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東アジア産カラスショウジョウバエ種群の系統分類学・進化遺伝学的研究

ベトナムからカラスショウジョウバエ種群の新種を発見した。新種の染色体は2n=12 (1V+4R+1D)と本種群のなかで最多であり,核型進化上,祖先種とみなされた。形態分析と交配実験から,シノニムとされてきたD. pengiは生物種,北部ミャンマー産のD.longiserrataはD.aferの新参シノニムとなった。カラスショウジョウバエ種群はアジア低緯度で発生し,東アジア緑地帯沿いに分布域を拡大し,その一部は地史的過去に存在していたベーリング陸橋を通して新大陸に渡り住んだ。Drosophila melanica種群(カラスショウジョウバエ種群)は欧米の進化遺伝学者によってその系統進化が詳細に研究されている。そのうちDrosophila tsigana Burla & Gloor(和名カラスショウジョウバエ)はユーラシア中緯度地帯の広域分布している種で,各地方集団には外部形態上の変異があることが知られていた。本年度の研究で日本列島における自然集団の遺伝的分化の程度についての概略が分かった。すなわち九州地方から東京までの暖温帯に分布しかつて"Drosophila pengi"とされていたものは中国南西部の集団と同じ形態や核型をもち,両集団間では生殖的隔離が存在しない。これらは欧州ピレネー山脈から原記載されたDrosophila tsiganaそのものと言える。一方,札幌近郊のものは暖温帯型と腹部背板の黒色模様が異なり,両者の間には極めて強い交尾前隔離が存在する。札幌産に関してはNesiododrsophila septetriataとして報告されている(後にDrosophila tsiganaの同物異名とされた)ので,本研究の完成時にはDrosophila septentriataとしてまたはDrosophila tsiganaの1亜種として再記載されることになる。冷温帯型は北海道最南端まで分布していることが明かとなったが,暖温帯型と同所的に分布しているのは分かっていない。地理的分布を明らかにするには暖温帯と冷温帯の移行帯である東北地方での調査が必要である。ベトナム・バビ国立公園から得られた疑問種について外部形態,生殖器構造,核型構成を調べた結果,melanica種群の1構成種であることが分かった。本種群は温帯種であるので,アジア亜熱帯からの本種の発見は祖先種の可能性があり,極めて重要である。平成23年3月に実施したベトナム自然保護区での野外調査で得られたカラスショウジョウバエ種群の疑問種,依然として分類学的な課題があるNesiododrsophila septetriataとDrosophila tsigana,および系統姉妹群のクロショウジョウバエ区の十数種について,形態構造の詳細な分析,生殖的隔離機構,地理的分布情報,光周期反応等を調べた。特に前者に関して,近縁種間で量的形質,生殖器構造の詳細な観察を行った。雄の腹部背板の全面が黒色で,外部形態上はユーラシア大陸に広域分布しているDrosophila tsiganaと酷似しているが,Surstylus端部に位置するsetaeが約20と極めて多いこと,aedeagusが極めて短いこと,雌の貯精嚢がキチン硬化していないことなどから,本種群の新種と結論した。核型分析から,本種は2n=12(4R,1V,1D)で,X染色体は端部付着型であること,棒状染色体が4対と本種群のなかでは最多であることから,カラスショウジョウバエ種群の祖先型に最も近い種と考えられた。アジア低緯度高地という分布も興味深い。生物が温帯や寒帯へ生息域を拡大する為には,そこで起きる季節変化に対応しなければならない。特に冬期間を安全に過ごす機構の獲得が必須である。そこでアジア低緯度高地に棲息する3種(新種を含む)について,光周期反応,生殖休眠機構の有無を調べた。実験は,明期11時間から1時間毎に15時間までの間,飼育温度12°C,15°C,18°Cで行った。12°Cでは卵から成虫羽化までには至らなかった。18°Cではどのような光周期でも卵巣発達が進行し,交配がなされた。15°Cの短日条件(明期L:暗期D=12:12)では明らかに卵巣発達が抑制された。回帰直線から臨界日長は12.5時間となった。これらの結果から,アジア低緯度地帯で発生したカラスショウジョウバエ種群の祖先種はすでに季節変化に対する適応機構を獲得しており,このことが温帯や寒帯進出を可能とし,異なった気候帯や植生帯での適応放散を導いたものと考えられる。カラスショウジョウバエ種群(Drosophila melanica species group)はユーラシア大陸と北アメリカ大陸の温帯域に広域分布しているが,欧米の進化遺伝学者によってその系統進化が詳細に研究されてきた。

申請者等による最近の研究から北アメリカ大陸に適応放散している種はどれも系統進化の末端部に位置するもので,本分類群の出現はアジア低緯度山岳地帯に求められることが示唆されていた。亜熱帯域に位置するベトナム・バビ自然保護区で得られた種について,外部形態,生殖器構造,核型構成を近縁種と比較し調べた。近縁種間での交配前隔離機構を無選択法と雄選択法で調べた。これらの結果からバビに棲息する種は新種で(Drosophila denruoi Awit &Watabe 2013と命名),雄aedeagusの先端部がserrationsを欠いていること,surstylusの中央部のみに微毛が分布していること,雌spermathecaが膜状で硬化していないことなどで他種とは明確に区別できた。近縁種間での生殖的隔離はほぼ完全で,稔性のある雑種第1代は得られなかった。染色体は2n=12で,その構成は1対の中央部附着型,4対の端部附着型,1対の点状染色体であった。性染色体に関して,Xは端部附着型,Yは異質染色質に富む次中部附着型であった。新種の2n=12の染色体数は本種群で最多である。新種のX染色体は普通の大きさで,北米産の多くの種にみられる大型の中部附着型X染色体の約半分である。常染色体に関して近縁既知種はどれも大型の中部附着型常染色体を有しているが,新種にはみられない。これらから,新種の2対の端部附着型常染色体の動原体融合によって近縁種が有する1対の大型中部附着型染色体が生じた仮説が成立し,核型進化上Drosophila denruoiは祖先種に近い最も原始的な種と考えられる。Drosophila tsiganaの冷温帯タイプと暖温帯タイプ,およびベトナム・バビ自然保護区産の疑問種に関しての形態比較,生殖的隔離機構,核型比較等の研究は予定通り進行している。Drosophila tsigana2タイプの地理的分布上,重要と考えられる東北地方での野外調査は大震災の影響もあり,次年度に延期することにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.ベトナム・バビ産の新種について,論文発表する。2.Drosophila tsiganaの冷温帯タイプと暖温帯タイプに関して,東北地方で地理的分布域の調査を行う。分布が同所的ならば両タイプは互いに別種,異所的ならば亜種と認められる。3.東アジア産melanica種群の検索キーを作成する。4.新大陸のmelanica種群の各種との系統関係を再構築する。
高齢農業従事者の疲労と健康を規定する食生活を主とした生活要因とその改善

