hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
科学的根拠に基づく当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラム開発評価研究

本研究は、20年間の追跡調査と介入研究により、「科学的な根拠に基づく当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムの開発と評価」を目的とした。臨床的重要性と統計的妥当性を加味しながら有効な項目を抽出して体系化し、「当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラム」を作成した。プログラムを実践の場で活用し、有効性を確認した。平成21年度には、下記の研究を行った。1.当事者と専門職に対するフォーカス・グループ・インタビューに基づく当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムの開発公民館、地区集会所、老人クラブ、小中学校、保健センター、子育て支援センターなどで、世代間交流を促進するコミュニティ・エンパワメントプログラムの当事者ニーズと内容を抽出するため、当事者および専門職に対するフォーカス・グループ・インタビューを4グループに対し実施した。「楽しさ」「共感」「ともにつくる」をキーワードに実際の経験、当事者ニーズ、体験に基づく重要項目などなどを討論の柱として、具体的な内容を詳細に収集した。1グループあたり原則として約2時間の時間をとり、逐語記録と観察記録を合わせてデータ化した。2.追跡データを活用したコミュニティ・エンパワメントプログラムの効果評価平成元年20年に実施したのべ80,000名の調査対象者の中から、これまでのプログラム参加者を抽出し、非参加者と比較しながら精神面・身体面の効果の軌跡と関連要因を分析した。3.国内外のコミュニティ・エンパワメントプログラムに関する系統的レビューとエビデンス・テーブルの構築「コミュニティ・エンパワメントプログラム」の開発過程、内容、評価に関する海外先進機関の訪問調査、既存研究の系統的レビューとエビデンス・テーブルを構築した。米国とカナダにおいて開発研究を実施している研究機関を訪問し、情報交換と情報収集を行った。4.当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラム試案の作成上記13を活用し、臨床的重要性と統計的妥当性を加味しながら、有効な項目を抽出して体系化し、当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラム試案を作成した。平成22年度には、下記の研究を行った。1.フォーカス・グループ・インタビュー推移分析に基づく当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムの開発公民館、地区集会所、老人クラブ、小中学校、保健センター、子育て支援センターなどで、世代間交流を促進するコミュニティ・エンパワメントプログラムの当事者ニーズと内容を抽出するため、当事者および専門職に対するフォーカス・グループ・インタビューの結果より、推移分析を行った。「楽しさ」「共感」「ともにつくる」をキーワードに実際の経験、当事者ニーズ、体験に基づく重要項目などなどを討論の柱として、具体的な内容を詳細に、できるだけ数多く収集した。2.追跡データを活用したコミュニティ・エンパワメントプログラムの効果評価平成元年20年に実施したのべ80,000名の調査対象者の中から、これまでのプログラム参加者を抽出し、非参加者と比較しながらさらに経年的な精神面・身体面の効果の軌跡と関連要因を分析した。平成23年度には、下記の研究を行った。1.フォーカス・グループ・インタビューに基づく当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムの開発公民館、地区集会所、老人クラブ、小中学校、保健センター、子育て支援センターなどで、世代間交流を促進するコミュニティ・エンパワメントプログラムの当事者ニーズと内容を抽出するため、当事者および専門職に対するフォーカス・グループ・インタビューの結果より、推移分析を行った。2.追跡データを活用したコミュニティ・エンパワメントプログラムの効果評価平成元年23年に実施したのべ85,000名の調査対象者の中から、プログラム参加者を抽出し、非参加者と比較しながらさらに経年的な精神面・身体面の効果の軌跡と関連要因を分析した。4.当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムの作成

上記13を活用し、臨床的重要性と統計的妥当性を加味しながら、有効な項目を抽出して体系化し、当事者共創型コミュニティ・エンパワメントプログラムを作成した。
メタノール酵母分子育種株によるバイオコンバージョン

本研究では、安価なメタノールの存在により強く誘導される新規な真核生物の異種遺伝子発現系として、本申請者によって開発されたメタノール資化性酵母Candidaboidinii発現系を用いたバイオコンバージョンシステムについての基礎研究を行った。まず、C.boidinii AOD1 5'-隣接断片をS.cerevisiae ADK1構造遺伝子の上流に連結しC.boidinii染色体内へ導入して、アデニル酸キナーゼの大量発現を試みた。すると菌体内蛋白質の28%にも及ぶアデニル酸キナーゼがC.boidinii内で大量発現された。また染色体挿入型あるいは自律複製型など様々な種類の形質転換体を作成しその発現制御について検討した結果、先にクローンされたC.boidinii AOD1遺伝子の5'-隣接領域にはAOD1遺伝子の発現制御を司るのに必要十分なcis-配列が存在していることも明らかとなった。さらに、得られたC.boidinii形質転換株の菌体反応を用いてアデノシンを基質としたATP生産を、形質転換株を用いて行い野生株と比較した。野生株ではアデニル酸キナーゼによるAMPからADPへの変換反応が律速となっていたが、形質転換株では、本酵素活性が5000倍から10000倍に増強されているために、培養液当たりのATP生産活性は23倍に増強した。このような形質転換株を用いてpH制御下で基質を添加しながら反応させることにより、45hの反応で230mM(117g/1)のATPを反応液中に蓄積することができた。これらの事実は、単にATPを生産するための手段ではなく、本異種遺伝子発現系が、例えば、高価なATPを添加することなく、他のATP要求性バイオコンバージョン反応に利用できる可能性を示したものである。
産卵鶏における脂質代謝制御と卵生産に関する研究

