hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗酸菌感染で誘導される免疫抑制マクロファージの標的T細胞への抑制シグナル伝達機構

具体的には、GST-hARあるいは6xHis-hARといった組換え融合蛋白をbait proteinとして、Jurkat細胞の細胞抽出液とインキュベーション後に共沈する蛋白質をプルダウンアッセイにより検討したところ,いずれのbait protein(GST-hAR,6xHis-hAR)にも,共沈する蛋白質が認められなかった.今回の成績は,bait proteinとして用いた融合蛋白質がいずれも,大腸菌菌体内で発現したものであること,一方,45kDa, 48kDaおよび55kDa蛋白は,バキュロウイルス発現系で作成された組換えヒトAR蛋白をbait proteinとして供試した場合にのみ検出されたことから,ヒトAR蛋白と共沈する蛋白を検出するためには,AR蛋白が適切な翻訳後修飾を受けていることが重要であると考えられた.今後は,酵母を利用したTwo-hybrid systemなどを利用することで,ARと相互作用する可能性があると考えられる45kDa, 48kDaおよび55kDa蛋白の同定を進める予定である.免疫抑制性マクロファージ(suppressor MΦ:S-MΦ)は,Th17細胞からのIL-17産生を増強するとともに,Th1細胞からのインターフェロンγ産生を強力に抑制することが明らかとなったことから,抗酸菌感染宿主に誘導されるS-MΦの役割についての新しい知見を得ることができた.これにより研究はおおむね順調に進展しているものと評価した.24年度が最終年度であるため、記入しない。チロシンリン酸化ARと相互作用する蛋白質の同定は本研究における重要課題の1つであることから,リン酸化蛋白質を効率的に検出できる蛋白質染色試薬を新たに使用することにより実験系を改良し研究を推進する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
マルチビーム型RFQリニアックによる大強度イオンビームの加速制御に関する研究

本年度は,平成18年度に製作したマルチビーム型IH-RFQリニアックのためのレーザーイオン源開発と,ビーム加速試験を中心に研究を展開した。まず,マルチビーム型IH-RFQリニアック本体の開発については,製作したプロトタイプ機についてネットワークアナライザを使用した低電力試験や真空試験をおこない,電気的特性や真空特性が問題ないことを確認した。高周波増幅器には既存装置を利用する計画であったが,制御系システムが旧式で本研究用に対応しなかったため,新しく高周波電源用制御ユニットを整備し,高周波電力増幅器の動作確認とあわせて現地調整を実施した。マルチビーム対応レーザーイオン源の開発については,ミラー系などの詳細検討結果をもとに,ダブルビーム型を新しく設計・製作した。そして,既存のイオン源テストベンチを利用して,ビーム電流量やビーム波形など基本特性の測定をおこなった。また,ビーム出射系として通常のシングルビーム用の偏向電磁石やビームモニターは使用できないため,静電偏向分析器やマルチビーム対応のファラデーカップなどを新しく製作した。レーザープラズマ直接入射法を利用する本研究では,イオン源と加速空洞が直結されるので,ビーム入射系に関しては不要である。そじて,レーザーイオン源,プロトタイプ機およびビーム分析系を組み合わせてビーム加速実験システムを完成させ,現在は総合試験の実施中である。これらの研究成果については, The 9th European Conference on Accelerators in Appl ied Researchand Technology (ECAART-9)や,日本原子力学会などにおいて報告をおこなった。本研究で開発するマルチビーム型IH-RFQリニアックの原理実証システムは,直接プラズマ入射型のマルチビームレーザーイオン源,マルチビーム型IH-RFQ加速空洞,ビーム収束系,ビーム分析・測定部,高周波増幅器および真空ポンプから構成される。今年度は,これまで研究準備をおこなってきたマルチビーム型IH-RFQリニアックの詳細設計と製作を重点課題とした。また,次年度におこなうイオン源開発やビーム加速実験について準備をおこなった。マルチビーム型IH-RFQ加速空洞の開発については,運転時に使用する既存の高周波電源設備の周波数帯域や最大出力を考慮するとともに,電極の配列方法など準備研究における知見も取り入れながら,3次元CADにより基本モデルを設計した。そして,そのCADデータを3次元電磁場シミュレーションソフトウェアに直接取り込み,共振周波数,Q値,消費電力および電磁場分布を計算し,空洞各部および電極類の最適化をおこなった。また,電磁場解析,伝熱解析および構造解析を組み合わせた連成解析を実現させ,高周波発熱に対する効果的な冷却水路形状を明らかにするとともに,高周波電力を供給するための高周波結合器なども設計した。これらの結果については,International Conference on the Application of Accelerators in Research and Industry(CAARI2006)や,日本原子力学会などにおいて報告した。そして,加速電極の試作などを通じて加工精度なども含めた最終形状を決定し,原理実証のためのプロトタイプ機の製作をおこなった。次年度におこなうイオン源の開発準備としては,直接プラズマ入射法とRFQリニアックの研究に取り組んでいるBrookhaven National Laboratory(米国)を訪問し,技術打ち合わせと関連実験をおこなった。また,ビーム加速実験に向けては,加速器運転時に必要となる冷却水循環システムや高周波電源など周辺機器について整備した。
日本植民地・占領地教科書と「新教育」に関する総合的研究～学校教育と社会教育から

