hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非接触磁気方式ポジションセンサと解析法に関する研究

平成23年度は,本研究で主に扱うパラメータである複素透磁率の非線形分布を考慮した周波数応答解析手法及びに非接触磁気方式ポジションセンサの最適化を中心に研究を行った.まず複素透磁率の非線形分布を考慮した周波数応答解析は,従来の透磁率の分布が線形的である周波数応答解析との比較を行った.その結果,提案した解析手法の有効性が確認でき,平成23年1月の電気学会研究会,また平成23年7月にオーストラリアのシドニーで開かれた国際学会COMPUMAGにて研究成果を発表し,体系的にまとめて電気学会論文誌に投稿し最終審査待ちの状態である.ただし,非接触磁気方式ポジションセンサで発生される磁束領域では,実測に近い結果は得られたが,従来の解析手法とほぼ同じ結果であったため,最適化を行う際は従来の周波数応答解析を用いることにした。非接触磁気方式ポジションセンサの最適化には,一般的に用いられる実験計画法の直交表を採用して検討を行った.さらに,ポジションセンサのシールドの内側の形状が複雑であったため,円筒に簡易化することで,コア材料,コイル,シールド,それぞれの間のギャップが変位に対するインピーダンスの感度や直線性に及ぼす影響を調べた.その結果,インピーダンス感度を得られるための各パラメータの傾向を把握することができた.その一方,インピーダンス直線性に関しては目標とした誤差±1%以下のパラメータは得られたが,変位に対しての感度変化が異なることがわかり,高精度なポジションセンサの設計のため以降コイル形状と変位に対するインピーダンスの直線性を検討していく予定である.平成22年度は,本研究で主に扱うパラメータである複素透磁率の非線形性を考慮した周波数応答解析手法を中心とした研究となった.この解析手法の細かな設定(修正)を行う際,解析PCの仕様の問題で解析要素数の限界が発生したため,本来の目的であった以下の非接触磁気方式ポジションセンサの特性解析より優先して問題を解決することに変更した.何故なら,この解析手法を設計ツールとして最適化およびセンサの感度特性解析を行うためである.1.様々なコア材料特性の影響(センサとしての検出特性-感度および直線性など)を調べ,最適なコア材料特性を明らかにする.2.非接触磁気方式ポジションセンサの感度に影響を及ぼす因子を考慮して,寸法パラメータの最適化を実行し,プロトタイプの試作機と定量的な評価を行う.解析手法の修正をすると同時に,非線形性を考慮するためのコア材料特性を測定した.磁束密度が時間に線形的変化をしていても,高周波領域においては材料の表面と内部で,磁束密度の粗密の差により透磁率のバラツキが生じていると考えられるが,周波数応答解析(線形解析)では材料内はすべて同じ透磁率の値で解析される.このように磁束密度の線形領域で,材料内での非線形的分布を考慮して解析した結果,より測定値に近い結果を得ることができた.なお,非接触磁気方式ポジションセンサの発生磁力領域では両者で大きな変化は見られなかった.以上の結果を踏まえ,時間コストを削減し,かつ,より多要素で解析し評価するために高性能解析用PCを購入した.また,平成23年1月の電気学会静止器・回転機合同研究会にて得られた結果をまとめ発表を行った.さらに,平成23年7月のCOMPUMAGにダイジェストを投稿中(4月20日ダイジェスト結果発表).上記の非接触磁気方式ポジションセンサ特性解析に関する内容は現在進行中である.(インピーダンス感度および直線性,最適化など)平成23年度は,本研究で主に扱うパラメータである複素透磁率の非線形分布を考慮した周波数応答解析手法及びに非接触磁気方式ポジションセンサの最適化を中心に研究を行った.まず複素透磁率の非線形分布を考慮した周波数応答解析は,従来の透磁率の分布が線形的である周波数応答解析との比較を行った.その結果,提案した解析手法の有効性が確認でき,平成23年1月の電気学会研究会,また平成23年7月にオーストラリアのシドニーで開かれた国際学会COMPUMAGにて研究成果を発表し,体系的にまとめて電気学会論文誌に投稿し最終審査待ちの状態である.ただし,非接触磁気方式ポジションセンサで発生される磁束領域では,実測に近い結果は得られたが,従来の解析手法とほぼ同じ結果であったため,最適化を行う際は従来の周波数応答解析を用いることにした。非接触磁気方式ポジションセンサの最適化には,一般的に用いられる実験計画法の直交表を採用して検討を行った.さらに,ポジションセンサのシールドの内側の形状が複雑であったため,円筒に簡易化することで,コア材料,コイル,シールド,それぞれの間のギャップが変位に対するインピーダンスの感度や直線性に及ぼす影響を調べた.その結果,インピーダンス感度を得られるための各パラメータの傾向を把握することができた.その一方,インピーダンス直線性に関しては目標とした誤差±1%以下のパラメータは得られたが,変位に対しての感度変化が異なることがわかり,高精度なポジションセンサの設計のため以降コイル形状と変位に対するインピーダンスの直線性を検討していく予定である.
セラミド選別輸送分子の機能に関する構造生物学的研究

スフィンゴミエリンは、小胞体膜上で生合成されたセラミドを前駆体として、ゴルジ体内腔にて生合成された後、小胞輸送により形質膜外層へと輸送される。Ceramidetransporter(CERT)は、セラミドを選択的に小胞体からゴルジ体へと輸送するタンパク質である。CERTはN末端にPHドメイン(CERT-PH)を、C末端にSTARTドメインを持つ。CERT-PHは、PtdIns(4)Pを特異的に認識する。PtdIns(4)Pはゴルジ体膜上に豊富に存在することから、STARTドメインによって小胞体膜上からセラミドを引き抜いたCERTは、CERT-PHによるPtdIns(4)Pの認識によってゴルジ体膜上へと移行する。前年度はCERT-PHのPtdIns(4)P/脂質膜認識機構をNMR法によって解析した。ゴルジ体膜の脂質組成を模した、PtdIns(4)Pを組み込んだリポソームを調製し、CERT-PHと混合して転移交差飽和実験を行った。顕著にシグナル強度が減少したアミノ酸残基をCERT-PHの立体構造モデル上にマッピングした結果、分子表面にて一つの連続した面を形成し、この部分がゴルジ体膜模倣リポソームと相互作用することが明らかとなった。本年度は、ゴルジ体膜模倣リポソームと相互作用することを明らかにしたアミノ酸残基の機能解析を行った。相互作用を行うアミノ酸残基について変異を導入し、さまざまな濃度のPtdIns(4)Pを組み込んだリポソームに対する結合について、速度論的解析を行った。その結果、PtdIns(4)Pの極性頭部を認識するアミノ酸残基と、脂質膜を認識するアミノ酸残基を各々同定することに成功した。PtdIns(4)Pはゴルジ体膜上に豊富に発現していることから、STARTドメインによって小胞体膜上からセラミドを引き抜いたCERTは、CERT-PHによるPtdIns(4)Pの認識によってゴルジ体膜上へと移行する。CERT-PHの大腸菌発現・精製系を構築した。安定同位体標識を施したCERT-PHを調製して測定を行い、CERT-PHのNMRスペクトルを帰属した。CERT-PHは、脂質二重膜上のPtdIns(4)Pを認識することから、CERT-PH-PtdIns(4)Pの相互作用解析には、PtdIns(4)Pを組み込んだリポソームを用いた。両者の結合界面の同定に我々が開発した転移交差飽和法を適用した。ゴルジ体膜の脂質組成を模したリポソームを調製し、CERT-PHと混合して転移交差飽和実験を行った。Ceramidetransporter (CERT)は、セラミドを選択的に小胞体からゴルジ体へと輸送するタンパク質である。

