hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
空間的な分布を持つ機微情報への差分プライバシー基準に基づく情報秘匿手法の評価

具体的には,その安全性から現在注目を集めている「差分プライバシー」と呼ばれるプライバシー保護基準に基づく処理手法の実用性を向上させる手法の研究を行う.差分プライバシーは,集計データにプライバシー保護のための処理を施した処理後のデータ群の中に,ある人のデータが含まれるか否かを判別することが困難であること(判別困難性)に基づいたプライバシー保護基準である.差分プライバシーを実現する代表的な手段として,各データに平均値が0のLaplaceノイズを付加する「Laplaceメカニズム」が用いられる.ここで対象とする実用性向上のポイントは,このLaplaceメカニズムにおける「無矛盾性の向上」「部分和精度の向上」「計算量の抑制」である.平成28年度の期間中には,年度予定に従って,平成27年度に収集したデータ,ならびに,作成したプログラムを使用して,計算機シミュレーションにより, “Top-down精緻化を伴うPrivelet法"の基本的な性質の評価を行った.具体的には,まず,比較評価の計画策定,ならびに,予備実験を実施した.次いで,シミュレーションのための計算機環境の再整備と,シミュレーションに適したデータ形式への,データの再加工・変換を実施した.さらに,整備した計算機環境とデータを用いて, Top-down精緻化を伴わないPrivelet法や,Top-down精緻化を伴うPrivelet法など,複数のプログラムの特性についての比較評価を,シミュレーションにより実施した.そして,評価結果についての学会発表を実施した.平成28年度の研究計画では,27年度に作成したデータベース,ならびに,プログラムを使用して,計算機シミュレーションにより,二分木型のデータ構造を対象にしたTop-down精緻化を伴うPrivelet法の基本的な性質の評価を行うことを予定しており,この計画に基づいて研究を進めた.具体的には,プログラムを人口データに作用させて,処理結果(出力値)の性質や傾向についての比較評価を行った.Top-down精緻化処理を組み込んだPrivelet処理プログラムによって秘匿処理が施された出力データの誤差量を,特徴の異なる複数エリアのデータを用いて比較した.実験対象エリアとしては,人口密集地を含む「関東エリア」,人口密度が低い「北海道エリア」,その中間程度に位置する「四国エリア」を採用した.評価実験から,人口空白地点数が増加するのに伴ってTop-down精緻化の効果が顕著となり,誤差量が抑制される傾向が確認できた.さらに,部分和の精度に関しては,小領域の部分和においてTop-down精緻化の効果が顕著となり誤差量が大きく抑制される傾向などが確認された.なお,本評価実験により得られたところの, Top-down精緻化処理が,(1)誤差量に対する抑制効果を有すること,(2)ゼロデータが多いスパースなデータほど誤差量に対する抑制効果が大きいことなどといった結果は,平成28年度電気・情報関係学会北海道支部連合大会にて発表を行った.本研究は,人に関わる集計データのプライバシーを保護し,かつ,有用性と処理効率を向上させる手法の開発を目指したものである.
癌促進的微小環境を標的とした膵癌内視鏡的治療法の開発

本邦において2006年2008年に診断された膵癌患者の5年相対生存率は7.9%と報告されている。この生存率はあらゆる癌種の中で最も低く、20%を下回るのは膵癌のみである。19931996年に診断された膵癌例の5年相対生存率は6.5%であり、様々な診断法や新しい抗がん剤が開発されてきた10年の時を経ても、生存率に大きな改善はみられていない。罹患数も増加傾向にあり2015年には39000人、死亡数もほぼ同数の33000人と推測される。その原因として、早期発見が困難であるとともに、進行癌に対する有効な治療法がないことが挙げられる。従って、膵癌患者の予後を改善するためには進行例に対する画期的な治療法を開発することが急務である。膵癌は周囲に豊富な間質を伴うことが多く、癌と間質細胞の相互作用によって癌が進展すると考えられている。癌細胞は酸素が充分にある状態でも、酸化的リン酸化ではなく解糖系によってエネルギーを得ることがWarbrug効果として古くから知られている。しかし、最近抗がん剤耐性や転移を示すような悪性度の高い癌細胞は、通常の癌細胞とは異なり、解糖系ではなく酸化的リン酸化によってエネルギーを得ている可能性が示唆され始めている。本年度は、膵癌で酸化的リン酸化に関係すると考えられる遺伝子Xを同定し、その解析を行った。遺伝子Xをノックダウンすると、ミトコンドリアによる酸素消費速度が増加した。さらに、Xタンパクを阻害する候補化合物を同定し、解析中である。順調に進んでいる新たに同定した酸化的リン酸化に関わる遺伝子Xの会合タンパクを同定して、詳細な機能解析を行う。私たちは間質におけるPOSTN発現が膵癌代謝や免疫をコントロールする重要な分子であると考え、POSTNを制御している、あるいはその標的となって癌促進的な微小環境の構築に関与するmiRを同定し、そのmiRを治療標的とすることを着想した。本年度は、膵癌発がんモデルマウスの作成を行った。特に問題なく進行している。順調に進んでいる1) POSTNが膵癌悪性化を促進する分子機構と関連するmiRを網羅的遺伝子解析にて明らかにする;2) POSTNが関与する癌代謝経路をメタボローム解析によって解明する;

3) POSTNが癌免疫機構へ関与しているか、マウス膵癌細胞をPOSTN KOマウスと野生型マウスに移植し、比較検討する;4) POSTN関連miRを標的とした膵癌治療の有効性を多数のpatient-derived xenograft (PDX)と遺伝子改変膵癌マウスモデルを用いて確認する。新たに同定した酸化的リン酸化に関わる遺伝子Xの会合タンパクを同定して、詳細な機能解析を行う。膵癌発がんマウスの掛け合わせにエフォートの大部分を割いたため、予定よりも少額支出となった。次年度以降のマウスの解析に残額を使用する。細胞株を用いた解析を中心に進めたため、当初の予定よりも安価であった。次年度以降はsiRNA,代謝測定キット等が必要になり、費用がかさむ予定である。
組織再生における有核血球細胞の動態解明

