hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋紡錘における機械受容変換膜イオンチャネル

変位依存性チャネルを超微形態的に観察しようとする試みは、凍結割断法とディープ・エッチング法を使って研究をしてきた。後者の方法で、感覚神経末端の置かれている環境構造が明らかにされ、網状のマイクロフィラメントが筋紡錘の形態依持に大きな役割を果していることがわかった。凍結割断法で明らかになった膜内パーティクルの密度は、神経末端の先きほど低い。除神経後3日で、その密度が正常時の20%までに低減すると、筋紡錘からの求心性インパルスは消失した。この形態と機能の並行する低下は、膜内パーティクルの一部が変位依存性チャネルである可能性を示唆するものであると考えた。筋紡錘感覚神経終末の機械受容チャネルを超微形態的に同定するために,凍結割断法を使って無髄神経膜内粒子(パーティクルの一部はイオンチャネルであることがわかっている)のレプリカ像を得て,その粒子密度や直径を計測した.その膜にはNa^+,K^+,Ca^<2+>などのイオンチャネルも混在することがわかっているから,これらと機械受容チャネルを区別できないかと考えて感覚神経を切断後の変化をしらべた.その結果,除神経後34日で膜内粒子密度が正常値の20%以下に下がると,伸張に対する応答が消失することがわかった.単離したカエル筋紡錘の嚢をコラゲナーゼで消化した後,イオンや薬物を直接に感覚神経終末に作用させることが可能になった.その標本ではディブチリール・サイクリツクAMPにより自発性放電頻度が顕著に高まる.フォルスコリンでも同様の効果があったから,機械受容にもcAMPの関与があることがはっきりした.自発放電頻度が高まっている間は,伸張応答が悪くなっていた.その応答は細胞外Ca^<2+>濃度を高めると改善されるから,Ca^<2+>の流入か,細胞内濃度と密接に関係していると考えられた.単離し,除出したカエル筋紡錘の感覚神経末端から記録される紡錘電位はCa^<2+>チャネル遮断剤の投与で完全に消失する.その後も伸張に対して求心性放電を出すから,眞の受容器電位といえない.正常リンガー液中では50nAまでの逆向性通電で紡錘電位の振幅は大きく修飾されるが,求心性放電頻度は殆んど変化しない.これは紡錘電位の発生する場所より求心性放電の符号化場所の方が一層末端にあることを意味している. K^+チャネル遮断剤作用下では50nA以下の逆向性通電により放電頻度が大きく修飾される.これらの結果から,筋活動電位によって筋紡錘感覚神経が誤発射しないように保護する機構の一つと推定した.食用ガエルの半腱様筋から単離された筋紡鍾の感覚神経終末の機能がその終末の急速凍結割断法で得られたP面内の大膜内粒子(12nm以上)の密度と密接に関連していることがわかった。膜内粒子の大部分は12nm以下のもので粒子直径ヒストグラム上ではっきり区別できる。その大膜内粒子は神経軸索無髄終末の膨大部(珠玉様になっている)周辺に集まっている。その膨大部は神経終末中で最も変形しやすく、そして伸張中に容積が増す場所であることが報告されている。食用ガエルの腰関節の背側で坐骨神経を挫滅した後の神経再生中に、伸張に対する応答は一過性放電から正常な放電へと恢復する。その経過にほぼ一致して大膜内粒子の密度は増した。しかし小膜内粒子密度は並行しない。腱切断によって6ー90日間、半腱様筋を正常値の約50%の長さに短縮させると、小膜内粒子密度は26倍に増える。半腱様筋を正常長より約130%に引き伸ばした状態に8日間保った後、小膜内粒子密度は正常の6070%に減少した。それに対して大膜内粒子密度は50%短縮後も、また130%伸展後も変化がなく、伸張応答も正常のままであった。これらの実験結果から、大膜内粒子が伸張応答に関連するイオンチャネルである可能性が示唆された。
新しいヒト化疾患モデルマウスを用いたナノ遺伝子修復治療法の開発

NOD/SCID/γc-nullの新生児マウスと患者造血幹細胞を用いて無ガンマグロブリン血症XLAのモデルマウスを作成した。無ガンマグロブリン血症患者ではそれぞれ末梢血のB細胞が欠損しているが、遺伝子異常が修復されればB細胞は分化・増殖する。そこで変異のある部分を修復して直す遺伝子修復療法を試みた。修復された細胞は生体内で分化・増殖するので長期間待てば再構築される可能性がある。陰性荷電を示すDNA分子と優れた分子間相互作用を示すナノ粒子を化学合成し、ナノ粒子の細胞生物学的な特性を観察した。しかしDNAと反応がいい分子は膜の透過性が悪いなどの問題が多く、まだ効率よく遺伝子修復する分子は得られていない。btk遺伝子の部位特異的な点変異の誘発についてナノ粒子を用いた方法でどの程度得られるかについて様々な方法で検討を行ったが、特異的変異の頻度があまりにも低く実用的でなかった。今後、ナノ粒子による遺伝子修復を成功させるためには、特異的に特定の場所のDNAに結合できるZFP(Zinc Finger Protein)などを用いた方法を導入し、この特異的変異の頻度を高める実験を進める必要がある。(1)ヒト化無ガンマグロブリン血症XLAモデルマウスの作成石川らが報告したHumanized Miceの作成手法に従って,患者由来のCD34陽性細胞(2-10x 10^4細胞)をNOD/SCID/γc-nullマウス(生後48時間以内)の顔面静脈に輸注した。マウスにおけるB細胞成熟系譜をフローサイトメトリーで移植後経時的に観察し,末梢血B細胞系列の分化が障害されていることを確認した。またレシピエントマウスの骨髄有核細胞を採取し,フローサイトメトリーを用いて、作製したマウスにおいてB細胞系列の分化成熟が障害されていることを確認した。このようにNOD/SCID/γc-nullの新生児マウスと患者造血幹細胞を用いて無ガンマグロブリン血症XLAのモデルマウスを作成した。(2)B細胞のGrowth advantageを利用した遺伝子修復療法無ガンマグロブリン血症患者ではそれぞれ末梢血のT細胞、B細胞が欠損しているが、遺伝子異常が修復されればT細胞、B細胞は分化・増殖する.そこで変異のある部分を修復して直す遺伝子修復療法を試みる。現在btk遺伝子の部位特異的な点変異の誘発についてナノ粒子を用いた方法でどの程度得られるかについて検討中である。
その場表面電位計測によるペロブスカイト太陽電池の動作原理解明

ケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)を用いた、太陽電池計測のためのその場電位計測技術を構築し、ペロブスカイト太陽電池の評価へ応用した。構築したシステムを用いて、光照射に伴うポテンシャル分布の変化を明瞭に観察し、かつ、定量的に測定することに成功した。また、光照射によって生じる変化分のみを抽出することでp-n接合の空間認識が可能であることを実証した。この手法を用いた評価から、p-n接合の位置(電荷分離が生じる場所)はペロブスカイト太陽電池の構造や材料組成によって変化することが分かった。今後はより多くのデバイスを評価することで、その要因を解明することがデバイス設計指針を得るために重要となる。これまでのペロブスカイト太陽電池に関するデバイス開発はエネルギー変換効率の改善を目的とした現象論的アプローチ(試行錯誤)が主流であった。本研究ではケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)を用いたその場静電ポテンシャル計測によりその動作原理の解明を試みる。これにより物理的理解に根ざした最適なデバイス構造を提案することを目的とする。27年度は、ガラス基板上に作製したペロブスカイト太陽電池を破断し、その断面にてKPFM計測を行った。これにより、p-i-n接合の空間認識やデバイス動作中の電荷蓄積状態、キャリア輸送機構に関する知見を得ることを試みた。まず、破断面にて原子間力顕微鏡(AFM)計測を行い、表面のラフネスを評価した。その結果、単純な破断でも比較的平坦な表面(100 nm以下のラフネス)が得られることが分かった。その後、光照射下でのKPFM計測を行い、提案した手法(暗状態と光照射下でのポテンシャルプロファイルを計測し、その差分を取ることでp-i-n接合の空間認識を行う)を用いてデータの解析を行った。その結果、光照射によりペロブスカイト層と電子輸送層の間でポテンシャルが大きく変化する様子が見られ、電荷分離過程に関する重要な知見が得られた。しかしながら、いくつかの試料において同様の実験を行ったところ、破断の具合によりデータにばらつきがあり、再現性が良くないことが分かった。この課題を解決するために、アルゴンイオンエッチングによる表面平坦化を試みた。平坦化処理によりラフネスを20 nm以下に抑えることができ、また、多層膜の各層をより明瞭にイメージングできることが分かった。しかしながら、平坦化処理中にデバイス性能の劣化や消失が多く見られ、その場KPFM計測を行うためには、プロセスの改善が必要であることが分かった。現在、デバイス性能を損なわずに表面平坦化を行う手法を開発中である。本研究の重要な課題の一つは、その場静電ポテンシャル計測により、ペロブスカイト太陽電池の動作原理(特に電荷分離の過程)を解明することである。27年度の成果より、ガラス基板の破断による断面ケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)計測および提案したデータ解析の手法を組み合わせることで、p-i-n接合の位置情報に関する知見が得られる事が分かった。現時点では、データの再現性に課題があるが、断面処理(表面平坦化)技術の工夫を行うことで、その改善が期待される。再現性・信頼性の高い実験データが得られれば、ペロブスカイト太陽電池の動作原理解明に資する重要な知見が得られると考えられる。そのため、研究は大旨順調に進展していると考えている。本研究では、ケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)を用いたその場電位計測によりその動作原理の解明を試み、これにより物理的理解に根ざした最適なデバイス構造を提案することを目的とした。28年度の研究で以下の成果が得られた。(1) 27年度に行った断面KPFM電位計測では、断面作製の具合によりデータにばらつきがあり再現性が得られないという課題があった。そこで、断面作製技術の開発に注力し、再現良く平坦な断面を露出させる手法を確立することができた。これにより、取得した電位計測データの再現性および信頼性が大きく向上した。(2) 27年度の研究で、光照射時と暗状態での電位分布の変化を直接観察することに成功した。しかし、その変化分がデバイスの開回路電圧の値と一致しないという課題があった。これについて原因を探ったところ、KPFM測定に使用するレーザ光がわずかながらデバイス側へ漏洩し、それにより完全な暗状態での電位分布計測ができていないことが分かった。そこで、測定方法を改良したところ、光照射による電位分布変化を定量的に計測することに成功した。これにより、高い信頼性でp-n接合の空間認識が可能となった。(3) (1)、(2)で開発した技術をもとにペロブスカイト層の組成や太陽電池構造の違いで、p-n接合の位置がどのように変化するかを測定した。その結果、太陽電池の構造だけでなく、ペロブスカイト層の組成によってもp-n接合界面の位置が大きく変化することが分かった。この知見はデバイス構造を最適化する上で、どの層を改良すれば良いか示唆する重要なデータであり、デバイス開発の設計指針に大きく貢献すると期待できる。

この手法を用いた評価から、p-n接合の位置(電荷分離が生じる場所)はペロブスカイト太陽電池の構造や材料組成によって変化することが分かった。今後はより多くのデバイスを評価することで、その要因を解明することがデバイス設計指針を得るために重要となる。27年度の成果から、清浄かつ平坦な断面を作製する技術の開発が、得られるデータの再現性・信頼性を向上するために必要であることが分かった。そこで28年度は、まずイオンエッチングによる断面作製技術の開発に注力する。現在一番問題となっているのは、イオンエッチング中に生じる、試料断面への金属膜の再堆積である。これは、断面処理の際に使用する金属の遮蔽板が試料と同様にイオンエッチングされることで生じる。再堆積が生じるとデバイスがショートしてしまうため、デバイス動作下でのその場KPFM計測ができない。そこで、再堆積を抑制するためのいくつかの手法を検討する。断面処理技術を確立した後は、当初の計画通り様々な条件下でKPFM計測を行い、ペロブスカイト太陽電池動作原理の解明を目指す。仮に断面処理技術の構築がうまく行かない場合は、単純な破断法を用いた試料作製により多くの実験を行い、統計的なデータ解析を行うことで、データの信頼性を担保する。表面物性計測当初の計画では、27年度は単純な構造を有したペロブスカイト太陽電池の作製に必要な実験系を構築する予定であった。しかし、簡便な作製法を用いたデバイスで評価テスト(光照射下でのケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)計測)を行ったところ、単純な構造のペロブスカイト太陽電池を作製することよりも、まず清浄かつ平坦な断面を作製するための技術開発を行うことが重要であることが分かった。そこで、27年度は断面作製技術およびその場KPFM計測手法に注力し、当初計画していたペロブスカイト太陽電池作製のための実験系の構築とそのための予算執行を28年度に延期することとした。繰り越しした金額については、27年度に計画していた単純な構造を有したペロブスカイト太陽電池作製のための実験系構築費用として使用する。また、28年度に計上していた予算に関しては計画通り、ケルビンプローブフォース顕微鏡計測のためのプローブ探針などの消耗品費として使用する予定である。
組み紐構造を用いたホップ代数の表現圏に関する研究

