hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疼痛疾患モデル一次性感覚ニューロンに認められるミトコンドリア異常の解析

マウスのwhisker padに10 mMカプサイシンを30分間作用させてTRPV1刺激を6日間行った。刺激と同側の三叉神経節の切片を作成して電子顕微鏡でミトコンドリアの観察を行った。なお、三叉神経節採取のタイミングは2, 4, 6日間投与完了の24時間後とした。2日投与では特に形態異常は認めなかったが、4日投与では主として小型の三叉神経ニューロンで内部構造の破壊を呈したミトコンドリアが確認された。しかし、6日間投与後にはニューロン内のミトコンドリア形態はほぼ正常であった。以上のことから、何らかの修復機構が作動するものと考えられた。細胞実験からミトファジーの機能が重要であることがわかった。本研究の目的は、代表的な疼痛疾患動物モデルを作成し、一次感覚ニューロン(primary sensory neuron: PSN)のミトコンドリアにどのような変化が引き起こされているかを解析することである。本研究の実施方法であるが、培養細胞のアッセイを用いた系と齧歯類頭痛モデルの系を用いた実験に二分できる。基礎的なデータを得るためにも、侵害性刺激の受容に関与するTRPV1 (transient receptor potential vanilloid subfamily, member 1)を安定的に発現するPC12クローンを用いた研究を先行させた。生細胞のミトコンドリアの染色には、MitoTracker Red CMXRosを用いた。TRPV1発現は、GFPの融合蛋白としてベクターを作成してあるので、蛍光顕微鏡で確認できる。TRPV1のアゴニストであるカプサイシン(10 microM)を培養液に加えたところ、3時間後にミトコンドリア数はvehicle (0.1% DMSO)を加えた群に比較して減少を認めた。カプサイシンの効果がTRPV1を介した反応であることを確認するために、TRPV1の阻害薬であるカプサゼピン(50 &#61549;M)を前投与したところ、ミトコンドリア数の減少は阻害された。一方、カプサイシンを24時間作用させた細胞では、ミトコンドリア数はvehicle群と比較して有意な変化を呈さなかった。これは、ミトコンドリアの新生が生じたためと推察している。動物自験では、侵害受容性疼痛モデルを作成し、三叉神経節標本で、電子顕微鏡観察を行った。その結果、オートファジーの誘導が2日後より観察された。空胞の一部にミトコンドリアも認められた。6日後には、オートファジー誘導は鎮静化していたが、小型のミトコンドリアが目立ち、ミトコンドリア新生が生じているものと推察された。本年度は、実際の慢性片頭痛に近い動物モデルの三叉神経領域感覚機能評価の確立を主目標にした。炎症スープ(セロトニン・PGE2・ブラジキニン)を硬膜に局所投与することにより炎症惹起による慢性片頭痛モデルを作成した。同モデルにおいて三叉神経第1枝領域に起こる感覚異常を、熱疼痛閾値の変化を指標に検出を試みた。当初はStoelting社のOrofacial Pain Assessment Device (OPAD)を用いた。これは、バーを押しのけるとミルクが飲めることで条件付けを行い、バーの温度を変化させることでwhisker pad付近の熱疼痛閾値を測定する系である。本法は解析ソフトと連動していて定量評価は可能であるものの、学習能力が結果に反映される。TRPM8KOマウスでは条件付けが野生型と比較して不良であることが判明した。そのため、独自で開発した頭部固定装置にマウスを設置した後に、Peltier素子による可変温度パッドをwhisker padに押し付けてマウスに誘発されるのけ反り行動をビデオ解析することによって学習によらない感覚評価法を確立した。これと並行して、同動物モデルの三叉神経節と脳幹を摘出し、電子顕微鏡によるミトコンドリア形態変化観察を進めている。さらに、本年度は皮質拡延性抑制(CSD)によるニューロンからのHMGB1 (high-mobility Group Box 1)の放出が、CSDの回数依存的に高まることを明らかにした。さらに、放出されたHMGB1はミクログリア上に存在するTLR2/4に作用して関連シグナル伝達機構であるMyD88とIRAK4を活性化して、ミクログリア肥大を引き起こすことを明らかにした。肥大ミクログリアでは、リソソーム加水分解酵素カテプシンDの発現が上昇していた。電子顕微鏡観察によりオートファジーの関与についても解析を進めている。動物モデルの評価法について、前述のように遺伝子改変マウスの解析に困難を感じていたが、解決した。電子顕微鏡観察用のサンプル作成も順調に進んでいる。CSDによる大脳皮質ニューロンからのHMGB1放出がミクログリアの形態変化を引き起こす原因になっていることを明らかにして、当該分野に権威あるジャーナルCephalalgiaとJ Cereb Blood Flow Metabに論文を発表できた。マウスの顔面に10 mMカプサイシンを浸した濾紙の貼付を30分間連日行うモデルでTRPV1刺激を行った。その結果、4日後には小型の三叉神経節ニューロン内のミトコンドリア内部構造の変化が生じると同時に、オートファゴソームの出現と、オートファゴソームとリソソームの融合が生じて、障害ミトコンドリアが細胞質から除去されていることが観察された。一方、6日後には形態異常を呈するミトコンドリアは著明に減少し、オートファゴソームの出現は認められなくなっていた。

これらの結果から、TRPV1の間欠的刺激を行ってから46日の間にオートファジーによる障害ミトコンドリアの除去が起こると同時に、ミトコンドリア新生が行われることで細胞内のミトコンドリア機能が回復していることをが推察される。そこで、神経系でのみオートファジー誘導が阻害されているマウスを用いて同様のTRPV1刺激を行い、ミトコンドリアの形態変化を含めた微細構造を観察予定である。Nestin遺伝子のプロモーター下にCreリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウス(Nestin-Cre)と、オートファジー誘導に必須なATG5の遺伝子がloxP配列で挟まれた遺伝子改変マウス(floxed ATG5)を交配して、神経系でのみオートファジー誘導が阻害されているマウスを入手した。対照にはfloxed ATG5遺伝子を持つがCre recombinase遺伝子を欠くマウスを用いている。平成29年度には、これらのマウスにカプサイシンによるTRPV1刺激を行った際に、侵害受容に関わる小型三叉神経節ニューロンにいかなる形態異常が引き起こされるかを電子顕微鏡を用いて解析する。これと並行して、内因性のTRPV1アゴニストとして脳内に広く分布するアナンダマイドでTRPV1刺激を行った時に、ミトコンドリア形態にいかなる変化が生じるかを株化細胞で検討していく。in vivoの実験では、電子顕微鏡に用いる三叉神経節組織のサンプリングを行っている状況である。Nestin-Cre/floxed ATG5マウスの交配はほぼ順調にいっているが、生後発育が悪く、顎が小さいなどの奇形があり食物摂取が十分でないために死亡する個体があり、実験対象となる個体の確保が若干遅れている。論文発表としては、Parkinson病の病態との関連を調べるために、TRPV1発現株化細胞にalpha-sunycleinを共発現させた上で、カプサイシン刺激を行って、細胞内ミトコンドリア数とalpha-sunyclein発現量の変化を解析した論文が80%程度完成しており、平成29年度中に投稿予定である。熱疼痛刺激やカプサイシン刺激で活性化されるTRPV1を刺激した際にミトコンドリアにいかなる影響を与えるかを検討した。TRPV1を発現するPC12細胞にカプサイシン刺激を行うと、ミトコンドリア障害が生じることを確認するためにミトコンドリア蛍光染色と電子顕微鏡観察を行った。カプサイシン投与量依存性に染色されるミトコンドリアは減少しており、さらに電子顕微鏡像では低用量カプサイシン刺激ではミトコンドリア膨化を、高容量カプサイシン刺激ではミトコンドリア破壊像が確認された。同時にオートファジー発生のマーカーである微小管関連蛋白質(microtubule-associated protein)LC3のウエスタンブロットではカプサイシン用量依存性にオートファジー誘導が生じていることが明らかとなった。
非定常ドップラーシフトを伴うマルチパス環境下での水中音響通信の研究

