hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞系譜解析を用いた角膜上皮幹細胞の恒常性維持機構の解明

細胞系譜解析を用いた角膜上皮幹細胞の恒常性維持機構の解明を目的に、LRIG1遺伝子ノックインマウスの創出に成功した。本マウスを用いて解析した結果、生体内で標識されたLRIG1(+)角膜上皮幹細胞は、角膜輪部に局在するのみならず、角膜周辺部、中央部にも散在的に存在することがわかった。また、本マウスを用いた長期追跡観察で、角膜輪部には全く細胞移動しない極めて静止状態に近い幹細胞が存在することがわかった。これらの結果は、角膜上皮が角膜輪部に存在する幹細胞でのみ維持されていると考えられている現在のコンセプトに再考の必要性を示す極めて重要な研究結果となった。一般に、生体の各臓器・組織には組織特異的な幹細胞が存在し、その修復・再生に重要な役割を担うと考えられている。これまでの細胞生物学的な基礎研究から、角膜上皮幹細胞は角膜周辺部に位置する角膜輪部の基底層に存在すると考えられている。しかし、角膜上皮幹細胞の細胞動態や維持機構に関しては不明な点が多く、今後、組織幹細胞を用いた角膜再生医療の発展を考える上では、その分子レベルにおける細胞動態の理解が必須である。そこで本研究では、組織幹細胞を用いた角膜再生医療の臨床基盤技術開発を念頭に、角膜上皮幹細胞の恒常性維持機構を分子レベルで解明することを主目的とした。具体的な本年度の研究実績としては、我々が昨年角膜上皮幹細胞マーカーとして報告したLrig1に焦点を当てて(Journal of Clinical investigation 2014)、薬剤誘導性に生体内で蛍光標識可能なLrig1遺伝子ノックインマウスの作成を試みた。その結果、Lrig1-EGFP-IRES-CreERTマウスとRosa26-LSL-tdTomatoマウスの交配後、genotypingにより目的とする遺伝子改変マウスの創出に成功した。また、本マウスが薬剤誘導性にLrig1(+)細胞が観察されるかをタモキシフェン誘導後、経時的に眼表面を観察した。その結果、Lrig(+)細胞が時間経過とともに出現し、その細胞動態が観察可能であることがわかった。また、その発現パターンは、眼表面に散在性に出現した後、中心部へ向けて移動する傾向が観察された。以上、今年度の結果より、Lrig1を指標とした最新の細胞系譜解析が可能な遺伝子改変マウスを創出し、細胞動態の解明が可能となった。またその細胞動態分布から、Lrig1は角膜における恒常性維持機構に重要な役割を担っている事がわかった。そこで、本年度はこれまでの知見をさらに発展させ、角膜をモデルに用いて、Lrig1による包括的な上皮幹細胞の恒常性維持機構の詳細な解析を行った。具体的には昨年度に確立した薬剤誘導性(タモキシフェン)に蛍光標識可能なLrig1ノックインマウスを用いて、Lrig1陽性細胞による細胞動態を継時的に観察した。Lrig1の細胞動態を蛍光標識(Confettiマルチカラー、TdTomato)で1年以上継時的に観察し、その細胞生物学的特性の詳細を解析した。その結果、誘導後早期(12W)まではLrig1陽性細胞は点状に分布し、時間経過とともに数珠上に拡大していくことがわかった。誘導後期(12W以降)では、Lrig1陽性細胞は輪部、周辺部角膜より拡大、streakを形成することがわかった。これまでの経過観察では、streakはいくつかのパターンに分類可能であることが判明した。以上、今年度の研究結果から、Lrig1を指標とした最新の細胞系譜解析可能なマウスモデルを用いて、角膜の恒常性維持機構の解明に重要な細胞動態を解析できた。また、Lrig1は角膜の透明性・恒常性維持に重要な役割を担っていることがわかった。当初の計画どうり、我々が報告した角膜上皮幹細胞マーカーであるLrig1の細胞動態を蛍光標識(Confettiマルチカラー、TdTomato)で1年以上継時的に観察でき、その細胞生物学的特性の詳細を解析できた。よって、現在までの研究の達成度としてはおおむね順調に進展していると考えられる。これまでの細胞生物学的・分子生物学的な基礎研究から、角膜上皮幹細胞は角膜周辺部に位置する角膜輪部の基底層に存在すると考えられている。しかし、角膜上皮幹細胞の細胞動態や維持機構に関してはいぜん不明な点が多く、今後、組織幹細胞を用いた角膜再生医療の基盤技術開発を考える上では、その分子レベルにおける細胞動態の理解が必須である。本年度はこれまでの研究成果をもとにさらに発展させ、Tomato蛍光色素(モノカラー)で生体標識可能なLrig1遺伝子ノックインマウスを用いて、様々な創傷状態におけるLrig1(+)角膜上皮幹細胞による細胞・組織修復機構の解明を目指し、その細胞動態の詳細を観察した。その結果、創傷範囲の大きさにより、Lrig1(+)角膜上皮幹細胞による修復パターンが明らかに異なることがわかった。

具体的には、角膜中央部における創傷では、創傷領域が小さい場合は、Lrig1(+)細胞は散在的に創傷領域内に観察されるのに対して、創傷領域が大きい場合は、Lrig1(+)細胞が連続的に細胞遊走して修復することがわかった。また角膜輪部領域の創傷では、Lrig1(+)細胞による角膜上に観察される発現パターン(streak)が明らかに乱れることがわかった。以上の結果より、Lrig1を角膜上皮幹細胞の指標とした細胞系譜解析により、角膜の定常状態のみならず、創傷過程においても、その細胞修復過程を可視化し解析することが可能となった。また、角膜輪部に存在するLrig1(+)細胞は、角膜の恒常性維持に極めて重要な細胞ソースであることがわかった。以上、Lrig1は角膜上皮における恒常性維持機構に極めて重要な役割を担っていることがあきらかとなった。細胞系譜解析を用いた角膜上皮幹細胞の恒常性維持機構の解明を目的に、LRIG1遺伝子ノックインマウスの創出に成功した。本マウスを用いて解析した結果、生体内で標識されたLRIG1(+)角膜上皮幹細胞は、角膜輪部に局在するのみならず、角膜周辺部、中央部にも散在的に存在することがわかった。また、本マウスを用いた長期追跡観察で、角膜輪部には全く細胞移動しない極めて静止状態に近い幹細胞が存在することがわかった。これらの結果は、角膜上皮が角膜輪部に存在する幹細胞でのみ維持されていると考えられている現在のコンセプトに再考の必要性を示す極めて重要な研究結果となった。計画の予定通り、我々が報告した角膜上皮幹細胞マーカー候補であるLrig1に注目し、細胞系譜解析が可能なLrig1-EGFP-IRES-CreERT/Rosa26-LSL-tdTomatoマウスの創出ならびに細胞動態解析を行った。以上より、現在までの研究の達成度としては、おおむね順調に進展していると考えられる。これまでのマウスモデルを用いた解析により、Lrig1が角膜上皮幹細胞の細胞動態、恒常性医事機構に重要な役割を担っていることが明らかとなった。そこで今後は、生理的な恒常性維持機構に関しては、細胞の分裂のパターン、細胞動態の部位別特性、増殖細胞との関連に注目して研究をすすめる。また、創傷治癒機構に関しては、創傷サイズによる生体の反応パターンを観察し、上皮幹細胞による恒常性維持機構、創傷治癒の分子機構に検討を加える。眼科学Lrig1が角膜の細胞動態、恒常性維持機構に重要な役割を担っている事が明らかとなった。そこで今後は、創出した遺伝子改変マウスを用いて、in vitro機能解析モデル、創傷誘導モデルを用いた角膜における組織学的、細胞生物学的考察を加えて、Lrig1の角膜における恒常性維持機構の分子レベルにおける機能解析を行う。
第四紀後期の南極の氷床変動と環境変化

