hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子インプリント膜による内分泌攪乱物質の認識とそれによる分離及び検出技術の確立

分子インプリント法を適応し、環境汚染物質であるジベンゾフランインプリント膜やビスフェノールA認識膜を開発し、これらの分離濃縮ならびに検出を目的とした研究を行った。ジベンゾフランはダイオキシンとほぼ似た骨格を有し、ジベンゾフランを刷り込んだインプリント膜はダイオキシンも同様に認識濃縮できることが明らかになった。作成された多孔膜は限外濾過膜の特性を有し、これにジベンゾフラン液を透過させると透過モードで濃縮分離が可能であることを見出した。この系では、認識の推進力としては電荷移動錯体が作用していることを吸収および蛍光スペクトルの測定から明らかにした。この結果により、ベースポリマーとなるポリスルホン骨格とジベンゾフランが電荷移動錯体を形成し、更に、光照射することにより400nm付近にブロードな発光体が出現し、これをモニターすることで検出デバイスとしても利用できることが明らかになった。また、ビスフェノールAを認識できるインプリント膜には、我々が開発したジチオカルバメート化ポリアクリロニトリル膜を利用した。今回、新規に2官能性のビスフェノールAモノマーを合成し、これを光グラフト重合によって、膜状にポリマー化した。同様に、メチレンビスアクリルアミドとの共重合層も形成させた。エステル形成で共有結合しているビスフェノールAを、酸加水分解で抽出し、膜表面の重合層内にインプリントサイトを形成させた。得られたインプリント膜をビスフェノールA、2ヒドロキシキシフェニルエチルアルコールや4-terブチルアルコールの認識性を検討した結果、ビスフェノールAに高い結合特性を有することが明らかになった。また、メチレンビスアクリルアミドとの共重合層の方が、インプリント効率が高いことが判明した。以上のように今年度は、これまでにない膜状インプリント材料の作成に成功し、その種々の認識特性について詳細に検討した。
がん特別研究の総括

本年度の総括班の成果は以下の如くである。1.平成2年度成立の226班(がん特1・83班、がん特2・143班)及び若い研究者58名の運営と総括を行なった。2.年7回総括班会議を開き研究班の計画・運営・評価を行なった。3.特別委員会4、検討班4を計画し、これを運営した。4.平成3年度の計画研究9班、重点研究8課題を計画した。5.班長会議(第1回平成2年6月4日、第2回平成3年2月1日)を行ない、がん研究の新しい方向、研究者の要望等につき討議した。6.がん特別研究の成果を発表し討議する公開シンポジウムを、平成3年1月31日、2月1日の両日東京において開催した。また、ミニシンポジウムを平成2年11月17日金沢市で開催した。7.研究技術交換等のための研究者の国内派遣の計画をした。8.年度初めに「平成2年度文部省がん特別研究組織」を、年度末には「文部省がん特別研究報告集録」を編集、印刷し、全員に配布した。9.「がん特ニュ-ス」を年3回全班員、関係者に配布し、研究連絡伝達を密にした。10.「コホ-ト研究による発癌要因の評価に関する研究」の研究を行なった。
体性感覚野へ上行する内臓感覚求心路の未知の脳幹中継核を光学的マッピングで同定する

身体内部の状態を常時監視して脳に伝える神経系があり、その中心的な役割を果たしているのが迷走神経である。この迷走神経を電気刺激すると様々な神経疾患に効果のあることが近年見いだされ、有力な治療法と注目されている。しかし、この方法がなぜ有効なのかはわかっていない。その作用機序を理解するためには、迷走神経刺激の信号が脳の中をどのように進むのかを明らかにする必要がある。本研究では、解剖学的神経連絡標識法と電気生理学的刺激・記録法ならびに光学的記録法を用いて、大脳皮質へ向かう経路の解明を目指す。
女性における荷物取り扱い作業時の身体的負担に関する研究

本研究では、女性における単独および複数で荷物取り扱い作業時の身体的負担を、筋電図、心電図、負担感により評価した。その結果、単独作業条件下では男性と比較すると女性の方が、肩部の筋負担が高まっていることが明らかになった。しかし、荷物の重量が異なる条件下において結果に十分な再現性が得られなかったため、再検証が必要である。単独作業条件と2人作業条件の比較では、2人作業条件の方が、全般的に筋負担が高まる傾向が認められた。また、女性よりも男性の方が、筋負担が高まる傾向も一部認められた。この理由として、作業者間の指先端高差、筋力差、荷物取扱い動作のタイミングの差などが影響している可能性が考えられる。作業関連性腰痛を発症させる可能性が高い作業として荷物取り扱い作業がある。荷物取り扱い作業は単独で行う場合だけではなく、荷物の重量や大きさ、運搬距離などによっては複数の作業者が協力して行う場合も多い。複数で作業を行う場合の作業負荷は、個々の作業者における荷物の保持方法や身長差などに依存して変化し、単に荷物の重量を作業者の数で割ったものには一致しないと考えられる。この問題は近年着目されつつあるものの、研究対象者は男性であることが多く、女性を対象とした研究例はあまり認められない。したがって、本研究では、複数で荷物取り扱い作業を行う時の身体的負担における性差および単独作業と複数作業者間の差異を明らかにすることを目的とした。今年度は平成24年度に実施した単独作業で用いた箱の重量と縦・高さの寸法を2倍にし、重量12kg、縦65cm×横43cm×高さ23.5cmの箱を用いて予備実験を行ったところ、男性、女性共に負荷が低すぎたため、負担感に床効果が生じてしまうこと、また、荷物の重量が軽すぎるため、荷物を持ち上げる際に上方向に引き上げ過ぎてしまう傾向がある等の問題が生じることが明らかとなった。そこで、これらの問題を解消するための負荷条件を安全上の許容範囲内に留めるよう配慮して高めることを検討した。また、負荷条件の変更に伴って研究実施計画時の作業条件で実験を遂行すると、計画時よりも疲労の蓄積が見込まれるため、試行回数の削減、試行間隔の延長など、実験プロトコル全般について見直しを行った。単独で荷物取り扱い作業を行う際の身体的負担における性差を明らかにするために、以下の方法で実験を遂行した。対象者は成人男性12名(平均年齢22.58歳)、成人女性11名(平均年齢20.73歳)であり、書面により同意を得た上で実験に参加してもらった。対象者には、縦32.5cm、横43cm、高さ23.5cm、重さ6kgの箱を用いて持ち上げ作業、持ち下げ作業、移動作業、運搬作業を行ってもらった。持ち上げ作業では床面に設置された箱を持ち上げ、高さ70cmの台上に置いてもらった。持ち下げ作業では高さ70cmの台上に置かれた箱を持ち、床面に置いてもらった。移動作業(体幹の捻りを伴う作業)では対象者の正面から右に30°および左に30°の方向に高さ70cmの台を2つ設置し、左右いずれかのに台上に箱を置いた。対象者は箱を持ち、もう一方の作業台に移動させた。運搬作業では床面に置かれた箱を持ち上げ、上肢を伸ばした姿勢で保持し、5m直進し、高さ70cmの台上に置いてもらった。測定指標として表面筋電図(上腕部、肩部、背部、大腿部)、心拍数(胸部誘導)、負担感(Borg scaleを使用)を計測した。筋電図の結果より、男性と比較して女性では全ての作業において、肩部の負担が高いこと、持ち上げ作業、運搬作業において上腕部の負担が高いことが明らかになった。また、同じ作業において、背部の負担が高くなる傾向が認められた。心拍数については男女間に作業負荷による有意差は認められなかった。負担感は移動作業以外で女性の方が有意に高いことが明らかになった。全ての作業において女性の方が肩部の筋負担が高くなった理由の一つとして、女性は男性よりも身長が低いため、箱を台上に置く際や箱を台上から降ろすために把持する際に、肩部を男性よりも挙上させる姿勢となっていることが推察された。前年度までの実験プロトコルを見直した上で、荷物を1人で取り扱う作業(以下1人作業とする)の再実験、および2人で取り扱う作業(以下2人作業とする)条件で実験を実施し身体的負担を評価した。1人作業では取り扱う荷物として縦33cm×横45cm×高さ30cm、重さ10kgの箱を用いた。実験参加者には持ち上げ作業(床に設置された箱を持ち上げ、高さ70cmの台上に置く)、持ち下げ作業(高さ70cmの台上に置かれた箱を床に降ろす)、運搬作業(床に設置された箱を持ち上げ、前方に3m歩行し、高さ70cmの台上に置く)を行ってもらった。2人作業では、1人作業で用いた箱と同等の寸法、重量を2倍の20kgとした箱を用い、1人作業と同様の条件で作業を行ってもらった。評価指標として僧帽筋、上腕二頭筋、脊柱起立筋、大腿直筋の筋電図、胸部CM5誘導による心電図を測定した。また、各条件後に指、肩、腕、背中、足、全身の負担感について7件法で回答を求めた。