あるクラスの有限次元ホップ代数に対して、その組み紐構造を用いて、多項式の形で与えられる不変量を導入した。この多項式不変量は、表現圏が同値であるようなホップ代数に対して同じ多項式を定めるため、表現圏が違うかどうかを知りたいときに役に立つ。ホップ代数の表現圏の不変量の典型例として表現環があるが、表現圏としては異なっているにも関わらず表現環が一致してしまうことがあり、表現環だけではホップ代数の表現圏の違いを捉えきることはできない。多項式不変量はこの問題の解決に寄与する。実際、本研究により、表現環は一致するが多項式不変量は異なるようなホップ代数の組の例が新たに見つかった。研究代表者により最近、ホップ代数の多項式不変量が定義された。この多項式不変量は、ホップ代数の組紐構造を用いて定義され、その定義の仕方から、表現圏の不変量、つまり、テンソル森田同値不変量になっていることがわかる。すでに、同じ表現環を持つ8次元の半単純ホップ代数は、この多項式不変量により区別されることがわかっているが、今回新たに、このような2組のホップ代数の例が、鈴木智支氏により定義された余半単純ホップ代数の族の代数構造を調べることにより、見つかった。彼の構成した余半単純ホップ代数の族はν,λ,N,Lによりパラメータづけされているが、このうち、ν=+の場合の代数構造を調べ、それが二面体群を部分群として含むある有限群の群代数Aと同じであることがわかった。ν=+の場合の鈴木氏のホップ代数と群ホップ代数Aとは同じ表現環を持つが、多項式不変量は異なることがわかった。研究代表者が定義した多項式不変量はホップ代数の基礎体を係数環とする多項式であるが、興味深いことに、これまで計算したホップ代数に対してはすべて整数係数になっている。そこで、多項式不変量が整数係数となるための条件を、研究分担者の増岡彰氏にアドバイスを受けながら、調べた。その結果、ホップ代数が分解型有限次元半単純で、かつ、ホップ代数の基礎体が有理数体のガロア拡大であって、そのガロア群がホップ代数にsemilinearに作用するとき、多項式不変量は整数係数になることがわかった。特に、位数nの有限群の群ホップ代数の多項式不変量は、その係数体が有理数体に1の原始n^3乗根を添加した体であるとき、常に整数係数になることがわかった。ホップ代数の表現論において、2つのホップ代数の表現圏が抽象的なモノイダル圏として同値になるための条件を知ることは基本的な問題である。研究代表者は、最近、半単純かつ余半単純な有限次元ホップ代数に対して、その組紐構造を用いることにより、表現圏の不変量になっているような多項式不変量の系列を定義した。ホップ代数の表現圏の不変量の典型例として表現環が知られているが、表現圏としては異なっているにも関わらず表現環が一致してしまうことがあり、表現環だけではホップ代数の表現圏の違いを捉えきることはできない。実際、研究代表者により、表現環は一致するが多項式不変量が異なるようなホップ代数の組の具体例が多数知られている。昨年度までの研究により、ホップ代数が、有理数体上定義された有限次元半単純ホップ代数を、有理数体の有限次ガロア拡大により係数拡大したものであるとき、その多項式不変量は整数係数になることがわかっている。当該年度においては、多項式不変量が持っている性質を明らかにするために、いくつかの群ホップ代数やKac-Paljutkin型ホップ代数に対して、その多項式不変量を整数環上で既約分解し、既約成分として現れる円分多項式をMaple,Mathematica等の数式処理ソフトを使って求めた。さらに、基礎体の拡大の下での多項式不変量の変化の様子について調べた。その結果、基礎体の適当な有限次分離拡大をとると、それ以上基礎体を拡大しても、組み紐構造は増えないことがわかった。このことから、多項式不変量は基礎体の適当な有限次分離拡大をとった後では、変化しない(安定する)ことがわかった。
スペクトロスコピックＸ線回折イメージングによるナノスケールＸ線吸収分光

昨年度実施した計算機シミュレーションの結果に基づき、コヒーレントX線回折イメージングによるX線吸収分光測定の原理実証実験を大型放射光施設SPring-8にて行った。厚さ1マイクロメートルの窒化珪素膜基板上に酸化マンガン(II)、酸化マンガン(II、III)をそれぞれ600ナノメートル成膜し、集束イオンビーム加工装置によって、最小構造100ナノメートルの文字列パターンを加工し、観察試料とした。原理実証実験は、SPring-8の理化学研究所専用のビームラインBL29XULにて行った。MnのK吸収端近傍のエネルギーに単色化されたX線を全反射集光鏡によって約600ナノメートル(半値幅)に集光し、試料に照射した。試料から散乱されたX線は直接撮像型二次元X線検出器によって検出した。入射X線エネルギーをMnのK吸収端近傍で変化させ、20点の入射X線エネルギーでコヒーレントX線回折強度パターンを測定した。そして、コヒーレント回折強度パターンに位相回復計算を実行し、試料像を再構成した結果、20ナノメートルのピクセル分解能で試料像を再構成することに成功した。そして、再構成像中の同じ箇所の1ピクセル強度の入射X線エネルギー毎に抜き出しプロットすることでX線吸収量のエネルギー依存性を調べた。X線吸収量のエネルギー依存性はX線吸収スペクトルの一般的な特徴を有し、参照試料のX線吸収スペクトルと良い一致を示していた。以上のように、コヒーレントX線回折イメージングにより高空間分解能X線吸収分光を実証することに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。スペクトロスコピックCXDIの実現可能性について計算機シミュレーションを用いて検討した。CXDIにより高い空間分解能を有するXAFSイメージングが原理的に可能であるが実験的には容易でない。なぜなら、XAFSスペクトルに現れる微細構造は変化が微弱であり、極めて高い感度でCXDI実験を行う必要があるからである。また、高い空間分解能を達成するためには、微弱な高角散乱強度を高い信号帯雑音比で取得する必要がある。サイズ500nmの鉄粒子からなるモデルについて、CXDIの計算機シミュレーションを行った。入射エネルギーを鉄のK吸収端を含む7.11 keVから7.15 keVの間の9点とし、回折強度パターンの強度ダイナミックレンジを4桁から8桁まで変化させた。位相回復計算により試料像の再構成を行った結果、強度ダイナミックレンジが6桁以上のとき鮮明な再構成像が得られ、複素透過関数から求まる吸収係数は入力値との誤差が3%程度であった。また、吸収スペクトルに見られる特徴的な微細構造を良く再現していた。このシミュレーション結果より、スペクトロスコピックCXDI実現には従来の実験と比較して1000倍程度大きなダイナミックレンジで回折強度パターンを取得する必要があることが判明した。当初の計画通り、スペクトロスコピックCXDIの実現可能性について計算機シミュレーションを用いて検討した。その結果、スペクトロスコピックCXDIを従来の方法で実現することが困難であることが判明し実験には至らなかったが、スペクトロスコピックCXDIを実現するための新測定法の検討しているため。スペクトロスコピックCXDIを実現するために、回折強度パターンをダイナミックレンジを圧縮する新手法の開発を行い、その早期実証を目指す。
分泌型miRNAによる褥瘡・糖尿病性皮膚潰瘍の評価方法の確立と新規治療法への応用

