hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機堆積物による地球表層から深部への新たな窒素の供給メカニズム

昨年度から引き続いて、複数の含窒素芳香族化合物を出発物質として、350 °C、1.5万気圧までの条件でピストンシリンダーを用いた高温高圧実験を行った。温度圧力条件や保持時間を変えた実験を行った。実験後、常温常圧に回収した試料のGC-FID分析から出発物質の残留量を調べ、化学反応が起こる温度圧力条件を明らかにした。GC/MS,MALDI/TOF-MSといった質量分析から、化学反応生成物の可溶性成分の質量数や分子構造の評価を行なった。不溶性成分についてもIR、X線光電子分光(XPS)、固体NMRなどによる評価を進めた。結果をもとに高温高圧下での化学反応のメカニズムを検討した。さらに、上記のピストンシリンダー型高温高圧発生装置より幅広い温度圧力条件での化学反応を明らかにするため、外熱式ダイヤモンドアンビルセルによる実験を進めた。また、化学反応に対する圧力の効果をより明確にするため、昨年から引き続いて、室温下での30万気圧程度までの様々な芳香族化合物の圧力誘起重合反応を調べた。XRD,赤外吸収スペクトル、XPS)の測定から圧力誘起の不可逆なアモルファス化と化学反応に伴う炭素の化学結合とN/C比の変化を明らかにした。以上の研究結果から、沈み込み帯に相当する高温高圧下における窒素を含む有機物の化学反応の考察を行った。研究成果をまとめ、国内外の学会で発表した。圧力測定装置の更新の必要があった影響による。また、外熱式アンビルセルでの実験について、当初想定していたより高温の条件での実験の必要があり追加の実験が必要となったため。ピストンシリンダーを用いた実験については、ほぼ実験が完了しており、結果をまとめている段階である。ダイヤモンドアンビルセルによる実験については温度圧力条件を拡張した実験を進めていく。今年度はピストンシリンダー型高温高圧発生装置を用い、窒素を含む有機物を出発物質として、300°C、1.5 GPaまでの条件での実験を行った。温度圧力条件や保持時間を変えて複数回の実験を行った。常温常圧に回収した試料は有機溶媒中に抽出した後、各種化学分析を行った。例えば元素分析により化学組成比の変化を調べた。さらに、GC/MSといった質量分析手法を用いた定性、定量分析から、出発物質の残留量の評価、反応生成物の分子量、分子構造の評価を行った。現在、実験結果をもとに化学反応のメカニズムの検討と温度、圧力が与える影響についての考察を行っている。また、高温高圧下で起こる化学反応をより詳細に検討するために、高温高圧下でのその場観察を行うことを計画し、外熱式ダイヤモンドアンビルセルの立ち上げを進めている。現在加熱テストを行っており、300°Cまでの加熱が可能であることを確認した。さらに有機物中のNH-O結合に対する圧力の影響を評価するために、有機堆積物中の主要な窒素源のひとつであるアミノ酸を対象としてKEK BL18Cにおける高圧下粉末X線回折実験、J-PARC BL11における高圧下中性子回折実験を行った。まずは圧力の効果を詳しく調べるため、室温下での実験を行い、10 GPaまでの格子定数の圧縮率の異方性を明らかにした。現在、中性子回折実験についてリートベルト解析を行い、分子間のNH-O結合がその変化に与える影響に対して考察を行っている。高温高圧実験、回収試料の化学評価とも順調に進み、目標としていた実験を行う事ができた。昨年度から引き続いて、ピストンシリンダー型高温高圧発生装置を用い、窒素を含む複数種類の芳香族化合物を出発物質として、300 °C、1.5万気圧までの条件での高温高圧実験を行った。温度圧力条件や保持時間を変えた複数回の実験を行った。さらに回収試料の有機元素分析を行い、化学組成比から、化学反応に伴う窒素の挙動を明らかにした。GC/MS,MALDI/TOF-MSといった質量分析から、化学反応生成物の質量数や分子構造の評価を行い、重合反応の有無を調べ、化学反応のメカニズムを検討した。さらに、窒素を含む有機物の挙動をより詳細に明らかにするため、上記のピストンシリンダー型高温高圧発生装置より幅広い温度圧力条件での高温高圧実験を行うことを計画し、外熱式ダイヤモンドアンビルセルによる実験環境の整備を行った。KEK BL18Cにおける4万気圧、300度までのその場粉末X線回折実験に加えて、回収試料のラマン、赤外吸収スペクトル測定、XPS測定を行って相変化、不可逆的化学反応の有無などを調べた。また、化学反応に対する温度、圧力の効果をより明確にするため、室温下での30万気圧程度までの圧力誘起重合反応を調べた。上記の実験手法による研究結果から、沈み込み帯に相当する高温高圧下における窒素を含む有機物の化学反応の考察を行った。研究成果をまとめ、国内学会での口頭、ポスター発表を行った。ピストンシリンダーでの実験は順調であったが、外熱式アンビルセルでの実験については、当初想定していた温度条件では化学反応が十分に進まなかった。より高温での実験を行えるように装置の改良を行う必要がある。

