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レジオネラ感染に対するヒトの自然抵抗性を支配する遺伝子 NAIP1 に関する研究

C57BL/6などほとんどの系統のマウスのマクロファージではレジオネラの細胞内増殖が抑制されるが,これには細胞死(pyroptosis)が深く関わっている.Pyroptosisにはカスパーゼ-1の活性化が必須であるが,この過程にNaip5遺伝子産物が関与していることが知られている.RAW264細胞では,レジオネラ感染時の,菌の細胞内増殖の抑制,カスパーゼ-1の活性化,および細胞死がほとんど観察されなかったが,C57BL/6 Naip5の強制発現のみならず,Naip5のヒトホモログであるNAIPを強制発現によってもこれらが回復した.さらに,Naip5の機能欠損が原因でレジオネラ感染感受性のA/J系統で,ヒトNAIPをマクロファージ特異的に発現させると,レジオネラ感染に耐性になる傾向を示した.Naip5の機能欠損をヒトNAIPが回復させたことから,マウス同様ヒトにおいてもpyroptosisによるレジオネラの感染防御機構が存在し,そこにNAIPが関与している可能性が強く示唆された.C57BL/6などほとんどの系統のマウスのマクロファージではレジオネラの細胞内増殖が抑制されるが,これには細胞死(pyroptosis)が深く関わっている.Pyroptosisにはカスパーゼ-1の活性化が必須であるが,この過程にNaip5遺伝子産物が関与していることが知られている.RAW264細胞では,レジオネラ感染時の,菌の細胞内増殖の抑制,カスパーゼ-1の活性化,および細胞死がほとんど観察されなかったが,C57BL/6 Naip5の強制発現のみならず,Naip5のヒトホモログであるNAIPを強制発現によってもこれらが回復した.さらに,Naip5の機能欠損が原因でレジオネラ感染感受性のA/J系統で,ヒトNAIPをマクロファージ特異的に発現させると,レジオネラ感染に耐性になる傾向を示した.Naip5の機能欠損をヒトNAIPが回復させたことから,マウス同様ヒトにおいてもpyroptosisによるレジオネラの感染防御機構が存在し,そこにNAIPが関与している可能性が強く示唆された.C57BL/6などほとんどの系統のマウスのマクロファージではレジオネラの細胞内増殖が抑制されるが,これには細胞死(pyroptosis)が深く関わっている.Pyroptosisにはカスパーゼ-1の活性化が必須であるが,この過程にNaip5遺伝子産物が関与していることが知られている.RAW264細胞では,レジオネラ感染時の,菌の細胞内増殖の抑制,カスパーゼ-1の活性化,および細胞死がほとんど観察されなかったが,C57BL/6Naip5の強制発現のみならず,Naip5のヒトホモログであるNAIPを強制発現によってもこれらが回復した.さらに,Naip5の機能欠損が原因でレジオネラ感染感受性のA/J系統で,ヒトNAIPをマクロファージ特異的に発現させると,レジオネラ感染に耐性になる傾向を示した.Naip5の機能欠損をヒトNAIPが回復させたことから,マウス同様ヒトにおいてもpyroptosisによるレジオネラの感染防御機構が存在し,そこにNAIPが関与している可能性が強く示唆された.ヒトNAIPによる,レジオネラの細胞内増殖の抑制.:RAW264でヒトNAIPを発現させた場合,レジオネラの細胞内増殖が顕著に抑制されるが,このときもカスパーゼ-1の活性化と細胞死を伴っていた.これらのことから,ヒトNAIPもマウスNaip5と同様にレジオネラ感染細胞のpyroptosisの誘導に関与し,レジオネラの細胞内増殖を抑制する機能を有していることが示唆された.ヒトNAIPの,個体レベルでのレジオネラの感染防御への寄与.:非致死量のレジオネラを経鼻感染させたところ,ヒトNAIPを発現するA/Jマウスでは,,野生型A/Jマウスに比べて,感染2日後に肺内に残存する菌が少ない傾向がみられた.また,致死量のレジオネラを経鼻感染させたとき,ヒトNAIPを発現するA/Jマウスでは,生存日数の延長傾向と生存率の上昇傾向が観察された.以上の結果から,ヒトNAIPはレジオネラ感染細胞のpyroptosisの誘導に関与することを通じて,ヒトのレジオネラの感染防御に寄与していることが示唆された.(考察)マウス個体に対してレジオネラを肺感染させたとき,ヒトNAIPを発現するA/Jマウスでは,肺内の菌数の減少と予後の向上が観察されたが,ヒトNAIPの発現の有無でレジオネラ感染による肺傷害に変化が起きているのか,については,今後検討しなければならない.気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞浸潤,および,肺中の炎症性サイトカインやケモカインのレベルを調べることにより,肺傷害の程度を比較する必要があろう.Legionella pneumophilaの病原性は,食細胞での増殖性と関連があるとされている.これまでに,ヒトNAIPがL. pneumophilaの細胞内増殖を抑制することを示し,L. pneumophila感染に対するNAIP遺伝子産物の防御的な役割を明らかにしてきた.本研究では,NAIPによる細胞死の制御機構について検討した.DNA傷害で誘導される細胞死は,ヒトNAIPの発現によって抑制されるが,このときカスパーゼ3およびカスパーゼ7の活性化が阻害されていた.

このことから,ヒトNAIPは,カスパーゼ3/7の活性化を抑制することにより,DNA傷害で誘導されるapoptosisを阻害することがわかった.また,L. pneumophila感染の際には,ヒトNAIPと菌のフラジェリンにより細胞死が誘導されるが,このときIL-1βが分泌されていた.IL-1 βの分泌はカスパーゼ1阻害剤によって抑制されたが,カスパーゼ3/7阻害剤では抑制されなかった.さらに,フラジェリンを欠損した変異株を感染させた場合では,IL-1 βの分泌が認められなかった.このことから,L. pneumophila感染の際には,NAIPがフラジェリン依存的にpyroptosisを誘導することが明らかになった.以上の結果から,ヒトNAIPは,細胞内に生じたストレスの種類に応じてapoptosisを抑制,またはpyroptosisを誘導することにより,細胞死を制御していることが示唆された.トランスジェニックマウスを使用した研究と培養細胞を使用した研究ともに順調で、結果も出始めている。結果の一部をまとめて英文論文として投稿して受理された。24年度が最終年度であるため、記入しない。レジオネラ症患者の数を増やして症例対象研究をすすめていく24年度が最終年度であるため、記入しない。
八重山島嶼沿岸域における生物学的岩盤風化機構の解明と理論シミュレーション研究

