hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間質性肺炎肺線維症における肺内細胞のLDHAおよびB遺伝子発現に関する研究

これらの細胞に対し様々な刺激(PMA,IL-1β,TNF-αなど)を加えた条件での総細胞RNAを抽出し,LDHAおよびB遺伝子の発現量の変化をmRNAレベルで検討中である.現在研究はon goingであり,今後さらにこのmRNAレベルの検討を継続すると共に,(1)LDHAあるいはB遺伝子が特異的刺激で発現レベルが制御される場合,この制御が遺伝子の転写レベルで行われるのか,あるいは転写後のレベルで制御されるのか否かを検討する.(2)実際の病変の場におけるLDH産生細胞を検討するため,IIP患者より肺の生検ないし剖検にて得られた組織標本を用いて,in situハイブリダイゼイション法にて,LDHAおよびB発現細胞の同定と発現のレベルの質的・量的解析を行う予定で,研究計画を検討中である.原因不明のびまん性間質性肺炎・肺線維症(IIP)の病勢に並行して血清lactate dehydrogenase(LDH)活性が上昇することが知られているが,この機序について詳細は不明である.LDHはM(A)およびH(B)サブユニットの結合よりなる4量体で5分画のisozymeが存在するが,間質性肺炎で上昇するLDHは主にH3M1(B3A1)よりなるLDH2である.本研究ではIIPにおけるLDH2の増加が肺組織を構成する細胞(肺上皮細胞,線維芽細胞など)のうち何れの細胞から,いかなる機序で引き起こされるのかを,LDHAおよびB遺伝子の発現レベルで比較検討し,細胞および分子レベルでの機序の解明を図ることを目的とするものである.本研究に対する平成5年度科研費より,当初の計画に沿って設備・備品・試薬を購入し,現在研究を進めている.1.LDHAおよびLDHB遺伝子のcDNAクローニングGenBankデータベースに登録されているLDHAおよびB遺伝子のmRNA(cDNA)の塩基配列を,日立社のDNASISプログラムを用いて検出し,それを元にA,BそれぞれのcDNA全体をカバーするオリゴヌクレオチドプライマー対を作成した.さらに,ヒト由来の肺線維芽細胞WI-38および,ヒト単核球よりmRNAを抽出し,これらを元に逆転写酵素によりcDNAに変換し,これを鋳型としてそれぞれのプライマー対を用いてpolymerase chain reaction(PCR)にて増幅した.さらに,これらcDNAの両端を特異的な制限酵素(HindIIIとXhoI)で切断後,pBluescriptIISK_+プラスミド内にサブクローニングした.得られたcDNA片の長さはLDHA1.6kb,LDHB1.3kbで,BamHI,XhoIなどの制限酵素による切断片の長さ,およびシークエンス反応による塩基配列からLDHAおよびBであることを確認した.2.肺由来の培養線維芽細胞,肺胞上皮細胞などにおけるLDHAおよびB遺伝子の発現の検討疾患において低酸素刺激や各種の炎症刺激の標的となる肺胞上皮細胞,線維芽細胞などの肺実質細胞について,モデルとしてそれぞれの形質を有する培養細胞を用いin vitroで実験を進めている.これらの細胞に対し様々な刺激を加えた条件での総細胞RNAを抽出し,LDHAおよびB遺伝子の発現量の変化をmRNAレベルで検討中である.
マルチカーネル学習の新展開

本研究課題は、再生核ヒルベルト空間論に立脚する機械学習の分野において近年注目を浴びている、複数再生核を用いた学習法に「射影バイアス推定」という新たな方法論を導入し、機械学習の性能を向上させることを目的としていた。一方、昨年度の理論研究の成果により、当初の目的を達成することは理論的に不可能であることが判明したが、当該検討の中で、汎化性能の高い再生核について新たな知見を得た。具体的には、推定対象である未知関数に想定する自己相関関数が期待値の意味で最適な再生核であることを解明している。今年度は、当該知見、すなわち、推定対象である未知関数の自己相関関数の重要性に立脚し、モデル選択において多く用いられる一方、その理論的妥当性については十分な解明がなされていなかった、Cross-Validation法の理論的妥当性について解析を行い、Cross-Validationの意味で最小誤差を達成するモデルは、汎化誤差を最小化するモデルと、期待値の意味で一致することを証明するに至った。また、当初想定していた、複数再生核に基づく「射影バイアス推定」に代わり、単一再生核において、最小射影バイアスを達成する再生核を近似的に同定できることも解明した。この知見により、新たなモデル選択手法の構築が可能となる。これらの知見は、今後、対外発表する予定である。他方、再生核を用いた機械学習の応用展開の一つとして、製鉄に用いる溶鉱炉中の材料表面の形状推定法について検討し、一編の論文を公表するに至っている。本研究課題は,再生核ヒルベルト空間論に立脚する機械学習の分野において近年注目を浴びている,複数再生核を用いた学習法に新たな方法論を導入し,機械学習の性能を劇的に向上させることを目的としたものである.より具体的には,推定対象を単なる複数再生核の線形結合で表現するのではなく,各再生核と訓練データが規定する部分空間への直交射影を拘束条件とし,当該拘束条件を利用して,射影により失われた成分を積極的に推定する(我々は,これを「射影バイアス推定」と呼んでいる)ことにより,より高精度な学習の実現を目指すものである.今年度当初の目標は,比較的単純な有限次元の再生核ヒルベルト空間における「射影バイアス推定」の可能性について検討する予定であった.一方,従来の複数再生核を用いた学習法について,これまでその理論的な限界や性質等が明らかになっていなかったことから,本研究課題にて構築を目指す新しい学習法の評価に支障をきたす可能性があると考え,今年度は,従来の複数再生核を用いた学習法の理論解析に充当した.その結果,従来,複数の再生核を用いることで,単一の再生核を用いた推定法よりも表現力の高いモデルが構築可能と考えられていたが,現実には,単に所与の複数再生核を線形結合して得られる単一の再生核による学習結果以上の推定精度は得られないことが理論的に明らかになった.このことは,本研究課題にて構築を目指す新たな学習法の優位性を相対的に高める結果となるといえる。研究実績の概要にて述べたように,今年度は,計画段階では予定していなかった,従来の複数再生核を利用した学習法の理論的な限界や性質等の解明に充当した.これにより,当初予定していた「射影バイアス推定」を用いた学習法の構築には若干の遅れが生じている.一方,今年度の成果,すなわち,従来の複数再生核を用いた学習法についての理論解析により,従来の複数再生核を用いた学習法は,本来,複数再生核を用いることにより期待される,潜在的な学習モデルの表現力の高さを有効に利用することすらできておらず,単に複数再生核を線形結合して得られる単一再生核を用いた学習に過ぎないことが初めて明らかとなった.これは,当初計画にはなかったものの,非常に重要な論点であり,また,結果と言える.また,この結果は,本研究課題にて構築を目指す新たな学習法の意義を相対的に高めるものであるとも言える.以上のことから,本研究課題は,概ね順調に推移していると考える.本研究課題は,再生核ヒルベルト空間論に立脚する機械学習の分野において近年注目を浴びている,複数再生核を用いた学習法である,所謂マルチカーネル学習に新たな方法論を導入し,機械学習の性能を劇的に向上させることを目的としたものである.より具体的には,推定対象となる関数を単なる複数再生核の線形結合で表現するのではなく,各再生核と訓練データが規定する部分空間への複数の直交射影を拘束条件とし,当該拘束条件を利用して,射影により失われた成分を積極的に推定する(我々は,これを「射影バイアス推定」と呼んである)ことにより,より高精度な学習の実現を目指すものである.今年度は,本研究課題の主論点である「射影バイアス推定」に関する詳細な理論検討を開始したが,当該理論検討を通して,計量の異なる再生核ヒルベルト空間に対応する複数の再生核に基づく直交射影を用いても,単一再生核を用いた直交射影による拘束条件以上の情報が得られないことが理論的に明らかになった.

