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高感度振動ＳＦＧ分光による水溶液中の生体分子膜の研究

水溶液中での生体分子膜の構造と機能の解明するための高感度振動和周波発生(SFG)分光法の要素技術の開発・検討と生体分子膜への応用研究を行った。開発・検討した要素技術は、(1)水晶薄膜を透過配置で使用した高感度ヘテロダイン検出振動SFG測定装置、(2)ナノ粒子増強振動SFG、(3)プリズム平行基板結合系による全反射配置振動SFG分光である。応用として、水上および基板上の脂質膜(L膜とLB膜)の構造の表面圧依存性、タンパク質水溶液表面のタンパク質および水分子の配向と構造についてヘテロダイン振動SFG分光によって研究を行った。振動和周波発生分光(振動SFG分光)は二次の非線形光学過程に基づく手法であり,双極子近似のもとでは反転対称性をもつ系で禁制となり,反転対称性が崩れる界面の振動スペクトルを選択的に得ることができる.このため,液体と接した膜の界面の研究に適している.水溶液界面における膜の振動SFG分光では,液相側からプローブ光を照射すると,赤外プローブ光が水により吸収されるため測定が非常に困難となる.しかし紫外赤外領域で透過な基板(薄膜SiO_2蒸着CaF_2基板,SiO_2層厚125nm)上に膜を作製し基板側からプローブ光を照射するという配置を用いると,水の赤外吸収による妨害を受ける事なく,SFGスペクトルを測定することが可能になる.今年度は,システイン修飾フルオレセイン単分子膜の水溶液界面での振動SFG分光に取り組んだ.測定に用いた単分子膜試料は,まずシリカ基板上にマレイミド単分子膜を作製し,さらにマレイミド基にチオール基を持つ5-FAM-Cys(システイン修飾フルオレセイン)を結合させることで準備した.振動SFGスペクトルの測定では,振動バンドのSFG信号光のエネルギーが5-FAM-Cysの電子吸収波長(502nm)に一致するように可視プローブの波長を546nmとし,電子共鳴条件下で空気界面,水溶液界面について測定を行った.得られたSFGスペクトルは,界面の雰囲気に依存してスペクトルの形状(強度パターン)が大きく異なっていた.この変化をフルオレセイン基の配向の雰囲気依存性を示していると帰属した.シリカ基板上にポリペプチドやポリヌクレオチドなどの生体分子を固定することを想定したSFG測定用の試料の作製の基礎技術を確立するために,アミノ基を有する化合物を固定するためのNHS基を持つシランカップリング単分子膜を作製した。NHSエステル膜作製のためのシランカップリング用試薬(TUNHS)は、10-undecylenic acid chlorideから2段階反応で合成した。作製したNHSエステル膜のカルボニル基の振動SFGスペクトルには五員環イミドのカルボニル基の振動バンドが現れており、基板上にNHSエステル膜が形成されたことが確認された。NHSエステル膜のアミノ化合物との結合能力は、リジン基を持つクマリン色素の一種であるLA-AMCの固定実験で評価した。反応後の膜の紫外可視吸収スペクトルに、LA-AMC溶液の極大吸収波長324 nmとほぼ同じ波長に吸収バンドが確認され、作製した基板は、アミノ化合物を固定できることが分かった。信号検出をヘテロダイン方式でも行えるように振動SFG分光装置の検出方法を改造する作業を行った。局所発振器としてYカット水晶薄膜結晶を試料部分の前に直列に配置した。薄膜水晶を透過配置で使用することで広い範囲のプローブ光のパワーが利用できるようになり、実験条件の設定の自由度が各段に広がった。試験測定としてシリカ基板上のオクタデカントリクロロシラン単分子膜の測定を行い、良好な複素非線形感受率スペクトルが得られることを確認した。ナノ粒子増強VSFGに関しては、金上の自己組織化膜に金ナノ粒子層を重ねた系に関してVSFG信号の増強度を検討した。その結果、可視プローブの波長を適切に設定すれば、VSFG信号が増強することが確認できた。今後、同じ試料に関して自発ラマン散乱の増強度を測定し、比較する予定である。ナノ粒子増強振動SFG(以下VSFG)に関して、金上の自己組織化膜に金ナノ粒子層を重ねた系に関して振動SFG信号の増強度を定量的に検討した。試料の反射モードでの紫外可視消失スペクトル、VSFGスペクトルおよび自発ラマンスペクトルの可視プローブ波長依存性を詳しく検討した結果、VSFGおよび自発ラマン信号の増強度は、おおよそVSFG信号波長とラマン励起レーザーの波長が試料の消失スペクトルのピークと一致すると大きくなり、信号増強はプラズモン共鳴の結果であることが示された。一方、自発ラマンの場合の増強度は最大で10の4乗程度の大きな値であるのに対して、VSFGの場合は高々5程度であり、増強度に著しい差が見られた。

この違いは、ナノ粒子の大きさや粒子と分子の相対位置関係の不均一性が分極の位相のばらつきにつながり、コヒーレント分光であるVSFGの強度の低下を招いていると解釈した。ヘテロダイン検出VSFGに関しては、水上単分子膜(L膜)の測定をおこなった。各種偏光条件での測定が可能なように拡張した。ステアリン酸や基本的な脂質であるDPPCに関して、L膜のスペクトルの表面圧依存性を詳細に検討した。またL膜を基板に移し取ったLB膜についても測定を行い、L膜の結果と比較した。分子面密度を補正し分子当たり感受率としたスペクトルは、表面圧の上昇にともないCH2伸縮振動のピーク強度が減少し、CH3伸縮振動のピーク強度の増加した。前者はゴーシュ形を多く含む構造から全トランス形へとアルキル鎖がコンフォメーション変化を、後者は配向性が向上を示している。LB膜のスペクトルはL膜と定性的には対応しているが、定量的に評価するとLE相のL膜に対応するLB膜のL膜よりも高い配向性を持ち、基板上で配向変化を起こしていることがわかった。さらに気液界面の表面過剰タンパク質に関しても、CH、OH、NH伸縮振動領域およびアミドI領域で良好なスペクトルが測定できることを確認した。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年11月、検出方法のヘテロダイン化作業を実施していたところ、VSFG分光装置の温度制御装置の不具合が発生し、装置が所定の能力を発揮できない状態となり、2ヶ月分の基礎データ収集が十分に行えていないことが判明した。所定の能力を発揮できるよう測定装置の改造を行い2ヶ月分の基礎データーを収集するために、2013年度の予算の一部の繰り越しを申請し認められた。繰り越し分の作業に関しては、ほぼ想定していた作業を行うことができたが、この分の時間的な損失があるため、全研究期間を通してみると当初計画で平成26年3月の作業が平成26年の10月に達成されたことになり、やや遅れているという状態である。物理化学繰り越した2013年度予算を使用し,分光装置に付属した装置の不具合を取り除き、VSFG分光装置が所定の能力を発揮できる状態ととなった最適化した装置を使用し,特に高感度であるというヘテロダイン化したVSFGの特徴を生かし,水上の脂質単分子膜等の測定に取り組む.また、ナノ粒子増強VSFGに関しては、VSFG信号の増強が確認できた同じ試料に関して自発ラマン散乱の増強度を測定し、比較検討する予定である。研究代表者である石橋は,平成24年9月1日付けで広島大学から筑波大学へ移動したが,移設予定の筑波大学の建物の耐震補強改修が始まったため,新たな移設場所の設定に時間が取られ,測定装置を筑波大学に移設時期が平成25年度3月となった.このため広島大学での移動準備期間も考慮すると平成24年度の研究期間が実質的に4ヶ月程度に短縮されたことが原因である.平成25年11月、検出方法のヘテロダイン化実験に使用していた分光装置に付属した温度制御装置に故障が生じたため、当装置の修理・改造が必要となった。また、この故障の結果、2ヶ月分の基礎データの基礎データに十分な結果が得られていないことが判明し、2ヶ月分の基礎データ収集とヘテロダイン化作業を再度行う必要が生じた。
高齢者の総合的機能向上を目指した複合運動トレーニングの有効性

