hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モラルジレンマを用いた「考え議論する道徳」授業に関する縦断的研究

この度の学習指導要領の改訂にあたり,「考え議論する道徳」授業をどのように行うかがさまざまな立場から議論されている。そこで、本研究では数ある道徳教材の中から「考えたり議論したりすることが可能と思われるモラルジレンマを参照し、小学生から高校生を対象として「考え議論する」ことのできる道徳教材の開発を行う。また、中学生の道徳性発達を縦断的に検討する。【研究1】中学生3学年および特別支援学級を対象として、道徳性および関連する社会的能力について縦断的研究を予定しており、その1年目をスタートさせた。今年度は縦断データがないため、横断的検討のみ行った。学年×性別による道徳性および関連する社会的能力の発達的な差異について明らかにした。副次的に既にデータを取得済みの高校生、大学生との比較も行った。多次元共感性の下位尺度はおおむね女子>男子であり、女子の方が発達していることが示唆された。行動基準には学年、性別による大きな違いは見られなかった。【研究2】小学校、中学校、特別支援学級を対象として「考え議論する」道徳の授業の調査を行った。授業を見ていく中で、考え議論する道徳授業を行うためには、道徳的課題についての認識の発達と道徳的課題を議論するスキルの発達の双方を見ていく必要が示唆された。これらの結果を踏まえ、子どもたちが考えたり、議論したりすることができるようなモラルジレンマ教材を執筆した。副次的に外国の道徳に相当する科目(倫理)の調査も実施した(フィンランド、中学生)。考え議論する道徳授業の開発を目的として調査をすることができ(小学校、中学校、特別支援学校、海外の学校)、「考え議論する」道徳授業について考察することができた。また、中学生の道徳性の発達を明らかにするために、調査を実施することができた。これらの結果を用いて論文執筆を行う予定である。以上の理由からおおむね順調に進展していると判断している。【研究1】中学校3学年および特別支援学級を対象として、道徳性および関連する社会的能力について縦断的研究の2年目を実施する。次年度は縦断的検討を行い、学年×性別による道徳性および関連する社会的能力の発達的な差異について明らかにする予定である。【研究2】小学校、中学校、特別支援学級を対象として「考え議論する」道徳の授業の観察を行う。副次的に外国の道徳に相当する科目(倫理)の調査も実施する(フィンランド、小学校あるいは特別支援学校を予定)。人件費と謝金の一部に関して、科研費での支払いが困難となった。また、英文校正は業者を使用するため、人件費ではなく「その他」扱いとなる。以上の理由から翌年度に繰り越すこととなった助成金は次年度以降の研究遂行に必要な「その他」(英文校正、テープ起こしなどを予定)に使用する。
新奇語と感覚情報（触覚，嗅覚，味覚）の連合過程を探る実験研究

本研究は,新奇語が触覚情報,嗅覚情報,味覚情報と連合する際のメカニズムを実験によって包括的に明らかにする。先行研究は,新奇語が視覚情報と連合する時の方が,聴覚情報と連合する時よりも連合の記憶成績が良いことを明らかにしてきた。一方で,新奇語が他の感覚情報である触覚情報,嗅覚情報,味覚情報と連合するメカニズムについては検証されておらず,不明瞭なままであった。本研究は,言語学,心理学等が関わる文理融合研究である点,語の意味形成の根幹となるメカニズムを明らかにできる点,に学術的独自性と創造性がある。
オートファージー誘導による内耳保護作用の新規分子標的治療への応用

酸化ストレス下で内耳培養細胞HEI-OC1にオートファジーが誘導されるかどうかを確認するため、GFP-LC3をHEI-OC1に遺伝子導入し、共焦点レーザー顕微鏡下にGFP-LC3の発現を細胞質内に確認した。その際に、形態的にはnecrosisを起こしていることを確認した。また、電子顕微鏡下でautophagic vacuolesを認め、酸化ストレス内耳培養細胞には、autophagyとnecrosisが同時に誘導されていることを確認した。また、オートファジー誘導剤であるラパマイシンを活性酸素処理したHEI-OC1に投与したところ、細胞生存率は活性酸素単独処理時と比較して有意に上昇した。内耳培養細胞HEI-OC1に、Atg7 siRNAをエレクトロポレーション法にて遺伝子導入し、Atg7をノックダウン(KD)させることでオートファジー不全状態を作製した。Western blot法にて、オートファジー不全状態の内耳感覚細胞において、Keap1, Nrf2の発現は著しく増加したが、p62の発現は不変であった。免疫染色による共焦点レーザー顕微鏡下での観察では、Nrf2は核内に完全移行していることを確認した。酸化ストレス下でのAtg7 KD細胞では、Keap1, p62の発現は著しく増加したが、逆にNrf2は低下した。また、免疫染色にては、Keap1, p62が細胞内に蓄積したが、逆にNrf2は完全に消失したことを確認した。これは、オートファジー不全状態の内耳感覚細胞は、酸化ストレス下においてNrf2は全く機能しないことを示し、その結果として、酸化ストレスへの脆弱性が亢進する可能性を示唆している。また、p62, Nrf2, Keap1の分子間クロストークが内耳細胞死シグナル伝達において中心的な役割を果たしていることも示唆している。また、理研より譲渡されたGFP-LC3レポーターマウスを用いて、内耳でのオートファジー誘導を可視化した。GFP-LC3の発現は外有毛細胞とらせん神経節細胞で活性化していた。この結果は、オートファジーは、外有毛細胞とらせん神経節細胞でのみ誘導される可能性があることを示している。また、Atg7を内耳特異的にノックアウトしたオートファジー欠損マウスを作製した。その結果、組織学的に、コルチ器ではAtg7の発現は消失していたが、神経節細胞ではAtg7の発現は残存していた。ABRにて、高音域に有意な聴力低下を確認した。この結果は、外有毛細胞において、オートファジーは、その維持に必要不可欠であることを示唆している。有毛細胞、らせん神経節細胞、支持細胞にも分化能のある内耳培養細胞HEI-OC1細胞を用いた実験を行った。p62 siRNAをエレクトロホレレーション法にて遺伝子導入し、p62をノックダウン(KD)させることで、オートファゴソーム形成不全内耳感覚細胞を作製した。Western blot法を用いて、p62 KD HEI-OC1細胞において、LC3-IIの発現は著しく低下することを確認した。ところが、Keap1の発現は低下したが、Nrf2の発現には変化があまりなかったことを確認した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、p62 KD HEI-OC1細胞におけるNrf2とKeap1の局在を検討したところ、Nrf2は核内に移行し、Keap1は細胞質内に蓄積することを確認した。さらに、酸化ストレス下でのp62 KD内耳感覚細胞は、細胞内クリアランス低下により酸化ストレスに対する脆弱性が増し、細胞死が促進することも確認した。p62は、内耳感覚細胞においてオートファゴソーム形成に中心的な役割を果たしていることが主たる原因であると推察している。さらには、内耳感覚細胞におけるp62は、オートファジーとNrf2/Keap1シグナル伝達を介在し、内耳感覚細胞死制御の中心的な役割を果たしていることを示唆している。Nrf2 KD細胞では、Keap1, p62の発現は共に低下した。Keap1 KD細胞では、Nrf2とp62の発現は、共に低下した。これらの結果は、内耳感覚細胞におけるp62, Nrf2, Keap1の間には、分子間クロストークが確実に存在することを示している。この結果は、平成24年度までに行った酸化ストレス下の内耳感覚細胞におけるp62, Nrf2, Keap1の相互作用を裏付ける結果と考えている。酸化ストレス下では内耳培養細胞HEI-OC1にオートファジーが誘導されるかどうかを確認することを目的として、GFP-LC3をHEI-OC1に遺伝子導入し、共焦点レーザー顕微鏡下にてGFP-LC3の発現を細胞質内に確認した。その際に、核は扁平化、細胞質は膨張し、形態的にはnecrosisを起こしていることを確認した。また、電子顕微鏡下でautophagic vacuolesを認めた。

