hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非整数次元表面のフラクタル解析

本研究の実験上における最大の目標である極低温(4.2K)He吸着装置を立上げた。He吸着装置はステンレス製,高分解能圧力トランスジュ-サ-,微小吸着吸着量計測システムからなり、一回の液体He供給により8時間の連続測定が可能である。更にXe等の温度制御システムの開発は遅れているが,液体窒素温度における精密N2吸着等温線ならびに303Kにおける有機蒸気吸着等温線の測定を行いえた。試料には新素材として脚光を集めている活性炭素繊維を用いた。分子サイズの異なる各分子吸着等温線のBET解析により、単分子吸着容量mを求め,分子断面積σとのフラクタル関係成立を調べた。これによると,logm ∞(D/2) logσ(1)(1)式が成立しており,フラクタル次元を決定できた。活性炭素繊維のフラクタル次元は3に近い非整数次元であり,活性炭素繊維の種類により差異がみられた。更に表面に鉄酸化物を高分散化処理するとフラクタル次元が変化し,フラクタル次元解析がミクロポ-ラス系固体にも有効な事が示された。一方,He吸着は活性炭素繊維系においては,分子ふるい効果が著しくあらわれ,ミクロ孔表面のフラクタル解析には、更に検討が必要である。ただし,分子ふるい効果は広義のフラクタルに含まれるものであり,今後定量的解析が行えよう。また,He吸着は7A°以下のウルトラミクロ孔の解析に極めて有効な事が示された。以上の実績は3編の論文として既に発表され,今後更に実績が積まれてこよう。
貪食細胞における活性酸素産生トランスポートソームの形成・活性化機構の解明

【研究の背景と目的】貪食細胞により貪食された微生物は、細胞膜と細胞内膜器官の膜成分により形成される食胞膜に取り込まれ、食胞膜上で形成されるNADPHoxidase(Nox)の機能的複合体形成により産生される活性酸素種により殺菌・消化される。貪食細胞におけるNoxであるNox2の機能的複合体は、細胞膜成分であるcytochrome b_<558>と4つの細胞質成分(p47^<phox>, p67^<phox>, p40^<phox>, Rac)により成る。このように、食胞は、複数の細胞内コンパーメントが、個々の独立した機序により集合し、貪食時に食胞膜で始めて機能を発現する"活性酸素産生トランスポートソーム"と見なし得る。本研究は、この"活性酸素産生トランスポートソーム"の分子構成、脂質-蛋白質結合、時空間動態、複合体形成にかかわる分子間相互作用を解析することにより、膜上でのNoxの活性化型複合体による活性酸素を産生するメカニズムの解明を目指すものである。【研究方法・研究内容】(1)p40^<phox>の構造変化を誘導する生理的機構のイメージング解析、(2) RhoGDI分子種による活性酸素産生制御機構のイメージング解析を行った。【研究結果】1.生細胞を用いて、共焦点レーザー顕微鏡下での可視化により、刺激時にp40^<phox>の構造変化が起こるメカニズムとp40^<phox>がNox2の活性化促進因子として機能するメカニズムについて解明した。2. RhoGDI分子種の違いにより活性酸素産生抑制能力に違いがあることを突きとめ、そのメカニズムが、RhoGDI-Rac複合体の膜ターゲット様式の違いに起因することを明らかにした。これらの両研究成果については、現在論文作成中である。【研究の背景と目的】貪食細胞により貪食された微生物は、細胞膜と細胞内膜器官の膜成分により形成される食胞膜に取り込まれ、食胞膜上で形されるNADPHoxidase(Nox)の機能的複合体形成により産生される活性酸素種により殺菌・消化される。貪食細胞におけるNoxであるNox2の機能的複合体は、細胞膜成分であるcytochromeb_<558>と4つの細胞質成分(p47^<Phox>,p67^<phox>,p40^<phox>,Rac)により成る。【研究方法・研究内容】本年度は、(1)p40^<phox>の構造変化を誘導する生理的機構のイメージング解析、(2)RhoGDI分子種による活性酸素産生制御機構のイメージング解析を行った。
量子輸送方程式と冷却原子系への応用

