hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境アクチノイド元素の放出起源・履歴分析に向けた極微量多元素全自動分離の開発

本研究では、環境中に放出されたアクチノイドなど極微量元素を対象とし、堆積物や植物など環境試料に含まれる極微量元素人工放射性元素の元素組成や同位体組成から放出期限や履歴を読み解く道具として、アメリシウムやプルトニウムを含む多元素の極微量化学分離から分析まで一連の技術を確立することを目的とする。分離分析対象とする元素はアメリシウム、プルトニウム、ウラン、トリウム、鉛、希土類元素である。研究代表者がこれまでの研究によって開発した逐次分離法を発展させて、アメリシウムを含む多元素同時分離技術を開発し、環境標準試料や模擬試料を分析して開発した技術の実用性を評価するまでを目標とする。28年度は、数多い溶離液を分離目的元素に合わせて切り替えられるように耐酸・耐圧製の多チャンネルのバルブを新規に購入し、バルブ切り換えを自動で対応できるように逐次分離システムを制御するパソコンのソフトウェアも改良し、分離システム全体を再構築した(第60回放射化学討論会にて発表)。29年度は、改良した全自動逐次分離システムを使い、目的元素である希土類元素, Am, Pu, Th, Uに対して分離度や回収率が最も良くなるように、溶離液の成分である酢酸、塩酸、硝酸およびフッ化水素酸の混合比率を変えて分離条件を最適化した。得られた研究成果は国際学会2件(6th APSORC(招待講演)とINCC-2017)で発表し、研究者に広く公開した。30年度は、希土類元素、アメリシウムおよびプルトニウムの分離性能を上げた。特にAmの分離条件にこだわり、類似の化学的性質を有する希土類元素との分離性能を上げた。得られた研究成果は国際学会2件(Radchem2018とERA13)で発表し、研究者に広く公開し、国際的に高い評価を得るとともに、Amと希土類元素の分離条件について論文誌にまとめ、広く一般に公開した。本研究では、環境中に放出されたアクチノイドなどの極微量元素を対象とし、堆積物や植物など環境試料に含まれる極微量人工放射性元素の元素組成や同位体組成から放出起源や履歴を読み解く道具として、アメリシウムやプルトニウムを含む多元素の極微量化学分離から分析まで一連の技術を確立することを目的とする。分離分析対象とする元素は放出起源や履歴によって濃度や同位体組成が変動しやすいアメリシウム、プルトニウム、ウラン、トリウム、鉛、希土類元素である。本年度(28年度)は、研究計画に基づき、Amも含めた逐次分離ができるように多チャンネルソルベントセレクタバルブを購入した。分離システムの制御ソフトウェア改良とインターフェースを製作して、このバルブが正常に動作することを確認した。このシステムを用いてアメリシウムを含めた目的元素(Am, Pu, U, Th, Pb,希土類元素)の全自動逐次分離を行い、高回収率でよく相互分離できる溶離液組成など、化学分離の最適条件を確立した。3pgのAmスパイク溶液を用いて酢酸濃度など溶離液組成を変えて分離条件を検討した結果、希土類元素からのAm分離を達成した。これらの検討した研究成果は第60回放射化学討論会で発表し、研究者に広く公開した。交付申請書に記載したとおり、研究の目的に則してアメリシウムを含めた目的元素の逐次分離条件の検討や分離システムの改造などが進展している。本年度(29年度)は、研究計画に基づき、得られた分離条件を更に最適化して希土類元素、アメリシウムおよびプルトニウムの分離性能を上げた。また、濃度既知の標準堆積試料を最適化した分離条件で目的元素の逐次分離を試みた。しかし、この実験過程で装置の要である多チャンネルソルベントセレクタバルブが故障し、新規に交換せざるを得ず、交換品を入手するまでに長期間かかってしまった。また、研究組織の事情で核燃料スパイク試料の使用が一時的に中止となった。このような研究計画では当初予期していなかった事態が生じたため、予定していた評価試験に遅れが生じた。これまでに得られた研究成果は国際学会2件(6th APSORCとINCC-2017)で発表し、研究者に広く公開した。特に6th APSORCでは招待講演として扱われ、国際的に高い評価を得た。研究計画では当初予期していなかった装置の要である多チャンネルソルベントセレクタバルブの故障や核燃料スパイク試料の一時的使用中止により、予定していた評価試験に遅れが生じたが、現在は遅れていた計画を取り戻して課題を進めている。