高齢社会の進行とともに,高齢農業従事者の疲労とその軽減対策は農村保健における重要な研究課題となっている。本研究においては,「農業従事者のための疲労に関するアンケート調査票」を用いた山口県大島郡内の柑橘類栽培農家を対象とした疲労調査結果を踏まえ,高齢農業従事者の健康を規定する生活環境要因について,食習慣と高齢者の健康の問題,農作業における疲労軽減対策も含めたQOLに関わる生活要因を明らかにし改善の方策を明らかにすること,また,食生活を含めて農業従事者のための疲労に関するアンケート調査票を確立し普遍化することを目的に研究を進めた。調査は大島郡内の農業従事者(柑橘類栽培農家)を対象に簡略版疲労調査票を作成し,当該地域で毎年実施されている基本健康診査に合わせて疲労調査を実施した。健診受診者のうち高齢農業従事者約300名を対象にアンケート調査を実施し,健診結果に基づく健康状況も含めた生活環境要因と疲労との関連について解析の結果,農作業による労働負担と疲労との明確な関連性が示され,柑橘類栽培従事者の疲労状況には男女で異なる傾向がみられた。農作業の量的負担要因より質的負担要因の方が疲労に対してより強い規定要因となりうること,社会的支援は疲労軽減に有効となりうることが示された。また,「農業従事者のための疲労調査票」は柑橘類栽培従事者の疲労調査とその規定要因の検討に有用であると考えられた。柑橘類栽培農家の疲労状況の特徴・問題点を踏まえた疲労軽減のための支援システムの検討,食生活を含めた生活環境の中における高齢農業従事者の健康問題の改善の方策について総合的な検討を行うためには,疲労を規定する生活要因についてさらに調査研究を行う必要があると考えられた。本研究においては,これまで実施してきた山口県大島郡内の柑橘類栽培農家を対象とした疲労調査結果を踏まえ,高齢農業従事者の健康を規定する生活環境要因について,特に食生活を含む生活習慣と疾病との関連,食習慣と高齢者の健康の問題,農作業における疲労軽減対策も含めたQOLに関わる生活要因を明らかにし改善の方策を明らかにすることを調査目的とする。13年度は,大島郡内の農業従事者(柑橘類栽培農家)を対象に簡略版調査票を作成し,再度疲労に関するアンケート調査を実施し,基本健康審査結果に基づく健康状況も含めた生活環境要因と疲労との関連について,現在調査データを集計・解析中である。本年度の研究実績の概要を以下に示す。1.簡略化したアンケート調査票の検討,作成前回使用した疲労調査票の結果をもとに質問項目数の削減,回答枝の検討を行い,簡略版疲労調査票を作成した。2.大島郡久賀町における高齢農業従事者の疲労に関するアンケート調査の実施当該地域で毎年実施されている基本健康診査に合わせて,地元保健センター,周東総合病院の協力を得てアンケート調査を実施した。健診受診者のうち高齢農業従事者約300名を対象にインフォームドコンセントを行った。疲労調査票は直接配布,郵送法による回収を行い,214名より回収された。3.アンケート調査及び検診結果による疲労規定要因の検討疲労調査票と保健センターと周東総合病院から提供を受けた検診データについて集計し,解析を行った。

14年度は,前年度実施したアンケート調査及び検診データの継続的解析により,高齢者の生活構造の中に潜在する健康問題の改善策についての検討,調査結果の一部について学会報告を行った。また,計画していた専業農家の食生活状況個別調査については協力が得られず実施することはできなかった。高齢者の栄養状態と食習慣の問題点,食生活のもたらす健康状況の問題点等について高齢農業従事者の健康問題改善に対する動機づけが不十分であったと考えられる。研究課題達成に資することを目的に,研究活動推進に関連のある研修会への参加を心がけた。本年度の研究実績の概要を以下に示す。1.アンケート調査及び検診結果による疲労規定要因の検討前年度実施した疲労アンケート調査及び保健センターと周東総合病院から提供を受けた検診データについて,SASを用いた解析を行った。2.調査結果の報告,発表3.研修会への参加栄養代謝生化学講座,臨床栄養学術セミナー,栄養行政担当者研修会等の受講,研修を行った。4.簡略化したアンケート調査票の再検討調査結果をもとに簡略版疲労調査票の質問項目数,回答枝について再検討を行った。高齢社会の進行とともに,高齢農業従事者の疲労とその軽減対策は農村保健における重要な研究課題となっている。本研究においては,これまで実施してきた山口県大島郡内の柑橘類栽培農家を対象とした疲労調査結果を踏まえ,高齢農業従事者の健康を規定する生活環境要因について,特に食生活を含む生活習慣と疾病との関連,食習慣と高齢者の健康の問題,農作業における疲労軽減対策も含めたQOLに関わる生活要因を明らかにし改善の方策を明らかにすることを調査目的とする。15年度は,13,14年度調査解析結果をもとに柑橘類栽培農家の疲労状況の特徴・問題点を踏まえた疲労軽減のための支援システムの検討,食生活を含めた生活環境の中における高齢農業従事者の健康問題の解析による改善の方策について総合的な検討を行い,調査結果の一部について学会誌への研究発表を行った。研究活動推進に関連のある研修会へ参加・研修し,課題達成の一助とした。1.アンケート開査及び検診結果による疲労規定要因の総合的検討疲労アンケート調査及び検診データの解析結果について総合的解析検討を行った。2.調査結果の報告,発表3.簡略化したアンケート調査票の再検討農村生活総合研究センターより発表された新たな改訂版「農業従事者用疲労調査票」を参考に質問項目,回答枝について再検討を行った。4.研修会への参加臨床薬理学基礎講座等の受講,研修を行った。
コンピュータネットワークを利用した適応型テストシステム

