hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜色素上皮細胞における機能分化の発生学的研究

網膜色素上皮細胞(RPE)は視細胞の支持機能を受持っており、種々の機能とその形態が報告されている。本研究は従来の研究とは観点をかえ、細胞の有する特異的蛋白質に対する抗体を作製し、或る蛋白質の出現と細胞の形態形成とのかかわり合いを探ろうとするものである。3年間の成果は以下の如く3部に分たれる。1:ニワトリ網膜の発生学的研究。色素上皮細胞の形態形成は視細胞の内節と外節の形態分化と平行していることが判明した。特に目立った変化としては頂部突起の長さは外節の形成に伴って伸びている。2:単クロ-ン抗体の産生。RPEを単離し、アジュバントと混合し、マウス腹腔内へ投与し、抗体産生細胞のハイブリド-マを作製した。限界希釈法で単クロ-ン抗体を分離したが、特にRPEと特異的に反応するもの、KM1、S5D8、S5H8について、その局在を検討した。2ー1.KM1抗体はSDSーPAGEとイムノブロットによると42kDの蛋白を認識する。RPEの細胞膜とともにミュ-ラ-細胞の膜とも反応した。発生学的には孵卵8日では反応せず、それ以降次第に強い反応を呈した。RPEミュ-ラ-細胞という網膜の2種類の支持細胞と認識するものとして今後検討をつづけたい。2ー2.S5D8とS5H8抗体はKM1と同様RPE発生後期より出現し63kDの抗原蛋白を認識した。RPEに特異性が高く、ウシ、ラット、ウサギ、マウス、ニワトリのRPEと反応するが、他の組織とは全く反応しない。免疫電顕によるとRPEの小胞体と反応していた。小胞体は細胞内小器官としては極く一般的であるが、他の細胞種の小胞体とは異なる抗原蛋白がRPEに存在することを示唆するこれらの抗体により、RPEの機能の解明のすすむことが期待される。本研究の材料となる網膜色素上皮(RPE)はニワトリ胚を用いることとし、まずニワトリ網膜の形態を発生学的に検索した。1.ニワトリ網膜の発生学的研究:視細胞は孵卵8日目では、外境界膜を形成する部位に、一対の中心小体がみられるのみで、網膜下腔へ向けての内、外節の形態形成は未だ始まっていない。この時期のRPE細胞は立方体であり、頂部突起は短く、基底陥凹もみられない。F-アクチンの分布をFITC標識ファロイジンで検索すると、RPE細胞の細胞間接着部にのみ見出された。孵卵15日目になると視細胞内節が完成し、結合線毛はみられるが、外節は作られていない。アクチン細糸はRPE細胞頂部および基底部に増量している。しかし、頂部突起の内部にはメラニン顆粒、小胞体およびアクチンの芯は認められない。孵卵19日には外節もすでに出来ており、RPE細胞の頂部突起はこの外節と深く篏合している。頂部突起中には特徴的なアクチン細糸の芯構造がみられ、メラニン顆粒もこれと接して存在する。これらの事象と一致して、RPE細胞質中にも細胞内小器官の分布に変化がみられた。即ち、糸粒体の基底部への偏在、メラニン顆粒の頂部突起および頂部細胞質への偏在、滑面小胞体の増加などである。このようなRPE形態分化は視細胞の分化と時を同じくして起こっている。2.ニワトリRPE細胞の単クローン抗体

作製:RPE細胞を単離し、アジュバンドと混合し、マウス(BALB/c)の腹腔内へ投与した。数週後に脾細胞を分離し、ミエローマ細胞のとハイブリドーマを作製した。培養細胞上清を用い、RPEとの特異的反応を検索中である。今後、RPEの形態形成過程で出現する抗原、その機能の検討を行う予定である。また、この方法論を他の動物にも応用し、RPEの機能発現にかかわる細胞膜タンパクを探す予定である。網膜色素上皮細胞は視細胞の支持機能を果たすことはよく知られている。その細胞に備わっているさまざまな機能、例えば貪食能、イオン輸送能、吸収・分泌能などは膜蛋白が関与するところ大であろうと思われる。これらの機能の色素上皮細胞での局在はよく知られているものもあるが、大部分は、この細胞の形態より推測されているにすぎない。一般的に云えば、機能局在は、或る既知のマ-カ-、例えばATPase等を用いて組織細胞化学的に検討するものであるが、われわれは、発想をかえ、色素細胞に存在する蛋白に対する単クロ-ン抗体を作製し、免疫組織化学的にその局在を調べ、ついで、網膜の組織分化のいづれの時期にこの抗体の抗原蛋白が出現するかを検討し、膜内に存在する機能蛋白と形態分化との相関を研究してきた。本年は、昨年よりも更に単タロ-ン抗体の数を増した。またイムノブロッテング法の再検討を行った。新しく得た抗体はS3D10、S5D8、S5F4などである。なかでも、S5D8は細胞質を顆粒状に染色し、網膜の他の細胞は全く染めない。しかも多くの哺乳類網膜の色素上皮細胞を染めることは特筆に値する。色素上皮細胞の支持機能の出現する孵卵15日(ニワトリの場合)前後にこの抗体に対する反応性も出現するところから、この細胞の機能に深くかかわるものと思われる。細胞内局在は免疫電顕により検討中であるが、この細胞に特徴的な滑面小胞体であろうと予測している。イムノブロッテング法による抗原蛋白の分子量は63KDであった。更に他の抗体についても発生学的検討をすすめている。ニワトリ網膜を構成する色素上皮細胞を単離し、完全フロインド・アジュバントと混合し、マウス腹腔内に注射し、3週後に抗体を産生す脾細胞を得た。限界希釈法により、単クロ-ン抗体とし、そのうちのS5D8およびS5H8について詳細な検討を行った。1.抗原蛋白の同定。ニワトリ胚および成鶏の網膜より色素上皮細胞を分離し、可溶性成分と核を除いた分画をサンプルバッファ-で可溶化した。12%ポリアクリルアミドでSDSーPAGEを行い、Hybond C extraーmembraneヘトランスブロットした。S5H8とS5D8を一次抗体とし、二次抗体にアルカリフォスファタ-ゼ標識した抗マウスIgGを用いウエスタンブロットを行ったところ、いづれも単一のバンド(分子量約63kD)認めた。2.免疫組織化学法による抗原の局在。二次抗体にFITC標識した抗マウスIgGを用いて蛍光顕微鏡により検索したところ、ウシ、ラット、マウス、ニワトリの色素上皮細胞と強く反応した。いづれも細胞質に果粒状の蛍光を認めた。反応は鋸状縁までで、網膜盲部に対応する色素上皮細胞には蛍光を認めず、更に虹彩部色素細胞にも認めなかった。神経網膜はS5H8で錐体細胞のパラボロイドに蛍光を認めた。これはパラボロイド中の滑面小胞体が反応していると考えているが、現在電顕レベルで検討中である。二次抗体にHRP標識した抗マウスIgGを用いた免疫電顕法によると、滑面小胞体膜へHRPの反応産物が沈着していた。粗面小胞体も反応していた。更に滑面小胞体の変形である層板小体も反応していた。
TDP-43選択的スプライシングによる ALS病態機序とバイオマーカー利用の検討

