hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱ショック蛋白(hsp)に対するT細胞免疫の研究

ストレス蛋白質、熱ショック蛋白質(hsp)は熱等のストレスにより生じた変性蛋白の処理、再生に働き、また、分子シャペロンとして様々な分子の輸送やアセンブリーに関わる重要な蛋白質である。我々は腫瘍抗原を解析する過程で、hspとT細胞との反応を発現した。我々はまず癌免疫の成立には細胞癌化に伴って発現(増量)する抗原が重要であると考え、ラットWFB非形質転換細胞の表面に陰性、かつWFBのH-ras癌遺伝子形質転換株(W31)に陽性の抗原を単クローン抗体067でとらえた。種々の解析によりこの抗体が実は70kDa heat shockcognate protein(hsc)を認識していることが判明した。宿主キラー細胞との反応をみると、CD4^-CD8^-、T細胞レセプターalphabeta^-のキラーT細胞(DNT)とW31細胞表面に発現したhsc70分子が反応していることが示唆された。つまりhsc70はtransfor-mation-associated antigenであり、しかも腫瘍拒絶抗原として宿主の特定のキラーT細胞(gammadelta型T細胞と推測される)と反応することが示された。この反応はさらにER-Golgiでの蛋白分子の会合阻害剤であるbre-feldin Aにより完全に抑制された。このことは、hsc70が細胞内の何らかのペプチドや蛋白との複合体の型でDNTに提示されていることを示唆した。さらに、W31細胞よりトリフロロ酢酸抽出によりペプチドを得、これを1%FCSで培養したW31(これはhsc70は細胞表面陽性であるがDNTにより障害されない)にパルスしたところDNTは1%FCSで培養したW31細胞に明らかな細胞障害性を示した。つい最近、hsc70とMHC class Iとの高次構造が酷似していることが報告されたが、我々の研究結果はhscの抗原提示分子としての可能性を直接支持する重要な実験事実と思われた。本年度は主としてheat shock proteins(hsp)に対する抗体を作製することに重点をおいた。即ち多くのhspはATPーbinding protein(ABP)である性質を利用し、HeLa細胞lysatesよりATPーagaroseを用いてABPを精製し、これを免疫原として単クロ-ン抗体(mAb)を開発した。その結果、70KDa hspに反応するいくつかのmabを得た(N7T2,N7T3など)。これらは、bovine脳より精製した70hspとも特異的に反応した。また、ラット70hspのcDNAをpET発現ベクタ-に組みこむことにより得たラット70hspリコンビナント蛋白とも反応することが確認されつつある。現在、これらのmabの70hspの各subーfamilyとの反応性を解析している。いずれにしても、これらのmAbは今後、hspの細胞表面発現機序や、T細胞との反応機序の解析に有効な手段を提出してくれるものと思われる。一方、我々は既にラット線維芽細胞WFBにHーras癌遺伝子を移入し、形質転換された際に発現する腫瘍抗原(TAAs)のひとつが実は70hspであり、しかも細胞表面に発現することを報告した。そこで次に、この抗原は70hspのどのsubfamilyに属するかを解析した。その結果、この抗原は70KDa heat shock cognate protein(hsc)であることが判明した。次に、TAAであるこの70hscが宿主免疫系と実際反応するか否かを検討した。WKAラットにBCGを注射し、末血や脾臓からCD4(ー)、CD8(ー)T細胞(DNT)をとり、これが70hscを構成的に発現する形質転換株W31に障害性に働くかどうかをみた。その結果、DNTはW31に明らかに障害性を示した。しかも、この反応性が70hscに対するmAbで阻止された。即ち、DNTが70hscをリガンドとして認識している可能性が示唆された。現在、DNTの特徴や、70hscが70hsc+抗原ペプチド、即ちpresenting moleculeとして働いている可能性も考え、ERでペプチドとの会合を阻止するbrefeldin Aなどを用いて研究中である。hspは細胞に熱等の様々な生理的ストレスを与えた時に発現増量をきたす分子であり、その様々な細胞生物学的機能が近年極めて重要視されている蛋白分子ファミリーである。免疫学的にもT細胞レセプターのリガンドになり得る可能性が示唆され、その反応機構の詳細と免疫生物学的な意義が注目されている。このような背景のもとに、今年度は下記のような研究成果を得た。(1)70kDa hspとT細胞反応:ラット線維芽細胞WFBはH-ras癌遺伝子で形質転換した際、単クローン抗体(mAb)067で認識される抗原を細胞表面に発現する。この抗原はストレス誘導性をもち、067免疫沈降物は抗ラット70kDa hsp抗体と反応した。ストレスによる細胞質から核への移行など、heat shockcognate protein 73(hsc73)の特徴を示した。T細胞応答をみたところ、CD3^+CD4^-CD8^-のT細胞が067抗原陽性のWFB形質転換株W31に細胞障害性に働き、この際hsc73をリガンドとして認識していることが067mAbを用いた細胞障害阻止試験により推測された。また、この反応はbrefeldin Aにより阻止された。

以上の結果は、T細胞がhsc73を認識する際、hsc73単体ではなくhsc73と他のペプチドや蛋白との複合体を認識していることが示唆された。(2)hsc73特異的mAbの開発とhsc73の細胞表面発現:上の事実は、hsc73がtransmenbrane domainを持たないにも拘ず、細胞表面発現を示すことを意味する。そこで、我々は、精製bovine hsc73、リコンビナントhsc73などを用いて、hsc73特異的なmAb(NT22)を開発しこの分子の細胞表面発現を検討した。その結果、hsc73はEB virus感染B細胞表面に強く発現し、一部の上皮性腫瘍細胞にも発現した。一方、resting B細胞には表面発現はみなかった。これらの結果を総合するとhsc73は腫瘍免疫のある側面、あるいはB細胞活性化の制御に一役を担っている可能性を示唆している。ストレス蛋白質、熱ショック蛋白質(hsp)は熱等のストレスにより生じた変性蛋白の処理、再生に働き、また、分子シャペロンとして様々な分子の輸送やアセンブリーに関わる重要な蛋白質である。我々は腫瘍抗原を解析する過程で、hspとT細胞との反応を発現した。我々はまず癌免疫の成立には細胞癌化に伴って発現(増量)する抗原が重要であると考え、ラットWFB非形質転換細胞の表面に陰性、かつWFBのH-ras癌遺伝子形質転換株(W31)に陽性の抗原を単クローン抗体067でとらえた。種々の解析によりこの抗体が実は70kDa heat shockcognate protein(hsc)を認識していることが判明した。宿主キラー細胞との反応をみると、CD4^-CD8^-、T細胞レセプターalphabeta^-のキラーT細胞(DNT)とW31細胞表面に発現したhsc70分子が反応していることが示唆された。つまりhsc70はtransfor-mation-associated antigenであり、しかも腫瘍拒絶抗原として宿主の特定のキラーT細胞(gammadelta型T細胞と推測される)と反応することが示された。この反応はさらにER-Golgiでの蛋白分子の会合阻害剤であるbre-feldin Aにより完全に抑制された。このことは、hsc70が細胞内の何らかのペプチドや蛋白との複合体の型でDNTに提示されていることを示唆した。さらに、W31細胞よりトリフロロ酢酸抽出によりペプチドを得、これを1%FCSで培養したW31(これはhsc70は細胞表面陽性であるがDNTにより障害されない)にパルスしたところDNTは1%FCSで培養したW31細胞に明らかな細胞障害性を示した。つい最近、hsc70とMHC class Iとの高次構造が酷似していることが報告されたが、我々の研究結果はhscの抗原提示分子としての可能性を直接支持する重要な実験事実と思われた。
クチナシカロテノイドの生理活性と調理性

