hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔保健行動の予測モデルの構築と歯科保健プログラムの開発

しかしながら、口腔保健行動がフォローアップ時において統制群よりも介入群の方が高くなり、また、両群においてプレテストからフォローアップ、ポストテストからフォローアップにかけて口腔保健行動が高まることが示された。これらのことから、HAPAの構成要素に従ったメールマガジンの配信による介入効果が少なからずあったと考えられる。本研究の目的は、青年期の口腔保健行動に対する評価指標の開発と予測モデルの検討し、予測モデルに基づく青年期の歯科保健プログラムの開発と効果の検証をすることである。予測モデルには、Health Action Process Approach(HAPA)を用い、歯科保健プログラムにもHAPAに基づいた教育プログラム作成し、その効果検証を行った。本研究の主な結果は、口腔保健行動チェックリスト、口腔保健行動への動機づけ評価尺度が開発された。さらに、HAPAによって青年期の口腔保健行動を予測することが可能であることが示された。HAPAに基づく教育プログラムによって、一定の教育効果が認められた。平成27年度に予定していたインターネット調査が実施できなかった理由としては、口腔保健行動のチェックリストの妥当性の検証に唾液サンプルの検査キットを用いる予定であったが、この検査キットが入手困難となり、他の方法によって妥当性を確保できないか検討しているためである。今後は、他の研究機関との協力を得て、口腔保健行動のチェックリストの妥当性を検証できないか検討する。平成29年度前半は、28年度から引き続いてデータの分析をし、HAPAに自己決定理論に基づく口腔保健行動に対する動機づけを含めたHAPAモデルの検討を進める。後半からは、自己決定理論を含めたHAPAモデルに基づく介入プログラムの作成、介入のプログラムの評価へとつなげていきたい。介入プログラムの作成にあたっては、動機づけの水準に応じて、HAPAを構成するどの心理的要因に働きかけることによって、効率的に口腔保健行動の促進につながるのかを検討した上で作成する。介入研究では、大学生を対象に実施する予定である。なお、平成28年度までに行われた横断的研究の成果のまとめ、適宜、投稿する。健康心理学購入を予定していた唾液サンプルの検査キット入手困難となり、さらに、インターネット調査が実施できなかったため、各費目を執行ができなかった。インターネット調査による費用が当初の計画よりも安価で済んだため、各費目を執行ができなかった。他の検査キットの購入、もしくは他機関と協力して、尺度の妥当性を確保した後、インターネット調査の費用として、主に執行を予定している。平成29年度に開催される国際学会(演題登録済)に於いて、本研究の成果の一部を発表するための費用に充てたいと考えている。
柳田国男監修高等学校国語科教科書所収教材の連携的・実践的研究

本年度は、柳田国語科教科書所収教材から「紙」(幸田文)を分析、考察した。また、柳田教科書所収教材の中から「浅春随筆」(栃内吉彦)を中心に、研究分担者である高等学校教員との連携により高等学校国語教室での実践を行った。実践に取り組むに際し、事前に日程打ち合わせ、教材研究会を行い、授業後には実践検討会を行った。実践報告から、教材としての有用性、問題点を抽出し、教材価値の検討を行った。時代は経過しても現代の高校生の国語教室において価値ある教材であるという共通認識を持った。研究組織全体で集まり、事務打ち合わせ、教材研究、実践研究等の交流を通し、個々が本研究の意義、重要性を共有できたことは、今後、研究を推進する基盤となるものである。加えて、柳田国男の著作からアイヌ文化に関わる記述に着目し、多文化共生社会の構築の視座から、研究チーム全体で学習会を行い、専門的知識の共有を図った。柳田がどのような意図を持って、教材選択に至ったのかを精査すべきであり、そのためには柳田の思想そのものを理解し、そこと関連づけながら考察する必要がある。多文化共生社会の視座を据えることにより、柳田国語科教科書所収教材の現代的意義を提示する前提となるものである。研究チーム全体で共有を図ることができたのは大きな成果である。今年度の研究成果は、学術雑誌に投稿し、計3本の論文が掲載されるに至った。また、高大連携により取り組んだ「浅春随筆」の実践研究報告についても学術雑誌に掲載された。学術雑誌に投稿し、計3本の論文が掲載されるに至った。「紙」については研究の見通しをつけることができた。柳田国男の著作から多文化共生社会の構築に関わる部分ついて、研究チーム全体で学習会を行い、専門的知識を共有した。高大連携により取り組んだ「浅春随筆」の実践研究報告についても研究成果報告に掲載された。柳田教科書所収教材である「紙」(幸田文)を分析、考察を継続する。昭和30年代の授業記録である増淵恒吉の「大蛇・小蛇」(片山広子)の実践について検討を加える。「地図をいろどる」(鏑木清方)を取り上げ、現代の高等学校国語教室において実践研究に取り組む。その有用性と問題点を抽出し、教材価値を検討する。加えて「大蛇・小蛇」(片山広子)の実践についても再度精査する予定である。資料調査、学会発表、研究協力者との協議に際し、旅費を使用する。また、事務作業、資料の整備等に謝金を使用する。平成30年度は、事務補助の適任者が不在であり、謝金が発生しなかった。
プレニル化インドールアルカロイドの生合成経路と生合成マシナリーの解明

私たちは、2種のAspergillus属真菌(能登半島のイガイから採集した海洋由来真菌とハワイのキノコから採集した真菌)から、Diels-Alderaseにより生合成されたと推定されるインドールアルカロイドの鏡像異性体を3組単離し、生合成機構に関する研究を行っている。2種の真菌には、異なるエナンチオ選択性を有するDiels-Alderaseが存在すると推定している。平成24年度に明らかになったことは以下の通りである。2.ハワイのキノコから単離された真菌にnotoamide Sを取込ませた所、Diels-Alder反応により生合成されたと考えられるビシクロ環を有する代謝物が得られたが、海洋由来の真菌に対して同様の取り込み実験を3回行ってもビシクロ環を有する代謝物は得られなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。私たちは、2種のAspergills属真菌からDiels-Alderaseにより生合成されたと推定されるインドールアルカロイドの鏡像異性体を3組単離し生合成機構に関する研究を行っている。2種の真菌には異なるエナンチオ選択性を有するDiels-Alderaseが存在すると推定されるが、これまでに天然資源からDiels-Alderaseの存在が確認されている例は3種類のみで、それらの酵素は2段階の反応、すなわち、初めにDiels-Alder反応の基質を提供するような全く別の反応を触媒し、次にDiels-Alder反応を触媒するという非常に巧妙な触媒機構を有している。本研究の遂行により、研究対象としている2種の真菌から第4、第5のDiels-Alderaseが発見され、精緻な構造と巧妙な機能が解明されると期待している。平成23年度に明らかになったことは以下の通りである。1.2種の真菌を用いてstephacidin Aを取込ませた所、両方の真菌からnotoamide Bが得られた。この結果は、2種の真菌においてエナンチオ選択的なpinacol-type転移が起きたことを示唆している。3.ハワイのキノコから単離された真菌にnotoamide Eを取込ませた所、notoamides CとDが得られた。4.最近、立体化学の異なる非天然物を取込ませた所、これまでに得られた化合物とは異なった骨格を有する化合物が得られた。この結果は、非天然物の存在により、これまで休眠していた遺伝子が発現して新たな反応を触媒するようになったことを示唆している。今後、この反応の発現機構も明らかにしたい。上記「9.研究実績の概要」に記載した項目のうち13は計画どおりであるが、4に記載したことは新たな研究課題の発見といえる。そこで、達成度として(1)を選んだ。取込み実験の結果から推定される生合成経路を検証するため、新たな実験を計画し実行する。また、「9.研究実績の概要」に記載した4について、その発現機構を明らかにしたい。
診断期から緩和ケアに基づく放射化学療法中の頭頸部がん患者の口腔粘膜炎への看護介入