本研究では、非定常ドップラーシフト環境下でのマルチパス環境が水中音響通信にもたらす影響についてシミュレーションによって解析し、通信条件などへの依存性を検証する。さらに、それに対して有効な新規手法を提案する。また、水槽実験、海域試験によって提案手法の有効性を実証する。本年度は、非定常ドップラーシフトを伴うマルチパス環境を反映した伝搬シミュレータを製作し、帯域幅や動揺状況を変数としたパラメトリックスタディーを実施した。結果として、非定常ドップラーシフトを伴った直接波、およびマルチパス波の影響は、動揺の大きさや動揺の速さだけでなく、通信で用いている帯域幅にも依存している事が判明した。単一搬送波を用いた水中音響通信では、通信のデータシンボルごとにチャネルレスポンスの推定を更新するのだが、帯域幅が大きい時、そのデータシンボルの間隔が短くなる。本年度のシミュレーション結果は、広い帯域幅での通信では、チャネルレスポンス推定の間隔が短くなるため、非定常ドップラーシフトへの追従の面で有利となる事を定量的に示している。加えて、Frequency Division Multiple Access(FDMA)方式を用いた水中でのマルチユーザー通信では、原理的にユーザー数に比例して帯域幅が狭くなる事が知られている。本年度の研究結果は、そのような狭帯域通信の場合に、非定常ドップラーシフトの影響が大きくなる事を示唆している。また、上記の結果を踏まえて、非定常ドップラーシフトに対して有効と思われる新規手法を考案し、同条件での動揺を加えた通信シミュレーションを実施した。次年度に、その評価を進める予定である。さらに、本年度に受波器アレイの台座を製作した。次年度、製作した台座を用いて水槽実験を実施する予定である。さらに、次年度の水槽試験のための準備のうち、音響信号収録で用いるソフトウェア開発に着手した。シミュレーションの解析結果は得られ、従来手法での評価は完了した。加えて提案手法の有効性も概ね確認されているが、改善効果のより詳細な解析が一部残っている。一方、次年度の水槽試験の準備に関しては、当初の予定にはないソフトウェア開発に着手できている事から、総合的に見て概ね順調と考えられる。次年度は、水槽試験を実施する予定である。本年度に得られたシミュレーションの解析結果を反映して、主にピッチ、ロールを模擬した運動を与える予定である。当初の予定よりわずかに受波器アレイ製作費が安価であったため。次年度の水槽実験における消耗品に使用する予定である。
トランスジェニック・シロイヌナズナを用いた植物転写因子の機能解析

本研究は、コムギヒストン遺伝子の転写調節に関わるbZIP型転写因子HBP-1bの機能を、その解析に必要な遺伝学的実験方法の開発を行ないつつ明らかにしていくことを目的としている。その第一段階として、本年度では、コムギヒストンH3遺伝子がシロイヌナズナの植物体内でどのように発現するのかを調べ、計画した実験が可能かどうかを検討した。コムギヒストンH3遺伝子のプロモーター領域を、大腸菌グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子のコード領域の上流につないだ。それをレポーター遺伝子として形質転換シロイヌナズナを作製し、異なる10個体以上の形質転換植物におけるGUS遺伝子の発現の様子を、発生段階をおって組織化学的に解析した。その結果、GUS遺伝子の発現が、すでに報告されているイネやコムギでのそれと同様のパターンを示した。このことから、単子葉植物であるコムギのヒストンH3遺伝子の発現制御機構を、双子葉植物であるシロイヌナズナを用いて解析できることが確かめられた。今後は、まず、bZIP型転写因子HBP-1bあるいはそのアンチセンスRNAを大量に発現させるためのエフェクター遺伝子の作製、及びそれを持つ形質転換シロイヌナズナの作製を行ない、エフェクター遺伝子の大量発現がシロイヌナズナの発生過程にどのように影響するのかを調べる。次に、レポーター遺伝子とエフェクター遺伝子を持つ形質転換シロイヌナズナの交配を行ない、HBP-1bあるいはそのアンチセンスRNAの大量発現が、植物体内でレポーター遺伝子の発現どのように影響するのかについて調べる。現在、エフェクター遺伝子の作製を行なっている。しかし、HBP-1bあるいはそのアンチセンスRNAの大量発現が大腸菌の生育にマイナスに働くためと思われるが、なかなか思うようには進んではおらず、さしあたりその克服に力を入れていく。
膠細胞腫瘍内浸潤樹状細胞の脳特異的分化・成熟機序の解明