一方,当該検討の中で,カーネル回帰における再生核の役割について新たな知見を得るに至った.より具体的には,再生核として,推定対象である未知関数の自己相関関数を用いることにより,期待二乗誤差最小という意味で最適な結果が得られることを理論的に証明した.また,本課題に密接に関連する,再生核ヒルベルト空間における標本化理論に関する新知見,具体的には,移動不変な再生核ヒルベルト空間と等間隔標本点に基づく標本化定理が成立するための新たな必要十分条件や,回帰推定において問題となる雑音を抑制する新たな手法を開発した.研究実績の概要にて述べたように,本研究課題の主論点である,カーネル回帰問題において複数再生核を用いた場合に,複数の再生核に由来する計量の異なる再生核ヒルベルト空間における直交射影による拘束を用いる「射影バイアス推定」に関して,実際は,当該拘束が当初予想したようには機能しないことが理論的に解明された.ところで,単一再生核を利用するにせよ、複数再生核を利用するにせよ,カーネル回帰の目的は,汎化性能の高い推定結果を与える手法を構築することにある.先に述べた主論点に関しては,これ以上の進展は望めなくなったものの,研究実績の概要にて述べたように,理論検討の中で,汎化性能の高い再生核とは何か,というより重要な問題に対して,一定の理論的成果を得た.具体的には,推定対象である未知関数の自己相関関数に対応する再生核が最も良い性能を与えるものであることを理論的に証明した.この成果は,単一再生核であるか、複数再生核であるかによらず,カーネル回帰問題に対して重要な知見であるといえる.また,本研究課題に密接に関連する標本化理論や雑音抑制等に関しても新しい知見も得ている。以上のことから,本研究課題は,概ね順調に推移していると判断する.本研究課題は、再生核ヒルベルト空間論に立脚する機械学習の分野において近年注目を浴びている、複数再生核を用いた学習法に「射影バイアス推定」という新たな方法論を導入し、機械学習の性能を向上させることを目的としていた。一方、昨年度の理論研究の成果により、当初の目的を達成することは理論的に不可能であることが判明したが、当該検討の中で、汎化性能の高い再生核について新たな知見を得た。具体的には、推定対象である未知関数に想定する自己相関関数が期待値の意味で最適な再生核であることを解明している。今年度は、当該知見、すなわち、推定対象である未知関数の自己相関関数の重要性に立脚し、モデル選択において多く用いられる一方、その理論的妥当性については十分な解明がなされていなかった、Cross-Validation法の理論的妥当性について解析を行い、Cross-Validationの意味で最小誤差を達成するモデルは、汎化誤差を最小化するモデルと、期待値の意味で一致することを証明するに至った。また、当初想定していた、複数再生核に基づく「射影バイアス推定」に代わり、単一再生核において、最小射影バイアスを達成する再生核を近似的に同定できることも解明した。この知見により、新たなモデル選択手法の構築が可能となる。これらの知見は、今後、対外発表する予定である。他方、再生核を用いた機械学習の応用展開の一つとして、製鉄に用いる溶鉱炉中の材料表面の形状推定法について検討し、一編の論文を公表するに至っている。平成29年度以降は,当初計画において主論点であった,「射影バイアス推定」に基づく,複数再生核を用いた学習理論の検討・構築に着手する.現状,基礎的な検討を行う数学的な方法論については概ね準備を終えた段階であり,本格的な理論解析にとりかかることが可能となっている.他方,今年度の成果により,従来の複数再生核を用いた学習法においても,改良の余地が大きく残されていることが判明したため,新たな論点として,従来の複数再生核の線形結合による学習法の直接の改良や,より精度の高い学習結果を与える再生核そのものの設計法についても並行して検討を進める予定である.研究実績の概要にて述べたように,本研究課題の主論点については,これ以上の進展は望めないことが明らかになった.
アメリカにおけるメディアとしてのペーパー・テストの普及に関する社会史的研究

