hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Patch clamp法を用いた受精現象の解明

ハムスタ-の未受精卵と受精卵を使用して実験を行ったが,実験デ-タはまだ解析中のため論文発表はされていない。ハムスタ-の未受精卵ではCa^+チャンネルの開閉の頻度は非常に少くない状態にあったが,培養液中に精子を滴加すると精子が卵に進入するpenetration時に一致して,Ca^+チャンネルの開閉が著しく増加する現象が観察された.このことは今までの実験でほぼ推定されていたことではあるが.これを直接的に証明したものと考えている。次にヒト未受精卵について卵胞期と黄体期にそれぞれ区分し,子宮筋腫などにより手術を受けた患者より同意を得て実験を行った。卵胞期のヒト未受精卵のCa^+チャンネルの開閉はほとんど認められなかった。黄体期の卵では卵胞期に比しCa^+チャンネルの開閉は増加していて、受精の準備状態にあると考えられた。しかし,ヒト妊卵を使用した実験は、日本産婦人科学会の統一見解としては行なってはいけないため、今回はこのpatch clamp法を用いての実験は行えなかった。ヒトにおいてもハムスタ-とほぼ同様のデ-タが得られるとは推定されるが、直接的なデ-タは現在の所無い状態である。
糖鎖の細胞認識と癌の進展、特性の研究

1.ヒト腎癌の高転移株は低転移株に比べ、スルファチド合成酵素活性が際立つて高く、高転移株は細胞表面のスルファチドと組織の間質ラミニンとの接着を介して浸潤増殖することが強く示唆された。2.シアリルLeX(SLeX)を発現する腸癌細胞と血管内皮の接着は坑体のみならず、ヘパリン結合ドメインの合成ペプチドによっても抑制された。3.SLeXに加え新たに、SLeAもE-セクレクチンのリガンドであることを見いだし、その発現は膵癌で高かった。4.高転移性のヒト膀胱癌、腸癌細胞と特異的に接着する、各々、血管内皮と肝類洞内皮の未知蛋白を見出し、クローニングを行っている。5.動物性シアリダーゼトして初めて、ラット肝細胞質より全長をコードするcDNAのクロン化に成功し、酵素蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結果、動物シアリダーゼは既知の微生物シアリダーゼとは全く相同性がなかった。6.ラット腎より、アスパラギン糖鎖の分岐に働くGlcNAc転移酵素IIIのcDNAに引き続き、ヒトのcDNAもクローニングした。両者は全体とした92%、触媒ドメインは99%のアミノ酸配列上の相同性があった。7.ヒトのcDNAライブラリーについて、LeXやSLeX発現の鍵酵素、α1,3Fuc転移酵素(FucT-III)をクロン化したところ、その下流13Kbに新しいFucT-VIを見出した。従ってα1,3FucTは19番染色体上で接近してmulti-geneを形成しており、癌での多様な発現が示唆された。今後の研究の展開に関し、本研究で新たに三つの糖鎖関連酵素のcDNAクロン化に成功したが、これによって、癌細胞へのcDNA導入による浸潤の高進や転移抑制を調べることが可能になった。
沈み込み帯地震発生域上限付近の多様な断層運動に関する実験的研究

東北沖日本海溝で沈み込む太平洋プレート被覆層チャートの主成分であるオパールについて、封圧150 MPa、間隙水圧50130 MPa、温度23200°Cの条件で軸方向変位速度を0.1, 1, 10 μm/sの間でステップ状に変化させながら三軸摩擦実験を行い、定常摩擦強度とその変位速度依存性(正ならば安定で非地震性、負ならば不安定で地震性となり得る)に関して、以下の結果を得た。1)間隙水圧50 MPaで温度を変化させた実験から、温度上昇または変位速度低下に伴って定常摩擦強度が増大し、定常摩擦係数の変位速度依存性が減少して正から負へと変化することが明らかとなった。高温の実験後試料は基質が密で粒子間の癒着が認められ、圧力溶解の作用を示唆している。従って、温度上昇または変位速度低下に伴って圧力溶解の活動度が増大し、それに伴って粒子間の癒着が促進されて定常摩擦強度が増大し、その結果、その変位速度依存性が減少して正から負へと変化し、非地震性断層運動から地震性断層運動への遷移を促すと考えられる。2)温度50°Cで間隙水圧を変化させた実験から、軸方向変位速度0.1 μm/sの場合に間隙水圧上昇に伴って定常摩擦係数の変位速度依存性が減少し、正から負へと変化することが明らかとなった。この温度(50°C)では、最も低速な軸方向変位速度0.1 μm/sの場合に圧力溶解の影響が認められ、それにより定常摩擦係数の変位速度依存性の間隙水圧による変化が現れたものと考えられる。この結果は、非地震性断層運動と地震性断層運動の遷移領域で間隙水圧が上昇すると、定常摩擦係数の変位速度依存性が負の小さな値へと変化し、スロー地震性の断層運動を促すことを意味している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。沈み込み帯地震発生域上限付近における非地震性から地震性への断層運動の遷移を再現するため、後述する玄武岩、チャート、泥岩、砂岩の掘削・メランジュ試料について、沈み込み帯地震発生域上限付近の想定温度(50200°C)・有効圧(12120 MPa)条件下で、変位速度を0.1155, 1.155, 11.55 μm/sの間でステップ状に変化させながら三軸摩擦実験を行い、断層運動の安定性の指標であるa -b値(正ならば安定で非地震性、負ならば不安定で地震性となり得る)を得た。100°C以下の実験には、南海トラフ付加体泥岩、南海トラフに沈み込む前の海洋地殻玄武岩・被覆層砂岩、および日本海溝に沈み込みつつあるチャート、それぞれの掘削試料を使用した。一方、150°C以上の実験には、陸上に露出した白亜紀付加体メランジュ中の玄武岩、チャート、泥岩および砂岩の各試料を使用した。実験の結果、50°Cでは全試料でa - b >0、100°Cでは泥岩ではa - b >0、砂岩と玄武岩でa - b 0、チャートでa - b <0、さらに200°Cでは全試料でa - b <0となり固着すべりを示した。このように、付加体構成岩石中で温度上昇に伴って非地震性から地震性への断層運動の遷移が起こることが再現できた。また、遷移温度はチャートで50100°C、玄武岩と砂岩で約100°C、泥岩で100150°Cである。これは、地震発生域上限付近では、同一温度でも断層帯を構成する岩石によって地震性非地震性の多様な断層運動が起こることを意味する。付加体構成岩石中で温度上昇に伴う非地震性から地震性への断層運動の遷移が再現でき、地震発生域上限付近では同一温度でも断層帯を構成する岩石によって地震性非地震性の多様な断層運動が起こることが明らかとなったため。

