hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レアア-ス金属・化合物およびその機能材料化に関する基礎研究

レアア-ス金属・化合物およびその機能材料化に関する基礎的な試験と研究を行い、次の実績を得た。1.電解処理による製造および機能材料化:LaとNaの相互分離を溶融塩中のフッ化物イオンとの錯体形成機能を利用して行えることがわかった。SmとGdのクロマト展開にEuを添加するとSmとGdの分離性は向上し、有効である。2.乾式処理による製造および機能材料化:還元ー拡散法によるFeーNd,FeーSm,CoーNdおよびCoーSm合金製造速度は既に生成されている化合物相中を拡散するレアア-ス元素により律速されることを明らかにした。3.湿式処理による製造および機能材料化:VA10/EH0/クロロホルムまたはジクロロエタン,VA10/TOPOおよびD2EHPA/LIX63系では従来の抽出系に比べてPrおよびNdの分離性の改善向上が認められた。抽出したSmの逆抽出液からSm酸化物を回収する場合の最適処理条件を明らかにした。4.微量成分の影響と機能化:希土類金属中の酸素と金属Ca蒸気によって除く試みは、Prについてはかなり効果のあることが確かめられた。他の希土類への効果も期待された。5.機能性材料への応用:Cuーレアア-ス系合金の機能性材料への応用の基本となる高温における熱力学デ-タの解明のため溶融CuーDy系合金の活量を測定した。Nd^<3+>イオンを添加した各種酸化物ガラスの輻射遷移確率を求め、組成パラメ-タPO値を用いて整理した。その他に本研究においてはレアア-ス金属に関わる新しい知見が得られており、今後用途が拡大し機能性の多いレアア-スの利用に対して、適用範囲が多いものと期待される。レアアース金属・化合物およびその機能材料化に関する基礎的な試験・研究を行い、5項目について次の実績を得た。(1)電解処理による製造および機能材料化:イオン交換樹脂のキレート樹脂により水溶液との接触条件が吸着容量、分離係数に影響する。(2)乾式処理による製造および機能材料化:Fe-Na二元系状態図の化合物調査の結果Fe_<17>Nd_2のみ存在が確認された。ReCl_3-NdCl-KClの蒸気圧と湿式法によるレアアース磁石スクラップからのNd,Sm回収の溶解度がわかった。金属LaによるEu_2O_3の還元反応はいずれの温度でも初期に進行し、その後停滞し、還元反応は物質移動が律速となっている。(3)湿式処理による製造および機能材料化:Sm-Co合金スクラップからのSm抽出分離においては、第1段でZrとFeを分離し第2段でpH調整によりSm抽出する方法が良いことが判明した。単独抽出剤によるPrとNdの分離係数をEHO添加により改善できることがわかった。(4)微量成分の影響と機能化:Pr-O系における酸素の吸収、放出反応の開始温度に顕著なヒステリシス現象が認められた。Nd-PrのCa還元ではPrの方が速く還元される傾向を示した。固体エレクトロトランスポート法による希土類金属の高純度化を検討し、浸入型元素(C,O,H等)に対して精製効果が顕著であることがわかった。(5)機能材料化への応用:クヌーゼーセン質量分析法により溶融銅-Nd合金の活量、混合エンタルピー、混合エントロピー等の熱力学的性質を測定した。赤外線透過用ガラスとして比較的ガラス化が容易でしかも安定なGa_2O_3をベースとするガラスの融点とガラス化範囲を決定した。Ca等を用いレアアース酸化物からニッケル合金を直接製造するための気相分圧と合金組成の関係を算出し、RD法の最適条件を検索した。また、水素吸蔵合金の高温における相関係を明らかにした。その他に本研究においてはレアア-ス

金属に関わる新しい知見が得られており、今後用途が拡大し機能性の多いレアア-スの利用に対して、適用範囲が多いものと期待される。レアア-ス金属・化合物およびその機能材料化に関する基礎的な試験と研究を行い、次の実績を得た。1.電解処理による製造および機能材料化:LaとNaの相互分離を溶融塩中のフッ化物イオンとの錯体形成能を利用して行えることがわかった。SmとGdのクロマト展開にEuを添加するとSmとGdの分離性は向上し、有効である。2.乾式処理による製造および機能材料化:還元-拡散法によるFe-Nd,Fe-Sm,Co-NdおよびCo-Sm合金製造速度は既に生成されている化合物相中を拡散するレアア-ス元素により律速されることを明らかにした。3.湿式処理による製造および機能材料化:VA10/EHO/クロロホルムまたはジクロロエタン、VA10/TOPOおよびD2EHPA/LIX63系では従来の抽出系に比べてPrおよびNdの分離性の改善向上が認められた。抽出したSmの逆抽出液からSm酸化物を回収する場合の最適処理条件を明らかにした。4.微量成分の影響と機能化:希土類金属中の酸素を金属Ca蒸気によって除く試みは、Prについてはかなり効果のあることが確かめられた。他の希土類への効果も期待された。5.機能性材料への応用:Cu-レアア-ス系合金の機能性材料への応用の基本となる高温における熱力学デ-タの解明のため溶融Cu-Dy系合金の活量を測定した。Nd^<3+>イオンを添加した各種酸化物ガラスの輻射遷移確率を求め、組成パラメ-タPO値を用いて整理した。
視野空間内における両眼注視の安定性に関する実験的検討

身体運動を精確に行う際には、注視の安定性が重要な要因の一つであると考えられている。そこで本研究課題では、両眼を用いた注視時における利き目と非利き目の挙動を個別かつ同時に分析することにより、3次元空間において安定した注視を実現するための利き目の寄与に関する知見を得ることを目的とした。本年度は、左右水平方向の各位置に呈示される視標に対して、頭部角度を固定した状態で一定の視線方向を維持させる際の両眼の挙動を測定し、左右眼間の差異について比較検討することを目的とした実験を行った。実験参加者は、左右眼の水平方向の眼球運動を個別に記録するための眼球運動測定装置を装着した。実験は暗室下にて行い、実験参加者の眼前に視覚ターゲットとなるLEDを呈示した。中央および左右水平方向に設置されたLEDの点灯に対して、頭部を台に固定した状態で視線を移動させ、点灯した位置を4秒間注視した。その後LEDが5秒間消灯して完全に暗室の状況下になった後も、できるだけ注視位置を維持するように実験参加者に教示した。その結果、右利き目および左利き目いずれの実験参加者においても、LED消灯後の利き目の視線方向は非利き目に比べ安定していた。また、左利き目の実験参加者は、左側に呈示されたLEDに対し注視位置を維持する際に、非利き目である右眼の視線方向が消灯後内側に移動した。一方、右利き目の実験参加者は、右側に呈示されたLEDに対し注視位置を維持する際に、非利き目である左眼の視線方向が消灯後内側に移動した。本実験から、記憶された目標位置へ向けての両眼注視を維持する際には、利き目と非利き目がそれぞれ異なる挙動を示し、利き目は非利き目よりも安定した視線方向を示すことが示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
癌幹細胞マーカーCD44v9を標的とした難治性卵巣がんの治療戦略

