hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
H2O2/Cu(II)/Cl系反応中に現れる誘導期の研究

誘導期への影響を観察するために次亜塩素酸イオンを加えたところ、弱酸環境下では暴走反応が見られたが、強酸性条件下では暴走反応に至らないうえ、凝集体の確認もできなかった。また次亜塩素酸を加えない通常の反応においても、反応中に液性の変化が見られたことから、反応中の液性が誘導期を呈する時間に影響を与えていることが考えられた。昨年度、計画上H30年度の実施する項目を前倒しし、重点的に遂行したが、今年度はH29年の積み残していた重点項目である誘導期の発生条件の探索,塩素オキソ酸イオンによる検討を実施し、おおむね順調に進展しているといえる。装置の整備が終了したので、H29年度実施予定であった誘導期の発生条件の探索や、反応終了後に残存する化学種の同定を行う。再現性の確保は今後も続けていく予定であるが、初年度と比較して作業になれてきたことから、データ取得作業は迅速化するものと考えている。これまでの成果から、塩素オキソ酸の役割についてより詳細な検討を行い、その知見を基に誘導期の制御・暴走反応防止対策の立案を行う。研究期間内に実施すべき項目の順番を、装置の整備等の理由から入れ替えて実施したことから支出が当初予定額よりも少なくなった。次年度は外部施設にて行う実験,学会など宿泊を伴う出張等も計画しており、未使用額については次年度研究費と併せて使用する予定である。装置の設備の充実のためH29年度に入れ替えたところ当初予定額よりも使用額が少なくなった。
医食同源への分子栄養学的アプローチ;スパイシーフードの感染防御免疫増強効果

唐辛子ならびに唐辛子辛味成分カプサイシンとその構造類似体を高コレステロール血症ラットに経口投与することにより血中コレステロールが正常化することを見出した。そこでそのメカニズムを検討したところ糞便中へのコレステロール排泄量が増加していること、ラットが軟便をきたしていることが明らかになった。人においても激辛料理を食べると便意を催す場合があり唐辛子辛味成分が消化管の蠕動運動の亢進に寄与することが推測された。そこでモルモット小腸小片を用いて唐辛子辛味成分カプサイシンとその構造類似体による収縮弛緩運動を測定し、消化管の蠕動運動の亢進の分子機構を解明した。カプサイシンは小腸カプサイシン受容体を介し神経終末よりヒスタミン、アセチルコリン、サブスタンスPの遊離を促し、それぞれは平滑筋の受容体に作用することにより収縮弛緩運動を誘発することが明らかになった。また小腸収縮弛緩運動は胃とは異なりCGRP、NOなどを介さないことが判明した。カプサイシンの構造類似体として辛味のない新規唐辛子成分カプシエイト、水溶性を増強したカプサイシン配糖体、バニイルアミン、しょうがエキス、胡椒の辛味成分ピペリンも同様にカプサイシン受容体を介し小腸収縮弛緩運動を誘発することが明らかになった。また偶然にもアルギニンリッチペプチドがカプサイシンによる小腸収縮弛緩運動をマイクロモルレベルで抑制することを見出した。このことはたんぱく質食品の消化の際に生成するカプサイシンによる小腸収縮弛緩運動抑制ペプチドを考慮に入れた、たんぱく質性食材の選択により消化管の蠕動運動の亢進が左右されることが示唆された。これらの結果は唐辛子辛味成分を含め各種食材に由来する消化管蠕動運動促進および抑制分子が栄養成分吸収やコレステロール排泄に関与していることを示唆した。今年は、コレステロール添加高脂肪食で飼育したウィスター系ラットを用いて、カプサイシノイドやカプサイシン配糖体を摂取させ血清脂質に及ぽす影響と腸管収縮効果と免疫系サイトカインを検討した。ウイスター系ラットを用い、1)コレステロール添加高脂肪食を投与した対照群、2)対照群にそれぞれトウガラシ粉末10%、3)カプサイシノイド0.03%、4)カプサイシノイド配糖体0.03%を添加し、ペアフィーデイングとした。飼育は個別ケージで4週間行い、飼育終了前3日間糞を採取し、コレステロール排泄率の測定に用いた。トウガラシ粉末、カプサイシノイド、カプサイシノイド配糖体を添加した群は対照群に比べ、血清T-chol、LDL-chol、TGは低下し、特にトウガラシ群、カプサイシノイド群の血清HDL-cholは上昇した。トウガラシ辛味成分による血清コレステロールの改善が認められた。カプサイシノイド群は肝臓TLが、カプサイシノイド配糖体群は肝臓TLとTGが低下し、2群とも糞中chol排泄率が増加した。トウガラシ粉末、カプサイシノイド、カプサイシノイド配糖体を添加したコレステロール添加高脂肪食を摂取したラットにおいて血清コレステロール値が改善することが明らかになった。血清コレステロール値の改善のメカニズムはカプサイシン類を含む飼料を食べたラットでは糞中chol排泄率が増加したことからカプサイシン類によるはコレステロール吸収の抑制による事が示唆された。そこでモルモットを用いカプサイシノイドによる腸管収縮作用を検討したところ強い収縮弛緩が認められ、それがカプサイシン類によるコレステロール吸収の抑制に関与しているものと思われた。なおサイトカインとしてIL1,IL2,IL6,IL12,INF,TNF,MBPに対するペプチド抗体やその抗体チップを作成中である。
原子間力顕微鏡と組み換え蛋白を使った筋分子モーターエネルギー変換の一分子解析

本研究では、ミオシンヘッドの運動にともなう微小な構造変化を検出し、同時に蛍光性ATP分子の結合・解離を観察することにより、ミオシンヘッドにおける化学反応・力学反応の関係を測定することを目標とした。そのため、現有の原子間力顕微鏡(AFM)に、まず、ナノメートル精度で駆動できるステージを組み込んだ。次に、単一蛍光分子が2波長で観察可能となるよう、レーザー、フィルター・ミラー類、微弱光検出システムを組み込んだ。以上のように改良をした装置で、微小変位計測と微弱光検出が同時にできることを確認した。次に、試料の固定方法を検討した。AFM探針と試料基板の間に、非特異的相互作用がないよう、両者ともマイナス電荷を持つよう化学処理をした。しかし、この処理をした場合でも、アプローチの際の押し込み量が大きいと、AFM探針と基板の間に結合力が生じることがわかった。このため、これを回避するためのアプローチ方法を工夫し、2000年9月の生物物理学会で報告した。こうして、まず、試料基板に遺伝子操作で特異的結合部位を導入したミオシンヘッドを使って、ミオシンヘッドをネック部分で特異的に結合させ、これに蛍光性ATPを加えて観察を行った。その結果、蛍光性ATPが基板に結合して輝点として観察できる場所にミオシンヘッドが結合していることを確認できた。次に、ステージを微小にスキャンさせそのミオシンヘッドの場所に探針をゆっくり近づけた。探針がステージとともに動き始めたところで、探針をわずかに押し込み、その後引き上げる。こうしてミオシンヘッドに微小な張力をかけ、ブラウン運動を抑えた状態で、連続測定が可能となった。この測定方法について、2001年3月の応用物理学関連連合講演会で報告する予定である。まだ実験の試行回数が少ないが、このまま試行を繰り返せばミオシンヘッドの化学・力学相関に関する情報が得られると期待できる。
次世代の肥満予防を目指した発育初期のポリフェノール摂取効果の検証と分子機構の解明

