hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
1分子ナノ計測によるバクテリアべん毛モーター最小機能単位の特性評価

細菌べん毛モーターは回転する分子機械である.大腸菌べん毛モーターの最大トルクは1300-4500 pNnmと報告によって開きがあった.そこで本研究では,光トラップによってトルクを直接的に求めた.べん毛繊維を介してカバーガラスに付着して回転する大腸菌の細胞本体を,1umのビーズで停止させた.モーターが発生するトルクは4500 pNnmであったが,光トラップが細胞本体にも影響をしていた.そこで,光トラップの細胞への影響を取り除くことで,モーターが約1800 pNnmのトルクを発生することがわかった.大腸菌べん毛モーターは,菌体の表層から突き出ているらせん状のべん毛フィラメントを回転させる直径約50 nmの分子機械である.モーターは約10個の固定子ユニット(Mot複合体)と回転子リングから構成され,固定子内を通過するイオンをエネルギー源として利用して回転する.一方,固定子をコードする遺伝子を欠損した大腸菌において,固定子ユニットを誘導物質を添加することで人為的に強制発現させると,固定子のモーターへの組み込みに従って段階的にトルクを発生することから,回転子リングに1個の固定子ユニットが配置している状態が最小機能単位と言える.本研究では,分子操作・ナノ計測に利用される光ピンセットを用いて,最小機能単位が発生するトルク特性の評価を行うため,以下の2点について研究を遂行した.・光ピンセット系の導入ー近赤外レーザーを顕微鏡に導入してマイクロメートルサイズの微粒子や細胞を捕捉することができた.・高速カメラによるナノ計測ー位相差像を撮影し,ビーズの重心位置をナノメートルの精度で計測できることを確認した.・モータートルクの評価ーべん毛フィラメント1本を試料表面に固定すると細胞本体が回転する.光ピンセットでビーズを介して細胞を捕捉して,その移動距離から発生するトルクを見積もった.しかし,正確なトルクの見積もりには,細胞本体の影響を取り除くことが必要であることが明らかとなり,現在も補正方法について検討している.当初の予定通り光ピンセットの光学系を構築してモーターのトルクの計測を行うことができたため,おおむね順調に進展していると判断した.大腸菌べん毛モーターは,菌体の表層から突き出ているらせん状のべん毛フィラメントを回転させる直径約50 nmの分子機械である.モーターの最小機能単位は回転子リングに1個の固定子ユニット(MotA/B複合体)が配置している状態である.本研究では,分子操作・ナノ計測に利用される光ピンセットを用いて,最小機能単位が発生するトルク特性の評価を行うことを目的としている.本年度は,大腸菌べん毛モーターが発生する最大トルクを光ピンセット法で検出することを中心におこなった.モーターから伸びるべん毛フィラメント1本を顕微鏡カバーガラスに固定し,その結果回転する細胞本体を光ピンセットでビーズを介して捕捉し,ビーズの重心位置を高速度カメラで取得した画像から解析した.また,昨年度の研究結果から光ピンセットの細胞本体への影響が懸念されたので,その補正方法を模索した.具体的には,モータートルクを発生する固定子ユニットを構成するタンパク質を欠失した株(motAB欠失株)を用いて,トルク計測と同じ手順で実験を行った.その結果,細胞・ビーズ・光ピンセットが作り出す新たな安定点を求めることができ,これを基準としたビーズの重心位置の移動距離からモーターの発生する実質的なトルクを見積もることができた.過去に同様の実験から求められた値の半分程度のトルクが実際には発生していることが明らかとなり,入出力特性の考察に重要なパラメータを得ることが出来た.また,2種類のイオンを利用するモーターについても,ビーズアッセイにより1ユニット当たりの出力を求め,入出力特性を見積もることができた.昨年度の問題点であった光ピンセットの細胞本体への影響を補正する方法を試し,良好な成果が得られたため.大腸菌べん毛モーターは,菌体から突き出るらせん状繊維を回転させる直径50 nmの超分子運動マシナリーである.モーターの最小機能単位は回転子リングに1個の固定子複合体(MotA/B複合体)が相互作用した状態である.固定子複合体は110個の範囲で同時に相互作用することができるが,その数によってモーター出力特性が変化する.また,モーターのエネルギー源は細胞膜を介したプロトン駆動力であり,固定子複合体内のチャネルをプロトンが透過する.本研究では,固定子の数とモーター回転特性の評価をおこなった.まず昨年度までに,光ピンセットによって停止トルクを計測するための補正方法の検討をおこなったが,本年度はその補正方法の最適化と別の回転計測法(ビーズアッセイ)で計測したトルクの値との比較をおこなった.その結果,2つの独立した計測方法によって得られた値の違いは20%以内となった.さらに,MotBのプロトン結合部位に変異を入れて,プロトン透過能を低下させたモーターについて,熱力学的定常状態に近い状況にあたる停止トルクの計測をおこなった.もし,プロトン透過速度だけが問題となるならば,停止トルクは野生型モーターと同等と期待されたが,実際には4割程度低下していた.つまり,この変異はプロトン透過速度だけではなく,固定子複合体の構造などにも影響を与えていると予想された.さらに,ほぼ無負荷時のモーターについて回転速度の計測をおこない,その速度ゆらぎの解析をおこなった.細菌べん毛モーターは回転する分子機械である.大腸菌べん毛モーターの最大トルクは1300-4500 pNnmと報告によって開きがあった.そこで本研究では,光トラップによってトルクを直接的に求めた.べん毛

繊維を介してカバーガラスに付着して回転する大腸菌の細胞本体を,1umのビーズで停止させた.モーターが発生するトルクは4500 pNnmであったが,光トラップが細胞本体にも影響をしていた.そこで,光トラップの細胞への影響を取り除くことで,モーターが約1800 pNnmのトルクを発生することがわかった.モータートルクを評価する過程で光ピンセットの細胞本体への影響を無視できないとが明らかとなったため,補正手法を模索する.長時間光ピンセットでモーターを捕捉し,その時間変化から最小機能単位のトルクを見積もることを目指す.生物物理学光ピンセットの制御方法に関して,当初の計画ではガルバノミラーの導入を検討していたが,画像ベースの制御を導入する方が良い計画である可能性が出てきた.現在採用する手法の検討を行っており,当初購入する予定であった部品を未購入であるため.今年度まで装置の開発および実験への応用を進めてきた.計測については比較的順調に進んでいるが,遺伝子組換えによる試料の改良には着手が遅れているため,次年度使用額が生じた.光ピンセット制御方法について,最適な手法を選定し,必要な部材の購入に使用する予定である.遺伝子組換えによる試料の改良のために,研究補助員の雇用および遺伝子組換え消耗品への使用を計画している.