本研究では、植民地・占領地の教科書及びその実践における「新教育」の影響を学校教育と社会教育から抽出し、その意味を検討した。「新教育」は「児童中心主義」と「詰め込み教育批判」である一方で、「海外に雄飛して国家発展に役立つ人物を育てる」ものでもあった。1910年代40年代における台湾、朝鮮、満州、南方への「新教育」の影響に地域的、時期的差異が見られた。これらは主に学校教育で見られ、社会教育ではほとんど窺えなかった。1.玉川大学教育博物館所蔵の旧日本植民地教科書のうち、各地域・科目担当者の教科書と新教育研究に必要な教科書資料を複写して配布した。また国内では関東圏における新教育を推進した学校所蔵の新教育関係資料の収集の他、新教育に関わった宗教団体での資料収集を行った。さらに未収の韓国における社会教育関連教科書や中国における教科書、教育会雑誌等の調査及び台湾における植民地期の学校教育を受けた世代への聞き取り調査及び資料の収集を行い、基本的な資料の収集を進めた。2.研究会を以下の日程で開催した。第1回全体研究会:平成22年6月19日(土)13:3017:00、20日(日)9:0012:00こども教育宝仙大学第2回全体研究会:平成22年10月30日(土)13:3018:00こども教育宝仙大学第1回グループ別研究会:平成22年10月31日(日)9:0012:00北海道大学東京オフィス第2回グループ別研究会:平成23年6月19日(日)9:0012:00こども教育宝仙大学3.全体研究会では、先行研究の成果と課題等を踏まえて、本研究の意義と今後の進め方を確認するとともに、今年度は植民地教科書と新教育に関わる膨大な資料を整理し、学校教育と社会教育から見る視点を明確にすることとした。これらの成果を踏まえた分析作業は次年度以降の課題である。グループ別研究会では、進捗状況とグループとしての課題の確認と方法上の問題について意見交換を行った。4.シンポジウムの開催:平成23年6月18日(土)13:3017:00こども教育宝仙大学テーマは、「1920年代の台湾、朝鮮、満州の教育会雑誌に見られる新教育の影響」で、今後の資料分析の視点の試行作業として実施した。これを参考に各自の課題に接近することとした。1.昨年度収集した玉川大学教育博物館所蔵の旧日本植民地教科書と新教育研究に必要な教科書の複写資科および国内外で収集した「新教育」関係資料の整理と分析を主たる活動して行った。第1回全体研究会:平成23年6月18日(土)13:3017:00こども教育宝仙大学(後述)第1回グループ別研究会:平成23年6月19日(日)9:0015:00こども教育宝仙大学第2回全体研究会:平成23年10月15日(土)13:3017:00大東文化大学第2回グループ別研究会:平成23年10月16日(日)10;0013:00北海道大学東京オフィス第3回全体研究会:平成24年3月17日(土)14:3018:00相模女子大学第3回グループ別研究会:平成24年3月18日9:0015:00相模女子大学3.全体研究会では、6月と3月にシンポジウムを実施し、1920年代と1930年代の植民地における「新教育」の実情に対する共通理解を図った。10月には全体的な研究状況を把握するために、学校教育と社会教育からそれぞれの研究成果を報告し、質疑討論を行った。グループ別研究会では、進捗状況とグループとしての課題の確認と成果をどのような視点でまとめていくかについて意見交換を行った。今年度は植民地教科書と新教育に関わる資料の整理と分析を行い、論文執筆構想を3月までに確定し、次年度には報告集としてまとめる予定である。4.シンポジウムは2回開催した。まず前年度3月実施予定のシンポジウムを平成23年6月18日(土)に実施した。テーマは、植民地と「新教育」1920年代を中心にであった。ここでは20年代の台湾、朝鮮、満州の地域的差異が明らかになった。2回目は、今年度のまとめとして平成24年3月17日(土)に実施した。前回と同様のテーマで1930年代を中心にするものであった。30年代でも引き続き「新教育」が展開し、その影響が様々な分野に見られることが示された。これらを踏まえて各自の課題に接近し、論文執筆をすすめることとした。今年度は、2年間で収集した旧日本植民地教科書または教科書の複写資料及び「新教育」関係資料に基づいて論文を執筆し、最終成果報告書を作成した。研究会・編集会議を以下の日程で開催した。

第1回全体研究会は平成24年6月23日(土)13:3017:00こども教育宝仙大学で、第2回全体研究会は平成24年6月24日(日)9:0015:00神戸大学東京六甲クラブで、第3回全体研究会は平成24年10月13日(土)13:3017:00こども教育宝仙大学で、第4回全体研究会は平成24年10月14日(日)10:0013:00こども教育宝仙大学で、第5回全体研究会は平成25年3月16日(土)14:3018:00中京大学で、第6回全体研究会:平成25年3月17日(日)9:0015:00中京大学で、編集会議は平成24年12月27日(木)10:0013:00北海道大学東京オフィスで。他メールで数回。全体研究会では、6月までは各自の論文の進捗状況、論文構想の報告を主として行い、10月以降は成果報告会として行った。12月に成果報告書の目次構成を確定し、翌年2月上旬上梓し、3月中旬に発行した。本研究のねらいは、教科書及びその実践における「新教育」の影響を抽出し、その意味を検討することであったが、「新教育」が「児童中心主義」と「詰め込み教育批判」という特性をもつとともに、その目的が「海外に雄飛して日本の国家の発展に役立つような人物を育てる」ことにあり、またそれらが植民地という現実の中でいかに「緊張と適合」がなされたのかという複雑な関係があり、その解明をかなり困難なものとした。成果としては、20年代30年代における台湾、朝鮮、満州への「新教育」の影響に地域的差異があることが明らかになったことである。しかし、その「異同性」の意味については充分に深めることは出来なかった。今後の課題である。年3回の研究会で進捗状況を確認しており、一部遅れている者もいるが、ほぼ順調に進んでいると理解している。24年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り、今年度も研究会を3回実施し、報告会を重ねて、最終報告書を作成する予定である。
食道正常上皮細胞・食道上皮幹細胞を軸に展開する食道発癌と分化誘導療法の基礎的研究

食道幹細胞と食道癌幹細胞1)ヒト正常食道上皮の長期培養系とp75を標識とした食道幹細胞候補集団の分離培養法を確立し、食道上皮幹細胞であることの不等分裂を証明した(Oncogene 2003)。2)Dysplasiaから早期癌への経過の観察からp75陽性細胞またはp75陽性細胞から1段階分化した細胞から癌化することが明らかとなった。3)進行癌においてもp75陽性細胞は一定頻度で存在し、癌幹細胞としての可能性の検討を開始した。4)p75陽性細胞の予後はp75陰性細胞に比し良好であり、その原因としてリンパ節転移が少ないことが上げられた。5)しかしながら、癌細胞株ではp75陽性細胞は増殖が早く大きなコロニーを形成した。6)p75に対するSiRNAの投与で食道癌細胞株の増殖が著明に抑制された。正常食道上皮における発癌メカニズム1)胆汁酸、膵液成分trypsin,胃酸による食道上皮障害の検討では、時間と用量依存性の変化であることが判明した。3者混合時に最もPGE2産生が高度であり、その機構としてアラキドン酸の産生亢進が関与していることが明らかとなった。(life Science 2004)。2)正常食道上皮細胞に対するニコチンの接触で、癌抑制遺伝子FHITのメチル化と蛋白発現減弱が起こり、ニコチンを排除すると、このメチル化が元に復帰し、蛋白発現も元に復することが判明した。この反応にはメチル化酵素であるDNMT1とDNMT3aが関与していた。長期ニコチン接触ではニコチン接触を中止してから遺伝子のタンパク発現復帰までより多くの時間を要した。3)したがって食道癌発癌防止には出来るだけ早期禁煙が不可欠と考えられた。4)この反応は短期ではメチル化される遺伝子として知られているp16をメチル化しなかった。このことはFHITがp16に比し、ニコチンに感受性が高いことが示唆された。1)ヒト正常食道上皮の長期培養系とp75を標識とした食道幹細胞候補集団の分離培養法を確立し、食道上皮幹細胞であることの不等分裂の証明をほぼ終了した。2)経時的正常食道上皮培養による染色体変化を検討し、検討した5株中3株は染色体に異常がないことを確認した。他の2株は2倍体や転座が認められ食道癌に付随する食道正常部おいてすでに変化が生じていることが判明した。メチレーションの確認はメチレーション特異的PCRの検出法に問題があり改良中である3)正常食道上皮へのキメラオリゴによるE-Cadherinの変異導入は困難であり、SiRNAによる遺伝子ノックダウン法に変更し、現在遺伝子導入ベクターの作成を行っている。4)骨髄移植モデルは骨髄細胞の食道上皮への集積は認められず、また損傷時の集積も確認できなかった。現在NMBA発癌モデルにより骨髄細胞の関与を検討中である。5)PPARγRXRのヘテロダイマーに対する分子標的治療により食道癌の増殖抑制が得られ、食道癌治療に有効である可能性が示唆された。6)胆汁酸、膵液成分trypsin,胃酸による食道上皮障害の検討では、時間と用量依存性の変化であることが判明した。正常食道