血液凝固後の経時的な遺伝子発現変化の解析を継続して行ってきた。無尾両生類であるアフリカツメガエルを用いて行ったこれまでの研究をもとに、近縁種であるネッタイツメガエルでも同様の遺伝子発現変化が生じるのかについて解析を進めている。両生類の中でも高い組織再生能力をもつ有尾両生類を用いた解析を行うためには、遺伝子配列情報を得る必要があった。しかし、イモリはゲノムサイズが大きいなどの理由で、研究の基盤となる遺伝子配列情報がほとんど整備されていなかった。有尾両生類であるイベリアトゲイモリは、日本の研究者が中心となって、飼育システムの確立、近交系の確立、高効率のゲノム編集法の開発など研究基盤の構築が進められており、実験室での飼育や繁殖が容易な新しいモデル生物として注目されている。そこで、国内の複数の研究機関と共同して、様々な試料から抽出したRNAをもとに網羅的な遺伝子配列情報を得た。その成果は国際誌に発表するとともに、得られた遺伝子配列情報はポータルサイト“iNewt"(http://www.nibb.ac.jp/imori/main/)で公開しており、世界中の研究者が自由に利用することが可能となっている。この他、細胞の挙動をリアルタイム観察するための方法として、ウイルスベクターによる蛍光タンパク質遺伝子の導入を検討した。培養細胞株や初期胚を用いて検討したところ、細胞の種類によって遺伝子導入効率がかなり異なることがわかってきた。血球細胞種によってはウイルスベクターによる遺伝子導入が効率的に行えない可能性もあるため、細胞を標識する手法について更に検討を進める必要がある。昨年度に引き続き「血液凝固時の経時的遺伝子発現の網羅的解析」、「各種血球マーカーの探索」を継続して進めている。血球細胞の挙動をリアルタイム観察するための手法の開発が遅れているが、研究計画全体はおおむね順調に進展しているといえる。血液凝固反応のあと経時的に発現が変化する遺伝子群についてパスウェイ解析などを進めることで、血球細胞にどのような変化が起こっているのか解析するとともに、ネッタイツメガエル・アフリカツメガエル・イベリアトゲイモリなど両生類間での比較解析を進める予定である。引き続き、マーカー候補遺伝子やレクチンマーカー等の探索を進める。それぞれの両生類において、各血球細胞を高精度で分取することができれば、マーカーの探索がより効率的に行える可能性があるため、アフリカツメガエルで新たに報告された手法を他の生物種へ適用できるか検討したい。ゲノム編集技術を用いてマーカー遺伝子にレポーターを導入する、蛍光標識したレクチンで生染色する、血球細胞を選別後に蛍光遺伝子等を導入する、などの方法により血液凝固後の各種血球細胞の挙動をリアルタイム観察することを目指している。同定した血球マーカー候補遺伝子が生体内でどのような役割を果たしているのかについても研究を進めたい。組織が損傷を受けた際、最初に起こる重要な生理反応が止血である。止血の際に形成される血餅には血小板と多くの赤血球がトラップされる。哺乳類以外の生物では、血小板の役割を果たす栓球と赤血球が有核であることから、無核である哺乳類とは異なる生理反応を示す可能性が考えられる。アフリカツメガエルを用いて行ったこれまでの研究から、採血直後の血液試料と血液凝固後1時間経過した血餅試料の間で多くの遺伝子の発現量が変化していることを見出していた。本研究では、血液凝固後の経時的な遺伝子発現変化を明らかにするため、凝固反応後1ー5時間の血餅試料を回収し、マイクロアレイを用いて網羅的な解析を行った。その結果、血液凝固後に上昇する遺伝子のセットが時間を追うごとに大きく変化していることがわかってきた。血液凝固反応がそれぞれの細胞にどのような変化をもたらすのか明らかにするためには、各血球細胞種の動態を追跡する必要がある。両生類の血球細胞に関してはまだ情報が十分とは言えず、細胞の種類によってはマーカー遺伝子すらよくわかっていない。密度勾配遠心法やフローサイトメーター等を用いて、各血球細胞を分取する方法の最適化を進めてきた。現在、一部の血球細胞に関するマーカー候補遺伝子の解析を進めている。細胞を分取する手法が確立した段階で網羅的遺伝子発現解析を行い、その結果に基づいてマーカー遺伝子を選定する。糖鎖構造も血球を区別する重要な要素となることから、各血球細胞の表面糖鎖構造を認識して特異的に結合するレクチンの選定も進めている。本年度計画していた、「血液凝固時の経時的遺伝子発現の網羅的解析」、「各種血球マーカーの探索」、これらすべてを実施した。血液凝固後時間を追って発現が変化する遺伝子群を明らかにした。遺伝子発現変化の生理学的意義について今後解析を進める。また、血球細胞に発現する新規因子を同定した。現在、どの細胞種に発現しているのか詳細な解析を進めている。各血球細胞を正確に分取する方法の最適化に時間を要しているが、研究計画全体はおおむね順調に進展しているといえる。

有尾両生類であるイベリアトゲイモリは、日本の研究者が中心となって、飼育システムの確立、近交系の確立、高効率のゲノム編集法の開発など研究基盤の構築が進められており、実験室での飼育や繁殖が容易な新しいモデル生物として注目されている。そこで、国内の複数の研究機関と共同して、様々な試料から抽出したRNAをもとに網羅的な遺伝子配列情報を得た。その成果は国際誌に発表するとともに、得られた遺伝子配列情報はポータルサイト“iNewt"(http://www.nibb.ac.jp/imori/main/)で公開しており、世界中の研究者が自由に利用することが可能となっている。この他、細胞の挙動をリアルタイム観察するための方法として、ウイルスベクターによる蛍光タンパク質遺伝子の導入を検討した。培養細胞株や初期胚を用いて検討したところ、細胞の種類によって遺伝子導入効率がかなり異なることがわかってきた。血球細胞種によってはウイルスベクターによる遺伝子導入が効率的に行えない可能性もあるため、細胞を標識する手法について更に検討を進める必要がある。昨年度に引き続き「血液凝固時の経時的遺伝子発現の網羅的解析」、「各種血球マーカーの探索」を継続して進めている。血球細胞の挙動をリアルタイム観察するための手法の開発が遅れているが、研究計画全体はおおむね順調に進展しているといえる。ネッタイツメガエルは2010年、アフリカツメガエルは2016年にゲノムが解読された。これらの情報を元に新たに設計したプローブを搭載したマイクロアレイの作製を進めている。今後は新しいマイクロアレイチップを用いて遺伝子発現変化やマーカー候補遺伝子の探索を進めるとともに、ネッタイツメガエル・アフリカツメガエルなど両生類間での比較解析も検討している。血液凝固反応のあと経時的に発現が変化する遺伝子群についてパスウェイ解析などを進めることで、血球細胞にどのような変化が起こっているのか全体像の把握に努める。また、同定した血球マーカー候補遺伝子が生体内でどのような役割を果たしているのかについても研究を進める。近年目覚ましい発展を遂げているゲノム編集技術を用いてマーカー遺伝子にレポーターを導入する、蛍光標識したレクチンで生染色する、血球細胞を選別後に蛍光遺伝子等を導入する、などの方法により各種血球細胞の挙動をリアルタイム観察することを計画している。組織損傷後もっとも初期におこる生理反応の一つが止血機構である。ラベルした血球細胞を止血反応後経時的に回収して遺伝子発現解析を行い、血液凝固反応を伴う創傷治癒の過程において各血球細胞がはたす役割を明らかにしたい。血液凝固反応のあと経時的に発現が変化する遺伝子群についてパスウェイ解析などを進めることで、血球細胞にどのような変化が起こっているのか解析するとともに、ネッタイツメガエル・アフリカツメガエル・イベリアトゲイモリなど両生類間での比較解析を進める予定である。引き続き、マーカー候補遺伝子やレクチンマーカー等の探索を進める。それぞれの両生類において、各血球細胞を高精度で分取することができれば、マーカーの探索がより効率的に行える可能性があるため、アフリカツメガエルで新たに報告された手法を他の生物種へ適用できるか検討したい。
構造規制表面におけるソフトナノリソグラフィと分子集積を利用した光機能創発

