hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高視野高速掩蔽モニター観測による太陽系外縁部の解明

平成29年度の前半には、平成28年度までの研究で開発した小型広視野高速観測システムを使用した可視動画モニタ観測を実行した。平成28年度に引き続き『沖縄県立宮古青少年自然の家』(沖縄県宮古島市)の協力のもと、同施設の屋上に観測システムを設置し、平成29年6月から8月にかけて断続的に同時モニタ観測を実施した。平成29年度の後半には、計2年間のモニタ観測で得られたデータの解析を進めた。本研究は10 Hz以上の時間分解能で取得された過去の可視サーベイ観測と比較し、最大量の測光データを取得することに成功した。得られた観測データについては掩蔽候補の検出パイプラインを用いて恒星掩蔽現象の検出を試みたほか、ノイズなどによる偽イベントの検出率の算出、および掩蔽候補イベントの検出効率を算出した。以上の研究を実行した結果、カイパーベルト領域に位置する太陽系外縁天体の天球上での個数密度に対して前例のない観測的制約を得ることに成功した。現在、本研究結果に関する論文を作成し、投稿準備中である。さらに、開発した高速観測システムを用いた観測データを詳細に解析した結果、高速観測システムを用いて未知の太陽系外縁天体の掩蔽観測だけでなく、既存の観測装置では詳細な観測が不可能であった微光流星、スペースデブリ、地球近傍小天体などのトランジェント現象の観測が実現することがわかった。こうした観測成果は本研究が最終的に目指している可視高時間分解能天文学の開拓につながるものである。当該の結果の一部に関しては平成29年9月の日本天文学会秋季年会にて報告した。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度には、キロメートルサイズの太陽系外縁天体(TNO)による恒星掩蔽を検出することを目的とした、具体的な観測手法の構築を実施した。交付申請時に提案していた、国立天文台すばる望遠鏡と東京大学木曽観測所シュミットカメラ等の大型望遠鏡を用いた掩蔽観測、および掩蔽モニタ観測専用の小型広視野高速観測システムを利用したモニタ観測、の両手法について、平成26年度中に得られていた試験観測データ等を基に、掩蔽現象の検出可能性を詳細に検討した。その結果、モニタ観測専用の小型の広視野高速観測システムを開発し、それを用いて掩蔽モニタ観測を実施することで、TNOによる恒星掩蔽をもっとも効率的に検出できることを明らかにした。考案した観測システムが実際にTNOによる恒星掩蔽を検出できるのか詳細に検証するため、小型高速広視野観測システムの試作機を開発し、平成27年7月と平成28年2-3月には沖縄県宮古島市にて試験観測を実施した。試験観測によって、作成した小型高速広視野観測システムが、Vバンドでのみかけの明るさがおよそ14等よりも明るい恒星およそ3000個を、15fpsのフレームレートで高速同時測光できることを確認した。また、テスト観測で得られた恒星の光度曲線を基に、光度曲線から掩蔽現象候補を検出するプログラムの作成も実施した。平成27年7月の試験観測の結果については平成27年9月に開催された、日本天文学会秋期年会に口頭およびポスター発表で報告した。研究実績の概要欄に記載があるとおり、平成27年度にはTNOによる恒星掩蔽を検出するための、具体的な観測手法を構築し、さらに掩蔽モニタ観測を行う小型広視野高速観測システムの試作機を製作し、試験観測を実施した。さらに掩蔽モニタ観測データの解析パイプラインの作成までを達成し、一部成果についての学会での報告までを実施した。以上の進捗は当初の研究計画に記載されていた平成27年度の計画内容とほぼ合致するものであり、本計画はおおむね順調に進んでいると評価できる。平成28年度の前半には、平成27年度の研究で開発した小型広視野高速観測システムの試作機を基に、改良版の観測システムを計2台開発した。開発した観測システム改良機については『沖縄県立宮古青少年自然の家』(沖縄県宮古島市)の協力のもと、同施設の屋上に設置し、平成28年6月から9月にかけて断続的掩蔽同時モニタ観測を実施した。モニタ観測では15.4Hzのフレームレートで銀河面と黄道の交点付近の多数の恒星を2台の観測システムで同時に観測した。平成28年度の後半には、モニタ観測で得られたデータの解析を進めた。平成27年までに作成していた解析パイプラインを改良することにより、観測データ内に写り込んだVバンドでの見かけの明るさが13.5等よりも明るい約4000個の恒星を同時に測光することができることを実証した。この結果は、本研究で開発した観測システムが、既存の観測装置の中では最も効率よく多数の恒星を同時に高速測光できる観測装置であり、発生確率が極めて小さいTNOによる恒星掩蔽現象を検出できる可能性があることを実証するものである。本研究結果に関しては平成28年9月の日本天文学会秋季年会および平成29年3月の日本天文学会春季年会で発表を行った。また、同内容に関する論文を作成し、投稿した。さらに、モニタ観測で得られた観測データを詳細に分析した結果、見かけの明るさが5等-10等の微光流星が2台の観測システムで同時に観測されていることがわかった。こうした現象を複数台の観測装置で同時検出できた例はこれまでほとんどなく、本研究が開拓している可視高時間分解能天文学の威力を示すものである。現在、観測された微光流星について解析中である。

研究実績の概要欄に記載した通り、平成28年度には太陽系外縁天体による恒星掩蔽を検出するための観測システムを開発し、掩蔽検出を目指したモニタ観測を実行した。また観測データの解析パイプラインの作成も達成した。以上の進捗は平成28年度の実行計画をほとんど達成したと考えられる。これらの成果に加え、開発した観測システムを用いた微光流星などの既存の観測装置ではほとんど観測例のないトランジェント現象の観測にも成功した。こうした観測成果は本研究が最終的に目指していた高時間分解能天文学の開拓につながるものであり、当初の計画以上に進展していると考える。以上から、本研究は全体として概ね順調に進展していると結論づける。平成29年度の前半には、平成28年度までの研究で開発した小型広視野高速観測システムを使用した可視動画モニタ観測を実行した。平成28年度に引き続き『沖縄県立宮古青少年自然の家』(沖縄県宮古島市)の協力のもと、同施設の屋上に観測システムを設置し、平成29年6月から8月にかけて断続的に同時モニタ観測を実施した。平成29年度の後半には、計2年間のモニタ観測で得られたデータの解析を進めた。本研究は10 Hz以上の時間分解能で取得された過去の可視サーベイ観測と比較し、最大量の測光データを取得することに成功した。得られた観測データについては掩蔽候補の検出パイプラインを用いて恒星掩蔽現象の検出を試みたほか、ノイズなどによる偽イベントの検出率の算出、および掩蔽候補イベントの検出効率を算出した。以上の研究を実行した結果、カイパーベルト領域に位置する太陽系外縁天体の天球上での個数密度に対して前例のない観測的制約を得ることに成功した。現在、本研究結果に関する論文を作成し、投稿準備中である。さらに、開発した高速観測システムを用いた観測データを詳細に解析した結果、高速観測システムを用いて未知の太陽系外縁天体の掩蔽観測だけでなく、既存の観測装置では詳細な観測が不可能であった微光流星、スペースデブリ、地球近傍小天体などのトランジェント現象の観測が実現することがわかった。こうした観測成果は本研究が最終的に目指している可視高時間分解能天文学の開拓につながるものである。当該の結果の一部に関しては平成29年9月の日本天文学会秋季年会にて報告した。今後も当初の研究計画通りに研究を実施する予定である。まず平成28年度には開発した広視野高速観測システム二台を用いた掩蔽モニタ観測を実施する。平成28年度はキロメートルサイズのTNOによる掩蔽現象の初検出を目指し、TNOの天球密度が高いと推定される黄道付近を集中的にモニタ観測する。さらに平成29年度にもモニタ観測を継続して実施する予定である。観測の進捗状況に応じて国内および国際学会にも参加する。また、モニタ観測中に掩蔽現象候補の検出ができ次第、検出を報告する論文を投稿する予定である。平成29年度も、平成28年度に引き続き、作成した掩蔽モニタ観測システム2台を用いたモニタ観測を継続する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
樹状細胞と腫瘍の融合細胞を用いた癌ワクチン療法の第I/II相臨床試験