本年度は,適応型テストで利用される項目反応モデルに関する理論研究と適応型テストシステムの開発を中心に行った。●中村・前川・菊池(1998)では,項目反応モデルの下でテスト得点分布を設足し,その分布に最適な項目を選択する方法を提案した。能力測定場面では,依然としてテスト得点が用いられていることが多く,現実には項目反応モデルを利用しているにもかかわらずテスト得点を考慮しなければならないことがある。本研究は,そのような場面での利用を想定して提案された方法である。今後,計算方法の改善や2パラメタモデルへの拡張を検討している。●中村(1999)では,教育心理学の測定・評価領域に関するレビューを行った。特に,テストに関する研究で利用される統計的手法に焦点をあて,手法の利用面から応用研究を紹介するとともに,統計的手法の方法論的研究も合わせて紹介し,議論を進めた。中心的に取り上げた手法は,近年,応用研究が進みつつある項目反応理論と共分散構造分析である。さらに,本研究では急速に発展してきたコンピュータと測定領域との関連についても,最新情報を交えて紹介した。●一般項目反応モデルに基づいた適応型テストを開発した。適応型テストにおける項目選択法として,被験者の能力パラメタと変動パラメタの事後標準偏差を同時に最小とする方法を用いた。開発されたテストシステムは,Delphi4.0のWebBrokerを利用したWebサーバ・アプリケーションであり,テスト受験者はネットワークを利用してテストシステムを利用することが可能である。今後,このシステムに受験者照合装置を加え,セキュリティ問題を解決した次世代型テストシステムを開発する予定である。適応型テストに関する基礎的な研究として以下の研究を行った。・被験者の能力変動を考慮した適応型テスト被験者の能力変動を考慮して能力の推定を行うモデルとして一般項目反応モデルがある。本研究ではモデルに基づいた適応型テストの新しいパラメタ推定法を提案した。最適項目の選択方法として,被験者の能力パラメタの期待事後標準偏差と能力変動パラメタの期待事後標準偏差の合計がもっと小さくなる項目を選択する方法をとった。この事により,テストを構成する全ての項目を利用せずとも,精度の高い能力推定が行えるだけでなく,被験者の能力変動情報についても精度の高い推定を逐次的に行うことができる。この研究の成果は日本心理学会第62回大会で発表される予定である。・双列相関のベイズ推定テストの各項目とテスト得点との相関係数を計算する際に利用される双列相関係数の新しい推定法を提案した。従来の推定法では,±1を超えることがあったが,事前分布を利用したベイズ推定を行うことにより,上記の問題を解決し,さらに従来の方法と比べより精度の高い推定を行うことができる。この研究の成果は日本心理学会第61回大会で発表された。・マルチメディアテストの開発NTT情報通信研究所が開発したビデオハイパーメディアを利用してマルチメディア・リスニングテストを開発した。このテストには,被験者の能力に適した項目を提示する適応型テスト機構が組み込まれている。開発後,ATM実験網を利用した遠隔テスト実験を行い,適応型テストの有効性を確認した。この研究の成果は,情報処理学会「マルチメディア,分散,協調とモ-バイル」ワークショップで発表された。
大脳皮質構築過程におけるMDGAファミリー因子群の役割

MDGAファミリータンパク質はMDGA1,MDGA2の2種類からなるイムノグロブリンスーパーファミリーに属するGPIアンカー型の細胞外タンパク質である。これらは中枢神経系において特徴的な発現様式を示し、なかでもMDGA1はマウス大脳皮質においてはII/III層選択的に発現する。MDGA1およびMDGA2欠失マウスをそれぞれ作製し、その大脳皮質構築過程における役割を解析したところ、MDGAファミリー因子群は、これらを発現する神経群において、その皮質板内における正常な放射状移動に必要であることが明らかとなった。また、欠失マウスの表現形と、脳梁交連神経群の一部サブタイプの皮質板内での移動様式から、皮質板内における放射状移動には多様性があることが示唆された。MDGA1はイムノグロブリンスーパーファミリーに属するGPIアンカー型の細胞外タンパク質である。我々はこれまでに、MDGA1が中枢神経系の特定の神経群において発現が見られること、また、軸索走行領域に存在する未同定の因子とMAMドメインを介してheterophilicに結合することなどを明らかにしている。大脳皮質形成時においては、MDGA1は上層を構成する神経群に選択的に発現しており、層構築過程において重要な機能を果たしていることが推察された。そこで、MDGA1の大脳皮質構築過程における役割を明らかにするために、LacZノックイン-ノックアウトマウスを作製し、さらに、遺伝的背景の違いによる擾乱を避けるためにC57BL6マウスと戻し交配を10回以上行い、コンジェニック系統を作出した。今年度は、作出したコンジェニック系統を用いて、MDGA1発現細胞の大脳皮質構築過程における振る舞いを詳細に解析した。その結果、MDGA1欠失マウスにおいては、MDGA1発現細胞の皮質板内での移動に遅滞が認められ、皮質板内の配置にも異常が観察された。興味深いことに、このとき、Cux2を発現する上層の神経群の移動・配置にはこのような異常は認められず、MDGA1は、これを発現する一部の細胞においてのみ、その正常な放射状移動に必要であることが明らかとなった。これらの結果は、MDGA1が大脳新皮質の正常な構築に関与していることを明確に示しているのみならず、大脳新皮質構築時における放射状細胞移動が、細胞種によって異なる制御を受けていることを示唆する初めての知見である。こうした細胞種選択的な放射状移動制御が、大脳新皮質構築の多様性・柔軟性を保証する機構の一助となっていることが推察される。我々はこれまでに、MDGAlが中枢神経系の特定の神経群において発現が見られること、軸索走行領域に存在する未同定の因子とMAMドメインを介してheterophilicに結合すること、さらに、大脳新皮質の発生過程においては主としてII/III層を構成する神経群において選択的に発現が見られることを明らかにしてきており、本研究においては、MDGA1およびそのファミリー分子であるMDGA2ノックアウトマウスの作製・解析により、MDGAファミリー因子群の大脳皮質構築過程における機能を探ることを目的としている。昨年度までに、MDGA1ノックアウトマウスの解析から、MDGA1は将来II/III層を構成する神経群の一部に発現しており、mGAlの欠失により、それら神経細胞群の皮質板内における放射状移動が遅滞することを明らかにした。このとき、Cux2陽性細胞の移動においては顕著な差異は認められなかったことから、皮質板内における放射状移動には細胞種による多様性が存在することが示唆された。今年度はこの仮説を検証する目的で、II/III層を構成する神経群の一部に選択的に発現する遺伝子群をマーカーとして、これらを発現する神経細胞群の皮質板内での位置を経時的に観察した。その結果、一部の遺伝子を発現する特定の神経群において、その皮質板内での存在様式に差異が認められた。この結果は、先の仮説を支持するとともに、その意義を明らかにしていく上でも有用な知見である。また、MDGA1のファミリー分子であるMDGA2ノックアウトマウスの作製を進め、その作出に成功した。MDGA1はIgSFに属するGPIアンカー型の細胞外タンパク質である。これまでに、MDGA1が中枢神経系の特定の神経群において発現が見られること、IgドメインおよびMAMドメインを介してそれぞれ他の因子と結合すること、大脳新皮質の発生過程においては主としてII/III層を構成する神経群において選択的に発現が見られることを明らかにしている。本研究においては、MDGA1およびそのファミリー分子であるMDGA2ノックアウトマウスの作製・解析により、MDGAファミリー因子群の大脳皮質構築過程における役割を探ることを目的としている。

