hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
行動モードの相転移を実現する脳情報動態

線虫C. elegansの2つの行動様式、「ローカルサーチ」と「グローバルサーチ」の違いを特徴付ける行動要素として、後退や急激な方向転換などのターン運動の頻度が挙げられる。すなわち、ローカルサーチモードではターン運動の頻度が上昇し、方向転換を繰り返しながら局所的な探索運動を繰り返すのに対し、グローバルサーチモードでは、方向転換の頻度を著しく減少させることで、より広範な範囲を探索する。本年度は、まず、行動の相転移がおきる温度環境下での、これらの後退などの方向転換運動を制御する神経細胞の同定を試みた。具体的には、すべての神経細胞が同定されている線虫の利点を生かし、個々の神経細胞が脱落した系統を多数作成した。これらの神経細胞脱落株での温度環境下での行動をMulti Worm Trackerによって計測後、得られたデータから後退や方向転換に寄与する神経細胞の同定を試みた。これによって、線虫の主要な温度受容ニューロンであるAFDや、その下流に位置するいくつかの介在ニューロンが後退などの方向転換の制御に関わっていることが明らかとなってきた。さらに、ローカルサーチからグローバルサーチへと行動が相転移を起こす際に、どのような神経活動が関与するのかを明らかにするために、行動中の線虫を高倍率で捉え、動きに合わせて追従しながら神経活動を計測する高速トラッキングシステムの拡張を行った。現在までに、複数の神経細胞から神経活動を得るための画像解析プログラムを更新した。本年度はmulti worm trackerによる計測や高速トラッキングシステムの拡張など、研究課題を推進することができた。今後は、行動モードの相転移に関わる神経回路同定を一層進めると同時に、前年度までに改良してきたトラッキングシステムを用いて行動モードの相転移を引き起こす神経活動動態を捉えることを目指す。
日本海地域で栽培される米の品質・食味におよぼす栽培環境の定量的研究

新潟大学1995年、コシヒカリの収量は:LP100(緩効性肥料100日効き、以下同様)>LP30>LP50>LP70>標準の順であった。精米中の窒素含有率は、標準とLP30で最も低かった。1996年、近赤外線装置を用いて、全国8カ所の試料について調べてみると、窒素含有率は、一般に南で高い傾向にあったが、脂質含有率には、一定の傾向が見られなかった。1997年、LP肥料の深層追肥とへの字型施肥では、深層追肥に比べて、への字施肥の収量が高く、一方窒素含有率は低かった。山形大学1995年、籾生産効率は、追肥時期の早い区ほど(出穂30日前)、また遮光率の小さい区ほど大きかった。追肥時期が遅いほど、精米中の蛋白含有率が増加した。1996年、基肥が下層に多く分布すると、籾生産効率が低く精米中の蛋白含有率が高くなった。1997年、穂揃期における、一籾当たり窒素量と精米中の蛋白含有率には、ハエヌキ、ササニシキとも正の相関係数が認められた。即ち、千粒重が重いと、相対的に蛋白含有率は低下する傾向にあった。金沢大学1995年、コシヒカリについて、LP70を用いた慣行移植の食味計スコアーは94,不耕移植のスコアーは74であった。1996年、硫酸カルシウムを施用すると地中10cm以下に分布する根の割合が増えた。堆肥とLP肥料施肥区を比べると、LP肥料使用で良食味を示した。1997年、ぼかし肥料を使用した有機栽培では、蛋白含有率が高く、整粒歩合は低下したが、さらに検討の余地がある。今年度、主な試験は、山形、新潟、石川の各県で行われた。以下に各地の試験の目的と結果を列記する。山形大学(県農試圧内支場にて):窒素(N)の追肥時期および遮光率が、籾生産効率および精白米の蛋白含量におよぼす影響を検討した。品種どまんなかを用い、追肥量を2g/m^2とし、その時期を出穂前30,25,20,15,10および5日とし、また遮光率(7月25日から8月10日まで)を0,36,55%とした。その結果、籾生産効率は、追肥時期の早い区ほど、また遮光率の小さい区ほど、それぞれ大きかった。追肥時期が遅くなるほど、一籾N量が増加し、精白米中の蛋白含有率が増加した。また遮光により、一籾N量が増加し、米粒充実が抑制された。新潟大学(大学内圃場にて):肥効期間の異なる緩効性肥料を深層追肥した場合のコシヒカリの収量と食味要因に及ぼす影響を検討した。品種コシヒカリを用い、緩効性肥料30日効き(LP30)、50日効き(LP50)、70日効き(LP70)、100日効き(LP100)を7月5日に深層追肥した。対照として標準区を設定した。その結果、(1)玄米収量(g/m^2)は、LP100>LP30>LP50>LP70>標準区の順で、籾数/穂と穂数/株も同じ傾向を示した。

(2)精白米(9割搗精米)のN%は、LP70で最も高く、標準とLP30で低かった。金沢大学(大学内圃場にて):コシヒカリを不耕起移植および慣行移植した場合の、根系と玄米の品質を調査した。LP70およびLPSS100を施用した慣行移植区で、玄米中の蛋白含量、アミロース含量はそれぞれ6.7-7.0%、19.9%を示し、食味計のスコアーは94であった。また、堆肥とLP肥料併用区、不耕起移植区のスコアーは、それぞれ80と74であった。不耕起移植区の根系生育は、慣行栽培に劣らなかった。なお、上記以外の地域の玄米の分析は、現在調査中である。新潟大学。近赤外の装置を用いて、9割搗精米用の窒素と油の含有率を出すための標準曲線をつくった。この曲線に、全国8か所から採取した米の試料をあてはめた。その結果、一般に、南の資料は北の試料に比べて窒素含有率、すなわち蛋白含量の高い傾向にあることが判った。しかし、油については一定の傾向がみられなかった。一方、昨年と同様に、コンクリートポットと田圃で、緩効性肥料(LP30,50,70)の試験を行った。その結果、LP30の収量が両方の栽培条件で高いこと、特に、後者では、約800kg 10a^<-1>が示された。穂相診断から、2次枝梗の籾数が4-5粒あることが判った。山形大学。以下の3試験を行い、次のような結果を得た。試験1中干し(6月26日から7月8日)と浅水(6月26日から8月20日)処理を行い、光合成速度を調べた結果、登熟中・後期において、中干し区が浅水区より14-23%高まることが判った。試験2珪酸処理により、光合成速度には、無処理との間に差がみられなかったが、精米中の蛋白含有率は、むしろ低かった。試験3元肥が下層に多く分布すると、籾生産効率が低く、精米中の蛋白含有率が高くなった。金沢大学。良質米の生産を目的として試みられている様々な農法で栽培したイネの、地上部および根系生育、根系の土中分布構造、さらに収量と品質(玄米、白米)についても検討した。硫酸カルシウムを施用すると、地中10cm以下に分布する根の割合が増した(収穫期)。多量の米糖を施用した場合、浅根状態の根系形態を示した。施肥として、堆肥、LP肥料および両者の混合を用いた場合、LP肥料を使用した処理区で良食味を示してした。新潟大学今年度は、コシヒカリを用いて、LP肥料の深層施肥の他に、への字施肥も加えて試験を行った。収量は、前年度までの結果と少々異なり、LPによる深層追肥よりも、への字による施肥で高かった。精白米中の窒素および脂質含有率は、への字施肥で低く、LPによる深層施肥で高かった。また、両要因については、への字施肥は、慣行処理のものよりも低かった。山形大学一粒重が精米中の蛋白質含有率の変動に及ぼす影響を検討した。品種にハエヌキ、ササニシキを用いた。穂揃期における一籾当たり窒素量と精米中の蛋白質含有率には、両品種とも正の相関関係が認められた。すなわち、千粒重が重いと、相対的に蛋白質含有率は低下する傾向にあった。また、耕起前に基肥を施用した圃場では、作土の下層への基肥の分布が多い傾向にあり、基肥窒素の利用率が高かった。そのため、籾生産能率が低く、精米中の蛋白質含有率が高い傾向にあった。金沢大学コシヒカリをもちい、ぼかし肥料を使用した有機栽培区に焦点をあてて収量調査と品質評価を実施した。今年度は、蛋白含量が高く、整粒歩合(良質米)は低下していた。この原因として、4-6月の低温寡照条件による生育遅延が、生育後半まで回復しないことが一因と考えられた。根系生育が劣り、かつ地上部の生育の遅延が続いた。米の官能検査と根のコアサンプルについては、今後調査する予定である。前年度の根の解析から、硫酸カルシウムを施用すると、全根乾物重中の10cm以上の根の割合が増えることがわかった。
SNAP-25のリン酸化とストレス障害の関係性の解明