今回我々は、標準的治療法が無効な進行再発消化器癌に対する腫瘍細胞と樹状細胞の融合細胞ワクチンの第I相臨床試験を終了した。さらに化学療法と融合細胞ワクチンの併用療法に関する基礎的検討を行った。(1)癌細胞と樹状細胞との融合細胞ワクチンを用いた臨床試験:倫理委員会の承認のもと、癌細胞と樹状細胞を融合させた細胞融合ワクチンの第I相臨床試験を標準的治療法が無効な進行再発消化器癌13例を対象に施行した。腫瘍細胞は、手術時の摘出腫瘍を酵素処理して用いた。樹状細胞は、末梢血単核球をサイトカインカクテル(GM-CSF,IL-4,TNF-α,IL-1β,IL-6,PGE2)で刺激し誘導した。その結果、いずれの症例も重篤な副作用を認めなかった。治療効果はPR1例、SD5例、PD7例であった。PRおよびSD症例において、ワクチン投与後Th1系サイトカイン(IFN-γ、IL-2)の増加ならびにTh2系サイトカイン(IL-10,IL-4)の低下を認めた。さらに、PR,SD症例において、免疫抑制因子である血中IAPおよびTGF-βの低下を認めた。これらの結果から、融合細胞ワクチンの安全性ならびに抗腫瘍免疫の誘導能が確認された。(2)融合細胞ワクチンと化学療法との併用療法に関する検討:マウスの肺転移における、融合細胞ワクチンと化学療法剤(TS-1,5-FU,CDDP)の併用療法の検討を行った。腫瘍細胞はMC38を用い、樹状細胞は骨髄細胞をGM-CSFとIL-4で刺激培養して作成した。マウスにMC38を尾静脈内投与した後、TS-1+融合細胞、5-FU+融合細胞、CDDP+融合細胞と融合細胞、TS-1、5-FU、CDDP単独投与群を比較検討したところ、各併用群は単独群に比較して有意に肺転移数が減少した。さらに化学療法剤との併用群でも脾臓のCTL誘導能の上昇が認められた。以上の結果から、融合細胞とTS-1,5-FU,CDDPといった化学療法との併用療法の有用性が示唆された。我々はこれまで、樹状細胞と腫瘍の融合細胞を用いた癌ワクチン療法の検討を行ってきた。今回は進行再発消化器癌患者の第I相臨床試験を終了し、さらにallogeneousな腫瘍細胞の臨床応用の可能性について検討を行った。1.樹状細胞と腫瘍の融合細胞療法による第I相臨床試験(1)標準的治療法無効な進行再発消化器癌を対象に樹状細胞と腫瘍の融合細胞療法の第I相臨床試験をを10例に施行し以下の結果を得た。(1)安全性:全例に重篤な副作用はみとめられず、安全性が確認された(2)腫瘍免疫の誘導:10例中、6例でDTH反応,Th1/Th2.Tc1/Tc2バランスの改善を認めた。(3)臨床効果:10例中、SD6例、PD4例であった。(2)DNAチップを用いた癌細胞のプロファイルの検討血清腫瘍マーカー発現の有無にかかわらず、癌細胞のプロファイルを検討した。2.自己の樹状細胞とallogeneousな腫瘍細胞からなる融合細胞の検討ヒト由来樹状細胞とallogeneousな腫瘍細胞の融合細胞を作成し、抗原提示能およびCTL誘導能をin vitro assayで検討したところ、CTL活性の誘導が確認された。

1臨床試験:標準的治療法が無効な進行再発消化器癌を対象に、樹状細胞と腫瘍の融合細胞を用いた癌ワクチン療法の第I相臨床試験を行った。目標症例数12例を終了し、以下の結果を得た。(1)全例に重篤な副作用を認めず、安全性が証明された。(2)臨床効果は、PR1例、SD6例、PD5例であった。(3)DTH反応、Th1/Th2バランス、血清中抗ペプチド抗体の測定結果から、12例中約半数の症例で抗腫瘍免疫の誘導が確認された。これらの結果から、進行再発消化器癌症例における融合細胞ワクチン療法は、重篤な副作用を認めず、抗腫瘍免疫誘導および一部の症例に腫瘍縮小効果を認めることから、癌ワクチン療法としての有用性が示唆された。2.基礎実験:マウスの消化器癌転移モデルを用い、融合細胞ワクチン療法と、他の免疫療法との併用効果について検討した。その結果、NKTおよびNK細胞との併用において、融合細胞ワクチンの転移治療効果が亢進することが判明した。化学療法剤との併用においては、現在TS1との併用効果の検討を進めている。1第I相臨床試験標準的治療法が無効な進行再発消化器癌を対象に、樹状細胞と腫瘍の融合細胞を用いた癌ワクチン療法の第I相臨床試験を行った。目標症例数13例を終了し、以下の結果を得た。(2)臨床効果は、PR1例、SD6例、PD6例であった。(3)末梢血Th1/Th2バランス、DTH反応、血清ペプチド抗体の測定結果から、PRおよびSD症例で抗腫瘍免疫の誘導が確認された。(4)免疫抑制因子である血清1畑およびTGF-βを測定したところ、PD症例はPRやSD症例に比べ上昇する傾向を認めた。(5)進行再発消化器癌症例における融合細胞ワクチン療法は、重篤な副作用を認めず、抗腫瘍免疫誘導および一部の症例に腫瘍縮小効果を認める、癌ワクチン療法としての有用性が示唆された。2.第II相臨床試験消化器癌を対象に、樹状細胞と腫瘍の融合細胞ワクチンおよび化学療法剤との併用療法による第II相臨床試験を開始した。現在、症例を集積中である。
活性化フライアッシュの創造技術の開発

