hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T1ρ map解析による肝線維化初期群検出プログラムの構築

本研究では最新MRI撮像技術を用いてT1rho値を計測することにより、肝線維化に寄与する高分子化合物の半定量による診断法を試みた。肝実質のT1rho値と肝線維化指標には弱い相関を認めるのみであったが、T1rho肝脾比においては肝障害との有意な関連性が示された。肝結節間においてはT1rho値に有意差は認めず、結節診断には適していないと考えられた。本手法は今後の技術開発とともにさらに精度の向上が期待され、悪性腫瘍の糖代謝解析や肝後性黄疸等、高分子化合物が集積する状況における臨床応用が期待される。平成27年度には本研究で使用するMRI撮像法についてパラメータの設定を行った。T1ρ-weighted imageの撮像にはspin lock pulseの印加が不可欠となる。理論上は0,10,20,40,60 msecでのspin lock pulse印加が必要となるが、20%程度の症例では60 msecの印加が行えない事象が生じ、MRI装置に関する静磁場の問題と考えられた。本事象については平成28年4月から当院に新規設置されたMRI装置ではこれまでよりも優れた静磁場が形成されているため、改善の有無について検討を進める予定である。現在までにボランティア撮像を含めて、92症例についてMRI撮像を行った。肝硬変症例ではT1ρ値がわずかに低下する傾向が見られているが、初期線維化群症例も含めてさらに症例の蓄積が必要である。T1ρ-weighted image以外のモダリティではEOB造影剤を用いた肝細胞相のシグナルが比較的早期の線維化症例検出に可能性があるようであり、これらを組み合わせたアルゴリズムを作成中である。症例の蓄積については概ね予定通り進行している。統計学的に十分な症例数ではないものの、データに大まかな傾向が見られるため、今後も当初の予定通り進める。平成28年度では本研究で使用するMRI撮像法についての検討を継続し、T1ρ-weighted imageの撮像に用いるSpin lock pulseの改良を行った。理論上は0,10,20,40,60 msecでのspin lock pulseが必要であったが、体格の大きな患者では60 msecの印加において比吸収率(Specific absorption rate:SAR)の影響により設定が困難となることを確認した。これは静磁場の不均一さによる局所SARのhot spotが原因として考えられた。静磁場改善のため、MRI装置のUpdataを待ち、2カ所のアンプから電磁波を照射することにより静磁場精度をより均質に保つことが可能となるMulti-transmitの導入を待ち、症例の蓄積に努めた。これにより新に得た94症例で解析を行った。肝予備能を間接的に表すChild-Pugh scoreが増加するにあたり、T1ρ値は一旦上昇するが、肝硬変症に近づくにつれてプラトーに達する傾向を確認した。肝予備能が極度に低下している症例数がわずか5症例と少なく、統計学的には境界域の有意差が得られた(P = 0.079)。肝結節性病変では肝嚢胞、肝細胞癌、肝血管腫、転移性肝癌においてT1ρ値には有意差を認めなかった。以上からT1ρ値は肝線維化の進行において変動することが示唆され、線維芽細胞の遊走や線維化の完成を反映していることが考察された。全体的な症例数は予定通り蓄積しているが、肝予備能が高度に低下した症例数が不足している。本研究は肝線維化開始に関わる肝組織内のコラーゲンやプロテオグリカン量の変化をT1 rho mapを用いてMRI画像より定量化し、肝線維化診断に関する新たなバイオマーカーを構築することを目的とした。最新MRI撮像技術では生体内において高分子化合物などにより影響を受ける水素原子のごく微弱な横磁荷の変化に対して、T1rho値を計測する手法があり、本研究において肝線維化に寄与する高分子化合物の半定量を試みた。撮像法については工夫が必要であり、MRIを施行した151症例のうち、57症例では横磁荷計測に必要なSpin-lock time = 60 msecの照射が不可能であった。体格や臓器の位置により十分なパルスが照射出来ない状態が確認されたが、MRI装置にMulti-transmitを導入することで解決した。肝実質のT1rho値と各種の肝線維化指標にはごく弱い相関を認めるのみであり、高分子化合物のみでなく炎症や水分量といった複数の因子が関連することが示唆された。しかしT1rho肝脾比においては肝障害との有意な関連性が示され、障害肝では有意に低値を示した。肝結節間においてはT1rho値に有意差は認めなかった。本研究において肝線維化診断への応用については肝実質のT1rho値よりもT1rho肝脾比が優れており、肝障害の有無を有意に判定出来る可能性が示された。肝の結節についてはT1rho値による有意差は認めず、結節診断への応用は困難と考えられる。

肝結節間においてはT1rho値に有意差は認めず、結節診断には適していないと考えられた。本手法は今後の技術開発とともにさらに精度の向上が期待され、悪性腫瘍の糖代謝解析や肝後性黄疸等、高分子化合物が集積する状況における臨床応用が期待される。症例の蓄積を行い、十分な統計力が得られた時点で重回帰分析を行い、最適な画像モダリティと計測法を確定する。その後は引き続き症例を蓄積した上で、作製したプログラムの再現性を確認して行く。引き続き症例の蓄積を行いつつ、現時点までのデータをまとめ、学会発表および論文作成を目指す。画像診断MRI装置のコンソールからプライベートDICOMタグを温存したままデータを収集するには、USBなどの記憶媒体に直接保存する必要があり、複数個購入したが、年末から年度末にかけた値引きのため予定よりも安く購入することが出来たため。購入直前での価格を考慮し、適正かつ効果的な使用を目指す。
イカ表皮色素の化学構造の解明と着色料への応用に関する研究

