hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑化面の日射反射と蒸散作用が建築および周辺環境に及ぼす影響とその機構解明

本研究では、建築環境の改善における緑化効果についてその定量的な評価を図るとともに、特に熱・湿気環境に焦点を当てて緑化効果の機構解明を目指すことを目的とし、具体的には、次の4項目について研究を実施した。(1)植物と土壌の日射が当たる場合の蒸散量の日変動、(2)植物と土壌の蒸発冷却効果がおよぼす微気象環境の解明、(3)建築物内の熱環境における屋上・壁面緑化の冷暖房負荷低減効果、(4)緑化面の日射反射による照り返しが室内熱環境に及ぼす影響。ヒートアイランド現象の顕在化、地球温暖化や化石資源の枯渇に対する懸念等を背景として、都市・建築環境においては、都市や建築物の緑化による室内温熱環境の改善効果が期待されている。しかし、緑化による室内温熱環境の改善効果について、現段階の知見は定性的なものに留まっており、定量化および熱・湿気環境に及ぼす影響の機構解明はなされていない。したがって、建築環境の設計において緑化を効果的に導入するためには、緑化の効果を定量評価するとともに、蒸散作用や日射遮蔽効果が建築環境・周辺環境に及ぼす影響についての機構を解明する必要がある。本研究では、建築環境の改善における緑化効果についてその定量的な評価を図るとともに、特に熱・湿気環境に焦点を当てて緑化効果の機構解明を目指す。具体的には、下記の4項目について研究を実施する。本研究を遂行する上で最大の阻害要因は天候であり、天候に左右される研究項目については複数年度に亘って計画した。平成20年度は研究初年度であり、各項目とも計画通りに研究を開始した。実施状況を併せて記す。(1)緑化植物の蒸散量定量化・・・「植物1株単位の蒸発量測定」を遂行。また、次年度実施予定であった「単位植栽面積(1m2)当たりの蒸散量測定」の測定装置を開発。(2)植物の蒸散による熱・湿気微気象環境の把握・・・「微気象測定装置の開発」を遂行。(3)建築物内の熱環境における屋上・壁面緑化の冷暖房負荷低減効果・・・緑化建物の冷房負荷測定を実施。(4)緑化面の日射反射による照り返しが室内熱環境に及ぼす影響・・・測定装置を開発、測定を開始。ただし、天候の関係で追試が必要。本研究を遂行する上で最大の阻害要因は天候や試験現場の状況であり、これらに左右される研究項目については複数年度に亘って計画した。平成21年度は昨年度に引き続き,計画に基づき研究を行った。(1)緑化植物の蒸散量定量化...「単位植栽面積(1m^2)当たりの蒸散量測定」の測定を開始。日射熱を受けた植栽の蒸発特性ならびに湿気伝達率を定量評価。(2)植物の蒸散による熱・湿気微気象環境の把握...「微気象測定装置を用いた測定」を開始。(3)建築物内の熱環境における屋上・壁面緑化の冷暖房負荷低減効果...緑化建物の冷暖房負荷測定を実施し,その効果を定量評価。(4)緑化面の日射反射による照り返しが室内熱環境に及ぼす影響...測定装置を開発、測定を開始。ただし、天候および試験実施現場の急変で追試が必要。本研究は、建築環境の改善における緑化効果について、特に熱・湿気環境を対象として、その物理的現象の機構を解明するとともに緑化効果の定量的な評価を図ることを目的とし、具体的には、次の(4)項目についての研究を行った。(1)緑化植物の蒸散量定量化、(2)植物の蒸散による熱・湿気微気象環境の把握、(3)建築物内の熱環境における屋上・壁面緑化の冷暖房負荷低減効果、(4)緑化面の日射反射による照り返しが室内熱環境に及ぼす影響。以下に本年度の研究実績を項目ごとに記述する。(1)緑化植物の蒸散量定量化:植栽の蒸発・蒸散量から植物の蒸散量と土壌の蒸発量を分離し、植物のみの蒸散量を抽出できる実験を行った結果、土の蒸発日変動と植物の蒸散日変動にタイムラグが生じていることがわかった。

(2)植物の蒸散による熱・湿気微気象環境の把握:土場表面から土壌内部への詳細な温度分布を時間ごとに測定し、午前9時頃と午後4時頃に土壌内部の温度がほほ同一温度になる、すなわち、この時間帯では土中への熱移動が見かけ上無視できることがわかった。(3)建築物内の熱環境における屋上・壁面緑化の冷暖房負荷低減効果:屋上緑化によって、夏期においては小屋裏の温度は低下し、天井の室内側表面温度も低下しているが、室内の窓からの日射熱の侵入の方が室温に及ぼす影響が大きい実測結果が得られた。(4)緑化面の日射反射による照り返しが室内熱環境に及ぼす影響:芝生、日射反射率の大きい白色、と小さい黒色の試料板、さらに試料板の表面を水で濡らした場合について実験を行った。測定に当たっては、自作のミニSAT計を高さ方向に20cm間隔に10個取り付けて温度分布を測定した。芝生の照り返しの影響は無視できない、また、蒸発冷却によってぬれ面の表面温度は低下し、そのため照り返しによる影響は少ないことを実証した。
カイコを簡易 in vivo 評価系に利用した天然由来新規抗真菌剤の創薬研究

