hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中国東北地方の悪性リンパ腫の発癌要因の学術調査

この研究は、1)中国東北地方の鼻のリンパ腫の発生状況を、免疫組織化学とEpstein-Barr virus (EBV)のEBER-1 in-situ hybridization (ISH)により検索し、EBV関連NK細胞性リンパ腫が扁桃、口腔、鼻腔の順に増加し、中国では非常に多いことが確認された。2)中国の壊死傾向の強い鼻NK細胞性リンパ腫では、p53蛋白の異常発現とリン酸化p53蛋白の高発現は見られなかEったが、マクロファージのアプトーシス産物の受容体であるCD204の発現が見られ、壊死傾向はアポプトーシスの結果であることが示唆された。ヒト生検標本でのアプトシースの検出法として、Cleaved caspase-3の免疫染色により核の変性前アプトシースの検出が有用であることが判明した。3)鼻NK細胞性リンパ腫の背景細胞を検索して、T細胞性リンパ腫の背景に発達するthymdinephosphorylase陽性樹状細胞よりも未熟な背景細胞の存在が示唆された。4)鼻NK細胞性リンパ腫の細胞由来の検索方法の検討として、幹細胞マーカーの免疫染色により骨髄、末梢血、組織中の幹細胞の検出を試み、骨髄由来NK細胞と鼻NK細胞性リンパ腫の腫瘍細胞の関係の検討に、幹細胞マーカーの免疫染色が有用であることが示唆された。5)中国の鼻NK細胞性リンパ腫の先行病変の存否は不明であるが、NK細胞性リンパ腫のもう一つの標的臓器である皮膚でも鼻型NK/T細胞性リンパ腫の発生を認めなかった。6)この研究は、中国の医療の中に存在する鼻悪性リンパ腫等を疑って検索された病理標本の検索を国際共同研究として行うので、この研究期間中に、研究倫理面での対応を行った。研究初年度として、中国東北地方の鼻のリンパ腫の発生状況を、従来検索された標本の免疫組織化学とEpstein-Barr virus(EBV)のEBER-1 in-situ hybridization(ISH)による検索を行うと共に、中国医科大学病理学関連施設で新規に診断される症例での研究試料の収集の体制と日本での検索体制の整備を行った。従来検索された標本の検討の結果、中国で臨床的に悪性リンパ腫が疑われた16例は、上咽頭癌2例、B細胞性リンパ腫2例、末梢T細胞性リンパ腫1例、NK細胞性リンパ腫7例、その他が4例であった。上咽頭癌の1例と末梢T細胞ないしNK細胞リンパ腫は全例がEBER-1陽性シグナルが腫瘍細胞等に見られるEBV関連症例であった。更に、その他の1例は,EBV関連NK細胞リンパ腫の膿瘍病変であり、1例はEBER-1陽性のCD5+ CD79a+の奇怪なB細胞の増殖をNK細胞の増生の中に認めたものであった。この検索で、中国東北地方の鼻領域の悪性リンパ腫が疑われた症例のほぼ半数はNK細胞性リンパ腫であり、EBV関連鼻領域の症例は12(75%)例に及ぶことを再確認できた。また、鼻NK細胞リンパ腫でも、EBER-1陽性腫瘍細胞の周辺には、EBER-1シグナル陰性の小型NK細胞を認める例や、慢性炎症病変内に、EBER-1シグナル陽性リンパ球を認める例も見られ、NK細胞性リンパ瞳が最も悪性度の高い腫瘍性病変であるEBV関連ないしNK細胞性リンパ増殖病変の存在が示唆された。中国医科大学関連の病理施設を実際に訪問し、新規に検索される症例での必要とされる免疫組織化学の中国への導入、新規症例での研究試料の収集の可能性と方法を、海外共同研究者の賈心善中国医科大学教授と検討を行い、試験的に研究試料の収集を実施することになった。

研究2年度として、中国の鼻NK細胞性リンパ腫に於ける1)癌抑制遺伝子p53の蛋白の発現の有無、DNA損傷を示唆するリン酸化p53蛋白の発現を検討し、中国の鼻NK細胞性リンパ腫ではp53蛋白の異常発現も、リン酸化p53蛋白の高発現で示唆されるDNA損傷は確認出来なかった。2)鼻NK細胞性リンパ腫に於ける背景の間質細胞の性格の検討として、CD68陽性細胞とthymidinephosphorylase(TP)陽性細胞の動態を検索し、CD68陽性でTP陽性の変わった樹状細胞の介在を認めた。3)大阪大学の青笹克之教授の分子病理学的研究に資料提供を行い、中国の鼻NK細胞性リンパ腫に於ける癌/増殖/抑制遺伝子の分子病理学的情報として、明らかな癌遺伝子の遺伝子異常が認められないことが明らかになった。4)中国での鼻NK細胞性リンパ腫の病理診断の状況を、海外研究協力者である賈質心善が調査し、炎症性肉芽腫と診断されている症例が多く、従来の報告では、中国の鼻NK細胞性リンパ腫の発生状況を把握するのが困難であることが判明した。従って、中国の鼻NK細胞性リンパ腫では、Epstein-Barr virus(EBV)感染と関連した腫瘍細胞の増殖と間質細胞の動態の検討が必要であることが明らかになった。また、5)軟部悪性腫瘍の中の滑膜肉腫が血液系の悪性腫瘍である可能性を認め、中国での滑膜肉腫の発生状況と病理診断の現状を把握する為に、固定組織標本の収集を始めた。研究3年度として、1)中国の鼻NK細胞性リンパ腫に於けるCD203の発現を検索し、日本での少数例での検討で鼻NK細胞性リンパ腫の背景のマクロファージがこのアプトーシス産物の受容体であるCD203を発現していることが判明し、中国での多数例の検索で、鼻NK細胞性リンパ腫並びに細胞障害性T細胞の悪性リンパ腫でこのCD203陽性マクロファージの出現が見られ、鼻のT/NK細胞性リンパ腫の特徴の一つであることが判明した。2)細胞起源の不明な滑膜肉腫の細胞起源の一つとして多分化能幹細胞の可能性があると考え、その証明には、成人での幹細胞の動態を把握必要があり、その一つの方法として、幹細胞のマーカーであるCD34とCD117(c-kit,SCF(幹細胞増殖因子)受容体)の超高感度免疫染色を試み、a)CD117は増殖幹細胞のマーカーであり、b)幹細胞からの分化直後の増殖細胞はCD34とCD117を発現している可能性があり、c)胸腺の皮質では、類上皮様細胞がCD34とCD17を発現し、胸腺細胞の一部はCD117を核に発現し、d)リンパ装置では胚中心周囲にCD117核陽性のリンパ球が存在し、e)リューマチ様関節炎(RA)の滑膜組織で、間質細胞と滑膜細胞の一部がCD34とCD117を発現し、RAの病態形成に幹細胞ないし特殊な方向への分化直後の細胞の関与が示唆された。今後、滑膜肉腫の検討に加え、上記の鼻NK細胞性リンパ腫でも、このCD34とCD117の超高感度免疫組織化学的染色法による検討が必要であることが示唆された。3)中国医科大学にて、鼻NK細胞性リンパ腫の研究の遂行の円滑化を計る為に、日中病理学シンポジウムを企画し、大阪大学の青笹克之教授の協力を得て、2003.10.7に実施した。4)海外学術総括班にて、報告等を行った。
無菌・常在菌モデルマウスによる歯周疾患発症メカニズムの形態・免疫学的解明

