hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜を超えた情報伝達：細胞表層ストレス応答システムに対する新視点からのアプローチ

本研究計画では、大腸菌における表層ストレス応答の主要な経路であるσ^E経路ストレス応答を対象とし、膜を越えて情報伝達を行うというユニークな細胞表層ストレス応答システムを理解することを目的とした。昨年度は好熱菌Aquifex aeolicusのRsePホモログ(AaRseP)のPDZ-NCドメイン(PDZタンデム)の結晶構造解析及び大腸菌RseP (EcRseP)を用いた生化学的機能解析を行い、いくつかの結果に基づき、PDZタンデムが膜表面においてゲート様の構造(PDZポケット)を形成し、DegSによって切断されたRseAのペリプラズム領域のサイズを感知して膜貫通領域の活性部位へ基質を取り込むような、サイズ排除フィルターとして機能するというモデルを提案したことを報告した。本年度は引き続き解析を進め、細胞膜上で実際にRseP PDZドメインがどのような配向を取っているかを調べるため、システイン置換体を用いた特異的修飾試薬による修飾実験を行ったところ、予測構造によく合致する結果を得た。さらにEcRsePのPDZ-Nに特異的な小さなα-Helix構造(Capping Helix)に着目し、その欠失変異や点変異が基質切断制御異常を引き起こすことや、全長RsePの生体中におけるTrypsin感受性が変化することを新たに見出した。これはPDZ-N, -Cドメイン間の配向変化等を含むPDZドメインのグローバルな構造変換を引き起こすことを示唆する結果である。これらの結果は、Capping Helixを介して引き起こされるPDZ-NCタンデムの構造変換によりPDZタンデムのサイズ排除ブイルター機能が調節され、過去の知見から示唆されてきた、DegS非依存的な未知のシグナル伝達経路の活性化を実現させている可能性を示唆する。本研究内容については国際学術雑誌Structureに掲載された。(抄録なし)本研究計画では、大腸菌における表層ストレス応答の主要な経路である♂経路ストレス応答を中心として、【1】新たなσ^E活性化経路の探索、【2】新視点によるストレス応答システムの高次・マクロ的鯉析という二つの観点から細胞表層ストレス応答システムを理解することを目的とした。本年度は主に【1】において研究上の進展があった。(1)RsePPDZドメインの生理的役割の解析:σ^E経路ストレス応答では、異常外膜タンパク質(OMP)の蓄積を感知し、2つの膜プロテアーゼDegSとRsePが膜貫通型anti-σ^Eタンパク質RseAを連続的に切断することで、ストレス応答転写因子σ^Eを活性化させる。RseAの二段階切断制御機構として、Liら(Li et al., 2009)はDegSによる切断で生じたRseAの新生C末端残基Val148を、RsePのPDZドメインが認識・結合することでRsePによる二段階目の切断が促進されると提唱した。そこで私がLiらのモデルを検証した所、in vivoでは、1)RseP PDZドメイン上の点変異、2)2つのPDZドメインの全欠失、3)RseA Val148残基のアミノ酸置換のいずれも基質切断能への影響はほとんど見られなかった。これらの結果は、PDZドメインによるRseAのC末端残基の認識は、RsePによる切断に主要な役割を果たしていないことを示唆する。さらに染色体rseP遺伝子上の2つのPDZドメイン領域欠失株を作製し、それぞれOMPによるσ^Eの活性化能を調べたが、野生株と比べほとんど差は見られなかった。このことは、PDZドメインが従来型のOMP依存的なσEストレス応答経路の制御には重要ではない事を示唆し、DegS非依存的な第二のσ^E活性化経路が存在する可能性を示唆している。本研究内容については国際学術雑誌Molecular Microbiologyにおいて発表した。(2)好熱菌AquifexRsePホモログのPDZ-NCタンデムの結晶構造鯉析:横浜市立大学の禾晃和准教授との共同研究により、好熱菌AguifexaeolicusのRsePホモログ(AaRseP)のPDZ-N,Cドメイン(PDZタンデム)の結晶構造解析を試みた。その結果、2つのPDZドメインがそれぞれの推定リガンド結合領域を向かい合わせて一つのポケットを構成する特殊な配向をとることなどのいくつかの知見を得た。また、大腸菌RsePのPDZタンデム欠失体ではRseA切断における二段階切断制御が損なわれる事を見出した。以上の知見から、PDZタンデムが、膜表面においてゲート様の構造を形成し、DegSによって切断されたRseAのペリプラズム領域のサイズを感知して基質を選別するような、サイズ排除フィルターとして機能するというモデルを提唱した。本研究内容については学術雑誌に投稿準備中である。

本年度は引き続き解析を進め、細胞膜上で実際にRseP PDZドメインがどのような配向を取っているかを調べるため、システイン置換体を用いた特異的修飾試薬による修飾実験を行ったところ、予測構造によく合致する結果を得た。さらにEcRsePのPDZ-Nに特異的な小さなα-Helix構造(Capping Helix)に着目し、その欠失変異や点変異が基質切断制御異常を引き起こすことや、全長RsePの生体中におけるTrypsin感受性が変化することを新たに見出した。これはPDZ-N, -Cドメイン間の配向変化等を含むPDZドメインのグローバルな構造変換を引き起こすことを示唆する結果である。これらの結果は、Capping Helixを介して引き起こされるPDZ-NCタンデムの構造変換によりPDZタンデムのサイズ排除ブイルター機能が調節され、過去の知見から示唆されてきた、DegS非依存的な未知のシグナル伝達経路の活性化を実現させている可能性を示唆する。本研究内容については国際学術雑誌Structureに掲載された。上記研究実績の項で掲げた2つの研究項目のうち、本年度は主として【1】の課題に取り組んだが、そちらは順調に推移している。成果としては学術論文一報を発表し、さらにもう一報を投稿に向け実験データを取りまとめている段階であり、当初の予定に対し充分な進展を見せたと考えている。もう一方の【2】の課題については本年度は目立った進展は得られていないが、交付申請書記載の研究計画書の予定では二年目から本格的に取り組む計画となっており、一年目となる本年度の時点での進展としては全く問題ない。上記研究実績の項で掲げた【1】の課題についてはここまで順調に推移しているので、このまま計画書通りに進行する。具体的には(2)のRseP PDZタンデムの結晶構造解析についての論文の学術雑誌掲載を一つの目標とする。また、研究計画通り【2】の課題の進展を本年度の主たる研究目標とする。具体的には表層ストレス応答関連因子の蛍光顕微鏡観察系の確立と、それを用いた関連因子群の細胞内イメージング解析を推進する。(抄録なし)
車車間通信における周波数利用の時間・空間変化を考慮した経路制御手法に関する研究