本研究では、高齢者における総合機能向上のための個別介入プログラムの開発を目指し、初年度は高齢者の生活機能自立に必要な体力レベルの水準値を求め、運動処方の指標作成にあたった。本年度はこの体力レベルの指標に基づき、個々の身体機能に応じて簡便な運動プログラムを処方し、体力や生活機能に及ぼす影響を検討した。対象はケアハウスおよび保健センターを利用している高齢者35名(平均年齢:69.9±4.1歳)とした。トレーニングは1回につき約40分、7種類のプログラムを週1回、計10回実施した。筋力トレーニング群(16名)には7種類すべて下肢筋力トレーニング、複合トレーニング群(19名)には4種類の下肢筋力トレーニングと3種類のバランス・筋パワートレーニングを実施した。体力評価として膝伸展筋力、握力、バランス(functional reach、開眼片脚立位保持時間)、柔軟性(長座体前屈)、敏捷性(開閉ステップテスト)を測定した。生活機能評価として、Timed Up&Go(TUG)、10m最大歩行時間、立ち座り速度を測定した。これらの項目についてトレーニング実施前後の変化を比較した結果、筋力トレーニング群ではトレーニング終了後に膝伸展筋力のみ有意な改善がみられたのに対して、複合トレーニング群では、膝伸展筋力、functional reach、開閉ステップ、TUG、最大歩行時間、立ち座り速度で有意な改善がみられた。さらに、膝伸展筋力の変化率についても、筋力トレーニング群より複合トレーニング群の方が有意に高い値を示した。今回の複合運動プログラムは虚弱高齢者に対しても安全に継続することが可能であり、そして体力の向上や生活機能の改善も可能であることが示唆された。このような簡便な運動プログラムは多くの高齢者施設や在宅において広く活用でき、長期的な自立支援・介護予防対策として役立つと考えられる。本研究は高齢者の総合的機能を維持向上するために至適な運動プログラムの開発を目的としており、初年度である平成17年度は高齢者の生活機能自立に向けた運動処方のための指標作成にあたった。対象は京都市内の保健センターを利用している地域在住高齢者32名(平均年齢:72.3±4.7歳)であった。総合機能評価として、歩行能力(10m歩行速度、Timed Up&Goテスト)、下肢筋力(膝伸展筋力)、握力、バランス能力(Functional reachテスト、片脚立位保持時間)、敏捷性(座位開閉ステッピングテスト、5回立ち座り時間)、柔軟性(長座体前屈)、身体組成(骨量、筋量、基礎代謝量)等の測定を行った。日常生活動作能力を老研式活動能力評価を用いて評価し、13項目すべてが自立している者を自立群(15名)、それ以外の者を非自立群(17名)に対象者を分類した。自立群、非自立群それぞれの各測定値を比較した結果、いずれの項目においても自立群は非自立群より成績が良かったが、統計学的に有意差が認められた項目は膝伸展筋力のみであった。この有意差が認められた膝伸展筋力について、判別分析を用いて自立群と非自立群とを最もよく判別する境界値を求めたところ、膝伸展筋力22.1kg(体重比筋力43%)で判別的中率は74.2%と良好であった。本研究において、高齢者の生活機能自立には特に下肢筋力が密接に関連しており、日常生活自立のためには膝伸展筋力を体重比43%程度維持することが重要であることが明らかとなった。このような体力水準値は高齢者に運動療法プログラムを処方する際の具体的かつ簡便な指標になり得ると考える。
唇顎口蓋裂患者におけるPRP(多血小板皿漿)の有用性に関する研究

口唇口蓋裂患者に対するPRPの有用性を検討するために、PRPを使用し顎裂部腸骨移植術を行った口唇口蓋裂患者28名34顎裂(PRP使用群)を対象として術後の移植骨の変化を分析し、PRPを使用しなかった口唇口蓋裂患者17名17顎裂(PRP未使用群)と比較・検討した。片側性唇顎口蓋裂患児の腸骨ブロック骨移植術ならびに骨延長術にPRPを使用し,術後治療成績を分析した。1.術前の血小板数は平均27.7×10^4/μlに対し、PRP中は平均86.8×10^4/μlで、濃縮倍率は319.9%であった。3.PRP使用群のアルミニウム当量値は、術後3か月までは急速に低下するものの、術後6か月では上昇する傾向を示し、PRP未使用群は術後6か月まで経時的に低下した。PRP使用群の骨再生がPRP未使用群に比べて早くなる傾向が認められた。4.骨架橋下縁の高さは、PRP使用群、PRP未使用群とも術後1週から術後6ヵ月までわずかに退縮する傾向を認めた。術後6か月のPRP使用群の良好例は17例中12例、70.6%で、PRP未使用群は17例中9例、52.9%と、有意にPRP使用群で良好例が多かった。5.骨架橋幅は、PRP使用群では術後1週に対し術後6か月の変化率は77.2%で、PRP未使用群では71.7%の変化率を示し、PRP使用群が骨吸収の少ない傾向を認めた。6.腸骨ブロック骨の骨変化は、術後3か月までに急速にAl当量値が減少し、その後徐々に上昇し、術後1年では90.7%であった。骨架橋の高さは、下縁で吸収が少しみられるものの術後1年の評価は上縁、下縁ともに良好であった。以上の結果より、PRPは、口唇口蓋裂患者の骨移植術に対して骨再生を促進し、術後成績に良い影響を与えることが示唆された。唇顎口蓋裂患児の治療は出生直後から長期に亘って行われ、特に手術の治療成績で良好な結果を得るには多大なる努力が必要である。近年、多血小板血漿(PRP)が術後の創傷治癒や骨移植後の骨再生促進に良好な治癒結果をもたらすと言われている。今回、われわれは唇顎口蓋裂患児の手術治療成績におけるPRPの有用性を検討するために顎裂部自家腸骨(海綿骨および骨ブロック)移植術にPRPを使用し、PRP中に含まれる成長因子TGF-β2と血小板濃縮率を測定するとともにその臨床的効果を検討し、若干の知見を得たので報告する。PRPは当科所有のSmart Prepシステムを使用し、患児の自己血20mlから約3mlを精製・作成した。抽出したPRPは、顎裂部に腸骨海綿骨を移植した患児9名(片側性唇顎口蓋裂6名、両側性唇顎口蓋裂3名)とインプラント埋入目的で腸骨骨片ブロックを移植した片側性唇顎口蓋裂患児1名に使用された。

