hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発癌と細胞増殖制御における硫酸化チロシン蛋白質の機能解明

細胞内で蛋白質が翻訳された後、そのうちのチロシンが硫酸化されることが近年発見された。本共同研究者らはウイルスにより誘導される癌細胞では正常細胞に比べ、蛋白質の硫酸化チロシンが激減することを見出した。また、遺伝子工学の分野でも翻訳後修飾の蛋白質の修飾が機能発現に極めて重要であることが明らかにされており、このチロシン硫酸化もその一つである。本プロジェクトでは蛋白質のチロシン硫酸化の機能解明と、チロシン硫酸化が発癌と細胞増殖制御にどのように関与しているかを解明することを目的として研究を行った。本研究の主目的である硫酸化チロシン蛋白質が発癌と細胞増殖制御にどのように関与しているかを解明することに関して、チロシン硫酸化は、蛋白質の立体構造に強く影響を与え、それに伴い生理機能調節に関与している可能性が裏づけされた。また、ラット胚繊維芽細胞(3Y1)とヒト肝癌細胞HepG2を用いて硫酸化チロシン蛋白質が代謝され、細胞外に分泌されるフリ-の硫酸化チロシンを定量した際、両細胞とも多量のフリ-の硫酸化チロシンを分泌していることが判明した。興味のあることに肝癌細胞HepG2のみに硫酸化チラミンの存在を発見した。本化合物は神経伝達機能に重要な役目を持っていると思われている。我々は現在までに牛肝臓のゴルジ体を多く含むミクロゾ-ム膜画分に硫酸化チロシン蛋白質に特異的なレセプタ-と考えられる膜結合TyrSーbinding protein(TyrSR)の存在を明らかにしており、同画分にこのレセプタ-が硫酸化チロシン蛋白質と複合体を形成し存在することが示されたことより、硫酸化チロシンをシグナルとし、レセプタ-を介在した分泌蛋白質の細胞内輸送系を提唱している。しかし分泌後の硫酸化チロシン蛋白質の挙動は現在のところ全く不明であるため、血液中に硫酸化チロシン蛋白質あるいはペプチドに対し特異的なキャリア-プロテインの存在を想定し、牛血清中のTyrSーbinding protein(TyrSBP)の検索及び単離精製を行い、その諸性質を検討した。その結果、硫酸化チロシン蛋白質に特異的に結合する分子量160kのBinding Proteinが得られた。牛肝臓のゴルジ体から調製したTyrosylprotein sulfotransferase(TPST)はZーGluーTyrやBocーCCKー8など数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTPSTの基質の忍識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。しかしTPSTの分離・精製は極めて困難である。最適基質ペプチドの検索及びアフィニティ-クロマトグラフィ-のリガンドの検討のため、硫酸化チロシン蛋白質をモデルとした11種の基質オリゴペプチド及び硫酸体の合成、構造同定を行った。その結果、最適ペプチドBocーAspーTyrーValの合成に成功した。ヒル由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrーのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的にE.coliまたは酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。牛肝臓由来のTPSTによる硫酸化を試みた結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功した。これらのことより、リコンビナント蛋白質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTPSTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。現在までのところフェノ-ル硫酸転移酵素(PST)は細胞質可溶性画分にのみその存在が報告されているが、ミクロゾ-ム画分には報告されていなかった。しかし、今回ミクロゾ-ム画分に新規の膜結合酵素の存在が示唆された。以上の内容を米国生化学会、日本生化学会および日本農芸化学会等で発表したところ、生化学会においては、発癌と細胞増殖制御の観点から、また、農芸化学会においては、遺伝子工学の産物としての蛋白質の修飾と機能発現という観点から、注目をあびた。

我々は現在までに牛肝臓のゴルジ体を多く含むミクロゾ-ム膜画分に硫酸化チロシン蛋白質に特異的なレセプタ-と考えられる膜結合TyrSーbinding protein(TyrSR)の存在を明らかにしており、同画分にこのレセプタ-が硫酸化チロシン蛋白質と複合体を形成し存在することが示されたことより、硫酸化チロシンをシグナルとし、レセプタ-を介在した分泌蛋白質の細胞内輸送系を提唱している。しかし分泌後の硫酸化チロシン蛋白質の挙動は現在のところ全く不明であるため、血液中に硫酸化チロシン蛋白質あるいはペプチドに対し特異的なキャリア-プロテインの存在を想定し、牛血清中のTyrSーbinding protein(TyrSBP)の検索及び単離精製を行い、その諸性質を検討した。その結果、硫酸化チロシン蛋白質に特異的に結合する分子量160kのBinding Proteinが得られた。牛肝臓のゴルジ体から調製したTyrosylprotein sulfotransferase(TPST)はZーGluーTyrやBocーCCKー8など数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTPSTの基質の忍識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。しかしTPSTの分離・精製は極めて困難である。最適基質ペプチドの検索及びアフィニティ-クロマトグラフィ-のリガンドの検討のため、硫酸化チロシン蛋白質をモデルとした11種の基質オリゴペプチド及び硫酸体の合成、構造同定を行った。その結果、最適ペプチドBocーAspーTyrーValの合成に成功した。ヒル由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrーのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的にE.coliまたは酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。牛肝臓由来のTPSTによる硫酸化を試みた結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功した。これらのことより、リコンビナント蛋白質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTPSTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。現在までのところフェノ-ル硫酸転移酵素(PST)は細胞質可溶性画分にのみその存在が報告されているが、ミクロゾ-ム画分には報告されていなかった。しかし、今回ミクロゾ-ム画分に新規の膜結合酵素の存在が示唆された。以上の内容を米国生化学会、日本生化学会および日本農芸化学会等で発表したところ、生化学会においては、発癌と細胞増殖制御の観点から、また、農芸化学会においては、遺伝子工学の産物としての蛋白質の修飾と機能発現という観点から、注目をあびた。生体内において硫酸化は、解毒または異物の代謝や、タンパク質のチロシン残基や糖鎖の翻訳後修飾として重要な役割を演じている。これらの硫酸化は異なる硫酸転移酵素により活性硫酸(PAPAS)から基質のOH基へ硫酸基を転移することらより行われる。種々の硫酸転移酵素は細胞質と膜の両画分に局在し、タンパク質チロシン硫酸化に関与する酵素(TPST)は、ゴルジ体の膜に結合する膜内在性糖タンパク質である。今回牛肝臓ミクロゾ-ム画分およびゴルジ体に存在する硫酸転移酵素の諸性質の検討と遺伝子工学の産作すなわちリコンビナントタンパク質の効率良いチロシン硫酸化を目的として研究を行った。その結果、ゴルジ体を含むミクロゾ-ム
ヒノキ及びスギ標準年輪曲線の延長と気候復元の高精度化

