hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好酸球性副鼻腔炎やアスピリン喘息を伴う鼻茸における肥満細胞の新たな役割

さらに抗tryptase抗体,抗CD3抗体、抗MBP抗体を用いて、鼻茸においてMMP2,9,13やTIMP1,2,を産生する細胞を、二重染色で検討、またMMP2,9,13とTIMP1,2を、ELISAにて測定検討している。鼻茸粘膜における肥満細胞でMMP9の発現が認められた。AIAの病因は複雑であり十分解明されていない。そして多くの研究は上皮細胞や好酸球メディエーターに焦点が置かれている。肥満細胞は鼻茸組織中の炎症細胞のなかで主要なものであり、AIAの鼻茸でも特に多く認められる。本研究では我々が確立した鼻茸粘膜由来の肥満細胞株の培養システムを用いて、AIAに伴う鼻茸における肥満細胞の活性化メカニズムを解明し、さらに鼻茸組織で見られる組織変化における肥満細胞の役割を明らかにすることを目的とした。鼻茸におけるCD34^+肥満細胞前駆細胞を、MACS sortingにて単離する。これをSCFとIL-6の存在下に96穴培養プレートでメチルセルロースを用いたcolony cultureを行い、鼻粘膜由来肥満細胞を培養した。抗FcεRI抗体を用いて肥満細胞を刺激し、肥満細胞から分泌されるヒスタミン、トリプターゼ、IL-4,IL-5,TNF-alpha,IL-13、TGF-βをELISAにて測定し、ヒスタミン、トリプターゼ、IL-4,IL-5,TNF-alpha,IL-13の産生量が増加した。この様なIL-4,IL-13などの増加が鼻茸におけるIgEの産生、好酸球性炎症に関与している。また鼻茸にMMP9(ゼラチナーゼ)が高く発現した。一方TIMP1,2,が僅かでした。肥満細胞や好酸球にはMMP9が発現した。鼻茸組織中のMMPとTIMPの蛋白量やmRNAを検討し、MMP9が増加した。一方TIMP1,2がわずかでした。この様にMMP9の増加とTIMP1,2が僅かである事が鼻茸の組織変化に関与する。現在StaphとLPSの刺激による影響を検討している。
完新世の海面上昇に伴う内湾環境の変化:三次元数値モデルと古生物データによる考察

本研究では、今から約5500年前の海水準が高く、海岸線の後退が顕著であった時代の東京湾の潮汐特性を数値シミュレーションにより調べ、特に湾口・湾奥では現在と大きく様相が異なっていたことを明らかにした。潮汐モデルの開発に当たっては、現在の東京湾と有明海へ適用することで潮位・潮流の観測値を良く再現するスキーム(開境界条件、干出条件、底摩擦の定式化)並びにパラメタ値を決定した。その結果M2潮の振幅を1.6cmの二乗平均誤差で観測値を再現し、有明海の干潟分布も良く再現できることが確認された。このモデルを用いて海水面だけを上昇させた場合と、さらに海岸線後退の影響も加味した場合の潮汐変化について数値実験を行い、現在の東京湾の潮汐と比較した。海水面が現在より2m高い場合、東京湾の最大潮差は数cm減少したが、海岸線が約50km後退した縄文海進時の地形を加味すると、湾奥での大潮平均高潮面が現在の約1mから1.5m以上と潮差が現在よりもかなり増大することがわかった。それに伴い浦賀水道付近のM2潮流の振幅も完新世中期には現在の倍以上であったことが示唆された。潮汐成分毎の寄与を見ると、潮差増加の大部分は半日周潮の増大に伴うものであった。固有値解析から算出した湾の固有周期並びに数値的に得た共鳴曲線の変化から、水位上昇に伴う潮差の減少、湾域拡大による潮汐の強化は、湾の共鳴周期が現在の6時間から5.5時間または9時間へ変化したことによる半日周潮の応答の変化で説明された。但し、共鳴極大値は周期に反比例するために単に共鳴周期が潮汐周期に近づくだけで潮汐が増大するとは限らない点も指摘している。日本沿岸の海水準変動は地質時代の大潮平均高潮面の記録と現在の潮位差から推定しており、潮位差の変動については十分検討されていない。このため本研究成果は古潮汐の力学機構の解明に加え、海水準曲線の精度向上に寄与すると考えられる。本年度は2次元潮流モデルの構築を中心に行った。湾口で周期的な水位変動を与えた際の湾内の応答を調べるモデルで、湾口の振る舞いが肝要であり、また低潮時には一部干出することから、湾口での開境界条件と間潮帯を扱う手法については特に注意をはらった。そして鉛直拡散以外は3次元へ拡張を念頭に入れたスキームになっている。このモデルを現在の東京湾に適用し、湾内のM2潮位、潮流を観測値と比較して両者が非常に良く合うことを確認した。さらに東京湾を対象に予備実験をいくつか試みた。実験では当時の海水準は現在より2m高く、海岸線は現在の標高7mの等高線にほぼ対応し、縄文海進後の堆積層の厚みが7mであったと仮定した。最初に海岸線は現在のままで水深だけ2m増やした場合の潮汐を調べたところ、湾奥の大潮平均高潮面(以下潮位と呼ぶ)がわずかに減少した。これは一次元の定在波理論から予想される結果であり、現在の東京湾のように固有周期が半日よりかなり短く、定在波的な性質が強い内湾では、海面水位の上昇自体は潮汐を弱める方向に働くことが確認できた。次の実験では、当時の海水準で、現在の陸地の標高を堆積層分下げた地形で実験を行った。その場合の湾奥の潮位は1.7mで現在の東京湾に比べ0.5m高いのに対し、湾口では現在と大差ないことがわかった。一方湾口の潮流は現在のM2成分0.3m/sに比べ0.8m/sと非常に強かったことがわかった。湾奥での潮位の増大は主に半日周潮の強化によるところが大きい。日周潮と半日周潮の振幅の比をとると、湾口では79%、現在の湾奥で63%であるのに対し、この実験の場合の湾奥では43%であり、潮汐がより半日周期的な性質を示すことがわかった。さらに本実験で想定したような複雑な地形では、単純な定在波理論だけで潮位の変化を説明することができず、本研究のような数値的な手法による解明が必要となることが明らかになった。

潮汐成分毎の寄与を見ると、潮差増加の大部分は半日周潮の増大に伴うものであった。固有値解析から算出した湾の固有周期並びに数値的に得た共鳴曲線の変化から、水位上昇に伴う潮差の減少、湾域拡大による潮汐の強化は、湾の共鳴周期が現在の6時間から5.5時間または9時間へ変化したことによる半日周潮の応答の変化で説明された。但し、共鳴極大値は周期に反比例するために単に共鳴周期が潮汐周期に近づくだけで潮汐が増大するとは限らない点も指摘している。日本沿岸の海水準変動は地質時代の大潮平均高潮面の記録と現在の潮位差から推定しており、潮位差の変動については十分検討されていない。このため本研究成果は古潮汐の力学機構の解明に加え、海水準曲線の精度向上に寄与すると考えられる。
喘息におけるステロイド抵抗性メカニズムの解明と臨床応用への挑戦