本研究では,八重山島嶼沿岸域における露頭岩盤で見られる風化作用に対して,主に微生物風化作用に着目し,フィールド調査と理論シミュレーションによってそのメカニズムの解明に挑んだ。その結果,西表島の沿岸部において岩内微生物による剥離風化を確認するとともに,琉球層群と八重山層群の境界部に柱状の特異な風化形態が発達していることを確認した。また,これらの風化現象を再現できる数理モデルを移流反応拡散理論に基づいて開発した。琉球層群の整形ブロックを利用した植物性風化実験を開始し,琉球石灰岩の一軸圧縮試験および圧裂試験によるマクロ強度をデータベース化した。同時に,破壊力学および反応拡散系理論に基づき,岩盤の生物学的風化(植物性風化および微生物風化)に関する数理モデルの具体検討に着手した。なお,有限要素法をベースとした破壊力学モデルに関しては,粘性土に生じる乾燥収縮亀裂の幾何パターンの実験値と計算値の比較分析を実施したところ,解の一致を確認している。これらの成果は国内外の学術誌や学術講演会において発表していく予定である。八重山層群の乾燥収縮風化を屋内実験室で再現できるシステムを構築した。その結果,ベントナイトを使用した検証実験を実施したところ,ベントナイトペーストのスレーキング化に伴って,乾燥収縮亀裂のフラクタル次元が大きく変化することが明らかとなった。同時に,この現象を計算機内で再現できるシミュレーション技術も開発することができた。本技術によって,亀甲状に拡散していくマッドクラックの進展挙動をコンピュータ上で解析することが可能となった。これらの成果については,国内外の学術誌や学術講演会にて発表済である。また,反応拡散理論に基づいた岩盤の生物学的風化モデルについては,特に微生物風化に着目し,エネルギー,栄養源,活性微生物,非活性微生物,紫外線を考慮した数理モデルを開発し,実装段階にまできている。これらの成果については,今後も積極的に発表していく予定である。現在までに,岩盤風化の基本となるスレーキング現象を再現できる実験システムや,それをコンピュータ上で解析できるモデルを構築することができており,幾つかの成果は,計算工学・土木工学・地盤工学分野の学術誌へも掲載されている。一方,微生物風化の数理モデル化については,八重山層群上に発達するハニカム風化や八重山層群と琉球層群の境界部分に発達する奇妙な風化形態を,定性的に再現できる数理モデルを実装する段階にまできている。今後は,次年度に集中的に実施するフィールド調査や実験結果を本モデルに組み入れることになる。以上のことから,本研究達成のために必要な知見やデータは順調に蓄積できていると考えている。なお,昨年度から引き続き実施している文献調査や他の研究者との会合を通じ,岩盤の生物学的風化作用に関しては,微生物風化の知見や研究が極端に少ないことから,今後もより集中的な研究が必要であることを確認している。八重山諸島西表島沿岸部の琉球層群と八重山層群の境界に見られる特異的な岩盤風化現象について,フィールド調査を実施し,その風化に岩盤中の微生物が関わっている可能性を検討するために,各種試験(原位置によるによる非破壊試験,走査型電子顕微鏡による微細構造分析,X線粉末回折による成分分析等)を実施した。その結果,境界部で柱状に残存している不安定岩盤は,砂質岩盤の空隙が石灰質固着物によって強化されていることを見出すことができた。ただし,この固着物が化学反応起源か微生物反応起源かを判別するまでには至っていない。同時に,沖縄島南部の琉球層群露頭に大量の微生物マットが形成されていることを発見した。この露頭のサンプルを走査型電子顕微鏡によって観察したところ,管状および粒状に風化する微細構造や,石灰岩がフィラメント状に生成している様子を捉えることができた。一方,岩石風化現象の数理モデル化に関しては,前年度に構築した微生物学的風化作用モデルを発展させ,移流反応拡散系モデル(3次元モデル)を新たに構築することができた。これにより,地下水流れを考慮した岩石の風化・生成シミュレーションが可能となる。八重山諸島西表島に見られる特異な岩盤風化現象の詳細調査や,微生物活動によるものと考えられる岩盤風化・生成現象の発見など,本研究で予定していたフィールド調査や実験を順調に進めることができている。これらの結果については,国内外の学術誌や学術集会において発表できている。また,数理モデルについても,前年度に開発した微生物学的風化作用モデルの差分シミュレータへの実装に加え,新たに移流反応拡散系モデル(3次元モデル)の構築にも成功している。なお,昨年度から引き続き実施している文献調査や他の研究者との会合を通じ,今後もより集中的な研究が必要であることを確認している。八重山諸島西表島沿岸部の琉球層群と八重山層群の境界に見られる特異的な柱状風化現象について,砂粒子と間隙材の内部に複数の微生物痕をSEM画像解析によって発見した。また,本境界面で規則的に見られる柱状構造は,室内実験の結果,砂質地盤の乾燥ー湿潤サイクルがもたらした「サンドクラック」に起因すると考えるに至った。更に,現地で複数発生している琉球層群(境界面上側の層)の崩壊が本境界面を起点として発生していることから,八重山層群(境界面下側の層)が過去に受けた風化・生成作用が現代の岩盤崩壊に多分な影響を与えていることが明らかとなった。

一方,岩の風化・生成現象をシミュレーションするために必要なパラメータとして,琉球層群の風化及び生成方向の反応速度係数を実験及びフィールド調査にて得ることに成功し,反応方程式に基づく簡易シミュレーションの結果,計測結果とシミュレーション結果の一致を確認した。ただし,風化に関しては,研究期間の制限から化学的作用のみを考慮している。これと同時に,化学・微生物反応による岩盤風化・生成作用と岩盤崩壊現象を結ぶシミュレーションを実現するために,差分法に基づいた微生物風化・生成反応の反応拡散モデルと有限要素法に基づく破壊力学モデルを結ぶマルチスケール解析法の理論を構築することができた。本研究では,八重山層群および琉球層群において,岩盤の微視領域での化学的・生物学的な反応が巨視領域における岩盤崩落に多分な影響を与え,それらを計算機上でシミュレーションする技術基盤を構築するに至った。本研究では,八重山島嶼沿岸域における露頭岩盤で見られる風化作用に対して,主に微生物風化作用に着目し,フィールド調査と理論シミュレーションによってそのメカニズムの解明に挑んだ。その結果,西表島の沿岸部において岩内微生物による剥離風化を確認するとともに,琉球層群と八重山層群の境界部に柱状の特異な風化形態が発達していることを確認した。また,これらの風化現象を再現できる数理モデルを移流反応拡散理論に基づいて開発した。植物性風化実験やマクロ強度データベースの構築,各種岩盤風化の数理モデル構築に着手することができ,幾つかの数理モデルに関しては,実験値との比較分析で良好な結果が得られている。数理モデルの一般化には至っていないが,本研究達成のために必要な知見やデータは順調に蓄積できていると考えている。当初の研究計画書に沿い,八重山層群,琉球層群における生物学的風化に関するフィールド調査,実験,数理モデルの構築を進める。特に,モルフォロジー理論を積極的に考慮し,フィールド調査・実験結果を数理モデルに導入することを予定している。また,得られた成果は,国内外の学術誌や学術講演会において積極的に発表する。数理モデルに関しては,岩盤の微生物学的・化学的・物理学的風化現象のマルチフィジックスモデルの構築を念頭に入れながら進めていくことを予定している。地圏工学,計算力学当初の研究計画書に沿い,八重山層群,琉球層群における生物学的風化に関するフィールド調査,実験,数理モデルの構築を進める。特に,モルフォロジー理論を積極的に取り入れた展開を予定している。数理モデリングと文献調査に専念したために,国内外の学術会議等参加のための旅費と人件費分を使用しなかったため。国内外の学術会議等参加,および人件費として使用する。
ゲーム論的確率論の予測理論への応用