CERT-PHは、PtdIns(4)Pを特異的に認識する。PtdIns(4)Pはゴルジ体膜上に豊富に存在することから、STARTドメインによって小胞体膜上からセラミドを引き抜いたCERTは、CERT-PHによるPtdIns(4)Pの認識によってゴルジ体膜上へと移行する。前年度はCERT-PHのPtdIns(4)P/脂質膜認識機構をNMR法によって解析した。ゴルジ体膜の脂質組成を模した、PtdIns(4)Pを組み込んだリポソームを調製し、CERT-PHと混合して転移交差飽和実験を行った。顕著にシグナル強度が減少したアミノ酸残基をCERT^PHの立体構造モデル上にマッピングした結果、分子表面にて一つの連続した面を形成し、この部分がゴルジ体膜模倣リポソームと相互作用することが明らかとなった。本年度は、ゴルジ体膜模倣リポソームと相互作用することを明らかにしたアミノ酸残基の機能解析を行った。相互作用を行うアミノ酸残基について変異を導入し、さまざまな濃度のPtdIns(4)Pを組み込んだリポソームに対する結合について、速度論的解析を行った。その結果、PtdIns(4)Pの極性頭部を認識するアミノ酸残基と、脂質膜を認識するアミノ酸残基を各々同定することに成功した。
這いまわる細胞の「進む」と「曲がる」の間をつなぐルールの解析

遊走性細胞の走化性の運動特性についてのルールの解明を目指し、昨年度までに、フォトリソグラフィを用いた微細加工技術と共焦点顕微鏡観察系の融合による、ハイスループットライブイメージング計測系を構築した。これまでの細胞遊走の先行研究の多くでは、せいぜい10から数十細胞分の遊走動態を解析していたのに対して、本計測系では、1000を超える細胞についての膜変形や細胞内分子動態解析が実現された。その結果として、大量の生細胞動態の画像処理が必要になるという新たな問題が生じたため、そのボトルネックを解消することを目的に、深層学習を利用した細胞輪郭の自動検出を実現し、大量の画像処理を自動的に行えるようになった。それらから、粘菌アメーバと好中球様培養細胞株HL60の移動速度と細胞極性動態が細胞サイズに依存することを見出した。細胞サイズが中程度の場合、移動速度と細胞サイズは正の相関を示し、F-actinの細胞局在動態から評価した細胞極性は単一の方向、誘引物質濃度の高い方向に安定していた。ある一定サイズを超えた大きい細胞では、細胞サイズが大きくなるにつれてむしろ移動速度は減少し、細胞は誘引物質濃度の高い側のみならず低い側に先導端を形成し双極的な極性を示した。細胞サイズが小さくなると、先導端が一方向に安定せず誘引物質の高濃度側と低濃度側の間を振動し、その結果、方向的移動が見られなくなった。細胞の誘引物質刺激への応答性と極性動態の関係をさらに調べるため、マイクロ流路を用いて誘引物質方向の時間反転実験系を構築し、誘引物質方向を反転させた場合の方向転換動態解析を現在進行中である。現時点で、誘引物質方向反転に対する細胞極性の誘引物質方向への追従性についても細胞サイズ依存性が見られるという予備的結果を得ており、今後、アクチン関連分子についての薬剤阻害や遺伝子欠損株を用い、さらに解析していく予定である。這いまわる細胞の細胞極性や移動速度(「動く」こと)と方向転換(「曲がる」こと)との間にある関係性を明らかにするために、まず本年度は、細胞の方向転換についての詳細な実験を可能とするマイクロ流路実験系である、"Microfluidic-lighthouse"を開発した。これまでは困難であった、層流と濃度勾配の方向を360°任意の向きに提示、制御して動的な細胞刺激場を作り出すことが可能になった。この新規流路系や、これまでに構築してきたマイクロ流路系を用いて、誘引物質cAMPや葉酸に対する細胞性粘菌の走化性応答動態を解析した。細胞の先導端を特徴づける、アクチン結合タンパク質とGFPの融合タンパク質やPIP3に結合するPHドメインタンパク質とRFPの融合タンパク質を発現させた細胞性粘菌株を作成し、それらを用いて細胞誘引物質であるcAMPや葉酸の動的な場の元での細胞運動の様子のタイムラプス計測を行った。誘引場の動態は、蛍光物質であるフルオレセインやAlexa594を葉酸溶液に混合することによって推定した。その結果、これまでの我々の研究からは、好中球様細胞のfMLPへの走化性や、細胞性粘菌のcAMPへの走化性では、濃度が時間減少する勾配を無視する"整流性"が見られることがわかっていたが、葉酸に対する粘菌細胞の走化性では濃度の時間変化に対して同様な振る舞いを示さず、むしろ濃度が時間減少すると積極的に方向転換を示すことが明らかになった。新規実験系の構築に成功し、生細胞の動態観察が順調に進行しているため走化性細胞の極性形成や方向転換能の解析を進めるにつれ、遺伝的背景が同一の細胞で、かつ同一の環境下においても、細胞の運動速度や走化性能に大きなばらつきが見られることがわかってきた。走化性能に関する個々の細胞の特性をより詳細に調べるため、高さ、幅が共に5μm程度に制限されたマイクロチャンネルをアレイ化したマイクロ流路を作成し、1回の実験で、細胞の形態や運動、走化性シグナル分子の細胞内局在動態を高解像度で数百細胞分取得できる実験系を構築した。この実験系を用いて解析を進めたとこr、粘菌細胞の移動速度が細胞サイズに依存し、細胞極性の動態には、細胞サイズによって三つの異なるパターンが存在することがわかってきた。中程度の大きさの細胞は、Fアクチン局在によって特徴づけられる先導端をただ1つもつという意味で単極性を示し、細胞の大きさに比例した速度で走化性誘引物質の高濃度側へと一方向に移動した。長さが35μmより大きい細胞は双極性を示し、2つの側面に先導端を形成した。12μmより小さい細胞では安定した細胞極性が形成されず、先導端はしばしば振動的に振る舞った。同様の実験を、ヒト好中球様細胞であるHL60に対して行ったところ、細胞の移動速度は細胞サイズと正の相関があり、その相関はノコダゾール処理した細胞で最も顕著であった。対照的に、Rac1阻害下では正の相関が失われ、双極的な細胞極性が観察された。細胞サイズに依存した細胞極性動態が粘菌細胞と好中球で同様のメカニズムによって生じていることが期待され、今後は、サイズ依存性がどのように細胞極性機構から生じ得るかについてさらなる解析を進める。当初予期していなかった細胞の個別性が明らかになってきたが、新たな実験系を構築することで効率的にデータ取得できるようになり、順調に知見が集まっているため。