上皮細胞と癌細胞に明らかな差を認め、正常上皮ではCox1優位であるが、癌細胞ではCox2が恒常的に産生されていることが判明した。現在アラキドン酸の産生機構について解明中である。PGEsについてはcPGEsに強い活性を認め、PGH2よりPGE2への変換にはcPGEsが関与していることが示唆された。1)ヒト正常食道上皮の長期培養系とp75を標識とした食道幹細胞侯補集団の分離培養法を確立し、食道上皮幹細胞であることの不等分裂を証明した(Oncogene 2003)。2)Dysplasiaから早期癌への経過の観察からp75陽性細胞またはp75陽性細胞から1段階分化した細胞から癌化することが明らかとなった。(投稿中)3)進行癌においてもp75陽性細胞は一定頻度で存在し、癌幹細胞としての可能性の検討を開始した。4)正常食道上皮へのSiRNAによる遺伝子ノックダウン法は遺伝子導入ベクターと組み合わせて恒常的に遺伝子をノックダウンする手技を確立した。今後、種々の遺伝子のノックダウンの予定である。5)骨髄移植モデルとNMBA発癌モデルは休止中である。6)胆汁酸、膵液成分trypsin,胃酸による食道上皮障害の検討では、時間と用量依存性の変化であることが判明した。3者混合時に最もPGE2産生が高度であり、その機構としてアラキドン酸の産生亢進が関与していることが明らかとなった。(life science in press)。7)正常食道上皮細胞に対するニコチンの接触で、ある癌抑制遺伝子のメチル化が生じることが判明し、ニコチンを排除すると、このメチル化が基に復帰することが判明した。これはメチル化特異的PCRと蛋白発現で確認された。長期接触では非可逆的であることが示唆されており、このことは喫煙による発癌機構の解明に繋がるものと考えられた。BSEによる正常細胞培養液の入手不足が生じることが予測され、新たな長期培養技術の確立にも取り組みを開始している。(678文字)食道幹細胞と食道癌幹細胞1.Dysplasiaから早期癌への経過の観察からp75陽性細胞またはp75陽性細胞から1段階分化した細胞から癌化することが明らかとなった。(投稿中)2.進行癌においてもp75陽性細胞は種々の割合で癌に混在した。3.p75陽性細胞の予後はp75陰性細胞に比し良好であり、その原因としてリンパ節転移が少ないことが上げられた。4.しかしながら、癌細胞株ではp75陽性細胞は増殖が早く大きなコロニーを形成した。5.p75に対するSiRNAの投与で食道癌細胞株の増殖が著明に抑制された。6.Dil labelretaining cellは必ずしもp75陽性細胞に一致しなかった。ニコチンと癌抑制遺伝子1.正常食道上皮細胞に対するニコチンの接触で、癌抑制遺伝子FHITのメチル化と蛋白発現減弱が起こり、ニコチンを排除すると、このメチル化が元に復帰し、蛋白発現も元に復することが判明した。2.この反応にはメチル化酵素であるDNMT1とDNMT3aが関与していた。長期ニコチン接触ではニコチン接触を中止してから遺伝子のタンパク発現復帰までより多くの時間を要した。3.したがって食道癌発癌防止には出来るだけ早期禁煙が不可欠と考えられた。4.この反応は短期ではメチル化される遺伝子として知られているp16をメチル化しなかった。
ヒトレトロウイルスの病原性の解析と治療に関する研究

ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)感染症モデル動物を用いて以下の結果を得た。1、HAM発症ラットモデルHTLV-1持続感染ラットはHAM/TSP類似脊髄症を発症する。この動物の脊髄ミクログリア/マクロファージ系細胞にはHTLV-1が感染していた。この動物発症約6か月前にオリゴデンドロサイトのアポトーシスによる脱髄が始まる。この時期に一致してpX遺伝子、THF-αの高発現とbcl-2の一過性の発現抑制を見た。LTR-env-pXトランスジェニックラットモデルは多彩な膠原病を発症する。この動物の末梢T細胞は種々の刺激に対し高反応性で、その表面には発症前に既にCD80/86やICAM-1など活性化の指標となる分子が発現していた。炎症局所の浸潤T細胞についてTCRVβmRNAのRT-PCR-SSCPで検索しオリゴクローナルであったが、異なる個体では必ずしも共通してはいなかった。env-pXトランスジェニックラットと正常ラット間での骨髄や脾細胞移入実験では、疾患によりリンパ球、標的組織あるいは胸腺などリンパ球の成熟に関わる組織のいずれの組織での導入pXの発現が重要かは異なり、少なくとも3通り発症機構が関与した異なる疾患が存在することが示唆された。以上、本研究ではモデル動物の開発とHTLV-1病原性の機序解明に一定の進展を見た。本研究では我々が開発したHTLV-I感染症モデル動物(HAMラット、HTLV-Iトランスジェニックラット)を用いてその治療法を確立することを最終目的としている。あおのためにはその病態を正しく理解することが必要で本年度はそれを主に行い以下の成績を得た。1)HAMラット病変脊髄のHTLV-Iの感染細胞の同定をin situ hybridazation法で行いミクログリオア/マクロファージ系細胞であることが証明された。経時的にはPCR法によりMT2投与後約3ヶ月頃より脊髄でのHTLV-I感染が証明された。競合的RT-PCRによるpXの発現は乏突起細胞のアポートシスが出現するMT2投与後約7ヶ月から急激に発現し1518ヶ月へかけてその発現量は徐々に低下した。また、TNF-αの発現も約7ヶ月から観察され、徐々に増加し11ヶ月移行比較的高いレベルで経過した。一方、アポトーシス抑制分子であるbcl-2発現は7-12ヶ月にかけ強く抑制されていた。T細胞表面分子の解析により本ラットでは疾患発症以前からCD80/86やICAM-1などのco-stimulatory分子を発現した末梢T細胞が多く、導入遺伝子により末梢T細胞が前活性状態にある可能性が示唆された。env-pXトランスジェニックラットと正常同系ラット間での骨髄細胞移植では、唾液線炎、皮膚炎は正常ラットに移植可能であったが関節炎などほかの疾患は正常ラットに移入されなかった。一方、正常骨髄細胞で骨髄が再構築されたenv-pXラットでは唾液線炎、皮膚炎は完全に抑制されたがそれ以外の関節炎などは程度は軽いものの発症し、env-pXラットに発症する膠原病には少なくとも2通りの発症機序が関与していると考えられた。Ick-pXラットが樹立できた。これらのラットの内いくつかの系統で胸腺腫の発生を確認したが、今のところ白血病の発症は確認されていない。ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I)は成人T細胞白血病(ATL)のみならず神経疾患(HAM)、関節炎(HAAP)、眼疾患(HAU)、シェ-グレン症候群等の発症にも関与することが明らかとなってきている。本研究はモデル動物を用いて以下の結果を得た。1)HTLV-I感染ラットはHAM/TSP類似脊髄症を発症する(HAMラット)。この動物の脊髄ミクログリア/マクロファージ系細胞にはHTLV-Iが感染していた。この動物の脱髄は発症約6か月前の潜伏期間中から出現するオリゴデンドロサイトのアポトーシスによるが、その出現時期に一致してpX遺伝子、TNF-