くちなしから分離したカロテノイドとほかのカロテノイドとの生理活性の比較を行った。まずメチレンブルーを光照射することによって生成した一重項酸素への影響を調べた。0.0186μMの力ロテノイドを2mlのベンゼン:メタノール(4:1,v:v)に溶かして,1mlのイソプロパノールと0.1888μMのメチレンブルーを加え,アンバーフィルターを通し,分光光度計で吸光度を記録した。最初の吸光度と5分後の吸光度との差によって各カロテノイドの一重項酸素の消去力を調べた。その程度はルテイン>リコペン>β-カロテン>クロセチン>ビオラキサンチン>ネオキサンチンであった。つぎに,フリーラジカルへの影響を調べた。0.186μMのカロテノイドを1mlのクロルベンゼンに溶かし,基質としてテトラリン1mlを加え,0.362MのAIBN(アゾイソブチルニトリル)クロルベンゼン溶液250μlを加えることによって自動酸化を促進させた。30°Cではすべてのカロテノイドでテトラリンの自動酸化を抑制することは出来なかった。しかし,60°Cでは自動酸化を抑制出来た。その強さはリコペン>β-カロテン>ネオキサンチン>クロセチン>ルテイン>ビオラキサンチンであった。以上の2種類の実験より,くちなしカロテノイドのクロセチンにも抗酸化力が存在することがわかった。しかしその強さはβ-カロテンより強いことはなかった。これらの結果は投稿準備中である。9月20日に本年度の予算のほとんどを占める、島津高速液体クロマトグラフ(HPLC)一式が納品された。それに先立ち研究分担者の一人が夏休み中に機器分析化学会主催のHPLCの研修をうけてきた。また、研究代表者はオランダ、ライデン大学で開催された第11回国際カロテノイドシンポジウムに出席し、加熱調理操作による縁葉カロテノイドの変化についてポスター発表をしてきた。この時、スイス、べルン大学の研究者が、クチナシのコロテノイド分析、同定しているポスターがあり、日本におけるこれまでの研究成果に触れていないのでその点のコメントをつけてきた。HPLCそのものが本学に初めて設置されたため、研究分担者に取り扱いになれてもらうため、まず、ホウレンソウなどのカロテノイドの分析から入った。10月末には京都府立大学で行われた第10回カロテノイド研究談話会に参加し、国内の研究者と情報交換をしながら資料を収集した。クチナシを用いての分析は2月になってから行ったが、ピークの確認の段階で、推定、同定にはいたっていない。今回の補助金では購入出来なかったフォトダイオードアレイがあればカロテノイド分析には便利であるが、この点がこの研究を続行していく点で大きな難点となる可能性がある。この機器を所有して、植物のカロテノイド研究をしている熊本大学教育学部、植物学研究室との連絡を密接にしていく必要があると考えている。共同研究者の退職により一人でとりかかることとなり、また、新任校のため足りない設備、器具が多過ぎて実験は予定に反して遅々として進まなかった。しかし、市販のくちなしの実より抽出した液のクロマトグラムと食品添加物として業務用に使われているA社のくちなし抽出液のクロマトグラムを比較することは出来た。いずれも23個のピークが得られた。しかし、さらにシャープなピークを得るためには、移動相にグラジエントをかけるためのポンプがあるとよいが、一個のポンプでは分離条件が思いどうりに調節するかとが困難であった。また、得られたピークのカロテノイドの性質を調べるのに便利なフォトダイオードアレイを年度末に譲り受けることが出来、以前よりはカロテノイドの研究が有利に出来るようになた。

10月World Cancer Reserch FundとAmerican Institute for Cancer Researchから出された、Food,Nutrition and the Prevention of Cancer :a global perspectを読み、カロテノイドと野菜のガン予防における疫学的な研究の一端にふれた。12月山口大学で行われた第11回カロテノイド研究談話会においては合成、動物実験、疫学、植物生理、合成酵素遺伝子などについて、若い研究者の発表が目立った。また、シス異性体の生体内役割が注目を浴びてきていることを再確認した。“Use of Radioactive Carotene to Compare Absorption Coefficients of cis and trans β-carotene"と“Relationship between the Color Values and Carotenoid Contents in Vegetables and Fruits"を投稿予定である。くちなしから分離したカロテノイドとほかのカロテノイドとの生理活性の比較を行った。まずメチレンブルーを光照射することによって生成した一重項酸素への影響を調べた。0.0186μMのカロテノイドを2mlのベンゼン:メタノール(4:l,v:v)に溶かして,1mlのイソプロパノールと0.1888μHのメチレンブルーを加え,アンバーフィルターを通し,分光光度計で吸光度を記録した。最初の吸光度と5分後の吸光度との差によって各カロテノイドの一重項酸素の消去力を調べた。その程度はルテイン>リコペン>β-カロテン>クロセチン>ビオラキサンチン>ネオキサンチンであった。つぎに,フリーラジカルへの影響を調べた。0.186μMのカロテノイドを1mlのクロルベンゼンに溶かし,基質としてテトラリンlmlを加え,0.362MのAIBN(アゾイソブチルニトリル)クロルベンゼン溶液250μlを加えることによって自動酸化を促進させた。30°Cではすべてのカロテノイドでテトラリンの自動酸化を抑制することは出来なかった。しかし,60°Cでは自動酸化を抑制出来た。その強さはリコペン>β-カロテン>ネオキサンチン>クロセチン>ルテイン。ビオラキサンチンであった。以上の2種類の実験より,くちなしカロテノイドのクロセチンにも抗酸化力が存在することがわかった。しかしその強さはβ-カロテンより強いことはなかった。これらの結果は投稿準備中である。すでに2報はFoodScience and Technology Researchに投稿済みである。
中枢神経系細胞に特有のカルシウムチャンネルの性質と制御機構

