hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
溶媒を使用しない食品の酸化安定性確認試験方法の開発

本研究では、食品を密封系へ閉じ込め、食品酸化に起因する容器内ヘッドスペース酸素濃度(HSO)の減少を指標にして食品の安定性を確認する方法を確立した。本法は通常法と違い有機溶媒を使用することなく食品の酸化安定性を確認できる。結果、蓋に酸素電極を埋め込んだ容器中にシソ油を入れて酸化させた際のHSO減少パターンと、油脂の過酸化物価(PV)変化パターンが一致した。さらに、シソ油を用いて作成したクッキーの酸化安定性を開発法と通常法で比較した。結果、クッキー試験においてもHSO変化とPV変化は同じパターンを示した。このことから、本試験で開発した方法は通常法と同じように使用できることが明らかとなった。本研究では、食品の酸化測定を行う際、有機溶媒を使用しないで測定が可能な簡便な器具の開発を行うことを目標としている。現在、食品酸化を評価する方法は食品中の酸化生成物を有機溶媒を用いた抽出などの処理をしたのちに測定する方法が主である。また、統一的な食品の酸化評価方法も世界中に存在しない。そこで本研究では食品を容器内に密閉し、一定温度に放置した際のヘッドスペース中酸素の減少を、酸素センサーを用いて測定することで食品の酸化が評価可能ではないかと考え、そのような器具の開発と、結果の妥当性評価を目標に研究を行っている。そのような中、初年度は、1容器のスクリューキャップ蓋部分に取り付ける空気入れ口および酸素センサーの選別と、圧力に耐えられる取り付け部分の加工方法検討。2容器と蓋部分での加圧空気漏えい防止方法の検討(Oリング、パッキンなど)。3圧力に耐えられる容器の選別と容器形状の設計。に注力して研究を行った。その結果、市販のマヨネーズ瓶をベースとした測定器を作成するに至った。この容器は、水中に沈ませた漏れ試験において空気漏れがなく、しかも食用油をサンプルとして使用した際、時間の経過に従いヘッドスペース部酸素の減少を経時的に測定することが出来た。この結果より、当初考えたアイディアで、食品中の酸化をヘッドスペース部の酸素濃度減少を指標として測定可能だと考えるに至った。さらに、特に圧力を加えなくてもヘッドスペース部の酸素減少を測定できることも確認するに至った。各種食品の酸化劣化に対する安定性を容器中のヘッドスペース酸素量を指標にして評価する手法を開発している。この手法を用いると、食品の酸化劣化を、溶媒抽出などによる食品の構造破壊を行わず(無溶媒)、非破壊で食品の劣化状態を把握することが可能となる。これまで2年間本研究を実施してきたが、平成26年度(1年目)の研究では測定容器の設計を行った。研究開始当初は、ある程度の圧力に耐えられる容器を用い、自転車の空気入れを用いて容器内へ空気を圧縮する手法を考えていたが、研究を進める内に容器内ヘッドスペース部の大気圧溶存酸素量だけでも食品の酸化劣化を充分測定可能であることが判明した。そこで、容器の構造を簡便化できるという利点もあることから、容器内に空気を圧縮することをやめ、大気圧空気中の酸素量を指標にして測定を行うこととした。平成27年度(2年目)は、実際の食品サンプルを用いて食品の酸化劣化を測定した。現在、食品中の酸化劣化指標として用いる指標は主に脂質由来の指標である。特に多く用いられる指標は過酸化物価(Peroxide Value: PV)であることから、開発した容器を用い、食品劣化をヘッドスペース酸素量変化にて観察すると同時に、各時間における食品のPV測定も行い、2つの変化を比較して、開発容器の性能評価とした。サンプルとしてはPV測定が容易である食用油(シソ油)を用いた。その結果、PVが急に上昇するタイミングに於いてヘッドスペース酸素量の減少速度が増加することを確認した。併せて、容器内にサンプルを入れていないときは、ヘッドスペース酸素量は変化しなかったことも確認した。これらの結果より、開発した測定容器を用いることで、食品の酸化劣化を非破壊で測定可能であることが判明した。実験計画の段階で、平成26年度(1年目):測定機器の開発平成27年度(2年目):開発した測定機器を用いての食品の酸化劣化測定と現在用いられている食品の酸化劣化指標との比較としていた。現在、この計画通りに研究は進んでいる。よって、「(2)おおむね順調に進展している。」と判断した。各種食品の酸化劣化に対する安定性を容器中のヘッドスペース酸素量(HSO)を指標にして評価する指標を開発した。この手法を用いると、食品の酸化劣化を溶媒抽出などによる食品の構造破壊を行わず(無溶媒)、非破壊で食品の劣化状態を把握することが可能となる。平成26年度(1年目)の研究では測定容器の設計と精査を行った。平成27年度(2年目)はその容器を用いて、シソ油保存中におけるHSO減少と過酸化物価(Peroxide Value: PV)変化を比較した。その結果、PVが大きく上昇するポイントで、HSOの減少速度が増加した。このことより、HSOを測定することでも油脂の酸化状態を把握可能であることが判明した。そこで平成28年度は、シソ油を用いたクッキーを作成し、固体状の食品でも同様の結果が得られるかを精査した。最初にビタミンE(VE)を除去したシソ油で作成したクッキーと、未除去のシソ油で作成したクッキーで比較した結果、VE除去クッキーでHSOの減少速度が速くなった。その傾向はPVにおいても同様であった。この結果から、本実験方法により試料の酸化安定性を比較することが可能であると考えられた。