αの発現とbcl-2の一過性の発現抑制を見た。2)LTR-env-pXトランスジェニックラットは多彩なcollagen vascular diseaseを発症する。この動物のの末梢T細胞は種々の刺激に対し高反応性であった。またその表面には発症前に既にCD80/86やICAM-1など活性化の指標となる分子が発現していた。炎症局所の浸潤T細胞についてTCRVβmRNAのRT-PCR-SSCPで検索しオリゴクローナルであったが、異なる個体では必ずしも共通してはいなかった。env-pXトランスジェニックラットと正常ラット間での骨髄や脾細胞移入実験では、疾患によりリンパ球、標的組織あるいは胸腺などリンパ球の成熟に関わる組織のいずれの組織での導入pXの発現が重要かは異なり、少なくとも3通り発症機構が関与した異なる疾患が存在することが示唆された。以上、本研究ではモデル動物の開発とHTLV-I病原性の機序解明には進展を見たが、これらの疾患の治療実験にまでは至らなかった。
ガスデポジション法による傾斜構造耐熱チタン基複合材料の開発

TiAlは、その強度が温度の上昇と共に増加するという、いわゆる正の強度の温度依存性があり、最高使用可能温度は1000°C、加えて耐酸化限界温度も900°Cを越えることから、軽量耐熱チタン材料としては最も期待されている。ただ、室温での延性が十分でなく、これがこのTiAl単体での耐熱用構造材料としての実用化を阻む最大の原因になっている。本研究では、低温側をTi合金、高温側表面を金属間化合物TiAlとし、この間の組成を連続的に変化させ、TiAlの低延性とTi合金の耐熱性の不足を相互に補完し、かつ接合部材にみられる熱応力を緩和することのできるTi合金/TiAl傾斜構造耐熱部材の開発を目的としている。本実験に使用するガスデポジション装置(以下GD装置)は微粒子が生成される2つの微粒子生成室1および2、微粒子が積層される微粒子積層室、その間を連結する搬送管、真空排気系、材料加熱系および基板制御系から構成されている。加熱系は、Ti用にアーク加熱、Al用に抵抗加熱を用いている。また、搬送媒体としてヘリウムガスを用いている。本研究において、GD装置を用い積層条件を検討した結果、基本的には材料を加熱する電力の調節により、微粒子の積層速度を調節できることが明かとなったが、さらに抵抗加熱装置の改良により積層速度の制御性を高め任意の混合比でTiとAlを混合することが可能となった。また、積層した試料の積層厚さ方向、積層方向の性状と積層条件との関係に関しても有益な知見が得られ、今後傾斜構造チタン基耐熱材料のみならず成分制御の任意性を活かした材料開発におおいに役立つと考えられる。金属間化合物TiAlは、高温で極めて高い比強度を持ちかつ耐熱性・耐酸化性に優れるため、高比強度耐熱部材として注目されている。しかしその延性の低さが大きな欠点となっており、単体で構造用材料とせいての使用は困難である。また接合部材としては、熱応力による剥離などが問題となっている。本研究では、低温側をTi合金、高温側表面を金属間化合物TiAlとし、この間の組成を連続的に変化させ、TiAlの低延性とTi合金の不足耐熱性を相互に補完し、かつ接合部材にみられる熱応力を緩和することのできるTi合金/TiAl傾斜構造耐熱部材の開発を目的としている。微粒子生成室内をヘリウムガス雰囲気で満たし、その中で蒸発された材料原子はヘリウムガス原子と衝突し、冷却された微粒子となる。生成された微粒子は微粒子積層室との差圧力により搬送管に吸い込まれ、搬送管先端にあるノズルより高速度で吹き出し、基板に積層される。生成室1は抵抗加熱方式、生成室2はアーク加熱方式である。生成室2でアーク加熱によりTiを、生成室1で抵抗加熱によりアルミニウムを蒸発させ、積層室内でノズルを通して吹き付け混合する。本年度の研究において、GD装置を用い積層条件を検討した結果、以下の結論を得た。1)材料を加熱する電力の調節により、微粒子の積層速度を調節できる。電力を増加させると、積層速度は増加する。2)アーク加熱において、微粒子生成室と積層室の差圧力を増加させると、積層速度は増加する。3)抵抗加熱において、加熱温度の変化によって微粒子の基板付着状態が異なる。4)GD装置を用い、材料を混合することが可能である。

ただ、室温での延性が十分でなく、これがこのTiAl単体での耐熱用構造材料としての実用化を阻む最大の原因になっている。本研究では、低温側をTi合金、高温側表面を金属間化合物TiAlとし、この間の組成を連続的に変化させ、TiAlの低延性とTi合金の耐熱性の不足を相互に補完し、かつ接合部材にみられる熱応力を緩和することのできるTi合金/TiAl傾斜構造耐熱部材の開発を目的としている。本実験に使用するガスデポジション装置(以下GD装置)は微粒子が生成される2つの微粒子生成室1および2、微粒子が積層される微粒子積層室、その間を連結する搬送管、真空排気系、材料加熱系および基板制御系から構成されている。加熱系は、Ti用にアーク加熱、Al用に抵抗加熱を用いている。また、搬送媒体としてヘリウムガスを用いている。昨年度の研究において、GD装置を用い積層条件を検討した結果、材料を加熱する電力の調節により、微粒子の積層速度を調節できることが明かとなった。今年度の研究では、抵抗加熱装置の改良により積層速度の制御性を高めることが可能となり、任意の混合比でTiとAlを混合することが可能となった。また、積層した試料の積層厚さ方向、積層面方向の性状と積層条件との関係に関しても有益な知見が得られた。
ショウジョウバエの視覚系構築メカニズム