ある種の植物由来のポリフェノールは、抗酸化作用や抗炎症作用を有し、さらに肥満や糖・脂質代謝異常を改善することが知られている。しかし、胎生期および乳児期の低栄養に起因する糖・脂質代謝異常に及ぼすポリフェノールの影響に関する知見は少ない。授乳期に摂取するポリフェノールの生理的役割を明らかにするために、以下の実験を行ってきた。妊娠期並びに授乳期に低栄養に曝された母ラットの授乳期にポリフェノールの一種であるケルセチンを雌雄仔ラットに与え、離乳後、実験1として雌性仔ラットに10%果糖液を11週間負荷し、実験2として雄性仔ラットに高脂肪食を44週齢まで負荷した。その結果、実験1では、過剰の果糖摂取した雌性仔ラットの腎臓間質では炎症細胞(マクロファージ)の浸潤数の増加、炎症性サイトカインであるTNF-αのmRNA発現量の増加がみられた。また、オートファジーの指標のひとつとなるLC3B-IIの発現量が減少した。これらに対して、授乳期にケルセチンを摂取し離乳後に過剰の果糖摂取した雌性仔ラットでは、腎臓間質のマクロファージ数やTNF-αのmRNA発現量は減少した。またLC3B-IIの発現量は増加した。このことから、授乳期に摂取したケルセチンは、離乳後の過剰の果糖により生じた慢性炎症やオートファジーの障害を軽減することが示唆された。実験2では、離乳後に高脂肪食を負荷した雄性仔ラットについては、試料の採取は終わっているので、今年度は高脂肪食摂取により生じる慢性炎症や糖・脂質代謝の異常を軽減するかを検討する。昨年度は、胎生期・脂質代謝乳児期に低蛋白食に曝された母ラットが授乳期に摂取するケルセチンは、離乳後、過剰の果糖を負荷し続けた雌性仔ラットの腎臓における影響について検討した。その結果、授乳期にケルセチンを摂取し、離乳後に過剰の果糖を11週間摂取した雌性仔ラットでは、腎臓における1マクロファージの浸潤やTNF-αのmRNA量の減少、2オートファジーにかかわるLC3B-IIの発現量の増加やp62発現量の減少などを見出し、授乳期に摂取したケルセチンは離乳後、過剰の果糖を摂取した雌性仔ラットの腎臓における慢性炎症を抑制し、オートファジーを促進する可能性が示唆された。このような結果をまとめて、現在、投稿準備を進めている。以上のことから、初年度の成果は目標を概ね達成していると判断した。今年度は、離乳後に高脂肪食を負荷した雄性仔ラットから得た試料を用いて、授乳期に摂取したケルセチンの生理調節機構を明らかにするために、雄性仔ラットが摂取する高脂肪食によって生じる腎臓をはじめ、他の臓器中の慢性炎症かかわるマクロファージの浸潤の程度、炎症性サイトカインの発現量やオートファジーにかかわる因子の発現量などに及ぼすケルセチンの影響を検討し、もし、影響を及ぼすならば、エピジェネティックな働きに関与する酵素(DNAメチル基転移酵素やヒストン脱アセチル化酵素)などの発現や活性を調べる。以上から、結果を取りまとめて、成果の発表を行う。胎生期や乳児期の低栄養によって、成長後の子の肥満の発症リスクが増大することがわかってきた。植物由来のある種のポリフェノールは、成人や成獣を用いた動物実験で肥満を改善することが知られている。また、肥満の発症には、エピジェネティクスな制御が関与しているという。しかし、ポリフェノールの摂取によって、胎生期や乳児期の低栄養に起因する肥満を改善するのか、また、低栄養に曝された子に生じる肥満においてポリフェノールがエピジェネティックな制御に関与するのかについてはよくわかっていない。これまで、胎生期および乳児期に低蛋白食に曝された母ラットが授乳期に摂取する緑茶抽出物(GTE)は、離乳後、高脂肪食を負荷し続けた雄性仔ラットの腎臓中の炎症細胞の浸潤、線維化面積や炎症性サイトカインの1つであるTumor necrosis factor-αのmRNA量を軽減することを明らかにした。しかし、授乳期に摂取したGTEがエピジェネティックな制御に関与する因子に影響を及ぼすかについてはわかっていなかった。そこで、今年度は、授乳期に摂取したGTEのDNAメチル基転移酵素(DNMTs)、ヘミメチル化DNA結合タンパク質(Uhrf1)、ヒストンメチル基転移酵素であるG9aのmRNA発現量に及ぼす影響を調べた。その結果、授乳期にGTEを摂取した群では摂取しない群に比べて、DNAのメチル化の維持に関わるDNMT1のmRNA量は減少した。一方、DNMT3aでは有意な減少は見られなかった。また、UHRF1やG9aの発現量は減少した。これらの結果は、授乳期に摂取するGTEは、エピジェネティックな制御を介して、高脂肪食の摂取により生じる腎臓の炎症や線維化を軽減する可能性を示唆していた。初年度では、胎生期および乳児期に低蛋白食に曝された母ラットが授乳期に摂取する緑茶抽出物(GTE)は、離乳後、高脂肪食を負荷し続けた雄性仔ラットの腎臓においてエピジェネティックな制御に関与するDNAメチル基転移酵素(DNMT)、UHRF1、G9aのmRNA発現量をリアルタイムPCR報告により解析した。これにより、授乳期にGTEを摂取した母ラットから産まれた雄性仔ラットの腎臓で認められたマクロファージの浸潤、線維化、炎症性サイトカインの低減は、エピジェネティックな制御が関連することを示した。これまでの成果をまとめて国際学術雑誌に公表することができた。

