hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エミッションを低減するための固体触媒によるバイオディーゼル燃料製造プロセス

油脂(植物油)のメタノールによるエステル化反応によって、メチルエステルを製造した。これはバイオディーゼル燃料と呼ばれ軽油の代替燃料としての利用が広がっている。通常の製造方法においてはKOHやNaOHをメタノールに溶解させて触媒として利用するため、副生するグリセリンにこれらの金属が含まれ、後処理に手間がかかる。そのため、最近は不均一系触媒を利用した方法が活発に研究されている。本研究では安価であることを理由にCaOの触媒としての利用について検討を行った。実験ではセパラブルフラスコに水冷式コンデンサーを接続してメタノールを還流させながら攪拌を行いながら反応をさせた。反応温度は恒温水槽によって一定温度に保った。CaOは粉末状のものと多孔質アルミナ等に担持したものを使った。この触媒の活性はCaOの製造条件によって大きく影響されることを明らかにした。最も活性の高い触媒においては、植物油を30g、メタノールを10g、触媒であるCaOを0.8g使用して、反応温度60°Cの条件で2時間反応させると、反応率は90%に達した。通常使用されているKOH触媒であれば10分もかからずに同じ収率に達する。この触媒を実用化するための大きな問題は活性の劣化であることが分かった。一度使用した触媒は、メタノールで洗浄しても、再度焼成してもその活性はもとにはもどらなかった。また、CaOは溶解度が0.004%と比較的小さいが、生成するバイオディーゼル中にカルシウムセッケンとして溶出するために、この除去のために水洗も必要となる。バイオディーゼル製造においては従来利用されている原料として、植物油(トリグリセライド)とメタノールを用いた。触媒としては、均一系触媒および固体触媒を調査した。KOH、CaO、Ca(OH)_2、BaO、Ba(OH)_2、CH_3OKを検討した。セパラブルフラスコに水冷式コンデンサーを接続してメタノールを還流させながらマグネチックスターラーにより攪拌を行いながら反応をさせた。原料への触媒の溶解度から見るとCH3OK、BaO、Ba(OH)_2は活性が大きいものの溶解度が大きく、一方CaOは他の触媒に比べて活性は劣るものの溶解度は0.004%と本実験で使用した触媒の中で最も小さい。回分反応器による実験で有力と思われたCaOを担持触媒として調製した。CH_3OK、BaO、Ba(OH)_2は均一系触媒であるKOHとほぼ同じ活性を示した。しかし、CaOでは他の触媒と比較して活性はやや低くなった。反応温度を上げ、調製条件を調整することでCaOについても高い反応率が得られることができた。KOHは約10分で収率が90%に達するのに対しCaOを用いた場合は約2時間で同じ収率になった。これは、KOHは反応前にメタノールに溶解しており実際の反応は液-液の2相系で進行する。この場合の活性種はメタノールとKOHの反応により生成したCH3OKであると報告されている。そのため、反応速度を決定する一つの因子は油相とメタノール相の接触面積である。一方、CaOはメタノールに対して溶解度が小さいために実際の反応は液-液-固系の3相反応である。この場合、活性種となるのはCaOの固体表面に生成したCa(OCH_3)_2であり強塩基性を示す。触媒固体表面での反応機構を考えると油脂とメタノールが固体表面に交互に接触しなくてはならずKOHと比べるとより複雑な反応になる。そのためCaOの反応速度はKOHに比べるとやや劣る。CaO担持触媒では使用回数を重ねるにつれて反応速度が低下したため、この劣化の原因について明らかにした。油脂(植物油)のメタノールによるメチルエステル化反応によって、メチルエステルを製造した。

通常の製造方法においてはKOHやNaOHをメタノールに溶解させて触媒として利用するため、副生するグリセリンにこれらのKやNaなどの金属が含まれ、後処理に手間がかかる。そのため、最近は不均一系固体触媒を利用した方法が活発に研究されている。本研究では安価であることを理由にCaOの触媒としての利用について検討を行った。実験ではセパラブルフラスコに水冷式コンデンサーを接続してメタノールを還流させながらマグネチックスターラーにより攪拌を行いながら反応をさせた。反応温度は恒温水槽によって一定温度に保った。CaOは粉末状のものと多孔質アルミナ等に担持したものを使った。この触媒の活性はCaOの製造条件によって大きく影響されることを明らかにした。最も活性の高い触媒においては、植物油を30g、メタノールを10g、触媒であるCaOを0.8g使用して、反応温度60°Cの条件で2時間反応させると、反応率は90%に達した。通常使用されているKOH触媒であれば10分もかからずに同じ収率に達する。この触媒を実用化するための大きな問題は活性の劣化であることが分かった。一度使用した触媒は、メタノールで洗浄しても、再度焼成してもその活性はもとにはもどらなかった。また、CaOは溶解度が0.004%と比較的小さいが、生成するバイオディーゼル中にカルシウムセッケンとして溶出するために、この除去のために水洗も必要となる。
順応による知覚的世界の適応的変容