3年間にわたる研究をまとめて、報告書を作成した。筆記試験はアメリカでは19世紀半ばに出現した。口頭試問にくらべて、筆記試験は、公正性、正確さ、客観性において優れているという理由であった。1870年代に鉛筆や紙の大量生産が始まったこと、学年制をもった学校が出現し、大量の生徒を対象として進級試験が実施されるようになったこと、などにより、筆記試験は19世紀末には主要な試験の方法になっていた。教師の間では、筆記試験が授業と試験の乖離をもたらすとして、その導入に慎重な意見も強かったが、20世紀初頭には、教育の能率と平等を追求する手段として、筆記試験がさらに普及していった。1910年代から1920年代にかけて流行した教育測定運動のなかでは新型といわれる筆記試験が登場した。それは、能率と客観性を徹底して追求するために、多肢選択式のペーパー・テストであり、教師の判断を極力排除しようとするものであった。20世紀初頭の進歩主義の学校では、知識の有無を調べるテストではなく、知識を行動にどのように結び付けようとしているかを問う形のペーパー・テストが開発された。その一つの例は、コロンビア大学ティーチャーズ・カレッジのホーレスマン・スクールで、チャセルが開発した道徳性を測定するためのテストであった。この方法は、道徳性の測定に関心をもっていたソーンダイクの意向を受けて実施されたものであった。ホーレスマン・スクールではプロジェクト・メソッドが実施されていたにも関わらず、実は、道徳性の習得に点数をつけるためのペーパー・テストとも深いつながりを持っていたのである。平成20年度は、先行研究の探索と整理、および史料の収集が主たる目的であった。宮本は20年11-12月にニューヨーク大学、ニューヨーク市公文書館、およびスタンフォード大学を、佐藤は平成21年3月にティーチャーズ・カレッジを訪問し、史料を収集すると同時に、教育史研究者に会って、米国における研究の状況を確認した。先行研究から、紙と鉛筆が19世紀の半ばに普及したこと、成績評価の客観性と能率向上を主な目的として、ペーパー・テストが19世紀後半に採用され始め、19世紀末に普及したことなどを知ることができた。しかし、学校現場での試験の実態についての研究は少なく、ペーパー・テストの普及が授業にどのような影響をもたらしたのかは解明されていなかった。そこで、宮本は、19世紀後半に書かれた教授理論書の収集と分析を進め、ペーパー・テストの普及によって、授業と試験との乖離がもたらされたことを突き止めた。19世紀半ばまでは、試験は、授業者が口頭で、個別に行なうことが普通であった。しかし、多くの生徒を対象に能率よく成績をつけるにはペーパー・テストが有効と主張する教育行政官が出現した。さらに、学年制が導入されると、彼らは進級の基準が客観的であることを要求するようになり、進級試験の判定に授業者が関与することは制限されるようになった。こうして、能率と客観性が追求されるなかで、試験が授業を改善するための手段という側面が捨象されてしまった。佐藤が分析を進めている20世紀の進歩主義学校でも、教師は当初、ペーパー・テストの精度を上げようと試みていたが、実験を重ねるうちに、ペーパー・テストが学力の一面しか見ていないこと、しかも、授業の改善にはつながらないということに気がついた。そこで、教師はペーパー・テストに代わる新しい評価方法を模索し始めたのである。宮本は、19世紀末後半から20世紀前半にかけて、筆記試験が普及した経緯とそれが小学校の授業と教師に与えた影響を中心に分析した。佐藤は、20世紀初頭のティーチャーズ・カレッジの付属小学校で、筆記試験に代わる評価方法としてどのようなものがあったかを探索した。2009年10月に相互に研究成果を報告しあって、進捗状況を確認した。宮本は、(1)19世紀末に紙と鉛筆が普及し、学校で利用されるようになったこと、(2)それによって、客観的で公平、かつ能率的な試験として、筆記試験が19世紀後半に普及したこと、(3)グレイド制が普及して、進級試験も筆記試験になると、授業者は試験の採点や合否基準に関与できなくなり、試験と授業との距離が生じて、その結果、授業改善を目的としない試験が普及したこと、(4)20世紀初頭に教育測定が普及し、授業の目的と試験との関係が無視されるようになったこと、などを示した。佐藤は、ティーチャーズ・カレッジ付属ホレースマン・スクールで行われた教育測定法の実験研究を詳細に分析した。同校でもペーパー・テストによって教育成果を測定する動きが強まっていたけれども、プロジェクト・メソッドを提起していたキルパトリックらはペーパー・テストではなく、観察を重視した子ども理解と指導(質問)のための方法を模索していた。それは市民性チャートとして具体化され、性格形成に関する測定の手段であると同時に、望ましい習慣・態度やそれに関する教科の知識を統合的かつ主体的に学習できるように導く手段として構想されていた。しかし、動機、興味、態度、欲求などの内的側面を評価して指導するには不十分であり、のちに、ペーパー・テストに取って代わられた。その経緯はさらに解明すべき課題である。

1870年代に鉛筆や紙の大量生産が始まったこと、学年制をもった学校が出現し、大量の生徒を対象として進級試験が実施されるようになったこと、などにより、筆記試験は19世紀末には主要な試験の方法になっていた。教師の間では、筆記試験が授業と試験の乖離をもたらすとして、その導入に慎重な意見も強かったが、20世紀初頭には、教育の能率と平等を追求する手段として、筆記試験がさらに普及していった。1910年代から1920年代にかけて流行した教育測定運動のなかでは新型といわれる筆記試験が登場した。それは、能率と客観性を徹底して追求するために、多肢選択式のペーパー・テストであり、教師の判断を極力排除しようとするものであった。20世紀初頭の進歩主義の学校では、知識の有無を調べるテストではなく、知識を行動にどのように結び付けようとしているかを問う形のペーパー・テストが開発された。その一つの例は、コロンビア大学ティーチャーズ・カレッジのホーレスマン・スクールで、チャセルが開発した道徳性を測定するためのテストであった。この方法は、道徳性の測定に関心をもっていたソーンダイクの意向を受けて実施されたものであった。ホーレスマン・スクールではプロジェクト・メソッドが実施されていたにも関わらず、実は、道徳性の習得に点数をつけるためのペーパー・テストとも深いつながりを持っていたのである。
DNA再複製の回避・修復に関与するゲノム安定性維持機構の解析

DNA複製制御機構の破綻により生じる再複製はゲノムの不安定化を引き起こす。研究代表者はこれまでにCdt1がDNA複製を抑制することでゲノム安定性維持に寄与する可能性を見出してきた。本研究では、ゲノムDNAの再複製によって誘発されるゲノム不安定化を回避するためのゲノム安定性維持機構の同定および、Cdt1によるDNA複製阻害機構の解明を目的とした。その結果、1)Cdt1が複製フォークの進行を阻害することで新生鎖伸長反応を抑制すること、2)この阻害作用にはCdt1の255-289アミノ酸領域が必要であること、3)Cdt1のライセンス化活性はDNA複製抑制作用には必要でないことを明らかとした。本研究では、再複製の回避・修復に関与するゲノム安定性維持経路の同定およびCdt1によるゲノム安定化作用との連携について分子レベルより解析することを目標とする。我々はこれまでにCdt1が再複製の際にDNA複製を抑止することでゲノム安定性維持に寄与している可能性を示す結果を得ている。そこで、Cdt1によるDNA複製抑制作用の詳細な分子的機序についての知見を得るため、アフリカツメガエル卵抽出液に過剰量のCdt1を添加したときの新生鎖伸長反応をアルカリアガロースゲル電気泳動法により調べた。CDKインヒビターであるp27を添加した卵抽出液に、DNAポリメラーゼ阻害剤であるアフィディコリンで処理したクロマチンを添加することで、再複製の開始が起こらない条件下でDNA鎖伸長反応を再開させた。このとき過剰量のCdt1を添加することにより、新生鎖伸長反応の顕著な抑制が観察された。これはCdt1による新生鎖伸長反応の阻害が再複製の開始に非依存的に起こることを示している。また、Cdt1がRPAのクロマチン結合に与える影響について調べたところ、アフィディコリンによって誘導されるRPAのクロマチン上への蓄積がCdt1によって抑制されることを見出した。この結果は、Cdt1が複製フォークの進行を阻害することで新生鎖伸長反応を抑制することを示唆している。さらに、複製フォークの停止に関わるCdt1の機能領域の同定を目指して、種々のCdt1変異体を作製し、新生鎖伸長反応に対する影響を調べた。その結果、N末端側1-254アミノ酸領域およびC末端側606-620アミノ酸領域は複製フォークの停止に必須の役割を果たしていないことが示唆された。本研究は、再複製の回避・修復に関与するゲノム安定性維持経路の同定およびCdt1による複製フォーク停止機構との連携について解明していくことを目的とし、培養細胞を用いた遺伝学的・細胞生物学的解析と、生化学的解析を密接に組み合わせながら研究を進展させることを計画している。現在のところ、Cdt1の機能についての生化学的解析を中心的に進めている。種々のCdt1変異体タンパク質が得られており、複製フォークの停止に関与するCdt1の機能領域の同定に向けた解析を順調に進めている。培養細胞を用いた解析については、ニワトリDT40細胞においてCdt1誘導発現株の樹立に向けた検討を進めているところである。本研究は、ゲノムDNAの複製開始機構とゲノム安定性維持機構の再複製時における連携の機序を明らかとすることを目的とした。研究代表者の研究グループはこれまでに、アフリカツメガエル卵抽出液においてDNA複製ライセンス化因子であるCdt1が過剰に存在すると、DNAの再複製が誘起される一方でDNA合成反応の抑制が引き起こされることを見出している。研究代表者は前年度までに、Cdt1が再複製の開始に非依存的に複製フォークの進行を阻害することで新生鎖伸長反応を抑制することを見出した。本年度では、複製フォークの進行停止に関わるCdt1の機能領域の同定を目指し、種々の欠失変異体タンパク質を作製し、アフリカツメガエル卵抽出液へ添加したときのDNA複製への影響について検討した。その結果、Cdt1の255-289アミノ酸領域が複製フォーク停止に重要な役割を果たしていることを明らかとした。さらに、ライセンス化活性を示さないアミノ酸置換変異体(R285A)においても野生型と同等の複製阻害活性を示すことを見出した。また、Cdt1の阻害因子であるGemininが、Cdt1による複製フォークの停止を解除するのに必要な機能領域の同定をおこなった。培養細胞を用いた解析では、再複製誘発時に機能するゲノム安定性維持機構の同定を目的として、ニワトリDT40細胞でCdt1発現誘導株の樹立をおこなった。まず、野生型DT40細胞を用いてCdt1発現誘導株を作製した。作製した細胞株にCdt1を強制発現したところ、顕著な再複製の誘導が確認された。現在、ゲノム安定性維持に関与する遺伝子を破壊した種々のDT40細胞株を用いてCdt1発現誘導株の作製を進めている。また、Cdt1過剰発現による複製阻害効果を培養細胞でも確認するため、DT40細胞とヒト細胞を用いて、種々のCdt1変異体誘導発現株の作製を進めている。