以上のことから、初年度の成果は目標を概ね達成していると判断した。ある種の植物由来のポリフェノールは、抗酸化作用や抗炎症作用を有し、さらに肥満や糖・脂質代謝異常を改善することが知られている。しかし、胎生期および乳児期の低栄養に起因する糖・脂質代謝異常に及ぼすポリフェノールの影響に関する知見は少ない。授乳期に摂取するポリフェノールの生理的役割を明らかにするために、以下の実験を行ってきた。妊娠期並びに授乳期に低栄養に曝された母ラットの授乳期にポリフェノールの一種であるケルセチンを雌雄仔ラットに与え、離乳後、実験1として雌性仔ラットに10%果糖液を11週間負荷し、実験2として雄性仔ラットに高脂肪食を44週齢まで負荷した。その結果、実験1では、過剰の果糖摂取した雌性仔ラットの腎臓間質では炎症細胞(マクロファージ)の浸潤数の増加、炎症性サイトカインであるTNF-αのmRNA発現量の増加がみられた。また、オートファジーの指標のひとつとなるLC3B-IIの発現量が減少した。これらに対して、授乳期にケルセチンを摂取し離乳後に過剰の果糖摂取した雌性仔ラットでは、腎臓間質のマクロファージ数やTNF-αのmRNA発現量は減少した。またLC3B-IIの発現量は増加した。このことから、授乳期に摂取したケルセチンは、離乳後の過剰の果糖により生じた慢性炎症やオートファジーの障害を軽減することが示唆された。実験2では、離乳後に高脂肪食を負荷した雄性仔ラットについては、試料の採取は終わっているので、今年度は高脂肪食摂取により生じる慢性炎症や糖・脂質代謝の異常を軽減するかを検討する。昨年度は、胎生期・脂質代謝乳児期に低蛋白食に曝された母ラットが授乳期に摂取するケルセチンは、離乳後、過剰の果糖を負荷し続けた雌性仔ラットの腎臓における影響について検討した。その結果、授乳期にケルセチンを摂取し、離乳後に過剰の果糖を11週間摂取した雌性仔ラットでは、腎臓における1マクロファージの浸潤やTNF-αのmRNA量の減少、2オートファジーにかかわるLC3B-IIの発現量の増加やp62発現量の減少などを見出し、授乳期に摂取したケルセチンは離乳後、過剰の果糖を摂取した雌性仔ラットの腎臓における慢性炎症を抑制し、オートファジーを促進する可能性が示唆された。このような結果をまとめて、現在、投稿準備を進めている。一般に、ある種の植物性ポリフェノールは、肥満や耐糖能異常を改善することが知られているが、胎生期および乳児期の低栄養に起因する脂質や糖代謝の異常に及ぼすポリフェノールの影響に関する知見は少ない。胎生期の栄養環境が、何らかの形で「記憶」されるというエピジェネティックな働きが関与し、成長後の肥満の発症に大きく関わっているという。しかし、ポリフェノールは、胎生期の栄養環境に起因する肥満を予防するのか、さらに、肥満にともなう慢性炎症をどのように制御するのかよくわかっていない。果糖の過剰摂取は、成人や成獣実験動物において糖尿病、高血圧および肥満の発症リスクが高まることが知られている。
網膜脈絡膜萎縮過程に生じる細胞死

ラット眼の硝子体内に微量のオルニチンを注入して網膜色素上皮を選択的に障害した(オルニチン網膜症)。光学顕微鏡的には障害された網膜色素上皮は注入後2日で崩壊したが、この時期には神経網膜や脈絡膜には明らかな変化をみなかった。注入後7日頃から脈絡膜毛細血管板の管腔が閉塞し、視細胞が消失していく過程が観察された。このオルニチン網膜症における網膜脈絡膜萎縮の過程でアポトーシス細胞を検出するため、TUNEL法を行った。オルニチン注入後2日では外顆粒層にTUNEL陽性の視細胞(アボトーシス細胞)が多数みられ、その後次第に減少していった。TUNEL陽性細胞は外顆粒層のみに限局してみられた。オルニチンによって障害された網膜色素上皮及び脈絡膜毛細血管板は全経過を通してTUNEL陰性であった。アポトーシスに陥った視細胞は電子顕微鏡的にも濃縮した核がみられた。以上の所見より得られた結論として、オルニチン注入によって原発性に障害された網膜色素上皮がネクローシスに陥ると、これに続発して視細胞と脈絡膜毛細血管板が消失した。視細胞の変化は免疫組織化学的手法によりアポトーシスであることが示された。これは網膜色素上皮による支えを失った視細胞の一部が計画的な細胞死(アボトーシス)へと導かれたものと考えられた。一方、脈絡膜毛細血管板の萎縮過程において内皮細胞はTUNEL陰性であり、視細胞の細胞死とは異なる機序が示唆された。このオルニチン網膜症における網膜脈絡膜萎縮の過程でアポトーシス細胞を検出するための免疫組織化学染色(TUNEL法)を行った。オルニチン注入後2日では外顆粒層にTUNEL陽性の視細胞(アポトーシス細胞)が多数みられ、その後次第に減少していった。これは網膜色素上皮による支えを失った視細胞の一部が計画的な細胞死(アポトーシス)へと導かれたものと考えられた。脈絡膜毛細血管板の萎縮については今回の結果からは細胞死の分類は困難であり、更なる検討が必要である。
EBウイルスリボ核酸EBERsによる上咽頭癌発癌機構の分子生物学的解析

Epstein-Barrウイルス(EBV)がコードする小RNAEBERsの発現ベクターを作成した。すなわち、EBER1、EBER2各遺伝子を各々1コピー、4コピー、10コピー直列につないでpcDNA3プラスミドに挿入した。それらを正常腎上皮細胞MDCKに形質導入し、形質転換能および増殖能を検討したところ、EBER1とEBER2を各々4コピーずつ含むプラスミドを導入した場合、軟寒天培地におけるコロニーの形成能が最も亢進した(コントロールの4倍)。EBER1とEBER2を各々10コピーずつ含むプラスミドを導入した場合のコロニー形成能は、コントロールの1.8倍、EBER1およびEBER2を各々単独で導入した場合にはコントロールと比較して、有意なコロニー形成能の亢進は認められなかった。次に、無血清培地におけるMDCK細胞の増殖能を指標としてEBERsの形質転換能を評価した。結果は、各々のコピー数のEBER1+EBER2の組み合わせのいずれにおいても有意な増殖能の変化を認めなかった。また、放射線および紫外線に対する感受性も、同様に変化を認めなかった。EBERsは核内で二本鎖RNAを形成してプロテインキナーゼR(PKR)を阻害して細胞の増殖能を促進することが示唆されている。EBERsを試験管内で合成し、MDCK細胞のリボゾームRNAをコントロールとしてPKR活性にEBERsが及ぼす影響を検討した。すなわち、PKRが燐酸化することが判明しているアミノ酸配列ILLSESRRRIRの中央のセリンと放射性同位元素γ32Pを用いてEBERsによるPKR酵素活性を評価したところ、EBERsはPKR活性に影響しないという結果を得た。上咽頭がん組織におけるEBERsの発現とEBVがん遺伝子LMP1の発現と各種臨床パラメーターとの相関を検討したところ、EBERsの発現はTstageが進行するにつれ増加する傾向にあったが統計学的に有意ではなかった。一方LMP1の発現は頸部リンパ節転移と有意に相関した。以上より、EBERs発現はMDCK細胞のanchor independentな増殖を促進するが、その現象にはPKR以外のシグナル伝達系が関与すること、EBERsは転移より増殖に関連が深いことが示唆された。Epstein-Barrウイルス(EBV)がコードするEBERsの発現ベクターを作成した。