すなわち、酸化ストレス下での内耳培養細胞には、autophagyとnecrosisが同時に誘導されていることを確認した。オートファジーが酸化ストレス下で内耳細胞生死のいずれに関与するのかを確認することを目的として、オートファジー誘導剤であるラパマイシンを活性酸素処理したHEI-OC1に投与したところ、細胞生存率は活性酸素単独処理時と比較して有意に上昇した。逆に、オートファジー関連遺伝子であるAtg7をsiRNAによってノックダウンし、オートファジー誘導を止めた場合、細胞生存率は有意に著しく低下した。この結果は、オートファジーが酸化ストレス下での内耳細胞生存に非常に重要な役割を果たしていることを示唆している。Western blot法にて、酸化ストレス処理したHEI-OC1にp62, Nrf2, Keap1の時間依存性の発現増加を確認した。Atg7をsiRNAによりノックダウン(KD)するとp62の発現は低下したが、Nrf2、Keap1の発現は不変であった。酸化ストレス下でのAtg7KD細胞ではp62、Nrf2、Keap1の発現も不変であり、細胞生存率はAtg7正常細胞と比較して有意に低下した。この結果は、酸化ストレス下での内耳細胞にはp62、Nrf2、Keap1の間に直接的な分子クロストークが存在し、この分子クロストークが細胞生存に促進的な役割を果たしていることを示唆している。平成23年度の研究成果である「酸化ストレス下での内耳感覚細胞において、オートファジー誘導は、細胞生存に中心的な役割を果たす。」という結果と、「p62を介してオートファジーとKeap1/Nrf2がリンクし、内耳感覚細胞を酸化ストレスから防御している」という結果を基盤にして研究を進行させた。Atg7 KD HEI-OC1細胞では、無処理状態では、Nrf2は細胞を防御するため核内移行するものの、酸化ストレス下では、免疫組織学的にはNrf2は核内から消失し、逆にKea1とp62は細胞内に蓄積し、蛋白レベルでは、Nrf2は低下し、Keap1とp62は増加することを確認した。この結果は、オートファジーは、p62を介してKeap1/Nrf2シグナルと密接に関与し、酸化ストレスに対する内耳感覚細胞内防御機構の中心的役割を果たしていることを示唆する全く新しい知見である。さらに、p62, Keap1, Nrf2のクロストークは、細胞レベルでは内耳感覚細胞死のマーカーに、臨床的には感音性難聴のバイオマーカーになる可能性もあると考えている。一方で、in vivo studyにも取り組み、オートファジーモニタリングマーカーであるGFP-LC3レポーターマウスを用いて、外有毛細胞とらせん神経節細胞にオートファジーが誘導される可能性を確認し、内耳特異的オートファジー欠損マウスを作製し、高音域を中心とする進行性感音難聴を示した。この結果も、全く新しい知見であり、老人性難聴を含む高音障害型感音難聴の解明に寄与すると考える。酸化ストレス下での内耳細胞生死:内耳培養細胞を用いた酸化ストレス下でのオートファジーの機能解析は、当初の計画からみると、少しの遅れはあるもののおおむね順調に来ている。
インドネシア村落における建築木材の使い回しにみる長期型自然資源利用

研究目的は、インドネシアの村落において、建築木材が世代を超えて使い回される仕組みを社会経済的、木質科学的視点から分析し、長期型自然資源利用の仕組みを成立させる要件を明らかにすることであった。研究の結果、対象村落での木造住居の建て替えは、婚姻や親世代の死去などで世帯主が変更した際に主に行われ、建て替え時に約半量の建材が新居や隣人の住居の建材として再利用されていた。村落間の比較から、自然資源の質やサイズ、自然資源利用の技術、土地の個人所有の普及、引っ越し頻度、親族関係、婚姻と死去、生計などが、長期型自然資源利用が成立する要因と示唆された。本研究は、インドネシア東カリマンタン州沿岸集落において建築木材が世代を超えて使い回される仕組みの実態とその成立要因を、同国リアウ州の状況との比較を踏まえて明らかにすることを目標としている。2014年度は、インドネシア東カリマンタン州とリアウ州の沿岸に位置する対象集落に各1ヶ月程度滞在し、木造住居の相続・売買と修理・建て替えに関して調査を実施した。現地調査では計100世帯に対する聞き取り調査、集落内の木造住居や人々の居住に詳しい地元大工や高齢者への聞き取り調査、そして役所における関連資料の収集を行った。住居の相続・売買に関しては、調査世帯の多くは核家族世帯であり、現在暮らしている住居は自らが建築したものであった。多くの世帯は、結婚後集落内の数件の住居を住み継いでいた。住居の住み継ぎは、東カリマンタン州の集落よりもリアウ州の集落の方が顕著であった。彼らが複数の住居を住み継いでいる背景には、親族との関係や経済状況などがあると示唆された。両地域において住居は双系相続されており、未子相続もみられた。住居の売買や貸借については、親族間や隣人間での住居の売買や貸借は東カリマンタン州の集落においてより頻繁にみられた。また東カリマンタン州の集落では住民から新規移住世帯への住居の貸借が確認されたが、リアウ州の集落ではほとんど確認されなかった。住居の修理・建て替えに関しては、両集落において2世代以上住み継がれている住居の多くは全面的に建て替えられていた。東カリマンタン州の集落では基礎材はほぼ取り替えられないのに対し、リアウ州の集落では基礎材は数年ごとに取り替えられていた。住居の修理については、屋根の取り替えが主に行われていた。また東カリマンタン州の集落では、住居の建て替え時に、約半量の建材が新居や隣人の住居の建材として再利用されていることが明らかとなった。2015年度は、インドネシア東カリマンタン州とリアウ州の沿岸に位置する対象集落に各1ヶ月程度滞在し、木造住居に利用される建材の腐朽・劣化状況の測定と、対象世帯の社会経済状況に関する聞き取り調査を実施した。建材に関する調査では、昨年度の現地調査より、建材の中でも基礎材が長期的に利用されていることがわかっていた。本年度は基礎材を中心に腐朽・劣化状況を測定し、両対象集落間の差異とその要因について検討した。調査の結果、対象とした木造住居では数本の基礎材は強度が低下しているものの、全体としては強度が保たれていることがわかった。波打ち際あるいは水場の下に位置する基礎材が特に腐朽していた。腐朽状況としては、東カリマンタン州ではカキ類の付着により材の細り、リアウ州では材の空洞が確認できたが何によるものかは特定できなかった。また、基礎材の取り付けにおける材の方向が材の腐朽に影響することが示唆された。詳細な分析は来年度に行う予定である。対象世帯の社会経済状況については、両集落とも人々は漁業を基盤としつつも、兼業漁業として生計を立てている状況が増えつつあった。東カリマンタン州の集落では世帯構成員に市内における公務員やサービス業などの仕事に就く者がいた。リアウ州の集落では公務員や船での物資輸送などの仕事に就く者が多かった。また世帯構成員の出稼ぎなどにより送金なども生計を支えていた。一方で、漁業だけで生計を立てている世帯もみられた。東カリマンタン州では近年ジャワからの新規移住者が増加しており、彼らの多くは漁業の補助作業に就くなど、漁業からの収入が定住の足がかりの一つと示唆された。当初予定していたとおり、東カリマンタン州とリアウ州の両州において木造住居に用いられる建材の腐朽・劣化に関する測定、そして対象世帯の社会経済状況を明らかにすることができた。基礎材の測定は、潮が引く時間に床下にもぐって行うためかなりの時間と労力がかかると考え、来年度への延長も覚悟していたが、研究協力者や地元の大工などの協力を得ることができ、予定期間内に完了することができた。建材強度の測定はこれまで両集落で行われたことがなく、古い木造住居の保全を検討しはじめている郡政府の関心を引き、新聞の取材を受けるに至った。このような点から、研究そして研究成果の地域社会への還元も順調に進んでいると評価した。本研究は、インドネシア東カリマンタン州沿岸集落において建築木材が世代を超えて使いまわされる仕組みの実態とその成立要因を、同国リアウ州の状況との比較を踏まえて明らかにすることを目標としている。2016年度は、前年度までの現地調査で得られた情報の整理と分析を進めた。