本研究では、環境中に放出されたアクチノイドなど極微量元素を対象とし、堆積物や植物など環境試料に含まれる極微量元素人工放射性元素の元素組成や同位体組成から放出期限や履歴を読み解く道具として、アメリシウムやプルトニウムを含む多元素の極微量化学分離から分析まで一連の技術を確立することを目的とする。分離分析対象とする元素はアメリシウム、プルトニウム、ウラン、トリウム、鉛、希土類元素である。研究代表者がこれまでの研究によって開発した逐次分離法を発展させて、アメリシウムを含む多元素同時分離技術を開発し、環境標準試料や模擬試料を分析して開発した技術の実用性を評価するまでを目標とする。28年度は、数多い溶離液を分離目的元素に合わせて切り替えられるように耐酸・耐圧製の多チャンネルのバルブを新規に購入し、バルブ切り換えを自動で対応できるように逐次分離システムを制御するパソコンのソフトウェアも改良し、分離システム全体を再構築した(第60回放射化学討論会にて発表)。29年度は、改良した全自動逐次分離システムを使い、目的元素である希土類元素, Am, Pu, Th, Uに対して分離度や回収率が最も良くなるように、溶離液の成分である酢酸、塩酸、硝酸およびフッ化水素酸の混合比率を変えて分離条件を最適化した。得られた研究成果は国際学会2件(6th APSORC(招待講演)とINCC-2017)で発表し、研究者に広く公開した。30年度は、希土類元素、アメリシウムおよびプルトニウムの分離性能を上げた。特にAmの分離条件にこだわり、類似の化学的性質を有する希土類元素との分離性能を上げた。得られた研究成果は国際学会2件(Radchem2018とERA13)で発表し、研究者に広く公開し、国際的に高い評価を得るとともに、Amと希土類元素の分離条件について論文誌にまとめ、広く一般に公開した。当初の研究計画に則して、濃度既知の標準堆積試料の分離・分析から最適化した分離性能が環境試料への応用可能であるかの性能評価を行う。試料の同位体比測定については、利用可能な加速器質量分析施設担当者との打ち合わせを行って測定に向けた検討を行う。得られた結果を取りまとめて国内外の学会において研究発表を行う。当初の研究計画に即して、環境模擬試料を作成し、分析値の正確さや精度の観点から性能評価を行う。実際に環境試料の分離・分析に適用し、この方法の分析下限などを評価する。利用可能な加速器質量分析施設担当者と試料の同位体比測定の可能性について打ち合わせを行う。平成28年度に予定していた自動低圧切換バルブの購入について、仕様を再検討した結果、想定に比べて購入価格を安価に抑えることができたことにより、物品費について次年度使用額が生じることとなった。本年度に行うはずであった評価試験が、予期していなかった事態(装置故障およびスパイクの一時的な使用中止)により行えなかったため、その評価試験の一部を次年度に行う必要が生じたため。次年度使用額は、試料分離に用いる消耗品購入のための物品費や得られた研究成果発表のための旅費に用いる。試料の分離・分析に用いる消耗品購入のための物品費や、得られた研究成果発表のための旅費に用いる。
サバイビン-Hsp90複合体阻害剤による膀胱癌治療モデルの確立

【目的】癌特異的標的分子であるsurvivinおよび様々なoncogenic proteinをクライアントとするHsp90をターゲットとするsurvivin-Hsp90 complex inhibitor, shepherdinを用い、非浸潤性膀胱癌に対する膀胱内注入療法モデルを確立する。来年度、膀胱癌に対するshepherdinの治療効果について、さらに検証を進めていく予定である。
慢性期脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植による革新的治療法の開発

ラット脊髄損傷モデルの慢性期に対し骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈的移植を行い、治療効果を検討した。T9高位の脊髄を圧挫し、重度脊髄損傷モデルを作製した。損傷10週後にMSCを経静脈的に移植した。後肢の麻痺は移植翌週から改善が見られ始め、対照群よりも有意な回復を得た。移植したMSCの数%が損傷部に集積した。血液脊髄関門の機能は、損傷後11週が経過していても不安定であったが、MSCの移植により速やかに安定し、このことが移植後早期の麻痺の回復に寄与していると考えられた。また、微小血管系の新生、損傷軸索の側枝形成、脱髄軸索の再有髄化などを認め、MSCの作用が多段階に生じていることを確認した。脊髄損傷は複雑な病態生理を呈し、組織内の出血、虚血、浮腫などが惹起する微小循環の機能不全によって、血液脊髄関門の破綻し、組織内浮腫が生じることが神経機能障害の原因となる。私たちはこれまでに骨髄幹細胞移植が、脊髄損傷動物モデルに対して治療効果を有することを明らかにし、その内在するメカニズムは神経栄養・保護作用、軸索損傷の再生、脱髄軸索の再有随化、免疫調節作用、血管新生作用などと提唱してきた。しかし、これまでの研究は、急性期脊髄損傷を治療ターゲットとしており、多くの患者が現存する慢性期脊髄損傷に対する治療法の開発はほぼない。本申請では、脊髄損傷慢性期に対する新たな治療方法の開発を目指す。固定化してしまった慢性期病巣をさまざまな方法で修飾し、骨髄間葉系幹細胞(遺伝子組み換えを含む)移植と組み合わせることによって、今までにない革新的な治療法の開発を試みることを目的とするものである。現在までに、本研究費によって、ラット脊髄圧挫モデルを作成し、胸髄(Th10)レベルに直接損傷を加えるモデルの作成を行ってきた。ラット脊髄圧挫作成機器によって、コンピューター制御されたロッドをラット脊髄に落下させ、脊髄損傷を作成した。本システムは、与えるインパクトによって脊髄損傷の重症度が変化するために、本年度は、損傷程度と神経機能の相関に関わる基礎的データ、および、慢性期における行動学的データを収集してきた。これらの行動学的データは骨髄幹細胞移植を行ったのちの機能回復の程度を比較解析する際に重要なコントロールデータとなりうる。また、組織学的・生化学的な解析法を取り入れて、ヘマトキシリン・エオジン染色、免疫組織化学および電子顕微鏡学的方法によってコントロールデータを採集してきた。以上のように、補助金は補助条件に従って、有効に使用されている。脊髄損傷は複雑な病態生理を呈し、組織内の出血、虚血、浮腫などが惹起する微小循環の機能不全によって、血液脊髄関門が破綻し、組織内浮腫が生じることが神経機能障害の原因となる。本申請では、脊髄損傷慢性期に対する新たな治療方法の開発を目指し、骨髄間葉系幹細胞(遺伝子組み換えを含む)の経静脈的移植によって、今までにない革新的な治療法の開発を試みることを目的とするものである。現在までに、本研究費によって、ラット脊髄圧挫モデルを作成し、胸髄(Th10)レベルに直接損傷を加えるモデルを作成している。行動評価の解析により、骨髄間葉系幹細胞移植群はコントロール群に比し、麻痺の改善が得られる傾向にある印象であり、今後は、動物数を増やし、統計的解析を行う予定である。また、モデルの脊髄組織を用いて、組織学的・生化学的な解析法を並行して行っており、免疫組織化学および電子顕微鏡学的解析を継続している。さらにMRIを用いた脊髄の画像解析を実施しており、移植により、脊髄神経線維の数の変化を解析している。ラット実験的脊髄損傷(脊髄圧挫)モデルを作成し、慢性期における行動学的・組織学的・生化学的解析を行っている。行動学的・組織学的・画像学的解析を実施しており、データの収集を順調に進めることができている。脊髄損傷(SCI)動物モデルに対し、骨髄間葉系幹細胞(MSC)を移植することで機能回復が得られるという報告が散見される。しかし、多くは急性期モデルを対象とした実験であり、慢性期モデルでの検討は少ない。今回、ラットSCIモデルの慢性期に対しMSCの経静脈的移植を行い、その治療効果、作用メカニズムについて解析を行った。雄SDラットのT9高位の脊髄をIHインパクターで圧挫し、重度SCIモデルを作製した。損傷10週後、無作為にvehicle群、MSC群に分け、前者には培養液のみを、後者にはMSC1000000個を大腿静脈より投与した。行動評価にはBBB scoreを用い、損傷20週後まで行動評価を行った。またGFP-MSCを用いてHoming効果の検討をした。損傷11週後にEvans blue (EvB)を静注し、脊髄組織内への漏出を評価することで、血液脊髄関門(BSCB)の機能を解析した。さらに、組織学的解析を行い、微小血管系・神経線維の修復について検討した。MSC群で、麻痺は移植後翌週から回復が見られ、vehicle群よりも有意に改善した。

