hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エキノコックス症に対するモノクロナル抗体の作成と臨床応用

1.本施設では北海道におけるエキノコックス症のほとんどすべての症例治療にあたり、また集検を積極的に行ってきた。60年度は26例、61年度は10例の本症の入院患者を扱い、肝切除を施行した。2)内野は本症の治療成績及び病態の特徴を解明し、1985年国際包虫症学会において発表した。さらにコットンラットにエキノコックスシスト内容を移植することにより肝エキノコックス実験モデルを作成することに成功し、1985年6月および1986年6月に日本肝臓学会において発表した。3.宇根等は、エキノコックス症に対するモノクロナル抗体を作成し、それがヒトおよびラットエキノコックス病巣に特異的に結合することを組織化学的に証明し、「外科治療」54巻5号に発表した。さらにラジオアイソトープラベルのモノクロナル抗体が、コットンラット病巣に集積することを証明し、1986年第27回日本消化器外科学会において発表、臨床応用の可能性を示唆した。4.宇根等はウェスタンブロット法により、確立したモノクロナル抗体5種類がコットンラットシスト抗原と反応することを証明した。抗原の分子量決定に向けて更に検索中である。5.【^(125)I】ラベル抗体を用いてエキノコックス症患者血清中の抗原を検出するシステムを確立すべく、抗体の精製よび【^(125)I】ラベルの至的条件を検索中である。
ネパール写本の画像データベースの構築

1.平成67年度科学研究費補助金一般研究(C)「画像データとテキストデータを連結させた写本データベースの構築」において構築したWindows3.1上で動作する画像データベースシステムを、現時点で最も普及しているオペレーティング・システムであるWindows95およびWindows98に対応したものに作り替えることを実現した。2.ネパール写本マイクロフィルムのCD-R(追記式で書き込み可能なCD-ROM)に焼き付けに関しては、当初の見積もりが1コマ65円であったのに対して、マイクロフィルムの状態が自動処理可能でない(コマの間隔が一定でない)という問題によって、大部分のものに関して1コマ130円が必要となったため、研究代表者および研究分担者が既に所有しているマイクロフィルムおよびInstitute for Advanced Studies of World Religions所蔵のマイクロフィルムから総計11131コマをデジタル画像データベースとして構築した。3.それらの写本資料の検索に必要な書誌データを入力した。4.入力した電子画像が多くのノイズを含んでいるため、ファイルサイズの圧縮の効果がなく、データが非圧縮の巨大なものとなった。その結果、一枚のCDでは一文献全体を納められなくなったため、DVD-RAMドライブを購入して、CD-R約30枚の元データをDVD-RAMディスク4枚に収めて、今後の保存と公開の基盤とすることとした。5.今後は、今までに入力したデータをインターネット上で広く研究者に公開できるように、原資料所蔵図書館との間に協定を結び、一写本画像のダウンロードごとに所蔵図書館にマイクロフイルム複写の際と同様の料金が送金されるようなシステムの開発に向けて努力していく予定である。1.平成67年度科学研究費補助金一般研究(C)「画像データとテキストデータを連結させた写本データベースの構築」において構築したWindows3.1上で動作する画像データベースシステムを、現時点で最も普及しているオペレーティング・システムであるWindows95に対応したものに作り替えることを実現した。2.ネパール写本マイクロフィルムのCD-R(追記式で書き込み可能なCD-ROM)に焼き付けに関しては、当初の見積もりが1コマ65円であったのに対して、マイクロフィルムの状態が自動処理可能でない(コマの間隔が一定でない)という問題によって、大部分のものに関して1コマ130円が必要となったため、研究代表者および研究分担者が既に所有しているマイクロフィルムから統計6347コマを焼きつけるにとどまった。4.平成67年度科学研究費補助金一般研究(C)「画像データとテキストデータを連結させた写本データベースの構築」で光磁気ディスクに保存した写本画像データと関連づけられているテキストデータをCD-RW(消去可能かつ再書き込み可能なCD-ROM)に焼き付ける点に関しては、CD-Rドライブの性能が2倍に向上するのを待って(これにより作業時間が半分に短縮するため)購入したため、現在作業中であり、年度内一杯に終了する予定である。5.部分的画像データベースを取り敢えずMOディスク上に構築して容易な使用体系の実現に向けてテストを実行中である。1. Windows98の出現に対応して、昨年度にWindows95に対応するものとした画像データベースシステムから、Windows98用のバージョンも作成した。2.ネパール写本マイクロフィルムのCD-R(追記式で書き込み可能なCD-ROM)に焼き付けに関しては、当初予定していた高岡コレクションが独自に電子画像化を進めているとのことであるので、無用な重複を避けて、代わりにInstitute for Advanced Studies of World Religinos所蔵のマイクロフィルムを対象とすることに変更し、そのうちから、4784コマを電子化した。

5.今後は、今までに入力したデータをインターネット上で広く研究者に公開できるように、原資料所蔵図書館との間に協定を結び、一写本画像のダウンロードごとに所蔵図書館にマイクロフィルム複写の際と同様の料金が送金されるようなシステムの開発に向けて努力していく予定である。
ドコサヘキサエン酸の血管細胞機能に及ぼす影響

