hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスポゾンを用いた発生後期鶏胚への遺伝子導入

本研究はトランスポゾンという遺伝子組み換え時に認められる構造を用いた遺伝子導入が発生後期のニワトリ胚でどれだけ有用かを検討したものである。この研究でトランスポゾンを用いて遺伝子発現ユニットを導入した場合、発生後期までの長期間にわたって遺伝子導入が可能となる可能性が示された。一方で目的とする細胞・組織に導入するには遺伝子発現ユニットの正確な構築が必要であることが明らかになった。脊椎動物の初期の発生を解析するための理想的なモデルである発育鶏胚において、発生の後期や孵化後についての種々の現象を解析するモデルとしての有用性を再検討するにあたり、Tol2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系の検討に着手した。まず既に作成したGFAPプロモータで作動するTol2トランスポゾンGFP発現ベクターを初期胚の様々な神経形成領域に導入し、後期胚での発現様式を観察した。その結果、孵卵開始から10日過ぎ孵化後のヒナにおいて脳や脊髄など様々な神経組織においてGFPを発現する細胞が認められ、これらの細胞で内在性のGEAPの発現が一致して認められ、アストログリアへの遺伝子導入を確認することに成功した。続いて脊髄運動ニューロン特異的に遺伝子導入するためにコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)のプロモータを含むと想定される領域を同定し、ニワトリのBACライブラリーから同領域を回収した後、Tol2トランスポゾンGFP発現ベクターの作成を行った。孵卵開始3日の胚に遺伝子導入し、7日目に脊髄横断切片を観察したところ前角にGFP陽性細胞が認められた。しかしながら14日目孵化後のヒナでは脊髄前角でGFPを発現する細胞が確認できなかった。この結果は、ニワトリBACライブラリーから単離したChATプロモータは7日目では前角の運動ニューロンで機能していることを意味する。一方、本来発生の後期ではChATプロモータはより活性を有することが期待されるが、T2トランスポゾン発現ベクターと組み合わせるとあまり有効に機能していないことを示唆する結果が得られた。Tol2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系の検討を昨年度に引き続き進めた。ニワトリのBACライブラリーより単離したコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)のプロモータがT2トランスポゾン発現ベクターと組み合わせるとあまり有効に機能していないことが前年度の研究で明らかになった。そこで脊髄運動ニューロンに優位に発現するLimホメオ蛋白の一つであるislet-1遺伝子のエンハンサー領域を用いてT2トランスポゾン発現ベクターを作成し、その遺伝子導入について検討した。ChATプロモータを有する発現ベクターと同様に遺伝子導入操作を行ったところ、遺伝子導入直後(E5E6)は前角の運動ニュー白ンにGFPが発現するのが確認されたが、さらに後期胚(E8E10)では前角以外の脊髄内の細胞に広範にGFPの発現が認められた。これは同転写調節領域を単純な発現ベクターを用いて遺伝子導入した場合と異なる結果であった。ChATプロモータで得られた結果と合わせて考えると、T2トランスポゾンに組み込むことで発現強度や特異性などのエンハンサー、プロモータ活性がDNA断片によってまちまちであることが推察された。また運動ニューロン特異的な転写調節領域以外に構成的発現を目的としたEF-1やCMVなどのプロモータと、GFPやDsRedなどの異なる蛍光タンパクの組み合わせでT2トランスポゾン発現ベクターを作成した。これらのベクターを初期の胚に導入したところ、複数の異なる細胞が異なる蛍光タンパクで標識されることを様々な発育ステージで広範な部位で確認することができた。これらの結果をふまえて、1)トランスポゾンに組み込むための新たな転写調節領域の探索、2)既に有効な転写調節領域を用いた様々な機能遺伝子発現ベクターの構築、に関して着手した。本年度はTol2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系について、通常の発現プラスミドを用いた遺伝子導入系と対比した検討を重点的に進めた。脊髄運動ニューロンに優位に発現するLimホメオ蛋白の一つであるislet-1遺伝子のエンハンサー領域を用いて作成したT2トランスポゾン発現ベクターと、同様のエンハンサー領域を用いたプラスミドベクターを発育鶏胚に導入し、レポーター遺伝子の発現パタンを追試、精査した。脊髄全体では前年度確認したようにTol2トランスポゾンを用いた系で前角の運動ニューロン以外でも広範に発現が認められる一方で、脊髄前角の運動ニューロンでの発現については、両者に共通して発生の進展とともに発現が減弱する傾向が認められた。Islet-1遺伝子のエンハンサーの活性をより正確に把握するため、半減期が短い変異型GFPをレポーターとして導入したところ、通常のGFPでは発現が減弱しつつも確認できるE8以降の脊髄ではGFP発現を確認することができなかった。この結果はislet-1遺伝子のエンハンサーが発育後期の鶏胚脊髄では活性が低く、通常のレポーター遺伝子の発現が確認できるのはエンハンサーの転写活性によるものではなく、既に発生初期で作られたタンパクの残存であることを示唆している。この結果を受けて、T2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系には、1)通常の発現プラスミドで機能する転写調節領域の選定、をまず行い、次に、2)

T2トランスポゾンの系で機能する遺伝子領域の選定、を行う必要があることが明らかとなった。複数の転写調節領域をT2トランスポゾンを用いた遺伝子導入系で確認し、後期胚で有効なものを見出すことに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後脊髄運動ニューロン、シュワン細胞、骨格筋など当初後期胚で遺伝子導入の標的としていた組織に適した転写調節領域の探索を一層進める予定である。また同様に発生中期後期で発達する眼球などの組織もトランスポゾンによる遺伝子導入の対象として検討を進めていく。既に効果的な遺伝子導入が認められるアストログリアに関して、機能遺伝子の導入や更なる遺伝子発現調節(発現抑制や薬物による誘導など)の可能性を検討する。
かにパルサーからの重力波の検出