神経細胞内のさまざまな情報伝達や代謝経路、或は神経細胞の活動機構にカルシウムが重要な調節的役割を果たすことが明らかにされてきたが、生物時計の時刻発信機構に対するカルシウムの関与については、未だ詳しい知見が得られていない。我々はラットを用い、生物時計が存在する脳内視床下部視交差上核(SCN)に細胞内へのカルシウムの取り込みに影響を与える種々の薬剤を浸透圧ポンプを用いて継続的に投与し、その飲水行動に対する効果を調べることによって次の実験成績を得た。イオノフォアA23187の投与はラットの飲水行動における日周性リズムの消失を引き起こし、カルシウムの過剰な細胞内への流入が時計の正常な働きを損なうことを示唆した。カルシウムチャネルブロッカサ-の中では、N型チャネルに特異的作用を示すωーコノトキシンの注入により飲水行動のリズムが影響を受け、日の総摂水量は変わらないが、昼間の飲水量が著明に増大した。これに対して、L型チャネルの阻害剤ニフェジピンやベラパミ-ルは有意な作用を示さなかった。また、Ni^<2+>も高濃度(10^<ー3>M以上)で投与すると明期の摂水量を有意に増加させたが、T型チャネルに特異的に働くとされる濃度(10^<ー4>M)では無効であった。これらの結果より、時計機構にはN型チャネルが主に関与することが示された。グルタミン酸または同受容体のアンタゴニストである。キヌレン酸を注入した場合にも飲水行動のリズムは乱れ、受容体作動性チャネルも時刻信号の発信に関与していることが明らかになった。細胞内へのカルシウムの取り込みを促進する処置と抑制する処置の両者が共に、日周性リズムの撹乱という結果を招いたが、このことは規則正しいカルシウムの動員が時刻情報の発信、伝達に重要な要因となることを強く示唆するものである。
中国地方における近代在来産業の展開と地域の特性

4年間の研究計画における第1の目的は、奥出雲におけるたたら製鉄業の歴史を明らかにすることであった。第2には、中国地方における製塩業の歴史を明らかにしようとした。第3には、柳井における綿織物業の歴史を明らかにしようとした。まず、我々は「山陰新聞」から在来産業についての多くの記事を収集することができた。つぎに、我々は仁多町櫻井家、横田町絲原家、江津市の澤津家のたたら操業について多くの史料を収集した。また、我々は山口県、大阪府、和歌山県の図書館と文書館に行き、在来産業についての多くの史料を収集した。その後、我々はたたら操業、奥出雲の鉄文化、高殿(たたら操業の施設)、山内(たたら製鉄操業労働者の居住地)での生活形態、について分析した。そして我々は塩業、織物業、たたら製鉄業についての論文を発表することができた。塩業労働者の争議において特徴的なことの一つは、物価の上昇と密接な関係にあるということである。浜子は皆専業である。他地方からの出稼ぎの者も多い。彼らの生活はほとんど農業に依存していない。日々現金生活であり、物価の上昇は彼らの生計を直撃する。浜子の同盟罷業は、ほとんどの場合、連年続いている物価上昇にもかかわらず、賃金があがらない場合におこっている。山口県の織物業は、江戸時代に開作地帯に広がっていた綿作を背景に農村工業として発展してきた。そして大島郡のように綿作はないけれども豊富な労働力を背景に玖珂郡の綿を使い、織物業の発展した所もある。近代においては、玖珂郡の柳井を中心に周防織物業界は白木綿、縮木綿、縞木綿など市場の要求に応じた織物を生産し、染色の工夫をして市場の獲得に努力してきた。たたら製鉄業については、経営の具体的な実態を明らかにすることに努めると同時に、山内の実態について明らかにしてきた。たたら操業については、3日操業と4日操業があるが、3日操業では生産がやや多く、4日操業では銑生産が多いが、いずれにおいても、銑ともに生産されており、大坂市場における価格が経営に大きな影響を与えていることを明らかにすることができた。また、山内は家族を含め大規模なもので500人から600人規模であり、数ヵ所に分かれていることがわかった。浜子は皆専業である。本年の主な研究活動として、島根大学図書館蔵「山陰新聞」のマイクロ版から、明治29年大正元までをコピーレ、在来産業関係記事を整理している。また、山口県文書館へ5日間、山口県光市ふるさと郷土館、同大島郡東和町、同郡久賀町歴史民俗資料館へ5日間の調査を行なった。収集した主な資料は、塩業関係資料、織物業関係資料である。本研究の具体的な成果として、「明治期の塩田小作争議と浜子の同盟罷業」(「史学研究」第229号所収)を発表することができた。

本論文では、三田尻塩田大会所(塩田地主組織)の性格を明らかにすると同時に、今まで明らかにされたことのない明治期における塩田小作争議の実例を紹介し、分析することができた。さらに浜子同盟罷業について多くの実例を紹介し、その特徴について分析した。すなわち、浜子の生活が現金生活であり、物価の上昇が彼らの生活を直撃することから、浜子同盟罷業は物価の上昇と密接な関係をもっていることなどを明らかにした。織物業関係については、まだ論文を発表していないが、主に山口県の柳井を中心にした縞木綿、岩国を中心にした縮木綿、大島郡を中心にした白木綿について、明治期の多くの統計資料、報告書などを収集することができた。特に白木綿については、朝鮮への輸出関係資料によって、多くの新たな事実を知ることができた。すなわち、山口県大島郡の白木綿問屋が明治20年代に朝鮮への進出を試み、しだいに市場を拡大し、28年には爆発的に輸出を拡大させたが、日清戦争後は輸出を減少させていることなどを明らかにすることができた。本年の主な研究活動は、昨年と同様島根大学図書館蔵「山陰新聞」のマイクロ版をコピーして在来産業関係記事を整理したことと、3件の史料調査をしたこと、その成果として、二本の論文を書いたことである。本年は、大正2年から昭和12年までの新聞記事をコピーし、順次切り抜き整理している。主な切り抜き記事は、農業、木炭業、和牛生産畜産業)、養蚕業、製糸業関係である。大正、昭和の記事は未だコピーのみで、来年度はこれを順次切り抜き、整理していく予定である。また、広島県福山市に3泊4日、山口市に3泊4日、徳山市に2泊3日して、史料調査し、塩業関係、織物業関係史料を多数収集した。それらを分析して、「近代在来産業の展開と地域の特性-塩業と織物業を中心にして-」を『山口県史研究』第10号に掲載の予定である(平成14年3月29日刊行予定)。また、今年度は、島根県仁多郡仁多町桜井家史料をはじめて閲覧させていただき、たたら製鉄関係史料1500コマを撮影した。そしてフィルムを焼きつけ、解読、分析して、「近世期鉄師頭取桜井家史料について」(『有馬毅一郎退官記念論文集』所収)を発表の予定である(平成14年3月31日刊行予定)。桜井家の史料は、はじめて公表されるものであり、近世期のたたら製鉄の経営を明らかにするために今後も調査を続ける予定である。本年度の研究活動は、昨年と同様島根大学図書館蔵「山陰新聞」のマイクロ版コピーのなかから、在来産業関係記事を切りぬき、整理したこと、3件の史料調査をしたことである。研究成果としては、二点論稿を発表した。本年度コピーした新聞記事は、主に大正時代の6年までのもので、これを切りぬき、整理した。主な記事は、農業、畜産業、養蚕業、製糸業関係のものである。史料調査については、山口県文書館、山口県立図書館の調査で2泊3日、和歌山県立文書館、和歌山県立図書館の調査に2泊3日、島根県簸川郡佐田町へ和牛(畜産業)の調査で3泊4日となった。山口市での調査では、木綿、木炭史料を収集した。和歌山市調査では、木炭関係史料を収集した。島根県簸川郡佐田町の調査では、畜産業の実態調査を行なった。このほか、研究活動としては、島根県奥出雲のたたら史料の分析をすすめた。その研究成果として、『櫻井家住宅調査報告書』に「松江藩の成立と鉄山業」「櫻井家の系譜」「櫻井家の鉄山経営」を掲載し、さらに大学コンソーシアム山陰主催第1回シンポジューム『はじめよう!!山陰学』に「19世紀奥出雲におけるたたら製鉄業」を発表した。本年度の主な研究実練は次のとおりである。
植物免疫応答におけるアクチン機能および細菌性エフェクターＨｏｐＷ１の作用機構解明