昨年度までに、MDGA1ノックアウトマウスの作製と解析を進め、その結果、MDGA1が大脳新皮質形成時において、これを発現する一部の神経群の正常な皮質板内放射状移動に必要であることを明らかにした。さらに、この結果から、画一的に見える放射状移動も細胞種によって異なった制御がなされていることが新たに推定された。そこで、脳梁交連神経群の一部サブタイプに選択的に発現する遺伝子群をマーカーとして、皮質板内での移動に細胞種による差違が認められるか、検証を試みた。その結果、これら細胞群の皮質板内における挙動には差異が認められ、6層に存在が仮定される抑制シグナルに対する感受性の有無と強弱によって4種の類型に分類された。これらのことより、大脳新皮質構築時における皮質板内の放射状移動には多様性が存することが示唆された。また、昨年度樹立したMDGA2ノックアウトマウスの解析を進めたところ、MDGA2の欠失によりMDGA1発現細胞の皮質板内での放射状移動に遅滞が観察された。これらのことから、MDGAファミリー因子群は、大脳皮質構築過程において、これらを発現する一部の神経群において、その皮質板内の正常な放射状移動に必要とされていることが明らかになった。MDGA1欠失マウスの解析結果から新たに得られた大脳新皮質構築機構についての仮説の検証に進展が見られたとともに、MDGAファミリー因子群の寄与を解析する上で不可欠なMDGA2ノックアウトマウスの作出に成功したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。MDGAファミリー因子がすべて欠失した状態において、大脳皮質構築過程にどのような異常が生じるのかを明らかにする。また、放射状細胞移動の細胞種による多様性が、大脳新皮質構築においてどのような意義を有しているのか、について解析を進める。
モノクローナル抗体によるヒトB細胞活性化機構の研究

我々は一連のヒトリンパ球膜抗原に対する単クローン抗体を作製した. L-29抗体によって認識される抗原はリンパろ胞の胚中心に存在する活性化B細胞に発現している.一方L-30抗体によって認識される抗原はリンパろ胞のmantle zoneに存在する静止期B細胞に発現している.この静止期B細胞は細胞膜にIgDとIgMの発現がある.又我々はインターロイキン2受容体に対する抗体(L10)も作製した.正常人末梢血リンパ球を抗原や,マイトージェンで刺激すると,正常B細胞は増殖を開始し, L-30抗原の発現は少くなり, B細胞が抗体産生細胞へと分化するにしたがい消失する.これに反してL-29抗原は,正常B細胞では発現していないが,活性化につれてつよく発現する.この様なB細胞にはL-10抗原も発現してくる.したがってL-29, L-30抗体はB細胞の活性化及び分化に伴って発現する抗原を認識している.これらの抗体は同時に悪性リンパ腫の診断にも応用できる.すなわち, diffuse small cleaved cell lymphomaではL-30とL-10抗原の発現がみられるが, L-29抗原の発現はない.これに反してLarge cell及びimmunoblastic lymphomaではL-29抗原の発現はあるが, L-30抗原の発現はない.Leukocyte-Common Antigen(LCA)は広く,リンパ球,マクロファージ,顆粒球に分布する抗原として知られている.LCA抗原上に存在するユニークな抗原決定基に対する単クローン抗体を作製した.この抗体(Yz抗体)はJurkat cellや一部のATLの細胞と反応する.LCA抗原がその細胞のtransfomationに伴って変化し, Y1抗体で認識される抗原決定基を発現したものと思われ,腫瘍特異的抗原としても使えることが明らかとなった.LCA抗原の遺伝子はB細胞にも存在するわけで,この抗原がいかにして特定の細胞にのみ発現するかを検討することは,リンパ球分化抗原のgene regulationを研究するうえで大変興味深いと思われる.我々は一連のヒトリンパ球膜抗原に対する単クローン抗体を作製した. L-29抗体によって認識される抗原はリンパろ胞の胚中心に存在する活性化B細胞に発現している.一方L-30抗体によって認識される抗原はリンパろ胞のmantle zoneに存在する静止期B細胞に発現している.この静止期B細胞は細胞膜にIgDとIgMの発現がある.又我々はインターロイキン2受容体に対する抗体(L10)も作製した.正常人末梢血リンパ球を抗原や,マイトージェンで刺激すると,正常B細胞は増殖を開始し, L-30抗原の発現は少くなり, B細胞が抗体産生細胞へと分化するにしたがい消失する.これに反してL-29抗原は,正常B細胞では発現していないが,活性化につれてつよく発現する.この様なB細胞にはL-10抗原も発現してくる.したがってL-29, L-30抗体はB細胞の活性化及び分化に伴って発現する抗原を認識している.これらの抗体は同時に悪性リンパ腫の診断にも応用できる.すなわち, diffuse small cleaved cell lymphomaではL-30とL-10抗原の発現がみられるが, L-29抗原の発現はない.これに反してLarge cell及びimmunoblastic lymphomaではL-29抗原の発現はあるが, L-30抗原の発現はない.Leukocyte-Common Antigen(LCA)は広く,リンパ球,マクロファージ,顆粒球に分布する抗原として知られている.LCA抗原上に存在するユニークな抗原決定基に対する単クローン抗体を作製した.この抗体(Yz抗体)はJurkat cellや一部のATLの細胞と反応する.LCA抗原がその細胞のtransfomationに伴って変化し, Y1抗体で認識される抗原決定基を発現したものと思われ,腫瘍特異的抗原としても使えることが明らかとなった.LCA抗原の遺伝子はB細胞にも存在するわけで,この抗原がいかにして特定の細胞にのみ発現するかを検討することは,リンパ球分化抗原のgene regulationを研究するうえで大変興味深いと思われる.(1)モノクローナル抗体の作製:EB virus-transformedB cell line(KOI)を用いてBALB/Cマウスを免疫した。免疫マウス脾細胞とNS/1細胞をKollerand Milsteinの方法により細胞融合を行った。得られたハイブリドーマの培養上清を各種ヒト培養株を用いてスクリーニングし興味ある2種類のモノクローナル抗体(L29,L30)を得た。(2)L29及びL30の反応性:扁桃B細胞の1/3とL29は反応し、L30は2/3と反応する。Percollを用いてB細胞を分画すると、L29は高比重で小型の静止期B細胞と反応し、L30は低比重で大型の活性化B細胞と反応することが明らかとなった。しかも扁桃腺を用いてその組織内分布を調べてみるとリンパ濾胞のマントルゾーンに分布する小型リンパ球とL29は反応し、胚中心に存在する大型リンパ球とL30は反応していた。しかもこれらの抗体はT細胞とは反応しない。これらの結果からL29は静止期小型Bリンパ球を認識し、L30は活性化された大型の胚中心にある分化度を示すB細胞を認識すると考えられた。さらにヒト末梢血B細胞をB細胞マイトージェンであるPWMで刺激し、L29及びL30との反応性を調べると、L29との反応性は減弱していくのに反し、L30との反応性は増強していくことがわかった。

したがってL29は静止期B細胞を認識し、B細胞が活性化し、抗体産生細胞へと分化を開始するにしたがって反応しなくなり、L30は静止期B細胞を認識せず、B細胞が活性化するにつれて反応するようになる。しかし両抗体ともB細胞分化の最終段階であるPlasma cellとは反応しない。両抗体の組合わせによりB細胞分化を明確に区別できると考えられ、今後B細胞腫瘍との反応性を検討し、その分化段階を明らかにしていきたい。
海上輸送用ウォーターバッグの疲労メカニズム解明と損傷検知システムの開発

