hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミトコンドリア機能異常は高齢期の重要な負の健康アウトカムに関与するか

評価できる点は、AlphaLISAによるGDF15測定システムを樹立することができたこと、その測定システムを用いて大規模高齢者コホート研究の保存血清中のGDF15濃度を高精度で測定できたこと、コホート研究ベースライン調査への参加者についてさらに追跡期間を延長して異動情報を収集できたこと、これらの上で血清GDF濃度をその後の余命との関連を分析し、性および年齢を調整しても血清GDF15濃度が死亡の予測因子であることを明らかにすることができたことである。他方、当初予定していた健康余命(=要介護認定までの期間)との関連分析までは手が付けられなかったことが課題として残された。老年学高齢者コホート研究とリンクすることにより、ミトコンドリア機能異常のマーカーである血清GDF15濃度が、高齢者の余命と関連していることが明らかになったことは画期的なことである。一方で、その関連性は統計学的に比較的弱いものであり、さらにGDF15濃度と健康余命あるいは平成27年度に計画していた認知機能低下との関連性をみるには、草津縦断研究では対象者の追跡期間を延長することと、他のコホート研究ともリンクすることでサンプルサイズを拡大することが必要と考えられる。そこで、今後は現研究対象者についてはさらに1年間追跡期間を延長することと、われわれがもう一つ保有している鳩山コホート研究とのリンクを考えている。ここではベースライン調査(2010年実施)に参加した約740人の血清が保存されており、今日まで追跡情報(死亡、介護保険認定、認知機能の変化)が得られている。草津縦断研究と鳩山コホート研究を統合することで、血清GDF15濃度の臨床疫学的意義をより詳細に調べることができる。直接研究費の旅費に大きな差額が生じたためであるが、これはGDF15濃度と介護保険認定との関連分析に必要な介護保険情報の収集を当初計画では予定していたが、それを次年度の研究事業に回したためである。草津縦断研究における介護保険情報の収集にあてるとともに、次年度はサンプルサイズを拡大して研究を進める必要が生じたため、鳩山コホート研究における転記情報や介護保険情報の収集に伴う経費に充てる予定である。
頭頸部扁平上皮癌の悪性転化におけるクロマチン・リモデリング

頭頸部扁平上皮癌の悪性化機構を明らかにするため、p63の実験系を基盤に、ゲノムワイドなクロマチンの構造変換と、表皮細胞分化に関係する遺伝子発現の変化を関連づける。1.p63は頭頸部癌で分化型維持に作用する核内制御因子と考え、高分化型の癌細胞株がp63を失うことによって起こる、ヒストン修飾およびDNAメチル化の変化をゲノム配列上にマップする。2.異なるステージの癌細胞株でのヒストン修飾とDNAメチル化の差異をゲノム上にマップする。加えて遺伝子発現プロファイルを解析して、クロマチン構造変化と対応させる。3.悪性度の異なる癌組織からなる組織アレイ(匿名化)において上記の実験結果を検証する。
ベンゾジシラシクロブテンを構成単位とする鎖状、環状、かご形化合物の合成と性質

本研究ではベンゼン環の1,2,4,5位をジシラン鎖で架矯したタルト形の大環状シクロファンおよび鎖状ホモログを合成し、その構造、包接化合物の生成、電子状態について調べた。これらの化合物はパラジウム触媒を用いてペンゾ[1,2:4,5]ビス(1,1,2,2-テトラメチル-1,2-ジシラシクロブタ-3-エン)のメタセシスを行い合成した。現在までに鎖状の二五量体と環状の四量体および五量体を単離した。X線結晶構造解析の結果、環状四量体は菱形のベルト状構造をとっており、分子内に7.3Åの空孔をもっているが、溶媒分子を包接していない。一方、環状五量体および環状四量体八酸化物をベンゼンから再結晶すると、それぞれ約11.9Åおよび10.4Åの空孔にベンゼンが1分子取り込まれた包接化合物が得られた。いずれもベンゼンはシクロファン環の面に平行な配置をとっている。また、環状五量体の空孔はやや大きく、ベンゼンは空気中で容易に脱離するが、環状四量体八酸化物ではベンゼンは空孔内に強く包接されており、空気中あるいは減圧下でも脱離しない。従って、環の大きさを制御することにより、ベンゼンを可逆的に包接したり、不可逆的に包接することができる。また、鎖状の三量体は1,2,4,5-テトラシリルベンゼン部分がジグザグに折れ曲がった構造をとり、折れ曲がりにできた空間にテトラヒドロフランを2分子包接する。このような包接様式は珍しく、ダブルピンセット型の包接作用を示すということができる。これらの鎖状および環状化合物の紫外吸収スペクトルでは、1,2,4,5-テトラシリルベンゼン単位の数が増加すると、吸収は長波長側にシフトし、分子吸光係数が増加する。従って、これらの分子はケイ素-ケイ素σ軌道とベンゼン環のπ軌道のσ-π共役が分子全体に広がった系であることがわかった。1,2,4,5-テトラキス(ジメチルシリル)ベンゼンのケイ素上の水素を塩素化して四塩化物とし、これをナトリウムでカップリングさせると、ベンゾ[1,2:4,5]ビス(1,1,2,2-テトラメチルジシラシクロブテン)が生成する。これを触媒量のテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウムと反応させると、ケイ素-ケイ素結合のメタセシスが起こり、ベンゾビス(ジシラシクロブテン)を構成単位をする鎖状および環状のオリゴマーが生成した。X線結晶構造解析の結果、これらのオリゴマーは溶媒分子を特異な様式で包接することがわかった。鎖状の三量体はベンゾビス(ジシラシクロブテン)単位がジグザグに折れ曲がった構造をとり、向かい合った2つのベンゾビス(ジシラシクロブテン)単位の間に溶媒のテトラヒドロフランが1分子ずつ包接されている。従って、ダブルピンセット型の包接様式をとっている。一方、環状四量体をトルエン中から再結晶すると、溶媒分子を包接せずに分子内に直径7.3Åの空孔をもったまま結晶化するが、環状五量体をベンゼン中から再結晶すると、直径11Åの空孔にベンゼン分子が1つ包接される。また、環状五量体の分子間のすき間にもベンゼン分子が包接されており、これはキャビテートであると同時にクラスレートでもあることがわかった。