近年の石炭火力発電所の増設に伴い、副産物として発生する石炭灰の量が増加し、平成19年度末には年間1000万トンを超えることが確実視されている。この大量に発生する石炭灰を資源として有効活用する用途としてコンクリート用混和材としての利用が最も有望視されている。しかし、我が国の建設工事では、フライアッシュを使用したコンクリートの使用実績はまだ少ない。この原因としては、(1)セメントの一部をフライアッシュに置換した際の初期強度発現性の低下、および、(2)燃焼方法の違いや石炭の種類の違いなどによる品質の大幅な変動が挙げられる。このため本研究では、これらの問題点を解決するための新たな手法として活性化フライアッシュの開発を試みるとともに、その実用性について検討した。研究初年度においては、微粉砕したフライアッシュに添加剤としてNaOHを添加した場合に、良好な圧縮強度の改善効果が得られた。しかし、この圧縮強度の改善効果は、その後の追加実験で再現性が低いことが明らかとなり、その原因特定と品質安定化のための改善策の検討が必要となった。研究2年目である本年度においては、品質改善効果の安定化に向けた実験を中心に行った。まず、過去の実験条件および結果の再調査を行い、再現性が得られなかった原因として、養生水のイオン濃度が一定でなかったことが考えられた。このため、養生水を水酸化カルシウム水溶液として、養生水中への成分溶出を低減した条件で再実験を行った。その結果、ある程度の品質改善効果の安定化傾向が得られた。しかし、養生水のイオン濃度で品質を制御することは、現実的ではないと考えられるため、実用化を視野に入れた手法の開発が今後の課題となる。本年度の研究では,以下に示す3種類のフライアッシュの活性度の改善手法およびそれらの組合せ効果を試し,その品質改善効果を立証するとともに品質改善メカニズムの解明を試みた。1)化学処理によるフライアッシュ粒子の表面形状改変による活性度の改善2)フライアッシュ粒子の微粉砕による活性度の改善3)添加剤の混合による活性度の改善その結果,「1)化学処理による表面形状の改変」に関しては,充分な活性度の改善効果が得られず,使用する薬剤および処理条件について再検討が必要であると考えられる。「2)微粉砕による活性度の改善」に関しては,複数種類のフライアッシュにおいて一定の活性度の改善効果が得られた。これに対して,「3)添加剤の混合による活性度の改善」に関しては,一部のフライアッシュにおいて「2)微粉砕」と組み合わせることにより非常に大きな活性度の改善効果が得られたのに対し,他のフライアッシュでは組合せの効果が全く現れないことも明らかとなった。これは,フライアッシュの種類(火力発電所の炉の違い,燃焼温度の違い,使用する炭種の違いなど)が活性度の改善効果に大きく影響していることを示しており,複数のフライアッシュに対して行ったX線回折の結果からも,その組成には大きなばらつきが存在することが明らかとなった。このため,安定的にフライアッシュの活性度を改善するには,新たに他の方法を導入する必要があることが明らかとなり,次年度の研究計画としては,「4)焼結炉を用いた添加剤の合成による活性度の改善」に関する検討を引き続き行っていく予定である。
柔軟なポリイミン配位子を用いた銀サブナノクラスターの精密合成法の開発

ポリイミン配位子は、イミン性窒素により多数の銀イオンを捕捉できる。銀イオンを還元してクラスターに変換するとき、配位子が柔軟であればクラスターから離れずに配位状態を保つことが可能となる。このようにクラスター表面が覆われた状態を保つことができれば、クラスター同士の凝集も防げる。申請者はこれまでに、柔軟な多座配位子としてイソピラゾールを基本骨格とするポリイミンを合成した。長さ・配位点数の異なる一連のポリイミンを用いて正確に銀イオンを捕捉し、還元することで銀サブナノクラスター合成を行う。
炭素質薄膜の電子物性の制御とそのデバイス化

先に我々はp-キシロキノン(PXQ)を原料とした炭素質薄膜とn-型シリコン(n-Si)との積層体(C/n-Si)が整流作用を有し、さらに太陽電池特性を発現することを見い出した。しかしながら、その再現性・調製条件の最適化に問題点があった。また、PXQのみでしか、この太陽電池特性は発現できていないことから、他の原料種での太陽電池特性発現の可能性、さらなる特性の向上、炭素質薄膜自身の物性制御の可能性等検討課題が残っていた。また、セル構成の改良点も多くあり、これらを通して安定的に高い変換効率を有する太陽電池の作製に興味がもたれる。そこで本研究では、炭素質薄膜の構造・物性の把握、さらに物性制御の可能性を追及するとともに、C/n-Si積層体の太陽電池特性の高効率化を目的とし、含酸素官能基を有する4種の芳香族化合物を原料とした熱CVD法により生成する薄膜の生成過程と得られる炭素質薄膜の電子物性(ここでは電気伝導度)についてその調製条件等の影響を検討し、その最適化を行った。その結果、ピロメリット酸二無水物(PMDA)が最も低温(500°C以下)から導電性の薄膜を生成し、官能基構造・芳香族構造それぞれが反応性に大きく影響していることがわかった。また、薄膜の電気伝導率は膜厚とは直接関係なく成長速度に大きく影響され、速度が遅いほど高伝導性の薄膜を生成した。また、PMDA系薄膜とn-Si積層体について光電素子としての可能性を調べた結果、太陽電池特性を示し、さらに調製条件の最適化を行うことで最高変換効率6.5%で、ほぼ安定的に5%を超える調製条件が確立された。本積層体の接合はショットキー接合に近いヘテロ接合であることが示された。
多関節系の身体運動におけるセグメント間の協調

身体は多関節系であり,様々な関節まわりの運動が複合して目的の一つの運動が成り立っている。本研究では,これらを個々の関節の運動として分析するだけでなく,各関節運動の動的な関係を分析することによって,身体運動における全体の安定性と部分の関節運動の協調性についてを明かにすることを目的とした。運動中に身体の中では,中枢神経から筋への情報の流れと同時に,運動によって筋から中枢系へ向かう情報が流れがある。そこで本研究では,力学的に安定な状態における神経情報の中枢系と運動系との入出力の関係を情報理論を用いて明かにするという方法を用いた。各関節運動の軌道がその運動が持つ情報のパターンとして仮定して,さらに,それらの情報の入出力の関係を相互情報量を用いて,間接的に調べることによって,全体の身体運動と部分の関節運動の協調性を考察した。実験は,被験者に様々なパターンで上肢をスイングさせながら,力学的に安定な立体姿勢を保持させ,その際の上肢の運動をゴニオメーターを用いて関節の角度変化として抽出すると共に,全身の安定性の指標として,足圧中心の変化をフォースプレートを用いて測定した。足圧中心の軌道と,関節運動の軌道の変動のパターンから,それらの間で流れる情報を,相互情報量を用いて相対的に計算した。その結果,足圧中心の運動パターンは,様々なパターンの関節運動の情報を受け入れ蓄積する能力に優れていた。これらのことから,力学的に安定な全身の姿勢は,運動中の様々な関節の情報を受け入れながら動的に安定している状態であると考えられた。
DDS製剤の体腔内投与を介した新規がん治療法の開発

