hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
亜鉛徐放型チタン系フレームワークと歯髄幹細胞による顎骨再生療法

4)骨芽細胞分化能の評価:1Zn-Ti上で培養した歯髄幹細胞は、Controlと比較して培養3日目および7日目ともに有意なアルカリフォスファターゼ活性の増強を認めた。2培養3日目および7日目のreal time PCRでは、Zn-Ti群において骨芽細胞分化マーカーであるtypeI collagen、BMP2、ALP、Runx2、OPNの有意なmRNA発現の増強を認めた。また、血管内皮増殖因子であるVEGF-AのmRNAは、骨芽細胞分化に伴い発現が上昇するとともに骨芽細胞分化を増強させることが報告されているが、Zn-Ti群においてVEGF-AのmRNA発現も上昇していることが確認された。3Smad1、Smad4の発現に著明な差は認めなかったが、Zn-Ti群でp-Smad1/5/8の発現の増強を認めた。4培養10日目、21日目のアリザリンレッド染色を行ったサンプルに関してサンプルの溶解後に吸光度測定を行ったところ、Zn-Ti群で有意な基質石灰化の増強が確認された。平成30年度の研究実施計画4)骨芽細胞分化能の評価:Zn-Tiフレームワークおよびコントロール上で培養したDPSCsに関して、培養3日目および7日目のアルカリフォスファターゼ活性を測定する。また、骨芽細胞分化マーカーのmRNA発現をrealtimePCR法で測定する。培養48時間後のSmad1、Smad4、p-Smad1/5/8のタンパク発現をウエスタンブロットで検索する。また、培養10日目、21日目における基質石灰化をアリザリンレッドS染色で評価する。平成31年度の研究実施計画2. Zn-Tiフレームワーク周囲の骨形成能のスクリーニング:ラットの頭蓋骨に、トレフィンバーを用いて直径8mmのcritical size(自然に治癒しない大きさ)の骨欠損を形成する。この骨欠損に、細胞数を変化させた歯髄幹細胞を浸潤させたシート状のコラーゲンスポンジ(typeIコラーゲン)を充填し、先の実験で用いたZn-Tiフレームワークで被覆する。コントロールは、生理食塩液を浸潤させたコラーゲンスポンジをZn-Tiフレームワークで被覆する。移植後4、8、12週に試料を摘出し、骨の再生を組織学的に評価する。なお、上記の実験でコントロールと有意な差が検出できない場合には、移植細胞数等を調整し、再度検討を重ねる。亜鉛徐放型フレームワークの作製、歯髄幹細胞の培養および細胞増殖能の評価の大半は、研究分担者である山形大学医学部および山形大学大学院理工学研究科で行うことができたため、本学で今年度使用する予算の減額を図ることができた。次年度使用額は,細胞実験の継続と動物実験および実験助手の人件費等に充てる予定である。共同研究者との実験の進行状況を合わせるために支出を抑えており,次年度への繰り越しが生じた。
持続可能な消費行動様式への転換による循環形成効果の評価

持続可能な消費行動様式への転換による循環形成効果の評価について、電子情報機器及び産業機械を対象として、解析をおこなった。電子情報機器については、既製品の一体型PCを「従来型PC」と定義した上で、消費者は「従来型PC」と「アップグレード型PC」の2つを選択肢としてその一方を選択すると仮定し、「従来型PCを選択する/アップグレード型PCを選択する」という消費選択行動モデルとして、ランダム効用理論の考え方に基づく二項ロジットモデルを採用し、アップグレード型PCの消費者選択行動モデルの中で用いる変数のデータを、アンケート調査(配票調査法)により得た。分析の結果、ユーザーメイドPCの認知度及びアップグレードの知識・技術レベルが、ユーザーメイドPCの選択確率に大きな正の影響を及ぼすこと、適切なサービス・サポートが充分でないと、PCを使いこなす技術を持たない人がユーザーメイドPCを選択する確率が低くなることなどが確認され、消費者に対する製品情報の充足、消費者個人の技能の向上、保証等のメンテナンスサービスの充実が必要であるということが明らかになった。また、循環施行の産業コンプレックス形成におけるライフサイクル管理を評価する、多部門一般均衡モデルを提案した。製品連鎖均衡、回収リサイクル、消費者選択、再使用・更新の4つのサブモジュールからなるモデル構造を描き、PCのリバースロジスティクス、アップグレードPC製品の消費者選択、ガス給湯器の更新と省エネルギーの解析を通じて循環形成の鍵となる各モジュールの操作変数を抽出した。持続可能な消費様式への転換による循環形成効果の評価について,電子情報機器及び食品系有機物残滓を指標製品として取り上げて解析をおこなった.均衡産出高オープンモデルをベースにした他部門線形計画分析をおこなう基礎として,まずモデル作成に必要なデータを以下のように獲得した.第1に,廃PCの回収について,逆ロジスティクスの各区間がどの程度の比率になるかをオーダーとして掴むための基礎的検討をおこなった.これをもとに一般モデルとしての定式化をおこなって変数変化の影響を考察した.第2に,農地から家計を含めた広義の食品の生産・消費システムとそれに携わるフードチェインのセクターを対象として現状のマテリアルフローを解析し,それぞれのエネルギー投入量,副産物量を把握した.解析の結果,廃PCについては,5058店舗(67市区町村あたり約75、約400平方mあたりに1つ)という販売拠点数の多さに起因して、PCの回収総走行台キロの8割を販売拠点回収拠点までの搬送がしめる結果となった.環境負荷への変換では、回収ロットの差から全体への寄与率は低下することが予想されるが最も大きな割合になることは容易に推察される.参考までに,これを市区町村あたり10程度の販売拠点(約2.8平方キロに1店舗)で回収するとした場合は,走行台キロは約8分の1にまで縮小し,回収拠点解体拠点の走行台キロが約5割を占め最も大きな寄与を与えることになった.また、有機副産物については,現状レベルの転換装置の炭酸ガス集約度や転換効率においても、適切な集約度の流通店舗(総供給の約5割に相当する中大型30店舗)での嫌気性消化と燃料電池システムを家庭系の下水汚泥と組み合わせることで,より環境効率の高いシステムを形成する可能性があることが分かった.これを,もとに,再資源化部門のアクティビティを含むモデル制約式とコスト、社会的効用などの目的関数設定の検討をおこなった.持続可能な消費行動様式への転換による循環形成効果の評価について、電子情報機器及び産業機械を対象として、解析をおこなった。
土壌の乾燥程度、蒸発量、水濡れを1つの安価な測器で計測する手法の開発

