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コフィリンが飽和結合したアクチン繊維の分子間相互作用を近原子分解能で解き明かす

そのプログラムを用いて、コフィリンが飽和結合したアクチン線維(以下、cofilactin)の3次元構造を、クライオ電子顕微鏡像の単粒子解析により7.4 &#197;分解能で明らかにした。分子動力学計算によるモデル構築プログラムMDFF (Trabuco et al., 2008)を用いて、密度マップに基づくcofilactin原子構造モデルを構築した。D-loopはアクチン分子単量体において最もフレキシブルな部位であるが、アクチン線維形成時にはループ構造を取り、線維の上下のアクチン分子間を強固につなぐ重要な接着点として働くことがわかっている。また、コフィリンがアクチン線維に結合して線維の分子間相互作用を変えるためには、このD-loopによる接着点を弱体化する必要があると考えられていた。しかし本研究によるモデリングの結果、D-loopはαヘリックス構造としてモデル化した方が密度マップをよく説明するとわかった。αヘリックス構造をとると、D-loopの側鎖は隣接アクチン分子から離れる方向を向くため、コフィリンが分子間結合を破壊する文脈でこれは効率の良いシステムである。また、cofilactin原子構造モデルの静電ポテンシャルを計算して可視化したところ、ヘリックス構造へとフォールドしたD-loopが存在する空間は、アクチンの負電荷表面とコフィリンの正電荷表面に挟まれており、αヘリックスの電気双極子を安定化する方向の電場が生じているとわかった。この電場がD-loopのヘリックス構造転移を促進・安定化し、コフィリンの作用を助けている可能性がある。現在、コフィリンの正電荷表面の正電荷残基の電荷反転変異体・電荷消失変異体の発現系を構築し、電場の役割を実験的に確かめている。高分解能を達成するための電子顕微鏡写真の収集、画像処理システムの構築、構造フィッティング法の理解と立ち上げに想定以上に時間がかかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で得られた原子構造モデルで示唆された残基間相互作用・構造転移の特徴付けを行うために、部位特異的変異導入を施した蛋白質を用いて構造解析・速度論解析を実施し、論文としてまとめ世に報告する。その後は近原子分解能を目指すために電子エネルギー分光器と電子直接検出器を搭載した透過電子顕微鏡を用いて画像収集する事で近原子分解能に挑戦したいと考えている。分解能が目標値に及んでいないが、電子顕微鏡撮影・単粒子解析・分子動力学法によるモデル構築という一連の流れは実施でき、これまでにない知見も得られた。分解能を向上させるための追加の電子顕微鏡写真の収集を既に行っており、その新しいデータを含めた計算を現在行っている。これまでに単粒子解析のアルゴリズム改良・モデル構築の試行錯誤は良く進められたため、新たな計算は比較的スムースに完了すると期待している。また、コフィリンの大量発現系の改善も行ったので、変異導入蛋白質実験実施の準備も進んだといえる。
嗅覚系における神経回路の形成と再生の分子基盤

私共はこれ迄に、マウス嗅覚受容体遺伝子MOR28クラスター(MOR28-10-83-29A)を導入したトランスジェニックマウスの解析から、MOR28遺伝子クラスターの発現には、その転写開始点上流約100kbの領域が必要であることを示した。最近、マウスMOR28クラスター及びそのヒトorthologクラスター領域に関するDNA塩基配列がそれぞれ決定され、私共の解析により、MOR28遺伝子の転写開始点上流約75kbに、唯一、双方で相同性の高い2kbの領域が同定された(Nagawa et al.,Gene292,2002)。本年度の研究において、MOR28遺伝子の上流に存在するこの相同性領域を欠失させたトランスジェニックマウスでは、MOR28,10,83,29A遺伝子の発現が同時に消失することが判明した。この観察は、嗅覚受容体遺伝子の発現がクラスターのレベルで制御されており、一つの嗅覚受容体遺伝子が選択される前に、一つのクラスターがchoiceされることを示唆している。また、私共はこれ迄に、染色体上で同一クラスターに属し、且つ、同一サブファミリーに属する嗅覚受容体遺伝子は、嗅上皮の同じゾーン内で発現し、それら発現細胞は嗅球上で近接した糸球に軸索を投射することを示した(Tsuboi et al.,J.Neurosci.19,1999)。そこで本年度は、マウス嗅覚受容体遺伝子MOR28クラスターを含めた複数のクラスターに関して、嗅覚受容体遺伝子を発現する嗅細胞の軸索投射先を解析した結果、"同一クラスター上に存在し、同一サブファミリーに属する嗅覚受容体遺伝子を発現する嗅細胞は、類似した匂い分子を受容し、嗅球においては局所的な糸球ドメインに軸索投射する"ことが示唆された。一方、嗅上皮で発現する嗅覚受容体遺伝子は、四つのゾーンの中いずれか一つに限定して発現しており、嗅上皮におけるゾーンに対応して、嗅細胞の投射先である嗅球にも四つのゾーンの存在が知られている。そこで本年度は、嗅細胞の特異的な軸索投射の第一段階であるzone-to-zoneの対応を解明する為、嗅上皮で領域特異的に発現する遺伝子をdifferential display法を用いて探索したところ、嗅上皮のゾーン1で特異的に発現している四つの新規クローンが得られた。その中でも新規遺伝子OMACSは、medium-chain acyl-CoA synthetase遺伝子と高い相同性を示し、嗅上皮のゾーン1を構成する細胞で特異的に発現しており、然もラットの胎生11.5日から発現していることから、ゾーン形成に何らかの役割を果たしていることが示唆された(Oka et al.,Eur.J.Biochem.,in press)。申請者らは、嗅細胞における嗅覚受容体遺伝子の相互排他的な発現、及び、それに依存して生じる嗅球への位置特異的な軸索投射の分子機構を解明する為、長年の懸案であったトランスジェニックマウスにおける嗅覚受容体遺伝子の発現系の確立を試み、YAC(yeast artificial chromosome)ベクターを用いることにより世界に先駆けて成功した(Nat. Neurosci. 3:687-693,2000)。我々の作製したマウスにおいては、460kbのYAC DNA上の嗅覚受容体遺伝子MOR28はIRES(internal ribosome entry site)を介してtau-lacZ遺伝子により標識されており、内在性のMOR28遺伝子は外来性の遺伝子を発現する細胞と区別する為、ノックインの手法を用いてIRES-gap-GFP遺伝子により標識されている。本研究において、このマウスを詳細に解析した結果、(1)外来性及び内在性のMOR28遺伝子は個々の嗅細胞で相互排他的に発現すること、(2)それぞれの遺伝子を発現する嗅細胞の投射先は隣接しているが異なる糸球であること、(3)それぞれの遺伝子を発現する嗅細胞の軸索の選別と収斂はpathfindingの過程ではなく、糸球構造の形成に伴って生じることが明らかとなった。次に本研究では、これ迄の解析からMOR28遺伝子の発現制御には、その上流約100kbのDNA領域が重要であることが示されているので、この領域に予想される制御エレメントを、様々な欠失を導入することにより絞り込んでいる。最近、マウスとヒトのゲノムプロジェクトにおいて、M0R28及びそのヒトortholog遺伝子クラスター領域に関するDNA塩基配列がそれぞれ決定され、私共の解析により、MOR28遺伝子の転写開始点上流約70kbに、唯一、双方で相同性の高い2kbの領域が同定された。平成14年度では、MOR28遺伝子の上流に存在する2kbの相同性領域を欠失させることにより、このクラスター内の嗅覚受容体遺伝子の発現がどの様になるかを検討する。また、嗅上皮で発現する嗅覚受容体遺伝子は、四つのゾーンの中いずれか一つに限定して発現しており、嗅上皮におけるゾーンに対応して、嗅細胞の投射先である嗅球にも四つのゾーンの存在が知られている。そこで、嗅細胞の特異的な軸索投射の第一段階であるzone-to-zoneの対応を解明する為、嗅上皮で領域特異的に発現する遺伝子をdifferential display法を用いて探索したところ、これ迄に複数の候補遺伝子が得られているので、それらの機能についても解析する。