1)^<14>C年代が35万年前を示す南極の隆起海浜に産する貝化石のなかに、より古いものが含まれている可能性が高いことから、クロスチェックの意味も含めて、ESR年代測定をおこなった。対象にした試料はすべてAMS^<14>C年代値をすでに得た貝化石Laternula ellipticaである。35万年の^<14>C年代を示した貝化石のESR年代は、43-57ka,59-76ka,73-93ka,162-190ka,154-207ka,203-253kaで、すべてAMS^<14>C年代よりも古い値であった。また、^<14>C年代が3.5kaの完新世試料のESR年代は1.5-1.7kaと測定され、^<14>C年代のリザーバー効果を考えると、整合性のある結果であった。2)同じ理由と目的で、さらに、同一試料のアミノ酸ラセミ化年代を測定した。ラセミ化速度は温度に依存するが、貝化石が経てきた温度環境が不明であるので、昭和基地の現在の年平均気温-10°Cを用いた。アミノ酸ラセミ化年代は完新世の貝化石を除くと、すべて21万年-41万年前の値を示し、三者の中でもっとも古い年代となった。過去の温度環境の検討を含めて、さらに研究を進める必要がある。3)南極沿岸露岩から採取した岩石試料の宇宙線照射年代(露出年代)を測定した結果、東南極の昭和基地付近では.LGMに先立つ5万年前頃から氷床の後退が始まっていたことを示す露出年代が得られた。4)南極沿岸から採取した海棲貝化石Zygochlamys andersoniの^<87>Sr/^<86>Sr年代を測定し、約100万年前の年代値を得た。南極の他地域に産する同種の化石年代からの類推で、第三紀鮮新世であることが予想されていたこともあり、さらに検討を要する。5)リュツォ・ホルム湾地域から得られた^<14>C年代データーを編集して、1998年に地図と説明書を刊行したが、その後の資料を加えてデーター集を作成した。氷床変動および海水準変動の年代値を得る一手法として、1)南極の隆起海浜から採取した海棲貝化石の、ESR年代測定法による測定をおこなった.対象にした試料はすべてAMS^<14>C年代値をすでに得たもので、3万年よりも古い^<14>C年代値を示したアラゴナイト貝化石である。比較のために、完新世の^<14>C年代値を示す貝化石についても測定した.35万年のAMS^<14>C年代を示す貝化石のESR年代は、6点が43-57ka,59-76ka,73-93ka,162-190ka,154-207ka,203-253kaとなり、すべてAMS^<14>C年代よりも古い値である.

ESR年代値は堆積層の含水率を5%で計算しているため、もし、堆積層が水や氷を多く含んでいた時代があったとすると、年代はより古くなる方向にズレる可能性がある.2試料は、放射線を当てても信号強度が大きくならない飽和現象に近い試料で、測定不能であった.このような試料の年代は、かなり古い場合が多い.ESR年代測定の性格上、年代値が古くなると外挿の幅が大きくなり、どちらかというと数値は若めの値をとることがある.したがって、年代値の数字そのものの確度の問題はあるが、AMS^<14>C年代はunderestimateの可能性がある。なお、^<14>C年代が3.5kaを示した完新世の試料のESR年代は1.5-1.7kaと測定され、^<14>C年代のリザーバー効果を考えると、整合性のある結果と言える.2)南極沿岸露岩から採取した岩石表面試料の^<10>Be,^<26>Al測定による露出年代を測定中である.3)南極沿岸から採取した第三紀の可能性がある海棲貝化石の^<87>Sr/^<86>Sr年代を測定中である.ソフトX線写真撮影装置を購入し、テスト試料(海底堆積物)のX線写真撮影を実施して正常動作を確認した.1)^<14>C年代が35万年前を示す南極の隆起海浜に産する貝化石の准かに、より古いものが含まれている可能性が高いことから、クロスチェックの意味も含めて、昨年度はESR年代測定法による測定をおこなった。対象にした試料はすべてAMS^<14>C年代値をすでに得た貝化石Laternula ellipticaである。35万年の^<14>C年代を示した貝化石のESR年代は、43-57ka,59-76ka,73-93ka,162-190ka,154-207ka,203-253kaで、すべてAMS^<14>C年代よりも古い値であった。また、^<14>C年代が3.5kaの完新世試料のESR年代は1.5-1.7kaと測定され、^<14>C年代のリザーバー効果を考えると、整合性のある結果であった。今年度はさらに、同一試料のアミノ酸ラセミ化年代を測定し、三者の年代値を比較した。アミノ酸のラセミ化速度は温度に依存するが、貝化石が経てきた温度環境が不明であるので、昭和基地の現在の年平均気温-10°Cを用いた。アミノ酸ラセミ化年代は完新世の貝化石を除くと、すべて21万年-41万年前の値を示し、三者の中でもっとも古い年代となった。過去の温度環境の検討を含めて、さらに研究を進める必要がある。2)南極沿岸露岩から採取した岩石試料の宇宙線照射年代(露出年代)を測定した結果、東南極の昭和基地付近では、LGMに先立つ5万年前頃から氷床の後退が始まっていたことを示す露出年代が得られた。3)南極沿岸から採取した第三紀の可能性がある海棲貝化石Zygochlamys andersoniの^<87>Sr/^<86>Sr年代を測定し、約100万年前の年代値を得た。南極の他地域に産する同種貝化石の年代からの類推で、第三紀鮮新世の化石であることが予想されていたこともあり、さらに検討を要する。4)南極周辺海域で採取された海底堆積物コアの粒度分析等のコア解析を実施した。
Mo,Tなどの原子薄膜を極低温超高真空下で作製できる凍結レプリカ装置の試作