スルメイカ表皮を塩酸/メタノール混合溶液に浸漬して赤色色素を抽出した。逆相LC/MSで分析した結果、黄色のオンモクローム色素であるxanthommatinが観測されたが赤色素は溶出しなかった。イオンペア試薬を添加した移動相による逆相HPLCで分析した結果、極大吸収が450nm530nmの範囲の複数の色素が観測された。陽イオン交換および逆相カラムクロマト分画で得られた赤色素は水溶性を示し常温で安定であった。赤色素画分をUPLC/TOF-MSで分析した結果、複雑な組成であり分子量は約450800Daの範囲であった。また分子内に硫黄分子の存在が示唆された。スルメイカ外皮から昨年度と同様に塩酸メタノールを用いて色素を抽出した。抽出液を逆相と陽イオン交換機能を兼ねたOasisMCX固相カートリッジ(Waters社)に繰りかえし負荷して色素を吸着させた後、25%アンモニア水/メタノール=1:25溶液でxanthommatin類と考えられる赤色色素を溶出した。この赤色素はアンモニア/メタノール溶液中で迅速に黄色色素へと変化した。続いて0.5M水酸化ナトリウム溶液を用いてommin類と推定される褐色紫色の色素が溶出した。褐色紫色の溶出液を大容量のC18カラムに負荷し、水、メタノールで洗浄後、塩酸/メタノール溶液で溶出させた。溶出液は鮮やかな紫色を呈した。この紫色素を含む画分を中和せずに減圧濃縮した。その結果、固形の色素が得られ、この色素は水溶性を示した。水に再溶解した色素を水/アセトニトリル/ギ酸を移動相に用いた逆相UPLC/PDA/TOF-MSによって分析した結果、複雑な組成のクロマトグラムを得た。観測された色素成分の極大吸収は480540nmまで幅広く、色素成分ごとに差異が認められた。この結果から本画分の色素は複数の色素成分によって形成されていることが改めて確かめられた。またTOF-MSによって観測された各ピークの分子関連イオンピークは、m/z 450800の間に観測された。最も主要な色素成分は正イオンモードでの分析においてm/z 759にイオンピークを示し、さらに高分解能マススペクトルによる元素組成予測を行った結果、複数の硫黄分子の存在が示唆された。過去の研究発表においてommin類には硫黄が含まれているとの報告があったが、その報告を追随する結果となった。スルメイカ外皮試料は水産加工会社より分譲されたものを用いた。外皮をアセトンで洗浄後、塩酸/メタノール溶液に浸して色素の抽出を行った。抽出液を中和した結果、赤紫色の色素が沈殿し黄色の上澄み液が残った。上澄み液を逆相UPLC/TOF-MSで分析した結果2つの黄色色素が確認され、極大吸収波長および精密質量から、xanthommatinおよびdecarboxyxanthommatinであることが示唆された。上澄み液はアスコルビン酸の添加で赤色へと変化し、xanthommatin類の性質を示した。沈殿した赤紫色素は、中性の水および有機溶媒に溶解せず、塩酸を添加した酸性アルコール溶液にのみ溶解し、逆相HPLCで溶出することができなかった。これらの結果から、沈殿した赤紫色素は強塩基性の化合物であることが示唆された。次に陽イオン交換樹脂を用いて抽出液の分画を行った。陽イオン交換固相カートリッジに抽出液を負荷し、25%アンモニア水/メタノール溶液で赤色色素を溶出した。この赤色素はで迅速に黄色色素へと変化した。続いて水酸化ナトリウム水溶液で褐紫色の色素が溶出された。溶出液をC18固相カートリッジに負荷し洗浄後、塩酸/メタノール溶液で溶出させた。この紫色色素も上記同様に中性溶媒に不溶であり、逆相HPLCで溶出することができなかった。紫色素は塩酸メタノール溶液中で安定であり、アスコルビン酸の添加による色調の変化は観測されなかった。最後にイオンペア試薬を添加した移動相による逆相HPLCで抽出液中を分析した。その結果、450nmから530nm近辺までの様々な極大吸収を持つ複数の色素が溶出された。これらの結果から、スルメイカ外皮の色素は黄色から紫色までの複数の色素成分で構成され、さらに色素成分はxanthommatin類を含む強塩基性の化合物であることが判明した。・最大の障壁であった不溶性色素のHPLC分析法を確立できた。

・黄色赤色の色素についてxanthommatin類であると同定することができた。・未知の紫色色素の精製方法が確立された。本年度の成果は全てが新しい知見である。当初の計画であった全ての色素構造の同定には至らなかったが、イカ色素の解明および添加物としての実用化にむけた大きな進歩であると考える。・主要色素の同定を行う。特に新規色素と考えられる紫色素の構造を明らかにしたい。・色素の定量方法を確立する。・添加物としての実用化を目指して色素の簡便な精製方法および安定な保存方法を確立する。すでに酸性条件下で安定であることを確認している。・色素のたんぱく質への染色力を量る。研究試薬購入等の物品費として使用する。
環境ストレスとしての農薬が非標的生物の成長と神経生理に及ぼす影響評価

平成7年510月にかけて筑波山北麓を流れる小桜川と川又川でシマトビケラ類(ウルマ-シマトビケラ:薬剤感受性種とコガタシマトビケラ:薬剤耐性種)の幼虫を生きたまま持ち帰り4令幼虫と終令幼虫に分けそれぞれガラス製水槽に入れて流水式(スターラー)で飼育を行った。各令期の幼虫にダイアジノン、フェンチオン、フェニトロチオンなどの有機リン系殺虫剤をそれぞれ5μg・1^<-1>の低濃度(野外で最大検出される程度の濃度)で暴露して、その成長期間をコントロールと比較した。その結果、ウルマ-シマトビケラでは、4令→終令、終令→蛹の成長は各薬剤で抑えられ、コントロールに比べて脱皮が57日間程度遅れた。また、コントロールが7080%の個体で蛹化まで達したものの薬剤投与では1020%程度しか蛹化しなかった(とくにダイアジノンでは010%程度しか蛹化が認められなかった)。しかし、コガタシマトビケラでは、薬剤の影響はみられなかった。シマトビケラに薬剤を投与して3日後に湿重量がそれぞれ3mg±1mgの4令幼虫と12mg±3mgの終令幼虫に薬剤を投与して幼虫体内のオクトパミン等神経伝達物質を液体クロマトグラフィーで測定した。その結果、ウルマ-シマトビケラの4令幼虫と終令幼虫でオクトパミン量がコントロールの2.83.5ng・mg^<-1>に対して、薬剤投与では68ng・mg^<-1>と高くなった。一方、コガタシマトビケラでは2.54.2ng・mg^<-1>とコントロールとあまり違いが見られなかった。以上の結果から、薬剤感受性種であるウルマ-シマトビケラは、野外において低濃度の殺虫剤に暴露されるとで成長にかかわる生理学的影響を受けている可能性があることが示唆された。
ショウジョウバエ末梢神経発生におけるRNA結合タンパクmusashiの役割

musashiと遺伝学的に強い相互作用をするmutantのスクリーニングを行ったが、transhetero zygoteで強くinteractする系統は得られなかった。そこで、msi遺伝子の強制発現で、msiの獲得表現型を示す個体を作成するために、msi cDNAをheat shock promoterを用いて発現するトランスジェニック個体作った。この個体の発生時期の様々な段階でheat shockを与えたところ、成虫のwing形成に異常をきたす個体が多数見られた。今後、羽以外にもphenotypeを発現するのか、また羽の表現型が他のmutationによって影響されるのか調べる予定である。polyclonal抗体作成のため、GST-fusionタンパクをバクテリアの大量発現系を用いて作成し、アクリルアミドゲルで部分精製しラットに免疫した。その結果、GST-fusionに対して、Western blotで強く反応する血清を得た。現在affinity purificationを行っているが、予備的な結果としてembryoの末梢神経系を特異的に染めることが分かった。今後はこの抗体を用いて、末梢神経細胞分化のどの時期にMSIが働いているのかさらに検討する予定である。
ディレイラインディテクターを用いた飛行時間RBS、飛行時間ERDの開発