ストレスはうつ病などの精神疾患の発症との関連が指摘されており、ストレスに対する適応機構の解明は医学的、社会的に喫緊の問題となっている。SNAP-25は神経伝達物質の放出に必須で脳の全域に存在すタンパク質であり、187番目のアミノ酸のSer(Ser187)がリン酸化されることにより神経伝達物質の放出を促進する事が示されている。そこで、ストレスに対する反応および適応機構におけるSNAP-25のSer187のリン酸化の役割に着目して解析を行ったところ、以下の結果が得られた。1)SNAP-25は、ある種のストレス刺激によってのみ、脳の辺縁系を中心とする領域でリン酸化されることを見出した。一方、ストレスによってアドレナリンやコルチコステロンを分泌する副腎では、ストレス刺激によるSNAP-25のリン酸化は検出されなかった。ストレス刺激によってリン酸化される他の分子を探索したところ、SNAP-25をリン酸化するストレス刺激によってGSK-3βのSer9がリン酸化されることを見出した。このSNAP-25とGSK-3βがリン酸化される脳の領域は、類似しているが一部異なることも見出した。2) SNAP-25のリン酸化を受けるSer187に変異を導入してリン酸化を受けなくさせた変異マウスでは、飼育環境から受けるストレスにより摂食意欲の低下を示す個体が出現することを見出した。3)最終年度には、SNAP-25がリン酸化される脳の領域では、ストレス刺激により神経伝達物質のあるモノアミンの放出量が増加することを見出した。以上より、ストレスに対する反応および適応機構において、脳のSNAP-25のリン酸化は、あるモノアミンの放出の増強を誘導する可能性が考えられた。また、SNAP-25のリン酸化は摂食意欲の発現に寄与する可能性も考えられた。これらの分子機構の詳細についてはさらなる解析が必要である。本研究では、脳や副腎のSNAP-25のリン酸化が、ストレス機構でどのような意義を持つのかを明らかにすることを目的としている。申請者らはこれまでに、ストレスを加えると脳内でSNAP-25がリン酸化されること、SNAP-25のリン酸化が刺激依存的なドーパミンの放出を増強する可能性があること、遺伝子操作でSNAP-25のリン酸化を消失させたマウスは、強い不安行動を示すことを明らかにしている。以下に本年の研究成果を示す。1ストレスと副腎:ストレス刺激により、副腎皮質からCORT、SNAP-25を発現する副腎髄質からアドレナリンが放出される。SNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスでも、拘束浸水ストレスでCORTとアドレナリンの血中濃度が上昇することを確認した。2ストレスの種類とSNAP-25のリン酸化:野生型マウスに長期の麻酔維持を与えても、海馬のSNAP-25のリン酸化が上昇することを見出した。調査したいくつかのストレス刺激では、血中CORT量は上昇するが、海馬でのSNAP-25のリン酸化の変化が認められないものがあった。したがって、HPA軸と脳内のSNAP-25のリン酸化は互いに独立している可能性も考えられる。脳の領域ごとに詳細な検討が必要である。3慢性ストレス:野生型マウスとは異なり、SNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスでは、代謝ケージでの飼育ストレスによって摂食量の減少をおこすものが出現した。この傾向は老齢であるほど顕著に認められた。この飼育環境下で、野生型マウスも変異マウスも血中CORT量は上昇し、ストレスを感知していることを確認した。またSucrose preferencetestにより、変異マウスは快楽消失を起こしていないことも明らかにした。ストレスにより拒食を示す感受性の変異マウスを環境適応の機構を探るモデルとして利用できると考えている。項目12には遅れがあるが、項目34では予定よりも進展している。1ストレスと副腎:野生型およびSNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスの両方で、拘束浸水ストレスによる血中アドレナリン濃度の上昇を確認した。ただし、アドレナリン測定に使用したHPLCの感度がそれほど良くなかったため、群間での放出量の有意差の検討を保留としている。これはELISA法を用いることで一挙に解決できると考えている。2副腎髄質のSNAP-25のリン酸化の役割:目標では、変異マウスと野生型マウスのそれぞれの副腎髄質細胞を培養し、3H-アドレナリンを取り込ませて放出量を比較する予定であったがまだ取り組めていない。培養には胎児の小さな副腎を用いる予定であったが、細胞数をかせげないことが問題であった。現在は成体の副腎を用いた培養に着手しており、上手くいけば動物個体数の節約も可能になる。3ストレスの種類とSNAP-25のリン酸化:予算の都合により予定していたストレス刺激の一部は中止したが、順調に進展している。SNAP-25のリン酸化が脳のいかなる状態から生じるのかを明らかにするためには、より詳細な部域の変化を見る必要があると考え、当初の計画にはなかった免疫組織化学の検討に着手をしている。4慢性ストレス:計画と異なる展開があったが、順調に進展している。当初は全ての変異マウスが代謝ケージで拒食を示していたが、特殊な餌箱による影響もあり、床に餌を置くことで約半数の摂食は改善することを確認した。感受性と非感受性の個体に分けて調査を行うこととした。変異マウスで快楽消失(Anhedonia)が生じていないことも明らかにした。SNAP

