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低温還元熱処理による高保磁力の3d遷移金属規則合金微粒子の創製（国際共同研究強化）

本研究では、ポリオールと呼ばれる多価アルコールを用いた液相法、すなわちポリオール法によるFe基微粒子の合成およびその熱処理により、希土類元素を一切用いずに室温で大きな保磁力を示す永久磁石用の素材を開発することを目的とし、ポリオール法でのFe基微粒子の合成および制御に関して多くの業績を挙げているUniversity Paris Diderot(仏国)のProf. Dr. Souad Ammarとの国際共同研究に取り組んでいる。昨年度までの研究において、ポリオール法によりロット状およびワイヤー状のFeアルコキシド粒子の合成に成功した。また、その粒子に熱処理を施すことにより異方形状を有した酸化鉄粒子が得られることを見出した。本年度は、ポリオール法によるアルコキシド粒子の合成と熱処理による酸化鉄粒子の作製の条件が形状に及ぼす影響を多角的に検討した。その結果、有機保護剤を添加して合成を行うと、ロット状のFeアルコキシド粒子は短くなることが明らかになった。一方、溶液の撹拌を行わずに合成を行うと、ワイヤー状のFeアルコキシド粒子は長くなる。また、熱処理を施して酸化鉄粒子を合成するとアスペクト比は小さくなるが、昇温スピードを下げることによりアスペクト比の減少は大幅に抑制できることを突き止めた。すなわち、ポリオール法で合成したFeアルコキシド粒子を前駆体とし、それに熱処理を施すプロセスでワイヤー状の酸化鉄粒子を得ることに成功した。また、上述の成果に基づいて、University of Maine(仏国)のProf. Jean-Marc GrenecheおよびUniversity of Lorraine(仏国)のProf. Michel Francoisとの国際共同研究を開始した。さらなる研究の発展が期待される。内定年度:2015ポリオールと呼ばれる多価アルコールを用いた液相法、すなわちポリオール法で合成したFeNi層状水酸化物に還元熱処理を施すと、比較的低温かつ短時間でも熱平衡に近い状態のFeNi合金粒子が得られる。本研究では、還元熱処理による合金化機構を明らかにして上述のプロセスを改良することにより、希土類元素を一切用いずに室温で大きな保磁力を示す永久磁石用の合金粒子の開発を目的とする。還元熱処理による合金化機構を明らかにし、優れた磁気特性の合金粒子を得るには、出発素材となる層状化合物粒子の結晶構造および形態を制御することが重要となる。そこで、本年度の11月1日より仏国に渡航し、ポリオール法での層状化合物の合成および制御に関して多くの業績を挙げているUniversity Paris DiderotのProf. Dr. Souad Ammarと共同研究を開始した。具体的には、異なるポリオールおよび金属塩を用いてポリオール法で合成を行った。Co塩を用いた合成の結果、層状構造を有したCoアルコキシド粒子を合成することに成功した。また、合成したCoアルコキシド粒子を、水を含むアルコールに浸漬すると層状構造の水酸化物粒子が得られることを見出した。この方法ではCoアルコキシドからCo水酸化物への変態に伴い、粒子の形態およびサイズはほぼ保持される。水酸化物粒子の形態を制御できる有効な手法を見出すことに成功した。一方、Fe塩を用いた合成の結果、ロットおよびワイヤー状のFeアルコキシド粒子の合成にも成功した。合成条件の調整により、Feアルコキシド粒子のアスペクト比を制御できることが明らかになった。層状水酸化物と類似の結晶構造を持つアルコキシドの合成に成功し、当初計画には無かった独自の方法で形態を制御して水酸化物粒子を作製するプロセスを見出した。ポリオールと呼ばれる多価アルコールを用いた液相法、すなわちポリオール法で合成したFeNi層状水酸化物に還元熱処理を施すと、比較的低温かつ短時間でも熱平衡に近い状態のFeNi合金粒子が得られる。本研究では、還元熱処理による合金化機構を明らかにして上述のプロセスを改良することにより、希土類元素を一切用いずに室温で大きな保磁力を示す永久磁石用の合金粒子の開発を目的とし、仏国に渡航してポリオール法での層状化合物の合成および制御に関して多くの業績を挙げているUniversity Paris DiderotのProf. Dr. Souad Ammarと共同研究を実施した。昨年度の研究において、Fe塩化物を用いたポリオール法によりロットおよびワイヤー状の高いアスペクト比の異方形状を有したFeアルコキシド粒子の合成に成功した。本年度において元素分析を行った結果、得られたFeアルコキシド粒子は塩素を含んでいた。また、メスバウアー効果測定により、粒子は三価の鉄で構成されていた。一方、磁化測定において粒子は室温で常磁性を示した。そこで、還元雰囲気下で熱処理を施したところ、Feアルコキシド粒子は酸化鉄に変態した。また、アスペクト比は小さくなるが熱処理後においても異方形状が保持されることが明らかになった。さらに、室温における磁化曲線は強磁性の振る舞いを示した。すなわち、ポリオール法で合成したFeアルコキシド粒子を前駆体とすることで、異方形状を有した強磁性の酸化鉄粒子を得ることに成功した。当初計画に無かったが、独自のプロセスで異方形状を有した強磁性の酸化鉄粒子を得ることに成功した。

昨年度までの研究において、ポリオール法によりロット状およびワイヤー状のFeアルコキシド粒子の合成に成功した。また、その粒子に熱処理を施すことにより異方形状を有した酸化鉄粒子が得られることを見出した。本年度は、ポリオール法によるアルコキシド粒子の合成と熱処理による酸化鉄粒子の作製の条件が形状に及ぼす影響を多角的に検討した。その結果、有機保護剤を添加して合成を行うと、ロット状のFeアルコキシド粒子は短くなることが明らかになった。一方、溶液の撹拌を行わずに合成を行うと、ワイヤー状のFeアルコキシド粒子は長くなる。また、熱処理を施して酸化鉄粒子を合成するとアスペクト比は小さくなるが、昇温スピードを下げることによりアスペクト比の減少は大幅に抑制できることを突き止めた。すなわち、ポリオール法で合成したFeアルコキシド粒子を前駆体とし、それに熱処理を施すプロセスでワイヤー状の酸化鉄粒子を得ることに成功した。また、上述の成果に基づいて、University of Maine(仏国)のProf. Jean-Marc GrenecheおよびUniversity of Lorraine(仏国)のProf. Michel Francoisとの国際共同研究を開始した。さらなる研究の発展が期待される。2種類以上の遷移金属元素を含むアルコキシド粒子の合成およびそれを用いた水酸化物粒子の合成を進める。異方形状に由来した保磁力の向上が期待されるので、熱処理条件の最適化に取り組む。
学校適応促進のための「読み書き学習支援」と「社会スキル発達支援」の統合