凝縮のない冷却原子系を対象に、場の量子論に基づく非平衡過程の定式化から量子輸送方程式を導出し、その数値解析を行った。自己エネルギーに現れる虚部の存在が熱平衡への緩和に必要であること、非マルコフ性は非平衡過程の進行をゆっくりさせることを明らかにした。凝縮現象を含む非平衡相転移過程記述の前提として、Bogoliubov近似が使えない有限サイズ系で、自発的対称性の破れに付随して現れるゼロモードの場の量子論として矛盾のない定式化に成功した。この定式化を冷却原子系で凝縮中にダークソリトンがある系や原子核αクラスターモデルにも適用し、従来全くない視点から理論的に解析した。基礎的内容で予想以上に大きな進展を得ることができた。我々の量子輸送方程式は非平衡Thermo Field Dynamics(TFD)で繰り込み条件から導出するわけで、TFDの深い理解は極めて重要である。TFDでは自由度を二重化されるが、それは混合状態期待値を純粋状態期待値で表わすためと通常は理解されている。我々は熱的状況下の古典力学でも自由度の二重化が必要であるというGalleyの理論を場の量子論に適用することによって、混合状態の概念なしに、非平衡TFDを導出したことが一つ目の成果である。二つ目は、自発的対称性の破れに伴うゼロモードに関して、これまで理論的には秩序パラメーターの位相が量子的に拡散してしまうという問題があった。この問題に対して、それはゼロモード演算子の線形項のみを考慮するために生ずる欠陥で、非線形項まで取り入れれば、位相の量子拡散はないということを明らかにした。この研究により、Bose凝縮体のある量子輸送方程式を定式化する際の最大の困難を克服したと言える。自発的対称性の破れのない冷却原子系の量子輸送方程式については、主に数値計算に基づく研究を進展させた。具体的には、二重井戸モデルや一次元光学格子モデルに対して、熱平衡への緩和が調べられ、自己エネルギーの虚部や実部の高次補正を取り入れることが必須であることを示した。また、量子輸送方程式適用の前の準備として、二次元、三次元光学格子中の冷却原子系のBose-HubbardモデルやFermi-Hubbardモデルで真空及び有限温度の理論的解析を進めた。特に、Fermi原子の粒子移動の解析を行った。また、自発的対称性の破れのある例として、Bose-Einstein凝縮中にダークソリトンが存在する系に対して、ゼロモードをきちんと取り入れた定式化を行った。その結果、ゼロモード由来の動的不安定性が生ずることを示した。本研究の目標は、非平衡Thermo Field Dynamicsの繰り込み条件から導出される量子輸送方程式を用いて、主に冷却原子系での非平衡過程を記述することにある。平成264年度の研究として、様々な具体的系で量子輸送方程式の数値計算を用いて研究を進める過程で、量子輸送方程式に自己エネルギーの虚部として現れる粒子の熱的不安定性の効果を取り入れることが極めて重要であるという結論に至った。その効果を取り入れる場合と取り入れない場合では量子輸送輸送方程式に従う緩和過程は大きく異なり、前者で平衡系までの緩和過程を追うことができるのに対して、後者では平衡系への緩和が困難という傾向が見られた。これまでの数値計算はBose-Einstein凝縮のない場合の量子輸送方程式に限られていたが、凝縮のある場合がより興味深い。凝縮現象は自発的対称性の破れと解釈されるが、有限サイズ系ではそれに伴って現れるゼロモードを平衡系でさえ理論的に正しく扱うことができなかった。ゼロモードの非線形効果まで取り入れることによって真空中及び平衡系で問題が解決されるという我々の提案は、非平衡の凝縮系を扱うことを原理的に可能とした。非平衡系への適用の前に、2014年度では凝縮体中にダーク・ソリトンのある系や原子核アルファクラスター模型へ応用し、我々のゼロモードの取り扱いの正当性をさらに吟味した。特に、これまで原子核理論では12C原子核のHoyle状態及びその励起状態が回転バンドと解釈されていたが、アルファ粒子の位相対称性の自発的破れでそれらのスペクトルが説明できるという全く新しい解釈を示せたことは大きな成果である。非平衡過程が観測可能な冷却原子系を対象に、場の量子論から導かれる量子輸送方程式の解析を中心に理論研究を行った。場の量子論から導かれる量子輸送方程式では、非マルコフ性とエネルギーの虚部の存在が大きな特徴である。三年間の研究期間を通じて行った様々な状況での数値計算で、非マルコフ性はよりゆっくりと非平衡過程を進行させること、虚部を取り入れないと数値計算で熱平衡への緩和が困難となること、この2点を明確にしたことは重要な成果である。また定常非平衡過程の解析を開始し、最終年度にはその成果を国際会議などで発表した。我々の用いる量子輸送方程式は非平衡Thermo Field Dynamics (TFD)で繰り込み条件から導出されるので、TFDの深い理解は極めて重要である。TFDではすべての自由度は二重化され、それは混合状態期待値を純粋状態期待値で表わすためとするのが通常の理解であった。熱的状況下の古典力学でも自由度の二重化が必要であるというGalleyの理論を場の量子論に適用することによって、混合状態の概念なしに非平衡TFDを導出したことは期間中の研究の大きな成果であり、今後の量子輸送方程式導出の議論に全く新たな視点を与えると予想される。相転移を伴う非平衡過程の理論研究は最も重要である。冷却原子系のBose-

Einstein凝縮は自発的対称性の破れと理解されるが、これまでそれに付随して現れるゼロモードを有限サイズで場の量子論として正しく取り扱う方法が知られていなかった。ゼロモードの非線形効果まで取り入れた定式化を提案し、真空理論や平衡系に適用し研究期間中多くの成果を得た。応用は、冷却原子系のダークソリトンに留まらず、原子核のアルファ粒子模型にも発展した。こうした我々のゼロモードの定式化により、凝縮が関わる相転移の非平衡過程の理論研究が可能となった意義は大きい。凝縮のない冷却原子系を対象に、場の量子論に基づく非平衡過程の定式化から量子輸送方程式を導出し、その数値解析を行った。自己エネルギーに現れる虚部の存在が熱平衡への緩和に必要であること、非マルコフ性は非平衡過程の進行をゆっくりさせることを明らかにした。凝縮現象を含む非平衡相転移過程記述の前提として、Bogoliubov近似が使えない有限サイズ系で、自発的対称性の破れに付随して現れるゼロモードの場の量子論として矛盾のない定式化に成功した。この定式化を冷却原子系で凝縮中にダークソリトンがある系や原子核αクラスターモデルにも適用し、従来全くない視点から理論的に解析した。凝縮体のない場合の量子輸送方程式の解析に関する研究は順調に進展している。非マルコフ性や自己エネルギーの虚部の影響についての理解は十分進んでいる。一方、凝縮体の存在する場合の量子輸送方程式の計算は計画通りには進んでいない。それは、ゼロ・モードを線形的に取り扱う通常の方法では秩序パラメーターの位相が量子拡散してしまうという困難のためであったが、ゼロ・モードの非線形項を取り入れる我々の方法を平成26年度の研究を通じて吟味した結果、その困難が克服できる見通しを持てる状況に至っている。場の晩量子論平成25年度、26年度を通じて、量子輸送方程式の数値解析を行い、様々なことも明らかにしたが、その計算コストの大きさ故に粒子数の少ない系に限られていた。数値計算アルゴリズムの工夫も進めてきたので、それを最大限に利用してより大きな系の数値計算に試したい。そうした計算結果とともに、凝縮体のない場合の研究成果を論文としてまとめる予定である。ゼロ・モードの取り扱に目途がついたので、凝縮体のある場合の量子輸送方程式の解析を開始する予定である。ゼロ・モードの我々の取り扱いについては、非平衡過程とは直接関係がないが、原子核アルファクラスタモデルで12Cに対して全く新たな解釈を与えるものであることが明らかになったので、16O、20Ne、・・・といった系列のより重い原子核への応用を目指している。平成25年度の研究計画で挙げていた項目は4つあった。(1)非マルコフ性を持つ量子輸送方程式の数値計算、(2)凝縮体がある場合で、ゆっくり変化する系の解析、(3)光学格子ポテンシャル中の平衡系の解析、(4)凝縮体中にダークソリトンがある場合のゼロモードを含む定式化と解析、である。(1)、(3)、(4)については予定通り進捗し、結果の一部は論文で発表している。(2)の定式化はなされているが、数値計算で明確な結果を得る結論には至っていない。実績の概要にも書いたように、基礎的な内容で二つの大きな成果を得ることができた。
TSHおよびATPによる甲状腺細胞の機能制御におけるGTP結合タンパク質の関与

