hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
過剰な攻撃行動と免疫系をつなぐ神経メカニズムの解析

縫線核ニューロンの逆行性ラベルを行ったところ、当初の想定に反し、逆行性ラベリングがうまくいかないことが判明したため、ラベリング方法をレトロビーズや、レトロAAVを用いて試みたところ、目的の特定の投射ニューロンの標識が可能となった。今後、この細胞の特徴を免疫組織化学的方法やin situ hybridizationを用いて明らかにしていく予定である。また、tTA発現トランスジェニックマウスを用いることで、この投射経路の中の特定の細胞種集団のみを光操作したときに、攻撃行動にどのような影響が出るかの検討も始めているところである。一般的に別の脳領域で用いられているAAV5を用いて特定の脳領域に投射している背側縫線核ニューロンの逆行性ラベルを行ったところ、当初の想定に反し、逆行性ラベリングがうまくいかないことが判明したため、繰り越しを行った。その結果、ラベリング方法をレトロビーズや、レトロAAVを用いて試みることができ、目的の特定の投射ニューロンの標識が可能となり、この細胞の特徴の今後の解析が可能となった。また、並行して、tTA発現トランスジェニックマウスを用いることで、この投射経路の特定の細胞種集団のみを光操作する実験も始めており、予備実験において攻撃行動に影響がでる光操作パターンが明らかになりつつあることから、今後本実験を進めていく予定である。1)攻撃行動中のサイトカインの脳内放出量を、マイクロダイアリシス法を用いて測定する2)背側縫線核からの特定の神経投射が攻撃行動中に活性化しているかの解析を、トレーサーとファイバーフォトメトリー法を用いて行う3)遺伝子ノックダウンの手法を用いて、DRNのIL-1β受容体のノックダウンによって、攻撃行動中のDRNセロトニンニューロンの活性がどのように変化するかを検討する4)過剰な攻撃行動を示すMSM系統の血中と脳内のサイトカイン量を、攻撃行動が低いC57BL/6J系統のものと比較することで、過剰な攻撃性に関わる免疫系応答の変化を調べる。1)攻撃行動中のサイトカインの脳内放出量を、マイクロダイアリシス法を用いて測定する2)背側縫線核からの特定の神経投射が攻撃行動中に活性化しているかの解析を、トレーサーとファイバーフォトメトリー法を用いて行う3)遺伝子ノックダウンの手法を用いて、DRNのIL-1β受容体のノックダウンによって、攻撃行動中の背側縫線核の特定の投射ニューロンの活性がどのように変化するかを検討する4)過剰な攻撃行動を示すMSM系統の血中と脳内のサイトカイン量を、攻撃行動が低いC57BL/6J系統のものと比較することで、過剰な攻撃性に関わる免疫系応答の変化を調べる。
サンプル値制御で実現できる最適性能の性質と制御環境の最適化

まず,理論の側面からも,応用の側面からも注目度の高い,一般化サンプラ・一般化ホールドを含むサンプル値制御系について,これを取り扱うための数学的枠組の構築を行なった.その結果,サンプラとホールドを積分作用素と見なし,その核関数として許されるものの集合をできるだけ広く取ることにより,これまでになく広い範囲の一般化サンプラとホールドを扱え,かつサンプラとホールドの扱いが双対になるという良い性質をもつ枠組ができた.さらに,これまで特殊な場合についてのみ成立が証明されていたサンプル値制御系の基本的な成立が,この広い枠組においても成り立つことが証明された.さらにこの枠組を用いてサンプル値制御系の収束性について解析を行なった.それによると,サンプル値制御で達成できる最適な性能が,サンプル周期を零に近付けるにつれて,連続時間時不変制御の最適性能に収束していくかどうかということは,用いるサンプラとホールドの種類に依存して変わる.特に,アンチエリアスフィルタの帯域幅をサンプル周波数に比例させてとると,収束しない可能性が高いので注意すべきであるということがわかった.しかしサンプラとホールドの種類をうまく選べば,ほとんどすべての制御対象について収束性を保証できることもわかった.これ以外にも,高信頼性制御におけるサンプル値制御の適用,およびそこで達成できる性能のサンプル周期への依存性についても研究した.まず,理論の側面からも,応用の側面からも注目度の高い,一般化サンプラ・一般化ホールドを含むサンプル値制御系について,これを取り扱うための数学的枠組の構築を行なった.その結果,サンプラとホールドを積分作用素と見なし,その核関数として許されるものの集合をできるだけ広く取ることにより,これまでになく広い範囲の一般化サンプラとホールドを扱え,かつサンプラとホールドの扱いが双対になるという良い性質をもつ枠組ができた.さらに,これまで特殊な場合についてのみ成立が証明されていたサンプル値制御系の基本的な成立が,この広い枠組においても成り立つことが証明された.さらにこの枠組を用いてサンプル値制御系の収束性について解析を行なった.それによると,サンプル値制御で達成できる最適な性能が,サンプル周期を零に近付けるにつれて,連続時間時不変制御の最適性能に収束していくかどうかということは,用いるサンプラとホールドの種類に依存して変わる.特に,アンチエリアスフィルタの帯域幅をサンプル周波数に比例させてとると,収束しない可能性が高いので注意すべきであるということがわかった.しかしサンプラとホールドの種類をうまく選べば,ほとんどすべての制御対象について収束性を保証できることもわかった.これ以外にも,高信頼性制御におけるサンプル値制御の適用,およびそこで達成できる性能のサンプル周期への依存性についても研究した.
性スイッチ遺伝子発現量と社会的地位への応答進化の統合：魚類性転換機構の解明