遊走性細胞の走化性の運動特性についてのルールの解明を目指し、昨年度までに、フォトリソグラフィを用いた微細加工技術と共焦点顕微鏡観察系の融合による、ハイスループットライブイメージング計測系を構築した。これまでの細胞遊走の先行研究の多くでは、せいぜい10から数十細胞分の遊走動態を解析していたのに対して、本計測系では、1000を超える細胞についての膜変形や細胞内分子動態解析が実現された。その結果として、大量の生細胞動態の画像処理が必要になるという新たな問題が生じたため、そのボトルネックを解消することを目的に、深層学習を利用した細胞輪郭の自動検出を実現し、大量の画像処理を自動的に行えるようになった。それらから、粘菌アメーバと好中球様培養細胞株HL60の移動速度と細胞極性動態が細胞サイズに依存することを見出した。細胞サイズが中程度の場合、移動速度と細胞サイズは正の相関を示し、F-actinの細胞局在動態から評価した細胞極性は単一の方向、誘引物質濃度の高い方向に安定していた。ある一定サイズを超えた大きい細胞では、細胞サイズが大きくなるにつれてむしろ移動速度は減少し、細胞は誘引物質濃度の高い側のみならず低い側に先導端を形成し双極的な極性を示した。細胞サイズが小さくなると、先導端が一方向に安定せず誘引物質の高濃度側と低濃度側の間を振動し、その結果、方向的移動が見られなくなった。細胞の誘引物質刺激への応答性と極性動態の関係をさらに調べるため、マイクロ流路を用いて誘引物質方向の時間反転実験系を構築し、誘引物質方向を反転させた場合の方向転換動態解析を現在進行中である。現時点で、誘引物質方向反転に対する細胞極性の誘引物質方向への追従性についても細胞サイズ依存性が見られるという予備的結果を得ており、今後、アクチン関連分子についての薬剤阻害や遺伝子欠損株を用い、さらに解析していく予定である。昨年度まで行っていた生細胞観察及び解析を進める。今後はより高時間空間分解能での動態解析を進め、さらに一連のシグナル伝達系構成分子の薬剤阻害や遺伝子改変株の利用により、細胞の運動と方向転換を司るルールに迫る。細胞サイズに依存した細胞極性動態が生じるメカニズムを明らかにするため、これまでに構築したハイスループット生細胞計測系を用いて、細胞内シグナル伝達系の動態を詳細に調べる予定である。また、細胞外誘引物質濃度を時間的に変動させることなどを通じて、細胞の情報処理と極性形成の関係を明らかにして行く。マイクロ流路作成が予想よりも順調であったため、それに関わる経費が予定よりも少額ですんだ研究計画を遂行する過程で、細胞の運動性と方向転換能の振る舞いが、個々の細胞によって大きく異なることが見出されてきた。細胞ごとの個別性・個性をより精緻に特徴付けるための実験を進めることが、研究目的達成に非常に重要であることを踏まえ、消耗費の一部や論文投稿関連経費を来年度に繰越すことにした。消耗品の経費に当てる
口腔の健康と軽度認知障害（MCI）の関連：MCI予防による認知症予防効果の検討

高齢化の進む日本では認知症有病者数は増大しつづけており、厚生労働省によると2025年には700万人(5人に1人)が認知症を有すると推測されている。認知症は突然発症するのではなく、健常な状態から軽度認知障害(MCI)、そして認知症と段階を経て発症するため、認知症に至る前のMCIの状態をスクリーニングで発見する必要性が重視されている。そこで口腔機能とMCIの関連を検討することを研究の目的とした。平成28年度に質問紙を作成し、日本老年学的評価研究プロジェクトの一環として高齢者を対象とした疫学調査を実施し、口腔の健康や認知機能についてのデータを得た。平成29年度にデータベースの作成と解析を開始し平成30年度も引き続き解析を行った。調査対象者の平均年齢は75.2歳(SD=6.2)であった。MCIの症状がある者は70,566人(47.6%)、噛み合わせの悪い者は19,777人(19.8%)であった。噛み合わせの良い者のうちMCIの症状がある者は56,076人(45.5%)、噛み合わせが悪い者のうちMCIの症状がある人は11,635人(58.8%)であった。年齢などの全ての交絡因子を調整した多変量解析の結果、噛み合わせの良い者に比較して噛み合わせの悪い者でMCIを有する有病率比が有意に高かった(PR:1.27 95%CI:1.25ー1.28)。ここから主観的な噛み合わせが悪いことがMCIを有することと関連することが明らかになった。交絡因子として現在歯数と義歯の使用の有無を調整した上でも有意な関連が認められたことから、主観的な噛み合わせが独立したファクターとして認知機能に関連している可能性が明らかにされた。これらの解析のほか、得られたデータからいくつかの疫学研究も実施した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまで我々は、口腔の健康と認知症発生、原因の一部となる脳血管疾患の発生、認知症を含む高齢者の要介護状態の発生の関連について研究を行ってきた。今回、認知症の予防に寄与するエビデンスを得るため、回復する可能性のある軽度認知障害(MCI)や主観的な認知機能(SCI)と口腔の関連を検討することとした。平成28年度は、疫学調査の実施が研究の中心である。これまでの口腔の健康や認知機能に関する論文をレビューし、調査する内容について決定し質問紙を作成した。そして高齢者を対象とした健康や生活習慣、社会的決定要因に関する疫学調査を実施し、質問法の郵送調査にて口腔の健康や認知機能に関する情報を収集した。口腔の健康状態としては、現在歯数、主観的な噛み合わせの状態、義歯やインプラントの利用の有無、食べにくさやむせることの経験、口の渇き、主観的な口腔のQOL、口腔の困りごと、歯科受診、歯みがきやその他の口腔清掃の習慣、間食頻度、歯の喪失経験義歯の清掃についてである。主観的な認知機能は記憶や物忘れについて先行研究で用いられている指標とした。そのほか、全身の健康状態や生活習慣に関する内容についても調査を行った。この疫学調査は、日本老年学的評価研究プロジェクトの一環である。これまで2010年、2013年にも調査を実施しており、今回の調査はそれらの過去の調査とデータ結合をすることで、口腔機能や認知機能の経年的な推移が把握できるようになり、今後の分析により両者の時間的な前後関係が明らかになることが期待される。東日本大震災の余震の大きな地震による調査の遅れなどがあり、予定よりは遅れたものの、調査は完了した。

