hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
lamininα3-Gドメインを用いた新規歯周組織再生療法の確立

上皮細胞と結合組織とは、ヘミデスモゾームを構成するアクチンなどの細胞骨格、インテグリンをはじめとする接着蛋白、およびtype 4 collagen、laminin-1、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックスとが協調して、基底膜による強固な結合を形成している。歯が付着部においても、エナメル表面と付着上皮は内側基底板を介して接着することにより歯周組織の恒常性を維持しており、そこにはlamininをはじめとする細胞外マトリックスとintegrinなどの接着タンパクが存在する)。なかでもlaminin-5はα3、β3、γ2の3つのサブユニットで構成され、細胞表面に存在する接着タンパクのintegrin α6β4、integrinα3β1などと共に細胞接着、細胞移動と密接に関与する事が知られている。研究代表者はIn vitroにおいて接着タンパク塗布後の歯肉上皮細胞動態の検索を行った。歯肉上皮初代培養細胞を用いたプラスチックディッシュ上における細胞動態の観察において、リコンビナントのlaminin-5を塗布した群を実験群とし、何も塗布していないものを対照群とした。Ca9-22およびラット歯根膜細胞に関しWound Healing Asseyにて、これらの動態を観察した結果、歯肉上皮細胞、歯根膜細胞双方においてlaminin-5塗布群にてより速い細胞移動が観察された。また、歯根膜細胞、上皮細胞間では細胞移動量に差は生じなかった。免疫組織化学的検索ではlaminin-5塗布群においてintegrinα3、およびintegrinβ4の創傷部断端での発現がるよく認められた。研究代表者はこれらタンパクの発現が歯肉-歯接着部において約14倍と高く発現することをレーザーマイクロダイセクションを用いたmRNAの定量によって証明しており(Kinumatsu et al, 2009)、これらのタンパク発現の制御は歯周治療の成功率を上昇させるであろうと結論付けている。本年度は、歯肉上皮初代培養細胞を用いたプラスチックディッシュ上における細胞動態の観察を行った。リコンビナントのlaminin-5を購入し、同タンパクの有無による細胞動態の観察をおもにおこなった。Ca9-22、ラット歯根膜細胞を用い、CytoSelectTM 24-well Wound Healing Assayにて創閉鎖の比較検討を行った。この際実験群はlamininー5を添加、塗布したグラスディシュとしコントロールは接着タンパクを応用しないものとした。結果としてlaminin-5コート群ではコントロール群と比較しより早い細胞移動が観察された。なおその移動に歯根膜細胞と上皮細胞間で差は生じなかった。免疫染色にてintegrinα3およびintegrinβ4の局在を観察したところ創傷治癒部にてintegrinα3の強い発現が観察された。次年度はこの現象がヒトの細胞でも同様であるかを確認するためヒト口腔上皮細胞および人歯根膜細胞のcelllineを用いて同様の実験を行うとともに、vivoにおける歯周疾患モデルにたいしlaminin-5を応用した際の上皮細胞の動態を観察する予定である。創傷治癒モデルの確立に時間がかかったため、その後のRNA解析等に使用する予定であった金額を使用することができなかったため。前年度予定していた実験については年度前半に終了しこの際に繰越金を使用する。今年度予定されていた実験はその実験と並行して行う予定である。
古社寺保存法時代の特別保護建造物の修理における設計変更の概念の生成とその確立

今年度は古社寺保存法による設計変更後に修理が竣工し、建築の年代と形式が複合することになった特別保護建造物の当初形式を読み解く指標について検討をおこなった。豊楽寺薬師堂は建立年代が仁平元年(1151)頃であり、明治修理の設計変更において近世の厨子が撤去され、須弥壇が改修されたことを明らかにした。その一方で、近世の向拝は、参拝者の便宜を図るという理由で撤去されておらず、小屋組はトラス構造に変更されていた。竹林寺本堂は室町後期(14671572)の建立であるが、設計変更によって移築されていた。近世の厨子と須弥壇は内陣におかれ、向拝が附加されたままであった。小屋材は遺構調査から墨書が確認され、明治修理において取り替えられていたことが判明したが、形式は和小屋である。明治修理による設計変更と維持修理から、建築の年代と形式が複合したものになっていた。新出資料の図面等と設計変更願が発見できたことにより、修理が竣工した建築のなかにも手がかりを見出し、修理内容を検証することにより、当初形式に復原されていないことを明らかにすることができた。豊楽寺薬師堂と竹林寺本堂の事例に、常楽寺本堂、榮山寺八角堂、圓成寺楼門、天恩寺仏殿、唐招提寺金堂を加え、古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物は、建設の年代と形式が複合したものと捉え、設計変更に焦点をあわせ、それ以外の変更と現状維持を把握し、それらを読み解く指標の確立を試みた。古社寺保存法による設計変更は、これまで等閑に付されてきたが、これに焦点をあわせ、それを読み解く指標を確立することで、修理資料を用いた建築史研究の有用性を提示できるようになった。近年の文化財建造物には、年輪年代測定法と放射性炭素年代測定法のふたつの科学的調査が実施されるようになっている。こうした調査に比べて、本研究はひろく知られていない。文化財建造物に指定された寺社は、明治中期から昭和初期に作成された「修理設計書」「設計変更」「精算書」が貴重な建築史研究の資料であることを認識しているとは言い難いところがある。本研究の成果を社会・国民に発信するために学術論文として公開したい。令和元年度は、科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)補助事業期間延長が承認されており、補助事業の目的をより精緻に達成し、学術論文として投稿する。(1)古社寺保存法施行細則にもとづく「修理設計書」「精算書」の資料調査今年度は、「竹林寺保存会箱入文書」の竹林寺本堂の明治修理の「修理設計書」、「本堂敷地変更御願」および「精算書」の「控」について考察を加えた。文書は「控」ではあるが、各工事の仕様書、木工・金工・塗工・葺工・石工の諸経費、監督費の内訳明細に検討を加え、解体修理された特別保護建造物の修理の方針および補足箇所が記載されていること、さらに明治移築に関する新たな知見を提供する重要な資料であることを明らかにした。(2)古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物ごとの資料整理関野貞『古建造物保存事業』(1929)によると、大正12年(1923)の関東大震災において社寺提出の図面や写真が焼失していたが、その後の保存修理事業に伴って修理前と竣工図の作成が再開されたとある。目録には、修理前および竣工後の図面の目録である『国宝・重要文化財建造物保存図目録』(2003)、摺拓本等の目録である『国宝・重要文化財建造物摺拓本等目録』(2001)、修理事業にともなって撮影された写真乾板の目録である『国宝・重要文化財建造物写真乾板目録』(5巻、20042012)が公刊されている。四国地方の四県を対象に、保存図の作成時期や写真の撮影時期は判明しなかったが、概ね修理竣工順ということもおり、その時期を検討した。目録は保存図、摺拓本、写真ごとに個別に公刊されており、特別保護建造物ごとにどのような資料が現存するのかを把握することが困難であった。そこで、古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物ごとに保存図、摺拓本、写真のうち、どの資料が現存するのかを精査し、その時期を確定することで、修理に関する資料整理をおこなった。(1)古社寺保存法施行細則にもとづく「修理設計書」「精算書」の資料調査今年度は「竹林寺保存会箱入文書」のうち、豊楽寺薬師堂の明治修理の「修理設計書」等の考察についても成果をあげており、平成29年度中に発表する予定である。古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物に関する新たな資料を発掘するに至らなかった。(2)古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物ごとの資料整理『国宝・重要文化財建造物保存図目録』『国宝・重要文化財建造物摺拓本等目録』『国宝・重要文化財建造物写真乾板目録』の三つの目録からの資料整理は、四国地方にとどまり、今後は中国地方ならびに九州地方等に広げ、系統的に特別保護建造物ごとにどのような資料が現存するのかを把握し、修理に関する資料整理を継続しておこないたい。