甲状腺細胞では各種の細胞外シグナルに対する受容機構があるが、細胞膜上のシグナルトランスダクション機構について、特にホスホイノシタイド-Ca系(PI系)についてはほとんど知られていない。これは、TSHによるこの系の活性化がきわめて弱く、そのほかのシグナルでもあまりよい実験系が作られていなかったためでもある。我々は先にラット甲状腺細胞株FRTL5を用い、ATPがP_2プリナージック受容系(P_2R)を介してPI系を著しく促進することを発見した。本研究では甲状腺PI系の活性化に関わる各種受容系を比較し、さらに、シグナルトランスダクション機構の新しい作用形式を発見した。1)TSH依存性の増殖を行なうこの細胞ではP.I系の活性化はATP>ノルエピネフリン(NE)>TSHの順に弱くなる。培養液からTSHを除いて培養を続けると、ATPによる活性化は変化しないが、NEによるそれは消失し、TSHによるものは著しく増大する。TSHに対するレスポンスの変化は培養液中の血清成分に依存し、血清成分の効果はIGF-I+ハイドロコーチソンで置き換えられる事を発見し、各受容系がそれぞれ特異的に外来性シグナルにより変動することを明らかにした。2)プリン誘導体の内アデノシンはPI系を活性化しないがcAMP系を阻害する。この阻害活性は百日ぜき毒素(PT)感受性G-タンパク質(GI=G_1またはG_1、様Gタンパク質)の関与を示す。GTPはPI系を中程度に活性化するがcAMP系への影響はきわめて低い。ATPは両方の活性を持ちPTで一部抑制される。ところがGTPのPI系活性化はアデノシンで著しく増大し、その増加分のみPT感受性となり、一見ATP様の作用を示す。このような非PI活性型アゴニストのPI活性化における許容効果はGIの新しい作用形式と考えられ、ATPの場合もcAMP阻害系を介して、自らのPI促進系に許容効果?をかけている可能性がある。
ヘテロダイン・コヒーレント型光ファイバ通信ならびに計測の研究

A.送信デバイスの研究コヒーレント光通信用の半導体レーザには、極めて高いスペクトル純度が要求される。本研究ではまず1.55μm帯InGaAsPレーザのスペクトル線幅の測定技術の確立につとめ、線幅・出力積10MHz・mWを得た。これはGaAlAsレーザをしのぐ値である。また線幅増大係数αの実測につとめ、α烱-2.22.8との値を得た。また特に高出力時に1/f雑音が大きな影響を与えていることを発見し、このことからAFC回路によって1/f雑音を十分に除去し、共振器のQ値を改善すれば、DFBレーザ単体でも将来スペクトル線幅1MHzの達成が可能との見通しを得た。B.伝送デバイスの研究ヘテロダインまたはホモダイン通信においては、受信光波の偏波状態の安定化が望まれる。その為の「絶対単一偏波」のひとつとしてサイドトンネル型ファイバを例にとり、非軸対称ファイバの特性解析法の開発につとめ、モード別電磁界形状等につき多くの新知見を得た。C.受信デバイスの研究ヘテロダインまたはホモダイン受信機においては、信号光と局発光の偏波状態の一致が要求される。しかし前項でのべた単一偏波ファイバぬ場合もあり、それにそなえて偏波ダイバーシティと偏波ゆらぎ補正装置の研究につとめた。特に後者については光ファイバクランク素子の発明・開発により、実用性の高い方式を実現した。D.通信システムの研究特にFSK,PSKについて光源の位相ゆらぎがBER(符号誤り率)に与える影響を理論的に明らかにし、かつ実験的に検証した。E.計測システムの研究受動型リング共振方式光ジャイロについて、その主要な雑音要因の強動の把握と低減法の開発につとめ、光学系設計の為の指針を得た。
新たに見いだされた神経特異的カルシウム結合蛋白質の構造と機能

平成7-8年度の成果は以下の通りである。1.新規NCaP遺伝子のcDNAをクローニングした。それらはカエル嗅上皮p26olf、錐体視細胞中のs26、ラット海馬に存在するHLP3とHLP4、分裂酵母第一染色体の存在する機能未知の蛋白質などである。2.ヒポカルシンについてゲノム遺伝子を単離するとともにヒトの第2染色体に存在することを明らかにした。また、遺伝子転写機構について検討し、エンハンサー、サイレンサー領域を推定した。3.S-モジュリンの標的蛋白質がロドプシンキナーゼであることが同定された。ロドプシンキナーゼ自身自己リン酸化されるが、S-モジュリンはその反応に影響を与えることはなかった。ニューロカルシンの標的蛋白質候補として、S100bとチューブリンb鎖が考えられた。4.脂質によるリカバリンの修飾の生理的役割について、ロドプシンキナーゼとの相互作用が高まること、キナーゼを細胞膜によりよくアンカーする作用があることが明らかになった。また、S-モジュリンとs26において見られる脂質膜への結合性の違いはC末端のアミノ酸の違いに原因があることが明らかになった。5.ムスカリン性アセチルコリン受容体に対するGRK2によるリン酸化がカルモジュリンまたはS100蛋白質によってカルシウム濃度依存的に阻害されることがわかった。6.キメラカルモジュリンを作成した研究の結果、一対のカルシウム結合サイトが共同的に機能するときのみ、活性をもつことがわかった。7.カルシニューリンの役割として、記憶のモデルである長期増強現象を制御してしることが明らかになった。また、分裂病モデルラットを使った実験から、NVPの分裂病の病態における役割を示唆する結果を得た。平成7年度には以下の成果が得られた。1.NCaP遺伝子のクローニング分裂酵母モデル系において、NVP様蛋白質を新たに精製し、遺伝子のクローニングを行いつつある(久野)。また、既にクローニングの終わっているヒポカルシンについて、ゲノムDNAの解析を行った(高松)。その結果、ゲノム構造はリカバリンのものと同様であることがわかった。さらに、NCaPの分子系統樹を作成し、NCaPの分子進化を明らかにした(徳永)。2.NCaPの大量調製S-モジュリンとs26の大量発現系を確立し、以後の実験に使用することができるようになった(徳永)。3.NCaP結合蛋白質の同定S-モジュリン(河村)、ニューロカルシン(日高)について、蛋白化学的方法によって結合蛋白質の同定を行った。その結果、S-モジュリンについてはロドプシンキナーゼであることが分かった。4.NCaPの局在S-モジュリン、s26について、網膜内での局在(河村)、ニューロカルシンについて中枢神経系での局在(日高)を明らかにした。5.NCaPの構造と機能の関係リカバリンの脂質修飾によってロドプシンキナーゼとの相互作用が高まることが明らかになった。(深田)。NVPのmRNA量が減少していることから、分裂病におけるNVPの関与が示唆された(久野)。6.他の系との比較キメラカルモジュリンを使って、カルモジュリンの構造と機能の関係について検討した(矢沢)。また、GRK2系において、カルモジュリンが受容体のリン酸化を阻害することが分かった。また、これにはトランスデューシンの関与はなかった(芳賀)。MEKA蛋白質のトランスデューシンとの結合部位を明らかにした(三木)。嗅覚系におけるNCaPの関与を検討する目的で、嗅上皮におけるS-

