hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌細胞におけるEMTマーカーとしてのZyxinの発現および機能について

Zyxin低発現である細胞株にZyxinの遺伝子を連続的に導入したベクターをコンストラクションし,プラスミドによって遺伝子導入を行い,得られた細胞を使用して,Zyxinの発現量,細胞機能および形態的解析についてコントロールと比較検討した結果,細胞の形態に変化は認められず,増殖能,運動能および浸潤能は,Zyxin導入細胞は非導入細胞と比較すると抑制されることが確認された.以上のことから,研究の目的である口腔ヒト扁平上皮癌細胞におけるZyxinの発現および機能との関連性についての検討はおおむね順調に進展していると考えられる.上記の実験結果から,口腔ヒト扁平上皮癌細胞において,Zyxinの発現量と細胞の増殖能,運動能および浸潤能との間には相関関係が確認された.一方で,Zyxinの高発現が認められた細胞株に対して,siRNAによるZyxinのノックアウトを行い,si-Zyxinをコントロールと比較した結果と,Zyxin低発現である細胞株にZyxinの遺伝子を連続的に導入したベクターをコンストラクションしプラスミドによって遺伝子導入を行うことにより得られた細胞を使用して,コントロールと比較検討した結果では,Zyxinの発現量と細胞の機能の相関関係が正反対の結果となり,細胞によってZyxinの機能が異なることが示唆された.これらのメカニズムについては明らかな結果を得ていないことから,Rho familyの関与も含めてメカニズムの検討を行うことが今後の課題である.当講座においては,細胞培養,分子生物学的および免疫組織学的研究に必要な基本機器は当研究室に整っており,また,遺伝子解析などに必要な指導技術や機器類については,本学遺伝学講座および先端医学研究所と適宜,共同研究が可能である.そのため,前年度と同様に,実験に用いる試薬類の購入などを中心に研究費を使用する予定である.また,研究の多様化による人手不足を補うために,定期的にに研究補助を雇い,謝礼を支払う予定である.さらには,研究における知識の習得および研究成果の発表を目的として,国内外の学会出席,発表を行い,論文として投稿する予定である.
高速波長掃引面発光レーザを搭載した口腔内OCTスキャナの開発

デジタルデンティストリーの更なる発展には、測定精度の向上、歯肉縁下マージン部の記録を可能とする口腔内スキャナのブレークスルーが必要である。本研究では、MEMS(micro electro mechanical systems)アクチュエータを集積した高速波長スキャンを可能とする波長掃引面発光レーザを光源とし、高速スキャン用MEMSビームスキャナを口腔内プローブに搭載した波長掃引型光干渉断層法(Swept source Optical Coherence Tomography: SS-OCT)口腔内スキャナを開発・社会実装することを目的とする。そこで本研究では、臨床応用上必要とされる生物学的、歯科補綴学的、光工学的要件を医工連携研究から探求、試作スキャナの開発を段階的に進めるとともに、生物学的安全性、有効性の検証を行い、社会実装へのトランスレーショナル研究、産学連携での機器開発へ繋ぐ非臨床POC(Proof of Concept)を研究期間内に獲得できるように研究を遂行する。当該年度の研究実績として、現有の波長掃引面発光レーザをOCT光源として用い、新鮮ブタ顎骨の歯・歯肉縁部を被験体として、掃引電圧、掃引速度、波長掃引幅等の光工学的パラメータ、歯肉の厚み・浸出液等の生物学的パラメータおよび得られる信号強度・分解能等の関連をサーベイした。この結果から口腔内スキャナとして求められる光工学的要件を検討した。さらに、波長掃引面発光レーザの出力ファイバとMEMSによる高速スキャンセンサを搭載した実験用プローブの設計・試作を行った。年初の研究計画の通りに、研究が進展していることから、(2)おおむね順調に進展していると判断した。今後の研究の推進方策として、2019年度には当初研究計画の通り、下記項目について実施する予定である。1.実験用プローブによるex Vivoでの実験、光工学的実験を継続し、性能向上に資する。2.上記をフィードバックし、改良型プローブならびにスキャナ本体を試作する。3.試作機を用い、ブタ顎骨でのex Vivo実験において性能評価を行う。この際、試験的支台歯形成を行い、シリコーン印象材による精密印象、既存の口腔内スキャナと比較検討を行う。これらデータは、光工学的設計にフィードバックするとともに、本装置の有効性の指標とする。4.ラットを用いたin Vivo生体安全性評価(歯肉の炎症所見等)を行う。
電子分光電子顕微鏡法によるSi中の酸素析出物の微細構造評価

目的:半導体デバイスプロセスの不純物ゲッタリング効果改善のための手がかりをつかむために、(1)不純物ゲッタリングシンクとしてSiウエハー中に導入された板状酸素析出物(SiO2)周辺の格子歪み分布を詳細に調べる。(2)Siウエハー裏面にCVD法でPoly-Siを被着させた場合の界面近傍のSi格子の歪み分布と比較検討を行う。結果:(1)酸素析出物の板面に垂直な方向(母相Siの[010]方向)には圧縮歪みが、板面と平行な方向(母相の[100]方向)には引っ張り歪みが存在することがわかった。(2)HOLZ線の分裂間隔および回折ディスクに現れる消衰縞の形状変化から、析出物とSi母相界面近傍でのSi格子の湾曲を定量的に評価することができた(板面から0.5μm離れた地点で2030mrad)。(3)ウエハー裏面に被着させたポリSiとの界面近傍の格子歪みと比べると、析出物周辺の方が歪み量は約1桁大きい。これにより、ウエハー裏面に被着させたポリSiとの界面よりも酸素析出物界面の方が不純物ゲッタリング効果が高いことを説明できた。これは半導体デバイスプロセスにおける不純物ゲッタリング効果改善のための重要な手がかりを与えてくれる。(4)新型のナノプローブ電子分光型電子顕微鏡を使用すると、従来の分析電顕に比べて回折の空間分解能(プローブ径:12nm)は1桁改善され、試料は1.5倍厚いもの(Siでは約450nm)が使用できることを証明した。
スケールアップモデルで探る細菌のメカニカルデザイン