子宮内膜症性嚢胞と子宮内膜症関連卵巣癌において、CD44v9とDNA損傷マーカーである8-OHdGについて免疫染色を行った。卵巣癌を合併した子宮内膜症においてはCD44v9の発現は低下、8-OHdGは発現が上昇していた。また、8-OHdGとCD44v9の発現には負の相関を認めた。CD44v9と8-OHdGの発現の変化が、子宮内膜症の悪性転化と関連している可能性が示唆された。またCD44v9を発現している卵巣明細胞癌細胞株に、抗癌剤とシスチントランスポーター(xCT)阻害剤の併用実験を行ったところ、細胞増殖能は相対的に低下した。xCT阻害剤の併用は、抗癌剤感受性を高める可能性が示唆された。我々は、17年間にわたる前方視的疫学研究から、子宮内膜症の約1%が将来明細胞腺癌や類内膜腺癌といった卵巣癌を発症することを報告した。子宮内膜症上皮は、陳旧性の血液を含む特殊な環境下におかれ、ヘモグロビン由来と考える鉄を過剰に含み、フェントン反応による強力な活性酸素により持続的に細胞傷害を受け発癌すると考えられている。我々はチョコレート嚢胞内容液中の鉄による持続的な酸化ストレス(ROS)が発癌に関与していることを報告した。内膜症由来の卵巣癌は特定の組織型を示し、特に高頻度にみられる明細胞腺癌は、化学療法に抵抗性を示し予後不良である。近年CD44のバリアントアイソフォーム(CD44v)は、様々ながん細胞において特異的に過剰発現して増殖・浸潤・転移と密接に関係し、単なる接着因子ではなく、様々なシグナル伝達に関わっていることが示唆されている。近年では癌幹細胞マーカーとして注目を集め、その中でもCD44v9は細胞膜上でシスチン・グルタミン酸トランスポーター(xCT)と結合し安定化し、細胞内へのシスチンの取り込みを増加させ、グルタチオン(GSH)の生成を促進することでROS抵抗性を高めて治療抵抗性に寄与することが報告されている。我々は、免疫組織学的検討において、卵巣明細胞腺癌においてCD44v9が特異的に過剰発現していることを確認した。CD44v9が子宮内膜症から明細胞腺癌への発癌機構に関与しているのかを解明するとともに、明細胞腺癌の新たな治療標的となり得るかを検討していく。子宮内膜症由来の卵巣癌は特定の組織型を示し、特に高頻度にみられる明細胞癌は、化学療法に抵抗性を示し予後不良である。近年CD44は癌幹細胞マーカーとして注目され、そのバリアントアイソフォーム(CD44v)にはROSに対する抵抗性を亢進させる機能があり、癌治療抵抗性に寄与していることがわかってきた。我々は、すでに明細胞癌において高頻度にCD44v9が発現することを明らかにしてきた。今回、CD44v9の発癌や抗癌剤耐性獲得への関与を解明し、新たな分子マーカーとしての血清診断と新たな分子標的治療を構築することを目的として研究を行ってきた。子宮内膜症や子宮内膜症由来の明細胞腺癌において、このCD44v9とその下流遺伝子の発現等を調べることで、これらが発癌に関与していることを確認するだけでなく、将来的に血清学的手法を用いた発癌の予知が可能となり得る。また、これまでの報告を再検討すると、明細胞癌の治療の標的となり得る遺伝子・蛋白発現異常として、PIK3CA,ARID1A, ZNF217,mTOR,PTEN,HIF-1α,VEGF,HNF-1β,EGFR等が挙げられる。これらは主に、細胞CD44v9は細胞膜上のxCTと結合し、還元型グルタチオン(GSH)の生成を促進しでROS抵抗性を高めることで、治療抵抗性を惹起し、また悪性細胞の生存・増殖を誘導する。今回の研究で我々はxCT特異的阻害剤であるスルファサラジン(炎症性腸疾患や関節リウマチにおいて臨床応用されている)を用いる。本薬剤の悪性腫瘍に対する治療可能性を考慮した研究は未だ無く、明細胞細胞株における治療効果を検討することは、新たな治療の確立に寄与し極めて有意義と考える。前年度の実験で、卵巣明細胞腺癌培養細胞株において、ウェスタンブロットによりCD44v9の発現を確認できた。このことから、卵巣明細胞癌に対しCD44v9が治療標的あるいはバイオマーカーとなる可能性が考えられる。CD44vによるシスチンの取り込みが抗酸化作用すなわち抗癌剤抵抗性を生み出すため、xCT(シスチントランスポーター)阻害薬であるスルファサラジンを用いたin vitro実験を行った。卵巣明細胞癌培養細胞株に対して、まずスルファサラジン単剤を投与したところ、細胞増殖能は有意に低下した(IC50 = 1mM)。これはCD44v発現癌細胞の抗酸化能が低下することで、自然発生する酸化ストレスへの感受性が高まり、癌細胞がアポトーシスに至ったと考えられる。次に、抗癌剤併用にて殺癌細胞効果に上乗せ効果を認めるかを確認するために、スルファサラジンとパクリタキセル・シスプラチン・ブレオマイシン・Chk1 inhibitorとを様々な濃度で組み合わせて投与する実験を行った。スルファサラジンを高用量で投与した場合、どの抗癌剤との組み合わせでも明らかな相加相乗効果は認めなかった。しかし、スルファサラジン単剤ではほとんど細胞増殖抑制しない程度の低用量(0.1mM)にて投与した場合、パクリタキセルとシスプラチンとの併用において細胞増殖能は相加的に低下した。