重篤な症状を呈する真菌症の起因菌であるカンジダ・アルビカンスを昆虫のカイコに感染させたin vivo様の感染モデルを利用し、新規抗真菌剤のリードを微生物の培養液中に求めた結果、治療効果を示す5つの化合物を同定した。また、深在性真菌症の有効な治療薬アムホテリシンBの抗真菌活性増強物質のスクリーニングも並行して行ない、shodoamideと命名した新規化合物の発見にも成功した。カイコを宿主としカンジダ(Candida albicans TIMM1768)を感染させた感染モデル(以下、カイコカンジダ評価系とする)を利用し、新規抗真菌剤のリードを微生物の培養液中に求めたスクリーニングを進めた。まずペーパーディスク法でカンジダのみに生育阻止円を示す培養液を選択し、次にカイコカンジダ評価系で治療効果(延命効果)を示すものを候補サンプルとして選択した。また、ペーパーディスク法では単独では抗真菌活性を示すことなく既存薬剤(アムホテリシンおよびミコナゾール)の抗真菌活性を増強する化合物のスクリーニングも並行して進めた。微生物培養液約1,000サンプルを評価した結果、幾つかの培養液を選択し、昨年度からの検討継続株3株と共に活性物質の精製を行った。その結果、放線菌K10-0569株が生産する活性物質をcopiamycin (Arai T. et al. J. Antibiot. 18, 63-67, 1965)と同定した。また、未同定真菌BF-0158の培養液中からは新規化合物の発見に成功した。さらにこれまでの研究成果によって発見された真菌Simplicillium minatenseFKI-4981が生産する新規抗真菌物質simplifunginとアムホテリシンBをそれぞれ単独では活性を示さない濃度併用すると、カイコの延命効果が確認された。重篤な真菌症を引き起こす病原真菌カンジダ・アルビカンスを昆虫のカイコに感染させたi n vivo様の感染モデル(以下、カイコ評価系とする)を利用し、新規抗真菌剤のリードを微生物の培養液中に求めた。まずペーパーディスク法において、カンジダのみに生育阻止円を示す培養液を選択した。次いでカイコ評価系においてその治療効果(延命効果)を調べた。また、重篤な症状を呈する深在性真菌症の有効な治療薬であるアムホテリシンB (AMPB)の活性増強物質のスクリーニングも並行して行った。これはペーパーディスク法において、カンジダの生育に影響しない濃度のAMPBを培地中に添加した検定プレートでのみ生育阻止円を示し、AMPB無添加の検定プレートでは阻止円を示さない培養液を選択した。本年度は微生物培養液約1,500サンプルを評価した結果、細胞毒性を示さずにカイコ評価系で治療効果を示すサンプルを6サンプル、AMPB増強活性を示す培養液を3サンプル得ることができた。これらにつては、現在活性成分の単離精製を進めている。また、AMPB活性増強物質の探索においては未同定真菌BF-0158株の培養液より新規化合物2成分を発見することができた。次に昨年度報告書に記載した新規抗真菌物質simplifunginの作用点の解析も進めた。本化合物は酵母様真菌に対して抗真菌活性を示し、AMPBとの併用では相加的な効果が確認された。またカイコ評価系においても、それぞれの化合物が単独で治療効果を示さない濃度でも併用による治療効果が確認されたことは、実験動物レベルでも効果を示す可能性を示唆している。さらに作用点は、LCMSを用いた評価系を構築し解析を進めた結果、酵母のスフィンゴリン脂質生合成過程の初期段階の酵素セリン-パルミトイル転移酵素を阻害することを明らかにした。最終年度も継続し、重篤な真菌症を引き起こす病原真菌カンジダ・アルビカンスのカイコ感染モデル(以下、カイコ評価系とする)を利用し、新規抗真菌剤のリードを微生物の培養液中に求めた。培養液約7,000サンプルについて、まずペーパーディスク法でカンジダのみに生育阻止円を示す培養液を選択し、さらにカイコ評価系においてその治療効果(延命効果)を調べた。その結果、細胞毒性を示さずに治療効果を示すサンプルを3サンプル取得した。これらについては、現在活性成分の単離精製を継続している。昨年度、作用点を明らかにした新規物質simplifunginについては、様々なモッシャー試薬を用いた誘導体化によって、3箇所全ての立体化学を明らかした。同様に、真菌Valsaceae sp. KFH-53が生産する新規物質valsafunginについても、2箇所の立体化学を明らかにした。またvalsafunginについては作用点の解析を行い、simplifunginと同じスフィンゴリン脂質生合成過程の酵素セリン-パルミトイル転移酵素を阻害することを明らかにした。さらに誘導体合成の過程で、simplifunginのカルボン酸メチル体が強い抗カンジダ活性(MIC; 0.25 &#181;g/mL)を示すことを明らかにした。今後、本化合物のカイコ評価系での治療効果を確認し、結果が良好であればマウスを用いた感染実験を実施し、抗真菌薬のシードの可能性を見極めたいと考えている。次に昨年度発見した未同定真菌BF-0158株が生産する新規物質shodoamide類は、アムホテリシンBの活性増強作用を示すことを明らかにし、これまでに4成分を取得している。

本化合物については今後、詳細な抗真菌スペクトルの測定およびカイコ評価系での治療効果等を調べ、創薬シードを目指した誘導体合成へと展開する予定である。重篤な症状を呈する真菌症の起因菌であるカンジダ・アルビカンスを昆虫のカイコに感染させたin vivo様の感染モデルを利用し、新規抗真菌剤のリードを微生物の培養液中に求めた結果、治療効果を示す5つの化合物を同定した。また、深在性真菌症の有効な治療薬アムホテリシンBの抗真菌活性増強物質のスクリーニングも並行して行ない、shodoamideと命名した新規化合物の発見にも成功した。カイコ評価系を用いたスクリーニングでは、幾つかの候補サンプルを選択できていることから、新規リード化合物の発見を目指した単離精製が継続して進められている。またAMPB活性増強物質においては、新規化合物BF-015 8類を発見できており、その立体構造の解析あるいは作用機序の解析に進めることができている。次に作用機序の解析の項目では、新規抗真菌物質simplifunginの作用点の解析が終了し、valsafunginなど次の化合物の解析に着手できている。天然物化学1.抗真菌剤のスクリーニングに関してはカンジダ・アルビカンスを用いて継続して実施するが、真菌症の他の原因真菌である糸状菌アスペルギルス・フミガタスおよび接合菌リゾパス・オリゼを加えることで適応可能な範囲を広げる。さらに1次スクリーニングの評価方法をペーパーディスク法から、より感度の高い微量液体希釈法に変更することで、さらなる新規抗真菌物質の発見を目指す。2.新規物質valsafunginおよびBF-0158類については、まず構造の立体化学を明らかにする。次に抗真菌スペクトルを測定し、カイコ評価系での治療効果を再確認する。さらに、その成績が良ければ合成グループとの共同研究を計画し誘導体合成へと展開することで、構造活性相関を明らかにする。3.新規物質valsafunginおよびBF-015 8類については作用機序の解明に着手する。また、simplifunginの作用機序の解析より明らかにしたスフィンゴリン脂質生合成経路が抗真菌剤の標的に成り得る可能性についても追求していく。スクリーニングに関しては予定したサンプル数には達していないものの、初年度に真菌の培養液中より新規物質を発見することに成功したことは評価できる点である。また、精製可能な培養サンプルも幾つか選択できており、化合物の取得の項目については概ね計画通り進められている。また、作用機序の解明の項目では、新規抗真菌物質simplifunginがカイコカンジダ評価系でも延命効果が確認されたことから、作用機序の解析に着手することが可能となった。本年度は、抗真菌物質の単離精製において購入予定としていた高速液体クロマトグラフィー用のカラム、樹脂等あるいは作用機序の解析に使用する試薬・抗体等が既存のもので代用できたため次年度使用額が生じた。微生物の培養液サンプルのスクリーニングを継続し、選択されたサンプルからの単離精製を進め、さらなる新規抗真菌物質の発見を目指す。今回発見出来た新規物質については、まずサンプルの大量取得を行う。次いで化合物の立体化学を明らかにし、カイコカンジダ評価系での効果を再確認すると共に、成績が良ければ合成グループとの共同研究を計画し誘導体合成へと展開することで、構造活性相関を明らかにする。Simplifunginなど既に幾つか得ている新規物質の作用機序の解明に着手する。
炭素資源の高度分子変換