本研究では、1トップダウン的な手法による有機分子層のナノドメイン化と2ボトムアップ的な分子積層技術それぞれを確立し、両者を組み合わせた分子集積構造作成に関する技術開発を行うことで、単一分子では発現しない機能性が分子集積によって発現する可能性について検討を行ってきた。1については、チオール分子の単層膜における電気化学還元脱離と金ナノ粒子の単分子層表面への吸着に伴う電気2重層の空間変調を組み合わせて、ナノサイズの分子層ドメインを電極表面に構築する手法について詳細な検討を行った。その結果、分子層ナノドメインのサイズが本手法で制御可能であることが確かめられた。分子層ドメインサイズによって分子集合体に協奏的に発現する機能性の制御が期待される。また、2については、有機単分子膜上に金属錯体を配位結合によって固定する積層法に関して、様々な有機分子層を用いて系統的に検討を行い、分子集積法の基盤技術を確立した。分子集積による機能性発現については、昨年度に見出した金電極上の有機単分子膜における特異な電気化学応答について、更なる検討を加えた。金基板の面方位によって有機単分子層の分子密度を変え、電気化学電位による基板ー分子間相互作用の変調によって駆動される分子膜構造の変化をラマン観測した。その結果、分子密度の高い時にだけ、特異な分子構造変化(2面角変化)が発現することが明らかになった。また、基板表面が原子・分子レベルで構造規制されていない粗表面では、このような電極電位に依存した2面角変化は全く確認されず、分子間相互作用によって発現する分子集積構造に特有の現象であることが確かめられた。以上のことから、分子間相互作用を適切に制御した分子ナノドメインにおいては、単一分子とは異なる性質を創発でき、精密な分子集積によってその機能を設計できる可能性が示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、(1)ナノ電極における特異な電気2重層構造を利用して、有機分子層をナノサイズで2次元パターニングする新規ソフトナノリソグラフィ手法の開発、(2)配位結合による機能性分子多層化技術の確立をめざし、これらトップダウン法とボトムアップ法の融合により、個々の単一分子には見られない性質が分子集合体に発現する機能創発を目的とした研究を行っている。本年度は、主に(2)の配位結合による分子積層法の検討を行った。原子レベルで平滑な金電極表面上に、積層膜の土台となるイミダゾール末端のアルカンチオール単分子膜を作成し、その上に金属ポルフィリンとピラジンを配位結合によって交互積層するこどに成功した。この結果は、様々な機能性分子を自在に組み合わせた分子集積構造を構築する技術として有用であり、分子集合体としての機能発現の設計に利用できると期待される。また、本手法によって集積した金属ポルフィリン層において、単層膜と積層膜で電気化学応答に違いが現れることを確認し、単一分子とは異なる性質が分子集合体に発現する可能性を見出した。また、(1)の2次元パターニング技術についても基礎的な検討を行い、さらに分子間相互作用に着目した機能創発の可能性についての検討を行った。電極表面に吸着した有機単分子層においては、分子間相互作用と基板-分子間相互作用のバランスを電気化学的に変えることが可能であり、その結果として単分子膜配向が変化する場合がある。外部からの電場印加によって単分子膜配向を変化させ、分子間の立体障害を利用して分子膜構造を動的に制御する試みにおいて、分子膜構造のin situ表面増強ラマン散乱測定から、分子コンダクタンスの制御に繋がる分子の平面性操作の可能性を示唆する結果を得た。これらは単一分子では発現しない機能を集合体として創発する例として期待される。

研究計画に従って、分子の積層膜構造を構築する手法の確立を行った。その結果、分子単体と積層構造体で異なる電気化学応答を示すことを見出し、分子の単一機能ではない集合体としての機能創発の可能性を示すことに成功したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究においては、電極表面2次元面内における分子パターニング技術を発展させ、分子ナノドメイン構造の作成による機能創発を目指す。これまでに、分子層上に金属ナノ粒子を吸着させることで金属ナノギャップ構造を形成し、電気化学環境下における電気2重層が大きく変調することで、有機単分子層を位置選択的に剥離できることを見出している。この技術を利用し、アゾベンゼンの単分子膜のナノドメイン化を検討する。アゾベンゼンの光誘起構造転移において、分子間の立体相互作用の影響を調べ、分子集合体において光強度に対して非線形な応答が発現するかどうかを調べる。また、分子間相互作用と基板-分子間相互作用のバランスを変えることで単分子膜配向を変えられることを利用し、分子集合体における創発的機能を外場制御することを試みる。例えば、分子間の立体障害と分子膜配向の動的制御を利用し、単分子膜のコンダクタンスを動的制御する可能性について検討する。
界面特性の異なる高密度ＤＮＡブラシを担持したナノ粒子の創製と細胞との相互作用評価

