hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Helicobacter pylori熱ショック蛋白の精製,製造解析と発現機構

(1)H. PyloriHSP60を確認するマウスモノクローナル抗体(mAb)の確立:H. Pylori HSP60の精製を目的として本菌HSP60を認識するmAbの作製を試みた。BALB/cマウスへの投与抗原にはSDS-PAGEのゲルより回収したH.Pylori 60kDa蛋白抗原を用いた。またこの抗原を固相化したELISAによりスクリーニングを行った。その結果、2つのmAb(H9およびH20)を確立した。H9およびH20mAbのクラスおよびサブクラスはそれぞれlgG2aおよびlgMであった。どちらのmAbも熱ショック応答により大量に誘導された本菌60kDa抗原を認識したことより,H. Pylori HSP60を認識していると考えられた。(2)H. PyloriHSP60を抗原構造:ELISAおよびイムノブロット法においてH9およびH20mAbはH. Pyloriと反応したが,FACSにおいてはH20mAbのみが反応した。これらの結果より,どちらのmAbも未変性および変性したどちらの状態のHSP60も認識した。またH20mAbの認識するエピトープは本菌菌体表層に存在しているが,H9mAbの認識するエピトープは菌体内に存在していると考えられた。(1)H. PyloriHSP60を認識する3C8mAbの認識するエピトープのアミノ酸配列:既に確立していたYersinia enterocolitica HSP60を認識するmAb,3C8がH. Pylori HSP60とヒト胃癌由来細胞株と反応することを明らかにした(J.Gastroenterol. 1996 inpress)。また本3C8mAbの認識するエピトープのアミノ酸配列にLue Gly Valの3つのアミノ酸が関与することを明らかにした(Microbiol. lmmunol. 40(1) 77-80 1996)。(2)H. PyloriHSP60を認識するH9およびH20mAbの反応性:どちらのmAbもH. Pylori HSP60およびヒト胃癌由来細胞株MKN45と反応性を示した。しかしながらH9mAbはEsherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosaと反応したがH20mAbは反応しなかった。これらの結果より,H. Pylori HSP60とヒト胃細胞に特異的なエピトープの存在する可能性が示唆された。H. Pylori HSP60の発現と病原因子との相関性:本菌のHSP60の発現,ウレアーゼ活性,空胞化毒素産生性およびヒト胃癌由来細胞株への付着率との間の相関性について検討した結果,本菌HSP60の発現と付着率との間に相関性が認められることを明らかにした(J.Med.Microbiol. 1996 inpress)。

しかしながらH9mAbはEsherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosaと反応したがH20mAbは反応しなかった。これらの結果より,H. Pylori HSP60とヒト胃細胞に特異的なエピトープの存在する可能性が示唆された。H. Pylori HSP60の発現と病原因子との相関性:本菌のHSP60の発現,ウレアーゼ活性,空胞化毒素産生性およびヒト胃癌由来細胞株への付着率との間の相関性について検討した結果,本菌HSP60の発現と付着率との間に相関性が認められることを明らかにした(J.Med.Microbiol. 1996 inpress)。
新しいペプチドーム解析法を用いた飲酒による血圧変動起因物質の探索

アルコールの循環器系への作用を解明するために、飲酒後に血圧と連動して変化するペプチドを探索した。飲酒45分後には血圧は低下し、この低下は飲酒後23時間持続した。飲酒後の後期には飲酒前に比べて、m/z 2662とm/z 2380のペプチドは有意に減少し、m/z 1467のペプチドは有意に増加した。m/z 1467とm/z 2662はフィブリノゲンα鎖由来断片ペプチドと同定され、m/z 2380は補体C4a由来断片ペプチドであることが明らかになった。このうちm/z 1467とm/z 2662のペプチドは、アルコール依存症患者で断酒後に変動すると報告されているペプチドとアミノ酸配列が一致していた。平成24年度に行った飲酒負荷実験の結果を基に、飲酒後数時間の急性期に観察される血圧変動と関連する血中ペプチドについて検討した。被験者に白ワイン(体重kgあたり3 ml)を10分以内に負荷すると、その45分後と23時間後にはいずれも全体として負荷前に比べて有意な血圧の低下を認めた。そこで、負荷前を含めた3つの時点で静脈採血を行い、血清を分離して、-80°Cで保存した。被験者より採取した各血清検体をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、BLOTCHIPに電気転写し、MALDI型質量分析計により質量分析を行った。そして得られた積算スペクトルを用いて経時的な3群の中で各2群間のディファレンシャルプロファイリング解析を行った。その結果、2群間で有意差を認めたピークが計33個見つかった。これらのペプチドにつき経時的変化パターンの解析を行い、最終的に18個のペプチドがアルコール負荷に連動して変化していることが示唆された。質量分析計による構造解析時の測定範囲が、m/z 3000程度までであることから、このうち13個のペプチドが同定候補になった。さらにこの中の7種のペプチドについては、BLOTCHIP上で精密質量が測定可能であったため、高速液体クロマトグラフィーによる分取精製を行ったところ、4種のペプチド(m/z 1467、1616、2380、2662)が得られた。この中から経時変化の小さいm/z 1618を除いた3種(m/z 1467、2380、2662)について、MS/MS構造解析を実施したところ、m/z 1467と2662はいずれもフィブリノゲンA由来断片ペプチドであると同定された。さらに、m/z 2380は補体C4A由来断片ペプチドであることが判明した。これらのペプチドは飲酒負荷による血圧変動と連動して変化しており、さらに断片の生成には血中のプロテアーゼが関与することから、今後、飲酒、血圧、ペプチド、プロテアーゼの関係をさらに探求する予定である。本研究の目的は飲酒に伴う血圧変動の原因を探求することにある。飲酒直後に出現する血圧低下の原因物質の候補として、これまでにアセトアルデヒド、プロスタサイクリン、カリクレインなどが挙げられてきたが、いまだ決定されていない。一方、飲酒後数日して出現する血圧上昇の原因としては、交感神経系やレニン-アンギオテンシン系の活性化やさまざまな体液性因子の関与などが報告されているが、その詳細は明らかにされていない。本研究では、最近開発されたBLOTCHIP®を用いたペプチドーム解析の技術を用いて、飲酒後に変動するペプチドおよびその断片中の血圧変動を惹起する物質を探索する。この方法ではアルブミン等のタンパク質除去,標識化,酵素消化など,従来のプロテオーム解析技術では必須だったあらゆる前処理操作を省略でき,包括的なペプチド検出と定量化が可能である。初年度である平成24年度には健康ボランティアに対して飲酒負荷実験を行った。予備実験として飲酒前後の循環動態をモニターし、血圧変動の時間帯の同定を試みた。その結果、全ての予備実験被験者において飲酒後30分以内に収縮期および拡張期血圧が10 mmHg以上の低下を示し、さらに飲酒後3時間以内には、全例で血圧はほぼ飲酒前値に回復した。一方、その後の血圧上昇については、各被験者間で一定せず、実験のための共通した血圧上昇の時間帯を設定することができなかった。そこで、本研究では飲酒に伴う血圧低下に焦点を当て、その原因物質を解明することにし、予備実験結果から血液検体の採取時間を決定した。その後、本実験において、白ワイン(体重kgあたり3 ml)を10分以内に負荷前後で血圧、脈拍、フラッシング症状などを観察するとともに、経時的にペプチドーム解析用の血液検体を採取し凍結保存した。