重症喘息におけるステロイド抵抗性のメカニズムとして、ホスファターゼの関与について検討した。我々が最近報告したホスファターゼと別のホスファターゼにも着目し、それらの発現が重症喘息患者の細胞で低下していることがわかった。また、イメージングフローサイトメーターを用いて、それらの各細胞レベルでの簡易な検出方法を至適化している。さらに、これらの発現レベルと実際のステロイド抵抗性との関連性についても検討中であり、今後、日常診療での応用が期待される。最終年度は、日常臨床で活用できるような簡易でかつ再現性のあるステロイド抵抗性を反映する指標となる検査法について検討した。対象サンプルとしては、主に重症喘息患者と健常者からの末梢血および気道上皮細胞(質と量を兼ね備えた鼻粘膜擦過細胞)を用いた。レーザー顕微鏡とフローサイトメーター(FCM)の2つの機能が備わっImaging FCMを用いて比較的簡易にGR-Ser226リン酸化レベルやPP2A発現レベルを確認することが出来るようになった。核内移行についてもImaging FCMで解析可能であるが、現時点では至適条件が定まっていない状況である。現在、各細胞ごとの発現レベルと実際のステロイド抵抗性との相関性を検討中である。PP2Aの他に、ステロイド抵抗性においてキーファクターとなりうるホスファターの関与についても検討した。JNK-GR-Ser226リン酸化経路に関与するホスファターゼから膜型tyrosine phosphataseの一つであるPTPRRそしてdual specificity phosphataseの一つであるDUSP4に注目し、重症喘息患者からの末梢血単核球におけるそれらの蛋白発現レベルを調べた。重症喘息患者では、健常者よりそれらの発現レベルが明らかに低下していて、特に興味深いことに、PP2Aの活性をPTPRRが制御する可能性が示唆された。なお、siRNAを用いた検討では、PTPRR、DUSPの発現低下により、GR-Ser226のリン酸化促進、ステロイド受容体の核内移行能の低下、そしてステロイド抵抗性誘導がみられている。また、Imaging FCMを用いて末梢血中の血球系細胞、気道上皮細胞におけるPTPRR、DUSPの発現レベルも検討した。喘息治療薬である長時間作動型気管支拡張剤(LABA)や新規マクロライドがPP2Aを活性化することがわかってきた。PTPRRやDUSP4もLABAによって活性化される可能性が示唆されている。引き続き、新規マクロライドの効果も含めたホスファターゼ活性化によるステロイド抵抗性改善についての研究を検討している。本年度は、気道上皮細胞(cell line)およびヒト末梢血好酸球における検討から始めた。気道上皮細胞におけるステロイド受容体(GR)の核内移行能の測定は、以前に単球・マクロファージ系細胞で行っていたWestern-blotting法にて再現し、至適化することができた。ステロイド抵抗性が誘導される酸化ストレス下にて、GR核内移行能が低下することも確認できた。GRのリン酸化(GR-Ser226)の検出方法をフローサイトメトリーを用いた方法で確立し、同様の条件下にてGR-Ser226のリン酸化が更新することも確認できた。さらに。ホスファターゼPP2Aの発現(Western-blotting法、フローサイトメトリー)および活性(免疫沈降タンパクを用いた活性測定法)の測定条件も気道上皮細胞で至適化し、ステロイド抵抗性が誘導される条件下ではPP2A活性が低下することがわかった(PP2A発現レベルは変化しなかった)。好酸球においては、ヒト末梢血から採取可能な総数に限りがあるためWestern-blotting法を用いたGR核内移行能の検討は困難であった。GR-Ser226リン酸化の検出方法に関しては、気道上皮細胞と同様にフローサイトメトリーを用いた方法で確立することができた。また、PP2Aの発現はWestern-blotting法で確認したが、活性についてはサンプル量の問題で困難であった。主に分離好酸球(CD16 negative selection法)を用いて検討してきたが、全血法でのGR-Ser226リン酸化の検出方法も並行して行ってきた。なお、ステロイド抵抗性との関連性はまだ確認できていない。重症喘息の病態において一役を担っている好中球における検討がまだできていないが、気道上皮細胞と好酸球に関しては順調に解析できている。ただし、病態モデルにおける検討が気道上皮細胞でしかできていない。好中球および好酸球に関してはヒト末梢血サンプルを用いるためにサンプリングの頻度や回収量に応じて実験の進行に影響が生じている。さらに、好中球や好酸球はかなりデリケートな細胞であり、再現性を保った測定方法の確立に時間を要している。また、同様にサンプルの問題でPP2Aの過剰発現およびノックダウンモデルの検討もまだできていないが、まずは気道上皮細胞から解析を進めていく準備は整っている。臨床サンプルに対する応用として、全血法を用いたGR-Ser226リン酸化の測定方法を好酸球において至適化できていることが、今後の進行速度の加速に繋がると考えられる。

好酸球および好中球のステロイド感受性への関与を病態モデル(IL-2, IL-4共培養や酸化ストレス下で誘導されるステロイド抵抗性モデル)においても検討していく。サンプルの問題で困難であることが予想されるが、フローサイトメトリーや免疫染色など少量のサンプルでも検出可能なmethodを駆使して解析を進めていく。可能であれば、気管支鏡検査で得られる気管支肺胞洗浄液や気道粘膜の解析も検討したい。なお、現在、臨床サンプル(気管支喘息を含む気道炎症性疾患)に関するプロトコールを倫理委員会に提出中であり、承認され次第、多くの疾患サンプルの入手が可能となる。ステロイド感受性とホスファターゼの関与(特にGR-Ser226リン酸化)については、PP2A以外の候補をRNA干渉を用いて探索していく。ターゲットホスファターゼを含む複合体の構成やその機能に対しても可能な限り検討する。ホスファターゼ活性を制御する物質を探り、各疾患におけるステロイド抵抗性改善の治療ターゲットになりうるかということにも触れてみたい。本年度で目的の実験系に使用可能な抗体(Western-blotting法やフローサイトメトリー用)をおおよそ選定することができた。臨床サンプルを解析していく上でこれらの抗体を追加購入していく予定である。ただし、予定していた計画より進行状況がやや遅れていることもあり、研究費の一部が次年度に持ち越しとなっているので、以下のものに関しても計画している。1フローサイトメトリーを用いてセルソーティングするための抗体、2RNA干渉による候補ホスファターゼのスクリーニングのために必要なsiRNAやその関連試薬、3ステロイド感受性テストに使用するELISA関連試薬(ステロイド感受性の指標としてELISAによるステロイドの炎症性サイトカイン抑制テストがすでに確立している。)、4研究成果の発表を目的国内外への学会参加費用(旅費や参加費など)、5論文作成に必要な資料収集や英文添削サービス利用料などの雑費
車いすスポーツにおける基本的スキルと競技用車いすセッティングの関係