高分解能ラザフォード後方散乱分光法(高分解能RBS)、高分解能反跳粒子検出法(高分解能ERD)はともに、固体の表面近傍(深さ数nmから十数nm)の元素組成を、高い深さ分解能(最高およそ0.2nm)で分析できる優れた組成分析法である。特に高分解能ERDは固体中の水素の濃度や深さ分布を調べることのできる数少ない分析法である。高分解能RBS、高分解能ERDは基本的には非破壊の分析法であるが、測定中においてイオン照射のため、軽元素とくに水素の脱離が起こる場合がある。本研究では、分析に要する照射量を低く抑えられるように、大型のディレイラインディテクターを用いた飛行時間RBS(TOF-RBS)、飛行時間ERD(TOF-ERD)を開発することを目的としている。平成18年度は、直径120mmのディレイラインディテクター(DLD)を用いて高分解能RBS実験を行い、深さ分解能の評価するとともに、問題点を明らかにした。シリコンウェハーSi(001)、膜厚2-3nmの酸化ハフニウム(HfO2)をシリコン基板(Si(001))に成長させた試料、PbSe(001)単結晶に100keVのHeイオンのパルスビームを入射して、約90度の方向に散乱されたHe粒子(イオンおよび中性原子)の検出を行った。その結果、1nm以下の深さ分解能で表面近傍を分析できることが確かめられた。また、大型の検出器の利点を生かして単結晶試料のブロッキングパターンの観察をすることができた。さらに上記のの試料表面に吸着した水素原子(水分子由来?)の反跳粒子検出も確認した。一方、次のような問題点があることが分かった。(1)検出器上の位置によって検出効率に斑がある。(2)飛行時間計測のための時間差波高変換モジュールが信号の数え落としをする。平成19年度に替わってからも、これらの問題点を解決するため研究を続けている。本研究では、分析に要する照射量を低く抑えて分析試料をよりあるがままの状態で観察できるように、大型のディレイラインディテクターを用いた飛行時間RBS(TOF-RBS)、飛行時聞ERD(TOF-ERD)を開発することを目的としている。今年度は、従来の高分解能ERD(比較的に立体角の小さい磁場型エネルギー分析器を用いた高分解能ERD)で、膜厚2-3nmの酸化シリコン(SiO_2)、酸化ランタン(La_2O_3)をシリコン基板(Si(001))に成長させた試料の、水素の深さ分布および水素の脱離速度の測定を行った。酸化シリコン薄膜の測定から、10^<-8>Torr台の真空では散乱槽内の残留ガスの試料表面への再付着が顕著であり、表面に再付着した水素原子がイオン照射によって試料内部に打ち込まれていることが分かった。この結果から、散乱槽のベーキング(焼き出し)によって10^<-9>Torr程度の超高真空を作ることが重要であることを確かめた。この成果を第17回イオンビーム分析に関する国際会議(セビリア市、スペイン、平成17年6月26日-7月1日)にて発表した。

(1)検出器上の位置によって検出効率に斑がある。(2)飛行時間計測のための時間差波高変換モジュールが信号の数え落としをする。平成19年度に替わってからも、これらの問題点を解決するため研究を続けている。
西洋近代諸国家における民衆的抗議行動に関する政治史的・社会史的研究

本共同研究は,近代西洋諸国家における民衆運動を多元的に論じることを目的とした。民衆的抗議運動は多様であり,その類型化にとどまらず,国家論的視点を取り込み,20世紀の国家・社会像を再検討するものとなった。従来の比較政治史・社会史にあっては,「近代化」を「自由で平等な個人」が創出されてゆく過程を前提に,これを阻害する要因を当該国家ないし社会の文脈に即して説明しようとしてきた。その際,「近代化」に伴う副産物としての様々な社会的矛盾が問われることがあっても,その前提そのものを再検討する作業は十分でなかった。本研究はこうした視座から「近代化」を問うものとなった。国家ないしエリート層による近代的秩序形成と民衆抗議行動にみられる伝統的規範とは,単なる衝突で終ったわけではなく,現実には互いの行動の読み違えが発生することで,両者とも意図しない方向へと状況を導く局面があった。国家権力にとって民衆の抗議行動が撹乱変数であったように,民衆世界にとって権力機構が撹乱変数であった。両者がどこかで折り合いをつけようとしても,この相互作用に「事件」が介在することによって,統合的・合理的な道筋をつけて事態に対応しようとする国家権力による一方的な操作が思惑通りに実を結ぶわけではなかった。重要なのは国家と社会との関係を通じて「公共性」が更新されていったことだと考えられる。今年度は、本格的な考察を開始する前の準備作業を中心に進めた。岡住正秀(研究代表者)は、1920世紀スペイン農民運動に関する研究を行なった。近年の社会運動史、特に農民運動研究動向を踏まえ、アンダルシア農民運動の展開を実証的に再検討し、当時のスペインが直面していた問題の中に彼らの抗議行動のあり方を位置づけた。行動形態は多様であるが、転換期の一特徴として組合主義運動の側面を明らかにした。久木尚志(研究分担者)は、1920世紀イギリス民衆運動に関する研究を行なった。1911年に南ウェールズで生じた反ユダヤ人暴動の持つ意味について分析を行ない、20世紀初頭の民衆運動の高揚と社会統制政策との関連について考察した。中野博文(研究分担者)は、近代国家の形成と民衆運動との関係を動的かつグローバルな観点から把握する分析枠組みの検討を行なった。その妥当性を英米の比較史研究によって検証するため、戦闘的な民衆の抗議活動が支配層によって国家形成活動に利用されていく世紀転換期イギリスの状況を検討した。また民衆統合のために政治体制、さらに体制を規範的に支える政治理念も変化したが、その変化が大西洋を越え、革新主義期のアメリカにも影響を与えていったことについて、一連の仮説を建設した。寺田由美(研究分担者)は、1920世紀アメリカ反禁酒運動に関する研究を行なった。特に禁酒運動の担い手であった女性が反禁酒運動へと結集する際のレトリックの転回過程を追い、それを社会背景の変化に絡めて考察した。同時に、今後の研究のために不足している文献と史料の収集を国内外で進め、研究成果に対する評価を受けるため、国内・海外出張を行なった。また、定期的に研究会を持ち、各自の進行具合を報告しあい、来年度以降の研究方針についての意見交換を行なった。今年度は昨年度の成果を踏まえ、研究活動の幅を広げるための試みを行なった。具体的には、研究領域が重なる他地域の研究者、研究手法の異なる同領域の研究者、さらには歴史学以外の研究者などを積極的に招聘し、本科研メンバーと報告を組み合わせ、活発な討議を行なった。それ以外にも定期的に個別報告の機会を持ち、各人の進捗状況の確認・意見交換を通じて、研究成果のまとめ・公開に向けた作業を行なった。個別研究は次のように進行した。岡住正秀(研究代表者)は、第一次大戦直後のスペインにおける農民運動の高揚(「ボルシェビキの3年」)に関して、アンダルシア地方のアグロタウンを対象に実証的な研究を行ない、運動の性格、労使関係と共同体の関係を明らかにした。

