hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Si－3次元フォノニック結晶が熱電特性に与える影響

KMPRの粘度調整、プリベーク温度・時間、レーザー照射時間、ポストベーク温度・時間、現像時間を調整することで、SU-8と同様な3次元周期的ナノ構造をレジスト内に作製することに成功した。縦方向の空隙間隔となるTalbot距離は、レジストの屈折率により変わるが、観察された差が、SU-8およびKMPRの屈折率の差と一致していることも判明し、理論的にも適切に形成できていることが確認された。更に、KMPRを溶液処理による除去だけでなく熱処理によっても除去できることも確認し、除去処理後の残留物質がSU-8よりも少ないことを確認した。これにより、様々な液体前駆体から作る半導体に対して3次元周期的ナノ構造の形成が検討できるようになった。液体材料の導入後のレジスト除去熱処理により、導入した半導体の結晶性が制御できなくなる懸念があったが、本検討により半導体の結晶性や電気的特性制御がより容易になり、今後充填するZnOやSiの熱電特性への影響をより詳細に検討できるようになった。Siの充填プロセスの改良も進んた。前年度は綺麗にレジスト内の空隙に液体Siを導入することができていなかったが、脱泡処理の導入によりレジスト内の空隙に液体Siを導入することが可能となった。ZnOを充填したナノ構造体は形成できているので、本構造体が熱伝導率に与える影響を検討する。また、シリコン充填法において、塗布後の脱泡を検討する。この場合、液体シリコンを塗布するグローブボックス装置内に脱泡装置を導入する必要があるため、環境整備を進める。液体シリコンを用いた場合でも熱伝導率測定に必要な面積でナノ構造体形成が実現されれば、ナノ構造サイズ分布を解析し、より小さい構造サイズ形成に必要なプロセスを実施していく。ZnOやSiによる3次元周期的ナノ構造体の形成を進める。ZnOやSiの液体前駆体の充填プロセスを早急に確立し、その熱伝導率、電気導電率の計測を行う。試料面積もこれら計測を行うのに必要な2×2cm角程度のものが用意できるようになっている。これにより、本研究の目的である、周期的ナノ構造が熱電特性に与える影響を明らかにすることができる。
妊娠の成立と維持に関する子宮内膜および全身におけるNK細胞の機能分担と機能発現

非妊時および妊娠時末梢血および非妊時子宮内膜のNK細胞の妊娠の成立・維持に関する検討を行い、NK細胞表面に発現するNCRs、特にNKp46の発現が生殖異常の方では変化していることが明らかとなった。またNK細胞が産生するサイトカインにも異常を来たす事が明らかとなった。さらにNK細胞表面に発現するNKp46とNK細胞のサイトカイン産生には直接関連があることが明らかとなった。非妊時子宮内膜、流産脱落膜および妊娠時末梢血における免疫担当細胞の機能分担と機能発現、NK細胞表面に発現するNatural Cytotoxicity Receptors(NCRs)とNK細胞産生サイトカインの妊娠成立および妊娠維持に関する役割を明らかにすることを目的に患者への説明と同意および倫理委員会の許可のもと以下の検討を行った。1.uNK細胞におけるNCRs発現非妊時子宮内膜(反復流産群、着床不全群、コントロール群)および流産脱落膜を対象とした。NK細胞サブセット(CD16、CD56)およびNK細胞上NCRs(NKp46、NKp44、NKp30)発現をフローサイトメトリー(FCM)にて測定した。CD16^+/CD56^<dim>細胞、CD56^<dim>/NKp44^+細胞、CD56^<dim>/NKp30^+細胞は子宮内膜に比して流産脱落膜で有意に高値であった。また着床不全群ではCD56^<dim>細胞とCD56^<bright>細胞との間にNKp44の発現差を認めた。2.妊娠高血圧症候群(PIH)発症におけるNCR発現とNK細胞産生サイトカイン【結論】着床不全患者子宮内膜および流産患者脱落膜におけるNCRs発現異常が存在した。PIH群ではNKp46がPIH発症前から低値を示した(PIHの予測因子となり得るかもしれない)。NKp46発現低下によりTNF-α産生細胞が増加し、NK細胞のタイプ1シフトを誘導し、PIHが発症する可能性を示した。1.uNK細胞におけるNCRs発現およびサイトカイン産生2.末梢血NKp46陽性NK細胞と子宮内膜NKp46陽性NK細胞との相関3.妊娠高血圧症候群(PIH)発症におけるNCR発現とNK細胞産生サイトカイン妊娠12、20、28、36週に末梢血NK細胞上NCR(NKp46)発現およびサイトカイン(TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10)産生をFCMにて測定し、PIH群と非発症群との間に差違を認めるか否かを検討した。昨年PIH群ではNKp46^+NK細胞が低値であることを報告したが、さらなるデータの蓄積によりPIHが重症になるほどNKp46^+NK細胞が低値となることが明らかとなった。またNKp46^+NK細胞の低下はPIHが発症する34ヶ月前から低下することが明らかとなった。子宮内膜および末梢血における免疫担当細胞の機能分担と機能発現、特にNK細胞表面に発現するNatural Cytotoxicity Receptors(NCRs)とNK細胞産生サイトカインの妊娠成立および妊娠維持に関する役割を明らかにすることを目的に検討を行い、以下の結果を得た。1.NK細胞におけるNCRs発現およびサイトカイン産生子宮内膜におけるCD56^+/NKp46^+発現はRecurrent pregnancy loss(RPL)群でコントロール群に比して有意に低値であった。また子宮内膜NK細胞におけるIFN-γ産生とTNF-α産生はRPL群でコントロール群に比して有意に低下していた。すなわちRPL群では胎盤形成における血管のリモデリングに異常を来しているものと思われた。2.末梢血NCR陽性NK細胞と子宮内膜NCR陽性NK細胞との相関末梢血と子宮内膜におけるNKp46陽性NK細胞およびNK44陽性NK細胞には有意な正の相関を認めたが、NKp30陽性NK細胞には相関を認めなかった。これより末梢血NKp46^+NK細胞およびNKp44^+NK細胞は子宮内膜NKp46^+NK細胞およびNKp44^+NK細胞を反映していることが明らかとなった。3.NK細胞におけるNCRs発現とNK細胞産生サイトカインとの関連性
拡大超対称性の部分的自発的破れと低エネルギー有効理論の決定

