hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA・RNAを認識する新しい金属フィンガーペプチドの創製

DNA認識モチーフの一つである亜鉛フィンガーは、特徴ある構造及び、DNA認識様式を有することから、近年大きな注目を集めている。今回演者らは、ヒト由来転写因子SplのDNA認識部位を構成する亜鉛フィンガーの(Cys)2(His)2ドメインのうち、2つのCysをHis置換した(His)4ドメインを有する人工亜鉛フィンガーペプチドを創製し、その高次溝造の変化及びDNA認識様式を調べ、新規DNA認識金属モチーフとして機能しうるかを検討した。Spl3フィンガードメインのうち2番目のフィンガーに相当するSplf2C2H2とHis置換体であるSplf2H4をFmoc固相合成法により合成し、円二色性スペクトルを測定した。次に、Spl3フィンガードメインであるC2H2Spl及びH4Splを大腸菌により発現し、精製した試科について円二色性スペクトルを測定した。更に、H4SplのDNA結合能並びに認識様式を調べるために、ゲルシフト法、DNaseIフットプリント法、メチル化干渉法を行った。円二色性スペクトルの実験からSplf2H4及びH4SplはZnの添加により一定の二次構造をとることが確認された。ゲルシフト法およびDNaseIフットプリント法の結果から、H4SplはGCboxに対して結合し、メチル化干渉法により、その認識様式はC2H2Splに類似していることが分かった。
エボラウイルスと宿主間相互作用の解析

エボラウイルスは、ウイルスグリコプロテイン分子(Ebo-GP)を宿主レセプター分子と結合させることによって宿主細胞内に侵入する。Ebo-GPと結合し宿主細胞表面に発現する新規レセプター分子EGPRを同定し、EGPRとEbo-GPとの結合には、Ebo-GP上の糖鎖が必須であることが判明した。さらに、EGPRはヒトに感染するエボラウイルス5亜種全ての感染性を増大することを明らかにした。宿主がウイルスを排除するためのNK細胞を活性化する分子EGPIMとそのリガンドとの結合をEbo-GPが阻害することが明らかとなり、エボラウイルスはNK細胞による細胞障害活性から逃避することが示唆された。エボラウイルスは、ウイルスグリコプロテイン分子(Ebo-GP)を宿主側レセプター分子と結合させることによって宿主細胞内に侵入(エントリー)することが知られている。Ebo-GPと結合し宿主細胞表面に発現する新規レセプター分子EGPRを同定し、Ebo-GPとEGPRとの結合がエボラウイルスのエントリーに関与するメカニズムを解析した。エンベロープを有するウイルスのエントリーにおいては、ウイルスエンベロープと宿主細胞の膜との融合(フュージョン)が必須である。EGPR発現細胞は、コントロール細胞に比較してEbo-GP発現細胞とのフュージョン効率を増大させた。また、EGPR発現細胞は、コントロール細胞に比較してEbo-GP発現シュードウイルスに対して高感染感受性であった。以上よりEGPRはEbo-GPと結合し、エボラウイルスのエントリーを増強することがわかった。一般にヒトやマウスをはじめとする哺乳動物へのウイルスの初回感染においては、ウイルスやウイルス感染細胞の排除のために、まず自然免疫系が反応する。ウイルス排除の中心的役割を担う自然免疫系における免疫担当細胞のひとつがNK細胞である。本研究では、NK細胞を活性化する分子EGPIMとそのリガンドとの結合をEbo-GPが阻害することがわかった。さらに、Ebo-GP発現細胞は、コントロール細胞に比べて、NK細胞の活性化を阻害することが明らかとなった。以上のことは、エボラウイルスが宿主免疫から逃避するメカニズムのひとつであることを示唆すると考えられた。エボラウイルスのエントリーにおけるフュージョンは、これまで、細胞内に存在するエンドソームなどの膜が宿主側のパートナーといわれてきた。研究代表者のフュージョンアッセイの結果から、フュージョン効率の増大が、エンドソームをはじめとした細胞内環境との関わりの有無などを詳細に解析する必要が生じてきた。また、Ebo-GPは糖鎖に富む分子であるので、糖鎖がEGPRを介したエボラウイルスのエントリーに関与するか否かの検討も必要である。さらに、エボラウイルスには5つの代表的な株がある。各エボラウイルス株のEbo-GPに関して、EGPRとの結合性、EGPR発現細胞とのフュージョン効率や、EGPR発現細胞へのエントリー効率を解析することが、グローバルな視点において、エボラウイルス感染におけるEGPRの関与の全体像を把握する上で必要であると考えられる。また、Ebo-GPは、当初同定した分子だけでなく複数の分子と結合し、NK細胞活性を制御していることがあきらかになってきた。従って、新たに判明した個々の分子に対するEbo-GPの細胞活性化に対する制御機構の解析も必要になってきた。すなわち、EGPIMと各リガンドの結合をEbo-GPが阻害する際に、結合阻害の効率に差があるのか、あるいは、生理的にこれら複数のリガンドとの結合阻害が相加的なものなのか、あるいは一つだけあれば十分なのかなども合わせて検討する必要がある。Ebo-GPは糖鎖修飾が豊富であり、この糖鎖がEbo-GPの機能に重要であることが知られているが、EGPRがEbo-GPと結合するには、Ebo-GP上の糖鎖が必須であることが判明した。また、エボラウイルスには数種類の株が存在しており、Ebo-GPの構造、病原性が異なることも知られている。各株のEbo-GP発現シュードウイルスに対しての感受性に関して、EGPR発現細胞はコントロール細胞に比較して高いことがわかった。以上よりEGPRはEbo-GPと結合し、Ebo-GPの糖鎖依存的にエボラウイルスのエントリーを増強することが明らかとなった。哺乳動物へのウイルスの初感染においては、ウイルスやウイルス感染細胞の排除のために、まずNK細胞などの自然免疫系が反応する。NK細胞を活性化する分子EGPIMとそのリガンド(EGPIM-L)との結合をEbo-GPが阻害することがわかった。さらに、Ebo-GP発現細胞は、コントロール細胞に比べて、NK細胞による細胞障害活性による細胞死が少ないことが明らかとなった。以上のことから、エボラウイルスがNK細胞などの感染初期の宿主免疫から逃避するメカニズムのひとつとして、Ebo-GPによるNK活性化受容体を介したNK細胞活性化の阻害が示唆された。Ebo-GPとEGPR、Ebo-GPとEGPIM-Lの結合を阻害することで、エボラウイルスの感染制御法の開発への基盤となることが期待される。