実験には同性同士で身長差5cm以内の2名を1組とした男性7組、計14名(平均年齢21.1歳、平均身長171.4cm)、女性5組、計10名(平均年齢20.6歳、平均身長159.5cm)が参加した。結果より、筋電図および負担感は男性と比較すると女性の方が高値を示す作業条件、測定部位が認められたものの、全ての作業条件、測定部位を通して一貫した傾向は認められなかった。心電図に基づいて求めた心拍数には有意な性差は認められなかった。また、平成27年度にはメタアナラシスを実施する予定であったが、収集した文献において研究デザイン上、バイアスのリスク等に問題点があることが明らかとなった。したがって、メタアナラシスの手法に則らず、各論文における個々の知見に基づき、女性が荷物取扱い作業に従事する際の安全性を確保する方策について総合的に考察を行った。平成27年度は単独および複数の作業者による荷物取扱い作業時の身体的負担に関する論文について系統的レビューを行うことにより,女性における当該研究領域における研究動向および今後の課題について検討した。論文の選定基準は,査読システムのある学術雑誌に公表されていること,英文であること,過去20年以内に発行されていること等とした.また,論文検索のキーワードには,manual handling, lifting, load, workload, team lifting, female, gender, sex differences等とした.データベースは,Pubmed, Google Scholar等を使用した.キーワード検索により選定された論文のうち,データベース間で重複する論文,選定基準に適合しない論文等を除外し,最終的に18件の論文をレビュー対象とした.レビューの結果,単独の作業者を対象とした研究では,体系的に性差を検討している研究は極めて少ないこと,包括的数理モデルを構築し身体的負担に関わる要因について多角的に検討がなされている研究が認められるものの,実験室実験により性差を検討しているものは極めて少ないこと,取り扱う荷物の寸法,持ち手の位置などについて女性を対象として検討を行っているものは僅かであることが明らかになった.複数の作業者を対象とした研究では,過去15年間で当該研究領域の研究数は増加しているものの,複数の作業者による荷物取り扱い作業特有の危険因子について女性を対象とし検討を行っているもの,性差を検討しているものは僅かであることが把握された.以上より,当該研究研究領域では,対象者に男性,女性双方を含み性差を検討すること,女性特有の生理学的危険因子についても焦点を当て早急に検討を行う必要があることが示唆された.本研究では、女性における単独および複数で荷物取り扱い作業時の身体的負担を、筋電図、心電図、負担感により評価した。その結果、単独作業条件下では男性と比較すると女性の方が、肩部の筋負担が高まっていることが明らかになった。しかし、荷物の重量が異なる条件下において結果に十分な再現性が得られなかったため、再検証が必要である。単独作業条件と2人作業条件の比較では、2人作業条件の方が、全般的に筋負担が高まる傾向が認められた。また、女性よりも男性の方が、筋負担が高まる傾向も一部認められた。この理由として、作業者間の指先端高差、筋力差、荷物取扱い動作のタイミングの差などが影響している可能性が考えられる。男女各8組の実験を実施する計画であったが、参加条件に適う参加者募集および参加者とのスケジュール調整が捗らず、男性1組、女性3組の測定が終了していない。この状況に伴い、研究の総括に至っていない。また、平成26年度に予定していた成果発表のため国際会議への参加を予定していたが、開催国近隣地域の治安悪化を考慮し参加を中止したため成果発表に至っていない。
酒石酸エステルを活用した二核キラル反応場の創成と実践的不斉有機分子の構築

有用な生理活性を示す天然ならびに非天然有機化合物の中には,光学活性を有するものが数多くあり,それらの生理活性は不斉炭素の立体化学に大きく左右されることが知られている。従って,構造活性相関の探求や,新規医薬あるいは農薬の創製のためには,任意の立体化学を有する不斉有機分子の高効率・高立体選択的な実践的構築法の確立が必要不可欠となる。本研究では,これらの課題に積極的に応える観点から,両鏡像体ともに入手容易な不斉源である酒石酸エステルを用いた新たなキラル反応場の創成による不斉有機分子の実践的構築法を開発し,今回その新たな展開を試み,以下のような研究実績を挙げることが出来た。1)これまでに酒石酸エステル亜鉛ジアルコキシドの亜鉛原子に結合および配位したアリルアルコールとニトリルオキシドとの間で不斉1,3-双極子付加環化反応が進行し,対応する光学活性2-イソオキサゾリンが高立体選択的に得られることを見出している。今回,置換アリルアルコールについて検討し,アルキル置換アリルアルコールばかりでなく,電子吸引基としてアルコキシカルボニル基を有するアリルアルコールの場合にも高エナンチオ選択的に不斉付加環化反応が進行することを見出した。さらに生成物であるtrans-2-イソオキサゾリンを塩基で処理するとcis体へ異性化すると同時にラクトン化することを見出した。結果的に光学活性4,5-二置換2-イソオキサゾリンのジアステレオマ-全てを合成可能にした。2)上の不斉1,3-双極子付加環化反応で得られた光学活性2-イソオキサゾリンを出発物質として用い,アルカロイドの一種であるLasubineIIの全合成について検討し好結果を得た。
微粒子形成前駆体の生成を削減する新規高効率燃焼システムの開発