本年度前半は、N=1超対称ゲージ理論における双対性の研究を行った。瀧雅人氏、寺嶋靖治氏、八木太氏(京都大学基礎物理学研究所)と協力して、近年発見された共型対称性を持つN=2超対称クイバーゲージ理論における双対性を利用し、様々なN=1超対称ゲージ理論における双対性を発見した。この双対性はこれまでは全く異なると思われていた理論どうしの双対性であり、超対称ゲージ理論の非常に興味深い特徴を表している。また、糸山浩氏、湊彰史氏(大阪市立大学)と協力して、自発的にN=2からN=1に破れた超対称性に伴う南部・ゴールドストンフェルミオンに関する低エネルギー定理を発見した。本年度後半は、近年発見されたN=2ゲージ理論と2次元共型場理論、行列模型との関係に対する研究を行った。江口徹氏(京都大学基礎物理学研究所)と共同で、log型の作用を持つ行列模型を調べた。ここでは行列模型のプラナー極限をとることで、スペクトル曲線としてSU(2)ゲージ理論のサイバーグ・ウィッテン曲線が得られることや自由エネルギーがプリポテンシャルと同定できることを示した。また、糸山浩氏、大田武志氏(大阪市立大学)と共同で、上記の行列模型のSU(n)ゲージ理論への一般化を調べた。SU(n)ゲージ理論に対応するものとして、n-1個の行列からなるクイバー行列模型が予想されていたが、我々はこの行列模型のプラナー極限でのスペクトル曲線が、一般的にSU(n)ゲージ理論のサイバーグ・ウィッテン曲線と同じ性質も持つことを示した。これらの研究は、log型の作用を持つ行列模型がプラナー極限でゲージ理論の結果を含んでいることを示しており、以後の発展に大きな影響を与えている。本年度前半は、N=2超対称性が部分的かつ自発的に破れるゲージ理論の真空構造に関する研究を行った。この理論には、N=1超対称ゲージ理論に比べ、N=1超対称を保つ真空がより多く存在することが知られていたが、これらの一部では運動エネルギーが負になるため物理的に意味のある真空とは思われていなかった。しかし、超弦理論や有効超ポテンシャルの解析から従う考察をこの理論に適応することにより、上記の負の運動エネルギーを持つ真空は超対称性が完全に破れた真空として記述できることを指摘した。さらに、この理論の特徴として、超対称性が破れた準安定な真空が存在し得ることを示した。これは自発的部分的に破れたN=2超対称性の低エネルギー有効理論に与える顕著な影響のひとつである。本年度後半は、N=2超対称性が自発的部分的に破れる理論をより一般的にした、N=1超対称性のみを持つ理論を考察した。特に、クォーク場に対応する物質場が存在し、さらにゲージ部分と物質場との間の相互作用が一般的な理論を構成し分析した。物質場の種類がある程度多く上記の相互作用が存在しない場合、この理論には、低エネルギーでの振る舞いが同じである別の理論(双対な理論と呼ぶ)が存在することが知られていた。そこで、上記の相互作用を加えた場合の双対な理論を発見し、その構造を分析した。また、この理論は本研究計画の22年度で扱う理論と関係しており、来年度の研究の足掛かりとなる研究となった。また、糸山浩氏、湊彰史氏(大阪市立大学)と協力して、N=2からN=1へ自発的に破れた超対称性が存在する場合の低エネルギー定理を、超対称電流を計算することにより導いた。これにより低エネルギーで南部・ゴールドストンフェルミオンが依然として非自明な相互作用を持つことなど興味深い振る舞いが明らかになった。
糖尿病・代謝疾患における病態解明及び克服のための探索的研究

2型糖尿病患者において心不全が増加していることが報告されている。心不全には左室駆出率の低下した心不全(HFrEF)と左室駆出率の保たれた心不全(HFpEF)があるが、HFpEFには治療法がなく、その病態解明と有効な治療法が求められている。病態としてNO産生低下など血管内皮機能障害との関係も考えられていることから、今回HFpEF患者に対し硝酸薬が有効かどうか検証した。その結果、HFpEF患者において硝酸薬の使用は逆に心血管イベントリスク増加と有意に関連していた(Tsujimoto et al. Mayo Clin Proc 2018)。この結果は糖尿病とは関係なく認められる結果であり、病態解明や治療内容の改善のためにさらなる調査が必要と考えられる。また、2型糖尿病患者において、冠動脈疾患の治療方針も重要な臨床課題である。今回我々の研究で、2型糖尿病患者の冠動脈疾患に対し、心筋梗塞の既往がない場合は冠動脈バイパス術の方が内科治療より主要冠動脈イベントのリスクが有意に低いこと、また、心筋梗塞の既往がある場合にはPCIは内科治療よりそのリスクが高いことを報告した(Tsujimoto et al. Sci Rep 2018)。さらに、2型糖尿病患者の冠動脈疾患において、PAI-1/tPA比が高い場合はPCI治療の方が内科治療より主要冠動脈イベントリスクが高いことを報告した(Tsujimoto et al. JAHA 2018)。また、obesity paradoxの存在が示唆されている2型糖尿病と冠動脈疾患を併存した非肥満患者に対してはインスリン感受性を高める治療がインスリンを追加する治療より有効であることも報告した(Tsujimoto et al. Int J Cardiol 2018)。研究は順調であり、糖尿病患者の治療方針のさらなる改善のため調査をすすめている。論文として今年度もpeer reviewjournalに4本アクセプトされており、研究費を含めて研究は順調であると考えられるから。糖尿病や肥満は心血管疾患やがんなど生命予後や生活の質(QOL)に関連する様々な疾患のリスクを上昇させることが示されている。そして、糖尿病や肥満は世界中のあらゆる世代で増加しており、日本を含め世界中でその対策を講じることが急務である。さらに、これからの高齢化社会においても、糖尿病や肥満の対策は心血管疾患だけでなくがん、心不全、認知症へ大きな影響を与えることから、ますます重要性が高まると考えられる。本研究は、糖尿病・代謝性疾患や肥満の病態解明及び克服のための探索的研究である。既存の大規模データベースを利用し、心血管疾患だけでなく、がん、心不全、認知症などの増加傾向にある重要疾患に対する予後改善を目指し、研究を続けていく必要がある。現在までに重要な臨床的知見を順調に論文化し、毎年報告している。また、腸内細菌や終末糖化産物などの専門的生体試料や持続血糖モニターなどの専門的臨床情報を用い、糖尿病・代謝性疾患や肥満の病態を明らかにすることも目的の一つであり、さらに研究を進めていく予定である。

既存の大規模データベースを利用し、心血管疾患だけでなく、がん、心不全、認知症などの増加傾向にある重要疾患に対する予後改善を目指し、研究を続けていく必要がある。現在までに重要な臨床的知見を順調に論文化し、毎年報告している。また、腸内細菌や終末糖化産物などの専門的生体試料や持続血糖モニターなどの専門的臨床情報を用い、糖尿病・代謝性疾患や肥満の病態を明らかにすることも目的の一つであり、さらに研究を進めていく予定である。
対人コミュニケーションにおける自走式椅子・机を用いた空間行動の誘導と対話支援

