hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コーパス利用による英語強意副詞の通時的研究

本研究課題が設定した目的は次の2つである。(1)通時的コンピュータ・コーパスを利用して中英語期から初期近代英語期にかけての強意副詞の消長の状況を明らかにすること、(2) Helsinki Corpusの公開(1991年)以降の通時的〔史的〕コンピュータ・コーパスの編纂の動向およびそれらのコーパスに基づいてどのような研究が蓄積されてきたか概観すること。特に前者においてはveryの使用拡大の状況、および単純形副詞と-ly形副詞(e.g. exceeding vs. exceedingly)の競合の状況を明らかにすることに重点を置いた。平成25年度は平成24年度に引き続き、(1)言語資料の収集・整形、(2)データの検索・分析、(3)強意副詞研究、歴史社会言語学、文法化理論の研究動向調査の3本の柱に沿って研究活動を行った。現在、英語コーパス学会設立20周年企画「英語コーパス研究シリーズ」全7巻のうち、第6巻「コーパスと英語史」の編集を担当している。編者として執筆が求められている「英語史領域におけるコーパス利用の外観と展望」は、本研究課題と密接に関連しており、上記3本柱のうち特に(3)が進展した。(1)(2)についても「コーパスと英語史」との関連で進めてきた。主として検索対象としていたParsed Corpus of Early English Correspondence (PCEEC)には不備が多いことが判明したので、利用は継続するものの、新たにPenn-Helsinki Parsed Corpus of Early Modern English (ver. 2)を検索対象に加え、資料の充実を図っているところである。平成24年度の研究計画として(1)言語資料の収集・整形、(2)データの検索・分析、(3)強意副詞研究、歴史社会言語学、文法化理論の研究動向調査の3つを挙げた。本研究課題と密接に関連するプロジェクトとして英語コーパス学会設立20周年記念企画「英語コーパス研究シリーズ」全7巻の刊行があり、その第6巻「コーパスと英語史」の編集と寄稿を依頼されている。各巻の編者には当該領域の研究動向の概観と展望の執筆が求められている関係で、上記3本の柱のうち、特に(3)に重点的に取り組んだ。補助金のおかげで購入できた、歴史言語学、コーパス言語学関係のハンドブック類、また数多くのコーパスを利用した研究書を参照し、過去20年余りの研究の動向を精査する過程で、コーパスを利用した英語の史的研究が、理論言語学、社会言語学等の進展とともに大きな拡がりを見せてきていることを明らかにするとともに、現代英語研究にも通時的な視点が大いに貢献することを現在準備中の原稿の中で指摘した。(1)(2)に関しても「コーパスと英語史」との関連で進めてきた。主として検索対象としたParsed Corpus of Early English Correspondence (PCEEC)は、規模は適切であるものの、付属のマニュアル、あるいはコーパス自体にミスが多いことが判明したので、その修正および、補完的な役割をする自家製コーパスの作成にも取り組んだ。その過程で、自分の研究テーマに有効なコーパスのフォーマットの問題について考察を深めることができた。平成26年度は平成25年度に引き続き(1)言語資料の収集と整形、(2)データの検索・分析、(3)強意副詞・強意表現研究、歴史社会言語学、文法化理論の研究動向調査の3本の柱に沿って研究活動を行った。現在従事している「英語コーパス研究シリーズ」(ひつじ書房2015年秋以降刊行開始予定)全7巻のうち、編集を担当している第6巻{コーパスと英語史」について、当該領域における総論的記事(論文)「英語史領域におけるコーパス利用の概観と展望(仮)」について引き続き資料の調査を行っており、上記(3)においていっそうの進展を見た。(1)(2)についても「コーパスと英語史」と関連するが、さらにデータを拡充する必要を痛感し、現在は調査対象を拡げながら研究を進めている。必要な文献の入手が遅れた関係で当初予定した3年間の研究機関を1年延長して、研究課題「コーパス利用による英語強意副詞の通時的研究」について(1)言語資料の収集と整形、(2)データの検索・分析、(3)強意副詞・強意表現研究の今日の動向という3つのテーマについて研究を進めた。本研究課題による補助金によって、「英語コーパス研究シリーズ全7巻」(ひつじ書房2015年秋刊行開始)のうち、編集を担当している第6巻「コーパスと英語史」に所収予定の2本の原稿(「Helsinki Corpus系のデータを利用した強意副詞研究」「英語史領域におけるコーパス利用の歴史概観および今後の展望」)の執筆に取り組んだ。編著者という立場上他の執筆者からの原稿を点検する必要もあり、当初の計画よりやや遅れ気味であるが、前者についてはほぼ完成してシリーズ全体の編者に提出して査読を受ける段階にある。後者については必要な資料の収集が完了した段階にある。今後は担当巻の上梓に向けて取り組む予定である。

特に前者においてはveryの使用拡大の状況、および単純形副詞と-ly形副詞(e.g. exceeding vs. exceedingly)の競合の状況を明らかにすることに重点を置いた。「研究実績の概要」にも記したように「コーパスと英語史」の編集作業と関連付けて本研究課題を遂行しており、より広い視点からの研究動向の概観ができるなど、当初想定していた以上の深い考察を進めることができている。英語学・言語学「コーパスと英語史」の巻の他の執筆者、さらには本シリーズの総括編集責任者と意見交換を行いながら、よりよい研究成果を取りまとめることを最大の目標とする。「研究実績の概要」にも記したように「コーパスと英語史」の編集作業と関連付けて本研究課題を遂行しており、より広い視点からの研究動向の概観ができるなど、当初想定した以上の深い考察を進めることができている。「研究実績の概要」にも記した通り、「コーパスと英語史」の編集と寄稿という、本研究課題と密接に関わる新たな仕事が加わったため、当初の3本柱間でバランスが少々狂った感は否めないが、本来の「強意副詞の通時的研究」は順調に進めることができている。「英語コーパス研究シリーズ」総括編集責任者との意見交換の中で、現在取り組んでいる総論的記事の範囲をより広げることとなった。これに必要な文献の刊行が当初より遅れたため未使用の金額が出た。また26年度中の研究の完了が不可能となったので、研究機関の延長が必要となった。平成26年度は最終年度であるので、これまでの3本柱に関わる研究を遂行することに加えて、成果のとりまとめ、発信を行う。当初の計画通り、平成24年度同様、(1)言語資料の収集・整形、(2)データの検索・分析、(3)強意副詞研究、歴史社会言語学、文法化理論の研究動向調査の3つの側面から研究を遂行する。また、「コーパスと英語史」用の原稿の提出、さらには関連する研究成果の発表を行う。入手が遅れている文献の購入、成果発表、シリーズ総括編集責任者との打ち合わせのための旅費として使用する。平成25年度内に入手可能と見込んで発注した研究書の一部が、海外の取次からの輸送中の事故により、年度内に納入されず、若干の未使用金額が出たものである。当該の書籍は平成26年度の早い時期には納品されることが確実なので、平成26年度の研究経費に加えて使用する。該当なし。
筋音図による動的な筋活動の評価