静注したEvBは脊髄損傷部を中心とした組織内に漏出していたが、MSC群で有意に低量であった。慢性期であってもBSCBの機能は低下していたが、移植後に速やかに安定したことが、早期の回復に寄与していると考えられた。移植した細胞の約5.5%が損傷部へ集積しており、微小血管系の修復や錐体路・錐体外路のsprouting、損傷軸索の再有髄化も、MSC群で有意に高く発現していた。これらが協奏的に働くことで麻痺の回復に貢献していると考えられた。ラット脊髄損傷モデルの慢性期に対し骨髄間葉系幹細胞(MSC)の経静脈的移植を行い、治療効果を検討した。T9高位の脊髄を圧挫し、重度脊髄損傷モデルを作製した。損傷10週後にMSCを経静脈的に移植した。後肢の麻痺は移植翌週から改善が見られ始め、対照群よりも有意な回復を得た。移植したMSCの数%が損傷部に集積した。血液脊髄関門の機能は、損傷後11週が経過していても不安定であったが、MSCの移植により速やかに安定し、このことが移植後早期の麻痺の回復に寄与していると考えられた。また、微小血管系の新生、損傷軸索の側枝形成、脱髄軸索の再有髄化などを認め、MSCの作用が多段階に生じていることを確認した。ラット実験的脊髄損傷(脊髄圧挫)モデルを作成し、慢性期における行動学的・組織学的・生化学的解析を行っている。また、一部、骨髄幹細胞をラット実験的脊髄損傷モデルへ静脈内投与し、行動学的・組織学的解析を開始している。慢性期脊髄損傷に対する骨髄間葉系幹細胞移植群は麻痺の軽減が得られる印象である。今後は、動物数を増やし、機能回復が得られるかどうかに関して検討する。さらに、機能回復に貢献するメカニズムの詳細な解析を推進する予定である。さらに、研究計画に従って、慢性期脊髄損に対して、より治療効果が得られる骨髄間葉系幹細胞移植方法の開発を進める予定である。整形外科学慢性期におけるラット実験的脊髄損傷(脊髄圧挫)モデルの行動学的実験をはじめとする種々の解析に加えて、骨髄幹細胞移植を行ったラット実験的脊髄損傷(脊髄圧挫)モデルに対する行動学的実験をはじめとする種々の解析を行う。さらに、研究計画に従って、慢性期脊髄損に対して、より効果的な骨髄幹細胞移植方法の開発を進める予定である。今後も動物数を増やすことで検証を進め、機能回復に貢献するメカニズムの詳細な解析に必要な実験を継続する必要があるため。動物代、試薬代、培養器具代などの消耗品に使用する予定である。
インド農村社会における不妊をめぐる生殖医療と多元的医療実践に関する人類学的研究

最終年度にあたる今年度は、インド西部マハーラーシュトラ州プネー市および近郊農村における短期間の補足的な現地調査を行った。具体的には、都市部における医療関係者への追加調査および診察などの参与観察、農村のフォローアップ、祭礼の参与観察などである。こうした現地調査に加えて、通年で行った文献の読解・分析を通して得られた今年度の研究成果としては、主要学会誌である「南アジア研究」を始めとする学会誌に学術論文を2本、「季刊民族学」を始めとする商業誌への寄稿文を2本、『医療人類学のレッスン』(共著)という学部生向けの医療人類学の教科書を1冊、執筆、刊行したことがあげられる。また、国内学会においても、日本文化人類学会を始めとする学会において4度の口頭発表を行った。これらの研究発表では、参加者からの多くの有益なコメントを頂戴することで、研究課題の学会におけるシェアと成果の還元が可能となった。いずれの論文・発表においても、インド社会における生殖医療技術をめぐる医師集団の言説分析および、インド調査村における民族誌的データの提示と分析を行うことによって、「インド農村社会における不妊をめぐる生殖医療と多元的医療実践に関する人類学的研究」という本研究課題の深化につとめたものである。1年を通した研究活動によって、現地調査による民族誌データの収集、および学会での研究発表、学会誌への論文投稿による研究成果の還元、という初年度にたてた研究目標を達成することができた。(1)論文発表の概要今年度における学会誌への論文発表として、学術論文を3本、商業誌への寄稿文を2本執筆した。また、国内学会において4度口頭発表を行い、多くの有益なコメントを頂戴することで、研究課題の学会におけるシェアと研究成果の還元を行なった。いずれの発表においても、インド社会における生殖医療技術をめぐる医師集団の言説分析および調査村における民族誌的データの提示を行い、研究課題の深化に勤めたものである。(2)海外調査および国際学会における研究発表の概要18年9月にはイギリスにおいてロンドン大学およびウェルカム医学史図書館など関連緒機関を訪問し、イギリス植民地期の医療政策に関する資料収集を行なった。さらに、ランカスター大学で開催された国際学会Gender and Spiritual Praxis in Asian Contextにおいて、研究成果の一部を'Gender, Caste and Childlessness : Religious treatment seekingbehaviour in Rural India'というタイトルで発表した。11月には、インド・プネー大学で開催された世界アーユルヴェーダ会議に出席するためインド・マハーラシュトラ州を訪問し、さらにプネー市内および近郊農村においてインド農村社会における不妊に関する補足調査を行なった。また、首都デリーの医学調査委員会を訪れ、インドにおける不妊治療に関する生殖医療技術の規制についての資料を閲覧・入手した。これらの活動によって、現地調査による民族誌データの収集および国際・国内学会での研究発表、学会誌への論文投稿による研究成果の還元という当初の目標を達成することができた。
刺激応答型ユニマーミセルを用いた内分泌撹乱化学物質の分離システムの開発