モジュリン様蛋白質を検索し、p26olfを単離・精製し、クローニングを行った(河村)。平成8年度は以下の成果が得られた。(1)新しいNCaP遺伝子cDNAをクローニングできた。それらはカエル嗅上皮p26olf、錐体視細胞中のs26、ラット海馬に存在するHLP3とHLP4、分裂酵母第一染色体の存在する機能未知の蛋白質などである。(2)ヒポカルシンについてゲノム遺伝子を単離するとともにヒトの第2染色体に存在することを明らかにした。(3)S-モジュリンの標的蛋白質がロドプシンキナーゼであることが同定された。ニューロカルシンの標的蛋白質候補として、S100bとチューブリンb鎖が考えられた。(4)脂質によるリカバリンの修飾の生理的役割について、ロドプシンキナーゼを細胞膜によりよくアンカーする作用があることが明らかになった。また、S-モジュリンとs26において見られる脂質膜への結合性の違いはC末端のアミノ酸の違いに原因があることが明らかになった。(5)ムスカリン性アセチルコリン受容体に対するGRK2によるリン酸化がカルモジュリンまたはS100蛋白質によって調節されることが分かった。(6)キメラカルモジュリンを作成し、それぞれのドメインがどの様な作用を持つのか調べた。その結果、一対のカルシウム結合サイトが協同的に機能するときのみ、活性を持つことが分かった。(7)カルシニューリンの役割として、記憶のモデルである長期増強現象を抑制的に制御している可能性があることが明らかになった。また、分裂病モデルラットを使った実験から、NVPの分裂病の病態における役割を示唆する結果を得た。
新規エンドO-マンノシダーゼの同定 ―新たな脱糖鎖ツ―ルの開発に向けて-

タンパク質への糖鎖修飾は真核生物に共通して見られる翻訳後修飾の一つであり,様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。我々は細胞質における糖鎖の分解・代謝の生物学的意義を解明するために,出芽酵母を用いて研究を行っている。その過程で,炭素源マンノースへと変化させた細胞培養条件では,新規O -マンノシダーゼ(EOM)の活性が細胞内で上昇すること,その結果,タンパク質上のO-結合型糖鎖が切り出され,大量の遊離O型糖鎖(fOGs)が生成されることを偶然にも見出した。そこで,出芽酵母が有する新規EOM遺伝子の同定を行ない,同定したEOMを解析ツールとして応用することを目的に研究を行った。真核生物において新たに合成されたタンパク質への糖鎖修飾はタンパク質自体の安定性・機能の向上に寄与しているだけではなく,様々な成体内プロセスにおいて重要な役割を果たしていることが様々な研究から報告されている。一方,タンパク質を修飾している糖鎖の分解についての分子メカニズムの詳細については,未だ不明な点が多いのが現状である。我々は,遊離N型糖鎖(fNGs)と呼ばれるタンパク質から切り出さたN-結合型糖鎖の分解経路を出芽酵母を用いて解析している過程で,今ままで報告のないO-結合型糖鎖由来の遊離糖鎖(遊離O型糖鎖(fOGs))がマンノースを炭素源とした培養条件下でのみ生成されることを見出した。従って出芽酵母は今まで知られていないような新規のエンドO-マンノシダーゼを持つことが強く示唆された。さらに,マンノース添加時にEOMの発現量は転写レベルで制御されているのかを検討するため,種々の転写因子欠損株におけるfOGsの生成量を解析した結果,Cyc8と呼ばれる転写抑制因子の欠損株では,マンノース培養条件下で,野生株に比べて過剰なfOGsを生成することを見出した。このEOM活性化による糖タンパク質からの過剰な糖鎖脱離の結果,細胞壁ストレスが起こり,最終的に生育阻害という表現型を示すことが判明した。現段階において,EOMの転写調節メカニズムについての詳細は不明であるが,EOMの活性は転写抑制因子Cyc8により厳密に制御されていることが示唆される。これらのことを踏まえ,EOMをコードする遺伝子を取得するために,「cyc8破壊株とその他全ての遺伝子変異株を掛け合わせ,cyc8株の表現型をレスキューする遺伝子変異株を探索する」方法によって現在遺伝子を探索している。当初計画したとおり変異原EMSによって取得したEOM活性を欠損株の変異点同定を行なった。残念ながら,全ての変異体の変異はEOM酵素本体に由来する変異ではなかった。そこで,我々はバックアッププランとして計画していたアプローチ「cyc8破壊株とその他全ての遺伝子変異株を掛け合わせ,cyc8破壊株の表現型をレスキューする遺伝子変異株を探索する」によってEOMを同定する方法への変更を余儀なくされた。つまり,cyc8変異株とその他の6000個の遺伝子変異株を掛け合わせた後に,胞子形成・減数分裂を誘導しcyc8破壊株とそれ以外の遺伝子の二重破壊株を作成し,cyc8破壊のマンノースに対する感受性を抑圧するような遺伝子群を同定,その中にEOM本体をコードする遺伝子が含まれていないかを検討する網羅的スクリーニングを行うことにした。しかしながら,cyc8破壊株は胞子形成にも欠損が出るため,他の変異株と掛け合わせを行うことが困難なことが判明した。そこで,cyc8の破壊株ではなく,CYC8シャットダウン株を作成することにした。具体的には2種類のCYC8シャットダウン株,Doxycyclin(Dox)依存型シャットダウン株(TetOff-CYC8)及びbeta-estradiol依存的に発現が制御できる株(Z3EV2-CYC8)を作成し,どちらがスクリーニングに適しているかを検討した。その結果TetOff-CYC8株はDox存在下でも僅かに発現するためcyc8破壊よりもマンノースに対する感受性が弱いことが判明した。従って,網羅的スクリーニングに適したZ3EV2-CYC8株を使用しEOMをコードする遺伝子の探索を行う予定である。タンパク質への糖鎖修飾は真核生物に共通して見られる翻訳後修飾の一つであり,タンパク質自体の安定性を向上させるだけでなく,様々な生体内プロセス(細胞間相互作用,シグナル伝達,細胞分化,がん細胞の転移など)に深く関わっていることが知られている。我々は細胞質における糖鎖の分解・代謝の生物学的意義を解明するために,出芽酵母を用いて研究を行っている(1,2)。そこで,出芽酵母が有する新規EOM遺伝子の同定を行うことを目標とし, EOM依存的なO-結合型糖鎖切り出しの生物学的意義の解明を目指した大きく分けて以下の2つのことを実施した。( I )CYC8遺伝子のbeta-エストロゲン依存的なシャットダウン株の作成・SGAによる大規模スクリーニングcyc8株はマンノースを炭素源とした培養条件で生育阻害を示す。この表現型を指標とした網羅的スクリーニングを行うための予備実験を行い,CYC8の遺伝子発現をシャットダウン出来る株を作成した。beta-エストロゲン非存在下でのCYC8のシャットダウンの確認を行ったところ,良好な表現型(マンノース感受性)が確認できた。