本研究課題ではアドホック車車間通信に着目し,(1)周波数有効利用,(2)ユーザQoSの満足,(3)ネットワーク全体の性能向上を実現するために、ダイナミックスペクトラムアクセス技術により利用可能な多様な周波数間の「帯域」,「通信距離」の違いを考慮するチャネル調整、及びルーティング手法を検討した。その結果、新たなチャネル選択メトリックを考案し、シミュレーション評価、及びプロトタイプシステムを用いた実証実験から有効性を確認した。またクロスレイヤ型のルーティング手法も検討し、成果を発表した。本年度、本研究では車車間通信における周波数利用の時間・空間変化を考慮した経路制御手法の要素技術として、以下の項目について研究調査を行った。*全周波数の利用状況が変動するコグニティブ無線環境における非実時間通信に適した「データチャネル選択メトリック」の検討、及びシミュレーションによる有効性評価まず、本研究では400MHz6GHzといった広範囲の周波数の利用状況が、時間的・空間的に変化するコグニティブ無線環境において、送受信ノード(車両)が複数の車両を経由して(マルチホップ通点)、動画及び音楽ファイルなどの非実時間通信を行う場合を想定し、その通信に適したデータチャネルの選択メトリックを新たに考案した。コグニティブ無線環境で取得可能なプライマリユーザに関する情報の粒度が未確定なため、本研究では(1)伝送レート、(2)プライマリユーザの統計的な平均利用率、(3)車両の移動に伴う隣接2ノード間の最大通信継続時間、(4周波数毎のセカンダリユーザの平均通信継続時間(プライマリの平均通信継続時間と利用率から算出)、という4つの情報を組み合わせる事で、粒度別の複数のメトリックの考案を行った。その後、各メトリックを用いた際のコグニティブ環境でのマルチホップ車車間通信の性能をシミュレーション実験で評価し、その有効性を明らかにした。これらの研究成果存国内研究であるアドホックネットワーク研究会で発表すると共に、国際会議IEEE VTC2009-fallにおいて招待論文として対外的に発表を行った。今後は、本年度提案した研究内容のジャーナル化を進めると共に、提案データチャネル選択メトリックを元に、コグニティブ無線環境に適した経路制御手法について検討を進める。また、制御メッセージについても着目し、確実かつ迅速な制御情報共有に向けたメッセージ交換アーキテクチャについて検討を進める予定である。本年度は以下の項目について研究を行った。(1)全周波数の利用状況が変動するコグニティブ無線環境における非実時間通信に適したデータチャネル選択メトリックの実装評価による有効性評価(2)経路制御技術で考慮する必要があるクロスレイヤ制御技術について着目し、下位レイヤとの連携手段について考察・検討したまず、400MHz6GHzの広範囲の周波数の利用状況が、時間的・空間的に変化するコグニティブ無線環境において、送受信ノード(車両)が非実時間通信を行う場合を想定し、その通信に適したデータチャネルの選択メトリックを昨年度考案したが、本年度はその実装を行い、実環境において実現性、及び有効性を検証した。その後、これらの研究成果を電子情報通信学会のソフトウェア無線研究会において対外的に発表した。次に、コグニティブ無線環境における経路制御では必要不可欠な上位/下位レイヤ間連携、つまりクロスレイヤ制御に着目し、経路制御が考慮する必要がある下位レイヤの情報について考察・検討した。具体的には、経路制御手伝は、(a)ノードの移動に伴うトポロジ変化や(b)プライマリの通信状祝の変化を検知するセンシング情報、(c)周波数切替によって発生するレート、遅延などの通信特性の変化、さらには(d)経路の面では通信インターフェース数を意識した制御が必要となる。これらのクロスレイヤ制御に関する検討については、電子情報通信学会のソフトウェア無線研究会においてパネル講演の中で発表を行った。今後は、今年度の実装をマルチホップ通信に拡張すると共に、考案したクロスレイヤ制御を満足する経路制御を提案し、まずはシミュレーションによる評価を行う。その後、提案経路制御手法を実装した上で、実環境において提案手法の有効性について検討を行う予定である。
正規型確率場の確率変分解析

レヴィのブラウン運動やフラクショナル・ブラウン運動のような正規型確率場を研究すると、保々のガウス過程が現れる。多次元パラメ-タの動きにつれて観測される確率場X(x)の変動(この解析が我々の主たる研究目的)を、いくつかの方向に分けて調べるという立場にたてば、自然に次が導かれる:(i)半径tの球面上でX(x)を加重平均してM(t)ー過程を得る。(ii)曲線Cを選びxをC上に制限して走らせるもう一つの考え方ーこうして得られるガウス過程X_C(t)に対し、Cの微少切片に応ずる変分量の解析(確率変分方程式)、及び法線方向への微少変形から定まる変分問題に、我々は興味をもつ。この方向への第一歩として、伊藤・飛田編の論文集「Gaussian Random Fields」(World Scientific)に発表した研究代表者の論文(レヴィのブラウン運動に対して直線からの微少変形を論じた)がある。この研究を線形加法的確率場へ拡張することを試み、小さからぬ収積を得た。フラクショナル・ブラウン運動へとさらなる飛躍を計りたい。さて我には、上述の立場からできるだけ広い枠組でガウス過程を解明したい。このための鍵は、標準表現X(t)=∫^t_oF(t,u)dB(u)であり、それと等価な確率伊藤=ヴォルテラ方程式X(t)=∫^t_oK(t,u)X(u)du+∫^t_oJ(t,u)dB(u)である。これまでの成果は次の通り:(i)多重マルコフの範囲内でJ≡1を保証する仮定をおき、二階線形微分方程式を解いて核FとKを求めることに成功。二重マルコフならば、これはピットと同水準の結果であるが、我々の方法は線形性と適用範囲の広さを有する。特に、岡部がKM_2Oーランジュバン方程式の名で扱った定常過程を取り上げ、研究発表欄に記載した論文で詳細な構造を記述した。(ii)J(t,u)=(t-u)^aととるべき過程に、フラクショナル・ブラウン運動から導かれるM(t)がある。部分的な解答を得ているが、十分な展開は今後の課題である。
認知・機能言語学的観点からの時間表現の統合的分析モデルの構築

