hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
食細胞特異的シトクロームb_<558>によるスーパーオキシド生成とその調節機構

殺菌に関与する食細胞NADPHオキシダーゼの本体は細胞膜に存在するシトクロームb_<558>(gp91^<phox>とp22^<phox>の2つのサブユニットから成る)であり、その活性化には2つの細胞質因子(p47^<phox>とp67^<phox>)が移行してシトクロームb_<558>と相互作用する必要があるが、活性化の分子機構は殆ど解っていなかった。本年度は以下のことを見いだした。(1)gp91^<phox>にNADPH結合部位が存在すること。(2)シトクロームb_<558>と細胞質因子の相互作用は、p47^<phox>(2つのSH3ドメインをもつ)とp22^<phox>の結合によるが、これはp47^<phox>のN末側SH3ドメインとp22^<phox>細胞質領域のプロリン・リッチ領域(PRR)の結合を介しておこり、高親和性でかつ極めて特異的なものであること。また、この結合がNADPHオキシダーゼの活性化に必須であり、活性化のON/OFFを担うと考えられること。(3)p47^<phox>のC末端領域が負の調節領域であること(p47^<phox>のSH3ドメインは、自身のC末端領域によりmaskされており、活性化に伴いunmaskされ標的蛋白質-p22^<phox>-と結合できるようになる)。(4)p47^<phox>とp67^<phox>の相互作用は、主としてp67^<phox>のC末側SH3ドメインとp47^<phox>C末端部分のPRRとの結合によること。(5)p40^<phox>(オキシダーゼのmodulator)は休止時細胞でp67^<phox>と会合しているが、この結合は、新奇なドメイン間の全く新しいタイプの蛋白質間相互作用によるものであること。また、この新しいタイプのドメインが酵母のシグナル伝達蛋白質にも存在し、同様の蛋白質間相互作用が酵母のシグナル伝達系でも重要な役割を果たすこと。
頚髄症に対する手術法の評価手法確立のための頸椎構造強度解析装置の開発と頸椎の動作解析

本研究は頸椎の粘弾性的特性を考慮して,変形速度制御が可能,かつ純粋なトルクを試料に負荷できる試験装置を試作したものである.装置は,二台のACサーボモータ,X軸およびY軸方向の動きに対応したXYステージおよび二台のZステージの動作の組み合わせによって6自由度の動きを実現している.例えば,Y軸回りの回転力を試料に与え時に生じる各軸方向の反力を,X, Y及びZステージを駆動させることで制御している.試験装置の試作・動作実験に基づく可動部の軽量化等および反力の制御方法の改善を行うと共に,試験装置の有効性を頸椎模型および豚頸椎を用いて実験的に検証した.I.頸椎模型による実験結果:1)多方向の反力を同時に0とする制御を行った場合,1方向の反力がキャンセルされても,他の方向の反力が大きく出る場合があり,その結果試料に曲げトルク以外の負荷を与えてしまう場合がある.この結果より,1方向のみの反力のキャンセル性能を重視するのでなく、全体としての釣り合いが重要である.II.豚頸椎による実験結果1)首を前屈させた場合:首を曲げる動作以外の動き(例えば頸椎の軸方向あるいはそれと直角方向の反力)を拘束すると,各反力を0とした場合と比較して曲げトルクが約3倍程度上昇する.この結果は,本装置が頸椎の単純曲げを可能にしていると推定できる.2)頸椎の軸方向に圧縮荷重を加えた場合:これは,自動車停止時に後ろから衝突された時のシートから突き上げられる状態を想定しており,むち打ち症の解明を目的としている.この実験結果と1)の首の前屈の結果を比較すると,より首を曲げよとする反力が大きくなっている.これは,むち打ち症は単に衝突方向のみに衝撃力が作用しているではなく,衝撃力がシートなどに伝播し,背骨が頸椎を突き上げるないしは頭の重量で圧縮力が働くと同時に首を曲げる衝撃力が作用すると考えるほうが妥当であることを示唆している.本研究は頸椎の粘弾性的特性を考慮して,変形速度制御が可能,かつ純粋なトルクを試料に負荷できる試験装置を試作したものである.装置は,二台のACサーボモータ,X軸およびY軸方向の動きに対応したXYステージおよび二台のZステージの動作の組み合わせによって6自由度の動きを実現している.例えば,Y軸回りの回転力を試料に与え時に生じる各軸方向の反力を,X, Y及びZステージを駆動させることで制御している.試験装置の試作・動作実験に基づく可動部の軽量化等および反力の制御方法の改善を行うと共に,試験装置の有効性を頸椎模型および豚頸椎を用いて実験的に検証した.I.頸椎模型による実験結果:1)多方向の反力を同時に0とする制御を行った場合,1方向の反力がキャンセルされても,他の方向の反力が大きく出る場合があり,その結果試料に曲げトルク以外の負荷を与えてしまう場合がある.この結果より,1方向のみの反力のキャンセル性能を重視するのでなく、全体としての釣り合いが重要である.II.豚頸椎による実験結果1)首を前屈させた場合:首を曲げる動作以外の動き(例えば頸椎の軸方向あるいはそれと直角方向の反力)を拘束すると,各反力を0とした場合と比較して曲げトルクが約3倍程度上昇する.この結果は,本装置が頸椎の単純曲げを可能にしていると推定できる.2)頸椎の軸方向に圧縮荷重を加えた場合:これは,自動車停止時に後ろから衝突された時のシートから突き上げられる状態を想定しており,むち打ち症の解明を目的としている.この実験結果と1)の首の前屈の結果を比較すると,より首を曲げよとする反力が大きくなっている.これは,むち打ち症は単に衝突方向のみに衝撃力が作用しているではなく,衝撃力がシートなどに伝播し,背骨が頸椎を突き上げるないしは頭の重量で圧縮力が働くと同時に首を曲げる衝撃力が作用すると考えるほうが妥当であることを示唆している.頸椎の動作解析や屈曲に対する剛性等を明らかにするために、頸椎構造強度解析装置の設計・製作を行った。本装置の構成は、y軸、z軸に関する回転を受け持つACサーボモータ、x軸に関する回転を実現する2台のzステージ、x軸、y軸およびz軸方向の変位に対するx-yステージおよび2台のzステージからなっている。すなわち、6自由度の動作解析試験装置であり、単一トルクあるいはモーメントに対応した曲げ剛性等を計測するものである。例えば、実際の頸椎を屈曲させた場合、頸椎は単純曲げに近い挙動をとるものと思われるが、両端を固定した試験機では指定した軸に関するトルク以外のトルクや反力を生ずる。この現象を回避するには、指定した軸以外のトルクや反力を検知し、それをキャンセルする変位角や変位を与えることが必要である。y、z軸にはそれぞれトルク計を、x軸に関するトルクおよびx、y、z軸方向の反力の測定には、半導体ひずみゲージを使用した自作の力センサーを使用した。本装置の性能評価のために、頸椎模型を製作し、頸椎の屈曲、すなわちy軸に関するトルクを与えた場合の実験を行い、以下の知見を得た。1)頸椎の屈曲(y軸に関する曲げ)時に作用する最大の反力は、x軸方向の反力であった。2)反力をキャンセルする制御(負荷フィードバック制御)によって、屈曲による剛性は約50%低減した。3)数方向の負荷フィードバック制御を行う場合には、1方向のみの反力のキャンセル性能を重視するよりも、反力(トルク)全体をバランス良く低減させることが重要である。

