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1ステップ型接着システムの溶媒が重合度および長期接着性能に及ぼす影響

さらに、HEMAを含有しない接着システムでは、溶媒の蒸散の過程で相分離がおき、最終的に得られる硬化物の構造に影響を与えることが示唆された。以上の実績を参考に、現在溶媒の蒸散と1-ステップ接着システムの強度の関係を検討中である。さらに溶媒の蒸散により相分離が起きる場合、実際の接着界面で観察される構造との関係を検討中である。本研究では、各種1ステップ接着システムにおいて、1)初期における溶媒の含有量、2)エアーブローによる溶媒の残存率の変化、3)溶媒の残存率をさまざまに変化させた場合のシステムの重合度、強度、硬さ、初期接着性能および長期接着性能等を評価する。その後ボンディングレジンの物性と接着性能の比較検討を行うことにより、長期にわたって安定した接着性能を維持するための製品の組成、臨床術式を確立するための指標を提示する。平成17年度:3種の1ステップ接着システムを37°C恒温槽に保存し、重量変化から溶媒の蒸散を評価した。その結果、溶媒の蒸散は溶媒の種類のみならず、溶媒の初期の含有量、接着システムに含まれるモノマーの種類(特にHEMAの有無)等の影響を受けることが明らかになった。また、エアーブローにより溶媒の大半は蒸散するが、親水性のモノマーと結合した溶媒の蒸散が困難であることが明らかとなった。さらに、HEMAを含有しない接着システムでは、溶媒の蒸散の過程で相分離がおき、最終的に得られる硬化物の構造に影響することが示唆された。平成18年度:エアーブロー時間を0秒、5秒、10秒と変化させたときの溶媒の蒸散を3種の接着システムについて評価した。また、エアーブロー0秒、5秒、10秒に相当する溶媒の蒸散率と1-ステップ接着システムの引張り強度の関係を検討した。その結果、エアーブロー時間の延長により強度が向上した。接着システム間の比較では、HEMAを含有するシステムの強度が高く、HEMAを含有しないシステムにおける相分離による構造上の欠陥が強度の低下に関わっていることが示唆された。現在、溶媒の残存及び相分離により生じた構造上の欠陥が接着システムの長期にわたる機械的性質、接着耐久性に与える影響について検討中である。
奇形腫を用いた発生工学的手法によるウイルス抵抗性マウスの作出に関する基礎的研究

本研究は、近年進展の著しい発生工学的技術とウイルスの分子生物学的研究を組み合わせることにより、ウイルス感染に抵抗性のマウスを人為的に作出するための実験系を開発することを最終目的とし、そのための基礎的研究を行うものである。研究は、1)遺伝子導入の担体としての奇形腫及び胚幹細胞株の開発及びキメラ解析技術について花岡が担当し2)マウス肝炎ウイルス(MHV)の分子生物学的研究は田口が担当して行なわれた。今までに得られた成果を以下に要約する。1)胚工学的操作技術:極めてキメラ形成能の高い奇形腫細胞株を樹立することに成功し、また、さらにキメラ形成能の高いとされる胚幹細胞株の樹立方法もほぼ確立した。また、発生工学的手法による細胞標式技術を確立した。この方法は、キメラマウスの解析に極めて有効と思われる。2)MHVの分子生物学的研究:MHVに対する抵抗性を賦与する方法としてMHV感受性細胞にMHVリセプタ-蛋白(E_2)遺伝子を導入することにより宿主細胞レセプタ-を被いかくすことをねらいとし、そのために必要なE_2蛋白遺伝子のリセプタ-結合領域の同定を試みた。E_2蛋白の持つ細胞障害性によりマウスでは研究が困難であることが判明したので、バキュロウイルスベクタ-(BV)を用い昆虫細胞で大量にE_2を発現する系を開発した。しかし、発現したE_2は細胞吸着活性が認められなかった。昆虫とマウスでは異なる糖が付加されていることがその原因として考えられる。今後、本実験系を確立するためには、ウイルスの分子生物学的知見がさらに蓄積することが必要であると思われる。現在多くの動物実験に使用されているマウスおよびラットは、これらの動物に病気を起こす病原体を持っていないSPF動物である。このような動物の大きな問題点は、マウス肝炎ウィルス(MHV)やセンダイウィルスなどの感染力が著めて高く、しかも重篤な病気を引き起こす感染から、いかに動物を守るかということであり、現在ではSPF動物をバリアーシステムの環境で飼育維持することが唯一の対策であると考えれらる。一方近年の遺伝子工学および発生工学の手技の発展に供い、異なる遺伝形質を持つ動物を人工的に作り出すことが可能になった。そこで我々はその様な手法を用いて、MHVに対して抵抗性マウスを作出するための基礎的実験として、MHV感受性細胞にMHV表面蛋白遺伝子を導入発現させ、MHVに対するレセプターを被うことにより抵抗性を付与するための実験を行なった。MHVのレセプター結合蛋白E_2は、細胞障害性があるので上記の実験にはその部分を取り除くことが必要である。そこで今回は約4kから成る全E_2cDNAと、中央部のclaI siteで切断して得た2つのフラグメント、E_2(A)、E_2(B)をそれぞれメタロチオネインプロモーターの下流に挿入し、マウスL細胞に導入したところ、全E_2cDNAでは蛋白を発現している細胞は継代不可能となった。このことは、発現されたE_2蛋白もウィルス蛋白同様細胞障害性を有していることを示唆している。現在E_2(A)、E_2(B)を導入した細胞について検討しているところである。一方、マウス個体に戻すための準備として、個体再構成能を有する培養細胞株の樹立及びその維持の方法についても検討を加えた。特に、将来様々なマウスの系統を用いることが必須であることから、系統差に依存せずに作成が可能な、マウス胚の直接培養による胚幹細胞株の樹立、維持の方法について検討を行った。その結果、いくつかの胚幹細胞株の樹立に成功した。現在そのキメラ固体形成能について検討中である。近年の発生工学及び遺伝子工学技術の発展に伴い、マウス個体における人為的な遺伝子改変が可能となってきた。

我々は、これらの技術を用いて、ウイルス感染に抵抗性の動物を人為的に作出するための基礎的研究を行ってきた。昨年にひき続き、マウス肝炎ウイルス(MHV)抵抗性マウス作成のための基礎的実験及び、遺伝子導入の担体としての胚幹細胞(ES)及び奇形腫(EC)細胞株の開発について研究を行った。MHVに対する抵抗性を賦与するための方策として、MHV感受性細胞にMHVリセプタ-蛋白(E_2)遺伝子を導入することにより宿主細胞のリセプタ-を被いかくすことが可能であるかについて検討を加えた。そのためにはE_2内に存在するリセプタ-結合領域や細胞障害領域を同定する必要がある。昨年度の実験により、E_2蛋白をマウス細胞で発現させリセプタ-結合部位を同定することは、E_2の細胞障害性のため困難であったので、本年度は、バキュロウイルスベクタ-(BV)を用いて昆虫細胞株においてE_2を大量に発現させることを行った。発現されたE_2は、ウイルス粒子のE_2と同程度に糖付加され、大部分の中和抗体産生エプト-プも存在していたが、細胞吸着活性は認められなかった。昆虫細胞を用いた本実験系では、マウスとは異なる糖が付加されE_2の吸着活性に影響している可能性が否定できず、他のベクタ-系を検討する必要があると思われる。遺伝子導入の担体としてのES/EC細胞の開発については、これらの細胞がキメラ個体の中でどのように分布しているかを確実に知るための技術開発を行った。クロランフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ(CAT)遺伝子の導入により、細胞を標識化することに成功した。この技術は、今後のキメラマウスを用いた研究に有効であると思われる。
マイクロマシンによる境界層遷移の能動制御