当初の予定通り,初年度に1)剖検組織でのTDP-43 mRNAの選択的スプライシング(AS)多様性の確認,定量,2)組織中でのTDP-43 mRNA ASに関与する因子の解析を行った.本年度は1) AS-mRNA由来のC末端変異型TDP-43蛋白(vTDP-43)の生化学的解析と2)罹患組織でのvTDP-43蛋白の局在確認を行った.野生型TDP-43 cDNAを鋳型にvTDP-43発現プラスミドを作成し,Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて,HEK293T細胞に発現実験を行った.72時間後に細胞を回収し,RIPA,Urea buffer可溶性分画をそれぞれ回収し,TDP-43 N-末抗体を一次抗体としてウエスタンブロットを行った,野生型TDP-43発現細胞と比較して,vTDP-43発現細胞では有意にUrea分画で多く発現蛋白質が検出された.また免疫染色では,vTDP-43発現細胞での凝集体形成が確認された.この結果から,vTDP-43蛋白の不溶性,凝集性が確認された.またvTDP-43特異的抗体を作成し,筋萎縮性側索硬化症(ALS)罹患組織である腰髄組織にて免疫染色を実施した.その結果,一部の残存運動神経細胞に,vTDP-43特異的抗体で認識される封入体を確認し得た.これらの結果より,vTDP-43蛋白質がALS病態に関与している事が示唆された.当初計画した予定に準じ,TDP-43 AS mRNA由来の変異型TDP-43蛋白質機能解析を行えている.当初の予定どおり,次年度はリキッドバイオプシー解析を行う.当初の予定通り,平成29年度に1)剖検組織でのTDP-43 mRNAの選択的スプライシング(AS)多様性の確認,定量,2)組織中でのTDP-43 mRNA ASに関与する因子の解析を行った.当初計画した予定に準じ,平成29年度に1)剖検組織でのTDP-43 mRNAの選択的スプライシング(AS)多様性の確認,定量,2)組織中でのTDP-43 mRNA ASに関与する因子の解析を行えている.当初の予定通り,初年度に1)剖検組織でのTDP-43 mRNAの選択的スプライシング(AS)多様性の確認,定量,2)組織中でのTDP-43 mRNA ASに関与する因子の解析を行った.本年度は1) AS-mRNA由来のC末端変異型TDP-43蛋白(vTDP-43)の生化学的解析と2)罹患組織でのvTDP-43蛋白の局在確認を行った.野生型TDP-43 cDNAを鋳型にvTDP-43発現プラスミドを作成し,Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて,HEK293T細胞に発現実験を行った.72時間後に細胞を回収し,RIPA,Urea buffer可溶性分画をそれぞれ回収し,TDP-43 N-末抗体を一次抗体としてウエスタンブロットを行った,野生型TDP-43発現細胞と比較して,vTDP-43発現細胞では有意にUrea分画で多く発現蛋白質が検出された.また免疫染色では,vTDP-43発現細胞での凝集体形成が確認された.この結果から,vTDP-43蛋白の不溶性,凝集性が確認された.またvTDP-43特異的抗体を作成し,筋萎縮性側索硬化症(ALS)罹患組織である腰髄組織にて免疫染色を実施した.その結果,一部の残存運動神経細胞に,vTDP-43特異的抗体で認識される封入体を確認し得た.これらの結果より,vTDP-43蛋白質がALS病態に関与している事が示唆された.当初計画した予定に準じ,TDP-43 AS mRNA由来の変異型TDP-43蛋白質機能解析を行えている.当初の予定どおり,次年度はリキッドバイオプシー解析を行う.予定した研究が順調に進行したため,使用予算が当初見込みより減額された.次年度以降も当初計画の予定に準じ,解析を進めていく.予定した研究が順調に進行したため,使用予算が当初見込みより減額された.次年度も当初計画の予定に準じ,解析を進めていく.
走査トンネル顕微鏡を用いた定在波法により界面散乱の位相の研究

最近のデバイスの設計においては縮小化に伴い、構成する物質間の界面の影響が全体の特性に及ぼす割合が高まっている。このため、金属・金属、金属・半導体、半導体ヘテロ界面など各種界面における電気的特性をナノレベル・原子レベルのスケールで理解することは重要となってきている。本研究では、原子レベルの空間分解能で物質表面の構造を明らかにすることのできる走査トンネル顕微鏡(STM)を界面の研究に適用して、界面における構造と電気的特性との関連を直接的に対応づけることを目的としている。STMにより界面をプローブしその像を得る方法は幾つか提案されているがここでは界面での散乱により薄膜層内に閉じこめられた電子定在波を検出することにより界面の特性を調べる手法を用いる。本研究では特定の界面系に限定するつもりはないが、これまでテストケースとして、ほぼ整合な金属・金属界面であるPd/Cu(111)界面の研究を進めている。この系は、両金属の仕事関数の差が大きく界面における散乱強度が大きいことが予想され、したがって界面散乱による定在波が検出されやすいと考えられる。現在、この界面における仕事関数(ポテンシャルに相当)がPd層の厚さによってどう変化するかを測定している。また、超高真空STMにMBEを取り付けての実験を行っており、半導体ヘテロ界面の基板として適当と考えられるGaAs(001)表面のSTMによる研究も進めており、この表面でのさまざまな構造についての原子構造が明らかにしている。
超臨界流体中での流体・粒子間物質移動速度の評価および高速抽出プロセスの検討