力センサのノイズの低減等の問題があるが、装置としては仕上げ(詰め)の段階にあり、平成17年度は本装置を用いた頸椎の各種動作実験を行う予定である。本研究は頚椎の粘弾性的特性を考慮して,変形速度制御が可能,かつ純粋なトルクを試料に負荷できる試験装置を試作したものである.前年度(平成16年度)に引き続き反力の制御方法の改善,可動部の軽量化等の装置の改善を行うと共に,試験装置の有効性を頸椎模型および豚頚椎を用いて実験的に検証した.装置は,二台のACサーボモータ,X軸およびY軸方向の動きに対応したXYステージおよび二台のZステージの動作の組み合わせによって6自由度を実現している.例えば,Y軸回りの回転力を試料に与え時に生じる各軸方向の反力を,X, Y及びZステージを駆動させることで制御している.紙面の都合上豚頚椎を用いた実験結果のみを説明する.1)首を前屈させた場合:首を曲げる動作以外の動き(例えば頸椎の軸方向あるいはそれと直角方向の反力)を拘束すると,各反力を0とした場合と比較して曲げトルクが約3倍程度上昇する.この結果は,本装置が頸椎の単純曲げを可能にしていると推定できる.2)頸椎の軸方向に圧縮荷重を加えた場合:これは,自動車停止時に後ろから衝突された時のシートから突き上げられる状態を想定しており,むち打ち症の解明を目的としている.この実験結果と1)の首の前屈の結果を比較すると,より首を曲げよとする反力が大きくなっている.これは,むち打ち症は単に衝突方向のみに衝撃力が作用しているではなく,衝撃力がシートなどに伝播し,背骨が頚椎を突き上げるないしは頭の重量で圧縮力が働くと同時に首を曲げる衝撃力が作用すると考えるほうが妥当であることを示唆している.
表皮ランゲルハンス細胞におけるIgE依存性T細胞活性化とその抑制

ヒト表皮ランゲルハンス細胞に発現される高親和性IgEレセプターによるT細胞活性化のメカニズムを研究する目的にて、マウスにおける実験系の検討を行った。BALB/cマウス、C3H/henマウス及び、Nc/Ngマウス(アトピー性皮膚炎様皮疹を発現するマウス-順天堂大学;免疫学;羅先生より供与)の3系のマウスを用い、耳介皮膚よりトリプシン処理にてランゲルハンス細胞を含む表皮細胞を回収した。この細胞浮遊液にたいし、抗マウスIgEレセプター抗体、抗マウスクラスII抗体(I-A^d,I-A^ketc.)をもちいた3color FACScanを行ったところ、マウスランゲルハンス細胞上には高親和性IgEレセプターの発現を認めなかった。ヒト表皮ランゲルハンス細胞で高親和性IgEレセプターの発現を誘導するIL-4の投与によってもマウス表皮ランゲルハンス細胞には細胞膜表面への高親和性IgEレセプターの発現は誘導されなかった。次にマウス表皮細胞浮遊液よりRNAを抽出、RT-PCRにてRNAレベルでの高親和性IgEレセプターα、β、γ鎖の発現を検索したが、上記3系のマウスでは、γ鎖のみが発現されており、α、β鎖の発現は認められなかった。以上より、マウスランゲルハンス細胞には、高親和性IgEレセプターはRNAレベルでも発現されておらず、マウスを用いた実験系ではそのT細胞調節機能の検討は困難であることが確認された。今後手術時のヒト皮膚を用いた実験系を検討したい。
必須因子のみからなる生体外タンパク質合成系の構築

前年に引き続き必須因子のみからなる生体外タンパク質合成系(PUREシステム)を用いてtmRNAというRNA分子が引き起こすトランストランスレーションのメカニズムの解明を行った。トランスレーション反応には機能未知なSmpBというタンパク質が関与しており、前年までの研究成果によりこのタンパク質が、tmRNAのアミノアシル化の効率を促進している、アラニルtmRNAがリボソームのエントリーに不可欠であるという二つの機能を有しているという結果を得た。通常の翻訳系において、アミノアシルtRNAのリボソームへのエントリーにはEF-Tuという翻訳因子がその役割を果たしているということが知られているがアラニルtmRNAのリボソームエントリーに関してはこのEF-Tuが関与しているという直接的な証拠は得られていない。そこで、終止コドンを欠いたジヒドロ葉酸還元酵素をコードするmRNAを調製し、これを翻訳させた後、終止コドンの手前で翻訳が止まってしまった複合体を超遠心によって調製し、これに対し、EF-Tuの存在下、非存在下、そしてEF-Tuの機能を阻害することが知られている抗生物質キロマイシンの存在下においてそれぞれアラニルtmRNAがリボソームにエントリーするかどうかを観察した。その結果いずれの反応系においても同程度にアラニルtmRNAがリボソームにエントリーするという結果が得られ、アラニルtmRNAのリボソームエントリーにはEF-Tuが必要でないことが明らかになった。さらに、クロスリンキングの実験によってEF-Tuが通常のアラニルtmRNAには結合することが可能であるが、SmpBの存在下においてはEF-Tuがもはや結合しないという結果が得られ、SmpBがEF-Tuの結合を阻害しているという事が明らかとなった。
大量データの高速処理のための超並列永続プログラミング言語の研究