そして、現在プロトセラ社と共同で採取検体を用いてペプチドーム解析を施行中である。今年度行った飲酒負荷実験の予備実験において、飲酒後の血圧変動の時間経過を検討した。その際に、予想以上に血圧上昇の相に個人差が大きく、ペプチドーム解析用の検体採取を統一的に行うことが困難と判断し、血圧低下因子のみを探索することにした。この予備実験に時間を費やし、本実験の実施が予定より遅れた。しかし、ペプチドーム解析に高額経費が必要であり、検体の反復測定は予算的に困難であることから、慎重な予備実験の施行は意義があり、これによって今後の本研究の着実な進行が期待できると考えている。飲酒後に出現する血圧低下原因物資のペプチドーム解析による解明は、新規の降圧物質の探索につながる可能性がある。現在実施中のペプチドーム解析の結果をもとにして、平成25年度には降圧物質の候補ペプチドを選定し、その合成ペプチドを作成し、生理実験によりペプチドの生理活性の有無を確かめる予定である。平成24年度に予定されていたペプチドーム解析の実施がやや遅れ、実際平成25年度初めにかけて実施しており、このペプチドーム解析の経費を繰り越された予算から支出する予定である。さらに今年度は解析情報をもとにしてペプチド合成と合成ペプチドを用いた生理実験のための予算の使用を予定している。
酸性ホスファターゼのチーズ熟成への寄与に関する研究

チーズ中における酸性ホスファターゼの寄与を明らかにし、高品質チーズ製造への基礎的知見を得ることを目的とし、以下の実験を行なった。1.乳酸菌由来酸性ホスファターゼ酸性ホスファターゼ(AP)活性が高いLactococcus lactis ssp.Lactis303からAPを精製しそれらの性質について検討した。細胞膜(CM)と細胞壁由来(CW)の2種のAPの存在が示唆された。それらの至適pH、温度はともにpH5.0-5.5,50°Cであった。酵素の熱安定性は異なり、CM酵素の方が強い耐熱性が示された。また、両者ともカゼインホスフォペフチドからはリンを遊離したがカゼインからは遊離しなかった。2.牛乳由来酸性ホスファターゼ牛乳中に存在する酸性ホスファターゼ類の性質を検討し、それらが1種以上の酸性ホスファターゼであることを示唆した。バターミルク(BM)中に1つ、スキムミルク(SM)中に2つの活性が認められた。牛乳中にAPのアイソザイムの存在が示唆され、それらは脱脂乳中またはMFGMに結合していると思われる。3.チェダーチーズ中の酸性ホスファターゼの挙動と熟成への寄与チーズ熟成に寄与するAPの起源を明らかにする目的で、スターター添加および無添加チェダーチーズを製造し、熟成期間中のAP活性の挙動およびプロテイナーゼ/ペプチダーゼとの協同作用について検討した。チェダーチーズの製造はスターターとしてL.lactis subsp.lactis303を添加した。スターター無添加チーズはgluco-δ-lactoneを用いpH調製を行った。チェダーチーズ中の水溶性画分のAP活性は時間の経過とともに減少し、水不溶性画分およびチーズ全体のそれは微増傾向が示された。また、乳/乳酸菌由来のAP類を作用させた後のカゼイン/ホスフォペプチドに対する乳酸菌由来プロテアーゼ類の活性は、細胞膜由来乳酸菌APを作用させたホスフォペプチドに対し高い活性が認められた。これらのことから、特に細胞膜由来乳酸菌APが熟成中の脱リン酸化に関与していると思われる。酸性ホスファターゼのチーズ熟成への寄与を解明するために今年度は、スターターとして汎用されているLactococcus lactis subsp.lactis303酸性フォスファターゼを精製し、酵素学的性質、一次構造の解明および遺伝子操作による改良乳酸菌の作製について検討した。1.精製および性質細胞膜(CM)および細胞壁(CW)由来酵素の精製は、DEAE-cellulose,Sephacryl S-200,PhenylSepharose,Sepharose 4B-200,Superdex S-200カラムクロマトグラフィーによって行われた。ゲル濾過によって推定したCM,CW酵素の分子量は>10^6および16000と推定した。また、調製SDS電気泳動によって分画したCM,CWは、35600、16300であった。最適pH、温度は、両酵素ともpH5.2、50°Cであった。CM、CW酵素の熱安定性は70°C、15分間の加熱に対し、33%、0%の残存活性を示した。CMとCW酵素に対する各種試薬の阻害性は異なった。

CM酵素は、カゼインホスフォペプチドαs1-CN(59-79),β-CN(1-25)からリンを遊離したが、カゼインからは遊離しなかった。CWは、両者から遊離した。2.精製酵素の一次構造の解析CMおよびCW由来酸性ホスファターゼについて分析した結果、N-端末がブッロクされていること示唆されることから、いづれかの酵素による分断後のアミノ酸配列の検索を予定している。3.ホスファターゼ生産性改良乳酸菌の作製ホスファターゼ生産を制御すると思われているプラスミドpNZ8048PReをLactococcus lactis NZ9800(プラスミドネガティブ株)に導入し、抽出DNAから得た精製PCR生産物をE.coli.101,Lactococcus lactis NZ9800およびMg1363に転写した。これら両菌株由来の酵素活性は、アルカリホスファターゼ活性の生産性は制御されるが、酸性ホスファターゼ活性の生産性については制御されないことが明らかになった。酸性ホスファターゼのチーズ熟成への寄与を解明するために今年度は、牛乳由来酸性フォスファターゼおよび乳酸菌プロテイナーゼを精製し、それらの性質を明らかにした。さらには、チーズ熟成中での発生が予想される酸性ホスファターゼとプロテアーゼ類との協同作用(熟成メカニズム)について検討した。1)牛乳由来の酸性フォスファターゼの精製と性質。新鮮牛乳から調製したバターミルク(BM)と脱脂乳(SM)をAmberlite IRC-50(NH^+_4 ),DMAE-Cellulose,Sephacryl S-200にかけることによって行われた。BM中にlつ、SM中に2つの活性が認められた。これらのうち主なBMおよびSM酸性ホスファターゼの最適pH、温度は、ともにpH4.5-5.5、40°Cであった。熱安定性は、75°Cの加熱に対しBM酵素はl0分間、SM酵素は60分間で完全に失活した。他、検討した性質から、牛乳中に酸性ホスファターゼのアイソザイムの存在が示唆され、それらは脱脂乳中またはMFGMに結合していると思われる。2)Lactococcus lactis ssp lactis IAM1198プロテイナーゼの精製と性質L.lactis IAM1198から、各種クロマトグラフィーによってエンドペプチダーゼを精製した。本酵素は分子量が95,000で、45kDaと52kDaのへテロサブユニットで構成されていると推定された。本酵素のcarbobenzoxy-L-phenylalany-L-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amideおよびL-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amideに対するKm値は、それぞれ38μMと25μMであった。本酵素はエンドぺプチダーゼとアミノぺプチダーゼの両活性を示した。3)酸性ホスファターゼとプロテイナーゼとの協同作用について乳/乳酸菌由来の酸性ホスファターゼ類を作用させた後のカゼイン/ホスフォぺプチドに対する乳酸菌プロテアーゼ類の活性は、細胞膜由来乳酸菌酸性ホスファターゼを作用させたホスフォぺプチドに対し高い活性が認められた。これらから、特に細胞膜由来乳酸菌酸性ホスファターゼが熟成中の脱リン酸化に関与していると思われる。
甘味受容体と味覚修飾物質の相互作用解析

