hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人類の耳垢型を決定するABCC11遺伝子多型と分子機能の生化学的解明

本研究の目的は、耳垢型決定遺伝子:ABCC11遺伝子の遺伝子多型と腋臭症および乳癌リスクとの関係、およびABCC11の生理的機能を解明し、その生理学的意義を考察することである。ABCC11の生理的機能をより詳細に解明するための解析系を開発するために、周囲の細胞や細胞外基質との相互作用あるいは細胞極性といった微小環境を再現可能な新規培養系を構築し、その有用性の検証を試みた。マウス初代培養肝細胞とEngelbreth-Holm-Swarm(以下、EHSと略す)ゲル上に形成されたヒト臍帯静脈内皮細胞ネットワークとから成るin vitro肝組織モデル(IVL_<EHS>: in vitro liver model on EHS gel)を構築した。肝細胞は、内皮細胞ネットワークの周辺に遊走し、互いに密着し合うように集合体を形成した。本培養系は、見かけ上の構造だけでなく、細胞間相互作用という観点からも、肝組織を模した共培養法であるといえる。構築した肝組織モデルに対してアセトアミノフェン処理を施したところ、細胞障害指標である乳酸脱水素酵素の放出が、単層培養系と比較して早期に誘導された。この生体外異物への高い応答性を裏付けるように、チトクロームP450に代表される薬物代謝酵素が、肝組織モデルにおいて高く維持されていた。代謝物解析の結果、肝組織モデルにおいて、より多くのアセトアミノフェン由来反応性代謝物が生成されていたことが見出された(慶應義塾大学先端生命科学研究所曽我朋義教授らとの共同研究)。さらに、このときの肝組織モデルにおけるATPエネルギー充足率は、肝細胞単独培養のものと比較して有意に低下していた。以上の結果は、肝組織モデルにおいて細胞障害が強く誘導されていたことに対応する。本肝組織モデル培養系を応用することで、既存の単層培養系よりも高い精度かつ短時間で肝毒性評価が達成されると考えられた。これらの知見は、より優れた肝毒性評価系を構築するための一助となり、動物実験代替システムとして発展すると期待される。本研究の目的は、耳垢型決定遺伝子であるABCC11遺伝子の遺伝子多型と腋臭症および乳癌リスクとの関係、およびABCC11の生理的機能を解明し、その生理学的意義を考察することである。生化学的解析を行うために、まず作製した抗ABCC11抗体の特異性を確認した。In vitro解析として、ヒト胎児腎臓由来Flp-In-293細胞に野生型および変異型ABCC11を発現させ、細胞内総タンパク質レベル、糖鎖修飾の有無および品質管理機構における被分解傾向を検証した。また、免疫組織染色法を用いて、ヒト外耳道アポクリン腺におけるABCC11タンパク質の局在を検証した。ABCC11 R180変異体には、838番目および844番目のAsn残基への成熟したN-結合型糖鎖修飾が起きておらず、野生型ABCC11と比較して、タンパク質レベルが顕著に低下していた。プロテアソーム阻害の結果、R180変異体のタンパク質レベルは有意に上昇した。ヒト組織において、野生型ABCC11はアポクリン腺分泌細胞の管腔側形質膜および細胞内顆粒に局在していたが、R180変異体において細胞内顆粒への局在は確認されなかった。R180変異体は、糖タンパク質として成熟する前にプロテアソーム依存的な分解系へと選別されるため、翻訳後修飾および細胞内輸送を受けておらず、その結果として機能を失い、劣性表現型をもたらしていることが強く示唆された。さらに、遺伝子型迅速診断法SmartAmp法を用いて、耳垢型決定遺伝子多型538G>Aと腋臭症との関係を検証したところ、野生型アレル(538G)と腋臭症リスクとの関係が明らかとなった。以上の結果より、ABCC11が、アポクリン腺の分泌活動を制御している可能性が強く示唆された。シーケンス解析の結果、我々はABCC11 538G>Aにおける野生型アレルが、腋臭症および乳がんリスクと正の相関を示すことを見出し、その成果をそれぞれ論文発表した。また我々は、トランスポータータンパク質の細胞内機能をin vitroにて解析するために、細胞極性などの組織環境を模倣した解析系が必要であると考えた。そこで我々は、ABCC11と同じサブクラスに存在し、肝臓に高発現する薬物トランスポーター:ABCC2に着目し、ex vivo肝様組織を応用した機能解析系の構築を試みた。この肝様組織は、EHSゲル上で管腔構造を有する細胞網を形成したヒト臍帯静脈内皮細胞とその周囲に遊走した初代培養マウス肝細胞とより成る高次構造体である。肝様組織構築が肝特異的遺伝子の発現維持に有効であるかどうかを検証するために、肝特異的遺伝子(Cytochrome P450などの代謝酵素やAbcc2などのトランスポーター遺伝子)の発現レベルをRT-PCRにて検証した。肝様組織における各遺伝子の発現レベルは、平面培養時のそれと比較して、維持される傾向にあった。また、肝様組織構築が生体異物に対する応答性に与える影響を検証するために、in vivo肝障害を誘導する薬物:アセトアミノフェン処理を施した。その結果、平面培養時と比較して、肝細胞障害が早期に誘導された。

以上の結果は、肝様組織がタンパク質本来の細胞内機能を解析するために有用であるとともに、この系が新規肝毒性評価系としても応用可能であることを示唆するものと考えられる。本研究の目的は、耳垢型決定遺伝子:ABCC11遺伝子の遺伝子多型と腋臭症および乳癌リスクとの関係、およびABCC11の生理的機能を解明し、その生理学的意義を考察することである。ABCC11の生理的機能をより詳細に解明するための解析系を開発するために、周囲の細胞や細胞外基質との相互作用あるいは細胞極性といった微小環境を再現可能な新規培養系を構築し、その有用性の検証を試みた。マウス初代培養肝細胞とEngelbreth-Holm-Swarm(以下、EHSと略す)ゲル上に形成されたヒト臍帯静脈内皮細胞ネットワークとから成るin vitro肝組織モデル(IVL_<EHS>: in vitro liver model on EHS gel)を構築した。肝細胞は、内皮細胞ネットワークの周辺に遊走し、互いに密着し合うように集合体を形成した。本培養系は、見かけ上の構造だけでなく、細胞間相互作用という観点からも、肝組織を模した共培養法であるといえる。構築した肝組織モデルに対してアセトアミノフェン処理を施したところ、細胞障害指標である乳酸脱水素酵素の放出が、単層培養系と比較して早期に誘導された。この生体外異物への高い応答性を裏付けるように、チトクロームP450に代表される薬物代謝酵素が、肝組織モデルにおいて高く維持されていた。代謝物解析の結果、肝組織モデルにおいて、より多くのアセトアミノフェン由来反応性代謝物が生成されていたことが見出された(慶應義塾大学先端生命科学研究所曽我朋義教授らとの共同研究)。さらに、このときの肝組織モデルにおけるATPエネルギー充足率は、肝細胞単独培養のものと比較して有意に低下していた。以上の結果は、肝組織モデルにおいて細胞障害が強く誘導されていたことに対応する。本肝組織モデル培養系を応用することで、既存の単層培養系よりも高い精度かつ短時間で肝毒性評価が達成されると考えられた。これらの知見は、より優れた肝毒性評価系を構築するための一助となり、動物実験代替システムとして発展すると期待される。
格子QCDによるπK間相互作用の研究