Vladimir VovkとGlenn Shaferによるゲーム論的確率論は以下の著書でその基礎が与えられた.そこでは,Skepticとよばれる賭をする人と,Realityとよばれる賭の結果を定める人の,二人のプレーヤーの間のゲームを設定することにより,ゲームの結果として確率が定まることが示されている.注目すべきは,測度論無しに,大数の強法則,中心極限定理,重複対数の法則,さらに数理ファイナンスにおける価格付けの諸公式,などが証明される点にある.竹村は,竹内啓,公文雅之との共同研究を通じて,ゲーム論的確率論に関する新たな結果を得ている.これらはtechnical reportとして発表されていたが,研究発表に示すように国際雑誌に刊行の段階となっている.Vladimir VovkとGlenn Shaferによるゲーム論的確率論は以下の著書でその基礎が与えられた.そこでは,Skepticとよばれる賭をする人と,Realityとよばれる賭の結果を定める人の,二人のプレーヤーの間のゲームを設定することにより,ゲームの結果として確率が定まることが示されている.注目すべきは,測度論無しに,大数の強法則,中心極限定理,重複対数の法則,さらに数理ファイナンスにおける価格付けの諸公式,などが証明される点にある.竹村は,竹内啓,公文雅之との共同研究を通じて,ゲーム論的確率論に関する新たな結果を得ている.これらはtechinical reportとして発表されていたが,研究発表に示すように国際雑誌に刊行,あるいは刊行予定の段階となっている.また,最近の研究成果として,堀越による修士論文研究の一環として,以下の研究成果を得た.この研究においては,戦略としてmomentum型の戦略とcontrarian型の戦略を区別し,特に後者の戦略から得られるさまざまな帰結が得られた.Vladimir VovkとGlenn Shaferによるゲーム論的確率論は以下の著書でその基礎が与えられた.そこでは,Skepticとよばれる賭をする人と,Realityとよばれる賭の結果を定める人の,二人のプレーヤーの間のゲームを設定することにより,ゲームの結果として確率が定まることが示されている.注目すべきは,測度論無しに,大数の強法則,中心極限定理,重複対数の法則,さらに数理ファイナンスにおける価格付けの諸公式,などが証明される点にある.竹村は,竹内啓,公文雅之との共同研究を通じて,ゲーム論的確率論に関する新たな結果を得ている.これらはtechnical reportとして発表されていたが,研究発表に示すように国際雑誌に刊行,あるいは刊行予定の段階となっている.また最近の研究成果として,以下の研究成果を得た.この研究においては,複数ステップを考慮したベイズ型戦略の性質を研究し,さらにそれを連続時間の取り引きゲームに応用した.Vladimir VovkとGlenn Shaferによるゲーム論的確率論は以下の著書でその基礎が与えられた.そこでは,Skepticとよばれる賭をする人と,Realityとよばれる賭の結果を定める人の,二人のプレーヤーの間のゲームを設定することにより,ゲームの結果として確率が定まることが示されている.注目すべきは,測度論無しに,大数の強法則,中心極限定理,重複対数の法則,さらに数理ファイナンスにおける価格付けの諸公式,などが証明される点にある.竹村は,竹内啓,公文雅之との共同研究を通じて,ゲーム論的確率論に関する新たな結果を得ている.これらはtechnical reportとして発表されていたが,研究発表に示すように国際雑誌に刊行の段階となっている.
細胞膜のIdentityの構成的理解

細胞膜や細胞小器官など細胞膜のIdentityを規定する分子の候補として、様々な脂質や膜タンパク質などが想定されている。しかしながら、どのような脂質や膜タンパク質が揃えば、細胞膜にIdentityを付与する上で十分な仕組みなのか否か、については、細胞生物学のこれまでの解析手法で証明することができない。そこで、私は本研究課題で、細胞内にリポソームやタンパク質を導入する方法の確立を試みた。その結果、細胞とジャイアントリポソームをエレクトロポレーションにより融合することで、ジャイアントリポソームに内包したリポソームやタンパク質の複合体を細胞内に導入する技術を確立した。細胞膜を構成する脂質分子種は多様であり、それらの分布や機能については不明な点が多い。これまで脂質分子種の機能解析には、脂質代謝酵素をノックアウトしてその表現型を解析する手法が広く利用されてきた。しかしながら、脂質代謝酵素の消失は、脂質代謝に広範な影響を及ぼすため、特定の脂質分子種の機能解析に適していない。そこで本研究課題に於いて、私は特定の脂質分子種を含むリポソームを細胞内に導入し、その細胞応答を観察することにより、1種類の細胞膜脂質の機能を解析する方法論の確立を目指している。この方法を用いて、特定の脂質分子種を特異的に認識し結合するタンパク質の探索や、特定の脂質分子種を含むリポソームが細胞小器官へ経時的に発展する様子を観察したい。今年度は形質膜に豊富に存在するPI(4,5)P2(ホスファチジルイノシトール-4,5-2リン酸)を含むリポソームを作出し、細胞内への導入方法の検討を行った。リポソームに蛍光ローダミン標識したホスファチジルエタノールアミンを少量混和して、細胞内へ導入されたか否かの指標として用いた。具体的に試みた方法としては、細胞内へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび細胞外液の組成を変化させて浸透圧差を利用した細胞内導入法の3種類の導入方法である。今年度は、引き続き導入の条件検討を行う。またPI(4,5)P2は、ホスホリパーゼCのPHドメインなど特異的に結合するタンパク質ドメインが既に知られている。PI(4,5)P2を含むリポソームを細胞内に導入したときに、リポソームを認識してこれらの既知のタンパク質が実際に集積するか否かについても実験を進める。細胞内に導入するリポソームのサイズの検討および導入方法の検討を行った結果、細胞内に導入されたリポソームが観察できるようになった。本研究提案では、生物の持つシステムを構成的に解析し、仮説を検証できる新たな実験系として「生細胞とジャイアントリポソームの簡便な融合法の確立」を提案し、この手法を駆使して、「細胞膜のIdentityの構成的理解」を目指す。細胞とリポソームの融合は、単純に細胞とリポソームを混ぜただけでは起こらない。そこで、本研究提案では電気穿孔法による細胞とジャイアントリポソーム(GUV)の融合を用いる。電気穿孔法は、細胞に電気パルスを与えることで細胞膜に微小な穴をあけてDNAなどを取り込む方法として広く活用されているが、細胞同士を密にコンタクトさせた状態で電気パルスを与えると、細胞膜の穴同士がつながり、高効率に細胞融合を起こしてしまうこと(Electrofusion)が知られている。その点を逆に利用し、電気パルスによって細胞とGUVの融合を起こし、「特定の脂質を含む直径の小さなリポソーム」や「タンパク質の複合体」を内包させたGUVと細胞を融合させることにより、細胞内部にこれらを直接導入することが可能になる。本研究提案では、この細胞内へのリポソームやタンパク質複合体を直接導入する技術を確立することによって、これまでの細胞生物学の解析手法では明らかにできていない、「細胞膜のIdentityがどのようにして決まるのか」という問題を、構成的な解析手法に明らかにすることを目的としている。まずGUVに蛍光色素標識した脂質を含む小さなリポソーム(SUV)を封入したものを作成し、細胞内への導入を試みたが、細胞内でのSUVの蛍光輝度が十分ではなく、その挙動を観察できなかった。そこで、内部空間に量子ドットを封入したGUVを用いて、細胞とGUVの融合、量子ドットの細胞内への導入効率を向上させる条件の検討や導入後の蛍光観察に適した実験系の確立を行った。研究計画通り、GUVと細胞膜の融合を観察することができた。その点を逆に利用し、電気パルスによって細胞とGUVの融合を起こせるのではないかと考えて、本研究提案に先立ち、まばらに培養した細胞の上にGUVをコンタクトさせた状態で電気パルスを与えると、効率よく細胞とGUVの融合を誘導できることを見出した。