寺田由美(研究分担者)は、全国禁酒法撤廃運動に焦点をあてて、この運動に対するアメリカ女性の三通りの姿勢を考察した。特に論争から距離を置こうとする、或いは無関心な女性の存在に注目し、社会的エリートから労働者階級までを視座に入れ、革新主義からニューディールへの移行期に生じた女性の社会改革への意識の変化について検証を試みた。中野博文(研究分担者)は、20世紀初頭のアメリカ社会で発生した民衆の規範意識の変化について考察を行なった。都市化が進展していく中、中産階級の文化の興隆とともに、平等主義的で人々の差異に寛容であった19世紀の民主主義文化が崩壊していく有様について、二次資料に依拠しつつ理論的な検討を進めた。久木尚志(研究分担者)は、英国の民族的少数派であるウェールズ人と、その少数派の中の少数派として位置づけられるウェールズ在住ユダヤ人の関係について、「共同性」の再定義の問題を軸に考察を進めた。具体的には、1911年のユダヤ人襲撃事件がウェールズ渓谷地帯の共同体のいかなる要因と関連付けらるのかを検討した。本共同研究は,近代西洋諸国家における民主運動を多次元的に論じることを目的とした。民衆的抗議運動は多様であり,抗議の諸形態の類型化にとどまらず,国家論理的視点を取り込みながら20世紀の国家・社会像を再検討することが可能となった。これが本研究の特徴である。従来の比較政治史・社会史にあっては,「近代化」を「自由で平等な個人」が創出されてゆく過程を前提とし,これを阻害する要因を当該国家ないし社会の固有の文脈に即して説明しようとしてきた。その際「近代化」に伴う副産物としての様々な社会的矛盾が問われることはあっても,この前提自体を再検討する作業が十分であったとはいいがいた。本共同研究はここにさかのぼって,「近代化」の意味を問うものとなった。各論文が明らかにしたように,国家ないしエリート層による近代的秩序形成と民衆の抗議行動にみられる伝統的規範意識とは,単なる衝突で終わっただけではなく,現実には互いの行動を読み違え,あるいは「合成の誤謬」が発生することで,両者とも意図しない方向へと状況を導く局面があった。国家権力にとって民衆による抗議行動が攪乱変数であったように,民衆世界にとって権力機構が攪乱変数であった。両者がどこで折り合いをつけようとしても,この相互関係に「事件」が介在するこによって,統合的・合理的な道筋をつけて事態に対応しようとする国家権力による一方的な操作が思惑通りに実を結ぶわけではなかった。重要なのは,こうした国家と社会の関係を通じて,「公共性」が更新されていったことだと考えられる。
高麗後期の君臣権力関係と内廷外廷権力構造に関する制度史的研究

朝鮮中世政治史の展望:朝鮮では16世紀以降,一般に「士林政治」と呼ばれる近世的な政治スタイル--朱子学を基盤とした儒教官僚層の輿論によって領導される政治スタイル--が定着していくが,そこに至るまでには専制王権の不断の伸張と,これに対抗する儒教官僚層との間にさまざまな葛藤の歴史が繰り広げられてきた。高麗時代(918-1392)にさかのぼって考えてみると,前期は王朝権力の発展と安定の時代,後期はその変動の時代ということができる。私はこれまで主として高麗前期の政治制度に焦点を当て,当該時代における政治権力の構造について若干の考察を行ってきた。今回は時代の焦点を高麗後期に置き,この時代における君臣権力関係や,政治権力構造の特質を明らかにすることによって,新王朝(朝鮮王朝)の創建に至る変革期の政治史--言い換えれば,中世から近世に至る過渡期の政治史--に,一つの新しい視座を打ち立てていきたいと考えている。昨年度は内侍・内僚などの内廷(宮中)の勢力が,高麗後期において著しく勢力を拡大し,外廷(政府組織)の中枢にまで進出していったことの背景を,当時の王朝権力をめぐる政治的・社会的な条件のもとに考察した。本年度は外廷を統轄する宰相府(中書門下、後に都評議使司)の機能と特質について考察し、それが高麗後期における内廷勢力の拡大と並行してどのように変質していったのかを明らかにすることを課題として研究を行った。この研究の成果については,現在研究論文の執筆に取り組み,ほぼ完成稿の段階に至っている。具体的には,内侍・内僚などの内廷(宮中)の勢力が,高麗後期において著しく勢力を拡大し,外延(政府組織)の中枢にまで進出していったことの背景を,当時の王朝権力をめぐる政治的・社会的な条件のもとに明らかにすること--これを本年度の課題として研究を行った。この研究の成果については,すでに朝鮮学会,第52回大会(2001年10月67日,天理市,天理大学)においてその一部を口頭発表したが,さらにこの発表内容を充実させた形で,現在研究論文の執筆に取り組み,ほぼ完成稿の段階に至っている。
ストレス・免疫系応答における視床下部ー自律神経系制御機構と第III脳室周囲器官の役割