研究代表者は、強い相互作用の基本理論である量子色力学(QCD)を用いて、ハドロン間相互作用に対する理解を与える事に興味を持っている。これに向けて、本課題では、π、Kと呼ばれるハドロンの間の相互作用を取り扱った。πK系には、I=3/2,1/2の二種類の状態が存在し、これらは実験的にそれぞれ、斥力、引力を示す事が知られている。特に、πK(I=1/2)系に代表される引力系は、クォーク線が消失する過程を含んでおり、このため、格子QCDを用いた研究は技術的に難しい。本課題は、今後、この分野の試金石となる研究であると考えられる。ここでは、終状態のハドロンの内の片方を特定の時刻に固定する事で、この困難を解決し、πK系の両状態における散乱長の評価を行なった。当初の予定通り、平成21年度中に、m_pi=0.29-0.70GeVでの計算が完了したが、物理点近傍での情報を得るために、平成22年度前半に、m_pi=0.16GeVでの計算も行なった。この領域において、通常のカイラル摂動論からのずれが見えており、格子間隔が有限である事の効果を取り入れたカイラル摂動論での解析が必要となった。この解析は、現在進行中であり、近日中に、最終的な結論を与える予定である。平成22年度後半において、有限の散乱運動量を伴う散乱位相の研究を行なった。当初、πK(I=1/2)系の散乱位相も評価する予定であったが、計算コスト軽減のために予定していたディラック演算子の固有値を用いる方法が有効でなかったため、平成23年度以降に持ち越しとした。しかし、πK(I=3/2),ππ(I=2),KK(I=1)系の計算は問題なく出来ており、これも近日中に論文として報告したいと考えている。本研究は、QCD第一原理計算の手法を用いて、二体ハドロン散乱の散乱長と散乱位相を研究し、ハドロン間相互作用を理解する事を目的とするものである。この目的に向けて、π-K系の研究を行なってきた。この系は、いくつかの点において、今後の散乱研究のための試金石となる要素を含んでいる。第一に、異種粒子同士の散乱過程である点。先行研究では、同種粒子同士の散乱を扱うか、異種粒子であっても不十分な扱いを行なっている場合が殆どである。しかし、メソン・バリオン散乱のような興味深い共鳴状態を含む過程の多くは、異種粒子同士の散乱過程であり、このような場合の取り扱いを明確にする必要がある。本研究では、このような系に適用可能な散乱公式の導出を行なった。第二に、同一の粒子内容でありながら量子数の異なる二種類のチャンネル(I=1/2,3/2)を含んでいる点。このような系は、カイラル摂動論のような模型の有効性を検証する上で、重要な役割りを果たす。本研究では、これら二種類のチャンネルにおいて、しきい値での相互作用を反映する量である散乱長の計算を行ない、引力・斥力といった定性的な理解を越えて、定量的な議論を行なった。
細胞内寄生細菌"ボルバキア"がマツノマダラカミキリの生殖機能に与える影響の解明

既往の研究により、マツノマダラカミキリの体内からボルバキアの遺伝子が検出されていたことから、マツノマダラカミキリはボルバキアに感染しているものと考えられていた。しかし、当研究課題において、そのボルバキアの性質を明らかにするための実験を進めたところ、ボルバキアがマツノマダラカミキリに感染しているのではなく、ボルバキアの遺伝子がマツノマダラカミキリの常染色体上に転移しているという驚愕の事実が明らかとなった。昆虫や動物などの高等生物において、遺伝子が大規模に水平転移していることを本研究のように具体的に証明した例は極めて少ないことから、本研究の成果は、今後高等生物における遺伝子水平転移の影響を解明していく上で非常に重要な知見であると考えられる。今年度は以下の2つの調査および実験を行った。1.野外のマツノマダラカミキリ個体群における性比およびボルバキアの感染率の調査茨城県内で採集したマツ枯死木から脱出したマツノマダラカミキリ成虫を用いて、雌雄の性比、およびボルバキアの感染率をPCR法により調査した。その結果、枯死木から脱出したマツノマダラカミキリ成虫は雄が22頭、雌が20頭であり性比はほぼ1:1であった。ボルバキアが宿主に引き起こす生殖異常の代表例である"雄殺し"または"雄の雌化"のような性比が雌に偏る規象は見られなかった。また、ボルバキアの感染率は雌雄とも95%と高頻度で感染しているようであった。2.抗生物質処理によるボルバキアの除去ボルバキアに感染していないマツノマダラカミキリ系統を作るため、抗生物質処理によるボルバキアの除出実験を行った。まず、上記1の調査でボルバキアが検出された雌雄を交配させ次世代孵化幼虫を採集した。それら次世代孵化幼虫をテトラサイクリンまたはリファンピシンを含む人工試料で飼育した。これらの抗生物質の濃度を0.05、0.1、0.5または1.0%と段階的に変化させるとともに、飼育期間も2週間、4週間、または6週間と変化させて、マツノマダラカミキリ体内からボルバキアが完全に除去される抗生物質の濃度と飼育期間を調査した。しかし、抗生物質の濃度および飼育期間にかかわらずマツノマダラカミキリ体内のボルバキアを除去することはできなかった。今年度は以の3つの調査および実験を行った1.ボルバキア感染系統と非感染系統の作成複数の地域のマツ枯死木を集め、地域ごとにマツノマダラカミキリ成虫を脱出させた。脱出成虫の精巣・卵巣からDNAを抽出し、PCR法によりボルバキア感染の有無を調査した。その結果、ボルバキアが検出される個体群と検出されない個体群が存在したため、それらの個体群をボルバキア感染系統と非感染系統として維持した。2.孵化率の調査ボルバキア感染系統と非感染系統を用いて交配実験を行い、組み合わせ間で卵の孵化率を比較した。ボルバキアに感染していない雌雄をかけあわせた時の卵の孵化率は84%であった(対照区)。一方、非感染雄と感染雌をかけあわせた時の孵化率は87%、また、感染雄と非感染雌をかけあわせた時の卵の孵化率は91%であった。このように、雌雄どちらかが感染した場合でも、その孵化率は対照区の孵化率とほとんど変化がなかったことから、マツノマダラカミキリが保持するボルバキアは宿主昆虫の卵の孵化率に影響を与えていないことが示唆された。3.性比の調査ボルバキア感染系統内、および非感染系統内での交配では、次世代の性比は常に1:1となることがわかっている。そこで、ボルバキア感染系統と非感染系統との間で交配実験を行い、組み合わせ間で次世代の性比を比較した。非感染雄と感染雌をかけあわせた時の次世代の性比は24:25(雄:雌)であった。また感染雄と非感染雌をかけあわせた時の次世代の性比は22:25であった。このように雌雄どちらかが感染した場合でも次世代の性比は1:1であったことから、マツノマダラカミキリが保持するボルバキアは宿主昆虫の性比に影響を与えていないものと思われた。今年度は以下の2つの実験を行った。1.系統内・系統間の交配で得られた子孫におけるボルバキアの遺伝子量の比較ボルバキア感染系統の雌雄交配により得られた子孫(++)と、感染系統と非感染系統の雌雄交配により得られた子孫(+-)を用いて、両者のボルバキアの遺伝子の量を比較した。