姉妹染色分体間の接着確立とDNA複製のクロストーク

アセチル化コヒーシンの動態を解析する為、染色体免疫沈降可能な特異的抗体を獲得することを目指した。結果、酵母、ヒトそれぞれのアセチル化コヒーシンを特異的に認識する抗体を得た。得られた抗体は酵母では、染色体免疫沈降が不可能であったが、ヒトのアセチル化コヒーシン抗体は、免疫沈降が可能であった。この抗体を用い、少数細胞からでも効率よく染色体免疫沈降実験(ChIP-seq解析)が可能なように、条件検討を重ねた結果、in vitro transcription法(一度RNAに変換することでバイアスを抑制する方法)を組み合わせることにより、ごく少量の免疫沈降DNAによるChIP-Seq解析法を構築し、ヒト染色体上のアセチル化コヒーシンの動態を明らかにしたアセチル化コヒーシンの動態を解析する為、染色体免疫沈降可能な特異的抗体を獲得することを目指した。この抗体を用い、少数細胞からでも効率よく染色体免疫沈降実験(ChIP-seq解析)が可能なように、条件検討を重ねた結果、in vitro transcription法(一度RNAに変換することでバイアスを抑制する方法)を組み合わせることにより、ごく少量の免疫沈降DNAによるChIP-Seq解析法を構築し、ヒト染色体上のアセチル化コヒーシンの動態を明らかにした研究目的;DNA複製により生じた姉妹染色体分体の間にはコヒーシン複合体による接着が形成され、この接着は正確な分配に必須なことが知られている。細胞周期のDNA合成期には、ゲノム維持に重要な二つの事象、DNA複製と接着の形成が並行して進行していることになるが、この両者間にどのような連携があるか未だに明らかでない。そこで、DNA複製と接着因子コヒーシンが互いにどのように制御し合い、その特異的役割を保障しているか、連携メカニズムを研究対象とし、実験を開始している。研究方法;出芽酵母を実験材料とし、分子生物学的手法を用いて実験を行う。すでに接着に必要とされる接着因子コヒーシンのアセチル化を特異的に認識する抗体の製作に成功している。この抗体を用い、一本の染色体上でのアセチル化されたコヒーシンの局在を、ChIP-Chip解析法、ChIP-seq解析法を用いて研究を進めた。解析に用いた手法は、すべて研究室内で機能し、成果を上げているものであり、必要機器類も備えられている。研究成果;まず、アセチル化コヒーシンを特異的に認識する抗体を用い、免疫沈降効率を向上させる条件等(細胞固定条件、破砕条件等)の最適化を量った。その結果、免疫沈降回収率が増加した。現在、染色体上に特異的にアセチル化コヒーシンシグナルを捉えられるか、CHIP-Chip解析に必要十分量のDNA量を得るため、免疫沈降物の増幅条件を検討中である。これらの改善により、DNA合成期途中の細胞においてアセチル化コヒーシンが複製の完了した染色体領域に現れるかどうかを調べることで、接着確立と複製とが共役しているかを示す明確な結果を得る。研究目的;DNA複製により生じた姉妹染色体分体の間にはコヒーシン複合体による接着が形成され、この接着は正確な分配に必須なことが知られている。そこで、DNA複製と接着因子コヒーシンが互いにどのように制御し合い、その特異的役割を保障しているか、連携メカニズムの解明を目的とした。研究方法;出芽酵母、さらにはヒト細胞を実験材料とし、分子生物学的手法により実験を行った。接着因子コヒーシンの機能確立に必須なアセチル化を特異的に認識する抗体はすでに製作に成功している。この抗体で一本の染色体上でのアセチル化されたコヒーシンの局在を、ChIP-seq解析法を用いて研究を進めた。研究成果;そもそもコヒーシンのアセチル化はごく少量のコヒーシンに生じていることが明らかとなっているため、1)ごく少量のアセチル化コヒーシンを免疫沈降可能な抗体の開発、および、2)少量の免疫沈降DNAを偏り無く増幅し、シークエンスする技法の開発、の二つの課題に取り組んだ。その結果、少なくともヒト細胞では、アセチル化コヒーシンに対する特異性の高い抗体の作成に成功し、アセチル化コヒーシンの局在をゲノムワイドに検出することに成功した。一方、出芽酵母では膨大な量の抗体をスクリーニングしたにもかかわらず、未だに検出には至っておらず、今後の課題となった。
ブレイン・マシン・インタフェース技術を応用した嗅覚評価方法の開発

近年、脳機能計測の発達により、香りが脳に及ぼす影響が少しずつ理解されるようになってきている。本研究では、ヒトの覚醒度を変化させる香料とブレイン・マシン・インタフェース技術を使って、被験者の嗅覚機能を数値化して調べる方法を開発することを目指した。合成したラベンダー・ローズマリー・イソ吉草酸・ヤチヤナギ・スイートオレンジの刺激を与えて脳波を測定すると、ラベンダーには後頭葉視覚野から発せられるアルファ波の振幅を大きく変化させる効果があることがわかり、嗅覚機能の定量的な評価の指標に使える可能性が示された。ただし香りに対する脳の反応には個人差が大きく、再現性のある結果を得ることが難しかった。本年度では、嗅覚に障害がない状態(ベースライン)の確定と、脳波分析手法の最適化を目指した。上記二点を達成するため、匂い刺激提示時の脳波データを健常者10名で計測したものを分析した。また、実験系を整備することで、無線脳波計を用いて簡便にデータを取得することができるようになった。従来と比べると記録までにかかる時間は30%程度まで減少した。計測において、香り刺激は、ラベンダー、ローズマリー、イソ吉草酸、ヤチヤナギとした。触感刺激や音刺激などと比べ、香りは、各個人ごとに嗜好性が大きく、ある被験者にとっては心地よい香りが、ある被験者では不快な香りと感じられることもある。このような嗜好性の差は意識的・主観的なものによるので、本研究が対象としている脳波による覚醒度の変化にはそれほど影響しないとも考えられたが、結果としてかなりの個人差を生じることがわかった。脳波周波数分析の数値からは少なくとも個人間で50%以上の変化があることがわかった。結果として、さらなる被験者数の拡大が課題となることがわかった。当初の目標よりも被験者数が少ないが、これは脳波の装着や機器の調整の時間がかかってしまうためである。現在までにこの時間的な問題は解決されており、今後はより効率的に計測が可能であると考えられる。本年度は、嗅覚刺激提示と脳波計測を同時におこなうシステムの作製と、被験者数の拡大を目標として研究を進めた。