最近、マウスMOR28クラスター及びそのヒトorthologクラスター領域に関するDNA塩基配列がそれぞれ決定され、私共の解析により、MOR28遺伝子の転写開始点上流約75kbに、唯一、双方で相同性の高い2kbの領域が同定された(Nagawa et al.,Gene292,2002)。本年度の研究において、MOR28遺伝子の上流に存在するこの相同性領域を欠失させたトランスジェニックマウスでは、MOR28,10,83,29A遺伝子の発現が同時に消失することが判明した。この観察は、嗅覚受容体遺伝子の発現がクラスターのレベルで制御されており、一つの嗅覚受容体遺伝子が選択される前に、一つのクラスターがchoiceされることを示唆している。また、私共はこれ迄に、染色体上で同一クラスターに属し、且つ、同一サブファミリーに属する嗅覚受容体遺伝子は、嗅上皮の同じゾーン内で発現し、それら発現細胞は嗅球上で近接した糸球に軸索を投射することを示した(Tsuboi et al.,J.Neurosci.19,1999)。そこで本年度は、マウス嗅覚受容体遺伝子MOR28クラスターを含めた複数のクラスターに関して、嗅覚受容体遺伝子を発現する嗅細胞の軸索投射先を解析した結果、"同一クラスター上に存在し、同一サブファミリーに属する嗅覚受容体遺伝子を発現する嗅細胞は、類似した匂い分子を受容し、嗅球においては局所的な糸球ドメインに軸索投射する"ことが示唆された。一方、嗅上皮で発現する嗅覚受容体遺伝子は、四つのゾーンの中いずれか一つに限定して発現しており、嗅上皮におけるゾーンに対応して、嗅細胞の投射先である嗅球にも四つのゾーンの存在が知られている。そこで本年度は、嗅細胞の特異的な軸索投射の第一段階であるzone-to-zoneの対応を解明する為、嗅上皮で領域特異的に発現する遺伝子をdifferential display法を用いて探索したところ、嗅上皮のゾーン1で特異的に発現している四つの新規クローンが得られた。その中でも新規遺伝子OMACSは、medium-chain acyl-CoA synthetase遺伝子と高い相同性を示し、嗅上皮のゾーン1を構成する細胞で特異的に発現しており、然もラットの胎生11.5日から発現していることから、ゾーン形成に何らかの役割を果たしていることが示唆された(Oka et al.,Eur.J.Biochem.,in press)。
電荷移動錯体の結晶相重合に基づく有機磁性導体の構築

BEDT-TTF誘導体の電荷移動錯体を基盤として、反応性を有する新規な錯体を構築することは新しい電子的・光学的性質を示す錯体系の構築に有望である。申請者はジアセチレン部の直結したBEDT-TTFと、種々の電子受容体との錯体を対象として立案したが、ジアセチレン化合物の重合には立体的な規制が大きく働くことが良く知られており、この研究を成功させるためには、まず、ドナーとTCNQ誘導体とが結晶内で適切な相互配置を取る条件を網羅的に探索することが欠かせない。申請者はここで、BEDT-TTFをドナー、種々のTCNQ誘導体をアクセプターとして二成分錯体を多数合成し、その構造-物性相関に関し系統的に検討を行なった。特に、TCNQの分子修飾を精密に行うことにより、アクセプター分子の形状・置換様式と、生成した錯体の集合様式の間に密接な立体的・電子的な相関関係があることを見いだした。尚その過程で、新しい積層様式を有する磁性錯体なども得ており、この内容については、国際会議においても発表を行なっている。以上の知見から、BEDT-TTF誘導体の電荷移動錯体の重合化に関しては、硫黄原子を介してジアセチレン部にEDT-TTFが直結した化合物と、分子幅のほぼ等しいフッ素置換TCNQの組み合わせにおいて、ドナーとアクセプターが長軸を揃えた理想的な結晶内配置を取ることが予想され、重合性錯体として有望であるとの結論に達した。これらの知見を元に、重合性ドナーの合成を試みた結果、カップリング反応条件下においてドナーが非常に不安定であることが判明し、単離が不可能であった。現在連結部としてメチレン基を導入した化合物について合成を継続中である。
血小板産生における細胞骨格蛋白質フィラミンの役割の解明

