on-chip(NoC)を対象に,タスク間のデータの依存関係やネットワークQoS制約を満足するNoC上のモジュール割り当て,ならびに,その間のルーターの通信構造を自動生成する方式を考案した.さらに,CPUを内蔵する小型センサデバイス上で歩行者同士の遭遇履歴情報を匿名性・リンク不能性を持たせてセキュアに蓄積・交換するための方式を考案するとともに,提案手法を用いて低消費電力でセキュアな遭遇履歴情報交換・蓄積を行う小型デバイスの開発を行った.本研究では,ユビキタスネットワークシステム用無線通信装置の設計手法の一つとして,マルチコンテキスト動的再構成可能プロセッサやNetwork-on-chip(NoC)を用いて,同一仕様から様々なネットワークQoSに動的に適応できる回路を設計・開発する方法を考案すると共に、提案手法に基づく回路合成システムを試作した.提案する手法では,実時間システムの検証法の一つであるパラメトリックモデル検査法を用いて,対象とするネットワークシステムの動作仕様が指定されたネットワークQoS(動作の時間制約や,送受信データサイズ,周期などのQoSパラメータ)を満足するためのパラメータ間の関係を条件式の形で導出する.次に,導出された条件式と使用する動的再構成可能プロセッサの外部仕様から,その条件式を満たすプロセッサの選択やマルチコンテキストへのタスクの自動割り当てを行うとともに,対象とするネットワークQoS(およびその変動幅)に応じたタスクスケジューラを機械的に生成する.また,Network-on-chip(NoC)を対象に,タスク間のデータの依存関係やネットワークQoS制約を満足するNoC上のモジュール割り当て,ならびに,その間のルーターの通信構造を自動生成する方式を考案した.さらに,CPUを内蔵する小型センサデバイス上で歩行者同士の遭遇履歴情報を匿名性・リンク不能性を持たせてセキュアに蓄積・交換するための方式を考案するとともに,提案手法を用いて低消費電力でセキュアな遭遇履歴情報交換・蓄積を行う小型デバイスの開発を行った.ユビキタスネットワークシステムで用いられる無線通信装置の回路を設計・開発する場合,QoSパラメータに依存して処理に必要なプロセッサ能力やメモリー速度,消費電力などを適切に調整する必要があり,各モジュールの性能をバランスよく高速化しなければ要求した性能が得られなかったり,与えられた実時間制約を満たさない回路が合成されてしまう危険性がある.本研究では,このようなユビキタスネットワークシステム用無線通信装置の設計手法の一つとして,動的再構成可能プロセッサを用いて,同一仕様から様々なネットワークQoSに適応できる回路を設計・開発する方法を考案することを目的とする.今年度はまず,ユビキタスネットワークシステムを都市環境で構築した際の性能や,データの転送率,パケット廃棄率などを詳細に調査し,それらと人や車のモビリティの関係を明らかにした.また,パラメトリックモデル検査法に基づき,ユビキタスネットワークの無線通信装置群の動作仕様が指定されたネットワークQoSなどの要求性質を満足するためのパラメータ間の関係を条件式の形で自動導出する方法を考案した.さらに,利用可能な動的再構成可能プロセッサやメモリーの性能・コスト・消費電力などからなる機能部品の性能表をもとに,どのモジュール群をどのコンテキストに配置すればコンテキストのサイズを最も小さくできるかなどの問題を線形計画法の手法を用いて定式化するとともに,最適値に近い解を生成するヒューリスティックアルゴリズムを考案し,その方法に基づくコンテキストの切り替えを行うスケジューリング回路を自動生成する方法を考案した.これらの研究成果を,3件の国際論文誌と1件の国際会議録,ならびに,1件の国内ワークショップで発表した.本研究では,ユビキタスネットワークシステム用無線通信装置の設計手法の一つとして,マルチコンテキスト動的再構成可能プロセッサやNetwork-on-chip(NoC)を用いて,同一仕様から様々なネットワークQoSに動的に適応できる回路を設計・開発する方法を考案すると共に,提案手法に基づく回路合成システムを試作した.提案する手法では,実時間システムの検証法の一つであるパラメトリックモデル検査法を用いて,対象とするネットワークシステムの動作仕様が指定されたネットワークQoS(動作の時間制約や,送受信データサイズ,周期などのQoSパラメータ)を満足するためのパラメータ間の関係を条件式の形で導出する.次に,導出された条件式と使用する動的再構成可能プロセッサの外部仕様から,その条件式を満たすプロセッサの選択やマルチコンテキストへのタスクの自動割り当てを行うとともに,対象とするネットワークQoS(およびその変動幅)に応じたタスクスケジューラを機械的に生成する.また,Network-on-chip(NoC)を対象に,タスク間のデータの依存関係やネットワークQoS制約を満足するNoC上のモジュール割り当て,ならびに,その間のルーターの通信構造を自動生成する方式を考案した.さらに,CPUを内蔵する小型センサデバイス上で歩行者同士の漕

遇履歴情報を匿名性・リンク不能性を持たせてセキュアに蓄積・交換するための方式を考案するとともに,提案手法を用いて低消費電力でセキュアな遭遇履歴情報交換・蓄積を行う小型デバイスの開発を行った.