(1)現存する「修理設計書」および「精算書」の分析と特別保護建造物の調査前年度の資料調査から得られた「修理設計書」あるいは「精算書」から修理に関する内容を取りまとめ、得られた知見について検証した。前年度と今年度の資料調査の成果にもとづいて、第一に「修理設計書」および「精算書」の資料的性格の解明、第二に保存図からトラス構造の導入など注目できる修理、第三に設計変更、移築や大規模な増改築について考察を加えた。当初形式の復原は設計変更として取り扱われ、諮問案件で43件が許可とあったが、その詳細について先行研究の成果に着目して検討を加えた。(2)日本建築史研究の著書と論文などから設計変更に関する修理のデータベース化天沼俊一の『日本建築史図録』(全6巻、19331939)は、日本建築史の研究史上重要な著書として周知の存在で、文化財修理に関する独自の見解が述べられ、批判的なコメントが付されていた。服部文雄の「建造物の保存と修理」(『佛教藝術』、第139号、1981)、岡田英男の「修理の技法」(『歴史的建造物の保存』所収、彰国社、1999)、村上訊一の『文化財建造物の保存と修理の歩み』(ぎょうせい、2010)は、個別の事例を取り上げ、修理の内容とその意義について論じられている。以上、先行研究では修理事例の重複が明らかになった。本研究では、古社寺保存法時代における修理に関する記述を検索し、修理物件ごとにデータベースを作成し、設計変更の内容の類型化を試みた。平成29年度はこれまで収集した資料について、その資料的性格を解明したうえで、部材の取替などで調査が困難と指摘されてきた課題などを検証した。さらに先行研究から古社寺保存法時代における修理に関するデータベースを作成し、設計変更に関する全容の解明にむけた研究が進捗中である。今年度は古社寺保存法による設計変更後に修理が竣工し、建築の年代と形式が複合することになった特別保護建造物の当初形式を読み解く指標について検討をおこなった。豊楽寺薬師堂は建立年代が仁平元年(1151)頃であり、明治修理の設計変更において近世の厨子が撤去され、須弥壇が改修されたことを明らかにした。その一方で、近世の向拝は、参拝者の便宜を図るという理由で撤去されておらず、小屋組はトラス構造に変更されていた。竹林寺本堂は室町後期(14671572)の建立であるが、設計変更によって移築されていた。近世の厨子と須弥壇は内陣におかれ、向拝が附加されたままであった。小屋材は遺構調査から墨書が確認され、明治修理において取り替えられていたことが判明したが、形式は和小屋である。明治修理による設計変更と維持修理から、建築の年代と形式が複合したものになっていた。新出資料の図面等と設計変更願が発見できたことにより、修理が竣工した建築のなかにも手がかりを見出し、修理内容を検証することにより、当初形式に復原されていないことを明らかにすることができた。豊楽寺薬師堂と竹林寺本堂の事例に、常楽寺本堂、榮山寺八角堂、圓成寺楼門、天恩寺仏殿、唐招提寺金堂を加え、古社寺保存法時代に修理が竣工した特別保護建造物は、建設の年代と形式が複合したものと捉え、設計変更に焦点をあわせ、それ以外の変更と現状維持を把握し、それらを読み解く指標の確立を試みた。古社寺保存法による設計変更は、これまで等閑に付されてきたが、これに焦点をあわせ、それを読み解く指標を確立することで、修理資料を用いた建築史研究の有用性を提示できるようになった。近年の文化財建造物には、年輪年代測定法と放射性炭素年代測定法のふたつの科学的調査が実施されるようになっている。こうした調査に比べて、本研究はひろく知られていない。文化財建造物に指定された寺社は、明治中期から昭和初期に作成された「修理設計書」「設計変更」「精算書」が貴重な建築史研究の資料であることを認識しているとは言い難いところがある。
土砂の量的・質的構成に基づく流域総合土砂追跡法の開発