本研究では,発達障害のある幼児期,学齢期の子どもに対して,「読み書きスキル」「社会スキル」の双方に関するコンピュータを活用した学習・発達支援教材を開発し,それを大学研究室および家庭内で継続的に実施し,その学習効果を,縦断的に分析することを目的とした。効果が実証された支援プログラムを、包括的発達支援プログラムとして統合した。介入研究を実施した結果、「読み書きスキル」「社会スキル」に含まれる適切な多様な行動に焦点を当て、学習機会を最大化し、高密度で強化すること、および、実証された支援方法をコンピュータに実装し、毎日家庭で実施してもらうことで、その獲得、般化、維持がなされることが明らかになった。平成26年度の実績として、まず第1に、学校適応のための包括的で系統的なアセスメント・ツールを構築した。以下はその評価項目の例である。1.「読み書きスキル」(1)文字(清音、特殊音節)、単語、句、文の「読み」。(2)ひらがな文字(清音、特殊音節)、単語、句、文の「書き」。(3)数。2.「社会スキル」(1)基本的コミュニケーションスキル。(2)日常生活スキル。(3)ルール理解スキル。(4)会話スキル。第2に、コンピュータを活用した学習・発達支援教材を開発した。「読み書きスキル」として、漢字の学習のためのコンピュータ支援指導プログラムを開発した。各試行において、視覚刺激としての漢字を提示し、同時に聴覚刺激としてその読みを対提示した。2つの刺激の対提示の直後に、絵を提示することで「意味」を付与するプログラムとした。10漢字を1セットとし小学校1年生の発達障害児に適用した。その結果、2回の同時提示訓練で、全問正解に到達した。第3に、コンピュータ支援教材として、タブレット端末を用いて社会スキルの指導を行った。その結果、適切な行動をあらかじめ画像化してそれを模倣させる「モデリング」訓練ではなく、iPadなどのタブレット端末を用いて、対人相互作用場面における子ども自身の行動を撮影しておき、その行動が出現した直後に映像として子ども自身に示すことで、自分の行動を自分自身でモニターする「ビデオフィードバック」訓練が有効であることがわかった。第4に、小学校高学年の児童を対象に、読んでいる時の視線追跡反応の計測と、読み理解の評価を行った。その結果、単語提示数が増加するほど、空間スペースの影響を受けやすく、適切な視線移動が難しいことがわかった。「分かち書き」の使用が有効であることが示された。さらに、単語、文節単位で読み指導を行うことで、文章理解も向上することがわかった。平成27年度の実績として、発達障害児を対象とした「小学校1年生で必要とされる行動チェックリスト100項目」を作成し、評価を行った。実際に保護者や支援者が当該の子どもを観察して支援前後で評価を行い、「読み書きスキル」支援と「社会スキル」支援の効果を検討した。以下が評価項目の例である。1.「読み書きスキル」(1)文字(清音、特殊音節)、単語、句、文の読み。(2)ひらがな文字(清音、特殊音節)、単語、句、文の書き。(3)数。2.「社会スキル」(1)日常生活スキル。(2)ルール理解スキル。(3)会話スキル。支援は、新たに開発した「学校適応のための包括的・系統的支援プログラム(Keio School Start Program: KSSP)」にもとづいて行った。大学のラボでの学習に加え、獲得した行動の定着をはかるため家庭でも取り組んでもらえるよう「コンピュータ支援教育教材」をタブレット型PCに実装し、保護者がそれを用いて支援を行った。その結果、標準検査による読み書き評価のスコアが向上した。同時に、社会スキル支援のため「学校シミュレーション」場面を構築し、その文脈の中での支援を行った。その結果、全体指示に対して正しく反応する数が増加し、さらに着席時間が長くなった。特に社会的スキルに困難さが見られた自閉症児に対して、本人の様子を撮影した動画を本人自身に見せ、適切な行動についてのフィードバックを行う「自己モニタリング法」を用いた支援を行った。その結果、適切な行動が獲得された。また、他者におもちゃを貸す、他者の話を聞く、負けても「大丈夫」と言う、などの社会スキルが獲得された。また、集団活動(集団遊び)の中で、身体プロンプト、言語プロンプトを用いた支援を行うことで集団遊びの輪に入る行動、協力行動が獲得された。読むスキル、書くスキル、理解するスキル、表現するスキル、生活スキル、適応スキル、コミュニケーションスキル、集団生活スキルなど、個別のスキルについての評価項目を精査し、それらを包括的に評価する項目を作成した。平成27年度には、それを構造化された面接場面での聞き取りによって実際に事前評価し、支援後の評価で変化を検出できた点が成果としてあげられる。また、上記の個別モジュールにとどまらず、学校シミュレーション場面を設定し、その中で包括的な発達支援・学習支援を実施し、以下のような成果を得たことも大きな成果である。(1)支援場面、家庭場面、園場面など子供を取り巻く多くの環境において、「読み書きスキル(ひらがな50音が読める、お手本を見て書ける、聴いて書けるなどの項目)」が向上した。(2)「社会的スキル(挨拶をする、おもちゃを貸す、ルールを守る、友達の輪に入る、片付ける、相槌をうつ、チャイムを聞いて着席する、忘れ物を申告するなどの項目)」が向上した。その中でも、新たに開発したコンピューター支援教育教材によって、読み習得に大きな成果が得られた。