GPIbαプロモーター下に緑色蛍光蛋白質GFPを発現させさらにその3'非翻訳領域に細胞骨格蛋白質フィラミンAの発現を特異的に抑制するmicroRNA配列を挿入する事で血小板特異的にフィラミンをノックダウンした巨核球、血小板をES細胞から得る事ができた。GFPの発現とフィラミンの発現は逆相関を認めたが、GFPの発現が弱くさらに高発現株をスクリーニング中である。同様のコンストラクトを用いてトランスジェニックマウスを作成中である。我々は細胞骨格蛋白質フィラミンAと血小板膜蛋白質GPIbαの相互作用が血小板産生,血小板活性化に重要な役割を演じている事を明らかにしてきた。研究の目的はフィラミンAを(血小板特異的に)ノックダウンしたES細胞株を樹立し, in vitroで巨核球,血小板に分化させる事でフィラミンの巨核球への分化,血小板産生,活性化における役割を明らかにする事である。初めにCMVプロモーターの下に緑色蛍光蛋白EGFPのcDNAをその下流にフィラミンをノックダウンするmicroRNA配列を挿入したvectorを作成した。ES細胞株(E 14tg2A)にこのコンストラクトをトランスフェクトし,抗生剤でゲノムに組み込まれたクローンを選択しさらにFlowcytometryでGFP高発現安定株¢Σcloningを行った。またwestern blottingでフィラミンの発現が親株と比較して10%以下である事を確認した。このフィラミンノックダウン株を胚葉体形成法で6日間分化させマウス造血幹細胞のマーカーであるCD41(GPIIb)の割合を検討した。親株では10%程度のCD41 positive細胞を認めたがフィラミンノックダウン株では高レベルのGFP発現分画(フィラミンのノックダウン効率が高い分画)ではCD41positive陽性細胞を認めなかったが,低レベルGFP発現分画(フィラミンのノックダウン効率が低い分画)ではCD41 positive細胞を認めた。以上よりフィラミンAの発現はES細胞から造血幹細胞分化に必須であると考えられた。フィラミンAは頭,頚部の形態異常や脳質周囲への神経細胞の移動だけでなく心血管系の形成にも重要な役割を演じている事が報告されている。今後神経細胞や,血管系への分化についても検討を行うと共にこの細胞株にヒトフィラミンを発現させ,血球系への分化が回復するかの確認を行いこの現象が本当にフィラミンAのノックダウンによるものなのか検討を行う予定である。我々は細胞骨格蛋白質フィラミンAと血小板膜蛋白質GPIbαの相互作用が血小板産生、血小板活性化に重要な役割を演じている事を明らかにしてきた。研究の目的はフィラミンAを(血小板特異的に)ノックダウンしたES細胞株を樹立し、in vitroで巨核球、血小板に分化させる事でフィラミンの巨核球への分化、血小板産生、活性化における役割を明らかにする事である。前年度はCMVプロモーターの下に緑色蛍光蛋白EGFPのcDNAをその下流にフィラミンをノックダウンするmicroRNA配列を挿入したvectorを作成し、これを用いてフィラミンAの発現が10%以下のES細胞株の樹立に成功した。さらにフィラミンの発現は造血細胞分化に必要である事を明らかにした。本年度はこの機序の解明を進めると共にCMVプロモーターをヒトGPIbαプロモーター3kbに置き換えたコンストラクトを作成し実験を行った。ES細胞株(E14tg2A)にこのコンストラクトをトランスフェクトし抗生剤zeocineで培養することでstable cloneを樹立した。これらのクローンを胚葉体形成法で分化させさらにThrombopoetin(Tpo)で培養することでGFP陽性の巨核球、血小板を得る事ができた。現時点ではGFPの発現が弱いためさらに高発現株をスクリーニング中である。またこの系で得られたGFP陰性血小板はすでにマウス末梢血血小板と比べてもサイズが大きく、in vitroの系での血小板の大きさの評価は難しいと考えられた。現在同じコンストラクトからベクター由来の配列を取り除き直線化し(4.7kb)このコンストラクトを用いてトランスジェニックマウスを作成中である。
1原子・1分子レベルの解析と操作による細胞膜機能の解明

細胞膜のグローバルな構造形成と機能の研究が、本格的に始まりつつある。例えば、細胞膜のドメイン構造の形成、細胞全体の形態の形成と変化、細胞運動、細胞分裂、エンドサイトーシス、隣接細胞との相互作用のための構造の形成、膜受容体と細胞内情報伝達分子の集合と局在化、などの、細胞膜が大きな構造体として関与する重要な現象について、それらの分子機構を解明するための研究である。このためには、従来の膜に関するアプローチだけでは不十分であり、膜ドメインの形成と膜骨格/細胞骨格との相互作用を常に視点にいれておくことが必要である。一方、顕微鏡下で、機能している1分子、生細胞内での1分子を見て操作する技法の最近の進展は著しく、細胞膜と細胞骨格の相互作用が直接的に1分子のレベルで調べられるようになってきた。分子同士を押し付けたり、1分子を引っ張ってみたり、捻ってみたりすることで、初めて、分子間の相互作用が理解できるようになる。本研究では、このような研究の発展段階に鑑み、細胞膜研究のエクスパートに、細胞骨格系の研究者と、1分子直視・操作の方法を開発している研究者を加えて、「膜タンパク質・脂質と膜骨格/細胞骨格との相互作用を直接に調べ、細胞膜のグローバルな構造形成と機能発現の機構を解明する」、という課題に答えられる新しい研究の方法と戦略を創出することを目指した。そのために、異分野の研究者によるパイオニア的共同実験と討論を実行し、1分子直視・操作の技術のさらなる開発と細胞膜系への応用法の開発を推進した。さらに、実際に、細胞膜でのドメイン構造形成の機構などを解明するための研究をおこなった。さらに、1原子レベルでの、膜分子間、及び、膜分子と膜表在性タンパク質との相互作用のパイオニア的研究もおこなった。細胞膜のグローバルな構造形成と機能の研究が、ようやく、本格的に始まろうとしている。このためには、従来の膜に関するアプローチだけでは不十分であり、膜骨格/細胞骨格との相互作用を常に視点にいれておくことが必要である。しかし、最近までは、技術的問題のため、膜タンパク質・脂質と膜骨格/細胞骨格との相互作用を直接的に調べることは困難であった。ところが、顕微鏡下で、機能している1分子、生細胞内での1分子を見て操作する技法の最近の進展は著しく、細胞膜と細胞骨格の相互作用が直接的に1分子のレベルで調べられるようになってきた。分子間相互作用は、究極的には、1原子のレベルで議論する必要がある。従って、1原子レベルでの、膜分子間、及び、膜分子と膜表在性タンパク質との相互作用のパイオニア的研究もおこなった。細胞膜が大きな構造体として関与する重要な現象について、それらの分子機構を解明するための研究をプロジェクトチームとして推進した。特に、膜骨格/細胞骨格との相互作用を中心に研究を進めた。方法としては、顕微鏡下で、機能している1分子、生細胞内での1分子を見て操作する技法を目的にあわせて変更し、これを用いた。細胞におけるタンパク質間の相互作用は本質的にヘテロジニアスであり、平均をとっても無意味なことが多い。