その結果、前者は後者の2倍近い量のボルバキア遺伝子を持っていたことから、マツノマダラカミキリから検出されるボルバキアの遺伝子は、マツノマダラカミキリの常染色体上に存在することが示唆された。2.マツノマダラカミキリの染色体上におけるボルバキア遣伝子の位置の確認マツノマダラカミキリの染色体上にボルバキアの遺伝子が存在することを視覚的に確認するためFISH解析を行った。その結果、マツノマダラカミキリが持つ10本の染色体のうち、大きい方から数えて7番目の常染色体上にボルバキアの遺伝子があることが明らかとなった。本研究によって、細菌としてのボルバキアがマツノマダラカミキリに感染しているのではなく、ボルバキアの遺伝子がマツノマダラカミキリの染色体上に存在している、すなわちこの2つの生物間で種を超えた遺伝子の水平転移が起こっているという事実が明らかとなった。これまで昆虫を含む高等生物では、遺伝子水平転移の実証例が極めて少なく、非常にまれな現象だと考えられていたことから、本研究により得られた成果は、今後、高等生物の生命活動や進化に与える遺伝子水平転移の影響を考える上で大変貴重な知見であると考えられる。
廃自動車シュレッダーダスト油化残差からの貴金属・レアメタルの分離回収

軽質ASRに含まれるプラスチックは主にウレタン、ポリプロピレン、ABS樹脂などの軽質プラスチックである。本研究では、これらのプラスチックに対して有機溶媒を用いた油化実験を行った。実験装置にはポータブルリアクター(容器サイズ:120ml)を用いた。実験は有機溶剤(エンジンオイル)49.75 gとプラスチック試料0.25gを混合し、撹拌羽根の回転数を600rpmに設定してバッチ式で行った。その結果、ウレタンとポリプロピレンはエンジンオイルの中で250°Cで10分間加熱すると全て溶解することが分かった。なお、ABS樹脂は300°Cで10分間加熱してもほとんど溶解しなかった。自動車に使用されているパラジウムは排気ガスを処理する触媒または電子部品に含まれている。通常、触媒はマフラー内にあることから、廃自動車をシュレッダー処理する前に手で取り外されている。よって、ASRに存在するパラジウムは主に電子部品由来であると考えられる。即ち、パラジウムは微細な状態で賦存していると予測されることから、空気選別では浮上物に、ふるい分けではふるい下産物に濃縮されていると推察される。そこで、平成24年度は九州メタル産業(株)のASR処理プラントのジグザグ空気選別機の浮上物(試料A)、箱型空気選別機の浮上物(試料B)、および箱型空気選別の沈下物を2 mm幅のスリットでふるい分けたふるい下産物(試料C)に対してパラジウムの賦存状況を調査した。採取された各産物の試料は2 mmおよび1 mmでふるい分けを行い、-2+1 mm産物および-1 mm産物を調整した。はじめに、-1 mm産物については高周波誘導結合プラズマ発光分光分析(ICP-AES:Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy)により定量分析を行った。分析は、試料を500 °Cで1時間熱処理した後に酸で溶解し、溶解液をICP-AESで分析した。その結果、パラジウムについては各試料中にはほとんど含まれていないことが分かった。一方、文献調査によりパラジウムは銅(Cu)やニッケル(Ni)を母材としメッキまたは複合化されている場合がある。そこで、金属片が多く見られる試料Cの+2 mm産物から32個の金属片を任意に抽出し、EPMA(Electron Probe Micro Analyzer:走査電子顕微鏡)による同定分析を行った。その結果、ニッケルと銅の合金の上にパラジウムと金の合金の層を持つ金属があることが分かった。【最終年度に実施した研究の成果】油化実験を行う前に、ASRの可燃分の分析を行った。なお、ASRは九州メタル産業(株)の廃自動車処理工程で排出されるジグザグ空気選別機浮上産物(以後、軽質ASRと称す)およびジグザグ空気選別機沈下産物(以後、重質ASRと称す)を対象とした。軽質ASRは+20mm産物と-1mm産物を、重質ASRについては-15+6mm産物、-6+2mm産物および-2mm産物を調整した。分析の結果、軽質ASR+20mm産物と-1mm産物の可燃分はそれぞれ52.2%と29.3%であった。重質ASR-15+6mm産物、-6+2mm産物および-2mm産物の可燃分はそれぞれ22.1%、11.1%、4.5%であった。これ等の結果から、可燃分が多い軽質ASRを油化実験の試料にすることにした。そこで、これらのプラスチックに対して有機溶媒を用いた油化実験を行った。実験装置には耐圧硝子工業(株)社製のポータブルリアクターTPR-1(容器サイズ:120cm3)を用いた。実験は有機溶剤(エンジンオイル)49.75 gとプラスチック試料(市販のウレタン、ポリプロピレン、ABS樹脂)0.25gを混合し、撹拌羽根の回転数を600rpmに設定してバッチ式で行った。これらの結果から、軽質ASR中のウレタンやポリプロピレンに対しては有機溶剤によって油化が行え、また、含まれている貴金属やレアメタルの重量割合を相対的に増加させられることが分かった。廃自動車シュレッダーダスト(ASR:Automobile Shredder Residues)は廃自動車をシュレッダー処理して有価金属を回収した後に残る残差である。