1.第III脳室前腹側領域(AV3V)による血中サイトカイン情報の処理機構の解明免疫系が放出するインターロイキン-1(IL-1)やインターフェロンα(IFVα)などのサイトカインの中枢作用機序を、麻酔下ウイスター系ラットを用い、AV3Vニューロンの活動を脳底部より記録することによって検討した。腹側のAV3V領域には、視床下部視索前野(MPO)および室傍核(PVN)へ軸索を送るニューロンが存在し、これらのニューロンは血中のIL-1βによって活動が減少した。末梢免疫機能の活性化によって産生されたIL-1βは、血液-脳関門を欠くAV3Vなどの脳室周囲器官に作用して発熱やACTH分泌などを起こすことが知られている。従って、血中のIL-1βがAV3Vの腹側部ニューロンに作用し、体温調節やCRFーACTH分泌系に深く関与しているPOAまたはPVNに、単シナプス性にその情報を送っていることが明らかになった。2.視床下部ー自律神経系による脾臓免疫機能の制御機構の解明脳内免疫サイトカインやストレス時に放出されるCRFなどによる、中枢性免疫制御機構における視床下部自律神経系の役割について検討した。脾臓を支配する交感神経を直接刺激すると、神経終末より放出されたノルアドレナリンのβ作用を介して、脾臓NK細胞活性が低下した。第III脳室内にIFNα、IL-1βおよびCRFを投与すると脾臓交感神経の活動は著明に上昇し、NK細胞の活性は低下した。さらに、MPOを電気的に破壊すると、脾臓NK細胞活性が著明に低下し、脾臓交感神経を切除しておくとその抑制は完全ブロックされた。この時、脾臓交感神経の電気的活動は上昇し、また、IFNαをMPOに微量投与すると、脾臓交感神経の活動は著明に上昇した。このような、脳から免疫系へのMPOー脾臓交感神経ーNK細胞機能制御機構および、AV3Vにおける血液ー脳免疫サイトカイン情報変換機構は、感染や腫瘍を含めた広い意味でのストレッサーに対する生体反応において、免疫サイトカインの中枢作用によるフィードバック機構と、出力系としての交感神経系の重要性を示唆している。本研究では、ストレス・免疫系応答における視床下部ー自律神経系制御機構の役割を検討するため、脳オピオイド系の賦活による脾臓ナチュラルキラ-(NK)細胞活性の抑制と視床下部ー交感神経系の関与について以下のことを明らかにした。(1)脳オピオイド受容体に結合することが知られているインタ-フェロンα(IFNα)をラット側脳室に微量注入すると、注入後30分で脾臓のNK細胞活性が低下し、オピオイド拮抗薬のナルトレキソンの前投与で活性低下が阻害された。このNK細胞活性の抑制は、脾臓交感神経によって、脾臓交感神経の電気的活動が、10ー20分の潜時で数時間にわたり著明に増加し、ナロキソンの静注で一過性に抑制された。(3)脾臓交感神経の電気刺激で脾臓NK細胞活性が低下し、βアンタゴニストの前投与で完全に阻害された。

αアンタゴニストは影響しなかった。(4)視索前野/前視床下野(POA)には、INFα感受性ニュ-ロンが存在し、またこの部位にβエンドルフィンを投与すると脾情のNK細胞活性が低下することはすでに報告した。POAを両側府壊すると、20分後には脾臓NK細胞活性が低下した。脾臓の交感神経を切除しておくと、この抑制は完全に消失した。脾臓交感神経の活動はPOAの破壊で数時間にわたり増加し、刺激で逆に活動が低下した。以上のことから、ストレスあるいはINFαによる脳内オピオイド受容体の活性化は、20ー30分の比較的速い時間経過で脾臓交感神経の活動を促進し、神経終末から放出されたノルアドレナリンのβ作用を介して、脾臓NK細胞活性を抑制することが明らかになった。また、POAは、脾臓交感神経を抑制性に支配することによって、交感神経ー脾臓NK細胞活性制御系の上位中枢の一つとして、重要な役割を果たしている可能性が示唆された。1.第III脳室前腹側領域(AV3V)による血中サイトカイン情報の処理機構の解明免疫系が放出するインターロイキン-1(IL-1)やインターフェロンα(IFNα)などのサイトカイン中枢作用機序を解明するため、麻酔下ウイスター系ラットを用い、体液性情報の神経伝達インターフェイスとして最も有力視されているAV3Vニューロンの活動を脳底部より刺入したガラス電極記録しながら、視床下部内側視索前野(MPO)および室傍核(PVN)の刺激に対する応答と、血中IL-1βに対する応答を検討した。OVLTを含む腹側のAV3V領域には、POAまたはPVNへ軸索を送るニューロンが半数以上存在し、これらのニューロンは血中のIL-1βによって体温上昇に先立って活動が減少した。末梢免疫機能の活性化によって産生されたIL-1βは、血液-脳関門を欠くAV3Vなどの脳室周囲器官に作用して発熱やACTH分泌などを起こすことが知られている。従って、血中のIL-1βがAV3Vの腹側部ニューロンに作用し、体温調節およびCRF-ACTH分泌系に深く関与しているPOAまたはPVNに、単シナプス性にその情報を送っていることが明らかになった。2.視床下部による脾臓免疫機能の制御機構の解明MPOには、IFNαやIL-1βなどに反応するニューロンが存在し、IFNαの微量投与で脾臓NK細胞活性が低下することが知られている。そこで、中枢性免疫制御機構におけるMPOの役割について検討した。MPOを電気的に破壊すると、脾臓NK細胞活性が著明に低下し、脾臓交感神経を切除しておくとその抑制は完全にブロックされた。この時、脾臓交感神経の電気的活動は上昇し、一方、MPOの電気的または化学的刺激によって、交感神経活動は低下した。さらに、IFNαをMPOに微量投与すると、脾臓交感神経の活動は著明に上昇した。すでに前年度において報告したように、脾臓交感神経を電気的に刺激すると脾臓NK細胞活性が低下する。従って、本研究で明らかになったMPO-交感神経系は末梢細胞性免疫機能の制御に重要な役割をはたしていると考えられる。
分子遺伝学実験法の高度化が実現する、白色腐朽に重要な遺伝子の網羅的・効率的同定

