hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レム睡眠P波発生メカニズムの電気生理学的探究

当初の予定よりも、より効率的に、たくさんの神経活動を記録することに成功したため、当初の計画以上に進展していると考えている。哺乳類の睡眠ステージは、レム(急速眼球運動)睡眠とノンレム睡眠からなる。睡眠は本能行動のひとつとして考えられているが、現在のところ、「何のために眠るのか?」「何故夢を見るのか?」という根本的な問いに、的確に回答することは難しく、睡眠の機能は、脳科学分野における最大の謎のひとつとされている。特に夢をみているとされるレム睡眠の機能は、実はまだほとんど分かっていない。レム睡眠時には、特徴的な脳波が測定される。海馬のシータ波と、橋(Pons)で発生するPonto-Geniculo-Occipital(PGO)波である。海馬のシータ波は、探求行動をしている覚醒時にも観察されるが、PGO波は、専らレム睡眠時に観察される。PGO波はネコで発見され、当初、同様の波形が次々と伝播し、外側膝状体(Lateral Geniculate Nucleus)や後頭葉(Occipital Cortex)でも記録されたことから、PGO波と命名された。その後、ラットでも報告されたのだが、橋でのみ観察されるため、P波と呼ばれている。一方、マウスでは、P波の測定に成功した例は皆無に等しい。本研究では、遺伝学的手法が使えるマウスにおいて、in vivoでP波を計測する手法を確立した。マウスにおいて、これまで存在しないとさえされてきたP波の測定に成功した。さらに、P波発生メカニズムを電気生理学的に詳細に解析した。具体的には、睡眠覚醒を繰り返す頭部固定状態のマウスの脳幹に、32チャンネル記録電極を搭載するシリコンプローブを刺入し、一度に数十個の神経活動を記録した。P波の発生に先行して、強く発火する神経細胞群の存在を明らかにした。これらの神経発火の集合電位が、P波という局所フィールド電位を生み出していると考えられる。本研究により、P波の生理的役割、さらにはレム睡眠そのものの生理的機能にも迫る新たな切り口が開拓された。昨年度、無麻酔・頭部固定下で、睡眠覚醒を繰り返すマウスの脳に、32チャンネル記録電極を搭載したシリコンプローブを刺入し、橋の神経よりin vivo細胞外記録を行った。使用したプローブは、4シャンクであり、広範囲の神経核より、一度にたくさんの神経活動を記録した。P波は、刺入したプローブの局所フィールド電位をもとに測定した。本年度は、データの解析を中心に行う。P波のようなスパイク状の波形が発生する際には、局所で、神経のバースト発火が起こっていると考えられる。得られたデータを解析したところ、現時点で、内側傍小脳脚核、青斑下核、橋脚被蓋核、前庭神経内側核に局在する神経が、P波に先行して、バースト発火することを見出した。さらに詳しくその発生源を特定するために、電流源密度測定法や、グレンジャーの因果性検定などを用いて、解析を行い、P波の発生メカニズムを解明する。得られた結果をまとめ、早急に単独筆頭著者として、論文発表を行う。さらに、オプトジェネティクスを用いて、レム睡眠時のみにP波の発生頻度を人為的に制御する実験を行う。これには、コリン作動性神経特異的に、青色光活性化タンパク質であるチャネルロドプシン2を発現する遺伝子改変マウスを用いる。
長鎖型ポリリン酸吸着アパタイト人工骨の骨再生能

長鎖型である鎖長130のポリリン酸の骨再生能と比較して中鎖型である鎖長65のポリリン酸は骨再生能が高く、またポリリン酸とbFGFとをアパタイトに組み合わせることで早期に骨形成を促進する人工骨になりうる可能性があることがin vitroおよびin vivoの実験結果から明らかとなった。平成24年度では新しいポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨による骨形成促進能の検討を行った。初めに前年度で濃度決定したbFGFと25%のポリリン酸を常温下にて24時間ジェルフォーミングした後、2500回転、2分間遠心分離を行い、37°C、3日間乾燥させることでポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨を創製した。その後、ニュージーランドホワイトラビット(3.03.5kg)の大腿骨部に円柱状骨窩(直径:3mm、長さ:5mm)を形成し、創製したポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨、ポリリン酸吸着型人工骨、コントロールとしてIP-CHAをそれぞれ骨窩に移植した。埋入後1,2及び3週の各期間で動物を屠殺、脱灰標本を作製し組織学的ならびに組織形態計測学的に検討した。組織学的観察において、埋入1週では各群間ともに炎症性細胞は観察されず幼弱な線維性骨が観察されたのに対して、2週ではポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨群ではコントロール群と比較して骨窩中の骨芽細胞は石灰化している像が観察された。また、3週ではすべての群において石灰化が完了している像が観察された。さらに、組織形態計測学的観察においても埋入後1および3週では各群骨形成量に大きな差を認めらなかったのに対して2週ではポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨群はポリリン酸吸着群ならびにコントロール群と比較して高い骨形成量であった。これらの結果から、ポリリン酸/bFGFインテリジェントコーティング人工骨は早期の骨形成を促し生体に安全な人工骨である可能性があることが解明できた。これまでの研究では、生体に近似する鎖長65の中鎖型ポリリン酸を用いてきた。予備実験からこの中鎖型ポリリン酸より長い鎖長を持つ長鎖型ポリリン酸が、破骨細胞によるポリリン酸の分解を遅らせて、骨吸収の抑制とポリリン酸の骨形成効果を持続できる可能性が明らかになった。そこで、鎖長の長いポリリン酸を用いることで、骨芽細胞の活性化が低下している骨内での骨再生がポリリン酸の作用延長によりさらに確実にならないかと着想した。本研究の目的は、長鎖型ポリリン酸を吸着させたアパタイト人工骨の骨形成能をin vitroおよびin vivoで解明することである。平成23年度では『鎖長の長いポリリン酸吸着型アパタイト人工骨』に関して従来の鎖長65に加えて、15および130の鎖長に調整したポリリン酸とマウス頭蓋骨由来骨芽細胞を培養し、骨形成時に特異的に発現するALP活性およびオステオカルシンを28日後までに経時的に測定した。さらに、アリザリンSレッド染色を用いて同様に21日、28日後での石灰化度を光顕的に観察した。得られた結果から、21日および28日後のALP活性およびオステオカルシンの発現は、鎖長65のポリリン酸の場合で他の鎖長と比較して有意差は認められなかったものの高かった。また、石灰化においても鎖長15および65のポリリン酸の場合に顕著な石灰化を認めた。実験中であるポリリン酸と破骨細胞との詳細な関連はまだ明らかになっていないもののこれらの結果から、骨形成において従来の鎖長65のポリリン酸が骨再生能を促進する可能性が示された。平成24年度では、現在実験中であるポリリン酸と間葉系幹細胞および破骨細胞との関連を明らかにするとともに、さまざまな鎖長をもつポリリン酸を吸着させたアパタイト人工骨の骨形成能を骨粗鬆症型の動物を用いてin vivoで実験し、ポリリン酸のより詳細な機能を明らかにする。