Ebo-GPと結合し宿主細胞表面に発現する新規レセプター分子EGPRを同定し、EGPRとEbo-GPとの結合には、Ebo-GP上の糖鎖が必須であることが判明した。さらに、EGPRはヒトに感染するエボラウイルス5亜種全ての感染性を増大することを明らかにした。宿主がウイルスを排除するためのNK細胞を活性化する分子EGPIMとそのリガンドとの結合をEbo-GPが阻害することが明らかとなり、エボラウイルスはNK細胞による細胞障害活性から逃避することが示唆された。EGPR発現細胞におけるエントリー機構の解明において、細胞内環境を模したフュージョンアッセイを行う。また、Ebo-GP発現シュードウイルスを用いて、EGPR発現細胞における膜融合活性発現箇所を顕微鏡下で詳細に解析する。各エボラウイルス株のEbo-GPをcloningし、EGPRと結合するかどうか、株間で結合度に差があるかどうかを解析する。Ebo-GP発現細胞とEGPR発現細胞のフュージョン効率を、フュージョンアッセイにて解析する。さらに、各エボラウイルス株由来Ebo-GP発現シュードウイルスを用いて、EGPR発現細胞へのエントリー効率を算出する。これらによって、エボラウイルス株間でのEGPRを介したエントリー効率の違いを明らかにする。EGPIMと各リガンドの結合をEbo-GPが阻害する際に、結合阻害の効率に差があるのかを、EGPIMと個々のリガンドの結合を、リガンドを個別に発現させた細胞において、Ebo-GPとの競合実験を行い、阻害効率を明らかにする。さらに、NK細胞ライン及び末梢血から得たNK細胞などを用いて、Ebo-GP発現細胞のNK細胞活性を解析するが、その際、各リガンド分子発現をCRISPR/Cas9やRNA干渉で制御するなどして、各分子のNK細胞活性への寄与度を測定する。ウイルス学膜融合アッセイからEGPRによる膜融合効率の増大が判明した。EGPRの発現局在から、これまでの定説であるエンドソームでの膜融合とは異なる機構が存在している可能性があり、EGPRを介した膜融合が行われる細胞局在解析をする必要性が生じた。また、EGPRは他のフィロウイルスであるマールブルグウイルスのGPとは結合しないことが明らかとなった。エボラウイルスにも5つの株があり、相互のEbo-GPの特徴も異なる。各株のEbo-GPとEGPRとの関連性の解析は、グローバルな視点で、EGPRが関わるエボラウイルス感染像の把握に有用である。EGPR発現細胞において、細胞内環境を模した膜融合アッセイを行う。また、Ebo-GP発現シュードウイルスを用い、EGPR発現細胞における膜融合活性発現箇所を顕微鏡下で解析する。各エボラウイルス株のEbo-GPをcloningし、EGPRとの結合性、EGPR発現細胞との膜融合効率、シュードウイルスのEGPR発現細胞へのエントリー効率を株間で比較する。EGPIMと各リガンドの結合に対するEbo-GPによる阻害効率を、リガンドを個別に発現させた細胞においてEbo-GPとの競合実験を行い、解析する。
プラズマプロセスによる微粒子ミクロ表面のバイオ活性制御技術の開発と医療応用

本研究では、ナノマイクロサイズの微粒子のバイオ・医療応用を目的とし、ナノサイズ境界面を有する微粒子とプラズマとの表面相互作用に関する基盤的研究を実施した。主な研究成果として、(1)プラズマプロセスによる微粒子表面官能基修飾のメカニズム解明および官能基数の定量評価、(2)アミノ基修飾磁気ナノ微粒子を用いたインフルエンザウイルスの高濃度化法の開発、(3) ZnOナノ蛍光体のプラズマ表面修飾および多糖類の固定化技術の開発等が挙げられる。研究期間に亘る研究成果として、著書・解説9編、査読付学術論文57編、国際会議94件(招待講演10件)、国内学会186件(招待講演16件)の発表を行った。本計画研究では、(1)各種材料を用いた微粒子の作製とその構造解析、(2)μmサイズの微粒子によるクーロン結晶構造を実現するためのプラズマ装置の整備、(3)プラズマ化学修飾による各種微粒子の表面修飾、(4)化学修飾された微粒子へのヘパリンなどの多糖類の添加、(5)微粒子蛍光体などの微粒子表面の生体適合性の付加など、様々な医療分野への応用を目的としている。平成21年度の主な研究成果は以下のとおりである。(1)各種材料を用いた微粒子の作製とその構造解析:レーザーアブレーションおよびDCアーク放電を用いて炭化水素ガス雰囲気中において鉄ナノ微粒子の作製を行った。TEMによる微粒子の構造解析の結果、鉄ナノ微粒子が数層のグラフェン層でカプセル化された構造であることを確認した。(2)微粒子表面のプラズマ化学修飾実験:ナノ微粒子表面の化学修飾実験のための高周波プラズマ装置を設計・試作した。アンモニアガスを用いたRFプラズマによるナノ微粒子表面のアミノ基修飾実験を行い、微粒子表面の親水性の改善を水接触角の測定より確認した。(3)表面化学修飾した微粒子の組成分析:プラズマ表面処理した微粒子のXPS解析およびTEM/EDSによる表面組成解析を行った。XPSおよびEDS解析の結果、アミノ基などの窒素含有官能基が表面に修飾されていることを確認した。また酸素プラズマ、アンモニアプラズマ、および水蒸気添加アルゴンプラズマを用いたカーボンナノチューブの表面修飾実験を行った。いずれの場合もナノチューブ表面での官能基修飾による親水性の向上、分散性が著しく改善されることを確認した。これらの結果は、表面化学修飾されたナノ微粒子の汚染除去吸着材としての環境分野への応用の可能性があることを示唆している。(4)研究成果の発表:研究成果は学術論文に11編、国際会議に12件、国内学会に30件発表を行った。本研究では、ナノサイズ微粒子のバイオ・医療応用に注目し、プラズマと微粒子との物理的・化学的表面相互作用、さらにプラズマによる微粒子表面の官能基添加による機能性付加や、逆にウイルス、細菌などの生物機能の消失など、ナノサイズ境界面を有する各種微粒子とプラズマとの表面相互作用に関する研究を実施し、医学・理学分野を融合した新学際的研究領域の創成に資することを目的としている。以下に平成22年度における主な研究成果を列記する。(1)プラズマ化学修飾による各種微粒子の表面修飾:アンモニアプラズマ処理によるグラフェン層でカプセル化された磁性体微粒子の官能基表面修飾実験を行い、親水性、分散性向上の確認、および蛍光色素によるアミノ基修飾の確認を行った。また、ドット配列カーボンナノチューブ基板を用いたプラズマ表面修飾実験を実施し、カーボンナノチューブ上へのアミノ基およびカルボキシル基などの官能基の選択的な修飾が可能であることを示した。(2)四重極質量分析器を用いたバイオ高分子とプラズマとの表面相互作用:マイクロ波励起窒素・酸素混合ガスプラズマによる芽胞菌の不活化メカニズムの解明を目的として、四重極質量分析器を用いて菌細胞エッチングの実験的検証を行った。実験結果は、菌のエッチングと励起酸素原子による発光強度との間に強い相関があることを示している。(3)化学修飾された微粒子表面への多糖類等の固定化:アミノ基などの化学修飾を行ったナノ微粒子表面へのデキストランなど多糖類の固定化とその表面解析を実施し、アミノ基にデキストラン分子が選択的に固定化されることを実験的に明らかにした。また、微粒子表面のアミノ基修飾率を向上させるため、外部パルス電圧印加による微粒子のプラズマ領域への導入法を提案し、アミノ基修飾率の向上を確認した。(4)研究成果の発表:研究成果として、学術論文に22編(うち査読有20編)、国際会議に24件(招待講演4件)、国内学会に19件(招待講演2件)の発表を行い、1件の特許出願を行った。