エンジン燃焼塔内で生成する多環芳香族炭化水素(PAH)の生成・排出抑制に資する反応機構の研究を行った.エンジンを模擬した圧縮膨脹反応装置を用いて,飽和炭化水素および芳香族炭化水素の混合燃料の着火燃焼特性を検討した結果,オクタン価と良い相関があることが解った.また,芳香族炭化水素から生成するPAH類の生成抑制には,酸素当量比3以下に抑える必要があることを直接的に確認した.芳香族炭化水素を含む混合燃料からPAHが生成する反応モデルを構築し,模擬エンジン燃焼条件におけるPAH生成をシミュレーションで確認した結果,実験と同様に,酸素当量比3以下に抑制することが重要であることが解った.放電プラズマを起源とするラジカルソースにより,内燃機関内部で発生するすす(PM)前駆体の生成・集積を抑制し,さらにそれを燃焼器内に還元して燃焼効率を上昇させる機構を開発する.本年度においては,内燃機関内部(エンジンシリンダ塔内および表面)で発生するPM前駆体(多環芳香族炭化水素等)を直接に検出・観測し,その生成経路を特定することを目的として,研究を推進した.まず,既存のシステムである模擬エンジン装置としての繰り返し型急速圧縮膨脹反応器を活用し,圧縮自着火による燃焼過程で生成するPAH等検出システムを構築し,実際にサンプリングを行って計測を試みた.その結果,圧縮過程における圧力上昇等のため非常に大きな振動が伝わり,計測に影響を与えたり装置システムにダメージをもたらす恐れがあり,振動を吸収するための改良が必要と判明した.そのため,接続方法ならびに装置の構造を工夫し,振動の低減に努めた結果,計測に支障が無い程度に抑えることができた.また,PAH生成のメカニズムに関連し,酸素共存下におけるPAH生成に与える影響について実験的に検証した.その結果,酸素共存下においても,生成される反応中間体に酸素原子が含まれる化合物は検出されず,PAH生成量は種類により増減の仕方に差違が見られることがわかった.この結果を既存のPAH形成メカニズムと照らし合わせると,一部の反応経路や分子構造の見直しが必要であることが示唆された.さらに,燃焼前の試料に対しラジカル等活性種を含む既燃試料を添加した場合,自着火性に与える影響についてモデル計算を行って検討した.その結果,添加する量や燃料と酸素の比率,繰り返し回数などにより,着火が加速する場合と減速する場合があることがわかった.当初計画通り,PAH類の検出および燃焼条件におけるその生成の影響について検討が進んでおり,振動等の問題点も概ね解決済みである.そのため,このまま進展させることで当初計画を達成できると見込まれる.放電プラズマを起源とするラジカルソースにより,内燃機関内部で発生するすす(PM)前駆体の生成・集積を抑制し,さらにそれを燃焼器内に還元して燃焼効率を上昇させる機構を開発する.本年度においては,燃焼過程で生成する小分子を起源とするすすの生成メカニズムに着目し,従来注目してきた芳香族分子を起源とするすす生成との相違や相互作用の影響を検討した.小分子の代表としてアセチレンを用い,生成する中間体を質量分析器により直接的に検出して,既存の反応モデルによるシミュレーション結果との比較により,実験とモデルとの対応関係からその精度を検討したところ,4環程度の多環芳香族炭化水素の生成過程については両者の結果が概ね一致していることが確認できた.このことから,本研究において開発される機構の検討において必要な,内燃機関内部の反応を模擬するモデルの選択およびメカニズムの検討は概ね完了したものと考えられるが,詳細な部分や,本システム開発によいて重要な実際のすす粒子の成長過程・酸化過程のメカニズムについては不明な点も多く,さらに検討が必要である.また,本年度においては,模擬エンジン装置に供給する燃料として,よりPMを生成しやすいと考えられる重質な炭化水素の供給源の開発も行った.本装置は,2流体噴霧機構を軸とし,通常の気泡式気化器では十分に気化されないような燃料についても均一な混合ガス化ができるように設計されている.この装置を用いて,従来用いてきた気泡式気化器による混合ガス化と比較したところ,一定の条件の下では同等の性能を発揮することが確認できた.すすの生成メカニズムは現在も多くの研究者が検討している複雑な機構であり,その基礎的な知見を得ることは非常に重要である.本研究では,中間体の生成を質量分析により直接的に観測し,その機構の検証に概ね成功している.そのため,当初の目的に沿ってすす前駆体の生成を削減するメカニズムの検討を行うための筋道はできており,今後さらに発展させることで計画を達成できるものと考えられる.模擬エンジン装置を用いて,PAH生成につながる条件下における着火実験および反応解析を行った.ノルマルヘプタンをベース燃料として芳香族炭化水素類を添加剤として用い,燃料過多(酸素に対する当量比が1を超える領域)における着火性および残留成分について解析した.その結果,特に当量比の高い領域において,これまでにもよく研究されているノルマルヘプタンでさえ,既往の反応モデルでは十分な再現性を得ることができないことが判明した.その傾向として,多くのモデルが着火性を過剰に再現した.燃料希薄領域(当量比が1より小さい領域)においても,条件によっては十分な再現性を得ることができないこともわかった.結果として,当量比1から外れた領域における燃焼化学反応については,本研究領域における今後の大きな課題であると言える.以上を踏まえつつ,既往の研究による反応モデルを適宜組み合わせてPAH生成を再現可能なモデルを構成し,これを用いてエンジン内を模擬した反応シミュレーションを行い,燃焼排出時において残存するPAHの種類を推定した.

