hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一粒子分光・時間分解分光による金ナノ粒子のパルスレーザー誘起形態変化の直接観測

パルスレーザー照射による金属ナノ粒子の形態変化・微細化の機構に関して、実験および計算機シミュレーションの両面から取り組んだ。まず、金ナノ粒子に関して電子温度、格子温度、および、媒体の温度上昇を時間の関数として計算し、実験的に得られる金ナノ粒子の融解、サイズ減少の閾値と比較することにより、計算結果の妥当性を示した。温度計算により、フェムト秒レーザー励起ではクーロン爆発機構、ナノ秒レーザー励起では光熱機構というメカニズムの明確な切り分けが可能となった。加えて、単一金ナノ粒子に対してCWレーザー励起を行った場合の粒子温度の見積りと基板・周囲媒体を通した冷却メカニズムについても明らかにした。第一に、フェムト秒レーザー照射による時間分解分光計測をおこなった。直径60nmの金ナノ粒子分散液に波長800nm,150fsのレーザーパルスをレーザー強度を変化させながら照射した。金ナノ粒子のレーザー加熱により、プラズモンバンドの幅広化による過渡的ブリーチが起こることは既に知られている。この過渡的ブリーチは等吸収点を持つことから、この波長でモニターすることにより、スペクトルの温度変化の影響を受けることなく、サイズ減少によるプラズモンバンドの過渡的減少を観測できると考えて、実験した。その結果、波長490nmにおいて、レーザー強度に依存した、プラズモンバンドのブリーチを観測した。この信号は約20-100psの時間範囲で観測され、この時間範囲で金ナノ粒子の分裂がおこると考えられる。分裂のためのしきいレーザーエネルギーは7mJ/cm2であり、レーザー強度に依存した金粒子温度のシミュレーションによれば、このレーザー強度では金は融点には達するが、沸点よりはるかに低い。このため、光熱過程による金の蒸発は考えにくい。この場合、クーロン爆発のしきい値は超えており、クーロン爆発を観測したと考えるのが妥当である。第二に、金ナノ粒子水溶液を高圧下に置き、そこでのレーザー照射による形態変化およびサイズ減少を見ることが課題である。常圧の水溶液中では、レーザー加熱された金粒子からの熱移動により、媒体である水の加熱が起こる。これが著しいい場合、superheating状態になり、300°Cあたりで爆発的蒸発が起こり、金ナノ粒子周囲にバブルが発生するというのが最近の通説である。このバブルの影響を調べるためには、加圧状態にしてバブル発生を抑えて実験するのが1つの手法である。そこで、加圧下でレーザー照射と分光測定ができる装置を開発し、これを使った実験を開始した。臨界圧である22.1MPa以上に加圧することにより、周囲の水の温度が臨界温度647Kを超える場合、バブルはもはや発生することができず、その代わりに超臨界状態になる。超臨界状態の金ナノ粒子への影響としては、バブルに比べて熱移動効率が高くなり、冷却効率がよくなると考えられる点である。我々は、高圧印加によって金ナノ粒子の形態変化がむしろ抑えられる傾向を観測した。単一金ナノ粒子のナノスケール熱伝導の計測金ナノ粒子を基板上において種々の媒体に曝した状態で、レーザー加熱した場合の温度計測に取り組んだ。金ナノ粒子の温度はレーザー強度に対してほぼ直線的に増加し、しかも、基板材質および媒体の種類に強く依存した。この挙動は数値シミュレーションによって再現可能であり、実験と計算による温度対レーザー強度の傾きはよく一致した。レーザー強度と粒子温度の関係を一次元熱伝導方程式によって解析することによって、種々の媒体・基板の組み合わせに対して有効熱伝導率を見積ることができた。この有効熱伝導率を用いれば、レーザー加熱下の粒子温度を計算することが可能となる。また、より詳細な解析として2次元熱伝導方程式の数値解析によって、粒子と基板媒体を含む粒子周囲の温度分布を視覚的に表すことができた。本法はこれまでに開発された単一粒子計測法に新たに温度計測法を付け加える意義がある。ピコ秒励起バブルダイナミクスピコ秒時間分解能でバブルダイナミクスが明らかなった。バブル発生により、まず、金ナノ粒子周囲の屈折率低下が起こり、100-500 psの時間スケールで、プラズモンバンドの短波長側でブリーチ信号が観測される。つぎに、バブルサイズの増大に伴いプラズモンバンドの両側に正の消衰信号が1-5 nsの時間領域で現れ、約16 ns後に消失した。このスペクトルは金コア・バブルシェルを仮定してMie理論に基づいて、バブルサイズの増大・減少としてシミュレーションにより説明することができた。高圧液中レーザー照射によるナノ粒子サイズ・サイズ分布制御水の臨界圧22.1 MPa以上の高圧下では、水が647K以上に加熱されると超臨界状態となり、バブル発生は起こらない。金ナノ粒子の沸点は常圧下では約3100 Kだが、100 MPaでは約6800 Kとなり、著しく蒸発しにくくなる。また、あるレーザー強度で加熱した場合、それより小さい特定のサイズでサイズ減少がストップしてしまう。

これは、加熱された金ナノ粒子の周りにできる超臨界水層を通して熱移動が効率的に起こるため、あるサイズ以下になると冷却のためもはや蒸発を起こすことができないからである。その場合、レーザー強度を更に上げることによって、冷却過程に打ち勝って再びサイズ減少を起こすことができる。このようにして、レーザー強度に依存した粒子サイズを実現することが可能となる。本研究は、「サイズ分布のそろった球形金ナノ粒子をサイズ制御して作製する」のに高圧が有用なことを示した。単一ナノ粒子分光計測によるナノ粒子の温度計測レーザー照射によるガラス基板上(周囲媒質:空気)の単一金ナノ粒子のLSPRに基づく散乱スペクトル変化を暗視野分光法により測定した。レーザー強度の増加に伴って、散乱スペクトルの長波長シフトと強度の減少が観測された。スペクトル変化から、500K程度での粒子表面における液体金のシェル層生成と、温度上昇に伴うシェル体積の増加に帰属されるスペクトル変化を観測した。より高温域での金ナノ粒子の特徴的な形態変化をAFMで観察した。時間分解分光計測による金ナノ粒子のサイズ減少を直接捉える実験に関してはほぼ予想通りの結果を得ることができた。ただし、当初予想しなかった、媒体の加熱による屈折率低下の効果を見積もる必要が出てきた。また、高圧実験に関しても、装置闘発および実験が進展しデータが出つつある。レーザー照射しながら溶液攪拌の必要が出てきたため、装置の改良を行う。単一粒子分光による金ナノ粒子のアブレーションの研究に関してもデータが出つつある情況である。25年度が最終年度であるため、記入しない。分光的手法によりレーザー過熱下の金ナノ粒子の温度計測に成功し、今後、この手法の応用の見通しが立った。高圧レーザーアブレーションにより金ナノ粒子の粒径およびサイズ分布制御に成功した。単一粒子分光実験および加圧でのアブレーション実験の更なる進展を図る。同時に、計算によるシミュレーションを更に発展させ、金ナノ粒子の温度上昇による周囲媒体屈折率変化による吸収スペクトルおよび散乱スペクトル変化を予測できるようにし、実験データの解釈を進展させる必要がある。金ナノ粒子のレーザー励起による初期過程から最終過程までをトータールに理解する筋道を確立する。そのための実験的手法を開発すると同時に計算機シミュレーションを行う。
担子菌を利用する農薬などで汚染された土壌のバイオレメディエーション