EBERsは核内で日本鎖RNAを形成してプロテインキナーゼR(PKR)を阻害して細胞の増殖能を促進することが示唆されている。EBERsを試験管内で合成し、MDCK細胞のリボゾームRNAをコントロールとしてPKR活性にEBERsが及ぼす影響を検討した。すなわち、PKRが燐酸化することが判明しているアミノ酸配列ILLSESRRRIRの中央のセリンと放射性同位元素γ32Pを用いてEBERsによるPKR酵素活性を評価したところ、EBERsはPKR活性に影響しないという結果を得た。以上より、適当なEBERs発現はMDCK細胞のanchor independentな増殖を促進するが、その現象にはPKR以外のシグナル伝達系が関与することが示唆された。Epstein-Barrウイルス(EBV)がコードする小RNAEBERsの発現ベクターを作成した。すなわち、EBER1、EBER2各遺伝子を各々1コピー、4コピー、10コピー直列につないでpcDNA3プラスミドに挿入した。それらを正常腎上皮細胞MDCKに形質導入し、形質転換能および増殖能を検討したところ、EBER1とEBER2を各々4コピーずつ含むプラスミドを導入した場合、軟寒天培地におけるコロニーの形成能が最も亢進した(コントロールの4倍)。EBER1とEBER2を各々10コピーずつ含むプラスミドを導入した場合のコロニー形成能は、コントロールの1.8倍、EBER1およびEBER2を各々単独で導入した場合にはコントロールと比較して、有意なコロニー形成能の亢進は認められなかった。次に、無血清培地におけるMDCK細胞の増殖能を指標としてEBERsの形質転換能を評価した。結果は、各々のコピー数のEBER1+EBER2の組み合わせのいずれにおいても有意な増殖能の変化を認めなかった。また、放射線および紫外線に対する感受性も、同様に変化を認めなかつた。EBERsは核内で二本鎖RNAを形成してプロテインキナーゼR(PKR)を阻害して細胞の増殖能を促進することが示唆されている。上咽頭がん組織におけるEBERsの発現とEBvがん遺伝子LMP1の発現と各種臨床パラメーターとの相関を検討したところ、EBERsの発現はTstageが進行するにつれ増加する傾向にあったが統計学的に有意ではなかった。一方LMP1の発現は頸部リンパ節転移と有意に相関した。以上より、EBERs発現はMDCK細胞のanchor independentな増殖を促進するが、その現象にはPKR以外のシグナル伝達系が関与すること、EBERsは転移より増殖に関連が深いことが示唆された。
脊椎動物の上陸に伴う四肢での細胞死システムの確立

脊椎動物は陸上へと進出したことで、高濃度の酸素環境に曝されるという環境ストレスに直面することになった。本研究では、脊椎動物が陸上に進出し、高い酸素ストレスに曝されたことで、四肢のプログラム細胞死という新しい形態形成システムが獲得されたとする形態進化のモデルを検証し、その獲得プロセスを明らかとすることを目的に研究を行っている。研究代表者らは、平成29年度までに、当初の計画通り、(1)ニワトリ胚の肢芽における細胞死とROS、血管、及びDNAダメージの比較、(2)アフリカツメガエル幼生の肢芽における細胞死とROS、血管、及びDNAダメージの比較、(3)アフリカツメガエル幼生の肢芽における細胞死経路関連遺伝子の発現解析、(4)ニワトリ胚の肢芽におけるROSの機能解析、及び(5)低酸素濃度環境がニワトリ胚の肢芽の細胞死に与える影響の検証のすべてを終わらせていた。平成30年度は、(6)アフリカツメガエル幼生の肢芽の血管網の人為的高密度化がプログラム細胞死に与える影響の検証、及び(7)幼生が水棲、および陸棲の各種両生類の肢芽における細胞死とROS、及び、血管網の比較を行った。その結果、人為的に血管網を高密度化したアフリカツメガエル幼生では、指間細胞死が増加することを明らかにした。さらに、当初、国内に生息しないことから、成果を得るまでに時間がかかると想定していた幼生期に陸棲の両生類胚については、ハーバード大学のJames Hanken氏との共同研究にすることで、陸棲の両生類の肢芽においては、指間領域に細胞死が確認できること、細胞死をおこしている細胞では高レベルのROSの産生が見られること、さらに、指間での血管網の密度が高いことを明らかにした。平成30年度までに行うとしていた上記概要の(1)から(6)のすべての項目の研究を終わらせただけでなく、研究計画の発案当初は難しいと思われた異種生物(ニワトリ胚とアフリカツメガエル幼生)間での指間組織の組織内酸素濃度を定量的に比較する手法を確立することができたことから、当初の計画以上に進展していると判断した。平成30年度までに、計画書に記載した研究項目はすべて遂行し、結果を得ることができているため、最終年度は、各種生物について、細胞死、血管、ROSについて、より詳細なデータの収集に務める。具体的には、データを定量的に解析する手法を確立し、異種生物間で得られたデータを数値化して、比較することを試みる。また、平成30年度には、計画提案当初は難しいと思われていた異種生物間の組織での酸素濃度を定量的に計測する手法の確立に成功していることから、この手法を用いて、環境酸素濃度の変化が組織内酸素濃度の変化を引き起こすかを定量的に比較することにも挑戦する。本研究では、肢芽の特定の領域がプログラム細胞死により取り除かれることが知られている羊膜類ニワトリ胚と肢芽での細胞死が報告されていないアフリカツメガエルをはじめとする両生類の幼生を題材に、肢芽でのプログラム細胞死システムの獲得機構を明らかにすることを目的とした。この目的で、平成28年度は、(1)ニワトリ胚の肢芽、及び(2)アフリカツメガエル幼生の肢芽において、細胞死が確認できる領域の特定を試みた。さらに、細胞死領域の中でROSが検出される領域を特定し、細胞死領域の相関関係を調べた。複数のステージのニワトリ胚で調べたところ、すでに報告されている肢芽の細胞死領域であるAER(Apical Ectodermal Ridge)、ANZ(anterior necrotic zone)、PNZ(posterior necrotic zone)、OP(opaque patch)のすべての領域で細胞死が確認され、それらの領域で高濃度のROSも検出されることが確認できた。また、(2)アフリカツメガエルについては、すでに報告されている通り、間充織細胞の指間領域では細胞死は検出されなかった。そこで、(3)アフリカツメガエル幼生の肢芽において、四肢のプログラム細胞死経路がどこまで確立しているかを検証するために、各種マーカーを用いて比較発現解析を行った。その結果、ニワトリ胚の間充織細胞の指間領域で細胞死を制御することが知られる各種マーカー遺伝子がアフリカツメガエル幼生の肢芽で発現していることが確認された。本申請課題では、平成28年度には、(1)ニワトリ胚の肢芽、及び(2)アフリカツメガエル幼生の肢芽における細胞死領域の特定を行うこと、及び(3)アフリカツメガエル幼生の肢芽において、四肢のプログラム細胞死経路がどこまで確立しているかを検証するために、各種マーカーを用いた発現解析を行うことを、研究計画として提案していた。平成28年度には、提案していた計画をすべて実行し、(1)ニワトリ胚の肢芽では、すでに報告されている肢芽の細胞死領域であるAER(Apical Ectodermal Ridge)、ANZ(anterior necrotic zone)、PNZ(posterior necrotic zone)、OP(opaque patch)のすべての領域で細胞死を確認し、それらの領域で高濃度のROSも検出されることを確認した。また、(2)アフリカツメガエル幼生の肢芽については、過去の報告通り、指間領域における細胞死は検出されないことを確認した。さらに、(3)アフリカツメガエル幼生の肢芽において、各種マーカーを用いた比較発現解析により、細胞死経路がどこまで確立されているかを検証し、用いたマーカー全てが、アフリカツメガエル幼生の肢芽の指間領域で発現していることを確認した。

