hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
制御RNAの機能発現とRNAシャペロンHfqの役割

SgrSとRyBをモデルとしてsRNAのバイオジェネシスについての研究を行い、大きく2つの成果を得た。第一に、ダブルターミネーター系を用いてsRNA遺伝子の転写終結を解析しストレス条件下で転写終結が促進されること、すなわち転写終結の制御が3'末端にポリUテールを有する機能的なsRNAの効率的な産生を保証していることを明らかにした。第二に、ターミネーターヘアピン構造を安定化させる変異sgrS遺伝子の解析からヘアピン構造は3'末端の転写終結位置を決定する重要な要素であり、sRNA遺伝子のターミネーターは3'末端に7塩基以上のポリU鎖を備えたRNAを合成するために最適化されていることを明らかにした。本研究の目的は、sRNAの機能発現におけるRNAシャペロンHfqの役割に焦点をあて、いくつかの未解明の課題に取り組むことであるが、平成25年度は、おもにsRNAのバイオジェネシスの解明とHfqとの機能的結合領域の一部である3'末端のポリU配列の役割を中心に研究を進めた。sRNAの3'末端のポリU塩基は、sRNA遺伝子の転写終結においても重要な役割を担う。そこで、sRNA遺伝子の下流に他の遺伝子の転写終結領域を連結するようにデザインしたレポーターsRNA遺伝子の発現系(ダブルターミネーター系)を構築した。この系を用いることにより、sRNA遺伝子の転写終結領域を読み飛ばした転写産物(リードスルー産物)を、転写終結産物と区別して検出することに成功した。このシステムを基に、sRNA遺伝子の転写終結については、リードスルーが50%以上生じていることを明らかにした。転写終結産物およびリードスルー産物とHfqとの結合を解析した結果、3'末端にポリU配列を持つ転写終結産物がHfqと安定に結合する一方、リードスルー産物はHfqとの結合能がないことを明らかにした。このことから、sRNA機能発現にとって、ポリU配列が3'末端に位置することが必要であると結論した。またダブルターミネーター系を用いた解析の中から、sRNA遺伝子の転写終結がストレスにより制御されている可能性を見いだした。一般にsRNA遺伝子は、種々のストレスにより転写が誘導される。sRNA遺伝子の転写終結がストレスにより制御されている可能性は、sRNA遺伝子の転写制御に加えて転写終結段階でのsRNA生合成の調節機構が存在することを示している。本研究の目的は、sRNAの機能発現におけるRNAシャペロンHfqの役割に焦点をあて、いくつかの未解明の課題に取り組むことである。平成26年度は、平成25年度に引き続き、sRNAのバイオジェネシスの解明とHfqの結合領域である3'末端の転写終結配列の役割を中心に研究を進めた。プラスミド上のSgrSおよびRyhB遺伝子の下流に強力なRho非依存性ターミネーターであるrrnBまたはrplLの転写終結領域を連結したダブルターミネーター系を構築し、主にノーザンブロット法により、細胞内におけるsRNA遺伝子の転写ターミネーターを読み飛ばした転写産物(リードスルー産物)を解析した。この結果、非ストレス条件ではsRNA遺伝子のリードスルーが高頻度で生じていること、すなわち、sRNA遺伝子の転写ターミネーターは比較的転写終結効率が低い特徴があることを明らかにした。転写終結産物およびリードスルー産物とHfqとの結合をin vivoおよびin vitroで解析した結果、リードスルー産物はHfqとの結合能がないことを明らかにした。このことから、ポリU配列が3'末端に位置することがsRNAの機能にとって必須であると結論した。この研究を進める目的で、合成RNAとbiotin-streptavidin系を利用したHfqとRNAの結合をin vitro解析する方法を新たに確立し、積極的に応用した。ゲノム上のsRNA遺伝子の転写が誘導される種々のストレス条件では、sRNA遺伝子のリードスルーが顕著に抑制されること、すなわち転写終結が増強されることを見いだした。ストレス条件でのリードスルーの抑制は、ゲノム上でのSgrS遺伝子においても観察されることから、sRNA遺伝子の発現は、転写開始に加えて転写終結段階でも制御されていると結論した。sRNA生合成の調節機構の重要な新たな一面を明らかにした成果である。本研究は、大腸菌をモデル生物として用い、原核生物に存在するHfq結合型小分子RNA(sRNA)の機能構造を明らかにすることを目的にしている。sRNAは塩基対を形成することにより、標的mRNAを抑制する。Hfqは、sRNA/mRNA間の塩基対形成を促進させるが、HfqによるsRNA/mRNA間の塩基対形成の促進作用の詳細な分子メカニズムは未だ不明である。これまでに、申請者らはsRNAの1つであるSgrSやRyBなどをモデルsRNAとして用いて、sRNAの機能的Hfq結合領域がsRNAの3'末端領域に存在することを明らかにした。平成27年度には、sRNAの機能的Hfq結合領域がsRNA遺伝子の転写終結領域と重複することに着目し研究を進めた。その結果、ストレスがない条件下ではsRNA遺伝子の転写終結領域におけるリードスルーが高頻度で起こることを見いだした。プルダウン法によりリードスルー産物はHfqとの結合能を失っていること、すなわちsRNAとして機能しない可能性を示した。また、合成RNAとbiotin/streptavidin系を用いたin vitro結合実験により、ポリUストレッチはsRNAの3'末端に位置した場合にのみHfq結合能を持つことを直接証明した。これらの観察から、ポリUストレッチはsRNAの3'末端に位置することで機能的なHfq結合モチーフとして働きうると結論した。多くのsRNA遺伝子の転写は、種々のストレスにより特異的に行われる。