本研究の目的は膜と細胞骨格などの相互作用を分子レベルで形態解析できるような新しい凍結エッチング装置の開発とそれを用いた膜構造の解析であった。初年度においてまず凍結エッチング装置を作製した。この装置は真空度約1×10^<-6>Pa、温度は室温と-160°Cの間で制御でき、さらに、ミクロトーム装置が内蔵されているのでガラスナイフやダイアモンドナイフにて試料を10nm以上の精度で切削できる。また電子銃も改良したためタングステンやモリブデンなど高融点金属を超高真空中で蒸着できる。従来の白金レプリカに比べ、極めて分解能が高くなった。このため、試料を必ずしも洗剤で洗い流す必要はなく、そのままで観察が可能である。したがって、洗剤による酸化などでのレプリカ膜の劣化を心配する必要がなく。白金以外のより粒子の細かい高融点金属を蒸着原として使用することが出来る。X線結晶回折と比べると劣るが、10nmぐらいの分解能で蛋白分子複合体の構造解析には有効である。平成14年度からは応用面に力を注ぎこの装置を用いて急速凍結ディープエッチ免疫レプリカ電顕法を行った。極めて容易に細胞膜の細胞質側表面を全面にわたって観察できた。細胞膜の近傍での膜骨格の形態や構造が明らかになりつつある。免疫金コロイド標識によって膜骨格は主にアクチンとスペクトリン、アデューシン、ゲルゾリンなどのアクチン結合タンパク質からなることがわかってきた。また、アクチンの枝分かれを可能にするArp2/3蛋白も同定することが出来た。クラスリン被覆ピットやカベオラと膜骨格との結合も見えはじめた。またこれらを定量的に解析するために三次元再構築を試みた。±45°の間で1°ステップで90枚の写真を撮り膜裏打ち構造のアニメーションや立体再構築に成功した。本研究の目的は細胞内その場分子複合体構造解析を目指した次世代の凍結レプリカ装置の開発とその応用である。EELS顕微鏡の出現によって、これまでのようにレプリカを完全に洗浄する必要はなくなった。実際、膜骨格などを付着させたままのレプリカの方が膜蛋白と骨格の関連がよくわり、また膜骨格や膜内の元素分析や免疫染色が同時にレプリカ上で可能となることから、膜のドメイン構造などを明らかにすることが出来る。本年度はタングステン蒸着による高分解能レプリカを作るため早急に新しい装置を試作した。真空排気系は以前開発したFR7000(日立サイエンスシステムズ)をベースに作製したため、容易に完成にこぎ着け、液体窒素で冷却した状態で10^<-6>Paという高真空を得ることが出来た。また、蒸着電源を5KVまで上昇させたためタングステンの蒸着が容易にできるようになった。しかし、タングステンを支える電極としてカーボンを用いたためカーボン蒸着も同時に行われてしまうため、これまで以上の高分解能レプリカを作製するに至っていない。本研究は次年度までの継続研究であることから、応用研究とともにタングステンを支える電極について工夫を凝らす予定である。これまでに明らかになったことは被覆小穴やカベオラが膜骨格のアクチン、スペクトリンと密接な関係にあることである。また、我々は細胞膜標本を採取する方法を確立したため、金コロイド抗体を用いて、一つの蛋白分子を同定することが可能となった。このようないわば免疫分子化学が確立できたので次年度では膜裏打ち構造において如何なる蛋白がどのような構築を形成しているかを明らかにできると考えている。また、膜裏打ち蛋白質の三次元構築が癌化などの病気により、如何なる変化をするかは大変興味があり今後の研究課題である。

本研究の目的は膜と細胞骨格などの相互作用を分子レベルで形態解析できるような新しい凍結エッチング装置の開発とそれを用いた膜構造の解析であった。我々の作製した装置は真空度約1×10-6Pa、温度は室温と-160oCの間で制御できる。さらに、この装置ではタングステンやモリブデンなど高融点金属を超高真空中で蒸着できるため、従来の白金レプリカに比べ、極めて分解能が高くなった。また、ミクロトームタイプの切削装置を備えているため、ダイヤモンドナイフで10nmの精度で膜直下まで削ることが出来る。このため、試料を必ずしも洗剤で洗い流す必要はなく、そのままで観察が可能である。したがって、洗剤による酸化などでのレプリカ膜の劣化を心配する必要がなく、白金以外のより粒子の細かい高融点金属を蒸着原として使用することが出来る。X線結晶回折と比べると劣るが、10nmぐらいの分解能で蛋白分子などを観察するには重宝である。応用面では急速凍結デイープエッチ免疫レプリカ電顕法で、細胞膜の細胞質側表面を全面にわたって観察することができるようになった。これによって、細胞膜の近傍での膜骨格の形態や構造が明らかになりつつある。さらに、免疫金コロイド標識によって膜骨格は主にアクチンとスペクトリン、アデューシン、ゲルゾリンなどのアクチン結合タンパク質からなることがわかってきた。また、アクチンの枝分かれを可能にするArp2/3蛋白も同定することが出来た。クラスリン被覆ピットやカベオラと膜骨格との結合も見えはじめた。またこれらを定量的に解析するために三次元再構築を試みた。±45°の間で1°ずつ90枚の写真を撮り膜裏打ち構造のアニメーションを作ることに成功した。
下顎骨切除後の咀嚼機能回復に関する実験的研究:rhBMP-2,生体吸収材料(プレート)および歯科インプラントの併用

