hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細孔径と分子識別能を調整可能な新しいナノ空間の創製

これまでの検討により、イオン液体、パラフィン共に多孔体への導入法を確立し、もともとの多孔体が持つ細孔容量を上限として、ほぼ自由に細孔容量を制御することが可能となった。また、パラフィンハイブリット多孔体の有機蒸気吸着ではいくつかの特異な形状の吸着等温線が現れることを見出した。これらの試料については、さらに応用を踏まえた検討を行っていく予定である。以上から、当初の目的に沿った、順調な成果を挙げたと言える。エネルギーを消費しない効率的な分子分離法の確立が強く求められている。本研究では、イオン液体に代表される不揮発性の液体をナノ空間中に導入し、その種類及び量を変えることで、実効細孔径と特定の分子に対するポテンシャルを調整可能なナノ空間の創製を行った。不揮発性物質としてイオン液体、およびパラフィンを、吸着媒としてメソポーラスシリカを用い、その合成法を確立し、吸着特性評価を行うことで、合成した多孔体の実効細孔径が制御可能で、またいくつかの有機分子に対して特異な吸着特性を示すことを確認した。メソポーラスシリカ-イオン液体混合体については、試料作製法の確立、およびキャラクタリゼーションについて順調に進展させることができたので、これまでの研究で得られた知見をもとに、別の試料による混合体作成を進める。また、作成した混合体の用途開発のため、圧力のみではなく温度を変数とした吸着能変化の検討を開始する。実験、研究は計画通り進展させ、成果の発表も積極的に進める。イオン液体、パラフィンを用いた混合体について、試料作製法の確立、およびキャラクタリゼーションについて順調に進展させることができたので、これまでの研究で得られた知見をもとに、さらに吸着能の制御法についての検討を進める。X線回折法やリバースモンテカルロ法の適用により、分子レベルでの構造状態の理解を行う。実験、研究は計画通り進展させ、研究のとりまとめ、および成果の発表を積極的に進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。コロイド科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
哺乳類ミトコンドリア蛋白質合成系の再構築と分子機構の解明（国際共同研究強化）

様々な哺乳類ミトコンドリア翻訳伸長リボソーム複合体のCryoEM構造解析に取組み、渡航期間中にPRE-recycling複合体(mtRRFmt/55S)とPOST-recycling複合体(mtRRF/mtEF-G2・GDPNP/39S)の構造を高分解能で決定した。ミトコンドリアにおけるリボソームリサイクリングの分子機構、リサイクリングとトランスロケーションにおけるEF-Gの作用機序、等の知見が得られた。ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体の構造について世界で初めての報告であり、薬剤デザインなどの医療応用にも直ちに結びつく成果である。内定年度:2015近年、ミトコンドリア翻訳因子の病的変異が相次いで同定されており、またミトコンドリアのリボソームや翻訳因子に誤作用して副作用をもたらす薬剤も報告されている。ミトコンドリアリボソームの機能構造相関を解明する必要性が高まっている。2016年4月5日から8月24日まで第1回目の滞在の予定であり、2015年度はサンプル調製を進めた。サンプル調製を行い、共同研究先へサンプルを送付した。これまでのところ特に大きな問題は生じていない。近年、医療応用の観点からミトコンドリアリボソームの機能構造相関を解明する必要性が高まっている。本研究課題では、ミトコンドリアのリボソーム構造動態を網羅的に理解することを目指し、様々な翻訳伸長リボソーム複合体のCryoEM構造解析に取り組んでいる。EF-G2mtは申請者自身が見いだした哺乳類ミトコンドリアのリボソームリサイクリングを担う新規の翻訳因子である(Tsuboi et al., 2009)。バクテリアでは、翻訳伸長過程におけるトランスロケーション反応とリボソームリサイクリング過程におけるリボソーム解離反応をEF-Gが担うが、ミトコンドリアではそれらを異なる2つの因子(EF-G1mtおよびEF-G2mt)が分担している。今回申請者は渡航先にて、2つのリボソームリサイクリング複合体(PRE-recycling complex, mtRRF/55S; POST-recycling complex, mtRRF/mtEF-G2・GDPNP/39S)について構造を決定した。分解能はそれぞれ4.0オングストローム、4.1オングストロームであった。ミトコンドリアのリボソームリサイクリングの分子機構の詳細が明らかになるとともに、リサイクリングとトランスロケーションにおけるEF-Gの作用機序の違い、リサイクリングにおけるEF-GによるGTP加水分解の役割、について知見が得られた。これまでにミトコンドリアリボソーム単体の構造について報告があるが、ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体について世界ではじめての報告となる。渡航期間中に、2つのリボソーム複合体の構造を高分解能で決定できたことは大変順調であったといえる。mtEFーG2は申請者自身が見出した哺乳類ミトコンドリアのリボソームリサイクリングを担う新規の翻訳因子である(Tsuboi et al., 2009)。バクテリアでは、翻訳伸長過程におけるトランスロケーション反応とリボソームリサイクリング過程におけるリボソーム解離反応をEFーGが担うが、ミトコンドリアではそれらを異なる2つの因子(mtEFーG1およびmtEFーG2)が分担している。今回申請者は渡航先にて、2つのリボソームリサイクリング複合体(PREーrecycling complex, mtRRFmt/55S; POSTーrecycling complex, mtRRF/mtEFーG2・GDPNP/39S)について構造を決定した。ミトコンドリアのリボソームリサイクリングの分子機構の詳細が明らかになるとともに、リサイクリングとトランスロケーションにおけるEFーGの作用機序の違い、リサイクリングにおけるGTP加水分解の役割、について知見が得られた。これまでにミトコンドリアリボソーム単体の構造について報告があるが、ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体については世界ではじめての報告となる。分子生物学
操船教科に関する教材情報システムの開発

操船の教科教育に必要となる操船局面の中で、タグボートによる操船支援という局面において、操船者として学生が理解すべき内容を明らかにした。さらに、検討結果を踏まえ、操船シミュレータとの連携を行い、時々刻々に変化する力学情報をアニメーション表示するシステムの開発を行った。このシステムを利用することにより、学生は船体運動のメカニズムを視覚的に理解することになる。このように、平成21年度においては、教材情報システムとして、操船シミュレータの教育面での新たな利用方法の一部を策定した。学生の「物理離れ」から脱却するためには、学生がより容易に、より深く物理現象を理解するための教材情報システムの提供が不可欠である。従来の操船シミュレータに関する研究は、訓練を対象としており、教育面からの利用は検討されていなかった。また、教育教材として利用するためには、どのような情報を、どのように表示すべきかについても、これまで検討がなされてきていない。平成21年度に実施した研究では、これまで無かったタグ操船に関する教材情報提供システムを開発、提供する点が特色である。国内、国内においても、この問題を取り組んできた研究は無く、学術的にも独創的なものである。また、本研究の成果として、開発した教育教材を国内外の教育機関に配布することが可能となり、船員教育の質的向上の面から社会に貢献できる効果を有する結果となる。これにより、より高度で、高品質な船員を海運界に提供できることとなり、海運全体の安全性向上に貢献できるという意義を持っている。
片側内耳破壊ラットの小脳片葉プロテオーム解析

