hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域空間の環境行動的研究

ここでは総合的に計画された高層住宅地の子どもの遊び場環境を、写真投影法、ビデオによる追跡撮影等を通して調査し、人工的な環境の中で様々なものを巧みに用いて遊びを創造していく子どもの環境構築を明らかにした。調査のまとめ方では子どものスピード感や3次元的に展開する遊び環境を表現するためにビジュアルを多用するなど様々な工夫を行った。「(3)生活者の環境行動から見た地域空間エレメントに関する読みとり」に関して「生活者から見た都市空間の研究」を行った。ここでは東京都内に住む様々な年齢、職業の人物20数名に対してアンケート、インタビューを行い、それぞれの実際の生活で都市空間の中のどのような施設を利用し、都市の中で個人の生活を展開させているのかを調査した。また調査した結果をヴィジュアルにまとめ、個人のプロフィールと支える都市空間内の施設の説明を加えたものを台湾「建築師」誌の95年12月号で「東京1995」として発表した。人と場所の関わり方のモデル地域環境を表現するに当たって、人と場所の関わり方を説明するモデルを提示しようという議論がなされており、認知科学で提唱されている「ド-ナツモデル」の他、「行動-期待モデル」、「環境のカスタマイズ・メンテナンス」などのモデルがたたき台となって議論が進んでいる。都市空間の中の居場所調査「都市と建築における居場所の獲得様態に関する考察」を行った。これは環境の質を「居場所」という概念で説明することを試みたもので、被験者に自分にとっての居場所をカードに記入してもらい、そのカードを分析することにより、居場所の獲得様態を明らかにし、居場所の構造化を試みた。複数のフィールドでの調査調査対象者に本人が普段使っている環境(地域)を案内してもらうい、その様子をカメラ、ビデオを用いて記録する「同行取材方式」の手法を用いて、東京及び九州福岡市でフィールド調査を実施。個々人により体験されている空間という観点から地域空間を表現することを試みた。こうした調査は一人一人に時間がかかるため、もっと簡便な方法を開発しようという議論がなされた。ビジュアルな提案を行う基礎資料づくり昨年度実施したフィールドワークの成果であり、台湾「建築師」に掲載された「東京1995」をデジタル情報としてハイパーテキスト化し、ビジュアルな提案を行う際の表現方法の基礎資料とした。また、この成果物をCD-ROMに納めることにより電子出版し、紙面以外の出版の可能性を検討した。最終年度としてこれまでの研究成果を基に議論検討して,以下の構成でまとめる作業を行った。1.研究の位置づけ:過去におこなった「特定地域の包括的研究」からの経緯と,人間と地域空間の要素(資源)の関係についての概念・モデルが不足しているという問題意識を整理した。2.既往研究のレビュー:1の問題意識のもとに,都市計画や地域施設計画,暮らし易さ指標など,地域空間を対象とした人間と環境の関係のモデルを整理しその問題点をまとめた。3.地域における環境行動的事例の調査研究:1)都市の市街地と計画された集合住宅地を対象とした生活行動のサーベイより「社会的環境との出会いを支援する地域環境」の意味,
有機ビスマスおよびアンチモン-酢酸マンガン(III)系を用いた複素環の構築

アルケン類やアルキン類、芳香族化合物および1,3-ジカルボニル化合物と酢酸マンガン(III)を用いたラジカル反応系に、有機ビスマスを加えた反応を行うことで、含ビスマス複素環化合物の合成を試みた。これまでの研究で、トリアリールビスマス(III)(1)は酢酸マンガン(III)によって容易に酸化されてジアセトキシビスマス(V)(2)となり、続く後処理でジクロロビスマス(V)(3)となることを明らかにした。化合物3の構造はX線単結晶解析によって決定された。化合物1から2への反応は比較的遅いので、1,3-ジカルボニル化合物やアルケン類の存在下同様の反応を行うことで、ビスマスを含む複素環化合物の生成が期待された。反応条件を種々検討したが、残念ながらビスマスを含んだ環化生成物は得られなかった。次に、シロキサン結合を含む末端ジエン4を合成して酢酸マンガン(III)存在下2,4-ペンタンジオンとの反応を検討した。その結果、シロキサン結合を側鎖に持つ4,5-ジヒドロフラン5が22%の収率で得られた。同様の反応をテトラメチレン-ビス(3-オキソブタノエート)を用いて行ったところ、シロキサン結合を含む15員環化合物6(12%)の合成に成功した。また、副生成物としてモノジヒドロフラン7が得られた。このことから、大環状化合物6の生成は段階的に進行すると考えられる。今後、この反応をさらに検討し、シロキサン結合を含む複雑な化合物の合成を行う予定である。
開放経済における金融政策に関する研究