この温度(50°C)では、最も低速な軸方向変位速度0.1 μm/sの場合に圧力溶解の影響が認められ、それにより定常摩擦係数の変位速度依存性の間隙水圧による変化が現れたものと考えられる。この結果は、非地震性断層運動と地震性断層運動の遷移領域で間隙水圧が上昇すると、定常摩擦係数の変位速度依存性が負の小さな値へと変化し、スロー地震性の断層運動を促すことを意味している。a - b値に対する間隙水圧の影響を評価する実験を行い、地震発生域上限付近の断層運動に対する間隙水圧の影響を評価する。また、実験前試料の鉱物組成分析や実験後試料の微細構造観察を行い、a - b値の温度、間隙水圧や岩質による変化が何に起因しているかを明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
F-18標識アミノ酸PETによるがん治療のモニタリング

当科で開発したF-18アミノ酸製剤F-18アルファメチルタイロシン(以下FMT)ががん治療のモニタリングに有用であるかを動物実験および臨床検査にて評価した。動物実験では直腸癌LS180を移植したヌードマウスを抗癌剤5-FU投与前と投与24時間後、さらに投与後7日目の3群に分けFDG,C-11メチオニン、FMTを各々投与し、腫瘍への集積量を測定した。その結果いずれのトレーサも5-FU投与前は高値を示し、投与24時間後の腫瘍径に変化のない時点で有意の低下を認めた。臨床的検討として肺癌8例(小細胞癌3例、非小細胞癌5例)良性肺疾患4例(サルコイドーシス2例、Mycobacteriumu aviumu complex(MAC)2例)の計12例に対し、FDG PETとFMT PETを施行した。また、小細胞癌3例についてはさらに化学療法1クール目、4クール目の計3回のPETを行い効果判定を行った。FDGはFMTより高い腫瘍への集積を示したが、良悪性の鑑別にはFDGよりFMTが優れた。また、化学療法施行中のモニタリングを行った3例の治療効果は1例がCR、1例がPRで1例はno changeであったが、治療期間中FDGは最終的な治療効果と関連なく集積が減少したが、FMTはCR例は著名に低下、PR例は低下、no change例は集積が変化せず早くから治療効果を反映するモニタが可能であった。本研究の目的は当科で開発したF-18標識アミノ酸製剤が、がん治療モニタリングに有用であるかを研究することである。本年度は動物実験として担癌ヌードマウスにおける、FDG、C-11メチオニン、F-18アルファメチルタイロシン(F-18標識アミノ酸)の生体内分布を調べた。その結果、いずれのトレーサも腫瘍内に高く集積することを確認し、今後の治療効果予測の実験の基礎データを作成した。動物実験と並行して臨床研究としては肺癌の化学療法施行例を中心にFDGとF-18アルファメチルタイロシンによるPET検査を治療前及び治療後の経過観察過程で反復施行し、化学療法と効果とPET所見の関係について検討した。現在56例であり、さらに症例を増やして検討していく計画である。動物実験では直腸癌LS180を移植したヌードマウスを抗癌剤5-FU投与前と投与24時間後、さらに投与後7日目の3群に分けFDG,C-11メチオニン、FMTを各々投与し、腸瘍への集積量を測定した。その結果いずれのトレーサも5-FU投与前は高値を示し、投与24時間後の腸瘍径に変化のない時点で有意の低下を認めた。臨床的検討として肺癌8例(小細胞癌3例、非小細胞癌5例)良性肺疾患4例(サルコイドーシス2例、Mycobacteriumu aviumu complex(MAC)2例)の計12例に対し、FDGPETとFMTPETを施行した。FDGはFMTより高い腸瘍への集積を示したが、良悪性の鑑別にはFDGよりFMTが優れた。また、化学療法施工中のモニタリングを行った3例の治療効果は1例がCR、1例がPRで1例はno changeであったが、治療期間中FDGは最終的な治療効果と関連なく集積が減少したが、FMTはCR例は著名に低下、PR例は低下、no change例は集積が変化せず早くから治療効果を反映するモニタが可能であった。
放射光とMRIを併用した高偏極希ガス凝縮系のレーザー分光と新偏極法の開発

レーザー光ポンピングにより高偏極希ガスを生成し、核スピン秩序の整った希ガス原子の液体・固体の光学応答などを、磁気共鳴映像・放射光を併用し表面原子に注目してレーザー分光学的に調べ、新たな原理による偏極希ガスの高効率な生成法の開発と偏極率の向上を目的として研究してきた。今年度は、低磁場(10mT)用に低周波(10kHz-10MHz)磁気共鳴装置を製作し、偏極キセノン原子の磁気共鳴信号を観測できるようにした。Rb原子の光ポンピングにより、キセノン原子の偏極率として約1%が得られていることを確認した。このような高偏極率が得られたのは、昨年度開発した狭帯域化高出力半導体レーザーにより、従来より弱い強度のレーザー光でも高効率に光の角運動量を希ガスに移すことができるようになったためである。今年度は、レーザー周波数の安定化・さらなる高出力化(20W)を行い、高効率な高偏極希ガスの生成を試みている。また本研究当初の目的である液体・固体希ガスの磁気共鳴計測や表面吸着偏極希ガス生成のため、Rb原子と分離したキセノンガスの偏極率をモニターしながら偏極率向上の条件を整えている。現在のところ、分離したキセノン原子の核スピン偏極率は、0.1%程度である。このような研究過程で、高密度なRb原子の電子スピンダイナミクスの偏極率・磁場・原子密度・振動磁場強度依存性を観測し、偏極希ガス生成条件におけるスピンの振る舞いを理論的に説明することができ、その一部を物理学会・学術雑誌などで発表した。レーザー光ポンピングにより高偏極希ガスを生成し、核秩序の整った希ガス原子の液体・固体の光学応答などを、磁気共鳴映像・放射光を併用し表面原子に注目してレーザー分光学的に調べ、新たな原理による偏極希ガスの高効率な生成法の開発と偏極率の向上を目的として研究している。本年度は希ガスの核スピン偏極率を向上させるため、高出力半導体レーザーの狭帯域化を行なった。半導体レーザー(マスターレーザー)に外部共振器を付加することによって線幅を狭帯域化し、そのレーザー光を2台目のレーザーに注入同期し出力光強度を増大させた。現在のところ約45GHzで3Wの光が得られているが、これはマスターレーザーの周波数の長期安定度が悪いためであり、これを改善すると単一モード発振をも得られる可能性を見いだした。しかし現在の発振周波数幅でも、高偏極希ガスの生成効率は大幅に向上した。今後、レーザー開発については、マスターレーザーの周波数安定度を増し単一モード発振をめざすとともに、強度を約20W程度まで強くする予定である。現在、希ガスとして^<129>Xeの核スピン偏極を、光ポンピングしているRb原子の偏極率を通して間接的に計測し、その偏極率の増大を確認している。本研究の当初の目的である液体・固体希ガスの磁気共鳴計測のため、低磁場中(0.1mT-10mT)の低周波(1kHz-100kHz)NMR装置を製作中である。このような研究過程で、薄型セル中または高密度なRb原子の電子スピンダイナミクスを観測し、高偏極という条件下で新たな知見を得ることができ、一部を論文で発表している。今後、高密度アルカリ金属原子の電子スピンダイナミクスと比較しながら、核スピン偏極した希ガス凝縮系のスピンダイナミクスを調べる予定である。