再複製誘発時に機能するゲノム安定性維持経路を特定し、その機能を理解することに重点を置く予定である。種々の遺伝子を破壊したニワトリDT40細胞にCdt1を強制発現し、再複製を誘発させたときの細胞の動態についての詳細な解析をおこなう。また、再複製誘発時にゲノム安定性維持に重要な役割を果たすことが示唆されたタンパク質について、アフリカツメガエル卵抽出液を用いた生化学的解析を実施し、その機能の詳細について明らかとすることを目指す。さらに、ゲノム編集技術によりヒト細胞の遺伝子操作をおこない、より詳細な細胞生物学的解析を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学28年度が最終年度であるため、記入しない。
マウス前立腺に及ぼすエストロゲン投与の効果と免疫系の相関

C57BL/6マウスの新生時期にエストロゲンを投与しておく(E2マウス)と、成獣になってからほぼ全例に前立腺の異形成、腺上皮の過形成がみられた。これらの病変に伴い激しいリンパ球や好中球の浸潤を認めた。エストロゲンを出生当日から3日間投与すると前立腺の病変は全例に発症したが、7日以降に投与しても形態学的な異常や、細胞浸潤は認めなかった。前立腺に炎症をもつE2マウスの血清中には前立腺に対する自己抗体は検出されなかった。一方、生後3日にC57BL/6マウスの胸腺を摘出しておく(Tx-3マウス)と、約1/3のマウスに自己免疫性の前立腺炎が発症した。同マウスの血中には前立腺上皮細胞と特異的に反応する自己抗体が蛍光抗体間接法で確認できた。この病変は生後7日以降に胸腺摘出したマウスには発症しなかった。生後7日の前立腺を、E2マウスとTx-3マウスの腎皮膜下にそれぞれ移植した。14日後にその移植片を病理学的に調べると、E2マウスに移植した組織は正常に前立腺に分化していたが、Tx-3マウスに移植した組織にはリンパ球の浸潤があり、上皮の傷害が認められた。Tx-3マウスに発症する前立腺炎は同系正常マウスの末梢のCD4CD25陽性細胞を注射しておくと、予防することができた。ところが、E2マウスに発症する前立腺炎は同処置では予防することができなかった。以上のことはTx-3マウスに発症する前立腺炎は自己免疫性であるが、E2マウスの前立腺炎には自己免疫現象の関与はないものと思われる。Tx-3マウスに生後7日あるいは14日から3日間E2を投与しておくと、高率に自己免疫性前立腺炎の発症がみられた。21日からの投与では変化がなかった。この現象は若年期E2の投与により、前立腺抗原の性状の変化やバリヤーの弱体化が示唆された。さらに環境ホルモンの免疫系に及ぼす影響を検討する上でも意義のある研究である。前立腺の原基である泌尿生殖洞を胎齢16日のマウスから採取し、E2マウスとTx-3マウスの腎皮膜下にそれぞれ移植した。

14日後にその移植片を病理学的に調べると、E2マウスに移植した組織は正常に前立腺に分化していたが、Tx-3マウスに移植した組織にはリンパ球の浸潤があり、上皮の傷害が認められた。Tx-3マウスに発症する前立腺炎は同系正常マウスの末梢のCD4陽性細胞を注射しておくと、予防することができた。ところが、E2マウスに発症する前立腺炎は同処置では予防することができなかった。以上のことはTx-3マウスに発症する前立腺炎は自己免疫性であるが、E2マウスの前立腺炎には自己免疫現象の関与はないものと思われる。C57BL/6マウスの新生時期にエストロゲンを投与しておく(E2マウス)と、成獣になってからほぼ全例に前立腺の異形成、腺上皮の過形成がみられた。これらの病変に伴い激しいリンパ球や好中球の浸潤を認めた。エストロゲンを出生当日から3日間投与すると前立腺の病変は全例に発症したが、7日以降に投与しても形態学的な異常や、細胞浸潤は認めなかった。前立腺に炎症をもつE2マウスの血清中には前立腺に対する自己抗体は検出されなかった。一方、生後3日にC57BL/6マウスの胸腺を摘出しておく(Tx-3マウス)と、約1/3のマウスに自己免疫性の前立腺炎が発症した。同マウスの血中には前立腺上皮細胞と特異的に反応する自己抗体が蛍光抗体間接法で確認できた。この病変は生後7日以降に胸腺摘出したマウスには発症しなかった。生後7日の前立腺を、E2マウスとTx-3マウスの腎皮膜下にそれぞれ移植した。Tx-3マウスに発症する前立腺炎は同系正常マウスの末梢のCD4CD25陽性細胞を注射しておくと、予防することができた。Tx-3マウスに生後7日あるいは14日から3日間E2を投与しておくと、高率に自己免疫性前立腺炎の発症がみられた。21日からの投与では変化がなかった。この現象は若年期E2の投与により、前立腺抗原の性状の変化やバリヤーの弱体化が示唆された。さらに環境ホルモンの免疫系に及ぼす影響を検討する上でも意義のある研究である。
コラーゲン特異的分予シャペロンHSP47の構造と機能