前庭代償モデルラットのプロテオーム解析を行い、めまいにおける前庭代償のメカニズムの解明を目指した。前庭代償に関与するタンパク質としてN-ethylmaleimide-sensitive fusion protein (Nsf)等10種類のタンパク質を同定した。このうちNSFは、翻訳後修飾が前庭代償急性期に関与している可能性が示唆され、その翻訳後修飾がリン酸化修飾されていることが考えられた。前庭代償モデルラットの前庭代償急性期(48時間後)と慢性期(1週間後)に小脳片葉(破壊側、対側)を摘出、タンパク質を抽出。蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動解析システム(2D DIGE)を用いスポットの発現を確認。コントロールと比較し、MALDI-TOF mass spectrometerにて質量分析を行った。得られたデータを解析しタンパク質の同定を行った。NSFはその翻訳後修飾が前庭代償急性期に関与している可能性が示唆された。NSFはゴルジ体層板間の小胞輸送において小胞の膜融合に関与する因子である。まずNsfの翻訳後修飾の解析を、ETD (Electron Transfer Dissociation)-Ion Trap MSを用いたLC-MS/MSにより、解明しようと試みたが、翻訳修飾の同定にまでは至らなかった。次に、NSFの翻訳後修飾として報告があるものとして、リン酸化、ニトロシル化があることから、まずラット小脳片葉におけるNSFおよびニトロシル化タンパク質の検出を、N-ニトロシル化抗体を用いWestern-Blotting法にて同定を試みた。ラット小脳片葉タンパク質を1次元電気泳動法、2次元電気泳動法を用い、SYPRO Ruby染色し、N-ニトロシル化抗体を用いてWestern-Blotting法を行った。結果は、1次元電気泳動、2次元電気泳動ともにNSFがニトロシル化修飾していることは証明されなかった。N-ニトロシル化抗体はシステイン残基への認識抗体なので、システインCyDyeは使用できなかったため、SYPRO Ruby染色を用いたが、NSFのスポット位置が確定できなかった。次にNSFの翻訳後修飾として、リン酸化、ニトロシル化の報告があり、ニトロシル化修飾を検討。1D、2DゲルをSYPRO Ruby染色(N-ニトロシル化抗体はシステイン残基への認識抗体で、システインCyDyeは使用できず)し、N-ニトロシル化抗体を用いてWB。結果、1D、2DともにNSFがニトロシル化修飾していることは証明されなかった。リン酸化修飾は、Pro-Q Diamond染色を用い検出を試みたがNSFは染まらなかった。Pro-Qの検出感度以下であることも考え、アルカリフォスファターゼ処理を行い、リン酸基を外し脱リン酸化し、何らかの差が生じるか実験した。脱リン酸化処理をした2Dゲルとしないものを、それぞれNSF抗体を用いたWBでその発現部位の違いを確認。脱リン酸化するとNSFタンパクに等電点の移動が見られ、NSFはリン酸化修飾されていることが考えられた。本年も昨年に引き続き、同定されたタンパク質のうちNSFにしぼった機能解析を行っている段階であり、最終目標としての前庭機能障害の治療標的となりうるタンパク質の同定、前庭代償の分子メカニズムの解明、めまいの治療薬の創薬や、前庭代償過程を進めることのできる技術の開発にはまだまだ到達されていない現状である。プロテオミクスにより、網羅的な解析ができる反面、個々の機能解析には、それぞれさらに予備実験を要する点、ならびに実験結果が予想に反する場合に直面することが多々あることが、遅れている要因と考える。本年は、同定されたタンパク質に対し、個々に機能解析を行っている段階であり、最終目標としての、前庭機能障害の治療標的となりうるタンパク質の同定、前庭代償の分子メカニズムの解明、めまいの治療薬の創薬や、前庭代償過程を進めることのできる技術の開発には、まだまだ到達されていない現状である。プロテオミクスにより、網羅的な解析ができる反面、個々の機能解析には、それぞれさらに予備実験を要する点が、遅れている理由の一つと考える。短期目標として、同定されたタンパク質に対し個々に機能解析を継続する。Nsfの翻訳後修飾の解析を先行したが、今回の実験からニトロシル化の可能性は低く、次いでリン酸化の可能性について検討してく予定である。中期、長期目標として、有意差のあった残り60スポットについても治療標的となりうるタンパク質スポットのため引き続き同定を継続していくとともに、機能解析をすすめ、前庭代償の分子メカニズムを明らかすることで、めまいの治療薬の創薬や、前庭代償過程を進めることのできる技術の開発につながることを目標とする。Nsfの翻訳後修飾の解析としてETD-Ion Trap MSを用いたLC-MS/MSにより、翻訳後修飾を明らかにする。

また前庭代償過程における小脳片葉でのNsf, Inexa, Pdia3の動態の解析として、免疫染色法を用いて内耳破壊後0時間、24時間、48時間、1週間での両側小脳片葉におけるNsf, Inexa, Pdia3のタンパク質動態を解析する。中期、長期目標として、有意差のあった残り60スポットについても治療標的となりうるタンパク質スポットのため引き続き同定を継続していくとともに、機能解析をすすめ、前庭代償の分子メカニズムを明らかすることで、めまいの治療薬の創薬や、前庭代償過程を進めることのできる技術の開発につながることを目標とする。本年度もタンパク質レベルでの発現を見るための実験消耗品に使用した。次年度も引き続き、翻訳後修飾の解析、プロテオミクス消耗品を中心に使用予定である。当研究にあたり二次元電気泳動画像解析システム(PDQuest)、タンパク質同定システム(Mascot)、塩基配列情報解析システム(DNASIS Pro)などのソフトウェアは当研究施設に既に用意されている。しかしながら、プロテオミクス解析消耗品(SYPRO ruby染色等)が非常に高額であり、消耗品を中心に試薬(Tris、DTTなど)20万円、プロテオミクス消耗品50万円、モノクローナル抗体50万円などを使用計画として予定している。本年度はRNAおよびタンパク質レベルでの発現を見るための実験消耗品に使用した。次年度も引き続き、翻訳後修飾の解析としてETD-Ion Trap MSを用いたLC-MS/MSの使用および、有意差のあるタンパク質スポット同定のためのプロテオミクス消耗品を中心に使用予定である。しかしながら、プロテオミクス解析消耗品(SYPRO ruby染色5L定価26万円、Cy Dye DIGE Saturation dye定価45万円など)が非常に高額であり、消耗品を中心に試薬(Tris、DTTなど)20万円、プロテオミクス消耗品50万円、モノクローナル抗体50万円などを使用計画として予定している。
イオン交換体等吸着剤の処理による無加熱臭果汁の製造に関する研究