甘味抑制物質であるギムネマ酸とグルマリンに関し、甘味受容体T1r2/T1r3再構築系を用いてその相互作用の解明を目指した。その結果、ギムネマ酸がヒトT1r3の膜貫通領域、グルマリンがマウスT1r3のアミノ末端領域に作用する結果を得た。さらにギムネマ酸は、ヒト甘味抑制物質であるラクチゾールと結合サイトを共有するが、ギムネマ酸感受性だけに重要なアミノ酸残基を同定した。グルマリンに関しては、各系統のマウスT1r2/T1r3の応答解析を行い、系統差を生じる変異を同定した生活習慣病やそのリスクファクターである肥満は、我々の甘味に対する強い嗜好性と食生活の乱れが主な要因であると考えられている。生体恒常性の破綻は、生活習慣病に繋がる可能性があり、甘味受容機構の解明により生活習慣病や肥満の予防、治療に役立つ味覚修飾物質の発見や、創薬につながる可能性が考えられる。その基礎として、甘味受容体T1r2/T1r3と基質との結合特性を解明することが現在緊急課題となっている。そこで本研究では、甘味受容体T1r2/T1r3と甘味抑制物質であるギムネマ酸(GA)とグルマリン(Gur)に関し、甘味受容体再構築系を用いてその相互作用の解明を目指した。本研究では、ヒトT1rs、マウスT1rsのホモロジーモデリングを行い、ドッキングシュミレーション解析により、ギムネマ酸、グルマリンのT1rsへの結合モデルの作成を行った。その結果、ギムネマ酸がヒトT1r3の膜貫通領域に結合し、グルマリンがマウスT1r3のアミノ末端領域に作用している候補モデルを得た。またグルマリンはマウスT1r2のアミノ末端領域にも作用する候補モデルも得た。カルシウムイメージングによる解析により、ギムネマ酸がヒトT1r3の膜貫通領域、グルマリンがマウスT1r3のアミノ末端領域に作用する結果を得て、シミュレーションの結果の妥当性が確かめられた。さらにギムネマ酸は、ヒト甘味抑制物質であるラクチゾールと結合サイトを共有するが、ギムネマ酸の感受性だけに重要なアミノ酸残基を同定した。グルマリンに関しては、各系統のマウスT1r2/3の応答解析を行い、系統差を生じる変異を同定した。そこで本研究では、甘味受容体T1r2/T1r3と甘味抑制物質であるギムネマ酸(GA)とグルマリン(Gur)および酸性条件下で甘味修飾効果を有するミラクリン(Mir)に関し、甘味受容体再構築系を用いてその相互作用の解明を目的としている。本年度は、ヒトT1rs、マウスT1rsのホモロジーモデリングを行い、ドッキングシュミレーション解析により、ギムネマ酸、グルマリンのT1rsへの結合モデルの作成を行った。またグルマリンはマウスT1r2のアミノ末端領域にも作用する候補モデルも得ている。現在、マウスの甘味感受性(主に甘味アミノ酸であるD-phe)やグルマリンによる甘味抑制に対する系統差を調べており、各系統のマウスT1rsの遺伝子コンストラクトの作成を行った。カルシウムイメージング法により、得られた各系統のマウスT1r2/3の応答解析を行い、系統差を生じる変異を同定した。得られたドッキングシュミレーションのモデルより、各味覚修飾物質の感受性に影響を与えるアミノ酸残基の推定が可能になった。味覚修飾物質の感受性に影響を与えるアミノ酸残基が同定されつつあり、おおむね計画通りに進んでいる。得られたドッキングシュミレーションのモデルより、各味覚修飾物質の感受性に影響を与える可能性があるアミノ酸残基を推定する。変異導入を行ったT1rsの味覚修飾物質に対する感受性を、カルシウムイメージング法を用いて解析する。その結果を踏まえ、ドッキングシュミレーションの解析結果の再評価・修正を行い、最終モデルを作成する。平成23年度の研究計画を基本的に継続する。(1)T1rs mutantの作成:味覚修飾物質に対する感受性に影響を与える可能性のある点変異を導入した発現コンストラクトを作成する。(2)HEK293細胞を用いたカルシウムイメージング法による解析:(1)で作成したプラスミドを用いて機能解析を行い、変異を入れる前の応答と比較・検討を行う。

(3)ドッキングシミュレーションの再解析:得られた点変異での解析結果を元に、より詳細なドッキングモデルを作成し、どのように味覚修飾物質が味覚受容体に結合し、作用するのかを検討を行う。
低Zセラミックス被覆材の耐熱性に関する研究

核融合炉第一壁材料としての低Zセラミックス被覆材の耐熱特性評価のための基礎研究として、グラファイト基板TiC被覆材を拡散焼鈍法およびCVD法により作成し、ヘリウムイオン照射試験、熱サイクル試験を実施して耐熱特性に及ぼすヘリウムイオン照射効果を調べるとともに、さらにパルス電子ビーム照射による熱衝撃試験を行った。拡散焼鈍法により作成し、表面研磨した膜厚18μmの【TiC_(0.8)】被覆材は、赤外線イメージ炉を用いての、下限温度600°C、上限温度1100°C、昇降温速度10°C/sec、1000サイクルの熱サイクル試験の結果、TiC被覆材表面に粒界ステップの発達が見られたが、ヘリウムイオンを照射(エネルギー20kev,線量5×【10(^(17)_(10ns))】/【sec^2】)して表面にブリスターを生成させた【TiC_(0.8)】被覆材では、上と同じ熱サイクル試験を行っても、粒界ステップの発達はみられず、熱サイクル試験の前後で表面形状に差異は認められなかった。また、ブリスター生成の臨界線量以下の照射を受けた領域に於ても、上記の熱サイクル試験の後では、表面に新たにブリスターが発生、剥離することが観察された。次に、CVD法により作成し、表面研磨した膜厚7μmの【TiC_(0.95)】被覆材に対する、パルス幅1.5秒のパルス電子ビーム照射による熱衝撃試験を行った結果、TiC被覆材の損傷は照射電子ビームのPower密度に非常にcriticalに依存することが確かめられた。すなわち、照射電子ビームのPower密度が2.9kw/【cm^2】以上では、照射中心部のTiCが融解、蒸発して基板のグラファイトが露出、欠損し、その周りのTiC融解部ではTiCの凝固、再結晶化、さらにその周囲のTiC変色部では直径1020μmのブリスターおよびその剥離跡で覆われていることが見出された。照射電子ビームのPower密度が2.8kw/【cm^2】以下ではTiC表面にcrackが発生するに留まり、さらに1.7kw/【cm^2】以下のPower密度では表面損傷は観察されなかった。
水辺植生基盤の洗掘と保全修復

