hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子クラスター内プロトン・電荷移動ダイナミクス―凝縮相との違いは何に起因するか

気相における水素結合クラスターの励起状態多重プロトン移動および金属イオンの配位・溶媒和構造について周波数領域のレーザー分光を用いて研究した。励起状態多重プロトン移動と水素結合ネットワークの異性化機構については、ピコ秒時間分解分光も行った。これらの実験から、プロトン移動と水素結合ネットワークの異性化ダイナミクスについて新奇な情報が得られた。更に、水和アミドのモデルクラスターであるアセトアニリドおよびホルムアニリドと水の1:1クラスターの光イオン化により、水分子がC=OサイトからNHサイトに転移することを発見した。2ーフェニルエタノールと水の1:1クラスターの光イオン化を行い水素結合の揺らぎを観測した。Mg、V、Fe、Co、Ni、Cu、Agの1価の金属イオンに水、メタノール、アンモニアなどを段階的に溶媒和させ赤外解離分光を適用することによって、配位・溶媒和構造について研究し、気相と溶液の配位・溶媒和構造の違いについて比較した。また、単一ポテンシャルエネルギー曲面を断熱伝播させる半古典凍結ガウス伝播法と非断熱遷移を考慮するために使われる散乱理論を用い,電子状態間の非断熱化学動力学を記述するための波束発展法の開発を行い、得られた方法をいくつかのモデル分子系に適用した。(1)水素結合クラスターにおける励起状態多重プロトン・水素移動:これまで、7-アザインドール(7AI)(H_2O)_2、7AI(MeOH)_2クラスターにおいて励起状態多重プロトン・水素移動を観測し、その機構について研究してきた。7AI(H_2O)_2、7AI(MeOH)_2のプロトン・水素移動ポテンシャルと反応経路について理論的に調査する。(2)金属・溶媒和クラスターにおける分子間相互作用:Fe、Ag、Coなど金属原子イオンに水、アルコール、アンモニア等の溶媒和したクラスターイオンを孤立気相中において生成させ、サイズ選別した赤外光解離分光を行う。量子化学計算により、振動数、エネルギーの計算を行い、金属イオンの種類、クラスターのサイズの増加に伴い、どのような配位構造をとるかについて調査する。Arとのファンデルワールス結合したクラスターイオンの赤外スペクトルと比較することにより、クラスター温度と安定構造との関係について調査する。(3)分子間相互作用が化学反応に及ぼす影響を微視的立場から考察するために、光吸収・発光反応を対象とした理論的ダイナミクス:具体的には、ab initio MD法の凍結ガウス関数の時間発展法による半古典化によって取り扱える系の大きさを増大させ原子核の運動を取り入れることにより、垂直遷移エネルギーだけでなくエネルギー幅を含めてスペクトルを再現しようという試みである。まずは、これまでも研究対象としてきた38原子系のビスインドリルマレイミド(BIM)誘導体に対して計算を進め、作成したプログラムの評価を行う。本研究は、孤立気相状態において、水、アルコールなどの極性溶媒分子を結合させた分子クラスターを生成させて、光誘起プロトン移動・電荷移動ダイナミクスについてレーザー分光法と量子化学計算を用いて解明することを目的としている。平成19年度においては、7-アザインドール(7AI)・メタノール/水クラスター、2-ヒドロキシピリジン・水クラスターの励起状態多重プロトン・電荷移動について調査した。その結果、以下の新規な成果が得られた。(1)7AI(CH_3OH)_n(n=1-3)の赤外イオンディップ分光と赤外スペクトルの理論計算から、電子スペクトルにおいて観測されたクラスターにおいて環状の水素結合が形成されていることが分かった。また、NBO解析から水素結合ネットワークにおいて水素結合相互作用に顕著な協同性が生じていることが示された。(2)7AI(H_2O)_n(n=1-3)の電子スペクトルの測定から、7AI(H_20)_2のS1状態においては励起状態3重プロトン/水素移動、7AI(H_2O)_3においては励起状態4重プロトン/水素移動が生じることを示した。また、内部エネルギーの低い状態において、7AI(H_2O)_3においては電荷移動が生じ、7AI(H_20)_2において電荷移動が生じない。量子化学計算から、^1L_a状態の極性が^1L_b状態のよりも大きいために、水分子の数が増加するにつれて^1L_a状態が1^1L_b状態より安定化の度合いが大きいことによることを示した。

(3) 2-ヒドロキシピリジン・水1 : 1または1 : 2クラスターにおいて励起状態プロトン移動が観測される可能性が、実験と理論から指摘されていた。しかしながら、分散蛍光スペクトルにおいてプロトン移動によって生成する互変異性体からの発光が観測されないことから、励起状態プロトン移動は他の減衰過程に比べて極めて遅いことが分かった。以下の3つのテーマについて成果が得られた。(1)気相における7-アザインドール・エタノールクラスター[7AI(C_2H_5OH)_n(n=1-3)]の励起状態プロトン/水素移動について調査した。1:2クラスターにおいて、振動状態選択的な励起状態3重プロトン・水素移動(ESTPT/HT)が生じることが分かった。7AI(C_2H_5OH)_2の1:2クラスターの共鳴多光子イオン化スペクトルにはエチル基のコンフォーメーションが異なる4個の構造異性体の遷移が観測された。これらの異性体おいて、顕著な反応性の相違が観測されない。したがって、ESTPT/HTポテンシャルは、環状の水素結合構造に支配されていることが示唆された。また、赤外分光と量子化学計算から、既にESTPT/HTについて報告した7AI(CH_3OH)_2のS_1が^1L_a状態であることが示唆された。_1L_a状態は^1L_b状態よりも極性分子と強い分子間水素結合を形成できるので、励起状態プロトン移動に有利であり、実験結果と一致する。(2) Ag^+(NE_3)_nおよびNi^+(NH_3)_nについて,赤外光解離スペクトルの測定および量子化学計算を行った。溶媒分子がNH_3の場合, Ag^+は正4面体型4配位構造, Ni^+は平面型4配位構造をとること分かった.既報である直線型2配位構造のCu^+(NH_3)_nも含めて考察を行い,金属イオンのd電子密度分布の非等方性と配位構造との間に密接な関係があることを見出した。(3)ビスインドリドマレイミド(BIM)誘導体の発光は多くは吸収に対して大きなレッドシフトを示す。その理由は明確にされていなかった。本研究では、BIM誘導体の基底状態および励起状態の高精度量子化学計算から、インドール部位からの脱プロトン化と片方のインドール環の電子励起状態におけるねじれにより分子内電荷移動性(ICT)が強くなることが励起状態の安定化を安定化させ、大きなレッドシフトの原因となることを明らかにした。これらは分子間相互作用とダイナミクス分野で新規な成果である。プロトン移動反応素過程の研究は、協同的に進行する溶液や生体内の複雑な反応機構について解明するために重要である。本研究では、分子間相互作用、励起状態ポテンシャルについて詳細に調査しながら、分子の協同的な運動のしくみについて解明することを目的とする。平成21年度は、以下の3つの課題において成果が得られた。(1)気相における7-アザインドール・t-buthylalcohol[7AI(t-buthyl-OH)_n(n=1-3)]の励起状態プロトン/水素移動について調査した。
III群・IV群抗不整脈薬のTdp誘発閾値と即効的治療(心臓立体マッピングによる検証)