本課題では,比較的短い( 50 bp)DNA二重鎖が固体表面にブラシ状に集積して形成されるDNAブラシ界面に関して,その表層構造の僅かな差に連動して変化する界面特性を表すためのパラメータ,およびその評価法の探索を目的とし研究を行った.シリコンカンチレバーを用い,周波数変調AFM(FM-AFM)法によってDNAブラシ層の垂直方向を走査しX-Z断面図を得たところ,DNAブラシ最表層の僅か一組の塩基対の構造の差(マッチorミスマッチ)が明瞭にdf断面分布に反映されることがわかった.申請者は,これまでの研究において,ナノ粒子表面にDNA二重鎖がブラシ状に集積して形成されるDNAブラシの界面特性が,最表層から約1ナノメートルの厚さの空間内における塩基対構造を反映して変化することを報告してきた.本年度の検討においては、末端近傍に導入されたACミスマッチが,pH 5-6程度の弱酸性条件においてプロトン介在型の非天然塩基対(A+-Cペア)を形成することがトリガーとなり,DNAブラシの界面特性が変化する現象を当該ナノ粒子の分散安定性の変化から新たに見出した.一方で,DNAブラシの界面特性を議論するにあたり,DNAブラシの「どのような」特性値が,末端近傍の塩基対構造に依存して「どれだけ」変化したかのを定量的に表すパラメータが,これまでの検討において欠如していた.この点に鑑み,表層構造の異なる数種類のDNAナノ粒子に対し,電気泳動移動度を測定し,Oshima-Healy-Whiteの近似式へフィッティング解析することで,DNAブラシ界面の柔らかさのパラメータを得ることを前年度より継続して検討した.しかしながら,本研究で対象とするDNAナノ粒子分散液のイオン強度が比較的高く,電気泳動中に発生するジュール熱や水の電気分解に起因するノイズ成分の影響を排除することが極めて困難であったため,このアプローチによるパラメータの獲得は断念した.そこで電気泳動法に依存しないDNAブラシの界面特性を評価する手法として,微小プローブによってDNAブラシ界面を走査し,力学的特性に関する情報を収集するナノ力学計測の適用を新たに検討した.その結果,DNAブラシ表層の僅か一組の塩基対の構造の差(マッチorミスマッチ)を界面構造の柔軟性(剛直性)の差として検知可能であることが示され,ナノ力学計測によるパラメータの取得が今後,DNAブラシの界面特性の定量的評価において有望であることがわかった.本課題では,比較的短い( 50 bp)DNA二重鎖が固体表面にブラシ状に集積して形成されるDNAブラシ界面に関して,その表層構造の僅かな差に連動して変化する界面特性を表すためのパラメータ,およびその評価法の探索を目的とし研究を行った.シリコンカンチレバーを用い,周波数変調AFM(FM-AFM)法によってDNAブラシ層の垂直方向を走査しX-Z断面図を得たところ,DNAブラシ最表層の僅か一組の塩基対の構造の差(マッチorミスマッチ)が明瞭にdf断面分布に反映されることがわかった.本課題は,ナノ粒子表面に形成したDNAブラシの界面特性が,培養細胞との相互作用に及ぼす影響を評価することを目的とするものである。これまでに申請者は,ナノ粒子上に形成されたDNAブラシの界面特性が,最表層から約1ナノメートルの厚さの空間内における塩基対構造(3塩基対分に相当)を反映して変化することを報告してきたが,界面特性の評価は定性的なものであった。そこで今年度は,界面構造の異なるDNAブラシを担持したDNAナノ粒子を数種類調製し,各々のDNAブラシの界面特性の物理化学的手法による定量化,すなわちDNAブラシ界面の構造ー物性相関を議論するための定量的指標の確立を目標とし研究を開始した。ブラントエンド,ダングリングエンド,ターミナルミスマッチ,ターミナルバルジなど,様々な界面構造のDNAブラシ層を有する金ナノ粒子(粒径:40ナノメートル)を調製した。Oshimaらにより提案されている,表面に透水性の高分子層を有する粒子の電気泳動挙動に関する理論式をもとに,ナノ粒子上のDNAブラシの“柔らかさ"(1/r値)の定量化を試みた。検討を開始した当初は,当該ナノ粒子の電気泳動挙動をキャピラリー電気泳動法により評価することを試みたが,高イオン強度条件における水の電気分解の影響を排除して電気泳動移動度を正確に評価することが困難であることが判った。現在,代替法として,高イオン強度に対応した電極系を採用した電気泳動光散乱装置を用いレーザードップラー法による評価を検討中である。また,従来検討を行ってきた金表面以外にも,窒化シリコン(SiN)基板表面へDNAブラシ層を高い再現性で構築する手法を確立し,表面・界面解析法の適用範囲を拡張することに成功した。研究計画のとおりブラントエンド,ダングリングエンド,ターミナルミスマッチ,ターミナルバルジなど,様々な界面構造のDNAブラシ層を有する金ナノ粒子(粒径:40ナノメートル)を設計し,そのライブラリーを構築することができた。表面に透水性の高分子層を有する粒子の電気泳動挙動に関するOshimaらの理論をもとにナノ粒子上のDNAブラシの“柔らかさ"(1/r値)の定量化に着手した。今年度の検討では,当該ナノ粒子の高イオン強度下における電気泳動挙動の評価が計画していた分析法で困難であることが判ったが,装置や測定法の改良により克服できるものと考えている。また,界面動電現象に依存しない界面特性評価に着手するため,反射干渉分光などで使用されるSiN基板上へDNAブラシ層を高い再現性で構築する手法を確立することに成功した。

一方,計画立案当初に想定していなかった成果も,本研究課題の遂行に付随して得られている。界面にチミンーチミンおよびシトシンーシトシンミスマッチ部位を有するDNAブラシ担持金ナノ粒子の分散安定性が,Hg(II)とAg(I)の2種類の金属イオンの組み合わせによって“論理的"に変化することを偶然見出し,新しい分子ロジックゲートの動作原理として投稿論文にまとめることができた。以上の理由より,本計画研究はおおむね順調に進行していると判断した。前年度から引き続き,DNAブラシ担持金ナノ粒子ライブラリーに対しOshimaらの理論に基づく電気泳動移動度解析を試み,DNAブラシの界面特性の定量化を検討する。一方で,電気泳動法に依存しないDNAブラシの界面特性評価に関する検討,具体的にはSiN基板上に形成したDNAブラシの反射干渉分光法による特性解析に取り組む。本年度の研究計画遂行過程において,研究計画立案時に想定していなかった困難に直面し,その対処・解決策の検討に予想以上の時間が掛かってしまったため,以降の段階で使用を計画していた設備備品の導入が大幅に遅れ,平成24年度未使用額が生じた。現在直面している困難を克服し,研究計画を遂行するための対応策は複数案準備しており,次年度では見通しが立ち次第,平成24年度未使用額分で導入が遅れている設備備品を出来る限り速やかに導入する予定である。また,その他の研究費は研究の遂行上必要となる物品・試薬の購入,および研究成果の発表に使用する計画である。
低酸素センサー/低酸素誘導因子1システムが炎症の進展に果たす役割の探求