その結果,当量比2程度まではほとんどPAHは成長しないが,当量比3を超えるではモデル上の最終生成物となるコロネンが多量に生成し,他の中間体はほとんど残存しない結果となった.しかし,さらに当量比を大きくすると,コロネンより小さいPAHが残存し,また,初期生成物となるベンゼンが多く残存した.これは,酸素が不足することにより反応が十分進まず,結果としてPAH生成過程もあまり進まないためと考えられる.さらに,生成したPAHを除去するための酸化条件の検討を行った.また,排出される微粒子成分の除去方法についての技術的検討も行った.エンジン燃焼塔内で生成する多環芳香族炭化水素(PAH)の生成・排出抑制に資する反応機構の研究を行った.エンジンを模擬した圧縮膨脹反応装置を用いて,飽和炭化水素および芳香族炭化水素の混合燃料の着火燃焼特性を検討した結果,オクタン価と良い相関があることが解った.また,芳香族炭化水素から生成するPAH類の生成抑制には,酸素当量比3以下に抑える必要があることを直接的に確認した.芳香族炭化水素を含む混合燃料からPAHが生成する反応モデルを構築し,模擬エンジン燃焼条件におけるPAH生成をシミュレーションで確認した結果,実験と同様に,酸素当量比3以下に抑制することが重要であることが解った.PAH生成からPMへ至る過程は,化学反応の面からみてほとんど解明がすすんでいない.そのため,燃焼排ガスにおいても実際にPMに至らないように処理するためにどのポイントで実装をすればよいかを明らかにすることが課題である.従って本研究においても今後その点に注目し,排気ポートから排出される燃焼排ガスの観察と分析を進める予定である.すす前駆体の酸化・分解メカニズムは,現在の所ほとんどわかっていない.このことが,あらたな技術開発の妨げになっていることは明らかである.そこで,本研究においては,実験技術的な検討に加え,反応理論に基づいて,すす前駆体の酸化の詳細メカニズムについても今後検討をすすめる.具体的には,量子化学計算を基礎として,多環芳香族炭化水素の酸化過程についての理解をすすめたい.29年度が最終年度であるため、記入しない。燃焼化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ゲノム編集技術を用いた遺伝性難病治療を実現する非ウイルスベクターの開発

本研究では、肝臓の遺伝子疾患(難病)であるトランスサイレチン型家族性アミロイドポリニューロパチー(ATTRーFAP)に対する根治療法としてのゲノム編集技術の開発を目的に、我々が構築した肝実質細胞特異的非ウイルスベクターであるLac-a-CDE(G3)およびPEG-LaC(G3)を用いて、ゲノム編集DNA(TTR-CRISPR pDNA)の肝臓特異的な送達を試みた。得られた結果を次に示す。1)Lac-a-CDE(G3)およびPEG-LaC(G3)は、TTR-CRISPR pDNAと静電的相互作用により複合体を形成した。2)Lac-a-CDE(G3)複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞に、アシアロ糖タンパク質受容体を介して取り込まれることが示された。3)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は、HepG2細胞において、TTR mRNA発現およびTTRタンパク質の発現を顕著に抑制し、またそれらの抑制効果は、Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体間において同等であることが示唆された。4)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は、ゲノム編集を介してTTRノックアウトを誘導可能であることが示唆された。5)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は上記実験条件下において、細胞障害性を示さないことが示された。これらの結果は、Lac-a-CDE(G3)/TTR-CRISPR pDNA複合体およびPEG-LaC(G3)/TTR-CRISPR pDNA複合体は、ゲノム編集に基づくATTR-FAPの治療としての可能性を示唆するものである。今後、ATTR-FAPモデルトランスジェニック(Tg)マウスを用いて、in vivoゲノム編集効果について検討する必要がある。本研究では、TTR-FAPに対する新規治療法としてゲノム編集技術の開発を目的に検討を行っている。平成29年度においては、次の知見を得た。1)肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとしてのラクトシル化デンドリマーとα-シクロデキストリンとの結合体(L-a-CDE)に加えて、静脈内投与後の細網内皮系からの補足を回避するために、L-a-CDEにPEG修飾を行ったPL-a-CDEを新規に構築した。2)PL-a-CDEは、TTR-CRISPR DNA(以下DNA)と複合体を形成し、その形成効率はL-a-CDEと同等であった。(3)DNA/PL-a-CDE複合体は、チャージ比50においてL-a-CDE複合体に比べて、わずかに大きな粒子径および中性荷電を有するサブミクロン粒子であることが示された。(4)本複合体をヒト肝がん細胞であるHepG2細胞にトランスフェクションすると、アシアロ糖タンパク質受容体を介して細胞内に導入され、その一部は核に移行し、レポーター遺伝子であるGFPを発現することが示された。(5)Surveyor nuclease assayの結果から、DNA//PL-a-CDE複合体は、L-a-CDE複合体の場合と同様に異型TTR遺伝子を切断することが確認された。(6)本複合体は、HepG2細胞にトランスフェクション後、チャージ比200まで細胞障害性を示さないことが認められた。(7)興味深いことに、L-a-CDEおよびPL-a-CDEは、in vitroにおいてTTRのアミロイド線維の形成を有意に抑制することが示された。これらの結果から、DNA/PL-a-CDE複合体は、培養細胞条件下、L-a-CDE複合体と同様に異型TTRに対してゲノム編集が可能であり、in vivoでのゲノム編集効果に優れる可能性が示唆された。平成29年度の当初の研究計画では、TTR-CRISPR DNAおよびL-a-CDEを用いてin vivo研究を実施するという計画であったが、予備的検討により、in vivoにおいてより優れたゲノム編集効果が期待できる非ウイルスベクターの開発の必要性を痛感し、今回、L-a-CDEにPEG修飾を行ったPL-a-CDEの構築を新規に行い、TTR-CRISPR DNAとの複合体形成能、物理化学的性質、培養細胞系での細胞取込、遺伝子発現効率、ゲノム編集効率、細胞障害性などについて、L-a-CDE複合体の場合と比較検討する研究を実施したことから、in vivo研究を本格的に実施するところまで辿りつけなかった。

3)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は、HepG2細胞において、TTR mRNA発現およびTTRタンパク質の発現を顕著に抑制し、またそれらの抑制効果は、Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体間において同等であることが示唆された。4)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は、ゲノム編集を介してTTRノックアウトを誘導可能であることが示唆された。5)Lac-PaC複合体およびPEG-LaC(G3)複合体は上記実験条件下において、細胞障害性を示さないことが示された。これらの結果は、Lac-a-CDE(G3)/TTR-CRISPR pDNA複合体およびPEG-LaC(G3)/TTR-CRISPR pDNA複合体は、ゲノム編集に基づくATTR-FAPの治療としての可能性を示唆するものである。今後、ATTR-FAPモデルトランスジェニック(Tg)マウスを用いて、in vivoゲノム編集効果について検討する必要がある。肝臓の遺伝子疾患(難病)である家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は血清タンパク質トランスサイレチン(TTR)変異体により形成されたアミロイド線維が全身諸臓器に沈着する遺伝性疾患である。本研究では、FAPに対する新規治療法としてのゲノム編集技術の開発を目的に検討を行っている。平成28年度においては、次の知見を得た。(1)マーカー遺伝子としてGFP遺伝子を挿入した異型TTRのゲノム編集を可能とする3種のTTR-CRISPR DNAを構築した。(2)肝実質細胞特異的非ウイルスベクターとしてのラクトシル化デンドリマー(G3)とα-シクロデキストリンとの結合体(Lac-a-CDE)を構築した。(3)TTR-CRISPRDNA溶液とLac-a-CDE溶液を混合後の複合体形成を電気泳動にて確認した。(4)TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE複合体の粒子径およびζ-電位はそれぞれチャージ(N/P)比50において125 nmおよび18.6 mVであり、全身投与後、肝臓に移行可能な物性を示すことを明らかにした。(5)チャージ比50で形成された本複合体をヒト肝がん細胞であるHepG2細胞にトランスフェクション後、DNAは細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体を介して細胞内に導入され、その一部は核移行すること、また、Surveyor nuclease assayの結果から、異型TTR遺伝子の切断が確認された。(6)本複合体をHepG2細胞にトランスフェクション後、チャージ比200まで細胞障害性を示さないことが認められた。これらの結果から、TTR-CRISPR DNA/Lac-a-CDE複合体は培養細胞条件下、異型TTRに対してゲノム編集が可能であることが示唆された。
トロホブラスト細胞膜リン脂質フロップへの自己抗体の干渉に関する研究

