hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチドを用いたナノ構造体の内包に基づく微小管の構造強化

細胞骨格の一種である微小管は内径15 nmのチューブ状構造体であり、その構造特性を利用したナノデバイス開発が広く進められている。ある種の微小管は内部におけるタンパク質の結合によって安定化されていることから、微小管内部に様々なナノ構造体を導入することで微小管の安定性や運動性の向上が期待できる。これまでに我々は、Tau由来ペプチドTPを用いた微小管内部への分子導入法を開拓している。本研究では、TPを修飾したナノ構造体(タンパク質や金ナノ粒子)を構築し、微小管に内包することで構造強化された微小管の創製を目指す。様々な物性のナノ構造体を用い、微小管の長さや剛直性、安定性、運動性などへの影響を解析する。
新規昆虫生体内試験系を導入したモンゴル薬用植物の成分・薬効解析と独自の伝承の活用

モンゴル国伝統薬用植物の成分薬効解析により新たな医薬シーズを見出すことを目的に研究を進めた。特に各植物成分の生体内作用の評価に昆虫を用いた試験を導入して生体に対する化合物の影響を考察した。主にヒトと昆虫が共通してもつ自然免疫系に着目し、エンドウヒゲナガアブラムシを用いてフェノール酸化酵素前駆体カスケードへの植物成分の作用を評価し、フェノール酸化酵素阻害物質をAtraphaxis frutescensより見出して報告した。更にOxytropis lanataに含まれる抗トリパノソーマ活性新規オキサゾールアルカロイドをはじめとして生物活性成分を40種類以上見出した。モンゴル国で伝統医療に使用されている薬用植物の含有成分の解析を行い、その生物活性の評価によって、薬効の科学的根拠とより有効な活用法を見出す。また、特に成分の活性評価系に昆虫の生体を用いた試験を確立、導入することで活性成分の生体内作用メカニズムについて昆虫をモデルに考察を得ることを目的としている。初年度は、昆虫を使用した試験法を確立することを優先的に行った。はじめに、対象昆虫を継代飼育や管理が容易であり個体数を確保し易いエンドウヒゲナガアブラムシに絞った。生体内投与を可能にするために、ガラスキャピラリーを用いて試料溶液をマイクロインジェクションする方法を立ち上げ、投与条件を検討した。免疫系への作用を評価するために、体液のメラニン化機構に着目し、メラニン化を増幅して検知する方法を立ち上げた。また現段階ではin vitroでの実験系となるが、昆虫アセチルコリンエステラーゼ(AChE)の活性について測定し、阻害活性試験に応用できるように検討した。並行してモンゴル国で重要視されている薬用植物を選定し、成分解析を行った。特にシソ科植物Caryopteris mongolicaより、抗グラム陽性菌活性及びコリンエステラーゼ(ヒト赤血球AChE及びウマ血清由来ブチリルコリンエステラーゼ: BChE)阻害活性を有する新規アビエタン型ジテルペノイドを15種類単離し、新モッシャー法などの化学的手法やCDスペクトル、x線結晶構造解析を使用して絶対立体配置を含めた化学構造を決定した。そのうち1種類の化合物は特徴的なオルトキノン構造とスピロ三員環構造を有しており、高い抗菌活性を示した。この結果及びC. mongolica地上部成分の抗コリン活性成分の同定については学術論文での報告に至った。モンゴル国薬用植物の含有成分解析と生物活性の評価により薬効の科学的根拠を明らかにし、また有効な活用法を見出す。特に活性評価系に昆虫の生体を用いた試験を確立、導入することで活性成分の生体内作用メカニズムについて昆虫をモデルに考察を得ることを目的とする。初年度に継代飼育と安定した試験への供給体制を確立したエンドウヒゲナガアブラムシを用いて、継続的に活性試験方法の検討を行った。これまでに、1.植物成分の自然免疫への影響を評価することを目的として、フェノール酸化酵素前駆体カスケードによるメラニン化反応に至るまでの現象を利用した試験。2.昆虫の有する酵素に対する植物成分の作用を評価することを目的とした試験(アセチルコリンエステラーゼを中心に)。について方法の検討と最適化を重点的に試みた。1.に関連して、昨年度に問題点で掲げた「免疫反応における各段階における反応や仕組みについて理解し実際の作用点を明らかにすべき。」を解決するために、上記カスケード各段階で作用する阻害物質を順に検討した。また、自然免疫系を活性化あるいは不活性化する要素(植物成分を含む化学物質や人為的処理)について実験を重ねた結果、複数の要素が明らかになり現在整理を進めている。並行してモンゴル国薬用植物の成分解析を行い、新たにAtraphaxis frutescensよりピロガロール構造を特徴とするフラボノイドをはじめとする33化合物(うち新規化合物7種類)、Brachanthemum gobicumよりアシル化リグナンを中心とする47化合物(うち新規11種類)などの成分を単離し、化学構造を決定した。更に、有力な抗酸化活性、抗原虫活性を認めたSaxifraga spinulosaの解析に新たに着手している。以上の成果について、学会発表を随時行ってきたほか、公表に向けて論文を現在執筆中である。昆虫試験系については自然免疫系や昆虫に特徴的な酵素活性を対象とした試験法の検討と並行して、これまでにモンゴル薬用植物から得た画分や成分を実際に上記試験系にて評価することを順次進めている。その結果、自然免疫に対していずれかの段階で作用する多数の画分を見出したほか、いくつかの活性化合物を明らかにした。モンゴル薬用植物の成分解析についても、一部継続中、検討中であるものの、実績の概要で述べた3種に加え、ハーブとしてモンゴル国内で重用されるThymus gobicus、ユニークな強壮に関する伝承を持つPullsatilla flavescens、日本のシャクヤクやボタン(生薬として重要)に近縁のモンゴル産Paeonia anomala、P. lactiflora、コリンエステラーゼ阻害活性や抗グラム陽性菌活性の活性本体を明らかにしたCaryopteris mongolicaなどについて主要成分を明らかにしている。現在、昆虫試験系について試験法の最適化と作用点の解明を試みており、特に1.自然免疫系。2.アセチルコリンエステラーゼに関連した活性。それぞれについて影響を示すモンゴル植物由来化合物、エキスを明らかにしたいと考えている。一方で、自然免疫に関与する酵素や昆虫の生体成分について精製を試みているが、これまでに新規性の高い結果は得られていないことから、今後精製方法の見直しも含めて検討課題である。さらに当初の研究計画で挙げた、抗酸化物質の生体内への影響の評価についても、これまでに得た知見を足掛かりに、検討を開始したい。

