hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正常(赤-緑)の遺伝子アレーを持つ先天色覚異常における錐体視物質遺伝子の解析

正常遺伝子型の1型色覚6例のL遺伝子イントロンに変異はなく、5例のエキソン3に稀な多型が認められた。これが当該L遺伝子の非(低)発現に関連している可能性が考えられた。正常遺伝子型の2型色覚のうち-71Cを持っていた3例においてもM遺伝子イントロンに変異はなかった。しかし-71Cを持つM遺伝子プロモーターは、通常の-71Aを持つM遺伝子プロモーターの3040%の活性しかなく、-71Cが当該M遺伝子の非(低)発現に直接的に関与している可能性が考えられた。錐体視物質遺伝子はX染色体上に「赤-緑」と並んでいるのが正常であり,不等交差により「赤のみ」「赤-赤」「緑のみ」あるいは「緑-緑」となるのが先天色覚異常の原因であるとされてきた。しかし、われわれによる日本人先天色覚異常の解析では「赤-緑」と正常に並んでいる例が559例中63例(11%)も存在した。本研究の目的は,遺伝子の並びが正常であるにもかかわらず色覚異常となっている原因をさぐることであった。上記63例中,ミスセンス変異やフレームシフト変異で説明できるのはわずか6例であり,前者については錐体視物質再構成実験を行い,当該変異の意義づけを行った。残る57例中,殆どの例(49例)は緑遺伝子のプロモーターに-71A→Cの塩基置換があった。-71Cプロモーターを作製し,ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイで解析したところ,同プロモーターは-71Aプロモーターの40%の活性しかないことが判明した。-71Cによって当該緑遺伝子の発現が低下していることが推測された。-71Cは-70の塩基とCGの配列を構成するのでメチル化されている可能性があった。白血球ゲノムを解析し実際にメチル化されていることを確かめたが,網膜錐体ではどうなのか,メチル化が遺伝子発現に影響するのか,などの解析は今後である。ミスセンス変異も-71Cの塩基置換も持っていなかった残る8例については,赤/緑遺伝子(約15キロ塩基対)の全塩基配列を解析した。正常色覚者30例も平行して解析し,未報告の多型を複数見出し,NCBIのSNPデータベースに登録した。色覚異常例だけで見出された変異についてはin vitroスプライシング系で解析したが,異常は見つからなかった。また,正常遺伝子のイントロンを上記のレポーターアッセイで調べたが,エンハンサー活性は検出されなかった。従って,これら8例については未だに遺伝子変異が判明していない状況である。日本人色覚異常例をさらに解析し、累計629例中70例が正常遺伝子型(11%)であり、本研究の対象である「正常(赤-緑)の遺伝子アレーを持つ先天色覚異常」が10%以上の高頻度で存在することを再確認できた。すでに正常色覚日本人において、視物質遺伝子イントロン内に新規な多型を15か所に見出し、また、イントロンにもエキソンと同じように赤型と緑型とがあることを見出していた。今回は、これらの知見が他の人種に適用できるかどうかを検討した。その結果、新規多型15か所の内14か所では、欧米人やアフリカンにおいても多型のあることが分かった。イントロンの赤型と緑型に関しては、15か所中14か所については欧米人でも確認できた。しかし、アフリカンでは、7か所で確認できたのみであり、アフリカンの視物質遺伝子は多型性に富むことが判明した。正常遺伝子型の1型色覚6例中5例に、あるエキソン3の多型が集中していることを見出した。この多型は、これまで報告された2000以上の視物質遺伝子中、この5例を含んでわずか24例でしか見出されていないという低頻度である。この多型が当該L遺伝子の非発現(あるいは低発現)に関連している可能性を現在検討中である。正常遺伝子型の2型色覚のうち、-71Cを持っていた10例について、緑遺伝子プロモーターを-888までシーケンシングしたが、-71C以外の変異は見いだせなかった。後続遺伝子プロモーターの-21はGではなくAであることを示した。また、イントロンの変異の意義を明らかにするためのスプライシングの解析系を確立した。
生体回路反応から着想を得た汎用ポリマーブラシコーティング技術の開発

高分子合成における重合系の安定化は、精密なポリマー構造を形成するための重要な要素のひとつである。精密ラジカル重合においては、系内の溶存酸素が活性種や触媒を失活させる原因となり、ポリマーの精密性を著しく低下させる。これまで、精密重合によるポリマーブラシの合成は、十分に制御された閉鎖系環境が必要不可欠であることから、実用的な表面処理(量産、大面積)への適用は困難とされてきた。本研究では、生体の代謝経路から着想を得た再生回路を精密ラジカル重合法に組み入れることで、閉鎖系環境を必要とせず、大気中で精密かつ高重合度のポリマーブラシを高効率、大面積で合成できるロバストネスな反応手法を開発する。
Bi系酸化物超伝導体高品質薄膜を用いた超伝導三端子素子の電界効果に関する研究

電界効果型の超伝導三端子素子は,ゲートに電圧を印加して超伝導体チャネル中のキャリアを制御しようとするものであるが,酸化物超伝導体を用いた研究においてはまだ大きな成果は得られていない。この原因の一つとして,大きな電界効果を得るための単位格子数個程度の厚さの良質な超伝導薄膜を作製するのが難しいという,製膜技術の問題がある。Bi系酸化物超伝導体Bi_2Sr_2Ca_<n-1>Cu_nO_xは,nの値により材料の特性が異なり,電界効果を系統的に調べるのに適しているが,その反面,理論的考察可能なデータを得るような良質な膜を作製しにくい材料である。申請者らのグループではこれまでに,薄膜としては世界最高の臨界温度を持つ薄膜をas-grownで得る方法を開発した。本研究ではこの高品質薄膜作製技術により製膜したBi系超伝導体の物性のゲート電圧依存性を調べ,Bi系超伝導体およびBi系超伝導体/絶縁体界面の物性の理論的,定量的検討を行うことを目的とした。本研究で得られた知見について以下に述べる。1.積層膜の作製および結晶性の評価Bi系超伝導体2201相(n=1)(BSCO)薄膜上に絶縁体としてSrTiO_3(STO)薄膜を積層させた。X線回折により結晶性を調べたところ,STO薄膜はBSCO薄膜上にエピタキシャル成長していることがわかった。680°Cにおいて成長させたSTO薄膜は表面平滑性,結晶性ともに良好であることがわかった。2.電界効果の測定および考察積層膜上にAgのゲート電極を設けたAg-STO-BSCO構造の試料において,ゲート電圧とBSCO薄膜の抵抗との関係を調べた。その結果,BSCO薄膜の抵抗-温度特性はゲート電圧により金属的なものから半導体的なものまで変化し,その変化の方向はキャリアをホールと考えた場合のものと一致した。これにより,BSCOチャネルのキャリア密度がゲート電圧により変化することが示唆された。
触媒学会参照触媒酸化チタンを利用する光触媒の標準化