今回、sRNA遺伝子の転写終結が種々のストレスにより促進され、結果的に3'末端にポリUテールを有する機能的なsRNAの産生を保証する仕組みであることを発見した。これは、sRNA産生の新たな制御様式の可能性を示したものである。以上の成果を、RNA研究の国際学術誌であるRNAに発表した。第1に、本研究課題である、sRNAの機能構造の全容の解明に対して、以下の進展があったことがあげられる。1)ストレスがない条件下ではsRNA遺伝子の転写終結領域におけるリードスルーが高頻度で起こることを発見した。2)sRNAの機能的Hfq結合領域が3'末端に位置することの重要性を、in vivoおよびin vitroで示した。3)sRNA遺伝子の転写終結が種々のストレスにより促進され、結果的に3'末端にポリUテールを有する機能的なsRNAの産生を保証する仕組みであることを発見した。第2に、以上の研究成果を種々の学会で発表し、さらには学術論文としてまとめ、国際学術誌であるRNAに発表したことをあげることができる。第3に、未発表ながら、以下の研究成果を得ていることも研究がおおむね順調に進行している理由の1つと考えている。1)sRNA遺伝子のRho非依存型ターミネーターのヘアピン構造を安定化させた場合、3'末端のポリUが短くなり、sRNAとしての機能を失う可能性が考えられる。このことを実験的に検証し、ゲノム上のsRNA遺伝子が機能的なsRNAを産生するためにうまくデザインされていることを明らかにした。2)SgrSの塩基対形成領域を必須遺伝子であるftsZ mRNAを標的にするように組み換えたSgrS組換え体がftsZ mRNAを特異的に抑制することを確認し、このシステムを利用して、Hfq結合領域の変異体を多数取得し、現在解析中である。3)同じ系を用いて、sRNAの作用発現に必須のHfq以外の因子のスクリーニングを行い、候補遺伝子の取得に成功している。Hfq結合型小分子RNA(sRNA)は標的mRNAの翻訳を制御している。Hfqの主な役割はsRNA/mRNA間の塩基対形成の促進である。申請者らは、sRNAのHfq結合領域がsRNAの3'末端領域に存在すること、3'末端のポリUテールが7塩基以上であることがHfqとの結合に必要であること、sRNA遺伝子の転写終結領域におけるリードスルー産物はsRNAとして機能しないこと、sRNA遺伝子の転写終結が種々のストレスにより促進されることなどを明らかにしてきた。平成28年度は、sRNA遺伝子のターミネーターヘアピン構造のsRNAの産生における役割に注目して研究を進めた。sRNA遺伝子のターミネーターには7塩基以上のポリTストレッチが存在するという特徴がある。これは機能的なsRNAが産生されるための必要条件である。実際に機能的なsRNAが産生されるためには、転写終結時に7塩基以上のポリU鎖として転写される必要がある。申請者らは、sRNA遺伝子のターミネーターは機能的なsRNAを転写するためのヘアピン構造を持つと考えた。
インプランタブル機能的電気刺激用電極の開発

手足が運動麻痺している脊髄損傷患者、脳卒中患者に対して、麻痺した末梢神経・筋系にプログラムされた電気刺激を与え、麻痺部位の機能を再建する機能的電気刺激(Functional Electrical Stimulation:FES)は有効である。申請者らは経皮的筋内埋め込み電極を用いた刺激装置を開発し、臨床的に使用している。本システムは刺激電極が皮膚を貫通して体内に埋め込まれるため、刺入部の感染、断線の可能性、注意深い手入れの必要性、外観上の抵抗感等の欠点がある。そのため、インプランタブル機能的電気刺激装置の開発が急務である。本研究では、現在の経皮的埋め込み電極より、一層信頼性の高い完全体内埋め込みシステム用の電極開発を目的としており、下記の成果が得られた。1.従来のSUS316Lステンレス鋼細線に加えクロム-コバルト基合金である604PHを用い径25μmの細線加工を行い十分な機械的性質を有する電極を作製した。2.SUS316L細線は塩素イオンを含む溶液(生理食塩水)中の電荷負荷加速腐食試験により孔食(pitting corosion)が認められた。一方、604PHでは孔食は全く認められず、高い耐食性を示した。インプランタブル機能的電気刺激用電極として、刺激装置との接続可能なコネクターおよび電極先端形状を開発した。これを用いることにより埋め込み手術中容易に20本以上の電極を安定して結合できた。現在、完全埋め込み型刺激装置のプロトタイプと2種類の電極(SUS316L細線および604PH細線)を用い、山羊へ埋め込み、システム全体の動作試験を行っている。本格的なシステム開発への有用な知見が期待される。1.電極材質、機械的性質、化学的安定性の検討コバルト基台金604PH(42.21Co-21.37Cr-16.89Ni-6.26Mo-1.10Mn)を2段階エレクトロスラグ再溶融(ESR)法により作製したところ、介在物がほとんど観察されない高清浄度のインゴットが得られた。このインゴットを用いて線引き加工を行い、径25μm以下の極細線まで製造が可能であることを確認した。この極細線は熱処理を工夫することにより従来のステンレス鋼SUS316L製の電極と同程度の引っ張り強度を示すことがわかった。化学的安定性として体内に長期埋め込むことを想定し、生理的食塩水中でのアノード分極曲線の測定および溶出試験を行った。不働態化処理に試料についてSUSU316Lと比較して、604PHの自然電極電位は貴に、不働態化維持電流密度は低下し、耐食性が優れていることがわかった。さらにピットもほとんど観察されず耐孔食性にも優れていることが認められた。溶出特性ではSUS316Lと同程度の結果であった。2.電極線の絶縁チューブおよび先端部の改良現電極では絶縁チューブとしてテフロンコーティングを行っている。本研究では、ポリウレタン、シリコン樹脂、ポリエチレン、ファイコンを用い電極の挿入試験を行った。挿入が容易な材質の場合は柔軟性に欠けるなど今後の更なる検討が必要である。次に電極先端部のバラケる問題については熱処理(テンパー)の条件を変化させて撚り止め効果を試験したところ十分に防止可能であることを確認した。電極材質の検討現在臨床的に使用している機能的電気刺激用経皮的筋肉埋め込み電極の素材であるSUS316Lステンレス鋼と比較して、より耐食性が優れていることが確認されたコバルト-クロム合金604PH(42.21Co-21.37Cr-16.89Ni-6.26Mo-1.10Mn-balanceFe)を用いて、径25μmの極細線を線引きした。

この細線を19本撚りし、表面をテフロンで被覆した後ヘリカル巻加工して従来の電極と同一の形状の電極を作製した。この両材質について、生理食塩水中でのパルス電流通電条件における累積10週間にわたる成分元素の溶出試験を行った。これは実際の体内での埋め込み条件に対して10年間に相当する加速試験である。更に、同溶液中で繰り返し回転曲げ疲労試験を行った。その結果、いずれの材質においてもニッケルの溶出が認められるが、2週目以降急激に減少した。溶出量はコバルト-クロム合金の方が僅かであるが少ない。しかしながら、SUS316Lでは鉄、604PHではコバルトがそれぞれニッケルと同等量溶出した。疲労試験において、10^7回時の疲労限はSUS316Lはr=4.0mm、604PHではr=4.0mm以下であり、若干ではあるが後者の方が疲労特性が良いと考えられる。しかしながら、長期間の埋め込みが予定される人体へのアレルギー性が懸念されるニッケルの溶出が少量といえども皆無でないため、ニッケルを含有せず、MRI対応で非磁性であり、耐食性に優れ、機械的強度も十分である新しい合金の開発に着手した。現在データベースを用いたコンピューターシュミレーションによる材料設計を行っているところである。試作電極の動物実験他のグループにより試作された間接的に電力および信号の供給が可能な刺激装置に特殊コネクターを介して、これらの電極を接続し、山羊に刺激装置とともに埋め込んだ。現在、化学的(井口)、電気的(星宮)、機械的(井口)、埋め込みの安定性(半田)についてデータの収集を行っている。年度内には更にもう1頭の山羊に2世代目の刺激装置とともに電極を埋め込む予定である。本研究では機能的電気刺激用完全体内埋め込みシステムのための高信頼性電極開発を目的としており、本年は以下の成果が得られた。○電極の腐食の検討SUS316L細線はCl-イオンを含む溶液(生理食塩水)中の電荷負荷加速腐食試験により孔食(pitting corrosion)が認められた。一方、604PH細線では孔食は全く認められず、高い耐食性を示した。○刺激装置との接続インプランタブル機能的電気刺激用電極として、刺激装置との接続可能なコネクターおよび電極の先端形状を開発した。これを用いることで、手術中容易に20本以上の電極を安定して接合できた。○システムの動作試験現在、完全埋め込み型刺激装置のプロトタイプと2種類の電極(SUS316L細線および604PH細線)を用い、山羊へ埋め込み、システム全体の動作試験を行っている。本格的なシステム開発への有用な知見が期待される。
向き付け不可能な曲面の極小挿入と調和写像の研究