本年も指示詞の時間表現への理論言語学的な考察と、スペイン語と日本語の対象言語学的な研究、特に時間表現の対照研究に関する考察を進めた。まず、昨年度から執筆を進めていた指示詞の時間表現に関する学術論文を完成した。「指示詞と時間ー認知文法の観点からー」(『認知言語学論考13』ひつじ書房.2015年度出版)のことである。具体的な内容は、昨年度もここに記したが、以下の通りである。現在に至るまで、指示詞(demonstrative)に関する数多くの研究が世界中でなされてきており、言語類型論の観点からの考察も盛んになってきている。日本語の指示詞コソアについても、その現場指示や文脈指示などの用法に関して、記述的・理論的に重要な研究が数多く存在する。しかし、時間表現における指示詞については、まとまった考察がなされていない。その考察を、上記の論文にて認知言語学の観点から行った。またスペイン語との対照研究に関するものとして、関西スペイン語学研究会から出版予定の『「スペイン語記述文法」章別和文要約』内の担当項目を完成した(2016年3月出版予定)。担当した論文は、第67章の「形態統語論」に関する論文である。ここでは、スペイン語の名詞句や動詞句、さらにはイディオム表現などが、文レベルの構造と比較されながら分析されている。この内容は、西山(2003)『日本語名詞句の意味論と語用論ー指示的名詞句と非指示的名詞句』にて行われている日本語の名詞句構造と文構造の対応関係に関する考察と通ずるものである。そして、両論考共に時間表現に関する考察も行われている。私が要約を行ったスペイン語学の論文と西山(2003)の内容を元に、日本語とスペイン語の時間表現の比較、更には時間表現と文構造の対応関係を対照言語学的に研究することが可能となると考える。この要約原稿作成を通して、その研究への基盤を作ることができたと考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。「研究の目的」に記した時間表現と文末のテンスやアスペクトとの共起関係のの理論的分析を進めた。まず、昨年度発表した論文と、現在執筆中の論文を通して、指示詞の時間表現の記述的な分析と理論的な考察を行った。具体的な状況を述べると、現在に至るまで、指示詞{demnstrative)に関する数多くの研究が世界中でなされてきており、言語類型論の観点からの考察も盛んになってきている(Lyons 1977, Levinsonl983, Diesse ll999, Lenz (ed.)2003, etc.)。日本語の指示詞コソアについても、その現場指示や文脈指示などの用法に関して従来から様々な研究がなされてきており、指示詞の記述・理論的な分析における重要な研究が数多く存在する(佐久間1951、三上1970、久野1973、黒田1979、金水・田窪1992など)。しかし、「この頃、このところ、そのうち、あの時」といった時間表現における指示詞については、まとまった考察がなされてきていない。その考察を、上記の執筆中論文にて行いたいと考えております。また、指示詞の時間表現の分析に加えて、他の時間副詞と文末のテンスやアスペクトの共起関係にまで考察対象を広げている。具体的には、中村(2001)で主張されている「時点+二格」は南の階層におけるA類要素であるという主張を批判し、元来南(1974}にて主張されていたとおりB類要素であることを指摘している。その結果、南の階層の観点から「時点+二格」と情報構造の関係を説明することは不可能であることを示し、統語構造の階層ではなく、あくまで語レベルでの二格との共起制限が強いものとそうでないものが存在しており、共起制限が弱い語が、文脈情報の影響を強く受けるという、時間表現自体に内在する意味情報が二格との共起関係に決定的に重要な影響を与えると分析している。このように、指示詞の時間表現の記述的・理論的な分析に加えて、時間表現一般と統語構造との関係についても考察し、研究の範囲を着実に広げてきている。

ここでは、スペイン語の名詞句や動詞句、さらにはイディオム表現などが、文レベルの構造と比較されながら分析されている。この内容は、西山(2003)『日本語名詞句の意味論と語用論ー指示的名詞句と非指示的名詞句』にて行われている日本語の名詞句構造と文構造の対応関係に関する考察と通ずるものである。そして、両論考共に時間表現に関する考察も行われている。私が要約を行ったスペイン語学の論文と西山(2003)の内容を元に、日本語とスペイン語の時間表現の比較、更には時間表現と文構造の対応関係を対照言語学的に研究することが可能となると考える。この要約原稿作成を通して、その研究への基盤を作ることができたと考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。「粒度」と関わる表現も含めた時間表現一般にまで考察対象を広げ、さらに、それらと文末のテンスやアスペクトとの共起関係の分析も進めてきており、現時点での研究は、当初の予定通りおおむね順調に進展しているといえる。英語やスペイン語などの他言語における現象と、日本語の現象を比較し、対照言語学的・言語類型論的に意義のある研究をさらに進めていくことが、今後の課題となる。また、時間表現と文末のテンスやアスペクトとの共起関係についても、記述的・理論的な分析をさらに進めていくことが必要となると考える。
c-kitリセプターと介した固型腫瘍の増殖及び運動制御に基づく治療法の検討

レセプター型チロシンキナーゼを規定するc-kitタンパクの固型腫瘍(特に肺癌と乳癌)の発生・進展における役割を検討することによって、c-kitリセプターを標的とした新しいがん化学療法の開発を目指した。肺癌の内でも高転移性で悪性度の高い小細胞癌に、異所性にc-kitが発現されていることを見い出すとともに、c-kitのリガンドであるSCFによってc-kitのリン酸化とそれに伴うchemotaxisが誘起されることを明らかとした。更に、SCFによって、c-kitを介して誘起されるchemotaxisを抗c-kit抗体によるSCF結合阻害、及びタイロシンキナーゼ阻害剤あるいは、細胞骨格成分の合成阻害剤等の添加によって阻止し得る可能性を示唆する結果が得られた。今後は、c-kitを介した転移の成立とその阻害の可能性について、in vivoの実験系等を用いて検討を重ねたい。一方、乳癌については正常乳腺上皮に強陽性のc-kitが、癌化に伴い消失することを見い出し、c-kitレセプターを介した乳癌の分化誘導・増殖抑制について検討した。c-kit陰性乳癌細胞株(MCF-7)にc-kit cDNAを導入したところ、G418選択後のコロニー数の減少を認めた。また、c-kit陽性コロニーの割合の著明な減少も認められ、c-kit発現が乳癌の増殖に負に働きいることが示唆された。現在、誘導可能なプロモーターを用いて、c-kitの発現を調節し得るトランスフェクタントが得られ、更に増殖抑制機構について解析を進めつつある。c-kit発現によって乳癌の増殖抑制し得る可能性を示唆する結果は、将来の遺伝子治療あるいは、c-kitを介する負のシグナルを誘導する新しいがん治療薬剤の開発に継がることが期待されよう。
重要災害拠点を対象とした非構造部材を含む建物の総合的な耐震余裕度評価法