単語読み課題については、「絵」「文字」「音声」を時系列的に提示し、3者の関係性を学習させる指導を行った結果、2名とも単語の読みを獲得した。さらに、訓練で使用していない単語についても読むことができるようになった。文章読み課題については、興味のあるキャラクターを主人公にした文章を文節区切りで時系列的に読む練習を大学ラボと家庭の両方で繰り返し実施した。その結果、読み時間が短くなり、正確性も増加した。訓練で使用していない文章についても訓練で用いた刺激と同様の効果が示された。平成28年度には、発達障害児を対象に、就学移行のための総合的なアセスメント(評価)と支援を実施した。評価として、発達障害児の行動と同時に、これまで開発した「小学校1年生で必要とされる行動チェックリスト」、「保護者へのインタビュー」、「保護者ストレス尺度(Parent Stress Index)」を実施した。開発した「学校適応のための包括的就学移行支援プログラム(Keio School StartProgram: KSSP)」を、発達障害児2名をペアとして、2ペアに対して適用した。集団活動の基礎となるスキル獲得のため、個別課題を週1回実施した。「社会スキルのビデオ課題」、「読み」、「協調運動」などをターゲット行動とした。また、獲得した行動の定着をはかるため家庭でも取り組んでもらえるよう「コンピュータ支援指導教材」を開発し、タブレット型PCに実装し、保護者がそれを用いて家庭で支援を行った。同時に、学校シミュレーション場面を設定して、集団指導を週1回実施した。「読み聞かせ」、「経験したことの発表」、「質問応答」、「共通の趣味をめぐる会話」、「姿勢・注意保持」、「共同運動」などをターゲット行動とした。個別指導、家庭での指導の結果、以下のことが示された。(1)読み書き評価のスコアが向上した。(2)ビデオ映像に対する適切なコミュニケーションを獲得した。(3)大人との間の協調運動が可能となった。集団指導の結果、以下のことが示された。(1)全般的注意、適切な姿勢の保持時間が増加した。(2)指示従事行動(コンプライアンス)が安定して出現するようになった。(3)適切な質問応答が可能になった。(4)問題行動(離席、かんしゃくなど)が減少した。これまでの研究で、読みスキル、書きスキル、理解スキル、表現スキル、適応スキル、コミュニケーションスキル、社会スキル、集団生活スキルなどの項目をモジュール化し、それぞれに対して、以下の3段階の支援構造を設定して、支援を進めてきた。このことで、現在までにそれぞれのスキルの向上を示すデータを得てきた。支援構造として、以下の設定を行った。(1)個人への支援、(2)セラピストとの相互作用の中での支援、(3)友人(peer)との相互作用の中での支援。特に、個別指導場面、家庭指導場面、学校シミュレーション場面を設定し、獲得が必要な各モジュールに対応させた文脈の中で、学習を進めてきたことが成果につながったと考えられる。
ピエゾセンサーを用いた簡便な嚥下機能評価システムの開発

過去の研究の結果から、在宅における患者自身での使用を考慮し、小型でピエゾフィルムを用いた嚥下機能評価訓練装置(ピエゾセンサーPC入力装置)を試作した。正常者の嚥下機能がこの試作機で評価可能か検討した。この嚥下機能評価訓練装置を用いたRSSTでの嚥下運動の検出率は91. 5(%)であった。よって本試作機は、ピエゾフィルムの湾曲の大きさから出力される電圧値によって、嚥下機能の評価ができる可能性が示された。RSSTを行う前に口腔水分計にて確認をしてから分析を行った。VFと同時分析も開始した。本結果は、2012年5月に日本補綴歯科学会で報告予定である。また、無歯顎高齢者補綴治療による嚥下機能改善効果に対する基礎研究について、高齢無歯顎患者の補綴治療による嚥下機能改善の基礎研究として、下顎義歯の大臼歯部舌側床翼長が長すぎると嚥下時に痛みを伴うことから、下顎乾燥頭蓋骨について大臼歯歯頸線から外斜線及び顎舌骨筋線までの距離の研究を行い、外斜線と顎舌骨筋線の関係や下顎大臼歯部の床翼長の指標の結果を報告した過去の研究の結果から、在宅における患者自身での使用を考慮し、小型でピエゾフィルムを用いた嚥下機能評価訓練装置(ピエゾセンサーPC入力装置)を試作した。また、無歯顎高齢者補綴治療による嚥下機能改善効果に対する基礎研究について、高齢無歯顎患者の補綴治療による嚥下機能改善の基礎研究として、下顎義歯の大臼歯部舌側床翼長が長すぎると嚥下時に痛みを伴うことから、下顎乾燥頭蓋骨について大臼歯歯頸線から外斜線及び顎舌骨筋線までの距離の研究を行い、外斜線と顎舌骨筋線の関係や下顎大臼歯部の床翼長の指標の結果を報告した嚥下機能評価について、携帯型超音波診断装置にて,ボランティアの正常者に対して嚥下時の舌エコー画像について検討し,分析可能であることを確認した。具体的にはピエゾフィルムを用いた簡易型嚥下機能評価装置を開発した。このピエゾフィルムによる簡易型嚥下機能評価装置の出力波形パターンと超音波画像および,咬筋筋電図は同時測定可能であることが明らかになった。無歯顎高齢者補綴治療による嚥下機能改善効果に対する基礎研究について,高齢無歯顎患者の補綴治療による嚥下機能改善の基礎研究として,下顎義歯の大臼歯部舌側床翼長が長すぎると嚥下時に痛みを伴うごとから,下顎乾燥頭蓋骨について大臼歯歯頸線から外斜線及び顎舌骨筋線までの距離の研究を行い,外斜線と顎舌骨筋線の関係や下顎大臼歯部の床翼長の指標の結果を報告した。本研究の目的は非侵襲的にかつ簡便に嚥下機能を評価する方法の開発である。この嚥下機能を評価する簡便な方法として、Piezoelectric Pulse Transeducer(以下PPT)を頸部に貼付して同部の動きを電気信号として出力し、咽頭期の嚥下運動を解析する方法が考案されている。研究協力者らは、PPTから出力された電圧とVF画像とを同時比較して、PPTの嚥下機能評価についてその有用性を報告してきた。本開発研究では、PPTのセンサー部分がフィルム状になったピエゾフィルム(東京センサー社)を使用した。ピエゾフィルムとは柔軟性のある圧電素子の一種である。ピエゾフィルムの嚥下機能評価についても報告があり、研究協力者らは嚥下時にPPTとピエゾフィルムは近似した電圧波形が記録できることを報告した。以上の先行研究の結果から、在宅における患者自身での使用を考慮し、小型でピエゾフィルムを用いた嚥下機能評価訓練装置(ピエゾセンサーPC入力装置)を試作した。正常者の嚥下機能をこの試作機で評価可能か検討した。この嚥下機能評価訓練装置を用いたRSSTでの嚥下運動の検出率は91.5(%)であった。よって本試作機では、ピエゾフィルムの湾曲の大きさから出力される電圧値によって、嚥下機能の評価ができる可能性が示された。RSSTを行う前に口腔水分計にて口腔乾燥状態を確認してから分析を行った。本結果は、「ピエゾフィルムを応用した嚥下機能評価訓練装置の試作」という演題で、2012年5月に横浜市で開催される日本補綴歯科学会で報告予定である。

また、無歯顎高齢者補綴治療による嚥下機能改善効果に対する基礎研究について、高齢無歯顎患者の補綴治療による嚥下機能改善の基礎研究として、下顎義歯の大臼歯部舌側床翼長が長すぎると嚥下時に痛みを伴うことから、下顎乾燥頭蓋骨について大臼歯歯頸線から外斜線及び顎舌骨筋線までの距離の研究を行い,外斜線と顎舌骨筋線の関係や下顎大臼歯部の床翼長の指標の結果を報告した。
海洋天然物プラキニジンAをはじめとする複雑な複素環骨格の効率的合成法の開発