本企画調査では、1)光触媒利用に適した酸化チタンの参照触媒としての確保(岡本、山下)、2)参照触媒酸化チタンの物性評価(岡本、丹羽、寺岡、野坂、松橋、片田、岩本、久保田、宍戸、西口、山方)、3)参照触媒酸化チタンの光触媒性能の評価(山下、三浦、大谷、亀山、田中、横野、町田、村松、古南、原、吉田)、4)得られたデータの総括と一般研究者への公表を行なった(全員)。平成16年9月、東北大学において「参照触媒を利用した光触媒反応:光触媒の調製、反応、評価の標準化を目指して」についての討論会を開催し、それぞれ役割分担項目の調査研究に関する発表を行ない、酸化チタン光触媒の現状と問題点を明らかにした。発表件数は17件であった。本調査研究から次の結論を得た。1)13種類の光触媒利用に適した酸化チタンを参照触媒として確保し、一定の物性を有する酸化チタンを安定供給し、光触媒の標準化に利用する体制を確立した。2)参照触媒酸化チタンの物性評価の問題点を複数機関の研究者により検討した。検討した測定は、組成分析、BET表面積、細孔分布、XRD、小角散乱、XAFS、XPS、UV-Vis、IR、ラマン、TEM、SEM、TPD、DSC、酸性質、塩基性質、表面水酸基量、欠陥量、時間分解吸収、電気伝導度、ESR、NMR、蛍光-リン光発光、ルミノール発光、ゼータ電位であった。文献にある手法は統一されていないため、同一の試料について種々の物性を測定する必要性が明かとなった。3)参照触媒酸化チタンの光触媒性能を正確に評価する必要があるが、文献中では、反応条件、触媒の処理等様々であり。それらを相互に比較することは不可能であり、光触媒の標準化のさまたげになっていることが明かとなった。参照触媒酸化チタンにこれらの反応性のデータを添付することで、意義のある標準資料の提供が可能になる事が提案された。4)今後、参照触媒酸化チタンの物性と光触媒反応特性についてデータを得、標準触媒としての参照触媒酸化チタンの特性を的確に評価し、新しく開発された光触媒の比較の指標として用いることができる。また、その成果を広く研究者に公表することで、光触媒調製・光触媒反応・光触媒評価の標準マニュアルとしての利用が期待できる。
溶質原子雰囲気ひきずり運動に基づくAlおよびMg系固溶体合金の結晶配向制御

典型的な固溶体硬化合金であるアルミニウム合金ならびにマグネシウム合金について、溶質原子雰囲気ひきずり運動が支配的になる条件で、変形挙動と集合組織形成の特徴を調べた。対象素材は、アルミニウム合金がAl-3mass%Mg、5mass%Mg、3mass%Mg-0.2mass%Scの三種、マグネシウム合金がAZ31およびAZ61合金の二種である。得られた結果の主たるものは以下のごとくである。アルミニウム合金について(1)Al-3mass%Mgおよび、5mass%Mgいずれにおいても、単軸圧縮変形下で、低歪み域では{011}繊維集合組織が形成されるが、歪み量の増大と共に、{011}+{111}二重繊維集合組織に変化し、最終的に{001}繊維集合組織となるや同一変形条件では、溶質濃度の高い5mass%Mg合金の方が{001}集合組織が早く発達する。(2){001}集合組織の形成は、{001}方位粒の高い成長速度に起因するとの仮説を実験的に検討するため、Sc添加材を熱処理し、安定な析出物を形成させた上で高温圧縮変形して集合組織の形成挙動を調べたところ、同一変形条件での二元系合金と比べて(001)集合組織の形成が著しく抑制され、仮説が実験的に証明された。マグネシウム合金について(1)本研究の条件内では例外なく動的再結晶が生じた。その際弱いながらも繊維集合組織が形成ざれた。集合組織の生成分は温度と歪み速度によって連続的に変化した。高温・低歪み速度側になるほど圧縮面が底面に近づく方向に主成分が移動した。(2)高温・低歪み速度条件で形成される集合組織は、底面すべり系と第二錐面すべりのCRSSがほぼ同一になった場合の安定方位と概ね一致した。Al-3mass%MgならびにAA5083合金を対象として、圧縮変形における変形条件と集合組織形成の関係を種々歪み量を変えて調査した。温度は室温、673K、723Kならびに773K、歪み速度は1.0×10^<-5>1.0×10^<-3>の範囲である。集合組織形成のメカニズムを吟味するため、EBSD測定による、集合組織の成分と結晶粒径や結晶粒形状の関係ならびに単結晶による結晶回転をも調べた。得られた結果は以下のごとくである。(1)673K以上の温度域では、応力-歪み曲線は例外なく極大値を示した後低下する、高温降伏を呈した。これらの温度域では、低歪みでは集合組織の主成分は(011)であった。しかし、歪み量が1.0付近から、極密度の集積が(011)と(001)の二カ所に見出されるようになり、歪み量が1.2を越えると(001)単一成分となった。(2)EBSD測定の結果、(001)方位の結晶粒は、変形の初期から徐々に結晶粒径が増大することが分かった。(3)単結晶における結晶回転は初方位が標準ステレオ三角形の中心付近の場合には、初期には主すべり系による単一すべりであるが、初方位が(001)に近い場合には、歪み量を増大させてもほとんど結晶回転は生じない。(4)これらの実験事実から、高温降伏が生ずる変形条件では、溶質原子雰囲気引きずり運動により格子回転が抑制されると同時に、(001)付近の方位は回復が容易であるため、変形の初期には単軸圧縮の安定方位である(011)に集積のある集合組織が形成されるが、歪みエネルギーが蓄積されると歪み誘起粒界移動によって(001)方位が集合組織の主成分になるのではないかと推論した。

アルミニウム合金としてAl-3mass%Mg、Al-5mass%MgおよびAl-3mass%Mg-0.2mass%Scの三種、マグネシウム合金としてAZ31およびAZ61合金の二種を対象として、高温圧縮変形における変形条件と集合組織ならびに組織形成の関係を種々歪み量を変えて調査した。得られた結果の主たるものは以下のごとくである。アルミニウム合金について(1)Sc添加材を熱処理し、安定な析出物を形成させた上で高温圧縮変形して集合組織の形成挙動を調べたところ、同一変形条件での二元系合金と比べて(001)集合組織の形成が著しく抑制された。このことから、高温加工中に生ずる動的再結晶下での(001)繊維集合組織の形成機構は、結晶方位に依存した蓄積エネルギー差に由来する結晶粒界移動であると結論した。(2)マグネシウム添加量を増大させると、(001)繊維集合組織の形成が促進される。このことも溶質原子雰囲気の効果が増大して、(001)方位以外の結晶粒の回復が抑制され、結晶粒界移動の駆動力が大きくなったと考えると理解できる。マグネシウム合金について(1)本研究の条件内では例外なく動的再結晶が生じた。その際弱いながらも繊維集合組織が形成された。集合組織の主成分は温度と歪み速度によって連続的に変化した。高温・低歪み速度側になるほど圧縮面が底面に近づく方向に主成分が移動した。このことは、温度の上昇と共に錐面すべりのCRSSが低下すると考えると理解できる。(2)AZ61合金では、溶質原子雰囲気引きずり運動の効果が顕著であるが、集合組織はAZ31と大きな差異はない。
部分空間同定法を用いた高選択性匂いセンサの開発