リ-マン面で、非正則かつ共形的な対合写像で不動点を持たないものを考える。この写像で同一視することで、向きつけ不可能な曲面が得られる。特に具体的には、2次元射影空間、ある種の超楕円リ-マン面から作られた向きつけ不可能な曲面を考える。これらの向きつけ不可能な曲面から、向きつけ可能な4次元リ-マン多様体への調和写像と、対応するリ-マン面から4次元多様体への対合写像不変な調和写像は1対1に対応する。それで前者の構成のために、後者の構成をする。4次元リ-マン多様体のツイスタ-空間に自然に、対合写像を導入する。すると後者の調和写像に、EellsとSalamonの基本定理を用いることによって、ツイスタ-空間への対合写像不変な正則写像が対応することが示せた。Bryantは2次元単位球面S^2から4次元単位球面S^4への調和写像のツイスタ-リフトの具体的な形を与えた。それをもちいて、2次元射影空間からS^4への調和写像を具体的に構成できた。Woodはリ-マン面から複素グラスマン多様体への調和写像の因子分解定理を与えた。その結果を用いて向きつけ不可能な曲面から複素グラスマン多様体への調和写像の因子の性質を明らかにした。特に因子の次数について詳しく調べた。向きつけ不可能な曲面の3次元ユ-クリッド空間への極小挿入の例は幾らか知られている。しかしその性質、例えば、埋め込みになるものはあるかとか、端点の個数、状態はどうかとかはほとんど明らかにされていない。そのようなことを調べるために、知られている例のコンピュ-タ-・グラフィクを作り、その形状を調べた。数学的な結論はまだ得られていない。
マルチスケール位相シフト光学システム開発とナノフルイドの動的濡れ計測への展開

金属や金属酸化物のナノ粒子が高濃度に分散した懸濁液である高濃度ナノフルイドは,プリンテッドエレクトロニクス用のナノインクへの応用などが期待される新たな機能性流体である。この高濃度ナノフルイドのナノインクへの応用にはその濡れ挙動,特に微視的な濡れの解明が重要となる。本研究では,これまで高濃度ナノフルイドの微視的な濡れの動的挙動を明らかにするために,マイクロスケールからナノスケールの膜厚分布が計測可能なマルチスケール位相シフト光学システムを開発した。本年度は開発した装置を用いた計測を通し,純溶媒およびナノ粒子を添加した懸濁液の微視的な濡れ評価実験を行い,研究を進めている。本年度は,開発した光学システムを用いて,微視的濡れ挙動に及ぼすナノ粒子の影響の評価に関する実験を行った。試料には先行薄膜の先行研究で多く用いられてきたポリジメチルシロキサン(PDMS),および表面をPDMSで修飾したシリカナノ粒子をPDMSに添加した懸濁液を用い,両者をシリコンウェハ上に滴下した際の微視的濡れ挙動の違いを観察した。得られた膜厚分布から液滴の拡張速度,微視的な接触角,先行薄膜の拡張領域を評価した結果,液滴の拡張速度や接触角にはナノ粒子添加の影響が観察されたが,先行薄膜の拡張領域にはその影響が表れないことが明らかとなった。この原因には凝集体の形成などが考えられるが,詳細はまだ明らかでないため,高濃度ナノフルイド内のナノ粒子構造の評価を進めていく。本年度,開発した光学システムを用いて,微視的な濡れ挙動に対するナノ粒子の影響の評価を行うことができ,研究の進捗はおおむね順調であると考える。今後は超臨界水熱合成法により合成した表面修飾ナノ粒子を用い,溶媒やナノ粒子の表面修飾鎖を種々変更しながら実験を進めるとともに,高濃度ナノフルイド内のナノ粒子構造の評価を進め,その微視的な濡れ挙動とナノ粒子構造の相関を明らかにする。高濃度ナノフルイドは、金属や金属酸化物のナノ粒子が高濃度に分散した懸濁液であり、導電性インク等への応用が期待されている新たな機能性流体である。高濃度ナノフルイドの導電性インクへの応用には、その濡れ挙動、特に微視的な濡れが重要となる。そこで本研究では、微視的濡れの動的二次元膜厚計測が可能なマルチスケール位相シフト光学システムを開発し、高濃度ナノフルイドを基板に塗布した際の微視的濡れ挙動の解明を目的とする。平成29年度は、マルチスケール位相シフト光学システムの開発に重点的に取り組み、ナノスケール液膜の計測を可能とする位相シフトエリプソメータを開発した。位相シフトエリプソメータの開発においては、3枚の位相シフト画像を使用する3ステップ位相シフトアルゴリズムを提案し、提案したアルゴリズムに基づいた光学システムと画像処理プログラムを開発した。また、測定試料の蒸発、凝縮などの実験環境のコントロールを目的とした密閉環境制御システムの開発を行った。以上の光学システムを検証するために、シリコンウェハ上に100 nm以下の膜厚を有する酸化シリコン薄膜サンプルを複数作製し、開発した位相シフトエリプソメータによる二次元の膜厚計測を行い、その精度を検証した。さらに、信頼性の高い手法として分光エリプソメータを用いて膜厚を数点計測し、両者の計測結果を比較することで計測結果の妥当性を検証した。位相シフトエリプソメータの計測結果は高い精度を示し、また分光エリプソメータの結果と良く一致した。研究概要に示したように、本研究で軸となる位相シフトエリプソメータの開発と妥当性検証を行い、基礎原理の証明ができたことが最も重要な点である。また、今後の微視的濡れ挙動の計測に向け、光学系と画像処理プログラムを含めたシステムとしての精度を評価し、十分な精度を有することがわかった。開発した光学システムの動的計測への展開を行う。