-25は開口放出にかかわるSNAREタンパク質の一種である。拘束浸水ストレスを加えると脳内でSNAP-25はリン酸化され、遺伝子操作でSNAP-25のリン酸化を消失させたマウスは、扁桃体でのモノアミン放出の低下、不安行動、てんかん発作を示す。本研究ではストレスと脳や副腎のSNAP-25のリン酸化の関係を明らかにすることを目的にしている。本年度は、免疫組織化学によるリン酸化SNAP-25の検出に成功し、脳領域の変化の詳細な解析が可能となった。SNAP-25は脳の全域に存在するが、野生型マウスに拘束浸水ストレスを与えた際にリン酸化が大きく亢進する部位は、辺縁系を中心する限られた領域であり、この経路を連絡する神経線維で特に強いことを明らかにした。この結果は、脳の領域ごとの摘出や細胞分画で得られたサンプルを用いた抗リン酸化SNAP-25抗体によるイムノブロットの結果とも矛盾しなかった。さらに、SNAP-25のリン酸化は麻酔薬によっても生じ、処理時間に応じてシグナルは強く広範囲まで広がり、また数分で麻酔から覚醒が起こるのと同時にSNAP-25のリン酸化も直ちに消失することを明らかにした。一方で、副腎のSNAP-25のリン酸化とストレスの関係性は見えていない。まず、リン酸化SNAP-25は、ストレスを受けたマウスの副腎やリン酸化を亢進させる薬剤処理をした培養副腎細胞においてもイムノブロットによって検出されてこない。SNAP-25の発現量は脳に比べて低いが、そのリン酸化割合も低いものと考えられた。そして、SNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスと野生型マウスに拘束浸水ストレスを与えると、血中CORT(副腎皮質が分泌)は両マウスとも同程度上昇し、血中アドレナリン(SNAP-25を発現する副腎髄質が分泌)は両マウスとも上昇を示していない。本年度は免疫組織化学によるリン酸化SNAP-25の検出法の確立に成功し、新たな抗体も作成した。これにより、SNAP-25のリン酸化の変化について、空間的な情報を得ることが可能になり、注目すべき神経回路をしぼることが出来た。麻酔薬や各種のリガンドの阻害剤を投与し、SNAP-25のリン酸化の変化をイムノブロットと免疫組織化学により調査した結果、麻酔薬によりSNAP-25のリン酸化が亢進することを明らかにした。いくつかの阻害薬でも変化する可能性が見いだされており、さらなる検討を行う予定である。また、各種の慢性ストレスの種類の検討においても興味深い結果を得た。慢性ストレスの1つとして個別飼育の影響を、各週齢の野生型マウスとSNAP-25のリン酸化が生じない変異マウスで調査した。変異マウスについては、摂食リズムは個別飼育と群れ飼育(対照群)でどちらも変動を示しつつも拒食は示さなかった。また野生型マウス、変異マウスともに、血中CORT濃度に特徴的な変化はなかった。しかし、野生型マウス脳内のリン酸化SNAP-25量は個別飼育の期間内での変動は検出されないが、群れ飼育と比べ個別飼育を体験した野生型マウスでは拘束浸水ストレスによるSNAP-25のリン酸化の上昇程度が低くなる可能性が見いだされた。
網羅的遺伝子解析をとおして同定した家族性白血病原因遺伝子の機能解析

新規ETV6変異の機能解析のため、ETV6標的分子であるEGR1, TRAF1についてレポーターアッセイと遺伝子発現解析を行った。Hela細胞にETV6野生型と新規ETV6変異型の発現ベクターおよびEGR1, TRAF1プロモーターベクターを導入し、ルシフェラーゼ活性を測定したところ野生型と新規変異型では有意差は認めなかった。さらに、野生型と新規変異型を導入したHela細胞から定量的PCR法で遺伝子発現を比較したがEGR1, TRAF1いずれも発現量に差は認めなかった。次に、マウス造血再構築における新規ETV6変異の機能解析のため、5-FUを腹腔内投与したドナーマウスから骨髄前駆細胞を採取しGFP標識されたレトロウイルスベクターを用いてMock、ETV6野生型、新規ETV6変異型を導入した。レトロウイルスベクター感染後48時間後、X線10Gyを照射したレシピエントマウスに経静脈的に感染骨髄細胞を移植した。移植後12週まで末梢血およびGFP陽性細胞の割合を評価した。4,8,12週で白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、血小板数に有意な差は認めなかった。さらに末梢白血球分画をGr1, Mac1, B220, CD3の推移で評価したがいずれの分画においてもMockおよび野生株との間に有意な差は認めなかった。これらの結果から、新規ETV6変異単独では白血化に関わるリンパ球分化へのバイアスや血球増多には関与しないことが明らかとなった。また、既報告ではETV6変異では血小板分化障害をきたすことが示されているが、コロニーフォーメーションアッセイの結果と同じくマウス造血においても血小板産生能は保たれており、臨床的に同患者の血小板値が保持されていることと合致する所見であった。今後は、白血病発症に関与するか検討するためETV6-RUNX1との相互作用と白血病発症促進効果の検討を行う予定である。白血病発症に関する責任遺伝子同定を目的に1家系の兄妹の白血病細胞を対象にRNAシーケンス法によるキメラ遺伝子スクリーニング、寛解期検体を対象に次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を施行した。得られた結果を元に更に詳細な解析を行っている。また別家系で新規に見出したETV6生殖細胞変異は既報告のETV6生殖細胞変異症例が全て血小板減少を伴っているのと異なり血小板数が正常である。今回見出した新規ETV6変異の機能解析として細胞内局在、転写抑制活性、造血分化能を評価した。具体的には、レトロウイルスベクターを用いてHela細胞を形質変換し細胞内局在機能解析を行った。変異型は野生型と比較し核内局在が減少していた。次にレポーター遺伝子アッセイで遺伝子発現解析を行った。変異型はMMP3やPF4転写抑制障害を認めず野生型と同様の抑制活性を保有していた。更にマウス造血幹細胞分画(LSK)に変異遺伝子を導入し分可能をフローサイトメトリーで評価した。野生型と比較してGr1陰性Mac1陰性分画減少を認めたが巨核球分画割合は保たれていて、臨床的に同患者の血小板値が保持されていることと合致する所見であった。上記の研究により今回我々が新たに見出した変異型ETV6は構造変化により核内移行に障害をきたす事が明らかになった。但しETV6の転写因子としてのMMP3やPF4抑制効果は保持されていた。マウス造血幹細胞を用いた実験より巨核球より上流の分化段階が障害されている可能性が示唆された。網羅的ゲノム解析を1家系に追加することができた。但しDNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を当初4家系に計画していたが金銭的に進める事が困難であった。機能解析に関しては計画したとおりに進める事ができた。白血病発症に関する責任遺伝子同定を目的に1家系のMLL遺伝子再構成陽性兄妹の白血病細胞を対象にRNAシーケンス法によるキメラ遺伝子スクリーニング、寛解期検体を対象に次世代シーケンサーによる全ゲノム解析を施行し、得られた結果を元に詳細なドライ解析を行ったが責任遺伝子を想定させる変異をみだすことはできなかった。ETV6-RUNX1キメラ遺伝子陽性一卵性双生児に見出した新規ETV6生殖細胞変異の機能解析として、A)転写因子ETV6が有する転写抑制活性が新規ETV6変異ではどのように変化するか、B)新規ETV6変異によって正常造血能がどのように変化するのか検討を行った。まず転写抑制活性を評価した。ETV6下流遺伝子であるMMP3やPF4のプロモーター領域を用いて野生型ETV6、既知ETV6変異、新規ETV6変異をそれぞれ遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイにより転写活性を評価したところ、既知の変異株で生じる転写抑制障害を認めず野生型と同様の抑制活性を保有していたため、別の遺伝子であるTRAF1でも検討したが転写抑制障害は認めなかった。今回認めたETV6生殖細胞変異はETV6転写因子としての機能への影響は大きくないと想定された。次に造血能を評価した。マウス造血幹細胞分画(LSK)に変異遺伝子を導入しフローサイトメトリーで評価したところ、野生型と比較してGr1陰性Mac1陰性分画減少を認めた、巨核球より上流の分化段階が障害されている可能性が示唆されたため、マウスLSK分画に野生型ETV6,変異型ETV6を遺伝子導入後に放射線照射免疫不全マウスへの移植実験を行った。