まず実際に評価で脳波分析等を利用するためには、測定している時点で分析の結果が分かるオンライン分析で評価するか、もしくは測った直後にすぐ分析にかけて数十秒で結果がわかるような即時性のある評価をおこなう必要があった。また通常の脳波計で、適切に測れるようになるまでには実験者がある程度計測に習熟している必要があり、取り付けにも相当の時間がかかるので、本研究の評価法を広く使えるようにするにはこの時間を短縮する必要があった。本年度はドライ式の脳波計を利用することで、ほとんど脳波計測の経験のない実験者が14チャンネルの脳波を記録することができるようになった。先行研究から、睡眠のためにアロマオイルの種類であるオレンジスイートオイルとラベンダーオイルが注目され、集中力を高めたいときにはオレンジスイートオイルとローズマリーオイルの使用が推奨されている。一方、ラベンダーオイルでは、脳波のθ波、α1波、α2波のパワーが増加し、血圧及び心拍が低下するのに対して、ローズマリーオイルではα1波,α2波のパワーが減少し、心拍・血圧・呼吸速度が増加するのでその影響はほぼ逆といえる。スイートオレンジオイルは神経系に与える影響は研究されているが、脳波については研究されていない。そのため、本年度は上記の3つの香り刺激に限定して、ラベンダーオイルとローズマリーオイルの反応が異なっていること、そしてスイートオレンジオイルは脳波に対してラベンダーオイルとローズマリーオイルのどちらに似た影響を与えるか調査した。被験者数の増加を目標としていたが、現在までに12名のデータを確保できた。分析では脳波パワースペクトルの算出などをおこない、異なる匂い刺激の間での差異を定量化した。今後も引き続き被験者を集めてデータ取得をおこない、より多いデータから統計的に有意な脳活動を抽出していく予定である。また現在オフラインで行っている分析をオンライン化することを目指す。実際に臨床的な評価として脳波分析等を利用するためには、測定している時点で分析の結果が分かるオンライン分析で評価するか、もしくは測った直後にすぐ分析にかけて数十秒で結果がわかるような即時性のある評価をおこなう必要がある。また通常の脳波計で、適切に測れるようになるまでには実験者がある程度計測に習熟している必要があり、取り付けにも相当の時間がかかる。本研究の評価法を広く使えるようにするにはこの時間を短縮する必要がある。今後は、この時間短縮も目指すともに新しい評価方法としての確立を目指していきたい。リハビリテーション工学参加を予定していた国際学会などが時間の都合で参加できなかったこと、および消耗品について、予想よりも安く手に入れることができたこと、また被験者について謝礼を払う必要がなくなったことなどによるものである。
生物における構造形成と情報に関する数理的研究

真正粘菌が鉄道網のような輸送ネットワークと等価なネットワークを形成する能力があることを実験的に示し、その数理モデルを構築することによって、ネットワークの新しい設計手法を提案した。また、卵割初期における空間的配位の決定や、肺や血管網の分岐構造の形成において、情報がどのような機序で働いているかを記述するモデルを提案した。これらの研究を通して、生物の構造形成と情報を結ぶしくみを記述する数理的手法を開発した。本研究では、生命現象を物質と情報の相互作用の場としてとらえることで、生物の構造形成を記述する新しい方法論を打ち立てることを最終的な目標とする。具体的には以下の研究目標で挙げる4つの系を対象として、実験家と協力しながら、生物における構造形成についての数理的研究を行う。(1)真正粘菌変形体をモデル生物とした研究(2)血管網を題材とした適応的ネットワークの研究(3)発生初期、特に卵割の研究(4)アメーバ運動の研究(1)では均質な要素からなる系の集団運動から情報機能が創発するしくみの解明、(2)では合目的的な流路系が構築されるための内皮細胞の環境に対する適応ルールの解明、(3)では細胞分裂による形作りの数理的記述の基礎の構築と、実際にそれを律するメカニズムの解明を目標とする。(4)では細胞のアメーバ運動の記述と、その自律分散制御の仕組みの解明を目標とする。真正粘菌変形体は原始的な神経系さえ持たない、単純な体制を持った多核単細胞生物であるが、迷路を解いたり最短経路問題を解く能力があることが、中垣らによって示されている。さらに、真正粘菌変形体は数多くの餌を提示された場合には、それらをできるだけ総長の短い経路でつなぐが、これは数理的にいえばスタイナー問題を近似的に解いていることに他ならない。NP完全問題であるスタイナー問題は、最短経路探索問題よりも遙かに困難な問題であり、まともに解けば計算時間の指数的発散という問題に直面するわけであるが、真正粘菌変形体はこれを数時間から1日で解くことができる。我々はPhysarum Solverを以下のように拡張する二とにより、スタイナー問題を近似的に解く方法を開発した。まず与えられた点を含む凸包を目の細かいネットワークで覆い、短い時間間隔ごとに2頂点のペアをランダムに選び、それにPhysarum Solyerを適用するのである。このようにすると、スタイナー最小木ではないが、それと位相的に等価な経路を求めることができる。これを元にスタイナー点の位置を緩和することにより、スタイナー最小木に到達できるのである。少なくとも頂点数が少ない場合についてはほぼ確実に正解に到達することがシミュレーションによって確かめられた。卵割の過程を記述するための数理的な記述の基盤を構築した。これには小林が物質科学の分野で開発してきたフェーズフィールドモデルを用い、細胞の存在を示す変数と、各細胞(割球)を示すための変数をカップルする。これに中心体の分裂と移動を組み合わせることで、卵割のカスケードを表現できるようにした。現在、中心体の分裂と移動を決めるためのモデル方程式を構築中である。真正粘菌変形体は原始的な神経系さえ持たない、単純な体制を持った多核単細胞生物であるが、迷路を解いたり最短経路問題を解く能力があることが知られている。我々の研究グループはこの過程をPhysarum Solverという数理モデルで記述することに成功してきた。Physarum Solverが極めて広いクラスのグラフ(平面グラフを含む)に対して、必ず最短経路を求める能力があることが、本専攻の大西勇氏らと共同研究で厳密に示された。また、変形体の運動とそれに伴う原形質流動をリアルタイムで観察することのできるシステムが研究分担者の中垣のグループによって開発された。真正粘菌変形体はCPG(Central Pattern Generator)の集合体とみなすことができる。