本研究では、以下の3点を目的とした。(1)既存標準曲線の延長・充実:現有の標準年輪曲線について、野外調査と試料の収集を行い、標準曲線を延長する。(2)気候復元の高精度化:試料点数を充実させることで、標準曲線の質を向上させ、気候変動の推定精度(気温の絶対値)を向上させる。(3)復元結果の比較と検証:本研究で得られる復元結果を日本、東アジアなど広い地域での歴史記録(飢饉、異常気象記録など)や他のプロキシーによる復元結果と比較し、モンスーンフロントに位置する日本の気候変動の特徴を明らかにする。その結果,ヒノキで過去約2000年間,スギでは,17世紀にギャップはあるものの,過去1200年間の標準年輪曲線が完成した。ヒノキ科に共通の気候応答成分を見いだし,標準曲線を構築した地域ごとに春気温の復元を行った。復元モデルは,統計的検証の結果,十分な性能を有することがわかった。朝鮮半島の標準年輪曲線と本研究の成果をあわせ,東アジアグリッド気温の気候場復元に成功した。内容:本年度は、標準曲線作成の目処が立っている中部山岳のヒノキと東北地方のスギを中心に試料の拡充と年輪計測を重点的に進めた。具体的な成果は以下のとおり。(1)現有試料のデータベースを作成した。(2)ヒノキ埋没木試料を収集し、その半数近くについて年輪幅計測と年輪年代測定を行った。その結果、BC30AD740ころまでの標準年輪曲線を作成した。(3)スギの現生木試料を3地点で収集し、標準年輪曲線を作成した。(3)スギの年輪解析を行い、気候との応答様式を明らかにした。また気候復元の性能を検証し、良好な結果を得た。(4)ヒノキ埋没木の加速器14C年代測定を実施し、ウイグルマッチング法により、年輪年代と調和的な成果を得た。(5)東北・四国地域での考古材に関する情報収集を収集した。(6)査読雑誌に論文が掲載された(1編)。国際学会で研究成果を発表した(2件)。東北地方のスギの年輪気候学的解析に関する研究成果をほぼ纏め終わり、次年度早々に査読雑誌に投稿できる目途がついた。意義・重要性:ヒノキ標準年輪曲線について当初の計画より長いものが得られた(過去2000年超)。この成果により、年輪を用いた古気候学において国際的な水準に到達した。また複数の測定法で年代の相互チェックは古気候復元の信頼性を確保する上できわめて重要な成果である。さらにスギについては東北北部・中部太平洋側・四国で標準年輪曲線の作成に成功し、広域の気候場復元に関する基礎データを得ることができた。これは東アジアでは前例が無い。年度当初の計画を順調に遂行した。すなわち,ヒノキおよびスギの樹幹試料を収集し,標準年輪曲線を作成した。標準年輪曲線と気象データとの応答関数解析を行い,中部地域のヒノキでは春期気温と前年夏気温がそれぞれ正・負に有意な相関を示した。気候復元を行い,較正関数を得た。気候復元結果の検証を行い,これまでの日本産針葉樹材による結果と調和的な結果を得た。本年度の特筆すべき成果は2点あげられる。(1)中部地域のヒノキ,秋田スギ,および朝鮮半島中部のマツ等の標準年輪曲線に主成分回帰法を適用して,環太平洋西部の広域気候復元に成功した。これは東アジア地域では初めてのことであり,本研究課題の重要な目的の一つであり,近々に論文を投稿する予定である。またこのために,韓国の研究者と共同研究を開始し,生データからの情報交換が可能となったことは,今後の当該分野の研究にとって意義深い。(2)これまでスギ及びヒノキと平行して進めてきたブナの年輪年代学研究の成果に対して,文化財科学会の奨励論文賞が授与された(平成20年6月)。また,今年度から埋蔵文化財センター等より年代測定の依頼があり,これに応じて本研究で開発した標準年輪曲線を用いた年輪年代測定を実施した。

(3)復元結果の比較と検証:本研究で得られる復元結果を日本、東アジアなど広い地域での歴史記録(飢饉、異常気象記録など)や他のプロキシーによる復元結果と比較し、モンスーンフロントに位置する日本の気候変動の特徴を明らかにする。その結果,ヒノキで過去約2000年間,スギでは,17世紀にギャップはあるものの,過去1200年間の標準年輪曲線が完成した。ヒノキ科に共通の気候応答成分を見いだし,標準曲線を構築した地域ごとに春気温の復元を行った。復元モデルは,統計的検証の結果,十分な性能を有することがわかった。朝鮮半島の標準年輪曲線と本研究の成果をあわせ,東アジアグリッド気温の広域気候場復元に成功した。
論理的設計による新規PPARリガンドの包括的創製