( II )破壊株シリーズを使ったfOGs生成に関わる遺伝子の探索出芽酵母の非必須遺伝子の破壊株コレクションを用いて5000個の各遺伝子破壊株の細胞内で生成されるfOGsの定量解析を進行中である。約半分までの数の解析を行ったが,fOGの生成量が著しく現象しているような株は未だ取得できておらず,今後解析を継続して進行させる予定である。タンパク質への糖鎖修飾は真核生物に共通して見られる翻訳後修飾の一つであり,様々な生体内プロセスに深く関わっていることが知られている。我々は細胞質における糖鎖の分解・代謝の生物学的意義を解明するために,出芽酵母を用いて研究を行っている。その過程で,炭素源マンノースへと変化させた細胞培養条件では,新規O -マンノシダーゼ(EOM)の活性が細胞内で上昇すること,その結果,タンパク質上のO-結合型糖鎖が切り出され,大量の遊離O型糖鎖(fOGs)が生成されることを偶然にも見出した。そこで,出芽酵母が有する新規EOM遺伝子の同定を行ない,同定したEOMを解析ツールとして応用することを目的に研究を行った。作成したCYC8シャットダウン株(Z3EV2-CYC8)と他の6000個の酵母の全遺伝子破壊株を掛け合わせ,二重破壊株を作成し表現系を確認する。この際,スクリーニングのスループットをあげる為に384の細胞を1プレート上で自動レプリカできるロボットを使用する予定である。このロボットによるスクリーニングによってコントロールよりマンノース存在下における生育が向上した株を同定,表現型抑圧の度合いにより順位付けを行い,一番生育が回復した株から順に解析を行ってEOMをコードする遺伝子の同定を試みる予定である。並行して,CYC8破壊株細胞内でEOM依存的に脱マンノシル化される基質糖タンパク質の同定を行う。具体的には,質量分析によりWTとcyc8シャットダウン株(もしくはcyc8破壊株)のO-結合型糖鎖付加部位を比較・定量する。この際,伸長したO-結合型糖鎖(Man2-5)は糖ペプチド断片のイオン化効率を低下させ検出感度を低下させることが知られているので,O-結合型糖鎖が伸長に関わることが知られている3つのマンノース転移酵素Ktr1Kre2Ktr3の破壊をWT,およびcyc8変異株上で行う予定である。糖鎖生物学
約款の不当条項規制論の再構成―事業者間契約におけるその意義

改正民法の新規定、「定型約款」(第548条の24)に関する一大論点は、「事業者間契約への適用の可否」である。法制審では、研究者委員が同契約が規制されることこそ新規定の意義だと主張したのに対し、事業者委員は強固な反対を示し、結論は今後の解釈論に委ねられることになった。そこで本研究では、事業者間契約につき「商慣習」を考慮しつつも規制対象とするとの規定(ドイツ民法310条1項)を有するドイツの議論を参考に、日本における事業者間契約規制のあり方への示唆を得る。
エガイ赤血球に含まれる異常2ドメイン型ヘモグロビンの進化と生理的特性に関する研究

奄美大島産エガイのヘモグロビン(Hb)異常2D鎖のイントロン・エキソン配置,及びδ鎖遺伝子について完全な塩基配列を決定することができた.これらの遺伝子に特異的に存在する2つのイントロン,プレコーディングイントロン(PI)及びブリッジイントロン(BI)の塩基配列を比較することによって,当初の目的の一つであった異常2ドメインHb鎖の生じたメカニズムの解明が達成された.要約すると,2D鎖を特徴づけるBIの5′領域は,δ鎖の3′非翻訳領域と非常に高い塩基配列の相同性を持っており,また,BIの3′領域はδ鎖のPIの3′領域と非常に高い相同性を持っていたのである.この結果,δ鎖が先ず遺伝子重複し,その後それらの遺伝子の不等交叉によって2D鎖が生じたのではないかと推定された.さらに,PIが他の軟体動物のHb遺伝子にも普遍的に存在し,Hbの多様化機構に大きな影響を与えたのではないかと類推し,深海底に棲む二枚貝シロウリガイのHbの遺伝子構造を調べた.その結果,今までHb遺伝子では前例のない位置(Aヘリックス)にイントロンが見つかり,このイントロンはPIが移動したものと思われた.奄美大島産エガイは,赤血球内に種類のHb,δ鎖から成るホモ2量体,α鎖とβ鎖から成る4量体,そしてδ鎖と2D鎖から成る多量体Hbを持っている.これらのHbを単離し,その安定性(自動酸化性)を測定することによって,Hb分子の生理特性を明らかにした.予想に反して,異常2D鎖を含む多量体Hbは最も安定で,最も不安定な2量体の自動酸化速度の5分の1であった.しかし,二量体の速度はヒトHbと同程度であり,エガイ属のHbは十分な安定性を保持していた.奄美大島産エガイのヘモグロビン(Hb)異常2D鎖のイントロン・エキソン配置,及びδ鎖遺伝子について完全な塩基配列を決定することができた.これらの遺伝子に特異的に存在する2つのイントロン,プレコーディングイントロン(PI)及びブリッジイントロン(BI)の塩基配列を比較することによって,当初の目的の一つであった異常2ドメインHb鎖の生じたメカニズムの解明が達成された.要約すると,2D鎖を特徴づけるBIの5′領域は,δ鎖の3′非翻訳領域と非常に高い塩基配列の相同性を持っており,また,BIの3′領域はδ鎖のPIの3′領域と非常に高い相同性を持っていたのである.この結果,δ鎖が先ず遺伝子重複し,その後それらの遺伝子の不等交叉によって2D鎖が生じたのではないかと推定された.さらに,PIが他の軟体動物のHb遺伝子にも普遍的に存在し,Hbの多様化機構に大きな影響を与えたのではないかと類推し,深海底に棲む二枚貝シロウリガイのHbの遺伝子構造を調べた.その結果,今までHb遺伝子では前例のない位置(Aヘリックス)にイントロンが見つかり,このイントロンはPIが移動したものと思われた.奄美大島産エガイは,赤血球内に種類のHb,δ鎖から成るホモ2量体,α鎖とβ鎖から成る4量体,そしてδ鎖と2D鎖から成る多量体Hbを持っている.これらのHbを単離し,その安定性(自動酸化性)を測定することによって,Hb分子の生理特性を明らかにした.予想に反して,異常2D鎖を含む多量体Hbは最も安定で,最も不安定な2量体の自動酸化速度の5分の1であった.しかし,二量体の速度はヒトHbと同程度であり,エガイ属のHbは十分な安定性を保持していた.研究は当初の計画通りに順調に進みつつあり,これまでに,奄美大島産エガイのヘモグロビン2D鎖のイントロン・エキソン配置,及びδ鎖遺伝子について完全な塩基配列を決定することができた.δ鎖の遺伝子構造は,3イントロン・4エキソン構造を取っており,脊椎動物ヘモグロビンの2イントロン・3エキソン構造とは異なっていた.即ち,δ鎖においては開始コドンの直前に特異的なイントロン(プレコーディングイントロン)を持っていた.一方2D鎖の遺伝子構造においては,脊椎動物でも存在する2つのイントロンに加えて,δ鎖に見られたプレコーディングイントロンと2つのドメイン間を分割するように存在するイントロン(ブリッジイントロン)が存在していた.このエガイ・ヘモグロビンの2D鎖及びδ鎖に特異的に存在する2つのイントロン,プレコーディング及びブリッジイントロンの塩基配列を比較することによって,当初の目的の一つであった異常2ドメインヘモグロビン鎖の生じたメカニズムの解明が達成された.要約すると,2D鎖を特徴づけるブリッジイントロンの5'領域は,シングルドメインδ鎖の3'非翻訳領域と非常に高い塩基配列の相同性を持っており,また,ブリッジイントロンの3'領域はδ鎖のプレコーディングイントロンの3'領域と非常に高い相同性を持っていたのである.この結果,δ鎖が先ず遺伝子重複し,その後それらの遺伝子の不等交叉によって2D鎖が生じたのではないかと推定された.昨年度の研究により,奄美大島産エガイのヘモグロビン2D鎖のイントロン・エキソン配置,及びδ鎖遺伝子について完全な塩基配列を決定することができた.