これらの鎖状および環状オリゴマーの紫外吸収スペクトルでは、ベンゾビス(ジシラシクロブテン)単位の数の増加とともに吸収が長波長側にシフトし、分子吸光係数が増大する。従って、これらの系ではケイ素-ケイ素σ結合とベンゼンのπ電子の間のσ-π共役が分子全体に広がっていることがわかった。前年度に1,2,4,5-テトラキス(ジメチルシリル)ベンゼンを構成単位とする環状四量体と環状五量体を合成し、環状四量体の環の内部は空孔のままであるが、環状五量体は空孔内にベンゼンを取り込むことを報告した。このことは、ベンゼン程度の大きさの分子を包接するためには、空孔の直径が環状四量体(7.3【。!A】)程度では不十分であり、環状五量体(11【。!A】)程度の大きさが必要であることを示唆している。そこで、環状四量体のケイ素-ケイ素結合に酸素原子を挿入することによって空孔を拡大し、包接作用を示すかどうか検討した。環状四量体を過剰量のトリメチルアミンオキシドと反応させると、8個のケイ素-ケイ素結合がすべて酸化され、4個のベンゼン環が8個のシロキサン鎖で架橋されたシクロファンが91%の収率で得られた。このものをベンゼン中から再結晶すると、分子内の空孔にベンゼンを1個取り込んだ包接化合物が得られた。X線結晶構造解析から、空孔の直径は約10.4【。!A】であり、ベンゼンはシクロファンの環平面に平行に包接されていることがわかった。また、ベンゼンは空孔内に強く包接されており、容易には脱離しない。この結果はやや大きい空孔をもつ環状五量体に包接されたベンゼンが空気中ではすぐに脱離するのと対照的であり、空孔の直径の役割が大きいことを示している。さらに、環状五量体と環状六量体についてもトリメチルアミンオキシドで酸化し、対応するシロキサン架橋のシクロファンを高収率で合成した。このものについてはさらに大きな空孔をもつと考えられ、その包接作用に興味が持たれる。
NFATファミリーの多様性にもとづく特異的制御法の開発

活性化分子NFATc2と抑制性分子NFATc4のキメラ分子を作製して検討したところ、NFATc4による抑制作用の責任領域はCRD領域にマップされた。CNとNFATの部分領域の結合活性を定量的に比較検討したところ、CRD内に新たなCN結合領域を見いだした(CNBR3)。マイクロアレイ比較解析によって、NFATc4を大動脈血管平滑筋に特異的に発現調節する因子としてWWTR1を発見した。NFATに対する特異的制御法は、薬理作用および副作用の両面において既存の免疫抑制薬を凌駕する治療法となりうる。本年度は、研究実施計画に準じ、その特異性に関わる分子内領域と特異的発現調節機構についての解析を実施した。まず活性化分子であるNFATc2と抑制性分子であるNFATc4の種々キメラ分子を作製した。それらの発現プラスミドをJurkat細胞に遺伝子導入し、各種サイトカイン発現に与える影響を検討した。その結果、NFATc4によるサイトカイン産生抑制作用の責任領域は、N末のCRDにマップされることが明らかとなった。次に、各NFATの部分領域とその調節分子であるカルシニューリンとの結合活性について定量的な比較検討を行った。当初計画していたALPHA法では、夾雑物の影響で正確なアフィニティーを測定することができないことが判明した。そこで、種々の分子間相互作用測定系について再度比較検討した結果、定量的免疫沈降法を用いることによって、最も信憑性の高いデータが得られることを見いだした。また、抑制性分子NFATc4における種々のプロモーターレポーターベクターを作製し、種々の細胞でその発現調節機構を検討した。その結果、NFATc4が高発現する血管平滑筋細胞において高い転写活性が認められた。そこで現在、変異/欠失させたレポーターベクターを作製して作用検討することにより、活性中心となる調節領域の絞り込みを行っている。以上、年度計画に準じた研究遂行により、NFATの特異性を決定する要因を分子レベルで特定する上で不可欠な成果が得られた。これらを端緒とし、平成22年度以降、さらに詳細な解析を実施する計画である。本年度の研究実施計画に準じ、NFATの機能特異性に関わる分子領域と発現特異性に関わる遺伝子領域についての解析を実施した。まず、NFATc4におけるN末のCRDをさらに細分化したサブドメインをNFATc2と交換したキメラ分子を作製して検討したところ、NFATc4によるサイトカイン産生抑制作用は、そのCRD領域全体で制御されていることが明らかとなった。次に、前年度開発した定量的免疫沈降法でNFATのCRD領域とカルシニューリン(CN)との結合活性を詳細に比較検討したところ、これまで知られている二カ所のCN結合部位だけでなく、その中間部位も明らかにCNとの結合活性を示すことを見いだした。また、抑制性分子NFATc4のプロモーターレポーターベクターを用いて作用検討した結果、その転写開始点より-390-330bpの領域を欠失させることにより、転写活性が劇的に減弱することを見いだした。さらにいくつかの点変異を導入して検討し、その活性中心となる約20bpのオリゴ配列を同定できた。そこで、その配列オリゴと変異オリゴを用いて血管平滑筋細胞抽出液を免疫沈降し、共沈した蛋白をプロテオーム解析した。並行して、血管平滑筋細胞より樹立したcDNAライブラリーを、NFATc4プロモーターベクターを恒常的に導入したJurkat細胞に導入して転写活性を増強する分子をクローニングした。それらの結果、合計7種類の分子を同定できたが、各々をサブクローニングした発現ベクターをJurkat細胞に導入して強制発現させてもNFATc4の発現を増強せず、今回見いだされた分子は全て擬陽性であると結論した。またNFATとの相対比較のため、他の転写制御因子であるZFPM1およびCtBPのTh2サイトカイン発現に与える影響を明らかにすると共に、in vivoにおける作用検討を行うためのT細胞移入マウスにおける気道炎症反応モデルについて、薬剤やノックアウトマウスを用いたプロファイリングを実施した。昨年度までに見いだしたNFATの新たなCN結合部位(CNBR3)CNBR3のCN結合活性を比較検討したところ、NFATc2およびNFATc4のCNBR3はCN結合に関与するが、NFATc1およびNFATc3ではほとんど寄与しないことを見いだした。並行してT細胞のIL-17A発現に対するNFATの役割を比較検討したところ、NFATc2はNFATc1に比しIL-17遺伝子発現を強く誘導し、IL-17Aの転写活性化にCNBR3が関与する可能性が示唆された。また対照として転写調節因子ZFPM1がT細胞のIL-4産生に与える影響も明らかにした。またCNBR3の発現ベクターをNFAT結合配列レポーターベクターと共にJurkat細胞に導入したところ、刺激誘導される転写活性化に対し、CNBR3は抑制作用を示した。ヒトT細胞に遺伝子導入すると、CNBR3はIL-2遺伝子発現を抑制した。CNBR3は、NFATの特異的制御を行う上で有望な標的となる可能性が示唆された。NFAT

特異的制御薬の作用検討に利用するため、T細胞移入マウスにおける抗原誘発気道炎症モデルについて、CD44およびステロイド感受性に着目してプロファイリングを行った。昨年度見いだされたNFAT発現調節候補分子は全て擬陽性であったため、異なる手法で同定を試みた。すなわち、T細胞と血管平滑筋細胞に発現する遺伝子をマイクロアレイ比較解析し、血管平滑筋で転写調節に関わる12分子を抽出した。それらの発現ベクターとNFATc4プロモーターレポーターベクターをJurkat細胞に導入して検討した結果、NFATc4の転写活性化を誘導し、NFATの特異的発現制御を可能にする標的分子として有望なWWTR1を見いだした。以上、引き続き詳細な検討を進めることによって、臨床応用も可能な選択的NFAT制御法を開発できると期待される。
大循環モデルと安定同位体を用いたシベリアにおける大陸水循環に関する研究