本研究は、農薬をはじめとする各種の環境汚染化合物を、微生物の持つ分解作用を利用して土壌などの環境から積極的に除去する基本的な技術、すなわち、バイオレメディエーションの技術を開発することを目的としている。この目的に用いる微生物として、各種のリグニン分解性担子菌を選択し、各種の色素、塩素科フェノール性化合物の分解を検討した。まず、Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)、Bjcrkandera adusta(ヤケイロタケ)やそのほか菌株によるズ-ルBなどの複素環色素やトロペオリンOなどのアゾ色素の分解を確認した。特にアズ-ルBについてはヤケイロタケで10日間で、また、ヒラタケでは22日間で90%の分解が認められた。液体培養におけるこの色素の分解は、一旦色素が菌体に吸着された後に、分解が生じることが観察された。また、ヒラタケにおいては、菌株によりこの色素の分解速度に相違がみられ、実用化のためには菌株の選定が重要であることが示唆された。つぎに、ヒラタケがハロゲン化フェノールである4-クロロレゾルシノールを7日間で分解することを認め、GC-MSによって脱塩素化合物の存在を認めたが、分解は急速に進み、中間代謝物の蓄積は極少量であった。さらに、休止菌体を用いるカラム型のリアクターによるアズ-ルBと4-クロロレゾルシノールの分解を試みた。一方、上記の担子菌の生産するリグニン分解酵素の分離を試み、Mn-ペルオキシダーゼとリグニンペルオキシダーゼを分離・精製した。ついで、これらの酵素がエチレングリコールやアセトンなど、有機溶媒中でも反応することを認め、水不溶性塩素系有機化合物の分解にもリグニン分解酵素が適用出来ることを示した。
高病原性インフルエンザ感染症の新たな制御法：標的分子、ウイルス活性化酵素の発見

インフルエンザウイルスの感染性獲得には、宿主側のプロテアーゼによるウイルス外膜糖タンパク質(ヘマグルチニン:HA)の限定分解が必須である。高病原性鳥インフルエンザウイルスに特異的なHA切断部位配列を認識する新規ウイルス活性化酵素(MSPL/TMPRSS13)を発見した。本研究ではまず、培養細胞およびノックアウトマウスにウイルスを感染させ、本酵素がウイルスの感染・増殖に関与することを証明した。次に、本酵素の構造解析に取り組みこれに成功した。さらに、この構造を基盤に合成した酵素阻害剤についてin vitroでの特異性を明らかにした。現在、感染実験に対する阻害剤の効果を検討中である。高病原性鳥インフルエンザウイルスが感染性を獲得するためには、弱毒株同様、宿主側のプロテアーゼによるウイルス外膜糖タンパク質(ヘマグルチニン:HA)の限定分解が必須である。高病原性である所以は、このHAのプロテアーゼ切断部位が、複数の連続した塩基性アミノ酸(RKKR↓、KKKR↓など)から構成されている点にある。また、高病原性鳥インフルエンザウイルス感染は全身性に広がることから、全身に発現し、特異的なHA切断部位配列を認識する宿主プロテアーゼの探索を進めた結果、新規ウイルス活性化酵素(MSPL/TMPRSS13)を発見した。本研究では、MSPL/TMPRSS13による高病原性鳥インフルエンザウイルス活性化機構の詳細を、1)MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた培養細胞レベルでのウイルス感染実験、2)特異的阻害剤を用いた酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化、3)MSPL/TMPRSS13ノックアウト(KO)マウスを用いた、個体レベルでのウイルス感染実験、4)特異的発現調節機構を応用した酵素活性の増減とウイルス感染増殖様式の変化から明らかにし、具体的なウイルス感染制御法を示す。昨年度は、培養細胞レベルでのウイルス感染実験およびKOマウスを用いたウイルス感染実験に取り組み、培養細胞レベルのみならず個体レベルでも、MSPL/TMPRSS13が高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染・増殖に関与することが照明された。本年度は、MSPLの特異的酵素阻害剤の探索にむけて、構造解析に取り組みこれに成功した(現在論文執筆中)。さらには、この構造を基盤とした合成ペプチド型の特異的酵素阻害剤の同定に近づきつつある。本研究では、MSPL/TMPRSS13による高病原性鳥インフルエンザウイルス活性化機構の詳細を、1)MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた培養細胞レベルでのウイルス感染実験、2)特異的阻害剤を用いた酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化、3)MSPL/TMPRSS13ノックアウト(KO)マウスを用いた個体レベルでのウイルス感染実験、4)特異的発現調節機構を応用した酵素活性の増減とウイルス感染増殖様式の変化から明らかにし、具体的なウイルス感染制御法を示す。本年度は、まず培養細胞レベルでのウイルス感染実験を行うとともに、KOマウスを用いたウイルス感染実験に取り組んだ。MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた解析では、HAが正しい部位で切断され、ウイルスの感染・増殖が確認できた。KOマウスを用いた解析では、ウイルス感染に由来する肺の炎症所見がKOマウスにおいて軽度であり、炎症性サイトカインIL-1βレベルも有意に低かった。よって培養細胞レベルのみならず、個体レベルでも、MSPL/TMPRSS13が高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染・増殖に関与することが照明された。現在、MSPLの構造解析を基盤とした特異的酵素阻害剤の探索を進めている。

