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北極域混相雲の頻発領域におけるエアロゾルの氷晶核能の詳細解明

氷晶核(氷形成能力を有するエアロゾル粒子)の存在は、極微量であっても、地球の気候や生態系に多大な影響を及ぼす。北極圏の下層大気(数百メートル数キロメートルの高度)では、年間を通して混相雲(過冷却の雲滴と氷晶とが混在する雲)が頻繁に発生している。混相雲内での氷形成過程には、氷晶核として機能するエアロゾル粒子の存在が必須である。しかしながら、北極圏の大気中における氷晶核の数濃度については、その計測が技術的に非常に困難であることから、実測データがほとんど報告されてきてない。また、氷晶核の供給源についても、未だによくわかっていない。本研究では、申請者が新たに確立した「超低濃度状態でも氷晶核の計測が可能な実験系」であるCRAFT(Tobo, 2016 Sci. Rep.)を用いて、北極圏の中でも特に混相雲の発生頻度が高い地域だといわれているスバールバル諸島に位置するニーオルスンにおいて、エアロゾル粒子の氷晶核としての役割に着目した調査研究を展開している。二年目にあたる今年度は、初年度の夏(2016年7月)と冬初春(2017年3月)にニーオルスンにて採取したエアロゾル試料の分析を進めることにより、氷晶核の数濃度や供給源の季節による違いについての検証に取り組んできた。また、氷晶核の数濃度の季節変動についての詳細を解明することを目的とし、自動エアロゾルサンプラーによるエアロゾル試料の通年サンプリングを2018年3月より開始した。さらに、氷晶核の数濃度ー粒径分布についても検証するために、2018年3月の集中観測期間中には、多段式インパクターを用いたエアロゾル粒子の粒径別のサンプリングを行った。初年度の夏(2016年7月)と冬初春(2017年3月)のスバールバル諸島・ニーオルスンでの集中観測時に採取した試料については、現時点で分析をほぼ完了している。その成果については、既に国内外の数々の学会等で発表してきており、現在、投稿論文にまとめているところである。また、当初の予定にはなかったニーオルスンでの氷晶核の通年観測も今年度(2018年3月)から開始したため、氷晶核の数濃度や供給源などの季節による違いの詳細についても、これから明らかになるものと見込んでいる。さらに、氷晶核の数濃度ー粒径分布の解明に向けた観測についても、今年度から取り組み始めている。2018年3月からスバールバル諸島・ニーオルスンでのエアロゾル試料の通年サンプリングを開始したが、そこで得られるエアロゾル試料の分析を進めることにより、この地点における氷晶核の数濃度の季節変動に関する詳細を明らかにしていく予定である。また、氷晶核の数濃度ー粒径分布の季節による違いについても調べるため、冬初春(2018年3月)の集中観測時に実施した多段式インパクターによるエアロゾル粒子の粒径別のサンプリングに関して、夏(2018年78月頃を予定)にも実施することを計画している。氷形成を誘発するエアロゾル粒子(氷晶核)の存在は、極微量であっても、地球の気候や生態系に多大な影響を及ぼす。北極圏の下層大気(約百m数千mの高度)では、年間を通して混相雲(液体の雲粒と氷晶とが混在する雲)が頻繁に発生しているため、混相雲の存在は、極域の気候に多大な影響を与えている。混相雲内での氷形成過程には、氷晶核の存在が必須である。しかし、北極圏のようにエアロゾル粒子の数濃度が低いクリーンな環境では、氷晶核の数濃度も極めて低いため、その計測は技術的に非常に困難であり、観測例はほとんどない。また、北極圏における氷晶核の供給源についても、未だにわかっていない。そこで初年度は、申請者が新たに確立した「超低濃度状態でも氷晶核の計測が可能な実験系」であるCRAFT(Tobo, 2016 Sci. Rep.)を用いて、北極圏の中でも特に混相雲の発生頻度が高いとされるスバールバル諸島のニーオルスンにおいて、エアロゾル粒子の氷晶核としての役割に着目した調査研究を計2回実施した。夏季にあたる2016年7月には、ニーオルスンに約一週間滞在し、大気中のエアロゾル粒子などのサンプリングを行った。そして、国立極地研究所や気象研究所の設備を利用し、これらの試料の氷核活性(氷晶核としての能力)や化学組成などの分析に取り組んだ。さらに、冬季における氷晶核の挙動についての明らかにするため、2017年3月には、ニーオルスンにて約一か月間にわたる集中観測を実施した。当初の予定通り、スバールバル諸島・ニーオルスンにて、夏季と冬季に集中観測を行うことを実施することができた。夏季(2016年7月)の集中観測時に採取した試料については、現時点で分析をほぼ完了しており、既に国際学会(極域科学シンポジウム)などでの研究発表を行ってきている。さらに今後、冬季(2017年3月)の集中観測時に採取した試料の分析を進めていくことによって、夏季と冬季における氷晶核の数濃度や供給源の違いが明らかになるものと見込んでいる。

しかしながら、北極圏の大気中における氷晶核の数濃度については、その計測が技術的に非常に困難であることから、実測データがほとんど報告されてきてない。また、氷晶核の供給源についても、未だによくわかっていない。本研究では、申請者が新たに確立した「超低濃度状態でも氷晶核の計測が可能な実験系」であるCRAFT(Tobo, 2016 Sci. Rep.)を用いて、北極圏の中でも特に混相雲の発生頻度が高い地域だといわれているスバールバル諸島に位置するニーオルスンにおいて、エアロゾル粒子の氷晶核としての役割に着目した調査研究を展開している。二年目にあたる今年度は、初年度の夏(2016年7月)と冬初春(2017年3月)にニーオルスンにて採取したエアロゾル試料の分析を進めることにより、氷晶核の数濃度や供給源の季節による違いについての検証に取り組んできた。また、氷晶核の数濃度の季節変動についての詳細を解明することを目的とし、自動エアロゾルサンプラーによるエアロゾル試料の通年サンプリングを2018年3月より開始した。さらに、氷晶核の数濃度ー粒径分布についても検証するために、2018年3月の集中観測期間中には、多段式インパクターを用いたエアロゾル粒子の粒径別のサンプリングを行った。初年度の夏(2016年7月)と冬初春(2017年3月)のスバールバル諸島・ニーオルスンでの集中観測時に採取した試料については、現時点で分析をほぼ完了している。その成果については、既に国内外の数々の学会等で発表してきており、現在、投稿論文にまとめているところである。また、当初の予定にはなかったニーオルスンでの氷晶核の通年観測も今年度(2018年3月)から開始したため、氷晶核の数濃度や供給源などの季節による違いの詳細についても、これから明らかになるものと見込んでいる。さらに、氷晶核の数濃度ー粒径分布の解明に向けた観測についても、今年度から取り組み始めている。まずは、2017年3月にニーオルスンより持ち帰った試料の分析を進めていく予定である。また、当初の計画では、年2回程度の集中観測のみを計画していたが、ニーオルスンのZeppelin山観測所(高度474 m)に自動でエアロゾル粒子を捕集できるサンプラーを設置し、今夏からは氷晶核の通年観測を開始することも視野に入れている。その他にも、北極圏の海洋大気中での氷晶核の挙動について明らかにするため、今夏に予定されているJAMSTECの海洋地球研究船「みらい」による北極航海時にも、サンプリングを行うことを計画している。2018年3月からスバールバル諸島・ニーオルスンでのエアロゾル試料の通年サンプリングを開始したが、そこで得られるエアロゾル試料の分析を進めることにより、この地点における氷晶核の数濃度の季節変動に関する詳細を明らかにしていく予定である。また、氷晶核の数濃度ー粒径分布の季節による違いについても調べるため、冬初春(2018年3月)の集中観測時に実施した多段式インパクターによるエアロゾル粒子の粒径別のサンプリングに関して、夏(2018年78月頃を予定)にも実施することを計画している。
ダウン症候群関連急性リンパ性白血病における細胞増殖機構の解明