この方法を用いることによって、GUVに、あらかじめ試験管内で作成しておいた「特定の脂質を含む直径の小さなリポソーム」や「タンパク質の複合体」を内包させて、細胞と融合させることにより、細胞内部にこれらを直接導入することが可能である。今年度は、本手法を用いることにより、細胞内部に、Qdotを導入して、導入の際のエレクトロポレーターの条件検討ならびに導入したQdotの蛍光を指標に細胞質の流動性の計測を行った。細胞膜や細胞小器官など細胞膜のIdentityを規定する分子の候補として、様々な脂質や膜タンパク質などが想定されている。しかしながら、どのような脂質や膜タンパク質が揃えば、細胞膜にIdentityを付与する上で十分な仕組みなのか否か、については、細胞生物学のこれまでの解析手法で証明することができない。そこで、私は本研究課題で、細胞内にリポソームやタンパク質を導入する方法の確立を試みた。その結果、細胞とジャイアントリポソームをエレクトロポレーションにより融合することで、ジャイアントリポソームに内包したリポソームやタンパク質の複合体を細胞内に導入する技術を確立した。細胞内に導入したローダミン標識した脂質分子を含む蛍光リポソームに、GFPを融合させたタンパク質が集積するか否かについて、ライブイメージングを用いて観察する。また現在の実験に用いているサイズのリポソームは長時間の細胞内での追跡が困難であることから、量子ドットなどをリポソームで被覆して細胞内へ導入する方法について検討を行う。GUVに内包した蛍光脂質やタンパク質を細胞内に導入した後、その動態を継時的に追跡するために、細胞側に様々なプローブを発現させる必要がある。今年度はそのような観察に必要となる細胞株の樹立を進める。細胞生物学リポソームの作成に必要な脂質標品および蛍光標識脂質は、研究室に存在していた古いストックから利用したため、今年度の実験で計上していた物品費の支出が無かった。しかし今年度の使用で脂質標品のストックが枯渇してしまったので、次年度に物品費を使用する。今年度は、GUVと細胞の融合に関する本研究課題の主たる研究成果を遂行するため、来年度分の経費を前倒しして活用した。次年度に、今年度に計上していた物品費を執行する。来年度は、既に確立された樹立した方法および細胞を用いた観察が主となる計画となる。研究代表者の研究室における研究内容や成果報告に関するホームページ
屋久島で独自の進化を遂げたアユ集団の保全生態学的研究

生態に関する情報が限られており、鹿児島県により消滅危惧II類に指定されている屋久島のアユの現在の生息状況、個体群構造、生活史について明らかにした。これまでに生息が確認されている一湊川、宮之浦川、安房川、栗生川、永田川で潜水目視調査を行ったが、調査期間を通じて一湊川、安房川、永田川で成魚を確認することはできなかった。仔稚魚の採集調査を実施したところ、一湊川では少数ではあるが標本が採集されたため、低密度ではあるが依然として個体群は維持されていると考えられた。十分な個体数の得られた宮之浦川と栗生川の仔稚魚標本を用いて遺伝解析を行った。その結果、両河川の個体群間には有意な遺伝的差異がみられ、現在、両河川間の個体の移動はほぼないと考えられた。宮之浦川個体群には、遺伝的に分化したいくつかの系統が認められ、本土産よりは若干低いものの遺伝的多様性がみられた。一方、栗生川個体群では遺伝的多様性は極めて低く、本河川における個体群が小さいことを反映していると考えられた。宮之浦川及び栗生川個体群を対象とし、仔稚魚の耳石による成長解析を行った。その結果、本土のアユに比べて産卵開始時期は11月中旬と遅く、産卵期間はおよそ20日と極めて短いことが分かった。成長率は本土の個体群に比べて最も高く、屋久島の中でも河川間で成長率に違いがみられた。栗生川の方が宮之浦川よりも成長が早く、河口域の環境や餌環境の違いが影響を及ぼしている可能性が示された。同じ低緯度の島嶼である奄美大島に生息するリュウキュウアユとは成長率、海洋生活期間、遡上生態に明瞭な違いがみられた。先行研究により、屋久島でアユの生息が確認されている4河川(一湊川、宮之浦川、安房川、栗生川)で、7月、9月にシュノーケリングによる目視調査を行い、現在の成魚の生息状況について明らかにした。また、12月から3月にかけて、調査が可能であった3河川(一湊川、宮之浦川、栗生川)の河口域及び沿岸域で小型地曳網による仔稚魚の採集を行い、出現状況について明らかにした。今回の調査で、一湊川と安房川で成魚および食み跡は確認されなかった。また、宮之浦川で成魚は確認されたが、生息密度は先行研究に比べて著しく低く、本流の定点ではみられなかった。一方で、栗生川の生息密度は同河川の先行研究の結果、現在の宮之浦川に比べて高く、比較的良好な状態にある可能性が示された(0.4ー1.2/10m2)。仔稚魚は12月に一湊川と宮之浦川、12月から1月に栗生川のそれぞれの河口域で採集された。先述したように一湊川で成魚および食み跡は確認できなかったが、採集数は他の河川に比べて著しく少ないにもかかわらず仔稚魚が採集されたことから(n=4)、資源量は低いが依然として個体群が存在していることが分かった。採集された仔稚魚の発達段階及びサイズ組成から、産卵期は11月末から12月初旬にかけて短期間に集中して行われていると推察された。屋久島のアユと同じ島嶼個体群であり、別亜種であるリュウキュウアユと比較した結果、成魚の生息密度は極めて低く、産卵期は短いことが明らかとなった。当初の研究計画で予定していた屋久島の4河川(一湊川、宮之浦川、安房川、栗生川)で、現在の成魚の生息状況について明らかにすることができた。また、3河川(一湊川、宮之浦川、栗生川)の河口域及び沿岸域で仔稚魚の出現状況について明らかにすることができた。着実にデータが取得できていることから、おおむね順調に進展していると判断した。前年度に引き続き、これまでに屋久島でアユの生息が確認されている3河川(一湊川、宮之浦川、栗生川)で8月に目視調査を行い、成魚の生息状況について明らかにした。また、12月から1月に4河川(一湊川、宮之浦川、栗生川、永田川)の河口域で小型地曳網による仔稚魚の採集を行い、出現状況について明らかにした。前年度、宮之浦川の河口域で採集した仔稚魚の耳石解析結果をもとに、産卵期及び成長率の推定を行った。前年度同様、一湊川で成魚および食み跡は確認されなかったが、採集数は少ないにもかかわらず仔稚魚が採集されたことから(n=3)、資源量は低いが依然として個体群が存在していることが分かった。宮之浦川の最上流の定点1で個体数密度は2.8尾(100平米当たり、以下全て同様)、中流に位置する定点2で3.0尾とそれぞれ推定された。最も下流に位置する定点3では前年度同様、成魚、食み跡ともに確認することはできなかった。栗生川の支流である小楊枝川の一定点で個体数密度は4.0尾と推定された。前年度同様、各定点の個体数密度は、先行研究(5.0-50尾)と比べ著しく低い値を示していた。仔稚魚は12月に一湊川と栗生川、12月、1月に宮之浦川の河口域で採集することができた。耳石解析結果から、産卵期は11月、Biological-intercept法により日間成長率は0.38mmと推定された。