(1)産卵中の鶏に炭水化物源の異なる飼料ヘパンテチンを添加給与し、産卵率、脂質合成、肝臓および腹腔内脂肪蓄積にどのような影響を及ぼすかを検討し、トウモロコシ配合飼料のように肝臓での脂質合成および脂肪含量が高くなるような飼養条件では、飼料にパンテチンを添加することによって、それらを低下させる効果が認められ、同時に血漿中エストジオ-ル濃度も低下した。そしてパンテチンによる肝臓中脂質含量への影響は血漿中エストラジオ-ルを介しているのであろうと推察した。そのため、血漿中エストラジオ-ル濃度が高くならない大麦配合飼料てはパンテチン添加によって、肝臓中の脂質含量への影響が観察されなかったのであろう。(2)産卵中の鶏を高温環境下(31±3°C)で飼育し、炭水化物源の異なる飼料にパンテチンを添加し、産卵率および脂質合成に及ぼす影響を検討した。産卵中の鶏を高温環境下で飼育したとき、いずれの飼料給与区においてもパンテチン添加によって産卵率が改善された。しかし適温環境下ては、飼料へのパンテチン添加は産卵率に影響を及ぼさなかった。このことはパンテチンは産卵中の鶏がその能力を充分に発揮てきるような条件では効果は認められないが、高温環境下での飼育のように能力を充分に発揮できないような条件下では、生体内でのホルモン分泌などのバランスを整えて、能力を発揮させる効果があるものと考えられた。(3)パンテチンが鶏の肝臓において、脂質合成に直接影響を及ぼすのかどうかを確認する目的で、鶏の単離肝細胞による脂質合成量は、パンテチンの添加濃度の増加にともない低下した。特にコレステロ-ル合成の低下が大きかった。この結果から、パンテチンは鶏の肝臓での脂質合成、特に脂肪酸およびコレステロ-ルの合成を抑制する効果のあることがin vitroでの実験においても確認できた。1.産卵鶏の産卵開始前後における肝臓での脂書酸合成能,肝臓と血漿中各脂質画分含量および血漿中エストラジオールとコルチコステロン濃度の変動を測定し,産卵開始前後の脂質代謝制御について検討した.その結果血漿中エストラジオール濃度は日齢とともに増加し,産卵開始直前(150日齢)に最高値を示した.肝臓と血漿中各脂質画分濃度は140日から150日齢に急速に増加した.そしてこれらの濃度は産卵開始により減少した.肝臓での脂肪酸合成能は140日齢で最大を示し,肝臓と血漿中トリグリセリド濃度の最大値より早い時期に最大の活性を示すことが解った.血漿中コルチコステロンは脂肪酸合成能との相関は観察されなかった.2.産卵中鶏にトウモロコシあるいは大麦を配合した飼料を給与し,高温環境下(3035°C)で飼育した.そして生体内でパントテン酸からCoAに変換される際の中間物質であるパンテチンを200prn飼料中に添加給与し,高温ストレスによる産卵率の低下,および脂質代謝,特に肝臓と腹腔内脂肪組織への脂質の過剰蓄積を抑制する効果があるかを検討した.その結果,高温環境によって低下した産卵率と卵重はパンテチンを添加することによって改善した.肝臓中の脂肪酸合成およびコレステロール合成関連酵素の活性はパンテチン添加によって低下あるいは低下の傾向を示し,パンテチンは肝臓での脂肪酸合成能とコレステロール合成能を抑御する効果のあることが推察された.そしてそれに伴って,肝臓と血漿中のトリグリセリドと全コレステロール含量も低下した.またパンテチン添加によって卵黄コレステロール含量の低下が観察され,低コレステロール卵生産の可能性が示唆される.

産卵中鶏の飼料へのパンテチン添加は血漿中エストラジオール濃度を低下,サイロキシン濃度を増加させた.このことが肝臓での脂肪酸合成能を低下させたものと推察できる.前年度で得られた結果を基に次の2つの研究を行った。1.鶏へのパンテチン給与が血中脂質濃度の低下に関与する機序を検討した。精製飼料と1%コレステロール添加精製飼料およびそれぞれにパンテチン200ppmを添加した4種類の飼料を白レグ雄(8週齢)に給与し実験を行った。その結果、パンテチンを給与した鶏はいづれも胆のうが著しく肥大しており胆汁分泌が活発であることが推察された。血漿中トリグリセリド、コレステロール及びLDLーコレステロール濃度は飼料へのコレステロール添加によって増加したが、パンテチン添加によって低下した。肝臓中コレステロール含量はコレステロール添加飼料によって増加し、パンテチン添加によって低下した。肝臓中の脂肪酸合成関連酵素の活性は飼料へのコレステロール添加によって低い値を示した。肝臓中のHMGーCoA reductase活性はコレステロール添加によって低下したが、同時にパンテチンを添加給与すると増加した。2.鶏(産卵中と成長中)の単離肝細胞を調整し、これをパンテチンを添加した培養液中で培養し、パンテチンの脂質合成能及びCO_2生成能への影響を検討した。その結果、単離肝細胞による1ー^<14>Cー酢酸からの脂質合成量は添加したパンテチン濃度が高くなるに伴って低下した。パンテチン添加による各脂質画分の合成量はいづれも減少したが、遊離型コレステロールの減少割合がほかの脂質画分に比べて大きかった。1ー^<14>Cー酢酸からのCO_2生成量はパンテチンの添加の増加に伴って徐々に増加した。更にパンテチンと一緒に30分間培養した単離肝細胞でのacetyl-CoA carboxylase,fatty acid synthetase及びHMG-CoA reductaseの活性は、無添加に比べて低かった。これらの結果は、鶏においてパンテチンが肝臓の脂質合成、特にコレステロール合成を抑制する効果のあることをin vitroでの実験においても確認できた。昭和62・63年度の研究結果を考察して、産卵中の鶏の脂質代謝に関して総合的にまとめた。(1)飼料成分、特に炭水化物源の異なる飼料へのパンテチン添加による産卵率および脂質代謝への影響。(2)高温環境下で飼育した際、飼料へのパンテチン添加による産卵率および脂質代謝への効果。(3)単離肝細胞を調整し、in vitroによる実験によって、パンテチンの脂肪酸およびコレステロ-ル合成への影響。以上のような結果について総合的に考察し、まとめた。そして専門学会誌へ投稿した。
歯科材料に起因する内分泌攪乱化学物質の研究(雌雄モザイクのサワガニによるバイオアッセイの確率)

生体に世代を越えた重大な影響を及ぼすことが懸念されている内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)は,歯科材料からも溶出している可能性が指摘されている。内分泌撹乱化学物質はきわめて低濃度でも作用する可能性があり,常時口腔内にある歯科材料においては,一般食品に劣らず厳格な安全性が求められるべきで,少しでも疑わしい物質が溶出することは事前に阻止されなければならない。そこで,歯科材料の安全性の検討の一手法として,実際の生体への影響を予測する上でもっとも効果的であるバイオアッセイ法を用いることとした。内分泌撹乱物質のバイオアッセイには,擬エストロゲン作用を直接判定することを含め,様々な手法が開発されつつある。本研究は,サワガニを用いたバイオアッセイ法を確立し,口腔内で溶出する内分泌撹乱物質の安全性の判断に応用するものである。サワガニは,カニ類の中でも例外的な直達発達型の発生をおこなうため,発生初期に親ガニから供給された卵栄養を通して内分泌撹乱物質に暴露していることが考えられ,きわめて微量の化学物質で雌雄モザイクを示すことが,本研究で確認された。この雌雄モザイクを引き起こす化学物質の濃度は,歯科材料からの未反応モノマー,重合開始剤,重合禁止剤,紫外線吸収剤等の溶出濃度よりも,はるかに低い濃度で発生することも判明した。さらに,歯科材料から溶出する化学物質の遺伝毒性およびエストロゲン活性試験を酵母を用いたin vitro試験系で実験を行い,サワガニを用いたバイオアッセイとの比較検討を行った結果,十分に活用できることが示唆された。本バイオアッセイは,日本各地域でのサワガニの生態調査および実際のサワガニを飼育してのin vivoでの暴露実験により,環境汚染の指標としても利用できると考えられる。生体に世代を超えた重大な影響を及ぼすことが懸念されている内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)は,歯科材料からも溶出している可能性が指摘されている。更に,発生初期からの生殖異常の生ずる過程を現在追跡中であり,生殖異常の生ずるメカニズムが解明されると考えられる。今後,雌雄モザイクを発生させる化学物質の種類および量の特定を行い,サワガニを用いたバイオアッセイ法の確立を目指している。