本研究では,複数人の対人コミュニケーションにおける対話中の非言語情報を計測・解析し,対話の状況(盛り上がり等)を自動的に推定する手法を検討した.その結果,3人会話および6人会話における場の盛り上がりを推定するモデルを構築した.そして,推定した状況に応じて,空間に自然に存在する机や椅子を自動的に動かして対話場に物理的に介入させることで,話者の空間行動(対人距離,向き,位置関係)を誘導し,対話の活性化を図るシステムを検討し,実際に話者の動きが誘発されることと,会話空間の印象が変化することなどを明らかにした.本研究では,複数人の対人コミュニケーションにおける対話中の非言語情報を計測・解析し,対話の状況(盛り上がり等)を自動的に推定する手法を検討する.そして,推定した状況に応じて,空間に自然に存在する机や椅子を自動的に動かして対話場に物理的に介入させることで,話者の空間行動(対人距離,向き,位置関係)を誘導し,対話の活性化を図るシステムを検討する.23年度は,複数人対話状況の推定モデルの検討と,自走式椅子・テーブルトップディスプレイの試作を行った.推定モデルに関しては,対話中の非言語情報をセンサにより取得し,対話中または対話後に行われたアンケート評価値との関連を詳細に調査した.具体的には,重回帰分析によりその両者の相関を解析し,非言語情報を用いて対話状況を数値的に推定するモデルを構築した.そして,過去に提案されているモデルとの差異や精度について検証した.その成果の一部は24年度に論文誌と掲載された.24年度は主に自走式テーブルトップディスプレイの試作・開発およびアプリケーションシナリオの検討を行った.自走式テーブルトップディスプレイは,コンピュータプログラムにより前進,後退,回転を無線にて制御されるものであり,二個実装した.それらを複数人対話のシーンへ導入し,提案システムを対話場に介入させた場合とそうでない場合をアンケートにより比較・評価した.特に会話場への侵入や,動的コンテンツの移動による表示,複数の会話場の結合などを実験的に評価し,提案システムによる情報提示の認知度,対話活性度,対人距離などの空間行動変化などについてデータを収集した.その結果,提案システムにより,なめらかに会話場を変化させることができ,有意に人の空間行動に作用することが明らかになった.本研究では,複数人の対人コミュニケーションにおける対話中の非言語情報を計測・解析し,対話の状況(盛り上がり等)を自動的に推定する手法を検討した.その結果,3人会話および6人会話における場の盛り上がりを推定するモデルを構築した.そして,推定した状況に応じて,空間に自然に存在する机や椅子を自動的に動かして対話場に物理的に介入させることで,話者の空間行動(対人距離,向き,位置関係)を誘導し,対話の活性化を図るシステムを検討し,実際に話者の動きが誘発されることと,会話空間の印象が変化することなどを明らかにした.本研究では,複数人の対人コミュニケーションにおける対話中の非言語情報を計測・解析し,対話の状況(盛り上がり等)を自動的に推定する手法を検討する.そして,推定した状況に応じて,空間に自然に存在する机や椅子を自動的に動かして対話場に物理的に介入させることで,話者の空間行動(対人距離,向き,位置関係)を誘導し,対話の活性化を図るシステムを検討する. 23年度は,複数人対話状況の推定モデルの検討と,自走式椅子・テーブルトップディスプレイの試作を行った.推定モデルに関しては,対話中の非言語情報をセンサにより取得し,対話中または対話後に行われたアンケート評価値との関連を詳細に調査した.具体的には,重回帰分析によりその両者の相関を解析し,非言語情報を用いて対話状況を数値的に推定するモデルを構築した.そして,過去に提案されているモデルとの差異や精度について検証した.また,自走式椅子・テーブルトップディスプレイの試作・開発に関しては,今年度は自走式テーブルトップディスプレイの開発を先に行い,その評価に重点を置いた.玩具を改造することで簡易な自走式テーブルトップディスプレイを製作し,前進,後退,回転を無線にて制御した.それを複数人対話のシーンへ導入し,提案システムを対話場に介入させた場合とそうでない場合をアンケートにより比較・評価した.アンケート評価では,提案システムによる情報提示の強度とその認知度,対話活性度,対人距離などの空間行動変化などについてデータを収集した.その結果,提案システムを用いて自走型テーブルトップディスプレイを対話場に介入させると,対話に対して強く,かつ行動を誘発するような刺激を与えることが確認できた.また,アンケートや観察結果に基づき,対話の誘導や活性化の可能性を示唆する知見を得た.23年度は,複数人対話状況の推定モデルの検討と,自走式椅子・テーブルトップディスプレイの開発を行う予定であった.推定モデルに関しては,対話実験中の非言語情報のセンサ値と,アンケート評価値との関連を重回帰分析により調査した.対話場を推定するための数理モデルであり,個人差などに伴うロバスト性などに課題は残すものの,対話状況の相対的変動は十分に検出できる結果がでており,本研究課題の目標である自走式椅子とテーブルトップディスプレイを用いた対話支援システムへ応用できる段階にあると考えられる.自走式椅子・テーブルトップディスプレイの試作については,テーブルトップディスプレイの開発が進み,玩具を改造した簡易システムと,十分な移動精度と速度を確保した実システムの2つの開発を終えている.また,簡易システムを用いて,実際に被験者による予備的評価実験を実施し,その効果を検証することができている.自走式椅子についても,安全性の確保のための検証段階であり,上記のテーブルトップディスプレイと同様のモーター制御機構を利用したシステム構築の準備が整っている段階である.

したがって,概ね順調な進展であると言える.24年度には,23年度に開発した対話状況推定モデルと試作した自走式椅子・テーブルトップディスプレイを活用して,対話支援システムの開発を行う.男女を含む複数人(3人以上)による親睦を深める場(パーティ等の一集団)を想定し,システムの実装を行う.対話状況の検出に関しては,推定モデルによる対話の盛り上がり変動とその時間変化,位置センサによって取得できる対話グループの構成とその分布,外れメンバの有無などを中心に扱う.これらの値に基づき,自走式椅子とテーブルトップディスプレイを用いて対話空間の演出および対話支援を検討する.好ましい空間行動の定義は様々に存在するが,ここでは大きな目的として,対話空間における,単位時間あたりの話者間での情報伝達量(発話,頭部方向,ジェスチャの向き等)ができるだけ大きくかつ複数人に対して均等になるような状況を目指して,自走式の椅子とテーブルトップディスプレイの動作を決定する.例えば,椅子の提供と回収で,対話の流れやテンポなどを制御することや,椅子を自動的に移動,回転させることでユーザの視点や視界を変えることなどを計画している.さらに,自走式テーブルトップディスプレイの提供と回収により,人の立ち位置やグループの再構築などを促すことも考えている.なお,開発の進度と計画を考慮し,椅子は2つ,テーブルトップディスプレイ1つの環境で支援システムを構築する予定である.その後,アンケート主体の実験を被験者同意の上に実施し,システムの有効性を評価する.24年度は,23年度に試作した自走式椅子・テーブルトップディスプレイの改良を行う必要があり,その予算を計上する.装置の大部分は継続して利用するが,被験者実験に向けて安全性などを高めるために,ハードウェアのチューニングに加えて,位置の計測部やソフトウェアに関してさらなる改良を行う.また,23年度および24年度の研究成果を国内・国外学会で発表するための旅費および印刷費等を計上している.
高等真核生物におけるDNA複製阻害遺伝子の単離