実際に現地に生育しているコアマモに作用する波力特性,および波による底質土砂の移動特性を室内水理実験と島根県中海における現地観測により調べ,コアマモの生育が可能な波浪限界の評価法を検討した. a)本模型サイズと同程度の天然コアマモを引き抜くことが可能なcuampは, cuamp>20m/sと推定できる.水深h=0.60.7m程度の浅い海域においては,このような大きな水平水粒子速度を有する波の発生・存在は不可能である.従って,これら沈水植物が来襲波の波力によって引き抜かれる可能性は非常に小さいと考えられる. b)平均粒径d50=0.51mmの珪砂を敷き詰めた砂層ボックス部の底面に生じる砂漣の発生状況を調べた.全面移動限界波高より少し大きな波高になると砂漣の発生が生じることを確認できた.c)模型植生群がない砂面においては,そのシールズ数Ψが限界シールズ数Ψcより小さい場合は,砂漣は生じず海底面の砂移動も生じていない.しかし,模型植生群を設置した場合は,模型植生群の沖側と岸側領域および模型植生群外の全計測線上で砂漣が誘発的に発生する. d)コアマモの群落が見られる島根県中海西岸の大井海岸や南岸の白鳥海岸において表層移動が生ずる移動限界波高Hiの評価を行った.湖面の風速Uが6.5m/s以上になると表層移動が生ずることが推定された. e)これら底面における砂漣や砂移動現象の発生は,コアマモの生育阻害の原因と考えられる.高潮や津波および河川の洪水流に対する防御策として海岸林や樹林帯の利用が検討されている.波がこれら透過性物体を通過するときに失われる波エネルギ-量を評価すると、海岸林が有する波の透過率と反射率は評価可能である.本研究では、小型実松に作用する流体力特性と射流中における樹幹をモデル化した直円柱に作用する流体力特性を室内実験で調べ、海岸林が有する波の透過率と反射率特性を評価した.葉がある樹木には大きな流体力が作用する結果,海岸林からの波の反射率が顕著となることが分かった.射流中に置かれた直円柱の抗力係数が, Fr数の増加に伴い減少する流れの機構も明らかにした.実際に現地に生育しているコアマモに作用する波力特性,および波による底質土砂の移動特性を室内水理実験と島根県中海における現地観測により調べ,コアマモの生育が可能な波浪限界の評価法を検討した. a)本模型サイズと同程度の天然コアマモを引き抜くことが可能なcuampは, cuamp>20m/sと推定できる.水深h=0.60.7m程度の浅い海域においては,このような大きな水平水粒子速度を有する波の発生・存在は不可能である.従って,これら沈水植物が来襲波の波力によって引き抜かれる可能性は非常に小さいと考えられる. b)平均粒径d50=0.51mmの珪砂を敷き詰めた砂層ボックス部の底面に生じる砂漣の発生状況を調べた.全面移動限界波高より少し大きな波高になると砂漣の発生が生じることを確認できた.c)模型植生群がない砂面においては,そのシールズ数Ψが限界シールズ数Ψcより小さい場合は,砂漣は生じず海底面の砂移動も生じていない.しかし,模型植生群を設置した場合は,模型植生群の沖側と岸側領域および模型植生群外の全計測線上で砂漣が誘発的に発生する. d)コアマモの群落が見られる島根県中海西岸の大井海岸や南岸の白鳥海岸において表層移動が生ずる移動限界波高Hiの評価を行った.湖面の風速Uが6.5m/s以上になると表層移動が生ずることが推定された. e)これら底面における砂漣や砂移動現象の発生は,コアマモの生育阻害の原因と考えられる.高潮や津波および河川の洪水流に対する防御策として海岸林や樹林帯の利用が検討されている.波がこれら透過性物体を通過するときに失われる波エネルギ-量を評価すると、海岸林が有する波の透過率と反射率は評価可能である.本研究では、小型実松に作用する流体力特性と射流中における樹幹をモデル化した直円柱に作用する流体力特性を室内実験で調べ、海岸林が有する波の透過率と反射率特性を評価した.葉がある樹木には大きな流体力が作用する結果,海岸林からの波の反射率が顕著となることが分かった.射流中に置かれた直円柱の抗力係数が, Fr数の増加に伴い減少する流れの機構も明らかにした.(A)植生基盤における洗掘現象の解明とその防止策に関する研究においては,以下の室内実験と現地観測を実施した.a)2次元造波水槽内の砂層ボックス内に設けた砂層上に,ヨシ等の抽水植生やアマモ等の沈水植物をモデル化した円柱群や人工海藻を設置し,汽水域や海岸において土砂移動が生じる限界流速や波高および移動限界水深の特性値におよぼす河床せん断力の影響を明らかにした.b)円柱群内および砂層上部近傍の流れ特性を2成分レーザードップラー流速計(LDA)と流れの可視化装置(PIV)を使用して調べた.これらの流れの計測により,植生間流れの空間流速分布,乱れ速度分布,レイノルズ応力分布等の流れ特性値を明らかにした.合わせて,せん断力計を植生基盤表面に設置し,基盤上に作用する底面せん断力の直接計測を行い,せん断力強度およびその変動強度(rms値)の平面分布特性を明らかにした.