マンチェスター大学のBulleid博士は、semi-permeabilizedcellを用い、in vitroでのコラーゲンの生合成過程におけるHSP47の機能を解析し、HSP47がコラーゲン合成の初期過程特に三重鎖の形成に分子シャペロンとして関わっていることを示した。本年は博士を京都大学に招き、セミナーを催すとともに、データの交換を行った。我々の研究室では、HSP47ノックアウトマウスを作成し、in vivoにおけるHSP47の機能解析を行った。ノックアウトマウス及びそのマウスから作成した線維芽細胞を用いた実験から、HSP47がすべてのコラーゲンの正常な分子の形成に必須であること、またその働きは、いわゆる酵素としてではなく分子シャペロンとして働いていることを明らかにした。Bulleid博士のin vitroでの解析、我々のin vivoでの解析共に、同じ結果を示し、HSP47が生体内で細胞を形作るために最も重要な分子であるコラーゲンの合成に必須の分子シャペロンであることを明らかにした。HSP47は、特異的分子に対して、明確な機能を持つ事が明らかになった最初の分子シャペロンである。HSP47の機能を明らかにする一助として、結晶構造解析を計画し、研究を進めてきた。種々の条件の組み合わせにより、結晶化を試みてきたが、現時点で未だ成功していない、今後さらに、コラーゲン様分子との共結晶化など、新たな方法の導入により、結晶化をはかり、構造を明らかにしていきたいと考えている。この二年間の国際共同研究を通して、HSP47の機能解析という大きな初期の目標を達成する事ができた。今後はさらにこの共同研究体制を押し進め、HSP47の分子シャペロンとしての詳細な作用メカニズムを明らかにしていきたいと考えている。コラーゲンに結合能を有する分子シャペロンHSP47は、生体内のコラーゲンの生成に重要な働きをしている。HSP47が、コラーゲン生成のどの過程で関与しているかについては、未だ決定的な結論を出し得ていない。両分子の結合・解離のメカニズムを解析する事は、両分子の相関関係を解明する上で、重要な手がかりとなる。欠損変異、点突然変異を導入したHSP47を用いた研究から、HSP47の結合には、コラーゲン特異的な結合ドメイン様の部位は存在せず、分子全体のコンフォメーションの変化によって、結合しているらしいと想像される。本年度は、両者の結合様式を解析する足がかりとして、HSP47の分子構造の解析を試みた。分子構造を解析する方法論として、X線による結晶構造解析、NMRによる解析等が存在するが、詳細な構造解析ができること、コラーゲンとの結合状態を視覚化できることから、X線による結晶構造解析を行う事とした。我々の研究室には、結晶解析を行う技術が無いため、共同研究を行う事とし、米国アーカンソー大学のJoshua Sakon博士に解析を依頼した。Joshua Sakon博士はX線による結晶構造解析を専門とし、コラーゲンと挙動を共にする種々の蛋白質の分子構造を明らかにしている。我々は、第一段階賭して、HSP47の結晶化を試みた。純化したHSP47は、その溶解度の低さから、結晶化が非常に困難であった。両研究室で条件の検討を重ね、現在ようやくその目途がたち始めている。次年度以降、急速な展開が期待される。次年度は、結晶構造の解析の結果をふまえて、in vivoにおける、コラーゲンとHSP47の共役関係をsemi-permeabilized cellを用いて、解析していく予定である。
上気道のアレルギー、炎症疾患の動態・治療へのサイトカインを介したアプローチ

A.気道ウイルス感染のモデルからヒト気道感染ウイルスの1つであるrespiratory syncytialvirus(以下RSウイルス)のマウス感染モデルを用いて種々の検討を行なった。RSウイルス感染ではG糖蛋白によりTh2サイトカインが、F糖蛋白によりTh1サイトカイン産生が特に優位に生じ、特異な病態形成に関与していることが想定される。粘膜免疫によりサイトカイン(特にTh2)産生の減少、肺での炎症反応の軽減化が認められた。鼻粘膜での有効なRSウイルス増殖の抑制は鼻内免疫群でのみ認められた。一方、RSウイルスを経鼻接種したマウスでは、ヒスタミン点鼻による鼻かき発作を知覚過敏の指標とした検討で、ウイルス増殖に伴って知覚過敏の亢進が一過性に認められた。この知覚過敏の機序として、上皮細胞の障害、脱落以外に、ヒスタミンH1受容体(H1R)の発現亢進が認められたH1R発現亢進には、ウイルス感染に伴う上皮細胞からのIL-6の関与があると示唆された。ウイルス感染により上皮細胞の障害や脱落による知覚神経の露呈、抗原や炎症メディエーターの透過性亢進のみならず、神経受容体にも変化が生じて、過敏性形成がみられると考えられた。B.サイトカインを強く発現したトランスジェニックマウスの検討からIL-10を鼻粘膜組織で強く発現させたトランスジェニックマウス(以下IL-10 TG)を用いて鼻アレルギー、上気道ウイルス感染へのIL-10の役割を検討したところ、IL-10を鼻粘膜局所で強く発現させたマウスでは、感染細胞でのアポトーシスの誘導亢進、アレルギー感作でのTh2/Th1サイトカインのアンバランス亢進など多彩な変化が認められた。1 RSウイルスのGあるいはF糖蛋白遺伝子を組み込んだリコンビナント・ワクチニアウイルス(G・rVV,F・rVV)を皮内接種し、3週間後にRSウイルスの経鼻接種を行なったBALB/cマウスでは、気道にリンパ球,好酸球浸潤を中心とした強い炎症反応,ならびにTh1,Th2サイトカインの高い産生が、対照としたコントロールワクチニア・ウイルスを接種したマウスに比較して認められた。一方、G・rVVあるいはF・rVVを腸管内接種あるいは鼻腔接種後にRSウイルスの接種を施行したマウスでは、炎症反応の軽減と、Th2サイトカイン産生の抑制が認められた。また、rVVの鼻内接種を行なっておいたマウスでは、肺のみならず、鼻粘膜においてもRSウイルスの著しい増殖抑制が認められた。2アミラーゼのプロモーターを利用して作製されたIL-10トランスジェニックマウス(IL-10TGマウス)の鼻粘膜でのIL-10の発現を検討したところ,IL-10遺伝子の強い発現と、器官培養にて高いIL-10蛋白の産生が認められた。抗IL-10抗体を用いた免疫染色では、鼻腺細胞に強い陽性細胞を認めた。これらIL-10TGマウスにRSウイルスの経鼻接種を行なったところ、対照とした非トランスジェニックマウスに比較して、肺・鼻粘膜いずれにおいてもRSウイルスの有意な増殖抑制が認められなかった。一方、気道局所でのサイトカイン産生には有意な差は認められなかった。ウイルス増殖抑制の機序について検討を進めている。1. C57B L/6マウスに、RSウイルスのF糖蛋白$遺伝子を組み込んだリコンビナント・ワクチニアウイルス(F・RVV)を腸管内あるいは鼻内に接種し、マイルドな増殖を認めた後に、RSウイルスの経鼻接種を行い、鼻腔及び下気道でのRSウイルス増殖、抗体産生、各種サイトカイン誘導について検討した。