さらに、VEを除去したシソ油にVEを0%、0.01%、0.03%の濃度で添加し、これを用いて作成したクッキーをこの容器中に密封し、HSO減少を測定した。この実験において、小麦粉と砂糖による酸素濃度の減少は微量のものであったため、酸素濃度減少はシソ油によると考えられた。また、HSOの減少速度は、添加したVEの濃度が低くなるほど増加することを確認した。PVにおいても同様の傾向が見られた。以上の結果より、本開発方法を用いることで、食品を非破壊かつ溶媒非抽出で酸化安定性評価が可能であることが判明した。本研究では、食品を密封系へ閉じ込め、食品酸化に起因する容器内ヘッドスペース酸素濃度(HSO)の減少を指標にして食品の安定性を確認する方法を確立した。本法は通常法と違い有機溶媒を使用することなく食品の酸化安定性を確認できる。結果、蓋に酸素電極を埋め込んだ容器中にシソ油を入れて酸化させた際のHSO減少パターンと、油脂の過酸化物価(PV)変化パターンが一致した。さらに、シソ油を用いて作成したクッキーの酸化安定性を開発法と通常法で比較した。結果、クッキー試験においてもHSO変化とPV変化は同じパターンを示した。このことから、本試験で開発した方法は通常法と同じように使用できることが明らかとなった。申請書類中に、平成26年度の実施項目として、1.スクリューキャップ蓋部分の設計、2.結合部分の設計、3.サンプル容器の設計、4.作成した器具を用いての酸化試験の実施、以上4つの項目を記した。結果的に、項目1-3はおおむね達成し、項目4に関しても食用油を用いた試験までは行うことが出来た。しかし申請書に記した、「パン、ショートブレッド、即席麺などの油脂を多く含む食品」の酸化をこの器具を使用してまだ評価していない。このような情況より、おおむね順調に研究は進んでいると考える。平成27年度の研究で、開発した測定容器で食品の酸化劣化を測定可能であることがわかった。しかしこの結果は、PV測定を容易にするために食用油を用いた結果である。そこで平成28年度(最終年)は、パンやクッキーなど、形を持つ食品でも開発した機器は使用可能か否かを評価する。具体的には、パンやクッキーを製造する際に使用する油に、添加する抗酸化剤であるビタミンE量を変化させ、その影響がどのように観察されるかをヘッドスペース酸素量変化を用いて評価する予定である。食品化学昨年度実施できなかった、製造した測定器具を用いたパンや即席麺の酸化評価を行い、さらに、「開発器具を用いた食品の酸化評価と、現状で使用されている食品酸化評価方法の比較」を行う予定である。たとえば即席麺を用い、一定温度における酸化試験を実施する。酸化試験では一定期間ごとにサンプリングを行い、JAS法で記載されている方法(エーテル抽出法)により即席麺から油脂を抽出する。抽出油脂の、PV、AV、AnVを測定し、開発器具で観察された結果と比較検討を行う。なお、これら実験を行う上ではなるべく正確な値を得る必要があることより、n数を多くする予定である。
自然免疫機構によるマスト細胞の活性化と感染型気管支喘息の病態への関与

気管支喘息の発症において、lipopolysaccharide(LPS)は病態の増悪因子であると考えられているが、そのメカニズムについては明らかでない。マスト細胞は、気管支喘息をはじめ、様々なアレルギー性炎症に深く関係していることが知られている。マスト細胞表面にはLPSの受容体であるToll-like receptor(TLR4)が発現しており、これによるマスト細胞の活性化が粘膜における感染防御において重要な役割を果たしていることが知られている。しかしながら、TLR4を介したマスト細胞の活性化機構とその情報伝達経路についての詳細は明らかでない。dsRAN-activated protein kinase(PKR)はLPSの受容体であるTLR4刺激により活性化されることが知られている。今回我々は、LPS刺激によるマスト細胞のNF-κB活性化におけるPKRの役割について検討した。はじめに、TLR刺激によるPKRのリン酸化を検討したところ、MyD88及びTIRAPの過剰発現によりPKRがリン酸化させることが明らかになった。次に、ラットマスト細胞株、RBL-2H3細胞におけるNF-κB活性化をルシフェラーゼ法で解析し、TLR4を介したNF-κB活性化におけるPKRの作用について検討した。PKRの不活性型mutantはLPSにおけるNF-κB活性化を有意に抑制し、また、PKRの阻害剤である2-aminopurineも同様にLPSによるNF-κB活性化を抑制した。LPSの情報伝達において、MyD88依存性及び非依存性に活性化されるPKRが、マスト細胞のLPSに対する応答に深く関係している可能性が示唆された。
哺乳類生殖細胞における減数分裂開始時のクロマチン高次構造変換メカニズムの解明

減数第一分裂期では、体細胞分裂期にある細胞とは異なった、特有の染色体動態及び構造変換が認められる。しかし、体細胞分裂を行う生殖幹細胞から、減数分裂期にある生殖細胞への遷移期の複雑な染色体の挙動と、それに伴った核内クロマチン高次構造のスイッチング機構には不明な点が多い。本研究では、マウスにおける減数分裂型インスレーターおよびコヒーシンタンパク質それぞれの相互作用因子及び生殖細胞核内における結合領域を同定することにより、生殖細胞系列におけるクロマチン高次構造のスイッチング機構を明らかにする。
血管老化・動脈硬化に対するオルタナティブオートファジーを軸とした治療法の開発

今回我々は、閉経モデル実験を行い検討を進めることとした。培養血管平滑筋細胞(VSMC)および血管内皮細胞(HUVEC)を使ったin vitro研究において、エストロゲン受容体を阻害し閉経状態を再現したところ、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア由来酸化ストレス増大、Senescence-associated βGalactosidase染色の増強、p53, p21, p16, PAI-1発現の増強を認め、細胞老化が促進された。さらに免疫組織化学染色や電子顕微鏡による検討により、その要因としてマイトファジーの低下による異常ミトコンドリアの蓄積であることが明らかになった。C57BL6マウスに卵巣摘除を行ったin vivo研究でも同様に、血中エストロゲン濃度の低下に伴い、血管におけるマイトファジー低下から異常ミトコンドリアが蓄積し酸化ストレス増大から血管老化が進展した。in vivo, in vitro実験ともに、エストロゲン補充によりマイトファジーは回復し、血管老化が抑制された。閉経状態再現に伴う血管・細胞内マイトファジーの低下やエストロゲン補充による回復は、Atg5やAtg7をknockdownしても観察されるものの、Rab9をknockdownにより影響を受けたことから、今回のモデルにおいて影響をうけたマイトファジーは、Atg5/Atg7/LC3非依存性でRab9依存性のオルタナティブオートファジ発現抑制が主体であり、Atg5/Atg7依存性でLC3IからIIへの変換が必須のコンベンショナルオートファジーの関与は低いことが判明した。さらに、エストロゲン低下/エストロゲン受容体阻害に伴うRab9依存性オルタナティブオートファジー由来マイトファジーの低下に、サーチュイン遺伝子ファミリーのSirt1発現低下が関与することが明らかとなった。本研究では、オルタナティブオートファジーを主体とした異常ミトコンドリアの選択的除去機構である「マイトファジー」を軸として、血管の老化や動脈硬化進展の原因を明らかにすることを目的としている。そのために2016年度は以下(1)(2)の検討を行った。(1)正常(C57BL6)マウスを使用し、6か月毎の月齢において大動脈サンプルを採取。この大動脈サンプルを用いて1Oil Red O染色・Senescence associated βGalactosidase染色による動脈硬化・血管老化の評価、2ATP産生能やComplex assayによるミトコンドリア機能や酸化ストレスの程度およびユビキチン化ミトコンドリアの量に関する経年的変化の評価、3コンベンショナルオートファジーのマーカーであるLC3とオルタナティブオートファジーのマーカーであるRab9各々の抗体を用いたWestern blotによる2種類のオートファジー各々の経年的変化を評価し、さらに4電子顕微鏡によるマイトファジーの経年的変化を評価した。これらの検討により、加齢に伴いミトコンドリアの機能は低下し、異常ミトコンドリアが蓄積し、LC3を必須としたコンベンショナルオートファジーに加齢性変化は認められなかったが、LC3非依存性・Rab9依存性のオルタナティブオートファジーは加齢に伴い低下することを明らかににした。(2)動脈硬化とオルタナティブオートファジー及びミトコンドリア障害との関係に関する検討を、易動脈硬化モデル動物Apolipoprotein E (ApoE)ノックアウト(KO)マウス(ApoE KO)を用いて施行した。正常マウスと比較しApoE KOマウスの大動脈では、動脈硬化や血管老化が進展しており、異常ミトコンドリアの蓄積が多く、オルタナティブオートファジーが抑制されていた。2016年度の研究計画を立案した時点で、すでに必要な実験動物を当該研究室で所有していたこともあり、特に問題を生じることもなく、また仮説通りの結果を得られていることから、本研究は現段階においておおむね順調に進展していると判断した。本研究は、「オルタナティブオートファジーを主体としたマイトファジーの低下が血管の老化や動脈硬化形成のメカニズムに大きく関与していることを明らかにすること」を目的とし、その為に以下の4つの研究を行うことを計画した。(1)加齢に伴うミトコンドリアの機能障害進展状況、異常ミトコンドリアの蓄積状況、コンベンショナルおよびオルタナティブ各々のオートファジーの加齢性変化を明らかにする。(2)動脈硬化と、コンベンショナルおよびオルタナティブ各々のオートファジー及びミトコンドリア障害との関係を明らかにする。(3)血管におけるオルタナティブオートファジーとマイトファジーとの関係を明らかにする。(4)オルタナティブオートファジーの亢進により、血管におけるマイトファジーを介したミトコンドリアの質管理が活性化し、ミトコンドリア機能改善・酸化ストレス軽減から血管老化・動脈硬化進展を抑制するという、改善効果を明らかにする(Rescue実験)。これら4つの研究のうち、初年度の平成28年度および本年平成29年度の2年間において、(1)(3)を完了できた。以下に具体的に列記する。(I)正常マウスと易動脈硬化モデルマウスとの比較において、コンベンショナルオートファジーに必須のLC3発現には差がなかった一方、オルタナティブオートファジーに必須のRab9発現が有意に低下していたことを明らかにした。(II)動物実験や、培養血管平滑筋細胞を用いた実験で、オートファジー(オートライソゾーム)形成に必須のLamp2とRab9の発現が一致しており、かつミトコンドリアタンパクであるTOMM20とも一致していた。また、rab9発現が低下した血管ではミトコンドリア機能が低下していた。