1)アンテナの共振周波数が低いため、厳重な防振を施し外部からの擾乱を防ぐ必要がある。そこで室温の真空中にステンレスのおもりとバネを多段に重ねた防振系を開発し、そこから細いワイヤーでアンテナを吊り下げる形式をとった。これによって十分な防振効果が得られることが実験的に確かめられた。クライオスタットの内部から発生する雑音に関しては、液体窒素を使用しないガスシールに方式なので、液体ヘリウムの泡だけを問題にすればよく、これは十分に小さいことが確かめられている。2)重力波アンテナの較正装置の製作が行なわれた。これは回転体が発生する変動重力場を利用するもので、発生器と受信器の距離を変えながら相互作用の強さを測定することにより、ニュートン力学をもとにアンテナの感度が求められる。また、この実験のために必要なコールドダンピングの技術的問題も検討され、適用可能であることがわかった。3)低温を長時間維持するために必要な装置類や、データ採録関係および解析装置等の周辺機器の製備が行なわれた。4)重力波アンテナの出力を解析するための、最適化フィルターなどの研究が行なわれち。ねらう信号の周波数がわかっている場合には、データ処理の方法として長時間フーリエ積分が最も有効であることが判った。5)岡山天体物理観測所において、光学望遠鏡を用いた、かにパルサーの光パルスのタイミング観測を1年に2回行なった。これによって重力波アンテナの出力の長時間積分が可能になる。直径1.1m,高さ1.0m,質量1,200kgのアルミ製ねじれ型アンテナのデザインが決まり、それにもとづいて材料の発注および加工製作が行なわれた。大型重力波アンテナは、入手可能な材料(アルミ合金5056)の大きさが限られるため、3分割で作りそれぞれをアルミ溶接で接合する形となった。これに関しては、あらかじめ種々の予備実験を行ない検討した結果、熱はめ法やボルト固定法に比べてアルミ溶接法が最も容易で確実なこと、複合型であってもQ値や安定性に何ら問題がないことが明らかにされた。出来上ったアンテナは常温常圧で2×【10^5】以上のQ値をもつことが確認されている。またアンテナを4.2Kに冷却し、それを真空中に収納するための、外径1.7m,高さ3mの大型クライオスタットが建設された。液体窒素を使用しないガスシールド方法であるが、液体ヘリウムの消費量は毎時2・5l以内に押えられる見込みである。一方で小型の重力波アンテナ(100kg)とクライオスタットをもとにしたモデル実験も平行して行なわれた。この装置を用い1408時間の重力波観測を行ない、かにパルサーからの重力波の上限としてh<1.9×【10^(-21)】を得た。特にアンテナの共振周波数をかにパルサーに完全に同調させるための電子同調機構については、モデルアンテナを用いて研究を進めてきたが、これによって実用化のめどがついた。また、岡山天体物理観測所における光学望遠鏡を用いた、かにパルサーの光パルスのタイミング測定も引続き行なわれており、これによって重力波の目標周波数が精度良く決定できるようになった。1.実験に用いる重力波アンテナ(アルミ合金5056製1,200kgねじれ型)は,まず3分割で作りそれを溶接によって一体化したものである.この場合,アンテナの上下のバランスがくずれていると外部からの振動に容易にカップルするため,バランスを調整しアイソレーションを良くすることが必要である.一方,アンテナのQ値が非常に高くバンド幅が狭いため,目標信号を捕らえるためには共振周波数を一定の範囲以内に収める必要がある.そこでアンテナの上下の首の部分をわずかづつ削ってはバランス及び共振周波数を測定するというステップを繰り返すことにより,共振周波数の微調整とバランスの調整を行なった.2.大型クライオスタット(直径1.8m,高さ3m,液体窒素を使わないガスシールド形式)の周囲に,アンテナ・防振系の支持と液体ヘリウム供給のための架台を建設した.真空中に置かれる防振系は,ステンレスのおもりとバネを多段に重ねた形となっている.架台は鉄骨構造であり, 10tonの重量に耐える強度を持っている.3.4Kにおけるアンテナのブラウン運動はまだ観測されていないが,このための電気系の準備が行なわれた.機械信号を電気信号に変換するトランスデューサーは静電型を使用するが,モデルアンテナ(100kg)に静電型トランスデューサーを組合せ,低温における重力波アンテナのコールドダンピング電子同調などの技術を試験し,実用可能なことを実証した.4.重力波アンテナの出力を長時間(1000時間)フーリエ解析し,雑音帯域幅を狭めることにり感度をあげるには,かにパルサーからの重力波の目標周波数が精度良くわかっている必要がある.そのため,岡山天体物理観測所において,光学望遠鏡を用いた,かにパルサーの光パルスのタイミング測定が引続き行なわれた.1)アンテナの共振周波数が低いため、厳重な防振を施し外部からの擾乱を防ぐ必要がある。

これは回転体が発生する変動重力場を利用するもので、発生器と受信器の距離を変えながら相互作用の強さを測定することにより、ニュートン力学をもとにアンテナの感度が求められる。また、この実験のために必要なコールドダンピングの技術的問題も検討され、適用可能であることがわかった。3)低温を長時間維持するために必要な装置類や、データ採録関係および解析装置等の周辺機器の製備が行なわれた。4)重力波アンテナの出力を解析するための、最適化フィルターなどの研究が行なわれち。ねらう信号の周波数がわかっている場合には、データ処理の方法として長時間フーリエ積分が最も有効であることが判った。5)岡山天体物理観測所において、光学望遠鏡を用いた、かにパルサーの光パルスのタイミング観測を1年に2回行なった。これによって重力波アンテナの出力の長時間積分が可能になる。
フーリエ変換型分光計及びレーザーヘテロダイン分光計を用いた金星大気の地上赤外観測

東北大学では、平成11年度に口径60cm反射望遠鏡を中心とした惑星光学観測システムを導入し、福島県飯舘村に設置した。本研究はこのシステムの赤外分光装置を用いて金星大気の観測を行うとともに、将来他の惑星観測にも応用できる観測技術を確立することを目的とする。赤外分光装置としては、フーリエ変換型分光計(FT-IR)およびレーザーヘテロダイン分光計がある。平成12年度は、FT-IRのInGaAs検出器の感度を黒体光源を用いて検定した。また、実際に金星を観測する際の視野の調整方法、迷光の防ぎ方などを検討した。レーザーヘテロダイン分光計については、音響光学型電波分光部の光軸調整機構の改良を行い、波数分解能を向上させることができた。なお、予算が申請額よりかなり削られているため、以後はFT-IRを用いた研究に専念することとした。平成13年度は、FT-IRを飯舘観測所の望遠鏡に接続し、InGaAs検出器を用いて波長0.9-1.7μmで金星の試験観測を行い、金星表面からの太陽反射光のスペクトルを確認した。また、新たに購入した2μm以上の波長領域を観測するためのInSb検出器の取り付け・調整を行った。平成14年度は、InGaAs検出器を用いて9月から1月にかけ8日程度の金星観測を行い、金星昼面・夜面のスペクトルを取得した。望遠鏡の追尾精度とのかねあいから現状ではS/N比は十分ではないが、11月29日、12月11,14,28日の観測では金星大気中のO_2 1.27μmの発光を確認することが出来た。また、試験的に観測した木星のスペクトルからは、木星大気中に多量に含まれるメタンの吸収線が確認された。InSb検出器でも試験的に金星のスペクトルを観測したが、望遠鏡及び分光器側壁からの熱放射が長波長側で大きく、フィルター等で長波長側をカットする等の工夫が必要なことがわかった。この装置は惑星及びその周辺の中性大気、プラズマの様々な現象をとらえるため、可視から赤外の広い波長範囲での観測が可能となっており、本研究は、この惑星光学観測システムの赤外分光装置を用いて金星大気の観測を行うとともに、将来他の惑星の観測にも応用できる観測技術を確立することを目的とする。赤外分光装置としては、フーリエ変換型分光計およびレーザーヘテロダイン分光計がある。現在、フーリエ変換型分光計には、波長0.9-1.7μmで使用可能なInGaAs検出器のみが組み込まれている。2μm以上の波長領域を観測するためにはInSb検出器が必要であるが、1.7μm以下ではInGaAs検出器の方が感度が一桁以上高いため、微弱な惑星からの光を検出するためS/Nを優先した結果である。今年度は、InGaAs検出器を用いたシステムが十分な感度を有することを黒体光源を用いて確認した。また、実際に金星を観測する際の視野の調整方法、迷光の防ぎ方などの検討を行った。なお、分光計はこれらの試験・調整を行うため、青葉山キャンパス内の実験室に設置している。これらInGaAs検出器でのデータを検討し、InSb検出器でも十分なS/Nを得られると判断した。