本研究は,開放経済における諸問題,特に金融政策の厚生評価を行うことを最終目的としている。平成19年度は,昨年度までの分析結果に基づき,論文としてとりまとめる作業を行うと共に,分析を発展・拡張させ,成果を学会や各種研究会および学術誌で発表した。具体的にはまず,昨年度に引き続き動学的開放経済モデルを用いて裁量的金融政策の国際協調が経済厚生を向上させるかを考察し,本研究独自の数値計算により数量的な意味を検証した。そして成果を日本経済学会で発表した。また伝統的な研究では国際政策協調の利益が強調されてきたが,近年の開放経済マクロ経済学では,価格硬直性の下であっても国際金融協調による利益は皆無または小さいという結論が出されていることにも着目し,その背景にあるメカ二ズムを解明した。そして成果を論文にまとめ,国際学術誌に投稿した。さらにその発展として,金融政策以外にも政策変数がある場合.政策協調が各国厚生に与える影響およびその源泉を明らかにし,国際学術誌に投稿した。この概究は,特定の政策に実行上の制限がある場合に代替的政策手段を用いる影響も明らかにするものであり,現実の政策運営への含意も大きいと期待される。また,対外債権債務が証券の形で累積している場合,金融当局は緊縮的金融政策を行う誘引を持つことを,動学的一般均衡により示した。ミクロ的基礎付けを持つ開放経済学の既存研究では,閉じた形で解を導出することが困難な場合が多いが,本分折では政策を解析的に導出し含意を考察している。この成果はHitotsubashi Journal of Economicsに掲載される。本研究は,開放経済における諸問題,特に金融政策の厚生評価を行うことを最終目的としている.初年度である平成17年度は,まず先行研究の調査を行い,またこの主題に取り組む際に必要となる技術を確認し,そして分析の基礎的な枠組みを構築した.本研究のモデルは確率的動学一般均衡に依拠しており,各経済主体の最適化を下敷きとしている為,社会厚生関数を尺度とした政策評価が可能である.その一方で,最適化された金融政策は往々にして非線形方程式となる為,近似を行うか数値的に解を求める必要がある.よって,本研究で扱う金融政策を分析するには従来の近時法や計算方法では不十分であることを踏まえ,新たに収束計算に大きく依存しないアルゴリズムの精緻化を行った.また,数値計算をするにせよ,内点解を得る為には,解くべき政策立案者の問題そのものが凹でなければならない.従来New Open Macroeconomicsの伝統的な定式化では,問題の非凹性のため内点解が得られないという潜在的問題を抱えており,これを回避する為には物価上昇の社会的費用を外生的に導人するなどのアドホックな対処がなされてきた.これに対し本研究では,貨幣の中の効用モデルを認めた上で,その貨幣からの効用の二通りの解釈を検討し,それぞれの解釈によって内点解の有無が異なることを内生的に示した.さらにこの枠組みを用いた数値計算の応用例としては,金融政策の国際協調が各国の経済厚生にもたらす変化を分析した.その際,採り得る政策の範囲としては,裁重政策や従来のコミットメントに加えてtimeless perspectiveを始めとする政策ルールの変化形も検討対象とし,国際政策協調によって各国の経済厚生に変化が生じ得るとの結論を得た.本研究は,開放経済における諸問題,特に金融政策の厚生評価を行うことを最終目的としている。二年目である平成18年度は,昨年度の分析結果に基づき,その一部を論文としてとりまとめ,また分析を発展・拡張させた。本研究のモデルは確率的動学一般均衡に依拠しており,各経済主体の最適化を下敷きとしている為,社会厚生関数を尺度とした政策評価が可能である。その一方で,最適化された金融政策は往々にして非線形方程式となる為,近似を行うか数値的に解を求める必要がある。本年度はそうした非線形な金融政策を数値分析する手法として,独自のアルゴリズムを開発すると共に,従来の近似法・計算方法との違いを整理した。また,数値計算をするにせよ,内点解を得る為には,解くべき政策立案者の問題そのものが凹でなければならない。従来New Open Macroeconomicsの伝統的な定式化では,問題の非凹性のため内点解が得られないという潜在的問題を抱えており,これを回避する為には物価上昇の社会的費用を外生的に導入するなどその場限りの対処がなされてきた。これに対し本年度は,貨幣の流動性便益に対する物価上昇の影響を厳密に検討し,内点解を得ることに成功した。さらに以上の枠組み・手法を応用し,国際的な政策協調が各国の経済厚生にもたらす変化を,政策が合理的期待に依存する場合について数値分析した。その際基本となる枠組みとして,各国の消費バスケットに差異がない場合の政策効果を体系的に整理し,論文にとりまとめ,現在は国際学術誌に投稿中である。またこれと同時に,より経済構造を一般的に拡張し,結果に変化が現れるか検証している。その一例としては,各国の消費バスケットに差異があるケースを考察した。

具体的にはまず,昨年度に引き続き動学的開放経済モデルを用いて裁量的金融政策の国際協調が経済厚生を向上させるかを考察し,本研究独自の数値計算により数量的な意味を検証した。そして成果を日本経済学会で発表した。また伝統的な研究では国際政策協調の利益が強調されてきたが,近年の開放経済マクロ経済学では,価格硬直性の下であっても国際金融協調による利益は皆無または小さいという結論が出されていることにも着目し,その背景にあるメカ二ズムを解明した。そして成果を論文にまとめ,国際学術誌に投稿した。さらにその発展として,金融政策以外にも政策変数がある場合.政策協調が各国厚生に与える影響およびその源泉を明らかにし,国際学術誌に投稿した。この概究は,特定の政策に実行上の制限がある場合に代替的政策手段を用いる影響も明らかにするものであり,現実の政策運営への含意も大きいと期待される。また,対外債権債務が証券の形で累積している場合,金融当局は緊縮的金融政策を行う誘引を持つことを,動学的一般均衡により示した。ミクロ的基礎付けを持つ開放経済学の既存研究では,閉じた形で解を導出することが困難な場合が多いが,本分折では政策を解析的に導出し含意を考察している。この成果はHitotsubashi Journal of Economicsに掲載される。
膵癌細胞の浸潤に関わる低分子量 G タンパク質を活性抑制するペプチド配列の同定

本研究では、癌細胞の浸潤転移を抑制する因子として同定したbinder of Arl Two (BART)タンパクが、低分子Gタンパクに対して特異的にGAP機能を持ち、さらに直接的にRho GTPase familyに属するRac1とRhoAタンパクの活性調節を行うことで、GAP機能依存的に膵癌の浸潤転移抑制に関与する作用機序を、分子生物学的に解明を行った。本研究の成果として、BARTと結合する低分子量Gタンパク質内の特異的結合部位を同定することにより、BARTがGAP機能依存的に膵癌細胞の浸潤・転移を抑制する基礎医学的知見を得ることができた。本研究では、癌細胞の浸潤転移を抑制する因子として同定したbinder of Arl Two (BART)タンパクが、低分子Gタンパクに対して特異的にGAP機能を持ち、さらに直接的にRho GTPase familyに属するRac1とRhoAタンパクの活性調節を行うことで、GAP機能依存的に膵癌の浸潤転移抑制に関与する作用機序を、分子生物学的に解明する。将来の膵癌浸潤および転移を抑制する新規創薬のための基礎医学的知見を得ることを目的とする。本年度は、N末から約30アミノ酸毎に相当するRac1およびARL2由来GST融合タンパクを精製し、ヒト膵癌細胞株のライセートと混ぜ合わせてプルダウンを行った。抗BART抗体でウエスターンブロットを行い、BARTと結合するRac1およびARL2由来GST融合タンパクを同定できた。同定した30アミノ酸に相当するペプチドを合成し、平成29年度の研究計画を進める予定である。予定していたBARTとRac1およびARL2との結合を阻害するペプチドの作成の段階に研究が進行しており、予定通りである。Rac1およびARL2由来GST融合タンパクを作成し、ヒト膵癌細胞株S2-013のライセートと混ぜ合わせて、S2-013に発現しているBARTと結合するアミノ酸配列を持ったGST融合タンパクをプルダウンした。その結果、BARTとRac1およびARL2との結合部位を同定することができた。BARTとRac1およびARL2との結合を阻害するペプチドを合成し、BARTとRac1およびARL2との結合を阻害するペプチドが、膵癌細胞の浸潤・転移能を変化させるかを検討した。平成29年度に予定していたBARTとRac1およびARL2との結合を阻害するペプチドが、膵癌細胞の浸潤・転移能を変化させるかの検討を終了することができた。BARTとRac1およびARL2との結合を阻害するペプチドが、膵癌細胞の浸潤・転移能を変化させるかをヒト膵癌細胞を用いて詳細に検討する予定である。同定された配列が転移能に影響を及ぼすかを検討するためにマウス実験を行う。我々は、種々のヒト膵癌細胞をマウス膵臓に局注し、膵周囲への浸潤と肺・肝転移の有無を検討した経験がある(Cancer Res 2011)。同定したペプチドと同様のアミノ酸配列に相当するDNA断片を強制発現用ベクターpCMV6-Entryへサブクローニングする。サブクローニングしたプラスミドを膵癌細胞株S2-013とPANC-1へ遺伝子導入し、発現安定株を作成する。我々は、同様の方法で、別のタンパク質同士の結合を阻害する膵癌細胞の発現安定株を作成した経験があり(Mol Cancer Res 2011)、本実験でも強制発現されたペプチドが、BARTとRac1およびARL2との結合を阻害すると予想している。コントロールは空ベクターを導入した細胞を用いる。作成した細胞をマウス膵臓に局注し、6週間後に肺・肝転移の有無を検討する。これらの実験により、同定されたBARTとRac1およびARL2との結合部位に相当する配列が膵癌細胞の転移にとって重要な働きをしていることを確認できる。研究計画は順調に進行しているが、抗体購入とリコンビナントタンパク質作成時のキット費用が予想より低く抑えることができた。次年度使用額は平成29年度の実験計画を実施する際に適正に使用する。
希土類錯体を含む窒化ケイ素セラミックスの電子状態