交絡因子として現在歯数と義歯の使用の有無を調整した上でも有意な関連が認められたことから、主観的な噛み合わせが独立したファクターとして認知機能に関連している可能性が明らかにされた。これらの解析のほか、得られたデータからいくつかの疫学研究も実施した。世界的に高齢化が進展しており、高齢者におおい認知症への対策が急がれている。高齢化の進む日本では認知症有病者数は増大しつづけており、厚生労働省によると2025年には700万人(5人に1人)が認知症を有すると推測されている。認知症は突然発症するのではなく、健常な状態から軽度認知障害(MCI)、そして認知症と段階を経て発症するため、認知症に至る前のMCIの状態をスクリーニングで発見する必要性が重視されている。口腔の健康は歯周病による慢性炎症や、会話やコミュニケーションなどの社会的機能を通して認知症発生に関連すると考えられる。そこで口腔機能とMCIの関連を検討することを研究の目的とした。平成28年度に質問紙を作成し、日本老年学的評価研究プロジェクトの一環として高齢者を対象とした疫学調査を実施し、口腔の健康や認知機能についてのデータを得た。平成29年度に詳細な各変数ごとの欠損値や外れ値を処理したデータクリーニングを実施し、解析用の大規模解析用データベースを作成した。要介護認定や認知症のない148,392人の65歳以上の高齢者のデータが解析用データベースに含められた。「いつも同じことを聞く」、「今日が何月何日かわからない時がある」、「物忘れが多い」の3つの質問に1つでも当てはまるものを主観的なMCIがありと定義した。男性47.0%、女性53.0%で平均年齢は73.7歳(SD=6.0)の対象者の内、MCIがありの者は47.6%であった。今後詳細な解析をさらに進めていく。昨年度の遅れを取り戻し、順調に進展している。調査データのクリーニングや、過去のデータとの結合を行い、口腔と認知機能の解析をスタートしていく。最初は単年度の横断データにより、軽度認知障害の有無をアウトカムにして、口腔の健康状態の関連のロジスティック回帰分析による検討を行う。その際、性別、年齢、社会経済状況、健康状態、保健行動などの共変量の調整を行う。口腔の健康状態としては咀嚼機能を用いることを検討する。またその解析結果をもとにして、複数年度の認知機能の変化と口腔の健康状態の変化を考慮した縦断データ分析の方法の検討を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。口腔機能とMCIの関連について、因果推論を実施するための疫学的な解析を進めていく。
健康作りに活用できる栄養調査方法の開発と妥当性の検討

新しく開発した、実物大のフードモデルを用いた食品摂取頻度・摂取概量法(量・頻度法)の有用性を検討するために、地域住民の同一対象者64名(男女40歳から69歳)について、この調査法と24時間思い出し法の二つの方法で栄養調査を行った。量・頻度法による栄養素摂取量は、エネルギー2258kcal、タンパク質85.1g、脂質53.6g、糖質319.4g、エネルギー比率は、タンパク質15.1%、脂質21.4%、糖質56.6%であった。量・頻度法は、24時間思い出し法に比較し、エネルギー、タンパク質、脂質、糖質の摂取量は、平均25%多く、食品群別摂取量もほとんどの食品で多かった。エネルギー比率は脂質で一致した。エネルギー、三大栄養素の摂取量、エネルギー比率の個人の値は、二つの方法間で有意な正相関を得た。食品群別摂取量もほとんどの項目で有意な正相関を得た。また、24時間思い出し法で得られたエネルギー、三大栄養素の摂取量とエネルギー比率を3群にカテゴリー化して検討した結果、量・頻度法との間に正の相関が認められた。この調査法で得られたエネルギー、三大栄養素の摂取量は、国民栄養調査結果より多いがそれに近い値であり、エネルギーや三大栄養素の把握は可能であった。この調査法は、特別な技術を必要とせず、事前にこの調査法の指導を受けた調査員で可能であった。以上の結果から、この調査法は、地域住民の食事状況を集団として把握する方法として有用であることが示された。次に、本調査法を用いて滋賀県内の6町村において血清総コレステロールの低下をめざした健康教育を無作為割り付けにより介入研究の方法で行った。対象者は、前年度の成人病検診において血清総コレステロールが240mg/dl以上であった者に参加を呼びかけ、応募した者である。介入研究の結果、介入群は対照群に比べて約7mg/dl低下することが認められた。疫学調査においては、集団の食生活を把握するだけでなく、個人の栄養素摂取量と疾病の因果関係を追及し疾病を予防するために個人についての栄養調査が必要とされるが、そのための方法が未だ正しく確立していない。そこで我々は実物大のフードモデルを用いた食品摂取頻度・摂取概量法(量・頻度法)を開発した。この量・頻度法の栄養調査としての有用性を検討するために、地域住民の同一対象者64名(男女40歳から69歳)について、量・頻度法と24時間思い出し法の二つの方法で栄養調査を行った。量・頻度法による栄養素摂取量は、エネルギー2258kcal、タンパク質851g、脂質53.6g、糖質319.4g、エネルギー比率は、タンパク質15.1%、脂質21.4%、糖質56.6%であった。

この調査法で得られたエネルギー、三大栄養素の摂取量は、国民栄養調査結果より多いがそれに近い値であり、エネルギーや三大栄養素の把握は可能であった。この調査法は、特別な技術を必要とせず、事前にこの調査法の指導をうけた調査員で可能であった。以上の結果から、この調査法は、地域住民の食事状況を集団として把握する方法として有用であることが示された。新しく開発した、実物大のフードモデルを用いた食品摂取頻度・摂取概量法(量・頻度法)の有用性を検討するために、地域住民の同一対象者64名(男女40歳69歳)について、この調査法と24時間思い出し法の二つの方法で栄養調査を行った。量・頻度法による栄養素摂取量は、エネルギー2258kcal、タンパク質85.1g、脂質53.6g、糖質319.4g、エネルギー比率は、タンパク質15.1%、脂質21.4%、糖質56.6%であった。量・頻度法は、24時間思い出し法に比較し、エネルギー、タンパク質、脂質、糖質の摂取量は、平均25%多く、食品群別摂取量もほとんどの食品で多かった。エネルギー比率は脂質で一致した。エネルギー、三大栄養素の摂取量、エネルギー比率の個人の値は、二つの方法間で有意な正相関を得た。食品群摂取量もほとんどの項目で有意な正相関を得た。また、24時間思い出し法で得られたエネルギー、三大栄養素の摂取量とエネルギー比率を3群にカテゴリー化して検討した結果、量・頻度法との間に正の相関が認められた。この調査法は、特別な技術を必要とせず、事前にこの調査法の指導を受けた調査員で可能であった。次に,本調査法を用いて滋賀県内の6町村において血清総コレステロールの低下を目指した健康教育を無作為割り付けにより介入研究の方法で行った。対象者は,前年度の成人病検診において血清総コレステロールが240mg/dl以上であった者に参加を呼び掛け,応募したものである。介入研究の結果,介入群は対照群に比べて約7mg/dl低下することが認められた。
放射光位相差Ｘ線ＣＴ法による血管退縮関連疾患群の異常血管の構造解析に関する研究