元年度において,DEAEーセルロファイン(CEL)やDEAEートヨパ-ル(TOY)のような陰イオン交換体がポリフェノ-ル酸化酵素(PPO)を強く吸着するが,その反応基質であるoージフェノ-ル類(ODP)に対する吸着力は比較的弱いことを認めた。そこで,本年度は本年度はこれらの吸着剤に加えて,イオン交換樹脂として知られているDowex(DOX)やAmberlite(AMB)等についても検討した。試料には主にアスコルビン酸(AsA)を添加して調製したリンゴの果汁を用いた。(1)バッチ方式:まず吸着剤の添加量の影響について調べたところ,イオン交換樹脂の中ではDOXやAMBが果汁のODP類を強く吸着することがわかった。しかし,樹脂の種類によっては吸着力が低いものもみられた。一方,PPO活性に対してはDOXがTOYやCELと同等の吸着力を示した。しかし,バッチ方式ではPPO活性が完全には吸着除去されないため,処理後の果汁は時間の経過につれて褐変していった。(2)カラム方式(連続処理法):元年度と同様の操作により,カラム通過後の果汁(吸着処理果汁)のポリフェノ-ル含量および褐変度の経時的な変化を追跡した。その結果,DOXおよびAMBのカラムを通過した果汁はODP含量が低く,褐変もみられなかったが,無処理果汁およびCELカラム通過果汁は著しく褐変した。しかし,供試した吸着剤はいずれも粒子サイズが相違しており,その吸着性に及ぼす影響が考えられた。DOXについて調べたところ,粒子サイズは100200メッシュ程度のものがODP等の吸着除去率が高く,目詰まりも少ないことがわかった。そこで,吸着処理したリンゴ果汁の成分を分析したところ,無処理果汁に比べていずれも糖度は変わらなかったが酸度の低下からみられ,特にDOXやAMBで処理した果汁の酸度低下が著しかった。AsAについても同様の減少傾向がみられた。しかし,本実験で実施した吸着処理方式では,果汁調製時に褐方防止のために十分量のAsAの添加が不可欠であり,これが果汁製造後の非酵素的褐変の原因となるので,今後はAsA無添加の搾汁方式を模索する必要がある。リンゴ、ナシ等の生果汁中に含まれるポリフェノ-ル酸化酸素及びその基質であるポリフェノ-ル化合物を、イオン交換体等を用いて吸着除去することにより生果汁の酵素的褐変反応を防止しようと試みた。[1]上記果実に0.250.5%になるようにアスコルビン酸を添加して迅速に磨砕した後、綿布濾過および遠心分離(8000rpm)を行い透明生果汁を得た。この生果汁を30°Cでincubateし、経時的に吸収スペクトルを測定した。差スペクトルにおいては、325nmに負のピ-ク、380nmに正のピ-クが出現し、生果汁中にクロロゲン酸(Chl)及びカテキン(Cat)類に対する酸化酵素活性の存在することが推定された。[2]生果汁20mlに吸着剤各1gを添加し5分間振盪した。その濾液について調べた結果、吸着剤の種類により活性物質の吸着力にかなりの差があることがわかった。[3]モデル果汁を調整し、その500mlをペリスタポンプを用いて可変型カラムに約80ml/lhrの速度で送液したところ、UV-モニタ-及びデ-タ処理装置は正常に作動し、試料忠の活性物質はカラムに吸着された。[4]モデル果汁については、供試した7種類の吸着剤のうち、DEAE-トヨパ-ル及びDEAE-セルロファインは酸化酵素活性を選択的に強く吸着したが、ポリフェノ-ル(Chl,Cat)の吸着力は弱かった。またダイヤイオン及びキトパ-ルは酵素活性並びにポリフェノ-ルともあまり強く吸着しなかった。これに対して、陰イオン交換樹脂には酵素活性及びポリフェノ-ルともに強く吸着するもの、ポリフェノ-ルは強く吸着するが酵素活性はそれほど吸着しないもの及び酵素活性もポリフェノ-ルもあまり吸着しないものなど3型のあることがわかった。そこで、吸着力の強かったカラムを用いてナシ、リンゴの生果汁を処理した。しかし、生果汁の場合はカラム通過前に褐変したり、処理中にカラムのフィルタ-の目ずまりを起こした。今後吸着力方式等についてさらに検討を要する。

(2)カラム方式(連続処理法):元年度と同様の操作により,カラム通過後の果汁(吸着処理果汁)のポリフェノ-ル含量および褐変度の経時的な変化を追跡した。その結果,DOXおよびAMBのカラムを通過した果汁はODP含量が低く,褐変もみられなかったが,無処理果汁およびCELカラム通過果汁は著しく褐変した。しかし,供試した吸着剤はいずれも粒子サイズが相違しており,その吸着性に及ぼす影響が考えられた。DOXについて調べたところ,粒子サイズは100200メッシュ程度のものがODP等の吸着除去率が高く,目詰まりも少ないことがわかった。そこで,吸着処理したリンゴ果汁の成分を分析したところ,無処理果汁に比べていずれも糖度は変わらなかったが酸度の低下からみられ,特にDOXやAMBで処理した果汁の酸度低下が著しかった。AsAについても同様の減少傾向がみられた。しかし,本実験で実施した吸着処理方式では,果汁調製時に褐方防止のために十分量のAsAの添加が不可欠であり,これが果汁製造後の非酵素的褐変の原因となるので,今後はAsA無添加の搾汁方式を模索する必要がある。
子宮内膜組織におけるアポトーシス制御機構の解析