屋久島のアユと同じ島嶼個体群であり、別亜種であるリュウキュウアユと比較した結果、成魚の生息密度は極めて低く、産卵期は短いこと、仔稚魚の成長率はともに低いことが明らかとなった。これまでにアユの生息が確認されていた屋久島の河川で、現在の成魚及び仔稚魚の出現状況について明らかにすることができた。また、仔稚魚の耳石解析結果から、宮之浦川個体群の産卵期、初期成長について推定することができた。着実にデータが取得できていることから、おおむね順調に進展していると判断した。生態に関する情報が限られており、鹿児島県により消滅危惧II類に指定されている屋久島のアユの現在の生息状況、個体群構造、生活史について明らかにした。これまでに生息が確認されている一湊川、宮之浦川、安房川、栗生川、永田川で潜水目視調査を行ったが、調査期間を通じて一湊川、安房川、永田川で成魚を確認することはできなかった。仔稚魚の採集調査を実施したところ、一湊川では少数ではあるが標本が採集されたため、低密度ではあるが依然として個体群は維持されていると考えられた。十分な個体数の得られた宮之浦川と栗生川の仔稚魚標本を用いて遺伝解析を行った。その結果、両河川の個体群間には有意な遺伝的差異がみられ、現在、両河川間の個体の移動はほぼないと考えられた。宮之浦川個体群には、遺伝的に分化したいくつかの系統が認められ、本土産よりは若干低いものの遺伝的多様性がみられた。一方、栗生川個体群では遺伝的多様性は極めて低く、本河川における個体群が小さいことを反映していると考えられた。宮之浦川及び栗生川個体群を対象とし、仔稚魚の耳石による成長解析を行った。その結果、本土のアユに比べて産卵開始時期は11月中旬と遅く、産卵期間はおよそ20日と極めて短いことが分かった。成長率は本土の個体群に比べて最も高く、屋久島の中でも河川間で成長率に違いがみられた。栗生川の方が宮之浦川よりも成長が早く、河口域の環境や餌環境の違いが影響を及ぼしている可能性が示された。同じ低緯度の島嶼である奄美大島に生息するリュウキュウアユとは成長率、海洋生活期間、遡上生態に明瞭な違いがみられた。今年度実施した成魚及び仔稚魚の出現状況に関する調査を継続して実施し、経年的変化について明らかにする。今年度の調査により、現在の屋久島においてアユの生息状況が最も良好な状態にあるのは栗生川であることが明らかとなったため、来年度以降実施する生活史調査は当初予定していた宮之浦川ではなく本河川で実施することにする。成魚の行動(縄張りの形成状況等)、海洋生活期間の推定を行い、得られる結果をもとに、本土のアユ及び同じく島嶼個体群であるリュウキュウアユとの比較を行う。これまでに2年間実施した成魚の出現状況に関する調査を最終年度も継続して実施し、個体数密度の経年変化について明らかにする。現在、アユの生息状況が比較的良好な状態にある宮之浦川と栗生川で成魚の行動(縄張りの形成状況等)、仔稚魚の成長等の初期生活史特性について明らかにする。得られるデータをもとに、本土のアユ及び同じく島嶼個体群であるリュウキュウアユとの比較を行う。
機械および植物と土とのダイナミックな相互作用に関する研究