ポーラスカップの空気侵入特性を利用し、土壌の乾燥程度、蒸発量を測定する手法を確立し、この手法を用いた測器を開発した。測器はポーラスカップと透明の塩ビ管を接着した構造で、塩ビ管内に水を満たし、シリコン栓をして測定する。塩ビ管内の水位が指標となり、測器を土壌に設置すれば土壌の乾燥程度、空中に吊せば蒸発量が測定できる。この測器の最大の特徴は、土壌の乾燥程度や蒸発量に応じた水位の低下が日々積算される点である。ポーラスカップを用いて、土壌の乾燥程度と蒸発量を測定する測器を開発した。開発した測器はポーラスカップと透明の塩ビ管(長さ1m、φ13)を接着しただけの構造で、塩ビ管内に水を満たした後にシリコン栓をして測定する。この測器を土中に挿せば土壌の乾燥程度、空中に吊せば蒸発量が測定できることを明らかにした。ロットによってポーラスカップの透水性は異なったが、土壌水分計および蒸発計としての計測には影響しなかった。土壌水分計としての特徴は以下の通りである。土壌がポーラスカップの空気侵入値(pF2.7)以上に乾燥すると、ポーラスカップを通して測器内部に空気が入り、塩ビ管上部に空気の層ができた。1日当たりの空気層の増加は、土壌が乾燥するほど大きくなった。また、この測器では土壌の乾燥程度に応じた空気層厚が日々積算された。この点は、土壌のpF値や体積含水率の瞬時値しか測定できない従来の土壌水分計と大きく異なる特徴である。また、土壌中に水が供給されると、空気層厚は0付近に戻った。これは、測器内部の空気は真空に近く、測器内の負圧により土中の水を測器内部に取り込むためであった。蒸発計としての特徴は以下の通りである。蒸発量はポーラスカップを通して蒸発した水量をポーラスカップの表面積で割ることにより求めた。小型蒸発パンの蒸発量と比較した結果、気温が低くなるほどこの測器で測定した蒸発量が多くなった。ポーラスカップ蒸発計と小型蒸発パンの蒸発量の比は夏季で1.0程度であったが、冬季は1.9程度となった。蒸発量の比が気温に体存することを利用し、ポーラスカップからの蒸発量を日平均気温で補正することにより、小型蒸発パンの蒸発量を±10%の誤差で推定できた。ポーラスカップ蒸発計は日々の蒸発量の積算値が測定される。そのため、1日当たりの蒸発量は前日の指示値(水位)との差から求めることができた。開発した測器はポーラスカップと透明の塩ビ管を接着しただけの構造で、塩ビ管内に水を満たした後にシリコン栓をして測定する。この測器を土中に挿せば土壌の乾燥程度、空中に吊せば蒸発量が測定できる。土壌水分計の特徴として以下の点を明らかにした。土壌の種類に関しては黒ボク土でも灰色低地土でも測定でき、土壌の圧力水頭に応じた指示値が日々積算された。しかし、砂に関しては2ヶ月程度測定を行っても指示値は0付近から動かなかった。また、塩ビ管内の圧力水頭も0のままだった。この測器はポーラスカップ内と土壌中の水の連続性が保たれないと測定できないことが示された。土壌水分計にメーカーが試作した低pF用(pF2.0、2.3、2.5)のポーラスカップを使用した結果、それぞれのpF値に応じた土壌水分から測器が作動した。これにより、本測器が野菜などの灌水指標として利用できる可能性が示された。蒸発計として以下の点を明らかにした。一般のポーラスカップで蒸発量を測定すると、測器内部は0.2気圧以下となり、雨などで濡れると指示値が戻り、蒸発量が算出できなくなる。メーカー試作の低pF用ポーラスカップを測器に使用した結果、測器内部は1気圧程度に保たれ、水に浸けても指示値の戻りはほとんど無かった。これにより、雨に濡れても蒸発量のみが測定される蒸発計が作成できることを示した。一般のポーラスカップを使用し、水濡れに伴い指示値が戻る特性を検討した。一般のポーラスカップは透水性に個体差があるが、土壌の乾燥程度や蒸発量の測定には透水性の個体差は影響しなかった。しかし、水に浸けたときに指示値が戻る速度(吸水速度)は透水性に比例した。このことは、濡れに対して反応が異なる測器が作成できることを示している。蒸発による測器内の水位低下と、降雨の吸水による水位上昇から、本測器による水収支評価の可能性が示された。開発した測器はポーラスカップと透明の塩ビ管を接着した構造で、塩ビ管内に水を満たした後にシリコン栓をして測定する。塩ビ管内の水位が指示値となり、本測器を土壌に挿せば土壌の乾燥程度、空中に吊せば蒸発量、雨に当てれば水収支が測定できた。

ポーラスカップが空気侵入値以上の吸引圧を受けると、ポーラスカップを通して測器内部に空気が入った。吸引圧が大きくても単位時間にポーラスカップを通過できる空気の量は決まっており、1気圧換算の空気量で0.566cm3/dayであった。空気の侵入量はポーラスカップの製造ロットや透水性には左右されなかった。本測器を土壌に設置した場合、土壌がポーラスカップの空気侵入値以上に乾燥すると、ポーラスカップから塩ビ管内に空気が入った。この空気が土壌の吸引圧に釣り合うまで引き伸ばされ、塩ビ管内の水位が低下した。本測器は水位の低下を指標として土壌の乾燥程度(吸引圧)を測定することができた。水ストレスを受けている植物の近くに測器を設置すると、植物はポーラスカップを通して塩ビ管内の水を吸水し、指示値に影響を及ぼした。本測器の指示値は植物(黒大豆)の水ストレスを敏感に示す指標となり、水位の低下量に比例して黒大豆の収量が低下した。本測器を空中に吊した場合、ポーラスカップから水が蒸発して塩ビ管内の水位が低下した。蒸発した水の体積と比較して、ポーラスカップから侵入する空気の量は上記のように少ないため、塩ビ管内は0.1気圧以下となった。この状態でポーラスカップに雨が当たると塩ビ管内の負圧により雨水が吸い込まれ、最終的には塩ビ管内がほぼ1気圧の状態となる水位まで吸い上げられた。この現象を利用しておおよその水収支が測定できた。ただし、雨水の吸水速度はポーラカップの透水性に左右されたため、水収支の比較観測を行う場合、透水性が同じポーラスカップで測定を行う必要があった。
側鎖に官能基を持つアミノ酸の安定同位体標識法の開発と配座解析