糖尿病に合併する慢性皮膚創傷の浸出液にはマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9が多量に含まれる。過剰なMMP-9は創傷治癒の遅延や臨床的重症度と関係する。軟膏基剤は薬効を持たない賦形剤と言われてきた。しかし本研究で、基剤のマクロゴールは創面においてMMP-9阻害という薬理作用をもつことを示した。滲出液マイクロRNAのmiR-126の発現は創傷により著名に増減した。低酸素環境が血管内皮細胞由来miRNAと血管内皮機能に与える影響の解析を進め、in vitroの培養細胞の系であるが、miR-126のノックダウン、過剰発現を行いMMP-9や血管新生、血流に関与する可能性を示した。褥瘡や糖尿病性皮膚潰瘍は高齢者に高頻度にみられる疾患である。病態は急性創傷と異なり複雑で個別性は高い。申請者はこれまで治療に用いる薬剤と潰瘍生体成分の相互作用に着目し、治癒を促進する外用薬の組み合わせを見いだしてきた。しかし多様な病態に適した外用薬の選択は容易ではない。一方、細胞外に放出される分泌型マイクロRNA (miRNA)が新たな疾患バイオマーカーとして期待されている。平成25年度は褥瘡治療に用いられるガーゼの吸水性に関する研究を進め、浸出液をガーゼから効率的に回収する方法を確立した。また褥瘡・糖尿病性皮膚潰瘍に特異的なmiRNAを微量の浸出液や血液から効率よく検出するための条件を検討した。今後浸出液に存在する分泌型miRNAの解析を進めていくうえでの基盤とした。褥瘡等の慢性創傷の浸出液には外科的急性創傷に比べマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9が多量に含まれており、そのコラーゲン分解活性も高くなっている。過剰なMMP-9は褥瘡の治癒の遅延や臨床的な重症度とも関係している。軟膏基剤マクロゴールはMMP-9のin vitroの検討からMMP-9の活性を阻害することを明らかにした。また、平成25年度の成果をもとに、平成26年度は褥瘡浸出液を医療用ガーゼから回収して分泌型miRNAの動態を解析した。また、分泌型microRNAの動態について喫煙者で興味深い知見を得た。喫煙者では閉塞性血管炎が発生しやすくその結果虚血性潰瘍をきたしやすい。喫煙者では8週間の禁煙により血管機能が回復するとともに末梢血のmiR-126レベルが回復することを明らかにした。禁煙による血圧の低下とmiR-126上昇は血管機能を回復する鍵となる可能性がある。糖尿病に合併する慢性皮膚創傷の浸出液には外科的急性創傷に比べ、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9が多量に含まれる。コラーゲン分解活性も高い。過剰なMMP-9は創傷治癒の遅延や臨床的な重症度とも関係する。我々は今年度、in vitroの検討から軟膏基剤マクロゴールによるMMP-9活性の阻害様式を明らかにした。従来、軟膏基剤は薬効を持たない賦形剤と言われてきた。しかし、今回の研究結果は基剤のマクロゴールは創面においてMMP-9阻害という薬理作用をもつことを明らかにした。外用薬による治療法の選択に酵素活性の制御という新たな方向性を加える事もできた。褥瘡など慢性創傷に対する外用薬は薬効成分に加えて吸水性を考慮して選択される。吸水作用も考慮することで、よりよい治療を提供できるようになる。今年度、我々は側鎖にアリル基を持つPEOを用いた新規軟膏基剤を開発し、側鎖を架橋させたゲル基剤の吸水性に及ぼす影響を明らかにした。ユーパスタと同等の吸水力をもち、吸水作用はユーパスタより長時間続き、ユーパスタより溶解しにくいという特性をもつ。今後の新規軟膏基剤の開発により、高齢者の慢性皮膚潰瘍や創傷がより速やかに治癒する可能性をさらに検討していきたい。滲出液miR-126の発現の増減はMMP-9の発現に影響を与え、組織リモデリングに関与していると考えられ、miR-126発現の制御は新たな治療標的となる可能性がある。低酸素環境が血管内皮細胞由来miRNAと血管内皮機能に与える影響の解析を進め、in vitroの培養細胞の系であるが、miR-126のノックダウン、過剰発現を行いMMP-9や血管新生、血流に関与することを示した。また、喫煙により低下したmiR-126は禁煙により回復することから、閉塞性血管炎などの皮膚病変におけるバイオマーカーとしてのmiR-126発現の検討をすすめて行く。

MMP-9活性を見るin vitroの評価系でマクロゴール軟膏はクローニングで得たMMP-9の吸光度を低濃度から低下させ、さらにMMP-9酵素活性を抑制した。阻害様式は現在解析中である。マクロゴール軟膏と混合したMMP-9でウエスタンブロッティングを行った結果、マクロゴールはMMP-9の泳動を阻害したのではなく、活性そのものを抑制したことが示唆された。また、褥瘡滲出液を含んだガーゼから滲出液を回収した。この滲出液からRNAを抽出してリアルタイムRCRを行いmiR-126の発現動態を解析した。滲出液におけるmiR-126の発現は、褥瘡初期から中期にかけて上昇がみられた。その後は後期に向けて発現が減少する傾向がいずれのサンプルからも得られた。miR-126の発現の増減はMMP-9の発現に影響を与え、組織リモデリングに関与していることが考えられる。臨床検査いままで軟膏の基剤は薬効を持たない賦形剤と言われてきた。しかし、今回の研究結果から、基剤のうちマクロゴールは創面において薬理作用をもつことが明らかとなった。いままで褥瘡など慢性創傷に対する外用薬は薬効成分や吸水性を考慮して選択されていた。今回の結果から外用薬による治療法の選択に酵素活性の制御という新たな方向性を加える事ができた。慢性創傷の外用薬は創面における基剤の薬理作用も考慮することで、よりよい治療を提供できるようになる。今後の研究により、マクロゴールの使用が速やかな創傷治癒へ貢献する機序をさらに明らかにしていきたい。滲出液miR-126の発現の増減はMMP-9の発現に影響を与え、組織リモデリングに関与していることが考えられるため、miR-126発現の制御が新たな治療標的となる可能性がある。In vitro培養細胞の系で、miR-126のノックダウン、過剰発現を行いMMP-9や血管新生、血流に関与する因子の発現変動を検討する。また、喫煙により低下したmiR-126は禁煙により回復することから、閉塞性血管炎などの皮膚病変におけるmiR-126発現の検討をすすめて行く。褥瘡治療に用いられるガーゼの吸水性に関する研究では臨床現場で用いられるガーゼの吸水性を評価した。ガーゼ1gあたり5-6gの吸水が見られた。吸水したガーゼからの水分は30分の遠心でおよそ90%を回収できた。滲出液のタンパク質量は血漿のタンパク質量より少ないためRNAの抽出はより効率的に行いうると推察された。また、リアルタイムPCR法で微量の浸出液や血液から効率よく分泌型miRNAを検出できるよう抽出法と反応条件を検討した。ヒトで血液0.5mlあたり数μgの総RNAを得られる。miRNAはRNAサンプル全体にわずか0.01%程度しか存在せず、検出に数ngのmiRNAを必要とする。低酸素環境に暴露した血管内皮細胞株の培養上清中には微量のmiRNAが存在するのみであり、微量の浸出液ないし血液を用いて測定するには感度の向上が必要であった。物品費における実験用プラスチック器具、試薬の使用におけるコストダウン努力により19,936円が残った。皮膚組織由来のmiRNAを臨床検査に応用することは高齢者には侵襲性が高い。侵襲性が低く簡便に検体を得て診断ができるよう分泌型miRNAに焦点を当てて解析する。引き続き褥瘡・糖尿病性皮膚潰瘍に特異的なmiRNAを微量の浸出液や血液から効率よく検出する条件を検討して確立する。miRNAの抽出
RARMIS概念に基づく時空間GISの自治体・地域活動への導入に関する研究