PRP精製による血小板の濃縮増加率では、精製前は平均29.0±7.3×10^4/mm^3で、精製後は平均97.3±23.3×10^4/mm^3で濃縮増加率は337.8%であった。術後の創傷治癒では、腸骨海綿骨ならびに骨片ブロック移植患児のいづれも治癒は良好で術後の創の感染や離開、骨露出を起こした症例は認めなかった。移植骨のアルミニウム当量値は、PRP未使用症例に比べ術後早期に上昇し、移植骨の骨再生促進に有用であることが示唆された。今後は、TGF-β2と移植骨の骨再生促進との関連性を研究する予定である。唇顎(口蓋)裂手術に多血小板血漿(以下、PRP)を使用し、その臨床的効果を検討した。対象は顎裂部自家腸骨海綿骨移植術(以下、腸骨移植術)を行った唇顎(口蓋)裂23名(片側性唇顎(口蓋)裂16名、両側性唇顎(口蓋)裂7名)および顎裂部のインプラント埋入目的で腸骨ブロック移植術と骨延長術を併用した片側性唇顎口蓋裂1名である。PRPは患者の自己血20mlからSmart Prepシステムで約3mlを作製し、移植骨に混入した。1.腸骨移植術時年齢は平均8歳8か月であった。3.術後6か月まで経時的にAl当量値を観察できたPRPを使用した唇顎口蓋裂7名(PRP使用群)とPRPを使用しなかった唇顎口蓋裂17名(PRP未使用群)について比較・検討した。PRP使用群の術後1週に対する術後6か月のAl当量値減弱率は91.3%で、PRP未使用群は88.3%で、PRP使用群はPRP未使用群に比べ術後早期の骨再形成を認めたが、血小板濃縮増加率ならびにTGF-β2と相関関係はなかった。4.腸骨ブロック移植術年齢は15歳4か月で、血小板濃縮増加率は334.7%であった。術後の創傷治癒は良好で創の離開はなかった。術後1週に対する術後1年のアルミ当量値減弱率は85.1%で、骨架橋幅は0.5mmの減少と術後1週とほとんど差はなく、骨幅の吸収はほとんど見られなかったが、インプラント埋入に充分な骨幅でなかったために骨延長術を行った。PRPは創傷治癒ならびに早期の骨再形成促進と骨吸収防止に有用であることが示唆された。
抽出剤担持ポリマーによる希土類金属の高度分離に関する研究

平成4年度には、抽出剤担持ポリマーの調製法、性質および希土類金属のバッチ吸着試験について検討した。本研究で示した調製法により抽出剤担持ポリマーの作成は可能である。抽出剤担持ポリマーに対する希土類金属の吸着機構は、PC-88Aの水素イオンと金属イオンとの交換反応で行われ、pHが高いときに吸着率は高い。吸着速度に関しては従来の陽イオン交換樹脂の吸着速度とほぼ同様である。平成5年度には、軽希土類であるNdおよびSmの分離試験と重希土類であるTb、DyおよびHoの2成分系での分離試験をカラム法を用いて検討した。吸着工程では原子番号の小さい希土類が高純度で回収され、溶離工程では原子番号の大きい希土類が回収できる。吸着カラム内では、先に抽出剤担持ポリマーに吸着した原子番号の小さい希土類と供給液中の原子番号の大きい希土類との交換反応が生じ、カラムからは原子番号の小さい希土類のみが漏出してくる。抽出剤担持ポリマーを繰り返し20回程度吸着・溶離工程に使用しても、樹脂中のPC-88Aの溶出はごく微量である。ベッド高さやカラム径などを大きくすることにより分離性は向上する。通液速度は、速すぎると希土類金属の十分な交換反応が起こらないため分離性は悪くなる。溶離については、塩酸濃度が低い場合は吸着した希土類金属が徐々に溶離し、塩酸濃度が高い場合には溶離曲線がシャープに立ち上がり回収される希土類濃度は高い。吸着破過曲線および溶離曲線を図積分することにより、Ndは純度100%で70%以上の収率が得られ、Smは収率100%で80%以上の純度が得られることがわかった。今年度の研究計画にしたがって,抽出剤担持ポリマーの作成法の確立とこのポリマーによる希土類成分の吸着平衡および吸着速度が研究された。抽出剤担持ポリマーの作成は,抽出剤PC-88Aをクロロホルムにて希釈し,同重量の多孔性樹脂(Amberlite XAD-7)と混合静置して樹脂に抽出剤を含浸させた後に,クロロホルムを留去して行うことができる。抽出剤の樹脂への担持率は50%程度までは可能であり,吸着試験には担持率50%のポリマーを使用した。抽出剤担持ポリマーによるLa,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Hoの10種の希土類の吸着平衡を調べ,つぎの結果を得た。これらの希土類の吸着はpH0.52.0の間で起こり,重希土類は軽希土類よりも低いpHで吸着されることがわかった。各希土類の吸着率とpHの関係を示す曲線は極めて近接しており,バッチ吸着法で希土類の分離を行うことが不可能であり,カラム法によらないと希土類の分離はうまく行えないように思われる。ここで得た各希土類の吸着率とpHの関係は,この抽出剤PC-88Aを溶媒抽出法として使用したときに得られる抽出率とpHの関係と類似しているので,抽出剤担持ポリマーの化学的性質が担持させた抽出剤の性質によって特徴づけられることがわかる。次に,抽出剤担持ポリマーによる希土類の吸着速度を調べた。希土類の吸着は,ポリマーと希土類を含む水溶液を振〓させる条件では,希土類の種類に係わらず10分で80%の吸着が起こり,60分以内で吸着は平衡状態に到達する。このような速い吸着速度は,通常のイオン交換樹脂による吸着速度と同じ程度であって,抽出剤担持ポリマーをカラムに充てんして使用する際に,全く問題を生じない吸着速度である。

以上の結果が今年度の研究成果として明らかにされた。今年度の研究計画にしたがって、抽出剤担持ポリマーによる希土類の吸着速度、カラム吸着試験およびカラム溶離試験が行われた。希土類の吸着速度は、従来の陽イオン交換樹脂の吸着速度とほぼ同様である。軽希土類であるNdおよびSmの分離特性についてカラム法を用いて検討した。2成分系の希土類混合溶液に抽出剤担持ポリマーを適用すると、吸着工程で原子番号の小さいNdが高純度で回収され、溶離工程で原子番号の大きいSmが回収できる。カラム試験について、抽出剤担持ポリマー中のPC-88Aの利用率を結合比を3:1として計算すると、約41%と推算される。吸着カラム内では、先に抽出剤担持ポリマーに吸着したNdと供給液中のSmとの交換反応が生じ、カラムからはNdのみが漏出してくる。ベッド高さやカラム径などを大きくすることにより、分離性は向上する。通液速度は、速すぎると十分なNdとSmの交換反応が起こらないため分離性は悪くなる。溶離については,塩酸濃度が低い場合は吸着した希土類金属が徐々に溶離し、塩酸濃度が高い場合には溶離曲線がシャープに立ち上がり回収される希土類濃度は高い。吸着破過曲線および溶離曲線を図積分することにより、Ndは純度100%で70%以上の収率が得られ、Smは収率100%で80%以上の純度が得られることがわかった。重希土類であるTb、DyおよびHoの2成分系での分離試験を同様にカラム法を用いて検討した。吸着工程では原子番号の小さい希土類が高純度で回収され、溶離工程では原子番号の大きい希土類が回収できる。抽出剤担持ポリマーを繰り返し20回程度吸着・溶離工程に使用しても、樹脂中のPC-88Aの溶出はごく微量である。
新方式ソフトスイッチング昇降圧形双方向直流電力変換器の研究開発

