hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マレーシア・サラワク州の熱帯雨林における流出・水質形成プロセスの研究

流出量測定は自然河道を用い、断面積と流速を実測して、水位-流量曲線を作成し、連続観測する水位記録から、水位-流量曲線を用いて、流量を求めた。現地滞在中に、自動採水装置を稼動させて、短い時間間隔で渓流水を採取した。対象とする流域の斜面やO次谷の末端にある湧水点における採水、支流の合流点における採水によって、渓流水質の空間分布を調べた。また、流域の水分状態による、空間分布の変動を把握した。既往の気象観測資料の解析から、10年間の年雨量、蒸発散量、樹冠遮断量、蒸散量を求め、それぞれ2600mm,1114mm,209mm,1323mmであることを公表した。また、年降水量の標準偏差が272mmあるのに対し、蒸発散量は74mmと年々変動が小さいことを示した。ランビル国立公園内の2流域は、SO42-が高濃度で流出しており、硫酸酸性の渓流水である。観測結果の詳細は、(1)渓流水SO42-濃度の空間分布の範囲は、時系列分布の範囲よりも大きかった。(2)支流の尾根および上流域に分布する砂質土壌の土壌水SO42-濃度は、下流域の斜面下部に分布する粘土質土壌の土壌水SO42-濃度より2オーダー大きかった。(3)土壌水のpHが4.8以下、Ca2+濃度が約20μmolcL-1以下になるとA1の溶出が始まり、さらに、SO42-濃度が約400μmolcL-1に達するとFeの溶出が始まった。よって渓流水の酸性が強くなる主要因は、過剰なSO42-を緩衝する塩基性カチオンがないことによる。また、既往の雨量、流出量と水質の観測資料より、ランビル国立公園では、年間のSO42-の流出量(64.6kh/ha/year)は降雨による流入量(6.5kg/ha/year)の約10倍もあることを明らかにした。物質収支推定の精度向上と年々変動を明らかにする研究は、さらに継続した観測記録の取得が必要であるが、これまでに明らかにした上記成果について国内外において学会発表と論文公表を行い、更に幾つかの学会誌投稿準備中である。
DNA依存性プロテインキナーゼを利用した放射線感受性予測と放射線増感

放射線によりDNAには様々な損傷が生じるが、細胞の生死にとって重要なのはDNA2本鎖切断であることがわかっている。DNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。このうち、人間の細胞では主に非相同的末端結合機構により修復が行われることが報告されている。非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)の活性がPI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninにより阻害され、放射線感受性が高められることを報告した。さらに、我々は培養食道癌細胞の放射線感受性とDNA-PK活性の間に相関関係が認められることを明らかにした。DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)活性と放射線感受性に相関があるかどうかを検討する目的で、食道癌と大腸癌を用いて正常組織と癌組織の間でDNA-PK活性に違いがあるかどうかを検討した。術前未治療の食道癌14例を検討した結果では、正常組織と癌組織の間でDNA-PK活性に有意な違いは認められなかった。術前未治療の大腸癌12例で検討した結果、12例中11例で癌組織においてDNA-PK活性が高かった。DNA-PKを構成するKu70、Ku80、DNA-PKcsの蛋白質量mRNA量を調べた結果、Ku70、Ku80は全例において、DNA-PKcsは12例中11例で癌組織の方が正常組織より発現が高かった。また、DNA-PK活性とKu70、Ku80、DNA-PKcsの蛋白質量・mRNA量には有意な相関関係が認められた。さらに、Ku70、Ku80、DNA-PKcsの蛋白質量は相互に有意な相関関係が認められた。以上のことから、大腸癌ではDNA-PKの転写レベルの調節によりDNA-PK活性が高く、それが放射線抵抗性の原因となっていることが推測された。
SGA性低身長を呈するミトコンドリア呼吸鎖異常症での脂肪酸輸送体FATP3の役割

ミトコンドリア病は、呼吸鎖複合体の酵素活性の低下によって引き起こされる先天性代謝異常症である。ミトコンドリア病と診断されたSmall-for gestational age (SGA)性低身長症の男児の全エクソーム解析を行った結果、Fatty acid transport protein 3 (FATP3)遺伝子にミスセンス変異が抽出された。FATP3はミトコンドリアに局在する脂肪酸輸送体であるが、呼吸鎖複合体との関係はよくわかっていない。そのため、本研究ではFATP3の生理的役割を細胞レベルで解明することを目的に、FATP3ノックアウトヒトiPS細胞(hiPS細胞)を作製した。FATP3ノックアウト細胞を作製するため、我々が樹立したhiPS細胞に最適な遺伝子導入条件とピューロマイシン選択濃度の検討を行った。次にFATP3のゲノム編集用ベクターとノックイン用ベクターを構築し、これらのコンストラクトを導入した。ピューロマイシンで薬剤選択した後、取得したクローンについてPCRによるジェノタイピングを行った。サンガーシーケンスで、選択カセットの挿入や欠失変異が確認されたクローンについて、FATP3遺伝子及び、タンパク質発現量をそれぞれqRT-PCRとウエスタンブロッティングで確認した。その結果、4クローンを樹立することができた。これらのクローンについて呼吸鎖複合体I、II、III、IVをそれぞれ構成するサブユニットのタンパク質発現をウエスタンブロッティングで調べたところ、正常hiPS細胞との差は認められなかった。また、SOX2の発現量にも差が認められなかった。増殖能にも顕著な低下は観察されず、以上のことから、分化誘導前のhiPS細胞の多能性や生存には、FATP3は重要ではないことが示唆された。今後は、内胚葉や外胚葉系へ分化誘導させたときのミトコンドリア機能の評価が必要である。ミトコンドリア病は呼吸鎖複合体の酵素活性の低下によって引き起こされる先天性代謝異常症である。Small-for-gestational age (SGA)性低身長症の男児がミトコンドリア病と診断されたため、病因遺伝子を明らかにするために全エクソーム解析を行った。その結果、Fatty acid transport protein 3 (FATP3)遺伝子にミスセンス変異が存在することがわかった。FATP3はミトコンドリアに局在する脂肪酸輸送体であることが知られている。本研究課題では、FATP3がどのようにミトコンドリア呼吸鎖複合体に影響を及ぼすのか理解するため、分子レベル、細胞レベルでFATP3の生理的役割を明らかにすることを目的としている。当初は株化細胞にてFATP3過剰発現細胞とFATP3ノックアウト細胞を作製し、二次元電気泳動による呼吸鎖複合体の解析を実施する予定であった。しかし、株化細胞では胎内発育不全を引き起こすメカニズム解明に直接アプローチすることはできない。また、研究代表者は平成28年度より、ヒトiPS細胞を対象に研究できる環境に異動したことから、株化細胞ではなくヒトiPS細胞でFATP3ノックアウト細胞を作製し、解析することにした。ヒトiPS細胞は未分化状態ではミトコンドリア活性が抑制されており、分化誘導に伴い代謝が電子伝達系-酸化的リン酸化にスイッチすることが知られている。この点からも、FATP3ノックアウトiPS細胞を樹立する際に、FATP3の発現抑制による細胞への影響を最大限に抑えることができると考えた。実際に使用するヒトiPS細胞でミトコンドリア活性が低下しているか調べるために、膜電位依存性の蛍光色素で染色し、ミトコンドリアの活性が低下していることを確認した。また、ゲノム編集による遺伝子改変やタンパク質発現実験、細胞培養系などの研究環境整備を行った。平成28年4月に愛媛大学に異動したため、今までの実験系を始めから構築する必要があった。また研究環境の整備や、iPS細胞培養技術の習得に時間がかかった。平成29年度は、我々が樹立したヒトiPS細胞でFATP3ノックアウト細胞を作成し、解析することを計画した。ゲノム編集によるFATP3遺伝子ターゲッティングを行うために、CRISPR/Cas9発現ベクターとFATP3ターゲッティングベクターの構築を行なった。FATP3にはisoformが3つ存在するため、実際にFATP3ターゲッティングに使用するヒトiPS細胞において、これらのisoformの発現量をqRT-PCRで測定した。その結果、FATP3の全てのisoformが発現していたことから、ヒトiPS細胞でFATP3の機能抑制の影響が表現型として出る可能性が示唆された。しかし、ヒトiPS細胞は通常、ミトコンドリア活性が抑制されており、分化誘導に伴い代謝が電子伝達系-酸化的リン酸化にスイッチすることが知られている。FATP3はミトコンドリアの呼吸鎖活性に関わっていると予想されるため、FATP3の発現抑制によるヒトiPS細胞への影響は、抑えることができると考えた。ターゲッティングのための予備実験として、使用予定のヒトiPS細胞への遺伝子導入条件と薬剤選択濃度の検討を行い、条件を決定した。FATP3に遺伝子変異が同定された患者は、胎内発育不全を呈したことから、FATP3ノックアウトiPS細胞は分化誘導した時に増殖能の低下が予測される。そのためFATP3ノックアウトiPS細胞の解析には、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の形成だけでなく、分化誘導効率の評価を行うことも重要と考えた。神経外胚葉への分化誘導方法は所属研究室において既に確立されているが、中内胚葉系への分化誘導方法は着手していなかったため、誘導条件の検討を行なった。