核内受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPAR)のリガンド創製研究を行っている。PPARにはα、δ、γの3サブタイプが存在することが判明しており、これまでにPPARα/δデュアルアゴニストTIPP-401、PPARδ選択的アゴニストTIPP-204、PPARパンアゴニストTIPP-703の創製に成功している。本年度は、PPARサブタイプ選択性に関する生物学的研究を行った。PPARδアゴニストのサブタイプ選択性発現機構解明;PPARα/δデュアルアゴニストTIPP-401とPPARδ選択的アゴニストTIPP-204で化合物の構造上の違いは中央ベンゼン環から伸びるアルキルエーテルがメトキシであるかブトキシであるかの違いのみである。なぜサブタイプ選択性に大きな影響を与えるかが解明されれば今後のPPARサブタイプ選択的リガンド創製に有用な情報となる。アルキルエーテル鎖と相互作用すると示唆されるアミノ酸残基をドッキングモデルから導き、点変異PPARを作成した。それを用いた転写活性化試験により、PPARαのMet325と対応するPPARδのVal334の差がサブタイプ選択性に大きく寄与していることを明らかとした。その後さらにPPARδアンタゴニスト/パーシャルアゴニストの創製研究を行った。PPAR等の核内受容体の活性化にはc末端のαヘリックスであるH12の適切な折りたたみが必須であることが明らかとなっている。私はPPARδアゴニストの構造中のH12と相互作用するカルボキシル基に注目し、カルボキシル基の位置を変えることでH12の折りたたみを制御できるのではと考えた。H12の折りたたみを完全に阻害できればその化合物はアンタゴニストに、一部阻害できればパーシャルアゴニストとなると考えられる、化合物の構造中に剛直な構造を有するビフェニルを導入し、アッセイしたところパーシャルアゴニスト活性を有する化合物を得ることができた。他のPPARδアゴニストと共存させることでアンタゴニスト活性を示すことも確認した。PPARにはα,δ,γの3サブタイプが存在することが判明しており、これまでにPPARα/δデュアルアゴニストTIPP-401の創製に成功している。本年度はTIPP-401をリード化合物に更なる構造展開を行った。PPARδ選択的アゴニストTIPP-204の創製;エイコサペンタエン酸とPPARδの共結晶のX線結晶構造解析の報告を参考に、TIPP-401の中央のベンゼン環の有するメチルエーテル基をより長鎖のアルキルエーテル基に置換することによってPPARδ活性を向上できるのではと仮説を立てた。エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基とアルキル鎖を検討したところ、PPARδ活性はブチル基で最も活性が強く、一方PPARα活性はブチル基では低下することが判明した。さらに疎水末端ベンゼン環のフッ素原子とカルボキシル基α位アルキル鎖の最適化を行い、PPARδ選択的アゴニストTIPP-204の創製に成功した。TIPP-204のPPARδ活性は約1nMと高活性であり、PPARα,γに対する選択性も100倍以上と高いものであった。また、TIPP-204のin vivo活性を調べるためマウスを用いた投与実験を行った。腹腔内投与後に肝臓におけるPPARδ活性に応じて誘導されるmRNA量を測定したところ、vehicle群に対してTIPP-204投与群では有意にmRNA量の上昇を確認し、生体内におけるTIPP-204のPPARδ転写活性化能を確認した。PPARパンアゴニストTIPP-703の創製;PPARリガンドの疎水性末端の置換基検討を行った。リガンドの疎水性末端部位に対応するPPAR側のポケットには立体的に大きな疎水性アミノ酸で囲まれた空間があり、置換基の検討により疎水性末端の構造活性相関を得ることとした。結果、トリフルオロメチル基をアダマンチル基とした化合物でPPARγ活性の向上が認められた。そこで、単剤でPPARの3サブタイプ全てを活性化できるPPARパンアゴニストの創製に取り掛かった。PPARγ活性を示すアダマンチル基とPPARδ活性に影響を与えるアルキルエーテル鎖の検討によりPPARパンアゴニストTIPP-703の創製に成功した。本年度は、これらの化合物をリードにさらなる構造展開を行ったと共に、PPARサブタイプ選択性に関する生物学的研究を行った。PPARパンアゴニストTIPP-705の創製;昨年度に報告したPPARパンアゴニストTIPP-703の活性上昇を目指してフッ素原子置換効果を検討した。フッ素原子は医薬化学研究において多用されており、その特徴は高い電気陰性度である。2つあるTIPP-703のベンゼン環上の置換基を検討することで、活性を大幅に向上させた化合物TIPP-705の創製に成功した。

PPARδアゴニストのサブタイプ選択性発現機構解明;PPARα/δデュアルアゴニストTIPP-401とPPARδ選択的アゴニストTIPP-204で化合物の構造上の違いは中央ベンゼン環から伸びるアルキルエーテルがメトキシであるかブトキシであるかの違いのみである。なぜサブタイプ選択性に大きな影響を与えるかが解明されれば今後のPPARサブタイプ選択的リガンド創製に有用な情報となる。ドッキングモデルと点変異PPARを用いた転写活性化試験により、特定のアミノ酸の差がサブタイプ選択性に大きく寄与していることを明らかとした。核内受容体ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体(PPAR)のリガンド創製研究を行っている。PPARにはα、δ、γの3サブタイプが存在することが判明しており、これまでにPPARα/δデュアルアゴニストTIPP-401、PPARδ選択的アゴニストTIPP-204、PPARパンアゴニストTIPP-703の創製に成功している。本年度は、PPARサブタイプ選択性に関する生物学的研究を行った。アルキルエーテル鎖と相互作用すると示唆されるアミノ酸残基をドッキングモデルから導き、点変異PPARを作成した。それを用いた転写活性化試験により、PPARαのMet325と対応するPPARδのVal334の差がサブタイプ選択性に大きく寄与していることを明らかとした。その後さらにPPARδアンタゴニスト/パーシャルアゴニストの創製研究を行った。PPAR等の核内受容体の活性化にはc末端のαヘリックスであるH12の適切な折りたたみが必須であることが明らかとなっている。私はPPARδアゴニストの構造中のH12と相互作用するカルボキシル基に注目し、カルボキシル基の位置を変えることでH12の折りたたみを制御できるのではと考えた。H12の折りたたみを完全に阻害できればその化合物はアンタゴニストに、一部阻害できればパーシャルアゴニストとなると考えられる、化合物の構造中に剛直な構造を有するビフェニルを導入し、アッセイしたところパーシャルアゴニスト活性を有する化合物を得ることができた。他のPPARδアゴニストと共存させることでアンタゴニスト活性を示すことも確認した。
鼻性NK/T細胞リンパ腫におけるCD70に対する分子標的治療の検討

NOGマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫の細胞株であるSNK-6を皮下に接種したところ、皮下に腫瘤が形成されるのが確認され、腫瘤は経時的に増大し、病理組織学的な検討により、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫の患者で得られる組織と矛盾しない所見であった。また、生着した腫瘍について移植腫瘍組織の免疫染色を施行したところ、in vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられた。SCIDマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株を移植し、腫瘍異種移植マウスアッセイを行ったところ、腫瘍細胞の生着が見られなかった。そのため、今後NODマウスを用いて腫瘍異種移植マウスアッセイを行う方針である。NODマウスは、SCIDマウスより、より厳しい飼育環境が必要であり、現在、NODマウスの飼育環境について整備工事中である。腫瘍細胞の生着をみたら、生着した腫瘍の増殖があるかどうか確認し、生着した腫瘍について、in vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられるかフローサイトメトリーにて確認し、実験を進めていく。また、腫瘍異種移植マウスに抗CD70抗体を投与し、腫瘍サイズ、個数が減少するか否かを検討する。また抗CD70抗体の濃度を変えて投与し、高濃度のものを与えた時とどうか治療効果についても考察する。また、本腫瘍ではカルボプラチンを主体とした多剤併用化学療法がこれまでに行われている。抗CD70抗体単独で劇的な治療効果が得られない場合、化学療法併用での抗体療法の効果も検討する。鼻性NK/T細胞リンパ腫は、多臓器不全により予後は極めて不良なリンパ腫であり、本疾患に対する治療については、CD20陽性悪性リンパ腫におけるリツキシマブのような分子特異的な治療もまだ開発されてはおらず、未だに従来の化学療法と照射が治療の中心である。治療を念頭に置いた腫瘍特性の理解が早急に求められており、本研究の成功により、本疾患に対する分子特異的な治療の開発が見込まれる。そのため、NOGマウスを用いて腫瘍異種移植マウスアッセイを行う方針となった。NOGマウスは、SCIDマウスより、より厳しい飼育環境が必要であり、NOGマウスの飼育環境について整備工事を施行し、実験環境を整えた。NOGマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫の細胞株であるSNK-6を皮下に接種したところ、皮下に腫瘤が形成されるのが確認された。この形成された腫瘤は経時的に増大し、腫瘍を摘出して病理組織学的な検討を行ったところ、多形性に富んだ大小不同の腫瘍細胞で形成されており、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫患者組織に認められる腫瘍細胞と矛盾しない所見であった。さらに、全腫瘍細胞でEBERが強陽性であり、NOGマウスに移植してもEBウイルス感染が持続していることが確認された。今後、生着した腫瘍についてin vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられるかフローサイトメトリーにて確認し、実験を進めていく。また抗CD70抗体の濃度を変えて投与し、高濃度のものを与えた時の治療効果についても考察する。SCIDマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株を移植し、腫瘍異種移植マウスアッセイを行ったところ、腫瘍細胞の生着が見られず、NOGマウスに移植することが必要となった。NOGマウスを飼育するためには、飼育環境の整備が必要なため。今後、抗CD70抗体を用いた抗体療法のin vivoでの抗腫瘍効果について検討する。当教室では、この異種腫瘍移植マウスを用いて、すでに薬剤の抗腫瘍効果について実験を行い成果を得ている。