小児の先天性心血管疾患の治療において、血管収縮に伴う狭窄病変に起因する疾患の予後は極めて不良であるが、血管収縮機転のメカニズムは解明されていない。大型放射光施設SPring8の大型加速器による放射光位相差X線CT法が、収縮血管の構造解析解明に有効ではないかと考え検証した。正常構造および血管退縮性疾患群の心臓ホルマリン標本を用い、放射光位相差X線CT法で血管組織を撮像。画像処理を施し、病理切片染色と詳細に照合した結果、一部疾患群では動脈管組織が正常血内へ進展している構造が明らかになった。本法は標本を破壊することなく退縮血管の構造解析を可能とし、今後の病因解明へ有効であると考えられた。本研究の目的は、様々な血管の退縮を契機として引き起こされる疾患群の検体を、超大型加速器(シンクロトロン)で得られる放射光を利用した分子構造解析を行い、血管退縮のメカニズムを明らかにすることにある。本年度は、正常心(胎児心)をコントロールとして、一方で対照群として左心低形成症候群や大動脈弓離断症・縮窄症などの、動脈管組織退縮と密接に関連する疾患群の標本を、大型放射光施設(SPring8)のビームラインを利用して、放射光位相差X線CT法による画像解析のを実施した。開始当初は、分子構造解析の実験データの安定・精度を担保するための具体的な手順の確立から開始し、画像の精度が得られて時点で、画像解析ツール・ソフトウエアによる構造解析を開始した。これらに必要な大量のデータを保存・処理・解析するためのハードウエア・ソフトウエアの導入と調整を実施した。さらに、得られた画像解析結果を、従来の染色切片標本と照らし合わせるため、切片標本を作製し、画像解析データとの照合を実施した。この結果、本法により従来は切片標本によってのみ局在の道程が可能であった動脈管組織の局在を、非破壊検査によって確認できることが明らかとなった。そこで、さらに画像解析を3Dデータとして処理する試みを開始。標本の任意断面における分子構造が放射光位相差X線CT法により得られることが示され、従来の切片による一断面2Dによる解析法に対する本法のアドバンテージが示された。当初対照群としてウサギの心臓・血管により、人の正常心標本のコントロールとして比較検討を予定していたが、胎児の正常心臓をコントロールとして解析することが可能となり、動物種の間による相違の検討を行う必要がなくなり、早い時期より疾患標本を対象とした解析が可能となったことから、当初予定よりも進展がみられている。また、解析できる標本のサイズが、実験系の改良により達成され、より多くの標本が解析対象とできていることが、当初計画よりも順調な実施に寄与している。放射光を利用した位相差X線CT法は、分子レベルの組織の相違を画像により検出できる新しいモダリティーとして注目されている。しかし、超大型加速器(シンクロトロン)を必要とすることから、研究の機会は現状では極めて限定的であり、その有効性や適応については現在研究が進んでいる過程である。今回の研究課題は、従来よりその分子構造が解明されていない血管退縮性疾患の構造解析を放射光位相差X線CT法により明らかにしようとする試みとなる。本研究を開始して、世界で初めて動脈管組織の放射光位相差X線CT画像を得ることができた。さらに標本を切片として従来の組織染色方法と比較検討し、今回非破壊検査によって新たに得られた画像が、従来の破壊的検査(組織切片染色)による組織構造を忠実に反映していることが示された。さらに、非破壊検査である本法のアドバンテージとして、撮像後に任意の断面を画像処理して描出することが可能であることが示された。このことにより、新たなモダリィティーが血管退縮性疾患の病態解明に有効な手段であることが示された。更に、非破壊検査であることから、現在各施設に保存されている血管退縮性疾患の貴重な標本を撮像することで、データベース化への道すじが示された。希少かつ致死的な疾患の病態解明には、その標本の精査が必要であるが、破壊検査しか方法を持たなかった従来の問題点(希少な標本を切片にできないという問題)に本法は解決を与えるものと期待される。放射光位相差X線CTによる組織撮像の標本・検体を全国規模で協力・提供を受けることができ、当初予定していなかった「正常標本」を含め、予定検体数よりも多くの撮像が可能となった。また、機器の整備により、標本撮影サイズが当初計画よりも大きく設定できることとなり、複数検体の同時撮像も可能となり、効率的なデータ収集が可能となったことによって、研究の進展が見られている。更に、組織学的検討に画像解析のソフトウエアが有効活用され、撮像結果をより詳細に検討できることとなった。またデータストレージを整備したことにより、巨大データを分割する必要がなくなり、画像処理のソフトウエア活用が一層進んでいる点が寄与している。放射光を利用した位相差X線CT法というモダリティーにより、分子レベルの組織解析が可能となった。特に、非破壊で三次元画像が得られる点、および病理組織レベルの解析が可能な点が従来にない特徴となっている。本年度は血管退縮性疾患、動脈管組織の進展形式の撮像と病理標本との突合により、本法によって非破壊で得られた3Dの画像が実際の病理組織の細胞成分と一致することが示された。