P. syringae由来のHopWIエフェクターは、アクチンの重合を阻害し、植物の免疫応答を抑制する。このHopWIのアクチンアイソフォームに対する影響を調べた。N. benthamianaの葉を用いた一過的発現系で、アクチンマーカーとHopWIを共発現した結果、アクチン結合ドメインのマーカーと同様にACT7はフィラメントが観察されず、HopWIの重合阻害の影響が見られた。一方、ACT2はHopWIが発現している細胞でもフィラメントが残ったままで、ACT2とACT7でHopWIの影響が異なっていた。次に、P. syringaeに対する病原抵抗性について、act2・act7機能欠損変異株で比較した(筑波大学との共同研究)。その結果、act7の病原抵抗性が野生型やact2よりわずかに上昇していることが明らかとなった。HopWIの影響や、1年目の研究でアクチン結合ドメインの結合がACT2/ACT7で異なっていたことから、他のアクチン結合タンパク質についてアクチンアイソフォームとの局在を調べた。束化タンパク質FIM1やVLN2、重合促進因子AtFH4の結合はアイソフォーム間で違いは見られなかったが、免疫応答への関与が示唆されている脱重合タンパク質ADF4はACT7特異的に結合した。また、興味深いことにアクチン結合ドメインやACT7と共局在しない微小管とACT2の共局在が観察された。1年目に樹立した蛍光タンパク質融合アクチン発現株の観察方法を検討した結果、細胞の化学固定によってフィラメントを観察することに成功し、異なる組織の表皮細胞でアクチン繊維の太さや長さが異なる様子が観察された。根の表皮細胞ではACT2は微小管様の局在を示し、ACT7は束化したフィラメントに取り込まれていた。以上の結果は、アクチンアイソフォームが植物細胞内で異なる機能を担っている可能性を強く示唆する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。高等植物は複数のアクチン遺伝子(アイソフォーム)を有するが、それぞれのアクチンアイソフォームが細胞内でどのように働いているのかよく分かっていない。H29年度は、正常な植物細胞内におけるアクチンアイソフォームの局在解析を行い、異なるアクチンアイソフォームが細胞内でどのように重合し、フィラメントを形成しているのかを明らかにすることを目的とした。本研究では植物の体細胞組織で発現量の多いACT2とACT7の2種類のアクチンアイソフォームの局在解析を行った。N. benthamianaの葉を用いて、海綿状組織と表皮細胞における局在を比較した。海綿状組織ではACT2とACT7がそれぞれフィラメント上にドット状に局在する様子が観察された。一方、表皮細胞ではACT2とACT7が全く異なるフィラメントに取り込まれている様子が観察された。この結果は表皮細胞においてACT2とACT7が異なる機能を果たしていることを強く示唆するものである。また、組織によってアクチンアイソフォームの重合パターンが異なることは、植物細胞内のアクチンの機能とアクチンアイソフォームの関係を理解する上で非常に重要な知見である。次に、アクチンアイソフォームとアクチン結合タンパク質の局在について理解を深めるために、植物細胞内のアクチンフィラメント観察に広く用いられているアクチン結合ドメイン(Lifeact, Talin ABD)との局在を比較した。その結果、2つのアクチン結合ドメインはACT2とACT7を均一にラベルしない様子が観察された。特に、LifeactはACT7のフィラメントをほとんどラベルした一方、ACT2のフィラメントをラベルしなかった。この結果は、アクチンのアイソフォームがアクチン結合タンパク質の結合に影響を与えるという、従来とは異なるアクチン結合タンパク質の局在機構の存在を示唆するものである。H29年度中に異なるアクチンアイソフォームの局在、アクチン結合タンパク質との局在を観察するための実験系を確立することができた。この実験系を用いて、異なるアクチンアイソフォームが植物組織によってユニークなフィラメントを形成していることが明らかとなった。特に、葉の表皮細胞でACT2とACT7の局在が異なっていたことは、アイソフォームによって機能が異なる可能性が期待され、H30年度に計画したアクチンアイソフォームノックアウトラインの解析につながるものである。また、アクチン結合タンパク質由来のアクチン結合ドメインの局在もアクチンアイソフォームによって異なっている様子が観察された。この観察結果について原因を調べるためにin vitroで結合実験を行い、考察を行うことができた。また、H30年度へ向けてHopWI発現コンストラクトの作成や蛍光タンパク質融合アクチン発現株の樹立など、おおむね計画通り研究を進めることができている。以上の結果、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価する。