hypoxia-inducble factor 1(HIF-1、低酸素誘導性因子1)が炎症の場において骨髄系細胞の成熟、機能に与える影響を本申請の期間内に明らかにすることが本研究の目的であった。計画に則り研究を遂行し以下のような結果を得た。1.ヒト単球THP-1(酸化LDL、PMA刺激などにより活性化を受けてマクロファージ様の性質をおびる)を分化因子で処理しマクロファージに分化誘導しその前後でHIF-1の活性化の程度を測定したところ、HIF-1は分化の程度と相関して活性化することが明らかになった。ただし分化過程はHIF-1の活性誘導には依存しないことが判明した。この活性化の機序は、低酸素誘導性のHIF-1の活性化とは異なることも同時に判明した。この研究成果は、公刊が受理され現在印刷過程にある。2.THP-1をLPS、TNF-α、IL-1βなどの炎症性物質で処理してHIF-1の活性化を測定したところマクロファージに分化したTHP-1をLPSで処理した場合にのみ顕著なHIF-1の活性化が観察された。またこの現象の分子機序の一部には活性酸素が関与していることを明らかにして関連学会の報告と共に論文としてとりまとめ投稿し現在審査中である。3.ケモカインの一種であるSDF-1がCXCR4依存的にHIF-1の活性化をもたらすことを明らかにした。以上の研究結果は、関係学会で口頭発表するとともに、一部は専門誌に公刊した。hypoxia-inducble factor 1(HIF-1、低酸素誘導性因子1)が炎症の場において骨髄系細胞の成熟、機能に与える影響を本申請の期間内に明らかにすることが本研究の目的であった本年度は計画に則り研究を遂行し以下のような結果を得た。2.THP-1をLPS,TNF-a,IL-1bなどの炎症性物質で処理してHIF-1の活性化を測定したところマクロファージに分化したTHP-1をLPSで処理した場合にのみ顕著なHIF-1の活性化が観察された。またこの現象の分子機序の一部には活性酸素が関与していることを明らかにした。hypoxia-inducble factor 1(HIF-1、低酸素誘導性因子1)が炎症の場において骨髄系細胞の成熟機能に与える影響を本申請の期間内に明らかにすることが本研究の目的であった本年度は昨年度の成果を元に計画に則り研究を遂行し以下のような結果を得た。1.ヒト単球THP-1(酸化LDL、PMA刺激などにより活性化を受けてマクロファージ様の性質をおびるを分化因子で処理しマクロファージに分化誘導しその前後でHIF-1の活性化の程度を測定したとろ、HIF-1は分化の程度と相関して活性化することが明らかになった。ただし分化過程はHIF-1活性誘導には依存しないことが判明した。2.THP-1をLPS, TNF-a, IL-1bなどの炎症性物質で処理してHIF-1の活性化を測定したところマクファージに分化したTHP-1をLPSで処理した場合にのみ顕著なHIF-1の活性化が観察された。

またの現象の分子機序の一部には活性酸素が関与していることを明らかにして関連学会の報告と共論文としてとりまとめ投稿し現在審査中である。3.ケモカインの一種であるSDF-1がCXCR4依存的にHIF-1の活性化をもたらすことを明らかにした。
地盤振動を利用した土石流警報ロボットに関する研究

桜島をシンボルとする鹿児島県では、台風や集中豪雨の時期になると、土砂災害が頻発し、毎年、大きな社会問題となっている。とりわけ、尊い人命が失われることの多い土石流は山間過疎地で発生することが多く、その警報及び避難のためには、色々な問題点を克服する必要がある。従来、警戒避難情報としては、雨量に重きをおいてきたが、本研究では実際の土砂や巨礫の流動に伴って生じる地盤振動の信号情報を利用した。土石流を擬似的に発生きせるバイブロプレートを用いた屋外走行実験を行い、検証した。地盤振動は桜島野尻川で得た周波数帯(50-100Hz)と同じであり、土石流の検出・検定作業に適切であることが判明した。土石流の検知動作回路部は密閉型の防塵耐湿ボックスに入れ、小型化し、現地設置用に改良し、一体型ロボットを製作し、国土交通省大隅河川道路事務所の協力を得て、現在活動中の桜島南側水系の野尻川の五号ダム上流地点にて設置を試みた。桜島の現場で、携帯電話は2つの経格(DoCoMoとWILLCOM)での双方向通信を行い、検証した。地形の起伏によって、電波の強弱が発生、外部アンテナや電波増幅用のケースを利用しながら、適宜、流域ごとに電波状況を改善する必要性があることが判明した。迅速な情報伝達及び維持管理のためには双方向通信が不可欠であることを確認した。更に、無線LAN経由での監視カメラの遠隔操作を実現した。今後は、土石流警報ロボットとしての動作の安定性の向上、及び具体的な観測データの集積と実証が課題となった。桜島をシンボルとする鹿児島県では、台風や集中豪雨の時期になると、多くの土砂災害が頻発し、尊い人命が失われ、多大な社会的損失が発生している。土石流警報のあり方には色々な問題点が指摘されている。従来、避難情報としては、雨量に重きをおいていた。これらの問題の解決策として、本研究では地盤振動センサーの信号情報を利用し、土石流災害を最小限に食い止めることのできる土石流警報ロボットの開発を行う。本研究は3カ年計画の初年度である。全体構想を再検討し、監視カメラ及び地盤振動センサーに関して、根幹となるシステム開発を行った。その内容を列挙すると、(1)屋外で土石流実験装置を完成後、流動体として数種類の玉石を転動したシミュレーション実験を行った。(2)振動センサーを3種類用い、性能の比較検討を行った。(3)地盤振動センサーからの膨大なデータは電圧の時系列変動の形で送出される。平均化プログラムを作成し、基盤回路への組み込み、無線LANに転送することに成功した。(4)指向生無線LAN経由を用い、監視カメラ及び地盤振動のデータ通信を行うことが可能になった。(5)警報ロボットに使用する太陽電池とバッテリーの性能試験を行った。次年度では、振動センサー(Geophone等)及び雨量センサーのデータを、各個人の携帯電話へデータ転送するシステムを開発する。更に、防塵耐湿を考慮に入れ、桜島において設置可能な地盤振動ロボットの製作、動作検証を行う予定である。本研究は3カ年計画の2年目で、本年度の主要な成果は下記のようである。