悪性胸膜中皮腫や胃がん腹膜播種転移など、胸腔や腹腔のいわゆる体腔内で増殖・浸潤した悪性腫瘍に対する新規治療法として、ドラッグデリバリーシステム(DDS)を利用したナノキャリア製剤の体腔内投与の有用性を評価した。胸膜中皮腫モデルマウスを作成し、ナノキャリア製剤として薬剤封入リポソームあるいは核酸搭載リポソームを胸腔内投与したところ、いずれも胸腔内での高い滞留性を示すとともに、胸膜中皮腫に対する高い治療効果を発揮した。体腔に浸潤した悪性腫瘍に対して薬剤の体腔内直接投与は非常に有効な治療法となり得るが、これを支持する根拠は乏しい。本研究課題は、ドラッグデリバリーシステム(DDS)を応用し、腫瘍環境下の体腔に投与されたナノキャリアおよび核酸/ナノキャリア複合体の体内動態を解析することで、当該疾患治療のための体腔内投与の有用性を支持する学術的根拠を示すことである。Luciferaseを恒常発現させたヒト胸膜中皮腫細胞(MSTO-211H-Luc)およびヒト胃がん細胞(NCI-N87-Luc)をそれぞれヌードマウスの胸腔内および腹腔内に移植することで、胸膜中皮腫モデルマウスおよび胃がん腹膜播種モデルマウスを作成した。移植した腫瘍の成長は、IVISを用いて非侵襲的に観察した。次に、作成したモデルマウスを用い、近赤外蛍光プローブのDiRで標識したナノキャリアの体腔内投与後の動態をIVISで観察した。胸膜中皮腫モデルマウスにカチオニックリポソーム(CL)あるいは核酸搭載CL(リポプレックス;Lpx)を胸腔内投与したところ、CLが投与24時間以内で全身循環へ移行したのに対し、Lpxは投与120時間まで顕著な移行は見られなかった。また、正常マウスでの動態と比較して、明らかな胸腔内滞留性の向上が認められた。同様に、胃がん腹膜播種モデルマウスにCLあるいはLpxを腹腔内投与したところ、どちらも正常マウスと比較した腹腔内滞留性の向上・血流への移行性低下が見られ、腹膜腫瘍への高い集積が認められた。さらに、凝集性Lpxにおいてこの傾向はさらに顕著となった。これらのことから、腫瘍が存在するという特殊な環境においてのみ体腔内投与したナノキャリアの体腔内滞留性が向上し、さらにそれは核酸/ナノキャリア複合体においてより顕著になることを明らかとした。本研究課題の目的は、ドラッグデリバリーシステム(DDS)を応用し、腫瘍環境下の体腔に投与されたナノキャリアおよび核酸/ナノキャリア複合体の体内動態を解析することで、当該疾患治療のための体腔内投与の有用性を支持する学術的根拠を示すことである。平成26年度では、MSTO-211Hヒト胸膜中皮腫細胞をマウス胸腔内に移植することで作成した胸膜中皮腫モデルマウスにおいて、カチオン性リポソーム(CL)および核酸搭載CL(リポプレックス;Lpx)が胸腔内投与後に長時間胸腔内に滞留することを見出した。そこで平成27年度においては、抗がん剤封入CLおよびLpx胸腔内投与による胸膜中皮腫治療効果を評価した。抗がん剤として当該疾患に対する標準治療にも用いられるペメトレキセド(PMX)を選択し、脂質組成の異なる2種類のCLを用いてPMX封入CL(PMX/Non-Chol CL、PMX/Chol CL)を調製した。各PMX封入CLの胸腔内投与による治療評価を行ったところ、PMX放出性の高いPMX/Non-Chol CLでは高い抗腫瘍効果が認められたのに対し、遊離型PMXおよびPMX放出性の低いPMX/Chol CLではそれがほとんど見られなかった。また興味深いことに、PMX/Non-Chol CL投与群の腫瘍内PMX量はPMX/Chol CL投与群の4分の1程度であり、PMX胸腔内投与による当該疾患治療のためにPMXを効率的に暴露させる放出制御型DDSキャリアの利用が重要であることが示された。次に、Lpx胸腔内投与による治療評価のため、腫瘍の成長に深く関与するチミジル酸合成酵素(TS)の発現を特異的に抑制するshRNAとカチオン性リポソームとの複合体(TS Lpx)を調製した。これを胸膜中皮腫モデルマウスに胸腔内投与したところ高い抗腫瘍効果が認められ、PMXとの併用投与で更に顕著な腫瘍増殖抑制およびマウス延命効果が認められた。以上より、TS Lpxの胸腔内投与は胸腔内長期滞留に起因する高い抗腫瘍効果を発揮することを明らかとした。当初予定していた、胸膜中皮腫および胃がん腹膜播種の同所移植モデルマウスの確立に成功し、それを用いてナノキャリアおよび核酸/ナノキャリア複合体の体腔内投与後の動態を評価することに成功したため。27年度が最終年度であるため、記入しない。

確立した同所移植モデルマウスを用い、核酸/ナノキャリア複合体の体腔内投与後の動態を継続して解析すると共に、核酸/ナノキャリア複合体の体腔内投与によるがん治療評価を行うことで、本研究課題の推進に努める。27年度が最終年度であるため、記入しない。
相互補完型マルチハイスループット技術による次世代放射線影響研究

