hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体活性無機ナノ粒子－有機ハイブリッド膜の創製とその化学的特性の評価

マグネシウム合金の生体内自己崩壊速度を制御する目的で,合金表面に無機有機ハイブリッド薄膜の創製を検討した.チオフィン系導電性モノマーと支持電解質である過塩素酸テトラブチルアンモニウムをMMAに溶解し,電解液とした.この電解液にナノハイドロキシアパタイト(nano-Hap)を添加した.合金をカソード,炭素棒をアノードとし電解処理をおこなった.合金表面をEPMA, XPS, FTIRおよびAFMにより分析した.その結果,合金表面にnano-Hapを含むPMMA薄膜,すなわち生体活性の無機ナノ粒子と有機のハイブリッド膜が生成され,合金の自己崩壊速度を制御する機能性ハイブリッド膜が設計できた.生体活性をもつナノ粒子の無機化合物と有機薄膜とのハイブリッド膜の創製を最終目的としている.生体活性をもつ無機化合物としてはリン酸カルシウムが挙げられるが,はじめにジルコニア,アルミナとルチルを選択し,これら酸化物をステアリン酸処理し,脱溶媒処理した.つぎにチオフィン系導電性試薬を非プロトン溶媒に溶解し,これをMMA(メチルメタクリレート)に加えた.この溶液にステアリン酸処理した酸化物を加え電解液とした.鏡面研磨したチタン板をカソード,Pt板をアノードとし電解処理を次のようにおこなった.試料と対極との距離を2 mmとし,20 VDCを3,600 s印加した.この際,マグネットスターラーを用いて電解液を撹拌した.カソードのチタン板上に有機無機の複合体が生成した.その分析には,X線マイククロアナライザー(EPMA),フーリエ赤外分光(FTIR)と原子間力顕微鏡(AFM)を用いた.その結果,EPMAの結果から有機物中に酸化物が分散していることが分かった.またFTIRの結果から, 3000 cm-1付近のC-H, 1731 cm-1 C=O, 1385 cm-1 CH3, 1240-1150 cm-1 C-O-Cに吸収スペクトルが確認された.これらのピークからMMAが電解重合しPMMA(ポリメチルメタクリレート)が生成したことが推測された.さらに導電性モノマーであるチオフィン由来のC-Cの1520,1385と753 cm-1のスペクトルも確認されたことから,有機薄膜はチオフィンを含むPMMA様有機物であると思われる.これは,いずれの酸化物においても確認された.PMMA様の有機薄膜と酸化物とのハイブリッド被膜の3次元AFM像とEPMAの酸化物の元素分布から,酸化物の粒子の大きさはサブミクロンと推測された.電解析出によるリン酸カルシウムの粒子と電解重合により生成する有機被膜とのハイブリッドの創製を目的としている.はじめに,リン酸カルシウム水溶液中で,白金板をアノードに,マグネシウム合金やチタンをカソードとして定電流または定電圧電解すると,電解初期にブルシャイトがカソード表面に析出し,電解を続けるとその結晶がアパタイトに転移することが確認された.つぎに,有機被膜とのハイブリッドを創製するために,電極表面にMMA(メチルメタクリレート)の電解によるPMMAの被膜生成を検討した.ハイブリッド膜を電解によって創製するために,有機膜に導電性が求められる.そこで,重合禁止剤を除いたMMAにチオフェン系導電性モノマーT2347と支持電解質TBAPを含む電解液を調整した.この電解液を電解セルに入れ恒温槽中で白金板をアノードに,マグネシウム合金または陽極酸化したチタンをカソードとして,一定電流密度で電解処理した.その結果,カソード表面にゲル状の膜が生成した.マグネシウム合金はやや茶褐色になった.つぎに電解処理した試料を30-40°Cで乾燥させると透明な被膜となった.電解液中の導電性モノマーの濃度が均一な有機被膜の生成に寄与することがわかった.生成した被膜のFTIRの結果から,導電性モノマーとPMMAに由来する官能基が確認された.また,XPSスペクトル解析からPMMAに帰属する特有のC1sとO1sスペクトルが得られた.さらに導電性モノマー由来のS2pのスペクトルも確認された.したがって,生成した有機被膜はPMMA様で,導電性モノマーを含むことがわかった.このように,電解による無機ー有機ハイブリッド膜を創製する準備ができた.生体内分解性材料として注目されているマグネシウム合金AZ31への有機被膜と無機有機ハイブリッド被膜の生成を検討した.チオフィン系導電性モノマーを含むMMAを電解液として調製した.AZ31をカソード,炭素棒をアノードとし,印加電圧10-50 VDC,1-5時間電解した.生成した被膜の特性をフーリエ赤外分光FT-IR, X線分光XPSと原子間力顕微鏡AFMを用いて検討した.その結果,合金表面にサブミクロンオーダーの厚さのPMMA被膜が生成した.さらに厚い被膜を生成するために電解液を約60°Cで2週間加温し粘性のある液体とし,この液体に支持電解質としてN,NジメチルホルムアミドDMFを加えた.これを電解液として同様に電解処理した.その結果,合金表面には白色の有機被膜が生成した.FT-IRとXPSの結果から,この被膜はPMMAと確認された.AFMによる形態観察から被膜の厚さは約10 umであった.また,マイクロホールが観察された.さらに電解重合の機序を検討するために電解電流を測定した.