既にマイクロコンピュータを用いた光学素子制御機構の開発に着手しており、今後は光学素子の制御機構を光学システムに組み込み、およびその調整・評価を行う予定である。また、純溶媒の動的な微視的濡れ挙動の可視化計測を進め、高濃度ナノフルイドの微視的濡れ挙動解明に向けた知見を蓄積していく。今後は超臨界水熱合成法により合成した表面修飾ナノ粒子を用い,溶媒やナノ粒子の表面修飾鎖を種々変更しながら実験を進めるとともに,高濃度ナノフルイド内のナノ粒子構造の評価を進め,その微視的な濡れ挙動とナノ粒子構造の相関を明らかにする。光学システム開発において効率的に予算を使用し、基本的な光学系構成を構築できた。そのため、平成30年度以降に予定している実験の対象に合わせた光学製品購入や、実験実施における消耗品購入に当てることが、より効率的な研究遂行につながると判断したため。平成31年度実施予定の実験で使用することが、より効率的な研究遂行につながると判断した。具体的には,シリコン基板,溶媒などの試料や実験対象に応じた光学システム用の光学素子の購入に使用する予定である。
磁気共鳴走査力顕微鏡技術による交換相互作用の原子分解能検出

磁気共鳴走査力顕微法の検討を行い、これを実現可能とする新しい走査プローブ顕微鏡システムの開発を行った。これまでに、走査型トンネル顕微鏡(STM)モードでSi(111)-7×7再構成表面の原子像の取得に成功し、セルの性能を確認した。また、原子間力顕微鏡(AFM)測定に必要となる光干渉測定系を構築し、ファイバ端とカンチレバーとの間の光干渉信号の検出に成功した。また、低温環境において、カンチレバーのQ値の増加などが測定可能であることを確認した。しかし、試料のアプローチに使用するZ粗動(慣性駆動)機構(attocube社製)の超高真空(10-8Pa)での動作が非常に不安定なため、走査プローブ顕微鏡システムとしての開発が終了していない状況となっている。他の部分は開発がほぼ終了しており、Z粗動機構さえ動作すればAFMとして動作することを確信している。磁気共鳴型力顕微鏡測定に最適な構造を持つ新しい磁性体探針の作製を行った。その結果、探針先端部にのみ数μm程度の磁性体を成長させることに成功した。元素分析の結果、形成されたピラーにはシリコンの混入があり、珪化鉄となっている可能性があるが、磁気力顕微鏡の測定では磁区像が得られており、探針先端部分では強磁性が発現していることを確認した。酸化ニッケル単結晶表面の観察を行い、交換相互作用検出に関する実験的な知見の蓄積を行った。探針材料とスピンに関する相互作用成分の大きさの比較の結果から、磁性体探針先端部の磁気特性が重要であり、磁化状態の制御された磁性体プローブが必要であることが確認された。GaAs(110)をモデル表面として、交換相互作用検出の際のカンチレバーの加振方法の評価検討を行った。また、交換相互作用力の定量評価を実現するための基礎技術として、微少な磁気センサを搭載したカンチレバー作製した。室温動作の非接触原子間力顕微鏡を用いて、清浄な酸化ニッケル表面を観察することで、交換相互作用検出に関する実験的な知見の蓄積を行った。とくに、鉄、ニッケル、シリコンと探針の材料をかえ、スピンに関する総合作用成分の大きさの比較を行った。これにより、非磁性では観察できないスピン成分が強磁性探針では観察できることが示せたが、強磁性材料による相互作用の大きさの相違については、実験値のばらつきが多く、これを明らかにするに至っていない。このばらつきは測定装置のノイズなどによる測定誤差に起因するものではなく、強磁性体先端部分での磁化方向、磁気異方性など磁気的な性質の違いによるものであると予想される。次年度は、基板となる探針先端部分の形状の制御や単結晶成長などを試み、探針先端部分の磁気状態の制御を目指す。カンチレバーの先端部分に高周波の給電を可能にするために、MESMプロセスを検討し、4つのリード電極の配置が可能なカンチレバーの自作を行い、強磁性共鳴用カンチレバーを作製するために必要なプロセス技術の習得を行った。さらに、室温非接触原子間力顕微鏡を用いて、接触電位差の動的な補償が可能になるように、ケルビンプローブ機能の追加を行い、その動作を確認した。極低温非接触原子間力顕微鏡システムの全体構成について検討し、それに必要な要件から、光干渉タイプの非接触原子間力顕微鏡ヘッド部の設計を作製を行った。さらに、高磁場の発生機構、高局波の導入方法を検討し、強磁性共鳴と組み合わせて、より汎用的な交換相互作用測定が可能な計測系全体の設計について検討した。室温動作の非接触原子間力顕微鏡による交換

相互作用力測定実験を引き続き継続し、鉄、ニッケル探針に加えコバルト探針による実験を進め、スピン依存であると期待される表面凹凸非対称性についての測定データの蓄積を行った。本年の主たる研究目標の一つである、in-situでの単結晶探針作製については、シリコン探針先端部への鉄単結晶成長を試みた。本年の研究において提案した単結晶成長方法は、試料基板上にin-situで鉄薄膜を形成し、試料基板を過熱した状態で、シリコン探針を鉄薄膜上にアプローチし、制御性良く試料表面に接触させ、試料表面薄膜から原料原子を供給し探針先端部へ単結晶を成長させるものである。基板温度、探針のアプローチ速度、接触の程度などの実験条件を詰めることによって、数ミクロン程度の結晶が形成できることを見出した。結晶表面の形状から、いくつかの単結晶粒塊からできている。EDX分析によればシリコンの混入があり、珪化鉄となっている可能性もあり、現在TEM等による詳細な分析を進めている。シリコン探針先端部に形成した結晶は、結晶がついている探針を磁気力顕微鏡の探針として利用して磁区観察をしたところ磁気像が得られた。磁気双極子探針的に振舞ったことから、結晶部では強磁性が発現していることが確認された。極低温非接触原子間力顕微鏡については、排気系、磁場印加用の超伝導コイルおよびグラディエントコイルを配置したクライオスタット、AFMヘッド部の試作が完了し、装置剛性の試験等をSTM測定から行いつつ、交換力測定用への最適化配置を検討し、改良を進めている。MESMプロセスによるカンチレバー作製については、4端子タイプのセンサーカンチレバーを磁気抵抗効果素子ならびにカーボンナノチューブの電界効果トランジスタ素子を搭載したカンチレバーの作製を試みつつ、必要となる強磁性共鳴用カンチレバーの作製技術の習得を行った。本研究で開発を進めてきた極低温非接触原子間力顕微鏡は、除振動機構、排気装置系、直流磁場印加用の超伝導コイル、傾斜磁場発生用のコイル、ならびにクライオスタット、クライオスタット内に配置する内部真空チャンバー、AFMユニットセル、AFMユニットセルの搬送機構などの組み上げ、システムとして動作確認を行なった。AFMヘッド部が組み込まれているAFMユニットセルは、Si(111)7x7の原子像の取得が可能であることでその動作を確認した。今回、新たに、カンチレバーの振動検出機構として光干渉機構を導入したが、AFMユニットセル内では微動機構を有した光ファイバーを利用し、大気側から真空側へ、また高温領域から低温領域への光伝達にも光ファイバーを利用した。AFMユニットセルを独立に可動するようにするために、真空・低温で利用可能なファイバカプラを作製した。これにより、AFMユニットセルを超高真空内で室温領域から低温領域に容易に搬送できるようになった。実際低温でのカンチレバーのQ値の増加などを光干渉機構により確認している。しかしながら、カンチレバー保持部の接合部分が熱サイクルで脱離しやすいなど、装置上改良を必要とする点がいくつか新たに見出されるなど、交換相互作用力測定の実験に継続的な研究が必要とされる。予備実験として準備した、単結晶探針作製条件等については、目処が立っため、同装置への作製機構の取り付けが可能な状態となった。また、カンチレバー作製についても、スピンバルブ型の磁気抵抗効果素子を搭載した4端子タイプのカンチレバー
心臓交感神経イメージング法を用いた右心不全に対する治療効果判定および予後評価