超並列計算機のためのプログラムを従来の言語で書く場合,単にプログラミングが困難であるだけでなく,特定のアーキテクチャに合わせて書かれたプログラムの移植性の問題がある.本研究では,ファイルアクセス手続きを隠蔽し,主記憶中のオブジェクトも二次記憶中のオブジェクトも同様に操作できる永続プログラミング言語と超並列プログラミング言語を統合する,超並列永続プログラミング言語の研究を行った。プログラムの目からはディスクが物理的に分散していることが隠蔽され,それらのから検索された多数の永続オブジェクトを多数のCPUで並列に処理する部分に専念することができる.しかし,分散メモリ型並列計算機を活用するためには,並列度の向上のためのCPU負荷の均一化や,通信の軽減が必要である.ディスク上にあるデータを処理の対象とする場合,処理対象の数やトポロジが実行時まで不定あり,さらに、ファイルに対するオブジェクトの挿入,削除,更新などの操作は,負荷の不均一性をさらに増す原因となる.そこで,本研究ではこれらの予測不可能な状況に対する動的負荷分散の方法として,オブジェクトの動的再配置による負荷分散を検討した.その結果,負荷の情報をなるべく小さくコストで実行時に採取しておき,それを用いてオブジェクトの再配置を行う方式として,オブジェクト数による再配置,外部参照頻度による再配置,特殊な参照関係を局所化する再配置,の3つを提案することができた.また,実験によりそれぞれの方式がうまく働くための条件を得ることができた.超並列計算機のためのプログラムを従来の言語で書く場合,単にプログラミングが困難であるだけでなく,特定のアーキテクチャに合わせて書かれたプログラムの移植性の問題がある.本研究では,ファイルアクセス手続きを隠蔽し,主記憶中のオブジェクトも二次記憶中のオブジェクトも同様に操作できる永続プログラミング言語と超並列プログラミング言語を統合する,超並列永続プログラミング言語の研究を行った。プログラムの目からはディスクが物理的に分散していることが隠蔽され,それらのから検索された多数の永続オブジェクトを多数のCPUで並列に処理する部分に専念することができる.しかし,分散メモリ型並列計算機を活用するためには,並列度の向上のためのCPU負荷の均一化や,通信の軽減が必要である.ディスク上にあるデータを処理の対象とする場合,処理対象の数やトポロジが実行時まで不定あり,さらに、ファイルに対するオブジェクトの挿入,削除,更新などの操作は,負荷の不均一性をさらに増す原因となる.そこで,本研究ではこれらの予測不可能な状況に対する動的負荷分散の方法として,オブジェクトの動的再配置による負荷分散を検討した.その結果,負荷の情報をなるべく小さくコストで実行時に採取しておき,それを用いてオブジェクトの再配置を行う方式として,オブジェクト数による再配置,外部参照頻度による再配置,特殊な参照関係を局所化する再配置,の3つを提案することができた.また,実験によりそれぞれの方式がうまく働くための条件を得ることができた.
溶岩流の流動モデルを火道側に発展させた非爆発的噴火の噴火・流動結合モデルの開発

パホイホイ溶岩は複数の冷却ユニットを持つため、その挙動を理論的にうまく説明したモデルはなかった。そこで本研究では、マグマを模擬した流体(パラフィン)を用いて室内実験を行うことで、次のような新たな物理モデルを構築した:(1)toeは冷却の殻が成長するまで粘性流体として流動する。(2)溶岩の流入が続いていても、殻が成長すると先頭が停止する。(3)行き場を無くした溶岩は膨張(インフレーション)し、内部に過剰圧を蓄える。(4)これが殻の強度を超えると、新しい流れユニットを作る。この物理モデルは実験結果だけでなく、ハワイの溶岩流のtoeやlobeのサイズ分布をうまく説明できた。その結果、パホイホイ溶岩流がなぜ全体として一つの流体のように振舞うかが、初めて理論的に明らかになった(Miyamoto and Crown, 2006)。全体として一つの流体として振る舞うのであれば、地形の影響を適切に考慮した数値流体モデルを用いた検討が重要となる。そこで数値発散を押さえて現実的な計算コストで地表面を流れる流体の数値モデルを開発した(Miyamoto et al., 2007)。複数の冷却ユニットを持つパホイホイ溶岩の挙動を、理論的にうまく説明したモデルはない。そこでマグマを模擬した流体(パラフィン)を用いて室内実験を行うことで、新たな物理モデルの構築を目指した。一つの冷却ユニットを持つ比較的小さな構造をtoeとし、それが重なり合ってできる構造をlobeと定義した上で、次のようなtoeとlobeの形成モデルを構築した:(1)toeは冷却の殻が成長するまで粘性流体として流動する。本研究の平成17年度の実績として、この物理モデルが実験結果だけでなく、ハワイの溶岩流のtoeやlobeのサイズ分布をうまく説明できる事を示し、パホイホイ溶岩流がなぜ全体として一つの流体のように振舞うかを初めて理論的に明らかにした(なお、この内容をまとめた論文はJournal of Volcanology and Geothrmal Researchで現在改訂中)。ところで、この理論モデルによって、溶岩チューブが重要な役割を果たすことが示唆された。従来溶岩チューブは発見が難しく、地球物理的にその構造が議論される事はなかったが、地中レーダーを用いてその構造を精密にマッピングできれば、上記の理論を実際の現象から検証できると考えた。そこで富士山の青木が原溶岩流を対象として、地中レーダーを用いた野外実験を行った。主に、(1)アンテナ上部をシールドし、(2)周波数を変調する、(3)反射波の極性を考慮する、という新たな改良を行う事で、精度良く溶岩チューブを検出できる事を明らかにした。この内容をまとめた論文は、Geophysical Research Lettersに掲載され、Journal highlightとして採択された。
重複障害児における姿勢・運動発達及び移動経験による社会性の発達的関連について

【研究目的】本研究は、自力移動が難しい重複障害児1名に対して、座位姿勢や寝返り、四つ這いなどの姿勢・運動発達を捉えながら、前言語的コミュニケーションや認知発達、社会性などの基礎となる「指さし理解」「視線の追従」「自発的提示・手渡し」等の共同注意行動の発達的特徴を検討することにした。これらの基盤的な発達形成にともない、電動車いすによる移動経験における社会性の発達的関連について研究することを目的とする。【研究方法】(1)対象:特別支援学校に在籍する肢体不自由を主とする自力移動の困難な重複障害児1名を対象とする。(2)分析:対人的相互交渉において座位や寝返り、四つ這いなど姿勢・運動へのアプローチを行う。「視線追従」「指さしの理解」「手渡し」「他者理解」「社会的参照」等の共同注意行動などを検討する。電動車いすによる移動経験における対象操作性と社会性の発達的関連について検討する。(3)データ収集:観察場面は、対象児の姿勢・運動(座位や寝返り、四つ這い姿勢など)及び電動車いすの操作性を記録し、ビデオ録画から文字転写資料を作成する。また、「運動発達」「社会的発達」「認知発達」「コミュニケーション」「他者の意識行動」の5つのカテゴリーに関するチェックリストを作成する。【研究成果】本事例研究は、対人的相互交渉を通して各身体部位の弛緩動作及び入力動作の経験から、より細分化された身体部位に気付き、その部位と名称の身体図式(ボディ・シェマ)を理解と獲得がされてきた。また、肢体不自由の運動制限があるなかで、寝返りや座位での頭部保持、寝返り、四つ這い姿勢、上肢コントロールなど自発的な運動経験の中で、頭部や体幹の動き、上肢動きと下肢動きの細分化した動作的表象の獲得が促された。さらに、電動車いすによる上肢動作活動及びSRC-Wでの移動経験によって、校舎内の空間把握が促され、移動目的に結びついたと考えられる。共同注意関連行動の発達においては、注視・追視の発達や他者の意図に合わせてモノを手渡す(放す)「提示・手渡し」や「後方の指さし」の理解が高まった。さらに、特定の他者との間では、「遊び・表象」の機能的遊びやからかい行動などの発達的行動が見られるようになった。つまり、乳幼児の発達同様に、重複障害児においても、対人的相互交渉を基盤として外界における環境との相互作用や自ら自発的に環境に働きかけていくことが重要であり、自発的運動による運動経験と認知発達が相互影響をすることが示唆された。
細菌性腸管感染症の初期過程(細胞への付着と侵入)に関わる因子と細胞応答反応