電解電流はマイクロアンペアオーダーであり,印加電圧が大きいほど初期の電解電流は大きく,その後は対数関数的に減少した.したがって,電解初期において合金界面でMMAの重合が急速に起こり,その後は徐々に遅くなると推測された.被膜の合金表面への密着性または接着性は,チオフィン系導電性モノマーに依存した.しかし,密着性はそれほど大きくなかった.つぎに,調製した電解液にリン酸カルシウム水溶液を加えた二相混合溶液での電解を検討した.この電解処理ではPMMAの被膜が生成しなかった.そこで,調製した電解液にナノ粒子のハイドロキシアパタイトを添加し撹拌しながら電解し,無機有機ハイブリッド被膜の生成を検討した.生体親和性に優れるチタン(cpTi)および生体内自己崩壊性合金として注目されているマグネシウム合金(AZ31, AZ91)表面に電解重合による無機有機ハイブリッド被膜の創製を検討した.無機材料としてナノメートルのハイドロキシアパタイト(Nano-Hap),有機材料としてはMMAを選択し次のように電解液を調製した.チオフィン系導電性モノマー2,3-ThiophenedicarboxaldehydeをMMAに溶解し,その濃度を0.01 Mとした.また,支持電解質としてMMAに溶解した0.1 M過塩素酸テトラブチルアンモニウムを用いた.両液体を混合して電解液とした.この電解液に約0.1 gのNano-Hapを添加した.合金をカソード,炭素棒をアノードとし,マグネットスターラーで撹拌(200 rpm)しながら電解処理をおこなった.また,電解時の電流値をデータロガーに記録した.カソード電極表面に生成したハイブリッド被膜をFTIR,EPMAとAFMを用いて分析した.その結果,電解電圧80 VDC,電解時間3600 sの電解条件では,両液体の混合体積比(導電性モノマー/支持電解質)が5/5, 7/3の場合,均一な被膜が生成された.これはカソードに用いた合金には依存しなかった.被膜は,FTIRスペクトルから導電性モノマーを含むPMMAと推測された.また,EPMAによる観察結果から生成した被膜内のNano-Hapの粒径は250 nm以下であった.ただ凝集状態の粒子も観察された.AFMによる平均表面粗さは,58 nmであった.以上の結果から,生体活性の無機ナノ粒子と有機薄膜とのハイブリッド被膜を合金表面上に生成することができた.マグネシウム合金の自己崩壊性の制御が可能な新しい表面処理を提案することができた.マグネシウム合金の生体内自己崩壊速度を制御する目的で,合金表面に無機有機ハイブリッド薄膜の創製を検討した.チオフィン系導電性モノマーと支持電解質である過塩素酸テトラブチルアンモニウムをMMAに溶解し,電解液とした.この電解液にナノハイドロキシアパタイト(nano-Hap)を添加した.合金をカソード,炭素棒をアノードとし電解処理をおこなった.合金表面をEPMA, XPS, FTIRおよびAFMにより分析した.その結果,合金表面にnano-Hapを含むPMMA薄膜,すなわち生体活性の無機ナノ粒子と有機のハイブリッド膜が生成され,合金の自己崩壊速度を制御する機能性ハイブリッド膜が設計できた.
光によって覚醒する麻酔モデルの作成

オワンクラゲの緑色蛍光色素であるGreen fluorescent protein(GFP)を5'端に癒合したα2Aアドレナリン受容体サブタイプを発現した遺伝子改変マウスのホモ体の機能解析を行った。まず作成した脳切片を蛍光顕微鏡にて観察し、fusion proteinが脳内、特に青斑核に強く発現していることを確認した。次に全脳を用いたデクスメデトミジンによる受容体結合実験にて、野生体、ホモ体のBmax値(fmol/mg protein)は、それぞれ509, 417で、Kd値(nM)はそれぞれ、1.33, 0.81であり、遺伝子改変マウスと野生体の間に有意差はなかった。以上の結果から、次年度はレーザー照射の条件設定を行うことができる。昨年度に行ったオワンクラゲの緑色蛍光色素であるGreen fluorescent protein (GFP)を5'端に癒合したα2Aアドレナリン受容体サブタイプを発現した遺伝子改変マウスのホモ体の機能解析結果より、受容体発現の密度には遺伝子改変マウスと野生体の間に有意差はなかったことから、本年度はレーザー照射の基本設定を行った。マウス用アダプターを取り付けた脳定位固定装置を使ってペントバルビタール麻酔下のマウスの青斑核にガイドカニューラを正確に立てる術式を習熟した。すなわち、Bregmaより後方に、5.34mm、側方に0.75mm、脳表より2.2mmの深さにガイドカニューラの先端を設置し、カニューラ上方をレジンにて固定した。デクスメデトミジン10μg in 0.2μl生理食塩水をカニューラを通じて青斑核にmicroinjectionし、麻酔がかかることによってその位置確認を行った。ガイドカニューラを通じてレーザー光を直接に青斑核に当てるために光ファイバー伝送システムに改良を加え、ファイバー1本にてレーザー光を発することができるようにした。すなわちFCコネクタに接続したファイバーケーブルの先端をヤスリにて研磨し、マウス頭部のガイドカニューラに挿入できるようにした。しかしまだ手技的には不安定でさらに習熟することが必要である。またコネクタ部のマウントが不安定でレーザー光を正確にレーザー発生装置からファイバーに伝送できず、この部分の改良も問題となっている。1)脳定位固定装置を使ってマウスの青斑核にガイドカニューラを正確に立てる術式を確立した。すなわち、SR-5脳固定装置にマウス用アダプターを装着し、ペントバルビタール麻酔下の遺伝子改変マウスを外耳道固定し、BregmaよりA=-5.34mm, L=0.75mm, V=2.2mmにてC313G guide cannulaをレジン固定した。確認のために翌日、このguide cannulaを通じてdexmedetomidine 0.04μg/gを投与し、loss of righting reflexを認めたマウスを本実験に使用することとした。2) guide cannulaを通るファイバー1本にてレーザー照射ができるようにレーザーシステムの改良を試みた。すなわち、イオンレーザー(メレスグリオ社)及び光ファイバー伝送システムにシングルモードファイバー入射システムを連結し、これに直接光ファイバー線維(NA O.37:ソーラボジャパン)を接続した。この先端を削ってシングルファイバーとしてマウス頭蓋のguide cannulaに挿入すべく様々な工夫を行った。しかしシングルファイバー線維の作成が困難で、青斑核に直接レーザー光を照射する実験を行うまでには至らなかった。
国際コラボレーションによる日本文学研究資料情報の組織化と発信