本研究の目的は、障がい者スポーツとして代表的な車いす競技の駆動動作を運動学的に分析し、車いすスポーツにおける効率の良い駆動と車いすセッティングの関係、障害を含む身体スキルとの関係を分析することである。三次元動作解析装置VICON NEXUSと床反力計を使用して計測し、Software for Interactive Musculoskeletal Modeling(SIMM:対話型・骨格筋モデリングソフトウエア)を使用して車いす身体モデルからジョイントモーメントを計算した。平成30年度はウイルチェアーラグビー選手8名の計測をした。研究参加者は、選手所有の競技用車いすを用いて、全身と車いすに反射マーカーを54貼付し、競技用車いすに乗る前の身体モデルを作成してから車いすに乗り、車いすと選手の身体を合わせたモデルを作成した。静止位からの加速動作と3mの距離を加速後の急停止動作を計測した。SIMMを用いて上肢・体幹の関節角度と上肢の関節モーメントを算出した。上肢の動作より関節にかかる負荷を算出し、駆動フォームの特長を分析した。ウイルチェアーラグビー選手は体幹機能や肘関節伸展や手関節機能障害を残存機能で代償するが、駆動や停止動作は個々の機能によって異なっていた。結果から駆動の特徴が明らかになり、駆動開始時に肩関節により多くの負荷がかかっている可能性が示唆された。障がい者アスリートに関する研究は対象が極めて少数であることと個別性が強いことが挙げられ、計測についても多くの工夫や調整が必要とされる。数少ないデータから多くの障がい者に適合する指針を作り出すことは困難とされるが、競技力が高い選手のデータを示すことは、これから競技を始める初心者にとって有用な方向性を示すデータとなるため意義は高い。9月に国内学会にて発表を行った。三次元動作解析装置ViconMXを使用して車椅子スポーツ選手の車椅子駆動動作計測し,床反力計から得られるデータと三次元位置座標を合わせ,SIMM(対話型・骨格筋モデリングソフトウエア)を使用して,関節により結合されたセグメントで骨格筋モデルを構成し,SIMM上で表示されたモデルを操作することによりジョイントモーメントを計算する.これまで車いすバスケットボールの選手の駆動動作について呼び計測を行っているが,一部データに欠損が見られていたためカメラを増設することが望ましい.今年度赤外線カメラを増設し,車椅子バスケットボールを計測する予定であったが,所属の事情により増設手続きができなかったため計測を実施していない.次年度はカメラを増設し,5月にSIMMを購入し,7月にウイルチェアラグビーの選手の計測を実施する.これまで車いすバスケットボールの選手の駆動動作について予備計測を行っているが,一部データに欠損が見られていた.今年度赤外線カメラを増設し,車椅子バスケットボールを計測する予定であったが,増設手続きができなかったため計測を実施していない.次年度はカメラを増設し,研究を実施する予定である.カメラの増設ができなくとも,既存の設備で計測は可能であるため平成28年度中に車いすバスケットボールの選手とウイルチェアラグビーの選手の計測を実施する.車いすバスケットボール選手の三次元動作解析装置Vicon MXを用いた計測とモデルプログラミングソフトBodybuilderを使用した分析はこれまで行ってきた研究である。本研究はそれを発展させたものである。三次元動作解析装置ViconMXを使用して計測し,床反力計から得られるデータと三次元位置座標を合せ,SIMM(対話型・骨格筋モデリングソフトウエア)を使用して,骨格筋モデルを関節により結合されたセグメントで構成し,SIMM上で表示された車いす選手モデルを作成することにより各パラメーターを算出する.今年度本学での赤外線カメラの増設とVICON MXのシステムの更新があったためその設置を待ったこと、また、体育館が工事の為使用できなかったことで選手を招致することができなかったことから本計測には至らなかった。そのため実施したことは、研究費の使用計画を変更し分析ソフトウエアSIMM Fullbody Modelの機能を拡充し、これまでに行っていた研究データを使用してSIMM Fullbody Modelを使用して車いす選手モデルの作成を行った。各パラメーターを算出するところまで可能となり、業者の訪問サポートを受けながらデモ-ストレーション計測と分析を2回行った。結果の分析についてはまだ行っていない。これまで継続している車いす競技における駆動動作の研究で計測してきたデータは欠損があるため、赤外線カメラを購入・増設してから計測する必要があった。初年度(平成27年度)は、研究費で購入する計画であったが、所属での設備更新が計画されていたためそれを待ったことで研究が進めることができなかった。今年度(平成28年度)は実際本学での赤外線カメラの増設とVICON MXのシステムの更新が行われたが、更新が年度後半にずれ込んだこと、また、研究が遅れた主たる理由は体育館改修工事のため体育館を使用できず選手を招致することができなかったことから計測には至らなかった。しかし、赤外線カメラの購入分の研究費で、計画にもある分析ソフトウエアSIMM Fullbody Modelの機能を拡大し、訪問サポートへの支出の変更を行った。そのため、今年度はこれまで継続していたデータを使用してモデル作成と、デモ計測を終了している。目的は,障がい者スポーツとして代表的な車いすバスケットボール・ウイルチェアラグビーなどの競技用車いすの駆動動作を運動学的に分析し,車いすスポーツにおける効率の良い駆動と車いすセッティングの関係,障害を含む身体スキルとの関係を分析することである.三次元動作解析装置Vicon

MXを使用して計測し, SIMM(対話型・骨格筋モデリングソフトウエア)を使用して車いす身体モデルからジョイントモーメントを計算する.昨年度は本学での赤外線カメラの増設とVICON MXのシステムの更新があったためそれらの設置を待ち,そのため研究費使用計画を赤外線カメラと分析ソフトを入れ変えて使用した.分析ソフトウエアSIMM Fullbody Modelの機能を拡充し,車いす選手モデルの作成を行ったが,体育館が工事の為使用できなかったことで選手を招致することができず,デモ計測に留まっていた.今年度は対象となる選手に対して計測を継続している.研究参加者は,身体23点,競技用車いすは,8点,合計31点の反射マーカーを貼付して計測するとしていたが,駆動時に反射マーカーが隠れてしまうことから手指や体幹などマーカーを増やすに至った.さらに,競技用車椅子に乗る前の身体モデルを作成してから車いすに乗り,車いすと選手の身体を合わせたモデルとなるように変更した.障がい者アスリートに関する研究は対象が極めて少数であることと個別性が強いことが挙げられ,計測についても多くの工夫や調整が必要とされる.数少ないデータから多くの障がい者に適合する指針を作り出すことは困難とされるが,競技力が高い選手のデータを示すことは,これから競技を始める初心者にとって有用な方向性を示すデータとなるため意義は高い.