hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
明日をひらく基質支配の化学反応開発

反応はフリーのカルボン酸で進行し、あらかじめカルボン酸をエステル化する必要はない。予定通り、大変に高い不斉収率で反応が進行し、光学活性エポキシドが高収率で得られる。反応後、基質の構造で少し異なるが、カルボン酸は生成するエポキシドを分子内で開裂させ、不斉のヒドロキシ基を持つガンマラクトンになった。不斉の収率は95%以上であり、場合によっては99%となる。全く新しい様式の不斉合成変換反応に成功したのである。それと同時に、創薬でよく用いられるインドール環を持つ化合物にもこの不斉合成反応を適用し、多環式のヘテロ環化合物の不斉合成を試み、これも非常に高い不斉収率で反応が進行することを確認した。カルボン酸の金属塩はカルボン酸鎖の反対側を活性化するのが、通例であり、その意味では単純な水酸基とは全く状況が異なっていた。本プロジェクトは順調に進展し、ほぼ、予想通りの成果をあげた。残念ながら、ガンマ・デルタ不飽和カルボン酸の不斉酸化は挑戦したが反応は進行しなかった。これは本触媒の両金属間の距離が十分ではなく、5-6オングストロームではなく少なくとも7-9オングストロームの距離が必要であったからである。現在、この目的とする配位子の合成に取り掛かっている。不斉収率は現在のところ、チタン触媒を用いているが、必ずしもチタンが良いとは考えられないので、ジルコニウムやハフニウム、さらにはコバルトやマンガン等のエステル交換反応の金属触媒にも可能性を広げ、有効な反応にする。さらには、アミド化反応にも用いることを検討したい。特にタンタルやニオブ触媒の可能性を探る予定である。金属間の距離を広げるには新しい設計概念が必要となる。ここではベンゼン環一つ分を離すことで、この目標を達成すべく、研究を進めている。こうした研究を進めることで、これまで必ずしも十分に研究が進んでいなかった基質支配の有機合成反応が展開すると信じている。また、反応は必ずしも、酸化反応ばかりでなく、エステル化やアミド化をはじめ、種々の炭素骨格合成やアミノ基導入反応にも展開してゆきたい。
酸化的塩基損傷を認識する修復酵素の同定と放射線や活性酸素に対する防御機能の解析

線虫C. elegansの塩基除去修復に関与する酵素(Nth, APN-1, EXO-3),酸化ヌクレオチド分解酵素(NDX-1, NDX-2, NDX-4),ミスマッチ修復酵素(MSH2, MSH6, MLH1, PMS2)とOXRIタンパク質の同定と精製・純化に成功し,その酵素活性を解析するとともにそれらの欠損変異株の性質から酸化ストレスでの防御的機能を明らかにした。さらに,ホヤのNth, APエンドヌクレアーゼの構造・機能を解析した。(1)カタユウレイボヤのAPエンドヌクレアーゼ(CiAPE)を精製し、その特徴を解析した。CiAPEは分子量約34kDaのタンパク質である。CiAPEはテトラヒドロフラン(THF)を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを効率よく切断した。また大腸菌のxth欠損株であるBW9093株を、CiAPEを組み込んだ発現ベクターで形質転換させたところ、その過酸化水素感受性が補完された。これらの結果よりCiAPEはカタユウレイボヤにおいて酸化ストレスに抵抗するようなAPエンドヌクレアーゼ活性を有することが示された。(2)大腸菌MutTのホモログは,酵母をはじめとする真核生物,植物,ヒトやマウスなどの高等動物からも見つかっており,8-oxo-dGTPの除去機能は生命の維持には欠かせないものであると推測される一方で,線虫C. elegansからはこの酵素のホモログが見つかっていない。C. elegansは発生および神経系の研究に適していると考えられモデル生物として用いられるようになったが,実験材料として優れた性質をもつことから酸化ストレスにおけるモデル生物として使えることも期待されており,そのためにストレス応答の機構の解明が現在の課題となっている。今年度の研究では、E. coli MutTやhuman MTHlとアミノ酸配列が相同であるC. elegansの遺伝子の候補を検索し、その中でC. elegans NDX-1は8-oxo-dGTPは分解しないが、8-oxo-dGDPを分解することがわかった。8-oxo-dGTPを分解する酵素は本研究では同定できなかったが、これまでに知られている8-oxo-dGTPaseとはアミノ酸配列の大きく異なった酵素が働いている可能性もあることから、別の実験によるアプローチを試み、数個の候補を得た。現在さらに解析中である。(1) C.elegansは多細胞生物ではあるが、体細胞の数はほかの生物と比較すれば少なく、また成虫まで成長すればその後は細胞分裂を停止する。これらの特徴からC.elegansはその生涯で行う細胞分裂の回数は非常に少なく、ゲノム複製に伴う誤対合の影響がほかのモデル生物と比較して小さく、damage responseの解析に有用である。C.elegansはMMRのホモログとしてMSH2, MSH6, MLH1, PMS2の4つをもっている。これらの遺伝子が欠損することにより自然突然変異の頻度が増大することが示されており、これらがMMRの経路で何らかの役割を果たしている可能性が高い。我々はまずそれぞれの遺伝子の欠損株を入手し、様々なmutagenに対する感受性を調べた。これまでの培養細胞の知見からMSH2, MSH6,MLH1, PMS2の4つは常にセットで働いていると考えられたが、与える損傷の種類やその程度によって感受性が変化することから4つの酵素で行われる経路以外にも、別の経路が存在することが示唆された。さらに寿命の測定から、それらの経路が老化に影響を及ぼしていることが分かった。(2)APサイト(脱塩基部位)は塩基除去修復経路の過程で生じるだけでなく、自然に起こる脱プリン反応によっても断続的に生じている。DNA複製の障害となるほか、分裂しない細胞でも転写の障害となり、細胞の生存に悪影響を及ぼす。APエンドヌクレアーゼはそのようなAPサイトを認識し、3'末端が適切な形になるようにDNAを切断する。我々はカタユウレイボヤにおけるAPエンドヌクレアーゼ(CiAPE)の機能を解明するため,GST融合CiAPE発現系を確立した。次にxth nfo欠損大腸菌にCiAPE発現ベクターを導入し、DNAアルキル化剤MMSおよび過酸化水素に対して抵抗性が回復することを発見した。(1)C.elegansは多細胞生物であるが、体細胞数はほかの生物と比較して少なく、また成虫まで成長すればその後は細胞分裂を停止する。C.elegansはMMRホモログとしてMSH2, MSH6, MLHI, PMS2の4つをもっている。