本研究の目的は,下顎骨区域切除後,骨欠損部に、rhBMP-2を用いて骨を誘導し,この部に歯科用インプラントを使用して咀嚼機能の回復をはかることである.このためには,rhBMP-2による骨誘導に適切な担体の検討が必要である.また,新生骨に置換されるまでの期間は担体の保持と骨欠損部の再建に必要な強度を有し,新生骨の形成後は吸収されるプレートが望ましい.1.ラットにおける骨誘導(1)rhBMPを含む担体,tricalciumphosphate(TCP)とフィブリン糊を皮下組織内に埋入し,骨誘導を確認した.フィブリン糊は,単独で使用するよりも他の担体の接着剤として使用すると利点が多い.TCPはX線不透過性で,X線写真による新生骨形成の確認に不都合であり,歯科用インプラントを植立するのに障害となる.(2)11週以内に新生骨を誘導するためには,少なくとも50μg/ml以上のrhBMP-2が必要と推測される.2.犬を用いた下顎再建・担体保持用吸収性プレートの開発非結晶性,分子量約26万,厚さ1mmの吸収性プレート(PLLA)を検討した.(1)下顎を1cm区域切除後,PLLAプレートとAOプレートで各側を再建した.再建直後の片持ち曲げ試験で両プレートを比較した結果,PLLAプレートは十分な固定力を有していると思われた.(2)区域切除前に,軟組織を剥離した下顎骨の印象採取を行った.これを基に石膏模型を作製しておき,PLLAプレートを加熱(7075°C)して石膏模型に圧接すると,下顎骨の形態が正確に再現され,トレー状のプレートが得られた.(3)下顎再建3カ月後にPLLAプレートを除去した.PLLAプレートには吸収部が散見され,3点曲げ試験による平均曲げ強度は未使用プレートの62%であった。新生骨が3カ月以内に形成されれば,PLLAプレートは顎再建,担体保持の要件を満たすと考える.本研究の目的は,下顎骨区域切除後,骨欠損部に、rhBMP-2を用いて骨を誘導し,この部に歯科用インプラントを使用して咀嚼機能の回復をはかることである.このためには,rhBMP-2による骨誘導に適切な担体の検討が必要である.また,新生骨に置換されるまでの期間は担体の保持と骨欠損部の再建に必要な強度を有し,新生骨の形成後は吸収されるプレートが望ましい.1.ラットにおける骨誘導(1)rhBMPを含む担体,tricalciumphosphate(TCP)とフィブリン糊を皮下組織内に埋入し,骨誘導を確認した.フィブリン糊は,単独で使用するよりも他の担体の接着剤として使用すると利点が多い.TCPはX線不透過性で,X線写真による新生骨形成の確認に不都合であり,歯科用インプラントを植立するのに障害となる.(2)11週以内に新生骨を誘導するためには,少なくとも50μg/ml以上のrhBMP-2が必要と推測される.2.犬を用いた下顎再建・担体保持用吸収性プレートの開発非結晶性,分子量約26万,厚さ1mmの吸収性プレート(PLLA)を検討した.(1)下顎を1cm区域切除後,PLLAプレートとAOプレートで各側を再建した.再建直後の片持ち曲げ試験で両プレートを比較した結果,PLLAプレートは十分な固定力を有していると思われた.(2)区域切除前に,軟組織を剥離した下顎骨の印象採取を行った.これを基に石膏模型を作製しておき,PLLAプレートを加熱(7075°C)して石膏模型に圧接すると,下顎骨の形態が正確に再現され,トレー状のプレートが得られた.(3)下顎再建3カ月後にPLLAプレートを除去した.PLLAプレートには吸収部が散見され,3点曲げ試験による平均曲げ強度は未使用プレートの62%であった。新生骨が3カ月以内に形成されれば,PLLAプレートは顎再建,担体保持の要件を満たすと考える.下顎骨の区域切除後、rhBMPによる骨誘導,これのdelivery systemとしてフィブリン糊とトレー型吸収性プレートの臨床応用が可能かを,ラット,犬を用いて検討してきた.1.rhBMP担体の工夫:Wister系ラット(雄,8週齢)を用いて実験を行った.フィブリン糊はrhBMPと混和して注射筒内に填入しておくと,注入が容易であり,長期の保存も可能となる等,臨床的な応用が可能であると考えている.他方,異所性(ラット背部皮下組織)の骨形成が認められたのは埋入後10週であり,他の実験結果に比べてかなり遅い.その原因として,フィブリン糊と併用した(Tricalcium phosphate),あるいはrhBMPとフィブリン糊の混合比が考えられるため,これらを確認する実験を行っている.2.吸収性プレートの機械的強度と経時的変化の確認,顎形態の賦与:吸収性プレートは顎再建に必要な初期強度を有し,かつ,加温により下顎の彎曲面に適合するような性状が必要である.犬(雄,成犬)の下顎(両側)に各1cmの区域切除を行い,AOプレートとポリ-L-乳酸poly(L-lactide)プレート(PLLAプレート)で固定した.

厚さ1mmのPLLAプレートが形態の賦与が容易で,片持ち曲げ試験による比較の結果,下顎再建時の初期強度を有していると考えられた.PLLAの基礎的実験でプレートは3カ月間は初期強度を保つとされているが,犬の下顎にプレートを装着して経時的吸収の程度と強度の変化を検討している.また,切除前の下顎形態を再現するには,印象採得後石膏模型を作製し,加熱(約70°C),圧接することにより形態の賦与が可能であることを確認した.rhBMP-2とトレー型吸収性(PLLA)プレートによる骨誘導による顎再建を目的とする基礎実験を引き続き行ってきた.1.rhBMP-2の担体:フィブリン糊はその接着性を利用すると臨床応用に適していると考えるが,フィブリン糊を担体とすると骨形成が遅延するという報告があり,これについて検討した.担体中のrhBMPの量を変えて骨形成までの期間をラットで観察した.フィブリン糊,フィブリン糊+TCP,対照として吸収性止血剤(インテグラン【encircledR】,スポンゼル【encircledR】)を用い,Wister系ラット(雄,6週齢)の背部皮下組織に埋入し,骨形成の有無を観察した.その結果,40μg/ml以下では,対照を含め,11週以内に骨形成は認められなかった.フィブリン糊の生体内での吸収期間は5日間と報告されており,rhBMPが急速に拡散する可能性があり,また,rhBMP-2とフィブリン糊を混和すると単位容積あたりのrhBMP-2量が減少する.フィブリン糊を担体として使用する場合は,吸収までの期間が長い他の担体と併用し,単位容積あたりのrhBMP-2量を考慮する必要があり,この期間内の骨誘導実験では少なくとも50μg/ml以上のrhBMP-2が必要であると推測された.2.吸収性プレートの経時的変化:ポリ-L-乳酸(poly-L-lactide,PLLA)トレイ型プレートは,rhBMPと担体を保持するのに適してしる.厚さ1mmのプレートは顎骨形態の賦与が容易で,下顎再建時の初期固定力を有している.犬の顎切除後の下顎再建に使用し,3カ月後の経時的変化を検討した.3点曲げ試験による曲げ強度は未使用プレートの約62%を示し,プレートの吸収は辺縁や中央部に散見され,走査型電顕の観察では表面粗さがめだち,分子量は軽度減少していた.新生骨が3カ月以内に形成されれば,PLLAプレートは顎再建,担体保持の要件を満たすと考える.
生殖機能と再分化の分子制御

第1グループ日向はBrassica campestris種の中の自家和合の系統について、S遺伝子とは独立したM遺伝子の存在を提唱した。また、柱頭の高温処理で自家不和合性が打ち破れることを明らかにした。鈴木はB.campestrisのS糖タンパク質を単離し、【S_8】糖タンパク質のアミノ酸配列の大部分を決定し、それぞれのホモ系統株間でのアミノ酸配列の異なる部分を明らかにした。新城は67種の細胞質雄性は不稔稲についてその雄性不稔細胞質と稔性回復遺伝子の同定を行い、7系統のものを同定した。木村は除雄剤の検索法を確立するため、クロマツの花粉を用いる方法を考案し、微生物代謝産物中の有効物質を検索し、javanicinを単離した。関谷は花粉細胞の分化成熱熟機構を研究し、ツバキ科植物とテッポウユリの花粉を用いて成熟花粉と発芽時の膜脂質の動態について検討した。第2グループ原田はニンジンを用い、植物ホルモンを含まない条件でのストレスによって不定胚を誘導できることを明らかにした。岩村はニンジン培養細胞におけるオーキシンの効果を検討し、カルス化、不定胚形成における種々のオーキシン誘導体の作用洋式はと推定した。安田は高い再分化能を有する培養細胞の誘導とその維持を計り、イネ科植物について4-フルオロフェノキシ酢酸がカルス誘導物質として有効であることを発見した。三位はホーレンソーおよびダイズを用いて、器官分化能の遺伝的な差異を研究するため、シュート分化の可能性を検討した。山口はニンジンとタバコを用いてTiプラスミドを導入した培養細胞について内生の植物ホルモンの解析を行った。丸茂は新インドール系のオーキシンを合成し、5,6-dichloro-IAAが強い活性を示すことを明らかにした。以上の研究は、本研究班の中で極めて有機的に行われているが、さらに班員間の連絡をはかるために、班会議を2度開催し、相互の研究の現状について報告した。
オランダ植民地期インドネシアの丁字入りたばこ産業の展開