I.III.の研究実施計画に沿って、以下の研究を行った。I.ハイスループット技術によるγ線照射下の細胞の生物学的指標のデータベース構築>未照射、0.007、0.069、0.347、0.694、1.388 mGy/minの線量率の異なるγ線持続照射環境で培養したヒト由来線維芽細胞を用いて、DNA損傷修復とストレス応答に関わる細胞内因子について免疫蛍光染色を行い、全自動共焦点レーザー顕微鏡画像撮影装置を用いて画像取得した。既存の画像解析ソフトを用いて、細胞形態と複数の細胞内因子の発現量及び局在変化について数値化し、データ化を行った。また、画像解析のデータを、平均値と分散及び時間変化を同時に解析することが可能な新しい解析ソフトの開発を行い、複数のハイスループットデータを解析を可能とするシステムを構築した。その結果、放射線照射の線量に依存したストレス応答と細胞運命との関連性について新たな知見が得らえた。II.siRNAライブラリによる細胞運命決定責任遺伝子の網羅的逆遺伝学スクリーニング>I.のデータと前年度の二次遺伝子スクリーニングの結果に基づいて、0.0690.694 mGy/minの照射環境下で現れる主な細胞応答の責任遺伝子であるクロマチン制御複合体の一つについて、発現抑制細胞の放射線応答性の解析を行ったところ、上皮間葉転換(EMT)を制御する遺伝子群の発現によって細胞老化の感受性が変化する可能性が示唆された。III.細胞運命決定の責任遺伝子の機能解析>クロマチン制御複合体を含む細胞応答責任遺伝子候補群のいくつかについて、照射された細胞での発現量変化、動態解析と、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子欠損細胞の樹立し、細胞老化を制御する遺伝子機能を解析した。以下のI.III.の研究実施計画を遂行した。I.ハイスループット技術によるγ線照射下の細胞の生物学的指標のデータベース構築0、0.007、0.069、0.347、0.694 mGy/minのγ線持続照射環境で培養したヒト線維芽細胞の次世代シーケンサRNA-Seqデータについて、新たな解析手法を確立し、各々の遺伝子の発現量解析を統合的に行った。その結果、0.347 mGy/minまでは段階的に、0.694 mGy/minで著しく減少する遺伝子群が抽出された。それらの遺伝子群を分類し、線量率と時間依存的な発現量変化をデータ化した。また、ハイスループットの分子イメージング解析によって細胞の分子応答・形態変化についてデータ化を行った。II. siRNAライブラリによる細胞運命決定責任遺伝子の網羅的逆遺伝学スクリーニングI.のデータに基づいて、持続照射環境での細胞応答性を定量化し、網羅的逆遺伝学スクリーニング法を確立した。確立したスクリーニング法によって、0.347、0.694 mGy/minの持続照射での細胞応答が変化する遺伝子を多数見出した。0.694 mGy/minの照射環境下で現れる主な細胞応答の責任遺伝子候補を1次スクリーニングで複数同定した。III.細胞運命決定の責任遺伝子候補の機能解析0.694 mGy/minの照射環境下の細胞応答に必要な遺伝子群について2次スクリーニングを行い、責任遺伝子の候補群を決定した。また次年度に向け、それらの遺伝子群およびそれらによって構成される複合体の機能解析の実験準備を行った。持続照射環境での細胞応答データ収集と細胞応答の責任遺伝子の同定はおおむね順調に進展している。責任遺伝子の同定について1次スクリーニングのデータ収集は順調であるいが、データ解析には更に時間を費やす必要がある。I.III.の研究実施計画に沿って、それぞれ以下の研究を行った。I.ハイスループット技術によるγ線照射下の細胞の生物学的指標のデータベース構築>未照射、0.007、0.069、0.347、0.694、1.388 mGy/minの線量率の異なるγ線持続照射環境で培養したヒト由来線維芽細胞を用い、DNA損傷に関わる様々な細胞内因子について蛍光免疫染色の条件を検討し、免疫染色を行った。全自動共焦点レーザー顕微鏡画像撮影装置と画像解析ソフトを用いて、細胞形態と複数の細胞内因子の発現量及び局在変化について数値化し、データ化を行った。また、全自動画像撮影装置を用いたアポトーシス、細胞周期分布、細胞老化の表現型の定量的解析系を開発した。II.siRNAライブラリによる細胞運命決定責任遺伝子の網羅的逆遺伝学スクリーニング>I.のデータと前年度の2次遺伝子スクリーニングの結果に基づいて、0.0690.694 mGy/minの照射環境下で現れる主な細胞応答の責任遺伝子候補群をいくつかに絞り込んだ。更に、それぞれの遺伝子の抑制細胞と次世代シーケンサを用いたRNA-seqのデータを組み合わせた解析を行うことで、細胞運命決定の責任遺伝子群としてクロマチン制御複合体の一つを同定した。III.細胞運命決定の責任遺伝子の機能解析>クロマチン制御複合体を含む細胞応答責任遺伝子候補群のいくつかについて、照射された細胞での発現量変化、動態解析と、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子欠損細胞の樹立作業を行った。持続照射環境下での線量率依存的な異なる細胞応答性の解析と、それぞれの細胞応答を制御する責任遺伝子の同定及び機能解析は、おおむね順調に進展しているものと考える。早期の遺伝子欠損細胞の樹立が現在の課題である。また、データベースの構築には更に時間を費やす必要があるものと考えられる。

I.III.の研究実施計画に沿って、以下の研究を行った。I.ハイスループット技術によるγ線照射下の細胞の生物学的指標のデータベース構築>未照射、0.007、0.069、0.347、0.694、1.388 mGy/minの線量率の異なるγ線持続照射環境で培養したヒト由来線維芽細胞を用いて、DNA損傷修復とストレス応答に関わる細胞内因子について免疫蛍光染色を行い、全自動共焦点レーザー顕微鏡画像撮影装置を用いて画像取得した。既存の画像解析ソフトを用いて、細胞形態と複数の細胞内因子の発現量及び局在変化について数値化し、データ化を行った。また、画像解析のデータを、平均値と分散及び時間変化を同時に解析することが可能な新しい解析ソフトの開発を行い、複数のハイスループットデータを解析を可能とするシステムを構築した。その結果、放射線照射の線量に依存したストレス応答と細胞運命との関連性について新たな知見が得らえた。II.siRNAライブラリによる細胞運命決定責任遺伝子の網羅的逆遺伝学スクリーニング>I.のデータと前年度の二次遺伝子スクリーニングの結果に基づいて、0.0690.694 mGy/minの照射環境下で現れる主な細胞応答の責任遺伝子であるクロマチン制御複合体の一つについて、発現抑制細胞の放射線応答性の解析を行ったところ、上皮間葉転換(EMT)を制御する遺伝子群の発現によって細胞老化の感受性が変化する可能性が示唆された。III.細胞運命決定の責任遺伝子の機能解析>クロマチン制御複合体を含む細胞応答責任遺伝子候補群のいくつかについて、照射された細胞での発現量変化、動態解析と、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子欠損細胞の樹立し、細胞老化を制御する遺伝子機能を解析した。次年度は持続照射環境での細胞応答データ収集を引き続き行い、細胞応答責任遺伝子の2次スクリーニングで得られた結果を再検証し、それらの遺伝子の機能解析を行う。また、それらの遺伝子の機能抑制細胞について、データ収集と解析を行う。次年度は、持続照射環境下での線量率依存的な細胞応答責任遺伝子の機能解析を主な研究計画として実施する。また、計画に沿ってハイスループット機器によって収集されたデータを用いたデータベースの構築を目指す。1次スクリーニングの解析が予定より若干遅れているため、試薬の購入が遅れており、次年度に繰り越す必要があるため。遺伝子欠損細胞の樹立に想定よりも時間がかかっており、研究計画の遺伝子機能解析に若干の遅れが生じている。樹立ができ次第、解析を行うため、その費用を次年度に繰り越すこととした。次年度に引き続きスクリーニング解析を行い、計画通りに執行する。
New-timerマウスを用いた膵β細胞成熟化機構の解明