本研究では、含希土類機能性セラミックス材料を電子論に基づいて設計することを最終の目的として、モデルクラスターとして希土類を格子間位置に含んだα-およびβ-Si_3N_4をとりあげ、その電子状態をDV-Xα法により詳しく調べ、実験的に知られている諸物性との対応を系統的に調べた。Ln^<3+>イオン周囲の化学結合性を評価したところ,Ln-N,Ln-Siともに強い反結合性を示し,この反結合性は,Lnのイオン半径の増大にほぼ比例して強くなった.この反結合の強さは,β-Si_3N_4構造においても同様であったが,Lnイオン周囲のSi-N結合がα-Si_3N_4において強化される分だけ,半径の小さいYb^<3+>などのイオンがα-Si_3N_4において安定化されることが判明した.このことは固溶量についての実験結果とよく対応している.さらに構造セラミックスの靭性を決める上で重要となる粒界結合力について,粒界のモデルクラスターを構築し,検討した.その結果,β-Si_3N_4構造でも粒界には,希土類原子は安定に存在可能で,La^<3+>のような大きなイオン半径を持つ原子が存在する場合と,Yb^<3+>のような小さいイオン半径を持つ原子が存在する場合とでは,界面結合力が前者で著しく低下することが判明した.この結果は,他の研究者による亀裂進展挙動とよく対応していた.以上の結果をもとに,窒化ケイ素セラミックスの材料設計の指針を,第一原理計算を基に初めて見いだした.本研究では、含希土類機能性セラミックス材料を電子論に基づいて設計することを最終の目的として、モデルクラスターとして希土類を格子間位置に含んだα-およびβ-Si_3N_4をとりあげ、その電子状態をDV-Xα法により詳しく調べ、実験的に知られている諸物性との対応を系統的に調べた。Ln^<3+>イオン周囲の化学結合性を評価したところ,Ln-N,Ln-Siともに強い反結合性を示し,この反結合性は,Lnのイオン半径の増大にほぼ比例して強くなった.この反結合の強さは,β-Si_3N_4構造においても同様であったが,Lnイオン周囲のSi-N結合がα-Si_3N_4において強化される分だけ,半径の小さいYb^<3+>などのイオンがα-Si_3N_4において安定化されることが判明した.このことは固溶量についての実験結果とよく対応している.さらに構造セラミックスの靭性を決める上で重要となる粒界結合力について,粒界のモデルクラスターを構築し,検討した.その結果,β-Si_3N_4構造でも粒界には,希土類原子は安定に存在可能で,La^<3+>のような大きなイオン半径を持つ原子が存在する場合と,Yb^<3+>のような小さいイオン半径を持つ原子が存在する場合とでは,界面結合力が前者で著しく低下することが判明した.この結果は,他の研究者による亀裂進展挙動とよく対応していた.以上の結果をもとに,窒化ケイ素セラミックスの材料設計の指針を,第一原理計算を基に初めて見いだした.
アワノメイガ属における食性進化と性フェロモンとの関連性の解明