本研究は,ガスセンサ出力をProny法に基づいたモデリングとパラメータ推定によって,入力である被験ガスの情報をセンサ出力信号の解析によって最大限に引き出し,センサ特性の制御,改善へと応用することを目指した.Prony法におけるパラメータ推定手順を部分空間同定法の枠組みにおいて解釈し,新たに部分空間法に基づいた手法を導出した.また,センサ応答モデルの同定によって得られるモデルパラメータを特徴点としたガス種の判別を行い,その有効性を確認した.本研究は,ガスセンサ出力をProny法に基づいたモデリングとパラメータ推定によって,入力である被験ガスの情報をセンサ出力信号の解析によって最大限に引き出し,センサ特性の制御,改善へと応用することを目指した.Prony法におけるパラメータ推定手順を部分空間同定法の枠組みにおいて解釈し,新たに部分空間法に基づいた手法を導出した.また,センサ応答モデルの同定によって得られるモデルパラメータを特徴点としたガス種の判別を行い,その有効性を確認した.本研究では,従来,材料工学的手法が主軸であった匂いセンサ開発において,センサの出力の解析という信号処理的側面からのアプローチを行い,従来,実現が困難な高い選択性を持ち,かつ所望の選択特性を持つようにその特性を制御可能なセンサの機能設計における新たなアプローチの実現を目指す. Prony法によるセンサ出力の過渡応答波形のモデル近似を基本に,パラメータ推定に部分空間同定法を導入し,出力信号の解析を行うことでセンサの出力から入力である被験ガスの情報を最大限に引き出すものであり,部分空間同定法を応用したセンサ特性の制御を可能とするアルゴリズムの開発を目指すものである.匂いセンサ出力のモデル近似とそのパラメータ推定において,選択性制御に必要なセンサ応答の時定数推定アルゴリズムを検討した.具体的には, Prony法と部分空間同定法の関連を検討し, Prony法における指数関数和によるセンサ応答の近似モデルを状態空間表現し,次数推定手順が部分空間同定法におけるシステム行列の推定と同じ枠組みで解釈できることを示した.また,基本的にオフラインでの処理を前提とした同手法の逐次化についても検討を行った.本研究は,従来,材料工学的な手法が主軸である匂いセンサにおいて,センサの出力の解析という信号処理的な視点に基づき,これまで実現が困難な高い選択性を持ち,かつ所望の選択特性を持つようにその特性を制御可能な匂いセンサの機能設計における新たなアプローチの実現を目指すものである.入力信号である被験ガスの情報を最大限に引き出すことを目的として,センサ応答波形から特徴点を抽出するアルゴリズムについて,センサ出力の過渡応答波形を指数関数和で近似し,部分空間に基づくProny法によるモデルパラメータ推定に基づく特徴点抽出について検討した.選択性制御に必要なセンサ応答からの時定数推定アルゴリズムに関して,Prony法よるパラメータ推定手順が部分空間同定法における拡大可観測性行列の推定手順と同じ枠組みのもとで解釈できるが,混合ガスに対するセンサ応答に対応する,同定対象のシステム次数を2次以上とした場合のセンサ出力(ステップ応答)に部分空間法を適用すると,数値シミュレーションで検討した結果,雑音が白色であるにもかかわらず,拡大可観測性行列が推定できないことがわかった,そこで,データ行列となるHankel行列の補助時数について検討したところ,例えば,4次程度のシステムに対して補助次数を数百とするような,通常,部分空間法を用いる場合と比較して非常に大きな値をとることで同定精度が向上することがわかり,今後,理論的な検証を更に進めていく必要がある.匂い認識を実現するシステムは,センサアレイと種々の多変量解析によるものが多いが,多変量解析を適用するパターンベクトルはセンサアレイにおける各センサ出力の振幅情報のみを用いたものが多く,その次元はセンサ数に依存する.これに対して,センサ応答モデルからシステムパラメータを推定することで,過渡特性を含む情報をパターンベクトルに包含でき,また,センサのキャリブレーションといった保守性や多変量解析を適用する際の多重共線性の問題から無制限に増加させることができないセンサ数に対して,センサ数以上に次元を拡大することも可能となり,その識別精度の向上が期待できる.本研究では,高選択性匂いセンサの実現に向けて,センサ応答のモデリングと同定によるセンサ出力からの特徴点抽出を行う,パラメータ推定に基づく匂い識別の有効性を検討した.具体的には,半導体式ガスセンサをセンサ素子に用いたセンサアレイを構成し,Prony法と部分空間同定法をベースとしたセンサ応答の指数関数和によるモデリングとそのパラメータ推定による特徴点抽出を検討した.閉チャンバー内に設置したガスセンサアレイへ一定濃度の被検ガスを導入し得られるステップ応答を用いて検討を行った.センサアレイを構成する個々のガスセンサにおいて,その振幅情報に基づいて多変量解析に供するパターンベクトルを構成した場合,正規化してもノイズや被検ガス濃度の変化に対する影響を受けやすい.これに対して,本実験における時不変系となるモデルパラメータの推定値を要素とするパターンベクトルを用いた場合は,主成分分析を用いた比較から良好な判別結果を与えることがわかった.今後は,リアルタイムな匂い識別のために,指数関数和モデルとアレイ化したセンサ応答の同定に関して,逐次部分空間同定法の適用等を検討する必要がある.
栄養欠乏応答性のアブラナ科植物種間比較解析

メタボロミクス解析を基盤に、アブラナ科植物に保存されているもしくは種特異的な栄養欠乏代謝応答の解明を目指す。アブラナ科モデル植物及び作物種を材料にして、1)植物の主要栄養元素である窒素、リン、硫黄の欠乏実験を行い、2)経時的代謝物変動の捕捉、栄養欠乏応答マーカー代謝物/遺伝子の探索、3)相関解析による種間比較を行い、栄養欠乏代謝応答に見られる頑健性/特異性の評価を行う。
核内輸送蛋白質インポーチンに着眼した成人T細胞白血病の発症機構の解明と治療戦略