従来、β細胞は専ら膵管から新生すると考えられてきたが、直接的な証拠はなかった。我々は新生β細胞の位置情報を解析するための遺伝子改変マウスを作成し、“β細胞がどこから生まれるか?"を解析した。その結果、新生β細胞には膵管に近接して存在する前駆細胞から分化する「膵管近接型新生β細胞」と既存の成熟β細胞と血管内皮細胞に近接して分化する「血管近接型β細胞」の2つの分化様式が存在することが明らかとなった。以前作製したinsulin promoter-eGFP-IRES-mRFP (MIP-G-R)のコンストラクトを受精卵に注入することによりtransgenicマウス作製を試みた(日本エスエルシーに依頼)。86匹の産仔のうち12ラインがMIP-G-R陽性であったが、β細胞にGFPあるいはRFPの発現を認めなかった。Genotyping陽性にも関わらず蛍光が観察できなかった原因は明らかではないが、複数コピーのtransgenesが染色体に組み込まれるよりは1コピーeGFP-IRES-mRFPがInsulin 1 locusにノックインされたマウスの方が適正量のtransgenes発現を誘導できるのではないかと考え、CRISPR/Casシステムを用いてknock-in newTimerマウスを作製している。Insulin-new-Timerマウスを作製し、生後0.5日(P0.5)のInsulin-new-Timerマウスの膵臓を摘出共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、膵管近傍に緑色蛍光細胞を認め、膵管からやや離れたところに黄色細胞(=分化したβ細胞)で構成される膵島様クラスターを認めた。これらのデータは内分泌前駆細胞からβ細胞へと分化した後に膵管から離れて行き、膵島を形成する過程が想起される。一方、緑色蛍光細胞の中には膵管から離れた箇所に存在し、同時に既存の膵島様クラスターと血管内皮細胞に近接して存在しているものもあった。これらのデータは既存の概念と異なり、膵管から離れた場所でβ細胞が新生し、その新生には血管内皮細胞からのシグナルが必須であることが予想された。当初予定していたトランスジェニックマウスの作成が思い通りに進まなかったことが、研究の遅れが生まれている。しかし、上述したように、それの代案であり、さらに研究目的にふさわしいマウスの作成を計画しながら、次善の策を用いて、研究目的を達成しようとしている。代謝学CRISPR/Casシステムを用いたknock-in newTimerマウスを作製するため、本学遺伝子解析モデル研究室の多田昇弘博士との共同研究を行なっている。胎生13.5日および、17.5日のIns-G;Ins-Rマウス胎児膵を用いてex vivo cultureを行い、緑色陽性細胞が実際に赤色蛍光を呈することを確認する。様々な発生段階のIns-G;Ins-Rマウス胎児膵を観察することで緑色蛍光細胞=新生β細胞がいつ、どこから生まれてくるのか解明したい。
「気になる」幼児に対する運動発達支援を通した自己コントロール感の形成

本研究では、「気になる」幼児の運動バランスを発達させると同時に自己コントロール感を形成することを目的とした。一連の研究から、(1)「気になる」子どもは2つの課題を同時にこなす二重課題に困難さを持っていること、(2)「気になる」子どもは、健常児に比べて運動に対する自己評価が低いことが示唆された。以上の結果から、運動調整の発達は「気になる」子どもの特徴を捉えるための重要な指標となり得ること、また運動協応の遅れが有能感・自尊感情の低下や対人関係に影響することが示唆された。<研究の目的>2010年度は、「気になる」幼児の運動調整の特徴を明らかにするために、しっかり渡せ「王冠リレー」課題と「タッチゲーム」課題を用いた2つの研究を行い、「気になる」子どもと他児の運動発達の特徴、とりわけ運動協応の特徴を比較した。<方法と結果>1.しっかり渡せ「王冠リレー」における運動協応の発達に関する研究:頭に「王冠」を載せ、それを落とさないように慎重になおかつ素早く移動するリレーをひとり条件とペア条件の2つの条件で行った。対象は、保育所の4歳児クラスと5歳児クラスの幼児であり、I期(5月6月)とII期(10月11月)の2回行われた。その結果、「気になる」子どもは他児に比べて、運動調整が難しいことが分かった。また、それは自分自身の運動だけでなく他児との調整も同時に行うペア条件において一層顕著になるということが明らかになった。2.タッチゲームによる運動協応の発達に関する研究:相手にタッチされないように特定のゾーンを通過して、反対側にあるマーカーを取るという「タッチゲーム」を行い、その攻撃得点と守備得点を算出した。対象は、保育所の3歳児クラス、4歳児クラス、5歳児クラスの幼児であった。また、年齢間の比較を行うための1回限りの横断的データと5歳児クラスの子どもを年間6回観察した縦断データの両方を取った。その結果、「気になる」子どもは他児に比べて得点が低く、対人的な運動調整を求められる課題に難しさを抱えている傾向があることが明らかになった。また、年齢間の比較を行う上では攻撃得点も守備得点も有効な指標であったが、18名の縦断データを分析したところ、縦断的な変化を追跡するためには、攻撃得点よりも守備得点の方が有効な指標となることが分かった。<研究の目的>2011年度は、「気になる」子どもの運動発達の特徴を明らかにするとともに、「気になる」子どもの運動に関する自己コントロール間を明らかにすることを目的とした。<研究の方法>(1)対象:保育所の4,5歳児混合クラスの幼児。(2)手続き:「ジグザグ・マーカー取り」「的当て」「サッカー・ゲーム」を1セットとする運動発達支援を行い、その後、それらの課題についての幼児の自己評価について聞き取りを行った。(3)研究期間:2011年7月2012年2月までの間に5回の運動発達支援と幼児の自己評価に関する測定が行われた。運動発達支援は、宮城県サッカー協会のコーチ3名によって実施され、幼児の自己評価の測定は発達心理学を専攻する大学院生、学部生によって行われた。<結果と考察>(1)「ジグザグ・マーカー取り」「的当て」「サッカー・ゲーム」の運動得点に関しては、「気になる」子どもとその他の子どもとの間には大きな違いは認められなかった。(2)運動の自己コントロールに関する自己評価得点については、前期においては、「気になる」子どもとその他の子どもとの間で違いがなかったが、後期においては、その他の子どもに比較して「気になる」子どもにおいて自己評価が低くなる傾向が認められた。(3)すなわち、「気になる」子どもにおいては、自分が行った運動に関する自己コントロール間が次第に低下する傾向があるのではないかということが示唆された。これは、運動そのものの低下とは連動せず、他児との比較などから次第に自分の運動能力、結果について高い評価を下せなくなる傾向が「気になる」子どもに生まれるのではないかということを示唆している。この点ついては、従来、小学校高学年頃から発達性協調運動障害の子どもの運動に関する自己評価が低下することが指摘されてきたが、「気になる」子どもにおいては幼児期からそのような傾向が見られることが示唆された。<研究の目的>2012年度は、「気になる」子どもと発達障害児の運動発達の特徴を明らかにするとともに、「気になる」子ども及び発達障害児の運動に関する自己コントロール間を明らかにすることを目的とした。<研究の方法>1対象:保育所の4,5歳児混合クラスの幼児。2手続き:「ジグザグ・マーカー取り」「ジグザグ・ドリブル」「サッカー・ゲーム」を1セットとする運動発達支援を行い、その後、それらの課題についての幼児の自己評価について聞き取りを行った。