本研究では、MSPL/TMPRSS13による高病原性鳥インフルエンザウイルス活性化機構の詳細を、1)MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた培養細胞レベルでのウイルス感染実験、2)特異的阻害剤を用いた酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化、3)MSPL/TMPRSS13ノックアウト(KO)マウスを用いた、個体レベルでのウイルス感染実験、4)特異的発現調節機構を応用した酵素活性の増減とウイルス感染増殖様式の変化から明らかにし、具体的なウイルス感染制御法を示す。昨年度までは、培養細胞レベルでのウイルス感染実験およびKOマウスを用いたウイルス感染実験に取り組み、培養細胞レベルのみならず個体レベルでも、MSPL/TMPRSS13が高病原性鳥インフルエンザウイルスの感染・増殖に関与することが照明された。また、MSPL/TMPRSS13に対する特異的阻害剤は、具体的な高病原性鳥インフルエンザウイルス感染制御法につながることから、MSPL/TMPRSS13の構造解析に取り組みこれに成功した。本年度は、この構造を基盤として合成した酵素阻害剤(4種)についてin vitroでの特異性を明らかにした。現在、感染実験に対する阻害剤の効果を検討中である。生化学・分子生物学本研究では、MSPL/TMPRSS13による高病原性鳥インフルエンザウイルス活性化機構の詳細を、1)MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた培養細胞レベルでのウイルス感染実験、2)特異的阻害剤を用いた酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化、3)MSPL/TMPRSS13ノックアウトマウスを用いた、個体レベルでのウイルス感染実験、4)特異的発現調節機構を応用した酵素活性の増減とウイルス感染増殖様式の変化から明らかにし、具体的なウイルス感染制御法を示すことを達成目標としている。現段階で既に、1)および3)はおおむね目標を達成しており、2)においても構造解析の成功により、特異的阻害剤の同定にむけて順調に進んでいることから、「研究の目的」の達成度はおおむね順調であると考える。本研究では、MSPL/TMPRSS13による高病原性鳥インフルエンザウイルス活性化機構の詳細を、1)MSPL/TMPRSS13安定発現細胞株を用いた培養細胞レベルでのウイルス感染実験、2)特異的阻害剤を用いた酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化、3)MSPL/TMPRSS13ノックアウトマウスを用いた、個体レベルでのウイルス感染実験、4)特異的発現調節機構を応用した酵素活性の増減とウイルス感染増殖様式の変化から明らかにし、具体的なウイルス感染制御法を示すことを達成目標としている。現段階で既に、1)および3)はおおむね目標を達成しており、2)の達成に向けた研究も順調に進んでいることから、「研究の目的」の達成度はおおむね順調であると考える。MSPLの構造を基盤とした特異的酵素阻害剤はまもなく同定できる予定である。よって、今後の研究の推進方策としては、この特異的阻害剤を用い、酵素活性の阻害とウイルス感染増殖様式の変化をMSPL/TMPRSS13安定発現細胞株ならびにMSPL/TMPRSS13ノックアウトマウスを用いて解析する。
ゾル-ゲル法で得られる酸化物ゲルの安定性に対する熱力学的アプローチ

ゾル-ゲル反応の加水分解過程-重縮合過程の反応機構を調べるために,オルトケイ酸テトラエチルやその官能基の一部をメチル基で置換したものなど数種のシリコンアルコキシドについて,反応熱を測定した。その結果として,次のことがわかった。(1)オルトケイ酸テトラエチルのゾル-ゲル反応の加水分解過程が大きな発熱反応であるのに対して,重縮合過程は非常に小さな吸熱または発熱反応である。重縮合過程の反応熱が非常に小さいことは水溶液系では以前から知られていたが,本研究により,ゾル-ゲル反応の溶媒であるアルコール-水共存系においても同じであるということがわかった。(2)加水分解初期の発熱速度が,TEOSでは酸触媒濃度に対して1.5乗に,MTESでは1.3乗に比例する。このように反応指数が整数にならないのは,加水分解反応が数段階の逐次反応であるためと考えられた。(3)触媒濃度が高くなると,加水分解初期の発熱速度は触媒濃度によらず一定となる。これは,触媒濃度が低濃度のときは反応律速となるが、高濃度のときにはアルコキシドの拡散が律速となるためと考えられる。(4)TEOSの反応初期の発熱速度は水の濃度の0.24乗に比例した。これは,水がエタノール溶媒中でクラスターとなって存在しているためと考えられる。また以上の熱力学的研究と共に実施した真空紫外反射率に関する分光研究から,これらの反応によって得られた酸化物ゲルはシリカガラスと異なった網目構造をもつことが明らかになった。1.本年度購入の熱量計を用いて測定したシリカゾル溶液とフッ酸の反応熱測定から、酸触媒と多量の水を含む溶液から得られるゾル溶液の生成エンタルピー(Hf)を、ゲル化反応時間の関数として求めた。ゲル化反応開始直後には、アルコキシドの加水分解によりHfは負の方向へ急激に増加した。加水分解終了後はHfはゆっくりと負の方向へ増加し、その速度は反応時間と共に低下したが、ゲル化点近傍で特別な変化はなかった。また、Hfの時間発展に出発溶液組成が大きく影響することが判明し、さらに、重縮合の初期にはHfの時間発展がゾル溶液の粘性と関係していることがわかった。2.ケイ素アルコキシドのゾル-ゲル反応において、反応初期のアルコキシドの加水分解段階では反応速度が速く反応熱も大きいため、当初の計画である(1)の方法よりもアルコキシドと水の反応熱を直接測定する方が、簡単に信頼性の高い熱力学データを得られることがわかった。その測定の結果、混合直後は大きな発熱や吸熱の反応は生じないが、混合後数分数十分(酸触媒をアルコキシドに対し0.01mol/mol含む場合)で大きな発熱が観測され、その後は大きな反応熱は発熱、吸熱共に生じないことがわかった。3.ケイ素アルコキシドから得られるゲル膜を種々の温度で予備焼成後に800°Cで本焼成してガラス化し、真空紫外反射率の測定を行った。予備焼成温度により反射スペクトルの励起子ピーク位置が異なり、400°Cの予備焼成すると溶融法で作製したガラスにほぼ近いピーク位置になることが見出され、ゲルから得られるガラスは焼成条件により電子構造が異なることが明らかになった。1.溶解熱熱量計を用いてシリカゾル溶液およびゲルのフッ酸との反応熱を求め,その値からシリカゾル溶液およびゲルの生成エンタルピーを求めた。これと同時にゾル溶液の粘性を測定し,生成エンタルピーとの関係を検討した。ゾル溶液調整後の数時間経った後は,最初は生成エンタルピーの変化速度は粘度の増大と共に減少するが、その後次第に,エンタルピー変化は粘度への依存性が小さくなることがわかった。2.テトラエトキシシランの加水分解反応の反応熱を測定した。その結果,この反応は発熱反応であり,アルコキシド:水:酸触媒のモル比が1:6:0.01