桜島の現地設置では、土石流の規模と土石流の検知センサーの応答を検定作業が必要となったため、土石流を擬似的に発生させるためにバイブロプレートを用いた屋外走行実験を行い、検証した。地盤振動は桜島で得られた50100Hzと同じの周波数帯であり、土石流の検出・検定作業に適切であることが判明した。海外の土石流観測での検知センサーとして、音響センサーやジオフォンを採用している例が多いことが分かったため、加速度センサーとの比較検証を行った。音響センサーはデータ収集が複雑、動作不安定であった。ジオフォンは、地盤振動に対する応答感度及び周波数特性は良好であったが、速度センサーのため土石流規模の推定には動作不安定となり、信号ケーブルの延長も困難で現場設置には難しい。土石流の検知動作回路部は密閉型の防塵耐湿ボックスに入れ、小型にし、現地設置用に改良した。監視プログラムは、一定時間間隔で、監視用画像カメラの映像・雨量及び土石流の振動レベルのデータを、コンピュータ端末で表示可能なものへ改良を加えた。土石流警報ロボット開発の最終年度として、本研究で開発をすすめてきた一体型のロボット2号機を、国土交通省大隅河川道路事務所の協力を得て、桜島火山の野尻川の五号ダム上流地点に設置した。とくに屋外現場における高温・多湿の状況下における検知センサーの動作の安定性、維持管理上の通信回線等の問題点について検証、ロボットの実用化を検討した。昨年度、現場土石流による地盤振動について、既往の観測されたデータを使って模擬的に再現した結果、住民の避難のためには、監視カメラによる画像・雨量強度の監視データ及び土石流による地盤振動データの計3つの情報が必要であることを確認した。迅速に同時に伝達し、維持管理のためには双方向通信が不可欠であることを理解した。採用した無線LAN経由での監視カメラの遠隔操作を実現した。設置現場では噴煙や天候の状況に左右される問題が生じ、準備した太陽電池によるバッテリー充電のみでは不十分な結果となった。暫定的に、観測所からの商用電源をロボットに供給し運用を継続した。今後、省電力型無線LAN採用の検討が必要である。携帯電話の採用は2つの経路(DoCoMo社とWILLCOM社)で双方向通信を確認し、地形の起伏による電波の強弱が発生、外部アンテナや電波増幅用のケースを利用し、適宜、各流域ごとに電波状況を改善していく必要性もあることが分かった。地盤振動データについては、高速演算回路を基板に組み込み、35秒間隔で、振動の大きさと振動周波数を送信することが可能になり、実用化が進展した。今後は、警報ロボットとしての動作の安定性を高めること、具体的な観測データの収集と実証が課題である。
子供のための物語創作支援システムの構築

近年,コンピュータを子供の教育支援に利用する試みが盛んである.例えば小さな子供が音楽や物語の創作をより簡単かつ楽しみながら行える環境を提供するシステムが提案されている.本研究では,幼稚園児から小学生低学年向けの物語創作支援システムの構築を目的とする.物語の題材として絵を使用し,システムは絵から考えられる物語の文章を提案し,対話を繰り返すことで物語創作を支援する.絵には物語に対する想像を膨らませ理解を容易にする効果があるため,絵を使用した物語創作支援システムがいくつか提案されている.しかしながら,これらのシステムは,物語創作を創発する絵の並びを提供するのみであり,物語の文章は全て子供が記入する必要がある.これは文章をある程度書けるレベルの子供の支援を目的としているためである.一方,本研究では小学校低学年や幼稚園児などの文章を書く能力が未熟な子供のために題材とする絵から考えられる物語文の候補を提供することで物語創作を支援することを目的としている.システムはコンピュータ上で実行されるソフトウェアである.まず子供はマウスを使って登場人物や物を背景に貼り付けるといった簡単な操作で絵を作る.合計4枚の題材となる絵を作る.システムはそれぞれの絵から考えられる物語文を子供に提示し,その中から自分の作りたい物語に合った文を選択して物語を完成させる.なお,必要な文が提示されていない場合は大人がキーボードを使って代わりに文の入力操作を行う.6歳から9歳の保育所年長組から小学校3年生の男女8名に本システムを利用して物語を1つ作ってもらい,アンケートを行った.全被験者が自分の作った物語に満足しており,物語創作が楽しかったと答えている.以上のことから本研究は小さな子供の物語創作意欲の向上と,文章作成能力,創造性の向上に結びつく.本申請では、子供のための物語創作支援システムの構築に取り組んでいる。まず、研究のアイデアを第8回日本感性工学会大会で発表し、色々なアドバイスを受けることが出来た。そして、それを踏まえ、システム開発に着手した。まず物語創作のための対話インタフェースを構築した、そして、19代後半から20代前半の被験者にインタフェースを用いて物語創作の実験を行いその成果を国際学会で発表した。子供を対象としていないためシステムの対話手法が異なるが、そのインタフェースデザインに大きな問題はなさそうであったので、子供のための物語創作支援システムのインタフェースもそれに近いデザインとし、開発を行っている。また、絵作成インタフェースがほぼ完成し第20回あいまいと感性ワークショップでデモを見せ、色々な意見をいただいた。現在システムの主要な部分である絵作成インタフェース、物語創作対話インタフェースがほぼ完成しており、今後は被験者実験を行いシステムの有効性を確認する必要がある。実験にあたっては、データーベースの作成を数名に手伝ってもらう予定である。実験は数名の幼稚園年長、小学生低学年の子供に行ってもらい、創作した物語の完成度、システムの使用感について評価を行ってもらう予定である。実験結果は国際会議ISIS07で発表する予定でありextededアブストラクトを投稿中である。なお、本年度は絵を用いた物語創作支援システムという枠組みの新規性と有効性を示すための論文発表を行っている。近年,コンピュータを子供の教育支援に利用する試みが盛んである.例えば小さな子供が音楽や物語の創作をより簡単かつ楽しみながら行える環境を提供するシステムが提案されている.本研究では,幼稚園児から小学生低学年向けの物語創作支援システムの構築を目的とする.物語の題材として絵を使用し,システムは絵から考えられる物語の文章を提案し,対話を繰り返すことで物語創作を支援する.絵には物語に対する想像を膨らませ理解を容易にする効果があるため,絵を使用した物語創作支援システムがいくつか提案されている.しかしながら,これらのシステムは,物語創作を創発する絵の並びを提供するのみであり,物語の文章は全て子供が記入する必要がある.これは文章をある程度書けるレベルの子供の支援を目的としているためである.一方,本研究では小学校低学年や幼稚園児などの文章を書く能力が未熟な子供のために題材とする絵から考えられる物語文の候補を提供することで物語創作を支援することを目的としている.システムはコンピュータ上で実行されるソフトウェアである.まず子供はマウスを使って登場人物や物を背景に貼り付けるといった簡単な操作で絵を作る.合計4枚の題材となる絵を作る.システムはそれぞれの絵から考えられる物語文を子供に提示し,その中から自分の作りたい物語に合った文を選択して物語を完成させる.なお,必要な文が提示されていない場合は大人がキーボードを使って代わりに文の入力操作を行う.6歳から9歳の保育所年長組から小学校3年生の男女8名に本システムを利用して物語を1つ作ってもらい,アンケートを行った.全被験者が自分の作った物語に満足しており,物語創作が楽しかったと答えている.以上のことから本研究は小さな子供の物語創作意欲の向上と,文章作成能力,創造性の向上に結びつく.
樹木年輪の１４Ｃ年代測定の実験室間比較による高精度の暦年代較正データの確立