その上で本法で得られた多数の3D画像を検討した結果、大動脈縮窄症において動脈管組織が広範に大動脈内膜への進展をしていることが確認された。この進展の形式を今後解析することにより病態生理の解明と、適切な治療法(適正な切除範囲の同定)の選択につながると期待される。非破壊検査で三次元構築の病理組織と同等もしくはそれ以上の解析能力を有する本法は、全国の施設で保管されている様々な先天性心疾患標本の活路となり、希少疾患の発生要因解析に重要な情報を与えることが示された。今後は、血管退縮疾患はもとより、刺激伝導系の異常など従来の方法では三次元化が困難であった分野への応用も期待され、すでに一部のデータは解析可能となっている。将来的には、希少疾患の貴重な標本を本法で撮像し、その解析データをデータベース化して共同研究に活用できるようにすることで、広く学問の進歩に寄与するものと期待される。小児の先天性心血管疾患の治療において、血管収縮に伴う狭窄病変に起因する疾患の予後は極めて不良であるが、血管収縮機転のメカニズムは解明されていない。大型放射光施設SPring8の大型加速器による放射光位相差X線CT法が、収縮血管の構造解析解明に有効ではないかと考え検証した。正常構造および血管退縮性疾患群の心臓ホルマリン標本を用い、放射光位相差X線CT法で血管組織を撮像。画像処理を施し、病理切片染色と詳細に照合した結果、一部疾患群では動脈管組織が正常血内へ進展している構造が明らかになった。本法は標本を破壊することなく退縮血管の構造解析を可能とし、今後の病因解明へ有効であると考えられた。今後の研究は、さらに血管退縮性疾患群の検体標本を解析する事から、標本のデータベース作成が急がれる。このデータベースをもとに、系統的な疾患解析のスケジュールを立て、解析結果をもとに、各疾患群の関連性や差異を明らかにして、それぞれの疾患が発症する機序を検討する貴重な材料としたい。課題として、対象とする標本の形態によっては、放射光位相差X線CTの画像に微細な気泡によるノイズが生じる事があり、対象とする標本の増加にともない、対応が必要となることが想定される。現在、解決策を模索しているが、安定化にはさらに検討が必要と思われる。昨年来のテーマであるデータベースの構築を最終年度に道すじをつける必要があると考えている。本研究は挑戦的萌芽研究であり、ここで得られた新たな成果を、今後継続的な学問領域として安定的に実施するためには、データベースによりデータの共有や活用へ道を開いておくことが重要と考えている。医歯学系対象として予定した家兎が、胎児心臓の提供を受けられる状態となり、計画の発展的な修正が可能となり、家兎及び関連予算の節約につながった一方で、画像処理用高機能デスクトップPCでの画像解析に必要な膨大なデータ処理のため、データストレージが必要となった。このために、年度内予算で予定していた高機能モバイルPCの購入予算が不足する事となり、発注を平成28年度に先送りしたことにより、最終的に当該年度所要学が当初計画より減少した。データベース化に伴う入力作業及び、標本の切片作成にかかる其々の人件費・謝金が必要と考えているが、本年度までの事業実施において、自力による作業、及び経費のかからない(研究の協力を得られる)範囲での実施が可能となったことから、支出されていないことによる。平成27年度予算の残額は、平成28年度に繰り越したモバイルPC購入の執行を予定している。その他については、実験の進行に合わせて、計画に従って執行する予定である。
血液脳関門プロスタグランディン輸送と薬剤誘発性血管障害機構の解明

脳内prostaglandinE2 (PGE2)は消失半減期12分で血液脳関門(BBB)を介して脳から循環血液中へ排出された。一方、PGE2は脳毛細血管内皮細胞増殖を促進させた。PGE2輸送を阻害するNSAIDsであるindomethacinおよびdiclofenacは脳毛細血管細胞増殖を低下させ、PGE2はそれを見かけ上抑制させた。以上の結果から、脳内PGE2クリアランスにBBBを介した排出輸送が関与すること、PGE2濃度の増加は脳毛細血管新生を促進させること並びにNSAIDsによるPGE2排出輸送阻害は脳毛細血管障害を悪化させる可能性があることが示唆された。炎症誘発物質であるプロスタグランディンE2(PGE2)は血液脳関門(BBB)を介して脳から血液方向へ排出され、その排出輸送にMRP4が関与することを明らかにすることを目的に、血液脳関門を介したPGE2の脳内から血液方向への排出輸送特性を検討した。In vivo BBBを介した脳から血液中へのPGE2排出輸送をBrain Efflux Index法を用いて解析したところ、マウス大脳に投与された[^3H]PGE2は少なくとも投与後60分まで経時的に脳から消失し、その消失半減期は12分と算出された。一方、反投与側大脳、小脳および脳脊髄液からは投与した[^3H]PGE2の0.5%以下しか検出されなかった。従って、[^3H]PGE2はBBBを介してマウス脳から消失することが示唆された。BBBにおける詳細なPGE2排出輸送分子を同定するにはBBBの実体である脳毛細血管内皮細胞のin vivo特性を反映したモデル細胞(TM-BBB細胞)を用いるのが有用である。また、siRNAを用いたRNAi法によってTM-BBB細胞に発現するMRP4をノックダウンすることで、BBBにおけるMRP4を介したPGE2排出輸送活性を特異的に評価できると考えた。しかし、マウス脳毛細血管内皮細胞はsiRNA導入効率が低い。そこで、内因性タンパク質であるGAPDH活性を指標に、TM-BBB細胞に対するsiRNA導入法を検討した。その結果、低濃度の化学修飾siRNAと今回検討した細胞毒性を引き起こさない量のliposomeを用いることによってTM-BBB細胞にGAPDH活性を最大40%抑制することが可能になった。以上の結果から、PGE2はBBBを介して脳内から速やかに消失することが示唆され、in vitro TM-BBB細胞においてPGE2輸送に関与する分子を同定するために必要なsiRNA導入法を確立した。炎症誘発物質であるプロスタグランディンE2(PGE2)は脳内にその代謝酵素が存在しないことが報告されていることから、血液脳関門(BBB)を介した脳から血液方向への排出輸送が脳内PGE2クリアランスに大きく関与すると考えられた。昨年度、Brain Efflux Index法を用いた解析からそれを実証した。In vitro BBBモデル細胞であるTM-BBB細胞においてPGE2輸送分子であるMRP4タンパク質発現が確認されたことから、これが一部PGE2排出輸送に関与する可能性が推察された。一方、炎症時などに大量に産生されたPGE2が脳毛細血管に傷害を与え、これがBBB崩壊につながると考えられた。PGE2はPGE2受容体(EP)を介して作用を示すことが報告されている。RT-PCR法を用いてその発現を検討したところ、TM-BBB4細胞においてEP-1およびEP-4 mRNA発現が確認された。PGE2がTM-BBB4細胞の細胞増殖に与える影響を検討したところ、PGE2 24時間処理においてTM-BBB4細胞の細胞増殖抑制効果は観察されず、反対に、PGE2濃度増加よって細胞増殖増加効果が観察された。さらに、PGE2は炎症治療に用いられるindomethacinおよびdiclofenacによるTM-BBB4細胞への細胞毒性を抑制させた。従ってPGE2はNSAIDsによるBBB障害作用を保護する作用を有することが推察される。以上の結果から、BBBは排出MRP4を介した排出輸送過程を介してPGE2クリアランスに関与し、さらに、MRP4を介して排出されたPGE2がNSAIDsによる脳毛細血管障害に対して保護作用を示す可能性があることが示唆された。
癌患者に対する多サイトカイン産生単核球移入療法