肺動脈性肺高血圧の治療薬(PGI2誘導体、エンドセリン受容体拮抗薬、PDE5阻害薬等)はいずれも肺血管抵抵抗と肺動脈圧を選択的に低下させ、生命予後を改善する。これらの薬剤が心臓交感神経系の活性に直接影響を及ぼしているか否かについて、現在、我々は、評価検討を行っている状況である。肺動脈性肺高血圧症と既に診断されているか、もしくは新たに診断され、入院加療が必要であった症例を対象とし、初期治療によって良好に経過した症例を現在エントリー中である。右心カテーテル検査を施行することにより血行動態を把握し重症度の評価を行っている。また、加療後に代償期となり退院が可能となった状態で、心臓交感神経機能を直接評価できるMIBG心筋シンチグラフィ、および交感神経系の活性を反映する新規バイオマーカーであるFABP4濃度を測定している。さらに、古典的な神経体液性因子の評価として、血中NE、hs-TnT、hs-CRP、PIIINP濃度も計測し、心エコー図検査にて、両心機能評価を行っている。現在、症例を蓄積中で、退院した症例においては、安定し外来通院している症例が多いが、心不全死、心不全増悪入院等の主要有害心イベントを来した症例も存在する。今後、症例を蓄積する事によって、肺動脈性肺高血圧の治療薬の効果判定や、予後予測が可能になると思われる。現在、症例を蓄積中で、一般的には稀有な疾患であるが、大学病院である特性を活かし、近隣病院からの紹介による症例の蓄積が出来ている。退院した症例においては、当院の外来による治療の継続が出来ており、安定し外来通院している症例が多いが、心不全死、心不全増悪入院等の主要有害心イベントを来した症例も少数ではあるが存在する。今後、さらなる症例を蓄積する事によって、肺動脈性肺高血圧の治療薬の効果判定や、予後予測が可能になると思われる。将来的には学会報告や論文化をする事により、肺動脈性肺高血圧の治療および予後に関して、新たな知見が公表できると思われる。当該年度において、極力使用額を節約して、研究を実施した。次年度においてはより有効に使用するために、積極的に研修会を行い、学会にも参加、発表を行う予定である。
上海地区の新人英語教員に対する研修と成長－5年間の縦断的研究

本年度は台湾の高雄市と台北市にある公立小中学校での新人教員の追跡を開始した。これは上海地区でのこれまでの新人教員の成長研究データと対比させる為であり、付加的に上海で商業ベースの英語スクールの新人教員の授業観察とインタビューも行った。高雄市では、教員2年目の小学校教師1名の5年生と6年生の授業、台北市では教員2年目の中学校教師1名の中学2年生の授業を観察、それぞれビデオに録画し、授業の前後にインタビューを行った。インタビューでは、英語教師になるに至った背景や、研修やサポートの実態、授業内容や授業実践について質問を行った。また、本研究の目的である、「新人教員に対する研修と成長」を明らかにするため、10月より、この2名が受けた、研修、ワークショップ、サポートをオンライン上で、随時報告してもらっており、この2名を数年に渡って、授業、研修とも調査する予定である。台湾での公立の小中学校での新人教員を追跡することにより、2020年に小学校3,4年生に英語が導入される日本の英語教育の参考になる提案が可能になるものと考えられる。本研究は、研究代表者と研究分担者が継続的に参加してきた科研費研究課題(2014-2017年陸)を、データも含め引き継いでおり、すでに収集済みのデータ(教師3名3年分と1名4年分の授業ビデオとインタビューデータ)と、台湾で引き続き収集予定の2名のデータの比較を行えば、上海と台湾の英語教育の比較も可能になる。上海の3年分のデータに加え、本年度より台湾にて新人教員2名の追跡を始めた。来年度の継続も了承がとれており、当初の目標に向けて、順調に進んでいる。本年度データを収集した、高雄、台北の新人教員2名を、毎年継続的に追跡していく。収集した授業データ、インタビューは書き起こし、教員研修や、受けたサポートについても2名の教員から引き続き随時報告してもらう。最終的には、上海と台湾で収集したデータを比較分析する予定である。本年度は3月7日(水)から11日(日)まで、上海にて、授業見学と現地調査、ならびに中国側のコーディネーター、授業観察対象教員と分析結果報告を兼ねた懇談会を行った。3月8日、市内の小中一貫公立校にて、小学校6年の授業(教員6年目女性)を見学、ビデオに記録した。授業は、教室の前と後ろにビデオカメラを設置し、生徒の様子なども把握できるようにし、ICレコーダーで音声も記録した。また、授業の前後に、約40分のインタビューを行った。インタビューでは、1教員研修やサポート体制、教員としての日常について、2授業内容や授業実践について、それぞれ研究分担者と、研究代表者が担当し、ICレコーダーに記録した。対象教員については、研究代表者と研究分担者が、継続的に参加してきた科研研究(2014-2016年陸)で収集済みのデータが過去3年分あり、今回はそれを継続した形で、4年目の授業データと、インタビューデータを収集することができた。また、陸科研研究では、本教員以外にも3人の教員を3年間に渡って追い続けた、授業ビデオとインタビューデータがあり、このデータを譲り受け、教員研修と教師の成長という二側面からの分析を、本科研研究で引き継ぐこととなった。この中の公立中学校教員(教員6年目男性)の2年分の授業データ分析結果は、データを収集してきた4人の教員との懇談会で、研究代表者が報告発表を行い、対象教員からもポジティブなフィードバックを得た。本年度は1名の授業観察にとどまったが、過去3年追跡した、4名の教員のデータを譲り受け、さらに次年度より新たに新人教員のデータを収集開始予定であり、当初の目的の達成に向けては、順調に進んでいる。本年度は、収集した授業およびインタビューデータを整理、分析を進め、得られた結果を学会で発表する。また、上海にて、教員一年目の新人教員の追跡を開始する予定である(人数や時期等に関しては現在交渉中)。