単球,マクロファージとともに広義に樹状細胞を含む概念である腫瘍内浸潤食細胞系(腫瘍内MPC)は,その大半が単球マクロファージに分類され,表面抗原上樹状細胞に分類できる細胞は少ないことが分かった。また,最近報告されている骨髄球由来抑制細胞(MDSC)との異同についての検討では,腫瘍内MPCが,強いT細胞増殖抑制能(アポトーシス誘導能)があり,表面抗原でもCD11b陽性Gr-1陽性という定義に当てはまるため,広義のMDSCの定義にも当てはまる可能性があったが,細かく細胞を検討した結果, 7割ほどは既にマクロファージへ分化しており,マクロファージとしての抗腫瘍活性もT細胞抑制機能と同時に併せ持つことが分かった。他方,マクロファージへ分化していない単球の特性を維持している段階の腫瘍内MPCには抗腫瘍免疫誘導作用があり,皮下にその細胞を樹状細胞ワクチンとして接種してから頭蓋内に腫瘍を接種すると生存日数が延長することが分かった。つまり,腫瘍内に浸潤して間もない単球分画には単球由来樹状細胞へと分化する能力があることが示唆された。ただし,皮下,頭蓋内,肝内で腫瘍内MPCを検討した結果では,腫瘍の接種部位が異なっても腫瘍内MPCの特徴は明らかな差異が見られなかったが,腫瘍の種類が違うと,差異がみられた。従って腫瘍の発育する環境というよりは,腫瘍から産生される因子による方が,腫瘍内MPCの分化には強く影響することが分かった。そこで,腫瘍の微小環境を免疫治療によって変化させてみた場合,対照群では大きく腫瘍内MPCの分化成熟に影響を及ぼしていなかったCD4陽性細胞が,免疫治療モデルでは,腫瘍内浸潤MPCの分化成熟に影響していることがわかった。さらに検討をすると,免疫治療モデルでは,腫瘍内浸潤CD4陽性T細胞の性格が,Th2よりもTh1優位になっているからであることが分かった。本年度腫瘍内浸潤単核食細胞系(mononuclear phagocytic system : MPS)の分化と特徴を解析し,どのようにすれば,腫瘍内浸潤樹状細胞を効率よく単離できるか検討した。MPSは,広義で樹状細胞(DC)とアクロファージに分けられ,樹状細胞はコンベンショナルDCと形質細胞様DC,マクロファージは浸潤型マクロファージと常在型マクロファージ,にそれぞれ分けられる。我々の系では,コンベンショナルDCは非常に少なく,回収した形質細胞様DCも,予想通りあまり強く活性化分子(例えばCD80やCD86)を発現しておらず,未熟な樹状細胞であった。また,樹状細胞を単離するにあたり,当初の予測どおり,マクロファージの除去が不可欠であったが,除去によって得られた腫瘍内浸潤マクロファージ有効に用いることで業績に挙げた結果を得た。つまり,(1)脳接種腫瘍内浸潤マクロファージ(TAM)は,膠細胞腫瘍GL261をTAM表面の細胞表面型TNFを介して殺傷している可能性が高い。(2)単離したCD11b陽性細胞は浸潤型と常在型のマクロファージを含むため,さらに解析したところ,大半が浸潤型のマクロファージであった。(3)また,単離したTAMは接種したGL261や大腸癌細胞株MCA38の接種臓器による差異は少なく,むしろ腫瘍の種類そのものにより,強く分化が影響される。以上の結果から,腫瘍内浸潤マクロファージは由来は単球由来で臓器による差異は無いものの,その臓器特異性が少なからず存在する可能性が示唆された。

この結果を参考にして腫瘍内浸潤樹状細胞の臓器特異性を現在検討中であるが,幸いにも緑の蛍光を発するGreen fluorescence Protein(GFP)マウスが手に入ったため,それらも駆使して,腫瘍内浸潤未熟樹状細胞が臓器特異的に分化したり,遊走する可能性があるかさらに次年度以降検討する予定である。1)樹状細胞は通常型DC(cDC)と形質細胞様DC(pDC)に分けられるが,そのいずれもほとんど存在しない。他方,腫瘍内のMDSC,マクロファージ群は,樹状細胞のマーカー分子であるCD11cを多数発現し(皮下,脳内いずれもほぼ同様),マクロファージ系のマーカーであるF4/80も発現していた。2)上記のMDSC,マクロファージ群は,培養すると紡錘形から類円形を呈し,強い接着性とNitric Oxide(NO)の産生やArginase Iの産生を認めた。つまり樹状細胞のマーカーをMDSC-マクロファージ系細胞も発現すると分かった。3)他方pDCに発現していると言われるPDCA-1も上述のMDSC-マクロファージ系は発現しており,今まで報告されてきたPDCA-1を用いた腫瘍内の樹状細胞の実験は実はMDSC-マクロファージ系なのではないかと思わせる。マクロファージには従来より,二面性があり免疫抑制性の性格(MDSCの機能)と,TNFを介した抗腫瘍活性(昨年度に報告)や,抗原提示能などがある。もしかすると,腫瘍内浸潤樹状細胞と報告された細胞のうちいくつかは腫瘍内浸潤単球-マクロファージ系の細胞の持つ抗原提示能をみていたのではないかと推察された。本結果は本年5月発刊の米国白血球細胞学会誌にMDSC-マクロファージ系の部分が掲載予定であり,さらに2008年4月の米国癌学会に樹状細胞としての項目を報告予定である。本年度は,樹状細胞が腫瘍内にほとんどないことを証明し齊尾が学会発表した。また,最近話題となっている骨髄球由来抑制細胞(MDSC)の概念と旧来からのclassical(M1型:抗腫瘍性の特徴を持つ)とalternative(M2型:腫瘍の増殖を助ける)活性化の概念の両方に基づいて腫瘍内浸潤食細胞の特徴が検討した。腫瘍内浸潤食細胞は概念上MDSCの定義に当てはまった。また,旧来からの報告では腫瘍内浸潤食細胞は単にM2型であるといわれていたが,本研究からむしろM1型のM2型の特徴を併せ持つように多面的に活性化することが示唆された。次に腫瘍内浸潤食細胞がマクロファージへと分化することが抑制できるか検討した。IL-2と可溶型TNFII型受容体(sTNFRII)の遺伝子導入腫瘍のモデルを用い,腫瘍内浸潤食細胞(単球/マクロファージ)の成熟に及ぼす遺伝子治療の影響を検討した。食細胞の成熟度はIL-2とsTNFRIIの共導入群で最も抑えられ,共導入群由来の食細胞は他群と異なり細胞死に陥りやすかった。その細胞死にはFasやM-CSF受容体の発現抑制が関与していた。共導入群の腫瘍内に浸潤するCD4T細胞はIFNγ優位となり,CD4T細胞を腫瘍環境から除去すると,共導入群における食細胞の成熟は完全に抑えられた。実際に免疫治療モデルで,明確に腫瘍内浸潤CD4T細胞の食細胞成熟への関与を証明した。次に皮下と頭蓋内の食細胞系の比較を行った。
有機ヘテロ原子化学の基礎と応用