このように、平成28年度は、当初の計画をすべて実行し、成果を得ることができたので、概ね順調に進展していると評価した。脊椎動物は陸上へと進出したことで、高濃度の酸素環境に曝されるという環境ストレスに直面することになった。本研究では、脊椎動物が陸上に進出し、高い酸素ストレスに曝されたことで、四肢のプログラム細胞死という新しい形態形成システムが獲得されたとする形態進化のモデルを検証し、その獲得プロセスを明らかとすることを目的に研究を行っている。研究代表者らは、平成29年度までに、当初の計画通り、(1)ニワトリ胚の肢芽における細胞死とROS、血管、及びDNAダメージの比較、(2)アフリカツメガエル幼生の肢芽における細胞死とROS、血管、及びDNAダメージの比較、(3)アフリカツメガエル幼生の肢芽における細胞死経路関連遺伝子の発現解析、(4)ニワトリ胚の肢芽におけるROSの機能解析、及び(5)低酸素濃度環境がニワトリ胚の肢芽の細胞死に与える影響の検証のすべてを終わらせていた。平成30年度は、(6)アフリカツメガエル幼生の肢芽の血管網の人為的高密度化がプログラム細胞死に与える影響の検証、及び(7)幼生が水棲、および陸棲の各種両生類の肢芽における細胞死とROS、及び、血管網の比較を行った。その結果、人為的に血管網を高密度化したアフリカツメガエル幼生では、指間細胞死が増加することを明らかにした。さらに、当初、国内に生息しないことから、成果を得るまでに時間がかかると想定していた幼生期に陸棲の両生類胚については、ハーバード大学のJames Hanken氏との共同研究にすることで、陸棲の両生類の肢芽においては、指間領域に細胞死が確認できること、細胞死をおこしている細胞では高レベルのROSの産生が見られること、さらに、指間での血管網の密度が高いことを明らかにした。平成30年度までに行うとしていた上記概要の(1)から(6)のすべての項目の研究を終わらせただけでなく、研究計画の発案当初は難しいと思われた異種生物(ニワトリ胚とアフリカツメガエル幼生)間での指間組織の組織内酸素濃度を定量的に比較する手法を確立することができたことから、当初の計画以上に進展していると判断した。平成28年度は、当初の計画通りに順調に研究が進展したので、平成29年度以降も、研究計画に従って、研究を推進する予定である。平成30年度までに、計画書に記載した研究項目はすべて遂行し、結果を得ることができているため、最終年度は、各種生物について、細胞死、血管、ROSについて、より詳細なデータの収集に務める。具体的には、データを定量的に解析する手法を確立し、異種生物間で得られたデータを数値化して、比較することを試みる。また、平成30年度には、計画提案当初は難しいと思われていた異種生物間の組織での酸素濃度を定量的に計測する手法の確立に成功していることから、この手法を用いて、環境酸素濃度の変化が組織内酸素濃度の変化を引き起こすかを定量的に比較することにも挑戦する。
びまん性肺疾患に対する高分解能MR撮像法の開発に関する研究

基礎検討として、急性間質性肺炎症例の肺標本を用いて、分解能向上をめざしたMR画像を検討した。伸展固定標本では、TE時間を最短にしたT1強調画像で、また、ホルマリン標本ではFSE法のT2強調画像で、二次小葉内に生じた不均一な病変分布や細気管支拡張がCT以上の分解能で描出された。つぎに、臨床例において、どこまで肺野の正常構造や種々の病変を描出できるかを検討するために、患者の同意を得てスキャンを追加した。臨床例では苦痛なく解析可能な画像が得られるFOVやスライス厚を用いて、FSE法、およびFGE法によりスキャンを行った。呼吸運動が安定していた症例では、FGE法において正常肺における末梢肺血管の描出は二次小葉内まで可能であったが、呼吸運動の不規則な症例では末梢血管の描出能の劣化がみられた。また、FSE法による呼吸同期T2強調画像は、正常肺ではほとんど解析可能な画像は得られなかった。間質性肺病変をもつ症例では、FGE法においてもFSE法によるT2強調画像においても、不均一な信号上昇がみられ、その内部に細気管支拡張も描出されたが、高分解能CT以上の情報は得られなかった。また、信号の特徴から組織性状を解析することも困難であった。肺野はプロトン量が少ないことに加えて、肺胞構造の特殊性に起因するsusceptibilityによる信号減少があり、呼吸運動の影響も大きい。したがって、実際に得られた肺野画像ではHRCTを越える空間分解能は得られなかった。また、T2強調画像での組織性状の解析も行ったが、病変内部に含まれる残存含気量によって、同じ組織像でも異なった信号が得られ、特徴的な変化を捉えることはできなかった。今後、革命的技術革新によって、呼吸停止下で得られる新たな高画質肺野画像撮像法の登場が肺野高分解能MR画像には必要と考えられた。1.正常ボランティアにおける予備検査5インチ表面コイルを背面に装着し、FSE法を用いたT2強調画像およびFGE法を用いた血管像を種々の条件下で撮像し、生体での末梢肺構造の描出能について検討した。FOVを10cm以下、スライス厚を3mm以下とした画像では現状の装置では正常肺構造の信号低下は著しく、画像としての評価は困難であった。しかし、FOVを16cm,スライス厚を6mmとした画像では、FGE法で胸膜から1cm以内の小葉内血管まで描出されることが示された。ただ、臨床への応用が期待されたFSE法でのT2強調画像は正常肺では明瞭な画像は得られなかった。呼吸運動、肺組織の磁化率の不均一による信号減弱等の複数の要因が考えられたため、呼吸運動を除いた剖検肺標本でのMR画像の解析を次に行った。2.びまん性肺病変を含む剖検肺のMRでの検討正常ボランティアにおける撮像条件をもとに、急性間質性肺炎症例で、伸展固定(空気を含む固定法)を行った標本とホルマリン注入固定を行った標本の両者で高分解能MR画像(1.5mmないし3.0mm厚、FOV12cm)を撮像した。進展固定標本では、TE時間を最短にしたT1強調画像で、また、ホルマリン標本ではFSE法のT2強調画像で、二次小葉内に生じた不均一な病変分布や細気管支拡張がCT以上の分解能で描出された。潜在的には、MR画像は微細肺病変の描出能においてCTを越える可能性が示唆され、臨床画像をどのように近づけていくかが今後の研究課題と考えられた。

