hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アレルギー発症に関わる細胞外マトリックス蛋白質の活性化機構の解明

アレルギー疾患に関わる細胞外マトリックス蛋白質ヒト・ペリオスチンの機能領域R1-R4(4つの連続したファスシクリン1様ドメインを含む)を大腸菌発現系を用いて巻き戻し法により取得することに成功した。引き続き、ゲル濾過を用いた相互作用解析によって結合能の高い抗ヒト・ペリオスチン抗体を2種選出し、Fab複合体試料を用いた結晶化実験を実施した。Periostinは細胞外マトリックス蛋白質の一つであり、Tenascin-C, Fibronectin, Collagen-V等の他の細胞外マトリックス蛋白質と結合することにより、種々のアレルギー疾患の病態の特徴である線維化等の組織的変化が生じる。Periostinはアレルギー疾患の中でも特にアトピー性皮膚炎発症に直接的に関係していることが最近明らかになっており、若年層のアトピー性皮膚炎の有病率が10数%にのぼり大きな社会問題となっている今日、Periostinは創薬の標的として注目を集めている。本申請研究はPeriostinの活性化機構を、その結合蛋白質といかなる量論的複合体を形成するかを明らかにし、さらにその立体構造決定を通じて理解することを目的としている。平成21年度前半は、ヒトPeriostinの全長体を昆虫細胞を用いて発現・調製した。調製した試料はゲル濾過クロマトグラフィーにより二量体状態であることが確認され、この試料を用いて結晶化条件の検索を実施した。平成21年度後半は、ヒトPeriostinの機能領域(FAS1領域)について、コンストラクトを計5種作製し、大腸菌発現系による大量発現に成功した。ただし、いずれも不溶性画分(変性状態)として取得されたので、巻き戻し条件を検討し活性状態のヒトPeriostinの取得を試みた。その結果、可溶性の試料を取得することができたので、この試料を用いて結晶化条件の検索を実施した。Periostinは細胞外マトリックス蛋白質の一つであり、Tenascin-C,Fibronectin,Collagen-V等の他の細胞外マトリックス蛋白質と結合することにより、種々のアレルギー疾患の病態の特徴である線維化等の組織的変化が生じる。平成22年前半は、ヒトPeriostinの全長体を昆虫細胞を用いて発現・調製した。調製した試料はゲル濾過クロマトグラフィーにより二量体状態であることが確認され、この試料を結晶化条件の検索に供した。平成22年後半はヒトPeriostinの機能領域(FASIドメインが4つ(Rl,R2,R3,R4)繰り返された領域)について、コンストラクトを計11種作製し、大腸菌発現系による大量発現に成功した。複数のFAS1ドメインを含むコンストラクトはいずれも不溶性画分(変性状態)として取得されたので、巻き戻し条件を検討し活性状態のヒトPeriostinの取得を試みた。その結果、機能領域全て(FAS1ドメインを4つ含むコンストラクト:RI-R4)の可溶性の試料を取得することができた。さらに連携研究者が取得している抗Periostin抗体の中からRI-R4に結合する抗体を選択し、抗体のFab領域と複合体状態で結晶化条件の検索を実施した結果、微結晶を取得することに成功した。Periostinは細胞外マトリックズ蛋白質の一つであり、Tenascin-C,Fibronectin,Collagen-V等の他の細胞外マトリックス蛋白質と結合することにより、種々のアレルギー疾患の病態の特徴である線維化等の組織的変化が生じる。平成23年度前半は、前年度に取得したヒトPeriostinの機能領域(FAS1ドメインが4つ(R1,R2,R3,R4)繰り返された領域)の可溶性試料(R1-R4)と、連携研究者が取得している5種の抗Periostin抗体との結合確認実験を実施した。これらの抗体は単にR1-R4その結果、R3に結合する2種の抗体がお互いに阻害せずR3の領域に結合することを確認できた。よって、この2種の抗体を外部発注(物品費として使用)により大量生産した。平成23年度後半はイオン交換クロマトグラフィーによりR1-R4の純度を向上させることに成功し、引き続き前半に取得した抗体との複合体試料を用いた結晶化実験を実施した。

R1-R4と抗体(Fab領域)の1:1複合体(2種)および1:2複:合体・(抗体2種を1分子ずつ結合)をゲルろ過により調製し、計1500条件の結晶化条件スクリーニングを実施したが、本研究期間内にX線回折データ収集可能な結晶を取得するには至らなかった。
核酸誘導体を識別する抗体の認識機構の解明