研究実施計画書に基づき、行った研究実績を以下にまとめる。(1)水蒸気同位体観測法の確立当初使用予定だった商用の除湿器が製造中止になってしまった為に、今回汎用品の流用をあきらめ、新たに自動で水蒸気を簡便に採取できる装置の開発を行った。新方式では、密閉容器内を加圧し、飽和水蒸気を越えた水蒸気が凝結し、容器下部に凝結水が溜まる仕組みになっている。またこの新方式の採取装置で採取された水蒸気の同位体比が現実の値を再現しているか明らかにするために、同位体機知の水蒸気を発生させられる、水蒸気発生装置の開発も同時に行った。この水蒸気発生装置で生成された水蒸気を新方式の水蒸気補修装置で採取したところ、捕集した水蒸気の同位体比は、発生させたものと比較して同位体濃度が高くでることがわかり、回収率が100%でないことに起因する誤差があることが確認され、現在その誤差を補正する実験式を作成する作業を継続している。今回は採取装置の開発が遅れた為に、補助金支給期間内に装置を野外観測に応用するところまではできなかったが、汎用的な新しい装置そのものは完成させることができた。(2)シベリアにおける広域同位体観測ステーションの設置シベリアでの観測は、現地の情勢変化に実施が困難となったために、チベット高原において、大陸内部における水蒸気の同位体比変動観測を行った。現地観測は、2004年8月にチベット高原中部に位置する那曲で行い、地表付近の水蒸気を6時間毎に連続して2週間観測を行った。また、採取した水蒸気に地表面からの蒸発散水の寄与を調べるために地表面から蒸発する水蒸気を同時に採取した。まず観測された蒸発散水の同位体比は、午前から夕方に向かって徐々に同位体比が高くなる顕著な日変化を示すとともに,表層の土壌水分量の変化に応じた顕著な時系列変化を示した。この原因を調べるために、鉛直1次元の陸面モデルに同位体組み込んだモデル解析結果を使って調べたところ、大まかな変化は、降水の同位体比変化に応答していることが示された。また、さらに細かい変動では、蒸発と蒸散の寄与率変化に応じて同位体比が変化しており、同位体トレーサーは、蒸発と蒸散の比の時間変化を調べる非常によいトレーサーであることが今回の観測から明らかになった.(Kurita and Yoshimura, 2006)。次にこのような顕著な時間変化が観測された地表面FLUXの同位体比変動と、地表付近で観測された水蒸気の同位体比を比較したところ、水蒸気の同位体比は、蒸発散水の変動に応答した時系列変動を示しており、地表面で観測される水蒸気は、大規模な循環を反映したものというよりもむしろ局地的な影響を強くうけていることがわかった。昨年の解析では、降水と水蒸気の同位体比が一致していることから、水蒸気の同位体比変化は、大気循環場の変動を反映していると考えられたが、今回のモデル結果から、降水が蒸発散水の変動に大きく影響しているために、地表面の水蒸気の同位体比変化と降水の同位体比の変化が一致していることが明らかになり、大気循環変動を解釈するためには、より高々度において同位体観測を行う必要性が今回の観測から示された。(3)同位体大規模循環モデル結果の検証既存の同位体大循環モデルを最新版のCCSR/NIES/FRCGCに移植する作業を昨年度から引き続き行い、プログラムバグの修正等を引き続き行うことで、観測された同位体比の特徴を再現することが可能になった。最新の結果では、シベリア域で観測された内陸部に向かって夏期に降水の同位体比が徐々に減少するといった特徴を再現することが可能になり、この同位体比変動は、地表面から蒸発する水の同位体比の分布が同様に内陸に向かうにつれて軽くなることが原因であることがわかった。これは、西シベリアでは、一降水の同位体比の季節変化に応じて表層土壌水の同位体比が変化しているのに対し、東シベリアでは、夏期に降水する同位体比よりも、軽い同位体比をもった水が維持されることに起因している。つまり、東シベリアでは、夏期の土壌水分に、夏期降水よりも軽い同位体比をもつ融雪の寄与が残っており、この融雪水の寄与がシベリアにおける蒸発水の同位体分布を作り出していることが明らかになった。このように同位体モデルを使って観測値を再現することによって、これまで観測できなかった、夏期降水に対する融雪水の寄与を証明することが可能になった。(1)水蒸気同位体観測法の確立購入予定だった市販の除湿機が製造中止になり,入手困難になってしまったので,同様の機構をもつ除湿機の試作を現在検討している。また,装置を開発することになったので,除湿剤も,同位体観測に最適なものを選択するために,様々な種類のものを入手して試験を行っている。(2)シベリアにおける広域同位体観測ステーションの設置今年度は,シベリア域で,水蒸気捕集観測を現地機関に委託して観測を始める予定であったが,上記の理由で,捕集装置の開発が遅れており,今年度のシベリア観測は断念した。代わりに,今年度はチベット高原での観測に参加する機会に恵まれたので,従来の水蒸気捕集装置を用いて大陸内部における水蒸気捕集試験をチベット高原で行った。チベット高原では,水蒸気捕集装置を高さ3mのところに設置して観測を行い,この変動を降水の同位体比変動と比較を行った。