腸管感染症の対策は発展途上国を中心に緊要な課題である。我々は互いに発症機序に特徴のある下記の3菌種を細菌性腸管感染症のモデルとして取り上げ、その発症に関わる初期(付着・侵入)因子を同定解析した。(1)病原性大腸菌について:3型分泌装置(TTSS)を介して標的細胞へ注入されるTirに結口する標的細胞側因子として、CortactinとTalin分子を同定し、これらの分子がEPECやEHECによるA旭病変形成の初期過程に重要な役割を演じていることを明らかにした。また3型分泌装置のニードル先端部を構成するEspBの生体側の結合分子としてαCateninを見出した。(2)腸炎ビブリオについて:腸炎ビブリオの主要な病原因子はTDHlTRHであるが、それ以の補助的因子の存在も否定できない。腸炎ビブリオの全ゲノム解析の結果から腸炎ビブリオは2セットの3型分泌装置を持ち、TTSS-1は大染色体上にあり、細胞毒性に関与しているのに対し、TSS-2は臨床由来株にのみ見られ、腸管毒性に関与するPathogenicity Islandを形成していることを明らかにした。(3)Provideneia alcalifaciens(PA菌)について:PA菌による集団食中毒をはじめて見出した。またPA菌の病原性発現機構として、大型Plasmid上に3型分泌装置をコrドする遺伝子群を見出した。異なるメカニズムで下痢を引き起こすと当初考えていた上記3菌種が共通の病原性発現機(TTSS)を有していることが判明した。これまでの病原因子の研究対象であった外毒素に代わり、当面TTSS、あるいはそのエフェクターに関する研究が注目されていくことになると思われる。本研究では本田が生物学的な解析を進めると共に研究を総括し、遺伝学的解析に実績のある柳原が、2名のポスドクと13名の大学院生を指導しながら、研究を進めた。(1)腸管出血性大腸菌に関する研究:EHECあるいはEPEC由来の精製Tir(付着のため菌自身が用意するIntiminレセプター)を用いたアフィニティカラム、抗Tir抗体を用いた免疫沈降法などでTirと結合する生体分子としてCortactinとTalinをこれまでに見出してきたが、さらにこれら2分子はそれぞれ直接Tirに結合することをLigand-overlay法などで明らかにするとともにこれら2成分はEHEC感染部位のアクチン凝集に関与していることが示唆できた。さらに、EHECの3型分泌装置を通じて標的細胞に注入されると考えられているエフェクター分子の1つであるEspBがαCateninと結合する可能性を見出した。(2)腸炎ビブリオに関する研究:腸炎ビブリオの腸管内定着に関与する因子の同定を目指しこれまでの研究で、菌側の因子(蛋白)としてcHA、遺伝子としてvagを見出したが、両者には現在のところ、関連性が見出せない。したがって本菌の付着には、複数の物質が関与していると考え、さらに解析を加えている。(3)Providenciaに関する研究:2001年に我々が見出した新型食中毒菌providencia alcalifaciensが細胞侵入性を持つことが分かったが、細胞侵入性を示さない菌株も存在したので、プラスミドの有無と侵入性の関係を解析したところ、約150kbp大のプラスミドの有無と相関する事が分かった。現在、このプラスミドを解析中。細菌性瘍管感染症の発症機構の相違点、共通点を探るため、次の3種類の腸管感染原因菌の発症機構を比較解析した。

(1)腸管出血性大腸菌の標的細胞への付着・定着に関わるTir-Intimin以外の新奇な因子の存在を示唆する成績を得るとともに、3型分泌装置を介して分泌されるエフェクター分子のうち、LEE上にあるエフェクターと同じく3型分泌装置により分泌されるが既知のPathogenicity IslandであるLEE以外の領域にある遺伝子にコードされる新奇なエフェクター分子を2種類見出した。現在その生物活性を検索中。(2)腸炎ビブリオの全ゲノムの解析を終え、本菌が2つの環状染色体を有することを確認すると共に、この2つの染色体上にそれぞれ1個の3型分泌装置を有していることを明らかにした。また、この2つの3型分泌装置の欠失変異体を作成し、別々に機能していることを明らかにした。(3)ヒト病原性Providencia alcalifaciensは約150kbpの大きなプラスミドを有し、この上に3型分泌装置をコードする遺伝子群を見出し、これがサルモネラの細胞侵入性に関わる遺伝子群(SPI-1)に近い(類似する)ことが明かになった。このように本研究で取り上げた3菌種は、研究開始時にはそれぞれ異なった発症機序を有すると考えたが、以上の研究で3型分泌装置を共通して有することが明らかになり、細菌性腸管感染症の病態の理解に新展開が期待できる。発症機構に特徴のある病原性大腸菌(EHEC)、腸炎ビブリオ、プロビデンシアの3菌種を取り上げ、それぞれの特徴をうかび上がらせ比較しながら解析を進め、以下のような知見を得た。1)EHECについて:3型分泌装置により分泌される未同定のエフェクター分子を検索し、3型分泌タンパクとして同定できたタンパクのうち未報告の蛋白と思われる蛋白(おそらくエフェクター)が見つかった。現在この蛋白の毒作用(生理作用)について解析している。2)Providenciaの病原性について:われわれが食中毒の原因菌として見出したProvidenciaの病原性発現機構の1つにサルモネラに類似した細胞侵入性を見い出したが、細胞内での殺菌作用を逃れるメカニズムを追及し、SOD (Superoxide disumutase)の関与を示唆する知見を得たので詳細な解析を行っている。3)腸炎ビブリオの病原性について:腸炎ビブリオの下痢原性はTDH(耐熱性溶血毒)も重要な病原因子として働いているが、tdh遺伝子を欠損させても、残存する下痢原性が見られたことから、TDH以外の未知の病原因子が存在する可能性が示唆された。一方、3型分泌装置(TTSS-1,TTSS-2)の構築に必要な遺伝子群を大および小染色体上に各1つ、計2ヶ所見い出したので、これらを欠損させて病原性を調べたところ、大染色体上のTTSS-1を欠損させると細胞毒性が消失し、小染色体上のTTSS-2を欠損させると腸管毒性(下痢原性)を失うことから、TTSS-2を介して分泌される下痢原性のあるエフェクターが存在する可能性が示唆された。現在、エフェクター分子の特定をすすめている。互いに特徴的と考えて選んだ3菌種であるが、上の結果に見るように、3型分泌装置、およびそれによって分泌されるエフェクター分子が広く病原菌の病原性に関わっていることが明らかになり、今後研究の中心課題の1つになるものと思われる。我々は互いに発症機序に特徴のある病原性大腸菌(EPEC, EHEC),腸炎ビブリオ,Providencia alcalifaciensの3菌種を細菌性腸管感染症のモデルとして取り上げ、研究をすすめた。
ウイルス感染マクロファージが引き起こす感染病態悪化機構の解明