本研究課題の目的は、ドコサヘキサエン酸(DHA)の循環器疾患に対する予防薬あるいは治療薬としての可能性を探るために、DHAの血管細胞主に血管平滑筋細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることであった。そこ培養血管平滑筋細胞を用いて細胞増殖性及びアンギオテンシンIIにより引き起こされる細胞肥大に対するDHAの影響をフローサイトメトリーにより検討したが有意な影響は認められなかった。そこで次に平滑筋細胞の細胞内カルシウム代謝と一酸化窒素(NO)産生に対するDHAの影響を検討した。脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)及びその対照動物であるウィスター京都ラット(WKY)由来の培養血管平滑筋細胞をDHA含有培養液で培養処理したところ、アシギオテンシンIIやセロトニンなどの血管収縮性物質による細胞内カルシウム濃度上昇作用がWKYでは有意に抑制されたが、SHRSPでは抑制されにくかった。この抑制作用は電位依存性チャネルなどのカルシウムチャネルの抑制によるが、ストアー作動性チャネルの抑制ではないことが示唆された。また、誘導型NO合成酵素(iNOS)によるNO産生に対するDHA処理の影響を検討したところ、WKYに比べてSHRSPではIL-1β刺激により誘導されるNO産生能が低下していた。DHAと共に培養することにより、WKY由来の血管平滑筋細胞ではIL-1β刺激によるNO産生量が有意に増加したが、SHRSPでは影響が現れにくかった。NOS発現に対するDHAの影響をウエスタンプロット法を用いて検討し、DHAはWKYにおいてiNOS蛋白発現を促進したが、SHRSPでは影響が認められなかった。また、DHAにはNOによると考えられる細胞障害を抑制することも示唆された。これらのDHAの平滑筋細胞に及ぼす作用がDHAの循環器疾患に対する有用性に関連していることが示唆された。本研究課題の目的は、ドコサヘキサエン酸(DHA)の循環器疾患に対する予防薬あるいは治療薬としての可能性を探るために、DHAの血管細胞機能に及ぼす影響を明らかにすることである。本年度の研究計画は、平滑筋細胞の細胞内カルシウム代謝と一酸化窒素(NO)産生に対するDHAの影響を検討することであった。そこで、ウィスター系ラット大動脈由来の血管平滑筋細胞をDHA含有培養液で培養処理したところ、アンギオテンシンIIやセロトニンなどの血管収縮性物質による細胞内カルシウム濃度上昇作用が有意に抑制された。この抑制作用は電位依存性カルシウムチャネルなどのカルシウム流入チャネルの抑制によることが示唆された。次年度ではその作用機序をさらに明らかにする計画である。また、脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)及びその対照動物であるウィスター京都ラット(WKY)由来の培養血管平滑筋細胞を用いて、誘導型NO合成酵素(iNOS)によるNO産生に対するDHA処理の影響を検討した。WKYに比べてSHRSPではIL-1β刺激により誘導されるNO産生能が低下していた。DHAと共に培養することにより、SHRSP由来の血管平滑筋細胞ではIL-1β刺激によるNO産生量が有意に増加することが明らかとなった。次年度では、iNOS発現に対するDHAの影響をウエスタンブロット法を用いてさらに明らかにする計画である。さらに血管内皮細胞内カルシウム代謝およびNO産生に対するDHAの影響についても検討する予定である。平成10年度の研究計画は、9年度に引き続き、平滑筋細胞の細胞内カルシウム代謝と一酸化窒素(NO)産生に対するDHAの影響をさらに検討することであった。脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)及びその対照動物であるウィスター京都ラット(WKY)

由来の培養血管平滑筋細胞を用いてDHA含有培養液で培養処理したところ、アンギオテンシンIIやセロトニンなどの血管収縮性物質による細胞内カルシウム濃度上昇作用がWKYでは有意に抑制されたが、SHRSPでは抑制されなかった。また、誘導型NO合成酵素(iNOS)によるNO産生に対するDHA処理の影響を検討したところ、WKYに比べてSHRSPでIL-1β刺激により誘導されるNO産生能が低下していた。DHAと共に培養することにより、WKY由来の血管平滑筋細胞ではIL-1β刺激によるNO産生量が有意に増加したが、SHRSPでは影響が認められなかった。iNOS発現に対するDHAの影響をウエスタンブロット法を用いて検討し、DHAはWKYにおいてiNOS蛋白発現を促進したが、SHRSPでは影響が認められなかった。また、DHAにはNOによると考えられる細胞障害を抑制することも示唆された。細胞増殖性及びアンギオテンシンIIにより引き起こされる細胞肥大に対するDHAの影響をフローサイトメトリーにより検討したが有意な認められなかった。
東南アジアの保存微生物の評価と多様性への対応に関する調査研究

1992年の生物多様性条約発効以来、微生物を含む生物資源の保存と持続的利用による医療、食糧、環境問題への貢献が重要となり、科学技術基本法やバイオテクノロジー戦略会議においてもその重要性が示されてきた。一方、東南アジアの微生物資源は減少の傾向にあり、資源の保存が重要な課題である。資源利用国である我が国にとっても、東南アジアの資源の持続的利用は戦略的に重要である。東南アジアの微生物資源は多様であるといわれ、多様性を推測させる報告も存在していたが、組織的に行った多様性の研究結果は無かった。本調査研究では、アジア諸国に於ける微生物資源の保護と持続的利用に資するために、微生物資源の多様性と利用の可能性評価を行い、東南アジア微生物資源の利用への指針と、それら情報を提供することを目的に下記の4点について行った。1)東南アジア由来微生物資源の各国における保存状況の調査では、タイ、ベトナム、フィリピン、台湾の複数の微生物保存施設、研究室を訪問し調査した。2)分子系統解析による微生物の多様性解析を総合的に行いその評価を行った。窒素固定細菌、放線菌、古細菌、子嚢菌酵母、担子菌酵母、糸状菌と幅広くその多様性を調査し、未知微生物が多く存在していることがわかった。特に、海外由来の新規微生物については、原産国研究者と共同して、学術論文への新規微生物の発表を行った。3)微生物資源の持続的利用を目指した生理活性物質生産株の探索と解析を行った。大阪大学と北里大学とタイ・マヒドン大学の3者の共同で、タイ・土壌より生理活性物質を生産する放線菌のスクリーニングを行った。4)収集情報の共有化と公開については、新規微生物については、理化学研究所・バイオリソースセンターへの微生物の寄託がされた。本プロジェクトを通し、東南アジア諸国の微生物多様性研究者と交流を深め、多数の新規微生物の発見と公開を行うことができた。タイ王国では、マヒドン大学,カセサート大学,TISTR, Biotechを訪問し、交流を深めると共に、土壌微生物株、酵母菌、乳酸菌、腸内細菌株の保存株の情報とそれぞれの研究機関で行われている微生物を対象にした研究内容について情報を入手した。また、実際に微生物の分離も積極的に行った。ベトナムでは、ハノイ大学への訪問を行った。微生物保存機関としては、近年ハノイ大学に設置された、Center of Biotechnologyを訪問し、保有する微生物株の保存状況を入手すると共に、今後の共同研究の方向性について話合った。フィリピンでは、フィリピン大学ロスバニオス校バイオテクノロジー研究所を訪問し、古細菌、好塩菌、放線菌について、保存菌株の状況、共同研究の方向性について相談を行った。台湾では、国立中興大学、中央研究院植物研究所、食品工業発展研究所生物資源保存研究センターを訪問し、糸状菌についての研究の情報交換と今後の共同研究の方向性について打ち合わせを行った。国内では、これまで東南アジア各国より分離した微生物株の整理並びに同定を行った。酵母菌株については、新種の報告を行った。機能微生物のスクリーニング法の情報交換を行い、今後、マヒドン大学とカセサート大学それぞれと、機能微生物に関する研究(一次スクリーング)を進めていくことを決定した。今年は、タイ、マヒドン大学内に設置している大阪大学、東南アジア共同研究拠点において、土壌より窒素固定菌と放線菌のスクリーングを、タイの研究者と共に行った。現在、微生物の同定を行うと同時に二次代謝産物のスクリーングも行っている。台湾並びに東南アジア5ヵ国との交流を行うと同時に、共同研究を通じ保存微生物株の把握と評価を行うことができた。

