hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
道徳教育課題に対応する「特別の教科道徳」を要とする道徳教育プログラムの開発研究

今年度は大きく次の5つを中心に研究を行った。1現在取り組まれている道徳教育の実践研究についての分析では、「特別の教科道徳」を要とする道徳教育について、全面実施となった小学校を中心に、授業改善と教科書の活用、評価の研究実践を中心に研究を行い、成果をまとめた。2アンケート調査の結果の分析と継続的アンケート調査の実施については、2017年度の3月に行ったアンケート調査の分析を行い、日本道徳教育学会で発表した。また、2018年度調査を3月に行った。3外国の道徳教育研究者との共同研究においては、アメリカのニューヨークで現地調査と現地交流研究会を行った。学校教育と同時に社会教育における道徳教育について、さまざまな団体や教育機関における取組み、学校との連携などについても調査することができた。ニューヨークの倫理協会において日本での研究成果について発表し研究交流を深めることができた。ドイツについては研究協力者に現地研究をお願いし、道徳教育の動向をまとめてもらった。4日本の道徳教育実践について、協力校との連携による研究では、特に、人権教育の基盤となる道徳教育の展開という視点からの研究を行った。また、ノート指導については、子どもたちの自己評価・自己指導能力の育成という視点からの研究を行った。5研究成果の発表については、日本道徳教育学会における発表、ニューヨークの倫理協会における発表、冊子による発表を行った。また、ホームページに、それらの内容についてアップした。全国の小学校、中学校を対象にしたアンケートを実施したことから、全国の実態を把握し、自由記述による情報を収集できたことから、研究内容を深めることができた。またアメリカでの現地研究・研究交流において、社会教育における道徳教育という広い視野から研究交流ができた。これらの成果は当初予想した以上のものがあった。他の研究計画においては、ほぼ計画通りに順調に進めることができた。全国アンケートは継続して行い、実態を分析するが、昨年の調査との比較を行い、全国の学校現場における道徳教育の推進状況や課題を的確に把握し、本研究の趣旨に応じた道徳教育プログラムの開発を、学校現場のニーズや要望に応える形で進めていきたい。また、大きな道徳教育改善が進んでいるときだけに、フォーラムを関東と関西で開催し、研究成果の一部公表を行い、学校現場に還元していく予定である。更に外国の道徳教育については、アジア、ヨーロッパについて、文献を中心とした分析を進めていく。うまく調整できれば現地研究も行いたい。協力校との研究実践は、今年度から「特別の教科道徳」が全面実施されている中学校にも広げて、特に発達段階に応じた道徳教育の進め方について研究を深めていく予定である。本研究の初年度として、特に次の点に取り組んだ。第1は組織づくりである。本研究を進めるに当たり、外国の道徳教育を研究する組織、国内の道徳教育を研究する組織、具体的に道徳教育実践を研究する組織を創り、それぞれの研究を進める上での体制を整えた。第2は、外国との研究交流を図る上で必要な、日本の道徳教育の現状や改革動向、研究動向、実践状況を説明する英文の資料の作成を行った。英文にする資料について、研究会を設けて検討し、外国の研究協力者にメールで配信した。第3は、現在の道徳教育研究の現状を文献を通して明らかにした。最近刊行された道徳教育に関する研究書や実践書を購入し、内容の分析を行うことから、現在の研究動向と実践動向を明らかにした。道徳教育改革は世界的動向であり、世界の国々が、道徳教育の重要性を認識し、それぞれの国の状況に応じて、社会の変化に対応した社会的自立をめざす道徳教育のあり方について、多様に追究されていることを確認し、その背景の分析を行った。

また、日本においては、平成18年の教育基本法改正を契機に道徳教育研究が加速され、平成27年の「特別の教科道徳」の設置が更に道徳教育研究を実践レベルで活発化している。その研究動向を分析した。第4は、全国アンケート調査の実施と結果の分析である。全国の小学校、中学校の約1割に当たる3000校を無作為抽出し、アンケート調査を行った。約3割の学校から回答があった。各学校で真摯に取り組んでいる実態と課題を明らかにした。第5は、ホームページの作成、公開である。研究内容が大きな改革の渦中にある道徳教育に関する研究であることから、研究成果を順次公表していく必要がある。このことを考慮して本研究用のホームページを開設し、研究成果をアップした。また、研究会を開催して研究者や実践者に研究成果を公開し研究交流を行った。研究の初年度ということで研究の基礎固めに力点を置いたが、特に、現状分析において多くの文献を収集し分析したことと、全国アンケート調査を行ったことから、当初予定していた計画よりも、より詳細な分析を行うことができた。また、外国の研究者たちとの交流においても、日本の道徳教育についての現状や研究動向を英文にまとめ配信したことから、多くの情報を得ることができた。これらのことから、これからの研究の方向性と具体的研究推進にかかわって、当初の計画以上の成果をあげることができた。全国アンケートは継続して行い、実態を分析するが、昨年の調査との比較を行い、全国の学校現場における道徳教育の推進状況や課題を的確に把握し、本研究の趣旨に応じた道徳教育プログラムの開発を、学校現場のニーズや要望に応える形で進めていきたい。また、大きな道徳教育改善が進んでいるときだけに、フォーラムを関東と関西で開催し、研究成果の一部公表を行い、学校現場に還元していく予定である。更に外国の道徳教育については、アジア、ヨーロッパについて、文献を中心とした分析を進めていく。うまく調整できれば現地研究も行いたい。協力校との研究実践は、今年度から「特別の教科道徳」が全面実施されている中学校にも広げて、特に発達段階に応じた道徳教育の進め方について研究を深めていく予定である。来年度は、研究代表者を務める挑戦的萌芽研究が最終年度に当たることから、その研究とも関連をもたせながら、本研究の充実を図りたい。外国の道徳教育についてはアメリカでの現地研究及び研究交流を計画している。また、日本の道徳教育においては、優れた実践研究を行っている学校との研究交流を深め、具体的な道徳教育プログラムの開発に取り組む。さらに、全国アンケート調査も行い、今回行った調査結果と比較しながら学校現場の実態や課題について更に詳細に分析する予定である。研究成果の発表においては、関東と関西においてフォーラムを開催し、研究成果の一部を公開し、参加者との質疑応答や、研究交流を通して、研究成果の普及と精緻化を図っていきたい。
線溶系関連遺伝子制御による虚血性神経細胞死の予防・防御に関する基礎的研究