本邦のダウン症候群の急性リンパ性白血病(DS-ALL)における細胞増殖機構を解明するために本研究を行い、以下の成果を得た。2.本邦のDS-ALLではEBF1遺伝子欠失の頻度が高いことが明らかとなった。EBF1遺伝子欠失の頻度はP2RY8-CRLF2融合遺伝子陽性例で有意に高く、本邦のDS-ALLの一部の症例ではこれら2つの遺伝子異常が協調して白血病の発症に関わっている可能性が示唆された。ダウン症候群(DS)は健常人の約10-20倍の頻度で急性リンパ性白血病(ALL)を発症し、DS関連ALL(DS-ALL)では、高2倍体やt(12;21)などの小児ALLにおいて代表的な染色体異常の頻度が低いことが知られている。最近欧米のグループからDS-ALLの約20%でJAK2遺伝子の活性化変異がみられること、約60%でサイトカインレセプターの1つであるCRLF2の遺伝子発現が亢進していることが報告された。さらに、CRLF2遺伝子の高発現がみられる症例のほとんど(DS-ALLの約半数)でP2RY8-CRLF2融合遺伝子が形成されていることが明らかとなった。また、CRLF2高発現例の一部においてCRLF2遺伝子変異(F232C)がみられるという報告もある。しかし、本邦のDS-ALL症例におけるこれらの遺伝子異常の頻度は不明である。そこで、本邦のDS-ALL症例の診断時骨髄細胞を用いて、JAK2およびCRLF2遺伝子変異、P2RY8-CRLF2遺伝子再構成の解析を行った。本年度は新たに9例の解析を行い、解析症例は合計32例となった。その結果、DS-ALLの32例中3例(9%)でJAK2遺伝子変異(R683G)が認められ、CRLF2遺伝子変異は1例も認められなかった。P2RY8-CRLF2遺伝子再構成が認められたのは32例中6例(19%)のみであった。また、cDNAの得られたDS-ALLの24例と非ダウンALLの25例についてCRLF2の発現量の解析を行ったが、両者の間で発現量の違いはみられなかった。本邦のDS-ALLでは、欧米と比べてJAK2およびCRLF2遺伝子異常の頻度が低いことが明らかとなり、発症メカニズムが異なる可能性が示唆された。そこで、本邦のDS-ALL症例の診断時骨髄細胞を用いて、これらの遺伝子異常について解析した。本年度は新たに6例の解析を行い、解析症例は合計38例となった。DS-ALLの38例中6例(16%)でJAK2遺伝子変異(R683G)が認められ、CRLF2遺伝子変異は1例も認められなかった。P2RY8-CRLF2遺伝子再構成が認められたのは38例中11例(29%)であった。また、cDNAの得られたDS-ALLの27例(P2RY8-CRLF2陽性7例、P2RY8-CRLF2陰性20例)と非ダウンALLの25例についてCRLF2の発現量の解析を行った。非ダウンALL群のCRLF2発現量の中央値の10倍以上を高発現と定義した場合、DS-ALLの27例中9例(33%)(P2RY8-CRLF2陽性例7例中6例、P2RY8-CRLF2陰性例20例中3例)で高発現が認められた。本邦のDS-ALLでは、欧米と比べてJAK2およびCRLF2遺伝子異常の頻度がやや低いことが明らかとなり、発症メカニズムが異なる可能性が示唆された。

さらに、CRLF2遺伝子の高発現がみられる症例のほとんど(DS-ALLの約半数)でP2RY8-CRLF2融合遺伝子が形成されていることが明らかとなった。また、CRLF2高発現例の一部においてCRLF2遺伝子変異(F232C)がみられるという報告もある。しかし、本邦のDS-ALL症例におけるこれらの遺伝子異常の頻度は不明である。そこで、本邦のDS-ALL 23例の診断時骨髄細胞から抽出したゲノムDNAまたはcDNAを用いて、PCRとダイレクトシークエンスにてJAK2およびCRLF2遺伝子変異、PCRにてP2RY8-CRLF2遺伝子再構成の解析を行った。また、cDNAの得られたDS-ALLの14例および非ダウンALLの25例について、リアルタイム定量RT-PCRにてCRLF2の発現量の解析を行った。その結果、DS-ALLの23例中2例(9%)でJAK2遺伝子変異(R683G)が認められ、CRLF2遺伝子変異は1例も認められなかった。P2RY8-CRLF2遺伝子再構成が認められたのは23例中4例(17%)のみであった。また、DS-ALLにおけるCRLF2の発現量は、非ダウンALLと比べて有意に高いという結果は得られなかった。本邦のDS-ALLでは、欧米と比べてJAK2およびCRLF2遺伝子異常の頻度が低いことが明らかとなり、発症メカニズムが異なる可能性が示唆された。当初の予定通り、本邦のDS-ALL患者の検体を用いて、JAK2遺伝子変異、CRLF2遺伝子変異、P2RY8-CRLF2遺伝子再構成、CRLF2の発現レベルの4項目について解析を行うことができた。本年度は新たに9例の解析を行い、解析症例は合計32例となった。本邦におけるDS-ALLの発症率を考慮すると、おおむね順調に集積することができたといえる。しかし、論文として成果を発表するためには症例数はまだ十分ではなく、40例程度を目標にさらに症例を増やす必要があると考えられる。23例という症例数も、本邦におけるDS-ALLの発症率を考慮すると、おおむね順調に集積することができたといえる。しかし、論文として成果を発表するためには症例数はまだ十分ではなく、30例以上を目標にさらに症例を増やす必要があると考えられる。これまでの解析から得られた、本邦のDS-ALLでは欧米と比べてJAK2およびCRLF2遺伝子異常の頻度が低いという結果を、さらに症例を増やして確認する。また、P2RY8-CRLF2遺伝子再構成やF232C変異以外のCRLF2遺伝子異常や、JAK2以外のJAKファミリーの遺伝子変異が生じている可能性も考えられるため、これらについても解析を行う予定である。また、最近DS-ALLにおいてIL7R遺伝子変異が報告されたため、この変異についても解析する。さらに、JAK2およびCRLF2遺伝子異常と、予後を含めた臨床像との関連については、欧米においても十分に解明されていないため、この点についても調査を行いたい。
SNPs等遺伝子多型解析による死因不明の突然死に関わる遺伝子の検索