本総合研究(B)は60・61年度に採択された総合研究(A)「ヘテロ原子の反応と有機金属錯体の反応の接点の探究」(研究代表者秋葉欣哉)の成果をさらに発展させ,本研究分野に対する国内外の関心の高まりと緊急性を調査・研究し,国内における研究態勢の整備と活性化の方策を検討するために行われた.具体的な討論の対象として以下の5項目をとりあげた:(i)第三周期典型元素,(ii)ハロゲン系元素,(iii)非金属典型元素,(iv)金属性典型元素,(v)典型元素と遷移金属との比較.62年7月に,IUPAC主催による国際会議「第1回ヘテロ原子化学国際会議」が神戸で開催され,プレコンフェランスが宇部で行われた.これら国際会議の対象とする分野がまさに本研究のそれと合致していたので,宇部において研究連絡会を開催し,さらに大多数の班員が神戸の本会議に参加し,本研究に関して種々の討論を行った.米国および欧州における有機典型金属化学および有機ヘテロ原子化学に関する最近の急速な研究の発展状况の報告・わが国における関係分野の討論会の活動状况・わが国研究者の海外での活躍と評価・有機典型元素(ヘテロ元素)化学の新規性と発展性・有機遷移金属化学との関連性などについて報告と討論が行われた.これらにもとづきわが国における研究態勢の整備と充実をはかり,世界の第一線をリードする役割をになうために,重点領域研究を申請することになった.あわせて本研究の報告書を作製した.その後の調査・研究の成果をふまえて,64年度発足をめざした重点領域研究「有機典型元素化合物の異常原子価」を提出した.これには4項目の主要研究項目がたてられている:(A)高配位有機典型金属化合物の異常原子価,(B)高配位有機ヘテロ原子化合物,(C)低配位有機典型元素化合物,(D)典型金属と遷移金属化合物の接点.本総合研究(B)は60・61年度に採択された総合研究(A)「ヘテロ原子の反応と有機金属錯体の反応の接点の探究」(研究代表者秋葉欣哉)の成果をさらに発展させ,本研究分野に対する国内外の関心の高まりと緊急性を調査・研究し,国内における研究態勢の整備と活性化の方策を検討するために行われた.具体的な討論の対象として以下の5項目をとりあげた:(i)第三周期典型元素,(ii)ハロゲン系元素,(iii)非金属典型元素,(iv)金属性典型元素,(v)典型元素と遷移金属との比較.62年7月に,IUPAC主催による国際会議「第1回ヘテロ原子化学国際会議」が神戸で開催され,プレコンフェランスが宇部で行われた.これら国際会議の対象とする分野がまさに本研究のそれと合致していたので,宇部において研究連絡会を開催し,さらに大多数の班員が神戸の本会議に参加し,本研究に関して種々の討論を行った.米国および欧州における有機典型金属化学および有機ヘテロ原子化学に関する最近の急速な研究の発展状况の報告・わが国における関係分野の討論会の活動状况・わが国研究者の海外での活躍と評価・有機典型元素(ヘテロ元素)化学の新規性と発展性・有機遷移金属化学との関連性などについて報告と討論が行われた.これらにもとづきわが国における研究態勢の整備と充実をはかり,世界の第一線をリードする役割をになうために,重点領域研究を申請することになった.あわせて本研究の報告書を作製した.その後の調査・研究の成果をふまえて,64年度発足をめざした重点領域研究「有機典型元素化合物の異常原子価」を提出した.これには4項目の主要研究項目がたてられている:(A)高配位有機典型金属化合物の異常原子価,(B)高配位有機ヘテロ原子化合物,(C)低配位有機典型元素化合物,(D)典型金属と遷移金属化合物の接点.
筋内化学受容器を選択的に刺激する運動トレーニングが血圧調節におよぼす影響

筋内代謝受容器を選択的に刺激する運動プロトコールを行った時の循環及び各種ホルモン動態を検討し、このような運動プロトコールの生理的意味を明らかにする事を目的とした。8名の健康な男子大学生が最大筋力の50%の筋力で1分間の持続的なハンドグリップ運動を行い、その運動終了直前に上腕を阻血して3分間保持した。阻血中は、筋内代謝受容器が選択的に刺激されるものと考えられるため、このハンドグリップと阻血の組み合わせを左右で3回ずつ交互に連続して計24分間行い、そのときの、動脈血圧、心拍数、血中レニン活性、カテコールアミン等を測定した。また、コントロールとしてハンドグリップ運動のみを行って阻血を行わないプロトコールも行った。阻血を行うことによって平均血圧は約25mmHg増加した。このとき、血漿レニン活性は安静値の1.78±0.3から2.79±0.32ng/ml/hに有意に増加した。また、ノルエピネフリンも266.9±22.4から535.6±39.3pg/mlに増加した。エピネフリンは運動を開始してから13分目には134.1±21.8pg/mlとなり、安静値(44.8±9.0pg/ml)よりも有意に増加したが、24分目には安静値と有意な差がなくなるまで低下した。上記のパラメーターは、阻血を行わず運動のみを行った場合にはほとんど変化しなかったことから、筋内代謝受容器反射の活動亢進によって生じた変化と考えられる。血漿レニン活性やノルエピネフリンの増加から、筋内代謝受容器反射時には腎への交感神経活動が亢進することが推察される。エピネフリンの増加で副腎への交感神経活動の増加が示唆されるが、この増加は一過性のものであり、他の部位での交感神経の活動パターンと異なることが示唆された。この結果から、上記のような運動プロトコールを行うことが、血圧調節やホルモン調節系に大きな影響を与えることが明らかとなった。今後は、計画当初の第二の目的である、上記運動プロトコールを使ったトレーニング法の効果について検討する予定である。
胃・小腸粘膜防御におけるニトロチロシン陽性細胞の動態と予防医学的検討

ラット胃・小腸粘膜における抗ニトリチロシン抗体を用いた抗ニトリチロシン陽性細胞が好酸球であることが判明した。すなわち、好酸球ペルオキシダーセが過酸化水素(H2O2)依存下で、亜硝酸イオン(NO2-)を酸化し二酸化窒素(NO2)を生成し、チロシンのニトロ化が生じることが解った。NO2を産生する好酸球が最も多く存在する胃、小腸、ホモジネートを用いた検討より、小腸は心臓、肺、脾臓に比しタンパク質チロシンのニトロ化能が低いにもかかわらず、アミノ酸チロシンのニトロ化能は非常に高かった。また、SHRラットより樹立された乳癌細胞株SST-2をSHRラットの胃、小腸の粘膜下に移植しその成長を観察し、組織学的に周囲粘膜の応答反応としての抗ニトロチロシン陽生細胞の動態を観察した。その結果、移植腫瘍は、胃、小腸で発育し、発育阻害が認められることはなかった。腫瘍の周辺組織の抗ニトロチロシン陽性細胞は、特に著しい変化を認めなかった。しかしながら、培養株では抗ニトロチロシン抗体に対する反応は認められないのに対し、腫瘍塊中心部には抗ニトロチロシン陽性の癌細胞がみとめられ、分化度と関係している可能性が示唆された。さらに、チロシンニトロ化物質として広く知られているパーオキシナイトライトをラット胃・小腸凍結切片に反応させニトロ化すると抗ニトロチロシン陽性細胞は、ほぼ好酸球であり、好酸球の胃、小腸における機能として、炎症における活性窒素種の消去系としての新しい役割が考えられた。正常ヒト及びラットの胃・小腸粘膜における抗ニトロチロシン抗体を用いた蛍光免疫組織化学的及び酵素免疫組織化学的方法により、その染色局在を検討した結果、蛍光抗体法で染色される細胞群も酵素免疫法により染色される細胞群も好酸球であり、粘膜固有層に局在がみられた。しかしながら、蛍光法では、ニトロチロシンをアミノチロシンに還元する還元剤で処理しても、蛍光の消失が認められないのに対して、酵素免疫法では、特殊な固定により染色性は、還元剤処理により消失し、酵素免疫法による染色の重要性が認識された。また、従来の固定法には、染色動態の点から、多くの問題があることが判明し、ニトロチロシンの胃粘膜病変における意義の再検討の必要性が認められた。蛍光法では、ラットの生後2周齢ですでに、陽性細胞の局在が見られる。NO合成酵素抗体を用いた検討では、胃・小腸粘膜におけるNO合成酵素の陽性細胞と抗ニトロチロシン陽性細胞をほぼ一致していた。すなわち、好酸球がNOを産生していることが示唆された。NO合成酵素の欠損マウスでは、ニトロチロシン陽性細胞が細胞数は少ないが認められた。このことより、胃・小腸粘膜において好酸球由来のNOの産生が粘膜防禦だけでなく、粘膜のアポトーシスをも調節している可能性が示唆された。好酸球及び胃・小腸粘膜可溶かホモジネートをNO2-とH2O2でニトロ化し、SDS-PAGE、Western blotでニトロ化蛋白のN末端アミノ酸配列を同定すると、核転写に関係する重要な蛋白質が著名にニトロ化されることが判明した。
林業労働災害と労働安全に関する総合的調査研究