以上から、rab9依存性オルタナティブオートファジーは血管においてマイトファジーとして機能していることを明らかにした。申請時に、平成29年度実施研究として計画していた、「血管におけるオルタナティブオートファジーとマイトファジーとの関係に関する検討」を完了できている。以下、具体的に列記する。(1)培養血管平滑筋細胞にストレスをかけると、従来のコンベンショナルオートファジーに必須であるLC3には非依存性であり、かつRab9依存性のオルタナティブオートファジーが増加することを明らかにした。(2)免疫化学染色や電子顕微鏡の検討により、ミトコンドリアを内包するオートファジー(即ちマイトファジー)がRab9依存性オートファジーであることを明らかにした。(3)易動脈硬化モデルマウスやカフ血管障害モデルマウスの実験により、動脈硬化や血管障害にRab9依存性オルタナティブオートファジーの低下が関与していること。また、ミトコンドリア機能障害が高度であること。以上より、オルタナティブオートファジーを基盤としたマイトファジーの低下により、異常ミトコンドリアが蓄積し、結果動脈硬化進展や血管障害進展を及ぼしていることが示唆された。今回我々は、閉経モデル実験を行い検討を進めることとした。培養血管平滑筋細胞(VSMC)および血管内皮細胞(HUVEC)を使ったin vitro研究において、エストロゲン受容体を阻害し閉経状態を再現したところ、ミトコンドリア機能障害、ミトコンドリア由来酸化ストレス増大、Senescence-associated βGalactosidase染色の増強、p53, p21, p16, PAI-1発現の増強を認め、細胞老化が促進された。さらに免疫組織化学染色や電子顕微鏡による検討により、その要因としてマイトファジーの低下による異常ミトコンドリアの蓄積であることが明らかになった。C57BL6マウスに卵巣摘除を行ったin vivo研究でも同様に、血中エストロゲン濃度の低下に伴い、血管におけるマイトファジー低下から異常ミトコンドリアが蓄積し酸化ストレス増大から血管老化が進展した。in vivo, in vitro実験ともに、エストロゲン補充によりマイトファジーは回復し、血管老化が抑制された。閉経状態再現に伴う血管・細胞内マイトファジーの低下やエストロゲン補充による回復は、Atg5やAtg7をknockdownしても観察されるものの、Rab9をknockdownにより影響を受けたことから、今回のモデルにおいて影響をうけたマイトファジーは、Atg5/Atg7/LC3非依存性でRab9依存性のオルタナティブオートファジ発現抑制が主体であり、Atg5/Atg7依存性でLC3IからIIへの変換が必須のコンベンショナルオートファジーの関与は低いことが判明した。さらに、エストロゲン低下/エストロゲン受容体阻害に伴うRab9依存性オルタナティブオートファジー由来マイトファジーの低下に、サーチュイン遺伝子ファミリーのSirt
ラジオフォトルミネッセンスを用いた放射線種弁別可能なイメージセンサの開発