カフェイン球一個を多数の同径のガラスビーズとともに管型抽出器に充填し、超臨界二酸化炭素を導入した抽出を行った。出口カフェイン濃度から、超臨界流体中での物質移動速度を評価した。本測定条件下で評価された物質移動速度は、Re>30の領域では、Re数の増大とともに増加したが、Re<30では、Reによらずほぼ一定値となった。気相・液相の物質移動速度の評価に広く用いられている若尾の式による推算値と比較した結果、低Re領域において、実測値は推算値より大きかった。これらの結果は、境膜内の濃度分布による自然対流の効果によるものと考え、Grを考慮したGarnerの式およびSteinbergerの式と実測値との比較を試みた。しかし、いずれの推算式も実測値を正確に記述することはできなかった。超臨界流体中では、動粘度が気相や液相と比較して小さく、その結果、Grが大きく自然対流が生じやすい。既存の式がここで得られた結果を良好に説明できなかったのは、気相や液相中ではGrを大きく変化させることができず、推算式中のGr数の感度が低かったためと考え、ここで得られた実測値を使って、新たなShの実験式を提案した。Sh=2+0.346(ScGr)^<1/4>+0.515Sc^<1/3>Re^<0.6>本式は、本実験結果のみならず、LimらおよびKnuffらにより過去報告された、超臨界二酸化炭素中での物質移動速度をも良好に記述することができた。また、それだけでなく、気相、液相中での物質移動速度についても十分に推算できることがわかった。
電池レス無線充電医療センサーを実現する偏波制御DRレクテナの開発

本研究の目的は、電池いらずで動作し続ける無線充電医療センサーを実現する偏波制御DRレクテナの開発である。これを実現するための課題は、1電波を直流に変換する整流器の高効率化、2人体装着時に生じる人体の動きとセンサーに到来する電波の偏波特性の相互作用による受信電力の低下、3人の歩行動作に起因する電波シャドウイングによる激しい信号瞬時遮断現象の克服の3点である。平成30年度は1電波を直流に変換する整流器の高効率化に取り組んだ。無線電力伝送において、高周波を直流に変換する検波回路(レクテナ)は上記システムを実現するキーデバイスである。レクテナの高周波ー直流電圧の変換効率を向上させるためには、RF信号を検波するダイオードに印加させる信号の振幅を増加させることが有効である。そこで、高いQファクターを有するλ/4同軸誘電体共振器と誘電体フィルムを用いることにより高い変換効率を実現できる誘電体共振器レクテナの開発に取り組んだ。レクテナへの入力電力が0dBmのときに60%の変換効率を達成できることがわかった。現在は更なる高効率化を目指してより高いQファクターを有する同軸誘電体共振器の利用に取り組んでいる。更に、腕振り歩行時の電力伝送実験を行った。生体センサーを腕に装着した際、腕振り角度が変化することによってアンテナの指向性特性が大きく変化し、レクテナの出力電圧に影響を及ぼすことが予想される。腕振り電磁ファントムを用いて無線電力伝送実験を行った結果、腕の角度が0度のときと比較して腕の角度が45度のときは40%程度出力電力が劣化することが明らかとなった。研究計画に沿って研究を進めており、平成30年度は概ね研究成果を得ることができた。電波を直流に変換する整流器の高効率化に取り組み、腕振り歩行時の無線電力伝送実験を行った。また、研究成果は学会で口頭発表を行った。平成31年度以降は、2人体装着時に生じる人体の動きとセンサーに到来する電波の偏波特性の相互作用による受信電力の低下、3人の歩行動作に起因する電波シャドウイングによる激しい信号瞬時遮断現象の克服について検討を行う予定である。平成30年度予算において約120万円の残額については物品購入を見合わせたことによるものであり、平成31年度において物品購入を計画している。
テロメラーゼ特異的アデノウイルス製剤による新しい頭頸部癌治療の開発

放射線耐性頭頸部扁平上皮癌細胞株におけるテロメラーゼ特異的制限増殖型アデノウイルスであるOBP-301と放射線治療の併用効果について検討を行った。OBP-301感染と放射線治療の併用療法は,in vitroおよび同所性頭頸部扁平上皮癌マウスモデルで単独治療と比較して有意に高い抗腫瘍効果を発揮し,相乗効果を認めた。DNA修復機構に関わるMRN複合体の発現がOBP-301によって低下すること,OBP-301と放射線の併用によりアポトーシスが誘導されることが示され,相乗効果の機構と考えられた。OBP-301と放射線治療の併用療法は頭頸部扁平上皮癌に対する新たな治療戦略となりうることが示唆された。テロメライシンと放射線の併用効果について放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌細胞を用いてin vitroの検討を行った結果、それぞれ単独で治療を行ったものと比較して有意に高い治療効果を発揮した。同所性頭頸部扁平上皮癌マウスモデルにおいてもテロメライシンと放射線の併用は、それぞれ単独で行ったものと比較して有意に腫瘍の発育を抑制し、腫瘍が30 mm^3まで増大するのに要した時間は対照群18.1日、放射線群22.9日、テロメライシン群23.2日、併用群30.0日であり、併用によるEnhancement factorは1.39であることから、相乗効果があると認められた。また、マウスから摘出した腫瘍の薄切標本をTUNEL法を用いて評価したところ、併用群におけるTUNEL陽性細胞の割合が単独治療群と比較して有意に増加しており、併用治療によって癌細胞のアポトーシスが誘導されることが示唆された。in vitroにおいても、併用治療によりアポトーシス関連タンパク質であるPARPの開裂が認められた。この機序を解明すため、in vitroでDNA二重らせん修復において重要な役割を担うMRN複合体(Mre11, Rad50, Nbs1)の発現を検討したところ、それぞれのタンパク質の発現はテロメライシンの用量に依存してテロメライシン投与後42時間後より低下した。逆に放射線治療のみを行うと、MRN複合体の発現量は増加した。両者を併用すると、テロメライシン単独投与時と同様にMRN複合体の発現量は抑制された。この結果より、テロメライシンはDNA二重鎖修復に重要な働きを担うMRN複合体の発現を抑制することにより放射線耐性頭頸部扁平上皮癌細胞の放射線感受性を増大させることが分かった。放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌の治療は困難で予後不良であるが、テロメライシンを治療に加えることで予後が改善する可能性がある。13種類の頭頸部扁平上皮癌の放射線感受性を検討し,その中から放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌細胞株を選抜した.放射線耐性細胞株に対するテロメライシン感染と放射線治療の併用治療はin vitroでそれぞれの単独治療と比較して有意に高い抗腫瘍効果を発揮し,同所性頭頸部扁平上皮癌マウスモデルにおいても有意に腫瘍の発育を抑制し,相乗効果が認められた.放射線治療を行うと頭頸部扁平上皮癌細胞におけるMRN複合体の発現量は増加したが,テロメライシンの感染は用量依存性にMRN複合体の発現を抑制した.放射線とテロメライシンを同時に投与した場合にも同様にMRN複合体の発現量が減少した.テロメライシン感染と放射線治療を併用することで,in vitroではアネキシンV陽性細胞の増加および開裂したPARPの発現量増加を認め,in vivoではTUNEL陽性細胞の増加が認められ,OBP-301と放射線の併用療法は,単独の治療よりも多くの細胞をアポトーシスへと誘導することが示された.本研究はOBP-301が放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌細胞の放射線感受性を増強することを示した初の報告であった.放射線耐性の機序には癌抑制遺伝子TP53の変異や低酸素状態,ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の活性上昇などの因子が挙げられる.テロメライシンによる放射線増感作用はTP53遺伝子が変異した細胞株で示されており,低酸素状態ではテロメライシンの増殖に有利となるヒトテロメラーゼ逆転写酵素の活性上昇が認められることから,テロメライシンによる治療は放射線耐性の細胞株に特に有効な治療法と考えられた.また,テロメライシンは抗癌剤との相乗効果も示されており,かつ第I相臨床試験で安全性が確認されているため,テロメライシンや放射線治療を含む集学的治療は放射線耐性の頭頸部扁平上皮癌患者に対する新たな治療戦略となりうることが示唆された.頭頸部外科学当初予定していたテロメライシンと放射線の相乗効果の有無に関する検討が達成でき、同時にその機序についてもおおむね解明することができた。