特定領域研究「炭素資源の高度分子変換」(平成1720年度)が終了したので、「取り纏め成果報告書」の作成と「取り纏めシンポジウム」の開催を行った。この研究費によって計画・公募班員全員の業績、成果を一冊の本にまとめるとともに、全研究期間の研究成果を「取り纏めシンポジウム」にて発表することにより、当該領域の推進度を対外的に発信することができた。まず、本特定領域研究の「成果取り纏めシンポジウム」を、6月12日(月、火)に京都市の京都テレサで行った。シンポジウムの内容については、連携研究者である野崎京子(東京大学大学院工学系研究科)、石井康敬(関西大学工学部)、大寺純蔵(岡山理科大学工学部)、富岡清教授(京都大学大学院薬学研究科)らと相談して、具体化した。すなわち、取り纏めシンポジウム会場として参加者の利便性や会場費を考慮して、京都テレサを選んだ。続いて、本特定領域研究の計画班員・公募班員の中から31件の最終成果発表者を選び、取り纏めシンポジウム要旨集及びポスターの作成については、代表者である丸岡が取り行った。一方、「取り纏め成果報告書」の作成については、連携研究者である野崎京子、石井康敬、大寺純蔵、富岡清教授らと相談して作成方法を決定し、本特定領域研究の計画・公募班員にメイルで連絡して、報告書原稿を集めた。その後、印刷業者に手渡して、全体の成果報告書を完成させた。さらに、本特定領域研究の「ポストシンポジウム」の開催を計画し、そのお世話を北海道大学大学院薬学研究院の橋本俊一教授にお願いし、10月16日(金)の午後に北海道大学大学院薬学研究院臨床薬学講義室で開催することに決めた。講演者として、本特定領域研究の計画班員・公募班員の中から8名を選び、ポストシンポジウムポスターの作成については、代表者である丸岡が取り行った。天然資源の乏しい我が国では、付加価値の高い新機能性材料や医農薬の創製に向けて、炭素資源の有効利用は最重要課題であろう。プロセス有機合成化学の分野においても、従来、出発原料として有効利用されてこなかった炭素化合物資源も数多く存在する。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素に始まるC1分子や、石油化学製品ではあるものの主に燃料として消費されていた低沸点飽和炭化水素(プロパン、ブタン、シクロヘキサン等)やベンゼン系化合物また単純アミノ酸であるグリシンやアラニン等を有効に利用するため、それらの高度な分子変換反応の開発など、為すべきことは多い。これからの「プロセス有機合成化学を駆使する新医農薬、新機能性材料の合理的開発」という時代の要請に応えるには、従来のやり方では間尺に合わず、プロセス有機合成化学を見据えた炭素化合物資源の高度分子変換反応の開拓に真摯に取り組む必要がある。本特定領域研究の目的は、有機合成プロセス開発に必要、かつ数十年後に残りうる真に有用な有機合成反応を新規開拓し、そこから得られた基礎研究成果を産業界の「プロセス有機合成化学」に供給する学術支援体制を早急に確立することである。そのために初年度は、本特定の創設シンポジウムを開催し、本特定の趣旨と各計画研究の内容を広く公開した。その際、本特定領域研究に関連した世界的に著名な研究者を国の内外から招いて講演を依頼して、計画班員との密接な情報交換を行った。また、本特定領域研究は産業界に密接に関係していることから、シンポジウムの開催通知などを日本プロセス化学会や野依フォラームのホームページ等に掲載し、産業界にも広く情報発信した。さらに、本特定領域研究に関連する幾つかの国際シンポジウムも併せて開催した。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素に始まるC1分子や、石油化学製品ではあるものの主に燃料として消費されていた低沸点飽和炭化水素やベンゼン系化合物、また単純アミノ酸等を有効に利用するため、それらの高度な分子変換反応の開発など、為すべきことは多い。そのため、第1回および第2回公開シンポジウムをそれぞれ岡山、東京で開催し、各計画および公募研究の内容・成果を広く公開した。その際、総括班会議や計画・公募班会議を、併せて開催した。また、本特定領域研究の関連研究者を国の内外から招き、国際会議、を開催した。さらに、この特定領域分野の次世代を担う若手研究者をエンカレッジするために、「高度分子変換の第1回若手シンポジウム」を開催した。シンポジウムの開催通知などを本特定ホームページや学会誌のみなら、本特定領域研究の関連研究者を国の内外から招き、日本プロセス化学会や野依フォラームのホームページ等に掲載し、産業界にも広く情報発信した。さらに、「高度分子変換ニュースレター」を電子版で年2回出版し、班員同士の最新の情報を共有した。

プロセス有機合成化学の分野においても、従来、出発原料として有効利用されてこなかった炭素化合物資源も数多く存在する。これらの炭素化合物資源を有効に利用するため、それらの高度な分子変換反応の開発など、為すべきことは多い。これからの「プロセス有機合成化学を駆使する新医農薬、新機能性材料の合理的開発」という時代の要請に応えるには、従来のやり方では間尺に合わず、プロセス有機合成化学を見据えた炭素化合物資源の高度分子変換反応の開拓に真摯に取り組む必要がある。本特定領域研究の目的は、有機合成プロセス開発に必要、かつ数十年後に残りうる真に有用な有機合成反応を新規開拓し、そこから得られた基礎研究成果を産業界の「プロセス有機合成化学」に供給する学術支援体制を早急に確立することである。そのため、第3回および第4回公開シンポジウムをそれぞれ札幌、京都で開催し、各計画および公募研究の内容・成果を広く公開した。その際、総括班会議や計画・公募班会議を、併せて開催した。特に第4回公開シンポジウム(京都)では日本プロセス化学会との合同シンポジウムを開催し、産学からの研究成果を発表し合うことにより、今後の産学連携の可能性について情報交換を行なった。また、本特定領域研究の関連研究者を国の内外から招き、国際会議を開催した。さらに、「第1回の日本・シンガポール2国間触媒シンポジウム」を開催し、日本側から特定班員16名が参加した。こういったシンポジウムの開催通知などを本特定ホームページや学会誌のみならず、日本プロセス化学会や野依フォラームのホームページ等に掲載し、産業界にも広く情報発信した。さらに、「高度分子変換ニュースレター」を電子版で年2回出版し、班員同士の最新の情報を共有した。天然資源の乏しい我が国では、付加価値の高い新機能性材料や医農薬の創製画向けて、炭素資源の有効利用は最重要課題であろう。そのため、第5回および第6回公開シンポジウムをそれぞれ仙台、金沢で開催し、各計画および公募研究の内容・成果を広く公開した。また、本特定領域研究の関連研究者を国の内外から招き、大津プリンスホテルにて国際会議を開催した。さらに、「第1回日英2国間触媒シンポジウム」や「第2回日本・シンガポール2国間触媒シンポジウム」を開催し、日本側から多くの特定班員が参加した。
腸管における炎症に深く関わる免疫細胞の機能解析と腸管保護食品創製への展開