程度の条件では,発熱が生じるまでに数分程度の誘導期間が必要であることがわかった。この事から,第1段の反応の反応熱は小さく,第2段以降の加水分解で,大きな反応熱が生じると考えられる。3.ケイ素アルコキシドから得られるゲル膜を種々の温度で熱処理した後,800°Cで本焼成し,様々な熱履歴を持つゾル-ゲルシリカガラス薄膜を作製した。その真空紫外反射率を測定し励起子ピーク位置の熱処理温度依存性を調べた結果,400°C付近で長時間熱処理すると,溶融法で得られるシリカガラスに近いスペクトルが得られることがわかった。これに対し,熱処理温度が高すぎても低すぎても,励起子ピーク位置は溶融法で得られるシリカガラスよりも低エネルギー側にあった。このことは,ゾル-ゲル法で得られるガラスは溶融法で得られるシリカガラスよりも屈折率が高くなる可能性を示している。
高分解能心電計を用いた除細動器植込み例での作動解析による突然死のリスク評価

突然死一次予防目的に両室ペーシング機能付き植込み型除細動器(CRTD)植込み術を施行した心不全患者125例を対象に、心室不整脈の発現と心電学的指標との関連性に関する検討を行った。ベクトル合成187チャネル高分解能心電計(DREAM-ECG)によるTp-e dispersionは有意に頻回作動例で大きく、心室遅延電位(LP)陽性例は頻回作動が多かった。非虚血性心不全患者103例を対象とした検討では、narrowing fQRS例は心室不整脈の発現率が低い傾向であった。CRT植込み術を施行した心不全患者において、脱分極異常および再分極異常ともに心室不整脈の発現と関連していることが示唆された。器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の異常と致死性不整脈との関連性に関する検討を行った。本研究は平成19年からのベクトル合成187チャネル高分解能心電計(DREAM-ECG)を用いた前向き観察研究である(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;2036)。突然死一次予防目的に両室ペーシング機能付き植込み型除細動器(CRTD: cardiac resynchronization therapy and defibrillator)植込み術を施行した突然死高リスク心不全患者128例を対象に、植込み型除細動器(ICD: Implantable Cardioverter-Defibrillator)の作動と心電学的指標との関連性に関する検討を行った。平均36ヶ月の観察期間中に18例で心室頻拍/心室細動による頻回作動(1日3回以上のICD作動)をきたした。CRTD植込み時の12誘導心電図による再分極過程の検討から、頻回作動例ではTp-e dispersion(68+/-22 vs. 48+/-20ms, p<0.05)が有意に大きいという結果であった。DREAM-ECGによる解析では、RT dispersion (92+/-22 vs. 74+/-29, p<0.05)およびTp-e dispersion (73+/-16 vs. 59+/-23, p<0.05)ともに有意に頻回作動例で大きいという結果であった。また、心室脱分極過程の異常を示す心室遅延電位(LP; late potential)の解析から、LP陽性例では頻回作動が多かった(21% vs. 10%, Log-rank p<0.05)。突然死一次予防目的にCRTD植込み術を施行した心不全患者において、ICD作動を伴う致死性不整脈頻発のリスク因子として、心室脱分極異常および心室再分極異常が有用であることが示唆された。1.器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討CRTD植込み術を施行した高リスクの心疾患患者を対象として、詳細な検討を行い、不整脈イベント予測に結びつく解析結果が得られた。2.心室脱分極および再分極指標と不整脈イベントに関する前向き観察研究平成27年9月1日より「日本人心不全患者における予後、心血管イベントに関する前向き観察研究」を開始している(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;3561)。平成28年3月31日現在までに、164例の対象患者が登録されている。1.器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討を行った。前年度に引き続き、突然死一次予防目的に両室ペーシング機能付き植込み型除細動器(CRTD)植込み術を施行した非虚血性心不全患者103例を対象に、植込み型除細動器(ICD)の作動と心電学的指標との関連性に関する検討を行った。CRT前の心室遅延電位によるfiltered QRS(fQRS)に比してCRT1週間後のfQRSが短縮したnarrowing fQRS例(n=53)では、non-narrowing fQRS例(n=50)に比して死亡率が有意に低かった。頻脈性心室不整脈の発現率は、narowing fQRS例で低い傾向であった。CRTを施行する際にはfQRSを短縮するための方策が、致死性不整脈の予防につながる可能性が示唆された。2.心室脱分極および再分極指標と不整脈イベントに関する前向き観察研究平成27年9月1日より「日本人心不全患者における予後、心血管イベントに関する前向き観察研究」として前向き観察研究を開始している(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;3561)。対象は、東京女子医科大学循環器内科において心不全の診断で入院し、本研究への参加同意が取得できた心疾患患者である。調査項目には、心室性不整脈の有無とともに、12誘導心電図での基本調律・心拍数・QRS時間・QT時間、DREAM-ECGでのRT dispersion・Tp-e dispersion・Late potential・T-wave alternansがある。引き続き症例の蓄積と追跡調査を行っていく。1.器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討CRTD

植込み術を施行した高リスクの非虚血性心疾患患者を対象として、詳細な検討を行い、CRTによる治療効果と不整脈イベントの予測に結びつく解析結果が得られた。2.心室脱分極および再分極指標と不整脈イベントに関する前向き観察研究平成27年9月1日より「日本人心不全患者における予後、心血管イベントに関する前向き観察研究」を開始している(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;3561)。平成29年3月31日現在までに、466例の対象患者が登録されている。1.器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討を行った。本研究は平成19年からのベクトル合成187チャネル高分解能心電計(DREAM-ECG)を用いた前向き観察研究である(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;2036)。突然死一次予防目的に植込み型除細動器(ICD)植込み術を施行した肥大型心筋症52例を対象に、ICDの適切作動と心電学的指標との関連性に関する検討を行った。非持続性心室頻拍と左室内圧格差を有する症例は、その他の症例に比して有意にICD作動の発現率が高かった。また、DREAM-ECGを記録できた33例での検討では、ICD作動を認めた症例で、12誘導心電図およびDREAM-ECGによる再分極指標(Tpeak-Tend dispersionおよびInter-lead difference between Tpeak-Tend intervals)が有意に大きいという結果であった。高リスクの肥大型心筋症については、非持続性心室頻拍と左室内圧格差をともに有すること、また再分極指標が突然死リスクと関連する可能性が示唆された。2.心室脱分極および再分極指標と不整脈イベントに関する前向き観察研究平成27年9月1日より「日本人心不全患者における予後、心血管イベントに関する前向き観察研究」として前向き観察研究を開始している(東京女子医科大学臨床研究課題倫理委員会承認番号;3561)。調査項目には、心室性不整脈の有無とともに、12誘導心電図での基本調律・心拍数・QRS時間・QT時間、DREAM-ECGでのRT dispersion・Tp-e dispersion・Late potential・T-wave alternansがある。症例の蓄積を継続した後に解析を行う予定である。突然死一次予防目的に両室ペーシング機能付き植込み型除細動器(CRTD)植込み術を施行した心不全患者125例を対象に、心室不整脈の発現と心電学的指標との関連性に関する検討を行った。ベクトル合成187チャネル高分解能心電計(DREAM-ECG)によるTp-e dispersionは有意に頻回作動例で大きく、心室遅延電位(LP)陽性例は頻回作動が多かった。非虚血性心不全患者103例を対象とした検討では、narrowing fQRS例は心室不整脈の発現率が低い傾向であった。CRT植込み術を施行した心不全患者において、脱分極異常および再分極異常ともに心室不整脈の発現と関連していることが示唆された。1.器質的心疾患に伴う心室脱分極・再分極過程の検討心疾患に対する非薬物治療のみでなく、薬物治療の効果も含めた詳細な検討を継続して行う。
リメディアル学習者のための「書く」技能を伸ばす英文法教材の開発と学習効果の検証