昨年度中に、FATP3ノックアウト細胞を作製し、ミトコンドリアの機能評価、分化能の評価まで終了する予定であったが、遺伝子導入の条件検討、及び分化誘導条件の検討の実施により、当初の計画のスケジュール変更を余儀なくされた。ミトコンドリア病は、呼吸鎖複合体の酵素活性の低下によって引き起こされる先天性代謝異常症である。ミトコンドリア病と診断されたSmall-for gestational age (SGA)性低身長症の男児の全エクソーム解析を行った結果、Fatty acid transport protein 3 (FATP3)遺伝子にミスセンス変異が抽出された。FATP3はミトコンドリアに局在する脂肪酸輸送体であるが、呼吸鎖複合体との関係はよくわかっていない。そのため、本研究ではFATP3の生理的役割を細胞レベルで解明することを目的に、FATP3ノックアウトヒトiPS細胞(hiPS細胞)を作製した。FATP3ノックアウト細胞を作製するため、我々が樹立したhiPS細胞に最適な遺伝子導入条件とピューロマイシン選択濃度の検討を行った。次にFATP3のゲノム編集用ベクターとノックイン用ベクターを構築し、これらのコンストラクトを導入した。ピューロマイシンで薬剤選択した後、取得したクローンについてPCRによるジェノタイピングを行った。サンガーシーケンスで、選択カセットの挿入や欠失変異が確認されたクローンについて、FATP3遺伝子及び、タンパク質発現量をそれぞれqRT-PCRとウエスタンブロッティングで確認した。その結果、4クローンを樹立することができた。これらのクローンについて呼吸鎖複合体I、II、III、IVをそれぞれ構成するサブユニットのタンパク質発現をウエスタンブロッティングで調べたところ、正常hiPS細胞との差は認められなかった。また、SOX2の発現量にも差が認められなかった。増殖能にも顕著な低下は観察されず、以上のことから、分化誘導前のhiPS細胞の多能性や生存には、FATP3は重要ではないことが示唆された。今後は、内胚葉や外胚葉系へ分化誘導させたときのミトコンドリア機能の評価が必要である。平成29年度はFATP3ノックアウトiPS細胞を樹立し、神経外胚葉系や線維芽細胞へ分化誘導して、ミトコンドリア依存的なエネルギー代謝の状態の時に細胞増殖や生存率に与える影響を解析したい。また、イメージング技術を用いてミトコンドリアの形態観察、膜構造を観察したい。分子レベルでの解析は、FATP3ノックアウトiPS細胞からミトコンドリアを単離し、2次元電気泳動法にて、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の挙動を調べる。平成30年度は引き続き、FATP3ノックアウトiPS細胞の作製を行う。樹立後のヒトiPS細胞の評価系の構築は、ほぼ終了したので、樹立でき次第、ミトコンドリアの機能評価、分化能評価を実施したい。
新有機炭素資源開発と評価のための生物機能利用

本研究は最も付加価値の高い物質である医薬,農薬等の生理活性資源の開発を目標として、生物機能を範とした人工物質の創製と資源転換などへの応用、資源の効率的利用を行っている生物の機能そのものを利用した有用物質の生産及び検索を具体的戦略として掲げ行った。1.生物機能を範とした触媒の創製生体内で選択的、効率的な反応を行っている酵素の機能を範とした人工酵素の創製を目指し、古賀は種々のパラシクロファン類を合成し、芳香族基質、脂肪族基質それぞれの形、大きさ、不斉因子を識別するホスト分子の構築に成功した。広部はチトクロームP450機能を有する種々のモデル化合物をデザイン合成し、効率のよい人工代謝系の構築に成功した。2.資源転換のための合成的利用法の確立広部は生体内酸化反応をモデルにリグニン由来のエーテル類のO-脱アルキル化によるカテコールアミン類への転換、RNAからの核酸塩基切出し反応の可能性を示した。亀谷は安価なインドール類から一重項酸素を用いた生合成型合成法により制ガン剤カンプトテシンの合成に成功した。生越は生理活性海洋天然物を範とした含フッ素ピロール誘導体の一般的合成法を確立した。木村はフェノールペンダントを有する生体由来の大環状ポリアミン類を合成し生体機能との関連を示した。3.酵素機能を用いた生理活性資源評価法の確立と有用物質検索生理活性資源の簡便なスクリーニング法として酵素反応の利用を試みた。三川はシクロオキシゲナーゼ等の阻害活性を指標とし天然物中より数種の優れた生理活性物質の検索に成功した。野副はグルタミンシンテターゼ阻害活性を指標に担子菌のアミノ酸画分および合成グルタミン酸誘導体中より2,3の活性物質の検索に成功した。
腎臓における水チャネル、クロライドチャネルの細胞内動態に関する研究