そごで,歯科材料の安全性の検討の一手法として,実際の生体への影響を予測する上でもっとも効果的であるバイオアッセイ法を用いることとした。内分泌撹乱物質のバイオアッセイには,擬エストロゲン作用を直接判定することを含め,様々な手法が開発されつつある。本研究は,サワガニを用いたバイオアッセイ法を確立し,口腔内で溶出する内分泌撹乱物質の安全性の判断に応用するものである。サワガニは,カニ類の中でも例外的な直達発達型の発生をおこなうため,発生初期に親ガニから供給された卵栄養を通して内分泌撹乱物質に暴露していることが考えられ,きわめて微量の化学物質で雌雄モザイクを示すことが,本研究で確認され,サワガニの雌雄モザイクの発生率とサワガニの生活環境中のヒ素との強い相関関係を見出した。現在,ヒ素の遺伝毒性およびエストロゲン活性試験を培養細胞および酵母を用いたin vitro試験系で実験を行っている。さらに,日本各地域でのサワガニの生態調査および実際のサワガニを飼育してのin vivoでの暴露実験を行い,原因究明を行っている。本研究は,イギリスおよび日本の環境省の共同研究としても取り上げられている。生体に世代を越えた重大な影響を及ぼすことが懸念されている内分泌撹乱化学物質(環境ホルモン)は,歯科材料からも溶出している可能性が指摘されている。内分泌撹乱化学物質はきわめて低濃度でも作用する可能性があり,常時口腔内にある歯科材料においては,一般食品に劣らず厳格な安全性が求められるべきで,少しでも疑わしい物質が溶出することは事前に阻止されなけれぱならない。そこで,歯科材料の安全性の検討の一手法として,実際の生体への影響を予測する上でもっとも効果的であるバイオアッセイ法を用いることとした。サワガニは,カニ類の中でも例外的な直達発達型の発生をおこなうため,発生初期に親ガニから供給された卵栄養を通して内分泌撹乱物質に暴露していることが考えられ,きわめて微量の化学物質で雌雄モザイクを示すことが,本研究で確認された。この雌雄モザイクを引き起こす化学物質の濃度は,歯科材料からの未反応モノマー,重合開始剤,重合禁止剤,紫外線吸収剤等の溶出濃度よりも,はるかに低い濃度で発生することも判明した。さらに,歯科材料から溶出する化学物質の遺伝毒性およびエストロゲン活性試験を酵母を用いたin vitro試験系で実験を行い,サワガニを用いたバイオアッセイとの比較検討を行った結果,十分に活用できることが示唆された。本バイオアッセイは,日本各地域でのサワガニの生態調査および実際のサワガニを飼育してのin vivoでの暴露実験により,環境汚染の指標としても利用できると考えられる。
臍帯血造血幹細胞制御の分子機構の解明とその無血清体外大量培養法への応用

(結果)(1)Flk2/Flt3は臍帯血中のCD34+細胞の約80%に発現されており、特に未分化細胞亜分画であるCD34+CD33-細胞、CD34+CD38-細胞中にもFlk2/Flk3発現細胞が認められた。(2)蛍光活性化細胞分離装置を用いて、CD34+Flk2/Flt3+細胞、CD34+Flk2/Flt3-細胞をFACSにて分画し、各々1x10^4個の細胞を4匹のNOD/SCIDマウスに移植したところ、CD34+Flk2/Flt3-細胞を移植されたレシピエントでは生着は認められなかったが、CD34+Flk2/Flt3+細胞を移植されたレシピエントでは、4匹とも生着が認められた。このことより、ヒト造血幹細胞はFlk2/Flt3を発現していると考えられた。(3)Lin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+細胞を単細胞分離し、一個のLin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+細胞を、FL、SCF、TPO、IL-6/sIL-6R存在下で培養したところ、61%(34/56)に増殖を認めた。培養1、2週後に増幅した細胞をNOD/SCIDマウスに移植したところ、移植後14-15週目の解析で、37.5%(6/16)でヒト造血再構築能を確認できた。以上の結果より、Flk2/Flt3を発現する造血幹細胞は単細胞レベルでも増幅が可能であることが示唆された。(結論)結語長期造血再構築能を有するヒト造血幹細胞はFlk2/Flt3を発現しており、Lin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+造血幹細胞はより効率的な体外増幅の標的細胞として有用である可能性が示唆された。臍帯血CD34+細胞を、種々のサイトカインの組合せで培養した後、培養中の造血前駆細胞や造血幹細胞の数を、クローナル培養法やNOD/SCIDマウス移植系を用いて検討した。1.マウス胎生期aorta-gonad-mesonephros(AGM)領域由来ストローマ細胞株AGM-S3の樹立我々は、臍帯血造血幹細胞の無血清体外大量培養法を確立するためには、胎生期造血に由来する臍帯血造血幹細胞の増殖機構を明らかにすることが重要と考え、胎生期マウスのAGM領域に注目した。胎生期マウスの造血幹細胞は、胎生10日のAGM領域に発生し、胎生11日にかけて著明に増幅する。従って、この時期のAGM領域には胎生期造血幹細胞を増幅する分子が発現されていると考え、胎生10.5日のAGM領域よりストローマ細胞株AGM-S3を樹立した。2. AGM-S3の造血支持能の検討