初年度は、災害事故資料を調査・収集することに大きい労力が必要であったが、労働基準局から労働者死傷病報告をベースとした(この資料そのものは、個人のプライバシーに関わるとして閲覧できなかったが)労働災害分析資料から5,558件の災害事故事例が得られ、国有林、全国演習林、地域別民有林に関する災害要因の分析がすすめられた。本研究では、個々の資料とくに多くの情報をもつ資料収集に最も多くの時間が使われたと言ってもよい。5,558件のデータ数は、災害要因の統計的分析にとって一応の水準に達したものと解釈できた。要因分析の結果と考察について幾つかに集約してみよう。1.林業の作業場は、(1)障害物が多い.(2)見通しが悪い.(3)急傾斜地が多い.などにみるように足元や身の回りの作業環境が非常に悪い。こうした作業環境の下で道具、可搬式機械を操作する作業が不安全状態となりやすく災害事故を多く誘発している。2.作業中に、その先の結果を予測することが難しい。例えば、玉切り材が作業の終了後どのように動くか予測がしにくい。誘発要因と人間との隔離手段を考えることが災害を減らすことに有効である。3.劣悪な作業環境から人間を守るためには、より水準の高い機械の導入が災害防止の役割を果すであろう。高性能機械によって生産性を高めることができれば、労働者数を減らすことができ、結果的に労働災害を減らすことに貢献できる。4.高齢化がすすむ労働力について、高齢者でも就労でき、災害の少ない作業種への配置について配慮していく必要がある。5.人間には、一日24時間の生活のなかに、生体リズムが存在し、大脳活動レベルの低下時に災害が多く発生していることが判った。生体リズムを考慮した休憩時間の設定などが災害防止に役立つであろうということも一つの見るべき知見であった。林業労働災害の実態を林業管理組織区分から調査分析していくことを計画し,過去5年間を目途として,とくに作業員の死傷病記録を基に,国有林,民有林,大学演習林の3カテゴリ-に分け,調査をすすめ分担作業に入ることとした。国有林関係は,林野庁が労働災害デ-タについて,直接の監督官庁であることからデ-タ収集がかなり容易に進展し,現在3000件以上のデ-タ収集が得られている。しかし,一方民有林関係は労働省の労働基準局が監督官庁となっていて,亊故災害の記録デ-タは企業と個人の秘密に関わることとして,デ-タ収集が難行し労働省との交渉を含めて大変苦労を重ねることとなった。実際には,地方労働基準局の対応も一様ではなく,デ-タ収集作業はデコボコの状態となっているが,度重なる交渉の結果,分担者間でできるだけ統一したフォ-マットに基づき,調査資料が入手できるよう,ようやくその見通しが得られる段階に到達した。なお,個人経営のレベルについても調査は難しいがデ-タ収集に務めている。演習関係は亊例が少ないようである。調査の進行の程度とそのペ-スは,国有林関係のデ-タ分析が最も先行できる状態にあり,現在分析作業に入っている。

したがって,研究成果の報告に関しては,デ-タ収集の経緯から現時点では発表できる段階には至っていないが,災害亊故の分析が間もなく進展することにより,(1),作業員の老齢化現象との関係,(2),亊故形態,状況を通し,安全対策のポイントをどこに絞ると効果的か,(3),亊故災害の減少に,新しい技術,新しい機械による対応がどのような意味をもってくるか,など,本研究テ-マの目標到達への分析と研究上まとめが今年一年で期待できると考えている。研究成果の公表は,今年秋の学会から順次可能と考えている。この研究組織の最終ターゲットは、災害要因分析そのものではなく、労働災害を減らしていくことにどのような考え方、対策が要因分析を通して見通せるがということにあった。災害事採に係わる資料の収集は、個人の神密に関係することで初年度は大変苦労したが、国有林を含めて災害事故の事例5,558件確保でき、災害要因の統計的分析にとって一応のレベルに達したものと解している。災害事故の内容を個々の要因(16)によって分類するとその項目は莫大な量となり、これらをコード化することにより分析がすすめられた。要因分析の結果から、新しい知見として得られたものを幾つか取り上げてみたい。1.現場労働者が高齢化してきており、50才台に災害例が多くなっているが、その就労者数の割合がらみると高齢者に多発するということは言えないことがわかった。しかし高齢者に任せる作業、その配置などについて共通の課題があることもわかった。2.1日の労働時間内で災害は午前11時頃、午後3時頃に最も多く発生していることがわかった。これは人間の1日の生体リズム(大脳活動レベル)と関係して災害の積極的防止に、人間側からの視点を入れることの必要性が示唆された。3.災害の多くは、道具作業、可搬式機械などによる低位の技術水準下で発生している。傾斜のある材然で、ナタ、鎌などの道具の使用や可搬式機械の操作は当然不安全労働になりやすいということが共通的にみられる認識であった。今の技術水準を変更しない限り、安全教育の徹底した繰り返しとその積み上げが災害防止に必要であることが確認された。4.技術をもう少し高いレベルに変更する場合、作業環境の改善が労働災害を著しく減らすし、同時にその技術による生産性の向上により労働者数を減らすことが可能であり、結果的に災害事例を減らすことに責献できるということも集約された。
骨髄間葉系幹細胞に発現する骨形成抑制因子の探求-再生医療への応用を目指して