頭頸部がんにおいて化学放射線療法(chemoradiotherapy: CRT)は主要な治療である。しかし、CRTによる口腔粘膜炎は、照射量が増加すると共に重症化し疼痛を伴い、患者のQOLを低下させる。さらに、治療中断による局所制御率の低下を招く。そのため、口腔粘膜炎の重症化を予防し、疼痛を緩和するケアが必要とされている。そこで、本研究は、早期から苦痛緩和を行うという緩和ケアの理念に基づいた、CRTに伴う口腔粘膜炎の疼痛に対する看護の在り方について検討することを目的とした。患者、医療者に対する実態調査を経てモデルの構成要素を抽出し、CRTに伴う口腔粘膜炎の苦痛を緩和するケアモデルを作成した。【目的】本年度は、化学放射線治療を受ける頭頸部がん患者を対象に、口腔粘膜炎に伴う疼痛の経時的変化と疼痛管理の実態について明らかにした。【方法】化学放射線療法(DOC+CDDP)を受ける頭頸部がん患者を対象に、放射線治療開始前から照射総線量が10±2Gy増す時点に計78回自記式アンケート調査とショートインタビューを行い事例ごとに分析した。調査内容として、疼痛は010Numerical Rating Scale(NRS)、口腔粘膜炎はCTCAE v4.0、Oral Assessment Guide(OAG)により評価した。また、口腔乾燥、オピオイド使用量、口腔ケアの状況を調査した。調査は、所属機関の倫理委員会の承認を得て実施した。【結果】対象者は男性5名、年齢中央値62歳(5966歳)であった。照射総線量は66Gyであった。口腔粘膜炎の疼痛に対しては、全員がオピオイドを使用していた(60135mg/日)。疼痛の変化では、事例A、B(Oropharyngeal cancer)は6週目で10点に上昇した。嚥下・会話・欠伸などで苦痛を感じており、口腔粘膜炎はGrade3になった。事例C(Hypopharyngeal cancer)の疼痛は、4週目で8点になったが、絶食とオピオイド使用で低下した。7週目の口腔粘膜炎はGrade2であった。事例D、E(Laryngeal cancer)は、6点以下の疼痛で経過し、口腔粘膜炎はGrade2であった。対象者は看護師や歯科医師による口腔ケアの指導やフィードバックを受け、5名中4名が含漱を1日5回以上継続し、46週目で口腔粘膜炎の潰瘍化はなかった。【考察】化学放射線療法によって生じる口腔粘膜炎の疼痛の変化は、Oropharyngeal cancerにおいて56週目で高かった。Oropharyngeal cancerでは、口腔の照射線量が多く炎症が増強するため、咀嚼・嚥下・構音時の苦痛が大きいと考えられた。そのため患者の治療計画作成時点から苦痛を予測して口腔ケアを支援する必要がある。また、口腔ケアの継続には医療者のフィードバックが重要であることが示唆された。本年度は粘膜炎の予防や疼痛への介入状況の実態や積極的な疼痛緩和が実施されていない背景を明らかにするための調査を行った。1.医師・看護を対象にした調査:【目的】頭頚部がん患者の化学放射線療法に伴う口腔粘膜炎に対する医師・看護師の鎮痛剤の使用並びに早期からの疼痛緩和を阻害している要因を明らかにすること。【方法】対象者は、化学放射療法を行う頭頸部がん患者の診療やケアを実施している医師や看護師のうち、研究協力の同意が得られた者。半構造化面接を実施、録音後逐語録を作成して内容分析を行なった。【結果】3施設から医師9名(頭頸部医師5名、放射線治療医師4名)、看護師7名の調査を終えた。疼痛緩和を阻害している要因としては、頭頸部がん患者のキャラクター、麻薬に対する恐れ、防ぎようがない強い症状、看護ケアの責任の自覚不足があった。2.患者を対象にした追加調査:【目的】口腔粘膜炎の予防や鎮痛剤の使用並びに早期からの疼痛緩和を阻害している要因を明らかにすること【方法】20歳以上の頭頸部がん患者で、照射野に口腔・咽頭、大唾液腺が含まれている対象に、疼痛の出現時と治療終了後の2回面接を実施した。面接内容は録音し、逐語録を作成したのち内容分析した。【結果】5名の対象者に対して、それぞれ2回の面接調査を終了した。1回目の面接では、治療開始時、オピオイドに対する抵抗、痛みは我慢したいという思いが要因として抽出された。2回めの面接では、自ら見つけ出した効果的な口腔ケアを行うための工夫が語られ、その効果を実感して自分の意思でセルフケアを継続したことが語られた。しかし、方法は自らあみ出したもので、妥当性が判断できず試行錯誤であったことが語られ、具体的な方法の指導に関する医療者の説明不足が要因として挙がった。本年度は、26年度の研究結果をもとに口腔粘膜炎疼痛緩和ケアモデルを作成し、その内容妥当性を検討した。口腔粘膜炎疼痛緩和ケアモデルは患者と看護師が治療開始時より信頼関係を築き、共通の目標を設定することから始まる。患者は治療により出現する症状のマネジメントへの動機付けを行い、看護師はどのような看護支援が出来るのかを具体的に説明し、治療期間中の支援を保証する。治療による症状の出現の時期には患者の症状の評価基準を共に設定することがKeyになる。その上で患者の症状の表現能力や薬剤の評価能力の向上を目指す。