得られた結果から、21日および28日後のALP活性およびオステオカルシンの発現は、鎖長65のポリリン酸の場合で他の鎖長と比較して有意差は認められなかったものの高かった。また、石灰化においても鎖長15および65のポリリン酸の場合に顕著な石灰化を認めた。実験中であるポリリン酸と破骨細胞との詳細な関連はまだ明らかになっていないもののこれらの結果から、骨形成において従来の鎖長65のポリリン酸が骨再生能を促進する可能性が示され、鎖長65のポリリン酸の骨芽細胞への作用の一端が解明された。また、さまざまな鎖長のポリリン酸と破骨細胞との関係について現在実験中である。以上の結果から、交付申請書に記載した研究の目的の達成度はおおむね順調に進展していると考える。平成23年度では『鎖長の長いポリリン酸吸着型アパタイト人工骨』に関して従来の鎖長65に加えて、15および130の鎖長に調整したポリリン酸とマウス頭蓋骨由来骨芽細胞を培養し、骨形成時に特異的に発現するALP活性およびオステオカルシンを28日後までに経時的に測定した。さらに、アリザリンSレッド染色を用いて同様に21日、28日後での石灰化度を光顕的に観察した。また、石灰化においては鎖長15および65のポリリン酸の場合に顕著な石灰化を認めた。以上の結果から、平成24年度では第一にポリリン酸の骨再生に有益な鎖長を決定する。その後、骨再生に有効な鎖長を持つポリリン酸を吸着させた人工骨を作製し、この人工骨を鎖長65のポリリン酸吸着型人工骨とアパタイトとともにラビット大腿骨に埋入し、埋入1、2および3週における骨マーカーの発現と骨再生の組織学的な観察および組織形態計測を行う。得られた結果から、確実な骨再生ができるか否かを明らかにし、鎖長の異なるポリリン酸の骨形成能を評価する。平成24年度では、平成23年度に得られた結果を基にしてポリリン酸の骨再生に有益な鎖長を決定する。その鎖長をもつポリリン酸吸着型人工骨を動物の生体内に埋入した場合、どのような骨再生促進の様相を表すのかを調査する。以下に平成24年度に使用を予定している材料を記載する。現在実験中のポリリン酸と破骨細胞との関連を調査するための細胞実験用各種器具、細胞培養培地および免疫抗体染色キット、また骨再生に有益な鎖長を持つポリリン酸を吸着させた人工骨を作製するためのアパタイトプレート、この人工骨を鎖長65のポリリン酸吸着型人工骨とアパタイトとともにラビット大腿骨に埋入するための動物購入費、飼育費および各種動物実験に必要な動物実験用薬品や切削用ドリルキット等、その後埋入1、2および3週における骨マーカーの発現と骨再生の組織学的な観察および組織形態計測を行うための標本作製用薬品および組織切片作製費が本年度に必要である。
強誘電・強弾性体に対するマルチスケール解析手法の開発

電気と変形が相互に連成する機能性材料の挙動予測を目的として,計算機による3次元シミュレーション手法の開発を行った.これまでの手法では電気と変形の連成が線形でなく非線形となる場合には対応できないことが多かったが,本研究で開発した手法を用いると非線形の場合でも安定的にシミュレーション可能となった.これにより,加速度センサやインクジェットプリンタ部品の挙動予測の高精度化が期待できる.電気と変形が相互に連成する機能性材料の挙動予測を目的として,計算機による3次元シミュレーション手法の開発を行った.これまでの手法では電気と変形の連成が線形でなく非線形となる場合には対応できないことが多かったが,本研究で開発した手法を用いると非線形の場合でも安定的にシミュレーション可能となった.これにより,加速度センサやインクジェットプリンタ部品の挙動予測の高精度化が期待できる.本研究の目的は,多結晶性強誘電体の電気機械的な非線形挙動を,マルチスケール的な視点から数理モデリングしてシミュレーションする手法開発である.本年度は,以下の2点について研究を実施した.1.次年度で検討予定の構成則に適合しうるモデルである,ランダウ型の現象論ポテンシャルを構成則に用いて,マクロ構造である3次元多結晶性強誘電体に対する非線形有限要素計算が,実用的な計算負荷で実行できることを確認した.本計算法の背景となる数理モデルの特徴は,熱力学における疑似ポテンシャルの存在の仮定であり,準安定状態を表現できる極小型変分法に基づいている点である.これは,線形問題である圧電問題に対する従来の電気機械的な有限要素解法(按点型変分法)とは異なる.本手法ではベクトル電気ポテンシャルと辺要素を使用することから,その3次元非線形問題の求解においてヘッセ行列の零空間が数値計算上の問題となるが,連立一次方程式の反復求解に三項漸化式に基づく最小残差(MRTR)法を用いることで,安定した数値解析手法を構築できた.また,超磁歪材料に代表される非線形な磁気機械問題にも応用可能であることが明らかとなったことも成果の一つである.2.この三次元計算の結果は,マクロ的には先に計算を実施していた2次元非線形計算と同様な傾向であることを確認したが,定量的には1割程度の低下があった,これは3次元効果と解釈できる.次年度の研究は,構成則としての疑似ポテンシャルのモデリング精度を上げることであり,統計力学的手法あるは第一原理計算とモンテカルロ法等による計算結果を用いた係数フィッティング法の検討を予定している.本研究は,強誘電・強弾性体の非線形有限要素解析手法の開発を目指したものである.本年度は,以下の項目について研究を実施した.1)強誘電体の構成則にランダウ型の疑似ポテンシャルモデルを用いる場合,動的な取り扱いが必要となるが,その基礎方程式を波動方程式に替えて拡散方程式に基づくものに変更し,検討を実施した.これはフェーズフィールド法の考え方をとりいれたものであり,時間積分法の時間刻みに課せられていた制限を低減できる.三次元多結晶体は乱数とボロノイ分割により作成した.また,ポテンシャルが凸となるために静的解析時の安定性が保証される弾塑性型の構成則の基本的検討も行った.なお,3次元計算であることから,計算の高速化にGPGPUを用いることで,約1/5に計算時間を短縮できた.2)辺・節点混合型の有限要素について,四面体要素だけでなく六面体要素の開発も行った.計算電磁気学で一般的に用いられている六面体の辺要素は,歪んだ形状に対してはパッチテストを通さないものであるので,補間関数を工夫することでこれを改善した.その結果,パッチテストは通さないものの,歪んだ要素形状に対しても工学的に許容できる範囲の性能であることを確認した。3)また,開発した辺・節点混合型の有限要素法を用いた応用として,フェーズフィールド法とレベルセット法を組み合わせ,磁歪デバイスのトポロジー最適化問題に応用し,妥当と考え得る最適化結果を得た.
保健婦による地区診断のためのデータベースの開発に関わる研究