本研究では,無菌状態のgerm-free (GF)マウスと口腔常在菌を有するspecific-pathogen-free (SPF)マウスを用いて,歯周組織の加齢変化に対する口腔常在菌の影響について検討した。SPFマウスでは,加齢に伴う歯槽骨吸収の有意な増加を認めたが,GFマウスでは歯槽骨吸収の加齢変化は小さかった。また, SPFマウスでは加齢に伴い,歯肉中のCD4 T細胞からのIL-17a等の炎症性サイトカインの発現の増加も認められた。口腔常在菌は,加齢に伴う顎骨吸収や炎症性反応の増加に影響を与えていると推測された。常在菌は宿主の免疫応答や組織の構造、機能に多大な影響を与えているが、口腔常在菌が歯周組織に及ぼす影響に関しては不明な点が多い。本研究では、口腔常在菌による歯周組織の影響について、無菌状態のgerm-free (GF)マウスと口腔常在菌を有するspecific-pathogen-free (SPF)マウス用いて経時的な変化を検討した。無菌群・常在菌群の2群間で歯槽骨周囲及び、歯槽骨代謝に関わる血液成分に着目した。実験開始後それぞれ、8、22週間後に屠殺を行い、血液を採取し生化学的に評価した。骨形成マーカーとしてosteocalcin、骨吸収マーカーとしてtartrate-resistant acid phosphatase form 5b(TRACP 5b)をELISA法で定量した。またマイクロCTを用いて、セメント・エナメル境から歯槽骨骨頂間の距離、歯槽骨の密度を計測し、歯槽骨の経時的な変化を評価した。osteocalcinは、SPFマウスに比べ、GFマウスの方が22wにおいて有意に増加していた(p<0.01)。一方TRACP 5bは、8w・22wにおいてそれぞれGFマウスに比べSPFマウスの方が有意に増加していた(p<0.01)。またセメント・エナメル境から歯槽骨頂までの距離は、8w・22wにおいてそれぞれGFマウスよりもSPFマウスの方が有意に大きかった(p<0.01)。また歯槽骨密度に関しては、SPFマウスに比べ、GFマウスの方が8w・22wにおいてそれぞれ有意に高かった(p<0.01)。常在菌を有するマウス(SPFマウス)は、無菌状態のマウス(GFマウス)と比べて炎症性細胞の浸潤や破骨細胞が活性化されており、歯槽骨吸収が強く認められた。歯周病病原菌だけではなく口腔常在菌もまた、炎症を介して歯周組織の形態や免疫応答に影響を与えているのかもしれない。本研究では, 8週齢と22週齢のGF・SPFマウスを6匹ずつ用いた。血清中の骨形成マーカーおよび骨吸収マーカーとして,osteocalcinとtartrate-resistant acid phosphatase form 5b (TRACP 5b)とを定量した。マイクロCTを用いて,上顎骨のセメント・エナメル境から歯槽骨骨頂間の距離と歯槽骨密度を計測した。さらに,加齢による歯肉の遺伝子発現の変化も網羅的に解析した。22週齢において,osteocalcin濃度は, SPFマウスよりもGFマウスの方が有意に高くなった(p<0.01)。TRACP 5b濃度は,8週齢と22週齢のいずれにおいても, GFマウスよりもSPFマウスの方が有意に高かった(p<0.01)。歯周組織では,セメント・エナメル境から歯槽骨頂間の距離は, GFマウスよりもSPFマウスの方が,いずれの週齢においても有意に大きかった(p<0.01)。さらに,SPFマウスでは,加齢に伴う歯槽骨吸収の有意な増加を認めたが(p<0.01),GFマウスでは歯槽骨吸収の加齢変化は小さかった。これらの結果は,口腔常在菌を有するSPFマウスの方が無菌状態であるGFマウスよりも加齢に伴う歯槽骨吸収が大きいことを示唆している。また,SPFマウスでは加齢による歯肉中のIL-17aの発現の増加もみられた。IL-17aは炎症性サイトカインの一つであり,常在菌のあるマウスでは加齢に伴う炎症性反応もみられたと考えられる。以上の研究成果から口腔常在菌は,加齢に伴う顎骨吸収や炎症性反応の増加に影響を与えていると推測される。口腔常在菌による歯周組織の影響について、無菌状態のgerm-free (GF)マウスと口腔常在菌を有するspecific-pathogen-free (SPF)マウス用いて経時的な変化を検討しており、問題なくマウスの屠殺およびサンプル採取も終えている。また当初の計画以上に、様々な角度から分析できており、より詳細な歯周組織への影響について分析できている。

27年度が最終年度であるため、記入しない。予防歯科学分野昨年度に採取したマウスのサンプルから、右側歯周組織の歯肉を用いる。8、22週間後のそれぞれ歯肉からmRNAを抽出し、詳細な歯周組織への影響を解明するために、PCRアレイ法を用いて歯周組織中のサイトカイン、ケモカイン、骨代謝関連因子の遺伝子解析を行う。また左側歯周組織を用いて、タンパク発現を解析するために、免疫染色を行い、病理組織学的変化の検討を行う予定である。また研究計画の変更に柔軟に対応できるように、サンプル(歯肉・血液)は極力多めに採取し、適宜対応できるように準備している。
CTLエピトープのトランスジェニックマウスを用いたGVH反応とGVT反応の解析

これ迄に、マウス変異型MAP kinase, ERK2由来9mペプチド(QYIHSANVL)が、マウスH-2Kdに提示されたBALB/cマウス由来肉腫CMS5の拒絶抗原であることを明らかにした。9m認識TCR(Vα10.1及びβ8.3)のtransgenicマウスDUC18より、脾臓CD8陽性T細胞を調製し野生型BALB/cマウスに移入すると、CMS5肉腫の拒絶が可能となる。9m発現CMS5に対する抗腫瘍性免疫応答と末梢免疫寛容を検討するモデルとして、自己抗原として変異型ERK2を発現しているmERK2 Tgマウス(9mTgマウス)を作製し、DUC18脾臓CD8陽性T細胞を移入し、個体内の動態と腫瘍拒絶能の解析を試みた。(1)9mTgマウスにDUC18脾臓CD8陽性T細胞1x106個を移入すると、day5より全身のリンパ節腫大を認め、day14には縮小する現象が認められた。鼠径リンパ節において9m特異的CD8陽性細胞のフローサイトメトリーでの解析を行なったところ、day7では細胞数の増加を認め、day14には減少した。CSFEラベルされたDUC18脾臓CD8陽性T細胞を用いた系においても,移入早期より著明な分裂、及び増殖が認められた。IFN-γELISPOT法においても同様な結果が得られた。(2)野生型BALB/cマウスにDUC18脾臓CD8陽性T細胞を移入し、2日後にCMS5肉腫を移植すると、全例のマウスで拒絶可能であった。しかしながら9mTgマウスにおいては全例で拒絶できなかった。9mTgマウスにDUC18脾臓CD8陽性T細胞を移入すると9m特異的CD8陽性細胞は、一過性に増殖するがその後、細胞死もしくはIFN-γの産生を失い、末梢トレランスが成立する可能性が考えられた。腫瘍特異的ではなく全身に発現している自己抗原の場合、能動免疫療法の標的とはなりにくい可能性が示唆された。
Ｔ細胞分化可塑性の分子メカニズムの解明と免疫疾患治療への応用