当初の大きな研究目標の柱は、課題名どおりAQP水チャネルとCLCクロライドチャネルの細胞内局在機構の解明であった。この中で、方法論的には、ヒトにおける病気をひき起こす変異体の細胞内での動態を野生型と比較し解析することで、本来の野生型の機能を知るということを主として行った。ヒトでの病気が明らかでないチャネルに関してはノックアウトマウスを作成し、まずその生理的機能を確定し、その後細胞内の局在の意味付をさぐり、その分子メカニスムを探るという手法をとった。AQP水チャネルでは、そのバゾプレシンによる細胞内ソーティング機構が尿濃縮機構の主役であるAQP2水チャネルについて主として検討を加え、CLCクロライドチャネルに関しては、腎臓での経上皮クロライドベクトル輸送に関わっているCLC-Kクロライドチャネルとそのベータサブユニットであるバーチンの相互作用の解析を行った。また、細胞内、細胞膜上とその存在部位に論争のあったCLC-3についてはノックアウトマウスを作成して、その生理的意義を確立させた。以下各論について項目のみ列挙。1)AQP水チャネルa)優性遺伝形式腎性尿崩症起因性AQP2変異の発見とその病態生理の解析。細胞レベル、トランスジェニックマウス、ノックインマウスでの解析。治療の試み。b)AQP2結合因子の単離。c)AQP12ノックアウトマウスの作成。d)AQP3のソーティング機構の解明。2)CLCクロライドチャネルCLC-3ノックアウトマウスの解析。a)細胞内膜系CLCクロライドチャネルの細胞内分布の同定。3)WNKキナーゼの上皮輸送に対する影響に関する検討。CLC-5クロライドチャネルは低分子タンパク尿症の原因遺伝子であるが、その病態とクロライドチャネルとしての機能の関連性は不明である。一方、CLC-3,4はCLC-5とは相同性の高いクロライドチャネルであり、未だその生理的役割は不明である。CLC-3は我々が1995年に単離したクロライドチャネルであり神経系に多く発現していたが、細胞容積感受性クロライドチャネルであるとの報告もあるものの、その生理的機能は不明であった。今年度、我々はCLC-3クロライドチャネルノックアウトマウスを作製し、その生理的機能の解明めざした。方法はマウスgenomic libraryよりmouse CLC-3遺伝子を単離し、エクソン5,6をネオマイシン遺伝子で欠失できるように相同組み替えベクターを作製した。CLC-3ノックアウトマウスは誕生後成長障害を呈し、死亡率も高かった。CLC-3は神経系に発現の多いクロライドチャネルであるため行動解析を行ったところ、多動を示していた。組織学的には腸管上皮の脱落、海馬、網膜の萎縮がみられた。現在のところ、CLC-3が細胞内膜系のクロライドチャネルとして膜内のH-ATP活性の維持に働いているとの仮説に基づき、これらフェノタイプを説明するCLC-3の役割について検討中である。治療の試み。CLC-3クロライドチャネルノックアウトマウスの作成を完了したため、外見上、組織学的上みられた形質(多動、腸管上皮の脱落、海馬、網膜の萎縮)とCLC-3ノックアウトがどのように結びつくのかを検討した。組織学的なの脳や腸管上皮の萎縮は、ライソゾーム酵素であるカテプシンDノックアウトに酷似しており、CLC-3が内膜系のクロライドチャネルであり、ライソゾーム酵素の至適pH環境(酸性環境)の維持に必要であると考えると、考えやすかった。しかしながら、CLC-3はライソゾ-ムにはほとんど存在せず、エンドソーム系に存在することが明らかになった。それでもなお、ライソゾーム内にはミトコンドリアF1FoArPaseサブユニットCが蓄積しており、何らかの機序で蛋白分解系が障害されていることが明らかになり、CLC-3ノックアウトマウスはヒト

neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)モデルであることが明らかとなった。また実際にエンドソーム系ではエンドソーム内のpHは上昇しており、これによりエンドサイトーシスはじめ、リガンド結合後のレセプター燐酸化後の脱燐酸化が障害されていることも判明し、その結果、燐酸化されたアフィニティーの低い神経伝達物質レセプターが、神経系では存在することも証明し、このことが、行動学的な異常と結びついている可能性も示唆された。腎臓における経上皮ベクトル輸送を司る輸送体、チャネル蛋白のうち、10年来我々の研究の対象としてきた水チャネル、クロライドチャネルについて、その細胞内のソーティーングメカニズムに今年度は焦点を当てて研究を行った。まず第一に腎臓特異的に発現し、遠位部尿細管の基底膜側に発現するクロライドチャネルである、CLC-Kクロライドチャネルの細胞膜へのソーティングに最近バーター症候群の原因遺伝子として発見されたバーチン蛋白がどのように関わるかを培養細胞系を用いて検討した。その結果以下のことが判明した。バーチンはCLC-Kクロライドチャネルと複合体を形成し、CLC-Kクロライドチャネルの細胞内分布はバーチンの存在部位に左右される。このことは病気を引き起こすバーチンの変異体をCLC-K2と共発現させると、変異バーチン自身がERにとどまり、それにひきずられてCLC-K2もERにとどまることから推定された。また、CLC-K2蛋白自体の安定性も、バーチン存在下で飛躍的に増大し、バーチンがCLC-K2蛋白の重要なサブユニットであることが示された。そのほか、ヒトCLC-KB遺伝子プロモーターを単離し、その下流にEGFPをつないだトランスジェニックマウスを作成し、長らくその相同性の高さから決着のつかなかったヒトCLC-KA、KBがラット、マウスのCLC-K1, K2どちらに相当するかに、決着をつけることができた。水チャネルに関しては、優性遺伝型AQP2水チャネルによる尿崩症で、そのdominant negative効果を培養細胞系で証明し、変異蛋白は本来とは逆の基底膜側に局在し、正常蛋白のapical側への輸送を妨げていることが判明した。このように、腎臓での水、クロライド輸送にクリティカルに関わる分子の細胞内ソーティング機構について新たな知見を得ることができた。1)CLC-Kクロライドチャネルのベータサブユニットであることが判明したバーチン蛋白が、いかにCLC-Kクロライドチャネルと相互作用し、CLC-Kクロライドチャネルを細胞膜に導くのか、またヒトでバーター症候群を引き起こすバーチンの変異が、バーチン自体にどのような影響を及ぼしているのかを、細胞培養系にて安定発現株を作成して検証した。その結果、バーチンとCLC-Kは免疫沈降で共沈すること、その結合にCLC-KのNないしC末の細胞内ドメインは関与していないことが明らかになった。また、R8Lというバーター症候群を引き起こす変異体は野生型のバーチンが細胞膜に存在するのに対し、ERにとどまることが判明した。
視床下部ペプチドによる難治性細菌感染症への挑戦：慢性感染―自律神経連関に注目して