小動物を用いたヒトの病態に近い、神経細胞障害(細胞死:アポトーシス)モデルを確立し、これに対する線溶系因子の関与を検討した。平成13年度にはi)前脳虚血-再潅流にともなう海馬錐体細胞の遅発性神経細胞障害がアポトーシスであることを明らかにし、ii)このアポトーシス発現への線溶系因子の関与を明らかにする目的で、線溶系因子の一つである組織型plasminogen活性化因子欠損マウス(tPA-/-マウス)を用いて検討したが、wildタイプとの有意性は観察されず、関連性は否定的であった。iii)虚血-再潅流にともなう網膜神経障害発現においてはtPAの関与は否定的であったが、興奮性アミノ酸のNMDA刺激に伴うアポトーシス発現は、tPA-/-マウスにおいて有意に減弱し、線溶系因子の関与が示唆された。そこで平成14年度は、NMDA刺激に伴うマウス網膜へのアポトーシス発現への線溶系因子の関与をより詳細に検討した。1)マウス眼内へのNMDA注入によるアポトーシス発現は、tPA-/-マウスではwildタイプに比べ、有意に減弱したが、これはtPAの眼内投与により解除された。2)今ひとつの線溶系因子である、ウロキナーゼタイプplasminogen活性化因子(uPA)欠損マウスならびに内因性のplasmin抑制因子(α2AP)欠損マウスにおけるNMDA刺激によるアポトーシス発現はwildタイプと差はなかった。3)plasminogen活性化因子に対する内因性の阻害因子(PAI-1)欠損マウスでのNMDA刺激に伴うアポトーシスはwildタイプに比べ有意に増大した。以上の結果から、内因性tPAは神経障害発現因子として関与していることが明らかとなり、またその作用はtPAの線溶系活性とは異なる、NMDA受容体を介した新たなメカニズムにより発現していることが強く示唆された。小動物を用いた一過性虚血・再潅流による、ヒトの病態に近い、神経細胞障害(細胞死:アポトーシス)モデルを確立し、これに対する線溶系因子の関与を検討した。I.脳虚血・再潅流モデル1)げっ歯類に一過性の脳虚血を負荷すると海馬錐体細胞に遅発性神経細胞障害が観察されるが、我々はこの神経細胞死発現に先立ち、アポトーシスの特異的関連因子である、Caspase-3の活性化が観察されることを見出した。このことから遅発性神経細胞死がアポトーシスであることが明らかとなった。2)海馬に神経細胞死が観察される条件を線溶系因子の一つである組織型plasminogen activator欠損マウス(tPA-/-)に負荷したところ、細胞死発現にWildタイプとの有意な差はなかった。II.網膜神経細胞障害モデル1)マウス眼内への圧力負荷にともない、虚血性の網膜神経障害が観察される。このモデルをtPA-/-マウスで検討したところ、Wildタイプに比べ、神経障害の程度は軽減されたものの、有意な差ではなかった。2)マウス眼内へ興奮性アミノ酸NMDAを注入すると、網膜神経障害が発現する。TPA-/-マウスへのNMDA注入にともなう網膜神経障害は、Wildタイプに比べ、有意に軽減していた。以上の結果から、内因性tPAは神経障害発現時に重要な抑制因子として関与していることが明らかとなったが、神経障害発現のメカニズムによりその関与が異なる可能性も示唆された。

小動物を用いたヒトの病態に近い、神経細胞障害(細胞死:アポトーシス)モデルを確立し、これに対する線溶系因子の関与を検討した。平成13年度にはi)前脳虚血-再潅流にともなう海馬錐体細胞の遅発性神経細胞障害がアポトーシスであることを明らかにし、ii)このアポトーシス発現への線溶系因子の関与を明らかにする目的で、線溶系因子の一つである組織型plasminogen活性化因子欠損マウス(tPA-/-マウス)を用いて検討したが、wildタイプとの有意性は観察されず、関連性は否定的であった。iii)虚血-再潅流にともなう網膜神経障害発現においてはtPAの関与は否定的であったが、興奮性アミノ酸のNMDA刺激に伴うアポトーシス発現は、tPA-/-マウスにおいて有意に減弱し、線溶系因子の関与が示唆された。そこで平成14年度は、NMDA刺激に伴うマウス網膜へのアポトーシス発現への線溶系因子の関与をより詳細に検討した。1)マウス眼内へのNMDA注入によるアポトーシス発現は、tPA-/-マウスではwildタイプに比べ、有意に減弱したが、これはtPAの眼内投与により解除された。2)今ひとつの線溶系因子である、ウロキナーゼタイプplasminogen活性化因子(uPA)欠損マウスならびに内因性のplasmin抑制因子(α2AP)欠損マウスにおけるNMDA刺激によるアポトーシス発現はwildタイプと差はなかった。3)plasminogen活性化因子に対する内因性の阻害因子(PAI-1)欠損マウスでのNMDA刺激に伴うアポトーシスはwildタイプに比べ有意に増大した。以上の結果から、内因性tPAは神経障害発現因子として関与していることが明らかとなり、また,その作用はtPAの線溶系活性とは異なる新たなメカニズムにより発現していることが強く示唆された。
Fプラズミド分配遺伝子産物SopA・SopBとDNAの高次複合体の構造生物学

今年度の研究成果は次の通りであった。(1)sopB変異体の解析-サイレンシングを起こさないsopBの変異体の解析を終了した。9つの新たな変異体のうちサイレンシングを全く起こさないものは、L92P変異体のみであった。この変異体は認識配列DNAに結合するにもかかわらず、野生型と異なり結合部位近傍の遺伝子のサイレンシングを起こさず、また、Fプラズミドの分配においても機能が低下していた。GFPとの融合タンパクは、野生型が細胞の中程に局在するのに対して、この変異体は細胞全体に一様に分布していた。この結果、サイレンシングはSopBタンパク質が局所的に高濃度で存在するために、結合部位近傍のDNAにも非特異的に結合することで引き起こされると結論した。(2)SopAタンパク質の構造の解析-タンパク質のフットプリントをSopAについて行った。その結果、この分子は2つのドメインからなることと、SopBとの相互作用によりSopAの中程のプロテアーゼ感受性が低下することがわかった。(3)SopA-SopB-DNA複合体の解析-SopAのDNA結合についてフィルターバインディング実験を行ったところ、ADP結合によってDNA結合が引き起こされるが、結合が配列非特異的であることがわかった。結合が配列非特異的であることは電子顕微鏡観察によっても明らかであった。さらにSopBが存在するときの電子顕微鏡像においてはDNAのcontourは非常に複雑になり、SopAとSopBがDNAに結合しながら相互作用することによって高次の複合体が形成されることが明らかになった。本研究の目標は、Fプラズミド分配遺伝子産物SopA・SopBの構造と機能の解明である。今年度はSopA、SopB各々の構造と機能に関する研究を中心に行い、次の結果を得た。1.SopBタンパク質の構造と機能SopBタンパク質の示すSilencing/IncG表現型のメカニズムと分配機能との関連を明らかにするために、Silencing/IncGを示さない変異体をスクリーンして表現型を分子遺伝学と生物化学的に調べ、以下の結果をえた。(1)野生型SopBタンパク質とGFPの融合タンパク質が細胞内では局在するのに対して、Silencing/IncGを全く示さない変異体はまったく局在しない。(2)野生型では、SopB結合配列近傍の遺伝子の転写や複製の抑制がおこるのに対して、変異体ではこれらが全くおこらない。(3)変異遺伝子をもつsopABC遺伝子のoriCピラスミドにおける分配機能は失われていない。(4)変異体タンパク質は野生型タンパク質と同様に細胞膜と相互作用する。2.枯草菌SpoOJタンパク質結晶化SopBタンパク質の結晶化の努力に引き続き、相同体である枯草菌のSpOJタンパク質と認識配列DNAの結晶化に取り組んでいる。大腸菌を用いた大量発現と精製に成功し、1Lの培養から30mgを回収できる。ハンギングドロップ法を用いて試行を行っているが、残念ながら結晶はまだ得られていない。3.SopAタンパク質の構造と機能SopAタンパク質のN末端とC末端の両側に抗原配列を付与したこのを発現・精製し、タンパク質のフットプリント法によって、ドメイン構造と機能の変化を追究した。その結果、このタンパク質はN末端側に特に消化酵素に感受性の部分があり、ATPとDNAの両方が存在するときに、この感受性が低くなることが分かった。ATP結合/分解によってDNAとの結合が可能になることを示唆している。
大腸菌O157の病原遺伝子発現における外来性tRNA遺伝子の役割