レーザーヘテロダイン分光計については、音響光学型電波分光部(AOS)の光軸調整機構の改良を行った。現有の光軸調整機構ではまだ十分とは言えないが、これらの調整機構で焦点位置等を調整することにより、波数分解能を向上させることができた。東北大学では、平成11年度に口径60cm反射望速鏡を中心とした惑星光学観測システムを導入し、福島県飯舘村に設置した。この装置は惑星及びその周辺の中性大気、プラズマの様々な現象をとらえるため、可視から赤外の広い波長範囲での観測が可能となっており、本研究は、この惑星光学観測システムの赤外分光装置を用いて金星大気の観測を行うとともに、将来他の惑星の観測にも応用できる観測技術を確立することを目的とする。今年度は主にフーリエ変換型分光計に関する性能試験や調整を行った。まず、4月にフーリエ変換型分光計を飯舘観測所の60cm反射望遠鏡に接続し、InGaAs検出器を用いて波長0.9-1・7μmで金の試験観測を行った。十分に時間がとれず望遠鏡と分光計の光軸調整が不十分であったものの、金星表面からの太陽反射光のスペクトルを確認した。60cm反射望遠鏡は夏期にこれまで設置されてたスライディングルーフから新しく導入されたドームに移設されることになったため、フーリエ変換型分光計は一旦東北大学に持ち帰り、黒体光源と生を用いて感度等の性能試験を行った。また、今年度新たに購入した2μm以上の波長領域を観測するためのInSb検出器の取り付けをメーカーにて行い、その後再び飯舘観測所に持ち込み、ドーム内に移設された60cm反射望遠鏡と接続し調整を行っている。今年度内に分光器単体での光軸調整は終了したため、今後望遠鏡との光軸調整を進めつつ、InGaAs、InSb両検出器を用いた金星の観測を行う。東北大学では、平成11年度に口径60cm反射望遠鏡を中心とした惑星光学観測システムを導入し、福島県飯舘村に設置した。前年度までにフーリエ変換型分光計の望遠鏡への接続・光軸調整を完了したため、今年度はInGaAs検出器を用いて波長0.9-1.7μmで金星の観測を行った。天候等の状況もあり十分に時間はとれなかったものの、9月から12月にかけ6日程度の観測を行い、金星昼面・夜面のスペクトルを取得した。望遠鏡の追尾精度とのかねあいから、現状では一回の観測で2分程度の積分時間しかとれないためそのままではS/N比が十分ではなく、現在重ね合わせなどを行い解析中である。また、試験的に木星のスペクトルを取ってみたところ、S/N比は不十分ながら金星とは全く異なったスペクトルが得られ、木星大気中に多量に含まれるメタンによると思われる吸収線が確認された。2μm以上の波長領域を観測するためのInSb検出器に関しても光軸調整は完了し、試験的に金星のスペクトルを観測したが、望遠鏡及び分光器側壁からと思われる熱放射が長波長側でかなり大きく、今後フィルター等で長波長側をカットする等の工夫が必要なことがわかった。
琉球列島・沖縄トラフに産する含マグネシウム炭酸塩の地球化学的研究

(1)竹富島沖の海底熱水域での試料採集と分析ダイバ-が潜水して、サンゴ礁海底に噴出する熱水およびガスと周辺の堆積物を採集した。これらの試料の地球化学的研究より、この熱水は地下で海水と岩石が相互作用をして、組成変化していることがわかった。堆積物は現生のドロマイトを含む石灰岩であり、鉄、マンガン、ウラン、砒素、水銀、アンチモン、バリウムなどの重金属濃度が高い。これらの金属の異常濃集はおよそ500ー2000年位前の比較的最近におこなわれたと考えられる。炭素と酸素の同位体分析をおこなったが、竹富島沖のドロマイトは溶けやすく、通常のリン酸溶液によってカルサイトと分離溶解することができなかった。ガス分析の結果とあわせて検討すると、この海底温泉の熱源は火山活動もしくは熱水活動に起因する可能性がたかいといえる。平成3年1月23日より、調査区域の西方40Km、深度数Kmの地点で群発地震が発生し、継続中である。竹富島海底温泉との距離が近いことから、今回の地震と海底温泉となんらかの関係が予想される。地下深所にかなり熱いものがあると予想されるので、今後、海底温泉と地震および海底火山との関係を明らかにすることが必要である。(2)沖縄トラフ熱水域(伊是名、伊平屋海域)での試料採集と分析潜水艇「しんかい2000」「なつしま」による調査に参加し、伊平屋海域で熱水噴出物(炭酸塩堆積物)を採集した。この地域では100°C以下の低温熱水であった。堆積物のX線回折から主要構成鉱物はカルサイトと菱マンガン鉱であった。また、中性子放射化分析により、これにはマンガン、砒素、水銀、銀などが含まれることがわかった(地球化学討論会1990,月刊地球1990で発表)。伊是名海域の試料についてγ線スペクトル分析をおこなった。ウラン系列とトリウム系列のラジウムとその娘核種の放射能がきわめてつよい。しかし放射平衡には達しておらず、堆積物はおよそ10年から60年前かけて生成されたものと考えられる。また、昨年度に、海底より泡状の液体が湧出するのが観察されたが、これは二酸化炭素を主成分とするガスハイドレイトであった(Science 1990)。以上により、熱水活動の影響で生成される炭酸塩の化学的特性を明らかにできた。1.沖縄トラフに産する海底炭酸塩堆積物の地球化学的研究では、潜水調査艇「しんかい2000」による一連の調査で、沖縄トラフで見つけられたチムニ-やブラックスモ-カ-を伴う熱水噴出は320oCに達し、この地域が西大平洋で最も活動的な海底熱水域であることが明らかにされた。2.「しんかい2000」による調査等に参加して堆積物試料を採集した。