本研究では,このRARMIS概念を実現するために開発を進めてきた時空間GIS(DiMSIS)を基盤とし,平常業務と災害時業務を連続して扱うことができる自治体対応アプリケーションシステムと,災害発生時に自治体と連携し活動する地域コミュニティーでの利用を考慮したアプリケーションシステムのプロトタイプ開発と,平常時の活動への効率のよい導入,災害時における情報収集・管理活動への円滑な適応を行うための方法論の提案を行った.開発したシステム・提案した方法論は,国内外の複数の自治体(神戸市長田区役所,富山県婦中町,鳥取県智頭町,岐阜県白川町,トルコドゥズジェ市など)や地域コミュニティー(真陽地区防災福祉コミュニティー)に実際に導入することで評価を行った.これらの研究成果は,各自治体での実際の業務に利用されるに至っており,平成15年3月に富山県婦中町で行われた報告会を兼ねた研究会では,北陸地域の自治体関係者,システム開発メーカを中心に100名以上の参加があった.また,防災面での利用として,神戸市長田区総合防災訓練,富山県婦中町総合防災訓練,東京都杉並区総合震災訓練において利用された.さらに,トルコドゥズジェ市においても,震災復興から平常業務までをカバーするシステムの中核として時空間地理情報システムが利用され始め,平成15年3月には研究会も開催された.本研究では,このRARMIS概念を実現するために開発を進めてきた時空間GIS(DiMSIS)を基盤とし,平常業務と災害時業務を連続して扱うことができる自治体対応アプリケーションシステムと,災害発生時に自治体と連携し活動する地域コミュニティーでの利用を考慮したアプリケーションシステムのプロトタイプ開発と,平常時の活動への効率のよい導入,災害時における情報収集・管理活動への円滑な適応を行うための方法論の提案を行った.開発したシステム・提案した方法論は,国内外の複数の自治体(神戸市長田区役所,富山県婦中町,鳥取県智頭町,岐阜県白川町,トルコドゥズジェ市など)や地域コミュニティー(真陽地区防災福祉コミュニティー)に実際に導入することで評価を行った.これらの研究成果は,各自治体での実際の業務に利用されるに至っており,平成15年3月に富山県婦中町で行われた報告会を兼ねた研究会では,北陸地域の自治体関係者,システム開発メーカを中心に100名以上の参加があった.また,防災面での利用として,神戸市長田区総合防災訓練,富山県婦中町総合防災訓練,東京都杉並区総合震災訓練において利用された.さらに,トルコドゥズジェ市においても,震災復興から平常業務までをカバーするシステムの中核として時空間地理情報システムが利用され始め,平成15年3月には研究会も開催された.本研究では,このRARMIS概念を実現するために開発を進めてきた時空間GIS(DiMSIS)を基盤とし,平常業務と災害時業務を連続して扱うことができる自治体窓口対応アプリケーションシステムと,災害発生時に自治体と連携し活動する地域コミュニティーでの利用を考慮したアプリケーションシステムのプロトタイプ開発と,平常時の活動への効率のよい導入,災害時における情報収集・管理活動への円滑な適応を同時に可能にするマニュアル(マルチメディア技術を応用したデジタルコンテンツ)の開発を行い,災害直後から利用できる自治体情報システムの確立を目指す.また,開発するシステムは,国内外の複数の自治体や地域コミュニティーに実際に利用してもらうことで評価を行い,この結果を基に,災害直後から利用できる総合的なシステムのフレームワークを行なうことを目的とする.本年度は,自治体,地域活動への導入課題の明確化を目的として,神戸市長田区役所,真陽地区防災福祉コミュニティー,富山県婦中町,鳥取県智頭町,岐阜県白川町,トルコドゥズジェ市における情報処理化の現状把握,GIS導入の可能性に関する調査及び,プロトタイプシステムの開発を行った.次年度は,これらの情報を交換し,地域の特徴とGISの導入法に関する検討を行う予定である.本研究では,このRARMIS概念を実現するために開発を進めてきた時空間GIS(DiMSIS)を基盤とし,平常業務と災害時業務を連続して扱うことができる自治体対応アプリケーションシステムと,災害発生時に自治体と連携し活動する地域コミュニティーでの利用を考慮したアプリケーションシステムのプロトタイプ開発と,平常時の活動への効率のよい導入,災害時における情報収集・管理活動への円滑な適応を行うための方法論の提案を行った.開発したシステム・提案した方法論は,国内外の複数の自治体(神戸市長田区役所,富山県婦中町,鳥取県智頭町,岐阜県白川町,トルコドゥズジェ市など)や地域コミュニティー(真陽地区防災福祉コミュニティー)に実際に導入することで評価を行った.これらの研究成果は,各自治体での実際の業務に利用されるに至っており,平成15年3月に富山県婦中町で行われた報告会を兼ねた研究会では,北陸地域の自治体関係者,システム開発メーカを中心に100名以上の参加があった.また,防災面での利用として,神戸市長田区総合防災訓練,富山県婦中町総合防災訓練,東京都杉並区総合震災訓練において利用された.さらに,トルコドゥズジェ市においても,震災復興から平常業務までをカバーするシステムの中核として時空間地理情報システムが利用され始め,平成15年3月には研究会も開催された.
Sn-Bi基合金の超塑性変形メカニズムの解明

本年度はSn-Bi合金における超塑性変形メカニズムの解明を目的とし、様々な合金組成のSn-Bi合金を秤量・溶解・鋳造・塑性加工によりドックボーン型試験片を作製し、その引張変形挙動、および変形に伴う組織変化の観察・EBSD(電子線後方散乱回折)分析などにより力学特性と超塑性変形に及ぼす各種因子の影響について調査した。本年度は特に、Snと金属間化合物を形成する元素(Cu、Ni)の影響を中心に調査した。これらの系では、試験温度60°C以上および低ひずみ速度(5.25×10-4 s-1以下)の条件で超塑性変形挙動を示した。また、その際に求められたひずみ速度感受性指数は最大でも0.25となり、これまでの報告で示された微細粒超塑性変形のしきい値を下回っていた。この理由としては、Sn-Bi合金は亜共晶組織を呈しており、初晶と共晶の主たる変形時期がひずみに依って異なることが予測された。そこで、異なるひずみまで変形させたSn-Bi合金の組織についてEBSD分析を行い、組織の変形メカニズムに関する検証を進めている。また、CuやNiの添加は共晶組織の微細化および共晶の粒界部への金属ないしは金属間化合物の偏析を助長するために、超塑性変形挙動をもたらすことが示唆された。今年度はCuおよびNi添加Sn-Bi合金の変形挙動について、引張特性および各種因子の影響についての調査を計画し、超塑性変形メカニズム解明につながる成果を十分に得られたため。今年度はSn-Bi合金の引張特性と各種因子の影響について、今後の指針に繋がる成果が得られた。そこで、今後はこれまでに得られた成果について、超塑性変形メカニズムに関するEBSD分析を行ってメカニズムの検証を進めていく。さらに、Snと固溶する系の添加元素の影響についても調査をおこない、超塑性変形メカニズムの解明を進める。物品費が予定より安く収まったため、差引額が若干生じた。値としてはほぼ予定通り遂行できたと考えている。今後も予定通り遂行するみこみである。
目的的行動から習慣行動への遷移を支える微視的理論と依存研究への応用