近年,エレクトロニクス産業の発達に伴う精密機械加工技術の飛躍的発展により,超小型のモータ・アクチュエータ等であるマイクロマシンが実用化されつつある.本研究はこの新しい技術を流れの制御に用いようとする試みである.一方流体力学の最近の話題として「受容性」の問題がある.「受容性」とは音波等外部からの微小な攪乱が流れの中に取り込まれて速度の変動に変換され,それが成長して流れ場全体に大きな影響を与える過程およびその効率を指す.重要なのは固体表面と流体との間の相対的な運動であるので,音を流れ場に注入する代わりに固体表面が微小な運動を行って同じ結果が得られ,音が引き起こす相対運動は数十数百Hzの周波数で数ミクロン数十ミクロン程度の振幅なので,固体表面をほんの少し動かすだけで同様の効果が得ることが期待できる.しかも,音の場合には広い領域にほぼ同位相の変動が伝わってしまうのに対し,固体表面を振動させる場合には,局所的あるいは場所ごとに異なる位相の変動の付加等が自由にできる優位点をもっている.我々は,ピエゾ素子,磁場の中に細いニクロム線を置き,それに交番電流を流すという2つの方法で境界層遷移の能動制御を試みた.その結果,ピエゾ素子を用いるためには,ピエゾ素子の大きさのため平板をくりぬいて設置せねばならず,段差の大きな前向きステップのはく離に関する実験ではうまく行ったものの,境界層遷移の実験に用いるほど小型化することはできなかった.それに対し,磁場の中に細いニクロム線を置きそれに交番電流を流す方法は,磁場をスパン方向に揃えるあるいは,交互にすることで,境界層遷移を引き起こすトルミーン・シュリヒティング波を同位相あるいはスパン方向に互い違いの位相で生成できることができた.この成果は,日本機械学会論文集に投稿中である.近年,エレクトロニクス産業の発達に伴う精密機械加工技術の飛躍的発展により,超小型のモータ・アクチュエータ等であるマイクロマシンが実用化されつつある.本研究はこの新しい技術を流れの制御に用いようとする試みである.一方流体力学の最近の話題として「受容性」の問題がある.「受容性」とは音波等外部からの微小な攪乱が流れの中に取り込まれて速度の変動に変換され,それが成長して流れ場全体に大きな影響を与える過程およびその効率を指す.重要なのは固体表面と流体との間の相対的な運動であるので,音を流れ場に注入する代わりに固体表面が微小な運動を行って同じ結果が得られ,音が引き起こす相対運動は数十数百Hzの周波数で数ミクロン数十ミクロン程度の振幅なので,固体表面をほんの少し動かすだけで同様の効果が得ることが期待できる.しかも,音の場合には広い領域にほぼ同位相の変動が伝わってしまうのに対し,固体表面を振動させる場合には,局所的あるいは場所ごとに異なる位相の変動の付加等が自由にできる優位点をもっている.我々は,ピエゾ素子,磁場の中に細いニクロム線を置き,それに交番電流を流すという2つの方法で境界層遷移の能動制御を試みた.その結果,ピエゾ素子を用いるためには,ピエゾ素子の大きさのため平板をくりぬいて設置せねばならず,段差の大きな前向きステップのはく離に関する実験ではうまく行ったものの,境界層遷移の実験に用いるほど小型化することはできなかった.それに対し,磁場の中に細いニクロム線を置きそれに交番電流を流す方法は,磁場をスパン方向に揃えるあるいは,交互にすることで,境界層遷移を引き起こすトルミーン・シュリヒティング波を同位相あるいはスパン方向に互い違いの位相で生成できることができた.この成果は,日本機械学会論文集に投稿中である.
有機パラジウム錯体のトランスメタル化反応を活かした三次元構造体の構築

本研究ではカチオン性のアリールパラジウム(II)錯体がトランスメタル化とよばれる反応に対して高い活性を有することを利用して、これを種々の環状構造分子の合成に応用したものである。結果として、分子量が数千にまで到達する環状オリゴマーの合成法であったり、光学活性な置換基を有する環状構造錯体、高度に歪んだ光学活性な有機分子の合成に至った。また、本研究の手段として用いていたトランスメタル化に関しても、これ自体が反応条件を整えると溶液中において可逆な反応であることを見出すなど、基礎的かつ重要な知見も得るに至った。アリールパラジウム(あるいは白金)錯体部分を含む単核および複核錯体の合成をおこなった。具体的には1,5-シクロオクタジエンあるいは2,2'-ビピリジンを支持配位子とするPd(II)あるいは白金(II)錯体の合成をおこなった。パラジウム錯体の合成では三叉型の有機配位子を用いるパラジウム錯体の合成に取り組み、その生成を確認している。白金(II)錯体の合成では、白金(II)-アリール炭素結合が溶液中で昇温(50 oC)すると動的な挙動を示すことを見出し、これを利用することで複核錯体合成に利用した。すなわち、二官能性トレーガー塩基と塩化白金(II)錯体の2:2の反応によって四角形型の白金二核錯体を熱力学的支配下において合成することに成功した。生成する錯体の立体構造は特に単結晶X線構造解析によって明らかにすることができた。その結果、四角形型の白金二核錯体にはトレーガー塩基部分に由来する光学異性体3種類が可能であるが、生成物がそのうち二種類の生成物に限定されている明らかにした。計算化学による結果から、この結果は生成物の熱力学的な安定性に支配されたものであると結論づけた。白金(II)-アリール炭素結合の動的挙動に関しては、特に重要な知見であるのでモデル錯体を用いて検討し、おもに速度論的な解釈および分子軌道計算の結果からそのトランスメタル化反応の機構を推測した。アリールパラジウム錯体の反応性の検討もおこない、特に一酸化炭素のパラジウムー炭素結合に対する挿入反応が円滑に進行することを見出し、なおかつ生成するアシル錯体に銀イオンを反応させた場合に分子間反応が速やかに進行してベンゾフェノンを効率的に生成することを見出した。環状および線状構造を有するアリールパラジウム(あるいは白金)二核および三核錯体の合成および化学反応性の研究をおこなった。塩化白金(II)錯体と二官能性トレーガー塩基(あるいはビス(アルキニル)トレーガー塩基)との2:2の反応によって白金ー炭素シグマ結合が形成され、共有結合型の四角形白金二核錯体を合成した。トレーガー塩基を架橋配位子として用いれば、対角に存在する白金原子間の距離が1.0 nmになる。白金とトレーガー塩基の間にさらにアルキニレン基を挿入して四角形構造を拡張することも可能であり、この場合には対角の距離が1.2 nmまで伸びる。四角形型の白金二核錯体にはトレーガー塩基部分に由来する光学異性体3種類が可能であるが、その異性体存在比は計算化学によって見積もった各異性体の安定性の関係とも一致している。モデル反応を含めた検討から、本研究によって合成した共有結合型の四角形白金二核錯体は熱力学的な生成物として得られているということを証明した。分子軌道計算の結果から、白金ー炭素結合の組換過程が本研究の鍵であり、なおかつこの素反応が白金上の支持配位子がオレフィン系の配位子である場合には進行しやすいものの、窒素系やリン系の配位子ではおこりにくいこともわかった。昨年までに、二官能性トレーガー塩基と塩化白金(II)錯体の2:2の反応によって四角形型の白金二核錯体を合成することに成功した。最終年度はこの結果をもとにして、より複雑な有機および有機金属構造体の合成に取り組んだ。まず四角形型の白金二核錯体を強い電子供与性を有するリン配位子存在下で加熱すると、還元的脱離反応が進行してトレーガー塩基の環化二量体を合成することができた。このトレーガー塩基は環状構造の為に高度に歪んでおり、2つの芳香環がつくる角度が既に報告されているトレーガー塩基誘導体のなかでももっとも小さくなることがわかった。この結果は実測のスペクトルとの比較を含めた、構造の理論計算から推測したものである。一方で前年までの結果をもとにして、アルキニル白金錯体部分を含む環状複核錯体の合成に取り組んだ。具体的には1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン(dppf)を支持配位子として有する白金(II)錯体の合成をおこなった。例えばPtCl2(dppf)と1,3-ジアルキルベンゼン、あるいは2,6-ジアルキニルピリジンとの反応をおこなったところ、それぞれ2:2あるいは3:3で反応が進行して、環状の複核錯体が生成した。