本年度は、計画通り、広島大学での予備調査、オランダへの資料調査を行うことができた。7月末に広島大学を訪れ、中心的な資料となるメールラポートのインデックスから、研究テーマに関する資料がある登録番号を控えるという作業を行った。8月にはオランダを訪れ、国立公文書館、オランダ王立言語地理民族学研究所、王立熱帯研究所で未刊行文書の調査を行った。それぞれの機関では資料をデジタルカメラで撮影することが許可されているため、発見した資料をカメラで撮影し、補助金で購入したノートPCに記録して持ち帰った。複写を頼んでいた頃に比べ、能率よく調査を行うことができた。本研究の目的は、第一に、オランダ植民地期、ジャワ島クドゥスの丁字入りたばこ現地人企業の展開を明らかにする、第二に、たばこ企業と労働者との関係、雇用方法、賃金、失業者の問題などから地域社会へたばこ企業が果たした役割について検討することである。第一の部分についてはこれまで収集した資料からかなり明らかになってきた。しかし、第二の地域社会へのインパクトについてはさらに新しい資料を探し、研究を深める必要性があると考えている。当初の計画では19年度も研究を継続し、収集した資料を基に論文を執筆する予定にしていた。しかし、オランダでの在外研究が急に決まり、日本を離れるため、来年度は補助金の申請を辞退することにした。今後はオランダでの調査をさらに進め、たばこ産業が現地人社会に与えた影響に関する研究を続けていきたい。
表面局在構造解析のためのSTM型表面電子顕微鏡の試作

走査トンネル顕微鏡を透過型電子顕微鏡に組み合わせて表面構造の解析を行なう新しい手法の開発を試みた.われわれは,超高真空・高分解能電子顕微鏡を開発し,表面構造を原子レベルで明らかにしたり,吸着の初期段階の動的過程の観察を行なってきた.この手法では,表面の広い領域にわたって秩序構造や乱れた構造を見ることが可能である.一方,走査トンネル顕微鏡(STM)では,表面の原子配列だけでなく,電子状態までも見ることが可能であるのだが,観察視野が狭い範囲に限られてしまう.そこで,双方を組み合わせて互いに相捕的に用いることにより,表面構造の解析が格段に進むことが期待される.本研究では,電子顕微鏡装置に組み込める形のSTM駆動機構を作って,その動作状態を調べ,安定に動作するSTMの試作を行なった.具体的には, 1)STMの探針をドライブするビエゾ素子を選択し, 2)ビエゾ素子ドライブを小型化するために,ずれ歪を利用した方式を採用し, 3)表面相転移の観察のため,試料の加熱が出来る機構を組み込んだ.また, 4)探針の先端形状を電子顕微鏡観察して, STM観察に適当な探針の材料,加工方法について,検討を行なった.その結果,現在のところ,黒鉛(グラファイト),モリブデナイト, PbSのへき開表面についてSTM観察を行い,表面原子による凹凸像が得られる段階にまでなった.ビエゾ素子のドライブ範囲は最大250Aである.相転移など表面の動的過程の研究には,速い走査速度のドライブが必要であるが,現在のところ,一画面を得るのに10秒以上かかる.この速さは,国内の他のものと比べると決して遅くはないが,より速い速度が,将来,必要となろう.走査トンネル顕微鏡を透過型電子顕微鏡に組み合わせて表面構造の解析を行なう新しい手法の開発を試みた.われわれは,超高真空・高分解能電子顕微鏡を開発し,表面構造を原子レベルで明らかにしたり,吸着の初期段階の動的過程の観察を行なってきた.この手法では,表面の広い領域にわたって秩序構造や乱れた構造を見ることが可能である.一方,走査トンネル顕微鏡(STM)では,表面の原子配列だけでなく,電子状態までも見ることが可能であるのだが,観察視野が狭い範囲に限られてしまう.そこで,双方を組み合わせて互いに相捕的に用いることにより,表面構造の解析が格段に進むことが期待される.本研究では,電子顕微鏡装置に組み込める形のSTM駆動機構を作って,その動作状態を調べ,安定に動作するSTMの試作を行なった.具体的には, 1)STMの探針をドライブするビエゾ素子を選択し, 2)ビエゾ素子ドライブを小型化するために,ずれ歪を利用した方式を採用し, 3)表面相転移の観察のため,試料の加熱が出来る機構を組み込んだ.また, 4)探針の先端形状を電子顕微鏡観察して, STM観察に適当な探針の材料,加工方法について,検討を行なった.その結果,現在のところ,黒鉛(グラファイト),モリブデナイト, PbSのへき開表面についてSTM観察を行い,表面原子による凹凸像が得られる段階にまでなった.ビエゾ素子のドライブ範囲は最大250Aである.相転移など表面の動的過程の研究には,速い走査速度のドライブが必要であるが,現在のところ,一画面を得るのに10秒以上かかる.この速さは,国内の他のものと比べると決して遅くはないが,より速い速度が,将来,必要となろう.研究の初年度にあたり、試作するSTM型電子顕微鏡の全体構成の概略、STM(走査トンネル顕微鏡)部分の構成について検討し、STMの心臓部であるプローブ用電極針について実験を行った。STMと電子顕微鏡法による固体表面の局所構造研究法開発を目的として既存の超高真空電子顕微鏡の試料室を部分的に改良し、そこにSTMの機能を組込む方式を考案した。STMの機能は、プローブ電極の先端構造、プローブ駆動用ピエゾ素子部、駆動の制御電源部、徐震機構の4つに分けられるが、制御電源部の設計・組立を行い、ピエゾ素子については23の新しい試みを加えて試作を行った。プローブ電極の先端は一原子程度の突起が出来ることによりSTMの高い分解能が得られるとのことなので、電子顕微鏡によって先端部形状の観察を行った。また、プローブ電極の製作法を確立する目的で、電子顕微鏡内でプローブ電極先端に電場を印加して、電極表面原子を電界蒸発させて、先端部の清浄化と先鋭化を試みた。化学研磨して作った多くのプローブについて、電顕内電場印加を行った結果、電圧を23KV程度かけたとき、プローブ電極を覆っている汚れがふき飛び、鋭い先端部が現れることが見出され、さらに、電場を強めると、56KV程度までは、先端原子の電界蒸発により、曲率半径数十【A!°】の先端が得られたが、より高い電圧では、プローブ電極先端部に放電してしまい、先端部が丸くなってしまうことが見られた。これらの観察により、STMに用いるタングステン製プローブ電極の清浄化・尖鋭化の基礎的手法の確立ができた。電子顕微鏡によっても、一方、表面構造の観察を行い、STM型表面電子顕微鏡に必要な機能の検討を行った。
アトラスの思想