AGM-S3の造血支持能を検討するために、蛍光活性化細胞分離装置で分離されたLin^-c-Kit^+Sca-1^+細胞とLin^-c-Kit^+Sca-1^-細胞をAGM-S3細胞上で共培養したところ、培養3日目のコブルストーン形成及び培養10日目のコロニー形成細胞、脾コロニー形成細胞産生はLin^-c-Kit^+Sca-1^+細胞との共培養系においてのみ認められた。このことより、AGM-S3細胞のマウス造血支持能は主に未分化なLin^-c-Kit^+Sca-1^+細胞に作用すると考えられた。さらに、Lin^-c-Kit^+Sca-1^+細胞中の長期造血再構築能を有する造血幹細胞をマウス移植系を用いて検討したところ、AGM-S3上で10日間共培養されたLin^-c-Kit^+Sca-1^+細胞中にも造血幹細胞は維持されていた。以上の結果より、マウスAGM領域由来ストローマ細胞株AGM-S3は、造血幹細胞を含む造血細胞を支持する能力を有すると考えられた。(目的)臍帯血造血幹細胞の体外大量培養のための条件を検討する。(方法)臍帯血CD34+細胞を、種々のサイトカインの組合せで培養した後、培養中の造血前駆細胞や造血幹細胞の数を、クローナル培養法やNOD/SCIDマウス移植系を用いて検討した。(結論)SCF、FL、TPO、IL-6/sIL-6Rの組み合わせた培養法は、臍帯血造血幹細胞の有効な増幅法と考えられた。(結果)(1)Flk2/Flt3は臍帯血中のCD34+細胞の約80%に発現されており、特に未分化細胞亜分画であるCD34+CD33-細胞、CD34+CD38-細胞中にもFlk2/Flk3発現細胞が認められた。(2)蛍光活性化細胞分離装置を用いて、CD34+Flk2/Flt3+細胞、CD34+Flk2/Flt3-細胞をFACSにて分画し、各々1×10^4個の細胞を4匹のNOD/SCIDマウスに移植したところ、CD34+Flk2/Flt3-細胞を移植されたレシピエントでは生着は認められなかったが、CD34+Flk2/Flt3+細胞を移植されたレシピエントでは、4匹とも生着が認められた。このことより、ヒト造血幹細胞はFlk2/Flt3を発現していると考えられた。(3)Lin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+細胞を単細胞分離し、一個のLin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+細胞を、FL、SCF、TPO、IL-6/sIL-6R存在下で培養したところ、61%(34/56)に増殖を認めた。培養1、2週後に増幅した細胞をNOD/SCIDマウスに移植したところ、移植後14-15週目の解析で、37.5%(6/16)でヒト造血再構築能を確認できた。以上の結果より、Flk2/Flt3を発現する造血幹細胞は単細胞レベルでも増幅が可能であることが示唆された。(結論)結語長期造血再構築能を有するヒト造血幹細胞はFlk2/Flt3を発現しており、Lin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+造血幹細胞はより効率的な体外増幅の標的細胞として有用である可能性が示唆された。臍帯血CD34+細胞を、種々のサイトカインの組合せで培養した後、培養中の造血前駆細胞や造血幹細胞の数を、クローナル培養法やNOD/SCIDマウス移植系を用いて検討した。
プロトン結合電子移動反応の実時間解析:量子キュミュラント動力学法

本研究の目的は、プロトン移動反応と結合した電子移動反応(PCET)の実時間解析である。その目的のため、近年申請者が提案している新規量子分子動力学理論(QCD法)を発展させ、その応用計算としてQM/MM法を用いた(非)プロトン溶媒下でのピレン-デオキシウリジンの分子内電荷移動におけるプロトンの運動の役割の解明を行った。プロトン溶媒中では、溶質と溶媒の間の水素結合による寄与が電子移動を活性化する原因と成る事が明らかとなった。また、QCD法の適用範囲を広げるため、理論の更なる深化とそのプログラム開発を行った。DNA塩基対間の水素移動反応における量子効果の役割を明らかにした。さらに、生体内で起こる電子結合プロトン移動反応の理論解析を通じ、タンパク質環境場が複数のプロトン化状態のエネルギーを拮抗させる事により、効率的にプロトン輸送を行える様にしているメカニズムを提案した。プロトンはその軽さ故に量子効果が最も効く原子であり、最も同位体の質量比が大きな原子でもある。同位体効果は核の量子効果、つまり「粒子性と波動性」の2重性を適切に取り扱うことで理解される。分子はゼロ温度においても静止しておらず、零点振動をしている。これは最も基本的な量子力学的効果である。しかし、動的な現象を解析するために現在広く行われている分子動力学計算では、核の運動は古典力学を用いて記述しているため、核の量子効果については範疇外であり、FTIRやラマン等の振動分光で捉えられる分子内振動すら適切に取り扱う事は出来ない。そこで、我々は準量子キュミュラント動力学法を提唱した。静的な理論として、量子論的な拡張変数を導入した、ポテンシャル超曲面解析による量子トンネル経路の探索や、基準振動解析の確立、また動的な理論として、核酸塩基対の水素結合における軽水素と重水素置換体の動力学的安定性(量子動的同位体効果)を解析する方法論を確立した(Shigeta, et.al. Bull. Chem. Soc. Jpn. 81, 1230(2008))。この手法では、古典的な座標ばかりではなく、量子論的なゆらぎ(古典座標からのズレ)も同時に評価している。そこで得られた情報から、密度分布を計算するための手法を提案した(Shigeta, J.Cheln. Phys.(Communication)128, 161103(2008))。今後この手法は、前述した水素の密度分布の決定にも適用可能であり、本年度はその基礎理論を構築したこととなる。今までの業績と本年度の業績に関して、第58回日本化学会進歩賞(課題名「量子ゆらぎと熱ゆらぎの動的分子理論」)を受賞した。これまで我々は、準量子キュミュラント動力学法を提唱した。静的な理論として、量子論的な拡張変数を導入した、ポテンシャル超曲面解析による量子トンネル経路の探索や、基準振動解析の確立、また動的な理論として、核酸塩基対の水素結合における軽水素と重水素置換体の動力学的安定性(量子動的同位体効果)を解析する方法論を確立してきた。平成21年度は人工核酸塩基の安定性解析(Matsui, J. Phys. Chem. B 113, 2790(2009)等)、核酸誘導体の溶液内電子移動反応解析を行った。その成果は文部科学大臣表彰若手科学者賞を受賞するなど、化学の分野で注目された。
生体分子を用いたIn vivo非侵襲的RNAリアルタイムイメージング法の開発