HopWIの影響や、1年目の研究でアクチン結合ドメインの結合がACT2/ACT7で異なっていたことから、他のアクチン結合タンパク質についてアクチンアイソフォームとの局在を調べた。束化タンパク質FIM1やVLN2、重合促進因子AtFH4の結合はアイソフォーム間で違いは見られなかったが、免疫応答への関与が示唆されている脱重合タンパク質ADF4はACT7特異的に結合した。また、興味深いことにアクチン結合ドメインやACT7と共局在しない微小管とACT2の共局在が観察された。1年目に樹立した蛍光タンパク質融合アクチン発現株の観察方法を検討した結果、細胞の化学固定によってフィラメントを観察することに成功し、異なる組織の表皮細胞でアクチン繊維の太さや長さが異なる様子が観察された。根の表皮細胞ではACT2は微小管様の局在を示し、ACT7は束化したフィラメントに取り込まれていた。以上の結果は、アクチンアイソフォームが植物細胞内で異なる機能を担っている可能性を強く示唆する。H30年度は、アクチンアイソフォームを区別して作用することの示唆されているP.syringae由来のエフェクターHopWIに着目し、植物免疫応答に関与するアクチンの機能を解明することを目的とする。H29年度に表皮細胞においてACT2とACT7の局在が異なっていることが明らかとなったため、HopWIと各アクチンアイソフォームの局在解析に関しては表皮細胞に着目して解析を進めることを計画している。また、アクチン結合ドメインの局在も表皮細胞で異なっていたことから、HopWI以外のアクチン結合タンパク質に関してもアクチンアイソフォームとの局在解析を進める。並行して、葉以外の様々な組織におけるACT2とACT7の局在や形成されるフィラメントの観察を目指し、蛍光タンパク質融合アクチン発現株の樹立に取り組む。H29年度中にすでに蛍光タンパク質融合アクチン発現株を樹立していが、この株はバックグラウンドの蛍光が強いという問題があったためH30年度はまず観察方法の確立を目指す。アクチンアイソフォームと植物免疫応答の関連について明らかにするために、ACT2とACT7のノックアウトラインの病原応答を比較する予定である。まず、ACT2とACT7のノックアウトラインを樹立した後、HopWIを有する(あるいは有さない) P. syringaeを感染させ、菌の増殖速度やエンドサイトーシス活性を比較する。ノックアウトラインの解析に加えて、HopWI耐性のWs株もコントロールとして用いる。また、並行してアクチンに作用する薬剤を用いてアクチンのどのような機能が免疫応答に重要であるかについて考察を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
抗炎症剤投与後の動脈管収縮による胎生期の鬱血性心不全と心肥大の研究

〔研究の目的〕妊娠の末期の母親に非ステロイド性抗炎症剤が流産防止の目的、或いは解熱、鎮痛の目的で投与される事がある。私達は既に1980年以来各種の非ステロイド性抗炎症剤が様々な程度に胎児の動脈管を収縮させる事を実験で証明して来た。この3年間の研究では、非ステロイド性抗炎症剤の代表的薬剤であるインドメサシンを用いて、胎生期の動脈管収縮の際の心不全と心肥大について、ラットを用いて研究した。〔研究の方法〕妊娠満期(21日)のラットにインドメサシン10mg/kgを胃内注入し、1、4、8、24時間後の胎仔の心臓について、帝王切開と全身急速凍結法で調べた。心不全の定量的研究には、心〓液量と右室、左室の容積を測定し、更に心肥大の定量には右室と左室の筋量を測定した。ラット胎仔の心臓は20mg前後であり、これらの測定を正確に行う方法は従来無かったので、私達はこの測定の方法を新たに確立する事から始めた。〔研究の結果〕ラット胎仔の心臓の計測を正確に行う方法として、全身急速凍結法で固定した心臓を0.5mm毎に切り、その断面を実体顕微鏡でカラー写真に連続してとり、その写真から、心〓液量、右室・左室の容積と筋量、右房と左房を定量する方法を確立した。この方法で測定した容積は、重量と比重から求めた容積と良く一致し、この測定方法が正しいことが証明された。インドメタシンによる胎生期動脈管収縮により、胎仔は48時間後に明らかな心不全を生じた。この時右室と左室は拡張し、心〓液量は増加した。24時間後にも心不全は続いていたが、右室の形態は内腔が縮小して壁が厚くなり、求心性肥大を示した。〔結論〕非ステロイド性抗炎症剤による胎生期動脈管収縮により、心不全と心肥大が生じる事を世界で初めて証明した。デジタルテレビ断層撮影の適切な方法の開発を試みたが, X線管とI.I.とが逆方向直線運動を行う断層撮影装置が,デジタル処理が簡便に行えるので,現段階では最も適切な装置であった.毎秒30フレームのデジタル情報の取込みを, 1回の平行運動中に行うことができるようにした.当初,連続X線では毎秒1回の平行運動,パルスX線では4秒に1回の運動しかできなかったが,装置の改良によってパルスX線でも1秒に1回の平行運動が可能なようにした.歪み補正処理は等間隔に並んだ格子を持つphantomをあらかじめ撮像し,各投影データをもとにそれぞれの位置における歪み補正テーブルを作成し,画像構成時に補正を行うプログラムを開発した.このphantomを撮像すると,フィルム法による断層撮影,パルス曝射による撮像,連続曝射による撮像の順に画像の劣化が認められた.臨床的研究では胸部,及び頭部の断層撮影に応用すると,断層面では従来の直線断層撮影と殆ど変わらない情報を得ることができたが,断層面から載面が離れるにつれて軽度の画像の劣化が認められた.しかし,臨床的には殆ど差を観察することはできなかった.一方,血管造影における応用では動脈相においては血管の拍動があること,及び血流が速いことなどのために,比較的大きな3mm以上の血管では良好な血管断層像を得ることができたが,直線運動方向の像の流れによってartifactが発生することがあり,充分な診断能を上げることは困難であった.

しかし,毛細管相,及び静脈相においては良好な画像が得られた.静脈相の解析には従来の血管造影法と殆ど変わらない情報を得ることができた.今後の研究の方向は,動脈相における画質の向上であり,パルスX線で情報収集間隔を短縮していくことが重要と思われた.
RO1-xFxBiCh2超薄膜における巨大ラシュバ効果の探索