Rb原子の光ポンピングにより、キセノン原子の偏極率として約1%が得られていることを確認した。このような高偏極率が得られたのは、昨年度開発した狭帯域化高出力半導体レーザーにより、従来より弱い強度のレーザー光でも高効率に光の角運動量を希ガスに移すことができるようになったためである。今年度は、レーザー周波数の安定化・さらなる高出力化(20W)を行い、高効率な高偏極希ガスの生成を試みている。また本研究当初の目的である液体・固体希ガスの磁気共鳴計測や表面吸着偏極希ガス生成のため、Rb原子と分離したキセノンガスの偏極率をモニターしながら偏極率向上の条件を整えている。現在のところ、分離したキセノン原子の核スピン偏極率は、0.1%程度である。このような研究過程で、高密度なRb原子の電子スピンダイナミクスの偏極率・磁場・原子密度・振動磁場強度依存性を観測し、偏極希ガス生成条件におけるスピンの振る舞いを理論的に説明することができ、その一部を物理学会・学術雑誌などで発表した。
陽子線を用いたがんの集学的治療研究推進のための基礎研究

本研究の目的は陽子線と薬剤などとの併用による陽子線の弱点の克服も含め、他のがん治療術式との効果的な連携によるがん治療の総合的戦線構築のための集学的治療研究の基礎的研究課題を具体的に提起することである。本研究では、陽子線の線量分布の特徴を生かした1回大線量・小分割照射の妥当性の評価を課題検討における基本的視点とした。この研究の結果1.腫瘍内の線量は均一とする視点を変えた照射法により線量分布の改善がみられ、1回線量10Gy・5分割程度の照射が効果量から可能である。小児の手術と併用される骨髄照射に付随する背部変形障害の改善などのにも修正照射法が期待される。2.照射法の選定にあたり、hyperradiosennsitivityの考慮が必要であり、照射を多門化する場合のデメリットの評価が重要である。3.機能障害分析法として、^<99m>Tc-GSAによる核医学診断が期待される。4.陽子線照射では、1部高LET成分を含むことも考慮した独自の分割間隔の設定が必要である。5.Doを小さくする薬剤や温熱との併用法の開発が必要である。腫瘍高線量・正常組織低線量照射では、穏和な温熱処理や低濃度のStaurosporineなどが期待される。等の知見がえられた。1回大線量・小分割照射は可能性を秘めた照射法であり、検証が急務である。1回線量10Gy・5分割照射程度の治療が実施可能となれば、1回転ガントリ-照射装置あたり、年間8001000人程度の治療がそれほど困難ではなくなる。照射技術開発の上に、コスト・有用性評価が必要な課題となる。これらの詳細は成果報告書にまとめられた。等の知見がえられた。
鉄代謝システムの包括的理解をめざした鉄代謝関連分子の網羅的同定

本年度の研究では、予備的研究にて構築した細胞内鉄量可視化システムを用いて、細胞内の鉄量を蛍光タンパク質の発現量に変換するレポーター細胞の作出に取り組んだ。HEK293細胞に必要な遺伝子発現コンストラクトを導入し、細胞クローニングと目的タンパク質の発現・機能確認を繰り返した後に、機能的なレポーター細胞を得た。このレポーター細胞は単一の細胞に由来し、細胞内の鉄量が多い時には強い緑色の蛍光を発し、逆に細胞内の鉄量が少ない時には蛍光を発しなかった。さらに、このレポーター細胞はゲノム編集を可能とするCas9タンパク質を薬剤誘導性に発現するように工夫されている。実際に、特定のガイドRNAをレポーター細胞に導入すると、薬剤を入れた後に対応する遺伝子領域のゲノム編集が確認された。また、これと並行して全ゲノムを対象としたガイドRNAを発現するレンチウイルスライブラリーも作製した。これらの研究ツールを用いることで、未知の鉄代謝関連分子を遺伝学的な手法で網羅的にスクリーニングすることが可能となった。さらに、スクリーニングの後に得られた候補分子の分子機能解析に利用するため、細胞内鉄量が増加・減少する遺伝子変異マウスの解析も進めており、この過程で鉄代謝の肝発がんにおける役割も明らかにした。肝臓における鉄の過剰は化学発がんや肝炎ウイルスのマウスモデルにおいてがんの進行を強力に促進することがわかり、がんの病態における鉄代謝制御の重要性が示唆された。本研究では、CRISPRライブラリーを用いた遺伝学的スクリーニングを行うことで細胞内の鉄量の変化に影響を与える分子を網羅的に抽出することを計画している。この目的のためには、同一細胞にヘムエリスリンとGFP遺伝子の融合タンパク質(予備的な研究により細胞内の鉄量に応じて蛍光タンパク質の量が変化することを確認しており、スクリーニングの際の鉄量モニターの役割を果たす)、および、tetレプレッサーとテトラサイクリン誘導性のCas9発現コンストラクト(誘導性にCas9を発現させる)を導入する必要があり、本年度は次のような手順でレポーター細胞の作出に取り組んだ。1.ヘムエリスリンGFP融合タンパク質をHygromycin薬剤選択を利用してHEK293A細胞に導入し、その後単一細胞のクローニングを行った。2.得られた40以上のクローンから、鉄量によるGFP発現の変化を指標に、最適な1クローンを選定した。3.選定した細胞にtetレプレッサータンパク質(Neomycin選択)、テトラサイクリン誘導性のCas9発現コンストラクト(Blasticidin選択)を導入し、再度単一細胞のクローニングを行った。4.得られた100種以上のレポーター候補細胞の中から、Cas9の発現誘導性を指標に、5個程度の候補を絞りこんだ。5.それぞれの細胞に既知のsgRNA配列を導入し、CRISPRによる遺伝子欠損の効率を指標に最終的なレポーター細胞を選定した。これらに並行して、全ゲノムを対象としたCRISPRのsgRNAレンチウイルスライブラリー(Puromycin選択を利用して導入する)の調整も終了した。さらに、本スクリーニングで得られた候補分子の個々の分子機能解析に利用するため、細胞内鉄量が過剰となるFBXL5欠損マウス、および、細胞内鉄量が減少するIRP2欠損マウスの解析も進めている。次年度は、本年度の研究によって得られたレポーター細胞とレンチウイルスライブラリーを用いてCRISPR変異細胞ライブラリーを作出し、実際に次世代シーケンサーを利用して全ゲノムを対象としたライブラリースクリーニングを行う。本年度は、レポーター細胞の作出にあたり、2度のクローニングや個別の検証に多くの時間を要したが、本研究計画2年間のマイルストーンである「細胞内鉄代謝に影響を与える鉄代謝関連分子の抽出と機能分類」は次年度中に達成できると期待される。さらに、スクリーニングで得られた候補分子の個々の分子機能に関しても、細胞内鉄量が過剰となるFBXL5 KOマウス、および、細胞内鉄量が減少するIRP2 KOマウスを用いて検証する。