地区診断は保健婦活動における重要な役割の一つとされているが、現実の場においては日常的に地区診断を行う余裕がない場合が多い。しかし、保健計画の策定時などは保健婦にとって地区診断の良い機会であり、昨年までに行った母子保健計画策定時の取り組み調査においても各市町村で地区診断が実施されていた。そこで、岡山県下全市町村の母子保健計画書の内容を分析・検討し、保健婦が地区診断に活用した情報を明らかにしたところ人口動態・健診実施状況等の情報は活用していたものの、それら既存資料の種類や年次は市町村でばらつきが大きく、資料から地区診断へのプロセスが明瞭でないなどの課題が発見された。今回、地区診断のデータベース開発にあたり、その収集項目について検討を行った。地区診断は、計画策定・実施・評価という一連のプロセスのスタートであり中心である。地区診断の内容は、そのまま評価指標にもつながるものである。市町村が平成8年度に母子保健計画を策定し、これにに基づいて活動を行った平成9年度の実績を評価することは、その結果が次の地区診断に繋がるものである。ここで、各市町村が自由に項目を設定することは、地区診断の方法を標準化する上で阻害になると考え、岡山県保健福祉部健康対策課と協力して、市町村が共通して持っている基礎的な情報を収集し、岡山県母子保健評価事業として実施し、そのデータベース化を行った。本年度は当初の計画に基づき、第1には文献より地区診断に必要なアセスメント項目を明らかにした。文献を検討する際、「Community as Client」を一つのキーワードと考え、地域をクライエントとしての一つの単位と考え、その健康に関わる状況をアセスメントする際に必要な項目を、和文献及び洋文献より明らかにした。各文献に示されたアセスメント項目を整理することにより、保健婦が地区診断をする場合に必要な項目の概要に関して明らかにすることが可能になった。また、当初保健婦に聞き取り調査をする予定であったが、コンピューターを利用した地区診断の実態を明らかにするために、岡山県下78の市町村に対し、地域の健康関連データに関する電算化について郵送法による調査を実施した。その結果、住民登録等に関連した人工動態についてはコンピュータ化されている市町村もあるものの、その他のデータに関してはコンピュータ化されている市町村はほとんどなかった。また、「保健婦さん」等の保健関連システムを導入している市町村もあるが、予防接種の対象者や健康診断対象者の出力や、健康診断結果の通知等に利用しており、地区診断等の地区の状況やニードをアセスメントするためのツールとして用いられている場合はほとんどなかった。これら保健関連独自のシステムが地区診断のために活用されない理由としては、コンピューターの操作自体になれていないため利用が困難である場合や、データの投入のための予算を確保することができないため、地区診断に必要な情報をコンピューターに投入することができないこと等があげられていた。保健婦がより的確で効率的な地区診断を行うために、その地域に関する情報の処理のためにコンピュータの導入は不可欠である。しかし、今年度の調査から明らかになったように、その活用はまだ困難である。今後、今回の研究を通じ明らかになった地区診断に関わるアセスメント項目により、実際に保健婦が地区診断を展開していけるよう、データベース化に関してさらに検討を重ねていく必要がある。地区診断は文献や教育の場等においてはその必要性が強く述べられ、保健婦活動における重要な役割の一つとされているが、現実の場においては日常的に地区診断を行う余裕がない場合が多い。昨年、岡山県内全市町村の保健婦を対象に行った調査においても、住民の日常生活行動や保健ニーズに関しては、「日常業務の中の印象として把握してる」と答えているものが多く、日常の業務の一環としてとして、体系的に地区診断をしているものは少なかった。しかし、今回の母子保健計画策定時には、既存もしくは新たな資料を活用し、地区診断を行ったものも多く、母子保健計画の策定は保健婦にとって地区診断の良い機会となった。以上のように昨年は、岡山県内における保健婦による地区診断の実態について明らかにしたが、今年度は、第2段階として、保健婦が地区診断に利用している情報に関する検討を行った。すなわち,岡山県下全市町村の母子保健計画書の内容を分析・検討し、保健婦が地区診断に活用した情報を明らかにした。

その結果、母子保健計画の策定に当たり、人口動態・検診実施状況等の既存の情報をその計画策定に当たり使用しているものが多く、またその他に地域住民のニードを把握するために、アンケート調査やヒアリングを実施していた。しかし、既存資料の種類や年次は市町村でばらつきが大きく、資料から地区診断へのプロセスが明瞭でないなどの課題が発見された。今回、母子保健計画策定時に行った地区診断に活用した資料」について検討したが、次年度は、体系的に地区診断を行っていくために、今回の検討結果を参考に、保健婦のためのデータベースの作成の実際を行えるものと考えている。地区診断は保健婦活動における重要な役割の一つとされているが、現実の場においては日常的に地区診断を行う余裕がない場合が多い。しかし、保健計画の策定時などは保健婦にとって地区診断の良い機会であり、昨年までに行った母子保健計画策定時の取り組み調査においても各市町村で地区診断が実施されていた。そこで、岡山県下全市町村の母子保健計画書の内容を分析・検討し、保健婦が地区診断に活用した情報を明らかにしたところ人口動態・健診実施状況等の情報は活用していたものの、それら既存資料の種類や年次は市町村でばらつきが大きく、資料から地区診断へのプロセスが明瞭でないなどの課題が発見された。今回、地区診断のデータベース開発にあたり、その収集項目について検討を行った。地区診断は、計画策定・実施・評価という一連のプロセスのスタートであり中心である。地区診断の内容は、そのまま評価指標にもつながるものである。市町村が平成8年度に母子保健計画を策定し、これにに基づいて活動を行った平成9年度の実績を評価することは、その結果が次の地区診断に繋がるものである。ここで、各市町村が自由に項目を設定することは、地区診断の方法を標準化する上で阻害になると考え、岡山県保健福祉部健康対策課と協力して、市町村が共通して持っている基礎的な情報を収集し、岡山県母子保健評価事業として実施し、そのデータベース化を行った。
線虫C.elegansを用いた感覚情報処理システムの分子機構の解析