この時期の看護援助では、患者の症状体験への関心を向けること、患者の気がかりを捉えること、患者のモチベーションをあげるために必要な声かけをしていく。さらに、患者はストレスへの対処法を獲得することが必要となり、看護師は患者のストレスの内容を把握し、対処法について話し合う。症状に対する患者のセルフケア支援では、治療前から知識や方法を伝えていても、実際にどのように行なうかの判断は患者自身に任されていたことから、患者の理解度に合わせた具体的指導とそのタイミングでの技術の習得状況の確認、不足部分の代償を行なうというものである。口腔粘膜炎疼痛緩和ケアモデル作成の過程において、患者が体験しているストレスについての現状も明らかとなり、身体症状の緩和と同時に行なっていくことが重要であることが示唆された。頭頸部がんにおいて化学放射線療法(chemoradiotherapy: CRT)は主要な治療である。しかし、CRTによる口腔粘膜炎は、照射量が増加すると共に重症化し疼痛を伴い、患者のQOLを低下させる。さらに、治療中断による局所制御率の低下を招く。そのため、口腔粘膜炎の重症化を予防し、疼痛を緩和するケアが必要とされている。そこで、本研究は、早期から苦痛緩和を行うという緩和ケアの理念に基づいた、CRTに伴う口腔粘膜炎の疼痛に対する看護の在り方について検討することを目的とした。患者、医療者に対する実態調査を経てモデルの構成要素を抽出し、CRTに伴う口腔粘膜炎の苦痛を緩和するケアモデルを作成した。平成26年度に計画していた化学放射線治療をうける頭頸がんの治療とケアに関わる医師・看護師への調査は予定通り終了した。しかし、口腔粘膜炎疼痛緩和ケアパッケージの作成には至らなかったため、当初の計画よりやや遅れている。がん看護当初の計画では、最終年度となる平成27年度は、口腔粘膜炎疼痛緩和ケアパッージの臨床適応を行い、効果を検討することであった。26年度に完成予定であった、口腔粘膜炎疼痛緩和ケアパッージの作成が遅れていることから、早期にケアパッケージを作成し内容妥当性の確認を行なう。専門看護師の協力を得て行うケアパッケージの内容妥当性の確認では、放射線治療看護認定看護師の協力も得て、早期に内容妥当性の確認ができるようにする。その上で、口腔粘膜炎疼痛緩和ケアパッージの臨床適応を行う。臨床適応にあたっては、放射線療法単独で外来治療をしている頭頸部がん患者も対象とすることで、対象者を広げて効果の確認を行なう。初年度の計画である、化学放射線療法をうける患者の口腔粘膜炎に伴う疼痛の経時的変化ついて、事例から明らかにすることができた。26年度に実施予定であった、口腔粘膜炎疼痛緩和のケアパッケージの作成と内容妥当性の検討が遅れていたために、経費の余剰が生じた。平成26年度は、当初の計画どおり、放射化学療法を受ける頭頸部がん患者に関わる医師・看護師の実態調査と患者を対象にした調査を行なう。研究連携者と協力して、複数の施設で調査を行なう予定である。実態調査1患者側の積極的な鎮痛剤の使用並びに早期からの疼痛緩和を阻害している要因の明確化実態調査2医師と看護師の積極的な鎮痛剤の使用並びに早期からの疼痛緩和を阻害している要因の明確化
電子デバイス配線接合用超微細熱圧着機構とそのモデル化

マイクロエレクトロニクス分野の実装工程に使用される細線ワイヤ及び角型リ-ドの接合過程とその機構を研究し,モデル化し、数値計算によりプロセス解析を実行した.超音波を印可しない熱圧着過程時のワイヤ及びリ-ドの変形過程をFEM(有限要素法)モデルに基づきコンピュータシミュレーションを実行した.その結果,ワイヤとリ-ドフレーム(またはパッド)間の界面密着成長過程を解析できた.パッドが堅く密着部が滑らないと,ワイヤの側面部がよく変形しリ-ドフレーム(パッド)にのびながら重なる(フォードルする)ように密着し,周囲部接合が生じる.他方,パッドが柔らかいか,パッド/ワイヤ界面で相対滑りが生じると接合部の中央部分で,界面伸びが著しくなるが,周囲部ではそれほど大きな界面伸びが生じない.一般には,周囲部接合が生じるので,密着界面は固着されている場合が多きことが理解され,そのような場合,接合部中央では強固な金属結合ができない.十分な周囲部接合を達成するには,0.5以上のワイヤ圧縮比が必要であることが数値モデルから予測されたが,この予測は,接合実験によって,確認された.ワイヤ/パッド間の接合界面面積(の増加)は,ワイヤの圧縮率によって制御されてているので,圧縮比がいっていなら,ボンディングツールに溝を付けて,ワイヤを拘束する方が,平坦なボンディングツールを使用するより接合面積を大きくすることができる.ワイヤボンディングに関しては以上の様な知見を得た.さらに,今後,接合部位の微細化が生じる事を考え,接合機構の立場から,微細化(サイズ)限界についても定量的に検討した.角形リ-ドボンディングに関しては,パッド厚さ,パッドの材料特性の界面密着過程に及ぼす効果を検討した.特に,パッド厚の効果は大きく,パッド/ワイヤ及びパッド/下地(シリコン基板)の界面応力分布さえも大きく変えてしまうことがわかった.これらは,実験データにより確証を得ている.さらに,固相状態での常温微細接合を試みた.そのためには,超高真空状態とイオンビームにより接合表面を活性化することが必要であるので,実験装置を試作し,これを元に実験を行った.常温なので,金ワイヤの弾性変形が生じ,接合強度を低下するが,この弾性力の緩和過程のモデル化も試み,興味ある結果をえた.マイクロエレクトロニクス分野の実装工程に使用される細線ワイヤ及び角型リ-ドの接合過程とその機構を研究し,モデル化し、数値計算によりプロセス解析を実行した.超音波を印可しない熱圧着過程時のワイヤ及びリ-ドの変形過程をFEM(有限要素法)モデルに基づきコンピュータシミュレーションを実行した.その結果,ワイヤとリ-ドフレーム(またはパッド)間の界面密着成長過程を解析できた.パッドが堅く密着部が滑らないと,ワイヤの側面部がよく変形しリ-ドフレーム(パッド)にのびながら重なる(フォードルする)ように密着し,周囲部接合が生じる.他方,パッドが柔らかいか,パッド/ワイヤ界面で相対滑りが生じると接合部の中央部分で,界面伸びが著しくなるが,周囲部ではそれほど大きな界面伸びが生じない.一般には,周囲部接合が生じるので,密着界面は固着されている場合が多きことが理解され,そのような場合,接合部中央では強固な金属結合ができない.十分な周囲部接合を達成するには,0.5以上のワイヤ圧縮比が必要であることが数値モデルから予測されたが,この予測は,接合実験によって,確認された.ワイヤ/パッド間の接合界面面積(の増加)は,ワイヤの圧縮率によって制御されてているので,圧縮比がいっていなら,ボンディングツールに溝を付けて,ワイヤを拘束する方が,平坦なボンディングツールを使用するより接合面積を大きくすることができる.ワイヤボンディングに関しては以上の様な知見を得た.さらに,今後,接合部位の微細化が生じる事を考え,接合機構の立場から,微細化(サイズ)限界についても定量的に検討した.角形リ-ドボンディングに関しては,パッド厚さ,パッドの材料特性の界面密着過程に及ぼす効果を検討した.特に,パッド厚の効果は大きく,パッド/ワイヤ及びパッド/下地(シリコン基板)の界面応力分布さえも大きく変えてしまうことがわかった.これらは,実験データにより確証を得ている.さらに,固相状態での常温微細接合を試みた.そのためには,超高真空状態とイオンビームにより接合表面を活性化することが必要であるので,実験装置を試作し,これを元に実験を行った.常温なので,金ワイヤの弾性変形が生じ,接合強度を低下するが,この弾性力の緩和過程のモデル化も試み,興味ある結果をえた.電子デバイス内の配線接続は種々の方法が採用されているが,その中でも,最も頻繁に使用されるのは,ワイヤボンディング法である.本研究では,まず,この接合法について検討した.現在の最細線である直径10μmのワイヤーのステッチボンディングの密着過程の解析を行った.相手側はリ-ドフレームとした.通常のボンディングでは,超音波を併用するが,本研究では,変形過程と密着過程の関係を基礎的に解析することを目的として,超音波の印加なしで接合を行った.また,その過程をモデル化し有限要素法を利用して,密着過程のコンピューターシミュレーション(動的解析)を行った.密着過程は接合面間の条件(固着しやすさ)によって大きく異なることが判明した.特に,一端密着した後リ-ドフレームにワイヤが固着し拘束を受けると,最初に密着した部分では,金属的結合が達成できず,周囲のみ接合する状態が生じた.これ現象は,リフトオフパターン(接合部をはがした領域の形態)を走査顕微鏡観察することにより確かめることができた.