前駆体蛋白質のミトコンドリア外膜への標的化と外膜透過機構の解析

ミトコンドリア蛋白質の殆どは細胞質で前駆体として合成され、細胞質因子によってミトコンドリアの受容体に運ばれさらに膜を輸送されてそれぞれの区画に局在化する。本研究費の補助による3年間の研究で次の事柄を明らかにすることができた。【1】細胞質因子MSFの機能解析:ミトコンドリア外膜受容体の細胞質領域の組み替え体(Tom70f、Tom20f)を用いて前駆体との結合を解析し前駆体のターゲティングにおける細胞質シャペロンの重要性を明らかにした。【2】外膜受容体と前駆体の相互作用解析:Tom70f、Tom20fおよびTom22、Tim23の膜外領域と前駆体との結合を解析した。そして外膜の内外に配置された輸送因子の酸性ドメインは輸送経路の下流にあるものほど前駆体への親和力が高いことを証明し、これが駆動力となって外膜透過が起ることを明らかにした。【3】外膜受容体因子の同定:37kDaの外膜蛋白質OM37が前駆体輸送における受容体として機能することを示し、OM37のcDNAクローニング、抗体の作成、抗体を用いた他の輸送因子との相互作用の解析などを行い、哺乳類ミトコンドリアに於ける新規な輸送因子であることを明らかにした。その他、外膜受容体Tom70,Metaxin、外膜の輸送チャネルの主要成分Tom40のクローニングとそれらの性質の解析を行った。【4】Tom20のターゲティング機構:外膜蛋白質のターゲティング機構を明らかにするためTom20-GFP融合蛋白質を用いてin vivoとin vitroで解析を行った。そしてTom20のN-末端の疎水性の膜貫通領域(TMD)とその直後にある塩基性アミノ酸とが共同してターゲティングシグナルとして働くことを見出した。TMDはSRPによって認識されるが、直後の塩基性アミノ酸がこの認識を阻害し、その結果ERへのターゲティングを回避してミトコンドリアへのターゲティングを行うことが明らかになった。【5】シトクロムc輸出機構:哺乳類ミトコンドリアは細胞外からのシグナルに応じて膜間スペースのアポトーシス因子(シトクロムcなど)を細胞質に放出しアポトーシスのカスケードを誘発する。我々は20SプロテアソームがdATP(orATP)とスタウロスポリンに依存してシトクロムcの放出を行うことを明らかにした。【6】内膜輸送系の解析:ラットミトコンドリアの内膜輸送因子rTim17、rTim23,rTim44をクローニングし、その性質を解析した。さらに内膜透過の素過程の解析を行った。

ミトコンドリアヘの前駆体蛋白質は細胞質シャペロンHsp70とMSFに依存して外膜上のインポート受容体に運ばれた後に外膜の輸送装置(TOM複合体)と内膜の透過装置(TIM複合体)の働きによってそれぞれの区画へと輸送される。本年度は以下の事柄を明らかにした。(1).ミトコンドリア外膜のインポート受容体Tom70とTom20の細胞質領域と前駆体との結合に及ぼす細胞質シャペロンMSFおよびHsp70の効果をin vitro系で解析した。その結果、(i)前駆体の種類に関わらずTom70への結合は細胞質シャペロンMSFに依存すること、(ii)尿素変した前駆体やHsp70で安定化した前駆体は直接Tom20に結合すること、(iii)前駆体/MSF複合体はTom70と結合し、前駆体/MSF/Tom70複合体を形成し、次にATPの加水分解によってMSFが脱離し前駆体/Tom70複合体が形成されること、(iv)Tom70、Tom20ともにミトコンドリアターゲティング配列を認識すること、(v)Tom70、Tom20間での前駆体のトランスファーがおこること、等を明らかにし、インポート受容体への前駆体ターゲティングに果たす細胞質シャペロンの重要性を明らかにした。(2)ラット肝ミトコンドリアの輸送因子としてTom20、metaxin、Tim17、Tim23、Tim44を同定しその性質の解析を行った。ミトコンドリアを構成する蛋白質の殆どは細胞質で前駆体として合成された後にミトコンドリア外膜と内膜に独立して存在する透過チャネルを輸送されてそれぞれの区画に定着する。本研究は、ミトコンドリアへの輸送の初期過程で働く細胞質因子MSFと外膜のNSF受容体の構造と機能を解析し、さらにそれらによる前駆体標的化の調節、並びに標的化された前駆体の外膜透過の機構を明らかにすることを目的としている。本年度の研究によって以下の事柄を明らかにした。(外膜受容体因子の同定)外膜成分に対する抗体を用いた実験によって37kDaの外膜蛋白質OM37が前駆体輸送における受容体として機能することを示し、om37のcDNAクローニング、大腸菌での発現と抗体の作成、抗体を用いた他の輸送因子との相互作用の解析などを行い、哺乳類ミトコンドリアに於ける新規な輸送因子("TOM38"と命名)であることを明らかにした(前田ら;投稿準備中)。その他、外膜受容体TOM70、Metaxin、および外膜の輸送チャネルの主要成分であるTOM40のクローニングとそれらの性質の解析を行った。(外膜受容体と前駆体の相互作用解析)ミトコンドリア外膜受容体(Tom70、Tom20)の細胞質領域の組み替え体およびTom22、Tim23の膜外領域をGSTまたはMBPとの融合蛋白と前駆体との結合をショ糖密度勾配遠心法などによって解析した。そして、外膜の内外に配置された輸送因子の酸性ドメインは輸送経路の下流にあるものほど前駆体への親和力が高いことを証明し、これが駆動力となって前駆体の外膜透過が起ることを明らかにした。さらに、それぞれの輸送因子によってミトコンドリア内局在を異にする前駆体の選別が行われることを明らかにした。(内膜輸送系の解析)ラットミトコンドリアの内膜輸送因子rTim17、rTim23、rTim44をクローニングし、その性質を解析した。さらに内膜透過の素過程の解析を行った。ミトコンドリアを構成する蛋白質の殆どは細胞質において前駆体として合成させ、前駆体のミトコンドリアターゲティング配列を認識する細胞質因子によってミトコンドリア表面に運ばれた後に膜を輸送されてそれぞれのコンパートメントに局在化する。