動物は、環境から様々な情報を感覚細胞を通じて受容し、神経回路上で必要な情報を取捨選択・統合し適切な応答をする。線虫C.elegansは、ゲノム配列が明らかなだけでなく単純な神経回路を持つなど、行動をつかさどる神経回路における情報処理機構について、分子・細胞・回路のそれぞれのレベルを結びつけて解析するのに適したモデル生物である。我々は、高次の感覚情報処理システムに関わる新しい分子機構を明らかにすることを目的として、C.elegansをモデルとして用いた遺伝学的解析を行っている。我々が同定したhen-1変異体は、感覚情報の統合と一種の連合学習に異常を示す変異体である。この変異体の原因遺伝子産物は、LDL受容体モチーフを持つ分泌タンパク質であり、成熟した神経系において細胞非自律的に機能していることなどから、神経回路上で感覚情報の就職や学習に広く関わる新規の神経機能調節因子であると考えられる。本研究では、その分子メカニズムを明らかにするため、相互作用する分子の探索を行った。HEN-1アルカリフォスファターゼ融合タンパク質を用いて、C.elegansの初代培養細胞の一部の膜表面に、HEN-1特異的な受容体が存在することを明らかにした。また、ショウジョウバエの類似タンパク質との相同性からC.elegansのALK受容体チロシンキナーゼ相同分子が、HEN-1の受容体である可能性があったので、その変異体について行動解析を行ったところ、hen-1変異体と類似の行動表現型を示すことが明らかになった。線虫C. elegansは、ゲノム配列が明らかなだけでなく単純な神経回路を持つなど、行動をつかさどる神経回路における情報処理機構について、分子・細胞・回路のそれぞれのレベルを結びつけて解析するのに適したモデル生物である。我々は、高次の感覚情報処理システムに関わる新しい分子機構を明らかにすることを目的として、C. elegansをモデルとして用いた遺伝学的解析を行っている。本年度は、その分子メカニズムを明らかにするため、相互作用する分子の探索を行った。HEK293細胞で発現させたHEN-1とアルカリフォスファターゼの融合タンパク質を用いて、C. elegansの初代培養細胞とり結合実験を行ったところ、HEN-1融合タンパク質は少数の細胞に結合したが、アルカリフォスファターゼは結合しなかった。このことは、HEN-1に特異的な結合タンパク質が少数の細胞でのみ発現していることを示している。現在、発現クローニング法などによりその分子の探索を進めている。その際、それまでの経験(記憶)などに応じて、感覚情報に対する応答が変化する。我々は、高次の感覚情報処理システムに関わる新しい分子機構を明らかにすることを目的として、C.elegansをモデルとして用い、学習・感覚情報の選択などの高次行動に関わる変異体について遺伝学的解析を行っている。我々は、一つの刺激に対する応答には異常はないが、二つの感覚情報の統合に異常を持つhen-1変異体の解析を行っている。このhen-1変異体は学習にも異常がみられる。hen-1変異体の原因遺伝子は、LDL受容体リガンド結合ドメインを持つ分泌タンパク質をコードしており、ショウジョウバエの発生制御遺伝子産物と配列上Jebと弱い相同性を持つ。HEN-1は二つの神経でのみ発現し、神経小胞と同じ機構で軸索へ運ばれる。

この分子は成熟した神経回路において細胞非自律的に働くことから、この分子は感覚情報の修飾や学習に広く関わる新規の神経機能調節因子であると考えている。ショウジョウバエの発生制御タンパク質Jebの受容体がDALKであることがわかった。DALKは、ヒトALK(anaplastic lymphoma kinase)のショウジョウバエ相同遺伝子産物であり、受容体型チロシンキナーゼをコードする。ALKのC.elegans相同遺伝子scd-2は、耐性形成制御に関わる遺伝子として同定されたが、詳細な解析は行われていない。そこで、C.elegansのscd-2変異体の行動解析の結果、二つの感覚情報の統合とNaClと飢餓の対提示による条件付け後のNaClに対する走化性のの変化のパラダイムにおいて、hen-1変異体と類似の表現型を示した。このことは、SCD-2がHEN-1の受容体である可能性を示唆している。
カンキツ属植物の自家不和合性はS-RNaseに支配されているのか？

自家受粉を行ったときに受精が阻害される自家不和合性は,結実性に影響を及ぼす農業上重要な形質である.いくつかのカンキツ属植物も自家不和合性を示すが,その分子メカニズムはほとんど明らかでない.本研究では,カンキツ属植物の自家不和合性にT2型RNase(T2 RNase)が関与しているとの仮説のもと,自家不和合性カンキツの一種であるヒュウガナツなどから獲得されているT2RNase遺伝子の遺伝解析や,他の自家不和合性カンキツ属植物からの新規T2RNase遺伝子の単離,ならびにT2RNaseタンパク質の機能解析を通して,その仮説の検証を行う.自家受粉を行ったときに受精が阻害される自家不和合性は,結実性に影響を及ぼす農業上重要な形質である.いくつかのカンキツ属植物も自家不和合性を示すが,その分子メカニズムはほとんど明らかでない.本研究では,カンキツ属植物の自家不和合性にT2型RNase(T2 RNase)が関与しているとの仮説のもと,自家不和合性カンキツの一種であるヒュウガナツなどから獲得されているT2RNase遺伝子の遺伝解析や,他の自家不和合性カンキツ属植物からの新規T2RNase遺伝子の単離,ならびにT2RNaseタンパク質の機能解析を通して,その仮説の検証を行う.
脳機能イメージングを用いた軽度発達障害児の病態解明と治療法に関する研究

