hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遷移金属カルコゲニド錯体の特性を利用した新規メタラサイクルの合成と機能解明

水素分子を活性化するヒドロゲナーゼは、2つの鉄またはニッケル-鉄がチオラートで架橋された構造をとっており、その酸化還元によって水素分子とプロトン間での変換反応を触媒し、嫌気性細菌のエネルギー代謝に重要な役割を果たしていることが知られている。我々は、高周期14族元素であるゲルマニウムと種々の遷移金属がカルコゲン原子で架橋された錯体の構造や反応性を検討し、ゲルマニウムビスカルコゲノラート[Dmp(Dep)Ge(S)(OH)]^-が配位したカチオン性ルテニウム-ゲルマニウム2核錯体がヒドロゲナーゼ様の反応を行うことを見いだした。本錯体と水素を反応させると、水の脱離とともにゲルマニウム-ルテニウム問に架橋ヒドリドを有するカチオン性錯体が定量的に得られた。架橋ヒドロキシル基を鍵とするこのような水素分子活性化反応はこれまで例がなく、興味深い。また本反応は可逆であり、得られた架橋ヒドリド錯体に水を加えて加熱すると水素の発生とともに再び架橋ヒドロキシ錯体が生成した。架矯ヒドリド錯体のヒドリド配位子は酸性度が高く、塩基を加えると脱水し、中性の複核錯体が得られた。この反応も可逆であり、この錯体にH(Et_2O)BAr^F_4を作用させると定量的に架橋ヒドリド錯体が生成した。すなわち、架橋ヒドロキシル基を有する錯体は最終的に水素分子を2つのプロトンに変換したと考えられ、先に述べたヒドロゲナーゼ反応のモデルとして、これまで提唱されていないタイプの反応機構をを示唆する結果を与えた。以上のように、カルコゲン架橋ゲルマニウム-ルテニウム複核錯体は、pHと水素および水の濃度で相互変換する系であり、環境によって反応性を変化させる酵素反応のモデル、特にヒドロゲナーゼのモデル反応として極めて興味深い。遷移金属錯体を反応剤または触媒とするアルケンおよびアルキンの環化カップリング反応は、複雑な環状化合物を選択的に合成するもっとも有用な方法である。本研究では、遷移金属と錯形成しやすい硫黄原子をヘテロ原子として導入したアルキンチオラートSC≡CRに着目し、これまでにジルコニウムやニッケル錯体を合成し、それらのアルキンチオラート部位がカップリング反応をすることを見いだしている。そこで、後周期遷移金属であるロジウムおよびイリジウムのビスアルキンチオラート錯体の合成およびカップリング反応を検討した。アルキンチオラートのアルカリ金属塩MSC≡CR(M=Li,Na)とCp^*Rh(PPh_3)Cl_2の反応によって目的のビスアルキンチオラート錯体Cp^*Rh(PPh_3)(SC≡CR)_2(R=Ph(1a),^tBu(1b),SiMe_3(1c),C≡CPh(1d))をそれぞれ高収率で合成した。同様にイリジウムビスアルキンチオラート錯体Cp^*Ir(PPh_3)(SC≡CPh)_2(2)を収率96%で得た。ロジウム錯体1aおよびイリジウム錯体2をトルエン中で加熱したところ、C≡C結合の分子内カップリング反応が進行しメタラシクロペンテンジチオン錯体がほぼ定量的に生成した。カップリング生成物3のメタラサイクル部位はリチウムナフタレニドおよびヒドリド還元剤によって容易に還元を受け、メタラシクロペンタジエン錯体Cp^*M(PPh_3){κ^2(C,C)-C(SH)=CPh-CPh=C(SH)} (M=Rh(4a),Ir(4b))が得られた。錯体1aの速度論的解析より、カップリング反応は分子内で進行していることを確認した。また、このメタラサイクルは高い求核性も示し、メチルトリフラートとの反応ではベンゾチオフェンを含む3種の錯体が生成した。

以上のように、カルコゲン架橋ゲルマニウム-ルテニウム複核錯体は、pHと水素および水の濃度で相互変換する系であり、環境によって反応性を変化させる酵素反応のモデル、特にヒドロゲナーゼのモデル反応として極めて興味深い。
自発発火のタイミングが決定する樹状突起の接続特異性