現在の日本国内の新人教員の追跡についても交渉中で、これが実現すれば、日中比較が可能となる。本年度データを収集した、高雄、台北の新人教員2名を、毎年継続的に追跡していく。収集した授業データ、インタビューは書き起こし、教員研修や、受けたサポートについても2名の教員から引き続き随時報告してもらう。最終的には、上海と台湾で収集したデータを比較分析する予定である。本年度は授業見学対象の教員が、先方の都合で1名に留まったため、繰越金が発生した。本格的な授業観察は、今年度より開始予定であり、上海への渡航費、書き起こし、下分析のアルバイト代、対象教員への謝礼などに支出予定である。台湾でのデータ収集を、3月24-29日に行ったため、2018年度の精算に間に合わない経費が発生した。
感情・動作・状況に応じた顔文字の自動生成に関する研究

2018年度は、顔文字生成の基盤となる顔文字のまとめ上げタスクを実施している。文字Embeddingを利用したニューラルネットワークによる顔文字の原形推定,奥村嶺,奥村紀之,2018年度人工知能学会全国大会(第32回),2B4-05,2018において研究成果報告を行い、約10万種ある手持ちの顔文字を約3000種の原形へ分類するシステムを構築し、およそ6割程度の正解率を得ている。顔文字生成についてはこの逆順を辿るシステム構成となるため、正しく分類することができれば、顔文字生成への第一歩となる。また、人手による感情ラベル付けにおける応答時間に着目した感情推定難易度の評価,山下紗苗,上泰,加藤惠梨,酒井健,奥村紀之,信学技報,Vol.118,No.210,NLC2018-9,pp.1-6,2018において、顔文字生成の基盤となる感情推定の難易度評価を行った。顔文字と感情は密接に関係しており、人間が感情を認識する過程を顔文字生成に組み込むための事前実験となる。なお、本発表は、発表者の学生が学生研究賞を受賞するなど高い評価を得ている。また、2019年6月にはニューラルネットワークによる顔文字の原形に基づくマルチクラス分類と題して、先のまとめ上げタスクの拡張モデルについて研究成果報告予定である。マルチクラス分類においては、複数の原形を持つ顔文字の原形推定を行うため、全ての原形を正しく抽出できた割合が5割程度とまだまだ精度の面で改善の余地が残されている状況である。当初の予定通り、顔文字のマルチクラス分類の実装を完了し、顔文字の自動生成のための敵対的生成ネットワークの検討に入っている。ただし、顔文字を生成するためのきっかけとなる感情解析についてはまだしばらくの検討を要するため、当初の研究期間通り3年での完結を目指している。基本的には申請書に記載したとおりの計画で進めていく。ただし、感情解析に関する部分の検証が非常に難しく、想定通りのタイミングで結果が出ない場合もある。その場合は次善の案として、感情解析を用いない顔文字生成を試みる予定である。大学の規定により科研費で購入したサーバ機を活用するためのデスクシステムを購入することができなかったため、科研費より充当した。当初科研費から支出予定であった旅費を大学予算に振り替えることで対応し、旅費の支出が予定より大幅に少なくなっているが、予定通りの研究活動を実施している。
ミヤコグサ－根粒菌の共生に関わる有機酸動態

マメ科植物の根に形成される根粒では、植物と根粒菌の間で窒素栄養と炭素栄養が交換される。植物から根粒菌へは炭素源としてリンゴ酸が供給されることが示唆されているが、その輸送を担うタンパク質は同定されていない。本研究ではマメ科のモデル植物であるミヤコグサを用いて、リンゴ酸輸送体候補としてALMTタンパク質の機能解明を行った。また同時に糖輸送体であるSWEET輸送体の機能解明mも行った。そして、LjALMT1およびLjSWEET3が根粒維管束で特異的に発現すること、LjALMT1はリンゴ酸など2価の有機酸を特異的に輸送すること、LjSWEET3はスクロース輸送能を有することなどを明らかにした。ミヤコグサー根粒菌の共生系における、根粒内の糖・有機酸動態を明らかにするために、ミヤコグサの有機酸輸送体および糖輸送体の解析を進めている。1)糖輸送体の内在生基質の同定:単糖輸送体を欠失した出芽酵母EBY4000株およびショ糖輸送体を欠失した酵母SUSY7株を用いて相補実験を行ったが、糖輸送体が両酵母とも液胞膜に局在したため、両酵母とも相補されなかった。今後、糖輸送体をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させて、再度輸送活性を測定する予定である。2)有機酸輸送体の輸送基質の同定:アフリカツメガエルの卵母細胞を用いて、二電極膜電位法により各種有機酸およびアニオンの輸送能を測定した。3)有機酸輸送体および糖輸送体の発現解析:プロモーターGUS解析により根粒内における有機酸輸送体および糖輸送体の発現細胞を特定した。4)有機酸輸送体および糖輸送体のの発現抑制株の作出に取り組んでいる。次年度に解析予定である。ミヤコグサー根粒菌の共生系における根粒内の糖・有機酸動態を明らかにするために、2年間で、2種の有機酸輸送体および1種の糖輸送体の解析を行った。まず有機酸輸送体に関しては、2種が根粒維管束の師部伴細胞で発現すること、その局在膜はそれぞれ内膜系と液胞膜であることを見出した。この2種について、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いて、二電極膜電位法により各種有機酸およびアニオンの輸送能を測定したところ、1種についてリンゴ酸やコハク酸など2価の有機酸特異的な排出活性を有することを見出した。またこの輸送体は塩化物イオンや硝酸イオンなどのアニオンに対しても選択的に輸送する活性を有していた。もう1種の有機酸輸送体の輸送活性を測定したところ、リンゴ酸インジェクション時に弱い排出活性を有することを見出した。しかしながら、C末にGFPをつなげたコンストラクトを用いて卵母細胞における発現を確認したところ、非常に弱い蛍光しか観察されなかったため、卵母細胞以外の異種発現系で今後詳細な輸送解析を行う必要がある。一方、糖輸送体についても同様に実験を行い、根粒維管束の師部伴細胞で発現すること、ある糖を選択的に輸送することを見出した。これらの遺伝子発現抑制株は、単独では野生株と著しく異なる表現型は示さなかったため、エネルギー源として重要な糖および有機酸は複数の経路で制御されていることが示唆された。SWEETが酵母で液胞膜に局在したため相補実験が出来なかったが、それ以外に関しては概ね当初の計画を達成できている。また、相補実験に関してもアフリカツメガエルの卵母細胞を用いた系で再度行う予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。大きな遅れはないため、当初の計画通りに進める。
血管病変におけるSirt7の機能解析