本研究ではまず、ハトを被験体として、習慣行動の形成に及ぼす強化スケジュールの違いの影響を検討した。強化スケジュールは、反応に対して反応数依存で報酬を提示する場合と時間経過依存で報酬を提示する2種類あり、そのスケジュールパラメータを系統的に操作しつつ、消去や先行給餌といった反応減少操作を行ったうえで、その反応減少の程度から習慣行動の形成を判定を試みた。併せて、得られた反応データのモデリングを通して、微視的なパターンの違いの検出が可能かを検討した。また、濫用薬物が習慣形成および依存様行動に及ぼす影響を検討するため3つの実験を行なった。実験1では、道具的行動における反応ー強化随伴性の知覚をメタンフェタミン(以下METH)慢性投与が阻害するか、マウスを用いて検証した。METH慢性投与後に餌報酬を用いてレバー押しを確立した後、行動に随伴しない報酬を段階的に高い確率で呈示することで、反応ー強化随伴性を段階的に低下させた。統制群では随伴性低下に応じて反応率が線形に低下したが、慢性投与群では非随伴報酬呈示に対する急激な反応低下が見られた。実験2では、パヴロフ型恐怖条件づけ課題を用いて、CS-USに随伴性が無い状況でMETH慢性投与が学習を成立させるか検証したが、群間に有意な差はなかった。実験3では、濫用薬物とギャンブル様行動との相互作用を検証するため、ニコチンまたはメタンフェタミンが強化変動性への選好に与える影響を検証した。終環にFR15とRR15の配置された並立連鎖スケジュールにおいて、ニコチン投与はRR選択肢への選好を有意に増加させた。強化スケジュールによる習慣行動形成の研究としては、強化スケジュールの値として56種類を設定し、全体として約60%を終えている状況である。先行研究では反応数依存型よりも時間経過依存型でより習慣行動が形成されているが、これとは一部異なる結果が得られつつある。また、反応データのモデリングに関して、従来の二重指数や四重対数正規モデル(Tanno, 2016)に加え、ベイズモデリングの手法も開発(Matsui et al., 2018)し、反応データが得られ次第モデリングに取り掛かる体制を整えている。行動薬理学的研究としては、年度前半ではラット用オペラント箱の部品購入ならびに環境整備を行うと同時に、すでに稼働しているマウス用の装置を用いて、実施計画に「研究3」として記載した実験および関連した2つの実験を遂行した。以上のように、当初予定していた研究および今後の研究を行うのに必要な環境整備がおおむね進展していることから、この評価した。2019年度前半までに強化スケジュールの値として設定した56種類について、残りの条件を順次実施し実験を完遂させる。そして得られた反応データについて、そのモデリングを通して微視的な反応パターンの特定を行う。この成果は、習慣行動形成における強化スケジュールの影響を系統的に検討したものとして位置づけられる。2019年度後半では、この成果の論文化に取り組み、海外学術雑誌絵の投稿を目指す。また、前年度でラット用の装置の整備が完了したため、習慣形成において文脈ー強化子連合と反応ー強化子連合との競合が果たす役割を検証する2つの実験を遂行する。また、前年度の研究結果を受けて引き続き依存形成のメカニズムに関する検証を行う。特にMETH慢性投与によって動物が反応ー強化随伴性の低下に対してより急激な反応率低下を示す結果は、習慣形成を前駆過程とする依存形成の従来仮説が妥当でない可能性を示すため重要であり、条件を追加しながら追試を行う。また、強化率が等しいが変動性の異なる2選択肢のもとで濫用薬物が変動性選択肢への選好を上昇させる結果についても、ギャンブル依存の理解に向けて重要な示唆を与えるため、引き続き検討する。

先行研究では反応数依存型よりも時間経過依存型でより習慣行動が形成されているが、これとは一部異なる結果が得られつつある。また、反応データのモデリングに関して、従来の二重指数や四重対数正規モデル(Tanno, 2016)に加え、ベイズモデリングの手法も開発(Matsui et al., 2018)し、反応データが得られ次第モデリングに取り掛かる体制を整えている。行動薬理学的研究としては、年度前半ではラット用オペラント箱の部品購入ならびに環境整備を行うと同時に、すでに稼働しているマウス用の装置を用いて、実施計画に「研究3」として記載した実験および関連した2つの実験を遂行した。以上のように、当初予定していた研究および今後の研究を行うのに必要な環境整備がおおむね進展していることから、この評価した。2019年度前半までに強化スケジュールの値として設定した56種類について、残りの条件を順次実施し実験を完遂させる。そして得られた反応データについて、そのモデリングを通して微視的な反応パターンの特定を行う。この成果は、習慣行動形成における強化スケジュールの影響を系統的に検討したものとして位置づけられる。2019年度後半では、この成果の論文化に取り組み、海外学術雑誌絵の投稿を目指す。また、前年度でラット用の装置の整備が完了したため、習慣形成において文脈ー強化子連合と反応ー強化子連合との競合が果たす役割を検証する2つの実験を遂行する。また、前年度の研究結果を受けて引き続き依存形成のメカニズムに関する検証を行う。特にMETH慢性投与によって動物が反応ー強化随伴性の低下に対してより急激な反応率低下を示す結果は、習慣形成を前駆過程とする依存形成の従来仮説が妥当でない可能性を示すため重要であり、条件を追加しながら追試を行う。また、強化率が等しいが変動性の異なる2選択肢のもとで濫用薬物が変動性選択肢への選好を上昇させる結果についても、ギャンブル依存の理解に向けて重要な示唆を与えるため、引き続き検討する。
肝再生・癌化過程における肝前駆細胞の細胞系譜とPdx-1遺伝子の役割の解析