本課題研究では、in vitro培養実験系を中心として、特にヒト子宮内膜組織におけるアポトーシス制御機構の解析を行ってきた。子宮内膜上皮細胞のアポトーシス解析実験としては、ヒト各種子宮内膜腺癌細胞株のFasアポトーシス/抗癌剤誘発アポトーシスを用いた実験系を確立し、各種のサイトカイン、細胞外基質、ホルモン剤、抗癌剤などによるアポトーシス制御機構の解析を行った。例えば子宮内膜上皮細胞への細胞外基質からのシグナルは、p53非依存性のFas介在アポトーシスを制御したが、p53依存性の抗癌剤誘発アポトーシスには何ら影響を示さないことを明らかにした。ヒト子宮内膜間質細胞はin vivoにおいては脱落膜という組織特異的な分化をとげることが良く知られており、これは受精卵着床に必須の現象と考えられている。そこで、我々は独自にヒト子宮内膜間質細胞のin vitro脱落膜化asay系を確立し、この制御系の解析を行ってきた所、ヒト子宮内膜間質細胞のアポトーシスを制御するサイトカイン(例えばLIF、IL-11、oncostatin Mなど)の存在を世界で初めて明らかにすることができた。さらに、ヒト子宮内膜間質細胞の分化にはPRL分泌細胞に変化する脱落膜化過程とは独立した、G-CSF分泌細胞へ分化するという第2の分化経路を発見した。そのふたつの分化経路を中心的に制御しているのがEGFであることも明らかにした。子宮内膜癌細胞における抗癌剤誘発アポトーシスシグナルの異常もモデル実験系を樹立し現在研究中にある。本申請研究では同時に以下のような多数の研究を行っている。(1)ヒト正常子宮内膜上皮のアポトーシス制御機構の解析:(1)各種間質細胞サイトカインが子宮内膜アポトーシス感受性を制御することを証明し(論文発表済)、現在はその細胞内シグナルを解析中。(2)現在、癌細胞由来アポトーシス阻害物質を精製している。(3)組織特異的なBcl-2関連分子による子宮内膜アポトーシス制御機構の存在を予測し(論文投稿中)、目下、遺伝子導入発現実験による直接証明中。(4)Fas介在子宮内膜アポトーシスでは組織特有のcaspaseを利用している(論文投稿中)。目下、アポトーシス刺激種と各対応するcaspase familyを同定中。(5)細胞外基質との細胞接着が子宮内膜上皮の運動能やアポトーシス感受性を制御している(論文投稿中)。現在は、細胞接着による細胞内アポトーシスシグナルの修飾を解析中。(2)子宮内膜腺癌のアポトーシス誘導療法の開発:(1)子宮内膜腺癌細胞ではアポトーシスシグナルが障害されている(論文投稿中)が、現在は手術摘出癌組織を用いてシグナル異常部位の遺伝子レベルの解析を検討中。(2)ある種のサイトカインや細胞外基質を加えると、抗癌剤アポトーシス誘導能が強化されるが、現在はそのシグナル制御について解析中。(3)子宮内膜腺癌からの抗癌剤耐性株を用いて、抗癌剤誘発アポトーシス制御分子のcDNAクローニングに取り組んでいる。(3)子宮内膜症におけるアポトーシス制御機構の意義と新しいアポトーシス誘導療法の開発:(1)子宮内膜間質細胞の分化誘導研究と並行して、子宮内膜症患者で低下した内膜細胞アポトーシス感受性を再亢進させる物質を検索中。(2)子宮内膜症治療薬Danazolは子宮内膜細胞のアポトーシス感受性を亢進させる(一部論文発表済、論文執筆中)が、現在は、このDanazolの作用点の細胞内標的分子を解析中。【平成11年度研究成果】以下の各プロジェクトに分けて子宮内膜組織のアポトーシス制御機構の解明と臨床応用を研究している。(1)ヒト正常子宮内膜上皮のアポトーシス制御機構の解析(詳細については発表論文を参照)

(1)各種サイトカインが子宮内膜アポトーシス感受性を制御することを証明しており、その細胞内シグナルを解析してきた。(2)癌細胞由来アポトーシス阻害物質の精製および性状解析中である。(3)組織特異的Bcl-2関連分子による子宮内膜アポトーシス制御機構の解析を試みている。(4)Fas介在子宮内膜アポトーシスでは組織特有のcaspaseを利用していることを証明しており、アポトーシス刺激種と各対応する子宮内膜におけるcaspase familyを同定を試みている。(5)細胞外基質との細胞接着が子宮内膜上皮の運動能やアポトーシス感受性を制御しているが、現在は、細胞接着による細胞内アポトーシスシグナル制御を解析中である。(2)子宮内膜腺癌のアポトーシス誘導療法の開発(詳細については発表論文を参照)(1)子宮内膜腺癌細胞ではアポトーシスシグナルが障害されているが、現在は手術摘出癌組織を用いてシグナル異常部位の遺伝子レベルの解析を検討中である。(2)ある種のサイトカインや細胞外基質は抗癌剤アポトーシス誘導能を強化するが、現在はそのシグナル制御について解析中である。(3)子宮内膜腺癌からの抗癌剤耐性株を用いて、抗癌剤誘発アポトーシス制御分子のcDNAクローニングを試みている。(3)子宮内膜症におけるアポトーシス制御機構の意義と新しいアポトーシス誘導療法の開発(詳細については発表論文を参照)(1)子宮内膜間質細胞の分化誘導研究と並行して、子宮内膜症患者で低下した内膜細胞アポトーシス感受性を再亢進させる物質を検索している。(2)子宮内膜症治療薬Danazolは子宮内膜細胞のアポトーシス感受性を亢進させるが、このDanazol作用の細胞内標的分子を検索している。本課題研究では、in vitro培養実験系を中心として、特にヒト子宮内膜組織におけるアポトーシス制御機構の解析を行ってきた。子宮内膜上皮細胞のアポトーシス解析実験としては、ヒト各種子宮内膜腺癌細胞株のFasアポトーシス/抗癌剤誘発アポトーシスを用いた実験系を確立し、各種のサイトカイン、細胞外基質、ホルモン剤、抗癌剤などによるアポトーシス制御機構の解析を行った。例えば子宮内膜上皮細胞への細胞外基質からのシグナルは、p53非依存性のFas介在アポトーシスを制御したが、p53依存性の抗癌剤誘発アポトーシスには何ら影響を示さないことを明らかにした。ヒト子宮内膜間質細胞はin vivoにおいては脱落膜という組織特異的な分化をとげることが良く知られており、これは受精卵着床に必須の現象と考えられている。そこで、我々は独自にヒト子宮内膜間質細胞のin vitro脱落膜化asay系を確立し、この制御系の解析を行ってきた所、ヒト子宮内膜間質細胞のアポトーシスを制御するサイトカイン(例えばLIF、IL-11、oncostatin Mなど)の存在を世界で初めて明らかにすることができた。さらに、ヒト子宮内膜間質細胞の分化にはPRL分泌細胞に変化する脱落膜化過程とは独立した、G-CSF分泌細胞へ分化するという第2の分化経路を発見した。そのふたつの分化経路を中心的に制御しているのがEGFであることも明らかにした。子宮内膜癌細胞における抗癌剤誘発
経済的中枢管理機能によるアメリカ・オーストラリア・イタリア・カナダの都市体系研究