当初はパラジウム三核錯体の合成を基盤にして計画を立てていたが、昨年度までのモデル錯体を含めた実験から検討を勧めた結果、白金錯体を用いたほうが化合物の安定性がよく、良い結果が得やすかったので二年目は金属として白金を用いる検討に重点をおいた。計画にあったクリプタンド型有機化合物やインターロック型化合物の合成には至っていないものの、2つの白金錯体部分を含む共有結合型の大環状構造の合成法を確立するにいたった。既報においては主に配位結合を基にして同様な構造体が多数合成されてきたが、本研究はそれを共有結合に置き換えたものであって、これによって金属炭素結合の反応性に由来する構造変換反応の検討が可能になって、当初計画と同様な超分子構造体の検討が可能になっている。これから派生して複数の研究結果を得ている。特に下記2点が重要である。(1)特に白金ー炭素共有結合の反応活性を指示配位子によって変化させられることが重要である。これは本研究計画を大きく進捗させているだけでなく、これまでに合成された白金錯体を有する配位高分子をすべて共有結合性の化合物として合成可能であることを示唆する結果であり、大きな波及効果が期待できる研究成果である。(2)トレーガー塩基への官能基導入の方法を複数開発した。これによって多彩な構造と合成計画の立案が可能になり、また生成物の溶解度や安定性などを適切に制御することが可能になった。このように立案した研究計画を当初計画した範囲の中で進展させることができている。なおかつモデル錯体を用いる検討により有機金属化学的にも重要な知見をえるに至っている。有機金属化学“現在までの達成度"で述べたとおり、本研究課題はおおよそ計画通りに進捗している。今後も研究計画書に記載した内容を基にして研究を推進する。すなわち、有機金属をもちいた環状構造錯体や超分子構造体の合成を行う。ただし昨年までに白金ー炭素共有結合が錯体分子間反応によって交換することを見出したので、今後は生成物を熱力学的生成物としてえるような戦略を積極的に採用して研究を遂行していく計画である。当初の研究計画はパラジウム三核錯体の基盤として計画されていた。本年度は、モデル錯体を含めて、単核および二核、三核のための有機配位子の合成から研究をスタートして、実際に錯体の合成にまで成功している。単核錯体からは、そのアリールパラジウム錯体部分に関する反応性の検討をおこない、分子間における配位子カップリング反応やイソシアニドおよび一酸化炭素の挿入反応を検討して、とくにアリール配位子上の置換基の立体的効果に関する知見を得た。二核錯体からは、有機配位子部分の構造によって生成物が環状化合物になったり、環状オリゴマーになったりすることを見出した。三核錯体の合成にも成功している。その三核錯体の反応からクリプタンドを合成する計画であったが、それに着手するには至っていない。ただし、パラジウムと同族の白金錯体をもちいて同様の健闘を並行して進めていたことにより、四角形型の二核錯体を効率よく合成する手法を開発するに至っている。特に白金錯体を用いた検討のなかでシクロオクタジエン配位子を有するアリール白金(II)錯体において、そのPt-C結合が溶液中で動的であることを見出すにいたった。
グルココルチコイド受容体活性化を介したミトコンドリア障害機序の解明

我々は、グルココルチコイド長期投与で骨格筋のミトコンドリア機能障害をきたすこと、その障害には活性酸素の過剰産生が密接に関係することを見出した。本研究は、グルココルチコイドが実際に培養神経・筋細胞においても活性酸素の過剰産生とミトコンドリア障害をきたすことを立証し、さらにその作用が活性化されたグルココルチコイド受容体を介したものであるか否か、さらに同受容体がミトコンドリア遺伝子の転写に直接作用したものであるか否かを明らかにすることを目的として計画された。平成14-15年度において、以下の知見が明かとなった。1)培養神経細胞および筋細胞におけるグルココルチコイドによるミトコンドリア障害の検討培養神経細胞(SH-SY5Y、TE671)および培養筋細胞(RD、L6)にデキザメサゾン(10^<-5>-10^<-7>M,1h-72h)を添加し、ミトコンドリア機能、膜電位の変化、アポトーシスおよびO^<2->の産生をFACS法にてそれぞれ解析したところ、ミトコンドリア膜電位の低下、アポトーシスの増加および活性酸素の過剰産生がおこり、これらの変化はミトコンドリアにおける活性酸素のスカベンジャーであるSOD-1の同時添加で抑制された。2)グルココルチコイド受容体の細胞内局在の解析ヒトグルココルチコイド受容体のcDNAクローンをGFP発現ベクターに導入し、GRF融合蛋白として培養神経細胞・筋細胞に一時的に発現させたのち、この細胞にデキザメサゾン(10^<-5>-10^<-7>M,1h-72h)を添加した時のGFP融合蛋白の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、グルココルチコイド受容体はグルココルチコイド非添加時にはcytosolに存在するものの、同剤の添加時には同受容体が核に移動した。さらに一部のシグナルはミトコンドリアに局在していることが示唆された。以上より、グルココルチコイドは培養神経・筋細胞においてもミトコンドリア障害とアポトーシスを誘発すること、その原因として活性酸素の過剰産生が関与していることが示唆された。さらに、グルココルチコイドはミトコンドリアに活性化されたグルココルチコイド受容体を介して、直接作用している可能性が考えられた。平成14年度において、以下の知見が明かとなった。1)培養神経細胞および筋細胞におけるグルココルチコイドによるミトコンドリア障害の検討培養神経細胞(SH-SY5Y、TE671)および培養筋細胞(RD、L6)にデキザメサゾン(10^<-5>-10^<-7>M,