DNA複製阻害点(RFB)とはDNA複製の進行を阻害する配列で、大腸菌からヒトの細胞に至る生物種で見いだされている。真核細胞でRFBはリボソームRNA反復遺伝子(rDNA)に存在し、出芽酵母での研究で、その活性には130bpからなる配列とそこに結合すると考えられる複製阻害タンパク質(Fob1p)が必須であることが見出された。RFBの生理機能としては、組み換えのホットスポットとして働いて、rDNAのコピー数の維持や老化と言った重要な生理機能に関係している。本年度は当初の研究計画の一つに挙げられていたように、Fob1pの主としてコンピュータによる解析を行ない、興味深い事実を得たので報告する。まず1次構造でFob1pと相同性のあるタンパク質は昨年度の報告にあるように出芽酵母の近縁種でのみ見つかった。そこで次に2次構造を予測し、それとの類似性を検索したところ、レトロウイルスのIntegraseが見つかってきた。Integraseはウイルスがホストのゲノムに挿入する時に働く酵素で、Fob1pに期待されるDNA結合と切断活性を有する。Integraseは主に2つのドメインを持ち、1つはZn-フィンガーモチーフでこれによりDNAと結合する。Foblpにもこのモチーフは保存されており、これを塩基置換で破壊すると、Fob1の完全欠損株と同じ表現型を示すことから、Zn-フィンガーモチーフはFob1pの機能に必須であることが示唆された。もう一つはDNAの切断反応を行なうドメインでその活性中心となるアスパラギン酸もFob1pで保存されている。現在同様の塩基置換実験を実行中である。本申請研究は今年度を持って終了するが、今後は上述のようにFob1pの生理活性が予測できたので、その精製を行ない、生化学的な解析を中心に進めていく予定である。DNA複製阻害点(RFB)とはDNA複製フォークの進行を阻害する配列で、大腸菌からヒトの細胞に至るほとんどすべての生物種で見いだされている。真核細胞でRFBはリボゾームRNA反復遺伝子(rDNA)に存在し、報告者らの出芽酵母を用いた研究で、その活性には約100bpからなる配列とそこに結合すると考えられる複製阻害タンパク質(Fob1p)が必須であることが見出されている。今までの所、RFBは組み換えのホットスポットとして機能し、rDNAのコピー数の維持や細胞の老化と言った重要な働きに関係していることが判っている。rDNAの基本的な構造は酵母からヒトの細胞に至るまで保存されており、RFBの生理的な機能も類似していると予想される。そこで高等真核細胞における複製阻害遺伝子を単離し将来的にはそのノックアウト生物を作成しRFBの生理的機能を解明することが本申請研究の目的である。本年度は、近縁種である分裂酵母でのFOB1ホモログ遺伝子の単離を試みた。ところがおそらく組み換えメカニズムの相違により、出芽酵母でFOB1遺伝子を単離するために用いた遺伝学的手法では期待どおりの結果がでなかった。そこで出芽酵母と同属にあたる4種について、サザン解析とPCR法を用い、FOB1ホモログ遺伝子の単離試みた。その結果、それらの菌からアミノ酸レベルで90%以上の高い相同性を示すFOB1ホモログ遺伝子を同定した。さらに今年度更新されたデータベースの検索により、別種の酵母Kluyveromyces属2種でFOB1ホモログと思われる遺伝子を発見した。これら遺伝子はFOB1とアミノ酸レベルで局所的に約50%の相同性を有している。現在その保存された領域を元に、構造と一次配列の両面からさらなるデータベースの検索を行なっている。
膵β細胞における糖毒性の分子機構-デイファレンシャルディスプレイ法による解析-

膵β細胞では複雑なシグナリングネットワークが形成されており、そうしたシグナリングの結果としてインスリン分泌が制御されていることが明らかになった。そしてブドウ糖の膵β細胞刺激作用の分子基盤ついて重要な知見が多く得られた。糖毒性の関連では自然発症糖尿病モデル動物であるGK ratで高濃度ブドウ糖はむしろ膵β細胞をprimingしていることが判明し、従来考えられていたように、高濃度ブドウ糖は常にβ細胞毒性に作用するとは限らないことが明らかとなった。またヒトでの高濃度ブドウ糖による膵β細胞毒性の典型的な例と考えられるケトーシス発症2型糖尿病についてはその一般的な臨床型を確立した。また発生工学的手法で得られたIRS-1、β細胞グルコキナーゼ、GPシャトルなどの欠損動物のβ細胞シグナリングの特徴を明らかにした。KATPチャネル非依存性のブドウ糖作用に関しては、ミトコンドリア代謝に由来するシグナルと解糖系上流に由来するシグナルとのsynergismが重要であること、脂質メッセンジャー/protein acylationが重要性であること、GTPの関与などを新たに確立した。また単一ラ氏島からのインスリン分泌のoscillationが必ずしも細胞内カルシウムのoscillatoryな変動に同期しておこるのではないことも証明した。こうしたことから、β細胞でのブドウ糖によるインスリン分泌刺激は単一のシグナルの変動がインスリン分泌の大部分を決定する、といった単純な機構でなく、「個々に変動した場合は必ずしも強力なインスリン分泌刺激をもたらさない多数のシグナル」が同時に変動することで、いわゆる2相性の正常なインスリン分泌が起こるのではないか、との作業仮説に到った。今後この方向で研究を継続する方針である。これらの成果を別紙サマリーにあるとおり、14の論文、12の書籍の分担執筆にて発表した。膵β細胞からのインスリン分泌のメカニズムについて精力的に研究を続行した。特にブドウ糖毒性について、自然発症糖尿病モデル動物(Goto-Kakizakiラット)やトランスジェニックの手法で作製した糖尿病モデル動物(膵グルコキナーゼとIRS-1のダブルノックアウトマウス)について新たな知見が数多く見いだされた。前者においては出生直後から高血糖の出現するNIDDMモデルであるが、β細胞に内在するブドウ糖感知機構の障害あると考えられている。この動物でインスリン治療前後にβ細胞機能を詳細に検討したところ、インスリン治療によって血糖が下がるとむしろβ細胞機能が抑制されることがわかった。驚くべきことにこうしたインスリン治療後にはβ細胞のインスリン含量も減少していた。結論として、このようにβ細胞のブドウ糖認知機構そのものに障害が生じた状態では、高濃度ブドウ糖は糖毒性というよりはむしろβ細胞刺激性に作用しているものと考えられた。また我々が見いだした膜のイオン透過性と関係のないブドウ糖作用は高血糖が持続する動物から得られたβ細胞でも正常に作働することも判明した。後者のトランスジェニックマウスではNIDDMがpolygenicな疾患であることを実験動物のレベルではあるが世界で初めて科学的に実証することができた。一方従来糖毒性に曝されたβ細胞の機能を回復させるとされているcAMPのβ細胞での作用点についても、ブドウ糖との協調作用でインスリン分泌のシグナリングのdistalの部分に作用するのが主たる役割であることが判明した。こうした事実に基づいて糖毒性の分子機構の解明に向けてさらに研究を進めて行く予定である。1)膵β細胞からのインスリン分泌機構について新たに以下の事実を明らかにした。i)サイクリックAMP(cAMP)の膵β細胞での新しい作用機構cAMPはインスリン分泌を強力に増強するがそのメカニズムは従来ブドウ糖のionic actionの増強と考えられていた。しかし、我々はcAMPがブドウ糖(栄養物)のない状態ではCa2+によって惹起されたインスリン分泌を全く増強しないことを見出した。

