hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
教師の授業計画が授業過程及び学習成果に及ぼす影響について

【目的】本研究の目的は,教師の授業計画(授業設計)と授業過程及び学習成果との関係を認知科学的アプローチによって検討することである.つまり,具体的には,2人の教師によって実践された同一教材の体育授業を対象に,その教師行動に差異が生じるのか,生じるとすれば,それは意思決定過程に関する教授スキルとどのように関係するのか,さらには授業計画段階での変数,特に,教師の授業観と授業についての知識とどのような関係にあるのか,そして,それが児童の学習行動や学習成果にどのような影響を及ぼすのかについて,検討を加えた.【方法】対象教師は,1名の小学校教師と1名の中学校教師で,A教師は39歳(17年目)・男・小学校6年生担当,B教師は32歳(7年目)・男・中学校3年生担当の教師である.対象授業は,2名の教師の学級担当クラスの授業を1授業ずつ,合計2授業である.資料収集は,(1)教師の授業設計についての知識を検討するインタビュー,(2)VTRによる授業中の教師行動及び子どもの学習行動の観察記録,(3)授業成果の観察記録,(4)教師の意志決定過程を検討する授業実施後のインタビュー(再生刺激法)の4段階によって行われた.【結果と考察】教師の授業設計の知識を検討した結果,体育教師は,(1))教材内容に付いての知識,(2)授業方法らついての知識,(3)子どもについての知識,の3つを領域として持っており,授業設計の段階でこれらが複合的な形で表出されており,その知識は学校段階・担任性・教材の授業経験等によって異なることがインタビューによって明らかになった.そして,教師の行動(即応的行動)は,その教師が持っている知識の質・量によって異なり,それが授業成果に影響することが確認できた.特に,子どもや教授方法についての知識は発問過程における意思決定サイクルに,教材内容についての知識は学習指導の方法論に強く影響を及ぼすことが明らかになった.【目的】本研究の目的は,教師の授業計画(授業設計)と授業過程及び学習成果との関係を認知科学的アプローチによって検討することである.つまり,具体的には,2人の教師によって実践された同一教材の体育授業を対象に,その教師行動に差異が生じるのか,生じるとすれば,それは意思決定過程に関する教授スキルとどのように関係するのか,さらには授業計画段階での変数,特に,教師の授業観と授業についての知識とどのような関係にあるのか,そして,それが児童の学習行動や学習成果にどのような影響を及ぼすのかについて,検討を加えた.【方法】対象教師は,1名の小学校教師と1名の中学校教師で,A教師は39歳(17年目)・男・小学校6年生担当,B教師は32歳(7年目)・男・中学校3年生担当の教師である.対象授業は,2名の教師の学級担当クラスの授業を1授業ずつ,合計2授業である.資料収集は,(1)教師の授業設計についての知識を検討するインタビュー,(2)VTRによる授業中の教師行動及び子どもの学習行動の観察記録,(3)授業成果の観察記録,(4)教師の意志決定過程を検討する授業実施後のインタビュー(再生刺激法)の4段階によって行われた.【結果と考察】教師の授業設計の知識を検討した結果,体育教師は,(1))教材内容に付いての知識,(2)授業方法らついての知識,(3)子どもについての知識,の3つを領域として持っており,授業設計の段階でこれらが複合的な形で表出されており,その知識は学校段階・担任性・教材の授業経験等によって異なることがインタビューによって明らかになった.そして,教師の行動(即応的行動)は,その教師が持っている知識の質・量によって異なり,それが授業成果に影響することが確認できた.特に,子どもや教授方法についての知識は発問過程における意思決定サイクルに,教材内容についての知識は学習指導の方法論に強く影響を及ぼすことが明らかになった.
銅イオン輸送ATPaseのドメイン間相互作用

銅イオン輸送ATPase(CopA)は、ATPを加水分解し余分な銅イオンを排出するイオンポンプである。同じくイオンポンプであるカルシウムATPaseでは、3つの細胞質ドメインの運動がイオン輸送に重要であることが明かされた。それらに加え、CopAではN末端側に他のイオンポンプには存在しない金属結合ドメイン(NMBD)を持つが、その意味は謎である。本研究では、CopAの生理的中間体を現す細胞質ドメインの複数のX線結晶構造を決定し、NMBDを含めたドメイン間の相互作用の解明を目指した。Cu^+-ATPase(CopA)は、ATPを加水分解し余分な銅イオンを排出するイオンポンプである。同じイオンポンプのCa^<2+>-ATPaseでは、細胞質ドメインの運動がイオン輸送に重要であることが構造解析で明かされた。CopAは他のイオンポンプには存在しない金属結合ドメイン(NMBD)を持つが、その意味は謎である。本研究では、CopAの生理的中間体を現す細胞質ドメインの複数のX線結晶構造を決定し、ドメイン間の相互作用様式の解明を目指す。初年度は、1)ATP加水分解過程を模したPNドメイン構造、2)NMBDとAドメインの複合体構造、そして3)銅シャペロンCopZとNMBD複合体構造を決定するため、蛋白質調製、結晶化、X線回折測定、そして構造解析を行った。第一段階である蛋白質調製に関しては、大腸菌を宿主として遺伝子工学的に大量発現させ、各種カラムクロマトグラフィーによって高純度に精製する系を確立できた。続く結晶化に関しては、市販のスクリーニングキットを用いて約600種類の結晶化条件の探索を行った。その際、リガンドを添加して蛋白質側の条件も変えて行った。初期の結晶が得られた場合は、条件の最適化を進め、X線を回折する結晶がいくつか得られた。得られた結晶を茨城県つくば市の高エネルギー加速器研究機構のフォトンファクトリー(PF)にてX線回折データを収集した。1)に関しては、PNドメインにADPとPiが結合した状態の構造決定に成功した。しかし、2)と3)で得られた結晶は、すべて単体のみであった。現在、遺伝子組み換え操作で連結させた蛋白質を作成し、擬似複合体の結晶構造決定を試している。同じくイオンポンプであるカルシウムATPaseの詳細な構造解析によって、3つの細胞質ドメインの運動がイオン輸送に重要であることが明かされた。3つのドメインに加えて、CopAではN末端側に他のイオンポンプには存在しない金属結合ドメイン(NMBD)を持つが、その意味は謎である。本研究では、CopAの生理的中間体を現す細胞質ドメインの複数のX線結晶構造を決定し、NMBDを含めたドメイン間の相互作用様式の解明を目指す。構造決定を目指すターゲットは、1)ATP加水分解過程を模したPNドメイン構造、2)NMBDとAドメインの複合体構造、そして3)銅シャペロンCopZとNMBD複合体構造、の3種類である。蛋白質試料は大腸菌で大量発現させ、各種カラムクロマトグラフィーにより高純度に精製し、幅広い結晶化スクリーニング、そして結晶化条件の最適化を行った。得られた結晶は茨城県つくば市の高エネルギー加速器研究機構のフォトンファクトリー(PF)にてX線回折データを収集し、解析ソフトを用いて構造を決定した。現在の進行状況に関しては、ターゲット1)については、PNドメインにADPとPiが結合した状態の構造決定に成功した。しかし、2)と3)に関しては遺伝子組み換え操作で連結させるなどの試料調製に工夫を試みたが、残念ながら構造解析に適した結晶を得るには至っていない。今後も試料調製などに改良を加えることで、目標達成を目指したい。
金属肺における循環系白血球の活性化に関する分子生物学的研究