本研究では、視知覚の様々な側面における順応と残効を調べた。たとえば、残像の形成、順応による形の知覚的変化、錯視的運動にあらわれる運動残効などである。我々は、残像は網膜上の光受容器の疲労パタンそのものではなく、脳活動を表すことを残像の形の変化から見出した。そして残像が現れたり消えたりするのは、脳内での視覚的要素間の相互抑制によることを発見した。また、運動残効の実験により、オップアートに見られる流れの錯視が、相対運動の検出によって決定されていることを示した。さらに、繰り返される動きに対するサッカードの学習についても調べた。これらの結果は、順応と残効がいかに脳の活動を知るのに有効かを証明している。本年度は以下の項目について、主要な研究成果が得られた。1.残像の研究を行なった。実際より明るく見えるような錯視を起こす図形に順応した後、残像が暗く見えるかどうかを検討した。グラデーションによって輝くように晃える図形、陰影と認識されることによって明るく見える図形を用いて実験した結果、錯視的明るさに対応するはっきりした残像は確認されなかった。また、円盤状の図形をしばらく見た後に見える残像は、6角形に見え、逆に6角形の図形をしばらく見た後に見える残像がしばしば円形に見える現象をPsychological Science誌に発表した。この現象は両眼間にも転移する現象であることから、網膜上の光受容器レベルの順応では説明できず、脳内での形態への順応によるものであることが明らかになった。2.視覚による自己移動感(ベクション)の実験において、しばらく動く刺激を見た後に、動かない線分だけを見てもベクションが生起、維持される現象を発見し、Experimental Brain Research誌に掲載が決定した。3.Enigma図形を回転させて観察すると、物理的回転とは逆の方向に「流れ」の錯覚が生じ、囲転を止めると、それまでの物理的回転と同方向に「流れ」が生じることを発見した。この「流れ」の方向の残効は、物理的回転に順応する際に相対運動が検出される条件で最大となり、相対運動がない条件で最小となることがわかった。このことから、Enigma錯視は、相対運動検出器の働きと密接に関係しており、その順応と残効により錯視的な「流れ」の方向をコントロール可能であることが明らかになった。現在この現象について論文を執筆中である。残像についての研究を行った。縦線と横線を組み合わせたパタンの残像を生じさせると、縦横の線の色が異なる際に、どちらか一方の線の残像が見えやすくなる残像の相互抑制が生じることがわかった。同じ色でパタンを構成すると、縦横の線は同時に見えやすかった。縦線と横線の提示位置をずらすと、色が違っても相互抑制はみられなかった。これらのことから、線の方位と色の組み合わせが残像を構成する単位であることがわかった。また、青に順応した場合、必ずしも黄色への感度が高まるとは限らないことも示された。Enigma錯視における動きの見えが相対運動によってコントロールできることを実験的に示した。放射線の運動を提示し、それを止めたときに、Enigma錯視の流れが放射線の運動方向に起こることを確認し、それをモデル化、論文にまとめた。相手の眼の動く方向へ自分の注意が移動する現象において、最初に正面を向いた顔を提示すると継時的な対比により注意の移動が促進されると予想し、実験を行ったが、顔が回転することにより、逆に注意の移動の効果が損なわれる現象が発見された。ヘッドマウントディスプレーを利用して、前後の視野を逆転させる実験装置を、業者と共に作成した。頭部が前に移動すると、後ろの視野映像が前方視野内で縮小することを確認した。次年度の研究において、視覚と体の動きの順応についての実験に使用する。新しい刺激表示装置としての有機ELディスプレーの特性を、視覚の実験装置の観点から考察し、論文として発表した。H24年度は、錯視と残効の関係を中心に研究を行なった。1.オップアートであるEnigmaは、何かがさらさらと図の中を流れるように見える運動錯視である。原因については多くの議論がある。本研究では、運動残効を利用することにより、相対運動検出器の自発的発火とその分凝が錯視の原因であることを見出し、モデルを作った。2.明るさの錯視である、明るさ対比、glowing効果、checker shadow錯視などに、残像が生じるかどうかを実験的に調べた。明るさ対比においては、対比を起こしている要素の残像が、残像における対比を起こすことがわかった。glowing効果そのものは残像を作らないようであるが、錯視の明るさと残像の暗さには相関が見られた。

checker shadow錯視では、残像の明るさに錯視が影響を及ぼしているように思えるが、明るさ対比の影響もあるのでさらに検討が必要である。3.回転運動をする対象を見つめた後に、瞬きをしたり、対象のテクスチャを別のものに入れ替えたりすると、反対方向にジャンプする一種の運動残効のような錯視を起こすが、これは人間の運動の知覚特性に由来するもので、必ずしも運動残効が原因ではないことがわかった。この現象はアメリカの学術ジャーナルPNASに発表された。4.順応を起こす視覚ディスプレーとして、液晶やCRTではその特性上難しい場合があるので、最新の有機ELディスプレーを導入し、次年度に使う実験装置としての検討を行なった。低輝度領域での特性や画面の均一性、時間特性等、十分に精密な実験に耐えられることがわかった。昨年度に引き続き、残像の相互抑制について調べた。方位が同じで色の異なる線分グループを同じ空間上に配置してその残像を調べた結果、相互抑制はほとんど見られず、それらを接触させてもそれらの残像は共に見え続けることがわかった。これらの結果を論文にまとめた。残像の運動残効について調べた。運動するテクスチャ上に静止した色パッチを重ねて提示し、それを数秒被験者に観察させた後、刺激を消失させた。運動するテクスチャは残像を作らなかったが、静止した色パッチに対応する残像が現れ、それがテクスチャの運動と逆方向に運動残効を起こすことを確認した。また、円を観察し続けると残像が多角形に見える現象を利用して、円周上を運動するテクスチャを見続けた後に、多角形が回転する残像を形成することに成功した。これはTokyo Symposiumon Optical Illusions2015において発表された。周辺視における順応による色の見えの変化について調べた。周辺視における紫色への順応による見えの色の変化をマッチングによって測定した結果、複数の順応メカニズムが存在し、それらの寄与の割合が網膜偏心度によって変化することが示唆された。国際共同研究として、眼球運動の学習について調べた。Flash Grab効果により、錯視的に左右に位置がずれて見える点滅に対してサッカードを行わせると、物理的に同一の位置でターゲットが点滅していても、錯視によって期待される方向へのサッカードを行うことがわかった。本研究課題の一部として取り扱った視覚と身体の関係性の順応については、応用面を含めて相当な発展が期待できることから、新たに基盤研究(A)「視覚経験を生み出す眼と脳と身体の連携」を立ち上げ、その中で展開していくこととした。26年度が最終年度であるため、記入しない。実験心理学26年度が最終年度であるため、記入しない。論文出版等の成果が着実に出ていることから、計画の進展は順調と判断する。残像の研究は当初の予定より進展している。その一方、視覚と運動の相互作用の順応の実験はやや準備が遅れている。総合的にはほぼ順調といってよい。実験はおおむね順調に進展しており、成果も出始めた。
因果関係解明のための統計的推測法の開発