本研究の目的は,英語に苦手意識を持つリメディアル学習者が,中学校で既習の英文法知識を再構築し,かつ主体的な「書く」技能を育成するための文法教材を開発することである。本文法教材は知言語学のイメージ図式理論を応用しており,パソコン上で動く,アニメーションを多用した教材である。このため,特に英語学習にあまり良い印象や経験を持っていないリメディアル学習者にとって,心理的障壁を生じさせにくい作りになっている。前年度(平成30年度)は「前置詞」「冠詞」「名詞」「過去時制3種」の教材を開発し,CEFRでいうところのA1レベルにあたるリメディアル学習者を対象に,教材の学習効果を検証してきた。その結果,一定の学習効果が見られ,また心理尺度や自由記述などのアンケート結果から,学習者にとって心理的負担の少ない教材であることも明らかになった。しかしながら,前年度は被験者のレベルや専門に偏りがあったため,本教材に普遍的な利用価値があるかを明らかにすることができなかった。このため,本年度(平成31年度)は被験者の偏りを解消するべく,他大学に出校し,同教材を同一の環境で提供する形で,前年度の被験者より英語力のレベルが上位(CEFRではA2-B1)の被験者を対象にして,更なる検証を行った。前年度および今年度に行った検証結果は,分析をすすめ,国際学会で口頭発表の形で随時報告を行っている。しかしながら,本年度は前期中に産前産後休暇を取得したため,分析および結果報告に遅れが生じており,平成31年度まで期限を延長することになった。本年度(平成30年度)は前期中に産前産後休暇を取得した。このため,結果の分析および報告に遅れが生じており,平成31年度まで期限を延長する運びになった。効果検証のための実験は既に終了しているため,結果の分析と報告を随時行う予定である。文部科学省は,2020年までに日本人留学生の数を2倍に増やすことを目標としており,海外の人々と主体的に協働することのできる人材,すなわち英語を受け身として「読む」「聞く」だけではなく,主体的に考えを表現する「書く」「話す」技能を持つ人材の育成を最重要課題としている。したがって,国際的な人材の育成には,主体的な運用能力のひとつである「書く」技能を伸ばすトレーニング方法の開発が急がれている。本研究は,英語に苦手意識を持つリメディアル学習者が心理的障壁を生じさせないように,パソコン上でアニメーションを多用した文法教材である「図式モデル教材」を開発し,これを学習することで学習者に既習の英文法知識の再構築を促し,自分の考えを英語で「書く」技能を伸ばすことを目的としている。本年度(H29年度)の前半では,既に開発していた前置詞5種の教材に修正を加えた上で20名強の被験者に対してパイロット実験を行った後,本実験として計100名弱の実験群と統制群の被験者に対して教材の効果の有効性を検証した。また,続く本年度(H29年度)の後半では冠詞,名詞,過去時制(単純過去,現在完了,現在完了進行)の3項目の「図式モデル教材」を開発し,計100名弱の実験群と統制群の被験者に対して効果を検証のための実験を行った。上記の実験の結果「図式モデル教材」は既習の英文法知識の再構築を促したため,実験の前後に課した英作文問題において一定の能力の向上が見られた。上記の成果は,学会誌への論文投稿と口頭発表の形で既に報告を始めている。H29年度は提出した計画通りに実験実施および成果報告を行っている。

H30年度前半は,研究代表者が16週間の産前産後休職を取得するため,実験と成果報告の2点において当初の予定より遅れる可能性がある。休職より復帰するH30年度後半においては他大学の実験協力者から既に協力の承諾を得ており,計画も進行しているため,予定通りの実験と成果報告ができる見込みである。効果検証のための実験は既に終了しているため,結果の分析と報告を随時行う予定である。次年度では結果の詳細化をはかるため,実験の規模を拡大する必要性がある。このため,実験に必要な機器の追加購入や外部委託の使用費が当初の見込みより多くかかることが予想される。平成30年度の前期中に産前産後休暇を取得した。このため,結果の分析と報告に遅延が生じている。平成31年度まで期限を延長し,データを管理しているサーバーの維持費や結果報告のための出張費用を計上する。
後期中英語の形容詞の語尾の機能と脱落過程