二つの系において、超微細金属粉末粒子が白血球を活性化することを、実証した。一つは、ラット金属肺モデルの末梢血中の白血球、もう一つは、ヒトの末梢血中の白血球である。前者は、ラットに超微細金属粒子を気管内投与しておいて(in vivo)、その末梢血から取り出した白血球をさらに、超微細金属粒子と培養した系(ex vivo)である。後者は、健康な人間から末梢血中の白血球を取り出して、培養した系(in vitro)である。前者の系では、ニッケルのみを用いた。0.1mgを投与したラットから、七日後に、白血球を取り出し、さらにそれをニッケルと培養したところ、無処置のラットに比べ、腫瘍壊死因子が高値に放出された。このことは、金属肺モデルでは、末梢血中の白血球も活性化されていて、さらにニッケルに曝露されれば、一層高く、腫瘍壊死因子始め、炎症性サイトカインを放出しえることを示唆している。後者の系では、白血球を単核球の画分と好中球の画分とに分けて、それぞれの画分からの放出を、同じ第八属に属する鉄、ニッケル、コバルト(いずれも超微細金属粉末)について測定した。単核球画分からは、ニッケルの場合が最も高く、炎症性サイトカイン(腫瘍壊死因子、インターロイキン8、6)が放出された。好中球画分からは、唯一の例外を除いて、サイトカインは放出されなかった。つまり、鉄のみによって、インターロイキン-1が放出された。同じ族にあっても、ニッケルが最も強く、白血球の中の単核球画分を活性化することが示唆された。好中球に対しては、ニッケルの活性化作用は見られなかった。以上のことから、超微細なニッケル金属粉末は、ラット肺に持続的な炎症を起こすことを通じて、末梢血中の白血球も活性化することが示唆された。ヒトの白血球、特に単核球は、同様にニッケルによっても活性化されることから、ナノ・テク粒子が何らかの経路で体内に進入すれば、起こりえると想像される。本科学研究費の配分決定が、昨秋であったので、現段階の研究成果は、以下のように不十分であることを、ご容赦願いたい。人の末梢血から白血球を分離し、さらに好中球と単核球(リンパ球、単球)とを分離した。これらを、同族であるところの、コバルト、ニッケル、鉄などの超微細金属粒子と培養した。その上清中に遊離される腫瘍壊死因子を測定したところ、好中球についてはニッケルが少しばかりの産生を起こした。単核球(リンパ球、単球)については、三つの金属の中で、ニッケルが最も高い産生を促した。そしてそのレベルは、好中球からの遊離されたものよりはるかに大量であった。以上のことから、微細な金属粒子、それもニッケルに特異的に、人の末梢血液中の白血球が活性化されることが示唆された。単核球の中でも、リンパ球、単球のいずれが関与しているのか、実験を続行中である。この現象が、人体にとり、防御的に有利に働くことなのか、炎症の異常な冗進を介して不利に作用するのか、今後の研究を待つ。

13年度には、人の全血から分離した白血球を用いて、第7属の金属である鉄、コバルト、ニッケルの超微細粒子の作用により、サイトカインの一種であるTNF-αが産生されることを明らかにした。14年度は、このことを踏まえ、(1)in vitro実験系を確立するため、ニッケルの超微細粒子でTNF-αを産生するヒトの株化細胞を選択する。(2)TNF-αの産生と関連する転写活性因子のひとつであるNF-κBの産生を検出する。(3)金属超微細粒子によるヒト白血球からの他のサイトカイン(IL-1β、IL4など)の産生を計画した。(1)については、株化T細胞の1つであるM8166について、TNF-αの産生をみたが、TNF-αの放出は、全てバックグラウンド値に近く、有意な上昇を観察できなかった。従って、他の白血球細胞株を探索中である。(2)については、キット実験で、NF-κBは、人の末梢血白血球分画から放出がわずかにみられたが、再現されなかった。購入したNF-κBのELISAキットの精度の問題があるので、実験条件の検討、キットの見直しを行っている。(3)については、これらサイトカインのキットを一部用いての予備実験にとどまった段階であり、次年度、本格的に実験を行う予定である。15年度は、鉄、コバルトおよびニッケルの超微細粒子が人の単球等の血球に作用して血管等に炎症性の作用を及ぼす可能性を検証するため、in-vitroの実験を行った。ヒト全血から単球を多く含む層と好中球を多く含む層とを分離し、それぞれの血球に金属の超微細粒子を濃度080μg/mlで添加し、14時間後に培養上澄を採取して、ELISA法により血球から放出されたサイトカイン(IL-1β、IL-8、IL-10)を測定した。その結果、ニッケルの超微細金属は、単核層においてIL-1β、IL-8およびIL-10のいずれも著しく放出させる。好中球層においてもこれらのサイトカインを放出させる傾向が認められた。コバルトの超微細粒子は、単核球層においてIL-8を放出させるが、その他は放出が認められなかった。鉄の超微細粒子は、単核球層においてIL-10を放出させることが確認された。以上の結果は、環境大気中に浮遊するニッケル等の超微細粒子が呼気から肺胞を通過して血液中に侵入した場合、炎症に関連したサイトカインの産生が誘導されることを強く示唆するものである。また、肺腹腔内においても、この白血球は存在していて、特に、先行した炎症(タバコによる気管支炎はその好例)があって、リンパ球、好中球が存在している場合、十分に起こりえる。今後、肺胞腔内のin-vitroでの実験や、各白血球細胞の株を用いてのin-vitro実験を行う予定である。16年度も、15年度に引き続き、鉄、コバルトおよびニッケルの超微細粒子が人の単球等の血球に作用して血管等に炎症性の作用を及ぼす可能性を検証するため、in-vitroの実験を行った。ヒト全血から単球を多く含む層と好中球を多く含む層とを分離し、それぞれの血球に金属の超微細粒子を濃度0(コントロール)、20および80μg/mlになるよう添加し、14時間後に培養上澄を採取して、ELISA法により血球から放出されたサイトカイン(IL-4、IL-5、IL-6)を測定した。その結果、IL-4は、単核球層と好中球層のいずれにおいても放出されなかった。IL-5は、単核球層、好中球層ともに、いづれの金属に対してもほとんど放出されなかった。IL-6は、単核球層ではコントロールでも超微細金属粒子を加えた場合と同様に多量に放出されていた。一方、好中球層では、ニッケルのみ単核球層の半分のレベルのIL-6を放出していた。
マウス1細胞期胚における個体形成能の評価法の開発および分子基盤の解明