ナイーブT細胞から誘導性抑制性T細胞(iTreg)を作製し免疫疾患治療や臓器移植の拒絶反応の軽減に適用できる事が多くのモデル系で示されている。しかし多くの自己免疫疾患では抗原が同定されていない。抗原特異的なエフェクターT細胞をTregに転換することが最も効果的な治療法になりうると考えられる。そこで高度に分化させたTh1やTh17からFoxp3陽性Tregを作製することを試みた。しかし一旦分化したTh1やTh17細胞は通常のTGFβ存在下の培養条件下ではFoxp3を発現誘導することはできなかった。そこでメモリー化を促進するためにTh1細胞を胸腺ストローマ細胞株Tst4フィーダー細胞上で培養したところ5%ほどの細胞がFoxp3陽性となった。さらにヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤(BIXO1294)、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(5AzaC)、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤などのエピジェネティック阻害剤の添加によってさらにFoxp3陽性細胞が増加する条件を見いだした。これらの細胞をFoxp3でソーティングし遺伝子プロファイリングを行ったところ、CD25やCTLA4の発現などTregとして機能分子を発現していることがわかった。今後このようなreprogramed Tregが個体でも機能するのか検討する。さらに様々な薬剤の組み合わせを行ってTh17から最も効率よくiTregを誘導する条件を検討した。最も効率よく誘導する組み合わせとして5aza-dC、ATRA、Rapamycin、8-Br-cAMP、TWSll9という5つの薬剤を組み合わせることによって相乗的にTh17からFoxp3陽性Tregを誘導する効果が見られた。分化したTh1やTh17細胞からFoxp3陽性細胞を誘導する培養条件を、様々なエピジェネテック試薬を用いて検討したところ、ある程度の割合でFoxp3陽性細胞を誘導することが出来た。しかし胸腺由来のnTregが増幅された可能性を否定する実験が必要である。また動物実験を行うに十分な細胞数を得る培養条件の検討も必要である。分化したTh1やTh17などのエフェクター細胞から抑制性細胞を誘導することは長期免疫寛容を成立させる有力な方法と考えられており、世界的にも様々な試みがなされている。本研究では様々なエピジェネテック試薬を用いてTh1やTh17をFoxp3陽性細胞に転換することを目標としている。しかしその効率は未だ10%以下で非常に低い。また細胞死が誘導されるために動物実験を行うに十分な細胞数を得ることも難しい。転換効率をあげてかつ細胞死を抑制する方法を確立する必要がある。そのためには細胞死を抑制する薬剤の添加、あるいは遺伝子の導入もしくはノックダウンが必要と思われる。T細胞理プログラミングの背景と目標:気管支喘息、花粉症等の免疫アレルギー疾患は、免疫過剰状態や免疫寛容が破綻したことにより、本来免疫系が反応しない自己抗原や花粉等に異常反応した結果である。本研究の目的は免疫応答の中心的役割を持つ炎症惹起を担うエフェクターT細胞(Teff)と炎症沈静化を担うFoxp3陽性抑制性T細胞(Treg)の免疫応答バランスの異常を修正しようとするものである。成熟したTeff細胞は自己タンパク質やアレルゲンに対する特異性を有するので、Teff細胞をTreg細胞に転換できれば、正常な免疫応答は保ったまま、原因抗原のみの炎症沈静化を誘導する理想的な治療方法となる。1年目研究進行計画本申請は4つの研究段階からなる。そのうち、研究段階2を進めた。まずは培養分化させたTeff細胞、次に、大腸炎誘発マウスから採取したTeff細胞(大腸炎の主因)を、エピジェネティック修飾化合物を培地に添加することにより、Foxp3陽性Treg様細胞に転換する方法を開発する。研究段階3作成したFoxp3陽性Treg様細胞がin vivoで大腸炎誘発モデルマウスの症状を軽減させることができるのかを評価する。以上の2段階を行った。1年目進捗研究段階2は終了し、現在研究段階3を行っている。Teffには大きく4つサブセットが知られている。少なくとも2サブセットからFoxp3陽性細胞Treg様細胞が得られ、これらは細胞増殖抑制能を持つことを示した。分化したTeff細胞がおそらく可塑的細胞状態を介してTreg様細胞へ分化することを示唆したことは新規のT細胞可塑性の発見になる可能性が高い。さらなる検証が必要である。次年度目標研究段階4に掲げた、Teff細胞がTreg細胞にリプログラムできた分子メカニズムを解析することによって、新規な観念である可塑的な細胞状態の特性の詳細な検証をする。

さらにヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤(BIXO1294)、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤(5AzaC)、ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤などのエピジェネティック阻害剤の添加によってさらにFoxp3陽性細胞が増加する条件を見いだした。これらの細胞をFoxp3でソーティングし遺伝子プロファイリングを行ったところ、CD25やCTLA4の発現などTregとして機能分子を発現していることがわかった。今後このようなreprogramed Tregが個体でも機能するのか検討する。さらに様々な薬剤の組み合わせを行ってTh17から最も効率よくiTregを誘導する条件を検討した。最も効率よく誘導する組み合わせとして5aza-dC、ATRA、Rapamycin、8-Br-cAMP、TWSll9という5つの薬剤を組み合わせることによって相乗的にTh17からFoxp3陽性Tregを誘導する効果が見られた。研究計画に沿って進めることができ流れは見えてきたが、まだ外部に発表できるほど確固なデータになりきっていないから。分化したTh1やTh17細胞からFoxp3陽性細胞を誘導する培養条件を、様々なエピジェネテック試薬を用いて検討したところ、ある程度の割合でFoxp3陽性細胞を誘導することが出来た。しかし胸腺由来のnTregが増幅された可能性を否定する実験が必要である。また動物実験を行うに十分な細胞数を得る培養条件の検討も必要である。Ragノックアウトマウス(リンパ球を持たない)にナイーブT細胞を静注することにより作製した大腸炎モデルマウスのTeff細胞からin vitroで作製したFoxp3陽性Treg様細胞が、同様に作製した大腸炎モデルマウスの炎症を沈静化を示すのかを検討する。作製したFoxp3陽性Treg様細胞はin vitroでは抗CD3抗体刺激に非常に弱く死にやすいことがわかっている。この点を克服しなければマウスに導入しても死んでしまう可能性があるので、炎症沈静化を観察することは困難かもしれない。アポトーシスを抑制するためにp53 siRNA導入を試してみる。分化したTh1やTh17などのエフェクター細胞から抑制性細胞を誘導することは長期免疫寛容を成立させる有力な方法と考えられており、世界的にも様々な試みがなされている。本研究では様々なエピジェネテック試薬を用いてTh1やTh17をFoxp3陽性細胞に転換することを目標としている。しかしその効率は未だ10%以下で非常に低い。また細胞死が誘導されるために動物実験を行うに十分な細胞数を得ることも難しい。転換効率をあげてかつ細胞死を抑制する方法を確立する必要がある。そのためには細胞死を抑制する薬剤の添加、あるいは遺伝子の導入もしくはノックダウンが必要と思われる。
トリスタン・ツァラの言語理論における「客観性」と「叙情的なもの」