このことを定量的に検討するため,数値実験を試みた.それによると,リ-ドフレーム表面とワイヤー表面のなす角度が45度以上のワイヤ部位がリ-ドフレームに密着する場合に,大きく界面伸びを伴うことが判明した.この45度以上のワイヤー側面をリ-ドフレームに密着させるにはワイヤの圧下率を少なくとも50%以上に確保する必要があることも明らかになった.また,本研究では,接合温度の低温化と低加圧を可能にする超高真空圧着装置を用いて,接合実験も試みた.低温・低加圧で接合すると,大変形を伴う熱圧着過程における密着過程とは大きく異なる接合現象が生じることが示唆された.昨年度は細線ワイヤーと電極パッド間の密着接合過程モデル化とその実験的検証を実施したが,今年度においても,確証実験とモデル化との照合を詳細に行った.その結果,ワイヤボンディングにおけるワイヤ周囲部接合の機構を明らかにした.すなわち,ワイヤをパッドに圧着させると,ワイヤの側面部が密着する段階で初めてワイヤ表面が大きく伸びパッドに密着する事が判明した.このとき,酸化皮膜の破砕(Fretting機構)が生じ,密着接合が生じるのである.角型(平型)のリ-ドをパッドやデバイス配線リ-ドフレームに接続させる接合では,リ-ド側面は密着しないので,ワイヤボンディングとは本質的に密着過程が異なる.そこで,微細角型リ-ドボンディングのモデル化とその密着接合過程における界面変形過程を数値シミュレーションすることにした.その結果,界面伸びと下地界面における応力状況は角型リ-ドの厚さとパッドの膜厚の寸法比によって大きく影響され,さらに膜の硬さに著しく影響されることが判明した.膜が薄くかつ硬い場合,リ-ドの両端で界面伸びが大きく,一方,パッド膜が柔らかくなると中央部で界面伸びが大きくなり,その結果,中央部で密着接合が起こり易い事がわかった.接合界面近傍及び下地界面近傍の接合中の応力分布,歪エネルギの蓄積等も解析し,下地のシリコンチップへの損傷を検討した.その結果,パッド膜が薄くかつ硬くなるとリ-ド両端部で大きな応力集中が生じチップ損傷の危険性があることを示唆することができた.また,実験との照合も行い,良好な一致が見られた.マイクロエレクトロニクス分野の実装工程に使用される細線ワイヤ及び角型リ-ドの接合過程とその機構を研究し,モデル化し,数値計算によりプロセス解析を実行した.超音波を印可しない熱圧着過程時のワイヤ及びリ-ドの変形過程をFEM(有限要素法)モデルに基づきコンピュータシミュレーションを実行した.その結果,ワイヤとリ-ドフレーム(またはパッド)間の界面密着成長過程を解析できた.パッドが堅く密着部が滑らないと,ワイヤの側面部がよく変形しリ-ドフレーム(パッド)にのびながら重なる(フォールドする)ように密着し,周囲部接合が生じる.他方,パッドが柔らかいか,パッド/ワイヤ界面で相対滑りが生じると接合部の中央部分で,界面伸びが著しくなるが,周囲部ではそれほど大きな界面伸びが生じない.一般には,周囲部接合が生じるので,密着界面は固着されている場合が多きことが理解され,そのような場合,接合部中央では強固な金属結合ができない.
ショウジョウバエに新たに出現した他種フェロモン認識機構の進化的起源