リン酸塩ガラスのラジオフォトルミネッセンス(RPL)現象を利用した放射線種弁別可能な二次元放射線イメージセンサシステムの開発を目指した。その結果、1RPLスペクトルを解析することで、放射線の種類の判別が可能であることを明らかにできた。2ビーズ状およびシート状ガラス線量計を作製するとともに、シート状ガラス線量計に潜像された放射線の二次元イメージを読み取るための「読み取り装置」作製できた。そして3シート状ガラス線量計を積層することで、放射線のエネルギー弁別可能な放射線モニタリングが構築できることを明らかにした。ガラスのラジオフォトルミネッセンス(RPL)現象を利用した「放射線種弁別可能な二次元放射線イメージセンサシステム」の開発をめざし、本年度は、1リン酸塩ガラスのRPLスペクトルの解析、2放射線種及びエネルギー弁別可能な二次元放射線イメージセンサの機能設計および3ガラスシートの積層化の検討を行った。その結果、ガラスシートの作製方法の確立を図るとともに、平成28年度に試作を行う予定のRPLの二次元読み出し装置の機能設計を終了した。また、成果の一部は、学会にて発表を行った。平成27年度は以下の研究を実施した。1リン酸塩ガラスのRPLスペクトルの解析、2放射線種及びエネルギー弁別可能な二次元放射線イメージセンサの機能設計、3ガラスシートの積層化の検討を行った。その結果、以下のような知見を得た。1リン酸塩ガラスに発光中心であるAgの濃度を変え作製し、RPLスペクトルの評価を行ったところ、Ag濃度が0.3 mol%のとき、最もRPL強度が高いことを明らかにできた(2015年秋の応用物理学会で発表)、2放射線の種類の弁別が可能なガラスシート作製法及び2次元のRPLイメージ読み出し装置の検討を行った結果、読み出し装置に関しては、設計が終わり、平成28年度の設備費用で作製の予定。また、ガラスシートについては、直径約50ミクロンメーターのリン酸塩ガラスビーズを作製し、それを有機フィルム上へ均一にまぶすことにより作製できることを確認するとともに、実際に放射線に対する応用を測定し、二次元の放射線イメージ媒体として利用が可能であることを確認した。リン酸塩ガラスのラジオフォトルミネッセンス(RPL)現象を利用した「放射線種弁別可能な二次元放射線イメージセンサシステム」の開発を目指し、本年度は、1リン酸塩ガラスビーズ(直径約50マイクロメータ)を有機フィルム上に積層して作製したリン酸塩ガラスシートを用いて、そこに潜像した放射線の2次元イメージをRPLにて読みだすためのRPL読み取り装置を試作した。その上で、ガラスシートに記憶された放射線の2次元イメージを読み取るためのノウハウを蓄積し、イメージを読み取ることが可能となった。この成果は学会においても高く評価を受けており、現在、千代田テクノル(株)アメリカのエール大学との共同で、リン酸塩ガラスビーズを薄い有機フィルム中に含浸させて作製した二次元RPLシートや放射線量の可視化が可能な作業用手袋などを試作し、福島原発などの放射能汚染区域で作業をする人の被ばく線量や放射性同位元素の付着具合等を可視化(紫外線を照射することで放射線の当たった個所や同位元素が付着した箇所でRPL発光が生じ、放射線量の可視化が可能である)するためのシステムの開発を行っている。2ガラスシートに、X線およびアルファー線のような粒子線を照射し、記憶された放射線イメージから放射線種の識別が可能か検討を行った。その結果、RPLのスペクトルの計上に違いにより放射線種が識別できることを明らかにできた。3また、成果の一部を学会(国際学会及び国内学会)にで講演発表を行うとともに、論文として投稿を行った。平成28年度は、昨年度の成果を基に、まずはリン酸塩ガラスシートを作製し、そのシートに記憶された放射線の二次元像を取得するための装置の試作・開発を行った。具体的には(1)リン酸塩ガラスビーズ(直径約50マイクロメータ)を有機フィルム上に積層して作製したリン酸塩ガラスシートを用いて、そこに潜像させられた放射線の2次元イメージをラジオフォトルミネッセンス(RPL)にて読みだすためのRPL読み取り装置を試作した。(2)ガラスシートに、X線およびアルファー線のような粒子線を照射し、記憶された放射線イメージから放射線種の識別が可能か検討を行った。(3)ガラスシートの積層化については、技術的な課題があり、今年度は試作できなかった。この件に関しては来年度検討することとし、最終的には、放射線種およびエネルギー弁別可能なイメージングセンサの最適作製条件を決定するとともに、放射線種の弁別が可能なセンサシステムを構築する予定である。本研究では、リン酸塩ガラスのラジオフォトルミネッセンス現象を用いて、放射線種及びエネルギー弁別が可能な二次元放射線イメージセンサシステムの構築をめざし、研究を推進した。そして昨年度までに、RPL読み取り装置の設計並びに試作および試験的な実験を終了し、最終年度の本年度は、試作したガラスシートとRPL読み取り装置を用いて、各種放射線の二次元イメージングの実験を推進した。今年度は、約50ミクロンメータの直径を持つガラスビーズを敷き詰めたガラスシートを試作するとともに、昨年度の設備費で試作をした「RPL読み取り装置」を用いて、X線あるいはγ線を照射したガラスシートの二次元放射線イメージを測定した。その結果、1放射線の二次元像をモニタリングできることを確認した。

ただし、A4サイズのシートの全画素を読み取るために約3時間必要であり、スキャンの高速化は課題として残った。2ガラスシートにイメージングできるX線あるいはγ線の放射線量の下限は、約100mGyであることが明らかにできた。また、さらに感度を上げるには、ガラスシートの放射線感度向上を目指すことが重要であることが分かった。3一応、ガラスシートおよび二次元イメージセンサ装置を用いて、二次元の放射線像をイメージングできるシステムを完成させたが、本研究の最終目標である放射線種および放射線エネルギー弁別可能なイメージセンサシステムの開発には、ガラスシートの感度向上およびシートを積層した形でのモニタリング実験が必要である。これについては今後の課題とし、今後も研究を精力的に推進する予定である。一方、ガラス線量計を有機フィルム中に含浸させた作業用グローブについては昨年度に引き続き研究推進中である。リン酸塩ガラスのラジオフォトルミネッセンス(RPL)現象を利用した放射線種弁別可能な二次元放射線イメージセンサシステムの開発を目指した。その結果、1RPLスペクトルを解析することで、放射線の種類の判別が可能であることを明らかにできた。2ビーズ状およびシート状ガラス線量計を作製するとともに、シート状ガラス線量計に潜像された放射線の二次元イメージを読み取るための「読み取り装置」作製できた。そして3シート状ガラス線量計を積層することで、放射線のエネルギー弁別可能な放射線モニタリングが構築できることを明らかにした。平成28年度は、放射線照射したガラスシートを紫外線で励起した際、発生するRPL発光の2次元分布を計測するためのRPL読み取り装置の構築を図る。具体的には、前年度機能設計をしたRPL二次元読み取り装置を作製する。作製はEMFジャパン(株)に依頼をする。読み取り装置の完成後、ガラスシートに種類の異なる放射線を照射し、そのあとの紫外線励起により発生するRPLの励起、発光スペクトルを測定し、放射線種識別をどのように行えばよいかの検討を行う。本研究の最終年度である平成29年度は、前年度試作をしたリン酸塩ガラスシートとRPL読み取り装置を用いて、いろいろな放射線種に対する応答を測定し、開発したRPL二次元放射線イメージセンサの最適化を図るとともに、放射線種の判別の検討を行う。また、リン酸塩ガラスシートの積層化についても検討を行い、最終的には放射線種の弁別が可能な二次元放射線イメージセンサシステムの構築を目指す。放射線物性工学平成28年度には、前年度設計をしたRPL読み取り装置の製作(EMFジャパンで作製予定)を行う。そのため、平成27年度は成果報告のための旅費を中心に使い、残りは平成28年度の物品費に充てるために、約18万円残した。今年(平成28年)度に試作予定のRPL読み取り装置の製作を行うために、平成27年度の予算(約18万円)を少し繰り越しをして、28年度の予算に上乗せする形をとった。その結果、何とか予算の枠内での試作を行うことができた。最終的には、わずか約5万円ほど、残額が残ったので、この分は最終年度に回すこととした。
胎児期～小児期における有機臭素系難燃剤曝露が肥満症に及ぼす影響に関する研究