転写因子NF-κBやAP-1は細胞増殖や生存に重要な遺伝子の発現を制御し、ATLの治療標的分子である。本研究の目的は、HTLV-1感染により発症する成人T細胞白血病(ATL)の治療戦略の再構築である。転写因子の核局在信号に結合して、核内に輸送する役割を担うインポーチン(IPO)の二つのサブユニットαとβのうち、βファミリーの一つIPOβ1の発現が感染により誘導されること、IPOβ1の遺伝子ノックダウン(K/D)やIPOβ1阻害剤Importazole(IPZ)やIPOα/β1阻害剤であり、感染者が合併感染する糞線虫の駆虫薬Ivermectin(IVM)が細胞増殖や生存を抑制することを昨年度は見出した。両阻害剤の特異性について検討すると、非感染T細胞株や健常人PBMCに比べて、感染T細胞株のIC50は有意に低値であった。IPZやIVMはアポトーシスを誘導したが、広域スペクトルのカスパーゼ(CASP)阻害剤により細胞死が部分的に抑制されたことからもCASP依存性細胞死の誘導が確認された。昨年度はSCIDマウスを用いたIVMの抗腫瘍効果を検討したが、サロゲートマーカーである血清可溶型IL-2RやCD30を測定したところ、治療群で低下していた。本年度は、ATLと同様に難治性で、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)感染により発症する原発性体腔液性リンパ腫(PEL)の治療標的としてのIPOβ1の可能性についても検討した。IPOβ1のK/DやIPZ、IVM処理はKSHV感染PEL細胞株にG1期での細胞周期停止やCASP依存性アポトーシスを誘導し、細胞株移植後SCIDマウスに発生する腹水の貯留をIVMは有意に抑制した。IPOβ1はATLのみならず、PELの治療標的でもあり、IVMの抗腫瘍効果の発見は、既存薬を別の疾患薬として利用する「ドラッグ・リポジショニング」の成果とも言える。これまでの解析の結果、(1)HTLV-1感染T細胞株に選択的にIPOβ1が高発現しており、HTLV-1感染によってウイルストランスフォーミング蛋白質Taxの発現と並行してPBMCに発現誘導されること、(2)IPOβ1をK/Dすることで感染T細胞株の増殖が抑制され、細胞周期のG1期からS期の移行に重要なc-myc、cyclin D1/D2の発現が抑制されること、(3)試験管内実験及び動物実験において、IPOβ1阻害剤(IPZやIVM)がNF-κBやAP-1の核内移行やDNA結合を阻害し、両転写因子制御下の細胞周期関連蛋白質(c-Myc、cyclin D1/D2/E、CDK2/4/6)やアポトーシス阻害蛋白質(survivin、c-IAP1/2、XIAP、Bcl-xL)の発現を抑制し、アポトーシス誘導蛋白質(Bak)の発現を増強させ、pRbの脱リン酸化を誘導すること、その結果、G1期での細胞周期停止とCASP依存性アポトーシスが誘導され、抗ATL効果を発揮することを証明した。以上の結果、IPOβ1を標的としたATL治療の可能性が示された。IVMの抗腫瘍効果の発見は、今後、感染者のウイルス量低減効果といった臨床試験を開始する理論的根拠ともなりうる。現在、これらの成果をまとめ、国際的学術誌に論文を投稿中である。さらに、KSHV感染PEL細胞株においても、IPOβ1のK/Dは細胞増殖を抑制し、IPZやIVMは細胞増殖や生存を特異的に抑制し、G1期での細胞周期の停止とCASP依存性アポトーシスを誘導した。また、PELモデルマウスにおいてもIVMの腹腔内投与は治療効果を認めた。すなわち、IPOを標的とした治療は、他のウイルス関連悪性腫瘍でも有効である可能性が示唆され、対象疾患はさらに増加する可能性も期待される。ATLにおけるIPOβ1阻害剤のNF-κBやAP-1経路に関しての解析は、ほぼ終了したが、他の転写因子であるSTATの経路に関しても解析を実施する。また、広域CASP阻害剤の作用が、限定的だったことから、IPZやIVMにより誘導される細胞死は、CASP非依存性の経路も解析する必要があり、ネクロプトーシスやフェロプトーシスの誘導についても検討を開始している。またこれらの細胞死と関連するROSの関与についても検討する予定である。KSHV感染PEL細胞株に対するIPZやIVMの作用機序に関しては、上記転写因子の核内移行、DNA結合に対する影響や下流の細胞遺伝子発現に及ぼす影響、さらにウイルス遺伝子の発現に及ぼす影響を解析する。また、KSHV感染とIPOβ1発現の関係についても解析し、これらの成果をまとめて、来年度は学会発表を予定しており、論文投稿を目指す。さらに、その他のウイルス関連悪性リンパ腫(バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫)についても治療標的としてのIPOβ1の可能性について検討していく。HTLV-1、KSHV、EBVのトランスフォーミング遺伝子によるIPOβ1発現誘導を検討し、発現制御機構を解明する。またIPOβ1を過剰発現、もしくは発現を抑制することで変化する遺伝子を網羅的に解析する。IPOβ1以外のIPOβファミリーやαファミリー遺伝子に関しても感染による発現変化の検討を進める。さらに、臨床検体を用いて、疾患発症危険群予測因子や予後因子としてのIPOの可能性について検討する。そして、総合的にウイルス関連悪性腫瘍におけるIPOの役割を検証する。

HTLV-1感染により引き起こされる成人T細胞白血病(ATL)の発症・進展において核内転写因子が重要である。本研究では核内輸送蛋白質インポーチン(IPO)に着目し、ATL発症・進展におけるIPOの役割の解明と治療戦略の可能性を探るべく検討を行っている。IPO蛋白質の一つ、IPOβ1の発現を検討すると、健常人末梢血単核球(PBMC)と比べHTLV-1感染T細胞株で高発現していた。また、PBMCをPHAで刺激すると発現が増強した。PBMCにHTLV-1を感染させたところ、IPOβ1の発現が誘導された。感染T細胞株でIPOβ1をノックダウンすると、細胞増殖能が抑制され、cyclin D1/D2とc-myc遺伝子の発現が低下した。IPOβ阻害剤importazole及びIPOα/β阻害剤ivermectinを感染T細胞株に作用させると細胞増殖や生存率が抑制され、G1期での細胞周期停止とカスパーゼ3/8/9依存性のアポトーシスが誘導された。一方、PBMCや非感染T細胞株に対する影響は軽微だった。Importazoleやivermectinは、細胞周期関連蛋白質(c-Myc、cyclin D1/D2/E、CDK2/4/6)の発現を低下させ、Rbを脱リン酸化した。また、アポトーシス関連蛋白質であるsurvivin、c-IAP1/2、XIAP、Bcl-xLの発現低下とBakの発現上昇をもたらした。細胞周期やアポトーシス関連蛋白質の発現を制御する転写因子NF-κBとAP-1の核内移行に及ぼす影響を検討したところ、NF-κB(RelA)とAP-1(JunB/JunD)の核内移行が阻害され、NF-κBとAP-1のDNA結合が抑制された。さらに、ivermectinの腹腔内投与はHTLV-1感染T細胞株を移植したATLモデルマウスにおいて腫瘍増殖抑制効果を示し、腫瘍にアポトーシスが誘導された。初年度の解析の結果、(1)HTLV-1感染T細胞株に特異的にIPOβ1が高発現しており、HTLV-1感染によって健常人PBMCに発現が誘導されること、(2)IPOβ1をノックダウンすることで、HTLV-1感染T細胞株の増殖が抑制されること、(3)試験管内実験及び動物実験においてIPO阻害剤(importazoleやivermectin)が転写因子NF-κBやAP-1の核内移行を阻害し、細胞周期やアポトーシス関連蛋白質の発現を変化させ、抗ATL効果を示すことを確認した。以上の結果から、IPOβ1は細胞増殖や細胞生存に重要な分子であり、HTLV-1感染T細胞に特異的に発現していることから、IPOを標的としたATL治療の可能性が期待される。関連学会においては、既に研究成果を発表し、これまでの研究成果をまとめて、現在論文を執筆中である。このように、本研究は順調に進展していると判断される。転写因子NF-κBやAP-1は細胞増殖や生存に重要な遺伝子の発現を制御し、ATLの治療標的分子である。本研究の目的は、HTLV-1感染により発症する成人T細胞白血病(ATL)の治療戦略の再構築である。
気体分子センサータンパク質の構造機能解析とそのバイオ素子への応用