実験後、常温常圧に回収した試料のGC-FID分析から出発物質の残留量を調べ、化学反応が起こる温度圧力条件を明らかにした。GC/MS,MALDI/TOF-MSといった質量分析から、化学反応生成物の可溶性成分の質量数や分子構造の評価を行なった。不溶性成分についてもIR、X線光電子分光(XPS)、固体NMRなどによる評価を進めた。結果をもとに高温高圧下での化学反応のメカニズムを検討した。さらに、上記のピストンシリンダー型高温高圧発生装置より幅広い温度圧力条件での化学反応を明らかにするため、外熱式ダイヤモンドアンビルセルによる実験を進めた。また、化学反応に対する圧力の効果をより明確にするため、昨年から引き続いて、室温下での30万気圧程度までの様々な芳香族化合物の圧力誘起重合反応を調べた。XRD,赤外吸収スペクトル、XPS)の測定から圧力誘起の不可逆なアモルファス化と化学反応に伴う炭素の化学結合とN/C比の変化を明らかにした。以上の研究結果から、沈み込み帯に相当する高温高圧下における窒素を含む有機物の化学反応の考察を行った。研究成果をまとめ、国内外の学会で発表した。圧力測定装置の更新の必要があった影響による。また、外熱式アンビルセルでの実験について、当初想定していたより高温の条件での実験の必要があり追加の実験が必要となったため。これまで行ってきたピストンシリンダーを用いた実験をさらに進め、温度圧力条件や保持時間をさらに広げた実験を行う計画である。さらに、出発物質の窒素の含有量や結合状態の異なる出発物質を用いた実験を行う計画である。また、高温高圧下の試料のその場観察のため、外熱式ダイヤモンドアンビルセルを用いた実験を行う。ピストンシリンダーでの実験については、出発物質を変えてさらに実験を進めていく計画である。外熱式アンビルセルでの実験について、さらに高温での実験を行えるよう装置の改良を進める。研究成果をもとに、沈み込み帯に相当する温度圧力条件における有機堆積物中の窒素の挙動について、考察を進めていく。ピストンシリンダーを用いた実験については、ほぼ実験が完了しており、結果をまとめている段階である。ダイヤモンドアンビルセルによる実験については温度圧力条件を拡張した実験を進めていく。新たに導入を検討している外熱式ダイヤモンドアンビルセルの設計や予備実験、必要な環境整備に時間がかかり、本年度に導入が間に合わなかったため、次年度使用額が生じた。外熱式ダイヤモンドアンビルセルの改良に関して、予定より時間がかかり、製作が次年度になったため、次年度使用額が生じた。次年度は早々に外熱式ダイヤモンドアンビルセルおよび、周辺装置の導入を進める。さらに実験を進めるのに必要不可欠な消耗品である金属カプセルの材料、ダイヤモンドアンビルの購入を計画している。外熱式ダイヤモンドアンビルセルを用いた実験に関して当初想定していたより高温条件での実験が必要となり、環境整備および実験に時間を要した。次年度はヒーター等に改良を加えつつさらに実験を進める計画である。ピストンシリンダーを用いた実験については現在結果を国際誌へ投稿中であり、研究経費を掲載料等として使用する計画である。外熱式ダイヤモンドアンビルセル用いた実験のための環境整備のための費用として用いる計画である。
HMGB-1が視床下部-下垂体においてバソプレシン産生・分泌におよぼす影響の解明

HMGB-1が敗血症において視床下部-下垂体系に与える影響を検討するために、抗HMGB-1抗体を前投与し、AVP-eGFP Tgラットの敗血症モデルにおける視床下部室傍核(PVN)におけるAVP-eGFPの蛍光量の変化をLPS投与後0,24,48,72時間と経時的に測定し解析を行ったが、抗HMGB-1抗体前投与群とコントロール群の間で有意な差を認めなかった。また、PVNでのAVP分泌ニューロンの活性化について検討するために、c-fos mRNAの経時的な変化をin situハイブリダイゼーション法を用いて検討を行ったが、抗HMGB-1抗体前投与群とコントロール群の間で有意な差を認めなかった。今回の研究の目的である「HMGB-1が視床下部-下垂体後葉におけるバソプレシン産生・分泌およびHPA軸におよぼす影響の解明」のために、今年度の計画では、まずウィスター系成熟雄性ラットにHMGB-1を投与し、視床下部室傍核(PVN)および視索上核(SON)のバソプレシン(VP)ニューロンの活性化をFos蛋白の免疫染色によって確認する予定であった。しかし、共同研究を行っている産業医科大学第一生理学教室より、アルギニンバゾプレッシン(AVP)を緑色蛍光タンパク(eGFP)で標識したAVP-eGFPトランスジェニック(Tg)ラットを提供して頂いたため、まず血中HMGB-1が上昇することが既に報告されているLipopolysaccaride (LPS)を投与した敗血症モデルをAVP-eGFP Tgラットにて作成した。その敗血症モデルラットにおけるPVNおよびSONのAVP-eGFPの蛍光量の変化をLPS投与後0,24,48,72時間と経時的に測定し解析を行った。その結果、下垂体後葉から血中に分泌されるAVPを産生する室傍核大細胞領域(mPVN)では、LPS投与48,72時間後に蛍光量が有意に低下し、ACTH分泌調節に関わるAVPを産生する室傍核小細胞領域(pPVN)では、LPS投与後24,48,72時間後に蛍光量が有意に上昇した。現在、前述のPVNおよびSONのAVPの変化が、mRNAおよびhnRNAレベルでどのように経時的に変化しているか検討をしている。具体的には、ウィスター系成熟雄性ラットで前述と同様の敗血症モデルを作成し、抗HMGB-1抗体の前投与が経時的なAVP mRNA、AVP hnRNAの発現に影響を与えるかをin situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いて解析中である。また、前述の実験で同時に採取した血液中のAVP濃度やHMGB-1の濃度を測定し、視床下部におけるAVPの発現やAVP mRNA、AVP hnRNAの発現と相関しているか検討する予定である。今回の研究の目的である「HMGB-1が視床下部-下垂体後葉におけるバソプレシン産生・分泌およびHPA軸におよぼす影響の解明」のために、まずウィスター系成熟雄性ラットにHMGB-1を投与し、視床下部室傍核(PVN)および視索上核(SON)のバソプレシン(VP)ニューロンの活性化をFos蛋白の免疫染色によって確認する予定であった。しかし、共同研究を行っている産業医科大学第一生理学教室より、アルギニンバゾプレッシン(AVP)を緑色蛍光タンパク(eGFP)で標識したAVP-eGFPトランスジェニック(Tg)ラットの提供を受け、まず血中HMGB-1が上昇することが既に報告されているLipopolysaccaride (LPS)を投与した敗血症モデルをAVP-eGFP Tgラットにて作成した。その敗血症モデルラットにおけるPVNおよびSONのAVP-eGFPの蛍光量の変化を、LPS投与後0,24,48,72時間と経時的に測定し解析を行った。続いて、抗HMGB-1抗体を前投与し、前述したAVP-eGFP Tgラットの敗血症モデルにおけるPVNおよびSONのAVP-eGFPの蛍光量の変化をLPS投与後0,24,48,72時間と経時的に測定し解析を行ったが、抗HMGB-1抗体前投与群とコントロール群の間で有意な差を認めなかった。