本研究では主として、腸内細菌代謝産物の腸管バリア回復効果をTNF-α処理したCaco-2細胞およびDSS腸炎マウスを用いて評価した。腸内細菌のリノール酸初期代謝物である10-hydroxy-c12-octadecenoic acid (HYA)は、TNF-αあるいはDSSによるタイトジャンクション関連因子の発現変化を抑制するとともに、TNF receptor 2発現を抑制した。HYAはGPR40発現を上昇させたが、GPR40アンタゴニストの添加によりHYAのバリア保護効果は消失した。一方、炭素鎖12位に二重結合をもたないオレイン酸初期代謝物には本活性が見られず、GPR40発現も低下させた。本研究では、腸管における炎症の引き金を引くTh17細胞に着目している。腸管炎症疾患においては、Th1やTh17などの炎症性Th細胞の活性化が病因に深く関与している。また、これらの炎症性Th細胞の活性化を抑制することは、腸管ホメオスタシス維持において非常に重要である。そこで本年度は、DSS誘導性腸炎モデルマウスを用いて、Th1やTh17細胞の活性化メカニズムを解析するとともに、ビフィズス菌による大腸炎抑制効果の評価、および腸管Th1/Th17細胞の抑制メカニズムの解明を試みた。試験には、Th17細胞抑制効果が明らかにされているBifidobacterium infantisを用いた。DSS誘導性大腸炎モデルマウスを用いた実験により、B. infantisは腸管のTh1/Th17活性化を抑制することによって大腸炎を緩和することが示された。DSSマウスの大腸上皮細胞は、CD80やCD40などの共刺激分子を高発現しており、CD4+T細胞と相互作用してTh1/Th17細胞の分化を誘導することが明らかになった。B. infantisはこれらの共刺激分子の発現増加を抑制し、Th1/Th17活性化を抑制することが示唆された。このように、B. infantisは免疫細胞に直接作用するのではなく、大腸上皮細胞に作用することでTh1/Th17細胞を抑制するという、ビフィズス菌の新たな免疫調節作用機序を見出すことができた。その他、炎症部位において低酸素(O2濃度1%未満)状態である領域が広がり、そこにTh17細胞が浸潤していることに着目し検討を行った。腸間膜リンパ節細胞を1%酸素下で培養すると、Th17(RORγt+ CD4+細胞)およびTh17型樹状細胞(CD11b+ CD11c+細胞)の割合が増加し、Treg(Foxp3+ CD4+細胞)の割合が減少した。今年度、引き続き、腸管における炎症に深く関わる免疫細胞、とりわけTh17細胞や樹状細胞についての機能解析を継続して実施するとともに、炎症によってルーズになる腸管バリアの食品因子による保護について検討を深めた。特に、代表的な腸内細菌である乳酸菌のリノール酸代謝産物(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid; HYA)の腸管バリア保護メカニズムを明らかにするために、MAPK経路との関わりに着目して検討を行った。【結果・考察】HYAは、MAPK経路の一つであるERKのリン酸化を促進した。一方、p38やJNKのリン酸化には影響を与えなかった。また、GW1100存在下では、HYAによるERKリン酸化が消失したことから、HYAはGPR40を介してERKをリン酸化することが明らかとなった。さらに、HYAはIFN-γによって誘導されたTNFR2発現を抑制したが、U0126の共存によってその効果が消失した。加えて、HYAはIFN-γ+ TNF-αによって誘導されたTER低下およびFD-4透過亢進を有意に回復したが、その効果はU0126によって部分的に消失した。これらの知見は、HYAがGPR40/MEK-ERKを介してTNFR2発現を制御し、腸管バリア保護効果を発揮することを示唆している。腸管は、大量の異物が体内に到達する入り口として極めて重要である。外来物質に対し過剰に反応しないよう「寛容」状態となっているが、その制御が崩れ炎症が惹起されることは種々の疾病に繋がる。本研究では、(1)腸管上皮バリアの脆弱化、(2)共刺激分子の異常発現、(3)低酸素などの状況に対して、乳酸菌・ビフィズス菌およびその代謝産物による回復に着目し、上記(1)(2)について以下のことを明らかにした。(1)腸内細菌のリノール酸代謝産物(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid: HYA)は、ヒト腸管上皮細胞のモデルであるCaco-2細胞において、IFNgamma+TNFalphaによるタイトジャンクションの損傷を回復した。そのメカニズムの1つとして、HYAがGPR40を介してERKをリン酸化し、TNF receptor 2の発現亢進を抑制することを明らかにした。さらに、HYAの経口投与によりDSS腸炎マウスの症状が緩和された。また、10-hydroxyoctadecanoic acidはHYAのような活性を示さなかったことから、HYAに存在する炭素鎖12位の二重結合が、本活性に重要な働きをすることが示唆された。我々の日常生活におけるストレスなどによって炎症が起こっていると考えられるが、これを腸内細菌が修復していると推察される。今後、乳酸菌・ビフィズス菌のヒトでの効果がより明確に証明されることを期待したい。

本研究では主として、腸内細菌代謝産物の腸管バリア回復効果をTNF-α処理したCaco-2細胞およびDSS腸炎マウスを用いて評価した。腸内細菌のリノール酸初期代謝物である10-hydroxy-c12-octadecenoic acid (HYA)は、TNF-αあるいはDSSによるタイトジャンクション関連因子の発現変化を抑制するとともに、TNF receptor 2発現を抑制した。HYAはGPR40発現を上昇させたが、GPR40アンタゴニストの添加によりHYAのバリア保護効果は消失した。一方、炭素鎖12位に二重結合をもたないオレイン酸初期代謝物には本活性が見られず、GPR40発現も低下させた。当初は、腸管における炎症に深く関わる免疫細胞、とりわけTh17細胞に着目していたが、さらに腸管バリアとの関連にも検討を広げ、「研究実績の概要」に記したような成果を得ることができた。菌体に含まれる活性候補物質とは別に、菌の新規代謝産物による全く新しい腸管保護メカニズムを明らかにできたので、標記のように評価している。27年度が最終年度であるため、記入しない。食品機能学1)乳酸菌によるTh17抑制機構の解明(低酸素下,アドレナリン添加時)腸管免疫細胞を低酸素条件下、アドレナリン存在下で培養し、乳酸菌添加時のTh17抑制効果について確認する。また、樹状細胞を介したTh17抑制を考慮し、Th17ー樹状細胞の相互作用を中心としたTh17抑制機構を、遺伝子の網羅的発現解析(DNAマイクロアレイ)により解明する。2)乳酸菌によるTh17抑制炎症軽減評価(炎症性腸疾患患者)炎症性腸疾患患者から同意を頂けたら、生検組織を用いて、乳酸菌のTh17抑制効果を、免疫染色法・フローサイトメトリーなどでex vivo解析する。本系で効果の見られた患者には、当該乳酸菌を経口摂取して頂き、in vivoでのTh17抑制・腸炎軽減を確認する。1,2)を通して、最終的に、腸管保護食品創製へと展開する。腸炎とTh17細胞との関わりについてDSSマウスを用いて検討を行った結果、腸炎マウスの大腸上皮細胞では、CD40発現が亢進しており、CD4+T細胞と相互作用してTh1/Th17細胞の分化を誘導することを明らかにした。また、B. infantisが大腸上皮細胞に直接作用することでTh1/Th17細胞を抑制するという、新たな免疫調節作用機序を見出すことができた。加えて、炎症部位において低酸素状態である領域が広がっていること、そこにTh17細胞が浸潤していることを確認した。また、腸間膜リンパ節細胞を低酸素下で培養すると、Th17にシフトすることも明らかにした。これらのことから、CD40強制発現細胞やノックアウトマウスを用いる検討にまでは至らなかったものの、研究はおおむね順調に進展していると判断している。H26年度は、まず腸内細菌やプロバイオティクスと腸管バリアとの関連について検討する予定である。具体的には、L. reuteri数株の腸管バリア保護機能を比較し、それとゲノム情報をリンク(pan-genome解析)することを試みる。また、低酸素とTh17細胞の関連について引き続き検討する。
ミクログリアによる活性酸素生成の分子機構

