hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵管癌と胆管癌の比較から見た発癌機構の解明

膵管癌と胆管癌は、その発生部位が近接しておりどちらも腺癌に分類されるという類似点はあるが、予後が大きく異なること、転移進展様式が異なることなど、本当に類似した癌かどうかは明らかではない。また、膵では粘液産生が特徴な膵管内乳頭状粘液腫瘍(IPMN)が存在し異なる病態を示すのと同様に、胆道では胆管内乳頭状腫瘍(IPNB)が提唱されている。しかし、IPMNとIPNBの発生機序が類似しているかどうかは明らかではない。申請者らは本科学研究費補助金を申請する4年間において、膵管癌と胆管癌およびIPMNとIPNBを、遺伝子レベル蛋白レベルでの相違点を明らかにし、膵管癌と胆管癌の発癌機序の解明とそれに基づく新規治療法の開発を行おうとするものである。平成28年度には、膵管癌と胆管癌のホルマリン固定パラフィン包埋組織からレーザーマイクロダイセクションにより癌細胞を選択的に回収し、LC/MS/MSを用いて網羅的プロテオーム解析を行った。対象となる膵管癌10例と胆管癌8例を抽出した。平成29年度には、これら両群の発現タンパク質プロファイルを、スペクトラルカウント法およびG検定を用いて、最終的に15のバイオマーカー候補タンパク質を同定した。さらに大量の試料を免疫組織化学的検証を行うための準備として、まず膵頭部癌12症例と遠位胆管癌12症例の検体を検証し、両群で発現に差を認めるタンパク質を5タンパク質を絞り込んだ。さらに両群それぞれ80検体を用いて、大規模検証群の免疫染色を行い、同5タンパク質のバイオマーカーとしての妥当性を検討した。並行して、臨床現場で、実際に診断が困難であった症例を用いても、同バイオマーカー、バイオマーカーパネルの有用性を検討した。平成31年度は、IPMNおよびIPNBの遺伝子解析、プロテオミクス解析、免疫染色を中心として取り組む予定であり、準備を進めている。膵管癌と胆管癌は、その発生大きく予後が異なること、転移進展様式が異なることなど、本当に類似した癌かどうかは明らかではない。申請者らは本科学研究費補助金を申請する平成28年度から平成31年度の4年間において、膵管癌と胆管癌およびIPMNとIPNBを、遺伝子レベルから蛋白レベルでの相違点を明らかにし、膵管癌と胆管癌の発癌機序の解明とそれに基づく新規治療法の開発を行おうとするものである。対象となる膵管癌10例と胆管癌8例を抽出、膵管癌10例のLC-MS/MSデータを解析したところ、膵管癌で発現を認めたタンパク質は1361個であった。同様に胆管癌8例では1274個のタンパク質が同定された。共通に発現が見られたタンパク質を含め、のべ1820個のタンパク質が同定された。両群の発現タンパク質プロファイルを、スペクトラルカウント法を用いて半定量的に解析し相対的に2倍以上発現していたタンパク質の絞り込みを行った。さらにG検定を用いて、両群間で有意差(p < 0.01)を持って発現していたタンパク質を同定していき、最終的に15のバイオマーカー候補タンパク質を同定した。この15のバイオマーカータンパク質の市販抗体を入手し、膵管癌と胆管癌の免疫組織化学染色を行った。免疫染色の陽性率が2倍以上であることを基準に、膵頭部癌あるいは遠位胆管癌で発現が多く見られるタンパク質を7種類同定した。この7種類のタンパク質の発現の偏倚は、半定量比較解析法の結果と一致していた。平成28年度には、我々は膵管癌組織から抽出したタンパク質プロファイルと、胆管癌から抽出したタンパク質プロファイルを明らかにし、その鑑別を可能とする新規タンパク質バイオマーカーを同定することを試みた。膵管癌と胆管癌のホルマリン固定パラフィン包埋組織からレーザーマイクロダイセクションにより癌細胞を選択的に回収し、LC/MS/MSを用いて網羅的プロテオーム解析を行った。

膵管癌と胆管癌は、その発生大きく予後が異なること、転移進展様式が異なることなど、本当に類似した癌かどうかは明らかではない。また、膵では粘液産生が特徴な膵管内乳頭状粘液腫瘍(IPMN)が存在し異なる病態を示すのと同様に、胆道では胆管内乳頭状腫瘍(IPNB)が提唱されている。しかし、IPMNとIPNBの発生機序が類似しているかどうかは明らかではない。申請者らは本科学研究費補助金を申請する4年間において、膵管癌と胆管癌およびIPMNとIPNBを、遺伝子レベル蛋白レベルでの相違点を明らかにし、膵管癌と胆管癌の発癌機序の解明とそれに基づく新規治療法の開発を行おうとするものである。平成28年度には、膵管癌と胆管癌のホルマリン固定パラフィン包埋組織からレーザーマイクロダイセクションにより癌細胞を選択的に回収し、LC/MS/MSを用いて網羅的プロテオーム解析を行った。対象となる膵管癌10例と胆管癌8例を抽出、膵管癌で発現を認めたタンパク質は1361個であった。同様に胆管癌8例では1274個のタンパク質が同定された。共通に発現が見られたタンパク質を含め、のべ1820個のタンパク質が同定された。平成29年度には、これら両群の発現タンパク質プロファイルを、スペクトラルカウント法およびG検定を用いて、最終的に15のバイオマーカー候補タンパク質を同定した。さらに大量の試料を免疫組織化学的検証を行うための準備として、まず膵頭部癌12症例と遠位胆管癌12症例の検体を検証し、両群で発現に差を認めるタンパク質を5タンパク質を絞り込んだ。さらに両群それぞれ80検体を用いて、大規模検証群の免疫染色を行い、同5タンパク質のバイオマーカーとしての妥当性を検討した。並行して、臨床現場で、実際に診断が困難であった症例を用いても、同バイオマーカー、バイオマーカーパネルの有用性を検討した。膵癌症例と遠位胆管癌症例の集積は順調であり、多くの症例をもとに、膵癌と遠位胆管癌を鑑別するバイオマーカーの同定がほぼ出来た。膵管癌と胆管癌は、その発生部位が近接しておりどちらも腺癌に分類されるという類似点はあるが、予後が大きく異なること、転移進展様式が異なることなど、本当に類似した癌かどうかは明らかではない。対象となる膵管癌10例と胆管癌8例を抽出した。さらに両群
日中戦争期における上海に関する総合的研究-基礎資料(データベース)の整理と公開、そして聞き取り調査を中心に-