変形体における振動子に対するフィードバックの考察から、齟齬関数という概念を提案した。現在、この概念をキーとして、自律分散制御に関する理論的枠組みを展開しようとしているところである。血管網研究に関しては、Chickの卵黄嚢に展開される血管網の変化をリアルタイムで観察できるシステムが研究分担者の三浦によって開発された。この系の観察から、動脈系と静脈系が別の層に分離しているという可能性が示唆されている。これが事実ならば、これまで考えてきた数理モデルの根本的な改変が必要となることが判明した。卵割の過程を記述するための数理モデルを新たに構築した。多細胞系の細胞分裂を含む卵形状の時間発展の記述に関しては、北海道大学の手老篤史氏らとの共同研究により、中心体の分裂方向が、卵の存在する2つの化学物質の分布(特にその勾配および凸性)によって決定されるという仮説に到達した。現在、この仮説の妥当性を検討中である。鉄道網・道路網・電力網・電話網・インターネットなど、人・物・エネルギー・情報を輸送するネットワークは、現代社会の重要な基盤である。このようなネットワークにおいては、効率・輸送コスト・対故障性といった複数の基準をバランス良く満たす必要がある。

生物の作るネットワークは長年にわたる自然の淘汰を生き抜いてきたものであるので、それを研究することによって、優れたネットワークをデザインするための指針を得ることが期待できる。我々は、真正粘菌変形体に東京圏の鉄道網を作らせ、実際の鉄道網と同程度の(場合によってはそれ以上の)ネットワークを形成することを示した。さらに、粘菌のネットワーク形成のモデルとして開発した拡張型Physarum Solverを用いて、粘菌や実際の鉄道網より優れたネットワークをデザインできることを示した。この仕事は2010年1月にScience誌に掲載された。アメーバプロテウスの運動において、後部収縮による内圧上昇に基づく仮足形成というロコモーション機構を数理モデル化した。現実のアメーバで観察される二つの運動モード、すなわち定速度進行とリズミック進行が、尾部の進行速度をパラメタとして切り替わることがわかった。実験当初においては、この2つの運動モードをコントロール下で選択的に出すことに成功していなかったが、飢餓処理をして活性度を下げればリズミック進行が出るということを数理モデルによって予言し、それは実験によって確認された。卵割、特にウニ卵の卵割過程を記述する数理モデルを提案した。植物極と動物極で生成される拡散性の2種のモルフォゲンにより、中心体の運動がコントロールされるという仮説をもとにこのモデルは構成されている。シミュレーションにより、第4卵割までの正常卵割および摂動実験の結果を、不等割まで含めて再現することができた。この結果はモルフォゲンの複雑な分布を仮定せずとも、両極でのモルフォゲンの生成のタイミングの制御だけで、卵割面の方向や位置をコントロールできることを示している。アメーバ運動の数理モデルを構築するには、形状の大変形と、ゲル層の収縮によって引き起こされる原形質ゾルの流れ、ゾルゲル変換、および運動を制御する情報処理のメカニズムを記述する必要がある。我々はフェーズフィールドモデルに粒子法(SPH法)を組み合わせることによって、物理層を記述する数理モデルを提案した。さらに単純な反応拡散系を組み合わせることで、極性を自発的に作ることができることを確認した。中垣らは、アメーバ運動に伴う細胞変形と原形質流動の3次元計測システム、床反力の測定システムを開発し、概ね後方で強く踏ん張っていることを観察した。この結果は、アメーバ運動に関する我々の仮説「前方は後方に比較して柔らかい」を支持するものである。前年度に提案した卵割モデルは、中心体の運動が植物極と動物極で生成される拡散性の2種のモルフォゲンによりコントロールされるという仮説に基づいている。質量分析の専門家の協力を得て、実際のウニ卵におけるモルフォゲンの探索を開始した。また、形状変化まで含めた現実的な卵割の過程を数理的に記述するために、多細胞型フェーズフィールドを用いたモデリングを行った。三浦は肺の分岐構造の形成の数理モデルを提案した。
胃炎・胃癌患者のヘリコバクター・ピロリおよび胃内フローラの解析と胃粘膜病変

慢性胃炎患者および胃癌患者の胃粘膜におけるHelicobacter pylori感染と胃内細菌叢との関連性を調べた。胃炎患者では連鎖球菌属が優勢であり、H. pylori陽性者にのみアトポバクテリウム属、腸球菌属、乳酸桿菌属が検出された。胃癌患者の胃内菌叢はH. pylori陰性者の胃内菌叢に近かった。メタゲノム解析の結果、H. pylori陽性胃炎患者ではナイセリア科、バークホリデリア科細菌が多かったが、同陰性患者では腸内細菌科、シュードモナス科細菌が多かった。これらの結果はH. pylori感染が胃酸分泌の低下を介して、胃内環境を他の細菌の生存に適したものへと変化させることを示唆した。検体から総DNAを抽出後、16SrRNA遺伝子をターゲットとするユニバーサルプライマー(27Fおよび1492R)でPCR増幅を行い、制限酵素HaeIII、HhaI、MspIを用いて処理し、解析を実施した。MspI処理したT-RFLP解析の結果、H. pyloriと考えられたフラグメントが全試料中に占める割合はH. pylori培養陽性の検体では72.4から97.8%と高かく、分離されたピークの数は2ー8本で、H. pylori陽性者の胃内には他の細菌の存在は極めて低い割合であることが示唆された。これに対して、増幅産物を得た2検体についてT-RFLP解析を実施した結果では、ピークの数は11本と17本であり、胃内には多菌種が存在していることが示唆された。しかし、H. pylori陰性者の胃内菌数の解析の結果、2検体は16SrRNA遺伝子をターゲットとしたPCRによる増幅産物を十分得ることができず、胃内に存在する細菌数が極めて少ないことが示唆された。また、サンプルのT-RFLPの結果からウォード法によるクラスター解析を実施した。H. pylori陽性の胃炎3例と胃癌1例、H. pylori陰性2例、陽性胃炎1例が別のクラスターとして認識された。胃癌患者の胃内菌叢がH. pylori陽性者と比べて陰性者の胃内菌叢に近いパターンを示す原因は不明であり、今後症例数を増やすとともに詳細な解析が必要と考えられた。H.pyloriの胃内細菌叢に占める割合は0.7%と算出され、陰性患者の胃からは検出されなかった。