本年度は、土の動的応答に関する基礎実験を行うとともに、個別要素法を土の挙動解析に適用できるかどうかの試みを行った。植物の根と土との相互作用は土を粒子の集合体とみなして個々の粒子の運動をとらえる個別要素法が計算力学的解析手法として適していると思われる。最初の試みとして、土の粒子を円板でモデル化し、二次元状態で圧縮時の応力変化をとらえてみた。実験結果と定性的には一致したが、数値的には多くの解決しなければならない問題があることを示した。本年度は最終年度にあたるので、これまでの研究成果をまとめて報告書を英文にて作成した。その内容は以下の通りである。第1章緒言、第2章土の力学的特性、第3章土のレオロジー挙動の解析、第4章有限要素法による土の応力緩和現象の表現、第5章有限要素法による車輪の時間依存沈下現象の表現、第6章有限要素法によるラグ車輪のラグと土との相互作用の解明、第7章土の締固めへの変形速度の影響(走行タイヤと土との相互作用)、第8章土のせん断強さへの振動の影響(振動しているタイヤと土との相互作用)、第9章植物の根と土との相互作用解明のための基礎的研究(個別要素法の適用)、第10章結論、参考文献。土の動的な挙動の一つとして、時間依存性を有する粘弾性的な応力-ひずみ関係を取り上げ、砂壌土およびシルト質粘土ロームの応力緩和の実験を行った。試料の含水比と密度を変化させて、試料上部・下部での応力、長さ方向・横方向のひずみ、体積ひずみなどの変化を計測した。この実験結果に基づいて、応力緩和を表現する5要素レオロジーモデルを提示するとともに、この構成方程式を理論的に誘導した。また、機械と土との相互作用を表現するために、上述の粘弾性構成方程式を有限要素法プログラムに組み込み手法を開発し、土の側面拘束状態における応力緩和の有限要素法計算結果と実験結果とを比較し、その有用性を示した。この結果は、International Agrophysics(ポーランド)に掲載された。土の動的な挙動の一つとして,時間依存性を有する粘弾性的な応力-ひずみ関係を取り上げ,中間土の応力緩和の実験を継続して行った。すなわち試料の含水比と密度を変化させて,試料上部・下部での応力,長さ方向・横方向のひずみ,体積ひずみなどの変化を計測した.この実験結果に基づいて,既に提示した応力緩和を表現する5要素レオロジーモデルの各パラメータに対する土の密度および含水比の影響を調べた.これらの効果を考慮した土の構成方程式を機械と土との相互作用を表現するための有限要素法プログラムに組み込めば,機械と土とのダイナミックな相互作用を統一して表現することができる.実験は続行中である.第1章緒言、第2章土の力学的特性、第3章土のレオロジー挙動の解析、第4章有限要素法による土の応力緩和現象の表現、第5章有限要素法による車輪の時間依存沈下現象の表現、第6章有限要素法によるラグ車輪のラグと土との相互作用の解明、第7章土の締固めへの変形速度の影響(走行タイヤと土との相互作用)、第8章土のせん断強さへの振動の影響(振動しているタイヤと土との相互作用)、第9章植物の根と土との相互作用解明のための基礎的研究(個別要素法の適用)、第10章結論、参考文献。
東日本大震災被災者の生活再建に関する調査研究（釜石市と多賀城市を中心にして）

この研究は、東日本大震災・津波の被災者の生活再建のプロセスを中心に、いくつかの側面から調査研究を実施することを目標とした。対象としたのは、岩手県・宮城県の沿岸部である。まず、津波の被災者に対して、3・11の経験の実態、その後の生活の変化、住宅再建の希望や地域社会への要望等について、複数回の継続的なインタビューを実施した。さらに、東北地方の約300人の大学生にアンケート調査を実施し、震災復興に関する意識を探った。具体的には、大学生の震災津波経験の実態、ボランティア活動、学習ニーズ、意識等を尋ねた。本研究は、東日本大震災(特に津波被災者)によって大きな問題に直面する被災者に焦点をあて、異なる地域性を有する2つの都市(岩手県釜石市と宮城県多賀城市)を調査対象者に選び、継続的インタビュー調査を通じて、個々の被災者が生活を再建し、地域社会に位置づくプロセスを明らかにすることを目的とした。研究2年目の平成25年度は、当初の予定通り、3つの調査を並行して実施したが、特に「A釜石調査」を先行的に実施した。今回も前年度の研究を継続して、調査対象地である岩手県釜石市に赴き、復興状況の確認と、仮設住宅の立地場所の確認を行った。さらに、釜石と市域を接している大槌町、さらに北部に位置する山田町の復興状況の確認と資料収集を行った。特に、今年度は震災復興を象徴する重要なイベントを観察することに重点をおいた。具体的には、2013年9月に実施された「釜石よいさ」祭り、2014年3月の大規模ショッピングセンター「釜石イオンタウン」のオープン時に訪問した。また、「C学生に対するアンケート調査」は、平成24年に実施したものを高橋が中心になって集計し、第1次報告として報告書にまとめた。研究1年目の平成24年度は、当初の予定通り、3つの調査を並行して実施したが、特に「A釜石調査」を先行的に実施した。釜石インタビュー調査は、研究代表者の高橋と分担者の今野が担当した。まず、調査対象地である岩手県釜石市に赴き、今後の本格的な調査に向けて、復興状況の確認と、仮設住宅の立地場所の確認を行った。釜石市の津波被災者については、複数名のインタビュー調査を開始しており、仮設住宅の役員を務める方、仮設住宅にお住まいの方、新たに自宅を再建された方、勤め先が被災した方などにお話を伺った。平成24年度は「A釜石調査」に時間を割いて実施したため、「B多賀城調査」については、現地視察と資料収集を中心に行った。「C学生に対するアンケート調査」は、高橋が中心となって調査票の原案を作成し、研究会を実施して調査計画を確定した。所属する3大学(仙台白百合女子大学、山形大学、秋田大学)で調査票を配布し、250人以上の回答を得た。平成26年度は、釜石市と多賀城市の調査を継続しつつ、釜石市を重点的に実施した。釜石市に赴き、復興状況の確認と、仮設住宅から復興公営住宅の建設状況を視察した。被災者に対する聞き取りを継続的に実施し、生活再建のプロセスを把握することに努めた。当初の計画では、研究代表者・分担者の所属する大学で、複数回の学生アンケート調査を実施する予定であったが、今年度は実施しなかった。その代わりに、学生とともに、宮城県内で被災者支援を行っている市民活動団体等の現在の状況を把握し、いくつかの聴き取りを実施した。3年の研究期間中の釜石市・多賀城市への定期的な視察を通じて、震災発生当時の復興予測から、住宅等のインフラ再建が大幅に遅れていることを観察できた。特に釜石市では、中心市街地の復旧が本格化しておらず、個人商店主のなかには再建の方針をいまだに確定できない人々もいる。また、周辺自治体との復興の進捗状況には大きな差があり、将来的に地域間格差につながる可能性が高いと思われる。釜石市・多賀城市ともに、3・11という未曾有の災害を経て、発生以前の状態の復旧とは異なった、新たなまちづくりを推進しようとしている。特に釜石市では、ラグビー・ワールドカップの開催、世界遺産への登録の可能性等、大規模予算を必要とする事業が予想されるが、遅れている浸水地域の住宅建設等とどのように折り合いをつけ、住民の気持ちをまとめていくのかが課題であろう。