1.各国の日本学関連研究機関や学会,並びに国際的な日本学関連学会との連携を図り,具体的な課題による海外共同研究拠点を形成し,共同研究を進めた.各国における日本文学研究者ディレクトリ,研究論文,翻訳作品等の資料,情報を共同して収集し組織化し,データベース化し,公開を促進した.特に,AISTUGIA(イタリア日本研究学会)及びSFEJ(フランス日本研究学会)とのコラボレーションにより,日本文学研究論文並びに翻訳書の目録データベースが完成し,高い評価を得た.2.古典学を対象とするXMLによる電子化テキストを共同研究し,実用化した.日本古典文学大系(岩波書店刊行,全100巻600作品)について,データ共有化を促進した成果は大きい.奈良絵本の原本画像とテキストとの比較や対応を可能とする多重処理技術の研究を進め,実用化した.イタリアのサレジオ大学マリオ・マレガ文庫所蔵日本書籍目録の英文編を完成し,刊行した.3.源氏物語等の古筆切や蔵書印を画像データベース化し,インターネットを介して,注釈や翻刻アノーテーションを行う共同研究システムを実用化した.複数の情報資源をネットワークで統合し共有化を図るため,メタデータ(Dublin Core)と標準検索プロトコル(Z39.50)によるシステムを実証的に研究し,その有用性を確認した.4.日本学術振興会による中間評価を得た(2003年度).伊,仏,台,印の研究者を招聘し国際研究集会を開催し,中間評価を行った(2004年度).イタリアで,ICJS(日本文学国際共同研究)研究集会をAISTUGIAと共催で開催し,国際的な評価を受け,研究成果の有用性を確認した(2005年度).各年度毎に研究成果報告書を作成した.また,最終年度では最終研究成果報告書を発行した.ホームページはhttp://www.nijl.ac.jp/kiban-s/である.1.各国の日本学関連研究機関や学会,並びに国際的な日本学関連学会との連携を図り,具体的な課題による海外共同研究拠点を形成し,共同研究を進めた.各国における日本文学研究者ディレクトリ,研究論文,翻訳作品等の資料,情報を共同して収集し組織化し,データベース化し,公開を促進した.特に,AISTUGIA(イタリア日本研究学会)及びSFEJ(フランス日本研究学会)とのコラボレーションにより,日本文学研究論文並びに翻訳書の目録データベースが完成し,高い評価を得た.2.古典学を対象とするXMLによる電子化テキストを共同研究し,実用化した.日本古典文学大系(岩波書店刊行,全100巻600作品)について,データ共有化を促進した成果は大きい.奈良絵本の原本画像とテキストとの比較や対応を可能とする多重処理技術の研究を進め,実用化した.イタリアのサレジオ大学マリオ・マレガ文庫所蔵日本書籍目録の英文編を完成し,刊行した.3.源氏物語等の古筆切や蔵書印を画像データベース化し,インターネットを介して,注釈や翻刻アノーテーションを行う共同研究システムを実用化した.複数の情報資源をネットワークで統合し共有化を図るため,メタデータ(Dublin Core)と標準検索プロトコル(Z39.50)によるシステムを実証的に研究し,その有用性を確認した.4.日本学術振興会による中間評価を得た(2003年度).伊,仏,台,印の研究者を招聘し国際研究集会を開催し,中間評価を行った(2004年度).イタリアで,ICJS(日本文学国際共同研究)研究集会をAISTUGIAと共催で開催し,国際的な評価を受け,研究成果の有用性を確認した(2005年度).各年度毎に研究成果報告書を作成した.また,最終年度では最終研究成果報告書を発行した.ホームページはhttp://www.nijl.ac.jp/kiban-s/である.本研究は欧米の研究者とのコラボレーションによる日本文学とその周辺のためのコンテンツの充実,すなわちデジタル・アーカイブズの共同構築とその流通促進を目的とする。欧米に共同研究拠点を設け,コラボレーション・システムを構築し,次の3課題を研究する。1.日本文学のための国際的コンテンツの整備2.日本文学研究資料情報アーカイブズの共同構築と利用3.メタデータ・データベースの構築と共有化である初年度は具体的な研究計画を各国と共同して固めることから始めた。現在,共同研究者としてアメリカ,イギリス.フランス.イタリアとの枠組が整ってきている。今年度は次の研究を開始した。1.システム研究:基本サーバを導入し,コラボレーション・システムの要求仕様を各国の研究拠点において固めた。2.コンテンツ研究:各国の研究者との調整により,網羅的な高品質の学術研究用情報を選び,収集法・デジタル化法を検討した.重要な研究拠点として,日本学関連学協会の協力を得ている。今年度の研究活動は随時のミーティングおよびメーリングリストにより研究を推進し,また専用のホームページを立ち上げた。さらに.関連する様々な研究会やシンポジウムに積極的に参加し,研究発表並びに報告を行った。今年度の研究成果報告書にまとめている。本研究は欧米の研究者とのコラボレーションによる日本文学とその周辺のためのコンテンツの充実,すなわちデジタル・アーカイブズの共同構築とその流通促進を目的とする。1.日本文学のための国際的コンテンツの整備2.日本文学研究資料情報アーカイブズの共同構築と利用3.メタデータ・データベースの構築と共有化定例的に2ヶ月に1度研究会を開催し(計6回),研究討議を行った。またこの他に,随時のミーティングを月1回程度開き,研究連絡・推進・調整に当たっている。

さらに,日々の研究推進に当たってはメーリングリスト,ホームページにより,緊密な研究連絡,調整を行っている。共同研究者としてアメリカ,イギリス,フランス,イタリアとの枠組が整ってきた。なお,具体的な研究成果は以下の通りである。1.システム研究:導入した基本サーバにおいてコラボレーション・システムの要求仕様を各国の研究拠点において固めた。一方,関連する様々な国内外の研究会やシンポジウムに積極的に参加し,研究発表並びに報告を行い,評価を得た。以上については、今年度作成した研究成果報告書にまとめている。研究成果を次の3点にまとめる.(1)基盤的な情報資源の収集体制の確立とその進展.(2)海外共同研究拠点の形成とその進展.(3)コラボレーションシステム環境の推進.(1)海外の研究拠点における研究ディレクトリ,研究論文目録データベース,翻訳作品目録データベースなどを中心とする情報資源の蓄積が進んだ.ホームページの充実も促進した.(2)海外の多くの学協会との協力関係が進展した.とりわけ,AISTUGIA(伊日研究学会)の協力は大きく,Adriana Boscaro教授(会長,Venezia大学)を始め多くの日本文学研究者の全面的な支援を得て,コンテンツの蓄積を行った.SFEJ(仏日研究学会)も,Cecile Sakai教授(会長,Paris7大学)始め,College de Franceなどの多くの研究機関から具体的支援を得て,コンテンツ蓄積を軌道に乗せた.BAJS(英国日本研究協会)学会にも参加し,研究発表を行い,コラボレーションを強化した.EAJS(全欧日本学国際会議)に参加し,研究発表を行った.(3)研究基盤の準備として,国文学研究資料館における各種の形態の異なる情報資源の共有技術の確立を行い,これを基に同種の研究機関の資源共有化の方策を検討し,成果を得た.例えば,国立歴史民俗博物館,国際日本文化研究センター,国立民族学博物館,東京大学史料編纂所,大阪市立大学との情報資源共有化の進展である.基盤技術として,メタデータと標準情報検索プロトコルによる各種データベースの横断利用システム環境の構築を進めた.さらに,総合研究大学院大学共同研究プロジェクト「資源共有化」と密接な連携を強化し,データベースの一元的共有化実証実験を推進した.各基盤研究機関との接続は成功し,現在試験的に研究者に公開し,評価を進めている.2日間にわたる公開の合同研究集会を開催し,研究発表,講演を通じて,多大の評価を得た.本研究も中間期を向え,日本学術振興会による本研究の中間評価があった.評価は「A:現行のまま推進すればよい」であった.基盤機関などの法人化にあたって,財産の引継に課題があり,基盤機関と協議して解決することが求められた.一方,関連する様々な国内外の研究会やシンポジウムに積極的に参加し,研究発表並びに報告を行った.また,今年度の研究成果報告書をまとめた.
肺線維症におけるＩＬＣ２の役割解明