本研究では、生体内RNAの非侵襲的イメージングを目的として細胞内で産出可能なプローブを用いた新規RNA検出法の開発を行っている。今年度までに、本研究ではRenilla luciferaseのcomplementationを利用した発光プローブ(RLuc probe)及びRLucとEYFPを使用したBRETprobeの開発に成功しin vitro及び生細胞中での詳細な特性解析を行った。in vitroの結果よりBRET probeはRLuc probeに比べRNAに対する結合力を損なっていた上、シグナル変化が比較的小さかったため、細胞内RNA検出の系にはRLuc probeを用いることとした。RLuc probeの細胞内での詳細な挙動解析を行うために試料としてRLuc probeを一過性発現させた細胞ライセートやTet-on system制御下のプローブを安定発現するHEK293細胞株を樹立した。その際、細胞内の幅広いターゲットRNAに対応させる事ができるか検証するため、局在化シグナル付加によりRLuc probeの局在変化も確認した。局在の確認は免疫染色法により確かめた。これらの結果、(1)RLucprobeは生細胞中でもRNAに対する特異性と親和性を損なわず特異的なRNA結合時に活性回復する(2)活性上昇率はin vitroの系より小さい(3)核内に局在する(4)MAPKK由来のNES配列付加により細胞質へ局在変化可能ことが分かった。特に(2)はin vitroとin vivoの環境の違いがタンパク質機能のアロステリック制御へもたらす影響の違いとして興味深い。(2)の理由として細胞内の高密度な環境に於いてはタンパク質のドメインの動きが制限されるため、活性変化率が小さいのではないかと考えられた。このRLuc probeと前年度までに開発した任意の配列検出のためのtransducerの役割を果たすspit-RNAprobeを生細胞中で働かせることによって直接的に細胞に導入したRNAの発光シグナル変化による検出に成功した。これは生細胞中のRNAを直接的に生物発光で検出した初めての例となる。また今年度からは更なる高感度化のため量子収率及び発光波長の改善を目指し、有機合成的手法を取り入れRlucの基質であるセレンテラジンの類縁体合成を行い評価をしている。本研究では細胞内RNAの非侵襲的リアルタイムイメージングを目的とした細胞内で産出可能な生体分子を利用したプローブの開発を行っている。本年度は、当初の研究計画を変更して採用第二年度目に行う予定であった新規RNAイメージング法の開発に着手した。RNA結合タンパク質であるArginine Rich Motif peptide(ARM peptide)とRlucとEnhanced Yellow Fluorescence Protein(EYFP)を組み合わせたタンパク質プローブを遺伝子工学的に構築した。この設計により特定モチーフを有するRNA結合時のARM peptideの構造変化をこれら二つのタンパク質問のBioluminescence Resonance Energy Trasnfer(BRET)効率の変化に結び付けられると期待した。ARM peptideは三種類を選択し、異なるリンカー長を有する全12種のBRETプローブを設計した。これらprobeはヒト子宮頸がん由来HeLa細胞に強制発現させ、そのライセートを用いて特性評価を行った。各BRETprobeは融合した各AMR peptide認識RNA配列依存的なBRET効率の変化と、リンカー長依存的なBRET効率の変化が見られた。更に任意配列RNAの検出のため、target RNAとの結合によりARM peptide結合モチーフの再構成が起こるように設計したsplit-RNA probeと、BRET probeを協調させることによりtarget RNAの検出を試みた。しかしながら本研究で以前構築し、その有用性が示されていたsplit-RNAプローブを使用したところtarget RNAに依存した有意なBRET signal変化がほとんど見られなかった。このsplit-RNA配列に対して種々の変更を加えたところtarget RNA配列特異的なBRETsignal変化に改良が見られた。以前のsplit-RNAプローブの配列が適さなかった理由として使用bufferの組成の違いやBRET probeとの間の立体障害が考えられる。この結果はプローブの使用環境に応じて逐一RNA配列を最適化する必要が示唆され今後の課題の一つとなり得る。今後は、今回得た設計指針を基にsplit-RNAプローブ配列の更なる改良を行うと共に細胞内RNA検出に向けたタンパク質プローブの選別を行っていく予定である。本研究で構築したプローブは生体分子のみから構築されており遺伝子レベルで細胞に組み込むことが出来るため個体レベル、細胞レベルでの非侵襲的に長期に渡ったRNA検出への応用が期待できる。前年度までの構築したRenilla luciferaseのcomplementationを利用した発光プローブ(RLuc probe)の細胞内での詳細な挙動解析を行った。BRETを利用した系も同様に開発していたが、In vitroの結果ではRLuc probeに比べRNAに対する結合力を損なっていたことと、シグナル変化が比較的小さかったため、暫定的に細胞内RNA検出の系にはRLuc probeを用いることとした。当初の予定通りまずはRLuc probeの細胞内での詳細な挙動解析を行った。試料としてRLuc probeを一過性発現させた細胞ライセートやTet-on system制御下のプローブを安定発現するHEK293細胞株を樹立した。またRLucprobeにも細胞内の幅広いターゲットRNAに対応させる事ができるか検証するため、局在化シグナル付加によりRLuc probeの局在変化も確認した。その結果、(1)RLuc

probeは生細胞中でもRNAに対する特異性と親和性を損なわず特異的なRNA結合時に活性回復する(2)活性上昇率はin vitroの系より小さい(3}核内に局在する(4)MAPKK由来のNES配列付加により細胞質へ局在変化可能ことが分かった。(2)の理由として細胞内の高密度な環境に於いてはタンパク質のドメインの動きが制限されるため、活性変化率が小さいのではないかと考えられた。このRLuc probeと前年度までに開発した任意の配列検出のためのtransducerの役割を果たすspit-RNAprobeを生細胞中で働かせることによって直接的に細胞に導入したRNAの発光シグナル変化による検出に成功した。これは生細胞中のRNAを直接的に生物発光で検出した初めての例となる。本研究では、生体内RNAの非侵襲的イメージングを目的として細胞内で産出可能なプローブを用いた新規RNA検出法の開発を行っている。今年度までに、本研究ではRenilla luciferaseのcomplementationを利用した発光プローブ(RLuc probe)及びRLucとEYFPを使用したBRETprobeの開発に成功しin vitro及び生細胞中での詳細な特性解析を行った。in vitroの結果よりBRET probeはRLuc probeに比べRNAに対する結合力を損なっていた上、シグナル変化が比較的小さかったため、細胞内RNA検出の系にはRLuc probeを用いることとした。RLuc probeの細胞内での詳細な挙動解析を行うために試料としてRLuc probeを一過性発現させた細胞ライセートやTet-on system制御下のプローブを安定発現するHEK293細胞株を樹立した。その際、細胞内の幅広いターゲットRNAに対応させる事ができるか検証するため、局在化シグナル付加によりRLuc probeの局在変化も確認した。局在の確認は免疫染色法により確かめた。これらの結果、(1)RLucprobeは生細胞中でもRNAに対する特異性と親和性を損なわず特異的なRNA結合時に活性回復する(2)活性上昇率はin vitroの系より小さい(3)核内に局在する(4)MAPKK由来のNES配列付加により細胞質へ局在変化可能ことが分かった。特に(2)はin vitroとin vivoの環境の違いがタンパク質機能のアロステリック制御へもたらす影響の違いとして興味深い。
隔離政策がもたらしたハンセン病回復者の尊厳を回復する社会支援システムの再構築