研究代表者・分担者は、本研究で得られた基礎的な研究にもとづいて、釜石市・多賀城市の復興まちづくりの研究をさらに発展させる予定である。社会学平成24年度当初の計画では、「A.釜石調査」、「B.多賀城調査」、「C.学生アンケート調査」の3つの調査を並行して実施することにしていたが、最も力を注いでいるのは、「A.釜石調査」である。釜石では、「釜石イオンタウン」の出店という新たな要素が加わったため、個人に対するインタビューだけでなく、まちの復興そのものも調査研究の対象に加えた。また、「C.学生アンケート調査」では、平成24年度内に調査を実施した調査票を集計し、その結果(第1次)を報告書にまとめた。感想等を自由に書ける「自由記述」欄への記述率が高く、内容も充実した回答が多かったため、調査実施の意義があったと思われる。一方、上記2つを重点的に取り組んだため、「B.多賀城調査」は、現在、資料収集や震災復興の視察を中心に行っており、本格的な調査には着手できていない。このことから、当初の予定よりも「やや遅れている」と評価した。平成24年度当初の計画では、「A釜石調査」、「B多賀城調査」、「C学生アンケート調査」の3つの調査を並行的に実施することにしていた。だが、実際に研究に着手したところ、調査協力者との日程調整や、研究代表者の研究従事時間の配分などを考慮し、「A釜石調査」を先行的に実施することにした。「B多賀城調査」は、平成25年度以降に取り組むものの、3年という研究期間のなかで、「A釜石調査」にいっそう力点を置く必要があると感じている。優先的に取り組んだ「A釜石調査」については、計画通り順調に進んでいる。本研究の特徴でもある継続的インタビューにより、数ヶ月間隔でインタビュー対象者(調査協力者)にお会いするなかで、生活再建に向けた被災者の行動や意識の変化をその都度確認することができている。「B多賀城調査」は、被災者のインタビュー調査に着手しなかった。被災地域の地理的・地域的特性を考え、今後は支援団体や事業所の調査に重点をおく必要があると考えている。「C学生アンケート調査」では、研究代表者・分担者の所属する3つの大学で、1年生を中心に調査票調査を実施した。単に数量的に処理するよりも、率直な意見を寄せてもらうことを重視し、自由記述欄を設けたところ、多くの意見が寄せられている。東北地方にある大学として、震災復興に関する学生の意見を把握するだけでなく、そうした意見を今後の大学教育に活かすことができる点で、大きな成果となるであろう。研究の3年目(最終年)として、引き続き、「A釜石調査」、「B多賀城調査」、「C大学生調査」の3つの調査を実施する。「A釜石調査」については、初年度に実施したインタビュー調査の協力者に、あらためてインタビューを行う予定である。さらに、周辺の大槌町・山田町を引き続き訪問し、「復興ツーリズム」事業のあり方を検討することにしたい。「B多賀城調査」については、「地域調査」の側面を重視し、事業所の復興状況に関する実態把握や、多賀城市の復興計画の具体化に伴う空間編成に着目して調査を実施する。ここでも、「復興ツーリズム」への取り組みをあわせて把握したい。「C大学生調査」では、2回目の調査票調査を実施したいと考えている。それぞれの大学で100名以上の回答が得られるよう計画的に実施していきたい。
キラルカルバニオンからの不斉転写によるアレン誘導体のエナンチオ選択的合成法の開発

γ-ブロモ-α,β,γ,δ-不飽和アシルシランに,相間移動触媒としてシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させると,2-シアノ-2-シロキシビニルアレンが最大エナンチオマー比79:21で得られた.本反応は,カルボニル基へのシアニドイオンの求核付加/Brook転位/ブロモ基の1,4-脱離を経て進行しているが,脱離の際にC-Si結合とC-Br結合がsyn配置を取っていることも明らかになった.キラルな臭化アンモニウム誘導体とKCNの組合せが,キラルなシアニドイオン源になり得るという知見は興味深く,今後の更なる展開が期待される.γ-ブロモ-α,β,γ,δ-不飽和アシルシランに,相間移動触媒としてシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させると,2-シアノ-2-シロキシビニルアレンが最大エナンチオマー比79:21で得られた.また,この反応の立体過程を明らかにするために中間体であるシリルアルコールの単離を検討したが,不可能であった.これはシアノ基のα-カルバニオン安定化能に起因するBrook転位の加速によるためと考えられたので,シアニドイオンに換えて安定化能に乏しいヒドリドに着目した.α位にキラリティを持つキラルリチウムアミドからのヒドリド転位を利用して,Brook転位を経由する1,4-脱離反応の立体過程を検討した.その結果,シリケート中間体において切断される炭素-ケイ素結合と炭素-臭素結合が同じ向きを向いた配座から進行するsyn-1,4-脱離で進行していることが明らかになった.シリルアルコールの単離を目的に,脱離基を持たないアクリロイルシランを同様の反応に付したところ,シリルアルコールは単離できなかったものの,O-シリルシアノヒドリン誘導体が最大エナンチオマー比86:14で得られた.このことから,Brook転位で発生させたキラルニトリルカルバニオンを完全にラセミ化する前に水で捕捉可能であることが明らかになった.以上の結果は,キラルな臭化アンモニウム誘導体とKCNの組合せが,キラルなシアニドイオン源になり得るという新規な知見を与えるもので,今後の更なる展開が期待される.γ-ブロモ-α,β,γ,δ-不飽和アシルシランに,相間移動触媒としてシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させることにより,光学活性なアレン誘導体が得られ,またその立体過程についても明らかにすることができた.反応機構に関する検討を行う過程で,アシルシランからBrook転位によって発生させたキラルニトリルカルバニオンを水によって捕捉可能という新規知見も見出した.当初の目的からの若干の軌道修正はあったものの,十分な成果をあげることができたと考えている前年度までに,γ-ブロモ-α,β,γ,δ-不飽和アシルシランに相関移動触媒としてシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させると,アシルシランへのシアニドイオンの付加/Brook転位/1, 4-脱離反応を経て2-シアノ-2-シロキシビニルアレンが最大エナンチオマー比79:21で得られることを報告した.本年度は,本反応の立体過程を完全に明らかにするために,シアニドイオンが付加した後にBrook転位が起こる前にプロトン化されたシリルアルコールの単離を検討した.種々条件を検討したが,本基質から生成するシリルアルコールを単離することはできなかった.そこで,脱離基を持たない種々のアシルシランにおいてシリルアルコールが単離できるかどうかを検討した.その結果,ほとんどの場合,Brook転位が起こった後のO-シリルシアノヒドリン誘導体が生成したが,無水条件下,3-(benzyloxy)-1-(tert-butyldimethylsilyl)propan-1-oneを基質として用いた場合にラセミ体ではあるが,シリルアルコールが得られることが明らかになった.さらにこのシリルアルコールを水酸化ナトリウム水溶液で処理すると瞬時にO-シリルシアノヒドリンとなることも確認した.今後,キラルカラムにより単離した片方のエナンチオマーと,これを原料にして得られたO-シリルシアノヒドリンの絶対構造を決定することにより,反応の立体過程を明らかにすることが可能である.また,その過程において,アシルシランを二層系溶媒中キラルな臭化アンモニウム誘導体とKCNで処理することにより,光学活性なO-シリルシアノヒドリン誘導体が得られるという興味深い知見が得られたのであわせて検討した.この時,隣接位に三重結合を有すると,三重結合の末端でプロトン化されたアレンが得られることも明らかになった.γ-ブロモ-α,β,γ,δ-不飽和アシルシランに,相間移動触媒としてシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させると,2-シアノ-2-シロキシビニルアレンが最大エナンチオマー比79:21で得られた.本反応は,カルボニル基へのシアニドイオンの求核付加/Brook転位/ブロモ基の1,4-脱離を経て進行しているが,脱離の際にC-Si結合とC-Br結合がsyn配置を取っていることも明らかになった.キラルな