その結果、F・rVVの腸管内投与に比べ鼻腔投与では、より高いIgA抗体産生、IFN-γの誘導、RSウイルス増殖の抑制が認められたが、単球、リンパ球を中心とした細胞浸潤が鼻腔、下気道ともにいずれのマウスにも認められた。2. IL-10トランスジェニックマウス(IL-10TGマウス)にRSウイルスの経鼻接種による感染実験を行ったところ、対照とした非トランスジェニックマウスに比較してウイルス増殖の抑制が認められたが、鼻腔洗浄液中のサイトカインには、差が認められなかった。一方、タネル法にてアポトーシス陽性細胞が感染IL-10TGマウスでは有意に多数認められた。マウスT細胞をIL-10と共に培養すると、Fasリガンドの発現亢進がフローサイトメトリーにて確認された。このFasリガンドの発現を亢進させたリンパ球は、RSウイルス感染鼻粘膜上皮細胞に対して、強い細胞障害活性を示した。3. C57B L/6マウスに、アラム、百日咳菌をアジュバンドとして、卵白アルブミンを抗原として感作を行い、鼻アレルギーモデルを作製した。同様な感作を、IL-10TGマウスを用いて行ったところ、鼻症状の増悪が、非TGマウスに比較して認められた。この機序について、検討を進めている。1.RSウイルス抗体陽性者より、recombinant library法により作製された抗RSウイルスF糖蛋白抗体は非常に高いRSウイルスの中和活性能を持つことが、プラーク法によりin vitroで認められた。この抗体7μgをRSウイルスを経鼻接種後24時間目のマウスに腹腔内投与を行ったところ、3日後には著明に肺組織でのウイルス増殖が抑制されていた。しかし、鼻粘膜組織でのRSウイルスの増殖抑制は明らかではなかった。一方この抗体1μgを同様なRSウイルス感染マウスに、感染後12時間、24時間目に点鼻投与したところ、鼻粘膜組織でのウイルス増殖も著明に抑制された。さらに、点鼻投与と腹腔内(全身)投与と組み合わせることで、上気道を含む全気道から有効にウイルス増殖を抑制された。また、抗体投与により、肺や鼻粘膜での炎症反応の増殖は認められなかった。2.C57BL/6マウスに、アラム、百日咳菌をアジュバンドとして、卵白アルブミンを抗原に用いて感作を行い、鼻アレルギーモデルマウスを作製した。同様な感作をIL-10TGマススを用いて行ったところ、鼻症状の増悪が、対照非TGマウスに比較して認められた。この機序として、IL-10TGマウスでは、Th1サイトカインとTh2サイトカインのアンバランスの亢進が生じていることが確認された。
咬合干渉が咀嚼筋の血液動態に及ぼす影響

急性あるいは亜急性に咬合に変化が生じた後に咀嚼運動を行った場合に起こった咬筋や側頭筋の血液動態の変化としては、還元ヘモグロビン濃度が上昇し、酸化ヘモグロビン濃度が減少することが明らかとなった。以上より、咀嚼時の咬合干渉によって閉口筋の酸素消費量が増加することが明らかとなった。酸化ヘモグロビン濃度は咀嚼開始後30秒で一度上昇した後に減少した。この減少量は咬合干渉を与えたときのほうが与えなかったときよりも大きかった。このような変化は作業側においても非作業側においても同程度であった。筋血液酸素飽和度は咀嚼中にわずかに減少し、咀嚼終了後15分で安静時レベルに回復した。以上より、咬合干渉が咀嚼筋の血液動態に咬合干渉による影響は咀嚼運動後に顕著に出現することが明らかとなった。本研究では、顎口腔機能時(咀嚼時)の咬合干渉による歯根膜の圧受容器からの刺激(顎口腔系への機械的刺激)が自律神経の活動に及ぼす影響、およびその後の自律神経系の活動が逆に咀嚼筋活動や筋の血液動態に及ぼす影響について、生理学的、運動制御学的に検討することを目的として行われた。平成19年度は、正常咬合を有する成人女性について、習慣性咀嚼側でガム咀嚼運動を行わせ、非観血式連続血圧測定装置、心電計、レーザー血流計、筋電計を用いて、血圧、心電図、皮膚血流、閉口筋筋電図などを同時に測定し、予備実験を行った。急性あるいは亜急性に咬合に変化が生じた後に咀嚼運動を行った場合に起こると考えられる咬筋の血液動態の変化としては、還元ヘモグロビン濃度が上昇し、酸化ヘモグロビン濃度が減少することが明らかとなった。本研究では、顎口腔機能時(咀瞬時)の咬合干渉による歯根膜の圧受容器からの刺激(顎口腔系への機械的刺激)が自律神経の活動に及ぼす影響、およびその後の自律神経系の活動が逆に咀噛筋活動や筋の血液動態に及ぼす影響について、生理学的、運動制御学的に検討することを目的として行われた。平成20年度は、10名の正常咬合を有する成人女性について、習慣性咀噛側でガム咀囑運動を行わせ、非観血式連続血圧測定装置、心電計、レーザー血流計、筋電計を用いて、血圧、心電図、皮膚血流、閉口筋筋電図などを同時に測定し、予備実験(平成19年度実施)の結果に基いて考案した解析方法により、咬合干渉を装着した時としない時で血流動体を比較した。急性あるいは亜急性に咬合に変化が生じた後に咀喀運動を行った場合に起こった咬筋の血液動態の変化としては、還元ヘモグロビン濃度が上昇し、酸化ヘモグロビン濃度が減少することが明らかとなった。以上より、咀囎時の咬合干渉によって閉口筋の酸素消費量が増加することが明らかとなった。
規則化メソ孔を有する結晶性チタン酸バリウム自立膜の液相界面合成