本研究では、「ミクログリアによる活性酸素生成」における食細胞NADPHオキシダーゼの役割について検討した。ミクログリアは、オキシダーゼ構成成分であるシトクロムb_<558>及びP47^<phox>とp67^<phox>を豊富に発現していること、細胞レベルでの最も強力なオキシダーゼ活性化剤であるPMA刺激により大量のスーパーオキシド(O_2^-)を生成すること、このO_2^-はオキシダー阻害剤DPIにより著明に抑制されること、等を見いだした。以上の知見はミクログリアに食細胞NADPHオキシダーゼ系が存在し、この系によって刺激依存性にO_2^-が生成されうることを意味する。更に私共は、アミロイドペプチドAβ(25-35)および細菌由来ホルミルペプチドfMLPが濃度依存性に(EC50はそれぞれ4μMと0.1オM)、ミクログリアによるO_2^-生成を強力に誘導することを見いだした。Aβ(25-35)やfMLPによるO_2^-生成も、DPIがほぼ完全に阻害することから、NADPHオキシダーゼによるものと考えられる。また、PI3キナーゼ阻害剤であるwortmaninやLY294002は、Aβ(25-35)及びfMLP刺激によるO_2^-生成を著明に抑制したが、PMA刺激によるO_2^-生成には影響を与えなかった。一方PKC阻害剤は、PMA刺激によるO_2^-生成を完全に抑制するものの、Aβ(25-35)やfMLP刺激によるO_2^-生成には弱い抑制効果しか示さなかった。以上のように、Aβ(25-35)及びfMLPはPI3キナーゼを介してNADPHオキシダーゼを活性化し、ミクログリアのO_2^-生成を引き起こすと考えられる。Aβ(25-35)やfMLPがミクログリアを活性化し大量のO_2^-生成を誘導するという本研究の知見は、アルツハイマー病や細菌感染時の病態形成に、O_2^-に由来する種々の活性酸素が深く関与している可能性を示唆している。
マグネシウム合金の温間成形におけるスプリングバック特性の解明とその有限要素解析

地球温暖化対策が喫緊の課題である昨今,マグネシウム合金は軽量化材料として大きな注目を集めている.本研究ではマグネシウム合金板のプレス成形時に問題となるスプリングバック(弾性回復による形状変化)について詳細な検討を行った.その結果,スプリングバックの低減には成形中に材料を加熱する方法が最も有効であることが明らかとなった.一方,理論的にスプリングバックを高精度に予測するには,温度変化に伴う弾性係数(ヤング率)の変化とともに結晶レベルの変形がスプリングバックに及ぼす影響を適切に考慮することが重要であることが明らかとなった.地球温暖化対策が喫緊の課題である昨今,マグネシウム合金は軽量化材料として大きな注目を集めている.本研究ではマグネシウム合金板のプレス成形時に問題となるスプリングバック(弾性回復による形状変化)について詳細な検討を行った.その結果,スプリングバックの低減には成形中に材料を加熱する方法が最も有効であることが明らかとなった.一方,理論的にスプリングバックを高精度に予測するには,温度変化に伴う弾性係数(ヤング率)の変化とともに結晶レベルの変形がスプリングバックに及ぼす影響を適切に考慮することが重要であることが明らかとなった.本年度は,研究立ち上げと次年度からの円滑な研究推進を目的として,主として以下の項目を遂行した.(1)ハット曲げ実験金型の作成まず基準条件(ダイ肩半径5mm,クリアランス1.2mm)のハット曲げ金型を作成し,均一な金型温度分布が得られるヒーター挿入穴の位置,またダイ肩半径やクリアランスを高精度かつ高効率に変更できる金型機構について詳細に検討した.それにより,ダイ肩半径5通り,クリアランス5通りの計25通りもの条件で,常温300°の範囲で金型表面全体に亘ってほぼ均一に加熱できる金型を設計製作した.本金型はしわ押さえ力を独立に負荷する機能も有する.実験例として,基準条件下でMg合金の温間ハット曲げ実験を行い,金型温度のスプリングバック量に及ぼす影響を検討した.その結果,予測通り温度を上昇させるほどスプリングバック量が低減した.これより,本金型を用いることで適切な温間成形実験が遂行できることを確認した.(2)弾粘塑性有限要素法解析プログラムの開発まず,これまで提案されたさまざまな定式化手法を詳細に調査し,本研究で採用する静的陽解法弾塑性有限要素法解析プログラムに導入するのに最も適した手法を検討した.その結果,冨田らによって提案された手法が適切と判断し,それを改良することで全く新しい弾塑性粘塑性有限要素法解析プログラムを開発した.Mg合金の温間角筒絞り成形の解析を行い,他研究者による実験結果と比較したところ,妥当な解析結果が得られることを示した.(3)Mg合金の変形特性に関する調査文献調査により,Mg合金が鋼,アルミ合金といった従来の材料とマクロな変形特性において異なる点を詳細に検討した.その結果,ハット曲げ成形では,(1)オーバーラン時のパンチとの接触による温度変化,(2)曲げ曲げ戻し時の引張り特性と圧縮特性の違い,がスプリングバック量に影響しうることが予測された.また従来の連続体理論に基づく有限要素法解析プログラムでの再現の可否について詳細に検討した.今年度は特にマクロなスプリングバック特性に注目して研究を推進した.得られた成果を以下に示す.(1)高温引張り特性炉のついた万能試験機を用いて,常温200°の温度域で静的引張試験を行った.得られた知見を以下に示す.(1)ヤング率,引張り強さは温度上昇とともにほぼ線形に低下する,(2)一様伸びの大きさは温度に依らず変化しない,(3)約150°以上で再結晶により結晶粒の顕著な微細化が確認された.(2)温間引張り曲げ成形におけるスプリングバック特性ダイ肩半径5mmとして,金型温度やしわ押さえ力をさまざま変化させてスプリングバック特性を検討した.得られた知見を以下に示す.(1)金型温度の上昇に伴いスプリングバック量は顕著に低下し,200°付近ではほぼゼロとなった.(2)温度上昇に伴ってスプリングバック量が低下するのは,ヤング率の低下以上に引張り強さの低下が顕著なためと考えられる.しかし200°付近でスプリングバック量がゼロになる原因はマクロな機械特性のみでは説明できず,ミクロレベルも視野に入れたさらなる検討を要する.(3)高温下での成形でも,引張り試験の場合ほど顕著な再結晶は確認されなかった.また部位によって再結晶の発生に大きなバラツキが見られた.これは加熱時間と大きく関係していると考えられる.(4)高温,高しわ押さえ力になるほど材料に焼き付きが発生し,適切な成形が困難であった.これは潤滑剤に問題があると考えられ,今後適切な潤滑剤の検討を要する.(3)結晶塑性有限要素法プログラムの開発詳細な検討より,従来の有限要素解析では適切なマグネシウム合金板成形解析の遂行は困難であることが示唆された.そこで均質化法結晶塑性有限要素解析プログラムの開発に着手した.当初は常温成形を対象とし,マクロ-ミクロ変形の関連について検討することを主目的として,開発を推進している.これにより従来の有限要素解析では不可能だった多くの知見が得られることが期待される.交付期間の最終年度である本年度は,主として組織観察によるミクロな変形特性について調査を行い,マルチスケール的視点に基づくスプリングバック特性の体系的な理解に向けた基礎検討を行った.以下に,得られた主な知見を箇条書きに示す.(1)本年度は新たな潤滑剤を用いることで,高温且つ高しわ押さえ力下での実験に成功した.