前年度の基礎的検討の結果に基づき、サイトカイン産生単核球の腫瘍内投与を1)胃癌を中心とする消化器癌症例、2)再発および手術不能脳腫瘍症例、3)進行口腔領域癌症例に対して実施し、安全性および臨床効果について検討した。結果:1)胃癌患者10症例について術前末梢血より分離したOK-432処理単核球(10^7細胞)を胃内視鏡にて胃癌局所に投与。5-12日目に切除胃を病理学的に検索。1例に腫瘍消失、1例に広範囲壊死、2例に部分壊死を認めた。その後更に12例において実施。2例に広範壊死、2例に部分壊死を認めた。計22症例を通じ発熱等の副作用は認めていない。また、1例の胃癌術後の肝転移再発症例に対し術前凍結保存したOK-432刺激脾細胞を肝動脈より投与し、増殖速度の低下が観察された。2)口腔領域癌においては現在まで18症例に対し自己単核球の腫瘍内および支配動脈よりの投与を完了。内9例において切除標本の病理検索が終了しているが、3例にCR、6例にPR、1例にMRを認めている。また嚢胞形成型の腫瘍症例において単核球投与後腫瘍縮少とともに嚢胞内液の腫瘍マーカーの低下が認められた。更に、凍結保存した他家単核球を2症例に投与したが2例ともに明らかな腫瘍縮小効果が認められ、1例においては治癒切除術が施行された。これらの投与を通じ一過性の発熱以外特に記載すべき副作用は認められなかった。3)脳腫瘍に対しては現在まで5例の患者に対しオンマイヤーのリザーバーより単核球を投与し、投与局所での多サイトカインの産生、腫瘍の壊死性変化、生存率の有意の延長(コントロール12か月に対し治療群は約26か月)が確認された。但し、発熱、血圧低下などの副作用が出現し今後の課題である。1.OK-432で12時間以上刺激した単核球は、その後培養素からOK-432を除去しても〓L-1,〓FNα,〓FNγ,TNFα,TNFβ,TGIFなど種々のサイトカインを産生し続ける事が判明した。PHAや〓L-2処理によっても〓FNγを中心とするサイトカイン産生が認められたがその種類及び程度はOK-432に比べ低い。また,PSK,レンチナンのサイトカイン産生能力は最も低かった。またサイトカイン生産能は個体差が大きい。2.培養腫瘍細胞、手術時摘出新鮮腫瘍細胞を標的細胞としたin vitroにおけるサイトカインの組合わせを検討した結果、IFNαとIFNγ,IFNαとTNFα,IFNαとTGIF,IFNγとTGIF,IFNγとTNFαなどの間に相乗的細胞増殖抑制効果が認められ、これらの結果からOK-432処理単核球の産生する多サイトカイン混合物は単一の遺伝子組み替えサイトカインに比べ著しい腫瘍細胞増殖抑制活性を示し、作用もより殺細胞的で、増殖抑制スペクトラムも極めて広い事が判明した。3.以上の結果から現時点では単核球を12-24時間in vitroでOK-432処理した単核球がサイトカイン産生の面からみて理想的であり、単核球のソースとしては末梢血単核球ついで脾細胞単核球が適当であり、リンパ節および癌性胸腹水中の単核球も使用可能である。サイトカインの中心的役割をなすTGIFの精製は平成4年度では目的を達成できなかった。但し、negative selection法により産生細胞はT-リンパ球であると推測された。

今後、引続き本物質の精製、抗体作製に精進する。4.以上の結果よりOK-432処理自己単核球の腫瘍局所への投与(多サイトカイン産生単核球移入療法)を胃癌、口腔領域癌、脳腫瘍患者を対象に行った。胃癌、口腔領域癌に対しては特に問題となる副作用は認められず臨床応用可能と判断された。脳腫瘍に対しては発熱、血圧低下症例を経験し、本療法との関連性を更に検討する必要がある。前年度の基礎的検討の結果に基づき、サイトカイン産生単核球の腫瘍内投与を1)胃癌を中心とする消化器癌症例、2)再発および手術不能脳腫瘍症例、3)進行口腔領域癌症例に対して実施し、安全性および臨床効果について検討した。結果:1)胃癌患者10症例について術前末梢血より分離したOK-432処理単核球(10^7細胞)を胃内視鏡にて胃癌局所に投与。5-12日目に切除胃を病理学的に検索。1例に腫瘍消失、1例に広範囲壊死、2例に部分壊死を認めた。その後更に12例において実施。2例に広範壊死、2例に部分壊死を認めた。計22症例を通じ発熱等の副作用は認めていない。また、1例の胃癌術後の肝転移再発症例に対し術前凍結保存したOK-432刺激脾細胞を肝動脈より投与し、増殖速度の低下が観察された。2)口腔領域癌においては現在まで18症例に対し自己単核球の腫瘍内および支配動脈よりの投与を完了。内9例において切除標本の病理検索が終了しているが、3例にCR、6例にPR、1例にMRを認めている。また〓胞形成型の腫瘍症例において単核球投与後腫瘍縮小とともに〓胞内液の腫瘍マーカーの低下が認められた。更に、凍結保存した他家単核球を2症例に投与したが2例ともに明らかな腫瘍縮小効果が認められ、1例においては治癒切除術が施行された。これらの投与を通じ一過性の発熱以外特に記載すべき副作用は認められなかった。3)脳腫瘍に対しては現在まで5例患者に対しオンマイヤーのリザーバーより単核球を投与し、投与局所での多サイトカインの産生、腫瘍の壊死性変化、生存率の有無の延長(コントロール12か月に対し治療群は約26か月)が確認された。但し、発熱、血圧低下などの副作用が出現し今後の課題である。
酵母自食作用関連因子の網羅的分離とそのネットワークの構築