この目的のためには、同一細胞にヘムエリスリンとGFP遺伝子の融合タンパク質(予備的な研究により細胞内の鉄量に応じて蛍光タンパク質の量が変化することを確認しており、スクリーニングの際の鉄量モニターの役割を果たす)、および、tetレプレッサーとテトラサイクリン誘導性のCas9発現コンストラクト(誘導性にCas9を発現させる)を導入する必要があり、本年度は次のような手順でレポーター細胞の作出に取り組んだ。1.ヘムエリスリンGFP融合タンパク質をHygromycin薬剤選択を利用してHEK293A細胞に導入し、その後単一細胞のクローニングを行った。2.得られた40以上のクローンから、鉄量によるGFP発現の変化を指標に、最適な1クローンを選定した。3.選定した細胞にtetレプレッサータンパク質(Neomycin選択)、テトラサイクリン誘導性のCas9発現コンストラクト(Blasticidin選択)を導入し、再度単一細胞のクローニングを行った。4.得られた100種以上のレポーター候補細胞の中から、Cas9の発現誘導性を指標に、5個程度の候補を絞りこんだ。5.それぞれの細胞に既知のsgRNA配列を導入し、CRISPRによる遺伝子欠損の効率を指標に最終的なレポーター細胞を選定した。これらに並行して、全ゲノムを対象としたCRISPRのsgRNAレンチウイルスライブラリー(Puromycin選択を利用して導入する)の調整も終了した。さらに、本スクリーニングで得られた候補分子の個々の分子機能解析に利用するため、細胞内鉄量が過剰となるFBXL5欠損マウス、および、細胞内鉄量が減少するIRP2欠損マウスの解析も進めている。次年度は、本年度の研究によって得られたレポーター細胞とレンチウイルスライブラリーを用いてCRISPR変異細胞ライブラリーを作出し、実際に次世代シーケンサーを利用して全ゲノムを対象としたライブラリースクリーニングを行う。本年度は、レポーター細胞の作出にあたり、2度のクローニングや個別の検証に多くの時間を要したが、本研究計画2年間のマイルストーンである「細胞内鉄代謝に影響を与える鉄代謝関連分子の抽出と機能分類」は次年度中に達成できると期待される。さらに、スクリーニングで得られた候補分子の個々の分子機能に関しても、細胞内鉄量が過剰となるFBXL5 KOマウス、および、細胞内鉄量が減少するIRP2 KOマウスを用いて検証する。商品キャンペーンによる価格低下等の理由により当該年度予算に残額が生じたが、次年度使用額は予定していた当該年度の所要額の1割程度で、概ね計画通り予算を使用し研究が進んでいる。次年度も引き続き必要な消耗品等の物品を購入し、研究計画を遂行する。
多細胞スパイク活動の情報幾何学的解析手法の確立と実験データ解析への応用

近年、電気生理実験の発展によって、大脳皮質錐体細胞が、その膜電位を閾値直下にもつ'UP'と呼ばれる状態と'Down'と呼ばれる状態の二状態を自発的に遷移することが知られているが、このような二状態間遷移がどのようなメカニズムによって実現され、どのような情報処理を行うのかは依然わかっていない。そこで本研究者は、多様なチャネルを持つ現実的な大脳皮質神経細胞モデルを構築し、それらがAMPA型やNMDA型といったモデルシナプスを介して互いに結合し、抑制性介在細胞からのGABA型抑制を受けるような錐体細胞間ネットワークを、スパイクタイミング依存可塑性(STDP)に従う学習を行わせたときに形成される回路の動態と構造を調べた。その結果、STDPによって学習された回路において、'UP'状態への遷移が、ミリ秒レンジの精度を持った時系列を構成し、それらが数秒を隔て繰り返すような挙動を示すことがわかった。このような時系列は近年、カルシウムイメージングによって観測された皮質スライスにおけるカルシウム流入の時系列と類似している。このような回路は、H-currentを強く発現させたペースメーカーニューロンらによって駆動されるが、時系列の形成はペースメーカーと非ペースメーカーにわたって顕著な違いは見られなかった。また、学習された構造をシャッフルすることによって時系列は激減した。上記二点より、'UP'状態遷移の精緻な時系列は、ペースメーカーニューロンによって駆動された回路がそれらの入力を広範囲にわたって伝えるような回路が自己組織化されることによって生じることがわかった。研究の方向性において、大脳皮質神経活動の理解のために、神経発火の相関を実際の実験データを解析することを計画していたが、後述するような最新の知見をまず理論的に解明する方向へと修正が行われた。近年、生体内細胞内記録により、神経細胞が'UP'状態と呼ばれる発火の閾値直下の電位をもつような状態と、静止電位付近を示すような'DOWN'と呼ばれる二つの状態を自発的に遷移することが明らかにされている。このような'UP-DOWN'状態は、大脳皮質神経回路において定常的に存在し、神経情報表現の本質にも関係する、重要な機構である可能性を秘めている。しかし、大脳皮質においてそのような二つの状態間遷移が生じるメカニズムについてはよくわかっていない。そこで、皮質錐体細胞における有力な情報処理的役割を担うと思われる二状態間遷移の発生メカニズムを検討するために、大脳皮質の神経回路を詳細にモデル化し、その自己組織化過程を計算論的に調べた。その結果、こうした自発的な遷移は主に、錐体細胞間再帰入力およびH-currentの脱分極効果による'UP'状態への遷移と、M-currentおよび抑制性入力による'DOWN'状態への遷移が繰り返すことによって実現されることがわかった。その他にも、回路において'UP-DOWN'状態間遷移は同期して起こったが、'UP'状態におけるスパイクは非同期的な発火を示し、さらに、このような'UP-DOWN'遷移を可能とする再帰的入力は、STDPによって学習されたシナプスによって実現され、その際先行研究でみられるようなSTDPによるシナプス間競合は見られないというようなことがわかった。これらの結果は、論文としてまとめNeural Networks誌および日本神経回路学会誌に投稿し採録された(後者は軽微な修正中)。また、上記研究内容を学位論文として執筆し、博土(工学)の学位を取得した。
P進表現の岩澤理論