ショウジョウバエの複眼は約750個の個眼からなり、1つの個眼は8個の光受容細胞を持つ。そのうち外側の6個(R1-6)はラミナ神経節へ、内側の2個(R7-8)はメダラ神経節へと投射する。両神経節はOPC(Outer Proliferating Center)とよばれる領域に由来し、ラミナ前駆細胞は水平方向に移動してラミナを形成し、メダラ前駆細胞は垂直方向に深部に移動してメダラを形成する。これらの幹細胞の分化の詳細は解っていない。分化しつつあるラミナ細胞に活性型Notchを発現させると、ラミナ前駆細胞の移譲増殖が観察される。また、OPCにおいてNotchシグナルを抑制すると、前駆細胞が神経へと分化することから一般に知られているNotchの神経形成における役割がこの系においてもみられる。ところがNotchの機能欠損変異では一般的な概念では説明できない表現型が観察される。Notch変異クローンをラミナ前駆細胞に作ると、クローンの外側の広い範囲において前駆細胞が神経に分化する非自律的な表現型がしばしば観察される。さらにこの表現型の浸透度は1割程度と低く、表現型を示さない大きなクローンも観察される。NotchのリガンドであるDeltaの発現を調べると、本来ラミナ細胞が分化し始める領域で高くなるDeltaの発現レベルがNotch変異クローンでは変化しないことが観察される。一方メダラにおいてはNotchクローンにおいてわずかなDeltaの上昇が観察されることがある。また、メダラ神経の分化マーカーであるElavの発現がNotchクローンでは自律的に遅れる様子も観察される。また、この系においてNotchと他のシグナル系の相互作用も明らかになりつつある。これらの断片的な知見から神経幹細胞の分化制御におけるNotchの役割を再検討し、脳における神経幹細胞分化メカニズムを明らかにしたい。
高効率ウイルスベクターを用いたメラノーマ遺伝子治療の開発

当展開研究では、メラノーマ患者の臨床治療研究に実際に適用することができるようなベクターを開発するための前臨床研究を行う。特に高効率のファイバー変異型アデノウイルスを作製し、in vitroでの有用性を検討する。さらに、実験動物治療モデルを用いて、in vivoでの有効性、副作用の有無などを検討する。実験動物治療モデルとしては、主としてヒトのメラノーマ由来の腫瘍Hs695TならびにA375のヌードマウス移植系を用いた。NG2プロテオグリカンの発現はメラノーマ、グリオーマなどの悪性腫瘍とその腫瘍血管に限局することが報告されており、腫瘍標的化のターゲット候補である。NG2を標的とするペプチドモチーフTAASGVRSMH (TAA)を含んだAdv-F40S/TAAは、NG2を高発現するA375メラノーマやA172グリオーマに高い選択性を示し、これらの腫瘍の選択的標的化に有望である。NG2高発現のA375メラノーマ担癌ヌードマウスBALB/c-nu/nuSlcに、経静脈的にF40S/TAAを投与したところ、このウイルスは肺・心臓・肝・脾臓・腎臓・血液細胞などにはほとんど取り込まれず、A375腫瘍組織に高い集積を示した。静脈内投与で標的化可能なアデノウイルス変異型に関しては、世界的にも報告がないため、慎重なデータの再確認が必要である。今期は、すでに作成したlacZレポーターのデータを再度確認するため、AxCAZ3-F40S/TAAアデノウイルスを633細胞(後述)を用いた方法で再作成するとともに、lacZと異なるレポーターとしてEGFPを用い、AxCA-EGFP-F/wt、AxCA-EGFP-F40S、AxCA-EGFP-F40S/TAAのアデノウイルスを作成し、実験動物での静脈内投与による標的化に関して確認を進めている。当展開研究では、メラノーマ患者の臨床治療研究に実際に適用することができるような高効率のファイバー変異型アデノウイルスを作製し、in vitroでの有用性を検討する。実験動物治療モデルとしては、新規ベクターの遺伝子導入効率や発現量を見ることを目的とする場合は、主としてヒトのメラノーマ由来の腫瘍Hs695Tのヌードマウス移植系を用いた。一方、GM-CSF/IL-4などの樹状細胞活性化と腫瘍拒絶抗原提示による免疫遺伝子治療実験では、マウスのメラノーマ細胞B16のマウス皮下移植系の治療モデルを用いて実験を進める予定である。A-1)インテグリンをターゲットとするAdv-F/RGDベクターによる初代培養ヒトメラノーマ細胞への遺伝子導入効率の検討:Adv-F/RGD変異型を用いることによって、初代培養メラノーマ細胞への遺伝子導入効率が50倍程度増強し、臨床的にも実施可能なウイルスの量で100%の細胞に遺伝子導入を行うことができるようになった。A-2)Adv-F/RGDベクターによる動物治療モデル実験:ヒトIL-2を発現するアデノウイルスを用いてヒトのメラノーマ由来の腫瘍Hs695Tのヌードマウス移植系の治療実験を行ったところ、Adv-F/RGDベクターを用いることによって、野生型ファイバーを用いる場合に比べ、10倍以上も高いIL-2の局所発現と著明な腫瘍縮小効果が得られた。B)特異性の強化:Adv-F40SとF/RGD変異型との組み合わせたベクターAdv-F40S/RGDを新たに作成し、ヒトメラノーマ細胞ならびにヒト正常細胞に対する遺伝子導入効率を検討中である。