また、前述のPVNおよびSONにおけるc-fos mRNAの経時的な変化についてもin situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いて検討を行ったが、抗HMGB-1抗体前投与群とコントロール群の間で有意な差を認めなかった。救急医学交付申請時の計画書では、まず初めにウィスター系成熟雄性ラットにHMGB-1を投与しAVPニューロンの活性化をFos蛋白の発現で検討する予定であったが、HMGB-1の購入および抗AVP抗体の入手が困難であったため、AVP-eGFP Tgラットを用いて、血中HMGB-1濃度が上昇することが既に報告されているLPS投与した敗血症モデルラットにて実験を行うことで代替している。また現在、平成25年度に行う予定であった実験の全ては終了していないが、平成26年度に行う予定であった「ラットにおいてHMGB-1がHPA軸におよぼす影響についての検討」も同時に行っているため、全体の進捗状況は少し遅れている程度と考える。また、AVP-eGFP Tgラットの敗血症モデルにて、LPS投与後0,24,48,72時間のmPVN、pPVNおよびSONのAVP-eGFPの蛍光量の経時的変化を解析し検討したが、今後、この変化が抗HMGB-1抗体を前投与することでどのように変化するのかを、前述と同様にAVP-eGFP Tgラットの敗血症モデルを用いて検討を行う予定である。また、この時の血中のHMBG-1およびAVP濃度の変化も比較検討する予定である。平成25年度は平成26年度に行う予定であった実験も同時に行っていたため、予定していた平成25年度の物品費より多く計上したが、実験結果の解析が終了していないため学会発表を行っておらず、旅費を使用しなかった。また、その他で検体検査のための試薬を購入予定であったが、平成25年度に行った実験で採取した採血検体の測定を平成26年度に行う実験で採取予定の血液検体と一緒に測定することとしたため、検体検査料を計上しなかった。今後検査試薬を購入し測定する予定である。今年度は、実験結果を学会で発表する予定であり、そのために旅費を使用する予定である。さらに論文を作成し投稿する予定であり、そのための諸費用を計上する予定である。また、前述したように、平成25年度に行った実験で採取した採血検体の測定を平成26年度に行う実験で採取予定の血液検体と一緒に測定することとしたため、今後検体検査料として使用する予定である。
量子論に現れるハミルトニアンの特異性に関する作用素解析的研究

非相対論的量子電磁気学において、非相対論的に捉えた電子と量子化された電磁場を記述する模型(具体的には水素様イオン等を記述する数学的模型)であるPauli-Fierz模型にいくつかの物理的近似を施したNelson模型に対して、実際の量子電磁気学において原子の構造に現れるCoulombポテンシャルを持つ場合にNelson模型で赤外発散が起こることを証明し、さらに、この証明方法から赤外特異条件が赤外発散をもたらしたりもたらさなかったりする数学的メカニズムをCarleman作用素で特徴付けた。また、数理物理学でよく使われる有用なpull-through公式に対する作用素論における厳密な証明は本研究以前まで与えられていなかったが、本研究の結果として初めてこの証明を与えた。この証明を得ることで上述のCarleman作用素が定義可能となった。赤外発散が起こる数学的メカニズムは、このCarleman作用素の定義域とpull-through公式を詳しく調べることによりなされた。上述の研究結果により、Nelson模型に対しては赤外発散が起こるので、基底状態が存在しない状態空間を記述するFock表現から、実際の物理を記述し基底状態の存在する状態空間の表現への移行を行った。その表現上で赤外切断、さらには、紫外切断の両切断を取り除いた模型を構成し、さらに、その模型が基底状態を持つことを作用素解析的に証明した。2次元空間上を動く相対論的粒子が特異性を持つAharonov-Bohm磁場と相互作用するハミルトニアンのノルム・レゾルベント収束を調べ、特異点における境界条件に付随する自己共役拡張に対して、どの自己共役拡張が実際の物理に適した表現であるかを調べた。場の量子論に現れる、量子力学的粒子もしくはスピンとボース場が相互作用した模型において、赤外特異条件の下で基底状態とその基底エネルギーを調べた。赤外特異条件の下で、赤外発散が起こり基底状態が存在しなくなる場合と、赤外発散を起こさず基底状態が通常の状態空間に収まる場合の違いを把握するため、まず、後者の場合を研究した。代表的な例として、スピンとボース場が相互作用したモデル(spin-boson model, Wigner-Weisskopf model,など)と非相対論的量子力学的粒子とボース場が相互作用したモデル(Pauli-Fierz model)をとりあげた。Wigner-Weisskopf modelに対しては、この研究の副産物として、原子核の模型としてこのモデルを捉えたとき、相互作用の強さを大きくすると基底状態の遷移が起こることが分かった。この遷移は、場の量子論の超放射的基底状態や量子光学のRabi floppingと関係があると思われる。また、この遷移が起こるときは総粒子数が増すことから、原子核の理論においてボース場はπ中間子を記述すると考えられるので、π中間子凝縮との関わりも想像される。今年度の研究で、赤外特異条件の下で、どのような相互作用を持った模型では赤外発散が起こらないかを把握したので、次に赤外発散の起こる模型をも研究し、これらの結果から紫外切断を除き、赤外切断と紫外切断の両方を除いた模型が構成できるかを調べて行く(ただし、赤外発散が起こる場合は状態空間の表現を変える必要がある)。さらに、それらの模型に対して基底状態があるかどうかを研究することを今後の課題とする。場の量子論に現れる、原子核を数学的に記述するネルソン模型に対しての赤外特異及び紫外特異を研究した。より具体てきには、ネルソン模型のハミルトニアンから赤外切断及び紫外切断の両方を除去できる表現を与え、その表現の上で実際に両切断無しのハミルトニアンを構成し、その両切断無しのハミルトニアンに対して基底状態の存在を証明した。以上の結果を出すために新しい数学上の技術を考案したが、この方法を応用すると、ネルソン模型においては、表現を変えない元のハミルトニァンに対して赤外特異条件下では基底状態が存在しないことも証明ができた。従って、表現を変える数学的重要性もはっきりした。

今後の研究課題として、これらの考察を量子電磁気学における非相対論的に捉えた電子と量子化された電磁場を記述する模型、具体的には水素様イオン等を記述する数学的模型、に対する研究に発展させる。非相対論的量子電磁気学において、非相対論的に捉えた電子と量子化された電磁場を記述する模型(具体的には水素様イオン等を記述する数学的模型)であるPauli-Fierz模型にいくつかの物理的近似を施したNelson模型に対して、実際の量子電磁気学において原子の構造に現れるCoulombポテンシャルを持つ場合にNelson模型で赤外発散が起こることを証明し、さらに、この証明方法から赤外特異条件が赤外発散をもたらしたりもたらさなかったりする数学的メカニズムをCarleman作用素で特徴付けた。また、数理物理学でよく使われる有用なpull-through公式に対する作用素論における厳密な証明は本研究以前まで与えられていなかったが、本研究の結果として初めてこの証明を与えた。この証明を得ることで上述のCarleman作用素が定義可能となった。赤外発散が起こる数学的メカニズムは、このCarleman作用素の定義域とpull-through公式を詳しく調べることによりなされた。上述の研究結果により、Nelson模型に対しては赤外発散が起こるので、基底状態が存在しない状態空間を記述するFock表現から、実際の物理を記述し基底状態の存在する状態空間の表現への移行を行った。その表現上で赤外切断、さらには、紫外切断の両切断を取り除いた模型を構成し、さらに、その模型が基底状態を持つことを作用素解析的に証明した。2次元空間上を動く相対論的粒子が特異性を持つAharonov-Bohm磁場と相互作用するハミルトニアンのノルム・レゾルベント収束を調べ、特異点における境界条件に付随する自己共役拡張に対して、どの自己共役拡張が実際の物理に適した表現であるかを調べた。
アメリカ進歩主義教育期における幼稚園－小学校接続に関する思想史的研究