本研究では、ナノサイズ微粒子のバイオ・医療応用に注目し、プラズマと微粒子との物理的・化学的表面相互作用、さらにプラズマによる微粒子表面の官能基添加による機能性付加や、逆にウイルス、細菌などの生物機能の消失など、ナノサイズ境界面を有する各種微粒子とプラズマとの表面相互作用に関する研究を実施し、医学・理学分野を融合した新学際的研究領域の創成に資することを目的としている。以下に平成23年度における主な研究成果を列記する。(1)プラズマ化学修飾による各種微粒子の表面修飾:アンモニアプラズマ処理によるグラフェン層でカプセル化された磁性体ナノ微粒子の官能基表面修飾実験を行い、蛍光色素によるアミノ基修飾およびカルボキシル基の修飾を確認した。また、微粒子表面の官能基修飾率を向上させるため、外部パルス電圧印加による微粒子のプラズマ領域への導入法を提案し、アミノ基修飾率の向上を確認した。(2)四重極質量分析器を用いたバイオ高分子とプラズマとの表面相互作用:マイクロ波励起窒素・酸素混合ガスプラズマによる芽胞菌の不活化メカニズムの解明を目的として、四重極質量分析器を用いて菌細胞エッチングの実験的検証を行った。窒素プラズマでは、プラズマからの紫外線発光が主な不活化要因であることを示し、さらに四重極質量分析器測定の結果、酸素プラズマと同様に励起窒素原子による菌細胞のエッチングが生じていることを明らかにした。(3)化学修飾された微粒子表面への多糖類等の固定化:アミノ基などの化学修飾を行ったナノ微粒子表面へのデキストランなど多糖類の固定化とその表面解析を実施し、アミノ基にデキストラン分子が選択的に固定化されることを実験的に明らかにした。また、デキストランなどの多糖類や糖鎖などをアミノ基修飾を施した性体ナノ微粒子表面に固定化することに成功した。この結果により、ウイルスに対して特異的吸着能を有する糖鎖糖鎖を固定化することにより、アミノ基修飾した磁性体ナノ微粒子のウイルスの選択的高濃度検出への応用が期待される。(4)研究成果の発表:研究成果として、学術論文に18編(うち査読有15編)、国際会議に15件(招待講演1件)、国内学会に50件(招待講演5件)の発表を行い、1件の特許出願を行った。本研究では、ナノサイズ微粒子のバイオ・医療応用に注目し、プラズマと微粒子との物理的・化学的表面相互作用、プラズマによる微粒子表面の官能基添加による機能性付加や、ウイルス、細菌などの生物機能の消失など、ナノ界面を有する各種微粒子とプラズマとの表面相互作用に関する研究を実施し、医学・理学分野を融合した新学際的研究領域の創成に資することを目的としている。平成25年度の主な研究成果は以下の通りである。(1)プラズマ化学修飾による微粒子表面の官能基添加の高効率化:プラズマ表面修飾による各種微粒子表面の官能基修飾のメカニズム解明および官能基数の定量評価を行った。微粒子表面修飾におけるArガスプラズマ前処理の効果を明らかにするとともに、基板ステージへの負電圧パルス印加による微粒子噴き上げ法を提案し、アミノ基数が一微粒子あたり400007500であることを明らかにした。(2)化学修飾された微粒子への多糖類の固定化:アミノ基修飾した磁気ナノ微粒子表面にウイルス抗体を固定化させ、インフルエンザウイルスを磁気回収により約17倍に濃縮できることを実験的に検証し、本研究の結果が市販磁気ビーズを用いた場合よりも優れている濃縮特性を有することを示した。
多発性骨髄腫の微小環境の制御におけるプラスミンの役割