体表面心電図の四肢誘導のT波ピークと終末部から求めた心室再分極の指標(Tp-e)は心臓全体の立体的再分極不均一性を反映していたが、局所の心室貫壁性の再分極不均一性には一致しなかった。ペーシング治療はAP-Aモデル> E-4031モデル>ベプリジルモデル>アミオダロンモデルの順で効果がみられた。カリウム補正の効果はE-4031モデルで最も顕著であった。マグネシウム治療はAP-Aモデルに対してはARIを短縮させて多形性心室頻拍を抑制した。AP-Aモデル以外では、不整脈基盤の不均一性の是正よりもトリガー早期興奮の抑制にある可能性が示された。抗不整脈薬を安全に使用するために、抗不整脈薬による多形性心室頻拍(TdP)の誘発閾値と予知指標、発症した場合の効果的治療を心臓立体マッピングで検証する研究を開始した。ビーグル犬を静脈麻酔下に人工呼吸管理を行って、多極針電極を用いて心室貫壁性(心内膜側・心筋中層・心外膜層)のマッピングを行った。2.心室のARI延長程度は部位によって異なり、左室心筋中間層の延長が最も顕著であった。このためにそれぞれのモデルで心室貫壁性の再分極不均一分布が生じた。3.E-4031モデルは交感神経緊張によって多形性心室頻拍が一部に生じた。多形性心室頻拍の発症には、心筋中間層での伝導ブロックが関与していた。AP-Aモデルでは徐脈依存性に多形性心室頻拍が生じ、その際にも心筋中間層で早期興奮の伝導ブロックが観察された。ベプリジルモデルは、交感神経刺激、徐脈負荷によって多形性心室頻拍は生じなかった。4.心周期を延長させるとQT間隔とARIは延長したが、その程度はAP-Aモデル>E-4031モデル>ベプリジルモデルの順であった。ARIの心周期は対する変化をhyperbolic fitで解析したところE-4031モデルとベプリジルモデルに相違が見られた。5.ペーシング治療は、AP-Aモデル>E-4031モデル>ベプリジルモデルの順で効果がみられた。6.マグネシウム治療はAP-AモデルでARIを短縮して多形性心室頻拍を抑制した。しかし他のモデルに対する効果は異なる可能性が示唆され検討を進めている。抗不整脈薬を安全に使用するためい、抗不整脈薬によって生じる多形性心室頻拍(TdP)の発症基盤の特徴、不整脈の誘発閾値、発症した場合の治療法について心臓立体マッピングで検証する研究を継続した。ビーグル犬静脈麻酔下に人工呼吸管理を行った、多極針電極を用いて心室貫壁性(心内膜測・心筋中層・心外膜層)のマッピングを行なった。迷走神経管と星状神経節刺激によって自律神経興奮を調節した。2.心拍数を減少させた場合、いずれのモデルもM細胞層で再分極時間が最も書く辻長して心室貫壁性再分極分布の不均一性が増幅した。増幅程度はAP-Aで最も大きく、ベプリジル・アミオダロンはE-4031よりも小さかった。3.AP-AとE-4031では星状神経節刺激によって多形性心室頻拍が一部に生じた。多形性心室頻拍の発症には心筋中間層での伝導ブロックが関与していた。4.各モデルで心周期に対するARIの変化をhyperbolic fitで解析した。E-4031とベプリジルの比較では、ARImaxとCL50はE-4031のM細胞層で最も大きく、ベプリジルの心外膜層で最も小さかった。5.ペーシング治療(最大140ppm)によるARIの短縮とARI-dispersionの減少効果は、AP-A>E-4031>ベプリジル=アミダロンの順であった。6.ベプリジルの心房性不整脈に対する治療効果の一部に、活動電位持続時間が迷走神経緊張時に短縮することへの抑制効果が含まれていた。抗不整脈薬を安全に使用するために、抗不整脈薬によって生じる多形性心室頻拍(Tdp)の発症基盤の特徴・発症した場合の治療法について、心臓立体マッピング法を用いて検証する研究を継続総括した。ビーグル犬を静脈麻酔下に人工呼吸管理を行い、多極針電極を用いて心室貫壁性(心内膜・心筋中層・心外膜)の心臓立体マッピングを行った。体表面心電図を装着して心内外の電気現象の相関を検討した。迷走神経管と星状神経節刺激を用いて自律神経興奮を調節した。研究結果:(1)

心内再分極分布:抗不整脈薬によって心臓再分極分布が不均一化した。再分極分布の不均一性は、長軸方法(心基部vs.心尖部)、水平方法(中隔側vs.自由壁側)、貫壁方向(心内膜vs.心外膜)において増幅し、伝導障害の基盤が誘導された。(2)立体的に変化する心臓再分極分布が、体表面心電図に反映される過程をコンピュータ解析で検証した。四肢誘導から求めた心電図再分極指標(Tp-e)は心臓全体の立体的再分極不均一性を反映していたが、局所の心室貫壁性の再分極不均一性には一致しなかった。(3)交感神経緊張による不整脈発症の閾値は抗不整脈薬の種類によって異なった。ベプリジル・アミオダロンは交感神経興奮の際の不整脈発症に抑制効果を示す可能性が示された。(4)心室細動の周波数解析で、dominant frequencyは心臓の各部位で異なる傾向が示された。(5)治療効果は抗不整脈薬の種類によって異なる傾向がみられた。オーバードライブペーシングの効果は、アミオダロン・ベプリジルよりもanthopleirin-A・E4031でより顕著であった。マグネシウム静注による治療効果は、anthopleirin-A以外の薬剤では不整脈基盤の不均一性の是正よりも、トリガー早期興奮の抑制にある可能性が示された。
間葉系細胞による微細環境制御を活用したヒト毛包再生促進技術の開発