野生型ETV6、変異型ETV6ともに生着後から徐々にキメリズムが低下し生着維持や再構築能の障害が疑われた。以上の解析結果から新規ETV6変異は転写抑制活性および造血分化能に関する明らかな障害機構は同定できなかった。網羅的ゲノム解析を追加した1家系の詳細なドライ解析を行ったが結果には結びつかなかった。機能解析に関しては計画したとおりに進める事ができたものの造血障害や分化障害を示唆する結果は得られなかった。新規ETV6変異の機能解析のため、ETV6標的分子であるEGR1, TRAF1についてレポーターアッセイと遺伝子発現解析を行った。Hela細胞にETV6野生型と新規ETV6変異型の発現ベクターおよびEGR1, TRAF1プロモーターベクターを導入し、ルシフェラーゼ活性を測定したところ野生型と新規変異型では有意差は認めなかった。さらに、野生型と新規変異型を導入したHela細胞から定量的PCR法で遺伝子発現を比較したがEGR1, TRAF1いずれも発現量に差は認めなかった。次に、マウス造血再構築における新規ETV6変異の機能解析のため、5-FUを腹腔内投与したドナーマウスから骨髄前駆細胞を採取しGFP標識されたレトロウイルスベクターを用いてMock、ETV6野生型、新規ETV6変異型を導入した。レトロウイルスベクター感染後48時間後、X線10Gyを照射したレシピエントマウスに経静脈的に感染骨髄細胞を移植した。移植後12週まで末梢血およびGFP陽性細胞の割合を評価した。4,8,12週で白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、血小板数に有意な差は認めなかった。さらに末梢白血球分画をGr1, Mac1, B220, CD3の推移で評価したがいずれの分画においてもMockおよび野生株との間に有意な差は認めなかった。これらの結果から、新規ETV6変異単独では白血化に関わるリンパ球分化へのバイアスや血球増多には関与しないことが明らかとなった。また、既報告ではETV6変異では血小板分化障害をきたすことが示されているが、コロニーフォーメーションアッセイの結果と同じくマウス造血においても血小板産生能は保たれており、臨床的に同患者の血小板値が保持されていることと合致する所見であった。今後は、白血病発症に関与するか検討するためETV6-RUNX1との相互作用と白血病発症促進効果の検討を行う予定である。ETV6の転写因子としての機能に影響を与えないかどうか、別の遺伝子のレポーターアッセイを行う。また血小板分化に与える影響について明らかにするために、マウスLSK分画に遺伝子導入後に移植実験を行い、フローサイトメトリーにて詳細な解析を予定している。MLL遺伝子再構成陽性兄妹に関して、全ゲノム解析から発症を促進させる原因遺伝子の同定を進めていく。機能喪失型の候補遺伝子に関してはsgRNAライブラリーを用いて遺伝子発現を抑制することでMLL白血病発症が促進するクローンを同定する。変異型ETV6に関しては白血病発症やリンパ球分化に与えるバイアスについて検討する。具体的にはETV6-RUNX1キメラ遺伝子と共発現させることで変化が生じるか解析する。1家系に計画していた追加の網羅的ゲノム解析には予算が足らず施行しなかったため。次年度のマウスを用いる実験で使用予定である。
ライム病の感染と遊走性紅斑出現の機構について