プラスチックス製(ポリエステル等)の柔軟なシートまたは袋による海上輸送技術(シール材またはコンテナとしての利用)が、低コストで低環境負荷型な輸送手段として注目されている。本研究では、このウォーターバッグに関して、疲労メカニズム解明と損傷(すなわち内容物流出のリアルタイム)検知システム開発の2つの検討を行った。すなわち、まず、ウォーターバッグの損傷の主要因と考えられている(内容物輸送後の)リールへの巻き取り時等における疲労損傷発生に関し、室内実験として「巻き取り模擬試験」を行い、それに基づき「損傷発生メカニズム解明」ならびに「疲労プロセス解明」を行った。この際に、万能試験機制御装置を導入し、既存設備である万能試験機(島津UH-500KNI)を本研究用途に改造してデータの収集を行った。その結果に基づき、繰り返しによる疲労損傷プロセスの解明が行なわれ、より長寿命で信頼性の高いウォーターバッグ設計への提言を行うと共に、モニタリングによる損傷検出のための方針を策定した。一方、上記の検討を通して明らかとなった損傷の形態や大きさの情報をもとに、過剰な設計を避けて最適なライフサイクルコストを実現することを目的として、ウォーターバッグ内外の電位差変化に着目した低コストな損傷検知システムの開発を行った。具体的には、「巻き取り模擬試験」のデータと考察をふまえた実際の損傷形態と大きさにもとづき、電位差変化により損傷の有無と場所を検知するための理論構築を行い、検知システムを開発した。本研究では、このウォーターバッグに関して、疲労メカニズム解明と損傷(すなわち内容物流出のリアルタイム)検知システム開発の2つの検討を行っている。すなわち、まず、ウォーターバッグの損傷の主要因と考えられている(内容物輸送後の)リールへの巻き取り時等における疲労損傷発生に関し、初年度である平成15年度には、室内実験として「巻き取り模擬試験」を開始し、それに基づき「損傷発生メカニズム解明」ならびに「疲労プロセス解明」を行った。その結果に基づき、繰り返しによる疲労損傷プロセスの解明が行なわれ、より長寿命で信頼性の高いウォーターバッグ設計への提言を行うと共に、モニタリングによる損傷検出のための基本方針を策定した。一方、上記の検討を通して明らかとなった損傷の形態や大きさの情報をもとに、過剰な設計を避けて最適なライフサイクルコストを実現することを目的として、ウォーターバッグ内外の電位差変化に着目した低コストな損傷検知システムの開発に着手した。平成15年度は「巻き取り模擬試験」のデータと考察をふまえた実際の損傷形態と大きさにもとづき、電位差変化により損傷の有無と場所を検知するための理論構築を行った。プラスチックス製(ポリエステル等)の柔軟なシートまたは袋による海上輸送技術(シール材またはコンテナとしての利用)が、低コストで低環境負荷型の輸送手段として注目されている。本研究では、このウォーターバッグに関して、疲労メカニズム解明と損傷(すなわち内容物流出のリアルタイム)検知システムの開発を行った。すなわち、まず疲労メカニズム解明としては、リール巻き取り時等における損傷発生と、その繰り返しによる疲労損傷プロセス及び最終破断メカニズムの解明を目的として、平成15年度に引き続き「巻き取り模擬試験」と「疲労プロセス解明」を行い、損傷プロセスの動画や損傷部位の分析写真などを知識データベース化して損傷パターンとその改善根拠を明らかにすることによって、より高信頼性・高耐久性を有するウォーターバッグの設計指針を提言した。なお、この際、疲労プロセスの導入は既存の装置を使用し、最終破断は衝撃試験機用ロードフレームを導入して検討した。一方、損傷検知システムの開発においては、過剰な設計を避けて最適なライフサイクルコストを実現することを目的として、ウォーターバッグ内外の電位差変化に着目した理論を構築して、その実験的検証結果をもとに、低コストな損傷検知システムを開発し、「巻き取り模擬試験」のデータと考察をふまえた実際の損傷形態と大きさにもとづき、電位差変化により損傷の有無と場所を検知するための室内実験を行い、その有効性を検証した。
超加速変異型サルマラリア原虫を用いたヒト赤血球への適応進化の解析

サルマラリア原虫Plasmodium knowlesi(Pk)はヒトに感染するが、地域で感染性や病原性が異なる。本研究ではその分子基盤を明らかにするため、ヒト赤血球では長期培養できないがサル赤血球では長期培養できるPk株の進化速度を人為的に加速することでヒト赤血球で効率よく発育できる原虫株を確立し、全ゲノム解析により責任遺伝子を同定する事を試みることを目的とした。まず、ニホンザルで維持され、培養系に適応したことのない2株のPkの培養株化の樹立を試み、成功した。適応進化を加速する遺伝子導入プラスミドを作製した。また、Pkへの遺伝子導入の条件検討を行い、研究室で遺伝子導入を行う体制を整えた。近年、東南アジアのサルに感染しているマラリア原虫Plasmodium knowlesi (Pk)がヒトに感染することが報告されているが、地域により血中感染率や症状が異なる。通常低い感染率を示すP. knowlesiが、ボルネオでは高い感染率でヒトに感染し、死亡する例も出ている。そのため、P. knowlesiのヒトへの感染性や強毒化する分子基盤を明らかにすることは重要な課題である。本研究では、ヒトの赤血球では長期培養ができないが、サルの赤血球では長期培養できるPk株に突然変異率を増加させる分子を遺伝子導入し、適応進化を加速することでヒト赤血球で効率よく発育できる原虫株を確立し、全ゲノム解析により責任遺伝子を同定する事を試みることを目的とした。平成25年度は、オランダのBiomedical Primate Research CentreのKocken博士からサルの赤血球でのin vitro培養系に適応したサルマラリア原虫Pkを入手し、アカゲザルとニホンザルの赤血球を使用した培養を開始したが、原虫がうまく増殖しなかった。そのため、研究分担者の川合よりニホンザルに適応したPk原虫株を入手し、アカゲザルとニホンザルの赤血球を用いて培養を行った。その結果、1カ月は培養できるようになったが、1カ月を超えると原虫が増殖しなくなる傾向があり、培養条件の再検討を行った。一方、超加速変異型原虫作製用の遺伝子導入プラスミドの作製は順調に行った。平成26年度は、ハーバード大学から培養に適応したPk株を入手し、培養条件を再度検討することで、安定的に長期培養を行うことができるようになった。確立した条件を用いて、培養株が存在しないP. knowlesiのHackeri株について世界で初めて培養株化に成功した。P. knowlesi培養株への遺伝子導入も確立し、超加速変異型原虫作製用の遺伝子導入プラスミドの作製もほぼ終了したが、培養条件の確立に1年余りを費やしたため、本研究の期間内には超加速変異型原虫の解析にまで到達できなかったが、その基盤を整えることができた。医歯薬学オランダでは培養ができている原虫株が、当教室では増殖せず、その原因として、培養に用いている献血由来のヒト血清のロット間のばらつきが考えられた。培養の条件検討をする必要が出たため、遺伝子導入まで進んでいない。平成26年度は、サル赤血球による培養の確立条件を確定し、作製したプラスミドを遺伝子導入し、組換えP. knowlesiを得る。培養中にヒト赤血球を徐々に加えて培養を継続し、ヒト赤血球に適応しin vitro培養ができるP. knowlesiの作製を行う。ヒト赤血球適応株ができれば、全ゲノム解析と全ゲノム転写解析より、複数の株間で変異や転写量の変化が共通して見られる遺伝子座を検出してリスト化する。その後、遺伝子導入により責任遺伝子座の同定をできる所まで行う。計画が遅れ、遺伝子導入を次年度に行うことになったため。平成25年度に予定していた遺伝子導入を行うための消耗品に使用する。
GAによるコンクリート建築物のライフサイクルマネージメント最適化手法に関する研究

