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都市ごみ埋立層における酸素移動機構と酸素消費反応の動力学の研究

本研究によって次のような成果が得られた。1.埋立地内管網における空気流れについて(1)管網の両端が大気に開放されることで外気が浸出水流出端から相当の速度で流入する。(2)その駆動力は、ごみ層内と外気の温度差と埋立地表面に吹く風による吸上げである。(3)管網内のガス組成はかなり大気のそれに近い。(4)吸い込み流速に大きく影響する因子は、管壁温度、埋立地表面の風速、埋立深さ、管網内の詰まりである。2.管網内からごみ層内への酸素の浸入について(5)酸素のごみ層内への主な浸入機構は、濃度勾配による通常拡散移動である。(6)酸素浸入フラックス及び浸入深さに影響する因子は、ごみ層内間隙の構造を示す因子(屈曲係数/空隙率)、ごみ層内の酸素消費速度、管網内の酸素濃度である。(7)ごみ層内への酸素浸入量や浸入深さを制御できる因子は、管網内の酸素濃度が高くなるように管網を設計すること、及び埋立作業で粒度の非常に小さな覆土を用いたり、汚泥のみを埋めたりしないことである。3.好気性ごみ層における水中BOD除去能力の実験的検討(8)実験した廃棄物・砕石層では、好気性微生物反応が起こっており、しかも酸素消費速度はTOC浄化速度にほぼ等しい。(9)長期的な実験では、焼却灰層および混合ごみ層では、水やガスの流れが悪くなった。(10)酸素消費速度R(BOD除去速度)と酸素ガス濃度Pの関係は、モノ-式で表現することができた。好気的廃棄物・砕石層のBOD除去能力はかなり高いと考えてよい。(11)アンモニア性窒素の酸化反応速度は小さく、有機物中の炭素の酸化反応速度に比べて僅かであった。4.底部集排水管近傍におけるBOD浄化能力の評価(12)好気性ゾ-ンの厚さは大略、焼却灰層で0.5m、不燃ごみ層で2m、混合ごみ層で0.2mであり、好気性混合ごみ層の持つ浸出水中BOD除去能が著しく小さく評価された。(13)粗い試算では、焼却灰や不燃ごみ層では、数千mg/LのBOD低下が期待できるのに対して、混合ごみ層では、数百mg/LのBOD低下しか期待できない。(14)集排水管の周りの砕石層では12mの好気性ゾ-ンが期待でき、しかもその部分では不燃ごみ層ないしそれ以上のBOD除去能が期待できる。(15)このような計算から、準好気性埋立地における浸出水の安定化、特にBOD濃度の早期低下の機構の一つは、浸出水集排水管近傍の好気性ゾ-ンにおけるBOD浄化反応である。

(15)このような計算から、準好気性埋立地における浸出水の安定化、特にBOD濃度の早期低下の機構の一つは、浸出水集排水管近傍の好気性ゾ-ンにおけるBOD浄化反応である。1)集排水管近傍のごみ層の酸素消費速度及び間隙構造測定実験について焼却灰、不燃ごみ、混合ごみカラムを作り、これを好気性状態に維持することで各々のごみ層の集排水管近傍の好気性ゾ-ンの酸素消費速度R_<02>(浸出水中BOD除去速度)を、酸素分圧P_<02>を変えながら測定した。その結果、R_<02>がP_<02>の関数でしかもmonod型の速度式で表現できることが分かった。単位ごみ層容積当りの最大R_<02>は標準活性汚泥法のBOD容積負荷に相当し、好気性ごみゾ-ンの持つBOD浄化能力は相当に大きいことが分かった。このことが準好気性埋立構造埋立地における浸出水早期安定化の根拠であることが示唆された。また、砕石層のR_<02>は、他のごみ層のそれに匹敵することが分かり、集排水管近傍における浸出水中BOD除去の解析において砕石層の効果を無視できないことが分かった。2)湿潤ごみの好気性分解反応速度の定式化コンポスト反応を解析するためのパラメ-タ-は多く、実験デ-タからのみでは十分に解析できない。そのためには、好気性微生物の増殖率や死滅係数などの定数を他の研究から集める必要があるが、まだ十分ではない。3)埋立地内の管路網での空気流動の理論的解析1.5m程度の管径の集排水管を使うと、少しの内部温度の上昇で1m/s程度の空気流速が得られることが理論的に分かった。この流速を低下させるもっとも大きな因子の一つは、管内の詰まりであることが分かった。また、管網の計算では少しの管路条件の変更で空気の流動状況が大きく変わるが、流入する空気量には大差のないことなどが分かった。次年度は、個々の課題を進めると共に、3つの課題を総合する試みを行い、準好気性埋立地の浸出水集排水管の設計について具体的な提案を行いたい。昨年度に続いて、浸出水集排水管近傍の好気性廃棄物層・砕石層における、好気性微生物による水溶性有機物の分解実験を継続した。今年度の実験でも、前年度と同様に廃棄物層の酸素消費速度(BOD除去速度)と層内酸素ガス濃度の関係をモノ-式で表現することの検討を行い(つまり長期的な酸素消費特性の変化を追求した)、さらに汚水量を変化させることによって酸素消費速度に対する水量の影響を求めた。今回の継続実験では焼却灰層は酸化鉄の生成のために、通水が因難となった。また、混合ごみ層でも層内の水分滞留量が多く、層内への空気供給が不安定となった。実験によって得られた主な結果は次の通りである。(1)モデル解析により層内のガスの流れを解析した。層内のガスは拡散により相当に混合が激しい状態にあることが分かった。(2)人工汚水中のNaCl濃度を変えてトレ-サ応答を行い、層内の滞水量を測定した。さらに、層内の水流れの混合が激しいことも分かった。(3)実験層内では、好気性微生物反応が起こっており、さらに酸素消費速度をTOC(BOD)除去速度の代用として使えることが分かった。このことは前年度の成果と同じである。(4)前年度と同様にモノ-式(R_1=R_1^<max>×P/(K_0+P)ここでR_1:酸素吸収速度、R_1^<max>:最大酸素吸収速度、P:層内酸素分圧、Ko:飽和定数)で表現することができた。また、微生物の酸素吸収がガス中の酸素濃度にきわめてよく対応することが分かった。(5)得られたモノ-式のパラメ-タ値は前年度と比較して、R_1^<max>には大きな変化はなかったのに対して、Koは非常に小さくなり、層内の微生物が低酸素環境に馴致されたと思われる。特に砕石層でBOD除去能力が高いことは浸出水集排水管近傍のBOD除去能力を安定的に確保する上で重要である。(6)水量の増加と共に、R_1^<max>は増加していくが、TOC除去率は低下する傾向にあった。
自然言語における文法的機能の表示を支配する原理の研究