神経伝達物質・神経修飾因子、ストレスホルモン、神経免疫、メラトニン非侵襲的脳機能評価法を駆使して、包括的な神経学的指標を確立した。また治療・介入前後での生物学的指標の変化から、科学的な有効な治療法の開発を検討した研究で、多くの新しい知見が得られた。昨年度(平成19年3月31日)の研究実施成果アイマークレコーダー(眼球探索追跡装置)を用い、健常7歳、10歳,14歳児と成人の各群12名の合計48名を対象に、4種類の提示図を用いて探索眼球運動を比較検討した。成人群が他の群より総移動距離が有意に長く、注視点総数が有意に多かった。また総移動距離は7歳が最も短かった(結果は投稿中)。探索眼球運動は、大脳の前頭前野機能1を表していると考えられており、ADHD、高機能自閉症、学習障害等の軽度発達障害児の評価で重要な基礎データーとなる。現在、ADHD、高機能自閉症、学習障害児童で検討中である。また48マルチチャンネルの近赤外線トポグラフィーを使用して、年齢が7-10歳の小児6人と6人の成人ボランティアーで、ビデオゲーム課題中の前頭前野およびその他の脳部位の脳血液量の変動を計測し以下の結果が得られた。小児では全例ゲーム中には全ての部位で全一Hb、酸化型一Hbが低下したが成人では増加し、異なった結果が得られた。子どもが学童早期からゲーム遊びにさらされる事の脳への影響を報告した(BrainDev,2006)。現在、摂食障害児の課題試行時の脳血流を近赤外線トポグラフィーを用いて検討中で、興味ある結果が得られている。さらに、摂食障害児、発達障害児のストレス反応性をみるため、唾液を用いた非侵襲的な方法で、コーチゾール、IgA, MHPGを測定する系を確立し検討中である。大脳深部の脳活動については、発達障害児、摂食障害児でfunctional MRI、SPECT、PET、SPM解析を用いて高次脳機能評価を解析中である。さらにCBCL、SDQ、POMS、幸福度と含む調査票(WHOのSUBI)などを用いて神経心理学的評価をおこなっている。また、心の問題や、発達障害を持つ児童に各種の睡眠障害が多いため、予防、治療的観点からアクチグラム等を用いた睡眠研究もおこない早期介入の効果を検討している。昨年度(20年3月31日)の研究実績成果アイマークレコーダー(眼球探索追跡装置)を用い,健常7歳,10歳,14歳児と成人の各群12名の合計48名を対象に,4種類の提示図を用いて探索眼球運動を比較検討した。成人群が他の群より総移動距離が有意に長く,注視点総数が有意に多かった。また総移動距離は7歳が最も短かった。(臨床神経生理学35:479-486,2007)探索眼球運動は,大脳の前頭前野機能を表していると考えられており,ADHD,高機能自閉症,学習障害児の評価で基礎データとなる。現在までに16歳,成人を加えて合計84人で統計解析を行い,総移動距離,注視点総数とも加齢とともに増加し16歳と成人で他の群と比べ有意に多かった。また48マルチチャンネルの近赤外線トポグラフィーを用いて摂食障害児の課題施行時の脳血流を施行し,興味ある結果が得られ(投稿中),摂食障害児の10人(平均年齢13.2歳)女児のSPECTでは対照群と比べ両側頭頂葉,後部帯状回の血流が低下していた(投稿中)。さらに,軽度発達障害児のスクリーニングとして,現在40カ国以上で標準化されているStrength and Difficulties Questionnaireを2899人,4-12歳で男女別に標準化し報告した(Brain Dev.2008,in press)。さらに25人のADHD,25人の高機能自閉症でSDQをチェックし,自閉症は社会性が有意に点数が高く,注意欠陥多動性障害児では行為問題と多動において得点が高かった(現在投稿中)。また心の問題や,障害発達を持つ児童に各種の睡眠障害が多いため,予防,治療的観点からアクチグラム等を用いた睡眠研究もおこない早期介入の効果を検討している。Strength and Difficulties Questionnaire (SDQ)を、4-12歳の日本の子供2899人で基準値を作成し、その有用性を報告した(Matsuishi T, Brain Dev 2008)。SDQは子ども達の苦手な面だけでなく、良い行動面を評価する事が含まれているため社会性を含む発達評価に役立つ。世界の40カ国以上で使用されており、これを使用する事で子どもの精神・心理の国際比較も可能である。またSDQを用いて、注意欠陥多動性障害と高機能自閉症の特徴を分析し、投稿中である。また発達障害児は、夜間の入眠時刻が遅く、総睡眠時間が短い事を今までに証明してきた。

唾液中のメラトニンと血中の相関を、ELISAを用いた測定系で確立し、治療前後のメラトニン、コーチゾールの変動をチェックできる系を確立である。
肺線維化における細胞活化抑制メカニズムの解析

肺ガン細胞の培養上清の精製10%FBS-DMEMで肺ガン細胞A549を培養したconditioned meiumに、肺線維芽細胞MRC-5の形態変化を誘導する物質をこれまでに見いだした。本年度は、その培養上清を、様々な逆相カラムで分画し、活性を調べたところ、C18カラムと相互作用をもつ活性物質を得ることができた。そこで、最初にオープンカラムを使ってC18カラムと相互作用する物質を精製し、さらに細かく分画するため、HPLCを用いて分析と分取をおこなった。分析の結果から、A549の培養時間に依存して、増加するピークを見いだすことができた。その増加するピークを分取し、活性を測定したところ、MRC-5の形態変化の誘導とα-SMAの発現を抑制する効果が見られた。現在は、その物質を大量に分取し、マススペクトロメトリーによる分子量の測定とNMRを用いた構造解析を行っている。筋線維芽細胞のタンパク質発現変化これまでの結果から、A549のconditioned mediumで肺線維芽細胞MRC-5を培養すると増殖が抑制され、細胞周期停止が誘導されることがわかった。また、その時に細胞周期停止に関連するタンパク質p21の発現が増加した。今回、A549のconditioned mediumから精製した物質を用いて、同様な活性があるかどうかを調べると、精製した物質が早期にMRC-5の細胞周期を停止させ、p21の発現増加を誘導した。この結果から、精製した物質はA549のconditioned medium中で働いている主な活性物質であることが考えられた。今後、この物質を用いて、細胞内のタンパク質発現について詳細に調べていきたいと考える。肺ガン細胞の培養上清の精製筋線維芽細胞の遺伝子およびタンパク質発現変の検討これまでの実験から、MRC-5の形態変化にはMAPKが関与していることが考えられたので、conditioned mediumで処理したMRC-5を経時的に回収しERKのリン酸化を調べた。その結果、時間依存的にα-SMAの発現が減少していくのに相関して、ERKがリン酸化されることがわかった。さらにERKの阻害剤,PD98059で細胞を処理すると形態変化が抑制された。以上の結果から、A549による形態変化はERKを介していることが示唆された。今後の予定としては、RNAiを用いてERKの遺伝子発現等を抑制した筋線維芽細胞で、α-SMAおよびstellate cellへの形態変化に関わるメカニズムについて調べていきたいと考える。肺ガン細胞の培養上清の精製10%FBS-DMEMでヒト肺ガン細胞株A549を培養したconditioned mediumに、ヒト肺線維芽細胞株MRC-5の形態変化を誘導する活性を見いだした。本年度は、conditioned mediumを限外ろ過膜で分画した後、C18逆相カラム、SMARTシステムを用いて活性物質の単離を試みた。SMARTシステムで分析を行った結果conditioned medium中には、10%FBS-DMEMに含まれるピークとは異なるピークが含まれていることがわかった。さらに、そのピークを分取し、MRC-5に対して処理をおこなうと、4日間で形態変化が誘導されることがわかった。この物質の性状を調べるため、UVスペクトルを測定すると260nmに単一の極大吸収をもつ物質であることがわかった。これまでの知見から、活性型の筋線維芽細胞から不活性型の星細胞へと形態変化を誘導する物質には、cAMPやPGE2が知られている。今回、EIA法を用いて、conditioned medium中のそれらの濃度を測定したが、MRC-5の形態変化における関与は見いだせなかった。現在、FAB-MSを用いて、正確な分子量を測定中である。今後の予定としては、活性物質のNMRを測定し、物質の同定を進めていきたいと考える。筋線維芽組胞の遺伝子およびタンパク質発現変化の検討これまでの実験結果から、conditioned mediumでMRC-5を培養すると、細胞の増殖が抑制されることがわかった。そこでFACSを用いて細胞周期を解析すると、G0/G1とG2/M期で細胞周期停止が誘導されることがわかった。さらに、ウェスタンブロット法で細胞周期停止に関連するp21の発現を調べると、conditioned mediumで処理した群では、早期に発現が増加するという結果が得られた。今後、細胞周期停止とMAPKの関係を、さらに調べていきたいと考える。筋線維芽細胞のタンパク質発現変化