この研究結果をもってテロメライシンのヒト頭頸部扁平上皮癌に対する臨床応用への道筋をつけることができただけではなく、アデノウイルスをはじめとしたウイルス治療が放射線治療との相乗効果を発揮するという基礎的裏付けができ、今後の頭頸部扁平上皮癌に対するウイルス治療が発展するための重要なデータとなった。テロメライシンはDNA修復機構の阻害という同じ機序で抗癌化学療法薬の感受性を増強させる可能性があり、これについても検討を行う。また、テロメライシンに放射線治療、化学療法を組み合わせた集学的治療法についても検討する。現在海外で進行中の臨床第II相試験の結果を踏まえて、国内における早期臨床試験のプロトコールの立案と規制当局への対応を開始する。実験プロトコールの適正化により実験用マウスの必要数が減少したため、マウス購入費および関連試薬代金が減少した。平成26年度に化学療法薬とテロメライシンの併用実験を加えて行い、テロメライシンを用いた集学的治療法の可能性について検討を行う。また、テロメライシンを用いた早期臨床試験の計画作成に当たっては、マンパワーの確保が必要となる見込みであり、さらに論文・学会発表等を通じてテロメライシンの有用性についてのコンセンサスを得る必要がある。このため、これらにかかる人件費・旅費について平成25年度分を次年度使用額として平成26年度に使用する計画である。
高スピン金属錯体クラスターに対する異種金属ドーピング

Mn12核金属錯体クラスター[Mn_<12>O_<12>(MeCO_2)_<16>(H_2O)_4]は、上向きと下向きのスピン間にポテンシャル障壁をもち、単分子磁石と考えられている。さらには、障壁をすり抜けるトンネル効果による磁気緩和も知られている。前年度の研究により、結晶溶媒を含む結晶[Mn_<12>O_<12>(PhCO_2)_<16>(H_2O)_4]・2PhCOOHの合成に成功している。今年度は詳細な磁気を行い、この系はブロッキング温度の異なる2種類の分子が結晶内に共存するモザイク結晶であることを見いだした。結晶を用いた磁気異方性の測定や量子トンネル効果の測定から、双方の分子の磁化容易軸に決定的な違いがあることを発見したほか、結晶構造解析により、この磁気的な違いが、Mn_<12>分子に含まれるMn^<3+>サイトのヤーン・テラー変形の差異に起因していることが明らかになった。Mn12核金属錯体クラスター[Mn_<12>O_<12>(MeCO_<12>)_<16>(H_2O)_4]は上向きと下向きのスピン間にポテンシャル障壁をもち、単分子磁石と考えられている。Mn12核錯体を構成単位とし、超分子磁性体の構築を目的として、有機ラジカルm-MPYNN^+との塩(m-MPYNN^+)[Mn_<12>O_<12>(PhCO_2)_<16>(H_2O)_4]^+を合成した。構造解析に格子定数を決定したが、結晶が不安定であるため、全解析には至らなかった。磁気測定の結果、有機ラジカルとクラスターはエネルギー移動という観点から結びついていること、この相互作用により、クラスターの磁化緩和が著しく促進されることが分かった。さらに、結晶溶媒を含む結晶[Mn_<12>O_<12>(PhCO_2)_<16>(H_2O)_4]・2PhCOOHの合成に成功した。構造解析の結果、今まで知られている無溶媒のクラスター結晶では、構成分子の分子面が平行であったのに対して、この結晶中では単位格子に配尚の異なる2分子が存在し、分子平面が互いにほぼ直交していることが分った。磁気測定の結果、ブロッキング温度の異なる2種類のドメインが結晶内に生成することが分った。
ＲＮＡｉを用いたアクアポリン機能調節による脳浮腫抑制のｉｎ　ｖｉｖｏへの応用

RNAiはinvitrogen社製を利用しshRNAを発現するベクターを作成した。293FTセルラインでshRNAiを発現するレンチウイルスの作成を完了した。AQP4発現量を、RT-PCRで確認した。以前のKnockdownの発現率に比較して、強くKnockdownしていることが確認できた。昨年に引き続きアクアポリン(AQP)Knockdown lentiviralの確立を重点に行った。293FTセルラインでレンチウイルスを発現させるため、作成したpLenti4/BLOCK-IT/Expression Constructに加え、レンチウイルスの作成能力を高めるpLP1、pLP2、pLP/VSVG、pENTER-gusのプラスミドをcotransfectさせた。以上により目的となるAQP KnockdownのshRNAiを発現するレンチウイルスの作成を完了した。これらの操作により作成した、レンチウイルスを培養液に加えアストロサイトのAQP4の発現量を現在検討中である。発現は、テトラサイクリンで調節できるためその抗生剤による調節の有用性も検討中である。今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdown lentiviralの確立を重点に行った。アクアポリン(AQP)Knockdownの確立およびoverexpressionの観察、低酸素負荷状態での形態変化の観察を行った。AQPcDNAを遺伝子導入することで、Knockdownのphenotypeがwild-type程度の発現量に戻せることを確認するための、AQP4のcDNAを作成した。Wild-typeのアストロサイトに導入し、overexpressionできることを確認した。今後、rescueできるかを検討中である。低酸素負荷によりAQP knockdownと、overexpression細胞株のphenotypeの形態学変化、培養液の変化を観察した。詳細を検討中である。麻酔科学RNAiを用いて、アストロサイトに強く発現し脳浮腫との関係が強く示唆されているAQP4をknockdownのcell lineを得るに至っていること。AQP4発現量については、まだ十分であるといえず、現在条件設定などを検討中であること。RNAiを用いて、アストロサイトに強く発現し脳浮腫との関係が強く示唆されているAQP4をknockdownのcell lineを得るに至っていること。AQP4発現量の調節などの詳細部分について現在検討中であること。LentiウイルスでのRNAiの手法を用いてAQP4をknockdownしたアストロサイトのcell lineを確立する。現在の段階では、目的のshRNAを発現する遺伝子をもったpLenti4/BLOCK-IT/Expression Constructvectorを大量に作成するには至ったが、発現量の調節などの完成には至っていない。それらを、完成させ、実験を円滑に進めるようなcell lineを完成する。また、AQP4 overexpression細胞株も作成する。AQP4 knockdownに正常のAQP4 cDNAの遺伝子導入し、rescue experimentsを行うことで、AQP4蛋白の役割を確認する。さらに、AQP4 knockdownまたはoverexpression株に低酸素負荷を行い、AQP4の増減が低酸素付加による脳浮腫に与える影響を明らかにする。それらに加えて、低酸素負荷に対する低温による保護効果を確認し、さらに薬剤処置を行うことでの併用効果を検討し、AQP4の発現機能調節が脳浮腫の発生、治療への関わりを明らかにする。これらの実験結果を踏まえて、in vivoでの応用を模索する。RNAiを用いて、アストロサイトに強く発現し脳浮腫との関係が強く示唆されているAQP4をknockdownのcell lineを得るに至っているが、AQP4発現量については、まだ十分であるといえず、現在条件設定などを検討中である。そのため、これらに関する試薬の予算を繰り越すこととした。