害虫に好まれない作物を育種できれば、農薬に頼らず害虫被害を軽減でき抵抗性の発達も回避できる。害虫が無数の植物の中から食草を探索するのに植物が発する匂いを指標にしていることは十分考えられる。そこで、トウモロコシの害虫として知られるアワノメイガのゲノム塩基配列の概要を決定して、触角で匂いの検知に重要な役割を果たす嗅覚受容体遺伝子の構造を網羅的に解析した。さらに食性の異なる近縁種の遺伝子も解析して、食性の違いに寄与する相違がないかを検討した。25年度は、ゲノムワイドでの嗅覚受容体遺伝子の探索を可能にするため、次世代シーケンサーHiSeq2000を用いて、アワノメイガ・オス蛹1個体のゲノムDNAを100bpペアエンド解析を行った。その結果、総サイズ約511Mbの概要ゲノム配列が得られ、遺伝子のエクソン部分は網羅していると考えられた。これらのゲノム配列から、RNA-seq解析により触角で発現している嗅覚受容体をコードすると考えられるcDNA配列とほぼ同一か、有意な相同性を有する配列を検索したところ、51個の新規嗅覚受容体遺伝子様配列を見出すことができた。これらの遺伝子候補について、それぞれ特異的なプライマーを設計してアワノメイガフォスミドライブラリーをPCRスクリーニングしたところ、51個中41個を単離することができた。さらに同じプライマーでヨーロッパアワノメイガとアズキノメイガのBF1集団を用いてマッピングを試みたところ、約半数の座乗染色体を明らかにすることができ、特定の染色体上の部位にクラスタリングしている遺伝子群も見出された。また、ヨーロッパアワノメイガのBACクローンとアワノメイガ・ウスジロキノメイガのフォスミドクローンについて、次世代シーケンサーGS-FLXを用いた塩基配列決定を行った。その結果と補足的なサンガーシーケンシングにより、アワノメイガ・ヨーロッパアワノメイガ・ウスジロキノメイガのフェロモン受容体とフェロモン結合タンパク質遺伝子領域全体のゲノム塩基配列を決定した。このうちフェロモン受容体遺伝子クラスターについては、3種間で遺伝子構成に違いがあり、遺伝子重複により生じた遺伝子コピーに欠失や不活化が進んでいることが示唆された。さらに、BAC・フォスミドクローンをプローブとしたFISH解析を行い、全染色体を網羅したアワノメイガ属の高精度な細胞遺伝学的地図を作製した。アワノメイガの食草であるトウモロコシを圃場で栽培し、約3か月間にわたり摂食中の終齢幼虫を800頭超採集して凍結保存し、うち480頭から個別にゲノムDNAを調製した。これとは別に休眠幼虫を500頭超を越冬させ、27年度の食草の選好性検定や遺伝解析に供する予定である。アワノメイガの触角で発現が確認された嗅覚受容体遺伝子を含むフォスミドクローンをPCRスクリーニング法により単離して、次世代シーケンサーHiseq2000による塩基配列決定を行った。得られたコンティグ配列を嗅覚受容体遺伝子のcDNA配列をもとに整列化して、残されたギャップをサンガー・シーケンシングにより埋めて、新規遺伝子49種のゲノム構造を決定した。さらにカイコゲノムデータベースに対して相同性検索を行い、カイコにおける相同領域の推定を行った。また、アワノメイガの近縁種であるヨーロッパアワノメイガのBACライブラリーを同様にスクリーニングして、24個のクローンを単離した。27年度にこれらのクローンの塩基配列を決定して、嗅覚受容体遺伝子の種間比較を行う予定である。アワノメイガゲノム配列と染色体上の位置情報を統合するために、BAC/fosmidクローンをプローブとしたFISH解析を行い、アワノメイガの全31染色体を網羅する地図を作成した。アワノメイガはチョウ目の共通祖先の核型(n=31)を保持しているのに対して、カイコでは染色体融合が3回起き、現在の第11・23・24染色体が形成されたと推定されている。染色体融合箇所近傍に座乗するカイコ遺伝子に相同な遺伝子を含むクローン約10個をこの地図にマッピングすることにより、候補領域を絞り込むことに成功した。圃場にアワノメイガのイネ科以外の食草であるショウガを栽培し、幼虫や蛹を採集して個別にゲノムDNAを調製した。また年次変化を調査するため26年度と同様にトウモロコシからも採集したほか、ゴボウからもアワノメイガ属幼虫を採集してゲノムDNAを調製し、フェロモン受容体遺伝子構造に種間や種内に相違があるかを検討した。その結果、アワノメイガにおいてOR3遺伝子が重複してOR1遺伝子に挿入したことによりOR1遺伝子が不活化されると考えられる変異を見出した。今後、食性の違いと嗅覚受容体遺伝子における変異との関連性をアンプリコンシーケンシングにより検索する予定である。既に構造を決定したフェロモン受容体サブファミリーを除く45種のアワノメイガ触角で発現している既知遺伝子のうち42種を含むフォスミドクローンのDNAを混合してHiSeq2000で解析した。得られたスキャフォールド配列のギャップを埋めるためサンガー法によるシーケンシングを行い、既知遺伝子に加え14種の新規嗅覚受容体遺伝子を見出し、既知遺伝子を含めてその遺伝子構造を決定した。これらの一部は同一転写方向の遺伝子25個からなる11個のクラスターを形成していた。連鎖解析や隣接する遺伝子のカイコオルソログから約90%の遺伝子の座乗染色体を推定することができた。

ヨーロッパアワノメイガとウスジロキノメイガについても、BAC・フォスミドライブラリーから嗅覚受容体遺伝子を含むクローンの単離を行い、ヨーロッパアワノメイガについては27個、ウスジロキノメイガについては6個のクローンについてHiSeq2000による塩基配列決定を行った。今後、両種についても概要ゲノム塩基配列を決定することにより、種特異的な遺伝子を含めた比較を行い食性との関連を明らかにする予定である。害虫に好まれない作物を育種できれば、農薬に頼らず害虫被害を軽減でき抵抗性の発達も回避できる。害虫が無数の植物の中から食草を探索するのに植物が発する匂いを指標にしていることは十分考えられる。そこで、トウモロコシの害虫として知られるアワノメイガのゲノム塩基配列の概要を決定して、触角で匂いの検知に重要な役割を果たす嗅覚受容体遺伝子の構造を網羅的に解析した。さらに食性の異なる近縁種の遺伝子も解析して、食性の違いに寄与する相違がないかを検討した。アワノメイガ触角で発現している嗅覚受容体遺伝子の近傍を広くカバーするゲノム塩基配列を決定することができ、今後食性や性フェロモン成分の異なる種の断片的なゲノム配列との比較が容易になった。また、遺伝的解析と染色体情報を統合可能な地図を構築したことにより、より高精度な表現型と遺伝型との関連性の解析や他のチョウ目昆虫との比較が可能となる。さらに、種内多型を定量的に解析可能な規模の個体別DNAを確保したうえに、休眠から1度に覚醒させることにより、十分な数の成虫を実験に確保できるようになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。農学今後、アワノメイガのトウモロコシ以外の食草であるショウガを栽培して、来訪した個体がトウモロコシと遺伝的に異なる特徴を有するのかを検討する。またアズキノメイガなどの食草の異なるアワノメイガ属昆虫についても、アワノメイガやヨーロッパアワノメイガで決定した嗅覚受容体遺伝子とのコピー数や配列の相違を検討して、母蛾の産卵のための食草探索に寄与している遺伝子を探索する必要がある。次世代シーケンシング技術の普及と低廉化により、基準となるアワノメイガのゲノム構造と遺伝子発現の解析は計画以上に進んでいる。また、解析の基盤となるFISHによる細胞遺伝学的地図も作製できた。26年度はアワノメイガ個体の採集とその嗅覚受容体の遺伝子構造の解明及び染色地図の確立を重点的に行ったため、アワノメイガ近縁種まで解析を充分に行うことが困難であった。その結果、当該種の採集・飼育等に関わる経費に余剰が生じた。今後は、アワノメイガとは食性と性フェロモン成分の異なる近縁種の解析を進めて、アワノメイガとの相違点を明らかにし、表現型の違いをもたらしている遺伝子の解明を進める必要がある。しかし、野外昆虫を対象にするため種内の遺伝的多様性も大きいことが予想される。したがってゲノム構造の比較に当たっては、種を代表する特定の個体同士の比較ではなく、充分な個体数を確保した集団をリシーケンシングするなどして、集団間で共通してみられる違いを見出すとともに、種分化に先行して起きる遺伝子の変化がみられないかを確認する。また、性フェロモン成分が食草から予想されるものとは異なる個体など、興味深い表現型を示す個体については、個体ごとに詳細な遺伝子型の調査を行う必要がある。
放射線による塩基除去修復過程でのpolβ及びPCNA依存性経路の役割に関する研究

