hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小胞体ストレス応答の破綻による膵β細胞障害とインスリン抵抗性の分子機構

細胞内の小胞体の機能異常が、様々な疾患の根底に隠れていることが想定されている。私たちは、小胞体の恒常性の維持に重要である転写因子ATF6αの欠損マウスを高脂肪食で飼育するなどの方法で解析した。その結果、ATF6αひいては小胞体の機能異常が、糖尿病の基本病態であるインスリン分泌障害とインスリン抵抗性亢進に複雑に絡んでいることが明らかとなった。さらに、本研究において、膵β細胞の小胞体機能維持に重要と思われる新たな遺伝子を同定した。膵β細胞障害とインスリン抵抗性形成における小胞体ストレス応答の役割ATF6αノックアウトマウスを高脂肪食で飼育したところ、野生型より耐糖能異常の悪化を認めた。この耐糖能障害には、膵インスリン含有量低下と糖負荷試験時のインスリン分泌低下を伴っていた。高脂肪食摂食によるインスリン抵抗性がもたらすインスリン産生重要の増加が、β細胞に小胞体ストレスを惹起するが、ATF6α欠損状態では、増加した小胞体ストレスに十分対抗できずに、膵β細胞数の低下を招いたと推察される。一方、肝臓では、糖新生系の酵素の発現の亢進が認められ、肝糖放出の増加を来して耐糖能低下に関与していると考えられた。また興味深いことに、インスリン負荷試験の結果から、高脂肪食飼育下では、ATF6αノックアウトマウスは野生型に比ベインスリン感受性が良好であり、骨格筋におけるAKTのリン酸化の亢進も認められた。このように、ATF6αは糖代謝に関与する各々の臓器において、固有の役割を担いながら、個体の耐糖能の調節に関与していることが示唆された。また、小胞体ストレス応答の主要な要素であるPERK-eIF2α-ATF4経路は、様々なストレス応答に共通のintegrated stress responseの上流にある。翻訳抑制因子4E-BP1は、ATF4によって転写誘導される分子であるが、酸化ストレスではeIF2α-ATF4経路が小胞体ストレスと同定度に活性化されるにも関わらず、4E-BP1の転写誘導は軽度であった。興味深いことに、酸化ストレス下では、4E-BP1のリン酸化状態が変化して、細胞の翻訳制御に関与することが明らかとなった。これらのストレス応答分子の役割を詳細に解析することによって、環境ストレスと2型糖尿病発症のメカニズムの解明の道が開けていくと考えられる。昨年度、高脂肪食で飼育したATF6αノックアウトマウスにおいて耐糖能障害を見出した。本年度まず、その病態を詳細に検討するため、電子顕微鏡を用い細胞内オルガネラの異常を検討した。その結果、ATF6αノックアウトマウスのβ細胞において小胞体の膨満化を高頻度に認めた。これは小胞体ストレスにより破綻した小胞体と考えられ、ATF6α欠損状態では、高脂肪食により増加した小胞体ストレスに十分対抗できないためと推察された。また、インスリン抵抗性の元での病態をさらに確認するため、Agouti yellow (Ay)マウスとの交配を行った。高脂肪食負荷時と同様、膵インスリン含量の低下を認めた。さらに、Akitaマウスと交配させたところ、高血糖のさらなる悪化を認め、ATF6αがβ細胞において小胞体ストレスに対抗する重要な役割を担っていることが強く示された(投稿準備中)。一方、肝臓では糖新生系の酵素とともに脂肪合成系酵素の発現亢進を認めたが、興味深いことに血中脂質は低下していた。これは、肝臓からの脂質放出系に異常が起こっていることを示唆すると考えられた。このように、ATF6αは糖尿病に関係する個々の病態を改善する方向にも、悪化させる方向にも働くことが明らかとなった。また、小胞体ストレス応答の主要な要素であるPERK-eIF2α-ATF4経路の解析等から、新規の小胞体ストレス応答分子Zcchc12/sizn1を見出した。Zcchc12は、骨形成タンパク質(bone morphogenic protein)シグナル系を修飾するタンパク質として見出された新規の分子である。その遺伝子内に小胞体ストレスに応答する部位を同定した。また、本タンパクは核内へ移行して作用を発揮すると考えられるが、その分子内に塩基性アミノ酸に富む核移行シグナルを2か所同定した。現在、その発現を抑制した細胞を作製して詳細な機能を解析中である。昨年度に引き続き、高脂肪食で飼育したATF6αノックアウトマウスの解析を、主にATF6αがインスリン抵抗性に果たす役割に焦点をあてて、行った。その結果、骨格筋において、ATF6αがPGC-1αの発現調節に重要な役割を担っている可能性を示唆する知見を得た。現在その詳細なメカニズムの検討を行っている。ATF6αノックアウトマウスの解析としては、前年度までの結果と上記の結果を加えて、論文として発表した。昨年度までの解析で明らかにした膵β細胞で小胞体ストレスで発現増加するZcchc12/Sizn1(Zincfinger CCHC

domain containing protein 12/Smad interacting zinc fingerprotein)のストレスによる誘導機構を明らかにするため、転写調節領域をクローニングし、その中にATF4結合領域となりうる配列を見出した。Non-codingregionであるexonを含め上流領域をluciferase cDNAを結合させたplasmidを用いて検討を行うと、小胞体ストレスに応答するとともにArF4タンパク単独の発現でも発現増加が認められ、逆に小胞体ストレスに対する応答が、ATF4のドミナントネガティブタンパクの発現で抑制された。以上より、Zcchc12がATF4の下流で応答することが明らかとなった。Smad1やSmad4タンパクの発現は、小胞体ストレスにて変化しないことも見出したが、Zcchc12が小胞体ストレスに応答することで、Smmdのシグナル系がストレス応答の修飾にかかわる可能性が示唆された。また、酸化ストレスが小胞体ストレス応答のIRE1-XBP1経路を修飾するメカニズムを検討するために、IRE1のタンパクリン酸化能と、リボヌクレアーゼとしての働きのそれぞれの機能を欠損した変異IRE1タンパクを発現する細胞を作製し、検討中である。
枯草菌の代謝制御ネットワークの解析