細菌のサイズとかたちはいかにして決まるのか。その鍵を握るのは、細胞壁と膨圧の力学バランスである。この力学均衡は、細菌の形態だけでなく、成長、分裂、輸送、調整といった中心的な生物学的プロセスにも深く関与する。さらに、細菌の細胞骨格はこれらの過程を化学的に維持・調整する力学的足場の役割を果たす。では、弾性シェル(=細胞壁)、弾性リボン(=細胞骨格)、圧力(=膨圧)が協調すると、一体どのような構造力学が実現するのか?本研究計画では、この問題をマクロ模型による精密計測実験と有限要素法による数値実験を組み合わせて調べる。研究計画の初年度にあたる今年度は「微小変形に対する力学応答:実効的な剛性率と幾何学的な効果の検証」をおもな研究計画として掲げていた。それにあわせて、円筒形弾性シェルの線形特性を、理論、数値シミュレーション、計測実験を組みあわせて詳細に調べた。具体的には、我々は円筒シェルの一端をピンチし、誘起した変形が軸に沿って減衰し、シェルが元の形状に戻るまでの長さを調べた。我々はこの特徴的長さを回復長と呼ぶ。我々はまず、浅い半円筒シェルに対して回復長の新しいスケーリング則を理論的に導出した。次に、有限要素法による数値シミュレーションと実際の模型をもちいた精度の高い測定実験を実施し、このスケーリング則を確立した。加えて、これらの実験結果から、浅いシェルに対して導いたスケーリング則が、任意の深さのシェルに対して正当であることを発見した。以上の成果を1編の論文にまとめてEPLに出版した。研究計画の初年度にあたる昨年度は「微小変形に対する力学応答:実効的な剛性率と幾何学的な効果の検証」をおもな研究計画として掲げていた。これにしたがって、昨年度は円筒形弾性シェルに内在する幾何学的な剛性について調べ、理論、有限要素シミュレーション、マクロ模型を使った実験によって説得力のある研究を達成することができた。一方で、円筒シェルに内圧をもたせ、かつこれをいかにコントロールするか、という点にテクニカルな問題を抱えているため、これについては今年度に取り組まなければならない。成果の出ている部分もあり、壁にぶつかっている部分もあるので、全体としてみるとおおむね順調という判断になる。今年度は、円筒シェルに内圧を印加し、これを制御できる実験モデルを作成することに取り組む。同時に、座屈における内圧の効果を有限要素解析によって調べ、先行研究との比較も行う。同時に、円筒シェル内部にらせん構造やその他の構造(多孔質構造)などをもつ場合に、Blazier局所座屈のようすがどのように変化するか、おもにシミュレーションをもちいて調べ、実験モデルの作成の足がかりとする。この力学現象は、茎の安定性など、植物のメカニクスにも関係が深い。当初提案したバクテリア細胞との関係性のみならず、力学現象の普遍性という観点から、より広いスケールでのバイオメカニクス現象も対象とし、本研究の主目的である「弾性シェル+骨格構造+内圧、の組み合わせから生まれる機能性の解明」という課題を推進していく。

同時に、円筒シェル内部にらせん構造やその他の構造(多孔質構造)などをもつ場合に、Blazier局所座屈のようすがどのように変化するか、おもにシミュレーションをもちいて調べ、実験モデルの作成の足がかりとする。この力学現象は、茎の安定性など、植物のメカニクスにも関係が深い。当初提案したバクテリア細胞との関係性のみならず、力学現象の普遍性という観点から、より広いスケールでのバイオメカニクス現象も対象とし、本研究の主目的である「弾性シェル+骨格構造+内圧、の組み合わせから生まれる機能性の解明」という課題を推進していく。
乾燥剤を用いた出土木製品凍結乾燥法の基礎的研究

申請者は水浸出土木製品と市販で容易に入手可能な乾燥剤(シリカゲル等)を密封し、冷凍庫に一定期間保管するのみで、出土木製品の凍結乾燥を行うという方法を着想し、本格的に出土木製品へ応用することを目指し基礎的研究をおこなった。本研究では、氷点下乾燥剤乾燥における寸法安定性と乾燥方法の検討を進めた。平成27年度は基礎的実験が中心であった。シリカゲル等を用いた場合の乾燥剤の乾燥能力(乾燥可能量)や乾燥速度の評価のため、凍結乾燥処理を実験的に行った。実験に使用した乾燥剤は、シリカゲル・脱酸素剤等を利用した。実験試料及び乾燥剤の密閉にはデシケーターやシール容器(タッパーウエア等)を用いた。実験方法は、氷点下で使用可能な上皿秤に実験試料を載せ、乾燥剤とともにデシケーター等に密閉し、橿原考古学研究所既設の大型冷凍庫で一定期間保管した。試料は寸法安定性すなわち変形度合いの評価のため予め三次元形状計測装置にて形状計測を行い、処理期間中の試料の重量変化を計測し、乾燥状態と乾燥剤乾燥量の評価を行った。木製品の劣化状態や寸法などに応じて処理期間・効果が異なる可能性があるため、複数パターンの試料を準備し、劣化度合い等の異なる木製品に対する評価を行った。基礎情報収集のための実験は計画通り進んでいる。情報収集方法は実験を繰り返しながら改良し、データが集まりつつある。乾燥処理前後の試料組織観察および内部構造調査については、技術的な検討を加えている状況である。本研究では、特別な機材や薬剤を必要とすることなく、簡易で安価な水浸出土木製品の「乾燥法による」保存処理方法として、乾燥剤を用いた出土木製品の凍結乾燥(以下、乾燥剤凍結乾燥法と称す)の有用性に関して研究を進めている。平成28年度は、氷点下において乾燥剤と共に密閉保管した水浸出土木製品およびその環境変化を調べることを目的として、氷点下に乾燥剤と共に密閉保管した水浸出土木製品の寸法および重量と密閉容器内圧力の変化について検討をおこなった。供試試料は、針葉樹(スギ)と広葉樹(アカガシ亜属)の出土木材である。乾燥実験は針葉樹から実験片1点、広葉樹から実験片2点を作製し、実験前の三次元形状計測と飽和重量測定をおこなった。その後、3点の試料を上皿天秤に載せ、1,000gのa型シリカゲルと共にガラスデシケーターに密閉し、-30°に設定した業務用冷凍庫に納めた。デシケーターコックを装着し、そこからシリコンチューブ経由しマノメーターを装着した。不定期に重量の変化を記録し、ある程度の期間を経た時点でデシケーター内の真空度を測定した。重量減少は開始直後は緩やかで、7日経過後から急激に進み、16日目から再び緩やかになった。以降緩やかに減少する傾向を示した。16日目以降46日目前後まで徐々に庫内温度が低下すると共に、試料の重量減少は緩やかに進行した。46日目以降は庫内温度がほぼ一定になると共に試料の重量減少がさらに緩やかになった。以降はほぼ一定の割合で減少が続いた。重量減少に伴う密閉用器内の圧力変化を調査するため、27日経過した時点で圧力測定をおこなった。その結果、外気圧と141Pa(1.0575Torr)の差圧を確認した。僅かな減圧状態にあった。水浸出土木材の乾燥に要する期間は木製品の樹種や寸法、含水率に応じて異なると考えられる。引きつづき、木製品の樹種や寸法、劣化状態に伴う乾燥の特性把握を進める。基本的な実験は順調に進んでいる。情報収集のため実験を繰り返しおこなっており、データが蓄積されている。本研究では、特別な機材や薬剤を必要とすることなく、簡易な水浸出土木製品の「乾燥法による」保存処理方法として、乾燥剤を用いた出土木製品の凍結乾燥(以下、乾燥剤凍結乾燥法と称す)の有用性に関して研究を進めている。平成29年度までに、氷点下において乾燥剤と共に密閉保管した水浸出土木製品およびその環境変化を調べることを目的として、氷点下に乾燥剤と共に密閉保管した水浸出土木製品の寸法および重量と密閉容器内圧力の変化について検討をおこなってきた。平成29年度には、乾燥方法の検討と形状による乾燥効果について検討を加えた。乾燥方法は、資料と乾燥剤がほぼ接触する方法(接触法)と完全に接触しない方法(非接触法)の二通りを検討した。形状による乾燥効果は丸太状と板状の試料を準備して実験を行った。乾燥実験の前後には形状変化を視覚化するため三次元計測を行うとともに、非破壊的に内部状況を観察するためX線透過撮影を行った。乾燥剤には青色シリカゲル使用し、氷点下の乾燥は、設定温度-20°Cの家庭用冷凍庫もしくはー30°Cの業務用冷凍庫を用いた。実験の結果、乾燥方法については、接触法は乾燥が早く進むものの試料の外観や内部の形状変化が見られた。一方、非接触法は乾燥までに接触法の3倍近くの時間を要したが、比較的安定的な形状を示した。形状が乾燥に与える影響は、板状の試料は丸太状の試料よりも顕著に形状変化を生じた。板状試料の場合、全体の乾燥が均質に進むよう配慮する等配慮すべき点があることが把握できてきた。