本年度では,地震後の建物の残存耐震性能を総合的に評価する構造ヘルスモニタリングとして,地震時に建物で観測される床加速度応答を用いて,建物の物理パラメターとして層剛性を同定するシステム同定法や,機械学習のアプローチを取り入れた構造部材の損傷度と損傷位置を同定する損傷同定法の枠組を構築した。前者については,実際の建物でのセンシング技術の運用状況を踏まえて,観測データが得られる層位置を限定したシナリオを想定し,限られたデータから建物の固有モード性状と高層建物にも対応する曲げせん断型モデルとして層剛性を評価する方法である。後者については,鋼構造骨組を対象として柱や梁といった構造部材の損傷の模擬方法に課題は残るものの,地震経験後に損傷度と損傷位置が未知な観測データに対して,あらかじめチューニングされた対象建物のフレームモデルに対して,単一の部材が損傷した際の層剛性変化量をデータベースとして活用するものである。機械学習による損傷部材数と損傷度を推定することで,損傷位置を同定する探索範囲を限定し,単一の部材の損傷による層剛性変化量の重ね合わせにより損傷位置を特定することが特徴であり,構造ヘルスモニタリングにおいて重要な課題を克服するものである。また,非構造部材も対象とした総合的な残存耐震性能評価方法を確立するために,対象とする非構造部材として天井裏の配管系統の地震被害事例を集積し,被害が生じた事例について分析を行った。現在の設計指針に基づき,解析モデルを構築した上で,非構造部材に生じる応答を評価することで,非構造部材に生じた被害モードと解析から得られる応答データの関係性を整理した。本課題において構造ヘルスモニタリングとして地震後の建物の健全性を評価する上で,物理パラメターを同定するシステム同定や損傷位置の特定を行う損傷同定法は,建物における構造部材に対する被害状況の推定する基幹技術である。これらの手法は,本課題での取り組みにおいて重要な位置づけにあるものであり,本年度までに構築した方法は,実際の建物での観測データの収集を踏まえた実現性の高い方法であると考えている。本課題では建物の総合的な残存耐震性能評価として非構造部材についても評価対象としており,本課題で構築する建物の地震時応答を用いたシステム同定によって推定される床応答から建物に付随する非構造部材の応答性状をどのように評価し,被害モードを分類するのかを建物における非構造部材として配管等の詳細モデルを用いた数値シミュレーションによる数値実験により応答データを集積する。地震後の建物構造部材と非構造部材の損傷度について,信頼性理論に基づき損傷確率として評価する従来からの方法では取り扱われていない応答の履歴に着目し,システム同定を介して推定されるこれらの対象の時刻歴応答データから損傷確率を評価し,残存耐震性能評価法を展開する。現段階では,非構造部材として配管等を対象とした実験計画を進めるにあたって,計測装置の構成・選定を行っている段階にある。当初はこれらを当年度内に終了し,予算を配分していたが,実験を遂行する上で,実験の規模に応じて必要な計測装置の数も変わるため,これらを確定させ次第次年度以降に,これらの消耗品等の購入に使用する。
日本およびその周辺に分布する小型コウモリ類の系統地理学的および遺伝学的研究

標記の研究課題については、最近,北海道から中国大陸にかけてのキクガシラコウモリ類の分子系統関係を調べるためのDNAの配列決定を完了した.これらのサンプルにつていはカイル・アームストロング自身で採集したもののほか,イギリスとハンガリーの博物館に収蔵されている標本,そして日本,香港および台湾の共同研究者が採集したものも含んでいる.現在,技術的な問題を解決した上で,ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNAを用いた集団遺伝学的な研究が完了している.また,エコロケーションに用いられる音声を北海道から西表島にかけておよそ1300個体から録音し,これについても解析が完了した.さらに,奈良教育大学の前田喜四雄氏が採集された個体を用いて,特に歯に着目した形態学的な解析が進行中である.カイル・アームストロングは現在,共著者として日本産コウモリ類の生物地理学,およびその保全に関する問題についての論文を執筆中である.これらの研究成果は第9回国際哺乳類学会(於・北海道札幌市,2005年8月)で発表した.なお,この費用については自己負担としている.標記の研究課題については、最近,北海道から中国大陸にかけてのキクガシラコウモリ類の分子系統関係を調べるためのDNAの配列決定を完了した.これらのサンプルにはカイル・アームストロング自身で採集したもののほか,イギリスとハンガリーの博物館に収蔵されている標本,そして日本,香港および台湾の共同研究者が採集したものも含んでいる.現在,技術的な問題を解決した上で,ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNAを用いた集団遺伝学的な研究が完了している.また,エコロケーションに用いられる音声を北海道から西表島にかけておよそ1300個体から録音し,これについても解析が完了した.さらに,奈良教育大学の前田喜四雄氏が採集された個体を用いて,時に歯に着目した形態学的な解析が進行中である.これらの研究成果は第9回国際哺乳類学会(於・北海道札幌市,2005年8月)で発表した.カイル・アームストロングは現在,共著者として日本産コウモリ類の生物地理学,およびその保全に関する問題についての論文を執筆中である.報告者の研究は、日本のコウモリRhinolophus cornutusの、島嶼と大陸の集団における遺伝的・形態的・行動学的類似性についての研究である。今年度は、生きたコウモリからDNAサンプルとエコロケーションのデータを得るため、琉球列島他の各島(沖縄島、徳之島、対馬、久米島他)においてフィールド調査を行い、種による鳴き声の違い(超音波域)を調べるとともに、合計で約730サンプルを採集した。採集したDNAサンプルは現在研究室で解析中である。分類学的問題の解決のため、DNAを抽出し、2つの遺伝マーカーについてシークエンスを行った。これらの結果は2005年8月札幌で開催される第9回国際哺乳類学会において発表する。本研究の集団遺伝学的部分であるマイクロサテライトのプライマーは現在テスト中であり、サンプル解析は近日中に開始する予定である。日本におけるこれらの研究成果は、日本哺乳類学会定期大会(於・神奈川県厚木市、平成16年10月)、東アジア哺乳類学シンポジウム(於・台湾・台中市、平成16年11月)の2つのシンポジウムで発表した。以上の研究を遂行するため、JSPS研究補助金を以下のように使用した(主要なもののみを挙げる)。1.琉球・対馬における、生きたコウモリのサンプリングのためのフィールドワーク2.コウモリのエコロケーション(音響探知法;)録音専用の電子機器購入3.DNA抽出・増幅・配列決定のための試薬類、マイクロサテライトDNA用のプライマー標記の研究課題については、最近,北海道から中国大陸にかけてのキクガシラコウモリ類の分子系統関係を調べるためのDNAの配列決定を完了した.これらのサンプルにつていはカイル・アームストロング自身で採集したもののほか,イギリスとハンガリーの博物館に収蔵されている標本,そして日本,香港および台湾の共同研究者が採集したものも含んでいる.現在,技術的な問題を解決した上で,ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNAを用いた集団遺伝学的な研究が完了している.また,エコロケーションに用いられる音声を北海道から西表島にかけておよそ1300個体から録音し,これについても解析が完了した.さらに,奈良教育大学の前田喜四雄氏が採集された個体を用いて,特に歯に着目した形態学的な解析が進行中である.カイル・アームストロングは現在,共著者として日本産コウモリ類の生物地理学,およびその保全に関する問題についての論文を執筆中である.これらの研究成果は第9回国際哺乳類学会(於・北海道札幌市,2005年8月)で発表した.なお,この費用については自己負担としている.標記の研究課題については、最近,北海道から中国大陸にかけてのキクガシラコウモリ類の分子系統関係を調べるためのDNAの配列決定を完了した.これらのサンプルにはカイル・アームストロング自身で採集したもののほか,イギリスとハンガリーの博物館に収蔵されている標本,そして日本,香港および台湾の共同研究者が採集したものも含んでいる.現在,技術的な問題を解決した上で,ミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNAを用いた集団遺伝学的な研究が完了している.また,エコロケーションに用いられる音声を北海道から西表島にかけておよそ1300個体から録音し,これについても解析が完了した.さらに,奈良教育大学の前田喜四雄氏が採集された個体を用いて,時に歯に着目した形態学的な解析が進行中である.これらの研究成果は第9回国際哺乳類学会(於・北海道札幌市,2005年8月)で発表した.カイル・アームストロングは現在,共著者として日本産コウモリ類の生物地理学,およびその保全に関する問題についての論文を執筆中である.
骨軟部肉腫における血中循環腫瘍細胞の新規検出法による予後予測