ilv-leuオペロンのTnrAによる負の制御の解明を行った。pMUTIN挿入破壊株を用いた解析により、TnrAによりilv-leuオペロンが負に制御されていることが分かり、ゲル移動度アッセイとDNaseIフットプリント解析により転写開始点約200bp上流にTnrAが結合することが分かった。欠失解析により、TnrAが転写開始点約200bp上流に結合することにより直接的にilv-leuオペロンを負に制御していることを明らかにした。しかし、この制御は既に分かっている結合位置とかなり離れていたので単独ではなく複数の因子によってこの負の制御が行われていると考えた。そこで、CodYとCcpAについて解析を行った。CodYについては、既にilv-leuオペロン上流域での結合領域が分かっていたので、CcpAの結合配列であるcreを検索し、オペロン転写開始点約100上流に見出すことが出来、DNaseIフットプリント解析によってCcpAが結合することを確認した。これらのことにより、TnrA、CodY、CcpAの3つの制御因子がilv-leuオペロン転写開始点上流域で結合し、直接的に制御を行っていることが分かった。そこで、これらの制御因子が単独で作用するのかそれとも相互作用によって作用するのかについて欠失解析を行った。その結果、グルタミンを窒素源としたグルコース最少培地にアミノ酸(ヒスチジン、チロシン、アスパラギンを除く)を添加した窒素源過剰条件下では、CcpAによる正の制御とCodYによる負の制御が作動し、TnrAは機能しなかった。さらに、CcpAとCodYは互いの制御に関係なく独立に機能することが判った。また、グルタミン酸を窒素源としたグルコース最少培地を用いた窒素源制限条件下では、CcpAによる正の制御とTnrAによる負の制御が作動し、CodYは機能しなかった。私は、枯草菌シグマ因子のECFファミリーの一つであるsigYオペロンの構造と発現について研究を行った。sigYオペロンは、6つ(sigY,yxlC,D,E,F,G)の遺伝子から構成され、窒素源飢餓条件により誘導された。ECFシグマ因子なので窒素飢餓に対応するための機能があるのではないかと考えた。その転写産物は、sigY遺伝子の31bp上流からyxlHまでの4.2kpであった。sigYオペロンの発現は、o-^Yにより正の制御を受けていた。プライマーイクステンションによる転写開始点の同定とsigYプロモーター領域のディレーション解析により、sigYプロモーターの"-10"、"-35"領域は、それぞれ"CGTC"、"TGAACG"であった。この後者の配列は、o-^W,o-^X,o-^Mが認識する-35領域配列とは区別された。sigYオペロンの転写は、YxlC,Dによりネガティブに制御された。このことは、YxlC,Dが、アンチo-^Yであることを示唆した。しかし、最初考えた窒素飢餓への対応という機能は観察することが出来なかった。o-^Yの機能については、胞子形成期に高い活性が観察されたので胞子形成との関連を疑い胞子形成テストを行った。sigY破壊の効果は、窒素源飢餓条件下での胞子形成で増加した。しかし、窒素源飢餓によるsigY誘導は、胞子形成過程に関係なかった。sigYオペロンの構造と機能は、厳しい環境で生育する幾つかの微生物で、明確に保存されていた。
リシン脱メチル化酵素ＬＳＤ１阻害をトリガーとする二重機能型抗がん剤の開発

リシン特異的脱メチル化酵素1 (LSD1)は乳がんをはじめ多くのがん細胞に高発現している。そのため、LSD1はがんのバイオマーカーや分子標的として注目されている。本研究ではLSD1とその阻害薬trans-2-phenylcyclopropylamine (PCPA)を利用した新規二重機能型抗がん剤PCPA-drug conjugate(PDC)の開発を目指した。28年度が最終年度であるため、記入しない。リシン特異的脱メチル化酵素LSD1は血液腫瘍、神経芽細胞腫、乳がん等に高発現し、がんの増殖に関与している。今日までに多くのLSD1阻害薬が報告されており、その代表としてtrans-phenylcyclopropylamine(PCPA)が挙げられる。最近の研究によりPCPAとall-trans-retinoic acidの併用が優れた抗白血病効果を示すことが報告された。またLSD1はヒストン修飾酵素や核内受容体等と協同的に働き、がんの増殖に関与することが明らかとなってきた。そのため、LSD1阻害薬とヒストン修飾酵素や核内受容体に対する阻害薬を併用すれば、優れた抗がん作用が期待できる。そこで、本研究ではLSD1の酵素活性の阻害を引き金にヒストン修飾酵素や核内受容体にも作用する二重機能型抗がん剤の開発を目指した。本年度はPCPAのLSD1阻害機構を元にPCPAと標的タンパク質に対する医薬品あるいは医薬品候補化合物をハイブリットさせた数種類のPCPA誘導体の設計、合成を試みた。合成を達成した化合物は市販のLSD1アッセイキットを利用してLSD1阻害活性を評価した。その結果、いくつかの合成化合物でPCPAよりも強いLSD1阻害活性を示した。一方で、合成化合物は生理的条件下で不安定であるという問題点が明らかとなった。この不安定さを解決するべく、化学修飾を行い、一定の安定性を獲得した化合物も得ることができた。予備的な実験ではあるが、LSD1存在下、合成化合物から対応する医薬品が放出されることをHPLCなどにより確認することできた。リシン特異的脱メチル化酵素(LSD1)は乳がんをはじめ多くのがんに高発現している。これまでにtrans-2-phenylcyclopropylamine(PCPA)をはじめ多くのLSD1阻害薬が報告されているが、臨床応用するには未だ薬理活性が不十分であると考えられる。最近の研究から、LSD1阻害薬とヒストン修飾酵素・核内受容体に作用する抗がん剤の併用が相乗的な抗がん効果を示すことが報告された。そこで、本研究ではLSD1阻害を引き金に、ヒストン修飾酵素や核内受容体にも作用する二重機能型抗がん剤の開発を目指した。本年度は、昨年度に引き続き新規二重機能型抗がん剤候補化合物の設計、合成と機能評価を行なった。その結果、PCPAと乳がん治療薬の活性代謝物4-hydroxytamoxifen(4OHT)をリンカーで結んだPCPA-tamoxifen conjugateが合成した中で最も強力なLSD1阻害活性を示した。また、質量分析により、PCPA-tamoxifen conjugateがLSD1存在下、対応する4OHTを放出することが確認された。さらに、PCPA-tamoxifen conjugateはLSD1高発現の乳がん細胞の増殖を抑制した。さらに、ウエスタンブロッティングによる評価から、PCPA-tamoxifen conjugateが乳がん細胞内でLSD1と4OHTの標的であるエストロゲン受容体の機能を阻害することが確認された。すなわち、PCPA-tamoxifen conjugateは二重機能型抗がん剤として機能していることが示唆された。当初の計画通り、LSD1を高発現するがん細胞で効果を示す二重機能型抗がん剤の創製に成功したため。当初の計画通り、化合物の合成を達成し、in vitroの実験で一定の結果が得ることができたため。最終年度はこれまでに得られたた知見を基に、構造最適化研究や引き続き新規二重機能型抗がん剤の設計、合成及び機能評価を行なうことで本研究課題の一般性の検証を行なう。今後、LSD1阻害活性を有し、一定の安定性を持つ化合物に関してはがん細胞系での評価を行っていく予定である。また細胞系での結果を併せ、新たな化合物の設計、合成も行っていく。
mRNPの形成とmRNAの局在