遺伝子の本体である核酸に紫外線や環境中の有害物質が作用すると核酸の塩基部が修飾を受けた誘導体が生じる.本研究の目的は,紫外線により生じるシクロブタン型チミンダイマーおよび(6-4)光産物と抗光損傷DNAモノクローナル抗体との特異的認識を原子レベルで解析し,得られた知見を基にして,紫外線損傷DNAを修復する機能を有する触媒抗体を設計するための基礎的データを得ることである.これまで得られた研究成果について以下に述べる.一連の紫外線損傷DNA特異的抗体の抗原となるシクロブタン型チミンダイマー,(6-4)光産物およびDewar isomerを含むDNA断片の大量合成を行った.次に,これらと特異抗体の抗原結合領域(Fab)との結合活性を調べた.また,可変領域(Fv)遺伝子をクローニングし,一本鎖抗体(scFv)遺伝子を構築した.scFv蛋白質の大量発現を行い,得られたscFvと核酸誘導体との結合反応速度定数を求めた.さらに,CDRの位置特異的変異およびランダム変異により,核酸誘導体との結合部位を解析した.一方で,原子レベルでの解析のため,Fabの大量調製を行い,損傷DNA断片との結晶化を行った.特に,(6-4)光産物認識抗体のFab単体およびFabと(6-4)光産物との複合体の三次元構造をX線構造解析により明らかにした.また,NMRにより抗(6-4)光産物抗体と抗シクロブタン型チミンダイマー抗体の安定同位体標識したFabと抗原DNA誘導体との結合の動的解析を行った.構造から得られた知見を基に抗原結合部位にランダム変異を導入したscFvを構築し,生物活性を見出した.遺伝子の本体である核酸に紫外線や環境中の有害物質が作用すると核酸の塩基部が修飾を受けた誘導体が生じる.本研究の目的は,紫外線により生じるシクロブタン型チミンダイマーおよび(6-4)光産物と抗光損傷DNAモノクローナル抗体との特異的認識を原子レベルで解析し,得られた知見を基にして,紫外線損傷DNAを修復する機能を有する触媒抗体を設計するための基礎的データを得ることである.これまで得られた研究成果について以下に述べる.一連の紫外線損傷DNA特異的抗体の抗原となるシクロブタン型チミンダイマー,(6-4)光産物およびDewar isomerを含むDNA断片の大量合成を行った.次に,これらと特異抗体の抗原結合領域(Fab)との結合活性を調べた.また,可変領域(Fv)遺伝子をクローニングし,一本鎖抗体(scFv)遺伝子を構築した.scFv蛋白質の大量発現を行い,得られたscFvと核酸誘導体との結合反応速度定数を求めた.さらに,CDRの位置特異的変異およびランダム変異により,核酸誘導体との結合部位を解析した.一方で,原子レベルでの解析のため,Fabの大量調製を行い,損傷DNA断片との結晶化を行った.特に,(6-4)光産物認識抗体のFab単体およびFabと(6-4)光産物との複合体の三次元構造をX線構造解析により明らかにした.また,NMRにより抗(6-4)光産物抗体と抗シクロブタン型チミンダイマー抗体の安定同位体標識したFabと抗原DNA誘導体との結合の動的解析を行った.構造から得られた知見を基に抗原結合部位にランダム変異を導入したscFvを構築し,生物活性を見出した.1)抗原としての光損傷部位を含む核酸の合成においてはシックロブタンチミンダイマー体の大量合成法を確立した.6-4光産物を含むDNAはBIAcoreによる結合,NMRによる相互作用解析に充分な量を合成した.T-T6-4光産物の保護したブロックの合成を行った.保護基を除去することによりNMR測定用サンプルおよび共結晶調査用サンプルとした.構造解析用のスピラベル体の合成のために,5'末端にアミノリンカーを持つオリゴヌクレオチドの合成を行った.3'末端誘導体についても合成ルートを確立した.2)64M系抗体を抗原として認識する抗体産生細胞(N-553-17-10)は得られたが,TDM系抗体を抗原として認識する抗体を産生する細胞はこれまでに得られていない.N-553-17-10細胞は,アイソタイプの異なる64M系抗体5種を抗原として認識することが分かった.3)初年度に計画していた,抗体の抗原結合部位のFab蛋白質の結晶化は3種の抗体について成功した.6-4M-2と5の抗体Fabの結晶性のX線回析による評価も計画通りに進行し,既にX線解析にも着手した.さらに,光産物DNAをFabとの複合体として精製する手順も構築でき,複合体の結晶化に向けた準備と見通しを得た.4)NMR解析は,6-4M5FabおよびTDM-2Fabの抗原結合部位の動的構造の精密解析を行った.ハイブリドーマ細胞の無血清培養法により主査アミド窒素をアミノ窒素をアミノ酸選択的に15N標識したFabフラグメントを多種類調整し,13C-15N二重標識法により個々のシグナルの位置特異的帰属を行った.1)抗原としての光損傷部位を含む核酸の合成についてはシクロブタンチミンダイマー体の大量合成法を確立した。6-4光産物を含むDNAはBIAcoreによる結合,NMRによる相互作用解析に充分な量を合成した.T-T6-4光産物の保護したブロックを用いてダイマーおよびテトラマ-の合成を行った.NMR測定用サンプルおよび共結晶調整用サンプルを合成した.構造解析用のスピラベル体の合成のために,5′末端にアミノリンカーを持つオリゴヌクレオチドおよび3′末端誘導体との反応を行い目的とするラベル体を合成した.

2)NMR法ならびにX線回析法に必要な抗体のFabフラグメントの大量調製を行うために抗体の大量生産・精製系を確立した.3)抗体の抗原結合部位のFab蛋白質の結晶化は3種の抗体について成功した.6-4M-2と5の抗体Fabの結晶性のX線回析による評価も計画通りに進行した.6-4M-2については光産物との複合体の結晶化成功し,三次元解析が進行中である.4)NMR解析は,6-4M5FabおよびTDM-2Fabの抗原結合部位の動的構造の精密解析を行った.ハイブリドーマ細胞の無血清培養法により主鎖アミド窒素をアミノ酸選択的に15N標識したFabフラグメントを多種類調整し,13C-15N二重標識法により個々のシグナルの位置特異的帰属を行い,6-4光産物のリンNMRを解析を行った.5)一本鎖抗体およびその変異体の大腸菌を用いる発現系を確立し,BIAcoreによる抗原との結合実験を行った.遺伝子の本体である核酸に紫外線や環境中の有害物質が作用すると核酸の塩基部が修飾を受けた誘導体が生じる.本研究の目的は,紫外線により生じるシクロブタン型チミンダイマーおよび(6-4)光産物と抗光損傷DNAモノクローナル抗体との特異的認識を原子レベルで解析し,得られた知見を基にして,紫外線損傷DNAを修復する機能を有する触媒抗体を設計するための基礎的データを得ることである.これまで得られた研究成果について以下に述べる.一連の紫外線損傷DNA特異的抗体の抗原となるシクロブタン型チミンダイマー,(6-4)光産物およびDewar isomerを含むDNA断片の大量合成を行った.次に,これらと特異抗体の抗原結合領域(Fab)との結合活性を調べた.また,可変領域(Fv)遺伝子をクローニングし,一本鎖抗体(scFv)遺伝子を構築した.scFv蛋白質の大量発現を行い,得られたscFvと核酸誘導体との結合反応速度定数を求めた.さらに,CDRの位置特異的変異およびランダム変異により,核酸誘導体との結合部位を解析した.一方で,原子レベルでの解析のため,Fabの大量調製を行い,損傷DNA断片との結晶化を行った.特に,(6-4)光産物認識抗体のFab単体およびFabと(6-4)光産物との複合体の三次元構造をX線構造解析により明らかにした.また,NMRにより抗(6-4)光産物抗体と抗シクロブタン型チミンダイマー抗体の安定同位体標識したFabと抗原DNA誘導体との結合の動的解析を行った.構造から得られた知見を基に抗原結合部位にランダム変異を導入したscFvを構築し,生物活性を見出した.
精神分裂病の病因および病態に対する高ビリルビン血症の関与について