これは、少量のスルファサラジンにより抗酸化能を軽度低下させることで、抗癌剤による高度の酸化ストレスに対して感受性が非常に高まったためと考えられる。子宮内膜症由来の卵巣癌は特定の組織型を示し、特に高頻度にみられる明細胞癌は、化学療法に抵抗性を示し予後不良である。近年CD44は癌幹細胞マーカーとして注目され、そのバリアントアイソフォーム(CD44v)はROSに対する抵抗性を更新させる機能があり、がん治療抵抗性に寄与することがわかってきた。我々はすでに明細胞癌において高頻度にCD44v9が発現することを明らかにしてきた。今回CD44v9の発癌や抗がん剤耐性獲得への関与を解明し、新たな分子マーカーとしての血清診断と新たな分子標的治療を構築することを目的として研究を行ってきた。子宮内膜症や子宮内膜症由来の明細胞癌において、このCD44v9とその下流遺伝子の発現等を調べる事でこれらが発癌に関与していることを確認するだけでなく、将来的に血清学的手法を用いた発癌の余地が可能となりうる。また、これまでの報告を再検討すると、明細胞癌の治療の標的となりえる遺伝子・蛋白発現異常として、PIK3CA、ARID1A1、ZNF217、mTOR、PTEN、VEGF、HNF1β、EGFR等が挙げられる。これらは主に細胞、CD44v9は細胞膜上のxCTと結合し、還元型グルタチオン(GSH)の生成を促進しROS抵抗性を高める事で、治療抵抗性を惹起し、また悪性細胞の生存・増殖を誘導する。今回の研究で我々はxCT特異的阻害剤であるスルファサラジン(炎症性腸疾患や関節リウマチにおいて臨床応用されている)を用いる。本薬剤の悪性腫瘍に対する治療可能性を考慮した研究は未だ無く、明細胞癌細胞株における治療効果を検討することは、新たな治療の確率に極めて有意義と考える。子宮内膜症性嚢胞と子宮内膜症関連卵巣癌において、CD44v9とDNA損傷マーカーである8-OHdGについて免疫染色を行った。卵巣癌を合併した子宮内膜症においてはCD44v9の発現は低下、8-OHdGは発現が上昇していた。また、8-OHdGとCD44v9の発現には負の相関を認めた。CD44v9と8-OHdGの発現の変化が、子宮内膜症の悪性転化と関連している可能性が示唆された。またCD44v9を発現している卵巣明細胞癌細胞株に、抗癌剤とシスチントランスポーター(xCT)阻害剤の併用実験を行ったところ、細胞増殖能は相対的に低下した。xCT阻害剤の併用は、抗癌剤感受性を高める可能性が示唆された。CD44v9が子宮内膜症から明細胞腺癌への発癌機構に関与しているのかを調べるため、子宮内膜症性嚢胞と内膜症由来の明細胞腺癌の臨床検体を用いて、免疫組織学的検討をおこなった。その結果、子宮内膜症性嚢胞では、明細胞腺癌を合併している子宮内膜症と比較し、有意にCD44v9の発現が高いことがわかった。そこで、活性酸素によるDNA損傷の指標として8-OHdGの発現を検討した結果、CD44v9と8OHdGの発現にはR=ー0.46と負の相関関係を認めた。さらに、8OHdGは40才以上において発現が高まっており、「加齢」によってDNA損傷の機会が増え発癌のリスクになっていることが示された。
化学物質暴露時の魚胚内酸化ストレス強度と影響発現に関わるアスコルビン酸の重要性

アスコルビン酸は抗酸化物質でもあるが軟骨形成にも関与している。我々の過去の研究により酸素化多環芳香族炭化水素類(OxyPAHs)をヒメダカ胚に暴露すると、孵化仔魚の形態異常と魚胚中アスコルビン酸(AsA)の減少が確認された。これはOxyPAHs暴露により生じた酸化ストレスに対応するためAsAが投入されてしまい、軟骨形成に必要なAsA量が不足し、奇形が生じた可能性が示唆された。そこで本研究では、孵化仔魚の奇形誘発には、化学物質暴露による酸化ストレスの強さに応じた胚中のAsAの消費量が大いに関係しているのではないかと仮説を立て、検証のために1)化学物質暴露時の酸化ストレスの強さと胚中AsA量の変化の関係、2)奇形の重症度の相違、3)胚中コラーゲン量変動との関連を調べ、酸化ストレスと奇形誘の関連性、及び生体内防御物質としてのAsAの重要性を明らかにすることを目的とする。初年度となる30年度は、まず1)酸化ストレスの強さによるROS生成量と胚中AsA量の変化の関係を調べるために、先行研究を参考に魚類に対して酸化ストレスを与えると考えられる化学物質を数種類選定を行った。選定した化学物質は、既に我々の研究により魚胚に対して酸化ストレスを与えることがわかっているOxyPAH、水環境から比較的高濃度で検出されるPAHs、同じく環境中から検出され古くから毒性影響研究の対象となっているクロロフェノール類とした。それぞれ2種類を各56濃度区用意し、ヒメダカ胚に孵化するまで暴露を行って半数影響濃度を求めた。それぞれの化学物質暴露により、発生途中で卵膜強度が弱まるような現象や、胚の形態異常、孵化仔魚の形態異常など異なった影響が観察されたため、化学物質種によって酸化ストレスの強弱やAsAの量には違いがあるのではないかと考えられた。昨年4月より9月末まで育休を取得したため、当該年度は半年間の研究期間であったが、研究計画に記載した1)化学物質暴露時の酸化ストレスの強さと胚中AsA量の変化の関係を探るための暴露物質の選定及び毒性試験を行い結果を得ることができた。なお、1年間の研究期間の延長を申請しており、従前の計画の遂行は十分可能であると考えられる。30年度で得た毒性試験の結果をもとに、EC50から数分の1の物質濃度、さらにその10分の1程度の濃度の暴露試験を行い、暴露した胚を採取し数種類の酸化ストレスマーカーの胚中量を測定する。また、暴露したヒメダカ胚中のAsA量を測定し、各暴露物質の酸化ストレスやROS生成量とAsA消費量の相関を明らかにする。
エクソソーム由来分泌型ｍｉＲＮＡを用いた新規動脈硬化評価法の開発

申請者らは、miRNAが動脈硬化症発症のマーカーとなり得るかどうか検討するため、名古屋市立大学病院心臓・腎高血圧内科を受診した患者の血液よりより単離したmiRNAをマイクロアレイを用いて解析することで、特異的な発現を示す分泌型miRNAの候補を得た。本申請ではさらに、リアルタイムPCR法によるmiRNAの検出方法について、miRNA抽出法や反応条件の検討を行った。現在我々は、これらの得られたmiRNA候補のスクリーニングを進めている。バイオマーカーは生理的状態や病態の変動、治療への応答等と相関した血液や尿、組織等の生体試料から得られる客観的な指標である。近年、病態の診断や予防、治療への反応性や効果などを予測することを目的としたバイオマーカーの開発が注目されており、疾病の予防やオーダーメイド医療への応用が期待されている。動脈硬化性疾患の発症や再発を阻止するには、より早期の診断と治療開始が必要であるが、動脈硬化症発症の初期段階を診断可能なバイオマーカーはまだ実用化されていない。近年、細胞外に放出される分泌型microRNA (miRNA)が新たなバイオマーカー候補として期待されている。申請者はこれまでに、miRNAが動脈硬化症発症のマーカーとなり得る可能性に着目して検討を行い、動脈硬化症モデルマウスの病変部位において特異的に発現が変動するmiRNAの存在を見いだした。しかしながら、申請者が予備的な検討で得た大動脈組織由来のmiRNAは、直接臨床検査に応用することは侵襲性が高く現実的ではない。本研究ではより侵襲性が低く簡便に検体を得て診断ができるよう、分泌型miRNAに焦点を当てて解析を行った。申請者らは、miRNAが動脈硬化症発症のマーカーとなり得るかどうか検討するため、名古屋市立大学病院心臓・腎高血圧内科を受診した患者の血液よりより単離したmiRNAをマイクロアレイを用いて解析することで、動脈硬化発症の初期段階に特異的な分泌型miRNAの候補を得た。本年度は、名古屋市立大学病院心臓・腎高血圧内科の外来を受診した、古典的な心血管危険因子(高血圧、脂質異常症、糖尿病、喫煙)を有する無症候かつ無治療の患者(重篤な肝疾患や腎障害、コントロール不良の糖尿病、内分泌疾患、悪性腫瘍の合併者は除外する)を対照に採血およびmiRNAの抽出を行い、マイクロアレイによりmiRNA発現の変動を検討することで、動脈硬化発症早期に特異的な発現変動を示すmiRNA群を得た。申請時には病態モデル動物を用いて研究を開始する予定であったが、実験当初から臨床検体を用いて解析を行ったため、効率的に研究を進展させることができた。平成25年度以降は、引き続き同定したmiRNA分子の機能解析を進めるとともに、新規な動脈硬化診断法の実現に向け、臨床検体を用いた解析を行う。リアルタイムPCR法でより微量の血液から効率よく分泌型miRNAを検出できるよう、miRNA抽出法および反応条件を検討する。miRNAはtotal RNAサンプル全体にわずか0.01%程度しか存在せず、検出には数ngのmiRNAを要するため、より微量の血液を測定するには検出感度の向上が必要である。本研究では、miRNAの抽出・精製法およびリアルタイムPCR法による反応条件を改良することで、最終的に全血100 μl以下から効率よくmiRNAの検出を可能にする。