自己抗体である抗リン脂質抗体aPLが特に子宮内(あるいは胎盤)において血栓を好発する原因は明らかでない。血栓が好発する妊娠初期には絨毛や子宮蝶旋動脈など血液に接する面でアポトーシスが起こっていることが知られており、その隙に、血液に暴露する陰性荷電リン脂質、具体的にはフオスフアチジルセリン(PS)、は凝固の素地になるはずである。従って、aPLの分子病態論を構築するには、PS露出に際して当然起こり得るべき凝固を防止する生理機構の解明が必要であり、その機構のaPLによる破綻あるいはかく乱によって説明されるべきであろうと考えた。そこで、オクチルセフアロースに固相化したPSにイオン的に結合する血漿成分をプロテオーム技法により探索した。支持体として用いたオクチルセフアロースはリポタンパク質など脂溶性分子に対して親和性があるので、そのような非特異的結合成分を未処理の固相化オクチルセファロースで予め血漿から除いておいた。その結果、β2GPI, IHRP、補体第4因子,factor H, FHR-1の5つのタンパクが挙がった。PS結合性が知られているβ2GPIが検出されたことは、この方法が所定の目的を達しているであろうことを示していた。その他の分子についてはリン脂質結合タンパク質としては分類されていない。中でも、factor Hは自己膜面上でC3bに結合することで、非自己膜に対しては起こるべき補体活性化を制御していることが知られており、factor H欠損症では腎微小血管血栓を病理像とする溶血性尿毒症症候群を起こし、aPLもまた腎梗塞、腎微小血管血栓が好発であることを考えると、分子病態との関わりは容易に推測できる。他の分子も含め、この実験結果は陰性荷電リン脂質の血液への暴露に際し、補体経路が非炎症的な制御のための役割を果たしている可能性を示唆した。主題で問題とした自己抗体である抗リン脂質抗体aPLが特に子宮内(あるいは胎盤)において血栓を好発する原因は明らかでない。血栓が好発する妊娠初期には絨毛や子宮螺旋動脈など血液に接する面でアポトーシスが起こっていることが知られており、その際に、血液に暴露する陰性荷電リン脂質、具体的にはフォスファチジルセリン(PS)、は凝固の素地になるはずである。そこで、オクチルセファロースに固相化したPSにイオン的に結合する血漿成分をプロテオーム技法により探索した。支持体として用いたオクチルセファロースはリポタンパク質など脂溶性分子に対して親和性があるので、そのような非特異的結合成分を未処理の固相化オクチルセファロースで予め血漿から除いておいた。その結果、β_2GPI, IHRP, complement 4,factor H, FHR-1の5つの主要なタンパクが挙がってきた。PS結合性が知られているβ_2GPIが検出されたことは、この方法が所定の目的を達しているであろうことを示していた。中でも、factor Hは自己膜面上でC3bに結合することで、非自己膜に対しては起こるべき補体活性化を制御していることが知られており、factor H欠損症では腎微小血管血栓を病理像とする溶血性尿毒症症候群を起こし、aPLもまた腎梗塞、腎微小血管血栓が好発であることを考えると、分子病態との関わりには期待がもてる。

他の分子も含め、この実験結果は陰性荷電リン脂質の血液への暴露に際し、補体経路が非炎症的な制御のために役割を果たしている可能性を示唆していた。血栓症の危険因子である抗リン脂質抗体は、周産期領域では胎盤に血栓を形成することで流死産を起こす。患者の抗リン脂質抗体を妊娠マウスに投与すると流産が起こるが、補体C3欠損マウスでは流産が起こらないことから、抗リン脂質抗体による流産には補体活性化が関わっている。アポトーシス細胞には補体C3が結合するが、補体制御H因子によって活性化が阻害され、非活性C3断片iC3bを標的とした貪食によって非炎症的に処理される。そこで、「抗リン脂質抗体はH因子とアポトーシス細胞初期に細胞膜上に露出するフォスファチジルセリン(PS)との結合を阻害することで、H因子によるC3制御を障害し、補体活性化を介して凝固系の活性化が起こる」という作業仮説を立て、今回、次のことを明らかにした。(1)ELISAを用いるH因子とリン脂質の結合解析によって、H因子の陰性荷電リン脂質(PS,CL)への結合を証明した。(2)H因子はActinomycin Dによってアポトーシスを誘導したJurkat細胞に結合することを蛍光顕微鏡下で証明した。(3)ELISAによって、不育症患者の中にH因子に対する自己抗体を有する患者があることを証明した。妊娠初期子宮内膜では胎盤形成に伴うアポトーシスが活発に起こっており、また、絨毛のトロホブラスト細胞ではアポトーシス初期と同様に細胞膜上へのPSの露出が起こることから、これらの実験結果は抗リン脂質抗体による流産にも適用できると考えられ、今後、H因子を中心にした補体制御による治療の方向が考えられた。
大腸癌微小環境におけるエクソソームを介したクロストーク