本申請研究は経済的中枢管理機能という高次都市機能の分析を通して,アメリカ・オーストラリア・イタリア・カナダの都市体系を研究すること目的としていた。本研究は各国の都市体系の研究にとどまらず,日本をはじめてとして申請者が既に分析を終了している国々との比較をも行い先進国の都市体系としてまとめることを目的としている。ここでいう都市体系とは経済的中枢管理機能のあり様からとらえた,各国の主要都市の相互比較・都市間結合の状況を意味している。アメリカ合衆国については,まず何よりも特定都市への本社集中度が低いことを挙げなくてはならない。本社数最多都市はニューヨークであるが,それは対象とした主要企業の4.3%にすぎない。支所についてはシカゴが最も多く,ニューヨークは第8位にすぎない。首都であるワシントンDCはいずれも多くを所有していない。このようなタイプは先行研究の西ドイツに類似している。オーストラリアとイタリアについては,まだ本社の分析にとどまっている。前者ではシドニー,そしてメルボルンに本社が多く,後者ではローマが本社最多都市であった。首都キャンベラに主要企業の本社が多くないというのはアメリカ・西ドイツと同じであり,歴史的な慣性のほかに政治制度が大きく関与していると思われる。カナダでは,本社数最多都市はトロントであり,モントリオールやカルガリ-がこれに続く。しかし,支所数第1位都市はモントリオールである。カナダではトロントとモントリオールがこの機能からみた二大都市であるが,両都市に本社をおく企業は相互に多くの支所を出しあっていることが確認された。言語をはじめとしてケベックとそれ以外の州との異質性・分離性が強調されることの多いカナダではあるが,この機能からみる限り,両地方は強い結びつきをもっていることが明らかになった。本申請研究の目的はアメリカ合衆国・カナダ・オーストラリア・イタリアの都市体系を経済的中枢管理機能の分析を通して研究することにある。そして、既に同様の視点で分析を行なった日本、韓国、西ドイツ、フランスの結果と比較検討することにある。予定していた本年度の研究のうち、アメリカ合衆国については分析を終了し、その他の国々については分析中である。さて、アメリカ合衆国については『THE CAREER GUIDE 1991』を使用し、そこに掲載されている主要民間企業4289社を対象とし、その本社数が10以上、支所数350以上のSMSAをとりあげた。分析の概要は次の通りである。アメリカ合衆国については、本社の集中度が低いことを最初に指摘できる。本社数最多都市はニューヨークであるが、その数は185であり、全体に占める比率は4.3%にすぎない。また、本社数10以上の都市は64を数えた。州別にみれば、カリフォルニア州が最も本社が多い州であるが、それでも405社、全体の9.4%である。しかも、同州内で本社数最多のロスアンゼルスには62を数えるにすぎず、10以上の6都市を合計しても157社で、同州全体の38.8%にすぎなかった。このような傾向はいずれの州においてもみられるものであり、アメリカ合衆国の本社分布は旧西ドイツと類似した特徴をもつ。支所の点から分析すると、シカゴを筆頭に4SMSAが1000をこえる支所をもっていた。ニューヨークの支所数は最多SMSAシカゴのそれの61.3%にとどまるものである。概して人口の多いSMSAは支所数も多いという傾向を認めることはできたが、その対応関係は弱いものであった。本申請研究は経済的中枢管理機能という高次都市機能の分析を通して,アメリカ・オーストラリア・イタリア・カナダの都市体系を研究することを目的としていた。本研究は各国の都市体系の研究にとどまらず,日本をはじめとして申請者が既に分析を終了している国々との比較をも行い先進国の都市体系としてまとめることをも目的としている。

アメリカ合衆国については,まず何よりも特定都市への本社集中度が低いことを挙げなくてはならない。本社数最多都市はニューヨークであるが,それは対象とした主要企業の4.3%にすぎない。支所についてはシカゴが最も多く,ニューヨークは第8位にすぎない。首都であるワシントンDCはいずれも多くを所有していない。このようなタイプは先行研究の西ドイツに類似している。オーストラリアとイタリアについては,まだ本社の分析にとどまっている。前者ではシドニー,そしてメルボルンに本社が多く,後者ではローマが本社最多都市であった。首都キャンベラに主要企業の本社が多くないというのはアメリカ・西ドイツと同じであり,歴史的な慣性のほかに政治制度が大きく関与していると思われる。カナダでは,本社数最多都市はトロントであり,モントリオールやカルガリ-がこれに続く。しかし,支所数第1位都市はモントリオールである。カナダではトロントとモントリオールがこの機能からみた二大都市であるが,両都市に本社をおく企業は相互に多くの支所を出しあっていることが確認された。言語をはじめとしてケベッックとそれ以外の州との異質性・分離性が強調されることの多いカナダではあるが,この機能からみる限り,両地方は強い結びつきをもっていることが明らかになった。
微細構造を有する繊維集合体からの熱伝達特性と伝熱制御に関する研究

本研究では、極細線繊維集合体を用いた高応答性加熱器による気体の伝熱制御に関する基礎研究として、繊維群の熱伝達特性を解明するため、素線径8μmのカ-ボン繊維集合体の常温域における極低レイノルズ数域での熱伝達特性を実験的に明らかにした。つまり、本研究を遂行するために、下記の手順で実験・解析を行った。1.実験装置の製作まず常温域のガス流を対象とする小型風洞を製作した。この装置は、線径8μmのカ-ボン繊維を多数並列に配列した極細線繊維群加熱器を内臓するもので、空気を作動流体として、非定常加熱による応答特性を測定することによって、極低レイノルズ数域における熱伝達特性を簡便に測定するものである。2.測定原理の確立実験で用いた繊維は8μmのカ-ボンファイバ-のため、細線表面の温度計測を行うことは不可能である。そこで本研究では、予め繊維群の熱伝達率を仮定して繊維群加熱器の非定常伝熱特性について数値解析を行い、任意の入力パルス形状に対する加熱器の出口ガス温度の推定値と実験値を比較することによって、繊維群の熱伝達率を推定する手法を取った。3.極細線群の熱伝達率の評価上記の実験を種々のガス流速について行い、例えばガス流速=14cm/sで熱伝率h=約12W/(m^2K)の測定値を得た。流速14cm/における単一極細線の熱伝達率を本実験条件に対して見積ると、h=1300となり、両者に大きな隔たりがある。これらの結果は、低レイノルズ数で単一粒子や単一細線に漸近する充填層等で用いられている熱伝達率の実験式と矛盾し、極低レイノルズ数域での充填層や繊維郡の熱伝達率は、単一粒子や繊維の熱伝達率に漸近しないことが明らかとなった。以上要するに、本年度の研究目的は、ほぼ達成されたものと考える。
ヒト上肢運動時における運動単位の動態解明