宿主の免疫反応により病態が悪化する様々なウイルス感染症が報告されている。それらのウイルスの中には、マクロファージを標的とする様々なウイルスが存在する。ウイルスに感染したマクロファージは宿主体内を遊走してウイルスを全身に拡散するとともに、大量のサイトカイン・ケモカイン等の産生を引き起こし病態を悪化させる。ウイルス性脳炎発症におけるTNFαの役割を明らかにするために、マウスに致死的な急性脳炎をおこすMHV-JHM株を用いて、TNFα遺伝子欠損マウスに対して脳内接種経路での感染実験を行った。その結果、マウスの生存率、CNSにおけるウイルス力価、脳の病理組織学的変化にはマウスの系統による違いは見られず、TNF-αはJHM感染による急性脳脊髄炎の病態発生に重要な役割を果たしていないことが示唆された。また、JHM感染TNF-α遺伝子欠損マウスにおけるサイトカイン発現について検討したところ、各種サイトカインおよびこれらケモカインの発現には系統による差が見られず、TNF-αはJHMによる急性脳脊髄炎におけるサイトカイン動態に関与しないということが示唆された。また、劇症肝炎型株(MHV-3)、脳炎型株(JHM)および弱毒株(S)の3株のマクロファージでの増殖能およびサイトカイン等の遺伝子発現について検討した。MHV増殖能では、3株で有意な差は認められなかった。MHV-3感染マクロファージは、他の株と比べTNFα、MIP1-α等のmRNAが他の2株と比べ多く発現していることが明らかとなった。様々なウイルスにおいて、ウイルスが宿主のマクロファージに感染し、病態を悪化させることが知られている。マウス肝炎ウイルス(MHV)は、その株によりマウスにおいて急性の激症肝炎・慢性肝炎・脳脊髄炎・脱髄などを発症するが、その病態悪化には宿主側の免疫系の影響、ウイルス感染マクロファージの放出するTNFαやIL-1βなどのサイトカイン、ケモカインの関与が示唆されている。本年度、我々はマウスに致死的な急性脳炎をおこすMHV-JHM株を用いて、TNFα遺伝子欠損マウスに対して感染実験を行った。対照であるC57BL/6マウスと比較し、生存日数・生存率に差がは認められず、また暴利組織学的解析においても差が認められないことからTNFαはJHM株により発症する急性ウイルス性脳炎には重要な役割を果たしていないことが明かとなった。また、ウイルス感染時の脳におけるサイトカイン・ケモカイン等のmRNA量の変動について検討したところ、TNFα遺伝子欠損マウスとC57BL/6マウス間で有意な差は認められなかった。一方、TNFα遺伝子欠損マウスおよび対照であるC57BL/6マウスの腹腔内マクロファージを回収し、マウスに劇症肝炎を引き起こすMHV-3株を感染させてウイルス量の変動およびサイトカイン・ケモカイン類の発現量の変化について比較検討した。我々のこれまでの研究から、TNFα遺伝子欠損マウスはMHV-3感染に対し、抵抗性となっていることが明かとなっている。腹腔内マクロファージでのウイルスの増殖能では、TNFα遺伝子欠損マウス、C57BL/6マウスので差は認められなかったが、ウイルス感染により形成されるシンシチウムの大きさに明らかな差が見られた。また、ウイルス感染マクロファージにおける炎症性サイトカインの発現量にも有意な差が確認された。本年度、我々は劇症肝炎型株(MHV-3)、脳炎型株(JHM)および弱毒株(S)の3株のマクロファージでの増殖能およびサイトカイン等の遺伝子発現について検討した。

MHV-3感染マクロファージは、他の株と比べTNFα、MIP1-α等のmRNAが他の2株と比べ多く発現していることが明らかとなった。一方、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス(FIPV)は直接マクロファージに感染するだけでなく、抗体依存性にマクロファージに対して感染を増強する代表的なウイルスで、FIPVのSタンパク質は宿主の産生した抗体の主要なターゲットとなっている。FIPV I型ウイルスには強毒株から弱毒株まで様々な病原性を示す株が知られているが、詳細な研究は進んでいない。そこで、本年度は、病原性の強いUCD 1株と病原性の比較的穏やかなUCD 3株のSタンパク遺伝子をクローニングしその塩基配列を比較した。その結果、UCD 3株はアミノ酸残基385-424領域で40アミノ酸(120塩基対)の欠失が見られることが明らかとなった。また、欠失領域を境として、N末側はアミノ酸配列のホモロジーが85%とC末側と比べ低いことが明かとなった。
RAGEとマクロファージ極性変化を標的とした糖尿病性神経障害の新規治療法の開発