また、本申請課題で同定したmiRNA分子種を糖尿病や心血管疾患の既往歴を有する患者の血液より検出し、血管内皮機能との関連を検討することで新規な動脈硬化症の診断法としての可能性を探る。名古屋市立大学病院心臓・腎高血圧内科の外来を受診した患者(重篤な肝疾患や腎障害、コントロール不良の糖尿病、内分泌疾患、悪性腫瘍の合併者は除外する)を対照にし、採血およびmiRNAの検出、ならびに血流依存性血管拡張反応検査(FMD)を行い、本研究で同定したmiRNAの発現量と血管内皮障害との相関を検討し、新規な動脈硬化症の診断法としての可能性を探る。本申請課題の申請時には病態モデル動物を用いた解析を行う予定であったが、研究の進捗により動物を使用する必要がなくなったため、動物の購入や飼育にかかる費用を削減することが出来、次年度へ繰り越すこととなった。当該助成金と合わせて平成25年度に使用する助成金の主要な用途は消耗品である。一般試薬や抗体等の分子生物学用試薬類、ディッシュやピペット等のプラスチック・ガラス器具類、培地や血清等の細胞培養試薬類、実験動物、ラジオアイソトープ試薬等の購入が必要である。また、学会で研究成果を発表するために必要な出張経費や論文発表の際の諸経費を計上した。
高性能近似アルゴリズムの設計法に関する研究

グラフ問題や組合せ問題のような離散構造をもつ問題のほとんどはNP完全(最適化問題の場合はNP困難という)であり,現在の計算機では計算時間が膨大になり手に負えない問題である.しかし,たとえNP困難であっても,計算機を用いてなんとか解かなければならない離散最適化問題が情報処理の現場ではますます増えている.たとえば,ORの分野では,より大規模なネットワーク上での資源割当て問題やスケジューリング問題を解かなければならない.また,人工知能の分野では推論処理のような高度な計算を要求する問題がつぎつぎと発生している.このような現実を踏まえ,たとえ求まる解が最適ではなくとも,それに十分近いことを保証できる近似アルゴリズムの設計論が今日の重要な研究テーマとなっている.本研究では、グラフの彩色問題と集合被覆問題を中心とした代表的離散最適化問題に対する高性能近似アルゴリズムを開発するとともに,これまでに提案されている近似アルゴリズムを設計手法の立場から調査・分類し一般的設計法を構築する.今年度の研究成果は以下のようである.最小重み木状被覆問題と頂点彩色問題に対して近似アルゴリズムを設計した.また重みつき集合被覆問題及び集合多重被覆問題に関して成果を得た.この他,センサーネットワークのプロトコルや無線ネットワークの初期化アルゴリズムについて研究を行った.グラフ問題や組合せ問題のような離散構造をもつ問題のほとんどはNP完全(最適化問題の場合はNP困難という)であり、現在の計算機では計算時間が膨大になり手に負えない問題である。しかし、たとえNP困難であっても、計算機を用いてなんとか解かなければならない離散最適化問題が情報処理の現場ではますます増えている。たとえば、ORの分野では、より大規模なネットワーク上での資源割当て問題やスケジューリング問題を解かなければならない。また、人工知能の分野では推論処理のような高度な計算を要求する問題がつぎつぎと発生している。このような現実を踏まえ、たとえ求まる解が最適ではなくとも,それに十分近いことを保証できる近似アルゴリズムの設計論が今日の重要な研究テーマとなっている。本研究では、グラフの彩色問題と集合被覆問題を中心とした代表的離散最適化問題に対する高性能近似アルゴリズムを開発するとともに、これまでに提案されている近似アルゴリズムを設計手法の立場から調査・分類し一般的設計法を構築する。本年度の研究成果は以下のようである。グラフ彩色問題の高性能アルゴリズムの開発を行った。集合被覆問題および集合充填問題の高性能アルゴリズムを開発した。これは各集合に重みがない場合のアルゴリズムを重み付きの場合に拡張したものである。グラフの最大カット問題(MAX CUT)に関して半正定値計画法にもとづく方法とグラフ隣接行列の固有値を用いる方法の検討をおこなった。この他、公開鍵暗号系において重要な演算であるスカラー倍計算の効率的なアルゴリズムを与えた。また、3次元離散ボロノイ図を効率よく求めるアルゴリズムとそのハードウェアアルゴリズムを提案した。グラフ問題や組合せ問題のような離散構造をもつ問題のほとんどはNP完全(最適化問題の場合はNP困難という)であり、現在の計算機では計算時間が膨大になり手に負えない問題である。本年度の研究成果は以下のようである.グラフ問題に関しては、ある制限された最小重み木状被覆問題に対し近似アルゴリズムを与えた。一般化された彩色問題に対し高性能な近似アルゴリズムを開発した。グラフの縮約問題に関して近似困難性を示した。集合被覆問題に関しては、重みつき集合被覆問題および集合多重被覆問題に関して成果をえた。この他,公開鍵暗号系において重要な演算であるスカラー倍計算の効率的なアルゴリズムを与えた.また,画像処理で有用な距離変換を効率よく求めるハードウェアアルゴリズムのVLSI設計を行った.グラフ問題や組合せ問題のような離散構造をもつ問題のほとんどはNP完全(最適化問題の場合はNP困難という)であり、現在の計算機では計算時間が膨大になり手に負えない問題である。たとえば、ORの分野では、より大規模なネットワーク上での資源割当て問題やスケジューリング間題を解かなければならない。本年度の研究成果は以下のようである,グラフ問題に関しては、最小重み木状被覆問題に対し近似アルゴリズムを与えた。また、頂点彩色問題に対して高性能の発見的アルゴリズムを設計した。さらに、一般化された彩色問題に対し高性能な近似アルゴリズムを開発した。