本研究ではアミノ酸側鎖のジアステレオトピックなメチレン水素やメチル基の一方のみを立体選択的に重水素標識し、必要な位置に^<13>Cや^<15>Nを導入した多重標識アミノ酸の合成を行い蛋白質構造解析のプローブを提供すると共に、蛋白質の立体構造や機能発現のモチーフとなっているオリゴマーの配座特性を明らかにすることを目的としている。^<13>Cや^<15>Nの導入に関しては、標識された原料化合物に制約があるため若干の工夫が必要ではあるものの、殆どの場合は既知のアミノ酸合成法により目的を達成することができる。しかし、アミノ酸側鎖を立体選択的に重水素標識するためには側鎖を構築する際に不斉合成の技術を駆使する必要があり、従来のアミノ酸合成法を用いることができない。従って、高立体選択的な重水素導入法を含めた新規なアミノ酸合成法の開発が必要となる。これまで、種々の安定同位体標識アミノ酸の合成法を開発し、いくつかのアミノ酸についてはモノマーの配座解析を行うことによって蛋白質構造解析のプローブとしての有用性を確認した。また、これらの標識アミノ酸は蛋白質合成の際、効率よく蛋白質中に取り込まれることも判明している。しかし、側鎖に官能基を持つアミノ酸の同位体標識については、その重要性にもかかわらず、これまで未着手であった。本研究では、L-グルタミン酸から容易に得られる光学活性なラクタムやラクトンをテンプレートとする新規アミノ酸合成法を開発し、ロイシン、イソロイシン、プロリン、リジン、オルニチンの位置・立体選択的重水素標識を達成した。また、D-セリンから得られる重水素標識セリノールを鍵中間体とする重水素標識セリン、シスチン、アスパラギン酸の合成手法を確立した。今年度はこれまで合成の困難さから未着手であったアルギニン、セリンなど側鎖に官能基を持つアミノ酸の安定同位体標識法の確立を検討した。安定同位体標識オルニチンの合成既に、アルデヒドと光学活性なジオキソピペラジンとの縮合によって得られるデヒドロアミノ酸の水素添加により、β位を立体選択的に重水素標識した各種アミノ酸が得られることを明らかにしている。本年度は相当する重水素標識アミノアルデヒドの立体選択的合成法の確立とアルギニンの前駆体であるオルニチンへの変換を検討した。L-グルタミン酸から容易に得られるラクトンを出発原料とし、オレフィンの立体選択的重水素添加、Schmidt転位を用いるエステルのアミン誘導体への立体選択的変換、デヒドロアミノ酸の水添条件の最適化を行い(2S,3S,4R,5R)-[2,3,4,5-D_4]オルニチンの合成を達成した。安定同位体標識セリンおよびシステインの合成D-セリンを出発原料とし、側鎖水酸基およびカルボキシル基の官能基変換により重水素化セリンアルデヒドを合成した。アルデヒドを不斉還元することによりβ位が立体選択的に重水素標識されたL-セリンに誘導した。また、水酸基をメルカプト基に変換することにより重水素標識L-システインに誘導した。

これまで本研究では4-ヒドロキシプロリンやL-ピログルタミノールをアミノ酸不斉合成のテンプレートとして用いてきた。しかし、重水素導入の立体選択性や総収率が不十分であり、実用的な品質および量のアミノ酸を得ることが困難であった。そこで今年度は新規なピログルタミン酸テンプレートを開発することにより、高品質な標識アミノ酸の簡便・大量合成法を確立することを目的とした。一般にピログルタミン酸から誘導される光学活性なテンプレートはα位のラセミ化を防ぐためにカルボキシル基を還元して用いられおり、適当な置換基を導入した後、必要に応じてカルボキシル基を再生する必要が生じる。本研究では、N-Boc-ピログルタミン酸tert-ブチルエステルを直接オレフィンにした後、重水素化することにより、簡便に重水素標識ピログルタミン酸エステルを合成しうることを明らかにした。得られた重水素標識ピログルタミン酸土ステルを中間体として利用することにより重水素標識グルタミン酸、プロリン、ロイシンの大量合成が可能となった。重水素標識プロリンについてはジペプチド(Ac-Gly-[3,4,5-D_3]Pro-OMe)を合成し配座解析も行った。本研究ではアミノ酸側鎖を位置選択的に重水素標識すると同時に、必要な位置に^<13>Cや^<15>Nを導入した多重標織アミノ酸の合成を行い蛋白質構造解析のプローブを提供すると共に、蛋白質の立体構造や機能発現のモチーフとなっているオリゴマーの配座特性を明らかにすることを目的としている。本年度は側鎖に官能基を持つ長鎖アミノ酸の一つであるL-[5,5,6,6-D_4]リジンの合成および新規なL-ピログルタミン酸テンプレートを用いるL-[3,4-D_2]グルタミン酸の合成について検討した。L-[5,5,6,6-D_4]リジンの合成L-グルタミン酸の末端カルボキシル基を還元的に重水素化することによって得られた重水素標識アルコールをヨウ化物に変換した後、シアノ基を導入し、接触重水素化によりL-[5,5,6,6-D_4]リジンを合成した。新規L-ピログルタミン酸テンプレートの開発一般にピログルタミン酸から誘導される光学活性なテンプレートはα位のラセミ化を防ぐためにカルポキシル基を還元して用いられており、適当な置換基を導入した後、必要に応じてカルボキシル基を再生する必要が生じる。本研究では、カルボキシル基をオルトエステル(ABOエステル)で保護した不飽和ピログルタミン酸エステルの合成検討を行い、α位のラセミ化を伴うことなくMichael付加、Diels-Alder反応、ジヒドロキシル化、水素添加などオレフィンの変換反応を行うことができることを明らかにした。水素化の際、重水素ガスを用いることによって得られる重水素標識ピログルタミン酸エステルを加水分解したところ(2S,3S,4R)-[3,4-D_2]グルタミン酸を高立体選択的に与えることが明らかとなった。
転写アクチベーターの作用と転写開始複合体の機能解析

空間的相互作用に関する情報が蓄積している大腸菌の転写装置(RNAP)とその代表的な転写制御因子CRPをモデル系として、転写開始反応とCRPによる転写活性化機構について解析を行った。これまでにCRPの作用点が転写開始複合体形成の促進までに限定されることを証明した。即ち転写開始複合体形成が転写制御のキーポイントなのである。本研究では転写開始複合体形成に焦点を当て解析を進めたところ、malTプロモーターにおいてはCRP非存在下で転写開始点付近のDNA2本鎖は開裂するものの伸長反応に移行できない新規の不活型転写複合体が形成されることを見出した。malTプロモーターは-35領域から9bp離れた位置にA/Tに富む配列をもつ。このA/Tに富む配列の転写開始複合体形成への影響を解析した結果、この領域がUPエレメントとして機能すること及びそのコアプロモーターとの相対位置によって転写複合体の性質に影響することが明かとなった。UPエレメントの位置による転写開始複合体の性質の変化は他の数種のコアプロモーターにおいても観察され、この結論の一般性が示唆される。次にmalTプロモーターのCRP転写活性化に対するUPエレメントの影響について検討した結果、UPエレメントはCRP作用に必要であった。即ち、UPエレメントによってRNAPのDNA結合活性が促進され、CRPがpost-recruitment段階においてRNAPと相互作用することで不活型から活性型転写複合体への変換を促進することが示唆される。本研究において得られたCRP,RNAP,DNA各々の相互作用の関係についての新たな知見がより一般的な転写調節機構の理解に繋がることが期待される。本研究では空間的相互作用に関する情報が蓄積している大腸菌の転写装置(RNAP)とその代表的な転写制御因子CRPをモデル系として、転写開始反応とCRPによる転写活性化機構について解析を行った。私はCRPの作用点が共通して転写開始複合体形成の促進であることを証明してきた。その過程でmalTプロモーターにおいてCRP非依存に不活型転写複合体が形成されることを見出した。近年、プロモーター上流のA/Tに富む配列(UPエレメント)が第三のシス因子として転写活性を上昇させることがrRNA等の強いプロモーターにおいて報告されている。このA/Tに富む配列の転写開始複合体形成への影響を解析した結果、この領域がUPとして機能すること及びそのコアプロモーターとの相対位置によって転写複合体の性質に影響することが明かとなった。同様のことは他のコアプロモーター(1acP1)においても観察され、この結論の一般性が示唆される。この不活型転写複合体は転写開始点付近のDNA2本鎖は開裂するものの伸長反応に移行できない新規の転写複合体であった。現在、CRPによる転写活性化に対するUPエレメントの影響および不活型転写複合体形成の生理的意義について解析を進めており、UPエレメントがCRPの作用に必要であるという結果を得ている。
ゼブラフィッシュを用いた生理活性脂質リゾホスファチジン酸関連遺伝子の網羅的解析