日本産試料について得られた14C年代を暦年較正データIntCalを用いて較正すると,予想される年代よりも古くなる傾向にある.IntCalが日本産試料に適用できるか否か,さらに日本産試料の14C年代と暦年代との関係を示すデータを増やすために,現代から2000年前に遡る年輪について,高精度の14C年代測定を行った.その結果,日本の樹木年輪の14C年代は,IntCalの対応する14C年代よりも古くSHCal(南半球の試料に適用可能とされる暦年代較正データセット)のそれよりは新しい.日本産樹木年輪の14C年代はIntCalに比べておおよそ2030年古く得られた.日本独自の較正データが不可欠である.日本産試料について得られた14C年代を暦年較正データIntCalを用いて較正すると,予想される年代よりも古くなる傾向にある.IntCalが日本産試料に適用できるか否か,さらに日本産試料の14C年代と暦年代との関係を示すデータを増やすために,現代から2000年前に遡る年輪について,高精度の14C年代測定を行った.その結果,日本の樹木年輪の14C年代は,IntCalの対応する14C年代よりも古くSHCal(南半球の試料に適用可能とされる暦年代較正データセット)のそれよりは新しい.日本産樹木年輪の14C年代はIntCalに比べておおよそ2030年古く得られた.日本独自の較正データが不可欠である.本年度は,屋久杉年輪(西暦97年1551年)について,1年輪の14C測定を進めた.測定が終了した年輪は,602年から1072年である.この結果をIntCa109と比較すると,屋久杉の14C年代はIntCa109が.示す14C年代よりも古い値を示す傾向があることが明らかとなった。これは,これまで歴博などから報告.されてきた結果と同様な傾向である.太陽活動が異常に活発化したときには,太平洋高気圧が強くなり海洋の気団が夏場に日本を広く覆うため,海洋気団の14C濃度の低い大気の寄与が大きく作用するためだと考えられる.日本の複数地点で,このような効果が一般的に見られるか否か,すなわち地理的な効果を調査する必要がある.これについては,単に年輪年代が既知の古い樹木を探すだけではなく,様々な地点から採取される埋没樹木などについて,年輪の14C年代測定を行いIntCa109較正データに対してウイグルマッチングを行ってそのマッチングの有り様を確認することからも研究を進めていく.14C測定実験室間の比較実験については,共通試料を5つの実験室に配布した.試料は屋久杉年輪で,比較的年輪幅が広い箇所で10カ所の年輪について,同一の年輪試料から10mg×5個の試料に分割して,5カ所の実験室に配布した.最終結果はまだ得られていない.また,青森県各地から様々な樹種の現生年輪を採取し14C濃度測定を行った結果,常緑針葉樹と落葉広葉樹との間に明瞭なオフセットを見出した.このことにより,高精度の暦年代較正データを確立するためには,地域的効果以外にも,こうした樹木の種別効果を考慮しなければならない可能性が指摘できる.この点についても,今後さらに詳しく調べる必要がある.さらに,数多くの年輪試料について安定的に高精度の14C年代を得るために,試料調製方法の最適化に向けて試験を行い,半自動で1mg以下の炭素量の二酸化炭素からグラファイトを効率よく合成するための試料調製装置の開発を進めた.これまでに実施した樹木年輪の14C濃度測定は,奈良県室生寺スギ材からAD1617AD1739の年輪,また鹿児島県屋久島産の2本の屋久杉からAD1413AD1615及びAD146AD1072の年輪を選別し,1年輪ごとに14C濃度を測定した.これらの日本産樹木年輪の14C測定によると,日本産樹木の14C年代は,IntCal09が示す14C年代に対して,AD146AD1072の年輪で+24.7±30.4 14C年,AD1413AD1615の年輪で+15.9±22.1 14C年,AD1617AD1739の年輪で+5.3±24.0 14C年ほど古い年代側へのずれが見られた.日本産樹木とIntCal09間の14C年代のずれは,14C年代のばらつきの範囲内ではあるが,日本産の樹木の方がIntCal09に比べて古い14C年代を示すことが明らかとなった.既に,大気の循環により局所的な大気中二酸化炭素の径時的な14C濃度変動が起こることがHua and Barbetti (2007)により指摘されている.