c)現地で採集した比較的小型の実植生を,2次元造波水槽内の砂層ボックス内に移設し,上記a)と同様な実験を行なった.対象とする水辺植生には,ヨシ,コアマモ,アマモ,松苗,杉苗を用いた.d)波の静穏な海域に置かれた生け簀内に,土砂を入れた小型容器を吊り下げアマモとコアマモの育成実験を行なった.土壌の嫌気化や付着生物の増加によりこれら植生の安定した育成は困難であった.e)植生の茎葉による浮遊土砂補足現象,発達した根茎による土壌緊縛作用,茎部や葉部の流れや波に対する揺動や渦励振動現象等の影響を,室内模型実験と現地観測を行い調べた.現地海岸における土壌基盤の洗掘状況や浮遊土砂の観測には,今年度購入した堆積・侵食測定器を使用した.(B)ホトトギス貝による砂泥表層の硬化安定作用に関する研究においては,以下の室内実験と現地観測を実施したa)二枚貝(ホトトギス貝)の「足糸」による砂泥表層の硬化安定作用を検証する模型実験を,造波水槽を用いて行なった.b)コアマモのパッチ内とそれに隣接する無植生の場所において,土壌の粒度分析と硬度を調べた.c)生プラスチック,天然やし繊維等の様々な素材の植栽用マットを利用し,その洗掘防止効果と植生の生育に対する影響を調べた.(A)植生基盤における洗掘現象の解明とその防止策に関する研究においては,以下の室内実験と現地観測を実施した.a)2次元造波水槽内の模型海浜砂層上に,ヨシ等の抽水植生やアマモ等の沈水植物をモデル化した円柱群や人工海藻を設置し,植生基盤内の洗掘特性と海浜地形変化に及ぼす植生群の影響を調べた.植生群設置区間では海底地形が低下すること、および植生群設置区間の岸側部では海底砂は岸方向に移動・堆積することを明らかにした.b)平成22年度の中海での現地観測を6回(5月,8月,11月,1月,3月)実施した.平成22年5月に,中海の大橋川河口で採取したコアマモを現地土壌を含ませた麻マットに移植し,島根大学中海分室の野外水槽内の稲苗育成箱内に設置し育成を行なった.8月下旬に,このコアマモ育成用麻マットを、中海の葭津海岸と下意東の白鳥海岸に移植した.11月25日の白鳥海岸での観察ではその生育が確認された.平成23年4月27日の白鳥海岸での観察ではその生育は不明であった.c)平成22年8月30日の観測では、白鳥海岸に長期記録用の波高計、流速計、水質計、砂面計を設置した。11月,1月,3月の観測では,データー取得と機器調整を行なった.平成23年1月24日には,流れと波の水粒子速度の合成値の最大値として33cm/sが記録された.d)波の静穏な海域に置かれた生け簀内に,土砂を入れた小型容器を吊り下げアマモとコアマモの育成実験を継続して行なった.夏期の水温上昇により植生の安定した育成は困難であった.e)植生の茎葉による浮遊土砂補足現象,発達した根茎による土壌緊縛作用,茎部や葉部の流れや波に対する揺動や渦励振動現象等の現地観測を行い調べた.現地海岸における土壌基盤の洗掘状況や浮遊土砂の観測には,昨年度購入した堆積・侵食測定器を使用した.(B)ホトトギス貝による砂泥表層の硬化安定作用に関する研究においては,以下の室内実験と現地観測を実施したa)二枚貝(ホトトギス貝)の「足糸」による砂泥表層の硬化安定作用を検証する現地観察を試みた.ホトトギス貝の成育個体数が少ないため,「足糸」による砂泥表層の硬化安定作用の確認は困難であった.b)ホトトギス貝も模擬した人工固形物を砂面に設置し,その洗掘防止効果と植生の生育に対する影響を調べた.(A)植生基盤における洗掘現象の解明とその防止策に関する研究においては,以下の成果が得られた.a)
戦後転換期における中野重治の文学と思想の基盤的研究-60-70年代の日記を中心に-

中野重治は、その文学的出発にあたって「微小なるものへの関心」ということを言った文学者である。と同時に、石川啄木について論じて国家権力に敵対することを己に課した詩人である。以来、自分固有の世界、固有の視点を保ちながら、同時に「大きな物語」への鋭い関心を持ち続けた作家である。その人がその晩年に「戦後転換期」に際会して、世の変動に己の感性を全開して書き切ったのが長篇『甲乙丙丁』であるが、そこに至るまでに何を見、その心に何が生じ、同時代の政治・思想・文学とどう斬り結んだか、それを、残された日記・書簡などによって知ろうとした。平成九、十年度で日記の第一次読み合せと、粗ら打ち込みは終了し、十一年度は第二次読み合せと註付けに入った、しかし平成十二年度にはそれを一旦中断して、一九六三年日記と六四年日記との精密な読みと註付けの作業に入った、研究年度が終った平成十三年度にもその作業は続き、しかもなお、我々がここに提出するのは未完成の「テスト版」に過ぎない。一九六三、四年と言えば東京オリムピックを目掛けて、日本の社会が音を立てて変わって行った年々である。世界的には中ソ論争が起き、部分核停条約の評価を回って国内でも議論が始まり、新日本文学会第十一回大会は大いに揺れた。原水禁世界大会も分裂した。そうした事態に、全力を挙げて非妥協的に戦いつづけた中野重治は、自らが中央委員であった日本共産党を除名される。そしてその年末から『甲乙丙丁』が書き始められる。そうした重要な時期を扱って、我々の研究がどれだけ核心に迫りえたか。忸怩たるものがある。これは我々の到達点ではなく、出発点である、そんな風に思っている。月例研究会の他に十二月に熊本で、一、二、三月に東京で合宿研究会を開くことができ、研究は多いに進捗した。熊本合宿研究会の際、共同研究の方法について大いに討論され、それ以後インターネットを利用した、事前準備、事前討議が行われるようになった。その結果能率は大いに上がるようになった。中野重治戦後日記を、1971-73年分解読して打ち込むのが、交付申請書に書いた本年度の目標であったが、1974年の半ばまで進めることができた。註の付け方も改良され、事前に各人が分担分の註を考え、インターネットで全員に回覧することによってことによって能率も上がり正確を期することができるようになった。中野重治総合年表は、A5判を上下二段に割り、上段に入れた松下裕作成の年譜、および年譜補正を、日記、手紙、その他の資料で増補し、下段に作品年表と註を入れ、関連事項を入れるという形で進めているが、第四稿を作ることができた。遺族から借り受けた、中野重治宛諸家書簡を読み取って、日記・総合年表の中に取り入れていく仕事を少しづつ始めた。これも順次打ち込んで、データーベース化したい。その他にも、未整理のまま遺族から借り受けた資料が沢山あり、ほとんど手が付いていない。書簡の一部は『梨の花通信』『中野重治研究』に発表された。これまでに発表された書簡を上の中野重治宛諸家書簡と共に、「往復書簡集」としてまとめ、「日記」「総合年表」とともに三本の柱として、相互照応させること、が今後の課題となる。忸怩たるものがある。