真核細胞内では、mRNAは特定の蛋白質との複合休であるmRNPの形で存在する。mRNPの主要なコンポーネントとしてY-ボックス蛋白質が知られる。この蛋白質の量によって、特定のmRNAの翻訳の促進あるいは抑制が調節される。本研究ではY-ボックス蛋自質FRGY2; CiYB1やYB-1をプローブとして、mRNP形成とそのmRNA代謝への影響を調べた。1. FRGY2とmRNAとの複合体を試験管内で再構成し、生化学的解析、電子顕微鏡での観察をおこなった。細胞内で貯蔵されているmRNAの状態をある程度再現したmRNPを、Y-ボックス蛋白質単独で形成できることを示した。2.ホヤ卵母細胞のciYB1と母性mRNAの局在について検討した。ciYB1は細胞質全体に存在するが、特に後極に強いシグナルが観察された。後極に局在する母性細胞質因子であるCi-macho mRNAなどはCiYB1蛋白質と複合体を形成していた。無細胞系でCiYB1はこれらのmRNAの翻訳を抑制した。3.トリDT40細胞よりYB-1を含む複合体を調製した。この複合休の解析によって、多くのRNA結合蛋白質やリボソーム奪白質がRNA依存的にYB-1と複合体を形成していることを見出したほか、RNA非依存的にYB-1と結合する酸性蛋白質YBAP1を同定した。さらに、YBAP1が無細胞翻訳系でのYB-1による翻訳抑制を解除することがわかった。YBAP1はYB-1をmRNAから引きはがすことでmRNAの翻訳を回復させるというメカニズムを明らかにした。以上の結果は、Y-ボックス蛋白質などによるmRNPの形成とその構造変化がmRNAの局在化および翻訳活性の調節に重要な役割を果たすことを示す。また、mRNPの構造変化が、YBAP1のような蛋白質によって引き起こされる可能性が示された。今回我々は、カタユウレイボヤのYボックス蛋白質CiYB1に対する抗体を作成し、卵や初期胚の免疫染色を行った。CiYB1は細胞質全体に存在するが、特に後極に強いシグナルが観察された。ホヤ卵後極には発生に重要な母性細胞質因子であるmRNAが局在している。実際、後極に局在することが知られるCi-macho mRNAやCipem mRNAはCiYB1蛋白質と共局在を示し、生化学的にも複合体を形成していることがわかった。ホヤの卵母細胞や初期胚のライセートをNicodenz平衡密度勾配遠心で分画してCiYB1の分布を調べたところ、発生の進行とともに貯蔵mRNPから離れ、リボソーム画分や、RNAと結合していない蛋白質の画分に移行した。これはCiYB1の解離が母性mRNAの翻訳開始に重要であることを示唆する結果である。一方、培養細胞を用いてYボックス蛋白質の機能を明らかにするため、これまでにトリDT40細胞のYB1遺伝子破壊株を作成し、細胞増殖が遅くなることを明らかにしている。この遺伝子破壊株にエピトープタグつきのYB1を発現させ、免疫沈降でYB1を含む複合体を調製した。この複合体に含まれる因子の同定をすすめた。動物の卵母細胞には発生に必要な蛋白質を作るためのmRNAが翻訳されずに多量に貯蔵されている。

Yボックス蛋白質は卵母細胞でmRNAに結合して貯蔵mRNPを構成している主要な蛋白質で、mRNAの安定化や翻訳調節に関与することが知られている。培養細胞を用いてYボックス蛋白質の機能を明らかにするため、これまでにトリDT40細胞のYB-1遺伝子破壊株を作成し、細胞増殖が遅くなることを明らかにした。この遺伝子破壊株にエピトープタグつきのYB1を発現させ、免疫沈降でYB-1を含む複合体を調製した。この複合体に含まれる因子の同定をおこなったところ、いくつかのRNA結合蛋白質やリボソーム蛋白質がRNA依存的にYB-1と複合体を形成していることがわかった。そのほかに、RNA非依存的にYB-1と結合する酸性蛋白質YBAP1を同定した。YBAP1はYB-1のC末側の塩基性領域と結合することがわかった。さらに、mRNAとYB-1との複合体を形成させると無細胞翻訳系でのそのmRNAの翻訳が抑制されるが、ここにYBAP1を添加することにより、翻訳の抑制が解除されることを見出した。mRNA-YB-1複合体とYBAP1をインキュベートしてショ糖密度勾配遠心で分画すると、mRNAが含まれない画分にYB-1-YBAP1複合体が見出されることから、YBAP1はYB-1をmRNAから引きはがすことによって、mRNAの翻訳を回復させるというメカニズムが明らかになった。
熱ホール測定による量子スピン液体相のスピンカイラリティ研究

物質中の電子がある種のねじれた構造をもつと、そのねじれかたに特有の性質が現れることが知られている。磁石のもととなる電子のスピンにも似たようなねじれ(スピンカイラリティ)による性質が現れることが理論的に予測されてきたが、スピンカイラリティをどのように実験的に検出してよいかわからなかった。そこで、本研究では熱流の微小な曲がり具合を測定する熱ホール測定を低温まで行うことによって、スピンカイラリティの研究を可能にする。これらの研究から量子スピン液体相におけるスピン励起のトポロジーやスピンカイラリティによる現象を明らかにする。
農協による農業経営の総合的な事業展開と地域農業の構造変化に関する研究

担い手問題の解決策の一つとしての農協出資型農業生産法人は経営数の飛躍的拡大にともない質的な変化を遂げつつある。近年みられる変化は、1耕種から酪農・畜産部門までの多様化と総合化という経営部門の変化、2農地の管理・耕作、農業経営に止まらず、耕作放棄地復旧や新規就農研修事業を通じた担い手育成、6次産業化など新たな事業を展開している。本研究は、農協による農業経営が従来の事業の枠を超えて地域農業が直面する多様な課題に対応しつつある様相と背景を明らかにするとともに、こうした事業展開が地域の農業構造に与えている影響を検討することを通じて、日本農業再編の今後の可能性に新たな視野を与えようとするものである。
細胞容積感受性クロライド・チャネルの分子細胞生理学的研究