平成15年度は,「因果関係を視覚化するツールである因果ダイアグラムを,グラフィカルモデリング等の多変量解析法により統計的に推測する方法論を開発し,同時にその数理的基盤を整備すること.さらに,これらの結果を計算機へ実装すること」を目的とした研究を行った.その結果,因果ダイアグラムの理論のフレームワークにおいて以下のような結果を得た.1.反応変量の観測が困難である場合において,因果効果を識別するのに十分な代用特性と共変量集合の組を選択する基準を、ノンパラメトリックな立場から与えた.2.共変量を探索するための方法論として、群間に線形傾向を仮定したクラスター化法としてk-planes法を開発し,計算機へ実装した.3.総合効果を識別するための方法論である条件付操作変数法に着目し、その推定精度について考察した.反応変量の観測が困難である場合において,総合効果を識別するのに十分な代用特性と共変量集合の組を選択する基準を与えた.また、本結果と因子モデルとの関連性について考察した。4.因果構造を完全に回復するために,因果構造探索アルゴリズムに追加するのに十分な外的操作の回数とそれらのグラフにおける位置関係について考察した.5.因果効果の推測問題を,観察研究と実験研究の両面から考察するために,Shainin' Variable Search methodにおける、推定可能母数と別名関係について議論した.平成14年度は,「統御された無作為化実験での要因効果を受動的な観察研究から推測するための,観測変数の選択基準や個体の選択基準といった観察計画法の基本的フレームワークを与えること」を目的とした研究を行った.その結果,因果ダイアグラムの理論のフレームワークにおいて以下のような結果を得た.1.反応変量の観測が困難である場合において,総合効果を識別するのに十分な代用特性と共変量集合の組を選択する基準を与えた.また,そのときの因果的効果の推定精度についても検討した.2.複数の処理変量から反応変量の分散への因果的効果を定式化した.また,複数の処理変量から反応変量への因果的効果を回帰モデルにより推測する方法論を開発した.3.線型構造方程式モデルにおいて,複数の処理変量へ条件付き介入をおこなったときの反応変量への因果的効果を定式化することにより,従来の条件付き介入効果の推測法を一般化した.また,反応変量の分散を小さくする条件付き介入の方式を定式化した.4.バックドア基準を満たす共変量集合が複数存在するとき,分散に対する因果的効果を推定精度の観点から,共変量の優劣関係について検討した.また,その優劣関係がグラフ構造を用いて記述できることを明らかにした.5.因果関係に関する情報が不十分であるとき,因果的効果を識別するための共変量を絞り込むための方法論を提案した.6.回帰モデルの枠組において,条件付き併合可能性条件を導出し,バックドア基準との関係を明らかにした.平成15年度は,「因果関係を視覚化するツールである因果ダイアグラムを,グラフィカルモデリング等の多変量解析法により統計的に推測する方法論を開発し,同時にその数理的基盤を整備すること.さらに,これらの結果を計算機へ実装すること」を目的とした研究を行った.その結果,因果ダイアグラムの理論のフレームワークにおいて以下のような結果を得た.1.反応変量の観測が困難である場合において,因果効果を識別するのに十分な代用特性と共変量集合の組を選択する基準を、ノンパラメトリックな立場から与えた.2.共変量を探索するための方法論として、群間に線形傾向を仮定したクラスター化法としてk-planes法を開発し,計算機へ実装した.3.総合効果を識別するための方法論である条件付操作変数法に着目し、その推定精度について考察した.反応変量の観測が困難である場合において,総合効果を識別するのに十分な代用特性と共変量集合の組を選択する基準を与えた.また、本結果と因子モデルとの関連性について考察した。4.因果構造を完全に回復するために,因果構造探索アルゴリズムに追加するのに十分な外的操作の回数とそれらのグラフにおける位置関係について考察した.5.因果効果の推測問題を,観察研究と実験研究の両面から考察するために,Shainin' Variable Search methodにおける、推定可能母数と別名関係について議論した.
ソーシャル・キャピタルとしての宗教に関する国際比較研究

本研究は、海外との比較により、ソーシャル・キャピタルとして日本の宗教が担う社会的な役割の特徴を明らかにした。3割以下と宗教人口の少ない日本においても宗教の社会貢献活動が活発化している。その内容は、災害時救援活動、発展途上国支援活動、平和運動、環境への取り組み、地域での奉仕活動、医療・福祉活動、教育・文化振興など非常に多岐にわたり、日本の宗教がソーシャル・キャピタルとして機能する可能性が示唆された。◆本研究は、法制度、組織、社会と個人(規範意識、宗教心、価値観)の各次元から包括的にソーシャル・キャピタル(社会関係資本)をとらえ、宗教の社会的な役割にアプローチする。国際比較により、文化、歴史、社会、法制度の中で、宗教が担う社会的な役割の特徴を明らかにすることを目的とする。◆本年度は、本研究の包括的研究課題、ソーシャル・キャピタルを支援する法制度(宗教法人法、チャリティ法、NPO法、公益法人法など)、対象国における宗教(キリスト教、仏教、ヒンズー教、イスラームなど)、ソーシャル・キャピタル概念の検討を行い、各調査研究・事例研究への連結を行うことに重点を置いた。研究代表者、研究分担者が、宗教の社会貢献活動研究プロジェクトの研究協力者とともに、研究会で研究打ち合わせを実施した。◆本年度の主な海外調査としては、研究代表者の稲場圭信がイギリスのロンドンで、キリスト教のホームレス支援活動などの慈善活動や仏教団体が瞑想教室を一般に向けに開放し社会と積極的にかかわっている活動をフィールドワークした。また、研究協力者、天理大学教授、金子昭が、台湾に出張調査し、現地での宗教の社会参加、社会運動をフィールドワークし、台湾におけるソーシャル・キャピタルとしての宗教の実態を調査した。◆本年度の主な国内調査としては、研究揚力者の白波瀬達也が、北海道と北九州で、宗教者による社会参加、社会活動をフィールドワークした。◆本年度の主な海外調査としては、究分担者の濱田陽が、韓国に出張調査し、現地での宗教の社会参加、社会運動をフィールドワークし、韓国におけるソーシャル・キャピタルとしての宗教の実態を調査した。◆本年度の主な国内調査としては、研究揚力者の長澤壮平、羽黒修験の宿坊と講の共同性をソーシャル・キャピタルの視点から調査した。◆本年度は、本研究の包括的研究課題、ソーシャル・キャピタルの概念、対象国における宗教、ソーシャル・キャピタル概念の検討を行った。そして、研究代表者、研究分担者が、宗教の社会貢献活動研究プロジェクトの研究協力者とともに、研究会で調査報告を検討し、図書としてまとめた(稲場圭信・櫻井義秀編著『社会貢献する宗教』世界思想社)。本研究は、制度、組織、社会と個人の各次元から包括的にソーシャル・キャピタルをとらえ、欧米、タイ、韓国など海外との比較により、日本の宗教が担う社会的な役割の特徴を明らかにした。3割以下と宗教人口の少ない日本においても、宗教の社会貢献活動が活発化している。その内容は、災害時救援活動、発展途上国支援活動、平和運動、環境への取り組み、地域での奉仕活動、医療・福祉活動、教育・文化振興など非常に多岐にわたる。しかし、直接的に目に見える社会的実用性のみではなく、寺院や神社など宗教施設が、地域社会での居場所、交流の場、安らぎの場、イベントや福祉活動の場、市民との交流の場として機能している事例から、西欧やタイなどの東南アジア諸国とも異なる独自のあり方で、日本の宗教がソーシャル・キャピタルとして機能する可能性が示唆された。折しも、本研究期間の最終段階で、3月11日、東日本大震災が発生した。多くの犠牲者、被災者に宗教者が寄り添っている。これらも今後の研究課題であるが、その情報・データは、本科研のメンバーが設立した「宗教者災害救援ネットワーク」http://on.fb.me/gNUVkBに集積されている。本年度は、3年間の研究期間の最終年度にあたり、研究会、学会発表、シンポジウムなどを企画し、最終報告書の作成が主な取り組みであった。研究成果の情報発信として、電子ジャーナル『宗教と社会貢献』Religion and Social Contribution (ISSN : 2185-6869)を刊行する作業を進めた。平成23年4月に刊行予定である。研究の成果を幅広く発信するために、無料のオンライン刊行とする。研究の成果を、学術書として刊行する予定である。
過酸化水素バイオイメージングのための高速・高感度過酸化水素蛍光プローブの開発