in vivoでは6週齢の野生型マウス(W)とRAGE欠損マウス(W)にストレプトゾトシンにて糖尿病(D)を誘発し8週後に解析を行った.WDはWに比して有意に神経伝導速度(NCV)が低下し糖尿病性神経障害(DPN)を発症していたが,RDではNCVがRと同等に維持されておりDPNの発症が抑制されていた.坐骨神経(SN)の病理学的解析ではWDで他群に比して有意に多くのiNOS陽性M1マクロファージ(Mφ)の浸潤を認めたが,RDではM1の浸潤は少なく,一方で他群と比して有意に多くのCD206陽性M2マクロファージの浸潤を認めた.また,SNのqPCRではWDでM1マーカーであるiNOS,RDでM2マーカーであるCD163のmRNAの発現が他群に比して有意に上昇していた.SNのウエスタンブロッティング(WB)ではインスリン感受性の指標としてヒトインスリン5単位20分の刺激に対するAKTのリン酸化を評価した.WDではWと比してAKTのリン酸化が低下していたが,RDではRと同等に維持されていた.in vitroではシュワン細胞株IMS32とMφ株RAW264の共培養を行った.BSA添加(M0),AGE添加(M1),IL4添加(M2)により分極させたMφとIMS32を0.4μm孔の半透膜を介して共培養した(それぞれM0-SC,M1-SC,M2-SC).共培養後IMS32におけるヒトインスリン0.24単位10分の刺激に対するAKTのリン酸化をWBにて評価した.M1-SCではM0-SCと比してAKTのリン酸化が低下していたが,M2-SCではM0-SCと同等に維持されていた.以上の研究成果からRAGEの有無によりSNにおけるMφ浸潤様式が変化することが見出され,M1浸潤に伴う炎症が神経のインスリン感受性の低下を介してDPNの発症に寄与している可能性が示唆された.当初予定している研究計画の遂行に向けてモデル動物の解析,共培養系の樹立が順調に進んでいる.糖尿病性神経障害(DPN)におけるM1マクロファージの浸潤がシュワン細胞(SC)および神経軸索(Ax)の機能に及ぼす変化について検討を深める.SCのインスリン感受性に影響するM1由来の因子を特定し,その分子機序を解明するために共培養後IMS32のDNAマイクロアレイ解析を行う.Axにおけるインスリン作用は軸索輸送(AT)の調節に重要であり,M1浸潤と炎症の惹起に伴うインスリン感受性の低下がATに影響する可能性がある.マウス由来脊髄後根神経節ニューロンを用いて高濃度糖負荷,インスリン刺激,炎症性刺激(M1との共培養を想定)等に対するATの変化を解析する.DPNに対するMφの直接作用を裏付ける実験として坐骨神経(SN)におけるMφの除去が必要である.しかし,多くの研究で使用されているクロドロン酸ではSNのMφを除去することができなかった.これに関しては血液神経関門の移行性を原因として考えている.クロドロン酸に代わる方法として放射線照射によるMφの除去と野生型マウス-RAGE欠損マウス間の骨髄移植によるM1/M2極性の操作を検討している.in vivoでは6週齢の野生型マウス(W)とRAGE欠損マウス(W)にストレプトゾトシンにて糖尿病(D)を誘発し8週後に解析を行った.WDはWに比して有意に神経伝導速度(NCV)が低下し糖尿病性神経障害(DPN)を発症していたが,RDではNCVがRと同等に維持されておりDPNの発症が抑制されていた.坐骨神経(SN)の病理学的解析ではWDで他群に比して有意に多くのiNOS陽性M1マクロファージ(Mφ)の浸潤を認めたが,RDではM1の浸潤は少なく,一方で他群と比して有意に多くのCD206陽性M2マクロファージの浸潤を認めた.また,SNのqPCRではWDでM1マーカーであるiNOS,RDでM2マーカーであるCD163のmRNAの発現が他群に比して有意に上昇していた.SNのウエスタンブロッティング(WB)ではインスリン感受性の指標としてヒトインスリン5単位20分の刺激に対するAKTのリン酸化を評価した.WDではWと比してAKTのリン酸化が低下していたが,RDではRと同等に維持されていた.in vitroではシュワン細胞株IMS32とMφ株RAW264の共培養を行った.BSA添加(M0),AGE添加(M1),IL4添加(M2)により分極させたMφとIMS32を0.4μm孔の半透膜を介して共培養した(それぞれM0-SC,M1-SC,M2-SC).共培養後IMS32におけるヒトインスリン0.24単位10分の刺激に対するAKTのリン酸化をWBにて評価した.M1-SCではM0-SCと比してAKTのリン酸化が低下していたが,M2-SCではM0-SCと同等に維持されていた.以上の研究成果からRAGEの有無によりSNにおけるMφ浸潤様式が変化することが見出され,M1浸潤に伴う炎症が神経のインスリン感受性の低下を介してDPNの発症に寄与している可能性が示唆された.当初予定している研究計画の遂行に向けてモデル動物の解析,共培養系の樹立が順調に進んでいる.糖尿病性神経障害(DPN)におけるM1

マクロファージの浸潤がシュワン細胞(SC)および神経軸索(Ax)の機能に及ぼす変化について検討を深める.SCのインスリン感受性に影響するM1由来の因子を特定し,その分子機序を解明するために共培養後IMS32のDNAマイクロアレイ解析を行う.Axにおけるインスリン作用は軸索輸送(AT)の調節に重要であり,M1浸潤と炎症の惹起に伴うインスリン感受性の低下がATに影響する可能性がある.マウス由来脊髄後根神経節ニューロンを用いて高濃度糖負荷,インスリン刺激,炎症性刺激(M1との共培養を想定)等に対するATの変化を解析する.DPNに対するMφの直接作用を裏付ける実験として坐骨神経(SN)におけるMφの除去が必要である.しかし,多くの研究で使用されているクロドロン酸ではSNのMφを除去することができなかった.これに関しては血液神経関門の移行性を原因として考えている.クロドロン酸に代わる方法として放射線照射によるMφの除去と野生型マウス-RAGE欠損マウス間の骨髄移植によるM1/M2極性の操作を検討している.12月に科研費の残額を超過した解析を行った.その際の支払いを他の研究費で支払ったため科研費に次年度使用額が生じた.翌年度以降に,研究成果公表に係る学会参加費等(国際学会への参加予定あり)に充てたい.
学童の気管支喘息の危険因子に関するコホート調査

1. ATS-DLD76に準じた呼吸器症状に関する質問票調査を平成4年から平成7年まで,毎年,横浜市内の私立小学校10校の学童約4400名を対象に行なった.2.前項の学童のうち,平成4年度に第3学年に在学した学童約730名を対象に,平成4年から平成7年の暖房期および非暖房期に窒素酸化物(NO,NO2)個人被曝量を測定した.3. 2項の対象学童に対して,2項の測定時に採取した早朝尿のコチニン量を測定した.4.対象学童の在学する学校における室内外の窒素酸化物を2項の調査時に測定した.5. 1項の対象校10校のうち4校について,一部学童のフロー・ボリューム曲線を主とした肺機能検査を実施した.6. 15項で得られたデータの解析作業横浜市内にある私立の小学校10校の学童約4,000名を対象に以下の調査を行った。1.ATS-DLD76に準じた呼吸器症状に関する質問票調査を行った。この調査により、気管支喘息の既往、新規発生、既往の増悪寛解及びこれらに係わると考えられる要因を調べるため統計解析を行った2.RAST法による総IgE量、ダニとスギに対する特異的IgE抗体量の測定(→本年度中に測定を実施する予定である)3.尿中コチニン量の測定を行った。4.暖房期と非暖房期に窒素酸化物(NOとNO_2)の個人曝露量測定を行った5.学校における校舎の内外の窒素酸化物の測定を行った6.フロー・ボリューム曲線を主とした肺機能調査を行った横浜市学童を対象に、学童の気管支喘息の発症、増悪および寛解に関わる危険因子について、喘息様症状と有症率等多目的に解析し、危険因子の重み付けの評価を行ない、ぜん息様症状の予防に役立てることを目的として研究を行なってきたが、今回は、1-6歳の乳幼児期を対象に、同様の調査を実施した。対象は、東京都内の某保育園の1-6歳の園児60名で、ATS-DLD76調査票をもとに独自に作成した調査票を用い、各保護者に記入してもらった。本調査では、呼吸器症状および疾患の既往歴や、家庭内環境等に関するものなども含まれている。さらに、生化学検査として、ファルマシアCAP-IgE FEIA測定キットを用い、血清中total-IgE抗体価、ダニ、スギに対する特異的IgE抗体価もduplicateで測定した。その他、NOx個人曝露量(フィルターバッジ使用)の測定、たばこ煙への曝露量(尿中コチニン量)等の測定も行なった。1. ATS-DLD76に準じた呼吸器症状に関する質問票調査を平成4年から平成7年まで,毎年,横浜市内の私立小学校10校の学童約4400名を対象に行なった.2.前項の学童のうち,平成4年度に第3学年に在学した学童約730名を対象に,平成4年から平成7年の暖房期および非暖房期に窒素酸化物(NO,NO2)個人被曝量を測定した.3. 2項の対象学童に対して,2項の測定時に採取した早朝尿のコチニン量を測定した.4.対象学童の在学する学校における室内外の窒素酸化物を2項の調査時に測定した.5. 1項の対象校10校のうち4校について,一部学童のフロー・ボリューム曲線を主とした肺機能検査を実施した.6. 15項で得られたデータの解析作業
ガレクチン-3の細胞表面への結合による正常細胞の増殖抑制の分子メカニズム