嗅覚系において、嗅球における特異的回路形成がにおい認識の要である。僧帽細胞が生後発達期に主樹状突起の刈り込みを介して1つの糸球体へのシナプス接続を行うことは知られており、以前に僧帽細胞の自発神経活動が樹状突起の刈り込みに必要であることを示したが、自発神経活動の実態については明らかでなかった。そこで本研究では生体あるいは単離した嗅球を用いてカルシウムイメージングを行い、発達に従って、同期的な自発神経活動が糸球体特異的なパターンへと変化することを明らかにし、イオンチャネル型グルタミン酸受容体とギャップ結合が自発神経活動に必要であることを明らかにした。神経細胞が機能的な脳を構成するに至るまでには、まず神経突起を伸長しシナプスを形成することに加えて、その後過剰に接続されたシナプスを刈り込むことで混線状態を解消し、回路を精緻化することが必要である。この過程において神経細胞はどのような情報を根拠に、この神経突起が必要でこの神経突起が不要であるという判断を下しているのだろうか?予備的な実験から、生後発達期の嗅覚神経回路において僧帽細胞の樹状突起の刈り込みに神経活動が必要であることと、この時期に僧帽細胞が自発的な神経活動をしていることを見出していたため、本研究では生後発達期の自発神経活動に注目し、1)発達期の嗅球上をグローバルに伝播する自発的な神経ネットワーク活動の計測、定量、2)発達時期の違いによる神経ネットワーク活動のパターン比較、3)薬理学的手法を用いた神経ネットワーク活動生成因子の探索、を行うことを1年目の目標とした。これまでに、嗅球スライスおよび覚醒マウスを用いて、in vitro、in vivoの両面からカルシウムイメージング解析および定量をする実験系を確立し、定量的解析を行うことができた。生後の間もない時期は、僧帽細胞は糸球体間で同期的な自発神経発火を示すのに対して、生後3日以降、糸球体間の自発発火パターンが非同期化することが観察された。また、in vitroカルシウムイメージングと薬理学的手法を用いた実験から、ギャップ結合およびイオンチャネル型グルタミン酸受容体が僧帽細胞の自発的なネットワーク活動に必要であることがわかった。当初掲げた3つ実験計画について達成されており、引き続き次年度の計画を進めてゆく。ここまでの研究成果については、日本神経科学学会および北米神経科学会の年会をはじめ国内外5つの学術集会にて発表を行ったほか、近く論文投稿を行う予定である。前年度までの研究により、自発神経発火のパターンの変化と樹状突起の刈り込みについて相関が示唆されるデータが得られているものの、因果関係は不明であった。本年度は、自発神経発火のパターンと樹状突起刈り込みの因果関係とメカニズムについて精査するため、1)自発神経活動の時間パターンと「勝者」となる樹状突起の空間パターンの同時測定。2)光遺伝学的手法を用いた神経活動の時間パターン操作と「勝者」となる樹状突起の選択。3)カルシウムシグナルの下流で主樹状突起の「勝者」「敗者」を決める分子機構、の3項目について研究計画を立て、実験を行った。1)については、2色同時測定のための顕微鏡整備及び、形態観察用の蛍光プローブおよびカルシウム蛍光プローブの組み合わせについて検討を行い、概ねデータ取得のための体制を整えた。2)については、チャネルロドプシンを用いた光照射依存的な神経刺激の条件検討を行った。3)についてはCrispr/Cas9システムを組み込んだベクターの設計を設計し表現型がわかっている既知遺伝子のノックアウトを行い、実験系が機能していることを確認した。また、樹状突起の刈り込みに関わることが予想される複数の遺伝子候補に対してgRNA発現ベクターの設計を行った。また、当初の計画とは方向性が異なるが、樹状突起の刈り込みを終えた糸球体においても、GABA-A受容体のアンタゴニストを薬理学的に作用させると糸球体固有の非同期的な自発神経活動パターンが同期することを見出した。このことは自発神経活動のパターン変化に抑制性回路が関与することを示唆しており今後さらに研究を進める予定である。当初掲げていた分子機構については、Crispr/Cas9システムを組み込んだベクターの設計にとどまったが、発達とともに起こる嗅球の自発神経発火のパターンの変化にGABA作動性の抑制性インターニューロンが関与する可能性を示す薬理学的なデータが得られた。当初の計画とは異なる方向性ではあるが神経活動のパターン変化を制御する因子として抑制回路が関与する可能性を示す進展があったため、総合的にみておおむね順調に進展しているといえる。前年度までに、生後発達期における嗅球の自発神経発火のパターンの変化と僧帽細胞の樹状突起の刈り込みについての相関を示唆するデータや薬理学的実験から抑制性回路の関与を示唆するデータが得られていた。そこで本年度は、抑制性回路の発達と僧帽細胞の樹状突起刈り込みとの因果関係を明らかにするために、GABAの産生を抑制したマウスを用いて解析を行った。GABAの産生を抑制したマウスでは、発火パターン変化のタイミングと刈り込みともに遅れが生じることを見出しが、その表現型は限定的であった。引き続き、特定の抑制性インターニューロンからのシナプス伝達を遮断したマウス等を用いてさらに解析を進める。樹状突起の刈り込みを制御する細胞内分子機構については、LTP、LTD関連遺伝子に対するCRISPR/Cas9システムベクターを子宮内エレクトロポレーション法にて僧帽細胞に導入し、細胞単位で遺伝子をノックアウトする実験を行い、ノックアウトによって樹状突起刈り込みに異常が起こる遺伝子をいくつか同定できた。これらの遺伝子と神経活動との関係性を明らかにしていくことが今後の課題である。

また僧帽細胞にChR2を発現した新生仔マウスの嗅球直上にLEDを取り付け、人工哺乳しつつ糸球体間に同期的な光刺激を与える実験系を確立した。嗅覚系において、嗅球における特異的回路形成がにおい認識の要である。僧帽細胞が生後発達期に主樹状突起の刈り込みを介して1つの糸球体へのシナプス接続を行うことは知られており、以前に僧帽細胞の自発神経活動が樹状突起の刈り込みに必要であることを示したが、自発神経活動の実態については明らかでなかった。そこで本研究では生体あるいは単離した嗅球を用いてカルシウムイメージングを行い、発達に従って、同期的な自発神経活動が糸球体特異的なパターンへと変化することを明らかにし、イオンチャネル型グルタミン酸受容体とギャップ結合が自発神経活動に必要であることを明らかにした。ここまでの研究で、自発神経発火のパターンの変化と樹状突起の刈り込みについて何らかの関係性が示唆されるデータが得られているが、因果関係は不明である。今後、自発神経発火のパターンと樹状突起刈り込みの因果関係とメカニズムについて精査するため、以下の3項目を掲げて研究を行う。1)自発神経活動の時間パターンと「勝者」となる樹状突起の空間パターンの同時測定。2)光遺伝学的手法を用いた神経活動の時間パターン操作と「勝者」となる樹状突起の選択。3)カルシウムシグナルの下流で主樹状突起の「勝者」「敗者」を決める分子機構。細胞内分子機構については、引き続き設計したCrispr/Cas9システムベクターを子宮内エレクトロポレーション法にて僧帽細胞に導入することにより、樹状突起の刈り込みを制御する細胞内分子機構を明らかにする。また、抑制性回路の発達と僧帽細胞の樹状突起刈り込みとの因果関係を明らかにするために、GABAの産生を抑制したマウスの解析や特定の抑制性インターニューロンのシナプス伝達を遮断したマウス等を用いて解析を行う。同時に、光遺伝学的手法を用いて人為的なパターン変化を引き起こした時に樹状突起刈り込みにどのような変化が現れるかを調べる。神経科学論文投稿を行い査読者コメントに対応する実験を設計する過程において、本研究課題の成果を最大化するために、当初計画していた実験に加えて新たな実験を行う必要が出てきたため。抑制性回路機能を減弱したマウスの解析および赤色カルシウムプローブとチャネルロドプシン発現マウスを組み合わせて神経活動パターンの操作と樹状突起刈り込みの測定を行う。そのための消耗品費用として使用する。
地域資源の利用を通じたローカル・ガバナンスの構築―小水力発電を事例に―