その結果,スプリングバック量の低減にはしわ押さえ力上昇よりも温度上昇の方がはるかに効果的であることが明らかとなった.(2)ハット曲げ成形においてスプリングバック量を左右する要因の一つである縦壁部の逆曲げについて直接観祭により検討した.その結果,常温ではほとんど逆曲げが発生しなかったのに対して局温では顕著な逆曲げが観察された.この傾向にはしわ押さえ力の影響は見られなかった.以上より,逆曲げの発生が高温でスプリングバック量が極めて小さくなる要因の一つであることが示唆された.(3)成形品の組織観察を行った.常温の場合,ダイ肩部で圧縮変形を受ける側の面(表面)近傍ではタイ肩部で多くの双晶が発生するが,その後縦壁部で引張変形を受けることでその多くが消滅した.一方その裏面近傍では,圧縮変形を受ける縦壁部で多くの双晶が発生するが,その数は表面に比べて少なかった.以上より,双晶の活動に起因して板の表裏面で成形性が大きく異なることが示唆された.また高温の場合, 200度以上での成形では顕著な再結晶が確認され,高温でスプリングバック量が極めて小さくなる要因の一つが再結晶であることが示唆された.(4)結晶塑性有限要素法解析プログラムを開発した.単軸圧縮・引張変形の解析を行った結果,実験と定性的に良い一致を示した.一方,板表裏面で見られた双晶活動の違いは再現できていない.今後応力経路反転に伴う双晶活動の変化を定式化することで,高精度な結晶塑性解析プログラムを開発し,スプリングバック特性の体系的理解の一助とする所存である.
精神病発症危険状態症例の発症を阻止する生物学的背景に関する研究

統合失調症において、精神症状が改善した症例では脳梁の白質の統合性が改善することが報告されている。これは、精神病症例の認知機能や精神症状の改善には脳梁の生物学的な改善が寄与することを示唆するものである。本研究はARMS非発症症例の発症閾値下の精神症状の発現阻止や改善においても、脳梁の生物学的変化が関連するという仮説をたて検討することを目的としている。既に平成29年度に、これまで偽陽性と考えられてきた非発症群においても健常群と比べ脳梁のアブノーマリティーが生じていることを示唆する結果、また、脳梁の体積の増加と閾値下の精神病症状の改善が相関する結果を示し論文発表した。平成30年度には、さらに脳梁と神経連絡を持つ、脳内の各神経核の体積の縦断的変化やこれら神経核も発症閾値下の精神症状の発現阻止や改善と関連するかを調べた。その結果、(1)Baselineの時点でARMS非発症群と健常群の間で被殻の有意な体積の差を認めた。これは、これまで偽陽性と考えられてきた非発症群においても脳梁との関連が示唆される部位でアブノーマリティーが生じていることを示すものである。(2)さらにARMS非発症群において側坐核の体積の1年間の縦断的な増加が、閾値下の精神病症状の1年間の改善に回帰した。これも、脳梁との関連が示唆される部位にも回復力(レジリエンス)が備わっていることを示す結果である。これらの結果は、論文にまとめられ、Psychiatry Research: Neuroimagingに掲載された。研究計画は概ね順調に達成されてきた。上述のように、既に、一部研究成果は国際学会や論文で発表を終えている。しかし、研究を進めてきた中、脳梁のみならず、脳梁と神経連絡を有する側坐核などの神経核も、発症閾値下の精神症状の発現阻止や改善と関連することが明らかになった。そのため、研究計画の仮説を完全に立証する上で、関連する神経核と脳梁の関係性につき、さらに解析する必要が生じた。その上で、統計学的な有意性を担保するために被験者(ARMS群、健常群)を追加で募集し規模を増して再解析を行う必要性が生じた。これら研究計画の見直しのため、補助事業期間の延長が必要と判断し申請した。平成31年度(令和元年度)は、脳梁と被殻、尾状核や側坐核など他の脳部位との体積の変化の縦断的関連を明らかにすることを予定している。複数部位の解析を行うことから、統計学的な妥当性を得るため、さらにARMSや健常者の症例数を増やす必要がありARMS症例と健常者の募集の継続を予定している。また、引き続きBaselineから一年経ったARMS症例に対しても、baselineと同じく脳MRI T1強調画像を撮像し、SOPSにより52週の時点の精神症状の評価を行う予定である。これらの結果がまとまり次第、学会発表或いは、論文作成を行うことを予定している。研究参加への同意を得た後、baseline時として、脳MRIにより、ARMS群と健常群のT1強調画像を撮像した。また、ARMS症例のbaseline時の精神病閾値下の精神病症状の評価をThe Scale of Prodromal Symptoms (SOPS)により行った。ARMS症例はユースクリニックや早期精神病症例やARMS症例を対象としたデイケアユニットであるイルボスコで経過を追った。非薬物療法的介入を原則としたが、著しい精神状態の変化や自殺企図等の切迫した状況が差し迫った場合には少量の抗精神病薬も処方した。一年間の観察期間の精神病への移行はSIPSにより定期的に調べ、一年間で精神病への移行が認められた群をARMS発症群、認められなかった群を非発症群とした。Baselineから一年経ったARMS症例に対しては、baselineと同じく脳MRI T1強調画像を撮像するとともに、SOPSにより52週の時点の精神症状の評価を行った。当該年度においては既に、ARMS症例30症例以上で2回目(52週)のMRI撮像とSOPSによる評価を終えている。さらに、これらのデータを詳細に解析するため、研究協力者であるMelbourne NeuropsychiatrycentreのChristos Pantelis教授の協力のもとMRI画像データの解析方法についての検討も終えている。既に、ARMS症例30症例以上で2回目(52週)のMRI撮像とSOPSによる評価を終えており、さらに解析方法も概ね検討を終えていることから、順調に進展していると判断している。平成28年度は、前年度に続き、精神病発症危険状態(At risk mental state; ARMS)群と健常者群の募集を行った。一年間(52週)の観察期間での精神病への移行はSIPSにより定期的に調べ、一年間で精神病への移行が認められた群をARMS発症群、認められなかった群を非発症群とした。Baselineから52週経ったARMS症例に対しては、baselineと同じく脳MRI T1強調画像を撮像するとともに、SOPSにより52週の時点の精神症状の評価を行った。平成28年度において、既にARMS症例は40症例を超え、統計解析の施行が可能な症例数に達したため、研究協力者であるMelbourne NeuropsychiatrycentreのChristos Pantelis教授の指導のもと、Melbourne大学にて画像統計解析を行った。