代表者らは、生体中のマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性化を起点とした造血因子の細胞外ドメイン分泌の促進と共に、骨髄由来のCD11b陽性F4/80陽性細胞が、白血病・リンパ腫細胞周囲の微小環境中に集簇し、血管新生因子やMMPの産生を通じて、これらの腫瘍増殖に関与することを明らかにした。さらにこれら各種プロテアーゼが、新たな骨髄腫を含む血液腫瘍性疾患治療上の分子標的となることを示唆した。本研究は、多発性骨髄腫の病態形成における線溶系亢進の生理学的意義と骨髄腫細胞の骨髄内増殖及び浸潤機構、そして骨髄微小環境がその機構中で担う役割を解明することを目的としている。研究代表者らは、これまでの研究で、生体内の骨髄腫病態進展の促進因子と考えられているマトリックスメタロブロテイナーゼ(MMP)の活性化-潜在型酵素pro-MMPから活性型MMPへの変換が、線溶系因子プラスミノーゲン(Plg)の活性化-プラスミンの生成によって制御されていることを明らかにした。昨年度代表者らは、マウス生体に移植された骨髄腫の類縁疾患であるリンパ腫の細胞の増殖が、線溶系の亢進により、MMPの活性化を介して促進されることを見出し、この時、骨髄由来細胞の末梢組織中への動員とKit-ligand (stem cell factor)等の一部の造血因子の細胞外ドメイン分泌が惹起されることを確認した。今年度の研究で代表者らは、線溶系因子プラスミンの阻害剤YO-2を使用することにより、マウス悪性リンパ腫細胞の増殖抑制に成功した。抗線溶-プラスミン阻害剤の作用機序としては、血中のMMP活性、および末梢組織中で血管新生因子やケモカインの供給源となる骨髄由来の炎症性細胞の腫瘍組織中への動員抑制を介して、生体内のリンパ腫細胞増殖を制御するものと考えられた。骨髄腫細胞はBリンパ球が成熟化した細胞が癌化したものと考えられており、同じ造血器腫瘍というカテゴリーに属する。従ってリンパ腫マウスモデルで得られた本研究成果は、骨髄腫病態の理解においても有用性の高いものと言える。来年度は、ヒト骨髄腫細胞を利用した骨髄腫マウスモデルを作製し、本仮説の検証を目指すことを計画している。本研究では多発性骨髄腫の病態形成における線溶系亢進の生理学的意義と骨髄腫細胞の骨髄内増殖及び浸潤機構、そして骨髄微小環境がその機構中で担う役割を解明することを目的とする。近年、多発性骨髄腫の病勢と、一部の線維素溶解系(線溶系)因子の血中濃度との相関が指摘されており、骨髄腫及びストローマ細胞より供給されるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)及びこれを制御する線溶系酵素群が骨髄腫細胞増殖の制御因子となっている可能性が指摘されている。昨年度までの研究で代表者らは、近交系マウスにマウス由来の多発性骨髄腫、B細胞性リンパ腫を皮下に移植することにより、生体内で骨髄腫細胞が増殖するプロセスを精査するモデルを確立した。今年度の研究では、これらのマウスにMMP阻害剤を投与することにより骨髄腫・リンパ腫の増殖抑制が起ることを明らかにし、このことはこれらの腫瘍増殖過程においてもMMPの活性が重要な役割を有していることを示唆したものと言えよう。さらに代表者らは、線溶系・プラスミン阻害剤の投与が、一部の白血病・リンパ腫の増殖を抑制し得ることを明らかにしており、このことは潜在型酵素pro-MMPから活性型MMPへの変換を制御する線溶系酵素群が、その上流からMMP活性を制御することによって、Kit-ligandをはじめとする各種細胞増殖因子の細胞外ドメイン分泌を促進すること、また腫瘍増殖に至適な微小環境を構築する接着分子ないしは細胞群を動員することによって血液腫瘍の生体内増殖を制御している可能性を示唆するものである。現在、代表者らはマウス及びヒト骨髄腫モデルにおける、これら線溶系・プラスミン阻害剤の作用について精査中であり、本研究成果は多発性骨髄腫の新規分子療法開発の基礎研究としても重要な意味を有している。本研究では多発性骨髄腫の病態形成における線維素溶解系(線溶系)亢進の生理学的意義と骨髄腫細胞の骨髄内増殖及び浸潤機構、そして骨髄微小環境がその機構中で担う役割を解明することを目的とする。近年、多発性骨髄腫の病勢と、一部の線溶系因子の血中濃度との相関が指摘されており、骨髄腫及びストローマ細胞より供給されるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)及びこれを制御する線溶系酵素群が骨髄腫細胞増殖の制御因子となっている可能性が指摘されている。

今年度の研究で、代表者らは、生体中のMMPの活性化を起点としたKit-ligandをはじめとする造血因子の細胞外ドメイン分泌(プロセシング)の促進と共に、分化・増殖、そして骨髄より動員される骨髄由来のCDllb陽性F4/80陽性細胞が、T細胞由来の白血病・リンパ腫細胞周囲の微小環境中に集簇し、血管内皮増殖因子等の血管新生因子やさらなるMMPの産生を通じて、これらの腫瘍増殖に関与することを明らかにした。さらに代表者らと神戸学院大学との共同研究で見出された新規プラスミン阻害剤は、各種プロテアーゼの活性化を上流より阻害し、これらのT細胞性白血病・リンパ腫の増殖を抑制することを報告した。このことは、血液凝固・線維素溶解系因子群の血液腫瘍性疾患病態における新たな機能ばかりでなく、腫瘍増殖における骨髄由来細胞の重要性を示している。代表者らはマウスB細胞、形質細胞由来の細胞株によるマウス骨髄腫モデルを確立し、前出のプラスミン阻害剤、そして昨年度に有効性を確認したMMP阻害剤との併用療法の有効性について精査中である。本研究成果は多発性骨髄腫の新規分子療法開発の基礎研究としても重要な意味を有している。
イムノPCRによる微量血痕試料からの高感度薬物検出法の開発に関する研究

1.フェノバルビタール(以下PhBと略)を含む血液で血痕を作製し、イムノPCR法の原理を応用してPhBの検出をこころみた。その結果、血液付着の担体線維や血中蛋白等の夾雑物にマーカーDNAが物理的に付着し非特異的反応が強く現れ、PhBを特異的に検出することが困難であった。2.そこで、実験系を単純化して検討するため、PhB含有水溶液を試料とした。3.本研究で行ったイムノPCR法の操作手順は次のとおりである。(1)抗PhBマウスIgG一次抗体をマイクロタイタ-プレート上に固相化させ、2%BSAでブロッキングした。(2)PhB含有試料を反応させた後、変性試薬の添加および加熱乾固によって一次抗体の変性とPhBの化学的解離を行った。(3)グルタルアルデヒドを加えてPhBをウェル上の蛋白と共有結合させ、余分なアルデヒド基はNaBH_4で還元させた。(4)1本鎖のDNA(97mer)で標識した抗PhBウサギ血清(二次抗体)を反応させ、PCRを行った。上記の各操作毎にTween 20含有PB又はTBSで洗浄を行った。対照実験系として、上記の手順からPhB,一次抗体,二次抗体,変性試薬等を除外した7系を試みた。変性試薬としてSDS,メタノール,HCl,プロテアーゼK,NaOH等を検討した。以上の実験により、変性試薬として0.5N NaOHを用いた場合には、抗原PhBが存在する系では97bpのPCR増幅バンドが検出され、一次抗体を変性させた対照実験系では非特異的バンドは出現しなかった。一次抗体を変性させなかった対照実験系および一次抗体の変性が不十分な場合には、それぞれ非特異的バンドが出現した。以上から、一次抗体を変性させる手順を加えてイムノPCR法を行うと溶液中PhBの特異的検出の可能なことが示唆された。一層の適切な条件の設定、精製したDNA標識二次抗体の使用、血痕抽出液の前処理法につき引き続き検討を加える計画である。
統合失調症者の地域生活における自己効力感に関する研究