高効率かつ低電磁ノイズ特性を有する直流DC-DCコンバータにおいて,電流双方かつ電圧昇圧・降圧可能な回路方式の検討とその実証評価を試みた。最終結果として,昇圧回路および降圧回路のみならず,極性反転型昇降圧回路に共通して適用できる高周波ソフトスイッチング部分共振回路を考案し,昇圧形を中心とする実験検証によりその有効性を実証した。20年度の取り組みにおいては,第一に当初考案していた「オープンブリッジ構造」のソフトスイッチング双方向DC-DCコンバータ回路の動作をシミュレーション解析にて検証した。その結果, 1)ソフトスイッチング方式による双方向電力制御特性と2)広範囲におよびソフトスイッチング動作を明らかにした。しかし,スイッチング損失の低減と相反して,半導体スイッチ素子数の増加から導通損失の増加,およびその発熱処理の複雑化を招く恐れがあることが課題点として明らかになった。そこでこの問題点の解決策として,回路構造の簡単化と制御システム構築の容易化を目的として2種類の非絶縁DC-DCコンバータの組み合わせによる高昇降圧比型双方DC-DCコンバータを新たに考案し,その動作検証を行っている。この新回路構造では入出力電圧の動作範囲を従来の回路構造と同条件で動作させても,スイッチング素子の耐圧および電流定格を増加さすことなく双方向電力変換が可能である特性を持つ。また,新型パワーデバイスの適用による電力変換器の高効率化についても検討を加え,とくに回路の昇圧モード時に環流ダイオードとして動作するダイオードのシリコンカーバイドショットキバリアダイオード(SiC-SBD)化により,スイッチング損失を大幅に低減できることを実証試験により明らかにした。今後,試作機による実証試験を中心に本双方向コンバータの評価を行う。前年度の結果で明らかとなった昇圧形DC-DCコンバータのソフトスイッチング化による高効率化について,試作機実験によりその効果を明らかにした。最初に,RCDスナバと提案するソフトスイッチングセルの損失分析を行い,変換効率の観点からソフトスイッチングセルの有効性を実証した。スイッチング周波数の高周波化とともにソフトスイッチング導入効果が高まり,変換器(コンバータ)の効率を飛躍的に高めることを実証した。なお,ソフトスイッチング導入によるパワー半導体デバイスのスイッチングノイズの低減効果を実証するには至らなかったが,回路の実動作波形などから実現可能であることを確かめた。次に,スイッチに次世代パワーデバイスであるシリコンカーバイド接合形ダイオード(SiC-SBD)を導入した回路を検討し,出力ダイオードおよびIGBT逆並列ダイオードのリカバリレス化から,ターンオン損失の大幅な低減によるスイッチング損失の大幅な低減の効果を実証した。この評価では,スイッチの逆並列ダイオードにおけるSiC-SBD導入効果について,回路の変換損失低減そのものに対する導入効果は明らかとならなかった。さらに,部分共振セル内の寄生振動を抑制し,スイッチの耐圧を押さえることのできるスイッチングセルを考案し,回路の優れた特性を実験により評価した。本研究で得られた成果は,昇圧形以外のDC-DCコンバータに応用する事が出来るため,昇圧形/降圧形を組み合わせた昇降圧形DC-DCコンバータ,さらにはその双方向化にも拡張可能である事が明らかとなった。
マスキング現象におけるエンベロープパタンの影響

エンベロープパタンの異なる音刺激を用いて、聴覚の動特性に関連する一連の実験を行い、下記の結果を得た。(1)急激に立ち上がり、ゆっくり減衰する音(滅衰音)の主観的持続時間は、物理的継続時間より短く知覚された。このことは、減衰音の場合、after-effectがないこと、および、時間的に先行する部分が後続する部分をマスクするという同一音内でのマスキングが生じていることを示唆する。(2)ゆっくり立ち上がり、急激に減衰する音(立ち上がり音)、および定常音の主観的持続時間は、物理的持続時間より長く知覚された。このことは、刺激のoff-set部分に強いエネルギーがある時、刺激のoff-set後もafter-effectが存在することを示唆する。(3)連続する2つの減衰音の一部が重畳している場合の重なり感について検討した結果、重畳部分の同時マスキングだけでは説明できないマスキングの影響がみられ、同一音内でのマスキングが示唆された。(4)連続する2つの減衰音の一部が重畳している刺激と、重畳部分がない刺激とを比較し、重畳部分の検知閾について検討した。また、減衰音の先端部に別の音を重畳させた場合の検知閾を測定し、同時マスキングについて検討した。さらに、減衰音の末尾を切断した刺激と元の減衰音との弁別実験を行い、末尾部の有無の検知について検討した。これらの結果、2つの減衰音の一部が重畳している場合には、重畳部の同時マスキングと先行する減衰音内で失行する部分から後続する部分へのマスキングが生じていることが示唆された。(5)減衰音と定常音の音系列を用いて、リズム知覚について検討した。その結果、主観的持続時間の長短がリズムの印象に関与することが確認できた。このことは、音系列のリズム感も音の大きさやマスキングの実験に基づいて提案された音の動特性のモデルによって説明しうることを示唆している。聴覚における継時マスキングの研究においては、通常、アスクする音とされる音とに異なった音が用いられる。しかし、我々の先行研究では、一定の長さを有する単一音内部での継時マスキングの存在を示唆する結果が得られているため、本研究において実験的な検討をおこなった。261.6Hz、349.2Hz、392Hzの3種類の周波数の純音を用いて、立ち上がり10ms、立ち下がり590msのエンベロープをもつよう作成した刺激(減衰音と呼ぶ)を標準刺激、その末尾部分を0ms200msまで段階的に削除した刺激を比較刺激とし、標準刺激と比較刺激が同じか異なるかの判断を求めた。その結果、弁別閾は約85msとなり、標準刺激の末尾部分がマスクされていることを示唆している。この結果は、刺激の初頭部分から末尾部分への継時マスキングの存在を示唆するものである。また、上の減衰音のうち互いに異なる周波数をもつ2音を継時的に発生させ、その重畳部分の長さを20ms300msまで変化させるものを標準刺激、その第1音の第2音との重畳部分を削除したものを比較刺激として弁別実験をおこなった結果、弁別閾は約170msとなった。2音の場合の弁別閾が、先の1音のみの場合の弁別閾よりも大きな値を示したのは、第1音の初頭部分から末尾部分への継時マスキングに加え、第2音の初頭部分から第1音末尾部分への同時マスキングが生じていたことによると考えられる。