本研究は,代表的な強誘電体材料であるBaTiO_3のナノスケールにおける新しい組織・形態制御技術の開拓を目指したものである.本研究では,ゾル-ゲル法を基本とし,気-液界面の2次元面内で前駆体分子(BaイオンとTi(OR)_x(OH)_y(OTi)_z(x+y+z=6)からなるクラスター)を自己組織化させて様々な鋳型分子が展開した界面上で自立膜を成長させる独自のアプローチによりナノ構造BaTiO_3自立膜の合成を試みたものである.研究期間内に得られた成果は次の通りである.1.界面上への展開溶液として用いたBa, Tiアルコキシド溶液中の前駆体分子構造を明らかにした^<3)>.溶液内では,メタノールおよび2-メトキシェタノール混合溶媒と配位子交換反応,キレート形成反応により,Ba/Ti=1で分子内にTiO_6八面体構造を有するヘテロニ金属アルコキシドBa(OMe)_4(0Et)(OEeOMe)が生成することを明らかにした.また,高濃度の溶液とすることでイオン解離を極めて抑制することができ,化学量論比組成のBaTiO_3ゲル膜の生成に有効であることがわかった.さらに,前駆体分子構造の特徴から,加水分解反応と重縮合反応によってBaTiO_3結晶を生成しやすい理由について考察した.2.緻密なナノ構造BaTiO_3自立膜作製では,ゲル膜中に存在するメソ孔を粒成長を伴わずに消去することが問題である.1で述べた高濃度前駆体溶液から得られたBaTiO_3モノリシックゲルでは,問題となるメソ孔が焼成過程において粗大化せず,結果として透光性を示すBaTiO_3セラミックスが得られることが明らかとなった.本研究では,ナノスケールにおける新規組織・形態制御技術の開拓を目指し,金属アルコキシド分子,あるいはそれを加水分解して生成したBa-TiO_6クラスター(BaイオンとTi(OR)_x(OH)_y(OTi)_z(x+y+z=6)からなるクラスター)を液相界面に形成した分子鋳型に沿っての自己組織化させ,規則化メソ孔を有するBaTiO_3自立膜の作製を試みる.これまでに,Ba-TiO_6クラスターを気-液界面の2次元面内で自己組織化させナノ構造BaTiO_3自立膜の合成に成功している^<2)>.本年度に得られた成果を次に示す.1.自己組織化の制御のために最も必要な情報である,高濃度アルコキシド溶液内における金属アルコキシドの前駆体分子構造を明らかにした^<3)>.高濃度溶液内では,メタノールおよび2-メトキシエタノール混合溶媒と配位子交換反応,キレート形成反応により,BN/Ti=1で分子内にTiO_6八面体構造を有するヘテロ二金属アルコキシドBa(OMe)_4(OEt)(OEeOMe)が生成する.高濃度溶液内におけるイオン解離は極めて低かった.加水分解によるアルコキシ基の除去と重縮合反応でBaTiO_3へ結晶化しやすい理由が前駆体分子の構造の観点から明らかになった.2.Ba-TiO_6クラスターが自己組織化して形成したゲル中に存在するメソ孔が,焼結過程においてどのように収縮するか,バルクセラミックスを用いる実験から明らかにした^<1)>.メソ孔は焼成過程において粗大化せず,メソ孔が残ったままで透光性を示すBaTiO_3焼結組織が得られた.このことから,周期的メソ孔を保持した自立焼結膜を原理的に得ることができることが明らかとなった.本研究は,代表的な強誘電体材料であるBaTiO_3のナノスケールにおける新しい組織・形態制御技術の開拓を目指したものである.本研究では,ゾル-ゲル法を基本とし,気-液界面の2次元面内で前駆体分子(BaイオンとTi(OR)_x(OH)_y(OTi)_z(x+y+z=6)からなるクラスター)を自己組織化させて様々な鋳型分子が展開した界面上で自立膜を成長させる独自のアプローチによりナノ構造BaTiO_3自立膜の合成を試みたものである.研究期間内に得られた成果は次の通りである.1.界面上への展開溶液として用いたBa, Tiアルコキシド溶液中の前駆体分子構造を明らかにした^<3)>.溶液内では,メタノールおよび2-メトキシェタノール混合溶媒と配位子交換反応,キレート形成反応により,Ba/Ti=1で分子内にTiO_6八面体構造を有するヘテロニ金属アルコキシドBa(OMe)_4(0Et)(OEeOMe)が生成することを明らかにした.また,高濃度の溶液とすることでイオン解離を極めて抑制することができ,化学量論比組成のBaTiO_3ゲル膜の生成に有効であることがわかった.さらに,前駆体分子構造の特徴から,加水分解反応と重縮合反応によってBaTiO_3結晶を生成しやすい理由について考察した.2.緻密なナノ構造BaTiO_3自立膜作製では,ゲル膜中に存在するメソ孔を粒成長を伴わずに消去することが問題である.1で述べた高濃度前駆体溶液から得られたBaTiO_3モノリシックゲルでは,問題となるメソ孔が焼成過程において粗大化せず,結果として透光性を示すBaTiO_3セラミックスが得られることが明らかとなった.
農村開発に果たすオルタナティヴな食料生産・消費の実践に関する地理学的研究

本研究では、大規模企業主導のオルタナティヴな食料供給ネットワーク(以下,大規模AFN)における「オルタナティヴ性」のもつ意味を、「ネットワークの質」の観点から検討した。その結果、以下の点が明らかとなった。大規模AFNは、部分的であれ「相互作用を軸とした主体間の水平的関係」を構築している点で、「オルタナティヴ」な性格を有しているといえる。しかし,一方で垂直的な「官僚制組織」も内包しており,「ネットワーク型組織-ヒエラルキー型組織」のハイブリッドな形態を呈している。本年度は、大手食品企業のオルタナティヴな食料供給体系の実態と、そこでのオルタナティヴ性の内実に関するフィールド調査を行った。具体的には、1)プレミアムフードを市場投入している大手食品企業がどのような原料調達システムを構築しているのか、2)それが原料生産者と取り結ぶ関係にどのような特徴(たとえば、「介在主体の行為の社会的・領域的埋め込みの度合い」や「取引における公正性」、「原料農産物の質の評価基準」)がみられるのか、についての聞き取り調査を行った。具体的な事例として取り上げたのは、地元農家との酒米契約栽培に取り組む清酒製造業A社(新潟県長岡市)の原料調達体系である。調査の結果明らかとなったのは、以下の諸点である。(1)A社の原料調達システムは長岡市内でほぼ完結しており、比較的狭小な空間スケールにおいて酒米生産・調達が行われている。(2)A社は、「原料生産者との権力関係の発生」や「原料調達の非効率化」を回避するために酒米農家の組織化を進めている。その結果、生産者もA社に対してある程度の発言権を有するようになっており、農家とA社従業員間の個人的紐帯の強さも認められる。(3)一方で、A社と酒米生産者の関係には、「栽培勉強会への参加」や「科学的手法に基づく酒米の品質管理」をめぐる厳格なルールが存在している。来年度は、地場食品企業のローカルフードシステム(LFS)との比較検討を通じて、大手食品企業と地場企業の良質食品供給体系の構造的特質の異同に言及し、LFSにみられるオルタナティヴ性がもつ意味を明らかにする。具体的には、大手企業の良質食品の供給体系が、製品の質においてのみオルタナティヴ性が強いもの(=Alternative food network)なのか、もしくは主体間の関係性についてもオルタナティヴ性が強いもの(=Alternative food network)なのかを重点的に考察する。本年度は、大規模AFN(Alternative food network)におけるオルタナティヴ性alternativenessのもつ意味を、「取引される製品の質」や「ネットワークの質」の観点から検討した。具体的には、1良質食品を市場投入する大規模な食品企業(大規模酒造業者C社)が「良質」概念をいかに捉え、その実現に向けどのような原料生産・調達体系を構築しているのか、2そこでの企業と原料生産者との連関には具体的にどのような個人的紐帯や権力関係が認められ、それらは各アクターの行為にどのような影響を及ぼすのか、3大規模AFNにおける「製品/ネットワークの質」の特徴が、「小規模AFN(地場酒造業者A・B社)にみられるそれ」と具体的にどのように異なるのか、という諸点を明らかにした。その結果、以下の諸点が明らかとなった。1大規模AFNと小規模AFNの双方において、水平的組織(=主体間の水平的な結びつき)がみられるが、大規模AFNのそれの方が主体間の「強い紐帯」を軸とした凝集性の高いものとなっている。これは、酒米の品質改善に向け、主体間で食料生産をめぐる規範や価値の同質化を図る必要があるためである。2大規模AFNでは、その規模ゆえに、「ネットワーク内の分権的統治」や「酒米の質の均質化」の実現が容易ではない。それゆえ大規模AFNは、組織化・ルール制定による垂直的な統合を図っている。3大規模AFNは、部分的であれ「相互作用を軸とした主体間の水平的関係」を構築している点で、「オルタナティヴ」な性格を有しているといえる。ただし、小規模AFNと異なり、垂直的な「官僚制組織」を内包しているのが特徴である。つまり大規模AFNは、機械的/有機的組織のハイブリッドな形態であるといえる。
子宮内膜スフェロイドを用いた生体外着床モデルの構築