現在までに120種を超える細菌のゲノム全配列が報告されている.これらすでに報告されているゲノム全配列を用いて,種特異的な遺伝子と外来性と考えられる菌株特異的遺伝子のゲノムレベルでの進化を,バイオインフォマティクスから得られた予測をもとに分子生物学的な検証を試みた.種特異的な遺伝子を検索するソフトウェアCodonViewerを開発した.本ソフトウェアは,ゲノム全配列からコドン使用頻度をゲノムレベルで視覚的に表現するソフトウェアで、UNIXだけでなく,生物学研究者に広く使われているMacintosh, Windows上でも動作可能である.本ソフトウェアを用いることで,コドン使用頻度をゲノムレベルで遺伝子単位で表示することが可能となり,コドン使用頻度が偏っている領域を簡単に特定することが可能となっている.また,本ソフトウェアにはコドン使用頻度による分類だけでなく,非線形主成分分析法,ノンパラメトリック回帰分析など複数の手法による特異的遺伝子の抽出が可能となっている.本ソフトウェアを用いて,腸炎ビブリオのゲノムから種特異的な遺伝子の抽出を試みた.その結果,腸炎ビブリオが有する病原性遺伝子群である3型分泌装置や,ビブリオ属に特徴的なSuper-integron領域は,他のゲノムの領域と比較してコドン使用頻度が大きく異なっていた.これらの領域のコドン使用頻度を他の遺伝子と比較したところ,大腸菌O157の病原性遺伝子領域やファージの領域と同様であることが明らかとなった.このことは,これら外来遺伝子の供給源が同じである事を示唆している.大腸菌O157のゲノム全配列から本ソフトウェアにより特異的遺伝子を抽出し,それら遺伝子の翻訳効率を実験的な解析を試みた.しかしながら,作成したtRNA供給ベクターを用いてもK-12では特異的遺伝子が発現せず,これらファージ由来と思われる遺伝子を発現させるためには,さらなる要因の追求が必要という結論に至った.これらtRNAをもいちる遺伝子は,ファージ上のみならず,O157,K-12バッグボーン上にもコードされており,かつ分子進化解析より,これら遺伝子が機能していることが予想されることから,生命維持のため何らかの機能を有している事が明らかである.したがって,さらなる検討を続けることで,外来遺伝子を取り込むことによる,ゲノムの進化を論じる事が可能になると期待している.現在までに100種を超える細菌のゲノム全配列が報告されている.これらすでに報告されているゲノム全配列を用いて,種特異的な遺伝子と外来性と考えられる菌株特異的遺伝子のゲノムレベルでの進化を,バイオインフォマティクスから得られた予測をもとに分子生物学的な検証を試みた.種特異的な遺伝子を検索するソフトウェアCodonViewerを開発した.本ソフトウェアは,ゲノム全配列からコドン使用頻度をゲノムレベルで視覚的に表現するソフトウェアで,UNIXだけでなく,生物学研究者に広く使われているMacintosh, Windows上でも動作可能である.本ソフトウェアを用いることで,コドン使用頻度をゲノムレベルで遺伝子単位で表示することが可能となり,コドン使用頻度が偏っている領域を簡単に特定することが可能となっている.また,本ソフトウェアにはコドン使用頻度による分類だけでなく,非線形主成分分析法,ノンパラメトリック回帰分析など複数の手法による特異的遺伝子の抽出が可能となっている.本ソフトウェアを用いて,腸炎ビブリオのゲノムから種特異的な遺伝子の抽出を試みた.その結果,腸炎ビブリオが有する病原性遺伝子群である3型分泌装置や,ビブリオ属に特徴的なSuper-integron領域は,他のゲノムの領域と比較してコドン使用頻度が大きく異なっていた.これらの領域のコドン使用頻度を他の遺伝子と比較したところ,大腸菌O157の病原性遺伝子領域やファージの領域と同様であることが明らかとなった.このことは,これら外来遺伝子の供給源が同じである事を示唆している.現在は大腸菌O157のゲノム全配列から本ソフトウェアにより特異的遺伝子を抽出し,それら遺伝子の翻訳効率を実験的に解析している.現在までに120種を超える細菌のゲノム全配列が報告されている.これらすでに報告されているゲノム全配列を用いて,種特異的な遺伝子と外来性と考えられる菌株特異的遺伝子のゲノムレベルでの進化を,バイオインフォマティクスから得られた予測をもとに分子生物学的な検証を試みた.種特異的な遺伝子を検索するソフトウェアCodonViewerを開発した.本ソフトウェアは,ゲノム全配列からコドン使用頻度をゲノムレベルで視覚的に表現するソフトウェアで、UNIXだけでなく,生物学研究者に広く使われているMacintosh, Windows上でも動作可能である.本ソフトウェアを用いることで,コドン使用頻度をゲノムレベルで遺伝子単位で表示することが可能となり,コドン使用頻度が偏っている領域を簡単に特定することが可能となっている.また,本ソフトウェアにはコドン使用頻度による分類だけでなく,非線形主成分分析法,ノンパラメトリック回帰分析など複数の手法による特異的遺伝子の抽出が可能となっている.本ソフトウェアを用いて,腸炎ビブリオのゲノムから種特異的な遺伝子の抽出を試みた.その結果,腸炎ビブリオが有する病原性遺伝子群である3型分泌装置や,ビブリオ属に特徴的なSuper-integron領域は,他のゲノムの領域と比較してコドン使用頻度が大きく異なっていた.これらの領域のコドン使用頻度を他の遺伝子と比較したところ,大腸菌O157の病原性遺伝子領域やファージの領域と同様であることが明らかとなった.このことは,これら外来遺伝子の供給源が同じである事を示唆している.