リン脂質は主にグリセロール骨格に極性頭部と2本の脂肪酸が結合した構造を有する。リン脂質は極性頭部の構造の違いから、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルイノシトール(PI)などの種類に分類される。リン脂質はそれぞれ結合する脂肪酸の種類が大きく異なる。この脂肪酸の多様性は「リモデリング反応」によって調節されている。しかし、リモデリング反応に関わる酵素群はこれまでほとんど同定されておらず、また、リン脂質の脂肪酸多様性はなぜ必要なのか、それが破綻するとどのような異常や病態を招くのかという問題も解明されていない。リモデリングを担う酵素が同定されていない原因として、性状のよく似た数百種類のリン脂質分子をひとつひとつ区別し、かつ網羅的に解析する手法が十分に確立されていないことが挙げられる。そこでまず私は、マススペクトロメトリーを用いた網羅的脂質解析手法の開発を行った。他分野の先生方に協力して頂き、約200種類のリン脂質を高感度に測定できる方法を開発することに成功した。この脂質測定系を用いて、生体内機能・基質特異性が不明な細胞内型ホスホリパーゼA1 (iPLA1)を解析した。その結果、iPLA1ファミリーのうち、iPLA1αとiPLA1γが脂肪酸リモデリング反応を担っていることを見出した。さらに、iPLAIを介したリモデリングがミトコンドリアの形態形成に重要であることが分かった。近年、遺伝性痙性対麻痺の原因遺伝子としてiPLA1が同定された。本研究の結果から、iPLA1欠損によるミトコンドリアの形態異常、それに伴って起こる機能異常が病態発症の原因である可能性が考えられる。(抄録なし)本研究はゼブラフィッシュを用いてリゾホスファチジン酸(LPA)前駆体供給経路、産生されたLPAの代謝経路、およびLPAの輸送経路を個体レベルで明らかにすることである。そのために、モルフォリノを用いて機能を抑制したゼブラフィッシュの表現型解析とマススペクトロメトリー(MS)による高感度な脂質分析法を組み合わせて、機能的かつ生化学的にLPA代謝経路を明らかにする。LPAの産生・分解経路は複数存在し、また脂肪酸の種類と同じだけLPAの分子種が存在するため、代謝機構全体を理解するには、LPAとその代謝物を脂肪酸別に幅広く網羅的に測定できる方法が必要不可欠である。そのため、脂質を脂肪酸別に分離できる逆相カラムを用いた脂質測定方法の確立を目指した。これまでLPA,ホスファチジン酸(PA),ホスファチジルセリン(PS)の逆相カラムを用いた分離条件ではピークがブロードとなり、分離が不十分であることが問題であった。そこで私は、カラムと移動層条件を検討したところ、C18MGII、C18ACRカラムと移動層A(5 mM ammonium form ate in water pH4.0)、移動層B(5 mM ammonium formate in 95%(v/v)acetonitrile pH4.0)を組み合わせることで、LPA,PA,PSのすべてを逆相条件で分離することが可能となった。HeLa細胞から脂質を抽出し、上記の条件を用いてMS/MS(SRM)解析を行ったところ約85種のジアシルリン脂質、35種のリゾリン脂質、10種のスフィンゴ脂質を同定することができた。ゼブラフィッシュは脂質を豊富に含むegg yolkと呼ばれる組織を有しており、ゼブラフィッシュ個体の脂質解析においてこの組織を除くことが必要である。私は、2種類のバッファーを用いることでegg yolkの個体への混入をタンパクレベルで1/1000以下まで除くことに成功した。分離した個体とyolkの脂質解析を行ったところ、個体では飽和脂肪酸を有するリン脂質が多く、yolkでは不飽和脂肪酸を有する脂質が多いことが分かった。このことは個体とyolkでは異なる脂質代謝メカニズムが存在することを示唆している。ホスホリパーゼA1(PLA1)は、リン脂質のsn-1位の脂肪酸を加水分解して、2-アシルリゾリン脂質を産生する酵素である。PLA1は細胞内型、細胞外型に大別される。細胞内型PLA1(iPLA1)は線虫、ショウジョウバエでは1種類、脊椎動物に3種類(iPLA1 α、β、γ)存在する。このうち線虫iPLA1は主にホスファチジルイノシトール(PI)のsn-1位の18:1の脂肪酸を切り出し、18:0の脂肪酸を導入するリモデリング反応を促進して、幹細胞様上皮細胞の非対称分裂に関わることが分かっている。また、脊椎動物では、遺伝性痙性対麻痺と呼ばれるヒト遺伝病の原因遺伝子としてiPLA1 α、γが同定された。リコンビナントタンパクを用いた実験では、iPLA1 α、γが様々な種類のリン脂質に対して特異性を示すことが分かっている。しかし、細胞内での基質特異性や機能に関して不明な点が多く残されている。そこで我々は、高速液体クロマトグラフィー/マススペクトロメトリー(LC/MS)を用いた網羅的なリン脂質測定方法を開発し、細胞内におけるヒトiPLA1のリン脂質代謝機能を解析した。ヒトiPLA1 αの野生型と活性中心変異型を過剰発現したHeLa細胞を比較すると、PIの総量に変化はみられなかったが、野生型では変異型と比べて18:0を含むPIの量が増加して、一方で18:0を含まないPIが減少した。逆に、iPLA1 αをノックダウンしたときには、18:0を含むPIの量が減少して、18:0を含まないPIが増加した。