対象者は男性71名、女性27名の合計98名であり、平均年齢は43.0歳であった。SECL(精神障害者の地域生活に対する自己効力感尺度)総得点の平均値は68.6点であった。SECL総得点と属性(年齢、性別、同居の有無、入院回数、入院期間、発症年齢、通所の有無)の間に有意な相関は認められなかった。またSECLと一般性自己効力感(GSES)には有意な相関はみられなかったが、自尊感情、QOLには中程度の正の相関がみられた。SECLで最も得点が高かった下位尺度は「治療に関する行動得点」(20.2点)であり、最も低かった下位尺度は「対人関係得点」(17.2点)であった。最も得点が高かった項目は「約束どおり病院へ通う」(4.6点)、「処方されたくすりをきちんとのむ」(4.4点)であり、低かった項目は「自分から人とつき合ったり、友人をつくる」(3.3点)、「必要なときに公的な援助サービス(役所・保健所など)を利用する」(3.5点)、「くすりの副作用があらわれたとき、自分で気づく」(3.5点)であった。スタッフの評価による生活技能プロフィール(LSP)とSECL、QOLの間にそれぞれ中程度の正の相関がみられた。SECL下位尺度とLSP下位尺度の間では、11の項目間で有意な正の相関はみられたが、負の相関はみられなかった。よって統合失調症者の主観評価とスタッフによる生活技能の客観評価には大きなずれはみられず、現実検討能力は維持できていると言える。以上より、統合失調症者の地域生活における自己効力感を高めるためには、自尊感情やQOLの向上に焦点を合わせた介入が必要であることが示唆された。さらに、対人関係や公的な援助サービスの利用等について、自信を持って自らが積極的に行動できるような働きかけを行うことが重要であると考えられる。地域で生活する統合失調症者の主観的体験である自己効力感やそれに影響を及ぼすと考えられる要因を把握するためのアンケート用紙を作成した。アンケート内容は(1)属性:年齢、性別、同居の有無、居住形態、入院回数・期間、罹病期間、通所の有無・場所、サポートの有無・希望、(2)統合失調症者の地域生活に対する自己効力感尺度(SECL)、(3)一般性自己効力感尺度(GSES)、(4)自尊感情(Rosenberg Self-esteem)、(5)満足度(WHO/QOL)とした。また統合失調症者は主観的評価と客観的評価の乖離が大きいことが特徴であるため、スタッフに対象者の社会生活能力を評価してもらい、主観的評価との比較を行うためのアンケート用紙を作成した。アンケート内容は(1)属性:年齢、性別、職種、勤務年数、(2)生活技能プロフィール(LSP日本版)とした。研究協力の承諾が得られた石川県内の生活支援センター・デイケアにおいて、各施設長より紹介された通所者にアンケートの趣旨・方法、回答は自由意志によるもので強制されるものではないこと、プライバシーの保護のために無記名であること、得られた結果は研究以外の目的で使用しないこと、結果を公表する場合もプライバシーの保護に十分配慮すること等対象者の権利について説明し、研究参加への同意が得られた165名を対象にアンケート用紙を配布し、121名より回収した。回収率は70.9%、有効回答率は96.7%であった。またアンケートに回答して下さった通所者の生活場面を観察できるスタッフにスタッフ用のアンケート用紙を配布し、述べ120名より回収した。回収率は99.9%、有効回答率は100%であった。次年度は得られた結果を分析し、統合失調症者の主体的な地域生活を援助する方策について検討する予定である。

以上より、統合失調症者の地域生活における自己効力感を高めるためには、自尊感情やQOLの向上に焦点を合わせた介入が必要であることが示唆された。さらに、対人関係や公的な援助サービスの利用等について、自信を持って自らが積極的に行動できるような働きかけを行うことが重要であると考えられる。
タンパク質のリン酸化を蛍光レシオ検出する人工低分子ペプチドプローブの開発

初年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、共有結合標識手法はほぼ存在していない。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを目指してきた。前年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において数十分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質間での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。本年度(平成20年度)は、Gタンパク質共役受容体に対して標識を試みた。受容体の細胞外領域にタグ配列を導入し、HEK293細胞に発現させた。この細胞を蛍光プローブで染色したところ、受容体を発現している細胞上に標識由来の蛍光が観測された。この蛍光は細胞膜上の受容体局在と一致したことから、タグ導入受容体に対する選択的な標識であることが示された。分子認識による選択性と化学反応の選択性を融合させた本手法が、夾雑系において有効なタンパク質標識手法となりうることを示すことができた。本手法は生体機能を支える重要なタンパク質の局在や動態を観測するバイオイメージング研究や、タンパク質工学のための分子ツールとしての貢献が期待できると思われる。本年度は、これまでリン酸化部位の認識に用いてきた金属配位子相互作用だけでなく他の相互作用を検討した。現在認識可能であるリン酸基周辺の側鎖と、様々な置換基を有する人工ペプチドプローブ分子とのリン酸基以外との相互作用による親和性の向上をねらった。そこでモデルプローブ分子としてこれまでに知見のあるアミノ酸型認識ユニットDpaTyr 2Znを用いた(J.Am.Chem.Soc.,128,10452-10459(2006))。モデルペプチドには親和性の向上をねらいヒスチジンやシステイン、アスパラギン酸を含んだものをFmoc固相合成法によりミニライブラリーを作成し、評価・検討をおこなった。この検討の過程において、DpaTyr2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが特定のアミノ酸配列(Cys-(Ala)n-Asp-Asp-Asp-Asp)と親和性を有するだけでなく非可逆的に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。このように認識による選択性と共有結合反応をカップリングさせることで、他の親和性を持った種の共存下、特定アミノ酸配列のみを認識した化合物種へと収束可能になるかもしれない。またさらに詳細な検討をおこなった結果、モデルペプチドの空間配置の最適化により水中における通常の分子間反応と比較して反応初速度が約1500倍を越え、非常に速くラベル化可能であることが明らかになった。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、非可逆な標識手法はあまり存在していない。そのため、このような配列をタンパク質タグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法を提案できるのではないかと考え、現在研究を進めている。前年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを本年度は目指した。本年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質(緑色蛍光タンパク質)に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において30分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質問での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。次に生体内を指向した夾雑成分存在下での標識を試みた。タグつきモデルタンパク質(マルトース結合タンパク質)を発現する大腸菌を破砕したライセート対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで生体内成分共存下でのラベル化が可能であった。さらに、大腸菌細胞内の標的タンパク質に対しても標識が可能であった。

初年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、共有結合標識手法はほぼ存在していない。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを目指してきた。前年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において数十分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質間での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。本年度(平成20年度)は、Gタンパク質共役受容体に対して標識を試みた。受容体の細胞外領域にタグ配列を導入し、HEK293細胞に発現させた。この細胞を蛍光プローブで染色したところ、受容体を発現している細胞上に標識由来の蛍光が観測された。この蛍光は細胞膜上の受容体局在と一致したことから、タグ導入受容体に対する選択的な標識であることが示された。分子認識による選択性と化学反応の選択性を融合させた本手法が、夾雑系において有効なタンパク質標識手法となりうることを示すことができた。本手法は生体機能を支える重要なタンパク質の局在や動態を観測するバイオイメージング研究や、タンパク質工学のための分子ツールとしての貢献が期待できると思われる。
腫瘍制御向上を目指した高濃度アスコルビン酸併用放射線治療の研究