DNA polymerase β(pol β)(-/-)およびpol β(+/+)細胞を用いた解析から、電離放射線照射後に起こる塩基除去修復経路においては、少なくとも細胞死という観点からみた場合、pol β依存性経路の寄与が小さく、もう一つのPCNA依存性経路が主に機能している可能性が示された。実際、照射後クロマチン結合型PCNAの動態は、po1 β(1-/-)およびpol β(+/+)細胞において差を認めず、両者同様に機能していた(Radiat. Res., 153, 773-780, 2000)。さらに、オワンクラゲ由来の蛍光タンパクGFPとpol βとの融合タンパクを細胞に発現させ、放射線照射後のクロマチン結合型pol βが検出できるかどうかを検討し、pol βが電離放射線照射後のDNA修復に全く関わっていないのか直接調べることを試みた。松影博士(日本女子大)より供与されたrat pol βcDNAを鋳型にPCRによってfull codingregionを増幅し、クロンテック社のpEGFP-C1にフレームがずれないように組み込み、発現用プラスミドとした。これを、ヒト扁平上皮癌細胞に一過性に発現させたところ、核に局在することを確認した.そこで、pol βの関与が明らかであるMMS処理を行い、0.3%Triton-Xにて処理後、蛍光顕微鏡にて観察すると、全く蛍光は認められなくなった。処理時間等の検討を行ったが、この方法にてクロマチン結合型pol βを検出することは今の所できていない。このことは、pol βとDNAとの結合力が、PCNAとは異なり非常に弱い可能性を示しており、他の方法を現在模索中である。これが可能になれば、その条件で電離放射線照射後のクロマチン結合型pol βの有無を検出できるはずである。また、pol βの欠失変異体とGFPとの融合タンパクを発現させ、pol βの核移行シグナル領域を検討したところ、N末1-100番目のアミノ酸領域まで限定することができた。さらに、領域をしぼり、ドメインを現在同定中である。本年度は、DNA polymerase β(pol β)(-/-)及びpol β(+/+)細胞を用いて、放射線生物学的特徴づけを行なった。コロニー法による放射線感受性、アポトーシス活性(放射線照射後のミトコンドリアの膜電位の低下、caspase-3様の活性、PKC-δ分解活性)、G2ブロック解除のキネテイクス、照射後のクロマチン結合型PCNAの解離動態を調べたところ、両細胞株に有意な差は見い出されなかった。このことは、電離放射線照射後の少なくとも細胞の生死にかかわる現象に対しては、主にPCNA依存型塩基除去修復経路が関与しており、pol β依存型経路の寄与は重要ではないことが、in vivoにおいて初めて示唆された。この結果は、Radiation Research,153,773-780,2000に報告した。また、新規遺伝子産物としてクローニングされた核蛋白質NP95が、DNA複製複合体に一致して検出されることをクロマチン結合型PCNAを指標にして詳細に検討した。その結果、NP95はPCNAと同じ範疇に属するlate growth-regulated geneであること、S期前半にはクロマチン結合型PCNAと同じ場所に存在するが、中期以降、局在が不一致になり、後期にはほとんど一致しなくなることをつきとめた。このことは、PCNAとは異なり、NP95はDNA複製装置として必須の役割を担ってはいないことを示している。1つの可能性として、S期の中でDNA損傷の修復に関与する可能性が考えられたが、放射線照射後、大きな局在の変化は認められず、homologous recombinationへの関与も否定的であった。この結果は、Experimental Cell Research,263,202-208,2001に報告した。

これが可能になれば、その条件で電離放射線照射後のクロマチン結合型pol βの有無を検出できるはずである。また、pol βの欠失変異体とGFPとの融合タンパクを発現させ、pol βの核移行シグナル領域を検討したところ、N末1-100番目のアミノ酸領域まで限定することができた。さらに、領域をしぼり、ドメインを現在同定中である。
児童貧困の測定に関する基礎的研究

Aわが国における児童貧困の推計を行った。資料は国民生活における世帯類型別にみた所得階層分布を用いた。(1)国民生活基礎調査における所得階層が50万円ごとであるので、仮定された世帯類型から生活保護基準を算出し、貧困線として使用可能な近似値を設定した。結果、「夫婦と未婚子世帯」については年収250万円、「単親と未婚子」世帯については年収200万円を貧困線として設定した。(2)結果、2000年度において、夫婦世帯の5.3%、単親世帯の25.2%が貧困線以下であった。この比率に近い子どもが、貧困の中で児童期をすごしていることが示唆された。(3)1986年からの年次推移を検討したところ、この比率は1994年を境に減少から上昇に転じており、近年の不況下で児童貧困の問題が深刻化していることを伺わせた。特に変動の幅は単親世帯で大きく、母子世帯における児童貧困問題の大きさが示された。(5)上記は中間的なまとめであり、より詳細な分析と検討は、今後継統される必要がある。B2002年1月に渡英調査を行ない、資料収集とともに、ロンドン大学政治経済学院(LSE)社会行政学部D. Piachaud教授にインタヴューを行った。イギリスの動向の検討から以下の諸点が示唆された。(1)1997年の労働党政権成立による政策の変更で児童貧困の比率は減少したとはいえ、いまだ大きな問題でもある。たとえば貧困線以下の子どもの比率は2000年で19%(夫婦世帯16%、単親世帯30%)推計され、政策的効果によって2003年までに15%(それぞれ13%、21%)まで減少するとの推計される。(2)貧困線の設定については、生活保護基準ではなく、平均所得の中央値を基準に、住宅費などいくつかの状況を勘案して複線的に検討する傾向にある。(3)社会的排除という概念に基づいて貧困研究を行うことが増えており、児童貧困と社会的排除の問題を連動して考える理論枠組みが必要とされている。上記の成果の詳細は今後公表される。
H.pylori制圧を期待できるチガイソ科海藻胞子葉のウレアーゼ阻害成分