特に、共同研究によりいくつかの学術的成果を得ることができ、微生物資源の多様性とその保護を視野に入れた東南アジア諸国への対応の一つの形を得ることができた。具体的には、東南アジア諸国研究機関で保存されている微生物の評価を行うことにより、国内研究者による技術提供を行うと同時に、国内微生物保存機関への微生物株の委託を可能とした。さらに、新規微生物もいくつか発見することができ、これらについては学術雑誌への投稿を行った。タイでは、マヒドン大学、カセサート大学、スラナリ大学、バイオテクノロジー研究所を訪問し、保存微生物:窒素固定細菌、病原性腸内細菌、放線菌、酵母菌の評価を行った。また、タイで分離された放線菌について、その生理活性物質の探索と同定のために研究者を招聘し、技術提供と共同研究を行った。その結果、抗寄生虫活性を示す活性物質の単離精製を行うことができた。フィリピンでは、フィリピン大学・ロスバニオス校及びデリマン校を訪問し、保存されている古細菌の評価とその多様性評価を行った。フィリピン大学・ミンダナオ校の研究者を日本に招き、窒素固定細菌の取り扱い並びに、同定方法の手法の指導を行った。ベトナムでは、ベトナム国立大学・ハノイ大学の研究員を招聘し、ハノイ校保存微生物の評価のための同定実験を日本で行った。新規酵母の発見に至った。また、ベトナムを訪問し、乳酸菌についての多様性評価を行った。台湾では、中央研究院(台北)、生物資源保存及研究中心(新竹)、国立中興大学(台中)を訪問し、糸状菌の同定、評価を行った。タイプ由来株が現存していないものについては、分離を試み、epitype strainの提案を行った。国立台湾大学に保存されている乾燥標本の観察を行うことにより、保存糸状菌の評価と今後の共同研究について具体案の作成を行った。インドネシア・ジャカルタ大学の研究者と共に、乳酸菌のアミノ酸生成に関する知見を得、リジン高生産株の育種に向けて共同研究を行った。平成17年11月にタイ・バンコクで開催されたタイバイオテクノロジー学会において、本プロジェクトが主催するセミナー"Biodiversity and Bioresources in Microbiology"を開催した。研究分担者8名と国内招聘1名計9名の日本人が参加し、タイ研究者8名を加え、微生物多様性と微生物資源について発表を行った。タイには、未だ未知微生物が豊富であることと、将来有用な微生物資源が多数存在していることの可能性が示唆され、今後、日本の微生物研究者がいかに他国と微生物資源の確保という点において協力していかなければならないかについて、意見が交わされた。将来の微生物研究には、それぞれの自国に微生物を安全に正確に保存し、分離者(分離国)の権利を確保しつつ、他の研究者や利用者に提供するシステムの構築が重要であることが確認された。バイオテクノロジー研究者のネットワーク構築をより強固にすることがきた。大阪大学では、微生物の種多様性解析のためにタイ・ナレスワン大学教員を招聘し、土壌酵母の多様性研究を共同に行うと共に、研究成果のとりまとめを行った。新たに2種の新規酵母菌の同定を行った。
有機錫化合物及びレクチン類のDNAへの影響

有機錫化合物とレクチン類のDNAに及ぼす影響を培養細胞の系で検討を行なった。1)細胞の培養:白血病細胞株8種類、乳がん細胞株1種類の培養が可能となった。2)有機錫化合物及びレクチン類の細胞増殖への影響:有機錫化合物は骨髄系細胞に比べリンパ系細胞株に毒性が強く表れ、中でも細胞株(Molt-3,Molt-4)に強い毒性が見られた。分化の進行度の面からは未分化の細胞に毒性がより強く表れた。トリブチル錫は10^<-10>Mの低濃度でMCF-7乳がん細胞株を増殖させ、内分泌撹乱化学物質作用を有することが観察された。3)分化誘導への影響:DMSOによるFriend細胞の分化誘導はジブチル錫とDMSOを事前に混合して培養細胞に添加すると、事前の混合時間が長い程、分化誘導に強い抵抗性(80%)がみられた。この現象の生物学的意義についての解析は意義があると思われる。4)糖鎖への影響:ウサギ血清中より入手したレクチンはモルモット補体の存在下でウサギ血球を溶血した。この性質はマンノース結合レクチンや、リン脂質結合レクチンの性質とも類似しており、またアミノ酸分析からはIgMとも考えられ、抗菌、抗ウイルス性などの生来から備わっている生体防御系に関与している可能性があるが、更なる精製及び機能の解析が必要である。5) DNA及び8-OHdGの分析:全DNAを細胞から抽出し、NonRI法であるDIG法での検出を試みたところ、RI法並の感度で検出が可能であった。またDNA損傷物質の尿中8-OHdGを陽イオン、陰イオン交換樹脂で前処理し、HPLCによる高感度分析の検討を行ったが、前処理方法の回収率に改善の余地がみられた。培養細胞を用いて有機錫化合物やレクチン類の添加時のDNAへの影響を,DNA損傷物質(8-CHdG)量の変化や遺伝子発現の面より解析することを目的とした.平成8年度の計画のうち1.細胞の培養では白血病細胞株8種類の培養が可能となった.2.有機錫化合物,レクチン類の細胞増殖への影響ではまず有機錫化合物では分化度の異なりも考慮に入れ検討を行った.リンパ系細胞株は骨髄系細胞株に比らべ有機錫化合物の毒性を受けやすく,中でもT細胞株(Molt-3,Molt-4)により強い毒性が表われた.また分化の進行程度の面からみると,未分化の細胞により毒性が見られる傾向が観察された.有機錫化合物の中ではジブチル錫の毒性が強く,ジブチル錫による胸腺萎縮のin vivoの報告などと考え併わせると,興味深い結果が得られた.3.有機錫化合物,レクチン類の分化誘導活性の有無及びDMSOなどの分化誘導剤による分化誘導に対しての抵抗性の有無の検討では,有機錫化合物では分化誘導活性が見られなかった.しかしDMSOによるFriend細胞の分化誘導実験ではジブチル錫に1020%の抵抗性が見られた.その機構を検討したところ,ジブチル錫とDMSOを事前に混合したものを培養細胞に添加すると,事前の混合時間が長い程,強い抵抗性(80%)がみられた.今後はこの現象の生物学的意義について解析する予定である.有機錫化合物とレクチン類のDNAに及ぼす影響を培養細胞の系で検討を行なった。有機錫化合物とレクチン類のDNAに及ぼす影響を培養細胞の系で検討し,8-ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)及び癌遺伝子による解析を行うことを目的に実験計画を立てた。培養細胞としては白血病細胞(HL-60細胞,M1細胞,u-937細胞,Molt-