当展開研究では、メラノーマ患者の臨床治療研究に実際に適用することができるようなベクター開発の前臨床研究を行う。A)インテグリンをターゲットとするAdv-F/RGDベクター:今期間中は、臨床に応用するベクターとして、腫瘍特異的増殖型(dAdB3)と薬剤感受性遺伝子UPRTaseの発現カセット(CAUP)とを併せ持つAdv-F/RGDベクターを作成した。アデノウイルスの作成法に関して、従来用いられてきたアデノウイルスのゲノムにTP(terminal protein)の結合したDNA-TPCとのコトランスフェクションを用いるcos-DNA-TPC法は、野生型のE1やファイバーのゲノムの混入する確率が若干高いため、以後の安全性のチェックに困難を伴うことが経験された。従って、今回の臨床応用を目指したアデノウイルスの作成方法としては望ましくない。そこで、私たちはF/RGDを含むアデノウイルスのゲノムを含み、かつ、目的とする発現カセットをあらかじめ組み込んだプラスミド1種のみを293細胞へトランスフェクトする方法を独自に樹立して用いた。この方法によると、アデノウイルス産生の効率はcos-DNA-TPC法に比較して数十倍低下するものの、不必要なゲノムの持ち込みがないため、以後の増幅の過程で予想外のゲノムの変化が生じる確率が低く、安全性の高いベクター作成方法であると考えられる。同様の方法を用いて、現在、免疫遺伝子治療の臨床研究に用いるAdv-F/RGDベクターを作成している。また、並行して、ベクターの安全性の評価を進めている。B)特異性の強化:メラノーマに特異的に発現するNG2プロテオグリカンを標的とするベクターAdv-F40S/TAAを新たに作成し導入効率を検討中である。当展開研究では、メラノーマ患者の臨床治療研究に実際に適用することができるようなベクターを開発するための前臨床研究を行う。特に高効率のファイバー変異型アデノウイルスを作製し、in vitroでの有用性を検討する。さらに、実験動物治療モデルを用いて、in vivoでの有効性、副作用の有無などを検討する。実験動物治療モデルとしては、主としてヒトのメラノーマ由来の腫瘍Hs695TならびにA375のヌードマウス移植系を用いた。NG2プロテオグリカンの発現はメラノーマ、グリオーマなどの悪性腫瘍とその腫瘍血管に限局することが報告されており、腫瘍標的化のターゲット候補である。NG2を標的とするペプチドモチーフTAASGVRSMH(TAA)を含んだAdv-F40S/TAAは、NG2を高発現するA375メラノーマやA172グリオーマに高い選択性を示し、これらの腫瘍の選択的標的化に有望である。NG2高発現のA375メラノーマ担癌ヌードマウスBALB/c-nu/nuSlcに、経静脈的にF40S/TAAを投与したところ、このウイルスは肺・心臓・肝・脾臓・腎臓・血液細胞などにはほとんど取り込まれず、A375腫瘍組織に高い集積を示した。静脈内投与で標的化可能なアデノウイルス変異型に関しては、世界的にも報告がないため、慎重なデータの再確認が必要である。
神経幹細胞の領域特異化に関する分子生物学的解析

本申請は、運動ニユーロン・オリゴデンドロサイトの発生に必須の役割を果たしているbasic helix-loop-helix型転写因子・Olig2の作用機序を解析し、神経幹細胞が領域特異的な性質を獲得するメカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、Olig2の下流で働く遺伝子を同定するために、我々が作製したOlig2ノックアウトマウスと野生型マウスにおいて発現の差のある遺伝子をsubtraction PCR法にてスクリーニングした。いくつかの候補遺伝子が単離されており、現在これらの遺伝子が実際にOlig2の下流遺伝子として働いているかどうか、解析を進めている。また、熊本大学の田賀哲也博士・近藤亨博士との共同研究により、Olig2がp300と結合することにより、アストロサイトの分化に必須のSTAT3/Smad/p300複合体に拮抗的に働くことを示した(Cell Death Diff.11,196-202,2004)。この結果により、Olig2がアストロサイトの分化に対して、拮抗的に働く分子メカニズムを明らかにした。
マイクロ電解液ジェット加工の研究

電解液ジェット加工は電解液のジェット噴流直下に電流密度の分布が集中することを利用して、ジェットの当たる部分のみを選択的にマスクレスで電解加工する方法である。ノズルの走査を制御することにより流体軸受の微細溝、マイクロレンズアレイなど、凹凸がミクロンオーダあるいはナノメータオーダの微細形状が安価なシステムで効率よく加工できる。本年度は以下に述べるように、微細ノズルによる微細加工、微細流路を持つ放電加工用電極の製作への応用、表面に微細な凹凸をもつワイヤソーの製作への応用、の3点について研究を行った。まず、市販の薬剤微量吐出ノズル(ノズル径50ミクロンと25ミクロン)を利用して、微細径の電解液ジェットを形成し、微細パターンの加工を行った。ノズルの詰まりが頻繁に生じたが、ノズルの直前にフィルターを設置することによりその問題を解決できた。そして、ノズル径50ミクロンの場合は溝幅70ミクロン、25ミクロンの場合は溝幅40ミクロンの微細パターンを加工できることが分かった。次に、電解液ジェット加工の応用として、微細溝を形成した銅板を拡散接合することにより、内郭に毛細血管のような微細な流路をもつ放電加工用の工具電極を製作した。その流路から加工液を噴出させることにより、深溝などの加工くずの排出が困難な場合にも安定して放電加工が行えることを実証した。また、もうひとつの応用として、シリコンインゴットのスライシングに使用するワイヤソー(直径0.1ミリ)に微細な凹凸を形成し、遊離砥粒を巻き込み易くすることによってワイヤソーの加工速度を向上させる研究に着手した。硝酸ナトリウム水溶液を用いた除去加工により、ワイヤ上に微細な窪みを形成できることを確認した。さらに、硫酸ニッケル水溶液を用いた付着加工によりワイヤ上に微細な突起を形成可能なことを明らかにした。本研究に関して、16年度は、加工条件、特に電流密度が加工面の表面粗さに及ぼす影響を調べた。また、加工効率をさらに向上させるため、多数のシングルノズルから構成されるマルチノズルを考案し、ノズル間の距離や、ノズルと工作物とのギャップ長の短縮がジェット噴流間の干渉を引き起こし、加工特性に悪影響を及ぼす現象について調べた。その結果、1)電流密度を高く設定することで、加工速度だけでなく表面粗さも向上すること、2)ノズルの走査角度を調節することで様々な溝間隔の加工が1回の走査で行えること、3)ノズルの走査なしで一度に25個のピット加工を行え、加工効率を25倍向上させたことが分かった。しかし、マルチノズルを使用する際、以下のような点に注意しなければならない。すなわち、電解液の流れの干渉を受けずに加工を行うためには、ノズル間距離やタンク圧力、ギャップ長を最適な値に設定する必要がある。また、加工深さの均一性のためには、すべてのノズルのギャップ長を均等にするか、ギャップ長を長くしてギャップ長の不均一性の影響を低減する必要がある。なお、16年度では、任意の3次元形状を加工する場合のノズル走査の制御方法として、単純溝の重ね合せによって複雑な形状を有する溝を加工する際の重ね合わせ係数を算出する方法を確立し、ノズルの走査速度の制御で実現できることを検証した。また、その方法の精度を加工実験により調べた。
がん細胞における新規耐性マーカーとしてのＡＲＦ―ＧＥＰ１００の検討