本研究の目的は、マウスの1細胞期胚の個体形成能を評価する技術の確立とその技術を用いて、個体形成能に重要な分子メカニズムを解明することである。初年度(2017年)にはこの目的のために研究代表者がこれまでの研究で用いてきたfluorescence recovery after photobleaching (FRAP)法の改良を行い、解析した胚から正常な産仔を得ることができる条件を決定し、この手法をzFRAP法と命名し公表している。未成熟な精子である円形精子細胞を注入したROSI胚は、通常の精子を用いた場合の半分程度の産仔率となる。このROSI胚ではクロマチン構造の緩さに異常が見られ、しかもこの異常はHDACiの一つであるTSA処理によって回復することが判った。最終年度(2018年)では、このTSA処理によるクロマチン構造改善の分子メカニズムの解明を試みた。すなわち、ROSI胚ではクロマチン構造の緩さに異常を引き起こす原因因子の探索を行った。結果として、ROSI胚において、円形精子細胞由来のゲノムには緩んだクロマチン構造の形成に重要と考えられるH3変異体の一つであるH3.3の存在量が少なく、その原因が受精後のH3.3のdeposition量の不足であることが示唆された。TSA処理によりH3.3の存在量の不足が修正されたので、H3.3を強制発現したところ、クロマチン構造の緩さの改善が見られた。しかしながらその改善効果はごく僅かなものであり、TSA処理による効果を再現するには及ばないものであった。ただし、本探索によりROSI胚ではH3.3以外にも様々なエピジェネティックな因子の異常が起きていることが明らかとなり、その中にはTSA感受性のものも含まれていた。以上より、TSA処理ROSI胚の解析により、クロマチン構造の緩さの制御機構に関与する因子の同定が可能であることが示唆された。平成29年度は、様々な方法で作製した、異なる個体形成能を持つマウス1細胞期胚について、zygotic Fluorescence Recovery After Photobleaching (zFRAP)法によるクロマチン構造の緩さの解析を実施した。これにより、zFRAP法の個体形成能の評価方法としての妥当性の検証とその評価のための規格値の設定を試みた。調べた胚の中で、未成熟な円形精子細胞注入(Round spermatid injection :ROSI)胚について、興味深い知見が得られた。個体形成能が高い体外受精(in vitro fertilization: IVF)胚や成熟した精子を注入した顕微授精(Intracytoplasmic sperm injection: ICSI)胚では、雄性前核が雌性のものよりも顕著に緩んだクロマチン構造を獲得し、約70%の胚で雌雄差が生じている。これに対して、個体形成能がICSI胚の半分ほどのROSI胚では雄性前核におけるクロマチン構造の緩さが顕著に低くなり、この雌雄差を形成できる胚が約40%と非常に少ないことを見出したのである(未発表)。さらに、既にROSI胚の雄性前核において生じると報告されていた異常なDNAのメチル化が、このクロマチン構造の緩さの消失の原因であることを示唆するデータが得られている(未発表)。以上のことから、1細胞期胚の個体形成能には、雄性前核の顕著に緩んだクロマチン構造の獲得とその結果形成されるクロマチン構造の緩さの雌雄差が重要であることが考えられた。実際に、一見正常に見えるIVF, ICSI胚でも雄性前核が緩んだクロマチン構造の獲得に失敗するものも存在するので、今後はこのような胚が本当に個体形成能の低い胚なのかを調べる予定である。まず、zFRAP法の実験系の構築に成功したことが挙げられる。zFRAP法ではヒストンH2BにeGFPを融合させ、1細胞期胚の前核の核質内での動性(mobility)を解析する。この手法が、クロマチン構造の緩さの程度を解析した胚の産仔までの発生能力を損なわないことを国際誌に公表することができた(Ooga et al 2017, 2018)。次に、申請段階では、zFRAPによって得られるクロマチン構造の緩さの指標、mobilityから算出されるmobile fraction (MF)という値の雌雄前核の平均値のみを使用する計画であった。しかしその妥当性を検証するために、ROSI胚についてzFRAP解析をしたことで、雌雄前核の平均値のみならず、雌雄のMF比(♂/♀>1.2)が重要であることがわかってきた。さらに、このクロマチン構造の雌雄前核のMF比はDNAのメチル化の雌雄前核での不均一性に依存する値であった。この時期のDNAのメチル化の不均一性を形成するTet3をノックアウトしたマウスでは、多くの胚で胚性致死を引き起こす。したがって、zFRAP法により得られる雌雄前核の雌雄のMF比は、胚の個体形成能の指標としての妥当性が考えられる(投稿準備中)。重要なことは、概要でも触れたようにIVFやICSI胚のような、個体形成能が高く、60-70%ほどの胚が産仔となりうる胚であっても、MF比がROSI胚の多数(60%)と同等(♂/♀<1.2)のものが30%程含まれるということである。つまり、MF比と個体形成能には相関があることが示唆された。以上のように、本研究では、胚の個体形成能の指標となりうるクロマチン構造の緩さを、胚を殺さずに解析する系を確立し、さらにzFRAP法から得られる値の規格値の設定に成功しつつある。