トリスタン・ツァラの詩作品を、反文学や反美学を標榜したダダの観点から読解するだけでなく、1920年代末から30年代にかけてのシュルレアリスムへの接近を通じて結実したと推察される、客観性と主観性(叙情的なもの)の混交に関する言語理論を明らかにした上で検討・評価していくことが本研究の目的である。本年度は主に以下の二つの研究を実施した。第一に、シュルレアリスム期の作品である『種子と表皮』を構成する異なる二つの文体(客観性と結びつくと考えられる「レシ」と主観性と結びつくと考えられる「ポエジー」)が混交する構成の分析に注力した。まずこの混交構成に寄与したと考えられる弁証法とツァラの思考の関わりを明らかにすることを試みた。それを通じて、異なる文体の混交は、従来のジャンルや語源からは掴みきれない意味を表出させるものであると指摘し、このことを国際学会での発表と一本の論文で公表した。次いで「レシ」と「ポエジー」の混交を実践的な側面から理解するために、『反頭脳』における文学的コラージュや、『種子と表皮』および『不眠症の人間』における句読点の操作について検討し、このことを国内学会での発表で公表した。第二に、30年代の「詩の状況に関する試論」の中で触れられる「語り得ぬもの」について、同時代人のアンリ・ブレモンの「純粋詩」論に登場するそれと比較しつつ検討した。「語り得ぬもの」を神秘そのものとし、それを前にした人間の沈黙を必然とするブレモンに対して、ツァラにとって「語り得ぬもの」とは「詩を成すに値しない要素」、すなわち元来の詩の起源、定義から外れる要素であり、しかもその要素を口にすることが試みられていると考えられた。それを裏付けるために、作詩法の観点からツァラの詩を分析し、ダダの時代における詩への「雑音」の導入が、ダダ後の詩作品『近似的人間』における「頭語反復」の技法へと繋がる可能性を見出そうとした。『種子と表皮』における「レシ」と「ポエジー」の混交構成に関する分析は、ほとんど当初の研究実施計画通りに進展した。ヘーゲルやマルクス、エンゲルスの哲学を経た当時のツァラを理解するための基礎条件の一つとなった弁証法が、具体的な実践としてジャンルや語源との関係性において機能しうることを確認できたのが最も重要な現在までの進捗である。また、同時代的な言説とツァラの詩を関連付けながら詩の定義とその境界をはみ出るものを考察するにあたり、新たなる手がかりとして「純粋詩」を発見できたのも大きい。以上の理由により、現在までの達成度を「おおむね順調に進展している」とした。混交という語彙を鍵として保持しつつ、『種子と表皮』、『反頭脳』、『不眠症の人間』の読解を深める。そして混交のために要求される異なる要素、つまり客観性と主観性の問題が、理性と非理性、現実と夢、覚醒と眠りといった対立し合う概念に向けられていることに着眼しつつ、それらの特性を明らかにする。そのために、第一に、ツァラの詩作の前提となる思想に関して深く調査する予定である。具体的には、前年度にツァラと弁証法という観点から調査を既に開始しているヘーゲルやマルクス、エンゲルスらの哲学関連の著作に加え、フロイト、ユング、ランクといった精神分析関連の著作、「人間の現象学についての研究」グループで交流していたと推察されるバシュラール、カイヨワ、モヌロ、ジャック・スピッツらの著作、および関連する研究書と論文の読解に注力するつもりである。第二に、『種子と表皮』におけるツァラの思想の独創性を確認するために、シュルレアリストたちの作品を文体、構成、語彙に特に注目しながら読解する。具体的な読解対象としては、アラゴン(『文体論』等)、アルプ(『摘みとられた日々』等)、ブルトン(『シュルレアリスム宣言』『通底器』等)らの作品を想定しており、関連する研究を適宜参照する。

「語り得ぬもの」を神秘そのものとし、それを前にした人間の沈黙を必然とするブレモンに対して、ツァラにとって「語り得ぬもの」とは「詩を成すに値しない要素」、すなわち元来の詩の起源、定義から外れる要素であり、しかもその要素を口にすることが試みられていると考えられた。それを裏付けるために、作詩法の観点からツァラの詩を分析し、ダダの時代における詩への「雑音」の導入が、ダダ後の詩作品『近似的人間』における「頭語反復」の技法へと繋がる可能性を見出そうとした。『種子と表皮』における「レシ」と「ポエジー」の混交構成に関する分析は、ほとんど当初の研究実施計画通りに進展した。ヘーゲルやマルクス、エンゲルスの哲学を経た当時のツァラを理解するための基礎条件の一つとなった弁証法が、具体的な実践としてジャンルや語源との関係性において機能しうることを確認できたのが最も重要な現在までの進捗である。また、同時代的な言説とツァラの詩を関連付けながら詩の定義とその境界をはみ出るものを考察するにあたり、新たなる手がかりとして「純粋詩」を発見できたのも大きい。以上の理由により、現在までの達成度を「おおむね順調に進展している」とした。混交という語彙を鍵として保持しつつ、『種子と表皮』、『反頭脳』、『不眠症の人間』の読解を深める。そして混交のために要求される異なる要素、つまり客観性と主観性の問題が、理性と非理性、現実と夢、覚醒と眠りといった対立し合う概念に向けられていることに着眼しつつ、それらの特性を明らかにする。そのために、第一に、ツァラの詩作の前提となる思想に関して深く調査する予定である。具体的には、前年度にツァラと弁証法という観点から調査を既に開始しているヘーゲルやマルクス、エンゲルスらの哲学関連の著作に加え、フロイト、ユング、ランクといった精神分析関連の著作、「人間の現象学についての研究」グループで交流していたと推察されるバシュラール、カイヨワ、モヌロ、ジャック・スピッツらの著作、および関連する研究書と論文の読解に注力するつもりである。第二に、『種子と表皮』におけるツァラの思想の独創性を確認するために、シュルレアリストたちの作品を文体、構成、語彙に特に注目しながら読解する。具体的な読解対象としては、アラゴン(『文体論』等)、アルプ(『摘みとられた日々』等)、ブルトン(『シュルレアリスム宣言』『通底器』等)らの作品を想定しており、関連する研究を適宜参照する。
膜分離法を用いた下・廃水処理システムの開発とその応用に関する研究