また、前年度の調査時にわかった、住居の修理や建て替えに大きく関わる親世代の社会経済状況について、両州に各2週間ほど滞在し、調査した。以上の研究結果は投稿論文としてとりまとめ中である。東カリマンタン州における建築木材の世代を超えた使い回しの仕組みの実態は、次のように要約できた。人々は住居の建て替えや修理、新築、また相続などの中で、建築木材の約半量を新居や隣人の住居の建材として再利用していた。特に基礎材は、建築時から取り替えられることなく、100年以上世代を超えて利用されている例も存在した。基礎材の使い回しは材料の強度面からも成立していると言えた。劣化状況を測定した結果、材中の含水率が未使用材に比べて高くなっており強度の低下が示唆されるものの、劣化評価の一指標である超音波速度は未使用材と同程度であり、強度はおおむね保たれていることがわかった。この建築木材の使い回しの成立要因は、次のように考えられた。集落内における親族や隣人との婚姻が多くみられ、集落内で新規世帯が住居を必要する、また世代間で住居の相続が続く状況があると考えられた。経済基盤としては、漁業が新規移住者の足がかりとして機能し、また漁業と他の生業と組み合わせた兼業漁業、また集落外に住む親族からの送金などが多くの人々の経済基盤として比較的安定して存在していると考えられた。現存している住居の中には、1990年代後半から2000年代前半にかけての商業伐採の収入によって建築あるいは修理された住居が少なからず存在し、商業伐採からの経済的インパクトは大きいと示唆された。研究目的は、インドネシアの村落において、建築木材が世代を超えて使い回される仕組みを社会経済的、木質科学的視点から分析し、長期型自然資源利用の仕組みを成立させる要件を明らかにすることであった。研究の結果、対象村落での木造住居の建て替えは、婚姻や親世代の死去などで世帯主が変更した際に主に行われ、建て替え時に約半量の建材が新居や隣人の住居の建材として再利用されていた。村落間の比較から、自然資源の質やサイズ、自然資源利用の技術、土地の個人所有の普及、引っ越し頻度、親族関係、婚姻と死去、生計などが、長期型自然資源利用が成立する要因と示唆された。当初予定していたとおり、東カリマンタン州とリアウ州の両州において木造住居の相続・売買、そしてその中での修理・建て替えの状況を明らかにすることができた。加えて、来年度予定している長期利用された木材の腐朽や強度に関する分析の予備調査も実施し、調査の実施方法を検討した。また、来年度予定している調査対象世帯の社会経済状況に関する調査の準備として、役所における資料収集を進めた。このような点から研究が概ね順調に進んでいると自己評価した。来年度は、今年度までの研究内容をまとめ、論文を執筆する予定である。基礎材の腐朽・劣化に関しては、引き続き詳細な分析を進める。基礎材以外の建材の測定結果についても分析を進め、住居全体の建材の強度とそれの関連要因を両対象集落の状況を比較しつつ考察する。社会経済状況に関しては、住居の建築および修理や建て替えなどの費用は、本年度明らかにした世帯生計によって支えられていると考えられる。世帯の中には、例えば十数年前の商業伐採からの収入を建築費に充てた世帯も少なからずみられ、数世代を視野に入れて社会経済状況を把握する必要があると考えられた。
硫化水素分解生物とメタ戦略を組合せた広域下水管網長寿命化技術開発