1400年頃の『マンデヴィル旅行記』の3つの写本を対象に、形容詞の語尾-eを分析した結果、いずれの写字生もこの-eを単数・複数の区別なく、また、語源や過去の屈折の型を問わず、形容詞ごとに有標・無標の語尾を定めていたことが明らかとなった。それゆえ、中英語後期の形容詞の語尾-eには明確な機能があることから、脱落していたとは言えない。当時の形容詞の語形変化を研究する場合、個々の語形の有標性を確定することは不可欠である。本年度の研究計画は、『マンデヴィル旅行記』を主な分析対象として、主要な形容詞について、単数形と複数形の双方の無標の形式と有標の形式を確定し、限定用法と叙述用法のそれぞれにどのような特徴が現れるかを明らかにすることであった。分析の結果、第一に、中英語の形容詞の語尾に関する語源と屈折の型に基づく従来の一般化は、少なくとも『マンデヴィル』には有効ではないこと、第二に、この旅行記の書き手は形容詞の語尾-eの有標性と無標性をはっきりと区別していたこと、第三に、語尾の有無と数に関する類型化を行うと、この文献の形容詞が3つの型に分けられ、それぞれ分布と頻度に関して顕著な特徴を示すことを指摘できたことである。これらの分析結果は、通説と大きく異なるだけではなく、その正当性はデータと理論によって裏付けられていることから、学界において今後、高い評価が与えられる期待が持てる。上記の研究成果は、平成20年11月15日の日本英語学会第26回大会において発表し、さらに同学会の研究発表論文集JELS26(pp.51-60)に掲載された。上記の研究と並行して、中英語のwhan that型の連結従属接続詞とリズムについて研究を行い、その成果はTsukuba English Studies27号に"On the Function of That of ComplexConjunctions in Late Middle English"(pp.1-11)としで収録されている。また、古英語の所有代名詞と人称代名詞の属格形の形式と機能の区別に関する分析結果はBenjamins社から刊行予定のThe Development of the Anglo-Saxon Language and Linguistic Uni-versals Vo1.1の論文"Old English Pronouns for Possession"に発表した。本年度はボドレー版(以下、B写本)の『マンデヴィル旅行記』の形容詞の語尾-eを対象に分析した。最初に、この写本の個々の形容詞について、単数・複数のそれぞれの無標・有標の形式を確定した。その結果、頻度数の多い在来の形容詞gret 'great', fayr 'fair', good, holy, long, yong 'young'の場合、単数形は無語尾が無標、複数形は-eで終わる形式が無標であることが明らかとなった。一方、riche 'rich'は単数の無標の形式が-eで終わるが、dyuers 'diverse'とpreciousは複数形に無語尾が多く、他の形容詞と反対の傾向を示す。これはフランス語からの借用語であることから、原語の綴り字の影響の可能性があることなどの指摘をおこなった。次に、前年度にコットン版(以下、C写本)について設定した「主要語の後ろという有標の位置に生じる後置形容詞は無標の形式に限られる」という仮説はB写本にも当てはまることを証明した。さらに、頻度数の少ない形容詞についても、無標・有標の区別を明確にした上で分析を行った。その結果、B写本はC写本より成立時期が50年遅いとみなすSeymour (1963, 1967)の説は事実に反することを指摘した。また、語末の-eの脱落は1400年頃までとするMinkova (1991)の説は、それ以降に成立したとみなされるB写本の形容詞は古英語や古フランス語の語尾を維持している確率が高いことから、再考の必要がある。昨年度と今年度の研究成果は先行研究の見直しを迫るものである。また、分析基準や仮説は妥当なものであり、成果が学会誌や研究紀要等に公刊され、加えて、平成22年度の研究も大きな成果が期待できることから、今後、英語史の分野の研究に大きな貢献をすることになろう。後期中英語の形容詞の語尾の脱落過程を探るために、今年度は、『マンデヴィル旅行記』(欠損版)を主な分析対象とした。この旅行記については、平成20年度のコットン版の分析によって、「有標の語尾を伴う形容詞は被修飾語である主要語の後位置という有標の位置を占めることはない」という仮説が設定され、平成21年度のボドレー版の分析によって検証されている。そのために今年度は欠損版での検証が中心課題となった。欠損版でも仮説どおりの分析結果が得られたことから、いくつかの興味深い指摘が可能となった。

すなわち、いずれの写本においても、形容詞の語尾は、単数・複数の区別、限定的・叙述的用法の区別、強変化・弱変化という過去の屈折の区別、および語源に基づく語尾の有無という観点からすると、写字生はかなり無作為に語尾-eを付加または削除しているように思われる。しかし、使用頻度数の多いgreat,good,fair,long,holyなどの形容詞のそれぞれについて、数と用法の区別に関して、使用頻度数の多い語尾を無標(unmarked)、少ない語尾を有標(Marked)と規定すると、限定用法の場合、有標の語尾は主要語(head)である名詞の後という有標の位置を占める例は皆無であった。このことから、いずれの写字生も、形容詞の語尾-eの付加については明確な原則を守っていたことになる。それゆえ、現代英語の名詞・動詞・代名詞・指示詞などに明確に存在する数の区別が、形容詞には欠落しているという事実の背後にある歴史的変化の過程を探る場合、分析対象とする文献の個々の形容詞の語尾の有標性の区別は不可欠であることになる。したがって、本研究の成果は、今後の英語史研究の分析方法に大きな貢献をするものと思われる。なお、本研究の成果に基づくチョーサーの『カンタベリ物語』における形容詞の語尾の脱落過程についても分析を進めつつあることから、成果が期待される。
時間栄養学（給餌タイミング）による魚類肉質改善法の確立

時間栄養学(栄養学を時間生物学の立場から扱う)に着目した魚類筋内脂肪量の調節が可能となるかどうかを証明するために、以下の解析を行った。(1)明期・暗期給餌による筋内脂肪蓄積の違い(明期・暗期給餌による筋内脂肪蓄積の観察):明暗周期を明期12時間、暗期12時間としたゼブラフィッシュに、150cal/匹/日(高カロリー食)の餌を1日に1回、明期(明期給餌群)と暗期(暗期給餌群)にそれぞれ2か月間与え、体長、体重変動の測定及び肥満度を測定した。2ヶ月間の給餌実験で、標準体長には明期・暗期群に大きな差は認められなかったが、2ヶ月目の体重と肥満度において、暗期群が明期群と比べ高い値を示した。(2)筋内時計遺伝子による概日リズムの発振機構(筋内脂質関連酵素の時計遺伝子による発現調節機構):ゼブラフィッシュ筋内では正の制御因子であるBmal1とClockのmRNA発現量が明期開始時であるZT2時間目に他の時間帯と比較し低値を示した。これらの発現量は明期の終わりまで増加傾向であり、暗期開始前のZT10時間目に最も高い発現量を示した。その後、暗期の終わりまで減少傾向を示した。これに対し、負の制御因子であるPer2とCryでは、ZT2時間目においてそれぞれ最大の値を示した。Cryの発現量はZT14が最も発現量が低く、その後やや増加した。Per2の発現量は暗期期間を通して低値を示した。明期・暗期給餌による体重・肥満度の違いが得られ、ゼブラフィッシュ筋内において、時計遺伝子の発振が認められた。計画通りに研究が進行している。(1)明期・暗期給餌による筋内脂肪蓄積の違いb.明期・暗期給餌による筋内脂質関連酵素の発現解析:前述した2か月間の高カロリー明期給餌群と暗期給餌群の筋肉からmRNAを抽出し、real-time PCRを用いて、筋内脂質関連酵素の発現量を解析する。(2)筋内時計遺伝子による概日リズムの発振機構c.筋内脂質関連酵素の時計遺伝子による発現調節機構:筋内時計遺伝子による概日リズムの発振機構を確認するために、筋内脂質関連酵素の上流プロモーター領域の発現ベクターと、我々が所有する時計遺伝子(Clock, Bmal1)を培養細胞へ共発現し、ルシフェラーゼアッセイによりリアルタイムに脂質関連遺伝子の発振性(日周性が確認されるかどうかをin vitroで解析する)を解析する。(3)養殖魚への応用d.魚類筋内時計遺伝子及び脂質関連酵素の発振性解析時間栄養学(栄養学を時間生物学の立場から扱う)に着目した魚類筋内脂肪量の調節が可能となるかどうかを証明するために、以下の解析を行った。(3)養殖魚への応用d.魚類筋内時計遺伝子及び脂質関連酵素の発振性解析論文校閲と論文投稿のための予算を当初計画していたが、データのとりまとめが間に合わなかった。
心不全におけるカルジオトロフィン-1およびその受容体の生理的、病態的意義の解明