具体的には、(1)Baselineの時点でのARMS非発症群、ARMS発症群と健常群の三群間のそれぞれの脳梁anterior, mid anterior, central, mid posterior, posteriorの体積を調べ、これまで偽陽性と考えられてきた非発症群と健常者との生物学的相違の有無を明らかにした(横断的研究)。(2)次にARMS発症群と非発症群の二群間の一年間の閾値下の精神症状の変化及び、脳梁anteriorposteriorの体積の変化の縦断的相違を明らかにした(縦断的研究)。(3)さらにARMS非発症群の脳梁anteriorposteriorの体積の1年間の縦断的な変化が、それぞれの群の閾値下の精神症状の1年間の変化に回帰するかを明らかにした。これらの結果は、論文にまとめ、現在Neuroimageに投稿中である。当初より平成28年度は、前年度に続き、精神病発症危険状態(At risk mental state; ARMS)群と健常者群の募集とを行うとともに、Baselineから一年経ったARMS症例に対しても、baselineと同じく脳MRI T1強調画像を撮像し、SOPSにより52週の時点の精神症状の評価を行う予定であった。これらの結果は、研究を計画した段階で目標とした結果と概ね一致するものであった。現在Neuroimageに投稿中であり、研究計画通りに順調に進捗していると判断する。平成29年度も、前年度に続き、精神病発症危険状態(At risk mental state; ARMS)群と健常者群の募集を行った。一年間(52週)の観察期間での精神病への移行と発症閾値下の精神症状は、SIPSにより定期的に調べ、一年間で精神病への移行が認められた群をARMS発症群、認められなかった群を非発症群とした。健常群とARMS症例に対しては、研究への参加時(Baseline)に、脳MRI T1強調画像を撮像した。また、ARMS症例に対しては、SOPSにより精神症状の評価を行った。52週経った時点で、ARMS症例に対しては、再度、脳MRI T1強調画像の撮像とSOPSによる精神症状の評価を行った。既に平成28年度においてARMS症例は40症例を超え統計解析の施行が可能な症例数に達していたため、平成29年度は、10月14日21日に研究協力者であるMelbourne NeuropsychiatryCentreのChristos Pantelis教授の指導のもと画像統計解析を行い、以下の結果を得た。(1)Baselineの時点でARMS非発症群と健常群の間で脳梁のmid anterior, central, mid posteriorで有意な体積の差を認めた。これは、これまで偽陽性と考えられてきた非発症群においても生物学的なアブノーマリティーが生じていることを示唆するものである(横断的研究)、(2)さらにARMS非発症群において1年間の閾値下の精神症状の改善に脳梁centralの体積の1年間の増加が有意に回帰した。これは、脳には生物的な回復力(レジリエンス)が備わっていることを示唆する結果である(縦断的研究)。これらの結果は、論文にまとめられ、Psychiatry Research: Neuroimagingに掲載された。平成29年度は論文投稿を目標とした。
アトピー性皮膚炎患者由来iPS細胞を用いた病態解析および治療法の研究

本年度は、赴任した大学での実験開始の準備を整え、倫理審査の結果を待っていたが、審査が長引いて実施に至らなかった。実験できない期間は、久留米大学の共同研究者に日常の細胞メンテナンスを依頼し、月に1度の出勤の際に、自分でも細胞保存管理の確認を継続した。実施環境は整えていたが、倫理審査に時間がかかり、研究実施に至らなかった。翌年度から、もともと実験を行っていた久留米大学へ戻ることが決定したため、期間を1年延長して、実験を再開する。第一段階として、iPS細胞から表皮細胞・線維芽細胞への分化法の確立と健常人・患者由来細胞の相違点の確認を行う。第2段階としては、それらの細胞を用いた3D皮膚培養を行い、健常人・患者での相違を再度確認する。次に第3段階として、両者の相違から治療につながる分子の同定を行うことを想定している。まず、日本皮膚科学会にて、研究概要の発表を行った。その後、異動先では、研究環境整備のみで実際の実験は遂行できなかった。そのため、研究分担者は、これから必要になると思われる試薬や備品の購入とiPS細胞保存のみ実施した。今後の研究遂行に関して、前所属の久留米大学での実施が必要になると思われるため、数回の打ち合わせを行った。所属異動に伴い、研究実施環境の再整備が必要になったため。樹立したiPS細胞を皮膚細胞への分化を行う前に、久留米大学に保存中のiPS細胞の品質をチェックした。方法は染色体分析、免疫蛍光染色、ウエスタンブロットの3つを用いた。(1)iPS染色体分析:長期保存中の患者血液由来iPS細胞の培養を再開し、染色体分析を行った。分析したものはいずれも、46,XXの正常核型であった。(2)免疫蛍光染色(IF):カバーグラス上に培養したiPS細胞を用いて、iPS細胞に発現しているNanog, Oct, Sox2, SSEA4, TraI60について、免疫蛍光染色を行った。5種類すべてのタンパクの発現を認めた。(3)ウエスタンブロッティング:培養iPS細胞のタンパクを抽出し、IFと同様に5種類のタンパクについてウエスタンブロットを行った。IFと同様、5種類とも発現が認められた。(1)(3)の結果は、iPS細胞樹立直後の結果と同様であり、長期保存中の樹立iPS細胞の品質に問題はないと考えられた。転出先の岩手医科大学では,iPS細胞を用いた実験ができず、久留米大学へ短期出張することで、保存中のiPS細胞の品質チェック実験のみしか行えなかったため。転出大学の状況に合わせ、まずは購入したiPS細胞細胞を用いた表皮細胞での分化・誘導実験を行う予定となる。分化・誘導の詳細な方法を確立したのち、分担研究者が所属している久留米大学皮膚細胞生物学研究所において、患者由来iPS細胞を用いた病態解析実験に移行する予定である。現在の勤務先である聖マリアンナ医科大学では実験が可能であるということから、現在倫理審査申請中である。承認後直ちに実験を再開する。当該年度にiPS細胞の品質確認は終了しているので、分化実験のところから開始予定である。所属異動に伴い、研究実施のための環境整備を行わなければならなくなったから。(理由)転出先の岩手医科大学で実験ができなかったため、計画していた実験のうち、一部しか実施していない。(使用計画)主に、細胞培養、リアルタイムPCR、免疫蛍光染色、ウエスタンブロットに必要な試薬・消耗品に大部分を使用する予定である。その他、成果発表のための学会参加費および旅費・宿泊費、および研究分担者との打ち合わせのための旅費などに充てることを計画している。予期せぬ所属変更によりこれまで研究がほとんどできていなかったが、今年度は従来所属していた大学へ戻ることが決定し、研究再開が可能となったことから研究期間を1年延長したため、次年度使用の必要性が生じた。ほとんどは実験再開に伴う、試薬・消耗品に充てる。また、予算の一部は、得られた研究成果を発表、または当該分野の現在の状況を把握するための、学会・研究会の旅費・参加費に充てる。本年度から所属大学の設備に合わせた実験をスタートし、まずは表皮細胞への分化・誘導の部分を行う予定としている。当初はそのために必要な試薬や消耗品の購入に充てる。また、その後に行う健常人・および患者由来iPS細胞については、保存している期間が長かったため、品質確認から開始し、試薬・消耗品購入に充てる。