本研究の目的は、マウスの1細胞期胚の個体形成能を評価する技術の確立とその技術を用いて、個体形成能に重要な分子メカニズムを解明することである。初年度(2017年)にはこの目的のために研究代表者がこれまでの研究で用いてきたfluorescence recovery after photobleaching (FRAP)法の改良を行い、解析した胚から正常な産仔を得ることができる条件を決定し、この手法をzFRAP法と命名し公表している。未成熟な精子である円形精子細胞を注入したROSI胚は、通常の精子を用いた場合の半分程度の産仔率となる。このROSI胚ではクロマチン構造の緩さに異常が見られ、しかもこの異常はHDACiの一つであるTSA処理によって回復することが判った。最終年度(2018年)では、このTSA処理によるクロマチン構造改善の分子メカニズムの解明を試みた。すなわち、ROSI胚ではクロマチン構造の緩さに異常を引き起こす原因因子の探索を行った。結果として、ROSI胚において、円形精子細胞由来のゲノムには緩んだクロマチン構造の形成に重要と考えられるH3変異体の一つであるH3.3の存在量が少なく、その原因が受精後のH3.3のdeposition量の不足であることが示唆された。TSA処理によりH3.3の存在量の不足が修正されたので、H3.3を強制発現したところ、クロマチン構造の緩さの改善が見られた。しかしながらその改善効果はごく僅かなものであり、TSA処理による効果を再現するには及ばないものであった。ただし、本探索によりROSI胚ではH3.3以外にも様々なエピジェネティックな因子の異常が起きていることが明らかとなり、その中にはTSA感受性のものも含まれていた。以上より、TSA処理ROSI胚の解析により、クロマチン構造の緩さの制御機構に関与する因子の同定が可能であることが示唆された。ROSI胚を用いた実験から着目した「前核におけるクロマチン構造の緩さについての雌雄差」の、1細胞期胚の個体形成能の評価指標としての有用性を検証する。ここでいう雌雄差とは、雄性:雌性前核のMF比が1.2倍以上あるかどうかで判断する。ROSI胚において、このような胚はおよそ40%存在し、ICSIあるいはIVF胚では約70%の胚が該当する。この値は、それぞれの種類の胚の産仔率(ROSI:30-40%, ICSI:60-70%)と相関を示す。そこで、ROSIおよびICSI/IVF胚で雌雄前核のMF比が1.2倍以上の胚と、1を下回る(雄性前核クロマチンが雌性前核のものよりも締まった構造になってしまっている)胚をそれぞれ区分けし、擬妊娠マウスの卵管および子宮へと移植し、その産仔率を比較する。上の検証を経て、クロマチン構造の緩さについて、雌雄前核のMFの平均値および雌雄前核のMF値の雌雄比の規格値を設定する。その後は、当初の予定通り、個体形成能の高い胚と低い胚のRNA-seqを実施し、胚の個体形成能に重要な遺伝子発現のパターンを特定することを目標としている。また、その一方で、ROSI胚について詳細に解析した結果、60%以上のROSI胚をMF比:♂/♀>1.2に回復させることが可能であることがわかった。今後これらの胚の産仔率が向上する、すなわち個体形成能が増強されたのかを調べることで、MF比の個体形成能の評価の指標としての妥当性を検証する。
スポーツ指導者のサーバントリーダーシップ尺度の開発と選手への影響の検証

本研究は,主に3つの研究から構成される.インタビュー調査では,プロレベル・全国レベルで指導している,あるいは指導経験のあるスポーツ指導者を選定し,半構造化インタビューを実施する.また,選手に対しても調査を行い,構成概念を抽出していく(研究1).質問紙調査では,研究1の結果からスポーツ指導者のサーバントリーダーシップ尺度を開発し,選手との関係性に及ぼす影響を検証する.尺度開発に関しては,尺度開発の国際的な基準であるCOSMINに基づき進める(研究2).選手への影響に関する調査では,スポーツ指導者のサーバントリーダーシップがスポーツ指導者と選手との関係性に及ぼす影響を検証する(研究3).本研究は,主に3つの研究から構成される.インタビュー調査では,プロレベル・全国レベルで指導している,あるいは指導経験のあるスポーツ指導者を選定し,半構造化インタビューを実施する.また,選手に対しても調査を行い,構成概念を抽出していく(研究1).質問紙調査では,研究1の結果からスポーツ指導者のサーバントリーダーシップ尺度を開発し,選手との関係性に及ぼす影響を検証する.尺度開発に関しては,尺度開発の国際的な基準であるCOSMINに基づき進める(研究2).選手への影響に関する調査では,スポーツ指導者のサーバントリーダーシップがスポーツ指導者と選手との関係性に及ぼす影響を検証する(研究3).
宿主-腸内細菌叢間の代謝プロファイリングによる宿主の恒常性の指標化と評価法の構築

近年、腸内フローラの改善による腸管関連疾患やアレルギーなどの改善・予防効果が明らかになってきているが、それらの効果を裏づける科学的根拠は乏しいため、腸管病原性大腸菌O157によるマウス感染死を実験モデルとして用い、宿主-腸内フローラ間相互作用(cross-talk)の情報を代謝物および遺伝子発現レベルより解析した。無菌マウスにO157を投与すると7日以内に全例が死に至るが、O157と共に典型的なプロバイオティクスであるBifidobacterium longum(B.longum)を投与すると感染死は完全に予防されることを見出した。一方、成人の腸管内に常在するビフィズス菌であるBitfidobacterium adolescentisを投与しても感染死が予防できないことも明らかにした。B.longum前投与によりO157のマウス腸管内における生菌数、シガ毒素産生量、シガ毒素活性、腸管内pHにはB.longum前投与の有無によらず違いは認められなかったが、O157単独投与時にみられた血清中のシガ毒素濃度の増加および大腸上皮の軽い炎症は認められなかった。従って、B.longumによる宿主腸管上皮バリアー機能や免疫能の増強が感染死予防に寄与する可能性が示唆された。そこで、このようなプロバイオティクスの効果をその代謝産物から評価するため、NMRを用いたプロバイオティクス投与マウスの糞便中代謝物の網羅的プロファイリング技術を確立した。その結果、前投与によりO157感染死を予防できるビフィズス菌2菌種(B.longumを含む)と予防できない2菌種(B.adolescentisを含む)を同定し、マウス糞便中の代謝物が感染死予防能と相関してクラスタリングできることを見出した。プロバイオティクスがどのような機構で宿主動物と、あるいは微生物同士が相互作用(cross-talk)し、宿主に有益な効果をもたらすのかについての詳細は明らかでないことから、腸管出血性大腸菌O157:H7による無菌マウスの感染死をモデル動物実験系として用い、マウス感染死とその感染死予防を遺伝子発現プロファイリングおよび代謝物プロファイリングの手法を用いて評価した。無菌マウスにE.coli O157:H7とBifidobacterium longumをそれぞれ、あるいは両方を投与したノトバイオートマウスを作製し、それらの小腸柔毛上皮細胞およびパイエル板上に特殊に分化した上皮細胞を剥離・回収し、cDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイリングを行った。得られた数値データは多変量解析手法の一つである主成分分析法を用いてO157、B.longum、または両菌株投与群における腸管上皮細胞での遺伝子発現変動を時系列データとともに評価した。代謝物を分析した場合には、上記のノトバイオートマウスの盲腸内容物を採取し、核磁気共鳴(NMR)を用いてその低分子化合物を^1H-NMR法により網羅的にプロファイリングした。得られた^1H-NMRスペクトルは数値データに変換し、同様に主成分分析法を用いて評価した。B.longum単独投与マウス(BL)とO157単独投与マウス(EC)とではIECとFAEにおける遺伝子発現プロファイルが大きく異なったが、B.longum+O157投与マウス(BE)ではBLマウスとそのプロファイルが類似した。特にGO termで分類されるimmune responseやcytoskeletonに関る遺伝子群の変動が顕著であった。代謝物レベルでもBL、ECおよびBEのプロファイルは異なったが、やはりBEはBLのパターンと類似した。
光制御によるAMPA受容体機能破壊技術の開発