1h-72h)を添加し、ミトコンドリア機能、膜電位の変化、アポトーシスおよびO^<2->の産生をFACS法にてそれぞれ解析したところ、ミトコンドリア膜電位の低下、アポトーシスの増加および活性酸素の過剰産生がおこり、これらの変化はミトコンドリアにおける活性酸素のスカベンジャーであるSOD-1の同時添加で抑制された。2)グルココルチコイド受容体の細胞内局在の解析ヒトグルココルチコイド受容体のcDNAクローンをGFP発現ベクターに導入し、GRF融合蛋白として培養神経細胞・筋細胞に一時的に発現させたのち、この細胞にデキザメサゾン(10^<-5>-10^<-7>M,1h-72h)を添加した時のGFP融合蛋白の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、グルココルチコイド受容体はグルココルチコイド非添加時にはcytosolに存在するものの、同剤の添加時には同受容体が核に移動した。さらに一部一部のシグナルはミトコンドリアに局在していることが示唆された。以上より、グルココルチコイドは培養神経・筋細胞においてもミトコンドリア障害とアポトーシスを誘発すること、その原因として活性酸素の過剰産生が関与していることが示唆された。さらに、グルココルチコイドはミトコンドリアに活性化されたグルココルチコイド受容体を介して、直接作用している可能性が考えられた。我々は、グルココルチコイド長期投与で骨格筋のミトコンドリア機能障害をきたすこと、その障害には活性酸素の過剰産生が密接に関係することを見出した。本研究は、グルココルチコイドが実際に培養神経・筋細胞においても活性酸素の過剰産生とミトコンドリア障害をきたすことを立証し、さらにその作用が活性化されたグルココルチコイド受容体を介したものであるか否か、さらに同受容体がミトコンドリア遺伝子の転写に直接作用したものであるか否かを明らかにすることを目的として計画された。平成15年度において、以下の知見が明かとなった。グルココルチコイド受容体の細胞内局在の解析ヒトグルココルチコイド受容体のcDNAクローンをGFP発現ベクターに導入し、GRF融合蛋白として培養神経細胞・筋細胞に一時的に発現させたのち、この細胞にデキザメサゾン(10^-5-10^-7M,1h-72h)を添加した時のGFP融合蛋白の細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。さらに一部のシグナルはミトコンドリアに局在していることが示唆された。
金属アレルギー特異的T細胞と抗原の特定

金属アレルギーは接触性皮膚炎の一つとして分類され、遅延型過敏反応と考えられている。近年の医療技術の進歩により生体材料として金属が多用され、それに伴い金属アレルギーの罹患者数は年々増加している。金属アレルギーの発症機序は不明な点が多く、ステロイドによる炎症緩和以外に治療法はなく、根治療は現時点では困難である。金属アレルギーと従来から報告されている接触性皮膚炎との違いについて分子レベルでの詳細な解析はなされていない。その理由としては、金属アレルギーにおける抗原提示細胞やT細胞、抗原ペプチドの同定が金属種ごとに包括的に進められていないことが挙げられる。そこで本研究では金属アレルギーの予防および診断に関する理論的基盤の確立を目指し、金属アレルギーの原因となる抗原とT細胞受容体を明らかにすることを目的とした。しかしながら、接触性皮膚炎の発症機序と金属アレルギーの発症機序が、完全に一致しているのかどうか、またタンパク抗原が原因の遅延型過敏反応や低分子化合物等のハプテンが原因とされる接触性皮膚炎と金属アレルギーとの違いについて分子レベルでの詳細な解析はなされていない。これまでに我々は、金属に特異的に反応するT細胞を捉え、レパトアを同定した。このT細胞が濃縮状態にあるマウスの所属リンパ節細胞を用いることで、これまでのリンパ球幼若化試験とは一線を画するin vitroにおける反応系の構築を試みた。in vivoにおいて金属感作を行ったマウスから採取したマクロファージを抗原提示細胞としてT細胞と共培養したところ、金属添加によりT細胞からのサイトカイン産生が認められたことから、この実験系を用いて抗原ペプチドの探索を進めた。抗原ペプチドのソースとしては、各種臓器から抽出したタンパク質に各金属を結合させ、金属結合性のタンパク質画分を得た後、上記の共培養系に供した。その結果、金属結合性のタンパク質画分の添加による特異的なT細胞の反応は捉えられなかった。したがって、現在は金属結合性および非結合性のペプチド画分を用いて、抗原ペプチドの探索を引き続き行っている。また、前年度までの研究により、パラジウム特異的に反応するT細胞受容体レパトアが同定されたことから、遺伝子導入による再構築T細胞の作製を行った。同時に、ニッケルを用いた金属アレルギー誘導系を再構築すると同時に、ニッケルが蓄積されやすい細胞内小器官を解析し、ニッケル結合性のペプチドおよびタンパク質についての情報収集を進めている。金属アレルギーは年々増大の一途を辿っており、掌蹠膿疱症などの重篤な合併症を併発するケースも少なくない。医療技術の進歩により、生体材料としてステント、インプラントなどの埋入金属、補綴治療が多用されているが、アレルギーや炎症などの原因となった場合、簡単に取り外すことは出来ず、患者の時間的・身体的・経済的負担が大きい。また、金属アレルギーの発症機序は未だ不明であり、早急な対策が求められている。金属アレルギーの診断法は、パッチテストが広く用いられており、各金属に対する反応性の有無をダイレクトに捉えられるという利点がある一方、パッチテストにより新たな金属に対して感作が成立し発症する症例や、パッチテスト試薬の製造元により反応性が異なる場合もあることから、安全で確実な新規診断法の開発が求められている。そこで本研究では、金属アレルギーの予防および診断に関する理論的基盤の確立を目指し、金属アレルギーの原因となる抗原とT細胞受容体を明らかにすることを目的とする。本目的を達成するためには、金属アレルギーの発症機序を時系列を追って解析することが必要である。しかしながら、これまでモデル動物が存在せず、世界的にもヒト患者サンプルを用いたin vitro研究が主流であり、時系列的解析は不可能であった。申請者らは、独創的観点から金属アレルギー発症マウスモデルの開発に成功し、金属アレルギーの発症機序を時系列を追って解析することが可能となった。申請者は、金属アレルギーにより、T細胞レパトアに変化が見られること、マウスの系統により反応性が異なることなど、in vivo, in vitro, in silicoにおいて重要な知見を得ており、実験手法は既に確立している。本研究では、このマウスモデルを応用し、T細胞受容体の解析を行うと同時に抗原ペプチドの解析を進め、金属アレルギーの抗原提示の詳細を明らかにする。パラジウム(Pd)を用いて金属アレルギーをマウス耳介に誘導した後、所属リンパ節の細胞を遺伝的背景が同じ免疫不全マウスに養子移入を繰り返すことで、Pdアレルギー特異的なT細胞を濃縮し、Pdアレルギーに特異的に関わるT細胞受容体レパトアの解析を行った。