本研究はR(O,F)BiCh2層状化合物の単結晶を育成し,量子振動観測を目指し,巨大ラシュバ効果の探索につなげることを目的として推進した.量子振動観測を目指した磁気抵抗測定のために,R(O,F)BiS2超薄膜デバイスの作製を斉藤が中心となり推進した.R(O,F)BiS2単結晶(R = Pr, Nd)を剥離法により劈開し,電気抵抗測定用デバイスの作製を行った.2018年度末にデバイス作製に成功したが,超薄膜化した結晶表面に端子を作製する手法の確立に時間を要したため,磁場中測定は今後行う計画である.バルク単結晶での量子振動観測および新奇な物性の探索を目指し,水口が中心となり強磁場中物性評価を推進した.特に良質な結晶が得られたLa(O,F)BiSSeバルク単結晶に関して,強磁場中での磁気抵抗測定を行った.これらの単結晶は低温で超伝導を示すため,東北大金研の共同利用として磁気抵抗測定を推進した.結晶のc軸方向に電流を流し,25 Tまでの磁気抵抗測定を行った.その結果,La(O,F)BiSSeバルク単結晶においては量子振動が観測できなかった.量子振動観測に向けた測定は,上述の通り,超薄膜デバイスを用いた磁気抵抗測定を今後進める計画である.一方,La(O,F)BiSSeバルク単結晶において特異な磁気抵抗の面内方向異方性を見出すことに成功した.本系は転移温度3.8 Kの超伝導体であるが,2軸ローテータにより様々な方向から磁場をかけ,磁気抵抗異方性を測定したところ,Bi-Ch伝導面内に結晶構造の回転対称性(正方晶のため4回回転対称)を破った2回回転対称性を見出した.この現象は近年注目を集めているネマティック超伝導状態と類似しており,本現象についても今後詳細に解明する予定である.本研究では,巨大ラシュバ効果をBiCh2系層状化合物において探索するために,REOBiCh2型の結晶構造を持つ系に着目する.REO1-xFxBiCh2の結晶育成と物性評価,強磁場中輸送特性評価を行う.量子振動の観測を目指し,その解析あkら組成の変化によるスピン軌道相互作用の変化を解明することを研究目的とする.初年度は,LaO1-xFxBiSSe単結晶の育成と,基礎物性評価を行った.x = 0.10.5の仕込み組成においてフラックス法を用いて結晶育成を行い,良質な単結晶を得ることに成功した.フラックスとしてCsClを用い,真空石英管中で結晶育成を行った.また,LaO1-xFxBiSSe系の基礎物性を理解するために多結晶試料の測定も併せて行った.低温での磁化率および電気抵抗率測定,結晶構造解析,組成分析を行った.また,東北大金属材料研究所の強磁場センターにて,x = 0.1と0.3の単結晶の強磁場中輸送特性測定を行った.0.5 K以上の温度領域で,15Tまでの磁場を印加して単結晶の輸送特性を評価した結果,x = 0.1に対する測定に成功し,磁場ー温度相図を解明した.また,面内および面間の超伝導異方性を検討した結果,x = 0.1の試料では面間だけでなく面内にも超伝導異方性があることが分かった.次年度はこれらの単結晶においてさらに精密な測定を実現するために,微細加工技術を用いた測定試料作製を行い,目的である量子振動観測を目指す.上記の結晶育成および物性評価と並行して,PrO1-xFxBiS2単結晶の超薄膜化とデバイス化も進めている.現時点で,超薄膜化に成功し,端子設置のためのマスク作製を行っている.LaO1-xFxBiSSe単結晶育成にあらたに成功し,超伝導特性が良好であることを確認できた.また,強磁場中測定を学内および共同利用(東北大金研)で開始できており,研究目的である量子振動観測に近づいていると考えている.また,PrO1-xFxBiS2単結晶を用いた超薄膜化に成功しており,微細加工後に強磁場測定を実施する計画である.以上,計画時点で想定していた研究内容の半分程度が実現していると判断し,おおむね順調に進展していると報告する.本研究はR(O,F)BiCh2層状化合物の単結晶を育成し,量子振動観測を目指し,巨大ラシュバ効果の探索につなげることを目的として推進した.量子振動観測を目指した磁気抵抗測定のために,R(O,F)BiS2超薄膜デバイスの作製を斉藤が中心となり推進した.R(O,F)BiS2単結晶(R = Pr, Nd)を剥離法により劈開し,電気抵抗測定用デバイスの作製を行った.2018年度末にデバイス作製に成功したが,超薄膜化した結晶表面に端子を作製する手法の確立に時間を要したため,磁場中測定は今後行う計画である.バルク単結晶での量子振動観測および新奇な物性の探索を目指し,水口が中心となり強磁場中物性評価を推進した.特に良質な結晶が得られたLa(O,F)BiSSeバルク単結晶に関して,強磁場中での磁気抵抗測定を行った.これらの単結晶は低温で超伝導を示すため,東北大金研の共同利用として磁気抵抗測定を推進した.結晶のc軸方向に電流を流し,25 Tまでの磁気抵抗測定を行った.その結果,La(O,F)BiSSeバルク単結晶においては量子振動が観測できなかった.

量子振動観測に向けた測定は,上述の通り,超薄膜デバイスを用いた磁気抵抗測定を今後進める計画である.一方,La(O,F)BiSSeバルク単結晶において特異な磁気抵抗の面内方向異方性を見出すことに成功した.本系は転移温度3.8 Kの超伝導体であるが,2軸ローテータにより様々な方向から磁場をかけ,磁気抵抗異方性を測定したところ,Bi-Ch伝導面内に結晶構造の回転対称性(正方晶のため4回回転対称)を破った2回回転対称性を見出した.この現象は近年注目を集めているネマティック超伝導状態と類似しており,本現象についても今後詳細に解明する予定である.研究に用いる単結晶組成はLaO1-xFxBiSSeとPrO1-xFxBiS2と確定しており,次年度は強磁場測定を3種類の試料[(1)単結晶,(2)超薄膜化した試料,(3)FIBで微細加工した単結晶]に対して行う.量子振動観測を目指し,得られたデータの解析からスピン軌道相互作用の大きさを評価する.特に,BiS2系とBiSSe系の違いやキャリア濃度の違いによるスピン軌道相互作用の大きさの変化を解明し,巨大ラシュバ効果発現の糸口を見出す.単結晶試料を育成するための原料について,当初は数種類の希土類を用いる計画だったが,LaおよびPrで本研究遂行が可能であると判断したため追加購入は行わなかった.一方,東北大金研の強磁場施設を共同利用し始めたため,次年度の出張実験費として127506円を繰り越し,利用する計画である.
形質転換ラン藻を用いたベタインの低分子シヤペロンとしての役割に関する研究

形質転換型ラン藻(Synechococcus sp PCC7942)を大腸菌のベタイン合成酵素遺伝子を持つシャトルベクターで形質転換を行った。形質転換体は細胞内に約50mMのベタインを蓄積し、耐塩性の強化が見られた。15EA02 :野生株は0.3M Nacl存在下で育成させるとCO_2固定酵素が失活していることが明らかになったが形質転換体では本酵素の失活が抑制されていた。又塩ストレス下でCO_2固定酵素RuBisCOのmRNA、蛋白質レベルの低下は見られなかった。従ってベタインはRuBisCO蛋白質のコンホメーションを安定させる効果を持つことが推察された。又塩ストレス下で育成させた野性株中のRuBisCOを抽出し、ベタインを添加すると活性が部分的に回復することを見いだした。酸で失活させたRuBisCOにシャペロニン(GroELS)を添加すると活性が回復することが知られているので、シャペロニンの代わりにベタインが効果を示すかどうかを検討した。その結果ベタインはシャペロニン様の作用を持つことが判明した。この結果をPlantJ.に投稿している。
単純ヘルペスウイルス感染細胞における粒子形成過程の解析