19世紀アメリカにおける幼児学校と幼稚園の教育原理の背景となるペスタロッチ主義とフレーベル主義の幼児教育における意義について明らかにするとともに20世紀進歩主義教育期における幼稚園の教育原理と小学校の教育原理の相互作用について明らかにする。
小脳顆粒細胞のアポトーシスに関する分子細胞生物学的研究

小脳顆粒細胞および大脳皮質ニューロンの培養系を用いて神経栄養因子、特に脳由来神経栄養因子(BDNF)の細胞死抑制効果の解析を行った。培養大脳皮質ニューロンでは、インシュリン様成長因子-1(IGF-1)によっても、アポトーシスが顕著に抑制される。BDNFはこのアポトーシスに対し抑制効果をもつものの、その効果はIGF-1と比べ著しく低くかった。しかしながら、PI3-キナーゼの活性化およびAkt-キナーゼの活性化はほぼ同程度であった。さらにPI3-キナーゼの特異的阻害剤であるLY294002により、BDNFによる細胞死抑制効果は完全に抑えられるのに対し、IGF-1による効果は部分的にしか抑えられない。このことは、BDNFによる細胞死抑制効果はPI3-キナーゼの活性化に依存しているのに対し、IGF-1の抑制効果はPI3-キナーゼの活性化だけではなく、他の機構にも依存していることを示している。実際、PI3-K経路以外のシグナル蛋白質、Shp-2、Grb-2、N-Shc、PLC、MAPK等については、両因子による活性化に大きな違いを見出している。以上のことは、アポトーシスを防御する2つの神経栄養因子間で、それらの防御機構において大きな違いが存在することを示している。今後、その違いの原因を分子レベルで明らかにすることは、神経栄養因子によるアポトーシス防御機構の解明に大きく貢献するものと考えられる。分子レベルで神経細胞死の機構を研究する時、培養小脳顆粒細胞がモデルとしてよく用いられている。生後11日のラットから小脳顆粒細胞を高カリウム培地で4日間培養し、低カリウム培地に置換した。この時、置換後3時間まではRNA合成阻害剤で抑制されることがわかった。そこで、置換前と後3時間後の培養細胞からRNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成しdifferential subtractionを行った。その結果、いくつかのクローンを候補として見出した。その一つ、SNF1 related kinase(SNRK)を見いだした。SNRK蛋白質はin vitrotranslationの結果、81kDaのバンドが検出され、これは、SNRKの分子量に相当する。また、SNRKのN-terminalに対する抗体と免疫沈降すると、同様に81kDaのバンドが検出された。ラット小脳の内因性のSNRKのimmunoblottingの結果では、65kDaのバンドが検出された。このバンドはCOS細胞やPC12細胞でも見つかった。内因性のSNRKの経時発現変化を見てみると、SNRKmRNAの経時発現変化と同じように、低カリウム培地置換後3時間後から蛋白質の発現量が上がっていることがわかった。これらの結果より、SNRKは培養ラット小脳顆粒細胞における低カリウム培地置換による細胞死に関与しているとことがわかった。しかし、SNRKの制御はプロセッシングによってなされていると思われるが、その機構は明らかではない。また、先に報告されたSNFlのように、SNRKもtranscription factorを制御する可能性があると思われる。ラット顆粒細胞のアポトーシスに関与することが明らかになったSNRKは、今後の細胞死のメカニズムの解明に貢献できると思われる。

このことは、BDNFによる細胞死抑制効果はPI3-キナーゼの活性化に依存しているのに対し、IGF-1の抑制効果はPI3-キナーゼの活性化だけではなく、他の機構にも依存していることを示している。実際、PI3-K経路以外のシグナル蛋白質、Shp-2、Grb-2、N-Shc、PLC、MARK等については、両因子による活性化に大きな違いを見出している。以上のことは、アポトーシスを防御する2つの神経栄養因子間で、それらの防御機構において大きな違いが存在することを示している。今後、その違いの原因を分子レベルで明らかにすることは、神経栄養因子によるアポトーシス防御機構の解明に大きく貢献するものと考えられる。
講義と実習を連動させた効果的な漢方教育プログラムの開発と教育効果の検証

医学教育モデル・コア・カリキュラムおよび医学教育分野別評価基準において漢方教育は必修化された。また、医学教育ではシミュレーション教育や診療参加型実習が推奨され、漢方教育においても講義と実習を連動した教育プログラムが必要となるが、モデルとなる実践例がないため全国的に漢方教育は暗中模索の中にある。本学ではこれまで漢方臨床推論、シミュレーション漢方教育、診療参加型漢方実習を行える環境を整備してきた。本研究では、講義と実習を連動させた効果的な漢方教育のプログラム開発と実践および教育効果の検証を行うことを目的とし、各大学における漢方教育発展に寄与できるよう改定をめざす。
家畜の遺伝性および感染性疾患の分子診断と予防に関する研究