毛包の再生にはその周囲の環境が重要と考えられている。本研究ではその環境を制御することでヒト毛包再生に有利な条件の確立を試みた。まず、毛包の再生にとって重要なWNTシグナル経路の刺激をヒトの毛包周囲から分離・培養した線維芽細胞に与えると、細胞増殖因子であるFGFファミリーのうちFGF9の上昇やFGF7の低下といった変化が毛包を構成する細胞に作用し毛包の再生に有利な条件をつくり出すことがわかった。ヌードマウスを用いた毛包再生実験ではFGF9を加えることで毛包の再生が促進され、毛包のサイズや数が増えた。本研究の結果は、ヒトの毛包再生技術の確立の一助となりうると考えられた。ヒト健常皮膚より毛乳頭細胞、結合組織鞘細胞、線維芽細胞を分離、単独培養した上でtotal RNAを抽出、cDNAに変換し、毛包新生に重要とされるFGFファミリーの各種類についてPCR解析を行った。その結果、単独培養した線維芽細胞では毛包新生に抑制的に働くことが報告されているFGF5, 13, 18の発現が他の細胞に比して高かった。次にWNTシグナルを活性化させる低分子化合物CHIR99021を含む培養液で線維芽細胞を単独培養し、それぞれのFGFの発現をリアルタイムPCRで解析したところ、FGF7の発現は著明に抑制された一方で、FGF9, 16, 20の発現は有意に上昇した。さらにFGF7, FGF9の発現は加えたCHIR99021の濃度に依存して変化することが示された。FGF7, 9はそれぞれ毛包新生に対し抑制的、促進的に働くことが報告されている。これらの結果より、WNTシグナルの活性化により繊維芽細胞でのFGFの発現プロファイルが変化することで毛包新生に促進的な微小環境が形成される可能性が示唆された。次に、線維芽細胞で起こる上記のプロファイル変化が毛乳頭細胞に与える影響を検証するため、FGF7, 9それぞれを加えた培養条件で毛乳頭細胞を48時間単独培養し、毛包新生に重要とされる各遺伝子の発現をリアルタイムPCRで検証したところ、FGF9添加条件下ではRGS2, SPRY4, NOGの発現が上昇した。上記の結果よりWNTシグナル発現の変化により引き起こされる毛包周囲線維芽細胞のFGFプロファイルの変化が毛乳頭細胞に影響することで毛包新生に対して促進的な微小環境が形成される可能性が考えられた。当初予定していた平成27年度の研究実施計画に含まれる間葉系細胞の分離培養を行い、毛包新生に必要なメディエーターの一つであるFGFに着目して各細胞におけるプロファイルの遺伝子レベルでの解析を完了した。さらにWNTシグナル活性条件下での線維芽細胞のプロファイリング変化を解析し、濃度依存性に変化することを確認した。さらにこれらの変化が毛乳頭細胞における各メディエーター発現に与える影響を検証したことで、平成27年に計画されていた課題をほぼすべて完了したといえる。一方で解析はPCRによる遺伝子レベルに限られ、ELISAやウェスタンブロットによるタンパクレベルでの解析は未施行である。以上より本研究は完全ではないものの、おおむね順調に進展していると考えた。本研究の目的は毛包をとりまく間葉系細胞の毛包発生シグナルに対する反応を明らかにし、それを応用し毛包再生を促す基礎的技術の確立である。前年度までの検討でヒト健常皮膚由来線維芽細胞は他の毛包由来細胞と比して特異的なFGF発現プロファイルを有し、毛包発生に重要なWNTシグナルの活性化によりそれをFGF7の低下、FGF9の上昇に代表される毛包促進的なものに変化させる事が明らかとなった。また、毛乳頭細胞へのFGF7、9の添加により毛包新生に重要とされる遺伝子の発現が変化することが確認された。本年度は特にFGF7、9に着目し、その毛包再生促進効果を検証した。まずWNTシグナル活性化因子CHIR99021の添加によるFGF7、9の発現変化がタンパクレベルかつ濃度依存性に起きることを明らかにした。次に毛乳頭細胞へのFGF7、9の添加実験を、ケラチノサイトとの共培養下で行い、単独培養時と同様の重要遺伝子の上昇傾向を確認した。また、ケラチノサイトにFGF7、9を添加し、単独培養、毛乳頭細胞との共培養下での重要遺伝子の発現変化を検証したところ、TRPS1やKRT75などの遺伝子の有意な発現変化が共培養時にのみ認められた。さらにFGFの毛包再生に与える影響をin vivoで検証すべく、マウス背部皮下に移植したチャンバー内にマウス胎児皮膚より分離した真皮・表皮細胞を混合移植し、FGF7、9を2週間投与後に、再生上皮の毛包再生効果を検証したところ、FGF9投与群では他群に比して早期に毛包再生が確認され、再生毛包数、毛包直径ともにコントロール群を有意に上回ったのに対し、FGF7群では再生毛包直径が有意に小さかった。以上より、ヒト頭皮由来線維芽細胞は局所のWNTシグナル活性化に伴い毛包再生に促進的な微細環境形成に寄与することが示唆された。その特性はヒト再生毛包の実現に活用できる可能性があると期待される。

まず、毛包の再生にとって重要なWNTシグナル経路の刺激をヒトの毛包周囲から分離・培養した線維芽細胞に与えると、細胞増殖因子であるFGFファミリーのうちFGF9の上昇やFGF7の低下といった変化が毛包を構成する細胞に作用し毛包の再生に有利な条件をつくり出すことがわかった。ヌードマウスを用いた毛包再生実験ではFGF9を加えることで毛包の再生が促進され、毛包のサイズや数が増えた。本研究の結果は、ヒトの毛包再生技術の確立の一助となりうると考えられた。平成27年度の研究成果として、WNTシグナルが線維芽細胞に与えるFGFプロファイルの変化および、その結果として起こる毛乳頭細胞での各メディエーターの発現プロファイル変化が得られた。これらの変化を踏まえ、次に毛乳頭細胞とケラチノサイトの相互作用に着目する。特に毛包新生において重要と考えられ、我々の実験でもWNTシグナル刺激により有意な発現変化を示したFGF7, 9につき、それらの組み換えタンパクを添加した培養条件下でケラチノサイトの単独培養およびケラチノサイトと毛乳頭の共培養を行い、毛包関連マーカー(KRT75, TRPS1, MSX2, LEF1など)のプロファイル変化を検証する。有意な変化が得られた場合には適切条件化での培養上清を共培養系に加えて同様の結果が得られるかを検証する。またin vitroの解析で得られた遺伝子の発現変化が実際に毛包再生の効率を向上させるか、in vivoの実験系を用いて検証する。具体的にはKRT75, TRPS1, MSX2, LEF1などの添加下で培養された線維芽細胞または結合織鞘細胞、毛乳頭細胞、表皮細胞をマウス皮下に共移植し、5-6週後に回収する。形態学的評価、免疫組織科学的評価、遺伝子発現解析などを用いて活性化因子添加間葉系細胞が毛包再生に与える影響について評価する。これらの実験によりケラチノサイトでの毛包マーカー(KRT75, KRT33A, TRPS1など)の遺伝子レベルでの上昇をPCRを用いて確認し、毛包再生促進効果を評価する。毛髪疾患当初300000円の旅費を直接経費の交付予定額に含んでいたが、研究代表者が取得した参加学会からの旅行助成金および所属施設からの支出で賄うことができた。各プライマーおよびRNA抽出、cDNA化、PCRに必要な試薬に関して、研究代表者が所属する研究室ですでに保有していたものを使用することができた。・研究に関連した学会参加のための旅費に使用する。・ヒト余剰皮膚から得られる各間葉系細胞に限りがあり必要な母数を獲得するための各種細胞の購入に使用する。
細胞との情報授受を行う機能性架橋点を持つ３次元ポリマーネットワーク