今後、抗CD70抗体を用いた抗体療法の実現に向けて研究を重ねていく。NOGマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫の細胞株であるSNK-6を皮下に接種したところ、皮下に腫瘤が形成されるのが確認され、腫瘤は経時的に増大し、病理組織学的な検討により、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫の患者で得られる組織と矛盾しない所見であった。また、生着した腫瘍について移植腫瘍組織の免疫染色を施行したところ、in vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられた。SCIDマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株を移植し、腫瘍異種移植マウスアッセイを行ったところ、腫瘍細胞の生着が見られなかったため。今後、NOGマウスに生着した腫瘍についてin vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられるかフローサイトメトリーにて確認し、実験を進めていく。また、腫瘍異種移植マウスに抗CD70抗体を投与し、腫瘍サイズ、個数が減少するか否かを検討する。腫瘍学今後NODマウスを用いて腫瘍異種移植マウスアッセイを行う方針である。NODマウスは、SCIDマウスより、より厳しい飼育環境が必要であり、現在、NODマウスの飼育環境について整備工事中である。SCIDマウスに鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株を移植し、腫瘍異種移植マウスアッセイを行ったところ、腫瘍細胞の生着が見られず、NOGマウスに移植することが必要となった。NOGマウスを飼育するためには、飼育環境の整備に時間を要した。SCIDマウスに腫瘍細胞の生着がみられず、今後、NODマウスへの腫瘍生着実験を予定している。現在、NODマウスの飼育環境を整備中であり腫瘍細胞生着後の予定したいた実験が行われていないため。今後、NOGマウスに生着した腫瘍について実験を進めていく。腫瘍細胞の生着をみたら、生着した腫瘍の増殖があるかどうか確認し、生着した腫瘍について、in vitroでの結果と同様に、移植腫瘍でもCD70の発現がみられるかフローサイトメトリーにて確認し、実験を進めていく。また抗CD70抗体の濃度を変えて投与し、高濃度のものを与えた時とどうか治療効果についても考察する。また、本腫瘍ではカルボプラチンを主体とした多剤併用化学療法がこれまでに行われている。抗CD70抗体単独で劇的な治療効果が得られない場合、化学療法併用での抗体療法の効果も検討する。
超音波法を用いた新しい拡張機能評価法の確立

我々は、diastolic color kinesis index (CK-DI :拡張早期30%時間以内に拡張した面積を全拡張期時間で変化した面積で除した値)を用いた、拡張機能評価の確立を試みた。動物実験では、CK-DI法は左室拡張能の薬物療法による改善を感知した。また、心筋梗塞患者を用いた臨床研究では、従来評価し得なかった正常と思われる非梗塞部位の拡張機能の症例における違いを感知した。以上より、CK-DI法は、病態解明、診断法として新しい情報を臨床現場に提供する方法であることがわかった。我々は、収縮機能評価における左室駆出率のように、単独で用いられ、感覚的に理解しやすい左室拡振機能評価法確立の必要性を踏まえて、diastolic color kinesis index(CK-DI:拡張早期30%時間以内に拡張した面積を全拡張期時間で変化した面積で除した値)を用いた、拡張機能評価の確立を試みた。Diastolic Color Kinesis(CK)法はAcoustic Quantification(AQ)法の原理を応用し収縮末期から拡張末期に至る心内膜の移動距離を心電図同期によりカラー表示するものである。よって、心臓全体のみならず、局所的な拡張機能障害を視覚的に捉えることが可能である。高血圧性心不全動物モデル(6週齢より8%食塩を与えたダール食塩感受性ラット、n=30)を用いて検討すると、左室全体のCK-DI平均は偽正常化を示さなかった(正常コントロール54±9%,代償性肥大期29±7%,心不全期32±6%)ため、時定数Tauと有意な相関(R=0.44,p<0.05)を認めた。一方E/Aは心不全期では偽正常化を認め、Tauとは相関しなかった。臨床症例では、左室全体のCK-DI平均は正常者(60±13%,n=10)に比し、拡張不全症例(38±3%,n=8)のみならず糖尿病症例(46±16%,n=26)も低値を示し、糖尿病患者での早期拡張機能障害をも検出するものと考えられた。また、局所の拡張機能評価法としての有用性を検討するために、当院で行われた、拡張型心筋症に対する細胞移植心において移植された部位のCK-DIを移植前後で比較すると、著明な改善が検出され、補助心臓離脱のひとつの根拠となりえた。よって、CK-DIは全体、または局所左室拡張機能評価法、主に弛緩能の指標として有用であると考えられた。我々は、収縮機能評価における左室駆出率のように、単独で用いられ、感覚的に理解しやすい左室拡張機能評価法確立の必要性を踏まえて、diastolic color kinesis index (CK-DI:拡張早期30%時間以内に拡張した面積を全拡張期時間で変化した面積で除した値)を用いた、拡張機能評価の確立を試みた。本年度は、動物モデルを用いて、心不全への進行過程における拡張機能障害に対する薬物効果を本法を用いて捉えることができるかを検討した。ダール食塩感受性ラットを、正常食塩食群(N群,n=7)、高食塩食群(ARB(-)群,n=14)、高食塩食+血圧を低下させない量のアンジオテンシン受容体阻害薬テルメサルタン0.1mg/kg/日を投与した群(ARB(+)群,n=9)に群分けし、15週齢にて血圧測定、心エコー検査、心臓カテーテル検査を施行した。結果、左室時定数(Tau)、negative dp/dt/LV pressureにおいて、TauはARB(-)群でN群と比し有意に延長した。そして、降圧効果のない低用量のARBを投与することでも、Tauは改善認めた。この傾向はnegative dp/dt/LV prssureでも同様の傾向を認めた。このtelmisartanの降圧効果に依存しない左室弛緩能改善効果を、左室流入血流速波形(E/A、E波の減衰時間、E波の速度)は捉えられなかったが、CK-DIはN群と比しARB(-)群では有意に低値であり、ARB投与によって、収縮期血圧、心拍数に変化を与えずにCK-DIを有意に改善し、拡張機能改善効果を捉えることが可能であった。以上より、CK-DIはARB(telmisartan)による左室弛緩能の改善を非侵襲的に感知することができた。一方、広く拡張機能評価法として用いられている左室流入血流速波形では、ARBの効果を検出しえなかった。CK法は左室拡張能の薬物療法による改善を鋭敏に感知しうる、有用な非侵襲的拡張機能評価法と考えられた。
古細菌におけるチオレドキシン系抗酸化システムの解明