文法的機能の表示は、任意の言語で作られるあらゆる文に対応する事態において実現されなければならず、機能をできるだけ普遍性を失わない形で事態表示に組み込むことは、言語表出と言語理解の双方を適切に処理することを目的とする本来の言語研究において不可欠の手段である。本研究では、コーカサス諸語、ツングース諸語、ウラル諸語、ゲルマン諸語そして日本語という、十分に多様な言語資料を分析することによって、自然言語一般において文法的機能がいかなる方法によって表示されるのかを詳細に検討することができた。他の言語に比べて大きな数の機能形態素が述語に付加されることにより、述語の表示する事態がより限定された形になるコーカサス諸語の分析成果は、従来それほど研究の対象とはなっていなかったこのタイプの言語が示す文法的特徴をも含めた形で、事態表示をより一般化することに貢献した。名詞の意味的機能を表示する手段が、世界の諸言語の中でも際だって豊富なウラル諸語の分析は、離散的な性質をもっと考えられる意味役割の普遍的な設定を可能にするものである。名詞がもつもう一つ重要な性質である定性を表示する冠詞の機能は、冠詞の有無に関わらず、事態の成分としての個体や事態の集合の性質を普遍的に表示するために欠くべからざる視点を提供する。この点で、冠詞をもつ言語であるゲルマン語の分析は、研究対象となっている他の言語に冠詞が見られないだけに、名詞の意味的性質をより正確に表示すると同時に、冠詞のもつ統語的性質をも明らかにした。ツングース諸語と日本語の分析は、個々の機能形態素が一意的に文法的機能を表示するという特質をもつ言語であるため、事態の成分にいかなる意味的・文法的特徴を与えるのが適切かに関して、すぐれて基本的な知見をもたらすものであった。自然言語の文法的機能を表示する範躊として最も重要なのは名詞と動詞である。名詞が表示する文法機能に関しては、言語普遍的な意味成分としての意味役割の表示を担う格形式が、文を構成する成分および文の表示する事態との関係において、どのようなメカニズムでいかなる意味役割に対応するかを解明することが主要な課題となる。この点において、佐久間が、フィンランド語の主格と属格の使用と、文形式およびその意味との間に密接な関連性があることを指摘した。また名詞は、その表示する事物の性質によって文法的振る舞いに変化を来すことがあるが、田村は、ツングース諸語の名詞が、その表示する事物の定性(definiteness)の有無によって形態論的に異なった特徴を示すことを示した。この内容は、本研究グループが主要なメンバーでもある東海言語学研究会およびボンで開催された第1回満州ツングース語学会で発表された。動詞に関しては、櫻井がゲルマン諸語およびロマンス諸語において、完了時制が複合形式として形態的に固定化していく過程を理論的に説明したし、柳沢は、コーカサス諸語に属するアブハズ語の動詞形態論を、類型論的立場から記述することを試みている。名詞と動詞の機能的特徴の解明は、文を構成するこれらの範躊に属する語または形態素を配列する個別言語ごとの規則を説明することをも可能にすると考えられる。町田は、言語の類型論的特徴が、文を構成する形態素配列規則に大きく関与することを実証することを試みたし、この実証の過程を数量的に保証する手段として、形態素列が表示する事態の個数を表示するための理論的基礎を提供した。文が表示する事態の中で主要な役割を果たす名詞と動詞に付加されて、これらの品詞に属する単語が表示する内容の文法的な性質を表す形態素に関する研究が今年度の主要課題となった。

佐久間は、世界の諸言語の中でも際だって多様な格形式をもつフィンランド語において、これらの格形式が基本的にいかなる機能を示すのかを研究し、文中において状況補語的に使用される構文中での格形式の選択が、その基本的な機能によって説明されることを論証した。柳沢は、動詞語幹に種々の文法的機能をもつ形態素が付加するという抱合語的特徴をもつアブハズ語の動詞句構造が決定される機構の解明を試みた。この研究成果は、本研究グループが主要なメンバーである東海言語学研究会において発表されている。また柳沢は、動詞が表示する事態の性質のうちで、従来より大きな問題となっている他動性に関して、印欧語を題材としながら一般的な特徴を解明するための試みを続けている。文法的機能の表示は、内容語に付加される形態素だけではなく、特に孤立語的な特徴をもつ言語においては、形態素配列の順序によっても行われる。町田は、この形態素配列の規則が、文の表示する事態の理解を最も効果的に実現するような方法で決定されるのだということを、理解の過程において順次構成されていく形態素列の表示する内容の限定性を数値的にとらえるという観点から論証した。本年度は3年間の研究の成果を最終的にとりまとめた。文法的機能の表示は、任意の言語で作られるあらゆる文に対応する事態において実現されなければならず、機能をできるだけ普遍性を失わない形で事態表示に組み込むことは、言語表出と言語理解の双方を適切に処理することを目的とする本来の言語研究において不可欠の手段である。本研究では、コーカサス諸語ツングース諸語、ウラル諸語、ゲルマン諸語そして日本語という、十分に多様な言語資料を分析することによって、自然言語一般において文法的機能がいかなる方法によって表示されるのかを詳細に検討することができた。他の言語に比べて大きな数の機能形態素が述語に付加されることにより、述語の表示する事態がより限定された形になるコーカサス諸語の分析成果は、従来それほど研究の対象とはなっていなかったこのタイプの言語が示す文法的特徴をも含めた形で、事態表示をより一般化することに貢献した。名詞の意味的機能を表示する手段が、世界の諸言語の中でも際だって豊富なウラル諸語の分析は、離散的な性質をもつと考えられる意味役割の普遍的な設定を可能にするものである。名詞がもつもう一つ重要な性質である定性を表示する冠詞の機能は、冠詞の有無に関わらず、事態の成分としての個体や事態の集合の性質を普遍的に表示するために欠くべからざる視点を提供する。この点で、冠詞をもつ言語であるゲルマン語の分析は、研究対象となっている他の言語に冠詞が見られないだけに、名詞の意味的性質をより正確に表示すると同時に、冠詞のもつ統語的性質をも明らかにした。ツングース諸語と日本語の分析は、個々の機能形態素が一意的に文法的機能を表示するという特質をもつ言語であるため、事態の成分にいかなる意味的・文法的特徴を与えるのが適切かに関して、すぐれて基本的な知見をもたらすものであった。
胃粘膜下層浸潤癌に対する内視鏡治療後の病理組織学的判定方法の確立に関する研究