結果は,水蒸気の同位体比は観測期間中,非常に大きく変動し,特に擾乱の通過に伴って大きく値が減少する傾向を示した。この傾向は,降水の同位体比の変化と同様であり,このことから,大陸内部では,高度3m程度に装置を設置すれば,大気循環場を反映した試料を採取できることが明らかになった。(3)同位体大循環モデル結果の検証本年度,旧版のCCSR/NIES大循環モデル(5.4g)に組み込まれていた同位体スキームを,現行版のCCSR/NIES大循環モデル(5.7b)への移植を行った。旧版から現行版への移行では,陸面スキームが大きく変更されていたので,それに併せて同位体スキームの改良も行った。改良後,陸面スキームの検証を行うために,昨年度チベット高原で観測した気象データを陽的に与えてチベット高原での陸面からの蒸発水の同位体比を予報し,これを観測値と比較した。結果は,従来の同位体スキーム(陸面からの蒸発はすべて蒸散であると仮定)では,観測値を再現することができず,陸面からの蒸発水の同位体比を正確に再現するには,土壌面からの蒸発効果を加味しなければならないことが明らかになり,現在そのスキーム開発を行っている。この知見は,今回,水蒸気の同位体観測をすることによって明らかになった知見であり,水蒸気の観測を行うことは,同位体大循環モデルの開発に非常に有益であることを証明している。研究実施計画書に基づき、行った研究実績を以下にまとめる。(1)水蒸気同位体観測法の確立当初使用予定だった商用の除湿器が製造中止になってしまった為に、今回汎用品の流用をあきらめ、新たに自動で水蒸気を簡便に採取できる装置の開発を行った。新方式では、密閉容器内を加圧し、飽和水蒸気を越えた水蒸気が凝結し、容器下部に凝結水が溜まる仕組みになっている。またこの新方式の採取装置で採取された水蒸気の同位体比が現実の値を再現しているか明らかにするために、同位体機知の水蒸気を発生させられる、水蒸気発生装置の開発も同時に行った。この水蒸気発生装置で生成された水蒸気を新方式の水蒸気補修装置で採取したところ、捕集した水蒸気の同位体比は、発生させたものと比較して同位体濃度が高くでることがわかり、回収率が100%でないことに起因する誤差があることが確認され、現在その誤差を補正する実験式を作成する作業を継続している。今回は採取装置の開発が遅れた為に、補助金支給期間内に装置を野外観測に応用するところまではできなかったが、汎用的な新しい装置そのものは完成させることができた。(2)シベリアにおける広域同位体観測ステーションの設置シベリアでの観測は、現地の情勢変化に実施が困難となったために、チベット高原において、大陸内部における水蒸気の同位体比変動観測を行った。現地観測は、2004年8月にチベット高原中部に位置する那曲で行い、地表付近の水蒸気を6時間毎に連続して2週間観測を行った。また、採取した水蒸気に地表面からの蒸発散水の寄与を調べるために地表面から蒸発する水蒸気を同時に採取した。まず観測された蒸発散水の同位体比は、午前から夕方に向かって徐々に同位体比が高くなる顕著な日変化を示すとともに,表層の土壌水分量の変化に応じた顕著な時系列変化を示した。この原因を調べるために、鉛直1次元の陸面モデルに同位体組み込んだモデル解析結果を使って調べたところ、大まかな変化は、降水の同位体比変化に応答していることが示された。また、さらに細かい変動では、蒸発と蒸散の寄与率変化に応じて同位体比が変化しており、同位体トレーサーは、蒸発と蒸散の比の時間変化を調べる非常によいトレーサーであることが今回の観測から明らかになった.
ヒト悪性黒色腫全5病型のそれぞれに対応した最適熱中性子捕捉療法の確立

本プロジェクトでは現在まで12名の黒色腫患者にホウ素熱中性子捕捉療法を施してきた。治療結果を総括すると:性別男7、女5;治療時年令5085;病型肢端黒子型6、結節型5、悪性黒子型1;原発巣8、転移巣3、衛星転移を伴った原発巣1;に対し、完治6、顕著縮退4、経過観察中2を得た。病巣位置は足底部6のほかは後頭部、ソケイ部、頭皮、顔面、拇指爪甲下、下肢、足部などさまざまであった。平成34年度中の処置例3のうち、1例は女性顔面に広範に発症した悪性黒子型であるが、本療法により完治をみた。顔面の黒斑は今も次第に褪色を続けている。第2例は左右ソケイ部リンパ節に転移巣をもつもので、重水を使用して中性子束の減衰を少なくし、線束を深在病巣に届かせるように計らい治療した。第3例(肢端黒子型)は目下経過観察中であるが、順調で再発の徴候を認めない。武蔵工大炉不調のため、表在拡大型黒色腫と悪性青色母斑の治療を所定年度内に実施できず、次期送りとなったことは甚だ残念である。1.病型と腫瘍浸潤状況に応じた最適の治療方法を追球・実施。顔に広範囲に原発した悪性黒子型黒色腫,左右鼡径リンパ節に転移発生した深在病巣症例など経過良好。後者では体液の一部を重水置換して照射熱中性子の深部到達を図り,その有効性を確認。2.3種の小動物で生体内^<10>B濃度の時間変化を即発γ線法で追跡,蓄積デ-タで得た新視点に立って^<10>B化合物の投与法を追究。3.ファントム実験とSimalation計算で熱中性子束の体内分布を求め,深部線量増加の3手法(1)照射病巣前方に空洞作成(2)入射ビ-ムの方向性を変化(3)体液の一部重水置換を試み,各々に効果を認む。併用可。4.武工大炉治療例(脳腫瘍99黒色腫9)と'89MIT会議の合意事項を総合し治療に必要な照射時間は「最大背景線量が2500RBE-cGyに達する時間」と定義した。同炉では4.06hrに当る(実例平均4hr強)。目,頭を含む全身,頭を除く全身の被曝は300,100,30RBE-cGy以下としたい(実例平均209,62.9,23.6)。5.Chymotrypsinによる光学分割で^<10>B-BPAのD体とL体を単離,臨床必要量の供給可能。分離過程で生じる不純物はCelite処理で除去。o-BPAとm-BPAの合成に成功,上記法の援用で光学分割も可能。6.第1項の2症例に鎮静剤投与と照射前後に亙る患者心身状態の管理・監視を施行。異状なし。7.女性顔面治療法樹立。悪性黒子(1項参照)症例に^<10>B-BPA換算薬量85mg/kg体重を2回投与。局面病巣・正常皮膚・血液内^<10>B濃度をICP-MS定量,病巣表面線量は0.85×10^<13>nvtが最適と判断。後日170mg/kg単回投与と上記線量の照射で軽度糜爛を経て治癒。8.^<10>B-BPAを点滴静注した患者の血液・正常皮膚・腫瘍の^<10>B濃度を経時測定,皮膚耐容線量を「点滴終了後の時間」の関数として追求。ある時間を超えると腫瘍根治線量の照射は皮膚障害のため不可。9.直径1cmの腫瘍を41°Cに保つと血流量は無加温に較べ1.5倍,2cm腫瘍では1.0のまゝ。腫瘍/皮膚の^<10>B濃度比は無加温の1.2倍で加温長短(0.52hr)による有意差なし。