毎月末の土曜日曜に合宿研究会を開いて、未公開の第一次資料である戦後日記(195357年、1963年以降の二十二年間分)のうち未解読分1974年79年の本文を解読し、註の一部を附けることが出来た。今年度から、毎回半年分を、十二人のメンバーで分担し、各自が自分の分担分の解読、註付し、インターネットで全員に送り、意見交換し、その上で合宿に臨むようにしたので、大いに能率が上がったのである。中野重治書簡を何通か借り受け、解読して、打ち込み、同じく註を付けて、「梨の花通信」に発表した。黒田道宅との往復書簡を刊行すべく準備を進めた(一九九九年度に刊行の予定)。中野重治宛諸氏書簡は平成七年に遺族から借用してある。すでに学生アルバイトによって、一覧表の作成、コピーが進んでいる。その整理を続け、また、同じく遺農から借り受けた未整理資料の整理を始めた。これらも日記の註、次に述べる「中野重治総合年表」の材料として生かしうろことが分かった。Quark Xpress上で、年譜に日記記載事項、書簡の内容、中野宛諸氏書簡で明らかになったこと、聞き書きによる事項を加え、下段に著作年表と註を加え、更に政治史、社会史、文化史の項目を加え、多角的網羅的な「中野重治総合年表」の、先に平成68年度科学研究費基盤研究(B)(1)、課題番号06301048、研究課題名「世界へ開かれたものとしての戦後日本の文字・政治・思想の流れに面する総合的研究ー中野重治を中心としてー」の研究成果報告書として提出した第四稿を、さらに増補・訂正して第五稿の途中まで進めた。前年迄に日記を一通り見終わったので、今年度と来年度とはもう一度本文を見直すこと、註の項目立てを全員行い、それを元に全員が分担して註を書き、それを集成することになった。毎月末の土曜日曜に或いは臨時に合宿研究会を開いて、最も特徴が明らかである1963年日記から始め、1970年までの八年間の日記本文の見直し、その分項目立て、と分担、インターネットによる註の交換、脚註、人名註、花項目などの分類、整理が行われた。1963年分から順次最終稿を作りつつある。中野重治書簡を何通か借り受け、解読して、打ち込み、同じく註を付けて、『梨の花通信』に発表した。中野重治文庫記念丸岡町民図書館から『中野重治と黒田道宅との往復書簡』を刊行した(一九九九年三月に刊行)。その整理を続け、また、同じく遺族から借り受けた未整理資料の整理を始めた。これらも日記の註、次に述べる『中野重治総合年表』の材料として生かしうることが分かった。Quark Xpress上で、年譜に日記記載事項、書簡の内容、中野宛諸氏書簡で明らかになったこと、聞き書きによる事項を加え、下段に著作年表と註を加え、更に政治史、社会史、文化史の項目を加え、多角的網羅的な『中野重治総合年表』の、先に平成68年度科学研究費基盤研究(B)(1)、課題番号06301048、研究課題名「世界へ開かれたものとしての戦後日本の文学・政治・思想の流れに関する総合的研究-中野重治を中心として-」の研究成果報告書として提出した第四稿を、さらに増補・訂正して第五稿の途中まで進めた。1998年度迄に日記を一通り見終わったので、1999年度からもう一度本文を見直すこと、註の項目立てを全員行い、それを元に全員が分担して註を書き、それを集成することを始めた。毎月末の土曜日曜に或いは臨時に合宿研究会を開いて、最も特徴が明らかである1963年日記から始め、本年度の夏前までに1973年までの十一年間の日記本文の見直し、その分項目立て、と分担、インターネットによる註の交換、脚註、人名註、花項目などの分類、整理が行われた。
サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

私たちは最近、ゼノパス卵の受精シグナル伝達の生化学的・細胞生物学的解析を行っている。本研究では従来の研究を背景に、発生初期過程を蛋白質レベルで包括的に研究する手法の開発を目的としている。受精の細胞内シグナル伝達は新規の遺伝子発現を伴わず、卵由来の蛋白質やmRNAを中心にまかなわれるため、蛋白質分子の機能を全体的に解析する手法を確立することは重要である。今年度は、以下の2項目について検討を行った。1.受精シグナル伝達経路の再構成受精直後の生化学的・細胞学的変化(卵活性化)を指標に、ゼノパス卵の受精成立におけるSrc型チロシンキナーゼ(SFK)の機能を検討した。その結果、SFKはホスホリパーゼCgの活性化に働く卵活性化の必要因子であることや、過酸化水素がSFK活性依存的に卵活性化を起こすことを見いだした。卵蛋白質の強いチロシンリン酸化をおこす過酸化水素の実験系は、次項のサブトラクション免疫抗体作成に抗原を提供するモデル系として利用した。2.サブトラクション免疫による抗体作成受精卵特異的な発現やチロシンリン酸化を受ける蛋白質を網羅的に同定するためのモノクローナル抗体群の作成を行った。未受精卵の抽出液を免疫したマウスを免疫抑制処理し、さらに受精卵ないし過酸化水素処理卵の抽出液で追免疫した。免疫抑制はシクロホスファミドで行い、その有効性はELISA法により確認した。現在追免疫が終了し、脾臓の摘出/ハイブリドーマの樹立を行っている。追免疫による抗体価の上昇も既に確認しており、年度終わりにはクローンの選択を行う見通しである。分子基盤的な部分については一定の成果が得られ、学術論文による成果公表も行えた。抗体作成については、免疫開始が前年9月とおそく、免疫抑制作業/成否確認を必要とするなど時間のかかるスケジュールとなり、本報告が不完全である点は反省している。次年度は抗体作成を継続しながら、卵の精子受容部位(受精の場)に存在する分子群に焦点を絞った生化学的解析と特異抗体の作成に着手する。
植物の養分吸収における細胞壁の意義

植物の養分吸収や環境応答における細胞壁、特にペクチンの役割を明らかにするため、ペクチンの機能と性質に関する以下の研究を行なった。(1)ラムノガラクツロナンIIの生合成と機能に関する研究ペクチンの一種ラムノガラクツロナンII (RG-II)の構造に変異を持ち、多糖の高次構造が攪乱された植物の表現型を解析しようと考えた。このためにRG-IIの特異的構成糖KDOの生合成に必要な酵素CTP:KDOシチジル酸転移酵素(CKS)についてT-DNA挿入変異株をスクリーニングしたが、CKSの欠失は雄性不稔をもたらしホモ変異株は得られなかった。雄性不稔の原因を明らかにするため+/cksヘテロ接合体の花粉についてviability・形態を観察したが異常は認められなかった。この結果は、cks変異は花粉の形成・発達ではなく花粉管の伸長段階を阻害することを示唆する。またCKSタンパク質の局在部位について検討し、ミトコンドリアに局在することを示した。(2)細胞壁結合型キナーゼ-ペクチン質多糖複合体に関する研究膜貫通型受容体キナーゼの一種で、ペクチンと結合した細胞外ドメインを持つ細胞壁結合型キナーゼ(wall-associated kinase; WAK)の生理機能について研究した。前年度クローニングしたタバコ培養細胞BY-2のWAKホモログNtWAKL1の生化学的性質について検討した。NtWAKL1のC末端にGFPを融合させたタンパク質をCaMV 35Sプロモーターを用いタバコBY-2細胞に発現させたところ、GFP蛍光は細胞表層に観察され、このタンパク質が原形質膜に結合していることが確認された。細胞を原形質分離させると蛍光の大部分は表層から離れたが一部は細胞壁に残り、NtWAKL1-GFPが原形質膜・細胞壁の双方に結合している可能性が示された。1ペクチン質多糖の構造を改変した植物の養分吸収特性の解析細胞壁多糖の含量や構造と養分吸収特性の関係について明らかにするため、ペクチン質多糖合成に関連する酵素遺伝子を過剰発現あるいは低下させた細胞・個体の作出を進めている。18年度はラムノガラクツロナンII領域に着目し、特異的構成糖KDOの合成に必要な酵素CTP : KDOシチジル酸トランスフェラーゼについてノックアウト株のスクリーニングを行なったが、ホモ変異株が得られなかった。ホモ株が得られない原因は、cks変異が花粉の機能を損ない雄性不稔となるためであることが明らかとなった。現在RNAi誘導発現系を用いたノックダウン株を作成中である。2細胞壁結合型キナーゼ-ペクチン質多糖複合体の機能解明ペクチン質多糖と結合したレセプター様キナーゼである細胞壁結合型キナーゼ(wall-associated kinase ; WAK)の生理機能について研究を行なった。生化学的・細胞生物学的解析に有利なタバコ培養細胞で実験系を構築するためにタバコのWAKホモログを探索し、WAK様遺伝子NtWAKL1を単離同定した。NtWAKL1はWAKの特徴であるEGF様ドメイン、膜貫通領域、セリン/スレオニンキナーゼドメインをコードし、既知のWAK(シロイヌナズナWAK)と同様にサリチル酸処理で転写量の上昇が認められた。また大腸菌組換え蛋白質を用い、翻訳産物が実際にセリン/スレオニンキナーゼ活性を持つことを確認した。現在、NtWAKL1-GFP融合蛋白質発現系を用いて、NtWAKL1が細胞壁に結合するか確認中である。
機能性材料作製のための反応設計