近年、肥満症は、成人のみならず、小児においても急激に増加しており、先進国を中心に大きな社会問題となっているが、この原因の一つに、環境化学物質の関与が指摘されている。本研究で対象とする有機臭素系難燃剤(Brominated Flame Retardants; BFRs)は、家電製品や繊維製品の難燃剤として広く用いられる一方、脂溶性に富み、生物蓄積性も高いという性質から、室内環境などからの曝露による健康影響が懸念されている環境化学物質である。本研究では、BFRsの胎児期から小児期における曝露が、小児、あるいは成人の肥満、および肥満に起因する諸病態の発現・進展に及ぼす影響を評価し、その作用機構を解明することを目的とする。H25年度は、BFRsの一つであるデカブロモジフェニルエーテル(DecaBDE)の飲水曝露が、普通脂肪食、あるいは高脂肪食摂取下におけるマウスの肥満症の発現・進展に及ぼす影響を検討した。その結果、いずれの食餌においてもDecaBDE曝露による体重変化は認められなかったが、精巣上体周辺の脂肪組織は、高脂肪食摂取下におけるDacaBDEの低用量曝露で有意に減少し、対照群に比してインスリン抵抗性の改善傾向を認めた。一方、高脂肪食摂取下におけるDacaBDEの高用量曝露により、インスリン抵抗性は亢進する傾向を示した。空腹時血糖は、高脂肪食摂取下におけるDacaBDEの高用量曝露で有意に上昇した。以上の結果から、高脂肪食摂取下におけるDecaBDE曝露は、用量によって糖・脂質代謝に及ぼす影響が異なる可能性が考えられた。また、マウス前駆脂肪細胞3T3-L1を用い、DecaBDE曝露が脂肪細胞の分化過程に及ぼす影響について検討した結果、DecaBDE曝露による分化への影響は認められなかった。H25年度は、有機臭素系難燃剤(Brominated Flame Retardants; BFRs)の一つであるデカブロモジフェニルエーテル(DecaBDE)の経口曝露が、普通脂肪食、あるいは高脂肪食摂取下におけるマウスの肥満症の発現・進展に及ぼす影響を検討した。その結果、DacaBDE曝露により高血糖と軽微なインスリン抵抗性の亢進を認め、この傾向はDecaBDEの高用量曝露、および高脂肪食摂取でより顕著であった。本年度は、DecaBDE曝露による高血糖亢進の作用機序について、各組織における遺伝子発現変化をRT-PCR法を用いて解析した結果、DecaBDE曝露によって、インスリン感受性を亢進させるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)の肝臓における発現や、細胞への糖の取り込みに関与するグルコース輸送体4(Glut4)の骨格筋における発現などが減少していた。これより、DecaBDE曝露による糖代謝機能のかく乱が、高血糖亢進に寄与している可能性が考えられた。また、ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)の胎児期乳児期曝露による肥満症への影響についても実験を開始した。加えて、3T3-L1マウス前駆脂肪細胞とRAW264.7マウスマクロファージ様細胞の共培養系を確立した。本培養系を用いることにより、脂肪組織における脂肪細胞とマクロファージの相互作用に対するBFRsの曝露影響、および作用機構の解明が期待される。H26度までの成果として、有機臭素系難燃剤(Brominated Flame Retardants; BFRs)の一つであるデカブロモジフェニルエーテル(DecaBDE)の飲水曝露が、マウスの肥満症の発現・進展に及ぼす影響を検討した結果、高脂肪食摂取下におけるDecaBDE曝露により血糖値の上昇を認め、関連組織(肝臓、骨格筋、視床下部)における糖代謝機能のかく乱が寄与している可能性を示した。本年度はさらに、脂肪組織における遺伝子発現変化を検討した結果、高脂肪食摂取下におけるDecaBDE曝露により、褐色脂肪組織において、糖の取り込みに関与するmTORC2の発現低下を認めた。一方、白色脂肪組織では糖代謝および炎症に関連する因子の発現に有意な変化は認めなかった。また、ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)の胎児期から乳児期における曝露による仔マウスの肥満症に対する影響については、引き続き検討中である。マウス線維芽細胞株3T3-L1から分化誘導した脂肪細胞とマウスマクロファージ様細胞株(RAW264.7)を用いてHBCD曝露の影響を検討した結果、脂肪細胞の単独培養に対する影響は軽微であったが、マクロファージとの共培養系において、マクロファージの細胞数およびHBCD濃度依存的にMCP-1/CCL2の顕著な増加が認められた。加えて、マクロファージに由来するTNFαの産生もHBCD曝露濃度依存的に増加した。これより、HBCD曝露は脂肪細胞とマクロファージの相互作用を修飾し、炎症反応を亢進する可能性が示唆された。H27年度に予定していたDecaBDE曝露の再現性確認のための実験が計画時より遅れを生じ、さらに追加実験を行ったことから、データの解析および成果発表がH28年度に持ち越しとなった。昨年度に引き続き、胎児期から小児期における臭素系難燃剤ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)曝露が仔の肥満症に及ぼす影響について検討した。妊娠5日目から出産後21日目までHBCDを飲水曝露し、雌雄の仔獣に対して5週齢より高脂肪食、あるいは普通脂肪食を摂取させ、経時的変化(体重、摂餌量、摂食量)、および解剖時(20週齢)における影響を検討した。