本年度は、チガイソ科海藻チガイソ(Alaria crassiforia)の胞子葉に含まれているウレアーゼ阻害成分であるフロロタンニンの分子量の検討した。さらにフロロタンニンの微生物由来酸性ウレアーゼに対する阻害活性の検討を行った。チガイソを含水アセトンで抽出した後に、溶媒分画を行い、セルロースカラムクロマトグラフィーに供してフロロタンニンを得た。得られたフロロタンニンの分子量測定には、疎水性高分子化合物の分子量測定用のゲル浸透高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法を用いた。フロロタンニンはフェノール性水酸基が多数存在するために、多数の分子が会合対を形成していると推定できる。よって、フロロタンニンをそのままゲルろ過クロマトグラフィーに供すると見かけの分子量が高値を示すと予想できる。そこで、フェノール性水酸基のアセチル化を行い分子間相互作用を抑えた。フロロタンニンアセチル化物をゲル浸透HPLCに供した結果、アセチル化物の分子量は30007000と見積もられた。昨年度はJack beans由来の中性ウレアーゼを用いて阻害活性を検討した。今年度は胃内のような低pH条件下でのフロロタンニンのウレアーゼに対する阻害活性を検討した。乳酸菌Lactobacillus fermentumの生産する酸性ウレアーゼに対する阻害活性を調べた結果、pH4の条件下でもフロロタンニンは酵素阻害活性を示す(IC_<50>0.18mg/mL)ことを明らかにできた。この値は中性条件下で行ったJack Beans由来ウレアーゼに対する阻害活性とほぼ同等であった。フロロタンニンのH.pylori由来ウレアーゼに対する阻害活性の検討までには至らなかったが、フロロタンニンは微生物由来の酸性ウレアーゼに対して阻害活性を示したことから、胃内でのH.pyloriウレアーゼに対する阻害効果を期待できると結論した。本年度は、チガイソ科海藻であるワカメとチガイソの胞子葉からウレアーゼ阻害成分を単離し、その構造決定を行った。ウレアーゼ活性の測定は、入手が容易なJack bean由来のウレアーゼを用い、37°C・10分間酵素反応を行い、生成したアンモニアをインドフェノールへと誘導後に、吸光光度法で定量した。北海道南部の海岸でワカメ胞子葉およびチガイソ胞子葉を採集して、80%アセトンで抽出した。エキスを酢酸エチルに転溶後に、2回のセルロースカラムクロマトグラフィーおよび透析で分画して、ウレアーゼ阻害成分を得た。阻害成分はジメトキシベンズアルデヒドに陽性で、メタジフェノール構造を有することが明らかになった。阻害成分の構造決定のためにNMRスペクトルを測定したところ、^1H-NMRでは6ppm付近にブロードなシグナルのみがみられ、^3C-NMRでは150-160ppm、126-127ppmおよび96-97ppmにブロードなシグナルがみられた。これらの結果は本阻害物質がフロロタンニンであることを示唆している。得られたフロロタンニンの平均分子量の測定を限外ろ過膜法やゲル浸透液体クロマトグラフィー法で試みたが、確定するには至らなかった。フロロタンニンのJack beanウレアーゼに対するIC_<50>値は約0.3μg/mlであり、既知阻害物資であるベンゾヒドロキサム酸より阻害が強かった。今後は得られたフロロタンニンの平均分子量を確定し、H.pyloriウレアーゼに対する阻害活性を検討する。さらに、他に阻害成分が存在するかを確かめる。
脊髄損傷の根本的治療-中枢神経再生への挑戦

本年度は主に神経幹細胞を用いた中枢神経特に脊髄の再生に関して研究を行った。損傷を加えた脊髄に神経幹細胞を直接損傷部位に移植する場合、脳脊髄液を介して移植する場合等を研究した。まず、脊髄にニューヨーク大学式脊髄圧迫損傷器具をもちいて損傷を加え、その組織の経時的変化を観察し、神経幹細胞を移植するための基礎実験を行った。神経幹細胞は胎生16日頃のラット海馬組織より採取し、浮遊培養法によりNeurosphereを得た。これを、圧迫損傷を加えた脊髄に移植した。直接損傷部位に移植したもの、第4脳室に幹細胞を注入し脳脊髄液経由で投与したものを検討した。また、脊髄に損傷を加えた直後に移植したもの、損傷後3週間経過した後移植したものも検討した。損傷された脊髄は3日目頃よりマクロファージ等の炎症細胞が侵入し、約2週間で損傷が完成し、脊髄組織内に空洞形成されることがわかった。移植した神経幹細胞は宿主の脊髄組織に、いずれも良く生着し増殖しているものと思われた。損傷部位では、いずれの移植法でも一部損傷脊髄内に侵入し、宿主脊髄細胞と相互作用をしていると思われた。免疫組織化学染色により、宿主内に侵入した神経幹細胞は、主に星状膠細胞に分化している姿が得られた。また、数は少ないが、ニューロンに分化していると思われる細胞も見られた。また、希突起膠細胞に分化している細胞はほとんど見られなかった。損傷により形成された空洞を埋めるほどの再生は得られていないが、今後の研究に期待がもてる結果が得られた。哺乳類の中枢神経の再生の実験を、褐藻類より抽出・精製し、我々が独自に改良し、細胞毒性を無くしたアルギン酸スポンジを用いて行った。アルギン酸ゲルをラットの脊髄に移植し、脊髄内軸索の再生を検討した。ラット(生後10日および30日)の胸髄(Th7-9)を完全に切断、除去し、2mmのギャップを作成した。ここに、先のアルギン酸をスポンジ状に加工したものを移植した。移植術後6-8週間で、電気生理学的にギャップを越えた信号伝達が、上行性にも下行性にも見られた。また、術後8週間で組織を固定し、光学顕微鏡で見るとギャップの中央部に、再生したものと思われる有髄軸索が多数見られた。この軸索を透過型電子顕微鏡で観察すると、有髄軸索や、無髄軸索が見られた。この有髄軸索は、未梢神経の形態をとってはいたが、存在部位より中枢神経系に属する脊髄内軸索であろうと考えられた。移植術後8週間で固定した組織を、免疫組織化学的に染色した。神経組織、神経膠組織に特異的に結合する各種の抗体を用いて染色したところ、ギャップの内部に、再生軸索、感覚性軸索、錐体路の軸索などが確認できた。移植術後3-6ヶ月の時点で、軸索の順行製トレーサーとして、HRPを坐骨神経・大脳皮質に注入し、標識された軸索を観察した。その結果、幼若な時点で移植したラットでは、上行性の軸索(後索路)はギャップを越えて約8mm頭側まで伸びていることが確認できた。下行性軸索(錐体路)でも幼若なものは、約2mm尾側まで伸長していることが確認できた。生後30日ラットでも、数は少ないものの、ギャップを越えて伸長している脊髄内軸索が上行路、下行路とも確認できた。脊髄内軸索が移植したアルギン酸を通って再生、伸長し対側の脊髄に再侵入していることがわかった。運動機能回復など、まだ問題点は多く、今後の研究課題となる。研究の目的:近年、中枢神経、特に脊髄の欠損を再生させる研究の報告が多いが、いずれも脊髄組織、末梢神経等の生体材料を移植した報告である。生体材料は、未知の病原体による感染、拒絶反応、採取部の犠牲等問題も多く、臨床での使用は困難な場合も多い。人工材料の場合、上記の欠点を克服することは可能である。今回われわれは、人工材料にて脊髄再生を試みるため、新規に共有結合架橋による凍結乾操アルギン酸スポンジを開発し、利用した。方法:生後8-12日の幼若ラットの脊髄を、第6-8胸椎のレベルで切除し、約2mmのギャップを作成した。ここに、凍結乾操アルギン酸スポンジを充填した。術後12週で、電気生理学的、組織形態学的に脊髄神経の再生、伸長を検討した。結果:電気生理学的には、大脳皮質を電気刺激すると後肢の筋より誘発筋電図(MEP)が得られた。さらに、後肢を電気刺激すると、大脳より感覚誘発電位(SEP)が得られた。このSEP、MEPの波形は、正常ラットより得られたものに近く、また、正常ラットで、脊髄を切断すると、両者とも消失した。組織学的には、ギャップ中央部では、移植したアルギン酸はほぼ吸収されていた。電子顕微鏡下で、様々な太さの有髄、無髄神経が見られた。ミエリンの厚さも様々で、ミエリン化途中の無髄神経も見られた。これら有髄神経は、シュワン細胞様の細胞と1対1の対応をなす、末梢神経型であった。