本研究では、魚類の性転換現象といった「性」に関する話題に焦点をあて、生物の表現型適応の進化機構を、遺伝子発現・生理的機構に着目しモデル化する。生理学・分子生物学と生態学・行動学をつなぐ新しいアプローチを確立することが目的である。今年度は「適応性」に焦点をあて、以下の2つのことを明らかにした。[1]基本的に自家受精する雌雄同体と雄との共存条件カブトエビは、初夏に水田で大量発生する節足動物である。日本のカブトエビは、同時的雌雄同体のみで自家受精をおこなう。一方ヨーロッパで見られるカブトエビは、雌雄同体だけでなく雄が見られ、雄は雌雄同体と配偶する。カブトエビの性システムを決める条件を数理モデルで明らかにした。解析によると、自家受精による卵の近交弱勢が強く、かつ雌雄同体が他家受精をするために雄に出会う頻度が高くなれば、他家受精する雌雄同体と雄の共存(ヨーロッパ型カブトエビ)が局所的に安定になる。一方で、雄が存在しない集団では他家受精できないため、他家受精を希望する雌雄同体は、最初から自家受精だけをする雌雄同体よりも不利になる。その結果、最初から自家受精をする雌雄同体のみの集団(日本型カブトエビ)は必ず進化的に安定であることがわかった。[2]社会性昆虫アリにおける齢に応じた仕事分業がなぜ起こるのか一般的に、若齢個体は卵や幼虫の世話など巣内での仕事を担当し、老齢個体では巣の外で餌集めや見張りなどの仕事に従事する。餌集めといった外勤の仕事は危険がたくさんあり、内勤アリよりも死亡率が高いとされる。齢に応じた仕事分業を説明するための動的最適化モデルを作成した。このモデルの解析はこれからである。アリの齢による仕事の違いも、サンゴ礁魚類で見られる性転換現象を説明した「死亡コストモデル」と同じ定式化で解ける見込みである。両モデルの比較検討もおこなう。身内の不幸と介護があったため、研究時間が確保できず研究計画が遅れている。今年度は、遺伝子発現・生理的機構に着目した新しいモデルを展開できず、これまで研究代表者がおこなってきた適応性に関するモデルを作成・解析するだけにとどまった。[1]遺伝子発現・生理的機構に着目したモデリングとして、性表現は雌雄同体のみで、自家受精をする魚であるマングローブキリフィッシュに注目する。この魚では、雌雄同体の一部が雄に性転換することがわかっている。基本的な繁殖は自家受精によるので、ほとんどすべての個体は遺伝的にクローンである。この状態で性転換が起こるときに、体内での遺伝子発現量およびホルモン量に着目してそのダイナミックスを微分方程式で記述し、雌雄同体と雄での性ホルモン量の違いをもたらす要因を明らかにする。[2]研究実績の概要で述べた、[2]社会性昆虫アリにおける齢に応じた仕事分業がなぜ起こるのかについてのモデルの解析をおこない、魚類の性転換モデルとの比較をおこなう。本研究では、魚類の性転換現象に焦点をあて、生物の表現型適応の進化機構を、遺伝子発現・生理的機構に着目しモデル化する。以下の2つのことを明らかにした。[1]ホルモンー酵素動態がもたらす双方向性転換にかかる時間非対称性双方向性転換では、一般的に雄から雌への方向には長く時間がかかる傾向がある。この問いに答えるために、性を制御するホルモンと酵素アロマターゼの動態をモデル化した。また進化生態学における適応を取り入れ、性転換にかかる時間がもたらす適応度の損失を考慮した。その結果、一夫多妻の場合、雄は多数の雌の産む卵を独占的に授精するので、雄としての機能開始遅れが重要になり、アロマターゼの分解速度を上昇させて、雄への性転換時間を早めることがわかった。一方、一夫一妻の場合、アロマターゼの分解速度は速くならず、雄化時間と雌化時間はほぼ等しくなることがわかった。以上の議論は、サイズ有利性モデルのような至近要因を考慮しない既存の進化生態学モデルではできなかった予測である。[2]双方向性転換魚における両性生殖線の進化条件双方向性転換の生殖腺構造は2タイプが知られている。ほとんどの種では、機能的性の生殖腺のみを持ち、性転換時に他方の性の生殖腺へと作り替える。一方ベニハゼ属などでは常に卵巣と精巣の両方を持つ(両性生殖線)。両性生殖線を持つ利益は、社会的状況が変化した時、すぐに性転換を完了でき、繁殖活動に遅れが生じないという点である。しかしその維持にはコストがかかり、繁殖成功の損失が生じるだろう。両性生殖線の維持が有利になるのはどのような時か、簡単なマルコフ連鎖モデルで説明した。その結果、社会的状況が頻繁に変化する時は雌雄両方が両性生殖線を持ち、社会的状況が変化しにくい時は機能的性の生殖腺しか持たないことがわかった。研究実績の概要「[2]双方向性転換魚における両性生殖線の進化条件」は平成28年度の当初の研究計画では予定していなかった研究で、生殖腺の形態学と進化生態学を結びつけた新たな研究である。実績の概要[1]および[2]の研究は国際誌に掲載され、計画以上に研究が進んでいると言える。

本研究では、魚類の性転換現象そして魚類や爬虫類で多く見られる温度性決定現象に焦点をあて、生物の表現型適応の進化機構を、遺伝子発現・生理的機構に着目しモデル化する。生理学・分子生物学と生態学・行動学をつなぐ新しいアプローチを確立することが目的である。以下の2つのことを明らかにした。[1]なぜ双方向性転換が稀なのか?社会的状況に応じて双方向に性をかえる種もあるが、一方向の性転換をする種がほとんどである。性表現を制御するホルモンのダイナミックスをモデル化することで、この問いに答える。結果、(1)個体がより優位になるにつれ、雌性ホルモンは増加するが、あるところでその量は急激に減少する。このときに雌性先熟的性転換が起こる。(2)一方、個体の地位がより劣位になるにつれ、雌性ホルモンはあるところで、急激に増加する。このとき雄性先熟的性転換が起こる。(3)雌と雄の表現型がともに安定な領域(双安定)があることがわかった。双安定領域の幅がある程度存在することが、双方向性転換が起きにくい原因となっていることが示唆された。[2]温度性決定の生理的機構のモデル化雌雄を決定するホルモンのダイナミックスを考え、そこに関与する酵素の反応速度が温度に依存する場合に、どのような温度性決定パターンが見られるかをモデル化した。全ての酵素反応の速度が同じ温度依存性を持つと、平衡状態のホルモン量は変化せず、温度依存性決定は生じない。複数の反応で温度依存性があり、その反応速度がArrhenius式に従うときは、FMF型(低温と高温でともに雌になり中間温度で雄になる)が出現しない。温度性決定を示す爬虫類の多くで見られるFMF型を出すには、高温での温度依存性をさらに高める何らかの機構、例えば選択的スプライシング、翻訳後修飾、多量体形成などが温度依存的に生じることが必要と推測される。研究実績の概要「[2]温度性決定の生理的機構のモデル化」は平成29年度の当初の研究計画では予定していなかった研究で、[1]のモデルを応用して展開した。温度性決定の祖先型と推定されているFMF型は、化学反応理論から導かれる速度反応式(Arrhenius式)の適用では説明できず、高温での温度依存性をさらに高める何らかの機構が必要であることを提唱した新たな研究である。本研究では、魚類の性転換現象といった「性」に関する話題に焦点をあて、生物の表現型適応の進化機構を、遺伝子発現・生理的機構に着目しモデル化する。今年度は「適応性」に焦点をあて、以下の2つのことを明らかにした。[1]基本的に自家受精する雌雄同体と雄との共存条件カブトエビは、初夏に水田で大量発生する節足動物である。日本のカブトエビは、同時的雌雄同体のみで自家受精をおこなう。一方ヨーロッパで見られるカブトエビは、雌雄同体だけでなく雄が見られ、雄は雌雄同体と配偶する。カブトエビの性システムを決める条件を数理モデルで明らかにした。解析によると、自家受精による卵の近交弱勢が強く、かつ雌雄同体が他家受精をするために雄に出会う頻度が高くなれば、他家受精する雌雄同体と雄の共存(ヨーロッパ型カブトエビ)が局所的に安定になる。一方で、雄が存在しない集団では他家受精できないため、他家受精を希望する雌雄同体は、最初から自家受精だけをする雌雄同体よりも不利になる。
RecG蛋白質による相同組換え中間体ホリデ-構造の分岐点移動反応の分子機構