大腸菌O157のゲノム全配列から本ソフトウェアにより特異的遺伝子を抽出し,それら遺伝子の翻訳効率を実験的な解析を試みた.しかしながら,作成したtRNA供給ベクターを用いてもK-12では特異的遺伝子が発現せず,これらファージ由来と思われる遺伝子を発現させるためには,さらなる要因の追求が必要という結論に至った.これらtRNAをもいちる遺伝子は,ファージ上のみならず,O157,K-12バッグボーン上にもコードされており,かつ分子進化解析より,これら遺伝子が機能していることが予想されることから,生命維持のため何らかの機能を有している事が明らかである.したがって,さらなる検討を続けることで,外来遺伝子を取り込むことによる,ゲノムの進化を論じる事が可能になると期待している.
ｉＰＳ細胞とモデル動物を用いたＦＵＳ遺伝子変異を伴う家族性ＡＬＳの病態解析

1.百寿者iPS細胞由来神経細胞は、その他の疾患由来iPS細胞と比較して、神経変性疾患におけるバイオマーカーを評価した研究におけるコントロールとして応用可能であることが示された.本研究より、超高齢者の亡くなられたあとの皮膚からでもiPS細胞樹立は可能であり、神経変性疾患研究へ応用が可能であることが示された.2.C末端の欠損株(△C-FUS)の変異型FUS Tgマウスの樹立を行った.表現型の検討で運動ニューロン疾患を示唆する所見は認められなかったが、組織学的な検討において、△C-FUSの変異型マウスにおいて核移行の障害を認めた.1.百寿者iPS細胞由来神経細胞は、その他の疾患由来iPS細胞と比較して、神経変性疾患におけるバイオマーカーを評価した研究におけるコントロールとして応用可能であることが示された.本研究より、超高齢者の亡くなられたあとの皮膚からでもiPS細胞樹立は可能であり、神経変性疾患研究へ応用が可能であることが示された.2.C末端の欠損株(△C-FUS)の変異型FUS Tgマウスの樹立を行った.表現型の検討で運動ニューロン疾患を示唆する所見は認められなかったが、組織学的な検討において、△C-FUSの変異型マウスにおいて核移行の障害を認めた.疾患iPS細胞を用いた研究を行う際に、重要な問題となるのはコントロールとなる正常iPS細胞である.神経変性疾患のような年齢依存性に頻度の上がる高齢発症疾患は、細胞提供者が晩年に発症する可能性は否定できない.従って、神経変性疾患患者のコントロールには、重篤な疾患が否定された高齢者からiPS細胞を作成する必要があると考え、生前重篤な疾患がなく極めて健康な老後を過ごした百寿者(105歳以上)の2例よりiPS細胞の樹立を行い、特性解析を行った.免疫染色において、Tra1-60、Tra1-81、SSEA3、SSEA4の発現確認を行った.RT-PCRにおいて、transgeneのsilencingとESマーカーの確認を行った.三胚葉の分化能を評価するため、in vitroで胚葉体を介して、内胚葉・中胚葉・外胚葉への分化を行った.またin vivoでSCIDマウスへiPS細胞の皮下注を行い、テラトーマの形成にて三胚葉への分化の確認を行った.以上より、超高齢者の皮膚からでもiPS細胞を作り出せることを示したとともに、重篤な疾患のない理想的な正常iPS細胞(スーパーコントロール)が確立できた.変異型FUS Tgマウスの作成を行った.C末端の欠損株(△C-FUS)をThy-1プロモーターの下流に導入し、トランスジェニックベクターを作成して、受精卵のマイクロインジェクションを行い、複数の系統(ファウンダーマウス)を作成した.大脳におけるウエスタンブロットで、最も発現量が高い系統を主に繁殖させて、現在、表現型(体重、運動機能、行動)の評価を行っている.1.変異FUS患者由来iPS細胞を用いた検討前年度に引き続き、スーパーコントロールとしての百寿者からのiPS細胞の解析を行った.百寿者由来神経細胞レベルで、Aβおよびαsynucleinをバイオマーカーとした研究におけるコントロールとして応用可能であることが示された.本研究より、超高齢者の亡くなられたあとの皮膚からでもiPS細胞樹立は可能であり、神経変性疾患研究へ応用が可能であることが示され、早期診断法や新規治療薬の開発につながるものと考えられる.2.変異型FUS Tgマウスの作製と分子メカニズムのin vivo解析において、C末端の欠損株(△C-FUS)の変異型FUS Tgマウスの表現型評価を行った.経時的に体重測定、運動機能評価(rota-rod treadmill、hanging wire test)、異常反射(abnormal limb reflex)の出現の有無について、評価を行ったが、経過期間中(生後50週まで)において明らかな異常所見は認められなかった.また、組織学的な検討において、△C-FUSの変異型マウスにおいて核移行の障害を認め、細胞質へFUSの蓄積を認めたが、明らかな神経変性は認められなかった.よって、我々は、さらなる検討を行うために、ホモ接合体の変異型FUS Tgマウス(△C-FUS)の作成およびTDP-43とのdouble TGマウスの作成を行って、表現型の解析を進めている.今年度は、iPS細胞の実験系においては、コントロールとなりうる百寿者由来iPS細胞の樹立・解析を行い、今後、iPS細胞を用いた神経変性疾患研究への応用が可能であると考えられ、重要な進展であると考えられる.in vivoの実験系においては、ALS関連神経疾患モデルマウスとして、変異型FUSトランスジェニックマウスの樹立・解析を行った.それらのマウスにおいて、表現型・生化学的解析を現在行っているところである.表現型として進行性の神経症状を呈し、免疫組織学的にも神経細胞死が確認されれば、画期的なモデルマウスであると考えられ、ALSに関連した運動ニューロンの神経変性メカニズムを解析する意味で非常に重要なツールとなりうる.25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、疾患由来iPS細胞の樹立を行い、さらには治療ターゲットの同定を目標とする.樹立したiPS細胞は、胚様体を介して、神経細胞へ分化誘導を行う.疾患由来神経細胞において、生化学的、細胞生物学的解析を行う.生化学的解析として、TDP-43・FUSの発現量、SGの形成をウエスタンブロット、蛍光免疫染色により正常対象者と神経疾患を比較する.25年度が最終年度であるため、記入しない。
肝細胞三次元培養系から得られたC型肝炎ウイルス粒子の性状解析