すなわち、本研究においては、単一音内部での継時マスキングと2音間の同時マスキングが加算的にはたらいていたと考えられる。ただし、2音の周波数関係によって継時マスキングと同時マスキングの加算的関係が変化するとの予備的な実験結果も得られており、その点について現在検討を重ねているところである。聴覚における継時マスキングの研究では、通常、マスクする音とされる音とで異なった音が用いられる。しかし、我々の先行研究および9年度におこなった研究で、単一音内部での継時マスキングの存在が強く示唆された。本研究では、それらを受け、更に異なった角度から単一音内部での継時マスキングの存在とその特性について検討した。F4(349.Hz)、G4(392Hz)、C5(523.3Hz)の3種類の純音を用いて、立ち上がり10ms、立ち下がり590830msの刺激(減衰音と呼ぶ)を作成し、2つずつを重畳時間を変化させながら(120240ms)継時的に組み合わせた。その後、第2音立ち上がり以前の第1音先行部を系統的に削除し、2音の重なり感の有無と重畳時間および第1音先行部の長さとの関係をみた。その結果、重畳時間が長いほど、重なり感が消失するために多くの第1音先行部を必要とすることが示された。この結果は、重なり感の有無に、異なる音間の同時マスキングだけではなく、同一音内の継時マスキングが影響していることを示唆している。次の実験では、G4の純音を用いて、立ち上がり5ms、立ち下がり45595msの減衰音と立ち上がり45595ms、立ち下がり5msの刺激(立ち上がり音と呼ぶ)を作成し、立ち上がり立ち下がりともに5msの定常音と比較する形でそれぞれの主観的持続時間を測定した。その結果、立ち上がり音では、定常音と物理的持続時間が同じ時に主観的持続時間もほぼ同じとなったのに対し、減衰音では物理的持続時間の概ね2/3の長さをもつ定常音と主観的持続時間が同じとなった。同一音内の初頭部が強いエネルギーを有する場合にのみ主観的持続時間が短くなるというこの結果は、再び、同一音内での継時マスキングの存在を示唆するものと解釈された。
細粒度行動履歴にもとづくプロジェクトモニタリング機構を備えたクラウド型ＰＢＬ支援

ソフトウェア開発を対象としたPBL(Project-Based Learning)は,少人数で構成される受講生グループにソフトウェア開発プロジェクトを主体的に遂行させる学習手法である.PBL型授業は,コミュニケーションやマネジメントといった総合的な学びを提供できるため,ICT人材教育の手段として良く利用されている.一方で, (S1)環境の構築,(S2)プロジェクトの進捗状況把握,(S3)受講生の評価,といった点における課題がPBL型授業の運用において存在する.本研究では,クラウドを利用したPBL型授業運用環境を構築し,受講生の開発履歴記録・評価が可能なデータ収集・分析のための仕組みを実現した.昨年度構築したIaaS環境を用いたPBL運用環境にもとづいて,プロジェクトモニタリング環境の構築を行った.具体的には,版管理のためのsubversion,プロジェクト管理のためのTrac,受講生が開発したWebアプリケーションを公開するためのアプリケーションサーバであるTomcatといった各環境において,各受講生がどのような開発行動を実施したかを収集する仕組みを構築した.さらに,ネットワークを介してアクセス可能なクライアント環境(Windows OS上にeclipse, jdk等の開発環境が導入されている)上に,受講生がいつどのアプリケーションを動かしたか,ファイルをどのように編集したか,といった開発状況を収集する仕組みを導入した.これらの環境を組み合わせることで,受講生がいつ何を実施しているかを教員が把握できるようになった.H25年度はこれらの環境を実際に構築し,実際のチーム開発を伴う講義において複数の受講生に利用してもらい,データの収集が可能であることを確認した.国立情報学研究所(NII)と連携し,実際のIaaS環境を用いたPBL運用環境の配備を行った.配備した環境としては,半管理のためのSubversionやプロジェクト管理のためのTrac,Webサーバ等が相当する.配備においては,1グループを対象としたものを容易に複数グループ向けに展開できるようなしくみを構築し,実際のPBLにおいて環境配備が用意となることを確認した.さらに,実際のソフトウェア開発を前提としたPBLに必要となるクライアント環境を構築し,受講生に提供した.具体的には,Windows OS上にeclipse等の統合開発環境や開発に必要なサーバアプリケーションを導入し,ネットワークを介して受講生がアクセスし,利用できる環境を整えた.これらの環境を組み合わせて,30名程度のPBLカリキュラムで実際に利用可能であることを確認した.昨年度構築したPBL運用環境及びプロジェクトモニタリング環境にもとづいて,実際のPBLを実施し,開発状況の収集・分析を行った.具体的には各受講生の開発環境からアプリケーションの起動ログ,eclipseIDE上でのファイル編集履歴,サーバ側では版管理システムsubversionのアクセスログ,アプリケーションサーバTomcatのアクセスログ及び実行ログ,版管理システムにアップロードされたソフトウェアに対して実行されたテストケースの実行ログ,受講生に開発されたソフトウェアのコンパイル,実行ログを収集し,チームごとのパフォーマンスを分析・評価した.この分析・評価により,チームごとの開発実績を様々な観点から比較することが可能になり,定量的な分析結果としてチームに結果を返すことが可能となった.昨年度までに開発を行ったプロジェクトモニタリング環境を50人規模の学生を対象としたチーム開発において利用可能になるようシステムの改善を行った.また,国立情報学研究所のアカデミッククラウド及びDropbox等のパブリッククラウドサービスを併用し,多様なプロジェクトログの収集・分析が可能な環境の構築を行った.具体的にはソフトウェア起動・終了の記録やIDE上での詳細な振る舞い(ツールの選択,エディタでの編集作業,文字列のコピー・ペースト等),パブリッククラウドサービスを利用したファイルの編集履歴や様々な開発環境の記録情報を収集し,チーム開発における各個人のパフォーマンスや詳細な開発履歴を分析・可視化することが可能となった.各個人のパフォーマンス分析においては,チーム内での開発作業の詳細な偏りや特定の開発作業に関与していない学生の顕在化が可能となった.PBL運用上のルールとして,開発機会の均等による学習効果の向上を掲げ,本システムでの検出とあわせることで,すべての学生に開発に関与させ,教えあいによる能力の向上,学生間教育機会の創出が可能となった.ソフトウェア開発を対象としたPBL(Project-Based Learning)は,少人数で構成される受講生グループにソフトウェア開発プロジェクトを主体的に遂行させる学習手法である.PBL型授業は,コミュニケーションやマネジメントといった総合的な学びを提供できるため,ICT人材教育の手段として良く利用されている.一方で, (S1)環境の構築,(S2)プロジェクトの進捗状況把握,(S3)受講生の評価,といった点における課題がPBL型授業の運用において存在する.本研究では,クラウドを利用したPBL型授業運用環境を構築し,受講生の開発履歴記録・評価が可能なデータ収集・分析のための仕組みを実現した.今年度は最終的に細粒度プロジェクトモニタリングシステムをクラウド環境上に構築し,実運用する計画を立てていた.しかしながら,利用する予定だったクラウドサービス側の障害等の理由で今年度の利用が急遽困難となったため,一部のシステム構築を次年度に延期することになった.ソフトウェア工学今年度実施する予定であったクラウド環境への細粒度モニタリングシステムの導入を実施し,実験レベルではない,数十人を対象としたPBL授業に適用し,チームレベル・個人レベルでの開発状況の収集・分析作業を行う.個人レベルでの分析手法がまだ確立できていないが,データの収集手法については今年度ほぼ確立することができたため,複数の分析・可視化手法を適用し,評価を行っていくことを予定している.