1.高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者の精神医学的、神経学的特徴に関する研究:高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者とそれを合併しない患者(各33名)を対象に精神症状評価にPANSSおよびBPRSを、錐体外路症状評価にAIMS、DIEPSS、Banes AKS-Sを用いて両群間の精神症状、錐体外路症状の出現頻度と重症度の比較検討をした。また、両群間の予後比較のためGAFを用いた評価もおこなった。その結果、高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者は精神症状が重度であり、錐体外路症状がより高頻度に出現し、その症状も重度であることが明らかとなった。予後評価に関しても高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者は予後は不良であることがわかった(業績参照)。2.高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者の脳の形熊的変化の特徴の画像的研究:高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者の脳の形態学的変化の有無について頭部CT画像を用いて検討した。その結果、統合失調症群では健常対照群に比較して、前頭側頭葉脳溝、大脳縦裂、側脳室の面積に有意な拡大が認められた。さらに、高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者は健常対照群および高ビリルビン血症非合併の統合失調症者群のいずれにも比較して、前頭側頭葉脳溝、大脳縦裂、側脳室の面積の有意な拡大が認められた(業績参照)。3.高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者の脳の形態的変化の特徴のFLAIRMRI研究:高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者の脳の形態学的変化の有無について頭部MRI画像を用いて検討した。その結果、統合失調症群では健常対照群に比較して、海馬、扁桃体などで信号強度の上昇が認められた。さらに、高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者は健常対照群および高ビリルビン血症非合併の統合失調症患者群のいずれにも比較して、上記部位での信号強度の上昇が認められた(業績参照)。1.高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者の精神医学的、神経学的特徴に関する研究:高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者とそれを合併しない患者(各33名)を対象に精神症状評価にPANSSおよびBPRSを、錐体外路症状評価にAIMS、DIEPSS、Banes AKS-Sを用いて両群間の精神症状、錐体外路症状の出現頻度と重症度の比較検討をした。その結果、高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者は精神症状が重度であり、錐体外路症状がより高頻度に出現し、その症状も重度であることが明らかとなった。また、予後評価に関しても高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者は予後は不良であることがわかった。以上の結果は現在、国際専門誌に投稿中である。2.高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者の脳の形態的変化の特徴の画像的研究:高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者の脳の形態学的変化の有無について頭部CT画像を用いて検討した。その結果、精神分裂病群では健常対照群に比較して、前頭側頭葉脳溝、大脳縦裂、側脳室の面積に有意な拡大が認められた。さらに、高ビリルビン血症を合併する精神分裂病患者は健常対照群および高ビリルビン血症非合併の精神分裂病患者群のいずれにも比較して、前頭側頭葉脳溝、大脳縦裂、側脳室の面積の有意な拡大が認められた。以上の結果は国際専門誌において発表した(業績参照)。

その結果、統合失調症群では健常対照群に比較して、海馬、扁桃体などで信号強度の上昇が認められた。さらに、高ビリルビン血症を合併する統合失調症患者は健常対照群および高ビリルビン血症非合併の統合失調症患者群のいずれにも比較して、上記部位での信号強度の上昇が認められた(業績参照)。
大深度立坑を利用した実スケール雲化学実験-二酸化硫黄の酸化に関する研究

釜石鉱山にある高さ430mの立坑において、坑頂に設置したファンで風速約1m/sの上昇気流を起こさせることにより人工雲を生成させ、次の実験を行なった。1.大気中の二酸化硫黄が雲粒に取り込まれ、液相反応により酸化される過程を調べるために、坑底で二酸化硫黄ガスを放出し、エレベーター等を利用して立坑内の種々の高さで慣性衝突捕集器により雲粒とエアロゾル粒子を分別採取、さらに炭酸ナトリウム含浸濾紙により二酸化硫黄ガスも採取した。捕集面にはホルムアルデヒド含浸濾紙を用いて亜硫酸の酸化を抑制し、S(IV)とS(VI)をそれぞれ定量した。この実験により次の知見が得られた:(1)雲底直上で雲粒中のS(IV)は気相二酸化硫黄と平衡に達している。すわち二酸化硫黄のレインアウトは非常に速い。(2)雲粒中のS(VI)/S(IV)比は高さによってほとんど変化しない。したがって溶存酸素との熱反応による酸化は遅い。雲化学過程の特徴は、反応場(水滴)そのものが生成・消滅する点である。本研究2年目以降は坑内エレベーターの使用が出来ず、高度プロファイルによる反応の追跡が不可能になったことも考慮して、研究対象を雲粒の生成・成長過程に絞って次の結果を得た。2.レーザー距離計により雲底を観測したところ、その高度は距離スケール100m、時間スケール10秒程度で変動していることが明らかとなった。3.雲核となり得る塩化ナトリウムや塩化リチウムの水溶液を坑底で噴霧し、雲粒濃度および雲粒径に及ぼす影響を坑頂で観測した。その結果、無機塩噴霧により雲粒濃度が著しく増加し、また粒径分布は大粒径側に向かって長い裾が伸びることが認められた。しかし粒径の最頻値は一定であった。噴霧開始から坑頂で濃度増加が認められるまでの時間は粒径に依存し、その解析により水滴の成長速度に関する知見を得た。平成8年9月2日より6日まで釜石鉱山において、立坑内に人工雲を発生させ、これに向けて二酸化硫黄を放出する実験を合計3回行った。今回は坑底にブロワ-を設置して二酸化硫黄を強制的に拡散させ濃度の均一化を図った。放出量は平均0.5l/min、坑底での濃度は約30ppbであった。観測用エレベータ-に搭載した二酸化硫黄濃度計により濃度の鉛直プロファイルを調べたのは前回(平成56年一般研究(B))と同様であるが、濃度計の時間応答性にとくに注意を払ってエレベータ-運行プログラムを設定した。得られたプロファイルから二酸化硫黄の雲への取り込み(レインアウト)速度に関する結果の再現性をチェックした。また新しい試みとして坑底にレーザーレーダーを設置して雲底高度の時間変化を追跡した。その結果、雲底は平均して約100mの高度にあるが、低いときは40m、高いときには160mと大きな幅で変動していることが明らかとなった。これとは別にエレベータ-に載せたビデオカメラによる目視観測結果を合わせ考えると、上記雲底高度のみかけ上の変動は、必ずしも雲生成高度の変動を意味するのではなく、雲粒濃度の空間分布がかなり不均一で、1mあるいはそれ以下のスケールの塊状になっていることによるものと考えるのが妥当であるとの結論に達した。雲あるいは霧がこのような不均一構造をもつことは定性的にはこれまで多く指摘されてきたことであるが、定量的解析に耐えるデータは極めて少ない。