【目的】反復的かつ動的な筋活動中の発揮パワー、筋音図平均振幅値、筋電図平均振幅の関係を明らかにすることによって、動的な筋活動における筋の機械的活動の評価に筋音図を用いる利用可能性について検討した。さらに、動的筋活動での筋音図に含まれるノイズ成分についての検討も行った。【方法】健常男性9名が自転車エルゴメータ駆動による最大漸増負荷運動を行った。電磁ブレーキ式自転車エルゴメータの負荷を1分間に20Wづつステップ状に増加させ、被検者はペダル回転速度60回転/分になるようにピッチ音に合わせた。被験者右脚の外側広筋上皮膚表面より表面筋電図、筋音図を得、各負荷での後半6回転分のデータより、筋音図平均振幅、筋電図平均振幅を分析した。【結果と考察】疲労困憊にいたるまでの運動時間と発揮パワーは、13.3【plus-minus】1.6分、276.7【plus-minus】34.7Wであった。筋電図平均振幅と負荷の関係では、高い負荷において直線的な関係が失われたが、筋音図平均振幅値と負荷の関係では、各被検者においてすべての負荷範囲で直線的な関係であり(r=0.8680.995)、被検者全員の筋電図平均振幅の平均値と負荷の間には極めて高い直線関係が認められた(r=0.995)。また、検者によって回転されたペダルの上に被検者の足を載せておいたときの被検者の筋音図平均振幅は、負荷による影響を受けなかった。以上より、自転車駆動のような動的な筋活動においても外側広筋の筋音図が取得可能であり、ノイズ成分の影響も少なく、また、筋音図平均振幅が発揮パワーと直線的な関係にあることから、筋の機械的活動を反映することが示【目的】反復的かつ動的な筋活動中の発揮パワー、筋音図平均振幅値、筋電図平均振幅の関係を明らかにすることによって、動的な筋活動における筋の機械的活動の評価に筋音図を用いる利用可能性について検討した。以上より、自転車駆動のような動的な筋活動においても外側広筋の筋音図が取得可能であり、ノイズ成分の影響も少なく、また、筋音図平均振幅が発揮パワーと直線的な関係にあることから、筋の機械的活動を反映することが示
イネ萎縮ウイルスの感染・増殖に関与する宿主タンパク質の構造と機能に関する研究

イネ萎縮病の防除には抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつであるが、本病の病原であるイネ萎縮ウイルス(RDV)に対する抵抗性品種は未だ報告されていない。本研究では、RDVの感染・増殖に関与する宿主タンパク質の構造と機能の解析を行い、イネのウイルス病抵抗性育種素材の作出に資することを目的とする。これまでに、イネ品種日本晴のミュータントパネルからRDV感受性喪失原因遺伝子Rice dwarf virus multiplication 1 gene(RIM1)の単離及び機能解析を行ったところ、本RIM1タンパク質は転写制御因子として機能して間接的にウイルスに作用するものと推察された。そこで本年度は、RIM1の下流で発現制御され且つウイルス分子と相互作用するタンパク質を探索する目的で、DNAマイクロアレイを用いてイネ品種日本晴とrim1変異系統間における包括的な遺伝子発現変動のモニタリングを行った。得られたデータを基にして、特異的に発現が抑制されている遺伝子を拾い上げ、これらの遺伝子が破壊されているミュータントパネル内の系統に対してウイルス接種試験を行ったが、ウイルス分子と直接相互作用する宿主因子は得られなかった。一方、上記と並行して、DNAマイクロアレイを用いて健全イネとRDV感染イネ間における遺伝子発現の差異をモニタリングしたところ、感染イネにおいて多数の病害抵抗性遺伝子群の発現促進が認められた。これら植物自身に生来備わっている自己防御機構を感染特異的により迅速、強力に発現させるように工夫するなど新たなウイルス病抵抗性形質転換イネの開発に向けた有益な基盤情報を得た。そこで、本研究では(RDV)の感染・増殖に関与する宿主タンパク質の構造と機能の解析を行い、イネのウイルス病抵抗性育種素材の作出に資する。これまでに、イネ品種日本晴あ内在性レトロトランスポゾンTos17の挿入によって得られた約5,500の遺伝子破壊系統(ミュータントパネル)を対象としたRDV感受性変異系統の探索試験から、感受性を喪失した1系統が得られ、この遺伝子.破壊系統を用いた連鎖解析よりRice dwarf virus multiplication 1 gene(RIM1)を含むゲノムDNA断片を単離した。そこで、本ゲノム断片等を用いてウイルス感受性相補試験を行った。Tos17挿入による遺伝子破壊系統(rim1)に野生型RIM1のゲノムDNA断片ならびにmDNAから得たcDNAを導いた形質転換体を用いて,RDVの接種試験を行ったところ、RDVに対する感受性が野生株と同等に復帰した。次いで、本遺伝子破壊系統のウイルス特異性を明らかにするため、RDVと科が異なるウイルス、すなわちRDVと同一の媒介昆虫により伝搬されるイネ黄葉ウイルスとイネ縞葉枯ウイルスの接種試験を行った。その結果、野生型と同様に本遺伝子破壊系統は、両ウイルスに対して感受性を示したことから、RIM1はRDVに特異的に作用する宿主タンパク質であることが明らかとなった。そこで、本研究ではRDVの感染・増殖に関与する宿主タンパク質の構造と機能の解析を行い、イネのウイルス病抵抗性育種素材の作出に資することを目的とする。これまでに、イネ品種日本晴の内在性レトロトランスポゾンTos17の挿入によるRDV感受性喪失系統が1系統得られ、ウイルス感受性相補試験により、この原因遺伝子Rice dwarf virus multiplication 1 gene(RIM1)を含むcDNA領域がRDVの感染・増殖に関与していることを明らかにした。本年度は、RIM1タンパク質がウイルス感染に関わるという直接的な証拠を得るために、RIM1タンパク質とRDVがコードする12種のタンパク質間で相互作用するか否かについて解析を行った。まず、ファーウェスタン法を用いてRIM1タンパク質とウイルス粒子との相互作用を解析したところ、両者の結合は認められなかった。次いで、酵母two-hybrid法を用いてRIM1タンパク質とRDVの12種タンパク質間との相互作用を解析したところ、いずれの組み合わせにおいても結合は認められなかった。一方、この実験で、RIM1タンパク質をbaitとして酵母内で発現させたところ、レポーター遺伝子の転写が活性化された。以上より、RIM1タンパク質は、植物内でも同様に転写因子として機能し、間接的にウイルスに作用しているものと推察された。

得られたデータを基にして、特異的に発現が抑制されている遺伝子を拾い上げ、これらの遺伝子が破壊されているミュータントパネル内の系統に対してウイルス接種試験を行ったが、ウイルス分子と直接相互作用する宿主因子は得られなかった。一方、上記と並行して、DNAマイクロアレイを用いて健全イネとRDV感染イネ間における遺伝子発現の差異をモニタリングしたところ、感染イネにおいて多数の病害抵抗性遺伝子群の発現促進が認められた。これら植物自身に生来備わっている自己防御機構を感染特異的により迅速、強力に発現させるように工夫するなど新たなウイルス病抵抗性形質転換イネの開発に向けた有益な基盤情報を得た。
東京市「特殊小学校」の普通小学校との比較によるその独自性と共通性の検討