1分子ずつ、個別に見て操作することによって、さまざまな相互作用の存在がはじめて見えてきた。見るだけではなく、操作することが重要であった。分子同士を押し付けたり、1分子を引っ張ってみたり、捻ってみたりすることで、初めて、分子間の相互作用が理解できるようになってきた。本研究では、細胞膜研究のエクスパートに、細胞骨格系の研究者と、1分子直視・操作の方法を開発している研究者を加えて、「膜タンパク質・脂質と膜骨格/細胞骨格との相互作用を直接に調べ、細胞膜のグローバルな構造形成と機能発現の機構を解明する」、という課題に答えられる新しい研究の方法と戦略を創出することを目指した。そのために、異分野の研究者によるパイオニア的共同実験と討論を実行し、1分子直視・操作の技術のさらなる開発と細胞膜系への応用法の開発を推進した。さらに、実際に、細胞膜でのドメイン構造形成の機構などを解明するための研究をおこなった。細胞膜のグローバルな構造形成と機能の研究が、本格的に始まりつつある。例えば、細胞膜のドメイン構造の形成、細胞全体の形態の形成と変化、細胞運動、細・胞分裂、エンドサイトーシス、隣接細胞との相互作用のための構造の形成、膜受容体と細胞内情報伝達分子の集合と局在化、などの、細胞膜が大きな構造体として関与する重要な現象について、それらの分子機構を解明するための研究である。このためには、従来の膜に関するアプローチだけでは不十分であり、膜ドメインの形成と膜骨格/細胞骨格との相互作用を常に視点にいれておくことが必要である。一方、顕微鏡下で、機能している1分子、生細胞内での1分子を見て操作する技法の最近の進展は著しく、細胞膜と細胞骨格の相互作用が直接的に1分子のレベルで調べられるようになってきた。分子同士を押し付けたり、1分子を引っ張ってみたり、捻ってみたりすることで、初めて、分子間の相互作用が理解できるようになる。本研究では、このような研究の発展段階に鑑み、細胞膜研究のエクスパートに、細胞骨格系の研究者と、1分子直視・操作の方法を開発している研究者を加えて、「膜タンパク質・脂質と膜骨格/細胞骨格との相互作用を直接に調べ、細胞膜のグローバルな構造形成と機能発現の機構を解明する」、という課題に答えられる新しい研究の方法と戦略を創出することを目指した。さらに、1原子レベルでの、膜分子間、及び、膜分子と膜表在性タンパク質との相互作用のパイオニア的研究もおこなった。
海洋島・大陸内部・沈み込み帯の火山のタイプの比較研究

ハワイ・カナリア・アゾレスの各諸島の主だった火山とアセンション火山島の地形分類図を描き、それらの火山の地形発達と火山タイプの特徴について検討を行った。ハワイ諸島ではKilauea,Mauna Kea,East Maui,Lanai,Molokai,Oahu島の火山、カナリア諸島ではTenerife,Lanzarote,Ferteventura,Hierro,Gran Canaryの各島の火山、アゾレス島ではFayal,Flores,Graciosa,Alegranza,Corvo,San Jorge,Terceira,Miguel,Picoなどの火山島を研究対象とした。それから得られたいくつかの知見をのべる。ハワイ諸島の火山はその主体が薄い玄武岩質溶岩流からなる大型楯状火山である。その形成には100万年程度の歳月を要するが、その活動終止後、数百万年経過して高アルカリ岩質の小型火山が生ずる。一方カナリア・アゾレスなどの火山島では大型楯状火山の形成に平行するか遅れて、フォノライト質の溶岩ドームや厚い溶岩流が多く見られる。例えばアゾレス諸島のTerceira火山島では楯状火山の上に火砕流を噴出した後に形成されたカルデラ、その中に生じたフォノライト質溶岩ドームが大量に認められる。一方同じくアゾレス諸島のSan Jorge火山島はリフトに沿って長く延び、頂部に多くのスコリア丘をもつ典型的な楯状火山である。カナリア諸島のTenerife,Hierro火山島でも火砕流噴出と関連したカルデラ、成層火山の形成が楯状火山の形成と平行するか、遅れて起こっている。またFerteventura,Lanzarote、Gran Canary火山島では1000万年以上以前(海底の火山体も含めると1-2億年前からかも知れない)から継続的に火山活動があったことが知られ、これら大西洋の海洋火山島の諸火山の性格は太平洋にあるハワイの火山群の特徴と異なることが明らかになった。これらの特徴の差異はカナリア・アゾレスの火山がマントル深部に起源をもつプルームによって生じたいわゆるハワイ型のホットスポットの火山でない可能性を示唆する。
飛躍型確率微分方程式のマリアバン解析

この研究による第一の成果は,或る飛躍型確率過程の系に対するフイルタリング方程式の解の正則性に関するものである.マリアバン解析における新しいKey Lemmaを用いて,一般化Hormander条件のもとで,方程式の解に滑らかな密度関数が存在することが示された.第二の成果は次の内容のものである:x^u(0)はuについて滑らかで,確率過程x(t)=(x^u(t))はHilbert空間H=(L^2(R^d,β(R^d),μ))^Nに値をとると仮定する.π:H→R^Mを有界線形写像とする.確率変数π(x(T))の分布が滑らかな密度関数を持つことを,その確率微分方程式の偏準楕円性ということにする.H上のベクトル場:に対して偏Hormander条件というものを導入する.偏Hormander条件のもとで偏準楕円性が成り立つという偏Hormander定理が,H上の確率微分方程式に対して,新しいKey Lemmaを用いるマリアバン解析を実行することによって証明される.そして,この偏Hormander定理は,或る確率微分方程式系で定義される確率流によって導かれる測度についての,絶対連続性の伝播に関する問題に適用することが出来る.この研究による第一の成果は,或る飛躍型確率過程の系に対するフイルタリング方程式の解の正則性に関するものである.マリアバン解析における新しいKey Lemmaを用いて,一般化Hormander条件のもとで,方程式の解に滑らかな密度関数が存在することが示された.第二の成果は次の内容のものである:x^u(0)はuについて滑らかで,確率過程x(t)=(x^u(t))はHilbert空間H=(L^2(R^d,β(R^d),μ))^Nに値をとると仮定する.π:H→R^Mを有界線形写像とする.確率変数π(x(T))の分布が滑らかな密度関数を持つことを,その確率微分方程式の偏準楕円性ということにする.H上のベクトル場:に対して偏Hormander条件というものを導入する.偏Hormander条件のもとで偏準楕円性が成り立つという偏Hormander定理が,H上の確率微分方程式に対して,新しいKey Lemmaを用いるマリアバン解析を実行することによって証明される.そして,この偏Hormander定理は,或る確率微分方程式系で定義される確率流によって導かれる測度についての,絶対連続性の伝播に関する問題に適用することが出来る.Malliavin解析という方法は確率解析の分野で既に確立した方法になったが、それは標準Wiener空間という有限次元空間内の連続曲線の作る関数空間上での解析に限定した場合であって、標準Wiener空間から外れた空間上でのMalliavin解析については状況が異なる。安定過程とWiener過程の合成であるLevy過程を絶対連続的に変位させることにより、Levy過程の汎関数の微分を考えることができる。しかしながら、これによって定義されるcad-lag空間という不連続写像を含む関数空間上での汎関数微分の扱いは容易ではない。確率微分方程式に対するMalliavin解析で中心となるのは関数空間上の部分積分公式であるが、標準Wiener空間上の解析と同じ理論展開によってそれを扱おうとすると重大な困難に直面する。解析目的に合せた特殊な部分積分公式を考える必要が生じると共に、従前のものとは異なる道筋での理論展開が求められる。研究代表者小松等は、飛躍型の確率微分方程式の解の分布の密度関数が滑らかであるための十分条件としてのHormander条件を導く目的で、cad-lag空間上の汎関数の微分の定義を始めとするMalliavin解析の枠組みの再構築を試みた結果、「共分散の非特異性」を示す単純であるが強力な方法を考案した。それはある種のsemimartingaleの汎関数についての評価式を利用するものである。この成果は、「飛躍型の確率微分方程式の解の密度関数の滑らかさについて」という題で国外の専門雑誌に掲載された。その方法を飛躍型確率過程のfiltering方程式に適用したのものは、国際シンポジウムの会議録に掲載予定である。一方、連続なsemimartingaleの汎関数についての評価式をHilbert空間上の確率微分方程式の偏準楕円性問題に適用して得られた成果を、今年度国内で開催の研究会及び学会で発表した。この研究による第一の成果は,或る飛躍型確率過程の系に対するフイルタリング方程式の解の正則性に関するものである.マリアバン解析における新しいKey Lemmaを用いて,一般化Hormander条件のもとで,方程式の解に滑らかな密度関数が存在することが示された.第二の成果は次の内容のものである:偏Hormander条件のもとで偏準楕円性が成り立つという偏Hormander定理が,H上の確率微分方程式に対して,新しいKey Lemmaを用いるマリアバン解析を実行することによつて証明される.そして,この偏Hormander定理は,或る確率微分方程式系で定義される確率流によって導かれる測度についての,絶対連続性の伝播に関する問題に適用することが出来る.
国家間法としての一般国際法規則の現代グローバル法秩序への適用