本研究から、シリカゲル等乾燥剤と密閉容器、冷凍庫が準備できれば、形状の著しい変化を抑制しながら水浸出土木材の乾燥処理が実施できる可能性が高いことを見いだすことができた。申請者は水浸出土木製品と市販で容易に入手可能な乾燥剤(シリカゲル等)を密封し、冷凍庫に一定期間保管するのみで、出土木製品の凍結乾燥を行うという方法を着想し、本格的に出土木製品へ応用することを目指し基礎的研究をおこなった。本研究では、氷点下乾燥剤乾燥における寸法安定性と乾燥方法の検討を進めた。基礎情報収集のための実験を引き続きおこない、十分なデータを取得する。それらを基に、乾燥方法の改良点を検討し、さらに寸法安定性が確保される乾燥法について研究を進める。得られたデータを基に乾燥のための的確な方法を検討する。外形のみならず木材中の組織の変化の有無についても具体的な把握を進めたい。文化財保存科学当初購入予定であった一部の実験資材が、事件過程見直しにより、直ちには必要ではなくなったための購入を見送った。また、外部の研究協力者との打合せ等が、メール等でおこなうに足りる状況であったため、当初予定の旅行が実施されなかった。以上の理由により、次年度使用残額が生じた。基礎実験の見直しにより実験資材が変更されたため、一部費用が変更となった。当初見込んでいた外部研究者との打合せもメールなどによる情報交換によって研究遂行が可能であったため、当初計画の旅行が実施されなかった。以上の理由から、次年度残額が生じた。実験計画を修正しながら進めており、その過程で必要となった資材を順次準備する。また、実験をより一層前進させるため、さらに研究協力者1名の協力を得る計画である。今年度以降は、実試料を手に取りながら研究協力者との検討が必要となるため、各地との往来のための旅費が必要となる。基礎実験を繰り返しおこなっており、必要となる資材を順次調達する。研究協力者らと実資料を確認しながら打合せを密に行うため、各地との往来のため旅費を利用する。
自動埋設実現のための地中熱ヒートポンプ熱交換器の埋設深度と土壌との密着性の解析

地中熱ヒートポンプの熱交換器と土壌との密着性が採・放熱効率に与える影響について、実用上どの程度までの密着性が必要かについてはほとんど議論されてこなかった。また、熱交換器をどこまで浅く設置しても十分な熱がとれるかについて、科学的な知見が少ない。そこで本研究では、圃場試験と数値シミュレーションにより、1地中熱ヒートポンプの熱交換器と土壌との密着性と熱交換効率の関係を定量的に評価し、2どの程度までの浅さまで熱交換器を埋設しても温室を冷暖房する上で十分な熱が得られるかを明らかにする。これにより、温室の冷暖房に適した水平型熱交換器の設置条件を明らかにする。
大腸菌耐熱性下痢原因毒素IIの受容体およびメディエーターに関する研究

毒素原性大腸菌が産生する耐熱性エンテロトキシンII(STII)の簡便なアッセイ法を、マウスの腸管ループを用いて確立した。このアッセイ法を駆使し、STIIの精製に成功した。確立したマウスの腸管ループ法を用いてSTIIの下痢発現機構について検討した。また、最近、外国渡航者の下痢原因菌として注目されているAeromonas sobriaが産生する溶血毒素を精製し、その性状についても検討した。主たる成果は以下の通りである。1.STIIはマウス腸管上皮細胞のプロスタグランジンE_2(PGE_2)の産生を促進し、STIIの下痢は、PG合成阻害剤であるインドメタシン(IM)処理で阻害された。さらに、STIIはマスス腸管上皮細胞のカルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)を活性化し、STIIの下痢は、CaMKIIの特異的阻害剤であるKN-93処理で阻害された。これらの結果から、STIIの下痢発現にPGE_2およびCaMKIIが重要であることを明らかにした。2.A.sobriaが産生する溶血毒素の精製に成功した。この溶血毒素は、溶血活性の他に、下痢活性をも有する特異な毒素である事を明らかにした。溶血毒素はマウス腸管上皮細胞のPGE_2の産生を促進し、溶血毒素の下痢はIM処理で阻害されることから、溶血毒素の下痢発現にPGE_2が重要であることを明らかにした。3.A.sobriaの溶血毒素はT84細胞に対し、サイクリックAMP(cAMP)産生を促進し、しかも、細胞外cAMP濃度を上昇させた。今後、cAMPと下痢との関係を検討する。4.A.sobrianの溶血毒素は、腸管由来細胞であるIntestine407の細胞膜に存在する分子量約66kDaのGPI-アンカータンパク質に結合することを明らかにした。大腸菌耐熱性下痢原因毒素II(STII)の下痢発現機構を解明するため種々検討し、下記の事が明らかとなった。1. STIIはマウス腸管上皮細胞のリン脂質代謝を亢進し、プロスタグランジンE_2の産生を促進する。3. STIIの下痢は、プロスタグランジン合成阻害剤であるインドメタシン処理で阻害される。4. STIIの下痢は、CaMKIIの特異的阻害剤であるKN-93処理で阻害される。以上の結果から、STIIの下痢発現にプロスタグランジンE_2およぴCaMKIIが重要であることが判明した。最近、外国渡航者の下痢原因菌として注目されているAeromonassobriaが産生する溶血毒素の精製に成功した。この溶血毒素は、赤血球を溶血させる溶血活性の他に、下痢活性をも有する特異な毒素である。本毒素はマウス腸管上皮細胞のプロスタグランジンE_2の産生を促進すること、そして、本毒素の下痢活性はプロスタグランジン合成阻害剤であるインドメタシン処理で阻害されることが明らかとなった。STIIの下痢発現にプロスタグランジンE_2が重要であることから、溶血毒素の下痢発現機構を解明することは、STIIの下痢発現機構の解明に大きく貢献すると考える。現在、溶血毒素の下痢発現機構を詳細に検討し、STIIのそれと比較検討している。最近、外国渡航者の下痢原因菌として注目されているAeromonas sobriaが産生する溶血毒素の精製に成功した。この溶血毒素は、溶血活性の他に、下痢活性を有する特異な毒素である。