本研究は、オナジショウジョウバエ(以下オナジ)において新たに獲得された「他種(キイロショウジョウバエ、以下キイロ)のフェロモン7,11-HDを認識し、種間交雑を抑制する神経経路(以下7,11-HD求愛抑制経路)」の実態とその進化的期限を明らかにすることを目的とした。材料としては、行動解析により7,11-HD求愛抑制経路を持つことが推定されるオナジとキイロの雑種を用いた。初年度には、雑種の7,11-HD求愛抑制経路の入口となる味覚ニューロン群(以下GrXニューロン)を特定し、その行動機能がキイロと雑種で異なることを明らかにした。GrXニューロンの数や形態に明確な違いがなかったことから、この機能の違いがGrXニューロン自体の解剖学的性質に起因するとは考えにくい。そこで最終年度は、GrXニューロンの行動機能の違いは、その下流に接続するニューロンの違いによるという仮説を、特定の2つのニューロン群間の神経接続を再構成GFPで可視化するGRASP法を用いて検証した。下流に接続するニューロンとしては、GrXニューロンの出力部位付近に投射部位を持ち、求愛を抑制する効果が知られるニューロン(以下Yニューロンと呼ぶ)を候補とした。GrXニューロンとYニューロンにGRASP法を適用すると、キイロでは再構成GFPシグナルが観察されなかったのに対し、雑種では再構成GFPシグナルが観察された。この結果は、雑種のGrXニューロンは抑制性Yニューロンと接続することで求愛を抑制するのに対し、キイロのGrXニューロンはYニューロンと接続せず、これにより求愛抑制効果を持たないことを示唆している。すなわち、オナジにおける7,11-HD求愛抑制経路の新たな出現は、GrXニューロンとYニューロンとの神経接続によって成立した可能性が高い。本研究は、オナジショウジョウバエ(以下,オナジ)において「姉妹種キイロショウジョウバエ(以下,キイロ)のフェロモン7,11-HDによって求愛を抑制する経路(以下, 7,11-HD求愛抑制経路)」の実体とその進化的起源を明らかにするものである。本年度は、7,11-HD求愛抑制経路の入口となる味覚ニューロンを特定するため、遺伝学的ツールの少ないオナジ♂のモデルとしてオナジとキイロのF1雑種♂を用いた解析を行った。雑種の特定の味覚ニューロン群(以下, GrXニューロン)を神経阻害すると、キイロ♀に対する求愛抑制効果が低下したことから(石川、未発表)、このGrXニューロンが7,11-HD求愛抑制経路の入り口であることが既に示唆されていた。しかしこの先行研究で用いた系統において標識レベルが個体によってばらついていたため、本年度はまず、このGrXニューロンを安定して標識する新たな系統を探索した。その結果、GrXニューロンを安定して標識する新たな系統を得、またこれを用いたGrXニューロンの神経伝達により、キイロ♀への求愛抑制効果が低下することが確認できた。一方、キイロ♂のGrXニューロンを神経阻害しても、キイロ♀への求愛活性への影響は検出できなかった。このことから、GrXニューロンの機能はキイロ♂と雑種♂で異なり、雑種♂ではキイロ♀への求愛活性を低下させる一方、キイロ♂ではこのような機能を持たないことがわかった。この機能の違いが、ニューロンの解剖学的差異に由来する可能性を検証するため、GrXニューロンを標識し、比較した。GrXニューロンは、脚と口吻、咽頭にある細胞体から、直接あるいは胸腹部神経節を介して顎神経節に投射しており、キイロ♂と雑種♂でその形態と数に明確な違いはなかった。このことから、GrXニューロンの機能の違いは、ニューロンの形態そのものには起因しない可能性が高い。当初の計画のとおり、7,11-HD求愛抑制経路の入口となる味覚ニューロン(以下, GrXニューロン)の特定に成功した。さらにGrXニューロンを安定して標識するGal4系統を確立したことにより、この系統を用いて、GrXニューロンの下流に存在する7,11-HD求愛抑制経路の解析を進めていくことが可能になった。さらに、キイロ♂と雑種♂においてGrXニューロンの神経阻害を行い、その機能の違いを明らかにした。雑種♂のGrXニューロンがキイロ♀への求愛を抑制する一方で、キイロ♂のGrXニューロンはこのような効果を持たなかった。このことから、GrXニューロン及びその下流に存在する7,11-HD求愛抑制経路には、キイロ♂と雑種♂で何らかの違いがあると考えられる。GrXニューロンの数や形態に明確な違いがなかったことから、この違いがGrXニューロンの解剖学的性質であるとは考えにくい。今後下流に接続するニューロンの解析を進め、GrXニューロンの機能の違いをもたらす神経機構を同定し、7,11-HD求愛抑制経路の進化的起源を明らかにする。さらに、GrXニューロンの神経活動がキイロ♀への求愛抑制に十分かどうかを調べるために、光遺伝学によるGrXニューロンの強制活性化を試みた。しかし、GrXニューロン全体の強制活性化により、口吻伸展やグルーミングなどの異常行動が惹起され、求愛活性への影響を評価することができなかった。今後、活性化の条件を検討する必要がある。さらに本年度は、平成30年度に先駆けて、オナジにおける遺伝子導入の確立も試みた。

φC31システムを用いて、キイロにおいて特定のニューロンを標識するプロモーター配列をオナジに導入することで、オナジの相同なニューロンを標識することに成功した。一方、標識レベルが少し弱いことから、本研究に用いる系統を確立するためには、より良いホスト系統を探索する必要がある。本研究は、オナジショウジョウバエ(以下オナジ)において新たに獲得された「他種(キイロショウジョウバエ、以下キイロ)のフェロモン7,11-HDを認識し、種間交雑を抑制する神経経路(以下7,11-HD求愛抑制経路)」の実態とその進化的期限を明らかにすることを目的とした。材料としては、行動解析により7,11-HD求愛抑制経路を持つことが推定されるオナジとキイロの雑種を用いた。初年度には、雑種の7,11-HD求愛抑制経路の入口となる味覚ニューロン群(以下GrXニューロン)を特定し、その行動機能がキイロと雑種で異なることを明らかにした。GrXニューロンの数や形態に明確な違いがなかったことから、この機能の違いがGrXニューロン自体の解剖学的性質に起因するとは考えにくい。そこで最終年度は、GrXニューロンの行動機能の違いは、その下流に接続するニューロンの違いによるという仮説を、特定の2つのニューロン群間の神経接続を再構成GFPで可視化するGRASP法を用いて検証した。下流に接続するニューロンとしては、GrXニューロンの出力部位付近に投射部位を持ち、求愛を抑制する効果が知られるニューロン(以下Yニューロンと呼ぶ)を候補とした。GrXニューロンとYニューロンにGRASP法を適用すると、キイロでは再構成GFPシグナルが観察されなかったのに対し、雑種では再構成GFPシグナルが観察された。この結果は、雑種のGrXニューロンは抑制性Yニューロンと接続することで求愛を抑制するのに対し、キイロのGrXニューロンはYニューロンと接続せず、これにより求愛抑制効果を持たないことを示唆している。すなわち、オナジにおける7,11-HD求愛抑制経路の新たな出現は、GrXニューロンとYニューロンとの神経接続によって成立した可能性が高い。本年度明らかになったキイロ♂と雑種♂のGrXニューロンの機能の違いをもたらす神経機構を同定するため、「GrXニューロンの機能の違いは、GrXニューロンの下流に接続するニューロン(以下, GrX下流ニューロン)の違いに起因する」という作業仮説を検証する。GrX下流ニューロンは、GrXと接続を持つはずであるが、そのようなニューロンはこれまで報告されていない。そこで、1候補ニューロンの解析、2網羅的探索という2つの方法を用いて、GrXニューロンの機能をの違いに寄与するGrX下流ニューロンを同定する。1では、まずGrXニューロンの出力部位付近に投射部位を持つニューロンを、GrX下流ニューロンの候補として、GRASP法を用いてGrXニューロンとの神経接続を推定する。雑種において神経接続があったニューロンをGrX下流ニューロンとし、キイロ♂でも同様の解析を用いて、GrXニューロンとの神経接続の有無や程度に違いがあるかどうかを解析する。さらに、GrXニューロンの強制活性化と組み合わせた候補ニューロンのCa2+イメージングにより、機能的な接続に関しても比較する。2では、trans-Tango法を用いて、GrXニューロンの下流に接続するニューロンを網羅的に標識し、キイロ♂と雑種♂で比較する。標識されたGrX下流ニューロンの形態から、これらを安定的に標識するGal4系統を探索し、GRASP法やCa2+イメージングによってGrXニューロンとの接続を解析する。
微生物を活用した、環境調和型　Ｗａｓｔｅ－ｔｏ－Ｅｎｅｒｇｙ　プロセスの構築