東京市「特殊小学校」の普通小学校との比較が研究課題であったが、行った作業は大きく、二つにわかれる。一つは、主に1932年の市域拡張により東京市に編入された地域(新市域)に関する、また、中でも貧困層が多く流入した地域に関する資料・図書の収集であり、もう一つは、「特殊小学校」と比較しうる新市域の中心的な普通小学校を探る作業である。以下、具体的に行った作業を記すことにする。1、新旧市域に関する資料収集(1)新旧市域に関する調査研究、報告を多く含んだ当時の福祉・教育関係雑誌の調査・整理。重要なものについての複写および購入。(2)東京都立公文書館や東京都立図書館東京室に所蔵されている新旧市域における福祉・教育関係の資料の調査と必要なものについての複写。2、「特殊小学校」と比較しうる新市域の中心的小学校を把握する作業(1)該当小学校を絞り込むための、1で収集した資料を整理する作業。(2)当時の調査類をもとにした該当区域や小学校の整理。(3)「特殊小学校」の区移管後の学校経営の様子を記した資料の収集・整理。この他、東京市の都市=首都としての性格を把握するため、日本と比較しうる、海外における都市と「貧民」教育に関する資料の収集も行った。
幕末明治初期釜石製鉄所の「職工社会」と「技術伝承」

本年度の研究の主目的は、幕末大島高任によって指導された洋式木炭高炉が比較的順調に出銑をみたのに対し、30年後横山久太郎によって試みられた再建小高炉が出銑に難渋したのは何故かをさぐることにあった。そのため幕末高炉については「南部家文書」「鈴木家文書」等を詳細に調査し、横山高炉については「公文録」(国立公文書館)「横山久太郎殿下功績録」等にくわしくあたった。その結果、幕末大島高炉が、南部「たたら金山」の「たたら大工」をはじめ、成熟した「同職集団」に組織された熟造した職人層に依拠し、その知恵と工夫を最大限に生かしてしたのに対し、再建横山高炉は、「釜どけし」とよばれる近在漁民出身のある種の潟浪民にしか依存できていなかったことが明らかになり、それが明暗の重要な要因であることが確認できた。このことは旧来の「資本の原始的蓄積」論に、重要な問題提起を行うものでもある。つまり近代産業の「離陸(ティクオフ)」にとっては、いわゆる「二重の意味で自由な労働者」のみでは決して充分とはいえず、成熟した「同職集団」の動員が、決定的なカギであったことを、示しているからである。筆者はすでにかかる論旨を中心に、別掲「初期製鉄業と職工社会」を発表している。今後の課題としては、一端成立した幕末大島高炉が、南部「たたら金山」の衰退と共に、何故に急速に閉鎖的地縁社会へと閉塞としてったかの究明が重要になろう。そのために未使用の史料である「釜石鉱山書上」(岩手県立図書館蔵)「釜石鉱山諸用留」(盛岡中央図書館)などを共に、特に明治初期の釜石鉱山の分析を続けたい。
超常磁性ナノパーティクル内包シャペロニンナノチューブの開発と機能開拓

ATPに応答して機械的な構造変化を行うシャペロニンタンパク質GroEL、および超常磁性酸化鉄ナノ粒子に注目し、それらやそれらの複合体の医学的応用に関して研究を行った。まず、GroELの一次元集積により生成するナノチューブの長さの調節を可能にする手法を開発した。ナノチューブの末端に結合すると重合停止を引き起こす可能性があるハーフカット(シングルリング)GroELを設計し、その共存下でGroELを超分子重合させると、生成するナノチューブの長さを広い範囲で制御できることがわかった。さらに、長さが異なるナノチューブの細胞への取り込み能を評価し、短いナノチューブほど細胞に取り込まれやすい傾向を示すことを確認した。次に、外場を用いてナノチューブを操る仕組みを構築した。超常磁性酸化鉄ナノ粒子を合成し、その表面配位子を最適化することによりGroEL内部へのナノ粒子の取り込みを実現した。得られたGroEL/ナノ粒子複合体を超分子重合させ、超常磁性ナノ粒子の一次元連鎖の構築に成功した。さらに、この一次元連鎖を磁場中におくと、ナノチューブ内部の超常磁性ナノ粒子間にスピン相互作用が発生し、結果として一次元連鎖同士が一時的にバンドル構造を形成することがわかった。次に、人工ウイルスとしてのsiRNAを含むタンパク質ナノチューブの構築とsiRNA送達について研究した。電荷が中和されたsiRNAナノカプレットと前述のGroELの混合物がナノチューブを形成する現象を見出し、siRNAへのメロシアニンユニットのインターカレーション又は疎水性相互作用がそのプロセスに重要であることを示した。このナノチューブ状人工ウイルスにDTTやATPをそれぞれ単独で加えるとナノチューブが部分的に切断し短くなること、およびATPとDTTの混合物を加えるとナノチューブがモノマーにまで解離してsiRNAを放出することがわかった。29年度が最終年度であるため、記入しない。鉄ナノ粒子を含んだシャペロニンナノチューブが磁場に応答して自己組織化をするのを確認して論文としてまとめ、平成27年に発表した。約4.5nmの直径の穴を持つシャペロニンに、双性イオンリガンドで修飾された小さいサイズの超常磁性ナノ粒子を内包させると、ナノチューブが0.5 Tの磁場で自己組織化することを発見した。この現象は電子顕微鏡や光学散乱などの実験で確認した。この自己組織化はチューブの横にバンドル化される異方性があり、超常磁性ナノ粒子単独の自己組織化とは異なる性質を示した。超常磁性ナノ粒子のMRI造影剤としての性能が表面リガンドによって大きく変わる現象を水のプロトンの緩和時間測定(T1とT2)によって証明した。安定性が高くて電荷を持つ双生イオンのリガンドを使うことによって、より近く粒子表面に電荷を蓄積させるのが可能であるところに着目した結果、知られているリガンドの中で高い性能を見せた。生体モデルとしてマウスやラットを用いた脳MRI撮影の結果、腫瘍の周りの血管が可視化された。当時の計画より共同研究が早く進んでおり、計画以上の成果が達成された。siRNAを用いてナノ構造が作れることから新しいキャリアーとしての機能を見つけたため、研究内容をより広く拡張した。ナノスケールの相互作用をナノ構造の設計に利用することで、新たな機能性構造体の構築に成功したため。