3細胞,Molt-4細胞,Friend細胞など)を用いたところ,有機錫化合物,特にジブチル錫はT細胞株(Molt-3,Molt-4)に強いダメ-ジを与えことが分かり、in vivoの報告とも一致した。ジブチル錫のT細胞,特に未熟なT細胞への傷害のメカニズム解明に,分化度の異なるT細胞株の使用が有用であると思われる。Friend細胞より全DNAを抽出し,Non RI法であるDIG法での検出を試みたところ,RI法並の感度で検出出来た。今後はジブチル錫添加時のDNA損傷を癌遺伝子をプローブとして解析する予定である。一方、in vivo実験系においてDNAの損傷があると,尿中に8-OHdGが検出され,DNA損傷の指標となりうることが報告されている。そこで今年度は尿中8-OHdGの検出を陰イオン・陽イオン交換樹脂前処理後に高速液体クロマトグラフィーにより行なった。尿に標品の8-OHdGを添加し,高速液体クロマトグラフィーの検出条件を検討したところ,測定を行なえるようになった。しかし前処理からの全行程を行うと回収率が2030%と低く,実際に正確に測定するにはまだ改善の余地が残された。平成810年度の研究計画実施中に内分泌撹乱化学物質問題が大きなトピックスとして浮上してきた。そこで本年度は当初の研究計画の他にその視点からも研究に取り組んだ。1)有機錫化合物の細胞増殖への影響:現在、本物質も内分泌撹乱化学物質の一種とされている。そこで平成8,9年度の細胞株の他にエストロジェンレセプターを持ち、エストジェンの存在により増殖するMCF-7乳がん細胞株の増殖に及ぼす影響についても観察を行った。トリブチル錫は10^<-10>Mの低濃度であってもMCF-7乳がん細胞を増殖する作用を持ち、その程度はトリフェニル錫よりも強かった。2)糖鎖による解析の準備:ウサギ血清中より分離精製したレクチンは我々のみが入手している新種のレクチンであり、その性質について解析を行った。そのレクチンのアミノ酸分析では、N末端が可変領域と一致し、またこのレクチンとモルモットの補体の両方が存在すると、ウサギの血球を溶血した。これらのことによりこのレクチンはIgMの性質を有していると考えられる。植物由来のリン脂質結合レクチンやマンノース結合レクチンは補体の存在により溶血作用があり、抗菌、抗ウイルス作用があると報告されている。リン脂質結合レクチンは生来から生体に備わっており、その機能として生体防御系に関与していると考えられている。これらのレクチンは動物に存在しており、我々の入手しているレクチンも同様の機能を有していると思われるが現段階の精製純度ではIgGが混入していることも考えられ、更なる精製と機能の解析が必要である。
一酸化窒素(NO)による実験的脈絡膜新生血管の抑制効果の証明

1.一酸化窒素(NO)の培養網膜色素上皮細胞の遊走能に対する作用培養皿上で培養した網膜色素上皮細胞(RPE)を擦過した後に、培養液中にNO供与体であるs-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン(SNAP)10^<-2>Mを投与しても、対照群と比較してRPEの修復過程には差がなかった。即ち、NOはRPEの遊走能に影響を及ぼさなかった。また、この時のRPEのチミジン取り込み量についても有意差がなかった。2. NOの培養網膜色素上皮細胞のゲル収縮能に対する作用24穴培養皿に1型コラーゲンゲル培地を作成して1×10^5個/mlのRPEをゲル上で培養した。24時間後にコラーゲンゲルを培養皿から剥離して、培養液中に10^<-2>M、10^<-4>M、10^<-6>Mの濃度になるようにSNAPを添加した。添加3、6、12、18、24時間後にコラーゲンゲルの面積をコンピューターで測定して、ゲル収縮率((培養皿の面積-コラーゲンゲルの面積)/培養皿の面積)を計算した。添加12時間後でSNAPを添加しなかった群では、ゲル収縮率は42.6±4.3%であった。一方、10^<-2>MのSNAPを添加した群では、ゲル収縮率は28.6±2.2%で両群の間には統計学的に有意差がみられた。SNAPは量依存的にゲル収縮率を低下した。即ち、SNAPは培養ラットRPEのゲル収縮能を抑制した。眼内炎症で産生が亢進するNOは、RPEが主役を演じる増殖性硝子体網膜症を抑制している可能性が示唆された。以上、一酸化窒素が網膜色素上皮細胞の遊走能には影響せずに、ゲル収縮能を抑制したことは非常に興味深い。今後、一酸化窒素の網膜色素上皮細胞接着能に対する影響を検討して、in vivoの研究を行う予定である。1.ラット網膜色素上皮細胞の培養当初、ニワトリ胚の網膜色素上皮細胞を培養予定であったが、購入および取り扱いが容易な幼若ラットの網膜色素上皮細胞を培養することにした。次いで、眼球を0.1%trypsin入りBSS溶液に37°Cで50分間浸した後、前眼部を切除した。実体顕微鏡下で眼球杯から、網膜色素上皮を出来るだけシート状に脈絡膜から分離して、10%ウシ胎児血清添加MEM溶液に採取した。Calcium/Magnesium Free BSS溶液で3回洗浄後、網膜色素上皮細胞を10%ウシ胎児血清添加MEM溶液に懸濁して培養皿にまき、37°Cで培養した。2.網膜色素上皮細胞の確認眼球から分離して培養した細胞が網膜色素上皮細胞であることを確認するために、一次抗体にサイトケラチン抗体を用いて免疫染色を行った。培養細胞はサイトケラチン抗体に陽性であったことから上皮系の細胞であることが確認され、網膜色素上皮細胞であることが明らかになった。3.培養網膜色素上皮細胞への障害と修復過程の観察培養した網膜色素上皮細胞に対して、ピペットの先で各培養皿毎に同じ幅の擦過領域を作成し、実体顕微鏡を用いてその修復過程を観察した。4.今後の研究の展開今回、当教室にて確実なラット網膜色素上皮細胞の培養系を確立できたので、今後は一酸化窒素(NO)自発発生化合物であるS-ニトロン-N-アセチル-DL-ペニシラミン(SNAP)の各種濃度溶液でインキュベートして、障害された網膜色素上皮細胞の増殖に対するNOの影響を観察する。その後、NO消去剤(Carboxy-PTIO)とNO合成酵素阻害剤(N^G-ニトローL-アルギニン)の影響を観察する。

眼内炎症で産生が亢進するNOは、RPEが主役を演じる増殖性硝子体網膜症を抑制している可能性が示唆された。以上、一酸化窒素が網膜色素上皮細胞の遊走能には影響せずに、ゲル収縮能を抑制したことは非常に興味深い。今後、一酸化窒素の網膜色素上皮細胞接着能に対する影響を検討して、in vivoの研究を行う予定である。
超新星爆発の理論と高密度核物質の状態方程式