本毒素の下痢発現機構を明らかにすることは、大腸菌が産生する耐熱性下痢毒素II(STII)の下痢発現機構解明に大きく貢献すると考える。そこで、溶血毒素の性状について検討し、以下の結果を得た。1,溶血毒素は、活性のない前駆体として菌体外に分泌された後、プロテアーゼでC末側が切断され、活性化されることが明らかとなった。2,溶血毒素は、マウス腸管上皮組織に損傷を与えることなく、下痢を引き起こすことが明らかとなった。3,溶血毒素はマウス腸管上皮細胞のプロスタグランジンE_2の産生を促進すること、そして、本毒素の下痢活性はプロスタグランジン合成阻害剤であるインドメタシン処理で阻害されることが明らかとなった。4,A.sobriaの溶血毒素は、大腸ガン由来細胞であるT84細胞に対し、サイクリックAMP(cAMP)産生を促進し、しかも、細胞外cAMP濃度を上昇させた。今後、cAMPと下痢との関係を検討する。5,A.sobrian溶血毒素は、腸管細胞膜に存在する分子量が約66kDaのGPI-アンカータンパク質に結合することを明らかにした。
血管平滑筋細胞とコラーゲンによる小口径代用血管開発に関する研究

本研究の目的は、培養血管平滑筋細胞と精製コラーゲンとを混和して生体血管類似の管状構造物を作成し、小口径代用血管としての可能性を追究するものである。研究方法は実験動物としてイヌを用い、まずこの動脈または静脈から酵素法によって血管平滑筋細胞を採取し、組織培養技術を用いて細胞数をふやす。十分量の細胞数が得られたところで、ガラス試験管内において細胞浮遊液と精製コラーゲンとを混和すると、中心に固定した小口径ガラス棒の周囲に平滑筋細胞ーコラーゲン管が付着形成され血管モデルが得られる。これを実験動物の動脈ないし静脈に移植することにより小口径代用血管としての耐久性、開存性、生体適応合性を検討する予定であった。研究実績としては、血管平滑筋細胞ならびに血管内皮細胞の初代培養の確立ならびに継代培養の維持、これら血管壁構成細胞の合成素材への付着性に関するコラーゲン被覆および非被覆の影響、平滑筋細胞ーコラーゲン管の試験的作成、血管平滑筋細胞と血管内皮細胞との混合培養による内皮化の促進と組織学的所見、血管内皮細胞撒布合成素材(ハイブリッド人工血管)の移植実験による抗血栓性の検討、生体染色を用いたハイブリッド人工血管の内皮化の直接的評価などであった。本研究による血管類似管状構造物の恒常的作成には、血管平滑筋細胞の大量培養の必要性、管状構造形成に至る培養条件の検討、生体血圧に耐える強度を付加するための外周補強などの問題点がある。以上の研究成果から、今後の問題として、血管平滑筋細胞および血管内皮細胞の培養を応用したハイブリッド人工血管の開発研究、コラーゲン以外の結合蛋白質をくみこんだハイブリッド材料の開発、血管壁構成細胞の生着性のよい組織適合性に富む合成素材の開発、血管平滑筋細胞自体の抗血栓性に関する基礎的検討などの課題について多分野からの学際的研究が必要であるとの結論を得た。我々の研究目的は、血管平滑筋細胞と精製コラーゲンとを混和させて管状構造物を作成し、小口径代用血管としての可能性を追究するものである。今年度の研究実施計画の概要は、イヌの血管を無菌的に切除し、これより血管平滑筋細胞を採取して培養したのち、精製コラーゲンと混和してガラス管内において、コラーゲン管の作成をおこなうことであった。この実施計画にもとずいて、イヌの頚静脈ないし頚動脈を無菌的に切除する手技は確立した。分枝をていねいに結紮処理したのちに、血管腔内に酵素液を作用させて、まず血管内皮細胞を採取した。この内皮細胞は人工血管とくみあわせることによって、ハイブリッド人工血管を作成する実験研究に利用することができた。次いで、更に酵素液を作用させる方法、もしくは血管組織を細切して組織片から直接的に細胞を遊離させる方法によって、血管平滑筋細胞を採取した。コラーゲン管を作成するためには、大量の平滑筋細胞を必要とするため、初代培養から継代培養まで、注意深い無菌操作と組織培養技術の習得が要求された。平滑筋細胞の成長曲線を得ようとする当初の計画より、若干の遅れをみているが、今後、大量培養装置の購入などが可能となれば、研究計画実施に資するところ大であろうと考える。ガラス管内における、精製コラーゲンと平滑筋細胞の混和による、コラーゲン管の試験的作成は遂行されたが、管状構造物としての満足すべき形態は、未だ恒常的に得られない状況である。従って、実験動物への移植予備実験は、今年度は実施することができなかった。

来年度以降の展望としては、米国においてこの方面の研究に実績をあげた進藤俊哉の研究分担加入により飛躍的な発展が期待される。コラーゲン管作成のために静脈を切除したイヌの、静脈再建や動脈再建の実験を績み重ねることによって、マトリックスの組合せや細胞成分の検討、新素材の開発など新しい目標への展開が期待できる。本研究の目的は,血管平滑筋細胞と精製コラーゲンとを混和させることによって管状構造物を作成し,小口径代用血管としての可能性を追求するものである.昨年度の研究によって,実験動物(イヌ)の動脈もしくは静脈から無菌的に酵素法を用いて,血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を採取,培養する技術は確立し得た.これらの血管壁構成細胞は,本年度もひきつづき,人工血管との組み合わせによって,ハイブリッド人工血管への応用の可能性を探る基礎的実験に用いることができた.今年度の研究計画では,ガラス管内における精製コラーゲンと血管平滑筋細胞の混和によるコラーゲン管の作成を恒常的なものとして,動物血管への移植実験をすすめる予定であった.しかし,コラーゲン管作成のためには,大量の血管平滑筋細胞数が必要であるため,初代培養からの増殖に23ヶ月を要する結果となった.また,コラーゲンとの混和による管状構造物としては,未だ満足すべき形態が得られるまでに至っていない.米国におけるこの方面の研究に従事してきた進藤俊哉によれば,この原因の一つとして,培養液組成など基本的問題が考えられている.今年度の研究実績としては,以上のように,当初の計画からの後退があるものの,血管平滑筋細胞の培養維持が可能であること,コラーゲンを被覆した人工素材への植え付けが実験的に確められたこと,同時に採取される血管内皮細胞を用いてのハイブリッド人工血管の可能性が示唆されたことなど,今後の小口径代用血管開発の研究に寄与する成果が得られた.来年度は,本研究の最終年度として基礎的検討の見直しと,コラーゲン管の作成をつづけ,動物への移植実験をおこなって研究のまとめとする.本研究の目的は、血管平滑筋細胞と精製コラーゲンとを混和させることによって生体血管類似の管状構造物を作成し、小口径代用血管としての可能性を追求することである。昨年度の研究によって、実験動物(イヌ)の動脈または静脈から無菌的に酵素法を用いて血管内皮細胞および:血管平滑筋細胞を採取し、それぞれ継代培養することが可能となった。これらの細胞は、本年度の研究においても、従来にひきつづき、人工血管との組み合わせによるハイブリッド人工血管の応用への基礎的研究に用いることができた。今年度の研究計画は、ガラス管内において精製コラーゲンと培養血管平滑筋細胞とを混和してコラーゲン管の作成を恒常的におこない、動物への移植実験をすすめるものであった。しかし、コラーゲン管を作成するために必要とする大量の平滑筋細胞の採取、培養維持が容易でなく、初代培養からの期間として約3ヶ月を要した。また、精製コラーゲンとの混和による管状構造物の作成については、均一な口径を有する、適度な強度をもったものが得られなかった。この結果から、培養液組成や培養条件などの点で、今後更に検討を加えていくべきものと推察された。今年度の研究実績概要は、実験動物からの血管内皮細胞および血管平滑筋細胞の採取および培養維持、コラーゲン被覆人工素材への植え付けおよび非被覆合成素材への撒布による細胞生着の可能性、平滑筋細胞と内皮細胞の混合培養の撒布による良好な内皮化など、ハイブリッド人工血管への開発をすすめる上で、基礎的な方向付けと知見が得られたことであった。
拘束領域に引き込まれる移動柔軟体に発生性する自励的不安定振動の励振メカニズム解明