1.肢端黒子型黒色腫の3例目を単回照射で治癒させ得た。リンパ節転移巣をもつ黒色腫症例にL-^<18>F^<10>BPA投与によるPET(positron emission tomography)を試行した。深在黒色腫をも特異的に検知できる新診断法として有望。23.中性子を生体深部に到達させるため、(1)病巣前方にピンポン球を置き空隙を作成、(2)体液の一部を重水置換、(3)中性子線束は平行成分と等方成分を持つが、前者の比を増加させる、の3手法を追求。各々をファントム実験と輸送計算で定量評価し、よい一致をみた。(3)の実用化のためにコリメータを改造。4.照射場中の熱外中性子成分の制御・調製を目的に数値計算を施行。炉心・照射場間に挿入するスペクトラムシフターの種類と厚さの変更でエネルギースペクトルとその強度を自由に変え得ること判明。5.(1)メチレンブルー法による迅速定量で1.記載症例の血中^<10>B濃度を所望時間内に求め得た。(2)血中p- ^<10>BPAのHPLCによる定量、(3)m- ^<10>BPAの合成と光学分割は予期通りに成功。6. ^<10>BPA点滴静注患者の腫瘍・血液・正常皮膚内^<10>B濃度の経時変化を測定、clearanceの皮膚/血液、腫瘍/血液比間に相関性を認めた。これに基づき点滴直後の血中^<10>B濃度から皮内^<10>B濃度の経時的変化を推定し、治療計画を定めた。3例中2例では所期の腫瘍褪縮が、許容範囲内の皮膚障害で得られた。1例は浅い潰瘍後治癒。7.X線感受性と不感受性の黒色腫細胞に^<10>B-BPA投与、熱中性子照射。両者のDoに差なし。本処理を受けた細胞は障害修復不可能。8. ^<10>BPA単独および利尿剤Lasix同時静注の黒色腫担癌ハムスター2群で^<10>B濃度の時間推移を比較。群間に有意差なく、利尿剤による腫瘍/皮膚の^<10>B濃度比向上には改良研究要。9.1.記載患者の照射中および後の全身管理施行。経過順調で特記事項なし。10.L- ^<18>F ^<10>BPA投与の黒色腫担癌ハムスターで腫瘍の画像診断、腫瘍内化合物濃度とその時間推移測定の可能性を立証。脳、リンパ節転移の黒色腫診断への応用に成功(1.参照)。
繰り返し地震にかかる統計的予測手法のベイズ型時空間モデルへの発展

日本内陸には非常に多数の活断層が分布し,大地震を将来引き起こす危険を孕んでいる.大地震の予測においては,その活動周期の長さゆえにデータの不足および信頼性の問題がつきまとう.これらに起因するパラメータの推定誤差やデータの不確定性に対処し,安定した予測性能を確保する手段として,ベイズ予測手法を確立した.また,小規模の繰り返し地震も,プレート境界の準静的滑りが再来間隔に反映されるため,プレート境界滑りのモニタリングに有効である.そこで,更新過程を拡張した時空間モデルを開発し,プレート境界の滑り速度の時空間分布を推定した.今年度は、公的な地震予測に用いられるBrownian Passage Time(BPT)分布更新過程を拡張したモデルを複数提案し,国内外の繰り返し地震カタログに適用して解析した結果を学会および論文にて発表した.1. BPT分布更新過程を時空間へ拡張させたモデルを提案し,カリフォルニア州サンアンドレアス断層の繰り返し地震カタログに適用して地震活動の時空間的変動の解析を行った.モデルによる推定の有効性を数値実験により示し,また2004年パークフィールド地震などによる地震活動の急激な変化の最中でも提案したモデルがよく当てはまることを示すことができた.さらに解析結果からサンアンドレアス断層における地震活動が大地震により励起され,一定方向に伝播していく様子などが捉えれており,これらの成果を今年度論文にて発表した.2.東北日本沖の太平洋プレート境界における繰り返し地震群にBPT分布更新過程から拡張した時空間更新過程モデルを適用し,特に大地震前後のプレート境界上の準静的滑りの時空間的変化を推定した.推定結果より,福島沖における2008年からの長期的スロースリップの滑り分布とその時間推移の詳細が確認でき,また,2011年東北地方太平洋沖地震の半年程前から震源より北側で発生した滑り加速と,それが南へと伝播したことを発見した.これらの成果を学会で口頭発表し,現在は論文執筆中にある.3. BPT分布更新過程を用いた日本の内陸活断層地震の長期確率予測の予測精度を向上させるため,地震発生間隔のばらつきに地域的特性が見られることを利用して,ばらつきのパラメータの空間分布を推定する手法を提案し,推定結果を学会等の場にて発表した.今年度は,前年度に開発した繰り返し地震群に対する時空間Brownian Passage Time分布更新過程モデルを以下のように幾つかの地震カタログへと適用し,得られた知見や地震の長期予測について学会および論文にて発表した.1.東日本太平洋沖のプレート境界における繰り返し地震群に上記のモデルを適用し,プレート沈み込み速度の時空間的変動をスプライン関数の形で推定した.特に,スプライン関数に局所的な時間不連続点を与えることにより,マグニチュード6以上のクラスの地震がプレート沈み込み運動に与えた影響を議論することができた.ここで開発した手法は,既存のGPSシステムによるプレート沈み込み速度の推定手法とも整合性が取れていることが確認でき,GPS観測の及びづらい沖合いの推定精度を補完する新たな代替手法として,今後他の地域でも活用されることが期待される.2.日本の主要な内陸活断層地震のカタログに対して,地震発生間隔のばらつきかたに空間的類似性があることを利用して,ばらつきのパラメータにガウス過程事前分布を導入した時空間BPT更新過程モデルを適用した.さらに,マルコフ連鎖モンテカルロ法を用いて将来の地震発生時期のベイズ予測を行い,将来の一定期間内に内陸活断層地震が発生する確率を評価した.提案手法による長期予測について,地震調査研究推進本部が公開する長期予測との比較を行ったところ,主にばらつきのパラメータの違いに起因して幾つかの活断層について長期予測に大きな差異があることが判明した.特に,地震調査研究推進本部が長期地震確率を非常に高くあるいは非常に低く見積もっている活断層に対して,提案手法ではより平準化された地震確率を与える傾向があり,今後の内陸活断層地震の長期予測に一石を投ずる研究成果となった.既に地震学分野に大いに貢献する研究成果が幾つか得られており,今年度は主に学会にて成果発表を行ってきた.現在は得られた成果について本課題の期間内に論文発表を行えるよう執筆および投稿を進めているところである.今年度は,前年度以前から継続している繰り返し地震に基づくプレート沈み込み速度推定と,新たに前震群の統計的判別を利用した短期的本震予測の研究を行い,それぞれについて以下の結果を出した.1.前年度に推定した東日本太平洋沖のプレート沈み込み速度分布について,既存のGPSによる地殻変動データから推定された滑り遅れ速度分布との比較検証を行い,本研究の推定結果が先行研究と整合的であることを確認することで,提案手法の妥当性を示した.また,沈み込み速度の時間推移の地域的傾向を考察し,2003年十勝沖地震以降の沈み込み速度が少なくとも2011年まで高水準を維持していたこと,M6クラスの地震や群発活動による間欠的な沈み込み加速(スロースリップ)を繰り返している領域があることなどを示した.以上の成果を論文にまとめ,査読付国際論文誌にて成果発表を行った.2.本震に先行して起こる前震現象は,大地震を短期的に予測する上で非常に有効な手掛かりとなるものの,本震発生前に前震活動をそれと見分ける確実な方法は未だ存在しない.しかし,前震活動が他の地震活動に比べて顕著であるいくつかの特徴がこれまでに多数報告されている.そこで,本研究ではそのような前震活動の傾向について定量的に議論し,スプライン関数を用いたロジスティック回帰モデルで表現することにより,本震発生前に前震活動を識別する手法を提案した.日本国内の地震カタログを分析した結果,主な前震活動の特徴として,短期間に集中していること,震源の空間的ばらつきが大きいこと,最大と2番目のマグニチュード差が低く群発的活動である等の結果が得られた.