本研究では、白色腐朽菌ヒラタケを用いた順遺伝学および逆遺伝学アプローチによって、木質中のリグニン分解に重要な遺伝子の同定を試みた。新たに開発した効率的な順遺伝学実験によって、現在までに、リグニン分解能力に著しい欠陥をきたす変異遺伝子を、合計6種類同定することができた。また、主にヘミセルロース(キシラン)分解酵素であるGH10およびGH11をコードする遺伝子(合計5種類)の単独ならびに多重破壊株(最大3遺伝子破壊株)を作成し、これらのリグニン分解能力への影響を調査した。しかし現時点では、ブナ木粉培地中のリグニン分解能力が顕著に減少したものは発見できていない。【リグニン生分解に不全をきたす原因変異の特定】現在までに、ブナ木粉中のリグニン生分解に欠陥をきたす原因変異遺伝子として3遺伝子(pex1、chd1、wtr1)が確定できた。この中で、pex1とchd1は、白色腐朽(多糖よりもリグニンを優先的に生分解する)を起こさないことが観察された。実際に、腐朽前後におけるリグニン含有率変化からも、そのことは支持された。ブナ木粉培地上で培養した菌体から抽出したRNAを用いたRNA-seq解析(野生株vs変異体)を行ったところ、過酸化水素供給に関わる酵素ならびに特定種類のレクチンをコードする遺伝子などが、複数の変異体で共通して著しく転写減少することを発見した。現在、これら単独ならびに多重遺伝子破壊株を作成し、リグニン生分解能力への影響を観察しているところである。また興味深いこととして、白色腐朽しないpex1ならびにchd1破壊株では、同時に子実体発生開始にも不全をきたした。その一方で、wtr1破壊株は(ブナ木粉に対して、小麦ふすまを比較的多量に添加した木粉培地上では)白色腐朽および子実体発生開始に影響はなかった。また、新たに得た多数のRBBR脱色不全突然変異体の中から、実際のブナ木粉に対する白色腐朽に影響があるものを選び出し、現在原因変異遺伝子の特定を行っている。【多糖分解酵素遺伝子の破壊が、リグニン生分解に与える影響】多糖加水分解酵素をコードする遺伝子を、合計7種類単独破壊した。その結果、一つの遺伝子破壊株において白色腐朽不全が観察された。現在、詳細な木質化学分析を行っているところである。リグニン生分解に欠陥を生じる原因変異遺伝子の同定および遺伝子破壊株の取得は、予想通りに進んでいる。さらに申請時の範囲を超えて、トランスクルプトームおよびリグニン化学分析までを組み合わせて、順遺伝学研究知見の結果に基づいた、逆遺伝学アプローチからも、新たな白色腐朽に重要な遺伝子の候補を多数発見することに成功した。一方、多糖分解酵素の単独破壊株によって、白色腐朽に重要な多糖分解酵素を特定しつつある。これも、申請当初の予想どおりの結果が得られた。【リグニン生分解に不全をきたす原因変異の特定】新たに5種類の突然変異体を分離し、ゲノムリシーケンスと遺伝分析を併用した方法を通して原因変異遺伝子を特定することができた。原因変異遺伝子としては、昨年度に引き続いて転写制御因子(DNA結合性転写因子およびクロマチン構造変換因子)が多かった。この結果に基づいて、野生株とリグニン分解変異体の間で比較RNA-seq解析を行った。その結果、複数のリグニン分解に関わりそうな遺伝子の転写発現が顕著に転写減少していた一方で、多数の多糖分解(主に結晶性セルロースの分解)に関わりそうな遺伝子の転写発現が、顕著に上昇していた。この結果は、リグニン分解系とセルロース分解系をダイナミックに転写レベルでスイッチする機構が存在することが示唆された。現在、上記で判明したセルロース分解酵素だと思われるタンパク質をPichia papastorisで異種発現させることを通して、本当にセルロース分解に寄与する酵素をコードしている遺伝子かを検証している。しかし、上記で特定されたリグニン分解に関わりそうな遺伝子(リグニン分解酵素とされているVP2、ならびに過酸化水素生成系い関わるとされているGLOXなど)を単独および二重遺伝子破壊を行ったが、顕著にブナ木粉中のリグニン分解能力を減少させるものは得られなかった。野生株における【多糖分解酵素遺伝子の破壊が、リグニン生分解に与える影響】本研究で用いてきたブナ木粉だけではなく、稲わら培地で培養した場合も含めて、各GH10, GH11遺伝子の単独および多重破壊株の腐朽能力比較を行うこととした。現時点では、野生株における各成分の減少量、菌体外酵素活性、遺伝子発現などを精査しているところである。1.昨年度までに分離した突然変異体の変異原因遺伝子を確定させる(相補形質転換もしくは遺伝子破壊まで行う)2.RNA-seqにおいて、突然変異体で共通して転写不活性化している遺伝子を破壊し、白色腐朽への影響を調べる

3.上記を通して、本研究助成を受けて得られた結果を含んだ論文を、最低3報は発表できるようにデータを整える菌類分子遺伝学年度末の学会(木材学会)への参加・成果発表にかかる旅費をもって全額使い切る予定であったが、諸事情により1日早く帰る必要が出てきた。そのぶん1泊の宿泊代が余ってしまった。研究のさらなる進展のために、消耗品として使用させて頂く。
青年期の愛着不安と自己愛傾向が不適応な状態や行動を生起させるプロセスに関する研究

研究1と2では、愛着不安と自己愛傾向が周囲の他者あるいはパートナーからの被受容感を媒介して攻撃性ならびに抑うつ傾向に影響を及ぼすという仮説モデルについての検討を行った。それらの結果、愛着不安と自己愛傾向は共に、一般他者もしくはパートナーへの攻撃性を高めること、さらに、それらの攻撃性への影響は、周囲の他者やパートナーからの被受容感によって媒介されることが示された。研究3の目的は、親密な関係破綻後のストーカー的行為の加害リスク要因を明らかにすることであった。分析の結果、男女共通で、愛着不安と過去の交際時の唯一性が、関係破綻後の独善的執着を高めることでストーカー的行為を増大させることが示された。平成26年度は、「青年期の愛着不安と自己愛傾向が不適応な状態や行動を生起させるプロセスに関する研究」への研究助成の初年度に当たるため、まず、研究基盤を固めるための先行研究のレビューを入念に行い、その後、それらを踏まえての調査を、大学生を対象に1度実施した。また、併せて、本助成金対象研究の準備のためにこれまでに行ってきた研究の結果について学会等で発表を行った。本研究は、青年期の愛着不安ならびに自己愛傾向が、概念的には対置されるものであるにも関わらず、それらがなぜ共に攻撃行動や他者軽視、問題行動や規範違反といった不適応な状態や行動を生起させるのかについてのプロセスを、自己の不安定性と自己への関心の焦点化という観点から自我脅威状況を設定することで明らかにしようとするものである。そのため、まず、第一段階の調査として、1Parental Bonding Instrument(Parker et al., 1979)ー幼少期の母親の養育態度を測定、2愛着不安尺度(中尾・加藤, 2004)、3評価過敏性-誇大性自己愛尺度(中山・中谷, 2006)、4被受容感尺度(杉山・坂本, 2006)ー日常的に他者から受け入れられているかどうかを測定、5親密な他者(親、友人)への自己開示尺度(Miller, Berg, & Archer, 1983)、6GHQ12(中川・大坊, 1996)ー精神的健康を測定、7敵意的攻撃インベントリー(秦, 1990)ならびに回答者の性別、年齢を尋ねる項目からなる質問紙を用いて、7月から10月にかけて289名の大学生を対象に調査を実施した。この調査に関しては、現在分析中であり、その結果については、今後、学会等で発表する予定である。また、この調査結果を踏まえ、本年度、リサーチ会社等を通し、社会人を対象としたWeb調査を実施することを予定している。平成27年度は「青年期の不安と自己愛傾向が不適応な状態や行動を生起させるプロセスに関する研究」への研究助成の二年目であることから、前年度での遅れを取り戻すべく、先行研究についての詳細なレビューを行いながら、大学生を対象に一度質問紙調査を、さらに、一般の人を対象としたWeb調査を一度実施した。また、併せて、前年度実施した調査結果について学会等で発表を行った。本研究は、青年期の愛着不安ならびに自己愛傾向が、概念的には対置されるものであるにも関わらず、それらがなぜ共に攻撃行動や他者軽視、問題行動といった不適応な状態や行動を生起させるのかについてのプロセスを、自己の不安定性や他者からの受容の程度といった自我脅威状況を加味することで明らかにしようとするものである。まず、第一回目の調査は、平成27年6月に学生を対象に実施され、その目的は、愛着不安ならびに自己愛傾向が一般的他者からの受容もしくは特定の親密な関係にある他者からの受容を媒介して個人の適応状態(他者軽視、攻撃性、幸福感、抑うつ傾向)に対して影響を及ぼすことを明らかにするためのものであった。また、二度目の調査は、平成27年10月に社会人を対象としたWeb調査を実施した。その目的は、愛着不安と自己愛傾向が、恋愛や夫婦関係におけるDV、あるいは関係解消後のストーキング的行為にどのような影響を及ぼすかを検討することであった。第一回目の調査については、仮説の一部を支持するように、関係不安は一般的他者からの被受容感や被拒否感を媒介して攻撃性や抑うつに影響を及ぼすこと、また、自己愛については被受容感を媒介して攻撃性や抑うつに影響を及ぼすことが示され、この結果は今後学会等で発表を行う予定である。また、第二回目の調査については、未だ詳細な分析を行えておらず、今後、それを実施していく必要がある。平成27年度は二度の調査を実施したことから初年度と比較すると研究はかなり進展した。しかしながら、実施した調査の分析については未だ詳細に行うことができておらず、また、研究結果についての文字化も遅れているため、依然、研究の進捗状況はやや遅れていると言わざるを得ない。その主な理由は、本申請研究の研究助成の初年度から継続して、本務校で二つの役職(副学部長ならびに学科長)を担っており、さらに、学部のカリキュラム改革のための仕事も担当しているゆえ、本助成金対象研究を行うための時間を十分に捻出できていないことにある。それゆえ、現時点では、残念ながら当初の研究計画からはやや遅れていることになる。今後は、遅れを取り戻すためにも、研究時間の捻出を行っていくとともに、分析や研究の資料整理等についてはアルバイトを積極的に雇うことで研究の進捗状況の改善を図るつもりである。