昨年度までに様々な知見を得ていたマウス間葉系幹細胞(C3H10T1/2)に加え、マウス線維芽細胞(L929)を細胞やたんぱく質と相互作用のないことで知られているリン脂質ポリマーハイドロゲルに内包しその増殖率を測定した。幹細胞と異なり、足場依存性の増殖を示すことで知られているL929についてもリン脂質ポリマーハイドロゲル内での増殖が認められた。この2種類の細胞の増殖率を比較することで細胞種によって異なる増殖率の貯蔵弾性率依存性があることがわかった。これらの細胞に対して細胞ータンパク質間の接着に関わる膜タンパク質であるインテグリン、および細胞ー細胞間の接着に関わる膜タンパク質であるカドヘリンの発現量を測定した。インテグリンの発現量については、細胞種、増殖率のいずれについても相関は得られなかったが、カドヘリンの発現量については増殖の抑制された細胞について発現量が増加することがわかった。これらの結果は細胞の増殖が周囲から与えられる圧力により制御されているのではないかという仮定を支持するものであると考えられる。特に、今回細胞の増殖に変化がみられる貯蔵弾性率の範囲が細胞の弾性率として報告されている弾性率と近い値であること、またカドヘリンの発現量が特に影響されることから細胞は自身の固さと同等の固さの周辺環境におかれることで増殖を停止するのではないかと考えられる。このため、今後の応用を考えると周辺環境は内包する細胞に合わせた弾性率を有することが望ましいが、このリン脂質ポリマーハイドロゲルは架橋点部位となるフェニルビニルボロン酸の密度で弾性率を制御することが可能であるため適応することのできる範囲は広い。さらにサブマイクロメートルオーダーのポリマー微粒子をリン脂質ポリマーで架橋する方法を確立したため、今後はさらにシグナル分子を架橋点に付与することも可能となる。27年度が最終年度であるため、記入しない。3次元ネットワークの架橋点形成部位および培養液に存在する糖分子の間の結合定数を測定した。低分子同士の結合とは異なる高分子効果による挙動を評価することで架橋点部位の結合定数を基準として考えることで異なる糖濃度を有する細胞培養用培地においても架橋点形成を可能とするポリマー設計が証明された。3次元ネットワークの貯蔵弾性率を架橋点密度により制御した。また3次元ネットワーク形成に関与していない高分子を混和することで貯蔵弾性率を保ったまま浸透圧を変化させた。ネットワーク内のタンパク質の拡散定数を測定することでタンパク質といった化学的なシグナルに影響を与えることなく、細胞周辺環境の物理的な環境を制御することができたことが確認された。マウス間葉系幹細胞をハイドロゲルに内包したところ、貯蔵弾性率を1.0 kPa以上とすることで内包細胞の増殖が抑制され、24時間で95%以上の細胞の細胞周期が間期に収束した。膨潤により貯蔵弾性率を0.6kPa程度まで低下させると細胞の増殖を再開することが可能であった。このように内包細胞を間期に収束させ、任意のタイミングで増殖を再開させることができることを利用して分化誘導シグナルの導入を試みた。細胞周期を制御せずシグナルを導入したものに対し、細胞周期を制御してシグナルを導入したものは3日後の分化マーカーの発現量が1.7倍に増加した。化学的や試薬を使用したり細胞を飢餓状態にする事なく高効率に分化誘導シグナルを導入することが可能であった。間葉系幹細胞に加え、繊維芽細胞の内包することで細胞種によって増殖が認められる貯蔵弾性率の範囲が異なることがわかった。これは細胞周辺環境の物理特性が細胞に与える影響を理解する上で重要な結果となる。また、貯蔵弾性率一定のまま浸透圧を変化させることによっても細胞の増殖率が変化するという現象を見いだしている。

細胞との化学的な相互作用のない3次元ネットワークを構築したことを確認する実験手法、および化学的な相互作用のない3次元ネットワークに適した物性評価の系を確立することができた。三次元ネットワークの構築に関してはその架橋点形成を結合定数として評価することで同様のボロン酸ージオールの反応を用いた異なる分子構造を有する高分子に対しても一義的な評価が可能になった。現在、粒子表面にジオールを配置しボロン酸を含む高分子を利用した3次元ネットワークの構築に取り組んでおり、その分子設計においても今回得られた知見は有用である。また、3次元ネットワークの物理的特性として貯蔵弾性率に加えて浸透圧係数を測定する方法を確立した。このことによりフリーポリマーの導入により二つの物性を分けて議論することが可能となった。細胞を化学反応の集合体としてとらえた場合、細胞に作用する圧力が細胞の機能発現に影響を与えることは想像に難くない。この3次元ネットワークの構築により微細な圧力変化が細胞に与える影響を議論することが可能となった。これらの物理的な測定に加え、細胞の機能評価方法を確立した。細胞内の遺伝子発現を解析するためのRT-PCR法、細胞膜表面に存在する膜タンパク質をフローサイトメーターにより解析する方法が確立されている。また、現在細胞内のNADPHの量を定量することを試みている。このような測定により、細胞の機能発現を定量的に評価することが可能となる。ネットワークの物理的な測定と合わせることにより、細胞周辺環境の情報、また細胞の情報の両方を数値としてとらえることが可能となった。最後に架橋点として機能性粒子を導入する方法であるが、現在乳化重合法による粒子の作成、および三次元ネットワークを構築可能なポリマーの合成を行っている。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策として大きく二点挙げられる。一つは現在までに確立した細胞周辺環境、及び細胞機能の定量評価方法を用いて細胞に影響を与える周辺環境のパラメーターを明らかにすることである。現在までに細胞の遺伝子発現、タンパク質の発現から増殖といった初期から後期までの応答を評価することが可能となった。さらにNADPHの量を評価することによりこれらの反応系のつながりを明らかにすることができる。これらの反応の関連性および時間変化を定量することにより細胞内で起こっている化学反応についての理解が深まると考えられる。二つ目はより詳細な制御が可能な細胞周辺環境の構築である。現在現在乳化重合法による粒子の作成、および三次元ネットワークを構築可能なポリマーの合成を行っている。安定的に3次元ネットワークを構築できるようにした後に所属する研究室で既に方法が確立している粒子への機能付与を行うことで、細胞へのシグナルを更に高度に制御した3次元ネットワークを構築することができる。これら二つの項目を達成することにより、細胞周辺環境が細胞に与える影響を化学反応系として理解することが可能となる。これはより的確で能動的な細胞機能制御に繋がる。
全トランス型レチナールを発色団とするロドプシン類の解析とGPCRモデル化