確立したcell lineでのAQP4発現量などの調節。Overexpression細胞株の確立。AQP4ノックダウンに対するrescue experimentでのAQP4蛋白の役割の確認。以上の計画で実験を遂行していきたい。そのための、実験器具、試薬、動物、培養液や実験の遂行で必要な記録の媒体やソフトなど必要な資材を購入する予定である。確立したcell lineでのAQP4発現量などの調節Overexpression細胞株の確立AQP4ノックダウンに対するrescue experimentでのAQP4蛋白の役割の確認以上の計画で実験を遂行していきたい。
モンテカルロフィルタを用いた金融時系列における潜在要因の推定

金融時系列における潜在要因の推定についてさまざまなモデルについて研究を行った。特に資産価格のボラティリティの推定について2つの成果が得られた。1つは新しいJump-GARCHモデルを提案し、実際のデータに適用してボラティリティの推定、予測を行った。もうひとつは高頻度データを使った実現ボラティリティの推定法について新しい手法の開発を行い、その有効性をシミュレーションおよび実際のデータを使って調べた。時系列解析の目的の1つに観測値の背後に隠れている性質や関係を抽出することがあげられ、特に状態空間表現によるアプローチが盛んに研究されている。本研究ではこのようなアプローチを金融時系列に適用して実証分析を行う。しかしながら、ベースとなる理論モデルは、近年の数理ファイナンス学の発達の過程で、より複雑なモデルが提案されるようになった。ただし、実務界においては計算手法の制約から線形モデルなどの比較的単純なモデルのみが利用されてきた。近年、計算機やアルゴリズムの発達により大規模な計算が可能となり、より現実的なモデルの適用が可能になってきた。モンテカルロフィルタも,そのような計算手法の発展の中で開発されたもので,平易な計算アルゴリズムにより様々な形のモデルを推定することが可能である。ここではモンテカルロフィルタを使った金融データへの応用を考え、対象系列としては,金利変動の実証分析に関するもの,投資信託のデータに関するもの,ボラティリティの推定に関するものである.本年度においては、まず、データの整備を行い、それらに対して予備的な解析を行った。モンテカルロフィルタのパラメータ推定について考察を行い、いくつかの方法について比較検討を行った。その結果、自己組織化によるアプローチによって、第1段階の推定値を求め、その値の周りに乱数を使って散らばし、その中でもっとも尤度の高い推定値を最終的な推定値とするのが現実的な方法であることが分かった。この方法を用いて、投資信託のデータに対してモンテカルロフィルタを適用して、これまでにはないモデルの推定に成功した。この結果を来年度にはまとめて、投稿する予定である。資産価格のボラティリティの推定については、ジャンプを含むようなモデルの開発を行ったが、これをモンテカルロフィルタで推定する際に問題があることが分かったので、その対策を検討していく。平成19年度は金融データのボラティリティのモデル化とその実証分析を中心に研究を行った。ボラティリティはデータの背後に隠れているばらつき具合を表す潜在的な要因で、金融の実務ではリスク管理等に広く用いられているが、直接、観測できる指標ではなく統計学的な分析が必要不可欠な対象の1つである。金融データのボラティリティについてはこれまでもいろいろな研究がなされているが、この研究ではGARCHモデルをベースにして、ジャンプ構造を取り入れたモデルについて研究した。具体的にはボラティリティの背後には通常の変動を表す部分とジャンプ的な動きから導き出される部分があると考える。そのジャンプ構造においてジャンプしやすさをあらわすインテンシティを比較的平易なモデルによって記述して、これが時間とともに変動するようなモデルを提案した。これまでもジャンプを含むようなモデリングは提案されてきたが、このような形で時変的なインテンシティをモデル化するような研究は少なかった。さらに、個別の金融データに応じて、どのようにインテンシティが変化するかについて、個々の動きの特徴を捉えるような項を加えるようして、より幅広い構造を捉えることに成功した。また、この年度の研究では上下のジャンプ構造の非対称性にも着目して、これと、従来提案されてきた非線形時系列モデルとの融合を試みた。その結果、ジャンプ構造を取り入れることによって従来のモデルでは検出されないような非対称性が検出できるようになった。これらの結果をまとめ、いくつかの学会で発表した。さらにモンテカルロフィルタの応用が期待される季節調整、マクロ経済分析についても研究活動を行った。平成20年度においてはJump-GARCHタイプのモデルに関する実証分析とともに、資産価格の高頻度観測データを用いた実現分散の推定に関しても研究を行った。いずれの研究も金融データのボラティリティのモデル化とその実証分析に関するものである。Jump-GARCHモデルの研究では、日本、米国、中国などの株式データに適用して、その性質を調べた。このモデルでは推定すべきパラメータが多いがデータによっては意味のあるパラメータとそうでないパラメータがあることがわかり、データによってパラメータの制約を変えるなど工夫をしてパラメータ数を削減することができた。さらに予測可能性についても検証を行った。さらに、近年、1日よりも短い間隔のデータが利用可能となり、高頻度データを使った実現ボラティリティの推定問題が注目を浴びてきている。しかしながら、単純にリターン系列の2乗和を推定値とするやり方では、観測間隔が短くなるにつれて過大評価しやすくなることがよく知られている。これは、観測誤差に相当するランダムノイズが本来の株価にのっているためだと考えられている。