1. FOV一定時におけるマトリックスの画像に与える影響昨年度の研究によって、伸展固定肺標本を用いたMR画像においては、T1強調画像が最も分解能の高い画像が得られたので、この画像を用いて、FOV、スライス厚を一定(12cm、2mm)にしてマトリックスを変化させた場合の肺野の画像の変化を検討した。対象は、正常肺、正常肺に生理食塩水を注入して作成した肺水腫、急性間質性肺炎の3種類である。256X160では正常肺においてバックグラウンドの雑音とは異なる肺野構造の網目が描出されたが、320X320ではより微細な網目が出現し、最高の分解能を求めた512X512では、逆に肺野の構造はほとんど描出されず雑音のみとなってしまった。実際の標本との比較では、このような構造はみられず、マトリックスに応じて呼吸細気管支や肺胞管といった構造が平均化され強調されてできた画像と考えられた。肺水腫では、320X320の画像で高信号域のなかに、嚢胞状の構造がみられたが、512X512では不均一な高信号としてしか描出されず、また、間質性肺炎の器質化に伴う気管支拡張像も320X320の方が明瞭に描出された。撮像時間を4倍にした512X512の画像においても画質の向上はほとんどみられなかった。HRCTの空間分解能を越えるマトリックスは現状の装置では肺野の高画質の画像を得ることは困難であった。2. T2画像の可能性伸展固定標本では、通常のT2画像(FSE法、SE法)では、肺野の構造はほとんど描出されず画像診断は困難であったが、間質性肺炎の器質化部分はほとんど信号が得られないのに対して、肺水腫は明瞭な高信号として描出されるので、T1強調画像と併用した場合には、線維化成分と浮腫成分の分離に役立つ可能性は残され、今後の検討課題である。1.臨床例における肺野MR画像の検討伸展固定標本での検討を元に、臨床例において、どこまで肺野の正常構造や種々の病変を描出できるかを検討するために、他疾患の検索を目的としてMR検査を施行した症例において、患者の同意を得てスキャンを追加した。伸展固定標本で用いたFOV 12cm,スライス厚2mmでは臨床例においては解析可能な画像が得られなかったために、FOV16cm,スライス厚6mmを用いて、FSE法、およびFGE法によりスキャンを行った。呼吸運動が安定していた症例では、FGE法において正常肺における末梢肺血管の描出は二次小葉内まで可能であったが、呼吸運動の不規則な症例では末梢血管の描出能の劣化がみられた。また、FSE法によるT2強調画像では、症例にかかわらず正常肺ではほとんど解析可能な画像は得られなかった。間質性肺病変をもつ症例では、FGE法においてもFSE法によるT2強調画像においても、不均一な信号上昇がみられたが、その内部構造の分離は困難で、また、信号の特徴から組織性状を解析することも困難であった。2.臨床例の問題点の検討肺野はプロトン量が少ないことに加えて、肺胞構造の特殊性に起因するsusceptibilityによる信号減少に加えて、呼吸運動の除去が現在のMR撮像では不可能である。したがって、肺野のMR画像はHRCTの空間分解能を越えることは原理的には可能であるが、実際に得られた画像ではHRCTを越える空間分解能は得られなかった。また、T2強調画像での組織性状の解析も行ったが、病変内部に含まれる残存含気量によって、同じ組織像でも異なった信号が得られ、特徴的な変化を捉えることはできなかった。伸展固定標本での画像を考えると、呼吸停止下で得られる新たな高画質肺野画像撮像法の登場が肺野高分解能MR画像には必要と考えられた。
動物実験モデルを用いた口腔内アミロイドの形成機序の解明

従来アミロイドは、アミロイド線維が病変部に沈着し、組織を侵していくと考えられている。全身性アミロイド症において、口腔内にもアミロイドの沈着が認められる。本研究はin vivo及びin vitroにおいて口腔内アミロイド沈着の形成機序に関する基礎的研究を行った。アミロイドの誘導には、アミロイド症の動物実験モデルを用た。マウスにFreund's Conplete Adjvant(FCA)とM.Butyricumのemulsionを投与し、その脾臓からAmyloid Enhancing Factor(AEF)の精製を行った。AEFの精製において、マウスの系統に違いが見られた。脾臓にアミロイドが沈着されるまでの経過時間が、CBA/j系が最も早く、C3H/Hej系が遅かった。AEFの効果に違いは見られたかった。アミロイド誘導試薬とAEFをマウスに投与し、アミロイド症を誘導した。アミロイド症の発現部位を知るために脾、肝、腎、舌、唾液腺を試料とし、光顕および電顕観察を行った。アミロイド症の誘導により各臓器に急性期の炎症が認められ、臓器の肥大、被膜の肥厚、癒着が見られ、脾臓や肝臓におけるマクロファージの数、アミロイドタンパク前駆物質、Ploteoglycan,およびAmyloid P componentの増加が認められた。アミロイドの沈着は、各組織の被膜や小葉間結合組織に局在する太い血管周囲の結合組織に多く見られた。舌においては、粘膜固有層や、粘膜下層の結合組織にアミロイドの沈着が観察された。腹腔内マクロファージを培養し、in vitroにおいてアミロイドを誘導させた。マクロファージ及びが線維芽細胞がアミロイドの形成に深く関与していることが認められた。本研究において、アミロイドの構造と構成成分の関係を解明し、その形成機序を把握した。全身性アミロイド症において、免疫グロブリンL鎖由来のALアミロイド症は、口腔内にもアミロイドの沈着を認められる。しかしながら、アミロイド症の研究試料は、ヒトの生検や剖検からしか得られないため、疾患の経歴、組織の鮮度、薬物投与の影響などさまざまな問題が生じ、アミロイド症の基礎的研究を行ううえで多くの弊害となっている。このような問題を解決するためにすでに確立されているAAアミロイド症の動物実験モデルを応用し、ALアミロイド症の場合に適応させアミロイドを誘導させることにより、in vivoにおける口腔内アミロイド沈着の形成機序に関する基礎的研究を行った。アミロイドの誘導には、マウス(15-20g)にアゾカゼインを投与し、その脾臓からAmyloid Enhancing Factor(AEF)の精製を行った。C3H/Hej,BALB/C,CBA/Jのマウスにアゾカゼインを投与し、脾臓にアミロイドが沈着されるまでの経過時間が、CBA/J系が最も早く、C3H/Hej系が遅かった。誘導されたアミロイド症が、ALアミロイド症であることを確認するために過マンガン酸処理法を行い、コンゴーレッド染色後、偏光性を示すことにより確認した。各組織の被膜や小葉間結合組織に局在する太い血管周囲の結合組織にアミロイドの沈着が見られた。
シトクロームP450によるビタミンE代謝の解明とゴマ摂取によるその調節