これまでの結果から、A549のconditioned mediumで肺線維芽細胞MRC-5を培養すると増殖が抑制され、細胞周期停止が誘導されることがわかった。また、その時に細胞周期停止に関連するタンパク質p21の発現が増加した。今回、A549のconditioned mediumから精製した物質を用いて、同様な活性があるかどうかを調べると、精製した物質が早期にMRC-5の細胞周期を停止させ、p21の発現増加を誘導した。この結果から、精製した物質はA549のconditioned medium中で働いている主な活性物質であることが考えられた。今後、この物質を用いて、細胞内のタンパク質発現について詳細に調べていきたいと考える。
関節炎による軟骨変性の早期変化に対する新しい解析法の確立

非造影MRIにて関節軟骨のプロテオグリカンの量を評価する方法として、T1ローマッピング法に注目した。この方法のシーケンスを決定し、健常成人の膝関節を撮像したところ、良好な画像が得られた。そこで、本学の倫理委員会のプロトコール審査を得た後に、変形性関節症患者について撮像を開始した。その結果、軟骨変性の肉眼的程度と良く相関して、MRIの信号変化がおこることが確認された。人工関節置換術の際に軟骨を採取し、組織染色にてプロテオグリカンの染色を行い、MRIの信号強度との相関を検討した。また、軟骨組織からプロテオグリカンを生化学的に抽出し、その数値とMRIの信号強度との相関を検討した。この方法は非侵襲に膝関節の変性の程度を定量評価できる方法として、臨床応用が期待される。健常者3名に対して、dGEMRIC法造影MRIをそれぞれ2回ずつ施行し、inter-observer reliabilityと2回の検査間のreproducibilityを検討した。その結果、測定誤差はそれぞれ7%と5%であり、臨床的に実用的であることが確認された。その後、関節リウマチ患者12名に対して施行した。その結果、関節軟骨のプロテオグリカン含有量を間接的に表すと言われているT1緩和時間は、関節リウマチ患者では健常者に比べて有意に短縮していた。また、患者のT1緩和時間は患者のX線でのLarsen scoreとは相関せず、X線での変化が軽度である症例においても、関節軟骨の質的変性は始まっており、本法はその早期の変化をとらえることができるということが示唆された。患者はTNF阻害剤やメトトレキサートの使用開始前に撮像されており、今後、薬物療法導入後1年程度で再度撮像し、関節軟骨変性防止効果について検討する予定である。関節軟骨変性の評価として、造影MRIによる方法を行ったが、今年度は新たに非造影によるシーケンスを設定した。非造影では造影剤使用による侵襲を回避でき、より現実的である。まず、ファントムを用いてシーケンスの設定をおこなった。その後、倫理委員会の承認をうけ、健常者の撮像をおこなった。さらにシーケンスの調整を行い、再現性のよい画像が得られ、臨床的にも妥当な画像であった。約8名の健常者を撮像し、さらに関節炎患者での撮像を開始した。軟骨変性部では明らかに信号強度が変化しており、人工関節置換時に得られた関節軟骨の状態と画像を対比してその妥当性を検討しているところである。さらには軟骨より基質を抽出して、定量しようと試みている。また、分子生物学的検討も行い、変性関節軟骨での基質分解酵素の発現とそれをコントロールする因子の検討を行った。MMP13の発現を調節する因子としてC/EBPを同定し、その作用機序を解析した。C/EBPは変性軟骨部において発現しており、MMP13の発現部位とも一致した。C/EBPの強制発現によって、MMP13のプロモーターが活性化し、MMP13のmRNAや蛋白も発現が亢進した。MMP13のプロモーターにおいて、C/EBP結合領域に変異を組み込むと、プロモーター活性が低下した。本研究結果はArthritis Rheumatism誌に発表した。現在、さらに他の基質分解酵素についても解析をすすめているところである。滑膜細胞においても同様に発現が認められる。新たに非造影MRIによる軟骨基質評価の方法としてT1ローマッピングのシーケンスを確立し、倫理委員会の承認を得た後に、変形性膝関節症患者の撮像を行った。人工膝関節置換術の際に得られた軟骨標本から、その肉眼的軟骨変性のスコアリングと得られたMRI画像上でのT1ロー値との間に相関があり、重症度をよく反映することが明らかとなった。さらに組織標本を詳細に検討し、軟骨基質の組織学的変性も反映していることが明らかとなり、この方法の妥当性が示された。この方法を用いれば、変形性関節症の早期の軟骨変性を非侵襲的に撮像することができ、新たな臨床評価法として利用可能である。また、同時に研究を行っていた軟骨変性の分子生物学的検討については、MMP3の発現に関わる重要な転写因子C/EBPを見いだし、その機能を解析した。関節炎における軟骨変性の早期変化にかかわる重要なシグナルであることが示された。
1分子時系列情報に基づく革新的マルチスケールモデリング