集合被覆問題に関しては、重みつき集合被覆問題に関して成果を得た。この他,画像処理で有用な距離変換を効率よく求めるシストリックアルゴリズムの提案を行った.また、センサーネットワークのプロトコルや無線ネットワークの初期化アルゴリズムについて研究を行った。グラフ問題や組合せ問題のような離散構造をもつ問題のほとんどはNP完全(最適化問題の場合はNP困難という)であり,現在の計算機では計算時間が膨大になり手に負えない問題である.しかし,たとえNP困難であっても,計算機を用いてなんとか解かなければならない離散最適化問題が情報処理の現場ではますます増えている.たとえば,ORの分野では,より大規模なネットワーク上での資源割当て問題やスケジューリング問題を解かなければならない.また,人工知能の分野では推論処理のような高度な計算を要求する問題がつぎつぎと発生している.このような現実を踏まえ,たとえ求まる解が最適ではなくとも,それに十分近いことを保証できる近似アルゴリズムの設計論が今日の重要な研究テーマとなっている.本研究では、グラフの彩色問題と集合被覆問題を中心とした代表的離散最適化問題に対する高性能近似アルゴリズムを開発するとともに,これまでに提案されている近似アルゴリズムを設計手法の立場から調査・分類し一般的設計法を構築する.今年度の研究成果は以下のようである.最小重み木状被覆問題と頂点彩色問題に対して近似アルゴリズムを設計した.また重みつき集合被覆問題及び集合多重被覆問題に関して成果を得た.この他,センサーネットワークのプロトコルや無線ネットワークの初期化アルゴリズムについて研究を行った.
成人T細胞白血病の分子病態

ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-I)の感染後、約60年という長い潜伏期間を経て発症する成人T細胞白血病(ATL)の発がん機構と分子病態の解析を行った。1)癌抑制遺伝子p16のDNAメチル化がエクソン部分から連続性に進展していくことを明らかにした。またHTLV-1プロウイルスの5'側LTRのメチル化によりウイルス遺伝子の転写が抑制されることを見出し、プロウイルスのメチル化がgag, pol, env領域から始まり5',3'側へと進展することを明らかにした。Methylated CpG island amplification/representativedifference assay (MCA/RDA)法によりATL細胞で特異的に低メチル化される遺伝子としてMEL1Sを同定し、その異所性発現がTGF-βに対する抵抗性に関連することを報告した。ATLで高メチル化される遺伝子としてEGR3,KLF4遺伝子を同定しEGR3の転写抑制によりATL細胞はFasリガンドの発現を抑制しFasからのアポトーシスを回避していることが明らかとなった。2)ATL細胞がRANKリガンドを発現し血液幹細胞から破骨細胞への分化を誘導し、破骨細胞数を増加させることによって高カルシウム血症を起こすことを示した。4)Tax蛋白質は腫瘍化に中心的な役割を担っていると考えられるが、腫瘍となった段階では発現しないものが多い。ATL細胞におけるTaxの不活化機序として1)tax遺伝子の遺伝的変異、2)5'側LTRのDNAメチル化、3)5'側LTRの欠失の3つが存在することを示した。1)成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia:ATL)に高率に合併する高カルシウム血症の分子機構を解明するために破骨細胞の分化に必須の分子であるRANK ligandの解析を行った。ATL細胞におけるPTH-rP,TNF-a,M-CSF,OPG,RANK ligand遺伝子の発現を解析したところ高カルシウム血症の存在はRANK ligandの発現と有意に相関していた。RANK ligandの発現のあるATL細胞と正常人骨髄から単離したCD34,c-kit陽性血液幹細胞を共培養すると破骨細胞への分化誘導が認められた。この分化誘導はRANK ligandの作用を阻害するOPG-Fcにより抑制されRANK-RANK ligand系がATL細胞による破骨細胞への分化誘導、ひいては高カルシウム血症に密接に関与していることが示された。RANK-RANK ligand系はTリンパ球と樹状細胞の相互作用にも重要であり、本研究はATLにおける高カルシウム血症の治療に結びつくだけでなく、ATLの増殖機構の解明、治療につながるものと考える。2)HTLV-I感染者における免疫不全状態の機序を明らかにするために解析を行い、HTLV-I感染者では特異的にナイーブTリンパ球の減少が見られ、一方、メモリーTリンパ球は増加していることを明らかにした。胸腺機能の指標であるT-cell receptor gene excision circle(TREC)をsequence detectorを用いて定量したところHTLV-I感染者では胸腺レベルにおけるTリンパ球の産生障害が認められることが明らかとなった。このようなナイーブTリンパ球の減少による免疫不全の結果としてHTLV-I感染者ではEpsten-Barr VirusのDNA量が増加していることを示した。このようなHTLV-I感染による免疫不全はATLの発症にも関連していると考えられる。ヒトT細胞白血病ウイルスI型(Human T-cell leukemia virus type I : HTLV-I)の感染から成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia : ATL)の発症へ至る発がん過程ではHTLV-IによってコードされるTax蛋白質が重要な役割を果たしていると考えられているが腫瘍化機構におけるTaxの意義を明らかにするためにATL細胞株での解析を行った。ATL腫瘍細胞由来の細胞株(5株)では、p53の機能抑制が見られ、このうちTaxを産生していない3株では欠失、または変異によりp53蛋白質が存在していなかった。Tax産生細胞株ではp53蛋白質は正常に存在した。

Tax非産生細胞株ではnon-sense mutation, deletionに加え5'側LTRの選択的メチル化によりTax産生性が障害されていた。以上の知見からATLの発がん過程にTax依存性、非依存性の時期が存在し+Taxが様々な原因で発現できなくなる段階ではTaxの機能を代償する細胞側遺伝子の変化が起こっていることが示唆された。ATL患者では免疫不全が存在し日和見感染症の合併が治療上の大きな問題点であるが、我々はHTLV-Iキャリア、ATL患者における免疫不全の原因としてナイーブTリンパ球の減少が存在しT-cell receptor excision circle(TREC)の測定から胸腺レベルにおけるナイーブTリンパ球の産生の障害が原因であることを明らかにした。さらに血中IL-7が、その代償作用として高値となっており、このIL-7は感染細胞や腫瘍細胞のアポトーシス抑制、増殖により腫瘍化機構にも関連していることが示された。1)腫瘍細胞で高メチル化されているDNA領域、遺伝子の単離、同定Methylated CpG island amplification/representativedifference assay (MCA/RDA)法を用いてATL細胞で高メチル化、低メチル化されているDNA領域の単離を行った。ATL細胞と正常CD4陽性Tリンパ球からのgenomic DNAを用いてMCA/RDA法にてATLで高メチル化されているDNA領域、ATLで低メチル化されているDNA領域を増幅した。メチル化状態の確認はSmaI, XmaIを用いたサザン法、Combined Bisulfite Restriction Analysis、sodium bisulfite sequencing法で確認した。その結果、これら単離したDNA断片の高メチル化はATLの進展に伴って増加していくことが明らかとなり、進展に関連していることが示唆された。次にATL細胞と正常細胞で発現を解析し、ATL細胞で高メチル化されているDNA近傍の遺伝子群を明らかにした。今後、その生物学的意義を解析していく予定である。2)ATL細胞に対する抗Fas抗体の効果ATL細胞は活性化Tリンパ球の形質を有しており、Fas抗原を高発現している。このためFas抗原を介するシグナルに高感受性であるが、Fasからシグナルを入れる抗体(CH-11等)は、肝細胞にもアポトーシスを誘導するため臨床応用できない難点があった。米原らの開発したHFE-7A抗体はマウスからヒトへ至る広い種に渡るFas抗原を認識し、アポトーシスシグナルを入れる。しかし、この抗体は肝細胞にはアポトーシスを誘導しないことから臨床応用が可能な抗体となっている。
中止未遂の理論的検討及び司法実務における機能的考察