表皮吸収法や生体内へのマイクロインジェクションは技術的には可能であり、上記方法で明らかになってきた自然免疫作用物質のいくつかは、抗酸化活性とも関連が深いことから総合的な考察ができることを目指している。モンゴル国伝統薬用植物を対象に含有成分解析と生物活性の評価を行うことで薬効の根拠を明らかにし、より効果的な活用方法や新たな医薬シーズを見出すことを目的に研究を進めた。特に各成分の生体内作用の評価に昆虫を用いた試験を導入することで、昆虫をモデルとして生体に対する化合物の影響や効き方について考察を得ることを目標とした。主にヒトと昆虫が共通してもつ自然免疫系への植物成分の影響を評価するためにエンドウヒゲナガアブラムシを用いてフェノール酸化酵素前駆体カスケードによるメラニン化反応に至るまでの現象を利用した試験を実施した。上記アブラムシは自然免疫反応が弱いとされていたが、前処理方法の工夫により評価を可能にし、昆虫自然免疫系に作用するエキス画分や化合物を得た。特にタデ科植物Atraphaxis frutescensより免疫カスケード最終段階のフェノール酸化酵素活性を阻害する化合物を見出し報告に至った(J. Nat. Prod. 2016, 3065-3071)。次に昆虫の生体メカニズムへの植物成分の作用を調べることに関連して、寄生虫媒介者となる昆虫や感染性疾患に対する効果が伝承されるモンゴル国植物を選び継続発展的に研究を進めた。結果、抗トリパノソーマ活性を示すマメ科Oxytropis lanata由来新規オキサゾールアルカロイドを見出し報告した(J. Nat. Prod. 2016, 2933-2940)ほか、エキスの段階で昆虫に毒性を示したキク科Brachanthemum gobicumから新規アシル化リグナンを、またユキノシタ科Saxifraga spinulosaより抗ピロプラズマ活性を示す新規フラボノイド配糖体を見出したので今後成果を公表していく予定である。当補助金のおかげで当初の計画を達成し、また発展的に有意義な研究を展開できたことに深く感謝したい。モンゴル国伝統薬用植物の成分薬効解析により新たな医薬シーズを見出すことを目的に研究を進めた。特に各植物成分の生体内作用の評価に昆虫を用いた試験を導入して生体に対する化合物の影響を考察した。主にヒトと昆虫が共通してもつ自然免疫系に着目し、エンドウヒゲナガアブラムシを用いてフェノール酸化酵素前駆体カスケードへの植物成分の作用を評価し、フェノール酸化酵素阻害物質をAtraphaxis frutescensより見出して報告した。更にOxytropis lanataに含まれる抗トリパノソーマ活性新規オキサゾールアルカロイドをはじめとして生物活性成分を40種類以上見出した。おおむね予定通り進行しているものの、昆虫試験系とモンゴル薬用植物の成分解析の順序を当初計画から一部入れ替えて実施している。当初は昆虫を用いた試験系を初年度でほぼ確立する計画であった。
海産微細藻類感染性RNAウイルスの分子生物学的性状と生態学的機能に関する研究

HcRNAVは赤潮原因渦鞭毛藻ヘテロカプサに感染するRNAウイルスであり、海洋環境中に広く分布する渦鞭毛藻に感染するRNAウイルスとしては世界で初めて分離された種である.HcRNAVは種内宿主特異性の異なる2系統からなる。一方でヘテロカプサの分離株には、いずれのウイルス系統に対しても溶藻反応を示さないものが存在する。マイナス鎖特異的プローブを用いたノーザン解析の結果、このヘテロカプサ分離株はUA系統のウイルスの複製および感染性ウイルス粒子の再生産をサポートしていることが明らかになった。以上の結果からウイルス感染による細胞死が認められない場合でもウイルス粒子生産が起こることを明らかにし、赤潮動態に及ぼすウイルスの影響に新たな知見を与えた.また、実際のヘテロカプサ赤潮現場から約80株のヘテロカプサ株を分離し、ウイルスRNA蓄積量にもとづくウイルス感受性試験を行ったところ、現場環境にはこれまで考えられてきた以上のHcRNAV感受性タイプが存在することを明らかにした.さらに、すでに確立されている分離株からヘテロカブサ1個体を再分離し、約1ヶ月間実験室環境中で経代した15分離株間においても、ウイルスの複製効率が異なることを明らかにした.この結果は、ヘテロカプサのウイルス感受性がわずかな期間でも変化しうることを示しており、海洋環境中におけるウイルスと宿主の進化について新たな知見を与えるものである(Mizumoto, et. al.,2008).HcRNAVは赤潮原因渦鞭毛藻ヘテロカプサに感染するRNAウイルスであり、海洋環境中に広く分布する渦鞭毛藻に感染するRNAウイルスとしては世界で初めて分離された種である.本年度の研究により、HcRNAVの全長約4.4kbの一本鎖プラスセンスRNAからなる全塩基配列を決定した.またウイルスゲノムの5'末端と3'末端には、真核生物のほとんどのmRNAが保持するCap構造とpoly(A)配列が存在せず、3'末端には安定なステムループ構造が存在することを明らかにした.以上の成果は論文として発表済みである.(Nagasaki et al.,2005).HcRNAVの種内宿主特異性の異なる2系統からなる。この感染特異性が、ウイルスの感染過程のどの段階で決定されるかを調べるため、ウイルスの複製過程で特異的に合成されるマイナス鎖を特異的に検出するプローブを作製し、ノーザン解析を行った.その結果、接種感染が成立しないウイルス株-宿主株の組み合わせにおいては、マイナス鎖の蓄積が認められなかった.また、HcRNAVゲノムRNAの3'末端側遺伝子にコードされる構造タンパク質はサブゲノムRNAを介して発現する可能性が示唆された.ヘテロカプサの分離株には、上述のいずれのウイルス系統に対しても溶藻反応を示さないものが存在することが示されている.マイナス鎖特異的プローブを用いたノーザン解析の結果、このヘテロカプサ分離株はUA系統のウイルスの複製をサポートしていることが明らかになった.マイナス鎖特異的プローブを用いたノーザン解析は、従来法より感度の高いウイルス感染検出技術であると考えられる.また、この分離株の性状を分子生物学的側面から解析することにより、ウイルス-宿主間の相互作用がさらに詳細に解明されるものと期待される.HcRNAVは赤潮原因渦鞭毛藻ヘテロカプサに感染するRNAウイルスであり、海洋環境中に広く分布する渦鞭毛藻に感染するRNAウイルスとしては世界で初めて分離された種である.HcRNAVの種内宿主特異性の異なる2系統からなる。この宿主特異性がウイルスの感染過程のどの段階で決定されるかを調べるため、ウイルスマイナス鎖RNAを特異的に検出するノーザン解析を行った.その結果、感染が成立しないウイルス株-宿主株の組み合わせにおいては、マイナス鎖の蓄積が認められなかった.また、渦鞭毛藻へのウイルスRNA導入技術を開発しウイルスRNAを直接細胞内に導入したところ、いずれの宿主株においてもウイルスのマイナス鎖RNAの合成が確認された。以上の結果より、HcRNAVの宿主特異性はウイルスと宿主レセプターの特異的結合過程を含む感染過程初期過程にあることを明らかにした(Mizumoto et al.,2007)。ヘテロカプサの分離株には、上述のいずれのウイルス系統に対しても溶藻反応を示さないものが存在する。以上の結果からウイルス感染による細胞死が認められない場合でもウイルス粒子生産が起こることを明らかにし、赤潮動態に及ぼすウイルスの影響に新たな知見を与えた(Mizumoto et al.,平成19年度日本水産学会春季大会)。また、実際のヘテロカプサ赤潮現場から約80株のヘテロカプサ株を分離し、ウイルスRNA蓄積量にもとづくウイルス感受性試験を行ったところ、現場環境にはこれまで考えられてきた以上のHcRNAV感受性タイプが存在することを明らかにした(Mizumoto et al.,第54回日本ウイルス学会学術集会)。マイナス鎖