初年度(平成27年度)は,本学での設備更新に伴う研究費使用変更が生じたことで研究が進めることができなかった.昨年度(平成28年度)は本学での赤外線カメラの増設とVICON MXのシステムの更新が行われたが,年度後半にずれ込み,その後分析ソフトウエアの購入への変更に時間を要した.また,研究が遅れた主たる理由は体育館改修工事のため体育館を使用できず選手を招致することができなかったことから車いす身体モデルの作成とデモンストレーションで実際の計測には至らなかった.今年度(平成29年度)は車いすバスケットボール選手1名(予定25名),ウイルチェアーラグビー選手13名(予定15名)の計測を行い,データ解析も同時に進めている.昨年度までの研究計画からの遅れと,障害による測定の工夫や調整によりたびたび変更を要するため,研究期間を延長するに至った.本研究の目的は、障がい者スポーツとして代表的な車いす競技の駆動動作を運動学的に分析し、車いすスポーツにおける効率の良い駆動と車いすセッティングの関係、障害を含む身体スキルとの関係を分析することである。三次元動作解析装置VICON NEXUSと床反力計を使用して計測し、Software for Interactive Musculoskeletal Modeling(SIMM:対話型・骨格筋モデリングソフトウエア)を使用して車いす身体モデルからジョイントモーメントを計算した。平成30年度はウイルチェアーラグビー選手8名の計測をした。研究参加者は、選手所有の競技用車いすを用いて、全身と車いすに反射マーカーを54貼付し、競技用車いすに乗る前の身体モデルを作成してから車いすに乗り、車いすと選手の身体を合わせたモデルを作成した。
テネイシン-C及びその新規レセプターによる癌細胞浸潤の解析

癌浸潤における細胞外蛋白質の一つであるテネイシン-C(Tn-C)の役割について,そのスプライシング・バリアントに注目し研究を行った.Tn-Cの各スプライシング部位特異的抗体,各ドメイン蛋白質を用いた検討から,スプライシング部位を含むlarge type Tn-Cの発現が乳癌細胞の浸潤面および増殖能が高い細胞周囲に一致してみられること,スプライシング・ドメイン蛋白質がTn-C欠損マウス乳癌由来培養細胞の遊走能,増殖能を高めることを明らかにした.また,large type Tn-Cが,matrix metalloproteinase-9(MMP-9)の高発現を誘導し,さらにTGF-βとの協調作用がみられることを明らかにした.即ち,Tn-Cのスプライシング・ドメインが癌細胞の浸潤能を直接高める機能ドメインであることを明らかにし,Tn-Cが癌細胞の病態進展に関与するTGF-βと協調して,細胞外基質の産生・分解に関わり,癌浸潤に密接に関与することを示唆した.更に,スプライシング・ドメインに結合する蛋白質として,新たに膜7回貫通型レセプターと推定されるグルタミン酸レセプター類縁蛋白質を同定した.グルタミン酸レセプターは,シナプスにおける情報伝達だけでなく,シナプス間接着,細胞形態等に重要な役割を果たすことが示されている.グルタミン酸レセプター類縁蛋白質とTn-Cとの結合は,癌細胞における細胞・基質間,細胞・細胞間に新たな接着,情報伝達機構が存在する可能性を示唆し,癌浸潤のさらなるメカニズム解明につながることが期待される.そこで,新規蛋白質の転写後修飾(糖鎖修飾)を考慮にいれ,培養細胞系を用いた大量のrecombinant蛋白質発現系を構築し,特異的抗体を作成し.詳細なメカニズムの解析を試みている.癌などの病態進展に伴う組織再構築において,細胞外基質は単なる足場ではなく,その発現量,種類の変化,蛋白質分解酵素による破壊など様々な情報を細胞に伝え,細胞機能を直接変化させると考えられている.細胞外基質蛋白質のひとつであるテネイシン-C(TN-C)は,その発現量が癌の悪性度の指標となること,いくつかのスプライシング・バリアントの存在が報告されているが,バリアント発現の生理的意義は不明である.そこで,スプライシング部位の特異的抗体,TN-Cの各ドメイン蛋白質TN-C欠損マウス乳癌細胞などを用いて癌細胞浸潤における関連性を検討した.その結果,癌細胞自身がスプライシング部位含むTN-Cを癌細胞浸潤面及び癌細胞増殖が活発な部位に高度の発現すること,また培養細胞においてスプライシング部位が細胞の遊走能および細胞増殖を亢進させることを明らかにした.更に,TN-Cがmatrix metalloproteinase(MMP)-9の発現を誘導し,この発現誘導は,TGF-bと協調的に作用し基底膜浸潤に関与することを明らかにした.即ち,TN-Cが乳癌の浸潤・進行に直接重要な役割を担うことが考えられた.そこでこれらのメカニズムを検討するため,スプライシング部位結合蛋白質を,アフィニティーカラム法や大腸菌two-hybrid法を用いて検索しいくつかの分子を見いだした.その中で,7回膜貫通型のレセプターと推定される分子に注目し検討を進めている.これまでにin vitroにおけるTN-Cと結合を明らかにしている.現在,特異的抗体を作製中で,癌浸潤におけるTN-Cとの関連性など検討中である.癌浸潤における細胞外蛋白質の一つであるテネイシン-C(Tn-C)の役割について,そのスプライシング・バリアントに注目し研究を行った.Tn-Cの各スプライシング部位特異的抗体,各ドメイン蛋白質を用いた検討から,スプライシング部位を含むlarge type Tn-Cの発現が乳癌細胞の浸潤面および増殖能が高い細胞周囲に一致してみられること,スプライシング・ドメイン蛋白質がTn-C欠損マウス乳癌由来培養細胞の遊走能,増殖能を高めることを明らかにした.また,large type Tn-Cが,matrix metalloproteinase-9(MMP-9)の高発現を誘導し,さらにTGF-βとの協調作用がみられることを明らかにした.即ち,Tn-Cのスプライシング・ドメインが癌細胞の浸潤能を直接高める機能ドメインであることを明らかにし,Tn-Cが癌細胞の病態進展に関与するTGF-βと協調して,細胞外基質の産生・分解に関わり,癌浸潤に密接に関与することを示唆した.更に,スプライシング・ドメインに結合する蛋白質として,新たに膜7回貫通型レセプターと推定されるグルタミン酸レセプター類縁蛋白質を同定した.グルタミン酸レセプターは,シナプスにおける情報伝達だけでなく,シナプス間接着,細胞形態等に重要な役割を果たすことが示されている.グルタミン酸レセプター類縁蛋白質とTn-Cとの結合は,癌細胞における細胞・基質間,細胞・細胞間に新たな接着,情報伝達機構が存在する可能性を示唆し,癌浸潤のさらなるメカニズム解明につながることが期待される.そこで,新規蛋白質の転写後修飾(糖鎖修飾)を考慮にいれ,培養細胞系を用いた大量のrecombinant蛋白質発現系を構築し,特異的抗体を作成し.詳細なメカニズムの解析を試みている.