平成25年度の内容として想定していたプロジェクトモニタリング環境の開発及び実施までが完了したため.初年度に想定していたサーバ環境及び受講生側PBL運用環境の構築は予定通りに完了し,現在平成25年度以降の実施を想定していたプロジェクトモニタリング環境の構築を一部前倒しで進められるようになったため.今年度は最終的に細粒度プロジェクトモニタリングシステムをクラウド環境上に構築し,実適用する計画を立てていた.しかしながら,利用環境の障害等の理由で,予定していたクラウド環境が今年度から急遽利用できなくなり,そのための費用が使えなくなってしまった.初年度にはPBLにおいて利用する環境をクラウド上に構築し,次年度にはその環境において受講生の開発状況を記録するためのモニタリング環境を構築した.今後はPBL運用環境及びPBLモニタリング環境を利用し,受講生グループ内の負荷の分散度合いや受講生の空き時間の有無によるタスク割り当て効率の評価,進度状況のチーム間比較といった,プロジェクト評価等を実際に行う手法を考案する.研究課題遂行上の課題としては,PBL運用環境を稼働させているNIIのクラウドサービスが近日中に終了することが決まっているため,別の環境への移行を年度内に実施する必要がある.現在移行環境を選定中であるが,具体的な候補を近日中に確定させ,年度内の計画完遂を目指す予定である.初年度にはPBL型授業におけるプロジェクトを受講生(および受講生グループ)が遂行するためのPBL運用環境の分析・構築を行った.今後は,これらのPBL運用環境に加え,プロジェクトにおけるソフトウェア開発工程の進捗度合いを客観的に観測するための分析・可視化環境の構築完遂を目指す.ここでは,進捗を把握するための最小単位として,タスク(受講生一人が短時間に終わらせられる仕事)を定義し,タスクを利用したプロジェクトモニタリング環境の実現を目指す.プロジェクトは通常,複数のマイルストーンから構成されており,各マイルストーンはその中で遂行されるべきタスクを複数持っている.本研究課題では,タスクの遂行量だけでなく,受講生グループ内の負荷の分散度合いや受講生の空き時間の有無によるタスク割り当て効率の確認,過去の類似プロジェクトを用いた進度状況比較等の多様なモニタリング手法を再利用可能なサービスとしてクラウド上に構築し,その有用性の評価を行う.細粒度プロジェクトモニタリングシステムをクラウド環境上に構築し,実適用する.今年度は一般的なサービスとしてのクラウド環境だけでなく,自前でミニサイズのクラウド環境も残予算で導入することを計画している.
絹の劣化度の科学的評価

絹の劣化度の定量的評価法の確立に関しては,劣化促進によって基準資料を作成し,各種の機器分析法を用いて得られた分析データと劣化促進時間との相関について検討した。また,劣化促進時間と相関性のある手法を,経年変化を受けた絹資料に適用し,実資料に適用する際の問題点について検討した。(1)絹の劣化度の定量的評価法の確立主として波長300-400nmを放射するブラックライトを用いた劣化促進装置を試作し,紫外線による劣化促進を行った。約600時間までは緩やかに強度が減少し,約2000時間の放射で,補絹に用いている電子線照射絹と同程度の強度となった。同試料に対し,電子スピン共鳴法,紫外可視分光分析法,化学発光計測法,赤外分光分析法を適用し,有機ラジカル量,芳香族アミノ酸量,アミド結合量および表面から放出されるフォトン量と劣化促進時間との相関を検討したところ,電子スピン共鳴法および紫外可視分光分析法が適用可能であった。(2)実試料への応用の問題点黒および緑に染色した絹試料について劣化促進試験を行い,上記の2法を適用したところ,光劣化では表面層に分布した染料が優先的に光分解して有機ラジカルを生成するため,電子スピン共鳴法による評価は困難であった。また,染料による遮蔽効果で絹本体の劣化速度が減少することが明かとなった。また,8世紀より収蔵されていた未染色の絹試料に関して,上記2法を適用した。分析データから推測される強度と実試料の強度は対応し,未染色のものに関する適用の可能性を示唆した。各時代の絹に同法を適用し,直線性を確認し,適用の是非を検討する必要があることがわかった。
水電解質分泌における輸送体タンパク間の協奏機構