放射線治療の効果を高めることを目的に、アスコルビン酸併用放射線治療の研究を行った。白血病細胞、線維肉腫細胞、腺癌細胞、扁平上皮癌細胞の計4種類の癌細胞を使い、放射線照射単独とアスコルビン酸併用放射線照射の比較をすると、アスコルビン酸により細胞死が増加し、すべての細胞で、アスコルビン酸併用放射線照射群では生存率が有意に低下していた。今後、放射線にアスコルビン酸を併用することで、放射線治療の効果が高まることが期待され、臨床研究を行う必要がある。放射線治療は、悪性腫瘍の根治的治療ではあるが、単独では十分な局所制御は得られていない。近年、静注によるアスコルビン酸の高濃度治療が可能になり、血中で10mM程度までアスコルビン酸濃度を維持させることが可能になった。我々は、アスコルビン酸を併用することにより、照射と異なるアポトーシス系路が追加され、抗癌作用が増加すると考えており、以下の研究を行った。1.アスコルビン酸放射線照射における相乗効果の確認ヒト白血病細胞(HL60)を用い、放射線照射単独(0-8Gy)、アスコルビン酸単独(0.01mM-50mM)、アスコルビン酸併用放射線照射の3群の、細胞数およびDNA断片化などから、アポトーシスを定量的に測定し、アスコルビン酸に相乗効果があるか具体的に検討した。その結果、アスコルビン酸単独では濃度5mMで、アポトーシスの頻度が高かった。このためアスコルビン酸5mMを併用し2Gy照射したところ、2Gy照射単独より、アポトーシスが増加した。以上より、アスコルビン酸は放射線と相乗して抗癌作用のあることが示唆された。2.相乗効果機構におけるカスペース活性とアポトーシス関連蛋白の解明我々は、Colorimetric assay kit (Bio Vision)を使用し、上記細胞のカスペース(3,8,9)活性の測定を行ない、各細胞のアポトーシス移行の傾向を調べた。その結果、カスパーゼ3活性、カスパーゼ8活性、カスパーゼ9活性のすべてにおいて、アスコルビン酸併用X線照射が最も高い値を示した。また、すべての処理で、カスパーゼ3およびカスパーゼ9活性は経時的に上昇したが、カスパーゼ8活性は、アスコルビン酸単独とアスコルビン酸併用X線照射で上昇がみられたが、X線照射単独では顕著な上昇はみられなかった。特に問題になるのは、分割照射により発生する放射線抵抗性細胞であり、この存在が放射線の治療効果を減弱させる一因と考えられている。我々は、アスコルビン酸を併用することにより、照射と異なるアポトーシス系路が追加され、抗癌作用が増加することを昨年示した。そこで、放射線抵抗性腫瘍を樹立し、その分子生物学的性質を明らかにするとともに、アスコルビン酸併用により、この放射線抵抗性株でも抗腫瘍効果が増強するか検討した。1.放射線抵抗性株の樹立と分子生物学的分析ヒト白血病細胞(HL60)に4Gyを1週間おきに4回照射(計16Gy)した。その後、生存した細胞を継代し放射線抵抗性株とした。この放射線抵抗性株に4Gy照射し、対照と生存率をコロニーアッセイで比較したところ、抵抗性株では有意に高かった。抵抗性株の細胞周期を調べたところ、放射線照射後はG2/M期の割合が上昇していた。また、抵抗性株では照射後もcaspase 3の活性化が低い傾向が見られ、DNA断片化も減少していた。このように抵抗性株では、放射線に対してアポトーシス抵抗性になっていた。2.放射線抵抗性株のアスコルビン酸併用放射線の効果について。この放射線抵抗性株を用い、放射線照射単独、アスコルビン酸単独、アスコルビン酸併用放射線照射の3群の、細胞数およびDNA断片化などから、アポトーシスを定量的に測定し、アスコルビン酸に相加効果があるか具体的に検討した。アスコルビン酸5mMを併用し2Gy照射したところ、2Gy照射単独より、アポトーシスが増加し、細胞生存率は減少した。以上より、アスコルビン酸併用放射線療法は放射線抵抗性株にも有効である可能性が示唆された。1)上皮系ならびに肉腫系の複数の細胞株による効果判定ヒト線維肉腫細胞(HT1080),扁平上皮舌癌細胞(SAS),肺腺癌細胞(A549)の3種類の細胞を10万個ずつ4群に分け,放射線照射単独(Rad)群,アスコルビン酸投与(AsA)群,併用(Rad+AsA)群,Control群とし、処理を施した.その3日後、トリパンブルー排斥法により生細胞数を測定しcontrol群を100%として生存率を比較検討した。その結果、すべての細胞で、放射線単独よりアスコルビン酸併用のほうが腫瘍細胞を抑制していた。以上より、放射線単独に比較してアスコルビン酸を併用したほうが、上皮系ならびに肉腫系の細胞株においても効果的であることが示唆される。

2)動物実験によるアスコルビン酸併用療法の有効性の確認線維肉腫細胞(HT1O80)をヌードマウスに500万個後頸部に注入し、腫瘍を移植後、7日および9日後に、下記に示す処置を3群に行った。Rad群:マウスに麻酔を行い、腫瘍部以外をすべて防護した後、4Gyの照射を行う。AsA群:アスコルビン酸を5mMに調整し、200μLを腫瘍に直接、局所注射する。Rad+AsA群:アスコルビン酸5mM200μLを腫瘍に局所注射した後、マウスに麻酔を行い、腫瘍部以外をすべて防護した後、4Gyの照射を行う。実験開始13-14日後に、腫瘍の大きさ(長径×短径)を測定した後、マウスを安楽死させ、腫瘍重量を計測した。その結果、安楽死時において腫瘍の大きさ(長径×短径)および腫瘍重量ともに、放射線単独よりアスコルビン酸併用のほうが小さい傾向がみられた。以上より、腫瘍を移植した動物実験においても、放射線単独に比較してアスコルビン酸を併用したほうが、効果的であると考えられた。
粒子線治療用レンジ補償フィルタ高速補正計算アルゴリズムの開発