抗がん剤の耐性因子(P-糖タンパク質;Pgp)の発現にARF-GEP100(GEP100)が関与しているかを抗がん剤のDoxorubicin(DOX)を用いて耐性細胞を作製し検討した。その結果、Pgpの発現が確認されるとGEP100の増加が認められ、Pgpに対する抗体を用いて、免疫沈降を行ったところ、GEP100はPgpとともに共沈した。siRNAを作成し検討したところ、ARF6のノックダウンではPgpやGEP100の発現は変化しなかった。以上のことから、GEP100は、Pgpの発現にともなって増加し、ARF6が関与しない新たなpathwayによってPgpの発現に影響を与えることが示唆された。昨年度検討の出来なかった乳がん、大腸がん細胞、リンパ球系白血病細胞(Jurkat、MOLT-4)を用いて、デキサメタゾン、エトポシド、ビノレルビン酒石酸塩、ドキソルビシン処置で長期間処置しP-糖タンパク質とARF-GEP100の発現を検討したところ、いずれの細胞および薬物でP-糖タンパク質の発現は認められなかった。ARF-GEP100の発現を検討したところ、MCF-7(乳がん細胞)においてドキソルビシン処置で発現の増加が確認された。また、Spiruchostatin B (SP-B)耐性NALM-6細胞を用いて検討したところ、P-糖タンパク質およびARF-GEP100の発現の増加が認められなかった。さらに、K562細胞の細胞膜画分を調製し、Western blotを行ったところ、P-糖タンパク質とARF-GEP100の発現の増加が確認された。このことから、P-糖タンパク質の機能発現にARF-GEP100の関与が示唆されたことから、P-糖タンパク質およびARF-GEP100に対する抗体を用いてproteinGによる免疫沈降法を行い、ARF-GEP100の関与を検討した。その結果、いずれの抗体を用いても、P-糖タンパク質とARF-GEP100が結合していることが確認できなかった。ARF-GEP100は、ARFを活性化するタンパク質として同定され、ARFの活性化が関与する種々の機能を調節するとともに、細胞の機能を多面的に調節している可能性が示唆される。そこで、ARF6の発現とARF-GEP100の発現をWestern blotで検討したところ、ARF6の増加認められるとARF-GEP100の発現の増加も認められた。このことから、P-糖タンパク質の発現には、ARF6およびARF-GEP100の関与が示唆された。ARF-GEP100(p100)は、ARF(ADP-ribosylation factor)を活性化する因子として発見され、様々な細胞機能に関与することが知られている。一方、P-糖タンパク質(Pgp)は抗癌剤に対する多剤耐性を獲得したがん細胞において発現しており、種々の抗がん剤を細胞外に排出輸送する。このことから、Pgpは多剤耐性因子として位置づけられており、Pgpの抗癌剤排出機能を阻害することにより多剤耐性の克服が期待されている。そこで我々は、p100が薬剤耐性化に伴うPgpの発現への関与とバイオマーカーの可能性についてをDoxorubicin(DOX)に対する耐性細胞を作製し検討した。K562細胞を低濃度のDOX存在下で継代培養し、耐性細胞を作製した。p100およびPgpの発現は、特異抗体を用いてWestern blottingで検討した。DOXを処理したK562細胞におけるp100やPgpの発現を経時的に確認した。その結果、Pgpの発現が確認されるとp100の発現が増加することが確認された。Pgpは、糖鎖付加により細胞膜に移動したうえでリン酸化を受け薬剤排出ポンプとして機能することから、p100の細胞膜画分における発現の変化を検討した。その結果、p100は細胞膜画分において増加することが確認された。さらに、Pgpに対する抗体を用いて、免疫沈降を行ったところ、p100とPgpがともに回収された。p100は乳癌細胞においてARF6を活性化し、浸潤や転移を関与することが報告されたいる。そこで、siRNAを作成しPgpとp100の発現を検討したところ、ARF6のノックダウンでは、Pgpやp100の発現は変化しなかった。以上のことから、p100はPgpの発現にともなって増加し、ARF6が関与しないpathwayによってPgpの発現に影響を与えることが示唆された。

がん細胞におけるARF-GEP100の薬剤耐性化のマーカーとしての検討を白血病細胞をはじめとする各種癌細胞を用いて検討するため、研究分担者の染谷は、ARF-GEP100の部分ペプチド合成し、ウサギに免疫しペプチド抗体の作成を行った。その結果、ARF-GEP100を認識する特異性の高い抗体を作ることができた。研究代表者の蓬田は、白血病細胞であるNalm-6およびK562を用いて、ドキソルビシンを1週間に0.5nMづつドキソルビシンの濃度を徐々に上げて行くことで耐性細胞の作成を行った。そして、これらの細胞を用いて、ARF-GEP100の発現について、Western bloting法で検討したところ、ドキソルビシン耐性細胞において、ARF-GEP100の発現の上昇が認められた。さらに、Nalm-6細胞において、ドキソルビシンを長期に処理することで、ARF-GEP100の発現が上昇することが、確認された。そして、ドキソルビシンを処理したNalm-6およびK562がん細胞におけるP-糖タンパク質の発現について検討したところ、ドキソルビシン耐性細胞では、P-糖タンパク質の発現が認められた。そして、ARF-GEP100とP-糖タンパク質の発現の時間経過を検討したところ、ARF-GEP100は、ドキソルビシンを処置することにより、P-糖タンパク質に比べ、先にその発現が増加することを確認することができた。さらに、P-糖タンパク質の発現に、ARF-GEP100の発現が相関するかを検討したところ、耐性細胞においてARF-GEP100の発現が増加するとP-糖タンパク質の発現も増加することが確認された。以上のことから、ARF-GEP100は、ドキソルビシンをを処理することで、P-糖タンパク質よりも先に発現が増加し、P-糖タンパク質の発現に影響を与えている可能性が示唆された。予定では、メカニズムの検討をsiRNAなどを用いて行っているところだが、P-糖タンパク質の発現に、6ヶ月1年、かかることから、再現性を取るのに時間を要したとこと。また、複数の細胞、薬剤を用いて行ったことにより、さらに時間を要した。また、免疫沈降法による検討において、試行錯誤を繰り返しながら行い、思った以上に時間を費やしたことによる。当初の予定では、乳がん、前立腺がん、肺がん、白血病細胞などを用いて、デキサメタゾン、抗がん剤(複数)について耐性細胞の作成し、ARF-GEP100とP-糖タンパク質の発現について相関性があるかをWestern bloting法で検討する予定であった。現在のところ、ARF-GEP100の抗体の作成が完了したが、がん細胞を用いた検討では白血病細胞のみとなっている。しかしながら、ドキソルビシン処置により、P-糖タンパク質の発現より先にARF-GEP100の発現の増加が認められたという新たな知見が得られた。このことから、当初の計画よりもがん細胞と抗がん剤の種類の検討について、やや遅れているが、ほぼ当初の研究目的を達成したと考えられる。現在、乳がん及び肝臓がん細胞を用いて同様の検討を行っている。K562細胞は、ドキソルビシンで処置すると、IC50の濃度を超えると細胞が大きく変化することを確認している。そこで、P-糖タンパク質の機能発現にARF-GEP100やARF6の関与をsiRNAによるノックダウンによって、K562細胞がどのように変化するかを確認する。さらに、ドキソルビシンの細胞外への放出について、フローサイトメトリーを用いて検討する。
咀嚼機能の多軸評価に基づく補綴歯科治療の効果判定ツールの開発