移入繰り返しマウスに金属アレルギーを誘導し、24時間目の所属リンパ節および耳介の両方からRNAを抽出し、各T細胞レパトアの発現量を定量することで、理論上5 x 100,000,000,000,000,000通りの多様性を持つT細胞を数種類にまで絞り込み、Vα鎖を決定した。さらに抗原ペプチドとの結合部位であり、最もvariableな配列を持つ領域であるCDR3領域のクローナリティを解析したところ、モノクローナルなT細胞受容体α鎖がPdアレルギーに関わる可能性を見出した。Pdアレルギー特異的T細胞受容体レパトアの情報をもとに、スーパーコンピューターを用いin silicoでT細胞受容体の3次元立体構造の解析を行った。結合エネルギーを指標に、より安定に免疫シナプスを形成するMHCについて計算を行い、候補のMHCを決定した。以上の研究結果は、本研究の研究目的である「Pdアレルギーに関わるT細胞受容体レパトアの決定」および「in silico解析を用いた抗原ペプチドの予測」に向けて大きく進展できているといえる。また申請者は現在、金属アレルギーを発症する際にMHCを介してT細胞に提示される抗原ペプチドの分画・精製を進めており、採取されたペプチド配列のうちin silico解析で予測されるアンカーペプチドと相同性の高いペプチドについてin vivoで評価を行うことで、金属アレルギー発症において未だ解明されていなかった「特異的T細胞は何か」「抗原は何か」に対する情報を得られると考えている。金属アレルギーの原因金属といわれるニッケル(Ni)についても、同様特異的T細胞の濃縮を行い、T細胞レパトア解析を行うとともに、スーパーコンピューターによるin silico解析でT細胞受容体の3次元立体構造を明らかにする。これにより金属種ごとに特異的に反応するT細胞をクローニングし、金属間での交差反応の有無について、in vivo(モデルマウスの系)およびin vitro(T細胞クローンの系)の両面から確認する。また、マウスの系統(特にMHCのハプロタイプの違い)により反応するT細胞レパトアが異なるかどうかを検討する。前年度の研究計画により特異的に反応するT細胞が同定され、各金属イオンが抗原となった際に抗原提示に関わるMHCのサブクラスが判明した。in silico解析でMHCに提示されるペプチド鎖の長さおよびアンカーアミノ酸が推測されていることから、前年度に引き続き金属アレルギーモデルマウスの所属リンパ節をソースとしてダイレクトに抗原ペプチドを捕える。抽出した各ペプチドサンプルおよび、前年度特定したアンカーアミノ酸をもとにしたペプチドライブラリーを用いて、T細胞クローンをマウス脾臓から得た抗原提示細胞と共培養し、各ペプチドサンプルを供した際のT細胞の活性化・増殖状態をフローサイトメトリーにより解析し、抗原能を評価する。in vivoおよびin vitroにて金属イオンとともに抗原能を有するペプチドサンプルについて、LC/MS/MSによりアミノ酸配列を決定する。
分子シミュレーションによる生体分子系における励起エネルギー移動の理論的解明

本研究では、量子化学計算と分子動力学シミュレーションを効率良く結びつける手法を開発し、光捕集アンテナの高効率な光エネルギー伝達機能におけるタンパク質の構造および揺らぎの役割を解明することを目的とする。これまで光捕集アンテナ中の色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを解析可能な手法を開発し、光捕集アンテナFMOタンパク中の7つの色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを、世界で初めて定量的に再現することに成功した。また、色素間の励起子相互作用の大きさと揺らぎを解析可能な手法の開発も行った。光合成の反応中心に光エネルギーを送る役割を担う光捕集アンテナの内部では、異なる環境に置かれた色素が相互作用し、かつ適度に揺らぐことで高速・高効率な励起エネルギー移動が起こっている。このように複雑に相関している系について、タンパク質の微細な構造や揺らぎの役割を実験結果だけから理解することは難しい。一方、理論計算においても、タンパク質の構造や揺らぎの役割の解析には、従来の手法では非常に多くの構造で高コストな量子化学計算を行わなければならず、世界最高クラスの京コンピュータを用いてもほぼ不可能である。そこで本年度は、我々が開発した色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを効率的に解析可能な手法を用いて、光捕集アンテナの1つであるFenna-Matthews-Olson(FMO)タンパク中の異なる環境に置かれたクロロフィル色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを解析した。また、FMOタンパク中では色素の励起エネルギーが密集して揺らいでいるため、量子化学計算手法の精度が重要となるが、我々が開発した様々な溶媒におけるクロロフィル色素の吸収エネルギーや再配向エネルギーを正しく記述可能な量子化学計算手法を用いた。FMOタンパクは内部に7つの色素を持つ。この7つの色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを分子動力学シミュレーションにより解析した。まず、各色素の励起エネルギーの大きさは、実験スペクトルから予測されるものとほぼ定量的に一致した。次に、励起エネルギーの揺らぎの大きさを表すSpectral Densityは、7つの色素のうち1つだけ実験的に測定されているが、シミュレーションによってよく再現された。さらに、7つの色素のうち励起エネルギーの大きい2つの色素の揺らぎが他の5つと大きく異なることを明らかにした。現在、この結果を論文に投稿する準備を進めている。光合成系において反応中心に光エネルギーを伝達する役割を担う光捕集アンテナは、内部に複数の色素を持つ。光捕集アンテナは、この色素の励起状態を最適化することで、高速・高効率な励起エネルギー移動を達成している。しかし、タンパク質の微細な構造や揺らぎがどのようにそれを達成しているか全く明らかになっていない。本研究では実験・理論の両面で古くから広く研究されてきた光捕集アンテナであるFenna-Matthews-Olson(FMO)タンパクに着目する。FMOタンパク中の色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを解析するため、これまで我々は、色素の励起状態を適切に記述可能な量子化学計算手法およびFMOタンパク中の色素の大きさと揺らぎを解析可能な手法を開発してきた。本年度はこれらの手法を用いて、2つの菌種Prosthecochloris aestuariiとChlorobium tepidum由来のFMOタンパク中の色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを解析した。この2種類のFMOタンパクは、互いに77%の類似性を持ち、色素周囲の残基も全て同じだが、低温での吸収スペクトルが大きく異なることが知られている。このことからFMOタンパク内の色素の励起エネルギーが異なることが示唆されているが、その分子論的起源についてはよく分かっていない。我々の解析の結果、僅かな残基の違いが色素の構造や電子状態に影響を与え、色素の励起エネルギーに大きな影響を与えることを明らかにした。また、光捕集アンテナにおける励起エネルギー移動を理解するためには、色素間の励起子相互作用を計算する必要があるが、その計算には莫大な計算コストを必要とする。そこで、励起子相互作用を効率的に計算可能な手法を開発した。現在、この手法を用いてFMOタンパク中の色素間の励起子相互作用を解析中である。本年度は励起子相互作用を効率的に計算可能な手法を開発する予定だったが、この手法を開発しただけでなく、2つの菌種由来のFMOタンパクの励起エネルギーの違いの分子論的起源も明らかにした。したがって、当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究の目的は、量子化学計算と分子動力学シミュレーションを効率良く結びつける独自の手法を開発し、光捕集アンテナと呼ばれる生体分子の構造や揺らぎが励起エネルギー移動(EET)ダイナミクスにどのような影響を及ぼしているのかを解析し、高速・高効率なEETの分子論的機構を明らかにすることである。光合成細菌や緑色植物では、光捕集アンテナと呼ばれる生体分子で太陽から吸収した光エネルギーをEETにより高速・高効率に活性中心に伝達することが知られている。しかし、生体分子の微細な構造や揺らぎがどのように高速・高効率なEETを制御しているか全く明らかになっていない。そこで本年度は、EETダイナミクスの計算に必要な色素の励起状態間のカップリングの大きさと揺らぎを解析可能な手法を改良した。昨年度は、遷移密度間の相互作用を原子上に局在化した遷移電荷の相互作用として記述するTrESP法と外場や構造変化に対する1次の応答で電荷の揺らぎを記述するCRK法を組み合わせたTrCRK法を開発した。