標記課題について、以下の知見を得た(裏面研究発表参照)。中止未遂の根拠を示す学説として、従来、未遂犯の違法性、責任との関係から説明を試みる法律説と未遂犯の違法性、責任とは別個の論理から特別の法的効果を正当化する刑事政策説とが対立してきた。だが、両説の対立は近年相対化され、両者の併合説が有力化している。かかる傾向を考察するために鍵となる概念「刑事政策」に着目してドイツの立法資料、裁判資料等を精査検討した結果、刑事政策説を基盤とする学説は、法律説との対決を通して変容を遂げていることが判明した。即ち、当初未遂犯の体系的整合性の見地から、中止未遂により未遂犯の違法性、責任が減少すると説く法律説を批判することが存在理由であった刑事政策説が、中止未遂の成否基準を導く基準たり得ないとの反批判に遭い、未遂犯の犯罪成立要件たる違法性、責任とは無関係な予防の観点を取り入れることにより、中止未遂の論理構造を説こうとする刑罰目的説へと変貌したことが端的にそれを表している。刑罰目的説の登場により、従来の刑事政策説が前提としていた中止行為と未遂行為とを別個に考察する思考方式から中止行為と未遂行為とを一体的に考察する全体的考察の手法が刑事政策説に導入された。このことにより、未遂行為と中止行為とを別個に考察する思考方式は必ずしも刑事政策説に特徴的な論理ではないことが明らかになる。それと同時に、従来批判されたような「いったん生じた違法性、責任の事後的消滅」は法律説に必然の論理ではないことも判明した。つまり、中止未遂をめぐる議論の対抗軸が変わったのである。以上の考察を踏まえると、未遂犯の違法性、責任とは無関係な考慮に頼らなくとも中止未遂の成否基準を明確に提示することができるであろう。なお、その具体的基準については、改めて別稿を準備中である。本年度は、主に文献資料の収集、とりわけ日独の立法資料、裁判資料を中心に調査収集した。その資料の一部を用いて、日本の中止未遂論に多大な影響を与えたドイツにおいて、現在もなお少なからぬ支持者を有する刑事政策説の理論的系譜を探求し、論文にまとめた(「中止未遂における刑事政策説の意義について(一)」)。本論文においては、刑事政策説の祖と称されるフォイエルバッハの唱えた論は、実は現在の意味における刑事政策説とは異なり、むしろ彼は未遂犯の可罰性を否定する性質を中止未遂に見出していたことを論証した。刑事政策説は、その後、フォイエルバッハの高弟ミッテルマイヤーが、中止未遂が未遂の可罰性に影響を与えることを否定したことにより、理論化されたものである。ドイツライヒ刑法及び現行刑法の制定過程を通時的に調査することを通して、中止未遂の存在意義を、未遂の中止を奨励することにあると説く純粋な刑事政策説(奨励説)の特色は、未遂と中止未遂とを分断して捉える点にあったことも判明した。だが、近時、中止未遂を未遂の当罰性を排除するものであると位置づける見解が再度有力化しつつあり、その中で刑事政策説も変容を迫られている。次なる課題は、かかる刑事政策説の変容とその意義とを検討することである。さらに、未遂と中止未遂との関連を違法性、有責性、さらに量刑の側面からも探求することを予定している。
直接メタノール型燃料電池における触媒性能向上に関する研究

直接メタノール型燃料電池は高変換効率、クリーンな排ガス等のため、非常に興味が持たれている。しかしながら、メタノールのクロスオーバ、メタノールの低酸化活性やCOの被毒などの解決すべき課題もある。そのため、耐CO被毒性のPt合金触媒の精力的な研究が行なわれている。まず、白金触媒及び白金-ルテニウム合金触媒の作製と評価について検討した。安定剤としてポリビニールピロリドンを用いてアルコール還元法によって作製した白金及び白金-ルテニウム合金触媒は従来の市販品に比べて、簡単な方法であるが極めて均一なナノ微粒子が作製できることが明らかになった。得られた触媒の評価をUV-Vis分光法、X線回折法や光電子分光法、サイクリックボルタメトリーを用いて評価した結果、新らしい方法で作製した触媒は市販品と比較して酸素還元及びメタノールの酸化において優れていることが分かった。さらに、逆エマルジョン中で化学還元法を用いて作製した白金-ルテニウム合金触媒の作製法についても検討した。作製されたナノ微粒子はきわめて均一で2-4nmの範囲であること、また粒子の形態はマイクロエマルション中の水の量に関係すること、電気化学的な測定から作製した触媒は市販品と比較して高い活性を示すことを明らかにした。白金-ルテニウム-スズ三元触媒及び白金-ルテニウム-鉄触媒の作製と評価について検討した。カーボン担持白金-ルテニウム-スズ(Pt_3Ru_2Sn/C)の触媒活性がカーボン担持白金-ルテニウム(Pt-Ru/C)触媒に比べて非常に高いことが明らかになった。これは3元合金触媒中のスズが白金の電子状態を変え、耐CO被毒性を向上することためと考えられる。また、白金-ルテニウム-鉄(Pt_3Ru_2Fe/C)の触媒活性についても検討した。この触媒のメタノールの酸化活性はCO被毒性の改良によってPt-Ru/C触媒のそれと比較して2.5倍高くなることが分かった。これは鉄が白金の電子状態を変え、白金へのCOの結合を弱めてRu上の水との反応を増進するためであることを明らかにした。DMFCの実用化において高分子電解質膜のメタノールクロスオーバーの低減とメタノールの酸化過程で生じるCOの影響を受けない新規高活性アノード電極触媒の開発は急務である。この研究では、COの影響を受けない新規アノード触媒の開発を行うことを目的としている。そこで、平成15年度では白金微粒子及び白金-ルテニウム(Ru)微粒子の作製と調製した触媒の性能を確認した。まず、安定化剤としてポリビニルピロリドンを用いてアルコール還元法により、白金塩及びRu塩から白金及び白金-Ru担持カーボン触媒を調製した。調製した触媒は紫外可視分光法、X線回折測定、X線光電子分光法や透過電子顕微鏡により評価した。その結果、極めて均一なナノ微粒子触媒が得られていることが分かった。また、微粒子の凝集がポリビニルピロリドンによって抑制されていることが確認された。さらに、X線回折の結果から、白金粒子は面心立方格子の結晶構造をしており、白金-Ru合金微粒子は白金原子の一部がRu原子で置き換わった面心立方格子の結晶構造をしていることが明らかになった。X線光電子分光法で表面組成を検討したところ、白金-Ru微粒子はRu原子でデコレイトされた白金-Ru合金ナノ微粒子であることが明らかになった。