その結果、伊平屋海凹で熱水性炭酸塩堆積物を、伊是名海穴で金、銀、銅、鉛、亜鉛を含む硫化物、硫酸塩鉱床を採集できた。またこれらの周辺で柱状海底堆積物を採集した。3.試料について、X線回析、非破壊中性子放射化分析、蛍光X線分析、非破壊ガンマ線スペクトル分析、酸素、炭素およびストロンチウムの安定同位体分析をおこなった。4.その結果、沖縄トラフ海底熱水域に産する炭酸塩は炭酸マンガンを主体とするもので、炭素およびストロンチウムの同位体組成からすると、マグマからの寄与が大きいと考えられる。沖縄トラフの海底熱水活動がきわめて活発であることが裏づけられた。5.スポット的にウラン系列とトリウム系列の放射能が異常に高いところがある。放射能年代測定から熱水鉱床の生成は3-5年、5-8年、10年以上となった。熱水鉱床が極めて最近になって生成されたことが分かった。6.竹富島沖のMg炭酸塩堆積物の地球化学的研究については、竹富島沖のサンゴ礁にも熱水起源と思われる炭酸塩堆積物がある。この炭酸塩はMgを含むドロマイトであり、水銀含有量が高いのが特徴である。これらについて中性子放射化分析による重金属元素の分析と、酸素と炭素の同位体組成を分析し、解析を継続中である。(1)竹富島沖の海底熱水域での試料採集と分析ダイバ-が潜水して、サンゴ礁海底に噴出する熱水およびガスと周辺の堆積物を採集した。この熱水は地下で海水と岩石が相互作用をして、組成変化していることがわかった。堆積物は現生のドロマイトを含む石灰岩であり、鉄、マンガン、ウラン、砒素、水銀、アンチモン、バリウムなどの重金属濃度が高い。これら金属の異常濃集はおよそ500ー2000年位前の比較的最近におこなわれたと考えられる。炭素と酸素の同位体分析をおこなったが、竹富島沖のドロマイトは溶けやすく、通常のリン酸溶液によってカルサイトと分離溶解することができなかった。平成3年1月23日より、調査区域の西方15Km、深度数Kmの地点で群発地震が発生し、継続中である。竹富島海底温泉との距離が近いことから、今回の地震と海底温泉となんらかの関係が予想される。地下深所にかなり熱いものがあると考えられるので、海底温泉と地震および海底火山との関係を明らかにすることが必要となった。(2)沖縄トラフ熱水域(伊是名、伊平屋海域)での試料採集と分析潜水艇「しんかい2000」「なつしま」による調査に参加し、伊平屋海域で熱水噴出物(炭酸塩堆積物)を採集した。この地域では100°C以下の低温熱水であった。堆積物のX線回折から主要構成鉱物はカルサイトと菱マンガン鉱であった。また、中性子放射化分析により、これにはマンガン、砒素、水銀、銀などが含まれることがわかった。結果の一部は地球化学討論会(新潟大学1990)および月刊地球誌(1990)で発表した。伊是名海域の試料は採集できなかったが、手持ちの試料についてγ線スペクトル分析をおこなった。ウラン系列とトリウム系列のラジウムとその娘核種の放射能がきわめてつよい。しかし放射平衡には達しておらず、堆積物はおよそ10年から60年前にかけて生成されたものと考えられる。また、昨年度に、海底より泡状の液体が湧出するのが観察されたが、これは二酸化炭素を主成分とするガスハイドレイトであった(Science1990)。
ベクトル束の特異エルミート計量と相対随伴束の順像層の正値性の研究

本研究の目的はベクトル束の特異エルミート計量の性質を解明すること、及びそれを応用して相対随伴束の順像層の正値性を調べることである。これらに関連して、報告者は以下の結果を得た。(1)ベクトル束の特異エルミート計量の曲率カレントに関する研究:ベクトル束の特異エルミート計量に付随する曲率カレントは、一般には測度係数として適切に定義できないことが知られている。Griffiths半負な特異エルミート計量について、その計量が非退化な集合上では曲率カレントが適切に定義できるという定理がある。報告者は計量が退化している集合上で曲率カレントが適切に定義されるための、ある十分条件を見つけた。また、行列式の計量が最小特異計量となるような特異エルミート計量というものを導入し、ある良い条件の下ではこの計量に付随する曲率カレントが適切に定義できることを示した。(2)ヘルマンダーのL2評価式の逆とベクトル束の新たな正値性について:近年、多重劣調和性を新たに特徴づける研究が行われている。具体的には、領域上の上半連続関数が大沢竹腰の拡張定理の条件のようなものを満たすとき、その関数が多重劣調和関数であることが示された。報告者はこの結果を応用することで、ヘルマンダーのL2評価式の条件を満たす上半連続関数の多重劣調和性について研究した。具体的には、まず捻りを加えたヘルマンダー条件というものを導入し、領域上のある程度特異性の小さい上半連続関数がこの条件を満たすならば、この関数が多重劣調和関数になることを示した。また、上記2つの条件のベクトル束版について考察し、それがベクトル束に正値性を与えることを見た上で、Griffiths正値性や中野正値性といった古典的な正値性との関連について調べた。上記(1)の研究によって、曲率カレントが適切に定義できる計量のクラスが拡張された。また(2)の研究によって、曲率カレントを直接用いないで定義できる正値性の概念が導入された。これらは、特異エルミート計量の正値性の研究における大きな進展である。(1)新たに導入したヘルマンダーの条件から得られる正値性と、中野正値性についての関係を研究する。(3)上記(2)と関連して、領域上のp-Bergman核やLp版の大沢竹腰の拡張定理について研究する。
リン酸化ヒスチジンの同定法の開発とヒスチジンリン酸化タンパク質の解析