しかし、本年度の解析の結果、共役系において、構造に対する1次の応答では、遷移双極子モーメントの揺らぎを過小評価することが明らかになった。これは1次の応答では、2つの二重結合が同時に伸縮する際などの影響を取り込めないからである。そこで、構造に対して2次の応答の効果まで取り込むTrCRK2法を開発した。この手法をテスト計算として共役系のペンタ-2,4-ジエンイミニウム(PSB3)カチオンに適用したところ、MDシミュレーション中の各構造における遷移双極子モーメントを非常に高精度に遷移双極子の揺らぎを再現した。現在、この手法を光捕集アンテナFMOタンパクに適用し、色素の励起状態間のカップリングの大きさと揺らぎの解析を進めているところである。本研究では、量子化学計算と分子動力学シミュレーションを効率良く結びつける手法を開発し、光捕集アンテナの高効率な光エネルギー伝達機能におけるタンパク質の構造および揺らぎの役割を解明することを目的とする。これまで光捕集アンテナ中の色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを解析可能な手法を開発し、光捕集アンテナFMOタンパク中の7つの色素の励起エネルギーの大きさと揺らぎを、世界で初めて定量的に再現することに成功した。また、色素間の励起子相互作用の大きさと揺らぎを解析可能な手法の開発も行った。当初の計画では、次年度以降に予定していた光捕集アンテナ中の色素の励起エネルギーの揺らぎの解析を本年度中に行うことができた。したがって、当初の計画以上に進展していると考えられる。次年度は、本年度に開発した色素間の励起子相互作用を用いて、FMOタンパク中の色素の励起子相互作用の大きさと揺らぎを計算し、それらにおけるタンパク質の構造や揺らぎの影響を明らかにする予定である。理論化学光捕集アンテナにおける励起エネルギー移動を理解するためには、光捕集アンテナ中の色素の励起エネルギーの大きさや揺らぎだけでなく、色素間の励起子相互作用も評価する必要がある。しかし、その計算には莫大な計算コストを必要とする。そこで、次年度は色素間の励起子相互作用を高精度・低コストで計算可能な手法の開発を行う。
天然ドロマイトを応用した抗菌性義歯の開発

【目的】天然鉱物であるドロマイトは食品添加物として用いられる一方で、その抗菌活性から医療用マスクやタオルなどにも応用されている。われわれは、ドロマイト自身には抗菌活性はないが、ドロマイトを加熱処理することにより得られる一炭酸塩ドロマイトを主成分としたドロマイト微粒子に抗菌活性があることを明らかにした。そこで、申請者は、床用レジンにドロマイト微粒子を添加することによる義歯の抗菌処理を目指し、ドロマイト添加レジンの、組成分析と抗菌性評価を目的とした。【研究計画】1.使用するドロマイト微粒子の特性評価粉末X線回折(XRD)による相同定、粒度分布測定を行った。2.試料の作製義歯床用レジンにドロマイト微粒子を10質量%添加し重合した試料を作製した。試料を電解放射型走査型電子顕微鏡(FE-SEM)にて観察するとともに、ドロマイトの分布状態をエネルギー分散型X線分析(EDX)にて評価した。3.物性評価,抗菌性試験試料の所要性質の測定を行い、JIS規格との比較を行った。抗菌性評価には黄色ブドウ球菌を用いた。前培養後、菌数を10^7CFUdm^<-3>に調整した菌混濁液に、試料を浸漬した。その後、液を回収し寒天培地で培養を行った。36°Cで24、48時間培養した後、形成したコロニー数の計測を行った。【研究成果】XRDにより、用いたドロマイト微粒子は一炭酸塩ドロマイトおよび酸化マグネシウムから成ることを確認した。SEM、EDX分析から、一炭酸塩ドロマイト微粒子がレジン中に均一に分布していることを確認した。物性評価では、曲げ強さ、曲げ弾性率、吸水量ともに、ドロマイト微粒子を添加してもJIS規格内の値を示した。抗菌性試験では、ドロマイト微粒子を添加することにより培養後(黄色ブドウ球菌)の形成コロニー数が減少した。以上の結果より、ドロマイト微粒子を10質量%添加した床用レジンは物性評価に問題なく、抗菌効果を発現することが明らかになり、臨床応用の可能性が示唆された。
食物アレルギー耐性誘導のための食生活に関する研究