そしてこの2D鎖及びδ鎖に特異的に存在する2つのイントロン,プレコーディング及びブリッジイントロンの塩基配列を比較することによって,研究目的の一つであった異常2ドメインヘモグロビン鎖の生じたメカニズムの解明が達成された.本年度は,2D鎖が生じる過程において重要な役割を果たしたと思われるプレコーディングイントロンに先ず焦点を当てた.このイントロンが他の軟体動物のヘモグロビン遺伝子にも普遍的に存在し,ヘモグロビンの多様化機構に大さな影響を与えたのではないかと類推し,深海底に棲む二枚貝シロウリガイのヘモグロビンの遺伝子構造を調べた.その結果,今までヘモグロビン遺伝子では前例のない位置(ヘリックス)にイントロンが見つかり,このイントロンはプレコーディングイントロンが移動したものと思われた.奄美大島産エガイは,赤血球内に種類のヘモグロビン,δ鎖から成るホモ2量体,α鎖とβ鎖から成る4量体,そしてδ鎖と2D鎖から成る多量体ヘモグロビンを持っている.これらのヘモグロビンを単離し,その安定性(自動酸化性)を測定することによって,ヘモグロビン分子の生理特性を明らかにした.予想に反して,異常2D鎖を含む多量体ヘモグロビンは最も安定で,最も不安定な2量体の自動酸化速度の5分の1であった.しかし,二量体の速度はヒトヘモグロビンと同程度であり,エガイ属のヘモグロビンは十分な安定性を保持していることが示された.
読む行為を贈与として捉える可能性と意義についての基礎的事例研究

本来の最終年度に当たるため、研究成果の公表に力を注ぎ、学会における口頭発表と、それをもとに学術論文を制作・発表する活動を行った。2018年8月31日テクスト研究学会第18回大会(佛教大学)と、同年10月27日に日本英文学会中国四国支部大会第71回大会(鳥取大学)の場で単独発表の形で口頭発表を実施、その後、前者はテクスト研究学会の学術雑誌である『テクスト研究』第15号に掲載された「1つに重ねた読む行為の記録ーイアン・マキューアン作『贖罪』第1部における誠実さ」と題する論文(査読あり)に結実し、後者は大幅加筆の上、論文「赦されるのは時間の問題ーIan McEwanのAtonementにおける時系列の印象操作」となって、『山口大学文学会志』第69巻に収録された。ともに2019年3月の発行である。贈与交換の考え方と極めて密接に結びついている赦し・贖罪のテーマを、読み行為に結びつけるアプローチの具体的事例研究を、時系列問題に目配りしながら小説作品を精読する試みを二通り実践してみせた。その中で、読み直しの反省的反復という倫理の問題と、贈与のお返しや罪滅ぼしという埋め合わせにどれほど時間を掛けるべきかという倫理問題の重要性を浮き彫りにした。結果的に2018年度は、現代英国人作家マキューアンの作品のみに注意を集中する形の成果報告となったが、別の作家による小説の研究論文と、また他の作家の作品7本を扱う「研究序説」のような論文も、9割がた書き終えている。しかしこちらは残念ながら発表に至らなかった。突発的な形で校務の作業量が増大したことが計画の進捗に大きく影響した。幸い、本研究計画の一年間延長を認めていただき、また勤務校を替わったため、2018年度に担っていた校務から解放されたこともあるので、見送ることになった成果発表活動を推進する。具体的には、現代英国人作家サリー・ルーニーの小説『ノーマル・ピープル』についてテクストの贈与交換の見地から考察した論文を、PALA(国際文体論学会)の場でまず口頭発表することを目指す。これは発表申し込みがすでに受理されている。また、数作品を扱いながら研究を総括する「研究序説」的論文も、いずれかの場で論文として公表する予定である。同年11月19日・20日には日本文体論学会の年次大会に参加、文体論や物語論の研究方法論に関する新しい知見を吸収した。また、上記の英語論考の成果も部分的に取り入れつつ、さらに贈与に関する議論を広汎にした日本語論文「『あるときの物語』における純粋贈与志向」を執筆した。これは、米国とカナダ両国の国籍をもつ現代女性作家ルース・オゼキの長編小説に見られる種々の《テクストのやりとり》および《読む行為》を、さまざまな贈与論者の議論枠に当てはめつつ解釈した研究である。本小説は西洋文学としては珍しく、道元の禅思想を取りこんだ物語であるが、その禅思想が「純粋贈与」の概念において東洋哲学と西洋哲学を出会わせている点を、本論考では重視して論じた。この論考は平成28年12月に、研究紀要『英語と英米文学』誌上で発表した。本研究を本格的に推進するのに、まず研究の方向性の妥当性を確認するパイロット的な位置づけの口頭発表を国際学術会議において行う予定にしていたが、これは計画通りに実行できた。また、日本語による論文も年度内に一本執筆・発表したが、これもほぼスケジュールどおりである。その論文の内容も、あるひとつの作品の検討を通して、各種贈与論者の主張を概観して一種のマッピングを行うという企図を、ほぼ実現するものとなった。研究図書の購入が、廉価版の刊行を待つなどしたため予定していたペースよりやや遅くなった、という部分はあるものの、ほぼ当初計画の通りに研究が進行した、と判断できると考えている。読み行為を贈与交換と捉える枠組みの妥当性をいわば傍証的に主張する論考を完成し、日本英文学会九州支部第70回大会(10月21日22日)において、「テクストを読む行為を贈与論で捉えるアプローチの可能性ーそれぞれの論争に共通するもの」と題して研究発表を行った。この研究発表では、1920年代から1970年代を経て現代に至るまでの、贈与論における有力な主張の変遷と、読者論における有力な議論の変遷を並べて観察し、両者の経年進行のあいだに顕著な共通性があることを指摘した。鍵になるのはデリダの純粋贈与の概念と、受容美学や読者反応理論である。いずれも行為の起点となる者(授与者・書き手)の存在感を希薄にしたいという傾向を持っているのだが、近年になって、そうした者の存在をしかと認識することの方が倫理的に望ましいと見る懐古的傾向が現れている。このような指摘を示した。この論考は、本研究の大枠を起承転結に見立てるならば、「転」の部分を担うことになる見通しである。ほかに、文体論を扱う学会やテクスト研究の方法論を論じる学会において、テクスト処理の認知的な図式化に関する知見を得、また、テクストを受容した者が行う反対贈与のひとつの形として「アダプテーション」という手法・現象を考察する可能性についても、有益なヒントを得た。文学と贈与の関わりを扱う国際学会への参加を計画していたのだが、本務校での業務が多忙になったためこれは残念ながら断念せざるを得なかった。