2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸のナトリウム塩(NaAMPS)と12-メタクリルアミドドデカン酸のナトリウム塩(NaMmD)の共重合ポリマーを高分子基材にグラフトし、代表的な内分泌撹乱化学物質のビスフェノールA(BPA)の吸・脱着特性を検討した。このポリマーはpHが10以下になるとミセルを形成し、BPAを吸着した。一方、pH 10以上ではミセルが崩壊し、BPAが脱着された。BPAはミセル内の疎水性ドメインに安定に保持され、その量はNaAMPSとNaMmDとの共重合比およびpHの変化速度に依存した。これらの結果から、分離システム開発に関する指針が得られた。本研究は、刺激に応答して単一高分子鎖でミセルの形成(ユニマーミセル)および崩壊を起こす特殊なポリマーをプラズマ開始重合法によって基材にグラフトし、低濃度の内分泌撹乱化学物質の新規な分離システムを構築することを目的としている。本年度は、pH応答型ポリマーである12-メタクリルアミドドデカン酸のナトリウム塩(NaMmD)と2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸のナトリウム塩(NaAMPS)の共重合ポリマーに関して、pHに応答したミセルの形成・崩壊を確認すること、このポリマーをポリプロピレン(PP)不織布ヘグラフトし、代表的な内分泌撹乱化学物質のビスフェノールA(BPA)のpHスイングによる吸・脱着特性を検討することを目的とした。このポリマーはpHが10以下になるとミセルを形成し、pHがさらに低下するとミセル同士の凝集体を形成するが、これらはNaAMPSとNaMmDとの共重合比に大きく依存した。このポリマーのPP不織布へのグラフトは問題なく行われ、これを用いてBPAの吸着を検討したところ、ミセルが形成されるpH以下でBPAの吸着が見られたが、ミセルに取り込まれるものと、単純に疎水性相互作用によってミセル周辺の疎水基に吸着しているものがあることが見出された。低濃度のBPAに対しては疎水性相互作用による吸着分離は難しく、低濃度の分離にはBPAをミセル内へ取り込む必要がある。そこで、ミセルへの取り込み量を増加させる方法について検討した結果、NaAMPSとNaMmDの共重合比およびミセルの形成速度が重要なことを見出した。特に、pHを徐々に変化させてミセルの形成速度を制御するとミセルへの取り込み量が著しく増加することを見出した。また、pHを増加させてミセルを崩壊させると、取り込んだBPAはほぼ完全に放出された。これらの結果から、低濃度のBPAの吸着分離に関する指針が得られた。昨年度は、pH応答型ポリマーである12-メタクリルアミドドデカン酸のナトリウム塩(NaMmD)と2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸のナトリウム塩(NaAMPS)の共重合ポリマーをポリプロピレン(PP)不織布へグラフトし、代表的な内分泌撹乱化学物質のビスフェノールA(BPA)のpHスイングによる吸・脱着を確認すると共に、BPAの吸着にはミセル内部に取り込まれるものとミセル周辺の疎水基に疎水性相互作用で吸着するものがあることを見出した。さらに、低濃度のBPAの吸着にはミセル内部へ取り込まれることが重要であるが、ミセルへの取り込みの増加にはpHを徐々に変化させることが効果的であることをみいだした。今年度は、これを具現化する方法として、従来の不織布に代わってポリオレフィン多孔体(厚さ4mm)にポリマーをグラフトし、BPA溶液を透過させる方法を提案し、その効果を検証した。その結果、透過させるBPA溶液のpHを適切に選ぶとミセルへの取り込み量が増加することを確認した。これは、液の透過方向にイオン交換によるpHの勾配ができ、多孔体内部でpHが徐々に変化することによると考えられる。また、pHに代わって温度応答型のポリマーを調整するために、感温性のNIPAMのマクロモノマーの合成を行い、マクロモノマーの分子量の調整法を確立すると共に、温度応答型ミセル形成ポリマーとして検討予定のNaAMPSとNIPAMマクロモノマーとの共重合ポリマー合成のための予備検討を行った。本研究は、刺激に応答して単一高分子鎖でミセル(ユニマーミセル)の形成および崩壊が起こる独特なポリマーを用いて、低濃度内分泌撹乱化学物質の新規な分離システムを構築することを目的としている。