本研究は、容易に日常点検が行えない下水管網に対して、主としてフィンランドの研究者、技術者(VTT国立研究所、他)などの研究協力者(海外)と連携して、硫化水素分解微生物の活用を実現するものである。これと地理情報システム(GIS)など様々な最新IT技術を組合せて、特定のマンホールをモニタリングポイントとし、下水管渠の損傷要因に係る環境データを計測し、メタ戦略による任意管網内の硫化水素ガス発生量を高精度で定量的に予測し、可能な限り早期(予防的)に任意のマンホールを通して効率良く噴霧(注入)する先駆的な広域下水管網の予防保全計画策定支援システムを構築するとともに山口県内の自治体において効果検証を試みるものである。2年目(最終年)となる平成22年度は、VTT(Finland)と共同で両国での各種システム開発の多くの経験を組み合わせて、下水管網の維持管理支援システムを遠隔モニタリングなどの知識情報処理(メタ戦略)技術の援用によって構築することを試みるとともに、研究成果の適用範囲拡大を検討した。その結果、以下の結果を得た:(1)ITの利用と統合システムの動作確認および機能改良:平成21年度の検討結果に基づいて開発した統合システムの動作確認を目的に、日本、フィンランド両国でそれぞれ実施し、必要に応じて逐次改良を加えた。ここでは、平成21年度に購入したインテリジェントセンサーを組込んだ計測、通信システムの小型化を達成した。このように、両国の関連する先端技術を持ち寄り改良作業の効率化をはかった。(2)長寿命化支援システムへの統合と実用化のための検証実験の実行:平成21、22年度にわたって開発してきた種々のシステムと既存技術による比較検討を行った。また、開発した統合システムの検証を山口県内の地方自治体の下水管網を対象にして実用化のための各種検証試験を行うとともに、国内外での広報に努めた。このために、日本、フィンランド両国を始め、アジア、アメリカなどでWorkshop開催および国際会議参加によって本システムの考え方の普及をはかった。初年度の平成21年度は、硫化水素分解微生物産出、特性解明および高機能化と環境データ利用によるメタ戦略との統合を行った。すなわち、メタ戦略で選定されたマンホール内の硫化水素ガスなどの環境データを遠隔計測し、最適な時期に適量の硫化水素分解微生物を噴霧(注入)する手法の確立と生物の特性に配慮した大量産出の検討が重要となるため、以下の検討を具体的に行った:(1)硫化水素分解微生物産出と特性解明および大量産出技術の調査・確立:フィンランドで活用が進んでいる、主に深海に生息する硫化水素分解微生物の高機能化と特性解明を連携して詳細に調査し、共有化を検討した。そして、大量産出に必要な技術的課題を克服するための種々の試みを、極限環境生物圏研究センターなどの国内他機関とも連携して実施した。(2)メタ戦略によるヘルスモニタリングシステムからの環境データ利用技術の確立:日本およびフィンランドで開発した無線通信センサーなどの先端技術、ネットワーク技術を持ち寄り、センサーの最適配置方法および環境データなど種々の観測データからの必要項目の予測手法を確立した。また、時々刻々収集されるデータを自動的に選別しデータベース化する統合化ソフトを開発した。各種計測は、リアルタイムで行う必要があり、ネットワークを利用した独自システムの構築を行った。なお、重要データ情報流出を防ぐため、現在フィンランドで先行している高度なセキュリティ技術の導入を検討した。

(2)長寿命化支援システムへの統合と実用化のための検証実験の実行:平成21、22年度にわたって開発してきた種々のシステムと既存技術による比較検討を行った。また、開発した統合システムの検証を山口県内の地方自治体の下水管網を対象にして実用化のための各種検証試験を行うとともに、国内外での広報に努めた。このために、日本、フィンランド両国を始め、アジア、アメリカなどでWorkshop開催および国際会議参加によって本システムの考え方の普及をはかった。
複合領域の最適化のためのロバスト設計法の開発

自動車などの複数の機能を寄せ集めてものを開発する場合,個別レベルの性能向上と全体システムの性能向上のすり合わせが上手くいかずに何度もこれを繰り返す必要が生じ,開発時間を長くしてしまうことが常態化している.QFDを書き,各機能と変数の関係を明確化したのちに,開発手順を考慮することで出戻りを減らす方法が提案されている.多層の最適化の構造を基本的には変数は確定値をベースとしており,すり合わせの解消へ向けた工夫が十分とは言えなかった.本研究では,最初に摂動範囲の最大化を含めたロバスト設計方法を確立し,複合領域の最適化を行うことですり合わせの出戻りを抑制する方法としてのロバスト設計の活用方法を提示する.自動車などの複数の機能を寄せ集めてものを開発する場合,個別レベルの性能向上と全体システムの性能向上のすり合わせが上手くいかずに何度もこれを繰り返す必要が生じ,開発時間を長くしてしまうことが常態化している.QFDを書き,各機能と変数の関係を明確化したのちに,開発手順を考慮することで出戻りを減らす方法が提案されている.多層の最適化の構造を基本的には変数は確定値をベースとしており,すり合わせの解消へ向けた工夫が十分とは言えなかった.本研究では,最初に摂動範囲の最大化を含めたロバスト設計方法を確立し,複合領域の最適化を行うことですり合わせの出戻りを抑制する方法としてのロバスト設計の活用方法を提示する.
酸化ストレスの精密測定システム確立に関する研究

まず高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に電気化学検出(ECD)を組み合わせた方法を用いた喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシンの測定は窒素化ストレスの定量法として有益であり、気道・肺における窒素化ストレスの産生亢進がCOPDの発症や進展に関与していることを示した.次に実際に人において窒素化ストレスの制御がCOPDの気道炎症を改善すると仮定し、クロスオーバースタイルにてCOPD患者にテオフィリンを投与し、検討を行った.活性窒素種の測定に関して、上述のHPLC/ECD法による定量的な検討もあわせて行ったところ、テオフィリン投与群では、気道中の活性窒素種産生量が減少し、好中球性の気道炎症が抑制されることを見出し、同薬剤がCOPDの新たな抗炎症薬となる可能性が示唆された.今後は本システムを用いてCOPDの気道・肺炎症に関連する原因物質を特定し、その病的意義及び特異的に制御し得る薬剤の検証をすすめて、COPDの病態解明・治療効率の向上へ寄与できると考えられる.まず高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に電気化学検出(ECD)を組み合わせた方法を用いた喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシンの測定は窒素化ストレスの定量法として有益であり、気道・肺における窒素化ストレスの産生亢進がCOPDの発症や進展に関与していることを示した.次に実際に人において窒素化ストレスの制御がCOPDの気道炎症を改善すると仮定し、クロスオーバースタイルにてCOPD患者にテオフィリンを投与し、検討を行った.活性窒素種の測定に関して、上述のHPLC/ECD法による定量的な検討もあわせて行ったところ、テオフィリン投与群では、気道中の活性窒素種産生量が減少し、好中球性の気道炎症が抑制されることを見出し、同薬剤がCOPDの新たな抗炎症薬となる可能性が示唆された.今後は本システムを用いてCOPDの気道・肺炎症に関連する原因物質を特定し、その病的意義及び特異的に制御し得る薬剤の検証をすすめて、COPDの病態解明・治療効率の向上へ寄与できると考えられる.本年度はまずHPLC/ECD法による3-ニトロタイロシンの定量化のため標準曲線と検出感度を測定した。その結果retention timeは13.5分、検出感度は10fmolであり、1000fmolまでの直線性も確認した。さらに、実際の検体の3-ニトロタイロシン量も100fmolまでで、この標準曲線の範疇に入ることを確認した。同時にHPLC/ECD法によるタイロシンのretention timeが5.35分で、0.110μmolの範囲で標準曲線が作成できることを確認した。次に喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシン量測定に及ぼす唾液の影響を検討するため、COPD患者の検体を用いて唾液中の3-ニトロタイロシン量をHPLC/ECD法によりそれぞれ測定した。その結果、唾液の影響は僅少であり、気道・肺の窒素化ストレスマーカーとして喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシンの発現量を測定する妥当性を得た。次にCOPD患者、および呼吸機能正常喫煙者の誘発喀痰を採取し、HPLC/ECD法により3-ニトロタイロシンおよびタイロシンを測定した。その結果呼吸機能正常喫煙者に比較し、COPD患者は有意に3-ニトロタイロシン量および3-ニトロタイロシン/タイロシン比が増大し、気道の閉塞性障害の程度と有意な逆相関を示した。以上よりHPLC/ECD法を用いた喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシン測定は窒素化ストレスの定量法として有益で、さらに気道・肺における窒素化ストレスの産生亢進がCOPDの発症や進展に関与している可能性が示唆された。昨年度,1.高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に電気化学検出(ECD)を組み合わせた方法を用いた喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシンの測定は窒素化ストレスの定量法として有益であること(∵3-ニトロタイロシンの検出感度が高く《10fmolまで測定可能》,喀痰中の蛋白結合3-ニトロタイロシン量測定は唾液の影響を受けにくいため)2.気道・肺における窒素化ストレスの産生亢進がCOPDの発症や進展に関与していること(∵COPD患者の気道中の3-ニトロタイロシン量が気道の閉塞性障害の程度と有意な逆相関を示したため)以上の2点を示した。本年度はこの結果に基づいて,実際に人において窒素化ストレスの制御がCOPDの気道炎症を改善すると仮定し,クロスオーバースタイルにてCOPD患者にテオフィリンを投与し,検討を行った。窒素化ストレスの測定に関して,誘発喀痰の細胞成分を用いた従来の免疫組織学的な検討に加え,喀痰の上清成分を用いた上述のHPLC/ECD法による,定量的な検討もあわせて行った。さらに肺機能,気道の炎症性マーカーであるIL-8測定も合わせて施行した。現在症例を集積中であるが,テオフィリン投与群では,気道中の活性窒素種産生量が減少し,好中球性の気道炎症が抑制される傾向であり,同薬剤がCOPDの新たな抗炎症薬となる可能性があり,引き続き検討する予定である。