骨軟部肉腫のおいては、癌腫で臨床上頻用されるような腫瘍マーカーはほとんどなく、末梢血の解析により、患者の病態を客観的に推察する指標はない。そこで、我々は平成25年度から27年度に科学研究費助成事業として「骨軟部肉腫における腫瘍特異的融合遺伝子を目的とした血中循環微量腫瘍細胞の検出」について検討し、その有効性について基礎的な結果を示すことができた。本年度は、ユーイング肉腫、粘液型脂肪肉腫と滑膜肉腫の様々な病態の患者から末梢血を採取し、それぞれに特異的な融合遺伝子であるEWSR1-FLI1, FUS-DDIT3とSS18-SSX1,2に対する特異的なプライマーを作成し定量的RT-PCR法により血中循環腫瘍細胞の検出が可能か、さらにその相対定量と病態との相関性はあるかなど検討を重ねてきた。その結果、現在の手法では滑膜肉腫の進行期で多発転移を生じている症例の末梢血において、融合遺伝子が検出されたが、それ以外の症例では検出できなかった。このため、現状の検出法では臨床応用は困難であると考えている。一方で、末梢血から融合遺伝子以外のバイオマーカーで骨軟部肉腫の病勢を推測するようなものはないか、様々な検討も重ねている。軟部肉腫(悪性軟部腫瘍)においては、顆粒細胞数やCRP、γ-GTPの上昇レベルが生命予後にも関連することを見出し、臨床的にも病勢の推測に役立つことを見出した。さらに、乳がんや肺がんなどで予後との相関性が指摘されているスタニオカルシン-1の発現について、軟部肉腫の一種である脂肪肉腫で組織学的悪性度と相関があり、良性に比べ悪性で発現が高いことを見出した。スタニオカルシン-1については、がん組織におけるワールブルグ効果(嫌気性解糖系によるエネルギー産生)にも関連していることが報告され、悪液質を呈している患者末梢血からの発現レベル解析も進めてる。当初計画した通り、あらかじめ保存してある骨軟部肉腫の50症例の末梢血から、腫瘍特異的な融合遺伝子を標的とした定量的RT-PCR法による末梢血液中の循環腫瘍細胞の検出を検討した。滑膜肉腫で進行期・多発転移を生じている症例の血液から、特異的融合遺伝子であるSS18-SSX1, 2の発現を検出することができた。しかし、ユーイング肉腫や粘液型脂肪肉腫に関しては、いまだ明らかな検出が行えておらず、当初の予定より進捗が遅れていると言える。このため、本年度に予定していた病勢に応じた循環腫瘍細胞の融合遺伝子検出コピー数の変化についての検討は、今のところ行えていない。一方で、末梢血中の他のバイオマーカーを用いた骨軟部肉腫患者の病勢との相関については検討が進んでいる。臨床において患者診療の過程で行った血液検査を後ろ向きの解析したところ、軟部腫瘍においては、良性に比べ悪性で顆粒球数、CRP値、血沈値、γ-GTPが有意に上昇していることを見出した。また、軟部肉腫においては顆粒球数、γ-GTP、CRPの上昇レベルが予後とも相関していることを見出した。また、本研究の過程で得られた、微量検体からのRNA抽出や定量的RT-PCR法の手技を応用することにより、様々な腫瘍組織の良悪性鑑別や悪性度評価なども進めている。脂肪系腫瘍においては、微量の腫瘍検体から定量的RT-PCR法によりCDK4やMDM2といった遺伝子の相対的発現量の比較が良悪性の鑑別に有用であることを見出し、臨床現場でも応用している。さらに、様々な脂肪系腫瘍において、スタニオカルシン-1遺伝子の発現量が悪性度と相関して高くなることも見出した。スタニオカルシン-1については、一部の軟部肉腫においては予後とも相関があることも見出している。これらの結果については、学会や論文で報告し、当初の予想外の進展となっている。これまで、予定通りに進んでいない部分についてはより強力かつ迅速に研究を推し進めていく必要がある。研究の進捗に最も問題となっているのは、腫瘍組織から血中に侵入して体内を循環している、血中循環腫瘍細胞の効率的な回収法であると考えれる。これまで、有効な回収法がなかったため、末梢血全体からRNAを抽出し、腫瘍特異的融合遺伝子を標的に定量的RT-PCR法をベースとした技術で数少ない腫瘍細胞の高度な検出法を検討してきた。しかし、期待するほどの検出感度が得られているとは言えない。一方で、血中の循環腫瘍細胞の分離回収については、従来の抗体を用いたセルソーター法や免疫磁気ビーズを用いる方法では、上皮性マーカーを発現していない骨軟部肉腫細胞の回収はできなかった。近年、分子マーカーを使用せず、循環腫瘍細胞のサイズと質量の違いにより、流体力学的に赤血球や白血球などの他の血球成分と分離するシステムであるClearCell&reg; FXシステム(Clearbridge BioMedics社・シンガポール)が開発された。本法によりラベルフリーで生きたまま循環腫瘍細胞を濃縮回収できることから、その後の遺伝子発現解析もより高感度に行えるものと推測される。問題点は、まだ実績の少ない検出装置であり、信頼性や再現性が確立していないことと、本体価格が高額であることとなる。すでに現有している施設との交渉を進めており、共同で研究を進めたいと考えている。