今回得られたデータは雲粒の生成・拡散・凝集過程を複雑系として解析する可能性を与えるものとして価値がある。さらに、採取した雲水をイオンクロマトグラフィーにより組成分析し、SO_4^<2->、NO_3^-,Cl^-,Na^+,K^+,Mg^<2+>,Ca^<2+>等の濃度を求めた。SO_4^<2->は最高10ppmに達し液相熱反応によるS(IV)→S(VI)の酸化反応が裏付けられた。また、雲核として作用する無機塩類濃度に関する知見が得られた。平成8年9月に釜石鉱山において行った人工雲への二酸化硫黄放出実験結果を解析し、二酸化硫黄の雲化学過程に関する次のような知見を得た。二酸化硫黄濃度の鉛直方向減衰率は雲底より上で明白に増加することが認められた。また、雲水を採取してS(IV)濃度を測定したところ、雲粒のpH6という条件で二酸化硫黄が気液平衡にあると考えた場合の濃度と一致した。これらの結果より、雲粒の生成とともに気相の二酸化硫黄はすみやかに雲へ取り込まれて平衡量まで水滴に移行することが判った。実際雲粒の平均径を10μmとして、最も速く平衡に達するまでの時間を見積もると約30秒となるが、これは上昇気流速度を考慮すると雲底上30mに相当し実測結果とほぼ一致する。一方、雲水に含まれるS(IV)とS(VI)濃度の比は、観測高度すなわち反応時間にほとんど依存せずほぼ一定であった。このことから水滴内の熱反応による二酸化硫黄の酸化はこの実験の時間スケール(約10分)に比べて遅いことが結論される。また、坑頂で観測した雲粒の濃度と粒径分布は激しく変動するのが認められ、レーザーレーダーによる雲底高度の変動(昨年度既報告)と併せて考えると、坑内の温度、湿度、風速が極めて安定しているにもかかわらず、雲生成過程には大きな揺動が生じていることが判明し、雲の生成過程そのものに既成の考え方では十分理解できない側面があることが示された。そこて平成9年11月9日15日の期間、主として水蒸気→水滴の相変化過程を調べる目的で再度実験を行った。この実験では、雲核となり得る塩化ナトリウムや塩化リチウムの水溶液を坑底で噴霧し、雲粒濃度および雲粒径に及ぼす影響を坑頂で観測した。その結果、上記の無機塩噴霧により雲粒濃度が著しく増加し、また粒径分布は大粒径側に向かって長い裾が伸びることが認められ、定量的解析により凝縮速度に関する知見が得られることが判った。二酸化硫黄の雲化学的酸化反応においては、雲粒という反応場そのものの生成過程が重要な因子である。この過程を調べるため、平成10年11月24日28日の期間、坑底におけるエアロゾル噴霧を中心とした実験を行なった。前年の実験の再現性を検証する目的で、前年と同様硫酸アンモニウム、食塩および塩化リチウム粒子を用い、前年より低い濃度で噴霧して坑頂において雲粒の個数と粒径分布の変化を観測した。その結果、a)無機塩粒子の噴霧により雲粒の個数濃度が増加し、同時に粒径分布は大粒径側に裾が伸びること、しかし、b)粒径の最頻値はほぼ7μmで一定であること、C)塩の種類の違いは雲粒の生成にほとんど影響を持たないこと、について再現性ある結果が得られた。また今回はとくに、噴霧液にポリオキシエチレンアルキルエーテルを主成分とする界面活性剤を加えて凝結核から雲粒への成長過程に及ぼす表面張力の影響を調べた。界面活性剤添加により表面張力は事実上0となり、ケルビン効果は消失してラウール効果のみが発現するはずである。したがって、水蒸気凝結に関する立坑壁と凝結核の間の競争は後者に有利となり、雲水量が増加するものと予想される。
生命観から見た明治期における生命科学の近代化過程の科学技術史的研究

明治21年(1888年)に創刊され、その後日本の動物学研究の成果を発表する中心となった日本動物学会(東京動物学会)の雑誌『動物学雑誌』と欧文誌『動物学彙報』Annotationes Zoologica Japonensesについて研究を行った。まず、明治期におけるこれらの雑誌の論文、記事、翻訳紹介、総説等の内容について一覧表を作って、動物学会の研究内容を総合的に把握する資料を整えた。明治期『動物学雑誌』の総合的な見取り図を描こうと試みた。次に、著者、翻訳者、対象動物、対象動物の分類群、方法論・研究領域等のキーによって掲載された記事の内容を整理・分類して、どのような文章がどの程度掲載されたのかを数量的に表記することを試みた。その結果の分析を行って、『動物学雑誌』が動物学研究の推進とともに普及の役割を果たしたこと、各領域をめぐって、主にどのような人が、何を対象として研究を行ったのか等の具体的な研究の推移を明らかにした。また、それらの結果として、日本明治期の動物学研究の主目的が日本のファウナの確定と新種発見にあったこと、遺伝学や細胞学、実験発生学は文献紹介的な段階にあったことを明らかにした。これまで日本明治期の生物学の歴史記述は、進化論の導入を重視し、多くの場合一部の研究者の研究成果を強調してきたが、より総合的な見地から明治期の動物学史を行う基礎となる文献調査を行った。1.日本における近代的な動物学の形成がどのようなものであったかを明らかにすることを目標とし、東京動物学会(後の日本動物学会)の雑誌『動物学雑誌』(Zoological Magazine)およびその周辺に関する文献調査と考察を行った。具体的な検討課題は次の通り。(1)おおよそ明治時代中期の日本の動物学の明治期の動物学についてこれまで記述されてきた文献のサーベイを行った。(2)『動物学雑誌』初期の論文については、データベース化し、マスとして分析が可能なようにした。分析の結果として、初期の論文の傾向の一端を明らかにした。(3)Public Understanding of Sciecneの観点から、動物学の普及を問題にして、雑誌のあり方についての分析を行った。『動物学雑誌』の位置づけが変化していったことを、具体的、実証的に示した。(4)西洋における生物学の成立の事情については、二次文献のサーベイを行って、それとの比較という観点から、日本における動物学の成立の特殊性の一端を明らかにした。2.今後は、明治時代後期についても、同様のデータベース化を行い、動物学が成立していった過程を、さらに広い時代範囲において調査する。
イネの生殖過程における金属制御機構の解明

イネの胚発生過程において重要な遺伝子を探索するため、野生型イネの開花前および開花後、種子成熟の初期の3段階の子房および未熟種子を集め葉に対する発現を比較するマイクロアレイ解析を行った。花粉発芽時の遺伝子発現解析も行った。実験で明らかになった、イネ胚発生時に重要な遺伝子および花粉発芽時に重要な遺伝子には数種の金属トランスポーターがあり、イネ胚発生時および花粉発芽時に金属が重要であることを示唆した。鉄、亜鉛、銅、などの金属元素は動植物の生育にとって必須である。特に生殖成長や胚発生時の形態形成にはこれらの金属元素が重要な役割を果たすと考えられる。本研究は植物における金属栄養と生殖成長、形態形成および種子成熟との関わりを明らかにすることを目的とした。具体的には、鉄、亜鉛、銅などの金属元素と生殖成長や種子の成熟とを結ぶ物質と考えられる金属キレーター、ニコチアナミンに焦点をあて、生殖器官への金属元素の輸送システムを探るとともに、輸送後の細胞内における金属元素の制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度はイネの胚発生過程における解析を中心に行った。イネの胚発生過程において重要な遺伝子を探索するため、野生型イネの開花前および開花後、種子成熟の初期の3段階の子房および未熟種子を集め葉に対する発現を比較するマイクロアレイを行った。また、花粉発芽前後のマイクロアレイも行った。両方の実験で明らかになった、イネ胚発生時に重要な遺伝子および花粉発芽時に重要な遺伝子には数種の金属トランスポーターがあり、イネ胚発生時および花粉発芽時に金属が重要であることを示唆した。21年度、これらの実験で明らかになった重要な遺伝子について詳細な解析を進める。具体的には、鉄、亜鉛、銅などの金属元素と生殖成長や種子の成熟とを結ぶ物質と考えられる金属キレーターニコチアナミン、他の金属キレート化合物、金属タンパク質、金属のトランスポーターに焦点をあて、生殖器官への金属元素の輸送システムを探るとともに、輸送後の細胞内における金属元素の制御機構を明らかにすることを目的とした。イネの種子成熟過程の子房を12段階にわけて収集し各段階に応じて代謝化合物や遺伝子を抽出した。これらすべての段階の抽出物を材料としてメタボローム解析、およびマイクロアレイ解析を行った。その結果、金属結合能をもつ有機酸濃度が生育段階に応じてに変化することが分かった。また、アミノ酸が主として3パターンの変化をすることが明らかになった。玄米に多く含まれるとされてきたGABAの濃度はむしろ種子成熟に伴って低下することが分かった。さらに糖代謝産物は種子成熟の中期に濃度が高まることが明らかになった。遺伝子発現の変化もこれら代謝産物の変化と関連して変化していた。これらのことからイネ種子成熟過程において、ニコチアナミンのみでなく他の有機酸や代謝化合物の重要性が明らかになった。
リンパ組織毛細血管後小静脈の免疫組織学的性状の動物種・系統差