大腸菌のRecGタンパク質は,遺伝的相同組換えの反応中間体であるホリデ-構造のDNA分岐点移動反応を促進するDNAヘリケースである。ホリデ-構造のプロセッシングには,別にRuvタンパク質群(RuvA-RuvB複合体;ホリデ-構造のヘリケース,RuvC;ホリデ-構造特異的エンドヌクレアーゼ)が知られており,RecGとRuvタンパク質との機能的相違点は興味が持たれるが,本研究では,RecGタンパク質の新たな機能として以下のことを明らかにした。1)RecGタンパク質は,2次構造をとるRNAとDNAとのハイブリッド(R-ループ)のRNA部分を巻戻す活性(R-ループ特異的RNAヘリケース活性)がある。2)RecGの過剰発現によって,ColE1プラスミドのコピー数が減少する。3)in vitroのColE1のDNA複製開始が,RecGを添加することによって阻害される。ColE1の複製開始には,R-ループがプライマーとして関与することが知られており,RecGによるこのDNA合成阻害は,1)の活性によるものである。以上の結果は,RecGがColE1プラスミドのDNA複製開始にも関与していることを示す。一方,RnaseH欠損株でみられる大腸菌の染色体複製(安定DNA複製)にRecGが関与することを示唆する他のグループの遺伝学的解析があるが,本研究成果は,そのアナロジー,もしくは,モデル系と考えられ,今後,RecGの染色体複製における役割をin vitroで解析する端緒とすることができた。
網膜幹細胞から膵臓細胞への分化転換に機能する新規分子機構のゲノムワイド解析

多分化能を持つ幹細胞から3つの胚葉(内胚葉・中胚葉・外胚葉)が分化する過程において、それぞれの胚葉特異的な遺伝子が発現する一方、他の胚葉への分化に必要な遺伝子発現は抑制される。分化した細胞から異なった細胞へ分化する現象を分化転換と呼び、分化転換には遺伝子発現の変換が必要である。申請者の研究成果からNotch情報伝達系を阻害することにより、ゼブラフィッシュの網膜・脳・脊椎(中枢神経系)において、膵臓マーカー遺伝子を含む内胚葉遺伝子や中胚葉遺伝子の発現が誘導されることが明らかになった。この胚葉を超えた遺伝子発現の分子機構を解明することにより、再生医療で用いられる分化転換技術の発展の一助となりうる。(1) Notch情報伝達系抑制胚を用いた解析Notch情報伝達系が抑制されているmind bomb(mib)変異体を用いて解析を行ったところ、網膜において、初期内胚葉マーカー遺伝子(sox32・sox17)、初期中胚葉マーカー遺伝子(no tail a)のほかに、外胚葉・中胚葉・内胚葉の分化マーカー遺伝子の異所的発現も検出された。これらの結果から、Notch情報伝達系が抑制された網膜では、胚葉を越えた遺伝子発現がおこっていることが示唆された。この異所的な遺伝子発現に関与するシグナル伝達系を探索したところ、中胚葉と内胚葉の遺伝子発現にはNodal情報伝達系が必要である事が示唆された。一方、Notch情報伝達阻害剤処理胚では、網膜以外に脳と脊椎の腹側においてインスリンなどの異所的な遺伝子発現が検出された。阻害剤処理の処理時間と脊椎の神経分化過程を比較した結果、腹側脊椎におけるインスリン発現細胞はオリゴデンドロサイトである事が予想された。(2)転写活性型・転写抑制型のヒストン修飾の検出(1)の実験結果から、Notch情報伝達系抑制胚では大規模な転写の活性化が起こっている事が予想された。そこで、転写活性型ヒストンの目印であるヒストンH3K9とH3K27のアセチル化や、転写抑制に関与するヒストンH3K9とH3K27の3重メチル化、DNAメチル化を特異的な抗体を用いて組織染色を行うことにより検出した。その結果、コントロールと比較しmib変異体や阻害剤処理胚の網膜において大きな変化は見られなかった。Ddx46変異体の網膜において、in situハイブリダイゼーションやRT-PCRを行った結果、dealtaAやher6など、Notch情報伝達系の構成因子をコードする遺伝子や標的遺伝子の発現低下やmRNAスプライシングの異常が検出された。そこで、Notch情報伝達系の阻害剤であるγ-secretase xxで処理した胚や、Notch情報伝達が抑制された変異体であるmind bomb (mib)変異体を用いて、preproinsulin (ins)の発現を検出したところ、Ddx46変異体の網膜と同様に、網膜においてinsの異所的な発現が認められた。また、γ-secretase xx処理胚において、Notchの細胞内ドメインを過剰発現した結果、異所的なinsの発現は観察されなかった。この結果から、Ddx46変異体の網膜における異所的なinsの発現は、Notch情報伝達の低下が原因の1つである事が示唆された。また、γ-secretase xx処理胚の網膜において、様々な遺伝子発現を調べたところ、中内胚葉の分化の際に発現するnodal lerated 1・2 (ndr1・2)や、初期内胚葉マーカー遺伝子(sox32・sox17)、初期中胚葉マーカー遺伝子(ntla)の異所的な発現が確認された。一方、神経分化マーカーであるelavl4の発現は維持されており、網膜において中内胚葉マーカー遺伝子を発現している細胞群は、神経細胞の性質も維持している事が示唆された。γ-secretase xx処理胚やmib胚の網膜において、組織切片を作製し、ndr1やinsが発現している細胞の種類を調べたところ、これらの遺伝子を発現している細胞群がガングリオン細胞層に見られる事が明らかとなった。[平成24年度・平成25年度の研究成果]Ddx46変異体の網膜における、膵臓遺伝子を含む内胚葉・中胚葉遺伝子発現は、Notch情報伝達系の異常が原因であることを明らかにした。そして、Notch情報伝達系阻害胚では、網膜に加え、脳と脊椎(中枢神経系)において内胚葉・中胚葉遺伝子の異所的な発現が認められた。また、この遺伝子発現にはNodal情報伝達系が必要であることを明らかにした。[平成26年度の研究成果]