臭化アンモニウム誘導体とKCNの組合せが,キラルなシアニドイオン源になり得るという知見は興味深く,今後の更なる展開が期待される.アシルシランにシンコナアルカロイド由来の四級アンモニウム塩存在下,二層系溶媒中KCNを反応させた場合の面選択性およびBrook転位の立体過程を明らかにする.また,Brook転位を経由する光学活性なO-シリルシアノヒドリン誘導体合成法を確立する.また,光学活性なアレン合成についても引き続き検討を行う.有機合成化学新規に合成した化合物に適した液体クロマトグラフィー用の分析用キラルカラムを購入する必要が生じたため.計画通り分析用キラルカラムを購入するとともに,研究の進捗状況に応じて,セミ分取用カラムの購入も視野に入れる.
神経膠芽腫幹細胞の代謝特性の解明

神経膠腫幹細胞の代謝特性及び分子背景を解析し、治療標的となりうる代謝関連因子の同定を目標として研究を行った。具体的には、悪性神経膠腫のマウスモデルを用いて、解糖経路を利用する腫瘍幹細胞及びTCA回路を利用する腫瘍幹細胞を樹立し、代謝特性の解析を行った。その結果、各々の幹細胞分画について利用する基質及び代謝特性を規定する酵素群を同定した。さらに、TCA回路を利用する神経膠腫幹細胞が低酸素の条件下では柔軟に代謝経路を変えることができ、代謝可塑性を有することを見出した。癌幹細胞は腫瘍再発の責任細胞として知られている。再発率が高く、生存期間が2年に満たない膠芽腫では、その幹細胞がDNA損傷修復能、薬剤排出能とも高いため、現行の治療ではそれらを根絶することが不可能である。申請者はこれまでの研究で、膠芽腫幹細胞(Glioma stem cells:GSC)が二つのエネルギー産生経路を利用することができ、それらの代謝経路が正常脳・腫瘍組織の中でも極めて特徴的であることを見出した。さらに、それぞれの代謝経路を利用するGSCのモデル細胞の樹立に成功した。本研究ではGSCの代謝特性の分子基盤を詳細に解析し、膠芽腫幹細胞のエネルギー産生を規定し、治療標的となりうる代謝関連因子を同定することを目標としている。初年度の平成26年度では、HRasV12-dsRED発現マウスGSCよりエネルギー代謝経路の異なる分画をフローサイトメトリーにて分取する方法を確立した。酸化ストレスマーカー及び代謝産物の蛍光標識類縁体によるソーティングを行った場合、増殖速度の違いに伴う代謝速度の差異は認められたが、代謝経路の違いは認められなかった。一方、細胞内酸素化状態を反映するマーカーによるソーティングでは代謝経路の異なる分画の単離に成功した。ソーティングにて分取・樹立したGSC分画は糖消費、乳酸産生などの細胞外代謝産物フラックスが有意に異なっていた。また、GSC分画をマウスの脳内に移植した際、腫瘍形成能、血管新生にも有意差が認められた。本研究ではGSCの代謝特性の分子基盤を詳細に解析し、膠芽腫幹細胞のエネルギー産生を規定し、治療標的となりうる代謝関連因子を同定することを目標とした。本年度では代謝特性の異なるGSC 2種類について主に二つの解析を行い、以下の結果が得られた。1代謝経路、悪性度の規定因子を同定するため、樹立した2種類のマウスGSCのマイクロアレイ解析よりgene set enrichment analysis(GSEA)法を用いて、各々の分画において発現が他細胞群より3倍以上変動している代謝関連遺伝子を同定した。次にウェウスターンブロットを用いて、同定した因子の発現がタンパクレベルでも変動していることを確認し、2種類のGSCの間で発現が有意に異なる解糖系関連酵素を同定した。2前年度に確立したソーティング法を用いて、マウス膠芽腫由来のGSCから代謝経路の異なる分画を樹立した。乳酸産生測定にて分取の成功が確認されたが、その後、長期培養によって、酸化的リン酸化を利用する分画の代謝特性が変わることが明らかになった。代謝が柔軟に変えられる分画に注目し、解析を進めたところ、GSC代謝可塑性を誘導する条件として低酸素を同定し、さらに低酸素時のGSCの代謝プロファイルを明らかにした。代謝可塑性の制御因子の候補も探索し、浮かび上がった第一候補についてRNAiを用いた実験を開始した。本研究では膠芽腫幹細胞の代謝特性を解明すると同時に、エネルギー産出経路の規定因子を同定することを最終目標としています。本年度ではまず、培養中のマウス膠芽腫幹細胞の代謝経路の違いを簡便に検出できる方法を確立した。また、本年度は具体的な目標であった、エネルギー代謝経路、腫瘍形成能、悪性度の異なるGSC分画の樹立に成功した。以降の研究では同様の方法を用いることによって、ヒト膠芽腫幹細胞からの代謝経路別分画の樹立が期待できる。がん前年度に確立したソーティング法を用いて、ヒト膠芽腫由来のGSCからも代謝経路、腫瘍形成能の異なる分画を樹立する。代謝経路、悪性度の規定因子を同定するため、樹立したマウスGSC2種類、ヒトGSC2種類からRNAを抽出し、マイクロアレイ用のサンプルを調整する。

マイクロアレイ解析後、特定のパスウェイに関連した遺伝子群が抽出可能なgene set enrichment analysis(GSEA)法を用いて、各々の分画において発現が他細胞群より3倍以上変動している代謝関連遺伝子を選定する。次に各分画より細胞内代謝産物を抽出・固定し、CE-TOFMSを用いたメタボローム解析を行い、GSCにおいて細胞内畜産量が特異的に増加・低下しているメタボライトを探索する。最後に、マイクロアレイで同定した遺伝子の中からさらに、CE-TOFMS解析で特定したメタボライトを制御する遺伝子を選び、GSC代謝の制御因子候補とする。同定した因子について阻害剤、遺伝子改変操作による機能阻害実験を行い、GSCの代謝、生存、腫瘍形成能への影響を評価する。さらに、マウスの病理標本・髄液・血液サンプルの定性的・定量的解析を行い、同定した因子がGSCのバイオマーカーとして適しているかどうか検証する。有用性の高いものについてはPETトレーサを作成し、マウスの脳内に形成させた腫瘍のイメージングを行い、その実用性を評価する。最後に、動物モデルを用いて、同定した因子に対する阻害剤を投与する実験を行う。GSCを定位的にマウスの脳内に移植し、腫瘍サイズの推移及びマウスの生存期間を測定し、阻害剤の効果を評価する。