ナノチューブの末端に結合すると重合停止を引き起こす可能性があるハーフカット(シングルリング)GroELを設計し、その共存下でGroELを超分子重合させると、生成するナノチューブの長さを広い範囲で制御できることがわかった。さらに、長さが異なるナノチューブの細胞への取り込み能を評価し、短いナノチューブほど細胞に取り込まれやすい傾向を示すことを確認した。次に、外場を用いてナノチューブを操る仕組みを構築した。超常磁性酸化鉄ナノ粒子を合成し、その表面配位子を最適化することによりGroEL内部へのナノ粒子の取り込みを実現した。得られたGroEL/ナノ粒子複合体を超分子重合させ、超常磁性ナノ粒子の一次元連鎖の構築に成功した。さらに、この一次元連鎖を磁場中におくと、ナノチューブ内部の超常磁性ナノ粒子間にスピン相互作用が発生し、結果として一次元連鎖同士が一時的にバンドル構造を形成することがわかった。次に、人工ウイルスとしてのsiRNAを含むタンパク質ナノチューブの構築とsiRNA送達について研究した。電荷が中和されたsiRNAナノカプレットと前述のGroELの混合物がナノチューブを形成する現象を見出し、siRNAへのメロシアニンユニットのインターカレーション又は疎水性相互作用がそのプロセスに重要であることを示した。このナノチューブ状人工ウイルスにDTTやATPをそれぞれ単独で加えるとナノチューブが部分的に切断し短くなること、およびATPとDTTの混合物を加えるとナノチューブがモノマーにまで解離してsiRNAを放出することがわかった。遺伝子変形を組み合わせることによって、シャペロニンの変異体の作成し、その変異体でシャペロニンナノチューブの長さの制御に成功した。その結果を元にして長さと細胞に振り込まれる効率を詳しく調べる実験系を設計する予定である。ナノ構造物の生医学的応用に新たな指針を提供し、当該分野の発展に大きく貢献する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
白金錯体の集合および包接制御による高輝度りん光性分子の創成

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
多成分超流体における新奇な秩序化現象とその相転移動力学の確立

2成分ボース・アインシュタイン凝縮体と超流動3Heの二つの多成分超流体でおこる,自発的対称性の破れによって引き起こされる新奇な物理現象を理論的に調査した.この研究では,Lancaster大学で実施されたブレーン対消滅の模擬実験を理論的に解明することを目指している.その理論構築の過程で,「射影された対称性の破れ」という新しい物理概念を提唱した.また,水と油の相分離のような構造形成を生む系で離散的な対称性の自発的破れを伴うダイナミクスが,浸透理論と結びつく直接的な証拠を初めて示し,2成分超流体の相分離では,量子論と浸透理論のそれぞれが支配的な二つの長さスケール領域が共存することを明らかにした.以下の研究成果1は研究実施計画の課題【2】と【4】に,2と3は課題【3】に対応する.1.超流動ヘリウム3B相における界面の対消滅過程と射影された自発的対称性の破れの理論的解明・・・超流動ヘリウム3B相において双極子相互作用が支配的な場合に,超流体中における界面の対消滅過程で起こりえる位相欠陥の種類,および,生成機構を理論的に明らかにした.この現象を対消滅面に平行な2次元空間に射影させると,ドメイン壁と点渦が自発的対称性の破れによって形成されたものと見なすことができる.先行研究との類推から,これらの位相欠陥形成後のダイナミクスは,2次元空間における秩序化動力学に従う事が予想される.この考察に基づいて,位相欠陥密度が特徴的なスケーリング則に従うことを理論的に予言した.この理論的解析手法は,超流体だけでなく,連続的な対称性が自発的に破れた系ならば普遍的に適用することができる.2.2成分超流体の相分離過程におけるパーコレーションの理論的解明・・・2成分ボース・アインシュタイン凝縮の相分離過程に,パーコレーション理論を適用し,動的なパターン形成の統計的な側面を明らかにした.この系が動的スケーリング則と有限サイズスケーリングが同時に適用できる系である事を数値実験により見出し,これにより,相転移ダイナミクスにおける時間発展後期の統計的な振る舞いを予言できることがわかった.3.擬一次元系におけるラビ結合した対向超流動の解と安定性の理論的解明・・・2成分ボース・アインシュタイン凝縮(BEC)の対向超流動状態に,成分間のコヒーレント結合効果を生むラビ結合を作用させたとき,2成分の全密度と相対位相による特徴的なソリトン構造が実現することを理論的に明らかにした.このようなソリトン構造はこの系で未だ確認されておらず,今後の理論・実験的発展が期待される.以下の番号は研究実施計画の課題の【1】【4】に対応する.【1】【4】の成果により,射影された対称性の破れ(PSB)をフェルミオン超流体にも適用される.一方,最近MITの実験グループによってフェルミオン超流体におけるスネーク不安定性が観測された.このグループでは外部ポテンシャルの勾配の影響を無視できる箱型ポテンシャルを使ったフェルミオン超流体の実験が計画されている.申請者が当初想定していた調和ポテンシャル中の現象よりも,MITグループの系ではより鮮明にPSBの効果を観測できるであろう.申請者はこの実験グループを訪問して研究打合せを行った.計画を変更して,箱型ポテンシャル中のPSBの大規模数値計算を現在実施中である.【2】【4】で一般化されたPSBの理論を,双極子相互作用が強く効いた超流動3He-Bに適用し,国際会議および学術論文として発表した.ランカスター大学で実施された界面対消滅の実験を説明する機構として,【3】で明らかにした秩序化過程のパーコレーションが興味深い可能性としてあげられる.【3】2次元空間におけるドメイン壁の生成を伴う秩序化過程において長時間生き残る開いた壁(infinite domain wall)の統計的性質を明らかにした.この研究によると,動的スケーリング仮説に基づく解析が成立する長時間の間,開いた壁は非整数のフラクタル次元を保持する事が明らかになった.同様な振る舞いは捻じれネマチック液晶の系においても報告されており,今後【4】と関連して系を跨る普遍的な理解が進展するものと期待される.得られた成果は国際会議および学術論文として公表している.【4】この研究は【2】と同時進行で行われている.PSBに関して,超流体だけでなく一般の秩序相に適用できる形式で位相幾何学的な考察を与えると共に,射影低次元空間における有効ハミルトニアンの一般的な導出方法を提案した.一年目における課題【2】と【4】に関して予想以上の進展があったために,課題【1】の解析を2年目の後半に先送りしていたが,この時期に研究遂行に充てるエフォートをうまく確保できなかった.その主な理由は,10月から量子流体力学に関する著書の原稿執筆を再開した事と,昨年末に第一子が誕生したことで研究課題遂行に充てる時間が減少したが挙げられる.一方,課題【1】では,MITの実験グループとの研究打合せにより,射影された対称性の破れ(PSB)を検証する上でより理想的な実験系を見出したことは大きい.また,課題【2】に関して,ランカスター大の実験を説明する機構の一つが,課題【3】の秩序化過程のパーコレーション解析によって導かれたことは理解を大幅に進展される重要な成果である.課題【4】では捻じれネマチック液晶との類似性という新たな方向性が見出された.