これまでに、pH応答型ミセル形成ポリマーの12-メタクリルアミドドデカン酸のナトリウム塩(NaMmD)と2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸のナトリウム塩(NaAMPS)の共重合ポリマーを基材にグラフトし、ビスフェノールA(BPA)の分離を検討し、pHスイングによる吸脱着が可能なこと、BPAの吸着にはミセル内に非常に安定に取り込まれるものとミセル外の疎水性部分に吸着するものがあること、ミセル内への取り込み量はpHを徐々に変化させると増加することなどを見いだした。さらに、pHを徐々に変化させる方法として、このポリマーをグラフトした多孔体にBPA溶液を透過させる方法を検討し、その効果を実証した。本年度は、BPAの吸着量に及ぼすNaAMPSとNaMmDの共重合比の影響を検討した。また、感温性のN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)オリゴマーとNaAMPSの共重合ポリマーを合成し、温度応答型ユニマーミセル形成の可能性を検討した。NaMAPSとNaMmDの共重合比の影響については、NaMmDの割合が多くなると、BPAの吸着に最適なpHが高pH側にシフトし、BPAの吸着量は増加するがミセルへの取り込み量が低下すること、一方、NaMmDの割合が低下すると、最適なpHが低pH側へシフトし、BPAの吸着量もミセルへの取り込み量も低下すること、NaAMPSとNaMmDを等モル共重合した場合が最もミセルへの取り込み量が多いことを見いだした。また、温度応答型については、NIPAMオリゴマーの分子量を適切に制御すると、温度応答型ユニマーミセル形成の可能性があることをチンダル光の観察によって確かめた。
静脈内皮からリンパ内皮への分化と管腔形成に伴う内皮細胞の分子特性と形態変化

ゼブラフィッシュとメダカを用いて、静脈内皮からリンパ内皮細胞への分化に伴う形態変化と分子特性の変化を関連づけて追究した。1.ゼブラフィッシュとメダカの胚から成魚に至る全てのリンパ管系の詳細な発生解剖アトラスの編纂に必要なデータを取得した。2. Arrey Tomography法により静脈内皮からリンパ内皮への形態変化過程を追究した。3. VEGFR3(flt4)ミュータント系統の頸部リンパ嚢の分化を制御するメカニズムを解析した。本研究は小型魚類をリンパ管研究の実験モデルとして確立すると同時に、静脈内皮からリンパ管内皮前駆細胞そしてリンパ嚢胞、さらにそれらが融合して管腔形成にいたるまでのリンパ内皮細胞の形態変化と分子特性の変化を関連つけて追究する。さらに、リンパ内皮の分化とリンパ管の形態形成メカニズムに関わる分子の発現と機能の解明を目的とする。研究成果1.胚について、リンパ管内皮あるいはその前駆細胞がEGFPを発現するfli-1トランスジェニックゼブラフィッシュとVEGFR3のプロモーターでEGFPが発現するトランスジェニック透明メダカについて,リンパ内皮細胞の分化,リンパ嚢からリンパ管の形成,胸管が静脈角に開口し機能を開始するまで、二光子顕微鏡システムにより生体イメージングを行った。2.幼魚・若魚・成魚について、リンパ管内皮が異物を取り入れる性質を利用してリンパ管系を色素で標識する方法を開発して標本を作製し、発生解剖アトラスを編纂してその一部を公開した。3.ゼブラフィッシュのメダカについて免疫組織化学法によりProx1とTie-2の発現を解析した。4.リンパ内皮の分化関わる候補遺伝子flt4, lyve1, prox1の働きをMorpholino micro injectionで阻害し、flt4について明確な阻害効果を確認した。5.ゼブラフィッシュとメダカの内臓リンパ管内皮の脂肪吸収・運搬機能を生理学的に検討した。6.硬骨魚類(肉鰭類)の静脈内皮からリンパ管内皮への分子特性の変遷を検証する目的から、オーストラリア肺魚のリンパ管内皮について、免疫組織化学法によりProx1とTie-2の発現解析を行った。本研究は小型魚類をリンパ管研究の実験モデルとして確立すると同時に、静脈内皮からリンパ管内皮前駆細胞そしてリンパ嚢胞、さらにそれらが融合して管腔形成に至るまでのリンパ内皮細胞の形態変化と分子特性の変化を関連づけて追究する。さらにリンパ内皮の分化とリンパ管系の形態形成メカニズムに関わる分子の発現と機能の解明を目的とする。研究成果1.リンパ管内皮が異物を取り入れる性質を利用して開発した幼魚・若魚・成魚リンパ管系を標識する方法により標本を作製し、前年度に引き続きゼブラフィッシュとメダカの発生解剖アトラスを編纂して結果を公表した。2.走査型電子顕微鏡連続断面観察による生物組織三次元再構築(Arrey Tomography法、岩手医科大学バイオイメージングセンターとの共同研究)により、静脈内皮からリンパ内皮への連続した形態変化過程を細胞レベルで詳細に追究した。3.前年度のMorpholino Microinjectionによるリンパ管内皮の分化の阻害実験で、候補遺伝子flt4について明確な阻害効果を確認した。下田研究室との共同研究flt4を欠損するゼブラフィッシュ系の確立を試みた。今年度の後半、眞昌寛博士(米国Lawson Lab.)が同系を既に確立していることが分かり、眞博士との共同研究として同系の解析に着手した。1.リンパ管内皮が異物を取り入れる性質を利用して開発した幼魚・若魚・成魚リンパ管系を標識する方法により標本を作製し、ゼブラフィッシュとメダカの発生解剖アトラスに必要なデータを取得し結果を公表した。これまでに得た全てのデータを解析しアトラスとして編纂中。胚から成魚に至るリンパ管系の詳細な発生解剖アトラスを編纂している。このアトラスがリンパ管系に奇形を生じた劣勢突然変異体の大規模なふるい分け(large-scale forward-genetic screening)とその原因遺伝子の追究を可能にし、分子遺伝学的リンパ管研究を大きく推進すると考えている。2.米国マサチューセッツ大学の眞昌寛博士(Lawson Lab.)が確立したリンパ内皮細胞の増殖と移動のコントロールに関与するチロイシンキナーゼ受容体VEGFR3(flt4)に欠損を持つゼブラフィッシュのミュータント4系統のリンパ管系について解析した。これまでに、我々はゼブラフィッシュで体幹部の胸管系を中心に研究が進め、体幹部胸管叢の形態形成過程においてケモカインのシグナルがその解剖学的構造を段階的に組織化する役割を果たしていることを明らかにした。本年度の研究により、ゼブラフィッシュ頸部リンパ嚢の形成過程についてライブイメージングによる解析を進めた。VEGFR3に欠損を持つゼブラフィッシュのミュータント成魚を解析したところ、貧弱ではあるが頭部では野生種と同様の形態を示す主要リンパ集合管系が認められ、体幹部では貧弱な胸管系(他の主要リンパ集合管系は欠損)が認められた。リンパ集合管を構成する内皮細胞の起源を探ったところ頸部リンパ嚢由来であった。この結果は“リンパ内皮の由来とその分化を制御するメカニズムが頸部と胸部では異なる可能性を示唆した。