歯の欠損に対する補綴治療の前後において、咀嚼機能の主観的・客観的評価、および心理テスト等による社会心理学的評価を行った。その結果、咀嚼機能の客観および主観評価データは著明に向上し、両者には関連が認められた。しかし、関連が認められない被験者も散見された。以上より、咀嚼機能を指標として欠損補綴治療の治療効果を判定する際には、本研究のような、咀嚼機能の多軸的評価による治療効果判定が必要であることが示唆された。咀嚼機能の多軸評価に基づく欠損補綴治療の治療効果判定法を新規に開発することを目的として、欠損補綴治療を行う患者30名を対象に、臨床診察[医療面接、口腔内診察、咬合検査など]、咀嚼機能の客観評価[寒天節分法による咀囑能率測定、咬合力測定]、咀嚼機能の主観評価[VASを用いた主観評価、OHIP(Oral Health Impact Profile)日本語版]および社会心理学的因子の測定[質問票(社会心理学的因子に関する調査票)、心理テスト(GHQ60健康調査票、POMS短縮版)を行った。さらに、これらの患者のうち欠損補綴治療が完了して3か月経過した患者15名を対象に、上記の測定を行った。その結果、咀嚼機能の客観評価データは有意に向上した[咀嚼能率(p<0.01)、咬合力(p<0.05);それぞれ対応のあるt検定]。また、主観評価データも有意に向上した[VAS(p<0.05)、OHIP日本語版(p<0,05);それぞれWilcoxon検定]。しかしながら、客観評価データと主観評価データには有意な相関関係は認められず(p>0.05;Spearmanの順位相関)、客観的データでは著明に咀嚼機能が改善しているにもかかわらず、主観的なデータ(咀嚼のしやすさなど)には改善が認められない患者がみられた。さらに、社会心理学的因子の測定[質問票、心理テスト]に関しては、治療前後でスコアに有意な変化は認められなかった。以上のことから、咀嚼機能を指標として欠損補綴治療の治療効果を判定する際には、単一的な評価のみではなく、咀嚼機能の多軸的比較による治療効果判定が必要であることが示唆された。咀嚼機能の多軸評価に基づく欠損補綴治療の治療効果判定法を新規に開発することを目的として、平成19年度に引き続き欠損補綴治療を行う患者45名(一部平成19年度登録患者との重複あり)を対象に、臨床診察[医療面接、口腔内診察、咬合検査など]、咀嚼機能の客観評価[寒天篩分法による咀嚼能率測定、咬合力測定]、咀嚼機能の主観評価[VASを用いた主観評価、OHIP (Oral Health Impact Profile)日本語版]および社会心理学的因子の測定[質問票(社会心理学的因子に関する調査票)、心理テスト(GHQ60健康調査票、POMS短縮版)を行った。さらに、欠損補綴治療が完了して3か月経過した時点で、同様の測定を行った。また、主観評価データも有意に向上した[VAS(p<0.05)、OHIP日本語版(p<0.05);それぞれWilcoxon検定]。客観評価データと主観評価データには有意な相関関係が認めらたが(p<0.05;Spearmanの順位相関)、客観的データでは著明に咀嚼機能が改善しているにもかかわらず、主観的なデータ(咀嚼のしやすさなど)には改善が認められない患者も散見された。さらに、社会心理学的因子[質問票、心理テスト]に関しては、治療前後でスコアに有意な変化は認められなかったものの、被験者によっては、咀嚼機能の客観評価データの向上に伴って改善する者もみられた。
二重鎖識別人工DNAの創製とアンチジーン法への展開

疾患治療、さらにはその予防の究極的な方法にアンチセンス・アンチジーン法がある。アンチジーン法は、DNAという遺伝子発現の根源に作用する手法である。遺伝子自身はゲノム中に1個しかなく、この1個さえ阻害すれば原理的にはタンパク質の発現を防ぐことができる。ここ数年本申請者らは、精密分子認識の視点に立って、ナノサイエンスとしての人工DNAの創成と、ナノテクノロジーとしての人工DNAの利用を多方面に検討してきた。これらの成果を最大限に活用し、二重鎖の"塩基対"の配列を高度に識別できる理想的な"アンチジーン分子"を開発する。本萌芽研究期間においては上記の基礎データを集め、本手法の将来性を判断することを目的とする。"アンチジーン分子"の具体的な候補骨格として、昨年度までにアルキニルC-ヌクレオシドを開発し、核酸塩基部位として人工ユニットの導入に成功した。今年度は、水素結合が可能な人工核酸塩基をアルキニルC-ヌクレオシドに連結し、DNA自動合成機に導入できるよう人工ヌクレオシドに化学変換を施した後、自動合成機にて人工DNAオリゴマーを作成した。得られたオリゴマーは水に易溶であり、人工DNAオリゴマーどうしで相補的な水素結合介して人工DNA二重らせんを形成した。人工DNA二重鎖は、天然DNA二重鎖と同様、アンチアラレル配向の右巻きらせん構造であった。また、二重鎖形成における熱力学パラメーターも天然DNAとほぼ同等であった。さらに、人工DNAオリゴマーは天然DNA鎖と配列特異的に二重鎖形成可能であることもわかった。加えて、人工DNA鎖は三重鎖も形成可能であったことから、アルキニルC-ヌクレオシドを用いた人工DNA骨格が"アンチジーン分子"の基本構造として妥当であることが確認できた。各々の塩基対におけるmajor grooveでの官能基パターンを考慮し,そのパターンと選択的な相互作用の可能な官能基が配列した分子骨格を準備する.その化合物を本申請者らの開発した合成反応で非天熱様式にて糖に結合させる.この人工ヌクレオシドをDNA自動合成機で使えるように化学修飾(ホスホロアミダイト化)し,ターゲットとする塩基配列にあわせて連結する.このようにして合成した人工オリゴヌクレオチドは,人工的な糖-リン酸骨格を持ち,アンチジーン分子に要求される全ての項目を満たしたものとなるはずである.以上の研究内容に関して,平成19年度に実施した具体的な研究実施計画を箇条書きに記す.なお役割分担に関しては,それぞれの研究者の得意分野と経験値を基に決定し,各項目は,いくつもの候補に関して同時進行で結果をフィード・バックさせながら実施した.1計算機化学的手法を用いて4種類の"塩基対"認識部位の設計を行った.2塩基対認識部位を有する人工ヌクレオシドの合成ルートの検索を行った.3選択された同合成ルートを実施し,収率の改善を含め,それを確立した.4人工ヌクレオシドの塩基対に対する選択性を調べる方法を,分光学的手法に基づいて検討した.5 4で検討した最適な手法で,人工ヌクレオシドの塩基対に対する選択性を調べた.6 5の結果に基づいて,塩基対認識部位の改良を行った.7最良の結果を得るために16を繰り返し検討した疾患治療、さらにはその予防の究極的な方法にアンチセンス・アンチジーン法がある。