3研究期間: 2012年5月2012年2月までの間に5回の運動発達支援と幼児の自己評価に関する測定が行われた。運動発達支援は、宮城県サッカー協会のコーチ3名によって実施され、幼児の自己評価の測定は発達心理学を専攻する大学院生、学部生によって行われた。<結果と考察>1「ジグザグ・マーカー取り」「ジグザグ・ドリブル」「サッカー・ゲーム」の運動得点に関しては、発達障害児はマッチング児に比べてその得点が低かった。また、2運動の自己コントロールに関する自己評価得点についても、発達障害児はマッチング児に比べて自己評価が低くなる傾向が認められた。3すなわち、発達障害児は、いわゆる健常児に比べて運動協応を必要とする運動得点においてもそれらに対する自己評価においても低くなる傾向があることが示唆された。これは、前年度行った研究における「気になる」子どもの傾向とは異なっていた。すなわち、「気になる」子どもにおいては、時期とともに運動得点は低下しないものの、自分が行った運動に関する自己コントロール間が次第に低下する傾向があったのとは異なる。平成23年度は、東日本大震災の影響から、研究の開始がやや遅れたが、新たに導入した課題と手続きにより、「気になる」子どもの運動発達と運動コントロールに関する自己評価との関連を捉えることができた。これは、当初の計画した研究の方向に合致している。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は研究の最終年度に当たるが、平成23年度に実施した方法と同じ手続きで研究を進める。但し、運動発達支援と幼児の自己評価で用いた課題については、より微妙な変化が検出できるものを探るために、新たな課題を導入する。
ゲノム研究基軸放線菌における抗生物質生合成鍵酵素の構造予測と機能解析

(研究目標)ゲノム研究基軸放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)の生産する抗生物質に注目し,その生合成鍵酵素タンパクに関してその構造及び機能についてタンパクモデリング・酵素化学的観点から解析し、ゲノム中での二次代謝関連遺伝子機能の分子進化的位置付けを解明する。(今年度の研究成果)ACT生合成に関与する立体化学制御タンパク(RED1)遺伝子としてactVI-ORF1遺伝子、並びにACTとは逆の立体配置を有するBIQ系抗生物質グラナティシン(GRA)の生合成に関与する立体化学制御タンパク(RED2)遺伝子として,gra-ORF6に注目し、両遺伝子産物の基質認識機構及び3次元構造を探るべく、両還元酵素の3次元構造をホモロジーモデリング法により予測した。RED1はヒト由来3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼRED2は真菌由来のヒドロキシナフタレン還元酵素をそれぞれ鋳型とする有意な3次元構造モデルを得ることができたが、両者の3次元構造に有意な相同性は見出されなかった。一方、モデリング結果からは両酵素の活性発現に必須と予想されるアミノ酸残基が見出されたので、反応機構の詳細を探るべく化学的に不安定な基質に代わるアナログ基質類を合成し、これらを用い各酵素の大腸菌由来の組換えタンパクによる生化学的解析を行ったところRED1還元活性活性検出に成功した。また、比較ゲノム研究の一環として同種の立体化学制御に関与すると推定される遺伝子med-12をメダマイシン生産菌Streptomcyces sp. AM-7161株よクローニングすることにも成功した。
肺癌細胞株のEGFRリン酸化経路に対するsiRNAと分子標的薬の併用効果の検討

[目的]肺腺癌細胞株におけるgefitinibへのsiRNAおよびEGFR下流分子阻害薬の併用効果を検討する。[方法]3種類の肺腺癌細胞株(H1650:gefitinib感受性EGFR遺伝子変異あり、H1975:gefitinib耐性EGFR遺伝子変異あり、H2347:野生型EGFR遺伝子あり)を対象とした。EGFR発現抑制siRNAベクター構築を試みた。また、二本鎖siRNAによる細胞増殖抑制効果について検討を行った。一方で、AKT、ERK、STAT3各々に対する阻害薬とgefitinibとの併用効果について、細胞増殖抑制効果・リン酸化抑制効果・細胞周期抑制効果から評価した。相加相乗効果はCombination Index(CI)の値から判定した。[結果]siRNAベクターにて、H1975のEGFRの発現抑制が認められた。また、H1650/H1975/H2347いずれの細胞においても、二本鎖siRNA濃度が50nMの際に細胞増殖抑制効果が最も高かった。これらの相乗効果は各下流分子のリン酸化抑制によることが示された。また、gefitinibへの阻害剤併用によって、単剤に比して高頻度の細胞周期停止が確認された。[結論]EGFRを標的としたsiRNAによりEGFRの発現抑制および、細胞増殖抑制効果が得られた。gefitinib耐性EGFR遺伝子変異を有する肺腺癌細胞株に対して、gefitinibに加えEGFR下流分子阻害薬併用が有用であり、下流分子のリン酸化阻害および細胞周期停止がその機序であることが示された。[目的]肺癌細胞株におけるgefitinibへのsiRNAおよびEGFR下流分子阻害薬の併用効果を検討する。[方法]3種類の肺癌細胞株(gefitinib感受性EGFR遺伝子変異を有する細胞株(H1650)、gefitinib耐性EGFR遺伝子変異を有する細胞株(H1975)、野生型EGFR遺伝子を有する細胞株(H2347))を対象とした。EGFR発現抑制siRNAベクターの構築を試みた。一方で、EGFR下流分子であるAKT、ERK、STAT3各々に対する阻害薬とgefitinibとの併用効果について、細胞増殖抑制効果およびリン酸化抑制効果から評価した。解析はChou TCらのdose-effectanalysis theoryに従い、相加相乗効果の判定はCombination Index(CI)の値から、CI≦0.9の時に相乗効果あり、0.9<CI≦1.10の時に相加効果あり、1.10≦CIの時に阻害効果ありと判定した。gefitinibと下流分子阻害薬の併用にて、H1650では、AKT・ERK阻害薬併用での相乗効果が認められた(CI<0.8)。H1975では、AKT/ERK/STAT3阻害薬併用で高い相乗効果が得られた(CI<0.5)。H2347では、いずれの阻害剤併用においても高い相乗効果は得られなかった(0.8<CI<1.5)。gefitinib耐性EGFR遺伝子変異を有する肺癌細胞株に対して、gefitinibに加えEGFR下流分子阻害薬併用が有用であり、その機序は下流分子のリン酸化阻害であることが示された。
ヒューマンQOL・インプットアウトプット解析

本研究は,循環型社会形成を目指して,家庭におけるインプット(製品購入)とアウトプット(廃棄物発生)の関係を調査し,QOL(Quality of Life)の変動による環境負荷低減の可能性を評価することを目的とする。本年度は製品購入と廃棄物発生に関する調査を行った。調査は,愛知県,名古屋市等の自治体の協力の下,愛知県下約500世帯に依頼した。500世帯をA, Bの2グループに分け,2週間その世帯が購入した食品と日用品の種類と重量,生ゴミおよび容器包装ゴミの発生を記録してもらった。第1週は普段の生活を送ってもらい,第2週はAグループには冷蔵庫の中身をチェックして購入量を調整してもらい,Bグループにはエコクッキングにより廃棄物の発生量削減をお願いした。結果によると,ただし,A, B両グループとも生ゴミが減少したグループと増加したグループに分かれ,その比は約6:4であった。各グループの平均を取ると,A, B両グループとも生ゴミは第1週目より第2週目のほうが約10%少なかった。これにより,冷蔵庫チェックやエコクッキングが生ゴミ削減に効果があることがわかった。また,購入量と廃棄物発生量の関係を調べると,購入量と調理くず発生量は相関が見られたが,購入量と食べ残し,賞味期限切れは相関が見られなかった。これは,調理くずに関しては,購入行動が影響しているが,食べ残し,賞味期限切れに関しては購入行動以外のライフスタイルが大きく影響していることが示唆される。
オンチップ微小液滴電気穿孔プロセスの数値解析と現象メカニズムの解明