星の進化の最終段階である超新星爆発は、天文学のみならず、核物理学においても非常に興味深い現象である。それは、超新星物質の状態方程式を通して、地上の実験と共に核物質の理論を研究・検証するための絶好の機械を与えてくれるからである。一方、超新星爆発の理論は、SN1987Aからのニュートリノの検出によって大筋では正しいことが証明されたが、現在もその爆発機構を明らかにできずにいる。最近になって、核物質の状態方程式が超新星爆発に重要であることが指摘され、それに刺激されて核物質の理論的研究が進んだ。その結果、超新星物質の現実的な状態方程式が計算されるようになった。更に、以前から、最も高密度になるコアの中心部分では、パイオン凝縮やフォーク物質等への相転移の起こることが指摘されており、相転移を考慮した状態方程式の計算も進んできた。本研究の目的は、新しく計算された超新星物質の状態方程式が超新星の爆発過程に与える影響を調べ、超新星の物理を明らかにすると共に、現在の混迷した理論の現状を打開し、超新星の爆発機構を解明することにある。研究は、すべて数値シミュレーションによる。平成7年度は、小型のワークステーションを導入して研究環境を整備し、プログラムの開発と数値シミュレーショを行う準備をした。現実的な超新星物質の状態方程式や、相転移のある場合の状態方程式の性質を調べることは既に終了したので、現在、それらを用いて超新星爆発のシミュレーションを行う準備を進めてする。特に、ニュートリノ輸送と電子捕獲反応の計算プログラムの開発中であり、完成後、シミュレーションに取り組む予定である。
カンナビノイドと他の脂質メディエーターとのクロストーク

主要な内因性カンナビノイドである2-AGおよびその代謝産物が脳機能にどのような影響を及ぼすのかを調べるため、ラット培養海馬ニューロンを用いた電気生理学的実験およびマウスの3レバー・オペラント課題の行動解析を行い、以下の結論を得た。(1)2-AGおよびその代謝産物は、カンナビノイドCB1受容体を介さずにシナプス活動を上昇させる。(2)CB1受容体の基礎的活性はシナプス活動の維持に寄与している。(3)2-AG/CB1受容体シグナルは、行動の柔軟性に関与している。内因性カンナビノイドが記憶・学習などの脳機能に重要な役割を担っていることが次第に明らかになってきた。本研究では、主要な内因性カンナビノイドである2-AGについて、その働きの全貌を明らかにすることをめざしている。本年度は以下の2つの実験を行った。(1)2-AG投与によるシナプス活動上昇のメカニズムの解明:我々はすでに、培養海馬ニューロンを用いて、2-AG合成経路とカンナビノイド受容体を阻害した条件で2-AGを投与すると、シナプス活動が促進されることを見出している。そこで、そのメカニズムを明らかにするために、静止膜電位、活動電位閾値、膜の各イオンコンダクタンス、興奮性および抑制性シナプス後電流の振幅、自発性シナプス後電流の発生頻度などに対する2-AG投与の効果を調べたところ、自発性シナプス後電流の発生頻度が2-AG投与により上昇したが、その他の要素は変化しないことが判明した。(2)2-AG分解産物の関与について:2-AG投与によるシナプス活動上昇作用が、2-AGそのものによるのか、あるいはその代謝産物によるのかを明らかにするために、2-AG代謝経路の酵素に対する阻害剤の効果を調べた。その結果、2-AGを加水分解してアラキドン酸を生成する酵素であるMGLの阻害剤により、2-AGの効果が部分的に抑制されることを見出した。また、アラキドン酸投与は、2-AG投与の場合と同様に、シナプス活動を上昇させる作用があることが確かめられた。以上より、2-AGは、主にその分解産物であるアラキドン酸を介してニューロンの興奮性を上昇させ、シナプス活動を促進させると考えられた。本研究では、内因性カンナビノイドおよびその代謝産物がシナプス活動にどのように関わっているのかを明らかにすることをめざしている。昨年度は、2-AG投与の効果について調べた。本年度は、細胞自身が生成・放出する内因性カンナビノイドの作用を調べるために、以下の3つの実験を行った。(1)CB1受容体を阻害した条件下で、自発性シナプス後電流(sPSC)の発生頻度を種々条件下で測定し、2AG合成酵素阻害剤処理の有無で比較した。その結果、活動が低い条件下では両群で差はみられなかったが、活動が高い条件下では、処理群の方がsPSC発生頻度が有意に低いという結果が得られた。よって、CB1受容体が働かない条件下では、活動依存的に2-AGが放出されると、活動性がさらに高まることが確かめられた。(2)sPSCの発生頻度を種々条件下で測定し、CB1受容体阻害剤処理の有無で比較した。その結果、活動が低い場合も高い場合も、処理群の方がsPSC発生頻度が著しく低いという結果が得られた。よって、内在性の内因性カンナビノイドによるCB1受容体の活性化は、シナプス活動の維持に寄与している可能性が考えられた。(3)実験2で得られた「CB1受容体の活性化によるシナプス活動の維持」に関与する内因性カンナビノイドが2-AGなのかアナンダミドなのかを明らかにするために、CB1受容体阻害剤の代わりに2AG合成酵素阻害剤を用いて同様の結果が得られるのかどうか調べた。その結果、同様の作用はないことが判明した。よって、「CB1受容体の活性化によるシナプス活動の維持」に関与する内因性カンナビノイドはアナンダミドである可能性が高いと考えられた。以上より、内因性カンナビノイドによるシナプス活動調節作用には、アナンダミドによるCB1受容体を介する作用と、2AGあるいはその代謝産物によるCB1受容体を介さない作用とがあると考えられた。交付申請書の「平成27年度の研究実施計画」に記載されている実験2つの内の1つはすでに平成26年度に前倒しで行っている。よって残り1つを行い、「細胞自身が生成・放出する2-AGの興奮上昇作用」を確認した。しかし、その作用は小さかったため、そのメカニズムを解明する実験には進まずに、代わりに、細胞自身が生成・放出する内因性カンナビノイドのCB1受容体を介する作用について調べた。その結果、驚いたことには、「CB1受容体の活性化によるシナプス活動の維持」にアナンダミドが関与している可能性を示す予想外の結果を得た。以上より、ある部分に関しては「3.やや遅れている」ものの、「1.当初の研究以上に進展している」部分もあり、総合評価として、「2.おおむね順調に進展している」と判断した。カンナビノイド系はさまざまな脳機能に関与している。本研究では、培養海馬ニューロンを用い、内因性カンナビノイドおよび関連脂質メディエータの働きを明らかにすることを目指した。本年度はCB1受容体を介してネットワーク活動を維持するメカニズムを電気生理学的方法にて検討した。また、動物行動実験にて内因性カンナビノイド2-AGの運動学習における役割を調べた。得られた結果は以下の通りである。(1)CB1