本研究で明らかにしたことを、以下にまとめて示す.(1)板などの柔軟な物体が狭いスリットに吸込まれる場合に,その尾端が激しく振動するスパゲティプロブレムと呼ばれている不安定振動が発生する.本研究はその励振メカニズムを解明するために,multibody dynamicsに基づく数値シミュレーションモデルを構築した.(2)モデル化手法の妥当性を調べる為に、実験装置を組立,行った実験結杲を、数値シミュレーション結果と比較した.その結果、実験・数値シミュレーションともに、吸込み過程終盤における振動の急激な増大が観測され、かつ、その挙動が良く一致していることを確認した.(3)さらに,吸込み口のギャップの大きさが柔軟梁の動的挙動に及ぼす影響についても実験と数値シミュレーションを行った.それらの結果から、モデル化手法の妥当性が確認され,吸込み口の剛性が励振メカニズムに大きな影響を与えることを明らかにした。(4)これまでの吸い込み口と移動柔軟体の弾性衝突を含んだ力学モデルに,さらに軸力の効果と移動柔軟体振動と周りの流体流れとの流体・構造連成の影響を考慮した,より厳密な力学モデルの構築を行い、流体流れの安定性への影響を明らかにした.本研究で明らかにしたことを、以下にまとめて示す.(1)板などの柔軟な物体が狭いスリットに吸込まれる場合に,その尾端が激しく振動するスパゲティプロブレムと呼ばれている不安定振動が発生する.本研究はその励振メカニズムを解明するために,multibody dynamicsに基づく数値シミュレーションモデルを構築した.(2)モデル化手法の妥当性を調べる為に、実験装置を組立,行った実験結杲を、数値シミュレーション結果と比較した.その結果、実験・数値シミュレーションともに、吸込み過程終盤における振動の急激な増大が観測され、かつ、その挙動が良く一致していることを確認した.(3)さらに,吸込み口のギャップの大きさが柔軟梁の動的挙動に及ぼす影響についても実験と数値シミュレーションを行った.それらの結果から、モデル化手法の妥当性が確認され,吸込み口の剛性が励振メカニズムに大きな影響を与えることを明らかにした。(4)これまでの吸い込み口と移動柔軟体の弾性衝突を含んだ力学モデルに,さらに軸力の効果と移動柔軟体振動と周りの流体流れとの流体・構造連成の影響を考慮した,より厳密な力学モデルの構築を行い、流体流れの安定性への影響を明らかにした.近年の機械の高速化と軽量化の時代を背景に,鋼板や紙などの様な薄い柔軟体が,巻き取りローラや高速コピー機入口などの狭い拘束領域(吸い込み口)に高速で引きずり込まれる際に,その終端部分が激しく自励的な不安定振動を起こす振動問題が,急浮上して来ており,鋼板や紙などの高速送搬と軽薄化は技術的障壁に直面している.本研究は,この不安定振動現象の発生メカニズム解明のために,これまでに構築したマルチボディダイナミクス解析手法を用いた物理モデルを発展させて,より厳密な物理モデルの構築を行った.具体的には,(1)移動柔軟体の大きな回転運動(大変形)と有限ひずみ効果を,絶対節点座標系によって厳密に取り扱える物理モデルを構築した.(2)吸い込み口における複雑な非線形弾性衝突の影響,および柔軟体と流体流れとの流体・構造連成効果の影響を考慮した物理モデルを構築した.また,構築した物理モデルを基に数値計算プログラムを構築した.そして,この構築した数値計算プログラムを用いた数値シミュレーションを行い,移動柔軟体に発生する不安定振動の特性を数値計算により明らかにした.さらに,拘束領域に引き込まれる移動柔軟体として薄い板を急速に拘束領域に吸い込む(巻き取る)実験装置を設計・製作し,移動柔軟体に発生する不安定振動の振動学的特性を,レーザ変位計と高速ビデオカメラを用いた実験により明らかにした.そして,得られた実験結果と数値計算結果を比較して,構築した物理モデルの妥当性を確かめた.本研究で明らかにしたことを、以下にまとめて示す.(1)板などの柔軟な物体が狭いスリットに吸込まれる場合に,その尾端が激しく振動するスパゲティプロブレムと呼ばれている不安定振動が発生する.本研究はその励振メカニズムを解明するために,multibody dynamicsに基づく数値シミュレーションモデルを構築した.(2)モデル化手法の妥当性を調べる為に、実験装置を組立,行った実験結果を、数値シミュレーション結果と比較した.その結果、実験・数値シミュレーションともに、吸込み過程終盤における揖動の急激な増大が観測され、かつ、その挙動が良く一致していることを確認した.(3)さらに,吸込み口のギャップの大きさが柔軟梁の動的挙動に及ぼす影響についても実験と数値シミュレーションを行った.それらの結果から、モデル化手法の妥当性が確認され,吸込み口の剛性が励振メカニズムに大きな影響を与えることを明らかにした.(4)これまでの吸い込み口と移動柔軟体の弾性衝突を含んだ力学モデルに,さらに軸力の効果と移動柔軟体振動と周りの流体流れとの流体・構造連成の影響を考慮した,より厳密な力学モデルの構築を行い、流体流れの安定性への影響を明らかにした.
骨格筋内脂肪蓄積機序の解明とその病態生理学的意義に関する研究