リン酸化による情報伝達機構は生命を理解する上で最も重要で普遍的な反応のひとつである。しかし、セリン、トレオニン残基やチロシン残基のリン酸化反応に比べ、哺乳類でのヒスチジン残基リン酸化反応の解析はまだ研究が少ない。これはリン酸化ヒスチジンの化学的に不安定なことと抗リン酸化チロシン抗体の様なリン酸化ヒスチジンを解析する良いツールがないことが原因である。そこで、リン酸化ヒスチジン特異的なボスファターゼであるPHP-1を用い、ヒスチジン残基リン酸化タンパク質の解析が行えるかを検討した。大腸菌で発現させたヒトPHP-1タンパク質は分子内のCys残基のジスフィルド結合によりマルチマーを形成するため、活性に係らないCys残基をSer残基に変異し安定性を高めた。また、PHP-1のホスファターゼ活性に係るが、その基質結合には影響がないHis残基を変異させたPHP-1変異体を用いてHEK293細胞、HL-60細胞抽出液中の結合タンパク質をファーウエスタン法による解析を行った。その結果、PHP-1変異体は293細胞、HL-60細胞中のタンパク質と特異的に結合した。また、リン酸基に対して特異的に結合するPhos-tagにより、これらの結合タンパク質の幾つかはリン酸化されていることが明らかになった。リン酸化ヒスチジンは酸性処理によりリン酸基が遊離することが知られているがこの処理によりPHP-1と結合が無くなること、またPhos-tagとの反応が低下することより、このPHP-1変異体によって認識されるバンドが、リン酸化ヒスチジン残基を持つタンパク質である可能性が示唆された。そこで本研究ではリン酸化ヒスチジン残基特異的な結合するタンパク質のスクリーニングを行い、リン酸化ヒスチジンの簡易同定法を確立することを第一の目的とする。これによりヒスチジンリン酸化の動態、リン酸化されるタンパク質を明らかにすることができると考えられる。現在までに哺乳類細胞でヒスチジン残基のリン酸化が報告されているタンパク質としてヒストンH4、三量体Gタンパク質β鎖、P-セレクチン、カルシウム活性化カリウムチャネルKCa3.1等があげられる。ヒスチジン残基をリン酸化するヒスチジンキナーゼは細菌などの2つのサブユニットからなるキナーゼがよく知られているが、哺乳類にはこれに相当するキナーゼは存在しない。これに対しリン酸化ヒスチジンを脱リン酸化するヒスチジンホスファターゼとして14kDaのプロテインヒスチジンホスファターゼ-1(PHP-1)が報告されている。そこでこのホスファターゼPHP-1を用い、ヒスチジンリン酸化タンパク質同定することができないか検討した。PHP-1とその変異体を大腸菌で発現させ、293細胞や巨核球系の細胞であるUT-7細胞抽出液を用い結合解析を行った所、幾つかのリン酸化タンパク質と結合することが明らかになった。現在このPHP-1組換えタンパク質に結合するリン酸化タンパク質がリン酸化ヒスチジン残基を介しているのか検討中である。
肺癌におけるtwo compartment modelの検証及び発展

これまでわれわれは肺癌の発生機序について、発生母地の生物学的違いに基づくtwo compartment modelを提唱してきた。近年他施設からもこのモデルによって説明可能となる結果が多く報告され、このモデルによって生物学的な意味をもって統合できる可能性を示している。本研究では、4つのテーマ(#1.mutation loads/burden, #2. Unique translocations, #3. Cis-type amplification, #4. Stepwise progression model)に沿って検討を遂行した。課題#1について、次世代シークエンサーでの網羅的遺伝子変異検索をスタートし、mutation burdenの基礎となる遺伝子変異情報を蓄積した。TMBの算定方法については、現在CAP/AMPによるコンセンサスガイドラインの作成が進みつつあり、ガイドラインの制定に積極的に関与するとともに、その完成をまってそれと整合性を取りつつある。課題#2については、未知の反復する融合遺伝子は見出されなかったが、既知のドライバー遺伝子との新たな融合パートナー遺伝子を見出し、論文作成中である。課題#3. cis-type amplificationの検討については、Amplicon sequenceにて遺伝子多型部位とドライバー変異とが同時に見える部位を複数抽出し、cis-typeに変異が加わっていることを確認するとともに、その遺伝子増幅について検討した。EGFR以外には増幅している遺伝子は少なく、あったとしても数コピーの増加にとどまり、その生物学的意義について検討を進めている。課題#4についての基本構想については、概念および仮説を書籍の章としてまとめることができた。また共同研究として行った早期病変の結果も加え、さらなる概念の発展につなげていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。近年他施設からもこのモデルによって説明可能となる結果が多く見出され、蓄積されつつある個々の知見が提唱しているモデルによって生物学的な意味をもって統合できる可能性を示している。本研究では、これまでの我々の解析で明らかにしてきたがん化機序とそのモデルとの関係を検証するとともに、4つのテーマ(#1.mutation loads/burden, #2. Unique translocations, #3. Cis-type amplification, #4. Stepwise progression model)に沿って検討を遂行することを企てている。初年度である平成28年度の進捗としては、課題#1について、次世代シークエンサーでの網羅的遺伝子変異検索をスタートし、mutation burdenの基礎となる遺伝子変異情報を蓄積した。課題#2については、ドライバー変異がない症例の抽出を完了し、RNA-seqを行うための症例抽出をほぼ終えるに至った。課題#3. Cis-type amplificationの検討は28年度は進めることができなかったが、課題#4についての基本構想については、著作の1つの章としてその基本となる概念および仮説をまとめることができた。課題#4については、その仮説についてのreview articleの構想について海外研究者と協議している。これら課題#1-4の検討を通して、統合的にがん化機序と提唱モデルの検証するととともに、さらに発展させていきたい。4つのテーマ(1.mutation loads/burden, 2. Unique translocations, 3. Cis-type amplification, 4. Stepwise progression model)に沿って検討を遂行する計画であるが、課題#1について、次世代シークエンサーでの網羅的遺伝子変異検索をスタートし、mutation burdenの基礎となる遺伝子変異情報を蓄積した。課題#3. Cis-type amplificationの検討は28年度は進めることができなかったが、課題#4についての基本構想については、書籍の章としてその基本となる概念および仮説をまとめることができた。課題#3を除いてはおおむね順調に進展していると考えている。近年他施設からもこのモデルによって説明可能となる結果が多く報告され、蓄積されつつある細々とした知見がこのモデルによって生物学的な意味をもって統合できる可能性を示している。これまでの進捗としては、課題#1について、次世代シークエンサーでの網羅的遺伝子変異検索をスタートし、mutation burdenの基礎となる遺伝子変異情報を蓄積しつつある。また、対応する免疫チェックポイント阻害剤に対する薬剤応答性を含む臨床情報との関連付けを進めつつある。課題#2については、ドライバー変異がない症例の抽出を完了したことから、Oncomine comprehensive cancer panelでの解析を始め、複数例の解析を終了している。さらに解析を進め、新規知見を見出していきたい。課題#3. Cis-type amplificationの検討においては、シークエンスリードにおけるSPNsを利用して遺伝子増幅におけるtypeを決定できることをパイロットスタディーで検証することができた。この方法を用いて増幅様式を調べ、遺伝子増幅のメカニズムを明らかにしていきたい。課題#4についての基本構想については、書籍の章としてその基本となる概念および仮説をまとめることができ、発表することができた。さらに、これまで蓄積されている知見について打ち立てたモデルに当てはめて再検討を行い、このモデルの構想を更に発展していきたい。4つのテーマ