現在、自動車リサイクル法においてガス化溶融や焼却・熱回収などのサーマルリサイクルによって適正処理されているが、ASRにまだ残っている貴金属やレアメタルは回収されずに溶融スラグや焼却灰に含まれたままで埋め立て処理されているのが現状である。本研究では、国内における資源確保という観点から、ASRに含まれる貴金属およびレアメタルを油化により残渣側に濃縮し、その濃縮物から浮遊選別により回収する実験を行う。なお、研究計画では回収対象物として貴金属は金(Au)および銀(Ag)、レアメタルはタングステン(W)およびチタン(Ti)をとしていたが、レアメタルの回収物はネオジウム(Nd)とパラジウム(Pd)に変更する。平成23年度は九州メタル産業株式会社(北九州市)の廃自動車処理工程で発生しているASR中の貴金属(Au、Ag)について定量分析を行った。対象とした工程産物はジグザグ空気選別機の浮上物、ジグザグ空気選別機の沈下物を箱型空気選別機に投入して得られた浮上物、重質ASRを箱型空気選別機に沈下物を2 mm幅のスリットでふるい分けたふるい下産物である。各産物についてはさらに1 mmのふるいでふるい分けを行い、それぞれを試料(1)、試料(2)および試料(3)と命名した。各試料は500 °Cで1時間熱処理した後に酸で溶解し、溶解液をICP-AESで分析を行った。分析の結果、Auは試料(1)に10 ppm、試料(2)に5 ppm、試料(3)に7 ppm含まれていることが分かった。また、Agは試料(1)に27 ppm、試料(2)に43 ppm、試料(3)に102 ppm含まれていることが分かった。対象する貴金属をパラジウムに変更してその分布状況を調べることから本年度の研究を始めたが、調査の結果、ASR中においてパラジウムは微細な粒子ではなくCuやNiの表面にメッキとして使用されていることが分かった。本研究ではASR中の可燃分を油化することにより貴金属を相対的に油化残渣側に濃縮させ、浮遊選別法により回収することを目的としているが、浮遊選別は微細な粒子状のものを取り扱う選別方法である。このため、今後対象とする貴金属は平成23年度に調査した金および銀に再度変更した。しかしながら、学内業務が多忙であっため、平成24年度は専ら油化および浮遊選別の実験に使用するためのサンプルの作製および調整しかできなかった。今回の調査結果によって、Auについては試料(1)、Agについては試料(3)に多く含まれていることが確認された。平成24年度は試料(1)および試料(2)を熱分解することによって有機物油化し、貴金属を固形物残渣に濃縮する実験を行う。平成23年度では熱分解装置(ポータブルリアクター)を購入したが装置を組み立てる段階までしか行っていない。このため、熱分解に関する実験は文献調査のみ行っている。本年度行えなかった有機溶剤によるASRの油化に関する実験を行う。使用する有機溶剤はC重油および廃潤滑油を用いる。また、脱塩素化処理中の温度-圧力特性の把握および脱塩素化率を明確にするための実験を行う。次に、油化残渣に対して浮遊選別法による貴金属の回収を試みる。さらに、目的とするレアメタル(Nd)に対して、ASR中の分布状況を調査すると共に、油化試験および浮遊選別試験を行い、最適な回収条件を調べる。平成24年度は有機溶剤によるASRの油化に関する実験を行う。使用する有機溶剤はC重油および廃潤滑を用いる。
悪性脳腫瘍に対する硼素中性子捕捉療法の標準治療化と新規開発

われわれの施設において硼素中性子捕捉療法により治療した新規診断GBMおよび再発悪性グリオーマの治療成績を検討したところ、後述のように有意な治療効果が確認できた。一方で、硼素化合物のキャリアーとしてはtransferin-liposomeを開発し、これによる治療効果の改善を動物実験モデルを用いて報告した。2009年度は上記結型サイクロトロ果を基に、多施設共同第二相臨床試験を計画している。加えて、新規中性子源として小ンの開発に成功し、新規硼素化合物と合わせた治験を計画中である。昨年度の科学研究費補助金を使用して、以下の研究を行なっている。1.新規診断神経膠芽腫非開頭BNCTの成績新規診断膠芽腫にたいしてBNCTを施行し、1年以上経過を観察できた症例(1年以内の死亡例も含む)は21例であり、その生存期間中央値は15.6ケ月であり、20-30Gyの分割外照射を追加した11症例の生存期間中央値は18.0ケ月であった。これらの症例には再発が確認されるまで、化学療法を行なっていない。ことにRPAで予後不良群に分類される症例に対して、延命効果が顕著であった。2.再発悪性グリオーマの治療成績。22例の再発悪性グリオーマの症例の生存期間を調査した。その結果は全症例の生存期間中央値はBNCT施行後より11.0ケ月であった。再発悪性グリオーマの標準治療が確立していない現時点でこの成績が満足しうるものか否か検討することは難しいが、J Clin Oncol 25:2601, 2007.の報告(最近の米国における10個のPhase 1,2 study)と比較するとどのRPAクラスでも生命予後はBNCT群が勝っていた。3.悪性髄膜腫の治療成績13例の再発悪性髄膜腫に対して、BNCTを施行した。どの症例も画像上、腫瘍体積は顕著に縮小し、その有効性が確認できた。しかしながら、9例が死亡し、その死因を分析すると、局所再発1例、髄腔内播種3例、全身への転移3例、放射線壊死1例、多重癌併発1例であり、局所制御はおおむね良好と考えられた。BSH包埋Tf-PEG-liposomeによる治療実験を人脳腫瘍脳内移植ヌードマウスを用いて、その有用性を証明した。5.BSHにアミノ酸を付加することにより、細胞内取り込みの増強を検討中である。6新規診断神経膠芽腫に対する化学療法併用多施設共同研究用プロトコールを京都大学探索医療センターとの共同作業で作成中である。悪性脳腫瘍ことに悪性グリオーマ、なかんずく神経膠芽腫は集学的治療を行っても、その根治は期待しがたい。我々は悪性グリオーマの治療法として硼素中性子捕捉療法(BNCT)の研究を進めて来た。すでに2002年より2007年12月末までに65例の悪性脳腫瘍の患者に述べ81回のBNCTを適応してきた。新規診断GBM21例の生存期間中央値(MST)は、TMZをはじめとする化学療法抜きで15.6カ月であり、われわれの施設での過去15年間におけるX線分割照射およびACNUを中心とした化学療法を併用した標準治療によるMST(10.3カ月)を凌駕する成績を残している(ハザード比0.399,p<0.0038)。これら症例のうち、後期11例にはX線の分割外照射(XRT)を20-30Gy追加することによりMSTは23.5か月にまで延長した。また、再発悪性グリオーマ22例を対象とした治療効果はMSTが11か月を超え、予後別解析(RPA)を加えると、本来悪い予後の症例ほど延命効果を示した。以上が臨床結果である。2009年度は上記結果を基に、多施設共同第二相臨床試験を計画している。加えて、新規中性子源として小型サイクロトロンの開発に成功し、新規硼素化合物と合わせた治験を計画中である。また2008年度には、当該プロジェクトが先端医療開発特区(スーパー特区)にも採択された。
アロマターゼとGPR30による疼痛制御に基づいた新規疼痛治療薬の開発