ライム病は米国でマダニ(Ixodes scapularis)により媒介されるボレリア感染症であることが1970年代に発見され、またその特長的な所見としてこの遊走性紅斑が有毒マダニ寄生部位に現れることが再確認された。我々もこの紅斑部組織からライム病の起因菌であるBorrelia burgdorferi sensu lato(主にB.garinii)を検出している。そのためマダニ寄生後にこの所見が出現すればライム病と判定してもよいとの意見も見られる。この紅斑の出現は、旭川医大の人体例からマダニ寄生後約7日間を必要とするものと推測される。この起因菌の感染と遊走性紅斑の出現機構については明確に解明されていない。感染モデル動物としてウサギ(日本白色種)を使用した。B.gariniiとB.afzeliiで有毒化したシュルツェマダニのコロニーを除毛した腹部に吸着感染群(15頭)、野外で採取したヤマトマダニ吸着群(2頭)、また、BSK培地で増殖した菌体を皮下への注射群(3頭)の3群を作成した。各ダニの吸着実験はウサギ17個体と皮下に直接注射による感染実験は3個体の合計20個体の動物を作成し、各ダニ吸着の2群はダニ除去後10日、注射群は20日間の観察を行ったが遊走性紅斑はいずれの個体にも観察されなかった。組織学的には真皮内にリンパ球と好酸球の炎症性細胞浸潤を認めた。この原因としては、(1)観察期間が短い、(2)兎は不適な動物、(3)日本産菌体は欧米産より弱毒、などが推測され、今後この点について検討する。ライム病は米国でマダニにより媒介されるボレリア感染症であることが発見され、またその特長的な所見としてこの紅斑がダニ寄生部位に現れることが再確認された。欧米や日本の本患者に高頻度に出現する。我々もこの紅斑部組織からライム病の起因菌であるBorrelia burgdorferi sensu latoを検出している。そのためマダニ寄生後にこの所見が出現すればライム病と判定しても良いと考える。この起因菌の感染と遊走性紅斑の出現の機構について明確に解明されていない。かつて予備的実験で人体分離株を兎の皮膚へ注射器により感染させたが、明確な紅斑の所見は得られなかった。マダニの唾液には血管拡張作用、抗炎症作用、抗血液凝固作用、免疫抑制作用を示す物質が含まれている。そのため、現在、有毒マダニのコロニーを作成して自然の状態での感染実験を実施する計画で、昨年から、成虫を野外から採集し、兎へ吸着・飽血・産卵、ふ化した幼虫を、有毒マウスへ吸着・飽血、休眠・脱皮-若虫、有毒または健康マウスへ吸着・飽血、休眠と現在は成虫への脱皮を待ちつつある。前年度に作成した有毒シェルツェマダニ・コロニー使用による兎への吸着感染実験を行った。各兎はダニ吸着2日前に除毛クリームで左右腹側(8×6cm)を除毛した後、一側にダニ5個体をプラスチック容器に入れ粘着バンドで固定し24時間皮膚に暴露した。このような試みを15頭の兎に実施した。また、野外で採取したヤマトマダニを前群と同様な方法で2頭の兎に行いシュルツェマダニ群と比較した。これら寄生ダニは2472時間放置後に手指またはピンセットで除去し、その後10日間観察した。一方、BSK培地に増殖した菌体(B.garinii)を10^<2-5>/

mlに調整して3頭の皮下に直接接種した群を作成し、この群はその後20日間観察を行った。今回ダニ吸着または注射によるライム病病原体(Borrelia burgdorferi sensu lato)の感染実験で遊走性紅斑の出現は認められなかった。病原体感染部位の組織学的所見は真皮内にリンパ球や好酸球を主体とする非特異的な炎症性細胞の浸潤が見られ、特に指でダニを除去した例に口下片の残留が多く、その周囲には強い反応が現れた。
実験的角膜屈折矯正手術におけるストレス蛋白の解析

現在行われている屈折矯正手術は、光学的角膜切除と角膜切開の2つに大別される。今回われわれは家兎角膜にそれぞれの手術を行い、膠原線維産生のシャペロンとして機能すると考えられている47kDa熱ショック蛋白(Hsp47)の発現を免疫組織化学的手法を用いて経時的に観察した。【方法】白色家兎28羽に対し、エキシマレーザーを用いた光学的角膜切除術および放射状角膜切開術を施行した。術施行0、1、3、5、7、14および28日後に眼球を摘出し、固定・包埋のうえ切片を作成し、Hsp47の発現について経時的に観察した。【結果】光学的角膜切除術では術後3日では角膜上皮細胞基底部と実質浅層の角膜実質細胞にHsp47の発現が認められた。術後5日および7日ではHsp47の発言は角膜実質深層にまでおよんでいた。術後14日ではHsp47の発言は減弱していた。角膜切開術では術後1日で切開部の角膜上皮細胞基底部とその近傍の角膜実質細胞にHsp47の発現が認められた。術後3・5および7日でもHsp47の発現はみられたがその部位は切開部の角膜上皮細胞基底部と切開創の近傍に限局していた。【考按・結論】いずれの方法でもHsp47の発現が認められたが、その範囲は光学的角膜切除術ではレーザー照射部位の周囲にまで及んでいたが、角膜切開術では切開創の近傍に限局していた。このことより光学的角膜切除術では角膜切開術に比べてより広い範囲に影響を及ぼしている可能性が示唆された。1.実験的角膜屈折矯正手術モデルの作成白色家兎を麻酔し、その角膜に対してradial keratotomy(RK)をヒトに準じて施行した。まず、光学部および切開部に相当する上皮面を専用のマーカーでマークした。次にRK用ダイアモンドナイフを用いて、8本の放射状切開を置いてRKを作成した。RKの深さが一定になるように試みたが、方向によりブレが生じ工夫が必要と思われた。手術後、1日、2日および3日の角膜を細隙燈顕微鏡で観察し、角膜に切開線が淡く形成されたのを確認した。その上で眼球を摘出し、以下の解析の試料とした。2.組織学的検討はじめにヘマトキシリン-エオジン染色を行い、光学顕微鏡で実験的角膜屈折矯正手術を施行した家兎角膜の形態学的特徴を観察した。RKを施行した部位に一致して、プラグ状に角膜上皮が増殖しており、また角膜実質細胞もこれを取り囲むように増殖していた。次に、70kDストレス蛋白に対する抗体を用いた免疫組織化学的検討を行い、その局在を検討した。すなわち、70kDストレス蛋白に対するマウスモノクローナル抗体を1次抗体とし、蛍光抗体法による免疫組織化学法を行った。また、アポトーシスに関しても検討を試みた。アポトーシスに伴うDNA fragmentationの検出をTUNEL法にて行い、角膜組織における発現を検討した。最近の眼科臨床医学において、角膜屈折矯正手術が注目を集めており、radial keratotomy(RK)やastigmatic keratotomy(AK)は、角膜形状を変えることで屈折を正常化することを目標としている。一方、これらの治療に対する角膜組織反応の細胞生物学的な解析はいまだ十分とはいえず、とくに創傷治癒に関する研究は重要と思われる。現在行っている研究は、実験的角膜矯正手術を対象とし、組織学的解析によりそのストレス応答すなわちストレス蛋白の動態に関して解析することを目標としている。