自己免疫疾患におけるエクソソームによる炎症制御機構の解明

27年度、炎症誘導物質をモニター可能なレポーター細胞を用いて、種々の自己免疫疾患患者由来血清中に含まれる炎症誘導活性を測定し、SLE血清においてtype I IFN (IFN-I)活性ならびにIFN-I誘導活性が高いことを見出した。また、様々な核酸受容体欠損レポーター細胞を作成し、SLE血清によるIFN-I誘導がSTING依存的に惹起されることを見出した。28年度は、STINGを介してIFN-Iを誘導する因子について検討を行い、SLE血清中にはdsDNAが多く含まれており、それらはDNase Iに対する分解から保護されており、血清中の細胞外膜小胞に着目した。210,000gにて単離されるexosomeよりもやや大きい16,000gにて単離されるapoptosis-derived membrane vesicle (AdMVs)分画にIFN-I誘導活性が多く含まれていることを見出した。このことから、SLE血清中には、apoptosis由来物質特にDNA断片が、AdMVsに内包されて存在し、それらが食作用により細胞質内に取り込まれ、dsDNA受容体のcGASで2'3'- cGAMPに変換されてSTINGを活性化し、その結果IFN-I産生が亢進する、という、膜小胞によるIFN-I産生亢進機序が存在し、SLEの増悪に寄与することが分かった。本研究は自己免疫疾患ごとに炎症プロファイルが異なるとの予想に基づき、その炎症プロファイルの違いがエクソソームによる炎症誘導活性の違いよるか否かについて明らかにしようとするものである。本年度は、各自己免疫疾患における炎症プロファイルを同定するために、通常のELISA法に加えて、レポーター細胞を用いた評価系を構築し、自己免疫疾患由来血清におけるサイトカイン活性や、炎症誘導活性の測定を行った。これは、NFkBやIRFといった炎症誘導分子のプロモーター下流にレポーターを挿入することで炎症誘導活性をモニターすることが可能な細胞で、これらにサイトカイン受容体を強制発現させることによりサイトカイン活性を評価できたり、CRISPR/Cas9システムを用いて炎症誘導に重要な自然免疫系受容体の欠損細胞株を作成することで、炎症誘導活性や関与するシグナル経路の同定が可能となる細胞である。また、このレポーター細胞は、実際の生物学的活性やエクソソームなどの膜小胞に内包された物質による炎症誘導活性を評価することが可能で、さらに、shRNAや遺伝子改変技術を併用することにより炎症誘導に関与する分子メカニズムまで解析が可能となる。本年度は、エクソソーム分画に細分化する前に、エクソソームを含んだ血清全体による炎症誘導活性について検討し、我々のシステムの有用性を検証した。また、これまで遺伝子導入や遺伝子改変が困難と言われていたヒト単球系細胞であるTHP-1細胞株への遺伝子導入方法を確立し、STING欠損THP-1レポーター細胞株も樹立した。現在、MyD88など様々な炎症関連分子欠損レポーター細胞株の樹立を行っており、今後、エクソソームを用いた実験を効率よく進められるよう実験基盤を整えることに労力を費やした。エクソソームによる炎症誘導活性の評価は、従来ヒト末梢血単核球細胞を単離してそれに振りかけ、24時間後の培養上清をELISA法により評価する方法で検討していた。手間、費用、再現性、系の発展性といった観点から、評価系の改良の必要性を認識し、研究実績に記したように炎症誘導活性の評価系の樹立に労力を割いた。当初の計画とは若干戦略や方法が異なってはいるが、これまでに樹立した評価系は、比較的安価にハイスループットな解析が可能で、遺伝子改変技術を応用したり、新規薬剤のスクリーニングにも応用可能であるなど、系の発展性という意味において非常に有用な評価系が樹立できたものと思われる。今後、研究計画に基づいた炎症誘導活性や誘導機構の違いについて評価可能な状況になりつつある。また、関節リウマチのサンプル収拾については、生物製剤の利便性が高まったことにより、治療導入を外来で行ってしまう症例が増加し、合併症や薬剤投与による修飾を受けないフレッシュな患者検体の収拾が予想を下回ったため当初の予定よりも若干遅れている。また、臨床的意義を明らかにするための患者医療情報データベースの整備に時間を要していたため、患者検体を用いた評価については当初の計画よりもやや遅れてしまっている。エクソソームのプロテオミクス解析については、炎症誘導活性の表現形とリンクさせた形で進めたいと考えておりまだ着手できていない。今後、炎症誘導活性や誘導経路を指標に分類してプロテオミクス解析を進めたい。昨年度、血清中に含まれるサイトカインの活性や炎症誘導物質の活性についてレポーター細胞を用いて測定できるシステムを構築した。本年度は、それらの細胞を用いて、全身性エリテマトーデス(SLE)、強皮症(SSc)、皮膚筋炎(PM/DM)、シェーグレン症候群(SjS)、関節リウマチ(RA)といった自己免疫疾患患者の血清について評価した。なかでもSLEにおいて、血清中のtype I IFNの生物活性が他疾患に比べて高いことを示し、これまでの方法よりもより簡便に、かつ非常に高感度に血清中type I IFN活性を測定可能なことを明らかにした。さらに、IFN誘導活性を測定可能な別のレポーター細胞を用いて、SLE由来血清中にtype I IFNを誘導し得る物質が含まれていることを見出した。また、SLE血清中に含まれるtype I IFN誘導物質を同定にする目的に、細胞内DNAセンサーであるSTINGおよびTLR9欠損レポーター細胞株を樹立した。これらの細胞を用いて、SLE血清によるtype I IFN誘導メカニズムについて検討したところ、STING欠損レポーター細胞においてSLE血清によるtype I