本研究の目的は、従来の歴史学研究の中心であった文献史料の研究にとどまらず、聞き取り調査を重視し、写真史料などの分野をも視野に入れながら日中戦争期に「国際都市」上海がどのような変容を余儀なくされたか、その全容解明を目指すものである。この研究・調査で入手した史料を使用して日中戦争期(193745年)の「国際都市」上海に関する論文を作成・発表した。また、写真史料の一部は日本大学文理学部のデジタルアーカイブにおいて公開することを予定している。私は戦前の上海日本人居留民関係者から聞き取り調査を行い、彼らの上海イメージは複雑な様相を示していることを明らかにし、それを職業・年齢・ジェンダーなど要因から分析した。また、聞き取り調査や回想録を利用して上海日本人居留民の引揚者たちの「上海ノスタルジー」という感情の歴史的な形成過程を検証した研究を行い、「上海日本人引揚者たちのノスタルジー」と題する論文にまとめた。私は、日中戦争期における上海に関する一次史料である木村英夫の遺稿『亜細亜再建秘録-敗戦前夜』を熊本において発見し、同遺稿を校閲し解題を付して、『日本占領下上海における日中要人インタビューの記録』として刊行した。日中戦争期における「国際都市」上海の変容を検証した研究としては、「日中戦争期における『上海租界問題』」と「日本占領下における『国際都市』上海」の二論文をまとめた。前者は日中戦争期における「上海租界問題」に関する日本側の認識と対応を考察することを主要な課題とした。後者は日本軍の上海租界への進駐に伴う上海外国人政策及び外国人居留民の状況を検討することであり、それを通じて日本占領下において「国際都市」上海がどのように変容したのかを実証的に明らかにした。私はこれまで史料文献が極めて少ない上海の日本人コミュニティを解明する方法の一つとして聞き取り調査を重視し、戦前上海において居留民として生活していた日本人及び彼らと関係していた中国人・朝鮮人を含む30名近くの方々から聞き取りを行ってきた。この上海日本人居留民関係者聞き取り調査の(1)目的と意義(2)実施要綱(3)聞き取り調査結果の概要を論述した拙稿「オーラル・ヒストリーによる上海日本人居留民史研究」(日本上海史研究会編『上海史研究の新たな模索』2001年7月)を発表した。上海日本人居留民関係者聞き取り調査から、彼らにとって上海イメージは複雑な様相を示しており、それは上海を体験したときの年齢、ジェンダー・エスニシティーの問題、職業といった様々な要因と関係していることを指摘した。私は上記のような聞き取り調査を行っているが、戦前の上海に生れ育った上海引揚者たちの多くは上海を「わが故郷」と呼び、上海での子供時代・学校生活などを懐かしそうに目を輝かせて語ってくれた。私は上海日本人居留民の生活実態を明らかにする目的で聞き取り調査を始めたのであったが、彼らにとって上海の記憶がいかなる意味を持つのかという感情の問題を理解することなしに、上海日本人居留民についての客観的事実も十分究明できないことに気がついた。そこで上海日本人居留民の引揚者たちの「上海ノスタルジー」という感情の歴史的な形成過程を検証した研究を行い、「上海日本人引揚者たちのノスタルジー」と題する論文にまとめた。同研究の一端は2001年12月に上海档案館主催の国際学術シンポジウム『租界与近代上海』において「『我的故郷・上海』的誕生」と題して発表した。また、完成論文「上海日本人引揚者のノスタルジー」は財団法人東洋文庫『近代中国研究彙報』第24号(2002年3月)に掲載される。また、『アジア遊学-特集上海』

第33号(勉誠出版、2001年11月)は私が全面的に企画・編集したものである。この特集の一つの柱は、近年の上海都市社会の大きな変容を歴史や文化に関係づけて論じることであり、いま一つの柱は日本人にとって上海とは何であったかを論じることにあった。本誌において私は「オールド上海と日本人」をテーマに甫喜山精治(上海日本居留民団立学校幹事)・古厩忠夫(日本上海史研究会代表)両氏と鼎談を行い、その記録を掲載した。私は、日中戦争期における上海に関する一次史料である木村英夫の遺稿『亜細亜再建秘録-敗戦前夜』を熊本において発見し、同遺稿を校閲し解題を付して、『日本占領下上海における日中要人インタビューの記録』として不二出版から刊行した。同遺稿『亜細亜再建秘録』は、木村英夫が上海日本総領事館特別調査班のスタッフとして1941年4月1944年10月に行なった上海在住あるいは上海来遊の日中要人へのインタビューの記録である。同遺稿には、1941年1944年にかけて日中戦争=日中関係の現状と展望についての日中双方の要人たちによる生の声に近い証言(談話)が時系列的に200編以上を収録されており、日中戦争史に関する貴重な根本史料であることは疑いないものと言えよう。同遺稿はそれを編纂した木村英夫の本来的な意図に従うとすれば、日中戦争=日中関係の行き詰まりに憂慮した日中両国の要人たちのさまざまな意見・批判・建策などを時局の変化に即して読み解くことが求められる。また、日本占領期の上海に関する貴重な証言史料集であるということも見逃すことはできない。同遺稿には、上海時局の変動にともないアジア太平洋戦争の勃発による上海の国際的存在価値の変貌をめぐる議論や上海租界の性格をめぐる議論が数多く紹介されているが、それ以上に注目されることは日本占領下の上海に生きていた中国人の生の声が記録されていることである。それらの多くは中国民衆の声を代弁するスタイルで語られており、日本の上海占領政策に対する批判・不満・怨嗟の声が日を追って高まっていったことが窺われる。同遺稿は中国人の視線から見たところの日本占領下における上海の実態を同時代的に語っている史料としてもたいへん貴重なものである。木村のインタビュー記録はその全容に触れてはじめて史料的価値が明らかになるものであり、その全インタビュー記録=『亜細亜再建秘録』を公刊することは日中戦争史の研究は言うまでもなく、日中戦争期の上海史の研究にとっても画期的な意義を持つものであると確信する。平成15年度の「日中戦争期における上海に関する総合的研究」に関する研究実績としては、以下の3点がある。(1)「日中戦争期のおける『上海租界問題』」(日本大学通信教育部『研究紀要』平成16年3月刊行)。本論文は日中戦争期における「上海租界問題」に関する日本側の認識と対応を考察することを主要な課題とした。このような考察を通じて、アジア太平洋戦争勃発以後における日本軍の上海租界進駐に伴う「上海租界問題」の処理のあり方を規定したところの歴史的な背景を明らかにすることを試みた。本論文では日本側の「上海租界問題」認識については戦前において著名な中国租界史研究者であった植田捷雄の論稿と興亜院華中連絡部の調査報告により検討するものであり、次いでアジア太平洋戦争勃発に至るまでの実際に生起したところの「上海租界問題」への日本側の対応については主に元上海共同租界工部局警視副総監・上原蕃の『上海共同租界誌』に依拠した。
心筋形質維持におけるNRSF転写抑制複合体によるエピゲノム制御の意義の研究