実験方法としては、白色家兎を麻酔し角膜に対してradial keratotomy (RK)をヒトに準じて施行した。まず、光学部および切開部に相当する上皮面を専用のマーカーでマークした。次に、RK用ダイアモンドナイフを用いて、8本の放射状切開を作成した。手術後1日、2日、3日、4日、5日、7日および14日に角膜を細隙燈顕微鏡で観察するとともに前眼部写真を撮影した。その上で眼球を摘出し、以下の解析の試料とした。この際、手術を施行しない片眼をコントロールとした。組織学的検討としては、はじめに光学顕微鏡で実験的角膜屈折矯正手術を施行した家兎角膜の形態学的特徴を観察した。次に、70kDストレス蛋白に対する抗体を用いた免疫組織化学的検討を行った。すなわち、70kDストレス蛋白に対するマウスモノクローナル抗体を1次抗体とし、免疫組織化学法でその角膜における局在を明らかにする実験を行った。現在は、染色性の向上を目標に免疫組織化学法の条件を検討中であり、実験を継続している。エキシマレーザー屈折矯正手術は、屈折異常の矯正に有用な手技であるが、角膜組織に対する侵襲や異常な創傷治癒が懸念される。今回われわれは、家兎角膜にて47kDa熱ショック蛋白(Hsp47)の発現を免疫組織化学的手法を用いて経時的に観察した。【方法】白色家兎に対し、エキシマレーザー(PTKモード)を使用して直径6.0mm、深さ100μmの光学的角膜切除術を施行した。レーザー照射0、1、3、5、7、14および28日後に眼球を摘出し、固定・包埋のうえ切片を作成し、Hsp47の発現について経時的に観察した。【結果】術後1日ではレーザー照射部位の実質浅層に綿維芽細胞様に変化した角膜実質細胞が観察された。術後3日では角膜上皮細胞基底部と実質浅層の角膜実質細胞にHsp47の発現が認められた。術後5および7日後ではHsp47の発現は角膜実質深層にまでおよび、角膜内皮細胞にも発現がみられた。術後14日では角膜実質浅層での発現は減弱し、術後28日ではHsp47の発現はさらに減弱していた。【考按・結論】Hsp47はレーザー照射後の角膜において、角膜上皮層・実質浅層のみならず実質深層および角膜内皮細胞においても発現が認められ、またその範囲はレーザー照射部位の周囲にまで及んでいた。このことよりエキシマレーザーの照射による影響は角膜上皮層および角膜実質浅層のみにとどまらず、角膜実質深層および角膜内皮細胞へも何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆された。
ネパールにおける農村女性の社会参加をめぐる実証的研究

NAGAOKA ed, Our memory and experience Gorkha Earthquakeon 25th April 2015,SEFU, Nepal, 2017、「共に学び合う防災教育の必要性:ネパール大地震からの復興に向けて」、国立教育政策研究所紀要、第145集、国立教育政策研究所、(155頁167頁)、2016年、『ネパール女性の社会参加と識字教育:生活世界に基づいた学びの実践』(明石書店)、2018年2月。今後は大災害を経験した社会における女性の社会参加を促すノンフォーマルな学びの推進とともに、女性が情報へアクセスする術を学ぶことの重要性を質的に検討する。本研究に取り組み始めた2015年4月下旬、ネパールで大地震が発生した。本研究の調査対象地も壊滅的な被害を受け、研究計画段階における調査地の状況とは大きく様変わりしてしまった。現地の調査協力者と協議した結果、このような時こそ、被災した人々の生活再建に向けて、知見を共有することが求められるのではないかと判断し、現地情勢をにらみながら、当初の計画に即して進めていくことにした。また、調査地の中には、タライ地方(インドとの国境沿い)が含まれていたが、2015年8月中旬以降、新憲法の成立をめぐり、タライ地方の人々による抗議活動が大規模なストライキへと展開していった。そのため、ネパール国内の移動が困難となり、調査地への移動を回避せざるをえなくなってしまった。しかし、可能な範囲で調査を実施し、現状把握に努めた。その結果、「防災」の概念についても、女性の社会参加に関わることであり、広く理解を促し、普及に向けた活動に取り組んでいくことが不可欠であることを確認した。特に、災害時におけるジェンダーの視点から防災活動、防災に向けた教育活動が求められることが把握された。ネパール社会の情勢を考慮しつつ、検討していきたい。現在までの進捗状況については、以下のとおり。1、2015年4月25日に発生したネパール大地震により、ネパール国内の状況が大きく変化してしまったこと。2、同年8月以降、新憲法の成立をめぐり、タライ地方(インドとの国境付近)の人々によるストライキが拡大し、タライ地方の調査地への移動は回避しなければならなかったこと。1、2ともに、次第に状況は緩和されてきているようであるが、被災した人々の多くは、未だ困難な生活状況を強いられている。現地の情勢を伺いながら、今後も調査を進めていきたい。本研究は、ネパールの農村女性の社会参加の様相を把握することを目的としているが、本研究がスタートした2015年4月下旬、大地震が発生し、調査地も壊滅的な被害を受けた。社会教育研究においても、その土地の状況や社会の在り方、固有の知見や伝統的な社会の仕組みを把握し、災害後の社会の復興に向けて、どのような取り組みが望ましいのか、考えていくことが欠かせない。とりわけ、災害とジェンダーの視点から分析された研究では、災害後、被害は男女の置かれた社会的付置状況において不均衡に影響を及ぼし、また、その他の要因とも複雑に重なっていくことが指摘されている。調査地の村を中心に継続調査を行った結果、災害を経験した社会においては、女性は男性よりも被害の割合が大きく、災害後の生活においてこれまで以上に性役割分業を強いられ、労働負担が増していることが確認された。災害弱者を女性に限定してしまうことはできないが、貧困やカーストの問題が複合的に絡み合い、また、政治、経済的に周辺化される人々を創出している状況下では、結果として、女性はさらに不利益を被る状態に置かれている。今年度は、聞き取り調査により得られた証言を記録集としてまとめ、大地震における人々の記憶や経験をこれからの社会の復興に役立たせていくこととした。本研究の調査地の一つ(ブングマティ村)は、Kathmandu盆地の中でゴルカ大地震による被害が大きかった地域である。大地震の発生から約2年が経過しようとしている現在、被災地の人々の生活環境、状態に大きな変化は見られない。劣悪な環境の下、仮設住居での暮らしが続いているということさえ、注目されずにいる。調査地における調査を継続して行った結果、以下のような事柄が明らかになった。1仮設住居で生活している人々の多くは、土地を所有していないため、政府から罹災証明が得られない。そのため、義援金が支給されないこと。2村落内や世帯内でも女性には情報が行き届いていないケースが多いこと。3震災以降、怪我や疾病により体調を崩した人の割合は、圧倒的に女性の方が多いこと。4大地震の発生原因を科学的根拠よりも宗教的事由として受け止めている人が多いこと。人々の多様な経験や震災当日の記憶を記録しておくことが必要であり、個々人の記憶は地域社会の記憶としても、今後の社会の復興に役立てていくことができる。人々の経験を『Our memory and experience Gorkha Earthquake on 25th April 2015』として小冊子にまとめ、現地において配布できる体制を整えた。本研究を開始してまもない2015年4月25日、首都カトマンズ盆地を中心に発生した大地震(M7.9)により、多くの死傷者や歴史的建造物の倒壊等、甚大な被害が生じた。本研究では農村女性の社会参加の様相について実証的に探求しようと研究計画を立てていたにもかかわらず、調査地の状況が大きく様変わりしてしまったため、急遽、大震災後の実態調査を行うこととなった。予定していた調査地の家屋の9割近くが倒壊してしまったからである。