早期胃癌に対して行われた内視鏡治療後の追加手術の適応は治療後の病理組織診断によって決定されるが,特に粘膜下層(SM)浸潤癌の病理組織学的判定を標準化・均てん化することは喫緊の課題となっている.本研究で得られた成果として胃SM浸潤癌では1)粘膜筋板の形状が構造保持型,不連続・構造不明瞭型,完全断裂型の3つに分類することが可能であった.2)粘膜筋板の形状により肉眼型,浸潤距離,SM浸潤部主組織型,粘液形質,脈管侵襲,リンパ節転移の有無について臨床病理学的特徴が明らかとなった.3)組織標本をバーチャルスライド化した場合でも組織学的判定は光学顕微鏡下での観察と同等であった.胃粘膜下層(SM)浸潤癌について,胃癌の内視鏡的切除の適応を考える上で最も重要な組織学的判定方法における問題点を抽出した.第14版胃癌取扱い規約では,SM浸潤癌の診断の際に粘膜筋板下縁からの実測値の測定が必要となるが,粘膜筋板が不明瞭の定義が明確ではなく,かつ不明瞭な場合の仮想線の引き方に関する基準がないことが問題となっている.平成25年度は,外科的切除された胃SM浸潤癌68例について検討し,免疫組織化学のdesmin染色を用いることにより粘膜筋板の形状が構造保持型,不連続・構造不明瞭型,完全断裂型の3つに分類できることを明らかにした.さらに,粘膜筋板の形状別に臨床病理学的検討を行ったところ,構造保持型では肉眼型に陥凹型が多く腫瘍径が大きい傾向がみられ,完全断裂型の肉眼型には混合型が多い傾向がみられた.SM浸潤距離は不連続・構造不明瞭型と完全断裂型で有意に大きく,SM浸潤部主組織型は完全断裂型において高分化型管状腺癌が少なく,組織混在率が高い傾向があった.粘液形質は不連続・構造不明瞭型と比較し完全断裂型で腸型の粘液形質を有する傾向が認められ,有意に胃型が少なかった.また,脈管侵襲は完全断裂型に有意に多く,リンパ節転移も他の2型と比較し多い傾向を認めた.胃癌内視鏡治療後の追加外科手術の適応は,病理組織学的に組織型,脈管侵襲の有無,断端を評価するとともに粘膜下層への浸潤距離も重要な評価項目となる.粘膜筋板の形状によっていくつかの臨床病理学的な特徴を認めることが本研究で明らかとなったことから,浸潤距離の計測に粘膜筋板の形状を加味する必要性が示され,客観的でより正確なSM浸潤距離の評価につながるものと考えられた.初年度の研究において,胃粘膜下層(SM)浸潤癌においては粘膜筋板の形状によって臨床病理学的特徴が異なることが明らかとなり,浸潤距離の計測に粘膜筋板の形状を加味する必要性が示された.平成26年度はさらに胃SM浸潤癌の症例数の上積みと免疫組織学的な粘液形質分類や内視鏡的肉眼型などの検討項目を増やし,現在その解析を行っている.現時点では,特に粘膜筋板の構造保持型と完全断裂型において浸潤幅,組織型混在の程度,脈管侵襲の有無などで有意な差を認めた.これは早期胃癌に行われた内視鏡治療の病理組織診断において,粘膜筋板の形状を加味して評価することで,胃SM浸潤癌後の外科的追加切除(手術)の必要な転移や再発のリスクがある症例をより厳密に抽出できる可能性を示している.さらに,初年度に用いた胃SM浸潤癌68例の組織標本をバーチャルスライド化し,2名の病理専門医がブラインドで病理組織学的項目について評価したところ,光学顕微鏡下における評価との整合性が得られた.すなわちバーチャルスライドにより可視化することで透明性が確保され,上記データの客観性がより明確となり,多施設間における検討も可能であることが示された.今後は本研究で使用している組織標本について全てバーチャルスライド化する予定である.胃粘膜下層(SM)浸潤癌は粘膜筋板の形状によって臨床病理学的特徴が異なり,浸潤距離の計測に粘膜筋板の形状を加味する必要性が示された.平成26年度はさらに症例数を82例まで増やし免疫組織学的な粘液形質分類や内視鏡的像との関連を検討したところ,粘膜筋板の構造保持型と完全断裂型において浸潤幅,組織型混在の程度,脈管侵襲の有無,内視鏡的肉眼分類において有意な差を認めた.上記の検討に使用した組織標本を全てバーチャルスライド化し,光学顕微鏡下で得られる組織評価との整合性を確認し,組織画像データを含めたデータベース化を終了した.しかし,研究施設におけるICT基盤整備の遅れにより他施設との判定基準の均てん化についての検討は今後行う予定である.胃SM浸潤癌の病理組織学的評価で粘膜筋板を3型に分類することは臨床病理学的に意義があることが判明した.また,組織標本をバーチャルスライド化した場合でも光学顕微鏡下での観察と同等の結果が得られ,今後,評価方法を均てん化する際に役立つものと考えられる.上記に関して一定の結果が得られており,研究はおおむね順調に進展した.早期胃癌に対して行われた内視鏡治療後の追加手術の適応は治療後の病理組織診断によって決定されるが,特に粘膜下層(SM)浸潤癌の病理組織学的判定を標準化・均てん化することは喫緊の課題となっている.本研究で得られた成果として胃SM浸潤癌では1)粘膜筋板の形状が構造保持型,不連続・構造不明瞭型,完全断裂型の3つに分類することが可能であった.

2)粘膜筋板の形状により肉眼型,浸潤距離,SM浸潤部主組織型,粘液形質,脈管侵襲,リンパ節転移の有無について臨床病理学的特徴が明らかとなった.3)組織標本をバーチャルスライド化した場合でも組織学的判定は光学顕微鏡下での観察と同等であった.胃SM浸潤癌の病理組織学的評価で粘膜筋板を3型に分類することは臨床病理学的に意義があることが判明し,研究の進展により新たな知見が得られている.また,組織標本をバーチャルスライド化した場合でも光学顕微鏡下での観察と同等の結果が得られ,今後,評価方法を均てん化する際に役立つものと考えられる.上記に関して一定の結果が得られており,おおむね順調に進展している.医歯薬学内視鏡的な早期胃癌の深達度診断は胃粘膜の表面構造だけでなく,粘膜,粘膜筋板,粘膜下層がどのように変化しているかを推測することが重要である.胃SM浸潤癌の粘膜筋板の形状を3型に分類しそれぞれの特徴を明らかにすることは,内視鏡治療の適応を考える上で有用と考えられ,内視鏡所見と病理所見の対比についても今後検討していく予定である.なお,バーチャルスライド化したものを他施設と共有し将来の判定基準の均てん化につなげるためにはICTの整備が必要であるが,研究施設におけるICT基盤の整備が遅れており,多施設間における検討をどのように進めるかについては今後の課題である.胃SM浸潤癌の病理組織学的評価における問題点として粘膜筋板の形状が抽出され,さらに3型に分類した粘膜筋板の形状によって臨床病理学的特徴が明らかとなった.これはほぼ当初の計画に沿って進展していると考えられる.また,当初の予定よりも早く研究成果を学会発表することができ,研究の進捗が順調であることを示しているものと思われる.研究は順調に進展しており学会発表は初年度に行うことができたため,当初の予定に免疫組織学的な検討を加え,より詳細な検討を行っている.平成26年度は,平成25年度の結果をもとに,対象症例数を約100例程度まで広げるとともに病理組織学的な検討項目を増やし,粘膜筋板の形状ごとの臨床病理学的特徴,浸潤距離との関連を評価する.さらに,リンパ節転移陽性群(追加切除が必要な群)と陰性群(追加切除が不必要な群)との間で臨床病理学的な相違を導き,粘膜筋板の形状を加味した胃SM浸潤癌の評価方法を確立することを目標とする.また,本研究で作製した病理組織標本は全てスライドガラスデジタル化装置によりバーチャルスライド化し,ここで特に客観性,透明性を発揮すると思われる形態計測,免疫組織化学の判定についてデータを収集し,光学顕微鏡下における評価とバーチャルスライドを使用した評価との整合性を確認する.上記の研究成果は国内の関連学会で発表するとともに,論文投稿を行う予定である.免疫組織学的な手法を加えるとともに研究対象を広げ,さらにバーチャルスライド化による病理組織学的評価方法の均てん化を図る.また,最終結果が出た時点で学会発表や論文投稿を行う計画である.
価値観に関する質的・量的研究