現在までに、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α(PPARα)リガンド摂取によるビタミンE濃度の低下が、酸化ストレス亢進によって起こっているのではなく、ビタミンE代謝の促進によって起こる可能性を示した。平成17年度は、ビタミンE代謝産物の排泄量を調べることによって、PPARα活性化によるビタミンE代謝促進の可能性をさらに追求した。1カルボキシエチルヒドロキシクロマン(CEHC)排泄量に及ぼすPPARαリガンド摂取の影響3週齢のWistarラット(雄性)にビタミンE無添加飼料を4週間摂取させて、ビタミンE欠乏ラットを作製した。このビタミンE欠乏ラットに、α-トコフェロール(α-T)添加飼料、α-TおよびWY14,643添加飼料、またはα-Tおよびクロフィブレート添加飼料を3日間摂取させた。屠殺前12時間のα-CEHC排泄量は、3群間に有意な差は観察されなかった。したがって、PPARαの活性化によってα-Tからα-CEHCへの代謝が促進される可能性は低いと考えられた。2種々の遺伝子発現に対するビタミンE摂取の影響6週齢のWistarラット(雄性)にビタミンE無添加飼料を4週間摂取させて、ビタミンE欠乏ラットを作製した。このビタミンE欠乏ラットに、ビタミンE同族体として、(α-T、γ-トコフェロール(γ-T)、またはトコトリエノール(主にα-トコトリエノールとγ-トコトリエノールを含む,T3)を胃内に強制投与し、24時間後に屠殺した。ビタミンE代謝に関与すると予想されるシトクロームP450(CYP)3A3、3A11、3A13、3A18、脂質や薬物の主要なトランスポーターであるABCA1、B1、C1、およびα-トコフェロール輸送タンパク質の肝臓中のmRNAレベルを測定したが、いずれもビタミンE同族体の摂取による有意な変動は観察されなかった。一方、CYP3Aの基質として知られるケトコナゾールを投与した場合には、CYP3A、3A13、3A18の肝臓中のmRNAレベルの上昇が認められた。したがって、今回の結果から、ビタミンE代謝に対するCYP3Aの関与を明らかにすることはできなかった。最近Sontagら(2002)がビタミンE異化の律速酵素であると報告したシトクロームP450(CYP)4Fは、培養細胞においてペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)によってその遺伝子発現が変動すると報告されている。そこで、平成15年度は、種々のペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)リガンドおよびフィブレート系薬剤を用いて、ビタミンE代謝へのペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)関与の有無を、ラット個体レベルで調べた。ビタミンE無添加飼料を4週間摂取させたビタミンE欠乏ラット(Wistar系)に、ビタミンE添加飼料、またはビタミンEおよびPPARαリガンド添加飼料を3日間摂取させた。PPARαリガンドには、代表的なリガンドであるClofibrate (0.2%添加)とWY14,643(0.05%添加)を用いた。飼育後、主要な組織および血清中のビタミンE濃度をHPLC法で調べたところ、肝臓、腎臓および血清中のα-トコフェロール濃度が、ClofibrateまたはWY14,643の摂取で有意に低下していた。次に、肝臓α-トコフェロール濃度に対する様々なフィブレート系薬剤の影響を調べた。フィブレート系薬剤として、Clofibrate、Bezafibrate、Fenofibrate、Gemfibrozilの4種を用いて、上記と同様の実験を行った。その結果、すべてのフィブレート系薬剤の摂取で肝臓のα-トコフェロール濃度が有意に低下した。以上の結果から、PPARαリガンド摂取によるビタミンE濃度の低下が明らかになり、核内レセプターであるPPARαによってビタミンE濃度が調節されていることが示唆された。平成16年度は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPARα)によるシトクロームP450(CYP)遺伝子発現の調節によってビタミンE代謝が変動する可能性について検討するとともに、酸化ストレス亢進によってビタミンEが消費された可能性についても検討した。1.ビタミンE摂取時のCYP遺伝子発現の変動雄性Wistarラットに、α-トコフェロールまたはトコトリエノール添加飼料を3日間摂取させた。肝臓のCYP4A2/3 mRNAレベルがトコトリエノール摂取により上昇する傾向が見られ、CYP3Aおよび4F mRNAレベルには明らかな変化が見られなかった。2.PPARαリガンド摂取時のビタミンE代謝の変動ラットに、ClofibrateまたはWY14,643添加飼料を3日間摂取させた。ClofibrateとWY14,643の摂取によって、血清および肝臓のα-トコフェロール濃度が75%以下に低下し、肝臓のCYP4F5 mRNAレベルが上昇した。この時、肝臓のTBARS濃度に変化は見られず、アスコルビン酸濃度も低下しなかった。3.フィブレート系薬剤摂取時のビタミンE代謝の変動ラットに、種々のフィブレート系薬剤(Clofibrate, Bezafibrate, Fenofibrate, Gemfibrozil)添加飼料を3日間摂取させた。血清と肝臓のα-トコフェロール濃度は、すべての薬剤摂取によって55%以下に低下し、肝臓のCYP4F5 mRNAレベルが上昇した。