本課題では、セルロース分解微生物と酵母、メタン生産菌叢、水素生産菌叢等(以下、燃料微生物)を併用し、セルロース系バイオマスからバイオ燃料を生産する“Waste-to -Energy"プロセスを開発することを研究目的とした。研究室保有のセルロース分解微生物および新規探索した微生物と燃料微生物の培養組組み合わせを試験した結果、セルロース分解微生物G. japonicusと醸造酵母の組み合わせで海藻多糖からエタノールが、木材腐朽菌Trametes versicolorと水素生産菌叢の組み合わせで水素が生産された。セルロース系バイオマスは地球上で最も多く発生する生物系廃棄物であるが、普及を期待できるような資源化法が見出されていない。申請者はこれまで、セルロース糖化に利用可能な微生物を本州、北海道、沖縄で探索し、セルロースのみならず、ヘミセルロースやリグニンにも分解能も併せ持つ微生物を分離した。そこで本課題では、これらの分解微生物と油脂生産酵母、炭化水素生産微細藻類、およびPHA生産細菌(以下、燃料微生物と呼称)を併用し、セルロース系バイオマスからバイオ燃料を生産する“Waste-to-Energy"プロセスを開発する。本年度は『CB糖化からバイオ燃料の生産が可能な、混合培養の微生物組み合わせ』を見つけることを目標に研究を行った。具体的には、オガクズ粉末を含む培養液をフラスコに調製し、研究室保有のセルロース分解糸状菌と燃料微生物(酵母)の各種を加えて培養することで、両者が同一フラスコ内でともに生育するか検討した。しかし実験の結果、いずれの組み合わせでもセルロース分解糸状菌が優占的に増殖し、酵母の生育は完全に抑制されている状態が観察された。糸状菌には他種微生物に対する抗菌物質を分泌するものが多く知られており、研究室保有の糸状菌も酵母に対して何らかの生育阻害物質を出していることが示唆された。そこで別種のセルロース分解菌ならば酵母と混合培養できる可能性があると期待し、これを探索した。その結果、Streptomyces属でセルラーゼおよびキシラナーゼを生産する細菌株、ならびにキシラナーゼとキチナーゼを生産する糸状菌株を分離できた。細菌株は同属の新種であり、糸状菌株は既知属種であったが酵素生産能は初めての報告例となることも判明し、学術雑誌に投稿、受理された。本年度は『CB加水分解物を栄養源とした、燃料微生物の培養法の確立』について研究した。具体的には、研究室保有のセルロース分解微生物をAvicel/Xylan混合物で培養した際に得られる培養上清液における酵素活性を検討した。その結果、Mandel培地で最も高い酵素活性が見られ、燃料生産微生物の培養に適用可能であることが期待された。他方、ミミズ等の環形動物の腸内や消化汚泥には嫌気性分解細菌が棲息することが以前から知られているが、申請者が実験対象とする糸状菌性分解菌については知られていなかったことから、新規分解株を探索したところ、前者からはCBを栄養源として生育できる菌株、後者からは消化汚泥バイオマスを栄養源として生育する菌株を得た。今後これらの菌株を用いたバイオマス加水分解物も調製し、その利用可能性についても検討していく。本年度は、CB糖化に応用が期待される、培養困難種のセルラーゼ遺伝子を探索を目標に研究を行った。具体的には、粉末セルロースやオガクズ粉末をすきこんだ土壌を2ヶ月間静置し、土壌に棲息しているセルロース分解微生物(実験室での培養可否に関わらず)の増殖を促した。次に、この馴化土壌から微生物DNAを一括抽出した。また、このための最適培養条件についても検討した。その結果、DGGE解析パターンから多様な細菌・糸状菌が含まれるDNAを抽出することに成功した。さらにセルラーゼのアミノ酸配列保存領域に基づき設計されたプライマーを用いてPCRを行ったところ、多数の増幅断片が検出され、様々な微生物に由来するセルラーゼ遺伝子がDNA試料に含まれることがわかった。

そこで本課題では、これらの分解微生物と油脂生産酵母、炭化水素生産微細藻類、およびPHA生産細菌(以下、燃料微生物と呼称)を併用し、セルロース系バイオマスからバイオ燃料を生産する“Waste-to-Energy"プロセスを開発する。本年度は、昨年に得られた土壌DNA抽出液をDGGE解析にかけ、多様なセルロース分解微生物のDNAが細菌および糸状菌ともに回収されていることを確認できた。また、その中にはこれまでセルロース分解能が報告されていない属種も存在することから、培養困難種のWaste-toEnergyプロセスへの応用可能性が期待された。さらに、土壌と微生物細胞の剥離の際に高濃度のEDTAを使うと細胞をさらに分画できることがわかった。他方、腐植が地上に較べて少ない海洋底泥よりセルロース分解微生物を探索したところ、カルボキシメチルセルロースおよびアガロースを炭素源として生育できる海洋細菌を分離することができた。16S rDNA解析およびDNA交雑実験より、この株はGilvimarinus属の未報告種(新種)である可能性が強く示唆され、さらに研究を進めているところである。最後に、昨年見出した消化汚泥分解微生物の酵素液を嫌気消化菌叢に加えて培養したところ、加えない場合と比較して水素の生産が優位に増加した。メタンの場合は、有意差は認められなかったが酵素添加によって増加の傾向はうかがえた。研究実績の概要でも述べているとおり、抽出された土壌DNAから未報告のセルロース分解微生物の遺伝子の存在を確認できた。。この成果は学術論文として1報が発表され、学会でポスター1件を発表済みである。また、海洋細菌の内容については1報が投稿・審査中、学会で1件をポスターで発表済みである。消化汚泥分解菌の内容については1報が発表され、学会で1件をポスターで発表済みである。以上から、順調に達成されていると判定した。セルロース系およびキチン系バイオマス(以下、不用バイオマス)は地球上で最も多く発生する生物系廃棄物であるが、普及を期待できるような資源化法が見出されていない。申請者はこれまで、不用バイオマスを糖化する微生物を本州、北海道、沖縄で探索し、複数の糖化酵素活性を併せ持つ微生物を分離した。そこで本課題では、これらの分解微生物と発酵微生物を併用し、不用バイオマスからバイオ燃料を生産する“Waste-to-Energy"プロセスを開発できるか検討した。今年度は特に、これまでに分離してきたセルロース分解微生物およびキチン分解微生物の酵素液を醸造酵母あるいは嫌気消化槽微生物に添加することで不用バイオマスからエタノールあるいは水素を生産できるか小ボトルスケールで発酵試験を行った。まずセルロース分解微生物G. japonicusの酵素液がどのような種類の海藻に対して糖化能を持つかを検討したところ、緑藻と紅藻に対して分解能を持っていた。そこで藻類糖化液を醸造酵母に与えて発酵させたところ、終濃度1%でエタノールが生産され、海藻の糖化を経てバイオエタノール生産ができる可能性が示された。また、キチン分解能を持つ微生物として分離した消化汚泥分解微生物6株を調べたところ、キチン分解酵素のみならずヘミセルロースおよびケラチン分解酵素の活性も検出された。これらの株の酵素液を嫌気消化
大量ナノバブルにより増強したキャビテーション効果を利用したソノポレーションの評価