「青年期の不安と自己愛傾向が不適応な状態や行動を生起させるプロセスに関する研究」への研究助成の三年目である平成28年度は、平成27年度に行った大学生を対象とした調査結果を踏まえ、夫婦ペアを対象としたWeb調査を8月に実施し、さらに、夫婦ペアの縦断調査(Web調査)を23月にかけて実施した。また、平成27年度に実施した研究の結果について、日本社会心理学会第57回大会ならびに日本グループ・ダイナミックス学会第63回大会において発表を行った。平成27年度の大学生を対象にして行った調査結果では、青年期の愛着不安ならびに自己愛傾向が、概念的には対置されるものであるにも関わらず、愛着不安と自己愛傾向は共に、個人間適応である一般他者への攻撃性を高めること、さらに、それらの攻撃性への影響は、周囲の他者からの被受容感によって媒介されることが示された。平成28年度は、その結果を踏まえ、一般他者との関係性のみならず、特定の親密な関係においても同様の結果が再現されるのかについて検討を行うため、夫婦ペアを対象としたWeb調査を実施した。その結果、先の一般他者との関係性の場合と同様に、愛着不安と自己愛傾向の双方が、個人間適応であるパートナー(配偶者)への攻撃性を高め、さらに、それらのパートナーへの攻撃性への影響は、パートナーからの被受容感によって媒介されることが示された。これらの二度の調査結果については、論文としてまとめ、査読付き雑誌である社会心理学会に投稿を行った。また、愛着不安と自己愛傾向が、恋愛や夫婦関係破綻後のストーキング的行為に及ぼす影響について検討を行うために実施した平成27年度のWeb調査の結果を踏まえて、平成28年度に全国調査を行い、それらの結果については現在論文にまとめている最中であり、これについても査読付き雑誌に投稿する予定である。平成28年度は二度のWeb調査を実施し、また、これまでの調査結果についても一部論文化し、そのうち1本については査読付き雑誌に投稿を行った。それゆえ、研究は比較的進展したと言える。しかしながら、当初予定していた実験的研究については実施することができなかった。本助成金対象研究を行うための時間を十分に捻出できていないことの主な理由は、本申請研究の研究助成の初年度から継続して、本務校で二つの役職(副学部長ならびに学科長)を担っていたこと、また、学部のカリキュラム改革についても主導的な役割を担っていたことにある。ただし、平成29年度からは、学科長の役を降り、副学部長の役のみとなったことから、今後は研究時間の捻出を行い、研究計画の遅れを取り戻す予定である。また、雑務等についてはアルバイトを積極的に雇うことで研究の進捗状況の改善を図るつもりである。研究助成の最終年度である平成29年度は、これまでの調査成果のアウトプットを行うのがメインの課題であった。一つ目の研究では、大学生を対象とした調査において、パーソナリティ特性の愛着不安と自己愛傾向は、一般他者からの被受容感ならびに被拒絶感を媒介して攻撃性を高めること、さらに、愛着不安は抑うつ傾向を高めるが、自己愛傾向は抑うつ傾向を抑制するように作用し、また、それらの影響は被受容感と被拒絶感によって媒介されることが示された。同様の結果は、夫婦ペア調査でもほぼ再現され、愛着不安と自己愛傾向は共に、パートナーへの攻撃性を高めること、さらに、それらの攻撃性への影響は、周囲の他者やパートナーからの被受容感によって媒介されることが示された。加えて、愛着不安と自己愛傾向の抑うつ傾向への影響も被受容感によって媒介されるという結果が得られた。
発光レポーター遺伝子による養殖魚の残留農薬モニタリング