本年度は、平成11年度に引き続き、遺伝的アルゴリズムの多目的最適化問題に対する応用の検討を詳細に行うとともに、拡散も出るの検討・修正を行い、コンクリート建築物のライフサイクルマネージメント最適化システムの構築を行った。1.拡散モデルの検証平成11年度の研究に引き続き、二酸化炭素の拡散劣化を中心にとして、コンクリート表層部の取り扱いについて劣化モデルの改良を行い、システムの改善を行った。2.遺伝的アルゴリズムによる多目的最適化システムの構築に関する研究平成11年度に得られた知見から、維持管理・補修改修問題は、同時に複数の要求条件と複数の制約条件(コスト、耐用年数、補修間隔など)が与えられる多目的最適化問題として捉えられることが明らかとなり、多目的最適化問題に関するより深い検討が必要であるとの見解に到った。そこで、多目的最適化問題に対するパレート最適解空間の概念を導入が重要であることを確認し、解空間を各世代に保持しながら最適解の導出を行う遺伝的アルゴリズムが有効であることが明らかとなった。具体的には、Goldbergらにより提案された共存型GAに改良を加えた改良型多目的共存GA(MOVGA)の開発を行い、ライフサイクルマネージメント最適化システムの構築・提案を行った。また、MOVGAの有効性を確認すべく、より多くの多目的問題であるコンクリートの要求性能型調合設計支援システムへの応用を試み、多目的最適化問題に大してMOVGAが非常に有効であることを確認した。尚、本研究で得られたライフサイクルマネージメント最適化システムのアプリケーションについて、今後WEB上に掲載・配布することで、広くこの知見を公開する予定である。本年度は、文献調査による劣化モデルの作成と、遺伝的アルゴリズムによる建築物のライフサイクルマネージメント最適化プログラムのフレームワーク作成およびそのプロトタイプの作成を行った。以下に、その結果を示す。1.劣化モデルの検討文献調査を中心として検討を行った結果、コンクリート構造物の主な劣化現象である中性化および塩害は拡散論に立脚した劣化プロセスとして捉えられるが、中性化においては拡散と同時に反応を伴うこと、各仕上げのコンクリートの保護効果の経時変化を考慮する必要があること、GAに組み込んだときの計算量を押さえる必要が有ること等を考慮し、差分法による劣化モデルを採用した。さらに、コンクリートの見かけの拡散係数、仕上げ材の透気係数など各パラメータを既往の文献により検討し、劣化モデルのプロトタイプを作成した。2.透気性試験装置による表面仕上げの効果の同定文献調査から得られた劣化モデルの正確なパラメータを抽出する必要があるため、主な劣化現象である中性化を対象に、表面仕上げや補修・改修が施されたコンクリート部材の外的因子の透気性を同定するための試験装置の開発を行いその試作器を得た。現在その試作器により、セラミックを用いた数水準の予備試験を行いデータ収集を行っている。3.遺伝的アルゴリズムプログラミングによる維持管理計画最適化手法の検討・開発遺伝的アルゴリズムによる最適化シミュレーションの開発と検討を行った。特に、建築物のライフサイクルマネージメント最適化問題を多目的(多評価関数)最適化問題として捉え、遺伝的アルゴリズムによる多目的最適化プログラムのフレームワークの作成をプログラミングを行った。得られたプログラムに上記劣化モデルを適用し、プロトタイプを作成した。その結果、遺伝的アルゴリズムが、維持管理計画最適化問題に有効であることが確認された。
〓敬の基礎的研究

昨年に引き続き九部経解のテキストデータ化を進め、7月に完成した。テキストデータについては著作別にフォルダに入れたものを仮アップし、研究者に提供することにし、その際不明な文字については個別に問い合わせに応じる予定である。その後内閣文庫蔵『九部経解』及び『山草堂集』の調査を進め、2005年2月には国家図書館(北京)、湖北省図書館(武漢)、浙江省図書館(杭州)、復旦大学図書館(上海)を調査した。湖北省図書館と浙江省図書館では当該書籍の実物を見ることができなかったが、国家図書館では『山草堂集』、復旦大学図書館では『九部経解』の原本を見ることが出来、内閣文庫蔵のものと比較していくつかの知見を得た。『山草堂集』については、1:北京国家図書館蔵本は内外編揃った完本であった。2:内閣文庫蔵『山草堂集』は、端本ではなく、北京図書館本系統のものを再編集したものであった。3:再編集の課程で「小山草」の一部の差し替えが行われ、北京図書館本にない文章が内閣文庫本に存在していた。『九部経解』については、1:湖北省図書館・復旦大学図書館とも完本は所蔵していない。2:内閣文庫本所蔵の二本は同一の版木からなっているが、細部について微修正が加えられており、それは単に文字の誤りの訂正にとどまらず、内容の訂正に及んでいる。3:影印出版されている復旦大学蔵「礼記通解」は、版本系統を分析するのに重要な箇所が別本に差し替えられている。4:内閣文庫蔵の二本のうち一本は最も早く印刷されたもので、国会図書館蔵本はもっとも新しい形である。本年度は主に以下のような実施計画を立てた。(1)国内図書館における所蔵状況の調査。(2)『九部経解』デジタルデータ化の底本である国会図書館所蔵本の全件複写。(3)『九部経解』デジタルデータ変換発注。(北京書同文数字化技術有限公司)(4)『山草堂集』の全件複写と解題作成着手。(1)は京都大学人文科学研究所のデータベースを中心に、既存の目録類を参照して予備調査とした。内閣文庫に『九部経解』刻本が二本所蔵されていることが分かり、現地調査の結果、毛利高標旧蔵に由来する一本は完本であることがわかった。現時点では我が国にある『九部経解』唯一の完本であり、電子テキスト化は該本を底本とすべきであろうが、マイクロから起こす必要があり、相当の費用がかかることから、事前調査で使用予定にしていた国立国会図書館所蔵本を用いることとし、該本は版本の基礎調査に必要な箇所のみ複写した。一方、すでにマイクロ化されている、国立国会図書館所蔵『九部経解』は(一部抄本)全件複写した。所蔵状況のデータベース化については、いくつかの機関について実地調査を行ったところ、京大人文研のデータベースの情報がすでに非常に完備された状態であることを再認識し、これに付加価値をつけられるかどうか検討している最中である。電子テキストの作成については、書同文数字化技術有限公司より提示された金額が、当初の予定を大幅に上回ったが、今回のプロジェクトの根幹であることから費用の一部を次年度に持ち越すこととして予定通り実施することとし、発注した。なお、このデータは来年7月に完成の予定である。翻刻許可が下り次第仮公開をし、校訂の完了したものから順次本公開していく。『山草堂集』の解題作成に関しては、全件複写するまでの予算の余裕がないことから、今回は予備調査にとどめたが、これも〓敬研究の基礎資料となることから、小山草を中心に予定通り解題を作成することとしたい。
一過性脳虚血後の神経細胞死に対する5型代謝調節型グルタミン酸受容体の関与