近年、鹿児島市近隣の肉用牛農場において、これまで国内では報告されたことのない細菌性血色素尿症に類似する感染性疾患の集団発生事例が認められた。本研究では、本疾患の原因解明と診断法確立のために、次のような実験を実施して成果を得た。1.原因微生物の同定原因菌としてClostrdium haemolyticumが疑われるため、保存血液を使って嫌気培養を試みたが血液には生菌は残存していなかった。そこで、本菌のflagellin遺伝子における本菌種特異的領域を増幅して、その増幅産物をシーケンス解析した。その結果、増幅した領域はC.haemolyticumに特異的な配列であり、本疾患は本菌の感染によるものと確定診断された。2.肝内寄生虫(肝蛭)の駆虫による細菌性血色素尿症の予防本菌は肝内クッパー細胞内で潜伏し、肝蛭などの機械的刺激で活性化し、本症を発症すると考えられている。そこで、本症発生農場の牛群にtriclabendazoleを投与して、肝蛭の駆虫を行った。その結果、駆虫後には本症発症牛が現在まで全く認められなくなった。3.遺伝子診断法の開発とその応用本症の診断法として、flagellin遺伝子の一部をnested PCRにて増幅する方法を開発した。その後、広島県で同様の症状を呈した牛2例が認められ、これらの症例の血液を使って、本診断法を適用した。その結果、抗生物質により治癒した場合においても、およそ発症から2週間くらいまでは、全血試料から抽出したDNAを用いて、本菌に特異的をDNAが増幅され、本症を確定診断できるこどか明らかとたった。平成20年度には、過去に当教室で発見されたが疾患未同定であった黒毛和種のライソゾーム病(J.Vet.Med.A,2006)について、疾患を同定するために以下の実験を実施した。1.生化学的分析結果発症個体の保存試料を分析した結果、シアル酸結合オリゴ糖ならびにGM3ガングリオシドが、正常個体の試料に比較して、増加・蓄積していることが推測された。2.候補遺伝子配列の解読上記の生化学的分析結果から、ある種の糖蛋白代謝異常症の可能性があることが推定されたため、いくつかの候補遺伝子の内、NEU1およびPPGB遺伝子のエクソン部分の配列をダイレクトジーケンス法にて解読した。その結果、両遺伝子配列には、本疾患に関わるような異常は認められなかった。3.既知遺伝子変異の調査牛のライソゾーム病には、α-マンノシドーシスの原因となる変異が2種類、β-マンノシドーシスの原因となる変異が1種類知られている。したがって、これら3種の変異の有無をPCRおよびシーケンス法にて調査した。その結果、本症例にはこれらの変異は認められなかった。以上の結果より、本黒毛和種症例は、ライソゾーム病の中でも糖蛋白代謝異常症のひとつである可能性が高いことが明らかになった。しかし、シアリドーシスおよびガラクトシアリドーシスはほぼ否定され、αおよびβ-マンノシドーシスについても、過去に報告された変異には関与していないことが示された。
軟部肉腫に対する抗血管新生療法確立のための基礎的研究

軟部肉腫に対する抗血管新生療法確立のための基礎的研究として、粘液型線維肉腫に焦点を絞り、再発あるいは遠隔転移出現を規定する因子を検討した。不適切な切除縁のみならず、骨・関節への接着が粘液型繊維肉腫の局所再発の危険因子であった。粘液型線維肉腫の局所浸潤能と血管新生の関与を評価することにより、軟部肉腫に対する抗血管新生療法の応用に繋がると期待される。軟部肉腫肺転移と血管新生の関連を検討するため、当科で加療を行った軟部肉腫症例の原発腫瘍のパラフィン切片を作製し、血管新生誘導因子Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)に対する免疫染色を行い、VEGF陽性群と陰性群の2群に分類した。今後は、この2群間での後ろ向き検討を行い、肺転移の出現率を検討する予定である。軟部肉腫におけるCTRの存在と軟部肉腫原発腫瘍切除による生体内の血管新生誘導能の亢進を検討するため、軟部肉腫症例の初診時の血清を採取し、血清中の血管新生誘導因子VEGFの濃度をELISA法にて定量化している。現在症例の集積中である。今後は、前向き検討にて血清VEGF濃度と肺転移の出現の相関性を検討する。さらに、原発腫瘍切除前と切除後の患者血清を採取し、それぞれの新生血管誘導能をMatrigel Plug Assayを用いて定量化し、血管新生誘導能を術前後で比較検討し、CTR存在の有無を評価する予定である。軟部肉腫の局所浸潤能あるいは肺転移形成能と血管新生の関連を検討することが本研究の目的であった。高齢者四肢に好発する軟部肉腫である粘液型繊維肉腫は、局所浸潤能が高く、腫瘍周囲の筋膜に異型細胞が広がっている事が知られている。当科で加療を行ったため、当科で加療を行った粘液型繊維肉腫症例においても全症例で腫瘍周囲の筋膜への異型細胞の広がりを確認している。腫瘍切除後の局所再発の危険因子を検討したところ、不十分な切除遠に加えて、骨あるいは関節に腫瘍が接している事が、局所再発の危険因子である事をわれわれは報告した。本年度は、血管新生の亢進が粘液型繊維肉腫の局所再発に関連していないかを検討する。粘液型繊維肉腫症例の原発腫瘍のパラフィン切片を作製し、血管新生誘導因子Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)に対する免疫染色を行い、VEGF陽性群と陰性群の2群に分類する。この2群間での後ろ向き検討を行い、局所再発の出現率を検討する予定である。軟部肉腫の局所浸潤能あるいは肺転移形成能と血管新生の関連を検討することが本研究の目的である。そのため、適切な切除縁の獲得が困難なことが多く、高い局所再発率が示すことが特徴である。当科で治療した粘液型繊維肉腫症例においても全症例で腫瘍周囲の筋膜への異型細胞の広がりを確認している。さらに、粘液型繊維肉腫不適切切除例に対しては追加切除が技術的に困難であったり、機能障害が大きくなることもあって、放射線照射が選択されることがある。しかしながら、粘液型繊維肉腫不適切切除例に対する放射線照射の局所再発予防効果に関して確立されたエビデンスはないため、術後放射線照射の局所再発抑制効果を検討した。不適切切除縁をmicroscopical positivemarginとgrosslypositive marginの2群に分けその効果を評価した。microscopical positive groupでは術後放射線照射を行なうことで局所再発を阻止できていたが、grossly positive groupでは術後放射線照射を行なっても全例で局所再発を生じていた。切除縁がmicroscopical positive marginとなった症例に対しては、放射線照射を追加することで、局所再発を予防しうるが、grossly positive marginと評価された症例に対しては放射線照射ではなく追加切除などの治療法を選択するべきであると結論する。
光給電システムを付加した光ファイバセンサの開発