傷が治るモデルとして、シャーレ中で増殖した繊維芽細胞が接触し増殖を停止する現象が挙げられる。本研究ではこの系を用い、細胞密度が高くなると細胞内からガレクチン-3が細胞外へ分泌され、細胞表面のVCAM-1という糖タンパク質の糖鎖に結合し、この結合が増殖を制御する細胞内情報伝達系の分子の活性化を阻害する一端を解明した。傷口に発癌物質を塗布すると傷口は盛り上がり、本研究は癌細胞の増殖異常の解明とも絡む。ガレクチン-3が密度依存的に細胞外へ分泌されるメカニズムの解明1)SNAP-ガレクチン-3の構築:細胞を固定し細胞外へ分泌されたガレクチン-3を抗体で検出すると、固定法により細胞内へ抗体が侵入し細胞膜直下のガレクチン-3を検出し、細胞表面のガレクチン-3と区別できなかった。そこでSNAP-tagをもつガレクチン-3を構築し、これを発現する安定細胞株を取得し、細胞外に分泌されたSNAP-ガレクチン-3を膜透過性のない蛍光標識をしたSNAPの基質と結合させ解析すると、密度70%の細胞でガレクチン-3は検出され始めた。2)GFP-ガレクチン-3の局在性:GFP-ガレクチン-3を発現する安定細胞株を取得しその蛍光を観察すると、密度の増加とともに細胞膜直下に顆粒状の構造が観察された。ガレクチン-3はエクソゾーム(外分泌顆粒)を形成して分泌されることから、この顆粒がエクソゾームであることを証明するため、そのマーカーであるRab4に対する抗体で染色した。その結果、ガレクチン-3の顆粒近辺にRab4の抗体が反応したが、さらなる解析が必要である。3)エクスクリーションのメカニズムの解明:エクソゾームの形成はカルシウムイオンで促進されるので、エクソゾームが見られない密度10%の細胞をカルシウム・イオノフォアA23187で処理をすると、GFP-ガレクチン-3が顆粒状に集積している像が観察された。細胞内カルシウム濃度は密度依存的に亢進するので、現在どの密度で細胞内カルシウム濃度が増大するかをカルシウム・インジケーターFluo-4AMを用いて解析している。4)カメレオン・タンパク質を発現させた細胞の作製:カメレオン・タンパク質はカルシウムと結合すると、その蛍光をCFPからYFPヘシフトする。この特性を用いて、カメレオン発現細胞でどのような刺激(細胞同士の接着など)でカルシウムが流入するかを特定する予定である。昨年度の研究で、VCAM-1の発現が消失したSV-T2細胞(癌細胞)にVCAM-1遺伝子を導入すると、細胞の増殖制御に関与するRas-MAPK経路のc-Raf,ERK1,2のリン酸化が抑制、細胞骨格の再編成に関わるPI3K/Akt経路のPTENが活性化されPDK1,Akt,mTORが抑制され、さらにその下流のp70S6KやSTAT3が抑制された。一方、インテグリンを介して接着シグナルを伝達するFAKのリン酸化は変化せず、細胞の増殖分化を促進するPKCのリン酸化(活性化)や細胞周期を制御するGSK3βのリン酸化が抑制(活性化)されていた。以上の結果から、VCAM-1を発現したSV-T2細胞を軟寒天培地で培養するとPI3K/Akt経路、STAT3経路、MAPK経路が阻害され、癌細胞の性質である足場非依存的な細胞増殖能が抑制される一方、自身が癌細胞であることから細胞の増殖を促進しようと、PKCやGSK3βが活性化される(空回りする)ことが判明した。即ち、VCAM-1の細胞膜への発現も、細胞の増殖を制御する一因子であることが判明した。VCAM-1の細胞質領域にはリン酸化部位がないので、VCAM-1が直接情報を伝達することはできない。このことから、VCAM-1は何らかの細胞内のアダプター分子と相互作用をすることで、シグナル伝達を制御していることが推測される。細胞膜分子と細胞内骨格を結びつけるアダプター分子としてEzrin,Radixin,Moesin(ERMタンパク質)が知られている。密度依存的な細胞の増殖が抑制されたBalb3T3細胞から細胞膜を調製し、タンパク質を可溶化後抗VCAM-1抗体とDynabeads Protein Gを用いて免疫沈降を行ない、VCAM-1と結合している分子をウエスタンブロット法で解析したが、ERMタンパク質を検出することはできなかった。我々はBalb3T3細胞の密度依存的な増殖阻害が細胞外へ分泌されたガレクチン-3が細胞膜糖タンパク質VCAM-1の糖鎖と結合することで起こることを見出し、本研究はその分子機構を解明することにあった。

まずSNAP標識のガレクチン-3を用い、ガレクチン-3は細胞密度が50%前後になると細胞外へ分泌されること、この分泌はCaイオノフォアで促進されること、さらに細胞密度が50%前後になると細胞内Ca濃度が増すこと、ガレクチン-3はエクソソームのマーカーRab4と共局在することを見出した。以上の結果から、Balb3T3細胞は細胞密度が50%前後になると細胞内Ca濃度が増大し、増大したCaはエクソソーム形成とその分泌を促進し、ガレクチン-3は細胞内から細胞外へ移動すると考えられた。VCAM-1は細胞質領域にリン酸化部位がなく、アダプター分子と相互作用をすることでシグナル伝達を制御していると考えられた。アダプター分子の候補としてEzrin, Radixin, Moesin (ERMタンパク質)を考え、ガレクチン-3が細胞外へ分泌される密度50%の細胞を固定し、抗VCAM-1抗体で染色し、次に膜透過処理を行い抗Ezrin抗体や抗Moesin抗体と反応させ、二重染色を行った。その結果、各抗体による蛍光の半分以上は共局在し、EzrinやMoesinは一部のVCAM-1の細胞質領域とも結合している可能性が示された。これを確立するために、免疫沈降法による解析等が必要である。VCAM-1が癌化で消失したSV-T2細胞にVCAM-1遺伝子を導入発現させると、MAPK経路やmTOR, p70S6K, STAT3のリン酸化の抑制が起こり、足場非依存的な細胞増殖が抑制された。このことからVCAM-1の発現自身にも細胞の増殖を調節する機能があると考えられ、今後の課題となった。ガレクチン-3は密度が50%くらいになると細胞内から細胞外へ分泌されるが(excretion)、このガレクチン-3の細胞外への分泌を誘導する因子が未だに解明できていない。さらに昨年度の研究から細胞の増殖制御にはVCAM-1自身の細胞膜での発現量も重要であることが判明し、ガレクチン-3による細胞の増殖制御にこのファクターを加味して解析を行わなければならなくなったから。24年度が最終年度であるため、記入しない。密度依存的な繊維芽細胞の増殖制御に、ガレクチン-3とVCAM-1の結合,それに引き続くRas-MAPK経路の抑制を明らかにしつつある。この過程で最も重要なステップはガレクチン-3の時期を得た細胞外への分泌(excretion)であり、この分泌を促進する因子が何であるかを明らかにすることが真に重要である。excretionはカルシウムで促進さることが報告されているので、カルシウム・イオノフォアやキレート剤を用いてガレクチン-3の細胞からの分泌を解析する計画である。
マウス胚ノードにおける初期左右軸形成の分子機構の解析