リンパ組織毛細血管後小静脈(PCV)は再循環型リンパ球が末梢血中よりリンパ浸潤域、或は、リンパ髄に特異的にhomingする場として注目されているが、1986年それらPCV内皮細胞表面のユビキチンなるポリペプタイドが帰還受容体(homing receptor)として存在する事が相次ぎ報告され、より詳細なPCV内皮細胞の免疫学的性状の解明が急務となってきている。本課題では、それらPCVに関し、実験動物学的レベルにて、動物種差,系統差など調べるため正常マウスリンパ節PCV,ヌードマウスリンパ節PCV,NODマウス膵島リンパ球浸潤域PCV(以上ゲッ歯目)とスンクスリンパ節と扁桃PCV(食虫目)などについて超微形態的,免疫組織学的研究を行った。正常マウス及びヌードマウスのPCVの所見については既に、筆者がlmmunology 1983に報告しているが、いづれもPCVを通過するリンパ球が確認(前者ではT・Bリンパ球、後者ではBリンパ球)され、リンパ球の通過認識機構にT細胞依存免疫系が関与しない事は明らかである。今回の糖尿病自然発症マウスでは生後4週頃から膵島にリンパ球浸潤がみられるようになり6週頃から、それら浸潤リンパ球によるβ細胞破壊がみられたが、PCVは第5週頃に顕著に認められる様になり、PCVを介するリンパ球のhomingが予想された。また、5週以後、PCV周辺の膵島β細胞の破壊が急速に進行する事などから、膵島炎発現機構でのPCV免疫系の関与が示唆された。この事は上記のヌードマウスPCVの免疫学的negativeな所見と相反するがリンパ組織にのみ特異なPCVが存在する事は事実であり、今後、再考の余地がありそうである。最後にスンクスPCVでもリンパ球通過をリンパ節,扁桃PCVで認めたが、ゲッ歯目のそれらと超微形態的には差異を認めなかった。(第11回国際電子顕微鏡会議、京都に、その一部を発表した。)リンパ組織毛細血管後小静脈(PCV)は再循環型リンパ球が末梢血中よりリンパ浸潤域、或は、リンパ髄に特異的にhomingする場として注目されているが、1986年それらPCV内皮細胞表面のユビキチンなるポリペプタイドが帰還受容体(homing receptor)として存在する事が相次ぎ報告され、より詳細なPCV内皮細胞の免疫学的性状の解明が急務となってきている。)
PETを機軸とするアルツハイマー病態カスケード診断法の確立

本研究課題では、アルツハイマー病の発症機序における神経機能障害の診断法確立を目的とし、認知症モデルマウス脳における代謝型グルタミン酸受容体5(mGluR5)の分子動態を蛍光生体イメージングとポジトロン断層撮影(PET)で評価する事を通じて、同受容体の画像診断バイオマーカーとしての有益性を検証した。その結果、蛍光生体イメージングによる同受容体を利用した病態評価は実現まで至らなかったものの、rTg4510系統モデルマウス脳におけるタウ病変依存的な神経機能障害をmGluR5プローブ[11C]ABP688によるPET撮像法で検出できる事が見出された。本年度はグルタミン酸受容体(iGluN、mGluR5)に着目し、(1)蛍光ライブセルイメージング、(2)二光子顕微鏡イメージング、(3)ポジトロン断層撮像(PET)により同受容体の分子動態と機能連結を評価可能であるか検証した。(1)pH感受性の蛍光蛋白質SEPを融合したiGluN、mGluR5を初代培養神経細胞に発現させ、wide-field顕微鏡による蛍光ライブセルイメージング実施した。iGluNはシナプスにmGluR5は細胞膜全体にそれぞれ分布し、いずれの受容体も80%が細胞表面膜に局在する事が明らかとなった。NMDAやPCPなど薬理学的操作に応答して生じるmGluR5膜表面量の変化は微量であり、解析対象をiGluNにも拡張して検証を進めている。(2)マウス大脳皮質の体性感覚野にCranial Windowを設置し、皮質II/III層錐体細胞に発現させたEGFPやGCaMP6など蛍光蛋白質の分子動態を二光子顕微鏡イメージング可能である事が確認された。SEPを融合したiGluN、mGluR5遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの許容長を超える為にベクターでの遺伝子導入が困難であり、トランスジェニックマウス作製も含めた遺伝子導入法を検討中である。(3)放射性標識リガンド[11C]ABP688を用いてPET撮像を実施した結果、マウス生体脳におけるmGluR5受容体の非侵襲イメージングが実現された。PCPを尾静脈投与した後にPET撮像を実施した場合には、投与前と比較してリガンド結合量の低下が認められ、この変化率はiGluN-mGluR5機能連結の強度を反映する指標になると考えられた。当初の計画通りウイルスベクターによる遺伝子導入法を確立し、蛍光ライブセルイメージング、二光子顕微鏡、そしてPET撮像によるイメージング実験系が構築された。SEPを利用したグルタミン酸受容体の動態解析では、定常状態における同受容体の細胞内分布や膜表面量の定量評価が達成された。グルタミン酸受容体間の機能連結に関しては、蛍光イメージングによる実験的な検証が不十分であるものの、薬理学的な作用とPET撮像の組合せによりリガンド結合量の変化率を検出できた点は有益であり、次年度以降の認知症モデルマウス脳における病態診断マーカーとしての応用価値が期待される。本研究課題では、アルツハイマー病発症機序における神経機能病態の解明とその画像診断法の確立を目指し、mGluR5グルタミン酸受容体に着目してその分子動態の解析と、認知症モデルマウス脳におけるバイオマーカーとしての有益性の検証に取組んだ。平成29年度は、前年度までに確立されたmGluR5特異的PETプローブ[11C]ABP688によるPET撮像法を利用して、rTg4510系統タウ病変モデルマウスの神経機能病態を評価する画像診断バイオマーカーとしての有益性を検証した。病態進行度の程度が異なる月齢のrTg4510マウス脳において、小脳を参照領域とした[11C]ABP688結合能のPET定量解析を実施し、平行してMRI形態学的解析により脳萎縮の進行度を評価した。5ヶ月齢のrTg4510マウス脳では、皮質や海馬など前脳領域において[11C]ABP688結合能の有意な低下が観察され、これらは前脳におけるタウ病変PETプローブ[11C]PBB3により検出される脳内タウ蓄積の亢進時期や脳体積の低下開始の時期ともよく一致した。タウ病変が生じない線条体領域においては、若齢期から[11C]ABP688結合能が低下している所見が観察され、[11C]ABP688を指標とする解析には脳領域依存的な相違がある事も見出された。また、炎症性ミクログリアマーカーであるTSPOに対するPETプローブ[11C]AC-5216による解析により、同モデル動物脳では早期より神経炎症の亢進が生じている事も見出されており、神経機能病態との因果関係も示唆された。薬理学的操作に応答したグルタミン酸受容体の動態解析を引き続き検証中である。