Notch情報伝達系により中枢神経系において発現が抑制される転写因子に着目し、機能阻害実験を行った結果、bHLH型転写因子であるAchaete-scute family bHLH transcription factor 1a (Ascl1a)が、Notch情報伝達系阻害胚の中枢神経系における内胚葉・中胚葉遺伝子発現の原因であることが明らかとなった。一方、Ascl1aの過剰発現実験では、この内胚葉・中胚葉遺伝子発現は検出されなかったことから、Ascl1aと共に機能する因子が必要であることが予想された。続いて、遺伝子発現の活性化に機能するヒストンメチル基転移酵素Mixed-lineage leukemia (MLL)の阻害実験を行ったところ、Notch情報伝達系阻害胚の中枢神経系における内胚葉・中胚葉遺伝子の発現が抑制された。この結果から、ヒストンのメチル化修飾が、中枢神経系における内胚葉・中胚葉遺伝子の発現に必要であることが明らかとなった。[意義・重要性・これからの課題]これらの結果により、中枢神経系から他の細胞系譜の遺伝子発現を制御する機構が明らかになり、新規性が高く、重要な発見であった。これからの課題として、Ascl1aと共に機能する因子を同定することが挙げられる。それにより、生体内で細胞系譜を超えた遺伝子発現を調節することが可能になると考えている。発生生物学、細胞生物学平成25年度の実験計画では、網膜における遺伝子発現変化の原因となるDNAメチル化とヒストン修飾や、その過程で関与する因子との相互作用の検出を計画していたが、Notch情報伝達系抑制胚の網膜では、DNAメチル化やヒストン修飾の大きな変化は検出できなかった。DNAメチル化抗体や修飾ヒストン抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行うことにより、修飾を受けているDNAやヒストンを遺伝子特異的に検出することを計画したが、網膜内の遺伝子発現に異常を示している領域のみを単離して実験を行うことは困難である事が予想された。そのため、マウス繊維芽細胞の細胞株であるNIH 3T3細胞を用いて実験を行ったが、良い結果は得られていない。その一方、異所的な遺伝子発現はNodal情報伝達系が関与する事を明らかにした。また、Sonic hedgehog情報伝達系を抑制して、網膜の神経分化を抑制した結果、異所的な遺伝子発現が抑制された事から、神経分化の過程が網膜における胚葉を越えた遺伝子発現に必要である事が示唆された。現在はゼブラフィッシュ初期胚や脊椎を用いた実験を準備しており、実験条件を精査してからほ乳類の培養細胞の実験系に移行する事を計画している。平成24年度の研究計画では、網膜幹細胞でEGFPのトランスジェニックフィッシュの作製を計画していたが、γ-secretase xx処理胚における異所的なins遺伝子の発現が、ガングリオン細胞層の一部で見られたため中止となった。また、次世代シーケンサーを用いた網羅的解析もトランスジェニックフィッシュが作製できなかったため、平成24年度は行っていない。しかし、Ddx46変異体の網膜における異所的なins遺伝子発現の原因の1つとして、Notch情報伝達系の低下を特定したことで、今後Notch情報伝達系に関与する因子群に注目して研究を進める事が可能になった。また、γ-secretase xx処理胚やmid胚の網膜のガングリオン細胞層において、ins遺伝子の他に、中内胚葉マーカー遺伝子や初期内胚葉マーカー遺伝子などが異所的に発現していることが明らかとなり、研究すべき遺伝子群や細胞種が以前より明確になった。現在、マウス神経幹細胞を用いてNotch情報伝達系の阻害実験も開始している。
熱力学的手法による生体膜モデル系における揺らぎの検出

脂質二分子膜を基本とする生体膜は,その様々な機能の発現に揺らぎが関与する典型的な生体分子系であり,この脂質二分子膜における揺らぎの検出と解明は重要である.本研究では,モノアシルグリセロール/水系を擬生体膜モデルの基本系として取り上げ,それに摂動として異種分子を加えることによる熱力学的諸量の変化を精密に測定することにより,熱力学的アプローチによる擬生体膜の揺らぎの検出を試みた.摂動分子として構造がリジッドで生体膜中にも多く存在するコレステロールを選択した.二分子膜中ではコレステロールのリジッドな部分が脂質のアルキル鎖の位置に入ることから,アルキル鎖の運動に対する影響が大きい.シス体のモノオレイン/水系を基本形としたモノオレインーコレステロールー水系のラメラ相と等方相における断熱法による精密熱容量測定を行った.その二相間の熱容量差から,脂質二分子膜系のエネルギー揺らぎのコレステロール濃度依存性を見いだすことに成功した.この熱容量差とコレステロールの成分比の関係は線形ではなく,脂質二重膜とコレステロールの間に協同的な相関があることを示唆する結果が得られた.また,研究を迅速に進めるために,ペルチェ素子を使った超高感度示差走査熱量計の開発を行い,少量の試料で熱容量差を検出することに成功した.本研究により,系のエネルギーの“揺らぎ"に直接対応する熱力学量である熱容量を介して脂質二分子膜系における揺らぎの検出に成功し,さらにそのアプローチ法を生体膜モデル系に適用する道筋をつけることができたといえる.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。脂質二分子膜を基本とする生体膜は,その様々な機能の発現に揺らぎが関与する典型的な生体分子系であり,この脂質二分子膜における揺らぎの検出と解明は重要な研究課題である.生体膜を構成する脂質は一般に長いアルキル鎖を1本ないし2本持ち,脂質二分子膜中ではこのアルキル鎖のコンフォメーションは常温程度の熱エネルギーで十分乱れている.このコンフォメーションの揺らぎにより,二分子膜の動的な変化や柔軟性,膜中への脂溶性等が維持され,生体膜として機能している.本研究では,脂質二分子膜の揺らぎに大きな影響を与える脂質のアルキル鎖に着目し,脂質二分子膜の構造が穏やかに崩壊する過程を利用し,揺らぎの情報の抽出を試みることが研究目的である.最終的には,脂質二分子膜に他の分子を導入することによる摂動を加え,より現実に近い生体膜モデル系における揺らぎ・ダイナミクスの情報を熱力学的な測定手法を用いて行うことを目的としている.脂質二分子膜のモデル化合物としてラメラ相を示す脂質二分子膜における脂質の分子構造とアルキル鎖のダイナミクスとの関係を明らかにし,またラメラ相の揺らぎが分子構造により違いが出ることを明らかにし,論文にまとめた.これを基にして,異分子摂動の影響を見るために用いる系の検討を進めた.また,アルキル鎖のダイナミクスに関して知見を得るために,液晶相におけるメソゲンのアルキル鎖のダイナミクスに関しての検討を行い,脂質二分子膜や液晶相などの柔らかい相におけるアルキル鎖のダイナミクスの重要性について検討を進めた.脂質二分子膜を基本とする生体膜は,その様々な機能の発現に揺らぎが関与する典型的な生体分子系であり,この脂質二分子膜における揺らぎの検出と解明は重要である.本研究では,モノアシルグリセロール/水系を擬生体膜モデルの基本系として取り上げ,それに摂動として異種分子を加えることによる熱力学的諸量の変化を精密に測定することにより,熱力学的アプローチによる擬生体膜の揺らぎの検出を試みた.摂動分子として構造がリジッドで生体膜中にも多く存在するコレステロールを選択した.二分子膜中ではコレステロールのリジッドな部分が脂質のアルキル鎖の位置に入ることから,アルキル鎖の運動に対する影響が大きい.シス体のモノオレイン/水系を基本形としたモノオレインーコレステロールー水系のラメラ相と等方相における断熱法による精密熱容量測定を行った.その二相間の熱容量差から,脂質二分子膜系のエネルギー揺らぎのコレステロール濃度依存性を見いだすことに成功した.この熱容量差とコレステロールの成分比の関係は線形ではなく,脂質二重膜とコレステロールの間に協同的な相関があることを示唆する結果が得られた.また,研究を迅速に進めるために,ペルチェ素子を使った超高感度示差走査熱量計の開発を行い,少量の試料で熱容量差を検出することに成功した.本研究により,系のエネルギーの“揺らぎ"に直接対応する熱力学量である熱容量を介して脂質二分子膜系における揺らぎの検出に成功し,さらにそのアプローチ法を生体膜モデル系に適用する道筋をつけることができたといえる.24年度が最終年度であるため、記入しない。震災の影響で測定に用いる予定の装置に被害が出たために当初の研究計画に大きな支障が出たが,基本となる系に関する考察を進め,研究全体としては進展している.24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画を遂行するために,さらに研究対象の測定およびデータの解釈を進める.
OS言語の談話処理メカニズムに関するフィールド心理言語学的研究