ヨーロッパにおけるアトラス〈地図帳〉の歴史は、古代ローマにおけるK.プトレマイオスの『地理学』付載の地図集にまで遡るが、それはルネサンス期に甦った。また大航海時代による世界認識の拡大は、新たなアトラスへの期待を醸成し、そうした状況下で誕生したのがA.オルテリウスの『世界劇場』であった。これ以降G.メルカトルの『アトラス』(1595年)を頂点として、約100年間にわたる「アトラス世紀」が現出した。現代の日本においても、学校地図帳はじめ各種地図帳の原型となっている『世界劇場』や同時代のアトラス類の今日的意味を問い直すことは、大きな意義を有すると考える。本研究は、以上のような問題意識のもとに、(1)準備段階としてプトレマイオス『地理学』をはじめ、オルテリウス『世界劇場』、メルカトル『アトラス』などの諸版の調査、(2)序文やテクストにみられる各編纂者の思想の解読、トレース図作成による収録地図の分析、各図とそれに付載されたテクストとの照合、(3)各アトラスとオルテリウスの『世界劇場』との比較考察、などを行なった。従来、近代以前の地図ないしは地図帳の研究では、地図自体のみが研究対象とされてきたが、本研究では原点に立ち返って地図をそのテクストとともに解読する努力を試みた。この結果、近世のアトラスが単に空間的に世界を表現するだけでなく、地図帳編纂者自らの世界観から宗教観、宇宙観を表明し、またオルテリウスの商業的関心から、メルカトルの科学的関心に至るまでの間にさまざまなレヴェルの基本的編纂方針が存在したことが明らかになってきた。本年度は、第一段階の準備作業として、メルカトル『アトラス』を始めとする近世アトラスの諸版を調査した。具体的には、K.プトレマイオスの古典的地図集のルネサンス期諸版をはじめ、近世のG.デ・ヨ-デ『世界の鏡』、G.ブラウン=F.ホ-ヘンベルフ『世界都市図帳』、L.J.ワ-ヘナ-ル『航海者の鏡』など、すでにファクシミリで刊行されているラテン語初版や英語版の地図帳類を収集して、各地図帳の内容を詳細に検討し、また日本国内各地の図書館・博物館が所蔵するドイツ語、フランス語版等の初版もできる限り閲覧して、それぞれの収録図を撮影した。これらの結果を研究補助者により、分類・整理し、図版用ファイルにまとめる作業を継続している。この上で各アトラスの異同を比較するだけでなく、プトレマイオス、オルテリウスの世界像から、その後のアトラス編纂者の世界像への変遷過程をたどることを追究している。なお、最新の欧米地図史に関する文献を図書および複写の形で収集することにも努めた。これらの成果の一部は、訳書『近代地図帳の誕生』の形で公刊した。本年度は、準備作業の継続として、オルテリウス『世界の舞台』、メルカトル『アトラス』を始めとする近世アトラスの諸版を調査した。すでにファクシミリで刊行されているラテン語初版や英語版などを購入あるいは閲覧して、各地図帳の内容を詳細に検討し、あるいは国立国会図書館、国土地理院、神戸市立博物館をはじめとする、国内各地の図書館・博物館が所蔵するドイツ語、フランス語版等の諸版もできる限り閲覧して、それぞれの収録図を複写した。これらの結果を研究補助者により、分類・整理し、図版用ファイルにまとめる作業を行なった。その上で各アトラスの異同を比較するだけでなく、オルテリウス、メルカトルの宇宙像・世界像から、その後のアトラス編集者の世界像への変遷過程をたどることを追究した。また、最新の欧米地図史に関する文献を図書および複写の形で収集することにも努めている。なお、神戸市立博物館、江戸東京博物館などにおいて近世日本の地図帳類を調査し、ヨーロッパの近世アトラスとの比較を試みつつある。この一環として、平成10年10月に東京において、欧米の地図史研究者とアトラスに関する研究打合せ会を開催した。

本年度は、昨年度に引続きオルテリウス『世界劇場』やメルカトル『アトラス』をはじめとする近世アトラスの諸版の補足的調査を行い、さらには国内各地の図書館・博物館が所蔵するドイツ語、フランス語版等の諸版もできる限り閲覧して、それぞれの収録図を撮影するように努めた。これらの結果を研究補助者により、分類・整理し、図版用ファイルにまとめている。この上で各アトラスの異同を比較するだけでなく、オルテリウス、メルカトルなどアトラス編纂者の宇宙像・世界像や、その後のアトラス収録地図の変遷過程をたどった。さらにこれら近代アトラスの原点ともいうべき、ローマ時代のプトレマイオス『地理学』所収の復元地図集を古代アトラスと位置付け、その近世における復活と変容について考察した。こうした成果の一部をギリシャのアテネで開催された国際地図史学会で報告し、近世のヨーロッパと日本における地図帳の意味を問いかけた。最終年度に当たるため、年度末には総合的な研究成果を、『アトラスの思想』として公刊した。
ニホンジカの高密度から低密度への過程におけるレガシー効果をもたらす要因の解明

ニホンジカの個体数調整によって個体数を大幅に低下させたにもかかわらず、森林の植生や生態系の回復が進まないレガシー効果が問題になっている.シカ低密度化後の生態系回復の可否やその速度は,植生タイプやシカ高密度期間などのさまざまが要因によって変わってくると予想される.本研究では,申請者が22年間にわたって継続調査を行っている植生タイプや地形の異なる地点間で,高密度状態から低密度状態に至るまでのシカ密度,林床植生,樹木実生,土壌,動物群集の変化を比較分析することで,レガシー効果の程度とその要因の違いを明らかにする.また,地点ごとにその程度と原因に応じた回復手段を実験的に実施し,その効果検証を行う.ニホンジカの個体数調整によって個体数を大幅に低下させたにもかかわらず、森林の植生や生態系の回復が進まないレガシー効果が問題になっている.シカ低密度化後の生態系回復の可否やその速度は,植生タイプやシカ高密度期間などのさまざまが要因によって変わってくると予想される.本研究では,申請者が22年間にわたって継続調査を行っている植生タイプや地形の異なる地点間で,高密度状態から低密度状態に至るまでのシカ密度,林床植生,樹木実生,土壌,動物群集の変化を比較分析することで,レガシー効果の程度とその要因の違いを明らかにする.また,地点ごとにその程度と原因に応じた回復手段を実験的に実施し,その効果検証を行う.
好塩基球におけるインターロイキン４産生シグナルとその制御機構の解明