聞き取り調査を行う中で、被害は貧困層や低カースト層の女性に大きく負担がのしかかる不均衡な状況を生み出していていることが明らかになった。生活再建のために新たに就労の機会を求める人が増しているものの、女性は就労条件も悪く、劣悪な環境の中で低賃金労働に従事せざるをえない状況にあった。さらに、情報へのアクセスを促す体制づくりが急務であることも述べておきたい。本研究における具体的な研究成果は下記のとおりである。『ネパール女性の社会参加と識字教育:生活世界に基づいた学びの実践』(明石書店)、2018年2月。今後は、大災害を経験した社会における女性の社会参加を促すノンフォーマルな学びの促進に向けて、情報へのアクセスを促す活動に焦点を当て、その社会的意義を質的に検討するとともに、女性も情報へアクセスする術を理解し、学ぶことの重要性を問うていく必要がある。NAGAOKA ed, Our memory and experience Gorkha Earthquake on 25th April 2015,SEFU, Nepal, 2017、「共に学び合う防災教育の必要性:ネパール大地震からの復興に向けて」、国立教育政策研究所紀要、第145集、国立教育政策研究所、(155頁167頁)、2016年、『ネパール女性の社会参加と識字教育:生活世界に基づいた学びの実践』(明石書店)、2018年2月。今後は大災害を経験した社会における女性の社会参加を促すノンフォーマルな学びの推進とともに、女性が情報へアクセスする術を学ぶことの重要性を質的に検討する。引き続き、下記の方針で調査研究に取り組む。1、文献研究:南アジアの女性と開発、途上国のノンフォーマル教育に関する理論研究。2、フィールドワーク:ネパールにおける農村女性のライフヒストリーを収集、分析。3、南アジアにおける女性の社会参加に関する実態把握と検証、に取り組む。今年度は本研究の最終年度となる。研究計画に従い、これまでの研究活動の成果をまとめていく。女性の社会参加の様相を他のアジア諸国との比較においても分析を進めていきたい。2015年4月に生じたネパール大地震の他、ネパール国内の政情が不安定になったため、現地調査について、当初の計画に変更、調整をしなければならなくなってしまったため。1印刷費として、前倒し請求により20万円の予算を設定していたが、大幅にコストを抑えることができたため。2計画ではバングラデシュの訪問を予定していたが、現地の治安が不安定であるため、渡航を見合わせたため。2015年4月に生じたネパール大地震の他、ネパール国内の政情が不安定になったため、現地調査について変更、調整をしなければならなくなってしまった。そのため、使用額に差が生じてしまったが、次年度では現地情勢をうかがいながら、実行できるように努めたい。最終年度である今年度は、これまでの調査により得られた知見を広く発信、報告していくことが有効であるため、1英文による論文執筆のための費用(英文校閲等)に使用していく。2また、南アジアの女性の教育支援活動に取り組む機関の訪問調査(バングラデシュを予定している)を実施し、ネットワーク、意見交換にも取り組み、研究成果の報告に活かしていく。
マウス乾癬様皮膚炎モデルにおけるTLR2およびTLR4の役割の解明

TLR2ノックアウト(TLR2-KO)マウスではイミキモド誘発乾癬様皮膚炎が野生型(WT)マウスと比べて増強するが、TLR4-KOマウスではWTマウスと同等であった。TLR2-KO群ではWT群と比べて、Day2の病変部皮膚におけるTh1サイトカインの発現が上昇し、Th17サイトカインとFoxp3の発現は低下していた。皮膚所属リンパ節では、Day2でTLR2-KO群ではWT群と比べてTGF-βの発現およびCD4(+)Foxp3(+)細胞が減少していた。Th1サイトカインの上昇と制御性T細胞の数的および機能的異常がTLR2-KOマウスにおける乾癬様皮膚炎の増強に関与していると考えられた。TLR2ノックアウトマウス、TLR4ノックアウトマウス、TLR2/4ダブルノックアウトマウス、およびその野生型マウスであるC57BL/6マウスを用い、マウスの背部を剃毛し、5%イミキモドクリームを連続6日間背部および片耳への塗布を行った。背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の程度をそれぞれ5段階(0なし1軽度2中等度3高度4著明)で点数化し、皮疹スコアの合計点を経時的に算出した。また、イミキモドを塗布した方の耳の厚さを経時的に測定した。TLR2ノックアウトマウスはday2以降day5まで、野生型マウスと比べて、背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点が有意に高かった。TLR4ノックアウトマウスではday0以降day5まで、野生型マウスと比べて、背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点には有意な差はなかった。TLR2/4ダブルノックアウトマウスではday2以降day5まで、野生型マウスと比べて、背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点が有意に高かった。またTLR4ノックアウトマウス比べてもTLR2/4ダブルノックアウトマウスの背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点はday2以降day5まで有意に高かった。TLR2ノックアウトマウスと比べるとTLR2/4ダブルノックアウトマウスの背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点には有意な差はなかった。イミキモドを塗布した耳介皮膚の厚さについては、TLR2ノックアウトマウス、TLR4ノックアウトマウス、TLR2/4ダブルノックアウトマウス、および野生型マウスの4群においてday0以降day5まで、野生型マウスと比べて、背部皮膚の紅斑・鱗屑・浸潤の皮疹スコアの合計点には有意な差はなかった。以上より、TLR2がイミキモド誘発マウス乾癬様皮膚炎において皮膚炎の誘発を負に制御している可能性が考えられた。平成25年度の研究においてTLR2ノックアウトマウスではイミキモド誘発乾癬様皮膚炎がその野生型マウスであるC57BL/6マウスと比べて増強するが、TLR4ノックアウトマウスでは野生型マウスと同等レベルであることが判明した。その結果を受け、イミキモドを外用したTLR2ノックアウトマウスおよび野生型マウスの皮膚における各種サイトカインの発現を検討した。イミキモドを外用した皮膚を採取しmRNAを抽出しreal-time RT-PCR法にて検討した。イミキモド外用後の皮膚においてTLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べて、IFNγ, CXCL9, CXCL10, p35, p28, EBI3の発現の上昇がみられた。また、TLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べて、IL-10, IL-17, IL-22, CCL20, p19, p40の発現は逆に低下していた。さらに、制御性T細胞のマスター転写因子であるFoxp3のイミキモド外用部での発現がTLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べて低下していた。TNF-αの発現には両者で差がなかった。IFNγ, CXCL9, CXCL10, p35, p28, EBI3はTh1系のサイトカインであり、その一方IL-17, IL-22, CCL20, p19はTh17系のサイトカインであることを考えると、イミキモド外用にてTh17系のサイトカインの発現は低下し、Th1系のサイトカインの発現は上昇していることになる。また、IL-10は抑制性のサイトカインとして知られている。乾癬は通常Th17/Th1が関わる疾患であることを考えると、Th1系サイトカインの上昇と制御性T細胞の数的減少や抑制性サイトカインの発現低下がTLR2ノックアウトマウスでのイミキモド誘発乾癬様皮膚炎の増強に関与している可能性が考えられた。TLR2ノックアウトマウスではイミキモド誘発乾癬様皮膚炎がその野生型マウスであるC57BL/6マウスと比べて増強するが、TLR4ノックアウトマウスでは野生型マウスと同等レベルであることが判明した。イミキモドを外用した皮膚における各種分子の発現をRT-PCR法にて検討したところ、TLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べて、IFN-γ, CXCL9, CXCL10, p35, p28, EBI3の発現の上昇がみられ、IL-10, IL-17, IL-22, CCL20, p19, p40の発現は逆に低下していた。また、制御性T細胞のマスター転写因子であるFoxp3のイミキモド外用部での発現がTLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べて低下していた。