血管病変において増加しているSirt7の役割を解明するために,Sirt7ノックアウトマウスおよび平滑筋特異的Sirt7ノックアウトマウスを用いてワイヤー挿入による大腿動脈内膜剥離を行い、血管内皮障害モデルを作成した。その結果,Sirt7ノックアウトマウスおよび平滑筋特異的Sirt7ノックアウトマウスではコントロールマウスに比較し、新生内膜の増生が有意に抑制されていた。またBrdU染色による評価では,Sirt7ノックアウトマウスの新生内膜では野生型マウスと比較して細胞増殖が抑制されていることを見出した。さらにSirt7の血管病変に及ぼす影響の分子機序を解明するために,新生内膜や動脈硬化巣の形成の中心的役割を果たす血管平滑筋細胞を用いた検討を行った。野生型マウス由来のVSMCsに比較して,Sirt7ノックアウトマウス由来VSMCsは血清刺激による細胞増殖が低下していた。またボイデンチャンバーを用いた評価ではSirt7由来VSMCsでは野生型マウス由来VSMCsに比べ,遊走能が低下していた。またその機序として細胞増殖に関与するmiRNA(miR290-miR295)がSirt7ノックアウトマウス由来血管平滑筋細胞において増加することを見出している。さらに平成30年度には小胞体ストレスが動脈硬化や平滑筋の増殖を亢進させることに注目し、Sirt7による平滑筋の増殖や遊走能制御に小胞体ストレス応答が関与すると仮説を立て検証を行った。小胞体ストレスを誘導する、ツニカマイシンの投与で増加するXBP1sの発現はSirt7ノックアウトマウス由来のVSMCsにて有意に減少することを見出した。これらの所見によりSirt7がmiRNAや小胞体ストレス応答を制御することにより血管平滑筋増殖を制御すること考えられる。平成28年度は血管病変において増加しているSirt7の役割を解明するために,Sirt7ノックアウトマウスを用いて血管障害モデルを作成し研究を行った.野生型マウスおよびSirt7ノックアウトマウスに対してワイヤー挿入による大腿動脈内膜剥離を行い、血管内皮障害モデルを作成した。28日後に新生内膜増生をHE染色にて評価した.その結果,Sirt7ノックアウトマウスでは野生型マウスに比較し、新生内膜の増生が有意に抑制されていた.またBrdU染色による評価では,Sirt7ノックアウトマウスの新生内膜では野生型マウスと比較して細胞増殖が抑制されていることを見出した.さらにSirt7の血管病変に及ぼす影響の分子機序を解明するために,新生内膜や動脈硬化巣の形成の中心的役割を果たす血管平滑筋細胞を用いた検討を行った.野生型マウス、Sirt7ノックアウトマウスよりそれぞれ初代培養した血管平滑筋細胞(VSMCs)を用いた実験において,野生型マウス由来のVSMCsに比較して,Sirt7ノックアウトマウス由来VSMCsは血清刺激による細胞増殖が低下していた。またボイデンチャンバーを用いた評価ではSirt7由来VSMCsでは野生型マウス由来VSMCsに比べ,遊走能が低下していた.これらの所見はSirt7が細胞増殖を制御することにより新生内膜増生を制御することを示唆する所見である.平成29年度はSirt7による細胞増殖制御機構を分子レベルで詳細に検討する予定である.熊本地震により動物実験を含めた研究が一時停止していたが,その後施設および実験器具の復旧によりおおむね予定通りの研究ができていると考える.平成29年度はSirt7ノックアウトマウスで見られたワイヤー障害後の新生内膜抑制作用がどの細胞のSirt7を介しているかを検討するためにSirt7flox/floxマウスとSM22-Cre過剰発現マウスを交配することで平滑筋特異的Sirt7ノックアウトマウスを作成した。モデルの確認のために、肝臓、大動脈および血管平滑筋を用いてウエスタンブロットによる評価を行い、血管平滑筋でのみSirt7がノックアウトされていることを確認した。このマウスに対して、ワイヤー挿入による大腿動脈内膜剥離を行い、血管内皮障害モデルを作成した。その結果、全身でのSirt7ノックアウトマウス得られた所見と同様に平滑筋特異的Sirt7ノックアウトマウスでもワイヤー障害後の新生内膜の増生が有意に抑制されることを見出した。平成28年度にCyclinAやCDK4などの細胞周期蛋白がSirt7ノックアウトマウス由来平滑筋において減少することを見出していたが、どのようにしてSirt7が細胞周期蛋白を制御するかは不明であった。そこで我々はmiRNAに注目し、探索を行ったところ、細胞増殖に関与するmiRNA(miR290-miR295)がSirt7ノックアウトマウス由来血管平滑筋細胞において増加することを見出した。これらの所見はSirt7がmiRNAを制御することにより、細胞周期関連蛋白の発現を調整することを示唆する所見である。実験に用いるマウスを十分数得ることに時間がかかったため。

さらにSirt7の血管病変に及ぼす影響の分子機序を解明するために,新生内膜や動脈硬化巣の形成の中心的役割を果たす血管平滑筋細胞を用いた検討を行った。野生型マウス由来のVSMCsに比較して,Sirt7ノックアウトマウス由来VSMCsは血清刺激による細胞増殖が低下していた。またボイデンチャンバーを用いた評価ではSirt7由来VSMCsでは野生型マウス由来VSMCsに比べ,遊走能が低下していた。またその機序として細胞増殖に関与するmiRNA(miR290-miR295)がSirt7ノックアウトマウス由来血管平滑筋細胞において増加することを見出している。さらに平成30年度には小胞体ストレスが動脈硬化や平滑筋の増殖を亢進させることに注目し、Sirt7による平滑筋の増殖や遊走能制御に小胞体ストレス応答が関与すると仮説を立て検証を行った。小胞体ストレスを誘導する、ツニカマイシンの投与で増加するXBP1sの発現はSirt7ノックアウトマウス由来のVSMCsにて有意に減少することを見出した。これらの所見によりSirt7がmiRNAや小胞体ストレス応答を制御することにより血管平滑筋増殖を制御すること考えられる。平成29年度は動物モデルを用いた検討を引き続き行うとともに、ヒト血管平滑筋細胞を用いてsiRNAおよびアデノウイルスを用いたSirt7のgain- and loss-of functionの検討も行う.われわれは予備検討で,Sirt7が細胞周期制御タンパクであるCyclin D1やCDK4の発現に影響を与える可能性を見出しており.その機序のひとつとしてがん抑制遺伝子であるp53が関与している可能性を考えている(Pharmacol Res. 2008).Boberらは,Sirt7はp53の脱アセチル化を介してp53の活性を制御していると報告しており(Circ Res. 2007),Sirt7のp53を介した細胞周期制御機構を明らかにする.Sirt7の欠如による平滑筋増殖抑制にmiRNA関与が示唆されたため、アンチセンスオリゴを用いて、Sirt7がmiRNAを介して、平滑筋の増殖を制御しうるかどうかを検証する。またどのようにしてmiRNA発現をsirt7が制御するかも検討する。平成28年度は学会出張費を計上していたが,使用しなかったこと、また動物実験をメインに行ったため、試薬の消費が少なかったため使用するマウスが十分増えなかったため、必要な実験の遂行が遅れているため。大動脈瘤や動脈硬化巣の評価のため多数の染色費用が必要になる。また細胞実験でもsiRNAの導入や過剰発現系を作成する必要があり、平成29年にそれらの支出を行う予定である。
IgA腎症における糖鎖不全IgA1産生に対する黄色ブドウ球菌膜蛋白抗原の関与