受容体アンタゴニストであるAM281とNESSを用い、ネットワーク活動に及ぼす影響を調べた。逆アゴニスト作用を有するAM281処理の場合は、ネットワーク活動の低下がみられたのに対し、逆アゴニスト作用を有しないNESSの場合は、ネットワーク活動はむしろ高まる傾向がみられた。したがって、CB1受容体の基礎的活性がネットワーク活動の維持に関与すると考えられた。(2)AM281の効果における抑制系(GABA)およびIhチャネルの関与について調べた。AM281の急性投与の効果は,GABAA受容体阻害剤で消失することから、ネットワーク活動の低下は抑制系の促進が原因であると考えられた.一方、AM281の前処理の効果は、GABAA受容体阻害剤で消失しないことから、興奮系(グルタミン酸)の低下も関与すると考えられた。また、Ihチャネル阻害剤の急性投与はネットワーク活動に影響を及ぼさなかったことから、AM281の急性投与の効果はIhチャネルを介さないと考えられた。(3)2-AG合成酵素欠損マウスのレバー押し行動を調べたところ、CB1受容体欠損マウスと同様に、環境の変化に対応して行動を変える柔軟性が低下していることが示唆された。以上より、CB1受容体や内因性カンナビノイドが、神経ネットワーク活動の調節や行動の柔軟性に関与していることが明らかとなった。主要な内因性カンナビノイドである2-AGおよびその代謝産物が脳機能にどのような影響を及ぼすのかを調べるため、ラット培養海馬ニューロンを用いた電気生理学的実験およびマウスの3レバー・オペラント課題の行動解析を行い、以下の結論を得た。(1)2-AGおよびその代謝産物は、カンナビノイドCB1受容体を介さずにシナプス活動を上昇させる。(2)CB1受容体の基礎的活性はシナプス活動の維持に寄与している。(3)2-AG/CB1受容体シグナルは、行動の柔軟性に関与している。交付申請書の「平成26年度の研究実施計画」に記載されている実験のほとんどを行うことができた。結果は大半がネガティブであったため、「メカニズムの解明」はできなかったが、大きな前進となった。また、一部については、平成27年度の研究実施計画に記載されている内容(アラキドン酸を投与し、2-AGと同様の作用を誘導することができた)を前倒しで行うことができた。以上より、ある部分に関しては「3.やや遅れている」ものの、「1.当初の計画以上に進展している」部分もあり、総合評価として「2.おおむね順調に進展している」と判断した。これまでの実験結果より、従来より知られている「2-AGによるCB1受容体を介するシナプス活動抑制作用」の他に、「2-AGあるいはその分解産物のアラキドン酸等によるCB1受容体を介さないシナプス活動上昇作用」と「アナンダミドによるCB1受容体を介するシナプス活動上昇作用」の二つがある可能性が示された。今後は、そのメカニズムの解明をめざす。特に、2-AGとアナンダミドの作用の違いの原因を調べる。両者は共にCB1受容体を活性化させるため、類似の作用を有すると思われている。しかし、我々の実験は、両者の作用は正反対であることを示し、意外な結果となった。そこで、何故このようなことが可能であるのかを明らかにする。
移動性細胞の形成と移動における細胞内骨格の役割

タコノマクラ胚を用いて、第一次間充織細胞が形成されるときの細胞内骨格の動態を蛍光顕微鏡,サイトカラシンB(CB)処理,透過型電子顕微鏡による微細構造観察等によって調べた。孵化直後の胞胚の植物極は他の部域と同様の扁平上皮からできているが、やがてこの部分が肥厚して植物極板を形成するようになる。この時期では将来第一次間充織細胞になる前駆細胞は形態上区別できない。しかし、CB処理をこの時期に行うと、植物極板を形成している細胞群だけの胞胚腔側の細胞質が胚表側へと退縮し、やがて胞胚腔上皮から脱落する。これらの細胞を除去した胞胚には第一次間充織細胞が形成されないことから、脱落細胞が第一次間充織前駆細胞であることを示している。CBに感受性を示す細胞群はFーアクチンのみを選択的に識別するローダミンファロイジン(RP)に強く染色されることが正常胞胚で明らかになり、他の胞胚腔上皮とは異なる状態の細胞内骨格を持っていることが示唆された。しかも、これらのRPに染まる細胞内領域が胞胚腔側の細胞膜直下に限られており、CB処理への反応が最初にこの部分にみられることはCB感受性構造がここにあることを物質的に裏付けたことになる。事実、CB処理を受けた胞胚ではこのようなRPで染められる細胞内領域が消失する。透過型電子顕微鏡観察によると、正常胞胚では植物極板を形成している細胞群の胞胚腔側の膜直下にマイクロフイラメントの層を持ち、これらのマイクロフイラメントは胞胚腔に短く突出された細胞突起構造中に分布している。その他の胞胚腔上皮細胞の胞胚腔側にはほとんどマイクロフイラメントは見られない。一方、CB処理胞胚ではマイクロフイラメントがほとんど消失している。以上の結果から、第一次間充織細胞は形態分化以前にF-アクチンを胞胚腔側の細胞膜直下に形成することによって、移入準備を完了していることが明らかとなった。
牛乳中のガングリオシドを含むスフィンゴ糖脂質の化学構造と分子種の解析

1.スフィンゴ脂質の収量:牛乳20lからのスフィンゴ脂質の収量は1.1gで、スフィンゴミエリン(SPM),モノグリコシルセラミド(【G_1】CM),ジグリコシルセラミド(【G_2】CM)およびガングリオシドの割合は、ほぼ69:10:20:1であった。2.脂肪酸組成:スフィンゴ脂質全体を通して主要な構成脂肪酸は【C_(20)】【C_(24)】の飽和酸で、とくに【C_(23)】の存在が特徴的であった。また【G_1】CMと【G_2】CMには2-ヒドロキシ脂肪酸も検出された。牛乳中のガングリオシド(G【M_3】とG【D_3】)の脂肪酸組成についてはKeenanおよびKaungの報告があるが、今回の結果はそれらのパターンとは異なっていた。3.スフィンゴイド組成:主要なスフィンゴイドは各スフィンゴ脂質に共通で、【C_(18)】-スフィンゲニン(【h_2】18:1)が最も多かった。その他【h_2】16:1,16-メチル-【h_2】17:1,【h_2】16:0および17-メチル-【h_2】18:1などが認められた。直鎖型と分枝型の割合は、ほぼ9:1であった。4.スフィンゴミエリンの分子種:SPMをホスホリパーゼCで処理して得られたセラミド(CM)をGC-MSに供した結果、8個のピークが検出された。これらのピークのマスクロマトグラフからSPMを構成するCM基の分子種は、炭素数32から42までの分子種群が認められ、とくに炭素数39から42までのものが70%以上を占めていた。この中で主要なタイプは【h_2】18:1-【C_(23)】:0,【h_2】16:1-【C_(23)】:0,【h_2】18:1-【C_(16)】:0および【h_2】18:1-【C_(22)】:0であった。5.牛乳スフィンゴ脂質の分子種:牛乳の各スフィンゴ脂質の脂肪酸組成およびスフィンゴイド組成が高い類似性を示すことから、牛乳スフィンゴ脂質の構造は、SPMとほぼ同様の共通のCM基を有することが示唆された。またガングリオシド画分の微量の2つのスボットについては分析できなかった。今後は、これらの成分についてもさらに解析を進めたい。
横隔膜損傷の定量的評価をめざした血清バイオマーカーの検索