また、所属大学でできない部分は前施設である久留米大学で実施することになると思われるため、細胞の保存にかかる費用、実験のための試薬・消耗品および旅費などを支出することになると考えられる。
溺死の診断のためのクローン解析に基づく水棲微生物の血中及び臓器内分布について

溺死の際,どのような水棲の微生物(藍藻,細菌,古細菌,珪藻,鞭毛藻,緑藻など)が,溺水の吸引と共に,体内に侵入ないし増殖しているのか,その情報はあまり明らかにされていない.そこで,本研究では次世代シーケンサーの優れた並列解析能力を利用し,溺死体の体内に侵入したあらゆる微生物を網羅的に解析したいと考えた.そして本研究結果から,我々の設計したプライマーを用いることで,溺死体の血液や臓器中には様々な種類の水棲微生物が侵入していることが世界で初めて明らかとなり,さらにそれらの情報は溺死の診断に役立つことが示された.溺死の際,どのような水棲の微生物(藍藻,細菌,古細菌,珪藻,鞭毛藻,緑藻など)が,溺水の吸引と共に,体内に侵入ないし増殖しているのか,その情報はあまり明らかにされていない.そこで,本研究では次世代シーケンサーの優れた並列解析能力を利用し,溺死体の体内に侵入したあらゆる微生物を網羅的に解析したいと考えた.そして本研究結果から,我々の設計したプライマーを用いることで,溺死体の血液や臓器中には様々な種類の水棲微生物が侵入していることが世界で初めて明らかとなり,さらにそれらの情報は溺死の診断に役立つことが示された.特定の水棲微生物を指標として溺死の診断に役立てる試みはこれまでに数多く報告されている.しかし,実際に溺死体の血液および臓器中にどのような種類の水棲微生物(藍藻,細菌,古細菌,珪藻,鞭毛藻,緑藻など)がどのような割合で,広く存在しているのか明らかにされていない.そこで,これらを明らかにするために,本研究ではまず藍藻,細菌及び珪藻(葉緑体)に共通して存在し,最もデータベースが構築されている16S rRNA遺伝子に着目した.即ち,これら微生物の16S rRNA遺伝子には,微生物間で共通する保存領域と,属ないし種レベルでの識別が可能な可変領域が存在する.そこで保存領域に設定した一組のプライマーセットを用いて可変領域を増幅し,ピロシーケンス法を用いて網羅的に解析すれば,難培養性の微生物群も含め広く群集構造を明らかにすることが可能と考えた.特に珪藻以外の水棲微生物についてはその情報があまり明らかにされていないことから,珪藻の少ない水域で溺死した場合に貢献できるのではないかと考えられる.上記微生物間のアライメント解析の結果,可変領域であるV7及びV8領域を挟む位置に,高度に保存された領域が存在し,本研究ではこの領域約300bpを増幅し解析することとした.また上記プライマーを用いてこれまで我々が主に溺死例から単離した細菌48種について増幅を試みたところ,すべてに増幅が確認された.次いで実際の淡水溺死例及び海水溺死例のそれぞれ2例について,血液(左心血,右心血,大腿静脈血),臓器(右肺下葉内部,左肺上葉辺縁部,腎臓,肝臓)及び現場水からDNAを抽出し,目的の領域を増幅させた.今後,100万個のフラグメントを一度に解析可能な次世代シークエンサーGS FLX (Roche)を用いて各試料を解析し,群集構造を明らかにしていく.溺死の際,どのような水棲の微生物(藍藻,細菌,古細菌,珪藻,鞭毛藻,緑藻など)が,溺水の吸引と共に,体内に侵入ないし増殖しているのか,珪藻以外について,その情報はあまり明らかにされていない.そこで,本研究では次世代シーケンサーGS FL XSystem (Roche,454)の優れた並列解析能力を利用し,溺死体の体内に侵入したあらゆる微生物を網羅的に解析したいと考えた.まず藍藻,細菌,古細菌,珪藻,鞭毛藻,緑藻など様々な水棲微生物の16S rRNA遺伝子についてアライメント解析を行った.そしてできる限り多くの種類を,可能な限り属レベルで識別可能な可変領域(増幅領域)及び保存領域(プライマー領域)を決定した.次いでこれまで我々が主に溺死例から単離した細菌72株についてプライマーの有効性を確認した.さらに実際の淡水及び海水溺死例の2例について,血液試料(左心血,右心血,大腿静脈血),臓器試料(右肺下葉内部,左肺上葉辺縁部,腎臓,肝臓)及び水試料(遺体発見現場)から全DNAを抽出・精製した.次いで,各試料中の微生物の可変領域をPCRで増幅後,精製・定量し,エマルジョンPCRを行った.さらに,ピロシーケンスを行いGenome SequencerFLXsystem (454)を用いて各試料を解析した.その結果,我々の設計したプライマーを用いることで,水中死体の血液や臓器中,そして現場水から多様な水棲微生物(Cyanobacteria, Bacillariophyceae (diatom), Cryptophyceae, Dictyochophyceae, Chrysophyceae, Trebouxiophyceaeなど)が検出可能であり,そしてこの解析によって得られた水棲微生物に関する膨大な情報は,実際に溺死の診断を行う際に有力な根拠を示し得ることが示された.