過去の研究および陽性荷電ペプチドに着目して、グレリンの抗菌作用を検討した。2種類の非結核性抗酸菌株(Mycobacterium avium 104(標準株)とM. intracellulare(高病原性臨床株) M.i.198に対する直接的作用および貪食細胞内感染菌に対する作用を検討したところ、予想に反して、グレリン濃度依存的に菌数が増加した。そこでグレリンの異化抑制に伴う、間接的な抗菌作用発現の可能性を考え、脂肪細胞および筋肉細胞の培養上清の作用を検討したところ、培養上清は菌の増殖を促進した。今回の結果は、非結核性抗酸菌感染における、グレリンの抗菌作用を否定するものであった。過去の他グループによる研究において、グレリンの黄色ブドウ球菌や緑膿菌に対する増殖抑制効果を示唆することが報告されたため、今回、非結核性抗酸菌に対するグレリンの抗菌効果を検討した。2種類の菌株(Mycobacterium avium 104(標準株)とM. intracellulare(高病原性臨床株) M.i.198において、0-400 μg/mlのグレリン存在下での5日間培養後の菌数を検討したところ、他グループの報告とは異なり、菌数がグレリン濃度依存的に増加することが判明した。また、100 nM PMAで分化させたTHP-1マクロファージ細胞に感染させたM.i.198の菌数変化を検討したところ、グレリン存在下(100 nMから1 μM)で、1週後の細胞内での菌数が増加した。今回の結果は、非結核性抗酸菌に対して、抗菌作用を有さないことを示しており、他の視床下部ペプチドにおける既報の抗菌作用についても再検討の必要性を示唆する。また、グレリンが敗血症性ショックや慢性炎症性疾患における炎症性サイトカイン産生を抑制するという知見から考察すると、今回の結果は、グレリンがマクロファージの炎症性サイトカイン(TNF-α等)産生抑制を介して菌増殖を促進することを示唆する。今年度は、当初の予定通り、グレリンの直接的抗菌作用および細胞内感染菌に対する作用を検討した。既報の結果とは異なり、グレリンが非結核性抗酸菌の増殖を促進することが判明したが、その機序を検討することは、グレリンの抗炎症作用機序の解明、ならびにグレリンの臨床応用における着眼点や注意点の解明につながる。したがって、進捗状況としては、おおむね順調に進展、と判断した。2種類の菌株(Mycobacterium avium 104(標準株)とM. intracellulare(高病原性臨床株) M.i.198において、0-400 μg/mlのグレリン存在下での5日間培養後の菌数を検討したところ、既報とは異なり、菌数がグレリン濃度依存的に増加することが判明した。生体において、グレリンが脂肪や筋肉などの末梢器官において、同化作用をもたらすことが知られている。そこでグレリンの異化抑制に伴う、間接的な抗菌作用発現の可能性を考え、脂肪細胞3T3-L1および筋肉細胞C2C12の培養上清を用いて、マクロファージ内感染菌に対する抗菌作用を検討した。グレリン投与の有無にかかわらず、上記の培養上清は菌の増殖を促進した。さらに、脂肪細胞ならびに筋肉細胞を感染マクロファージと共培養したところ、脂肪細胞におけるtlr2ならびにtnfrsf9の発現抑制、ならびに筋肉細胞におけるil6、および代表的な筋萎縮関連遺伝子であるatrogin1の発現抑制を認めた。今回の結果は、非結核性抗酸菌感染における、グレリンの直接的抗菌作用を否定するものであった。グレリンの作用は上記のほか、迷走神経刺激、食欲増進等、生体内では非常に多面的な作用をもつため、慢性持続性感染におけるグレリンの作用解明には生体レベルでの検討が必要である。過去の報告では、グレリンの直接的抗菌作用が示唆されていたが、今回、非結核性抗酸菌に対して、グレリンが菌の増殖を促進するという全く反対のデータを得た。この作用は、マクロファージ内での感染菌においても確かめられたことから、生体においては、グレリンのマクロファージに対する炎症性サイトカイン産生抑制作用を介した、菌の増殖促進作用が推測された。現在、これを確かめるために、サイトカイン産生抑制作用を確認する実験を行っている。

今後の計画として、細胞実験による炎症性サイトカイン発現パターン、およびマウス等生体内での非結核性抗酸菌症における菌数-炎症反応の関係を検討することにより、非結核性抗酸菌感染症における菌増殖-抗炎症-病態形成の関係を検討する。細菌学当初より2年間の研究計画であり、かつ、今年度も実験を行う必要が生じたため、前年度使用額からの残高を、今年度分の使用額とする。おもに、real time PCR試薬、培地、シャーレ等の実験消耗品に使用する。その他、学会発表、論文発行等に使用する。
一分子ナノ粒子を用いた偽（Pseudo)原虫の構築とそのマラリアワクチンへの応用