平成25年度は本研究の目的である粒子線治療用レンジ補償フィルタの高速計算アルゴリズムの開発に必要なCTデータ(DICOMフォーマット)の取得プログラムおよび、患者体内の任意の点の水等価深さを計算するアルゴリズムの検討および作成を行った。これらの処理は市販のソフトウェアを用いると大量データの一括処理ができない、処理速度が遅い、拡張性がない等の問題が起こるため、C++をベースとしたプログラムにより高速かつ拡張性をもつ処理環境を構築した。水等価深さの計算はレンジ補償フィルタ補正計算の基本となる部分であるため、ここでの不要な近似計算による誤差は補正計算の精度および速度に影響を与えてしまう。ここでは計算voxelを任意の3次元的角度で入射粒子が通過する場合に対して、近似を用いず計算速度を高速に保つ方法で計算アルゴリズムを作成した。また、入射粒子の患者体内における散乱を考慮に入れた"実効"水等価深さの導入について検討・作成を行った。計画段階で検討したアルゴリズムは、入射粒子が患者体内で直進することを仮定した水等価深さに基いたレンジ補償フィルタで計算された線量分布に補正を加える方法である。これに対して、予め散乱効果を考慮して患者体内の線量計算点に寄与する患者体内のCT値を重み付きで3次元的に積算する"実効"水等価深さを導入することにより、最適化イタレーションを伴わない高速な計算アルゴリズムが実現できると考えられる。レンジ補償フィルタの高速計算を実現するために最適な方法を開発するために、上記の2種類の深さ計算を検討・作成を行った。平成26年度は、前年度に作成した水等価深さおよび実効水等価深さを用いたレンジ補償フィルタの作成アルゴリズムの作成を開始した。平成25年度は本研究の目的である粒子線治療用レンジ補償フィルタの高速補正計算アルゴリズムの開発に必要なCTデータ(DICOMフォーマット)の取得プログラムおよび、患者体内の任意の点の水等価深さを計算するアルゴリズムの検討および作成を行った。これらの処理は市販のソフトウェアを用いると大量データの一括処理ができない、処理速度が遅い、拡張性がない等の問題があるため、C++をベースとしたプログラムにより高速かつ拡張性をもつ処理環境を構築した。本研究の最終的な目的は、最適化イタレーションを伴わないレンジ補償フィルタ高速計算アルゴリズムを開発することである。その前段階として、入射粒子の直進を仮定した水等価深さをベースにした線量計算に基くレンジ補償フィルタの補正最適化計算を開始することが平成25年度の計画であった。

研究を進める過程において、線量計算点の水等価深さそのものに散乱効果を取り入れた"実効"水等価深さの導入により当初の計画の目標である最適化イタレーションを伴わない高速かつシンプルな計算アルゴリズムを開発できると考えられたため、最適化計算を開始する前に実効水等価深さの計算の検討・作成を行った。そのため、最適化計算そのものは開始していないがその代替手段となる実効水等価深さの計算を作成しているため、研究全体としてはおおむね順調に進展していると考えられる。平成26年度は、前年度に作成した水等価深さおよび実効水等価深さを用いたレンジ補償フィルタの最適化アルゴリズムの作成を行う。当初の計画である通常の水等価深さを用いたレンジ補償フィルタの最適化計算の作成および高速化に加え、実効水等価深さを用いた場合のレンジ補償フィルタの計算アルゴリズムの作成を行う。この実効水等価深さの導入は当初の目的である最適化イタレーションを伴わないアルゴリズムを実現するために有効な手段であると考えている。これらの計算アルゴリズムを総合的に比較することにより最適なレンジ補償フィルタの高速補正計算アルゴリズムを開発する。研究の過程において、当初の計画になかった実効水等価深さを導入するアイディアが発生したことにより、本研究の目的である最適化イタレーションを伴わないレンジ補償フィルタ計算アルゴリズムを、当初の計画より高速かつシンプルな形で実現できる可能性が出てきた。そのため、この新しいアイディアを研究の一部に取り込み総合的に比較することにより、精度および速度の点において最適なレンジ補償フィルタの計算アルゴリズムを作成してから成果発表を行うことが適切であると判断し平成25年度の成果発表を見合わせた。そのため次年度使用額が生じた。平成26年度は、当初の計画である通常の水等価深さを用いたレンジ補償フィルタの高速補正計算アルゴリズムに加えて、実効水等価深さを用いた最適化イタレーションを伴わないレンジ補償フィルタ計算アルゴリズムを開発する。これらのアルゴリズムを総合的に比較検討し、最適なアルゴリズムを開発する。それらの成果を平成26年度に公開する予定である。
求愛歌に着目した性的隔離の遺伝学的基盤とその進化に関する研究

昨年度に引き続き、各モザイクゲノム系統由来の雄とD. ananassae(以下ana)、D. pallidosa(以下pal)雌との交尾率測定および配偶行動の観察を継続して実施。当初予定としていた全266系統の行動観察はダニ混入による新規系統移入の中断などによりかなわなかったが、計65系統について詳細な行動観察および交尾率の算出を行った。さらに行動観察で得た各雄の求愛に対する雌の反応を指標化するためにFemale Response Index(FRI)を開発した。交尾率は複数の要因から成る性的隔離を単一の結果で示すが、行動観察で得た記録データから算出するFRIは情報量が豊富で解像度の高い結果が得られると期待された。FRIにより行動データを数値化してみた結果、交尾率とほぼ同一の傾向を示した。これは、雄の求愛を受けた雌の反応が交尾の有無を決定していることを明確に意味する。前述の交尾率および行動観察の結果と、既に設定済みの9つの分子マーカーとを併せてデータを解析した結果、3つのマーカーに性的隔離との強い関連性が認められ、また異なる3つのマーカーにやや強い関連性、残りの3つのマーカーにはほとんど関連性が認められない、など、領域によって明らかに異なる結果が得られた。しかしながら、より詳細にデータを見ていくと、これら効果の認められた複数領域のうち、特定の1領域によってどちらの雌に受け入れられるかが強く支配されていることが分かった。さらにこの最も支配的な効果を持つ領域をより詳細にマッピングを行うために新たに9個の新規マーカーを設計し、行動観察を行った65系統について遺伝子タイピングを実施した。また同様に既に決定済みの9マーカーのある領域についても新たにマーカーを設計、タイピングすることで過去のデータと一致しているかの確認を行った。本研究計画では種の起源となる種分化において重要な役割を担っている性的隔離機構を、遺伝学的、行動学的、進化学的に明らかにすることを目的として研究を行っている。とくに、性的隔離に重要な役割を持つ音情報のコミュニケーション機構の種特異性に着目し研究を進めており、ショウジョウバエの雄が発する求愛歌と性的隔離機構の遺伝学的基盤の解析を行っている。24年度の計画ではD. ananassaeとD. pallidosaの種間モザイクゲノム系統由来の雄の交尾率の測定と、求愛歌の録音・解析を予定していた。D. ananassaeとD. pallidosaの2種間では特に雄の翅振動により発せられる求愛歌と、雌によるその音受容と識別が性的隔離に最も重要であり、本研究計画では性的隔離を引き起こす雄の遺伝学的背景を明らかにすることを最初の目的としている。そこで、染色体が2種間で様々にシャッフルされ、完全なホモとなっているモザイクゲノム系統由来の雄を使い、2種の雌が各系統の雄の求愛行動に対してどのような反応を示すか(拒絶、交尾など)を調べた。その結果、雌の反応と染色体の一部特定領域に非常に強い関連性が認められた。この領域に2種の性的隔離を決定づける遺伝子が含まれていると考えられる。D. ananassaeとD. pallidosaは、同所的に生息しているにもかかわらず、交配後隔離がなく、いったん交尾してしまうと妊性のある雑種を形成する。つまりこの2種の種の維持には性的隔離が最も重要であり、また過去に起きたであろう2種の種分化にもこの性的隔離機構の確立が決定的な役割を担ったと考えられる。つまりこの染色体の特定領域をさらに詳細に調べることで、種分化を決定づけた遺伝学的変化を知ることができる。当該年度において明らかになった結果はその第一歩となるものである。