この問題に対して、新しく分離情報最尤推定法(SIML法)という手法を提案し、その推定値の性質を調べるとともに、日経平均先物のデータに応用し、他の金融資産との相関やヘッジ係数の推定なども行った。これも潜在要因の推定といえる研究である。これらの成果をもとに国際会議等で発表を行った。
19世紀を中心とした軍事的学知をめぐる人と書物の交錯

本研究は、国民国家が形成される19世紀を中心とし、軍人のグローバルな移動による人的ネットワークと、軍事関連書の翻訳・流通・受容という分析視角から、軍事的学知の交錯を研究するものである。日本・フランス・ドイツを主とし、オランダ・オスマン帝国・清朝を参照系と位置づけ、軍人と軍事関連書(人とモノ)の移動から、軍事的学知(学知)に光を当てることにより、軍事史的観点からみた新たな世界史像を提起したい。本研究は、19世紀国民国家が形成される中で、軍人が社会の知的エリート層の一翼を担っていた点に注目し、その軍事的学問・教養・思想の伝搬を明らかにしようとするものである。軍事関連書の翻訳や伝搬を手掛かりにして日本・フランス・ドイツを主に、ネットワークの拡大(それは軍人の担う知識の伝搬と重なり合う)を解明しようとする比較史の試みである。19世紀国民国家創設の時代における「知」のあり方を、知的エリートとしての将校たちが担った軍事的学知から分析を試みる切り口は斬新である。さらにヨーロッパの戦争や軍隊に偏りがちだった従来の軍事史研究を批判し、オスマン・トルコや中国、日本などアジアにおける近代受容の一環として捉えようとする視点もよい。作業手順の焦点がよく絞られており、スケールの大きな比較史として成果が期待できる。
ライブクレムを基盤とする分子特異的ナノイメージング法の開発

独自に開発してきたライブクレム法をさらに発展させ、接着性細胞以外にも適応できる、汎用性の高い分子特異的ナノイメージング法の開発を行った。本研究により、浮遊性細胞である分裂酵母や出芽酵母、遊走性の高いテトラヒメナ細胞に適応できるライブクレム法を確立した。また、蛍光画像と電顕画像との位置合わせの精度を格段に上げる方法を考案した。ライブクレム(Live CLEM)とは、蛍光顕微鏡を用いて特定分子を観察した後に、同じサンプルを電子顕微鏡で観察する方法であり、生きた細胞の蛍光観察から得られた分子ダイナミクスと、電子顕微鏡観察から得られたナノメートルオーダーの超構造解析を同一試料で比較することにより分子特異的なナノイメージングが達成できる。本研究課題は、これまで独自に開発してきたライブクレム法をさらに発展させ、より汎用性が高く・空間精度の高いナノイメージング法を開発することを目的とする。具体的な目標としては、1)これまで接着細胞に限定されていた適応範囲をより広い生物試料に広げることと、2)蛍光像と電顕像の位置合わせの精度を向上させることである。本年度は、項目1)として、これまでライブクレム観察が不可能だった浮遊性細胞、分裂酵母に対して、細胞が動かないように固定(immobilize)していた方法に工夫を加えることによって方法の最適化を行い、分裂酵母に適応できるライブクレム法を確立した。遺伝学的解析が容易な分裂酵母での成功は、分子レベルの変化をナノレベルでの細胞構造変化に関連付けることが可能となるため、生命現象の理解のために特に有用である。項目2)では、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像の位置合わせの精度を向上させることを試みた。位置合わせの指標として細胞内に人工的なプラスティックビーズ(直径1マイクロメートル程度)を挿入し、その位置情報を元に、蛍光像と電顕像の位置決めを行い、これによって位置合わせが容易になることを確認した。この方法は、入れたビーズによって細胞機能が変化する可能性があるのが難点ではあるが、位置合わせの精度を上げることには有効であることが明らかになった。本年度は、項目1)として、浮遊性の細胞だけでなく、水中で動き回るテトラヒメナ細胞を用いて、自発的に動き回る細胞にも適応できるライブクレム法の開発を試みた。特殊なアガロースで細胞を固定することによって、ライブクレム法の観察条件を確立した。また、昨年度開発した、分裂酵母(Asakawa et al,2010)や出芽酵母(Kawai-Noma et al,2010)に適応できる方法については論文発表を行い公開した。項目2)では、位置合わせの指標として細胞内に導入した人工的なプラスティックビーズ(直径1マイクロメートル程度)を用いて、蛍光顕微鏡像と電子顕微鏡像の位置合わせの精度を向上させる方法を検討した。この結果、入れたビーズによって、位置合わせの精度は向上したが、細胞機能が変化するという問題点が明らかになった。この問題を回避するために、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両用プローブを使って位置合わせをする方法を検討した。プローブとして、目的分子を特異的に認識する抗体を使って、最適な観察結果が得られる条件の検討を行った。ライブクレム(Live CLEM)とは、蛍光顕微鏡を用いて特定分子を観察した後に、同じサンプルを電子顕微鏡で観察する方法であり、生きた細胞で得られた分子ダイナミクスと、電子顕微鏡観察から得られたナノメートルオーダーの超構造解析を同一試料で比較することにより分子特異的なナノイメージングが達成できる。本研究課題は、独自に開発したライブクレム法をさらに発展させ、より汎用性が高く・空間精度の高いナノイメージング法を開発することを目的とする。具体的には、1)これまで接着細胞に限定されていた適応範囲をより広い生物試料に広げること、2)蛍光像と電顕像の位置合わせの精度を向上させることを目標とする。本年度は、項目1)として、遺伝子デリバリー目的で開発された試薬のヒト細胞での効果について発表した(Hirose et al,Mol.Ther L,2012;Kobayashi et al,J.Gene Med.,2012)。項目2)として、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両用プローブを使用する方法を検討した。プローブとしてGFPを特異的に認識する抗体に蛍光色素と金粒子を結合させたものを使用し、分裂酵母の核膜タンパク質Ish1に対して観察に最適な条件を検討した。その結果、適度な量の界面活性剤の使用により良好な結果を得ることができた。

今回作成した方法は、プローブとして抗GFP抗体を使っているため、GFP融合タンパク質を発現させている様々な生物試料に応用できる可能性が高く応用範囲が広い。本研究課題終了にあたって総括すると、浮遊性の細胞であるため、これまでCLEMの対象となっていなかった分裂酵母(論文2編)、出芽酵母(論文1編)、テトラヒメナ(論文準備中)でも観察方法を確立することができた点、抗体を使って位置精度を格段に上げる方法を作成した点で大きな成果を上げた。これらの成果は学会や論文で発表した。
基底膜ライブイメージングによる組織構築メカニズムの解析