申請者らは、本研究にいて、転写調節因子NRSFの心筋特異的ノックアウトマウス作成に成功し、その解析の結果、心拡大・心収縮能の低下・心室性不整脈の出現等のヒト心不全に類似した表現型が出現することを見出し、NRSFが正常な心臓の形態・機能維持に必須の分子であることを明らかにした。またその分子的機序の詳細を解明するために、HDAC1/2といったヒストン修飾因子のノックアウトマウスとの交配モデルの作成、解析などを行った。さらに三量体Gタンパク質の抑制型サブユニットであるGαoの発現増加を介した機序に注目し、Gαoの機能阻害が心機能の改善や生存率の改善を来す可能性を示唆するデータを得た。本研究では、最近申請者が作製に成功したNRSF心筋特異的ノックアウトマウスをはじめ、NRSFとの複合体形成が知られる複数のヒストン修飾因子のノックアウトマウスの解析と、その詳細な比較検討を行い、NRSF転写抑制複合体の心筋形質維持に係わる分子機序とその破綻のメカニズムを、特にエピゲノム制御の観点から明らかにし、新規心治療標的探索を行う。NRSFストレートノックアウトマウスは胎生期に死亡するため、心筋でのNRSFの転写・エピゲノム制御における意義を検討するために、まず本年度申請者はNRSF floxマウスを用いて、心筋特異的、及び時期特異的にNRSFを欠失するNRSFconditionalノックアウトマウスを作製した。具体的には、NRSFloxp/lopxマウスを、心臓特異的なalphaMHC-CREマウスおよび、薬剤誘導性alphaMHC-MerCREMerマウスと交配し、得られたマウスを解析した。その結果、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスは正常に生まれてくるが、生後約10週までに徐々に進行する心機能低下を伴い、心室性頻拍などの不整脈が多発し、最終的に突然死する結果を得た。またDNAマイクロアレイなどの解析結果から、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスでは、dnNRSF-Tgと同様複数の心筋胎児型遺伝子の発現が亢進していることも確認した。またNRSFloxp/lopx; alphaMHC-MerCREMerマウスも作成し、タモキシフェンを投与し、生後6-8週令で心臓におけるNRSFの発現量が野生型の約70%まで低下したマウスを得た。現在このマウスの心機能、生存率など解析中である。また申請者はヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2およびヒストン脱メチル化酵素LSD1のfloxマウスを入手し、それぞれ心筋特異的CREマウスとの交配を開始した。本研究では,NRSF心筋特異的ノックアウトマウスをはじめとした複数のモデル動物の解析を行い,NRSF転写抑制複合体の心筋形質維持に関わる分子機序とその破綻のメカニズムを明らかにし,新規新治療標的探索を行うことを目的とする。NRSFストレートノックアウトマウスは胎生期に死亡することから,申請者はNRSF floxマウスを作製した。このfloxマウスを用いて心筋特異的,及び時期特異的にNRSFを欠失するNRSFcKOマウスを作製し解析を行った。NRSF floxマウスを、心臓特異的αMHC-CREマウスと交配したcKOマウスでは若い週齢で心収縮能の低下・心拡大を来し,生後10週までに心室性不整脈にて死亡した。このことから転写因子NRSFが心不全の病態と関連する可能性が示唆された。またNRSFflox/flox:αMHC-MerCreMerマウスを作成し,NRSFの薬剤誘導性ノックアウトを成獣マウスにて行ったところ、類似した心機能の低下などの表現型が示され,上記の知見を補強するデータを得た。現在これらマウスの解析を継続すると共に、NRSFと複合体を形成するLSD1, G9aなどのエピゲノム修飾因子の心筋特異的ノックアウトマウスを作製中である。さらにNRSFの機能阻害が心不全を呈する機序を解明するために,NRSFcKOマウスで発現が増加する三量体G蛋白Gαi/oに着目した。同サブユニットは心不全の心筋で増加していることが報告されており,アレイ解析などの結果からNRSFによる転写調節を受けていることが示唆されている。同サブユニットの阻害剤であるPTXの投与によりNRSFcKOマウスの心機能・生存率の改善のデータが示され,心不全病態形成においてNRSFの下流で機能している可能性が考えられた。現在NRSF ckoとGαo KOとの交配を行い、さらなる解析を継続する予定である。循環器内科NRSF flox

マウスを用いて、心筋特異的、及び時期特異的にNRSFを欠失するNRSFconditionalノックアウトマウスの作製に成功し、その表現型の解析を開始した。具体的には、NRSFloxp/lopxマウスを、心臓特異的なalphaMHC-CREマウスおよび、薬剤誘導性alphaMHC-MerCREMerマウスと交配し、得られたマウスを解析した。その結果、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスは正常に生まれてくるが、生後約10週までに徐々に進行する心機能低下を伴い、心室性頻拍などの不整脈が多発し、最終的に突然死する結果を得た。またDNAマイクロアレイなどの解析結果から、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスでは、dnNRSF-Tgと同様複数の心筋胎児型遺伝子の発現が亢進していることも確認した。またNRSFloxp/lopx;alphaMHC-MerCREMerマウスも作成し、タモキシフェンを投与し、生後6-8週令で心臓におけるNRSFの発現量が野生型の約70%まで低下したマウスを得た。現在このマウスの心機能、生存率など解析中である。またはヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2およびヒストン脱メチル化酵素LSD1のfloxマウスを入手し、それぞれ心筋特異的CREマウスとの交配を開始しており、進捗状況はおおむね順調であると考える。今後の研究は以下のように推進方策は以下のとおりである。1.NRSFconditionalノックアウトマウスにおける遺伝子転写・エピゲノム変化の解析。NRSF conditionalノックアウトマウスにおける上記解析を継続する。心筋特異的NRSFノックアウトマウスの解析の継続に加え、薬剤誘導性CREマウスを用いた時期特異的かつ心筋特異的NRSFノックアウトマウスの、心臓の各成熟過程、あるいは病的負荷時におけるNRSFの役割の解析を行っていきたい。2.LSD1 conditionalノックアウトマウスおよびHDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスにおける遺伝子転写・エピゲノム変化の解析。心筋特異的HDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスおよびLSD1 conditionalノックアウトマウスの作成を継続し、解析を開始する。特に先行しているHDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスにおいては、alphaMHC-CREとの交配、解析に加え、薬剤誘導性CREマウスとの交配による、時期特異的conditionalノックアウトマウスの作製と解析を行う。3.NRSF複合体の機能を修飾する分子、および低分子化合物の同定・解析。エピゲノム制御におけるNRSFの機能、およびその修飾の分子機構を同定するために、yeat two-hybrid(Y2H)、NRSF依存性転写抑制活性を指標とするhigh throughput screening、またNRSFトランスジェニックを用いたtandem affinitypurificationを行い、NRSFと複合体を形成したり、その転写・エピゲノム制御活性に影響を与えうる分子の新規同定の試みを開始したい。
脳領域特異的プロサイモシンα欠損による精神神経疾患誘導とその分子機能基盤の解明