放電プラズマ焼結装置を活用した異種複合材料半溶融接合成形法

本研究では,放電プラズマ焼結装置を用いて異種金属素材等の各種複合素材を,型孔内で半溶融状態に加熱し加圧成形することにより,接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を開発することを目的としている.研究成果の概要は次の通りである.1.放電プラズマ焼結装置を用いて異種金属素材等の接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を具体化するための型設計,成形素材の組合せ,成形条件等の成形試験条件の検討を行った.2.放電プラズマ焼結装置を用いて,1000°C以上2000°Cまでの加熱温度で接合試験を可能にするため,赤外線温度計を購入し,これによる温度制御システムの設計・試作および温度検定を実施した.3.複合素材として、各種金属素材の組合せについて、加熱・圧接接合試験を行った.その結果,鋼系の金属同士の接合では,いずれもほぼ100%に近い接合強度が得られた.しかし,その他の異種金属同士の接合では,銅とチタン合金及び鋼系合金は50%以上の接合強度が得られたが,チタン合金と鋼系合金との接合は困難であることがわかった.4.ステンレス鋼とチタン合金の組合せについて,接合条件を種々工夫した結果,界面に銅粉末を介在させることにより,ほぼ40%程度の接合強度が得られることが明らかになった.5.材質の異なる低炭素鋼と高炭素鋼からなる2部品の接合を試みた結果,750°C以上でほぼ100%の継ぎ手効率が得られることが明らかになった.6.ステンレス鋼および高炭素鋼の円柱素材を用いて,黒鉛型内で突合わせ接合と鍛造を同時に行う「接合成形法」の開発を目的に,放電プラズマ焼結装置内で試作を行った結果,接合効率50%以上の接合強度が得られるとともに,据え込み鍛造による成形と接合を同時に行う「接合成形法」の確率の可能性を明らかにできた.本研究では,放電プラズマ燒結装置を用いて異種金属素材等の各種複合素材を,型孔内で半溶融状態に加熱し加圧成形することにより,接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を開発することを目的としている.本年度に実施した研究結果の概要は次の通りである.1.放電プラズマ燒結装置を用いて異種金属素材等の接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を具体化するための型設計,成形素材の組合せ,成形条件等の成形試験条件の検討を行った.2.放電プラズマ燒結装置を用いて,1000°C以上2000°Cまでの加熱温度で接合試験を可能にするため,赤外線温度計を購入し,これによる温度制御システムの設計・試作および温度検定を実施した.3.複合素材として、各種金属素材の組合せについて、加熱・圧接接合試験を行った.その結果,鋼系の金属同士の接合では,いずれもほぼ100%に近い接合強度が得られた.しかし,その他の異種金属同士の接合では,銅とチタン合金及び鋼系合金は50%以上の接合強度が得られたが,チタン合金と鋼系合金との接合は困難であることがわかった.4.ステンレス鋼とチタン合金の組合せについて,接合条件を種々工夫した結果,界面に銅粉末を介在させることにより,ほぼ40%程度の接合強度が得られることが明らかになった.本研究では,放電プラズマ焼結装置を用いて異種金属素材等の各種複合素材を,型孔内で半溶融状態に加熱し加圧成形することにより,接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を開発することを目的としている.研究成果の概要は次の通りである.1.放電プラズマ焼結装置を用いて異種金属素材等の接合とニアネットシェイプ成形を同時に行う複合材料の半溶融接合成形法を具体化するための型設計,成形素材の組合せ,成形条件等の成形試験条件の検討を行った.2.放電プラズマ焼結装置を用いて,1000°C以上2000°Cまでの加熱温度で接合試験を可能にするため,赤外線温度計を購入し,これによる温度制御システムの設計・試作および温度検定を実施した.3.複合素材として、各種金属素材の組合せについて、加熱・圧接接合試験を行った.その結果,鋼系の金属同士の接合では,いずれもほぼ100%に近い接合強度が得られた.しかし,その他の異種金属同士の接合では,銅とチタン合金及び鋼系合金は50%以上の接合強度が得られたが,チタン合金と鋼系合金との接合は困難であることがわかった.4.ステンレス鋼とチタン合金の組合せについて,接合条件を種々工夫した結果,界面に銅粉末を介在させることにより,ほぼ40%程度の接合強度が得られることが明らかになった.5.材質の異なる低炭素鋼と高炭素鋼からなる2部品の接合を試みた結果,750°C以上でほぼ100%の継ぎ手効率が得られることが明らかになった.6.ステンレス鋼および高炭素鋼の円柱素材を用いて,黒鉛型内で突合わせ接合と鍛造を同時に行う「接合成形法」の開発を目的に,放電プラズマ焼結装置内で試作を行った結果,接合効率50%以上の接合強度が得られるとともに,据え込み鍛造による成形と接合を同時に行う「接合成形法」の確率の可能性を明らかにできた.