フラスコにて培養した1x10^9個のFLC4細胞を培地制御槽に播種し、1日当たり無血清または2%血清添加培地50-100mlを用い、温度を37度より徐々に低下させ培養したところ、肝細胞を100日以上の長期に渡り、継代することなしに培養することができ、その間、酸素消費量、グルコース消費量などで示される肝細胞の活動性は保たれていた。この3次元培養系に感染性クローンRNA 10ugをトランスフェクションしたところ、培養上清中のHCVRNAはトランスフェクション後から徐々に減少し、44,47,51,54日目には10^3copies/ml未満が続いたものの、その後57日目に再び10^4copies/mlまで増加し、100日目まで約10^<3-4>copies/mlと持続した。また、培養上清中のコア蛋白も徐々に増加した。この培養液中のウイルス粒子の存在様式を調べるために、トランスフェクション後100日目前後の培養液を超遠心法で濃縮し、電子顕微鏡で観察したところ、様々なサイズのウイルス様粒子が認められた。この濃縮培養上清について抗HCVE1抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行したところ、特異的に反応する50-60nmのウイルス様粒子を認めた。そこで濃縮培養上清をショ糖密度勾配法にて分画したところ、コア蛋白の多い分画の密度は約1.07および1.18g/mlで2峰性になり、HCV RNAの多い分画は約1.07g/mlであった。このことから培養液中に2種類のウイルス粒子の存在が示唆された。平成14年度はそれぞれの分画について抗core, E1,E2抗体を用いた金コロイド免疫電顕間接法を施行し、より詳細な粒子の性状解析を行う予定である。
メダカ逆遺伝学的手法を基盤とした個体・組織レベルでの損傷応答解析系の確立

本申請は、「メダカを用いた個体・組織レベルでの遺伝子機能解析系の確立」を目指している。逆遺伝学的手法を確立し、そこで得られた変異個体をベースに、別途確立する組織特異的遺伝子発現系により組織特異的に当該遺伝子発現の制御を行い、組織間・異なるタイプの細胞間での遺伝子機能の違い、その最終生物作用の違いを解析する、というのが基本戦略である。このグランドデザインのもとにモデルケースとして、「DNA損傷に対する生物応答、その生物作用」を「突然変異生成」を指標に解析する系を確立した。このグランドデザインのもとにモデルケースとして、「DNA損傷に対する生物応答、その生物作用」を「突然変異生成」を指標に解析する研究を目指している。本申請では、「メダカを用いた個体・組織レベルでの機能解析系の確立」を目指している。逆遺伝学的手法を確立し、ここで得られた変異個体をベースに、別途確立する組織特異的遺伝子発現系により組織特異的に当該遺伝子発現の制御を行い、組織間・異なるタイプの細胞間での遺伝子機能の違い、その最終生物作用の違いを解析する、というのが基本戦略である。本年度は、基本となる逆遺伝学的手法の確立において大きな成果を得た。逆遺伝学的手法として、TILLING法によるメダカ変異体スクリーニングを行っているが,PCR増幅産物中に存在する変異を、Tm値の違いとして、HRM (Hi-Res Melting・融解温度曲線分析)法により検出する(Light Scanner, Idaho Tech.)新たな変異検出法を確立した。これにより,極めてハイスループットに,しかも低コストでの変異体取得が可能になった。本法により、ATM, ATR, Rb, p53の変異体を同定できた。現在これらの変異体について,野生株とバッククロスする事により想定外の導入変異を除去するとともに,ホモ個体の樹立を行っている。これらの変異体の表現型解析を行うとともに,更に損傷応答に重要な役割を果たす他の遺伝子群についてスクリーニングを試みる。また,組織特異的遺伝子発現系の確立については,基本となるBACの改変技術(recombineringの手法)を確立するとともに、赤外レーザを用いたヒートショックプロモーターによる遺伝子発現制御の基本的手法を確立した。上記逆遺伝学的手法で得られた変異体をベースに,組織特異的遺伝子発現系構築の為の技術的基盤が整備できた。本申請では、「メダカを用いた個体・組織レベルでの遺伝子機能解析系の確立」を目指している。昨年度においてTILLING法によるメダカ逆遺伝学的手法を確立した。確立した変異体スクリーニング法は,PCR増幅産物中に存在する変異を、Tm値の違いとして、HRM(Hi-Res Melting・融解温度曲線分析)法により検出する(Light Scanner,Idaho Tech.)新たな変異検出法である。本年度は、引き続きメダカ変異体のスクリーニングを行うとともに、得られた変異体の表現型解析を行った。本法により、ATM,ATR,Rb,p53,Rev1,Exo1,Msh2の変異体を同定できた。これらの変異体について,野生株とバッククロスする事により想定外の導入変異を除去するとともに,ホモ個体を樹立し、変異体の表現型解析を行った。得られた変異体の多くは、マウス、ヒトで報告されていると同様の表現型を示し、メダカがモデル動物として有用である事が明らかとなった。一方、ATR変異体はある程度まで発生が進む事、Rev1変異体は野生株に比べ化学発癌の頻度が低くなる事等、マウスと異なる、あるいは新たな表現型を検出できた。今後の、分子レベル・組織レベルでの解析が期待される。また,組織特異的遺伝子発現系の確立については,基本となるBACの改変技術(recombineringの手法)を確立し、Cre-loxPを用いたtransgenic個体樹立を試みるとともに、赤外レーザを用いたヒートショックプロモーターによる遺伝子発現制御の基本的手法を報告し、当方法をメダカに適用する系を樹立しようと試みている。上記逆遺伝学的手法で得られた変異体をベースに,組織特異的遺伝子発現系構築の為の技術的基盤の確立を目指している。

本申請では、「メダカを用いた個体・組織レベルでの遺伝子機能解析系の確立」を目指している。逆遺伝学的手法を確立し、ここで得られた変異個体をベースに、別途確立する組織特異的遺伝子発現系により組織特異的に当該遺伝子発現の制御を行い、組織間・異なるタイプの細胞間での遺伝子機能の違い、その最終生物作用の違いを解析する、というのが基本戦略である。一昨年度、昨年度においてTILLING法によるメダカ逆遺伝学的手法を確立し、ATM, ATR, Rb, p53, Rev1, Exo1, Msh2の変異体を同定した。これらの変異体について,野生株とバッククロスする事により想定外の導入変異を除去するとともに,ホモ個体を樹立し、変異体の表現型解析を行っている。これら変異体スクリーニングと並行して,組織特異的遺伝子発現系の確立を試みている。基本となる赤外レーザ顕微照射による遺伝子発現誘導法確立については本年度報告したが、この技術をメダカに適用する為にメダカヒートショックプロモーターの単離・解析、及びErt2-Creの開発を行なっている。繰り返しになるが、本法で最終的に目指しているのは、体細胞での遺伝子発現制御による組織特異的遺伝子機能の解析である。このような研究においてメダカを用いる最大の利点は、受精卵への遺伝子導入が哺乳動物に比べ格段に容易で、かつ様々な操作が可能な点である。受精卵への遺伝子導入による体細胞解析をより効率よく、しかも正確性を持って行なう為に、トランスポゾンpiggyBacベクターのメダカへの適用を試みている。上記逆遺伝学的手法で得られた変異体をベースに,組織特異的遺伝子発現系構築の為の技術的基盤の確立が現実のものとなりつつある。過去3年間においてTILLING法によるメダカ逆遺伝学的手法を確立し、数多くの変異体を同定してきた。TILLING法においては、一度ライブラリーを作成すれば、変異のスクリーニングが最も重要なステップとなる。我々は高精度融解曲線(HRM)法に依る,ハイスループット・低コストな解析系を実現している。HRM法は従来法に比べ極めてハイスループットではあるが,それでも1エキソンの解析に10日間を要する。そこで,次世代シークエンサーを用いた、よりハイスループットな変異検出法の開発を行った。'次世代シークエンサーの現実的利用には,混合した多種類サンプルから正確に変異を検出できる事が必須である。ABI社SOLiDを用いた場合の検出感度を検討し、48サンプル混合でもほぼ100%の正確さで変異検出が可能である事を見いだした。そこで,SoLiDを用い120遺伝子、500エキソンについての変異検索を開始した。
ゲインスケジューリング理論に基づく非線形制御系の解析設計法に関する研究