新規技術として一分子ナノ粒子であるグリコーゲン(NPG)を足場にした抗原の高分子量化とその生産技術の基盤構築に成功した。DNA結合タンパク質(DBP)にワクチン抗原を融合させ、DNA結合能を利用し、DNA上に抗原を配置する。さらにDBP-マラリアワクチン抗原/DNAの複合体(DBP-Vaccine/DNA)が分子全体としてマイナスの電荷を有することから、プラスの電荷を導入したNPGと静電相互作用を利用した三種複合体の創成に至った。この三種複合体は免疫実験の結果、抗原単独やDBP-Vaccine/DNA二種複合体よりも有意に高い抗体応答を示すことが分かり、本技術の有用性を示すことができた。今年度は一分子ナノ粒子(NPG)を用いた偽原虫の構築法の確立とその性状学的解析を進めてきた。予備実験で検討した比較的分子サイズの小さいエピトープ搭載偽原虫の構築データから、まず最初にモデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を用いてNPGに搭載することを実施した。部位特異的に抗原を搭載できることを期待したSH基を導入したNPGに関しては、反応系の確立に時間を要したので、今年度は特にアミノ基を導入したNPGを基本とした偽原虫構築を目指した。化学融合法を用いてOVAとNPGを融合させる際に重要だと考えた分子比率、架橋剤の種類、生物物理的条件の各種検討を試みた結果、OVAを搭載したNPGを構築することができた。分子サイズとしてはNPG自体が巨大分子であるので、正確なサイズを検証することはまだできていないが、巨大分子の状態で抗原性を確保した分子構築法を確立出来たと考えている。しかしながら、融合効率がまだ低く、効率のよい偽原虫を作成するには検証する必要がある。よって次年度は融合効率の向上を目指した分子設計についても検証をすすめると同時に構築できた偽原虫のワクチン効果の解析についても進める。今年度は、昨年度に実施したモデル抗原(卵白アルブミン、OVA)と一分子ナノ粒子(NPG)の結合条件の検証結果に基づき、実際のマラリアワクチン候補抗原へ移行した。マラリアワクチン候補抗原としては三日熱マラリアワクチン候補抗原であるPvs25を用いた。これまで利用してきた化学的融合法での高分子量体作出は確認できたが、ワクチン効果を検証するには不十分の作成効率であった。よって今年度は融合方法の検証として生体高分子相互作用を利用することに転換した。具体的にはアミノ基を有するNPGが陽電荷を有することを利用して、陰電荷を有する物質であるDNAを足場かつ架橋剤として使うことを検討した。このDNAにマラリアワクチン候補抗原をDNA結合タンパク質と融合させることでDNA上に配置させ、さらにNPGへ配置するという分子デザインを実施した。この結果、顕著に融合効率が上昇し、三種複合体が形成されることが分かった。この作成した融合を用いて、実際のワクチン機能について、現在検証中である。偽原虫の作成方法を変更したが、変更したことで、作成効率が向上し、機能性評価へと移行する材料の確保に成功したこともあり、最終年度でワクチン機能評価をする準備は順調に進んでいることから、研究の進行には大きな問題はない。本研究課題では、寄生虫、特にマラリア原虫に対するワクチン開発に寄与する新しい技術を構築することを目的とした。一分子ナノ粒子であるグリコーゲン(NPG)を足場として、モデル抗原である卵白アルブミン、OVAを搭載させる効果的なワクチン複合体の作出を化学融合法により進めてきた。この複合体作成戦略はモデル抗原の検証データをもとにして、実際の三日熱マラリアワクチン抗原Pvs25へ応用を開始した。OVAと同様に複合体の作出には成功したが、生産性の観点から作成効率に問題が生じてきた。ワクチン機能としては効果的な分子構築ではあるが、生産効率においては課題となった。そこで作出方法を分子相互作用を利用する戦略に変更し、アミノ基を付加させた陽電荷を有するNPG、陰性電荷をもつDNA、ワクチン抗原とDNA結合蛋白質の融合体の三者を利用した複合体作成を検討してきた。この新しい作出方法によって作出効率が向上し、ワクチン機能評価を実施するに十分な量を確保することができた。最終年度では、この得られた複合体を用いてBalb/cマウスで、作出した抗原に対する免疫原性を検証した。評価群としてワクチン抗原単体群、DNAとワクチン抗原の複合体(二者複合体)群、NPG、DNAとワクチン抗原の三者複合体群の免疫実験の結果から、いずれも抗原に対する免疫応答が見られたが、複合体にすると、より効果が増強され、採取的に三者複合体にすることで、十二分に高い免疫応答が得られることが分かった。将来的には実際に三日熱マラリア患者の血液を用いた伝搬阻止効果を評価する必要がある。偽原虫の構築の基礎部分については確立し、その性状学的解析についても良好な結果を得ている。

しかしながら、まだまだ検証すべき項目もあり、次年度予定している研究項目と同時並行的に作業することで、研究の進行には大きな問題はない。効率的な偽原虫の作成ができ、その機能的な評価を実施する段階である。具体的にはマウスを用いた動物実験により、マラリアワクチン評価を進める、まず抗原性および免疫原性解析をすすめて、最終的にはワクチン効果の評価を実施する。医歯薬学ナノ粒子に比較的大きな分子サイズの抗原を搭載することは予想以上に効率が低かった。その点に関しては今後、改善する必要があると感じている。その対応策として、現在主に用いている化学融合法だけでなく生体相互作用を活用した融合方法を活用することを考えており、本年度の予備的検討を実施しており、高効率の融合法になりうると考えている。最終年度には動物での評価を多く実施するため、動物実験への予算配分を多くするために前年度の予算を一部、繰り越した。今年度予定していた分子構築および性状解析に関する予算について概ね予定通り使用したが、来年度予想される性状解析に使用する試薬が増えることおよびその試薬の使用期限も考慮して、効率のよい予算消化のために、わずかではあるが残額が生じた。繰り越した予算と今年度の予算を用いて、これまでに構築したワクチン候補物質の動物実験による評価を実施する。次年度は今年度以上に分子構築が進むと予想しているので、その性状解析に使用する糖分解酵素など使用期限が短いものを効率良く購入するために、本年度の残額予算と次年度の予算を合算して使用することを計画している。
植物由来架橋型ポリマーをバイオナノファイバーで強化するバイオマスナノコンポジット

アルコール類との反応により液化した木質バイオマスから液状エポキシ樹脂を高効率に合成する反応経路を見出した。硬化樹脂の耐熱性や弾性率は、アルコール種選択およびバイオマス含有率により制御可能であった。合成した液化木材エポキシ樹脂をセルロース繊維間に真空圧含浸し、セルロースナノファイバー/植物バイオマス由来架橋型ポリマー複合材を作成した。複合材の弾性率や強度は樹脂単独に比較して顕著に高く、高性能な新規バイオマスコンポジットを得ることができたアルコール類との反応により液化した木質バイオマスから液状エポキシ樹脂を高効率に合成する反応経路を見出した。複合材の弾性率や強度は樹脂単独に比較して顕著に高く、高性能な新規バイオマスコンポジットを得ることができた本研究は、カーボンニュートラルな循環再生可能資源である植物バイオマスを有効利用し付加価値の高い材料を生み出すことを大目的とする。具体的には植物バイオマスを原料に合成したネットワーク(架橋)型ポリマーをマトリックス樹脂として合成し、高強度・高弾性率を有するバイオナノファイバー(セルロースナノファイバー)を強化材として用いて界面制御を行うことにより、既存の植物バイオマス樹脂(例えばポリ乳酸や澱粉系樹脂)系グリーンコンポジットより高性能な新規バイオマスナノコンポジットを創生することを目指している。本年度は、研究実施計画に挙げた(1)植物バイオマス由来ネットワーク型ポリマーの高性能化、(2)強化材としてのセルロースの表面化学修飾、および(3)植物バイオマス由来ネットワーク型ポリマーの複合材マトリックスとしての成形性向上の3項目について、それぞれ次の研究成果を得た。(1):アルコール類との加溶媒分解反応により液化した木質バイオマス(アルコール液化木材)を原料とし、そのアルコール性水酸基を起点にグリシジルエーテル化反応を行う合成ルートにて液状エポキシ樹脂を合成した。その際、木質バイオマス中のリグニン等に由来して必然的に存在するフェノール性水酸基をあらかじめアルコール性水酸基に変換する予備反応により、従前法では副次的に生じていた不溶物が減少しエポキシ樹脂収率が著しく向上し、かつ樹脂の接着性能も改良されることを見出した。(2):セルロース粉末をモデル物質として用いてオリゴエステル化反応を施し、ポリ乳酸との複合界面接着性が改善されることを見出した。(3):合成したアルコール液化木材由来エポキシ樹脂がセルロース繊維との複合化可能な粘度レベルにあることを、真空含浸法により評価・確認した。本研究は、カーボンニュートラルな循環再生可能資源である植物バイオマスを有効利用し付加価値の高い材料を生み出すことを大目的とする。具体的には植物バイオマスを原料に合成した架橋型ポリマーをマトリックス樹脂として合成し、高強度・高弾性率を有するバイオナノファイバー(セルロースナノファイバー)を強化材とする、高性能な新規バイオマスナノコンポジットの創生を目的とした。研究実施計画に挙げた3項目についてそれぞれ次の成果を得た。(1)植物バイオマス由来架橋型ポリマーの高性能化:アルコール類との加溶媒分解により液化した木質バイオマス(アルコール液化木材)にグリシジルエーテル化を行い、液状エポキシ樹脂を合成した。脂肪族アルコールから芳香族アルコールへの変更およびバイオマス含有率増加により、耐熱性および室温弾性率の著しい向上を達成した。(2)植物バイオマス由来架橋型ポリマーの複合材マトリックスとしての成形性評価:合成した芳香族アルコール液化木材エポキシ樹脂をセルロース繊維不織布間に真空樹脂注入法を用いて含浸することにより、複合材料成形が可能となることを評価・確認した。(3)セルロースナノファイバー/植物バイオマス由来架橋型ポリマー複合材の高性能化:セルロース繊維不織布単独および木材エポキシ樹脂単独に比較して、両者からなる複合材の弾性率や強度は顕著に高く、高性能な新規バイオマスコンポジットを得ることに成功した。
甲状腺ホルモンの細胞内輸送担体cDNAの機能発現クローニング