特異的プローブを用いたノーザン解析の結果、このヘテロカプサ分離株はUA系統のウイルスの複製および感染性ウイルス粒子の再生産をサポートしていることが明らかになった。以上の結果からウイルス感染による細胞死が認められない場合でもウイルス粒子生産が起こることを明らかにし、赤潮動態に及ぼすウイルスの影響に新たな知見を与えた.また、実際のヘテロカプサ赤潮現場から約80株のヘテロカプサ株を分離し、ウイルスRNA蓄積量にもとづくウイルス感受性試験を行ったところ、現場環境にはこれまで考えられてきた以上のHcRNAV感受性タイプが存在することを明らかにした.さらに、すでに確立されている分離株からヘテロカブサ1個体を再分離し、約1ヶ月間実験室環境中で経代した15分離株間においても、ウイルスの複製効率が異なることを明らかにした.この結果は、ヘテロカプサのウイルス感受性がわずかな期間でも変化しうることを示しており、海洋環境中におけるウイルスと宿主の進化について新たな知見を与えるものである(Mizumoto, et. al.,2008).
インスリン分泌細胞におけるTRPM2チャネル活性化機構の解明と創薬への応用

糖尿病が起こる一因として活性酸素による膵臓のβ細胞障害が知られている。本研究では、活性酸素によるβ細胞死の機構に関与していることが最近明らかとなったTRPM2チャネルの活性化機構の解明に着手し、これまでに報告されている活性化機構とは異なる機構(TRPM2チャネルの細胞質のC末端領域に存在するNudixモチーフのADPリボシル化反応)が関与している可能性について明らかとすることができた。TRPM2を発現している膵β細胞において、活性酸素による細胞死にTRPM2活性化が関与していることを明らかとした。しかしながらTRPM2はカルシウムだけでなくナトリウムも透過することから、TRPM2活性化により脱分極が生じ電位依存性L型チャネルも活性化される可能性ある。そこで本年度は、TRPM2と電位依存性L型カルシウムチャネルを有しているラット膵β細胞株RIN-5F細胞を用いて、過酸化水素刺激によりカルシウム応答と細胞死へのTRPM2とL型カルシウムチャネルの関与について検討した。その結果、過酸化水素刺激により2相性のカルシウム応答が認められ、このカルシウム応答には細胞内ストアからのカルシウム放出は関与せず、TRPM2とL型カルシウムチャネルを介した細胞外からのカルシウム流入が関与していた。電位依存性カルシウムチャネルが存在していないHEK293細胞にTRPM2を発現させた場合、過酸化水素刺激により1相性でかつ持続性のカルシウム流入が観察される。RIN-5F細胞を用いた実験においても、L型カルシウムチャネル阻害剤存在下では、TRPM2を介したカルシウム応答だと思われる持続性のカルシウム応答が認められた。一方、TRPM2チャネル阻害剤存在下では、過酸化水素によるカルシウム応答は一過性であった。なお、L型カルシウムチャネル阻害剤は過酸化水素によるTRPM2活性化に、またTRPM2阻害剤はL型カルシウムチャネルを介したカルシウム応答に影響しないことは確認している。さらに、過酸化水素による細胞死への各チャネルの関与について検討したところ、細胞障害についてはTRPM2の関与が大きく、L型チャネルも関与してはいるもののその寄与度は小さかった。以上の結果より、過酸化水素による膵β細胞障害にはTRPM2を介した持続性のカルシウム流入が大きく関与していろことが明らかとなった膵β細胞に存在しているTRPM2チャネルは、活性酸素により活性化され、細胞外から細胞内へ大量のカルシウムを流入させ細胞死を誘導する。TRPM2は、細胞内のNADやADPリボースが、細胞内のC末端領域に存在するNudixモチーフに作用することで活性化されると考えられているが詳細は不明だった。本研究では活性酸素によるTRPM2チャネル活性化へのADPリボシル化の影響について検討した。TRPM2を遺伝子導入したHEK細胞とTRPM2をネイティブに発現しているラット膵β細胞株RIN-5F細胞を用いて、過酸化水素によるTRPM2を介した細胞内へのカルシウム流入(TRPM2活性化)へのモノADPリボシル化転移酵素阻害剤の影響について検討した。その結果、過酸化水素によるTRPM2活性化は、モノADPリボシル転移酵素阻害剤であるMIBG、3-アミノベンザミド、ノボビオシンにより濃度依存的に抑制され、過酸化水素による膵β細胞障害も抑制された。TRPM2のC末端側に存在するNudixモチーフには、ヒト、マウス、ラット間で2箇所のアルギニン残基が保存されている。そこで、各アルギニン残基をグルタミン残基に変異させた発現ベクターを構築し、過酸化水素によるTRPM2活性化への影響について検討した。その結果、ヒトTRPM2のアルギニン残基を変異させたR1392Qでは、過酸化水素によるTRPM2活性化は影響されなかったが、R1400Qでは過酸化水素によるTRPM2活性化は認め照れなかった。したがって、過酸化水素によるTRPM2活性化には1400番目のアルギニン残基のモノADPリボシル化が関与している可能性が示唆された。
近世・近代移行期の職業転換にみる近世の学問の意義と展開