神経細胞は、シナプスを介した電気的な信号伝達により、学習記憶などの機能を発揮する。しかしながら、学習記憶などの高次機能において個々のシナプスがどのように機能しているかなどはまったく不明であり、シナプスレベルで脳情報を解読する技術は存在しない。本研究はシナプス機能に重要なAMPA受容体を、光で特異的に機能破壊できる新技術を世界で初めて開発し、脳情報の解読に向けた基盤技術を確立した。イメージングと同時に任意のタイミングでタンパク質機能を破壊する技術の開発は、イメージングで得られたシグナルパターンの生理的意味を解明するために不可欠な方法論である。本研究では学習記憶に重要なAMPA受容体のN末端にGFPを付加したGFP-GluR1をターゲットに、光制御にてGIuR1の機能破壊を誘導する新技術の開発を進めている。これまでにAMPA受容体を光により機能破壊可能な抗GFP抗体は既に一種類取得済みである。本年度はこの抗体の基本機能を解析と、抗GFP抗体スクリーニングをさらに進めた。GluR1発現CHO細胞にて本抗体を添加しても、GluR1のamplitudeには影響を与えず、光を照射して初めて機能破壊が誘導されることを示した。さらに光照射によってAccess Resistanceなどのパッチクランプ時の電気生理学的特性には影響を与えていないことも示した。抗体の特異性を示すためには、異なる複数の抗体で同じphenotypeがでるかを確認する必要がある。本年度は上記と平行してGluR1を光にて機能破壊可能な抗体のスクリーニングをさらに進めた。これまでに、従来の抗体と同程度の効率で機能破壊が可能な抗体を2種類取得した。現在はこれら3種類の抗体について、同じ発現パターンを示すNMDA受容に対する機能破壊の特異性を、電気生理学的に解析中である。また、内在性GluR1とGFP-GluR1を共に機能破壊可能なモノクロ抗体のスクリーニングを進めている。昨年度までに、GFP融合GluR1に対してエオシンラベルした抗GFP抗体を用いてCALIによる光照射依存的機能破壊の技術を開発した。今年度は本技術の特異性等について解析を進めた。まずCHO細胞にGFP-GluR1とNMDA受容体(NR1A/2B)を共発現し、グルタミン酸添加によるAMPA電流及びNMDA電流を測定する実験系を構築した。ここでCALIの前後で機能破壊の特異性を解析したところ、AMPA電流のみを特異的に機能破壊することが分かった。さらに海馬初代培養ニューロンにおいても同様な高い特異性が認められた。これらの実験はグルタミン酸添加によるものであり、シナプス性電流を抑制した結果であるかは不明である。さらに抗体がシナプスクレフトに入り込むかも大きな問題となる。そこで海馬初代培養ニューロンを培養したガラスに刺激電極を設置することでシナプス電流を発生させる実験系を構築し、CALIの効果を解析したところ、光照射依存的にAMPA電流のみが特異的に抑制できることがわかった。以上からエオシンラベルした抗体は、シナプスクレフトに入り込みCALIが可能であることが示された。また昨年度に引き続き、内在性GluR1細胞外ドメインに対する抗体のスクリーニングを続け、生きた細胞に発現させたGluR1を認識する抗体を見出した。今後はCALIが可能かなどを解析し、将来的にin vivoで使用する抗体を決定したい。
圧電センサを用いた非侵襲脳動脈硬さ評価技術の開発

頚動脈波による脳内血管の簡易診断を目的に、模擬脳動脈樹による脳内閉塞評価や、健常者と脳動脈閉塞患者の臨床計測を行った。圧電センサを用いて簡易計測システムを構築し、内頸動脈の閉塞患者と健常者の頸動脈波を計測した.各被験者の左右の脈波波形の比較検討により,閉塞の有無や閉塞の側を評価できた。救急医療では、搬送時に脳動脈閉塞が判断できれば最適な搬送先を選択できる。本システムは救急の現場でも期待される。本研究では低コストな圧電センサ計測システムを用いて頚動脈の皮膚変位(脈波)を計測し、その解析により脈波中に含まれる脳動脈血管の情報を抽出することを目的とする。研究内容は、以下の二つの側面をもつ。まず、血管内脈波の伝搬挙動の基礎的研究として、模擬血管による脳動脈モデルを作成し、脳内血管の狭窄などの疾病が脈波に及ぼす影響を実験的に検討する。また、圧電センサ計測システムを用いて、健常者や疾病患者の頚動脈脈波を計測し、両者の波形比較、波形の特徴量抽出を目指す。初年度の28年度は、100-200kPa程度(硬めの血管に相当)の弾性率をもつポリマーチューブを作成し、対称な形状の狭窄を含む頚動脈の模擬血管の作成に成功した。また、水を満たしたこのチューブ内に、血流を模擬してパルス状の圧力波を伝搬させた。比較的軽度の狭窄であっても、狭窄で圧力波が一部反射して観測されることを確認した。狭窄の形状による反射波形の変化も確認した。また、臨床研究では、圧電センサシステムを用いて被験者の頚動脈波を、超音波ドップラを用いて頚動脈内の血流波形を計測した。まず、中高年の健常者45例の頚動脈波波形と血流速度波形を検討し、年齢に応じて脳内からの反射と考えられる反射波の振幅が増大することを確認した。また、同システムを用いて、アテローム血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞などの疾病患者の頚動脈波、血流速度波形を測定し、健常者の結果との比較検討を行った。頚動脈を模擬した血管の作成でき、模擬血管内の圧力波伝搬現象を実験的に確認できた。また、比較的軽度な狭窄でも圧力波の反射を観測したことから、脳動脈内での狭窄が頚動脈で観測される可能性を見出した。また、アテローム血栓性梗塞やラクナ梗塞の被験者の観測を進めた。現在は得られた脈波波形や血流速度波形を健常者の結果と比較検討し、特徴量抽出の段階に進んでいる。低コストな圧電センサ計測システムを用いて頚動脈の皮膚変位(脈波)データから脳動脈狭窄の診断手法を開発するため、以下の二点の研究を進めた。まず、脈波の伝搬挙動を理解するため、模擬血管による脳動脈モデルを作成し、動脈中の狭窄が頸動脈波に及ぼす影響を実験的に検討する。また、圧電センサ計測システムを用いて、健常者や閉塞患者の頚動脈脈波を臨床計測し、両者の波形比較から閉塞時の脈波波形の特徴量抽出を目指す。平成29年度は、血管に近い柔らかさのポリマーチューブで、脳動脈樹の作成に成功した。また、水を満たしたこの人工動脈樹内に、血流を模擬してパルス状の水の圧力波を伝搬させたところ、脳内の血管床に近い内径1mm程度の模擬血管内閉塞からの反射圧力波が、頸動脈の位置で観測されることを確認した。また、臨床研究では、圧電センサシステムを用いて、内頚動脈閉塞患者8名と健常者19名の左右の頸動脈波の計測を行った。これらの患者の総頚動脈ED-ratioは1.4以上であり、片側の頸動脈の閉塞が確認されている。患者、健常者の左右の頸動脈波の速度波形を計測したところ、患者では左右の波形が異なる傾向が見られた。そこで左右波形の相互相関を算出した。その最大値は0.93(健常者平均)および0.58(患者平均)となり、値のばらつきはあるものの、健常者群は0.80以上、患者群はそれ以下に大別された。また、閉塞側の速度波形は高周波成分が多く、脳内からの反射波の重畳の効果が確認された。これらの結果により、本システムの頸動脈波計測により閉塞患者の簡易スクリーニングが可能であることが確認された。今後は、当初の予定に従い、健常者・患者の臨床計測を進めるとともに、健常者波形の特徴量抽出法を検討する。また、ラクナ梗塞、アテローム血栓性梗塞などを模擬した模擬脳動脈血管の作成に挑戦し、このような疾病による血管内圧力波の変化を物理的に検討する。血管内圧力波の変化は皮膚表面で観測される脈波に反映される。将来的に、ポータブルな計測を可能とするために、臨床用圧電センサ計測システムの小型化を検討する。