以上の結果から、PPARαの活性化によるビタミンE濃度の低下にCYP4F5が関与することが示唆され、また、酸化ストレス亢進によるビタミンE消費の可能性は低いと考えられた。現在までに、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α(PPARα)リガンド摂取によるビタミンE濃度の低下が、酸化ストレス亢進によって起こっているのではなく、ビタミンE代謝の促進によって起こる可能性を示した。平成17年度は、ビタミンE代謝産物の排泄量を調べることによって、PPARα活性化によるビタミンE代謝促進の可能性をさらに追求した。1カルボキシエチルヒドロキシクロマン(CEHC)排泄量に及ぼすPPARαリガンド摂取の影響3週齢のWistarラット(雄性)にビタミンE無添加飼料を4週間摂取させて、ビタミンE欠乏ラットを作製した。このビタミンE欠乏ラットに、α-トコフェロール(α-T)添加飼料、α-TおよびWY14,643添加飼料、またはα-Tおよびクロフィブレート添加飼料を3日間摂取させた。屠殺前12時間のα-CEHC排泄量は、3群間に有意な差は観察されなかった。したがって、PPARαの活性化によってα-Tからα-CEHCへの代謝が促進される可能性は低いと考えられた。2種々の遺伝子発現に対するビタミンE摂取の影響6週齢のWistarラット(雄性)にビタミンE無添加飼料を4週間摂取させて、ビタミンE欠乏ラットを作製した。このビタミンE欠乏ラットに、ビタミンE同族体として、(α-T、γ-トコフェロール(γ-T)、またはトコトリエノール(主にα-トコトリエノールとγ-トコトリエノールを含む,T3)を胃内に強制投与し、24時間後に屠殺した。ビタミンE代謝に関与すると予想されるシトクロームP450(CYP)3A3、3A11、3A13、3A18、脂質や薬物の主要なトランスポーターであるABCA1、B1、C1、およびα-トコフェロール輸送タンパク質の肝臓中のmRNAレベルを測定したが、いずれもビタミンE同族体の摂取による有意な変動は観察されなかった。一方、CYP3Aの基質として知られるケトコナゾールを投与した場合には、CYP3A、3A13、3A18の肝臓中のmRNAレベルの上昇が認められた。したがって、今回の結果から、ビタミンE代謝に対するCYP3Aの関与を明らかにすることはできなかった。
ナノチューブを用いた次世代3次元ピコインデンターチップに関する研究

本研究では、カーボンナノチューブなどのインデンターの先端をXYZ3次元的に超精密に制御し,インデンテーションをすることによって3次元ナノ構造体などの局所的な機械的特性を計測できる超小型ピコインデンターチップ装置を提案する.本年度では、昨年度提案したインデンテーション機構の装置化及びインデンテーション実験を行った.インデンテーション装置はインデンター部と試料支持部で構成される.インデンター部の3軸PZTアクチュエータにインデンターを取り付ける.試料支持部のレバーで試料を保持する.試料がインデンター部のZ軸PZTによって押し込まれると試料保持レバーがたわみ,そのたわみ量を静電容量型変位センサで計測する.PZTの押し込み量とレバーのたわみ量との差を取ることによって,インデンテーション深さを求める.また,レバーの弾性係数とたわみ量からインデンテーション力を計算する.試作した装置の基本特性を実験で調べた結果,インデンテーション深さとインデンテーション力の範囲はそれぞれ0.1nm6μm,0.2μN13mNとなっていることが分かった.また,120秒間のインデンテーション深さ及びインデンテーション力の安定性はそれぞれ5nmと10μNとなっていることを確認した.さらに,3次元微細構造の局所的な機械特性を調べる目的で,走査型電子顕微鏡でのインデンテーション実験も行った.走査電子顕微鏡を用いて特定した位置にインデンテーションを行った.位置決めの分解能は0.1μmオーダであった.試料にはLSIなどの配線で用いられているアルミを用いた.本装置でインデンテーションをして得たインデンテーション深さ及びインデンテーション力のデータからアルミ試料のマイクロハードネスを計算した.カタログ値に近い値が得られたことから本研究で開発したインデンテーション装置の有効性を確認した.本研究では、カーボンナノチューブなどのインデンターの先端をXYZ3次元的に超精密に制御し、インデンテーションをすることによって3次元ナノ構造体などの局所的な機械的特性を計測できる超小型ピコインデンターチップ装置を提案する。本年度では、インデンテーション力とインデンテーション深さが正しく測定できる機構の原理を提案し、プロットタイプ装置の基本設計と製作を中心に行った。提案した機構はインデンター部と試料支持部で構成される。インデンター部は3軸PZTアクチュエータにインデンターを取り付ける構造になっている。一方、試料支持部では試料を保持するレバーとレバーの変位を測る変位センサからなる。試料がインデンターによって押し込まれると試料保持レバーがたわむ。PZTアクチュエータによるインデンターの押し込み量と変位センサで計測したレバーの変位量の差から、正確なインデンテーション深さを計測することができる。また、試料保持用レバーの変位量とレバーの弾性係数からインデンテーション力を求めることもできるため、正しいインデンテーション曲線を得ることができる。ピコインデンテーションを実現するために、変位センサノイズの低減が重要な課題であり、本研究ではアクチュエータでインデンターを微小な振幅で振動させることによって、変位信号を変調させる技術を採用した。ロックインアンプを用いることによって、ノイズより二桁小さいレベルで変位信号を検出することができた。さらに、3次元微細構造の局所的な機械特性を調べる目的で、走査型電子顕微鏡を用いてインデンテーションする場所の位置決めを行うことにした。そのために、開発したインデンテーション装置を走査型電子顕微鏡内で作動できるように工夫した。電解研磨で製作した先鋭なタングステンインデンターを用いてナノインデンテーション実験から求めたアルミ試料の硬さは従来値とよく一致していることから装置の有効性を確認した。来年度はマイクロマシン技術による装置のマイクロ化とカーボンナノチューブによる実験を行う予定である。本研究では、カーボンナノチューブなどのインデンターの先端をXYZ3次元的に超精密に制御し,インデンテーションをすることによって3次元ナノ構造体などの局所的な機械的特性を計測できる超小型ピコインデンターチップ装置を提案する.本年度では、昨年度提案したインデンテーション機構の装置化及びインデンテーション実験を行った.インデンテーション装置はインデンター部と試料支持部で構成される.インデンター部の3軸PZTアクチュエータにインデンターを取り付ける.試料支持部のレバーで試料を保持する.試料がインデンター部のZ軸PZTによって押し込まれると試料保持レバーがたわみ,そのたわみ量を静電容量型変位センサで計測する.PZTの押し込み量とレバーのたわみ量との差を取ることによって,インデンテーション深さを求める.また,レバーの弾性係数とたわみ量からインデンテーション力を計算する.試作した装置の基本特性を実験で調べた結果,インデンテーション深さとインデンテーション力の範囲はそれぞれ0.1nm6μm,0.2μN13mNとなっていることが分かった.また,120秒間のインデンテーション深さ及びインデンテーション力の安定性はそれぞれ5nmと10μNとなっていることを確認した.さらに,3次元微細構造の局所的な機械特性を調べる目的で,走査型電子顕微鏡でのインデンテーション実験も行った.走査電子顕微鏡を用いて特定した位置にインデンテーションを行った.位置決めの分解能は0.1μmオーダであった.試料にはLSIなどの配線で用いられているアルミを用いた.本装置でインデンテーションをして得たインデンテーション深さ及びインデンテーション力のデータからアルミ試料のマイクロハードネスを計算した.カタログ値に近い値が得られたことから本研究で開発したインデンテーション装置の有効性を確認した.