PI以外のリン脂質では総量、脂肪酸組成ともに大きな変化は見られなかった。また、iPLA1 γをノックダウンした時、iPLA1 α同様、18:0を含むPIの量が減少して、18:0を含まないPIが増加した。このことから、細胞内においてiPLA1 α、γが線虫と同様にPIのsn-1位の18:1の脂肪酸を切り出し、18:0の脂肪酸を導入するリモデリング反応を担っていることが示唆された。PIあるいはその代謝産物が関わる生体内機能の異常が遺伝性痙性対麻痺の発症の原因となっている可能性が考えられる。リン脂質は主にグリセロール骨格に極性頭部と2本の脂肪酸が結合した構造を有する。リン脂質は極性頭部の構造の違いから、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルイノシトール(PI)などの種類に分類される。リン脂質はそれぞれ結合する脂肪酸の種類が大きく異なる。この脂肪酸の多様性は「リモデリング反応」によって調節されている。しかし、リモデリング反応に関わる酵素群はこれまでほとんど同定されておらず、また、リン脂質の脂肪酸多様性はなぜ必要なのか、それが破綻するとどのような異常や病態を招くのかという問題も解明されていない。リモデリングを担う酵素が同定されていない原因として、性状のよく似た数百種類のリン脂質分子をひとつひとつ区別し、かつ網羅的に解析する手法が十分に確立されていないことが挙げられる。そこでまず私は、マススペクトロメトリーを用いた網羅的脂質解析手法の開発を行った。他分野の先生方に協力して頂き、約200種類のリン脂質を高感度に測定できる方法を開発することに成功した。この脂質測定系を用いて、生体内機能・基質特異性が不明な細胞内型ホスホリパーゼA1 (iPLA1)を解析した。その結果、iPLA1ファミリーのうち、iPLA1αとiPLA1γが脂肪酸リモデリング反応を担っていることを見出した。さらに、iPLAIを介したリモデリングがミトコンドリアの形態形成に重要であることが分かった。近年、遺伝性痙性対麻痺の原因遺伝子としてiPLA1が同定された。本研究の結果から、iPLA1欠損によるミトコンドリアの形態異常、それに伴って起こる機能異常が病態発症の原因である可能性が考えられる。マススペクトロメトリーによる網羅的リン脂質解析の測定系の構築がほぼ完成した点に関しては、当初の計画通り進行することができた。一方でモルフォリノを用いた個体での評価がやや遅れ気味ではあるが、測定系が完成したことで、今後は飛躍的に研究が進行することが期待されるリゾリン脂質とジアシルリン脂質を網羅的に測定できる方法を確立した。この方法を用いて、iPLA1αとiPLAIγが脂肪酸リモデリングに寄与していることを発見した。これまでと比べて簡便かつ高感度にリン脂質を測定できる方法が開発できたため、現在ゼブラフィッシュを用いた解析以外にも応用することを試みている。リン脂質はほとんどの生理病理現象に関わっているが、詳細にリン脂質分子を捉えている研究は少ない。オートファジーは生体内分解機構のひとつであり、リン脂質代謝が大きな寄与を持っていると考えられているが、その詳細は不明なままである。私はオートファジーの解析に網羅的脂質測定法を応用することで、新しい代謝メカニズムをすでに見いだしている。
発現遺伝子プロファイルを用いた口腔扁平苔癬の薬剤感受性と悪性化の診断に関する研究

口腔扁平苔癬は、口腔粘膜に肇現する各種の皮膚科的疾患のなかでは最も頻繁にみられる慢性炎症性病変である。中年期の女性に頻度が高く、頬粘膜に好発し、発赤したびらん状の粘膜を背景に、白色丘疹の網状やレース状を呈することが多い。しばしば強い接触痛や刺激痛を伴い治療に難渋する症例を経験する。C型肝炎やGVHDとの関連が以前より指摘され、自己免疫機序の関与が示唆されているが、その病態はほとんどわかっていない。扁平苔癬は、特に様々な病態を含んだ症候群的色彩を有しているため、患者のQOL向上に寄与するため、症例毎に最も適した治療の選択が望まれる。本研究の目的は、様々な病態の口腔扁平苔癬の発現遺伝子プロファイルを比較し、それを応用して臨床的に問題となっている薬剤感受性および前癌病変の分子診断の可能性を検討することである。当科を受診した患者のなかで、生検により病理組織学的に扁平苔癬と診断された検体を対象とし、生検組織の残りからRNAを抽出しマイクロアレイに供した。対象は6例(男1、女5、平均年齢58歳)で、部位は全例頬粘膜であった。臨床視診型は、網状型4例、びらん型2例であった。このうち4週間以上に亘るステロイドの局所塗布による治療効果は感受性群が3例、非感受性群が3例であった。また、病理組織学的に異形成を伴っていたのは1例であった。上記感受性群と非感受性群間でマイクロアレイを施行したが、感受性群が非感受性群より1.5倍発現量が増加あるいは減少している遺伝子を抽出したところ、それぞれ55個、63個であった。この中で感受性症例で低下が見られる筆頭のPSORS1C2は皮膚疾患であるpsoriasis症例でSNPとの相関が報告されており興味深い。抽出されたこれらの遺伝子群に変化が予想され、今後十分な症例数を用いて検討をするとこの中から有意なマーカーが得られる可能性があると思われた。口腔扁平苔癬は、口腔粘膜に発現する各種の皮膚科的疾患のなかでは最も頻繁にみられる慢性炎症性病変である。当科を受診した患者のなかで、現在までに生検により病理組織学的に扁平苔癬または、扁平苔癬様病変と診断された検体を対象とし、生検組織の残りからRNAを抽出しマイクロアレイに供した。対象は10例(男2、女8、平均年齢58歳)で、頬粘膜8例、舌1例、臼後部1例であった。臨床視診型は、網状型6例、びらん型3例、潰瘍型1例であった。

このうち4週間以上に亘るステロイドの局所塗布による治療効果は感受性群が7例、非感受性群が3例であった。また、病理組織学的に異形成を伴っていたのは1例であった。上記感受性群と非感受性群間でマイクロアレイを施行したが、採取可能な検体は非常に少量で、抽出されたRNA量は非常に微量であったため、判読可能なデータは得られなかった。そこで、現在、検体の抽出法や、微量検体からでもラベリングができるキットを購入予定である。口腔扁平苔癬は、口腔粘膜に発現する各種の皮膚科的疾患のなかでは最も頻繁にみられる慢性炎症性病変である。中年期の女性に頻度が高く、頬粘膜に好発し、発赤したびらん状の粘膜を背景に、白色丘疹の網状やレース状を呈することが多い。しばしば強い接触痛や刺激痛を伴い治療に難渋する症例を経験する。C型肝炎やGVHDとの関連が以前より指摘され、自己免疫機序の関与が示唆されているが、その病態はほとんどわかっていない。扁平苔癬は、特に様々な病熊を含んだ症候群的色彩を有しているため、患者のQOL向上に寄与するため、症例毎に最も適した治療の選択が望まれる。本研究の目的は、様々な病態の口腔扁平苔癬の発現遺伝子プロファイルを比較し、それを応用して臨床的に問題となっている薬剤感受性および前癌病変の分子診断の可能性を検討することである。当科を受診した患者のなかで、生検により病理組織学的に扁平苔癬と診断された検体を対象とし、生検組織の残りからRNAを抽出しマイクロアレイに供した。対象は6例(男1、女5、平均年齢58歳)で、部位は全例頬粘膜であった。臨床視診型は、網状型4例、びらん型2例であった。このうち4週間以上に亘るステロイドの局所塗布による治療効果は感受性群が3例、非感受性群が3例であった。上記感受性群と非感受性群間でマイクロアレイを施行したが、感受性群が非感受性群より1.5倍発現量が増加あるいは減少している遺伝子を抽出したところ、それぞれ55個、63個であった。この中で感受性症例で低下が見られる筆頭のPSORS1C2は皮膚疾患であるpsoriasis症例でSNPとの相関が報告されており興味深い。抽出されたこれらの遺伝子群に変化が予想され、今後十分な症例数を用いて検討をするとこの中から有意なマーカーが得られる可能性があると思われた。
近現代の日本における行旅病人・行旅死亡人に関する歴史的研究