計測工学購入予定の装置の一部を借用できたため、28年度は物品費の使用額が予定より下回った。物品費については、29年度に研究をより進捗させるため、臨床用ポータブル型圧電センサ計測システムの開発費、血管模擬チューブ作成費として使用する。
大規模変数次元データの因果構造マイニング手法開発と遺伝子機能関係知識ベースの作成

科学者は多数遺伝子の発現強度変数測定データ(大規模変数次元データ)から、遺伝子発現間の因果関係を把握し、各遺伝子の機能を解き明かそうとする。しかし、人手では数十数百個もの変数間の因果関係を見出すのは困難である。ところが、最新の計算機データ解析技術でも2030変数間の因果関係解析しかできない。そこでこ、本研究では新たな統計的因果解析原理を開発し、計算機を用いて数十数百個の変数間の因果関係を明らかにする手法を確立した。さらに、この手法を用いて科学者が参照可能な遺伝子発現機能関係知識ベースの構築を行った。本研究の第1目的は,一般計算機を用いて数千数百万次元の大規模変数次元データから,因果関係が明確な部分変数間因果ネットワークを効率的に完全探索することである.そのため,東大・医科研の研究分担者を通じ,遺伝子発現度測定データの提供を受けた.そして,提供データ及び人工データをテストベッドとして,阪大・産研の研究代表者と阪大・基礎工及び統数研の研究協力者の協力により,グラフマイニングの枠組みに統計的因果推論を組み込む検討を実施した.そして,大規模変数次元ベクトルデータからの部分因果ネットワークを推定する手法の開発を行った.具体的には,マイクロアレー上の各遺伝子に対応する格子点5千個の変数次元ベクトルで表される比較的少数の検体データについて,独立成分分析(ICA)による統計的因果推論を施し,各変数間の因果関係を同定する検討を行なった.次に,このようにして同定した多数の因果関係ネットワークの集合データにグラフマイニングを適用し,多数の変数の間に安定して見られる変数間因果関係を同定した.解決に取り組んだ技術課題としては,(1)変数個数mが巨大なため,その計算量を低減する高速全相関係数推定アルゴリズム開発,(2)推定相関係数行列からの独立成分分析(ICA)による統計的因果推論手法,(3)安定した因果ネットワークを得るグラフマイニング手法の検討,(4)無駄のないアルゴリズム開発,(5)提供データ及び人工データをテストベッドとした部分因果ネットワーク推定手法の改良調整等が挙げられる.これらの取り組みにより第1目的はほぼ達成されたと考える.本研究では,数千以上の変数から成る大規模次元データから,変数間の因果関係が明確な部分を完全探索し,その因果関係ネットワークを同定する効率的手法の開発を第1目的とする.更に,この手法を遺伝子発現データに適用し,遺伝子の未知機能を明らかにするための遺伝子発現因果関係に関する知識べースの効率的作成と公開を第2目的とする.遺伝子発現実験では,コストや倫理の制約から,得られる検体事例数が多くても数十程度に限られることが多いにも拘わらず,各遺伝子発現度を表す変数は数千個以上にもなる.今年度は,初年度に検討した因果ネットワーク推定手法を発展させ,このような過小データから,投薬などの種々の外部からの刺激に対して,生体細胞内で最初に反応して発現する遺伝子群,即ち,外部刺激に対して受容体を構成する遺伝子群を同定する手法を開発した.これを実現するためには,与えられたデータに含まれる全変数の中で,因果関係上最上流に位置する変数群,即ち,外生的変数の集合を探索することが必要である.これを,因果的に上流に位置する変数ほど,その値の統計的揺らぎが非ガウス分布に従うことが多いと期待されるという仮定に基づき,独立成分分析の基礎原理を適用することによって達成した.そして,この手法を,National Center for Biotechnology Informationにて公開されている治療薬物を投与したる白血病細胞や乳がん細胞の遺伝子発現データに適用し,各薬物がどの遺伝子に働きかけるのかを同定した.本研究は,大阪大学基礎工学研究科の狩野裕教授,同大学産業科学研究所の大原剛三助教,猪口明博助教,東京大学医科学研究所の井元清哉准教授を連携研究者として,上記成果を得た.初年度に検討した大規模変数次元データからの部分因果ネットワーク推定手法を拡張し,最も可能性の高い遺伝子発現因果関係全体を表す因果ネットワークを推定導出する手法を開発した.これまでの2年間の各研究の結果,大規模変数次元データ上で因果ネットワーク候補を多数導出して,その上でグラフマイニングを適用して部分因果ネットワークを推定導出するよりも,独立成分分析(ICA)を用いて多変数間の因果関係全体を推定する方が,結果の精度と安定性において優れることが分かってきた.本年度は,この知見を生かした手法開発を行った.これによって,部分的な遺伝子発現メカニズムの解明のみならず,多数の遺伝子が相互に影響し合って発現する全体のメカニズムを解明する手段を提供できるようになった.更に2年度目に取り組んだ類似した遺伝子発現部分因果ネットワークに含まれる未知機能遺伝子の機能を類推する技術と,上記,遺伝子発現の全体因果ネットワーク推定導出種手法を組み合わせ,各種機能を有する遺伝子が全体としてどのように相互に影響し合って発現動作するかを解明する方法論を確立を目指した.