加齢による筋萎縮(骨格筋減弱症)や筋再生が正常に進行しない筋ジストロフィーなどの筋疾患では、骨格筋内に通常みられない脂肪細胞が出現する。この脂肪細胞は生体恒常性の維持を担う骨格筋機能に大きな影響を与えることから、本研究ではその出現機序や病態生理学的意義を明らかにすることを目指した。その結果、骨格筋内脂肪細胞の起源とされる間葉系前駆細胞の分化制御を担う新規分子としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン4を同定することができた。また、ヒトの病態を極めて忠実に再現し、骨格筋内に脂肪蓄積を生じる新規筋ジストロフィーモデルラットの開発に成功した。本研究は、我々が取得した骨格筋脂肪前駆細胞クローンやそれを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて骨格筋脂肪前駆細胞の動態解析・分化制御機構の解明を行うとともに脂肪細胞が筋分化を抑制する機序を明らかにすることを目的としたものである。本年度は以下のような研究成果が得られた。1.骨格筋脂肪前駆細胞クローンを抗原として作成したモノクローナル抗体(5C12抗体)について、in vitro、in vivoの両方における抗原分子の発現動態を観察した。その結果、本抗体はM-cadherin陽性を示す筋前駆細胞とは異なる細胞集団を認識すること、さらに骨格筋内では間質に存在する細胞群を認識することが明らかとなった。さらに、再生筋では本抗体陽性を示す間質の細胞数が一過的に増加することが判明した。これらの結果は筋損傷に伴い骨格筋脂肪前駆細胞の数が一過的に増加するという我々のこれまでの知見と合致するものであり、骨格筋脂肪前駆細胞を特異的に認識する新規モノクローナル抗体が取得できた可能性を強く示すものである。2.筋損傷が骨格筋脂肪前駆細胞の活性化を引き起こすこと、さらにそれを仲介する因子がFGFであることを明らかにした。また、FGFがこのような作用を発揮する際に骨格筋脂肪前駆細胞ではWISP2、NPY、CTGFの発現が変動していることを見いだした。これらの因子はいずれも液性因子であり、骨格筋脂肪前駆細胞の活性化という新規機能を持つ興味深い可能性が提示された。3.骨格筋脂肪前駆細胞に由来する脂肪細胞が筋芽細胞同士の融合を抑制することを見出した。さらに興味深いことに分化前の骨格筋脂肪前駆細胞は筋芽細胞同士の融合をむしろ促進することを発見した。また、いずれの作用についても液性因子の分泌を介して発揮されていることが明らかとなった。本研究は、我々が取得した骨格筋脂肪前駆細胞クローンやそれを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて、骨格筋脂肪前駆細胞の動態解析・分化制御機構の解明を行うとともに、脂肪細胞が筋分化を抑制する機序を明らかにすることを目的としたものである。1.ラット骨格筋脂肪前駆細胞クローン2G11細胞を抗原として得られたモノクローナル抗体5C12の認識する抗原の同定を行った。その結果、本抗体はchondroitin sulfate proteoglycan-4 (CSPG-4)を認識することが判明した。再生筋におけるCSPG4の動態を調べた結果、筋損傷後に一過的にCSPG4陽性細胞が増加すること、また、再生筋線維周囲にCSPG4が一過的に集積することなどを見いだした。2.新規ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法により、ジストロフィン遺伝子変異ラットの作出に成功した。得られたラットは、骨格筋への脂肪蓄積などヒト筋ジストロフィーと極めて似た病態を示すことから、非常に優れたモデル動物となることが期待される。3.脂肪細胞が筋芽細胞同士の融合を阻害することを前年度に見いだしたが、逆に、筋細胞が脂肪分化を抑制することを新たに発見した。さらに、この脂肪分化抑制作用には筋分化制御因子MyoDが中心的な役割を果たしていることが示唆された。1.我々が過去に取得した骨格筋脂肪前駆細胞クローン2G11細胞が、形質転換成長因子beta(TGF-beta)依存性の線維芽細胞への分化能をもつことが新たに判明した。このことから2G11細胞は単なる骨格筋脂肪前駆細胞でなく、線維芽細胞・脂肪細胞両者への分化能を併せもつ骨格筋間葉系前駆細胞クローンと位置づけるのが適当であると思われた。2.2G11細胞に対する抗体が認識する表面抗原分子CSPG4について、線維芽細胞・脂肪細胞それぞれの分化に関与している可能性を調べた。その結果、どちらの分化に対しても深く関わる可能性が示された。3.ゲノム編集技術により作出に成功したジストロフィン遺伝子変異ラットのF0世代から系統化を行ったところ、out-of-frame(OF)変異によりジストロフィンタンパク質を完全に欠損したOF系統と、in-frame(IF)変異により不完全な短縮型ジストロフィンタンパク質を発現するIF系統の2系統が確立された。OF系統はヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)に極めて似た表現型を呈し、月齢の進行とともに重篤な症状を示した。一方、IF系統はヒトベッカー型筋ジストロフィー(BMD)に似た表現型を呈し、軽症ではあるものの骨格筋や心筋に病変が観察された。

OF系統、IF系統の2系統の筋ジスラットが確立できたのは極めて大きな成果である。この両系統は脂肪蓄積の程度や病態の重篤さも異なっていることから、両者の関連性をin vivoで追求する上で重要なモデル動物であると考えられる。本研究は、我々が取得した骨格筋脂肪前駆細胞クローンやそれを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて骨格筋脂肪前駆細胞の動態解析・分化制御機構の解明を行うとともに脂肪細胞が筋分化を抑制する機序を明らかにすることを目的としたものである。期間延長により本年度は以下のような研究成果が得られた。1.前年度に確立したジストロフィン遺伝子変異ラットの2系統(OF系統とIF系統)の詳細な表現型解析を持続した。その結果、OF系統、IF系統ともに、骨格筋で細胞老化が生じていることが判明した。このことは筋ジストロフィーの病態進行機序の一部に老化細胞の出現という現象が関与している可能性を示すものである。2.間葉系前駆細胞の線維芽細胞および脂肪細胞両者への分化に関与することが判明した表面抗原分子CSPG4について、細胞成長因子による分化制御機構を仲介するドメイン探索のための変異体発現ベクター構築に着手した。さらに、CSPG4欠損ラットの作出を開始した。以上、いずれも今後の研究の発展に大きく貢献する成果が得られた。加齢による筋萎縮(骨格筋減弱症)や筋再生が正常に進行しない筋ジストロフィーなどの筋疾患では、骨格筋内に通常みられない脂肪細胞が出現する。この脂肪細胞は生体恒常性の維持を担う骨格筋機能に大きな影響を与えることから、本研究ではその出現機序や病態生理学的意義を明らかにすることを目指した。その結果、骨格筋内脂肪細胞の起源とされる間葉系前駆細胞の分化制御を担う新規分子としてコンドロイチン硫酸プロテオグリカン4を同定することができた。また、ヒトの病態を極めて忠実に再現し、骨格筋内に脂肪蓄積を生じる新規筋ジストロフィーモデルラットの開発に成功した。本研究は骨格筋内脂肪蓄積機序の解明を目的の一つに掲げたものであるが、新規ゲノム編集技術の導入により骨格筋内に脂肪細胞を再現性良く蓄積するモデルラットが得られた。これは当初の予定には含まれていなかったが、このラットの作出により今後の研究の大きな発展が期待される。本年度の研究成果を基盤として筋ジスラットの病態におけるCSPG4分子の関与についてさらに追求する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。獣医生理学おおむね当初の計画通りに進めるが、CRISPR/Cas9法を用いた複数の遺伝子改変ラットの作出などを導入して、さらに飛躍的な研究の進行を図る予定である。本研究では具体的には以下の4つの研究項目を設け、初年度については13について研究を遂行する計画であった。いずれも当初の計画通り順調に達成することができた。1.骨格筋脂肪前駆細胞の動態および特異的表面抗原の解析2.骨格筋脂肪前駆細胞の分化制御機構の解明3.骨格筋内脂肪細胞が筋細胞の分化を抑制する機序の解明4.中型実験動物を用いた他動物での普遍性の検討当初予定していた期間内に2つの大きな進展があった。間葉系前駆細胞マーカーCSPG
ヒト消化管腫瘍におけるガストリン受容体遺伝子の発現とその突然変異に関する研究