平成24年度に作製した脳領域特異的にProTαを欠損したマウスを用いて行動科学的解析を行った。その結果、野生型マウスと比べ脳領域特異的ProTα欠損マウスではProTαの本来の発現部位での欠損に依存すると推測されるいくつかの行動異常が観察された。このマウスは特異的な局所における神経細胞でのProTα欠損を生じることから、観察された行動異常は、ProTαの発現欠損による神経細胞ネットワークの脆弱性を反映した表現型であると推測できる。さらに、ProTαの発見の経緯である初代培養脳神経細胞に対する神経細胞死保護作用というin vitroでの作用を考慮すると、この結果はProTαが個体レベルにおいても神経細胞の機能亢進あるいは機能維持に関与していることを示すものと考えられる。今後は、本研究によって明らかとなった個体レベルでのProTαの神経機能の関与が、核内に存在するProTαの細胞内からの作用なのか、あるいは神経細胞外に分泌されたProTαの細胞外からの機能なのかを明確にする必要性があると考える。この課題に取り組むためには大量のリコンビナントProTαが必要となる。これまでのProTαの精製手法にはエンドトキシンの混入や蛋白質高次構造の崩壊という問題点を含む可能性が考えられた。そこで、GST融合蛋白質として作製したProTαをユニークなプロテアーゼにより切り出し回収するという新たな精製方法を確立し、in vivo投与に使用可能な高純度のProTαを大量に作製することにも成功した。この精製リコンビナントProTαは、脳領域特異的なProTα欠損マウスの行動異常レスキュー解析に使用できる有益なツールとなると考えられる。平成24年度は、大脳皮質および海馬に特異的な発現が認められるEmx-1のプロモーター制御、ならびに線条体、海馬、小脳顆粒細胞に特異的な発現が認められるg7のプロモーター制御によってCreリコンビナーゼの発現が誘導されるマウスとFloxed ProTαKnockinマウスを交配させることで得られた、大脳皮質と海馬領域特異的にProTαを欠損マウス(ProTα-Emx-1/Creマウス)と線条体、海馬、小脳顆粒細胞特異的にProTαを欠損マウス(ProTα-g7/Creマウス)を用いて以下の解析を試みた。ProTαの欠損確認:まず、それぞれのマウスにおいて予測される脳領域でのProTαの発現が欠損していることを免疫組織化学染色法を用いて解析した。その結果、ProTα-Emx-1/Creマウスでは大脳皮質と海馬領域の神経細胞において、また、ProTα-g7/Creマウスでは線条体、海馬領域の神経細胞と小脳顆粒細胞特異的にProTαの欠損が認められた。このことから、それぞれのマウスは、設計した通りの脳領域特異的なProTα欠損マウスであることが確認された。ProTα欠損領域での遺伝子発現変化の解析:ProTα-Emx-1/CreマウスのProTα欠損領域である海馬での遺伝子発現を野生型マウスとDNAマイクロアレイシステムを用いて比較し解析した結果、ProTαを欠損した海馬では神経活動に必要ないくつかの遺伝子の発現が有意に減少していることが明らかになった。平成24年度は、タイプの異なる2系統の脳領域特異的なProTα欠損マウスの産出に成功した。この結果は、作製したマウスを本研究課題に使用することの妥当性を示すものである。また、そのうち1系統においてProTα欠損領域での遺伝子発現の変化を野生型マウスと比較し網羅的に解析することで、ProTα欠損領域において神経細胞の活動に必要ないくつかの遺伝子の発現が減少していることも明らかにした。

この結果は、次年度に計画している脳領域特異的なProTα欠損マウスの行動科学的解析より得られる結果と併せることで、特異的な脳領域の神経細胞においてProTαが関与する分子制御基盤を解明するための非常に重要な手がかりとなる。このように平成24年度の研究実績は研究目的の達成に直結したものであり、実験計画は概ね順調に伸展していると考えられる。1)通常状態での脳領域特異的なProTα欠損マウスの行動科学的解析:領域特異的なProTα欠損マウスの通常状態における形態的解析として、マウス行動に関する網羅的検査パッケージ(SHIRPA法)を用いて解析するとともに、行動科学的解析として自発運動、活動リズム(KUROBOXシステム)、記憶・学習(KUROBOXシステム、フィアーコンディショナルテスト)などに関する行動解析を行いProTαの欠損部位と行動異常の関連性を明らかにする。2)ProTα欠損に依存した行動異常と遺伝子発現変化の関連性の検証:平成24年に行ったProTα-Emx-1/CreマウスのProTα欠損領域での遺伝子発現変化の解析によって変動が認められた分子の中で、項目1)で示された行動異常に関連性のある候補分子を抽出する。次に、その遺伝子をProTα欠損領域に発現させ行動異常が改善すること、さらに、野性型マウスの対応する脳領域その遺伝子の発現を抑制し行動異常が再現することを確認し、ProTα欠損に依存した行動異常の原因となる分子について検証する。3)ProTα欠損による遺伝子発現変化の原因を検証するためのES細胞の樹立:ProTα-Emx-1/Creマウスの解析によって認められたProTα欠損領域での遺伝子発現変動が、単に神経細胞からのProTαが欠損することで生じるのか、あるいはProTαが欠損した状態が持続することによって生じるかを検討するために、ProTα欠損マウスの胎盤胞の内部細胞塊よりES細胞を単離・調整する。平成25年度の直接経費は、1300千円である。解析に使用する動物購入費や細胞樹立などに使用する細胞培養関連試薬およびディスポーザブル器具の購入費などを含む物品費として1050千円を計上する。また、本年度は、学会発表ならびに情報収集に必要な旅費として200千円を計上する。さらに印刷代などをその他の費用として50千円計上する。
'アルカリ金属原子-ヘリウム'分子とクラスターの生成とレーザー分光