本研究は、近世において村役人などを勤めた地域の指導者や「学制」成立期の小学校教員を対象とし、近世までの学習履歴が近代における彼らの職業転換や学習におよぼした影響について、3つの事例を通して検討した。事例対象者らは、新しい職務に就いたことで、近世とは異なる学問を身につけることになったが、その際近世までに修得した学問や学習環境(書籍などの物的環境や学問を取り巻く人間関係)を活かしていたことを実証した。本研究は、近世において村役人などを勤めた地域の指導者層の人物を対象事例とし、近世までに習得した学問が、近代に入ってからの職業転換などその後の生き方に及ぼした影響について検討するものである。【内容】平成24年度は、神職を襲職した家の出身者である内藤東海(18341922)を事例とし、平成23年度に残した課題「近代以降に新しく習得した学問と職務との関連」について、人的ネットワークの視角から検討した。東海は、幕末から明治初年という移行期に、国学や俳諧、弓術を学んだ。このような学問習得を支える学習環境の1つに書籍をとりまく人的ネットワークがある。このネットワークは家業のネットワークとも重なり、相互補完的かつ限定的であるという特徴をもつ。東海が書籍を蒐集し、貸し出した人は血縁や家業、学芸において共通しており、互いの蔵書を補完していた。しかし、それは同質性が高いゆえに閉鎖的な関係でもあった。近世において、基本的に書籍は人を選ばず貸し出すものではなく、東海も同様だった。そのため、書籍をとりまく人的ネットワークは強い信頼関係を表すものであり、書籍を介して信頼関係は強化したと考えられる。近代に入り、東海は他地域の教導取締や地元の郵便取締役につき、学務委員を務めるなど、幕末を乗り越えて「出世」した。また、書籍をとりまくネットワークでつながっていた由緒ある中村家に養子入りした。近世までに学んだ学問や教養はその内容だけにとどまらず、学問や家業に関わる人的ネットワークを構築し、近代に入ってからの生き方に影響を与えることになった。【意義・重要性等】本研究の意義は、近世近代を貫く視点で行なう実証的な研究にある。平成23・24年度に行なった研究もこの視点に基づいている。また習得した学問内容だけでなく、学習をとりまく要素、特に今年度は昨年度よりも資料を精査して人的ネットワークに着目して研究を進めた。本研究は、近世の学習履歴が近代の職業転換などその後の生き方に及ぼした影響と近代の職業に対応すべく新たに習得した学問について検討するものである。【内容】「学制」成立期の教員の資質について、群馬県の教員79名の履歴の分析より明らかにした。特定の人物に焦点を当てる予定だったが、先行研究(花井信2011)でとりあげられた以上の多数の教員履歴書が見つかり、課題解決をより有効に進められると判断し、量的手法をとった。結果、以下の3点を明らかにした。1つは「学制」前(近世)に習得した学問である。ほとんどの教員は、漢学を学んでいた。「学制」期の洋算書や自然科学の教科書は、漢学の素養がないと読解自体難しく、漢学の素養が近代の新しい学問習得へと結びついていた。2つは「学制」後(近代)に習得した学問である。多くの教員が小学教則、洋算、洋学を伝習学校で学んだ。伝習学校卒業が教員資格となっていくことにより、伝習学校で必要な学問を学ぶことが問題なく教員として認められるルートとして確立された。3つは、伝習学校を卒業していない無資格教員の教員「資格」である。群馬県では、伝習学校設立前に前橋小学校が設立されたため、必然的に無資格教員が存在した。伝習学校がないという状況を克服するために、当該期の教員養成をめぐる学習環境として、金子精一が機能した。金子は洋学や洋算に精通し、学務専任として文部省へ出向き、「学制」の理念や学科、教授法(小学教則)を学んだ人物である。前橋小学校の教員(無資格教員)のほとんどが、金子精一のもとで学んでいた。「学制」成立期の教員は、「学制」前までに習得した学習履歴だけでは近代の教員にはなれず、伝習学校や金子精一のもとで小学教則、洋算、洋学を学ぶ必要があった。【意義・重要性等】本研究の意義は、近世近代を貫く視点にある。また、習得した学問内容だけでなく、学習をささえる学習環境にも着目した。【内容】1平成23年度は、遠江国(現静岡県浜松市)で神職を襲職した中村家の当主東海を事例にとりあげた。

東海は、神職を襲職してきた家の出身であり、幕末から明治初年にかけて神職内藤家に養子入りし、その後中村家の当主となった。東海が蒐集した書籍の内容により、幕末から明治初年という移行期において、東海が特に国学を熱心に学んだことがわかった。近世の遠江国では、国学を学ぶ神職が多数存在した。このような地域の学問状況を背景に、東海の国学習得があった。東海の学問習得をささえた学習環境(人的ネットワーク)として、(1)養子入りによって広がった人脈(2)三河国の国学者(神職)があげられる。このネットワークの中で、学問に必要不可欠である書籍の貸借も行なわれていた。近世において機能していた養子制度や支配関係(当該地域は、三河国吉田藩の支配を受ける)が、学習環境に大きく影響していた。近代に入り、東海は教導取締や学務委員等を命じられ、郵便局取締役にもついた。近世までに神職や村役人を勤めてきた家の出身者が就くことが多い職(職務)であり、東海の場合も近世までに学んだ学問や教養が近代においてもいかされることになった。2平成25年度の研究課題である「近代初期の教員の資質能力」について、先行研究を検討し、残された課題と研究方法を提示した。【意義、重要性等】本研究の意義は、近世近代を貫く視点で行なう実証的な研究にある。平成23年度に行なった研究もこの視点に基づいている。【内容】2で指摘したように、習得した学問の内容だけでなく、学習をとりまく要素(地域の特徴や人的ネットワーク、社会構造の在り方等)も考慮して、研究を進めた。本研究は近世において村役人などを勤めた地域の指導者や「学制」成立期の小学校教員を対象事例とし、近世までの学習履歴が近代の職業転換や学習に及ぼした影響について検討するものである。【内容】最終年度は、初年度の学会発表内容が学会誌に掲載された。また昨年度の研究課題に補足して論文を執筆した。さらに、近世の筑前国御笠郡(現福岡県大野城市)で庄屋を勤め、近代に入ると地域の農業振興の役等を歴任した高原謙次郎を事例としてとりあげ、研究を進めた。近世において、謙次郎の学問をとりまく人的ネットワークに福岡藩の儒者や勤王の志士等がおり、共に学問をするほか書籍を貸借していた。ただし、この時期の高原家では家業である農業と学問は分離していた。高原家に農事記録はあるものの、農業に関する知識を書籍から得たり、農業技術を執筆という形で地域に還元したりする様子はみられなかった。しかし、明治中期に謙次郎が福岡県の農業行政の重要な職務に就いた時期に、近世・近代の農業書を購入したり、近世以降の農事記録を編纂したりするようになった。編纂物に共通するのは飢饉である。近代に入っても地域の人々の生活や命に関わる飢饉は重大事であるため、近世の飢饉を乗り越えてきた地域の老人の経験や「旧記」や農業書の対応に学ぶことで、近代の危機を乗り越えようとした。研究期間を通じて3つの事例を検討した。近世から近代という大きな社会構造の変化の中で、事例対象者は新しい職務に就いたことで近世とは異なる学問を身につけることになったが、その際に近世までに習得した学問や学習環境(書籍などの物的環境や学問をとりまく人間関係)を活かしていたことを実証した。【意義・重要性等】本研究の意義は、近世近代を貫く視点で行なう実証的な研究にある。これまでの研究実績の概要で指摘したように、習得した学問の内容だけでなく、学習をささえる学習環境にも着目した。
樹状細胞とマクロファージの癒合細胞(ハイブリド細胞)による新規免疫細胞療法