本研究の目的は,再生可能エネルギーの一つである小水力発電を維持するための社会経済的条件の解明であり,195060年代に中国地方の農業協同組合などによって建設された小水力発電を事例としている。平成30年度は,電化農業協同組合(以下,「電化農協」)の関係者に対する聞き取り調査を行った。電化農協とは,発電事業を営むために地域住民が出資して設立した農業協同組合である。調査の結果,多くの電化農協は財政基盤がぜい弱なため,自力での資金調達ができず,発電設備を改修できていなかった。そのようななかで,鳥取県内の電化農協は地域外の企業と連携し,発電設備を改修するに至っていた。このことから,少子高齢化が深刻な農山村においては,コミュニティが再エネ導入・維持にかかる資金や人材,技術のすべてをまかなうことは難しいため,外部アクター(ここでは企業)からの関与を前提としながら,コミュニティが外部アクターとどのように連携していくかを考えることが重要であると考えられる。調査対象事例では,県レベルの発電協会が電化農協と企業を仲介し,双方に助言をしながら,企業側に一方的に有利な契約にならないように働きかけを行っていた。よって,コミュニティと外部アクターの連携においては,専門知識を持つ第三者による仲介が重要となると考えられる。また,調査対象事例では,設備改修後の20年間は地域外の企業が発電所を運営するが,水利施設の維持管理については電化農協側が責任を持つことになっている。これは,企業側が,発電所周辺の気候や地形,河川の知識や災害の経験などを地域住民が有していることを評価したことによる。企業は発電設備自体に関する専門知識は有していても,これら地域固有の情報は持っていないためである。よって,地域住民の役割の重要性を企業側に認識させることも,コミュニティと外部アクターの連携構築を資すると考えられる。本研究の目的は,再生可能エネルギーの一つである小水力発電を地域社会において維持していくための事業者や関係機関の連携(ローカル・ガバナンス)を明らかにすることであり,195060年代に中国地方で農業協同組合(以下,「農協」とする)などによって建設され,現在まで維持されている小水力発電所を事例としている。平成28年度は,岡山県内の小水力発電事業者(農協,土地改良区,市町村)への聞き取り調査や中国地方の小水力発電事業者を取りまとめている中国小水力発電協会事務局への聞き取り調査を行った。その結果,小水力発電事業者には総合農協や電化農協,土地改良区,市町村といった多様なタイプが存在し,事業者のタイプによって地域とのかかわりや小水力発電事業の運営が異なるとの示唆が得られた。そこで,中国地方の29の小水力発電事業者へのアンケート調査を行なった。また,中国地方で農協による小水力発電所が活発化した背景を明らかにするため,中国小水力発電協会事務局や,当時の状況を知る関係者への聞き取り調査を行った。主要な結果は以下の3点にまとめられる。(1)中国地方における小水力発電の導入時期は1940年代後半1960年代,1970年以降を維持期と判断できた。(2)小水力発電の導入期は多額の初期投資と電力会社との連系が課題であったが,農山漁村電気導入促進法による低金利融資や中国電力による原価主義・全量売電制度などにより,多数の発電所が建設された。(3)維持期は売電単価向上と多額の修繕費が課題であり,これらの解決に向けて中国小水力発電協会が中心的な役割を担っていた。計画当初,平成28年度は中国地方全域の小水力発電事業者への聞き取り調査,平成29年度にアンケート調査を予定していたが,関係者への聞き取り調査を通じて「事業者の種類によって地域とのかかわりや小水力発電事業の運営が異なる」との示唆が得られたことにより,先に小水力発電事業者へのアンケート調査を実施した。アンケート調査の入力は平成28年度中に終え,平成29年5月中に分析を終了する見込みである。本研究の目的は,再生可能エネルギーの一つである小水力発電を維持するための社会経済的条件の解明であり,195060年代に中国地方の農業協同組合(以下,「農協」とする)などによって建設された小水力発電を事例としている。平成29年度は,中国地方の29の小水力発電事業者へのアンケート調査結果を分析した。また,補足調査として鳥取県の5事業者および鳥取県小水力発電協会への聞き取り調査を行った。その結果,第一に,中国地方の小水力発電の多くは(1)地域振興や未点灯地域解消を目的として建設され,電力の自家消費は行われなくなったものの,地元雇用などにより地域に長年貢献しており,(2)資金繰りと気候リスク増大に伴う採算性低下が運営上の懸念事項であり,(3)FITにより発電施設の更新と収入増が実現したが,雇用増加効果はみられず,(4)今後も事業者単独での維持を志向していることがわかった。第二に,事業者別の特徴として,(1)電化農協や土地改良区は住民・農業者との深い関係から地元密着型の運営を行っており,経営基盤の脆弱さや政策的支援の乏しさ,発電事業以外の事業を持たないことにより事業の採算性や資金調達が課題であること,(2)農協や市町村は,有資格者の世代交代や日常の運営業務のための人員確保といった人的資源に関する課題を重要視していることを指摘した。以上の結果をふまえて,平成29年度後半では,地域との深いかかわりを持ちながらも運営に多くの困難を抱えている電化農協に対して,集中的に聞き取り調査を行っている。

小水力発電事業者へのアンケート調査より,事業者の種類によって事業運営や地域とのかかわりが異なることを明らかにすることができた。この調査結果をふまえて,平成29年度後半は,事業者のなかでも地域とのかかわりが相対的に深い電化農協の動向に焦点をあてて,事業者および関連団体への聞き取り調査を実施してきた。また,来年度の国際学会での報告に向けて,成果のとりまとめや執筆にとりかかっている。本研究の目的は,再生可能エネルギーの一つである小水力発電を維持するための社会経済的条件の解明であり,195060年代に中国地方の農業協同組合などによって建設された小水力発電を事例としている。平成30年度は,電化農業協同組合(以下,「電化農協」)の関係者に対する聞き取り調査を行った。電化農協とは,発電事業を営むために地域住民が出資して設立した農業協同組合である。調査の結果,多くの電化農協は財政基盤がぜい弱なため,自力での資金調達ができず,発電設備を改修できていなかった。そのようななかで,鳥取県内の電化農協は地域外の企業と連携し,発電設備を改修するに至っていた。このことから,少子高齢化が深刻な農山村においては,コミュニティが再エネ導入・維持にかかる資金や人材,技術のすべてをまかなうことは難しいため,外部アクター(ここでは企業)からの関与を前提としながら,コミュニティが外部アクターとどのように連携していくかを考えることが重要であると考えられる。調査対象事例では,県レベルの発電協会が電化農協と企業を仲介し,双方に助言をしながら,企業側に一方的に有利な契約にならないように働きかけを行っていた。よって,コミュニティと外部アクターの連携においては,専門知識を持つ第三者による仲介が重要となると考えられる。また,調査対象事例では,設備改修後の20年間は地域外の企業が発電所を運営するが,水利施設の維持管理については電化農協側が責任を持つことになっている。これは,企業側が,発電所周辺の気候や地形,河川の知識や災害の経験などを地域住民が有していることを評価したことによる。企業は発電設備自体に関する専門知識は有していても,これら地域固有の情報は持っていないためである。よって,地域住民の役割の重要性を企業側に認識させることも,コミュニティと外部アクターの連携構築を資すると考えられる。上述のとおり,平成29年5月中にアンケート調査の分析を終え,学会報告を通じて研究成果を公表する。また,アンケート調査の結果をふまえて,小水力発電事業者を複数選定し,聞き取り調査を行って,詳細な実態を明らかにする予定である。平成29年度後半より実施してきた電化農協と関連団体への聞き取り調査を平成30年度も継続する。平成30年度後半には,調査結果のとりまとめと原稿執筆を行う。また,最終年度にあたることから,平成30年夏に開催される国際学会において研究成果を発表する予定である。平成29年度末から発表に向けた準備を進めている。平成28年度は中国地方全域の小水力発電事業者への聞き取り調査を予定していたが,アンケート調査を先に実施することとなったため,予定していた旅費の支出が発生しなかった。また,計画当初,アンケート調査を郵送で実施する予定であったが,事業者の集まる会場にて配布・回収を行うことができた。そのため,予定していた消耗品費の支出が発生しなかった。
テンタゲート式水門の動的安全性確保の具体策とその実地検証