ホルマリンテスト、神経障害性疼痛と癌骨転移痛モデルに対してアロマターゼ阻害薬(Letrozole)は疼痛閾値を低下し、細胞膜局在のエストロゲン受容体GPR30阻害薬(G15)は、疼痛閾値を増加した。脊髄におけるGPR30およびアロマターゼの発現変化を神経障害性疼痛とがん性疼痛モデルについて免疫組織学的に調べた。閉経後モデルの卵巣摘出ラットとさらにアロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値低下には優位な差はなかった。それぞれの脊髄固定切片を用いて、IBa1免疫染色によるミクログリア活性化を比較し、それぞれのmiRNAをコントロールと比較して疼痛との関連を検討した。実験1.各種疼痛モデル動物を作製しGPR30の阻害剤とsiRNAやアロマターゼ阻害薬による疼痛への影響を検討する実験2.難治性疼痛の発症と維持におけるGPR30およびアロマターゼの関与を検討する実験1について、神経障害性疼痛モデル(Seltzerモデル)と大腿骨癌骨転移痛モデル(Mantyh J Neurosci. 1999)マウスをそれぞれ作成した。疼痛評価は、フリンチング、ホットプレートテスト、von Freyテストとアロディニアスコア等にて行った。モデル作成2週間後にアロマターゼ阻害薬(exemestaneとletrozole)と特異的GPR30拮抗薬(G15)を投与した時の各種疼痛モデル動物に対する影響を検討した。また、実験2については、GPR30とアロマターゼ発現変化の解析のためにそれぞれの疼痛モデルマウスの脊髄を摘出しサンプルとして冷凍保存した。実験1.各種疼痛モデル動物を作製しGPR30の阻害剤とsiRNAやアロマターゼ阻害薬による疼痛への影響を検討する。アロマターゼ阻害薬(exemestaneとletrozole)と特異的GPR30拮抗薬(G15)を投与して各種疼痛モデル動物に対する影響を検討しその鎮痛効果を確認し終了した。実験2.難治性疼痛の発症と維持におけるGPR30およびアロマターゼの関与を検討する。神経障害性疼痛モデルと癌骨転移痛モデルを用いてGPR30 siRNAにて鎮痛効果を確認した。また、脊髄レベルでのGPR30の変化についてもウエスタンブロットにて検討した。実験4.アロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値の変動のメカニズム解明と疼痛緩和薬の開発する。閉経後モデルとして卵巣を摘出した動物にアロマターゼ阻害薬を投与した時のマウスを用いて疼痛閾値の変化を調べた。実験2で難治性疼痛モデルの脊髄レベルでのアロマターゼの変化についてウエスタンブロットの条件設定に時間がかかっている。実験4で閉経後モデルとして卵巣を摘出した動物にアロマターゼ阻害薬を投与する条件設定に時間がかかった。平成27年度より国立がんセンター研究所研究員と国立がんセンター中央病院麻酔科医員の併任なり、研究時間が減少した。実験1.各種疼痛モデル動物を作製しGPR30の阻害剤とsiRNAやアロマターゼ阻害薬による疼痛への影響を検討するアロマターゼ阻害薬(exemestaneとletrozole)と特異的GPR30拮抗薬(G15)を投与して神経障害性疼痛とがん性疼痛モデル動物に対する疼痛増強の機序を検討した。実験2.難治性疼痛の発症と維持におけるGPR30およびアロマターゼの関与を検討する神経障害性疼痛モデルと癌骨転移痛モデルを用いてGPR30 siRNAにて鎮痛効果を確認し、脊髄レベルでのGPR30の変化について検討した。神経障害性疼痛など難治性疼痛の発症に関係深い脊髄レベルのミクログリアをGPR30とアロマターゼ阻害薬が活性化することを新たに発見した。実験4.アロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値の変動のメカニズム解明と疼痛緩和薬の開発閉経後モデルとして卵巣を摘出した動物にアロマターゼ阻害薬を投与した時のマウスを用いて疼痛閾値の変化を調べ、アロマターゼ阻害薬とGPR30阻害薬の効果を検討した。ミクログリアの活性化が関係していることから、アロマターゼ阻害薬によるミクログリアの活性化を抑制を指標にした疼痛緩和薬の開発に着手した。神経障害性疼痛モデルと癌骨転移痛モデルを用いてGPR30 siRNAにて鎮痛効果を確認し、GPR30とアロマターゼ阻害薬による脊髄レベルでの疼痛発症に関係するミクログリアを活性化することを新たに発見した。このミクログリア活性化のメカニズムを明らかにすれば、アロマターゼやGPR30と疼痛との関係を明らかにできるため、このことについて検討を開始した。アロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値の変動のメカニズム解明と疼痛緩和薬の開発については、閉経後モデルとして卵巣を摘出したマウスにアロマターゼ阻害薬を投与した時の疼痛閾値の変化を調べ、アロマターゼ阻害薬とGPR30阻害薬の疼痛への影響を検討し、その疼痛緩和作用について検討を開始した。ただ、閉経後モデルを作成してから検討する時期について設定するのに時間を要した。平成28年度に国立がん研究センターから国立国際医療研究センター国府台病院へ転勤となり、研究環境や研究機器について整備するのに時間を必要とした。このため研究期間を1年延長した。

閉経後モデルの卵巣摘出ラットとさらにアロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値低下には優位な差はなかった。それぞれの脊髄固定切片を用いて、IBa1免疫染色によるミクログリア活性化を比較し、それぞれのmiRNAをコントロールと比較して疼痛との関連を検討した。【実験I】各種疼痛動物モデルを作製しGPR30の阻害剤とsiRNAやアロマターゼ阻害薬による疼痛への影響を検討。急性炎症痛モデル、神経障害性疼痛モデルと癌骨転移痛モデルを用いて、アロマターゼ阻害薬(letrozole)と特異的GPR30拮抗薬(G15)を投与して疼痛に対する影響を行動薬理学的に検討した。Seltzerモデルと大腿骨癌転移痛モデルを用いて、疼痛評価はそれぞれフリンチング、von Freyテストとアロディニアスコアにて行った。Letrozole(5mg/kg)投与によりmechanical閾値は低下した。ホルマリンテストによる疼痛を増強した。【実験II】難治性疼痛の発症と維持におけるGPR30およびアロマターゼの関与GPR30並びにアロマターゼ発現変化の解析:脊髄におけるGPR30およびアロマターゼの発現変化について、神経障害性疼痛モデルとがん性疼痛モデルにおいて疼痛発症後に脊髄レベルで組織化学的に調べた。AromataseはDRGに存在し、GPR30はミクログリアに存在した。【実験IV】アロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値の変動のメカニズム解明と疼痛緩和薬の開発閉経後女性では卵巣機能の低下によりアロマターゼの発現が亢進した状態にあり、男性では加齢と共に酵素活性が亢進することが知られている。閉経後モデルとして卵巣を摘出した動物にアロマターゼ阻害薬を投与した時の動物を用いて疼痛閾値の変化を測定し、脊髄レベルでのGPR30の変化を組織化学的に調べ疼痛発症維持との関係を検討した。実験1については、侵害性疼痛モデル(ホルマリンテスト)と、慢性炎症性疼痛モデル(カラゲニン関節炎モデル)での検討が終わっていない。また、siRNAによる疼痛への影響についても至適なsiRNAの作成に時間を要している。実験2の難治性疼痛の発症と維持におけるGPR30およびアロマターゼの関与については、疼痛モデル動物の脊髄サンプリングまで終わっている。実験2で難治性疼痛モデルの脊髄レベルでのアロマターゼの変化についてウエスタンブロットで検討する。実験4で閉経後モデルとして卵巣を摘出した動物にアロマターゼ阻害薬を投与した時の動物を用いて、脊髄レベルでのGPR30、TRPV1、NGF等の蛋白量やmRNAを測定し、疼痛発症維持との関係を検討する。これらの測定条件の設定をすみやかに行う。GPR30とアロマターゼ阻害薬による脊髄レベルでの疼痛発症に関係深いミクログリアを活性化することを新たに発見した。このミクログリア活性化のメカニズムを明らかにするためアロマターゼやGPR30と疼痛との関係について検討を行っている。アロマターゼ阻害薬投与による疼痛閾値の低下を確認し、その疼痛を緩和する薬剤の開発を着手している。
X線レーザーに関する基礎研究