今年度はそれぞれのmutantのback-crossを行い、そのmutantのストレス感受性調べと4つの遺伝子昆虫細胞発現株を作成し、タンパク質精製を行った。(2)APサイト(脱塩基部位)は塩基除去修復経路の過程で生じるだけでなく、自然に起こる脱プリン反応によっても断続的に生じている。DNA複製の障害となるほか、分裂しない細胞でも転写の障害となり、細胞の生存に悪影響を及ぼす。APエンドヌクレアーゼはそのようなAPサイトを認識し、3'末端が適切な形になるようにDNAを切断する。我々はカタユウレイボヤにおけるAPエンドヌクレアゼCiAPEの発現in situで同定した。また、dominant negative法を用いて、CiAP導入ホヤ株の発生阻害を起こす様子を観察できた。(3)線虫の塩基除去修復欠損株ung, nth, exo-3の二重、三重欠損株を作成し、それらの遺伝子欠損と成長、発生、産卵数、酸化ストレス感受性について調べた。また、Apn-1は細胞核中に存在して、apn-1::GFP導入株と抗体による免疫染色方法で確認できた。Exo-3欠損によって産卵数の減少、そして寿命延長を観察できた。このことは生涯生育数と寿命との影響について線虫でも確認出来た。(4)線虫Ndx-1は8-oxodGDPを分解する活性を持ち、RNAi阻害線虫は酸化ストレス高感受性を示した内容をJournal Biochemistry雑誌上に公表した。(5)ホヤNth遺伝子を同定した、そしてN-末端がタンパク質活性に特に重要であることが分かった。
フラーレンのσ骨格変換反応による新規筒型π電子系化合物の合成と物性探索

カーボンナノチューブの部分構造とも考えられる輪状のπ電子系化合物は、合成化学・材料科学・理論化学など多方面から興味がもたれている。しかし、その実現は極めて困難であり報告例は未だ数例に限られている。本研究では、C_<60>の2箇所に巨大な開口部を構築することにより、筒型構造という従来にないナノチューブの最小基本構造を構築し、その構造と物性の相関を明らかにすることを目的としている。今年度の研究では、筒型化合物の合成を達成するため、理論計算を駆使した分子モデリングを行った。開口部の構築において高い位置選択性を実現することを指向し、様々なスペーサ牧を用いた分子の構造最適化を行い、目的とする位置への付加反応が優先的に進行すると期待される構造を見出した。実際に4段階の反応を経て、開口部形成の反応点を含んだスペーサー構造を構築し、更にフラーレンとの付加反応を行うことによってスペーサーを連結したC_<60>誘導体の合成を達成した。今後はこの誘導体に対する加熱あるいは光照射によって開口部形成を試み、筒型開口部を構築し、目的とする筒型π電子系化合物の合成を達成したい。これらの合成を達成した後は、筒型π電子系化合物をホストとしたゲスト分子の取り込みを試みたい。また、有機薄膜太陽電池のアクセプター材料としての性能を明らかにするため、デバイス作製から評価までを自ら一貫して行い、その応用可能性についても追及していく予定である。カーボンナノチューブの部分構造とも考えられる筒型のπ電子系化合物は、合成化学・材料化学・理論化学・超分子化学など、多方面から興味がもたれている。しかし、その合成は極めて困難であり、報告例は未だ数例に限られている。一方、当研究室では、フラーレンの表面に最大16員環で構成される巨大な開口部を効率的に設ける手法を既に開発しており、最近では開口C60誘導体が有機薄膜太陽電池のアクセプター材料として有用であることを見出している。そこで、本研究ではこれまでの知見を基に、C60の2箇所に巨大な開口部を形成することで筒型のナノチューブ最小モデルを構築し、その構造と物性の相関を明らかにする。さらに、筒型π電子系化合物をゲストとして利用する超分子化学への応用や、有機薄膜太陽電池のアクセプター分子として展開することを目的としている。筒型のπ電子系化合物の合成戦略として、まずピリダジンユニットを適切な長さのスペーサーで連結した分子を設計し、これを鋳型に用いてC60に位置選択的に開口部を形成させる。次いで、スペーサーを除去した後、酸化反応、硫黄挿入反応による開口部の拡大により、筒型のナノチューブ構造をもつ誘導体に導くことを考えた。鋳型とするピリダジン誘導体の合成を目指し、ビフェニル構造をスペーサー部位にもつ誘導体を合成した。すなわち、市販の出発原料とジクロロピリダジンとの根岸クロスカップリング反応を鍵として、非対称なピリダジン誘導体を合成した後、系中で発生させた酸ハロゲン化物との反応によってスペーサーを導入した。しかし、この鍵化合物は極めて剛直な分子であることから、一般的な有機溶媒に対して不溶で、C60との反応の解析は困難であると予想された。そこで、反応の位置選択性を保証した上で、適度な柔軟性をもつと予想されるフェニレン構造をスペーサーとする誘導体を合成したところ、クロロホルムなどの溶媒に可溶であることがわかった。今後は、この誘導体とC60の反応を実際に検討し、筒型π電子系化合物の合成を達成したい。研究の鍵化合物であるスペーサーを有する分子の合成を達成したため、おおむね順調に進展していると考える。途中、合成した分子の溶解性が予想以上に悪いという問題があったが、様々なスペーサーに対するスクリーニングを、理論計算を用いて迅速に行い、すぐに溶解性と反応の位置選択性を兼ね備えたスペーサーを導き出した上で実際に合成を達成している。

今後は、設計し直した分子を用いた反応を行う事で、目的である筒型の構造をもつ分子の合成が達成できると期待される。今後の最初の取り組みとしては、合成した誘導体を用いて、C60に位置選択的に開口部を形成させる検討である。その際、高温での反応のため、期待される位置選択性が達成されているかを慎重に検討する必要がある。一方、単離した化合物の構造決定は、位置選択的に反応を達成したことを証明するために特に力を入れて達成したいと考えている。
新規病原性因子CVFによる細菌間で共通した病原性発動システムの解明