さらに、平成27年度に行った皮膚所属リンパ節を用いた同様な検討においては、Day2でTLR2ノックアウトマウスでは野生型マウスと比べてTGF-βの発現度合およびCD4陽性細胞中のFoxp3陽性細胞の割合が低下していた。IFN-γ, CXCL9, CXCL10, p35, p28, EBI3はTh1系のサイトカインであり、IL-17, IL-22, CCL20, p19はTh17系のサイトカインであることを考えると、イミキモド外用にてTh17系のサイトカインの発現は低下し、Th1系のサイトカインの発現は上昇していることになる。また、IL-10やTGF-βは抑制性のサイトカインとして知られている。乾癬は通常Th17/Th1が関わる疾患であることを考えると、皮膚局所におけるTh1系サイトカインの上昇と皮膚および所属リンパ節での制御性T細胞の数的および機能的異常がTLR2ノックアウトマウスでのイミキモド誘発乾癬様皮膚炎の増強に関与している可能性が考えられ、この点をターゲットとした乾癬の新たな治療法の開発につながる可能性がある。TLR2ノックアウト(TLR2-KO)マウスではイミキモド誘発乾癬様皮膚炎が野生型(WT)マウスと比べて増強するが、TLR4-KOマウスではWTマウスと同等であった。TLR2-KO群ではWT群と比べて、Day2の病変部皮膚におけるTh1サイトカインの発現が上昇し、Th17サイトカインとFoxp3の発現は低下していた。皮膚所属リンパ節では、Day2でTLR2-KO群ではWT群と比べてTGF-βの発現およびCD4(+)Foxp3(+)細胞が減少していた。Th1サイトカインの上昇と制御性T細胞の数的および機能的異常がTLR2-KOマウスにおける乾癬様皮膚炎の増強に関与していると考えられた。平成25年度はマウスの確保の問題により研究に若干の遅れが生じていた。当初の研究計画では平成26年度中にイミキモド誘発乾癬様皮膚炎において、real-time PCR法を用いて皮膚炎局所でのサイトカイン・細胞成長因子等のmRNA発現の定量的解析を行う予定であった。平成26年度中にこれらの解析は終えることができ、ほぼ予定通りの進行状況と考えている。皮膚免疫現在イミキモドを外用したTLR2ノックアウトおよび野生型マウスの皮膚所属リンパ節における各種サイトカイン発現の違いをreal-time RT-PCR法にて検討中である。この検討が終わり次第、当初の予定通り平成27年度に予定していたイミキモド誘発乾癬様皮膚炎部に浸潤するT細胞のサイトカインプロファイルの検討を行う予定である。当初の研究計画では平成25年度中に皮膚炎の誘導、肉眼的評価(皮疹スコア)、組織学的評価(表皮肥厚、浸潤好中球・肥満細胞数)、免疫組織学的解析を行う予定であった。しかし、ノックアウトマウスの繁殖上の問題が生じ、実験を行う上で十分なマウスを確保するのに時間がかかってしまったため、現時点では乾癬様皮膚炎の皮疹の評価までしか行えていない。しかし、組織学的評価や免疫組織学的評価のための皮膚のサンプルはすでに確保しており、大幅な遅れではないと考える。平成26年度のreal-time PCRによるサイトカイン・細胞成長因子等のmRNA発現の定量的解析にあたっては既存の試薬や前年度購入した試薬の活用を最大限活用した。よって平成26年度は当初想定していたよりも、使用額が少なくなった。
閉経周辺女性の骨密度変化に関与する因子についての研究

和歌山県美山村(人口2639人)において1988年に設定した1543人のコホート集団の40-59歳の女性389人(40歳代135人、50歳代254人)より、住民台帳を用いて無作為に40歳代、50歳代各50人ずつ計100人を選出した。また和歌山県太地町(人工4098人)においても40歳代女性324人、50歳代女性338人から同様に住民台帳により40歳代、50歳代各50人ずつ計100人を選び、合わせて200人を対象とした。本対象について質問票調査より、月経の有無、閉経年齢について把握した後Dual energy X-rayabsorptiometryを用いて、腰椎を大腿骨近位部の骨密度を測定した。その後採尿、採血を行い尿中ピリジノリン(Pyr)、デオキシピリジノリン(D-Pyr)、血中オステオカルシン(BGP)の測定を行った。Pyr、D-PyrはHPLC蛍光法で、BGPはIRMA法で測定した。美山村における40歳代、50歳代女性の腰椎L2-4の骨密度の平均値(標準偏差)は40歳代から順に、1.18(0.16)、0.99(0.18)mg/cm^2であり、大腿骨頚部の骨密度は0.88(0.11)、0.75(0.11)mg/cm^2であった。尿中Pyr値は順に31.17(7.12)、41.42(11.10)pmol/mumol・Cre、D-Pyr値は5.13(1.49)、7.33(2.65)pmol/mumol・Cre、血清BGP値は6.79(3.30)、12.16(5.72)ng/mlであった。次に骨密度に与える閉経の影響を明らかにするため、年齢をマッチングさせ閉経前の女性10名と閉経後の女性10名(47-55歳)を選び、両群で骨密度を比較すると腰椎L2-4で閉経前0.83(0.14)、閉経後0.71(0.04)g/cm^2、大腿骨頚部で閉経前0.75(0.18)、0.59(0.07)g/cm^2となり、閉経前の群の方が有意に骨密度が高かった。以上より50歳代女性は40歳代に比して骨密度は有意に低く、骨代謝マーカー値は有意に高いことがわかった。これはこの年代間で骨密度の低下と骨代謝回転の亢進がおこっていることを示唆するものである。また閉経は骨密度の低下に影響を与える重要な因子であることが示された。太地町女性の調査でも同様の傾向が得られた。

以上より50歳代女性は40歳代に比して骨密度は有意に低く、骨代謝マーカー値は有意に高いことがわかった。これはこの年代間で骨密度の低下と骨代謝回転の亢進がおこっていることを示唆するものである。また閉経は骨密度の低下に影響を与える重要な因子であることが示された。太地町女性の調査でも同様の傾向が得られた。