(1)水溶性蛍光消光剤を利用した膜貫通ヘリックスの構造変化の解析:蛍光プローブを部位特異的に導入するため、システイン残基を「消去」したウシロドプシン(Rh)、ペロプシン(Pero)を作製し、それらのヘリックス6に存在する250番目のアミノ酸残基に蛍光色素bimaneを導入し、蛍光寿命を測定し、RhとPeroの発色団の光異性化にともなうヘリックス6の溶媒への露出度変化の解析を試みた。また、消光剤を用いず244番目の残基にbimaneを導入し、蛍光スペクトルの変化からら構造変化を解析した。その結果、Rhについては、光照射によりヘリックス6の溶媒への露出を示す構造変化がとらえられたが、Peroについては、特に後者の実験から、光照射によりほとんど構造変化しない可能性が考えられた。(2)部位特異的蛍光消光を利用した膜貫通ヘリックスの構造変化の解析ヘリックス3と6の構造変化の方向を比較するために、ヘリックス6の250、251番目に蛍光分子bimaneを導入、消光分子トリプトファン(Trp)をヘリックス3と5に導入した。ヘリックス3(139番目)へのTrpの導入は、Rhでは上手くできたが、Peroとレチノクロム(Ret)では困難であった。ヘリックス5の226と227番目にトリプトファンを導入した時、ともに発現量の低下がおこったが、227番目の場合(251C/227W変異体)についてはある程度純度よく精製に成功した。そこで、251C/227Wについて光依存的な分子内消光を解析した結果、Rhでは、光依存的にヘリックス6がヘリックス5に近づく結果が得られたが、PeroとRetの構造変化は捕らえられなかった。(1)と(2)から、ウシロドプシンに比べてペロプシンとレチノクロムでは、光依存的な構造変化がきわめて小さい、または光依存的にほとんど動かないかもしれないことが示唆された。これまでの研究から、ペロプシンは全トランス型レチナールを発色団とするが、光依存的にGタンパク質を活性化することが示唆されている。ペロプシンとロドプシンの構造変化を比較するために、蛍光プローブを導入し分光学的に以下の実験を行った。また、同じく全トランス型レチナールを発色団とするがGタンパク質を活性化しないレチノクロムも対照として実験した。(1)水溶性蛍光消光剤を利用した膜貫通ヘリックスの構造変化の解析ウシロドプシン、ペロプシン、レチノクロムについて、ヘリックス6の細胞質側に存在するアミノ酸残基をシステインに置換し、bimaneを用いて部位特異的蛍光標識を行うことができるのかを調べた。その結果、ウシロドプシンとペロプシンについては、蛍光標識したタンパク質を精製することに成功したが、レチノクロムについては、色素を効率よく精製することができなかった。さらに、ウシロドプシンとペロプシンについて、水溶性の消光分子KIを用いて解析を行ったところ、ウシロドプシンについては光依存的なヘリックス6の顕著な構造変化を検出することに成功した。現在、ペロプシン解析のための最適な条件を検討している。(2)部位特異的蛍光消光を利用した膜貫通ヘリックスの構造変化解析ウシロドプシンについて、ヘリックス6の残基の蛍光標識に加えてヘリックス3に消光分子であるトリプトファン残基を導入することができた。一方、ペロプシンについては発現量がすくなかった。すなわち、ヘリックス5などのヘリックス3以外の部位にトリプトファン残基を導入する必要があることがわかった。

(1)と(2)から、ウシロドプシンに比べてペロプシンとレチノクロムでは、光依存的な構造変化がきわめて小さい、または光依存的にほとんど動かないかもしれないことが示唆された。
減数第一分裂における還元分裂の制御メカニズムの研究

遺伝情報の正確な複製・分配は細胞が増殖する際に必須であり、そのメカニズムは細胞内で厳密に制御されている。真核生物ではその目的に応じて体細胞分裂と減数分裂の二つの異なる分裂様式を使い分けている。通常の細胞増殖に用いられる体細胞分裂では、母細胞と同じ遺伝情報を持つ二つの娘細胞が生み出される。この際、複製された二本の染色体(姉妹染色分体)は娘細胞へ一本ずつ均等に分配される(均等分配)。一方、減数分裂は半数体の配偶子を形成する際に用いられる分裂様式である。このため一回のDNA複製の後、二回の連続した分裂(減数第一分裂・第二分裂)がおきることで染色体数を半減させる。この減数第一分裂では体細胞分裂や減数第二分裂とは異なり、姉妹染色分体は接着を保持したまま片側の極へと分配される(還元分配)。このような均等分配と還元分配の違いを引き起こしているのは、姉妹動原体の方向性にあることが明らかになっている。体細胞分裂や減数第二分裂では姉妹動原体は両極からのびるスピンドル微小管に捉えられ二方向性結合を形成しているが、減数第一分裂では共に同一側の極から捉えられた一方向性結合になっている。この一方向性結合の確立には、減数分裂特異的なRec8コヒーシン複合体が姉妹染色分体のセントロメア中央領域(動原体形成部位)を接着することによって一方向性の構造を持つ姉妹動原体を作り出す事が必須であることが示されている。一方で、減数分裂期特異的な動原体タンパク質Moa1はPlo1(保存された分裂期キナーゼであるPoloキナーゼの分裂酵母ホモログ)と複合体を形成し一方向性結合の確立に必須の機能を果たしている。Moa1-Plo1複合体は一方向性動原体が形成される減数分裂前DNA複製期から減数第一分裂中期にかけて動原体に局在する事がわかっているが、どのようなメカニズムで一方向性結合の構築を制御しているのかは全く不明である。そこでまずmoa1遺伝子破壊株ではセントロメア中央領域におけるRec8の局在に変化がみられないことに着目した。このことからmoa1遺伝子破壊株においてRec8コヒーシン複合体は局在しているものの姉妹染色分体間の接着というコヒーシン本来の機能を果たしてないと考えられる。近年の研究からコヒーシン複合体が姉妹染色分体を接着するためには局在するだけではなくアセチル基転移酵素ECO1(分裂酵母ではEso1)によるコヒーシン複合体サブユニットのアセチル化が必要であることが明らかになっており、その主な標的はS期においてはSmc3、DNA損傷応答に際してはRad21(体細胞分裂期におけるRec8相同因子)であることが分かっている。このことからMoa1-Plo1複合体はコヒーシンのアセチル化状態の制御を行うことにより、セントロメア中央領域の姉妹染色分体間の接着を促進し一方向性結合を形成している可能性が考えられた。eso1遺伝子破壊株は致死であるため既存のeso1温度感受性株を用いて減数第一分裂における姉妹染色分体の分配形式を観察したところ、moa1遺伝子破壊株同様、減数第一分裂に欠損を生じる事が示された。また、moa1破壊株においてEso1を強制的にセントロメアに局在化させたところ、そのアセチル基転移活性に依存してmoa1破壊株の表現型を20%程度抑圧することが示された。そこでEso1とMoa1が複合体を形成する可能性を考え、Yeast Two-hybrid法および減数分裂期の細胞を用いて共沈実験を行った所、Eso1とMoa1は減数分裂期において相互作用している事が示された。このことからMoa1-Plo1複合体がEso1を介してセントロメア中央領域でコヒーシン複合体のアセチル化を亢進し姉妹染色分体の接着を促進していることが考えられた。細胞は染色体の分配形式の異なる体細胞分裂と減数分裂の二つの分裂様式を使い分けている。増殖の際に用いられる体細胞分裂では複製された姉妹染色分体は動原体の二方向性結合が確立し、両極へと均等に分配されるのに対し、生殖細胞で見られる減数分裂では減数第一分裂において姉妹動原体は一方向性の結合となり、同じ方向の極へと移動する(還元分配)。このような姉妹染色分体の分配様式の制御は遺伝情報を正しく子孫へと伝えるために必須であり、減数分裂期における染色体分配異常は流産およびダウン症やターナー症候群などの先天性疾患の原因となることが知られている。減数分裂における姉妹染色分体の還元分配の制御メカニズムは真核生物で広く保存されている事から、本研究ではモデル生物として分裂酵母を用いる事で還元分配および姉妹動原体の一方向性結合の制御メカニズムを詳細に解析する事を試みている。分裂酵母の減数分裂における姉妹動原体の一方向性の制御には、減数分裂期特異的動原体タンパク質MoalとPolo-likeキナーゼの分裂酵母ホモログPlo1の複合体が必須の役割を果たしている。そこで一方向性結合を確立するのに必要な新規因子を同定するためのスクリーニングを行った。その結果、スプライソソーム複合体に含まれる因子として同定されていたアセチル基転移酵素モチーフを持つ遺伝子を含むクローンが同定された。この因子は姉妹染色分体間の接着を確立するのに必要である事が知られている別のアセチル基転移酵素の温度感受性株のマルチコピーサプレッサーとしても同定されていた。