本研究では、国際法の大前提たる合意原則がどこまで貫徹されるべきであるのかという問題について、主として20世紀前半までに国家間法として形成された慣習国際法における諸規則が、現代グローバル法秩序においてどのように適用されるのかという観点から検討を行っている。平成30年度も、法形成過程に関与していない非国家主体へ国際法はそのまま適用されるのか、あるいは修正が必要となるのかという、国際法主体に関する問題に取り組み、日本の国際法学会、ヨーロッパ国際法学会、京都大学の研究会などの国内外のセミナー、学会等に積極的に参加し、知見を深めた。また、国際法資料に関しては世界最高峰のコレクションを誇るオランダの平和宮図書館にて資料収集を行った。研究成果としては、第一に、従来、国家間関係において形成された国内的救済完了原則という慣習国際法の原則が、投資家対国家にて争われる投資条約仲裁において、新たな国際法主体として登場した投資家の主張により、内容的な変化を受けているのかについて考察し、論考をまとめ、国際法学会の学会誌である国際法外交雑誌117巻1号にて公表した。第二に、非国家主体が慣習国際法形成に与える影響についてマンチェスター大学のJean d'Aspremont教授らと共同研究で進めてきた成果について、現代のグローバルな国際法秩序において投資家が慣習国際法形成にどのような影響を及ぼしうるかについての論考を令和元年度中に公表する予定である。第三に、ハーグ国際法アカデミーのCentre for Studies and Researchにて、平成27年より進めてきた個人の国際正義(international justice)へのアクセスに関する共同研究の成果として、非司法的手続による紛争解決についての論考を令和元年度中に公表予定である。平成29年度、平成30年度を通じて、ほぼ計画通りに資料を収集し、論考を公表してきている。令和元年度には、フィナンシャルレビュー(財務総合研究所)に内国民待遇原則に関する論考を、国際経済法学会年報に投資協定仲裁に関する書評を、坂元茂樹先生および薬師寺公夫先生の古稀記念論文集に外交的保護の国籍に関する規則についての論考を、それぞれ公表する予定で準備を進めている。平成29年度は、法形成過程に関与していない非国家主体へ国際法はそのまま適用されるのか、あるいは修正が必要となるのかという、国際法主体に関する問題に取り組み、ヘルシンキ大学や京都大学などの国内外のセミナー、学会等に積極的に参加し、知見を深めた。研究成果としては、第一に、博士論文のテーマであった外交的保護との関係で、従来は外交的保護の発動要件として国籍が絶対的に必要であるとされてきたところ、実際の居住を主とした人権保護の概念から提唱されるdenizenshipが、国籍に変わる概念として、外交的保護の発動要件となり得ることにつき、アイルランド国立大学ゴールウェイ校のEkaterina Yahyaoui Krivenko氏が編纂したHuman Rights and Power in Times of Globalisation (Brill Nijhoff, 2018)にて公表した。第二に、従来、国家間関係において形成された国内的救済完了原則という慣習国際法の原則が、投資家対国家にて争われる投資条約仲裁において、新たな国際法主体として登場した投資家の主張により、内容的な変化を受けているのかについて考察し、論考をまとめ、国際法学会の学会誌である国際法外交雑誌117巻1号にて公表予定である。構想段階にあった論考を1本公表し、あと1本も近日中に公表される予定である。

平成30年度は、これまで取り組んできた外交的保護という国家間での実行により形成された慣習国際法上の規則が国際投資条約仲裁で参照される際、私人への適用という訴訟当事者の性質の違いがあるにも拘わらず、そのまま適用されるのか、それとも何らかの修正が加えられるのかという問題につき、検討を継続させながらも、他の論点にも取り組む。具体的には、慣習法が条約化され、あるいは条約が慣習法化することにより形成された現代グローバル法秩序において、慣習法の果たす役割はいかなるものであるのかという問題について、例えば、投資条約仲裁と貿易法の関係などにも広めながら検討を進める。令和元年度には、フィナンシャルレビュー(財務総合研究所)に内国民待遇原則に関する論考を、国際経済法学会年報に投資協定仲裁に関する書評を、坂元茂樹先生および薬師寺公夫先生の古稀記念論文集に外交的保護の国籍に関する規則についての論考を、それぞれ公表する予定で準備を進めている。平成29年度は科研費以外にも、民間の研究助成を得ることができたため、本研究に対するエフォートが少なくなり、当初の計画よりも使用額が少なくなった。しかしながら、本年度は研究助成は、本科研費のみであるので、全ての項目において、昨年度よりも使用額が増額することが見込まれる。平成29年度に科研費以外に民間の研究助成を得たことで、本研究に対するエフォートが少なくなり、当初の計画よりも使用額が少なくなった。平成30年度は、当初の計画以上に本研究に取り組んだが、平成29年度からの繰越額全てを消化するには至らず、令和元年度に若干ながらの繰越額が発生するに至った。繰越額については、特別なことをせずとも計画に沿って着実に研究を進めれば、適正に執行することができると予想される。
一酸化窒素のヘリコバクター・ピロリ感染後の胃十二指腸病変発症における役割