本研究プロジェクトの目的は,マヤ諸語とオースロネシア諸語のなかのOS言語(特に,グアテマラのカクチケル語と台湾のタロコ語)を対象に,談話内での1.文理解過程,2.文産出過程,3.言語獲得過程,ならびに4.言語の語順と思考の順序との関係を,聞き取り調査やコーパス調査,行動実験,視線計測,脳機能計測などを用いて,フィールド心理言語学の観点から多角的かつ統合的に研究することである。より具体的には,14における個別言語の文法的要因と普遍認知的要因が文脈に埋め込まれた文の処理に与える影響を明らかにし,脳内言語処理メカニズムに関するより一般性の高いモデルを構築することを目指す。本年度は特に以下の研究を実施した。(1)カクチケル語とタロコ語でこれまでに得られた成果と比較するために,トンガ王国においてトンガ語の文理解実験と言語獲得実験を実施した。(3)これまでの本プロジェクトの成果に対する外部の専門家からのフィードバックを得るために,ハーバード大学に於いてInternational Workshop on Seediq and Related Languages: Grammar, Processing, and Revitalizationを開催した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究プロジェクトの目的は,マヤ諸語とオースロネシア諸語のなかのOS言語(特に,グアテマラのカクチケル語と台湾のタロコ語)を対象に,談話内での(1)文理解過程,(2)文産出過程,(3)言語獲得過程,ならびに(4)言語の語順と思考の順序との関係を,聞き取り調査やコーパス調査,行動実験,視線計測,脳機能計測などを用いて,フィールド心理言語学の観点から多角的かつ統合的に研究することによって,(1)(4)における個別言語の文法的要因と普遍認知的要因が文脈に埋め込まれた文の処理に与える影響を明らかにし,脳内言語処理メカニズムに関するより一般性の高いモデルを構築することである。それを踏まえて,27年度は台湾に2回,グアテマラに1回,渡航し,現地で調査・実験を実施した。グアテマラではカクチケル語話者を対象に,文脈付文産出実験2種類と文聴解時の脳波計測実験を行った。また,カクチケル語書き言葉コーパスの作成に向けて現地協力者と協議し,短い試作品を作って課題を検討した。親子会話コーパスの作成作業も進めた。当初の予定から実験内容の詳細は多少変更があったが,研究目的の達成にむけて必要な課題を予定をやや上回るペースでこなせている。タロコ語の聴解実験は27年度は予備実験だけの予定であったが順調に進み本実験も実施できた。以上から判断して,研究はおおむね順調に進展しているといえる。本研究プロジェクトの目的は,マヤ諸語とオースロネシア諸語のなかのOS言語(特に,グアテマラのカクチケル語と台湾のタロコ語)を対象に,談話内での(1)文理解過程,(2)文産出過程,(3)言語獲得過程,ならびに(4)言語の語順と思考の順序との関係を,聞き取り調査やコーパス調査,行動実験,視線計測,脳機能計測などを用いて,フィールド心理言語学の観点から多角的かつ統合的に研究し,(1)(4)における個別言語の文法的要因と普遍認知的要因が文脈に埋め込まれた文の処理に与える影響を明らかにし,脳内言語処理メカニズムに関するより一般性の高いモデルを構築することである。それを踏まえて本年度は,以下のような研究を行い,その結果の一部をThe 29th CUNY Conference on Human Sentence Processingをはじめ国内外の複数の学会で発表した。また,これまでの成果をまとめた論文をFrontiers in Psychologyなどの国際学術誌に出版した。[言語理論・神経基盤部門]前年度の各部門の調査・実験結果を踏まえて、検証すべき仮説を精緻化した。[理解部門](1)文全体を聞いてから正誤判断を行う全文聴解実験を実施して、語順の処理に与える個別文法的要因と普遍認知的要因の影響を調べた。(2)語順と態が文理解時の処理負荷の途中経過に与える影響を調べる脳波実験を実施した。[思考部門]タロコ語話者の思考の順序を調べる視線計測・ジェスチャー実験を行った。[獲得部門]カクチケル語の発話コーパスを拡充した。ほぼ当初の計画通りに順調に実験を行い,興味深い結果が得られている。また,その一部を国内外の学会で発表し,論文化の準備も進めている。[文法理論部門]タロコ語の文法調査を行った。[理解部門・神経基盤部門]文脈と語順が文処理に与える影響を調べるために事象関連電位を用いたタロコ語の実験を実施した。[産出部門・思考部門]タロコ語の文散出時に動詞のレンマがどのようなタイミングで活性化されるかを調べる実験の準備(予備実験を含む)を行った。

また,タロコ語話者の思考の順序やタロコ語の文産出に与える非言語的文脈や話者自身の動作の影響を調べるためのジェスチャー産出実験と文産出実験を行った。[全部門共通]トンガ語の調査・実験の実行可能性を調べるためにトンガ王国で現地見分を行った。また,ジャワ語の専門家を招いて,ジャワ語の調査・実験の実行可能性についての検討会を開催した。課題申請当初予定していたカクチケル語とタロコ語について優れた成果が得られただけでなく,それらとの比較のためにトンガ語とジャワ語についても調査・実験を行える目処が付いたから。本研究プロジェクトの目的は,マヤ諸語とオースロネシア諸語のなかのOS言語(特に,グアテマラのカクチケル語と台湾のタロコ語)を対象に,談話内での1.文理解過程,2.文産出過程,3.言語獲得過程,ならびに4.言語の語順と思考の順序との関係を,聞き取り調査やコーパス調査,行動実験,視線計測,脳機能計測などを用いて,フィールド心理言語学の観点から多角的かつ統合的に研究することである。より具体的には,14における個別言語の文法的要因と普遍認知的要因が文脈に埋め込まれた文の処理に与える影響を明らかにし,脳内言語処理メカニズムに関するより一般性の高いモデルを構築することを目指す。本年度は特に以下の研究を実施した。(1)カクチケル語とタロコ語でこれまでに得られた成果と比較するために,トンガ王国においてトンガ語の文理解実験と言語獲得実験を実施した。(3)これまでの本プロジェクトの成果に対する外部の専門家からのフィードバックを得るために,ハーバード大学に於いてInternational Workshop on Seediq and Related Languages: Grammar, Processing, and Revitalizationを開催した。応募時の予定では28年度もグアテマラと台湾の両方で調査・実験を行う予定であったが,27年度の研究成果を踏まえて,28年度はカクチケル語の研究はグアテマラから研究者を日本に招いて行い,遠征による調査・実験は台湾のみとすることにした。これまではOS言語であるカクチケル語とタロコ語を集中的に研究してきたが,今後は比較のために,オーストロネシア語族の他の言語にも研究の射程を広げる予定で準備を始めている。これまではOS言語であるカクチケル語とタロコ語を主に研究してきたが,新年度は比較のためにトンガ王国に赴き,トンガ語の文理解と言語獲得について調査・実験を行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
日独関係史における相互認識:想像、イメージ、ステレオタイプ