生命の抗酸化機構の進化をタンパク質科学の面から追究するため、古細菌のペルオキシレドキシン(Prx)および関連タンパク質の構造解析を行い、その特徴を明らかにした。特に、Prxと基質である過酸化水素との複合体の構造解析により、反応初期と遷移状態について議論した。また、古細菌のスーパーオキシドディスムターゼの構造解析により、その金属イオン選択性を議論した。タンパク質反応を水素原子が関与した形で明らかにするためには中性子回折データを得ることが必要である。そのためのタンパク質大型結晶の作製法を開発した。平成21年度は、超好熱性古細菌Aeroopyrum pernix K1由来のPrxタンパク質と基質(過酸化水素)が結合した状態の立体構造を明らかにした。タンパク質と基質の複合体の構造解析では、通常は反応が進行してしまうため、反応中間体や反応前の状態を明らかにすることは非常に困難である。しかし本研究の場合、タンパク質の結晶を基質を含む溶液に浸すことによって反応前の構造を明らかにすることができた。そして、活性部位のシステイン残基の硫黄原子の近傍に過酸化水素が結合している状態を立体化学的にとらえることができた。また、変異導入によりその硫黄原子を酸素原子に置換しても同様に過酸化水素が結合していたことから、基質の結合には直接反応する原子よりもむしろ、周辺の原子との相互作用が寄与しているということが明らかになった。この結果、反応中間体におけるPrxの構造変化に先だって過酸化水素の結合が起こることが明らかになった。また、過酸化水素と周辺の原子との相互作用が明らかになった。これは、Prxの反応のごく初期のメカニズムが立体化学的に理解できるようになるという意義がある。また、これまで他の生物種由来のPrxでは、活性部位近傍に結合した安息香酸のカルボキシル基の2個の酸素原子を過酸化水素に見立てて間接的に基質結合が議論されていた。それが直接可視化できたということは、活性酸素とタンパク質の反応という分野で意義深い発見である。チオレドキシンについては、本年度はんA.pernix K1のゲノムから3種類の遺伝子を取り出し、大腸菌における発現系を構築した。その一つについては高濃度で均一に精製することができたが、結晶化には至っていない。前年度までは好気性超好熱性古細菌Aeropyrum pernix K1由来のペルオキシレドキシン(Prx)について立体構造の面から反応スキームを明らかにした。平成22年度は、嫌気性超好熱性古細菌Pyrococcs furiosus由来のPrxについての研究を進め、嫌気性→好気性という進化の過程に抗酸化タンパク質の反応機構からせまることを目指した。ゲノムからPrxの遺伝子を取り出し、発現・精製をし、結晶化条件を探索した。その結果、針状結晶を得る段階までは進んだが、構造解析に適した結晶を得るための条件検討がまだ残っている。過酸化水素を基質とする酵素はPrxをはじめとする各種ペルオキシダーゼやカタラーゼがあるが、その上流に位置する酵素、すなわち過酸化水素を生成する酵素に、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)がある。平成22年度は、A.pernixK1由来SOD(ApeSOD)についてのタンパク質科学的な知見を得た。SODの反応は活性中心の金属イオンの酸化還元サイクルをともなって進行する。FeとMnの両方を金属コファクターとするととができるSODをcambialistic SODというが、ApeSODはcambialistic SODであり、FeよりもMnをコファクターとするほうが活性が高い。本年度は、ApeSODのアポ型・Fe結合型・Mn結合型の立体構造をX線結晶解析により明らかにした。Mn結合型では金属はtrigonal bipyramidal構造をとり、5原子が配位していた。それに対してFe結合型では金属はoctahedral構造をとり、水が1分子加わり、6原子が配位していた。新たに水が配位した場所は基質スーパーオキシドの結合サイトとされており、このことが基質結合阻害を引き起こしFe結合型ApeSODの低活性をもたらしたと考えられる。また、Fe結合型では活性部位近傍のチロシンの側鎖が1Å程度金属側に移動していた。大腸菌SODにおいて明らかになった知見から類推するに、Fe結合型ApeSODにおいては、生成物(過酸化水素)による阻害と類似したメカニズムが働いていることが考えられる。本研究は、抗酸化システムのメカニズムを、それを担うタンパク質の構造解析およびその解釈を通して解明しようとするものである。まず、過酸化水素を還元する機能を持つペルオキシレドキシン(Prx)について基質(過酸化水素)との複合体の構造解析をすることにより、反応初期のメカニズムを明らかにした。この構造情報は後にHallらによって、過酸化水素還元の遷移状態を記述するのに用いられた。しかしながら、その遷移状態は我々が提唱した超原子価中間体を経由する反応経路とは矛盾するため、今後その研究は整理する必要がある。