本年度は昨年度より引き続き、実際に人において薬剤による窒素化ストレスの制御がCOPDの気道炎症を改善すると仮定し、クロスオーバースタイルにてCOPD患者にテオフィリンを4週間投与し、症例の集積を行った。窒素化ストレスの測定に関して、誘発喀疾の細胞成分を用いた従来の免疫組織学的な検討に加え、喀疾の上清成分を用いたHPLC/ECD法による定量的な検討もあわせて行った。エントリー数は16例で、テオフィリン投与により誘発喀疾中の炎症細胞数は有意に減少し、その減少した細胞の8割程度を好中球が占めていた。窒素化ストレスに対する効果については、まず免疫染色による検討を行い、テオフィリン投与により気道中のニトロタイロシン陽性細胞が減少すること、つまり、COPD気道においてテオフィリンは窒素化ストレスを改善させる効果をもつことが示された。次に本研究課題である酸化ストレスの精密測定システム(HPLC/ECD法)を用いて、誘発喀疾上清中の蛋白結合3編ニトロタイロシンの精密定量測定を加えた。その結果テオフィリン投与によりタイロシンに占める窒素化の比率が有意に減少していることが示され、精密な定量法においてもテオフィリンが窒素化ストレス改善効果を持つことを示した。またテオフィリンによるCOPD気道での窒素化ストレス減少程度は好中球浸潤抑制程度と相関し、両者の因果関係が示唆され、同薬剤がCOPDの新たな抗炎症薬となる可能性があると考えられた。今後は本システムを用いてCOPDの気道・肺炎症に関連する原因物質を特定し、その病的意義及び特異的に制御しうる薬剤の検証をすすめて、COPDの病態解明・治療効率の向上へ寄与できると考えられる。
小学校におけるタブレットを用いた戦争記憶継承のための「歴史の視覚化学習」の研究

【研究の目的】本研究では、戦後70年が過ぎ人や町の戦争記憶が失われる中、戦争を知らない小学生が、校区での太平洋戦争中の様子を中心とした調べ学習を行い、タブレット端末を活用した「歴史の視覚化学習」に取り組むことが、戦争記憶の継承や平和・防災に対する意識の変容につながるかを検証する。【研究の方法】本研究は、次の様に行う。1アンケート形式による児童の太平洋戦争に関する意識調査。2「戦時中津波被災マップ」の作成(歴史の視覚化1)。3太平洋戦争についての学習。4戦争当時の様子を知るお年寄りへの聞き取り活動(歴史の視覚化2)。5聞き取り活動のまとめ(歴史の視覚化3)と補充的学習。6まとめの交流とアンケート形式による意識調査。7結果の考察。【研究の成果】本研究の成果は次の通り。(1)視覚化1では、資料の読み取りにタブレット端末を用いたところ、8割の児童が分かりやすいと感じた。タブレットの操作については、9割の児童が使いやすいと感じた。(2)視覚化2では、80代のお年寄り6人から聞き取りを行った。その様子は、タブレット端末のビデオ機能で撮影し、後日各グループの聞き取りが見合える様にした。その結果、直接話を聞く、聞き取り映像だけを見る、合わせて9割の児童がお年寄りに当時の話を聞くことが、学習になると感じた。(3)視覚化3では、各自が学んだことを他者へ伝えるために、3つのキーワードで説明する発表動画を作成した。テーマを「空襲」や「食べ物」と絞り込み、3分程度の短い動画にすることで、発表意欲を高め、各自が複数のテーマについて発表できるようにした。全員が、作品を完成させることができ、10割の児童がタブレット端末を用いた録画や発表が便利で楽しいと感じていた。また、課題としては、歴史記憶の継承についての効果を確認するための継続的取り組みの必要性、視覚化した内容の共有方法の確立、があげられる。7結果の考察。
極細径気管支鏡と気管内超音波検査を支援する仮想内視鏡の確立と腫瘤確定診断への応用