光ファイバセンサは電磁波の影響を受けずに、絶縁性に優れ、細径で、狭い領域の計測に適し、目的とする計測量を容易に知ることができ、生体計測に広く応用されている。ここでは、生体計測用の光ファイバの開発、光ファイバによる測定法の信頼性について、ならびに、光ファイバによるエネルギ供給について検討した。本事業で行った研究内容は、1)心拍数、呼吸数測定のための光電脈波・光ファイバセンサの開発これは、光電脈波測定装置と光ファイバを組み合わせたもので、検出信号から信号処理により心拍数、呼吸数を連続測定した。信号出力から可変のディジタルフィルタやウェーブレット変換を用いて波形の分離を試み、従来の方法と匹敵する結果を得ることができた。2)組織の動きがレーザ血流信号に与える影響筋や皮膚組織の振動がレーザドプラ血流計の信号成分に影響を与えている。これをスペクトル解析を用いて定量的に評価した。レーザドプラ血流計の信号と磁気センサで測定した信号を周波数軸で比較し、その大きさより、血流による成分と動きによる成分を分離できることが示された。3)紫外線照射による紅班の評価反射型光分光計を用いて紅班の有無を定量的に評価した。光ファイバによりハロゲン光を皮膚に照射し、反射光を光ファイバを介して受光し、分光分析した。その結果580から600nmの範囲で正常の皮膚と紅班のある皮膚との差が示された。4)光給電法の検討光ファイバによりエネルギを供給するシステムを構築し、その基礎的評価を試みたが、最大で10mW程度の電力しか得ることができなかった。エネルギ効率の向上を検討する必要がある。われわれは、遠隔地、劣悪環境下、ならびに生体植え込みの計測機器を作動させるために、エネルギーを光ファイバによって伝送させるシステムを検討している。これまでにレーザーダイオード、多成分ガラス光ファイバと太陽電池を用いてエネルギを供給することができることを明らかにしてきた。レーザダイオードと太陽電池の波長からいくつかの太陽電池を選択してエネルギー効率の実験を行った結果、GaAsを材料とした太陽電池が、シリコン、アモルファスなどの材料に比較して高いエネルギ変換率を得ることが示された。しかしながら、光ファイバの開口数が小さいので、より高いエネルギ効率を得るために、光ファイバ先端にレンズを組み合わせることにより開口数を大きくし、エネルギ効率を高めることを検討した。光学ベンチ上でレンズ、光ファイバ先端を直列にするなどの工夫をしたが、レンズ表面での反射が大きく、開口数は大きくなったがエネルギは必ずしも増大しなかった。そこで、ファイバ先端を回転させながら熔解させ球状とした。その結果、開口数が大きくなり、エネルギ伝送効率も向上した。さらに、光ファイバ先端の形状の違い(球、楕円球など)により焦点が変化させることができることが示された。次年度は、形状と焦点についての基本性能の確認とシステム評価を行う。さらに、センサについては以下の開発を試みている。現在、市販されている抹消血流測定のためのレーザ血流計は、血流速が一定にもかかわらず、振動の影響で信号出力が変化することが知られている。そこで、位置センサを用いて振動を測定し、振動を与えたときのレーザ血流出力と同時測定して、信号出力が補償できるかを検討する。そのための干渉の原理を用いた位置センサの開発を行った。次年度は、開発した機器を用いて実験を施行する。

ここでは、生体計測用の光ファイバの開発、光ファイバによる測定法の信頼性について、ならびに、光ファイバによるエネルギ供給について検討した。本事業で行った研究内容は、1)心拍数、呼吸数測定のための光電脈波・光ファイバセンサの開発これは、光電脈波測定装置と光ファイバを組み合わせたもので、検出信号から信号処理により心拍数、呼吸数を連続測定した。信号出力から可変のディジタルフィルタやウェーブレット変換を用いて波形の分離を試み、従来の方法と匹敵する結果を得ることができた。2)組織の動きがレーザ血流信号に与える影響筋や皮膚組織の振動がレーザドプラ血流計の信号成分に影響を与えている。これをスペクトル解析を用いて定量的に評価した。レーザドプラ血流計の信号と磁気センサで測定した信号を周波数軸で比較し、その大きさより、血流による成分と動きによる成分を分離できることが示された。3)紫外線照射による紅班の評価反射型光分光計を用いて紅班の有無を定量的に評価した。光ファイバによりハロゲン光を皮膚に照射し、反射光を光ファイバを介して受光し、分光分析した。その結果580から600nmの範囲で正常の皮膚と紅班のある皮膚との差が示された。4)光給電法の検討光ファイバによりエネルギを供給するシステムを構築し、その基礎的評価を試みたが、最大で10mW程度の電力しか得ることができなかった。エネルギ効率の向上を検討する必要がある。
先進ドップラー反射計を用いた周辺部輸送障壁における径電場分布計測法の開発

2台の高速掃引型シンセサイザを用いた先進ドップラー反射計を開発し、径電場分布計測と密度揺動径方向相関計測に適用した。径電場分布計測では、電場形成と密接に繋がっているプラズマ回転を変化させた時の径電場分布の変化を観測した。また、密度揺動の相関計測では、内部輸送障壁に電子サイクロトロン共鳴加熱を行った際、イオン温度分布の急峻な勾配が劣化する場合に密度揺動の長距離相関長が増加することを初めて明らかにした。本年度は、入射周波数を階段状に変化させることでプラズマ中の密度揺動の回転速度空間分布を計測するため、ドップラー反射計のミリ波回路部の開発を行った。空間分布計測に必要な入射周波数の掃引に時間がかかってしまうとプラズマの早い変化を計測することができなくなってしまうため、8-12.5GHz帯域で動作する同期した2台のシンセサイザを高速に周波数掃引可能な高速同期シンセサイザを開発した。周波数の変更開始から500μs以下で同期が取れるため、16msで空間10点をスキャンすることができた。このシンセサイザの信号を4逓倍することにより計測に必要な33-50GHz帯域のミリ波を得ることができた。このようにミリ波回路部の開発では目標通りの基本性能を得た。ドップラー反射計のミリ波回路部の開発と並行して、既存の密度揺動測定用反射計を用いて測定可能なプラズマ条件を調べた。そして、プラズマの位置や形状を最適化することで、電磁波がプラズマの磁気面に対し斜めに入射する条件があることを明らかにした。このとき、密度揺動測定用反射計にはドップラーシフトした反射信号が観測されており、既設の導波管やアンテナを使用してもドップラー反射計によるプラズマ計測が可能であることを示した。また、本研究の研究目標の一つであるELM特性に関する研究を行い、プラズマの径電場と強く関係しているトロイダル回転を変化させることでELM特性が大きく変化することを明らかにした。今後、本研究で開発したドップラー反射計による計測を行うことにより、ELM特性の変化と径電場分布構造の関係について新しい知見が得られると期待される。本年度は、開発したミリ波回路部を既設のコルゲート導波管に接続するためのアダプターを導入し、ドップラー反射計システムの開発を完了した。周波数掃引速度・S/N比・データ収集速度等の基本的な性能が設計通りであることを確認した後、JT-60における密度揺動計測を開始した。昨年度の知見をもとに計測に最適になるようプラズマ形状や位置を調整した結果、鏡面反射成分を除外し、ブラッグ条件を満たす密度揺動により散乱された電磁波のみを計測することができた。プラズマ中の屈折を考慮するため光線追跡コードを利用して評価した結果、プラズマ周辺部で観測された信号は電子反磁性ドリフト方向に回転する密度揺動により散乱されたものであること、観測されたドップラーシフトに対応するのは負の径電場であり従来の観測結果と矛盾しないこと、を明らかにした。ドップラー反射計システムは既設の周波数固定型のミリ波反射計と組み合わせて使用することで電子密度揺動の相関計測を行うことが原理的に可能である。周波数の掃引幅を調節し、相関反射計として内部輸送障壁の計測に適用した。プラズマ内部に輸送障壁を持つ放電に電子サイクロトロン共鳴加熱を行った際に輸送障壁が劣化する現象がこれまで観測されているが、相関計測の結果、内部輸送障壁内部において密度揺動の相関長が大きくなっていることを始めて見出した。これらの研究成果から、当初予定していたELM特性の変化と径電場分布構造の関係のみならず、内部輸送障壁の性能と電子密度揺動の径方向相関の関係にも着目した研究の進展が期待される。本年度は、開発したドップラー反射計システムを用いた密度揺動計測を行った。プラズマとアンテナの配置を調整し、ブラッグ条件を満たす後方散乱波のみを計測できるようにした結果、ドップラーシフトした密度揺動信号を観測することができた。ドップラーシフトしたスペクトルから径電場分布を評価した結果、プラズマ電流と同方向に回転しているプラズマでは正の径電場に、逆方向に回転しているプラズマでは負の径電場になっていることがわかった。一連のELM研究においてプラズマ電流と同方向に回転しているプラズマではELMが大きくなることを見出しており、径電場分布構造とELMの大きさに関する解析を継続している。また、プラズマ電流と同方向に回転しているプラズマでは、炭素不純物イオンからの発光を用いた荷電交換再結合分光をもとに評価した径電場分布とよく一致するのに対し、逆方向に回転しているプラズマでは大きくずれることがわかった。今後の研究でずれの原因を明らかにすることにより、どちらの評価手法がより適切かを判断できると思われる。本研究で開発したドップラー反射計システムは、既設の周波数固定型のミリ波反射計と組み合わせて使用することで電子密度揺動の径方向相関の評価が可能である。そこで内部輸送障壁における密度揺動計測を行い、ECH入射によりイオン温度分布に観測されるITBが劣化する場合には、長距離相関が増加することを明らかにした。