まず、脊髄にニューヨーク大学式脊髄圧迫損傷器具をもちいて損傷を加え、その組織の経時的変化を観察し、神経幹細胞を移植するための基礎実験を行った。神経幹細胞は胎生16日頃のラット海馬組織より採取し、浮遊培養法によりNeurosphereを得た。これを、圧迫損傷を加えた脊髄に移植した。直接損傷部位に移植したもの、第4脳室に幹細胞を注入し脳脊髄液経由で投与したものを検討した。また、脊髄に損傷を加えた直後に移植したもの、損傷後3週間経過した後移植したものも検討した。損傷された脊髄は3日目頃よりマクロファージ等の炎症細胞が侵入し、約2週間で損傷が完成し、脊髄組織内に空洞形成されることがわかった。移植した神経幹細胞は宿主の脊髄組織に、いずれも良く生着し増殖しているものと思われた。損傷部位では、いずれの移植法でも一部損傷脊髄内に侵入し、宿主脊髄細胞と相互作用をしていると思われた。免疫組織化学染色により、宿主内に侵入した神経幹細胞は、主に星状膠細胞に分化している姿が得られた。また、数は少ないが、ニューロンに分化していると思われる細胞も見られた。また、希突起膠細胞に分化している細胞はほとんど見られなかった。損傷により形成された空洞を埋めるほどの再生は得られていないが、今後の研究に期待がもてる結果が得られた。
禁煙・禁酒後の血中過酸化脂質と脂溶性抗酸化ビタミン類(A,E,βカロチン)の推移

禁煙・禁酒により血中のβカロチン(単位μg/dl)、レチノ-ル(同)、トコフェロ-ル(同)、過酸化脂質(nmol/ml)濃度がたどる経時的変化を知るために、喫煙、飲酒習慣を持つ2033歳の健康男子24名を禁煙群(7名)、禁酒群(2名)、禁煙・禁酒群(8名)、喫煙・飲酒を継続する群(7名)に割り付け、実行開始後2週、4週目、並びに解除後4週目に於けるこれらの測定値を群間で比較した。対照群に両習慣の無い者7名を設定した。βカロチンについては摂取量の影響を考慮するため、連続2日間の摂取量を実行開始前と、4週後に調査した。実行開始前では、対照群のβカロチン濃度の平均値31.5±16.4に比べ、両習慣のある24名の平均値11.7±6.8は有意(P<0.05)に低く、各群別では禁煙群の15.4は低めであり、禁酒群の5.1と禁煙・禁酒群の12.2、並びに継続群の9.4は有意に低かった(一元配置分散分析P<0.005,Scheffeの級間比較P<0.05)。実行開始4週後には禁煙群、禁酒群、禁煙・禁酒群のβカロチンの平均濃度は最も高い値を示し、解除後4週目では減少した。この時間変化は有意であったが、継続群では有意な時間変化を示さなかった。(一元配置分散分析と級間比較)。禁煙禁酒実行群全体(17名)と継続群の開始前でのβカロチン平均濃度は各々12.7±7.0と9.4±6.2で有意差はなく、4週後では29.9±15.4と16.0±13.0で有意差を認めた。βカロチン摂取量と血清濃度の間、並びに各々の変化量の間には有意な相関は認められなかった。過酸化脂質濃度の平均値は喫煙・飲酒習慣の無い群では2.5±0.5,両習慣のある群では2.9±0.7であり両群間には有意差は無く、又、継続群、実行群ともに有意な時間変化を示さなかった。レチノ-ル、トコフェロ-ル濃度も対照群と喫煙飲酒群、並びに継続群と実行群の間で有意差は認められなかった。以上より、禁煙、禁酒によりβカロチン濃度においてのみ上昇傾向が認められた。
LAMP法を用いたヘルペスウイルス皮膚感染症の迅速診断法の確立

材料と方法:プライマーはKSHV minor capsid protein geneを基に作成した。特異性の確認のため、KSHV感染細胞(BCP-1)より抽出したDNAに加え、単純ヘルペスウイルス1型、2型、水痘帯状疱疹ウイルス、EBウイルス、サイトメガロウイルス、さらにHHV-6A、6B、HHV-7の各DNAを用いた。感度決定のため標的領域をPCR法で増幅、得られたPCR産物をpGEM-T vectorを用いてサブクローニング。その後、精製したプラスミドDNAの希釈系列を用いて感度を測定した。結果:KSHV DNAのみが増幅され、他のヘルペスウイルスDNAは増幅されず、今回作成したプライマーはKSHVに特異的であることが確認された。感度は30分のLAMP反応で100コピーの検出が可能であった。臨床検体を用いた検討では、Kaposi肉腫患者検体17例(凍結切片10例、パラフィン切片7例)中、14例からKSHV DNAを検出可能でありreal-time PCRを用いた結果と一致した。考察:今回のLAMP法による定量法を確立したことで従来の方法より、より迅速かつ簡便にKSHV又はHHV-8の定量を行うことが可能となった。臨床検体を用いた検討でも、今回の方法の簡便性、有用性を示すことができた。今後更に検討を重ね、実際の臨床でも応用できるようにしたい。今後は臨床検体による検出を試みる予定である。
判断の「いい加減さ、慎重さ」はどのように調節される?-黒質網様部・抑制出力の解析