非線形制御問題の解法と設計アルゴリズムの確立を目指して,前年度に引き続き,安定性の問題,L^2ゲインを評価関数とする制御問題,ロバスト制御問題と検討を進めた.まづ,モデルの特殊性を考慮した拡張2次形式リアプノフ関数の適用により,状態フィードバックの場合と出力フィードバックの場合それぞれに設計法を提案した.実システムのモデルへの適用とシミュレーションを通して,提案法の有効性を確認した.提案法で必要となる状態に依存する線形行列不等式の解法についても,スケジューリングパラメータに依存する線形行列不等式の解法を準用することによって,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を提案した.また,k次多項式型という特別な非線形系については,可到達集合解析という新しい解析手法を用いて,L^2ゲインの解析を,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を開発した.本研究で展開した非線形制御問題へのアプローチは,状態あるいは状態の一部をスケジューリングパラメータと見なして線形系の手法を活用することにある.その場合,解決しなければならない問題は,不確かなパラメータが含まれる場合の問題,またスケジューリングパラメータの値域や変化率の範囲など事前に分かっていなければならない情報をどのようにして手にいれるかという問題がある.本研究では,この問題のそれぞれについて,一つの解決策を与えることに成功した.パラメータ依存の線形行列不等式の解法については,一つの実行可能なアルゴリズムを提案したが,この問題についてはさらに効率的な方法を考える必要がある.また本研究の提案法はさらに広範囲の制御問題の解法に適用可能であり,これらの問題は今後の課題である.非線形制御問題の解法と設計アルゴリズムの確立を目指して,前年度に引き続き,安定性の問題,L^2ゲインを評価関数とする制御問題,ロバスト制御問題と検討を進めた.まづ,モデルの特殊性を考慮した拡張2次形式リアプノフ関数の適用により,状態フィードバックの場合と出力フィードバックの場合それぞれに設計法を提案した.実システムのモデルへの適用とシミュレーションを通して,提案法の有効性を確認した.提案法で必要となる状態に依存する線形行列不等式の解法についても,スケジューリングパラメータに依存する線形行列不等式の解法を準用することによって,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を提案した.また,k次多項式型という特別な非線形系については,可到達集合解析という新しい解析手法を用いて,L^2ゲインの解析を,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を開発した.本研究で展開した非線形制御問題へのアプローチは,状態あるいは状態の一部をスケジューリングパラメータと見なして線形系の手法を活用することにある.その場合,解決しなければならない問題は,不確かなパラメータが含まれる場合の問題,またスケジューリングパラメータの値域や変化率の範囲など事前に分かっていなければならない情報をどのようにして手にいれるかという問題がある.本研究では,この問題のそれぞれについて,一つの解決策を与えることに成功した.パラメータ依存の線形行列不等式の解法については,一つの実行可能なアルゴリズムを提案したが,この問題についてはさらに効率的な方法を考える必要がある.また本研究の提案法はさらに広範囲の制御問題の解法に適用可能であり,これらの問題は今後の課題である.非線型システムとして多項式形式のものをとり上げ、状態の一部をスケジューリングパラメータにとることにより、多項式型自己スケジューリングパラメータをもつ入力アフィン線形システムに対する制御問題を定式化した。本年度は、このように定式化された非制御問題に対して、安定性の解析、安定化制御問題、L_2ゲイン解析、ロバスト制御問題を検討した。対象となる非線形システムは自己スケジューリングパラメータをもつ線形システムとなるため、著者らによって近年開発されたスケジューリングパラメータをもつ線形システムの解析・設計手法を適用した。そのとき残された問題はスケジューリングパラメータが状態に依存するという困難をいかに解決するかということであった。本研究では、2次形式の行列が状態に依存する拡張2次形式リアプノワ関数を用いて、解析・設計の条件を線形行列不等式の形式で導出することによってこの問題の解決を計った。しかしこの線形行列不等式は状態に依存するため無限次元の条件である。そこで状態空間に凸領域を設定し、パラメータとしての状態が形成する超曲面をとり囲むことによって、その端点のみで条件を解くことによって有限次元の行列不等式に帰着させている。以上の手順をアルゴリズムとして整理し、ビジュアルサーボ問題、ゴム人工筋による追従問題、混合液撹拌プラントの制御問題などの実プラントの数値例においてその有効性を確認している。上記のアルゴリズムは解析・設計において共通するものであるが、設計においては、線形の行列方程式を解くステップが追加される。この条件は局所的には自動的に成立する条件であり、特別な場合には解析的に解くことができる。しかし大域的な解を得るには数値計算に頼らざるを得ない。この条件を解く効率的な方法を開発することが今後の1つの課題である。非線形制御問題の解法と設計アルゴリズムの確立を目指して,前年度に引き続き,安定性の問題,L^2ゲインを評価関数とする制御問題,ロバスト制御問題と検討を進めた.まづ,モデルの特殊性を考慮した拡張2次形式リアプノフ関数の適用により,状態フィードバックの場合と出力フィードバックの場合それぞれに設計法を提案した.実システムのモデルへの適用とシミュレーションを通して,提案法の有効性を確認した.提案法で必要となる状態に依存する線形行列不等式の解法についても,スケジューリングパラメータに依存する線形行列不等式の解法を準用することによって,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を提案した.