特発性間質性肺炎(Idiopathic Interstitial Pneumonia; IIPs)は原因不明の特定疾患群であり、肺間質の炎症や線維化を特徴とする。IIPs患者の半数は、ステロイドや免疫抑制剤といった治療に抵抗性であり非常に予後が悪いため、病態の解明ひいては新しい治療法の開発が待たれている。数多くのIIPs研究がこれまでなされてきたにも関わらず、病態の全貌が未だ明らかになっていない原因の一つとして、適切なモデルマウスが存在しなかったことが挙げられる。従来モデルでは薬剤投与によって病気を引き起こしているため未病期を解析できないこと、さらに本来IIPsは年齢とともに病態が悪化していくのに対し、従来モデルでは自然寛解するため増悪期が解析できないことが問題であった。2型自然リンパ球(Group 2 innate lymphoid cells; ILC2)は当研究室で2010年に発見された新しいリンパ球であり、アレルギーの増悪や寄生虫感染時の防御に関わる細胞である。近年ILC2がこれらの疾患のみならず、他の様々な疾患の増悪・発症にも関与することが次々と明らかにされつつある。当研究室でILC2の主要な抑制機能を破綻させたマウスを作成したところ、ヒトIIPs様の症状を自然発症することが明らかになった。当研究ではこの新規IIPsモデルマウスを用いて、肺線維症の発症・増悪メカニズムを解析することを目的としている。新規モデルマウス作成の経緯から、モデルマウスにおける肺線維症の発症・増悪にILC2が関与している可能性が強く示唆されたため、前年度はこの仮説を証明することに主眼を置いた。申請者の研究により、ILC2がモデルマウス肺において線維化に先んじて活性化していること、さらにILC2なしには肺線維症は発症しないことが明らかになり、ILC2が発症に必須であることが示された。ILC2の主要な抑制機構としてIFNgシグナリング、制御性T細胞(Treg)がこれまで報告されており、当研究室でこれらの抑制機構を両方欠損するマウスIFNgR-/-Rag-2-/-マウスを作成したところ、ヒトIIPs様病態を示すことが明らかになった。病態形成にILC2の関与が強く示唆されたため、前年度はこの新規IIPsモデルマウスを用い、1. ILC2が肺線維症の発症に関与しているのかどうか、2. ILC2の自然な活性化はどのようにして起きるのかを明らかにすべく、解析を行なった。1について、IFNgR-/-Rag-2-/-マウスと、自然リンパ球(Innate lymphoid cells; ILCs)を欠損するgc-/-Rag-2-/-マウスを交配し、gc-/-IFNgR-/-Rag-2-/-マウスを新たに作成して解析したところ、このマウスでは肺線維症の発症は見られなかったため、肺線維症の発症にはILC2を含むILCsが重要であることが証明された。次に2について、前年度の研究計画書に記載したように、線維芽細胞由来SPP1がILC2の自然な活性化を引き起こす可能性を考え、SPP1をILC2の培養上清中に添加してILC2の活性化を見る実験を行なったが、期待されたような効果は得られなかった。そこで視点を変え、以下の実験を行なった。モデルマウス肺由来のILC2を様々なサイトカイン刺激下で培養したところ、野生型マウス肺由来のILC2と比較して、IL-2に対する反応性が上がっていることが明らかとなった。IL-2はILC2自身から産生されることが知られるサイトカインであり、定常状態においても放出されていることから、モデルマウス肺においてIL-2に対するILC2の感受性が向上していることが、ILC2の自然な活性化、ひいては肺線維症発症の原因であることが示唆された。今年度は前年度の結果を踏まえ、まずは1. IL-2がモデルマウスにおける肺線維症発症の原因となるかどうかを証明し、さらに2. ILC2がどのように繊維芽細胞に働きかけて活性化を誘導し、線維症を引き起こすのか、その詳細なメカニズムを明らかにすべく研究を進めていく予定である。1に関して、具体的にはモデルマウスにIL-2を投与し、肺線維症発症が早まるかどうかを検証する。また反対に、発症前のマウスにIL-2中和抗体を投与し、発症が抑えられるのかどうかを検証する。2に関して、ILC2が他の細胞を誘導し線維芽細胞を間接的に活性化させる可能性、もしくは直接活性化させる可能性の両方を考え、実験を進める。前者については、活性化ILC2はIL-5を放出して好酸球を誘導することが知られており、モデルマウス肺においても顕著な好酸球浸潤が見られることから、好酸球が病態に関与している可能性を考えている。現在モデルマウスと好酸球ノックアウトマウスを交配中して新しい系統を作成中であり、これが完成次第、肺線維症を発症するかどうかを解析予定である。また後者に関しては、現在モデルマウス肺由来線維芽細胞をin vitroで培養し、その活性化を評価する系を確立中である。この系を用い、ILC2と線維芽細胞を共培養し、線維芽細胞が活性化するのかどうかを確認する。さらに線維芽細胞の活性化因子と予想されるサイトカインの中和抗体を培養上清に添加し、活性化が阻害されるかを確認する予定である。