上記独立成分分析(ICA)を用いて多変数間の因果関係を逐次導出する手法に,専門家の知見を含めた機能推定手法を組み合わせることにより,各遺伝子の機能を解明できることを明らかにした.そして,以上の手法及び方法論を種々の遺伝子発現データに適用し,各々のデータについての遺伝子発現因果ネットワーク全体の推定,それらネットワーク上での各種遺伝子機能とそれらの発現関係の推定を実施した.遺伝子発現の因果ネットワークを知る意義の高いデータや因果ネットワークの導出のために整備された条件を有する公開データが限られるため,対象データの厳選と共に,更に適用可能なデータの洗い出しを進めながら解析を実施した.この上で,これら実施した推定結果を知識ベースとしてまとめた.
閉囲空間内部を拡大する火災の相似則に関する研究

閉囲空間内部を拡大する火災の相似則を実験的に究明するため、25cmから1m立法までの範囲の閉囲空間内部にさまざまなサイズのポリメチルメタクリレート板を設置して火災実験を行い、床面に沿う火災の伝播速度、燃焼速度、空間内部の温度分布とその時間的変化、閉囲空間を構成している壁材(不燃材カオウール板)内部の温度分布の時間変化、煙層の厚みの変化、開口部でのガスの流出入等を測定した。これら多くの測定データをコンピュータ解析し、模型のスケールと現象の相似性を検討した結果、次のような関係があることが見いだされた。1.可燃性物質であるポリメチルメタクリレート板の表面積および開口部パラメタA√<H>の双方が模型(閉囲空間)のサイズの二乗と相関を持つ。2.壁材の厚みはその物質のもつ熱拡散率と模型のサイズの平方根に相関を持つ。従って、例えば模型のサイズを2倍にすると、可燃性物質の表面積と開口部パラメタに双方を4倍にし、壁材の厚みを1.4倍にすることで現象に相似性が保たれる。これらの結果を踏まえて、火災現象を支配する基礎方程式を相似性が保存される形に変形し、無次元変数、無次元パラメタ等を合理的に設定すると、現象は基本的には無次元の放射熱伝達係数、無次元の開口部パラメタ、空気と可燃性ガスの混合過程を表わすパラメタ、および壁材の熱応答性を示すパラメタによって決定されることがわかった。一方フラッシュオーバーに至る時間は、上記の相似性が保存される基礎方程式から現象に関わる特性時間で代表されることが示され、模型のサイズの1次に関係することが明らかとなた。この結果は約15%程度の変動の範囲内で実験結果と一致することが認められ、実際の建物における火災の危険性予測に役立つものと期待される。
東南アジア諸国の中国省別・地域別貿易に関する調査研究

近年、東南アジア諸国と中国との貿易は増加傾向にある。なかでも、「後発」組と称されるCLMV(カンボジア、ラオス、ミャンマー、ベトナム)は、大メコン圏(GMS)開発プロジェクトによる道路などのインフラ整備が進んでいることもあり、中国の南部地域との貿易を活発化させている。*本研究は、2000年以降とくに顕著となった中国の台頭が、東アジア地域、とくに東南アジア諸国(ASEAN加盟国)の貿易にどのような影響を及ぼしたのか、貿易データを用いて分析し、明らかにしようとするものである。*本年度は、貿易データの解析を進るとともに、関連資料の収集に注力した。具体的には、貿易の電子データ(World Trade Atlas)を用い、中国の各省・地域と東南アジア諸国との貿易について、取引される上位品目を輸送手段別(陸路、海路(上海などを経由)、空路)にHSコード4桁分類で分析を行った。また同時に、東南アジア諸国と中国との貿易に関する最新の動向を把握するため、シンガポールおよびマレーシア・クアラルンプールにおいて、貿易関連資料の収集、関連機関・企業での聞き取り調査など、現地調査を実施した。*その結果、(1)先発ASEANは、上海市や深セン市など、沿岸地域の主要貿易都市との貿易が活発である一方、CLMVは、中国南部地域、雲南省の昆明市や広西省チワン族自治区の南寧市との貿易関係が相対的に大きいこと、(2)CLMVと中国南部地域(昆明市、南寧市)との貿易では、CLMVから中国南部地域へ木材や天然ゴムなどの天然資源が輸出され、逆に中国南部地域からCLMVへは工業製品が輸出されるという、典型的な垂直貿易が展開されていること、(3)ただし、ベトナムは深セン市との間に見られるように、IT関連製品の「水平分業」的な貿易構造の中に参画しつつあること、がわかった。*これらの詳細に関しては、中間報告として日本タイ学会第11回研究大会(2009年7月4日、京都大学)にて発表を行った。*中国は、人口や国土面積とともに、経済的にもいまや「巨大」な国である。そのため、東南アジア諸国、なかでもとくにCLMVとして括られる経済開発の途上にある国々との経済関係については、一国対一国として分析していると、まさに激変の中にあるにもかかわらず、大国間の経済関係の中に埋もれてしまい、正当に評価されないとの懸念が生じてきた。そこで、本研究では中国との貿易を省別・地域別(税関の所在地別)に分けて検討した。*具体的には、GTI社のWorld Trade Atlasと国連のUN COMTRADEを用い、HSコード4桁分類に従い分析を行った。*たとえば、ベトナムとの間では、広西チワン族自治区の南寧(Nanning)との貿易が多い。2008年には、ベトナムからの輸入地域として1位(9.4億ドル、対ベトナム輸入全体の22%)、ベトナムへの輸出地域として2位(30.5億ドル、対ベトナム輸出全体の20%)である。この背景には、中国の中央・地方政府の交通インフラの整備等をてこにした積極的な対外戦略がある。*一方、東アジア地域全体では、中国の台頭と域内貿易(IT関連製品の生産の分業体制)の進展により、相対的にアメリカへの依存を弱め、地域として自立しつつあることも観察できた。*これらの成果については、日本国際経済学会第69回全国大会(2010年10月17日、大阪大学)にて発表を行った。
機能性RNAの効率的製造法の開発