蛍光X線にはラジェーティブ・オージェ特性X線と呼ばれる微弱な特性X線がある.1990年にダスグプタはラジェーティブ・オージェ特性X線がバーチャル・ラマン効果を示し,そのためにX線レーザーとして用いるのに有望であるとの見解を述べている.我々はこのラジェーティブ・オージェ特性X線中にEXAFS(X線吸収微細構造)が現れることを発見し,蛍光X線発生原子と近接の原子との間に量子的干渉効果があることを初めて示した.また,この現象を利用し,従来,シンクロトロン放射光が必須とされてきたアモルファス材料等の局所構造解析に応用可能であることを示した.一方,我々はX線の全反射現象を利用した材料評価法の開発に関する研究を行ってきたが,X線レーザー開発の基礎研究としてX線の全反射現象に新たに着目した.白色X線を極低角で鏡面試料に照射した場合,全反射臨界エネルギーより僅かに高いエネルギーのX線は物質の極表面を伝搬する.この表面伝搬X線を半導体検出器を用いてエネルギー分析をすることにより,表面の密度測定が可能である.我々はPt薄膜から出射される表面伝搬X線を観測することにより,精度良く薄膜の密度を決定できた.また試料に膜厚数十nmの有機薄膜(パラフィン)を用いた場合,薄膜の側面から単色性の高いX線伝播X線が出射されることを発見した.X線ビームの可干渉性はビームのサイズに反比例するため,膜厚数十nmの薄膜から出射されるビームは極めて干渉性の高いビームといえる.今後,最適な高次構造を持つ薄膜を作成することにより,出射されるビームの強度の増加,干渉性の改善できるという指針も得ている.蛍光X線にはラジェーティブ・オージェ特性X線と呼ばれる微弱な特性X線がある.1990年にダスグプタはラジェーティブ・オージェ特性X線がバーチャル・ラマン効果を示し,そのためにX線レーザーとして用いるのに有望であるとの見解を述べている.我々はこのラジェーティブ・オージェ特性X線中にEXAFS(X線吸収微細構造)が現れることを発見し,蛍光X線発生原子と近接の原子との間に量子的干渉効果があることを初めて示した.また,この現象を利用し,従来,シンクロトロン放射光が必須とされてきたアモルファス材料等の局所構造解析に応用可能であることを示した.一方,我々はX線の全反射現象を利用した材料評価法の開発に関する研究を行ってきたが,X線レーザー開発の基礎研究としてX線の全反射現象に新たに着目した.白色X線を極低角で鏡面試料に照射した場合,全反射臨界エネルギーより僅かに高いエネルギーのX線は物質の極表面を伝搬する.この表面伝搬X線を半導体検出器を用いてエネルギー分析をすることにより,表面の密度測定が可能である.我々はPt薄膜から出射される表面伝搬X線を観測することにより,精度良く薄膜の密度を決定できた.また試料に膜厚数十nmの有機薄膜(パラフィン)を用いた場合,薄膜の側面から単色性の高いX線伝播X線が出射されることを発見した.X線ビームの可干渉性はビームのサイズに反比例するため,膜厚数十nmの薄膜から出射されるビームは極めて干渉性の高いビームといえる.今後,最適な高次構造を持つ薄膜を作成することにより,出射されるビームの強度の増加,干渉性の改善できるという指針も得ている.
弥生時代開始期における日韓の玉類の比較研究

本年度は、弥生時代前期までの日本列島と無文土器時代の朝鮮半島における碧玉製管玉の史料集成を進めた。そして、朝鮮半島で碧玉産地の可能性が指摘されていた浦項を中心とする東南部海岸地域を踏査し、原石の採集に努めた。しかし、現状では残念ながら、日本の弥生時代開始期に併行する時期の碧玉の理化学的データに合致する資料は得られていない。釜山市・金海市周辺で碧玉産地の可能性のある地点の情報を得ているので、今後も原石探求を継続する予定である。一方、日本列島では、無文土器時代の朝鮮半島産と予想される碧玉製管玉の東限を明らかにするため、徳島県の庄・蔵本遺跡の資料に対して、藁科哲男(遺物材料研究所)の協力で理化学的分析を行った。その結果、弥生時代の開始期には、朝鮮半島を原産地とする遺物が四国東部まで及んでいることが理化学的な裏付けを伴ったかたちで判明した。また、これまで蓄積してきたこの時期の資料には近畿地方で朝鮮半島産と考えられるものはないため、あくまで管玉からみた場合に限られるが、直接的に近い文化伝播は現状では瀬戸内東部までということになる。ただし、近畿地方のこの時期には四国東部の文化的影響があるため、朝鮮半島や九州北部からの間接的な影響は認められる。さらに、朝鮮半島の資料そのものではないが、西日本全体でも数の少ない有柄式石剣も近畿地方に存在する。東限での交流網の様相については時間軸を整理しつつ、さらに検討を深める必要があるだろう。さて、朝鮮半島において本年度から行う予定であった理化学的分析は、分析機材が不足しているという状況が判明したため、来年度に行うように変更した。本年度の交渉で韓国の研究協力者との計画は整ったので、来年度始めに機材を持ち込み、大邱広域市、大田広域市周辺の出土資料から分析を開始する予定である。
胃癌に対する5-Fu系抗癌剤の効果予測に立脚した術後補助化学療法の研究