本年度は、昨年度に引き続き、岡山県高梁市において「高梁市の住民意識調査」を実施した。調査の概要は以下のとおりである。調査対象高梁市に居住する成人男女抽出法二段階抽出法電話帳から世帯を抽出(間隔抽出法)世帯から「ネクストバースデイメソッド」で個人を抽出調査法郵送法による自記式調査法調査時期2000年12月サンプル数1000有効回収数500(回収率50.0%)この調査は、イングルハートの世界価値観調査に基づいて、選択回答法(制限回答法)と自由回答法の関係を捉えることを目的としている。自由回答項目はすべてテキスト入力し、コーディングを行った。当初の計画よりも調査実施時期が遅くなったのは、岡山県知事選、高梁市長選との重複を避けたためである。また、調査対象を少なくしたのは、調査費用、特にテキスト入力にかかる費用が大きな負担となったためである。また、昨年度行った学生の自由回答法によるデータ収集を今年度も行い、すべての回答をテキスト化し、コーディングを行った。これは、吉備国際大学の学生(社会学部国際社会学科・産業社会学科2年次以上「社会調査法」受講者)を対象とし、「高梁市に関する問題点」を中心として回答させる「指示的回答法」による自由回答データである。さらに、上記「高梁市における住民意識に関する調査」の自由回答データと比較した。「高梁市の住民意識調査」「学生調査」ともに、コーディングには富山大学佐藤裕氏によるAUTOCODE for Windowsを用いた。本年度は、来年度に計画している「岡山県高梁市における住民意識調査」を実施するべく調査票作成の準備作業を行なった。まず、高梁市、地域社会、社会調査法(自由回答法)、情報環境、価値観に関する文献の収集とその内容の整理を行なった。次に、過去5年間の世論調査年鑑の価値観に関する項目を抜き出し、京大型カードを用い、KJ法的に整理した。さらに、過去5年間の新聞の投書欄(「朝日新聞」縮刷版にて投稿者の住所が岡山県と判明するもののみ)をとりあげ、これもKJ法的に整理した。以上をもとに、本調査の前の予備調査で使用するための調査票を作成した。これを吉備国際大学の学生(社会学部国際社会学科・産業社会学科2年次以上「社会調査法」受講者)に「高梁市に関する問題点」を中心に自由回答法によってで回答してもらった。回答はデータ入力し、テキスト化し、KJ法的に整理した。その結果、学生は地方都市である高梁市に関して少なからず不満を抱いている反面、多くのことがらを期待していることが明らかになった。今後は、本調査を行なうべく調査票(質問紙)を精緻化して行く予定である。また、インターネットで広く高梁市民の意見を収集するべく自前のサーバーを構築する準備を行なった。まず、インターネットサーバーを構築するためのソフトウェアWebSTARを購入し、ウェブサーバーを構築した。さらには、意見をデータベース化するためのソフトウェアFileMakerProを購入し、インターネットのウェブサーバーを用いた自由回答法による意見の収集を開始した。
極めて簡便な神経染色法を応用した高校生物実験パッケージの開発と実践的検証

若者の理科離れが指摘されて久しいが、理科、さらには科学への興味を喚起するためには、どのような言葉を尽くすよりも、実際の実験を通して科学現象の不思議さ、精巧さ、美しさを児童、生徒、学生に体験してもらうことが重要である。そこで高校の理科室で実施可能な神経染色実験パッケージを開発した。これはNADPHジアホラーゼ染色法を用いたもので、低コストで安全に、動物から標本を採取して2時間以内に染色し、写真を撮影できる。解説スライドを含めた本パッケージは理科教育に大いに資するものであると考える。そこで高校の理科室で実施可能な神経染色実験パッケージの開発を試みた。以下を目標に掲げ、動物種、臓器種、試料作成法、染色条件などを検討した。「2時間以内で、動物から標本を採取して染色し写真を撮影すること」「特殊で高価な器機(クライオスタットなど)を使用しないこと」「特殊な動物でなく市中で入手可能な動物を用いること」「再現性が高い明瞭な結果が得られること(失敗しないこと)」「低コストで安全に行えること」。染色には以下の特長を持つ『NADPHジアホラーゼ染色法』を用いた。「染色手順が簡素でかつ染色に要する時間が短い」「すべての神経でなく一酸化窒素(NO)作動性神経を特異的に染める」「ゴルジ染色のように明瞭に神経細胞体と突起を描出する」「高価な試薬や観察機器を必要とせず低コストである」。昨年度および本年度の基礎的な検討から、標本は「ホルマリン固定したヒメダカの消化管全層標本」とし、良好な消化管神経系のNO神経の染色を得た。高大連携講義の際に大学の生物実習室において高校2年生を対象として実効性検証を行った。講義を含めて2時間半で染色実験を行うことができ、生徒たちはスマートフォンで顕微鏡写真を撮影することができた。これらの結果は第118回日本解剖学会総会で報告した。前年度までに作成した「メダカの神経染色実験」のプロトコールにさらに工夫を加えて、試薬や器具のキット化を進めた。染色反応に用いる容器を最小限の容量のものを用いたり、染色ステップの簡素化などを図って、器具や溶液のボリュームを徹底して低下させた。また安全に配慮して試薬の濃度を可能な限り下げたり、ピペット操作などを使わずに試薬を混合する方法などを工夫した。その結果、30名程度の実験を行うために必要なすべての試薬、器具を大型のスーツケース2個程度にまとめ、安全に大学外で実験を行えるキットとした。実験の原理や方法の解説のみならず、顕微鏡での生物観察についてや、動物の神経系についてというような周辺知識を含んだミニ講義と実際の染色実験のパックとして、大学外で実際に中学校2校、高校1校で実験を行った。すべての学校で3時間以内の取り組みでメダカの神経を染色し観察することに成功した。これらの実践により中学、高校の理科教員の興味を集めることとなり、理科教員を対象とした本実験のセミナーの開催を予定している。これによりそれぞれの理科教員が自らこの実験をそれぞれの学校で行って生徒を指導できるようになることを目指している。またセミナーを通じて、本実験をより良くするため意見を集めたり、他の新たな中学、高校の理科室で実施可能な理科実験プロトコールの開発に繋げたい。本研究の目的である高校理科室での神経染色実験の確立に向けて『NADPHジアホラーゼ染色法の改変』を以下の項目につき行った。【動物種の選定】犠牲死に対する生徒の心理的負担が少ないと考えられる小型魚類、及び食用に供されている食肉を実験標本とすることを試みた。市中の小売店で入手した冷蔵のイワシ、アユおよびウシの腸管を用いて標本を作製した。【標本の固定方法】手始めに原法のホルマリン固定を試み良好な標本を得た。その他のアルコールを用いた固定方法等については継続して検討中である。【標本薄切法の改変】原法では標本は主にミクロトームを用いた薄切切片を用いている。しかしながら高校理科室ではミクロトームの利用は困難であるので、理科室で作成可能な薄片標本として、消化管筋層の剥離標本の簡易作成法の確立を試みた。固定後の消化管を先細ピンセットで割き標本としたところ、いずれの動物種においても顕微鏡下で良好に観察することが可能な標本を得た。これら固定・薄切の一連の手技は特殊な器具を要さず簡便なものとすることができた。【染色法の改変】原法では発色試薬にNBT(nitro blue tetrazolium)を用い、リン酸バッファー中で約1時間の反応を行っている。