総じて本課題は順調に進展していると言える.以下では,研究計画調書に記載した研究課題【1】【4】に関する研究実施状況について述べる.課題【2】および【4】は昨年度に飛躍的な進展があったため,本年度は課題【1】および【2】の研究を遂行した.課題【1】に関しては昨年度に引き続き大規模な数値解析を実施中であったが,課題【3】に関して以下で示す重要な発見があったため,課題【1】の解析を中断して,課題【3】にエフォートを割いた.以下では主に課題【3】に関して得られた成果を報告する.課題【3】に関して,前年度に明らかにした2成分超流体の秩序化過程における浸透理論と無限欠陥の統計則に関する研究成果を,古典および量子流体の非平衡物理に関する国際会議「NEQFLUIDS2016」および統計物理学に関する国際会議「STATPHYS2016」,原子物理に関する国際会議「ICAP2016」において研究発表を行った.また,2016年9月に開催された日本物理学会秋季大会においても口頭発表を実施した.国際会議「STATPHYS2016」において,統計力学の分野の研究者との研究交流をきっかけに,課題【3】に関して新たな方向性が見出され,前年度に学術論文として出版された相分離する2成分超流体におけるドメインサイズ分布の研究を発展させた.その成果は,このサイズ分布には浸透理論によって普遍的に記述される巨視的スケーリング領域と,ドメイン壁の微視的ダイナミクスに依存する微視的スケーリング領域が存在することが明らかになったことである.得られた成果については,量子科学に関する国際シンポジウム「QSS2016」にて招待講演を行い,2017年3月に開催された日本物理学会年次大会で口頭発表を行った.この問題は学術論文(arXiv:1703.10581)として投稿が完了し,現在査読中である.2成分ボース・アインシュタイン凝縮体と超流動3Heの二つの多成分超流体でおこる,自発的対称性の破れによって引き起こされる新奇な物理現象を理論的に調査した.この研究では,Lancaster大学で実施されたブレーン対消滅の模擬実験を理論的に解明することを目指している.その理論構築の過程で,「射影された対称性の破れ」という新しい物理概念を提唱した.また,水と油の相分離のような構造形成を生む系で離散的な対称性の自発的破れを伴うダイナミクスが,浸透理論と結びつく直接的な証拠を初めて示し,2成分超流体の相分離では,量子論と浸透理論のそれぞれが支配的な二つの長さスケール領域が共存することを明らかにした.研究実施計画の課題【2】と【4】に対応する上記研究成果1は,当初の計画では2年目以降から実施を開始する予定であったが,想定よりも理論的理解に進展があったため予定を変更して1年目に実施した.そのため,当初1年目に実施予定であった課題【1】(多成分冷却原子気体ボース・アインシュタイン凝縮体中の射影低次元空間における秩序化過程の動力学と実験的検証)を,2年目以降に実施することとした.それにともない,【1】に関する計画が【2】と【4】により置き換わった形となった.また,並行して遂行していた課題【3】に関しても,想定よりも理論的理解に進展があった.そのため,当初の予定を繰り上げて成果報告を実施している.
京都市の歴史的中心市街地における持続可能な都市発展に関する研究

本年度の研究ではまず、京都市都心部の人口動向について検討した。都心部の人口は減少傾向にあるが、1980年代後半から世帯数は増加しており、これは世帯あたり人員減少の影響である。当地区では従来より職住同居・職住近接が実現可能であったが、職場はサービス経済化の影響を受けており、自宅での従業者は減る一方で、職場近辺での居住者は増加している。新規来住者は、伝統的な町家よりも共同住宅に多くみられる。年齢構成は、住宅の種類により異なり、共同住宅では比較的若い単身者や家族世帯が多いのに対し、伝統的な町家では高齢者が多い。共同住宅の居住者にも年齢構成に偏りがあるため、都心部の人口の質的構成の是正には、今後の町家居住者の動向が重要である。次に、個別的に新規来住者がみられた西陣地区の状況について検討した。当地区には、空き家となった伝統的な町家が多数存在する一方で、こうした町家への居住希望者に物件を紹介する組織が存在する。空き家の所有者の多くは、現状維持か居住者による修繕を条件に、共同住宅並みの家賃で貸している。こうした伝統的な町家の修復・再利用の動向は、地区外においても少数ながら起こっており、今後当現象の発現の可能性は大きいと考えられる。また、歴史的中心市街地の持続的な発展の可能性について考察した。人口増加の影響を及ぼした共同住宅は、都心部に多数存在する路地とそれに面した町家を取り壊して統合された敷地に建設されたものが多い。路地は地価も相対的に低く、今後再開発される可能性も高いが、伝統的な町家の存在する場所であり、コミュニティを保全するためには修復型の再開発が必要である。近年では景観に配慮した町家型集合住宅の建設とともに、町家を活用した店舗も多数あり、これらは歴史的中心市街地の持続的な発展を導くひとつの方策であるが、何よりもまず、人口の安定した社会をめざすことが重要である。本研究ではまず、1980年代と1990年代の空中写真を比較して、京都市の歴史的中心市街地の都市景観の変容について調査した。都心部では伝統的な町家が多数消失し、その後には広大な空閑地が出現するとともに、共同住宅が建設される一方、インナーシティのなかでも西陣地区においては、歴史的な町並みが維持されているところがあった。次に、物的変化によって生じた人口の変化について、昭和55年から平成7年までの国勢調査の小地域別集計結果を時系列に比較した結果、都心の一部地域で人口回帰が認められた。この人口回帰が確認された地区において、住宅地図等より従前の土地利用の把握等により、その要因について考察した結果、従来伝統的な町家の集中していたところに建設された共同住宅への来住者の増加によることが明らかになった。京都市の持続可能な都市発展にとっては、歴史的な町並みの維持・継承が重要であることを考慮し、その状況について現地調査を行った。都心部では、伝統的な町家を再利用した飲食店などの事例がみられるとともに、周辺の歴史的な町並みに配慮した町家型集合住宅も建設されており、このような建物を志向した住民の来住もみられた。西陣地区では、空き家の情報を提供するなど、積極的に伝統的な町家を維持・継承することにつとめる活動組織があり、これによる芸術家などの来住があった。これらの事例は、海外諸国で報告されているジェントリフィケーションの初期の状況を示しており、その要因や影響については平成12年度も調査研究を継続して実施する。
Ras変異体が誘導する新規チロシンリン酸化シグナルとがん悪性化の新機構