ミツバチの攻撃行動を規定する遺伝子の同定と解析

ミツバチの攻撃性に関与する候補因子として攻撃性の高い個体の脳から同定されたKakugoウイルス(KV)について、その感染が攻撃行動の制御に関わる頻度を調べるために、攻撃蜂におけるKVの感染率の検討を試みた。攻撃蜂1匹ずつにおけるKVゲノムRNAを定量的RT-PCR法を用いて定量した結果、感染が認められたのは一部の個体のみだった。このことから、攻撃蜂の全てがKVに感染しているわけではなく、ミツバチの通常の攻撃行動の制御には、KV感染と独立な機構も存在する可能性が考えられた。様々な働き蜂について、多くの個体数をまとめてKV量を検討した結果、コロニーレベルでのKV量が少ない状況では攻撃蜂に特異的なKVの感染が生じていたが、コロニーレベルでのKV量が多い状況では、攻撃蜂以外の働き蜂からもKVが検出される例が見出された。このことから、KVがミツバチのコロニー内に感染している場合には、コロニー内のKV量に応じてKVと攻撃行動との相関関係の有無が決まっており、KVの攻撃蜂特異的な感染が、コロニーレベルでのKV量が少ない状況に限定して成立している可能性が考えられた。これは、KV感染と攻撃性との関連について、感染の有無だけでなく、感染量を考慮する必要性を示唆した点で重要な知見である。KV量の高いコロニーの一つにおいて、巣内の働き蜂におけるKV感染率・量を経時的に検討した結果、KVの検出率やKV検出量に増加傾向が見られ、感染の拡大が推定された。このコロニーでは、幼虫の死骸が多数存在し、ミツバチの疾病であるチョーク病様の徴候を示していた。また、ミツバチのコロニーに寄生するミツバチヘギイタダニの発生が認められた。コロニーが病的な状態にある場合には、攻撃蜂以外の働き蜂にもウイルスの感染が拡大し、感染率が上昇する可能性が考えられた。ウイルスに感染したミツバチによる自殺的攻撃行動がコロニーの病原性と関連する可能性は、ミツバチの攻撃行動の進化を考察する上でも興味深いと思われる。1)新規昆虫ピコルナ様ウイルスゲノム様遺伝子、Agg-2の解析1-1)Agg-2のcDNAクローニング攻撃性の高いミツバチの脳に特異的に検出される新規遺伝子、Agg-2のcDNAクローニングが完了し、約10kbpについて塩基配列が決定された。その結果、全長にわたってピコルナ(様)ウイルスゲノムとの相同性が見られた。また、様々なピコルナ(様)ウイルスとの系統解析の結果、Agg-2は昆虫ピコルナ様ウイルスグループのゲノムRNAと最も近得であることが示された。さらに、Agg-2がミツバチのゲノム由来のものか否かを検討するために、ミツバチゲノムDNAを用いてサザンブロット解析を行った結果、Agg-2はミツバチゲノム中にはコードされないことが強く示唆された。したがって、Agg-2はミツバチに感染する、新規な昆虫ピコルナ様ウイルスのゲノムであると示唆された。そこで私はこのウイルスをKakugoウイルスと命名した。1-2)ウイルス感染実験Kakugoウイルスが感染性を持つか否かを検討するために感染実験を行った。Kakugoウイルスに感染している攻撃峰と感染していない採餌蜂の頭部からそれぞれライセート上清を調整し、採餌蜂の頭部にそれぞれ注射した。頭部におけるKakugoウイルス量を定量的RT-PCRを用いて経時的に定量した。その結果、攻撃峰ライセート上清を注射した場合には注射3日後にウイルスの増殖が見られた。採餌蜂ライセート上清を注射した場合には注射3日後ではウイルスは検出されなかった。このことから、Kakugoウイルスの感染性が示された。2)攻撃行動の制御に関わる遺伝子群の網羅的同定攻撃蜂と逃避蜂の脳由来cDNAと当研究室で作成したミツバチのDNAマイクロアレイを用いて攻撃峰の脳に選択的に発現する遺伝子群を検索した結果、攻撃峰に2倍程度強く発現する新規な遺伝子、Agg-3を同定した。定量的RT-PCRの結果、攻撃峰選択的な発現が確認された。(1)Kakugoウイルスの粒子形成に関する解析私は、攻撃性の高いミツバチの脳に特異的に検出される新規RNA, Kakugo(Agg-2)を同定し、解析する過程で、Kakugoは新規な昆虫ピコルナ様ウイルスのゲノムであることが示唆してきた。昨年度までには、このRNAについては全長クローニングが完了していると共に、感染性を有することが示唆された。しかし,Kakugo RNAが実際にウイルス粒子を形成するのか否かは不明だった。そこで、その点を検討するため、Kakugo RNAの検出されるミツバチの細胞粗抽出液をショ糖密度勾配遠心法によって10の画分に分画し、各画分におけるKakugo RNA量を定量的RT-PCR法で定量した。その結果、Kakugo RNAの検出される画分が3つ検出された。そのうちの一つは、同時に行ったポリオウイルス粒子の画分と一致した。もう一つは、この細胞粗抽出液から調整したTotal RNAを用いて行った結果と一致した。もう一つは、一番底の画分であった。これらの結果から、細胞内のKakugo RNAは沈降係数の異なる2つの形態で存在し、一つはウイルス粒子内のゲノムRNAとして、もう一つはゲノムRNA由来の遊離したmRNAとして存在することが強く示唆される。底の画分については破砕しきれなかった細胞や、粒子の凝集体由来のRNAを検出したものと考えられる。以上の結果から、Kakugo RNAは細胞内でウイルス粒子を形成することが強く示唆された。

(2)Kakugoウイルスの感染源に関する解析Kakugoウイルスがミツバチに感染する経路として、ミツバチの巣に寄生するダニからの感染が一つの可能性として考えられた。そこで、ミツバチの巣からミツバチヘギイタダニを採集し、RT-PCR法によつてKakugo RNAが検出されるか否かを検討した。ミツバチヘギイタダニにおいても、Kakugo RNAが検出された。したがって、Kakugoウイルスの感染源としてこのダニが一因である可能性が支持された。ミツバチの攻撃性に関与する候補因子として攻撃性の高い個体の脳から同定されたKakugoウイルス(KV)について、その感染が攻撃行動の制御に関わる頻度を調べるために、攻撃蜂におけるKVの感染率の検討を試みた。攻撃蜂1匹ずつにおけるKVゲノムRNAを定量的RT-PCR法を用いて定量した結果、感染が認められたのは一部の個体のみだった。このことから、攻撃蜂の全てがKVに感染しているわけではなく、ミツバチの通常の攻撃行動の制御には、KV感染と独立な機構も存在する可能性が考えられた。様々な働き蜂について、多くの個体数をまとめてKV量を検討した結果、コロニーレベルでのKV量が少ない状況では攻撃蜂に特異的なKVの感染が生じていたが、コロニーレベルでのKV量が多い状況では、攻撃蜂以外の働き蜂からもKVが検出される例が見出された。