黄色ブドウ球菌のcvfA遺伝子(SA1129)はカイコ感染モデルを用いて我々が同定した病原性制御遺伝子である。CvfAタンパク質はRNAの3'末端に生じる2', 3'ホスホジエステル結合を分解する活性を有する。cvfA遺伝子欠損株においては、黄色ブドウ球菌の全遺伝子の20%の発現が親株に比べて変化していた。さらに我々は、cvfA遺伝子欠損株の表現型がエキソヌクレアーゼをコードするpnpA遺伝子の欠損により回復することを見出した。従って、CvfAはエキソヌクレアーゼPnpAと協調して働くと考えられる。CvfBが新規構造を有するRNA結合タンパク質であることを明らかにした。cvfCが核酸代謝に影響を与える事を明らかにした。黄色ブドウ球菌は鞭毛を持たないグラム陽性球菌である。鞭毛を持つ細菌は鞭毛を用いて、固体表面上を移動する能力を持っている。細菌の鞭毛による移動能力は病原性に必要である事が知られている。黄色ブドウ球菌は鞭毛を持たない事から、近年まで移動する能力を持つとは考えられていなかった旨。申請者らは、寒天濃度を薄くする事により、その上で黄色ブドウ球菌が移動する事を最近見出し、C-olony Spreading (滑走)と名付け、国際誌に報告した。滑走には細胞壁、及び細胞膜のタイコ酸が必要とされる事は分かったが、滑走が黄色ブドウ球菌にとって何の意味があるのかは明らかでなかった。臨床上分離されるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)の滑走能力を検討したところ、多くのMRSAが滑走能力を低下している事を見出した。また臨床上大きな問題となっている市中感染型MRSA (CA-MRSA)の滑走能力は増大していることを見出した。申請者はこの滑走能力の違いを導く遺伝子が、メチシリン耐性能を賦与する遺伝子であるmecAの近傍にある機能未知遺伝子であることを見出した。申請者らはこの遺伝子を持つと菌が動かなくなることから、遺伝子の名前をfudoh (不動)とした。また、fudoh遺伝子は、滑走能力を抑制するだけでなく、黄色ブドウ球菌の病原性をも抑制した。最近、申請者らは、fudoh遺伝子が黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成を促進することを見出した。fudoh遺伝子を導入した株の培養液には、バイオフィルム形成を促進する事が知られている接着タンパク質の量が増加し、好中球の破壊に働く細胞溶解毒素Xの量が低下していた。毒素Xの欠損株はバイオフィルムを形成するが、滑走能力を著しく低下していた。従って、毒素Xの量の低下がfudoh遺伝子を持つ黄色ブドウ球菌の滑走能力低下を説明する。毒素Xの量の低下は放出段階での異常によることが示唆されたため、細胞膜の脂質の検討を行ったところ、fudoh面遺伝子の導入は極性脂質の組成を変化させることが分かった。fudoh遺伝子は、脂質組成を変化させる事により、細胞外放出タンパク質の量を変化させ、MRSAの滑走を抑制し、バイオフィルム形成を促進すると考えられる。本研究で明らかとなったfudoh遺伝子によるMRSAの病原性の調節メカニズムは、MRSAの宿主適応の理解、及び抗MRSA療法の開発を行う上で極めて有用だと考えられる。既に我々はカイコ感染モデルを用いて、黄色ブドウ球菌の新規病原性遺伝子、cvfA、cvfB、cvfCを3つ同定している。CvfAはRNAの3'末端の環状リン酸ジエステル結合を分解する事が明らかになった。また、cvfA遺伝子欠損株の表現型がRNA分解酵素PnpAの破壊によって回復することが明らかとなった。さらに、PnpAは、CvfAの基質である2',3'-環状型RNAは分解するが、CvfAの分解産物である3'-P型のRNAは分解できないことが明らかとなった。すなわち、CvfAはRNAの3'末端の構造を変えることにより、特定のRNAの安定性を変化させ、病原性の調節に働くと考えられる。一方、cvfBの機能解析については、リコンビナントCvfBタンパク質がpoly(U)結合活性を有する事、並びにCvfBの結晶構造解析から、CvfBが新規の構造を持つRNA結合タンパク質であることが明らかとなった。また、cvfCにっいては、遺伝学的解析から、ヌクレオチド合成酵素であるthyAの発現を介して、黄色ブドウ球菌の界面活性剤耐性と溶血毒素産生に寄与することが明らかとなった。
フローサイトメトリー法を用いた細菌の抗菌剤感受性迅速診断装置の開発

(1)検出装置の開発抗菌剤感受性結果の迅速化にあたり、細菌等の微少粒子を鋭敏に検出できる装置としてフローサイトメトリー装置を開発した。この装置は検体7.8μl中に含まれる総粒子数と1万粒子迄の各粒子の前方散乱光パルス強度(Fsc)とパルス幅(Fscw)及び蛍光強度(Fl)と蛍光強度幅(Flw)が測定可能であった。この装置を用い純培養下の菌液を蛍光染料を用いず測定し、粒子(細菌)のFsc及びFscw情報をパラメーターとして用いたdual-parameter-histogram(DPH)を描画すると、菌種の同定には至らないものの各菌種毎に特定の領域に集まる事を確認した。(2)抗菌剤感受性迅速化細菌の薬剤感受性に伴う細菌粒子数の変化及び細菌のDPHの変化により求める方法を考案した。グラム陰性桿菌ではアルゴンレーザーによるFsc及びFscwが、抗菌剤の感受性の有無により変化する事を発見し、2時間の培養にて抗菌剤の感受性を求める事に成功した。グラム陽性球菌では抗菌剤受性結果の指標になる程のDPHの変化を捕らえることは出来なかったが、最近粒子数の変化により抗菌剤感受性の有無が24時間の培養で求める事が可能であった。以上により、従来法なら約18時間要する所を大幅に短縮が可能になった。(3)細菌尿の診断健常人の尿は夾難物が少ないが、感染症患者の尿は膿尿や細菌尿を認める。また、無菌性膿尿や細菌尿のみを認める患者もいる。これらの鑑別は臨床症状を基に行われるが、最終的な判断は培養結果により、一晩以上の時間を要する。我々は細菌尿の診断の迅速化を目的に細菌尿を培養液に希釈し培養、培養前後で本フローサイトメトリー装置で測定したところ、DPHの培養前後の差し引きで細菌の存在を12時間で確認する事が出来た。(1)抗菌剤感受性迅速診断装置の開発にあたり、まず細菌増殖の形態学的変化を捉える方法を検討した。菌株は以下の13株を検討した(E.coli,E.cloacae,K.pneumoniae,S.marcescens,P.mirabilis,P.vulgaris,P.rettgeri,M.morganii,P.aeruginosa,S.aureus,S.epidermidis,E.faecalis,E.faecium)。37°Cに暖めたMuller-Hinton培地に前日塗布したシングルコロニーをピックアップ、純培養下に増殖の変化を観察した。培養条件として1.5mlマイクロチューブに菌液を1ml注入、マイクロチューブミキサーで激しく振盪した。これらを各菌株につき30分毎にフローサイトメトリーにて測定した。これらを各菌株につき3回同様の実験を行い形態学的変化を検討した。測定して得られた粒子情報をforwardscatter pulse intensity(Fsc)軸およびpulse width(Fscw)軸上で各々プロットしたところ各細菌の鑑別には至らないものの、細菌の増殖する領域とグラム陽性球菌と陰性桿菌ではおおまかな分類が可能であった。また、培養後の各時点と培養開始時とのsubtractionにて細菌の増殖時の変化が明瞭に捉えられ、後に検討予定の臨床検体から直接抗菌剤感受性を得る際に予想される夾雑物の混入に有効と思われた。(2)現在細菌尿の診断に際し臨床症状と尿沈査検査の所見によっているが、細菌を直接検出することは時間的制約があり診療の場ではまだ有効な方法に乏しい。今回尿から直接、抗菌剤感受性結果を得る予備的検討を行った。