本研究は、近代日本とドイツの関係史において、両国の相互イメージの形成とその形成要因、そして、このような相互イメージが二国間関係に与えた影響を明らかにしようとするものであった。2010・11年の日独修好150周年の催し物として、この研究をまとめる国際会議が2010年12月に行われ、20人の研究者が日独相互イメージを分析し、そのイメージを表象する視覚的資料を紹介した。なお、日独関係史の研究者のネットワークが深化された。日本とドイツは現在では、強い友好関係で結ばれているとはいえ、過去には、両国のメディアにおいて歪曲された他国のイメージが浮かび、そして、現在でも浮かぶことが明らかになり、多様な啓蒙活動の必要性が指摘された。初年度において、計5回研究会を開きました。2回研究代表・研究分担者の顔合わせを行ない、研究プロジェクトの具体化を図り、日独関係の先行研究を整理しました。書評会で2008年刊の工藤・田嶋編『日独関係史』を評価・批判しました。2回の研究会において外部報告者を呼び、「イメージ論」に関する理論的な体系を整理し、各研究分担者の研究テーマを具体化し、各分担者の研究テーマを理論的に裏付けてきました。研究会において、先行研究の弱点である外交・経済関係への過度な注目に関する問題意識の共有が進み、各分担者の研究テーマについて、活発に議論し、先行研究において利用されてこなかった資料についてもお互いに指摘しあいました。一部の研究分担者が国内外の資料館で新しい資料を発掘しました。なお、研究代表者がドイツに出張し、在ドイツの日独研究者との交流を深め、2009年6月に企画されているワークショップと2010年秋に企画されている国際シンポジウムへの参加について合意しました。研究代表者の上智大学への移籍のため、HP開設は遅れながらも、ビジュアル資料の収集などが進み、関係団体・組織との協力・対話も進めた。研究代表者は在東京の(社)ドイツ東洋文化研究協会(OAG)と協力し、1870年代からの日独関係において大きな役割をはたしてきた同協会の歴史を究明しはじめ、奈良県立図書情報館の協力を得て、同図書館にて2009年3月からOAGの歴史を紹介する展覧会を開きました。日独関係の150周年目の2010年に、OAG、同図書館と在日ドイツ大使館と再度展覧会を企画することに合意しました。本年度の研究は計画どおりに行われた。2010年12月に開催予定の国際シンポジウムの企画に関する打ち合わせを定期的に行い、代表者を始め、各分担者が外部研究者と交流を深めながら、報告者との打ち合わせも重ねて、シンポジウムの参加者を概ね決めた。そして、各分担者が自分の研究を進め、そのために必要な資料を調査し、日本・ドイツの文書館やオンライン・アーカイブ(主に雑誌)を分析した。2009年6月28日には、上智大学において「日本とドイツの文化交流と相互イメージ」というテーマでワークショップを開いて、多様な報告を聞き、活発な議論を重ねた。首都圏在住の研究者の他に、大阪大学の竹中享先生、甲南大学の田野大輔先生、プサン(韓国)からの葉照子先生とドイツからのHans-J. Bieber先生を迎え、有意義なワークショップであった。さらに、分担者を中心に、計2回研究会を開き、Rolf-Harald Wippich先生(上智大学)が「19世紀末・20世紀初頭におけるドイツ風刺画雑誌における日本観」について、代表者が「二国間関係におけるイメージ論研究の動向」について報告した。また、本プロジェクトのホームページも開設した(www.nichidoku.japanesehistory.de)。なお、代表者が在日ドイツ大使館の「日独関係の150年」というサイト開設に当たって、サイト内容についての協力を依頼され、それを引き受けた。大使館の「日独関係の150年概要」を執筆し、「在日ドイツ大使館の歴史」についての情報を提供した。そして、2010年12月のシンポジウムが在日ドイツ大使館の「日独交流150周年」の正式な催し物として公認され、ホームページでの在日ドイツ大使館の「日独交流150周年」のロゴマークの利用も承認された。本研究は、近代日本とドイツの関係史において、両国の相互イメージの形成とその形成要因、そしてこのような相互イメージが二国間関係に与えた影響を明らかにしようとするものであった。2010年度は、本研究の最終年度で、3年間の研究成果をまとめるため、2010年12月に国際シンポジウムを開催し、20人の報告を日独同時通訳付で行った。シンポジウムの参加者の延べ人数は150人にのぼった。

このシンポジウムは在日ドイツ大使館の「日独交流150周年」の正式な催し物として公認され、大使館のホームページで案内された上、大使のVolker STANZEL氏がシンポジウムで講演をされた。また、来日中であったドイツ国会副議長のWolfgang THIERSE氏もシンポジウムの閉会の挨拶をされた。シンポジウムの諸報告を出版物でまとめるため、報告の翻訳の財源を確保し、将来に日本語版・英語版の2冊の出版物を企画し、出版社の協力も確保した。さらに、研究代表者が在日ドイツ大使館の「日独関係の150年」(www.dj150.jp)というサイト開設に当たって、サイト内容についての協力を依頼され、「日独関係の150年概要」を執筆し、「在日ドイツ大使館の歴史」に関する情報を提供した。なお、本プロジェクトのホームページを開設し(www.nichidoku.japanesehistory.de)、そのページにてこれからも研究成果をさらに公開していく予定。
アブラナ科植物の自家不和合性における自己・非自己識別機構の分子基盤