本研究の本来の目的は突然死遺体よりのDNA試料を用いて、SNPs等のDNA多型解析を行い疾患感受性遺伝子を検索することであるが、我々の予測に反して大阪府や兵庫県の監察医事務所において、いまだ倫理委員会が設置されておらず、試料収集に困難を極めている。したがって、現在まで、その代替の方法として、突然死に至る可能性のある、致死性不整脈症候群患者より試料の提供をうけ、致死性不整脈症候群の病因遺伝子およびその症状を発症しやすくする感受性遺伝子の検索を行うこととし、現在その試料を収集中である。一方、これまでに我々が確立してきたHLA領域全体にわたるSNPsタイピングおよびKIR遺伝子多型を用いた多因子疾患感受性遺伝子の検索については下記の結果を得た。1)スギ花粉症患者群131名、慢性関節リウマチ(RA)患者群92名、口唇口蓋裂患者群70名および健常対照群180名の試料につき、HLA領域の165SNPsタイピング、KIR遺伝子およびハプロタイプタイピングおよびHLA-A,-B,-DR型タイピングを行った。2)花粉症においてはHLA-Aと-C遺伝子近辺のSNPsと相関がみられ、RAではHLA-DR近辺のSNPと強い相関が見られ、口唇口蓋裂ではHLA-BとMICA近辺に強い相関が見られた。3)慢性関節リウマチにおいてはKIR 3DL1遺伝子との相関が認められた。1)現在まで、突然死遺体および突然死につながると考えられているQT延長症候群患者からのDNA試料の収集を行ってきたが相関解析を行いうる数は得られていない。一方、平行して行ってきた慢性関節リウマチ、花粉症、口蓋裂患者、および健常対照群DNAについては各々92名のDNAを得て。これらについて、HLA領域のSNPsおよびKIR遺伝子多型調べ、相関解析を行った。2)HLA領域のSNPsについてはHLA全領域にわたる150SNPsについて調べた。そのうち、23SNPsには多型が認められず、28SNPsについては10%以下の多型しか認められなかった。その他の99SNPsについては10%以上の多型が存在した。これらのSNPsはCaucasianにおいてはすべて10%以上のが多型が存在するものであり、この差はpopulationの違いによると考えられる。3)HLA領域のSNPsとの相関解析において、スギ花粉症ではX^2値=11、P=0.001、Odds Ratio=5、口蓋裂ではX^2値=11、P=0.001、Odds Ratio=6、慢性関節リウマチではX^2値=11、P=0.001、Odds Ratio=4という値を示す相関のある領域を見出した。現在、これらの相関を確認し、このピーク領域をさらに狭める目的で、JSNPs等の公開されているデータを用いて、さらなるSNPs解析を行いつつある。4)同様のDNAサンプルについてKIR遺伝子の多型解析も行った。スギ花粉症および慢性関節リウマチについて相関解析を行ったところ健常対照とほとんど有意差はみられなかったが、いずれも1遺伝子についてのみサンプル数を増やすことにより、有意差がみられるのではないかと考えられるものがあった。現在さらにサンプル数を増やすべく準備中である。当法医学教室での解剖事例中、原因不明の突然死の事例は年間23件程度にすぎない。しかし、大阪府や兵庫県の監察医事務所においてはかなりの数の事例があるものと考えられ、倫理委員会が設置され、そこでの試料収集が可能となれば、本研究のための試料収集も可能であろうと考えられた。ところが、現時点においては我々の再三の要望にもかかわらず、いずれにおいても倫理委員会設立の見込みはなく、試料の収集は不可能である。したがって、突然死遺体からの試料収集はかなり難しいと判断し、突然死に至る可能性のある、致死性不整脈症候群患者より試料の提供をうけ、致死性不整脈症候群の病因遺伝子およびその症状を発症しやすくする感受性遺伝子の検索を行うこととし、現在その試料を収集中である。

1)スギ花粉症患者群131名、慢性関節リウマチ(RA)患者群92名、口唇口蓋裂患者群70名および健常対照群180名の試料につき、HLA領域の165 SNPsタイピング、KIR遺伝子およびハプロタイプタイピングおよびHLA-A,-B,-DR型タイピングを行った。2)花粉症においてはHLA-Aと-c遺伝子近辺のSNPsと相関がみられ、RAではHLA-DR近辺のSNPと強い相関が見られ、口唇口蓋裂ではHLA-BとMICA近辺に強い相関が見られた。
肝臓アデノシン動態を標的とした肝星細胞活性化制御によるNASH進行防遏方策の確立

肥満人口の増加に伴い、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の患者数は年々増加しているが、一部の患者では、さらに、NAFLDから予後不良なNASHへと進行する。この進行は不可逆的であり、その予後不良を決定づける重要な因子は肝線維化である。興味深いことに、NASHへと進行する(肝線維化する)患者は一部であり、進行しない(肝線維化しない)患者も多く存在する。すなわち、NASH進行にはトリガーとなる何らかのシグナルが存在し、それを同定することがNASHの予防法・治療法への応用につながると考えられる。本研究では、トリガー刺激を同定し、NASHの予防法や治療法への応用につながる基盤的知見を得る。
葉層構造をめぐる幾何学の研究