環境の熱運動による様々な緩和に隠れていた素過程は、原子を極低温下におくと観測することができる。それら原子の位相情報は、量子力学の理解を深めることに役立つ。液体・固体ヘリウム中ツリウム原子の分光では、ヘリウム原子の摂動が小さい内殻電子遷移に注目した。実験では、固体ヘリウムに捕獲したツリウム原子の長寿命な準安定状態を観測できた。これは固体ヘリウム中原子の精密測定への応用を可能にする結果である。このように媒質に原子を捉える方法以外に、レーザー冷却によって原子を捉えることができる。レーザー冷却原子は高密度に存在するので、原子間相互作用が光学遷移に影響を与える。冷却原子は原子時計にも応用されているので、高密度な原子と光の相互作用を理解することは重要である。高密度の極限として結晶中の分子の光学遷移を時間・スペクトル分解して観測した。極低温における薄層高密度な酸素分子では、光励起による完全反転分布から超放射が見られた。極低温の原子分子は弱い結合で環境と相互作用している。これを光学的手法のみによって非破壊的に観測することは難しいので、レーザー光とラジオ波を判用して磁気共鳴的に測定する。また共鳴周波数の化学シフトによってクラスターの種類、クラスターの存在する環境も区別することが可能になる。印加する磁場に勾配をつけると3次元磁気共鳴映像を観測できるので、極低温環境下のクラスターの密度分布を知ることもできる有用な手法である。現在室温ガラスセル中に^4HeとCsを封入し、磁気共鳴信号と2次元磁気共鳴映像を観測している。光偏極・光検出しているので高感度にCs原子分布の映像が得られている。映像の観測時刻と光偏極時刻の間隔を変化させると、偏極したCs原子のHe気体中における拡散を観測できる。今後ガラスセルの温度を変えて拡散の変化を調べ、さらに低温希ガス原子の磁気共鳴映像を観測する予定である。アルカリ金属原子とヘリウム原子からなるクラスターの構造・緩和機構について、超流動ヘリウム中の原子の分光実験によってデータが蓄積されてきた。アルカリ金属原子と比較するため、希土類元素であるツリウム原子を超流動あるいは固体ヘリウム中に注入して分光実験を行なった。ツリウム原子は外殻電子の遷移や外殻電子によって外部からの摂動が遮蔽された内殻電子の遷移など様々な種類の遷移が存在し、原子間の相互作用を研究するのに適した原子である。実験では、外殻電子遷移や内殻電子遷移などの種類によって様々な幅をもつスペクトル線が観測された。また励起状態の100nsから100msの6桁にわたる異なる寿命・緩和時間をデジタル遅延パルス発生器を購入して測定することができた。超流動ヘリウム中の原子の励起状態は、その電子波動関数の形状によって周りのヘリウム原子の配置を変える。つまり励起状態が変わればヘリウム原子の位置が変わるだけでなく、ヘリウム原子の数まで変わる。発光スペクトル線のエネルギーと電子状態エネルギーの半定量的計算結果とを比較し、原子の周りのヘリウム原子の位置・数の異なる、いわば異なるクラスターの発光に関する実験が報告されている。しかし、周りのヘリウム原子配置を直接に光学的手法によって観測することは難しい。現在、その予備的実験として、室温セルにアルカリ金属とヘリウムを入れて磁気共鳴信号を観測している。アルカリ金属原子の電子軌道とヘリウム原子核の重なりは非常に小さいが、核スピンのゼロでないヘリウム3にすれば、アルカリ金属原子とヘリウム原子との相対位置による共鳴周波数の変移を観測することができると期待している。極低温環境下における結合の弱いアルカリ金属原子-ヘリウムクラスターのエネルギー・構造を光学的手法のみによって観測することは難しい。

これを克服するためレーザー光と共にラジオ波を使用すれば、磁気共鳴的手段により結合の弱いクラスターを非破壊的に測定できると思われる。また磁気共鳴周波数の化学シフトによってクラスターの種類、クラスターの存在する環境も区別することが可能になる。さらに、印加する磁場に勾配をつけると3次元磁気共鳴映像を観測できるので、極低温環境下のクラスターの存在密度を知ることもできる有用な手法である。現在その前段階の実験として、室温のガラスセル中に^4EHe(約700Torr)とCsを封入し、磁気共鳴信号と2次元磁気共鳴映像を観測している。CsD^1線に共鳴するレーザーで光ポンピング・光検出しているので、高感度にCs原子分布の映像が得られている。映像を観測する時刻を光ポンピングの時刻から遅らせると、磁気共鳴映像の鮮明さが消失している。これは光ポンピングされたCs原子がHe気体中で拡散していることを示している。これまで気体試料の磁気共鳴映像を観測した例がほとんどないので、拡散を映像として観測できたことは注目すべき成果である。今後ガラスセルの温度を変えて、拡散などの変化を調べる予定である。上で述べた成果を発展させると、低温希ガス原子の磁気共鳴映像が得られる。核スピンのゼロでない希ガスをバッファにして、アルカリ金属原子から希ガス原子へのスピン偏極移行によって、希ガス原子の磁気共鳴信号を得る。アルカリ金属原子の電子軌道とヘリウム原子核の重なりは非常に小さいので、まずキセノン原子でスピン緩和などを調べた後、極低温ヘリウム3でアルカリ金属原子とヘリウム原子との相対位置による共鳴周波数の変移を観測する予定である。
アネキシン5遺伝子発現調節機構の解析

本研究計画は、新しいパラクリン/オートクリン因子と推定される、アネキシン5の遺伝子発現調節機序を解析し、アネキシン5が下垂体、卵巣における局所的な調節因子である可能性を追求したものである。今年度の実施結果は以下のように要約される。1. RT-PCR法を用いた、アネキシン5mRNAの定量アネキシン5のmRNA発現量を解析するために、RT-PCR法を利用した定量法を開発した。既に、内部標準とするG3PDHmRNAを同時に同一チューブ内で増幅するためのプライマーの設計、PCR条件の検討を終えた。この系を用いて下垂体、卵巣のアネキシン5mRNA量の変化を追跡中である。アネキシン5が、下垂体、卵巣を初めとした数々の組織に存在することを見いだしている。しかし、これらの組織は複数の細胞種の混在する組織であり、アネキシン5は、産生細胞によって細胞外に供給されている。そこで、どの細胞種がアネキシン5を産生し、これを局所に供給しているかを知るため、in situ hybridization法を用いて、アネキシン5mRNAの組織内分布を明らかにし、免疫組織化学法から得られた知見と比較検討した。卵巣でまず実験を行い、黄体細胞の中でも大型の細胞にmRNAの出現することを明らかにした。3.アネキシン5の細胞作用の検討ホルモン分泌を指標としてアネキシン5の効果を検討中である。下垂体ホルモン(LHとプロラクチン)の時間分解免疫測定法を開発し、初代培養系で組換えアネキシン5、アンチセンスDNAの効果を検討中である。2. In situ hybridization法を用いた、アネキシン5産生細胞の同定アネキシン5が、下垂体、卵巣を初めとした数々の組織に存在することを見いだしている。
高感度カラ-マイクロスコ-プによる辺縁歯肉の臨床的診断法に関する研究

歯冠補綴物の適応症の選択や予後の判定に実効のある新しい臨床的診断基準を確立することを目的として、高感度カラ-マイクロスコ-プ(拡大率250倍)を用い、歯冠補綴の立場から炎症性歯周病変の開始期における辺縁歯肉の微細構造の形態的変化をとらえることを試み、以下の結果を得た。被験者は肉眼的には観察部位の歯肉に炎症が認められない者21名(男7名、女14名、年令1935歳)、観察部位は上顎前歯部唇側辺縁歯肉及び歯間乳頭部とし、被験歯総数は73歯(歯周ポケットの深さ1.0mm2.5mm)である。<結果>1.高感度カラ-マイクロスコ-プの使用により、容易に辺縁歯肉の微細構造、特に毛細血管係蹄の状態を観察することができた。2.血管係蹄の状態を脚部の形態から(1)単純ヘアピン型、(2)脚部交又型、(3)脚部波状型に分類できた。3.辺縁歯肉の毛細血管係蹄の状態は初期歯周病変を診断するためのパラメ-タとして有効であり、血管係蹄の形態および各分類型の分布、単位面積あたりの係蹄数などから初期の炎症性歯周疾患の診断が可能であると考えられる。4.マイクロスコ-プの画像をビデオレコ-ダ-システムにより、ディスクファイルに記録、保存することにより経時的な変化を把握することが可能である。5.今回使用したマイクロスコ-プは構造上観察部位が限定され、臼歯部の観察は不可能である。前歯部においても画像の良否は歯槽部の形態に大きく左右されるという問題点も明らかになったことから、小型化、軽量化など更なる改良が必要である。
尿道炎におけるUreaplasma urealyticumのDNA診断法の開発