本研究では、気体分子センサータンパク質のなかでも特に、一酸化炭素センサータンパク質CooA、および酸素センサータンパク質HemATを研究対象とし、これらの気体分子センサータンパク質の構造と機能の解明、および、それらを利用したバイオ素子開発を目的として研究を行った。HemATによる酸素センシングにおいては、5配位構造の還元型ヘムの空配位座に酸素分子が結合することにより、酸素がセンシングされることを明らかにした。ヘムに配位した酸素分子には、遠位側ヘムポケットに存在するアミノ酸残基が水素結合していると考えられる。部位特異的変異導入法により調製した各種変異型HemATの性質を検討した結果、Tyr70およびThr95の二つのアミノ酸残基がヘム鉄に配位した酸素との間で水素結合を形成しているものと考えられる。Tyr70あるいはThr95のいずれかに変異を導入した変異体では、野生型と比べて酸素親和性、自動酸化反応速度などに違いが観測された。CooAによるCOセンシングにおいては、配位飽和な6配位構造を有している還元型ヘムの軸配位子となっているPro2とCOとの間で軸配位子交換反応が進行し、その結果誘起される分子構造変化が、CooAの機能発現のキーステップとなっていることが分かった。このように、同じヘムを活性中心としているにもかかわらず、HemATとCooAでは気体分子センシングの分子機構が大きく異なっていることが分かった。CooA、HemATは、いずれも分子中にプロトヘムを含むヘムタンパク質であり、ヘムが気体分子センシングの際の活性中心として機能している。しかしながら、両者の気体分子センシング機構は、大きく異なっていることが明かとなった。すなわち、CooAによるCOセンシングにおいては、配位飽和な6配位構造を有している還元型ヘムの軸配位子となっているPro2とCOとの間で軸配位子交換反応が進行し、その結果誘起される分子構造変化が、CooAの機能発現のキーステップとなっていることが分かった。それに対し、HemATによる酸素センシングにおいては、5配位構造の還元型ヘムの空配位座に酸素分子が結合することにより、酸素がセンシングされる。ヘムに配位した酸素分子には、遠位側ヘムポケットに存在するアミノ酸残基が水素結合していると考えられるが、その際に従来の酸素化型ヘムタンパク質の場合とは異なり、遠位側アミノ酸残基は、ヘム鉄に近い側の酸素原子との間で水素結合を形成しているものと考えられる。現時点では、この特異な水素結合様式が、HemATの機能発現に対し、どのような寄与をしているかは不明であるが、配位酸素との間で形成される水素結合により、遠位側ヘムポケットの構造変化が誘起されることが、HemATの機能発現の引き金となっているものと考えられる。
易卒中高血圧自然発症ラットの大腿骨頭壊死 とくに脂肪細胞の関与について

特発性大腿骨頭壊死症は近年疫学や臨床的研究が著しく進歩したため、大腿骨頭壊死症はSteroid Hormone治療で一時期に大量投与(12.5mg以上)で増加し、高脂血症との因果関係、更には細動脈や細静脈の内皮細胞の関与も明らかになってきている。近年腎臓などの諸臓器の生体移植や膠原病などでSteroid Hormone増加に相まって、大腿骨頭壊死症の増加が危惧され、社会問題となりうるため注目されている。研究の課題は特発性大腿骨頭壊死症における阻血機序の病態解析で、Steroid Hormone投与によって生じる脂肪細胞の増生、膨化と末梢循環特に血管内皮の関与を解明することを目標とした。上記病態解析のため、約100匹のSHRSP/Izmを17週齢で犠牲死とし、大腿骨頭を採取、光学顕微鏡用に病理組織標本を作製、また採血、多臓器採取も行った。壊死の有無を検鏡し、免疫組織学的に抗ラットの抗体を用いて、レプチン、アジポネクチン、PAI-1、TNFαの骨髄脂肪細胞内、および周囲の定性的反応性が確認された、Steroid Hormone投与の有無、大腿骨頭壊死の有無で各種サイトカインの定量的反応性を評価した。サイトカインの分子生物学的検討には大腿骨頭の光学顕微鏡組織標本から、大腿骨幹部の脂肪細胞から抽出を試みたが、技術的に困難であった。そこで脂肪細胞の動態を検討するためスタチン系薬剤であるプラバスタチンとヘパリン様物質のペントサンを投与する2実験を行った。両者ともに、壊死頻度は減少し、脂肪細胞の縮小・減少がみられ、脂肪細胞の大腿骨頭壊死症に関与の証明や治療薬の探索の観点で収穫が得られた。我々はSHRSPの大腿骨頭の観察を1998年より行いくSHRSPでは1519週齢でより高頻度に早急期の壊死が発生することを発見し、主としてステロイドホルモンや高脂血症の関与の研究を行ってきた。特発性大腿骨頭壊死症における阻血機序の病態解析で今回の大目標はステロイドホルモン投与によって生じる脂肪細胞が増生、膨化と微小循環特に血管内皮の関与の関係を解明することである。上記病態解析のため、まず基礎実験として牡40匹のSHRSP/Izmを17週齢にて屠殺し、大腿骨頭を採取、光学顕微鏡用に病理組織標本作製しまた採血、他臓器を採取した。壊死の有無を検鏡し、抗ラットのレプチン、アジポネクチン、PAI-1、TNFα抗体を用いて、免疫組織学的に各種サイトカインの局在を観察した。その結果レプチン、アジポネクチン、PAI-1、TNFα抗体の骨髄脂肪細胞内及び周囲に定性的反応性は確かめられた。ステロイドホルモンの投与の有無、大腿骨頭の壊死の有無での各種サイトカインの定量的反応性を評価するための所見の取り方集計方法を現在検討中である。また骨髄内脂肪細胞の各種サイトカインの分子生物学的実験を行うため骨幹部より骨髄脂肪組織を採取し、RNAlater (DNA, INA保存液)中に凍結保存をおこなっている。収穫率が悪く、採取法の改良を行いつつある。大腿骨頭の光学顕微鏡用組織標本からサイトカインの分子生物学的研究が可能かどうかも検討中である。ステロイドホルモン非投与に比してステロイドホルモン投与で、脂肪細胞が増大し、各種サイトカインも免疫組織学的に範囲や染色顆粒が増大しており、現在おこなっている実験計画は発展拡大させることで研究可能と思われる。