ハンセン病者として偏見差別を受けた社会の中で生活する上で、ハンセン病回復者にとって必要な社会支援システムを考える。本研究目的は、ハンセン病回復者の社会支援体制がどのようになっているのか、資料分析とハンセン病回復者及び支援団体からの聞き取りにより、その実態と課題を明らかにすることである。研究方法は、資料および全国47自治体の公式HPの事業内容を分析した。また、支援団体3か所5名に(東京・大阪・沖縄)活動の実際と社会支援体制の課題の聞き取りおよびフィールドワークを行い、内容分析を行った。その結果、社会支援体制は、各自治体で行政の取り組みの担当部署を設置していた。ただし兼務での人員配置で運営していた。主な事業内容は、パンフレット配布などの啓発事業、里帰り事業、訪問・相談事業・交流事業、社会復帰支援であった。啓発活動以外の事業は、各自治体により格差がみられた。支援団体の設置は全国2か所と絶対数が不足している。その他は任意の団体で運営していた。支援団体の取り組みでは、生活困難な状況の相談とタイムリーな解決支援が語られ、ハンセン病回復者の身近な相談者としての役割とその成果を見出せた。ハンセン病回復者の中には、知覚神経麻痺の後遺症を抱えており、後遺症の治療・ケアや老化に伴う介護・福祉・医療・看護サービスのニーズを要する。しかし、医療機関の受診はハンセン病の過去を告知することにつながる。過去に受けた差別偏見が恐怖・不安として想起され受診のためらいから病状悪化し下肢切断に至ったケースが語られた。ハンセン病回復者は、ハンセン病の病歴を語れないことによる医療機関への受診回避に伴う病状悪化、訪問看護・介護サービス利用回避、介護支援サービスや施設への入居困難がみられ、高齢者が利用する社会支援システムの活用が困難な状況が明らかになった。ハンセン病回復者に対する社会支援体制について、既存の高齢者支援の社会支援システムでは活用困難であることが明らかにできた。ハンセン病者への偏見差別が強かった地区での啓発活動のため公開シンポジウムを予定したが、ハンセン病者が受けた隔離政策、偏見差別の歴史の理解も不十分な状況であった。そこで小中学校への啓発教育依頼を行った(教育機関を通して2度)。しかし同意は得られなかった。そこで、国立療養所内2ヶ所で、職員へのハンセン病者が受けた偏見差別のセルフ・スティグマについての教育講義と学会での教育講演に方法に変更し、身近な支援者が必要とするハンセン病回復者への社会支援体制を分析した。これまでの研究の総括を行う。27年度、28年度及び29年度の研究結果からハンセン病回復者の内面化された差別への軽減を図る対策を検討する。ハンセン病回復者である後期高齢者が地域で活用できる介護サービスや医療サービスをためらうことなく受けられるための社会支援システムを再構築する。(ハンセン病者であったことを気づかれるのではないかという恐れから受診行動をとらないことによる病気の悪化や社会からの孤立化が改善されるような)本研究目的は、隔離政策がもたらしたハンセン病回復者の内面化された差別とそれに伴う心理状態を明らかに、社会の中で自己の存在意義を見出し限りある時間を生き生きと生活できる社会支援システムを再構築することである。本研究の実施計画は4段階に区分さした。第1段階では、ハンセン病回復者にある差別とその克服プロセスを把握する。調査方法は沖縄県、鹿児島県、熊本県、大阪府、東京都のハンセン病回復者11名へ、ライフストーリーインタビュー法を行い、参加観察法ではインタビュー前に研究協力者の講演活動や啓発活動のボランティアガイド・講師を務める研修への参加、カラオケクラブなどに参加し交流を深め関係性の構築に務めると伴にインタビューの補足データを得た。また出版された著書を読み、研究テーマとの関係で気になる状況の心理状態を聴き取った。インタビューデータおよび観察データ・著書を含む資料を分析した。ここでは代表的な結果を報告する。ハンセン病者は伝染病ではないが、その様に恐れられ強制収容、隔離された時代があった。ハンセン病者が療養所へ移動する際の衝撃的な差別には、「お召列車」と彼らが呼ぶ、客車と区別した貨物に荷物か動物のごとく収容され移送された体験であった。歩いた後をついて回り消毒液を噴霧されたこと、療養所内の教員は一定の距離を保ち答案用紙など直接受け取らないことなど、病者へのかかわりではなく、ばい菌の塊として接していたことが明らかになった。療養所内外の医療関係者の対応がハンセン病者自身のなかに差別を植え付けていったことが推察された。そこで、医療関係者8名に当時の対応について面接を行った。今後は、ハンセン病回復者自身のなかにある差別とその影響要因の一つに医療関係者の対応がどのように関係しているのか、第2段階として分析していく。第1段階のハンセン病回復者にある差別に関してのデータ収集は、順調に進んでいる。しかし、研究の性格からハンセン病回復者自身にある差別とそれに影響する要因を切り離してデータを収集したり、読み取ったりできないため、影響要因として考えられる医療者からの聞き取りを先に行った。このこともあり、時間的な関係からデータ分析が十分行えていない。ハンセン病回復者は、「らい予防法」による隔離規定や消毒規定に基づく生活を行ってきた。そのことにより社会的な差別・偏見を生み出し、ハンセン病回復者自身がセルフ・スティグマを内面化するに至った。本研究目的は、ハンセン病回復者自身のセルフ・スティグマの生成過程を明らかにすることである。