本研究では,発光遺伝子ルシフェラーゼを用いた養殖魚の残留農薬モニタリングシステムの開発を目的とした。ティラピアを各種農薬で曝露し,遺伝子発現解析を行ったところ,CYP1B1遺伝子の発現が経時的に上昇することを見出した。そこで,培養細胞を用いたTwo-hybrid systemにより,CYP1B1の発現を制御するAhRとArntのヘテロ二量体形成能を調べた。その結果,農薬曝露によりAhRとArntのヘテロ二量体形成が促進されることが明らかとなった。これにより,ルシフェラーゼ発光量を指標としてAhRとArntのヘテロ二量体形成能を調べることで,残留農薬をモニタリングできる可能性が示唆された。食品の安全性確保は世界的に重要性が増してきており,我が国では食品中への農薬類およびそれらの代謝物の残留は,ポジティブリスト制により規制されるようになった。これにより,生産段階での適切なリスクマネジメントがより一層求められるようになった。しかしながらここ数年,一部の養殖魚から,養殖生産の過程で直接使用することはないはずの農薬類が検出された例が報告されている。大雨などによる河川や農地からの流入や,飼料の汚染による経口的な蓄積などが疑われているが,養殖魚における農薬の残留を未然に防ぐことは困難であり,十分なモニタリングがなされていることを保証するシステムを確立することが緊急の課題である。平成25年度は,ホタルルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いた,簡便,安価で定量性の高い残留農薬モニタリングシステムを開発するための研究基盤を確立するために,発現コンストラクトの構築を行った。まず,ティラピア遊離肝細胞に様々な農薬を曝露したところ,薬物受容体PXRの標的遺伝子の一つであるP-gp遺伝子の発現上昇がリアルタイムPCRにより確認された。そこで,ティラピアゲノムのデータベース検索およびインバースPCRによりP-gp遺伝子のプロモーター領域約6 kbをクローニングし,ホタルのルシフェラーゼ遺伝子をもつpGL3-Basicベクターにサブクローニングした。また,ティラピアPXRとそのパートナーRXRα遺伝子についてもそれぞれpBINDおよびpACTベクターにサブクローニングし,ツーハイブリッドシステム用のコンストラクトを作製した。作製したベクターは,Midiprep法により大量調整した。食品中への農薬類およびそれらの代謝物の残留はポジティブリスト制により規制されており,生産段階での適切なリスク管理がより一層求められている。しかしながらここ数年,養殖生産の過程では使用しないはずの農薬が一部の養殖魚から検出されている。養殖魚における農薬の残留を未然に防ぐために,十分なモニタリングがなされていることを保証するシステムを確立することが緊急の課題である。本研究では,ルシフェラーゼ発光遺伝子をレポーターとして用いた残留農薬モニタリングシステムの開発を目的としている。これまでに,農薬曝露で発現が上昇する遺伝子としてPXRの標的遺伝子P-gpを同定したが,平成26年度は,さらなる候補遺伝子を探索するために,エンドスルファンおよびロイコマラカイトグリーン(LMG)を経口投与したティラピア肝臓の全RNAを用いて次世代シークエンサーによる網羅的解析を行った。その結果,これらの薬物により発現が上昇/低下する遺伝子が複数同定されたが,現在までに生物学的な意味を読み取れるパスウェイは見いだせなかった。そこで,研究の焦点をPXRに絞り,PXRおよびRXR発現コンストラクトをティラピアP-gpプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターコンストラクトとともに魚類培養細胞株EPCに導入した。遺伝子導入後にLMGを曝露したところ,PXR/RXRのP-gpに対する転写活性に変化は見られなかった。一方,遺伝子導入後にマラカイトグリーン(MG)を曝露したところ,PXR/RXRの転写活性がMG濃度依存的に減少した。次に,EPC細胞を用いたツーハイブリッドシステムによりPXRとRXRのタンパク質間相互作用を解析したところ,MGはPXRとRXRのヘテロ二量体形成を阻害することでP-gpの発現を抑制することが明らかとなった。本研究では,培養細胞株を用いたツーハイブリッドシステムなど,ルシフェラーゼ発光遺伝子をレポーターとして用いた残留農薬モニタリングシステムの開発を目的としている。これまでに,エンドスルファンを経口投与したティラピア肝臓の全RNAを用いて次世代シークエンサーによる網羅的解析を行い,CYP1B1遺伝子の発現が上昇することを見出した。ティラピア遊離肝細胞を用いたin vitroの試験においても,様々な農薬の曝露によりCYP1B1遺伝子の発現が経時的に上昇することが明らかとなった。Ensemblデータベースから予測した配列をもとにPROMOにより転写因子結合部位を予測したところ,ティラピアCYP1B1遺伝子の5 ́上流領域にはAhRの結合配列であるXREが複数存在していた。そこで,研究の焦点をAhRシグナル伝達系に絞り,魚類培養細胞株EPCを用いたツーハイブリッドシステムによりAhRとそのパートナー分子Arntのタンパク質間相互作用を解析した。その結果,高濃度のクロルピリフォスは,AhRとArntのヘテロ二量体形成を促進することでCYP1B1遺伝子の発現を誘導している可能性が明らかとなった。しかしながら,低濃度の農薬暴露ではAhRとArntのヘテロ二量体の促進は見られなかった。

本実験では,リガンド非依存的なヘテロ二量体も見られたことから,過剰発現によるAhRの局在の変化が高いバックグラウンドを生んでいると考えられた。本研究では,発光遺伝子ルシフェラーゼを用いた養殖魚の残留農薬モニタリングシステムの開発を目的とした。ティラピアを各種農薬で曝露し,遺伝子発現解析を行ったところ,CYP1B1遺伝子の発現が経時的に上昇することを見出した。そこで,培養細胞を用いたTwo-hybrid systemにより,CYP1B1の発現を制御するAhRとArntのヘテロ二量体形成能を調べた。その結果,農薬曝露によりAhRとArntのヘテロ二量体形成が促進されることが明らかとなった。これにより,ルシフェラーゼ発光量を指標としてAhRとArntのヘテロ二量体形成能を調べることで,残留農薬をモニタリングできる可能性が示唆された。これまでに,農薬曝露で特異的に発現が上昇する遺伝子として,PXRの標的遺伝子を候補遺伝子アプローチにより同定していた。平成26年度はこれに加え,エンドスルファンおよびロイコマラカイトグリーン(LMG)を経口投与したティラピア肝臓の全RNAを用いて,次世代シークエンサーによる網羅的解析を行った。その結果,これらの薬物により発現が上昇/低下する遺伝子が複数同定された。現在までに生物学的な意味を読み取れるパスウェイは見いだせていないが,GSEA解析やクラスタリングなどをさらに進めていくことで,新たな候補遺伝子やパスウェイを特定できる可能性が得られた。また,PXRおよびRXR発現コンストラクトを,ER-6,DR-3(PXR/RXRの結合部位)またはP-gpプロモーターにホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポーターコンストラクトとともに,魚類培養細胞株EPCに導入した。魚類培養細胞株の中には遺伝子導入効率が低いものも多いが,本研究では複数の遺伝子導入試薬を試みたことで,以降の解析に十分な導入効率を得ることができた。これに種々の農薬類を曝露したところ,LMGおよび有機リン系農薬(クロルピリフォス,マラチオン)の曝露では,PXR/RXRの転写活性に変化は認められなかったものの, MGを曝露したときにはPXR/RXRの転写活性が濃度依存的に減少することが明らかとなった。実験の再現性はいずれも高く,今後の詳細な解析が期待できる。なお,モニタリングとしては,ルシフェラーゼ活性が濃度依存的に上昇するものの方が適しているため,PXR以外の受容体についても同様に調べる必要がある。そこで平成26年度では,ティラピアAhRおよびそのパートナー分子Arntの発現コンストラクトについても作製した。水族病態生理学いくつかの農薬は,PXRとRXRのヘテロ二量体形成を阻害したことから,PXRはRXRと入れ替わるように核内受容体コリプレッサーと結合することが予想される。