平成30年度は前半で情報取集を行い、後半で動物実験を行った。平成27年度、28年度に行ったビーカー内での実験と家兎肝動脈へのナノバブルの注入、体表エコー照射実験の結果から、生体内でのキャビテーション、ソノポレーションが生じることを確認、さらにナノバブルに用いる二酸化炭素による血管塞栓が生じないことを明らかにし、安全性を確認した。この結果から、生体内でキャビテーション、ソノポレーションが生じることが明らかになり、小動物での実験は終了して、これを発展させる形でより人体の環境に近い状況でソノポレーションを生じさせることを検討することとした。豚での実験はこれまでも当研究チームでの使用経験があり、手技的な問題はなく妥当と考えられた。平成30年度前半は情報取集を行った。当初家兎の実験ではキャビテーション、ソノポレーションの確認のためにテクネシウム動注とSPECT-CTでの検出を計画していたが、当施設のSPECT-CTは小動物用のため、豚での実験では確認の方法を変更する必要があった。そのため、情報取集として、平成30年度前半で第77回日本医学放射線学会総会(平成30年4月12日から4月14日)、第47回日本IVR学会総会(平成30年5月31日から6月2日)など研究会、学会等へ参加し、最新の知見を得た。平成30年度後半で実際の動物実験を行った。豚の肝動脈からナノバブルとシスプラチンを同時に動注し、肝表面から超音波照射を行った。その後、超音波を当てた部分と、当てていない部分の肝組織を切り出し、病理的に解析した。この結果、病理的には変化がなく、生体内でより人体に近い状況でもソノポレーションが発生したことが明らかになった。平成28年1月26日、家兎1羽を用いて1体表エコーにより肝臓の描出が可能であることを確認した。また、2家兎耳介の静脈にカテーテルを留置し、血管造影剤を注入しX腺透視装置を用いて造影剤が描出されることを確認した。3家兎大腿部を切開し、大腿動脈を露出、直接穿刺により血管造影用カテーテルを家兎大腿動脈に留置可能であることを確認した。4X腺透視装置で、留置した血管造影用カテーテルが観察可能であること、この血管造影用カテーテルより注入した造影剤が観察可能であることを確認した。4X腺透視装置を用いて、血管造影の技術でカテーテルを操作し、家兎肝動脈まで到達できることを確認した。5家兎肝動脈に留置した血管造影用カテーテルよりごく少量のナノマイクロバブルを注入し、X腺透視装置により家兎肝動脈の描出が可能であることを確認した。同様に、6この血管造影用カテーテルからごく少量のナノマイクロバブルを注入し、体表エコーを用いて肝動脈内にナノマイクロバブルが描出可能であることを確認した。平成28年2月23日、上記再現性を確認する目的で家兎1羽を用いて同様の実験を行った。13の一部までの再現性は確認されたが、3で露出した大腿動脈に血管造影用カテーテルを留置できず、46の再現性を確認することが出来なかった。(家兎での実験が困難であった場合に豚を用いた実験も視野に入れていることから)この実験は、平成28度以降に実施を予定している家兎を用いた動物実験を行う上で必要な情報の収集を目的としており、他の実験動物の必要性や実験器具(血管造影用カテーテルなど)の改善の必要性も含めた実験全体の基礎となると考えられる。再現性は確認できなかったが、技術的な問題が改善されれば、家兎を用いた実験は可能であると判断できる結果を得ることが出来た。現在28年度になると想定していた家兎肝動脈内でのナノマイクロバブルの観察に成功している。ただし、当初27年度はファントム実験を用いた家兎肝動脈注入に適した基礎データ(吐出量、炭酸ガス量、バブル径、ボイド率、キャビテーションの証明)を予定していたが、実験環境の整備(特に実験用のファントムの調整)が難航したため、基礎データの収集と同時に動物実験を開始した。前年度に引き続き実験を行った。平成28年4月26日、ビーカー内でマイクロバブルを発生させ、ビーカー内外からの超音波照射を行うことで瞬時にマイクロバブルが消失することを確認した(各5回、計10回)。これにより、超音波の照射によりマイクロバブルが消失することが確認できた。平成28年7月26日、前年度の実験同様に家兎を用いた実験を継続した。1体表エコーにより肝臓の描出が可能であることを確認した。2大腿部を切開し、直視下に大腿動脈を穿刺して血管造影用カテーテルを留置、X線透視装置を用いて血管造影の技術でカテーテルから肝動脈造影を施行できることを確認した。3肝動脈に留置した血管造影用カテーテルよりごく少量のナノマイクロバブルを注入し、肝動脈の描出が可能であることを確認した。4同様に少量のナノマイクロバブルを注入し、体表エコーを用いて肝動脈内にナノマイクロバブルが描出可能であることを確認した。5さらに高周波照射を追加することで体表エコーで観察したナノバブルが瞬時に消失(4月26日のビーカー実験と同様にバブルの圧潰、はすなわちキャビテーションを生じていると推察する)することを確認した。

この時、エコー上肝臓の輝度上昇が確認された(これがソノポレーションを反映しした現象なのかは現在のところ不明である)。平成28年9月13日、上記再現性を確認する目的で家兎1羽を用いて同様の実験を行った。この際、15の再現性を確認した。また、4、5観察の際に、ナノバブルは門脈内(注入は肝動脈)にも広がっていることが推察され、より広範囲に影響しているものと考えられた。前年度の実験では技術的に再現性が確認できなかったが、本年度は技術的な改善もあり、実験の再現性が確認できた。この結果をもとに家兎での実験継続が可能であると判断し、平成29年度以降、生体内でのソノポレーションの確認を行うことを予定している。現在までに家兎肝動脈内でのナノマイクロバブルの観察に成功している。さらに超音波照射を行うことによりナノバブルが瞬時に消失することが確認できた。おそらく、バブルの圧潰を観察していると考える。バブルの圧潰はすなわちキャビテーションを生じていることになるが、ソノポレーションが生じているかは現在のところ明らかではない。当初予定していた実験回数よりも使用動物数が少ないが、上記結果を得ることができた。再現性の確認に関して、さらに実験回数を重ねる必要がある。平成29年度は情報収集中心に活動を行った。本年度は、平成27年度、平成28年度に行ったビーカー内でのマイクロバブルの発生/消失実験、家兎肝動脈での血管造影および家兎肝動脈へのナノバブルの注入、体表エコーでの家兎肝動脈内のナノバブルの消失実験をもとに、生体内でのソノポレーションの確認を計画した。この際使用するデバイスの選択や家兎内でのカテーテル操作方法など、生体実験の再現性を向上、ソノポレーション確認の方法(当初計画のテクネシウムの動注おおよびSPECT-CTでの画像作成を含めて)を検討するために、情報収集が必要と判断した。第76回日本医学放射線学会総会(平成29年4月13日から4月16日)、第46回日本IVR学会総会(平成29年5月18日から5月20日)、さらに、第63回中部IVR・第64回関西IVR合同研究会(平成30年2月17日)へ参加した。このほかにも多数の研究会、学会等へ参加し、最新の知見を得ることを中心に活動した。二酸化炭素ガスを用いた肝臓の超音波造影法など肝臓内のガスを体表から評価する手法や人体で旧来より使用されてきたリピオドール含め、抗癌剤を含侵させた球状塞栓物質の報告などの薬物デリバリーに関する情報を収集し、さらに核医学的見地から免疫複合体を用いた核種のデリバリー法など、他分野でも使用されている方法は参考となるものであった。期間中、これらの実験結果や収集した情報を分析し、いくつかの検討を行った。肝動脈への薬剤デリバリー関してもテクネシウムのほか、旧来の安全性が確立されているリピオドールエマルジョン投与の計画も作成した。このため、CO2噴出デバイスの本体および尖端形状を変更している。平成30年度はこれらを踏まえて、生体でのソノポレーションの確認を行うことを予定している。当初計画においては平成29年度には生体内でのナノバブルによるキャビテーションを発生させ、ソノポレーションを確認する初期段階の実験を終えている予定であった。前年度までの実験結果から、生体実験を継続するに当たり、使用するデバイスの選択や家兎内でのカテーテル操作方法など、生体実験の再現性を向上、ソノポレーション確認の方法(当初計画のテクネシウムの動注おおよびSPECT-CTでの画像作成を含めて)を検討するために、情報収集が必要であった。
突然変異体を用いたブラシノステロイドの生合成とその調節機構に関する研究