ラット心筋梗塞モデルにおいてCT-1、およびその受容体の構成成分であるgp130のRNAおよび蛋白の発現の検討を行なった。両因子の発現は、梗塞部、および非梗塞部である心室中隔あるいは右心室においても増加していた。発現は梗塞後1-2週間でピークに達し、慢性期(8週後)においても、sham群に比して、有意に増加していた。免疫染色法により、その局在を検討し、心筋細胞、繊維芽細胞において両因子の発現を認めた。心エコーで急速な左心室の拡大を梗塞後1-2週間までに認め、CT-1およびgp130の発現と心拡大の時期は一致した。CT-1は、その生理活性である心筋細胞肥大作用を介して、心室リモデリングに多大な影響を及ぼしていると推察された。CT-1はアポトーシスの抑制作用を有することが知られているが、現在同モデルで検討中である。また、ラット高血圧性心不全モデルにおいて、代償期の肥大心においてはCT-1の発現に変化はなかったものの、非代償期の心拡大をきたす時期に,一致して、CT-1の発現の亢進を認め、この時期に単離した心筋細胞の長軸方向への肥大を認めた。in vitroでの生理作用がin vivoモデルにおいても機能していることを明らかとした。両心不全モデルにおいて、ともに心拡大期にCT-1の発現の亢進を認め、心拍出量維持を目的とした、心拡大にCT-1が貢献していることが推測された。カルジオトロフィン-1(CT-1)は、心筋細胞を長軸方向に肥大させるユニークな作用を有する。CT-1およびその受容体の構成成分であるgp130の心拡大における役割を検討した。まず、ラット心筋梗塞モデルにおいて、CT-1およびgp130の発現を検討した。両因子は梗塞部および非梗塞部である心室中隔において、梗塞後1-2週後にピークに達し、慢性期においてもコントロール群に比して有意に増加していた。CT-1の発現パターンは心筋梗塞後の心拡大の進展度合いと平行に変化した。さらに、ダールラット食塩感受性高血圧モデルを用いて、CT-1の発現を検討した。本モデルにおいては、生後11週で代償性心肥大を、17週で非代償性心拡大(心不全)を示すが、心肥大期においてはCT-1の発現上昇は軽度であったが、17週の心拡大期には、CT-1の発現は著明に増加していた。また、心エコーで測定した左心室の拡張末期径とCT-1の発現レベルは正の相関を示した。単離した心筋細胞の長さは心拡大期に最も増大していた。これらのことより、CT-1はin vitroにおいて確認されている心筋細胞の長軸方向への肥大作用をin vivoにおいても促進させていることが確認された。心不全に至る過程において、心臓は心拡大により心拍出量を保とうとする機序を有するが、そのひとつの情報伝達分子として、CT-1の関与が明らかとなった。ダールラット食塩感受性高血圧モデルを用いて、CT-1およびgp130の発現を検討した。本モデルにおいては、食塩摂取により、生後11週で代償性心肥大を、17週で非代償性心拡大(心不全)を示す。心肥大期においてはCT-1の発現上昇は軽度であったが、17週の心拡大期には、CT-1の発現は著明に増加していた。一方、CT-1の受容体の構成成分であるgp130は、心肥大期および心不全期共にその発現は亢進していた。CT-1はgp130を介して心不全期に心筋細胞肥大を促している可能性が示唆された。

一方、gp130は心肥大期にもその発現が増加していたが、CT-1以外のIL6familyのサイトカインのシグナルを伝達していると考えられた。これらのことより、CT-1はin vitroにおいて確認されている心筋細胞の長軸方向への肥大作用をin vivoにおいても促進させていることが確認された。心不全に至る過程において、心臓は心拡大により心拍出量を保とうとする機序を有するが、そのひとつの情報伝達分子として、CT-1の関与が明らかとなった。
磁気二重刺激を用いての大脳運動野の皮質ならびに皮質間抑制と興奮性機序に関する研究-特に正常運動制御と不随意運動を呈する異常運動症患者との対比

本年度は次のA),B)の2点につき研究した。A)同一の運動野の2重刺激による皮質抑制手の運動野を磁気2重刺激(閾値下強度の条件刺激Cと閾値上試験刺激T)により、大脳運動野の抑制機能の評価が可能である。この手法を錐体外路系疾患の代表としてパーキンソン病患者群の運動皮質抑制機能を検討した。[対象と方法]検査に同意の得られたパーキンソン病患者10人と正常群10人を対象に、第1背則骨間筋を記録部位として大脳2重刺激法により皮質抑制度を検討。患者群には通常の抗パ剤服薬時(ON)と12時間以上OFFの状態に分け検討した。[結果]正常群ではCT intervalで6msにわたり強い抑制(56±6%)を認めたが、患者群ではON,OFFでそれぞれ78±12%(P<0.05),81±9%(P<0.01)と弱い抑制を示し、有意差を認めた。患者群のON,OFFでは有意差はなかった。[結論]パーキンソン病患者では運動野皮質抑制機能は減少している。大脳磁気2重刺激法による皮質抑制機構に対するl-dopaの関与は少ないと考えられた。B)同一大脳半球における皮質間抑制の機構解析i)健常者を対象とし記録部位をおとがい筋にとり、顔と足の運動野皮質間抑制を検討したが、抑制は全く生じなかった。第一背側骨間筋を記録部位とした手と足の皮質間抑制は最大50%の抑制を認めた。ii)上肢において、第一背側骨間筋、前腕屈筋、上腕二頭筋に記録部位を置くと、各筋とも同様に抑制を認めたが、その抑制度は、遠位筋程強く、近位筋程減弱していた。iii)近位筋と遠位筋群の両皮質間抑制は、上肢の各運動野皮質が極めて近接しており解析に不適切であることが判明した。[結論]大脳運動野の抑制機構には、各支配筋に対しての抑制度及び大脳皮質間を結ぶ線維結合の様式が互いに異なり、各々に、固有の運動発現機構を有している可能性が考えられた。
bHLH-ZIP型転写因子群によるゴルジ体ストレス応答の制御ネットワークの解明