IFN誘導が減少することを認めた。このことから、SLEでは、血清中に炎症増強しうる物質が含まれ、それらはSTINGを介してtype I IFNの産生を誘導し、そのtype I IFNが更にtype I IFNを誘導するというポジティブフィードバック機構の存在が明らかとなった。また、そのような炎症誘導物質はDNaseから保護されていることから、エクソソームによる炎症誘導の可能性が示唆されている。エクソソームによる炎症誘導活性を評価する前に、血清による炎症誘導活性を好感度に測定できるシステムとしてレポーター細胞を導入した。そして、炎症誘導活性の強い血清から単離したエクソソームの活性をレポーター細胞で測定可能なことも明らかとなった。また、実績豊富な質量分析の専門家との共同研究も始まり、彼らとのディスカッションを通じて、血清の夾雑物を除くためにエクソソームに絞り込むこと、バイオアッセイを通じてエクソソーム中のターゲット分子をある程度予想すること、ターゲット分子を多く含んでいるサンプルを同定することが、質量分析の精度を高めると指摘された。そのため、本年度はすぐに質量分析を行うのではなく、遺伝子欠損レポーター細胞株等を用いたバイオアッセイや、サンプルの絞り込みのための予備実験に時間を費やした。ことSLEに関しては、エクソソームを介した炎症誘導のメカニズムの解明に向けた方向性は定まりつつあり、臨床データの収拾も並行して行っている。研究課題では、自己免疫疾患全般について比較検討することを目指していたが、質量分析による炎症誘導物質の同定が炎症誘導分子経路の同定と切り離せないことから、自己免疫疾患各々における比較については、一つの疾患を深く追求した後に、他の疾患にも応用するという戦略で臨みたいと考えている。昨年度、炎症誘導物質をモニター可能なレポーター細胞を用いて、種々の自己免疫疾患患者由来血清中に含まれる炎症誘導活性を測定し、SLE血清においてtype I IFN (IFN-I)活性ならびにIFN-I誘導活性が高いことを見出した。また、様々な核酸受容体欠損レポーター細胞を作成し、SLE血清によるIFN-I誘導がSTING依存的に惹起されることを見出した。SLEでは何らかの原因によるapoptosisの亢進、それにより生じたapoptosis関連物質の分解障害が病態に関与することが知られており、我々の結果も加味すると、SLE血清中には、apoptosis由来物質特にDNA断片が、AdMVsに内包されて存在し、それらが食作用により細胞質内に取り込まれ、dsDNA受容体のcGASで2'3'-cGAMPに変換されてSTINGを活性化し、その結果IFN-I産生が亢進する、という一連のカスケードがSLEの病態に重要であることが明らかとなった。この成果をリウマチ性疾患関連雑誌の最高峰であるAnnals of Rheumatic Disease誌に投稿し、現在under revision中である。
高速結論発見器の実用化に関する研究

一階述語論理の結論発見器であるSOLARのスケーラビリティ向上のため,SOLタブロー計算法の分轄統治法の考案や,最良優先探索に基づく新しい結論発見器の開発と各種の枝刈り技術の導入,SAT技術に基づく命題論理版結論発見器の試作,その推論エンジンとなるSATソルバーの性能改善等に取り組み,従来のSOLARを超える性能を獲得し,SATソルバーは2011年,2013年のSAT競技会の応用UNSAT部門においてそれぞれ優勝・2位を獲得するなどの成果を得た.平成24年度は主に以下の3つの研究課題に関して取り組んだ.それぞれの実績概要を示す.1.分割統治法に基づく並列型分散結論発見システムの基盤構築:これまで開発を進めていた分割統治法に基づく直列型結論発見システムの実装方法では並列分散処理への拡張が難しいと判断し,新たに並列分散処理への拡張を前提としたシステムの構築に取り組んだ.そのために,最良優先探索に基づく結論発見手続きを考案し,実装した.最良優先探索では良いタブローを評価する尺度が重要となる.そのため各種の特徴量に基づく尺度を比較検討し,一定の条件下において,これまでの直列型結論発見システムを上回る性能を得ることに成功した.また分割尺度や効率的な統治アルゴリズムについても検討を行った.2.トップダウン型とボトムアップ型推論手続きの融合手法の実現と,トップダウン型推論手続きへの制限資源下での探索戦略の導入:トップダウン型とボトムアップ型の推論手続きを融合するための第一歩として,上述の最良優先探索に基づく結論発見手続きを考案した.また,ボトムアップ型推論手続きにおいて優れた現実的探索戦略として知られる制限資源下での探索戦略をタブローの評価尺度に導入し,一定の性能向上が得られることを確認した.3.命題版結論発見システムの実装と評価:これまでに開発したアルゴリズムに基づき,最新の命題論理の充足可能性判定器を用いて命題版結論発見システムを再構築した.大域的シンメトリーに基づく枝刈り手法は実現できたものの,局所的シンメトリーに基づく枝刈り手法は,充足可能性判定器からの充足不能コア抽出が実現した段階であり,今後の課題である.また評価実験において,現在のボトルネックが仮説生成や結論発見時の包摂検査にあることを明らかにし,包摂検査の効率化を図るため,前向きと後ろ向き包摂検査を同時に行う手法を考案・評価した.平成25年度は,24年度に新たに開発した最良優先探索に基づく結論発見システムに対して種々の改良を行った.具体的には,最良優先探索のためのタブローの深さ,幅,サブロールの一般性をもとにした新たな評価関数の実現,高速な項索引機構の実装を行った.また,最良優先探索では数多くのタブローを同時展開するため,それらの削減が非常に重要となる.そこで冗長なタブローを除去するために単位公理・単位補題マッチングの完全検査を実施し,大きな性能改善を得た.