細胞は飢餓時においてタンパク質合成を抑えるとともに、自食作用(autophagy)によって細胞質成分を非特異的に分解/再利用することによって限られたアミノ酸を効率よく利用している。自食作用においては、液胞近傍のドット状構造体であるPAS(pre-autophagosomal structure)から細胞質成分を非特異的に取り囲むように二重膜小胞(オートファゴソーム)が形成され、これが液胞と融合して内容物が分解される。本研究室を中心とした酵母を使ったスクリーニングにより、これまで27のAtg因子が自食作用(autophagy)に必須な因子として明らかとなっている。オートファゴソーム形成に必要なAtg因子はPASに局在し、そこでオートファゴソーム形成を行っている。こうしたAtg因子の中でAtg9は膜貫通型タンパクであることと、その細胞内局在がPASだけでなく細胞質中を動き回る無数の小さなドット状構造体にも見られる点でユニークな存在である。またAtg9pは他の多くのAtg因子のPASへの局在に必要とされる一方、それ自身のPASへの局在は他のAtg因子を必要としないことから、PAS形成の初期段階に機能していると考えられるようになってきた。しかしApg9p自身のPASへの局在機構は未知である。これまでの研究によりAtg9自身のdomain解析によってN末端およびC末端の親水性領域がPASへの局在化に必要なことが分かった。この領域を欠いた変異Atg9(ΔN-Atg9およびΔC-Atg9)は細胞質中の動くドット状構造体には局在するがPASには局在しない。しかし、これらを野生型全長Apg9pと共発現するとPASへの局在能を回復する。このことはAtg9同士が複合体を形成していることを示唆しており、実際、免疫沈降実験によりこの相互作用が確認された。また、ΔN-Atg9とΔC-Atg9を共発現させた場合でもPASへの局在が回復する。ΔN-Atg9とΔC-Atg9は免疫沈降で共沈しうることからN末とC末の親水性領域はPASへの局在化において、複合体内の異なる分子間でtransに作用しうることが示された。また、Atg9膜貫通領域における変異は不安定化を起こすが、ER associated degradationに関わる因子の破壊株で発現させると変異Atg9の発現量が増加した。したがって、Atg9がPASに局在化する過程でERの関与が考えられ、現在解析中である。自食作用において細胞質を非選択的に取り込むオートファゴソーム形成過程に機能している因子を新たに単離することを目的として、gcn変異株の抑制因子単離を始めた。gcn変異株は野生型に対して約30%50%の自食作用活性を示す。この活性を上げる因子を同定できる感度の高い系の確立を目指している。すでに、コロニーの色でスクリーニングする系を改変してフィルター上でアッセイする系を作成し、この感度をさらに高める条件設定および、飢餓条件でのcDNAライブラリー作成の後、スクリーニングを行う。さらに、酵母自食作用に必須であるApg9の解析を行った。現時点で明らかとなった点を挙げると、(1)Apg9は自食作用が誘導される飢餓条件下でリン酸化を受ける。(2)Apg9はApg9自身と複合体を形成する。(3)Apg9-GFPは他のApgタンパクと一致する液胞近傍のドット状構造(pre-autophagosomal structure : PAS)と一致しない細胞質中の無数のドット状構造に局在する。(1)については他のapg変異株の中にリン酸化が起こらないものがあることから、Apg9の作用段階が他のApg因子の下流にあり、自食作用がApg9のリン酸化を介して行われている可能性を示唆している。現在、リン酸化部位の同定を行っている。(2)についてはApg9同士の結合は栄養条件によって変化しない。この相互作用がApg9の機能に必要であるかを調べるためにいくつかの領域欠損型変異Apg9を作成している。(3)についてはApg9の局在が他のapg変異株で変化することを見いだし、このことと上述のリン酸化およびApg9同士の相互作用との関連を調べている。これまでの解析により、酵母自食作用必須因子であるApg9pは他の多くのApgタンパクのPAS (pre-autophagosomal structure)への局在に必要であることから、PAS形成の初期段階に機能していると考えられるようになってきた。網羅的解析等により、争くの膜輸送系タンパクが自食作用およびこれに類似したcvt経路に関与していることが示されており、これらとApg9p局在との関連を調べた。しかし、Apg9pはこれまでのところ、調べられた全ての膜輸送系変異株でPASに局在していた。したがって未知の経路によりPASに局在している可能性が強く示唆された。また、いくつかの他のapg変異株ではApg9p-GFP融合タンパクがPASに野生株より多く蓄積することを見出した。これを指標にN末親水性領域を欠いた変異Apg9p(ΔN Apg9p)がPASに局在できないことを見出した。しかし、ΔN Apg9pは野生型全長Apg9pと共発現するとPASの局在能を回復するする。

これまでの本研究でApg9p同士が結合することが明らかとなっていることから、上記の結果はこの結合を介したものによると考えられ、これについて現在解析中である。別のアプローチとしてApg9p膜貫通領域の変異解析を行った。その結果、ほとんどの変異Apg9pは発現量が減少した。温度依存的に減少する変異もあり、今後の解析に使用する予定である。ごく少数ではあるが、比較的安定かつ自食作用欠損を示す変異Apg9も単離された。しかしながら、この変異Apg9pはPASに局在しうることが明らかとなり、PAS局在に欠損があるのではないことが分かった。タンパク量が減少する変異Apg9pを過剰発現して解析すると、Apg9p-Apg9p結合が起きていないことから、この分子間結合とタンパク量の維持は密接にリンクしていると考えられる。プロテアソーム変異株および液胞プロテアーゼ変異株においてもこの変異Apg9pの量は変化しないことから、量の減少は分解によるものではなく、合成段階での制限による可能性があり、これについて今後解析する予定である。細胞は飢餓時においてタンパク質合成を抑えるとともに、自食作用(autophagy)によって細胞質成分を非特異的に分解/再利用することによって限られたアミノ酸を効率よく利用している。自食作用においては、液胞近傍のドット状構造体であるPAS(pre-autophagosomal structure)から細胞質成分を非特異的に取り囲むように二重膜小胞(オートファゴソーム)が形成され、これが液胞と融合して内容物が分解される。本研究室を中心とした酵母を使ったスクリーニングにより、これまで27のAtg因子が自食作用(autophagy)に必須な因子として明らかとなっている。オートファゴソーム形成に必要なAtg因子はPASに局在し、そこでオートファゴソーム形成を行っている。こうしたAtg因子の中でAtg9は膜貫通型タンパクであることと、その細胞内局在がPASだけでなく細胞質中を動き回る無数の小さなドット状構造体にも見られる点でユニークな存在である。またAtg9pは他の多くのAtg因子のPASへの局在に必要とされる一方、それ自身のPASへの局在は他のAtg因子を必要としないことから、PAS形成の初期段階に機能していると考えられるようになってきた。しかしApg9p自身のPASへの局在機構は未知である。これまでの研究によりAtg9自身のdomain解析によってN末端およびC末端の親水性領域がPASへの局在化に必要なことが分かった。この領域を欠いた変異Atg9(ΔN-Atg9およびΔC-Atg9)は細胞質中の動くドット状構造体には局在するがPASには局在しない。しかし、これらを野生型全長Apg9pと共発現するとPASへの局在能を回復する。このことはAtg9同士が複合体を形成していることを示唆しており、実際、免疫沈降実験によりこの相互作用が確認された。また、ΔN-Atg9とΔC-Atg9を共発現させた場合でもPASへの局在が回復する。ΔN-Atg9とΔC-Atg9は免疫沈降で共沈しうることからN末とC末の親水性領域はPASへの局在化において、複合体内の異なる分子間でtransに作用しうることが示された。また、Atg9膜貫通領域における変異は不安定化を起こすが、ER associated degradationに関わる因子の破壊株で発現させると変異Atg9の発現量が増加した。