特発性大腿骨頭壊死症は近年疫学、臨床的研究が急速に進歩したため、ステロイドホルモン治療で一時期に大量投与(12.5mg以上)で増加し、高脂血症との因果関係、更には細動脈や細静脈の内皮細胞の関与も明らかになってきている。近年腎臓など諸臓器の生体移植や膠原病などのステロイドホルモン治療の増加に相まって大腿骨頭壊死症の増加が危惧され、社会問題と成りうるため注目されている。研究課題は特発性大腿骨頭壊死症における阻血機序の病態解析で今回の大目標はステロイドホルモン投与によって生じる脂肪細胞が増生、膨化と微小循環特に血管内皮の関与の関係を解明することである。上記病態解析のため、約100匹の牡SHRSP/Izmを17週齢にて屠殺し、大腿骨頭を採取、光学顕微鏡用に病理組織標本作製しまた採血、他臓器を採取した。壊死の有無を検鏡し、抗ラットのレプチン、アジポネクチン、PAI-1、TNFα抗体を用いて、免疫組織学的に各種サイトカインの局在を観察し、レプチン、アジポネクチン、PAI-1、TNFα抗体の骨髄脂肪細胞内及び周囲に定性的反応性は確かめられた。ステロイドホルモンの投与の有無、大腿骨頭の壊死の有無での各種サイトカインの定量的反応性を評価検討中である。大腿骨頭の光学顕微鏡用組織標本からサイトカインの分子生物学的研究が可能かどうかも検討中である。骨髄内脂肪細胞の各種サイトカインの分子生物学的実験を行うため骨幹部より骨髄脂肪組織を採取し、RNAlater(DNA、RNA保存液)中に凍結保存をおこなっている。17週齢のラットの大腿骨骨髄の量は大変少なく、また骨梁が多くmRNAやDNA採取に難渋している。
グループホームに住む高齢知的障害者の生活実態及び支援に関する研究

3年間を通して愛知、群馬、福島各県の入所更生・授産施設、グループホーム及び通勤寮などで生活する40歳以上の中高齢知的障害者を対象に、加齢に伴う体力及び適応行動面の能力変化、生活実態及びそれらに対応するための支援体制などについて、実態調査を行った。平成9年度は、A.機能的体力面に関する調査(報告書冊子「第3章」)及びB.適応行動面に関する調査(同「第4章・第1,2節」)、C.処遇・配慮状況に関する調査(同「第4章・第3節」)に着手すると共に、D.アルツハイマー病により急激退行を示したダウン症者の事例検討(同「第2章・第2節」)を行った。平成10年度は上記A、Bの項目に関する追加調査を行うと共に、E.知的障害者の加齢問題及びQOL(生活の質)に関する文献研究も並行して進めた(同「第2章・第3節」、「第4章・第1節」、「第5章・第1節」)。最終年度にあたる本年度は、上記AEの整理検討を行うと共に、F.主観的QOLに関する予備調査を実施し、次なる課題へとつなげた。Aの結果に関しては、学術誌「老年社会科学第22巻第1号」に掲載された。Bに関しても再整理した上で投稿準備中である。主な結果概要は以下の通りである。(1)機能的体力面に関しては調整力及び筋持久力の側面で50歳以降の低下が見られ、対象者の大半が体力的に60歳代の健常高齢者以下のレベルであった。(2)適応行動面では自立機能、身体機能の諸側面に50歳以降の退行が認められ、行動異常面の発現に関しては加齢の影響以上に障害程度や性差、個人差などの影響が大きい。(3)処遇・配慮面に関しては、健康面に関するものが最も多い一方で、人員面に関するものが少なく、施設形態別の比較では、余暇外出と日常生活面でグループホームが入所施設に比べ、外的援助の導入を積極的に行っていた。平成9年度は、グループホーム・通勤寮等で地域生活を営む40歳以上の高齢知的障害者及び入所施設に居住する同対象者の加齢に伴う状態像の把握を目的に体力面・適応行動面に関する調査を実施した。体力面に関する調査に関しては、課題として高齢者向け検査である「AAHPERD式体力テスト」の5課題(長座体前屈・バランス歩行・缶置き換え作業・腕屈伸作業・804m急歩)と他の4課題(握力・背筋力・開眼片足立ち・反応時間)及び体位の測定を行った。結果として、高齢知的障害者内においては、年齢間による差よりも障害程度、性別による差が大きいこと、健常者との比較に関しては、各課題で60歳以上の高齢健常者の基準値を下回るものが多く、大半の者が40歳50歳段階で体力的に顕著な老化が進行している可能性が示唆された。本結果は平成10年7月の「日本老年社会科学会第40回大会」にて発表予定であり、追加データを加え研究誌への投稿を計画している。適応行動面につては、適応行動尺度成人版(ABS)及び自主制作の知的障害者の高齢化に関する調査票を用いた。結果は現在整理中で、平成10年9月の「日本特殊教育学会第36回大会」に発表予定である。また研究誌への投稿も計画している。