骨髄間葉系細胞(MSC)は分裂増殖を繰り返すと分化能が低下するだけでなく骨形成を抑制する因子を発現する。我々は、不死化したヒトMSCを使用し、抑制因子候補の過剰発現細胞、ノックアウト細胞の作製を行った。その結果、候補因子の一つであるSERPINB2に関してノックアウトに成功した。このSEPINB2のノックアウト細胞を培養して得られたconditioned mediumを用いてヒトMSCの骨芽細胞分化に対する影響を検討した結果、SERPINB2はBMP-2による骨分化に対しては促進的に働き、デキサメタゾンによる骨分化に対しては抑制的に働いていることが示唆された。以前実施したマイクロアレイによる継代培養により遺伝子発現が亢進する因子のうちから、骨形成を抑止している可能性があると考えられる5因子を選択した。各因子に対しノックアウトするツールとしてCRIPSRシステムを、過剰発現させるツールとしてレンチウィルスベクターを作製することにした。【骨形成抑制因子の候補因子をノックアウトするためのCISPR-Cas9の作製】Webツールを用いて、骨形成抑制因子候補に対するガイドRNA配列を設計し、pSpCas9(BB)-2A-GFPに挿入し、ガイドRNAとCas9配列を含むプラスミドベクターを各候補遺伝子につき、4種類ずつ作製した。【骨形成抑制因子を過剰発現させるためのレンチウィルスベクターの作製】前記の骨形成抑制因子の候補因子のcDNAをHEK293細胞から作製し、Gatewayシステムを用いてレンチウィルスベクター(CSII-CMV-RfA-IRES2-Venus)に組み込んだ。【ノックアウト骨髄間葉系幹細胞(MSC)の作製】細胞バンクより遺伝子導入により不死化したヒト間葉系幹細胞を3種類入手した。これらの細胞に対し、上記ツールを用いてノックアウトと過剰発現を試みた。しかしながら、予想通りレンチウィルスによる遺伝子導入の効率は低いだけでなく、細胞間で導入効率に大きな差が認められることが確認された。また、リポフェクション法にてCRISPRベクターの導入を試みたが、著しく導入効率が低いことが確認された。そこで、不死化細胞であることのメリットを活用し、各候補因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンを作製し、骨分化能に対する影響を評価することとした。現在、入手した各不死化MSCに関して、各因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンの作製を進めている段階である。マイクロアレイで確認した継代とともに発現が亢進する遺伝子のうち、発現比上位5因子を候補として選択し、CRISPRシステムによるノックアウト細胞クローンとレンチウィルスベクターによる過剰発現細胞クローンの作成を行った。骨髄液から培養した初代培養の骨髄間葉系細胞(BMSC)は、遺伝子の導入効率も低く、またクローニング操作に耐え得るほどの寿命を有していないため、セルバンクより不死化したBMSCのクローンを3種類入手し、実験に用いた。候補として5種類の遺伝子すべてに関して、過剰発現クローンとノックアウトクローンの作成を試みたが、入手した不死化BMSCは3種類ともレンチウィルスによる遺伝子導入効率、リポフェクションによるCRISPRベクターの導入効率が低く、4種類の候補遺伝子に関しては、現在のところ過剰発現クローン、ノックアウトクローンともに確立できていない。1種類に関しては過剰発現に関しては入手した3種類のBMSCのうち2種類で、ノックアウトに関しては1種類の細胞で、それぞれクローンを確立した。入手した3種類の細胞に関して、上記のクローンの作成と同時に、骨分化能などに関する評価を行った。同じドナー由来の不死化BMSCではあるが、それぞれ細胞の形態、増殖速度などのキャラクターは大きく異なっていた。しかしながら、最も問題なのは、BMSCでありながら骨分化能が低いということである。当初は目的遺伝子を過剰発現させたり、ノックアウトさせた細胞自体に対する骨分化能の評価を進めていく予定であったが、現実的には共培養やコンディションドメディウムなどを使用して、他の細胞の骨分化能などに与える影響みていくことで、候補因子の骨分化抑制効果について評価していく必要があると考えられる。ノックアウト細胞や過剰発現細胞のクローニングに予定以上の時間を要している。骨髄間葉系幹細胞(MSC)は多分化能・増殖能を有し、骨・軟骨、脂肪細胞など、様々な細胞に分化することができる。しかしながら、分裂・増殖を繰り返すことで分化能が低下してしまう。本研究の目的は、骨形成抑因子を同定し、骨芽細胞分化への影響を検討することである。ヒト骨髄液を培養し、培養開始早期のMSCと継代を繰り返したMSCの遺伝子発現をマイクロアレイで比較し、SERPIN B2, EPHA5, SCN9A, NTF3, SCINなどが継代・増殖により発現が亢進することが確認され、これらを分化抑制因子の候補として検討を進めていくこととした。この中でEPHA5に関しては細胞膜上に存在し分泌されない。そこで継代・増殖を繰り返してEPHA5の発現を亢進させたMSCとそうでないMSCを共培養で評価した。非接触系での共培養に比較して、混合した培養した接触系の共培養で、骨芽細胞分化が抑制されていることが確認され、EPHA5が骨形成抑制因子のひとつであると考えられた。他の因子に関しては、過剰発現細胞とノックアウト細胞を使用して影響を評価を行った。5種類の候補因子に関して、3種類の不死化MSCに対してレンチウィルスによる導入を試みたが、EPHA5を発現したMSCのクローン1種類を得られたにとどまった。また逆に、候補因子をCRISPRベクターを用いてノックアウトした細胞のクローニングも試みたが、SERPIN B2をノックアウトしたクローン1種類のみを得るにとどまった。SERPIN B2ノックアウト細胞を培養して得られたコンディションドメディウムをMSCの培養に用い骨芽細胞分化への影響を評価した。

骨髄を培養して得られたMSC、3検体に関して評価を行ったが、骨芽細胞分化への影響は細胞ごとに異なり、少なくともSERPIN B2が絶対的な骨分化抑制因子である可能性は低いと考えられた。骨髄間葉系細胞(MSC)は分裂増殖を繰り返すと分化能が低下するだけでなく骨形成を抑制する因子を発現する。我々は、不死化したヒトMSCを使用し、抑制因子候補の過剰発現細胞、ノックアウト細胞の作製を行った。その結果、候補因子の一つであるSERPINB2に関してノックアウトに成功した。このSEPINB2のノックアウト細胞を培養して得られたconditioned mediumを用いてヒトMSCの骨芽細胞分化に対する影響を検討した結果、SERPINB2はBMP-2による骨分化に対しては促進的に働き、デキサメタゾンによる骨分化に対しては抑制的に働いていることが示唆された。作製したCRISPRベクターやレンチウィルスの導入効率が低いため、各因子の過剰発現クローンとノックアウトクローンの作製に予想以上に時間がかかっているため。ノックアウト細胞、過剰発現細胞ともに確立できていない4候補因子に関してもクローンの確立を進めてゆくが、すでに確立された1因子に関しては、共培養やコンディションドメディウムなどを用いて、骨分化能に与える影響について評価を進めてゆく。骨再生、人工骨各候補因子の過剰発現クローン、ノックアウトクローンが作製され次第、各因子がMSCの骨芽細胞分化に与える影響などに関して、解析を進める予定である。年度末の残額では希望商品が購入できなかった。細胞培養に必用な血清を追加購入するにあたり、製品ロットを選択するために複数ロットのテストを行う必要がある。このテストが年度を越えてしまったため、年度内に予算を使用し切れなかった。次年度に消耗品費として執行予定。2015年5月時点で、ロット選択のためのテストは完了しているので、前年度から繰り越して翌年度分として請求した助成金は血清購入に使用する。
ナノデバイスを利用したNK4によるテーラーメイド膵癌遺伝子治療