多くの細胞は自らの容積を常に一定に保つメカニズムを持ち、細胞内外の浸透圧環境の変化によって一時的に膨張や収縮を強いられても元の容積へと復帰する能力を持つ。例えば、細胞内での浸透圧活性物質の蓄積や細胞外低浸透圧化によって膨張を強いられた場合には、そののち速やかに正常容積へと戻るところの調節性収縮(RVD:regulatory volume decrease)で応答する。このような容積調節能は、糖やアミノ酸などの有機溶質の能動的吸収の過程で細胞内外に大きな浸透圧勾配を形成する小腸上皮細胞においてとりわけ重要である。1994年度は細胞容積調節に関与する上皮細胞Cl-チャネルの特性をシングルチャネルレベルで明らかにした。多剤耐性薬物排出ポンプMDRIすなわちP糖蛋白が浸透圧性膨張時には容積感受性Clチャネルに機能スイッチするとの「ポンプ/チャネルスイッチ仮説」と、P糖蛋白は容積感受性Cl-チャネルそのものではないが、このチャネルに対してのCキナーゼを介する制御因子であるという「Cキナーゼ仲介性制御因子仮説」が提出された。そこで1995年度は、内在性のP糖蛋白が浸透圧性細胞膨張時に本当に容積感受性チャネルやそのCキナーゼ仲介性制御因子として振舞うかどうかをヒト小腸上皮細胞株Intestine 407を用いて検討し、内在性P糖蛋白については両仮説ともあてはまらないことを明らかにした。1996年度は、更に細胞外ヌクレオチドの効果を観察し、容積感受性Cl-チャネルは細胞外ATPによってオープン・チャネル・ブロックを受けること、細胞外サイクリックAMPやサイクリックGMPには同作用は見られないことを明らかにした。本年度は、MDR1遺伝子やその変異体を外来性に強制発現させたKB細胞系において両仮説を検討した結果、両仮説とも外来性P糖蛋白に対しても正しくないことが明らかになった。また、MDR1のATP水解活性は本Cl-チャネルの活性には何ら関係しないことも明らかにした。更に本年度は、容積感受性Cl-チャネルの活性化の細胞骨格系依存性と機械的膜伸展依存性の有無をしらべ、アクチン感受性を示すが、膜伸展ではなく膜のたたみこまれのunfoldingによって本チャネルが活性化されることをはじめて明らかにした。この細胞容積調節に関与する小腸上皮細胞の容積感受性C1^-チャネルの活性化のメカニズムを分子細胞生理学的立場から総合的に解明することが本研究の最終目標である。本年度は、培養小腸上皮細胞の容積感受性C1^-チャネルのシングルチャネル特性の詳細をあきらかにすることを目的にして、パッチクランプ研究を行った。私達はこれまでのwhole-cell clamp実験によって、小腸上皮細胞の容積感受性C1^-チャネルは大きな陽電圧コマンドによって急速に不活性化を示すという特徴的電位依存性を示すことを明らかにしている。そこでまず第一に、このような特徴をもったC1^-チャネルのシングルチャネル活性が浸透圧性膨張をしめした細胞の上ではcell-attachedモードで記録可能であるかどうかを確認するために、whole-cell実験とcell-attached実験を同時に行ういわゆるdouble patch-clampを行った。その結果、事実whole-cell C1^-電流の不活性化と同じ時間経過で次第に閉じていく単一C1^-チャネル活動を同定することができた。

その不活性化のスピードはwhole-cell電流と同様に印可陽電圧が大きければ大きいほど速いことが明らかとなった。そこで第二には、inside-outモードでの単一C1^-チャネル活動記録を試みたところ、パッチ膜を細胞からexciseするとそれは短時間のうちに消失することが観察された。そこで、細胞内側の液に3mM Mg存在下で1mM ATPを加えたところ、この単一チャネル活性はinside-out後も長時間維持しうることを見いだした。このチャネルの単一チャネル・コンダクタンスは、+60mVのときは32pS、+100mVのときは37pS、+140mVでは47pSであり、弱い外向き整流性を示すことが明らかになった。多くの細胞は自らの容積を常に一定に保つメカニズムを持ち、細胞内外の浸透圧環境の変化よって一時的に膨張や収縮を強いられても元の容積へと復帰する能力を持つ。例えば、細胞内での浸透圧活性物質の蓄積や細胞外低浸透圧化によって膨張を強いられた場合には、そののち速やかに正常容積へと戻るところの調節性収縮(RVD : regulatory volume decrease)で応答する。このような容積調節能は、糖やアミノ酸などの有機溶質の能動的吸収の過程で細胞内外に大きな浸透圧勾配を形成する小腸上皮細胞においてとりわけ重要である。昨年度は細胞容積調節に関与する上皮細胞C1^"チャネルの特性をシングルチャネルレベルで明らかにした。最近、多剤耐性薬物排出ポンプ遺伝子(mdrl)を外来性に強制発現させた細胞系においてのみ低浸透圧負荷によって大きな容積感受性C1^"電流が発生するという観察に基づき、MDR1すなわちP糖蛋白が浸透圧性膨張時には容積感受性C1^"チヤネルに機能スイッチするとの仮説が発表された(Valverdeeral.1992)。その後、P糖蛋白は容積感受性Cl^"チャネルそのものではないが、このチャネルに対してのCキナーゼを介する制御因子であるという仮説が提出された(Hardy et al.1995)。そこで本年度は、内在性のP糖蛋白が浸透圧性細胞膨張時に本当に容積感受性チャネルやそのCキナーゼ仲介性制御因子として振舞うかどうかをヒト小腸上皮細胞株Intestine407を用いて検討した。本細胞におけるP糖蛋白の発現は、Northern blot法、RT-PCR法、Western blot法、間接蛍光抗体法で確認された。P糖蛋白遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを4日間投与するとP糖蛋白の発現の著しい減少が見られたにもかかわらず、容積感受性C1^"チャネルの全細胞電流にはなんらの差も見られなかった。数種類のP糖蛋白単クローン抗体はいずれも浸透圧性膨張時のC1^"電流に有意な影響を与えなかった。また、P糖蛋白の基質を細胞内に投与しておいても容積感受性C1^"電流の発生はなんら影響を受けなかった。
炎症制御に関わる核内受容体機能の分子基盤の解析

近年、炎症とエネルギー代謝の相互制御メカニズムが注目されるに至っているが、両者の核内でのクロストークは、「エピゲノム制御」を介した形をとることが近年明らかになりつつある。その主役を担う一連の転写因子群のひとつが、脂溶性リガンドによって制御される核内受容体である。グルココルチコイドレセプター(GR)は、炎症を制御する代表的な核内受容体の一つである。GRの主な抗炎症メカニズムは炎症制御転写因子AP-1やNF-kBのリガンド依存性の転写抑制であることが知られている一方で、グルココルチコイドの長期投与による副作用は主にGRによる転写活性化に起因することが知られている。しかし抗炎症作用メカニズムの理解には未だにコンセンサスが得られていない。そこで、我々はグルココルチコイド受容体によるAP-1の転写抑制メカニズムを明らかにしようと考え、マクロファージ細胞系における解析に取り組んでいる。その過程で、1)グルココルチコイド依存性のc-Jun蛋白のSumo化が転写抑制の引き金となり、2)それに行き続くポリコームタンパク複合体PRC2の構成因子(EZH2)を含む複合体によるヒストンH3K27のメチル化によって可逆性のクロマチン構造変化がなされる、という2段階からなる未知の転写抑制制御メカニズムの存在を明らかにした。本年度は炎症に関与するグルココルチコイドレセプター(GR)と炎症制御転写因子(AP-1)に結合する因子群の同定を中心に行った。1.マクロファーファージ細胞系を用いた精製系の確立。ヒト単球由来のTHP-1細胞とマウスマクロファージ由来のRaw 264.7細胞を用いて、細胞の核内と細胞質内で抗体カラムを用いた目的因子の結合因子同定系を確立した。MALDI-TOF/MSとLC-MS/MSという2種類のペプチド同定方法を平行して使用し、結合する因子の中から炎症関連因子を同定した。2.結合因子の機能解析結合因子がクロマチン構造変換に関与するかどうかをヒストン修飾抗体を用いて解析した。また、タンパク分解制御に関与しているかを確認した。その結果、このような制御に関与する因子群の取得に成功した。3.炎症シグナル依存性の複合体機能の制御メカニズムの解析炎症シグナル依存性のダンパク質の挙動が明らかとなり、また、細胞質から核内への因子の移動に伴うタンパク分解機能制御が明らかになった。特に、リン酸化されたリガンドに結合しない細胞質内に存在するGRを分解する因子と分解制御機能を制御する因子を結合因子の取得に成功し、これらが核内でも機能することが明らかになったので、今後は結合する因子群の恒常発現株を作成し、複合体構成因子同定を目指す。本研究では核内受容体GRによる抗炎症作用メカニズムを解析することによる新しい創薬標的の同定の可能性を模索しているが、本年度は様々な機能制御による抗炎症作用制御の可能性を検討した。まず、エピゲノミックは制御として、GRによるAP-1に対する転写抑制メカニズムに焦点を絞って解析を行ったが、その結果GRを介するグルココルチコイド依存性のAP-1タンパク(c-Jun)のSumo化がこの転写抑制のスイッチの役割を果たしていることを明らかになった。さらにそのSumo化を契機としてSumo化されたAP-1タンパクを認識する形でヒストンH3K27をメチル化するヒストンメチル化複合体PRC2複合体の構成因子EZH2がリクルートされることを明らかにすることができた。一方で、GRタンパクの分解をリガンド依存性のGRタンパクの分解を制御する因子とリガンド非存在下のGRタンパクの分解制御を行う因子を生化学的に同定することができた。この因子群の機能によりGRにょる転写抑制の強弱が制御されていることも確認できた。これらの因子は、タンパクのターンオーバーによる制御を司っている可能性があり、エピゲノミックな制御との連動性についての解析が注目される。また、両者を制御しているGRやAP-1などのタンパク修飾を明らかにすることによってさらなる制御機構が明らかになると考えられる。実際、GRの炎症シグナル依存性のリン酸化がGRタンパクの分解制御に重要であることを明らかにしており、今後は網羅的な検索を必要としている。