p-進表現の岩澤理論は,有理数体上の楕円曲線などの代数多様体に付随する整数論的に重要な群とゼータ関数,L-関数といった解析関数の特殊値の間のミステリアスな関係をp-進的に研究する理論である.本年度は名古屋大学の坂内健一氏と協力し,CM楕円曲線に付随するHecke L-関数の特殊値のp-進的性質の研究を行った.具体的には,それらの特殊値を係数としてもつ2変数母関数の幾何学的特徴づけを与え,その特徴づけを用いて係数の分母のp-進的振舞いを具体的に計算した.とくに楕円曲線が超特異還元をもつような素数pに関する分母のp-進的振舞いを計算した.このような素数における2変数のHeckeL-関数の特殊値の母関数の研究は,これまでまったく未知の領域であり,この研究により新しい一歩が踏み出された.この研究の途中で得られた結果を2004年7月にフランスのブザンソンで行われた岩澤理論の国際会議において発表した.国内では東京都立大学(5月),早稲田大学(7月)において発表した.p-進表現の岩澤理論は,有理数体上の楕円曲線などの代数多様体に付随する整数論的に重要な群とゼータ関数,L-関数といった解析関数の特殊値の間のミステリアスな関係をp-進的に研究する理論である.本年度は名古屋大学の坂内健一氏と協力し,CM楕円曲線に付随するHecke L-関数の特殊値のp-進的性質の研究を行った.具体的には,それらの特殊値を係数としてもつ2変数母関数の幾何学的特徴づけを与え,その特徴づけを用いて係数の分母のp-進的振舞いを具体的に計算した.とくに楕円曲線が超特異還元をもつような素数pに関する分母のp-進的振舞いを計算した.このような素数における2変数のHeckeL-関数の特殊値の母関数の研究は,これまでまったく未知の領域であり,この研究により新しい一歩が踏み出された.この研究の途中で得られた結果を2004年7月にフランスのブザンソンで行われた岩澤理論の国際会議において発表した.国内では東京都立大学(5月),早稲田大学(7月)において発表した.
シロイヌナズナAGL6遺伝子の胚珠の形態形成における役割の遺伝解剖学的研究

AGL6遺伝子関連の形質転換植物から、同一花内あるいは隣接花間で萼片の表皮細胞の合着が見られる挿入突然変異体を同定し、当該遺伝子をACE(ADEHESION OF CAL YX EDGES)と名付けた。さらに、EMSを変異原とする5つのアレルを同定した。表現型の結果、ace突然変異体では萼片の表皮細胞間で後天的合着がおきていること、萼片の表皮細胞が野生型植物の花粉管を発芽させる能力を有すること、等が明らかとなった。挿入T-DNAを用いて、ACE遺伝子をクローン化した。ゲノム・クローンおよびcDNA,クローンの塩基配列の解祈から、ACE遺伝子は6個のエクソンと5個のイントロンからなり、FAD依存の何らかの酵素蛋白質をコードしていることがわかった。予想されるACE蛋白質は、青酸合成に関わる酵素であるmandelonitrile lyase(MDL)と全長にわたって高い相同性を示した。ACE遺伝子を含む約14kbのゲノムDNA断片の導入によるace-4変異の表現型の相補を確認した。T-DNA挿入系統(ace-1)では、T-DNAはACE遺伝子の第2エクソンの3'末端付近に挿入していた。また、調べた4系統のEMS突然変異体でいずれもアミノ酸置換を伴う塩基置換を確認した。RNAブロット解析の結果、ACE遺伝子は花序(花蕾)で最も強く発現していることが明らかになった。葉・茎においても弱い発現が認められたが、根では発現が認められなかった。これは突然変異体において表現型異常が認められた部位と一致する。ACE遺伝子は第1染色体下腕にマップされた。この領域にマップされる類似の突然変異として、hothead(hth)が最近になって報告されているが、そのアレルのひとつ(hth-9)はわれわれのスクリーニングによっても同定されたもの(CS2284)であり、対立性検定の結果、異なる遺伝子座の変異であることが確認された。
荷電 K 中間子崩壊によるレプトン普遍性の破れ探索実験の解析及び補正