一酸化窒素(Nitric Oxide : NO)とHelicobacter pylori感染との関連性を明らかにするためin vitroおよびin vivo実験を行った。Nitriteはnitrateに比べ強い抗H.pylori作用をもつことが明らかにされた。Nitrate投与群およびnitrate非投与群スナネズミでの定着H.pylori菌数に差異は認められなかった。Nitrate投与群の血漿および胃液におけるnitrate量およびnitrite量は、非投与群に比べ有意に高値を示した。H. pylori感染スナネズミにおいて、nitrate投与群では非投与群と比べ胃腺拡張の低下が認められた。これらの結果より、nitrateを含む食品の摂取がH. pyloriの胃粘膜に対する感染効果を調節する可能性が示唆された。in vitroでの硝酸塩(nitrate)および亜硝酸塩(nitrite)のH.pylori増殖に及ぼす効果を調べた。nitrate, nitriteいずれも0.13mM900mMの範囲にて増殖培地(7%ウシ胎児血清加ブルセラ培地)に添加して、37°Cにて微好気培養を行った。11mM以上の濃度のnitrate添加はH.pyloriの増殖を対照(nitrate無添加)の1/2以下(OD_<600>にて評価)に抑制した。これに対して、0.13mM以上の濃度のnitriteはH.pyloriの増殖を対照の1/2以下に抑制した。これらの結果よりnitrateに比べnitriteが強い抗H.pylori作用をもつことが明らかにされた。H.pylori TK1402株をスナネズミに経口感染させ、3ヵ月後に安楽死させた。定着H.pylori菌数は10^4CFU/g mucus以上を示した。H.pylori感染は血漿中、胃液中、胃粘膜中のnitrateおよびnitrite量に変化を与えなかった。しかし、H.pylori感染により、胃粘膜内誘導型No合成酵素(iNOS)の発現が亢進されていることがリアルタイムRT-PCR法により明らかにされた。H.pylori感染による病理学的解析の結果、H.pylori感染は好中球および単球の浸潤を引き起こすことが認められた。また、胃腺拡張は強く認められたが、腸上皮化生は検出されなかった。胃粘膜中の優勢菌であるlactobacilliの菌数をH.pylori非感染スナネズミおよび同感染スナネズミ間で比較した。定着lactobacilli数はH.pylori感染スナネズミにおいて低下する傾向がみられたが、統計学的に有意な差ではなかった血管拡張作用、突然変異作用、炎症惹起作用、発癌作用、免疫調節作用、抗微生物作用など多彩な活性を有する一酸化窒素(Nitric Oxide : NO)とHelicobacter pylori感染との関連性についてスナネズミ感染モデルを用いて検討した。食餌中の硝酸塩(nitrate)は消化管より吸収され、血流に入り、唾液腺により濃縮され口腔内に分泌される。口腔内の細菌による還元作用により亜硝酸(nitrite)に変換され、胃酸下でNO生成が行なわれるため、NO供給源として飼育用飲料水にnitrateを1mmol/kgあたりに添加した。スナネズミへのnitrate含有水投与がH.pyloriの胃内定着性、炎症発現性などにどのような影響を及ぼすかについて解析した。H.pyloriTK1402株をスナネズミに経口感染させ3ヵ月後に、定着H.pylori菌数、血漿中、胃液中、胃粘膜中のnitrate量およびnitrite量、病理学的所見を評価した。Nitrate投与群および対照群(蒸留水投与群)での定着H.pylori菌数はいずれも10^4 CFU/g mucus以上を示し、nitrate投与群において低値であったが、両者に統計学的有意差は認められなかった。Nitrate投与群の血漿、胃液および胃粘膜中におけるnitrate量およびnitrite量は、対照群に比べ有意に高値を示した。病理学的解析の結果、nitrate投与群では対照群に比べ炎症スコアおよび胃腺拡張の低下が認められた。本研究より胃粘膜内に生成されたNOは胃粘膜内に持続感染するH.pyloriの増殖を抑え、除菌する作用は見られなかったものの、定着菌数を抑える効果が認められた。加えてnitrateの投与はH.pylori感染に伴う炎症スコアおよび胃腺拡張の低減化が認められた。これらの実験結果はrutrateを含む食品の摂取がH.pyloriの胃粘膜に対する感染効果を減弱化させる可能性を示唆しており、今後の更なる検討が必要となる。

発癌作用、血管拡張作用、抗微生物作用など多彩な活性を有する一酸化窒素(Nitric Oxide:NO)のHelicobacter pylori感染に及ぼす影響について、本菌の感染モデルとして頻用されるスナネズミを使用して検討した。食餌中の硝酸塩(nitrate)は消化管より吸収され、血流に入り、唾液腺により濃縮され口腔内の細菌による還元作用により亜硝酸(nitrite)に変換され、胃酸下でNO生成が行なわれるため、NO供給源として重要である。in vitroでのnitrateのH.pylori増殖に及ぼす効果を調べた結果、11mM以上のnitrate添加はH.Pyloriの増殖抑制効果をもつことが明らかにされた。飼育用飲料水にnitrateをlmmole/kgあたりに添加し、Nitrate投与群とした。対照群では蒸留水を投与した。H.pyloriTK1402株をスナネズミに経口感染させ3ヵ月後に、定着H.pylori菌数、血漿中、胃液中、胃粘膜中のnitrate量およびnitrite量、病理学的所見を評価した。Nitrate投与はH.pyloriの胃内定着菌数を変化させなかった。Nitrate投与群の血漿、胃液および胃粘膜中におけるnitrate量およびnitrite量は、対照群に比べ有意に高値を示した。病理学的解析の結果、nitrate投与群では対照群に比べ炎症スコアおよび胃腺拡張の低下が認められた。本実験結果はnitrateを含む食品の摂取がH.pyloriの胃粘膜に対する感染効果を減弱化させる可能性を示唆している。加えて健康成人ボランティア25名を対象としてnitrateを豊富に含有する日本食の効果を評価した。日本食の摂取により、唾液および血清中のnitrate,nitrite濃度の増加に加え、拡張期血圧の低下が認められた。これらの結果より、NOはH.pylori感染のみならず生体の諸機能にも影響を及ぼしている可能性が示唆された。
光化学的新技術を用いたＤＮＡ結合タンパク質の網羅的クローニング法の開発