そこで現在この2つのアセチル基転移酵素がどのようにMoal-Plol複合体と関わる事により姉妹動原体の一方向性結合を制御しているかについて解析中である。分裂酵母の減数分裂における姉妹動原体の一方向性の制御には、減数分裂期特異的動原体タンパク質Moa1とPolo-likeキナーゼの分裂酵母ホモログPlo1の複合体が必須の役割を果たしている。また、一方向性結合の確立にはセントロメアにおいて動原体を形成している中央領域における姉妹染色分体間の接着が必要であることが知られている。そこで一方向性結合を確立するのに必要な新規因子を同定するためのスクリーニングを行った結果、cwf24遺伝子を含むクローンを同定した。cwf24はアセチル基転移活性ドメインを持つタンパク質をコードしており、同じくアセチル基転移酵索として知られるeso1の温度感受性株のマルチコピーサプレッサーであることが分かっていた。Eso1は既に体細胞分裂期において姉妹染色分体の接着に寄与する因子であることが知られており、減数分裂期においてcwf24は特徴的な発現パターンを示さないがeso1はmoa1と似たような発現パターンを示す事から、Eso1について減数第一分裂におけるEso1の機能、およびその機能がMoa1-Plo1複合体に制御されるものであるか、されるとしたらどのようなものであるか解析を試みた。まず、eso1遺伝子破壊株は致死であるため既存のeso1温度感受性株を用いて減数第一分裂における姉妹染色分休の分配形式を観察した所ところ、moa1遺伝子破壊株同様、減数第一分裂に欠損を生じる事が示された。また、moa1破壊株においてEso1を強制的にセントロメアに局在化させたところ、そのアセチル基転移活性に依存してmoa1破壊株の表現型を20%程度抑圧しすることが示された。そこでEso1とMoa1が複合体を形成する可能性を考え、Yeast Two-thybrid法および減数分裂期の細胞を用いて共沈実験を行った所、Eso1とMoa1は減数分裂期において相互作用している事が示された。Eso1が体細胞分裂期ではアセチル基転移活性を介して姉妹染色分体間の接着を促進していることが知られているため、減数第一分裂期においてはMoa1-Plo1複合体と相互作用することによってアセチル基転移活性が活性化されることで中央領域における姉妹染色分体間の接着が促進されるのではないかと考え、1)in vitro2)in vivoにおけるアセチル化活性解析を行った。出芽酵母およびヒトにおいてEso1によるアセチル化の最も重要な標的はコヒーシンサブユニットSmc3であり、そのアセチル化されるリジン残基も広く保存されており、姉妹染色分体間の接着に重要な役割を果たす事が分かっている。そこで分裂酵母Smc3においてもこのリジン残基がアセチル化されているかどうか、アセチル化Smc3(出芽酵母)特異的な抗体を用いて検出したところ、このリジン残基のアセチル化はeso1温度感受性株においてほぼ失われている事が示された。このことからEso1によるSmc3のアセチル化は分裂酵母でも保存されている事が示された。遺伝情報の正確な複製・分配は細胞が増殖する際に必須であり、そのメカニズムは細胞内で厳密に制御されている。真核生物ではその目的に応じて体細胞分裂と減数分裂の二つの異なる分裂様式を使い分けている。通常の細胞増殖に用いられる体細胞分裂では、母細胞と同じ遺伝情報を持つ二つの娘細胞が生み出される。この際、複製された二本の染色体(姉妹染色分体)は娘細胞へ一本ずつ均等に分配される(均等分配)。
植物のABC蛋白によるアルカロイド輸送制御と生体機能維持機構