標準模型では電子とミュー粒子は質量以外は同様に振る舞う。これはレプトンフレーバー普遍性(LFU)と呼ばれている。本実験ではK中間子の崩壊K→μν, K→eνの崩壊分岐比をJ-PARCにおける大強度ビームによる精密測定で決定するという手法でLFUの破れの探索を行い新たな物理に迫る。本研究において、検出器群の測定値の補正を行い、エネルギー測定アルゴリズムや粒子識別アルゴリズムの開発等を行った。また、モンテカルロシミュレーションの開発を行い検出器系の理解を進めた。これらの結果、部分データをもちいた崩壊事象の計数の成功、背景事象となる構造依存の放射性崩壊による事象の選別、理解を行うことが出来た。平成27年度においてはレプトンフレーバー普遍性の検証実験(J-PARC E36実験)のデータ収集を行った。実験はJ-PARCハドロン実験施設K1.1BRビームラインに置かれたトロイダルマグネットを中心とした検出器系によって、静止K中間子の2体崩壊モードK+ →μ+ ν(Kμ2)とK+ →e+ ν(Ke2)の2種類の崩壊を測定することで行われた。データ収集は4月から5月初めまでエンジニアリングランを行い、検出器系の不具合の洗い出しを行った。その後6月に初めの物理ランを行い物理データの収集を行った。この物理ランのデータは即時解析が行われ、それにより検出器系の理解が進み更なる改良が可能となった。その結果を元にして、夏のシャットダウンの間にデータのクオリティを高めるためにトリガーに改良を加えた。トリガーの改良点は2点である。1つ目は荷電粒子が検出器系のアクセプタンスの外を通ってしまい解析できないイベントが収集されたデータに含まれることが分かったため、これを除去するために崩壊荷電粒子の軌道を制限するためのトリガーカウンターの追加を行った。2つ目はターゲットの外にK中間子が静止してしまい崩壊点の測定がうまくできないイベントがデータに含まれることが分かったため、確実に粒子がきたことを保障するためにターゲットの読み出し機器にマルチプリシティ計数ロジックを組み込んだ。この二つの仕組みは効率的に機能し有効なデータのみを収集することが可能となった。これにより単位時間当たりのデータ収集の効率を向上することが出来た。この改良された検出器系で10月半ばから12月半ばまで物理データの収集を行った。このデータ収集により約40 M個の2体崩壊イベントを収集することができた。平成27年度は大きなトラブルは無く予定通り物理データの取得を行うことが出来た。検出器の健全性、データの健全性は常にオンラインモニターと即時解析で確認を行う様な体制でデータ収集を行っているため、データのクオリティは確認されている。検出器の正確な較正を行うようなプログラムの開発、および較正作業は進行中である。物理ランでの検出器の状態や検出効率を正確に理解するための解析作業が進行中である。平成28年度においては主に検出器の信号の解析が進められた。ファイバーターゲットの理解:ファイバーターゲットのデータから静止K中間子の位置、レプトンの飛程の算出法の確立を行うことが出来た。崩壊粒子の運動量の解析:検出器システムは磁場を挟んで5箇所で崩壊粒子の位置計測が出来るようになっている。これらの位置情報をから崩壊粒子の運動量を求めることが出来る。これに関する手法を確立した。現在の運動量分解能は標準偏差で0.9%となっている。エアロジェルチェレンコフ検出器の解析: K中間子3体崩壊から放出される陽電子を利用してエアロジェル検出器の補正を行い検出効率を向上させる手法の開発を行った。検出効率98%誤認識率3%を達成できた。鉛ガラス検出器の解析: K中間子3体崩壊から放出される陽電子及びミュー粒子を利用して補正を行った。TOF(飛行時間測定法):二つのTOFカウンタ間の時間差の解析を行った。測定精度は補正後で200 ps程度である。CsI(Tl)光子検出器の解析:光子検出器からの信号は波形情報として記録されている。その波形情報からモデル関数によるフィッティングを用いて検出器で測定されたエネルギーと粒子が通った時間を求める手法の開発を行った。検出器補正のための再試験:実験データからファイバートラッカー、ファイバーターゲットの読み出しシステムに理解が困難な増幅率の減少や検出効率の低下が見られた。これらの現象の理解を行うために実験セットアップの一部の再現し、制御された光を検出器に入射を行い、どのようなことが起こるかの再現試験を行った。これにより読み出し用集積回路の理解が進み、検出効率の低下を最小にするような解析手法が確立できた。解析の進捗はほぼ予定通りに進行している。目標としていた検出器信号の理解及び補正に関しては光子検出器を除きほぼ完了した。イベントの崩壊モードの同定は出来るようになってきている。それにより、K→eνイベントが収集されていて分離できることが確認できた。光子検出器に関しても手法の確立や解析方法の開発はほぼ出来ている。後は複数の信号が同時に来た場合の合成された波形情報から適切なエネルギー、時間の抽出を行うための手法の開発であるが、ほぼ確立しつつあり、条件やパラメータの最適化、高速化などを残すのみである。Geant4を用いたモンテカルロシミュレーションの開発に関しては若干遅延しているが、既に開発されているGeant3を用いたモンテカルロシミュレーションを併用して解析は進めることが出来ている。

予定通りに実験データでは良く理解できなかったファイバーターゲット等の検出効率の低下など現象に対し、読み出し機器の再試験により機器の特性を理解することが出来、それらを補てんして解析する手法を確立できた。検出器システムの解体、撤去に関しても順調に終了した。平成29年度においては以下のような進展が見られた。入射ビームであるK中間子と崩壊粒子であるミュー粒子、電子の崩壊点を求めるためのアクティブターゲットの解析に大きな進展があり、イベントの利用効率の向上と崩壊点の測定精度を向上することが出来た。崩壊粒子の運動量を測定するためのトラッキングアルゴリズムが向上しイベントの利用効率と運動量の測定精度が向上した。さらにカルマンフィルタを用いたトラッキング手法も開発され相互チェックが可能となった。粒子識別をするために最尤法による判定を行っているが、最尤法のアルゴリズムを更新しより的確な粒子識別が出来るようになった。崩壊粒子を識別するための粒子識別検出器エアロジェルチェレンコフカウンターと鉛ガラスカウンターについて、自動的に補正パラメータを算出する手法、プログラムの開発をおこない補正が進んでいる。CsI(Tl)光子検出器の波形フィッティング手法、K中間子の2体崩壊および宇宙線ミュー粒子の崩壊を利用した補正手法の確立を行うことが出来た。この手法は現在論文にまとめられ投稿中である。モンテカルロシミュレーションライブラリGEANT4を用いた全実験シミュレータプログラムの開発が進み、検出器系の理解および系統誤差を求めるための評価が始まった。平成27年度の実験遂行時に十分に出来ていなかった中心検出器内のTOFカウンターの効率測定を補完するために、中心検出器のみ稼働させ宇宙線を使った効率の測定を行った。この測定は最終的な系統誤差の評価に用いられる。これらの解析の進展によりごく一部のデータ(300 RUN)を用いてK中間子の電子2体崩壊、電子放射崩壊などのイベントの特定、計数を行うことが出来ている。これは、全データを用いた最終結果への道しるべとなるものである。またバイプロダクト計測である暗黒光子の探索についても一部データを用いた上限値を見ることが出来た。標準模型では電子とミュー粒子は質量以外は同様に振る舞う。これはレプトンフレーバー普遍性(LFU)と呼ばれている。本実験ではK中間子の崩壊K→μν, K→eνの崩壊分岐比をJ-PARCにおける大強度ビームによる精密測定で決定するという手法でLFUの破れの探索を行い新たな物理に迫る。本研究において、検出器群の測定値の補正を行い、エネルギー測定アルゴリズムや粒子識別アルゴリズムの開発等を行った。また、モンテカルロシミュレーションの開発を行い検出器系の理解を進めた。これらの結果、部分データをもちいた崩壊事象の計数の成功、背景事象となる構造依存の放射性崩壊による事象の選別、理解を行うことが出来た。本年度は物理ランでの検出器の状態や検出効率を正確に理解するための解析作業を中心に行う予定である。
乳酸菌の新規感染阻害因子の解析