蛍光イメージングに関しては、次年度も引き続き共焦点顕微鏡システムなどを使用してS/N亢進を図りつつ、新しい遺伝子導入法も試行するなど、さらなる改善の必要性について検討する。当初の計画通り、認知症モデル動物脳における[11C]ABP688リガンドによるPET撮像の意義を検証し、薬理学的作用との組合せによる病態診断マーカーとしての価値を追求する。神経科学当初の計画で本年度中に完了する事を想定していた検証実験の一部で、更なる改善点などを検討する必要性が生じたため。次年度使用額は必要性の浮上した検証実験を完了する為に使用し、次年度の実施計画は当初予定を変更する事なく遂行する。
大気・海洋結合モデルによる有明海における筑後川起源水の流動機構の解明

研究代表者は,有明海の環境研究を通して,梅雨期において諫早湾内では,諫早湾全体にわたる大規模な塩淡成層が形成し,ある時は湾奥部は通常海水の半分まで低塩分化し,ある時は通常海水に回復するという現象を見出した.本研究プロジェクトでは,この塩淡成層は有明海に流れ込む河川水によって作られ,成層構造の出現と消失プロセスは局地風に起因するという仮説の下,河川からの淡水供給と風応力を組み込んだ3次元流動モデルを開発し,再現計算を行った.その結果,成層構造は主に筑後川からの河川水に起因しており,諫早湾において卓越する北北東の風と南南西の風が成層構造の出現・消失プロセスに寄与することが明らかとなった.九州農政局が提供している2003年から2008年の水質データを解析し,塩淡成層の発生機構,低塩分水塊の風応答特性,低酸素水塊の発生・発達・消滅プロセス,風による低酸素水塊の応答特性を詳細に調べ,これまでの解析結果の妥当性を確認した.また,有明海奥部に流出する河川水の流動および調整池から南北排水門を通して排水される淡水の動態についても明らかにした.大気流動モデルとしてメソスケール気象モデル(WRFV3.0)を用いて,解析対象期間における有明海周辺地域の風のシミュレーションを行った.海上風シミュレーションでは,広領域(領域1)として九州を中心とした約1,000km四方の領域を計算領域に設定し,計算領域を約100km四方の狭領域(領域3)まで順次3段階に落とす3重ネストを用いた.また,計算には2ウエイネスティング手法を用いた.領域1の植生,土地利用および標高データの作成には,USG30秒のメッシュ値を用いた.領域2領域3における植生,土地利用データの作成には国土地理院数値情報1/10細分区画土地利用を,標高データの作成には国土地理院数値情報50mメッシュ値を組み込んだ.得られた解析結果を有明海周辺のアメダスデータと九州農政局が諫早湾中央で計測している海上風データと比較し,解析結果の妥当性が確かめられた.さらに,海上10mの高さの平均風速から水表面に作用する風応力を算定する経験式を用いて,海表面に作用する風応力の時・空間分布を求めた.その応力分布を既に構築している有明海3次元流動モデルの海表面に作用させ,流動シミュレーションを行った.有明海における物質輸送パターンは風応力を作用させるか否かによってに大きく異なることを明らかにした.また,調整池から排水された淡水が諫早湾内においてどのような流動パターンを取るかが明らかとなった.有明海奥部には筑後川をはじめ,六角川,嘉瀬川,矢部川,菊池川,白川,緑川の7つの一級河川が流れ込んでいる.海域に流れ込む河川水は,栄養塩を供給すると共に塩淡成層を形成するため,赤潮や貧酸素水塊の発生要因となる.諫早湾内の淡水は有明海からの流入量が支配的で,諫早湾潮受け堤防から排水された淡水量の5倍程度を占めると言われている.研究代表者は,九州農政局が測得した塩分データを解析し,夏季に諫早湾全域で形成される大規模で強い塩淡成層は,主に有明海奥部に流出する河川水に起因していることを見出した.本研究では,風応力分布を組み込んだ有明海3次元流動シミュレーションモデルを構築し,2009年7月1日31日を対象に各河川から供給された淡水粒子の流動特性を解析した.九州農政局が取得した塩分データを解析し,計算結果の再現性を確認するとともに各河川から流出した淡水がどのような割合で諫早湾内に流入・滞留するかについて検討した.また,卓越風向を北北東と南南西に固定した仮想計算を行い,卓越風向の違いによって諫早湾内への淡水流入プロセスがどのように変化するかについても検討した.さらに,諫早湾内に形成される大規模塩淡成層の要因について調べた.得られた結果は以下の通りである.1)諫早湾内に形成される大規模塩淡成層は,南北排水門からの淡水排水というよりはむしろ有明海に注ぐ一級河川からの淡水供給によって形成される.2)成層形成に最も大きな影響をもつ河川は筑後川であり,筑後川起源の淡水は,諫早湾に存在する河川起源の淡水の約61%を占める.3)諫早湾への河川水の流入は,基本的に潮汐運動のみによって引き起こされる.4)海表面に作用する風応力は諫早湾内に流入・流出する淡水量に大きな影響を与える.北寄りの風の連吹は,諫早湾内に存在する淡水の流出を抑制し,南寄りの風の連吹は,諫早湾以北に河口をもつ河川からの淡水流入を抑制する.研究代表者は,有明海の環境研究を通して,梅雨期において諫早湾内では,諫早湾全体にわたる大規模な塩淡成層が形成し,ある時は湾奥部は通常海水の半分まで低塩分化し,ある時は通常海水に回復するという現象を見出した.本研究プロジェクトでは,この塩淡成層は有明海に流れ込む河川水によって作られ,成層構造の出現と消失プロセスは局地風に起因するという仮説の下,河川からの淡水供給と風応力を組み込んだ3次元流動モデルを開発し,再現計算を行った.その結果,成層構造は主に筑後川からの河川水に起因しており,諫早湾において卓越する北北東の風と南南西の風が成層構造の出現・消失プロセスに寄与することが明らかとなった.