その結果、雌雄の仔獣ともに体重、組織重量(肝臓、内臓脂肪組織、脾臓、脳)、耐糖能においてHBCD曝露による明確な影響は認められなかったが、高脂肪食を摂取した雌の仔獣において、HBCD曝露による空腹時血糖の上昇傾向を認めた。また、内臓脂肪組織から調製した間質血管細胞の構成をフローサイトメトリーで解析した結果、雌の仔獣においてマクロファージの割合が増加傾向を示した。脂肪組織における炎症反応への影響を評価するため、脂肪組織培養の実験系の確立を試みた。採取した内臓脂肪組織をSerum-free M199培地で3日間培養し、培養上清中のTNF-α、MCP-1、IL-6の分泌を確認した。本培養系を用い、前述の実験系における雌仔獣の腸間膜、または卵巣周囲脂肪組織を培養し、培養上清中のTNF-α、MCP-1、IL-6を測定した結果、いずれもHBCD曝露により増加する傾向が観察された(腸間膜脂肪組織のIL-6産生を除く)。以上の結果から、胎児期から乳児期におけるHBCD曝露により、成長後の肥満病態における血糖値上昇を促進し、その作用機序として、脂肪組織における炎症反応の亢進が一部寄与している可能性が考えられた。H28年度に予定していた人員が確保できなかったため、解析の一部を外注で対応したが、計画全体に遅延が生じた。加えて、研究分担者が別の研究課題で多忙を極めたため、年度当初に予定していた研究計画の一部が実施できなかった。昨年度までの検討で、臭素系難燃剤ヘキサブロモシクロドデカン(HBCD)の胎児期から乳児期(妊娠5日目から出産後21日目まで)の飲水曝露により、雌仔において空腹時血糖が上昇することが明らかとなった。今年度は、雌仔における高血糖の作用機序を解明するため、糖代謝・糖新生関連遺伝子の発現をRT-PCR法を用いて解析した。その結果、肝臓のGlut2, G6pc, Pck1、骨格筋および白色脂肪組織のGlut4, Insr, Irs1, Akt, Pi3kの発現は、いずれの項目においてもHBCD曝露による顕著な変化が認められなかった。一方、卵巣周辺白色脂肪組織由来間質細胞のフェノタイプを解析した結果、F4/80+CD11c+細胞の割合が増加傾向を示し、Ccl2, Ccr2, F4/80, Cd11cの遺伝子発現も上昇傾向を認めた。加えて、免疫担当細胞の供給源である骨髄における変化を解析した結果、骨髄液中のケモカインレベルについては、Vehicle+HFD群に比し、HBCD+HFD群で、CCL2/MCP-1の増加およびSDF-1αの増加傾向が観察された。これより、影響の程度は大きくないものの、HBCD曝露による骨髄環境の変化が脂肪組織の炎症を誘導し、血糖値上昇に一部寄与している可能性が示唆された。病理組織学的評価では、肝臓におけるHBCD曝露の影響は認めなかったが、雌仔のHBCD+HFD群においてVehicle+HFD群に比し、膵臓における小葉の脂肪化の亢進が観察された。以上の結果から、胎児期から乳児期におけるHBCD曝露は仔の糖代謝機能に影響する可能性が考えられ、その影響には性差があることが示唆された。概ね当初の研究計画どおりに進展しているが、各組織における解析に時間を要したため、DecaBDE曝露の再現性確認のための実験開始が予定より遅れたことから、成果発表はH27年度に行う予定である。
Household Finance-アジアにおける家計と金融の国際比較

アジアのHouseholdFinanceを巡って、日本、韓国、中国を中心に研究ネットワークの構築を行い、2000年代を中心にミクロ個票データを収集し、それをもとに分析を行った。アジア諸国の家計金融は、日本の家計金融とは対照的に積極的で、負債への傾斜が強い特性が明らかとなった。そのうえで、日本、韓国、中国、タイの家計金融について、金融情報、住宅金融、不動産市場、退職家計などの観点から、その特徴を明らかにした。研究は分析が始まったばかりで、未だ途上にある。近年アジア各国の家計に大きな変化が生じている。安全な貯蓄者から積極的な投資家へ、家計が変貌しつつある。それも単に自己資金を投資するにとどまらず、外から借り入れて投資をする家計がアジアでも広がりつつある。科研費プロジェクト「Household Finance-家計と金融の国際比較」の初年度として、資料ならびに統計整理を行った。その手始めに各国のFlow of Funds統計を収集し、その統計処理を行った。Flow of Funds統計は、先進国では整備されているが、アジア諸国では、まだ整備されていない国が多い。Flow of Fundsなどをつかったマクロ統計分析と並んで、ミクロデータ分析が近年の新しい研究潮流である。しかし先進国といえども、家計金融に関するミクロデータは個人情報問題もあり、分析データとして利用可能なものは少ない。日本でも徐々に情報開示が進められつつある。アジア各国における家計金融に関する個票データの利用可能性について調査を進めている。日本ならびに韓国についてデータの入手に努めた。今年度は、調査の中心を韓国におき、資料収集と人的ネットワークの構築に努めた。メンバー2名が韓国へ出張し、韓国銀行、ソウル大学を中心にヒヤリング、資料調査を果たした。とくに20023年のカード危機についてその概要、問題点を追求した。その過程で、韓国に見られた家計金融の変貌が、近年そのほかのアジアにおいても共通した現象であることが確認することができた。これまでのように自己資金を投ずるにとどまらず、外から借り入れ投資をする家計がアジアでも顕著にみられる。科研費プロジェクト「Household Finance-アジアにおける家計と金融の国際比較」の2年目の研究として、初年度につづき、統計並びに資料の収集と整理に重点を置いた。第一に、各国のFlow of Funds統計を収集し、その統計処理を行った。Flow of Funds統計は、マクロ金融統計として不可欠であるが、アジア諸国ではなお公表されていない国が多い。第二に、各国の家計に関するミクロデータの収集に努めた。近年の家計研究は、マクロデータ分析から個票データ分析へ焦点が移りつつある。日本でもようやく家計金融に関する個票データが入手可能となりつつあるにすぎない。アジア各国データの入手に全力を挙げている。ようやく日本、韓国、中国について収集のめどがついた。第三に、今年度は、昨年と同様、日本と韓国の研究者と研究会ならびにヒヤリング等を通じて交流を深め、ネットワークの構築に努めた。第四に、アジアを中心に、リーマンショック以降における家計金融の問題点を洗った。その結果、日本の家計と韓国の家計に対照的な違いが浮かび上がってきた。保守的な日本家計にくらべると、韓国における家計は積極性が顕著である。こうした家計における積極性は、近年のアジアのいくつかの国々でも共通してみられる現象である。これまで2年間、Household Financeを巡る国際比較研究を進めてきた。その間アジア各国における家計に関する個票データを中心に収集に努め、それら集めたデータをもとに分析を進めてきた。その成果の一部は、国際コンファランス「アジアにおける家計金融」において発表した(2013年2月23日法政大学比較経済研究所)。今年度の成果は以下のとおりである。(1)CambellによるHousehold Financeの提唱を中心に研究史を整理し、現代金融におけるHousehold Finance研究の重要性を展望した(靏見誠良)。(2)近年タイ家計における負債比率の上昇について職業別・地域別特徴を明らかにし、その間に起きた政治要因が影響したか否か、検討した(上坂豪)。(3)日本の家計において金融投資に関して新聞、ブログ、ファイナンシャルプランナーなど、どの情報源が有効かアンケート個票データを分析することにより特定した(郡司大志)。(4)日本の住宅借入において低所得家計が変動金利、高所得家計が固定金利を選ぶことをアンケート個票データ分析によって明らかにした(廉東浩)。(5)近年の韓国家計における負債問題を、不動産市場における実物市場と金融市場の連携の点から明らかにし、負債ストレス分析を試みた(Cho Man)。(6)韓国における退職家計において医療問題などの不安が、消費や資産投資行動に歪みを与えている点を個票データ分析によって明らかにした(Kyeongwon Yoo)。(6)中国においてカード発行が拡大しているが、それが銀行経営の効率性を高めた点を明らかにした(松田琢磨、袁媛)。

以上、個票データ分析はこれまで日本と韓国について試みたが、中国、タイについてはこれからの課題である。ここ2年間、ミクロデータの収集に努めたが、日本、韓国、中国についてめどがついた。24年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は、収集したデータをもとに分析し、報告論文にまとめる計画である。来年度内に成果を公表するのはやや時間的にきついかもしれない。
葉緑体の遺伝子組換えによるストレス耐性パンコムギの育成