大型テンタゲートの動的安定性を確保するために、実現性のある方法として巻上げワイヤーの剛性を下げる方法の提案を行った。巻上げワイヤーの剛性を下げることで、ゲートの動的安定性は確保しやすくなることはわかっているが、放水時にゲートを巻き上げるという本来の用途に支障が出る可能性が考えられるため、その両者のバランスを考慮し、巻上げワイヤーの中間に特殊なばね装置を取り付ける手法について検討した。提案の安全対策案について、ゲートの全質量を支えることができ、かつ、ばね定数が小さな特殊なばね装置を検討した。大型三次元モデルゲートを対象に、具体的な特殊ばね装置の設計・製作を行い、それによる動的安全性確保の効果を確認するためのモデル実験を行った。第一に、圧縮コイルばね装置をワイヤーロープの中間に設置する方法を検討した。設計した特殊圧縮ばね装置を大型三次元モデルゲートに取付けて実験を行い、その効果を確認した。ばね定数の異なる3種類の特殊ばね装置を作製し、実験を行った。いずれの場合にも、振動発生時の定常振幅を抑えるという一定の効果は得られたが、ゲートの全質量を支えるためにどうしてもばね定数をある程度大きくする必要があった。そのため、ゲートの固有振動数を十分に低下させることができず、完全な動的安定は確保できなかった。そこで、第二に、耐力が大きいさらばね装置をワイヤーロープの中間に設置する方法について検討した。さらばねの変形量が小さいため十分な効果を得るためには約100段重ねる必要があった。ばね装置の全長が長くなったが、コイルばねを用いた場合よりも効果的にゲートを動的安定に導けることが確認できた。ゲートの動的安全性を確保するための具体的な手法について検討した。ゲートを巻き上げるワイヤーケーブルの中間に特殊なばね装置を設置することで、ゲートを巻き上げるという機能を持ちつつ、動的安定を確保する方法を検討した。コイルばねと皿ばねを使用する方法をそれぞれ検討し、両者ともに一定の成果が得られている。引き続き条件を変えて実験を行うことで、データの信頼性を高めることができると考えられる。実験により提案手法の信頼性が高められれば、実用ゲートへの適用について、ゲートオーナーや関係機関と交渉を行うことが可能になる。本研究課題で提案している、ワイヤーケーブルの中間に特殊なばね装置を設置することでゲートの動的安定を確保する手法について、引き続きモデル実験を行い、有用性の検証と実機への適用の検討を進める。2018年度に得られた結果を踏まえ、圧縮コイルばねを用いる手法についてはその防振効果を高めるための検討を行う。さらばねを用いる手法については動的安全性確保のための最適な諸元を検討する。同時に、できるだけコンパクトな特殊ばね装置の検討を行う。さらに、これまでに振動実地調査を行い動的に不安定であることが確認されている実用テンタゲートの場合について、提案の手法を用いる場合の最適なばね装置の設計を行う。それらの結果を総合し、実用テンタゲートでの実証試験についての打ち合わせを進める。

2018年度に得られた結果を踏まえ、圧縮コイルばねを用いる手法についてはその防振効果を高めるための検討を行う。さらばねを用いる手法については動的安全性確保のための最適な諸元を検討する。同時に、できるだけコンパクトな特殊ばね装置の検討を行う。さらに、これまでに振動実地調査を行い動的に不安定であることが確認されている実用テンタゲートの場合について、提案の手法を用いる場合の最適なばね装置の設計を行う。それらの結果を総合し、実用テンタゲートでの実証試験についての打ち合わせを進める。当初計画していた加速度計の購入を控え、現有のものを使用した。また、特殊ばね装置の設計・製作に当たっては、一部の部品を流用できる形状にしたため、消耗品費の支出が抑えられた。国内学会に参加し、情報取集を積極的に行ったが、国外での協力者との打ち合わせを実施しなかった。以上により、次年度使用額が生じた。次年度使用額については、特殊ばね装置の種類を増やして実験を行うため、その製作・加工に使用する予定である。また、国際会議への出席を計画しており、資料収集および意見交換を行う予定である。
難治性皮膚損傷モデル作製と病態生理の解明～受傷後経過時間判定への応用を目指して～

1.糖尿病マウスを用いた皮膚損傷モデルの作製:平成20年度において確立したストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス,ならびにコントロールマウスの背部にバイオプシーパンチを用いて直径4mmの打ち抜き損傷を作製した.2.肉眼的観察:損傷作製後,経時的に損傷部面積の閉鎖率を比較したところ,糖尿病マウス群ではコントロール群と比べて有意に治癒が遅延していることが判明した.3.形態学的観察:損傷作製後経時的に採取した損傷部組織を用いて,パラフィン包埋切片を作製し,免疫組織化学的に損傷部への白血球浸潤の程度を検討した.糖尿病マウス群では好中球およびマクロファージ浸潤の減少が認められた.4.種々の分子の遺伝子およびタンパク質発現の検討:採取した皮膚試料を用いてRT-PCR法により種々の炎症性サイトカインの遺伝子発現を検討したところ,主に単球/マクロファージに対する走化能を有するケモカインMCP-1の発現が,糖尿病マウス群で減少していた.さらに,MCP-1の局在を免疫染色により検討したところ,マクロファージならびに線維芽細胞であることが判明した.また,MCP-1のレセプターであるCCR2のタンパク発現を,マクロファージ,線維芽細胞,血管内皮細胞に認めた.5.リコンビナント投与実験:損傷を作製した糖尿病マウスに,リコンビナントMCP-1 100ngを3回(dayO,2,4)損傷部局所に投与し,治癒を肉眼的に観察したところ,治癒遅延が回復していた.したがって,MCP-1/CCR2シグナルが皮膚創傷治癒に促進的に作用することが判明した.6.その他のサイトカイン発現の検討:野生型マウスの損傷部において,CCR5, oncostatin M receptor β(OSMRβ)の遺伝子発現およびタンパク発現の亢進を認めた.そこで,CCR5遺伝子欠損ならびにOSMRR遺伝子欠損マウスに皮膚損傷を作製したところ,いずれの遺伝子欠損マウスでも野生型マウスと比べて治癒が遅延することを見いだした.したがって,CCR5およびOSMRβを介したシグナルが,皮膚創傷治癒過程に重要な役割を担っていることが示唆された.1.糖尿病マウスの確立マウスにストレプトゾトシン200mg/kgを腹腔内投与し,経時的に血清グルコース濃度を測定した.ストレプトゾトシン投与後7日目の血清グルコース濃度が300mg/dL以上のマウスを糖尿病マウスとして用いることとした.また,コントロールとして,溶媒(クエン酸バッファー)のみを投与したマウスを同時に作製した.2.糖尿病マウスを用いた皮膚損傷モデルの作製糖尿病マウスならびにコントロールマウスに,ペントバルビタール腹腔内投与で麻酔し,各マウスの背部にバイオプシーパンチを用いて直径4mmの打ち抜き損傷を作製した.3.肉眼的観察損傷作製後,1,3,6,10,14日目に皮膚損傷部をデジタルカメラで撮影し,損傷部面積の閉鎖率を比較したところ,糖尿病マウス群ではコントロール群と比べて有意に治癒が遅延していることが判明した.4.コラーゲン産生量測定損傷作製後,経時的に皮膚損傷部を採取し試料とし,皮膚コラーゲンの主要構成成分であるハイドロキシプロリン含有量を測定した.糖尿病マウス群ではコントロール群と比べて,ハイドロキシプロリン含有量が有意に減少していた.したがって,糖尿病マウスでは損傷部へのコラーゲン蓄積の減弱を伴って,治癒が遅延していることが判明した.5.形態学的観察損傷作製後経時的に採取した損傷部組織を用いて,パラフィン包埋切片を作製し,HE染色を行った,受傷後6日目以降において,コントロール群で認められた著明な肉芽組織形成が,糖尿病マウス群では減弱していた.さらに,免疫組織化学的に損傷部への白血球(Ly-6G陽性好中球およびF4/80陽性マクロファージ)浸潤の程度を検討したところ,糖尿病マウス群では白血球浸潤の減少が認められた.したがって,糖尿病マウスでは損傷部への白血球浸潤の減少を伴って,治癒が遅延していることが示唆された.1.糖尿病マウスを用いた皮膚損傷モデルの作製:平成20年度において確立したストレプトゾトシン誘発糖尿病マウス,ならびにコントロールマウスの背部にバイオプシーパンチを用いて直径4mmの打ち抜き損傷を作製した.2.肉眼的観察:損傷作製後,経時的に損傷部面積の閉鎖率を比較したところ,糖尿病マウス群ではコントロール群と比べて有意に治癒が遅延していることが判明した.3.形態学的観察:損傷作製後経時的に採取した損傷部組織を用いて,パラフィン包埋切片を作製し,免疫組織化学的に損傷部への白血球浸潤の程度を検討した.糖尿病マウス群では好中球およびマクロファージ浸潤の減少が認められた.4.種々の分子の遺伝子およびタンパク質発現の検討:採取した皮膚試料を用いてRT-PCR法により種々の炎症性サイトカインの遺伝子発現を検討したところ,主に単球/マクロファージに対する走化能を有するケモカインMCP-1の発現が,糖尿病マウス群で減少していた.さらに,MCP-1の局在を免疫染色により検討したところ,マクロファージならびに線維芽細胞であることが判明した.また,MCP-1のレセプターであるCCR2のタンパク発現を,マクロファージ,線維芽細胞,血管内皮細胞に認めた.5.リコンビナント投与実験:損傷を作製した糖尿病マウスに,リコンビナントMCP-1 100ngを3回(dayO,2,4)損傷部局所に投与し,治癒を肉眼的に観察したところ,治癒遅延が回復していた.