また,k次多項式型という特別な非線形系については,可到達集合解析という新しい解析手法を用いて,L^2ゲインの解析を,有限次元の線形行列不等式の解法に帰着させる方法を開発した.本研究で展開した非線形制御問題へのアプローチは,状態あるいは状態の一部をスケジューリングパラメータと見なして線形系の手法を活用することにある.その場合,解決しなければならない問題は,不確かなパラメータが含まれる場合の問題,またスケジューリングパラメータの値域や変化率の範囲など事前に分かっていなければならない情報をどのようにして手にいれるかという問題がある.本研究では,この問題のそれぞれについて,一つの解決策を与えることに成功した.パラメータ依存の線形行列不等式の解法については,一つの実行可能なアルゴリズムを提案したが,この問題についてはさらに効率的な方法を考える必要がある.また本研究の提案法はさらに広範囲の制御問題の解法に適用可能であり,これらの問題は今後の課題である.
享保・宝暦期俳諧の新研究：芭蕉没後の「かるみ」伝播を軸にして

平成30年度の「研究実施計画」として挙げた4点について、実際に以下のような研究を行った。1の「宝永期後半から正徳期にかけての俳書を悉皆的に調査し、入集者と入集状況を整理する作業を推進する」については、正徳3・4年に関する作業をほぼ終え、「宝永正徳俳人大観」の2回分として、『近世文芸研究と評論』誌上に公表した。2の「享保・宝暦期の俳諧資料を入手するため、積極的に調査旅行などを敢行する」に関しては、研究代表者の体調不良により実施を断念した29年度の調査候補地に、改めて出かけて調査を行った。具体的には、愛知県犬山市の岩田洗心館と同岡崎市の岡崎市美術博物館を訪問し、所蔵される資料の調査を行った。ともに有益な資料が多数あり、4のための基礎資料として、データをとり保存している。3の「俳諧資料の中から数点を選び、翻刻と注釈の作業を推進する」に関しては、以下の2つに関して、ほぼ順調に作業を進めている。1つは『東風流』の翻刻作業で、研究代表者と分担者のほか、3人の研究協力者と計6人で翻刻した原稿に対して、全員で見直す作業を行った。この俳書を通じて、宝暦期の都市俳諧の実態が明らかになると考えている。もう1つは連句の注釈で、『きくいたゞき』所収の「他力あり」歌仙を対象に選び、研究代表者と分担者のほか、3人の研究協力者と計6人で注釈を行った。その原稿は、、『近世文芸研究と評論』誌に投稿済みである。4の「都市系俳諧と地方系俳諧の関係を考えていく」に関しては、昨年度末と同様、今のところさほどの進展が見られていない。しかし、都市系俳諧の実情は見えてきつつあり、これを以前に取り組んだ美濃派(地方系)の作品と比較することで、見通しが立つであろうと考えている。平成30年度の研究自体は、上記「研究実績の概要」にも記した通り、ほぼ順調に作業を進めることができ、「(2)おおむね順調に進展している」としてもよいかと考えられる。しかし、29年度に研究代表者が体調を崩し、約半年ほど研究がストップした影響は大きく、それを挽回するまでには至っていない。研究実施計画の1については、きわめて順調な進度で進み、31年度には正徳5年までの作業が終えられそうである。2も実際に行い、多大な成果を得ることができた。3もしっかり取り組んでいる。ただし、約半年の遅れを取り戻すまでには至っていない。4はこれからに期待するもので、その見通しができつつある。このように、約半年の遅れはあるものの、課題の本質的な部分に近づいている実感があり、まずまずの進捗状況かと考えている。上記の通り、平成29年度の遅れがあるものの、平成30年度は順調に作業を進めることができた。平成31年度は最終年度にあたり、研究のまとめをすべきところながら、やはり遅れを完全に取り戻すことは難しいかと考えている。本年度も、昨年度までの作業を続け、それぞれの研究課題の解明を目指していく。その上で、研究の総まとめについては、年次の延長ということも視野に入れ、じっくり行いたいと考えている。1については、これまでの方法を踏襲して、作業を継続する。2については、いくつかの候補地から選び、実施したいと考えている。3については、『東風流』の点検を終えて本文を確定させ、その上で、内容の検討にも入る予定である。また、享保期の連句作品も1つ選び、注釈を行う。4については、参加者の知を集めるべく、総まとめに向けて検討会を行う。平成28年度の「研究実施計画」として挙げた4点の内、1・2・3については、ほぼ順調にスタートを切った。1の「宝永期後半から正徳期にかけての俳書を悉皆的に調査し、入集者と入集状況を整理する作業に取りかかる」については、この予定通りに進行しており、調査・分析して得られた成果は、「宝永正徳俳人大観」と題して2回分を『近世文芸研究と評論』誌上に公表した。2の「享保・宝暦期の俳諧資料について、その所在を探る作業を開始し、1と合わせて調査旅行を敢行する」については、夏季に彦根市立図書館に所蔵される俳諧資料を調査し、重要な資料を自分たちの研究対象に加えることができた。これまでに収集した資料との関係づけも行いつつあり、一定の成果が見え始めている。3の「俳諧資料について、翻刻する価値のあるもの、注釈する価値のあるものを選定する」に関しても、翻刻対象として宝暦六年刊行の春来編『東風流』を選び、諸本の比較・検討などを始めている。また、他に伝本の知られない玄隆編『雪の下芽』(寛保三年序)を知り得たことから、研究代表者である佐藤勝明がこれを翻刻し、『近世文芸研究と評論』誌上に公表した。注釈対象としては、『五色墨』『四時観』などの数書を選び、これも諸本の調査などを始めると同時に、『五色墨』所収の「うぐひすや」歌仙が未注釈であることに注目し、佐藤勝明や研究分担者である玉城司・伊藤善隆のほか、服部直子・越後敬子・稲葉有祐にも研究協力者として協力を仰ぎ、実際に注釈を行い、これも『近世文芸研究と評論』誌上に公表した。4の「都市系俳諧と地方系俳諧の関係を考える一歩とする」については、今のところ格別の進展は見られない。