上記の動物種および標本作製法のもと作製した切片を用い検討したところ、原法での染色に問題が無いことを確認した。これらの実験は滋賀医大解剖学講座の実験室で医学部学生の協力のもとで行い、高校性レベルの初学者であっても充分実施可能であることを確認した。初年度の検討で染色実験そのものは高校理科室で実施可能であることが証明できた。理科室で可能な神経染色実験のプロトコールを完成させ、実際に高校生の手で染色を試み良好な結果を得た。2時間余りという短時間で講義を含めて実験を遂行でき、当初の計画を上回る簡便な方法とすることができた。NADPHジアホラーゼ法を高校の理科室での実験に応用するに際しての最大の問題であった「動物種」「薄切標本作製法」について解決を得た。実験プロトコールに沿った試薬や道具を完全にキット化し実習マニュアルを作成することで、専門家の臨席なしに実験を遂行できるようにする。そのためにいくつかの高校の理科室で試行を繰り返す。また教育効果を検証するため、現場の教師や生徒からの意見などを収集し分析する。実際の高校の理科室での実験を試み、問題点の洗い出しや教育効果について検討を行う。さらに標本、試薬、参考資料をキット化し、実験パッケージとしてまとめる。パッケージの一環として動画資料の作成を初年度に予定していたが未着手となり「次年度使用額」欄の予算が次年度使用となった。実験試薬、道具のキット化や冷凍輸送などのコストの検討するため。また高校理科室での現場へ出向いての試行に関わる経費として研究費を用いる。実際の高校理科室での実験実施に必要な試薬等の購入、実施に関わる旅費や助手への謝金、動画資料を含む実験パッケージの作製に対して経費を用いる。
Voxel-Based morphometryによる歯科心身症患者の脳形態変化

3D-MRIを応用し各個人の脳画像を標準脳座標上に変換、空間正規化することで全脳の形態的解析ができる。前年度に4例症例が集積追加され、合計22例(平均年齢63.3歳、男性3例女性19例)に対しVBMを行った。116か所のROIにおいて統計学的に分析したところ、標準偏差で平均で2.0以上委縮している箇所はなかった。しかしながらRt-Brodmann area34において1.62、左側の視床において1.76と高い委縮傾向を示し、それぞれ22例中8例は2.0以上の委縮を認めた。Brodmann area34は扁桃体の皮質内側核群に相当する。顎顔面領域の主な痛覚情報は三叉神経節を経由し橋に入り、延髄へ入力される.延髄では三叉神経脊髄路核の特に尾側亜核と呼ばれる神経核と第一・第二頸髄の後角表層に痛覚情報が入力されている。この部位で一次ニューロンから二次ニューロンに情報伝達されるが、二次ニューロンは脊髄視床路に軸索を伸ばし毛帯交叉で反対側の前索をさらに上行し視床髄板内側核群などに投射しているもの(内側系:medial system)と、毛帯交叉で反対側の外側端を上行し視床後内腹側核群に投射しているもの(外側系:lateral system)の二系統の経路が存在するといわれている。このことを考慮すると歯科心身症における痛みが、脳委縮に関連する可能性が示唆された。この2領域においては心理テストおよびVASによる疼痛スコアと明らかな相関はみられなかった。今後、さらなる症例の集積を行い再検討する予定である。Voxel-Based morphometry(以下VBM)はAshuburnerらにより脳形態変化を調べる方法として開発された。VBMは脳形態において近年注目されている方法であり、3D-MRIを応用し各個人の脳画像を標準脳座標上に変換、空間正規化することで全脳の形態的解析ができる。脳の形状変化を統計学的に調べ客観的に検出することができるため、正常加齢変化に伴う脳形態変化だけではなく統合失調症や認知症などの脳疾患にも応用されている。最近になり、線維筋痛症、慢性腰痛などさまざまな慢性疼痛疾患を対象としたVBMを用いた脳形態解析が行われており、前部帯状回、前頭前野、扁桃体、島などの領域において灰白質体積低下が報告されている。本研究では恐怖や不安など、負の情動の処理において中心的役割を担う神経核で、慢性疼痛患者に大きな影響があると考えられる扁桃体に着目した。今回われわれは、機能的身体症候群の一つである舌痛症、非定型顔面痛および特発性歯痛のいわゆる歯科心身症にVBMを施行し扁桃体の形態変化を解析すると他のFSSでみられたような脳形態変化がみられ、さらに質問票を用いた疼痛評価スコアが扁桃体の灰白質体積変化と相関するのではないかと考えた。このような目的において、7症例が集積できた。なお、初年度目標は適切なデータ解析方法の確立および症例集積としているため、統計分析は行っていない。本研究の研究期間は3年であるが、1年目は本人で撮像したMRIデータを解析ソフトにうまく適合させる必要があった。そのため、平成28年5月にVoxel-Based morphometry研究を先行して行っている滋賀医科大学神経難病センター(MR医学研究分野)にて行われたセミナーに参加した。セミナーでは本課題の遂行に必要な情報を収集でき、解析ソフトを入手することができた。しかしその後、バージョンアップされたソフトに再適合させることに時間がかかったため、計画していた症例数を集積することができなかった。脳の形状変化とくに委縮の程度を統計学的に調べ客観的に検出することができるため、正常加齢変化に伴う脳形態変化だけではなく統合失調症や認知症などの脳疾患にも応用されている。本研究では恐怖や不安など、負の情動の処理において中心的役割を担う神経核で、慢性疼痛患者に大きな影響があると考えられる扁桃体に着目している。しかしながら本研究で行っているVBMは脳の委縮を網羅的に観察することが可能であるため、当初では予見していなかった部位での委縮も観察される可能性がある。研究当初にみられた解析ソフトと当院MRI画像との適応は問題なくなったが、症例の集積に苦慮している。しかしながら、現時点で18症例が集積され簡易的な統計分析では痛みに関与する部位での有意な脳委縮がみられている。