したがって,MCP-1/CCR2シグナルが皮膚創傷治癒に促進的に作用することが判明した.6.その他のサイトカイン発現の検討:野生型マウスの損傷部において,CCR5, oncostatin M receptor β(OSMRβ)の遺伝子発現およびタンパク発現の亢進を認めた.そこで,CCR5遺伝子欠損ならびにOSMRR遺伝子欠損マウスに皮膚損傷を作製したところ,いずれの遺伝子欠損マウスでも野生型マウスと比べて治癒が遅延することを見いだした.したがって,CCR5およびOSMRβを介したシグナルが,皮膚創傷治癒過程に重要な役割を担っていることが示唆された.
分子標的薬の高精度化のための量子化学に基づく新規な結合エネルギー評価法の開発

生体内の分子認識反応は、ホスト-ゲスト間の様々な相互作用をきっかけに協奏的な構造変化を伴って互いを認識する複雑な現象である。抗ガン治療に使われる分子標的薬をはじめ、医・薬・生命科学の中心的テーマであり、その分子論的解明が急がれている。本研究では、分子認識の過程における構造変化と結合エネルギーの関係を各軌道間相互作用ごとの寄与として量子化学レベルで定量評価し、分子標的薬の高精度化につながる新規結合エネルギー評価法の構築を目指している。平成30年度は、Through-Space/Bond (TS/TB)相互作用解析法と構造最適化手法を結合させたTS/TB-OPT法をもとに、巨大系への適用に向けてElongation(ELG)法との結合を引き続き行った。高分子の重合反応のように電子状態を伸長させるELG法は、反応末端に局在化させた領域局在化分子軌道(RLMO)と攻撃モノマーのみ逐次解いていくことで高精度・高効率に巨大系の電子状態が得られる。昨年度開発したRLMOを基底としたTS/TB解析法(RLMO-based TS/TB法)を基にさらにプログラムの結合作業を進めた。当初、H30年度中盤には結合作業を終える予定であったが、手法間の基本骨格の違いから予想以上の時間がかかっている。また溶媒効果の導入についてはTS/TB法と連続誘電体モデルを結合したTS/TB-PCM法の改良を行った。別途、TS/TB-OPT法の検証の一環として、エチレンやベンゼン分子上のπ共役をカットすることによる構造への影響を調べた。今後、DNA塩基対、ペプチド等の解析を経て、ELG法との結合後はリガンド結合タンパク質の解析に進みたいと考えている。計算資源や人材確保等の問題もあり当初予定よりも遅れているが、最終年度となるH31年度(期間延長申請承認済み)は、方法論の完成と応用検証を進め、手法完成を目指す。初年度である平成28年度は、本課題の基盤技術であるThrough-Space/Bond (TS/TB)相互作用解析法を構造最適化手法(エネルギー勾配法)と結合させ、特定の軌道間相互作用をカットした仮想状態下での最適化構造を得るためのTS/TB-OPT解析法を開発した。続く平成29年度は巨大系への展開の第一歩として、Elongation(ELG)法で得た領域に局在化したRLMOをベースとしたTS/TB解析法を開発し(RLMO-based TS/TB法)、例えば各アミノ酸の間の相互作用など、特定の領域単位での相互作用解析を可能とした。平成30年度はRLMO-based TS/TB法を発展させる形で、TS/TB-OPT法とELG法の結合を進めてきたが、当該手法間の基本骨格の違いから結合作業に想定以上の時間がかかっており、年度内の完成が間に合わなかった。また、大型計算機が利用者多数のため十分確保出来ず、研究補助についても適当な能力を持った人材が確保できなかったことも遅れの原因となった。このような状況を受けて「やや遅れている」という自己評価を行った。1年間の研究期間延長の承認を得たため、最終年度となる平成31年度は方法論完成のための開発と検証を進めていく。巨大系への適用を目指し、RLMOをベースとしたTS/TB解析法(RLMO-based TS/TB法)を基にさらにTS/TB-OPT法とELG法の結合(ELG-TSTB-OPT解析法)をH31年度中盤を目処に進めていく。その後、溶媒効果導入と分子標的薬に対する本格的な応用検証を実施する。これにより、系全体の電子状態を考慮しつつ薬理活性を示す分子認識部位について構造変化と結合エネルギーの関係を各軌道間相互作用の寄与として解析可能な方法として開発し、分子標的薬の高精度化につながる新規結合エネルギー評価法としての完成を目指す。研究推進時に配慮する点として、開発過程で困難にあたった場合は、問題の切り分け、対象の簡単化、原点に立ち戻っての検証など、着実に前進できるよう心掛けるとともに、適宜、研究協力者と意見交換して問題解決にあたる。その際、基盤技術であるTS/TB法の定量性や、ELG法の高精度・高効率性などが開発過程で損なわれることの無いよう注意する。計画を見直す際、研究課題の意義や目標を再度確認し、優先順位を明らかにしつつ着実な研究計画遂行を心がける。抗ガン治療に使われる分子標的薬をはじめとして生体内の分子認識反応はホストーゲスト間に働く相互作用をきっかけに協同的な構造変化を伴いお互いを認識する複雑な現象であり、医・薬学の中心的テーマである。本研究では、巨大系中の分子認識に伴う構造変化と結合エネルギーについて、個別の軌道相互作用の寄与を電子状態を厳密に扱う非経験的な量子化学計算レベルにおいて定量評価可能な手法構築を目指している。相互作用カット前後の比較により分子認識過程における構造変化や結合エネルギーについて軌道相互作用単位で個々の寄与を定量評価できるような新規結合エネルギー評価法実現のため、平成28年度はまず、本課題の基盤技術であるThrough-Space/Bond (TS/TB)相互作用解析法を構造最適化手法(エネルギー勾配法)と結合させ、特定の軌道間相互作用をカットした仮想状態下での最適化構造を得るためのTS/TB-OPT解析法の開発を進めた。ここでTS/TB解析法は、人為的な軌道収縮により分子内の特定の軌道相互作用をカットし、カット前後の比較からその寄与を非経験的レベルで定量解析できる手法である。