このことから、KVがミツバチのコロニー内に感染している場合には、コロニー内のKV量に応じてKVと攻撃行動との相関関係の有無が決まっており、KVの攻撃蜂特異的な感染が、コロニーレベルでのKV量が少ない状況に限定して成立している可能性が考えられた。これは、KV感染と攻撃性との関連について、感染の有無だけでなく、感染量を考慮する必要性を示唆した点で重要な知見である。KV量の高いコロニーの一つにおいて、巣内の働き蜂におけるKV感染率・量を経時的に検討した結果、KVの検出率やKV検出量に増加傾向が見られ、感染の拡大が推定された。このコロニーでは、幼虫の死骸が多数存在し、ミツバチの疾病であるチョーク病様の徴候を示していた。また、ミツバチのコロニーに寄生するミツバチヘギイタダニの発生が認められた。コロニーが病的な状態にある場合には、攻撃蜂以外の働き蜂にもウイルスの感染が拡大し、感染率が上昇する可能性が考えられた。ウイルスに感染したミツバチによる自殺的攻撃行動がコロニーの病原性と関連する可能性は、ミツバチの攻撃行動の進化を考察する上でも興味深いと思われる。
小脳発生の研究:胎生期のニューロン誕生・移動の機構

本研究は,従来不明な点の多かった胎生期の小脳の形成過程について理解を深めることをめざした.求める基礎的知見が先天性疾患の病態解明や再生医療にむけた取り組みに役立つ事を念頭に,ニューロンと神経前駆細胞の挙動に焦点をあてて研究が行われた.ヒト小脳形成に重要と知られる細胞外因子「リーリン」が移動中の幼若なプルキンエ細胞に対してどういう働きかけをしているかをスライス培養下のライブ観察などによって明らかにした.また,プルキンエ細胞を産生する神経前駆細胞の細胞周期動態,分裂の様式を明らかにした.本研究は,従来不明な点の多かった胎生期の小脳の形成過程について理解を深めることをめざした.求める基礎的知見が先天性疾患の病態解明や再生医療にむけた取り組みに役立つ事を念頭に,ニューロンと神経前駆細胞の挙動に焦点をあてて研究が行われた.ヒト小脳形成に重要と知られる細胞外因子「リーリン」が移動中の幼若なプルキンエ細胞に対してどういう働きかけをしているかをスライス培養下のライブ観察などによって明らかにした.また,プルキンエ細胞を産生する神経前駆細胞の細胞周期動態,分裂の様式を明らかにした.小脳は,姿勢や運動の制御に重要な役割を果たすことで知られる.小脳に形成不全があると歩行に異常をきたす.小脳の中心的な存在であるプルキンエ細胞は本来胎生期に小脳原基の外側(表面近く)に並ぶ.歩行障害にもとづいて見つかった「リーラー」というミュータントマウスの小脳では,プルキンエ細胞の正しい配置が果たされず,プルキンエ細胞は深いところに沈んだように留まる.リーラー変異の的として1995年に発見されたリーリン遺伝子は,細胞外で機能する糖タンパク質をコードするが,ヒトで欠損すると先天性の脳形成不全となることが知られており,その働きの理解はきわめて重要である.小脳において,リーリンがプルキンエ細胞の配列を制御する,ということは分かっているが,具体的にその作用をどのようにして果たすのか,プルキンエ細胞がリーリンに反応してどのような振る舞いをするのか,依然分かっていない.そこで,本研究の大きな柱の一つとして,まずこの問題に対しての解析を行った.散発的な標識による形態描写,特異的マーカーを用いての同定,そしてスライス培養によるライブ観察を組み合わせることで,幼若なプルキンエ細胞の移動の様子を初めて詳しく観察することに成功した.プルキンエ細胞は,これまで考えられていなかった様式の移動をしていること,移動の後ではなく途中から回路形成用の極性化を示しており,巧みに層を形成する様子が分かった.この成果は,海外の学会を含めて,ポスターおよび口頭の発表を行ったのに加えて,論文としてまとめ,現在査読中である.なお,本研究と関連性のあるリーリンについての共同研究によって論文の出版に至った.小脳は,姿勢や運動の制御に重要な役割を果たし,小脳に形成不全があると歩行に異常をきたす.小脳のプルキンエ細胞は本来胎生期に小脳原基の外側(表面近く)に並ぶ.歩行障害にもとづいて見つかった「リーラー」というミュータントマウスの小脳では,プルキンエ細胞の正しい配置が果たされず,プルキンエ細胞は深いところに沈んだように留まる.リーラー変異の的として1995年に発見されたリーリン遺伝子は,細胞外で機能する糖タンパク質をコードし,ヒトで欠損すると先天性の脳形成不全となることが知られており,その働きの理解はきわめて重要である.小脳において,「リーリンがプルキンエ細胞の配列を制御する」ということは分かっているが,具体的にその作用をどのようにして果たすのか,プルキンエ細胞がリーリンに反応してどのような振る舞いをするのか分かっていなかった.本研究では,散発的な標識による形態描写,特異的マーカーを用いての同定,そしてスライス培養によるライブ観察を組み合わせることで,幼若なプルキンエ細胞の移動の様子を初めて詳しく観察することに成功した.プルキンエ細胞は,これまで考えられていなかった様式の移動をしていること,移動の後ではなく途中から回路形成用の極性化を示しており,巧みに層を形成する様子が分かった.この成果を論文として2010年9月にNeural Development誌(オープンアクセス)に報告し,「Highly Accessed」論文に選ばれた(その内容は,2010年10月4日中日新聞朝刊でもカラー図付きで紹介された).また,国内外での招待講演(日本先天異常学会シンポジウム,日本神経科学会シンポジウム,独マックスプランク研究所セミナー,理化学研究所脳科学総合研究センターチュートリアル)にて発表した.小脳は,姿勢や運動の制御に重要な役割を果たし,小脳に形成不全があると歩行に異常をきたす.リーリン遺伝子は,細胞外で機能する糖タンパク質をコードし,ヒトで欠損すると先天性の脳形成不全となることが知られており,その働きの理解はきわめて重要である.昨年度までに,誕生したプルキンエ細胞がどのように移動し,配置に至るのかに関して重点的に研究を進め成果を挙げたので,今年度は,プルキンエ細胞の誕生の局面について,解析を行ない,以下のような成果を挙げつつある.まず,プルキンエ細胞が産生される時期(マウスで胎生10日目から12日目)の小脳原基に存在する神経前駆細胞の細胞周期動態を調査し,細胞周期長が17時間程度である事を明らかにした.また,G1期,S期,G2期,M期の長さを推定する事もできた.また,前駆細胞が集団として示す分裂のモードについても明らかにする事ができた.