なお、前述したその他のバイオマーカーを用いた、末梢血による骨軟部肉腫患者の病勢や予後予測に関する研究は順調に進んでいるため、今後も症例を増やし、信頼性を高めていく予定である。骨軟部肉腫は癌腫に比べ、血行性転移が多くリンパ行性転移が少ないという特徴的な転移様式と、腫瘍特異的融合遺伝子の発現を多く認めるという病態に基づき、本研究を計画した。平成28年度は平成25年度から27年度に科学研究費助成事業として行ってきた「骨軟部肉腫における腫瘍特異的融合遺伝子を標的とした血中循環微量腫瘍細胞の検出」(課題番号:25462325)の研究結果を応用し、研究を進めてきた。インフォームドコンセントを得た後に骨軟部肉腫患者から採取した末梢血液検体から高効率のRNA抽出キットを用いることにより、高精度のRNAを抽出することに成功した。また、ユーイング肉腫、粘液型脂肪肉腫、滑膜肉腫、隆起性皮膚線維肉腫および胞巣状軟部肉腫のそれぞれに特異的な融合遺伝子であるEWSR1-FLI1, FUS-DDIT3, SS18-SSX1, 2, COL1A1-PDGFB,およびASPL-TFE3に対する特異的なPCRプライマーを外部企業に委託し、作製した。前述の末梢血液検体から採取したRNA中におけるこれらの融合遺伝子の発現について、上記プライマーを用いた定量的RT-PCR法によりユーイング肉腫と滑膜肉腫において高感度に検出が可能であることもすでに確認した。ただ、他の肉腫においては当初の期待した程度の検出感度には至っておらず、プログラムの修正やプライマーの変更などを行いつつ、さらなる感度の向上について条件設定を行っている。ユーイング肉腫と滑膜肉腫に関しては、現在、相対定量解析ソフトを使用することで血中循環腫瘍細胞中の融合遺伝子コピー数を相対定量化している。上記の通り、粘液型脂肪肉腫、隆起性皮膚線維肉腫と胞巣状軟部肉腫に特異的な融合遺伝子に関して、期待通りの感度での検出ができておらず、現在検出感度向上のための反応条件を修正中である。ユーイング肉腫と滑膜肉腫に関しては、良好な感度での融合遺伝子検出が可能となっており、先行して研究を進めている。現在、血中循環腫瘍細胞中の融合遺伝子コピー数の相対定量化を進めており、診療録から確認される各患者から血液を抽出した時期の病態と比較検討している。研究を開始した時点での検体数は50検体と限られた数であったため、現在新たな検体の採取も行っている。なお、当初予定していなかったスタニオカルシンという分子について、その発現量と病態や病勢との関連を偶発的に見出した。これは脂肪肉腫における組織学的悪性度との相関や、臨床的に病状の進行に伴い、スタニオカルシンの発現量が増加するというものであり、上記融合遺伝子の発現同様に腫瘍マーカーとしての有効性について併せて検討を進めていく。骨軟部肉腫のおいては、癌腫で臨床上頻用されるような腫瘍マーカーはほとんどなく、末梢血の解析により、患者の病態を客観的に推察する指標はない。そこで、我々は平成25年度から27年度に科学研究費助成事業として「骨軟部肉腫における腫瘍特異的融合遺伝子を目的とした血中循環微量腫瘍細胞の検出」について検討し、その有効性について基礎的な結果を示すことができた。本年度は、ユーイング肉腫、粘液型脂肪肉腫と滑膜肉腫の様々な病態の患者から末梢血を採取し、それぞれに特異的な融合遺伝子であるEWSR1-FLI1, FUS-DDIT3とSS18-SSX1,2に対する特異的なプライマーを作成し定量的RT-PCR法により血中循環腫瘍細胞の検出が可能か、さらにその相対定量と病態との相関性はあるかなど検討を重ねてきた。
混合潤滑下における境界膜の被覆率測定

本研究の目的は、吸着分子膜のレオロジー特性を考慮した境界潤滑領域の摩擦特性を定量的に予測するために必要な境界膜の被覆率を測定することである。境界潤滑膜の摩擦特性をあきらかにするために、ある条件(すべり速度,温度)の下で,吸着膜がどの程度の割合で接触面に存在するか(接触面での被覆率)を明らかにする必要がある。本研究では、軽荷重(mN、MPaオーダ)・極低速(μm/s)における被覆状態を、エリプソメトリおよび,ブリュースター角顕微鏡によって,摩擦直後のしゅう動面を観察することによって測定する。また、従来行ってきた100%被覆している状態(LB膜類似吸着膜)の摩擦特性から吸着膜のレオロジー特性を推定することで,混合潤滑の総合的な摩擦特性を説明できるようになるが,装置の改良による被覆率測定法の確立と,いくつかのパラメータを振った場合の境界膜の被覆率測定を試みた.エリプソメトリ・ブリュースター角顕微鏡測定で問題となった粗さのある面の微小な面の傾きによる影響は除去するのが非常に難しいことがわかった.また境界膜(吸着膜)の特性,とくに吸着膜の空間的な分布と表面の高さ分布を把握するために既存の走査型プローブ顕微鏡のAFM, FFM,交流FFMなどを使って,面圧,しゅう動速度,温度をパラメータとしてしゅう動時の被覆率がどのように変化するのかについてデータを収集し被覆率を推定するための摩擦係数のマッピングを行った.本研究の目的は、吸着分子膜のレオロジー特性を考慮した境界潤滑領域の摩擦特性を定量的に予測するために必要な境界膜の被覆率を測定することである。本研究では、軽荷重(mN, MPaオーダ)・極低速(μm/s)における被覆状態を、偏光顕微鏡システムによって,摩擦直後のしゅう動面を観察することによって測定する。また、従来行ってきた100%被覆している状態(LB膜類似吸着膜)の摩擦特性から吸着膜のレオロジー特性を推定することで,混合潤滑の総合的な摩擦特性を説明できるようになるが,そのための基礎的なデータを収集・整理することを考えている.本年度はそのための準備として,まずモデル境界膜(LB膜類似吸着膜)の被覆状態(被覆膜の厚さ・被覆率)を測定するための予備実験装置として,既存の顕微鏡を改造した偏光顕微鏡システムの試作を行った.この偏光顕微鏡システムは偏光強度と偏光角の関係を測定することで,ブリュースター角測定およびエリプソメトリを行うことが可能である.偏光顕微鏡製作においては,光軸調整の精度向上および空間分解能向上などが課題となっており,来年度は正確なブリュースター角測定とエリプソメトリによる膜厚測定の分解能向上を行い,実際のしゅう動面観察に応用する予定である.本研究の目的は、吸着分子膜のレオロジー特性を考慮した境界潤滑領域の摩擦特性を定量的に予測するために必要な境界膜の被覆率を測定することである。また、従来行ってきた100%被覆している状態(LB膜類似吸着膜)の摩擦特性から吸着膜のレオロジー特性を推定することで,混合潤滑の総合的な摩擦特性を説明できるようになるが,装置の改良による被覆率測定法の確立と,いくつかのパラメータを振った場合の境界膜の被覆率測定を試みた.エリプソメトリ・ブリュースター角顕微鏡測定で問題となった粗さのある面の微小な面の傾きによる影響は除去するのが非常に難しいことがわかった.また境界膜(吸着膜)の特性,とくに吸着膜の空間的な分布と表面の高さ分布を把握するために既存の走査型プローブ顕微鏡のAFM, FFM,交流FFMなどを使って,面圧,しゅう動速度,温度をパラメータとしてしゅう動時の被覆率がどのように変化するのかについてデータを収集し被覆率を推定するための摩擦係数のマッピングを行った.
ヒト由来PGD合成酵素の金属イオンによる活性化機構解明のための中性子線構造解析