さらなる手法改良・調整とテストが必要ではあるが、TS/TB法とエネルギー勾配法の結合作業については完了し、分子認識の小さなモデル系(例えば活性中心ポケット+薬剤分子のみ)を想定した検証計算について現在検討を進めている。平成29年度は、初年度に間に合わなかったTS/TB-OPT法による検証計算および手法の改良・調整を細心の注意を払いつつも効率的に進め、当初H29年度実施予定であった巨大系への適用のための高分子の高精度・高効率電子状態計算法であるElongation法との結合(ELG-TSTB-OPT解析法)、および、タンパク質ー薬剤分子系に対する応用検証について、なるべく早い時期での着手を目指す。当初、平成28年度の前半にThrough-Space/Bond (TS/TB)相互作用解析法を構造最適化手法(エネルギー勾配法)と結合させ、年度後半には、当該開発手法(TS/TB-OPT法)を用いた検証計算と手法改良・調整を行う予定であったが、結合作業についてTS/TB法の骨格を見直す必要性が出たため予想以上に開発時間がかかり、当初の計画に遅れが出た。手法の検証計算が年度内に間に合わなかったが、最重要部分であるTS/TB-OPT解析法については結合作業が完了したことを受け、「おおむね順調に進展している」という自己評価を行った。生体内の分子認識反応は、ホスト-ゲスト間の多様な相互作用をきっかけに協同的な構造変化を伴って互いを認識する複雑な現象である。例えば抗ガン治療に使われる分子標的薬をはじめとして、医・薬学および生命科学の中心的テーマであり、その分子論的理解が急がれている。本研究では、分子認識過程における構造変化と結合エネルギーについて個々の軌道間相互作用の寄与を量子化学計算レベルで定量評価し、分子標的薬の高精度化につながる新規結合エネルギー評価法の構築を目指している。平成29年度はまず、昨年度開発したThrough-Space/Bond (TS/TB)相互作用解析法と構造最適化手法(エネルギー勾配法)を結合させたTS/TB-OPT解析法をもとに、巨大系への適用に向けて、高分子の重合反応のように電子状態を伸長させるElongation(ELG)法との結合について開発を進めた。ELG法では、反応末端に局在化させた領域局在化分子軌道(RLMO)と攻撃モノマーのみ逐次解いていくことで高精度・高効率に電子状態を伸長させる。結合作業の最初のステップとして、ELG法で得た領域に局在化したRLMOをベースとしたTS/TB解析法を開発した(RLMO-based TS/TB法)。これにより、特定の領域単位での相互作用解析が可能となり(例えば各アミノ酸の間の相互作用解析など)、現在、さらに本手法に基づいて巨大系適用に向けELG法との結合を進めている。最終年度である平成30年度は、H29年度に間に合わなかったTS/TB-OPT法とELG法の結合を引き続き行い、後半は当初H30年度実施予定であった溶媒効果の導入と分子標的薬に対する本格的な応用検証の実施を目指す。当初、平成29年度はTS/TB-OPT解析法を巨大系への展開に向けてELG法と結合させる予定であったが、その第一段階として実施したELG法で得た領域局在化分子軌道(RLMO)をベースとしたRLMO-based TS/TB法の開発において予想外に多くの試行錯誤を必要としたため、次段階のELG法との結合について年度内の完成が間に合わなかった。
高速・無電荷ガスクラスタービームの生成とSIMSへの応用