HGFアンタゴニストとして独自に開発したNK4を用いて、難治癌である膵癌の遺伝子治療を確立するために前臨床試験を実施した。(1)GMP基準のアデノNK4を協力企業と共に作成し、動物を用いて安全性を確認した。(2)抗癌剤(gemcitabine)とアデノNK4併用療法の治療効果を評価し、臨床実施へ向けてより治療効果の高い投与方法を確立した。(3)膵癌肝転移制御としてアデノNK4の門脈内投与の有効性を示し、膵癌肝転移腫瘍への治療法を示した。(4)膵癌局所再発を制御するdrug deliverysystemとして、口腔粘膜上皮細胞、徐放シートによるアデノNK4並びに抗癌剤の局所治療を可能にした。(5)抗癌剤をfibringlue併用による膵癌局所治療効果を評価した。その成果に基づき、臨床試験をすでに3例行っており、現在継続中である。(6)膵癌患者より採取した膵液分析を行い、早期診断のマーカー開発に向けて遺伝子解析を実施した。さらにこれらを踏まえリアルタイムで迅速に判別できる機器開発を進めた。(7)抗癌剤(gemcitabine)とアデノNK4併用療法の治療効果を分子生物学的な手法により裏付け、とくにアデノNK4の感染効率がgemcitabine投与後に増加することを明らかにした。(8)膵癌細胞に放射線を照射すると、アデノNK4の遺伝子導入効率が増加し、CMVpromotor活性を増強されること、治療効果が増強すること明らかにした。(9)h-tert promotorを持ち腫瘍特異的制限増殖型アデノウイルスを新たに作成し、Gemcitabineにはtert発現促進作用があること、ウイルス感染効率の増強、殺細胞効果の増強など相乗効果を確認した。HGFアンタゴニストとして独自に開発したNK4を用いて、難治癌である膵癌の遺伝子治療を確立するために前臨床試験を実施している。(2)抗癌剤(gemcitabine)とアデノNK4併用療法の治療効果をin vitroとin vivoで評価し、臨床実施へ向けてより治療効果の高い投与方法を確立した(論文投稿中)。(3)膵癌肝転移制御としてアデノNK4の門脈内投与が有効であることを示し、難治性の膵癌肝転移腫瘍への治療法を示した(論文revise中)。(4)膵癌局所再発を制御するdrug deliverysystemとして、口腔粘膜上皮細胞、徐放シートによるアデノNK4並びに抗癌剤の局所治療を可能にした(論文掲載)。(5)抗癌剤をfibringlue併用による膵癌局所治療効果を評価した(論文投稿準備中)。さらにこれらを踏まえリアルタイムで迅速に判別できる機器開発を進めた(論文掲載)。(7)NK4による正確な投与と治療効果を判定できるナノデバイスの開発を進めている。以上の研究を踏まえ、最も有効と判断されるアデノNK4局所投与実施に向けて治療計画を作成し、現在学内倫理委員会に臨床研究実施の申請を準備中である。(2)抗癌剤(gemcitabine)とアデノNK4併用療法の治療効果をin vitroとin vivoで評価し、臨床実施へ向けてより治療効果の高い投与方法を確立した(論文掲載済み)。

(3)膵癌肝転移制御としてアデノNK4の門脈内投与が有効であることを示し、難治性の膵癌肝転移腫瘍への治療法を示した(論文掲載済み)。(4)膵癌局所再発を制御するdrug deliverysystemとして、口腔粘膜上皮細胞、徐放シートによるアデノNK4並びに抗癌剤の局所治療を可能にした(論文掲載済み)。(5)抗癌剤をfibringlue併用による膵癌局所治療効果を評価した(論文掲載済み)。その成果に基づき、臨床試験を申請中である。(6)膵癌患者より採取した膵液分析を行い、早期診断のマーカー開発に向けて遺伝子解析を実施した。さらにこれらを踏まえリアルタイムで迅速に判別できる機器開発を進めた(一部論文掲載済み)。(7)NK4による正確な投与と治療効果を判定できるナノデバイスの開発を進めている。以上の研究を踏まえ、最も有効と判断されるアデノNK4局所投与実施に向けて治療計画を作成し、現在学内倫理委員会に臨床研究申請の準備を進めている。HGFアンタゴニストとして独自に開発したNK4を用いて、難治癌である膵癌の遺伝子治療を確立するために前臨床試験を実施している。(1)膵癌肝転移制御としてアデノNK4の門脈内投与が有効であることを示し、難治性の膵癌肝転移腫瘍への治療法を示した(Murakami et al.Int J Cancer,2005)(5)膵癌細胞に放射線を照射すると、アデノNK4の感染効率が増加し、CMVpromotor活性を増強されることが判明した。その結果、放射線照射とアデノNK4併用療法が膵癌治療に有効であることが判明した。(論文投稿中)(6)h-tert promoterを持ち腫瘍特異的制限増殖型アデノウイルスを新たに作成した。また、Gemcitabineにはtert発現促進作用があることを認め、両者の併用療法が有効であることが示唆された。(論文投稿準備中)HGFアンタゴニストとして独自に開発したNK4を用いて、難治癌である膵癌の遺伝子治療を確立するために前臨床試験を実施した。(1)平成18年度までに抗癌剤(gemcitabine)とアデノNK4併用療法の治療効果をin vitroとin vivoで評価し、臨床実施へ向けてより治療効果の高い投与方法を報告しており、(Ogura, et. al.Cancer Gene Therapy,2006)、平成19年度は、その併用効果に相乗効果があることを分子生物学的な手法により裏付け、とくにアデノNK4の感染効率がgemcitabine投与後に増加することが明らかになった。また、in vitroだけでなくin vivoにおいてもそのNK4発現増強作用がgemcitabineにあることが確認された。(現在論文投稿中)
風穴式冷却システムの開発試験