そのために、類縁だが別種由来のPrxを用いて反応機構を解明するための研究を現在続けている。次に、Prxの基質である過酸化水素を生成する酵素に着目した。スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)は、2分子のスーパーオキシドラジカルを1分子の酸素および過酸化水素に不均化する酵素であり、活性中心に存在する金属イオンの酸化還元にともなって反応サイクルが進行する。SODは活性中心の金属イオンによりFe-SOD,Mn-SOD,CuZn-SOD,Ni-SODに分類される。FeとMnの両方をコファクターとするSODはcambialistic SODと呼ばれる。本研究では超好熱性古細菌由来のcambialistic SODに着目し、それぞれの金属との複合体の立体構造を明らかにした。立体構造は金属の種類によりほとんど変化はなかったが、活性中心のみに着目すると違いが見つかった。これらの違いにより、同cambialistic SODの金属イオン特異性を立体構造の面から説明することができた。SODの反応は金属と過酸化水素・酸素・スーパーオキシド・水が関与している。このメカニズムを明らかにするためにはX線結晶解析だけでは不十分で、中性子線回折を利用する必要がある。そのためには大型結晶の作製が必須であるため、その作製法の開発に取り組み、成功した。本研究では上記の内容と関連して、糖代謝系酵素の構造解析にも成功した。
ニューセラミックス製放射性有機廃液焼却炉の開発

廃液の燃焼に必要な焼却炉内温度の維持は、シンチレータ廃液自体の燃焼による自発熱で、燃焼開始時及び燃焼中の温度低下に対する昇温は都市ガスである。廃液、都市ガス共に高発熱燃料であり、安定した昇温並びに定温燃焼が可能であった。焼却炉、炉内液送管、残渣受け皿等をセラミックスで作製することにより、焼却試料中に含まれる恐れのある隣、硫黄等に対しても耐腐食性が増大した。また、燃焼ガス冷却器内面のテフロンコーティングと、全放熱管内に放熱棒を挿入して放熱面積を増大させることにより、排気ガスの低温化が可能になった。排水として回収された^3Hは約70%、^<35>Sは約20%であるが、^<14>C,^<32>P,^<45>Caは10%以下であった。また、排気中の^3H以外の割合は、^<14>Cが約40%、^<32>Pが約10%、^<35>Sが約20%、^<45>Caは約25%であった。したがって、排気ガス中放射能の回収を確実に、且つ安定して行う小型の装置を開発することが切望される。排気、排水中の割合が少ない^<32>P,^<35>S,^<45>Caについては、残渣中の放射能は高い値が期待されたが、3核種共に数%であった。残渣の量については、焼却廃液の成分により当然異なるが、焼却した廃液の合計100lに対して、回収された残渣は62.15gであった。焼却開始温度800°Cへの準備加熱を電気ヒ-タ-で行う方法について,焼却試料としてメタノ-ルを用い、実験炉での燃焼試験を行った。1.炉底部ワンポイント加熱方式による実験炉の設計、製作及び燃焼試験.炉内部に設置したシリコニットヒ-タ-で炉底部の一部分をメタノ-ルの燃焼開始温度600°Cまで加熱し,以後800°Cまではメタノ-ルを燃焼することで短時間の昇温が可能かどうか,実験で確かめた。(1)方法ステンレススチ-ル(SUS 304、厚さ2mm)を用い,外形寸法200mmφx500mmの底・藍付き燃,焼箇に,焼却試料の噴射器,温度計,覗窓及び圧力安全弁を設置した実験炉を製作した。600°Cへの炉底部ワンポイント加燃は臨時にガスバ-ナーで行い,加熱部分へ対してメタノ-ルを噴射し,600°Cから10°C間隔で温度を上昇した場合の,燃焼状態を観察した。(2)結果焼却炉底部の一部分の昇温でメタノ-ルを安定して着火させるには,加熱部分は800°C,炉内の空間で700°C程度が必要であった。2.遠赤外線電気ヒ-タ-を用いた炉下部外部加熱方式による焼却炉の設計,製作及び燃焼試験.焼却炉の下部を炉の外部から遠赤外線ヒ-タ-で加熱し,短時間で炉内部を800°Cまで昇温が可能な実験用焼却炉を開発し燃焼試験を行った。(1)方法ナテンレススチ-ル製の炉体の内面に石英ガラス製の内筒を配置し,ヒ-タ-は炉体の下約1/3を外周囲から包むように配置した。(2)結果炉の直径,容積に対する温度上昇速度の変化が大きく,大容量の焼却炉は実用上使用不可能だが,焼却速度が1時間当たり0.5l程度の規模であれば,製品化が可能であった。前年度の基礎実験炉の実験デ-タを基に,本実験用の試験炉を製作し,コ-ルドランによる燃焼試験(基礎デ-タの収集)を行った。

その結果,炉体は丸形竪形で,材盾は内部より順にセラミックスライニング(ファイバ-キャスト#1000,厚さ50mm),カオウ-ルグランケット#1300;厚さ70mm,ミネラルグラスファイバ-2号;厚さ25mm,ステンレススチ-ルSUS310S;厚さ2mmとした。燃焼試験の結果による性能は,(1)処理能力:3l/h(トルエン:メタノ-ル=1:1の場合),(g)点火方式:ガスバ-ナ-による炉内の予熱,設定温度に達すると自動的にポンプ・ブロア-が作動,(3)給排気方式:リングブロアによる送気,送気圧による自然排気,流量Max.2.0/2.5m^3/min,(4)捕集方式:2パス型多管式熱交換器(冷却水使用)により排ガス中の水分を捕集,(5)消費電力:定常消費電力0.9KW/h.(6)消費ガス量:33l/min(都市ガス13A,昇温時のみ約15分),(7)消費水量(6001000l/h(5°C15%)であった。また,科学技術庁の認可を受ける為の装置の配置,組立の設計及び安全装置の設計,検討を行ない,(1)自動送液停止装置,(g)放散孔,(3)爆発防止装置,(4)逆火防止装置,(5)過熱防止装置,(6)地震感知消炎装置,(7)火災検知装置,(8)異常高温監視装置,(9)焼却終了感知装置,(10)捕集装置の異常検出装置,(11)停電時対策,(1g)警報装置等を組み込んだ大学内ラジオアイソト-プ室での最終試験実験炉の設計図を完成させた。焼却前の昇温並びに運転中の緊急の温度低下に対する加熱を、都市ガスで行うか、電気ヒータによるかの決定が最後まで問題になった。基礎実験を繰り返した結果、燃焼速度が1L/hr程度の炉内容積に対しては、都市ガスまたはプロパンガス以外では、対応が不可能であった。しかし、都市ガス方式と決定した後の開発は計画通り進んだ。炉本体はムライト(Al_2O_3:SiO_2=85:41)で作製し、その外壁をSUS304で密閉した。焼却炉内部の液送管は、アルミナ(AL_2O_3:SiO_2=91:7)、残渣の受皿はマグネシア(MgO:SiO_2=97:1)、熱交換機の内面はテフロンコーティングをした。この試験炉に廃液注送ポンプ、ガスバーナ、送風機、温度計、温度センサー、圧力計、震度計および冷却水量計等の付属機器を取り付け、和歌山医大RI実験室に搬入し、本実験を行った。実験は、最初にコールドランによる排ガス、排水、炉内部等の温度特性、焼却速度、冷却水量、風量等の流量特性、各種安全スイッチの動作試験等、焼却炉としての一般的な安全試験を行なった。次に、^3H,^<14>C,^<32>P,^<35>S,^<45>CAの各標準液を含む乳化、液体シンチレータの合計10種類について焼却試験を行い、試料中の比放射能、排気・排水・残渣中の放射能、排気流量、回収水量、残渣量、排出総放射能、放射能回収率等の測定を行った。その結果、下記のような結論を得た。1)炉体は外部より、SUS304(2mm)、ミネラルグラスファイバ(25mm)、セラミック断熱材(77.4mm)、セラミックキャスタ(50mm)の4層で、大きな耐腐食性と2000°Cまでの耐熱性が得られた。2)焼却炉内の液送管をアルミナで作製したのでステンレスとは比較にならない耐久性が得られた。3)熱交換器の内面をテフロンコーティングしたので、耐腐食性が増大した。4)熱交換器内の表面積を実質拡大したのでRI排気設備が利用可能になり、排ガスの安全性が増した。5)自動化により省人化と安全性が増大した。
発光ナノシリコンによる細胞認識素子の作製と生体計測システムの開発