平行して実施したアルツハイマー病による急激な退行を示したダウン症者に関する事例研究に関しては、自立機能、身体機能面の低下が健康維持、介護面での困難化を招いていること、一方、社会性は比較的維持され、自閉性の高まりを除き、他の問題行動は認められないこと、環境変化によるストレスが状態像の悪化と関連する可能性があること等が示唆された。本結果は平成10年3月の「日本発達心理学会第9回大会」にて発表予定である。なお次年度以降は知的障害者自身へのヒアリング調査の実施を計画している。平成10年度は前年度からの継続として、グループホーム・通勤寮等で地域生活を営む40歳以上の高齢知的障害者及び入所施設に居住する同対象者の加齢に伴う状態像変化の把握を目的に、日常生活と関連の深い機能的体力及び適応行動面に関する基礎調査を実施した。機能的体力に関しては1998年7月に「日本老年社会科学会第40回大会」にて中間報告を行った後、追加データを加え内容整理したものを「中高齢知的障害者の機能的体力について-AAHPERD式機能的体力テスト、筋力、単純反応時間及び開眼片足立ちによる検討-」という題目で研究誌「老年社会科学」に投稿し現在審査中である。主な結論としては、(1)柔軟性以外の全ての項目で障害程度間の差が認められる、(2)PerformanceLevelは劣るものの、性差については健常者と同傾向である、(3)50歳以降には筋持久力、調整力の側面が特に低下し、元々ベースラインの低い知的障害者の場合、日常生活に支障をきたす者が現れる可能性が示唆される等である。適応行動に関する調査は、1998年9月に「日本特殊教育学会第36回大会」にて中間報告を行い、その後の追加調査によるデータも加え、現在資料を整理中で、研究誌に投稿予定である。中間報告における主な結論は、(1)40歳代の29.4%が何らかの疾病の為、定期通院しており、加齢と共にその割合が増加する、(2)40歳以上の51.2%で若い頃と比べての行動変化が認められ、その中には病的老化の徴候も見られる、(3)食事・健康面は比較的配慮されているが、人員・物理環境・余暇面についての配慮は不十分である等である。最終年度である次年度は、知的障害者本人の方々へのヒアリングによる老化の自覚度、老後への生活展望等についてのPilot Studyを実施すると共に、今までの成果をまとめ、最終報告書として上梓する予定である。最終年度にあたり、研究報告書のまとめを念頭に研究活動を進めた。前年度、日本老年社会学会第40回大会に報告した内容に関しては、日本老年社会科学会より推薦を受け論文化し、「中高齢知的障害者の機能的体力について-AAHPER式機能的体力テスト、筋力、単純反応時間及び開眼片足立ちによる検討-」の題目で受理され、老年社会科学Vol.22,No.1(2000年4月)に掲載予定である(内容については前年度の実績報告書で報告済み)。適応行動に関する調査に関しては、福島県のグループホームにおけるデータを追加し、「中高齢知的障害者の適応状況に関する報告(2)-ABS(適応行動尺度)による検討を中心に-」の題目で第37回日本特殊教育学会にて発表した。主な結果は(1)自立機能と身体機能において50歳以上における低下が認められた。(2)下位項目では排泄と容姿に関し、50代からの低下が認められた等である。本発表は特殊教育学会より論文化の推薦を受け、研究報告書執筆と並行し投稿準備中である。また、高齢知的障害者に対する配慮・援助導入状況に関しても上記データを加え、日本社会福祉学会第47回大会にて「中高齢知的障害者の生活の質に関する-報告-入所施設・グループホーム間での配慮・援助導入状況に関する比較-」の題目で発表した。主な結果として(1)健康面に関する配慮が最も多く、逆に人員面での配慮が最も少ない。(2)施設外からの援助導入状況に関しては、経済的援助(93.8%、主に障害基礎年金)と医療リハ援助(43.8%)が高い他は20%以下である。
脳磁図および脳波を併用した大脳感覚野の共鳴現象の解明

本研究は,感覚野(聴覚野)における確率共鳴現象の有無を確認するため,振幅変調音の雑音対信号比(N/S)を変化させた聴覚刺激時の脳磁界聴性定常応答(ASSR)を計測し,その40Hz成分のパワーと位相同期を評価した.40Hz成分の刺激に対する同期の指標として位相コヒーレンスを用いた.ASSRの各被験者のパワーと位相コヒーレンスの結果に最適な雑音強度が存在しているように見られたが,全体のデータに対して,統計処理(最大値検定とダネットの多重比較)を行った結果,パワーと位相コヒーレンスの結果に有意な雑音の効果が得られた.このことからASSRのパワーか位相コヒーレンスのどちらかに確率共鳴現象が見られることを示唆する.本研究は,感覚野(聴覚野)における確率共鳴現象の有無を確認するため,振幅変調音の雑音対信号比(N/S)を変化させた聴覚刺激時の脳磁界聴性定常応答(ASSR)を計測し,その40Hz成分のパワーと位相同期を評価した.40Hz成分の刺激に対する同期の指標として位相コヒーレンスを用いた.ASSRの各被験者のパワーと位相コヒーレンスの結果に最適な雑音強度が存在しているように見られたが,全体のデータに対して,統計処理(最大値検定とダネットの多重比較)を行った結果,パワーと位相コヒーレンスの結果に有意な雑音の効果が得られた.このことからASSRのパワーか位相コヒーレンスのどちらかに確率共鳴現象が見られることを示唆する.本研究の目的は,音のパターン(単語やメロディーの断片)認知や視覚認知(物体認知や空間認知),更に体性感覚認知をする際,部位間にどのような同期現象が生ずるのか,ということを振動子の位相の振る舞いから明らかすることである.まず,正常な脳磁界で比較的同期現象が起きやすいことで知られる脳磁界聴性定常応答において,刺激音に対する位相同期に確率共鳴現象が見られたことから,聴覚野における振動子の存在を明らかにした.このことは,聴性定常応答の発生機序の解明に繋がると考える.視覚機能に関しては,迷路課題遂行中の前頭θ波(5-7Hz)に着目して,複素コヒーレンスを用いて脳領域間の機能的関連性について検討している.複素コヒーレンス法を用いることで,脳波計測で問題とされる体積伝導の影響を無視して機能的な関連性を検討することが可能とある。この手法を用いて前頭θ波出現と後頭部の関連を報告した.これにより脳波計測において,脳活動のより局所的な脳機能の関連が検討可能である.体性感覚に関して,電気刺激の刺激周波数を変化させて,体性感覚誘発脳磁界反応(SI, SII)を検討した.その結果,刺激周波数により体性感覚野のSI, SIIの活動の違いが明らかになり,その活動の違いを電気回路モデルにより定量的に示した。この回路には共振回路が含まれることから,体性感覚においても同期現象が生じることが分かる.以上の結果より,ヒトの認知機能に関して脳活動の同期現象が重要な役割を果たすことを示した.本研究の目的は,音のパターン(単語やメロディーの断片)認知や視覚認知(物体認知や空間認知),更に体性感覚認知をする際,部位間にどのような同期現象が生ずるのか,ということを振動子の位相の振る舞いから明らかすることである.本年度は,聴覚機能に関して,長短三和音を呈示したときの脳磁界反応に対して,コヒーレンス解析を用いた結果,その脳磁界反応に対する違いが得られた.視覚機能に関しては,好悪画像を呈示したときの,脳磁界を計測した.その結果に対して位相コヒーレンス解析を用いることで,ヒトの好悪判断と脳磁界アルファ波の関連を検討した.その結果,好悪判断時の脳磁界アルファ波の位相同期で異なる結果を示した.これらの結果は,脳磁界を計測することで音のパターン認知や好悪判断に対して脳活動の同期現象を捉えられる可能性を示唆する.最後に体性感覚に関して,電気刺激の刺激周波数を変化させて,体性感覚誘発脳磁界反応(SI, SII)の刺激周波数-位相特性を検討した.その結果,刺激周波数により体性感覚野のSI, SIIの活動の違いや,刺激に対して同側と対側部位の違いが明らかになり,その活動の違いを電気回路モデルにより定量的に示した.この回路には共振回路が含まれることから,体性感覚においても同期現象が生じることが分かる.以上の結果より,ヒトの高次機能に関して脳活動の同期現象が重要な役割を果たすことを示した.本研究の目的は,音のパターン(単語やメロディーの断片)認知や視覚認知(物体認知や空間認知),更に体性感覚認知をする際,部位間にどのような同期現象が生ずるのか,ということを振動子の位相の振る舞いから明らかすることである.本年度は,聴覚機能に関して,10Hzで変調した長短三和音を呈示したときの脳磁界反応(聴性定常応答)に対して,その信号波形を検討した結果,その振幅に有意な差が得られた.視覚機能に関しては,情動画像(IAPS画像)を呈示したときの,脳活動(視覚誘発定常応答(SSVEF))を脳磁図により検討した.その結果,negative画像とpositive画像刺激呈示時におけるSSVEFの振幅に,統計的に有意な差が確認された.このことからSSVEFは,被験者の心理状態(ストレス)を反映していることが示唆される.最後に体性感覚に関して,電気刺激の刺激周波数を変化させて,体性感覚誘発脳磁界反応(SI,SII)の刺激周波数-位相特性を検討した.