本研究では,一過性全脳虚血/再灌流(I/R)後の海馬CA1領域神経細胞死とNMDA受容体NR1サブユニットセリンリン酸化に及ぼすmGluR5の関与について検討した.mGluR5拮抗薬であるMPEPを海馬CA1領域へ投与し, I/R後72時間目でこの領域に神経細胞が生じた.MPEPは濃度依存的にこの領域での神経細胞死を抑制した.MPEP30nmolの投与で最大の保護効果が得られた.次に, I/R後の海馬CA1領域でNMDA受容体NR1サブユニットS890およびS896リン酸化の経時的変化を解析した.これらのリン酸化はI/R後1時間目から増大し, I/R後24時間目まで持続した.MPEP投与はI/R後増大したリン酸化NR1 S890量を43.1%減少させたが,リン酸化NR1 S896量には影響を及ぼさなかった.NR1 S890およびNR1 S896はPKCによりリン酸化される.I/R後のNR1セリンリン酸化機構を解明すべく, NMDA受容体が高密度に存在するシナプス後肥厚部(PSD)を単離し, PKC量をサブタイプ別に解析した.I/R後1時間目に海馬CA1領域で解析を行った結果, PKCγ量が1.7倍増大した.このI/R後のPSDへのPKCγの集積はMPEP投与により抑制された.一方PKCα, PKCθ量はI/R後変化しなかった.これらの結果は, I/R後のS890リン酸化の増大にmGluR5を介したPKCγ集積機構が関与する可能性を示している.MPEPによる神経保護効果の発現メカニズムは明らかとされていないが,一部は上記に述べたようなNR1リン酸化機構調節が働いていると考えられた.以上,本研究はI/R後の海馬神経細胞死機序の一端を解明し, mGluR5アンタゴニストが有用な脳虚血保護薬となり得る可能性を提示した.本研究では,一過性全脳虚血/再灌流(I/R)後の海馬CA1領域神経細胞死とNMDA受容体NR1サブユニットセリンリン酸化に及ぼすmGluR5の関与について検討した.mGluR5拮抗薬であるMPEPを海馬CA1領域へ投与し, I/R後72時間目でこの領域に神経細胞が生じた.MPEPは濃度依存的にこの領域での神経細胞死を抑制した.MPEP30nmolの投与で最大の保護効果が得られた.次に, I/R後の海馬CA1領域でNMDA受容体NR1サブユニットS890およびS896リン酸化の経時的変化を解析した.これらのリン酸化はI/R後1時間目から増大し, I/R後24時間目まで持続した.MPEP投与はI/R後増大したリン酸化NR1 S890量を43.1%減少させたが,リン酸化NR1 S896量には影響を及ぼさなかった.NR1 S890およびNR1 S896はPKCによりリン酸化される.I/R後のNR1セリンリン酸化機構を解明すべく, NMDA受容体が高密度に存在するシナプス後肥厚部(PSD)を単離し, PKC量をサブタイプ別に解析した.I/R後1時間目に海馬CA1領域で解析を行った結果, PKCγ量が1.7倍増大した.このI/R後のPSDへのPKCγの集積はMPEP投与により抑制された.一方PKCα, PKCθ量はI/R後変化しなかった.これらの結果は, I/R後のS890リン酸化の増大にmGluR5を介したPKCγ集積機構が関与する可能性を示している.MPEPによる神経保護効果の発現メカニズムは明らかとされていないが,一部は上記に述べたようなNR1リン酸化機構調節が働いていると考えられた.以上,本研究はI/R後の海馬神経細胞死機序の一端を解明し, mGluR5アンタゴニストが有用な脳虚血保護薬となり得る可能性を提示した.
加工極表面の'その場'評価のための超薄片加工装置の試作

透過電子顕微鏡観察においては薄膜試料の調製がその作業の50%以上の比率を占めるといわれている。これは薄片試料が電子線を十分に通すだけの厚みであり、かつ表面は滑らかであることが要求されるためである。特にセラミックスにおいては多くが化学的に安定であるため、イオンシニング法が一般的に用いられているが、イオン衝撃による損傷(微小欠陥の発生,非晶質化)や表面荒れの問題を抱えているのが現状である。本研究においては、超精密位置制御機構を備えた自動研磨装置の試作と、歪の入らない機械研磨のみによる透過電顕用薄膜試料の作製技術の確立を目的とした。まず、従来よく用いられたきた種々の薄膜化法(研削,ポリッシング,ディンプラ研磨)による表面損傷の状況を透過電顕により調査した。炭化ケイ素多結晶体においては研削、ディンプラ研磨の双方とも表面に著しい残留応力があり、粒内割れ及び粒界割れが伴っていた。また、ダイヤモンドポリッシングは高密度の表面スクラッチが生成していた。これらの方法は電顕試料作製法としては適さないことがわかった。これらの観察結果から、高精度高能率の鏡面加工として注目されらいるメカノケミカルポリシングの手法を取り入れた新しい研磨の概念に基づく'ス-パ-ディンプラ'の設計・開発を行った。溶液中で回軽数10^4min^<-1>以上で回転するディスクを非接触で試料表面に近づけることにより、高速砥粒が無歪で研磨を行うことを原理とする。設計段階で課題となった振動対策は系全体の剛性を高める工夫によりこの問題を解決した。アルミナ砥粒で実験を行ったところ,非接触状態で除去加工が進行していることを確認した。これは,メカノケミカルポリシングを用いたディンプル加工が可能であることを意味する。将来的には加工時間を大幅に短縮し,表面損傷を回避した透過電顕用の薄膜作製ができることを示唆している。今後は工具の材質,形状などの改良により加工の性能を向上できると考えている。透過電子顕微鏡観察においては薄膜試料の調整がその作業の50%以上の比率を占めるといわれている。この薄片試料においては電子線を十分に通すだけの厚みであり、かつ表面は滑らかであることが要求され、試料作製の歩留りがすべてを律速するからである。特にセラミックスにおいては大半の場合が化学的に安定であるため、イオンシニング法が一般的に用いられているが、イオン衝撃による損傷(微小欠陥の発生,非晶質化)や表面荒れの問題を抱えているのが現状である。本研究においては、超精密位置制御機構を備えた自動研磨装置の試作を行い、機械研磨のみにより歪の入らない透過電頭用薄膜試料の作製技術の確立を目的とした。初年度は、従来よく用いられてきた種々の薄膜化法(研削,ボリッシング,ディンプラ-研磨)による表面損傷の状況を透過電頭により調査した。炭化ケイ素多結晶体においては研削,ディンプラ-研磨のいずれにおいても表面に著しい残留応力が残り、粒内割れおよび粒界割れが伴っていた。また、ダイヤモンドポリッシングにおいては高密度の表面スクラッチが生成していた。これらはすべては電顕試料作製法としては適さないことがわかった。また、軟質なセラミックスである窒化アルミニウムにおいては種々の硬さを持つ砥粒(アルミナ,酸化クロム,錫ラップ)によるポリッシングを試みたが、いずれの場合も表面に高密度転位の生成が伴うことが分った。これらの観察結果から、新しい研磨の概念にもとずく'ス-パディプラ-'の設計・開発を行った。