1.ヒト・ガストリン受容体cDNAを用いた検討から、ヒト肺小細胞癌と肺小細胞癌株の約半数、大腸癌細胞株の10%、大腸癌の20%にガストリン受容体遺伝子の発現が認められた。一方、胃癌細胞株、胃癌には一例も発現がなかったが、胃小細胞癌株2例のうち1例(ECC10)に明らかな発現が認められた。2.ガストリン受容体遺伝子の発現を認めたECC10細胞と大腸癌株LoVo細胞に対するガストリンの増殖効果を検討したところ、ECC10ではガストリンの増殖効果は認められなかったが、LoVo細胞はガストリンによって容量反応性の増殖反応を示した。3.これら全ての検体についてガストリン受容体遺伝子を調べたが、変異ガストリン受容体遺伝子は一例も認められたかった。4.ヒト・ガストリン受容体遺伝子をNIH3T3細胞に導入したところ、本細胞はガストリンによって著明な増殖促進反応を示した。またこの際ガストリン受容体刺激は、MAPキナーゼ、focal adhesion kinase (P125^<FAK>)のチロシン・リン酸化を著明に促進させた。さらにこの際MAPキナーゼ活性の明らかな増加を認めた。6.ガストリン刺激によりNIH3T3細胞のアクチン・ストレス・ファイバーの形成が促進され、細胞の可動性の増強が観察された。7.以上のように、ヒト消化器癌の一部にはガストリン受容体遺伝子が発現しており、ガストリンが増殖因子として作用している可能性が示唆された。さらにガストリンは一連のチロシン・キナーゼ活性化を通して細胞増殖を促進することが明らかとなった。またガストリンは細胞内骨格を変化させて転移能におよぼすことが推測された。今年度の研究においては、私達が世界に先がけてクローニングしたヒト・ガストリン受容体cDNAを用いて以下の成績が得られた。1.マストミスならびにヒトの胃カルチノイド腫瘍にガストリン受容体遺伝子の強い発現が認められた。2.ヒト・ガストリン受容体遺伝子を導入したNIH3T3細胞では、ガストリン刺激によって細胞増殖が著明に促進され、その際Cキナーゼの活性化と同時にP42MAPおよびP125FAK(Focal adhesion kinase)のチロジン・リン酸化が促進された。さらにガストリンは本細胞のc-myc,c-fos遺伝子の発現を明らかに増殖させた。3.ヒト肺小細胞癌細胞株の約50%にガストリン受容体遺伝子の発現が認められた。4.ヒト大腸癌10例中2例、大腸癌細胞株8例中1例にガストリン受容体遺伝子の発現が認められた。5.胃腺癌組織ならびに胃癌細胞株ではガストリン受容体遺伝子の発現が認められた例はなかったが、ヒト胃小細胞癌(内分泌癌)細胞株ECC10において強いガストリン受容体遺伝子の発現が認められた。6.これらガストリン受容体遺伝子の発現している細胞株にガストリンを投与したところ、その細胞増殖が促進された。7.これらガストリン受容体の発現している細胞からRT-PCR法によりガストリン受容体cDNAをクローニングし、このDNA塩基配列をみたところ、現時点ではガストリン受容体遺伝子の変異例は一例も見出していない。

3.ヒト・ガストリン受容体遺伝子をN1H3T3細胞に導入したところ、本細胞はガストリンによって著明な増殖促進反応を示した。またこの際ガストリン受容体刺激は、MAPキナーゼ、focal adhesion kinase(P125^<FAK>)のチロシン・リン酸化を著明に促進させた。さらにこの際MAPキナーゼ活性の明らかな増加を認めた。5.ガストリン刺激によりNIH3T3細胞のアクチン・ストレス・ファイバーの形成が促進され、細胞の可動性の増強が観察された。
植物マイコプラズマの遺伝子発現・制御メカニズム

植物マイコプラズマの各種pathovarの作出・分離およびそれぞれの詳細な性状解析を行うと共に、昆虫伝搬能喪失変異株の作出を行った。次いでこれらのpathovarを対象に、分子系統解析を行って遺伝学的背景を明らかにし、本研究遂行に必要な<植物マイコプラズマ>・<昆虫>・<植物>よりなるモデル系の構築を行った。次いで、各pathovarを感染植物組織より大量かつ高度に精製する技術を確立し、Phytoplasmaasteri野性株(pv.onion-W;OY-W)のゲノム構造の全容を明らかにする目的で、大規模なゲノムライブラリー(プラスミド)を構築し、組織的な構造解析を進めた。その結果、ゲノムにコードされる種々の重要なタンパク質遺伝子のクローニングに成功した。そして各pathovarに特異的に発現する遺伝子をスクリーニングし、それらの比較構造解析を行った。ゲノムに加えて、プラスミドおよび染色体外DNAの全構造解析を終了した。これらのDNA分子は非常にユニークで、全てローリングサークル複製型のDNAレプリコンであるが、その複製酵素から2種類の染色体外DNAの存在が明らかになった。またこれらのDNA分子には、病原性及び昆虫伝搬性をコードする遺伝子の存在が示唆され、また、これらの分子の間でダイナミックな再構成が起こり、植物マイコプラズマの病原性が宿主特異性などの形質と併行して急速な変異を遂げる一因となっていることが推測されるなど、従来の概念を覆す新たな知見を得ることが出来た。また、単離された遺伝子にコードされるタンパク質を大腸菌に大量発現させ、その動態解析を行う目的で特異抗体の作製を試みた。特に、全ての植物マイコプラズマに共通の抗原タンパク質遺伝子を取り出すことに成功し、世界で初めて植物マイコプラズマ共通の高感度診断系を確立することができた。各種植物マイコプラズマの16S rRNA遺伝子を特異的なプライマーを用いてPCR増幅し、シークエンスプライマーを用いてその全長の塩基配列を決定した。これらの配列データと海外の同様な配列データとをあわせて分子系統学的な解析を行い、世界中に発生する植物マイコプラズマの分子分類体系を確立した。このデータを元に、植物マイコプラズマの属及び種レベルでの分類体系を確立し、それぞれの植物マイコプラズマの種名を決定した。また、各種に特異的なプライマーを合成し、種の判別の分子生物学的な手法を確立した。これらの知見を元に、植物マイコプラズマの変異株を作出し、それらの分子系統学的な位置を解析し、特異的な変異株の選抜を行った。選抜されたそれぞれの変異株を用いて、染色体DNAや染色体外DNAを大量精製する手法を確立し、それらのサイズ等の比較を行った。その結果、変異株では染色体DNAや染色体外DNAにおいて、特異的に欠失が生じていることが推定された。特に変異株の特徴として、病微の軽減化が顕著に認められ、これらのDNAにおける欠失が病微の軽減化につながっているものと推定され、欠失した領域に病微決定遺伝子が座乗していることが強く示唆された。そこでこれらの精製DNAを用いて遺伝子ライブラリーを作製した。染色体DNAはファージベクター系を用い、染色体外DNAはプラスミドベクター系を用いてライブラリーを作製した。今後これらのライブラリーを用いてその解析を行って行く予定である。昨年度確立した分子分類体系に基いて、各植物マイコプラズマ変異株を選抜した。またそれらの感染細胞に各種処理を試み、パルスフィールド電気泳動法によるゲノム及びプラスミドの大量かつ高度な精製法を確立した。この方法に基づいて、野性株のゲノム及びプラスミドを精製した。また、ゲノム及びプラスミドの遺伝子解析系を確立し、その性状を究明した。