プラキニジンAをはじめとするプラキニジン類は1990年代にバヌアツ沿海で採取された海綿より単離され、ピロロアクリジン骨格を有する天然有機化合物として初めて構造決定された化合物である。複雑に窒素原子が置換した平面構造を有し、in vitroに於いてヒト大腸癌細胞HCT-116に細胞毒性、逆転写酵素阻害作用を持つことから、医薬品のリード化合物として期待できる。しかし、その位置選択的な置換基導入が困難であることから未だ全合成の報告はなされていない。そこで、プラキニジン類の全合成を達成しつつ、その特徴的なピロロアクリジン骨格の構築法を確立することにより、多彩なピロロアクリジン誘導体を合成するとともに、構造活性相関を明らかにすることを本研究の目的とする。プラキニジン類の合成で最も困難が予想される6置換芳香環であるB環はClaisen転位で構築できると考えた。モデル基質の検討において、Cinnamyl phenyl ether誘導体を加熱したところ、通常のClaisen転位体と、1,2-転位した異常転位体の混合物を得た。溶媒や添加剤の条件を検討したが、1,2-転位体の生成を抑制することはできなかった。そこでphenyl基のオルト位に電子吸引基であるメチルエステルを導入した基質において同様の条件で反応を行ったところ、1,2-転位は全く観測されず、Claisen転位体のみを得ることに成功した。今後、得られた転位体からプラキニジン類への誘導を行う。プラキニジンAをはじめとするプラキニジン類は1990年代にバヌアツ沿海で採取された海綿蔭り単離され、ピロロアクリジン骨格を有する天然有機化合物として初めて構造決定された化合物である。モデル基質の検討において、Cinnamyl phenyl ether誘導体を加熱したところ、通常のClaisen転位体と、1、2-転位した異常転位体の混合物を得た。溶媒や添加剤の条件を検討したが、1、2-転位体の生成抑制することはできなかった。そこでphenyl基のオルト位に電子吸引基であるメチルエステルを導入した基質において同様の条件で反応を行ったところ、1、2一転位は全く観測されず、Claisen転位体のみを得ることに成功した。
新規実践的インフルエンザ診断法の確立：高速PCR反応槽と自動分注流路の融合

インフルエンザウイルスの迅速診断技術の開発を行った。既に確立した超高速RT-PCR法(SHRT-PCR)法をベースとして、自動分注流路を組み込んだ新しいSHRT-PCR装置を試作し、ウイルスの迅速測定を試みた。流路に関しては当初の予定と異なり熱による変形等、予想外の問題が発生し、機能するには至らなかった。一方で、高速のPCRシステムは稼働し、一代前の機器とほぼ同等の速度を再現することができた。つまり、一代前のようなCDタイプの特殊なケースを用いなくてもSHRT-PCRが可能であることを示すことができた。今後の課題としては流路が機能するような条件の確立である。
ランタン銅酸化物の正方晶相と超伝導に関する研究

本研究では、La_<2-x>Sr_xCuO_4系の(高温)正方晶相(p>0.2)の超伝導特性を明らかにするため、T<Tcにおける電子比熱係数γの減少とマイスナー反磁性の大きさから超伝導体積百分率を調べた。T<Tcでのγの減少から正確な体積百分率を得るために常伝導状態のγ値(γ_N)を決める必要がある。今回は、Cuの一部をZnで置き換えることによって、超伝導を抑制しγ_Nを測定した。結果をまとめると、(1)常伝導相と超伝導相におけるγ値の差から見積った超伝導体積百分率fは、xが0.2を越えたあたりからxの増加と共に小さくなっていく。しかし、x=0.22ではfはまだ80%を越えており、正方晶相の超伝導も十分バルク的であることが分かる。(2)反磁性の大きさはフラックスの閉じ込めの影響を受けるため電子比熱系数γの測定に比べ信頼性が劣るが、やはり、(高温)正方晶相でも超伝導はバルク的との結果が得られた。以上の結果から、常圧の正方晶相(x>0.2)は、高圧下における正方晶相と同様に、バルク超伝導を示すことが結論された。しかし、xが0.2を越える領域では超伝導がギャップレスとなるため電子比熱係数γはT<<Tcでも有限の値に留まる。La-Sr系ではxが0.2を越えると局在磁気モーメントが現れるが、このことがこの領域の超伝導がギャップレスとなることと関連しているものと思われる。
人工遺伝子回路によって誘導される適応現象のトランスオミクス解析

細胞には、様々な環境の変化に柔軟に適応し、その適応形質を安定に継承する能力があります。この能力は遺伝子回路自体がもつ可塑性に基づくものであり、突然変異は適応状態を固定する役割を果たすという考え方が古くから唱えられてきました。私達は、人工遺伝子回路を介して酵母細胞に選択圧を加えると、それに適応した状態が選択圧消失後も安定に保持される現象を見出しました。その仕組みを調べるために、適応を起こした細胞のDNA、染色体、RNAの各階層を網羅的に調べるトランスオミクス解析を行い、動く遺伝子やヒストン修飾やミトコンドリアの関与の可能性を示唆する結果を得ました。我々は、出芽酵母に人工遺伝子回路を利用してS-アデノシルメチオニン(SAM)レベルを高く保つような選択圧を加えると、選択圧に対する適応が誘導されるのみならず、それが選択圧消失後も安定に継承されることを見出した。本研究では、この適応現象についてゲノム・エピゲノム・トランスクリプトームの階層を跨ぐトランスオミクス解析を行うことによって、適応誘導の背景にある遺伝子回路の可塑性と適応した発現パターンの安定継承を司るエピジェネティクス機構の2点を明らかにすることを目的に研究を行った。まず、適応株2種についてRNA-Seqによるトランスクリプトーム解析を行ったところ、レトロトランスポゾンTy1の発現誘導とSAM合成系遺伝子群の発現抑制を認めた。そこで解析対象の適応株の数を増やして、Ty1の発現レベルと細胞内SAM濃度の関連を検討したところ、両者の間に有意な相関が見出された。この発現パターンの形成に関わるエピジェネティック変化を検討すべく、ヒストンのメチル化や配置に影響を及ぼす遺伝子の破壊株を調べたところ、H3K4メチレースSET1の破壊株で適応株と同様のレポーター遺伝子誘導が見られた。適応株ではH3K4me3レベルが低下していた。次に、非適応株と上記2株について全ゲノム配列の決定を行ったが、転移は見出されず、染色体の異数性も見出されなかった。一方、別途単離した適応株については、ミトコンドリアゲノムの大規模欠失が見出され、上記2株の1株についてもミトコンドデータが得られた。以上の解析から、H3K4me3およびミトコンドリアゲノムの適応現象への関与が示唆された。
小腸を対象としたヒスタミンH2受容体の傷害制御