本研究により径方向相関長を評価することが可能になったので、乱流スペクトルの変化でイオン熱輸送の増加が説明できるかどうか、研究を発展させることが可能になった。
幹細胞による四肢パターンの構築-器官工学へむけて

イモリ等の有尾両生類の四肢は完全な再生を行なうのに、マウス、ヒト等の哺乳類では指先の再生しか見られない。この再生能の大きな差を埋め、ヒトを含めた哺乳類での四肢再生を可能にするため、本研究では、マウス新生仔の四肢を用いて、その再生能を調べた。四肢を前腕部レベルで切断すると、数日後に切断部の2本の骨(とう骨と尺骨)の肥大が起こり、その前に細胞増殖とMsx遺伝子の発現及び軟骨分化が見られた。これは再生芽に類似した構造が形成されたものと考えられるが、骨パターンとしては、切断部の骨が球状に肥大するのみで、より先端部に相当する骨または軟骨は形成されなかった。ところが切断部に細胞増殖のための空間を作り、骨形成タンパク質を加えると、より先端部に数個の軟骨や骨からなり、切断部の骨とは独立の構造が形成された。但し一部は切断部の骨と部分的に結合していた。これらの構造はまだ明確な軸は持っていないが、先端に行くほど構造は小さくなり、基部-先端部軸に対応した構造が見られた。切断部にあった、あるいは形成された幹細胞に骨形成タンパクが作用し、軟骨分化を引き起こし、より先端の構造を作ったものと考えられる。今後、Sonic hedgehogタンパク質の添加により前後軸を形成することにより、より完全な四肢再生を目指す。本研究は、哺乳類の四肢再生に新しい道を開いたものといえる。有尾両生類の四肢は成体でも完全に再生するのに対し、哺乳類の四肢は指先を除いて全く再生しない。再生が起こらない原因のひとつとして、切断部に再生芽が形成されない可能性を考え、外から幹細胞のような未分化様細胞を補うことを試みた。未分化様細胞として、まずマウス胚肢芽細胞を用いた。四肢の切断部で起こるシグナル伝達に反応でき、軟骨パターンを作れるという理由からである。新生仔マウスの掌部を切断し、内部の結合組織、筋肉組織を取り除いた後、解離して再凝集させた肢芽細胞を移植した。宿主との区別のために、移植にはGFPマウス由来の細胞を用いた。移植後10日で、分岐、分節を含む軟骨パターンが形成された。分節部では、II型コラーゲン量の減少とI型コラーゲンの発現がみられた。この結果から、新生仔マウスの四肢切断部には、凝集された軟骨細胞を四肢パターンに変える環境があると考えられる。一方、新生仔マウスの四肢を前腕部で切断すると、切断部での細胞増殖、軟骨分化が起こり、肥大化することが判った。またその際に未分化細胞のマーカーであるMsxタンパクの発現がみられた。この結果は、少数ではあるが、未分化細胞の出現を示している。
ブタ卵細胞質内精子注入卵における卵活性化機構の解析および新規卵活性化誘起法の開発