外分泌腺細胞は、水電解質輸送を遂行するため、細胞膜にチャネル、共輸送体、対向輸送体、Na/K ATPaseなどの輸送体が存在しイオンを一方向に輸送し分泌を起こすと考えられている。本研究の目的は、これらの輸送体がどのように協調しシステムとして巨視的な分泌を形成するか(協奏機構)の検討にある。協奏機構解明のため実験対象を大量の分泌をおこす唾液腺輸送体の制御機構に限定、最先端の測定手技を有する共同研究者の各実験サイトで、共通の実験試料を対象に水および複数のイオン種の動きを観察する。協奏機構モデルに測定値を適用し、最適化実験を繰り返し外分泌における輸送体の協奏機構について検討した。1995年はサブテーマi)試料調整の共通化,ii)細胞内メッセンジャー,iii)DlチャネルとKチャネル,iv)Na/H,Cl/重炭酸対向輸送体,v)Na/K/2Cl共輸送体,vi)Na/K ATPaseとエネルギー供給)について実施。1)生理研では、灌流臓器、遊離細胞を用い、a)水分泌速度と酸素消費測定を行い、各輸送体のエネルギー要求を解析。b)多核種NMRによる細胞内Na,K,Cl,アンモニウムの輸送量測定。c)電解質輸送量とチャネル活性の相関を解析。2)唾液腺細胞単離標本の分泌経過に伴うcyclic AMP,Caの濃度変化を定量(日本大学松戸歯)、細胞内情報達系とNa/K/2Cl輸送体活性の対応を分析した(NIH)。3)羊口腔腺の灌流標本を世界で初めて作製、羊口腔腺細胞の輸送体の電気特性測定実験(シドニー大学)と重ね合わせ解析を始めた。4)顕微分光法にて細胞内Caの動態を,HPLC法にてイノシトール燐化合物の動態と輸送体燐酸化の関係を解析(コペンハーゲン大学)。5)放射性同位体法によりNa,K,Clの輸送動態を解析、Na/K/2Cl共輸送体の制御を解析(NIH)。6)水分分泌及び開口分泌に伴う細胞間隙構造の変化をレーザー顕微鏡及びSEMにて観測、水分泌経路の制御様式を検討(北里大学・カリアリ大学)。7)11月研究打ち合わせ、輸送体の局在と細胞内制御機構の位置的関係、水及びイオンの輸送経路のサイズとその制御について討論。1996年、1)生理研では、新たに耳下腺の灌流実験系を開発、a)水分泌速度と酸素消費測定、Na,K輸送量測定により各輸送体のエネルギー要求を解析。Stewardと共同で容積増大時のK輸送測定(生理研・マンチェスター大)b)京都府立医科大学においてもNMR装置を立ち上げ、重水素NMR法・マイクロイメージングを導入、上皮膜水輸送への応用を検討。c)電解質輸送量とチャネル活性の相関を解析(トロント大学)。2)北里大学・カリアリ大学では、水分分泌及び開口分泌に伴う細胞間隙構造の変化をレーザー顕微鏡及びSEMにて観測、isotroterenol刺激とcholinergic刺激においてmicrofilamentによる制御様式の違いを発見。3)purin受容体活性化による水輸送の抑制を観察(ハーバード大・生理研)。HPLC法にてイノシトール燐化合物の動態と輸送体燐酸化の関係を解析、purin受容体活性化によるIP3放出ブロックを発見(コペンハーゲン大)。4)cyclicAPMによる開口分泌に関与する顆粒膜側タンパクとして新たにVAMP-2を同定、VAMP-2の標的タンパクの候補としてsyntaxin4,SNAP-23の役割を分子生物学的手法で解析(日大松戸歯)。5)シドニー大学において羊口腔腺の灌流実験を継続、マウス顎下腺導管のNaチャネル活性制御機構としてG蛋白の役割を解析。6)アンモニウムパルス法によりNa/K/2Cl共輸送体制御を解析、新しい共輸送体の働きとして陰イオンの排出機能を提案(NIH)。7)10-11月岡崎にて研究打ち合わせ(Steward,Seo,Young,Cook,Dinudom,Turner,Soltoff,Dissing)、輸送体の新しい機能とプリン受容体活性化による細胞内情報伝達の制御、単一細胞と組織構築を持った細胞の容積増大の違い、開口分泌の分子機序、などについて討論した。本共同研究は、事前の共同研究の基礎の上に実施されたために、有意義な成果をあげることができた。特に、臓器灌流法、遊離細胞灌流法、分子生物学の唾液腺への適用について、同じ手法で得られた試料から検証したので、各方法について基礎的な成果と研究者間の合意ができてきた。一方、最終目的である協奏機構モデルへのデータ適用、解析のスケジュールがやや遅れている。本研究により、水電解質分泌研究分野の問題点の理解が大きく進展し、現時点での国際的な共通理解を得、いくつかの共同研究をスタートした。1995年はサブテーマi)試料調整の共通化,ii)細胞内

メッセンジャー,iii)DlチャネルとKチャネル,iv)Na/H,Cl/重炭酸対向輸送体,v)Na/K/2Cl共輸送体,vi)Na/K ATPaseとエネルギー供給)について実施。1)生理研では、灌流臓器、遊離細胞を用い、a)水分泌速度と酸素消費測定を行い、各輸送体のエネルギー要求を解析。b)多核種NMRによる細胞内Na,K,Cl,アンモニウムの輸送量測定。c)電解質輸送量とチャネル活性の相関を解析。2)唾液腺細胞単離標本の分泌経過に伴うcyclic AMP,Caの濃度変化を定量(日本大学松戸歯)、細胞内情報達系とNa/K/2Cl輸送体活性の対応を分析した(NIH)。3)羊口腔腺の灌流標本を世界で初めて作製、羊口腔腺細胞の輸送体の電気特性測定実験(シドニー大学)と重ね合わせ解析を始めた。4)顕微分光法にて細胞内Caの動態を,HPLC法にてイノシトール燐化合物の動態と輸送体燐酸化の関係を解析(コペンハーゲン大学)。5)放射性同位体法によりNa,K,Clの輸送動態を解析、Na/K/2Cl共輸送体の制御を解析(NIH)。6)水分分泌及び開口分泌に伴う細胞間隙構造の変化をレーザー顕微鏡及びSEMにて観測、水分泌経路の制御様式を検討(北里大学・カリアリ大学)。7)11月研究打ち合わせ、輸送体の局在と細胞内制御機構の位置的関係、水及びイオンの輸送経路のサイズとその制御について討論。1996年、1)生理研では、新たに耳下腺の灌流実験系を開発、a)水分泌速度と酸素消費測定、Na,K輸送量測定により各輸送体のエネルギー要求を解析。Stewardと共同で容積増大時のK輸送測定(生理研・マンチェスター大)b)京都府立医科大学においてもNMR装置を立ち上げ、重水素NMR法・マイクロイメージングを導入、上皮膜水輸送への応用を検討。c)電解質輸送量とチャネル活性の相関を解析(トロント大学)。2)北里大学・カリアリ大学では、水分分泌及び開口分泌に伴う細胞間隙構造の変化をレーザー顕微鏡及びSEMにて観測、isotroterenol刺激とcholinergic刺激においてmicrofilamentによる制御様式の違いを発見。3)purin受容体活性化による水輸送の抑制を観察(ハーバード大・生理研)。HPLC法にてイノシトール燐化合物の動態と輸送体燐酸化の関係を解析、purin受容体活性化によるIP3放出ブロックを発見(コペンハーゲン大)。4)cyclicAPMによる開口分泌に関与する顆粒膜側タンパクとして新たにVAMP-2を同定、VAMP-2の標的タンパクの候補としてsyntaxin4,SNAP-23の役割を分子生物学的手法で解析(日大松戸歯)。5)シドニー大学において羊口腔腺の灌流実験を継続、マウス顎下腺導管のNaチャネル活性制御機構としてG蛋白の役割を解析。6)アンモニウムパルス法によりNa/K/2Cl共輸送体制御を解析、新しい共輸送体の働きとして陰イオンの排出機能を提案(NIH)。
全生物の共通の祖先超好熱菌説の実験的検証