本課題は、ヒスタミンによる腸管細胞傷害とH2ブロッカーによる傷害緩和のメカニズムを解明することである。本年度の研究目標は、H2ブロッカーの血球系細胞における影響と粘膜防御に対する効果を検証することであった。放射線照射後、尾部から採取した血液の血球数をカウントした。照射4日後には、赤血球数は投与前と比較して約80%程度まで、白血球数は15%程度までそれぞれ減少した。一方で、H2ブロッカー投与群においても同様の減少が見られ、H2ブロッカーによる造血系に対しての全身性レスキューは得られなかった。続いて、末梢での出血傾向を検証するため、組織標本を作成し、小腸絨毛組織に漏れ込んだ赤血球を視覚的に観察し、絨毛あたりの血球数をカウントし、評価したところ、照射線量(3Gy、5Gy、7Gy)が上がるつれ、血球数が上昇し、H2ブロッカー投与群で、顕著に低下した。これより、H2ブロッカーは少なくとも消化管の出血傾向を抑制する効果があることが明らかとなった。またムチン量を比較するため、小腸組織からムチンを抽出した。照射後のムチン量は、コントロール群に比べて増加したが、H2ブロッカー投与群では、さらに増加した。以上より、照射後4日目にはすでに回復が開始されている状態で、自己防御により、ムチン増加が見られているものと考えられた。そして、H2ブロッカーによりさらに回復が助長され、粘液による防御能が促進しているものと示唆された。ただし、大腸においては、上記のような傷害と回復の傾向は見られず、放射線感受性およびH2ブロッカーの作用点について、小腸と大腸では大きく異なると考えられた。事前に実験シミレーションを行い、マウスの体温調節管理を行うなどの工夫により、血液採取がスムーズに進行したこと、マウス個体差が少なく、安定したデータが得られたことにより、その後のデータの解析と精査に入念に行うことができた。これまでに、放射線照射により傷害をうけた消化管粘膜にH2ブロッカーを補うと、防御機能が割増されることが明らかとなったが、ムチン種についても解析する必要があると考え、今後はPGM34抗体、HIK1083抗体を用いた免疫化学的染色法により粘膜防御のメカニズムの詳細に迫る予定である。本研究の目的は、ヒスタミンH2受容体シグナルの胃以外の消化器官に対する作用を探ることであり、これまで、ヒスタミンH2受容体シグナルは、胃酸分泌がその主な作用として考えられていたこと、さらに、申請者が最近、H2遮断薬が小腸組織傷害を緩和することを見出したことから、「小腸」におけるヒスタミンH2受容体の役割を解明することを主題としたものである。初年度である28年度は、小腸におけるヒスタミン受容体の発現を確認した。まず、正常マウスBALB/cの小腸組織からRNAを抽出し、ヒスタミン受容体H2のmRNA発現をリアルタイムPCRにて検出した。小腸を口腔側から肛門側まで8分割し、それぞれの発現を比較したところ、どの部位においても発現が確認されたが、特に肛門側(特に回腸中央部)において発現が高く、口腔側(空腸)より10倍近い発現が認められた。しかしながら、発現が比較的高い回腸中央部における発現であっても、胃の数十分の1程度の発現量であった。また、そのリガンドであるヒスタミンのmRNA発現を確認したところ、ごくわずかにバンドが確認できる程度の発現であった。加えて、正常マウス小腸組織のホモジェネートにおけるヒスタミンの存在をELISAにて確認したところ、検出限界以下という結果となり、遺伝子発現およびタンパク質発現の結果の双方を加味すると、正常な状態のマウス小腸組織内のヒスタミン量は極めて少なく、傷害および炎症等の発現誘導を施した場合に発現上昇が見られるものと推察された。PCRの条件設定およびサンプル調製等が順調に進んだことなどから、当初の計画通りの進行状況となった。本研究の最終的終着点は、ヒスタミンによる腸管細胞傷害とH2ブロッカーによる傷害緩和のメカニズムを解明することであり、炎症性腸疾患患者へのH2ブロッカー投与の安定的な治療成績を得るというものである。そこで、本年は、消化管傷害モデルを作成し、H2ブロッカー投与の影響を検証した。放射線照射モデル(3Gy群)および照射後H2ブロッカーであるラフチジンおよびファモチジンを投与した群(それぞれ3Gy+L群,3Gy+F群)をコントロールと比較した。実験期間中の体重をそれぞれ測定した。摘出した小腸は上部(空腸)と下部(回腸)に分け、肉眼所見を観察したのち組織切片を作成した。各実験群における体重変化を比較したところ、コントロール群(C群)の体重変動率は、実験開始4日目には約5%程度増加したが、放射線照射群(3Gy群)はほぼ横ばいであった。ラフチジン投与群(3Gy+L群)およびファモチジン群(3Gy+F群)は、照射後1日目から増加率が抑制される傾向にあり、照射後4日目には3Gy群と比較して有意に増加した。3Gy+L群および3Gy+F群間に有意な差は見られなかった。病理組織像の観察において、3Gyの全身放射線照射を行ったWTマウス小腸において、照射後1日目にはクリプトの増殖細胞数が減少するが、3日目には盛んな細胞増殖が観察されることをこれまでの検討で確認しており、本実験においても放射線照射群(3Gy群)で、これまで同様の粘膜損傷が認められた。