臨床的に細菌尿と診断された尿を液体培地に10倍希釈し、その際の細菌の増殖を検討した。結果は菌種によるが12時間で細菌の存在を検出可能であった。(1)抗菌剤感受性迅速化抗菌剤感受性結果の迅速化にあたり、我々は細菌の薬剤感受性に伴う細菌粒子数の変化及び細菌の形態学的変化により求める方法を考案した。グラム陰性桿菌ではアルゴンレーザーによる前方散乱光及び前方散乱光幅が、抗菌剤の感受性の有無により変化する事を発見し、2時間の培養にて抗菌剤の感受性を求める事に成功した。グラム陽性球菌では細菌の形態学的変化を捕らえることは出来なかったが、細菌粒子数の変化により抗菌剤感受性の有無が4時間の培養で求める事が可能であった。以上により、従来法なら約18時間要する所を大幅に短縮が可能になった。(2)細菌尿の診断健常人の尿は夾雑物が少ないが、感染症患者の尿は膿尿や細菌尿を認める。また、無菌性膿尿や細菌尿のみを認める患者もいる。これらの鑑別は臨床症状を基に行われるが、最終的な判断は培養結果によらねばならず、一晩以上の時間を要する。我々はこれらの診断を12時間の培養とDPH(Dual-Parameter-Histogram)の培養前後の差し引きで求める方法を考案した。これにより、細菌の存在の有無を外来で患者を待たせた状態で求める事が可能になると思われた。
両親媒性分子混合系複雑液体の圧力誘起構造相転移における疎水性相互作用と秩序形成

AOT/水/アルカンからなる三元系マイクロエマルションにおいて、アルカンとしてデカン(炭素数10)及びヘキサン(炭素数6)を用いた場合の温度、圧力誘起構造相転移の様子を中性子小角散乱により測定し、この2種類の油による圧力効果の違いについて調べた。その結果、炭素数の変化に伴い、相転移温度、圧力は変化するが、形成される構造はほぼ等しいことが明確になった。この系の構造形成では、膜の自発曲率変化が自己組織化構造を制御することが明らかになってきた。その一つの証拠として、デカン系でもヘキサン系でも換算温度、圧力を導入することによって、様々な温度、圧力条件の構造パラメータのデータを規格化して表現することが可能である。ここでの相分離境界は膜の自発曲率にほぼ対応していると考えることができ、温度、圧力の変化による自発曲率変化が明確である。一方、AOT/水/デカン系における中性子準弾性散乱測定から、圧力上昇による膜の硬化、温度上昇による膜の軟化の傾向を得ることができた。しかしながら、温度上昇、圧力上昇で形成される構造はほぼ等しい。このことから、膜の弾性率はマイクロエマルション系の構造形成に重要であるが、今回測定した温度、圧力領域においては、膜の自発曲率変化によって構造形成が制御されていると考えることができる。さらに、AOT/水/デカン系の球状粒子濃度変化による構造変化を中性子小角散乱により調べた。これまでは、希薄系から濃厚系に至る濃度領域においての統一的な解釈の方法が確立されていなかったが、今回、中性子小角散乱データの新しい解析方法を提案し、測定した全濃度範囲において統一的な解釈を行うことができた。その結果、球状粒子濃度が60%以下の領域では、球状粒子半径は一定で、その濃度だけが変化しているが、60%を超えると、球状粒子の形状が変化している様子をとらえることに成功した。体積分率が約20%の陰イオン性界面活性剤AOT(dioctyl sulfosuccinate sodium salt)を体積分率約40%の水と油と共に混合した液体はマイクロエマルションと呼ばれ,室温常圧で均一な液体となる.その時の構造は濃厚な油中水滴構造であることが知られている.これまでの研究から油としてデカンを用いた場合,温度上昇,圧力上昇に伴い,水滴構造からラメラ構造への相転移が観測されることがわかっていた.この相転移のメカニズムは温度上昇と圧力上昇の場合は異なっている.圧力上昇による相転移のメカニズムを解明するためには,AOTの疎水鎖と油分子の相互作用について明確にする必要がある.そこで,今年度は,油としてヘキサンを用いたときの温度,圧力誘起構造相転移について中性子小角散乱により測定を行った.その結果,温度上昇,圧力上昇に伴い,デカンの場合と同様に,水滴構造からラメラ構造への相転移が観測された.ヘキサン系の場合,転移温度,転移圧力がデカンの場合より高いため,現有の圧力容器では高温,高圧相の観測は難しいことが明らかになった.得られた構造パラメーターの相転移点以下の振る舞いは,温度上昇か圧力上昇かに依らず換算温度,圧力を用いることによってスケールする事ができる.これはデカンの場合と同様である.また,このパラメーターを油の密度に対してプロットしてみると,圧力上昇による構造パラメーターの変化の仕方は,単純に密度変化の効果だけで現すことはできない.このことから,圧力誘起構造相転移のメカニズムとして,油の密度変化の他に,AOTの疎水基間の相互作用の増大が見込まれる.そのメカニズムはまだ明らかでない.この点を明らかにするため,来年度は,溶媒の粘性率の圧力依存性を測定し,更に中性子小角散乱を用いて他の油を用いたときの圧力誘起構造相転移の様子を観測する.これにより溶媒の種類と圧力誘起構造相転移の詳細な描像を比較検討し,この転移のメカニズムを明らかにしたい.AOT/水/アルカンからなる三元系マイクロエマルションにおいて、アルカンとしてデカン(炭素数10)及びヘキサン(炭素数6)を用いた場合の温度、圧力誘起構造相転移の様子を中性子小角散乱により測定し、この2種類の油による圧力効果の違いについて調べた。

これまでは、希薄系から濃厚系に至る濃度領域においての統一的な解釈の方法が確立されていなかったが、今回、中性子小角散乱データの新しい解析方法を提案し、測定した全濃度範囲において統一的な解釈を行うことができた。その結果、球状粒子濃度が60%以下の領域では、球状粒子半径は一定で、その濃度だけが変化しているが、60%を超えると、球状粒子の形状が変化している様子をとらえることに成功した。
若者の就労支援活動における相互行為の分析