U.urealyticumの16S ribosomalRNA遺伝子に相補的なoligonucleotideを合成し、伸長用プライマーとして用い、PCRをおこない15株のU.urealyticum臨床分離株から177bpのDNA断片の増幅が確認された。C.trachomatis、N.gonorrhoeae、M.hominis、M.pneumoniae、その他尿路感染症の原因となるE.coliなどのグラム陰性桿菌やグラム陽性球菌のDNAを用いた場合には、PCRにてDNAの増幅は認められなかった。PCRによるU.urealyticumの検出感度は、4.4×10^2コ/PCRであった。PCRによるU.urealyticumの検出方法は、U.urealyticumに特異的で、感度においても優れた検出方法であり、DNAの抽出から、電気泳動によるDNA断片の確認まで約6時間で可能であり、迅速性においても優れた方法であった。非淋菌性尿道炎においては検体採取時に患者に苦痛を与えない初尿を用いた診断法が主流となりつつあるので、男子尿道炎患者の初尿沈渣からのPCR法によるU.urealyticumの検出を行なった。男子尿道炎患者46例の初尿からPCR法およびT-broth法によるU.urealyticumの検出を試みたが、PCR法によるU.urealyticumの検出結果のT-broth法の結果に対する陽性一致率は68%(15/22)であり、陰性一致率は100%(24/24)であった。U.urealyticumのPCR法による検出率が、T-brothによる検出率より低値であったことから、尿の何らかの成分によるPCRの抑制に伴う偽陰性あるいはU.urealyticum以外の細菌によるT-broth法における偽陽性の可能性があった。そこでT-brothにより赤変した培地をT-agarにて培養し、U.urealyticumの同定を行い、さらに、尿成分によるPCRの抑制を防ぐために尿検体からのDNAの抽出方法の再検討も行なった。U.urealyticumの16S ribosomalRNA遺伝子に相補的なoligonu cleotideを合成し、伸長用プライマーとして用い、PCRをおこない15株のU.urealyticum臨床分離株から177bpのDNA断片の増幅が確認された。当初計画は、男子尿道炎患者の尿道擦過物からのU.urealyticumの検出であったが、非淋菌性尿道炎においては検体採取時に患者に苦痛を与えない初尿を用いた診断法が主流となりつつあるので、男子尿道炎患者の初尿沈渣からのPCR法によるU.urealyticumの検出に変更した。

男子尿道炎患者46例の初尿からPCR法およびT-broth法によるU.urealyticumの検出を試みたが、PCR法によるU.urealyticumの検出結果のT-broth法の結果に対する陽性一致率は68%(15/22)であり、陰性一致率は100%(24/24)であった。U.urealyticumのPCR法による検出率が、T-brothによる検出率より低値であったことから、尿の何らかの成分によるPCRの抑制に伴う偽陰性あるいはU.urealyticum以外の細菌によるT-broth法における偽陽性の可能性があり現在検討中である。U.urealyticumの16S ribosomalRNA遺伝子に相補的なoligonucleotideを合成し、伸長用プライマーとして用い、PCRをおこない15株のU.utealyricum臨床分離株から177bpのDNA断片の増幅が確認された。C.trachomatis、N.gonorrhoeae、M.hominis、M.pneumoniae、その他尿路感染症の原因となるE.coliなどのグラム陰性桿菌やグラム陽性球菌のDNAを用いた場合には、PCRにてDNAの増幅は認められなかった。PCRによるU.urealyticumの検出感度は、4.4×10^2コ/PCRであった。PCRによるU.urealyticumの検出方法は、U.urealyticumに特異的で、感度においても優れた検出方法であり、DNAの抽出から、電気泳動によるDNA断片の確認まで約6時間で可能であり、迅速性においても優れた方法であった。非淋菌性尿道炎においては検体採取時に患者に苦痛を与えない初尿を用いた診断法が主流となりつつあるので、男子尿道炎患者の初尿沈渣からのPCR法によるU.urealyticumの検出を行なった。U.urealyticumのPCR法による検出率が、T-brothによる検出率より低値であったことから、尿の何らかの成分によるPCRの抑制に伴う偽陰性あるいはU.urealyticum以外の細菌によるT-broth法における偽陽性の可能性があった。そこでT-brothにより赤変した培地をT-agarにて培養し、U.urealyticumの同定を行い、さらに、尿成分によるPCRの抑制を防ぐために尿検体からのDNAの抽出方法の再検討も行なった。
木質構造物の剛性偏心・耐力偏心を考慮した弾塑性挙動の解明

集成材フレームと木質耐力壁を併用した1層箱型試験体4体の振動台実験を実施し、耐力偏心を有する構造体の弾塑性挙動について実験的に検討した結果、以下の知見が得られた1)低靱性フレームと耐力壁を併用した場合でも、フレームに十分な高耐力があれば、高い耐震性能を有する2)高靱性フレームと耐力壁を併用した場合でも、フレームにある程度の耐力があれば、高耐震性能を有する3)疑似立体解析により併用構造の弾塑性挙動をおおむね追跡可能である。(1)剛性・耐力偏心を考慮した木質複合構造物の実大振動実験(1)実大振動台実験の予備試験として、高剛性低靭性タイプと低剛性高靭性タイプの集成材フレームの構造性能に関する情報収集を行った。収集した情報に基づき、集成材フレームの荷重変形関係を仮定し、実大振動台実験試験体の動的挙動を予測するための予備解析を実施した。(2)2種類の集成材フレームと木質耐力壁を並列に配置した1層箱型試験体を1棟ずつ、合計2体作成し、実大振動台実験を実施した。入力地震動は日本建築センター波(L1,L2)とした。各構面の負担水平力を把握するため、三分力計を配置した。実験結果として、いずれの試験体とも併進的な振動から木質耐力壁側が大きくねじれる挙動を示した。解析結果と比較すると、実験結果の方が大きくねじれる傾向を示した。(2)耐力偏心が木質複合構造物の弾塑性時の挙動に与える影響を考慮した設計法の提案1層立体試験体を模した2つの解析モデル(集成材フレームと木質耐力壁を耐震要素とする擬似立体モデルと、集成材フレームと木質耐力壁の耐震要素の構造性能を加算した1質点モデル)に対し地震応答解析を実施し、応答値を比較した。集成材フレームの剛性・耐力・変形性能をパラメータとした。解析結果から、弾性剛性は耐力壁より低くても、最大耐力が耐力壁と同程度で、かつ変形性能を有する集成材フレームでは、擬似立体モデルの応答変位は質点系と大きく変わらないこと、弾性剛性は耐力壁より高くても、変形性能に乏しいフレームでは、擬似立体モデルの応答変位は質点系モデルよりも大きくなる可能性があることが確認された。H24年度は、震災の影響で実施できなかった23年度実施予定の振動台実験を実施した。試験体は3.64m×3.64m、高さ2.8mの1層箱型試験体で、加振方向および加振直交方向に2構面を有する。加振方向には集成材フレーム及び耐力壁を1構面ずつ、加振直交方向には加振方向と同性能の耐力壁を有する。集成材フレームの接合形式は引きボルト形式とし、部材断面と接合ボルトの断面と材種を変化させることにより、「低剛性高靱性タイプ」と「高剛性低靱性タイプ」の2種類を設け、計2体について実験を実施した。試験体にはフレームと耐力壁の短期許容せん断耐力の単純和がC0換算で0.2となるように錘を設置した。