本研究では,流入土砂量の他に礫種構成比,X線回折法を用いた細粒土砂の鉱物構成比,細粒土砂の粒径分布比を用いた土砂生産源の追跡方法を開発してきた.また,微地形,土地利用状況,雨滴衝撃エネルギーを考慮して新たな2つのタイプの土砂生産モデルを開発した.本研究では,流入土砂量の他に礫種構成比,X線回折法を用いた細粒土砂の鉱物構成比,細粒土砂の粒径分布比を用いた土砂生産源の追跡方法を開発してきた.また,微地形,土地利用状況,雨滴衝撃エネルギーを考慮して新たな2つのタイプの土砂生産モデルを開発した.本研究では,流入土砂量の他に礫種構成比,X線回折法を用いた細粒土砂の鉱物構成比,細粒土砂の粒径分布と元素構成比,水・土砂・含有有機物の安定同位体比を用いた土砂生産源の追跡方法を開発する.また,本研究では微地形,土地利用状況,風雨の影響を考慮した新たな土砂生産モデルを開発するさらに,既存の土砂流出モデルに新たに開発される土砂生産モデルを結合して流域総合土砂追跡モデルを開発し,その結果と観測結果に基づく土砂源追跡方法を比較して,モデルと観測結果解析方法の両面の精度向上を図る.平成18年度は1-A)比較的大きな粒径の礫種構成比を用いた土砂生産源の把握では,富士川流域において目視で礫種判定できる程度の大きさの礫について,花崗岩や玄武岩などといった礫種を同定し,その構城比を流域内区間や支川毎に算出し,その流下方向の変動を連立方程式にしてその解を求めることで,土砂生産源を追跡し,1-B)X線回折法を用いた鉱物構成比による土砂生産源の把握では,ブランタス川上流域において鉱物組成をX線回折法にて同定し,その構城比を用いて1-A)と同じ方法で土砂生産源を追跡した.さらに同手法を富士川流域に適用し手法間の結果を比較考察した.さらに,1-C)土砂に含まれる水および物質中の酸素,窒素,炭素の安定同位体比分析を富士川流域で行うための解析準備を行い,1-D)細粒土砂の粒径分布の測定方法を確立した.さらに,2)斜面の微地形,土地利用状況,風雨の影響を考慮した新たな土砂生産モデルを組み込んだ流域総合土砂追跡モデルの開発のうち,雨滴が土砂に与えるエネルギーを考慮するための基礎的検討を行い,降雨強度と雨滴衝撃エネルギーの関係を定式化した.本研究では,流入土砂量の他に礫種構成比,X線回折法を用いた細粒土砂の鉱物構成比,細粒土砂の粒径分布と元素構成比,水・土砂・含有有機物の安定同位体比を用いた土砂生産源の追跡方法を開発する.また,本研究では微地形,土地利用状況,風雨,氾濫の影響を考慮した新たな土砂生産モデルを開発する.さらに,既存の土砂流出モデルに新たに開発される土砂生産モデルを結合して流域総合土砂追跡モデルを開発し,その結果と観測結果に基づく土砂源追跡方法を比較して,モデルと観測結果解析方法の両面の精度向上を図る.平成19年度は1-A)礫種構成比を用いた土砂生産源の把握,1-B)X線回折法を用いた鉱物構成比による土砂生産源を富士川流域に適用して,掃流砂量式とも比較して詳細に手法の検討を行った.さらに,1-C)水および物質中の酸素,窒素,炭素の安定同位体比分析を富士川流域で行って安定同位体を用いた土砂生産源追跡手法の検討も始めた.さらに,3)斜面の微地形,土地利用状況,風雨,氾濫の影響を考慮した新たな土砂生産モデルについて,詳細な微地形と土地利用状況を含み,GISと連携して計算可能な氾濫モデルを開発した.日本国内およびアジア域の貯水池の中には,土砂の堆積によって有効貯水容量が減少し,ダム本来の機能を発揮することができなくなる可能性があるものがいくつかある.一方で,貯水池や湖沼などでは土砂に含有する有機物質が嫌気性環境下において腐敗し,止水域の環境を悪化させるという事態も起こっている.また,沖縄などの亜熱帯・熱帯海域では珊瑚礁が赤土流出によって被害を受けている.そのような背景のもと,本研究では,流入土砂量の他に礫種構成比,X線回折法を用いた細粒土砂の鉱物構成比,細粒土砂の粒径分布,水・土砂・含有有機物の安定同位体比を用いた土砂生産源の追跡方法を開発してきた.また,微地形,土地利用状況,雨滴衝撃エネルギー,風雨の影響を考慮して新たな2つのタイプの土砂生産モデルを開発した.まず,比較的大きな粒径の礫種構成比を用いた土砂生産源の把握,X線回折法による鉱物構成比を用いた土砂生産源の把握,土砂に含まれる水および物質の同位体分析による土砂生産源の把握の開発を行った.その際の研究対象地域を富士川全流域,インドネシア・ブランタス川,ネパール・シワリックヒルとした.さらに,沖縄においては種々の雨滴計と既存の最先端偏波ドップラーレーダーを用いて詳細な雨滴衝撃エネルギーが赤土流出に与えているエネルギーを調査した.一方,流域総合土砂追跡モデルの開発では,側岸浸食や氾濫の効果も入れたモデルを開発し,メコン川流域を対象にして数値実験による土砂追跡を行うことができるようになった.計算に必要な河道条件などは現地調査を行い,研究結果の整合性を検証した.また,畑地からの面源土砂流出を推定することができるモデルも開発した.
卵巣顆粒膜細胞の分化と腫瘍化機構の研究:ヒト不死化顆粒膜細胞を用いた検討

1.顆粒膜細胞の分化調節機構の研究(1)ヒト顆粒膜細胞におけるステロイド産生とアポトーシスの細胞内分子機構ヒト卵巣顆粒膜細胞より樹立した細胞株HO-23を用い、(日)cAMP刺激により、細胞内にステロイド産生酵素のStARとP450sccが発現しプロゲステロン(P4)が産生される、(月)細胞増殖時にはSV-40のT抗原、変異型p53が発現する、(火)p53が活性化されアポトーシスに陥ることを見い出した。(2)卵巣内諸物質による顆粒膜細胞の分化調節機構(日)bFGFはHO-23のP4産生を抑制し、細胞外マトリックス(ECM)はこれを促進すること、(月)bFGFとECMはp53を介するアポトーシスを抑制すること、(火)この効果はp53を中和抑制する蛋白Mdm2の発現亢進によりもたらされることを見い出した。(3)ステロイド産生とアポトーシスとの関連アポトーシス初期には衰えず、ステロイド産生転写調節因子、コレステロール輸送蛋白、ステロイド代謝酵素の発現が不変であること、また、細胞骨格が再編成されミトコンドリアを含む細胞内小器官が核周囲に集まることがそのメカニズムであることを見い出した。2.卵巣悪性腫瘍に対する新しい治療法の確立喘息治療で用いられる濃度のテオフィリンが、卵巣癌治療に汎用される薬剤のCDDPの細胞死導入効果を3・5倍高めることを明らかにした。3.CDDPによる上皮性卵巣癌細胞(hOSE)の細胞死のメカニズムCDDPの効果発現機序を知る目的で、hOSEを用いCDDPによるアポトーシス誘導時の生存遺伝子IAPs発現を調べた。IAPファミリーのメンバーであるXIAPの抑制によりアポトーシス機構の中心的なプロテアーゼであるCaspaseが活性化され、その結果下流では基質分解が促進され、上流ではシグナル伝達経路、MDM2の分解を介したp53依存性アポトーシス経路が活性化されることを見いだした。1.顆粒膜細胞の分化調節機構の研究(ワイツマン研究所との共同研究)(1)ヒト顆粒膜細胞株HO-23の特徴の検討ヒト卵巣顆粒膜細胞より樹立した細胞株HO-23の特徴を分析し以下の知見を得た。(1)cAMP刺激により、細胞内にステロイド産生酵素のStARとP450sccが発現しプロゲステロン(P4)が産生される。(2)細胞増殖時にはSV-40のT抗原、変異型p53が発現する。(3)温度変化により野生型p53が活性化されアポトーシスに陥る。(2)卵巣内諸物質による顆粒膜細胞の分化調節機構卵巣内諸物質の顆粒膜細胞分化への影響を調べ、(1)bFGFはHO-23のP4産生を抑制し、細胞外マトリックス(ECM)はこれを促進すること、(2)bFGFとECMはp53を介するアポトーシスを抑制すること、(3)この効果はp53を中和抑制する蛋白Mdm2の発現亢進によりもたらされることが判明した。2.顆粒膜細胞の腫瘍化機構の研究(ワイツマン研究所との共同研究)HO-23をヌードマウスに移植すると未分化腫瘍が形成された。この腫瘍は(1)cAMP刺激によりP4を産土し、(2)抗癌剤のシスプラチン(CDDP)に抵抗を示した。