卵細胞質内精子注入(ICSI)法は有用な生殖補助技術だが、ブタではICSI後の卵(ICSI卵)の受精効率が低い。本研究では、その原因が卵活性化誘起不全にあると考え、精子が有する卵活性化誘起因子PLCzetaを用いた生理的な卵活性化誘起法を開発することによる改善を目指した。その結果、精子のPLCzeta保有量不足がICSI後の卵活性化誘起の失敗の原因であると明らかとなった。そして、ブタPLCzeta mRNAのブタICSI卵への注入により、効率的に卵活性化を誘起することができ、受精率の飛躍的な改善が認められた。ブタPLCzetaタンパク質による卵活性化誘起についても引き続き取り組んでいく。卵細胞質内精子注入(ICSI)技術は、数が少ない、運動性が乏しいなど通常の受精には関与できない精子であっても遺伝資源として活用することのできる有用な繁殖補助技術である。しかし、ブタにおいてICSIをした卵(ICSI卵)の受精、胚発生効率の低さが問題となっている。その原因の一つとして、ICSIによって注入された精子による卵活性化誘起の失敗が挙げられる。本研究では、ICSI卵の卵活性化誘起失敗は、ICSIに用いる精子の卵活性化誘起因子PLCzeta保有量不足に起因しているのではなかと考え、PLCzetaを保有する精子のみをICSIに用いた時の卵活性化誘起効率や卵活性化現象の検証に取り組んでいる。本年度は、PLCzetaを保有する精子の選抜方法を検討した。自力で透明帯を通過した精子はPLCzetaを保有していると考え、卵細胞質を除去して透明帯のみにした卵を用いて体外受精を行ったが、透明帯通過精子の判別が困難であった。また、生理的に卵活性化現象を誘起できる新しい人為的卵活性化誘起法の開発を試みている。具体的には、PLCzetaタンパク質を非侵襲的手法により卵細胞質内へ導入し卵活性化誘起を目指す。本年度は、ブタ精巣total RNAからPLCzetaをクローニングしブタPLCzeta mRNAを作成した。また、これをブタ卵に注入することにより卵活性化現象の引き金となるカルシウムオシレーションが生じることを確認した。さらに、蛍光標識したPLCzetaタンパク質を合成するために、蛍光タンパク質Venusを連結させたPLCzeta mRNA+Venusを作成した。これにより、Venusの発光強度を測定することで卵細胞質内に導入されたPLCzetaタンパク質量をモニターすることが可能となる。卵細胞質内精子注入(intracytoplasmic sperm injection: ICSI)技術は、数が少ない、運動性が乏しいなどの通常の受精には関与できない精子であっても遺伝資源として活用することを可能とする有用な繁殖補助技術である。本研究では、ICSI卵の卵活性化誘起失敗は、ICSIに用いる精子における卵活性化誘起因子Phospholipase Czeta (PLCzeta)の保有量不足に起因しているのではないかと考え、PLCzetaを保有する精子を選抜してICSIに用いることで卵活性化誘起効率が向上するのか検証を行っている。本年度は、パーコール密度勾配-遠心分離法によりPLCzeta保有精子率の高い分画を選抜することができた。その精子を用いたICSIでは卵活性化誘起効率が飛躍的に向上した。具体的には、PLCzetaタンパク質を合成し、非侵襲的手法により卵細胞質内へ導入することで卵活性化の誘起を目指す。本年度は、昨年度までに作成したPLCzeta mRNAを用いてタンパク質の合成および卵への導入を試みた。その結果、少量ではあるがタンパク質を合成することに成功した。しかし、タンパク質濃度が低く、卵内への導入試験では卵を活性化させることができなかった。より濃度の高いタンパク質を得られる条件を検討する必要がある。PLCzeta保有精子率の高い精子分画の選別に成功し、それをICSIに用いることで卵の活性化誘起効率が飛躍的に向上することを明らかにできた。その一方、卵活性化を誘起できるほどのPLCzetaタンパク質を合成することが未だできていないため。卵細胞質内精子注入(ICSI)技術は、有用な繁殖補助技術である。それゆえ、試薬や電気刺激などによる人為的卵活性化誘起処理が施されてきた。しかし、依然として受精、胚作出効率は低いため、生理的な卵活性化を誘起させる必要があると考えた。そこで本年度は、精子が本来有する卵活性化誘起因子とされるPhosphplipase Czeta (PLCzeta)を用いた、生理的な卵活性化現象を誘起できる新しい人為的卵活性化誘起法の開発を試みた。まず、ブタPLCzeta mRNAを用いた卵活性化誘起方法の確立を目指した。

その結果、300ng/μl PLCzeta mRNAをブタICSI卵に注入することで、自然受精卵と同様な卵細胞質内のカルシウム濃度変動パターンが誘起され、受精効率も79.4%となり、PLCzeta mRNAを注入していない卵(25.0%)に比べて有意に高くなった。さらに、昨年度に引き続き、ブタPLCzeta mRNAからPLCzetaタンパク質を合成し、非侵襲的手法により卵細胞質内へ導入することで生理的な卵活性化の誘起を試みた。昨年度の研究では、無細胞系タンパク質発現法により、少量ではあるがPLCzetaタンパク質を合成することに成功したが、タンパク質濃度が低く、卵内への導入試験では卵を活性化させることができなかったので、より濃度の高いタンパク質を得られる条件を検討する必要があった。そこで本年度は、細菌を用いる系でのタンパク質発現を目指した。その結果、昨年度に比べて多くのタンパク質の合成が確認されたが、目的タンパク質の精製が困難だったため、ブタ卵子内への導入には至らなかった。卵細胞質内精子注入(ICSI)法は有用な生殖補助技術だが、ブタではICSI後の卵(ICSI卵)の受精効率が低い。本研究では、その原因が卵活性化誘起不全にあると考え、精子が有する卵活性化誘起因子PLCzetaを用いた生理的な卵活性化誘起法を開発することによる改善を目指した。その結果、精子のPLCzeta保有量不足がICSI後の卵活性化誘起の失敗の原因であると明らかとなった。そして、ブタPLCzeta mRNAのブタICSI卵への注入により、効率的に卵活性化を誘起することができ、受精率の飛躍的な改善が認められた。ブタPLCzetaタンパク質による卵活性化誘起についても引き続き取り組んでいく。本年度中にPLCzeta保有精子の選別方法を確立して卵活性化現象の検証にとりかかる予定だったが、選別方法の確立には至らなかった。また、新たな卵活性化方法の開発については、PLCzeta mRNA合成に予想以上に時間を要したためPLCzetaタンパク質を合成することができなかった。PLCzeta保有精子を用いたICSIについては、学会および論文発表を行う。また、PLCzetaタンパク質を用いた卵活性化誘起法の開発については、タンパク質合成系の条件や手法を再検討することでタンパク質合成効率の改善を進める。家畜繁殖学PLCzeta保有精子の選抜方法については、パーコール遠心法での選抜を試みる。さまざまな濃度のパーコール溶液を用いて分画化された精子を用いて体外受精を行い、最も受精率が高かった分画の精子のPLCzeta保有率を免疫蛍光染色により確認する。そして、選抜された精子を用いてICSIを行い、MPFやMAPK、前核形成など卵活性化に関与する各種現象について解析する。新たな卵活性化方法の開発については、まずPLCzetaタンパク質を合成する。そして、卵細胞質内への導入方法を検討する。具体的には、電気刺激あるいはタンパク質導入試薬を用いて行い、導入効率、卵活性化や胚発生効率などを調べ、最適な手法および条件を検討する。カルシウム測定機器の故障が生じました。その対応のための予算を確保していたのですが、今年度中に修理を完了できなかったため次年度使用額が生じました。産前産後休暇を2014年12月から取得しています。当初、カルシウム測定のための機器購入を予定していました。