放射線照射後4日目の空腸粘膜のPAS染色像を比較したものである。PAS陽性細胞(杯細胞などが陽性)は、いずれの群においても照射後2日目までは特に変化なしだが、3日目から4日目にかけてごくわずかではあるが、3Gy群に比べて3Gy+Lおよび3Gy+F群で増加傾向が認められた。放射線照射による消化管粘膜傷害モデルマウスが安定的に作成できたことにより、その後の解析が順調に進行した。本課題は、ヒスタミンによる腸管細胞傷害とH2ブロッカーによる傷害緩和のメカニズムを解明することである。本年度の研究目標は、H2ブロッカーの血球系細胞における影響と粘膜防御に対する効果を検証することであった。放射線照射後、尾部から採取した血液の血球数をカウントした。照射4日後には、赤血球数は投与前と比較して約80%程度まで、白血球数は15%程度までそれぞれ減少した。一方で、H2ブロッカー投与群においても同様の減少が見られ、H2ブロッカーによる造血系に対しての全身性レスキューは得られなかった。続いて、末梢での出血傾向を検証するため、組織標本を作成し、小腸絨毛組織に漏れ込んだ赤血球を視覚的に観察し、絨毛あたりの血球数をカウントし、評価したところ、照射線量(3Gy、5Gy、7Gy)が上がるつれ、血球数が上昇し、H2ブロッカー投与群で、顕著に低下した。これより、H2ブロッカーは少なくとも消化管の出血傾向を抑制する効果があることが明らかとなった。またムチン量を比較するため、小腸組織からムチンを抽出した。照射後のムチン量は、コントロール群に比べて増加したが、H2ブロッカー投与群では、さらに増加した。以上より、照射後4日目にはすでに回復が開始されている状態で、自己防御により、ムチン増加が見られているものと考えられた。そして、H2ブロッカーによりさらに回復が助長され、粘液による防御能が促進しているものと示唆された。ただし、大腸においては、上記のような傷害と回復の傾向は見られず、放射線感受性およびH2ブロッカーの作用点について、小腸と大腸では大きく異なると考えられた。事前に実験シミレーションを行い、マウスの体温調節管理を行うなどの工夫により、血液採取がスムーズに進行したこと、マウス個体差が少なく、安定したデータが得られたことにより、その後のデータの解析と精査に入念に行うことができた。本年度は、傷害シグナルはH2受容体を介するのかを明らかにする。放射線誘導性消化管傷害マウス小腸組織を用いてH2受容体発現とその下流シグナルを解析する。場合によっては、大腸癌上皮細胞株を用いて、単一細胞での現象を捉えることで、一個体内でのクロストークによるものなのか、細胞内単体でも起こりうる事象であるかを検討事項とする。放射線照射による消化管粘膜傷害モデルマウスにおける血球系細胞におけるH2ブロッカーの効果および粘膜防御に対する効果を検証する。特に、粘膜への浸潤細胞(傷害による出血傾向指標として赤血球および炎症指標としての白血球)、ムチン量比較で評価する。これまでに、放射線照射により傷害をうけた消化管粘膜にH2ブロッカーを補うと、防御機能が割増されることが明らかとなったが、ムチン種についても解析する必要があると考え、今後はPGM34抗体、HIK1083抗体を用いた免疫化学的染色法により粘膜防御のメカニズムの詳細に迫る予定である。実験が比較的順調に進行し、遺伝子解析の条件設定等にかかる費用が削減できたため。
規則充てん物を用いた充てん精留塔による多成分系の精密分離

本研究は、まず規則充てん物を用いた場合の充てん塔内の圧力損失、液ホールドアップを検討するために、小型充てん塔にスルーザ-ラボパッキングを充てんした場合の、圧力損失および液ホールドアップを水、グリセリン水溶液およびケロシンを用いて測定を行った。その結果、規則充てん物の場合の液膜厚さに関してはNusseltの膜状凝縮理論が適用できることがわかった。また、液ホールドアップおよびフラディング点までの圧力損失に関する実験式を提案した。さらに、この規則充てん物(スルーザ-ラボパッキング)要素一個を用いてアセトン-エタノール系の全還流蒸留実験を蒸気速度および塔頂液濃度を変えて行い、蒸気分縮のない場合の無次元拡散流束に関する実験式および拡散流束に対する蒸気分縮の影響に関する実験式を提案した。また、アセトン-メタノール-エタノール系の3成分系の全還流蒸留実験を行い、2成分系の場合に提案した実験式が3成分系に対しても適用できることを明らかにした。上述の結果(規則充てん物要素一個の場合)を用いて、規則充填物を用いた場合の充てん精留塔による蒸留のシミュレータを開発し、規則充てん物を3個まで直列配置した充てん精留塔についての蒸留実験の結果と比較したところ、両者は良好に一致した。
黒潮続流域における海洋前線と大気の相互作用

黒潮続流域での海洋前線と大気の相互作用について、高解像度大気・海洋・大気海洋結合モデル群を用いて調べた。海洋前線に伴う急峻な海面水温勾配の存在が、大気の高低気圧活動を少なからず維持し、その集積効果として気候平均的な大規模大気循環を維持することを確認した。さらに、海洋前線流軸の南北変位によって強制された大気循環場応答と海洋前線変動を促した大気強制の間に正のフィードバックが働き、北太平洋大気海洋結合系の変動を強めている可能性が示唆された。黒潮続流域は、北太平洋における数年十年規模の気候変動の活動中心である。本年度は、この海域の海洋前線と大気の相互作用にとって重要な、以下の2つの素過程について、高/中解像度の大気海洋結合モデル及び高解像度領域大気モデルを用いて調べた。1.大気の傾圧性の回復と維持日々の高低気圧擾乱の発達のため必要な大気下層の傾圧性は、個々擾乱による南北熱輸送によって常時緩和されている。従ってストームトラックが維持されるめには、大気下層の傾圧性が維持するメカニズムが必要である。高解像度大気海洋結合モデルの詳細な解析から、海面水温前線を挟んで大きなコントラストを持つ大気海洋間の熱交換によって、擾乱によって緩和された傾圧性は、1日程度の速い時間スケールで回復する実態を明らかにした(Nonaka et al.2009)。さらに、海洋前線によって維持された大気下層の傾圧性が、ストームトラツクの平均場を維持するために不可欠であることを、海面水温前線を平滑化した領域大気モデルの数値実験から示した(Taguchi et al.2009)。2.海洋前線の十年規模変動と、海洋貯熱量・海面熱フラックス・大気ストームトラック変調との関係中解像度大気海洋結合モデルの長期積分を延長し、合計120年間積分を得た。モデルで再現された海面水温は、北太平洋亜寒帯前線沿いに顕著な十年規模変動を示し、この変動は海洋前線の南北移動に起因すること、また同期した大気下層傾圧性とストームトラック活動度の変調を伴っていることを確認した。また、海洋上層の貯熱量の変動要因および、その変動と海洋から大気へ放出される熱量との関係の解析から、黒潮・親潮続流域においては海洋変動が能動的に海面での熱放出を変化させうることが明らかとなった。黒潮続流域の海洋前線と大気の相互作用にとって重要な、以下の3つの素過程について調べた。1.黒潮続流域の北側再循環の十年規模変動高解像度海洋循環モデルOFESの解析により、最近発見された黒潮続流域の北側再循環の十年規模変動は、海洋渦活動の変調とその平均流へのフィードバックによって良く説明されることを示した。(Taguchi et al.2010)2.大気のストームトラックと大規模スケール循環場の応答観測データ及び海洋前線を解像する大気海洋結合モデル(CFES中解像度版)を用いて、北太平洋亜寒帯前線帯の十年規模海面水温(SST)変動に対する大気応答を調べた。持続的な十年規模SST偏差と相関する大気循環の十年規模ジグナルは、10月頃から出現し1月に最も強いシグナル(ストームトラック変調による平均場へのフィードバックに支えられた等価順圧的なPacific North Americanパターン)となって現れるものの2月に急速に減衰する、顕著な季節性を示すことを明らかにした。(Taguchi et al.2011,in revision)。3.海洋表層貯熱量と海面水温の変動との関係海洋から大気へのfeedbackに重要となる、海洋変動が海面熱flux偏差を生じさせる過程を理解するために、海洋水温躍層変動に強く影響される海洋表層貯熱量と海面水温の変動の相関分布から、海洋変動が海面水温偏差に与える影響を調べた。良く知られた赤道域とともに西部北太平洋の海洋前線帯でも海洋変動が海面水温へ影響しうることが確認された。同時に、大気からの直接的な強制の寄与が大きいと考えられていた亜熱帯前線帯においても相対的に弱いながら海洋変動から海面水温への影響が生じうることが示唆された。課題1.海面水温と海面熱フラックス及び海洋貯熱量の変動:海洋から大気へのfeedbackにおいては、海洋変動が如何に海面熱flux偏差を生むかが重要であり、海洋変動の指標としては海面水温(SST)が多く用いられる。しかしSSTは海洋変動と同時に大気変動の影響も直に受ける。そこで、海洋上層の熱的状態を表す指標として表層貯熱量を用いた結果、特に北太平洋西部の亜寒帯前線帯では、海洋表層貯熱量とSST、海面熱fluxに正相関が見られ、海洋前線の変動が大気に顕著な熱的強制を及ぼすことを明らかにした。課題2.亜寒帯前線変動に対する移動性高低気圧活動と大気循環場の応答:観測データと大気海洋結合モデルを用いて、北太平洋亜寒帯前線帯の十年規模SST変動に対する大気応答を調べた。