本研究においては,上肢運動時における運動単位の活動動態を解明することを目的として研究を遂行した.得られた成果は次の通りである.(1)肘を屈曲する運動時において,単一運動単位の活動電位波形のデコンポジショを行うシステムを試作し,重畳波形が出現する場合においても適用可能であることを示した.(2)運動時に抽出した単一運動単位の活動電位波形からテリトリを推定するシステムを試作し,運動単位のサイズを推定することが可能であることを示した.(3)活動電位波形のデコンポジション,運動単位のサイズを推定するシステムを上肢運動時に適用して,運動単位の活動動態を解析した.これまでの研究で,筋力トレーニングをよく行い上腕二頭筋の皮下脂肪組織が薄い被験者のSMUAPの計測・解析は難しいと予想された.そこで,今後多くの被験者に実験協力してもらうことを考え,このように表面筋電図の計測・解析が難しい場合に同定が行えるか確認を行った.計測したマルチチャネル表面筋電図に我々がこれまでに開発したシステムを適用したところ,肘屈曲時における運動単位活動電位波形の形状変化が大きいため同定が行えないことが確認された.問題を精査したところ,同定を行うアルゴリズムに原因があることが確認された.そこで,アルゴリズムを逐次型の同定手法に修正し,再構築したシステムを適用したところ,目視で同定を行ったのと同様の結果が得られた.また,解析の結果得られた運動単位の動態については,既に報告されている生理学的知見とよく一致していることが確認された.これまでの研究で,上腕二頭筋の皮下脂肪組織が薄い被験者の場合,皮膚表面で計測される運動単位活動電位波形(SMUAP)の計測・解析は難しいと予想された.そこで,問題を精査し,同定を行うアルゴリズムを逐次型手法に変更して計測・解析を行って来た(2014年度まで).2015年度も引き続き逐次型のアルゴリズムを用いてさらに研究を進める予定であったが,逐次型手法では計測・解析することが非常に難しい場合が生じた.その理由は,一度間違った同定を行うと間違いを引きずることである.対応策は,同定結果に間違いが生じているかユーザーインタフェースを通して細かく確認,修正できるようにしたことである.この方法では,オペレータによる手入力が必要になる場合があるが,時間的な問題は少なく,最も確実な方法である.この手法を用いて2015年度に解析を行った結果は既に報告されている生理学的な知見ともよく一致した.既存のプログラムを使用し,必要に応じて若干の修正を加える程度でSMUAPの同定がどのような場合でも行えると考えていた.本研究における我々の同定が上手く行えたという定義は, SMUAPをよく研究している者が目視で同定を行った結果とパーソナルコンピュータによる同定結果が一致した場合である.また,我々が目視でSMUAPの同定を行っている作業をパーソナルコンピュータに行わせることにより,SMUAPの同定を正確かつ短時間に行うことも研究の柱の一つである.これまでの我々の研究では,SMUAPの同定を行う場合,目視による同定結果と異なる結果が得られた場合の対処方法は,プログラムに使用するパラメータを変更することであった.進捗が遅れている理由は,運動時においてはパラメータを変更するだけでは同定を上手く行えない場合が現状では必ずあるということを特定することと,その対応策を決定するのに時間を要したためである.【背景・目的】ヒトの運動時における神経筋の機能的最小単位は運動単位である.そのため,スポーツや臨床の分野において,単一運動単位の活動動態を知りたいといニーズは極めて高い.非侵襲のマルチチャネル表面電極を用いて単一運動単位の動態計測を行うための課題は2つある.一つは,運動時において単一運動単位の活動電位波形の形状が変化することであり.もう一つの課題は重畳波形に対応した同定方法の構築である.本研究では,これら2つの課題を解決するために,マルチチャネル表面電極により記録した表面筋電図を解析するアルゴリズムを提案した.【方法】上腕二頭筋短頭を計測対象として,10%MVC程度のトルクの負荷に対して,5 deg/sec程度の速度で肘を屈曲するように被験者に指示をして,マルチチャネル表面電極を用いて信号の記録を行った.この筋電図信号の解析には提案するアルゴリズムを適用した.このアルゴリズムの特徴は2つある.一つ目の特徴は,運動時において皮膚表面で計測される活動電位波形の形状の変化が極めて少ない短区間において活動電位波形の同定を行っていることである.さらに,個々の単一運動単位の活動電位波形を加算平均することによりテンプレートを作成していることである.もう一つの特徴は,これらのテンプレートを組み合わせて作成した活動電位波形と計測した重畳波形の一致度を計算することにより,重畳波形に対しての同定を行っていることである.【結果】肘を屈曲させる動作時において上腕二頭筋短頭を計測対象として,マルチチャネル表面電極を用いて単一運動単位による活動電位波形だけでなく重畳波形に対しても同定を行うことが可能なアルゴリズムを提案して同定を行い,本提案手法の有用性が示唆された.ヒトの運動時において記録したマルチチャネル表面筋電図に我々が開発したアルゴリズムを適用して,単一運動単位による活動電位波形の同定を行った.このパーソナルコンピュータにより作成された同定結果と目視による同定結果を比較することにより,パーソナルコンピュータによる同定処理が正しく行えているか確認を行った.

本研究において提案する手法の真値は我々の目視によりおこなった同定結果である.目標とする同定処理が行えていない場合については,真値とする同定結果によく一致するようにアルゴリズムの修正を適宜行った.アルゴリズムの基本処理について述べる.はじめに,単一運動単位の活動電位波形について同定を行い,次に重畳波形についての同定を行う.すなわち,はじめの同定結果をもとにして単一運動単位の活動電位波形によるテンプレートを作成する.次に,このテンプレートの組合せることにより重畳波形を作成し,パーソナルコンピュータにより作成された活動電位波形と計測された重畳波形との一致度を計算し,重畳波形に対応した同定を行った.これらの一連の処理において,筋力トレーニングをよく行う皮下脂肪組織の薄い被験者にも対応して解析を行うアルゴリズムの作成に予想以上の日数を要したために進捗が遅れています.2020年に開催される東京オリンピックの影響もあり,近年においては健康,スポーツ,科学への関心が高まっている.特にスポーツにおける競技能力向上のため運動生理学の知見を援用する取り組みは世界的に行われており,in vivoにおいてヒト動作において重要かつ大きな役割を担う上腕部を対象として,その神経筋の機能的最小単位である運動単位について詳細を知る意義は極めて大きい.肘関節を屈曲するような運動時においては,皮膚表面にある電極と皮下の筋線維群(運動単位)との距離は変化する.この距離の変化に伴い運動単位の活動電位波形の形状は変化する.このため,運動時において運動単位の活動電位波形の同定が困難であるとの理由から,表面筋電図を用いて運動時における運動単位の生理学的なメカニズムを解析する研究はほとんど行われてこなかった.本申請では,ヒト肘関節屈曲動作時において変化する皮膚表面で計測される活動電位波形の形状を追跡するシステムを構築した.動作時の計測時間を30秒とした場合,活動電位波形の同定を30秒の区間で行うのではなく,3秒間という活動電位波形の形状があまり変化しない区間で行い,その結果を熟練者の調べた結果と比較することでシステムの改良を行った.この3秒間の解析結果を結合することで運動単位の動態を出力した.次に,負荷が大きくなるに従い確認される単一運動単位の活動電位波形が重なった重畳波形については,シミュレーションにより作成した単一運動単位の活動電位波形を組み合わせた波形を作成し,これら2つの波形の差を計算することにより活動電位波形の同定を行うシステムを構築した.最後に,同定を行った単一運動単位の活動電位波形をパーソナルコンピュータにおいてシミュレーションで作成した活動電位波形の差を比較することにより,計測した運動単位のテリトリを推定するシステムを構築した.本研究においては,上肢運動時における運動単位の活動動態を解明することを目的として研究を遂行した.得られた成果は次の通りである.(1)肘を屈曲する運動時において,単一運動単位の活動電位波形のデコンポジショを行うシステムを試作し,重畳波形が出現する場合においても適用可能であることを示した.(2)運動時に抽出した単一運動単位の活動電位波形からテリトリを推定するシステムを試作し,運動単位のサイズを推定することが可能であることを示した.
体液中におけるオピオイドペプチドの生理機能の解析ー様々な疾患時における動態ー