好塩基球はIL-3受容体を介しIL-4を産生するが、自身の活性化状態に伴いIL-3への応答性を変化させている。それは抑制型受容体Paired immunoglobulin-like-B(PIR-B)が、IL-3に対する応答性を負に制御する事によって担われる。さらにPIR-Bは、IgGに対する応答性も負に制御している。そして様々なPIR-B変異体の再導入実験により、PIR-Bの抑制作用にPIR-B細胞内ドメインが必須であり、さらにITIMチロシン残基に依存しない未知の抑制機構の存在が示唆された。申請者は、アレルギー疾患に関わっている過剰なTh2応答に密接に関わっている好塩基球によるTh2サイトカイン産生を負に制御する分子メカニズムの解明を目的とし、本研究を遂行した。その結果、好塩基球によるTh2サイトカイン産生は、抑制型受容体であるPaired Ig-like Receptor B(PIR-B)により負に制御されている事を明らかにした。以下、その詳細について言及する。IL-3で培養した好塩基球(IL-3-BMBs)は、PIR-Bの発現が上昇し、IL-3に対する応答性を消失する(IL-3不応答性の獲得)。一方でPIR-B欠損IL-3-BMBsはIL-3に対し多量のIL-4を産生し続け、IL-3不応答性が破綻する。このPIR-B欠損IL-3-BMBsによる異常なIL-3応答性は、FcRg-ITAM-Syk経路を介して誘導されており、さらに細胞内シグナル伝達において、PLCγ2のリン酸化が異常亢進していた。それらの結果はPLCγ2がIL-3受容体からのIL-4産生シグナル分子であり、PIR-BがPLCγ2のリン酸化を抑制する事により、そのシグナルを負に制御しているという事を示唆している。PIR-Bは抑制モチーフであるITIMを介して細胞内シグナルを抑制するという事が知られている。しかし、ITIM欠損変異型PIR-Bを導入したPIR-B欠損IL-3-BMBsにおいても、PLCγ2のリン酸化が抑制され、IL-3誘導性IL-4産生を強く抑制できる事がわかった。そしてこの抑制効果は細胞外部位変異体PIR-Bによってキャンセルされた。従って、IL-3誘導性IL-4産生シグナルの抑制がPIR-Bのリガンド依存的、そしてITIM非依存的にPLCγ2のリン酸化を制御する事によって担われているという、新たなメカニズムによって担われている事が明らかとなった。骨髄から単離したばかりの好塩基球はPIR-Bを発現しておらず、IL-3に応答しIL-4を産生する。一方で、IL-3で培養した好塩基球(BMBs)は、活性化マーカーであるCD69の発現が上昇し、同時にPIR-Bの発現が上昇した。それに伴いIL-3に対する応答性を消失した(IL-3不応答性の獲得)。このIL-3不応答性を獲得した野生型BMBsとは異なり、PIR-B欠損マウス由来のBMBsはIL-3に対し多量のIL-4を産生し続けIL-3不応答性が破綻した。そして、PIR-B欠損マウス由来のBMBsへ、野生型PIR-Bを再導入する事によりIL-3不応答性を再び獲得した事から、活性化好塩基球におけるIL-3不応答性の獲得はPIR-Bの発現によって誘導されている事を明らかにした。生化学的解析により、PIR-B欠損IL-3-BMBsはPLCγ2のリン酸化が亢進していた。そして野生型PIR-Bを導入したPIR-B欠損BMBsは、亢進していたPLCγ2のリン酸化が抑制され、IL-3不応答性を再度獲得した。PIR-Bは抑制モチーフであるImmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIM)を介して細胞内シグナルを抑制するという事が知られている。しかし、ITIM欠損変異型PIR-Bを導入したPIR-B欠損BMBsは、PLCγ2のリン酸化を抑制し、同時にIL-3誘導性IL-4産生も強く抑制できる事がわかった。これらの結果は、IL-3誘導性IL-4産生シグナルの抑制がPIR-BのITIM非依存的にPLCγ2のリン酸化を制御している事を示唆している。実施予定であった研究計画は、「1. IL-3により誘導されるIL-4産生誘導シグナルの解明」と「2. FcεRI応答性の獲得における可逆的スイッチングのメカニズムの解明」、さらに「3. IL-3応答性の消失におけるPaired Ig-like receptors-B(PIR-B)の役割の解明」であった。1と3に関しては、IL-3誘導性IL-4産生シグナルの抑制がPIR-BのITIM非依存的にPLCγ2のリン酸化を制御しているという事を明らかにできたように、滞り無く研究を進める事ができた。しかし「2. FcεRI応答性の獲得における可逆的スイッチングのメカニズムの解明」、すなわちIL-3存在下での獲得できる培養好塩基球はIL-4産生においてFcεRIの応答性を獲得している一方

IL-3への応答性を消失しており、IL-3非存在下12時間以上培養するとIL-3への応答性を回復し、FcεRIの応答性を消失するという分子メカニズムの解明についての研究は、予定通りの進展をしていない。PIR-B欠損活性型好塩基球は、野生型と同様にIgEに対する応答性を獲得し、IL-3非存在下で培養すると、IgEに対する応答性を消失する。従って、IL-3応答性の消失については完全にPIR-Bによって制御されているが、IgE応答性IL-4産生には無関係であり異なったメカニズムが存在している。FcεRIとIL-3RによるIL-4産生は共通してFcRγ-ITAM-Syk経路を介しているにも関わらず、全く異なる応答性を示すのはとても興味深い。またIL-3、IgEと同様にIgGに対しても好塩基球は応答性を持ち、さらにFcγRもFcRγ-ITAM-Syk経路を介している。好塩基球へのIL-3、IgE刺激に加え、IgG誘導性のIL-4産生が好塩基球の状態によってどのように変化をするのか?についても来年度の課題とする。PIR-BはB細胞、樹状細胞、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞など様々なリンパ球に発現し、ITAM含有受容体シグナルを負に制御することによって、免疫応答を抑制している。PIR-B細胞内ドメインであるITIMのチロシン残基がリン酸化されると、protein tyrosine phosphataseであるSHP-1とSHP-2がリクルートされ、活性化シグナルが抑制される事が示されている。しかし、好塩基球によるIL-3誘導性IL-4産生において、PIR-BはITIM非依存的にサイトカイン産生シグナルを負に制御しているというこれまでに全く知られていない抑制機構の存在が明らかになった。このITIM非依存的な抑制メカニズムにSHP-1/2は本当に関与していないのかを、さらなる変異型PIR-Bを作製し、分子生物学的に詳しく調べて行く予定である。また、現在はIL-3に対する好塩基球のサイトカイン産生シグナルに着目しているが、好塩基球は様々な刺激に応答し、IL-4を産生する事が知られている。その他の刺激(例えばIgEやFcγR)においてもPIR-Bによる抑制機序が関わっているのかどうかについても研究を行う予定である。さらに、PIR-Bによって誘導される好塩基球におけるIL-3応答性の消失の生理学的意義についても、研究を進めていきたい。すなわち、PIR-B欠損マウスはTD抗原に対して血中のIgG、IgEの発現レベルが上昇しアレルギー様の表現型を呈する事が明らかにされており(東北大学、氏家ら、Nature immunol)、従って、好塩基球がPIR-B欠損マウスが呈する偏ったTh2応答に関与しているのではないかと仮説をたて研究を行う予定である。来年度に研究で必須の実験手法は、フローサイトメトリー、免疫沈降法などの生化学解析、分子生物学的手法による遺伝子変異体の作製(活性型、不活性型の作製など)、そしてレトロウイルスを用いた遺伝子導入、干渉RNAによる目的の分子の発現抑制、IL-4産生など液性因子測定のためのELISA法である。そのため、抗体類(各種蛍光標識抗体、ビオチン標識抗体)、酵素類、ELIZAキットなど分子生物学試薬の購入のための研究費が必要である。
NOS阻害剤による住血吸虫虫体の殺滅とその機構解析