HO-23の腫瘍化に際しどのような癌遺伝子が発現しているか検討中である。3. CDDPによる上皮性卵巣癌細胞(hOSE)の細胞死のメカニズム(オタワ大学との共同研究)CDDPは卵巣癌細胞にアポトーシスをもたらすことから臨床に汎用される。この薬剤の効果発現機序を知る目的で、hOSEを用いCDDPによるアポトーシス誘導時の生存遺伝子IAPs発現を調べた。CDDP感受性hOSEでは、CDDP投与によりまずIAPsの発現が抑制され、次いでFasとFasリガンドが誘導され、アポトーシスが進行した。一方CDDP抵抗性hOSEでは上記現象を認めず、IAPsは卵巣癌細胞のアポトーシスを調節する重要な遺伝子であることが示唆された。1.顆粒膜細胞におけるステロイド産生とアポトーシスの相互作用(ワイツマン研究所との共同研究)(1)遺伝子導入により樹立したヒト顆粒膜細胞株HO-23のプロゲステロン(P4)産生はアポトーシス初期には衰えず、ステロイド産生転写調節因子のAd4BP/SF-1、コレステロ-ル輸送蛋白のStAR、P450sccステロイド代謝酵素、の発現はこの時期不変であることを明らかにした。電子顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡で形態的に検討し、細胞骨格が再編成されミトコンドリアを含む細胞内小器官が核周囲に集まりP4産生の効率が高まることがその理由と推察された。(2)cAMPによるP4産生刺激はアポトーシスを促進すること、この傾向は後にSV40DNAを省いて樹立した顆粒膜細胞株HRP53-10で一層顕著であることが判明した。2.顆粒膜細胞におけるテオフィリンとシスプラチン(CDDP)のアポトーシス誘導効果(ワイツマン研究所との共同研究)上記知見にもとづき、新たな卵巣癌化学療法として、細胞内cAMP濃度を高めるテオフィリンとCDDPとの併用療法に着目した。喘息治療で用いられる濃度のテオフィリンはCDDPの細胞死導入効果を3-5倍高めることを、in vitro実験で明らかにした。今後このメカニズムについて調べ、さらにin vivoモデルでの効果を検討する。3.CDDPによる上皮性卵巣癌細胞(hOSE)の細胞死のメカニズム(オタワ大学との共同研究)CDDP感受性hOSEにおいてCDDPによるアポトーシス誘導の際に重要なのはIAPsの発現抑制である。今年度は(1)IAPの発現の有無によりCDDP感受性が修飾されること、(2)IAPファミリーのメンバーであるXIAPの抑制によりアポトーシス機構の中心的なプロテアーゼであるCaspaseが活性化され、その結果下流では基質分解が促進され、上流ではシグナル伝達経路、MDM2の分解を介したp53依存性アポトーシス経路が活性化されること、を見いだした。今後これらin vitroの知見をin vivoモデルで検討する予定である。
日印両品種をそれぞれ遺伝的背景とするウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統の開発

日本型ならびにインド型水稲それぞれの遺伝的背景において、複数の抵抗性遺伝子を集積したピラミッドライン(PYL)を育成し、ウンカに対する増殖抑制効果を検証することにより、3種のウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統の開発を推進した.まず、ウンカ・ヨコバイ類に対する抵抗性遺伝子に関するNIL群の交雑を行い、抵抗性遺伝子のマーカー選抜と世代促進を実施して2遺伝子が集積されたPYL群を育成し、これらPYL群のトビイロウンカに対する増殖抑制効果を検証した。育成したNILとPYLをもちいて、トビイロウンカ地域個体群の加害性を検証し、ウンカ染色体上のBPH26に対する加害性因子の座乗位置を推定した。日印両水稲品種をそれぞれ遺伝的背景とするウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統の開発をおこなう.すなわち,(1)ウンカ・ヨコバイ類に対する抵抗性遺伝子に関するNIL群の交雑と世代促進によるPYL群の育成(安井),ならびに,(2)抵抗性遺伝子選抜用DNAマーカーのデザイン化(安井)を推進する.次に,(3)育成されたPYL群におけるウンカ増殖抑制効果の検証を通して, 3種のウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統を開発する(安井・松村).平成24年度は以下の成果を収めた.まず,ウンカ類に対する耐虫性を保有するNILとヨコバイ抵抗性NILについて, NIL間の交雑F1植物に戻し交雑を行い, B2F1世代の世代促進を実施した.つぎに,開発されたOVC, BPH25, BPH26, GRH2, GRH4抵抗性遺伝子座近傍のDNAマーカーを利用したマーカー選抜により,抵抗性遺伝子を保有する系統を選抜した.一方、海外共同研究者(Dinh Van Thanh, PPRI, Vietnam)の協力のもとに, BPH25, BPH26に関する国際判別NIL群を供試して,日本に飛来するウンカ類の越冬地である北部ベトナムBPH個体群(ベトナム紅河デルタ-現地試験-)の抵抗性遺伝子加害性をモニタリングした.その結果,トビイロウンカ抵抗性遺伝子BPH26は、北部ベトナムBPH個体群に対する抵抗性を消失していた.そこで, BPH26に対するトビイロウンカの加害性の遺伝的要因を解明するために,トビイロウンカ遺伝地図の構築に協力し, BPH26に対するトビイロウンカの加害性因子のウンカゲノム上の位置を推測した.トビイロウンカ、セジロウンカ、ヒメトビウンカは、アジア稲作地帯における重要な害虫である。まず、日本型水稲とインド型水稲それぞれの遺伝的背景にウンカ・ヨコバイ類に対する抵抗性遺伝子を導入した近似同質遺伝子系統(NILs)を育成した。これらの交雑後代において、マーカー選抜と世代促進を実施し、台中65号とIR24を遺伝的背景とする耐虫性に関する2遺伝子集積系統が作出された。これら植物体に放飼した羽化メス成虫の生存率と放飼5日目の蔵卵率に基づいて、2遺伝子集積系統のトビイロウンカ抵抗性を評価した。また、トビイロウンカ抵抗性遺伝子BPH26に対する加害性因子を同定するために、加害性が異なるウンカ個体群間のF2集団を用いてウンカゲノムのDNAマーカー連鎖地図を構築し、ウンカの抵抗性遺伝子加害性についてQTL解析を行った。その結果、複数のQTLがウンカゲノム上に見出された。このことは、イネの抵抗性遺伝子に対するウンカ加害性因子の解明につながると考えられた。(1)ウンカ・ヨコバイ類に対する抵抗性遺伝子に関するNIL群の交雑と世代促進によるPYL群の育成,ならびに,(2)抵抗性遺伝子選抜用DNAマーカーのデザイン化を推進する.次に(3)育成されたPYL群におけるウンカ増殖抑制効果の検証を通して, 3種のウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統を開発する.平成23年度は以下の成果を収めた.まず, 1.ウンカ・ヨコバイ類抵抗性NIL群間の交雑と世代促進(安井):ウンカ類に対する耐虫性を保有するNILとヨコバイ抵抗性NILについて, NIL間の交雑を実施した。得られた雑種F1植物を世代促進した.つぎに, 2.ウンカ・ヨコバイ類抵抗性遺伝子のマーカーデザイン化(安井): OVC, BPH25, BPH26, GRH2, GRH4に関して,遺伝子マッピングの結果に基づいて抵抗性遺伝子座近傍のDNAマーカーを開発した.さらに, 3.ウンカ類に対する耐虫性評価と複合抵抗性系統の開発(安井・松村):海外共同研究者(Dinh Van Thanh, PPRI, Vietnam)の協力のもとに, BPH25, BPH26に関する国際判別NIL群を供試して,アジア地域3昆虫個体群:日本採集BPH個体群(採集年: 1966, 1989, 1999, 2010),北部ベトナムBPH個体群(ベトナム紅河デルタ-現地試験-),フィリピン採集