タバコなどのナス科モデル植物で確立された葉緑体の形質転換技術をパンコムギに適用し、葉緑体の遺伝子組換え体を安定的に得る方法を確立すること、ならびにこの技術を用いて、強光や乾燥などの非生物的ストレスに強いパンコムギを育成することを目的に、以下の実験を行った。非生物的ストレスを受けた際、葉緑体内に発生する、有害な活性酸素分子種(ROS)の消去を担う、アスコルビン酸ペルオキシダーゼの遺伝子(apx)をパンコムギ用の葉緑体形質転換ベクターにクローニングし、そのDNAを遺伝子銃で未熟胚由来のカルスに射出して、組換え体を選抜したが、葉緑体ゲノムにapxを持つ組換えコムギは得られなかった。本研究は、モデル植物のタバコで確立された葉緑体の形質転換技術を作物であるパンコムギ(Triticum aestivum)に適用し、葉緑体の遺伝子組換えコムギを安定的に得る方法を確立することを大きな目的とする。また、この方法を用いて適切な遺伝子を葉緑体内で強発現させることにより、最終的には、強光や乾燥など、非生物的ストレスに強いパンコムギを育成することをめざしている。具体的には、葉緑体のアスコルビン酸-グルタチオン回路の酵素のひとつ、アスコルビン酸パーオキシダーゼの遺伝子(apx)を、パンコムギの葉緑体ゲノムに導入し、この遺伝子を強発現させることで、植物がストレスを受けた時に生じる有害な活性酸素分子種(ROS)を効果的に消去できる性質を付与しようとしている。今年度は、昨年度に構築した、apx遺伝子導入用の異なる4種類の葉緑体形質転換ベクター(葉緑体との相同領域はrbcL-ycf4あるいはrps12-16SrRNA、選抜マーカーはストレプトマイシンあるいはカナマイシン)DNAを大量調製し、外植片(パンコムギの未熟胚由来のカルス)にボンバードメントした。この実験に際し、昨年度に引き続き、今年度も鳥取大学乾燥地研究センターと共同研究を実施し、カルスからの再分化能力が高いとされるパンコムギの品種、アカダルマを夏から冬にかけて栽培した。この共同研究により、京産大のビニールハウスでは5月に、また鳥取大学乾燥地研究センターのグロースチャンバーでは12月に、それぞれ大量の未熟胚を調製可能な環境が整えられた。その結果、通算で約13,800個の未熟胚を調製することができ、70回を超えるボンバードメントを実施できた。未だ葉緑体の組換え体を得ることはできていないが、パンコムギを材料に、ある程度の規模で遺伝子導入実験を継続的に行うことはでいている。本研究は、モデル植物のタバコで確立された葉緑体の形質転換技術をパンコムギ(Triticum aestivum)に適用し、葉緑体の遺伝子組換え体を安定的に得る方法を確立することを大きな目的とする。また、この方法を用いて適切な遺伝子を葉緑体で強発現させることにより、強光や乾燥などの非生物的ストレスに強いパンコムギを育成することも目的とする。具体的には、葉緑体のアスコルビン酸-グルタチオン回路の酵素のひとつ、アスコルビン酸パーオキシダーゼの遺伝子(apx)をパンコムギの葉緑体ゲノムに導入し、この遺伝子を強発現させることで、ストレスにより発生する有害な活性酸素分子種(ROS)を効果的に消去させることをめざしている。今年度はまず、葉緑体へ導入する遺伝子を得るため、パンコムギの葉から調製した全RNAを鋳型に、RT-PCRによりapx遺伝子のcDNA断片をクローニングした。次にこのcDNA断片を加工し、異なる4種類の葉緑体形質転換ベクター(葉緑体との相同領域はrbcL-ycf4あるいはrps12-16SrRNA、選抜マーカーはストレプトマイシンあるいはカナマイシン)へクローニングすることで、apx遺伝子導入用のプラスミドコンストラクトを構築した。また、カルスからの再分化能力が高いとされるパンコムギの品種、アカダルマおよびBob Whiteを、京産大のビニールハウスおよび鳥取大学のグロースチャンバーで時期を違えて栽培し、5月と12月に未熟胚を大量に調製可能な環境を作った。その結果、通算で20,000個以上の未熟胚を調製することができ、300回を超えるボンバードメントを実施できた。今年度、葉緑体の組換え体は得られなかったが、パンコムギを材料に、ある程度の規模で遺伝子導入実験を行うことが可能となった。本研究は、タバコなどのナス科モデル植物で確立された葉緑体の形質転換技術をパンコムギ(Triticum aestivum)に適用し、葉緑体の遺伝子組換え体を安定的に得る方法を確立することを主な目的としている。またこの技術により、強光や乾燥などの非生物的ストレスに強いパンコムギを育成することも目的とする。

そのため、葉緑体のグルタチオン-アスコルビン酸回路の酵素遺伝子(アスコルビン酸パーオキシダーゼの遺伝子apxなど)を葉緑体ゲノムに導入して強発現させ、非生物的ストレスを受けた際に発生する有害な活性酸素分子種(ROS)を効率的に消去させることを目指した。これまで、apx遺伝子を持つコムギの葉緑体形質転換ベクターを作成し、遺伝子導入実験を行ってきたが、組換え体は得られていない。遺伝子導入のための外植片として葉を用いることができるタバコなどと比べ、コムギで組換え体を得るのが困難な要因として、外植片が開花後14日の未熟胚に限られることが挙げられる。未熟胚、およびこれを培養して得た黄白色のカルスでは、葉緑体が未発達であることが予想される。そこで今年度、転写因子のひとつGLK遺伝子に着目し、再分化可能な緑色カルスを生じる実験系統を作出することを試みた。今年度、鳥取大学の乾燥地研究センターのグロースチャンバーを拝借し、アカダルマとFielder両品種から、それぞれ6,619個と2,653個の未熟胚を単離した。これらを2,4-D(2mg/L)を含むLS培地に置床して25°Cで培養し、アカダルマから4,440個、Fielderから1,854個のカルスを得た。これらのカルスを遺伝子導入の外植片に用い、RT-PCRにより単離したコムギのGLK遺伝子とユビキチンプロモーターまたはアクチンプロモーターの下流につないだ導入ベクターを合計36プレート(プレートあたり約50個のカルスを置床)にボンバードした。現在、ビアラフォスを添加した培地で組換え体の選抜と再分化誘導を行っている。本研究の実験は、大きく、1)導入プラスミドコンストラクトの作成、2)遺伝子導入に用いる外植片の調製、の2つの過程に区分されるが、いずれの過程も、昨年度と今年度を通じて当初の目的を概ね達成できたと自己評価している。すなわち1)では、コムギ葉緑体ゲノムの塩基配列情報(AB042230)をもとに、導入領域(rbcL-ycf4、23SrRNA-ndhH、rps12-16SrRNA)および抗生物質耐性(ストレプトマイシン、カナマイシン)が異なる、合計6種類のパンコムギ葉緑体形質転換用ベクターの構築を終えているし、導入遺伝子に相当するapxは、6種類のベクターのうち4種類に組込むことができている(対照実験に用いるGFPは6種類すべてに組込むことができている)。これにより、導入領域や選抜マーカーの違いによる葉緑体形質転換効率の違いを調べるなど、将来の実験の基盤が整えられたと同時に、今年度はapx遺伝子を含むベクターDNAを、実際にコムギの外植片へボンバードメントすることができた。また2)については、昨年度に続き、鳥取大学乾燥地研究センターとの共同研究を実施し、現地のグロースチャンバーを借用して、パンコムギの品種アカダルマを栽培することで、12月に約13,000個の未熟胚を調製し、合計72回のボンバードメントを実施することが可能となった。また、次年度の5月に京産大のビニールハウスで栽培したアカダルマから未熟胚を大量調製するため、年末に植物材料の播種を終えている。昨年度から、通算で30,000個以上の未熟胚調製と400回を超えるボンバードメントを実施している。未だ葉緑体の組換え体が得られていないのは残念であるが、ある程度の規模で継続的に遺伝子導入実験を行うシステムは完成した。これが最終年度につながる成果であると考えている。本研究の目的を達成するために行う実験は、大きく、1)導入
HTLVー1 Tax蛋白によるcーfos発現誘導の分子機構