(1)メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染後腎炎の原因候補抗原の組換え蛋白を作製し、培養メサンギウム細胞と反応させたところ、メサンギウムの増殖に関し、正・負の両者のシグナルをToll-likeレセプターを介して伝達することを見出した。(2)Fcα/μレセプター(Fcα/μR)は、IgA・IgMに対する高親和性Fcレセプターである。Fcα/μRトランスフェクタントにより、患者血清中の多量体IgAを捕捉し、ヒンジ部O-結合型糖鎖を標識レクチンで染色し、フローサイトメトリーにて解析する系を開発した。(1)黄色ブドウ球菌膜蛋白抗原と培養メサンギウム細胞の直接的な反応性の検討。黄色ブドウ球菌膜蛋白抗原のリコンビナント蛋白を作製し、培養メサンギウム細胞と反応させたところ,適切な温度と反応時間で最大限の蛋白の細胞に対する接着が観察された。細胞接着は、メサンギウム細胞の培養条件によっても変化した。黄色ブドウ球菌膜蛋白抗原とメサンギウム細胞を共培養し、BrdUの細胞内取り込みによる細胞増殖に対する影響を検討したところ、極少量の共培養下ではメサンギウム細胞の増殖が充進する一方,ある程度の濃度を超えた状況ではメサンギウム細胞の増殖は減弱した。中和抗体によるブロッキングアッセイで、この反応は少なくともToll likeレセプター2・4を介していることが判明した。以上より、我々が同定した黄色ブドウ球菌膜蛋白抗原は、腎臓内のメサンギウム細胞と直接的に反応し、メサンギウム細胞の増殖に影響を与えることが示唆された(投稿準備中)。(2)ヒト血清IgAのヒンジ部0-結合型糖鎖を解析する簡便なアッセイ系の開発IgA、IgMと特異的に結合するヒトFcα/μレセプター(hFcα/μR)をマウス培養細胞株Bw5147に強制発現させ、ヒト血清と反応させた。このトランスフェクタントは、血清中のIgAを結合させることが可能であることをフローサイトメトリーで確認した。IgAヒンジ部の0-結合型糖鎖と結合することが可能なレクチンの一種である蛍光標識したジャッカリンとIgAを結合したトランスフェクタントを反応させ、フローサイトメトリーで検出できることも確認した。今後、IgA腎症患者血清および尿中IgAの0-結合型糖鎖と健常者のIgAでの差異を検討し、臨床応用の可能性を検討する予定である。○ヒト血清IgAのヒンジ部O-結合型糖鎖を解析する新規アッセイ系を用いたIgA腎症患者の血清IgAの解析Fcα/μレセプター(Fcα/μR)はlgAおよびIgMのFc部位に結合するレセプターで、主にB細胞およびマクロファージに強く発現する。私は、ヒトFcα/μRをマウスT細胞白血病株BW5147に強制発現させた細胞を用いて血清などの液相中に存在するIgAを細胞表面上に捕捉し、それらのlgAにおけるO-結合型糖鎖をプローブとしてレクチンを用い、フローサイトメトリーで解析する新規のアッセイ系を開発した。レクチンは種類毎に、糖鎖を認識する部位が異なり、理論上はO-結合型糖鎖不全を有するIgA腎症患者の血清IgAに対して、Jacalinは結合が低下し、Helix aspersaは上昇すると考えられる。これら2つのレクチンを反応させる条件を決定し、化学的にO-結合型糖鎖を障害したIgAではJacalinの結合が低下し、Helix aspersaの結合が上昇することを確認した。また、Fcα/μR上にIgAとともに捕捉されるIgMが、本アッセイ系では有意な影響を及ぼさないことも、2カラーフローサイトメトリーにて併せて確認した。この系を用いて、IgA腎症患者と健常人から得た血清中のIgAのO結合型糖鎖を、Jacalinにて解析したところ、健常人に比べIgA腎症患者の血清IgAはJacalinとの反応性が低下していた。現在、Helix asperaによる解析および症例数を増加させて、O-結合型糖鎖不全と臨床的なパラメーターとの相関を解析中である。○患者血清中の多量体IgAのヒンジ部0結合型糖鎖を解析する系の開発と臨床応用に関する予傭実験これまで、Fcα/μレセプター(Fcα/μR)を強制発現した培養細胞(トランスフェクタント)により、患者血清中のIgAを捕捉し、それらのIgAにおける0-結合型糖鎖を蛍光標識されたレクチンを用い、フローサイトメトリーにて解析する新規の系を開発した。これまでの他の解析法ではIgA腎症患者の腎糸球体に優位に沈着する多量体IgAを選択的に解析することは不可能であった。

Fcα/μRの抗体結合ドメインは、多量体IgA、IgMの受容体であるpolymeric Immunoglobulinレセプター(poly-IgR)の同部位と相同性が高いため、多量体IgAを選択的に捕捉する可能性について検討した。(結果)ヒト血清由来の単量体IgAと初乳から精製された多量体IgAのトランスフェクタントとの結合活性を検討したところ、単量体lgAは同細胞と結合せず、多量体IgAのみと強く結合した。マウスFcα/μR(mFcα/μR)およびヒトFcα/μR(hFcα/μR)トランスフェクタント間では、mFcα/μRトランスフェクタントの方が結合活性が高かった。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、多量体IgAはトランスフェクタントの細胞表面に島状に集束して結合していた。安定性に乏しいjacalinに代え、Helix aspersaレクチンに変更したところ、良好な再現性が認められた。IgA腎症と診断された患者(33名)および健常者(20名)に対し、上記解析法で、血清中の多量体IgAのヒンジ部0-結合型糖鎖の解析を行ったところ、不全型糖鎖に結合するHelix aspersaレクチンの蛍光強度がIgA腎症患者で有意に高かった。(結論)我々の開発した方法は、血清中の多量体IgAにおける0結合型糖鎖などの性状を簡便に解析することが可能であると考えられる。