具体的には,胎生10日目では仮に50個の前駆細胞が分裂して100個の娘細胞が誕生する場合にそのうちにプルキンエ細胞が30個ほど含まれるが,11日目には45個程度に,そして12日目には60個程度に,と徐々に割合が上昇する.集団としての非対称分裂の様態を初めて明らかにする上事ができた.さらに,非対称分裂の状況を上記のような「集団」レベルでの理解から,「個々の細胞」レベルでの理解に深める目的で,クローン解析にも着手した.具体的には,GFP遺伝子を組み込んだレトルウイルスを胎生10日目の小脳原基に注入し,きわめて散発的・低密度に前駆細胞を標識し,その前駆細胞の子孫細胞を様々な待ち時間後に解析し,どういう分裂が起きたために各クローンが生じたかを判定した.現在,クローン解析の規模を増やすとともに,ライブ観察で分裂の様子をとらえるべく準備中である.なお,2011年6月11-12日には,研究室公開を行ない、一般の方々に研究の紹介を行なった.小脳は姿勢や運動の制御に重要な役割を果たすが,プルキンエ細胞というニューロンが回路において重要な役割を担っている.本研究の前半部では,幼若なプルキンエ細胞がどのように小脳原基のなかで移動し,配置されるのかという問題について研究を進めて成果を報告した.脳原基の深い位置で誕生したプルキンエ細胞は,のちに軸索として機能することになる突起を伸ばしながら脳膜側に向けて細胞体を動かし,脳膜近くで方向転換を果たし,配置を達成する.その際,当初は後ろに持っていた短い突起をリモデルしながら方向転換が果たされる.この「方向転換を介しての配置」にはリーリンが重要な役割を果たしている.研究期間の後半では,プルキンエ細胞の誕生について研究を行ってきた.これまでに,小脳の神経前駆細胞の細胞周期動態を明らかにする目的でブロモデオキシウリジンを用いての解析を進め,細胞周期長および細胞周期の各局面(G1期,S期,G2期,M期)の長さも推定できた.その結果,大脳皮質原基に存在する神経前駆細胞との相違が浮き彫りになった.そして,レトロウイルスを用いてクローン解析を進め,プルキンエ細胞の産生はいくつかの異なる分裂モードの組み合せによって達成されることが示唆された.こうした成果を学会発表(9月,1月)した.さらに,成体小脳において認められるプルキンエ細胞の縞状の分布の成立の原理を,こうした神経前駆細胞の時間依存的な特性変化に立脚して理解するために,発現に次期特異性のある分子に注目して分裂モードのステージ依存的な変化を調べる必要がある.計画全体の主要な2つのパートは,プルキヒエ細胞の移動・配置の局面と,プルキンエ細胞の産生の局面に分けられる.このうち,「移動・配置」について,これまでに成果をあげ論文の出版,学会発表,新聞掲載などの発表に至っている.後者.「産生」の局面について,前駆細胞のふるまいを調査する研究を現在推進中である.24年度が最終年度であるため、記入しない。プルキンエ細胞の産生の機構に関して,前駆細胞の動態,細胞系譜の問題を追求する。具体的には,プルキンエ細胞の前駆細胞の細胞周期進行の状況についてBrdUを用いた標識法を分化マーカーと組み合わせることを通じて把握する.また,レトルウイルスをもちいたクローン解析もおこない,細胞系譜を明らかにする.さらにスライス培養を用いて,非対称分裂の様態について明らかにする.これらはいずれも開始しており,さらなるデータ取得を続ける予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
Ang/Tie2が関与する敗血症性臓器障害発症機序解明とその制御法の確立

救急領域で扱う過大生体侵襲に合併する臓器不全の病態解明とその制御法の確立を目指し、主に臨床血液サンプルを用いてVEGFやAng、それらの受容体などの血管新生関連因子と、敗血症、重症外傷、心停止後症候群に合併する臓器不全との関わりを検討した。特にAng2が凝固線溶異常と関連して重要な役割を果たしていることを証明した。この成果は海外4学会、国内6学会で発表、また英文誌4編に発表した。動物実験においては、動脈ライン、静脈ライン確保の手技も確立し、バイタルサインモニター、薬剤の静脈内投与も可能となったが、使用薬剤の入手が困難であり予定通りの結果を得ることができなかった。今後血管新生関連因子だけでなく、それらの発現を調節するHypoxic inducible factor-1α(HIF1α)も生体侵襲に合併する臓器不全の治療標的として、研究を進める予定である。生体は生体侵襲に対して非特異的な反応を引き起こすという仮説をもとに、sepsisだけでなくsepsis-like syndromeとも評されるpost-cardiac arrest syndrome (PCAS)や、sepsisと同様に血管内皮細胞障害を引き起こす重症外傷の臨床サンプルにおけるAngiopoietin(Ang)をはじめとした血管新生関連因子についての研究を行った。sepsis, PCAS,重症外傷の患者のICU入室時、3日目、5日目に血液データや各種臨床データを採取し、具体的にはAngなど血管新生関連因子の経時変化、さらに予後、臓器不全発症と血管新生関連因子との関係、またこれに関係する因子と凝固線溶マーカーとを多変量解析を用いて解析した。3つの侵襲すべてにおいて、Ang2がDIC、臓器不全発症を通じて、予後不良に強く関係しているという結果になった。この結果はsepsisに代表される血管内皮細胞傷害が病態の中心となる臓器障害の新しい治療ターゲットとしての高い妥当性を示唆するものである。またARDS発症においてもAng2が深く関与しているという結果を得ている。また動物実験の予備実験として、敗血症モデルを確立させた。LPS15mg/kgを腹腔内投与にて血中TNF-αが上昇することを確認した。我々実験グループの過去のモデルと相違ないことを確認している。また、動脈ライン、静脈ライン確保の手技も確立し、バイタルサインモニター、薬剤の静脈内投与も可能となった。