これまでに見出されたシロイヌナズナのブラシノステロイド(BR)矮性突然変異体は、いずれも、暗所では、胚軸の伸長抑制、光誘導性遺伝子の発現等が見られ、明所でも、矮性、雄性不稔等、極めて興味深い形質を示す。本研究では、BR関連の矮性突然変異体の解析を通して、BRの生合成やその調節機構の解明を試みた。本研究により、変異体の示す矮性をはじめとする数多くの表現形質が、実際にブラシノステロイドの欠損によるものであることを実証できただけでなく、変異体における変異部位の特定や生合成・代謝酵素に関する知見も得られ、ブラシノステロイドが植物の正常な生長や発達に必須の植物ホルモンであることを明確にすることができた。これまでに見いだされたプラシノステロイド突然変異体は、いずれも、暗所では、胚軸の伸長抑制、子葉の展開、光誘導性遺伝子の発現等が見られ、明所でも、矮性、頂芽優勢の減少、雄性不稔等、極めて興味深い形質を示す。本年度は、プラシノステロイドの生合成変異体である可能性の高いアラビドプシスの矮性変異体を用いて解析を進めた。det2については、原因遺伝子がクロー二ングされ、哺乳類のsteroid-5α-reductaseと高いホモロジーを有することが明らかにされていた。内生プラシノステロイドやステロールの定量分析および重水素標識体を用いた代謝実験の結果、det2は(24R)-24-methylcho1est-4-en-3oneから(24R)-24-methyl-5α-cholestan-3-oneへの変換段階に欠損のあるプラシノステロイドの生合成変異体であることが明らかとなった。また、dwfl/dimの原因遺伝子は既にクローニングされていたが、その機能については不明のままであった。この変異体について詳細な解析を進めた結果、24-methylenecholeStero1からcampesterolへの変換段階に欠損のあるプラシノステロイドの生合成変異体であることが判明した。さらに、dwf5とdwf7については、brassinolideやその生合成前駆体によって成長が回復することから、プラシノステロイドの生合成変異体であることが予想された。内生プラシノステロイドやステロールの定量分析の結果、いずれの変異体も内生プラシノステロイドはほとんど検出されず、24-methylenecho1eStero1やcampesterolのレベルも著しく減少していることから、変異部位は24-methylenecholesteroよりも前であることが示唆された。標識メバロン酸およびコンパクチンを用いた代謝実験の結果から、dwf5とdwf7は、それぞれΔ^7-stero1-C7-reduction、Δ^7-sterol-C5-desaturationの過程に欠損のあるプラシノステロイドの生合成変異体であることが明らかとなった。これまでに見い出されたブラシノステロイド(BR)突然変異体は、いずれも、暗所では、胚軸の伸長抑制、子葉の展開、光誘導性遺伝子の発現等が見られ、明所でも、矮性、頂芽優勢の減少、雄性不稔等、極めて興味深い形質を示す。本年度は、BR突然変異体bas1とbri1との解析を進めた。シロイヌナズナのbas1は、アクティベーションタギングにより見い出された矮性変異体であり、P450の過剰発現により、det2のようなBR生合成変異体とよく似た表現型を示す。BAS1がBRの生合成あるいは代謝に関与しているか否か明らかにするために、内生BRsの定量分析を行った。その結果、bas1では、brassinolide(BL)、castasterone(CS)、6-deoxocastasteroneのレベルが著しく減少しており、BAS1はBRレベルの制御に関与している可能性が示唆された。また、無菌培養したシロイヌナズナの実生を用いてBLの代謝実験を行ったところ、BLは26-hydroxybrassinolide(26-OHBL)に代謝されることが明らかになるとともに、bas1ではcontrolに比べ、この変換が促進されていることを見い出した。さらに、イネのラミナジョイントテストやシロイヌナズナのBR生合成欠損変異体を用いた回復実験から、26-OHBLの生理活性はBLに比べ著しく弱いことが判明した。以上の結果から、BAS1はBLの水酸化に関与していること、ならびに、bas1では、活性型のBLが水酸化されて不活性化されることにより矮性形質を示すことが示唆された。生合成欠損の変異体と同様に矮性を示すが、BRの投与によってその表現型の回復がみられないBR非感受性の突然変異体であるbri1について、内生BRの検討を行った。Bri1は野生型で検出されたすべてのBRsが検出され、bri1では6-oxo系列のBRsを顕著に蓄積していることが明らかになった。

とりわけ、BLやCSでは、野生型の数十倍蓄積しており、BRI1はBR生合成のfeedback制御に関わっていることが示唆された。前年度に引き続きブラシノステロイド関連の矮性突然変異体の解析を進めた。生合成中間体を用いた回復実験、内生ブラシノステロイドの定量分析、原因遺伝子の解析結果等から、dwf4は側鎖22位の水酸化がブロックされているブラシノステロイド生合成欠損変異体であることが明らかとなった。また、fackelは、内生ブラシノステロイドやステロールの定量分析、原因遺伝子の解析結果等から、Δ^<14(15)>の還元過程に変異のあるブラシノステロイド生合成欠損変異体であることが判明した。fackelはこれまで明らかにしてきたブラシノステロイド生合成欠損変異体の中では、変異部位が生合成経路上、最も上流に位置している。この変異体は通常の植物体内には存在しない8,14-diene-sterolを異常に蓄積しているだけでなく、他のブラシノステロイド生合成欠損変異体では観察されない胚形成過程の異常が認められた。さらに、非常に興味深いことには、これまでに明らかにしたブラシノステロイド生合成欠損変異体はブラシノステロイドの投与により、野生株の表現型に回復するのに対して、fackelはブラシノステロイドの投与では回復しなかった。従って、8,14-diene-sterolが正常な生長に阻害的な機能を果たしている可能性や既知のブラシノステロイド以外のステロールがホルモン様の役割を果たしている可能性が想定され、従来考えられてきた膜の構成成分としての役割よりもはるかに重要な役割をステロールが果たしている可能性が、この変異体の解析から示唆された。