マウス初期胚に出現するノードは左右軸の形成装置として機能する。この機能は時空間的な位置情報と近隣組織との相互作用に依存しており、ノードを胚体制と関連づけることは左右軸形成を理解する上で重要な視点である。本研究では、ノードや左右軸形成に必要なNodalシグナルの遺伝子発現制御機構、及びノード近傍の左右軸関連遺伝子の発現に必要なWnt3aの発現制御機構を解析した。また、これらの解析を進めるツールとしてSraTailorとChIP-Atlasを開発した。ChIP-AtlasはすべてのChIP-seqデータをIGVゲノムブラウザ上で閲覧できる統合データベースである。マウス左右軸形成は、原条頭側端に形成されるノードの一次繊毛の回転に始まる。繊毛運動によって発生する左向きの水流はノード側縁のcrown cellにおける左右非対称な遺伝子発現をもたらし、左側側板中胚葉におけるNodal発現域の確立に繋がる。左右軸形成に関わる組織の構築とその変化、及び関連遺伝子の発現を理解するには、鍵となる遺伝子の発現制御について解明する必要がある。近年、次世代シークエンサーが発達し、特定タンパクのゲノムとの結合を解析したChIP-seqのデータが、公共データベースにSequence Read Archives (SRAs)の形式で蓄積されてきている。これらは左右軸形成における遺伝子発現制御を解析する上で活用すべき情報であるが、SRAsを可視化するには各種ツールでコマンド入力による処理を適切に行う必要があり敷居の高いものであった。そこで、データベース上のSRAアクセッション番号を入力するだけで、特定タンパクのゲノムへの結合を可視化できるGUIソフトSraTailorを開発した。SraTailorはMacOS及びWindowsで利用することが可能であり、初回のソフトの起動で処理に必要な各種ツールを自動ダウンロードする。SRAのアクセッション番号を入力すると、Aspera Connect - sratoolkit - bowtie2/bowtie/bwa - samtools - genomeCoverageBed - bedGraphToBigWigで自動処理され、ゲノムブラウザーIGVで任意のゲノム上における特定タンパクの結合を表示することができる。SraTailorによって自前のChIP-seqデータも容易に解析することができ、関連研究分野に広く活用してもらうべく、フリーウェアとして研究室websiteで公開した。マウス初期胚のノードには左向きの水流が発生し、この水流がノードcrown細胞における複数の左右軸関連遺伝子の発現を左右非対称にする。これらの左右非対称発現は、ノードにおける分泌因子Nodalの活性を左側優位にし、その結果、左側側板中胚葉にNodal発現が拡張し左右軸が確立されることになる。ノードにおける非対称遺伝子発現の制御メカニズムの多くは不明であり、胚の一過的構造における短時間の現象であるため、定法によるシスエレメントの解析及びこれに結合するタンパク質の同定は難易度が高く時間もかかる。そこで、今年度は、公共データーベースに登録されてたすべてのChIPシークエンスの生データ(SRA)をスーパーコンピューターで処理し、ゲノムブラウザ上で任意のゲノム上におけるすべてのChIPシークエンスデータを一覧できるデーターベースChIP-Atlasを構築した。データーベースのURLは、http://chip-atlas.orgであり過日公開した。ChIPシークエンス技術の発展及びデータの集積は著しく、本データベースは公共データーベースに追加されたSRAを半永久的に自動処理し、ChIP-Atlasに追加する仕組みを組み込んだ。これによって、ゲノムDNA/転写因子関連の研究では既存のChIPシークエンス情報を最大限に活用できるようになった。私たちが着目する左右軸関連遺伝子の遺伝子座にも多くのタンパク質が結合していることが明らかになった。実験による初期左右軸形成機構の解析には時間がかかっているが、公共データーベースに登録されたすべてのChIPシークエンスデータ(SRA)を一覧可能なChIP-Atlasを構築することができたため、全体としては概ね順調に進展していると評価した。マウス初期胚は発生の進行と共に細胞及び形態を順次変化させながら胚体制を確立させ、これを基盤として左右軸を生み出すための組織(ノード、神経底板や側板中胚葉など)が胚全体に渡って構築される。原条の前端構造であるノード辺縁細胞(Crown細胞)ではNodalが発現するが、この領域のNodalが側板中胚葉へのシグナル伝播以外の役割を果たしているかは不明である。また、胚体制の確立においてもNodalはエピプラスの維持や原条形成に関わっていることもあり、本年度は組織分離が容易なエピブラストを用いてNodalシグナルの遺伝子発現制御を解析した。正常胚及びNodalシグナルを遮断した胚からエピブラストを顕微鏡下で単離し、これらのエピブラストで次世代シーケンサーによるRNA-seqを行った。得られたデータの情報解析を行うために、昨年度までに開発・公開していたChIP-seq統合データーベースChIP-Atlasの機能を拡張することにした。具体的には、任意のゲノム領域における公共データベース上のすべてのChIP-Seqデータの閲覧の他に、1)特定の転写因子が制御する可能性がある遺伝子の探索、2)特定の転写因子と共局在する因子の探索、3)遺伝子発現や特定ゲノムのリスト等のデータのenrichment解析の機能を組み込んだ。これらの機能は、ChIP-Atlas top page(http://chip-atlas.org)にリンクすることで、世界中の研究者がいつでも自由に使用出来るようにした。上記、エピブラストのRNA-seqデータはこれらの機能を活用して解析を行った。研究室の人員減少のためウェットの実験遂行が遅れている。一方で、次世代シークエンサーのデータ解析手段を発展させることができたので、全体としては「やや遅れている」との判断とした。