その結果,刺激周波数により体性感覚野のSI,SIIの活動の違いや,刺激に対して同側と対側部位の違いが明らかになり,その活動の違いを電気回路モデルにより定量的に示した.この回路には共振回路が含まれておりその共振周波数を調べることにより,体性感覚におけるSIおよびSIIの同期現象における周波数特異性を報告した.以上の結果より,ヒトの高次機能に関して各感覚野の同期現象が重要な役割を果たすことを示した.
癌細胞上のILT7/NKp44/BDCA2リガンド発現による免疫抑制機構の解明

癌細胞上に発現するILT7/NKp44/BDCA2リガンドを介した免疫抑制機構を明らかにすることを目的とし、各リガンド分子の同定を試みた結果、NKp44Lの同定に成功した。また、癌細胞上のNKp44L発現を制御できるシグナル経路が明らかとなった。これらの結果は、癌患者の免疫状態を改善する新たな臨床的方法を与え、免疫治療を改善できる可能性を示すものである。今年度は、主に癌細胞上でのNKp44Lの発現調節について研究を進めた。癌細胞には、NKp44Lが恒常的に発現するものとしないものに分かれたが、それぞれの群はさらにIFN-γで発現が増強されるものとされないものに分かれた。また、恒常的発現がある癌細胞の中にTGF-β処理で発現が低下するものが複数認められたことから、TGF-βによって誘導される上皮間葉転換(EMT)とNKp44L発現の関係を明らかにするためEMTを誘導する転写因子Snail,Slugを過剰発現させたところ、NKp44L発現の低下が認められ、EMTによってNKp44L発現が低下することが明らかになった。NKp44は活性化NK細胞に発現し、癌細胞に対する傷害を正に制御することが知られていることから、EMTでのNKp44L発現低下は転移時の癌細胞がNK細胞からの攻撃を避ける手段の一つである可能性がある。また最近、癌細胞でのNKp44Lの恒常的発現と相関して発現が変化する遺伝子を同定し、現在、その遺伝子発現がNKp44L発現を制御する可能性について解析を進めている。NKp44Lを高発現する癌細胞から作成したレトロウイルスcDNAライブラリーをレトロウイルス感染効率の高いマウス細胞株に発現させた後、NKp44細胞外領域とhIgGのFc部分との融合リコンビナント蛋白質を用いて染色を行い、染まった細胞からNKp44Lを分子同定するスクリーニングを行なっているが、まだ同定には至っていない。昨年度までに、癌細胞上でのNKp44Lの発現をレポーター細胞で検出したところ、IFN-γによる発現増強とTGF-βによる発現低下を複数の癌細胞株で認めたことから、IFN-γとTGF-βのシグナルクロストークに関わる分子の発現とNKp44Lの発現を解析した結果、一つの遺伝子についてNKp44L発現との相関が認められた。今年度、この遺伝子がNKp44L発現を制御する可能性について検討したが、否定的な結果が得られた。また、NKp44Lを高発現する膵がん細胞株と腎がん細胞株から一方向性と両方向性のレトロウイルスcDNAライブラリーを作成し、レトロウイルス感染効率の高いマウス細胞株に発現させた後、NKp44細胞外領域とhIgGのFc部分との融合リコンビナント蛋白質を用いて染色を行い、染まった細胞をソーティングする行程を繰り返したが、回収細胞数が多いほどゲノムに挿入された遺伝子のPCR増幅効率が低いことが障害になったため、単一細胞のソーティングを試み、NKp44-hIgGFc融合タンパク質で染まる細胞クローンを得ることができた。細胞クローンのゲノムにはライブラリー由来の遺伝子が多重に挿入されていたため、これらの遺伝子群からNKp44Lを決定する作業を進めている。昨年度までに、NKp44とDAP12を発現したレポーター細胞を用いてNKp44Lの発現の高い癌細胞を選出し、恒常的にNKp44Lを発現する腎がん及びグリオーマ細胞各1株、IFN-γによりNKp44Lの発現が増強した膵癌細胞株2株から一方向性と両方向性のレトロウイルスcDNAライブラリーを作成した。これらを、マウスB細胞株に発現させた後、NKp44-hIgG Fc融合タンパク質を用いた染色による単一細胞のソーティングを試み、NKp44-hIgG Fcで染まる細胞クローンを得ることができた。今年度、この細胞クローンのゲノムに多重に挿入されたライブラリー由来の遺伝子の配列決定と単離を進め、各遺伝子をマウスB細胞株に発現させた結果、これらの遺伝子群の中の1遺伝子の発現によりNKp44-hIgG Fcによる染色強度が著しく増強した。次に、レポーター細胞によりNKp44Lを検出できなかった癌細胞株にこの遺伝子を過剰発現させたところ、NKp44-hIgG Fcによる染色強度、レポーター細胞によるNKp44L検出シグナルの両方において、mockに比べて増強を認めたがその変化は遺伝子発現量の変化に比べて小さいものであったことから、NKp44Lは同定した遺伝子単独ではなく複合体として存在するか、何らかの翻訳後修飾を受ける可能性が示唆された。また、癌細胞上のNKp44Lの恒常的発現を担うシグナルを明らかにする目的で、癌細胞を様々なシグナル伝達阻害剤で処理した後、レポーター細胞によりNKp44L発現量の変化を検出したところ、1つのシグナルの阻害剤で処理した癌細胞で著しいNKp44L発現の増強を認めた。さらに、このシグナル分子を阻害する活性をもつキナーゼに対する阻害剤で処理した癌細胞ではNKp44L発現が低下したことから、このシグナルの調節によりNKp44L発現を制御できることが明らかとなった。

当初の計画にはなかった新たな展開もあるが、NKp44LとBDCA2Lの分子同定がまだ完了していない点で、やや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度のNKp44Lの発現クローニングから得られたNKp44L候補遺伝子群について、NKp44との結合を評価し、NKp44Lの分子同定を行う。今年度は特に、BDCA2Lの同定を集中的に試みる。これらの結果に基づいてNKp44L,BDCA2Lの癌病理組織免疫染色を行い、これらの発現と臨床病理学的因子との相関を明らかにする。また、ILT7L,NKp44L,BDCA2LのpDC機能抑制、Treg誘導、NK機能変化への寄与を解析するとともに、癌悪性形質への関与について検討する。癌におけるNKp44LとBDCA2Lの恒常的発現の抑制法を探索し、免疫抑制解除への応用を試みる。さらに、癌細胞膜に局在するリガンドが抗体療法の標的となる可能性について検討する。