転写調節などの様々な機能を担うDNA結合タンパク質の効率的な解析法とクローニング法について,光を照射するだけで共有結合をつくる性質をもつ光反応基を利用して開発研究を実施した.従来法では不可能であった複数のDNA結合タンパク質の同時解析を可能とした光化学的ゲルシフトアッセイ法を開発し,核抽出液を用いた実験でその解析能力の高さを実証した.光反応性DNAを分子生物学的手法であるパニング法や機器分析法である質量分析法と組合せることで光化学的クローニングを実施するための基礎的な実験を実施した.さらに,本解析法のターゲットとなる脳神経疾患の基礎的な知見を得ることができた.DNA結合タンパク質の網羅的な解析法、クローニング法を開発することをめざし、光反応基ジアジリンを利用したchemical biologyの新技術とバイオテクノロジーとを融合した光化学的パニング法、並びに高感度機器分析法である質量分析技術と融合させた方法を開発することを目的とした。H23年度の研究実績であるモデルタンパク質POUとの結合実験をベースとして、H24年度は、申請書の計画に従い【計画2】光化学的パニング法を利用したDNA結合タンパク質のクローニング法の開発と、【計画3】光反応性ユニットの新規開発と質量分析法を利用したクローニング法の開発について実施した。以下、H24年度の研究実績について示す。【計画2】DNA結合タンパク質としてモデルタンパク質として計画1で利用したPOUタンパク質を提示するファージを作成した。これに結合するDNA配列であるoctamerDNAをもつ光反応性DNAを利用しパニング実験を行った。光反応部位が異なるいくつかの光反応性DNAを利用したり、光反応基の種類などを変化させたりしたがパニングの効率が上昇しなかった。提示ファージに何らかの問題がある可能性が考えられる。【計画3】モデルDNAータンパク質の複合体として計画1で実績のあるPOUタンパク質と光反応性octamer DNAを利用して、質量分析法に利用しやすいキャッチ&リリース型の解析法の開発を試みた。発現したPOUタンパク質のペプチドマッピングで質量分析装置(Bruker microTOF-Q(四重極))の感度が十分であることを確認した。切断可能な部位を導入した切断効率の高い光反応性DNAの作成に注力している。DNAと結合するタンパク質は転写を始め,様々な生理的機能を調整する重要なタンパク質である.本研究では,DNAに結合するタンパク質を網羅的に解析する方法およびクローニングする方法の開発を目指した.そのために「化学」を土台に様々な方法との組合せを行った.光反応基ジアジリンをDNAに導入し結合タンパク質との共有結合を作る化学的な方法論を用いて,解析能力の向上とともにクローニング効率の向上を目指した「光化学的ゲルシフトアッセイ法」の確立に続き,「光化学的パニング法」と「質量分析法を利用した光化学的同定法」の開発に注力した.「光化学的ゲルシフト法」は従来法で不可能であった複数のDNAタンパク質の結合を同時に解析できることを,光反応基を導入したoctamer配列DNAとリコンビナントPOUタンパク質と核抽出液とを用いて証明した.「光化学的パニング法」は前述のoctamer配列DNAとPOUタンパク質を発現するファージとの組合せで評価実験を行った.DNA配列に導入する光反応基の位置を様々に変化させるなどリガンド側構造の工夫を行った.さらに,結合複合体を形成させる条件を変えるなどの工夫も試みたが,予想よりも低い選択効率であった.大腸菌で発現したPOUタンパク質は結合活性をもつものの,ファージで提示させたタンパク質では結合活性が弱いことが考えられた.「質量分析法を利用した光化学的同定法」では,クロスリンクしたタンパク質を遊離させる方法の確立を目指した.質量分析を効率的に行うためには必須の技術であり,切断性の光反応基ユニットをDNAに結合させる方法について検討を行った.これらの技術を用いての解析対象として,神経疾患に注目し,プリオン病や脳血管性認知症についての基礎的な知見を得ることができた.転写調節などの様々な機能を担うDNA結合タンパク質の効率的な解析法とクローニング法について,光を照射するだけで共有結合をつくる性質をもつ光反応基を利用して開発研究を実施した.従来法では不可能であった複数のDNA結合タンパク質の同時解析を可能とした光化学的ゲルシフトアッセイ法を開発し,核抽出液を用いた実験でその解析能力の高さを実証した.光反応性DNAを分子生物学的手法であるパニング法や機器分析法である質量分析法と組合せることで光化学的クローニングを実施するための基礎的な実験を実施した.さらに,本解析法のターゲットとなる脳神経疾患の基礎的な知見を得ることができた.光反応基ジアジリンを利用したchemical biologyの新技術の創製の一つとして,DNAと相互作用するタンパク質の解析に適した基盤とシステムを構築することを目的とした.当該年度は,DNAと結合タンパク質解析のモデルとして開拓したoctamer DNA配列を利用して,光反応基ジアジリンの機能を十分発揮できる方法論を検討した.【計画(1)】生物学的な解析に利用されている光反応基ベンゾフェノンを利用し,ジアジリンとPOUタンパク質への結合能力について比較した.次に,octamer DNA配列への光反応基ジアジリン導入位置を変化させ,ラベル効率を比較した.これらの実験結果から,ジアジリンはベンゾフェノンに比べて短時間でのラベルが可能であり,試料となるタンパク質やDNAに対して実験時の障害を少なくすることができること,また,DNA配列への導入部位が変化してもラベル効率には大きく影響しないことが明らかになった.しかしながら,導入部位を変えた例が少ないため,さらなる検討が必要である.【計画(2)】

申請者らが開発した光化学的パニング法(ジアジリンを使って1000倍以上の選択効率の向上を可能にした分子生物学的技術)を使用したDNA結合タンパク質の網羅的解析法の確立のため基礎技術の獲得を目指した.octamerDNA配列にジアジリンを導入し,POUタンパク質をもつ提示ファージを選択するモデル系を使用して確立を進めたが,現在のところ期待したほどの効率が得られず,効率を上げるための方策を模索している.以上のように計画(2)でさらなる工夫が必要なものの,計画(1)では一定の成果を得ることができた.光反応性ペプチドを利用した光化学的パニング法は従来法の1000倍以上の効率が得られた方法であるが、光反応性DNAを利用したパニングでは予想外に効率が悪く、ライブラリーのスクリーニングに適応できないことが、遅れている理由である。質量分析を利用したクローニング法に注力し、遅れを挽回する予定である。当該年度は研究代表者の異動と重なり,当研究を始めるための備品,消耗品を手配する必要があった.震災の影響もあり,予算交付が例年よりも遅れたこともあり,期間前半での研究活動が難しい状況であった.申請書に従い、次の計画を実行しDNA結合タンパク質のクローニング法の確立に注力する。【計画3】光反応性ユニットの新規開発と質量分析法を利用したクローニング法の開発質量分析法に適した切断型の光反応性DNAを利用して、DNA結合タンパク質のクローニング法を確立する。これらの実験を通して、機能的なツールの開発と実験ノウハウを蓄積する。【計画4】コンフォメーション病の脳疾患時でのDNA結合タンパク質の変化のプロファイリング脳疾患に関連するDNAモチーフについて反応性DNAを作成し、核抽出液から関連するDNA結合タンパク質が見つけられるような方法を確立する。申請書の計画に従い,【計画(2)】光化学的パニング法を利用したDNA結合タンパク質のクローニング法の開発と【計画(3)】質量分析法を利用したクローニングと構造解析法の開発に注力する.また,【計画(1)】で光反応基の導入部位を変えた例を増やし,ラベル効率との関連を明らかにする.次年度使用額は13.7万円である。これには1年目の繰り越し金7万円あまりも含まれている。実験の一部が計画通りに進まなかったために、繰り越し金が発生した。次年度の研究費は申請書にある通りに、光反応性リガンド作製費、遺伝子解析消耗品費、核抽出液作製消耗品費、電気泳動・検出消耗品費、質量分析用消耗品費等の研究を実施するために必要な消耗品を中心に使用する予定である。当該年度で使用できなかった研究費(約7万円)は,研究達成度の遅れによるものであり,次年度での消耗品購入費として活用し,遅れを取り戻すために使用する予定である.具体的には,【計画(1)】の光反応基の導入部位を変えた例を増やすために使用する予定である.
骨随幹細胞の肝細胞への分化制御機構と微小環境"niche"の解明-MMPノックアウトマウスを用いて-