我々の意思判断には限界があり、短時間で下す判断はいい加減になり、時間が許容される判断は慎重に下すことができる(Speed-Accuracy Tradeoff)。この意思判断の「いい加減さ、慎重さ」は、認知心理学で発展した計算モデルのある一つの変数「判断の閾値」によってうまく説明される。本研究の目的は、この行動から推定される「判断の閾値」の実態を神経科学的に解き明かすことであった。機能的、解部学的な知見より、「判断の閾値」は大脳基底核・抑制出力によって調節されるという作業仮説を提案し、それに基づく実験、解析によって以下の成果を報告した。微小電気刺激による大脳基底核・抑制出力の人工操作は、状況に依存して変化する単純なサッカード眼球運動課題を遂行中のサルに対して、黒質網様部の活動を制御する尾状核に微小電気刺激を与えると、サッカード(特に対側方向)の発現が抑制されることを以前報告した(Watanabe and Munoz 2010)。しかし、課題を遂行していない状態のネコでは、同じ微小電気刺激によって対側へのサッカードが誘発されることが知られている(Kitama et al.1991)。そこで今回、同一個体(サル)の同一の刺激部位において上記2つの実験を行った結果を解析した。これによると、同一刺激部位において、サッカード課題遂行中は側方向へのサッカードの抑制が生じ、課題を行っていない場合は対側方向へのサッカードが誘発された。これより、尾状核・微小電気刺激によって生じる大脳基底核・出力信号、状況依存的に変化することが示された。この結果より、強迫性障害等の治療で試験的導入されている尾状核・脳深部刺激の行動への影響が、日常生活の状況に依存して変化することが示唆された。この成果は2011年の北米神経科学会(ワシントンDC)にて発表した。
肥満・糖尿病に関連した新規遺伝子の機能解析

【目的】脂肪細胞分化におけるConnexin43の役割について検討した。【方法】Connexin43に対する阻害剤を用いて3T3L-1細胞の分化への影響を、Oil-red 0染色、脂肪細胞の分化マーカーを用いて検討した。Mitotic clonal expansion(MCE)への影響を脂肪細胞数とDNA合成量測定で検討した。またconnexin43の、siRNAを作成し3T3T-1細「胞の分化への影響を同様にして検討した。【結果】阻害剤を分化初期(0-2日)に3T3L-1細胞へ投与すると濃度依存性に脂肪蓄積が阻害された。それ以降の投与では脂肪蓄積は阻害されなかった。分化マーカーであるPPAR_γ、C/EBP_γ、GLUT4の発現は低下していた。C/EBP_βはmRNAレベルでは変化を認めなかったが蛋白レベルでは2つの翻訳産物のうちLAPは低下したがLIPは低下していなかった。Connexin43の発現は分化開始後数時間でピークになり、あとは低下することが示された。阻害剤がMCEの生じる分化0-2日目に最も効果的に作用することやconnexin43の発現パターンより、connexin43はMCEに影響を与えることが示唆された。MCEの指標である脂肪細胞数の増加とDNA合成を検討した結果、阻害剤により両方とも阻害されることが示された。2)siRNAによる阻害実験:3T3L-1細胞にconnexin43のsiRNAを作成し導入したところ、阻害剤の実験と同様に脂肪蓄積が阻害された。また、C/EBP_βの翻訳産物のうちLAPは低下したがLIPは低下していなかった。【考察】Connexin43はMCEに重要な作用をしていることが示唆された。Connexin43はLAP(C/EBP_β)の翻訳調節を介してPPAR_γ、C/EBP_αの発現を調節し脂肪細胞の分化に関与し、肥満発症に寄与する機序が考えられた。1.動物モデル、脂肪細胞における発現調節の検討肥満モデル動物であるZucker rat及びdb/dbマウスの皮下脂肪、内臓脂肪における新規遺伝子の発現をリアルタイムPCRにて測定した。その結果、この遺伝子の発現は皮下脂肪より内臓脂肪でより多く発現していた。また、肥満ラットでは、皮下脂肪、内臓脂肪ともにこの遺伝子の発現が低下していた。特に内臓脂肪での低下が著しいことが明らかとなった。絶食による影響はほとんど認められなかった。3T3L-1細胞での脂肪細胞分化過程においては、前駆脂肪細胞から発現が認められ、分化に伴う変化は認められなかった。2.細胞における糖・脂質代謝に及ぼす機能の解析新規遺伝子の全長cDNAを含むアデノウイルス組換え体とdominant negativeのアデノウイルス組換え体を作成した。現在、3T3L-1細胞に高発現させ、糖取り込みに及ぼす影響を検討中である。3.肥満患者における遺伝子多型と機能との関連性新規遺伝子の同定に至ったSNPの周辺の遺伝子多型を検索し、タイピングを行った。LDブロックを作成し、この遺伝子がひとつのLDブロック内に存在していること見出した。3'-flanking regionに有意なSNPが存在していたのでこの領域のレポータープラスミドを作成しルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、SNPにより転写活性に差があることを見出した。また、ゲルシフトアッセイにより一方のSNPにのみ結合する核蛋白が存在していることを見出した。4.ノックアウトマウスあるいはトランスジェニックマウスの作成

1.2.3.の実験が途中であるので、まだ行っていない。【目的】脂肪細胞分化におけるConnexin43の役割について検討した。【方法】Connexin43に対する阻害剤を用いて3T3L-1細胞の分化への影響を、Oil-red O染色、脂肪細胞の分化マーカーを用いて検討した。Mitotic clonal expansion(MCE)への影響を脂肪細胞数とDNA合成量測定で検討した。またconnexin43のsiRNAを作成し3T3L-1細胞の分化への影響を同様にして検討した。【結果】阻害剤を分化初期(0-2日)に3T3L-1細胞へ投与すると濃度依存性に脂肪蓄積が阻害された。それ以降の投与では脂肪蓄積は阻害されなかった。分化マーカーであるPPARγ、C/EBPα、GLUT4の発現は低下していた。C/EBPβはmRNAレベルでは変化を認めなかったが蛋白レベルでは2つの翻訳産物のうちLAPは低下したがLIPは低下していなかった。Connexin43の発現は分化開始後数時間でピークになり、あとは低下することが示された。阻害剤がMCEの生じる分化0-2日目に最も効果的に作用することやconnexin43の発現パターンより、connexin43はMCEに影響を与えることが示唆された。MCEの指標である脂肪細胞数の増加とDNA合成を検討した結果、阻害剤により両方とも阻害されることが示された。2)siRNAによる阻害実験:3T3L-1細胞にconnexin43のsiRNAを作成し導入したところ、阻害剤の実験と同様に脂肪蓄積が阻害された。また、C/EBPβの翻訳産物のうちLAPは低下したがLIPは低下していなかった。【考察】Connexin43はMCEに重要な作用をしていることが示唆された。Connexin43はLAP(C/EBPβ)の翻訳調節を介してPPARγ、C/EBPαの発現を調節し脂肪細胞の分化に関与し、肥満発症に寄与する機序が考えられた。