また各構面の加速度、各構面の層間変位、脚部および接合部の相対変位を加速度計及び変位計により、加振方向の鉛直構面の水平力を荷重計により計測した。加振波は日本建築センター波(以下「BCJ波」)のLevel1(100galに調整)およびLevel2(100%:355gal)を入力した。加振結果について、低剛性高靱性、高剛性低靱性タイプともにLevel1(100gal)では損傷は確認されず、弾性範囲の応答であった。一方、Level2(355gal)では、両タイプとも最大で1/20rad.を超える応答変位となった。フレームの破壊性状について、低剛性高靱性タイプでは接合ボルトに塑性変形が生じたが柱梁部材に割れ等の損傷は確認されなかった。一方高剛性低靱性タイプでは、引きボルト接合部のボルト定着部の木部せん断破壊がすべての接合部で生じていた。Level2加振時の両試験体の応答変位について、高剛性低靱性タイプのボルト定着部での木部せん断破壊が生じた際に変形が大きくなったが、加振終了時の最大変位は同程度となり、また加振中両者に大きなねじれ変形は生じなった。実験的検討として、集成材フレームと木質耐力壁を併用した構造物の動的挙動を確認するための実大振動台実験を実施し、併用構造物特有の振動性状を確認できた。解析的検討として、集成材フレームと木質耐力壁を併用したモデルの安全性について検討を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である24年度は、主として解析的検討を中心に行い、耐力偏心が木質複合構造物の弾塑性時の挙動に与える影響を考慮した設計法の提案を行う。
チェアサイドで可能な歯槽骨破壊活性検査法の開発

目的:歯肉溝滲出液(GCF)には歯周組織の代謝活性を反映した物質として硫酸化グリコサミノグリカン(S-GAG)が含まれており歯周病変活性の動的な指標として用いる研究が進められている。近年、このS-GAG値を簡便に測定する簡易微量測定法が開発されS-GAG値とクリニカルパラメーターや骨代謝との関連について検討されている。本測定法は、歯周病変活性を呈色によって示す方法であるため活性のモニター、患者のモチベーションとしてチェアサイドで行うことが望ましい。しかし現在用いられている呈色法はバックグラウンドの脱色のために長時間必要とし、臨床の現場で用いるには時間の短縮が避けられない。本研究は、本法の滲出液採取後の時間短縮をはかり、S-GAG値と連動した呈色の違いを患者に示す色見本を作製し、協力が得られた患者について経時的に本法を応用し、色判断によるチェアサイドでの病変活性モニターの可能性について検討した。被験対象:1)メインテナンス患者:本学附属病院歯周病科を受診しメインテナンス期間に入った患者33名(男性23名、女性10名3674歳平均年齢63.7歳)を対象とした。被験部位は5mm以上のポケットを有する40部位(前歯部8部位、臼歯部32部位)を選択した。被験者は13ヶ月に一度の来院時にペーパーストリップスによる歯肉溝滲出液採取と臨床検査項目としてポケットデプス(PD)、アタッチメントレベル(CAL)の測定を行った。2)急性歯周膿瘍:本学附属病院歯周病科に急患で来院し急性歯周膿瘍と診断された6名(男性3名、女性3名4866歳、平均58.2歳)の合計8部位を対象とし、ペーパーストリップスによる滲出液の採取の後消炎処置を行った。その後1週間時、1ヶ月時に同様に滲出液の採取を行い簡易微量測定法によってS-GAG値を算出した。結果及び考察:10分間浸漬中に1分間の振動を加えた方法では、従来の洗浄方法と比較して90%以上の割合の染色度が得られた為、滲出液採取後染色時間5分、脱色時間10分の計15分に短縮した方法はチェアサイドでの応用可能と考えられた。本法を用いて5mm以上のポケットを有する部位の長期観察を行った結果、測定期間中S-GAG値が大きく変動したAグループ(10例)、中程度変動したBグループ(15例)、殆ど変動しなかったCグループ(15例)に分けられた。測定開始時と最終測定時の間におけるアタッチメントロスはAグループで70%、Bグループで53%、Cグループで0%の値を示し、S-GAG値が高値を示したグループにおいて高い比率で見られた。また急性歯周膿瘍時、高値を示すS-GAG値は消炎処置後低値を示した。洗浄時間10分でペーパーストリップスを判定可能なまでに脱色でき、またシェードガイドによる呈色度合の判定ができることからからチェアサイドで患者に現在の歯周病変活性を提示出来ると考えられる。高値を示したAグループではアタッチメントロスが高い比率で見られ、低値で推移したCグループではアタッチメントロスが見られなかったことから簡易微量測定法は歯周組織破壊のモニターに有用であると考えられる。歯肉溝滲出液(GCF)には局所の炎症反応に関連した物質が含まれており、これら物質を測定することによって歯周病診断の客観的テスト法を開発する研究が行われている。細胞外マトリックス成分である硫酸化グリコサミノグリカン(S-GAG)はGCFに存在し、組織の代謝産物であると考えられている。特に、活動性の歯周疾患やインプラント植立時、歯牙の矯正時のGCFに多く含まれることから歯周疾患の活動性の有力なマーカーになりえるのではないかと考えられている。本研究はチェアサイドで歯周炎の活動性を判定することを最終目標として歯周炎患者を対象に歯周初期治療前後の患者のGCF中のS-GAGを簡易微量測定法で分析し、本測定法の歯周炎の組織破壊の指標としての可能性を検討する目的で行った。試料は健常者、歯肉炎、歯周炎患者からセルロースアセテート膜ストリップスを用いて採取した。その後直ちにpH1.5に調整したグアニジン塩酸、塩化マグネシウム、硫酸溶液を含むアルシアンブルー染色液に5分間浸し、その後洗浄液で40分脱色した。その後ストリップスを自然乾燥させ、2波長クロマトスキャナーで、染色濃度と染色面積からスキャナー値を算出し、標準試料に換算して測定試料に含まれるS-GAG量を測定した。健常、歯肉炎患者に比較して、歯周炎患者から得られた試料中のS-GAG量は有意に高値を示した。しかし、歯周初期治療後有意に低下した。初期治療前のGCF中に含まれるS-GAG量は臨床検査値が高くなるに従って多くなったが、治療後は臨床検査値の値に関わらず、一定の低値を示した。来年度では本測定法とELISA法で得られた測定値との相関関係、各臨床検査値との相関関係の検定を行い、本簡易微量測定法のバイオマーカーとしての信頼性検討を行う予定である。また、メインテナンス中の患者を対象に、本法で得られた測定結果が予知性を表すことができるかどうか検討する。