食物アレルギーを治癒に導くためには、少量でも原因食物を食べた方がよいのか、従来通り完全除去していた方が良いのかは結論が出ていない。本研究では、3歳未満の明らかな鶏卵アレルギー児で、加熱全卵1/8個は食べられないが、1/32個は食べられるのを確認した患者を対象とした。対象患者は一日おきに1/32個食べる群と完全除去の群に分け、6ヶ月後に1/8個を食べさせてみた。結果、1/32個を食べる群のほうが、1/8個を食べられる割合が明らかに多く、今後の食物アレルギー患者の食生活の送り方に関して、新たな情報を見出すことが出来た。これまで食物アレルギーを診療する医師は患者を治癒に導く手段を持ち合わせなかった。しかし、昨今の疫学調査や経口免疫療法の結果などから、患者は当該原因食物を当初から完全除去を行うのではなく、むしろ積極的に摂取したほうが、耐性獲得に有利である可能性が示唆されている。今回の研究では、事前の食物経口負荷試験で規定された症状誘発リスクのない安全量を継続して摂取し症状を誘発しないで生活していくことで、対照群(従来通り完全除去)に比べ原因食物の耐性獲得率が良くなる可能性を検証することを目的とする。本年度は従来の食物負荷試験で実施していた最小量レベルを1段下げ実施し、当該レベルの症状誘発状況を確認した。具体的には鶏卵であれば従来の1/4の全卵1/32個(E0)、牛乳と小麦は従来の1/8の牛乳3ml(M0)またはうどん3g(W0)を実施した。E0はオボムコイド特異的IgE値36.7±34.1IU/mlの児42名に実施して陰性率85.7%、M0はミルク特異的IgEの値37.4±35.5IU/ml43名に実施して陰性率58.1%、W0は小麦特異的IgE値44.7±37.3IU/mlの児36名に実施して陰性率54.5%であった。本調査対象である2歳未満で結果陰性の児はE0で14名、M0で4名、W0で10名であった。本年度研究から、かつてであれば完全除去されたであろう食物アレルギ患者が、少量摂取であれば可能であることが示され、また本調査の対象年齢に絞っても牛乳以外は相当数研究に登録できることが判明した。来年度には本調査を開始して無作為ランダム化群間比較試験を実施して少量摂取の有効性を確認する。尚、今年度の対象症例も事後の経過を検証する予定である。【本研究の意義および重要性】これまでの食物アレルギー臨床の基本は原因食物の完全除去であり、医師は患者を積極的な治癒に誘導する手段を持ち合わせなかった。このため、患者は強いストレス下に晒され、自然に耐性を獲得するのを待つことしか無かった。しかし、昨今の疫学調査や経口免疫療法の結果から、患者は当該原因食物を完全除去するよりも、診断当初から積極的に摂取したほうが耐性獲得に有利である可能性が示唆されている。本研究では、事前に食物経口負荷試験などで診断された食物アレルギー児のうち、3歳未満の年少児で、従来であれば完全除去を指導されていただろう患者を対象に、無作為ランダム化比較試験で少量ずつでも食べられる量を食べていく群と、従来のように完全除去群の耐性誘導率を比較するものである。【研究実績】本年度は最終年度の解析に向けて、引き続き患者エントリーを継続している。IRBの承認が遅れた関係で、エントリー期間が想定よりも短くなったが、月1-2例ペースでのエントリーが続いており、研究期間内には目標症例を達成できると考える。中間解析症例数までは達成していない。ごく少量の負荷試験は鶏卵(全卵1/32個)負荷試験(n=96)が陽性率30.2%であり、OVM特異的IgE値に有意差を認めた(陽性41.3vs.陰性27.8Ua/ml : p=0.043)。牛乳(3ml)負荷試験(n=94)の陽性率は52.1%であり、ミルク特異的IgE値に有意差を認めた(陽性47.4vs.陰性27.3Ua/ml : p=0.014)。小麦(うどん3g)負荷試験(n=54)の陽性率は53.7%であり、年齢に有意差を認めた(陽性3.0vs.陰性1.9歳: p=0.029)。引き続き最終年度はごく少量負荷試験を進め、エントリーを積み上げていく。このため、患者は食物除去という強いストレス下に晒され続け、自然に治癒(耐性獲得)するのを待つしかなかった。しかし、昨今の疫学調査や経口免疫療法の結果から、患者は当該原因食物を完全除去するよりも、積極的に摂取したほうが治癒(耐性獲得)には有利である可能性が示唆されている。本研究では、事前に食物経口負荷試験等で診断された食物アレルギー児のうち、従来であれば完全除去指導されたであろう3歳未満の年少児を対象に、無作為ランダム化比較試験で少量づつでも食べられる量を食べていく群と、完全除去群の耐性誘導率を比較するものである。【研究実績】

本年度は最終年度であったが当院IRBの承認が遅れたために、予定よりもEntry開始が遅れ、Entry数が伸びていなかった。最終年度の本年度までに目標数に到達しなかったため、本調査を来年度へ研究期間を延長して目標症例数に到達することを期することとした。本年度までに極少量の負荷試験は鶏卵で96例、牛乳で94例、小麦で54例以上が実施できており、それぞれに陽性率が30.2%、52.1%、53.7%であった。またこれら陽性および陰性群間において、抗原特異的IgE値が有意差をもって陽性群の方で高い結果となった。これら結果より、従来であれば完全除去指導されていた患者群に対し、極少量であれば摂取可能である患者が一定以上いることが判明した。延長された最終年度においては、これら対象のランダム化比較試験の集計、解析を行う。当院IRBの承認が当初予定よりも大幅に遅れ、本調査のEntry時期が遅くなったことで、予定3カ年における症例の集積が達成できなかった。このため、研究期間延長を申請して来年度まで研究を継続することとした。はじめに:症状誘発閾値を超えず原因食物の摂取をすることが症状誘発閾値を上げ、耐性誘導するかは明らかでない。我々は、乳幼児を対象に少量全卵の継続摂取が安全に症状誘発閾値を上げることが可能か検証した。対象と方法:2014年10月から2016年8月に当院で実施した3歳未満児の明らかな鶏卵アレルギー患者を対象とし、まず加熱全卵1/32個の食物経口負荷試験(以下負荷試験)を行い、陰性者を本研究の解析対象者とした。対象は無作為に2群(隔日摂取群もしくは完全除去群)に分類した。隔日摂取群は、登録後6ヶ月間、加熱全卵1/32個を1日おきに摂取し、完全除去群は、6ヶ月間完全除去を指示した。両群とも登録6ヶ月後に、加熱全卵1/8個の負荷試験を実施した。主要評価項目は、6ヶ月後の加熱全卵1/8個の負荷試験陽性率とした。副次評価項目は、検査値(総IgE値、抗原特異的IgE値等)の変化、研究期間中の有害事象の発生率とした。結果:11名の隔日摂取群と8名の完全除去群の患者背景(年齢、検査値、アナフィラキシー既往歴など)に有意差はなかった。登録6ヶ月後の加熱全卵1/8個の負荷試験の結果は、隔日摂取群の陽性率は0%、一方で完全除去群は50%であり、隔日摂取群が有意に低かった(p=0.018)。研究期間中の総IgE値の変化、卵白特異的IgE値の変化は両群間に有意差は見られなかったが、隔日摂取群の登録6ヶ月後のオボムコイド特異的IgE値は完全除去群と比較して有意に減少していた。研究期間中の誘発症状や有害事象は両群ともに報告はなかった。結語:乳幼児期において、少量の原因食物を、閾値を超えるような増量をしないで摂取し続けることは、安全に耐性を誘導する可能性があり、本手法は今後の食物アレルギーの臨床に大きな変革を与える可能性がある。食物アレルギーを治癒に導くためには、少量でも原因食物を食べた方がよいのか、従来通り完全除去していた方が良いのかは結論が出ていない。本研究では、3歳未満の明らかな鶏卵アレルギー児で、加熱全卵1/8個は食べられないが、1/32個は食べられるのを確認した患者を対象とした。対象患者は一日おきに1/32個食べる群と完全除去の群に分け、6ヶ月後に1/8個を食べさせてみた。結果、1/32個を食べる群のほうが、1/8個を食べられる割合が明らかに多く、今後の食物アレルギー患者の食生活の送り方に関して、新たな情報を見出すことが出来た。当院IRBの承認が当初予定よりも遅れた結果、患者エントリー期間が想定よりも短縮している。その結果エントリー患者も想定よりも少なめに推移しており、当初予定していた中間階咳を本年度行っていない。研究はシステマティックに遂行できており、引き続き患者Entryを継続する。
感潮河川域における窒素・リンの循環モデル