【目的と方法】5-FU代謝酵素であるThymidylate synthase (TS), Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)の活性は5-FUに対する感受性あるいは予後推測因子として注目されている。しかし、これらの酵素活性が5-FU投与により変化してその効果に影響を与える可能性は検討されていない。そこで、(1)臨床的検討として、術前にUFT(5-FUの前駆体とウラシルの合剤)を2週間以上投与した胃癌患者の投与前の生検と投与後の切除標本から腫瘍のTS, DPDのmRNAを定量測定し、組織学的効果との関連を検討した。次に、(2)基礎的検討として、胃癌培養細胞に5-FUを接触させて経時的にTS, DPD, thymidine phosphorylase (TP)の代謝酵素活性を測定し、薬剤感受性(細胞増殖抑制効果)との関連を検討した。【結果】(1)臨床的検討では、UFT投与前の腫瘍DPD mRNA低値の症例で5-FUの組織学的効果が高かった。しかし、効果が高くても、UFT投与後の腫瘍DPD mRNA値が投与前より大きく上昇する症例も存在した。TS mRNAの推移は組織学的効果と関連しなかった。(2)基礎的検討では、5-FU接触中のTS total/TS阻害率の上昇またはDPD持続低値が高感受性と関連していた。しかし、TP活性値は薬剤感受性に余り関連しなかった。【結論】本研究により5-FUの効果予測がより正確になり、補助化学療法の適応症例の選択に寄与することが期待される。一方で本研究は、胃癌細胞のTS, DPDのmRNA値あるいは酵素活性が5-FU投与により変化することを示した。胃癌細胞の5-FU感受性機構は細胞ごとに異なるが、5-FU接触によるこれら代謝酵素活性の変化は5-FUに対する感受性や長期投与時の耐性に関与する可能性もあると思われる。研究初年度の本年は、胃癌に対する術後補助化学療法における中心的な薬剤である5-FUの効果予測を代謝酵素であるthymidylate synthase(TS)およびdehydropyrimidine dehydrogenase(DPD)の発現について、治療前の内視鏡生検標本で検討した。次に、術前にUFT(5-FUとウラシルの合剤で5-FUの効果を高める)投与群(手術前日までの経口投与で投与期間2週間以上)と非投与群の2群に無作為に振り分け、これら2群において手術切除標本の病理組織の組織学的効果判定を行った。また、可能な症例には切除標本を用いてHDRA法による抗癌剤感受性試験を行い、これらの結果とUFT投与前後のTS,DPDの変化の相関を検討した。結果1.術前内視鏡による生検材料を用いて、22例全例でTSとDPDのmRNAの発現が測定可能であった。2.UFT400mg/day 2週間以上の術前投与(12例)によってmRNAの発現は一定の傾向を示さなかった。3.UFTの術前投与で全例にgrade laから2の組織学的効果を認めた。4.症例は少ないがDPDの発現の少ない症例で高い組織学的効果が得られる傾向が見られた。5.HDRA法による感受性試験は検体量の問題から試験成功率は67%に留まっており、組織学的効果との相関は今後の課題である。【目的と方法】

5-FUの代謝酵素であるThymidylate synthase (TS), Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD), Thymidine phosphorylase (TP)の酵素活性が5-FU投与により変化して感受性に影響を与えると仮定し、p53 statusの異なる3つの胃癌細胞(p53野生株のMKN-45、p53変異株のMKN-74、p53変異株のMKN-28)を用いて、以下を検討した。(1)各細胞の5-FUの増殖抑制効果。(2)5μMの5-FUに24時間接触後5-FUなしで培養し、接触終了時、接触終了後24、72時間後のTS, DPD, TP活性値。(3)5μMの5-FUに持続接触させ、接触開始後24、48、72、96時間後のTS, DPD, TP活性値。【結果】(1)p53野生株のMKN-45はp53変異株のMKN-74、MKN-28より5-FU高感受性であった。(2)MKN-45では、DPDとTPは常に持続低値であった。TS totalは5-FU投与24時間後に約3倍に上昇し、その後は5-FU接触の有無に拘わらず持続高値であった。しかし、TS阻害率は持続的に約50%と高く、DPD低値と相まって比較的高感受性に関与すると思われた。(3)MKN-74では、常にTPは極めて低値かつDPDも低値を持続した。TS totalは5-FU接触によりわずかに上昇したがTS阻害率は極めて低く、比較的低感受性に関与すると思われた。(4)MKN-28では、5-FU接触時間に拘わらずDPDとTPは持続的に最も高値であった。もともと低値のTS totalは5-FU投与24時間後に約2倍に上昇し、その後も5-FU接触の有無に拘わらず持続高値でTS阻害率は約50%と高かったが、DPD高値が比較的低感受性に関与すると思われた。【考察】胃癌細胞においては、5-FU接触前後のTSとDPDの活性の変化が感受性や長期投与時の耐性に関与する可能性がある。従って、薬剤投与前後の組織中酵素活性を検討することで、より正確に5-FUの効果が予測し得る。そこで現在は、より少量の組織での検討の可能性とメカニズムの解明のために、各酵素のmRNAの推移を検討している。【目的と方法】5-FU代謝酵素であるThymidylate synthase (TS), Dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)の活性は5-FUに対する感受性あるいは予後推測因子として注目されている。しかし、これらの酵素活性が5-FU投与により変化してその効果に影響を与える可能性は検討されていない。そこで、(1)臨床的検討として、術前にUFT(5-FUの前駆体とウラシルの合剤)を2週間以上投与した胃癌患者の投与前の生検と投与後の切除標本から腫瘍のTS,DPDのmRNAを定量測定し、組織学的効果との関連を検討した。次に、(2)基礎的検討として、胃癌培養細胞に5-FUを接触させて経時的にTS,DPD,thymidine phosphorylase (TP)の代謝酵素活性を測定し、薬剤感受性(細胞増殖抑制効果)との関連を検討した。【結果】(1)臨床的検討では、UFT投与前の腫瘍DPD mRNA低値の症例で5-FUの組織学的効果が高かった。しかし、効果が高い症例でも、UFT投与後の腫瘍DPD mRNA値は投与前より上昇する例が多かった。
宿主側の歯周病罹患リスクファクターの分子生物学的解析とその治療法の検討-歯周組織の老化に関する研究-

歯の喪失の最も大きな原因は、歯周病の進行による歯周組織の破壊である。本研究では歯周病の罹患・進行における遺伝子的要因(先天的リスクファクター、genetic risk factor)を明らかにするため、常染色体異常であるダウン症をサンプルとして解析を行った。歯周病の罹患・進行に関して細胞老化からの解析と、近年のヒトゲノム計画の成果を利用して、遺伝分子生物学的に解析を行った。1)ダウン症の細胞では一回の細胞分裂におけるテロメアDNAの短縮速度が速く、そのために早期老化症の形質を示すと考えられた。2)また、ダウン症の直接の原因である第21番染色体上の遺伝子について解析を行った。ダウン症の細胞ではインターフェロンα/β受容体が強発現し、インターフェロンγ(IFN-ァ)のシグナルが過度に伝達していることが明らかとなった。3)IFN-γ投与によるSTAT1の活性化も、ダウン症の細胞では促進していることが明らかとなった。この活性化はIFN-βの抗体投与で抑制されたことから、IFN-α/β受容体を介してIFN-γのシグナルが効率良く伝達していることが明らかとなった。4)IFN-γ投与によるインターロイキン6(IL-6)の産生量が増加していることが明らかとなった。IL-6は炎症性サイトカインのひとつであり、歯周組織の破壊に関与していることが考えられた。さらにIFN-γ投与による細胞増殖抑制効果も正常線維芽細胞よりも大きく、歯周組織の再生や修復に抑制的に働くことが考えられた。以上の研究成果は、第21番染色体上の遺伝子機能の制御が正常でないために、歯周病の罹患と進行に関与すると考えられる。今後の歯周病の罹患リスクの判定、予防および治療に利用可能な、有力な遺伝的要因(genetic risk factor)と考えられる。歯科において最も重要なことは歯の保存であるが、歯の喪失の最大の原因は歯周組織の破壊を引き起こす歯周病である。第21番常染色体トリソミーであるDown症(Down's syndrome)の患児は、齲蝕よりも歯周病の早期発症が多い。Down症の表現形質は早期老化症であり、その表現形の一つが歯周病と考えられる。このことからDown症の患児の歯周組織の破壊は細菌感染の他に、なんらかの遺伝子によって引き起こされていることが示唆される。そしてその原因は第21番常染色体上の遺伝子であることも容易に推測できる。しかし歯科で最も重要な歯の保存のための、歯周組織破壊に対する患者の遺伝子レベルでの解析はまだ行われていない。ところで、近年実用化されたDNA chip/Microarray法は、微量のサンプルから多数の遺伝子の発現解析を行うことを可能にした、非常に有用な方法と考えられている。そこで本年度は健常人およびDown症由来皮膚線維芽細胞について、DNA chip/Microarray法を使用して、ヒトの遺伝子クローン(EST 2949クローンを含む、約9000クローン)のmRNA発現を検討した。歯周病の原因の一つである内毒素LPS(Lipopolysaccaride)の投与に対して、健常人由来の細胞ではdown-regulateした遺伝子は0クローンだったが、up-regulateした遺伝子が2クローン認められた。しかしDown症由来の細胞ではdown-regulateした遺伝子は14クローンだがup-regulateした遺伝子は0クローンであった。現在、新たなドナー由来の皮膚線維芽細胞についてDNA chip/Microarray法の解析中である。また、これまでに判明した遺伝子の機能と歯周病の発症メカニズムに関して解析を継続する予定である。