前年度に引き続き、オウレンのmdr様ABC蛋白質であるCjmdr-1のベルベリン輸送機能をアフリカツメガエルの卵細胞を用いて詳細に解析し、本遺伝子産物が、真核生物としては最初の例となる、内向き輸送性のABC蛋白質であることを示した。また、そのインタクト植物における発現部位が、根茎の木部組織の一部であることをin situ hybridizationにより証明し、本ABC蛋白がベルベリンのアンローディングに関わっていることを示唆した。第2のcDNAクローンCjmdr-2に関して同様の輸送解析を現在行っているが、本遺伝子産物もCjmdr-1とほぼ同じ組織で発現していることを明らかにした。また本年度は、植物細胞の内在性ABC蛋白を検出するために、バナデートトラップ法を植物用に改良して、アキカラマツに応用した。これによりアキカラマツ細胞で発現するABC蛋白の特性を調べたところ、ベルベリン生産誘導下で特異的に発現してくるABC蛋白がベルベリンを輸送基質として認識することがが明らかとなった。さらに、アキカラマツの細胞がベルベリンをはじめ多くの芳香族化合物を取り込まないのは、その液胞膜に原因があるのではなく、細胞膜上の輸送体の特性によるものであることを示した。一方、ヒトMRPを発現させたタバコにおいて薬剤耐性や環境ストレス耐性の解析を行ったところ、この形質転換タバコがカドミウムや除草剤のアラクロールに耐性を示し、さらにこれらの物質を細胞内に取り込む活性を示すことが明らかとなった。これにより、植物のMRPも同様の生理的機能を担っていることを示すとともに、この植物を応用した環境浄化(ファイトリメディエーション)の方向にも研究を展開させた。本年度は主に、ベルベリンを多量に生産し液胞内に輸送するオウレン(Coptis japonjca)の培養細胞系をモデルとして用いた。本培養細胞は、培地に添加したベルベリンも効率良く液胞に輸送するが、これまでにこの輸送は細胞生長期に特異的で、培地のpH変化に依存せず、細胞内のλ正レベル及び膜ATPaseに依存することを明確にした。また本輸送活性は、種々のP-糖蛋白質の阻害剤で強く抑制され、これに対し液胞膜ATPaseの特異的阻害剤やΔψの破壊では強い阻害が認められなかったことから、改めてこの輸送に対するABC蛋白の寄与を示した。ただし、GSHやその生合成阻害剤ではほとんど影響を受けなかったことから、本輸送にMRPが関与する可能性は低いと考えられた。なお、ベルベリン非生産性の植物細胞ではこの取込み現象は観察されず、むしろ本アルカロイドによる毒性が発現した。即ち本輸送能は植物種特異的なものであり、自身の生産する活性物質に対する植物細胞の解毒機構として働いていることが示唆された。一方、mdrサブファミリーに共通なATP結合部位の保存配列を利用したRT-PCRと、5'-及び3'-RACEを組み合せることにより、約4kbのmdrl様遺伝子のcDNA全長をクローニングすることに成功した。本cDNA Cjmdr1は1289個のアミノ酸をコードしており、これはヒトのP-糖蛋白質と38%の相同性を示した。Cjmdr1と最も高いアミノ酸相同性を示したのはArabidopsisの機能不明の遺伝子Atmdr3で、67%の同一性を示した。また、そのhydoropathyprofileはP-糖蛋白質と酷似しており、同様のトポロジーを持つと判断された。さらに、ノーザンブロットにより、オウレン培養細胞では本遺伝子は培養期間を通じてほぼ構成的に発現していることを明らかにした。本年度はオウレンの単離液胞を用いた、ベルベリンのin vitro輸送活性測定法を確立した。同培養細胞のインタクト液胞をアルカロイドとインキュベートし、これをシリコンオイル相を通して遠心濾過し、取り込まれた標識ベルベリンの放射活性を輸送活性とした。本実験系において、ベルベリンの液胞への取り込みはATPの存在下で対照に比べ50%上昇するのに対し、非加水分解性アナログのATP-γ-Sではその上昇が全く見られないことを明らかにした。また、引き続きオウレンABC蛋白を検索し、全長4kbの新分子種Cjmdr2のcDNAをクローニングした。そのアミノ酸配列は、Cjmdr1のそれと82%の同一性を有し、同じmdrサブファミリーに属することが明らかとなった。これを植物由来のホモログと比較することにより、NBF1と次の膜貫通部位の間の約80アミノ酸に、分子種間で非常に多様性が高いドメインがあることを見いだした。また配列的特異プローブを用いたノーザン解析では、両分子種とも培養細胞においてはほぼ構成的に発現しているが、植物体では器官特異的発現に差異が見られた。即ちCjmdr1は花や花茎で中程度の、根茎では高い発現を示したのに対し、Cjmdr2はほとんど根茎でのみ発現していた。根茎はベルベリンの主要蓄積組織であることから、アルカロイド蓄積と両分子種の発現部位との間に密接な相関があることが示された。ベルベリン分泌型のアキカラマツ培養細胞において、ベルベリン非生産状態の細胞においてもその輸送能が保持されていることが明らかとなった。これは本植物のベルベリン輸送能がその内在性ベルベリンの有無に関らず発現していることを示す。

また蛍光プローブのCalcein AMを用いアキカラマツ細胞のmdr依存的輸送活性を観察したところ、アキカラマツではコントロールのタバコ細胞と異なり細胞質にCalceinが蓄積されず、原形質膜にヒトP-糖蛋白質と同様の物質排出機構を有することが認められた。本研究で取り上げている問題の一つに、アルカロイド耐性に対する植物種の特異性がある。本年度は、これに関わる遺伝子産物を同定することを目指し、オウレンから作成したcDNA libraryを酵母に発現させて、ベルベリン含有プレート上で形質転換体を選抜し、耐性株からオウレン遺伝子を回収してその実体を突き止める実験を行った。スクリーニングに用いた株としては、形質転換効率の良さから野生株を用い、10^6cfuの母集団から最終的に6クローンのcDNAが陽性クローンとして得られた。これらを含むプラスミドを酵母に再導入したところ、空ベクターの対照に比べて明らかにベルベリン培地上における生育が早いことが認められた。現在これらのうち、3クローンの配列解析が終了しているが、内2クローンはユビキチン、1クローンはデヒドロキナ酸デヒドラターゼのホモログであることが解明された。これらがオウレンのベルベリン耐性に寄与する機構の解明は今後の課題である。一方、植物におけるABC蛋白質の生理的役割を解明する手段として、既に生化学的性質が詳細に解明されているヒトの輸送体遺伝子を植物に導入し、その表現系を検定する手法をとった。ヒトのP-糖蛋白質遺伝子mdr1と、MRP群の代表であるMRP1の全長cDNAをバイナリーベクターにサブクローニングし、タバコに導入した。Mdr1はその転写物が検出されたのみにとどまったが、MRP1はタバコ植物体および培養細胞において、蛋白質レベルでもその発現を確認できた。MRP1導入タバコの外観は、野生株と比べて差違が認められず、形態に対する影響はほとんど無いものと判断されたが、形質転換タバコは野生型に比べて、明らかにダウノルビシンやカドミウムに対する耐性が上昇していることが認められた。このカドミウムに対する耐性の差は、芽生えの根の生育においてより顕著に現れていた。このことは、植物のMRPが植物の根を土壌中の重金属汚染から保護する役割を果たしているとの仮説を支持するものである。本研究においては、植物におけるABC蛋白質の発現およびその機能を解析し、生理的役割を明らかにすることを大きな目標としている。まずモデルとして、アルカロイドのベルベリンを高生産するオウレン培養細胞を用い、そこでアルカロイドの輸送に関与すると推定されている代表的ABC蛋白、Cjm dr1の機能を証明するため、Xenopusのoocyteに発現させた。その結果、Cjm dr1がベルベリンのinfluxに関与しているとのデータを得、この内向きの輸送が典型的なmdrタイプの分子種と類似の輸送特性を示すことを突き止めた。ベルベリンは、根組織で生合成された後、根茎に転流されて蓄積しているが、Cjm dr1はその根茎で最も発現が高い。そこで、根茎においてin situ hybiridzationを行ったところ、Cjmdr1に特異的なシグナルが、根茎の木部組織に認められた。これに対して、根組織ではCjmdr1に由来するシグナルが認められなかった。さらに、生化学的解析により、CjMDR1蛋白は、オウレンの細胞膜に局在していることが認められた。
倍数性コムギの比較ゲノム解析