(1.mutation loads/burden, 2. Unique translocations, 3. Cis-type amplification, 4. Stepwise progression model)に沿って検討を遂行する計画であるが、課題#1について、次世代シークエンサーでの網羅的遺伝子変異検索をスタートし、mutation burdenの基礎となる遺伝子変異情報を蓄積した。また、対応する免疫チェックポイント阻害剤に対する薬剤応答性を含む臨床情報との関連付けを進めつつある。課題#2については、ドライバー変異がない症例の抽出を完了し、Oncomine comprehensive cancer panelでの解析を始め、複数例の解析を終了している。抽出症例について引き続いて解析を進めていきたい。課題#3. Cis-type amplificationの検討においては、シークエンスリードにおけるSPNsを利用して遺伝子増幅におけるtypeを決定できることをパイロットスタディーで検証することができた。課題#4についての基本構想については、書籍の章としてその基本となる概念および仮説をまとめることができ、発表することができた(Tsao MS, Kerr MK, Dacic S, Yatabe Y, Hirsch F. IASLC Atlas of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer North Fort Myers, FL: Editorial Rx Press; 2017)。課題#3では若干遅れているが、おおむね順調に進展していると考えている。これまでわれわれは肺癌の発生機序について、発生母地の生物学的違いに基づくtwo compartment modelを提唱してきた。近年他施設からもこのモデルによって説明可能となる結果が多く報告され、このモデルによって生物学的な意味をもって統合できる可能性を示している。
ガレクチン-9による関節リウマチ滑膜細胞死誘導制御と関節炎モデルを用いた治療応用

ガレクチンファミリー分子は,免疫炎症応答性制御に深く関与していると予想される新たな動物レクチンとして注目を集めている.我々は,ガレクチン(Gal)-9の全身性自己免疫疾患とくに関節リウマチ(RA)への関与を調べるために,RA滑膜組織中の各ガレクチン分子の発現と培養RA滑膜細胞へのGal-9の生物学的作用を検討した.また独自に作製した安定化ガレクチン(Gal)-9改変体(sGal-9)投与によるRA関節炎モデルに対する影響について検討した.具体的には,RA滑膜組織,変形性関節症(OA)滑膜組織中のGal-1,3,8,9のmRNA発現,局在分布について検討を行った.各種ガレクチン刺激によるRA滑膜細胞増殖,アポトーシス誘導への影響を調べた.さらにDBA/1Jマウス,DA/Slcラットを用いII型コラーゲン誘導関節炎(CIA)モデルを作製した.sGal-9を腹腔内または静脈内に投与し,関節炎に対する修飾効果を関節炎スコアのモニター,組織学的およびX線学的に検討した.その結果,Gal-1,3,8とは異なりGal-9はmRNA発現を伴ってRA滑膜細胞,リンパ濾胞,濾胞内血管内皮細胞に局在を認めた.OA滑膜組織のGal-9陽性細胞は極少数であった.sGal-9は培養RA滑膜細胞増殖反応を抑制とともにアポトーシスを誘導した.CIA関節炎モデルのsGal-9投与群で関節炎スコアの有意な減少とX線学的関節破壊所見の軽減を認めた.同滑膜病変組織中ではアポトーシス陽性細胞集簇を認めた.以上の結果より,sGal-9によるRA滑膜細胞アポトーシス誘導,RAモデル関節炎重症度の減弱効果が確認された.Gal-9はRA滑膜増殖反応の負の制御因子として作用していると考えられ,sGal-9を用いた新規の抗リウマチ療法開発の可能性が示唆された.以上の実験データに関して現在,論文発表を準備中である.ガレクチンファミリー分子は,免疫炎症応答性制御に深く関与していると予想される新たな動物レクチンとして注目を集めている.我々は,ガレクチン(Gal)-9の全身性自己免疫疾患とくに関節リウマチ(RA)への関与を調べるために,RA滑膜組織中の各ガレクチン分子の発現と培養RA滑膜細胞へのGal-9の生物学的作用を検討した.また独自に作製した安定化ガレクチン(Gal)-9改変体(sGal-9)投与によるRA関節炎モデルに対する影響について検討した.具体的には,RA滑膜組織,変形性関節症(OA)滑膜組織中のGal-1,3,8,9のmRNA発現,局在分布について検討を行った.各種ガレクチン刺激によるRA滑膜細胞増殖,アポトーシス誘導への影響を調べた.さらにDBA/1Jマウス,DA/Slcラットを用いII型コラーゲン誘導関節炎(CIA)モデルを作製した.sGal-9を腹腔内または静脈内に投与し,関節炎に対する修飾効果を関節炎スコアのモニター,組織学的およびX線学的に検討した.その結果,Gal-1,3,8とは異なりGal-9はmRNA発現を伴ってRA滑膜細胞,リンパ濾胞,濾胞内血管内皮細胞に局在を認めた.OA滑膜組織のGal-9陽性細胞は極少数であった.sGal-9は培養RA滑膜細胞増殖反応を抑制とともにアポトーシスを誘導した.CIA関節炎モデルのsGal-9投与群で関節炎スコアの有意な減少とX線学的関節破壊所見の軽減を認めた.同滑膜病変組織中ではアポトーシス陽性細胞集簇を認めた.以上の結果より,sGal-9によるRA滑膜細胞アポトーシス誘導,RAモデル関節炎重症度の減弱効果が確認された.Gal-9はRA滑膜増殖反応の負の制御因子として作用していると考えられ,sGal-9を用いた新規の抗リウマチ療法開発の可能性が示唆された.以上の実験データに関して現在,論文発表を準備中である.
ゲノミクス技術を用いた造血幹細胞の腫瘍化機構解析

1)白血病類縁疾患には急性骨髄性白血病(AML)、骨髄異形成症候群(MDS)、慢性骨髄性白血病(CML)など様々な疾患群が存在する。これらの中で診断に有用な遺伝子マーカーが存在する例は極めて稀であり、DNAチップを用いた診断マーカーの同定が待たれる。我々は多くの白血病が造血幹細胞あるいはそのごく近傍の細胞から発症することに着目し、各種白血病患者骨髄より造血幹細胞分画のみを純化し保存する「Blast Bank」を設置した。平成13年3月現在で既に220例を越える様々な白血病芽球の保存に成功した。2)本バンク細胞を用いてDNAチップ解析をすることで、骨髄中の白血病芽球の割合やそれぞれの疾患における芽球の分化傾向の違いなどに影響されない、効率の良いDNAチップ解析が可能となると期待された。そこでまず以下の例をテストケースとして新たな分子マーカーの同定を試みた。MDSは病期の進行に伴って急性白血病様の病態へと変化する。白血化したMDSはde novo AMLと比べて薬剤抵抗性であり、生命予後も極めて悪い。しかし現段階で両疾患を区別する基準は細胞の形態異常の有無のみであり、鑑別はしばしば困難である。そこで我々は膜蛋白をスポットしたカスタムDNAチップを用いてMDS芽球に固有な発現を示す遺伝子の同定を試みた。その結果Delta/Notchファミリーに属するDlkがMDSにおいてのみ高発現することが明らかになった。しかもこの選択的発現はMDS22例、AML31例を用いた定量的real-time PCRによっても確認された。
消化管における神経伝達物質、VIP及び5-HT受容体の分子生理学的研究