秋から冬にかけて持続する十年規模SST偏差と相関する大気循環の応答は、10月頃から出現し1月に最も強いシグナルとなって現れるものの2月に急速に減衰する顕著な季節性を示すことを明らかにした。1月の大気応答は、等価順圧的なPacific/NorthAmerican(PNA)と良く似た空間構造を持ち、この応答は、海洋前線変動に同期して変調する総観規模擾乱に伴う渦熱/渦度フラックスによって維持されていることがわかった(Taguchi et al.2012,JC)。更に海洋貯熱量を指標とした解析から、年々の時間規模においても海洋変動が大気に影響を及ぼすことが示唆された。課題3.大気環場応答の海洋へのフィードバック:課題2で得られた大気応答は、北太平洋亜寒帯海域に負の風応力カール強制を及ぼし、亜寒帯前線帯の北偏と正のSST偏差を維持する正のフィードバックが示唆された。また、南太平洋を例にとり、海洋前線に対する海上風の局所的な応答も、海洋の力学応答を通じて海洋東西流を維持する機構を確認した(Taguchi et al.2012,GRL)。
神経発達の臨界期における有機リン系殺虫剤の縦断的曝露影響評価

小児における有機リン系殺虫剤曝露の健康影響リスクが注目されている。本研究では、胎児期および乳幼児期での尿中有機リン系殺虫剤共通代謝物濃度の測定と、6歳時での発達調査を行い、縦断的な曝露影響評価を行う。さらに、薬剤の違いによる影響も明らかにするため、共通代謝濃度の高かった参加者を対象に、曝露した薬剤を特定し、発達影響を評価する。
網羅的スクリーニングによる、動原体の安定性を保証する分子機能ネットワークの解明

本研究では、分裂酵母をモデル生物として用いて、真核生物の染色体上で動原体の確立を決定づける因子(動原体確立因子)を同定することを目的としている。平成27年度までに、LacI-LacO系を用いた動原体確立因子の網羅的探索を行った。LacIタンパク質とLacOリピートの間の結合を利用し、分裂酵母における動原体タンパク質をLacIタンパク質と融合させたplasmidを作成し、染色体上のLacOリピート上に結合させ、この状態で内在性のセントロメアを人工的に破壊することで、LacOリピート付近に動原体の新規形成を引き起こす動原体確立因子を同定した。興味深いことに、得られた因子は酵母からヒトまで幅広く保存されたDNA結合性のタンパク質であった。この因子の破壊株は致死であることから、生育に必須の重要な機能があると考えられる。平成28年度は、平成27年度中に同定したセントロメアの新規確立を決定づける確立因子の機能を、より詳細に解析した。この因子を強制的に結合させた際に新規の動原体が形成されるのは、染色体の末端付近に存在するヘテロクロマチンに隣接した領域に限られた。また、この動原体タンパク質のDNA結合ドメインと考えられている部位を人為的に欠損させた変異タンパク質を、GFP-LacIに融合しLacOリピートに結合させ、内在性のセントロメアを破壊させたところ、全長の際に観察された動原体の形成効率が、顕著に減少した。この結果は、このDNA結合ドメインが、ただ単にこの因子のクロマチンへのリクルートに寄与するだけでなく、セントロメアを新規に形成する過程において、新たな役割を持つことを示唆していた。これらの結果から、動原体確立タンパク質とcisのクロマチン状態が協調して新規に動原体を形成すると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、セントロメアにおいて集積と発散が繰り返される多数のタンパク質の中から、染色体上で動原体の確立を決定づける因子(動原体確立因子)を同定する。そして動原体確立因子の上流、下流で機能する因子との相互作用を解析することで、動原体の安定性を保証する分子機能ネットワークの解明を目的としている。平成26年度は、動原体タンパク質を任意の染色体部位に人工的に結合させるための系を構築した。一番染色体の腕部にLacOリピート配列を挿入した分裂酵母株を作成した。さらに、GFP-LacIタンパク質を酵母細胞内で発現させることが可能なplasmidを作成した。このplasmidを前述したLacOリピート保有酵母株に形質転換し、GFP-LacI融合タンパク質がLacOリピート上に確かに集積していることを蛍光顕微鏡観察により確かめた。さらに、培地にIPTGを加える事により、LacOとLacIの結合が損なわれ、GFP-LacIの集積が見られなくなる事も確認した。これらのことから、任意のタンパク質の染色体上への結合をIPTGによって自在に制御可能な実験系の構築に成功したと考えられる。さらに、GFP-LacIにいくつかの動原体タンパク質を融合させたplasmidの作成も完了している。現在、構築した動原体タンパク質の染色体への強制結合系と内在性のセントロメア破壊アッセイ系を組み合わせるための条件検討を進めている。本研究では、真核生物の染色体において、動原体の確立を決定づける因子(動原体確立因子)の同定を目的とする。さらに、その動原体確立因子の上流、下流で機能する因子を含め、これらの因子間相互作用を細胞周期特異性に注目して解析する。平成27年度は、平成26年度中に作成した、一番染色体の腕部にLacOリピート配列を挿入した分裂酵母株とGFP-LacIタンパク質を酵母細胞内で発現させることが可能なplasmidを用いて以下の実験を行った。GFP-LacIにいくつかの動原体タンパク質を融合させたplasmidを作成し、動原体タンパク質をLacOリピートに強制的に結合させ、それと同時に内在性のセントロメアを破壊した。その結果、GFP-LacIに融合した動原体タンパク質依存的に、セントロメア破壊後のサバイバーの頻度が上昇するものが得られた。これらサバイバーの染色体を解析した結果、新しいセントロメアがLacOリピート周辺に形成されていることが明らかとなった。このことから、セントロメアの新規確立を決定づける確立因子を同定することができたと考えられる。また、この動原体タンパク質をLacOリピート上に結合させた際に、幾つかの動原体タンパク質がLacOリピート上にリクルートされていることが蛍光顕微鏡観察により明らかになった。このことから、確立因子の下流に存在する因子に関しても27年度に同定することができたと考えている。目的としていた動原体確立因子を同定することができ、さらにその下流で働く因子に関しても幾つか同定できたため。