この現象を詳細に検討した結果、cAMPはブドウ糖のnon-ionic actionとのsynergismでインスリン分泌を増強することが明らかとなった(Diabetes,in press)。ii)脂肪酸によって形成される細胞内シグナルのインスリン分泌への関与従来からβ細胞内でのlong chainacyl CoAの蓄積がインスリン分泌刺激に関与する、という仮説が提唱されていたが、実際にインスリン分泌がこの経路によって刺激される、という事実が証明されていなかった。我々はβ細胞をパルミチン酸とともにインキュベーションするとインスリン分泌機構が賦活化されることを初めて証明した(Diabetes,in press)。iii)膵ランゲルハンス島の機能的多様性膵臓内には10万個から100万個のランゲルハンス島があり、これまでははっきりした根拠のないままに個々のラ氏島のレベルでインスリン分泌能には大きな違いがないものと見なされてきた。我々は初めて単離した個々のラ氏島からのインスリン分泌を系統的に測定することに成功し、著しい多様性があることを明らかにした(Diabetologia 41:A149,1998)。膵β細胞からのインスリン分泌のメカニズムについて精力的に研究を続行した。特にFFAによるインスリン分泌刺激機構について新たな知見が得られた。いわゆるブドウ糖のKATPチャネルを介さないインスリン刺激機構の細胞内シグナルの一部が細胞内の長鎖acyl-CoAの蓄積であることを示した。この結果を踏まえ、ブドウ糖から長鎖acyl-CoAへの代謝の律速段階であるacetyl CoA carboxylaseをアンチセンスオリゴを用いて選択的に低下させたINS-1細胞について検討してみたが、十分なデータの蓄積が得られなかった。また膵β細胞内でのcAMPのインスリン活性化機構がブドウ糖のnon-ionic actionとのinteractionによることを報告した。これらとは別に膵β細胞のNADHシャトル系の機能的役割をノックアウトマウスを用いた実験で証明した。また肥満をともなった2型糖尿病のモデル動物であるOLETFラットのβ細胞機能についてはこれまでの申請者らの成績を中心に書物としてまとめて報告した。一方ヒトでの糖毒性の最も代表的な例である急性ケトーシス発症糖尿病患者については長期予後を解析し、適切な初期治療が極めて良好な長期予後に結びつくことを見いだし報告した。こうした事実はブドウ糖によるインスリン分泌過剰刺激(糖毒性)の臨床的側面、実験動物での現れ方、細胞、および細胞内でのメカニズムを解明する上で重要な手がかりを与えた。もっとも重要な点はβ細胞がブドウ糖によって刺激された状態で活性化される細胞内シグナルのこれまでに不明であった部分がかなり解明されたことである。今後これらの分子基盤を発生工学の手法を用いて検討する予定である。
サケ白子由来DNAと骨芽細胞シートの併用による骨形成促進効果の検討

現在まで、我々は骨再生スカフォールドとして生体侵害性がなく、賦形性及び生体分解性を有する人工材料としてサケ白子から抽出したDNAによるDNAスキャホールドを作製し、この新規DNAスキャホールドの生体適応性と新生骨再生の促進効果について報告した。(Katsumata et al., 2015; Matsumoto et al., 2019)しかしながら、臨床応用を考えると高齢者や有病者の顎骨再建は治癒期間の遅延や感染リスク増大などの問題点があり、再生治癒期間を可能な限り短くする必要性がある。既に、骨芽細胞による細胞シートの形成を確立しており、より臨床応用性が高い脱分化脂肪(DFAT)細胞の使用出来ると考えた。この細胞は、高い増殖能と間葉系幹細胞様の多能性を示すことが報告されている。既に、我々のグループではDFATの培養法は確立しているため、下顎骨欠損ラットを作成しDFAT細胞自身の新生骨再生能を検討した。この結果、現在既に細胞療法として頻用されている脂肪細胞由来幹細胞(ASC)と比較してDFAT細胞はin vitroにおいて同程度の骨分化能を示した。又、老齢(6ヶ月齢)ラット下顎骨欠損モデルを用いた細胞移植では、コントロール(スキャホールド単独)群及びASC (スキャホールド+ASC)移植群と比較してDFAT移植群(スキャホールド+DFAT)が移植後3ヶ月において有意に新生骨形成率が増加した。さらに、有病者モデルとして卵巣摘出による骨粗鬆症モデルラットを用いて同様なin vivoにおける下顎骨再生能を検討したところ、やはり、DFAT移植群が最も新生骨再生能が増加していた。以上の結果より、DFAT細胞を用いた細胞移植はASCと共に自家細胞移植療法として将来有用で有り、これらを細胞シート形状として用いることでより迅速な治癒促進効果が望めることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。【目的】顎骨再建の臨床応用には、高齢者や有病者における治癒期間の遅延や感染リスク増大などの問題点があり、骨再生治癒期間を可能な限り短くする必要性がある。我々はサケの白子より抽出したDNAを素材としたDNAスキャホールド開発し、このDNAスキャホールドは、加齢マウスの頭蓋骨欠損部において新規骨形成を亢進する新規の骨伝導性を持つことを報告した。本研究は、骨このDNAスキャホールドと共に治療用細胞を併用することで更に骨再生治癒期間の短縮をもたらすと考えた。そこで、骨芽細胞を治療用細胞として用い、細胞外基質が存在し、生体に近い細胞シートとして適用して骨再生促進効果について下顎骨欠損モデルを用いて検証することを目的とした。【方法】マウス骨芽細胞株MC3T3-E1細胞を細胞シート作成用ディッシュ(アップセル社製)に播種する。細胞がコンフルエントになったら培地を吸引し、骨分化誘導培地にて分化誘導を行う。又、リン酸イオンの骨分化生成に及ぼす効果について検討する。【結果と考察】マウス骨芽細胞を用い、細胞密度を変化させて細胞シートの作成を検討した。この結果、1x104 cell/cm2の播種密度で細胞シート作成ディッシュ(アップセル社製)を使用して一層の細胞シートが形成できた。さらに、このシートを層状に重ね合わせることも可能であった。さらに、骨分化過程におけるリン酸イオンの効果を検討したところ、リン酸イオンの添加により相乗的に骨分化関連分子の発現が有意に増加した。これらの結果を基礎として、来年度はまずラット下顎骨欠損部モデルを作製し、DNAスキャホールドとこの細胞シートを併用させ埋入し、経時的な骨再生効果について比較検討する。1)骨芽細胞株を用いた細胞シートの作製や維持方法の確立、細胞シートをDNAスキャホールド表面に層状にコーティングする方法を確立する。→骨芽細胞を用いた細胞シートの作製方法は取得できたが、細胞シートをDNAスキャホールド表面に層状にコーティングすることが困難であったため、DNAスキャホールド上に細胞シートを置き、マウスの頭蓋骨欠損モデルにおける骨化の亢進を検討している。2)マウスを用いて頭蓋骨欠損部モデル各々の欠損部にDNAスカフォールド及び骨芽細胞の細胞シートを移植し骨形成の促進効果を検討する。さらに、既存骨補填材(コラーゲンやポリ乳酸)と組み合わせた場合についても比較する。→現段階ではDNAスキャホールド単独とDNAスキャホールド+骨芽細胞シートのものの比較検討しか行えておらず、母体数を増やし、リン酸や他の材料との比較検討が必要である。