本研究では、消化管感染症起因菌に対するLactobacillus reuteriおよびLactobacillus gasseriの競合排除能力を明らかにすることを最大の目的とした。この目的のため、第一に、L. reuteri JCM1081のH. pyloriの受容体であるスルファチドの硫酸化糖鎖への付着因子を解析したところ、Ef-Tuが本菌株のスルファチドへの新規付着因子であることが強く推察された。第二に、フィブロネクチン付着性を示すL. gasseri TM333のC. jejuniに対する鶏ヒナにおける定着阻害能力を検討した。本菌株を連続7日間経口投与したところ、盲腸内のC. jejuni菌数は98%減少し、本菌株が鶏ヒナからのC. jejuniの排除に有効であることが示唆された。細菌は細胞や粘膜に付着することで消化管内に定着し、その生存を可能としている。このため、細菌の細胞や粘膜に対する付着機構の解明は、有用細菌のさらなる利用および感染症に対する新たな対処法の開発に役立つと期待される。本研究室では、Lactobatillus reuteri JCM1081株がHelicobacter pyloriのスルファチドへの付着を阻害すること、JCM1081株がスルファチドに対する付着因子として、翻訳伸長因子であるElongation Factor Tu(EF-Tu)を持つことを報告しており、その付着機構の解明を目指している。本研究では、EF-TuのJCM1081株以外の乳酸菌における細胞局在性の解析と、EF-Tu組換え蛋白質と推定受容体との結合性の評価を行うことを目的とした。EF-Tuの細胞局在を調べた結果、菌体内だけでなく、全ての菌株の菌体表層及び培養上清画分にEF-Tuが検出され、EF-Tuが菌体外に存在することが示された。また、培養上清中のEF-TuはpHの低下に伴い減少した。組換えEF-Tu蛋白質と推定受容体の結合性を測定した結果、JCM1081株、SBT2055株ともにpHの低下に伴って結合性が強くなる傾向が見られ、菌種による結合性に差は見られなかった。以上の結果から、EF-Tuの局在性及び結合性にはpHが影響を与え、細胞への付着を制御していると考えられた。Lactobacillusreuteri TM3ではスルファチドなどの糖脂質に付着能をもつこと、菌体側の付着因子としてElongation factor-TuがHelicobacter pyloriのスルファチドといったLactobacillusreuteri TM3と同一のレセプターへの結合阻害活性を示すことを明らかにしてきた。さらに、Lactobacillus gasseri TM20が培養細胞に対してCampylobactar jejuniの付着を阻害すること、また両菌共にレセプターとしてECMタンパク質であるフィブロネクチンを認識し結合することを示してきた。本研究では、EF-Tuがスルファチドの糖鎖構造である硫酸化ガラクトーヌに確実に結合することを明らかにするとともにL.reuteriとL.gasseriのC.jejuniへのin vivo感染阻止効果を明らかにすることを目的とした。L.reuteriとL.gasseriからEF-tu遺伝子をクローニングし、組換えタンパク質として得た。次いで表面プラズモン共鳥法によって、EF-Tuと硫酸化ガラクトースおよびフィブロネクチンとの結合性を検討し。その結果、結合力に差ほあったが両菌株由来EF-Tuはともに酸性条件で硫酸化ガラクトースおよびフィブロネクチンに確実に結合することが明らかになった。次いで両菌株のC.jejuniへのin vivo感染阻止効果を雛を用いて検討した。雛盲腸内容物におけるC.jejuniの菌数を測定した。乳酸菌投与後7日目では、非投与区では1.48×10^5CFU/g、C.jejuni投与区で2.87x10^8CFU/g、TM3投与区で622×10^7CFU/g、TM20投与区で5.15×10^6CFU/gであった。非投与区では、C.jejuniの菌数の変化はほとんど確認されず、さらにC.jejuni投与区では増加し、TM3投与区では投与後3日目とあまり変化はなかったが、TM20投与区においてはC.jejuniのみ投与区と比較して減少し有意な差(p<0.05)が確認された。これらの結果から、C.jejuniの受容体に結合性を示す乳酸菌は、in vivoでの感染阻止効果を示すことが強く示唆された。

最近、問題化している腸管感染症は経口的に感染し、その予防は衛生対策を施す以外、確実な手段がなく、感染症予防対策は、医学領域にとどまらず幅広い領域で求められている。本研究では、申請者がin vitroで明らかにしてきた乳酸菌のCampylobacter jejuniおよびHelicobacter pylori(ピロリ菌)に対する感染阻止効果を取り上げ、その分子メカニズムを明らかにするとともに、in vivoでの効果を検討することを目的とする。H21年度までにL.reuteriの産生するピロリ菌感染阻止因子(硫酸化ガラクトース結合タンパク質)の精製を試み、遺伝子レベルでの同定を試みてきた。その結果、ピロリ菌感染阻止因子は、驚くべきことに翻訳伸長因子であるEf-tuであることが示唆された。一方、L.gasseriが産生するC,jejuniの腸上皮やフィプロネクチンへの接着抑制因子の解析を進めたところ、L.reuteri同様にEf-tuがその付着に関与していることが示唆されたことに加え、細胞表層タンパク質であるAggregation-promotingfactor(APF)の付着への関与が示唆された。また、両菌種のEf-TはpH依存的に細胞外へ分泌されることおよび細胞へ付着することがが明らかにされた。さらに、H22年度には、L.reuteriのEf-Tuが確実に硫酸化ガラクトースや細胞への付着に関与していることを明らかにするとともに、L.gasseriとL.reuteriのC.jejuniへのin viro感染阻止効果を解明してきた。その中で、L.reuteriのEf-TuがC.jejuniの感染阻止において重要な役割を果たしていることが示唆されたきた。H23年度は、L.gasseriのフィプロネクチンへの結合機構を解析することとした。L.gasseriの特定の株を解析したところ、S-layerと類似した特徴をもつ2種類のAPF)が発現されており、Fnへの付着に関与していることが示唆された。高い相同配列を持つ2種類のAPFのFnに対する付着への寄与について詳細を明らかにするため、それぞれのAPF欠損株を作製してFnへの付着性を調べたところ、apf1欠損株のFnへの付着性は野生株と比較し有意に低下したが(p<0.01)、apf2欠損株とapf1相補株は付着性を維持した。以上から、APF1がFnへの付着に大きく関与していることが示唆された。
関節リウマチのTh17細胞分化におけるWnt/カテニン-SGK1経路の役割の解明