BPH個体群の加害性をモニタリングした.当初計画に基づいて、NIL間の交雑後代の世代促進とマーカー選抜による抵抗性遺伝子保有個体の選抜が進行している。また、トビイロウンカ抵抗性遺伝子BPH26の加害性因子のウンカゲノム上の位置を推測した。当初計画に基づいて、NIL間の交雑と世代促進が進行している。また、東アジアトビイロウンカ個体群のイネ加害性について、国際判別NILを用いたモニタリングを実施して報告した。予定通り抵抗性遺伝子の集積候補個体を選抜して,ウンカ類に対する複合抵抗性イネ系統を開発する。(1)ウンカ・ヨコバイ類抵抗性NIL群間の交雑と世代促進を推進するとともに,(2)ウンカ・ヨコバイ類抵抗性遺伝子のDNAマーカー選抜よる耐虫性遺伝子集積を実施する.加えて耐虫性のみならず,昆虫媒介性ウイルス病に対する抵抗性の付与を試行する.合わせて,日本に飛来するトビイロウンカの越冬地(北部ベトナム)におけるウンカ加害性について現地モニタリングを実施する.北部ベトナムにおけるウンカ加害性評価のための圃場借り上げ料、現地調査協力費を計上した。耐虫性遺伝子座近傍のDNAマーカーによるマーカー選抜を実施するとともに,北部ベトナムにおけるウンカ加害性評価のための圃場借り上げ料,現地調査協力費を計上した.
語学学習・ジェンダー・言語イデオロギー―フィリピン系スカイプ英会話をめぐって―

本研究は、近年日本で人気を博しているフィリピン系スカイプ英会話に焦点をあて、語学学習・ジェンダー・言語イデオロギーの関係性について探究することを目的とする。特に、日本人男性英語学習者に着目し、彼らの語りを通じて、フィリピン人女性英会話講師がジェンダー化されていく様子を調査する。また、この現象を学術的に分析し、議論するための新しい理論的枠組を構築することも目指す。
ゲージ対称性を利用した古典及び量子スピングラスの解析

本研究の目的は、スピングラスの新たな性質を見出すことと、新たな解析手法の確立にある。本年度は、特に量子スピングラスの解析を中心に行う予定であったが、最も良い成果が出たのは、イジングスピングラスと関連する系の解析的研究であった。イジングスピングラスの平均場解は、基本的にレプリカ法と呼ばれる数学的手法を用いて構成されるが、その解の構成法は発見法的で、解釈のついていない部分が多い。また、有限次元系において、レプリカ対称性の破れを始めとする平均場描像が成り立つかどうかは、スピングラス理論において非常に重要な問題でありながら、決着がついていない。我々は、レプリカ法の物理的、数学的な意味づけを試みることで、この問題の基礎付けを行った。本年の成果は、主に二つに大別される。一つはイジングパーセプトロンという、ニューロンのモデルを解析することで、レプリカ法の解構成を再考察しそれに関する示唆を得たこと、二つ目は、イジングスピングラスの振る舞いを記述する母関数の零点を、ある可解格子上で、無限サイズまで計算したことである。一つ目の成果内容をもう少し詳述すると、(1)解空間のクラスター分布を解析的、数値的に求め、それがレプリカ法での通常の仮定に反する異常な分布を示すこと、(2)有限レプリカ数での相図を描き、相転移の構造を明らかにしたこと、(3)非典型サンプルの出現確率を解析的に評価したこと、の3つとなる。これらはレプリカ法を今後運用していく上で、その解釈を明確にしてくれるという点で重要な結果である。二つ目の成果内容を要約すると、イジングスピングラスでは、温度のような基本的な変数についての零点が実軸上に連続的に分布するということが明らかになったということに尽きる。これは、スピングラス相では相転移が置き続けているということを意味し、レプリカ対称性の破れの一つの側面を示しており、重要な成果と考えられる。本年度は、ゲージグラスの解析を中心に行う予定であったが、最も良い成果が出たのは、イジングスピングラスに関する解析的研究であった。イジングスピングラスの平均場モデルは、これまでにレプリカ法、Cavity法などを用いてよく研究されその熱力学的な性質はかなり良く理解されている。しかしその一方で、レプリカ法を用いての解の構成法は発見法的であり、解釈のついていない部分が多く、現在もそれについての議論が続いている。また、有限次元系において、レプリカ対称性を始めとする平均場描像が成り立つかどうかは、スピングラス理論において非常に重要な問題でありながら、未だ決着がついていない。具体的には、レプリカ数を複素数に拡張したときの分配関数のn次モーメントの解析性を調べ、レプリカ数に関する相転移が存在することを明らかにした。また、それとレプリカ対称性の破れとの関連を議論し、レプリカ対称性の破れの特異性の現れ方についての可能性を限定することができた。これによってレプリカ対称性の破れに新たな視点を与えることができた。また、我々が行った解析は、主に平均場モデルに対してのものであるが、原理的に我々の手法は有限次元系に拡張することができ、有限次元のスピングラスに対する新たな解析法を与えているという意味でも、重要である。
CIP・直交格子法による自由表面と物体の強非線形相互作用に関する数値計算法の開発