しかしながらRt-Brodmann area34において1.62、左側の視床において1.76と高い委縮傾向を示し、それぞれ22例中8例は2.0以上の委縮を認めた。Brodmann area34は扁桃体の皮質内側核群に相当する。顎顔面領域の主な痛覚情報は三叉神経節を経由し橋に入り、延髄へ入力される.延髄では三叉神経脊髄路核の特に尾側亜核と呼ばれる神経核と第一・第二頸髄の後角表層に痛覚情報が入力されている。この部位で一次ニューロンから二次ニューロンに情報伝達されるが、二次ニューロンは脊髄視床路に軸索を伸ばし毛帯交叉で反対側の前索をさらに上行し視床髄板内側核群などに投射しているもの(内側系:medial system)と、毛帯交叉で反対側の外側端を上行し視床後内腹側核群に投射しているもの(外側系:lateral system)の二系統の経路が存在するといわれている。このことを考慮すると歯科心身症における痛みが、脳委縮に関連する可能性が示唆された。この2領域においては心理テストおよびVASによる疼痛スコアと明らかな相関はみられなかった。今後、さらなる症例の集積を行い再検討する予定である。本研究の目標症例数は30例であるが、現在7症例のみである。29年度は医局員にも協力を図り症例の集積に努める。また、本年度も滋賀医科大学にて本研究に関するセミナーが開催されるため、参加しさらなる情報の収集を行う予定である。本研究の目標症例数は30例であるが、現在18症例である。本年度はよりいっそう医局員にも協力を図り症例の集積に努める。初年度にデータ解析のためのパソコン購入を計上していたが、解析ソフトと当院MRIデータとの適合に時間がかかり、購入できなかったため。本年度までは症例の集積および画像解析方法の習得に従事していたため。次年度は統計学的解析用のパソコン購入を計画しており、また得られた結果については、海外での学会発表および海外雑誌への論文投稿を検討しているため、その渡航費や翻訳・投稿費に使用する予定である。29年度にはパソコンを購入し、学会での発表を行う。
ウエルシュ菌α毒素の毒素活性と酵素活性の関係に対する分子生物学的及び構造学的解析

Co^<2+>及びMg^<2+>との共結晶化に成功し、セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ(Bc-SMase)のX線回析により構造解析した。Co^<2+>と共結晶したBc-SMaseには、唯一のクレフトが存在し、その中央に二個(AサイトとBサイト)のCo^<2+>が結合、そして、Mg^<2+>の共結晶の場合、Aサイトにのみ一個の金属イオンが結合していた。さらに、クレフトから離れた位置に、いずれの場合も、一個の金属イオンが認められた。Aサイトにおいて、金属イオン中心にアミノ酸残基と水分子が正八面体を示し、互いに完全に重なった。一方、Bc-SMaseの金属イオン存在下における酵素活性をカイネティク分析すると、Km、Vmaxは、ほとんど金属イオン間で相違が認められなかった。Co^<2+>との共結晶Bc-SMaseのクレフトにスフィンゴミエリン(SM)をコンピュータ上の計算で挿入すると、AサイトとBサイトのCo^<2+>の間にSMが挿入され、そのリン酸エステルの酸素原子が両金属イオンに接近すること、さらに、その真下に存在する水分子が救核攻撃する位置にあることが判明し、従って、金属イオンがその酸素原子の電子を引っ張り、水分子が救核攻撃すると、リン酸エステルが切れて、セラミドとホスフォリルコリンを生成する反応機構が明らかとなった。次に、Bc-SMaseには、可動性の突き出したβヘアピン構造があり、疎水性のアミノ酸残基が多く存在している事が明らかとなった。このヘアピン構造の先端のアミノ酸残基をアミノ酸置換し、結合と酵素活性を分析すると、いずれも、著しく低下することが判った。さらに、真核細胞のSMaseには存在しないこと、さらに、溶血作用を有する細菌由来SMaseには存在することを考慮すると、SMの脂肪酸側鎖に特異的に結合して酵素活性の基質との結合並びに膜破壊時の膜への結合に重要な役割を演じていると考えられる。従って、α毒素と同様に、SMase活性、溶血活性を有するにも関わらず、三次元構造は、全く異なることが判明した。ウエルシュ菌α毒素による溶血は、スフィンゴミエリン(SM)からスフィンゴシン1-リン酸代謝までの一連のSM代謝系が密接に関連していることを明らかにしてきた。一方、SMは、脂肪酸側鎖の種類によって多くの分子種が存在する事が推察されるので、毒素による溶血とSM分子種との間の関係を検討した。まず、ヒツジ赤血球膜からSM分画を精製し、LC/MA/MSにて18種類のSM分子種を同定した。そこで、その中の主要SM分子種であるパルミトイルSM、リグノセリルSM、そして、ネルボノイルSMをスキンド化赤血球とプレインキュベーション後、溶血を引き起こさない最大量の毒素をその前処理赤血球に作用させた。その結果、ネルボノイルSM前処理血球のみが溶血した。いずれの三種のSM分子種も、同様にセラミド(Cer)までは代謝されたが、ネルボノイルCer分子種のみがスフィンゴシン、そして、スフィンゴシン1-リン酸へ代謝された。従って、毒素によるネルボノイルSM代謝が溶血に密接に関係していることが明らかとなった。次に、α毒素のSMase活性が溶血作用など生物活性に重要な役割を演じていることから、セレウス菌

SMase(Bc-SMase)の溶血とSM代謝系との関連性をα毒素の場合と同様の方法にて解析した。その結果、α毒素は、百日咳毒素感受性Gタンパクを介して内因性SMaseを活性化してSM代謝系を亢進して溶血作用を発現するが、Bc-SMaseは、その酵素自体の酵素活性によって血球膜内のSMをCerに分解して溶血を発現することが判明した。この相違を解析するため、両者の三次元構造の比較を試みた。α毒素の三次元構造は、既に、明らかにされているが、Bc-SMaseの構造は、解析されていないので、まず、Bc-SMaseの大量産生系を確立後、結晶化し、そして、解析した。現在、Bc-SMaseの構造の90%以上の解析が完了している。来年度には、解析が終了し、α毒素とBc-SMaseの比較が出来ると確信している。Co^<2+>及びMg^<2+>との共結晶化に成功し、セレウス菌スフィンゴミエリナーゼ(Bc-SMase)のX線回析により構造解析した。Co^<2+>と共結晶したBc-SMaseには、唯一のクレフトが存在し、その中央に二個(AサイトとBサイト)のCo^<2+>が結合、そして、Mg^<2+>の共結晶の場合、Aサイトにのみ一個の金属イオンが結合していた。さらに、クレフトから離れた位置に、いずれの場合も、一個の金属イオンが認められた。Aサイトにおいて、金属イオン中心にアミノ酸残基と水分子が正八面体を示し、互いに完全に重なった。一方、Bc-SMaseの金属イオン存在下における酵素活性をカイネティク分析すると、Km、Vmaxは、ほとんど金属イオン間で相違が認められなかった。Co^<2+>との共結晶Bc-SMaseのクレフトにスフィンゴミエリン(SM)をコンピュータ上の計算で挿入すると、AサイトとBサイトのCo^<2+>の間にSMが挿入され、そのリン酸エステルの酸素原子が両金属イオンに接近すること、さらに、その真下に存在する水分子が救核攻撃する位置にあることが判明し、従って、金属イオンがその酸素原子の電子を引っ張り、水分子が救核攻撃すると、リン酸エステルが切れて、セラミドとホスフォリルコリンを生成する反応機構が明らかとなった。次に、Bc-SMaseには、可動性の突き出したβヘアピン構造があり、疎水性のアミノ酸残基が多く存在している事が明らかとなった。このヘアピン構造の先端のアミノ酸残基をアミノ酸置換し、結合と酵素活性を分析すると、いずれも、著しく低下することが判った。さらに、真核細胞のSMaseには存在しないこと、さらに、溶血作用を有する細菌由来SMaseには存在することを考慮すると、SMの脂肪酸側鎖に特異的に結合して酵素活性の基質との結合並びに膜破壊時の膜への結合に重要な役割を演じていると考えられる。従って、α毒素と同様に、SMase活性、溶血活性を有するにも関わらず、三次元構造は、全く異なることが判明した。
薄田泣菫文庫の全容解明に向けての総合的研究―明治・大正文壇の思想的水脈として―