しかし、都市系俳諧と地方系俳諧の関係は、13の作業を進めながら考えていくべきことで、13の作業が順調に進んでいることから、4についても、成果が期待されるものと考える。上記の「研究実績の概要」にも記した通り、平成28年度に関しては、予定していた通りの(あるいは、その予想をやや上回る)進捗状況であると考えている。以下、上記と重なることにはなるものの、14の項目ごとに、その状況を述べていく。まず、研究実施計画の1に掲げた、宝永期後半から正徳期にかけての俳書に関する悉皆的調査は、享保以後の俳諧史をとらえるために不可欠な作業と位置づけている。その方法については、『元禄時代俳人大観』(八木書店)で自分たちが使った方法をそのまま応用することができ、俳諧資料の閲覧や撮影、複写物の入手なども含め、何の問題もなく進行している。2の調査旅行は、メンバーの日程調整の関係で、28年度は1回にとどまったものの、その彦根市立図書館での調査は大きな成果をを挙げ、知られざる資料と遭遇することにもなった。その分析を通じて人的交流の実態を探る件についても、その見通しをつけつつある状況にあると言える。ただし、人的交流の様相を探ることについては、何らかの視点を導入する必要があり、その探索が今後の課題となっている。3の、翻刻や注釈をすべき資料の選定については、多くの候補の中から欠かせない数点を選び出すに至っている。しかも、予定にはなかった(あるいは、次年度以降に行う予定であった)作業として、『雪の下芽』の翻刻、『五色墨』所収の「うぐひすや」歌仙の注釈を断行し、いずれも論考として公表した。この点にについては、十二分の進行状況と言ってよいかと考える。問題は、4の都市系俳諧と地方系俳諧の関係をより明らかにすることにある。これは、俳諧史上の大問題であり、一朝一夕に片が付くようなことではない。これの解明を4年間の最終目標にしている次第であり、13の作業を順調に進めながら、つねにこの問題を考え続けていくことにしたい。平成29年度の「研究実施計画」として挙げた4点について、実際に以下のような研究を行った。1の「宝永期後半から正徳期にかけての俳書を悉皆的に調査し、入集者と入集状況を整理する作業を推進する」に関しては、やや作業速度が遅くなった面はあるにしても、正徳2年に関する作業を終え、「宝永正徳俳人大観」の1回分として、『近世文芸研究と評論』誌上に公表した。2の「俳諧資料を入手するため、積極的に調査旅行などを敢行する」に関しては、別の項でも記す研究代表者の体調不良により、断念せざるを得なかった。その代わりに、国内外の書籍目録を取り寄せて、資料の探索に努めた。3の「俳諧資料の中から数点を選び、翻刻と注釈の作業を推進する」に関しては、28年度に選定した『東風流』の翻刻作業を開始した。研究代表者と2人の研究分担者に加え、鹿島美里・稲葉有祐・真島望にも研究協力者として協力を仰ぎ、6人で分担して翻刻を行った。現在はその点検作業に入ったところで、ほぼ順調に進められている。また、『四時観』所収の「名月や」歌仙を注釈の対象として選び、研究代表者と2人の研究分担者に加え、服部直子・越後敬子・稲葉有祐にも研究協力者として協力を仰ぎ、注釈を行った。ただし、研究代表者の体調不良から、6人による研究会の開催が予定より半年ほど遅れ、年度末にようやく原稿を完成させ、『近世文芸研究と評論』誌に投稿をすませた。4の「都市系俳諧と地方系俳諧の関係を考えていく」に関しては、今のところさほどの進展は見られない。しかし、これらは13の作業に伴って明らかになると期待されるのであり、とくに3の翻刻・注釈の成果が積み上がることによって、進展するものと考えている。
生体脳内の転写因子活性の可視化と制御

本研究では、研究代表者によって開発された、生体内の細胞において内在転写因子の活性を高精度に定量測定する手法、および脳内の転写因子のダイナミックな活性変化をライブイメージングする技術を用いて、培養神経細胞および生体における神経活動依存的な多数の転写因子の活性を明らかにし、比較解析、活性操作することにより、それら活性変化と行動や病態への関わりを明らかにすることを目的とする。本年度は、鳴禽類幼弱個体が他個体の音声シーケンスを聞き、自分の音声シーケンスを獲得する過程における脳内の転写因子活性のライブイメージングを行った。これまでの研究代表者の研究により、この過程において転写因子活性CREBが音声シーケンスの習得に重要な役割を果たすことを示している(Abe et al., PNAS 2015)。本年度は、CREB転写因子活性レポーターウイルスを鳴禽類キンカチョウにウイルスベクターを用いて発現させ、頭部装着型の軽量蛍光顕微鏡によりその活性のライブイメージング観察を行った。キンカチョウ線条体にウイルスベクターを感染させ、脳内観察用のレンズを手術により埋め込んだのち2ー3週かけて顕微鏡装着に慣らせることにより、自由に行動するキンカチョウ脳内のCREB活性の変化を経時的に観察することに成功した。脳内CREBの活性は、他個体が発する音声シーケンスを録音したものをスピーカーより呈示しただけでは顕著な変化を生じることはなかったが、他個体が実際に隣接ケージに存在し、学習に必要な社会相互作用の存在下においては、音声シーケンスの呈示は脳内のCREB活性を大きく変化させた。また、転写因子活性の操作を行い、実際に音声シーケンスの習得を抑制および促進することを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度においては生体内の転写因子活性を解析する足掛かりとして、培養細胞系を用いて、開発した実験系の確認を行うとともに、生体内と培養細胞系の違いを生み出す機構の解析を目指した。本年度は、転写因子活性を可視化することが可能な転写医因子活性レポーターウイルス(Abe et al., PNAS 2015)を改変し、複数の転写因子に関するレポーターウイルスを作成し、蛍光観察可能な蛍光強度をしめすベクターを作成し、生体内での解析に使用可能な高力価ウイルスを精製した。これらのウイルスをマウス海馬神経細胞および大脳皮質神経細胞の初代培養系に感染させ、その機能や蛍光強度を確認するとともに、培養細胞系における細胞種による各種転写因子活性の違い、または、それぞれの細胞種において神経活動依存的な活性変化を示す転写因子の解析を行った。次に、それらのウイルスを生体マウス脳に感染させ、生体内においても刺激依存的な転写因子活性の変動を計測できることを確認した。本年度は、転写因子の活性依存的にレポーター遺伝子の蛍光強度を変化させ、その活性を可視化することを可能にするレンチウイルスベクターを順次作成した。また、ウイルス精製プロトコールの至適化を行い、効率的かつより安価に高力価ウイルスを作成する独自プロトコールを確立した。次に作成した、ウイルスベクターを用い、マウス海馬神経細胞の初代培養系を用いて、培養神経細胞における複数の内在転写因子の活性の定量計測を行った。高カリウムバッファーによる神経活動誘発処理後と無刺激群との内在転写因子活性の違いを解析し、処理群において、既知の神経活動依存的な転写因子CREB, EGR1, MEF2, SRFなどの活性上昇が認められた。また、上記の転写因子の他にも、有意な活性上昇や活性の低下を示す転写因子を多数同定した。また、海馬神経細胞および大脳皮質神経細胞の初代培養系にそれらを感染させ、無刺激状態の細胞における内在の転写因子活性を測定した。その結果、52種類中14種の転写因子に関して、有意な活性の違いが認められた。これら結果は、本解析系が細胞の由来による内在の転写因子活性の違いや活動に応じた活性の違いを高感度に検出できることを示す。次に、生体脳内の転写因子活性を明らかにする目的で、マウス個体に作成した転写因子レポーターウイルスを感染させ、刺激提示後の転写因子活性の変動を解析した。培養細胞で使用したものを基に生体内細胞におけるレポーター定量法の至適化を行い、生体内の細胞においても転写因子活性を定量的に解析する手法を確立した。また、神経活動を増強した刺激後において生体内においてもCREB, MEF2, SRFなどの既知の神経活動依存的な活性を示す転写因子の活性の上昇を1細胞レベルで検出することができ、本システムが生体内細胞においても有効であることを確認した。