本研究は,ラット肝障害・癌発生時に増生してくる肝前駆細胞(LPC)で発現するPdx-1遺伝子の役割を探るために,LPC株にてPdx-1遺伝子の過剰発現・ノックアウト(KO)実験を行った。またPdx-1遺伝子のKOにより発現変動する遺伝子を探るため,野生型株とのマイクロアレイによる遺伝子発現比較解析を行った。その結果,Pdx-1遺伝子はLPCの増殖制御には関与しないが,LPCの神経内分泌様表現型の発現,肝細胞への分化抑制に関わることが示唆された。またPdx-1発現細胞の遺伝的標識に向けて,ラットES細胞でのCRISPR/Cas9システムを用いたターゲティング技術を確立した。本研究は、肝再生や肝癌発生への関与が示されている肝前駆細胞における、PDX-1転写因子の役割を明らかにする事を目的としている。そこで肝前駆細胞株を用いて、Pdx-1遺伝子の強制発現やノックダウン、ノックアウト実験を行い、培養系・細胞移植/肝障害誘導実験系を用いて肝前駆細胞の細胞特性への影響を解析するというストラテジーを取ることとした。平成25年度は、「Pdx-1遺伝子の発現を改変した肝前駆細胞株の樹立とその細胞特性の解析」という当初の研究計画に従い、以下の実験を遂行した。1)Pdx-1強制発現プラスミドベクター、Pdx-1ノックダウンプラスミドベクター(Pdx-1 shRNA発現ベクター)、Pdx-1遺伝子ノックアウトプラスミドベクターの作製:Pdx-1強制発現プラスミドには、当初使用予定だったpIRES2-EGFPベクターによる遺伝子導入・発現効率が良くなかったため、トランスポゾンシステムを取り入れることでより効率よく遺伝子導入・発現させることができるようになった。shRNA発現には、テトラサイクリン誘導性のshRNA発現プラスミドを作製し、現在その誘導条件の検討を行っている。また、Pdx-1遺伝子のノックアウトに向けてCRISPR/Cas9システムを導入し、Pdx-1遺伝子を標的としたこれらプラスミドベクターを作製した。2)肝前駆細胞株への遺伝子導入方法の検討:肝前駆細胞株への遺伝子導入法を検討した。これまでのところ、市販の遺伝子導入試薬を複数試みたが導入効率は極めて低かった。一方、エレクトロポレーション法、及びポリエチレンイミン法にて条件検討を行った結果、上記Pdx-1発現プラスミドベクターやコントロールのEGFP発現プラスミドベクターを導入し、薬剤選択により安定遺伝子導入株(強制発現株)を得ることに成功した。肝前駆細胞は多分化能性を持った未分化な細胞であり、肝障害時に増生して肝再生に寄与する。本研究は、肝前駆細胞におけるPDX-1転写因子の発現に着目し、その細胞特性・動態制御におけるPDX-1の役割を明らかにする事を目的としている。まず初めに、近交系フィッシャーラット由来の肝前駆細胞株を用いてPdx-1遺伝子の発現を改変し、in vitro培養系・細胞移植/肝障害誘導実験系での細胞特性・細胞動態の解析を行うための実験系の確立を試みている。細胞への遺伝子導入法には、Viafect、及びPEIを用いた手法が有効であることがわかった。Pdx-1強制発現実験系として、Tol2トランスポゾンシステム、及びTet-Onシステムを用いた効率の良い強制発現・誘導的発現系を確立した。一方、Pdx-1遺伝子発現の抑制には、CRISPR/Cas9ダブルニッカーゼ法を用いた相同組換え法による薬剤耐性遺伝子の標的部位への挿入による遺伝子破壊を試みた。その結果、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ、及びPCR法によりターゲティングによる遺伝子破壊を確認した。現在、Pdx-1遺伝子発現変異細胞株の単離とin vitro培養系でのその表現型解析を進めている。また細胞移植/肝障害誘導実験系での解析に向け、フィッシャーラットへのガラクトサミン肝障害の誘導条件を決定した。次に、同じく近交系フィッシャーラット由来のES細胞を用いてPdx-1遺伝子の破壊ラット、及びPdx-1発現細胞標識ラットを作製するためのコンストラクトの作製を進めている。同時に、ES細胞への遺伝子導入法の検討と上記CRISPR/Cas9法を用いたターゲティング法によるPdx-1遺伝子破壊を試みており、同様に遺伝子破壊の陽性シグナルを得ている。今後、ターゲティングされたES細胞をシングルクローン化し、遺伝子改変ラットを作製していく予定である。肝前駆細胞(LPC)は肝障害時に増生して肝再生に寄与する多分化能性を持った細胞である。本研究は、ラットLPCにて特異的に発現するPdx-1遺伝子の機能解析と、肝再生・肝癌発生過程におけるPdx-1陽性LPCの細胞系譜解析に向けた実験系の確立を目的としている。研究期間全体を通じて以下の研究成果を得た。1)Pdx-1遺伝子の誘導的発現システムをラットLPC株に導入した。また、CRISPR/Cas9システムを用いてPdx-1遺伝子ノックアウト(KO)LPC株を作製した。これら細胞を用いて細胞増殖の比較解析を行った結果、LPCの増殖活性はPdx-1遺伝子の発現レベルの影響を受けないことが明らかとなった。次に、マイクロアレイによるPdx-1 KO株と野生型株間での遺伝子発現の比較解析を行った。

その結果、LPCの特徴の一つである神経内分泌性因子の発現において、これまでLPCでの報告がない因子とその発現制御に関わる因子がPdx-1 KO株にて揃って低下していた。また、コラーゲン等の細胞外マトリックス成分やインテグリンの発現変動も観察された。さらに、細胞分化マーカーの発現がやや肝細胞系譜へとシフトした。以上、Pdx-1は障害肝臓内の微小環境制御やLPCの遊走性、分化制御といった、LPCの重要な細胞特性制御に関与することが示唆された。2)細胞系譜解析に向けてラットPdx-1プロモーターのクローニングを試みたが、上流11kbpを用いたレポーターコンストラクトがLPC株で機能しなかったため、代わりにCRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いたPdx-1遺伝子座への相同組換えによる遺伝子導入を試み、レポーター遺伝子の組込みに成功した。また、同じシステムにてラットES細胞での相同組換えもPCRにより確認した。これにより、Pdx-1を発現する細胞を標識するための基盤となる技術が確立された。本研究は,ラット肝障害・癌発生時に増生してくる肝前駆細胞(LPC)で発現するPdx-1遺伝子の役割を探るために,LPC株にてPdx-1遺伝子の過剰発現・ノックアウト(KO)実験を行った。またPdx-1遺伝子のKOにより発現変動する遺伝子を探るため,野生型株とのマイクロアレイによる遺伝子発現比較解析を行った。その結果,Pdx-1遺伝子はLPCの増殖制御には関与しないが,LPCの神経内分泌様表現型の発現,肝細胞への分化抑制に関わることが示唆された。またPdx-1発現細胞の遺伝的標識に向けて,ラットES細胞でのCRISPR/Cas9システムを用いたターゲティング技術を確立した。肝前駆細胞への効率の良い遺伝子導入方法を決定することができ、作製したプラスミドの確認などが順調に進んだこともあり、Pdx-1遺伝子の効率の良い過剰発現系としてTol2トランスポゾンシステムを用いたプラスミド、及びTol2トランスポゾンシステムとTet-Onシステムを組み合わせた誘導的発現系を確立した。また、Pdx-1遺伝子の発現抑制実験では、当初予定のRNAiシステムが思うように働かなかったため、ストラテジーを変更してCRISPR/Cas9システムを用いたターゲティングによるPdx-1遺伝子の直接的破壊を試み、成功した。これに関しては、次年度に予定していたラットES細胞でのターゲティングにも成功している。今後はこれらを用いて作製した、Pdx-1遺伝子発現を改変された肝前駆細胞株を用いることで、PDX-1の役割を明らかにすることができる。一方、Pdx-1遺伝子発現細胞を標識するシステムとして、当初予定していた通りにPdx-1遺伝子のプロモーターを含む上流域(-11kbp)をクローニングしてその下流にEGFPを繋ぐトランスジェニックコンストラクトを作製したところ、プロモーターの活性化が十分に観察できなかった。
ヘッジホッグ蛋白の硬組織誘導および修復因子としての実用化の試み