本年度(平成29年度)は8月3031日、10月1314日、1月2627日の3回、メンバー全体が集まっての資料調査を倉敷市で行った。また、上記の期間中には資料調査と並行して、倉敷市文化振興課や薄田泣菫顕彰会さらには本科研費メンバー以外の大学研究者も交えての全体的な会合を持ち、本研究課題における各自の調査研究の報告や今後の研究活動計画の検討といったことを行ってきた(もちろん、それ以外にも本研究メンバー各自が、独自に倉敷市に訪れて調査研究を行なってもいる)。また、その他に本科研費の研究活動の集大成として、上記の倉敷市文化振興課や大学研究者と協力して、『薄田泣菫読本』という著作物を編集刊行した。そして、それに関わる行事として、2019年3月28日に倉敷市文化振興課と共催という形で、シンポジウム(『薄田泣菫を語ろう薄田泣菫・人と文学ー『薄田泣菫読本』刊行記念ー』)を開催し、これまでの本科研費で行なってきた研究に関して、研究者のみならず市民も交えて広く報告する機会を持った。それと同時に、同日、倉敷市の要請により、上記研究成果『薄田泣菫読本』刊行に関する記者会見を催し、本科研費の研究成果をマスコミを通して広く世間に向けて知らしめたことも、活動の一環としてあげられよう(下記「備考」欄参照)。さらに以上のこととは別に、下記にあげるような論文等により、個々のメンバーによる研究成果の公開も行なってきた。本年度(平成28年度)は7月3031日、10月89日、3月2829日の3回、現地倉敷での資料調査とともに、倉敷市文化振興課や薄田泣菫顕彰会も交えての全体的な会合を持ち、本研究課題における各自の調査研究の進捗状況や今後の計画について報告・検討した(もちろん、それ以外にも本研究メンバー各自が独自に調査のため倉敷市に訪れてもいる)。具体的には、倉敷市蔵の薄田泣菫旧蔵資料(以下、泣菫文庫と呼ぶ)の調査研究が本研究の主要目的であるが、特に本年度はまず『倉敷市蔵薄田泣菫宛書簡集』全3巻(倉敷市編、八木書店、2014.32016.3)にも収録されなかった、泣菫文庫の新出書簡資料の調査・整理(目録作り)ということを、その第1の目標として設定していた。それに関しては目録整備も終わり、一定の達成を見たといえる。そして、本年度できれば取り組みたい第2の目標=書簡資料以外の原稿・日記・メモ類の調査研究ということに関しては、とりあえずそれらの資料の確認・写真撮影を終え、研究の基盤を作ったところであり、現在本研究メンバー各自がそれらの資料の検討に取り掛かりつつある状況である。以上のように、本年度は本研究のための基盤づくりを中心に取り組んできた。これ以外にも、次年度に向けた活動として、今後研究成果を公開していくにあたり、最終的にそれらの調査研究の成果を集約的に報告するためのものとして、薄田泣菫に関する資料集か読本のようなものを、倉敷市と協力して発行するという計画を現在協議しているところである。「研究実績の概要」で記したように、本年度(平成28年度)については、本研究の基盤整備期間として当初から位置づけていた。すなわち、1第1の達成目標として泣菫文庫の新出書簡資料の調査・整理、2できれば行いたい第2の目標として、書簡資料以外の原稿・日記・メモ類の調査研究ということを掲げていた。1については上記のように既に目録の整備も終わって順調に進んでおり、2についても資料の確認・写真撮影を終え、現在それらを使って各資料の検討に入っている。つまり、実際に研究基盤の整備は進んでおり、今年度の研究実績は着実に積まれてきたといえる。確かに、本年度は以上のように研究の基盤づくりを中心に行なってきたため、研究成果として公開したものは、基本的には下記の研究論文1本に止まった(それ以外にもホームページ上の報告が若干あるにしろ)。しかし、そもそも本年度の目標の中心は研究に必要な基盤づくりであり、また「研究実績の概要」でも記したように、今後の研究成果の公開方法についても現在計画を立てて話を進めているので、その意味でもおおむね順調に研究は進んでいると判断した。本年度(平成28年度)は9月34日、10月78日、3月1011日の3回、メンバー全体が集まっての資料調査を倉敷市で行った。また、それと並行して、倉敷市文化振興課や薄田泣菫顕彰会さらには本科研費メンバー以外の大学研究者も交えての全体的な会合を持ち、本研究課題における各自の調査研究の報告や、今後の研究計画について検討といったことを行ってきた(もちろん、それ以外にも本研究メンバー各自が、独自に倉敷市に訪れて調査研究を行なってもいる)。特に大きな行事としては、9月3日に上記の倉敷市文化振興課や薄田泣菫顕彰会、さらには本科研費メンバー以外の大学研究者と協力して、シンポジウム(『薄田泣菫宛書簡集の刊行を終えて』)を開き、これまでの倉敷市蔵の薄田泣菫旧蔵資料(以下、泣菫文庫と呼ぶ)の調査と連続する形で、現在行っている本科研費で行っている研究について、広く報告する機会を持った。