この結果、現在既に細胞療法として頻用されている脂肪細胞由来幹細胞(ASC)と比較してDFAT細胞はin vitroにおいて同程度の骨分化能を示した。又、老齢(6ヶ月齢)ラット下顎骨欠損モデルを用いた細胞移植では、コントロール(スキャホールド単独)群及びASC (スキャホールド+ASC)移植群と比較してDFAT移植群(スキャホールド+DFAT)が移植後3ヶ月において有意に新生骨形成率が増加した。さらに、有病者モデルとして卵巣摘出による骨粗鬆症モデルラットを用いて同様なin vivoにおける下顎骨再生能を検討したところ、やはり、DFAT移植群が最も新生骨再生能が増加していた。以上の結果より、DFAT細胞を用いた細胞移植はASCと共に自家細胞移植療法として将来有用で有り、これらを細胞シート形状として用いることでより迅速な治癒促進効果が望めることが示唆された。自身を含めたいくつかの報告によりリン酸の存在が骨分化を促進することが明らかであるため、リン酸を添加した細胞シートも作製して、リン酸の存在で作成したシートに新規骨分化や基質形成能に差があるかどうか比較検討する。DNAスキャホールドと骨芽細胞シートの併用方法について再度検討する。マウス頭蓋骨欠損モデルにおいても健常マウスのみでなく老化マウスや糖尿病マウス、骨粗しょう症マウスを用いた骨化亢進の速度の差について比較検討を行って行く。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
マルチプロセッサ上での高エネルギー物理実験用データ解析システムの研究

並列処理システムの開発は、高エネルギー物理学研究所で準備が進行しているBファクトリー実験を対象として行われた。本システムの開発には共有メモリ型の並列計算機システムが必要であったが、Bファクトリー実験に参加している東京工業大学にこのタイプの大規模なシステムが存在したので、これを利用して開発を行った。開発は東京工業大学の協力で順調に進み、当初目的としたシステムの開発を完了することができた。このシステムは、高エネルギー実験のデータがイベント単位で独立しているという特徴を生かして、各々のイベントデータを異なるCPUに並列処理させるものである。それぞれの処理はUNIX上の複数のprocessとしておこなわれ、その間のデータの受け渡しを共有メモリを用いて行う構造になっている。入力データファイルを集中的に扱いイベント処理を行う複数のプロセスに別々のイベントをわたすevent server、処理されたデータを集め一つのファイルにまとめるoutput server、複数のイベント処理プロセスで別々に蓄積されるヒストグラムをまとめるhistogram process、モンテカルロ法を使ったsimulationを並列処理で行う場合に一貫した乱数のシ-ドを供給するためのseed server、それぞれのイベント処理プロセスからの出力を総合するI/O serverなどを順次開発し、全体の動きを統括するprocess controlプログラムからこれらのサーバーと複数のイベント処理プロセスを生成し協調して動作させることに成功した。このシステムは多くの異なった計算機システムでも変更なく動作するように構築され、実際に多くの計算機でテストされ動作することが証明された。さらにこのシステムの上で現在Bファクトリー実験で使用されている種々のソフトウェアを動作させることに成功し、これを用いて多くの異なった計算機の上で、実際に実験に使用する場合に近い条件下で、期待された性能が達成できることが確認された。この結果は高エネルギー物理実験での計算機利用についての国際会議であるCHEP95で発表された。
2-アザアリルラジカルカチオンと多重結合性分子との付加環化反応の創出