全生物の共通の祖先が超好熱菌であったという仮説を検証する実験を行った。酵素の系統樹を書くことから全生物の共通の祖先が持っていた酵素のアミノ酸配列を推定し、祖先型アミノ酸残基の酵素に対する影響を調べた。高度好熱菌Thermus thermophilusの持っていたイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を材料として、祖先型アミノ酸配列を変異として導入した祖先型イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を12種類作製した。その耐熱性を測定したところ6種類でタンパク質耐熱性が上昇していた。しかし、この祖先型変異酵素の推定では祖先型変異として良く保存されたアミノ酸を導入していた。従って、祖先型変異の効果がアミノ酸の保存性に依存した効果である可能性が否定できなかった。そこで、祖先型変異酵素の統計的解析を行い、祖先型酵素の耐熱性上昇効果はアミノ酸の保存性に依存した物ではなく、祖先型アミノ酸であることに起因していることを明らかにした。ついで、耐熱性上昇効果を持つ祖先型アミノ酸残基複数個をもつ多変異祖先型酵素を作製した。多変異祖先型酵素は、一変異祖先型酵素よりもさらに高い耐熱性を持つことが明らかとなった。さらに、こうして作製した一変異祖先型酵素及び多変異祖先型酵素は高温での高い活性を保持しているか、またはさらに高い活性を示すことが分かった。さらにNDTを材料として真正細菌の祖先生物が持っていた真正細菌祖先型NDTと古細菌の祖先が持っていた古細菌祖先型NDTの全合成を行った。全合成した遺伝子を大腸菌内で発現、精製に成功した。それらの完全祖先型遺伝子は高い耐熱性を保持している事が明らかとなった。全生物の共通の祖先に関しては、様々な仮説が提唱されている。本研究者は、全生物の共通の祖先の性質を明らかにする方法を考案した。本研究では、その方法を用いて全生物の共通の祖先の性質を検討する。すなわち、共通の祖先が持っていた遺伝子の配列を推定し、その配列を持つ蛋白質を、発現精製し、その性質を分析することから全生物の共通の祖先の性質を推定することを目的とする。これまでに、祖先型アミノ酸残基を変異としてもつ祖先型変異酵素の作成を行ってきた。それらの内、高度好熱性真正細菌Thermus thermophilusのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の祖先型変異酵素12種、超好熱性古細菌Caldococcusnoboribetusのイソクエン酸脱水素酵素の祖先型変異酵素4種、高度好熱性真正細菌Thermus thermophilusのグリシルtRNA合成酵素の祖先型変異酵素7種に関して、大量発現、精製を行い、その耐熱性を決定した。いずれも全生物の共通の祖先超好熱菌説を支持する結果であった。また、IPMDHとICDHの祖先型の配列を持つ完全祖先型遺伝子の全合成を行った。その遺伝子に関して大量発現と精製を試みたが、発現した遺伝子は不溶性画分となってしまった。現在精製法を検討中である。グリシルtRNA合成酵素遺伝子の祖先型配列を推定してその全合成を行った。合成した完全祖先型遺伝子の大量発現を行った。現在その精製法に関して検討中である。全生物の共通の祖先が超好熱菌であったという仮説を検証する実験を進めている。酵素の系統樹を書くことから全生物の共通の祖先が持っていた酵素のアミノ酸配列を推定し、祖先型アミノ酸残基の酵素に対する影響を調べている。すでに、昨年度までに高度好熱菌Thermus thermophilusの持っていたイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を材料として、祖先型アミノ酸配列を変異として導入した祖先型イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素を12種類作製した。これまでの祖先型変異酵素の推定では祖先型変異として良く保存されたアミノ酸を導入していた。

従って、祖先型変異の効果がアミノ酸の保存性に依存した効果である可能性が否定できなかった。今年度の研究で、祖先型変異酵素の統計的解析を行い、祖先型酵素の耐熱性上昇効果はアミノ酸の保存性に依存した物ではなく、祖先型アミノ酸であることに起因していることを明らかにした。ついで、耐熱性上昇効果を持つ祖先型アミノ酸残基複数個をもつ多変異祖先型酵素を作製した。多変異祖先型酵素は、一変異祖先型酵素よりもさらに高い耐熱性を持つことが明らかとなった。さらに、こうして作製した一変異祖先型酵素及び多変異祖先型酵素は高温での高い活性を保持しているか、またはさらに高い活性を示すことが分かった。これまでの研究では祖先型アミノ酸配列を現存する生物の酵素遺伝子に変異導入して、その祖先型変異の効果を検討した。今年度、NDTを材料として真正細菌の祖先生物が持っていた真正細菌祖先型NDTと古細菌の祖先が持っていた古細菌祖先型NDTの全合成を行った。全合成した遺伝子を大腸菌内で発現、精製に成功した。それらの完全祖先型遺伝子は高い耐熱性を保持している事が明らかとなった。
風化作用による成分の溶脱とその移動

人形峠地域の花こう岩については,まず野外において風化分帯を行い,かつ粘土鉱物組成・化学組成を求め,風化溶脱の実態を明らかにした.岩石あるいは構成鉱物の固さや変質の度合,および全岩のかさ密度などに基づき,風化殻には階層構造があり, 4帯に分帯することができる.即ち,上位より,密度が1.30g/cm^3以下でカオリナイト・ハロイサイトを産するI帯,密度1.311.74g/cm^3でハロイサイト・モンモリロナイトを産するII帯,密度1.752.45g/cm^3でモンモリロナイト・バーミキュライトを産するIII帯,及び密度2.46g/cm^3以上で,風化変質が微弱かあるいはほとんど認められないIV帯である.さらに,化学分析値とかさ密度の値から,一定体積の試料の溶脱量,溶脱率,孔隙率,および二次生成粘土鉱物の量をノルムで計算した.その結果,風化殻の下部から上部に向い,石英がわずかに減少し,斜長石が大幅に減少すること,斜長石は風化初期から溶脱が始まり,最末期には90%以上も溶脱すること,正長石は風化の中期ごろから急激に溶脱が始まること,さらに,これらの溶脱と二次鉱物の生成とがきわめてよく関連していることが明らかになった.瑞浪地方に関しては,基盤の花こう岩の風化については,同様の結果が得られた.瑞浪層群については,地表の露頭の試料だけからはその風化の実態があまり明確にならない.今後ボーリング試料を入手して検討する予定である.広島県三原市北方の花こう岩と新生界塩町層・山砂利層については,現在実験を続けているが,花こう岩とその上位のアルコース砂岩類については,風化の階層構造が明らかになりそうであり,しかも,これまで一括して山砂利層とされてきたものが,その風化変質という観点から細区分できる可能性が生じてきている.人形峠地域の花こう岩については,まず野外において風化分帯を行い,かつ粘土鉱物組成・化学組成を求め,風化溶脱の実態を明らかにした.岩石あるいは構成鉱物の固さや変質の度合,および全岩のかさ密度などに基づき,風化殻には階層構造があり, 4帯に分帯することができる.即ち,上位より,密度が1.30g/cm^3以下でカオリナイト・ハロイサイトを産するI帯,密度1.311.74g/cm^3でハロイサイト・モンモリロナイトを産するII帯,密度1.752.45g/cm^3でモンモリロナイト・バーミキュライトを産するIII帯,及び密度2.46g/cm^3以上で,風化変質が微弱かあるいはほとんど認められないIV帯である.さらに,化学分析値とかさ密度の値から,一定体積の試料の溶脱量,溶脱率,孔隙率,および二次生成粘土鉱物の量をノルムで計算した.その結果,風化殻の下部から上部に向い,石英がわずかに減少し,斜長石が大幅に減少すること,斜長石は風化初期から溶脱が始まり,最末期には90%以上も溶脱すること,正長石は風化の中期ごろから急激に溶脱が始まること,さらに,これらの溶脱と二次鉱物の生成とがきわめてよく関連していることが明らかになった.瑞浪地方に関しては,基盤の花こう岩の風化については,同様の結果が得られた.瑞浪層群については,地表の露頭の試料だけからはその風化の実態があまり明確にならない.今後ボーリング試料を入手して検討する予定である.広島県三原市北方の花こう岩と新生界塩町層・山砂利層については,現在実験を続けているが,花こう岩とその上位のアルコース砂岩類については,風化の階層構造が明らかになりそうであり,しかも,これまで一括して山砂利層とされてきたものが,その風化変質という観点から細区分できる可能性が生じてきている.