アレルギーや炎症の媒介物質であるプロスタグランジン(PG)D2は、補酵素グルタチオン(GSH)存在下、造血器型プロスタグランジン(PG)D合成酵素(H-PGDS)の働きによって産生される。以前、Ca,およびMgイオンの働きによって活性化される分子メカニズムをX線構造解析によって解明したが、これを中性子線解析法によって解明する目的で大型結晶の育成研究に取り組んだ結果、0.5 mm^3程度の高品質結晶が得られることが判明したアレルギーや炎症の媒介物質であるプロスタグランジン(PG)D2は、補酵素グルタチオン(GSH)存在下、造血器型プロスタグランジン(PG)D合成酵素(H-PGDS)の働きによって産生される。以前、Ca,およびMgイオンの働きによって活性化される分子メカニズムをX線構造解析によって解明したが、これを中性子線解析法によって解明する目的で大型結晶の育成研究に取り組んだ結果、0.5 mm^3程度の高品質結晶が得られることが判明した本研究では、アレルギー伝達物質であるプロスタグランジン(PG)D_2の産生を担うヒト由来造血器型PGD合成酵素(H-PGDS)の活性中心に存在するグルタチオン(GSH)をチオラート化によって活性化させる分子機構について、中性子線解析により原子レベルで解明し、GSHを活性中心に持つGSTファミリーに共通の反応機構の解明を目指すことを目的としている。通常、中性子構造解析のためには1mm角を超える大型の高品質結晶が必要となるため、22年度は、まずH-PGDSを大量に精製し、大型結晶のための育成実験に取り組み、最大で0.3×0.4×1.1mm程度の大型結晶の育成には成功したものの、中性子線回折実験に耐えうるような1mm角以上の高品質で大型の結晶を得るには至らなかった。これまでに、X線構造解析の結晶として、大量精製の確立および、Native結晶のX線構造解析(Nat.Struct.Biol., 2003)、および、阻害剤複合体のX線構造解析(J.Biochem., 2004, J.Biol.Chem., 2006)に成功し、さらなる大型高品質結晶の育成実験に関しては、ソユーズを使った宇宙実験に際してゲルチューブ法による結晶化を試み、最大で0.5×0.4×1.7mmの結晶が得られ、Native結晶については、1.28A分解能、阻害剤複合体に関しては1.05A分解能でのX線結晶構造解析に成功した。しかし、X線構造解析のためのX線回折強度データーの収集の際、強い放射光を長時間照射されたことによる酸化が進行し、余分な酸素との結合によるスルフィド結合の形成が起こっていた。さらなる高品質で大型結晶の育成実験を目的として新しい結晶化条件の検索のためのスクリーニングも行ったが、PEG6000を使った元来の結晶化条件以外に良好な条件は検索できなかった。撹拌実験、および、ゲルの入ったチューブによるカウンターディヒュージョンによる大型結晶化育成実験ではなく、最近我々の研究グループで開発しているゲル中での大型育成実験などを行うなど、新たな結晶化方法および条件の検索を行う予定である。本研究では、アレルギー伝達物質であるプロスタグランジン(PG)D_2の産生を担うヒト由来造血器型PGD合成酵素(H-PGDS)の活性中心に存在するグルタチオン(GSH)をチオラート化によって活性化させる分子機構について、中性子線解析により原子レベルで解明し、GSHを活性中心に持つGSTファミリーに共通の反応機構の解明を目指すことを目的としている。通常、中性子構造解析のためには1mm角を超える大型の高品質結晶が必要となるため、23年度は、22年度に引き続き、H-PGDSの大量精製、ミクロ種結晶化法、マクロ種結晶化法を駆使した種結晶化を繰り返し、大型結晶育成のための結晶化実験に取り組み、最大で0.3×0.5×1.5mm程度の大型結晶の育成に成功したが、ほとんどの結晶が種結晶化を繰り返すうちに結晶のモザイク性が大きくなることが一般的なX線回折実験により明らかとなり、中性子線回折実験には至らなかった。別途、標準サンプルであるリゾチームなどを用いて開発を行っている撹拌技術やゲルチューブ法を駆使した大型結晶育成実験も試みてはいるものの、いずれもモザイク性の高い結晶が得られ、種結晶化の回数が少なくても済むような結晶化条件の検索を行っている。一方、阻害剤との複合体を形成すれば標的タンパク質の活性部位の構造を安定化でき、良質の結晶が得られると考え、いくつか阻害剤複合体を作製し、構造解析を試みると同時に阻害活性との相関についても追究し、欧文誌による論文報告を行った。造血器型プロスタグランジン(PG)D合成酵素(H-PGDS)が補酵素グルタチオン(GSH)存在下でアレルギー物質であるPGD2を産生する際、2量体の中心に結合したMg2+はGSHのKm値を約4倍も向上させ、酵素を活性化することが知られている(Nat. Struct. Mol. Biol., 2003)。本研究課題では、ヒト由来H-PGDSの中性子線解析を成功させ、2量体の中心に存在するMg2+によってそれぞれのプロトマーごとに補酵素として結合するGSHのSH基をチオラート化する分子機構を直接観察によって明らかとし、2量体間のヘテロな構造も明らかとして、Mg2+による協奏的な活性化機構も解明することを目的としている。中性子線解析を成功させるためには、通常1 mm角以上の高品質で大型の結晶を得る必要があり、高純度サンプルの精製および大型結晶化を繰り返し行った。