本研究では,葉層の構造,性質などの研究を中心にしてさらに広く葉層をめぐる幾何学の研究も視野に入れる。特に,研究代表者は余次元1葉層の定性論における一連の古典的定理などをモデルにして,横断的に幾何学的構造を持つ高余次元の葉層構造に対してアナロジーがなりたつかなどを調べることを主とする。具体的には相似変換擬群の定性論を考察する。副産物として余次元1の場合と高余次元の場合にどういう違いが現れるかということについて新しい知見が得られるということを期待する。その他に有望な方向として,射影的アノソフ流と双コンタクト構造の関係や,ローレンツ計裏を白つ多様体上の全測地葉層の研究も視野に入れておく。当該研究期間の研究代表者の研究では,相似変換擬群の狭義セミプロパーな軌道がいつバブルをもつのかという問題に,集中的に取り組んだ。(「バブルをもつ軌道」に対しては余次元1葉層の古典的定理であるサックスティーダーの定理のアナロジー及びヘクター・ドゥミニの定理のアナロジーが研究代表者によって既に証明されていて,相似変換擬群の定性論では中心的な役割を果たしている。)基本的なアイデアは,狭義セミプロパーな軌道が与えられたとき,全空間を軌道の各点に対応するテリトリーに分解することが出来るが,適当な条件のもとでテリトリーがバブルになるということである。テリトリーがバブルになるためのさまざまな十分条件が得られたが,それらの間の関係を調べることが今後の課題になる。本研究では,広く複素力学系などを含めた意味での葉層の構造,性質などを研究する。また,これらに関連する幾何学の研究を行う。特に,研究代表者は余次元1葉層の定性論における一連の古典的定理などをモデルにして,横断的に幾何学的構造を持つ高余次元の葉層構造に対してアナロジーがなりたつかなどを調べることが中心になる。今年度の研究代表者の研究では,相似変換擬群の狭義セミプロパーな軌道がいつバブルをもつ(このときその軌道の閉包が縮小元の不動点を含みその軌道のケイレイグラフのエンド集合がカントール集合を含むことになり余次元1葉層の例外的極小集合のアナロジーになる)のかという問題を考えた。そのため軌道の存在するユークリッド空間の点を軌道上のもっとも近い点に対応させることによって,軌道の各点にテリトリーという集合を対応させるのであるが,軌道が狭義セミプロパーであることから各テリトリーは開集合になる。軌道がバブルをもつための一つの条件は,相似変換義軍の生成元の定義域の境界と交わるテリトリーをもつ軌道上の点が有限個しかないことであるということが示せた。また,テリトリーの体積に対する直径の次元数乗の比が有界であるという条件からも,狭義セミプロパーな軌道がバブルをもつことが示せることがわかった。(研究分担者の研究については論文リストを示すにとどめる)本研究では,広く複素力学系などを含めた意味での葉層の構造,性質などを研究する。特に,余次元1葉層の定性論における一連の古典的定理などをモデルにして,横断的に幾何学的構造を持つ高余次元の葉層構造に対してアナロジーがなりたつかなどを調べることが中心になる。その他に有望な方向として,射影的アノソフ流と双コンタクト構造の関係や,ローレンツ計量をもつ多様体上の全測地葉層の研究も視野に入れておく。今年度の研究代表者の研究では,相似変換擬群の狭義セミプロパーな軌道がいつバブルをもつのかという問題に集中的に取り組んだ。(バブルをもつとき,軌道の閉包がある縮小元の不動点を含み,その軌道のケイレイ・グラフのエンド集合がカントール集合を含むという研究代表者の定理が適用できる。)

この研究が拠ってたつ基本的なアイデアは,狭義セミプロパーな軌道が与えられたとき,全空間を各点に対応するテリトリーに分解することが出来るが,適当な条件のもとでテリトリーがバブルになるということである。テリトリーがバブルになるためのさまざまな十分条件が得られたが,それらの間の関係を調べることが今後の課題になる。(研究分担者の研究については論文リストを示すにとどめる。)本研究では,葉層の構造,性質などの研究を中心にしてさらに広く葉層をめぐる幾何学の研究も視野に入れる。特に,研究代表者は余次元1葉層の定性論における一連の古典的定理などをモデルにして,横断的に幾何学的構造を持つ高余次元の葉層構造に対してアナロジーがなりたつかなどを調べることを主とする。具体的には相似変換擬群の定性論を考察する。副産物として余次元1の場合と高余次元の場合にどういう違いが現れるかということについて新しい知見が得られるということを期待する。その他に有望な方向として,射影的アノソフ流と双コンタクト構造の関係や,ローレンツ計量をもつ多様体上の全測地葉層の研究も視野に入れておく。今年度の研究代表者の研究では,相似変換擬群の狭義セミプロパーな軌道がいつバブルをもつのかという問題に,前年度に引き続き集中的に取り組んだ。(バブルをもつ軌道に対しては余次元1葉層の古典的定理であるサックスティーダーの定理のアナロジーが研究代表者によって証明されている。)基本的なアイデアは,狭義セミプロパーな軌道が与えられたとき,全空間を各点に対応するテリトリーに分解することが出来るが,適当な条件のもとでテリトリーがバブルになるということである。)
原因不明の突然死に関する法医学的研究(血管の反応性を中心にして)

ヒト脳底動脈を用い,動脈硬化により内腔狭窄の程度に関連して,脳底動脈が拡大するのかどうか,またこの拡大により内腔の面積が正常に保たれるのかを形態計測学的な観点から検討した。内膜の面積および狭窄度(内膜の面積/内弾性板に囲まれた面積×100)は加齢とともに増加した。35才以下の標本では6%以上の狭窄を持った標本は認められなかった。内弾性板に囲まれた面積は狭窄度と正の相関を示した。内腔の面積あるいは中膜の面積は中等性から高度の狭窄度を示す標本において,変化を示さなかった。これらの結果は動脈硬化を伴った動脈において,動脈径は動脈硬化の程度に関連して増加し,しかも内腔は中膜の薄弱を伴った代償性拡大により維持されていることを示している。次にこれらの形態計測学的検討を考慮し,クモ膜下出血で死亡したヒト脳底動脈を用い等尺性収縮力を検討した。クモ膜下出血で死亡した(1日以内)群と脳障害以外で死亡した対照群においてKCl,ノルエピネフリンおよびセロトニンの収縮反応は両群で差は認めなかった。一方,トロンビン,ブラディキニンおよびカルシュウム・イオノフォアA23187による内皮依存性弛緩反応は対照群に比べクモ膜下出血群で有意に減弱していた。しかし,内皮非依存性弛緩反応を示すソデュウム・ニトロプルシッドによる反応は両群で有意差はなかった。これらの結果はトロンビンおよびブラディキニンによる弛緩反応の減弱は内皮細胞のレベルで生じており,平滑筋のレベルでの関与は少ないものと考えられた。この弛緩反応の減弱はクモ膜下出血後の脳血管攣縮の一因となるものと考えられた。血管における動脈硬化の進展は血管の機能や形態異常をきたし,最終的には心筋梗塞,脳梗塞等の内因的急死の原因となる。そこで,動脈硬化が血管におよぼす形態計測学的な観点からヒト脳底動脈を用い検討した。剖検時に得られたヒト脳底動脈をホルマリン固定後,その横断切片をElastica van Gieson染色し,image analyzer systemを用い内膜,中膜,管腔の面積,内弾性板に囲まれた面積および内弾性板の長さを測定し,これらの測定値から動脈硬化指数としてintimal indexおよび中膜の厚さを求めた。そして,得られた各々のパラメ-タ-に関して相関関係を検討した。Intimal indexは中膜の面積,管腔の面積と相関を示さなかった。また,intimal indexは中膜の厚さと逆相関を示し,内弾性板に囲まれた面積(血管の大きさを表わす指標)とは正の相関を示した。これらの結果は動脈硬化の進展にもかかわらず,管腔の面積はせまくならず,正常面積に保たれていることを示している。さらに,この正常な面積は動脈硬化の進展により,中膜の厚さの減少を伴って血管の大きさが大きくなることにより維持されていることを示している。今回,得られた結果は動脈硬化により血管の内腔が狭容するという一般の通念とは異なるものである。すなわち,動脈硬化の進展にかかわらず,血管が代償性に拡大することにより管腔が狭窄せず,正常に保たれているが,その代償性機能が失なわれると狭窄に転じる可能性がある新たな知見を得た。血管の脳血流の調節という観点から見ると動脈硬化による形態的変化よりむしろ機能的変化による病態におよぼす影響の重要性が認識される必要性を示唆している。クモ膜下出血後に生じる脳血管の攣縮は死亡原因につながる重大な一因であるが,その原因は明らかでない。