【目的】我々は、組織工学的手法によって作製したラット子宮内膜間質細胞のスフェロイドが、生体外で脱落膜化能を有する事を報告している。本研究では、子宮内膜スフェロイドと受精胚の相互作用を解析する事により、生体外着床モデルとしての有効性についての評価を試みた。【方法】コラーゲンゲル上で培養したラット子宮内膜間質細胞がコンフルエントに達した後、コラーゲナーゼ処理によってゲルを消化し細胞シートを脱離させた。その後細胞非接着性のアガロースコートプレートで培養し、自己収縮・凝集させてスフェロイドを作製した。スフェロイドを構成する細胞の生存性をTUNEL法によって調べたスフェロイドと脱出胚盤胞期胚を細胞非接着性のスフェロイドプレート内で共培養し、実体顕微鏡下で形態的な変化を観察した。さらに、共培養後のMMP産生をゼラチンザイモグラフィー法によって調べ、スフェロイドおよび脱出胚盤胞期胚のみの場合と比較した。【結果】脱離した細胞シートは収縮・凝集して脱離後3日目には辺縁部が滑らかとなり直径約500μmのスフェロイドが形成された。TUNEL法により少なくとも15日間はスフェロイド内部の細胞が生存していることが明らかとなった。共培養開始24時間後には受精胚と子宮内膜スフェロイドの接着が確認された。その後も受精胚はスフェロイドの内部に潜り込むように侵入していき、共培養3日後には子宮内膜スフェロイドと一体化するように浸潤を進めた。さらに、受精胚およびスフェロイド単独ではMMPの産生は検出されなかったが、両者を共培養した場合MMPの産生が認められた。これらの結果から、生体外で再構築した子宮内膜スフェロイド内部に脱出胚盤胞期胚が浸潤するが明らかとなり、生体外における着床モデルとして有効である事が示唆された。本研究は、組織工学的手法によって生体外で再構築した三次元の子宮内膜様構造体(子宮内膜スフェロイド)と脱出胚盤胞期胚との相互作用を解析する事から、着床・胎盤形成の生体外解析モデルを開発する事を目的としている。平成18年度は、脱出胚盤胞期胚を効率的に回収する系を確立するとともに、子宮内膜スフェロイドの特性解析および脱出胚盤胞期胚との接着条件についての検討を行う計画であった。自然排卵・交配後5日目に子宮より回収された胚盤胞期胚は10個ほどであった。一方、eCGとhCGCを用いた過排卵処理を行うと、胚盤胞期胚は回収できなかったものの、交配後3日目に卵管より4細胞期胚が4050個回収することが可能であった。これらの胚はほとんどが培養後胚盤胞期まで発生した。このことから、過排卵処理後に卵管より4細胞期胚を回収し、さらに培養することによって最も効率的に胚盤胞期胚が得られることが明らかとなった。ラット子宮内膜間質細胞の生体外における脱落膜化誘起方法を調べた結果、形態的な変化とマーカー遺伝子の発現誘導から、db-cAMPとMPAによる処理が最も効果的である事が明らかとなった。子宮内膜スフェロイドの特性検索として、この方法を用いてスフェロイドの脱落膜化能を調べた。その結果、RT-PCRおよび免疫染色化学によって、db-cAMP+MPA処理によってスフェロイドのデスミンおよびdPRPの発現が誘導されることが示された。この結果は、子宮内膜スフェロイドが脱落膜化能を有しており、受精胚に反応して脱落膜化できる可能性を示すものである。

脱出胚盤胞期胚とスフェロイドを共培養したところ、両者が接着しその後受精胚が内部に浸潤する事が確認された。平成19年度は、接着・浸潤過程の組織化学的検索を行うとともに、MMPを中心とした生化学的・分子生物学的な解析を行う。【目的】我々は、組織工学的手法によって作製したラット子宮内膜間質細胞のスフェロイドが、生体外で脱落膜化能を有する事を報告している。本研究では、子宮内膜スフェロイドと受精胚の相互作用を解析する事により、生体外着床モデルとしての有効性についての評価を試みた。【方法】コラーゲンゲル上で培養したラット子宮内膜間質細胞がコンフルエントに達した後、コラーゲナーゼ処理によってゲルを消化し細胞シートを脱離させた。その後細胞非接着性のアガロースコートプレートで培養し、自己収縮・凝集させてスフェロイドを作製した。スフェロイドを構成する細胞の生存性をTUNEL法によって調べたスフェロイドと脱出胚盤胞期胚を細胞非接着性のヌフェロイドプレート内で共培養し、実体顕微鏡下で形態的な変化を観察した。さらに、共培養後のMMP産生をゼラチンザイモグラフィー法によって調べ、スフェロイドおよび脱出胚盤胞期胚のみの場合と比較した。【結果】脱離した細胞シートは収縮・凝集して脱離後3日目には辺縁部が滑らかとなり直径約500μmのスフェロイドが形成された。TUNEL法により少なくとも15日間はスフェロイド内部の細胞が生存していることが明らかとなった。共培養開始24時間後には受精胚と子宮内膜スフェロイドの接着が確認された。その後も受精胚はスフェロイドの内部に潜り込むように侵入していき、共培養3日後には子宮内膜スフェロイドと一体化するように浸潤を進めた。さらに、受精胚およびスフェロイド単独ではMMPの産生は検出されなかったが、両者を共培養した場合MMPの産生が認められた。これらの結果から、生体外で再構築した子宮内膜スフェロイド内部に脱出胚盤胞期胚が浸潤するが明らかとなり、生体外における着床モデルとして有効である事が示唆された。