オピオイド活性を示す内因性物質・エンケファリン(ENK)は生体内に投与すると、その代謝酵素により迅速に、その生理活性が失なわれる。現在までに、生体内によりモルヒネ様ペプチドが数多く発見されたが、この様に安易に失活・分解することにより、疾患時にその役割を適格に把握することは不可能であった。更に、何故、体液中に様々なオピオイドペプチドが存在しているか。この様な物質が疼痛などの疾患時にどのような機能的役割を果しているかを解明することを目的として、我々は申請した。本年度、体液中のENK様物質の生理機能に関する研究する上で、簡便で再現性のある独自の測定系を考案した。既ち、体液中より低分子物質ENKを如何にして、その代謝酵素や結合蛋白質と分離するかを問題にし、従来の方法に透析法を導込した。その結果、ヒト血清を水に対して一晩透析し、外液をODSカラム、HPLCでENK様物質を精製し、RIA法で140Pg/ml前後含まれていることを明らかにした。正常ヒト脳脊髄液中にENKは365Pg/ml、性別・年齢により有意差は認められなかった。更に、疼痛疾患時に如何なる動態を示すか検討し、下肢外傷の急性疼痛群において正常人と比較し、3倍以上の高値を示した。併し、癌などの慢性疼痛時において115.4Pg/mlと低値を示した。一方、妊娠時におけるβーエンドルフィンは妊娠後期に高濃度に分泌され、分娩時における痛みの制御に主要な役割を果していると考えられている。妊娠時の血清中におけるENK様物質は、初期に顕著な動態を示した。既ち、妊娠初期56週において483Pg/mlと変常に高値を示した。体液中におけるENK様物質は脳神経細胞、脳脊髄、副腎髄質などより由来し、中枢系の疼痛制御および妊娠初期にENKが分泌促進され、生体の防御機構に重要な生理機能を担っている可能性が示唆された。体内にenkephalinを投与すると,その代謝酸素により迅速にその生理活性が失われる.現在までに,生体内よりopioid peptideが数多く発見されたが,この様に容易に活性が失われ,疾患時にその役割を適確に把握することは不可能な状態であった.何故,体液中に様々なopioid peptide様物質が存在しているのか,更に,疼痛などの疾患時にどのような機能的役割を果しているかを解明することを目的として我々は申請した.本年度,体液中のopioid peptide様物質の生理機能に関する研究する上で,簡便で再現性のある測定系が問題であると考えられた.それ故に,体液中より低分子のopioid peptideを如何にその代謝酸素や結合蛋白質と分離するかを検討した結果,透析法を考案した.そこで,ヒト血清を水で5時間透析後,外液をODSカラム, HPLCでLen-enkephalin様物質を精製し, RIA法で140pg/ml前後含まれていることを明らかにした.さらに,正常ヒト脳脊髄液中に500pg/mlと高濃度存在した.一方,この様な測定系を検討していく過程において, opioidpeptide結合蛋白質が血清・脳脊髄液中に存在していることを明らかにした.

これ蛋白質はヒト血清よりDEAE cellulose,arginine sepharoslさらにsepabexG-200などで精製した.即ち,この蛋白はenklphalenに対してKd10-8Mと高い親和性を有し,分子量が40万以上であることを明らかにした.次に,脳脊髄液中におけるLen-enkephalin様物質が疼痛疾患時に如何なる動態を示すか検討した結果,下肢外傷の急性疼痛において正常人と比較して3倍以上の有意な値を示した.併し,癌などの慢性疼痛患14名において115.4±100と顕著な低値を示した.更に,外因性オピオイド投与群と無投与群ではそれぞれの有意差が認められなかった.現在,疼痛妊娠時などのopioid peptideの動態を詳細に研究中である.モルヒネ同様の活性を有する内因性物質・エンケファリン(ENK)は生体内に投与すると、その代謝酵素により迅速に、その生理活性が失なわれる。現在までに、生体内よりオピオィドペプチドが数多く発見されたが、この様に容易に失活・分解することにより、疾患時にその役割を適確に把握することは不可能であった。更に、何故、体液中に様々なオピオイド様物質が存在しているか。この様な物質が疼痛などの疾患時にどのような機能的役割を果しているかを解明することを目的として、われわれは申請した。本年度、体液中のENK様物質の生理機能に関する研究する上で、簡便で再現性のある独自の測定系を考案した。即ち、体液中より低分子物質を如何にして、その代謝酵素や結合蛋白質と分離するかを問題にし、従来の方法に透析法を導入した。その結果、ヒト血清を水に対して一晩透析し、外液をODSカラム、HPLCでENK様物質を精製し、RIA法で140Pg/ml前後含まれていることを明らかにした。正常ヒト脳脊髄液中にENKは365Pg/ml、性別・年齢による有意差は認められなかった。そこで、疼痛疾患時に如何なる動態を示すか検討し、下肢外傷の急性疼痛群におてい正常人と比較し3倍以上の高値を示した。併し、癌などの慢性疼痛において115.4Pg/mlと低値を示した。次に、妊娠時におけるβ-エンドルフィンは妊娠後期に高濃度に分泌され、分娩時における痛みの制御に主要な役割を果していると考えられている。一方、妊娠血清中のENK様物質を検討し、初期に顕著な動態を示した。即ち、妊娠初期56週において483Pg/mlと非常に高い値を示した。体液中におけるENK様物質は脳神経細胞、脳脊髄副腎髄質などより由来し、中枢系の疼痛制御および妊娠初期にENKが分泌促進され、生体の防御機構に重要な生理機能を担っている可能性が示唆された。
脊椎動物キネトコア複合体の構造細胞生物学