我々の目的は、新規な非線形時系列解析に基づくモデル化手法の開発を通して、F1回転子の多様な時空間スケールで繰り広げられる化学・力学カップリングの動力学を抽出し、その化学エネルギーを力学エネルギーに変換する機構を明らかにすることである。当該年度は、μ秒の時間解像度をもつF1回転子の階段状になっている回転角度の時系列データからF1回転子が止まっている「停止」状態、回転している「回転」状態、それぞれの滞留時間をトレンド/変化点検出法を用いて同定した。この研究により、F1の回転している状態の統計的性質および相関が初めて明らかにされた。また、「停止」状態、「回転」状態のそれぞれの滞留時間の時系列データが得られたことで、我々が開発した速度論的スキームを構築する手法をF1回転子の時系列データに対しても適用することができるようになった。よく知られているように、一つの与えられた滞留時間の時系列に対し、その時系列がもつすべての統計的相関を正しく与える速度論的スキームは一通りとは限らず、複数存在する可能性がある。当然ながら複数存在する場合には、速度論的スキームは滞留時間の時系列が持つ相関だけからは一義的に定めることができない。我々は「与えられた滞留時間の時系列が持つすべての統計的相関を保持する速度論的スキーム全体の集合の中で、もっとも単純で偏りのない速度論的スキームはどれか?」という問いを立てることで、速度論的スキームを一義的に定める方法論を情報理論に基づき開発した。この手法は、滞留時間の時系列データからその時系列が持つすべての統計的相関の情報を過不足無く保持する唯一の速度論的スキームを抽出するものである。この手法は、一切の経験的パラメータに依存しない、という特徴をもつ。構成された本速度論的スキームを用いることで、実験により得られる滞在時間の時系列に観測される相関、記憶等と速度論的スキームのネットワーク構造との対応関係を明らかにすることができるものと期待される(PNAS投稿予定)。F_1-ATPase酵素反応の1分子時系列データに対し、(1)階層的な時空間スケールに跨る酵素反応モデルの自然抽出、(2)隠れた状態の探索(1次元に投影することによる"縮退"状態の分離)、(3)推量される階層的酵素反応ネットワークに基づくATP結合、加水分解、脱リン酸化と構造変化のchemo-mechanical couplingを解明することを最終目的とし、以下のことを実施した。F_1-ATPaseの高分解能(nm,μs)回転時系列データの動態構造をヒストグラム解析、相関解析、Change point解析、およびトレンド解析などの手法を用いて、解析した。相関解析の結果は10^<-3>秒のオーダーで一旦減衰した後も、有意な振幅をもちながら不規則な振動を長時間持続していることが判る(>0.1s)。これは回転運動が複数の時定数を有する階層的なダイナミックスであることを示唆している。我々は、非定常な一分子時系列データから観測ノイズに埋もれた状態間遷移のシンボル列を抽出する新しい階層的トレンド分解法を開発した。この手法により、できるだけ恣意性を排除した非定常時系列のシンボル化が可能となり、トレンド(回転/停止)とchange points(トレンドが変化する前後の時間)を客観的に同定することができる。定常時系列データを暗黙裡な前提とする従来のChanging point解析を適用すると、非定常時系列データに沿った各点をchange pointsを同定してしまう傾向があり、意味のあるシンボル化ができない。今回、開発した階層的トレンド分解法により、F_1-ATPaseの回転時系列データから状態遷移ネットワークを抽出するうえで、必要な観測ノイズに埋もれたシンボル列を抽出することが初めて可能となる。今後、F_1-ATPaseのATP結合、加水分解などの各状態の滞在時間分布、状態遷移ネットワークの抽出、Dynamic disorderの検証などを行う計画である。

構成された本速度論的スキームを用いることで、実験により得られる滞在時間の時系列に観測される相関、記憶等と速度論的スキームのネットワーク構造との対応関係を明らかにすることができるものと期待される(PNAS投稿予定)。
特異体質性薬物性肝障害の予測試験系の構築と発症バイオマーカーの探索評価研究

本研究の目的は医薬品開発における撤退理由の約30%である薬物性肝障害について、実験動物in vivoモデルを作出し、発症メカニズムを解明すること、さらに、in vivoモデルから得られたバイオマーカー候補をin vitrocell-basedスクリーニングシステムの構築に役立てることである。初年度は、(1) ACE阻害薬であるエナラプリル(ELP)は、ヒトで稀に重篤な肝障害が報告されている。通常の肝臓の状態のマウスでは、ELP肝障害は作成できず、デキサメサゾンと肝グルタチオン量を減少させるBSOの併用投与によって初めて肝障害を発症させることができた。この発症メカニズムには、酸化ストレス因子が主に関与し、好中球の浸潤は増悪因子として働いていることを明らかにし論文として発表した。(2)双極性障害治療薬ラモトリギンは、SJSや肝障害の発症が報告されている。反応性代謝物の介在が示唆されているため、肝グルタチオン含量を低下させた系で肝障害モデルマウスを作成できた。発症機序を詳しく検討した結果、Kupffer細胞の関与が示され、さらにERK/JNKシグナルを介し、HMGB1-TLR4シグナルの活性化が明確に示された。(3) Phase III終了後に撤退したTAK-875について、肝障害の原因について、マウスモデルを作成して探索している。薬効及び構造が類似であり肝障害発症リクスが低いと考えられるAMG-837とTUG-770の開発中の化合物を対照群として、発症経時的にマイクロアレイ解析を行った。その結果、ERストレス、アポトーシスと肝脂肪蓄積が主たる要因であることが示された。特にERストレスの関与について、4-PBAを用いてin vivoでその関与を定量的に示した。さらに、これらの結果をHepG2細胞を用いたin vitroの判定系に応用することができた。当初の予定どおり、信頼性が高いと思われるmiRNAarrayのデータを収集することができた。概要(1)のエナラプリルに起因する肝障害モデルについては、英文学術論文として発表することができた。概要(2)のラモトリギンについてはも、pathway解析を終了し、当初の予定通りの進捗であり、現在は英文論文を作成中である。概要(3)のTAK-875(ファシグリファム)については、enrichment解析を駆使して、pathwayを明確に示すことができた。さらに、in vitroでHepG2細胞を用いた系に応用することができた。さらに、実績として発表できる段階にはない研究については、以下の2課題について実施中である。(1)肝類洞内皮細胞が主に抗がん薬に起因した障害を受けることで、類洞閉塞症候群(SOS)が発症することが知られているが、ラットを用いたSOSモデルを既報に従った方法で作成した。目的はSOS発症の初期または発症前に、血中のmicroRNA(miRNA)をバイオマーカーとして、その早期予測診断に使えることを目指して研究中である。(2) miRNAが臓器障害の発症にかなり先んじた変化として捉えることができる。中でも肝細胞特異的に存在するmiR-122は、肝障害を血中で予測できるバイオマーカーとしての有用性が期待されているが、現状では病型判断には不十分である。本研究では肝細胞障害、胆汁うっ滞および脂肪肝について、早期に病型判断可能な血中miRNAの評価を目的として研究を行っている。肝障害モデル動物から、経時的に血液を採取し、血漿からRNAを抽出後、次世代シーケンサーを用いて血漿中miRNAを網羅的に解析を行っている。(1)ラットを用いたSOSモデルを作成した。SOS発症の初期または発症前に、血中のmicroRNA(miRNA)をバイオマーカーとして、その早期予測診断に使えることを目指しており、時間依存的な発現変化を血中で捉えることを目的としている。SOSの発症予測バイオマーカーとしてのmiRNAについては、現在網羅的発現解析のデータを解析中である。かなり有望なmiRNAバイオマーカーを抽出できると予想している。(2)の肝細胞障害、胆汁うっ滞および脂肪肝の早期に病型判断可能なmiRNAの評価を目的とした。典型的なラットモデルにおいて、次世代シーケンサーを用いて血漿中miRNAを網羅的に解析した。ピーク時点や障害の程度が異なる病型間でのmiRNA発現を比較するために、時系列的miRNAプロファイルのクラスターパターンから肝障害の初期、中期、後期を定義し、各時点において増加または減少したmiRNAを、ベン図を用いて病型別、または網羅的に解析予定である。さらになる薬物性肝障害の研究課題として、糖尿病治療薬として市販後撤退したことで有名なトログリタゾンの肝障害モデルを、マウスを用いて作成し、典型的なidiosyncraticな起因薬による発症のメカニズムを解析する予定である。本研究の目的は医薬品開発における撤退理由の約30%である薬物性肝障害について、実験動物in vivoモデルを作出し、発症メカニズムを解明すること。さらに、in vivoモデルから得られたバイオマーカー候補をin vitrocell-basedスクリーニングシステムの構築に役立てることである。今年度は、(1) Phase III終了後に撤退した抗糖尿病薬TAK-875による肝障害について、解析が終了し、論文を投稿中である。(2)双極性障害の治療薬であるラモトリギンは、SJSや肝障害の発症が報告されている。肝障害の発症機序を詳しく検討した結果、炎症や免疫因子の関与ではなく、酸化ストレスの関与が大きいことが見出され、論文を投稿中である。