本研究の目的は膜分離を固液分離の手法に導入した廃水処理プロセスを基礎研究の段階から更に実用化へ進める点にある。主な結果を以下に示す。1.膜ろ過の特性......平膜型の限外ろ過膜、精密ろ過膜を用い、それを活性汚泥のエアレーションタンクと組み合せた時のろ過抵抗とろ水の水質を調べた。ろ水水質は膜の孔径に全く依存しなかった。ろ過速度はMLSS濃度によらず、また膜の孔径によってもさほど大きくは影響されない。高分子の有機成分がエアレーションタンク中に蓄積して来る現象が見られた。ゲルクロマトグラフィーを用いて残留有機成分の分子量分布を求めた。2.好気性処理への中空糸膜の応用......孔径0.1ミクロンの中空糸膜を実験室規模の活性汚泥法のエアレーションタンクに直接浸漬して吸引する方法を検討した。連続的に吸引を行うと閉塞の問題が起きたが、間欠的に吸引することによってこの問題は解決した。MLSSが40,000mg/Lという高濃度に至るまで約1年の間順調に運転を続けることができた。しかし、生物濃度が非常に高くなると溶存酸素レベルが低下し顕著にCOD除去率が低下した。一般的には、間欠運転法を用いる限り本法は非常に有望である。3.嫌気性処理への膜分離法の適用......平膜を嫌気性処理に組み合わせたプロセスを検討した。従来方式の嫌気性消化法では生物体の滞留時間を長くとれないという欠点があったが、それを解消するものである。ミルクを用いた実験では良好なメタン生成が起き、MLSSは15,000mg/Lにまで達した。下水汚泥を用いた場合、従来法に比べ2040%増のメタンが10日という比較的短い滞留時間で発生した。一方、PVAを用いて酸生成菌及びメタン生成菌を包括固定化する試みを行なった。生成したビーズは十分に安定であり、固定化後一定期間の培養を行なうことによって微生物活性を高めることができ、有望であることがわかった。本年度は以下の点について研究分担者をそれぞれで研究を分担し、松尾が総括した。松尾、山本は人工下水を用いた生物処理実験を行ない、分離膜の種類と透水速度及び処理水質の関係を調べ、次のような結果を得た。1)分画分子量1万30万の範囲の限外3過膜(U下膜)では、分画分子量が大きい程透水速度も大きくなるが、それ以上では一定となり、さらに表面孔径が大きくなりある限界を超えると、膜の中に目詰まりが起きて、逆に透水速度は低下する。2)本研究で調べたUF膜(分画分子量1万300万)、精密ろ過膜(MF膜、孔径0.11.0μm)の範囲では、処理水質は膜の分画分子量あるいは孔径にほとんど関係なく、良好な処理水質が得られる。3)槽内MLSSの増加に伴い槽内上澄水のCODが増加し、高分子物質の蓄積が認められた。4)ゲルクロマトグラフィーで槽内上澄水を分画定量したところ、槽内蓄積物質の大部分は、分子量10万以上の物質であった。5)槽内MLSSと透水速度には有意な関係は認められなかった。

また、松尾、山本は活性汚泥曝気槽に直接中空糸モジュールを浸漬し、呼引ろ過を行うシステムを試作し、運転条件等予備的検討を行なった。中村は研究会等で各研究について助言を与えた。綾は、膜分離法を用いた嫌気性処理システムの実験的検討を行ない、流入TOC16,000mg/lに対し、処理水TOC60mg/l、ガス発生速度3.2l/dを得た。また、本法をガス廃液処理に適用し、滞留20時間程度でTOC除去率80%以の結果を得、後段の活性炭による吸着と組み合せて、コークス濾ガス廃液の無希釈処理が可能であることを示した。田中は、上向流濾床を用いた二相嫌気性消化における相分離の効果について検討を行ない、脂質は酸生成相で分解されず高級脂肪酸の形にとどまるが、かえって酸生成相の菌体に吸着された高級脂肪酸はメタン菌に阻害を及ぼさず、相分離効果があることを明らかにした。従来の生物的廃水処理の持つ限界を打ち破るために膜分離法の導入を行なったシステムの開発研究を実施した。本年度は最終年度であり、過去2年間に得られた結果を基盤として研究を実施し、完了した。1.研究打合せ会の開催...63年8月19日に最終研究打合せ会を開催した。ここでは、これまでに各分担者が得て来た研究結果が総括的に紹介され、低コスト・低エネルギー消費の膜分離生物処理法の実用化に向けて議論がなされた。スケールアップについては問題はないと考えられ、今後はパイロットスケールの実験によってコスト面の検討を行なうことが必要との認識が示された。2.好気性処理への応用(松尾・花木)...中空糸膜を直接ばっ気槽に入れ吸引する方式に焦点をしぼって研究した。間欠吸引の導入によって膜の閉塞が防止できるという前年度の成果を更に発展させ、吸引と休止の比率を変えることによって処理水量の増加をねらった。閉塞の有無は休止時間よりはむしろ吸引の継統時間に依存することがわかった。この中空糸膜法は0.20.5気圧程度の差圧で透水が可能であるので、現実の装置では水位差によって透水を行わせることができ、有望である。3.嫌気性処理への応用(綾・田中)...平膜タイプのモジュールを用いて、下水汚泥の嫌気性消化を行なった。メタン生成量は従来法(完全混合で返送なし)に比べて2040%増となった。これは反応器内に微生物を長期間保持できる効果のためであり、水理学的滞留日数は10日間で安定した運転ができた。膜の閉塞についても、長期間の運転に耐えられることがわかった。一方、膜分離と微生物の包括固定化を組み合わせた嫌気性処理ステムにについて実験的検討を加えた。その結果、メタン生成菌、酸生成菌を固定化して安定して働かせることが十分に実用的に可能であることがわかった。
地域移動と定住化過程の諸類型-沖縄在住本土出身者のライフコース