プロトがん遺伝子Rasの変異は、多くのがんの原因となる。これまでに、Rasを起点とした発がんのシグナル伝達については多くの知見が蓄積されている。一方、Rasのシグナルと、発がんの過程で発生したがん細胞が悪性化する過程との関係は明らかではない。これまでに、申請者らはがん化型Ras(G12V)変異体による細胞の形質転換(発がん)では、がんの悪性化に関わるチロシンキナーゼMerの発現が亢進し、Ras(G12V)による細胞遊走能の亢進をMerが促進することを見出した。本課題は、MerとMer結合タンパク質に焦点をあて、Ras変異体が誘導する発がんとがんの悪性化を網羅するシグナル全体の理解を目的とするが、本年度は、1)RasのシグナルにおけるMerの活性化メカニズムの解析、2)ヒトの培養細胞でのRasを起点とした発がんシグナルにおけるMerの役割の解明を行なった。1)に関しては、まずMerの発現を抑制した細胞に野生型Merまたはキナーゼ活性を欠損したMer(KD変異体)を発現させた。次に、これらの細胞抽出液から得たMerの免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体によるイムブロットを行ったところ、野生型Merのみにリン酸化が認められた。また、Merの発現抑制による細胞遊走能の低下は、野生型Merを発現したとき部分的に回復し、KD変異体の発現では回復が見られなかった。これらのことから、Ras/Merシグナルによる細胞遊走の亢進に、Merの自己リン酸化が必要であると考えられる。2)に関しては、ヒト肺がん由来がん化型Ras(G12S)変異体をもつA549細胞についてMerの阻害剤UNC569で処理、あるいはMerの発現を抑制したところ、マウス線維芽細胞と同様に細胞遊走能が抑制された。以上もことから、ヒト細胞においても、Rasの発がんシグナルにおいてMerが細胞遊走に関与すると考えられる。本年度の研究により、計画通り、Rasの発がんシグナルにおけるMerの活性化メカニズムと、がん化型Ras変異体をもつヒト細胞の細胞遊走に対するMerの影響を示すことができ、全体の計画はおおむね順調に進行していると考える。本年度の計画をもとに、計画通り、Ras/Merシグナルによって活性化する細胞遊走の活性化メカニズムをMerの下流で機能する分子を基軸に明らかにして行く。Merの下流で機能する分子の候補としては、これまでに細胞抽出液から免疫精製により精製したMer複合体の質量分析解析によって同定した複数のMer結合タンパク質を中心に解析する予定である。これらin vitroの解析と並行して、腫瘍形成と悪性化に対するMerとMer結合タンパク質の影響を明らかにするため、マウスを用いたin vivoの解析をすすめる予定である代表的なプロトがん遺伝子Rasの変異は、発がんの開始・促進を誘導する。これまでに、発がんにおけるRasを起点としたシグナル伝達については多くの知見が蓄積されている。一方、発がんの過程で発生したがん細胞が浸潤・転移能を獲得して悪性化する過程とRasのシグナル伝達との関係は明らかではない。これまでに、申請者らはがん化型Ras(G12V)変異体による細胞の形質転換(発がんの開始・促進)では、がんの悪性化に関わるチロシンキナーゼMerの発現が亢進することを見出した。本課題では、MerとMer結合タンパク質に焦点をあて、発がんとがんの悪性化を網羅するRas変異体が誘導するシグナルの全容を理解することを目的とした。本年度は、1)Ras(G12V)による細胞遊走能に対するMerの影響の解析、2)Rasのシグナル経路におけるMerの活性化メカニズムの解析、3)Mer結合タンパク質の同定を行うこととした。1)に関しては、Merの発現を抑制した細胞ではRas(G12V)による細胞遊走能が抑制され、この細胞にMerを過剰発現させると細胞遊走能が回復した。このことから、RasはMerを介してがんの悪性化に関与していると考えられる。2)に関しては、Ras(G12V)により形質転換した細胞の抽出液から得たMerの免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体によるイムブロットを行ったところ、Merのリン酸化が認められた。このことから、Rasのシグナル経路におけるMerの役割はチロシンキナーゼであることが示唆された。3)FLAGタグを付加したMerの組換えタンパク質を発現させた細胞の抽出液から精製したMer複合体を質量分析計により解析したところ、細胞骨格やシグナル伝達に関与する複数のMer結合タンパク質が同定された。本年度の研究により、計画通り、Ras(G12V)による細胞遊走能に対するMerの影響とRasのシグナル経路におけるMerの活性化メカニズムを示し、これらMerの働きに作用することが期待される複数のMer結合タンパク質を同定できており、全体の計画はおおむね順調に進行していると考える。

本課題は、MerとMer結合タンパク質に焦点をあて、Ras変異体が誘導する発がんとがんの悪性化を網羅するシグナル全体の理解を目的とするが、本年度は、1)RasのシグナルにおけるMerの活性化メカニズムの解析、2)ヒトの培養細胞でのRasを起点とした発がんシグナルにおけるMerの役割の解明を行なった。1)に関しては、まずMerの発現を抑制した細胞に野生型Merまたはキナーゼ活性を欠損したMer(KD変異体)を発現させた。次に、これらの細胞抽出液から得たMerの免疫沈降物について抗リン酸化チロシン抗体によるイムブロットを行ったところ、野生型Merのみにリン酸化が認められた。また、Merの発現抑制による細胞遊走能の低下は、野生型Merを発現したとき部分的に回復し、KD変異体の発現では回復が見られなかった。これらのことから、Ras/Merシグナルによる細胞遊走の亢進に、Merの自己リン酸化が必要であると考えられる。2)に関しては、ヒト肺がん由来がん化型Ras(G12S)変異体をもつA549細胞についてMerの阻害剤UNC569で処理、あるいはMerの発現を抑制したところ、マウス線維芽細胞と同様に細胞遊走能が抑制された。以上もことから、ヒト細胞においても、Rasの発がんシグナルにおいてMerが細胞遊走に関与すると考えられる。本年度の研究により、計画通り、Rasの発がんシグナルにおけるMerの活性化メカニズムと、がん化型Ras変異体をもつヒト細胞の細胞遊走に対するMerの影響を示すことができ、全体の計画はおおむね順調に進行していると考える。本年度の計画をもとに、計画通り、RasシグナルにおけるMerの細胞遊走に対する役割をMer結合タンパク質の機能解析を基軸に明らかにしていく。これらin vitroの解析と並行して、腫瘍形成と悪性化に対するMerとMer結合タンパク質の影響を明らかにするため、マウスを用いたin vivoの解析を進める予定である。本年度の計画をもとに、計画通り、Ras/Merシグナルによって活性化する細胞遊走の活性化メカニズムをMerの下流で機能する分子を基軸に明らかにして行く。Merの下流で機能する分子の候補としては、これまでに細胞抽出液から免疫精製により精製したMer複合体の質量分析解析によって同定した複数のMer結合タンパク質を中心に解析する予定である。これらin vitroの解析と並行して、腫瘍形成と悪性化に対するMerとMer結合タンパク質の影響を明らかにするため、マウスを用いたin vivoの解析をすすめる予定である
シスプラチン耐性がんに有効な新規複核白金錯体と核酸との相互作用に関する研究