COサイクロボルタンメトリーの結果、調製した触媒は市販の触媒に比べてメタノールの酸化及び酸素還元反応においても、より優れていることが確かめられた。次に作製した触媒を用いて膜/電極接合体(MEA)を作製し、燃料電池の性能をV-I特性より評価したところ、作製した触媒は市販の触媒よりも優れていることが確かめられた。現在、白金-Ru-スズ三元触媒の調整を試みている。得られた結果の一部は日本化学会の春季年会およびChemistry Lettersに発表した。また、研究で得られた知見を含めて、図解燃料電池を執筆し、ナツメ社より出版した。現在,直接メタノール形燃料電池(DMFC)のアノード用触媒にはPtRu/C触媒が広く使用されている。しかし,PtRu/C触媒はメタノール酸化の活性が低く,CO被毒やコスト高といった問題も抱えている。そこで平成16年度では,Pt, RuにSnを加えて三元触媒化することによって触媒活性を向上させるため、Pt, Ru, Sn担持カーボン触媒の調製を試みた。調製した触媒は紫外可視分光法、X線回折測定や透過電子顕微鏡により評価した。また、触媒活性は回転リングディスク電極やポテンショ/ガルバノスタットを使った電気化学的な測定によって評価した。作製した各触媒のTEH観察から,いずれも3-5nmの金属微粒子がカーボン上に担持されていることが確認できた。また,XRDパターンにおいてPtピークはRu添加により高角側へ,Sn添加では低角側にシフトすることが認められた。このことから,RuやSnはptと合金化し,原子間距離を変化させていることが明らかになった。さらに、0.5vol%のCOガスを0.1MH_2SO_4電解液中に連続的に流して測定したポテンショダイナミックの結果、Pt/CではCO酸化の開始電位が約0.65Vであったのに対して,Ru添加により約0.25V, Sn添加では約0.35V低電位側にシフトした。このことから,特にSnとの合金化による耐CO被毒性の向上が大きいことが分かった。また、PtRu/CとPt_3Ru_2Sn/C触媒についてメタノール酸化のポテンショダイナミック測定を行うことでSnの添加効果を調べた。その結果、測定した電流値をCOストリッピング測定から見積もった合金の表面積で割った値を求めた。ピーク電流においてPt_3Ru_2Sn/C触媒の方が電流密度が大きいことより,単位表面積あたりのメタノール酸化反応の速度が向上することが明らかになった。これまでに触媒の微粒子化や、Ruに代わる金属との合金化、酸化物の添加等によって触媒活性の向上を目指した研究を行ってきた。そこで、これまでの研究の成果を元に、平成17年度ではPt,RuにSnを加えて三元触媒を調製し、この触媒の酸化活性をボルタンメトリー測定で評価するとともに、この触媒をMEAに組み込んだ直接メタノール型燃料電池の電圧-電流特性を測定し、電池の性能を検討した。作製したPt-Ru-Sn担持
FRPロッドを用いたPC梁の曲げおよびせん断挙動

アラミド繊維や炭素繊維ロッド(AFRP及びCFRP)のコンクリート構造部材への適用が考えられているが,その材料特性が鋼材の場合と種々の面で異なる。すなわち,鉄筋腐食環境下でも腐食せず,その引張強度がPC鋼材よりも高い。弾性係数が鋼材の場合の1/4(AFRP)及び3/4(CFRP)と小さく,伸び能力は約3.5%(AFRP)及び約1.5%(CFRP)程度で鋼材の場合の1/51/10程度である。本研究では、これらの材料特性がFRPロッドを用いたポストテンション型PC梁の曲げ及びせん断強さに及ぼす影響について、緊張材量,プレストレス力,軸方向補強材種別と量を変化させて検討した。プレストレストコンクリートにすることによって,FRPロッドの引張強度を十分に活用できるし,全断面有効となる荷重の大きさを大きくできるので,剛性の低下を相当防ぐことができると思われる。本研究の範囲内で以下のことが認められた。1)FRPを緊張材に用いたPC梁の曲げ耐力はプレストレスを増大させることによって増大する。しかし,緊張力-引張強度比を0.75にすると,梁の曲げ圧縮破壊から曲げ引張破壊に移行し,曲げ耐力が増大しなくなる。2.FRPを用いたPC梁を曲げ圧縮破壊させても,FRP緊張材の弾性係数が小さいため,破壊に至る過程でたわみが大きくなり,曲げひび割れが梁上縁近くまで進展した後,梁圧縮部コンクリートが圧壊するので,破壊の予知は十分可能であり,曲げ圧縮破壊になるような設計をすることが曲げ引張破壊するようにする場合より望ましいと思われる。3)曲げ圧縮破壊をするFRPロッドを用いたPC梁の曲げ耐力は緊張材量の増大に伴って大きくなる。これはPC鋼材を用いた場合と異なる点である。4)FRPロッドを用いたPC梁のせん断耐力はプレストレスを増大させることによって増大する。
出芽酵母DNAポリメラーゼεが関与するDNA複製異常認識の分子機構