平成29年度の終わり頃から、本研究の序(起承転結でいえば「起」にあたる部分)の論文を書き始め、7割方完成している。また、具体的な事例研究として、イアン・マキューアンの小説『贖罪』に見られる読み行為表象を贈与論で論じる論文にも着手した。平成28年度までは順調に推移していたが、平成29年度になって予想外の本務校業務増大があり、研究の進度を若干落とさざるを得なくなった。具体的にいうと、勤務している学部において、教職課程の英語課程が再課程認定を受けるための準備を行う責任者に任ぜられたため、本研究にあてるエフォート率が下がるという状況が生じた。本来の最終年度に当たるため、研究成果の公表に力を注ぎ、学会における口頭発表と、それをもとに学術論文を制作・発表する活動を行った。2018年8月31日テクスト研究学会第18回大会(佛教大学)と、同年10月27日に日本英文学会中国四国支部大会第71回大会(鳥取大学)の場で単独発表の形で口頭発表を実施、その後、前者はテクスト研究学会の学術雑誌である『テクスト研究』第15号に掲載された「1つに重ねた読む行為の記録ーイアン・マキューアン作『贖罪』第1部における誠実さ」と題する論文(査読あり)に結実し、後者は大幅加筆の上、論文「赦されるのは時間の問題ーIan McEwanのAtonementにおける時系列の印象操作」となって、『山口大学文学会志』第69巻に収録された。ともに2019年3月の発行である。贈与交換の考え方と極めて密接に結びついている赦し・贖罪のテーマを、読み行為に結びつけるアプローチの具体的事例研究を、時系列問題に目配りしながら小説作品を精読する試みを二通り実践してみせた。その中で、読み直しの反省的反復という倫理の問題と、贈与のお返しや罪滅ぼしという埋め合わせにどれほど時間を掛けるべきかという倫理問題の重要性を浮き彫りにした。結果的に2018年度は、現代英国人作家マキューアンの作品のみに注意を集中する形の成果報告となったが、別の作家による小説の研究論文と、また他の作家の作品7本を扱う「研究序説」のような論文も、9割がた書き終えている。しかしこちらは残念ながら発表に至らなかった。突発的な形で校務の作業量が増大したことが計画の進捗に大きく影響した。28年度後半からは、研究の理論的なアプローチと個別作品による具体的アプローチの両方を展開し始めている。前者については、29年度中にまずは口頭発表を行うべく、準備中である。後者については、二、三の作品について精読作業を進めているところである。これも、年度内には研究論文あるいは口頭研究発表のかたちにまとめる予定である。29年度も、当初計画から大きくずれることなく研究を進められる見通しであるが、必要に応じて贈与論の専門家に助言を求めたいと考えている。幸い、研究代表者が所属する学部に、贈与論に造詣の深い文化人類学者が29年4月に赴任した。今後相談に乗っていただこうと考えている。「現在までの進捗状況」で言及した業務について、とりあえず目途が立ったため、今後は研究進展のエフォートは申請時に予想していた率に戻すことができる見込みである。現在書きかけている複数の論文の完成を急ぎ、最終年度である30年度中の発表(活字媒体もしくは口頭発表)を実施していきたい。発表先の目標は定めてある。また勤務している学部の社会学講座に、贈与や社会交換についての造詣が深い研究者が着任し、その教員たちのアドバイスを仰ぐ算段も付けることができた。この環境をじゅうぶん活用していきたい。
ヒト皮膚由来の多能性幹細胞を用いた骨髄移植法の開発