多くの固形癌は微小環境において他の細胞と相互に作用しながら増殖していく。癌間質の線維芽細胞は癌関連線維芽細胞と呼ばれ、癌微小環境の中で腫瘍増大に中心的な役割を果たしているが、その成り立ちは未だ十分に解明されているとは言えない。本研究は癌細胞-線維芽細胞間のクロストークにおいて、癌細胞より分泌されるエクソソームが線維芽細胞活性化を介した腫瘍増大において果たす役割について解明することを目的としている。これまでにp53野生型大腸癌細胞の機能欠損により線維芽細胞共在下の腫瘍増大が促進すること、また、その腫瘍増大にエクソソームの変化が関わることを明らかにした。さらに、エクソソーム中のマイクロRNAに着目し、p53野生型大腸癌細胞由来エクソソームとp53機能欠損大腸癌細胞由来エクソソームにおけるマイクロRNAの発現変動を明らかにするためマイクロアレイ解析を行った。その結果、癌細胞のp53機能欠損によりエクソソーム中のマイクロRNA profileが変化し、発現量の上昇したマイクロRNAによって線維芽細胞のp53遺伝子発現が抑制されること、さらにp53遺伝子発現を抑制された線維芽細胞は癌細胞の増殖を促進することをin vitroにおいて明らかにした。また、それらのマイクロRNAの特異的阻害剤にて線維芽細胞のp53遺伝子発現が回復する結果も得た。これらの結果について学会発表を行い、peer-reviewされる英文学術誌に投稿中である。現在、癌細胞由来エクソソーム中のマイクロRNAが標的とするp53以外の線維芽細胞の遺伝子について検討を行い、候補遺伝子について臨床検体での検討、in vitroでの検討をすすめている。その結果、癌細胞のp53機能欠損によりエクソソーム中のマイクロRNA profileが変化し、発現量の上昇したマイクロRNAによって線維芽細胞のp53遺伝子発現が抑制されること、さらにp53遺伝子発現を抑制された線維芽細胞は癌細胞の増殖を促進することをin vitroにおいて明らかにしている。また、それらのマイクロRNAの特異的阻害剤にて線維芽細胞のp53遺伝子発現が回復する結果も得られている。これらの結果についてはすでに学会発表を行った。現在、癌細胞由来エクソソームが線維芽細胞を活性化するさらなる詳細な分子学的な機序について検討をすすめており、新たな治療標的としての可能性を検討していく予定としている。すでに線維芽細胞活性化機序の中で、p53抑制に着目し、癌細胞由来エクソソーム中のマイクロRNAにおいてマイクロアレイ解析を行い、線維芽細胞のp53抑制に関わるマイクロRNAを同定し、同定したマイクロRNAにより線維芽細胞のp53遺伝子が抑制されることを見出した。p53遺伝子が抑制された線維芽細胞が癌細胞の増殖を促進し、腫瘍増大に関わる結果も得られており、大腸癌患者血清を用いた解析も進めている。概ね当初の計画通り研究は進捗していると考える。

今回の研究で得られた成果はすでに学会で発表しているが、さらに随時国内および国際学会にて発表予定である。またpeer-reviewされる英文学術誌に投稿し、研究成果を発信する準備をすすめている。現在、新たな治療標的としての可能性を模索するため、さらなる詳細な分子学的な機序について検討をすすめている。
胸腺萎縮の分子メカニズム解明とその法医学的応用：児童虐待撲滅を目指して

近年,児童に対する虐待事案並びに虐待が疑われる事案が急速に増加し,大きな社会問題となっており,臨床医学・法医学を問わず実効性のある被虐待児の診断および虐待防止対策が急務とされている.法医学分野において,新旧多発する外傷,異常な不潔,他に原因のない栄養不良に加え,著明な胸腺萎縮が虐待を疑う所見とされている.この胸腺萎縮は,ストレス環境下では胸腺のリンパ球のアポトーシスが誘導されることによって生じると考えられており,その過程においてサイトカイン・ケモカインの関与が示唆されている.そこで今回,マウスを用いてストレス暴露下における胸腺萎縮におけるサイトカイン・ケモカインの役割を解析し,マウス実験で得られたの結果を剖検試料に応用することによって,法医学的に虐待の補助的診断および虐待期間の推定法の確立,臨床医学分野においては虐待の証明方法の確立を目指すものであり,医学的且つ社会的に極めて有意義な研究と考える.マウスの拘束ストレスモデル用いて,胸腺が退縮することを明らかにした.さらに,胸腺のT細胞に発現しているケモカインレセプターに着目し,ケモカインレセプターの1つCCR5に着目した.そこで,CCR5遺伝子欠損マウスと野生型マウスを拘束ストレスに供したところ,野生型マスでは胸腺重量が高速前の約25%程度にまで減少していた.一方,CCR5遺伝子欠損マウスでは,胸腺退縮は観観察されたが,重量の減少は約50%程度にとどまっていた.このことは,拘束とレスによる胸腺退縮が野生型マウスと比較してCCR5遺伝子欠損マウスでは抑制されたことを意味するものである.拘束ストレスでは,ストレス応答として副腎重量が増加することが知られている.野生型マスでは拘束ストレスにより,副腎の重量が有意に増加したものの,CCR5遺伝子欠損マウスでは副重量は有意な変化を認めなかった.これまでの進捗状況として,CCR5遺伝子欠損マウスを用いるため,マウスの繁殖が必要不可欠であるが,特に支障なく,CCR5遺伝子欠損マウスは順次繁殖している.また,その他の遺伝子欠損マウスについても,順調に繁殖していることから,次年度の以降の研究に何ら支障はない.また,ヒトの胸腺資料についても,適宜収集している.今後,CCR5を介したシグナルがどのように胸腺細胞のアポトーシスを含め胸腺萎縮のメカニズムに関与しているのかを明らかにするためにCCR5のリガンドケモカインとしてCC chemokine ligand 3 (CCL3), CCL4およびCCL5の3種類が存在することから,最も胸腺萎縮に関与するケモカインの機能と動態を解析する準備を進めている.さらにその他のケモカインレセプターについても遺伝子欠損マウスを用いて,ストレスによる胸腺退縮への関与を検討する.近年,児童に対する虐待事案並びに虐待が疑われる事案が急速に増加し,大きな社会問題となっており,臨床医学・法医学を問わず実効性のある被虐待児の診断および虐待防止対策が急務とされている.法医学分野において,新旧多発する外傷,異常な不潔,他に原因のない栄養不良に加え,著明な胸腺萎縮が虐待を疑う所見とされている.この胸腺萎縮は,ストレス環境下では胸腺のリンパ球のアポトーシスが誘導されることによって生じると考えられており,その過程においてサイトカイン・ケモカインの関与が示唆されている.そこで今回,マウスを用いてストレス暴露下における胸腺萎縮におけるサイトカイン・ケモカインの役割を解析し,マウス実験で得られたの結果を剖検試料に応用することによって,法医学的に虐待の補助的診断および虐待期間の推定法の確立,臨床医学分野においては虐待の証明方法の確立を目指すものであり,医学的且つ社会的に極めて有意義な研究と考える.マウスの拘束ストレスモデル用いて,胸腺が退縮することを明らかにした.さらに,胸腺のT細胞に発現しているケモカインレセプターに着目し,ケモカインレセプターの1つCCR5に着目した.そこで,CCR5遺伝子欠損マウスと野生型マウスを拘束ストレスに供したところ,野生型マスでは胸腺重量が高速前の約25%程度にまで減少していた.一方,CCR5遺伝子欠損マウスでは,胸腺退縮は観観察されたが,重量の減少は約50%程度にとどまっていた.このことは,拘束とレスによる胸腺退縮が野生型マウスと比較してCCR5遺伝子欠損マウスでは抑制されたことを意味するものである.拘束ストレスでは,ストレス応答として副腎重量が増加することが知られている.野生型マスでは拘束ストレスにより,副腎の重量が有意に増加したものの,CCR5遺伝子欠損マウスでは副重量は有意な変化を認めなかった.これまでの進捗状況として,CCR5遺伝子欠損マウスを用いるため,マウスの繁殖が必要不可欠であるが,特に支障なく,CCR5遺伝子欠損マウスは順次繁殖している.また,その他の遺伝子欠損マウスについても,順調に繁殖していることから,次年度の以降の研究に何ら支障はない.また,ヒトの胸腺資料についても,適宜収集している.今後,CCR5を介したシグナルがどのように胸腺細胞のアポトーシスを含め胸腺萎縮のメカニズムに関与しているのかを明らかにするためにCCR5のリガンドケモカインとしてCC chemokine ligand 3 (CCL3), CCL4およびCCL5の3種類が存在することから,最も胸腺萎縮に関与するケモカインの機能と動態を解析する準備を進めている.さらにその他のケモカインレセプターについても遺伝子欠損マウスを用いて,ストレスによる胸腺退縮への関与を検討する.
NMR法による椎間板内不凍水と水分子自己拡散の定量的解析