本研究の目的は真核生物の染色体分配装置の立体構造と機能をタンパク質レベルから細胞レベルに至る多面的な解析を行い、その分子機構を明らかにすることにある。今年度はCENP-L-CENP-N複合体とCENP-CのNMR解析に向けたサンプル調整を行った。N15とC13ラベルしたサンプルを調整したところ、サンプルの不安定性およびオリゴマー形成のためNMRに必要なタンパク質濃度まで濃縮することができずNMR測定できなかった。一方、より小さなコンストラクトでは4度で2週間ほど安定であった。現在はこの試料を用いて立体構造解析、相互作用領域特定のためNMR解析を行っている。一方、細胞を用いた解析ではCENP-Cをノックアウトしたニワトリ細胞にドメインを欠失したCENP-Cを導入し、その際に他の染色体分配因子がどのように局在し、そのレベルが変化するかを観察した。その結果、CENP-CのN末端1/3を欠失したコンストラクトではCENP-Hのキネトコア局在レベルが低下した。一方、C末端1/3のCENP-Cコンストラクトではそのような低下は見られなかった。別の染色体分配因子Mis12の場合はN末端1/3欠失したコンストラクトおよびC末端1/3コンストラクトいずれにおいてもキネトコア局在レベルは観測できなかった。このような違いはCENP-HとMis12がCENP-Cに結合する領域及びその制御が異なっていることを意味する。現在はこのような相互作用に関わる領域の立体構造解析を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は脊椎動物キネトコア複合体の立体構造知見を細胞生物学と組み合わせて解析することでガンや遺伝病と密接に関係する染色体分配機構の作用機序を解明することにある。特に構成的にセントロメアに存在するキネトコアの一群に焦点を当てて研究を行っている。今年度は構成的セントロメア局在ネットワーク蛋白質群(CCAN)のうちCENP-L/CENP-N複合体の機能と構造について解析した。これまでの解析からCENP-NのC末端とCENP-Lが相互作用し、安定な複合体を形成していることはわかっていたがこの複合体が他のキネトコア因子とどのように相互作用するかは不明であった。特にCENP-Cは重要なキネトコア因子であり、CENP-Aの局在やその他のキネトコア因子の局在に重要な役割を果たすことが知られている。まず我々はCENP-L/CENP-N複合体とCENP-Cの相互作用を生化学的に調べた。CENP-Cを5つの断片に分けてCENP-L/CENP-N複合体との相互作用をプルダウン法により解析したところ、CENP-Cの中間領域とCENP-L/CENP-N複合体が弱く相互作用していることがわかった。現在この相互作用に必要な最小領域を特定するべくコンストラクトを作成しているところである。CENP-L/CENP-N複合体はCCANと呼ばれる構成的に染色体セントロメア領域に局在するキネトコア因子の一群であるが、これまでにどのような因子によりセントロメアへと局在するかわかっていなかった。今年度の解析によりCNEP-Cがその候補の一つである可能性が示唆されたことは大きな進展で、今後生化学的、細胞生物学的に解析を行うことによりその詳細が明らかになると考える。また本相互作用を更に構造生物学的に解析することで本研究の目的である構造生物と細胞生物学を融合することが可能になる。今後はCENP-L/CENP-N複合体とCENP-Cとの相互作用の詳細を明らかにする目的でNMRを使って相互作用部位の同定を行うとともにX線結晶構造解析を行い、その相互作用を原子レベルで明らかにする。
癌転移の鍵酵素・CaMKPを分子標的とする低毒性癌転移阻害薬創製のための基礎研究

CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP/PPM1F/POPX2)はPPMファミリーに属するセリン/スレオニンプロテインホスファターゼである。最近の研究ではCaMKPが、がんの転移浸潤に重要な役割を果たすことが示唆されている。本酵素の有効な阻害剤を開発するため、東大創薬機構から提供を受けた約10万種の化合物ライブラリーを用いて、CaMKPを阻害するが同じPPMファミリーに属するPP2Cα(PPM1A)を阻害しない化合物の大規模スクリーニングを行った結果、ピロガロール骨格を持つ一群の化合物を阻害剤候補として同定した。これらの化合物をCaMKPとインキュベートすると強く酵素活性を阻害したが、同一条件下で近縁のPP2Cαは殆ど阻害しなかった。次にこれらの化合物をCaMKPと時間を変えてプレインキュベートし、酵素活性を測定したところ、時間依存的に強く活性を阻害した。この時、Biotin-hydrazideを用いたwestern blottingで酵素タンパク質のカルボニル化を調べたところ、時間依存的にCaMKPが顕著にカルボニル化されていたが、PP2Cαのカルボニル化は殆ど認められなかった。ピロガロール骨格の4位の水酸基をメチル化した化合物では、CaMKPのカルボニル化、酵素活性阻害が共に見られず、CaMKPの阻害には、ピロガロール骨格の4位の水酸基が必須であることが示された。また、酵素活性を失った変異酵素を用いて同様の実験を行ったところ、この変異酵素は全くカルボニル化されなかった。更に、CaMKPとピロガロール誘導体に基質リン酸化ペプチドを加えてインキュベートすると、CaMKPのカルボニル化が顕著に亢進した。以上の結果から、これらのピロガロール誘導体が、CaMKPを酵素活性依存的・特異的にカルボニル化し活性を阻害するという新奇な阻害機構が示唆された。新規に発見したCaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)阻害剤の阻害機構を解明するため、これらの阻害剤によって引き起こされるCaMKPのカルボニル化と酵素阻害の関係を詳細に調べた。その結果、カルボニル化によって酵素阻害が引き起こされるという仮説を支持する状況証拠を多数得ることができたが、その因果関係を明確に証明するには、阻害に直接関係するカルボニル化部位を同定し、その残基をカルボニル化が起こらない残基に変異させることによって阻害が解消されることを示す必要がある。そこで、質量分析を用いたカルボニル化部位の同定を進めているが、リン酸化などの修飾に比べてカルボニル化部位の解析技術は確立されておらず、また複数の部位のカルボニル化が考えられるため、感度等の不足により、サイト同定に十分なデータが得られていない現状である。サンプル調製の条件等を再度検討して回収率や感度の向上を図って、質量分析によるカルボニル化部位の同定を更に推し進めるとともに、サイトがある程度絞り込めた段階で、候補部位に対する変異酵素を作製し、その変異酵素のカルボニル化の解析から責任部位の同定を目指す。カルボニル化されない阻害剤耐性の変異酵素を取得できれば、ノックダウン細胞に変異酵素を発現させることで、細胞レベルでの阻害剤の作用機作の解析も進めていきたい。

その結果、カルボニル化によって酵素阻害が引き起こされるという仮説を支持する状況証拠を多数得ることができたが、その因果関係を明確に証明するには、阻害に直接関係するカルボニル化部位を同定し、その残基をカルボニル化が起こらない残基に変異させることによって阻害が解消されることを示す必要がある。そこで、質量分析を用いたカルボニル化部位の同定を進めているが、リン酸化などの修飾に比べてカルボニル化部位の解析技術は確立されておらず、また複数の部位のカルボニル化が考えられるため、感度等の不足により、サイト同定に十分なデータが得られていない現状である。サンプル調製の条件等を再度検討して回収率や感度の向上を図って、質量分析によるカルボニル化部位の同定を更に推し進めるとともに、サイトがある程度絞り込めた段階で、候補部位に対する変異酵素を作製し、その変異酵素のカルボニル化の解析から責任部位の同定を目指す。カルボニル化されない阻害剤耐性の変異酵素を取得できれば、ノックダウン細胞に変異酵素を発現させることで、細胞レベルでの阻害剤の作用機作の解析も進めていきたい。