九州農政局が提供している2003年から2008年の水質データを解析し,塩淡成層の発生機構,低塩分水塊の風応答特性,低酸素水塊の発生・発達・消滅プロセス,風による低酸素水塊の応答特性を詳細に調べ,これまでの解析結果の妥当性を確認した.また,有明海奥部に流出する河川水の流動および調整池から南北排水門を通して排水される淡水の動態についても明らかにした.大気流動モデルとしてメソスケール気象モデル(WRFV3.0)を用いて,解析対象期間における有明海周辺地域の風のシミュレーションを行った.海上風シミュレーションでは,広領域(領域1)として九州を中心とした約1,000km四方の領域を計算領域に設定し,計算領域を約100km四方の狭領域(領域3)まで順次3段階に落とす3重ネストを用いた.また,計算には2ウエイネスティング手法を用いた.領域1の植生,土地利用および標高データの作成には,USG30秒のメッシュ値を用いた.領域2領域3における植生,土地利用データの作成には国土地理院数値情報1/10細分区画土地利用を,標高データの作成には国土地理院数値情報50mメッシュ値を組み込んだ.得られた解析結果を有明海周辺のアメダスデータと九州農政局が諫早湾中央で計測している海上風データと比較し,解析結果の妥当性が確かめられた.さらに,海上10mの高さの平均風速から水表面に作用する風応力を算定する経験式を用いて,海表面に作用する風応力の時・空間分布を求めた.その応力分布を既に構築している有明海3次元流動モデルの海表面に作用させ,流動シミュレーションを行った.有明海における物質輸送パターンは風応力を作用させるか否かによってに大きく異なることを明らかにした.また,本研究によって,調整池から排水された淡水が諫早湾内においてどのような流動パターンを取るかが明kとなった.1九州農政局が提供している2003年から2008年の水質データを解析し,塩淡成層の発生機構,低塩分水塊の風応答特性,低酸素水塊の発生・発達・消滅プロセス,風による低酸素水塊の応答特性を明らかにすることを,研究目標に掲げている.九州農政局が公表している観測データの解析は順調に進んでおり,有明海奥部に流出する河川水の流動および調整池から南北排水門を通して排水される淡水の動態が,3次元流動モデルを用いて非常によく再現された.よって,研究目標1は,順調に進展したと判断される.2大気流動モデルとしてメソスケール気象モデル(WRFV3.0)を用いて,解析対象期間における有明海周辺地域の風のシミュレーションを行うことを研究目標に掲げている.今年度は,広領域(領域1)として九州を中心とした約1,000km四方の領域を計算領域に設定し,計算領域を約100km四方の狭領域(領域3)まで順次3段階に落とす3重ネストを用いた.また,計算には2ウエイネスティング手法を用いた.得られた解析結果を有明海周辺のアメダスデータと九州農政局が諫早湾中央で計測している海上風データと比較した結果,解析結果の妥当性が確かめられた.また,有明海表層付近における物質輸送のパターンと輸送量は風応力を作用させるか否かによってに大きく異なることを明らかにした.さらに,調整池から排水された淡水が諫早湾内においてどのような流動パターンを取るかを明らかにした.よって,研究目標2は,順調に進展したと判断される.(1)本年度の研究の第一目標は,九州農政局が提供している2003年から2008年の水質データを解析し,塩淡成層の発生機構,低塩分水塊の風応答特性,低酸素水塊の発生・発達・消滅プロセス,風による貧酸素水塊の応答特性を詳細に調べることにあった.
軟弱地盤中の水理破砕による亀裂の発達に関する研究

1.目的:農業用のフィルダムにおける漏水の原因の一つとして水理破砕があげられるが、その原因の一つとして堤体および基礎地盤中の縦亀裂の存在が考えられる。破壊靭性の測定の結果、軟弱な粘性土では1cmの程度の亀裂でも1m弱程度の水圧で発達する危険性があることが分かった。したがって、小さいな亀裂でも水理破砕へと発達する可能性が考えられる。一般的に物質は延性から脆性へとその性質を変えるにしたがい、せん断分離より引張分離が優先されることを考慮すると、土であっても鉛直方向の載荷により縦亀裂が生じる危険性が考えられる。そこで本研究では鉛直方向の圧縮による縦亀裂の発生の有無について検討した。2.方法:漏水を生じた農業用ダムの基礎地盤から採取した粘性土と建設中のダムの築堤材となっている砂質シルトを試料とした。粘性土は不撹乱試料と撹乱試料により、砂質シルトは撹乱試料により供試体を作成し、これらを用いて三軸圧縮試験を行った。この実験では側方への伸びによる縦亀裂の発生の有無について幾つかの拘束条件下で検討した。具体的には供試体の上下端面の拘束を極力排除した場合、既存の方法のまま行った場合等である。また、局所変位測定装置を用いた側方ひずみの測定も行い、縦亀裂発生時の応力・ひずみ量の検討も行った。3.結果:粘性土、シルトとも縦方向の圧縮により、側方への伸びひずみが生じ縦亀裂が発生する場合があることが分かった。この場合、縦亀裂はせん断亀裂よりも早期に発生するが、これによる強度の低下は見られなかった。このことは、ダムの堤体や基礎は構造物としての破壊は生じなくても、内部に漏水の原因となる縦亀裂が生じる可能性があることを示してる。1.目的:農業用のフィルダムにおける漏水の原因の一つとして水理破砕が考えられる。水理破砕には地盤や堤体中の亀裂が水圧により押し広げられる現象があげられるが,この現象は破壊力学で用いられる破壊靭性により定量的に扱えることが明らかになっている。破壊靭性は供試体が無限の広がりをもつことが理論上の仮定とされているが、実際の供試体は有限であるため、破壊靭性を測定する場合、円柱供試体の直径に対する初期亀裂長の影響を考える必要がある。これまでの研究では、直径7.0cmの供試体に対し初期亀裂長を変化させて破壊靭性を求めたが、初期亀裂長を1.0cmより小さくすることは困難であった。そこで本研究では、初期亀裂長1.0cmに対し、逆に供試体の直径を7.0cmより大きくする実験を行うことにより、既往の実験を補い、破壊靭性の測定における、適切な初期亀裂長に対する供試体の直径の比を求めることを目的とする。2.方法:実験装置は三軸圧縮試験機を改良したものを用い、円柱供試体の直径7.0cmに対し、初期亀裂長を4.0cm、3.0cm、2.0cm、1.0cmと変化させた場合と、初期亀裂長1.0cmに対し、供試体の直径を7.0cm、8.0cm、9.0cmと変化させた場合において測定を行った。実験は、供試体の初期亀裂内にグリセリン水溶液を加圧注入し、圧力を段階的に上昇させ、圧力が急落した時点の注入圧を破壊圧力として破壊靭性を求める。3.結果:供試体の直径が同一な場合なら、初期亀裂長が小さくなるほど破壊圧力は高く、それとともに破壊靭性も高くなる傾向が見られる。しかし、初期亀裂長1.0cmに対し供試体の直径が7.0cm以上になると、破壊圧力、破壊靭性はある程度の幅はあるが、ほぼ一定となった。したがって円柱供試体を用いて破壊靭性を測定する場合、理論的仮定を満たすためには、供試体の直径は初期亀裂長の7倍程度必要であると考えられる。