昭和62年度に完成したNMR法による水分子自己拡散係数測定装置は試験的に運転中であり、本装置を用いて牛尾椎々間板、牛膝関節前十字靱帯を試料として水分子自己拡散係数を測定した。屠殺直後の成牛尾椎の椎間板を適出し、髄核と線維輪に分け、線維輪はさらに前方、前側方、側方、後側方、後方の各部分に分割した。これらの各部について試料中の水分子自己拡散係数を測定した。水分子の拡散は髄核部分で大きく、1.6×10^5cm^2/secであった。線維輪では各部位別に有意差はみられず、平均1.2×10^5であった。拡散係数は試料中の水分含有率と正の相関がみられ、水分含有率の増大に伴なって拡散係数の増加がみとめられた。線維輪はコラーゲンの豊富な組織であるため、線維成分に由来する拡散係数の異方性について測定した。すなわち、線維輪の層状線維方向に平行あるいは垂直に傾斜磁場を加えて拡散係数を測定したが、拡散係数の異方性に有意な差は観察されなかった。一方、靱帯組織においては拡散係数はコラーゲン線維の配向に対応する異方性が観察され、維維方向とその直交方向では約10%の差がみられた。椎間板線維輪と前十字靱帯の間に異方性の有無に差違が生じた。このことは線維輪がコラーゲン間にプロテオグリカンを保持しており、グリコサミノグリカンの微細な立体構造と陰性荷電が水分子の自由な拡散を制限しているためと考えられた。線維輪の各部位別の拡散係数に差がなく、線維方向に拡散が影響されないことは髄核の水分出納に線維輪は全周性に均一な緩衝帯として存在していると考えられた。NMR法による椎間板内不凍水の定量は、温度可変NMRプローベの試作が終了し、液体窒素を用いて冷却空気を試料に送気して試料温度を調節することが可能となった。試料温度のモニターとNMR測定中の試料温度の安定化のために装置に改良が必要である。椎間板基質の主要構成高分子であるコラーゲン,プロテオグリカンは多量の結合水を有し,水分子の自由な拡散を制限し基質内に水分を保持する役割を演じている.椎間板内水の拡散は基質高分子の構造と組成を反映すると考えられる.このことを明らかにするためNMR法による椎間板内水の拡散係数の測定システムを作製した.バルスグレージェント磁場発生装置を日本電子(株)製JNM-FSE-60E型NMR装置とオンライン化し, NMR装置のRFパルスと磁場勾配バルスをマイクロ秒の時間分析能で同期化した.スピンエコーNMR法における90°と180°RFパルス間にパルス磁場勾配をかけることにより,エコー信号強度は磁場勾配の大きさと時間に依存して減少した.この減少の程度は水分子の拡散が大きいほど増加した.本測定システムを牛尾椎々間板髄核と牛膝間接軟骨に適用し,軟骨組織内の水分子自己拡散係数を求めるための測定条件を検討した.この結果, RFパルス間の間隔は2040msecの間で一定とし,磁場勾配の大きさは変化させず,磁場勾配を与える時間を110msecで変化させる方法が精度の高い拡散係数を得るのに良いことがわかった.また,牛尾椎々間板髄核内の水分子の拡散係数は純水中の拡散係数の約3035%に低下しており,牛膝間接軟骨内水のそれば純水の約2328%に低下していた.これらの組織内の拡散係数は,組織の水分子含有率とグリコサミノグリカン密度に強く影響された.水分含有率の増加に伴い水分子の拡散は増大し,グリコサミノグリカン密度の増加に伴い水分子の拡散は減少した.軟骨組織の水分保持能力と水分子拡散の関係が示された.以上の内容の一部は第2回日整会基礎学術集会にて報告した.NMR法による椎間板内不凍水の定量は,液体窒素を用いた温度可変NMRプローブを使用する必要があり,現在プローブの試作中である.昭和62年度に完成したNMR法による水分子自己拡散係数測定装置は試験的に運転中であり、本装置を用いて牛尾椎々間板、牛膝関節前十字靱帯を試料として水分子自己拡散係数を測定した。

このことは線維輪がコラーゲン間にプロテオグリカンを保持しており、グリコサミノグリカンの微細な立体構造と陰性荷電が水分子の自由な拡散を制限しているためと考えられた。線維輪の各部位別の拡散係数に差がなく、線維方向に拡散が影響されないことは髄核の水分出納に線維輪は全周性に均一な緩衝帯として存在していると考えられた。NMR法による椎間板内不凍水の定量は、温度可変NMRプローベの試作が終了し、液体窒素を用いて冷却空気を試料に送気して試料温度を調節することが可能となった。試料温度のモニターとNMR測定中の試料温度の安定化のために装置に改良が必要である。
環境アセスメント制度の比較法研究-EC法との比較を中心として

(1)本研究では、複数国家(ないしは国際機関)が形成したルールが国内公法に取り入れられ実施される際に生ずる諸問題について言及した。素材としては、環境アセスメント制度の導入を定めたEC指令がドイツ法で実施された過程を選定した。したがって、本研究は、公法学の基本問題のみならず、環境法(とりわけ環境アセスメント制度)、EC法(とくにECの立法諸形式)、都市計画法に関し、新しい研究分野を開拓したものである。本研究の具体的成果は、次の4点に整理することができる。第1は、EC法で環境アセスメント制度が確立した結果、同手法は英米法、大陸法を問わず広く国際ルールとして承認され、わが国も今後、同制度の法定化を迫られることとなる。第2は、国際ルールの形成にあたっては、協議のための組織及び手続が重要となる点が明らかにされ、今後はとりわけ、こうした国際間の手続原則の解明が必要であると考える。第3に、国際ルールを国内法にとり入れる際には、一方で、独自の文化的、社会的背景をもって発展してきた各国の公法システムへのインパクトが少なくなるような配慮が必要であり、しかし他方で、一国内でしか理解を得られない行政慣行などは変革せざるをえない点が明らかとされた。第4には、超国家機関の組織編成と国内機構の組織編成に共通点が見られる場合に、2つのシステムがうまく機能することが確認された。つまり、広域主体がより狭域の主体の利害に配慮を払うような仕組み、すなわち、「下からの合意形成の尊重」という視点が不可欠となることを指摘した。
網膜色素上皮細胞におけるプロテインキナーゼCの生理学的病理学的役割