神経伝達物質であるVIPおよび5-HTは、消化管の機能(イオン輸送や平滑筋活動)調節に深く関与している。しかしながら、VIPおよび5-HTが機能発現するために必須の受容体の分子基盤については、殆ど明らかではない。本研究では消化管の機能(イオン輸送や平滑筋活動)にとって重要なVIPおよび5-HTの生理作用発現の分子基盤となる受容体の分布と生理作用について検討を加えた。まず、5-HT type3の受容体研究にとって必要な構造および機能ドメインに対する部分抗体を作成した。作成した抗体は、受容体の局在を明らかにするための免疫組織化学に十分耐えうるものであった。しかしながら、最近の詳細な研究により抗体を作成するために作成した部分ペプチドの配列中にソマトスタチンの前駆体構造の部分配列と同等のものが見つかり、共同研究を行っているフランスおよびオーストラリアでの研究から、この抗体はソマトスタチンをも認識していることが明らかとなった。従って、正確な受容体の局在を決定するための抗体を新たに作成しなければならないこととなった。また、VIP受容体の名称が研究実施中に国際薬理学会により名称変更されたため、この抗体についてもさらに新しい抗体を作成する必要に迫られることになった。しかしながら、生理学実験においてはラットやモルモットの消化管で5-HT含有神経が炎症等により選択的に機能障害を受けること、5-HT3あるいは5-HT4が消化管運動調節に深く関与していることを明らかにした。VIPや5-HT受容体に対する我々の研究成果を基に、エルゼビアー社から刊行される書物に2つの総説を書くことができた。神経伝達物質であるVIP及び5-HTは、消化管の機能(イオン輸送や平滑筋活動)調節に深く関与している。しかしながら、VIP及び5-HTが機能発現するために必須の受容体の分子基盤については、殆ど明らかではない。本研究では消化管の機能(イオン輸送や平滑筋活動)にとって重要なVlP及び5-HTの生理作用発現の分子基盤となる受容体の細胞レベルでのsoring mechanismや合成・成熟過程を従来の生理学的手法と組み合わせて行うことにより、分子生理学的ならびに構造生物学的に明らかにする事を目的とした。そこで、本年度は5-HT type3受容体の研究に必要な構造及び機能ドメインに対する部分抗体を作成し、それらの抗体に対する有用性を検討した。その結果、作成した抗体のうち1種類について、それが研究遂行に十分耐えうる物であることを確認し、次年度はその抗体を使用し、生理学研究を行う予定にしている。本研究では消化管の機能(イオン輸送や平滑筋活動)にとって重要なVIP及び5-HTの生理作用発現の分子基盤となる受容体の分布とその生理作用について検討を加えた。まず、VPACl及び5-HT type3受容体の研究に必要な構造及び機能ドメインに対する部分抗体を作成し、それらの抗体に対する有用性を検討しさらに生理学実験を行った。まず、1)抗体作成のための抗原としてのペプチドの選択を行い、以下に示す6種類のペプチドフラグメントを合成し、合成したペプチドフラグメント用いてウサギに免疫を行った。5-HT type3受容体のN-端及びC-端部に存在する機能及び構造ドメインに対する部分抗体も、上述した方法で作成を行った。次に、作成した抗体の特異性及び有効範囲のの検討を、以下の4種類の方法により検討した。1)免疫蛍光抗体法3)免疫沈降法による測定限界の検討4)機能的方法による抗体の有用性についての検討さらに、これら受容体が、消化管運動にどのような影響を与えるか検討した。その結果、VPACl受容体及び5-HT3受容体が粘膜下神経叢及び筋間神経叢に存在することを免疫組織学により証明した。

また、VPACl受容体及び5-HT3受容体は、消化運動を、それぞれ抑制と亢進させることを明らかにした。以上の結果を、現在論文に取りまとめ中である。
サイクリン依存性キナーゼインヒビター遺伝子導入滑膜細胞のシグナル伝達機構の解析

慢性関節リウマチでは滑膜細胞の増殖とこれに伴う骨・軟骨の破壊が特徴的である。我々はすでにサイクリン依存性キナーゼインヒビター(CDKI)であるp16INK4aの遺伝子導入により、ラットアジュバント関節炎、マウスコラーゲン関節炎の発症を抑制できることを明らかにしてきた。今回は、慢性関節リウマチ患者から分離培養した滑膜細胞にヒトp16INK4aを含む組み換えアデノウイルスAxCAp16あるいは挿入遺伝子を持たないAx1W1を50MOIで導入し、3日後にpoly-A RNAからcDNAプローブを作製し、Atlas human expression Library(Clontech)にハイブリダイズさせることにより遺伝子発現の変化を検討した。なお、対象とした遺伝子は細胞周期や免疫に関係する2352の遺伝子である。以上より、p16INK4a遺伝子の導入により、細胞内シグナル関連遺伝子の発現の増強と減弱、接着分子及びサイトカイン関連遺伝子発現の減少など種々の変化がみられ、遺伝子治療の効果と関連することが推測された。
癒着胎盤に関連するmRNA/microRNAの同定と臨床応用に関する研究