日本住血吸虫感染マウスにNOS阻害剤の投与を行い、感染6週後に寄生虫体数を調べた.その結果、阻害剤を投与することにより感染防御効果が高まることを初めて認めた.更に注目されたことはL-NAME投与のみならず、コントロールとして併用したD-NAMEでも効果を認め、C57BL/6マウスにおいては後者でより一貫した感染防御効果があったことである.C57BL/6マウスでのD-NAMEの投与効果は濃度、時期、処理期間で大きく異なった.投与法を詳細に検討した結果、濃度は50-100μg/ml,投与時期はセルカリア感染後14-24日(肝内期)に効果があることが分った.期間は6日間の連続投与が適当であった.NOS阻害剤の効果を種々のサイトカインノックアウトマウスを用いて検討した時、IFN-γKOマウスではD-NAMEで防御効果を示すが、L-NAMEは無効であり、IL-4KO, IL-13KOマウスではそれとは逆にL-NAMEで明らかな効果を示した.C57BL/6マウスでの結果と合わせ、光学異性体の効果が異なるサイトカイン環境下でこのように変ってくることは極めて興味ある結果である.NOS阻害剤投与マウスでどの様にNO産生が変化するか調べた.C57BL/6マウスにおいてはD-NAME投与でNO産生が高まることを認めた.異性体で異る効果を示すIL-13KOについて同様に検討したとき、逆の結果が認められた.即ち、L-NAME投与でNOは増加していた.これらの結果からNOS阻害剤の投^によりNO産生が高まり、感染防御効果が亢進したことが考えられる.NOS阻害剤投与後のサイトカイン産生の変化についても検討したが、感染防御効果を示す群ではIL-10産生が低下する傾向を示したことは興味深い.以上の如く、我々の実験結果はNOS阻害剤投与によりNO産生が高まり日本住血吸虫に対する感染防御効果が高まることを示している.日本住血吸虫感染マウスにNOS阻害剤の投与を行い、感染6週後に寄生虫体数を調べた.その結果、阻害剤を投与することにより感染防御効果が高まることを初めて認めた.更に注目されたことはL-NAME投与のみならず、コントロールとして併用したD-NAMEでも効果を認め、C57BL/6マウスにおいては後者でより一貫した感染防御効果があったことである.C57BL/6マウスでのD-NAMEの投与効果は濃度、時期、処理期間で大きく異なった.投与法を詳細に検討した結果、濃度は50-100μg/ml,投与時期はセルカリア感染後14-24日(肝内期)に効果があることが分った.期間は6日間の連続投与が適当であった.NOS阻害剤の効果を種々のサイトカインノックアウトマウスを用いて検討した時、IFN-γKOマウスではD-NAMEで防御効果を示すが、L-NAMEは無効であり、IL-4KO, IL-13KOマウスではそれとは逆にL-NAMEで明らかな効果を示した.C57BL/6マウスでの結果と合わせ、光学異性体の効果が異なるサイトカイン環境下でこのように変ってくることは極めて興味ある結果である.NOS阻害剤投与マウスでどの様にNO産生が変化するか調べた.C57BL/6マウスにおいてはD-NAME投与でNO産生が高まることを認めた.異性体で異る効果を示すIL-13KOについて同様に検討したとき、逆の結果が認められた.即ち、L-NAME投与でNOは増加していた.これらの結果からNOS阻害剤の投^によりNO産生が高まり、感染防御効果が亢進したことが考えられる.NOS阻害剤投与後のサイトカイン産生の変化についても検討したが、感染防御効果を示す群ではIL-10産生が低下する傾向を示したことは興味深い.以上の如く、我々の実験結果はNOS阻害剤投与によりNO産生が高まり日本住血吸虫に対する感染防御効果が高まることを示している.我々はこれまでNOS阻害剤による日本住血吸虫の殺滅を検討してきた.これまで明らかになった事項は以下の通りである.方法;C57BL/6にセルカリア30隻を経皮的に感染し、NOS阻害剤を経口的(飲水に混じて)に投与した.対照(感染のみ)と比較し、感染6週後の虫体回収率が30%以上減じたとき効果があると判定した.2.投与濃度を検討したとき、100μg/mlでは効果はなく、200-300μg/mlで一定の効果を得た.3.投与期間について検討した.7,10,20,40日間の投与を行ったとき、その効果にあまり差異は見られなかった.即ち、一週間の投与で効果は十分見られることを認めた.4.感染後の投与時期について検討した.感染後1-12、15-25,35-42日についト主に検討したところ、35-42日では一貫して効果はなかった.1-12或は15-25日のいずれが適当か一定の結果がでておらず更に検討を要する.5.サイトカインと阻害剤投与の関係をサイトカイン欠損マウスで検討した.IL-4,IL-18,IFN-γ欠損マウスを用いたところ、IL-4KOマウスで一貫した効果を認めた.即ち、虫体殺滅にサイトカインの関与を示し、Th2応答はその効果を減じることが認められた.

6.阻害剤による虫体の殺滅を組織学的に検討したとき、幼若虫体が多数認められ、その形態学的特徴から、消化管に一定の障害(吸収、排泄作用の障害)があることが認められた.感染症におけるNOのeffector moleculeとしての役割は広く知られている.しかし、多細胞生物、特に蠕虫類における報告は極めて少なく、今回、検討した住血吸虫感染症でもその関与について十分明かでない.本研究では1.我々は日本住血吸虫感染マウスにNOS阻害剤(L-NAME)を投与したとき、日本住血吸虫が殺滅されること2.更に詳細に検討を加えた結果、L-NAMEのみならず、コントロールとして用いたD-NAME投与でも感染率の明かな低下があること3.投与法の詳細な検討を行い、ある特定の時期に効果があること4.阻害剤の投与による感染率の低下にはNOが関与することを認めた.L-NAME或いはD-NAME投与により感染虫体数の減少があるが、その効果はマウス系統で異る.即ち、C57BL/6,IFN-gKO、IL-18KOマウスではD-NAMEがより効果的であり、IL-13KO,IL-4KOマウスではL-NAMEがより効果的である.C57BL/6マウスで投与法の検討を行ったとき、D-NAME濃度では50mg/mlを飲水に入れて投与したとき最も効果が高い.また、投与効果を認めた時期は感染後、14-22日(肝内期)で、その間に3-6日間の投与で有意な効果(対照に比べ、30%以上の感染虫体数の減少)があった.阻害剤投与によるNOの変化を検討したとき、感染率の減少を認める群ではNOの増加を認めた.即ち、C57BL/6マウスではD-NAME投与でNOが上昇し、IL-13KOマウスではL-NAME投与で上昇することを認めた.以上の我々の結果は住血吸虫の殺滅にNOが関与することを示すとともに、従来知られていないNOS阻害剤の作用を呈示したものである.