昭和61年度には元安川の6測点における総合調査3回と、定点における25時間連続観測3回を行った。その他補助的なフィールド調査とデータ解析を助けるための室内実験を行い、また放水路について数値実験と理論計算を試みた。総合調査ではSTD,DOメータ,濁度計による鉛直分布の測定と、採水による塩分,DO,栄養塩類,溶存および懸濁態の全窒素と全リンクロロフイルa,尿素,ATPなどの測定をした。また、流下藻類,海産性植物プランクトンの調査を行った。たらに、底質について有機物量や微生物調査を行った。定点では流速,塩分,温度,DO,濁度の連続観測と2時間ごのと採水・分析を行った。懸濁物量も栄養塩類濃度もほぼ塩分と逆相関を示すが、塩分13%で大きなズレが見られた。有機態窒素は上流水門から河口近くまでは塩分と逆相関になるが、河口域では再び増大した。プランクトンの分布とクロロフィルa,ATPの分布との間にも相関のある部分とズレのある部分とが見られた。これらの流況,水質,底質,プランクトンなどのデータを使って物質収支を見た。元安川において比較的安定した冬季の窒素収支は次の通りである。大芝水門から1潮時に溶存無機態窒素は370kg供給され、河口から海へ出るのは18kgである。この減少は川岸や川底の付着藻類,流下藻類,海産性植物プランクトン,細菌などによる吸収,利用,吸着と考えられる。これらの栄養塩類の挙動は室内実験の結果とよく対応しており、アンモニアについては粒子への吸着,沈降,除去が主と考えられる。溶存有機態窒素は下げ潮時には流下するに従って増大する。これは細菌による有機物の分解と流下藻類,植物プランクトンからの溶出による。1潮時でみた時には、流下中に減少しており、海水との接觸による溶存有機物の凝固,沈殿によるものである。これらの研究の成果を報告書(環境科学研究報告書B-315)にまとめた。
喘息におけるアラキドン酸カスケードの薬理遺伝学的解析とオーダーメイド治療の確立

我々は個々のアレルギー(主に気管支喘息)患者について、その血液および尿など用い、アラキドン酸、ロイコトリエン、トロンボキサンを測定しその病態や解析し、それらを基にし,重症度の予測や適切な治療(適切な抗アレルギー剤の選択)に結びつけられるのではないかと考えている。さらに薬理遺伝学的な観点から,薬物動態や薬の作用する位置に関する遺伝子の解析を行ない,オーダメイド治療へ発展させようと考えている。20032004年度は以下の点を明らかにした。1.ロイコトリエン受容体拮抗薬としてプランルカストについて、小児気管支喘息患者において定常状態における血漿中薬物濃度を解析した。小児気管支喘息患者22例に文書により同意を取った後、プランルカスト70mg/kg/日を朝食および夕食後の2回に分けて反復投与し、投与後1週間以上内服したのち採血し、定常状態における血漿中薬物濃度を解析した。結果として小児においては投与後13時間後に最高血漿中濃度(482ng/ml)に達し,成人の約5時間後に対し早い傾向を認めた。クリアランスは1.81 1/hr/kgで成人より約1.6倍大きかった2.小児気管支喘息患者において尿中LTE4や尿中11DTXB2を発作時、非発作時、症状改善時について検討したところ、尿中LTE4排泄量は発作時に増加し、症状改善時には減少する傾向を示し、尿中11DTXB2排泄量は発作時に増加し、症状改善時にも排泄増加を維持する傾向を示した。また両者の排泄量の関連を検討したところ相関は認められなかった。以上よりアラキドン酸カスケード内における5-lipoxygenase系およびcyclooxygenase系の代謝経路において不均衡がある可能性が示唆された。我々は個々のアレルギー(主に気管支喘息)患者について、その血液および尿など用い、アラキドン酸、ロイコトリエン、トロンボキサンを測定しその病態や解析し、それらを基にし,重症度の予測や適切な治療(適切な抗アレルギー剤の選択)に結びつけれるのではないかと考えている。2003年度は以下の点を明らかにした。クリアランスは1.811/hr/kgで成人より約1.6倍大きかった2.小児気管支喘息患者において尿中LTE4や尿中11DTXB2を発作時、非発作時、症状改善時について検討したところ、尿中LTE4排泄量は発作時に増加し、症状改善時には減少する傾向を示し、尿中11DTXB2排泄量は発作時に増加し、症状改善時にも排泄増加を維持する傾向を示した。

さらに薬理遺伝学的な観点から,薬物動態や薬の作用する位置に関する遺伝子の解析を行ない,オーダメイド治療へ発展させようと考えている。20032004年度は以下の点を明らかにした。1.ロイコトリエン受容体拮抗薬としてプランルカストについて、小児気管支喘息患者において定常状態における血漿中薬物濃度を解析した。小児気管支喘息患者22例に文書により同意を取った後、プランルカスト70mg/kg/日を朝食および夕食後の2回に分けて反復投与し、投与後1週間以上内服したのち採血し、定常状態における血漿中薬物濃度を解析した。結果として小児においては投与後13時間後に最高血漿中濃度(482ng/ml)に達し,成人の約5時間後に対し早い傾向を認めた。クリアランスは1.81l/hr/kgで成人より約1.6倍大きかった2.小児気管支喘息患者において尿中LTE4や尿中11DTXB2を発作時、非発作時、症状改善時について検討したところ、尿中LTE4排泄量は発作時に増加し、症状改善時には減少する傾向を示し、尿中11DTXB2排泄量は発作時に増加し、症状改善時にも排泄増加を維持する傾向を示した。また両者の排泄量の関連を検討したところ相関は認められなかった。以上よりアラキドン酸カスケード内における5-lipoxygenase系およびcyclooxygenase系の代謝経路において不均衡がある可能性が示唆された。