1.細胞内甲状腺ホルモン輸送機構についての研究:細胞内ホルモン輸送の変化がSick euthyroid syndrome(SES)の病態に関与する事を明らかにした。重症疾患で増加するIL-1,IL-6,TNFαがSESの病態形成に関与する可能性が指摘されていた。今回の研究で、脳下垂体細胞でのtetracの核への輸送がTNFαにより3-4倍促進され下垂体TSH分泌を抑制するが、肝臓や心筋細胞のtetracの核輸送の促進は1.5-2倍と弱く、甲状腺ホルモン作用の乖離が生じ、SESの病態が惹起される事を明らかにした。2.細胞内甲状腺ホルモン輸送担体の臓器における違いを認識する薬剤の開発以前に報告された肝臓でのみ活性を有する甲状腺ホルモンアナログのSK&F L-94901は、細胞内輸送担体の臓器での違いを利用した肝臓選択的アナログである事を証明し論文発表した。さらに1)同様の機序による新しい肝臓選択的アナログ、および2)核受容体の臓器における違いを認識する肝臓選択的アナログを開発した。3.甲状腺ホルモンの細胞内輸送担体cDNAクローニング:細胞外から核への甲状腺ホルモン輸送担体クローニングに関してはヒト胎児脳cDNAライブラリーより、細胞質から細胞核へのトリヨードサイロニン(T3)輸送を制御するタンパク質cDNAをクローニングした。さらに他の臓器でのcDNAクローニングと構造解析を行い、臓器選択的作用を示すリガンドのデザインおよび薬物としての応用を検討する。細胞内甲状腺ホルモン輸送担体の酵母細胞(S.cerviciae)での発現クローニングについて。レチノイドX受容体(RXR)ホルモン結合領域とGAL4 activation domainの融合蛋白、甲状腺ホルモン受容体(TR)とGAL4 DNA bindingdomainの融合蛋白を発現した酵母細胞(HFc7)がGAL4の下流のHisを甲状腺ホルモン(triiodothyronine ; T3)依存性に活性化してHis非存在下で生存できるようになる。従ってTRとRXRはDNAに結合していなくてもそれぞれのホルモン結合領域において二量体を形成できる事を示した(業績2)。酵母細胞には細胞内甲状腺ホルモン輸送担体が存在しないため細胞外T3濃度がTRとT3の結合親和性より100-1000倍高いことが必要で、T3濃度10^<-8>Mから10^<-6>Mで濃度依存性の変化を示す。ここへ輸送担体をコードするcDNAが発現した場合T3に対する感受性が増加し10^<-8>MのT3によりHis非存在下で生育が可能になることを指標にpositive cloneを拾い上げる予定である。これまでの予備実験で、輸送担体非存在下に10^<-8>MのT3により生育してくるback groundを抑える条件を確立した。さらにdirectional cDNA libraryとcDNAの発現ベクターを作成した。既にいくつかプラスミド依存性にHis要求性を解除するcDNAクローンが得られている。これらのcDNAがコードする蛋白質の機能が細胞内T3輸送担体である事を確認することと、そのシーケンシングを行う予定である。レチノイドX受容体(RXR)ホルモン結合領域とGAL4 activation domainの融合蛋白、甲状腺ホルモン受容体(TR)とGAL4 DNA bindingdomainの融合蛋白を発現した酵母細胞(HFc7)がGAL4の下流のHisを甲状腺ホルモン(triiodothyronine; T3)依存性に活性化してHis非存在下で生存可能になる。従ってTRとRXRはDNAに結合しなくてもそれぞれのホルモン結合領域において二量体を形成できる事を明らかにした。ここへ輸送担体をコードするcDNAが発現した場合T3に対する感受性が増加し10^<-8>MのT3によりHis非存在下で生育が可能になることを指標にpositive cloneを拾い上げた。予備実験で、輸送担体非存在下に10^<-8>

MのT3により生育してくるback groundを抑える条件を確立した。さらにdirectional cDNA libraryとcDNAの発現ベクターを作成した。既にいくつかプラスミド依存性にHis要求性を解除するcDNAクローンが得られている。これらのcDNAがコードする蛋白質の機能が細胞内T3輪送担体である事を確認することと、そのシーケンシングを行っている。これにより得られたcDNAのいくつかは細胞核内での甲状腺ホルモン発現に関与する蛋白質であった。cDNAライブラリー発現ベクターの選択において、当初はpACT2(Invitrogenより購入)を改造して作成する予定であったが、その過程においてトラブルが生じ、実験の進行が遅れている。現在は宝酒造から新しく発売されたpAUR123を用いて順調に進んでいる。1.細胞内甲状腺ホルモン輸送機構についての研究:細胞内ホルモン輸送の変化がSick euthyroid syndrome(SES)の病態に関与する事を明らかにした。重症疾患で増加するIL-1,IL-6,TNFαがSESの病態形成に関与する可能性が指摘されていた。今回の研究で、脳下垂体細胞でのtetracの核への輸送がTNFαにより3-4倍促進され下垂体TSH分泌を抑制するが、肝臓や心筋細胞のtetracの核輸送の促進は1.5-2倍と弱く、甲状腺ホルモン作用の乖離が生じ、SESの病態が惹起される事を明らかにした。2.細胞内甲状腺ホルモン輸送担体の臓器における違いを認識する薬剤の開発以前に報告された肝臓でのみ活性を有する甲状腺ホルモンアナログのSK&FL-94901は、細胞内輸送担体の臓器での違いを利用した肝臓選択的アナログである事を証明し論文発表した。さらに1)同様の機序による新しい肝臓選択的アナログ、および2)核受容体の臓器における違いを認識する肝臓選択的アナログを開発した。3.甲状腺ホルモンの細胞内輸送担体cDNAクローニング:細胞外から核への甲状腺ホルモン輸送担体クローニングに関してはヒト胎児脳cDNAライブラリーより、細胞質から細胞核へのトリヨードサイロニン(T3)輸送を制御するタンパク質cDNAをクローニングした。さらに他の臓器でのcDNAクローニングと構造解析を行い、臓器選択的作用を示すリガンドのデザインおよび薬物としての応用を検討する。4.その他の研究:RAによりアポトーシスが惹起される培養ヒト骨髄性白血病細胞(HL-60 cells)にalltrans-RAを漸増していきアポトーシスが起きないRA抵抗性細胞株を2株樹立し抵抗性の機序を解明した。また核受容体共通の情報伝達系路として、RXRと相互作用する因子を解析し、octamer-bindingtranscription factor 1(Oct-1)がRXR作用を低下させている事を発見した。
高速自動解析手法を用いた巨大地震がメイオファウナ群集に与えた影響評価