1500個のアルゴン(Ar)原子から構成されるクラスターイオンを、5 eV/原子以下の衝突エネルギーで数種類の金属試料に衝突させた時、クラスターイオンの解離の激しさ(解離度)が金属の種類によって異なることを発見し、この現象が衝突時の衝撃力の違いによるものであることを明らかにした。弾性衝突近似のもとでは衝撃力は試料のヤング率に依存するので、解離度の測定から未知材料のヤング率を求めることができる。さらに、銅基板にグラフェン(1層)を積層させた試料にこの方法を応用した結果、衝突時にグラフェンが変形することによって、グラフェンを積層させない場合に比べて解離度が1/5に緩和されることが示された。高速・無電荷クラスタービームの生成評価装置を試作する前段階として、アルゴン(Ar)クラスターイオンを各種金属に衝突させたときの、クラスターイオンの中性化率および解離特性を調べた。クラスターの構成原子数:10002000原子、加速電圧:57.5kVの条件で実験を行った。この結果、以下の知見が得られた。1Arクラスターイオンの構成原子1個あたりの平均的運動エネルギー(Ea)(イオン全体の運動エネルギーを構成原子数で割った値)を変えて照射し、試料から放出される二次イオンの質量スペクトルを計測した。質量スペクトルはEaの値によって変化した。2Eaが210eVの範囲では、質量スペクトルはArクラスターイオンが解離した25量体(Ar2+Ar5+)程度の小さいクラスターイオンのみで構成された。ここで、入射イオン電流に対する解離イオンの総和電流の比を1から引いた値をクラスターイオンの中性化率と定義すると、中性化率は97%程度(銀試料に対して)であった。Eaが10eV以上になると、解離イオンに加えて試料金属の二次イオン(Ag+など)が検出された。3同一のEa条件で照射したにも関わらず、解離イオンの相対強度は衝突する金属の種類によって異なることが判明した。この結果について弾性衝突近似により解析した結果、解離度(検出された解離イオン強度の総和に対する2量体イオンの強度比)は、各種金属との衝突時にクラスターが受ける衝撃応力にほぼ比例することが明らかとなった。前年度において、アルゴン(Ar)クラスターイオン(構成原子数:10002000)を構成原子1個あたりの運動エネルギー(Ea)が210eVの条件で数種類の金属に照射した結果、Arクラスターイオンは構成原子数が25程度の小さいクラスターイオンに解離すること、さらに、解離度(解離イオン強度の総和に対する2量体イオン(Ar2+)の強度比)が各種金属との衝突時にクラスターが受ける衝撃応力にほぼ比例することを明らかにした。今年度は、上記のクラスターイオン衝突法による解離度の変化をどの程度の薄い金属まで検出できるのか調べるために、銅(Cu)基板の表面にグラフェン(1層)を積層させた試料について検討した。この結果、以下の知見を得た。1グラフェン試料にArクラスターイオンを照射し続けること(プレスパッタリング)により試料表面の吸着汚染物が除去されるとともにクラスターイオンの解離度が減少し、やがて一定の値(清浄化されたグラフェンとの衝突による値)に収束する。2プレスパッタリング後では、グラフェンを積層させたCu試料の解離度は積層しないCu試料の約1/5である。これはグラフェンと銅の原子間ポテンシャルが影響していること、巨視的にはグラフェンの変形によって衝突時の衝撃が緩和されていることを示している。3プレスパッタリング時のEaを12eVまで上げて照射するとグラフェンの炭素原子がスパッタリングによって除去されるため解離度は次第に上昇し、Cu試料の値に一致する。以上の結果から、クラスターイオン衝突法によって金属原子1層までの力学物性を評価できる可能性が得られた。また、プレスパッタリング処理によって試料に損傷を与えることなく表面の吸着汚染層を除去できることは本法のメリットの一つである。本研究の当初の目的は、二次イオン質量分析(SIMS)用の一次ビーム源として高速で無電荷のアルゴン(Ar)クラスタービームを生成することにあった。しかし、本研究開始直後において、Arクラスターイオンを異なる金属に同じ速度で衝突させたにも関わらず、金属の種類によってクラスターイオンの解離特性が異なるという現象を発見した。本課題期間では上記の現象を詳しく解明し、以下の知見を得た。11500個のAr原子から構成されるクラスターイオンを同一の運動エネルギー(10eV/atom以下)で5種類の金属(金、銀、銅、白金、タングステン)に衝突させると、27原子程度のAr原子から成るクラスターイオンに解離するが、これらの相対強度は衝突する金属の種類によって異なる。この現象について弾性衝突近似により解析した結果、解離度(検出された解離イオン強度の総和に対する2量体イオンの強度比)は、各種金属との衝突時にクラスターが受ける衝撃応力にほぼ比例することが明らかとなった。衝撃応力は金属のヤング率に依存するので、未知材料に関して解離度の測定からヤング率を測定できる可能性が示された。2銅基板上にグラフェン(1層)を積層させた試料および積層させない試料に上記のクラスターイオンを衝突させた結果、積層させた試料における解離度は積層させない試料の約1/5であった。3(最終年度の成果)分子動力学シミュレーションによって、銅上グラフェンとArクラスターイオンの衝突現象を解析した結果、衝突時に銅上のグラフェンが変形することによりクラスターの受ける衝撃を緩和していることが示された。

これらの結果から、1、2における解離現象が衝突時の力学的応答によるもであること、さらに、クラスターの衝突解離を検出することにより原子1層レベルの力学物性を計測できることが明らかとなった。1500個のアルゴン(Ar)原子から構成されるクラスターイオンを、5 eV/原子以下の衝突エネルギーで数種類の金属試料に衝突させた時、クラスターイオンの解離の激しさ(解離度)が金属の種類によって異なることを発見し、この現象が衝突時の衝撃力の違いによるものであることを明らかにした。弾性衝突近似のもとでは衝撃力は試料のヤング率に依存するので、解離度の測定から未知材料のヤング率を求めることができる。さらに、銅基板にグラフェン(1層)を積層させた試料にこの方法を応用した結果、衝突時にグラフェンが変形することによって、グラフェンを積層させない場合に比べて解離度が1/5に緩和されることが示された。ナノサイズのクラスターイオンを衝突させて、その解離挙動からターゲット材料の力学物性を評価するという試みはこれまでに報告がなく、本例が初めてである。本法は、ヤング率、硬度など材料強度の微小領域計測やその二次元マッピング、さらには材料作成中のin-situ計測などへの応用が期待できる。現在、グラフェンに代表される二次元材料の研究は活発化しているが、これらの材料の力学特性を評価できる実用的な方法は確立されていない。このような状況において、今年度に得られた成果の意義は大きい。表面科学、ビーム応用、質量分析、ナノサイエンス本計測法の原理的可能性を明らかにするために以下の研究を推進する。1分子動力学法等によりアルゴンクラスターイオンと既知金属の衝突によるクラスターイオンの解離度を計算し、実験値との比較を行う。2プレスパッタリング後の試料表面の状態や構造(極薄酸化膜、微視的構造など)が解離度に及ぼす影響を明らかにする。上記の実績のうち、3の内容について詳細に検討したため当初の計画である無電荷クラスタービーム生成評価実験がやや遅れている。しかし、3の結果は無電荷クラスターの生成を含めてナノクラスターのより広範な基礎および応用の分野において極めて大きな意義をもっているものと考える(後述)。研究の内容上、実験試料の購入費および旅費がほとんどであったため。3の結果は、クラスターの解離に及ぼす衝突力学的効果を観測したものであり、報告者の知る限り、このような観測は世界初である。これまでクラスターと固体の衝突現象については、主として量子力学あるいは分子動力学などをベースとする原子・分子論的アプローチから研究がなされてきた。これに対して、本結果はクラスターを一つの連続体とみなして古典力学によってクラスターと固体の衝突を解析できる可能性を示唆するものである。金属との衝突時にクラスターが受ける衝撃応力は弾性衝突近似のもとでは金属のヤング率によって決まる。したがって、未知材料との衝突によるクラスターイオンの解離スペクトルを検出することによって、当該材料のヤング率を測定することが可能である。以上のような状況に鑑み、今後はArクラスターイオンの衝突誘起解離特性の研究を優先させ、併せて無電荷クラスタービーム生成への手がかりを探っていく。実験設備の製作費、試料の購入費、および旅費に充てる予定である。
衛星による南極氷床氷緑および白瀬氷河の変動の研究