鉄錯体を過酸化水素との反応点として有する蛍光プローブを複数開発した。これらの過酸化水素蛍光プローブは無蛍光であるが、細胞内で微量の過酸化水素と反応し、秒スケールで赤色や緑色蛍光物質(レゾルフィンやフルオレセイン)を生成する。これらの蛍光プローブの一つを用いて、上皮細胞成長因子の刺激によってA431細胞が情報伝達物質として生産する過酸化水素のリアルタイムイメージングに成功した。細胞が成長因子による刺激によって過酸化水素をシグナル伝達物質として生成することが分かっているが,シグナル伝達物質として生産される過酸化水素の濃度,拡散過程は明らかにされていない.本申請者は,シグナル伝達物質として生産される過酸化水素の時空間イメージングを目指し,高感度過酸化水素蛍光プローブの開発を行ってきた.既に,昨年度にO-アルキル化レゾルフィンをプロ蛍光団として,鉄錯体を過酸化水素との反応点として有する過酸化水素蛍光プローブMBFh2を開発し,細胞内でMBFh2と過酸化水素との反応から生成する赤色蛍光色素を利用して細胞内の過酸化水素を検出するために様々な条件を検討し,10 μMのMBFh2を用いた場合に上皮成長因子刺激によってA431細胞が生産する過酸化水素を細胞内で赤色蛍光を用いて観察できることを見出している.本年度は,過酸化水素のマルチカラーイメージングを目指し,緑色の蛍光色素を用いる高感度過酸化水素蛍光プローブの開発を行い,過酸化水素の細胞内の過酸化水素を緑色蛍光を用いて観察することに成功した。この結果は,異なる場所に存在する過酸化水素のマルチカラーイメージングを可能にするだけでなく,我々のプローブ設計の一般性の高さを示すものである。本研究の成果は,本論文として報告した(Development of Green-Emitting Iron Complex-Based Fluorescent Probes for Intracellular Hydrogen Peroxide Imaging,Bull. Chem. Soc. Jpn. 10.1246/bcsj.20140055)。既に過酸化水素と迅速に反応し酸化活性種を与える小分子金属錯体に着目し、プロ蛍光団AmplexRedを分子内に有する単核鉄錯体(MBFh1)を設計、合成している(Y. Hitomi, T. Takeyasu, T. Funabiki, and M. Kodera, "Detection of Enzymatically Generated Hydrogen Peroxide by Metal-Based Fluorescent Probe", AnalyticalChemistry, 2011, 83 (24), pp 9213-9216.)。本年度は、MBFh1を用いて細胞内外の過酸化水素の検出を試みた。その結果、MBFh1は細胞培養条件において、MBFh1のアミド部位が自発的な加水分解を受け、過酸化水素非存在下においても赤色蛍光を与えることが判明した。そのため、アミド結合を持たない新たな単核鉄錯体MBFh2を設計、合成した。現在までにMBFh2の合成と基礎的な解析を終えている。MBFh2はMBFh1と同様、秒単位で過酸化水素と反応し、赤色蛍光を与えること、また、細胞培養条件においても十分に安定であることを確認している。HeLa細胞、A431細胞に対して、MBFh2を添加した結果、顕著な細胞毒性は認められなかった。MBFh2は細胞透過性を有しており、MBFh2をHeLa細胞あるいはA431細胞に添加後、外部から過酸化水素の添加に対し、細胞内に赤色蛍光の増大が観測された。また、上皮成長因子の添加によっても、A431細胞内に赤色蛍光の増大を観測することができた。以上、本年度は研究計画どおり、細胞実験に用いることが可能な高感度の過酸化水素蛍光プローブの開発に成功した。過酸化水素は生体に害を与える活性酸素種の1つとして認識されてきた。しかし,近年,過酸化水素が細胞の分化や成長,遊走に関わる情報伝達物質として生産されることが明らかとなり注目を集めている。例えば,上皮細胞の場合,上皮成長因子(EGF)などの刺激によるEGF受容体の自己リン酸化を契機として,膜タンパク質であるNADHオキシダーゼ(Nox)が活性化され,Noxによる酸素分子の還元により一旦,細胞外に過酸化水素が生産され,水チャネル蛋白質アクアポリンを通り,過酸化水素が細胞内に流入するとされている。昨年度までに,上記の情報伝達物質として生産される過酸化水素を細胞内で検出できる高感度な金属錯体型蛍光プローブMBFh1およびMBFh2を開発している。MBFh1およびMBFh2は,過酸化水素と反応し、秒単位で赤色蛍光物質レゾルフィンを放出する高感度な過酸化水素蛍光プローブである。本年度は、細胞の異なる領域での過酸化水素の発生(例えば、細胞の内外)をマルチカラーで捉えるために,過酸化水素との反応により緑色蛍光物質を生成する複数の金属錯体型蛍光プローブの合成を行った。

その結果,ジヒドロジクロロフルオレセインと単核鉄錯体を有するプローブが良好な過酸化水素蛍光プローブとして機能し,細胞内の過酸化水素の検出に利用できることを見いだした(Y. Hitomi et al. Bull. Chem. Soc. Jpn., 87, 2014, 819-824.)。生体関連化学細胞内で使用できる過酸化水素蛍光プローブのレパートリーを増やすことに成功し,本アプローチの一般性の高さを実証することができた。また同時に,過酸化水素のマルチカラーイメージングに1歩近づくことができた。計画通り、今後の実験の核となる細胞実験に利用可能な高感度過酸化水素蛍光プローブMBFh2の開発に成功しているため。情報伝達物質としての過酸化水素の役割を明らかにするには,蛍光プローブの局在化が課題となる。今後は,本研究で開発した蛍光プローブをもとに細胞膜や細胞内小器官に局在化できる新たな過酸化水素蛍光プローブを開発する。MBFh2を用いて上皮成長因子の添加によって発生する過酸化水素の濃度上昇過程、局在化を蛍光顕微鏡を用いて観測する。更に、併行して、MBFh2の改良を進める。具体的には、細胞外の膜近傍で発生すると考えられている過酸化水素の検出のために、細胞膜局在化が可能な高感度の過酸化水素蛍光プローブを開発する。また、細胞内への移行効率の向上と細胞内器官への局在化を実現するために、過酸化水素蛍光プローブMBFh2への膜透過ペプチドの導入も行う計画である。様々な波長を有する過酸化水素蛍光プローブの合成法を確立できたために、2年次はプローブ合成に集中した。そのため、細胞染色実験を3年次にまとめて行った方が効率が良いと判断した。細胞染色実験に必要なA431細胞や上皮成長因子、蛍光プローブの波長にあった蛍光顕微鏡のダイクロイックミラーを購入し、効率良く、合成したプローブの機能評価を行う。また、上皮細胞成長因子が発生する過酸化水素の拡散過程を可視化できる新たな蛍光プローブ、および、細胞膜や細胞内小器官に局在化できる新たな過酸化水素蛍光プローブを開発する。本年度はMBFh2およびその改良型蛍光プローブのための合成試薬、ペプチド、溶媒、ガラス器具、また、細胞培養に必要な試薬を計上している。
中枢興奮薬の逆耐性現象における神経可塑性を標的とした創薬研究