本研究は、iPS細胞の高効率生産を可能にする「オンチップ微小液滴電気穿孔プロセス」の開発に対し、流体数値解析による設計支援を行う。具体的には、1細胞整列のためのディーン流れと慣性集束、2細胞を一つずつ分離するための液滴形成、3細胞膜穿孔のための膜電荷分布と細胞膜破砕、4DNA導入のための電気泳動について、COMSOL Multiphisicsを用いて計算モデルを開発する。数値解析の実現により、14各現象の力学的メカニズムを解明し、さらに、プロセスの成否と流れ条件の相関を明らかにする。本研究により、マイクロリアクターで遺伝子導入を実現するプロセス設計の基礎データを整理・蓄積することができる。
羽毛を試料としたミトコンドリアDNA解析法による鳥類の系統分類学的研究

1.鳥類の羽毛を試料としてDNAを抽出し、PCR法により特定部位のmtDNAを増幅して、シークエンサーによりその塩基配列を明らかにしたり、また制限酵素による切断パターンを比較することにより、鳥類の系統・類縁関係を明らかにするのが本研究の目的である。2.試料として羽毛を用いることの利点は、試料を採取する際に生体に与える損傷を最小限にすることができる点、および希少鳥類・絶滅鳥の羽毛か系統分析に必要なDNAを得る可能性のある点である。3.ニワトリ、野鶏の羽毛からのDNA抽出は可能であった。しかし、羽毛から得られたDNAはごく微量であるため、DNAをSUPRECスピンカラムで精製してからでないとPCR増幅物が得られない場合もあった。また、始めからDNAの抽出できない場合もあった。4.PCRによって得られた増幅物を何種類かの制限酵素を用いて切断の、その切断パターンを比較解析した(RFLP解析)。その結果実験グループをいくつかの型に分類することができ、本法も系統解析に利用できることが分った。5.PCRに用いた全てのサンプルから増幅物が得られなかったため、新規にプライマーを設計する必要にせまられた。試行錯誤のすえ何種類かのプライマーを開発し、全ての実験個体からPCR増幅物が得られた。その結果、純系の種として飼育されていた個体が、RFLPパターンを比較分析することにより、交雑種であることが判明するなど興味深い結果が得られた。1.羽毛を試料に用いてミトコンドリアDNAを抽出し、PCR法(遺伝子増幅)を行った後に、そのミトコンドリアDNAを遺伝的に解析して鳥類の系統分類を再検討するのが本研究の目的である。2.羽毛を試料に用いる利点は、サンプリングの際鳥に負担をかけることなく実験試料の採取が可能となり、また希少鳥類・絶滅鳥などの標本から得られた羽毛を用いて、それらの遺伝的解析が可能になるなど、研究の広がりを期待できる。3.平成7年度は、羽毛からのDNA抽出に先だち、鳥類の組織、血液からのDNA抽出と、PCR法による遺伝子増幅を行ない、羽毛からのDNA抽出法との違いについて検討した。その結果、羽毛からのDNA抽出量は大変少量ではあるが抽出可能であることが明らかとなった。しかし、DNA量が少ないため抽出に失敗する場合が2030%の高率であった。比較的新しい羽毛を用いての実験においても、失敗例が多かったので、今後はDNA抽出の実験法について更に改良の必要を感じた。4.標本作成後10年程の羽毛からのDNA抽出実験を行ったが、DNAの小断片は抽出できても、分子量の大きなDNAはほとんど抽出することができなかった。古い標本を用いてDNA抽出を行ない、鳥類の系統関係を調べるのは、現在の本実験室でのレベルでは可能性がうすい状況である。羽毛を試料としての実験だけでなく、標本よりの皮膚もDNA抽出サンプルとする実験法の確立を目ざす必要を感じた。5.8年度は、これらの結果をふまえて更に本方法による確実なDNA抽出の実験系の開発と確立を目ざす。1、羽毛を試料としてDNA抽出を行い、PCR法によりミトコンドリアDNAの特定部位の増幅後、得られたミトコンドリアDNAの遺伝的特性を検出、解析して鳥類の系統分類を再検討するのが本研究の目的である。2、羽毛を試料に用いることの利点は、試料採取に際して鳥体に負担をかけることが少ないという点である。したがって、希少鳥類からも試料を得ることができ、更に絶滅鳥などの標本の羽毛を用いて、それらの遺伝的解析が可能となるなど、鳥類の系統研究の広がりを期待できる。3、昨年度の研究では、生体から採取した羽毛を用いてDNA抽出を行い、ごく微量ではあるがDNAの抽出に成功している。しかし、DNA抽出に失敗する率30%と高く、抽出成功率を高めるための実験法の改良が必要となった。4、本年度の研究目標は、生体から採取した羽毛から確実にDNA抽出できる実験法を確立こと、および古い標本の羽毛からのDNA抽出であった。本年度の研究結果は、前者の新しい羽毛からのDNA抽出は、抽出率90%以上となるまで実験法の改良をおこなった。

後者の古い羽毛からのDNA抽出は、解析可能なDNA断片の抽出法を調査中である。5、来年度は、これらの結果をふまえて古い標本からのDNA抽出を確実に行なえるよう実験法の確立をめざす。1、鳥類の羽毛を試料に用いてDNAの抽出を行い、得られたDNAをPCR法によりミトコンドリアDNAの特定部位を増幅し、遺伝的解析を行なって鳥類の系統関係を再検討するのが本研究の目的である。2、羽毛を試料に用いる利点は、試料を採取する際、鳥に負担をかけることが少なく、かつ古い標本からもDNA抽出できる点である。したがって、希少鳥類や絶滅鳥の系統関係を遺伝的に解析することが可能になる。3、本研究は、平成7年度から9年度までの3年間の継続研究として行なった。初年度は、ニワトリの生体を試料として予備的実験を行い、羽毛、肝臓、筋肉、血液からDNA抽出の比較実験を行なった。その結果、肝臓、筋肉、血液からは多量のDNA抽出ができた。羽毛からのDNA抽出は、量が少ないだけでなく、抽出に失敗するサンプルも20%ほどあり、抽出技術の改良が必要となった。4、次年度は、生体から得たニワトリの羽毛からほぼ100%DNA抽出が行えるよう実験法を改善した。同時に、他の鳥類の新しい羽毛からのDNA抽出も行なった。次に、5年10年ほど前に作った標本の羽毛からDNA抽出を試みたが、実験に使えるほど大きな分子のDNA抽出がなかなかできないという結果になった。羽毛から抽出したDNAをPCR法により、ミトコンドリアDNAチトクロームb領域と12S領域の増幅を行なった。5、羽毛から抽出したDNAを試料としてニワトリ、メジロのミトコンドリアDNAのチトクロームb領域を制限酵素で切断し、DNAの塩基配列を明らかにして、種内の系統関係を調査した。また、ツル類、サギ類のミトコンドリアDNA12S領域塩基配列を明らかにし、両グループの系統関係の解析をおこなった。