本研究では炎症制御の中核を担っているグルココルチコイドレセプター(GR)による転写因子AP-1の転写抑制メカニズムの本体を明らかにすることによる炎症制御の分子基盤の探求を目指してきた。その過程で、GRを介するグルココルチコイド依存性のAP-1タンパク(c-Jun)のSumo化がこの転写抑制のスイッチの役割を果たしていることを明らかにすることができた。本年は、そのSumo化制御の詳細なメカニズムを明らかにしたうえで、これまでの解析で明らかになったGRタンパクの分解制御メカニズムにこのエピゲノム制御がどのように相互に関係するかを明らにしようとした。その結果、細胞質と核内におけるタンパク分解を司る因子は異なること、そして両者が別々のメカニズムでGRの転写制御に関与していることが明らかになった。また、そのタンパク分解制御がGRに対する修飾依存性になされることを明らかにした。GRは、その転写活性化領域に対する修飾依存性に分解制御がなされるが、その分解制御を司る領域と転写活性に相関がある事が明らかとなった。一方、AP-1構成タンパクc-Junに対してもGRのタンパク分解を制御する因子は関与しており、転写抑制御の複雑さが明らかとなった。以上の事は、グルココルチコイドの様々な組織での機能の多様性を説明しうるとともに、その薬理効果のタイミングが異なる場合の機能制御の切り替えの可能性を示唆しており、臨床的に意味でも興味深いと考えられる。
製鋼用上吹転炉のエネルギー有効利用と高効率化のための超音速ノズルシステムの開発

超音速ノズルの工業的応用例として製鋼プロセスで用いられる上吹転炉用超音速ノズルがある.上吹転炉は溶融銑鉄の上方より高圧の酸素ガスを超音速ノズルから噴射し,不純物(過度の炭素・硫黄,燐など)を気体として除去して鋼の品質を調整する一般的な手法である.製鋼用上吹転炉では,銑鉄溶融液面に向けた噴射ノズルからの超音速酸素噴流が液面に衝突するときの全圧(ピトー全圧とよばれる)が大きいほど酸素が溶融銑鉄の中に深く浸入し,不純物の除去効率が高くなる.したがって製鋼用上吹転炉の効率を向上させるためには,超音速噴流のピトー全圧が流れ方向にできるだけ遠方まで維持され減衰しないような超音速ノズルシステムの開発が必要である.大気中に噴出する超音速噴流についてはこれまで数多くの研究が行われ,ポテンシャルコア長さ,超音速域長さや噴流速度の減衰特性が明らかにされている.しかし,製鋼用上吹転炉の純酸素超音速噴流ように,高温の大気中に噴出する超音速噴流に関する研究はほとんど行われておらず,その特性は明らかになっていない.そこで,1500Kの高温大気中に設計マッハ数2.0のノズルから噴出する適正膨張噴流の数値シミュレーションを行い,超音速噴流の特性を調べた.その結果,1500Kの高温大気中に噴出する超音速噴流は,常温の大気中の場合に較べて噴流のポテンシャルコア長さが2倍以上になることが分かった.数値シミュレーション結果を詳細に調べた結果,その原因は周囲気体の温度が高い場合,噴流周囲の気体密度が小さくなるために噴流の混合領域の運動量が小さくなり,そのため,逆に噴流中心部の運動量はノズル出口の状態のまま下流まで維持されるためであることが明らかになった.転炉は,不純物を多く含む溶融状態の銑鉄中に酸素ガスを超音速で吹き込んでリン,硫黄,過剰炭素などの不純物を取り除く製鋼プロセスの一部を成している.上吹転炉用超音速噴流は鉄鋼メーカーの転炉プロセスで標準的に利用されているが,1000°Cを超える特殊な雰囲気中に噴出する超音速噴流であるため実験による再現が難しく,その特性はよく理解されていない.そこで,上吹転炉用超音速噴流の基本特性を明らかにするため,設計マッハ数2.0の超音速ノズルからの超音速噴流の非定常乱流数値シミュレーションを行った.特に,転炉の特性に大きな影響を与える噴流のポテンシャルコア長さに着目した.乱流モデルは圧縮性を考慮したk-εモデルを用いた.基礎式の空間差分は3次精度TVD法,時間積分は3段階ルンゲ・クッタ法を用いた.計算を簡単にするため,作動気体および周囲気体は物性が酸素に近い空気とした.計算条件は貯気圧0.78MPa,貯気温度298K,周囲圧力0.1MPa,周囲温度298Kと1500Kとした.流れ場は軸対称であると仮定し,中心軸上で反射境界条件,自由境界で非反射境界条件とし,ノズル出口では一次元等エントロピー理論から計算される物理量を与えた.簡単のため,気体の比熱比は一定,気体は理想気体とした.また,本計算では気体の化学反応はないものと仮定した.数値シミュレーションの結果,周囲気体温度が1500Kの場合は298Kの場合よりもポテンシャルコア長さが約2倍に伸びた.噴流中の物理量の分布を詳細に調べ,流れ方向の運動量保存則に基づいて考察した結果,周囲気体温度が1500Kの場合は混合層中の気体密度が小さいために運動量も小さくなり,その結果ポテンシャルコア中の運動量が相対的に大きくなるためポテンシャルコア長さが長くなることが分かった.超音速ノズルの工業的応用例として製鋼プロセスで用いられる上吹転炉用超音速ノズルがある.上吹転炉は溶融銑鉄の上方より高圧の酸素ガスを超音速ノズルから噴射し,不純物(過度の炭素・硫黄,燐など)を気体として除去して鋼の品質を調整する一般的な手法である.製鋼用上吹転炉では,銑鉄溶融液面に向けた噴射ノズルからの超音速酸素噴流が液面に衝突するときの全圧(ピトー全圧とよばれる)が大きいほど酸素が溶融銑鉄の中に深く浸入し,不純物の除去効率が高くなる.したがって製鋼用上吹転炉の効率を向上させるためには,超音速噴流のピトー全圧が流れ方向にできるだけ遠方まで維持され減衰しないような超音速ノズルシステムの開発が必要である.大気中に噴出する超音速噴流についてはこれまで数多くの研究が行われ,ポテンシャルコア長さ,超音速域長さや噴流速度の減衰特性が明らかにされている.しかし,製鋼用上吹転炉の純酸素超音速噴流ように,高温の大気中に噴出する超音速噴流に関する研究はほとんど行われておらず,その特性は明らかになっていない.そこで,1500Kの高温大気中に設計マッハ数2.0のノズルから噴出する適正膨張噴流の数値シミュレーションを行い,超音速噴流の特性を調べた.その結果,1500Kの高温大気中に噴出する超音速噴流は,常温の大気中の場合に較べて噴流のポテンシャルコア長さが2倍以上になることが分かった.数値シミュレーション結果を詳細に調べた結果,その原因は周囲気体の温度が高い場合,噴流周囲の気体密度が小さくなるために噴流の混合領域の運動量が小さくなり,そのため,逆に噴流中心部の運動量はノズル出口の状態のまま下流まで維持されるためであることが明らかになった.
スプライシング阻害化合物GEX1Aの作用メカニズムの解明