メタンフェタミンなどの覚醒剤は連用によって感受性が亢進して、逆耐性現象が発現する。神経化学的研究から、ドパミン系機能亢進によるcAMP依存性リン酸化反応の亢進、NMDA受容体の過剰興奮によるカルシウムシグナル伝達系の亢進がその病態に関わると考えられる。私達は逆耐性モデル動物でのドパミン神経、グルタミン神経系のシグナル伝達系異常を評価する実験系を確立して、覚醒剤中毒による前頭葉機能障害や統合失調症に対する創薬を目指している。本研究では統合失調症に関与するドパミンD2受容体のサズタイプD2LとD2S受容体の細胞内局在、シグナル伝達系の違い、さらにドパミン神経系の活性をモニターするための指標について新しい知見を得た。細胞内第3ループに29アミノ酸の挿入されたD2L受容体は形質膜のみならず、小胞体、ゴルジ装置に局在するのに対してD2Sは形質膜のみに発現している。D2受容体はG_<i/o>蛋白質を介してアデニル酸シクラーゼを抑制するほかに、MAPキナーゼを活性化する。本研究によってD2L受容体はD2S受容体に比べて強いMAPキナーゼ活性化作用を有することを見いだした。特に、D2L受容体刺激後のカルシウムシグナルの活性化がMAPキナーゼの活性化反応に関わることを証明した。さらに、ドパミン神経系の活性をモニターするための指標として転写因子NF-κBが有用であることを見いだした。
次世代型バイオエタノール生産に適したイネの開発研究

本研究では環境破壊、原油枯渇問題の克服を目指し、セルロース由来バイオエタノールの生産に適したイネの開発研究を行う。具体的には、老化誘導プロモーターとセルラーゼ遺伝子を利用し、収穫後に稲わらのセルロースを容易に糖に分解できるイネの開発を行う。この研究開発により人類の持続的発展に貢献する。今年度は、セルラーゼ過剰発現イネの糖化性を調べた。その結果、3種類のセルラーゼのうちエキソグルカナーゼの過剰発現により稲わらの糖化性を向上させることができること、エンドグルカナーゼを過剰発現するイネは作成できず、致死的な効果を与えること、ベータグルコシダーゼの過剰発現はそれ単独では稲わらの糖化性に影響を与えないことを明らかにした。また、エキソグルカナーゼの過剰発現により引き起こされる様々な形態異常や不稔性あるいはエンドグルカナーゼ過剰発現による致死性を回避するため、老化時に特異的に発現する遺伝子のプロモーターの利用を試み、そのプロモーターが実際に老化特異的にレポーター遺伝子の発現を誘導できることを示した。以上の結果は、セルラーゼを用いた稲わらの糖化性の向上が可能であることを示すと同時に、イネ生育時のセルラーゼ過剰発現による形態異常や不稔の回避に老化誘導プロモーターが有用である可能性を示している。このような稲わらの糖化性が向上したイネを利用することにより、種子(コメ)収穫後の未利用稲わらを効率的なバイオエタノール生産の原料にすることが可能になり、地球温暖化問題の解決に寄与することが期待される。今年度は、まずエクソセルラーゼ遺伝子導入イネでセルラーゼ活性を蛍光基質を用いて測定した。その結果、高いセルラーゼ活性を有していることを確認できた。セルラーゼ過剰発現イネは様々な形態異常を示すが、新たに部分不稔を示すこともわかった。さらにこのイネを再形質転換することにより、エクソセルラーゼとエンドセルラーゼの両方を過剰発現するイネの作成を開始した。また、様々な形態異常や部分不稔等のイネの生育に対する悪影響を回避するには、誘導プロモーターの利用が有効と考えられる。そこで、2つの老化誘導遺伝子のプロモーターをクローニングし、このプロモーターによりセルラーゼを発現するイネの作成を開始した。それと平行して、この老化誘導プロモーターの発現特性解析のため、GUSレポーター遺伝子に連結し、イネに導入する実験も開始した。一方、高活性のセルラーゼを選抜するため、10個のイネのセルラーゼを大腸菌で発現させたが、いずれも不溶性となり、セルラーゼ活性を測定することはできなかった。来年度は、現在作成中のイネの形態、細胞壁構造、糖化性を調べ、評価することが最重要課題である。
正常ヒト分秘型IgAサブクラスの細菌に対する抗体活性の検索

1.マニラ産Jackfruitの種子からえられるレクチン(Jacalin)はヒト免疫グロブリンの中でIgA1とのみ結合する。このレクチンを精製しその構造、糖特異性、IgA1との反応に影響をあたえる因子を解析した。ヒトIgA1との結合は、G_2lβ1→3G_2lNAc及びG_2lNAc糖鎮による。2.定量的ラテックス凝集反応を、J_2c_2linの糖特異性の決定及びIgA1との反応に影響する因子の解析に利用できるようにはじめて開発応用した。3.J_2c_2lin親和クロマトグラフィ-法で、血清及び分泌型IgAをIgA1とIgA2の二つのサブグラスに分離できた。4.インフルエンザ杆苗、肺炎双球菌及び髄膜炎菌からIgA分解酵素をとり出した。いずれのIgAプロテア-ゼも血清IgA1及び分秘型IgA1により不活性化された。この不活化は分秘型IgAのSC分子にはなくFabフラグメントにあること、すなわちIgA1分子の抗体活性にわることを実験的に証明できた。5.フィリピン産Jackfruitからえられるレクチンはヒト単量体IgGを除く全てのクラスの免疫グロブリンと結合することを見い出した。このレクチンで親和クロマトグラフィ-を行なうと、免疫グロブリン製剤からIgM,IgA,IgE,IgDを除去できる。6.Jackfruitの種子を世界9ケ国から14検体収集し、その免疫グロブリン結合性を調べた。その結果、種子の入手先により著しい結合性の相違を示した。1.東南アジアを中心とした国からパンの木の種子を集め各バッチから抽出したレクチン(ジャカリン)とヒト各種免疫グロブリンとの反応を調べた。沖縄産:1gA_1の他IgA2m(1)、1gM、1gD、1gEと反応、シンガポール産:1gA_1の他1gM、1gD:1gEと反応。マニラ産(1):1gA_1とのみ反応、マニラ産(2):1gG以外の他の全ての免疫グロブリンと反応した。2.IgA_1とのみ反応するジャカリンは、1gA_1分子のヒンジ部分に存在するGalβ1-4GalNA_c糖鎖と結合する。1gDにも同じ構造の糖鎖があるが、シアル酸が末端に付着しているため反応しない。他のクラスないしサブクラスの免疫グロブリンにあるGal.βl-4Gl_cNA_cやGal_βl-6Gl_cNA_cとは結合しない。この研究のため新しく定量的ラテックス凝集反応法を開発してジャカリン-lgA_1反応を調べた。3.ジャカリンアフィニティークロマトグラィー法による分泌型lgAのサブクラスへの分離。前述のジャカリンをセファロースに固定化しカラムを作製し、母乳から精製したlgAをアプライした。非吸着lgAは1gA_2のサブクラスであり、ガラクトースで溶出した吸着lgAはlgA_1サブクラスであった。母乳中の分泌型lgAのサブクラス比はlgA_1:lgA_2=5:57:3と母乳のバッチの違いにより異なった。1.Jacalin親和カラムを使い、ヒト初乳から精製した分泌型IgAを二つのサブクラスに分離することができた。インフルエンザ桿菌、肺炎双球菌、髄膜炎菌からえたIgA分解酵素は、正常成人血清及び分泌型IgAIによりいずれも不活性化された。この抗IgAプロテア-ゼ活性はsIgAのSC分子にはなくFabフラグメントにあること、すなわちsIgAI抗体分子にあることを実験的に証明した。正常成人の場合は抗IgAプロテア-ゼ活性が、上記三菌に対する感染防御機構の一つとして働らいている。