溶液中で回転数10^4min^<-1>以上で回転するディスクを非接触で試料表面に近ずけることにより、高速砥粒が表面を無歪で研磨を行うことを原理とする。設計段階では振動対策が重要な課題であった。系全体の剛性を高める工夫によりこの問題を解決し、現在、この装置の組み上げを行っている最中である。本研究においては,超精密位置制御機構を備えた自動研磨装置の試作を行い,機械研磨のみにより歪みの入らない透過電顕用薄膜試料の作製技術の確立を目的とした。セラミックスの表面における加工損傷の観察結果から,高精度高能率の鏡面加工として注目されているメカノケミカルポリシングの手法を取り入れた新しい研磨の概念に基づく"ス-パ-ディンプラ"の設計・開発を行った。溶液中で高速回転するディスクを非接触で試料表面に近付けることにより,巻き込まれた砥粒が試料との間でメカノケミカル反応を起こし,表面を無歪みで研磨を行うことを原理とする。メカノケミカル反応を進行させるために,工具の回転には高速DDエアスピンドルを採用し,回転数1万rpm程度で工具を回転させメカノケミカル反応の進行する条件を整えた。そして,薄片加工のため,最小ステップ0.0156μmで試料を送ることが出来る機構を採用した。そして加工条件として重要な加工圧を測定するためにロ-ドセルを,そして加工部に余計な圧力をかけず工具と試料の間隔を測定するために過電流式の非接触変位計を用いた。これらにより,非接触加工のための機構は完成した。装置作製の後,通常用いられているアルミナ砥粒で実験を行ったところ,非接触状態で除去加工が進行していることを確認した。これは,メカノケミカルポリシングを用いたディンプル加工が可能であることを意味し,即ち将来的に加工時間を大幅に短縮し,表面損傷を回避した透過電顕用の薄膜作製が十分に期待できることを示唆している。また,実際には完全な非接触状態を定常的に作ることは困難であることがわかった。今後は工具の材質,形状などの改良により加工の性能が上がると考えている。
クロライドチャネルの細胞死誘導機能とその活性制御メカニズム

まず第1に、脳虚血時の脳腫脹と脳障害の原因となるグリア細胞の乳酸アシドーシス性細胞膨張とネクローシス死誘導におけるC1^-チャネルの役割を調べた。アストロサイト由来のC6細胞を乳酸アシドーシス条件におくと持続性膨張を示し、やがてネクローシス死におちいった。この膨張時に容積を調節すべき容積感受性外交整流性(VSOR)C1^-チャネル活性が抑制されていることが明らかとなった。またピロリ菌毒素ペプチドVacAの投与によって外来性アニオンチャネルの導入を行う細胞容積が回復し、ネクローシス死もかなり救済された。以上より、乳酸アシドーシスによるネクローシス死の誘導にVSOR C1^-チャネル抑制が関与していることが結論された。第2に、上皮細胞アポトーシス誘導におけるC1^-チャネルの役割を調べた。ミトコンドリア仲介性刺激、死レセプター仲介性刺激のいずれによるアポトーシス誘導によっても、ヒト上皮HeLa細胞は、その初期に発生するアポトーシス性容積減少(AVD)に対応してVSOR C1^-チャネルの活性化を示すことが明らかとなった。ミトコンドリア仲介性刺激の場合には、その活性化シグナルは活性酸素種ROSであることも明らかにした。VSORブローカーやROSスカベンジャーによってAVDの発生を阻止すると、アポトーシス死も救済されることが明らかとなった。以上により、アポトーシス死の誘導にもVSOR C1^-チャネルが大きな役割を果たすことが結論された。第3に、ニューロンのグルタミン酸過興奮毒性におけるC1^-チャネルの役割を調べた。大脳皮質ニューロンをNMDAで過興奮刺激すると、細胞体膨張と樹状突起varicosity形成が見られた。このときVSORチャネルの活性化が見られた。これが持続するとネクローシス死におちいるが、VSORブロッカーで膨張及びvaricosity形成を抑制すると、ネクローシス死も著しく救済されることが明らかになった。以上により、ニューロンの過興奮毒性ネクローシス死誘導にVSOR C1^-チャネルが関与することが結論された。Cl^-チャネルは、神経や筋肉などの興奮性細胞においては(多くは興奮性を抑制して膜を安定化するという)"バックグラウンド"的役割を果している。また上皮細胞においてはNaClと水の分泌・吸収機能に直接的に関わっている。最近、細胞容積の調節や、細胞増殖や細胞分裂や細胞分化にもCl^-チャネルは本質的な役割を果していることが明らかにされはじめている。本研究では、これらの機能に加えて、Cl^-チャネルの新しい一般生理学的機能として細胞死誘導機能があることを明らかにしたい。本年度は、グリア及び神経系細胞の乳酸アシドーシス性のネクローシス死の誘導と容積感受性Cl^-チャネルの関係を調べた。脳虚血においては嫌気的解糖反応の亢進によって、乳酸の蓄積と一体となったアシドーシスが伴われて、その結果、ニューロンやグリア細胞が膨張して脳腫脹がもたらされ、容積が調節されることなく膨張し続けて、それらはネクローシス死にいたるからである。実際に膨張後の容積調節に関与することの知られている容積感受性Cl^-チャネルの全細胞電流を記録すると、アストロサイト由来のC6細胞でも、神経分化後のNG108-15細胞でも乳酸アシドーシス下では細胞内酸性化が原因で著しく抑制されていることが明らかになった。