目的;骨髄細胞が肝細胞に分化する過程におけるMMP9の重要性を検討する。方法;MMP-9 KOマウス(♀)をhostとして、GFP-TGマウス(♂)の骨髄細胞を移植し、肝細胞への分化過程を形態的に検討し、MMP9とSDF-1、CXCR-4の関連を検討する。結果;肝臓におけるSDF-1の発現は急性四塩化炭素障害と放射線照射を併用すると強く誘導されることが確認され、放射線照射後に四塩化炭素障害を引き起こす実験モデルで骨髄移植を行った。骨髄細胞中のCXCR-4陽性細胞数Lin+細胞では5.7%であるのに対しLin-細胞で41.1%であり、本実験ではLin-細胞を分画して移植を行った。移植されたhostの肝臓内の単核球を解析すると、CXCR4+細胞数は対照群;25%、MMP9 KOマウス;10%, MMP inhibitor投与群;20%であった。また移植された肝臓内GFP+細胞数は対照群;4.8%, MMP9 KOマウス;2%, MMP inhibitor投与群;2.5%であった。肝臓内でのGFP,Y染色体Sryの発現も同様であった。次に骨髄細胞のin vitroの結果では骨髄細胞はSDF-1によって細胞遊走能が著明に促進されるがMMP inhibitor添加で完全に抑制された。またSDF-1添加で骨髄細胞はMMP-9の発現が誘導され、一方MMP-9添加で骨髄細胞はCXCR-4の発現が増強した。結論;SDF-1は骨髄細胞のMMP-9の発現を誘導し、CXCR-4発現増強を介して肝臓へのrecruitmentを誘導すると考えられた。これらの結果は骨髄細胞がnicheからの遊離とともに障害部位へのrecuruitmentにMMP-9が重要であると推察される。現在、肝不全患者に対する確立された根治療法は肝移植のみであり、自己骨髄幹細胞や臍帯血幹細胞を用いた肝再生医療の開発が期待される。しかし骨髄や臍帯血幹細胞がどのように肝細胞へ分化するのか、また分化するために必要な微小環境"niche"はどのようなものか、など不明な点が多い。本研究では骨髄幹細胞が肝細胞へ分化する制御機構、および分化に必要な"niche"を解明することを目的とする。同時にHGF,SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)投与有無の各群を用いて、移植されたマウスの肝臓におけるGFP陽性細胞の分化過程を経時的に検討し、肝細胞への分化における制御機構と"niche"でのMMP,HGF,SDF-1の意義について検討する。これらの研究の成果は、将来的に自己骨髄細胞をex vivoの条件として"niche"に準じた微小環境条件に類似させることが可能となり、肝不全に対する有効な細胞移植療法を開発しえる。マウスCD34陽性幹細胞における遊走能をmigration assayで検討した結果SDF-1は対照に比し約5倍の細胞に遊走させることが確認された。また遊走した細胞に肝細胞分化Markerの発現率が高いことをPCRで確認した。CC14投与肝障害モデルでは肝内にSDF-1の発現が検出され、SDF-1発現量は肝臓傷害の程度に相関した。それに対し、肝内骨髄由来GFP陽性細胞数も傷害の程度に相関した。傷害肝モデルにおけるHGF投与結果、GFP陽性細胞数がもっと多く、その一部が肝細胞転写因子HNF4陽性細胞に分化した。
日伯司法共助に関する比較法的研究

今年度は、前年度の研究を継続し、アメリカ合衆国及びポルトガルの国際司法共助の調査を行った。調査の一環として、2週間アメリカのコロンビア大学に、そして2週間ポルトガルのコインブラ大学に滞在した。1960年代、国際司法共助に関するプロジェクトがコロンビア大学で実施されたので、調査のためにコロンビア大学を選択した。この研究は、後のアメリカ大陸の国々間で、そしてアメリカ合衆国と他の国との間で締結された司法共助の基本となった。ポルトガルでは、ブラジル・ポルトガル間の司法共助及びEUの加盟国間の司法共助の調査を行った。EU加盟国間の司法共助は、特定の法令に従い書類の送達や判決の告知がスムーズに行われる仕組になっている。このように、ブラジル、日本、アメリカ合衆国そしてポルトガル間の司法共助の調査を行った。それぞれの国間の司法共助は、異なった条約に基づいている。つまり、日本、アメリカ、そしてポルトガルは1965年の「民事又は商事に関する裁判上及び裁判外の文書の外国における送達及び告知に関する条約」に基づき、ブラジルとアメリカ合衆国は1975年の「アメリカ大陸間の嘱託書に関する条約」に基づき、そしてブラジルと日本、ブラジルとポルトガルは二国間条約に基づいているのである。この調査で、それぞれの司法共助の仕組を広範に検討し、それぞれの利点を確認することができた。本研究によって、今後ブラジル・日本間の二国間条約の見直しに関する議論が行われた際に、最善の仕組の提案が可能になったのである。本研究の分析及び結論は、現在執筆中の単行本に発表する予定である。まず、ブラジルの国際司法共助に関する文献の調査をおこなった。資料の中には民事、商事、労働及び行政司法協力、嘱託書の実施、外国判決の承認、無料裁判扶助等、国際司法共助の枠組みでブラジルが締結したすべての二国間条約が含まれる。この調査をもとに、各分野の主なる基準及び問題点を指摘・比較し、表にした。次に、日本国法律における国際司法共助の調査をおこなった。嘱託書に関する資料を中心に分析したが、同時に1954年の民事訴訟手続に関する条約、1965年の民事又は商事に関する裁判上及び裁判外の文書の外国における送達及び告知に関する条約、日本国とアメリカ合衆国との間の領事条約、日本国とグレート・ブリテン及び北部アイルランド連合主国との間の領事条約、1940年9月23日に調印された日本とブラジルとの間の二国間共助取決め等、国際司法共助の枠組みで日本が締結した条約の分析をおこなった。現在、ブラジル司法からの司法共助要請が多い他の国との間で、それがどのように実施されているのかを明らかにするために、ブラジル国とアメリカ合衆国との間の司法共助に関する資料の研究をおこなっている。今後は、ブラジル国とポルトガル国及びフランス国との間の司法共助に関する資料の調査をおこなう予定である。また、当初の研究計画には含まれていなかったが、経済統合によって国間における通商関係に変化が生じ、それに伴い司法共助を一部では革新する条約が締結される等、司法関係に影響がでていることから、同経済ブロックに属する国間の司法共助のあり方の研究を取り入れる予定である。具体的には、EU及びメルコスールで実施された嘱託書及び外国判決の承認の手続きの調査を計画している。