ゴルジ体ストレス応答は、細胞の需要に応じてゴルジ体の機能を強化する自律的恒常性維持機構である。研究代表者は世界に先駆けてゴルジ体ストレス応答の研究を開拓している。予備的な実験から、ゴルジ体ストレス応答を制御する中心的調節因子である転写因子TFE3を同定していた。本研究課題では、TFE3の活性がリン酸化状態による細胞内局在性によって制御されていることを明らかにするとともに、ゴルジ体ストレスの分子的実体がゴルジ体での糖鎖修飾や小胞輸送の不全に起因することを明らかにした。また、神経細胞やグリア細胞、杯細胞などの細胞分化過程においてTFE3が活性化されることを見出し、ゴルジ体ストレス応答が生理学的に重要な機能を有することを明らかにした。ゴルジ体は分泌タンパク質の修飾を行う細胞小器官であり、その細胞内の存在量は細胞の需要に応じて厳密に制御されている。研究代表者はこのゴルジ体の量的調節機構であるゴルジ体ストレス応答の分子機構の研究を行っている。予備的な研究から、ゴルジ体ストレス応答によって転写が誘導される標的遺伝子(ゴルジ体の糖鎖修飾酵素や小胞輸送因子、構造形成因子をコードする遺伝子)を同定し、転写誘導を制御する転写制御配列GASE(Golgi apparatus stress response element)を同定するとともにGASEに結合する転写因子TFE3とMLXを単離した。TFE3を過剰発現するとGASEからの転写が活性化され、TFE3の発現を抑制するとゴルジ体ストレス依存的な転写誘導が見られなくなることから、TFE3はゴルジ体ストレス応答を制御する主要な転写因子であると考えられる。本年度は、ゴルジ体ストレスによるTFE3の活性化機構を解析した。TFE3を特異的に認識する抗体を作製して調べたところ、TFE3は平常時には高度にリン酸化されて細胞質に係留されているが、ゴルジ体ストレス時には脱リン酸化されて核へ移行し、ゴルジ体関連遺伝子の転写を誘導していることがわかった。現在、どのようなリン酸化酵素や脱リン酸化酵素が関与しているのか調べている。また、ゴルジ体ストレスの分子的実体を調べるために様々な方法でゴルジ体に負荷を与えてゴルジ体ストレス応答が誘導されるかどうか調べたところ、(1)本来酸性であるゴルジ体を中性化してゴルジ体の機能を喪失させる、(2)ゴルジ体からの小胞輸送を阻害する、(3)ゴルジ体を断片化してその機能を喪失させるなどの処理によってゴルジ体ストレス応答(TFE3の脱リン酸化)が誘導されることがわかった。現在、これらの処理によるゴルジ体ストレス誘導の分子機構を解析している。ゴルジ体は、分泌タンパク質の修飾や選別輸送を行う細胞小器官である。ゴルジ体の量は細胞の需要に応じて厳密に制御されているが、その機構(ゴルジ体ストレス応答)の詳細は不明である。前年度までの研究によって、ゴルジ体ストレス応答によって転写が誘導される標的遺伝子(ゴルジ体の糖鎖修飾遺伝子やゴルジ体以降の小胞輸送因子遺伝子)を同定し、転写誘導を制御する転写制御配列GASEと転写制御因子TFE3を同定した。また、平常時にはTFE3はリン酸化されていると同時に、細胞質に存在しているが、ゴルジ体ストレス時(ゴルジ体の機能が不足する状態)には脱リン酸化が起こることと、核へ移行することを見いだした。今年度は、TFE3のリン酸化部位を検索した結果、108番目のセリン残基(S108)がリン酸化に必須であることを見いだした。S108をアラニンに置換したTFE3-S108A変異体は細胞質に繋留されず、常に核に局在することがわかった。このことは、TFE3の細胞内局在性がリン酸化によって制御されていることを示している。また、ゴルジ体ストレスの分子的実体について解析するために、細胞にゴルジ体の機能を不足させる処理を行い、TFE3が活性化されるかどうか調べたところ、ゴルジ体での糖鎖修飾を阻害する薬剤(ムチン型糖鎖付加の阻害剤Benzyl-GalNAcやプロテオグリカンの糖鎖付加阻害剤Xyloside、ゴルジ体のマンノシダーゼII阻害剤swainsonine)や、ゴルジ体以降の小胞輸送の阻害する薬剤(PI4Kの阻害剤WortmanninやLY294002、PIK-93、PIKfyveの阻害剤YM201636)などによってTFE3の活性化が起こることがわかった。このことは、ゴルジ体での糖鎖修飾が未完成のままであったり、ゴルジ体に大量の分泌タンパク質が蓄積することがゴルジ体ストレスの引き金になっていることを示唆している。細胞小器官の量的調節機構は細胞生物学の重要な研究課題である。

研究代表者は小胞体の量的調節機構である小胞体ストレス応答の機構を明らかにし、現在ゴルジ体の量的調節機構であるゴルジ体ストレス応答の機構を研究している。これまでの研究から、ゴルジ体ストレス応答を制御する転写制御配列GASEとGASEに結合してゴルジ体の機能を担う遺伝子の転写を活性化する転写因子TFE3を同定した。平常時にはTFE3はリン酸化されて細胞質に留められているが、ゴルジ体ストレス時(ゴルジ体の機能が不足した状態)には脱リン酸化されて核へ移行することも見出した。本研究課題の前年度までの解析によって、108番目のセリン残基(S108)が平常時にリン酸化されることでTFE3が細胞質に繋留されていることを明らかしにした。またゴルジ体での糖鎖修飾阻害剤を用いてゴルジ体ストレスの分子的実体を解析したところ、ゴルジ体での糖鎖修飾不全がゴルジ体ストレスを惹起していることを見出した。本年度は、TFE3をリン酸化するキナーゼをsiRNAライブラリーを用いて検索した。その結果、CKIαの発現を低下させるとTFE3が脱リン酸化されて核へ移行した。興味深いことに、S108付近のアミノ酸配列は、CKIαの基質のコンセンサス配列と一致していた。これらのことは、CKIαがTFE3のリン酸化酵素であることを示唆している。また、ゴルジ体でのシアル酸修飾が不全の変異細胞Lec2でもTFE3の脱リン酸化や核移行が見られた。このことは、ゴルジ体での糖鎖修飾の不全がゴルジ体ストレスの惹起に関与していることを遺伝的に示すものである。今後は、TFE3を脱リン酸化するフォスファターゼを同定するとともに、ゴルジ体ストレスを感知するセンサー分子を同定し、ストレス感知機構を明らかにする予定である。ゴルジ体ストレス応答の中心的制御因子TFE3の活性化機構が、分子の脱リン酸化に伴う細胞内局在性の変化であることを明らかにすることができた。このことは、ゴルジ体ストレス応答の基本機構の中心的制御機構が脱リン酸化によって制御されていることを示すものであり、画期的な成果であると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。ゴルジ体ストレス応答の中心機構が転写因子TFE3の脱リン酸化であることを明らかにしたので、次年度はTFE3のリン酸化を制御する因子(リン酸化酵素と脱リン酸化酵素)の単離を試みる。単離したリン酸化酵素と脱リン酸化酵素の活性化機構を解析し、順次情報伝達経路の上流に向かって解析していくことによって、最終的にゴルジ体ストレスを感知するセンサー分子に至る細胞内情報伝達経路の全貌を明らかにする。