本研究では、船舶海洋工学分野での自由表面・物体の強非線形相互作用現象、例えば荒天の場合に船舶の大振幅動揺、スラミングや海水打ち込みなどの流体衝撃などの現象を定量的に予測する目的で、CIP・直交格子法を開発する。研究期間(平成18年4月1日平成20年3月31日)に実施された研究により、以下の成果が得られた。(1)3次元の水波と浮体の強非線形相互作用の計算プログラムに対して、自由表面計算の界面捕捉法としてTHINC(Tangeht of Hyperbola for Interface Capturing)スキームを改良して応用した。改良された数値計算法でModified Wigley模型による水槽実験に対応して、3次元数値シミュレーションを行った。THINCスキームの応用により、船体の運動、甲板及び上部構造物に加わる波衝撃圧の予測精度が顕著に改善されたことが分った。(2)CIP・直交格子法を実際の船型の計算に対応させるために、複雑船体表面(上部構造物も含む)に関する形状情報の入力方法として、船体のCADデータから船体表面に均一に仮想粒子を分布させる方法を開発した。この方法を使って、コンテナ船模型(S-175)に対して数値シミュレーションを行い、その有効性を確認した。(3)開発した計算コードを実際の問題に応用するには、より高解像度数値シミュレーションが必要となることから、PCクラスタシステムを使って大規模数値計算方法について研究をはじめた。圧力計算部分に対する並列化が成功した。また、フリーソフトウェアPOV-RAYを使用して計算結果の可視化について研究も行った。2)開発されたCFDコードの検証にデータベースを整備するために,昨年度に続き,新たな二つの喫水状態に対して,3次元数式船型モデルを用いた大振幅水波の打ち込みによる甲板上での圧力の計測実験を行った。改良されたCIP・直交格子法によりこれらの実験と比較計算を行い,精度検証を行った。自由表面の計算にTHINC法の使用によって,衝撃圧の計算精度の向上が確認された。1)前年度で完了したWigley模型による水槽実験に対応して、3次元CIP・直交格子法の計算プログラムで数値シミュレーションを行い、計算結果と実験計測値(各圧力計測点における圧力及び船体の運動)を比較して、数値計算精度の評価を行った。本数値計算法では、船体の運動に対する計算について良い結果が得られたが、衝撃圧のピーク値の予測は実験値より低い。研究によって、格子解像度の増加と自由表面に関する界面捕捉法の改良により衝撃圧のピーク値の予測が改善されたことが分った。2)CIP・直交格子法を実際の船型の計算に対応させるために、複雑船体表面(上部構造物も含む)に関する形状情報の入力方法として、船体のCADデータから船体表面に均一に仮想粒子を分布させる方法を開発した。3)開発した計算コードを実際の問題に応用するには、より高解像度数値シミュレーションが必要となることから、PCクラスタシステムを使って大規模数値計算方法について研究をはじめた。
ヨーロッパ冷戦史再考

研究成果の要点は以下の通りである。本研究によって、研究代表者の高橋は、まず『歴史としてのドイツ統一』という単著をまとめることができた。またその関連で、英文論文を完成することができた。また共同研究者である中山は、フランス政治史に関する2本の概説的論文と1つの仏文論文を完成した。しかしながら、「ヨーロッパ冷戦史再考」というテーマをヨーロッパからみてみると、研究成果報告書に記載したように、冷戦研究をめぐるアメリカとヨーロッパとの顕著な違いであり、極端な表現を用いれば、アメリカでは冷戦史研究であるが、ヨーロッパではあくまで戦後史研究であるという違いである。この違いが、単なる学問的伝統の違いなのか、それとも冷戦時代におけるアメリカとヨーロッパとの関係を反映したものであるのかが、今後の1つのテーマとなるという確信をもつに至った。この意味で冷戦史研究もアメリカ、ヨーロッパなど各地域の独自性を反映したものであり、日本の冷戦史あるいは戦後史研究を考える上で大きなショックであった。換言すれば、外交史研究の国際的普遍性と各国民国家的独自性の問題であり、アメリカの各分野での研究のもつ過度な普遍性への日本での傾斜への警告を示すものとして、興味のあるテーマであった。この意味で、ヨーロッパ側からの視点を加味すれば、(1)冷戦史を現代史のなかでどのように位置付けるのか、(2)冷戦後の時代を日本の独自の観点からどのように解明するのか、を痛感させられたテーマであったといえる。1.本年度は、ヨーロッパ冷戦史のヨーロッパ側の研究状況を把握することに努めた。2.まず資料の公開状況がアメリカと異なっており、いまだアメリカでなされているような体系的な研究は数多く見当たらないことを指摘することができる。それは当該分野に従事する研究者の数がアメリカと比較して少ないことなどにも由来するが、史料の整理・管理が拡散しており、様々な文書館を使用することがかなり困難になっていることにもよると思われる。3.ついで、冷戦と関連するものとしてEUの歴史が存在し、冷戦の進展とEUの進展との関係づけが大きな関心を呼んでおり、ヨーロッパ側の研究者は冷戦史よりもEUの歴史により多くの関心を抱いていることを指摘できる。同様な問題はNATOに関しても指摘できるところであり、特に軍事面ではNATO史という観点からの研究の方が関心を集めている。4.さらにイギリス、フランス、ドイツ(西ドイツ)などの多国間関係が問題になるが、進展をみせているのは独仏関係のみであり、英仏、独仏などの関係に関する研究は遅れている。5.以上を踏まえ、次年度は米ソ冷戦史のなかでヨーロッパ側が主体として登場しえたテーマ領域(東方外交、CSCE、EUの進展、80年代の欧米、欧ソ関係)を中心にフォローすることにしたい。

この意味で、ヨーロッパ側からの視点を加味すれば、(1)冷戦史を現代史のなかでどのように位置付けるのか、(2)冷戦後の時代を日本の独自の観点からどのように解明するのか、を痛感させられたテーマであったといえる。
新規温度応答性分離膜の開発－膜透過可能な分子サイズの温度による制御－