通常の胸部写真では発見されないような微小な早期肺癌例がCTにて散見されるようになってきている。このようにして発見される末梢小型肺病変に対して従来の気管支鏡での到達は難しいことが多く、CT下での経皮的針生検でも目標が小さく術前の診断が難しい場合が多い。極細径気管支鏡は先端の径が2.8mmと非常に細く、気管支抹消まで到達可能である一方で非常に操作が難しくまた視野が狭い。その結果肺内での位置確認が難しく被検者の咳嗽反射により気管支鏡の位置ずれが起こりやすいなどの難点がある。MDCTにて収集されたデータから構築された3D画像及び仮想内視鏡は被検者の位置情報を持ち合わせており細径気管支鏡に位置センシングを行いこの2つの座標系で表現された画像データ問の位置的対応を決定することは可能である。これにより手技者は簡便に病変へと極細径気管支鏡を誘導可能となり、また気管支鏡先端部の軸位、矢状断、冠状断のCT画像で気管支内腔と病変との関係を把握し確実に生検を行うことが可能となる。肺門縦隔リンパ節に対する気管支腔内超音波検査でのエコーガイド下の吸引細胞診などの支援などの可能性も考えられる。我々は気管、気管支壁の透過性を変化させることにより気管支内腔の情報のみではなく周囲の血管やリンパ節をも色分けして同時に観察可能とした。この結果気管支鏡術者への術前及び術中の情報量は飛躍的に高まり安全に生検を行うことに役立った。極細径気管支鏡及び気管支腔内超音波検査支援仮想内視鏡システムの構築を行いその成果として肺癌患者の術前ステージングに関して"Comparison of endobronchial ultrasound, positron emission tomography, and CT forlymph node staging of lung cancer."Chest 2006 ; 130 : 710-8.として発表した。最近、肺癌CT検診や偶然CTにて発見され、通常の胸部写真では発見されない微小な早期肺癌例が散見されている。この様な末梢小型肺病変は従来の気管支鏡での到達が難しい。近年multi-detector-raw CT(MDCT)の出現により高精度の画像を立体構築し、3次元の情報を得ることが可能となり、立体診断や手術前計画などに広く応用されている。MDCTにて収集されたデータからvolume rendering法で構築された3D画像、および仮想内視鏡は、被検者の位置情報を持ち合わせている。本研究は医療分野における4次元画像診断の手法に、応用物理学・応用数学の手法を取り入れる。CTによる胸部画像を呼吸運動・心拍動を考慮して補正し、極細径気管支鏡との座標の誤差を極少化し、気管支鏡検査支援仮想内視鏡システムを構築することを目的とする。また位置センシング手法の分析を行う機器環境を確立し、これらの異なる座標を登録して誤差が最小となるように調整し、臨床応用可能な手法を確立することを最終目標とする。本年度はまず、四次元胸部CT画像を作成し、気管支の抽出と動的解析を行う解析機器環境及びコンピュータのプログラムの確立を目指した。ソフトの開発は千葉大学工学部と協同で実施し、呼吸運動及び心拍動などを含む複雑系に対して応用数学的手法を用いてモデル化を試みた。しかし、今年度中には期待した様なプログラムを開発することが出来なかった。その最大の原因は呼吸同期の組み込みであった。次年度以降は本年度不十分であった箇所を修正すると共に、モデル化した各種のパラメーターをコンピューターで離散(デジタル)的に解析するためのプログラムの開発を行う予定である。また、同時に解析した結果を4次元画像として表示するためのプログラムの開発を行う予定である。
新粒子成長過程における大気エアロゾル粒径別化学組成の追跡分級計測システムの開発

エアロゾルは直接・間接効果によって地球の放射収支に大きな影響を与える。新粒子生成はエアロゾルおよび雲凝結核の数濃度を変化させる要因として重要である。本研究では、粒子分級装置と質量分析計を組み合わせて、新粒子成長過程における粒子化学組成を実時間計測するシステムの開発を目指した。ナノ粒子型エアロダイナミックレンズを新たに開発し、レーザー脱離質量分析計と組み合わせてナノ粒子組成分析を可能にした。また、粒径分級と質量分級のタンデム装置を構築し、その自動制御ソフトを開発した。全体システムの完成には至らなかったものの、アジアにおける新粒子生成の研究に向けて重要な基盤を構築することができた。エアロゾルは直接・間接効果によって気候変動に大きな影響を与える。新粒子生成は雲凝結核数を変化させる要因として重要である。本研究の目的は、エアロゾル粒子質量分級装置(APM)やレーザー脱離質量分析計(PT-LDMS)等を駆使することにより、新粒子成長過程における化学組成の変化を実時間計測するシステムを開発することである。当該年度は各要素部分の試作・評価等を行った。1. PT-LDMSの試作・評価: PT-LDMSでは、エアロダイナミックレンズ(ADL)によって粒子ビームを生成し、特殊なトラップに粒子を捕集してレーザー脱離質量分析計により組成を定量する。粒径100 nm以下の透過率を向上させるため、ナノ粒子型ADLの設計・試作を行った。また、レーザー脱離条件や反応セル温度などの改善策について検討を行い、新粒子の主要成分である硫酸塩の検出感度を向上させた。2.高効率粒子分級部の開発: PT-LDMSは粒子分級部(単極荷電部、DMA、APM)の下流に設置され、分級された粒子の組成を計測する。APMでは、粒子に作用する遠心力と静電気力のつり合いを利用して、質量により分級する。電気移動度分級装置(DMA)による分級粒子から多価帯電粒子を除去し、+1価粒子のみを取り出すことを目的とした回転速度と電圧の最適化を粒径50 nmと100 nmにおいて行った。いずれの粒径においても、多価粒子の+1価粒子に対する割合を1/10に低減することが可能となった。さらに、単極荷電の効率を粒径10 nm、30 nm、100 nmにおいて評価した。10 nmと30 nmでは、両極荷電と比較して+1価の荷電効率が大きく向上した。一方、100 nmではほとんど変わらないという結果が得られた。当該年度は各要素部分の改良を行うとともに、これらを統合して全体システムの開発を行った。また、産総研において試験観測を実施した。1.各要素の評価・改良: PT-LDMSのナノ粒子型エアロダイナミックレンズ(Nano-ADL)と改良型チェンバーを組み合わせた装置の性能評価を行った。実験室において硫酸塩およびオレイン酸の粒子を発生させて粒子透過効率の測定を行った。その結果に基づき改良を施し、ナノ粒径の透過率向上を実現した。さらに、粒子分級部(単極荷電部、電気移動度分級装置(DMA)、APM)の試作を完了し、性能評価を行った。放電型単極荷電装置の粒子荷電効率を測定し、粒径30 nmにおいて従来の放射性同位体型荷電装置を上回る+1価荷電効率が得られることを確認した。2.全体システムの開発と校正:各要素技術のうち粒子分級部(DMAとAPM)のシステム化開発を行った。DMAの粒径を段階的に変化させ、各粒径でAPMの質量をスキャンし下流の粒子数濃度を測定するためのハードウェア・ソフトウェアを構築した。これにより、各粒径で質量分布(混合状態別の数濃度)を自動測定することが可能になった。校正用のナノ粒子発生装置については、長時間安定に粒子を発生させるための機器改良を行った。3.試験観測と分析条件の決定:開発したシステムを用いて産総研において試験観測を行った。粒子分級部の粒径分解能や積分時間等を変化させて最適条件の検討を行った。エアロゾルは、直接・間接効果によって気候変動に大きな影響を与える。(1)各要素部分の評価・改良:ナノ粒子型エアロダイナミックレンズ(Nano-ADL)に関しては、様々なオリフィスの組み合わせを試行し、可動遮蔽板を用いて粒子ビーム幅を精密に測定した。従来に比べて粒径50 nmにおける透過率および収束性を大幅に向上させることに成功した。また、レーザー脱離質量分析計(PT-LDMS)については、粒子捕集部の構造、レーザー照射条件、質量分析計パラメータを変更して検出感度の向上を試みた。硫酸塩粒子を用いて定量性の評価を行った結果、質量分析部単体として都市大気濃度レベルの測定が可能であることが示された。