A.樹状細胞(DC)とマクロファージ(mφ)の融合細胞の作成A/Jマウス皮膚由来のDC株XS106とA/Jマウス由来腹腔mφをPolyethylene glycol(PEG)法にて融合させた。我々はすでに、HAT感受性、ネオマイシン耐性のXS106由来の細胞クローン(V2)を樹立している(Matsue H,et al.,Blood 98:3465,2001)。実は、V2はFasLを導入したときのコントロールの細胞で、in vitro及びin vivoで強力な抗原提示能を示す細胞であり(Matsue H.,Nature Med 5:930,1999)、この実験に適したDCの特性を有すると思われた。DC-mφHybridsの選択には我々が開発したdouble selection法を用いた。C.DC HybridsのHeterogeneity : DCと腫瘍細胞を細胞融合し、ハイブリド細胞のクローンを樹立した。56クローンのうち51クローン(91%)が腫瘍の形質を有していたが、ただ1つのクローンのみがDCとしての形質、すなわち、I-A,CD86陽性、抗原提示能を示した。そのクローンは、腫瘍抗原特異的CTLを誘導し、腫瘍細胞に対するワクチン効果があることを示した(Matsue H et al.,CancerBiology & Therapy 3:1145-1151,2004)。このことは多くのハイブリドはDCの形質を細胞融合後に失われることを示した。すなわち、DC-mφHybridsにおいても、両細胞の生物学的機能の持つHybridsを注意深くスクリーニングしなければならないことを示している。現段階では、まだ機能的DC-mφHybridsは確立されていないが、DCと他の細胞との融合方法の方法論は確立したので、今後種々の組み合わせの2種類の免疫担当細胞のハイブリド細胞で様々な免疫応答を制御する方法論となると思われる。またこのプロジェクトの副産物として、DCの活性化にGjが重要な役割を果たしていることを発見したので、その制御による免疫応答(抗腫瘍免疫を含む)の制御の研究も進めたい。A.樹状細胞(DC)とマクロファージ(mφ)の融合細胞の作成DC、mφ、DC-mφHybridsについて、Phenotypeの解析、DNA量・染色体数の測定、ネオマイシン耐性遺伝子の解析をした。D.Gap juntion(Gj)を介した細胞間相互作用の解析:DCが抗原提示する際に、DC間のGjを介した情報伝達が重要であることを明らかにした。DC-mφHybridが所属リンパ節内でのDCに抗原を渡し、活性化するのに重要なメカニズムと考え、解析中である。A.樹状細胞(DC)とマクロファージ(mφ)の融合細胞の作成我々は、DCと腫瘍細胞を細胞融合し、ハイブリド細胞のクローンを樹立した。

このことは多くのハイブリドはDCの形質を細胞融合後に失われることを示した。すなわち、DC-mφHybridsにおいても、両細胞の生物学的機能の持つHybridsを注意深くスクリーニングしなければならないことを示している。DCと他の細胞との融合方法の方法論は確立したので、今後種々の組み合わせの2種類の免疫担当細胞のハイブリド細胞で様々な免疫応答を制御する方法論となると思われる。
蛍光標識法を用いた光合成ウミウシ体内における植物由来オルガネラの動態解析

貝殻を持たない貝の仲間であるウミウシにおいては、餌である藻類から葉緑体を盗みとり、自身の細胞に埋め込んで光合成を行う変わりものがいる。本研究では、この光合成ウミウシの盗葉緑体現象を詳細に解析するため、ウミウシの餌である多核緑藻類ハネモのオルガネラ(核、葉緑体、ミトコンドリア)を蛍光標識して、それらが光合成ウミウシに摂取された後、ウミウシ体内でどのような挙動を示すのかをライブイメージングにより観察・解析できる実験系を、世界に先駆け開発・構築した。光合成ウミウシは餌である海藻の細胞質を吸い取り、葉緑体を自らの細胞に取り込んで光合成を行う。この現象はkleptoplasty(盗葉緑体現象)と呼ばれ、動物が光合成を行う稀有な例であるが、そのメカニズムはほとんど分かっていない。本研究はウミウシの餌となる緑藻類ハネモのオルガネラ(葉緑体、ミトコンドリア、核)を蛍光標識し、それらオルガネラのウミウシ内での動態変化をリアルタイムで観察する実験系の開発を目的にしている。初年度の研究より、この目的を達成するためには、「ハネモオルガネラの低蛍光標識効率」、「ハネモ内におけるGFP遺伝子発現の不安定性」の問題を解決しなければならないことが明らかになってきた(平成23年度研究実施報告書)。そこで平成24年度は、これら2つの問題解決に取り組んだ。具体的には、1)高発現型プロモーターを用いたGFPの発現増強と、2)ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いた安定形質転換体の選抜を試みた。その結果、これらの試みは成功し、最終的に、安定にGFPを高発現する形質転換ハネモを得ることができた。またこれらの形質転換ハネモを用いてウミウシ内の藻類オルガネラのリアルタイムモニタリング解析を行い、当実験系に関する基礎情報を取得した。本年度における最も大きな成果は、本研究の基盤技術であるハネモの形質転換系に関する詳細な情報が得られたことである。ハネモの様な多核緑藻類の形質転換に関してはこれまで報告がなく、本研究で開発された形質転換手法は学術的に大きな価値があると考えられる。現在、ハネモ形質転換に関する研究成果について、学術雑誌への投稿準備を進めている。近海に生息する光合成ウミウシは餌である海藻の細胞質を吸い取り、その葉緑体を自らの細胞質に取り込んで光合成を行う。この現象はkleptoplasty(盗葉緑体現象)と呼ばれ、動物が光合成を行う稀有な例として知られるが、そのメカニズムはよく分かっていない。本研究は光合成ウミウシの餌である多核緑藻類ハネモ(Bryopsis plumosa)のオルガネラ(核、葉緑体、ミトコンドリア)を蛍光標識して、それらが光合成ウミウシのコノハミドリガイ(Elysia ornata)に摂取された後、ウミウシ体内でどのような挙動を示すのかをリアルタイムで観察する実験系の開発を目的にしている。本研究では研究実施計画に従って平成23年度に、各オルガネラ蛍光標識コンストラクトによるハネモの形質転換体の作成が行われ、平成24年度において、分子生物学的手法によるハネモオルガネラ蛍光標識効率の改良が行なわれた。最終年度(平成25年度)においては、顕微鏡観察による細胞学的解析が進められ、形質転換ハネモをコノハミドリガイに摂取させる実験により、ウミウシ体内における海藻由来の蛍光標識オルガネラの動画を撮影することに成功した。また取り込まれた蛍光標識オルガネラを定量的に動態解析する上で、ハネモオルガネラの蛍光標識効率をさらにあげる実験系の改良が必要であることも明らかになった。本研究は、世界で初めて多核緑藻類の形質転換系の開発を行い、蛍光標識法を用いたウミウシ体内での海藻由来オルガネラのモニタリング系を世界に先駆け構築した。これらの実験系は、ウミウシの盗葉緑体現象の研究だけでなく、これまで形質転換が困難であった大型藻類や多核細胞の研究に応用可能であると考えられる。現在、これら研究成果の論文発表の準備を進めている。ウミウシの中には、動物なのに光合成をする変わりだねがいる。彼らは、餌となる海藻に穴を空けて細胞質を吸い取り、その中の葉緑体を自分の細胞内に取り込んで、緑のウミウシとなって光合成をする。この現象はchloroplast symbiosis (葉緑体共生)とかkleptoplasty(盗葉緑体現象)等と呼ばれ、嚢舌目のウミウシにみられる極めて特異な現象だが、そのメカニズムは殆ど未知である。本研究では、餌となる海藻のオルガネラ(葉緑体、ミトコンドリア、核)を蛍光標識し、それらがウミウシ体内でどのように挙動するのかをリアルタイムで観察できる世界初の実験系を開発することを目的としている。平成23年度の研究においては研究計画実地計画に従って、ウミウシのエサである緑藻ハネモBryopsisplumosaの葉緑体、核、ミトコンドリア蛍光標識コンストラクトを作成し、ハネモへの遺伝子導入実験を行った。