研究目的過度な運動負荷により呼吸労作や骨格筋疲労を引き起こし、横隔膜損傷を誘発する危険性が指摘されている。しかし、横隔膜を含めた骨格筋損傷の有無をin vivoで定量的に同定することは困難である。そこで、横隔膜損傷を、FABP3やCPKなどの筋損傷マーカーの血清中レベルにより定量的に評価することが可能か否か、についてマウス横隔膜損傷モデルを用いて検証することを目的とした。研究方法1、正常マウスの横隔膜におけるFABP3の発現局在を免疫組織学的に検証した。2、マウス横隔膜損傷モデル(気管結束によるモデル)はc57BL/6マウス(1216週齢)を用いた。麻酔下に気管結束を行うことで数日にわたり低強度負荷で横隔膜に負荷をかけ、横隔膜損傷モデルを作成した。3、血清サンプルは、感度と定量性に優れたサンドイッチELISA法を用いて、FABP3、CPKおよびMLC-1の血中量を測定した。4、骨格筋および横隔膜損傷領域の形態学的評価:マウス横隔膜損傷モデルより得られた骨格筋および横隔膜筋サンプルに骨格筋損傷領域と横隔膜損傷領域の定量的評価(傷害細胞数・面積・体積)を施行した。具体的な評価法としては、サンプリングした骨格筋と横隔膜筋を固定後、パラフィンあるいは凍結切片を作成し、HE染色に付し、顕微鏡下に骨格筋と横隔膜の損傷領域の評価を行った。研究成果マウス正常横隔膜におけるFABP3の発現を免疫組織化学法にて検証したところ、細胞質に豊富な発現を認めた。次に横隔膜損傷モデルの作成を試みたが、損傷後に多くのマウスが死亡したため、現在、適切な気管結束法について最適化を行っている。モデル作成が成功したマウスについては、パラフィン切片を作成し病理学的評価を行うとともに、血清をサンプリングした。病理学的評価については、現在鋭意検討中である。血清中のFABP3量については、今のところFABP3を検出することができておらず、さらなるELISA検出系の改良が必要であると考えられた。
タンパク質高次構造におけるダイナミクスの解析

重水素化試料及び溶媒コントラスト変調法を用いた中性子小角散乱法により、タンパク質の高次構造のダイナミクスの解析法を確立した。同手法を用いて、20Sプロテアソームを形成するサブユニットの1つ(α7)が単独で作る会合体において、そのサブユニットが交換する現象が存在することを初めて確認し、同時にそのKineticsの解析も行った。今年度は、「タンパク質サブユニットの交換」というダイナミクスの存在を証明するための実験的研究を精力的に行った。そのために、タンパク質の代謝において重要な役割を担っている20Sプロテアソームに注目した。20Sプロテアソームは、それぞれ異なる7つのサブユニットから成るαリング・βリングがαββαの順に会合した14種類・合計28個のサブユニットから構成される巨大複合タンパク質である。このうちαリングを形成するサブユニットの1つである「α7」は、単独でαリングに相同な7回回転対称体を自律的に作り、更に、この7回回転対称体が2つ結合した中間会合体を形成する。申請者らの想定するサブユニットの交換のダイナミクスはこの場合「α7リング内のサブユニットが他のα7リング内のサブユニットと水溶液中で交換する」と言うものである。このような動的機構が存在しても通常の手法では測定することができない(交換の前後で、見かけ上、何も構造に変化が起こっていない)そこで、申請者らは、重水素化したα7リングを用意し、通常のα7リング(軽水素で構成されている)の水溶液と混合した。この時、中性子小角散乱法を用いて構造測定を行うと、中性子から見たら重水素と軽水素は全く異なる散乱体であるため、申請者らのシミュレーションよれば、サブユニットの交換が起これば、それは散乱データに明瞭に現れることが予測されている。実験結果は、軽水素体・重水素体のα7リング水溶液の混合により、散乱データに明瞭な変化が現れ、サブユニットの交換機構の存在を証明することができた。今年度は、「タンパク質高次楮形成におけるKinetics」として、Subuniti交換現象の研究を推進した。タンパク質の代謝において重要な役割を担っている20Sプロテアソームは14種類28個ものサブユニットからを形成される巨大複合タンパク質である。(7つのサブユニットから構成される2種類のリング、α・βリングが、αββαの順で結合した中空円筒形状をしている)この構成サブユニットの1つである「α7」は、単独で7回回転対称体を持つリング状の構造体(α7リング)を自律的に作り、更に、このα7リングが2つ結合した2重リングを形成する。前年度の研究により「α7リング内のサブユニットが他のα7リング内のサブユニットと水溶液中で交換する」と言う現象が存在する事を重水素ラベリングと中性子小角散乱法を組み合わせる事で初めて確認した。今年度は、更にこの現象の経時変化をSimulationを用いて詳細に検討した。観測された現象が、2重リング間のリング-リング交換現象である事は否定された。また、交換可能なサブユニット数が2つである事(リングにつき1つ)、交換現象は、少なくとも2段階にわたっている事を示す事が出来た。また、α7リング水溶液にα6サブユニットを添加すると、α6サブユニットがα7リングに取り込まれる事も確認することが出来た。散乱関数の検討より、α6サブユニットを取り込んだα7リングのサイズは若干増加している事が示された。平成22年度までの研究によりα7中間会合体におけるサブユニット置換現象が存在することを世界で初めて確認できた。その成果に基づき、本年度は、この現象をより詳細に解明することに取り組んだ。軽水素化2重α7リングと重水素化2重α7リングの80%重水溶液中で混合における中性子小角散乱強度の経時変化の測定では、1.ゼロ点散乱強度は、初期値の0.8程度で強度減少が停止する。2.ゼロ点散乱強度の経時変化は、2つの減衰指数関数で表現される。事が詳細解析より判明した。1に関しては、3回同様の実験を繰り返し確認した。この結果と計算機Simulatonから、置換可能なサブユニットは1つの2重リングあたり、2つの置換可能なサブユニットが存在することが判明した。(この結果は、1つのリングあたり1つの置換可能なサブユニットの存在を強く示唆しており、この事は同時にα7リングの構造非対称性の可能性も示唆している)一方、2に関しては、この現象に2つの時定数の異なる反応が関与している事を示唆している。この事を解明するために、これまで考えてきたサブユニット交換反応に加え、サブユニット交換活性-不活性反応が存在していると仮定した。つまり、活性状態のサブユニットだけが交換可能であり、また、サブユニットは交換活性-不活性状態を一定の時定数で繰り返していると言う仮定である。(このような反応は、酵素などの結合反応に良く見られる)この仮定のもとに計算機Simulationを行ったところ、サブユニット交換.の時定数と活性-不活性反応の時定数の比が、5.5:1であることが判明した。