高効率粒子分級部に関しては、単極荷電装置の改良を行い、粒径30 nmに加え、粒径100 nmにおいても従来の放射性同位体型荷電装置を上回る+1価荷電効率が得られることを確認した。(2)全体システムの評価・改良および観測・解析:電気移動度分級器(DMA)とエアロゾル質量分級装置(APM)を統合したシステムを用いて実大気観測を行った。データ解析アルゴリズムを開発し、粒子密度分布を調べるとともに、分級条件の検討を行った。実大気観測に適用可能なDMA-MS、DMA-APMの開発は実現したものの、DMA-APM-MS全体システムの完成には至らなかった。研究期間終了後も開発を継続し、早期の完成を目指す。今後の展開に向けて、新粒子生成の重要性が高い中国や韓国の観測場所を訪問し、研究基盤の構築を行った。エアロゾルは直接・間接効果によって地球の放射収支に大きな影響を与える。新粒子生成はエアロゾルおよび雲凝結核の数濃度を変化させる要因として重要である。本研究では、粒子分級装置と質量分析計を組み合わせて、新粒子成長過程における粒子化学組成を実時間計測するシステムの開発を目指した。ナノ粒子型エアロダイナミックレンズを新たに開発し、レーザー脱離質量分析計と組み合わせてナノ粒子組成分析を可能にした。また、粒径分級と質量分級のタンデム装置を構築し、その自動制御ソフトを開発した。全体システムの完成には至らなかったものの、アジアにおける新粒子生成の研究に向けて重要な基盤を構築することができた。1. PT-LDMSの試作・評価:平成25年度に行った実験により、PT-LDMSの粒子検出効率を向上するための方策が新たに見出されたため、設計を見直すとともに改良試作の時期をやや遅らせた。具体的には、ナノ粒子の拡散損失を低減するために、ADLと粒子トラップの距離を大幅に短縮するという改良案である。当初予定より作業時期は遅れたものの、平成26年度中に感度の向上を達成することができた。2.高効率粒子分級部の開発:APMと単極荷電部の評価・最適化はおおむね予定通り進行した。3.ナノ粒子発生装置の準備:メーカー側の都合により、当該年度に産総研に導入予定であった新型ナノ粒子発生装置の発注が延期されたため、補助金の繰越を行った。これに伴い実験の順序を一部変更した。平成26年度前半は、産総研所有の代替装置で予備実験を行った。平成26年度後半にナノ粒子発生装置を導入し、校正実験のための粒子発生条件の検討を行った。当初予定より作業時期は遅れたものの、平成26年度中に重要な項目は完了することができた。1.各要素の評価・改良: PT-LDMSについては、平成26年度に行った改良試作によって粒子検出効率が大幅に向上した。一方、実験データを詳細に解析した結果、粒子トラップ温度、反応セル温度、真空排気系についてさらなる改良案が見出された。このため、要素単体としての完成はやや遅れている。2.全体システムの開発と校正:粒子分級部のシステム化については、おおむね予定通り進行している。一方、PT-LDMSは上記の改良を優先し、全体システムとの統合の時期を遅らせた。3.試験観測と分析条件の決定:粒子分級部の試験観測についてはおおむね予定通り進行している。27年度が最終年度であるため、記入しない。
サテライトグリアと神経前駆細胞

広く終脳皮質内に分裂能を持つ細胞が散在し、それらがNG2と言うマーカーを持つことはすでに報告されている。この細胞は皮質ニューロンに接して存在することから、いわゆるサテライトグリアの一部と考えられる。新生したNG2細胞がその後どのように変化して、神経系の各細胞(ニューロン、マクログリア)になるのかを、マーカーを用いた組織化学的検索をおこない、サテライトグリアの一部が神経系の幹前駆細胞である確証を得た。研究過程で、細胞種や分化度を分類するマーカーの定義の「ゆらぎ」を修正するための検討もおこなった。我々はすでに正常成獣終脳皮質でいわゆるサテライト細胞が前駆細胞としての役割を持っている可能性を指摘してきた。本年はこの細胞のうち、NG2(+)のものが、どのように分化していくのかを追究した。細胞分裂の標識にはBrdUとKi67抗体をもちい、さらにニューロン系やグリア系の各分化段階のマーカー抗体を用いて、多重免疫染色をおこない、経時的に増殖後の分化過程について観察した。その結果、(1)NG2(+)細胞集団には未熟ニューロンのマーカーであるDCXを発現するものとしないものが存在する。(2)BrdUおよびKi67抗体にて分裂細胞を同定したところ、DCX(+)/NG2(+)細胞のみが該当し、DCX(+)/NG2(+)のサテライト細胞が神経系前駆細胞である確証を得た。(3)BrdU投与14日後の脳で、多くのBrdU陽性細胞はDCX(+)/NG2(+)娘細胞であった。さらに、(4)DCX(+)/NG2(-)細胞はTUC-4陽性・グリア系マーカー陰性であったのに対して、DCX(-)/NG2(+)細胞はGST-pi陽性でニューロン系マーカー陰性であったことから、DCX(+)/NG2(-)細胞はニューロン系に分化しつつある細胞であり、DCX(-)/NG2(+)細胞はオリゴデンドロサイトへと分化しつつある細胞であると考えられた。(5)BrdU投与28日後では、BrdU陽性で、NG2(-)/GST-pi(+)の細胞が観察され、これらはCNPaseにも陽性であったことから、成熟オリゴデンドロサイトへの分化が確認された。(6)このGST-pi反応産物は分化過程で、核内から細胞質にトランスロケ-ションすることも明らかとなった。(7)一方、核膜タンパク質のラミンのサブタイ1プ(A/C,BI,B2)とニューロン分化の関係についても検索し、サブタイプ構成比が分化に従って変動することを明らかにした。(8)レトロウィルスによる分裂細胞標識については、感染実験設備内での動物実験を立ち上げ準備実験をおこなった。われわれは、哺乳類成獣脳に存在する神経前駆細胞の分化過程を追究している。これは脳室下帯や海馬といった既知の部位でなく広く脳内に分布するものである。この前駆細胞はNG2陽性のサテライトグリアであるという前提のもとに、本科研費ではこの性質を明らかにする研究をおこなう。前年度の研究では、細胞分裂をBrdUで標識し、各種神経分化マーカーで染色して新生細胞の28日後までの分化過程を明らかにした。本年度、いくつかの疑問点解決をおこなった。(1)まず未熟ニューロンマーカーと言われているDCX分子は神経突起形成にかかわるとされるが、網膜水平細胞では分化成熟後もこの分子を持つことが判明した。このことは水平細胞が成熟後も神経突起再構成をおこない続けているか、または、この分子が別な機能も持つ可能性が示唆された。(2)これまでの研究から分裂細胞のほぼすべてはNG2陽性を示すものの、BrdUで標識された分裂細胞の一部はNG2非陽性であることが判っている。この細胞群の性質を明らかにすることが不可欠であり、染色感度・標識率や観察法などを工夫したところ、NG2非陽性の分裂細胞は血管内皮細胞であって、それを除外するとNG2細胞と神経系分裂細胞は完全一致することが確認された。(3)ニューロンとマクログリア(オリゴデンドロサイト・アストロサイト)は神経系の細胞系譜であるが、ミクログリアは由来が異なる。このミクログリアを標識して区別する必要があり、その点を検索したところ、これまで未分化細胞に発現し神経前駆のマーカーとされてきた中間径フィラメント分子nestinがミクログリアの一部にも発現することが判明した。(4)BrdU標識では1か月以上の長期追究が困難なためか神経回路形成まで観察することができなかったため、レトロウィルスで遺伝子導入したGFPにて標識したところ標識率の問題で本研究には有用でないと判明した。
脱カルボニル反応によるラジカル重合停止反応の機構解析と合成応用