3. VEGFR3(flt4)ミュータント系統の頸部リンパ嚢の分化を制御するメカニズムを解析した。ArreyTomography法による静脈内皮からリンパ内皮への形態変化過程の追究とflt4を欠損するゼブラフィッシュ系の解析は本研究が発展して新たに加わったものであり、予定していた以上の量の成果をもたらしたため、その処理に時間を費やした。発生学・形態形成学1.ゼブラフィッシュとメダカの発生解剖アトラスを編纂する3.flt4を欠損するゼブラフィッシュ系の解析を進める。本研究は小型魚類をリンパ管研究の実験モデルとしてリンパ内皮細胞の形態変化と分子特性の変化を関連つけて追究することにあるが、本年度は形態変化の解析(研究実績の1,2)に主眼を置いたため、分子特性の変化(研究実績の3,4,5,6)の解析がやや遅れている。年度の後半、眞昌寛博士がflt4を欠損するゼブラフィッシュ系を既に確立していることが分かり、下田研究室と進めていた計画と調整する必要が生じたため。平成25年度に引き続いて、正常な内皮細胞の形態・分子特性の変化を解明する。下田研究室との共同研究で、flt4を欠損するゼブラフィッシュ系の確立を予定していたが、眞昌寛博士(米国Lawson Lab.)が同系を既に確立していることが分かり、眞博士との共同研究として同系の解析に研究計画を変更し実行する。25年度は形態変化の解析(研究実績の1,2)に主眼を置いたため、分子特性の変化(研究実績の3,4,5,6)の解析がやや遅れたため。26年度は分子特性の変化(研究実績の3,4,5,6)に主力を置き、遅れを取り戻す。
血管安定化過程におけるVEGF/VEGFR2シグナルの役割

生体内のあらゆる組織はその発生過程において血管がくまなく張り巡らされる。この血管成長を担っているのが、血管内皮成長因子(VEGF)と、その受容体であるVEGFR2のシグナルである。VEGFシグナルの発芽、血管増殖に関する役割は広く認知されているものの、血管の安定化・成熟化の過程に関してはよく知られていない。本研究は、最新の遺伝子改変マウス、可視化テクノロジーを駆使しVEGFシグナルの血管安定性維持における役割を明らかにすべく遂行された。具体的には神経特異的VEGF欠損マウス網膜では、既に成熟した血管の安定性が損なわれており、この表現型は血管内皮特異的VEGFR2欠損マウスでも再現された。血管内皮最長因子(Vascular endothelial growth factor: VEGF)シグナルの血管新生における重要性は、これまでの多くの基礎研究により確立されており、既に臨床の場においてVEGF阻害による抗血管新生療法が、有意な制がん効果を有するということも判明している。しかしながらその延命効果については、がんの種類によっては極めて限定的であり、マウスなどの動物実験における結果と比較すると、VEGF阻害の効果はかなり軽微なものと言える。さらには、脳出血・消化管出血などの副作用も強く、これまで十分に解析されてこなかった、in vivoにおけるVEGFシグナルの血管内皮細胞に対する影響について、最新のgenetic toolを駆使して再度解析しなおす必要があると考えられる。これを背景に、本研究における中心的なプロジェクトとして、当研究室の作成した新規タモキシフェン誘導性血管内皮特異的Creマウスと、血管新生に必須の受容体であり、VEGFのメイン受容体であるVEGFR2のfloxマウスとの交配する。得られたマウスを用いて、出生後血管内皮VEGFR2をノックアウトし、その血管形成の変化を、最新の可視化テクノロジーを駆使して、徹底的な形態学的観察が行われている。当該変異マウスのこれまでの解析結果により、血管の新たな成長の停止だけではなく、既存血管の密度の著しい減少、つまり安定化した後の血管の退縮も著明であった。これはVEGFR2シグナルが血管成長だけではなく、成熟した血管の安定性の維持にも機能していることを示唆している。1まず、タモキシフェン誘導性血管内皮特異的VEGFR2ノックアウトマウスに対し、生後1日目からタモキシフェン投与を行ったところ、生後6日目網膜において、血管形成が全く見られなかった。この結果は、他の類似のタモキシフェン誘導性血管特異的CreラインにおけるVEGFR2のノックアウトで得られた表現型に比べて、明らかにシビアな表現型であり、網膜血管形成において血管内皮細胞におけるVEGFR2シグナルが極めて重要であることが示されるとともに、類似のマウスより遥かに効率よく血管内皮で遺伝子をノックアウトできることが示された。次に、生後3日目からのタモキシフェン投与に変更し、既に完成した血管網に対するVEGFR2欠損の影響を調べた。その結果、血管が生後3日目以降成長しないばかりか、既存血管の密度の著しい減少、つまり安定化した後の血管の退縮も見られた。これは成熟血管内皮細胞に対して、VEGFR2シグナルがその安定性の維持に機能していることを示唆している。また、無血管領域のアストロサイトのみで発現するとされるVEGFの発現をより詳細にin situ hybridizationで解析した結果、アストロサイトだけではなく、神経からもVEGFが発現することを見出した。興味深いことに、神経におけるVEGFの発現は、血管が張り巡らされた場所でも見られ、アストロサイト由来VEGFとは異なる役割を有することが示唆された。これらの結果は神経由来VEGFの成熟血管の安定性への寄与を示唆するものであり、今後の研究を展開する上で重要な指標となっている。上記の理由から、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。生体内のあらゆる組織はその発生過程において、一部の無血管組織を除き、動脈・静脈・毛細血管からなる血管ネットワークがくまなく張り巡らされる。この血管成長を担っているのが、血管内皮成長因子(VEGF)と、その受容体である2型血管内皮成長因子受容体(VEGFR2)のシグナルである。VEGFシグナルは血管発生だけでなく、がんの血管新生にも大きな役割を果たしており、VEGFの働きを阻害する抗VEGF中和抗体(ベバシツマブ)が2004年、米国FDAにより認可され、VEGF阻害剤のがん抑制効果が世界的に脚光を浴びている。その一方、VEGFシグナルの単一細胞レベルでの血管内皮細胞の挙動をはじめとする基礎的な知見がやや不十分なまま、応用研究が先行してきた傾向が指摘されている。特にin vivoにおいては血管内皮細胞1個1個の挙動に対する作用はcontroversialであり、in vitroとin vivoで異なる事象も観察される。VEGFシグナルの発芽、血管増殖に関する役割は広く認知されているものの、血管の安定化・成熟化の過程に関してはよく知られておらず、透過性亢進作用からむしろ血管を不安定化させるとされている。この数年で、組織、個体のイメージング技術、遺伝子工学のテクノロジーは飛躍的な進化を遂げた。本研究は、これらの最新のテクノロジーを駆使し、また申請者らの確立した血管可視化技術、および遺伝子改変マウスを用いてVEGFシグナルの血管安定化における役割を明らかにすべく遂行された。具体的には神経特異的、またはグリア特異的VEGF欠損マウス網膜では、既に成熟した血管の安定性が損なわれており、この表現型は血管内皮特異的VEGFR2欠損マウスでも再現された。