また作成した形質転換ハネモをコノハミドリガイElysia ornataに餌として与え、ハネモ由来の蛍光標識オルガネラが光合成ウミウシ体内で観察されるかどうかについても調べた。その結果、ハネモオルガネラ由来だと考えられるGFP蛍光輝点がウミウシ体内において世界で初めて観察され、本研究の開発コンセプトが正しいことが示された。また、本研究課題を達成する上で克服しなければならない問題点、「ハネモオルガネラの蛍光標識効率が低い」「ハネモ内でのGFPの発現が長期間持続しない」が明らかになってきた。23年度の研究で得られたこれらの知見により、より的確で効率的な研究開発を行うことが可能になった。平成23年度の研究により、本研究の目的を達成する上で2つの問題、「ハネモオルガネラの低蛍光標識効率」と「ハネモ内でのGFP発現の不安定性」を解決しなければならないことが明らかになった。そこで平成24年度は、優先的にこれらの問題に取り組み、解決までにこぎ着けた。現在、これまでに得られた研究成果を論文として発表するべく、最終確認のための実験を進めている。以上より、おおむね順調に進展していると考えている。平成23年度中に蛍光標識ハネモ-コノハミドリガイを用いた顕微鏡観察実験を行ったことで、本研究の開発コンセプトが正しいことが明らかになった。また蛍光標識ハネモ-コノハミドリガイのリアルモニタリング系の開発における問題点が一通り洗い出された。研究手法の正当性が示され、具体的問題点が整理され、より効率的な研究が可能になったことは、大きな進展だと申請者は考える。当初の計画の一部(藻類オルガネラの黄色・赤色蛍光標識)は平成23年度中に達成することができなかったが、これは研究過程で明らかになってきた問題点「ハネモオルガネラの低い蛍光標識効率」「ハネモにおけるGFP発現の不安定化」の解決を最優先にしたためで、この問題解決のために行われた実験の知見は、今後研究を展開する上で重要だと考えられる。以上のことから、本研究の進捗具合はおおむね良好だと申請者は考える現在、培養している形質転換ハネモをウミウシの摂取させ、ウミウシ内でのハネモの蛍光標識オルガネラを蛍光実体顕微鏡で観察し、それらの動態解析を行う。そして、これらの研究結果を論文の形にまとめて発表する。平成23年度における研究により、ハネモにおける「オルガネラ蛍光標識効率の改善」や「GFPの発現の安定化」が研究目的を達成する上で必須であることが明らかになってきた。そこで、平成24年度においては、これらの改善を行うため、プロモーター等を改変した改良型GFP発現コンストラクトの作成し、ハネモに導入する形質転換実験を行う。また作成した蛍光標識ハネモをウミウシに食べさせて、ウミウシ体内に取り込まれたハネモ由来オルガネラの動態をリアルタイムで観察・追跡する。当初の予定(平成24年度実地計画)にあった多色蛍光標識ハネモの作成については、上述の実験で得られた改良型オルガネラ蛍光標識ハネモを用いて行う。平成24年度においては、予定していた緑藻類ハネモのオルガネラ蛍光標識法の改良と、そのハネモを用いたウミウシ体内における植物オルガネラの動態解析を進めたが、得られた研究成果を論文として発表するためには、まだ幾つかの確認実験が必要である。このため補助事業期間延長を申請して承認された229,077円を、次年度における論文発表のための実験、英文校正等の経費に充てる予定である。
血液透析を受ける認知症高齢者の主観的経験-標準的看護方法構築に向けて-