特発性間質性肺炎(Idiopathic Interstitial Pneumonia; IIPs)は原因不明の特定疾患群であり、肺間質の炎症や線維化を特徴とする。IIPs患者の半数は、ステロイドや免疫抑制剤といった治療に抵抗性であり非常に予後が悪いため、病態の解明ひいては新しい治療法の開発が待たれている。数多くのIIPs研究がこれまでなされてきたにも関わらず、病態の全貌が未だ明らかになっていない原因の一つとして、適切なモデルマウスが存在しなかったことが挙げられる。従来モデルでは薬剤投与によって病気を引き起こしているため未病期を解析できないこと、さらに本来IIPsは年齢とともに病態が悪化していくのに対し、従来モデルでは自然寛解するため増悪期が解析できないことが問題であった。2型自然リンパ球(Group 2 innate lymphoid cells; ILC2)は当研究室で2010年に発見された新しいリンパ球であり、アレルギーの増悪や寄生虫感染時の防御に関わる細胞である。近年ILC2がこれらの疾患のみならず、他の様々な疾患の増悪・発症にも関与することが次々と明らかにされつつある。当研究室でILC2の主要な抑制機能を破綻させたマウスを作成したところ、ヒトIIPs様の症状を自然発症することが明らかになった。当研究ではこの新規IIPsモデルマウスを用いて、肺線維症の発症・増悪メカニズムを解析することを目的としている。新規モデルマウス作成の経緯から、モデルマウスにおける肺線維症の発症・増悪にILC2が関与している可能性が強く示唆されたため、前年度はこの仮説を証明することに主眼を置いた。申請者の研究により、ILC2がモデルマウス肺において線維化に先んじて活性化していること、さらにILC2なしには肺線維症は発症しないことが明らかになり、ILC2が発症に必須であることが示された。ILC2の主要な抑制機構としてIFNgシグナリング、制御性T細胞(Treg)がこれまで報告されており、当研究室でこれらの抑制機構を両方欠損するマウスIFNgR-/-Rag-2-/-マウスを作成したところ、ヒトIIPs様病態を示すことが明らかになった。病態形成にILC2の関与が強く示唆されたため、前年度はこの新規IIPsモデルマウスを用い、1. ILC2が肺線維症の発症に関与しているのかどうか、2. ILC2の自然な活性化はどのようにして起きるのかを明らかにすべく、解析を行なった。1について、IFNgR-/-Rag-2-/-マウスと、自然リンパ球(Innate lymphoid cells; ILCs)を欠損するgc-/-Rag-2-/-マウスを交配し、gc-/-IFNgR-/-Rag-2-/-マウスを新たに作成して解析したところ、このマウスでは肺線維症の発症は見られなかったため、肺線維症の発症にはILC2を含むILCsが重要であることが証明された。次に2について、前年度の研究計画書に記載したように、線維芽細胞由来SPP1がILC2の自然な活性化を引き起こす可能性を考え、SPP1をILC2の培養上清中に添加してILC2の活性化を見る実験を行なったが、期待されたような効果は得られなかった。そこで視点を変え、以下の実験を行なった。モデルマウス肺由来のILC2を様々なサイトカイン刺激下で培養したところ、野生型マウス肺由来のILC2と比較して、IL-2に対する反応性が上がっていることが明らかとなった。IL-
脂質分子集合体の融合、分裂のダイナミクスの数値的研究

前年度までに構築した脂質分子模型を用いて、二重膜構造をもった小胞(ベシクル)の力学的な力によるベシクルの融合のダイナミクスを明らかにした。融合経路は中間の準安定状態として、両ベシクルの内膜が2分子膜を構成する経路と中間体を形成せずに直接融合する経路の2通りがあることが分かった。力が大きい場合は後者の経路のみが見られる。弱い力の元ではこの2つの経路は確率的に決まる。前者の経路で得られた中間体はストーク模型で予想されていた中間体の構造と似ている。この融合経路は前年度の計算で得られた自発的な融合で得られた経路と異なる。このように融合経路は融合を誘起する要因に依存する。生体内でも複数の融合経路を使い分けている可能性がある。また、ゲル相で観察される多面体の形状のベシクルを数値計算を用いて調べた。これまでの模型に新しい単分子膜の曲率ポテンシャルを考え、加えた。その結果、4面体や立方体など、多数の多面体状ベシクルを得ることができた。このような形状は単分子膜の自発曲率によって調整することができる。多面体の稜での膜の構造などを明らかにした。今後、実験でも様々な形状の多面体ベシクルが得られることが期待される。
皮膚常在菌及びHMGB1 A-BOXによる難治性皮膚潰瘍に対する新規治療法の開発

創傷遅延の原因の一つに、創部での持続する病原性細菌感染とそれに伴う炎症反応の持続が挙げられる。通常は抗菌物質の全身投与が行われるが、そもそも遷延性難治性潰瘍周囲は瘢痕形成などにより血流が悪く、血液中の抗生物質の到達効率が著明に低下している。また、局所的な抗菌物質投与は耐性菌の早期出現を促すため、消毒剤や殺菌性外用剤が用いられることが多いが、これらは同時に細胞毒性を有するため、細胞毒性による創傷遅延を生ずる要因となっている。故に現在は、消毒・殺菌を行うのではなく、生理食塩水などを用いた洗浄処置による細菌量を減少させる方法が主流となってきた。しかしながら細菌増殖能が強く、これを制御できない場合は、やむなく消毒剤や殺菌性外用剤を選択・使用せざるを得ない現状にたびたび遭遇する。我々はこのような難治性皮膚潰瘍にて対して、1)皮膚常在菌である表皮ブドウ球菌の競合的制菌作用と、2)炎症を遷延させる原因の一つである炎症性メディエーターの中で、生体のすべての細胞に存在する核内タンパクであるHMGB1(High mobility group box 1)に注目した。この表皮ブドウ球菌と抗HMGB1抗体であるHMGB1Aboxを補助的に用いることによる抗菌・抗炎症効果を同時に目論んだ新しい治療方法の開発を試みる。今回我々が提案する新規治療法は、細胞障害性を有さず、従来の抗菌物質投与と併用可能な新たな治療オプションとしても期待される。この方法が効果的と判断されれば、臨床現場での新規の強力な治療オプションとして還元される可能性は極めて大きいと見込まれる。1.まず正常人角化細胞を用いた単層培養細胞に対し、マイクロピペット先端(100u用)を用いて、物理的創傷を作成した。その後、皮膚科領域細菌群(e.g., Group B, Streptococcus, Group A streptococcus, S aureus, MRSA, poly(I:C))を作用させて創傷治癒遅延モデルを作成した。細菌群では創傷治癒遅延がみられたが、細菌の増殖によりその後の刺激実験モデルとしては表皮ブドウ球菌以外の細菌群は殺細胞作用が強いため、poly(I:C)刺激によるモデルを用いることとした。2.既に作成されたHMGB1 A-boxのプラスミドを使用し(Yang et al., PNAS, 2004)、愛媛大学プロテオサイエンスセンターにて、コムギ無細胞タンパク質合成技術によりRecombinant HMGB1 Aboxを作成した。3.先ほどの創傷遅延モデルに対し表皮ブドウ球菌とHMGB1 Aboxを投与することで、創治癒の改善がみられた。次に細胞由来のLTA(lipoteichoic acid)とpoly(I:C)の創傷モデルでも改善がみられた。4.次に三次元培養表皮(Livingskin equivalent; LSE)を用いて、同様な実験を行った。物理的創傷にはマイクロピペット先端を用いた。単層培養モデルとは異なり、LSEにおいては創傷治癒モデルの確立が難しく、さらに工夫が必要であると思われたため、現在創傷治癒モデルを作成中である。表皮ブドウ球菌とHMGB1 A-box合成ペプチドによる創傷遅延の改善につき引き続き評価検討を行いつつ、正常マウス(Balb/c)、TLR-2ノックアウトマウスの背部または耳介に形成した皮下膿瘍および創傷モデル(感染有群・無群)を作製したのち、表皮ブドウ球菌死菌含有外用剤、HMGB1 A-box合成ペプチドの効果と細胞毒性をそれぞれ評価した後、両者の混合軟膏を作製する。マウスモデルにおける外用剤の効果を継続検討し、また人角化細胞に対する毒性を検討する。倫理委員会の承認を得たのち、表皮ブドウ球菌死菌およびHMGB1 A-box合成ペプチド含有外用剤をヒト難治性潰瘍(糖尿病性潰瘍など)に対して使用を試み、効果判定を行う。