2.フィリッピン産のJackfruitからえられるレクチンは、ヒト単量体IgGを除く全てのクラスの免疫グロブリンと結合することを見い出した。このレクチンで親和クロマトグラフィ-を行なうとヒト免疫グロブリン製剤から、IgA、IgM、IgD、IgEを除去することができる。IgA除去したグロブリン製剤は、IgA欠損症患者に安全に投与できる。3.Jackfruitの種子を世界9ケ国から14検体収集し、その免疫グロブリン結合性を調べた。Artocorpus属の種は、A・heterophyllus、A・integer、A.lakoocha、A・tonkinesis、A・communisの5種である。後者四種類はヒトIgAIサブクラス及びIgD(4/5)と特異的に結合した。一方A・heterophyllusはその免疫グロブリン結合性が検体により著しい相違を示した。第一は、IgAI及びIgDの一部と結合するもの。第二はIgA2m(1)、単量体IgGと結合しないがそれ以外の全てのクラスの免疫グロブリンと結合するもの。第三は、単量的IgGと結合しないがそれ以外の免疫グロブリンと結合するもの。以上三種類に分けられた。最初免疫グロブリンの結合性の違いは、A・integerとhybrid形成しているためと考えたが、この説は否定された。さらに各レクチンの分子構造の相違も考えられたが、これも否定的である。
Transferrin受容体を介したin vivo max遺伝子導入

合成陽性脂質である(+)-N, N[bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-N-[2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl]ammonium iodideと中性脂質であるDOPEからなるリポソームに対して、transferrinあるいはasialoglycoproteinなどのリガンドを結合させ、β-galactosidase発現ベクターを用いてリポソーム-リガンド-DNA複合体を作成した。この遺伝子導入効率をin vitroの培養細胞系で検討した結果、リガンドはtransferrinの導入効率が高いことを見いだし、さらに種々の細胞系にてリポソーム-リガンド-DNAの最適比率について検討した(研究発表欄文献参考)。ラットに静脈内投与して経時的に全身の実質臓器における発現をβ-galactosidase染色によって検討したところ、その発現は不満足なものであった。そこで、rabbit max cDNAを上記の方法にてラットに静脈内投与し、今度は実質臓器およびリンパ球を用いて、外因性および内因性のrabbit max mRNA遺伝子コピー数をon-line real-time quantitative RT-PCR(Light Cycler法)にて定量したところ、リンパ球において一過性ではあるが著明なrabbit max mRNAの増加を認めたが、実質臓器では有意な発現量の変化は認めなかった(Shichiri et al. submitted)。以上から本法にて静脈内投与された遺伝子は直ちに流血中のリンパ球に取り込まれるため、高効率に遺伝子は発現するが実質臓器には到達しないことが推察された。この結果はリンパ球に発現させることにより治療効果が得られる疾患には本法は有用であることが示唆されたため、動脈硬化モデルに対するよりもLDL受容体欠損家兎にrabbit LDL受容体cDNAを投与する実験がより有効と考え施行した結果、満足すべき投与遺伝子の発現と臨床的なデータの改善を見た(Shichiri et al. submitted)。合成陽性脂質である(+)-N,N[bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-N-[2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl]ammonium iodideと中性脂質であるDOPEからなるリポソームに対して、transferrinあるいはasialoglycoproteinなどのリガンドを結合させ、β-galactosidase発現ベクターを用いてリポソーム-リガンド-DNA複合体を作成した。この遺伝子導入効率をin vitroの培養細胞系で検討した結果、リガンドはtransferrinの導入効率が高いことを見いだし、リポソーム-リガシド-DNAの比率も検討した(文献参考)。そこで、rabbit max cDNAを上記の方法にてラットに静脈内投与し、今度は実質臓器およびリンパ球を用いて、外因性および内因性のrabbit max mRNA遺伝子コピー数をon-line real-time quantitative RT-PCR(LightCycler法)にて定量したところ、リンパ球において一過性ではあるが著明なrabbit max mRNAの増加を認めたが、実質臓器では有意な発現量の変化は認めなかった。以上から本法にて静脈内投与された遺伝子は流血中のリンパ球に取り込まれ、高効率に遺伝子は発現するが、実質臓器には到達しないことが推察された。この結果はリンパ球に発現させることにより治療効果が得られる疾患には本法は有用であることが示唆されたため、動脈硬化モデルに対するよりもLDL受容体欠損家兎にrabbit LDL受容体cDNAを投与する実験を開始している。合成陽性脂質である(+)-N,N[bis(2-hydroxyethyl)-N-methyl-N-[2,3-di(tetradecanoyloxy)propyl]

ammonium iodideと中性脂質であるDOPEからなるリポソームに対して、transferrinあるいはasialoglycoproteinなどのリガンドを結合させ、β-galactosidase発現ベクターを用いてリポソーム-リガンド-DNA複合体を作成した。この遺伝子導入効率をinvitroの培養細胞系で検討した結果、リガンドはtransferrinの導入効率が高いことを見いだし、さらに種々の細胞系にてリポソーム-リガンド-DNAの最適比率について検討した(研究発表欄文献参考)。ラットに静脈内投与して経時的に全身の実質臓器における発現をβ-galactosidase染色によって検討したところ、その発現は不満足なものであった。そこで、rabbit max cDNAを上記の方法にてラットに静脈内投与し、今度は実質臓器およびリンパ球を用いて、外因性および内因性のrabbit max mRNA遺伝子コピー数をon-line real-time quantitative RT-PCR(Light Cycler法)にて定量したところ、リンパ球において一過性ではあるが著明なrabbit max mRNAの増加を認めたが、実質臓器では有意な発現量の変化は認めなかった(Shichiri et al. submitted)。以上から本法にて静脈内投与された遺伝子は直ちに流血中のリンパ球に取り込まれるため、高効率に遺伝子は発現するが実質臓器には到達しないことが推察された。この結果はリンパ球に発現させることにより治療効果が得られる疾患には本法は有用であることが示唆されたため、動脈硬化モデルに対するよりもLDL受容体欠損家兎にrabbit LDL受容体cDNAを投与する実験がより有効と考え施行した結果、満足すべき投与遺伝子の発現と臨床的なデータの改善を見た(Shichiri et al. submtted)。
細菌芽胞の形成と発芽の阻害剤としての1,5-アンヒドロフルクトースの評価