遺伝子発現が関連する難病の治療薬として人工的な小分子RNAなどが期待されている。しかし、現在のRNA合成法は、手間やコストがかかり、創薬という点で問題がある。本研究は、意図したとおりの配列をもつ人工RNAを微生物により生産させることを目指し、圧倒的な低コストでの高機能RNA医薬の製造法を開発しようとするものである。本研究では、自然界で自身のRNAやDNAを培地に放出する性質をもつ海洋性光合成細菌、Rhodovulum sulfidophilumを操作し、機能をもつ人工RNAアプタマーをこの菌の培地中に生産させることに世界で初めて成功した。海洋性光合成細菌、Rhodovulum sulfidophilumは、細胞外にDNAやRNAを放出している。本研究は、まずこの菌が生産するRNAの解析を行い、次に菌の遺伝子操作法を開発し、最終的に任意の機能性RNAを簡便に、かつ圧倒的低コストで製造する方法を開発しようとするものである。いくつかの細菌において、培養する際培地中に能動的に核酸を生産じていることが知られている。これは、単なる溶菌による核酸の漏出とは区別できる生理的現象である。本年度の研究において、そのような菌のうち海洋性光合成細菌Rhodovulum属について核酸生産の現象を解析した。いくつかのRhodovulum属細菌のうち、Rbodovulum sulfidophil DSM2351株が量的に最も多い核酸を菌体外に生産していた。その生産は、対数増殖期に起こっていることも明らかになった。さらに、これまで、菌体外核酸の報告はあるものの、どのような種類の核酸が生産されているのかということはまったく明らかになっていなかったことから、本研究では、これを明らかにすべく、解析を行った。DNAおよびRNAが生産されており、DNAについては、パルスフィールドゲル電気泳動によりおよそ30キロ塩基対(kbp)の大きさを中心にスメアなバンドが得られた。さらに、様々な遺伝子の塩基配列をブローブとするサザンハイブリダイゼイションによる菌体内ゲノムDNAとの比較から、菌体外DNAはゲノムDNAに由来するものと結論された。菌体外RNAに関しては、クローニングおよび塩基配列解析から、主に16Sおよび23SリボソームRNAの断片と多くの種類のtRNAであり、tRNAの場合、その多くが成無体のまま(分解されず成熟体未端配列も削られることなく)培地中に生産されていることが明らかになった。これらのことから、R.sulfidopbilum DSM2351株の菌体外に生産される核酸は、菌体内にもともとあった核酸が、長いものはある程度分解され、tRNAのような比較的短鎖で高次構造をもつものは、そのままの形で放出されているものであることが明らかになった。これは、細菌が菌体外に生産する核酸についての初めての詳しい解析である。昨年度は、本菌が自然に生産しているRNAの解析を行い、初めてその構造を明らかにしたが、この段階では、外来性RNA(本菌が通常保持しない遺伝子の転写産物)が生産できるか否かは不明であった。本年度は、本菌由来の光合成に関与する転写プロモーターをもつプラスミドを入手し、そのプロモーターの下流に、任意の配列を挿入し、このプラスミドを大腸菌との共培養の手法でR.sulfidophilumの細胞に導入した。任意の配列としては、二つの例を行った。一つは、大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lac z)、もう一つは、完全な人工RNAであるストレプトアビジン結合能をもつRNAアプタマーの配列である。これらのプラスミドはR.sulfidophilumの細胞に導入され、これら外来性RNAのいずれも細胞外へ生産されていることが、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の手法で明らかになった。本研究の意義、重要性は以下のように述べることができる。伝統的な環境微生物学と核酸ドラッグ研究のような先端医薬の研究とを結びつけた点はユニークであり、核酸ドラッグの製造コスト問題を一気に解決しようという世界に先駆けた研究である。本菌で人工RNAが生産できることを世界で初めてしましたもので、特許出願も行った。

昨年度までに本菌で異種RNAを発現させるための遺伝子操作法を開発し、大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lac z)mRNA、および、完全な人工RNAであるストレプトアビジン結合能をもつRNAアプタマーの配列を発現させることに成功した。しかし、その発現量はNorthern解析で確認できる程度で十分な発現量とは言えなかったため、本年度は、より強いプロモーターの開発と本菌の菌体外核酸生産について微生物生理学的な解析を行った。まず、RNA発現のプロモーターとしては、本菌のリボソームRNA(rRNA)のプロモーター(rrnプロモーター)が最適と考えられるため、インバースPCR法によりrRNA遺伝子上流よりrrnプロモーターを単離した。このプロモーターとこれまで使っていたpufプロモーターとをβ-ガラクトシダーゼをレポーターとして比較したところrrnプロモーターがpufプロモーターの100倍のプロモーター活性を有していることが明らかになった。このrrnプロモーターについても国際特許出願をしている。一方、本菌の菌体外核酸生産の生理学的解析から、本菌を富栄養培地で培養することにより貧栄養培地の場合と比較して菌体外核酸を多く生産することが明らかになった。また、本菌はフロック(菌の集合体)を形成するが、フロックの細胞間をつなぎ止める物質として核酸を利用している証拠が得られた。そのことから、培地中に放出された形の菌体外核酸を効率的に得るには、フロック形成を抑える処理をすることが効果的であることも明らかになった。海洋性光合成細菌、Rhodovulum sulfidophilumは、細胞外にDNAやRNAを放出している。本研究は、まずこの菌か生産するRNAの解析を行い、次に菌の遺伝子操作法を開発し、最終的に任意の機能性RNAを簡便に、かつ圧倒的低コストで培養液中に製造する方法を開発しようとするものである。昨年度までに強いプロモーターであるリボソームRNAのプロモーター(rrn)をこの菌から取り出しプラスミドに導入することによって、それまでよりも数十倍量のストレプトアビジンRNAアプタマー(ストレプトアビジンに結合する能力を有する人工RNA)を菌を培養するだけで生産させることに成功していた。しかし、生産されたRNAの配列はRT-PCR法などで確認したものの、実際に結合能をもつことを示す実験データは得られていなかったため、本年度、このRNAを精製し、ゲルシフトアッセイ法により活性を確認した。培養で得られたこのRNAアプタマーをin vitro転写のRNAアプタマーと比較したところ、まったく同様のストレプトアビジンへの結合活性が確認された。このことは、人工的機能性RNAである活性を保持するRNAアプタマーを菌の培養だけでその培地に生産できることを世界で初めて示したもので、当該基盤研究の最も重要な部分を達成したことを示す。現在のところ、1Lの培養液当たり100ngが生産できているところで、まだ、量的な点でさらなる研究が必要であった。本菌の培地にはリボヌクレアーゼがないことを確認していたものの培養中に生産されたRNAアプタマーの減少傾向も見られた。このことは、わずかながらリボヌクレアーゼが存在する可能性を示していた。一方、この時点までに生産されていたRNAの末端は、5'-OH、3'-リン酸の形であった。