近代化・都市化の過程において定住型社会から流動型社会への急激な移行を遂げた日本社会においては、いまや地域間移動経験を持つ流動者層が多数派を占めつつある。その「根無し草的」存在ともいうべき流動者層のライフコースの類型化(主に定住志向や適応過程)、流動者層による地域社会へのインパクト、流動者のライフコースと地域社会変動、全体社会変動との相互連動関係の解明が本調査研究の基本的課題であった。本研究期間においては、沖縄社会の地域情報を収集するとともに、特徴的な地域について、沖縄在住本土出身者(主に地域づくりの担い手層)のライフヒストリーを収集・分析した。調査対象者は実生活の中で様々な影響を沖縄社会に与える一方、沖縄社会と触れることにより、意識・態度変容を多かれ少なかれ経験していた。調査内容は、主に、地域社会との関わりと意識変容プロセスである。対象地域は、本島各地域(那覇都市圏、南部玉城村、中部沖縄市、勝連町、石川市、読谷村等)であり、それぞれの地域内バリエーションおよび地域毎・属性毎の特性の析出を試みた。その結果をもとに、ライフコースパターンの析出、ライフコースと地域社会史との連動関係の解明および沖縄県内各地域間での比較・検討を行っている。沖縄を取り巻く状況は、近年、大きく変化しており、沖縄在住本土出身者の意識や、新規来住者層の属性の変化も見受けられる。今後、新規来住者の諸特性を明らかにするとともに、今までにライフヒストリーを聞き取った対象者を中心に、パネル調査を実施することにより、その変容と方向を捉えようと、調査を続行しているところである。近代化・都市化の過程において土着型社会から流動型社会への急激な移行を遂げた日本社会においては、いまや地域間移動経験を持つ流動者層が多数派を占めつつある。その「根無し草的」存在ともいうべき流動者層のライフコースの類型化(主に定住志向や適応過程)、流動者層による地域社会へのインパクト、流動者のライフコースと地域社会変動、全体社会変動との相互連動関係の解明が本調査研究の基本的課題である。対象である沖縄社会は、「本土」との様々な歴史的経緯を踏まえた上で、新たな関係性を模索している。本調査の直接的な調査対象者である沖縄在住本土出身者は実生活の中で様々な影響を沖縄社会に与える一方、沖縄社会と触れることにより、意識・態度変容を経験した、いわば本土-沖縄関係の象徴的存在である。現調査段階においては、沖縄社会の各地域情報の提供を受けるとともに、特徴的な地域について、主に、地域社会との関わり、意識変容プロセスに焦点をあてた、対象者のライフヒストリーを収集している。特に、本島各地域(那覇都市圏、南部玉城村、中部沖縄市、勝連町、読谷村)、石垣市等を対象に、調査継続中であり、地域内バリエーションと同時に、地域毎の特性を析出中である。今後の課題は、対象地域への量的調査を通した、ライフコースパターンの析出、ライフコースと地域社会史との連動関係の解明であり、本申請期間内に、それぞれ特異なパターンが予測されている沖縄県内各地域間での比較・検討を行うことである。
非線形拡散方程式における波面、及び曲面の力学的挙動の研究

本研究の目的は、非線形の拡散現象を記述する数理モデルである非線形拡散方程式の解の振る舞いについて、波面やその理想化としての曲面のような空間的な局在構造に着目して、理解を深めることであったが、反応拡散方程式や曲率流方程式等の非線形拡散方程式の解の振る舞いを、主に比較定理や力学系的手法を用いて解析した。特に.『(広い意味での)特異摂動問題』、『力学的に安定な局在パターンが局所的には小さく、しかしながら、大域的には大きな変形を受けたときに示すダイナミクスを支配する縮約方程式の数学的導出』、『解の初期状態と、そこから長時間経過の後に解が示す振る舞いとの関係』、『自己相似解や進行波解に代表されるような後方大域解』等に興味を持って研究を進めた。単安定系の進行波解の存在・非存在問題について考察を行った結果、次のような予想を得た。この問題に関して一般論を展開する場合、従来の研究では力学系のコンパクト性(あるいは、その類似物)を仮定している。ところが、空間一次元の問題に限っては、系の平行移動不変性と単調性を巧妙に組み合わせた議論を行うことによって従来の結果を拡張できることに気付いた。このことによって、空間一次元の問題については『不連続な進行波』が現れる場合も同列に扱えることが結論できる。また、非等方拡散方程式について考察を行った結果、等方拡散方程式の球対称解を非線形変換で移すと非等方拡散方程式の解になることが物理的な議論により指摘されていたが、方程式の解を粘性解として解釈することによって数学的にも正当化できることが期待できることが分かった。これによって等方拡散方程式の球対称解に関する結果が非等方拡散方程式の結果として移植できることになる。本研究の目的は、非線形拡散方程式の解の振る舞いについて、波面やその理想化としての曲面のような空間構造に着目して、理解を深めることであったが、反応拡散方程式や曲率流方程式等の非線形拡散方程式の解の振る舞いを、主に比較定理や力学系的手法を用いて解析した。特に『(広い意味での)特異摂動問題』、『力学的に安定な局在パターンが局所的には小さく、しかしながら、大域的には大きな変形を受けたときに示すダイナミクスを支配する縮約方程式の数学的導出』、『解の初期状態と、そこから長時間経過の後に解が示す振る舞いとの関係』、『自己相似解や進行波解に代表されるような後方大域解』等に興味を持って研究を進めた結果、中でも次のような確定的な成果を得た。平面内の多角形の発展方程式であるクリスタライン曲率流の非凸自己相似解について研究した。儀我らによりクリスタライン流は非等方曲率流の極限として導出できることが知られているが、一方、非等方曲率流には非凸自己相似解は存在しない。これに対して、正三角形と正方形のウルフ図形をもつクリスタライン流で非凸自己相似解をもつ例を構成した。平面内の曲線の発展方程式V=1-Kについて研究した。この曲線の発展方程式についても既に研究した双安定反応拡散方程式の波面の場合と同様にして、外へ広がる円に対する摂動は円の半径が十分大きいとき、時刻無限大までほとんど保たれるということを示せるが、さらに、曲線の発展方程式の場合には摂動がとる時刻無限大での形状が確定すること、ならびに時刻無限大での形状に対して初期摂動は一意であることを示した。『(広い意味での)特異摂動問題』、『力学的に安定な局在パターンが局所的には小さく、しかしながら、大域的には大きな変形を受けたときに示すダイナミクスを支配する縮約方程式の数学的導出』、『解の初期状態と、そこから長時間経過の後に解が示す振る舞いとの関係』、『自己相似解や進行波解に代表されるような後方大域解』等に興味を持って研究を進めた。具体的には、以下のような成果が得られた。有界領域上でNeumann境界条件を課したべき乗型の非線形項をもつ拡散方程式の解の爆発形状について研究した。拡散係数が大きいときの解の爆発形状は、初期条件のラプラシアンに関する第二固有成分で特徴づけられることを示した。Giraoらにより平面内の曲線短縮方程式はクリスタライン曲率流で近似できることが示されている。これに対して本研究では、2次元において成功した石井&Sonerの摂動試験関数法による証明を微分幾何のMinkowski問題の古典的理論を用いて拡張することによって、3次元空間内のガウス曲率流が原点対称なウルフ図形をもつクリスタライン流で近似できることを示した。平面内の非等方曲線短縮方程式について研究した。Gageらは、凸曲線は漸近的に自己相似解となること、及び、非等方性がπ周期的である場合には自己相似解は一意であることを示した。一般の場合では、非一意である例が存在し得ることがAndrewsにより指摘されていたが証明は未完成であった。本研究では、その簡単な証明を与えた。

特に.『(広い意味での)特異摂動問題』、『力学的に安定な局在パターンが局所的には小さく、しかしながら、大域的には大きな変形を受けたときに示すダイナミクスを支配する縮約方程式の数学的導出』、『解の初期状態と、そこから長時間経過の後に解が示す振る舞いとの関係』、『自己相似解や進行波解に代表されるような後方大域解』等に興味を持って研究を進めた。単安定系の進行波解の存在・非存在問題について考察を行った結果、次のような予想を得た。この問題に関して一般論を展開する場合、従来の研究では力学系のコンパクト性(あるいは、その類似物)を仮定している。ところが、空間一次元の問題に限っては、系の平行移動不変性と単調性を巧妙に組み合わせた議論を行うことによって従来の結果を拡張できることに気付いた。このことによって、空間一次元の問題については『不連続な進行波』が現れる場合も同列に扱えることが結論できる。また、非等方拡散方程式について考察を行った結果、等方拡散方程式の球対称解を非線形変換で移すと非等方拡散方程式の解になることが物理的な議論により指摘されていたが、方程式の解を粘性解として解釈することによって数学的にも正当化できることが期待できることが分かった。これによって等方拡散方程式の球対称解に関する結果が非等方拡散方程式の結果として移植できることになる。
植物病原糸状菌の宿主認識と受容性誘導に関する分子メカニズムの解明