1.まず正常人角化細胞を用いた単層培養細胞に対し、マイクロピペット先端(100u用)を用いて、物理的創傷を作成した。その後、皮膚科領域細菌群(e.g., Group B, Streptococcus, Group A streptococcus, S aureus, MRSA, poly(I:C))を作用させて創傷治癒遅延モデルを作成した。細菌群では創傷治癒遅延がみられたが、細菌の増殖によりその後の刺激実験モデルとしては表皮ブドウ球菌以外の細菌群は殺細胞作用が強いため、poly(I:C)刺激によるモデルを用いることとした。2.既に作成されたHMGB1 A-boxのプラスミドを使用し(Yang et al., PNAS, 2004)、愛媛大学プロテオサイエンスセンターにて、コムギ無細胞タンパク質合成技術によりRecombinant HMGB1 Aboxを作成した。3.先ほどの創傷遅延モデルに対し表皮ブドウ球菌とHMGB1 Aboxを投与することで、創治癒の改善がみられた。次に細胞由来のLTA(lipoteichoic acid)とpoly(I:C)の創傷モデルでも改善がみられた。4.次に三次元培養表皮(Livingskin equivalent; LSE)を用いて、同様な実験を行った。物理的創傷にはマイクロピペット先端を用いた。単層培養モデルとは異なり、LSEにおいては創傷治癒モデルの確立が難しく、さらに工夫が必要であると思われたため、現在創傷治癒モデルを作成中である。表皮ブドウ球菌とHMGB1 A-box合成ペプチドによる創傷遅延の改善につき引き続き評価検討を行いつつ、正常マウス(Balb/c)、TLR-2ノックアウトマウスの背部または耳介に形成した皮下膿瘍および創傷モデル(感染有群・無群)を作製したのち、表皮ブドウ球菌死菌含有外用剤、HMGB1 A-box合成ペプチドの効果と細胞毒性をそれぞれ評価した後、両者の混合軟膏を作製する。マウスモデルにおける外用剤の効果を継続検討し、また人角化細胞に対する毒性を検討する。倫理委員会の承認を得たのち、表皮ブドウ球菌死菌およびHMGB1 A-box合成ペプチド含有外用剤をヒト難治性潰瘍(糖尿病性潰瘍など)に対して使用を試み、効果判定を行う。Reconbinant HMGB1の作製費が安く抑えられたことと、LSA実験が遅れたため、購入予定であったELSAキットの購入を見送ったため。
間質性肺炎合併肺癌術後の新規治療戦略の構築

間質性肺炎合併肺癌の生物学的特性を検討するために、病理病期I期の間質性肺炎合併肺癌の切除症例を検討したところ、非合併肺癌と比較して、術後の再発率が有意に高いことを見出した。さらに、間質性肺炎合併肺癌の術後の再発部位を詳細に検討したところ、非合併肺癌と比較し、胸腔内再発、特に肺転移による再発が多く認められた。このことから、「間質性肺炎における肺の環境が、肺癌の肺転移巣の形成を促進させる」という仮説を立てた。C57BL/6マウスにブレオマイシンを経気道的に投与することで、ブレオマイシン誘導性IPモデルマウスを作成した。C57BL/6マウスの左肺に、同系マウス由来の肺がん細胞株であるLewis lung carcinomacell (LLC)を同所性移植させる肺がんの同所性肺移植モデル、さらにLLCをC57BL/6マウスの尾静脈より尾静注し肺転移を形成させる、肺癌細胞株尾静注肺転移モデルを確立した。ブレオマイシン誘導性間質性肺炎マウスモデルにLLCを左肺に同所性肺移植して形成された腫瘍を、コントロールとしてPBSを経気道的に投与したマウスに形成された腫瘍と比較したところ、腫瘍の大きさに有意差は認められなかったものの、コントロールマウスでは全く認められなかった対側肺転移が認められるようになった。ブレオマイシン誘導性間質性肺炎マウスモデルにLLC細胞を尾静脈注射し形成された肺転移巣を、コントロールマウスに尾静注して形成された腫瘍と比較したところ、肺転移巣の数はブレオマイシン誘導性間質性肺炎マウスモデルで有意に多かった。間質性肺炎の肺の環境が肺癌の肺転移巣の形成を促進させるという、臨床研究の成果に基づいた洞察により導いた作業仮説を、マウスモデルを用いて検証することができた。研究ツールとしてのマウスモデルを確立させることができた。さらに、間質性肺炎における肺の環境は、肺癌の肺転移巣の形成を促進させるのかという、臨床研究から導いた仮説をマウスモデルで検証することができた。間質性肺炎マウスモデルに抗線維化薬を投与し間質性肺炎を制御することによって、肺転移巣の形成が抑制されるのかを検討する。当初購入を予定していた抗線維化薬の購入が遅れたため。抗線維化薬を購入し、抗線維化薬を投与し間質性肺炎を制御することで、肺癌の肺転移巣の形成は抑制されるかを検討する。
植物特有な転写因子Dofタンパク質による転写制御に関する研究