前年度までに確立したイメージング・フローサイトメーター(FlowCAM:Flow Cytometer and Microscope)を用いたメイオファウナの画像の取得手法をオープンアクセスの国際雑誌で公開し、手法の普及を図った。また、同手法により取得した画像データを迅速に分類するために、機械学習・深層学習による自動分類の実現を目指した。学習に必要な教師データを蓄積し、NVIDIAが提供するDIGITS、及びNECが提供するRAPIDを用いて、深層学習による画像データの分類を試みた。その結果、2つの深層学習システムとも深海メイオファウナ群集で優占する線虫類とカイアシ類の2つの分類群の分類は約98%と高い精度での分類に成功した。学習に用いる画像データの加工方法を検討し、他の分類群も分類できるような学習データセットの構築を進めている。東北地方太平洋沖地震後の三陸沖日本海溝斜面のメイオファウナ群集の解析も行った。光学顕微鏡を用いた底生カイアシ類の詳細な形態観察の結果、地震後の全ての測点で2011年から2012年にかけての群集組成の変化は見られなかった。さらに、地震前の当該海域の群集組成と類似していると考えられる千島海溝周辺域の群集組成と比較すると、両者の深度変化パターンに有意な差は見られず、地震などの撹乱が頻発する三陸沖日本海溝斜面では、もともと撹乱に強い分類群が存在していたと考えられた。また、本内容を国際雑誌Limnology and Oceanographyで公開した。イメージング・フローサイトメーター(FlowCAM:Flow Cytometer and Microscope)を用いたメイオファウナの迅速解析法を確立した。2015年3月に東北海洋生態系調査船「新青丸」によるKS15-01次航海において岩手県大槌町沖で採集したサンプルの内、メイオファウナの生息密度が異なると予想される水深の異なる4つの測点(水深65 m, 303 m, 1,064 m, 1,677 m)の堆積物サンプルを用いて、本技術の有用性を検証した。コロイド状シリカ溶液に堆積物を懸濁し、遠心することで、生物を堆積物粒子から分離した。この分離した生物をFlowCAMに投入し画像を取得し、得られた画像を高次分類群毎に計数した。また、FlowCAMでの観察後に再捕集したサンプルを顕微鏡下で観察し、高次分類群毎に計数した。両者の作業時間を比較すると、検鏡作業はどの試料についても数時間だったのに対して、FlowCAMを用いた作業は数10分程度であった。また計数された個体数については、メイオファウナ全体、及び深海メイオファウナ群集で優占する線虫類、カイアシ類において、顕微鏡下での計数とFlowCAM画像による計数は有意に相関していた。これまでのメイオファウナ研究の伝統的な手法では、小さな個体を実体顕微鏡下で観察するという時間の掛かる作業が必須であり、複数の観測点に及ぶ長期的な個体群動態を把握することが困難であった。本研究で開発した新規の手法は、東日本大震災による東北沖深海メイオファウナ群集への影響や、撹乱からの遷移・回復を評価のような、長期的なモニタリングを行う際に有用だと考えられる。東日本大震災から5年目にあたる本年度8月に海洋研究開発機構所有の東北海洋生態系調査船「新青丸」による研究航海を実施したが、台風による荒天と船のトラブルでサンプルを得ることができなかった。しかしながら、2015年3月に採集した同海域で採集したサンプルを用いることで、FlowCAMの画像取得による計数作業は、通常の顕微鏡下での作業と同等の結果を、迅速に得ることができる。本研究で開発したFlowCAMを用いたメイオファウナの迅速解析法を特許として出願した(特願2016-232868)。また、国内学会(2016年日本ベントス学会・日本プランクトン学会合同大会)で成果を発表した。昨年度に確立したイメージング・フローサイトメーター(FlowCAM:Flow Cytometer and Microscope)を用いたメイオファウナの画像の取得法により、画像データの蓄積を行ない、目視により高次分類レベルで分類を行った。沖縄トラフで行われた科学掘削(人為的撹乱)による周辺メイオファウナ群集への影響を解析した結果、従来の顕微鏡下での解析方法と本手法でも同様の結果を示し、本手法でも十分に人工撹乱による環境改変の影響を検出できることを確認した。東北地方太平洋沖地震という自然撹乱によるメイオファウナへの影響も本手法で解明できると考えられる。一方で、メイオファウナの画像データを取得するまでの時間は大幅に短縮されたものの、画像を取得した後の画像データの分類は目視で行っており、群集解析を行う上で、大幅な時間を占めている。解析に掛かる時間をさらに短縮するために、機械学習・深層学習を応用した画像の自動分類の実現を目指している。深層学習に必要な教師データを充実させる必要があり、FlowCAMを用いた手法で様々な環境のメイオファウナ画像を蓄積し、データベースの構築を進めている。これまで地震直後からのサンプルの蓄積のある岩手県大槌沖において研究船「新青丸」による航海を行った。荒天のため大幅な予定変更を余儀なくされたが、これまでサンプリングしてきた測点の内、4測点で堆積物サンプルを採集することに成功した。昨年実施できなかった研究航海を実施することができたが、これまで蓄積してきたサンプルも含めて、サンプルの処理が進んでいない。