胃内細菌叢の構成を門レベルで比較した結果、H.pylori陽性者ではProteobacteriaが最も多く、次いでFirmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria, Actinobacteriaであった。H. pylori陰性者の構成も同様であったが、Fusobacteriaは認められなかった。さらに、Proteobacteria門細菌の構成をみると、H.pylori陽性者においてNeisseriaceae, Burkholderiaceaeなど口腔由来の細菌の比率が高かったのに対して、陰性者ではEnterobacteriaceaeが(全体の約13%)、Pseudomonadaceae(10%)を占めていた。また、Firmicutus門細菌の比較ではH.pylori陽性、陰性者ともにStreptococcaceaeの比率が10%を超えていたが、Staphylococcaceae、Enterococcaceaeが陰性者の細菌叢にのみ少数検出された。Bacteroidetes門ではPrevotellaが陽性陰性者ともに多かった。Actinobacteria門の構成菌は陽性者ではRothiaが優勢であるのに対し、陰性者ではPropionibacteriumが多かった。今後は症例数を増やして解析するとともに、陽性者で口腔細菌の割合が高い原因を口腔フローラの解析と合わせて比較していく必要性が示された。萎縮性胃炎患者8名、胃癌患者1名に対して胃粘膜フローラおよびH. pyloriに関する基礎的解析を行った。培養法により胃粘膜フローラ構成細菌を分離するとともに、胃生検材料から全DNAを抽出し胃内フローラの構成を解析した。さらに、H. pyloriの存在については、培養およびPCRにより判定した。胃炎患者8名のうち、H. pylori陽性者は4名、陰性者は4名で、培養の結果とPCRによる結果が一致していた。胃内フローラの定量解析からは、Streptococcus属およびLactobacillus属が高頻度に検出されたが、H. pylori陽性と陰性の患者による差は認められなかった。Atopobacterium属菌、Enterococcus属菌、Veillonella属菌がH. pylori陽性の患者にのみ検出された。胃癌患者1名の胃粘膜はH. pylori陽性であり、Streptococcus属細菌がPCR法により検出された。

分離培養菌株については、16SrDNA遺伝子配列により同定した。その結果、分離培養菌はStreptococcus属が最優勢となり、培養陰性の一例を除くすべての患者から検出された。分離菌はS. salivalius S. parasanguis, S. mitis, S. oralisが多く、これらは口腔由来のStreptococcus属細菌であると考えられた。その他、Neisseria属菌、Actinomyces属菌、Rothia属菌などが検出された。少数例ではVeillonella parvullaが検出された。本結果はH. pylori感染が胃酸分泌の低下を介して、胃内環境を他の細菌の生存に適したものへと変化させる可能性を示唆する。分離培養された胃内細菌とH. pyloriとの相互作用については今後の検討課題となる。平成23年度に菌種特異的な16S rRNA遺伝子をターゲットとするプライマーを使用してリアルタイムPCR法にて胃内細菌叢の定量的解析を行なった。生検提出時には分離培養を実施して、分離された菌株はー80°Cにて保管している。平成24年度にはT-RFLP法を用いて胃炎および胃癌患者における胃内細菌叢の解析を行った。これにより、異なった手法により胃内細菌叢構成細菌とH. pylori感染との生態学的基礎知見が得られたことは、最終年度の研究に大きなインパクトを与えている。研究計画では胃炎患者20名(H. pylori陽性10名、陰性10名)および胃癌患者20名(H. pylori陽性10名、陰性10名)より内視鏡的に胃生検材料を採取することになっていた。平成23年度では胃炎患者8名(H. pylori陽性4名、陰性4名)および胃癌患者1名(H. pylori陽性)より内視鏡的に胃生検材料を採取することが可能であった。予定症例数には達することができなかったが、PCR法による胃内細菌叢解析法および胃内細菌の分離法についての実験条件・手技を確立することができた。平成24年度には予定検体数を確保するように研究分担者との連携を図る。研究分担者の高橋により多数の胃炎患者および胃癌患者の胃生検材料を採取するように努める。外来胃内視鏡検査では胃炎患者が胃癌患者に比べて圧倒的に多いため、胃癌患者からの胃生検材料の採取が比較的困難となるが、目標とする20例の試料を採取できるよう努力する。全ての生検材料について菌種特異的な16S rRNA遺伝子をターゲットとするプライマーを用いたリアルタイムPCR法による定量的解析およびT-RFLP法を用いて胃内細菌叢を調べる。加えて、胃粘膜より分離培養された菌株を用いて抗H. pylori活性のスクリーニングを行う。予定された胃生検材料(胃炎患者12名、胃癌患者19名)を採取し、胃粘膜フローラの解析および分離培養細菌の性状解析を行う。胃炎および胃癌由来の胃内フローラとの間に相違がないかどうかを比較検討する。分離培養胃内細菌のH. pyloriに対する効果(抗菌作用、病原因子産生阻害作用など)もについてin vitroにて解析を行う。胃内フローラの解析および分離された胃内細菌の性状解析に必要な試薬、器具を購入するために使用する。
植物の上下軸の決定と上下軸に沿ったパターン形成を担う分子機構

受精は個体発生の原点である。研究代表者らは近年、植物において受精卵から始まる胚発生過程のライブイメージングに世界で初めて成功した。その結果、受精卵の極性化や胚のパターン形成がダイナミックかつ秩序だった様式で起こることを見出した。しかし、何が受精卵の極性化方向を決め、どのように細胞分裂パターンが決まるのかといった、本質的な点がいまだ謎のままである。そこで本研究では、高精細なライブイメージング解析によって、生きた受精卵や胚の内部で起こる現象を網羅的に可視化するとともに、大規模な遺伝子発現解析を行うことで、それらの現象を制御する遺伝子をも突き止める。
日中間労働力移動のメカニズムと経済・社会的影響