特に種結晶化による大型化を試みたが、最大で0.3×0.4×1.1 mmを超える良質で大型の結晶育成には成功しなかった。一方で、以前、ソユーズを使った宇宙実験を試み、ゲルチューブ法を用いた結晶化を試み、Native結晶について1.28Å分解能、阻害剤複合体に関しては1.05Å分解能でのX線回折強度測定に成功している。マキシマムエントロピー(MEM)法による構造精密化を終了し、これまでに見られなかった水和構造について明らかとなった(in preparation)。しかし、活性中心のチオラートは放射光によるX線損傷によって酸化され、本来の活性型の構造ではなかった。一方、本研究課題を推進する過程で、ゲルを使った結晶核の発生方法や、溶液撹拌技術と組み合わせた大型結晶育成実験などを試み、新たな結晶化方法の開発に成功している。中性子線回折用の大型結晶の作製が非常に困難で、大型結晶の育成実験に成功(厚みが0.5mm,大きさが2.0mを超える)しても、何度か種結晶化を繰り返すうちに結晶のモザイク性が増大し、ほどんどの結晶が中性子回折実験に不適な結晶となり、進捗がやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。一般的な標準サンプルを用いて大型結晶育成に関するツールの開発も別途進めている。それらツールを用いた結晶育成を行うと同時に、育成途中の結晶を用いて強力な放射光のX線も用いた超高分解能での構造解析も進め、活性化メカニズムの解明を目指す。
チアノーゼ心筋におけるエンドセリン受容体拮抗薬の心筋保護効果

1.低酸素が心機能に及ぼす影響を評価するために、8週令のWistar系雄性ラットを用いて、8週間低酸素暴露下で飼育し、慢性低酸素血症モデルラットを作成。その心機能を経胸壁心エコー図法で計測し、同週令の正常ラットと比較検討した今回・従来の評価項目に加え、右室流出血流の計測や、心腔内造影法による左室収縮能の評価なども新たに導入した。慢性低酸素血症ラットは、動脈血酸素飽和度の低下と多血症を呈した。また低酸素によるhypoxicpulmonary vasoconstrictionから肺動脈圧が上昇し、右室肥大を呈した。心機能は、左室収縮能は維持されていたが、拡張能の低下を認めた。この原因として、肥大した右室が左室の拡張能を物理的に低下させた可能性と、肺動脈圧の上昇に伴う右室駆出時間の延長が拡張能を低下させた可能性が考えられた。2.生直後より低酸素暴露下に4週間、8週間飼育した低酸素血症モデルラットを作成。それぞれ摘出心をLangendorff回路を用いて、20分の常温虚血後、40分間再潅流した。虚血後の左心室収縮能および拡張能の回復は、低酸素血症期間の短い4週飼育群の方が優れていた。3.犬を用いた心停止ドナーからの心臓移植実験において、エンドセリン受容体拮抗薬を、心停止前に静注投与し、また心筋保護液にも追加した。投与群では、非投与群に比べ、心停止直前の肺動脈圧が有意に低く、移植後の右室機能が良好であった。平成12年度は当教室独自の病態モデルである、慢性チアノーゼモデルラットを作成し、その評価を行った。帝人社製の在宅酸素療法用医療装置ハイサンソを改良利用し、低濃度の酸素(FiO2=10%)を得たのち、これを密閉したchamber内に吹き込み、hypoxic chamberとした。このhypoxic chamber内で酸素及び二酸化炭素濃度さらに温・湿度などをモニターしながら、8週令のWistar系雄性ラットを4週間飼育し、実際に慢性チアノーゼモデルラットを作成した。これらの慢性チアノーゼモデルラットと、通常のroom airで4週間飼育した8週令のWistar系雄性ラット(コントロール群)を比較検討した。まず、慢性チアノーゼモデルラットは4週間の飼育中にほとんど体重の増加を示さなかった。また、心筋の湿重量においてコントロール群と比較すると、左室/体重比に有意差は認めないものの、右室/左室比および右室/体重比は有意に増加し、右室の肥大を認めた。さらにヘマトクリット値は、慢性チアノーゼモデルラットではコントロール群と比して、有意に高く、多血症を呈した。現在、これら慢性チアノーゼモデルラットの心筋内エンドセリンの発現を証明すべく、免疫組織学的検討を行っている。平成13年度は以上の結果をふまえ、エンドセリン受容体拮抗薬の心筋保護効果に関して検討する。8週令のWistar系雄性ラットをFiO2=10%にコントロールしたhypoxic chamber内で8週問飼育したChronic Hypoxic Rat(H群;n=7)と、通常のroom airで飼育した同週令のNormoxic Rat(N群;n=8)を対象とし、チアノーゼモデルラットの心機能を心臓超音波検査で評価した。麻酔はketamine(50mg/kg)とxylazine(10mg/kg)の腹腔内投与で行った。心機能はアロカ社製フルデジタル超音波診断装置SSD-5500と電子リニア探触子UST-5545を用いて評価した。また心臓超音波検査終了後、動脈血採血と心臓及び肺を摘出し、湿重量を測定した。H群はN群と比較して、動脈血酸素飽和度は82±3(N群:98±0.1)%と低下し、Hct.61±3(47±1)%と多血症を認めた。

また右室/左室の湿重量比は0.39±0.06(0.25±0.03)と右室肥大を呈していた。心臓超音波検査では、右室流出血流のpeak velocity 0.75±0.05(0.99±0.05)m/s、AcT/ET 0.33±0.03(0.43±0.04)と肺高血圧の所見を呈していた。左室収縮能は%FS 41±6(44±5)、mVcf 5.0±0.5(5.5±1.1)circ/sと差を認めなかったが、左室流入血流は、E/A 4.2±1.5(1.8±0.3)及びE Deceleration 28±7(17±2)m/s2とrestrictive patternを示し、左室拡張能は低下していた。さらに肺湿重量/体重比も4.93±0.44(3.75±0.16)mg/gと差を認めた。Chronic Hypoxic Ratでは、肺高血圧と右室肥大を呈し、その左室機能は、収縮能は維持されているが、拡張能は障害されていた。慢性的な低酸素状態では、左室機能が低下することが明らかとなった。