SCIDマウスにX線照射を行い、ヒト真皮由来Muse細胞を尻静脈から投与すると骨髄に一部は生着し、ヒトの白血球系、リンパ球系のマーカー陽性細胞に分化することがマウス末梢血のFACS解析で分かった。またGFPで標識されたMuse細胞が前赤芽球のマーカーCD235a陽性の細胞として分化して骨髄内に生着していることが確認された。多能性Muse細胞からの造血系細胞への分化が期待できる可能性が示唆された。皮膚や骨髄などの成人ヒト間葉系組織あるいは培養間葉系細胞に多能性を有する新たな幹細胞Muse細胞を見出した。この細胞はNanog, Oct3/4, Sox2などの多能性幹細胞マーカーを発現し、1細胞から3胚葉性の細胞に分化する能力を有し、自己複製能を持つ。ヒトES細胞のマーカーSSEA-3を発現し、このマーカーを用いることによりヒト線維芽細胞,骨髄間葉系細胞の培養細胞の他に、新鮮骨髄液、皮膚などの生体組織からも直接分離可能である。また通常の成人ヒトの組織に存在し、腫瘍性がない。本研究では多能性を有するが腫瘍性の無いMuse細胞の特性を骨髄移植に活用することを目的とし、皮膚(真皮)由来のMuse細胞から造血系細胞への分化の可能性を模索した。本年度はX線照射を行った免疫不全マウスSCIDマウスへの移植を行った。lentivirus-GFPでラベルされたヒト皮膚線維芽細胞由来Muse細胞をマウスの尾静脈から投与した。投与した細胞数は1万細胞とした。6ヶ月後にGCSFを投与して投与されたマウスの末梢血を回収し、FACSで解析した。その結果、ごく少数のヒトGFP+細胞がGFP陽性細胞におけるpacific blue-CD45(白血球系マーカー)、PE-Cy7-CD2(T細胞リンパ球系マーカー)、APC-CD19(B細胞系)を発現していることが確認された。また骨髄内を組織学的に検討した結果、GFP陽性のMuse細胞が造血系細胞マーカー陽性の細胞として分化して骨髄内に生着していることが確認された。真皮は中胚葉由来組織ではあるものの、同じ中胚葉とはいえ造血系細胞は性質がかなり異なる。多能性のMuse細胞を使うことによって、造血細胞への分化の可能性が示唆されたと言える。皮膚や骨髄などの成人ヒト間葉系組織あるいは培養間葉系細胞に多能性を有する新たな幹細胞Multilineage- differentiating Stress Enduring cell (Muse細胞)を見出した(Kuroda et al., PNAS, 2010)。本研究では多能性を有するが腫瘍性の無いMuse細胞の特性を骨髄移植に活用することを目的とし、患者本人やドナーから簡便に採取できる皮膚などに存在するMuse細胞から造血系細胞への分化を模索する。lentivirus-GFPでラベルされたヒト皮膚線維芽細胞由来のMuse細胞をマウスの尾静脈から投与した。6ヶ月後にGCSFを投与して末梢血を回収しFACSで解析した結果、ごく少数のヒトGFP+細胞がGFP陽性細胞におけるpacific blue-CD45(白血球系マーカー)、PE-Cy7-CD2(T細胞リンパ球系マーカー)、APC-CD19(B細胞系)を発現していることが確認された。申請時に計画したX線照射SCIDマウスへのlentivirus GFP-ヒトMuse細胞(皮膚由来)の移植を行い、ごく少数ではあるがGFP陽性細胞におけるpacific blue-CD45(白血球系マーカー)、PE-Cy7-CD2(T細胞リンパ球系マーカー)、APC-CD19(B細胞系)が確認されたことは大きな進展である。さらに移植個体の骨髄を組織学的に検討し、GFP陽性のMuse細胞がcluster状に生着し、赤芽球系前駆細胞マーカーCD235a陽性を発現していることも確認されたことは大きな成果である。従って研究はおおむね順調に進んでいると思われる。しかしin vitroでの造血系細胞への分化はまだ成果が出ていないので完璧であるとは言えないと考えている。

H24年度には引き続き移植実験を行うと共に、培養系での造血系細胞への分化も進めて行く予定である。前年に引き続き、骨髄移植実験とFACSを行い、培養系での造血系細胞への分化誘導を試みる。同時にMuse細胞がヒトにおいてAllograftすなわち他者のMuse細胞の移植が可能であるかを検討する。HLA1、2の発現をFACSなどで解析し、まずはこれらの因子の発現を探る。次に免疫染色、Western blot、RT-PCR、リンパ球活性化試験などの検証で、それらの組織適合抗原の発現があるかどうかを調べる。細胞はヒト線維芽細胞、ヒト脂肪由来幹細胞などを用いる。平成24年度は、実験のための試薬や培養器具等の消耗品購入に95万円、国内での成果発表を目的に10万円を旅費とし、外部研究者からの専門的知識の提供に対する謝金として10万円、成果論文(英語)の校閲料に10万円、その他として会議費(成果発表に係る打合せ)を5万円計上する。
食物質による腸管上皮トランスポートソーム制御の機能的解析

(1) α-リポ酸による腸管の解毒排出トランスポーター活性の制御腸管上皮モデルLS180細胞において、α-リポ酸がMRP2及びBCRPのような異物排出トランスポーターのmRNA発現量およびタンパク質レベルでの発現量を上昇させ、さらに薬剤の排出活性をも上昇させることを明らかにしてきたが、この発現調節にP13K経路や、ERK、JNK、p38などのMAPK経路は関わらないことが示された。また昨年度の研究でその寄与が示唆された転写因子NrfはMRP2発現制御には関わらないらしいことが新たに示された。さらに、MRP-2の発現調節に関わる遺伝子上流のエレメントを探索した結果、それが2ヶ所の領域にあることが示唆された。(2) α-リポ酸の腸管上皮細胞層透過に関与するトランスポーターの同定と特性解析α-リポ酸および中鎖脂肪酸の輸送にかかわると推定されるプロトン依存性トランスポーター(Tr-X)の発現クローニングを試みるために、アフリカツメガエルoocyteでの発現実験を進めたが、充分な活性が得られず、本研究期間中でのクローニングには成功しなかった。腸管上皮Caco-2細胞のオクタン酸輸送活性をクロロゲン酸(CLA)が有意に上昇させる現象について検討し、CLA処理は輸送速度は変化させないが、Km値を低下させる(基質の親和性を上昇させる)ことが示された。CLAによる活性上昇は、細胞をCLAで前処理することによっても見られたことから、CLAの細胞膜面あるいはTr-Xそのものへの結合がオクタン酸輸送システムを変化させるものと考えられた。(1) α-リポ酸による腸管の解毒排出トランスポーター活性の制御α-リポ酸が腸管上皮モデルLS180細胞においてMRP2及びBCRPのmRNA発現量を増加させたことから、その時間依存性及び濃度依存性などを検討し、MRP2及びBCRPの発現上昇を確認した。またWestern blot法により両者のタンパク質レベルでの発現増加を明らかにした。さらにMRP2に関しては、α-リポ酸によって転写活性が上昇すること、Calceinのような薬剤の排出活性が上昇することを明らかにすることが出来た。siRNAを用いた実験により、MRP2の発現制御には転写因子Nrfが関わっていることも示された。また、細胞内でのα-リポ酸の代謝物であるジヒドロα-リポ酸にも同様の活性があることが示された。(2) α-リポ酸の腸管上皮細胞層透過に関与するトランスポーターの同定と特性解析α-リポ酸の腸管上皮透過にはプロトン依存性のトランスポーターが関与しており、これは中鎖脂肪酸輸送にも関わると考えられることから、本トランスポーター(TrX)の単離・同定を試みているが、未だ成果は得られていない。(3) TrXの活性を調節する食品因子の解析腸管上皮Caco-2細胞へのオクタン酸取り込みを指標に、オクタン酸の輸送活性に影響する栄養素・食品成分の探索を行ったところ、クロロゲン酸(CLA)がTrX活性を有意に上昇させることが見出された。CLAはエネルギー依存的なオクタン酸の取り込みのみを促進した。CLAの作用機構について検討を進めている。(4)腸管のアミノ酸トランスポーターの制御機構の解析タンパク質合成阻害剤が腸管の中性・塩基性アミノ酸トランスポーターの発現を亢進することを見出した。