アブラナ科野菜類炭疽病菌はモデル植物シロイヌナズナに感染することから,病原菌-植物間相互作用を解析する上で有用な糸状菌である。本菌の感染器官分化時に発現している遺伝子、1700個について配列情報を明らかにした。それら配列情報について、糸状菌および酵母ゲノムデータベースを対象にしたBLAST検索を行い、相同性から予測される機能に基づき遺伝子分類を行った。その結果、1110個が既知遺伝子と相同性を示し、その内訳は遺伝子発現20%、細胞分化21%、代謝20%、機能未知39%であった。上記で得られた情報を利用して本菌の感染メカニズムの解明を効率的に進めていくためには、効率の良い遺伝子機能解析実験系を確立することが重要である。相同組み換えを利用した特異的遺伝子破壊株作出法は遺伝子機能を推測するための有効な手段の一つである。申請者はこれまで、アグロバクテリウムを利用して数種の糸状菌の効率的な遺伝子破壊実験系を確立してきたが、その中でアブラナ科野菜類炭疽病菌の相同組み換え効率が他の供試菌と比較して著しく低いことが明らかになった。そこで、本菌の非相同組み換えに関与する遺伝子を破壊することにより、相同組み換え効率向上株の作出を試みた。遺伝子修復に関与するアカパンカビ由来の遺伝子Mus-51と高い相同性を持つ遺伝子をアブラナ科野菜類炭疽病菌から単離し、ChMus-51と命名した。chmus51破壊株を作出し、その性状解析を行った結果、菌糸生育および病原性に野生株との差は認められなかった。つづいてChmus51破壊株を親株として、ポリケチド合成酵素遺伝子ChPKS1の破壊実験を行った結果、破壊効率は2.4%から97.5%へと大きく向上した。以上の結果から、アグロバクテリウム法を用いた本菌の効率的な遺伝子破壊株の作出にchmus51破壊株が有用であると考えられた。アブラナ科野菜類炭疽病菌の感染器官分化時における各器官よりRNAを回収し、完全長cDNAライブラリーを作成した。その中から、任意の1700クローンについてシーケンス解析を行い、本菌の感染器官分化時に発現している遺伝子群の配列情報を得ることに成功した。個々の配列情報について、糸状菌および酵母ゲノムデータベースを対象にしたBLAST検索を行い、相同性から予測される機能に基づき遺伝子分類を行った。既知遺伝子との相同性に基づき各遺伝子の機能を予測することは可能である。しかしながらその機能を実証するためには、各遺伝子について相同組み換えを利用した特異的破壊株を作出し、その性状解析を行うことが望ましい。当研究室ではこれまで、アグロバクテリウムを利用して数種の糸状菌の効率的な遺伝子破壊実験系を確立してきたが、その中でアブラナ科野菜類炭疽病菌の相同組み換え効率が他の供試菌と比較して著しく低いことが明らかになった。この結果は、本菌で効率的な遺伝子機能解析を行ううえでの大きな障害になると予想された。近年のアカパンカビ研究の中で、遺伝子修復に関与する遺伝子Mus-51の破壊により、相同組み換え効率が上昇するとの報告があったことから、これと同じ現象をアブラナ科野菜類炭疽病菌で再現することができれば、上記の問題を解決できると考えた。そこで、保存配列を利用したPCRクローニング法により、アブラナ科野菜類炭疽病菌のMus-51オルソログ(ChMus-51)を単離した。その推定アミノ酸配列はアカパンカビのそれと60%の相同性を示した。現在、ChMus-51遺伝子破壊株の作出を行っている。

つづいてChmus51破壊株を親株として、ポリケチド合成酵素遺伝子ChPKS1の破壊実験を行った結果、破壊効率は2.4%から97.5%へと大きく向上した。以上の結果から、アグロバクテリウム法を用いた本菌の効率的な遺伝子破壊株の作出にchmus51破壊株が有用であると考えられた。
過剰指形成ウズラ:四肢パターン形成の遺伝子的制御機構解析のためのモデル動物の開発

Herditary Multiple Malformation突然変異は全身に発育の遅延および形態形成異常を示す突然変異である。本形質は常染色体性の単一劣性遺伝子に依って支配されており、ホモ型胚の大部分は孵卵6日目に死亡する。残りの胚も孵卵15日までに全て死亡する。孵卵13日胚を用いて調査した異常形態の概略は以下の通りである。体表では、全正羽域において羽芽が出現していたが、その伸長はみられず、大腿部・肩甲部等にわずかに着色部が存在するのみであった。この羽芽の状態は正常胚の孵卵8.5-9日のものに相当した。頭部では、上顎・下顎の伸長が著しく抑制されていた。腹部では筋胃、肝臓、および小腸の体外への部分的突出がみられた。四肢においては、前肢で4-7本、後肢で6-8本の指・趾が形成されていた。これらの胚の骨格は全身ほとんど軟骨の状態であり、頭部および胸部に化骨部が存在するものの、その化骨の程度は、孵卵9-10日の正常胚のものと同程度にすぎなかった。頭部では、舌骨体の欠損が大きな特徴であった。脊柱では、頚椎以降の全ての椎骨に形成不全がみられた。四肢では、前後肢ともに指・趾骨数が増加していた他、脛骨および腓骨の屈曲が大きな特徴であった。本突然変異は四肢パターン形成研究分野をはじめ、形態形成研究分野で有用なモデルになり得ると考えられる。本研究は、四肢の過剰指形成をはじめとする多発性奇形を示すウズラについて、その異常形質の特徴および遺伝様式を明らかにすることを目的とした。突然変異胚は全身に発育の遅延および形態異常を示し、孵卵13日を越して生存することはなかった。孵卵13日胚の体表では、全正羽域において羽芽が出現していたが、その伸長はみられず、大腿部・肩甲部等にわずかに着色部が存在するのみで、既に着色綿毛が全身を覆っている正常13日胚とは大きく異なっていた。この羽芽の状態、および眼瞼の閉鎖程度は正常胚の孵卵8.5-9日のものに相当した。また、後肢は体幹に密着すると共に、遠位部が頭方に屈曲していた。これらの胚の骨格は全身ほとんど軟骨の状態であり、頭部、胸部、および四肢に化骨部が存在するものの、その化骨の程度は、頭部ならびに胸部では正常胚の孵卵9-10日のものと、四肢では6-8日のものと同程度にすぎなかった。脊柱では、頸椎以降の全ての椎骨に形成不全がみられた。また、正常胚では3本である中足骨が4-5本存在した。遺伝分析の結果、本形質は、常染色体性の単一劣性遺伝子によって支配されており、ホモ型胚は孵卵初期から13日に至る各時期に死亡すると考えられた。本突然変異名を“遺伝性多発性奇形、hereditary multiple malformation"、遺伝子記号をhmmとすることを提唱する。本突然変異は四肢パターン形成研究分野をはじめ、形態形成研究分野で有用なモデルになり得ると推測された。Hereditary Multiple Malformation突然変異は全身に発育の遅延および形態形成異常を示す突然変異である。