2001年度から2003度までの3年間に得られた成果は次のようにまとめられる。(1)ピラゾール及びその誘導体を架橋配位子とする新規白金複核錯体を申請者の開発した合成法により調製しNMRやIRスペクトル法などを用いて構造に関する情報を得た。(2)本複核錯体の反応機構を検討する目的で、求核剤としての塩化物イオンの存在下、HPLCやNMR法などにより反応を速度論的に解析し、酸性ではヒドロキソ架橋配位子がプロトンの攻撃を受けた後に、正方平面白金(II)錯体の配位子置換反応機構に従うことを認めた。(3)本複核錯体は核酸と強い配位結合を行うが、反応完結には生理的pHでは20時間以上を要した。一方、本複核錯体は反応直後に核酸の融解温度を上昇させ、CDスペクトルを変化させた。平衡透析法及び蛍光法により解析した結果、これら配位結合を伴わない相互作用は静電的相互作用及びインターカレーション様相互作用に基づくことを認めた。(4)シスプラチン耐性がん細胞への白金の取り込み量を原子吸光法により測定した結果、本複核錯体はシスプラチンより多量に細胞内に取り込まれることを認めた。(5)以上の結果、本複核錯体が白血病細胞L1210及びそのシスプラチン耐性株に対して強い細胞毒性を発現する機序として、核酸との配位結合のみならず静電的相互作用やインターカレーション様の相互作用を経るアポトーシス誘導が示唆された。現時点では、後二者の相互作用の制がん活性への関与の程度は不明であるが、シスプラチンでは認められない相互作用であり、シスプラチン耐性がん細胞に有効である原因である可能性が考えられる。今後、本相互作用を詳細に解析することにより新しい観点からの制がん剤の開発が期待される。本研究は,シスプラチン耐性がん細胞に有効な新規複核白金錯体を合成し、それらと核酸の結合様式、並びにがん細胞が薬剤耐性を獲得する際に重要な役割を果たすといわれる生体チオールとの相互作用を、各種分光法および電気泳動法などにより解析し、単核錯体シスプラチンの場合と比較し、なぜ複核錯体が耐性がんに有効であるのかを明らかにすることを目的とする。本年度得られた成果は次のようにまとめられる。(1)ピラゾールなどアゾール化合物並びに水酸化物イオンをそれぞれ架橋配位子とする二核白金錯体を合成し、NMR法、IR法などによりキャラクタリゼーションを行った。(2)複核白金錯体が、複核構造を保ったまま核酸や核酸塩基と配位結合することをアガロースゲル電気泳動法、NMR法およびキャピラリー電気泳法などにより証明した。(3)核酸と白金錯体との相互作用研究に有用なアガロースゲル電気泳動法の測定条件を比較検討し、白金錯体の結合した核酸の回収には限外ろ過法が優れていることを明らかにした。(4)ヒト白血病細胞L1210およびシスプラチン耐性L1210において、細胞内グルタチオン濃度が異なることを見いだした。また、複核錯体はアポトーシスを誘導することをアガロースゲル電気泳動法およびセルアナライザー法により確認した。(5)核酸に白金錯体を結合させた後、発蛍光インターカレーターを反応させ、本年度購入した分光蛍光光度計を用いて測定中であるが、本複核白金錯体は核酸と配位結合する前に、弱い相互作用を行うことを見いだしたので、それらを含めて現在検討中である。(6)海外共同研究者のReedijk教授(オランダ)は11月に我々の研究室に来られ、その際互いの研究成果の交換を行った。

本研究成果を含む同教授の講演が、日本薬学会近畿支部主催で大阪薬大において行われた。1ピラゾールおよび4-メチルピラゾールを架橋配位子とする二核白金錯体を申請者の開発した新規合成法により合成した。2新規白金錯体のキャラクタリゼーションは,核磁気共鳴(1H-,195Pt-NMR)法,質量スペクトル法(それぞれ大阪薬科大学現有設備)および元素分析法などにより行った。3本複核錯体は核酸に強く配位結合する前に、,弱い相互作用を行うことを新たに見い出した。この弱い相互作用は、融解温度および粘度の測定、発蛍光インターカレーターを用いる蛍光分光法などにより検討した結果、静電的相互作用であると推定した。4本複核錯体の酸性下および塩化ナトリウム溶液中での挙動を、HPLC法および1H-NMR法により経時的に測定し、速度論的に解析した。その結果、ヒドロキソ架橋はプロトンの攻撃を受けアコ体へ変化するが、塩化ナトリウムが存在すると置換反応が生じ、ジクロロ体に可逆的に変換されることを見いだした。その際、ピラゾラート架橋は解裂せず、複核構造が保たれていることを1H-NMR法により確認した。5シスプラチン耐性がん細胞に及ぼす白金錯体の影響をセルアナライザー(フルオロサイトメトリー)法により検討し,新規白金錯体はシスプラチンより強いアポトーシス誘導能を有することを認めた。6グアニン塩基関連化合物と複核白金錯体との相互作用については、主としてNMR法により解析した。なお、研究代表者は、ライデン大学より同大学の博士論文審査員として招聘され、'2002年5月にライデンに出張した。その際、研究分担者と本研究に関する互いの成果を交換し、内容について討論した。7以上を総合して、新規複核白金錯体の核酸との反応における特異性を単核白金錯体シスプラチンのそれと比較しつつ、シスプラチン耐性がん細胞増殖抑制に有効な白金錯体の分子設計について考察を加えた。本年度に得られた成果は次のようにまとめられる。1.ピラゾール及びその誘導体を架橋配位子とする新規白金複核錯体を申請者の開発した合成法により調製し、NMRやIRスペクトル法などを用いて構造に関する情報を得た。2.本複核錯体は核酸と強い配位結合を行うが、反応完結には生理的pHでは20時間以上を要る。一方、これらの複核錯体は反応直後に核酸の融解温度を上昇させ、CDスペクトルを変化させた。平衡透析法や蛍光法などにより解析した結果、これら配位結合を伴わない相互作用は静電的相互作用及びインターカレーション様の相互作用であることを認めた。3.シスプラチン耐性がん細胞への白金の取り込み量を原子吸光法により測定した結果、本複核錯体はシスプラチンより多量に細胞内に取り込まれることを認めた。4.本複核白金錯体と核酸オリゴマーとの相互作用に関しては、海外共同研究者グループがすでに結晶化に成功し、X線結晶構造解析法などにより解析中である。5.以上の結果、本複核錯体が白血病細胞L1210及びそのシスプラチン耐性株に対して強い細胞毒性を発現する機序のひとつとして、核酸との配位結合のみならず静電的相互作用やインターカレーション様の相互作用が示唆された。現時点では、それらの相互作用の制がん活性への関与の程度は不明であるが、シスプラチンでは認められない相互作用であり、シスプラチン耐性がん細胞に有効である原因である可能性が考えられる。今後、本相互作用を詳細に解析することにより。新しい観点からの制がん剤の開発が期待される。
機能的胆管ネットワークを配備した肝組織の体外体内一貫構築