東アジア周辺は,夏季には太平洋高気圧が発達するため海洋気団の影響を受け,逆に冬季にはシベリア高気圧の発達で大陸気団の影響を受ける.南半球の低緯度からもたらされる海洋気団に影響を受けると,その影響を受けて育つ陸上植物の14C濃度は相対的に低くなる.こうして,夏季に太平洋高気圧が異常に発達する気候が数年数十年間継続することがあれば,東アジア地域で生育した陸上植物に,14C濃度が相対的に低い期間が発生しうることになる.日本は北緯30度以北にあるが,夏季には熱帯収束帯(ITCZ)の北端境界付近に位置することになり,上記のような影響を受ける可能性がある.これについては,広く日本各地の樹木年輪の14C年代測定を行いデータを蓄積する必要がある.奈良県室生寺スギ材からAD16171739, AD17901860の年輪,2本の屋久杉からAD72382, AD5891072, AD14131615の年輪を選別し,1年輪ごとに14C濃度を測定した.日本産樹木年輪の14C年代をIntCal09, SHCal04と比較すると測定された暦年代のほぼ全区間に亘って,日本産年輪の14C年代は,IntCal09の14C年代より古く,SHCal04の14C年代よりも新しい.すなわち,日本産樹木の14C年代は,IntCal09が示す14C年代に対して,平均的に,2030 14C年ほど古い年代側へのズレが見られた.また,青森県産アスナロの年輪AD13811449の年輪では+35±22 14C年ほど古い年代側へのズレが見られた.すなわち,北日本の青森県で生育した樹木でも同様にIntCal09よりも古い14C年代を示すことが明らかとなった.東アジア太平洋沿岸に位置する日本では,大気循環により局所的な大気中二酸化炭素の経時的な14C濃度変動が起きている.夏季には熱帯収束帯(ITCZ)の北端境界付近に位置することになり,夏季の太平洋高気圧と冬季のシベリア高気圧の発達に影響を受ける.夏季に太平洋高気圧が異常に発達する温暖な気候が数年数十年間継続することがあれば,日本域で生育した陸上植物に,南方の大気の影響を受けて14C濃度が相対的に低い期間が発生しうる.この観点については,北日本産樹木年輪を用いて検討を進める必要がある.これらの研究成果を,オーストラリアにて2014年1月に開催された第19回年輪年代学国際会議において発表してオーストラリアの研究者と議論し,日本に生育した樹木年輪に記録されている14C濃度はIntCalデータと一致しないこと,14C年代に換算すると,平均的に2030年古い年代を示すことを確認した.これまでに実施した樹木年輪の14C濃度測定は,奈良県室生寺スギ材からAD16171739, AD17901860の年輪,また鹿児島県屋久島産の2本の屋久杉からAD14131615及びAD72382, AD5891072の年輪を選別し,1年輪ごとに14C濃度を測定した.これらの日本産樹木年輪の14C測定によると,日本産樹木の14C年代は,IntCal09が示す14C年代に対して,AD72382の年輪で+26±36 14C年,AD5891072の年輪で+24±30 14C年,AD14131615の年輪で+16±22 14C年,AD16171739の年輪で+5±21 14C年,AD17901860の年輪で+14±22 14C年ほど古い年代側へのずれが見られた.また,青森県産アスナロの年輪AD13811449の年輪では+35±22 14C年ほど古い年代側へのずれが見られた.日本産樹木とIntCal09間の14C年代のずれは,14C年代のばらつきの範囲内ではあるが,日本産の樹木の方がIntCal09に比べて古い14C年代を示すこと,また,北日本の青森県で生育した樹木でも同様な傾向を示すことが明らかとなった.東アジア太平洋沿岸に位置する日本では,大気の循環により局所的な大気中二酸化炭素の径時的な14C濃度変動が起きている.日本は北緯30度以北にあるが,夏季には熱帯収束帯(ITCZ)の北端境界付近に位置することになり,夏季の太平洋高気圧と冬季のシベリア高気圧の発達に影響を受けて,夏季に太平洋高気圧が異常に発達する温暖な気候が数年数十年間継続することがあれば,日本域で生育した陸上植物に,14C濃度が相対的に低い期間が発生しうる.これらの点について,北日本産樹木年輪の14C年代測定を行い,データを蓄積してさらに検討を進める必要がある.本年度は,樹木年輪の14C濃度を測定するための主要機器であるタンデトロン加速器質量分析計が,平成23年8-10月さらに12月に断続的に故障したため,測定利用が進まず研究費の一部を次年度に繰り越した.その後,修理は完了したものの研究自体は予定のとおりには進まなかった.
糖尿病性細小血管症の成因としての蛋白質糖化反応メカニズムの解明-糖化反応中間体代謝酵素の遺伝子ターゲッティング-

糖尿病で形成が亢進する糖化反応中間体3-deoxyglucosone(3-DG)は、高反応性のジカルボニル化合物で細胞障害性を有しているため糖尿病細小血管症進展の原因物質となり得ることが提唱されている。これに対する生体内防御機構として、3-DGを非活性物質に代謝するアルデヒド還元酵素(ALR)の重要性が指摘されていることから、本研究ではこのALRのノックアウトマウスを作製することによって3-DG代謝機構と細小血管構成細胞に現れる機能変化との関係を解析することを目的としている。平成11年度には、既知のラットALR cDNA塩基配列を参考にしてマウス肝cDNAライブラリーを鋳型にPCRを施行し、次にそのPCR産物をプローブとしてマウス肝cDNAライブラリーから全長のマウスALR cDNAをクローニングした。平成12年度には、上記の塩基配列情報からコドン開始部位を含むプローブを作製し、マウス肝ゲノムライブラリーからハイブリダイゼーション法によってほぼ全長のALRゲノムDNAを得ることができ遺伝子地図を作製した。そして、それを元にエクソン25部分で相同組換えを起こすことを目的としたターゲティングベクターを作製した。同時に、遺伝子導入されたES細胞の中から相同組換えを起こした細胞を有効にサザンブロットによってスクリーニングすることができるようなプローブの設定も行った。今後は、相同組換え体ES細胞をマウス胚にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製後引き続きノックアウトマウスを確立し、その動物における3-DGの代謝変化とそれに伴う細小血管の機能変化を解析する。糖尿病で形成亢進し細胞障害性を有する高反応性ジカルボニル化合物3-deoxyglucosoneを不活性化する機構において重要な役割をしているアルデヒド還元酵素(ALR)の遺伝子をクローニングするために、まず、マウスALRcDNAのクローニングを試みた。既知のラットALRcDNA塩基配列の中で類似酵素と比較してALRに比較的特異性が高いと思われる部位のoligonucleotideを作製してプライマーとし、マウス肝cDNAライブラリーを鋳型にPCRを施行した。次に、そのPCR産物をプローブとしてマウス肝cDNAライブラリーに対してハイブリダイゼーション法によってcDNAをスクリーニングし全長のマウスALRcDNAをクローニングした。塩基配列解析の結果、ラットALRcDNA塩基配列との相同性は95%であり、ヒトALRcDNA塩基配列との相同性は85%であることが判明した。引き続き、null mutationによるノックアウトマウス作製を目的としたターゲッティングベクターを構築するために、上記で得られたマウスALRcDNA塩基配列の情報からコドン開始部位を含むプローブを作製した。現在、このプローブを使ってマウス肝ゲノムライブラリーに対してハイブリダイゼーション法によって目的に合ったゲノムDNAのスクリーニングを行っている。今後は、ターゲッティングベクターを構築してALR遺伝子ノックアウトマウスを作製していくことによって、この酵素の機能が固体レベルで明らかになると共に、数少ない糖尿病性合併症のモデル動物としてその発症機序の解明が可能になることが期待できる。平成11年度にクローニングしたマウスALR cDNAの塩基配列情報からコドン開始部位を含むプローブを作製し、今年度はこれを使ってマウス肝ゲノムライブラリーからハイブリダイゼーション法によってゲノムDNAのスクリーニングを行った結果、ほぼ全長のALRゲノムDNAを得ることができ遺伝子地図を作製した。それを元にエクソン25部分で相同組換えを起こすために必要なゲノム領域のDNAをサブクローニングし、欠失させる上記部分をネオマイシン耐性遺伝子で置き換えたターゲティングベクターを作製した。

同時に、遺伝子導入されたES細胞の中から相同組換えを起こした細胞を有効にスクリーニングすることができるようなサザンブロット用プローブをターゲティングベクターコンストラクトの5'側および3'側のDNA配列から選択した。今後は、このターゲティングベクターを導入したES細胞から上記プローブによって選択された相同組換え体ES細胞をマウス胚にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製後引き続きノックアウトマウスを確立し、その動物における3-DGの代謝変化とそれに伴う細小血管の機能変化を解析する。