GEX1Aは、放線菌の代謝物から単離同定された抗腫瘍活性を持つ低分子化合物である。光親和性標識法によりGEX1Aの標的タンパク質がSAP155であることを明らかにした。SAP155は、イントロンを除去するスプライソソーム構成要素のU2snRNPに含まれるタンパク質である。スプライシング反応の進行には、キナーゼであるCdk2とホスファターゼであるPP1によるSAP155の可逆的なリン酸化制御が必須であることが報告されている。そこで、GEX1Aを添加することによるスプライシング反応阻害とSAP155のリン酸化制御の関連を調べた。その結果、GEX1Aの作用によりCdk1およびCdk2の不活性化が示唆される結果が得られた。これらの結果と先行研究から、GEX1Aの作用とCdk1およびCdk2のキナーゼ活性の関係を明らかにした。GEX1Aは、協和発酵キリン(株)により放線菌の代謝物から単離同定された抗腫瘍活性を持つ低分子化合物である。GEX1Aの特徴的な生理活性として、スプライシング反応阻害や細胞周期の停止などがある。GEX1AをHeLa細胞に添加するとサイクリン依存性キナーゼCdk2の阻害因子であるp27とともに、スプライシング反応阻害によって形成されるp27のC末端欠損型が蓄積する。スプライシング反応阻害剤としてspliceostatin Aおよびpladienolideがすでに報告されているが、GEX1Aの作用メカニズムの違いはわかっていない。そこでまずGEX1Aの標的タンパク質を探索するために、GEX1Aのビオチン付加体に光反応基を導入した誘導体を作成し、光親和性標識試薬を作成した。その結果、標的タンパク質はSAP155であることを明らかにした。そこで次に、GEX1Aを添加することによるスプライシング反応阻害とSAP155のリン酸化制御の関連を調べた。SAP155のリン酸化部位を特異的に認識する抗体で確認したところ、GEX1A添加時にSAP155のリン酸レベルが低下することを見出した。GEX1Aの特徴的な生理作用として、スプライシング反応阻害と細胞周期の停止が挙げられる。そこで、GEXIAを添加することによるスプライシング反応阻害とSAP155のリン酸化制御の関連を調べた。SAP155をリン酸化する酵素としてはCdk1およびCdk2が考えられる。Cdk2に関しては、spliceostatin Aと同様にGEX1AにおいてもCdk2阻害因子p27のC末端欠損型の蓄積を促し、これによりCdk2キナーゼ活性が低下し、細胞周期をG1期及びG2/M期に停止させる一因となっていること那確認された。一方、Cdk1についても検討したところ、GEX1Aの経時的な作用によりCdk1の不活性化が示唆される結果が得られた。これらの結果と既知の報告から、GEX1Aの作用とCdk1およびCdk2のキナーゼ活性の関係を考察した。
ヌクレオシド含有ポリマーの組織化と細胞表面の糖転移酵素による認識

ウリジンを有するポリスチレン(PUSS)を疎水性シャーレ表面にコートし、細胞膜表面にガラクトシルトランスフェラーゼを有する線維芽細胞3T3-Llの接着や増殖を検討した。ウリジンを有するポリスチレンの疎水性シャーレ友の吸着はESCAにより確認した。未処理のシャーレと比較して、ポリマーで処理したシャーレでは、スルホニルエステルに由来する硫黄のピークと、ウリジンに由来する窒素のピークが観察された。PUSSでコートされた疎水性シャーレへの線維芽細胞3T3-Llの接着は、未処理シャーレ上への接着と比較して、接着細胞数の増大が確認された。しかも、この細胞接着はEDTAによって阻害された。即ち、この細胞接着は金属イオンを必要とする特異的接着であり、ガラクトース転移酵素に2価の金属イオンが必要であることから考えて、細胞表面の糖転移酵素を介したものである可能性が高いと推測される。pussコートシャーレ表面における水の接触角を測定することにより、ポリスチレン表面を処理する際のpussの濃度によって、親水性に違いが見られることを発見した。即ち、1mg/mlの濃度で処理した場合には、pussの吸着がESCAによって確認されていても表面は疎水性を保ったままであるのに対して、50mg/mlの濃度で処理した場合には、PUSSの吸着が確認されると同時に親水性の表面に変化していることがわかった。ガラクトース転移酵素により得られた抗血清を用いて、間接免疫蛍光法によって2種類の細胞の細胞膜表面を観察すると、3T3-Ll細胞がガラクトース転移酵素を持っているのに対して、HeLa細胞はガラクトース転移酵素を持っていないことが示唆された。これら2種類の細胞を用いて細胞接着実験を行う之、細胞膜表面にガラクトース転移酵素を持たないHeLa細胞が親水性の表面に吸着しにくくなるのに対して、細胞膜表面にガラクトース転移酵素を持つと思われる3T3-Ll細胞は、ウリジンに対する特異的相互作用を介して親水性の表面にも強く接着した。
細胞の形状変化の履歴情報の記憶と呼び出し機構に関する研究

CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集は、近年ゼブラフィッシュをはじめ様々なモデル生物で盛んに行われるようになった。しかし、外来配列をゲノムへ導入するノックインに関しては、マウスなどの他のモデル生物と比べるとゼブラフィッシュには導入効率が低いという問題であった。そこで、導入効率を改善するため、クロマチン構造を緩めるDNAメチル基転移酵素阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤をゼブラフィッシュ卵に共注入し導入効率を改善させることに成功した。この新しい手法を用いてV2介在神経の前駆細胞(V2細胞)の挙動を経時的に記録できる遺伝子改変ゼブラフィッシュを作製し、V2細胞の形状履歴をライブイメージングにて記録した。その結果、従来の遺伝子改変ゼブラフィッシュを用いた場合よりも詳細な形状変化を経時的に観察でき、V2細胞の生成から非対称分裂を経てV2aとV2bの二種類の介在神経が分化するまでの様々なイベントの履歴を追跡できるようになった。現在、これらのイベントの履歴と非対称分裂後の運命選択の関係を解析しているが、まだ有意に相関する細胞挙動を特定するに至っていない。また、V2aとV2bの運命選択を決定すると考えられているDeltaCリガンドのV2細胞表面上の分布を制御する機構を明らかにするため、DeltaCタンパク質の細胞内ドメインを他のDeltaタンパク質の細胞内ドメインに入れ替えた遺伝子改変体を作製した。DeltaCタンパク質と他のDeltaタンパク質は、細胞膜上での局在が異なるため、この遺伝子改変体でのキメラDeltaCタンパク質の振る舞いとV2a/V2bの運命選択との関係を明らかにすることにより、V2細胞が形状履歴を記憶し娘細胞の運命選択を制御する機構を解析していく予定である。平成29年度は、まずV2介在神経の前駆細胞(V2細胞)の形状変化を経時的に記録することを試みた。しかし、過去の研究(Akanuma et al., Nature Communication, 7:11963, 2016)でV2細胞の形を観察するのに用いていた遺伝子改変ゼブラフィッシュTg(vsx1:GFP)では、細胞間の蛍光強度のばらつきが大きく、効率良くV2細胞の形成から分裂までを記録することが難しいことが判明した。また、V2細胞の形状変化に伴うDeltaCタンパク質の局在の定量的な変化を追跡するため、内在のdeltaC遺伝子座に直接in-frameで蛍光タンパク質の配列を導入する必要があった。そこで、これらの問題を解決するため、CRISPR/Cas9システムによるターゲティングを行うことにした。ゼブラフィッシュを用いたゲノム編集は、近年盛んに行われるようになったが、遺伝子導入に関しては、マウスなどの他のモデル生物と比べると効率の低さが問題であった。そこで、導入効率を改善するために条件検討を行ったところ、合成Cas9 mRNAを用いると、GFP陽性胚の割合は高いがモザイク性は低く、一方、リコンビナントCas9タンパク質を用いると、合成mRNAと比べてGFP陽性胚の割合は下がるが、モザイク性は上がることが分かった。また、クロマチン構造を緩めるDNAメチル基転移酵素阻害剤5-アザシチジンとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンAをゼブラフィッシュ卵に共注入すると、CRISPR/Cas9によるゲノムの切断効率、および蛍光タンパク質配列の導入効率が上昇することを見出した。現在は、これらの条件をもとに、腹側神経管マーカーであるnkx6.1やvsx1、deltaCといった各遺伝子座に蛍光タンパク質配列の導入を行っている。当初予定していた遺伝子改変ゼブラフィッシュTg(vsx1:GFP)では、V2細胞の形状履歴を効率良く記録するのに十分なGFPの発現を得られず、新たに遺伝子改変ゼブラフィッシュを作製する必要があった。また、定量性を維持したままDeltaCタンパク質の局在変化を追跡するには、内在のDeltaCタンパク質を可視化する必要があった。これらの理由から、当初の実験計画を変更し、CRISPR/Cas9システムによる遺伝子改変を行うことにしたため。

Tg(vsx1:GFP)の代わり、nkx6.1プロモーターで膜局在型mCherryを発現する遺伝子改変ゼブラフィッシュを用いる。V2細胞の同定には、vsx1プロモーターでCeruleanを発現させる。DeltaCタンパク質の可視化には、deltaC-GFP融合遺伝子を導入する。これらの遺伝子改変ゼブラフィッシュを作製した後は、当初の実験計画に立ち返り、V2細胞の形状変化の履歴と非対称分裂後の娘細胞の運命選択の関係を明らかにする。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。当該年度以降分の助成金は当初の計画通りに使用する予定である。次年度使用額については、研究計画の変更に伴い、当初の予定にはなかった遺伝子改変ゼブラフィッシュを作製する際のPCR、プラスミド精製などの生化学用試薬や飼育管理費、および飼料代として使用する。
化学コントラストを有するＡＦＭの実現に向けての研究

走査型力顕微鏡のヘッド部分の改良を行い、原子分解能の得られる率を高めた。計測されたデータからモースパラメータを算出するアルゴリズムを改良し、いままで1ピクセルあたり1秒程度かかっていたものを、1/500秒程度に短縮した。その結果、通常の走査速度である、1ライン(500ピクセル)を1秒で走査した場合、ほぼリアルタイムのモースパラメータ同定が可能となった。急冷したシリコン(111)の準安定面を観察したところ、様々なモースパラメータを有する原子分解能の像が得られた。特記すべきこととして、減衰長Lが10pm程度の分解能で演算され、その違いが原子ごとの色の差異を生んでいた点である。その際、最小ポテンシャル値Ebの大きな差は認められなかった。おそらく、準安定なシリコン表面の大部分はシリコン原子が存在し、減衰長の違いだけが色のコントラストを生んでいたと考えられる。今後、減衰長に差異のある理由を考察するとともに、多種類の原子からなる表面の観察を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。光学系の見直しを行うとともに、試料の準備方法について検討を行った。シリコンの良好な原子分解能撮像を提案した手法で実証するために、シリコンの試料準備方法に付いて検討を加え、加熱温度や排ガスの状況について調べた。その結果、従来の装置と比較して、ポンプの能力が低く、デガス、酸化膜の除去を従来の装置と同程度のレベルで実施できていないことを見いだした。現在、試料準備室のコンビネーションポンプの能力を400リットルから1600リットルに増やし、実験を行っている。AFMヘッドの各種機構に付いても見直しを行い、安定した探針のアプローチが可能となっている。提案の手法のより好ましい作動条件を見いだすべく、探針を近接力の作用範囲に入れた状態で、カンチレバー振幅、試料台位置変調振幅、各種変調周波数を変化させ、その影響を調べている。その結果、フリースタンディングのカンチレバーの振幅対周波数ノイズの関係、カンチレバー振幅と周波数シフトカーブの関係、カンチレバー振幅と極小自励周波数の関係、周波数の極小値においてスナップインを起こさない最低カンチレバー振幅、良好なSN比が得られるカンチレバー振幅等についての傾向や、最適値を求めることが可能になった。シリコンや不純物を含んだシリコンの撮像に加えて、提案する手法の有効性を示す一例として、同研究所の枝川圭一教授の協力を得て準結晶の観察を試みている。現在、各種試料準備方法を試み、準結晶のSTM観察、準結晶の従来方法に依るAFM観察を行っている。まだ原子分解能の像や、提案した手法に依る撮像に成功していない。今まではカンチレバーの最低振動周波数をプロットしていたが、取得した像がEb/LxLを表していることを示した。ここでEbはポテンシャルの谷の深さ、Lは減衰長を示す。像において複数のモースポテンシャルパラメーターがカップリングしているため、より厳密に試料の状態やポテンシャル場を求めるには、モースポテンシャルを規定する3つのパラメーターを独立して計測することが望ましい。この課題に対し、今年度は、試料探針間の距離を位置変調し、それに伴う自励周波数ωの変化を計測した。計算により、1ω成分がゼロになるように探針試料間距離を制御した場合、2ω成分とDC成分、ならびに制御にともない変化する探針試料間距離を用いることにより、3つのモースパラメーターの実時間計測が可能であることを示した。計算に要する時間は、周波数を電圧に変換する回路の時定数と、計測結果からモースパラメーターを数値演算するアルゴリズムの計算負荷によって決定される。本手法の有効性を確認するための一方法として、位置変調振幅を変化させ、それによるパラメーター同定への影響を調べた。結果として、位置変調振幅が1L程度の大きさの場合、EbならびにLの値がほぼ一定の値として求められ、実験条件によらず一定の値が得られることが示された。解析面では有意な成果を得ることができたが、実験面では、追試性の確保と、求められたポテンシャルパラメーターの定量的評価にまでは至らなかった。背景力の影響を探針形状や修飾方法、ならびにポテンシャルの制御によって低減する。それにより、より正確に探針と試料原子によって生じるポテンシャル場のパラメーターマッピングを可能にする。本手法は、様々な変調技術を用いている。