さらに,前震活動が識別されたときの本震マグニチュードの予測についてもモデル化を行い,その適用例として2016年熊本地震の前震活動からM7以上の本震発生確率を見積もった.日本内陸には非常に多数の活断層が分布し,大地震を将来引き起こす危険を孕んでいる.大地震の予測においては,その活動周期の長さゆえにデータの不足および信頼性の問題がつきまとう.これらに起因するパラメータの推定誤差やデータの不確定性に対処し,安定した予測性能を確保する手段として,ベイズ予測手法を確立した.また,小規模の繰り返し地震も,プレート境界の準静的滑りが再来間隔に反映されるため,プレート境界滑りのモニタリングに有効である.そこで,更新過程を拡張した時空間モデルを開発し,プレート境界の滑り速度の時空間分布を推定した.現在まで研究の成果は概ね順調に出ており,それを幾つかの学会にて発表してきた.学会等での議論で指摘された課題に対応するために,論文の執筆および投稿に予定より若干遅れが生じているが,現在論文執筆を優先的に進めており十分に挽回できるものである.1.今年度に開発した繰り返し地震群に基づくプレート沈み込み速度の推定手法について,カリフォルニアや西南日本など他の地域へと応用し,地域によるプレート沈み込み運動の違いを含めて議論していく.2.今年度に開発した国内内陸活断層の長期予測手法について,今年4月に発生した熊本地震の震源断層へと適用し,長期予測の検証およびモデルの改善を検討する.3.熊本地震はマグニチュード7.3の本震より前に,最大マグニチュード6.5の前震活動が起こっている.本震発生前に前震である確率を評価することで,より大きな本震の発生を予測する手法を現在開発しており,熊本地震の本震がどの程度予測可能であったかを検証する.統計地震学今年度に提案してきた繰り返し地震の統計モデルを,次年度は新たに提供された地震データに適用し,繰り返し地震の新たな知見および予測結果を得ることを目指す.1.カリフォルニア州サンアンドレアス断層における繰り返し地震について,カリフォルニア大学バークレー地震研究所から今年度の研究成果よりさらに広範囲の地震データの提供を受けており,これを時空間モデルで解析して地震活動の変化について新たな知見を示していく.2.日本の内陸活断層地震の長期確率予測について,今年に入り追加された関東地方の活断層地震も加えて再度解析を行う.各活断層の地震発生間隔の分布パラメータについて,これまで空間統計モデルを用いた推定を行っており,次年度はこれを元に新たな長期地震確率の予測を行い,公的な地震予測との比較検証を進める.
強力集束超音波と微細気泡を用いた非侵襲腫瘍治療技術のための数理的研究

前年度の成果を受けて、本年度は、超音波と気泡を併用した低侵襲腫瘍治療技術開発に向けた基盤の構築を主眼におき、以下の4点を遂行した:(1)多数の気泡を含む水中における弱非線形音響波伝播を記述する、非線形波動方程式群(KdV-Burgers方程式・非線形Schrodinger方程式)の数値解析を行った。有限差分波形を描き、非線形性・分散性・散逸性の競合に対する定量的理解を得て、そのボイド率依存性を明らかにした;(2)気泡壁近傍の局所的高圧を記述可能である点に特長を有する気泡流の平均化モデル方程式系(Egashira, Yano & Fujikawa, 2004)の固有値解析を行った。運動量保存則の相関輸送項に組み込まれる付加慣性力の表式が、モデル方程式の数学的適切性に強く寄与することを証明した;(3)マイクロオーダの脂質気泡造影剤を治療増感剤に用いることを目指して、気泡群が壊れないような低強度の集束超音波を用いて、音場の基礎的な計測を行った;(4)リング型トランスデューサを用いた超音波トモグラフィにおいて、屈折を考慮した音速再構成法の検討を行った。以上のとおり、気泡力学と音響学が絡み合う多様な系における、多様な観点および手法をとおした成果の創出とは、技術開発へと資する基盤創成に他ならない。今後は、腫瘍治療技術の設計に向けて、これらの成果群を統合することに力を注ぐ。(抄録なし)代表者らのグループでは、超音波による診断・治療の融合器を創成すべく、音で診て音で治す、USCT(UltraSound Computed Tomography)とHIFU(High Intensity Focused Ultrasound)の統合を提案している。これは、国内外を問わず報告例が皆無な革新的チャレンジであるが、生体中の音響伝播の複雑さゆえに、その基盤すら報告例は皆無である。本年度は、基礎的側面に重点をおき、診断と治療おのおのを、理論的・数値的・実験的に調べた。HIFUによる腫瘍焼灼などの低侵襲治療は、非切開手術であるがゆえに、治療中の患部を視認できない問題を有する。現在の腫瘍のリアルタイム可視化技術の主流はMRIであるが、高価かつ装置の大型化などの欠点を打開せねばならない。そこで、診断をも音に委ねるUSCTを提案する。乳房のように、骨などの硬組織を含まず、かつ、異媒質間の音響インピーダンスの差がわずかな軟組織であるならば、屈折や回折による音の経路の変化は大きくはなく、その有用さが期待される。リング型アレイトランスデューサを使い、乳房をリングで覆い囲むように音源を配置し、各素子から乳房に向けて放射された透過超音波を受信し、乳房内部の画像再構成(CT)を行う。CTでは、組織の音速などの空間分布が計算可能であるがゆえに、CTの情報をもとに、腫瘍焼灼中におけるHIFU照射の高精度制御が期待される。音速の温度依存性をとおして、焼灼中の温度上昇を予測することで、腫瘍近傍組織の加熱といった悪影響をも回避可能にすることが、診断・治療統合器の最大の利点といえる。HIFUの死亡事故という最悪な事例が散見されるが、「治療部位をきちんと診さえすれば」回避できるがゆえ、ここで改めて「モニタリング」の重要性を強調しておく。本年度の具体的成果を、診断・治療の両側面から述べる:(1)診断:音は回折・屈折・反射を伴うが、これらを無視した直進CTを遂行し、どの程度の精度の画像再構成が可能かを調べた[日本機械学会流体工学部門一般表彰(優秀講演表彰)(金川哲也)受賞]。次年度は、屈折や回折を考慮した数値的検討を行う。(2)治療:気泡を含む液体中の超音波伝播に対して、理論・実験の両手法から基礎研究を行った。前者では、音の周波数の高低を系統的・統一的に扱う理論体系を提案した[2011年度日本機械学会賞(論文)受賞]。後者では、マイクロオーダのSonazoidを用いて、気泡群が壊れない程度の低強度超音波を用いて、音場計測系の構築および気泡の共振を考察した。