本研究では,無機多孔質膜上に感温性高分子を被覆することで,温度に応答して分子の透過速度を制御できる膜を合成することを目的とした。また,高分子が体積変化を起こす温度(相転移温度)を変化させる目的で,架橋剤(BIS)を添加した複合膜も合成された。メチルオレンジ(MO)分子をモデル分子として透過実験した結果,相転移温度より高温の方が,低温の場合よりもMO分子透過速度は大きいことが分かった。また,BIS添加量を増加させると低温ではMO分子が膜を全く透過しないことも明らかにした。このように温度を変化させることで分子の透過速度を変化させられる膜の合成に成功した。本年度は基板として市販のガラスフィルター(フィルター直径φ40.5mm,厚さ4mm,細孔径1016μm)を使用し,その表面に3-ジメチルアミノプロピル基を固定化したものを使用した。感温性高分子であるポリN-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAM)をラジカル重合法によって約0.04gガラスフィルター上に固定化した。高分子固定化の際に,架橋剤であるN,N'-メチレンビスアクリルアミドを約0.5wt%添加することで,高分子層のガラスフィルターへの結合強度は増した。昨年度作製した膜透過装置を用い,メチルオレンジ(MO)およびコンゴーレッド(CR)透過速度の温度依存性を検討した。膜透過実験の条件は供給側と透過側のMO初濃度をそれぞれ100と0ppm,水溶液の流速0.5L/min,水溶液の温度は25又は40°Cとした。MO透過量は透過側のMO濃度をUV-Vis(日本分光V-630)で連続的に測定することで定量された。高分子を被覆していないガラスフィルターの場合,MO物質移動係数は1.4×10-6m/sであった。温度応答性膜を使用した場合,温度によって物質移動係数は異なった。PNIPAMの相転移温度(約32°C)より高い40°Cでは物質移動係数は1.3×10-6m/sで,未修飾のガラスフィルターとほぼ同様の値であった。一方,低温である25°Cでは6.4×10-7m/sと小さくなった。以上の結果は,PNIPAMが温度に応答して体積変化し,高温では体積収縮により高分子鎖間の空隙が広がってMOが透過しやすく,低温では体積膨張により高分子鎖間の空隙が狭まってMOが透過しにくくなったことを示している。分子サイズの大きなCRの場合も同様の温度応答性を示したが,その物質移動係数はMOの場合より1桁小さいものとなった。このこともまた,PNIPAM層が分子の拡散抵抗になっていることを示唆している。本年度はガラス繊維ろ紙に感温性高分子(ポリN-イソプロピルアクリルアミド,PNIPAM)を固定化した温度応答性膜を合成し,膜透過装置の製作及びメチルオレンジ(MO)膜透過速度の温度依存性を検討した。ガラス繊維ろ紙はPNIPAMの支持体として使用し,これにPNIPAM固定化のための足場としてシランカップリング剤を反応させた。その後,窒素雰囲気下でNIPAMのラジカル重合反応を行った。PNIPAM固定化後のフィルターのFT-IRスペクトルには,PNIPAMに特徴的な吸収が現れた。また,フィルターの重量は2030%増加した。これらのことから,フィルター上にPNIPAMが固定化されたことが明らかとなった。この温度応答性膜を仕切りとして2室(原料供給室,透過室)に分離し,それぞれの室に溶液を流通させることができる膜透過装置を作製した。透過側のMO濃度はフローセルを取り付けたUV-Visで連続的に測定することで定量された。純粋なガラス繊維ろ紙のMO物質移動係数は約2.1×10-7 m/sであった。PNIPAMの相転移温度(約32°C)より高い40°Cでは物質移動係数は約2.3×10-7 m/sで,純粋なガラス繊維ろ紙とほぼ同様の値を示した。一方,低温である25°Cでは約2.0×10-8 m/sと小さな値を示した。以上の結果は,PNIPAMが温度に応答して体積変化し,相転移温度より高温では体積収縮により高分子鎖間の空隙が広がり,MOが透過しやすく,相転移温度より低温では体積膨張により高分子鎖間の空隙が狭まり,MOが透過しにくくなったことを示していると考えられる。本年度も昨年度から引き続き,基板として市販のガラスフィルター(GF)を使用した。

感温性高分子の足場となるシランカップリング剤として,本年度は3-ジメチルアミノプロピルメチルジエトキシシランからアリルトリエトキシシランに変更した。これにより,シランカップリング剤にかかるコストは約1/7にまで減少させられた。そして,アリルトリエトキシシランからでもポリN-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAM)の被覆は可能であった。また,架橋剤であるN,N'-メチレンビスアクリルアミド(BIS)を用い,高分子合成を行った結果,その添加量の増加に伴いPNIPAM固定化量は増加し,BISを5 wt%添加することで,PNIPAM固定化量は約1 wt%にまで増加させられた。平成24年度に作製した膜透過装置を用い,メチルオレンジ(MO)透過速度の温度依存性を検討した。実験条件は供給側と透過側のMO初濃度をそれぞれ100と0ppm,水溶液の流速0.5L/minとした。MO透過量をUV-Vis(日本分光V-630)で定量した。GF単独では,MO物質移動係数は2.9×10-7 m/sであった。合成した膜の場合,相転移温度より高い40°Cでは物質移動係数は1.9×10-7m/sで,未修飾のGFとほぼ同程度であった。一方,25°Cでは4.5×10-9m/sと2桁程度小さくなった。この結果は,高温ではPNIPAMの体積収縮により高分子鎖間の空隙が広がってMOが透過しやすく,低温では体積膨張により高分子鎖間の空隙が狭まってMOが透過しにくくなったことを示している。架橋剤を添加した場合,BISの添加量の増加に伴い,透過速度が遅くなり,その傾向は低温で特に顕著に現れた。本年度の当初の予定では,中空糸への感温性高分子の固定化も計画していたが,そこまでは実施できなかった。次年度以降,引き続き実施する予定とする。界面化学本年度に実施を予定していた膜透過装置の製作は昨年度既に完成している。また,今年度から膜透過速度の温度依存性の検討を始めることになっており,実際に当初予想していたような結果が得られており,おおむね順調に進展している。本年度に実施を予定していた多孔質ガラス薄膜の製造については,市販のガラス繊維ろ紙を使用したところ,本研究の用途のためにはこれで十分であることが分かったため,実施しなかった。一方,ガラス繊維ろ紙上への感温性高分子の固定化はシランカップリング剤を使用することで達成可能であることを明らかにした。本年度後半からは平成25年度に実施予定であった膜透過装置の製作及び膜透過実験にも着手できており,当初の計画以上に進行している。平成26年度はガラスフィルター上に固定化する感温性高分子の相転移温度の制御を行う。具体的にはアクリルアミドのような他のモノマーとの共重合が考えられる。我々のグループの別の実験では,PNIPAMにアクリルアミドを20wt%添加することで,相転移温度を約15°C高温側にシフトさせることに成功している。多孔質膜上でも同様の効果が得られると考えている。また,現在は平面フィルター上へのPNIPAMの固定化を行っているが,チューブ状の多孔質膜上へのPNIPAM被覆も試みる予定である。平成25年度はガラス繊維ろ紙上に固定化する感温性高分子の相転移温度の制御を行う。具体的には架橋剤の添加,他のモノマーとの共重合を行い,これらの量や種類がPNIPAMの相転移温度にどのような影響を及ぼすか検討する。また,現在は平面ろ紙上へのPNIPAMの固定化を行っているが,管状の多孔質支持体上へのPNIPAM被覆も試みる予定である。
性分化疾患における新規原因遺伝子の同定と機能解明