(3) ACE阻害薬であり高血圧の治療に用いられているエナラプリル(ELP)は、ヒトで稀に重篤な肝障害が報告されている。通常の肝臓の状態のマウスでは、ELP肝障害は作成できず、デキサメサゾンによって脂肪肝に近い状態において、初めて肝障害を発症させることができた。この発症メカニズムには、酸化ストレス因子が主に関与し、好中球の浸潤は増悪因子として働いていることを明らかにし、論文発表を行った。(4)様々な病型の肝障害惹起薬について、特に肝細胞障害性型、胆汁うっ滞型と脂肪肝の3種類の病型について、発症経時的に血液中のmicroRNAを次世代シークエンサーで網羅的に解析し、初期のバイオマーカーとしての病型別microRNAの組み合わせを確定し、論文投稿中である。(5)ラット肝類洞内皮細胞(LSEC)特異的microRNAのバイオマーカーとしての利用について検討し、抗癌剤の毒性標的になり得る類洞内皮細胞に特異的なmiRNAを特定し、LSEC特異的障害のマーカーになることを見出し、論文を発表済み1報と投稿中1報がある。当初の予定よりも進捗が遅いが、予定していた全ての検討項目について着手で消え入る。順次研究を仕上げ、論文として発表できる段階にきているものもある。(1)抗糖尿病薬TAK-875による肝障害について、炎症因子及び免疫性因子の関与が最も顕著に見出されたが、さらに最近の分子標的型抗がん薬で報告されている肝障害についてもin vivoマウスモデルで検討中である。(2)ゾメピラク(非ステロイド性抗炎症薬)による肝障害や腎障害における免疫因子の関与を明らかにする研究を行った。好中球の関与が最も顕著に見出され、機序を検討し、その結果を論文として発表した。しかし、それ以上の分子生物学的原因追求はできなかった。論文として投稿した。(3)肝障害惹起薬であるエナラプリルの機序については、酸化ストレスが最も疑われ、好中球の関与も明確にし、論文発表した。(4) LSEC特異的に発現が見出されたmiR-500-3pについて、肝類洞内皮細胞閉塞症(sinusoidal obstruction syndrome, SOS)の早期のバイオマーカーになりうるというデータをラットの病態モデル(モノクロタリン投与)で取得でき、論文投稿準備中である。(5)胆汁うっ滞型の肝障害を惹起する薬は多いが、これを予測できる動物試験系はない。そこでラットに様々な胆汁酸の代謝物を投与し、胆汁うっ滞の症状の予測について検討中である。具体的には、極めた種類の多い胆汁酸の代謝物の中で、低濃度代謝物であるケノデオキシコール酸の前投与によって、被験薬の胆汁うっ滞性を感度良く検出できるラットのモデル系が出来た。現在この系の評価検討中である。(6)特異体質性肝障害惹起薬として極めて有名な抗糖尿病トログリタゾンについて、初めて肝障害マウスモデルの作成に成功した。
虚血性神経細胞死におけるミクログリア活性化と脳血液関門機能障害の評価

遅発性に海馬CA1神経細胞死を発症する一過性前脳虚血高血圧自然発症ラット(脳卒中発症系)は、ヒト脳血管性痴呆症の実験モデルである。我々の作業仮説「脳血液関門(BBB)を越えて血中から侵入し脳内で活性化されたエンドセリン作働性ミクログリアが、神経細胞死を引き起こす」を検証するために、我々の受容体画像化定量システムでBBBの機能的変化を観察すると共に、BBBを越えて侵入した単球の脳内における活性化の過程を単球遊走化因子(MCP-1)受容体発現を指標に評価した。方法論(1。定量的受容体オートラジオグラフィー法、2。定量的放射免疫組織化学法、3。in situ hybridization法)の確立を基礎に実験を展開した結果、1)高血圧自然発症ラットの両側頚動脈10分間結紮の虚血再灌流7日後、海馬CA1神経細胞死の領域に、エンドセリンET_B受容体の発現に一致して^<125>I-MCP-1の集積が認められた。エンドセリン作働性ミクログリアに多量なMCP-1受容体発現が観察された。2)同時に、VEGF受容体の発現上昇もあり、MCP-1受容体発現部位と全く異なり神経細胞死領域を取り囲む周辺の、主に血管内皮細胞上に観察された。3)虚血直後、2日後、5日後、いずれも、MCP-1受容体とVEGF受容体両者の有意な発現増加は無かった。BBBの機能的破綻とミクログリアの活性化は虚血後緩徐にジワジワと起きるのではなく、遅発性神経細胞死の直前に短期間で生じることが推測された。また、ミクログリアを活性化するMCP-1はBBBを構成する毛細血管内皮細胞で産生され、また逆に、BBBを強化補強するVEGFはミクログリアで産生されることから、神経細胞死におけるミクログリアの両面性(攻撃的かつ防御的)が示唆された。更に、BBBとミクログリアの相互関係cross-talkの解明が必要である。方法論(1。ヒト脳血管性痴呆症の成因と予防の探索のために、実験モデルである脳卒中易発症高血圧自然発症ラットにおける、(1)脳血液関門の機能的変化を^<125>I-VEGFとVEGF受容体抗体およびVEGF受容体mRNAプローブを用いた我々の受容体画像化定量システムで明らかにすること、および(2)脳血液関門を越えて侵入した血中単球の脳内における活性化の過程を、単球遊走化因子(MCP-1)受容体発現を指標に評価することにした。初年度は、まず本研究の方法論的確立につとめた。1)定量的受容体オートラジオグラフィー法(in vivoで、10μm厚の脳凍結乾燥切片に、放射性受容体リガンドを結合させる。エンドセリンET_A受容体リガンドの^<125>I-PD151242、ET_B受容体の^<125>I-IRL1620、脳一酸化窒素合成酵素(NOS)活性の定量のためのL-Nc-[2,3-^3H]-nitroarginine、脳血液関門機能検定に^<125>I-MCP-1を用いる。)、2)定量的放射免疫組織