若者就労支援に取り組むNPO組織の協力を得て、2018年7月から2019年3月の間に作業の収録を月1回の頻度で計8回実施した。また、2回イベントに参加した。1.収録:1回につきチームメンバー2名が現地に赴き、次の場面のビデオ撮影と音声録音を行った。(1)屋内の内職作業:ラベルの袋詰め(ラベルを規定枚数に分け小袋に入れてテープを貼る一連の作業を各自で行う)およびワイヤーハーネス組み立て(端子に3種類のコードを挿す作業。参加者はコードの種類毎に担当を受け持ち、流れ作業で組み立てる)(2)就労訓練:屋外のアパート清掃(各自持ち場で清掃する)およびレンタル会社の備品整備作業(テント用クロスを広げ、洗剤を吹き付けた後に布で汚れを落とす)。いずれの作業も、スタッフが必要に応じて指示を出す。撮影対象者は利用者、ボランティア、スタッフで内職は18名前後、就労訓練は5,6名。8回の収録時間合計は25時間程度。2.文字化:約160分程度終了。3.分析:各メンバーで関心のある現象の抽出、分析観点の共有、検討を通して、次の点に注目して分析することを確認した。他者と作業を効率的かつ協働的に遂行するために、(1)限られた作業空間をどのように用いているか(作業空間の組織化)(2)作業の進捗をどのように他者に向けて可視化しているか(3)支援の必要性の提示(言語化される/されない場合)がどのようになされるか(4)効率的な作業のやり方がどのように伝播するか。また、利用者にとって運営者間の会話がどのような行為になりうるかについても分析を進める。4)ラポール形成:毎月の撮影では、可能な限り作業に参加し、利用者や運営スタッフ、ボランティアと話すように心がけた。また、NPO団体によるイベント(7月)と団体創設記念セミナー(10月)に参加し、作業から離れた場で関係者と交流する機会を持ち、信頼関係の構築に努めた。・多様な作業場面が収録できたことで、若者就労支援のOJTにおける相互行為を多角的に分析する準備ができた。・協力先のNPO団体と、非常に良好な関係が構築でき、継続的に協力いただけることを確認した。1)収録:引き続き収録を月1回ペースで行う2)文字化および分析:これまでのデータをすべて文字化し、各メンバーの関心に基づいて分析を進める。データセッションを随時行い、進捗報告と結果を検討することで、より分析を深める3)成果発表の計画:日本社会学会(10月)および社会言語科学会(3月)で発表する。並行して協力先の関係者を対象に報告会を開催し、分析成果を伝え、フィードバックを受ける若者就労支援に取り組むNPO組織の協力を得て、2018年7月から2019年3月の間に作業の収録を月1回の頻度で計8回実施した。

並行して協力先の関係者を対象に報告会を開催し、分析成果を伝え、フィードバックを受ける1.フィールドの性格上、収録日が前もって確定できない(収録承諾を得られない利用者が参加する作業は収録ができないことから、スケジュール決定と変更が変則的)ため、年度末ぎりぎりまでフィールドまでの旅費を確保しておく必要があった。2.音声データの文字化にかかる費用として予算を確保していたが、協力先から提案された作業現場が複数にわたったこともあり、文字化するデータの優先順位が絞り切れなかったため、翌年度にまとめて文字化することとした。【翌年度の使用計画】翌年度は成果発表のための旅費がかなりかかることが予想されるため、今年度の繰り越し分は、主にデータの文字化と旅費にあてることを計画している。
腎障害形成・進展における硫酸抱合型尿毒素の役割究明を機軸とする尿毒症抑制薬の探索

Sult1a1欠損マウスにおいて,シスプラチン投与に伴う血清及び腎組織中インドキシル硫酸(IS)蓄積が対照マウスに比較して顕著に低減すること,それに伴い腎機能および腎組織内酸化ストレスの蓄積が抑制され,組織障害も軽減されることが判明した.さらに,シスプラチンを投与したSult1a1欠損マウスに,ISを追加投与することにより腎組織中の酸化ストレス蓄積が亢進し,組織病変並びに機能障害が増強(再現)されることを確認した.Sult1a1欠損マウスにおいて,IS蓄積の減少に伴い,インドキシルグルクロナイドの産生が亢進することが観察され,ISの産生(硫酸抱合活性)が抑制された肝内環境においてはグルクロン酸抱合反応が代替的に亢進していることが判明した.肝組織におけるSultアイソフォームのmRNA発現量を比較精査した結果,対照マウス肝においてSult1a1はシスプラチン投与に伴い発現亢進が認められたが,Sult1a1欠損マウス肝組織では発現亢進は観察されなかった.シスプラチン誘発急性腎障害時のIS蓄積上昇の要因として肝Sult1a1の発現亢進が関与すること,シスプラチンによる直接的もしくは尿細管障害を介した二次的影響により肝Sult1a1を誘導する可能性が推察された.腎虚血再灌流処置をしたSult1a1欠損マウスでは,IS追加投与により血清および腎組織中IS蓄積の顕著な亢進が認められた.さらに,腎虚血再灌流処置をしたSult1a1欠損マウスでは,IS追加投与に伴いBUNおよび血清クレアチニンの上昇が観察され,急性期腎障害進展にISが増悪因子として関与していることが判明した.また,虚血再灌流誘発急性腎障害に伴い腎線維化関連因子の遺伝子発現の増加が観察され,この現象にISが活性化因子として関与していること,急性腎障害後の線維化形成過程においてISが増幅的に寄与している可能性が示唆された.硫酸転移酵素Sult1a1を遺伝的に欠損したノックアウトマウスSult1a1(-/-)を用い、虚血再灌流処置並びに抗がん剤シスプラチン等の薬剤投与による急性腎障害惹起試験を実施し、腎臓の機能的障害・病理的損傷を中心とする病態情報、血液・組織中の硫酸抱合型尿毒素の蓄積変化、血清・腎組織中の酸化ストレス発生変化、酸化ストレス防御反応、腎線維化・尿細管障害等の分子・病理的変化等について、対照動物と比較精査することにより基礎データを集積した。いずれの急性腎障害モデルマウスにおいても、Sult1a1欠損により腎障害の軽減・防御効果が明確に観察され、インドキシル硫酸が障害増悪・進展因子として直接的に関与していることをはじめて見出した。H29年度は、概ね期初の計画通りに研究展開しており、得られた新規成果を踏まえて次年度の計画を予定通り遂行する予定である。既に確立したインドキシル硫酸産生系を用いたin vitroスクリーニング法(特許取得済み)を活用し、共同研究提携企業が保有する化合物ライブラリから定性的・定量的にSult1a1阻害活性を示す化合物を探索し、シーズとなる候補薬物の選定試験を展開する。本スクリーニング法はp-クレジル硫酸の産生活性にも応用可能であることを既に検証済みである。本スクリーニング系は、肝臓より遠沈・分離によりS9画分を精製した後、インドールもしくはp-クレゾール添加による尿毒素の代謝・産生活性を定量測定する反応系である。β-NADPH(還元型ピリジンヌクレオチド)やPAPS(ホスホアデノシンホスホ硫酸)の添加条件等の設定は確立済みである。インドキシル硫酸と同時に、CYP2E1/CYP2A6により産生されるインドキシル、インドキシルグルクロン酸抱合体(インドキシルのエスケープ抱合体)についても定量測定する。Sult1a1欠損マウスを用い、腎障害惹起性薬剤アデニンの投与(経口投与)による慢性腎臓病の病態モデルを作成し、腎機能・組織変化について比較精査を行う。本疾患モデルマウスは、CKD類似病態形成に概ね8-9週間程度を要するため、経口投与期間、投与量・投与間隔等の投与条件並びに血清・組織採取スケジュールの綿密な試験設定を行う。対照C57BL/6マウスおよびホモ接合体Sult1a1欠損マウスを用い、生理食塩水投与のみ行う対照マウス(C57BL/6,コントロール群)、アデニン投与マウス(慢性腎臓病モデル群)の各グループを作成する。Sult1a1欠損マウスにおける腎機能変動、抗酸化ストレス防御転写因子Nrf2の活性化現象、腎組織障害の改善度並びに毒性の評価を行う。特に、評価項目として血清中並びに組織中インドキシル硫酸及びp-クレジル硫酸濃度、腎機能マーカー(血清クレアチニン(sCr)、血清尿素窒素(BUN))、腎障害関連バイオマーカー(Kim-1、Ngal、L-FABP、尿中アルブミン)、肝障害マーカー(AST,ALT)について比較精査を行う。インドキシル硫酸の腎不全進展作用を確認するため、比較対象としてAST-120(クレメジン)を用いて比較試験を実施し、腎機能保護効果及び腎障害進展度について検証する。Sult1a1欠損マウスにおいて,シスプラチン投与に伴う血清及び腎組織中インドキシル硫酸(IS)蓄積が対照マウスに比較して顕著に低減すること,それに伴い腎機能および腎組織内酸化ストレスの蓄積が抑制され,組織障害も軽減されることが判明した.