臨床サンプルにおいて、敗血症に代表される過大生体侵襲に伴う急性肺障害、DIC臓器不全発症に血管新生関連因子、特にAng2が関連していることを証明し、海外、国内の主要学会でその成果を発表、また英文誌にも投稿し受理されている。動物実験において使用するAng2の抗体を海外の他研究グループから提供していただくことを計画していたが、同様の研究を行うグループへの提供を理由に提供を受けることができなくなった。市販の抗Ang2抗体は完全な中和抗体ではないため、どの程度Ang2をブロックできるかなど予備実験が必要になると思われる。研究費の約5割を実験費(動物、抗体、測定キット、一般生化・薬理試薬など)として使用する予定である。また実験費約3割を学会旅費にあてる。複数回の海外学会発表を考えているので、費用は相当額になることが予想される。残りは論文投稿に際して必要な、英文校正費、出版代などにあてる予定である。
カイコの新型トランスポゾンを用いた突然変異誘発法および遺伝子タギング法の開発

昨年度、カイコゲノムからAquila、Cygnus、Lyraと命名した昆虫レトロウイルス様因子を発見した。今年度は、さらにゲノム情報の網羅的探索を実施した。マイマイガ核多角体病ウイルスの膜融合タンパク質を手がかりに、カイコゲノム情報をin silicoで探索した。その結果、新規のレトロウイルス候補2種類の配列を得、それぞれArcturus、Denebolaと名付けた。Arcturusは三つのORFを持ちそれぞれがGag、Pol、Env様タンパク質をコードしており、それらORFの外側にはLTR配列が存在していた。またDenebolaは二つのORFを持ち、1番目のORFにGag様タンパク質及びPol様タンパク質をコードし、2番目のORFにEnv様タンパク質をコードするという構造を持っていたが、LTRは同定できなかった。また、envの塩基配列の一部を基準にしてコピー数を見積もったところ、Arcturusが10コピー、Denebolaが16コピー存在すると推定された。一方で、新たにpiggyBacに弱い相同性を示す新しいトランスポゾンを発見した。これは最初p50T系統のW染色体に由来するBACクローン1C7Cから発見され,全長、は3419bpであった。674アミノ酸残基からなるトランスポザーゼをコードしており、そのアミノ酸配列はpiggyBacと34%が一致していた。ORFの外側に16塩基の逆向き反復配列があり,左右の逆向き反復配列のさちに外側にTTAAというターゲット重複配列が認められた。PCRおよびサザンブロットによる解析より,W染色体におけるこのトランスポゾン様配列の挿入は,p50T系統に特異的であることが判明した。この結果から,このトランスポゾン様配列には転移能力がある可能性が高いと判断し,yabusame-Wと命名した。1.カイコゲノムからのレトロウイルス様因子の発見gypsyやTEDなどの昆虫レトロウイルスのORF3をqueryにしてESTデータベースおよびゲノム塩基配列を相同性検索した結果,Lyra, Aquila, Cygnusの3種のレトロウイルス様因子を発見した。染色体上ではいずれも両端のLTRにはさまれた三つのほぼ完全なORFを有していた。3種類ともカイコ個体でRNAとして転写されており,完全長RNA以外にENVをコードするサブゲノミックRNAが生成していた。培養細胞BmNにおいて,Aquilaは100倍以上にコピーが増えていることが判明した。これらがカイコのレトロウイルスであるなら,遺伝子導入ベクターとして有望である。2.カイコゲノムからのpiggyBac様配列の発見カイコESTデータベース上には多くのClassII型転移因子様配列が認められる。そのなかに,イラクサキンウワバのトランスポゾンpiggyBacに相同性を有する配列を発見した。piggyBacはカイコの遺伝子導入ベクターであり,ゲノムに内在性piggyBacが存在することは,実験手法上大きな問題になる。3.カイコの染色体ゲノム塩基配列を対象にした高頻度反復配列のサーベイランスカイコp50系統の全ゲノムショットガン配列9600個をPFPフィルターに通し,ベクターの配列や既知のカイコ反復配列と100bp以上一致する配列などをマスクした。その過程で,mariner様配列が848リード,BMC1が481リードなどと,多数の反復配列が検出された。残った8557リードをCAP4でアセンブルした結果,6469リードのシングレットと843のコンティグ(=2088リード)にまとめられた。これらの配列には,まだBMC1が201リード,Bm1が808リードなどと,反復配列が認められたが,いずれも数十から数百bpの短い配列であった。
アメリカザリガニの水分調節に関する研究

Topological mass spectrometry分析とはMALDI-TOF MSやquadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) MS分析とクローニング法を組み合わせて神経ペプチドを効率良くスクリーニングする方法である。本研究で我々はこの手法を用い、アメリカザリガニにおける水分調節に関わる神経ペプチドの同定を試みた。まず肛門呼吸を通じた水分調節に焦点を定め、肛門や後腸の動きを支配している神経細胞を含む第六腹部神経節の切片を作製し、direct MALDI-TOF MS分析を行った。結果、オルコキニン類や甲殻類SIFamide、タキキニン関連ペプチド、甲殻類心臓作用性ペプチド(CCAP)の存在が明らかになったが、他に未知物質の存在を示唆するデータが得られた。その内、分子量1270のものについては、分子量を指標とした精製を行い、Q-TOF MS/MS分析によって部分配列が(L/1)DHVF(L/1)RFamdeでありミオサプレッシン様ペプチド(MSLP)と示唆された。