我々は、まず血液透析認定看護師10名に「認知症の人特有の経験」を質問し、「後半、突然に起こる多様な行動に恐怖を感じる」「認知症者の興奮が周囲を巻き込み困惑する」等を抽出した。次に、研究者8名が、本人の主観的経験を焦点にして、血液透析中の認知症者12名に参加観察を行った。その観察記録から、「特定の時間(開始後11.5H、終了11.5H前)に原因の異なる高リスク行動がある」「睡眠後に失見当識が強い」等行動の特徴を明らかにした。結果に基づき、研究者8名で、透析経過、認知症重症度との関連を検討し、熟練看護師2名の専門的意見を加えて、「重症度別の透析経過に沿った標準的看護支援方法」を作成した。研究全体の目的は、血液透析を受ける認知症高齢者の看護方法の構築で3段階の調査で構成されている。今年度は第1段階「血液透析の認知症高齢者の看護している透析看護認定看護師の経験」を明らかにする調査を実施した。協力者は透析看護認定看護師10名(男3名・女7名)、平均年齢44.4歳であった。「透析室で認知症高齢者にどのように困ったか」などインタビューし、逐語録を老年看護専門看護師、認知症認定看護師、透析看護認定看護師、透析室臨床看護師の複数の視点で質的帰納的に分析した結果、5つの大カテゴリ-により、下記の認知症高齢者の透析看護師の困難の全体像が示された。透析看護師は、透析を受ける認知症高齢者を看護するなかで【後半に突然に起こる多様な行動から抜針に至る恐怖】を強く感じ、【周囲を巻き込む興奮行動への困惑と対応の困難】から【認知症ゆえに起こる透析中の困難の繰り返しとケアから逃れられない高ストレス】を感じていた。そして、透析-透析間の「認知症ゆえに生じる(患者の)生活管理の問題に対応しきれないことへの苦慮】が透析看護を解決の糸口のない問題にさせていると捉えていた。が、このような多くの困難のなかで、透析看護師は【透析中の認知症高齢者の立場に立った柔軟な対応】を必死で行っていた。5つの大カテゴリーにおいて、他4つのカテゴリーと関連が強く、最も頻繁に見られた【後半に突然に起こる多様な行動から抜針に至る恐怖】を中核カテゴリーと位置づけた。この結果から、認知症高齢者の抜針事故の重大性が、看護師の深刻な困難の中心であること、透析の特定の時間に問題が生じやすいこと、透析室の特殊な環境と透析前の生活管理の不十分さが透析看護をより困難にさせていることが明らかで、看護方法構築の貴重な資料となった。また、次年度2段階めの「(認知症高齢者の立場に立った)認知症高齢者の主観的経験」調査の重要な資料となった。血液透析を受ける認知症高齢者の看護方法を構築するための2段階目の本調査を実施した。本調査は、血液透析室で透析を受ける認知症高齢者を34時間、参加観察をする。平成28年2月の予備調査4名の結果を受け、調査方法についての検討会議を終えて、平成28年8月と11月に2病院(石川、岐阜)で実施した。調査者は認知症認定看護師2名、老年看護の教員5名で、調査できた認知症高齢者は12名であった。分析は、精神混合疾患がない、途中で中止になった、男性である、を除き7名とした。7名は平均年齢86.1才、認知症は重度1名、中等度1名、重度5名であった。分析方法は、透析中の対象者の言葉と行動から「透析継続を阻む言葉と行動の危険度基準」を作成し対象者毎に経過に沿って記載して比較した。導き出された結果は5つである。1.軽度・中等度2名には危険度の高い言動が少なく、重度で多く見られた。2.全員が穿刺時には危険な言動がない(透析・穿刺の意味を理解している)。3.開始後30分1.5時間は、何も言わないで動く行動が多くリスクが最も高い、4.開始終了までの中間時間帯は余り訴えなくなり体を動かし始める程度である、5.終了前11.5時間には、「ここはどこ」「いま何時」「あとどんだけ」と訴えが非常に多くリスクが高い(終了を理解して抑制の苦痛を訴えていると思われた)。以上の結果から、透析中にリスクの高い行動を示す可能性の高い重症度、時間帯が明らかにされたことで、抑制の時間減少、看護の焦点化のヒントが示された。今後は、逐語録の質的分析を行い、どのような看護を、いつ行うかについて明らかにする。調査対象者を18名を予定したが、調査対象者が得られず、12名となった。本年度は全体計画の3段階目である。目標は、2段階目(平成27年)の2か所の血液透析室で参加観察を実施した認知症高齢者12名の逐語録に基づき結果を抽出し、1段階目(平成26年)の血液透析熟練看護師のインタビュー結果と合わせた分析によって、標準的な看護方法を抽出することである。まず、4月6月に第1段階目の調査結果を再度見直し、論文投稿をして広く意見を頂いた(8月掲載)。次に、2段階目の分析については、昨年度に実施した対象者7名の血液透析34時間の実施経過におけるリスク言動の特徴を4月国際アルツハイマー学会に発表し、その後、5名の対象者の追加分析を行った。

その結果、1MMSE17点以上の対象者には問題言動はなくMMSE16点以下、特にMMSE4点以下の対象者はリスクの高い言動がみられた、2開始時の穿刺の激痛に対し、問題言動が大きいと予測したが、殆ど問題言動がなく、対象者は全員激痛を耐えていた、3開始後301時間30分、開始後3時間以降に問題行動が多くみられた」、「開始後3時間以降の問題行動の原因は同一体位苦痛で、30分1時間30分の問題言動のの原因は原因が違っていた」の示された。以上により、標準的看護方法抽出の方法として、時期ごとに区分して看護方法を立案することが示唆された。そこで、分析の第2として、上記の時期の区分に沿って研究代表者及び研究協力者1名が、対象者12名の言動の質的分析をすることを開始した。しかし、研究代表者の家族の発症(9月)により対象者4名の分析で中断を余儀なくされた。さらに、平成29年1月に開催予定していた協力者8名全員による検討会議が、協力者1名の病気発症、2名の勤務移動のため日程調整が困難となった。その結果研究結果分析終了に至らず、研究期間延長申請を行った。質的分析は研究代表者及び協力者1名によって、統一した視点で分析をする予定であった。4名の質的分析は終了したが、研究代表者の配偶者の病気発症(9月)による入院のため平成29年1月まで実施できず、その後も自宅改修、介護保険開始、自宅介護などの対応に追われ、対象者12名の逐語録質的分析を中断せざるを得なかった。加えて、協力者1名の病気発症、協力者2名の勤務移動、および認知症認定看護師2名が認知症加算制度による予期しない業務量の増大により、検討会議開催日程調整を何度も行ったが、開催日を設定することができなかった。そのため、平成29年5月に会議開催を延長した。血液透析を受ける認知症高齢者の参加観察データに基づいて、標準的看護支援方法を構築するために、平成29年度(期間延長)は最終年度であった。平成27度までに2ヶ所の血液透析室で参加観察を行った認知症高齢者12名の逐後録のデータから、血液透析標準的看護方法を抽出した。まず、対象者12名全員(昨年までに4名分析)の34時間の透析経過中における「言動のリスク度を数量的にみた分析結果」を見ながら、「言動を質的に記述した変化」を抽出して、「透析開始から終了までの経過に沿った看護支援内容」を抽出した。その後昨年実施できなかった協力者8名(血液透析室勤務の認知症認定看護師2名、透析経験のある大学教員1名、認知症看護を専門領域とする大学教員4名)による検討会で意見交換を行った。多様な視点での疑問、確認、意見を踏まえて、「認知症患者への透析経過に沿った看護支援」を修正した。平成30年3月28日に、研究者2名と透析看護を専門とする認定看護師1名とで会議を開催し、「認知症患者への透析経過に沿った看護支援」の根拠と実現可能性についての意見交換をした。最終的には、平成30年4月に「慢性心不全のある認知症看護の研究(大津)」、「がん性疼痛を有するがんの認知症看護の研究(久米)の研究結果と本研究結果の照らし合わせを行い、「身体的急性状況における認知症高齢者の看護としての共通点、各疾患別の特徴を抽出して「認知症患者への透析経過に沿った看護支援」の内容を決定した。我々は、まず血液透析認定看護師10名に「認知症の人特有の経験」を質問し、「後半、突然に起こる多様な行動に恐怖を感じる」「認知症者の興奮が周囲を巻き込み困惑する」等を抽出した。次に、研究者8名が、本人の主観的経験を焦点にして、血液透析中の認知症者12名に参加観察を行った。その観察記録から、「特定の時間(開始後11.5H、終了11.5H前)に原因の異なる高リスク行動がある」「睡眠後に失見当識が強い」等行動の特徴を明らかにした。
唾液腺腫瘍に共通するp53遺伝子変異様式の決定とその意義