ヘッジホッグ(hedgehog;hh)ファミリーは、形態形成の鍵として注目されている一群の蛋白因子である。骨格形成においてもShh(Sonic hedgehog)およびIhh(Indian hedgehog)の間接的関与が報告されている。Shhは前後軸決定因子としてだけでなく、BMP、FGFを介して軟骨原基の形成速度調節にかかわることが明らかになっている。また、Ihhは肥大軟骨細胞層で発現し、PTHrpを介して軟骨細胞の石灰化を抑制することにより、長管骨の伸張速度を調節していることが示唆されている。本研究においては1)硬組織形成におけるヘッジホッグ蛋白質の作用機構を解析し、その生理学的意義の解明を行うとともに、2)ヘッジホッグ蛋白の硬組織修復因子としての実用化を検討した。その結果、Shhのリコンビナント標品(rShh-N)単独では軟骨・骨の形成はほとんど誘導されないが、BMP-2と同時に投与すると異所性軟骨性骨化が誘導されることが判明した。さらに、その作用はBMP-2単独と比較して強力であった。また、硬組織欠損修復作用についても、rShh-N単独では作用は非常に弱いが、BMP-2の作用を著明に増強することが判明した。一方、rShh-Nは軟骨前駆細胞に直接作用し、その分化を促進すること、また、その作用はBMP-2の存在により強力に促進されることが判明した。つまり、rshh-NはBMP-2と共同して、軟骨原性および骨原性細胞の分化を促進し、異所性内軟骨性骨化の誘導を行うことが明らかになった。IhhもShh-Nと同様の作用を保持していた。以上の結果は、ヘッジホッグ蛋白はBMPとの併用により、硬組織修復因子となる可能性を示唆する。また、骨格発生において、ヘッジホッグ蛋白はBMPなどの因子と共同で、軟骨前駆細胞の分化を制御していることも示唆された。1.リコンビナントヘッジホッグ蛋白の作成および精製方法の確立ソニックヘッジホッグ蛋白(Shh)のリコンビナント標品(rShh-N)作成および精製の方法を確立した。本標品はニワトリ肢芽の重複肢誘導能を保持していた。また、軟骨細胞への分化誘導能において、ニワトリN末端のソニックヘッジホッグをコードする遺伝子を導入した線維芽細胞の培養上清と同等の活性を保持していた。本標品を用いて、rShh-Nが軟骨細胞への分化誘導能を保持すること、その作用はBMPにより増強されることを確認した。1)軟骨細胞の増殖および分化に及ぼすShh-Nの作用の検討:ニワトリ18日胚の胸骨より成長軟骨細胞を分離したのちRCASレトロウイルスベクターを用いてShh-N遺伝子を導入し、Shhの軟骨細胞の増殖、基質形成能、および最終分化能に対する作用を調べた。その結果、Shh-Nは軟骨細胞に対して、著明な影響を与えないことが明かとなった。2)骨芽細胞の分化機能に及ぼすShh-Nの作用の検討:ニワトリ胚頭蓋骨より分離した骨芽細胞にRCASレトロウイルスベクターを用いてshh-N遺伝子を導入し、Shh-Nの骨芽細胞の分化機能発現に対する影響を検討した。その結果、Shh-Nは骨芽細胞の分化機能発現を安定化させること、さらに、分化機能発現を亢進させ、石灰化を促進することを明らかにした。

1.リコンビナントヘッジホッグ蛋白による異所性内軟骨性骨化の誘導ソニックヘッジホッグ蛋白(Shh)のリコンビナント標品(rShh-N)が異所性内軟骨性骨化の誘導能を保持するか否かを検索するために、ヌードマウスの大腿筋筋膜下にコラーゲンゲルを担体として移植し、rShh-Niによって誘導される組織を組織学的に解析した。その結果、rShh-N単独では軟骨・骨の形成はほとんど誘導されないが、BMP-2と同時に投与すると異所性内軟骨性骨化が誘導されることが判明した。さらに、その作用はBMP-2単独と比較して強力であった。また、頭蓋骨に欠損を作成し、rShh-Nをその部位に投与することにより、硬組織欠損の修復がはかれるかどうかを検討した。異所性内軟骨性骨化の誘導と同様にrShh-N単独ではその作用は非常に弱いが、BMP-2の作用を著明に増強することが判明した。2.ヘッジホッグによる骨・軟骨誘導機構の解明rShh-Nは軟骨前駆細胞に直接作用し、その分化を促進すること、また、その作用はBMP-2の存在により強力に促進されることが判明した。つまり、rshh-NはBMP-2と協同して、軟骨原性および骨原性細胞の分化を促進し、異所性内軟骨性骨化の誘導を行っていることが明らかになった。ヘッジホッグファミリーであるIndian hedgehog(Ihh)もShh-Nと同様の作用を保持していた。さらに、ニワトリ発生肢芽にIhhを過剰発現させると、軟骨原基の過形成および関節部の癒合が生じた。肢芽におけるIhhの発現は軟骨細胞の出現箇所と密接に連動しており、肢芽の軟骨原基の形成にIhhが重要な役割を果たしていることが示唆された。ヘッジホッグ(hedgehog;hh)ファミリーは、形態形成の鍵として注目されている一群の蛋白因子である。骨格形成においてもShh(Sonic hcdgehog)およびIhh(Indian hedgehog)の間接的関与が報告されている。Shhは前後軸決定因子としてだけでなく、BMP、FGFを介して軟骨原基の形成速度調節にかかわることが明らかになっている。また、Ihhは肥大軟骨細胞層で発現し、PTHrpを介して軟骨細胞の石灰化を抑制することにより、長管骨の伸張速度を調節していることが示唆されている。本研究においては1)硬組織形成におけるヘッジホッグ蛋白の作用機構を解析し、その生理学的意義の解明を行うとともに2)ヘッジホッグ蛋白の硬組織修復因子としての実用化を検討した。その結果、Shhのリコンビナント標品(rShh-N)単独では軟骨・骨の形成はほとんど誘導されないが、BMP-2と同時に投与すると異所性内軟骨性骨化が誘導されることが判明した。また、硬組織欠損修復作用についても、rShh-N単独では作用は非常に弱いが、BMP-2の作用を著明に増強することが判明した。一方、rShh-Nは軟骨前駆細胞に直接作用し、その分化を促進すること、また、その作用はBMP-2の存在により強力に促進されることが判明した。つまり、rshh-NはBMP-2と共同して、軟骨原性および骨原性細胞の分化を促進し、異所性内軟骨性骨化の誘導を行うことが明らかになった。IhhもShh-Nと同様の作用を保持していた。以上の結果は、ヘッジホッグ蛋白はBMPとの併用により、硬組織修復因子となる可能性を示唆する。また、骨格発生において、ヘッジホッグ蛋白はBMPなどの因子と共同で、軟骨前駆細胞の分化を制御していることも示唆された。