またMSLPとCCAPの前駆体クローニングにより、その周辺配列は夫々-KRQDLDHVFLRFGRSQ(Stop)及び-KRPFCNAFTGCGKKR-であると判明し、MSLPはpEDLDHVFLRFamideであると決定できた。さらにその神経節におけるin situ hybridization解析を行うことにより、後腸を直接支配しているposterior median cell clusterがオルコキニンのみならずMSLPも産生しており、CCAPはこれら細胞群の両脇に接している細胞で産生されていることが示唆された。次に、これら種々の神経ペプチドを合成し、肛門や腸管に対する作用及び肛門からの水分の取り込みについて検定した結果、それぞれが肛門や後腸、直腸の各部位に対して特異的な作用を示すことが判明し、水分の取り込みは複数のペプチドによる複合的な作用により支配されていることが示唆された。Topologicalmass spectrometry分析とはMALDI-TOF MSやquadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) MS分析とクローニング法を組み合わせて神経ペプチドを効率良くスクリーニングする方法である。甲殻類においては既にアラトスタチンやFLRFアミド関連ペプチドが多種類同定されているが、その生体内における生理作用については不明な点が多く、また遺伝子についても全く明らかにされていない。そこでザリガニの脳・神経節より両者の前駆体タンパク質のcDNAクローニングを行った。DNA配列を解析した結果、FLRFアミドの前駆体はAYSDRNFLRFamide、SRNFLRFamide、ALDRNFLRFamide、DRNFLRFamide、APQRNFLRFamideを1コピーずつ、NRNFLRFamideを2コピー含む構造であると推定された。一方アラトスタチン前駆体は、AGPYAFGLamideを4コピーとSGPYAFGLamideを3コピー、さらに22種類のアラトスタチン様ペプチド(-YXFGLamide)と3種類の推定ペプチド[-(Y/M)(G/S)Lamide]をそれぞれ1コピーずつ含むマルチプルな構造を有していた。次にこれらペプチドと我々が現在までに明らかにしたオルコキニンやSIFアミド、タキキニン関連ペプチド(TRP)の存在部位を解析し比較するためにまずRT-PCR解析を行ったところ、何れのペプチドも脳と腹部神経節の両者で発現していることが判明した。ザリガニの腹部第六神経節は肛門による水分調節を支配していると考えられており、これら神経ペプチドが関与している可能性が示唆された。さらに脳内におけるin situ hybridization解析を行った結果、FLRFアミドやアラトスタチンは主にcluster 9に細胞体を有する介在神経で発現しており、TRPやオルコキニンはcluster 9と11の両者にある多数の介在神経で共発現していることが判った。一方、SIFアミドはcluster 10にある大部分の投射神経で発現していることが明らかとなった。

これらの結果は、FLRFアミドやアラトスタチン、TRP、オルコキニンというペプチド群がolfactory lobeに投射された嗅覚情報に対する神経修飾物質としての機能を有し、SIFアミドについてはそれらの結合された情報を受けて眼柄内前脳への出力を担う神経ペプチドであることを示唆するものである。我々は昨年度までにアメリカザリガニ(Procambarus clarkii)においてオルコキニンやSIFアミド、タキキニン関連ペプチド(TRP)、アラトスタチン様ペプチド、FMRF関連ペプチドのcDNAクローニングや脳内mRNA発現解析を行っているが、凍結切片を用いたMALDI-TOF質量分析を行った結果、腸管を支配していると考えられる腹部神経節には、上記ペプチド以外に甲殻類心臓作用性ペプチド(CCAP)の存在も示唆された。そこでCCAPのcDNAを第六腹部神経節ライブラリーよりクローニングしDNA配列解析を行った結果、前駆体タンパク質はCCAP(PFCNAFTGCamide)を1コピー含み126アミノ酸残基から成る構造であることが判明した。アミノ酸配列のホモロジー解析を行うと最も相同性の高い配列は近縁種のザリガニ(Orconectes immunis)で94%の相同性を示し、他に昆虫ではゴキブリ由来のCCAPが最も相同性の高い配列(28%)であった。さらにこれらペプチドの多くはアミド化されていることから、ザリガニにおけるC末端アミド化酵素の分布を調査する目的で、アミド化酵素のクローニングを試みたところ、上記ライブラリーよりpeptidylglycine--hydroxylating mono-oxygenase(PHM)の完全長cDNAクローニングに甲殻類で初めて成功した。このcDNAには脊椎動物のようなpeptidyl-hydroxyglycine-amidating lyase(PAL)の配列が連結されておらず、ザリガニにおけるPHMとPALは別個のmRNAにコードされている昆虫型であることが推定された。実際にアミノ酸配列のホモロジー解析ではショウジョウバエのPHMに最も相同性が高く(52%)、マウスに対しては13%の相同性を示すのみであった。前年度までにザリガニの第六腹部神経節に豊富に存在することが示唆されたオルコキニンとCCAPの発現について、蛍光二重染色in situ hybridization法を行い解析したところ、両者は排他的な発現パターンを示すことがわかった。これらの発現細胞の細胞体の一部は、お互いに密接に接触して存在している部位のあることが判明し、両者の産生細胞が相互に直接影響を及ぼしていることが示唆された。またタキキニン関連ペプチドとCCAPの発現パターンについても解析を行い、両者も排他的な関係であることを確認した。さらに前年度に引き続きザリガニの第六腹部神経節の凍結切片を用いたMALDI-