近年、このS-GAG値を簡便に測定する簡易微量測定法が開発されS-GAG値とクリニカルパラメーターや骨代謝との関連について検討されている。本測定法は、歯周病変活性を呈色によって示す方法であるため活性のモニター、患者のモチベーションとしてチェアサイドで行うことが望ましい。しかし現在用いられている呈色法はバックグラウンドの脱色のために長時間必要とし、臨床の現場で用いるには時間の短縮が避けられない。本研究は、本法の滲出液採取後の時間短縮をはかり、S-GAG値と連動した呈色の違いを患者に示す色見本を作製し、協力が得られた患者について経時的に本法を応用し、色判断によるチェアサイドでの病変活性モニターの可能性について検討した。被験対象:1)メインテナンス患者:本学附属病院歯周病科を受診しメインテナンス期間に入った患者33名(男性23名、女性10名3674歳平均年齢63.7歳)を対象とした。被験部位は5mm以上のポケットを有する40部位(前歯部8部位、臼歯部32部位)を選択した。被験者は13ヶ月に一度の来院時にペーパーストリップスによる歯肉溝滲出液採取と臨床検査項目としてポケットデプス(PD)、アタッチメントレベル(CAL)の測定を行った。2)急性歯周膿瘍:本学附属病院歯周病科に急患で来院し急性歯周膿瘍と診断された6名(男性3名、女性3名4866歳、平均58.2歳)の合計8部位を対象とし、ペーパーストリップスによる滲出液の採取の後消炎処置を行った。その後1週間時、1ヶ月時に同様に滲出液の採取を行い簡易微量測定法によってS-GAG値を算出した。結果及び考察:10分間浸漬中に1分間の振動を加えた方法では、従来の洗浄方法と比較して90%以上の割合の染色度が得られた為、滲出液採取後染色時間5分、脱色時間10分の計15分に短縮した方法はチェアサイドでの応用可能と考えられた。本法を用いて5mm以上のポケットを有する部位の長期観察を行った結果、測定期間中S-GAG値が大きく変動したAグループ(10例)、中程度変動したBグループ(15例)、殆ど変動しなかったCグループ(15例)に分けられた。測定開始時と最終測定時の間におけるアタッチメントロスはAグループで70%、Bグループで53%、Cグループで0%の値を示し、S-GAG値が高値を示したグループにおいて高い比率で見られた。また急性歯周膿瘍時、高値を示すS-GAG値は消炎処置後低値を示した。洗浄時間10分でペーパーストリップスを判定可能なまでに脱色でき、またシェードガイドによる呈色度合の判定ができることからからチェアサイドで患者に現在の歯周病変活性を提示出来ると考えられる。高値を示したAグループではアタッチメントロスが高い比率で見られ、低値で推移したCグループではアタッチメントロスが見られなかったことから簡易微量測定法は歯周組織破壊のモニターに有用であると考えられる。
マウス始原生殖細胞発生過程におけるX染色体再活生化の解析

Oct4遺伝子のプロモータによりPGCでGFPを発現するTgマウスを用い、11、12、13日目の3ステージの胚から、GFPの蛍光を指標にPGCを回収、マイクロアレイ解析を行った。対象としては市販のUniversal Mouse Referenceを用いた。遺伝子発現パターンの比較のために胚性幹(ES)細胞、ES細胞を分化させて得られたPGC様細胞や、胚性生殖細胞(EG)細胞さらに、精原細胞由来の幹細胞であるGS細胞も用い、近年注目されている幹細胞とPGCの比較を行った。得られたアレイデータは主成分分析(PCA)や自己組織化マッピング法(SOM)により、クラスタリングを行った。その結果、各種生殖細胞と幹細胞とは二つのまったく異なる細胞群に分類できることが分かった。一つ目のグループはES細胞と雄由来のEG細胞とからなり、他方のグループには、PGC、PGC様細胞、GS細胞と、雌由来のEG細胞が含まれていた。同じステージのPGCから樹立されたEG細胞が、雌雄によってまったく異なる発現プロファイルを示しており、性染色体の構成が異なるだけで、まったく同じ培養条件下においても遺伝子発現の状態が異なるという知見が得られた。さらに、クラスタリングにより、PGC特異的な発現を示す遺伝子群、幹細胞特異的発現を示す遺伝子群を同定することが出来た。X染色体再活性化を可視化する実験系については技術的な問題が生じ、実際にPGCにおいて再活性化現象を観察することが出来なかった。しかし、大阪大学・小林慎博士との共同研究により、初期胚において、X染色体上の遺伝子がインプリンティングを受けていることを発見し、X染色体上の遺伝子の発現制御に関する新たな知見を得ることが出来た。始原生殖細胞(PGC)におけるX染色体の再活性化をXist RNAを可視化し、PGCにおける再プログラム化の指標として用いることを目標とした研究を行っている。X染色体活性変化はタンパク質をコードしないXist RNAに支配されており、配列特異的RNA結合タンパク質MS2を用いて生きた細胞内におけるXist RNAの可視化を試みている。これまでにX染色体不活性化中心を含むBACのXist遺伝子へMS2認識配列の導入に成功、さらにノックインマウス作製のBAC改変とコンストラクト作成を行っている。また、MS2タンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質を全身的に発現する遺伝子導入マウスを作成し、現在その発現を確認している。一方、Oct4遺伝子のプロモータによりPGCでGFPを発現するTgマウスを用い、11、12、13日目の3ステージの胚から、GFPの蛍光を指標にPGCを回収、マイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイの解析はES細胞を対象として用い、ES細胞を分化させて得られたPGC様細胞や、胚性生殖細胞(EG)細胞も用い、近年注目されている幹細胞と、PGCの比較を行った。雄由来のEG細胞はES細胞と非常によく似た遺伝子発現プロファイルを示し、由来となったPGCとは大きく違っていることが分かり、EG細胞の樹立の過程で大規模な遺伝子発現の変化が起きていることが分かった。一方、PGC様細胞はちょうどEG細胞と胚由来のPGCの中間的な発現様式を示し、細胞分化によりPGCの形質に近い状態に分化しているが、不完全であることが分かった。現在、マイクロアレイの結果のクラスタリング解析を行っており、PGC発生過程において重要な発現をする遺伝子の同定を試みている。X染色体再活性化を可視化する結果とあわせて詳細なステージングによりPGCにおけるゲノム再プログラム化を担う遺伝子群の同定ができると考えている。