表皮や臓器の表面、血管の内面などは、互いに密着した細胞でおおわれている。基底膜はその細胞を下から支えるシートで、細胞の構造を保つために重要な役割をもつ。しかし生体内で基底膜がどのように変化しているかはほとんどわかっていない。そこで本研究では基底膜を蛍光標識する方法を開発し、マウス体内での基底膜の形成や分解を観察することを目的とした。蛍光標識を遺伝子導入したマウスでは、胎仔から成体まで、全身の基底膜に蛍光標識がみられることが確認された。このマウスを利用することで、将来的に血管の異常やがんの浸潤などの際に基底膜がどのように変化するかを解析し、病気のメカニズムの解明につながることが期待される。平成25年度は、まず基底膜蛋白質nidogen-1にEGFPの他、mCherry, Venus, Kaedeなど様々な蛍光蛋白質を融合させた複数の組換え蛋白質発現系を試作し、哺乳類細胞での発現・分泌効率が高いものの探索を行った。その結果、赤色蛍光蛋白質mCherryを融合させたnidogen1(nid1-mCherry)が高い発現・分泌を示すことが確認できた。そこでnid1-mCherry発現コンストラクトをマウスES細胞に導入し、安定発現細胞株を得た。nid1-mCherry安定発現ES細胞は、未分化状態ではほとんど蛍光が認められなかった。一方で胚様体に分化させた場合、基底膜部位にmCherryの蛍光が集積する様子が認められた。nid1-mCherryは未分化状態のES細胞では発現・分泌レベルが低く押さえられているか、もしくは分泌されてもすぐに拡散されており、胚様体が分化して基底膜を形成する状態になって始めて基底膜に集積して蛍光が観察されたものと考えられる。以上の結果から、nid1-mCherryを用いた基底膜ライブイメージングが可能であることがin vitroで確認できた。この成果をふまえ、基底膜イメージングモデル動物としてnid1-mCherry発現トランスジェニックマウスの作製に着手した。トランスジェニックマウス作製は理化学研究所発生・再生科学総合研究センター動物資源開発室との共同研究で行い、ROSA26遺伝子座にnid1-mCherry発現コンストラクトをノックインし、Cre-loxPシステム依存的にnid1-mCherryの発現が制御できるようにデザインした。これまでに相同組換えES細胞が得られている。平成26年度は、新たなin vitro基底膜イメージングモデルとして、MDCK細胞のcyst形成における基底膜の動態観察を行う系を確立した。具体的には、蛍光蛋白質を付加した基底膜蛋白質nidogen1(蛍光nid1)を安定発現するMDCK細胞株を作製し、Matrigel上で培養して細胞がcyst構造を形成する際の基底膜形成過程のライブイメージングを行った。その結果、蛍光nid1はまず細胞内で発現量が増加し、次第に細胞周囲に集積することが示唆された。また、in vivo基底膜イメージングモデルとして、蛍光蛋白質mCherryを付加したnidogen1(nid1-mCherry)を発現するトランスジェニックマウスを作製し、全身でnid1-mCherryを発現する個体が成長、繁殖可能であることを確認した。これらのマウス組織ではnid1-mCherryが内在性の基底膜部位に集積しており、基底膜イメージングモデルとして有用であることも示された。平成27年度は、基底膜イメージングモデル動物として作製したトランスジェニックマウスの評価を行った。Rosa26-CAGプロモーター下で全身にnidogen1-mCherryを発現するトランスジェニックマウス(nid1-mCherry Tg)は正常に出生・成長し繁殖可能である(平成26年度の成果)。nid1-mCherry Tgの胎仔、新生仔、および成体において複数の臓器でnidogen1-mCherryの蛍光が基底膜に局在するかどうかを評価した。胎仔期においては、発生初期のE6.5でエピブラスト基底膜およびReichert膜に蛍光が確認された。また発生後期では表皮、腎臓、肺、消化管で上皮や血管の基底膜に蛍光が局在していることも明らかとなった。特に消化管や血管の平滑筋層においては、筋細胞の基底膜にnidogen1-mCherryの蛍光が非常に強いことも見出された。新生仔および成体においても表皮、腎臓、肺で同様に基底膜に蛍光が局在している様子が認められた。一方で、成体の腎臓においては、尿細管の一部で細胞内に非常に強い蛍光が集積していることも明らかとなった。これは尿細管上皮細胞におけるnid1-mCherryの発現・分泌能の差異を表していると考えられるが、その詳細は今後の解析が必要である。胎仔組織を用いたwhole-mount観察を行ったところ、基底膜の蛍光とともに細胞内小胞の蛍光が強く、基底膜ライブイメージングを行うにあたってはさらに詳細な条件検討が必要であることが明らかとなった。平成26年度4月より研究代表者が異動したため研究環境が変化し、マウス組織を用いた培養実験の条件検討を十分に行うことができなかった。そのため目標としていた器官培養における基底膜ライブイメージングおよび基底膜の動態解析のデータが得られていない。平成27年度までに確立した基底膜イメージングモデルトランスジェニックマウス(Nid1-mCherry Tg)を用い、基底膜ライブイメージングにむけての評価と解析を行った。

これらのマウスでは蛍光タンパク質mCherryを融合したNidogen-1(Nid1-mCherry)が発現しており、胚発生の初期から成体まで広範な組織の基底膜においてNid1-mCherryが集積して基底膜に蛍光が観察されることが確認されている。本年度は、まずNid1-mCherry Tgマウスを用いて胎仔の顎下腺の器官培養系における基底膜のライブイメージングを試みた。摘出した顎下腺の上皮組織では基底膜の蛍光が認められたものの、間質組織におけるバックグラウンド蛍光が強いため、器官培養の条件下で基底膜の動態を継続的に観察するには不十分だと考えられた。そこで、その結果をふまえてマウス胎仔および成体組織において基底膜のライブイメージングに適した組織をさらに探索し、網膜の血管基底膜に着目して検討を行った。Nid1-mCherry Tgマウス網膜の毛細血管では、nid1-mCherryの蛍光が血管基底膜部位に明瞭に集積し、摘出した網膜のwhole-mount観察においてもバックグラウンドの低い状態で血管基底膜の蛍光が明瞭に観察されることが明らかとなった。マウスの網膜血管網は生後に発達することから、Nid1-mCherry Tgマウス網膜を用いることで生理的な血管新生における基底膜の変化について詳細な解析が可能になると期待される。さらに、網膜血管形成異常をともなう疾患モデルを用いることで、病的な血管リモデリングにおける基底膜の動態変化を解析し、疾患メカニズムの理解にもつながるものと期待される。前年度までの解析結果および今年度の成果をそれぞれ学術論文として報告する予定である。表皮や臓器の表面、血管の内面などは、互いに密着した細胞でおおわれている。基底膜はその細胞を下から支えるシートで、細胞の構造を保つために重要な役割をもつ。しかし生体内で基底膜がどのように変化しているかはほとんどわかっていない。そこで本研究では基底膜を蛍光標識する方法を開発し、マウス体内での基底膜の形成や分解を観察することを目的とした。蛍光標識を遺伝子導入したマウスでは、胎仔から成体まで、全身の基底膜に蛍光標識がみられることが確認された。このマウスを利用することで、将来的に血管の異常やがんの浸潤などの際に基底膜がどのように変化するかを解析し、病気のメカニズムの解明につながることが期待される。In vitro基底膜イメージングモデルとして、当初予定していたMDCK細胞を用いた基底膜プローブの安定発現株を作製し、基底膜の蛍光標識を継続的に観察することが可能となった。また、in vivoでも基底膜プローブを発現するトランスジェニックマウスが得られた。このトランスジェニックマウスは成長、出産に大きな異常がないことから、基底膜プローブの過剰発現が内在性の基底膜の機能を損なうものではないことが確認できたのは大きな進展といえる。Nid1-mCherry Tgマウスを用いた基底膜ライブイメージングの条件を確立し、胎仔組織の器官形成期における基底膜の動態を明らかにする。次年度使用額は以上の計画の遂行に必要な費用として使用する予定である。
膀胱癌の発癌、再発、進展における芳香族炭化水素受容体発現の意義