この知見から,補題の積極的な生成が重要になると考え,従来の閉じたサブタブローから補題を生成するだけでなく,タブローのオープンノードが1つであった場合に補題を生成する新たな手法を考案し,さらなる性能改善が得られることを実証した.また,冗長なタブローを抑制するため,持ち上げ補題と分岐補題を重複するサブタブローの削減だけでなく,矛盾を導出できないサブタブローの削減にも活用し,特に充足可能な問題の証明に対して効果があることを実証した.結論発見手続きSOLにおいて,タブロー数の増大をもたらす主要因は,タブローの拡張操作にある.これを改善するため,代入が等しい操作を1つにまとめ上げ,代入のみ適用して拡張操作を遅延評価する遅延拡張技術を考案した.どのような場合に遅延評価を行うか判断するヒューリスティクスが問題に依存する側面があるため,頑健な評価基準の構築はまだ実現できていないものの,一定の性能改善が得ることができた.この技術は組み込み述語などの導入においても基盤となるものである.これらの改善の結果,従来のトップダウン型結論発見システムを上回る性能向上を達成した.また,命題版結論発見システムの基盤となる命題論理の充足可能性判定器について,バイナリ融合節に基づく軽量な動的簡単化手法を考案し,性能改善を達成した.一階述語論理の結論発見器であるSOLARのスケーラビリティ向上のため,SOLタブロー計算法の分轄統治法の考案や,最良優先探索に基づく新しい結論発見器の開発と各種の枝刈り技術の導入,SAT技術に基づく命題論理版結論発見器の試作,その推論エンジンとなるSATソルバーの性能改善等に取り組み,従来のSOLARを超える性能を獲得し,SATソルバーは2011年,2013年のSAT競技会の応用UNSAT部門においてそれぞれ優勝・2位を獲得するなどの成果を得た.平成23年度は主に以下の2つの研究課題に関して取り組んだ.それぞれの実績概要を示す.1.分割統治法に基づく直列版結論発見手続きの実現結論発見手続きSOLタブロー法に分割統治法を導入した手法を考案した.提案手法では,タブローを部分タブローに分割し,それぞれ独立して直列に解いた後,部分問題の解集合を統合する.提案手法を実装し,一階の定理証明問題からすべての反駁を求める評価実験を行った結果,分割統治法を適用することで大きく求解数が向上することを確認した.また結論発見問題では,部分結論集合同士の統合が必要となるが,部分結論集合をトライにより表現し,統合時に重複する繰り返し計算を抑制することで,統合に必要な計算量が大きく改善できることを示した.2.命題論理版SOLARのアルゴリズムの検討命題論理

版SOLARの実現のため,SOLタブロー手続きに,矛盾からの節学習やバックジャンプ法,高速単位伝搬等の手法を導入したソルバを試作し性能評価を行った.その結果,一階のSOLARより性能は向上するものの,SATソルバーが対象とするような大規模問題ではスケーラビリティの点で難があることが判明した.そこで,SATソルバーを直接利用する反駁定理に基づく結論発見手法を考案した.この手法では,年々性能が向上するSATソルバーの高速性を直接利用可能であるとともに,最新SAT技術であるインクリメンタル探索や原因解析技術を用いて仮説候補を枝刈りし,またモデルやシンメトリーに基づく枝刈り手法を導入することでさらなる性能の向上が見込める.これらの技術の一部を実装した試作ソルバーを開発し,命題版SOLARよりも大きな性能向上が得られることを確認した.研究実績の概要で示した3テーマのうち,「2.トップダウン型とボトムアップ型推論手続きの融合手法の実現と,トップダウン型推論手続きへの制限資源下での探索戦略の導入」については,アルゴリズムの考案と実装,評価が完了しており,当初の計画以上に進展している.次に「3.命題版結論発見システムの実装と評価」に関しては,その推論エンジンとなる命題論理の充足可能性判定器の高速化にも成功し,それに基づく結論発見器の構築も完了している.その一方で,前年度に考案したシンメトリーに基づく枝刈り手法の導入のため,充足不能コアの抽出技術を実装する必要があり,その基本部分は完成しているものの,各種の簡単化技術への対応が今後の課題である.また,「1.分割統治法に基づく並列型分散結論発見システムの基盤構築」に関しては,まだ並列型への拡張を前提とした基盤システムの構築が完了している段階であり,並列分散処理の実現には至っておらず,この点では少し遅れていると判断した.以上より,テーマ1に関しては計画よりも遅れているものの,テーマ2については計画よりも進展している.テーマ3に関しては,計画通り進まなかった点はあるものの,当初の計画にはない成果も挙がっており,おおむね順調に進展しているといえる.よって総合的におおむね順調と判断した.研究実績の概要で示した2テーマのうち,「1.分割統治法に基づく直列版結論発見手続きの実現」に関しては,直列版結論発見手続きを考案し,その実装もほぼ完了しており,計画通り進展している.また「2.命題論理版SOLARのアルゴリズムの検討」に関しては,当初の計画では命題版SOLタブロー法に最新SAT技術を導入した手法をもとに研究を進める予定であったが,試作ソルバーの性能評価実験よりスケーラビリティの点において今後の改善が困難であると判断し,SATソルバーを直接利用する反駁定理に基づく結論発見手法を考案するに至った.本手法では,各種の枝刈り手法を考案し,その一部をすでに実装済みであり,試作ソルバーも命題版SOLARよりも大きく性能が向上している.今後すでに考案済みのシンメトリーに基づく枝刈り手法を導入することで,さらなる性能の向上が期待できるため,本テーマに関しては当初の計画以上に進展していると判断している.