残りの胚も孵卵15日までに全て死亡する。孵卵13日胚を用いて調査した異常形態の概略は以下の通りである。体表では、全正羽域において羽芽が出現していたが、その伸長はみられず、大腿部・肩甲部等にわずかに着色部が存在するのみであった。この羽芽の状態は正常胚の孵卵8.5-9日のものに相当した。頭部では、上顎・下顎の伸長が著しく抑制されていた。腹部では筋胃、肝臓、および小腸の体外への部分的突出がみられた。四肢においては、前肢で4-7本、後肢で6-8本の指・趾が形成されていた。これらの胚の骨格は全身ほとんど軟骨の状態であり、頭部および胸部に化骨部が存在するものの、その化骨の程度は、孵卵9-10日の正常胚のものと同程度にすぎなかった。頭部では、舌骨体の欠損が大きな特徴であった。脊柱では、頸椎以降の全ての椎骨に形成不全がみられた。四肢では、前後肢ともに指・趾骨数が増加していた他、脛骨および腓骨の屈曲が大きな特徴であった。本突然変異は四肢パターン形成研究分野をはじめ、形態形成研究分野で有用なモデルになり得ると考えられる。
ヒト細胞の活性状態を規定する工学パラメータの策定と細胞寿命評価

ヒト正常細胞に関して,工学的パラメータに基づいた細胞寿命評価手法の構築とその生理的な裏付けを行った.まずヒト角化細胞は細胞寿命に近づく際に,残り分裂回数がある一定以下に到達すると,外的指標である細胞面積の増大と内的指標である抗酸化酵素の発現量の増大が相関した形で引き起こされることを明らかにした.次に,核内分裂が生じることで核と細胞質の巨大化が進行し,やがて細胞死に至るヒト細胞の巨核球分化を対象とし,酸化ストレス因子である過酸化水素を添加すると寿命の短縮と巨核球分化の促進が引き起こされ,内的指標である遺伝子発現レベルにおいて酸化ストレス応答が重要であることを明らかにした.ヒト正常細胞に関して,工学的パラメータに基づいた細胞寿命評価手法の構築とその生理的な裏付けを行った.まずヒト角化細胞は細胞寿命に近づく際に,残り分裂回数がある一定以下に到達すると,外的指標である細胞面積の増大と内的指標である抗酸化酵素の発現量の増大が相関した形で引き起こされることを明らかにした.次に,核内分裂が生じることで核と細胞質の巨大化が進行し,やがて細胞死に至るヒト細胞の巨核球分化を対象とし,酸化ストレス因子である過酸化水素を添加すると寿命の短縮と巨核球分化の促進が引き起こされ,内的指標である遺伝子発現レベルにおいて酸化ストレス応答が重要であることを明らかにした.1.細胞活性の外的指による評価外的指標としては,既に開発済みの細胞観察装置と画像解析ツールを活用して,ヒト培養細胞の平均移動速度を算出した.その際に、ヒト子宮がん細胞の培養中に抗がん剤であるカンプトテシンのストレス負荷を行ったところ、高濃度領域では極端な寿命の短縮が確認されたが、低濃度領域ではある程度の細胞増殖が保たれる代わりに平均移動速度が約3倍に増加した。これらの検討により得られた知見はこれまでに報告がなく、一般にがん細胞の移動速度はがん転移に関連するため、低濃度の抗がん剤への暴露ががん細胞の移動速度を増加させるという現象は、がん治療における抗がん剤の適切な投与を行う上で興味深い研究成果である。2.細胞活性の内的指による評価細胞活性の内的指標の一つとして,カタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼといった抗酸化酵素の遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより確認した。測定対象としては、ヒト角化細胞を選択し、過酸化水素のストレス負荷の有無により継代培養を行い、培養中における増殖速度や細胞寿命の変化の解析塗行った。その結果、ヒト角化細胞は細胞寿命に近づいていく際に、残り分裂回数がある一定以下に到達すると細胞面積の増大と抗酸化酵素の発現量の増大が相関した形で引き起こされることが判明した。細胞面積は細胞の外的指標として、遺伝子発現量は内的指標として有効であり、細胞寿命との密接な関連性が示された。以上の研究成果は、これまでに報告のない新規性の高い内容として学会発表を行った。1.生理活性物質を培養面に固定化する新規手法の開発ヒト培養細胞の培養基材としての有用性が報告されている,フェノール性水酸基を導入したカルボキシメチルセルロース(CMC)のヒドロゲルを対象に選択した.微生物由来のセルロース結合モジュール(CBM)が,CMCヒドロゲルに特異的に吸着することを,タンパクモジュールとGFPの融合タンパク質を作成することで明らかにした.これらの結果はこれまでに報告のない新規性の高い内容として学会発表を行った.さらに,マウスの胚性幹細胞(ES細胞)の未分化維持(寿命の延長)に必須の生理活性物質であるleukemiainhibitoryfactor (LIF)とCBMの融合タンパク質を作成し,CMCヒドロゲル上に特異的に吸着させた培養面において,マウスES細胞の未分化維持培養を行い,細胞内的な評価として未分化に関与する遺伝子発現量の解析を行った.2.細胞寿命や分化に関わる生理活性物質の探索ヒト造血幹細胞のモデル細胞株であるK562細胞は,生理活性物質であるphorbol 12-mydstate13-acetate(PMA)を培地中への添加することで,細胞寿命の短縮とともに巨核球への分化が引き起こされる.巨核球分化では,本来浮遊系の細胞であるK562が培養面へと付着・伸展し,核内分裂が生じることで核と細胞質の巨大化が進行し,やがて細胞死に至る.本研究では,K562細胞のPMA分化の際に,代表的な酸化ストレス因子である過酸化水素を添加すると寿命の短縮と巨核球分化の促進が引き起こされ,内的指標である遺伝子発現レベルにおいて酸化ストレス応答が重要であることを明らかとした.以上の研究成果は,これまでに報告のない新規性の高い内容として学会発表を行った.ヒト造血幹細胞のモデル細胞株であるK562細胞は,生理活性物質であるphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)を培地中への添加することで,細胞寿命の短縮とともに巨核球への分化が引き起こされる.巨核球分化では,本来浮遊系の細胞であるK562が培養面へと付着・伸展し,核内分裂が生じることで核と細胞質の巨大化が進行し,やがて細胞死に至る.前年度までは,K562細胞の巨核球分化に酸化ストレスが重要な役割を果たしていることを明らかにし,外因性の過酸化水素を添加することで分化が促進されることを報告した.そこで今年度は,得られた知見を基にヒト初代造血幹細胞を用いて,巨核球分化における酸化ストレスの影響を確認した.ヒト