VEGFはVEGFR2を介して血管安定性を正に制御するという、これまでのパラダイムとは逆の作用があることを証明した。生体内のあらゆる組織はその発生過程において血管がくまなく張り巡らされる。この血管成長を担っているのが、血管内皮成長因子(VEGF)と、その受容体であるVEGFR2のシグナルである。VEGFシグナルの発芽、血管増殖に関する役割は広く認知されているものの、血管の安定化・成熟化の過程に関してはよく知られていない。本研究は、最新の遺伝子改変マウス、可視化テクノロジーを駆使しVEGFシグナルの血管安定性維持における役割を明らかにすべく遂行された。具体的には神経特異的VEGF欠損マウス網膜では、既に成熟した血管の安定性が損なわれており、この表現型は血管内皮特異的VEGFR2欠損マウスでも再現された。1上記のこれまでの研究成果を踏まえたうえで、今後の研究の展開としてはリガンド側、VEGFの発現の欠損の影響についてコンディショナルノックアウトマウスを用いて検討する。上述のように網膜におけるVEGFの発現細胞は、主にグリア細胞の一種であるアストロサイトであるのはよく知られている。アストロサイト由来のVEGFは低酸素依存性に発現し、血管が到達するとその発現は抑えられる。この濃度勾配により、網膜血管は一方向性の(無血管領域への)成長が可能となるとされる。またTip細胞の発芽も、このアストロサイト由来VEGFに依存するとされている。本年度の研究では、神経特異的にVEGFをノックアウトしたマウスであるChx10-Cre+Vegfaflox/floxマウスに関し、その網膜血管の表現型を形態学的に観察する。そのパラメーターとして、Tip細胞および糸状仮足の数、BrdUの取り込みにより、いわゆる血管新生の程度を、またCollagen IV(ColIV)/ IsolectinB4(iB4)染色により血管の安定性についても検討する。ColIV陽性iB4陰性のempty sleeve(そこに血管があったが退縮したことを示す構造物)が増加している場合、血管の安定化不全が存在することが示される。以上の研究と昨年度までのタモキシフェン誘導性血管内皮特異的VEGFR2ノックアウトマウスの結果を合わせて考えることにより、発生期網膜血管形成過程において、神経由来のVEGFがVEGFR2のシグナルを介して、血管成熟を正に制御しているかどうかを検討する。血管生物学
安定なケイ素、ゲルマニウム、スズ二価化合物を基盤とする異常分子の合成

本研究計画では、最近受入研究者らが安定化合物として合成することに成功したシリレンなど高周期14族元素二価化合物を機軸化合物として、これまで未知のさまざまな安定高周期14族元素不飽和化合物に誘導し、その構造と反応性を明らかにしようとしている。この研究での合成目標化合物は、ケイ素-酸素二重結合化合物、シラアレン誘導体、分極したジシレンなど、特異な電子状態、構造を持つ一群の化合物であり、これまでまったく知られていない構造様式の分子も含まれている。昨年度までに安定シリレンといくつかのポリハロアルカンとの付加反応により、ケイ素上および炭素上にハロゲンを有する化合物の合成できることを確認していた。本年度は、安定シリレンのフェニルトリクロロシランのケイ素-塩素結合への挿入によって得られる1,1,2-トリクロロジシランのカリウムグラファイトを用いる還元によって、目的とするケイ素-ケイ素二重結合化合物を得ることはできなかったが、興味深いビシクロ[1.1.0]ブタン化合物を得、X線構造解析によって、その分子構造を決定した。このものは橋頭位ケイ素上にフェニル基をもち、このため溶液中で、これまで知られているビシクロ[1.1.0]テトラシランに比べて、容易に環の反転を起こす。またこのものの熱反応によって、低収率ながらエキソケイ素-ケイ素二重結合をもつ三員環状化合物、すなわち、ペルシラメチレンシクロプロパン誘導体の得られることが明らかになった。シリレンのハロシランへの挿入-引き続く還元法はケイ素-ケイ素不飽和化合物合成の一般的方法を提供するものである。
売薬需要の実態からみた明治期日本人の健康状態とその地域的特質