単純ヘルペスウイルス(HSV)感染細胞において、感染性子孫ウイルス粒子がどこでどのように形成されるのかについて感染性を指標にしながら生化学的並びに細胞生物学的な手法によりウイルス粒子形成過程を定量的に解析した。細胞内酸性小胞の小胞内pH上昇作用を示す塩化アンモニウム及びクロロキンによるウイルス増殖阻害についての解析から、HSV粒子形成部位、即ち、ウイルスヌクレオカプシドのエンベロ-プ獲得部位が細胞内酸性小区画であること、その酸性pHがウイルス粒子形成にとって重要であることを明きらかにした。試薬処理条件下でのウイルススパイクタンパク質の生合成と細胞内輸送を調べる一環として、HSV感染細胞表面への感作赤血球吸着反応のカイネテイックスを解析した。試薬処理条件下でもスパイクタンパク質の合成と輸送は正常である。また、細胞内小器官の中で最も酸性で試薬感受性の部位と知られているゴルジ体について、ブレフェルディンA(BFA)を用いてHSV粒子形成における役割について検討した。その結果、ウイルス粒子形成部位は2種類在り、感染性ウイルスはBFA感受性部位(こちらで8割のウイルス粒子が作られる)で作られ非感受性部位では非感染性粒子のみが形成されることを明らかにした。これらの結果に基づき、HSVー1感染細胞におけるウイルス粒子形成(ヌクレオカプシドのエンベロ-プメント)は、ゴルジ膜とその他の膜系(例えば、核膜)とで行われるが、感染性ウイルスは前者でのみ形成されるという仮説を提唱し、現在、検討を行っている。単純ヘルペスウイルス1型HF株のベロ細胞におけるビリオン形成過程について解析し、以下の結論を得た。1.感染性ウイルス形成は、培養液への塩化アンモニウムの添加によって直ちに停止する。ヌクレオカプシド形成は、試薬添加後、正常に継続するが、ビリオン形成は大きく形成量を減じている。試薬の作用点は、第一義的に感染性ウイルス形成であり、その主な原因はウイルスヌクレオカプシドのエンベロ-プ獲得過程(ビリオン形成過程)に対する阻害によると考えられる。2.単クロ-ン抗体を用いて調べたところ、ビリオン形成阻害条件下においてもエンベロ-プ蛋白質の合成と細胞表面への輸送は阻害されていない。さらに、感染細胞表面への感作赤血球吸着能(エンベロ-プ蛋白質の活性)の出現が試薬存在下でも阻害されないので、細胞表面のエンベロ-プ蛋白質は正常な生物活性を持つ。これらの結果は、試薬による阻害がウイルス蛋白質合成や輸送の阻害による間接的な結果ではないことを示す。3.サイクロヘキシミドの添加により感染細胞の蛋白質合成を阻害すると、感染性ウイルス形成は直ちに停止するが、ビリオン形成は正常に一時間余り継続して停止する。この結果は、感染性ウイルス形成には蛋白質合成の継続が必要であるが、ビリオン形成には必要でなく感染細胞内に必要な蛋白質のプ-ルを持つことを示す4.塩化アンモニウムと同様の阻害は、低濃度で有効なクロロキン、細胞内小胞の膨化を引き起こさず有効なトリ-N-ブチルアミン、作用機構の異なるモネンシンによっても見られる。これら試薬類の共通作用点は細胞内酸性小胞の酸性pHの中和であり、感染細胞における子孫ウイルス形成部位(ヌクレオカプシドのエンベロ-プ獲得部位)は細胞内酸性小胞であること、及び、その酸性pHが感染性ウイルス形成に必須であることを示す。単純ヘルペスウイルス1型(HSVー1)の感染性子孫ウイルスが感染細胞内のどの小器官でどのように形成されて行くのか明らかにする目的で、HSVー1のエンベロ-プメント過程について定量的な解析を行ってきている。塩化アンモニウムによるHSVー1増殖阻害についての解析から、HSVー1の粒子形成は細胞内酸性区画で行われるということを昨年度明らかにしたので、細胞内で最も塩化アンモニウム感受性部位と報告されているゴルジ体に焦点を絞り、HSVー1粒子形成におけるゴルジ体の役割について検討した。

1.ゴルジ体に特異的に作用して処理細胞からゴルジ体を消失させる薬剤ブレフェルディンA(BFA)によりHSVー1の増殖が抑えられ、HSVー1の増殖(感染性ウイルス産生)にゴルジ体が必須の役割を担っている。2.gDスパイク糖蛋白質のプロセッシングを指標にBFAのHSVー1感染Vero細胞への作用を調べたところ、試薬は添加と同時にゴルジ機能を阻害する。3.感染性ウイルス産生は試薬濃度の増加とともに指数的に減少するのに対し、ウイルス粒子形成は80%までは指数的に減少するがそれ以上の減少はなく、残り20%の粒子形成は高濃度の試薬存在下においても継続する。4.細胞内にウイルススパイク蛋白質やヌクレオカプシドが充分に蓄積されている感染後期にBFAを添加しても、試薬添加と同時に粒子形成阻害がみられ感染性子孫ウイルス形成も停止した。これらの結果、(1)HSV感染細胞内にはBFA感受性(ゴルジ体と考えている)と非感受性(核膜及びER膜と考えている)と2種類のエンベロ-プメント部位があること、(2)感染性ウイルスはBFA感受性部位からのみ生じることを示唆しており、検討を続けている。
マインドフルネス認知療法による総合的自殺対策