この場合、縦亀裂はせん断亀裂よりも早期に発生するが、これによる強度の低下は見られなかった。このことは、ダムの堤体や基礎は構造物としての破壊は生じなくても、内部に漏水の原因となる縦亀裂が生じる可能性があることを示してる。
口腔粘膜細胞のDNA認識機構の解明と口腔粘膜炎症の調節

口腔粘膜上皮細胞や線維芽細胞はヘルペス由来dsDNAの侵入を細胞内受容体によって認識し,NF-kBの活性化を介して,CXCL10の発現誘導を行っていることが示唆された.またヘルペス由来dsDNAの認識に対して口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞はRNA受容体であるRIG-Iが関与していることが明らかになった。一方,IFI16の抑制は線維芽細胞におけるdsDNA誘導性のCXCL10の発現を抑制した。IFI16のdsDNA認識機構については現在さらに詳細なメカニズムの検討を行っている。口腔粘膜細胞は細菌、ウイルスなど病原体の侵入に対して自然免疫応答に伴う特異的な防御反応を惹起すると考えられる。しかしながらヘルペスなどのDNAウイルスに対するDNA認識機構や口腔粘膜炎症性疾患との関与は不明である。本実験はウイルス由来DNAに対する口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞によるDNA認識受容体を介した口腔粘膜防御機構を明らかにし、さらに口腔粘膜炎症性疾患との関与や特異的DNA受容体を介した粘膜炎症制御、調節機構を検討する。これらの結果から、口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞はHSVのdouble strand DNAを細胞内で認識し、炎症性サイトカインを発現誘導していることが示された。口腔粘膜細胞は細菌,ウイルスなど病原体の侵入に対して自然免疫応答に伴う特異的な防御反応を惹起すると考えられる。近年申請者らは口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞が非メチル化CPGモチーフをもつDNA(CPG-ODN)を認識する受容体TLR9を発現していること,さらに細胞内ウイルス認識受容体であるRIG-Iがdouble strand RNAを認識し,I型IFNを発現誘導することを国内外で初めて発見している。しかしながらヘルペスなどのDNAウイルスに対する口腔粘膜細胞のDNA認識機構や口腔粘膜炎症性疾患との関与は不明である。申請者らは予備実験で口腔粘膜上皮細胞(RT7),線維芽細胞(GT1)が新規DNA認識受容体であるAIM2, IFI16を発現している結果を得ている。さらにAIM2, IFI16のligandと考えられている単純ヘルペス由来のDNAを細胞内にトランスフェクションした際に,炎症性サイトカインの発現が増加することを発見している。この結果は,口腔粘膜細胞がIFI16のような細胞内DNAセンサーを持っており,DNAの侵入により抗ウイルス遺伝子や,炎症性遺伝子を発現することを示唆している。さらに申請者らは歯肉線維芽細胞にCPG-ODNを添加することでCXCL10の発現誘導が抑制されることを報告している。これらの結果は粘膜炎症性疾患においてDNA受容体が炎症病態の形成に関与していること,さらに特異的DNAによるDNA受容体を介した粘膜炎症の抑制機構が存在することを示唆する。本実験はウイルス由来DNAに対する口腔粘膜上皮細胞,線維芽細胞によるDNA認識受容体を介した口腔粘膜防御機構を明らかにし,さらに口腔粘膜炎症性疾患との関与や特異的DNA受容体を介した粘膜炎症制御,調節機構を検討する。単純ヘルペスウイルス(HSV)は口腔粘膜の感染の原因となる。一方で口腔粘膜細胞はヘルペスのようなDNAウイルスに対して何らかの宿主防御応答を行っていることが考えられる。しかしながら口腔粘膜細胞におけるDNA認識に関与する初期免疫応答機構については不明である。不死化口腔粘膜細胞を用いてヘルペス由来dsDNAが細胞内に侵入した際の炎症関連遺伝子の発現誘導などの初期免疫応答やDNA受容体を明らかにする。実験期間を通じて以下の結果を得た。3.各種DNA受容体ノックダウン細胞を用いてHSV dsDNAで誘導されるCXCL10の発現の影響を検討した結果,RIG-Iのノックダウンは,両細胞においてコントロールと比較してHSV dsDNA誘導性のCXCL10の発現が抑制された.IFI-16のノックダウンは, GT1においてCXCL10の発現を抑制したが, RT7ではCXCL10の抑制は認められなかった。今回の結果において,口腔粘膜細胞はヘルペス由来dsDNAの侵入を細胞内受容体によって認識し,NF-kBの活性化を介して,CXCL10の発現誘導を行っていることが示唆された。口腔粘膜上皮細胞、線維芽細胞がHSVのdouble strand DNAを細胞表面ではなく、細胞内で認識し、抗ウイルス作用や炎症の誘発に関連する白血球遊走因子であるCXCL10が発現誘導されることを、国内外で初めて発見した。今後はDNAを細胞内で認識する受容体を検討していく。本年度はDNAウイルス認識受容体発現による受容体相互の細胞内伝達経路の干渉を検討するため、DNA認識受容体過剰発現株あるいはsiRNAによる欠損株を用いて特異的ligand処理によって発現誘導される遺伝子の変化、相互のDNA認識受容体発現の変化をReal time PCR法,western blotting法にて検討する。

さらにDNAウイルス認識受容体発現による受容体相互の細胞内伝達経路の干渉を検討するため、siRNAによる欠損株を用いて特異的ligand処理によって発現誘導される遺伝子の変化、相互のDNA認識受容体発現の変化をReal time PCR法,western blotting法にて検討する予定である。口腔外科HSV DNAで誘導されたCXCL10の発言誘導がAIM2などのDNA認識受容体を介する応答であるか検討するため、各種DNA、RNA認識受容体のSi欠損株を用いて、特異的DNA処理によるCXCL10の発現誘導におけるDNA受容体の影響をELISA法によって確認する。さらに、各種DNA認識受容体の発現と局在をWesternBlotting法、蛍光検疫染色法で検討する。HSDNA認識による細胞内シグナル伝達経路を検討するため、NF-kB、EPKなど転写因子の活性をWesternBlotting法で検討する。次年度必要な試薬購入のため予算確保した状態である現在までの達成した項目に加えて、HSV DNAで誘導されたCXCL10の発現誘導がAIM-2, IFI16などのDNA認識受容体を介する応答であるかを検討する必要がある。本年度中に解析が終了しなかったことから、各種DNA認識受容体の発現と局在をWestern blotting法、蛍光検疫染色法で検討する。