機能的胆管ネットワークを保持した肝組織構築を最終目的として,ラット胎児肝細胞とラット成熟胆管上皮肝細胞からなる三次元球状凝集塊を,invitroで形成させたところ,後者を前者の3倍混合した凝集体で,連続的かつ機能的な胆管ネットワークが凝集塊全体に形成されることを確かめた.さらに,形成した球状凝集塊を,マトリゲルに浸したポリ乳酸不織布担体に包埋して免疫不全マウスの腸管膜上に移植したところ,胆管上皮細胞への分化能力を持つ胎児肝細胞の凝集塊では胆管構造が全く形成されなかったのに対し,invitroで成熟胆管上皮細胞を混合した凝集塊では,胆管ネットワーク構造が安定的に維持された.以上,成熟した胆管上皮細胞の存在が胆管ネットワーク形成に極めて重要な役割を果たすことを明らかとした.機能的胆管ネットワークを保持した肝組織構築を最終目的として,ラット胎児肝細胞とラット成熟胆管上皮肝細胞からなる三次元球状凝集塊を,invitroで形成させたところ,後者を前者の3倍混合した凝集体で,連続的かつ機能的な胆管ネットワークが凝集塊全体に形成されることを確かめた.さらに,形成した球状凝集塊を,マトリゲルに浸したポリ乳酸不織布担体に包埋して免疫不全マウスの腸管膜上に移植したところ,胆管上皮細胞への分化能力を持つ胎児肝細胞の凝集塊では胆管構造が全く形成されなかったのに対し,invitroで成熟胆管上皮細胞を混合した凝集塊では,胆管ネットワーク構造が安定的に維持された.以上,成熟した胆管上皮細胞の存在が胆管ネットワーク形成に極めて重要な役割を果たすことを明らかとした.ラット胎児肝細胞とラット成熟胆管上皮細胞を用いて,二通りのアプローチから胆管様構造を導入した微小肝組織構築について研究を進めてきた.一つ目のアプローチとして,初代胎児肝細胞と初代胆管上皮細胞を,それぞれ分散させた状態で混合し,浮遊状態で共培養することでヘテロスフェロイドを形成した.その結果,形成されたスフェロイド内部には胆管上皮細胞マーカーであるCK19陽性細胞から成る胆管様の構造が構築され,それらを取り囲むように肝実質様細胞が存在していることが確認された.このことから,これら二種の肝細胞を分散させてスフェロイドを形成すると,細胞がスフェロイド内部で自発的に再構成を行い,その結果胆管様構造が配備された肝臓様組織が構築されることが確かめられた.さらに,ネットワーク様に構築された胆管構造を導入することを目指して二つ目のアプローチを試している.まず初代胆管上皮細胞をコラーゲンゲルサンドイッチ培養することでネットワーク様構造を構築した.続いてコラゲナーゼ処理にてゲルを除去することで,この胆管様構造断片を取り出した.取り出した胆管様構造断片を初代胎児肝細胞と共培養することで,高度なネットワーク様構造を有した微小肝組織を構築することができた.以上の成果については第10回日本再生医療学会で口頭発表にて報告した.今年度は,胆管構造を含む三次元肝細胞凝集体の作成技術と内部構造や胆管と実質細胞(ラット成熟または胎児)との組織化・胆汁排泄蓄積能を評価・最適化することを目標にして研究を行い,以下の成果を得た.第一の方法として,ラット成熟肝から採取される成熟胆管上皮細胞をコラーゲンゲルサンドイッチ法にて自発的ネットワークを形成させ,その後コラーゲンを消化することで,部分的に組織化された胆管ネットワーク断片を得,これと胎児肝細胞や成熟肝細胞とを,マイクロウェル構造を持つ特殊なプレート内に播種し,各々のウェル内でヘテロトロピックな三次元凝集体へと組織化する手法を試みた.しかしながら,胆管片と後から播種する実質細胞のとの組織化がうまく行われないことが判明し,次の第二法に移った.第二の手法は,ラット成熟肝から採取される成熟胆管上皮細胞と組織再構築能に優れたラット胎児肝細胞とを単離後,直接マイクロウェルにて凝集体へと効率的に組織化する手法である.両者の比を胎児肝細胞:胆管上皮細胞で1:10・1:3・1:1・3:1・10:1と広範に振ってヘテロ細胞凝集塊を形成し,その組織学的・機能学的評価を行ったところ,成熟胆管上皮細胞を胎児肝細胞の3倍以上混合した凝集塊においてのみ,胆汁溜りが全体に分布し,かつ互いに連続していることが確認できた.胎児肝細胞集団の中には本来,胆管上皮細胞にも分化可能な前駆細胞が含まれているはずであるが,それらは発達した機能的胆管を生体外で構築するこのことにはあまり寄与できず,むしろ成熟胆管上皮の寄与が大きいとの結果となった.この理由は現時点では不明であるが,少なくとも現状の培養条件下では,胎児肝細胞から自律的に肝細胞と胆管上皮とをバランスよく分化誘導し,機能的胆管を配置する組織を形成するに至らなかった.24年度は,胆管構造を含む三次元肝細胞凝集体に焦点を絞り,生体外において内部構造や胆管と実質細胞との組織化・胆汁排泄蓄積能を最適化し,並行して移植実験を行い両者の結果を互いにフィードバックすることにより,胆汁排泄能を持つ肝組織の構築を目指した.まず生体外において,組織再構築能に優れたラット胎児肝細胞とラット成熟肝から採取される成熟胆管上皮細胞とを, “3 : 1", “1 : 1", “1 : 3"の混合比で非接着性プレートにて培養することで凝集体へと組織化した.

その結果,成熟胆管上皮細胞の存在比に依存して組織内部に胆管ネットワーク構造が形成されることが確認できた.さらに,蛍光性の代謝物を用いて胆汁排泄・蓄積能を評価したところ,成熟胆管上皮細胞が“1 : 3"の場合にのみ,連続したネットワーク様構造への胆汁蓄積を見ることができた.これらのことから,機能的胆管構造の生体外構築において成熟胆管上皮細胞が重要な役割を果たすことが示された.さらに,生体内での胆管構築においても成熟胆管上皮細胞が必要となるかを検討するため,上述のように生体外で構築した“1 : 1"凝集体および対照群として胎児肝細胞のみで構築した凝集体(“1 : 0")を,マトリゲルに浸したポリ乳酸不織布担体に包埋して免疫不全マウスの腸管膜上に移植し,生体内における更なる胆管ネットワーク構築の可能性を検討した.移植4週間後に移植片を摘出し組織像を観察したところ,“1 : 0"では肝実質様構造のみが形成されていたのに対し,“1 : 1"では実質構造に加え胆管上皮細胞で形成されるネットワーク構造も形成されていることが確かめられた.以上の結果より,胆管構造をもつ肝組織の構築を目指す上で,生体外・生体内いずれにおいても成熟胆管上皮細胞の存在が極めて重要な役割を果たすことが明らかとなった.胎児肝細胞から実質細胞と胆管上皮細胞とをバランスよく分化誘導し,自律的に胆管ネットワークが配備された凝集塊の形成を目指したが,現状では不可能であり,代わりに,生体外における胆管ネットワーク形成における成熟胆管上皮の大きな寄与を確かめることができ,移植実験への展望が開けた.24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は,成熟胆管上皮と胎児肝細胞とのヘテロ細胞凝集塊における胆汁排泄機能の詳細解析を行うと共に,移植による更なる高度な胆管ネットワーク系の構築にトライする.24年度が最終年度であるため、記入しない。