1ジアミン誘導体に光増感触媒を添加し光照射を行ったところ、2-アザアリルラジカルカチオンもしくはその等価体が発生後ニトロンと[3+3]光付加環化を起こし新規オキサジアジナンが得られた(収率22%-65%)。NMRによる反応追跡を行なった結果、中間体が観測され構造を精査したところ想定している化学種が発生していることは確実であった。反応量子収率算出にも成功し熱的なラジカル連鎖機構の関与はないことが分かった。2-1:1の反応について全14例の実施例を示すことができた。(論文執筆中)2-2:多重結合性分子としてα,β-不飽和化合物を用いると[3+2]光付加環化反応が進行しγ-ラクタム誘導体が得られ(NMR収率50%-80%、単離収率4%-29%)全5例の実施例を示すことができた。本反応を用い抗うつ薬および慢性疼痛治療薬前駆体の短工程合成を達成した。(論文執筆中)2-3:多重結合性分子としてイミンも用いると[3+2]光付加環化反応が進行し新規イミダゾリジン誘導体を複数合成できた。既に反応条件の最適化が完了しており基質一般性を検証中である。(H31年内論文報告予定)2-4:多重結合性分子としてアルデヒドも用いることもできたが、もう少し精査が必要である。3北里大学理学部との共同研究において、CV、DPV、電解反応、消光実験を行いその結果をもとに2-1の反応を共著で論文を執筆中である。工学院大学教育推進機構との共同研究では、ラジカルの反応性に関する理論計算を行いその結果をもとに2-1の反応を共著で論文を執筆中であり、本研究課題と関連するアルケンの[2+2]光付加環化反応の論文を1報共著で報告済、1報共著で投稿済である。2-2、2-3の反応についても、共著の準備を進めている。4新規光増感剤を創出し、1、2-1、2-2、2-3の反応の発展と応用および新展開としてその他の新奇光反応を開発できた。1ニトロンとの形式的[3+3]光付加環化では、有機合成実験、分光実験の結果を合わせて考え反応機構を提示できるだけの結果を得ることができた。しかし2-アザアリルラジカルカチオンもしくはその等価体のどちらが発生しているのか、もしくは両者が同時に発生しているのかは直接的に証明できていない。2多重結合性分子の反応部位として、炭素-窒素二重結合2種類、炭素-炭素二重結合1種類、炭素-酸素二重結合1種類、合計4種類の多重結合との反応に成功し様々な複素環の新規合成法を開発できた。また得られた複素環のうち新規化合物である割合が高かった。3共同研究について、得られた成果を共著として報告できる状態にすることができた。また、共同研究者の人的ネットワークに入ることができ、異分野の研究者との議論を交わす機会を得ることができた。4新規光増感剤は緩和な条件で反応を行うことができるため、原料の分解を抑え抗うつ薬および慢性疼痛治療薬前駆体の短工程合成を達成することができた。1ニトロンとの形式的[3+3]光付加環化において、レーザー分光分析による過渡吸収スペクトルの測定を行い、2-アザアリルラジカルカチオンもしくはその等価体のどちらが発生しているのか、もしくは両者が同時に発生しているのかを直接的に証明する必要がある。同時に、理論計算による反応経路のシミュレーションも必要である。2多重結合性分子として、アルデヒド(C=O結合)、ケトン(C=O)、ニトリル(C≡N)、チオカルボニル(C=S)などと反応させバリエーションを増やす必要がある。3共同研究について、一つでも多くの成果を共著論文として報告するためにさらに密な連携をはかる。共同研究者の人的ネットワークに積極的に入り、本研究の異分野への展開に挑戦する。4新規光増感剤を用いる反応について、医薬品候補化合物の創製に応用する。(H31年内論文報告予定)

2-4:多重結合性分子としてアルデヒドも用いることもできたが、もう少し精査が必要である。3北里大学理学部との共同研究において、CV、DPV、電解反応、消光実験を行いその結果をもとに2-1の反応を共著で論文を執筆中である。工学院大学教育推進機構との共同研究では、ラジカルの反応性に関する理論計算を行いその結果をもとに2-1の反応を共著で論文を執筆中であり、本研究課題と関連するアルケンの[2+2]光付加環化反応の論文を1報共著で報告済、1報共著で投稿済である。2-2、2-3の反応についても、共著の準備を進めている。4新規光増感剤を創出し、1、2-1、2-2、2-3の反応の発展と応用および新展開としてその他の新奇光反応を開発できた。1ニトロンとの形式的[3+3]光付加環化では、有機合成実験、分光実験の結果を合わせて考え反応機構を提示できるだけの結果を得ることができた。しかし2-アザアリルラジカルカチオンもしくはその等価体のどちらが発生しているのか、もしくは両者が同時に発生しているのかは直接的に証明できていない。2多重結合性分子の反応部位として、炭素-窒素二重結合2種類、炭素-炭素二重結合1種類、炭素-酸素二重結合1種類、合計4種類の多重結合との反応に成功し様々な複素環の新規合成法を開発できた。また得られた複素環のうち新規化合物である割合が高かった。3共同研究について、得られた成果を共著として報告できる状態にすることができた。また、共同研究者の人的ネットワークに入ることができ、異分野の研究者との議論を交わす機会を得ることができた。4新規光増感剤は緩和な条件で反応を行うことができるため、原料の分解を抑え抗うつ薬および慢性疼痛治療薬前駆体の短工程合成を達成することができた。1ニトロンとの形式的[3+3]光付加環化において、レーザー分光分析による過渡吸収スペクトルの測定を行い、2-アザアリルラジカルカチオンもしくはその等価体のどちらが発生しているのか、もしくは両者が同時に発生しているのかを直接的に証明する必要がある。同時に、理論計算による反応経路のシミュレーションも必要である。2多重結合性分子として、アルデヒド(C=O結合)、ケトン(C=O)、ニトリル(C≡N)、チオカルボニル(C=S)などと反応させバリエーションを増やす必要がある。3共同研究について、一つでも多くの成果を共著論文として報告するためにさらに密な連携をはかる。共同研究者の人的ネットワークに積極的に入り、本研究の異分野への展開に挑戦する。4新規光増感剤を用いる反応について、医薬品候補化合物の創製に応用する。
有機金属活性種の構造と物性