本研究は、次世代遺伝子解析技術を用いて性分化疾患(DSD: Disorders of sex development)患者における既知および新規原因遺伝子変異を同定することを目的に行われた。257例に対して次世代遺伝子解析を行った。特記すべき成果は下記の通りである。(1)重度のDSDの47症例のうち、8例で病的意義が明確な既知遺伝子変異、29例で候補遺伝子変異、4例で染色体微小欠失を検出した。(2)尿道下裂の150症例のうち、7例で既知遺伝子変異、23例で疾患感受性多型を同定した。(3)低ゴナドトロピン性性腺機能低下症例においてはじめてFGF8遺伝子のフレームシフト変異を同定した。研究期間を通して下記の研究が行われた。(1)重度の外性器異常を伴うDSDの47例:既知DSD責任遺伝子と候補遺伝子を対象とする次世代シークエンス(NGS)解析、および、アレイCGH解析。(2)尿道下裂150例:既知尿道責任遺伝子と候補遺伝子を対象とするNGS解析。(3)低ゴナドトロピン性性腺機能低下症(HH)60例:既知HH責任遺伝子を対象とするNGS解析。研究成果は下記の通りである。(1) NGS解析では、8例において病的意義が明確な既知遺伝子変異が、29例で候補遺伝子の変異が同定された。重症DSD症例においては、既知遺伝子変異の同定頻度が高い事が明確となり、DSD発症におけるoligogeneityの可能性および既知遺伝子変異による表現型の多様性が見出された。また、候補遺伝子変異について、現在機能解析を進めている。アレイCGH解析では4例の染色体微小欠失を検出し、その成果は学術雑誌に掲載された。(2)尿道下裂7例より既知遺伝子変異が、23例で疾患感受性多型が同定された。現在、成果を論文化し、学術雑誌へ投稿準備中である。また、学術的に有意義な候補遺伝子変異について、現在機能解析を進めている。(3)FGF8遺伝子のフレームシフト変異が、視床下部-下垂体不全の病因となる事を示した。またその成果は、学術雑誌に掲載された。本研究では、次世代遺伝子解析技術が、遺伝的異質性を有する疾患の変異スクリーニングに有用であることが明らかとした。本研究は、早期的な疾患責任遺伝子変異の同定に貢献するほか、疾患成立機序の解明の一翼を担うものである。平成24年度は、実験計画に基づき合計141例の解析を下記の通り行った。(1)重度の外性器異常を伴う46,XY DSD/46,XX DSD (n=47):既知DSD責任遺伝子と候補遺伝子計120を対象とするターゲットエンリッチメント、および、全ゲノムCGHを行った。NGSの陽性対照として、4例の既知変異陽性患者を同時に解析した。(2)比較的軽度の外性器異常を伴う46,XY DSD (n=95):既知DSD責任遺伝子と候補遺伝子計20を対象とするアンプリコンシークエンスをおこなった。結果は下記の通りであった。(1)NGSでは、62種類の遺伝子変異が同定された。変異の約80%が直接塩基配列決定で再現可能であった。陽性対照の変異はすべて検出された。8例において病的意義が明確な既知遺伝子変異(AR, SF1, SOX9, BNC2)が、29例で候補遺伝子の変異が同定された。CGHでは4例の染色体微小欠失が検出された(DMRT1を含む9番染色体2例、2番染色体1例、20番染色体1例)。(2) 2例で既知遺伝子変異が3例で候補遺伝子変異が検出された。重症度の異なるDSDにおける既知遺伝子変異の寄与が明確となり、DSD発症におけるoligogeneityの可能性および既知遺伝子変異による表現型の多様性が見出された。なお、CGH解析の成果については、現在科学論文に投稿中である。平成24年度は、NGS解析により性分化疾患(DSD)患者の141例での変異解析を実施した。解析の結果、病的意義が明確な既知遺伝子変異や候補遺伝子の変異が多く同定され、現在はそれらの機能解析を進めている。また、50例でアレイCGH解析を実施した結果、4例で病的意義のある片側アレルのdeletionを見出した。これらの研究成果については、複数の学会にて口頭発表を行った。またアレイCGH解析の成果については、現在科学論文に投稿中である。

申請者は、本研究の進捗状況や発表状況から、本研究がおおむね順調に進展していると考える。平成25年度は、24年度に引き続きDSD症例におけるNGS解析による遺伝子解析を行う。これに並行して、これまでに同定した遺伝子変異について、in silico解析およびin vitro機能解析を行い、さらに臨床情報との比較によりその病的意義を判断する。本研究により得られたデータを詳細に解析し、学術的にまたは臨床的見地から有用である情報を抽出し、学会や研究会、論文などで発表することで、国内外に幅広く発信していく。研究費は、下記の目的で使用する計画である。1)遺伝子変異解析および同定した遺伝子変異の機能解析の為の物品費として。2)学会・研究会などで研究成果を発表する為の旅費として。3)科学論文への投稿費として。
膜貫通型膜タンパク質の反応機構解明のための赤外分光法の開発

1.新規赤外分光光度計の開発酵素タンパク質の反応機構を明らかにするためには、活性部位に異方性をもって配置されたアミノ酸の反応性の違いを検出し得るほど高感度の時間分解赤外分光法が必要不可欠である。しかし、どのようなタンパク質にも適用可能な時間分解赤外分光法は開発されていなかった。この目的のために本研究では、赤外マルチチャンネル検出器と流路が200μm×200μmのCaF_2製フローセルを組み合わせ、赤外白色レーザー光を光源とする新規赤外分光光度計を設計した。まず、グローバー光源を用いて、一酸化炭素結合型チトクロムc酸化酵素を測定したところ、νc-o由来の吸収帯の検出に成功した。次に一酸化炭素結合型酵素の光乖離と再結合のダイナミクスの追跡に挑戦し、Δt=0、20、40msの時間分解赤外吸収スペクトルの測定に成功した。したがって、フローセルを用いて酵素の構造ダイナミクスを測定できる新規装置が稼働した。より高精度のスペクトルを得るための光源である赤外白色レーザーは、現在、最終調整を行っており、一ヶ月以内に終わる予定である。2.ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素による酸素活性化反応の追跡ミトコンドリア中のチトクロムc酸化酵素の時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定した。酸素化型、P型およびF型反応中間体に由来するν<Fe>-o振動モードの観測に成功した。これらの振動数は、可溶化酵素の、対応する反応中間体の振動数と一致した。一方、酸素化型反応中間体は、ミトコンドリア中では反応開始後1.4msでも観測されたが、可溶化状態では0.5ms程度で消失することが知られていた。このことは、ミトコンドリア内膜系がチトクロムc酸化酵素の反応中間体の寿命に影響を与えていることを意味するが、そのしくみを調べることが次の課題である。