抗IL-6受容体抗体(アクテムラ)の投与前後で関節リウマチ患者のCD4陽性T細胞における遺伝子発現をDNAマイクロアレイを用いて網羅的に比較したところ、著効例においてWnt/βカテニンシグナルの下流に位置するSGK1、DACT1、Myc等の発現が有意に低下していることを見出した。さらにβカテニンのチロシンリン酸化を調整するポリアミンの代謝経路において重要な酵素であるSAT1の発現が低下していることを見出した。本研究者はマウスTh17細胞にSAT1が高発現していることも見出しており、Wnt/βカテニンシクナルがポリアミン経路を介してTh17細泡の分化あるいは維持に何らかの役割を果たしていることが示唆された。そこで本研究はTh17細胞の分化および機能発現におけるWnt/βカテニンシクナルの役割を解明することを目的とした。まず、ポリアミン代謝の上流にあるオルニチン脱炭酸酵素の阻害薬であるDFM0をTh17細胞分化条件に添加したところ、濃度依存的にIL-17A産生細胞が減少した。一方、Foxp3陽性細胞分化条件ではFoxp3陽性細胞に変化は認められなかった。さらにTh17細胞分化条件にDFMOを添加した際の転写因子の発現を検討したところ、Th17細胞分化に重要なRORgtの発現は低下していたが、BATF,Foxp3,T-betの発現に変化は認められなかった。また、このDFMOによるTh17細胞分化の抑制はオルニチン脱炭酸睦素の下流にあるプトレシンの添加により解除された。以上の結果からオルニチン/ポリアミン代謝経路はTh17細胞分化に重要な機能を果たしていることが明らかとなった。現在、Th17細胞が重要な役割を果たしている実験的脳脊髄炎モデル(EAE)を用いてTh17細胞依存的病態におけるポリアミン代謝経路の役割を検討中である。IL-6シグナルを選択的に阻害する生物学的製剤アクテムラを投与した関節リウマチ患者において、アクテムラ投与前後でCD4陽性T細胞における遺伝子発現をDNAマイクロアレイを用いて比較したところ、著効例においてWnt/βカテニンシグナルの下流に位置するSGK1、DACT1、Myc等の発現が有意に低下していることを見出した。さらに我々はマウスTh17細胞にSGK1が高発現していることも見出しており、Wnt/βカテニンシグナルがTh17細胞の分化あるいは維持に何らかの役割を果たしていることが示唆される。また、SGK1はFOXO3aの抑制を介してT細胞メモリーに関与することが示されており、Wnt/βカテニンシグナルはメモリーTh17細胞の分化誘導に関与していることも示唆される。そこで本研究ではTh17細胞の分化および機能発現におけるWnt/βカテニンシグナルの役割を解明することを目的とした。まず、マウスCD4陽性T細胞をTh17細胞誘導条件下で培養した際のWnt/βカテニンシグナルの標的遺伝子(Myc, Axin)の発現を定量的PCR法で検討したところ、いずれの遺伝子の発現も有為に高いことが明らかとなり、Th17細胞ではWnt/βカテニンシグナルが亢進していることが示唆された。さらにTh17細胞分化におけるSGK1の役割をSGK1阻害薬を用いて検討したところ、SGK1阻害薬はTh17細胞の分化を抑制することが明らかとなった。現在、SGK1阻害薬がTh17細胞の分化を抑制する分子機構を解析中である。平成23年度の研究では、in vivoの解析の達成度は不十分であったが、Th17細胞分化におけるWnt/βカテニンシグナルの役割に関するin vitroの解析は予定以上に進展した。以上より、研究計画全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。

Th17細胞でWnt/βカテニンシグナルが亢進していること、SGK1がTh17細胞分化に関与していることを確認できたことから、RNAiノックダウン法によるWnt/βカテニンシグナルの標的遺伝子の機能解析およびTh17細胞分化におけるWnt/βカテニンシグナルの作用点の解析を進めるとともに、Tcf1欠損マウスと活性型βカテニントランスジェニックマウスをもちいたin vivoの解析に着手する。関節リウマチ患者の関節液中CD4陽性T細胞の解析も計画している。研究費は上記研究に用いる制限酵素、培養液、牛血清、各種抗体等の消耗品として使用する予定である。
チャータースクールとCMOsの「公ー私の連携」に関する実証的研究

本研究は、アメリカのチャータースクールとCMOs(Charter Management Organizations)の連携、いわゆる「公-私の連携」の構造を明らかにすることを目的としている。2019年度は連携に関する分析枠組みの設定と、2020年度実施予定の海外調査(主にカリフォルニア州)の準備をする。2020年度は設定した分析枠組みをもとに、海外調査を実施し、チャータースクールとCMOsの教職員に対して、学校運営や教育実践等に関わるインタビュー・質問紙調査を実施、分析、そして研究成果の公表をする。2021年度は追跡調査を実施しながら、収集したデータ分析と研究成果の発表に努める。
ロタウイルスVP7に対するアプタマーの作成

ロタワイルスは乳幼児の重症下痢症の原因として最も車症なワイルスである。ロタウイルスの外郭蛋白の1つであるVP7は中和抗原を誘導する抗原である。本研究はロタウイルスの主要な5つの血清型(G1,G2,G3,G4,G7)のVP7に対するDNAアプタマーの作成法の確立を目的とした。我々は昨年,バキュロウイルス発現系を用いてロタウイルスの主要な5つの血清型の外郭蛋白であるVP7を大量に発現した。大量に発現したそれぞれのVP7蛋白をNi-NTA法を用いて精製しウエスタンブロット法にて確認した。HNS-activated Sepharoseを用いて発現,精製したタンパク質をカラムと結合し,アプタマーに対する結合基質として使用した。60base長のランダム配列のオリゴヌクレオチドを合成し,精製した個々のVP7タンパク質に対するアプタマーの作成を試みた。カラムに結合した蛋白質とランダム配列のオリゴヌクレオチドとの結合,洗浄,溶出を繰り返し施行したが,選択されたすべてのアプタマーの特異性は非常に低く,特異性の高いアプタマーの作成は困難であった。現在,結合・溶出の回数を増やす,あるいはTAクローニング法を使用し作成されたアプタマーから特異性の高いものを再選択する研究を継続中である。本研究はヒトロタウイルスの外郭蛋白質に対するアプタマーを作成するはじめての試みであったが,アプタマーの作成は可能であるものの,その選択法は更なる改良が必要であると考えられた。ロタウイルスは乳幼児の重症下痢症の原因として最も重要なウイルスである。ロタウイルスの外郭蛋白の1つであるVP7は中和抗体を誘導する抗原である。一方、アプタマーは短鎖の一本鎖オリゴヌクレオチドで、特定の物質と結合あるいは何らかの作用を有するものである。本研究ではヒトに感染する主要な5つの血清型(G1,G2,G3,G4,G9)のロタウイルスVP7に対するDNAアプタマーの作成法の確立を目的としている。本年度に実施した研究の概要を以下にまとめる。1.5つの血清型に属するロタウイルスの代表株をMA104細胞にて培養2.Plaquepurificationを3回繰り返して単一のウイルスを選択3.培養上清よりロタウイルスRNAを抽出4.RT-PCR法によりロタウイルスVP7の全領域を増幅5.増幅したPCR産物のシークエンス6.バキュロウイルス発現ベクターにクローニング7.遺伝子組み換えバキュロウイルスの大量培養によりロタウイルスVP7を大量に発現ロタウイルスのVP7の全長をnativeなウイルスの配列のままバキュロウイルスの発現系に組み込んでも血清型にかかわらず蛋白の発現が可能であった。しかしながら、5つの血清型の違いにより発現量にかなりの相違を認めるため、発現量が低いものに関してはプロモータ配列の改変等を考慮する必要がある。今後は、発現した蛋白質を精製し、それぞれの血清型を特異的あるいは非特異的に認識するDNAアプタマーの作成、選択、評価を行う予定である。