一方で、画像取得後の画像解析について、その手法の習得、データベースの整備を行なった。3月に行われた日本生態学会に参加し、生態学の分野で用いられる深層学習を含めた画像解析技術について情報を収集し、本研究でも十分に実行可能であることを実感した。前年度までに確立したイメージング・フローサイトメーター(FlowCAM:Flow Cytometer and Microscope)を用いたメイオファウナの画像の取得手法をオープンアクセスの国際雑誌で公開し、手法の普及を図った。また、同手法により取得した画像データを迅速に分類するために、機械学習・深層学習による自動分類の実現を目指した。学習に必要な教師データを蓄積し、NVIDIAが提供するDIGITS、及びNECが提供するRAPIDを用いて、深層学習による画像データの分類を試みた。その結果、2つの深層学習システムとも深海メイオファウナ群集で優占する線虫類とカイアシ類の2つの分類群の分類は約98%と高い精度での分類に成功した。学習に用いる画像データの加工方法を検討し、他の分類群も分類できるような学習データセットの構築を進めている。東北地方太平洋沖地震後の三陸沖日本海溝斜面のメイオファウナ群集の解析も行った。光学顕微鏡を用いた底生カイアシ類の詳細な形態観察の結果、地震後の全ての測点で2011年から2012年にかけての群集組成の変化は見られなかった。さらに、地震前の当該海域の群集組成と類似していると考えられる千島海溝周辺域の群集組成と比較すると、両者の深度変化パターンに有意な差は見られず、地震などの撹乱が頻発する三陸沖日本海溝斜面では、もともと撹乱に強い分類群が存在していたと考えられた。また、本内容を国際雑誌Limnology and Oceanographyで公開した。本年度開発したFlowCAMを用いたメイオファウナ解析法を用いて、これまで採集してきた東日本大震災後の三陸沖堆積物の解析を行う。また、次年度も東北海洋生態系調査船「新青丸」による研究航海を実施し、地震から6年後の三陸沖堆積物中のメイオファウナの状態を把握する。FlowCAMを用いてメイオファウナの画像データの収集を行う。機械学習による画像データの分類自動化の手法を確立し、データ取得から解析までの時間の短縮化を図り、地震後の三陸沖堆積物中のメイオファウナの回復・変遷過程を解析する。本年度8月に予定していた東北海洋生態系調査船「新青丸」航海が荒天と船舶トラブルにより中止になったため、予定していたサンプルを採集できなかった。サンプルの処理が進まずデータ解析、論文執筆まで行えなかったため、次年度使用額が生じてしまった。次年度にサンプル処理を進め、論文投稿のための英文校閲や投稿料に使用する。中止を余儀なくされた航海を次年度に再度行うことで、新たなサンプルを取得する。また、これまで採集しているサンプルの処理も進めていく。
東日本大震災後の地域コミュニティの再編と宗教の公益性に関する調査研究

本研究は主にいわき市における宗教とコミュニティをテーマに、宗教団体、民俗行事、市民イベントの調査を重ねてきた。その結果、以下の3つの成果が得られた。(1)被災者支援が後退していくなかで、宗教団体や宗教者による支援は継続され、そのことが宗教の有する公益性や公共性を高めていることが判った。(2)いわき市震災モニュメントの悉皆調査を実施し、23カ所のモニュメントを確認し、16カ所については所在地、形状、意味、建設経緯などを整理した。(3)市民の街づくり会議等に出席するとともにボランティアを行いながら調査を行う「関与型調査」を模索し、学会と公開シンポジウムで、その成果を問うことができた。本年度は代表者と分担研究者が中心となって2011年より実施してきたいわき市における東日本大震災後のコミュニティの再編と宗教文化との関わりをめぐる調査を継続するとともに(9月と3月に調査を実施)、特にいわき市内の震災モニュメント建立の状況を調べるために、また被災三県への調査地拡大するために、以下の調査を行った。(1)震災モニュメント調査:いわき市内約200カ寺に郵送アンケートを実施し、震災モニュメントに関する情報を集約し、22カ所のモニュメント調査を行った(9月に2回)。あわせて震災モニュメントに関わる先行研究の収集と紹介をする研究会を定期的に開催した。(2)釜石キリスト教調査:釜石市の仮設住宅等で被災者への継続的な支援を行っているキリスト教3団体を対象に聞き取り調査を実施した(2月)。(3)会議等の出席:仙台で開催される国連防災世界会議に合わせて現地に赴き、現地の被災寺院の僧侶を中心に聞き取り調査を実施した(3月)。本年度の下記の調査を実施した。17月18日20日にいわき市(平・小名浜・豊間)で震災後の地域活動を展開している市民団体2か所と新たに震災モニュメントを建立した斎場と復興商店街における聞き取り調査と海開きと神輿渡御の観察。27月1819日にいわき市(泉・平)のプロテスタント教会2か所で復興住宅支援に関する聞き取り調査。37月31日1日に釜石市でキリスト教の被災者支援の参与観察。49月17日18日にいわき市(平)で創価学会会員への聞き取り調査。53月9日11日に仙台・大船戸でカトリック教会の震災後の取り組みに関する聞き取り調査。63月10日12日に釜石市、山田町、大槌町、大船渡市の宗教施設訪問。73月10日12日にいわき市(小名浜・平・久之浜・小浜)の追悼行事参加と関係者聞き取り調査。また6月19日、10月12日、12月17日、1月11日、3月29日に先行研究の学習会と調査準備会議・報告会議を開催した。以上のようにいわき市を中心に仙台市と釜石市に調査範囲を広げ、着実なるデータの蓄積につとめている。本研究課題の2年目のテーマである調査地の拡大に関しては仙台・釜石において調査を開始することができた。しかし予備調査に留まり、次年度上半期に本格的な調査を実施する。本年度は予定通り、いわき市の調査を主に仙台市と釜石市に拡げるとともに、被災地における街づくりや復興イベント作りに関わりつつ研究を進めた。いわき市における取り組みに関して、小名浜の復興イベントである第1回「どんとやれ大漁旗」(5月4日)に準備段階からボランティアとして関わりつつ関与型調査を行い、事後調査を実施するとともに、2017年の第2回イベントにも関わりを持っている。同様に市内平の大國魂神社にも定期的に足を運び、例大祭(5月3・4日)の参与観察などを行った。また平で年数回開催されている未来会議に注目し、ワークショップ型の街づくり会議に出席(9月4日・2月5日)した。この他、市内においては創価学会やグレイスチャペルにおける聞き取り調査も継続しいている。調査地の拡大に関して、カトリックいわき教会(5月4日)の調査を手がかりに、白河教会・須賀川教会で震災後の教会再建、被災者支援の他、外国人信徒の動向や教会による支援について調査を行った。また福島県川内村における新住民調査に着手した。宮城県では南三陸町での調査の他、仙台市内の住民移転地域にある浄土寺と昭徳寺の調査も年度を越えて実施している。さらに岩手県では仮設住宅から公営住宅へ移転する際のコミュニティ解体および再構築について実態把握するべく、釜石市社会福祉協議会、新生釜石教会、カリタス釜石、そして大槌町中村仮設において聞き取り調査を実施した。本年度は6月14日、1月12日・19日・26日、2月6日に研究会を開催するとともに、これまでの成果の一端を日本宗教学会でパネル報告「震災後の宗教とコミュニティー関与型調査からの再考察ー」(9月11日)するとともに、3月4日には講師に薄井篤子氏と高橋和義氏を招き、公開シンポジウム「東日本大震災後の新しい生き方とコミュニティ、そして宗教」を一般公開で開催した。