コムギは倍数化により進化してきたことを特徴とする。本研究は、温帯性冬作の重要作物である6倍性パンコムギの比較ゲノム解析を目的とする。パンコムギで高分子DNAを挿入したゲノミックライブラリーを構築する。このライブラリーから効率よく遺伝子をスクリーニングできるシステムを開発する。さらに、環境に応答して倍数種のゲノム間ででのように遺伝子発現を調節しているか、解析する。熱帯性・夏作のイネとの比較により、イネ科植物でみられる自然変異に分子発生遺伝学的基礎をあたえ、進化のメカニズムの解明をめざす。本年度の具体的成果は、1)コムギの生活環の代表的な10組織のcDNAクローン116232塩基配列を25971contigに整列化した。これらのうちから、比較的発現量の多い5199contigを選抜し、10組織における遺伝子発現のボディマップを作成した。2)5199遺伝子のうち3069遺伝子をゲノムあたり単一である、と推定した。これらのうち、90遺伝子についてPyrosequencing法とパンコムギのナリーテトラソーミクス系統を組み合わせることにより、A, B, Dゲノムの座乗染色体を決定した。さらに、10組織による3種ゲノムにおけるゲノム毎の遺伝子発現パターンの特徴を明らかにした。3)低温・高温、日長、塩・等の非生物的ストレス、またかび病等の病原菌等の生物的ストレスをかけ、cDNAライブラリーを構築した。構築したcDNAライブラリーを総括班に送り、塩基配列を決定している。4)日長に感応して出穂性を制御するHd遺伝子、および花の形態形成を支配するMADS box遺伝子であるAP1,PISTILATAおよびAGAMOUSをクローニングした。これらの遺伝子の発現パターンの特徴を解析している。
頭頚部癌の遺伝子不安定性とField cancerization

頭頚部癌の癌化に関わる遺伝子不安定性(microsatellite instability : MSI)の頻度と臨床病理学的因子との関連を明らかにすることを目的として実験をおこなった.また癌化に関わる因子として癌抑制遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化を指標としてp16遺伝子の不活性化を検討した.1)研究材料本学付属病院で検査,治療を受けた頭頚部癌患者から採取した癌組織と末梢血リンパ球を用いた.2)研究方法頭頚部癌組織から腫瘍DNAを抽出した.同時に末梢血リンパ球からもコントロールとして正常DNAを抽出した.特定の染色体領域のPCR primerを購入し,ラジオアイソトープでラベルし,マイクロサテライト解析で遺伝子異常(MSI)を調べた.3)結果MSIは約20%に認められた.MSIと臨床病理学的因子との関連は明らかでなかった.p16癌抑制遺伝子のDNAメチル化は約40%に認められ,頭頚部癌の癌化と密接な関連が見出された.重複癌,多重癌との関連について検討をおこなったが,明らかな関連は認めなかった.Field cancerizationについての検討を引き続きおこなうこととした.以上の結果は平成13年12月の日本耳鼻咽喉科学会神奈川県地方部会,14年5月の日本耳鼻咽喉科学会総会,14年5月の日本耳鼻咽喉科学会,6月の日本頭頚部腫瘍学会,10月の日本癌学会で発表した.またThe Tokai Journal of Experimental and Clihical Medicineに掲載予定である.頭頚部癌の癌化に関わる遺伝子不安定性(microsatellite instability : MSI)の頻度と臨床病理学的因子との関連を明らかにすることを目的として実験をおこなった.また癌化に関わる因子として癌抑制遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化を指標としてp16遺伝子の不活性化を検討した.1)研究材料本学付属病院で検査,治療を受けた頭頚部癌患者から採取した癌組織と末梢血リンパ球を用いた.2)研究方法頭頚部癌組織から腫瘍DNAを抽出した.同時に末梢血リンパ球からもコントロールとして正常DNAを抽出した.特定の染色体領域のPCR primerを購入し,ラジオアイソトープでラベルし,マイクロサテライト解析で遺伝子異常(MSI)を調べた.3)結果MSIは約20%に認められた.MSIと臨床病理学的因子との関連は明らかでなかった.p16癌抑制遺伝子のDNAメチル化は約40%に認められ,頭頚部癌の癌化と密接な関連が見出された.重複癌,多重癌との関連について検討をおこなったが,明らかな関連は認めなかった.Field cancerizationについての検討を引き続きおこなうこととした.以上の結果は平成13年12月の日本耳鼻咽喉科学会神奈川県地方部会,14年5月の日本耳鼻咽喉科学会総会,14年5月の日本耳鼻咽喉科学会,6月の日本頭頚部腫瘍学会,10月の日本癌学会で発表した.またThe Tokai Journal of Experimental and Clihical Medicineに掲載予定である.頭頚部癌の癌化に関わる遺伝子不安定性(microsatellite instability:MSI)の頻度と臨床病理学的因子との関連を明らかにすることを目的として実験をおこなった.1)研究材料本学付属病院で検査,治療を受けた頭頸部癌患者から採取した癌組織と末梢血リンパ球を用いた.2)研究方法頭頸部癌組織から腫瘍DNAを抽出した.同時に末梢血リンパ球からもコントロールとして正常DNAを抽出した.特定の染色体領域のPCR primerを購入し,ラジオアイソトープでラベルし,マイクロサテライト解析で遺伝子異常(MSI)を調べた.また新たに癌化に関わる因子として癌抑制遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化に着目し,p16遺伝子の不活性化を検討した.3)結果MSIは約20%に認められた.MSIと臨床病理学的因子との関連は明らかでなかった.p16癌抑制遺伝子のDNAメチル化は約40%に認められた.以上の結果は平成13年12月の日本耳鼻咽喉科学会神奈川県地方部会で発表し,14年5月の日本耳鼻咽喉科学会総会で発表予定である.引き続き,重複癌における遺伝子異常やField cancerizationについても検討する予定である.頭頚部癌の癌化に関わる遺伝子不安定性(microsatellite instability : MSI)の頻度と臨床病理学的因子との関連を明らかにすることを目的として実験をおこなった.また新たに癌化に関わる因子として癌抑制遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化に着目し,p16遺伝子の不活性化を検討した.1)研究材料本学付属病院で検査,治療を受けた頭頸部癌患者から採取した癌組織と末梢血リンパ球を用いた.2)研究方法頭頸部癌組織から腫瘍DNAを抽出した.同時に末梢血リンパ球からもコントロールとして正常DNAを抽出した.特定の染色体領域のPCRprimerを購入し,ラジオアイソトープでラベルし、マイクロサテライト解析で遺伝子異常(MSI)を調べた.また腫瘍DNAのメチル化の有無をmethylation specific PCR法で調べた.3)結果MSIは約20%に認められた.MSIと臨床病理学的因子との関連は明らかでなかった.p16癌抑制遺伝子のDNAメチル化は約40%に認められ,頭頸部癌の癌化と密接な関連が見出された.重複癌,多重癌との関連について検討をおこなったが,明らかな関連を見出せず,Field cancerizatioについての検討を引き続きおこなうこととした.