本研究は、研究期間(平成21年23年度)において、現地調査と統計資料の整理を通じて、日中両国間の双方向の労働力(人口)の移動規模、移動者の産業別分布・地域分布とその影響要因、両国間労働力移動による移動先(地域)への経済・社会的影響などについて考察・分析した。こうした調査・分析に基づいて完成した調査報告・研究論文は、日中両国で開催される関連国際研究会・学会で報告されたとともに、一部の論文は研究雑誌で掲載され、一部の研究成果は公刊著書『新移民と中国の経済発展:頭脳流出から頭脳循環へ』(多賀出版,2012)などに編入されている。本研究の研究期間は3年間(平成21年23年)である。平成21年度においては、まず両国の人口センサスデータや在留外国人統計・外国人労働力関連の調査資料の収集を通じて、両国間双方向の労働力移動のタイプ、規模、転出地・転入地構造に関する基本情報を整理した。それと同時に、両国政府の関連政策の推移や両国の経済動向および主要地域の国際労働力動の動向を調べるために、日本国内のいくつかの地域(東京、関西、九州)のほか、中国の首都(北京)、上海経済圏(最大規模の在中日本人の滞在先)、東北地域(在日中国人の最大出身地域)で調査を行った。また、両国間の各種労働力移動を影響する制度的・経済的・社会的要因についても分析し始めた。なお、研究計画に沿って日中間労働力移動に関する調査・分析を進めているとともに、労働力移動(特に国際労働力移動問題)全般に関する研究も行っている。他の2つの関連論文は、上海人民出版社に出版された論文集(2009)や雑誌『東アジアへの視点』(2009)に収録・掲載された。本研究の研究期間は3年間(平成21年度23年度)である。平成22年度においては、前年度に引き続き、日中両国での現地調査・訪問を通じて両国間双方向労働力移動の実態を調査するとともに、両国間の労働力(専門技術者・単純労働者)移動規模、移住労働力の産業別分布と地域分布を影響する諸要因について、分析を進めた。また、両国間の労働力移動による移動先への経済・社会的影響(例えば、労働市場・住宅市場への影響)についても分析をはじめた。以上の調査・分析に基づいて作成・修正した幾つかのWorking Paperは、それぞれ日本国内で開催された国際シンポジウム「INCOME INEQUALITY : A NEW THREAT TO GLOBALIZlNG ECONOMIES」(京都、2010年4月10日)と「中国経済学会2010年大会」(名古屋大学、2010年6月19日)および海外で開催された関連国際研究会(上海復旦大学、2010年5月29日;シンガポール南洋理工大学、2010年12月21日)で報告した。完成したWorking Paperのうち、2つは日本国内の雑誌(『赤門マネジメント・レビュー』、『東アジアへの視点』)に掲載され、1つは論文集に収録、さらに中国の有力出版社(上海人民出版社)で出版された。また、このほかに2つの関連論文を英文学術誌に投稿している。なお、こうした調査・研究・交流活動を通じて国内外の多くの実務者・研究者の意見を吸収しながら、23年度の補足調査と研究内容および最終研究報告書の構成を確定した。平成23年度においては、(1)21-22年度に調査・収集した日中両国間の双方向労働力(人口)移動の実態に関する資料・データ、(2)2011年に公表された両国の2010年人口センサスデータ(在日中国人・在中日本人に関するデータ)を用いて、両国間の労働力移動規模、移住労働力の産業別分布・地域分布、およびその影響要因について分析するとともに、両国間の労働力(人口)移動による日中両国への経済的・社会的影響(地域人口変動、国際観光、対外直接投資、産業発展などへの影響)についても、分析を行っている。また、23年度を含む過去数年間で整理した資料と完成した論文に基づいて、2012年2月に、欧米・日本に移住した中国人高学歴者(新移民)を主な分析対象とする単著『新移民と中国の経済発展:頭脳流出から頭脳循環へ』(248ページ)を完成した。この本は、国際東アジア研究センターの研究叢書として、2012年6月に多賀出版(東京)に出版される予定である。
免疫寛容の分子機構

西川は、無血清培地を用いたプロB細胞培養法を用いて、fynキナーゼが分裂溝形成に重要な役割を演じていることを明らかにすると共に、Flk2の発現を指標にして、プロB細胞の最も初期段階を定義できることを明らかにした。桂は、末分化胸腺細胞群(c-kit^+,CD44^+,CD25^-)はFcR^-とFcR^+に分けることができることを示すと共に、FcR^+はT細胞系列に決定されていることを明らかにした。菅村は、IL-2受容体γ鎖変異マウスを作製した。γ鎖変異マウスは、T、B細胞の著減とNK細胞の消失による免疫不全を示した。平野は、IL-6受容体を介するシグナル伝達にJAK-STAT伝達路が関与していることを示すと共に、IL-6によるマクロファージの分化にSTAT3が必須の役割を示していることを明らかにした。斎藤は、TCRシグナルの強さによって、T細胞選択が決まることをCD3ξ欠損マウスとTCR-Tgマウスの交配によって明らかにした。又、Jak3はT細胞の増殖に不可欠であることを明らかにした。阪口は、プレB細胞においても、μ/VpreB/λ5がシグナル伝達に関与していることを明らかにすると共に、新たな機能分子p52の構造決定を行った。上出は、CTL4分子を5量体にすることによって、より効率良く移植片拒絶反応を抑制できることを示した。須田は、Fasが脾臓等の胚中心に強く発現すること、LPS刺激によりB細胞が機能的Fasを発現することを示し、活性化B細胞の細胞死におけるFas関与を示唆した。又、膜型ヒトFasリガンドが蛋白分解により、細胞障害活性を維持したまま分泌されることを示した。さらにヒトFasリガンドに対するモノクローナル抗体を樹立し、ELISA系を樹立した。桂らは、胸腺培養系で、胸腺細胞のクローン除去を誘導できる系を確立すると共に、クローン除去能を有する細胞株を同定した。クローン除去には、この細胞由来の第2シグナルが必要であることを明らかにした。西川らは、骨髄ストローマ細胞依存性の造血やB前細胞の増殖を支持できる完全無血清培地の開発に成功すると共に、抗IL-7受容体モノクローナル抗体を樹立し、IL-7シグナルがリンパ球初期分化に必須であることを証明した。斉藤らは、CD3ζ鎖欠損マウスを作製し、ζ鎖の代わりにFcR_γ鎖ダイマーをシグナル伝達分子として使用していることを証明した。阪口らは、抗原受容体の機能分子として、新しいp52,p160分子を発見した。さらに、これらの分子に対するモノクローナル抗体を作製すると共に、p52分子をコードする遺伝子の単離に成功した。さらに、成熟B細胞と未熟B細胞では、抗原受容体を介するシグナル伝達系に差があり、p52やp160分子は、この問題を解明するための重要な分子であることを明らかにした。平野らは、IL-6受容体を介するシグナル伝達経路に、JakチロシンキナーゼとStatファミリーに属するシグナル伝達性転写因子が重要な役割を果していることを明らかにした。さらに、骨髄ストローマ細胞より、B前駆細胞の増殖支持能を有する新しい膜蛋白BST-1の遺伝子クローニングに成功した。菅村らは、IL-2R_γ鎖がシグナル伝達に重要であると共に、IL-4,IL-7受容体のサブユニットとして作用していることを証明した。上出らは、T細胞活性化に重要な補助シグナル伝達分子であるB7には、スプライシングの差で異なるサブタイプが存在しており、この分子(MB7-2)は、B7とは異なる役割をしている可能性を明らかにした。