本研究は、タンパク質のサブユニット交換現象をその存在証明を含めて動態解析を行った初めての例であり、また、中性子小角散乱を用いてのみ実現可能な研究であった。そのためこの成果は高く評価され、米国のBiophysical Journalに掲載された。
表皮幹細胞の動態に関する研究

本研究は大きく3つのステップに分かれている。1)組織で細胞の動態を2次元的に観察する。2)表皮細胞の中の幹細胞やtransitamplifying cellの動態を追跡するための指標を検討する。3)表皮組織にDNA障害刺激を加え、それによって引き起こされる細胞動態の変化を観察する。第1のステップには標本の基底膜構成蛋白に及ぶダメージを最小限にして表皮シートを作成する処置が必要であった。これに適した条件は小沼らの論文に示したように1MNaBr加PBS浸漬37°C1時間で、得られた表皮シートで表皮幹細胞のマーカーとされているケラチン19とβ1インテグリンの発現を検討した。毛包に部分的な発現を見たものの毛包間表皮ではほとんど発現が確認できなかった。第2のステップに使用する良い指標が得られなかったが「幹細胞は長期間分裂をしない細胞である。」という定義に基づき検討を進めることにした。すなわち創傷の際には、通常と異なり幹細胞の細胞分裂およびDNA合成が亢進すると考えられ、幹細胞を含むDNA合成亢進細胞の動態を調べることを目的としてBrdu標識を用いて観察した。その結果DNA合成亢進細胞は創周辺ほど密に存在していたが一定の法則は見出せなかった。第3のステップとして、細胞への障害としては軽微だがDNAに障害を引き起こす刺激を広く加える事を試みた。すなわち幹細胞、TA細胞では周囲の細胞障害に反応してDNA修復のほかに細胞分裂が亢進し、それ以外の細胞ではDNA修復のみが起こると考え、紫外線照射(UVB)やDMBA(発癌プロモーター)塗布とBrdu標識を用いて検討した。特にUVB照射は照射量、照射からBrdu標識までの時間について条件を検討したが、表皮基底層細胞核のBrdu標識の濃淡には規則的配列を見出せなかった。これまでの結果では表皮幹細胞を直接検出するためのマーカーが選択できず、幹細胞の動態を検討するという当初の目標は果たせなかったが表皮シートを用いることにより細胞の動態を2次元的に検討するという新しい研究手法が確立できた。この方法にレーザー共焦点顕微鏡の併用やディスパーゼ処理などの緩徐な条件での表皮シート作成を用いることでより生体に近い情報が増えると考えている。以上表皮での角化細胞の動態をモニターするための新しい手法は確立できたという点で本研究は有意義であった。幹細胞は種々の組織に存在し、障害からの再生や癌化の過程で中心的な役割を果たしていると考えられる。表皮においても創傷治癒や発生分化の際に重要と考えられており、その存在が毛包の立毛筋付着部に推定されているものの確実ではない。今回我々は、マウス表皮細胞層における幹細胞の動態を2次元的に明らかにするため研究を計画した。1)表皮基底層を2次元的に観察するために、ヘアレスマウスを用い損傷していない表皮シートを作成した。細胞基底膜面の抗原性に変化を与えないためなるべく緩和な条件での作成条件を検討した。

その結果1MNaBr37°C80分処理が最も良好な結果が得られ、このシートを用いて表皮幹細胞のマーカーとされているβ1インテグリン、ケラチン19の発現を調べた。両者とも毛包に部分的に発現を見るものの表皮では発現は低く確認できなかった。そこでBrdUを用いたS期細胞のラベリング法を幹細胞検索に用いることとした。2) BrdUを用いたS期細胞のラベリング法の条件設定まずS期細胞が的確に検出できるかを確認するための予備実験を兼ねて、創傷をマウス背部に作成しBrdU処置をおこなった。そしてDibutyryl cyclic AMP(dbcAMP)投与がおよぼす影響を検討した。その結果、S期細胞の増数がdbcAMP投与群で見られ、本剤の創傷治癒促進機構には増殖細胞数の増加が関連している可能性が示唆された。3)不死化角化細胞との比較上記のin vivoでの検討が進展しにくいのは確実な幹細胞マーカーがないからと考えられる。幹細胞の大きな特徴としてはその不死性があげられる。そこで我々は表皮角化細胞、種々の処置(HPV遺伝子トランスフェクション)で不死化した角化細胞及び特発性に不死化した角化細胞(HaCat細胞)の性質や遺伝子発現を比較することを計画している。その予備段階としてHPV不死化角化細胞を作成した。本研究は、表皮組織における幹細胞の動態が創傷や紫外線照射という外的な要因によってどのような影響を受けるかを調べることを目的としている。昨年までβ1インテグリンやサイトケラチン19などを幹細胞の指標とすることを試みたが、有意の所見は得られなかった。幹細胞は長期間分裂しない細胞であるという定義は広く受け入れられている。創傷の際には幹細胞は細胞分裂が亢進し治癒過程を促進すると考えられ、DNA合成が亢進している細胞の中には幹細胞が混在していると考えられるので、まず第一段階として創傷治癒過程におけるDNA合成亢進細胞の動態を観察することとした。詳細は論文発表したが(日本皮膚科学会誌109巻1015-1019)、ヘアレスマウスの背部皮膚に表皮欠損を作成しBromodeoxyuridineを用いてDNA合成細胞に標識をした後、表皮をシート状に剥離したもので2次元的に観察した。その結果ではDNA合成の亢進した細胞は創周辺ほど密に存在していたが、配列には一定の法則は推定できなかった。これらのDNA合成亢進細胞群の中から幹細胞を選別するマーカーについてはさらに検討を加える予定である。また今後、1)紫外線を照射した場合、2)発癌プロモーター活性を有する物質を塗布した場合、3)接触アレルギーを惹起した場合でDNA合成亢進細胞が2次元的にどのように配列しているかに関して検討を進め、幹細胞マーカーに結びつく所見を蓄積する予定である。本研究は、表皮組織における幹細胞の2次元的動態が創傷などの外的要因でどのような影響を受けるかを検討し、組織修復過程についての理解を深めることを目的にしている。昨年は、幹細胞は創傷によってDNA合成が亢進する細胞の中に混在していると想定して、DNA合成亢進細胞の創傷治癒過程での動態を観察した。その結果では創周囲にDNA合成亢進細胞が高密度で存在し、それ以外の解剖学的構造(特に皮膚附属器など)に一致した局在は示さなかった。本年は、ヘアレスマウス背部皮膚に外的要因