そこで,等尺性張力の測定により,血管攣縮の機序につき機能的な観点から検討した。剖検時に得られたクモ膜下出血で死亡したヒト脳底動脈を用い,ラセン条片を作成し,その血管条片をKrebsーRinger液の入ったorgan bathに懸垂し,種々薬物による血管の反応性を等尺性張力を測定することによって検討した。クモ膜下出血で死亡したヒトからの血管条片は,クモ膜下出血以外で死亡したヒトからの血管条片に比べて,内反依存性の他緩反応を示すトロンビン,ブラディキニンおよびカルシウム・イオノフォアA23187による弛緩反応は減弱したが,内皮非依存性の弛緩反応を示すソデュウム・ニトロプルシッドによる反応は減弱しなかった。一方,KCl,ノルエピネフリンおよびセロトニンによる収縮反応は両群で差は認められなかった。これらの結果はクモ膜下出血後のヒト脳底動脈は内皮依存性弛緩反応の減弱は平滑筋細胞レベルでなく,内皮細胞レベルで生じており,おそらくクモ膜下出血により内皮細胞が損傷され,内皮細胞で合成放出される内皮由来の弛緩因子の減少によってひきおこされるものと考えられる。今回,得られた結果は動物を使用したクモ膜下出血モデルにおいても,報告されているが,ヒトにおいても同様の現象が生じていることが証明され,この弛緩反応の減弱がクモ膜下出血後の血管の攣縮の原因の一因になっていることが示唆された。
ゲノム解析に基づくNSAID潰瘍高リスク群の設定及びその効率的な予防戦略の確立

SAID潰瘍のリスクファクターについて薬物動態の観点から検討を行い、個別化療法に応用することを目的に研究を行った。健常ボランティアに対しナプロキセンを内服後の胃粘膜傷害を評価し、胃粘膜傷害に関わる因子を検討した。CYP2C9^*3アレル保持者で胃粘膜傷害の程度が高く、CYP2C9^*3はNSAID潰瘍のリスクファクターと考えられた。しかし、CYP2C9^*1/^*1でも比較的重度の粘膜傷害を呈する例があり、この遺伝子多型のみでは、リスク評価に限界があると考えられた。そこで、^<13>C-naproxenを応用することとした。この化合物は代謝される際に13Cの部分が二酸化炭素、すなわち、^<13>CO_2となるため、内服後の呼気中に出現する^<13>CO_2はナプロキサンの代謝の指標となる。そこで、前述のボランティアに対して^<13>C-naproxen内服後の呼気中の^<13>CO_2とナプロキサン内服後の胃粘膜傷害の相関を検討したところ有意な相関関係をみとめたため、この^<13>C-naproxenはナプロキサンの胃粘膜傷害の予測マーカーと考えられた。同様の検討を他のNSAID(Indomethacin)で行ったところ同様な結果が得られたため、本試験はNSAIDの胃粘膜傷害の予測マーカーとなると考えられた。そこで、新たにボランティアを募集し、ナプロキサン単独内服群(N群)、ナプロキサンとランソプラゾール内服群(NL群)、そして、^<13>C-naproxenを行いリスクの高いと判断された者のみナプロキサンにランソプラゾールを併用した(低リスクではナプロキサンのみ)テーラーメイド群(T群)を前向きに比較検討した。すると、N群に比較してNL群は有意に胃粘膜傷害が低値であったが、T群も同様にN群と比較して有意に低く、NL群と同様であった。今回もCYP2C9^*3アレル保持者は^<13>C-naproxenにて高リスクと判断されていた。以上より、NSAIDの胃粘膜傷害にはNSAIDの代謝がかかわり、CYP2C9^*3はリスク要因と考えられたが、^<13>C-naproxenも同様にリスクの予測マーカーとなりえると考えられた。NSAID潰瘍のリスクに関してNSAAIDの代謝酵素のひとつであるCYP2C9の頻度を検討した。NSAID潰瘍患者におけるCYP2C9*3アレルの頻度は、非潰瘍患者と比較してほぼ同等で非常に低く、本邦においてはCYP2C9変異はNSAID潰瘍のリスクには成り得ないと考えられた。ボランティアにおいてNSAID内服後の胃粘膜傷害を検討した。すると種々の程度の胃粘膜傷害が認められ、粘膜防御に関わる遺伝子多型、血中NSAID濃度、PGE2濃度を測定中である。NSAIDの胃粘膜傷害のリスクマーカーの検討、特に遺伝子多型の検討を行ってきた。1)CYP2C9