平野らは、骨髄ストローマ膜蛋白BST-1のcDNAをクローニングし、その構造を決定すると共に、BST-1がADPリボシールシクラーゼ活性を有していることを示した。又、慢性関節リウマチ患者で、特に関節破壊の激しい症例において、血清中の可溶型BST-1濃度が高いことを明らかにした。さらにIL-6受容体を介するシグナル伝達にJak-STATを介する経路と、BtK/Tccを介する2つの経路が存在することを明らかにした。阪口らは、B細胞抗原受容体を介するシグナル伝達に関与すると考えられる新しい分子p52とp160を同定すると共に、p52をコードするcDNAをクローニングした。西川らは、無血清培地でプロBリンパ球を培養する系を確立すると共に、IL-7受容体を介するシグナルの標的とて、cyclin D3/cdk4を同定した。又、未熟Bリンパ球の増殖におけるPDGFやM-CSFの役割を明らかにするために、PDGFやM-CSF受容体に対するモノクローナル抗体を作製した。桂らは、胎仔胸腺臓器培養系を用いて、T細胞の前駆細胞を解析する系を検討した。斎藤らは、ζ鎖を欠損させたマウスにζ鎖の変異遺伝子を導入することにより、ζ鎖を介するシグナルは、未熟胸腺細胞の分化・増殖には不可欠だが、成熟胸腺細胞分化には、他のCD3分子を介するシグナルで十分であることを明らかにした。菅村らは、IL-2受容体γ鎖がIL-9受容体のサブユニットとしても共用されていることを証明した。又、IL-2受容体にはJAK1とJAK3チロシンキナーゼ分子が会合していることを明らかにした。上出らは、B7-1の変異型であるMB-7-2は、活性化T細胞に対しては増殖を誘導するが、静止期T細胞に対しては、B7-1やB7-2を介する増殖を抑制することを明らかにした。須田らは、マウスgld突然変異がFasリガンド遺伝子の点変異であることを明らかにした。西川は、無血清培地を用いたプロB細胞培養法を用いて、fynキナーゼが分裂講形成に重要な役割を演じていることを明らかにすると共に、Flk2の発現を指標にして、プロB細胞の最も初期段階を定義できることを明らかにした。桂は、未分化胸腺細胞群(c-kit^+,CD44^+,CD25^-)はFcR^-とFcR^+に分けることができることを示すと共に、FcR^+はT細胞系列に決定されていることを明らかにした。菅村は、IL-2受容体γ鎖変異マウスを作製した。γ鎖変異マウスは、T,B細胞の著減とNK細胞の消失による免疫不全を示した。平野は、IL-6受容体を介するシグナル伝達にJAK-STAT伝達路が関与していることを示すと共に、IL-6によるマクロファージの分化にSTAT3が必須の役割を示していることを明らかにした。斉藤は、TCRシグナルの強さによって、T細胞選択が決まることをCD3ζ欠損マウスとTCR-Tgマウスの交配によって明らかにした。又、Jak3はT細胞の増殖に不可欠であることを明らかにした。阪口は、プレB細胞においても、μ/VpreB/λ5がシグナル伝達に関与していることを明らかにすると共に、新たな機能分子p52の構造決定を行った。
拡張可能なステートフルアスペクトの設計と実装

従来ステートフルアスペクト言語では,開発者は正規表現を用いたパターン記述で実行履歴の絞り込みを行う.記述されたパターンはプログラム実行時に評価されるが,パターンをどのように解釈し,実行履歴にマッチさせるのか,というパターンの意味論は予め言語設計者が決定しており,開発者は変更できない.そこで本研究では,柔軟なパターン記述を行うため,パターン解釈の意味論を開発者が変更可能なステートフルアスペクトの基本要素と織り込み方法(モデル)を提案し,具体的なプログラム言語を用いたシステムを実現した.また.アスペクトの織り込み方法を応用し.非同期処理の複雑な緩和する手法の提案,およびライブラリの実装を行った.今年度は当初の計画通り,アスペクトを実行時に織り込む機構を実現するべく,参考となるAspectScriptの実装を調べることから研究を始めた.AspectScriptの開発者であり,本研究を共同で進める予定のPaul Legerの助けもあり,アスペクトの実行時織込み方法は当初の予定よりも早く実現の目処がたち,本研究の対象言語であるActionScript3を用いてアスペクトの織込みを実現するライブラリのプロトタイプシステムを完成させた.実現した織り込み方法では、関数の呼び出しをクロージャで内包し,関数呼出し,および実行をすべて観測することによって実行時にアスペクトを織り込むことを可能にしている.今年度は本来の目的であるステートフルアスペクトの履歴にマッチする意味論,およびアドバイス織り込みの意味論を動的に切り替える機構と並行し,実現した織り込み機構を拡張することで,近年軽量言語を用いたweb開発で問題となるcallback地獄を解決する手法を考案し,実現した.この手法によって,本来コールバック関数を渡り歩いて記述せざるを得ない非同期処理を,同期処理と同じように記述することが可能になった.この成果を国際会議に投稿し,発表を行うと共に、国内ワークショップにおいてポスター発表を行った.また,実現した織り込み方法を拡張し,アスペクトの評価部分にMacherCellsのアイデアを応用することで、本研究の目的であるステートフルアスペクトの履歴にマッチする意味論,およびアドバイス織り込みの意味論を動的に切り替える機構のプロトタイプも実現でき,ここまでの成果をジャーナル論文としてまとめ,投稿した。