粒子状ナノシリコンの作製には、スパッタ法および各種ガス雰囲気での熱アニール法によって行った。その後、フッ酸ガス雰囲気を照射することによってナノシリコン粒子の取り出しには成功を収めた。特に、液相エッチングを実施するためにエッチング溶液の濃度や温度条件を調査することで収量や良質な粒子状ナノシリコンの作製条件を見い出した。取り出した粒子状ナノシリコンを安定に扱うために溶液内に分散させる。その分散溶液としては、ナノシリコンの表面との相互作用が少なく安定的に発光を得る必要がある。現在は、純水に対するナノシリコンの経時変化は200時間程度で飽和し、その後一定の輝度で安定する。しかし、減衰率が50%程度になり、その劣化を防止する必要が発生した。平成18年度は、溶液(純水や生理食塩水などの生体内を擬似的に評価できる溶液)中にナノシリコンを導入し、その基礎特性(導入濃度、発光波長および発光効率)等を実験により分析した。最適条件を調査することで劣化現象を解消することが可能になった。生体内での流動現象の可視化への適用について検討を行った。心臓冠動脈血管ヘナノシリコンを導入した結果は、血流の流動性が目視で確認でき、有用性が示唆された。また、小腸内への導入によって腸のぜん動運動が容易に認識でき、生体内での流れの可視化への応用性が確認された。今後は、この成果を基に、生体認識素子としての可能性の拡大に向けて研究を進める計画である。真空中でのスパッタリング法で作製した薄膜中のナノシリコンより、本研究により開発した溶液中への抽出方法で固体中のナノシリコンを溶液中に取り出した。具体的には、シリコンウエハ上に堆積したシリコン酸化物(SiO_2)中にシリコン原子を混入させ、その後、電気炉による熱処理によってシリコン酸化物中にナノシリコンを形成させる。このシリコン酸化物中のナノシリコンを粒子状として取り出すには、シリコン酸化物を容易に溶解するフッ酸(HF)溶液を用いた。当初の実験計画に沿って、粒子状ナノシリコンの取り出しには成功を収めた。その分散溶液としては、ナノシリコンの表面との相互作用が少なく、安定的に発光を得る必要がある。そこで、来年度は、溶液(純水や生理食塩水などの生体内を擬似的に評価できる溶液)中にナノシリコンを導入し、その基礎特性(導入濃度、発光波長および発光効率)等を実験により分析する。本劣化現象を解消するためにナノシリコン表面に劣化防止コート膜を塗布し、その効果を検討する計画である。粒子状ナノシリコンの作製には、スッパタ法および各種ガス雰囲気での熱アニール法によって行った。

生体内での流動現象の可視化への適用について検討を行った。心臓冠動脈血管ヘナノシリコンを導入した結果は、血流の流動性が目視で確認でき、有用性が示唆された。また、小腸内への導入によって腸のぜん動運動が容易に認識でき、生体内での流れの可視化への応用性が確認された。今後は、この成果を元に、生体認識素子としての可能性の拡大に向けて研究を進める計画である。
がん関連遺伝子発現の個体差と宿主・環境要因に関する研究