また、10月8日には薄田泣菫顕彰会が開いた泣菫忌茶会に本科研費メンバーも出席し、薄田泣菫文庫について、倉敷市長をはじめとした一般市民と語らう機会を設けたことも、本科研費の研究成果の公開の一環としてあげられよう。これ以外にも、下記にあげるように論文や学会発表等、個々のメンバーによる研究成果の公開も行なってきた。本年度(平成29年度)は、前年度(平成28年度)に完成させた薄田泣菫文庫の目録や画像データを利用して、今年度は泣菫文庫の資料解析ー具体的には、そこに含まれる原稿・日記・メモ類の翻刻や注釈、さらには研究的分析を行うことが研究課題であった。日記やメモに関しては個人的なものであるがゆえにどうしても字が読みづらいこともあって、なかなか分析が進まない面もあるが、原稿に関しては既に成果をあげつつある。そして、上記したようにシンポジウム等も開催し、それらの研究成果の公開も、積極的に行ってきた。また、最終年度に向けた活動として、これまでの資料の調査研究の成果を集約的に報告するためのものということで、薄田泣菫に関する資料集か読本のようなものを、倉敷市と協力して発行するという計画を現在協議しているところである。最終年度を見据えて研究成果の公開の仕方を検討し、それを着実に推進しつつあるという意味でも、おおむね順調に研究は進んでいると判断した。本年度(平成29年度)は8月3031日、10月1314日、1月2627日の3回、メンバー全体が集まっての資料調査を倉敷市で行った。また、上記の期間中には資料調査と並行して、倉敷市文化振興課や薄田泣菫顕彰会さらには本科研費メンバー以外の大学研究者も交えての全体的な会合を持ち、本研究課題における各自の調査研究の報告や今後の研究活動計画の検討といったことを行ってきた(もちろん、それ以外にも本研究メンバー各自が、独自に倉敷市に訪れて調査研究を行なってもいる)。また、その他に本科研費の研究活動の集大成として、上記の倉敷市文化振興課や大学研究者と協力して、『薄田泣菫読本』という著作物を編集刊行した。そして、それに関わる行事として、2019年3月28日に倉敷市文化振興課と共催という形で、シンポジウム(『薄田泣菫を語ろう薄田泣菫・人と文学ー『薄田泣菫読本』刊行記念ー』)を開催し、これまでの本科研費で行なってきた研究に関して、研究者のみならず市民も交えて広く報告する機会を持った。それと同時に、同日、倉敷市の要請により、上記研究成果『薄田泣菫読本』刊行に関する記者会見を催し、本科研費の研究成果をマスコミを通して広く世間に向けて知らしめたことも、活動の一環としてあげられよう(下記「備考」欄参照)。さらに以上のこととは別に、下記にあげるような論文等により、個々のメンバーによる研究成果の公開も行なってきた。本年度(平成28年度)の活動を踏まえ、2年目以降は出来上がった研究基盤を利用して研究を深めていきたい。具体的には、既に撮影し終わった写真映像を使って、泣菫文庫に残る原稿や書簡、日記、メモといった資料の分析を行っていきたい。これらの資料は薄田泣菫自身のものだけでなく、芥川龍之介、与謝野鉄幹・晶子、坪内逍遥、有島武郎、武者小路実篤など、著名な作家や文化人のものが多く、特に原稿・書簡・メモ類は泣菫文庫に手つかずのまま残っている。それらの資料はこうした作家・文化人の作品や思想の成立過程が窺える場であり、それらの検討を通じて本研究課題の副題にも掲げるように、明治・大正期文壇の思想的水脈、すなわち泣菫と同年代あるいは後輩にあたる作家・文化人たちとの〈知〉の交流についてあとづけていきたいと考えている。そして、本年度は研究の基盤づくりが中心となったが、だんだんと研究成果の公開のほうへ今後はシフトしていく予定である。
人工受容体を用いた樹状細胞の増幅システムの開発とガン治療への応用

樹状細胞は有能な抗原提示細胞であり、抗原特異的な細胞傷害性T細胞を効率良く活性化できることから、がん治療への応用が期待されている。しかし、樹状細胞を効率良く増幅する手法は未だ確立されていない。そこで本研究では、樹状細胞の源である造血幹細胞においてサイトカインや増殖因子とは全く異なる抗原に応答して増殖シグナルを伝達する人工受容体を発現させ、抗原添加によって造血幹細胞の増幅が可能であることを実証した。樹状細胞を用いた免疫療法は、免疫系の最初の段階である樹状細胞の抗原提示を利用したもので、他の手法より副作用が少なく、広範かつ強いガン免疫誘導ができることが見込まれている。樹状細胞は骨髄の造血前駆細胞であるCD34陽性細胞に由来し、未熟樹状細胞へと分化して外来抗原を取り込んで提示し、成熟樹状細胞となる。従って、ガンの治療プロセスとしてはガン患者本人からCD34陽性細胞を採取して増幅し、必要に応じて未熟樹状細胞に分化させてガン抗原を取り込ませて提示させ、患者体内に戻すことが考えられる。このプロセスの中で、CD34陽性細胞の増幅に関しては、現状では不充分な成果しか挙げられていない。既往の方法としては、Flt3リガンド(FL)、幹細胞因子(SCF)、スロンボポエチン(TPO)、インターロイキン6(IL-6)、IL-3を組み合わせて添加した培地中でのCD34陽性細胞の増幅が報告されているが、数ヶ月程度が細胞増殖・未分化維持の限度であり、未分化維持増殖はある程度達成できても、同時に分化も生じてしまうことが問題点である。従って、天然の受容体とそのリガンドを添加することでの樹状前駆細胞の増幅には限界があると考えられる。そこで、本研究では樹状前駆細胞においてサイトカインや増殖因子とは全く異なる抗原に応答して増殖シグナルを伝達する人工受容体を発現させ、その発現量をコントロールすることで、分化を抑えて未分化維持増殖だけを特異的に長期間達成できるシステムを構築することを目標とした。既往の研究において、IL-6受容体シグナル伝達サブユニットであるgp130、および幹細胞因子受容体c-Kitの細胞外ドメインを抗フルオレセイン(F1)抗体のScFvで置換したキメラ受容体(SCFV-gpl30、ScFv-c-Kit)が、抗原であるF1標識BSA(BSA-F1)依存的な増殖シグナルを伝達することを示した。造血前駆細胞の増幅は複数のサイトカインの添加によって効率よく達成されるため、それぞれのサイトカインに対するキメラ受容体を作製して遺伝子導入することが考えられるが、導入遺伝子の数やサイズが大きくなるとウィルスベクターのパッケージング効率や遺伝子導入効率が下がってしまう。従って本年度はまず、gp130とc-Kitをタンデムに連結したキメラ受容体(ScFv-gp130-c-Kit、ScFv-c-Kit-gp130)を作製し、1つの遺伝子で2つの受容体シグナルを伝達できるかどうかの検証を試みた。各キメラ受容体をIL-3依存性血球細胞株Ba/F3にレトロウィルスによって遺伝子導入後、BSA-Fl存在下で培養した結果、遺伝子導入細胞が選択的に増幅された。選択後の細胞をシグナル伝達解析した結果、STAT5などのシグナル伝達分子が活性化されていることが分かったが、gpl30とc-Kit双方のシグナルが伝達されていることは検証できていないため、マウス骨髄細胞で今後検証していく予定である。また、樹状前駆細胞や造血前駆細胞での増幅効果が単独でも示されているスロンボポエチン受容体c・mplを用いて新たにキメラ受容体を作製し、機能解析を試みた。Ba/F3細胞での増殖アッセイの結果、ScFv-c-mpl発現細胞はBSA-Fl濃度依存的に増殖促進されることが示されたことから、現在はマウス骨髄から取得した造血前駆細胞での増幅効果を検証中である。即往の研究において樹状前駆細胞での増幅効果が単独で示されているc-mplの細胞外ドメインを抗フルオレセイン(FL)抗体のScFvで置換したキメラ受容体(ScFv-c-mpl)が,培養細胞株Ba/F3細胞において,抗原であるFL標識BSA(BSA-FL)依存的な増殖シグナルを伝達することを示した。造血前駆細胞の増幅は複数のサイトカインの添加によって効率よく達成されるが,本年度はまず,キメラ受容体ScFv-c-mplについて,マウス骨髄から取得した造血前駆細胞での増幅効果を検証した。まず,ScFv-c-mpl発現レンチウイルスベクターを作製し,パッケージングして,ウィルス上清を高力価になるまで濃縮した。これをマウス骨髄からセルソーターで純化した造血幹細胞に導入し,遺伝子導入細胞を,SCFのみ,SCFとTPO存在下,そしてSCFとBSA-FL存在下で5日間培養し,それぞれの条件下で増幅された細胞数とEGFP陽性率を比べた。