まず,昨年度末に投稿していた,本研究課題の主目的であるプログラムの実行履歴にマッチするステートフルアスペクトの意味論,およびアドバイス織り込みの意味論を動的に変更する機構をまとめた論文がSCP(Science of Computer Programming)に採択された.本論文では,実行履歴のパターンをファーストクラス(パターンオブジェクト)として扱い,Open Implementationのガイドラインに従って,アスペクトの織り込み機構とパターンオブジェクトとのインタフェースを厳密に定義することでアドバイス織り込みの意味論を実行時に変更することが可能であることを示した.本論文ではJavaScriptとクロージャ機構を用いてパターンオブジェクトを実現しているが,本論文での提案や結論は,パターンをオブジェクトとして表現可能な言語であれば,特定の言語に依存せず適応可能である.また,昨年度は,本研究の織り込み機構とアスペクトを利用し,同期/非同期処理の違いを隠蔽する機構の提案,およびプロトタイプの実現を行ったが,今年度はこの機構を拡張して一般の開発者が利用可能なライブラリ(SyncAS)とし,定量的な評価を行ってIJSEKE(International Journal of Software Engineering and Knowledge Engineering)に投稿し,採択された.SyncASの実装にはActionScriptを使用しているが,クロージャサポートする言語(JavaScriptやDartなど)であれば同様の機構を実現することができる.一方,SyncASでは利用者に同期/非同期の違いを意識せずに記述することを可能にしているが,try-catchやreturnなど,制御がプログラムの実行がジャンプする場合,およびwhileやforとなどのループの中でSyncASの機構を適用することができないという問題点も判明した.これらの点はこれからの課題である.昨年度に引き続き,当初予定したステートフルアスペクトプログラムの実行履歴にマッチするステートフルアスペクトの意味論,およびアドバイス織り込みの意味論を動的に変更する機構は実現でき,その成果として論文にまとめ掲載された.そのため,現在は本課題のアスペクト織り込み機構実装の際に着目した,アスペクトを利用してシングルスレッド環境下での非同期処理記述を隠蔽する機構の研究に取り組んでいる.本機構実現のための技術検証,プロトタイプ作成は昨年度に行い,今年度は非同期処理記述の複雑さをプログラマから隠蔽するため,本機構を用いたライブラリ(SyncAS)の実装を行い,性能評価をして論文にまとめ論文誌に掲載された.また,並行して非同期処理を多用したオープンソースのソフトウェアに対してSyncASを適用し,実用的なアプリケーション開発にSyncASが適用可能であることを示した.そして,その成果を国際会議に投稿し発表を行った.さらに,非同期処理に関するアプローチの中で代表的な,C#のasync/await, JavaScriptでのPromiseパターンとSyncASを,書きやすさ,オーバーヘッド,モジュール性の観点から評価した.その結果,モジュール性という観点からはSyncASが最も優れているということが分かった.しかしながら,Promiseや現在のSyncASではループ処理やtry-catchの中で適用できないということもわかり,今後の課題となっている.本研究は,当初の目的であるプログラムの実行履歴にマッチするステートフルアスペクトの意味論,およびアドバイス織込みの意味論を動的に変更する機構に関しては一定の成果を挙げ,ジャーナル論文(Science of Computer Programming)を執筆,採択された.

その後,研究遂行過程で実現したアスペクト織込み機構を応用し,近年特にWebの開発で利用されている非同期処理の複雑さを隠蔽する機構の研究に取り組み,ActionScriptを用いてライブラリ(SyncAS)の研究開発を行い,その成果をIJSEKE(International Journal of Software Engineering and Knowledge Engineering)で発表した.SyncASでは,try-catchやreturnなど,プログラムの実行がジャンプする場合や,ループといった制御構造が存在すると本研究の機構が適用できないことが判明しており,それを解決することが課題であった.この問題を解決するため,今年度はアスペクトとCall/CCを応用し,JavaScriptで同等の機構を実現する研究(Sync/CC)に取り組み,プロトタイプシステムを実装し,その成果をFOAL2016(Workshop on Foundations Of Aspect-Oriented Languages)で発表した.Sync/CCはまだプロトタイプシステムであり,一般的なブラウザでは動作しない.そのため,JavaScriptのプログラムをContinuation Passing Styleに変換する機構(Translator)が必要である.Translatorを実現し,非同期処理を多用するWebアプリケーションでその効果を確認することが現在の課題である.本研究の当初の目的は達成できており,その意味で当初計画以上に研究は進展している.昨年度実現したSync/ASでは,try-catchやreturnなどプログラムの実行がジャンプする場合や,whileやforといったループが含まれていると機能しないという問題がわかっており,これを解決することがが新たな研究目的であった.そこで,本年度はプログラム言語の研究成果であるCall/CCとアスペクトを組み合わせることでこの問題に取り組み,プロトタイプシステム(Sync/CC)を実現した.Sync/CCでは,JavaScriptと,アスペクト思考フレームワークであるAspectScript,そして継続(Continuation)をサポートしているJavaScript実行エンジン,Rhinoを利用している.Sync/CCでは,Webアプリケーションのイベント処理に着目し,非同期処理を含むイベントハンドラの実行を次のようにして中断・再実行している.(1)非同期処理の実行直後にアスペクトを織込み,Continuationを保持する.(2)イベントハンドラの実行からメインスレッドに処理を戻す.(3)非同期処理のコールバック実行時にアスペクトを織込み,本来の処理を実行した後,(1)で保持したContinuationを取り出してイベントハンドラの処理を継続する.