本研究は、食品工業界で問題となっている食中毒の原因菌の一つである芽胞細菌に対する1,5-アンヒドロフルクトース(1,5-AF)の効果を検証することが目的である。研究の結果、まず1,5-AFはグラム陰性細菌よりもグラム陽性細菌の生育を阻害することが見出された。酵母や糸状菌などの真菌類には全く抑制効果を示さなかった。枯草菌の培地に1,5-AFを添加して培養したところ、この糖が芽胞形成を阻害することが見出された。この阻害作用は枯草菌のみでなく、食中毒菌として有名なセレウス菌、好酸性芽胞細菌などでも見出された。さらに、調製した枯草菌の芽胞を用いた発芽実験により、芽胞が発芽し成菌にまで生育することが1,5-AFにより極めて強く阻害することが見出された。これらを総合した結果、1,5-AFは芽胞細菌の芽胞の形成と発芽を極めて強く抑制するすぐれた食品素材であることを明らかにすることができた。枯草菌が菌体内外に生産するタンパク質を解析したところ、菌の成長に関与する制御因子、および芽胞の形成に関与するいくつかのタンパク質生産が抑制することが見出された。さて、これらのことから考えるに、我々の生活に強く危害を与える細菌の中で芽胞を形成する特徴を有する細菌、例えばボツリヌス菌やウェルシュ菌、さらには炭疽病菌なども同じ様な芽胞の形成と発芽の機構を持つと考えられ、これらに対しても1,5-AFが強い抑制効果を示すことが期待される。1,5-AFがどのような分子機構で芽胞細菌に効果を示すのか、今後詳細に解析する予定である。実験にはBacillus subtilis NBR3009を供試菌とし、また肉エキス培地を標準培地とした。B.subtilisを培養する際に肉エキス培地、およびグルコースあるいは1,5-アンヒドロフルクトース(以下AF)を加え、まず培地のpHの生育に及ぼす影響を調べた。培地のpHはあまり高くないほうが生育をよく抑えた。これはAFがアルカリ性側でやや不安定であることが理由と考えられた。次に上記の条件での培養の際の、培地中の炭素源の減少と芽胞の形成率を調べた芽胞形成は肉エキス培地そのものでは2日目に急激に始まり(80%)、6日目には約90%の形成率であった。1%グルコースを添加した場合、糖は24時間で消費されたが芽胞形成は3日目から始まった。そのときのパターンは肉エキス培地のみでの様子とほとんど同じで、1日ずれただけと考えられた。つまり、グルコースが消費される間だけ芽胞の生成がずれたと考えられた。一方、AFを加えた場合は3日目で芽胞形成が始まったものの3日目で5%、7日目でも10%であった。AFの培地からの減少は緩やかで、3日目で約25%、7日目でも8%程度が残存していた。これらより、AFが芽胞形成を阻害することが確かめられ、この阻害が糖の資化速度と関連していることが推測できた。3種類の培地で培養し、超音波破砕した菌体からトリクロル酢酸沈澱法で菌体内蛋白質画分を、培地から同じく菌体外蛋白質画分を調製し、二次元電気泳動法で分離した。分離された蛋白質画像を画像として取り込み、比較検討したところ、菌体内蛋白質で30種程度、菌体外では7種程度AFで特異的に生産あるいは抑制される蛋白質を認めた。現在それらを解析中であるが、同定された蛋白質には、蛋白質の高次構造形成に関係するものや芽胞形成に重要な働きをするものなどが見出されており、今後さらに解析を続けていく。

本年度の研究計画で最後に予定していたヒトの細胞培養は予定通り進行中である。1,5-D-アンヒドロフルクトース(1,5-AF)を培地に添加することにより、枯草菌は芽胞の形成が顕著に抑制された。グルコースに比べ1,5-AFは緩やかに培地から減少した。水和した1,5-AFの構造はグルコースと類似しているため、グルコース同様菌体に取り込まれるがその分解速度が遅いと思われ、グルコース様の糖が存在するために芽胞形成が抑制される可能性が考えられる。それぞれの糖質を含む培地で培養した枯草菌の菌体内外に生産されるタンパク質を比較したところ、1,5-AFの存在によりいくつかのタンパク質が生産されなくなることを認めた。二次元電気泳動で認められたこれらの差のタンパク質を試みた結果、菌体内タンパク質では芽胞形成の第4ステージに機能するYqfD、σ^BファクターのポジティブレギュレーターRsbVが1,5-AFにより生産されなくなったことを認めた。また、菌体外タンパク質では、芽胞形成を開始するのに必須のオリゴペプチドABCトランスポーターの、芽胞のタンパク質の系統的なアセンブリーに必要なFtsYタンパク質の生産が認められなかった。1,5-AFはこれらのタンパク質生産を抑制する結果、芽胞の形成が抑制される。次に、健全な芽胞を調製しこれを発芽処理、あるいは菌体への復帰のための培養時に1,5-AFを加えると増殖が抑制されることについて解析を始めた。二次元電気泳動により芽胞のタンパク質を分離することを試みたが、再現性のある定量的な芽胞のタンパク質調製が大変困難であることがわかった。さまざまな方法を検討した結果、ガラスビーズとともに激しく振盪し物理的に破砕し、タンパク質を有機溶媒で沈殿精製する方法が現在のところ最良であった。この方法で調製したタンパク質を来年度精力的に解析する予定である。1,5-D-アンヒドロフルクトース(1,5-AF)を培地に添加することにより、枯草菌は芽胞の形成が阻害され、また発芽後の生育が顕著に抑制されることを今までに明らかにしてきた。今年度はこれらの理由をプロテオミクス解析により明らかにすることをめざした。この点を明らかにするための最も大きな障壁は、芽胞からの蛋白質の抽出法であることが確認できた。芽胞から最も再現性良く蛋白質を回収できたのは、ガラスビーズと混和し機械的に破砕する方法であった。これにより、1,5-AFが枯草菌に与える影響を解析したところ、芽胞形成期には昨年度見出したYqfD、RsbV、FtsYなどの欠如が再確認され、またシャペロン関係蛋白質と解糖系のいくつかの酵素が抑制されていることが見出された。これらのデータを総合すると、1,5-AFは微生物が生育して培地の成分が不足するという環境ストレスを微生物に検出させないことが主因と考えられ、このことにより芽胞形成系がうまく起動していないと考えられた。一方、芽胞が発芽する際に1,5-AFが与える影響としてはペプチド延長因子やシャペロニン蛋白質が欠損していること、また芽胞の生育に重要なペプチドを分解する酵素が抑制されていることが見出され、これらが原因で芽胞が発芽・生育できないことが明らかになった。また、1,5-AFは枯草菌だけでなく、病原性芽胞菌Bacillus cereus、清涼飲料水の生産での問題菌Alicyclobacillusの芽胞生成、と発芽も抑制することが見出され、芽胞形成菌に共通の機構と考えられた。これまでの結果を総合して、1,5-AFはヒトにとって有害性は無く、一方で芽胞を形成する菌にとっては、ストレスの検出系とエネルギー獲得系のいくつかのキーとなる酵素生産を抑制することによって芽胞の形成と発芽を抑制できる極めて好ましい糖質であることがわかった。
肺腺癌の初期進展課程におけるEGFR、KRAS遺伝子変異の検討