さらに,シスプラチンを投与したSult1a1欠損マウスに,ISを追加投与することにより腎組織中の酸化ストレス蓄積が亢進し,組織病変並びに機能障害が増強(再現)されることを確認した.Sult1a1欠損マウスにおいて,IS蓄積の減少に伴い,インドキシルグルクロナイドの産生が亢進することが観察され,ISの産生(硫酸抱合活性)が抑制された肝内環境においてはグルクロン酸抱合反応が代替的に亢進していることが判明した.肝組織におけるSultアイソフォームのmRNA発現量を比較精査した結果,対照マウス肝においてSult1a1はシスプラチン投与に伴い発現亢進が認められたが,Sult1a1欠損マウス肝組織では発現亢進は観察されなかった.シスプラチン誘発急性腎障害時のIS蓄積上昇の要因として肝Sult1a1の発現亢進が関与すること,シスプラチンによる直接的もしくは尿細管障害を介した二次的影響により肝Sult1a1を誘導する可能性が推察された.腎虚血再灌流処置をしたSult1a1欠損マウスでは,IS追加投与により血清および腎組織中IS蓄積の顕著な亢進が認められた.さらに,腎虚血再灌流処置をしたSult1a1欠損マウスでは,IS追加投与に伴いBUNおよび血清クレアチニンの上昇が観察され,急性期腎障害進展にISが増悪因子として関与していることが判明した.また,虚血再灌流誘発急性腎障害に伴い腎線維化関連因子の遺伝子発現の増加が観察され,この現象にISが活性化因子として関与していること,急性腎障害後の線維化形成過程においてISが増幅的に寄与している可能性が示唆された.硫酸転移酵素Sult1a1を遺伝的に欠損したノックアウトマウスSult1a1(-/-)を用い、虚血再灌流処置並びに抗がん剤シスプラチン等の薬剤投与による急性腎障害惹起試験を実施し、腎臓の機能的障害・病理的損傷を中心とする病態情報、血液・組織中の硫酸抱合型尿毒素の蓄積変化、血清・腎組織中の酸化ストレス発生変化、酸化ストレス防御反応、腎線維化・尿細管障害等の分子・病理的変化等について、対照動物と比較精査することにより基礎データを集積した。いずれの急性腎障害モデルマウスにおいても、Sult1a1欠損により腎障害の軽減・防御効果が明確に観察され、インドキシル硫酸が障害増悪・進展因子として直接的に関与していることをはじめて見出した。H29年度は、概ね期初の計画通りに研究展開しており、得られた新規成果を踏まえて次年度の計画を予定通り遂行する予定である。既に確立したインドキシル硫酸産生系を用いたin vitroスクリーニング法(特許取得済み)を活用し、共同研究提携企業が保有する化合物ライブラリから定性的・定量的にSult1a1阻害活性を示す化合物を探索し、シーズとなる候補薬物の選定試験を展開する。本スクリーニング法はp-クレジル硫酸の産生活性にも応用可能であることを既に検証済みである。本スクリーニング系は、肝臓より遠沈・分離によりS9画分を精製した後、インドールもしくはp-クレゾール添加による尿毒素の代謝・産生活性を定量測定する反応系である。β-NADPH(還元型ピリジンヌクレオチド)やPAPS(ホスホアデノシンホスホ硫酸)の添加条件等の設定は確立済みである。インドキシル硫酸と同時に、CYP2E1/CYP2A6により産生されるインドキシル、インドキシルグルクロン酸抱合体(インドキシルのエスケープ抱合体)についても定量測定する。Sult1a1欠損マウスを用い、腎障害惹起性薬剤アデニンの投与(経口投与)による慢性腎臓病の病態モデルを作成し、腎機能・組織変化について比較精査を行う。
4D DSA画像とCFDを応用した脳動脈瘤内の血流解析アプリケーションの開発