本研究では、(1)近代日本における「行き倒れ」(行旅病人・行旅死亡人)の実態と救護・取扱法制に関する政府、道府県、市町村の基本史料を全国的に収集し、(2)それに基づいて、明治維新後の政府・各府県の「行き倒れ」対応法規の成立・展開とその背景を明らかにし、(3)さらに、行旅病人・行旅死亡人の実態とその救護・取扱の実際を具体的に明らかにし、(4)以上を通して、「行き倒れ」という視角から日本社会の特質の究明を試みた。研究期間の第1年目である今年度は、4年間の研究の基盤となる関係史料の収集に全力を注いだ。その結果、史料収集をほぼ終え、経費の関係で進捗が遅れた戦後の「官報」所載の行旅死亡人公告の収集と若干の補充調査を残すのみとなった。また、本研究の特色の1つである「行き倒れ」発生地の現地踏査も、福島県内各地で行い、その具体的状況を確認した。以上の成果の詳細は、次のとおりである。1.「行旅病人・行旅死亡人」取扱法制に関する政府資料を、国立公文書館所蔵の太政官文書及び内閣・内務省文書について網羅的に収集した。また、関係法制の展開を「法令全書」で確認した。これによって、政府の対応とその変遷を実証する史料の収集を基本的に終えた。2.府県庁文書については、群馬県・宮城県・長野県の各県庁文書の収集を完了し、収集済みの福島県・秋田県・栃木県・埼玉県の各県庁文書を加えて、現在保存・公開されている関東・東北諸県の県庁文書中の「行旅病人・行旅死亡人」関係文書の大半を収集した。3.さらに行旅病人救護・行旅死亡人取扱の行政的責任主体である市町村の役場文書については、善光寺の存在から「行き倒れ」が多発するとの予測の下で、長野県の松本市域・長野市域の旧町村役場文書の調査を両市の文書館について行い、各町村役場文書から関係史料を収集した。4.「行き倒れ」発生地の現地踏査は、福島県庁文書によって場所を特定できる事案について行い、福島市域、会津若松市域、いわき市域(磐城炭鉱地帯)で発生地の状況を具体的に確認した。収集史料の分析は現在進めているが、その成果の最初の発表は、本年5月の法制史学会総会(於・東北大学)の研究報告の場で行い、その後、これを学術論文として投稿する。従って、本研究主題に関する発表論文は平成21年度にはなく、成果の発表は平成22年度から始める。4年間の研究期間の2年目に当たる2010年度は、史料調査を継続しつつ、研究成果の公表に努めた。1.史料調査研究成果の学会報告に併せて宮城県公文書館、山形県立図書館・文翔館において、関係史料・図書の調査を行った。また、新たに関係史料(県庁文書)の存在が確認された奈良県立図書情報館において、奈良県庁文書中の関係史料の調査を行い、その過半を撮影した。2.学会報告5月29日に東北大学法学部で開催された法制史学会第62回総会の一般報告の部で「近代日本における『行き倒れ』取扱法制とその行政的運用の諸段階-政府・府県・町村の関係及び『行き倒れ』の実態に注目して-」と題して報告した。また、主として都道府県立公文書館において史料調査を行ってきたことから、全国歴史資料保存利用機関連絡協議会の招待を受け、同協議会の2010年度京都大会(11月25日、会場・京都テルサ)において「近現代史研究と文書館-利用者の立場からの1つの文書館論-」と題して報告した。この報告のために、全国の36の公文書館・相当施設に自らアンケートを行い、行政文書の目録整備・公開に関する実証分析を行った。3.学術論文等の執筆・発表法制史学会での報告は、その後の史料調査と史料分析の結果も反映させて、「近代日本における行旅病人・行旅死亡人対応法制の成立と展開-明治維新後の政府・府県の「行き倒れ」対応法規-」としてとりまとめ、『部落問題研究』第196号に発表した。そこでは、明治維新後3段階に改定・整備された明治政府の行旅病人・行旅死亡人対応法制の成立・展開過程とその要因を、府県における関係規則とも関連させて分析・解明した。また、上述の全国歴史資料保存利用機関連絡協議会京都大会での招待報告「近現代史研究と文書館」も、アンケート集計表とともに同協議会『会報』第90号(大会報告号)に提出し、印刷中である。4年間の研究期間の3年目に当たる2011年度は、史料調査を継続しつつ、研究成果の公表に努めた。1.史料調査(1)国立公文書館において、政府関係文書中の行旅病人・行旅死亡人関係文書の調査を、日本新聞博物館新聞ライブラリーにおいて、行旅病人・行旅死亡人関係の新聞記事調査をそれぞれ行い、関係史料を収集した。(2)奈良県立図書情報館において、奈良県行政文書中の行旅病人・行旅死亡人関係文書の調査・閲覧を行い、関係史料のほとんどを撮影・収集した。2.学会報告

10月23日に同志社女子大学(京都市上京区)で開催された第49回部落問題研究者全国集会(歴史II分科会)において、「近現代の『行き倒れ』(行旅病人・行旅死亡人)の実態とその救護・取扱いから見た日本社会の歴史的特質」と題して報告を行った。報告では、(1)行旅病人・行旅死亡人に関する歴史的研究・社会福祉学的研究等の全体を鳥瞰して成果と課題を示し、(2)戦前期における行旅病人・行旅死亡人数の府県別統計とその推移を提示するとともに、全国統計と府県統計の関係、その根拠となっている行旅病人・行旅死亡人の発生実態を検証し、(3)日露戦後の福島県における行旅病人・行旅死亡人の実態分析をもとに、これを生み出す日本社会の特質に言及した。当日は、高岡裕之氏(関西学院大学)によるコメント「戦前日本における行旅病人・死亡人救護事業をめぐって」を得て討論が行われ、質問に答えつつ研究成果を展開した。3.学術論文等の執筆・発表上記法制史学会第49回部落問題研究者全国集会での報告を、同名の学術論文にとりまとめ、『部落問題研究』201に掲載される「報告特集号」原稿として提出した。同号は、2012年6月に刊行予定である。4年間の研究の最終年にあたる2012年度は、1福島県・宮城県における史料の確認調査、2行旅病人・行旅死亡人の人数を精確に確認するための一次史料である各種統計書等の比較分析、3行旅病人の実態を出郷理由・家族関係・移動中の糊口手段・「行き倒れ」に至る直接的理由等の分析、4日露戦後の福島県において「行き倒れ」を生み出す要因としての家族・労働・地域社会の在りようの分析を、それぞれ行った。そして、その分析に基づく研究成果を、『部落問題研究』201・『日本史研究』607に、それぞれ学術論文として発表した。以上により、1『帝国統計年鑑』『内務省統計報告』『府県統計書』「行旅病死人台帳」(群馬県行政文書)の比較および県庁・市町村役場文書の分析に基づいて「行き倒れ」関係史料の史料論的検討を行い、2『帝国統計年鑑』により「行旅病人」「行旅死亡人」数の年次推移と全国合計・同府県別人数の比較検討を行い、3戦間期東京府・東京市における「行き倒れ」人の人数及び「行き倒れ」発生地・「行き倒れ」人の本籍地等を分析し、4福島県における「行き倒れ」の発生地・出身地を明らかにし、5「行旅病人尋問調書」の分析に基いて家族関係と女性・子どもの実態を究明し、6出郷者を誘因するものとして炭坑・鉱山・北海道の存在を析出し、7「行き倒れ」の救護における地域社会の役割を明らかにした。最後に、以上を総括して、「行き倒れ」の歴史的特質を究明する分析視角として「家族・労働・地域社会」という問題設定が有効であることを実証分析をもとに提示した。第1に、研究目的の中心である行旅病人・行旅死亡人関係史料の調査・収集という点では、全国の都道府県立文書館および国立公文書館等の調査と関係史料の閲覧、写真撮影をほぼ完了しえたこと、第2に、収集史料の分析の上に立って行旅病人・行旅死亡人の歴史的研究を行い、成果を発表するという点では、学会報告1回、都合4編の論文の発表(掲載確定分1編を含む)により、行旅病人・行旅死亡人の実態とその取扱法制に関する実証分析を進めることができたことによる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
小型姿勢センサモジュールの開発と手術手技訓練システムの構築