カボチャのアスコルビン酸酸化酵素(AAO)遺伝子5'上流域に結合するタンパク質AOBPは、Dofドメインと呼ばれる植物特有なDNA結合ドメインを持つ。これまでに、いくつかのDofタンパク質は植物特有な生理機能に関与した転写因子であることが示唆されている。しかし、Dofタンパク質が植物遺伝子の発現調節機構にどのように関わっているかについてはほとんど分かっていない。そこでDofタンパク質AOBPの機能を明らかにするため、モデル植物であるタバコのAOBP(NtAOBP)を用いて解析を行った。NtAOBPのターゲットであると考えられるタバコAAO遺伝子の5'上流、約1500bpのプロモーター領域を単離し、この領域をプローブとしてゲルシフトアッセイをおこなった結果、NtAOBPが実際にAAO遺伝子のプロモーター領域に結合し得ることが分かった。しかし、認識配列特異性が低く1500bpの様々な領域に結合可能であったことから、転写調節を特異的に制御するためには、AOBPと他のタンパク質との相互作用が重要ではないかと考え、酵母のTwo-hybridシステムを用い、AOBPと相互作用しているタンパク質の同定を試みた。その結果、転写因子ファミリーとして認められているbHLHファミリーに属するタンパク質(bHLH)のcDNAが得られた。GFPを用いて、得られたbHLHの細胞内局在性を解析した結果、本bHLHは核に局在することが示された。また、トランジェントアッセイ系を用いて、本bHLHの転写活性を調べた結果、本bHLHは転写活性能を有していた。したがって、NtAOBPと結合するタンパク質として単離されたbHLHは、転写因子として機能している可能性が示され、NtAOBPとbHLHはお互いに拮抗しながら、転写調節に関与している可能性が示唆された。アスコルビン酸酸化酵素(ascorbate oxidase, AAO)は、細胞伸長に深く関与していることが示唆されているが、その発現調節の機構については不明である。AOBPは、このAAO遺伝子の5'上流域のサイレンサー様配列に結合するタンパク質として、そのcDNAがクローニングされた。AOBPはDof (DNA binding with one finger)ドメインと呼ばれるZnフィンガー型DNA結合ドメインを有するが、一般のZnフィンガーは1つのタンパク質あたり複数単位存在するのに対し、DofドメインのZnフィンガーは1単位しか存在しないという特徴を有する。現在のところ、Dofドメインは植物以外の生物では見つかっておらず、非常にユニークなDNA結合ドメインとして植物界で広く保存されているものと思われる。しかし、植物体におけるDofタンパク質AOBPの生理機能については未だ明確にはされていない。そこでAOBPの生理機能を明らかにするため、現在、実験系の確立したモデル植物であるタバコを用いて解析を行っている。これまでに、タバコAOBPホモログ(NtAOBP)のcDNAを単離し、その発現様式を調べた結果、AAOとNtAOBPの発現には負の相関が認められ、NtAOBPがAAO遺伝子の発現を抑制する転写因子として機能している可能性が示唆された。また、NtAOBPの発現を抑制した形質転換タバコでは、コントロールのものに比べ葉が非常に細長くなる等、異常な形質を示した。これはAAOのリプレッサーと考えられるNtAOBPの発現が抑制されたため、AAOの発現が増加し、細胞が一定方向にのみ伸長し、葉が細長く変形したものと推測される。今後、NtAOBPの生理機能解明のために、本形質転換体の更なる解析を行う予定である。カボチャのアスコルビン酸酸化酵素(AAO)遺伝子5'上流域に結合するタンパク質AOBPに、Dofドメインと呼ばれる植物特有なDNA結合ドメインを持つ。そこでDofタンパク質AOBPの機能を明らかにするため、現在、実験系の確立したモデル植物であるタバコのAOBP(NtAOBP)を用いて解析を行っている。スクリーニングの結果、転写調節に関わる興味深い因子、HSP90 familyのcDNAを得た。HSP90は細胞内のシグナル伝達経路に関わるタンパク質をターゲットにする分子シャペロンで、転写因子であるステロイドホルモンレセプターに結合して、標的タンパク質の細胞内局年性、DNAへの結合能および転写調節活性を制御しているという報告もある。これまでのところDofタンパク質とHSPが相互作用しているという報告は無く、現在、転写調節におけるAOBPとHSPの機能について、詳細な解析を試みている。

そこでDofタンパク質AOBPの機能を明らかにするため、モデル植物であるタバコのAOBP(NtAOBP)を用いて解析を行った。NtAOBPのターゲットであると考えられるタバコAAO遺伝子の5'上流、約1500bpのプロモーター領域を単離し、この領域をプローブとしてゲルシフトアッセイをおこなった結果、NtAOBPが実際にAAO遺伝子のプロモーター領域に結合し得ることが分かった。しかし、認識配列特異性が低く1500bpの様々な領域に結合可能であったことから、転写調節を特異的に制御するためには、AOBPと他のタンパク質との相互作用が重要ではないかと考え、酵母のTwo-hybridシステムを用い、AOBPと相互作用しているタンパク質の同定を試みた。その結果、転写因子ファミリーとして認められているbHLHファミリーに属するタンパク質(bHLH)のcDNAが得られた。GFPを用いて、得られたbHLHの細胞内局在性を解析した結果、本bHLHは核に局在することが示された。また、トランジェントアッセイ系を用いて、本bHLHの転写活性を調べた結果、本bHLHは転写活性能を有していた。したがって、NtAOBPと結合するタンパク質として単離されたbHLHは、転写因子として機能している可能性が示され、NtAOBPとbHLHはお互いに拮抗しながら、転写調節に関与している可能性が示唆された。
高機能高品質ソフトウェアの構成原理に関する研究 総括班

本総括班は研究領域全般の進度調整、主要研究項目、計画研究間の調整その他運営上の判断を下し、研究の円滑化をはかることを目的としている。9計画研究をもって昨年度より研究を開始したこの重点領域研究は昨年3月の審査会において14の公募研究を採択した。公募研究の班別の内訳はA01:0件、A02:2件、A03:0件、B01:3件、B02:1件、C01:2件、C02:3件、D01:1件、D02:1件である。重点領域全体として総括班会議1回(6月27)、シンポジウム1回(11月25日)、全体会議2回(4月24日26日、1月27日29日)、研究代表者会議1回(2月15日)を開催したほか、班会議は研究会10回、合同研究会2回の計12回を開催し、各研究会の平均参加者数は11.5名であった。総括班会議では本研究領域の運営に関する一般的な議論のほか、秋に計画するシンポジウムと冬に開催する全体会議について相談し、細目をとりきめた。また研究代表者会議では本重点領域研究のまとめ方とその後の展開の可能性につき議論した。シンポジウムは昨年度につづき、本年もまた東京大学で開催することになった。米国スタンフォ-ド大学CSLIのエチェメンディ教授、京都大学数理解析研究所萩谷助教授の招待講演と、領域内の研究発表(溝口(D01)、川合(D01)、宮本(D02)、吉田(D02))を行った。シンポジウム参加者は約67名であった。最終年度のシンポジウムは地方で開催したいと考えている。領域内の研究者間で相互の研究内容を理解するために開催する全体会議は、4月に昨年度の分を行い、計画研究の代表者、分担者、公募研究の代表者に自分の研究の紹介をしてもらった。本年度は1月末に開催したが、全員が紹介すると長大な時間を必要とするので、今回はA、Bの班で担当した。来年度はC、D班の予定である。
σ１／５－ＨＴ１Ａ受容体間相互作用による前頭葉ドパミン神経調節機構の創薬基盤研究