多型:NSAIDの代謝を担うCYP2C9の多型とNSAIDの粘膜傷害との関連について検討した。15例のボランティアにナプロキサン600mg内服後2日後の胃粘膜傷害とCYP2C9多型との関連を検討すると、CYP2C9^*3アリル保持者での粘膜傷害が、非保持者に比較して有意に重症であり、CYP2C9の多型がNSAIDによる胃粘膜傷害の予測因子になりうることを明らかにした。すなわちNSAIDの代謝動態がさらに、NSAIDの代謝活性を2)H_2S合成酵素多型:リスクに関連すると考えられるものとして、硫化水素(H_2S)の合成酵素に注目し、その多型の検出方法の確立に努めた。CSE, CBSの多型について検出方法の確立を行った。3)新たなリスクマーカーの開発:1)でNSAIDの代謝活性がNSAIDの胃粘膜傷害に関わることが考えられたため、NSAIDの個々の動態を簡便に評価する方法として^<13>C-Naproxen breathtestを開発した。この検査はNSAIDの粘膜傷害の指標となることが明らかになり特許を出願することとした。前向き試験の検討CYP2C9^*3アレルの有無や^<13>C-Naproxen breathtestにてNSAIDリスクを予測して、PPIを併用する群と全例PPIを併用する群、PPIを併用しない群の3群で、胃粘膜傷害の程度をエンドポイントとした前向き試験を施行中である。NSAID潰瘍のリスクファクターについて薬物動態の観点から検討を行い、個別化療法に応用することを目的に研究を行った。健常ボランティアに対しナプロキセンを内服後の胃粘膜傷害を評価し、胃粘膜傷害に関わる因子を検討した。CYP2C9*3アレル保持者で胃粘膜傷害の程度が高く、CYP2C9*3はNSAID潰瘍のリスクファクターと考えられた。しかし、CYP2C9*1/*1でも比較的重度の粘膜傷害を呈する例があり、この遺伝子多型のみでは、リスク評価に限界があると考えられた。そこで、^<13>C-naproxenを応用することとした。この化合物は代謝される際に13Cの部分が二酸化炭素、すなわち、^<13>CO_2となるため、内服後の呼気中に出現する^<13>CO_2はナプロキサンの代謝の指標となる。そこで、前述のボランティアに対して^<13>C-naproxen内服後の呼気中の^<13>CO_2とナプロキサン内服後の胃粘膜傷害の相関を検討したところ有意な相関関係をみとめたため、この^<13>C-naproxenはナプロキサンの胃粘膜傷害の予測マーカーと考えられた。同様の検討を他のNSAID(Indomethacin)で行ったところ同様な結果が得られたため、本試験はNSAIDの胃粘膜傷害の予測マーカーとなると考えられた。そこで、新たにボランティアを募集し、ナプロキサン単独内服群(N群)、ナプロキサンとランソプラゾール内服群(NL群)、そして、^<13>C-naproxenを行いリスクの高いと判断された者のみナプロキサンにランソプラゾールを併用した(低リスクではナプロキサンのみ)テーラーメイド群(T群)を前向きに比較検討した。すると、N群に比較してNL群は有意に胃粘膜傷害が低値であったが、T群も同様にN群と比較して有意に低く、NL群と同様であった。今回もCYP2C9*3アレル保持者は^<13>C-naproxenにて高リスクと判断されていた。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカンによる筋収縮シグナル制御の研究

興奮性細胞における初期のカルシウム濃度の上昇はマイクロドメインから起こり、強い刺激を受けると局所的なカルシウム濃度変化が融合して細胞質の区画全体に及ぶ広域的なカルシウム濃度上昇を引き起こすというステップが想定されている。そこには何らかの細胞外マトリックスによるシグナル局在化のメカニズムが働いている可能性がある。我々はヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカン欠損疾患であるScwartz-Jampel症候群における骨格筋の持続収縮ミオトニア症状のメカニズムについてモデルマウスを使って解明しているが、その過程でいくつかの複合要因が考えられている。その一つに筋の易収縮性を考えている。さらにモデルマウスの血管平滑筋の収縮試験においてエピネフリンに対する平滑筋の過収縮が観察され、パールカン非存在下でのカルシウムシグナルへの過剰反応の可能性が示唆された。近年、細胞内シグナル伝達における糖鎖の関与が注目されるが、カルシウムシグナルと筋収縮においても例外ではないと思われる。申請者はパールカン欠損疾患モデルマウスでの骨格筋、平滑筋の収縮異常に関し、糖鎖とカルシウムシグナル伝達機構の制御機構を明らかにすることを目的とした。マウス初代培養筋の系を用いてin vitroの系で生理学的手法、カルシウムイメージング等の手法を用いてその変化を確認する系を立ち上げて測定を開始した。本研究課題はカルシウムシグナルと筋収縮におけるヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカンの関与を明らかにすることを目的としている。筋、神経等興奮性細胞における初期のカルシウム濃度の上昇はマイクロドメインから起こり、強い刺激を受けると局所的なカルシウム濃度変化が融合して細胞質の区画全体に及ぶ広域的なカルシウム濃度上昇を引き起こす。我々は、その初期過程で、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが細胞膜でのシグナル局在化に関わり、カルシウム濃度変化の誘導を制御していると考えた。これまでにパールカン欠損骨格筋の易収縮性の発症機構を検討し、神経終末からのアセチルコリンの放出亢進、神経筋接合部でのアセチルコリンエステレース欠損が明らかになりつつある。今年度は、マウス大動脈平滑筋を用いた薬理学的検討を行い、パールカン欠損大動脈では野生型(WT)大動脈に比べ、フェニレフリンによる濃度依存的な血管収縮が有意に亢進することが解った。カルシウム流入を介する高K刺激収縮は正常であったことより、アクトミオシン系等の収縮機構に異常はないと考えられた。血管平滑筋においては、カルシウム遊離機構(IP3-induced Carelease)あるいはカルシウム感受性(Rho/Rho-kinase系)亢進の存在が疑われた。一方、AChによる内皮依存性一酸化窒素(NO)遊離を介する血管弛緩は、パールカン欠損血管ではWTに比べ有意に減少していた。SNPによる弛緩が正常であったことより、内皮由来血管弛緩因子であるNOに対する血管平滑筋側での感受性に異常はなく、内皮細胞におけるムスカリン受容体の感受性の低下、IP3-induced Careleaseの減少、内皮型NO合成酵素(NOS)の発現低下などの可能性がその原因として考えられた。骨格筋における収縮異常との関連性も含め興味深い知見と考えられ、次年度にカルシウム動態などの詳細な検討が必要と考えられた。
最適パターン発見に基づく大規模半構造データからの知的情報獲得システムの開発