コーホート研究により、発がんの免疫的宿主防御であるNK活性に関与する遺伝的要因として、NK細胞の活性型受容体であるNKG2Dの遺伝子領域にNK活性と強く関連したハプロタイプブロックを見いだした。次に、コーホート内症例対照研究を行いNKG2Dハプロタイプの発がんリスクの評価を行った。コーホート内症例対照研究により、NK高活性に関連したハプロタイプの発がん相対危険が低いことを示した。すなわち、NK高活性に関連したアリールをhomozygousにもつHNK1/HNK1の人は、NK低活性に関連したアリールをhomozygousにもつLNK1/LNK1に比べ、オッズ比0.48(95%CI、0.24-0.95)の低い全がん罹患リスクを示した。これらの結果は、がん免疫予防の主たる対象となる高危険群の同定に有用であり、NK活性を代理マーカーとした新たながん予防の道を開くものと考える。コーホート研究と並行して、臓器別にがん予防に有用な生体マーカーの研究を進めた。H. pyloriが遊離する新しい発がん因子Tipαはホモダイマーが活性型であり、Tipαのダイマー形成阻害を戦略とした新しい胃がん予防を目指す。緑茶ポリフェノールEGCGとsulindac、all-trans-retinoic acidあるいはcelecoxibを併用すると、GADD153を強く誘導し、相乗的に肺がん細胞のアポトーシスを誘導する。乳がんのエストロゲン応答解析用cDNAチップを用いて、HDAC6、IGFBP4、EGR3の乳がんの新規予後因子を見出した。hnRNPB1は肺発がん早期から高発現しており、肺がん患者の血漿hnRNPB1 mRNA量は、非がん群より高かった。迅速定量法の開発により、肺がん検診および前がん病変のマーカーとしての応用を検討している。本研究の目的は、発がんメカニズムの個体差の理解に基づいたがん予防を実現することである。まず、多段階発がんとがんの場という基本的な概念に基づいて、発がんの各段階に関与する遺伝子の発現・構造の変化が、個体の宿主要因及び環境要因によってどのように修飾されるか、その内因性のメディエーターを含めて"発がん個体差の起源"を明らかにする。また、発がんプロモーションに注目したがん予防法を確立するために、内因性の発がんプロモーターの役割及び発がんリスクとの関係を明らかにする。さらに、発がんハイリスクグループを対象としたがんの化学予防研究を基礎から臨床試験まで統合した形で推進する。(1)コホート研究で発がんとの関連を見出したNK活性の個体差について実験医学的検討を行い、granule及びFas ligand依存性NK活性に重要なレセプターを見出した。さらに、PHAによるリンパ球幼若化反応が、喫煙者の発がんリスクの指標となること及びDNA鎖切断と相関することを見出した。(2)臨床材料を用いて発がん関連遺伝子の発現を検討したところ、乳がんの発生・進展に重要なエストロゲンレセプターERαの機能がMDM2との相互作用により促進され、野生型p53により抑制されることを見出し、ERαの活性制御による乳がん予防の可能性を示した。また、肺がんで過剰発現するhnRNPB1が、微小肺がん、気管支異形成においても高頻度に過剰発現することを見出し、肺がん高危険群の同定及び予防の代理指標として有用である可能性を示した。3.胃がんの発生に重要な役割を持つH.pyloriの主要な膜タンパク質の一つが発がんプロモーション活性を持つことを見出した。また、緑茶ポリフェノールによる遺伝子発現の変化をcDNAアレイによって検討し、緑茶によるがん予防効果を表わす代理指標となる候補遺伝子を見出した。本研究の目的は、発がんメカニズムの個体差の理解とそれに基づいたがん予防を実現することである.まず、1986年に開始したコホート研究対象者及び新規対象者8,000人について、第2次調査として生活習慣調査を完了した。また、約500人について、発がん防御の視点に立った詳細な免疫学的調査を行い、リンパ球DNA及び血清を分離・保存した。次に、発がんの早期に関与する生体因子・環境の研究では、(1)H.pyloriの膜蛋白質(MP-1)が、内因性発がんプロモーターであるTNF-αの産生を誘導し、HP-MP1遺伝子をBhas42細胞に導入すると形質転換を誘導することから、HP-MP1は新しい発がん因子であると示唆された。(2)エストロゲンレセプターαのプロモーターの重要な調節因子として同定したERBF-1は、C/EBPβファミリーに属するLAP/LIPであった。また、大規模cDNAアレイにより約200のエストロゲン応答性遺伝子群を同定した。これによりホルモン療法反応性の個人差及び良性乳腺疾患患者の乳がんリスク評価の研究を進める.(3)RNA結合蛋白質であるhnRNPB1は、微小肺扁平上皮がん及び気管支異形成、微小腺がんといった肺がん発生の早期から60%以上に高発現しており、肺がん予防の代理指標の可能性を示した。さらに、緑茶のがん予防効果を判定する生体指標の研究を進め、cDNAアレイにより、EGCGがRARα1遺伝子発現を亢進し、NF-kB inducing kinase,Rho Bなど4つの遺伝子発現を抑制することを見出した。また、EGCGはhnRNPB1蛋白質の発現を濃度依存性に抑制することを見出した。これらの結果は、発がんメカニズムの解明にとどまらず、発がん高危険群の同定及びがん予防の効果を評価する生体指標の開発という点で重要である.

本研究の目的は、発がんメカニズムの個体差の理解とそれに基づいたがん予防を実現することである。すなわち、発がん高危険群の選別、予防効果の評価に有用な生体因子を見出し、がん予防に役立つトランスレーショナル研究を行う。平成14年度の主要研究成果は以下の通りである。1.コーホート研究により、喫煙量とは独立に、血清α_2-グロブリンが喫煙者の発がんリスクを示すことを見出し、喫煙者及び禁煙者のがん予防において有用なリスクマーカー及び予防効果を判定する代理マーカーとなる可能性を示した。また、コーホート研究で測定したNK活性の個人差が、NK細胞の殺細胞メカニズムあるいは標的細胞のHLAクラスI分子の発現に依存しないことを示した。現在、NK活性が既知であるがん罹患群及び対照群について、HLAクラスIハプロタイプを中心とした遺伝的相関分析を進めている。3.エストロゲン応答性遺伝子のカスタムチップが、乳がん患者のエストロゲン応答性の違いの層別化に有用であることを示した。4.RNA結合蛋白質であるhnRNPB1は肺がん細胞特異的に高発現している。肺腺がんの前がん病変である腺腫様過形成では、早期腺がんや進行がんに比べ発現は低かった。hnRNP B1と細胞周期関連因子を組み合わせることにより、形態のみでは鑑別の困難な前がん病変と腺癌との鑑別の可能性を示した。本研究の目的は、発がんリスクの個体差の理解とそれに基いたがん予防を実現することである。そのため、環境だけでなく宿主要因に注目した発がん高危険群の選別とがん予防に有用な生体マーカーを開発することが必要である。まず、埼玉県住民を対象としたコーホート研究により、末梢血リンパ球のNK活性と発がんとの関連をすでに報告しているが、NK活性の個人差を規定する遺伝的要因を見出した。すなわち、NK活性が低い健常群と高い健常群を比較する関連解析により、NK細胞の主要な活性型受容体であるNKG2Dの遺伝子領域にNK活性と強く関連した2つの主要なハプロタイプを同定した。これらのハプロタイプは日本人での頻度も高く、大きな個人差を示すNK活性の主要な遺伝的要因であると考えられる。また、NK細胞は周囲の細胞とHLAクラスIを介して、その恒常性を維持していると考えられるため、HLAクラスI遺伝子型とNK活性を比較した。その結果、HLAクラスIの4つの遺伝子型がNK活性と有意な関連を示し、NK活性の個人差にも関与していることを示唆した。コーホート研究と並行して、臓器別にがん予防に有用な生体マーカーの研究を進めてきた。胃がん:H.pyloriが遊離する新しい発がん因子Tipの研究を進め、Tipは菌体中でホモダイマーを形成して遊離されるが、モノマーは発がん活性を示さないことを見出した。Tipのダイマー形成阻害は、胃がん予防の新しい戦略となると考えられる。乳がん:HDAC6やIGFBP4などの新規予後因子を見出した。肺がん:肺がん患者の血漿hnRnPB1 mRNA量が、良性肺疾患患者、健常人に比べて有意に高いことを見出した。hnRNPB1は気管支異形成でも高発現することから、前がん病変のマーカーとしても有用である可能性がある。