本研究では、S遺伝子以外の原因で自家和合性に変異した系統を遺伝解析し、原因遺伝子の単離を目的として、染色体のどの領域に変異が生じているかを明らかにした。シロイヌナズナの花粉側S因子のSP11に逆位がある系統を見いだし、遺伝子改変、遺伝子導入により、自家不和合性にすることに世界で初めて成功した。受粉反応が起きる乳頭細胞をLMDで切り出し、次世代シークエンサーと組合せで、下流因子の候補の基盤構築も行った。アブラナ科植物の自家不和合性は、1遺伝子座S複対立遺伝子系によって説明されており、花粉因子SP11と雌ずい因子SRKの自己特異的相互作用によって自家不和合性が誘起される。しかしながら、SRKによる自己情報が雌ずい内にどの様に伝達され、その結果、自己花粉が拒絶されるかという点については、ほとんど不明である。本研究では、アブラナ科自家不和合性研究で欠落しているS遺伝子下流因子の解明に向けて、B.rapaとシロイヌナズナを融合的に利用して、S遺伝子下流因子を解明する。昨年までの研究から、自家和合性のシロイヌナズナにおいても、柱頭側因子SRKが機能している系統(Wei-1)を見いだしていた。花粉側因子SP11の逆位を遺伝子組み換え技術で元に戻して、再導入した結果、自家不和合性になることを見いだし、国際科学雑誌Natureに発表した。この研究は、スイス・チューリッヒ大・清水准教授との共同研究として行った。F2,F3での自家不和合性の安定性のためにプロモーターなどの改変も試みたが、十分な安定性を得ることができず、Wei-1以外の系統の方が有効でないかと判断し、より安定性のある系統の探索を行い、3系統を見いだすことができた。アブラナの自家和合性系統については、QTL解析を行う前の問題として、用いる和合性系統の和合因子がどの染色体上にあるかを検討した。その結果、第1染色体、第3染色体に和合因子が座乗しており、これらは既存のMLPK,ARC1,THLとは異なる戦力対領域に位置しており、このことはQTL解析が有効であることを示した。さらに、今年度は、これらの系統の柱頭で発現している遺伝子を網羅的に解析するために、LMDと次世代シークエンサーを融合した大量遺伝子発現解析を開始した。柱頭でのLMD解析については、同じアブラナ科のシロイヌナズナの系しか公表されておらず、このプロトコールを改変して、サンプルの固定、包埋、LMDによる切り出し、RNAの調整を試みた。その結果、RNAが次世代シークエンサー解析に利用できるようなサンプルを得ることができた。次年度は、このサンプルを使って、RNA seq解析を行う。これらの研究は、大阪教育大・鈴木准教授、三重大・諏訪部准教授との共同研究として行った。シロイヌナズナの自家不和合性を確立したが、後代において、表現型の安定性が問題になっていた。その点については、自家不和合性を示す近縁野生種からプロモーターを単離し、利用することにより、QTL解析に耐え得る系統を確立することに成功した。実際に数系統のシロイヌナズナ系統との交配から、和合性因子の単離ができる可能性を見いだした。和合受粉では花粉粒の接着、foot形成、吸水、発芽、花粉管伸長を経て受精に至るが、不和合受粉では柱頭表面の乳頭細胞において花粉の吸水・発芽・花粉管伸長が抑制され受精が起こらないと言われているが、多様な表現型が観察されている。表現型の違いについては、気象条件をはじめ様々な要因が推測されているが、その実態については明らかになっておらず、また関連因子についての解析もほとんど行われていない。そこで、Brassica rapa各Sホモ系統から開花前日の蕾を採集し、寒天培地上で開花させ、自家受粉および他家受粉させた。受粉後0分を起点とし、柱頭上での花粉の動態・挙動を実体顕微鏡下でタイムラプス観察した。受粉後0分から1分間隔で花粉の直径変化を測定した結果、自家受粉/他家受粉およびSホモ系統間で花粉の吸水速度・吸水率が異なることが明らかになった。また、自家受粉時の花粉発芽や吸水に注目して花粉動態を観察すると、6種類の代表的な表現型に分類でき、それらの割合はSホモ系統間で異なった。以上のことから、アブラナ科植物の自家不和合性反応は一様ではなく、花粉の吸水・脱水・発芽などが相互に関連し、必ずしも一方向的ではないことが明らかとなった。これらにあわせて、国民への科学の普及のために、アウトリーチ活動を73件行い、講義の後に児童・生徒から返却された手紙、レポート、2,300通以上全てに、返事を書いて、小中高の教員から高い評価を得た。

これまでの手法では、柱頭のサンプリングが困難であったことから、今年度は、レーザーマイクロダイゼクション(LDM)により、自家不和合性反応に機能している乳頭細胞を切り出し、次世代シーケンサー解析(NGS)と融合することにより、花粉と雌ずいの接点ともいえる局所的な遺伝子情報基盤を構築できると考えた。自家不和合性程度の異なるBrassica rapa4系統を材料に、網羅的にトランスクリプトーム解析を行ったところ、約11,800種類の遺伝子が共通に発現していた。この乳頭細胞発現遺伝子情報は、自家不和合性反応、受粉反応の分子機構を解明する上でも有用な遺伝子情報となった。現在、自家不和合性に関連すると考えられるいくつかの遺伝子について、モデル的に遺伝子破壊系統を作出することで、その機能解明を目指している。425系統の自然集団から見出した自家和合性系統(#1,#2)について、遺伝学的解析からS遺伝子以外の変異によるものではないことを明らかにし、QTL解析を行った。SSRマーカーにより構築された遺伝子地図上にマッピングしたところ、#1の和合性因子は第3染色体上に、#2は第1染色体上に位置しており、これらは新規のS遺伝7-下流因子をコードしていることを示した。また、昨年公開されたBrassica rapaのゲノム情報を活用し、原因遺伝子単離に向けた基盤が構築できた。これらにあわせて、この5年間の成果を最終報告書にまとめ、関連研究者などに配布した。また、国民への科学の普及のために、アウトリーチ活動を100件以上行い、講義の後に児童・生徒から返却された手紙、レポート、6,000通以上全てに、返事を書いて、小中高の教員から高い評価を得た。計画した実験については、概ね実施することができたが、これまでに行ってきた研究について、論文発表については、現在審査中・投稿準備中という状況上にあることから、概ね順調に進展していると判断した。この4年間で、シロイヌナズナ、アブラナの自家不和合性の原因、原因遺伝子の単離に向けた解析を行い、和合性因子のQTL解析等から、原因遺伝子の単離の可能性を示した。また、シロイヌナズナの自家不和合性安定性の原因についても、プロモーターの改変などにより、可能であることを示した。こうしたことから、最後の1年で自家和合性原因の分子基盤構築が可能になると、判断した。さらに、アウトリーチ活動についても、100件近く展開し、次年度以降も継続的に展開できるめどを立てた。
全身性強皮症に対する表皮細胞を標的とした核酸医薬外用薬の開発