本研究では,超小型姿勢センサの開発と,そのセンサの手術手技訓練システムへの応用を目的とした.3年間の研究において,無線通信が可能な超小型姿勢センサを開発した.また,それらのセンサを用いて実験を行い,姿勢センサの計測値から内視鏡手術手技を評価する方法を考案した.本研究では,超小型姿勢センサの開発と,そのセンサの手術手技訓練システムへの応用を目的とした.3年間の研究において,無線通信が可能な超小型姿勢センサを開発した.また,それらのセンサを用いて実験を行い,姿勢センサの計測値から内視鏡手術手技を評価する方法を考案した.本研究では,施術者の腕や指の動きを計測し,熟練者の動作と比較することで.具体的にどこをどのように改善すれば良いか呈示することが可能なシミュレーション教育システムの開発を目的としている.そこで,まず施術者の心理状態と動きの計測に着目し,生理指標(心電・呼吸・発汗・脈波)および全身の動作計測が可能な人間計測システムWB-2R(Waseda Bioinstrumentation system No. 2 Refined)を開発してきたが,動作計測に用いている姿勢センサモジュールは30×30[mm]と大きいため,手術における細かい動作を計測するには不向きである,また,各モジュールのキャリブレーションを手で行っていたため,センサの精度に比べ出力データにノイズが多く,セッティングに時間を要していた.そこで,本年度は,姿勢センサモジュールの小型化,およびキャリブレーションシステムの開発を行った.まず,小型化に際し,モジュールに使用していたレートジャイロ,加速度,地磁気各センサを選定し直した.そして,再設計を行ったところ, 20×25[mm]まで小さくすることに成功した.また,モジュールを1回転させて加速度のキャリブレーションを行った後,システムを横に倒してさらに1回転させると地磁気のキャリブレーションを行うことができるキャリブレーションシステム(総重量0.9[kg])を開発した.エンコーダの値と,従来の方法でキャリブレーションした際の加速度,キャリブレーションシステムを用いた際の加速度を比較したところ,従来の方法では大きな誤差が生じていたのに対し,キャリブレーションシステムではほぼ見られなくなった.さらに,固定方法,通信方法を改良することにより,計測中のずれ,ケーブル数を軽減し,新たな人間計測システムWB-3を開発した.本研究では,装着型小型姿勢センサの開発を行っている.本年度は,センサモジュールの小型化と,開発したセンサモジュールを用いた医療手技訓練システムの構築に取り組んだ.センサの小型化は,最新の3軸加速度センサ,3軸ジャイロ,3軸地磁気センサを組み合わせることで実現した.それと平行して,バッテリーとmicroSDカードを組み合わせた単独動作が可能なモジュールも開発した.今後は,モジュールとPC間の通信の無線化を行い,ユーザビリティーを向上させる.医療手技訓練システムの構築においては,腹腔鏡手術トレーニングを対象と定め,臨床医の協力のもと実験を実施した.腹腔鏡手術とは,小型カメラと特殊な器具を体表にあけた小さな穴から腹腔内に挿入し,カメラ画像をもとに特殊な器具を操作して,組織の切除や縫合を行う手術である,現在は,この手技の習得を目的として,腹腔内に見立てたボックスを使用した訓練が行われている.本研究では,手技水準が異なる2群の被験者(熟練医と研修医)を用意し,それぞれの被験者に小型姿勢センサを貼り付け,ボックストレーニングを行わせた.本トレーニングでは,手技水準の相違がデータに現れやすいと思われる複数のタスクを設定した.実験の結果,小型姿勢センサから得られるデータを用いて,手技水準の評価が可能であるということが示唆された.今後は,このデータの解析を進めて,評価関数の構築と医療手技訓練システムの完成を目指す.本研究では.医療手技を定量的に評価するための装着型姿勢センサの開発と,それから得られるデータより手技を評価するシステムの構築を目的としている,2010年度は,開発した姿勢センサとシステムの実証実験および応用分野の開拓に注力した.まず,実証実験としては,九州大学医学部の協力のもと,腹腔鏡手術訓練時の熟練医と未熟医の動作計測を行った.その結果,評価タスクを行う際,熟練医は左右の腕を同程度の割合で使用しているのに対して,未熟医は利き腕を使用している割合が高いことが確認された.これより,タスク実施中の利き腕の使用割合は,腹腔鏡手術手技の評価に有用であることがわかった.また熟練医は,手首の使用頻度が高いことも判明した.応用分野の開拓としては,ロボットをメディアとした遠隔地会議システムにおいて,ユーザの動作を計測するツールとして装着型姿勢センサの使用を提案した,そして,研究連携者の石井裕之をデンマークとドイツに派遣し,そこで計測した姿勢センサのデータをインターネット経由でリアルタイムに日本へ送信する実験を実施した.その結果,受信データに遅延と歪みが含まれるものの,姿勢センサで計測したデータをインターネット経由で海外に送信可能であることが確認された.以上より,本研究課題では,研究の目標としていた医療手技評価・訓練システムの構築を達成することができたと結論付ける.さらに,遠隔地会議システムへの応用についても,可能性が示された.
自己羊水幹細胞シートを用いた新生児難治性疾患に対する新規治療法の開発