膀胱癌臨床検体を用いて臨床病理学的に検討した結果、芳香族炭化水素受容体(AhR)の発現が尿路上皮癌の予後因子である脈管浸潤と相関することが明らかになった。膀胱癌細胞株を用いた検討では、細胞外マトリックスの分解にかかわるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現とAhRの発現が相関することを明らかにした。また、AhRの発現を調節することで膀胱癌細胞株の浸潤能が変化することを明らかにした。1.膀胱癌組織を用いた臨床病理学的検討膀胱癌患者の膀胱全摘臨床検体56例を用いて免疫組織化学染色を行い、臨床病理学的に検討を行った。芳香族炭化水素受容体(aryl hydrocarbon receptor:AhR)の発現は核染色をもって陽性とし、癌細胞の陽性率を判定した。また、陽性率が50%以上の症例をAhR高発現とした。【結果】病理学的病期(pT)(p=0.008)、脈管浸潤(p=0.04)とAhRの過剰発現との相関が認められたが、組織学的悪性度、リンパ節転移(pN)との相関は認めなかった。次いで予後との相関について検討を行ったが、AhRの発現は無病生存期間および疾患特異的生存期間いずれを予測する独立した因子ではなかった。【結論】本検討ではAhRの発現と予後との相関は認められなかったが、病理学的病期および脈管浸潤との相関が明らかになった。病理学的病期、脈管浸潤はいずれも浸潤能を反映する因子であり、AhRが癌細胞の浸潤を調節している可能性が示唆された。われわれは腎細胞癌細胞株において、AhRの発現調節によりslugやE-cadherinといった上皮間葉転換に関連する因子の発現に影響し細胞浸潤が変化することを明らかにした(26th Annual European Association of Urology Congress)。膀胱癌においても同様にAhRが上皮間葉転換を誘導する事で浸潤に寄与する可能性があり、今後の検討課題である。2.膀胱癌細胞株のAhR発現調節膀胱癌細胞株(T24)にAhRのリガンドである2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)を添加し、AhR発現が増加をすることを確認した。TCDDの至適投与濃度は10nMであった。AhRに対してデザインされたsiRNA配列をリボソーム法にて各細胞にトランスフェクションさせ、AhR発現が特異的に抑制されることを確認した。以上より、in vitroにおけるAhRの発現調節が達成された。【膀胱癌組織におけるAhRの発現の臨床的意義の解明】慶應義塾大学病院で膀胱癌に対して施行した膀胱全摘除術による膀胱癌臨床検体56例を用いて、芳香族炭化水素受容体(Aryl hydrocarbon receptor : AhR)の免疫染色を施行し臨床病理学的に検討を行い、脈管浸潤を認める症例においてAhRの発現が有意に高い事を明らかにした(p<0.05)。当教室は、膀胱と同じ尿路上皮から発生する上部尿路上皮癌において、AhRの発現と脈管浸潤が相関しそれぞれが予後を予測する独立した因子であることを報告している。本研究により膀胱癌においても上部尿路上皮癌と同様にAhRが予後を予測する因子である可能性が示唆された。【膀胱癌細胞株を用いたAhRの機能解析】realtimeRT-PCRにてmRNAの発現量を定量した。AhRのリガンドである2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)の膀胱癌細胞T24への投与により、AhRの発現は50.0%増加した(p<0.05)。また、siRNA導入によりAhRの発現は89.0%低下した(p<0.05)。AhRの発現量の調節が細胞周期・アポトーシスに与える影響は、T24においては認められなかった。AhRの発現量増加は、MMP-1、MMP-9の発現量をそれぞれ増加させ(187.6%、98.3%、p<0.05)、またAhRの発現量低下はMMP-1、MMP-9の発現量をそれぞれ低下させた(92.3%、94.8%、p<0.05)。Matrigel invasion assayを用いた検討では、T24の浸潤がTCDDの投与により68.6%亢進し(p<o.05)、siRNA導入により52.8%低下した(p<0.05)。【本研究の成果】膀胱癌においてAhRが浸潤と深く関わる可能性が示唆され、AhRを標的とした新規治療が期待される。
フォトクロミックフィルム放射線線量計の開発と医療応用への実践

医療におけるフィルムを用いた線量測定は、放射線治療における2次元線量分布の取得や個人被ばく線量の管理などに用いられる。フォトクロミック分子による化学反応でX線を高感度に可視化できる色素が本邦で開発された。本研究では、フォトクロミックフィルムの医療における線量測定へのポテンシャルを見極め、様々な放射線(X線、電子線、陽子線、炭素線など)に対応可能、簡便で安価、優れた空間分解能、迅速な結果の取得可能な新規フィルムの開発を目指す。
リンドウにおける外来遺伝子フリーのゲノム編集技術の確立

ゲノム編集は様々な作物で適用が進んでおり、リンドウでもCRISPR/Cas9系を利用してアグロバクテリウム法により編集体を作出する系が確立されている。実用を考えた場合、外来遺伝子を有しない編集体の作出が有効と考えられるが、リンドウはヘテロシス性が高く、育成に時間がかかる多年生植物であるため、交配によるnull-segregantの作出は困難である。そこで本研究では、Cas9とguide RNAを一過的に発現させることでリンドウのゲノム編集を可能とする、外来遺伝子組み込みフリーの系の確立と、その効率的な選抜法の開発を目指す。