研究方法は、関東圏から沖縄県在住のハンセン病回復者31名に1参与観察法(フィールドワーク),2エピソード・インタビュー,3資料収集の方法を用いたエスノグラフィーである.データ分析方法は,小田(2010),Angrosino(2016)のエスノグラフィー分析プロセスを参考に検討した.その結果、ハンセン病回復者が認識したセルフ・スティグマは,自身が「ハンセン病をうつす存在」「ハンセン病の『徴』としてのボディイメージの変化」「刻み込まれたハンセン病の病名」「家族に迷惑をかける存在」「自己存在の否定」であった.「ハンセン病をうつす存在」では,健常者との会食や子どもへの接触場面で,「うつらないと分かっていても接触を遠慮する」や,自らがうつすことを怖がり,「近寄らない」の行為の抑制があった.セルフ・スティグマの生成過程には,内面化の自己認識を示すエピソードとして, <差別されていると思い過ぎて,周りは気にしないのに,自分のなかに差別感がある>と語り,差別が身体化され,<うつらないのに子どもの時の教えによる日用品の共有や肌の接触を抑制する>状況が語られた.生成過程を分析すると,それは過去の偏見・差別の体験・経験に基づき,「怖い病気」として植え付け,「社会的スティグマ」を想起していた.そのことにより,「恐れるあまり」社会的スティグマが発生する状況で回避行動を取っていた.また、セルフ・スティグマの生成過程には3段階の循環が見いだされた。社会的スティグマに関連するハンセン病回復者のセルフ・スティグマについては、貴重な結果を見出すことが出来た。しかし、社会支援体制やシステムについては、ハンセン病支援団体から活動状況や役割、経緯、現状の問題と今後の課題について、資料収集とインビューを行ったが詳細な分析が必要である。ハンセン病者として偏見差別を受けた社会の中で生活する上で、ハンセン病回復者にとって必要な社会支援システムを考える。本研究目的は、ハンセン病回復者の社会支援体制がどのようになっているのか、資料分析とハンセン病回復者及び支援団体からの聞き取りにより、その実態と課題を明らかにすることである。研究方法は、資料および全国47自治体の公式HPの事業内容を分析した。また、支援団体3か所5名に(東京・大阪・沖縄)活動の実際と社会支援体制の課題の聞き取りおよびフィールドワークを行い、内容分析を行った。その結果、社会支援体制は、各自治体で行政の取り組みの担当部署を設置していた。ただし兼務での人員配置で運営していた。主な事業内容は、パンフレット配布などの啓発事業、里帰り事業、訪問・相談事業・交流事業、社会復帰支援であった。啓発活動以外の事業は、各自治体により格差がみられた。支援団体の設置は全国2か所と絶対数が不足している。その他は任意の団体で運営していた。支援団体の取り組みでは、生活困難な状況の相談とタイムリーな解決支援が語られ、ハンセン病回復者の身近な相談者としての役割とその成果を見出せた。ハンセン病回復者の中には、知覚神経麻痺の後遺症を抱えており、後遺症の治療・ケアや老化に伴う介護・福祉・医療・看護サービスのニーズを要する。
公的年金制度改革と出生行動への影響

少子・高齢化の進展に伴い、それに対応した社会保障政策が採られるだろう。その社会保障政策が、反対に少子・高齢化の原因である出生率そのものに影響を与える可能性もある。本研究は、特に公的年金制度に着目して、公的年金制度が出生率に与える影響について、理論的、実証的に分析している。特に、晩婚化による出産行動の変化を明示的に考慮し、現在結婚のタイミングを遅らせている女性の出産パターンの変化を捉えている。理論的には公的年金制度が賦課方式であれば、子供は親の純粋な愛情の対象であるとして捉えた場合は子供に将来追加的な負担を課せられるという意味で、子供は親が老人となって稼得能力が落ちたときに養ってもらえるものとして捉えた場合には公的年金給付が子供の代替財になり得るという意味で、どちらの立場からも出産を抑制する方向に影響することが示される。また、独自に実施した2049歳の女性を対象としたアンケート調査を用いて行った実証分析の結果によると、公的年金未加入者に比較して国民年金第一号被保険者である場合の方が出産確率が低下するということが明らかとなり、理論仮説と整合的である。これは、今後ますます進展する少子・高齢化に対応した公的年金制度改革を行う上で、その制度改革が反対に少子・高齢化を進展させる要因になり得ることを示唆するものである。出産行動の分析を結婚のタイミングを考慮して行うためには、同一女性の複数年にわたる情報が不可欠である。また、公的年金制度が出産行動に与える影響を分析する上では、出生の意思決定を行った時点における、加入していた公的年金の種類についての情報も必要である。さらには、公的年金と代替し得る可能性があるものとして、民間(年金)保険や貯蓄等の情報も必要である。しかしながら、これらの情報が全て網羅されたデータベースはこれまでのところ存在しない。したがって、本年度はまず、独自のアンケート調査を実施し、それに基づきデータベースの構築を行った。調査対象は2049歳の既婚女性である。調査内容は、調査対象者に過去を振り返ってもらい、婚約した時点、1人目から5人目の子供の妊娠が判明したそれぞれの時点の状況を尋ねた。具体的には、その時点において加入していた公的年金の種類、生命保険の加入の有無、生命保険以外の民間保険(個人年金保険など)の加入の有無、貯蓄残高、就業状態、勤務先の福利厚生の状況、所得等である。保険については、配偶者の加入の有無についても調査した。現在、作成したデータベースを用いて分析を開始したところである。本格的な分析は、来年度に実施する予定である。
メチオニン生合成の鍵酵素遺伝子におけるmRNAの安定性制御の分子遺伝学的研究