当初の研究計画よりも遅れている大きな理由としては、実験で使うために外部機関から移入したショウジョウバエ(約200系統)にダニが多数混入していたため、その駆除にかなりの時間を要した事が挙げられる。5月から移入を始め、数回に分けて移入し、最終的に全ての系統でダニの根絶が確認されたのが9月初旬であったため、実験を開始することができたのは9月末であった。また24年度の計画ではモザイクゲノム系統由来の雄の交尾率測定と求愛歌の録音、解析の2つを掲げていたが、求愛歌の録音についての計画を変更した。当初の予定では筑波大学の澤村京一講師の研究室を訪問し、本申請者が過去に組み立てを行い用いていた録音装置を使って録音を行う予定であったが、録音装置に必要な構成機器を検討した結果、新規に録音装置を作れる目処がついたので、京都-筑波を往復しての録音の計画を中止し、新規に録音装置を作り、京都で録音する計画に変更した。そのため、録音装置の設計、各部品の整合性などの検討、選定から行うことになり、試行錯誤をしながらの組み立てとなった。必要機器の選定、購入と、組み立てパーツの購入は完了し、完成の目処はついているが、録音はまだ行えていない。今後としては筑波までの往復をする必要がなくなったため、より現実的な実験運用ができる。もう一つの柱である交尾率の測定はおおむね順調に進んでいる。単純な交尾率の測定ではなく、配偶行動の観察を含めた記録を行うことにより、今後の解析により深みのあるデータが得られている。ただし、各ペアごとに観察を行っているため、単純な交尾率の測定よりは効率が落ちざるを得ず、当初の予定よりも時間がかかっている。また、理由は不明だが、系統によっては雄がなかなか得られないものがあり、必要サンプル数を得るまでに数ヶ月を要している系統もあるため、常に順調なペースでデータが取れているとは言いがたい状況である。当初の計画では初年度である24年度に「交尾率および配偶行動の観察」と「求愛歌の録音解析」、の2つの計画を立てていたが、完了していないため、25年度も継続して行う。25年度以降の計画としては、24年度の実験結果を受けてQTLマッピングを行うための新規マーカーの設計、タイピング解析を予定していた。24年度予定の実験は完了していないが、これまでにとられたデータから、染色体の一部特定領域が2種の性的隔離において重要な雄の種特異的配偶行動を支配していることを強く示唆するデータが得られているため、この領域について新規マーカーを設計しより詳細なマッピングを行う。該当なし。
訪問看護活動に不可欠なフィジカル・アセスメント技術の体系化に関する基礎的研究

訪問看護活動における臨床判断のための情報収集に不可欠なフィジカルアセスメント技術ならびに知識を把握する目的で、回答者の臨床経験背景と39のフィジカルアセスメント事項各々の知識、使用頻度、ニーズについて、自記式調査を行った。訪問看護職養成講座参加者を対象とした調査では、ニーズについては項目間の差はなく、全ての調査項目について必要性が確認された。「絶対に必要である」と回答した者が70%を超えた11のアセスメント項目の90%以上は「自分で行なえる程度」に知られており、80%以上が「週に1回以上から毎日」行われていた。ニーズについて「どちらともいえない」と答えた者が30%を超えた7項目は自分で行なえるほどの知識はなく使用頻度も低かった。ニーズについて「あったほうがよい」との回答が70%を超えた21項目については、「行なえる程度」に知られている場合には実際の使用頻度は高い傾向を認めた。これらの傾向は、訪問看護経験の有無や長さ、看護職経験の長さとは、いずれも有意な差異は認められなかった。訪問看護ステーション就業中の看護職を対象に行った調査では、ニーズについて「絶対に必要である」との回答が70%を超えた5項目についてはその項目を「自分で行なえる程度に知っている」または「他人に教えることができる程度に知っている」と回答した者がいずれも90%を超え、「週に1回以上行っている」あるいは「毎日行っている」と回答した者がいずれも80%を越えていた。さらにニーズについて「絶対に必要である」あるいは「あったほうがよい」と回答した者が70%を超えた15項目では「行なえる程度に知っている」場合には実際の使用頻度が高い傾向を認めた。看護職経験の長さの差、訪問看護経験の長さの差、医療機関での勤務経験の長さの差の各々において、ニーズ、知識、使用頻度に関して、有意差を認める項目を各々明らかにした。本年度は訪問看護場面におけるフィジカルアセスメントの技術・知識の現状把握を試みるために、訪問看護ステーションや保健所等に就業中、あるいはこれから就業しようとする現職の看護職のうち調査への同意を得られた37名を対象とした自記式調査を行った。回答者の臨床経験背景と39のフィジカルアセスメント事項について、知識、使用頻度、ニーズ、の各々について5段階で回答を求めた。ニーズについては項目間の差はなく、全ての調査項目について必要性が確認された。「絶対に必要である」と回答した者が70%を超えるアセスメント項目は11あり、それらの90%以上は「自分で行なえる程度」に知られており、80%以上が「週に1回以上から毎日」行われていた。ニーズについて「どちらともいえない」と答えた者が30%を超えた項目は7つあったが、これらは自分で行なえるほどの知識はなく使用頻度も低かった。ニーズについて「あったほうがよい」と回答した者が70%を超えた21項目については、「行なえる程度」に知られている場合には実際の使用頻度は高い傾向を認めた。しかしこの21項目のうちでも瞳孔対光反射、頸動脈拍動、頸静脈怒張の3項目では、知識量と使用頻度が比例しなかった。瞳孔対光反射については95%の者が「行なえる程度に知っている」が、「週1回から毎日は行っている」者は49%に過ぎず、頸動脈拍動についても81%の者が「行なえる程度に知っている」が、使用頻度では「週1回から毎日行っている」が38%で最多を占めた。