すなわち、ゲノミックライブラリーを作製するほか、プラスミドの遺伝子構造を決定した。ついで、その構造に基づいて特異的プローブを開発した。決定した遺伝子構造解析データに基づき、データベースより遺伝子の機能を解析した。この結果、約3kbpよりなるローリングサークル型のプラスミドを初めて見いだした。このプラスミドには複製酵素のほか、一本鎖DNA結合タンパク等がコードされており、このようなタイプのプラスミドはこれまでに例がない。また、この特異的プローブを用いて、植物マイコプラズマの各種変異株の感染細胞に特異的に発現されるDNAやRNA遺伝子の発現を調べた。これらのDNAおよびRNAを分離し、その性状を解析した。これらの知見は、植物及び昆虫の細胞内に共生または寄生して両生物間を水平移動する植物マイコプラズマの宿主決定や病原性に関わる遺伝子発現の制御メカニズムの解明に向けて大きな進展となった。今後以上の成果に基づき、植物・昆虫細胞における新規発現・制御系の開発に向けてさらに詳細な解析を進める。本研究は、植物及び昆虫の細胞内に共生または寄生して両生物間を水平移動する地球上で最小の微生物の細胞における遺伝子制御ネットワークを解明し、宿主決定や病原性に関与する遺伝子発現とその制御メカニズムを明らかにする。また生命体として必要最小限のゲノムセットを明らかにし、原始細胞の共生微生物由来とされる細胞器官との比較を分子レベルで試み、その起源を究明する。以上の成果に基づき、植物・昆虫細胞における新規発現・制御系を開発する目的で行った。本年度は、昨年度までに確立した野性株についてのゲノムのライブラリーの作製を行うと共に、その充実をさらに推進し、特異的な遺伝子群を明らかにする目的で、野性株および変異株間の差異について詳細を調べ、それらの病原性および宿主決定メカニズムとの関連性について詳細に解析を行った。また、それぞれの変異株にコードされるプラスミドについては、さらに詳細な解析を進め、各変異株について、複数の種類の染色対外DNAが存在することが明らかになった。そこで、それらのレプリコンについて詳細な解析を行い、コードされるオープンリーディングフレームの確定を試みた。そして、それぞれのレプリコンにコードされる各遺伝子の機能を調べ、病原性や昆虫伝搬性との関連性について、解析を進めた。一方、シャトルベクターの構築については、さらに改良が必要であることが判明したため、引き続きその開発を推進する計画である。植物マイコプラズマの各種pathovarの作出・分離およびそれぞれの詳細な性状解析を行うと共に、昆虫伝搬能喪失変異株の作出を行った。次いでこれらのpathovarを対象に、分子系統解析を行って遺伝学的背景を明らかにし、本研究遂行に必要な<植物マイコプラズマ>・<昆虫>・<植物>よりなるモデル系の構築を行った。次いで、各pathovarを感染植物組織より大量かつ高度に精製する技術を確立し、Phytoplasma
ウイルス感染植物における二本鎖RNAの構造と機能

1.ブロムモザイクウイルスのin vitroでの二本鎖RNA合成系を確立しまたウイルスがコ-ドする全ての蛋白質に対する抗体を作成した。これらを利用してRNAポリメラ-ゼによる二本鎖(ds)RNA合成シグナルを明らかにし、さらにRNAポリメラ-ゼの構成ペプチドを同定した。(古沢)2.アップルクロロティックリ-フスポットウイルス感染植物から5本のウイルス特異的dsRNAを検出した。この中で4.9×10^6の分子はウイルスゲノム複製型であった。(高橋)3.オオムギ黄萎ウイルス(BYDV)805株感染葉よりRNAの抽出法を確立した。各地から採集したBYDVのdsRNAの電気泳動パタ-ンからBYDV805株と異なる系統の存在が示唆された。4.野外で採集したキウリモザイクウイルス感染植物中におけるサテライトdsRNAの存否を指標として得た新たな4株のサテライトdsRNAの電気泳動移動度、生物学的諸性質、全塩基配列を決定した。(高浪)5.抗dsRNA抗体を作成した。この抗体を用いて、植物細胞中のdsRNAの分離法を検討し、イネ細胞からdsRNA様分子を分離した。(北川)6.ニンジンより分離された5種類の潜伏ウイルスは、ハイブリダイゼ-ション法で解析したところ、いずれも異なる塩基配列であった。キウリモザイクウイルスのdsRNAをフォトビオチンで標識してプロ-ブとするハイブリダイゼ-ション法を開発し、2pgRNAまで検出した。(奥田)7.各種サビ病菌とオオムギ斑葉病菌のウイルスの粒子形態、核酸ゲノム、血清学的性状、細胞内所在を究明し、さらに分布生態を調べた。(山下)8.イネ萎縮ウイルス(RDV)ゲノムセグメントの両末端領域の塩基配列を決定し末端共通保存配列を明らかにした。更にイネ黒条萎縮ウイルスとイネラギッドスタントウイルスの末端共通保存配列はRDVと異なることを明らかにした。(上田)1.ブロムモザイクウイルスのin vitroでの二本鎖RNA合成系を確立しまたウイルスがコ-ドする全ての蛋白質に対する抗体を作成した。(上田)1.ブロムモザイクウイルスのin vitroでの二本鎖RNA合成系を確立し、またウイルスがコードする全ての蛋白質に対する抗体が作成できた。(古澤)2.オオムギ黄萎ウイルス感染葉より二本鎖RNAの検出条件を確立し3種類の核酸を検出した。いずれの核酸もウイルスゲノム由来であることをハイブリダイゼーションで明らかにした。(小島)3.アップルクロロティックリーフスポットウイルス感染葉より5本の二本鎖RNAを検出した。これら二本鎖RNAを解析するために、更にウイルスゲノムRNAに対するCDNAを合成した。(高橋)4.85のキウリモザイク、ウイルス感染植物よりサテライトRNA二本鎖RNAの検出を試み、新たに3種のサテライトRNAが検出できた。(高浪)5.二本鎖RNAに対するモノクローナル抗体を作成したところ、これら抗体がγRNAと交叉反応することが明らかとなった。(北川)6.種々のサビ病菌やごま葉枯病菌よりウイルスを検出し、純化した。これらウイルスのゲノム核酸を分析したところ二本鎖RNAであることが明らかとなった。(山下)7.イネ萎縮ウイルスのゲノムセグメント12本(S112)のうち、全ての3'末端領域とS312の5'末端領域の塩基配列を決定し、セグメント間に見られる共通保存配列を明らかにした。(上田・四方)8.ニンジンより新しく4種の潜伏ウイルスを見出し、これらウイルスの二本鎖RNAゲノムをハイブリダイゼーション法で解析したところいずれも異なる塩基配列であることが分った。