高分子(ポリマー)の合成方法として最も用いられる手法であるラジカル重合反応について、その機構の詳細を明らかにすることで重合反応の最適化や有用な高分子合成法へつなげることを目的としている。本研究ではこれまでには十分に明らかではないラジカル重合反応の停止反応の機構を、反応法としてクリーンかつ効率的な脱カルボニル反応によるラジカル生成反応(脱カルボニル的ラジカル反応)をポリマー末端ラジカルの反応に適用することで明らかにする。これとともに、手法を高分子構造のプログラミングが可能な合成的法として発展させる。
がん抑制遺伝子ｐ５３を標的とする抗腫瘍性物質の深海性海産無脊椎動物からの探索

がん抑制遺伝子p53は、DNA損傷や細胞外ストレスなどに応答し、細胞周期を停止させ、正常細胞のがん化を抑制している。しかしながら、がん細胞の大半は、p53による細胞周期の制御機構を失っており、無制限の細胞増殖を繰り返すことが知られている。そのため、がん細胞に対して、p53の機能を活性化、あるいはp53と同様に細胞周期を停止させる化合物は、新たながん化学治療薬の創薬シードとして期待されている。我々は、細胞周期を蛍光タンパクの発現にって解析することができるFucciが導入されたHeLa細胞(HeLa/Fucci2細胞)の蛍光タイムラプスイメージングを海洋天然物の活性評価に応用し、細胞周期を停止させる活性を有する化合物の効率的な探索システムを構築した。また、構築したスクリーニング系を用いて、当研究室が所蔵するカイメン抽出エキスライブラリより、細胞周期停止誘導性化合物の探索をおこなった。その結果、沖縄県宮古曽根にて採取されたSpongia (Heterofibria)属のカイメンの抽出液が顕著な細胞周期の停止誘導活性を示してることを見出した。さらに、サンプルの抽出および分画をおこない、細胞周期をS期からM期にかけて停止させる新規化合物を発見した。また、類縁化合物との生物活性を比較し、細胞周期の停止に関与すると考えられる部分構造を明らかにした。我々は、本研究において、細胞周期関連機構を阻害し抗腫瘍活性を有する海洋天然物の探索研究の新しいプラットフォームを構築し、その有用性を実証した。26年度が最終年度であるため、記入しない。がん抑制遺伝子であるp53は、細胞外ストレスや遺伝子変異に応答し、細胞周期の停止やアポトーシスの誘導を引き起こす。多くのがん細胞においてp53の機能は失われており、そのため細胞のがん化が促進される。このような背景からp53の基応を回復、あるいはp53様の機能を活性化する化合物はがん化学治療薬として期待されている。海産無脊椎動物は様々な生理活性を示す二次代謝産物を含有しており、創薬におけるシードとして期待されている。特に、深海性海産無脊椎動物は、これまでに研究されてきた浅海域の海洋生物とは異なる二次代謝産物を含有すると考えられており、新たな生理活性化合物の探索源として期待されている。本研究では、深海性海産無脊椎動物からのp53を標的とする生理活性化合物の探索を目的とした。まず、当研究室所蔵の深海性海産無脊椎動物抽出エキスライブラリーを用いてp53を標的とする化合物のスクリーニングをおこなった。活性評価の指標としてp53の表現型の異なる三種類のがん細胞に対する細胞毒性試験をおこなった。p53野生型であるHCT116(p53+/+)、p53を欠損したHCT116(p53-/-)細胞、またp53変異型であるA431細胞を培養し、細胞毒性試験に用いた。スクリーニングの結果、ある深海性カイメンの抽出エキスにおいて、HCTI16細胞選択的に強力な細胞毒性を示すことが確認された。カイメンサンプルを抽出し、LCMSを用いて含有成分の成分分析をおこなった結果、活性化合物はこれまでに報告例のない新規化合物である可能性が示唆された。そのため、サンプルを大量抽出し、各種カラムクロマトグラフィー、およびHPLCを用いて目的化合物の単離精製をおこなった。得られた化合物をESIMSおよびNMRによって解析し、平面構造の決定を達成した。現在絶対配置も含めた構造決定をおこなっている。本化合物の構造決定が達成されると、有機合成による化合物の供給が可能となり、p53の機能との関係性や、化合物の生理活性機序の解析が可能となり、創薬におけるシードとしての利用へと発展していく可能性が考えられる。当該年度の研究では、新たな化合物スクリーニング系の確立、および化学分析を用いた効率的な活性評価系の検討をおこなった。がん抑制遺伝子p53は、正常細胞において、細胞障害あるいは遺伝的障害を受けた場合活性化し、細胞周期の停止ならびにアポトーシスへの誘導を引き起こすことが知られている。本研究では、p53様の機構で細胞周期の停止を停止させる化合物を検出するスクリーニング系を構築した。具体的には、生細胞の細胞周期を蛍光プローブにより可視化することのできるがん細胞を準備し、タイムラプスイメージングによる細胞周期の経時的変化を追うことで細胞周期を停止させる活性化合物の検出を試みた。海産動物の抽出エキスライブラリ約500サンプルをスクリーニングし、顕著な細胞周期停止活性を示したサンプルを選抜した。また、抽出液より活性化合物の単離と構造決定を達成した。単離した海洋天然物を用いて活性の再評価をおこなったところ、細胞周期を分裂期で停止させることが判明した。また、海産動物の粗抽出液は複数の生理活性物質の混合液であるため、目的の活性を有した化合物が存在していてもその他の化合物による影響で活性を検出できていない可能性が考えられる。そこで、粗抽出液を化学的処理を施し化学的物性の類似した化合物ごとに分類し、生物試験に供する手法を試みた。その結果、粗抽出液の状態では確認されなかった活性を検出することに成功した。今回確立した新しいスクリーニング系と生物試験前の分画システムを組み合わせることにより、今後より効率的に目的の活性化合物を発見することが可能になると考えている。