以上のとおり、気泡力学と音響学が絡み合う多様な系における、多様な観点および手法をとおした成果の創出とは、技術開発へと資する基盤創成に他ならない。今後は、腫瘍治療技術の設計に向けて、これらの成果群を統合することに力を注ぐ。当初の研究計画には含まれていなかった、医用超音波による診断・超音波CTの基礎的検討にも携わった点、および、マイクロバブルに係る音場の実験的検討をも遂行した点は、計画以上の進展と判断する。しかしながら、数理的研究という申請題目に即すような、新規性のある結果は、いまだ得られておらず、入り口に迫った程度に過ぎない。以上を総合視し「おおむね順調に進展している」との自己評価を下す。超音波診断の数理およびアルゴリズムに関しては、欧米の先行研究を眺めると、偏微分方程式論・逆問題に詳しい応用数学者とのコラボレーションが散見され、当研究においても応用数学者の参入が必要と考えている。現在、他機関の応用数学者の助言を乞うている最中にあり、次年度以降、申請者の得意とする応用力学的側面とのコラボレーションを計画している。一方、マイクロバブルと超音波の理論は、申請者の専門でもあり、これまでどおりに遂行するが、実験に関しては、所属機関内の超音波計測工学の専門家との密な打合せのもと、精密な計測および厳密な考察を遂行する予定である。(抄録なし)
癌腫病菌カバノアナタケに感染したシラカンバ植物体における全身獲得抵抗性機構の解明

カンバ類の癌腫病菌であるカバノアナタケIO-U1株に感染したシラカンバ幼植物体No.8に生成する、感染初期における菌感染特異的タンパク質の検出・同定を行った。その結果、菌感染した幼植物体No.8において、オキシダティブバーストと全身獲得抵抗性(SAR)機構が防御反応として生じていることが判明した。また、IO-U1株に感染した2種類の幼植物体No.8及び東北について、組織学・組織化学的観察を行った。その結果、菌感染した2種類の幼植物体において、フェノール性化合物の堆積とその重合物の堆積、及びスベリン化した壊死感染防御周皮の形成が、菌糸の生育を抑制していることが示唆された。続いて、ペルオキシダーゼのアイソザイム分析を行った。その結果、菌感染幼植物体においては、ペルオキシダーゼのアイソザイムが、フェノール性化合物の重合に、より特化していることが推測された。更に、全身獲得抵抗性(SAR)を誘導することが知られているサリチル酸を、幼植物体No.8に投与し、植物体内でSARが生じるかどうかプロテオーム解析を用いて調べた。その結果、サリチル酸投与により、幼植物体No.8内にSARが誘導されることが明らかになった。また、幼植物体No.8においては、カバノアナタケ菌による感染とサリチル酸投与の場合とでは、生じる抵抗性機構が異なることが示唆された。本研究では、カンバ類の癌腫病菌であるカバノアナタケIO-U1株に感染したシラカンバ幼植物体No.8に生成する、感染初期における菌感染特異的タンパク質の検出・同定を行った。組織培養によって大量に増殖させた3ケ月生無菌幼植物体に、菌を接種し、対照区(傷を付けたもの、無傷・無菌のもの)を同様に用意した。菌接種後2日目に植物体を収集し、急速凍結して粉末にし、これから緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。得られたタンパク質サンプルを二次元電気泳動にかけ、ゲルを銀染色した。ゲルの画像解析により、対照区のものと比較して菌感染特異的タンパク質を検出した。その結果、合計735個のタンパク質スポットが検出され、その内169個のスポットが菌感染特異的タンパク質であると判明した。これら菌感染特異的タンパク質の内、91個のタンパク質をゲルから切り出し、ゲル内消化後、質量分析に供した。その結果、二つのヒートショックプロテイン(Hsp70及びHsp60)とグルタチオンS-トランスフェラーゼが同定された。これらの結果から、IO-U1株に感染した幼植物体No.8において、オキシダティブバーストと全身獲得抵抗性機構が防御反応として生じていることが推測された。本研究では、また、IO-U1株に感染した2種類の植物体No.8及び東北について、組織学及び組織化学的観察を行った。菌接種後、2,4,12時間、1,2,10,30日後に植物体を収集し、菌感染部付近の横断面切片を作成した。対照区についても同様に植物体を収集し、横断面切片を作成した。No.8においては、菌接種付近の木部及び形成層帯に、菌接種後12時間2日目においてフェノール性化合物の堆積が観察された。このフェノール性化合物の堆積は、菌接種後10,30日目において菌接種付近の木部細胞壁に顕著に観察された。また、同期間にリグニンの顕著な堆積も同じ部位に見られた。更に、菌接種後2日目以降、菌接種付近の厚壁細胞の発達が観察された。一方、東北においては、フェノール性化合物の堆積が菌感染後2時間以降に観察され、その堆積が10日目に最も顕著となった。ペルオキシダーゼ活性もフェノール性化合物の堆積部位に、この化合物の堆積と同様のパターンで認められた。また、スベリン化した壊死感染防御周皮(NP)の形成が、菌感染後30日目に観察された。これらの結果から、IO-U1株に感染したシラカンバ幼植物体

No.8及び東北において、フェノール性化合物とその重合物の堆積、厚壁細胞の発達及びスベリン化したNPの形成が、菌糸の生育を抑制しているものと考えられる。本研究では,昨年度に引き続き,カンパ類の癌腫病菌であるカバノアナタケ10-U1株に感染したシラカンバ幼植物体No.8に生成する,感染初期における菌感染特異的タンパク質の検出,同定を行った。組織培養によって大量に増殖させた3ヶ月生無菌幼植物体に,菌を接種し(T),対照区(傷を付けたもの(C2),無傷,無菌のもの(C1))を同様に用意した。菌接種後2日目に植物体を収集し,急速凍結して粉末にし,これから緩衝液を用いてタンパク質を抽出した。得られたタンパク質サンプルを二次元電気泳動にかけ,今回はゲルをクーマシーブリリアントブルー染色した。ゲルの画像解析により,対照区のものと比較して菌感染特異的タンパク質を検出した。オキシダティブバーストと全身獲得抵抗性機構に関連しているタンパク質を中心に解析を進めたが,まだ解析途中である。本研究では,また,昨年度に引き続いて、10-U1株に感染した植物体No.8について、組織学及び組織化学的観察を行った。菌接種後,2,4,6,12時問,1,2,10,30日後に植物体を収集し,菌感染部付近の横断面切片を作成した。認照区についても同様に植物体を収集し,横断面切片を作成した。フェノール性化合物の堆積範囲及びぺルオキシダーゼ活性染色範囲は,C2では傷付近に,Tでは木部の細胞壁及び放射柔細胞に観察された。C2におげるフェノール性化合物の堆積は処理後1日目から,Tにおけるフェノール性化合物の堆積は処理後2時間から観察され,ペルオキシダーゼ活性の染色はC2,T共に処理後2時間から観察された。また,フェノール性化合物は,徐々に堆積範囲を広げて行ったが,ペルオキシダーゼ活性の染色範囲は,全処理時聞でC2及びTとも,ほぼ同じであった。さらに,これらの堆積及び染色範囲がほぼ同じであったことから,ペルオキシダーゼがフェノール性化合物の重合に関与し,これによって菌糸の伸長に対する防御の役目をしているのではないかと推察された。本研究では更に,ペルオキシダーゼのアイソザイム分析も行った。処理後2日目のタンパク質サンプルを用いて,等電点電気泳動を行い,ゲルをペルオキシダーゼ活性染色した。その結果,Tにおいて,C1及びC2で見られた塩基性域の3つのバンドが消失していた。塩基性ペルオキシダーゼは,シリンギルモノマーの重合に関与していると考えられているので,Tにおいては,ペルオキシダーゼのアイソザイムが,フェノール性化合物の重合に,より特化したのではないかと推定される。
アポトーシスにおける細胞形態の動的変化(アクティブブレッビング)に関する研究