これまでに,シグマ1 (σ1)受容体とセロトニン(5-HT)1A受容体の機能的相互作用による前頭葉ドパミン遊離増強にGABAA受容体の機能低下状態が必須であることを明らかにし,またGABAA受容体機能低下時にみられるような意欲障害が,両受容体の相互作用により改善されることを見出してきた.本年度ではさらに,GABAA受容体アンタゴニストであるピクロトキシンによる社会性行動の低下や明暗試験及び高架式十字迷路試験での不安様行動の増加が,σ1受容体アゴニスト作用を有するフルボキサミンによって改善されること,そしてσ1受容体に作用しないパロキセチンでは影響はみられないことを明らかにした.以上の結果から,σ1と5-HT1A受容体の機能的相互作用の発現が,より普遍的にGABAA受容体機能の低下による脳機能障害を改善させることを示した.また前年度において,σ1受容体と5-HT1A受容体の細胞内シグナルにおける相互作用を解析するため,ドパミン系神経モデル細胞として汎用されるヒトSH-SY5Y細胞を用いて,細胞内カルシウム濃度変化を指標に両受容体機能の評価系を構築した.しかしながらこのin vitroモデルでは,σ1受容体アゴニストSKF-10,047と5-HT1A受容体アゴニスト8-OH-DPATの共処置を行っても,両アゴニスト単独による細胞内カルシウム濃度増加以上の増強はみられなかった.またラット副腎褐色細胞腫PC12細胞を用いて,遊離ドパミン量(basalおよび高カリウム刺激)に対するSKF-10,047,8-OH-DPATの作用を検討したが,両薬物単独ならびに併用処置ともに影響はみられなかった.以上からin vitroにおいては,in vivoを反映するようなσ1受容体と5-HT1A受容体間の機能的相互作用はみられず,脳内での複雑な神経回路機構が関与していることが示唆された.抗うつ薬であるセロトニン(5-HT)再取り込み阻害薬(SSRI)のフルボキサミンは、シグマ1(σ1)受容体のアゴニストとしても作用し、そのことが他のSSRIと異なり、精神病性うつ病や統合失調症の認知機能障害への有効性に寄与していると考えられている。本年度は、5-HT1A受容体とσ1受容体の機能的相互作用によってみられる大脳皮質前頭前野のドパミン神経活性化のメカニズムと、その行動学的意義について検討を行った。精神疾患患者の一部でみられるような血中神経ステロイド減少を模倣した副腎・睾丸摘出マウス(AdX/CXマウス)では、GABAA受容体機能の低下が認められた。5-HT1A受容体とσ1受容体の両者を介した前頭前野ドパミン遊離増加の増強は、正常動物(偽手術マウス)ではみられず、AdX/CXマウスでのみ認められた。あらかじめベンゾジアゼピン受容体アゴニストを投与し、GABAA受容体機能を亢進させたAdX/CXマウスでは、前頭前野ドパミン遊離の増強は消失した。一方、GABAA受容体アンタゴニストであるピクロトキシンを前投与した正常マウスでは、AdX/CXマウスと同様に、5-HT1Aとσ1受容体の両活性化によるドパミン遊離増加の増強が観察された。以上の結果から、GABAA受容体機能が低下した条件下において、σ1と5-HT1A受容体が機能的相互作用を介して前頭前野ドパミン遊離を調節していることが明らかとなった(Psychopharmacology 233:3125-34, 2016)。さらに、このドパミン神経の複合調節機構の意義を行動学的に検討した結果、雌選択性試験という新規に開発したマウスの意欲評価法において、ピクロトキシンによってみられる無快感症(アンヘドニア)が、5-HT1A受容体とσ1受容体の機能的相互作用によって改善されることを明らかにした(Br J Pharmacol 174:314-27, 2017)。我々は、末梢の神経ステロイドが低下した状態(副腎・睾丸摘出)下において、フルボキサミンがσ1受容体を介して前頭葉ドパミン神経系を活性化することを見出してきた。本作用は他のSSRIあるいは5-HT1A受容体アゴニストとσ1受容体アゴニストとの併用においても認められることから、フルボキサミンに限定されないσ1受容体/5-HT1A受容体間の機能的相互作用による機構と考えられる。本年度では、この相互作用の発現にGABAA受容体の機能低下状態が必須であることを明らかにした。また当初、次年度以降に計画していた「相互作用によるドパミン神経機能調節を反映する薬効評価モデルの構築」に関して、並行して検討を進めていたところ、前頭葉ドパミン神経の活性化が、GABAA受容体機能低下による不安状態や無快感症(アンヘドニア)を改善することを見出した。これらの研究成果に関して、学術論文2報を公表することができた。以上より、当初の計画以上に進展していると判断する。前年度では,セロトニン1A (5-HT1A)受容体とシグマ1 (σ1)受容体間の機能的相互作用による前頭葉ドパミン遊離増強にGABAA受容体の機能低下状態が必須であることを明らかにした.本年度は,この相互作用に関与する脳活性化部位を特定するため,神経活動マーカーである最初期遺伝子c-fosの蛋白質発現を免疫組織化学染色法により解析した.その結果,GABAA受容体アンタゴニストであるピクロトキシンを前投与した状態においてのみ,5-HT1A受容体とσ

1受容体の両活性化により,大脳皮質前頭前野と腹側被蓋野におけるc-Fos発現が増加した.また,側坐核ではc-Fos発現に変化はみられなかった.腹側被蓋野で増加したc-Fos陽性細胞ではドパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシン水酸化酵素陽性の細胞が多くみられた.以上の結果から,GABAA受容体の機能低下状態においては5-HT1A受容体とσ1受容体の機能的相互作用により,腹側被蓋野が特異的に活性化することが明らかになった.また,5-HT1A受容体とσ1受容体の細胞内シグナルにおける相互作用を解析するため,ドパミン系神経モデル細胞として汎用されるヒトSH-SY5Y細胞を用いて,細胞内カルシウム濃度変化を指標とした両受容体機能の評価系の構築について検討を行った.SH-SY5Y細胞において,5-HT1A受容体とσ1受容体のmRNAが発現していることをRT-PCR法により確認した.カルシウム蛍光指示薬Fura-2を用いたシングルセルイメージング法により,選択的σ1受容体アゴニストSKF-10047,ならびに5-HT1A受容体アゴニスト8-OH-DPATがそれぞれ用量依存的に細胞内カルシウム濃度を増加させることを明らかにした.以上から,本細胞系が両受容体相互作用の解析において有用なツールとなる可能性が示唆された.本年度では,5-HT1A受容体とσ1受容体間の機能的相互作用による前頭葉ドパミン神経活性化に関与する脳部位を明らかにすることができた.また,その相互作用の詳細なメカニズムを解析するために,in vitroでの培養細胞を用いた実験系を予定どおり構築できた.以上から,おおむね順調に進展していると判断する.