本年度は,自殺念慮,自殺行動に対するMBCTアプローチを行うための土台作りを行った。まず,マインドフルネスとMBCTについての概念を整理し,心理学評論他複数の雑誌に寄稿した。また,複数の学会でMBCTの効果に関する発表を行い,聴衆から意見を得た。さらに,沖縄県内で自殺に関わる政策や当事者の情報を得るため,沖縄県自殺対策連絡協議会,また沖縄県自殺総合対策行動計画策定WGに参加し,委員としての活動を行う傍ら,情報収集を行った。そして,県内自死遺族の会に参加させて頂くために運営側と協議を行った。この他,MBCTの効果プロセスに関する実験を二件行った。一つは,Top Down処理がBottom Up処理へと,優先される処理モードが変化することがMBCTの効果をもたらすメカニズムであることを示すことを目的とした介入研究であり,もう一つは,MBCTにおいて,ヴィパッサナー瞑想の中で重視される「正念」「正知」「捨」というスキルの獲得が促進されるか否かを検証した介入研究であった。いずれも,健常者の職場ストレスを対象に,8週間の標準プログラムを行ってその効果を検証した。今後学会発表,論文発表等で成果の詳細を報告する予定である。まずは,予定していた二つの研究が確実に実施できて事は大きな前進と考えている。その上で,今年度は,自殺念慮傾向のあるものへのMBCTの適用,また自殺の心理学的プロセスに対する研究を行う予定であるが,そのための土台が築けたと考えている。そのため,上記の通り判断する。次年度は,自殺念慮の生起に関わる心理学的プロセスの実証的検討を行う予定である。敗北,エントラップメント,またそれらに関わる認知的機能要因である「自伝的記憶の過度な概括化」に焦点を当てる。また,これらの成果をもとに,自殺念慮傾向がある,あるいは過去に経験した大学生を対象にMBCTの効果を検討する。そうした研究を経て,再来年度以降には,自死遺族の苦悩の軽減や企図者の再発予防に対してもMBCTを適用した実証研究を行っていきたい。さらに,MBCT指導者の養成や,マインドフルネスに基づく自殺予防教育を普及する手立ても検討していきたい。そのためには,自死遺族の会等の関連団体とも密に連携をする必要がある。そうした活動も継続的に続けていきたい。本年度購入予定であった物品(スポーツマット)について,従来購入していた業者が所在不明となっており購入が出来なかった。そこで,同様品を扱う店を探したが,購入依頼が締切ギリギリとなってしまい,結局物品の到着が期限内に間に合わなかったため。
下行性疼痛抑制系における鎮痛機構について:性差および情動との係わりについて

急性実験においては,下行性疼痛抑制系において,オピオイドの種類および投与量の違いにより,テイルフリックテストを用いた疼痛反応においては,雌雄の差が認められた.下行性疼痛抑制系の腹側中脳水道周囲灰白質(vlPAG)および延髄吻側腹内側領域(RVM)においてμオピオイドアゴニストDAMGOを微量注入したとき,また,DAMGOとともにRVMに微量注入したκオピオイドアゴニストU69593とδ2オピオイドアンタゴニストnaltriben(NTB)においては、反応に雌雄の差が認められ,下行性疼痛抑制系のRVM-PAGでの相互作用に2通りの反応が認められた.しかしながら,δオピオイドアゴニストDELTやカナビノイド受容体作動薬(WIN55,2121-2)やノシセプチン(OFQ)では,テイルフリックテストでは,疼痛反応に雌雄の差を認めなかった.コントロールのラットおよびオピオイド作動薬を投与したときのラットにおいて,脳内のオピオイド受容体およびロエンケファリン,SPおよびCGRPの分布について免疫組織化学手法を用いて調べた.脊髄および下行性疼痛抑制系のPAGおよびRVMにおいては,明らかな性差を認めなかった.オピオイド受容体の中ではμオピオイド受容体陽性神経線維が脊髄後角1,2層に最も密に認められた.しかしながら,RVMにおいては,μ,κ,δすべてのオピオイド陽性線維は非常に疎にしか認められず,また陽性細胞は認められず,性差は認めなかった.下行性疼痛抑制系よりも,側坐核,扁桃体などに認められた.これらは疼痛反応と脳内報酬系との関与を示唆していると思われる.CB-1受容体免疫陽性線維または細胞は,下行性疼痛抑制系には認めなかった.雌雄のラットにおいてDAMGO,エンドモルフィン1投与時のconditioned place preference(CPP),両性ともpreferenceを示した.また、神経因性疼痛モデルにおいてもDAMGO投与でpreferenceを示した.急性実験においては,下行性疼痛抑制系において,オピオイドの種類および投与量の違いにより,テイルフリックテストを用いた疼痛反応においては,雌雄の差が認められた.下行性疼痛抑制系の腹側中脳水道周囲灰白質(vlPAG)および延髄吻側腹内側領域(RVM)においてμオピオイドアゴニストDAMGOを微量注入したとき,また,DAMGOとともにRVMに微量注入したκオピオイドアゴニストU69593とδ2オピオイドアンタゴニストnaltriben(NTB)においては、反応に雌雄の差が認められ,下行性疼痛抑制系のRVM-PAGでの相互作用に2通りの反応が認められた.しかしながら,δオピオイドアゴニストDELTやカナビノイド受容体作動薬(WIN55,2121-2)やノシセプチン(OFQ)では,テイルフリックテストでは,疼痛反応に雌雄の差を認めなかった.コントロールのラットおよびオピオイド作動薬を投与したときのラットにおいて,脳内のオピオイド受容体およびロエンケファリン,SPおよびCGRPの分布について免疫組織化学手法を用いて調べた.脊髄および下行性疼痛抑制系のPAGおよびRVMにおいては,明らかな性差を認めなかった.オピオイド受容体の中ではμオピオイド受容体陽性神経線維が脊髄後角1,2層に最も密に認められた.しかしながら,RVMにおいては,μ,κ,δすべてのオピオイド陽性線維は非常に疎にしか認められず,また陽性細胞は認められず,性差は認めなかった.下行性疼痛抑制系よりも,側坐核,扁桃体などに認められた.これらは疼痛反応と脳内報酬系との関与を示唆していると思われる.CB-1受容体免疫陽性線維または細胞は,下行性疼痛抑制系には認めなかった.雌雄のラットにおいてDAMGO,エンドモルフィン1投与時のconditioned place preference(CPP),両性ともpreferenceを示した.また、神経因性疼痛モデルにおいてもDAMGO投与でpreferenceを示した.本年度、我々は、ラットにおいて急性実験のテイルフリック法を用いて、雄雌のラットにオピオイドを投与したときの性差について研究をおこなった。μオピオイドアゴニストである[D-Ara2,N-Me-Phe4,Gly-ol5]-Enkephalin(DAMGO)を延髄吻側腹内側領域(RVM)に投与したときには、性差が認められ、雌では、μオピオイドアゴニストに対して雄と比較してより敏感であった。DAMGOをRVMへ投与後さらにκ-オピオイドアゴニストであるU69598を中脳水道灰白質(PAG)へ投与したときには、その効果に性差が認められた.雄では、テイルフリック時間が短縮したが、雌では、その時間が延長した。このことから、下行性疼痛抑制系では、オピオイドの効果に対して性により異なった反応をすることが推測された。臨床的には、オピオイドの作用効果に性差が見られることは臨床研究でも示されており、また、ノシセプチン(OFQ)やδ-オピオイドアゴニスト、アンタゴニストでは、これまでのテイルフリックテストのを用いて性差を研究中である。まだ、今後の研究が必要である。さらに、カナビノイドやニコチン受容体作動薬についての研究も行う予定である。また、免疫組織化学法において、μオピオイドレセプター、およびδ-オピオイド