医療用ワークステーション内に特殊なフォーマットで圧縮保存された4D-DSA画像を解凍し,撮影タイミング毎の3D画像として出力する手法を確立した.また,撮影された血管内のある領域における造影剤密度を抽出しグラフ化するまでの作業を,ほとんど自動化することに成功した.この作業の自動化は,将来的に多くの症例に対して本研究を応用する,あるいは本研究の成果を医療用ソフトウェアとして発展させる際に重要となる.さらに,CFD解析で流入面とする位置でのtime-intensity(TI)曲線(時間と造影剤密度の関係)の作成法と,それに基づき,流入条件の波形の位相,心拍数を得る手法を確立した.まず,医療用ワークステーション内に特殊なフォーマットで圧縮保存された4D DSA (4-Dimensional Digital Subtraction Angiography)画像を解凍し,撮影タイミング毎の3D画像として出力する手法を確立した.この意義は,撮影タイミングごとに画像を処理できるようにすることであり,造影剤密度の変化を解析するために必要な工程である.また,撮影された血管内のある領域における造影剤密度を抽出しグラフ化するまでの作業を,ほとんど自動化することに成功した.この作業の自動化は,将来的に多くの症例に対して本研究を応用する,あるいは本研究の成果を医療用ソフトウェアとして発展させる際に重要となる.ただし,現状では,造影剤密度の抽出に必要な血管の3Dモデルにおける血管中心線の作成を手動で行う必要があるが,将来的にシーメンス社のワークステーションとの連携(後述)を行う際,この機能は既にワークステーションに備わっている,あるいは既に開発済みの機能で代替することが可能である.熱流体解析ソフトウェアSTAR-CCM+を使用し,“mass fraction"という関数を設定することで,血管造影を模擬した血流シミュレーションが可能である.次のステップではこれを応用し,ある血管の区間において,本ソフトウェアによる造影剤の密度変化と,4D画像から抽出した造影剤密度の変化が一致するようにシミュレーションの計算条件(流入あるいは流出条件)を合わせることで,患者固有の計算条件を得ることを試みる.STAR-CCM+により患者個人の計算条件の特定が可能となることが確認できれば,本ソフトウェアと同じシーメンス社のワークステーションと連携させることで臨床用の血流シミュレーションソフトウェアの作成を行う予定である.医療用ワークステーション内に特殊なフォーマットで圧縮保存された4D-DSA画像を解凍し,撮影タイミング毎の3D画像として出力する手法を確立した.また,撮影された血管内のある領域における造影剤密度を抽出しグラフ化するまでの作業を,ほとんど自動化することに成功した.この作業の自動化は,将来的に多くの症例に対して本研究を応用する,あるいは本研究の成果を医療用ソフトウェアとして発展させる際に重要となる.さらに,CFD解析で流入面とする位置でのtime-intensity(TI)曲線(時間と造影剤密度の関係)の作成法と,それに基づき,流入条件の波形の位相,心拍数を得る手法を確立した.29年度が最終年度であるため、記入しない。数値流体力学29年度が最終年度であるため、記入しない。
コードブックパターン認識に基づく画像コンテンツ特定技術の研究

本研究では、簡便な手法で画像特有の特徴量を抽出し類似検索により画像の特定を行うため、ベクトル量子化コードブック空間情報処理に基づく、画像特徴量抽出、理論的な手法によるコードブック作成手法について研究を行った。画像特徴量には、ベクトル量子化により得られたコードベクトルの使用頻度(ヒストグラム)を用いる。まず、入力画像を4×4程度のブロックに分割し、平均値分離処理を行い輝度変化ベクトルに変換する。本研究の認識アルゴリズムは、画素の輝度値そのものではなく、変化の仕方に着目するために輝度変化ベクトルに変換する。次に、輝度変化ベクトルに対してベクトル量子化を実施し、コード番号別に使用頻度を集計し、画像に対するコード番号のヒストグラムを生成する。このヒストグラムが、画像の特徴を表した特徴量、すなわちコードブック空間情報となる。画像認識アルゴリズムをソフトウェアで実装し、PC上で実行したところ、画像に対する回転、反転、拡大、縮小、JPEG圧縮、トリミング、平滑化、先鋭化などのフィルタ処理による改変処理に対して、高い認識精度を持つことが分かった。画像の特徴量をコードブック空間で最適に表現するためには適切なコードブックが不可欠になる。ベクトル量子化に用いるコードブックの作成は、一般的に、学習によるコードブック作成手法と典型パターン抽出による理論的なコードブック作成手法の2つがある。学習による手法は、作成されたコードブックの構成が入力画像に依存して構築されるため、多種の画像に対応できる最適なコードブックを作成することが非常に難しいという問題がある。本研究では、画像認識用のコードブックを理論的なコードブック作成手法により作成した。コードブックの輝度変化は単調変化で、8方向(上下、左右、対角線)と4ステップ(2、8、21、55)の組み合わせである。また、ヒストグラム生成のときに、個々のブロックとその隣接ブロックのコード番号を関連付けることにより、異なる画像間のヒストグラム差が大きくなる結果が得られた。輝度変化の方向に合わせて始点から見た終点の輝度の増分値を与え、線形補間により輝度値を与えることにより作成される。
細胞表面接着型インターフェロンを利用した標的特異的作用型遺伝子治療システムの開発

本研究では細胞表面に高い接着能を持つIFN-γ誘導体を新たにデザインし、遺伝子導入部位でのIFN-γ濃度を選択的に高めるシステムを開発した。開発したIFN-γ誘導体は、細胞表面に接着可能であり、その遺伝子導入を行った臓器において選択的に生物活性を得ることが可能であった。また、本システムは従来のIFN-γ遺伝子治療システムと同等かそれ以上の治療効果を癌モデルマウスで発揮した一方で、従来のIFN-γ遺伝子治療システムにおいて認められた体重減少などの副作用を大幅に軽減することが可能であった。インターフェロン-γ(IFNγ)は強力かつ多彩な生理活性から、癌やウイルス感染などに対する有効な治療薬として期待される。IFNγを持続的に発現するベクターの開発により慢性疾患への応用が進められるが、IFNγが標的部位以外に移行することによる重篤な副作用が懸念される。本研究では細胞表面に高い接着能を持つIFNγ誘導体を新たにデザインし、これを発現するプラスミドベクターを用いてin vivo遺伝子導入を行なうことで、遺伝子導入部位でのIFNγ濃度を選択的に高め、治療効果の増強と副作用の軽減が可能なシステムの開発を目指した。細胞外マトリクスに親和性を有する構造として、extracellular superoxide dismutase由来C末端ヘパラン硫酸結合ドメイン(HBD)、あるいはCD8分子由来細胞膜貫通ペプチド(TMD)を選択し、それぞれとIFNγとの融合タンパク質発現プラスミドベクターを構築した。各プラスミドベクターを用いて培養細胞に遺伝子導入したところ、設計通りにIFN誘導体が細胞表面に滞留することが確認された。そこで、各融合タンパク質発現ベクターをハイドロダイナミクス法を用いてマウスに遺伝子導入したときの肝臓におけるIFNγ生物活性の指標として、IFNγによりそのmRNA発現が誘導されるSOCSlやOASのmRNA発現量を定量した。その結果、HBD融合IFNγは比較的高いIFN生物活性を示したが、TMD融合IFNγはほとんど生物活性を示さなかった。これはそれぞれの融合タンパク質の局在性の違いにより、IFN受容体との相互作用に関する効率が異なったためと推察された。一方、天然型IFNγ発現ベクターを投与した時と比較して、融合タンパク質発現ベクターを投与した際の血中IFNγ濃度は非常に低かったことから、HBDを用いることでIFNγ濃度を遺伝子導入部位である肝臓で特異的に増大することに成功した。インターフェロン-γ(IFNγ)はその生理活性から、癌やウイルス感染などに対する有用な治療薬として適用されることが期待される。IFNγの治療への適用には持続的なIFNγの供給を可能とする遺伝子治療が望ましいが、一方で持続的にIFNγが全身で非特異的に作用することで、標的部位以外における重篤な副作用が懸念される。本研究では細胞表面に高い接着能を持つextracellular superoxide dismutase由来C末端ヘパラン硫酸結合ドメイン(HBD)をIFNγに融合したIFNγ誘導体をデザインし、これを発現するプラスミドベクターを用いてin vivo遺伝子導入を行なうことで、遺伝子導入部位でのIFNγ濃度を選択的に高め、治療効果の増強と副作用の軽減が可能なシステムを開発した。前年度の検討において、HBDを用いることでIFNγ濃度を遺伝子導入部位である肝臓で特異的に増大することが可能であることを見出していた。そこで、本年度はその作用機序をより詳細に評価するとともに、HBD融合IFNγの利用による治療効果について検討した。まず、HBDと細胞外マトリクスとの結合を阻害するヘパリンを用いた検討から、HBD融合IFNγは細胞外マトリクスと相互作用していることを確認した。また、天然型IFNγあるいはHBD融合IFNγ発現ベクターを投与量を変化させて投与したときの肝臓におけるIFNγの生物活性を評価したところ、HBD融合IFNγ発現ベクターが天然型IFNγ発現ベクターと同等の生物活性を得るには約10倍の投与量が必要であった。肝転移腫瘍モデルにおいて治療効果と有害作用を評価したところ、天然型IFNγ発現ベクター投与群では体重減少などの有害作用が認められたが、HBD融合IFNγ発現ベクター投与群では有害事象は認められず、天然型IFNγ発現ベクターと同等以上の抗腫瘍効果を示した。
DExD/H RNAヘリカーゼファミリーの生理機能の研究