われわれは、唾液腺の悪性リンパ上皮腫にきわめて特異的にEBVの感染があることをみいだした。そこで、EBV感染がこの癌腫発生のどの段階に関与しているのかを検索するために、癌関連遺伝子変異状況を解析したいと考え、まずもっともヒト腫瘍で検索データの蓄積されているp53遺伝子について検索することを計画した。同時に、放射線被爆との関連性が明らかにされた粘表皮癌やワルチン腫瘍その他の唾液腺腫瘍についても同様に検索し、腫瘍間の異同につて検討することにした。具体的には、これまでわれわれが収集してきた唾液腺腫瘍外科摘出材料のパラフィン包埋切片よりDNAを抽出して、p53遺伝子のホットスポットの集中するエクソン57をPCR法で増幅し、直接シークエンス法による変異様式を解析することを計画したのである。この着想には、われわれが世界に例のない極めて多数のリンパ上皮腫症例のパラフィン包埋組織切片よりDNAを抽出して、ウィルス感染をPCR法増幅により検知可能にする研究技法を開発してきたところにあった。これらの技術を応用することによって、p53遺伝子についても解析が可能という展望がえられたわけである。その結果、リンパ上皮腫ではもっともp53遺伝子の広範かつ重篤な突然変異が症例間で共通した部位に生じていることが判明した。そのほかの腫瘍ではp53遺伝子変異頻度は少なくその程度も軽微であったものの、腫瘍種によって症例をこえて変異点が共通であることに注目された。さらに、それらの変異の一部は腫瘍種をこえて共通する部位に生ずる傾向があったことも新知見であった。以上の結果より、唾液腺腫瘍の発癌にはp53遺伝子の特定領域の変異が何らかの関与をしていること、したがって、ウィルス感染、放射線被曝、あるいはそれ以外の未知の要因による唾液腺腫瘍発生機序のいずれでも同遺伝子変異が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。今後はこれら変異の生成機序またはその変異による遺伝子カスケードがどのように変化するかを検討していく予定である。今年度は、これまで中国各地で収集した150例の唾液腺悪性リンパ上皮腫、同時に中国各地で収集したワルチン腫瘍および日本国内の被爆者症例を含むワルチン腫瘍の症例30例、さらに被爆者症例を含む粘表皮癌30例、腺様嚢胞癌50例、多形性腺腫70例、筋上皮腫30例の症例についてHE染色標本によって再度病理組織学的評価をおこなった。さらに、パラフィン切片からDNA試料採取部位を決定した。上記病例のうち、とくにリンパ上皮腫、粘表皮癌、およびワルチン腫瘍について重点的にパラフィン連続切片を作製し、p53遺伝子産物の局在を免疫組織化学的検索をおこない、腫瘍組織内の発現を確認した。その結果、p53蛋白質粘表皮癌に過剰発現していることをみいだした。ワルチン腫瘍ではほとんど発現はなく、リンパ上皮腫でも軽微であった。さらに、p53蛋白質過剰発現が確認された腺様嚢胞癌および多形性腺腫については、その背景としての組織構築の特異性を検討した。上記三種の腫瘍症例について、パラフィン切片を脱パラフィン後、プロテイナーゼKおよびフェノールよってDNAを抽出し、p53のexon5、exon6、exon7について、それぞれプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、各exon断片を増幅した。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって確認し、必要に応じて、ゲルを切り出しして二次PCRをおこない、その産物をカラム精製して、サーモシーケナーゼ反応をおこない、蛍光式DNAシーケンサによって塩基配列を決定した。

その結果、リンパ上皮腫ではきわめて高度かつ広範に変異がみいだされたが、粘表皮癌では変異は軽微であり、ワルチン腫瘍では遺伝子多型を示唆するものにとどまった。ただし、いずれの変異も症例間で共通した部位に出現していた。これらは、いわゆるp53遺伝子のホットスポットに位置するものであった。したがって、それぞれの唾液腺腫瘍発生にp53遺伝子の遺伝子変異ないしは遺伝子多型性が重要な役割をはたしている可能性が示唆された。今後はさらに解析対象の症例を追加して、今年度の結論の正当性を判断するとともに、変異部位の機能の解析を進める予定である。1)細胞培養:遺伝子導入および対照とする培養細胞、正常唾液腺上皮細胞((1)野生型一p53細胞:HPAMl, HPAFl、(2)non-functional-p53細胞:NS-DV, NS-MV)、および唾液腺腺様嚢胞癌細胞(ACC2, ACC3)およびその高転移株(ACCM)、さらに口腔粘膜由来扁平上皮癌細胞(ZK-1, ZK-2)およびその高転移株(MK-1)を、それぞれに適応する条件下で培養し、増殖曲線を把握した。2)遺伝子導入実験:高度で広範かつ症例間で共通する変異遺伝子断片を含むDNA断片(PCR産物)を、適切な制限酵素によるクローニングサイトを切断し、プラスミドに組込みことをこころみたが、現在までのところ、組込みならびにプラズミド精製に成功しておらず、遺伝子導入が完了していない。引き続き改良を続ける予定である。3)DNAチップ解析:上記細胞からTotal mRNAを抽出し、ノザンブロット法にて細胞周期の変化を観察するとともに、cDNAを逆転写合成し、蛍光標識後DNAマイクロアレイ法のためにDNAチップにハイブリダイズして、発現遺伝子の特徴を検索した。その結果、高転移株とそれ以外の細胞では、細胞接着、細胞外基質、細胞増殖、細胞死等に関連する遺伝子発現に一定の高低差があることが判明した。その結果とp53遺伝子変異様式の関連について検討をすすめているところである。4)唾液腺腫瘍の血管分布:唾液腺腫瘍にはその血管分布様式に特徴があり、とくに多形性腺腫、腺様嚢胞癌では、血管分布に乏しいことが判明した。これらの腫瘍では、p53遺伝子の特異的変異性が低く、腫瘍構築の成立に同遺伝子の関与が少ないことが示唆された。