プロテインキナーゼC(PKC)は、イノシトール燐脂質の代謝回転に共役して活性化される蛋白質燐酸化酵素であり、多くの生理活性による生体膜受容体伝達系を介して細胞機能を調節する。しかし、網膜色素上皮細胞(RPE)におけるPKCの役割は解明されていない。そこで本研究においては、以下の項目について検討した。(1)細胞培養は、特定の条件下での薬剤や酵素阻害剤あるいは促進剤の影響を評価するために有利である。そこで、ヒトRETの細胞培養創傷治療モデルを作成し、PKC阻害剤の創傷治療過程における影響を検討した。RPEをconfluenceになるまで培養し、直径2mmの細胞欠損領域を冷凍凝固法で作成した。欠損領域の細胞増殖過程を位相差顕微鏡および走査型電子顕微鏡にて観察した。コントロールでは役70%の欠損領域の細胞増殖が、約1週後に観察された。いっぽうstaurosporine(100nM)あるいはH-7(10μM)のPKC阻害剤が存在すると、明らかに欠損領域の治療は阻害された。さらに、新しい阻害剤であるmyristoylsted PKC pseudosubstrate peptideを使用して、この阻害作用を検討中である。C-AMPやC-GMP依存性プロテインキナーゼを阻害し、PKCにあまり影響しないHA-1004では。治療の阻害は認められなかった。これらから、PKCは細胞の移動。増殖の調節に重要な働きを担っているとかんがえられた。(2)RPEにはムスカリン受容体が存在することは知られているが、この受容体刺激につづくPKCに関わる細胞内情報伝達系については充分には解明されていない。本研究で、培養ヒトRPEにおいてムスカリン受容体がホスホリパーゼDにカップリングしていることが認められた。PLDは燐脂質の終末ジエステル結合に働きホスファチジル酸(PA)を産生する。PAは加水分解され1,2-ジ・アジルグリセロールになりPKCを刺激する。現在、PKC阻害剤によるPLDやホスホリパーゼCへの影響を検討している。培養網膜色素上皮細胞(RPE)をin vitroにて〔^3H〕ミリステリ酸、あるいは〔^3H〕アラキドン酸でラベルし、続いて、アセチルコリン(ACh)で刺激すると、ホスファチジル酸とジアシルグリセロールの増加を認めた。同様な反応をエタノールの存在下で施行すると、ホスファチジル酸の上昇と同時に〔^3H〕ホスファチジルエタノールの増加が得られた。これはRPEでのホスホリパーゼD(PLD)の一次アルコールの存在下で転移リン酸化反応を確認出来た事を示す。またPLD活性を測定する上で、どのくらいのエタノールの濃度が適当であるかについて、0.5%から2.0%までで検討し、ホスファチジルエタノール産生を見る上で、1.0%が適当であった。ホスファチジル酸とホスファチジルエタノールの産生はAChにdose dependentであり、1mM AChは、十分な濃度である事を確認した。ただしホスファチジル酸とホスファチジルエタノールの50%最大産生量に対するAChの濃度が異なる傾向を一種類のRPEの細胞系で得た。これが再現性があるか今後の課題であるが、これはPLDとホスホリパーゼC(PLC)がAChの異なる濃度に活性化されている可能性、すなわち受容体のsubtypeがそれぞれ異なる事を示唆しているのかもしれない。

以上の如く、RPEでのin vitroにおけるPLDの存在とそのACh濃度依存との関係で、興味ある知見を得た。ただし、当初に計画した目的に比べ、設備備品の整備に時間を要した為、RPEをホルボルエステルまたはホルボルエステルとアセチルコリンのいずれかで刺激する反応を施行出来なかった。しかし、その条件設定の為エタノールの濃度決定や反応時間の把握における貴重な情報は得られた。また、ジアシルグリセロールのバンドが、薄層クロマトグラフィー上で〔^3H〕アラキドン酸と容易に分離鑑定出来ず、ジアシルグリセロールの定量は他の溶媒系を利用するか現在検討中である。培養網膜色素上皮細胞の細胞遊走におけるPKC阻害剤の影響について:ヒト網膜色素上皮細胞(RPE)を培養し、confluenceの時期に培養RPE単層の中央に直径2mmの円形のろ紙を設置し、その上部から直径1.5mmの冷凍凝固チップをあてる。ろ紙を除去すると、直径2mmの円形の細胞欠損領域が作成された。プロテインキナーゼC(PKC)選択的阻害剤(Staurosporine,H-7)を培養液に混入し、細胞欠損領域のRPEの修復過程を位相差顕微鏡および走査型電子顕微鏡にて観察した。阻害剤混入のないものをコントロールとした。また、cAMPとcGMP依存性プロテインキナーゼを強く阻害し、PKC阻害作用が少なく、構造的にH-7類似のHA-1004も対照のため使用した。コントロールでは、創傷作成後10時間で創傷辺縁の細胞にruffleと突起伸展が観察され、48時間で辺縁細胞の突起延長と移動が著明となり、約1週間で細胞欠損面積の約70%が細胞で被覆された。H-7(100 uM)あるいはStaurosporine(100 nM)で、辺縁細胞の突起伸展は認められず、修復されなかった。HA-1004では、創傷修復は阻害されなかった。また、H-7による抑制は可逆的であり、H-7で10時間培養後阻害剤のない培養液に置換すると創傷修復が認められた。さらに、PKCのpseudosubstrate domainとして、いっそう選択的にPKCを阻害する合成ペプチドにミリステリ酸を添付して使用したところ、H-7のような細胞欠損領域の修復阻害はみられなかった。現在、この阻害剤の細胞への移行が影響するのか、濃度が問題になるのか検討中である。以上のH-7やstaurosporineの結果から、PKC活性はRPEの移動、創傷治癒の調節に重要な働きを担っていると考えられた。PKCは、アクチンのポリメライゼーションを調節することが知られる。このアクチンの伸展に基づく細胞遊走状態が、PKC阻害剤によって影響された事が示唆された。しかし、新しい合成ペプチド阻害剤があまり遊走を抑制しない結果について、今後の検討を必要とした。