作動周波数を高め、変調の深さや、周波数を吟味し、また回路の所定数の見直しを行うことによって撮像速度の向上を図る。いままでの信号処理では散逸を考慮していなかったので、それを含んだ解析を行う。さまざまな試料に本手法を適応し、その有効性を示す。微小な10pmオーダのカンチレバー振幅や、試料位置変調に依る周波数シフトカーブやノイズカーブの取得が安定して取得可能となっており、提案の手法の有効性を良好な像の取得を通じて実証することがここ数ヶ月で可能になると考えられる。準結晶の原子分解能撮像を通じて、提案手法の有効性を示すことを予定している。ただし、準結晶は試料準備の方法や条件によって表面の状態が変化したり、スパッタの条件によっては特定の原子が優先的に抜けてしまったりと、どの程度純粋に試料の"ありのままの"状態を可視化できるか試行例を積み重ねる必要があると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。別の装置で、数年前に世界的に見ても極めて良好な原子分解能像を取得した装置が現有装置としてある。この装置では、世界に先駆けて10pmオーダの振幅でシリコン(111)7x7表面のアダトムの撮像に成功している。他に、5MHzでの原子分解能撮像、ラテラル振動による原子分解能像の取得に成功している。現在構築中の装置と平行して、この装置に提案の手法を適応するための変更を加えることを計画している。現在、透過電子顕微鏡内でも良好なフォースカーブの取得が可能となっており、電子線照射の影響が、探針試料間距離がサプオングストロームの領域でも評価可能となってきている。今後、TEM内での力学的原子種や状態の同定を可能とする。
都市計画と都市社会運動の総合的研究

前年度の研究成果を踏まえながら、3つの実態調査地区をさらに拡大・発展させた。先ず東京都心地域では、原宿地区の都市再開発をめぐる住民運動において、行政側が消極的で十分に住民のニ-ズを反映させることができず、住民運動が発展の契機を見出せないでいたのに対し、行政側が積極的に住民に働きかけ運動を喚起している地域として環状7号線沿線杉並地区を取り上げ、環境保護に関して住民へのヒアリング調査を行った。また東京郊外地域では、武蔵野市における反原発運動ニュ-ウェ-ブの事例研究から、伊方原発出力調整実験以後のニュ-ウェ-ブ全体の動向を全国的規模で検討する方向に内容的に発展させた。仙台という地方中核都市地域では、反原発運動の現地としての女川-当該県としての宮城県-中央としての東京という図式から、六ヵ所村核燃サイクル建設反対運動に焦点を合わせて、現地の六ヵ所村-周辺都市の八戸、三沢、弘前-当該県の青森県-運動を支援する全国の地域の一つとしての仙台、東京という図式をつくり、反原発をめぐるそれぞれの都市での市民運動の質的な相違と関連についての研究へと発展させた。さてこれらの対象領域は、限定された小地域、影響によって段階づけられた幾つかの地域、全国規模と3様であるが、都市社会運動に焦点を合わせている点では共通している。発見された知見としては、1.行政側は積極的過ぎても消極的過ぎても自立した市民運動の成長には有害である。2.反原発運動ニュ-ウェ-ブの中に自分で責任を持って判断し行動する近代的個人の理想型が生活者として現れてきている。3.反原発運動全体は現地、当該県の市町村、大都市の三重ネットワ-クで捉える必要がある。4.各運動体間のネットワ-クは各地のキ-パ-ソンの個人ネットワ-クの上に成立しているなどがある。今後は多摩ニュ-タウンの都市計画とその実態の調査をも加えて、さらに充実した運動理論の構築を目指す。現在、都市における社会運動は第二の大きな転換期にある。第一の転換は、従来の政党や大組織の指導によらず普通の市民が自発的に立ち上がった70年代の草の根運動の登場であった。具体的にはエコロジー運動、フェミニスト運動、反核運動などに見られる。しかし1987年後半からさらなる第二の展開が始まり、それ以前の市民運動との差異を強調し自らを「ニューウェーヴ」と呼ぶ新しい市民運動が台頭してきている。本研究ではその実態の把握のために、都心、東京郊外、地方中核都市と、地域を限定してその中での新しい市民運動の展開の実際を調査した。都心では原宿地域を取り上げ、住民の環境への意識と住民運動の生成、および都市再開発計画との関連を郵送によって調査した。そこで見出されたことは、環境の悪化に対し住民が非常な危機感をもっていること、住民と事業主の利害が鋭く対立していること、両者を調停すべき行政側の都市計画が住民のニーズを反映していないこと、その結果住民は運動を発展させる契機を見出せないでいることなど否定的なものであった。これに対して東京郊外の武蔵野市では、「ニューウェーヴ」を先取りしたような市民運動が活発に生じている。活動家へのインタビューと運動体への郵送調査によって把握した特徴は次の通りである。まず価値観は現在の産業社会を批判しオルターナティヴ社会を展望するものであること、組織は自由な自主的参加の開かれたもので意思決定はコンセンサス方式であること、主体は日常生活を営む生活者であること、運動体どうしは異種の運動をもヨコに繋いだネットワーキングを形成していることなどが明らかになった。地方中核都市としては仙台を取り上げ、運動としては反原発運動に限定し、関係者のインタビュー調査により女川-仙台-東京を結ぶネットワークおよびその運動のニューウェーヴ性を明らかにしようとしている。