本研究班では前年度にひきつづき化学的に反応活性な有機金属分子について,基礎的な研究を推進して来た.以下に各々の班員の研究成果の大略を記す.共役ジエンの重合反応に触媒活性の大きい,有機チタンなどの活性種について分子軌道法により調べ,ジエンが金属と結合する場合の立体的及び電子的要因と結合後のジエンの反応性に及ぼす電子的効果を明らかにした(中村).ジシラニル鉄錯体の光反応で生ずるシリレン型錯体について,その構造と反応経路に及ぼす立体的及び電子的要因を調べ反応機構を確定した(荻野).反応性の高い遷移金属ケテン錯体を新たに合成し,その構造と反応性を調べ,新型の複核ビニルアルコール錯体をはじめて単離,その構造と物性を調べた(宮下).高度に反応活性な各種のシリレン分子を高真空中で発生し,マイクロ・ウェーブ精密分光法によりそれらの分子構造を精度良く決定した(広田).金属表面の触媒作用の中心となる有機金属活性種のモデルとして2核ロジウム錯体をとりあげ,架橋しているCH2と末端のCH_3基の間の結合生成プロセスをab initio法にて精密に検討し,最も重要な遷移状態での金属とC2-H_5基の独得の相互作用がはじめて理論的に示された(諸熊).反応活性が非常に高く,ジエンの反応で触媒作用を示すチタン・ジエン錯体, (C_5Me_5)TiX(diene),の内dieneとして, 1,4-ジフェニルブタジエン及び2,3-ジフェニルブタジエンを持つもののX線結晶解析を行い,フェニル基の影響により,チタンへのジエンの配位構造が全く異るという有機金属化学の基礎として重要な結果を得た(笠井).ニオブ及びタンタルの正八面体型6核クラスターのアルキル錯体を新たに各種合成し,それらの構造をX線解析によって調べ物性と反応性を調べた(斉藤).本研究班では前年度にひきつづき化学的に反応活性な有機金属分子について,基礎的な研究を推進して来た.以下に各々の班員の研究成果の大略を記す.共役ジエンの重合反応に触媒活性の大きい,有機チタンなどの活性種について分子軌道法により調べ,ジエンが金属と結合する場合の立体的及び電子的要因と結合後のジエンの反応性に及ぼす電子的効果を明らかにした(中村).ジシラニル鉄錯体の光反応で生ずるシリレン型錯体について,その構造と反応経路に及ぼす立体的及び電子的要因を調べ反応機構を確定した(荻野).反応性の高い遷移金属ケテン錯体を新たに合成し,その構造と反応性を調べ,新型の複核ビニルアルコール錯体をはじめて単離,その構造と物性を調べた(宮下).高度に反応活性な各種のシリレン分子を高真空中で発生し,マイクロ・ウェーブ精密分光法によりそれらの分子構造を精度良く決定した(広田).金属表面の触媒作用の中心となる有機金属活性種のモデルとして2核ロジウム錯体をとりあげ,架橋しているCH2と末端のCH_3基の間の結合生成プロセスをab initio法にて精密に検討し,最も重要な遷移状態での金属とC2-H_5基の独得の相互作用がはじめて理論的に示された(諸熊).反応活性が非常に高く,ジエンの反応で触媒作用を示すチタン・ジエン錯体, (C_5Me_5)TiX(diene),の内dieneとして, 1,4-ジフェニルブタジエン及び2,3-ジフェニルブタジエンを持つもののX線結晶解析を行い,フェニル基の影響により,チタンへのジエンの配位構造が全く異るという有機金属化学の基礎として重要な結果を得た(笠井).ニオブ及びタンタルの正八面体型6核クラスターのアルキル錯体を新たに各種合成し,それらの構造をX線解析によって調べ物性と反応性を調べた(斉藤).
動的イメージングによるRanvier絞輪内分子動態の解明

感覚や運動の高速な情報伝達の要となるのが有髄神経に存在するRanvier絞輪であり、その機能破綻は様々な病気の原因となりうると想定されている。本研究では、個体内においてRanvier絞輪を標識し、非破壊的に観察する手法を開発することで、Ranvier絞輪が異常時にどのように動的な変化するかを明らかにすることを目指した。特に、Ranvier絞輪を標識する蛍光プローブを開発し、本プローブをアデノ随伴ウイルスによりマウス脊髄軸索に発現させ、病態時のRanvier絞輪周辺の動的な変化を解析した。軸索における情報伝達の要であるRanvier絞輪周辺の分子動態が、異常時にどのように変化するかを生きた組織の中で可視化することが本研究の目的であり、それを通じて軸索の異常による病態の発症機構研究をさらに推し進めることを目指す。本年度は本研究目的を達成するための基盤技術の創出に従事し、主に以下に示す3点を達成した。(1) Ranvier絞輪が蛍光ラベルされたマウスの作成: Ranvier絞輪を蛍光ラベルするためのプローブを作成し、マウス脊髄への導入を試みた。アデノ随伴ウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行なうことでで脊髄軸索にまばらに目的遺伝子を発現させることを達成した。また、同時に細胞内Ca2+濃度、ミトコンドリア、細胞骨格などを可視化する蛍光プローブを発現させるアデノ随伴ウイルスベクターも作成し、こちらもマウスへの導入を試みている。(2)脊髄in vivoイメージング技術の確立:マウス脊髄においてin vivoイメージングを行なうための手術セットアップを作成した。特に脊髄の固定器具を作成し、これを用いてイメージングを行なうためのwindowの作成し、二光子励起顕微鏡を用いた画像の取得に現在取り組んでいる。(3)脊髄軸索の病態モデルの作成:脊髄軸索の病態モデルの誘導の条件検討を行なった。特に、遺伝子を導入したマウスにおいて多発性硬化症の実験モデルであるExperimental autoimmune encephalomyelitisの誘導に成功している。有髄神経の活動電位の伝導において要を成すRanvier絞輪の構造・構築が病態時のマウス個体内においてどのように変化するかを明らかにすることが本研究の目的であり、本研究を通じて軸索の異常による病態発症機構に関してさらなる理解を目指す。前年度は、マウス個体内においてRanvier絞輪を蛍光ラベルする手法の開発を行なうとともに多発性硬化症モデルであるExperimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)をマウスにおいて誘導する実験系の立ち上げを行なった。本年度は(1) Ranvier絞輪を蛍光ラベルしたマウス脊髄における軸索のトラッキング、(2)EAE誘導時のRanvier絞輪の構造変化の解析を行なった。(1)Ranvier絞輪を蛍光ラベルしたマウス脊髄における軸索のトラッキングRanvier絞輪が蛍光ラベルされたマウス脊髄を固定し、CUBIC法により脊髄を透明化し、ラベル化された軸索のトラッキングを試みた。広範囲に渡って連続的に3次元画像を撮影し再構成することで、3次元構造を保った組織において単一の有髄神経軸索の形態を1 mm以上の長さに渡ってトラックすることができた。(2)EAE誘導時のマウス脊髄において(1)の方法を適用し、解析を行なった。特にRanvier絞輪周辺部において形態異常が観察されるとともに、異常部位への細胞の集積が観察された。すなわち本結果は、Ranvier絞輪が病態時の有髄神経における異常発生開始部位である可能性を示唆する。今後本解析をin vivoイメージングに応用することで、形態異常や細胞の集積といった異常がどのような時系列で起こるかに関して詳細な解析を行なっていく予定である。当初の計画のうち、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてマウスの脊髄軸索に蛍光プローブを発現させることに関しては達成した。また、in vivoイメージングを行なうための固定具作成および手術法の確立にも取り組んだ。生きたマウスの脊髄からの画像の取得に何度か成功しており、現在成功率を増加させるべく手術法の改善に取り組んでいるところである。さらに、次年度に行なう予定であった脊髄の病態モデルの検討にも着手している。神経科学脊髄におけるin vivoイメージングの成功率を上げることが現在の課題である。具体的には、以下2点の問題を手術法の工夫により改善することで達成可能であると考えられる。(1)視野ずれを最小限に抑える。(2)手術部位の炎症を最小限に抑える。上記の問題を克服し、軸索Ranvier絞輪内分子動態のin vivoにおける可視化を世界に先駆けて達成したい。