歯周病の罹患・進行に関して遺伝子的要因(先天的リスクファクター、genetic risk factor)を明らかにするため、常染色体異常であるダウン症をサンプルとして解析を行った。ダウン症候群(Down syndrome)は第21番染色体が3本あることが直接の原因である。歯科では齲蝕よりも歯周病の早期発症が多いことが知られている。このことから、少なくともダウン症候群の人の歯周病には、第21番染色体上の遺伝子が関与していることが推測できる。インターフェロン(INF)は細胞増殖抑制や免疫調節作用といった細胞応答の制御にも関与している。I型INF受容体とII型INF受容体間でシグナルのクロストークが存在し、INF-γによる応答はII型INF受容体を介したシグナル単独でも発揮されるが、INF-α/INF-βのシステムを利用することによりさらに効率の良いシグナル伝達を可能としているが明らかとなっている。本研究結果からダウン症では第21番染色体にコードされているI型INF受容体(INFAR1, INFAR2)が正常の細胞よりも発現が強かった。さらにその下流の転写因子であるSTAT1が、ダウン由来線維芽細胞で強いことが明らかとなった。またINF-γの投与でIL-6の産生が誘導されることが明らかとなった。INF-γの投与量が50, 100, 500U/mlの場合では、誘導されたIL-6産生量は正常線維芽細胞よりもダウン由来線維芽細胞が多いことが明らかとなった。さらにINF-γの投与量依存的に正常線維芽細胞およびダウン由来線維芽細胞の増殖能は抑制された。以上の結果をまとめると、慢性感染である歯周病において局所で産生されたINF-γは感染に対する免疫応答として有利に働くはずであるが、ダウン症では過剰の染色体上の遺伝子によって、過度の免疫応答を生じる可能性が考えられた。と歯周病の発症メカニズムに関して解析を継続する予定である。
エストロゲンレセプターαプロモーターの組織特異的なメチル化領域の同定

ERα発現の高い組織と発現の低い組織におけるERプロモーター上流領域のDNAメチル化状態は、高発現組織では低メチル化状態、低発現組織では高メチル化状態であった。上流領域のみをメチル化したコンストラクトと非メチル化コンストラクトとでプロモーター活性を比較検討すると、メチル化コンストラクトではプロモーター活性が非メチル化の約5分の1であり、この領域が組織特異的メチル変化領域である可能性が示唆された。【目的】最近我々は、子宮平滑筋でERαのプロモーター領域のメチル化がERα発現に関与していることを明らかにした。そこで、本研究では、ERα遺伝子に注目し、ERα遺伝子のプロモター領域のDNAメチル化状況が組織によって異なり、このことが組織特異的なERα発現調節機構であることを明らかにすることを目的とした。【方法】ERα遺伝子発現量の異なる組織において、ERα遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化状態を解析した。ERα遺伝子発現が高い組織として、子宮内膜、乳腺、乳癌組織、子宮筋層などを用い、発現が低い組織として、エストロゲンレセプター陰性乳癌組織、胎盤、皮膚を用いた。(1)各組織よりRNAを抽出し、ERαmRNA発現をreal time RT-PCR法にて解析し比較した。(2)sodium bisulfite genomic sequencing法にてERα遺伝子プロモーター-1,188+229bpの領域(56CpG部位)のDNAメチル化状態を網羅的に解析し比較した。【結果】(1)ERαmRNA発現は、子宮内膜、乳腺、乳癌組織、子宮筋層では発現が高く、エストロゲンレセプター陰性乳癌組織、胎盤、皮膚では、ERαmRNA発現は認めなかった。(2)ERα遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化状態は、プロモーター下流の-556+229bpの領域(49CpG部位)においては、すべての組織で非メチル化状態で組織による差を認めなかった。プロモーター上流の-1,188-790bpの領域(7CpG部位)では、組織による差を認め、ERαmRNA発現が高い組織である子宮内膜、乳腺、乳癌組織、子宮筋層では低メチル化状態、ERαmRNA発現が低い組織であるエストロゲンレセプター陰性乳癌組織、胎盤、皮膚では高メチル化状態であり、同領域のDNAメチル化状態とERαmRNA発現に関連を認めた。【目的】最近我々は、子宮平滑筋でエストロゲンレセプターα(ERα)のプロモーター領域のDNAメチル化状態がERα発現に関与していることを明らかにした。本研究では、ERα遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化状態が組織によって異なり、このことが組織特異的なERα発現調節機構であることを明らかにすることを目的とした。【方法】平成22年度の結果より、ERαプロモーターの-1188-790の領域では組織によってDNAメチル化状態が異なることを明らかにした。そこで、ERαプロモーター-1244+37bpを含むフラグメントを作成しプロモーター領域を持たないpGL3-basicベクターに挿入した。このベクターを制限酵素処理することで-1244-638のフラグメントを切り出したのち、それをSssIメチラーゼでDNAメチル化処理を行った。メチル化した-244-638のフラグメントをベクターに再挿入し(pGL-me)、コントロールとして非メチル化フラグメントを再挿入しだ(pGL-um)1培養ヒト子宮平滑筋細胞にpGL-meとpGL-umをそれぞれトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。【結果】非メチル化コンストラクト(pGL-umlと比較してメチル化コンストラクト(pGL-me)ではプロモーター活性が約5分の1となっており、ERαプロモーター上流領域が、組織特異的にDNAメチル化制御を受けて遺伝子発現調節に関与する組織特異的メチル化変化領域(T-DMR: tissue dependent, differentially methylated region)である可能性が示唆された。