<白瀬氷河の浮氷舌の変動と気温・積雪・日射の関係>___ー:白瀬氷河の浮氷舌の末端の位置の観測は過去30年間続けられてきた。観測は1973年までは地上、航空機を利用。その後はLANDSAT,MOSー1衛星デ-タを用いた。浮氷舌が最も延びたのは1961年で長さは河口から約70km。浮氷舌の後退が示すことは、1)過去30年間浮氷舌は後退、最近では白瀬氷河の河口まで後退。2)浮氷舌がリュツオ・ホルム湾内に存在して伸長する場合、約2.5km/年の速度で延び、この速度は白瀬氷河の河口での流動速度と同じ。現在、河口まで後退した浮氷舌が再び1961年頃の長さに延びるには約25年かかる。3)1980ー81年および1987ー88年の例から浮氷舌が漂流するのはリュッオ・ホルム湾の海氷が広い範囲で割れるからであり、浮氷舌の存在とリュッオ・ホルム湾内の海氷は密接な関係にある。昭和基地の過去30年間の地上気温の年平均値には上昇傾向が認められ、1980年は年平均値が平年より約2°Cも高温、リュツオ・ホルム湾内では海氷が流出し、開水面が発生し浮氷舌が分離し氷山となって漂流。1980年は全球的にも気温が高かった年である。<リュッオ・ホルム湾の海氷変動>___ー:リュッオ・ホルム湾の海氷の状況は、棚氷が存在する湾の西岸では過去に流出した観測がなく多年氷が常に存在。一方、白瀬氷河の北方から昭和基地にかけてはポリニヤ露岩帯近くに毎年のように現われ、年によっては大きな開水面が広がる。リュツオ・ホルム湾全体で海氷が割れて開水面が拡がる原因は、海流や海底地形などによる海洋環境もあるが、年々の気象状況による影響と考えられる。海氷成長期に気温が高いときは、海氷厚が十分成長せず薄いので、夏には表面からの融解が進みやすく氷の強度が落ちる。擾乱によるうねりなどが外洋から湾内の海氷域へ進入した場合など海氷の破壊が進む。気象条件として、平年より高い気温、日射量が多く、積雪量が海氷上に少ないなどの条件がリュッオ・ホルム湾の海氷の存在状態に影響を及ぼしていることが明らかになった。
力学刺激によるPGE2/NGF/MMP産生機構に注目した変形性膝関節症の病態解明

我々は、独自開発した実験系(コラーゲンスポンジ培養担体と力学刺激装置)を用いて、ヒト培養滑膜・軟骨細胞の三次元力学刺激培養が、PGE2などの炎症メディエーター、マトリックス分解酵素(MMP)の産生を促進すること、さらには疼痛関連分子(NGF、Tac1)の遺伝子発現を促進することを見出した。その際、関節炎の病態で重要と考えられているIL-1βやTNFα経路の関与が少ないことから、メカニカルストレスが関節の恒常性及び変性に関与する未知の新たな機構が存在すると考えている。前述の実験系で、PGE2/NGF/MMP産生を指標として用いて、メカニカルストレスが関節症の病態に関与する機構の解明を目指す。
間質性膀胱炎の病態解明と脂肪幹細胞による治療の試み

原因不明の難治性疾患である間質性膀胱炎に対して、今だ作成されていない疾患モデルを作成し、それに対して脂肪幹細胞の膀胱内注入を行い、膀胱機能が再生可能かどうか、また疼痛の改善が可能かどうかの検証を行うことが本研究の目的であった。初めに疾患モデルである慢性膀胱炎ラットおよびマウスの作成を試みた。粘膜面を破壊するプロタミン硫酸塩および大腸菌由来のリポポリサッカライドを注入し、膀胱粘膜に炎症を惹起させることを平成25年に確認した。翌年の平成26年に実際の間質性膀胱炎と同様の症状を引き起こすかの機能実験を行った。結果、頻尿になるものの、1回排尿量の低下がなく間質性膀胱炎と類似した病態とならなかった。平成24年度は間質性膀胱炎のモデル動物の作製およびヒトの組織所見との一致性があるかどうかの評価を行っていた。プロタミンによるGAG layer破壊および膀胱動脈焼灼による虚血マウスモデルおよびラットモデルの作製を試みたが、致死率が高く、同モデルは間質性膀胱炎のモデルとしては不適応との結論に達した。ヒトでは膀胱粘膜に潰瘍を生じさせ、膀胱炎症状を起こすケタミンの用いた膀胱注入によるモデルも、ヒトでのケタミン膀胱炎の様な症状や病理所見を呈さず、同様に不適応と判断された。既存のシクロフォスファミド(CYP)モデルや塩酸モデルは急性炎症としての膀胱炎は惹起されたが、長期的な効果はなく、慢性膀胱炎である間質性膀胱炎と同様の病態は示さなかった。平成24年度には慢性膀胱炎モデルラットを確立し、それを用いて翌年の平成25年度に機能評価や薬剤投与を行う予定であったが、モデルラットの作製に難渋した。平成25年度よりラットの膀胱内に大腸菌由来のLPSを投与し、膀胱炎を惹起することで間質性膀胱炎様の炎症がラットの膀胱で起きるかどうかを検証している。現在プロタミンとLPSの併用により機能検査および病理検査上は良好な結果が得られており、薬剤投与後17日目にラットの排尿回数を確認すると頻尿が形成され、病理所見上も炎症細胞浸潤が認められている。本結果を元に、シストメトリーによる膀胱機能評価や分子生物学的な評価を行う予定である。本年度は間質性膀胱炎のモデル動物の作成およびヒトの組織所見との一致性があるかどうかの検討を主に行った。プロタミンによるGAG layer破壊および膀胱動脈焼灼による虚血マウスモデルの作成および手術手順の樹立を行い、メタボリックケージとシストメトリーで排尿機能評価を行った。また同モデル以外に近年ヒトでのケタミン中毒患者で報告されている潰瘍を伴う膀胱炎に類似した膀胱炎モデルラットとして、ケタミンの膀胱内注入による潰瘍形成膀胱炎ラットモデルを作成を試みたが、こちらについてはヒトと類似した病態を呈さず、膀胱炎のモデルとしては不適と考えられた。現在はラットの膀胱内に大腸菌由来のLPSを投与し、膀胱炎を誘発することで間質性膀胱炎と類似したモデルを作成している。現在は病理組織像および排尿機能評価を行っている。また、ヒト検体を用いて間質性膀胱炎膀胱におけるエストロゲンレセプターやVEGF、ケモカインの評価を免疫染色およびレーザーマイクロダイセクション、PCRで行っていいる。これらについては国際間質性膀胱炎研究会と国際排尿機能学会で発表を行った。前回報告した平成24年度は間質性膀胱炎のモデル動物の作成およびヒトの組織所見との一致性があるかどうかの評価を行った。プロタミンによるGAG layer破壊および膀胱動脈焼灼による虚血マウスモデルおよびラットモデルの作成を試みたが、致死率が高く、同モデルは間質性膀胱炎のモデルとしては不適応との結論に達した。同様に薬剤をヒトで間質性膀胱炎様症状を惹起するケタミンを用いてモデル動物の作成を試みたが、これも間質性膀胱炎に特異的な頻尿を起こさず、モデルとしては不適応であった。平成25年度よりラットの膀胱内に大腸菌由来のリポポリサッカライド(LPS)を注入し、膀胱炎を惹起させ、後に過知覚や疼痛を呈する間質性膀胱炎様の慢性症状を呈するか、頻尿の程度や組織学的所見のヒトとの類似性について検証を行ってきた。平成25年度の時点ではプロタミンとLPSの併用投与により炎症および頻尿を呈することが示されたため、平成26年度は本モデルを用いて、この症状および炎症所見が間質性膀胱炎の典型的な「慢性」症状となるかどうかを引き続き検証した。