平成30年度は前置胎盤15例の検体を集積した。妊娠20週頃より経時的に母体血の採血を行い、胎盤特異的microRNA(mir518bなど)を分子マーカーとして癒着胎盤のリスク推定を試みた。平成29年度の前置胎盤10症例についてはいずれも臨床的に癒着胎盤ではなかったため、癒着胎盤のリスク評価は不可能であったことから、癒着胎盤が疑われる症例は積極的に当科のへ紹介を依頼することで症例数は増加したが、15症例のうち病理組織学的に癒着胎盤であった症例は1例もなく、癒着胎盤のリスク評価を行うことはできなかった。また、帝王切開術中超音波検査は、すべての症例で施行できた。全例において子宮筋層と胎盤の間に存在する低エコー域(sonolucent area)が明瞭に描出された。Sonolucent areaは組織学的には脱落膜に相当すると考えられており、これを確認できた場合には胎盤と筋層に間に脱落膜が介在する、すなわち癒着胎盤ではないと判断できる。この所見が平成30年度のすべての症例において認められたことから癒着胎盤ではないと判断され、通常通り胎盤の剥離が試みられた。結果胎盤は全例で容易に剥離でき、胎盤剥離後の多量出血も認めなかった。娩出した胎盤は病理組織検査に提出したが、癒着胎盤を疑わせる所見は認めなかった。この結果から、術中超音波検査は癒着胎盤の診断に有用であることがあらためて確認された。平成27年度の研究計画のとおり、以下の成果を得ることができた。1.検体集積:同意を得て、前置胎盤は7例(うち癒着胎盤で子宮を摘出した症例は1例)の母体血漿を集積保存した。2.胎盤特異的microRNAの同定と前置胎盤との関連:chromosome19 microRNA cluster region (C19MC)に存在するmicroRNAが胎盤特異的であることを確認した。3. TaqManプローブの作成および条件設定:C19MC領域の胎盤特異的microRNAとして、母体血漿中mir-517aおよびmir-518b流入量のreal-time RT-PCRによる絶対定量法を確立した。4.胎盤特異的microRNAと前置胎盤との関連:前置胎盤20例(前置胎盤群)および正常妊娠26例(コントロール群)を対象とした。母体血漿は陣痛発来前の妊娠32週に採取した。両群間における母体血漿中胎盤特異的microRNA流入量を比較検討した。前置胎盤群における母体血漿中mir-517a流入量はコントロール群におけるそれと比較し、有意に高値であった(p=0.011, Mann-Whitney U test)。一方、前置胎盤群における母体血漿中mir-518b流入量はコントロール群におけるそれと比較して、有意に低値であった(p=0.004, Mann-Whitney U test)。以上より、C19MC領域のmicroRNAが胎盤特異的であることが確認された。そして、妊娠32週における母体血漿中C19MC領域のmicroRNA(mir-517aおよびmir-518b)流入量は前置胎盤の分子病態を推定するマーカーである可能性が示唆された。平成27年度の当初の研究計画の通り、C19MC領域のmicroRNAが胎盤特異的に発現することを確認し、それらの母体血漿中における定量法を確立することができた。そして、母体血漿中に流入する胎盤特異的microRNAと前置胎盤との関連について検討し、分子病態を推定するマーカーになりうる可能性が示唆された。平成28年度は前置胎盤10例の検体を集積した。妊娠20週頃より経時的に母体血の採血を行い、胎盤特異的microRNA(mir518bなど)を分子マーカーとして癒着胎盤のリスク推定を試みたが、平成28年度の前置胎盤10症例についてはいずれも臨床的に癒着胎盤ではなかったため、癒着胎盤のリスク評価は不可能であった。癒着胎盤は当科のような高次医療施設でも稀な疾患であり、平成28年度までの同様の方法で検体の集積を行った場合研究に必要な十分な検体数が集まらない恐れがある。今後は癒着胎盤が疑われる症例は積極的に当科への紹介を依頼することで十分な検体数の確保をはかる予定である。同部位は組織学的には脱落膜に相当すると考えられており、これを確認できた場合には胎盤と筋層に間に脱落膜が介在する、すなわち癒着胎盤ではないと判断できる。この所見が平成28年度のすべての症例において認められたことから癒着胎盤ではないと判断され、通常通り胎盤の剥離が試みられた。この結果から、術中超音波検査は癒着胎盤の診断に有用であることが確認できた。

平成28年度も引き続き前置胎盤の検体集積を行い、前方視的に癒着胎盤のリスク推定に胎盤特異的micro RNAが有用が検討したが、癒着胎盤症例が認められなかったため、その有用性を評価することが不可能であった。一方、術中超音波による癒着胎盤のリスク評価は有用であることが確認できたので、目的の半分は達成された。平成29年度は前置胎盤15例の検体を集積した。妊娠20週頃より経時的に母体血の採血を行い、胎盤特異的microRNA(mir518bなど)を分子マーカーとして癒着胎盤のリスク推定を試みたが、平成29年度の前置胎盤15症例についてはいずれも臨床的に癒着胎盤などではなかったため、癒着胎盤のリスク評価は不可能であった。癒着胎盤は当科のような高次医療施設でも稀な疾患であり、研究に必要な十分な検体数が集まらない恐れがあるため、今年度からは癒着胎盤の可能性がある症例については大学病院への積極的な紹介を依頼し、前置胎盤の症例数としては増加したが、それでも必要な検体を採取することはできなかった。平成30年度より研究代表者が長崎県北部の周産期基幹病院に移動したことから、今後は長崎県全体からの症例が集積できる予定である。また、帝王切開術中の超音波検査の有用性については、平成28年度までの研究で癒着胎盤の診断での有用性が確認されていた。平成29年度のすべての症例においても術中超音波検査は施行できており、全例において子宮筋層と胎盤の間に存在する底エコー域(sonolucent area)が明瞭に描出でき、超音波所見から癒着胎盤の可能性は低いと判断し胎盤剥離を試み、子宮摘出を要するような多量出血をきたした症例はなかった。娩出した胎盤は病理組織検査に提出したが、癒着胎盤を疑わせる所見は認めなかった。この結果から、術中超音波検査が癒着胎盤のリスク評価に有用であることが改めて確認できた。平成29年度も引き続き前置胎盤の検体集積を行い、前方視的に癒着胎盤のリスク推定に胎盤特異的micro RNAが有用か検討したが、癒着胎盤症例が認められなかったため、その有用性を評価することが不可能であった。一方、術中超音波検査による癒着胎盤のリスク評価は有用であることが確認でき、目的の半分は達成された。平成30年度は前置胎盤15例の検体を集積した。妊娠20週頃より経時的に母体血の採血を行い、胎盤特異的microRNA(mir518bなど)を分子マーカーとして癒着胎盤のリスク推定を試みた。平成29年度の前置胎盤10症例についてはいずれも臨床的に癒着胎盤ではなかったため、癒着胎盤のリスク評価は不可能であったことから、癒着胎盤が疑われる症例は積極的に当科のへ紹介を依頼することで症例数は増加したが、15症例のうち病理組織学的に癒着胎盤であった症例は1例もなく、癒着胎盤のリスク評価を行うことはできなかった。また、帝王切開術中超音波検査は、すべての症例で施行できた。全例において子宮筋層と胎盤の間に存在する低エコー域(sonolucent area)が明瞭に描出された。Sonolucent areaは組織学的には脱落膜に相当すると考えられており、これを確認できた場合には胎盤と筋層に間に脱落膜が介在する、すなわち癒着胎盤ではないと判断できる。この所見が平成30年度のすべての症例において認められたことから癒着胎盤ではないと判断され、通常通り胎盤の剥離が試みられた。結果胎盤は全例で容易に剥離でき、胎盤剥離後の多量出血も認めなかった。この結果から、術中超音波検査は癒着胎盤の診断に有用であることがあらためて確認された。平成28年度は以下の研究を推進する。胎盤特異的cell-free mRNA/miRNAの臨床的意義を評価する。