メチオニン生合成の鍵段階の酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の発現はmRNAの安定性の段階でフィードバック制御されており,しかもこの制御にはCGS遺伝子の第1エキソンにコードされるアミノ酸配列がシスに働く.この制御に機能している制御因子を遺伝学的に明らかにするため,発光クラゲの緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子に野生型CGSの第1エキソンをつなぎ,カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの制御下に置いた融合遺伝子を持つトランスジェニック・シロイヌナズナを親株として,GFP蛍光と葉緑体の自家蛍光の比が上昇した変異株のスクリーニングをおこなった.その結果,この制御にトランスに作用すると考えられる変異株を4株得た.この内の少なくとも1株は,内在CGS遺伝子と導入GFP遺伝子の両方のmRNAの安定性に対するメチオニン添加の効果が弱まっており,両mRNAの蓄積量も増加していた.この変異株の性質を調べるため,一過的発現系での解析を行った.変異株から液体カルス培養を起こし,カルスから調製したプロトプラストに電気穿孔法による遺伝子導入を行った.大腸菌β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をレポーターとした同様の融合遺伝子を導入し,培養へのメチオニンおよびS-アデノシルメチオニン(SAM)添加の有無でGUS活性を比較すると,野生型株のプロトプラストを用いた解析の場合に比べてメチオニン,SAMいずれについても添加の効果が低下していた.SAMは試験管内翻訳系を用いた解析により,CGSの転写後制御のエフェクターであることが明らかになっている.これらの結果からこの制御にトランスに作用する因子の変異株が分離されたと考えられる.メチオニン生合成の鍵段階の酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の発現はmRNAの安定性の段階でフィードバック制御されており,しかもこの制御にはCGS遺伝子の第1エキソンにコードされるアミノ酸配列がシスに働く.この制御に機能している制御因子を遺伝学的に明らかにするため,発光クラゲの緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子に野生型CGSの第1エキソンをつなぎ,カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの制御下に置いた融合遺伝子を持つトランスジェニック・シロイヌナズナを親株として,GFP蛍光と葉緑体の自家蛍光の比が上昇した変異株のスクリーニングをおこなった.その結果,この制御にトランスに作用すると考えられる変異株を4株得た.この内の少なくとも1株は,内在CGS遺伝子と導入GFP遺伝子の両方のmRNAの安定性に対するメチオニン添加の効果が弱まっており,両mRNAの蓄積量も増加していた.この変異株の性質を調べるため,一過的発現系での解析を行った.変異株から液体カルス培養を起こし,カルスから調製したプロトプラストに電気穿孔法による遺伝子導入を行った.大腸菌β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をレポーターとした同様の融合遺伝子を導入し,培養へのメチオニンおよびS-アデノシルメチオニン(SAM)添加の有無でGUS活性を比較すると,野生型株のプロトプラストを用いた解析の場合に比べてメチオニン,SAMいずれについても添加の効果が低下していた.SAMは試験管内翻訳系を用いた解析により,CGSの転写後制御のエフェクターであることが明らかになっている.これらの結果からこの制御にトランスに作用する因子の変異株が分離されたと考えられる.アスパラギン酸族のアミノ酸であるメチオニンはタンパク質を構成するばかりでなく、S-アデノシルメチオニンを経てメチル基転移反応やポリアミン合成、高等植物ではさらにエチレン合成にも関与する重要なアミノ酸である。アミノ酸の生合成はアロステリック酵素によってフィードバック制御されている例が多い。しかしながら、メチオニンの生合成の鍵段階を触媒するシスタチオニンγ-シンターゼはアロステリック酵素ではなく、mRNAの安定性の段階でフィードバック制御されており、しかもこの制御にはシスタチオニンγ-シンターゼ自身の第1エキソンポリペプチドが関与している。我々はこの制御が翻訳中に起こるとするモデルを考えており、これに従えば試験管内翻訳系でこの制御を再現しうると期待される。コムギ胚芽の試験管内翻訳系を用いた解析を行った結果、この制御が再現され、この制御におけるエフェクターはメチオニンではなくS-アデノシルメチオニンであると考えられた。また、反応後のRNAをノーザン解析により調べた結果,in vivoにおいて我々が既に見いだしているのと同様の5末端領域を欠いたRNAが検出された。さらに、反応後のRNAについて5領域でハイブリッドセレクションを行った結果、上記の5末端領域を欠いたRNAに対応すると考えられる短いRNAが認められた。このことは、シスタチオニンγ-シンターゼ第1エキソンによる発現制御にエンドヌクレアーゼが関与していることを示唆している。メチオニン生合成の鍵段階の酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の発現はmRNAの安定性の段階でフィードバック制御されており,しかもこの制御にはCGS遺伝子の第1エキソンにコードされるアミノ酸配列がシスに働く.また,シロイヌナズナのmtol変異はこの制御が欠損している.この制御に機能している制御因子を遺伝学的に明らかにするため,制御に関わる変異株の分離を行っている.

Green fluorescent protein (GFP)レポーター遺伝子に野生型CGSの第1エキソンを、つなぎ、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの制御下に置いた融合遺伝子を持つトランスジェニック・シロイヌナズナを親株としてGFP蛍光が増加した変異株のスクリーニングを行った.昨年度来の計約20万株のスクリーニングにより,12株の候補株を得た.これらの候補株について順次,遺伝解析ならびにCGSの第1エキソン領域の塩基配列の解析を行った.制御因子はトランスに作用すると期待されるが,本研究はCGSのフィードバック制御を解析していることから,反応産物も当然ながらトランスに作用する.従って,変異がシスに作用するかトランスに作用するかの判断には注意が必要である.12株の候補株のうちの10株では,内在性CGSタンパク質の蓄積レベルには野生型株と比べて変化は見られず,シスに作用する変異と考えられた.塩基配列の解析により,これらのうちの8株ではCGSの第1エキソンに変異が見いだされ,mtol変異タイプと考えられた.残り2株については,内在性CGSタンパク質の蓄積レベルも野生型株に比べて増加しており,トランスに作用すると考えられる.また,CGSの第1エキソンには変異が見いだされなかった.したがって,制御因子に生じた変異である可能性がある.ダイズβ・コングリシニンのβサブユニットプロモーターの硫黄栄養応答領域(βSR)をカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの-90bpの位置に3つタンデムにつないで挿入したキメラプロモーターは,本葉においても硫黄欠乏応答を示す.このプロモーターの下流に発光クラゲの緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子をつないだDNAを導入したシロイヌナズナ株(NOB株)を用いた解析を行った.O-アセチルセリン(OAS)は硫黄欠乏応答の鍵になると考えられる代謝産物であるが,NOB株のGFP蛍光は硫黄十分条件下でもOAS処理によって増加した.一方,グルタチオン処理によってNOB株のGFP蛍光は硫酸イオンの多寡にかからず抑えられた.これらの結果により,βSRが硫黄欠乏応答全般に中心的な役割を担っていることが示された.また,サイトカイニン処理によってNOB株のGFP蛍光が増加することが見いだされた.内在性の硫黄応答性遺伝子の発現もサイトカイニンに対して硫黄欠乏時と同様の応答を示した.しかしながら,硫黄欠乏によってサイトカイニン濃度は変化しないので,両者に対する応答は別の経路であると考えられる.βサブユニット遺伝子はメチオニンによつて発現抑制を受けるが,メチオニンを過剰に蓄積するmto1変異をNOB株に導入すると,種子ではGFP蛍光が抑制されたが,本葉では影響が見られなかった.一方,全長のβサブユニットプロモーターにCaMV35Sプロモーターのエンハンサー領域をつないだ場合には,本葉においてメチオニン応答を示した.硫黄栄養に対する応答機構は組織によって異なることが示された.
羊水由来iPS細胞を用いた体表欠損の治療法の開発-脊髄髄膜瘤・腹壁破裂への応用-

脊髄髄膜瘤や腹壁破裂といった体表が欠損する疾患は、子宮腔内に消化管や脊髄などの臓器が露出し、胎児期から進行性の臓器障害を引き起こす。本研究では、羊水由来iPS細胞から培養表皮を作製し、自家移植として妊娠中に欠損部を修復することで進行性の臓器障害を軽減し予後改善を目指す。我々は、先行研究で羊水由来iPS細胞から培養表皮を作成し、胎児脊髄髄膜瘤モデル動物に自家移植を行い、機能的に生着することを確認した。本研究では、再生医療等製品を目指し羊水由来iPS細胞を用いて安定的かつ安全な培養表皮の作製方法を開発する。さらに、体表欠損モデル動物へ胎児治療として移植し、生着率や出生後の機能障害の程度を検討する。