1.斬新な機能を有する高分子材料の創出を目指して、重合反応にまで立ち戻る検討を加えた結果、数々の新規な重合方法や高分子材料の合成法を確立した。その中の代表例を下に示す。さらに、一部については新しい機能(特異光劣化挙動)についての解明も行った。(1)結晶格子支配下での重合反応による高次立体規則性ポリマーの合成。(2)ポルフィリン系新触媒による分子量の制御されたポリマー・同ブロックコポリマー合成法のアクリル酸系モノマーへの展開。(3)新規モノマーの酸化・還元共重合法による新規交互共重合ポリマー合成法の確立。2.数々の新規電子供与性有機化合物を合成し、その電荷移動錯体の導電的性質を検討してきたが、さらにこれら化合物の磁気的性質とその構造との関連を検討した。これらの知見からの分子設計に基づき、引続き導電性有機結晶や分子性有機強磁性体の合成を試みる。3.L1_2型やB2型などの金属間化合物の高温強度、延性、耐熱性機械機能、水素脆性などの性質とその構造(化学組成、モルホロジー等)との関係について理論的考察を行なうとともに、軽量耐熱材料、原子炉材料などとして期待される物性発現のための多くの知見をえた。
ＲＮＡ分子の細胞内構造プローブ法開発と細胞質スプライシング機構解析

In-cell NMRは細胞内の生体分子の構造と挙動を解析できる優れた手法である。しかし核酸分子への応用はなされていなかった。そこで本研究では、in-cell NMR分光法で細胞内に存在する核酸分子(特にRNA分子)の構造及び細胞内プロセス過程をプローブする手法の開発をおこなう。まずRNA局所構造プローブのための長鎖RNA分子の汎用的な部位特異的標識法を開発した。また実際に、核酸分子のin-cell NMR測定に向けて、核酸分子の細胞内導入法について種々検討を行った。その結果、電気穿孔法により核酸分子が細胞内導入できることが解ったことに加え、導入した核酸分子のプロセス過程の観測を達成した。本研究課題では細胞内におけるRNA分子の構造解析、及び、動態解析(代謝過程の経時観測等)を目指している。このような解析を行うためには、観測対象のRNA分子と対象ではない内在性RNA分子を識別する必要がある。これを実現するための戦略として、研究代表者は標的RNA分子を安定同位体標識することを計画している。なお生理活性を有したRNA分子の機能にかかわる配列は全配列中の一部であるため、機能性部位のみを標識することで機能構造解析および代謝過程の経時観測が可能となる。従って、本研究課題においてはRNA分子の特定部位のみを標識する手法の開発から着手した。これまで既に、RNA分子の特定の1残基を標識する手法を開発したが、本手法ではRNA酵素分子(group I intron)を用いている性質上、グアノシンしか標識できない問題点があった。そこで平成24年度は、他の塩基も標識可能な新規標識法を確立することを目指した。具体的には近年報告されたRNA polymeraseのプライマー伸長反応(及び標識NTP)を利用して丸任意の核酸塩基(一塩基数塩基)を標識する新規の部位特異的RNA標識法を確立することを目指した。まずRNA polymeraseのプライマー伸長反応による一塩基伸長について検討したところ、A、G、C、Uの全てのヌクレオチドについて一塩基伸長が進むことが判った。また数塩基のプライマー伸長反応についても検討して、当該反応が進むことが示された。なおこれらのプライマー伸長反応により生成した一塩基(部分)標識RNA断片については、残りの3。断片との連結反応を行うことで、mRNA中の機能性RNA配列を一塩基、或は、部分標識することに成功した。このように、既存の手法ではなし得なかった「RNA分子内の機能性配列の一塩基/部分標識法」の汎用的手法を確立した。そこで平成24年度は、当研究室で開発した旧法の問題点を克服した任意の塩基を標識可能な新規標識法を検討した。検討の結果、RNA polymeraseのプライマー伸長反応(及び標識NTP)を鍵反応とする「RNA分子内の機能性配列の一塩基/部分標識法」の汎用的手法を確立した。次に平成25年度は、細胞質スプライシング切断反応を担う小胞体膜蛋白質Ire1p(RNaseドメイン)のRNA配列要求性について検証した。なおスプライシング基質のHAC1 mRNAの切断部位はループ構造をとると予想され、ループには保存配列(5' CXG/XXGX 3': /が切断部位)が存在する。本保存配列を元にした種々のRNA配列を調製し、in vitro切断実験にて配列要求性を解析した。その結果、1)切断部位のGは必須であること、2)切断部位Gの両脇に数塩基のRNA配列が必要であること、3)長いRNA配列では切断部位G以外の保存配列であるC-Gが塩基対を組んだ時効率よく切断がおこることが示された。このように平成25年度の研究により、細胞質スプライシング機構をIre1pの配列要求性(基質特異性)の観点、及び、基質HAC1 mRNAの二次構造の観点から明らかにすることができた。このような解析を行うためには、観測対象のRNA分子と対象ではない内在性RNA分子を識別し、着目している機能性部位の構造特性を素早く抽出するための手法が必要である。そこで平成24年度は、RNA分子の特定残基のみを標識する手法を開発した。具体的には、RNA polymeraseのプライマー伸長反応(及び標識NTP)を鍵反応とする「RNA分子内の一残基部分標識法」を確立した。本手法は、当研究室で開発した旧法の問題点(グアノシン一残基標識法)を克服した任意の塩基を標識可能な新規標識法である。次に平成25年度はin vitro切断実験にて、Ire1pRNaseドメインが切断可能なRNA配列を検証した(Ire1pは細胞質スプライシング切断反応を担う小胞体膜蛋白質)。その結果、Ire1pRNaseドメインの基質となるための配列要求性および基質RNA分子の構造特性が明らかとなった。本結果をうけて平成26年度は、基質RNA分子の構造解析を行った。