DExD/H RNAヘリカーゼファミリーが細胞内で複製するウイルスのセンサーとして機能し、抗ウイルス自然免疫反応を誘導することを見出した。このセンサーとしての機能は、ウイルスの複製の結果生じる特異的な構造のRNAを認識するためであることを明らかにした。また構造生物学的な解析によって比較的小さな、カルボキシル末端側のドメインがこの認識に深く関わっていることを明らかにした。高等動物における抗ウイルスの自然免疫反応はウイルスの増殖、複製を感知するセンサーによって活性化誘導されると考えられている。我々はDExD/H RNAヘリカーゼのひとつであるRIG-Iがこのセンサーであることを発見した。RIG-Iは特徴としてCaspase Recruitment and Activation Domain(CARD)を有していた。ウイルスの複製の結果、細胞質に生じた二重鎖RNAはRIG-Iと結合し、CARDを介して下流に伝達される。これまでにノックアウトマウスの作製、解析によりRIG-Iとその近縁ヘリカーゼであるMDA5は正の制御因子であることを明らかにした。また、RIG-I, MDA5はそれぞれ異なるウイルスを認識するセンサーとして機能することが明らかとなった。このファミリーの3番目のメンバーである、LGP2はCARDを持たず、細胞での過剰発現によってシグナルを抑制したところから、負の制御因子と考えられていた。しかし実際にノックアウトマウスの解析を行うと、LGP2を欠くマウス、およびその細胞はウイルス感染に対する応答が低下していることが明らかとなった。このことはCARDを欠くものの、LGP2も生理的に抗ウイルス応答の正の制御に重要であることを示している。この分子機構、特にヘリカーゼ間の相互連携について今後解析を進める計画である。これらヘリカーゼのノックアウトマウス、特にRIG-I, LGP2は発生過程での異常が観察されており、この発生異常が実際にインターフェロン遺伝子プロモーターの活性化を伴うかについて解析する目的で、インターフェロンプロモーターによって制御されるGFP遺伝子のコンストラクトを作製し、マウス個体での解析に着手した。我々はDExD/H RNAへリカーゼのひとつであるRIG-Iがこのセンサーであることを発見した。RIG-Iは特徴としてCaspase Recruitment and Activation Domain (CARD)を有していた。これまでにノックアウトマウスの作製、解析によりRIG-Iとその近縁へリカーゼであるMDA5は正の制御因子であることを明らかにした。また、RIG-I,MDA5はそれぞれ異なるウイルスを認識するセンサーとして機能することが明らかとなった。RIG-I,MDA5,LGP2の生化学的解析を目的にして昆虫細胞/バキュロウイルスを用いて組換え蛋白質を調製した。RIG-Iは2重鎖RNA並びに5'三燐酸RNAと特異的に結合した。また、3'突出を持つ2重鎖RNAを効率的に解く事が明らかとなったが、センサーとしての活性とは逆相関の関係であった。これらの非自己RNAの認識はRIG-IのC末端のドメインによって決定されており、特に表面に塩基性残基を有するくぼみ構造が重要である事が判明した。長い2重鎖RNAの認識にはMDA5が深く関与していることが示されていたが、今回の分子生物学的、あるいは生化学的な解析からこの認識にはLGP2も関わる事が示唆された。1 RIG-Iは非自己RNAを特異的に識別する重要な機能を果たしているが、この識別がカルボキシル末端に存在する約17kDのドメインによって行なわれていることを明らかにした。さらにこのドメインの結晶構造(文献2番)および溶液構造をNMR法(文献1番)によって明らかにした。またNMRを用いたRNAによる滴定実験によって、このドメインの塩基性に富む片側表面がRNAの特異認識に関与していることを発見した。また、MDA5およびLGP2のカルボキシルドメインの溶液構造を決定した。RIG-IとLGP2の立体構造は特に良く類似しており、RNA認識に関与していると考えられる「RNA結合ループ」の構造が特にこの両者で保存されていた(文献3番)。2ヒトでのRIG-IおよびMDA5の遺伝的多型がデータベースに登録されている。そのうちミスセンス変異、ナンセンス変異によって蛋白質の構造に変化を生じるものについてその機能を解析した。RIG-Iについては一つの変異(S183I)が活性を失い、ドミナントネガティブに阻害効果を示した。この変異を持つ個体は抗ウイルス自然免疫応答が顕著に低いことが予想された。

MDA5に関しては二つの変異(E627*,I923V)が活性を失う変異であることが明らかとなった。これらの変異はI型糖尿病の低リスクとの関連が報告されており、MDA5の活性化とI型糖尿病の発症の関連が強く示唆された(文献4番)。