HTLVー1 Tax蛋白はcーfos遺伝子の発現を転写レベルで誘導する。cーFosはcーJunとヘテロ複合体を形成してTREに結合し転写を活性化する事から、ウイルス感染に伴うTRE結合活性の変化を検討した。ウイルス感染、非感染細胞の核抽出液を用いたゲルシフト法により、ウイルス感染細胞特異的なTRE結合活性の増強が検出された。このTRE結合活性の増強はAPー1familyをコ-ドする複数の遺伝子の活性化による事が明らかになつた。即ち,cーjun,junB,junD,cーfos及びfraー1 mRNAがウイルス感染細胞特異的に昂進していた。これらAPー1familyの中でjunBを除く、cーjun,junD,cーfos及びfraー1の発現はTax依存性を示した。APー1familyは細胞増殖の制御に関わる事が知られており,以上の結果はウイルス発がんにおけるAPー1の関与を示唆する.2、TaxによるCArG boxを介したIE genesのトランス活性化cーfos遺伝子上流領域内のCArG boxがTax応答性の最小配列として同定された。他のTax応答遺伝子群について検索したところ、egrー1及びegrー2のプロモ-タ-領域内にもCArG boxが存在し、実際にTaxによって活性化された。即ち、CArG boxはこれら3種類のIE genesに共通なTax応答性エンハンサ-である。ゲルシフト法を用いて、これら3種類のCArG boxに共通に結合する2種類の細胞性因子が検出された。1つは、SRF(serum response factor)、もう1つはSRFとp62のヘテロ複合体と推定された。HTLVー1感染・非感染細胞間でこれらCArGbox結合因子の質問・量的な変化は認められなかつた。以上の結果は,TaxがCArG boxに直接結合せず,細胞性転写因子(SRF,p62)を介して転写を活性化する事が示唆する.HTLVー1 Tax蛋白はcーfos遺伝子の発現を転写レベルで誘導する。以上の結果は,TaxがCArG boxに直接結合せず,細胞性転写因子(SRF,p62)を介して転写を活性化する事が示唆する.
反復配列DNAから成るヌクレオソームの分子構造とクロマチンにおける機能解析

反復配列(GGA/TCC)nを含む裸のDNA断片が、DNA-DNA複合体を形成することを見いだした。そこで先ず始めに、この現象がクロマチンレベルでも生じるか否かを再構成クロマチンおよびゲノム中の(GGA/TCC)nを用いて、DNA-DNA複合体形成の有無や配列特異性について解析した。更にゲノム中での局在性を調べることから、反復配列の構造と機能に関する検討を行った。そこから、以下の結果を得た。1.反復配列(GGA/TCC)nを含むDNA断片をtriplex affinity capture法により濃縮し、マウスゲノム中から19個のクローンを単離した。2.19個のクローンをゲノム上にマッピングした結果、13個の染色体上にマップされた。3.我々が開発した核クロマチンをヘテロクロマチン(He)とユウクロマチン(Eu)へ分画化する方法を利用し、分離した反復配列(GGA/TCC)nを含むDNA断片のHe/Euへの分を定量PCR法により調べた。約半数(9/19)はHe分画に多く分布し、残りはHeとEu両分画に同程度分布し、調べたものの中にはEu分画に多く分布するものはなかった。4.クローン化した各々のDNAを用いてDNA-DNA複合体が形成するか否かをゲル移動度シフトアッセイ法およびDNaseI保護マッピング法により調べた。標識したDNAは同種の非標識DNAと特異的にDNA-DNA複合体が形成され、その複合体形成は配列特異性を示した。5.上記4項の配列依存性に関し、構築した種々のプラスミドDNA(GGAリピートの回数を変えたものやGGAリピート近傍の配列を変えたもの等)を用いた再構成ヌクレオソームの解析から、DNA-DNA複合体形成はGGAリピートの反復回数に依存し、GGAリピート近傍の配列依存性もあることが確認された。反復配列(GGA:TCC)n含むDNA断片が、ヌクレオソームのレベルで三本鎖構造やDNA-DNA複合体を形成するかを調べるため、実験系に用いるモノヌクレオソームの再構成とその性質について検討した。反復配列(GGA:TCC)_<11>をDNA断片の種々な位置に含む230-163bPの^<32>P標識DNA断片を高塩濃度下でヒストンコア(H2A,H2B,H3,H4)と混和し、透析法で塩濃度を徐々に下げることによりモノヌクレオソームの再構成を行った。ヌクレオソームの形成の有無については、ゲル移動度シフト法とマイクロコッ力ルヌクレアーゼ(MNase)消化による146bpのヌクレオソームDNAコアの出現を指標とした。その結果、反復配列が中央に位置する163bpDNAはヌクレオソームの形成能が殆ど無く、反復配列が中央からずれた時にはヌクレオソーム形成が認められた。一方、既に強いヌクレオソーム形成能があることが報告されている反復配列(CAG:CTG)_<11>では、反復配列が中央に位置する163bpDNAでも効率よいモノヌクレオソーム形成がみられた。モノヌクレオソーム形成がみられる230-163bpDNAのヌクレオソームのポジショニングをMNase処理で生じた146bPのコアDNAを精製し制限酵素切断により調べたところ、230bpDNAではモノヌクレオソームのポジショニングが6ヶ所にみられ、193-163bpDNAでは両末端を含む2ヶ所にポジショニングし、反復配列(GGA:TCC)n含むDNA断片のポジショニングは特定の場所には位置しないことが分かった。