具体的には、切断部位ループ配列(5' CXGXXGX 3')のヘアピンループRNA分子の構造解析を行った。本RNA分子において、ループ5'端および3'端近くのシトシン/グアニン残基を独立に15N標識したRNA分子を調製した。当該標識RNA分子について溶液NMR測定を行った。その結果、各標識残基由来のシグナルを選択的に観測することに成功した。なお15N-filtered 1D 1H NMRスペクトルから、グアノシンのイミノプロトンとシトシンのアミノ基のシグナルは塩基対形成時の化学シフト値を示した。このことから、ループ内でグアニンおよびシトシンは塩基対形成していることが判明した。このデータは、前年度のin vitro切断実験のデータを構造学的に裏打ちするデータである。本研究課題では細胞内におけるRNA分子の構造解析、及び、動態解析(代謝過程の経時観測等)を目指している。このような解析を行うためには、観測対象のRNA分子と対象ではない内在性RNA分子を識別し、着目している機能性部位の構造特性を素早く抽出するための手法が必要である。そこで平成24年度は、RNA分子の特定残基のみを標識する手法を開発した。具体的には、RNA polymeraseのプライマー伸長反応(及び標識NTP)を鍵反応とする「RNA分子内の一残基部分標識法」を確立した。次に平成25年度は本研究課題の解析対象の一つである「Ire1pにより細胞質スプライシングを受けるRNA配列」に関して、構造解析に適した配列を検証した。その結果、Ire1pの基質となるための配列/構造要求性は、「5' CXGXXGX 3'配列をループ部に有したヘアピンループRNA分子」であることがわかった。また平成26年度は構造解析用に本RNA分子を15N標識したRNA分子を調製し、溶液NMR測定を行った。これらの結果を受けて平成27年度は、「核酸分子の細胞内導入法」の検討を行った。生体分子の細胞内導入法として近年、電気穿孔法の親展が著しい。そこで、電気穿孔法を用いて核酸分子のHela細胞への導入を試みた。なお細胞内の他分子と識別するためにフッ素標識を行った核酸分子(trifluorothymidine)を細胞内導入を行った。その結果、細胞内に導入された核酸分子より、19Fシグナルを観測することができた。このことから、電気穿孔法が核酸分子の細胞内導入に使えることが判った。また興味深いことに、導入された分子のスペクトルに経時変化がみられ、当該核酸分子の細胞内プロセス過程の観測にも成功した。このように本研究課題の目的である」核酸分子の細胞内プロセス過程」の観測を達成することができた。In-cell NMRは細胞内の生体分子の構造と挙動を解析できる優れた手法である。しかし核酸分子への応用はなされていなかった。そこで本研究では、in-cell NMR分光法で細胞内に存在する核酸分子(特にRNA分子)の構造及び細胞内プロセス過程をプローブする手法の開発をおこなう。
人材流出を介した技術流出の経済的影響に関する実証分析

本研究は、人材流出を介した技術流出の経済的影響を明らかにしようとするものである。これまで技術流出の原因の一つとして退職者等による技術流出が問題視されてきたが、その影響額については明らかにされてこなかった。そこで、本研究においては、日本企業からアジア企業へ移動した技術者の名前や属性等を正確に同定したのち、移動技術者が移動先で関与した特許を特定し、その経済的価値を算定を行っていく。さらには、日本の企業別の経済的損失を推定し、技術者人材が企業に与える影響の検証や日本企業の技術流出対策と経済的損失の関係について実証的に分析を行っていくものである。研究の結果については、国際誌、国際学会において発表を実施した。データセットを構築し、実証分析を行っている。また、国際学会等において発表を行うことで、積極的に意見交換を実施してきた。その結果、当初の予定通り、おおむね順調に進展している。データセットの構築においては、かなりの労力を費やす必要があり、多大な時間をこの作業に割くことになった。結果として完成したデータセットは、多面的な分析に耐えうるものになっていると考えられ、現在進めている実証分析以外の切り口でも応用できるものと思われる。そこで、今後は、これまではあまり議論されてこなかった論点についても果敢に挑戦し、論文としてまとめていきたいと考えている。人材流出を介した技術流出の経済的影響について分析を行うため、特許および論文データから人材の移動状況を把握するためのアルゴリズムの作成を行った。名寄せに関するアルゴリズムを作成し、それに基づきデータセットの作成を進めている段階である。研究の成果の一部は論文や国際学会での発表に向けて準備を行っている。名寄せアルゴリズムは先行研究からさらに工夫を高め、高い精度での名寄せを実現することができている。この名寄せアルゴリズムを用いることで、移動者の移動状況や所属機関等につき、特許や論文データから抽出することが可能である。現在は、それらの作業に移行し、順次研究を進めているところである。これまでのところ、研究は研究計画に基づき、おおむね順調に進展している。名寄せアルゴリズムの作成が完了したことがその大きな理由である。名寄せアルゴリズムの作成と並行して、先行研究に関する調査を行ってきたほか、国際学会での発表の準備等も進めてきた。本研究の目的は、技術流出の原因の一つとして指摘される退職者等による技術流出について、その影響額の推定を試みることにある。当該年度は、日本企業からアジア企業へと移動した技術者の同定作業を行い、所属企業等のデータを整備することを行った。データ整備は現在のところ順調に進んでいる。今後は完成したデータセットを用い、分析を進めていく予定である。今年度の途中で産前産後休暇を取得したため、当初予定より若干遅れている。しかしながら、復職後は直ちに研究を再開したので、その影響は比較的小さいもののとどまっていると考える。本研究の最終的な目的は、人材流出を介した技術流出の経済的影響を把握することにある。この点、人材流出を把握するために不可欠な名寄せアルゴリズムは完成している。今後は、完成したアルゴリズムを用いて、人材の移動を正確に把握し、移動者が技術流出に与えた影響について分析を進めていくことになる。移動者と技術流出の関係については、特許データを用い、また経済的影響については企業・研究機関等の各種経済データも含めた分析が必要となり、それらの準備を順次行っていく。今後は、作成したデータセットに基づき、分析を行っていくとともに、国内外の学会・ジャーナルでの発表を行っていきたい。平成28年度の研究計画はおおむね順調に進展したものの、国内の研究発表の場所が都内であり、旅費が発生しなかったため。平成29年度に産前産後休暇を取得し、研究を一時中断した時期があったため、次年度使用額が生じた。産前産後休暇等を取得した関係上、研究中断期間が数ヶ月間発生したため。統計分析に用いるデータの購入費や書籍購入、投稿論文に係る英文校正費などに使用する予定である。