本研究では,大量のウェブページやXML等の大規模半構造データからのデータマイニング(ウェブマイニング)に基づき,大量のデータ解析を対話的に支援する効率的なツールとして,従来の情報検索システムを超えた新しい情報アクセスシステムの実現方式を明らかにすることを目標としている.鍵になる技術として,最適パターン発見を木やグラフ構造に拡張し,計算量理論と計算学習理論の最新の成果を援用しながら,半構造データに対する頑健かつ高速な最適化パターン発見アルゴリズムの開発に取り組んだ.平成15年度は,前年度の成果に基づき,(a)有用な情報源の発見,(b)特徴的なパターンの発見,(c)情報の抽出の3つの情報獲得問題について,次の研究を行った.(1)前年度開発した最適分類パターンを用いた高精度テキスト自動分類手法を一種の正規表現を扱えるよう一般化した.さらに,近似文字列照合を可能なパターン発見エンジンを開発し,加速学習法を用いて決定木学習システムBONSAIに組み込んだ(竹田・篠原).(2)XPathパターンに対する最適パターン発見アルゴリズムを設計し,半構造データマイニングエンジンを開発した.とくに今回は,より現実の半構造データに近い無順序木モデルに対して,高速なパターン発見エンジンを開発した.パターンの圧縮表現に対する,高速な列挙アルゴリズムを開発した.独自に開発したオンライン化技術を用いて,オンラインパターン発見手法を開発した(有村).(3)情報抽出に関して,現状の技術動向の調査を行い,水平方向制約(Sequence制約)付き半構造データに対するラッパー帰納アルゴリズムの設計を行った(坂本).さらに,半構造データに適した高性能圧縮アルゴリズムを開発し,性能に関する理論的解析を行った.並行して,開発したアルゴリズムの計算量を解析し(下薗,篠原),個々のアルゴリズムの最適化をおこない,性能を向上させた(全員).最後に,ウェブデータとXMLデータに関する評価実験をおこない,この方式の有効性を評価した(有村・篠原).本研究では,大量のウェブページやXML等の大規模半構造データからのデータマイニング(ウェブマイニング)に基づき,大量のデータ解析を対話的に支援する効率的なツールとして,従来の情報検索システムを超えた新しい情報アクセスシステムの実現方式を明らかにすることを目標としている.鍵になる技術として,最適パターン発見を木やグラフ構造に拡張し,計算量理論と計算学習理論の最新の成果を援用しながら,半構造データに対する頑健かつ高速な最適化パターン発見アルゴリズムの開発に取り組んだ.平成15年度は,前年度の成果に基づき,(a)有用な情報源の発見,(b)特徴的なパターンの発見,(c)情報の抽出の3つの情報獲得問題について,次の研究を行った.(1)前年度開発した最適分類パターンを用いた高精度テキスト自動分類手法を一種の正規表現を扱えるよう一般化した.さらに,近似文字列照合を可能なパターン発見エンジンを開発し,加速学習法を用いて決定木学習システムBONSAIに組み込んだ(竹田・篠原).(2)XPathパターンに対する最適パターン発見アルゴリズムを設計し,半構造データマイニングエンジンを開発した.とくに今回は,より現実の半構造データに近い無順序木モデルに対して,高速なパターン発見エンジンを開発した.パターンの圧縮表現に対する,高速な列挙アルゴリズムを開発した.独自に開発したオンライン化技術を用いて,オンラインパターン発見手法を開発した(有村).(3)情報抽出に関して,現状の技術動向の調査を行い,水平方向制約(Sequence制約)付き半構造データに対するラッパー帰納アルゴリズムの設計を行った(坂本).さらに,半構造データに適した高性能圧縮アルゴリズムを開発し,性能に関する理論的解析を行った.並行して,開発したアルゴリズムの計算量を解析し(下薗,篠原),個々のアルゴリズムの最適化をおこない,性能を向上させた(全員).最後に,ウェブデータとXMLデータに関する評価実験をおこない,この方式の有効性を評価した(有村・篠原).
新規ヒスチジン型プロテインホスファターゼの探索と基質特異性についての構造学的解析

最近我々は、ヒスチジン残基を活性中心とする全く新しいタイプのプロテインホスファターゼとしてPGAM5を見出したが、その酵素としての作用機構は分かっていない。本研究では、PGAM5の構造解析を行い、2つのヒスチジン残基と2つのアルギニン残基から酵素活性中心が形成されることを見出した。また、PGAM5は二量体を形成し、さらに二量体化がPGAM5の活性保持に必須であることも明らかとなった。この結果は、ヒスチジン型プロテインホスファターゼの作用機構の解明への大きな足がかりになると考えられる。最近我々は、ヒスチジン残基を活性中心とする全く新しいタイプのプロテインホスファターゼとしてPGAM5を見出した。興味深いことに、PGAM5はリン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンを特異的に脱リン酸化するのに対し、Sts-1およびSts-2は同じヒスチジン型プロテインホスファターゼでもリン酸化チロシンを特異的にリン酸化する。そこで本研究では、これら以外の新規のヒスチジン型プロテインホスファターゼを探索するとともに、それらの構造と基質特異性との相関から新たなホスファターゼファミリーとしての機能を探り、既知の分子の機能では説明のできないタンパク質脱リン酸化を介した細胞機能調節の解明を目指した。平成24年度においては、PGAM5のPGAMドメインおよびC末端領域(90-289AA)の構造解析を行い、2つのヒスチジン残基と2つのアルギニン残基から酵素活性中心が形成されることが見出した。しかし、構造解析に用いたPGAM5 90-289AAはほとんど活性を保持していないことが確認された。そこで活性の維持に必要なタンパク質領域を探ったところ、PGAMドメインよりN末端側も活性の保持に必要であることが分かった。平成25年度にはPGAM5の基質探索を行い、mRNAの代謝において重要な役割を担う核タンパク質SRm160を見出した。SRm160は定常状態において高度にリン酸化されており、PGAM5によって直接脱リン酸化されることが明らかとなった。今後、PGAM5の標的となるSRm160におけるリン酸化部位の特定を進め、PGAM5のヒスチジン型プロテインホスファターゼとしての脱リン酸化の分子機構の解明を進めたい。平成24年度においては、ヒスチジン型プロテインホスファターゼのプロトタイプであるPGAM5の構造解析を中心に研究を進めた。まず、PGAMドメインおよびC末端領域(90-289AA)については構造が明らかとなり、二量体として存在し、2つのヒスチジン残基と2つのアルギニン残基から酵素活性中心が形成されることが分かった。2量体形成に関しては、C末端どうしで相互作用していることが示唆されたため、C末端の欠失変異体を作製して共免疫沈降実験を行ったところ、C末端の7アミノ酸がPGAM5どうしの二量体形成に必要であることが明らかとなった。さらに、二量体化できないC末端7アミノ酸の欠失変異体はホスファターゼ活性を失っていることが分かり、二量体化がPGAM5の活性保持に必須であることが明らかとなった。一方、構造解析に用いた90-289AAのリコンビナントタンパク質のin vitroにおけるホスファターゼ活性を検討したところ、ほとんど活性を保持していないことが確認された。そこで、PGAMドメインよりN末端側の配列を保持したいくつかの欠失タンパク質のホスファターゼ活性を測定したところ、54-289AAでは活性を保持していることから、PGAMドメインよりN末端側も活性の保持に必要であることが分かった。その領域には種を越えて保存されたモチーフ(WDxNWDxR)が存在しており、このモチーフが活性制御に重要な役割を担っていることが示唆される。現在、54-289AAの構造解析を進めているが、うまく結晶が得られておらず、基質ペプチドとの共結晶化が必要と考えられる。そのため、PGAM5の基質分子を得るべく、結合分子探索も並行して進めているところである。新規ヒスチジン型プロテインホスファターゼについてはまだ同定には至っておらず、「やや遅れている」と判断した。活性を有するPGAM5の構造解析を進めるためにも、PGAM5の脱リン酸化基質の同定が急務である。また、新規ヒスチジン型プロテインホスファターゼの探索も引き続き精力的に行う予定である。平成24年度の研究においては、新規ヒスチジン型プロテインホスファターゼの探索が遅れたことにより、予想より支出が抑えられた。次年度においては、計画通りに研究を遂行するためには、前年度分残額と今年度の予定額を合わせた研究費が必要となる。
神経損傷後の知覚過敏状態の発生機序に関する実験的研究