また、我々は本研究課題の中でhAFS細胞シート作成に成功し特許出願を行った。そして、マウス皮膚全層欠損モデルを用いて、hAFS細胞シートが皮膚創傷治癒を遅延させることなくIII型コラーゲン主体の瘢痕化の少ない創傷治癒を促すことを明らかにしてきた。本年度は、この研究成果に関しても英文論文を作成し、現在、英文誌に投稿中である。一方、我々はこれまでに、ラット胎仔脊髄髄膜瘤モデルを用いて、hAFSが直接被覆とparacrine効果を介して脊髄髄膜瘤胎仔の脊髄神経損傷を軽減する胎児治療効果を見出してきた。このため、本年度の研究では、同じモデルを用いてhAFS細胞シートを胎仔病変部に貼付し治療効果の検討を試みた。しかし、ラット胎仔は極めて小さく細胞シート貼付時に破水しほとんどが流産に至った。このため、本動物モデルでのコンセプト検証は困難だった。このコンセプトの検証には、羊などの大動物を用いた脊髄髄膜瘤モデルを用いる必要があると考えられた。hAFSは筋、皮膚、神経、肝など多数の細胞種に直接分化するとされ、我々の実験系でも心筋様細胞、神経様細胞、血管内皮様細胞への直接分化能を見出してきた。本年度は、hAFSをスフェロイド化することで、単層培養よりも未分化性が上昇し、これらの細胞への分化誘導効率が上昇するとの仮説を検証した。hAFSスフェロイドは単層培養のhAFSと比較し、未分化マーカー(Oct4、Nanog)mRNAの発現が上昇することを見出したが、現在のところ分化誘導効率上昇には至らず、改良が必要であると考えられた。我々は、既報に基づき抗CD117抗体を用いてhAFSを分離・培養することに成功した(De Coppi et al., Nature Biotechnology. 2007)。また、得られたhAFSは骨・軟骨・脂肪のみならず神経系細胞、心筋様細胞への分化能を有することを確認した。さらに、マウス皮膚全層欠損モデルを作成し、背部2箇所に作成した創部にhAFSを局所注射することで瘢痕化・線維化の少ない創傷治癒が促進されることを見出した。古くから妊娠24週以前の胎児は全く瘢痕化なく皮膚創傷治癒する事、間葉系幹細胞はそれぞれの細胞起源により特徴が異なる事が知られている。上記のhAFS局所注射の結果は、胎児外界に存在する羊水中に、瘢痕化・線維化に寄与しうる幹細胞が含まれている事を示していると考えられる。さらに、動物種を超えて保存されている胎児皮膚の特徴を考慮したとき、hAFSが他の間葉系幹細胞以上に強力な瘢痕化・線維化を抑制する治療効果を有する可能性を示唆するものであると考えており、骨髄幹細胞をはじめとした他の間葉系幹細胞との比較検討を計画したいと考えている。また、hAFSの治療効果を高めるため戦略として「頻回の局所注射により治療期間中に生着する幹細胞数を増やす」方法が考えられるが、実際の臨床では患者負担を強いるものである。そこで我々は、簡便に幹細胞生着率を上げ非侵襲的な治療ツールとしてhAFS細胞シートの開発を行った。本研究費申請後(一昨年)から昨年度にかけて、温度感受性培養皿を用いた方法によりhAFS細胞シートの作成に成功し特許出願、ならびに優先権主張を行った。hAFS細胞シート作成に成功し、hAFSは骨・骨・軟骨・脂肪のみならず神経系細胞、心筋様細胞への分化能を有することを確認できたため。(1)処置後7,14,21日目に肉眼的創部面積を観察し創部縮小率の評価を行った。(2)安楽死させたマウスの皮膚組織を採取し,組織パラフィン切片を作成し組織学的検討を行った。具体的にはHE染色,Masson's trichrome染色、Elastica-van-Gieson染色,Picrosirius Red染色によって、再上皮化・肉芽形成・コラーゲン組成の評価を行った。その結果、hAFS細胞シートは無治療のコントロールと比較して、創部縮小率には変化を認めなかった。すなわち、hAFS細胞シートは創傷治癒を促進あるいは遅延させることはなかった。組織学的検討では、Masson's trichrome染色による再上皮化とElastica-van-Gieson染色による肉芽形成は、コントロールと比較して有意な変化を認めなかった。しかし、Picrosirius Red染色によって評価した処置後21日目のコラーゲン組成は、コントロールと比較しIII型コラーゲンが有意に多かった。以上より、hAFS細胞シートは創傷治癒を遅延させることなく、瘢痕化の少ない創傷治癒を促すことが明らかとなった。また、胎児型創傷治癒は成人型創傷治癒と比較しIII型コラーゲンが豊富に発現することが知られている。このことから、hAFS細胞シートは胎児型創傷治癒の特徴を保持していると考えられた。hAFS細胞シートは創傷治癒を遅延させることなく、瘢痕化の少ない創傷治癒を促すことを見いだしたため。

一方、我々はこれまでに、ラット胎仔脊髄髄膜瘤モデルを用いて、hAFSが直接被覆とparacrine効果を介して脊髄髄膜瘤胎仔の脊髄神経損傷を軽減する胎児治療効果を見出してきた。このため、本年度の研究では、同じモデルを用いてhAFS細胞シートを胎仔病変部に貼付し治療効果の検討を試みた。しかし、ラット胎仔は極めて小さく細胞シート貼付時に破水しほとんどが流産に至った。このため、本動物モデルでのコンセプト検証は困難だった。このコンセプトの検証には、羊などの大動物を用いた脊髄髄膜瘤モデルを用いる必要があると考えられた。hAFSは筋、皮膚、神経、肝など多数の細胞種に直接分化するとされ、我々の実験系でも心筋様細胞、神経様細胞、血管内皮様細胞への直接分化能を見出してきた。本年度は、hAFSをスフェロイド化することで、単層培養よりも未分化性が上昇し、これらの細胞への分化誘導効率が上昇するとの仮説を検証した。hAFSスフェロイドは単層培養のhAFSと比較し、未分化マーカー(Oct4、Nanog)mRNAの発現が上昇することを見出したが、現在のところ分化誘導効率上昇には至らず、改良が必要であると考えられた。本年度は計画の一部を変更する。第1に、hAFS細胞シートを用いてマウス皮膚全層欠損モデルに対する治療の効果を検討する。第2に、骨髄幹細胞シートなど他臓器由来の幹細胞シートとの治療効果の比較を行う計画とする。hAFSは胎児型創傷治癒に寄与することから、他の間葉系幹細胞よりも強い抗線維化作用を有している可能性があると考えている。このため、骨髄幹細胞など他の幹細胞源から得られた間葉系幹細胞シートで同様の実験を行うことで、hAFS細胞シートの特性を浮き彫りにしたいと考えている。hAFS細胞シートの抗繊維化作用について論文作成作業を行っていく。また、hAFSの多分化能の検討や、効率的な分化誘導条件の検討を行う。このことにより、hAFSの高い分化能を生かした細胞シートの作成が可能になると考えている。
唾液中miRNA計測とフードモデルを融合させた新たな糖尿病と合併症の非侵襲予防法

フードモデルは、近年、ICタグ内蔵によって、食事と栄養価をより視覚的かつ統合的に結びつけることができ、献立作成や栄養指導に効果を上げている。しかしながら、糖尿病と合併症のリスク評価と連動したフードモデルのシステムは存在しない。申請者の所属研究室ではこれまでに、肥満とインスリン抵抗性が、血中分泌型マイクロ(mi)RNA発現も介して、糖尿病と合併症の発症リスクを高めることを示してきた。こうしたmiRNAは血中のみならず、尿中や唾液中にも分泌される。そこで、本研究では、非侵襲で採取が可能な唾液に注目し、唾液中分泌型miRNA計測とフードモデルを融合させた新たな糖尿病と合併症の非侵襲予防法を確立する。