今年度は、全身性強皮症(SSc)の表皮細胞依存性皮膚硬化を制御する因子としてIL-1 alphaとIL-6が重要であること、さらにpsoriasin, LL-37も関与していることが明らかとなった。一部のSSc患者はmechanical stressを受けやすい部位に限局性強皮症(LSc)様皮疹を生じるが、この皮疹を生じるSSc患者では表皮細胞におけるIL-1 alphaの発現量が亢進している。表皮細胞特異的Fli1欠失マウス(Fli1flox/flox;K14-Cre)はSScの表皮細胞の形質を模倣し、かつ自然経過で皮膚硬化を発症するが、獲得免疫系を持たない形質をこのマウスに導入しても(Rag1-/-;Fli1flox/flox;K14-Cre)、皮膚硬化は自然発症することが明らかとなり、その過程には肥満細胞が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。SSc患者に伴うLSc様皮疹では肥満細胞の浸潤が顕著であり、肥満細胞はIL-1 alpha刺激によりIL-6を産生する性質を有していること、IL-6がSScの皮膚硬化に深くかかわることから、LSc様皮疹でみられる線維化にはIL-1 alpshaとIL-6が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。Psoriasin, LL-37については、SSc患者の病変部皮膚の表皮細胞において発現が亢進していること、それぞれ表皮細胞によるIL-6産生と形質細胞様樹状細胞によりIFN-alpha産生を介して皮膚線維化に関与する可能性が示唆された。以上の研究結果は、IL-1 alpha, psoriasin, LL-37が強皮症の表皮細胞を標的とした治療戦略を開発する上で、良き標的分子となりうることを示唆している。現在、これらの分子の発現を表皮細胞において抑制する方法として、核酸医薬外用薬の開発を進めている。今年度は、表皮細胞特異的Fli1欠失マウス(Fli1 flox/flox; K14-Cre, Fli1 KcKOマウス)の病態解析を行った。まず、Fli1 KcKOマウスと対照マウス(Fli1 flox/flox)から表皮細胞を単離し、DNA microarray解析を行ったところ、Fli1 KcKOマウス由来の表皮細胞では線維芽細胞を活性化する因子であるIL-1alphaとCTGFの発現が亢進していることが明らかとなった。次に、Fli1 KcKOマウスにおいて強皮症の主要3病態を評価したところ、皮膚と食道の線維化、および間質性肺疾患が自然発症することが明らかとなった。Fli1 KcKOマウスの肺の病理組織像がAire欠失マウスに生じる間質性肺疾患の病理組織像と酷似していることから、Fli1 KcKOマウスにおいて胸腺の異常が生じている可能性を見出し、さらに検討を進めたところ、K14を発現している胸腺髄質細胞においてFli1の発現が低下すると同細胞においてAire遺伝子の発現が低下し、免疫寛容が破綻することが明らかとなった。Rag1-/-マウスを用いてT細胞の養子移入実験を行ったところ、Fli1 KcKOマウスでは肺に対する自己反応性T細胞が存在することが明らかとなった。さらにRag1遺伝子を欠失したFli1 KcKOマウスを作製したところ、間質性肺疾患は見られなくなったが、皮膚と食道の線維化は発症した。以上から、表皮細胞においてFli1を欠失させると、表皮細胞由来の因子により皮膚と食道の線維化が生じ、免疫寛容の破綻により間質性肺疾患が生じることが明らかとなった。以上の検討結果は、表皮細胞を標的とした治療が強皮症の皮膚と食道の線維化に対して有効である可能性を示唆している。今後、表皮細胞の形質変化についてさらに解析を進め、治療標的となる分子の同定を試みる予定である。平成28年度は、表皮細胞におけるFli1遺伝子の欠失が皮膚硬化に及ぼす影響について検討する予定であったが、概ね計画通りに進んでいる。昨年度までに行った上皮細胞特異的Fli1欠失マウスを用いた解析により、表皮細胞依存性に皮膚線維化が生じることが明らかとなった。他の研究グループが行った先行研究において、強皮症病変部皮膚の表皮細胞ではIL-1 alphaの発現が亢進しており、その異常が強皮症皮膚線維芽細胞の活性化に関与している可能性が示唆されている。そこで、今年度はIL-1 alphaが表皮細胞から放出される過程に注目して研究を行うこととした。一部の強皮症患者はmechanical stressを受けやすい部位にmorphea様皮疹を生じるが、この皮疹を生じる強皮症患者では表皮細胞におけるIL-1 alphaの発現量が亢進していることが明らかとなった。また、このような皮疹を生じる強皮症患者の表皮細胞では、TUNEL染色陽性細胞の数が増えており、アポトーシスが異常に活性化していることが明らかとなった。表皮細胞はアポトーシスに陥るとIL-1 alphaを大量に放出することが知られているが、今回の検討結果は、強皮症の表皮細胞はIL-1 alphaを大量に発現するのみでなく、放出しやすいメカニズムをも獲得していることを示唆している。以上の研究結果は、IL-1 alphaが強皮症の表皮細胞を標的とした治療戦略を開発する上で、良き標的分子となりうることを示唆している。IL-1 alphaの働きを皮膚において抑制する方法として、現在IL-1

receptor antagonistをヒアルロン酸マイクロニードルで投与する方法を候補として考えている。その前提として、強皮症患者の病変部皮膚においてIL-1 receptor antagonistの発現量がどのように変化しているのかを検討する予定である。発現低下がみられた場合、実際にこの方法の可否について研究を進める予定である。表皮細胞を標的とした新規治療開発を行う上で、対象となる分子を決定することができた。今年度は、全身性強皮症(SSc)の表皮細胞依存性皮膚硬化を制御する因子としてIL-1 alphaとIL-6が重要であること、さらにpsoriasin, LL-37も関与していることが明らかとなった。一部のSSc患者はmechanical stressを受けやすい部位に限局性強皮症(LSc)様皮疹を生じるが、この皮疹を生じるSSc患者では表皮細胞におけるIL-1 alphaの発現量が亢進している。表皮細胞特異的Fli1欠失マウス(Fli1flox/flox;K14-Cre)はSScの表皮細胞の形質を模倣し、かつ自然経過で皮膚硬化を発症するが、獲得免疫系を持たない形質をこのマウスに導入しても(Rag1-/-;Fli1flox/flox;K14-Cre)、皮膚硬化は自然発症することが明らかとなり、その過程には肥満細胞が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。SSc患者に伴うLSc様皮疹では肥満細胞の浸潤が顕著であり、肥満細胞はIL-1 alpha刺激によりIL-6を産生する性質を有していること、IL-6がSScの皮膚硬化に深くかかわることから、LSc様皮疹でみられる線維化にはIL-1 alpshaとIL-6が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。以上の研究結果は、IL-1 alpha, psoriasin, LL-37が強皮症の表皮細胞を標的とした治療戦略を開発する上で、良き標的分子となりうることを示唆している。現在、これらの分子の発現を表皮細胞において抑制する方法として、核酸医薬外用薬の開発を進めている。まず、マウスの実験で得られた研究結果がヒトの強皮症において見られるか否かについて、皮膚生検組織を用いて検討する。次に、表皮細胞を標的としたsiRNA外用薬の効果について解析を進める。ヒアルロン酸で作成したマイクロニードルにIL-1 receptor antagonistを包含させ、表皮細胞特異的Fli1欠失マウスに貼付する。この方法により実際にマウスの皮膚硬化が改善するか否かについて検討を行う予定である。