慢性疼痛ラットモデルの作製本研究では、正常ラットの坐骨神経切断によって、切断側の後肢に対する自傷行動(爪、足指を噛みきる)が観察され慢性疼痛モデルラットを作製することができた。膜電位感受性色素を使った興奮伝導の検討脊髄スライス標本からの膜電位信号は非常に微弱であり、興奮伝搬の様子をとらえることは困難であったが本研究において照射光量、色素濃度、染色時間、刺激様式などの検討の結果、後根侵入部刺激による脊髄後角内の興奮伝搬の様子をかろうじて観察することが可能となった。しかし、依然として反応は微弱なため、後根侵入部刺激で60V、100msec以上の強度を必要とした。この刺激の16回の加算平均により、12msの時間経過で刺激部位から脊髄後角の深層に達する早い興奮伝搬が観察された。それに引き続いて、数秒にわたって後角内を浅層から深層に伝搬する遅い興奮が観察された。以上は正常ラットを用いた検討で明らかとなったが、慢性疼痛モデルラットに関する検討は、。本研究期間では試行できなかった。これらの結果から、成熟ラット脊髄スライス標本での膜電位画像解析法による興奮伝搬様式の検討は可能であることがわかったが、刺激強度による線維分別は困難で各1次求心性線維ごとの脊髄内での興奮伝搬の差違を検討することは、本研究期間では不可能であった。今後実験条件の更なる検討が必要であると考えられた。電気生理学的検討正常ラットと坐骨神経切断ラットの両者から、脊髄膠様質細胞からのパッチクランプ記録による比較では、坐骨神経切断ラットでは正常ラットと比べて、膠様質へのAβ線維による多シナプス性入力が増加することが観察され、正常ラットでは観察されないAβ線維による単シナプス性入力が観察された。以上、電気生理学的県検討の結果から、坐骨神経結紮により脊髄後角内での1次求心性線維入力の可塑的変化が生じていることが示唆された。本年度は成熟ラット脊髄スライス標本からの膜電位感受性色素を用いた膜電位画像解析に関する方法論の確立と坐骨神経結紮による慢性疼痛ラットの脊髄スライス標本からのパッチクランプ記録を行った。脊髄からの膜電位画像解析はこれまで当教室で行っていた成熟ラット脳海馬及び幼弱ラット脊髄からの画像測定と比べて、その信号が小さく著しく困難であり、非常に強い光量と100200回の加算平均を必用とした。Aδ線維以上の強い刺激強度での後根刺激では脊髄後角浅層部の脱分極にみが観察されたが、Aβ線維以下の弱い刺激強度では深層部の脱分極が観察されることが期待されたが実際にはまったく反応が得られず、光量、色素濃度、染色時間、加算回数等のさらなる検討が必要と考えられた。一方、坐骨神経結紮による慢性疼痛モデルラットでは損傷側の後肢に対する自傷行為等の疼痛行動が認められた。モデルラットの脊髄膠様質細胞からのパッチクランプ記録では正常ラットと比べてAβ線維による多シナプス性入力が増加することが観察された。また、正常ラットでは通常観察されないはずのAβ線維による単シナプス性入力が少数ではあるが観察された。以上のことから、坐骨神経結紮により脊髄後角内でAβ線維の何らかの可塑性変化が生じていることが示唆された。本年度は前年度に引き続き成熟ラット脊髄スライス標本からの膜電位感受性色素を用いた興奮伝搬の画像解析に関する検討を集中的に行った。

まず初めに正常ラット脊髄横断スライス標本を用い膜電位画像化解析を行った。脊髄スライス標本からの膜電位可視化信号は、これまで当教室で行っていた成熟ラット脳毎馬スライス標本からの信号に比べ非常に微弱であった。そのために、前年度は興奮伝搬の様子をとらえることは困難であった。しかし、今年度に行った諸条件、例えば照射光量、色素濃度、染色時間、刺激様式などの検討の結果、後根侵入部刺激による脊髄後角内の興奮伝搬の様子をかろうじて観察することが可能となった。しかし、その反応は微弱なため、後根侵入部刺激で60V、100msec以上の刺激強度を必要とした。この刺激の16回の加算平均により、12ミリ秒の時間経過で刺激部位から脊髄後角の深層に達する早い興奮の伝搬が観察された。それに引き続いて、数秒にわたって後角内を浅層から深層に伝搬して行くゆっくりした興奮が観察された。これらの結果から、成熟ラット脊髄スライス標本での膜電位画像解析法による興奮伝搬様式の検討は可能であることがわかったが、刺激強度による被刺激線維分別は困難で各一次求心性線維ごとの脊髄内での興奮伝搬の差違を検討することは、現時点では本研究期間では不可能であった。今後、照射光量、色素濃度、染色時間、刺激様式等の実験条件の更なる検討が必要であると考えられた。
新規ナルコレプシー感受性遺伝子CCR3の機能解析

ナルコレプシーは代表的な過眠症である。患者は日中の耐え難い眠気を経験するとともに、夜間の睡眠が断片化する。患者の脳の視床下部では、オレキシンを産生する神経細胞(オレキシン細胞)が脱落している。オレキシンノックアウトマウスの表現型がヒトナルコレプシーの症状に類似していることからも、オレキシン細胞の脱落がナルコレプシーの原因と考えられているが、脱落のメカニズムは明らかになっていない。研究代表者はこれまでに、日本人ナルコレプシー患者の検体を用いたゲノムワイド関連解析により、CCR3遺伝子の近傍に位置する一塩基多型がナルコレプシーと強く関連することを明らかにした。さらに、ナルコレプシー患者のCCR3のmRNA発現レベルが、健常者と比較して有意に低いことを見出した(Toyoda et al 2015)。さらに、CCR3遺伝子がナルコレプシー発症にどう寄与するかを知るため、Ccr3ノックアウト(KO)マウスを用いた動物実験を行った。Ccr3 KOマウスの脳波を測定したところ、明期(休息期)の睡眠が断片化していることがわかった。これは、ヒトナルコレプシーの夜間睡眠の断片化に似ている。また、免疫組織染色により、Ccr3 KOマウスは、同胞野生型マウスよりも視床下部のオレキシン細胞数が約10%少ないことがわかった(論文投稿中)。近年、ナルコレプシー発症と感染症との相関が複数報告されており、免疫系に影響を与える外的要因がナルコレプシー発症の引き金になることが強く示唆されている。そこで、研究代表者は、遺伝要因(CCR3の機能不全)と外的要因(免疫系の活性化を引き起こすもの)との相互作用によりナルコレプシーが発症するのではないかと考えた。本研究では、ナルコレプシー発症を引き起こすための外的要因(実験的炎症誘導等)の条件検討を行っていたが、研究代表者の所属機関辞職に伴い本研究を廃止した。