興味深いことに、得られた因子は酵母からヒトまで幅広く保存されたDNA結合性のタンパク質であった。この因子の破壊株は致死であることから、生育に必須の重要な機能があると考えられる。平成28年度は、平成27年度中に同定したセントロメアの新規確立を決定づける確立因子の機能を、より詳細に解析した。この因子を強制的に結合させた際に新規の動原体が形成されるのは、染色体の末端付近に存在するヘテロクロマチンに隣接した領域に限られた。また、この動原体タンパク質のDNA結合ドメインと考えられている部位を人為的に欠損させた変異タンパク質を、GFP-LacIに融合しLacOリピートに結合させ、内在性のセントロメアを破壊させたところ、全長の際に観察された動原体の形成効率が、顕著に減少した。この結果は、このDNA結合ドメインが、ただ単にこの因子のクロマチンへのリクルートに寄与するだけでなく、セントロメアを新規に形成する過程において、新たな役割を持つことを示唆していた。これらの結果から、動原体確立タンパク質とcisのクロマチン状態が協調して新規に動原体を形成すると考えられる。染色体上に任意のタンパク質を強制的に結合させる系を作成できた。また、その結合を化合物の添加により自在にコントロールできる条件を導き出せたため。同定した動原体確立因子が細胞周期のどのタイミングでどのような因子をリクルートするのか、蛍光顕微鏡観察とクロマチン免疫沈降法を用いて解析する。得られた研究成果について、論文にまとめて公表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。染色体上のLacOアレイに任意の動原体タンパク質を結合させることで、どのようなタンパク質が集積するのかを解析する。また、内在性セントロメアの破壊後、新規セントロメアがLacO上に構築される過程で、それらの集積因子が動原体の形成にどのように寄与するのかを調べる。
CD271シグナルによる下咽頭癌幹細胞制御と治療戦略への応用

我々は、表面分子CD271が下咽頭癌において癌浸潤部に強く発現し、予後との相関性を持つ悪性度マーカーであることを報告しているが、下咽頭癌における機能は未だ不明であった。本研究では、下咽頭癌におけるCD271の働きについて、臨床検体由来の細胞株を樹立し、siRNAを用いたノックダウン株を作成し検証した。ノックダウンの結果、下咽頭癌細胞株の細胞増殖は強く抑制され、免疫不全マウス皮下への造腫瘍能も抑制された。更に、増殖のみならず、CD271は下咽頭癌細胞の遊走能を制御していることも判明した。このことから、CD271は単なる予後マーカーではなく、自身が悪性度を制御する機能因子であることが示唆された。本課題では、下咽頭癌幹細胞マーカーであるCD271が、下咽頭がんに果たす機能の解明に取り組む。(1)機能性を検討する為、下咽頭癌細胞株BICR6へ野生型CD271(WT)、細胞内領域欠損型CD271(ΔC)発現ベクターを強制発現したところ、CD271WTでは造腫瘍能が顕著に上昇したのに対し、CD271ΔCでは造腫瘍能は減少した。このことから、CD271による造腫瘍能の制御には、細胞内のシグナルが重要であることが示唆された。(2)癌幹細胞の性質の一つに多分化能の維持がある。CD271WT発現細胞において、多分化マーカーであるNanog, Oct-4, Sox2のmRNA発現量を定量PCRで検討したところ、コントロールに比べて上昇していた。この結果から、CD271の発現が幹細胞性の維持に関わっている可能性が示唆された。(3)癌内部は酸化ストレスが強い状態にある。CD271が酸化ストレス抵抗性を持つかを調べるために過酸化水素による毒性試験を行った。この結果、CD271ΔC導入BICR6細胞ではCD271WT導入及びコントロール細胞に比べて有意に感受性が上昇していた。このことから、CD271の発現は癌細胞の生存に有利に働くことが示唆された。(4)下咽頭癌臨床検体において、CD271陽性細胞は浸潤に重要な酵素であるMMP1,MMP10を高発現している。この発現の制御がCD271によって行われているかを調査するため、CD271WTおよびΔC導入BICR6においてmRNAの発現を比較した。その結果、CD271WT強制発現細胞ではMMP1,10の発現が上昇し、逆にΔCにおいてはこれらのMMPsの発現は著しく減少した。この結果から、CD271は浸潤能の制御にも関わることが示唆された。以上のことから、CD271は頭頸部癌において下流シグナルにより癌の浸潤・造腫瘍能を制御する可能性が示唆される。本課題では、申請者らが報告した下咽頭癌幹細胞マーカーであるCD271が、下咽頭癌において果たす機能を解明することを目的とした。この機能性を検討するため、下咽頭癌患者由来検体から細胞株を樹立した。この細胞にsiRNAを導入することによってCD271ノックダウン細胞株を樹立し、がん細胞の特性の変化を検証した。その結果、CD271のノックダウンにより、in vitroにおける細胞増殖は著しく減少し、免疫不全マウスであるNOGマウス皮下への異種移植試験においても、CD271ノックダウン細胞は造腫瘍能を失っていた。ノックダウン細胞の増殖シグナルを観察したところ、特にERKを介したシグナルが減少していることが判明し、CD271がERKのリン酸化を介して下咽頭癌の増速制御を行っている可能性が示唆された。さらに、CD271ノックダウン細胞では細胞周期はG0期に強い誘導が起こっており、この現象はERKの阻害薬を用いても再現できなかった。このことから、CD271は少なくともErkの制御とG0期の誘導という二つの経路を通して細胞の増殖制御を行っていると考えられる。更に、増殖のみならず、CD271ノックダウン細胞は浸潤に重要な移動能が著しく低下していた。これは、CD271-RhoAの特異的阻害薬であるTAT-Pep5を用いた試験においても同様の傾向を認め、CD271は下咽頭癌において、複数の経路を介して悪性度を制御していることが示された。以上より、CD271は下咽頭癌の治療標的として有望であると判明したため、今後、CD271を標的とした治療法に着手し、下咽頭癌の根治に向けた取り組みを行っていく。計画に基づき、CD271細胞内ドメイン欠損型、変異型の発現細胞株を樹立し試験を行っている。NOGマウスにおける下咽頭癌ラインの樹立も順調である。