アポトーシスは、細胞の収縮やメンブレンブレビングに代表される特徴的な変化を引き起こす。この形態変化に関与していると考えられる分子は今までにいくつか報告されているが、形態変化のメカニズムについては不明な点が多い。本研究課題では、これを明らかにする目的で以下の3点の解析を行った。1.アポトーシス時におけるアクチン細胞骨格系の動きを解析した。EGFPラベルしたアクチンをHeLaFD5細胞に発現し、抗Fas抗体によってアポトーシスを誘導し連続写真撮影を試みたところ、刺激後細胞基底部でアクチンの環状構造が形成され、それに伴い細胞が収縮することがわかった。ブレブはアクチン環状構造を足場にして形成されると考えられ、またアクトミオシン系依存的に運動した。2.アポトーシスシグナル伝達経路のどのステップで細胞の形態変化を誘導するシグナルが生成するかを検討するために、種々のアポトーシス抑制因子のFas刺激が誘導する細胞の形態変化への影響を検討したところ、核の形態変化を効率良く抑制するBcl-2は細胞の形態変化を抑制する事ができず、またカスパーゼの多くを阻害するz-VAD-FMKは細胞の形態変化を抑制したが、caspase-3を特異的に阻害するDEVD-CHOは細胞の形態変化を抑制できなかった。したがって、細胞の形態変化を誘導するシグナル伝達経路は核の形態変化を誘導するそれと、Bcl-2やcaspase-3の作用点の上流で分岐している事が示唆された。3.細胞の形態変化に伴って変化する蛋白質をプロテオーム解析により同定するため、Bcl-2を過剰発現している細胞をFas刺激し、刺激しないものをコントロールとして、二次元電気泳動し、移動度の異なるスポットについてMULDI-TOF MS解析を行った。その結果、Lamin A/C、Lamin B、Vimentinを変化する蛋白質として同定した。本研究では、アポトーシス時におけるアクチン細胞骨格系の動きに注目し細胞形態の変化を詳細に観察することで、アクチン細胞骨格系の再構成が細胞の形態変化を引き起こしている可能性について検証することを目的とした。EGFPラベルしたアクチンを遺伝子導入によりHeLaFD5細胞へ発現し、抗Fas抗体によってアポトーシスを誘導し連続写真撮影を試みたところ、刺激後60-80分で細胞の基底部でアクチンの環状構造が形成され、それに伴い細胞が収縮することが分かった。ブレブはこのアクチン環状構造を足場にして形成されると考えられ、またアクトミオシン系依存的に運動した。この時見られた細胞の形態変化とアクチン環状構造形成はサイトカラシンDを用いてアクチン細胞骨格を破壊した時には見られなかった。またアクチンの重合・脱重合に作用するいくつかの薬剤を作用させた実験により、アクチン環状構造の形成には重合・脱重合やアクトミオシン系によらない因子の関与が示唆され、ブレブ形成にはアクチンの重合・脱重合が必要であることが示された。以上のことから、アポトーシス時にはアクチン環状構造が形成されアクチンの重合・脱重合を介して細胞の形態変化を引き起こし、アクトミオシン系によりブレブが活発に運動していることが示唆された。この細胞の形態変化に関与していると考えられる分子は今までにいくつか報告されているが、形態変化のメカニズムについては不明な点が多い。本研究では、アポトーシス時における細胞の形態変化のメカニズムを明らかにするため、以下の解析を行った。

アポトーシスシグナル伝達経路のどのステップで細胞の形態変化を誘導するシグナルが生成するかを検討するために、種々のアポトーシス抑制因子がFas刺激によって誘導される細胞の形態変化にどのように影響するかを検討したところ、核の形態変化を効率良く抑制するBcl-2は細胞の形態変化を抑制する事ができず、またアポトーシスシグナル伝達経路で重要な機能を担っているカスパーゼの多くを阻害するz-VAD-FMKは細胞の形態変化を抑制したが、caspase-3を特異的に阻害するDEVD-CHOは細胞の形態変化を抑制できなかった。したがって、細胞の形態変化を誘導するシグナル伝達経路と核の形態変化を誘導するシグナル伝達経路は、Bcl-2やcaspase-3の作用点の上流で分岐している事が示唆される。この細胞の形態変化に関わっている因子を同定するために、現在細胞の形態変化を観察できるin vitro系を構築している。アポトーシスは、細胞の収縮やメンブレンブレビングに代表される特徴的な変化を引き起こす。この細胞の形態変化に関与していると考えられる分子は今までにいくつか報告されているが、形態変化のメカニズムについては不明な点が多い。本研究では、アポトーシス時における細胞の形態変化のメカニズムを明らかにするため、以下の解析を行った。昨年度までに、アポトーシスシグナル伝達経路のどのステップで細胞の形態変化を誘導するシグナルが生成するかを検討し、HeLa細胞の誘導株では、Fas刺激によるアポトーシスにおいて、細胞の形態変化を誘導するシグナル伝達経路と核の形態変化を誘導するシグナル伝達経路が、Bcl-2やcaspase-3の作用点の上流で分岐している事を示してきた。従って、Bcl-2/Bcl-xLを過剰発現しているこの細胞では、Bcl-2/Bcl-xLによりミトコンドリアより下流のシグナル伝達経路が遮断されていると考えられる。細胞の形態変化に伴って変化する蛋白質をプロテオーム解析により同定するため、Bcl-2/Bcl-xLを過剰発現しているこの細胞をFas刺激し、刺激しないものをコントロールとして、二次元電気泳動し、移動度の異なるスポットについてMULDI-TOF MSを用いて解析を行った。その結果、Lamin A/C、Lamin B、Vimentinを変化する蛋白質として同定した。