これまでに出芽酵母DNAポリメラーゼεとその部分複合体Dpb3p-Dpb4pが二本鎖DNA結合能を有することを示した。Dpb3p-Dpb4p複合体はヒストン様のヘテロ二量体であり、Polεとクロマチンの相互作用に関わることが示唆される。Polεの二本鎖DNA結合能の細胞内での役割を明らかにする目的で研究を行い、平成15年度は以下のことを明らかにした。ヘテロ二量体形成は正常であるが、二本鎖DNA結合能が低下するアミノ酸置換型Dpb3pおよびDpb4pを分離し、それらを含む変異型Polεを精製したところ、そのサブユニット構成、複合体の安定性、およびDNAポリメラーゼ活性はすべて野生型Polεのそれと同じであった。一方、これら変異型Polεの二本鎖DNA結合能は野生型に比べ顕著に低下していた。以上の結果より、Polεの二本鎖DNA結合能は確かにDpb3p-Dpb4p部分複合体に担われていることが示された。(2)DNAポリメラーゼεの二本鎖DNA結合能の役割本特定領域の荒木ら(国立遺伝学研究所)により、dpb3欠損株においてはテロメア近傍領域の遺伝子サイレンシングの状況が野生型の場合と著しく異なることが報告された。通常何世代にも渡ってエピジェネティックに維持されるサイレンシングの状態(転写抑制の状態)が、この株では安定に維持されない。そこで、二本鎖DNA結合能が低下したPolεを産生するdpb3(K18D)変異株におけるテロメア近傍領域のサイレンシングを調べたところ、dpb3欠損株と同様の異常が観察された。この結果はPolεの二本鎖DNA結合能がテロメア領域におけるヘテロクロマチン形成に関わる機能である可能性を示唆するものである。Polεはテロメア領域の複製とヘテロクロマチン形成を共役させる働きを持つのかもしれない。出芽酵母DNAポリメラーゼε(Polε)は鋳型DNAに極めて安定に結合するが、この状態で別の単鎖DNA分子を認識して鋳型DNAから急速に解離する性質をもっている。本研究の目的は、このssDNA dependent Polεdisplacementの分子機構とその生物学的意義を明らかにすることである。特に、S期チェックポイント制御でのPolεの複製異常のセンサーとしての働きや複製開始制御におけるPolεの役割と関連に注目して研究を進めている。平成11年度は以下の項目について研究を行った。Polε複合体を構成する4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)の遺伝子を個別にバキュロウイルス多量生産系で発現させ、DPB2,DPB3,DPB4の遺伝子産物は十分に発現することを確認した。現在はDpb2の精製に取り組んでいる。また、出芽酵母細胞を大量培養して得られた菌体からPolε複合体およびPol2のN末端部分からなるp145タンパク質を精製し、それぞれ高純度の標品を新たに取得した。さらに、今後の生化学的解析に必要なPCNA、RF-C、RPAタンパク質についても同時に精製を進め、それぞれ多量の高純度標品を取得した。Polεの鋳型DNAからの解離は単鎖DNAによって特異的に引き起こされるが、中でもある種の高次構造を持つものがより強い効果を示すことを見出した。現在はBiacoreの実験系を用いてPolεの鋳型DNAからの解離を引き起こすDNAの構造特異性を調査している。さらに、ゲルシフト法を用いて、これらの高次構造を持つDNA分子に対するPolεの結合特異性や親和性の解析を行っている。出芽酵母DNAポリメラーゼε(Polε)は触媒サブユニット(Pol2)と3つのアクセサリーサブユニット(Dpb2,Dpb3,Dpb4)から成る複合体である。Pol2のポリメラーゼドメイン(N-末端領域)が細胞増殖に必ずしも必須でないのに対して、このC-末端ドメインは必須である。このC-末端ドメインはS-期チェックポイント制御にもその関与が示唆されている。本研究は細胞内でのPolεの役割を知るために、Pol2のC-末端ドメインおよびアクセサリーサブユニットの生化学的機能を明らかにし、これと細胞増殖、チェックポイント制御との関連を検討することを目的とする。平成12年度の成果は以下のとおりである。1.Polεの個々のサブユニットの発現と精製細胞増殖に必須であるアクセサリーサブユニット、Dpb2をカイコ体内で発現させ、この精製を完了した。Dpb3、Dpb4についてもこれらをカイコ体内で共発現させ、Dpb3-Dpb4複合体の精製に着手したが(2-(2)参照)、カイコ由来の他の蛋白質と大きな複合体を形成していたため精製が困難であった。現在大腸菌を用いた蛋白質発現系でDpb3-Dpb4の発現を試みている。2.Pol2C-末ドメインおよびアクセサリーサブユニットの生化学的機能(1)PCNAに依存したPolεのDNA合成反応:4つのサブユニット(Pol2,Dpb2,Dpb3,Dpb4)から成るPolεは、ある条件下でPCNAに依存したDNA合成を行うことが知られているが、これに対してPol2のポリメラーゼドメイン(C-末領域を欠く)のみではDNA合成活性は保持されているものの、PCNA依存性が非常に低いことを明らかにした。さらにこのPCNA依存性にDpb2が関わることを示唆する結果を得た。(2)PolεのDNA結合能:Polε複合体およびPol2のポリメラーゼドメインのDNA結合能をゲルシフト法を用いて解析した。その結果、Pol2C-末領域および(あるいは)アクセサリーサブユニットに依拠するDNA結合活性として二本鎖DNA結合能を見出した。

このDNA結合はDNA合成反応とは競合しない。さらに最近、ヒトのクロマチンリモデリング複合体の中にPolεのDpb3とDpb4様の蛋白質が含まれていることが示され、この解析により、Dpb3-Dpb4がこの二本鎖DNA結合に関わる可能性が示唆された。精製したDpb3-Dpb4を用いてこの点を検討したい。細胞増殖に必須であり、複製の進行をモニターして細胞周期を制御するチェックポイント機構にも関わることが示唆されている出芽酵母DNAポリメラーゼε(Polε)の生化学的機能を明らかにし、細胞内でのPolεの固有の役割を明らかにすることが本研究の目的である。平成13年度はPolε見出されたニック本鎖DNA結合能の役割を理解することを目的として以下のことを行った。1.PolεのアクセサリーサブユニットであるDpb3およびDpb4蛋白質の多量生産と精製大腸菌の蛋白質多量生産系を用いて、GST融合Dpb4蛋白質および、Dpb3蛋白質の多量生産株を作製した。GST-Dpb4とDpb3の共発現による精製により、Dpb3とDpb4は1:1の分子比で複合体を形成することを示した。また、Dpb4の単独精製も行い、これもホモ二量体を形成することが解った。Dpb3-Dpb4複合体のDNAとの相互作用をゲルシフト法により検討した結果、この複合体は二本鎖DNAに特異的に結合することが明らかになった。この二本鎖DNA結合は塩基配列非特異的な結合である。予想に反してDpb4ホモ二量体にもDNA結合活性が認められたが、これは一本鎖DNAにも二本鎖DNAにもほぼ同等の結合性を示した。3.Dpb3-Dpb4複合体のヌクレオチドとの相互作用Dpb3のアミノ酸配列の解析より、この蛋白質はヌクレオチドとの相互作用に必要なアミノ酸配列に類似する配列を持つことが解っている。そこで、Dpb3-Dpb4複合体のATP結合能およびATPase活性を調べた。しかしながら、いずれの活性も検出されなかった。4.変異型Dpb3-Dpb4複合体の作製Dpb3とDpb4の複合体形成能は保持しているものの、二本鎖DNA結合活性のみを失ったような、変異型Dpb3-Dpb4複合体の作製も進行中である。現在までに、変異を持つ複合体の精製まで終了している。今後DNA結合活性を調べる予定である。出芽酵母DNAポリメラーゼε(Polε)に固有の機能を知る目的でそのアクセサリーサブユニットの生化学的機能の解析を行っている。これまでにPolεが通常のDNAポリメラーゼには見られない本鎖DNA結合能を有すること、およびPolεの部分複合体Dpb3p-Dpb4pがこの活性を担うことを示した。この複合体はヒストン様のヘテロ量体であり、Polεとクロマチンの相互作用に関わることが示唆される。平成14年度は以下のことを明らかにした。