広帯域共鳴X線溶液散乱法の開発によるタンパク質・生体膜の機能構造の解明

X線異常分散(共鳴X線散乱)を利用すると,溶液中でのタンパク質や生体膜,特に多くの生体反応過程において重要な役割を果たしている金属原子を内包した金属タンパク質の機能構造に関して新たな検討を行うことができると期待されている。一方,最近の第3世代放射光光源を用いたタンパク質や生体膜の広角X線散乱法の進展により,0.2 nmから250nmの範囲の全層構造領域,すなわちタンパク質の2次構造から4次構造,生体脂質のアルキル鎖のパッキングから凝集体の全体構造までの観測が可能となっている。本研究の主眼は,共鳴X線散乱法と広角X線散乱法を用いて,生体分子の内部構造を観測する新たな手法の開発とその応用である。本研究は,放射光源の特徴である波長可変性を最大限利用した共鳴(異常)X線散乱により,溶液中でのタンパク質・生体膜の全階層構造と特定の部位(それらに内包される重元素,硫黄,リンなどの軽元素)の距離相関の同時測定を目指した広帯域共鳴X線溶液散乱観測法の確立を目指して実施されている。生体反応の分子機構の解明には,溶液中の機能状態でのタンパク質や生体膜の構造情報を得ることが重要である。一方,放射光X線溶液散乱法は,様々な環境条件下に於ける“その場"観測が可能なため,多くの研究に利用されているが,分子外形などの低分解能の評価に用いられることが多く,局所構造の解析には殆ど用いられていない。また,X線共鳴散乱を利用すると,特定の元素の散乱能を大きく変化させることが可能である。25年度は,モデルタンパク質としてS-S結合をHg置換したリゾチームを用いて,その熱変性過程におけるの共鳴散乱実験を,高輝度光科学研究センターSPring-8のBL40B2X線散乱装置を用いて2度実施した。各温度におけるX線散乱データを,Hg原子のL3吸収端近傍(硬X線領域)で入射X線のエネルギー(波長)をパラメータとして観測した。のべ1000データを取得し,解析した結果,昇温に伴う内部構造の変化を選択的に議論可能であることが判明した。結果の一部は現在投稿準備中である。また,高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設BL11C装置を用いて,軟X線領域の共鳴X線散乱の予備的な実験を生体脂質膜を対象として,リン原子の吸収端を利用して実施し,この手法の有効性を確認,論文として公表できた。平成25年度の水銀ラベルをしたリゾチームを用いた実験に引き続き,平成26年度は,Feの吸収端を用いた共鳴X線散乱実験の試料として,ミオグロビンを内包した脂質リポソームの測定を実施した。このリポソーム試料は,脂質成分として細胞膜表面に於いて分子認識や細胞接着などの機能を有する酸性糖脂質であるガングリオシドを含み,そのため,機能性ドラッグデリバリーシステムとして期待できる。薬剤モデルとしてミオグロビンを内包させ,リポソーム内でのそのタンパク質の存在状態を共鳴X線散乱により選択的に決定する目的で作成された。タンパク質内包リポソームのX線構造解析法は,それまでに報告されていなかったが,今年度行った実験と新たな解析法の確立によって,内部構造を含め解析可能である事を見いだしたため,論文として報告できた(J. Phys. Chem. B 2015, 119, 3398ー3406, DOI: 10.1021/jp511534u)。Feの吸収端近傍において,入射X線のエネルギーを変化させて散乱データを取得し,散乱パターンのエネルギー依存性(共鳴X線散乱)を観測できた。吸収端の異常散乱コントラストの変化による散乱パターンの変化の差分解析を行う事で,内包タンパク質の位置の選択的な同定を行う事が可能になると考えている。詳細な解析に関しては現在継続中である。また,十分な統計精度を得る必要が有るため,追試実験を計画している。X線異常分散(共鳴X線散乱)を利用すると,溶液中でのタンパク質や生体膜の機能構造に関して新たな検討を行うことができると期待されている。一方,放射光広角X線散乱法を用いると,タンパク質や生体膜の0.2 nmから250nmの範囲の全層構造領域(タンパク質の2次構造から4次構造,生体脂質のアルキル鎖のパッキングから凝集体の全体構造)の観測が可能である。本研究の主眼は,共鳴X線散乱法と広角X線散乱法を組み合わせた生体分子の内部構造を観測する新たな手法の開発とその応用であった。硬X線共鳴散乱実験には,Fe含有ミオグロビン,s-s結合をHgに置換した水銀ラベルリゾチームを,軟X線共鳴散乱実験にはリン脂質膜を使用した。また,タンパク質・脂質膜複合体として,ミオグロビン内包リポソームを作成し,実験に使用した。用いたX線吸収端は,FeとPはK吸収端,HgはL吸収端を利用した。吸収端近傍の入射X線のエネルギー変化に伴う溶質分子からの散乱強度変化は小さいが,原理的には測定可能であることが確認できた。基盤上積層配向脂質膜のP吸収端を用いた斜入射広角X線散乱測定には成功し,共鳴コントラスト変化法による解析が可能であることを報告した(Jpn. J. Appl. Physics,53, 2014)。また,ミオグロビン内包リポソームの測定を実施し,その解析法に関しては確立できた(J. Phys. Chem. B,119, 2015)。

複数の重原子を内包するHgラベルリゾチームの場合,共鳴散乱コントラスト変化による散乱パターンの変化は通常の溶液濃度でも十分測定可能のであることが確認できたが(学会&研究会報告),熱安定性に関しては,ラベルによる安定性の低下が著しく,差分解析は困難であることが判明した。ミオグロビンに関してはFeの含有率が低いため,測定が困難であったが濃度条件等を考慮して追試実験を計画している。X線異常分散(共鳴X線散乱)を利用すると,溶液中でのタンパク質や生体膜,特に多くの生体反応過程において重要な役割を果たしている金属原子を内包した金属タンパク質の機能構造に関して新たな検討を行うことができると期待されている。一方,最近の第3世代放射光光源を用いたタンパク質や生体膜の広角X線散乱法の進展により,0.2 nmから250nmの範囲の全層構造領域,すなわちタンパク質の2次構造から4次構造,生体脂質のアルキル鎖のパッキングから凝集体の全体構造までの観測が可能となっている。本研究の主眼は,共鳴X線散乱法と広角X線散乱法を用いて,生体分子の内部構造を観測する新たな手法の開発とその応用である。吸収端近傍の入射X線のエネルギー変化に伴う溶質分子からの散乱強度変化が小さいため,統計精度,試料調整,解析法を含めたさらなる追試と検討が必要であるが,原理的な可能性に関しては十分確認できている。生物物理学現在使用しているX線は所謂硬X線である。そのため,対象となる元素が金属原子に限られており,それらを多く含むタンパク質をターゲットとせざるを得ない。今年度は,利用している放射光施設でリン原子の吸収端の使用が可能となる予定であるため,脂質膜を中心的な試料として測定可能となる。十分な統計精度での観測か可能になり,共鳴X線散乱法の有効性を実証する予定である。平成25年度は,本研究が目指す新たな構造解析手法の妥当性を検討するために,モデル系として,人工的に作成した重原子ラベルタンパク質を利用した。X線吸収端を利用した構造解析には,十分な統計精度のデータを得ることが重要であると同時に,X線によるダメージを回避することが必要である。そのためには,各露光時間の短縮と繰り返し測定と積算による統計の向上が必要であることは分かった。また,25年度に試作した試料セルの改良の必要があることが判明した。今年度,改良をし,測定を行う。本研究最終的な目的は,天然状態のタンパク質や生体膜,それらの複合体の内部構造を解析する新たな手法の開発である。本年度は,硬X線領域の利用に有効な高輝度光科学研究センターBL40B2X線散乱装置の他に,本年度から利用可能となる予定である高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設BL15に設置された新たなX線散乱装置を用いて,軟X線領域の共鳴X線散乱実験を本格的に行う。従って,ターゲットしては,金属タンパク質に加え,タンパク質中のS-S結合および脂質膜のリン原子を対象とする。それらの位置情報を吸収端近傍の散乱データの差分から選択的に抽出することを試みる。