多くの腫瘍は、前癌病変→上皮内癌→微小浸潤癌→浸潤癌と多段階の発癌過程を経ると考えられている。肺腺癌も同様であり、前癌病変に相当する病変として、異型腺腫様過形成があげられる。異型腺腫様過形成は偶発的に見出されることがほとんどで、遺伝子検索が容易に行える凍結組織が得られることはほとんどない。また、5mm以下の小さな病変であることから、遺伝子変異の検討が進んでいないのが現状である。そこで、本研究に先だって現在解析可能なサンプルを用いて、簡便に遺伝子変異の検討を可能にする系を確立した(J Mol Diagn 2006)。この方法を用いて、肺腺癌における前癌病変についての遺伝子変異解析を包括的に行った。これまでの報告でも類を見ない多数例となる異型腺腫様過形成50例、上皮内癌50例、早期浸潤癌30例についての解析を行った。その結果、それぞれの段階の腫瘍間を比較すると、異型腺腫様過形成ではKRASの頻度が有意に高く、上皮内癌にはEGFR遺伝子変異が高い傾向があることが判明した。すでに報告しているように(J Pathol 2004)、浸潤癌ではKRAS遺伝子変異頻度が低いことから、異型腺腫様過形成が浸潤癌に進展すると考えると矛盾が生じる。そこで2つの知見を説明するには次の仮説が導き出された。すなわちKRAS遺伝子変異を有する異型腺腫様過形成はもはやそれ以上進展しない病変である可能性である。また、異型腺腫様過形成という病変は同じであっても、EGFR遺伝子変異を有する場合は上皮内癌から、さらには浸潤癌と浸潤する可能性が示唆された。これらの結果は、遺伝子改変マウスを用いた実験系の結果とよく一致する。また、この結果を用いて、現在臨床上問題となっている孤立性すりガラス様陰影の治療方針決定について遺伝子検査を導入することによってその判断の目安となる可能性が示唆された。肺腺癌の前癌病変であるAAHは偶発的に見出されることがほとんどで、遺伝子検索が容易に行える凍結組織が得られることはほとんどない。まだ、5mm以下の小さな病変であることから、通常検索法であるパラフィン切片からDNAをとることも容易ではない。これらの理由で遺伝子変異の検討が進んでいないのが現状である。そこで、パラフィン未染標本1枚から、これら遺伝子変異の検討を可能にする系を確立した(J Mol Diagn 2006)。この方法を用いて、世界に先駆けて包括的な肺腺癌における前癌病変についての遺伝子変異解析を行った。AAH 50例、上皮内癌に相当するBAC 50例、早期浸潤癌30例についての解析を終了した。その結果、AAH、BAC、早期肺腺癌で比較すると、AAHではKRASの頻度が有意に高く、BACにはEGFR遺伝子変異が高い傾向があることが判明した。この結果は、現在発表されている末梢肺細胞特異的に変異分子を発現させたマウスモデルと非常によく一致した結果である。すなわち、EGFR遺伝子変異マウスでは、AAH、BAC、浸潤癌のいずれも発症する。これに対し、KRAS変異単独ではAAHが生じるのみであり、それにcdk4遺伝子変異などの付加により浸潤癌を生じる。これらの結果とKRAS遺伝子変異が浸潤癌では頻度が低いことを考慮すると、KRAS遺伝子変異を有するAAHはもはやそれ以上進展しない病変の可能性が示唆された。

また、AAHという病変は同じであっても、EGFR遺伝子変異を有するAAHはBAC、さらには浸潤癌と浸潤する可能性が示唆された。現在CTなどで発見される孤立性すりガラス様陰影については、経過観察中の大きさの変化や充実性病変が付加された場合に切除が行われているが、切除すべきか否かの判断は難しい。得られた結果から、遺伝子異常を調べることで、積極的に介入すべきか否かについての情報を提供できるかもしれない。肺腺癌の前癌病変であるAAHは偶発的に見出されることがほとんどで、遺伝子検索が容易に行える凍結組織が得られることはほとんどない。また、5mm以下の小さな病変であることから、通常検索法であるパラフィン切片からDNAをとることも容易ではない。これらの理由で遺伝子変異の検討が進んでいないのが現状である。そこで、パラフィン未染標本1枚から、これら遺伝子変異の検討を可能にする系を確立した(J Mol Diagn 2006)。この方法を用いて、世界に先駆けて包括的な肺腺癌における前癌病変についての遺伝子変異解析を行った。AAH 50例、上皮内癌に相当するBAC 50例、早期浸潤癌30例についての解析を終了した。その結果、AAH、BAC、早期肺腺癌で比較すると、AAHではKRASの頻度が有意に高く、BACにはEGFR遺伝子変異が高い傾向があることが判明した。これらの結果とKRAS遺伝子変異が浸潤癌では頻度が低いことを考慮すると、KRAS遺伝子変異を有するAAう病変は同Hはもはやそれ以上進展しない病変の可能性が示唆された。また、AAHといじであっても、EGFR遺伝子変異を有するAAHはBAC、さらには浸潤癌と浸潤する可能性が示唆された。得られた結果から、遺伝子異常を調べることで、積極的に介入すべきか否かについての決定に役立つと思われる。そこで、早期肺癌を用いた国内臨床治験(JCOGなど)と連携をとり、まずは後ろ向き研究としてどのような結果が得られるか検討を始めつつある。