温暖化対策のためには、気候資源を利用した省エネを目指した技術開発を行い、特色ある産地作りなどの地域の多様な農業戦略の確立が急がれている。本研究では、中山間地域の傾斜地の地形と自然のエネルギー(地温)を生かした夏季の施設内冷却システムを開発し、善通寺市生野地区の大麻山の傾斜角度約20度の斜面において、長さ5m、内径60cmの土木排水管用外圧管を連結して、2m以下の地中に約70mに亘って埋設した。埋設したパイプが人工の風穴となり、夏季には、地中で冷却された空気を、傾斜地下部に設置した傾斜ハウスに送り込んで、施設内を換気冷却する。また、ハウス内部で暖められた空気は、ハウスの最上部に設置した煙突部から排出する。このシステムは、傾斜地の地下の地温で冷却された冷気と地上部の暖気の密度差をポンプの駆動力にした冷却システム(夏季に風穴からの冷気の吹き出しと類似)である。初期のパイプ埋設経費のみで、冷房機の運転に要するコストが不要なため、省エネシステムとして有望と考えられる。特にハウス内の気温が高温になる日中の午後に流量が大きくなって冷却効果が高まり、気温が低くなる夜間には流量が減少する特性を有している。工事が遅れたため、本研究期間には、暖候期の10月中旬と3月下旬のデータが僅かに得られただけであるが、晴れた日中に冷気がハウスに流入し、10°C程度冷却する事が確かめられている。一方、冬季には、気流の向きが逆転し、傾斜地上部から暖気が吹き出すことが確かめられており、上部にハウスなどを設置すれば、暖気を暖房用としても利用できることが証明されている。2006年7月に「傾斜地利用型環境調節システム」を特許出願し、2007年3月に岡山県内の2企業と技術移転の契約を行った。今後は、ハウス内の配管法などを工夫しながら、種々のデータを蓄積して、傾斜地利用型環境調節システムの開発、改良を進める予定である。
パーキンソン病における疾患感受性分子群の細胞生物学的解析

パーキンソン病(PD)は、ドーパミン神経細胞の変性・脱落とレビー小体の形成により特徴づけられる。レビー小体は可溶性タンパク質であるα-シヌクレイン(αS)が主要構成成分で、その生理的機能や、なぜレビー小体という不溶性凝集体を作るのか機序は不明である。αSはC末端領域の欠失やリン酸化によって凝集しやすい性質があり、また脂肪酸結合タンパク質(FABP)の一種としての働きも示唆され、FABPの脂肪酸結合モチーフとαSのN末端領域およびC末端領域では高い相同性が示されている。さらに不飽和脂肪酸によって可溶性αS重合体の形成が促進されることも知られている。本研究では、αSアミノ酸配列を欠失させた各種変異体を作成し、in vitro並びに培養細胞を用いた解析で、1)脂肪酸と結合するαS分子内の領域(アミノ酸配列)を同定、2)脂肪酸により起こる可溶性αS重合体の形成は脂肪酸との直接的な結合を介して生じるのか、それとも易凝集性が知られているαSのC末端領域の切断ならびにリン酸化による影響がより優位なのか、という点について検討した。結果、in vitro脂肪酸結合分析で、αSのN末端領域で脂肪酸と結合することを示した。培養細胞では、脂肪酸を介した可溶性αS重合体形成を確認することができ、in vitroの実験結果と同様に、N末端領域にある脂肪酸結合領域での脂肪酸との結合が、可溶性αS重合体形成を惹起することを示した。さらにin vitroで易凝集性が明らかにされているC末端領域欠失や129番目のセリン残基をリン酸化したαSにおいても、脂肪酸により惹起されるαS重合体形成は、N末端領域に依存していることを示した。結論として、αSはN末端領域を介して脂肪酸と結合し、脂肪酸による可溶性αS重合体形成に重要な役割を果たし、C末端領域の欠失やリン酸化は重合体形成の促進因子である可能性を示した。
SL/Niマウス:エピゲネチック機序による内在性ウイルス発現の多型性の研究

我が国で樹立された白血病好発系SLの一亜系であるSL/Niマウスは、内在性レトロウイルスに関連して血管炎・腎炎などの病変を発生し、ウイルス宿主関係の異常による自己免疫病モデルとされてきた。本系は内在性レトロウイルスの発現に関しポリモルフィックであって、ウイルス発現は母乳を介して伝達される母系因子により型特異的にエピゲネチックに抑制されている。母系因子陽性・ウイルス陰性のSL/Ni-Eco^-と、母系因子陰性・ウイルス陽性のSL/Ni-Eco^+の両亜系を分離し、ウイルス発現の遺伝的・非遺伝的調節機構を研究するとともに、すべてのSL系マウスについてウイルス学的、遺伝学的関係を調査した。同因子の活性を含むSL/Ni-Eco^-血清を塩析、液体クロマト・吸着クロマトで分画し、SL/Ni-Eco^+新生児に注射しウイルス発現を調べたところ、抑制活性はpassive hemadsorption、または間接蛍光拡体法で検出される抗ウイルス抗体を含む7Sグログリンと挙動を共にしていた。この抗体はウイルス中和活性はない。抗ウイルス抗体は内在性ウイルスのうちecotropウイルスに広く反応しMCFやmolonedウイルスとも交叉反応を示した。SL/Ni-Eco^-腺細胞より分離した10系のハイブリドーマの上清はいずれもMaLV-gp70抗体であり、血清抗体と類似した反応性を示した。ところが、これまで得られたハイブリドーマ上清はいずれも新生児のバイオアッセイではウイルス抑制効果を示さず、高ウイルス系マウスのリンパ腫自然発生も抑制し得なかった。我々のスクリーニング法でとらえ得る生物活性をもった自然抗体産生クローンが稀七日、またはIgAなど特定のクラスのみに限られているのか結論には至っていない。抗ウイルス抗体が母系因子の本体であるにせよ。外来性ウイルスではなく内在性ウイルスに対し選択的な抑制効果をもつことの分子生物学的理解については、更に今後基礎的な研究が必要である。従来の我々の研究により, SL/Niマウスは内在性白血病ウィルス発現が陽性のSL/NiーEco^+の両亜系に分離でき,SL/NiーEco^-では母乳を介して,抵抗性因子が子孫に伝達される結果,ウイルスの発現が抑制されていることが明らかになった.同因子は血清中にも存在し,新生児に血清を注射することにより高ウィルウ系マウスでも長期にわたるウイルス発現の抑制がみられた.母系抵抗性因子の物性とその産生,作用桟構の解明が本研究の目的である.SL/NiーEio^-マウではSL/NiーEco^+由来のecotropic MuLV(SNE2など)に対する高いレベルの自然抗体をもっている(MHA反応で測定). MuLVgp70に対する抗体がウイルス発現を抑制することはいくつかの報告がある.そこで,母系低抗因子が内在性ウイルスに対する抗体である可能性を検討した. protein Aーsepharoseにより同血清をIgM,IgG分画に分けたところ,抑制活性はIgG分画にあった.またゲル瀘過の成積もこれを支持した.そこで,SL/NiーEco^-の脾細胞とNSー1ミエローマ細胞を融合し,SNE2感染SCー1細胞を標的としたMHA反応でスクリーニングし,抗ウイルス活性をもつモノクローナル抗体の分離とその生物活性の検討を行った.報告の時点までに,5系統のクローンがとれ,免疫沈降法でいずれも抗gp70活性をもち,その反応域はクローンにより異り, SL/Niの内在性ecotro pic MuLVに限らない.