本研究の目的は、明治期日本各地における売薬の需要を検討し、当時の日本人がいかなる健康状態であったかその地域的特質を明らかにすることである。主たる資料として配置売薬における「売薬懸場帳」を用いるとともに、各地に存在する売薬製造所における売薬製造および営業関係資料の収集・分析を行った。とくに「売薬懸場帳」に関しては現今の医薬政策下において伝統的な家庭配置事業からの離脱が進行し、それに伴い歴史的「懸場帳」資料の散逸が進むなかで、当該資料の散逸防止を訴える意図もあった。資料分析および考察の結果、次の諸点が明らかになった。(1)現状ではすでに「懸場帳」資料の散逸が進み、同資料の対象地域を似て同一時点での日本全土を網羅することは難しい。しかし、得られた資料からみると明治昭和期における売薬需要には地域的特質が認められる。具体的には利根川下流域を中心とする膏薬多需要地域や九州にみられる目薬多需要地域である。(2)各地に共通する事項も認められ、その代表例が明治期における風邪薬需要の少なさである。なお、売薬資料の散逸防止、保存については今後いっそう力を注ぐ必要がある。本研究は売薬の「懸場帳」を主たる資料とし、国内各地域における売薬の需要を具体的にみてゆくことによって、明治期の日本人がどのような健康あるいは傷病の状態であったのかその地域的特質を明らかにすることを目的とした。本年度は、明治期を中心に配置売薬および店舗での売薬販売が行われていた地域を抽出し、当該地域における「懸場帳」資料に関する情報の収集および売薬の製造と販売の実態に関する聞きとり調査を行った。その結果、(1)売薬製造地域は都市部のみではなく、市街地から離れた村落部においても相当数が立地すること(2)風邪薬の生産および消費は大正期以降増加するが、明治期には比較的少ないとみられること(3)「懸場帳」による売薬需要地域は今日の日本国内にとどまらず樺太、朝鮮、旧満州に及ぶ地域の情報も得られるが、売薬業者のあいつぐ廃業、転業により「懸場帳」の散逸が著しく進みつつあること、などが判明した。本研究により、従来から着目されつつあった富山、奈良、滋賀、佐賀という四大産地以外の状況が明らかになることは、今後それら売薬の需要、とくに地域的消費の問題を解くうえで重要な資料となるものである。(1)現状ではすでに「懸場帳」資料の散逸が進み、同資料の対象地域を以て同一時点での日本全土を網羅することは難しい。しかし、得られた資料からいると明治昭和期における売薬需要には地域的特質が認められる。
CD40を標的としたEBウイルス感染細胞制御に関する研究

上皮細胞へEBウイルス(EBV)が感染することでCD40リガンド(CD40L)が発現誘導され、上皮細胞上に存在するCD40と相互作用をすることでアポトーシス回避、細胞増殖に働いていることが示された。また、このCD40シグナルを阻害すると感染細胞のアポトーシス回避、細胞増殖が抑制された。これにより、EBV感染可能な細胞の全て(上皮細胞、B,T,NK細胞)でCD40シグナルが感染細胞の標的分子となりうることが明らかとなった。これまで申請者らはリンパ球系におけるEBV感染によるCD40,CD40リガンド(CD40L)発現とその機能解析を行ってきているが、残るEBV感染宿主細胞として報告される上皮細胞へのEBV感染におけるCD40シグナルの果たす役割解明についても進めて行く。その成果は、EBV関連胃癌や上咽頭癌などのEBV関連主要の感染細胞増殖制御や感染成立機序の解明につながる可能性が期待される。そして、リンパ球系におけるEBV感染やそこでのCD40シグナルの果たす役割と上皮系におけるEBV感染やCD40シグナルの果たす役割についての比較検討を行うことを通し、EBVのライフサイクル解明の可能性も期待される。上皮細胞へのEBV感染におけるCD40,CD40Lの発現解析およびCD40シグナル伝達機構解析を行った。in vitroでの上皮細胞へのEBV感染効率は25%程度のため、申請者らはEBV陰性胃癌細胞株(AGS,MKN28,MKN74)にG418でEBV感染細胞を選択的に樹立できる組換EBVを感染させ、EBV陽性上皮細胞を樹立した。樹立された細胞と非感染細胞からRNAを抽出しRT-PCR法を用いてCD40,CD40Lの発現とEBV遺伝子の発現を解析した結果、EBV感染により上皮細胞上にCD40とCD40Lが共発現誘導していた。一方、胃癌細胞株(AGS,MKN28,MKN74)に非組換型のEBVを感染させ、感染細胞とCD40,CD40L発現の関係を感染後24時間、48時間でin situハイブリダイゼーション法により感染成立と発現の相関関係を解析したところCD40は常に上皮細胞上に発現しているがCD40Lが感染24時間以内に発現誘導されることが示された。また、この発現誘導されたCD40LとCD40の相互作用を阻害すると細胞増殖が低下しアポトーシス抵抗性も低下することが示された。このことからCD40シグナルを標的としたEVウイルス感染細胞制御はリンパ球系の感染細胞と同様に、上皮感染細胞でも有用であることが示され、全てのEBウイルス感染細胞においてその増殖を制御できる可能性が示された。EBV感染細胞におけるCD40L-CD40相互作用の様式の決定EBV感染BおよびT,NK細胞にはCD40LとCD40が共発現している。両分子の相互作用の様式として、1)隣り合う細胞表面の分子が会合する、2)同一細胞上の両分子が会合する、3)CD40Lが分泌される、の3つの可能性が考えられる。そこで、両分子を蛍光染色し共焦点レーザー顕微鏡で観察することにより、両分子が同一細胞上で共局在するか否かを決定した結果、1)2)3)のいずれも示された。また、両分子が共免疫沈降した。CD40LとCD40が同一細胞上で会合する場合は、一方の分子の発現により、他の分子の発現の局在が影響を受けて変化する可能性がある。そこで、CD40のみを発現するprimaryB細胞やEBV陰性B細胞株(たとえばRamos細胞)、あるいはCD40Lのみを発現するprimary T細胞やEBV陰性T細胞株(たとえばJurkat細胞)にEBVを感染させ、それぞれCD40LあるいはCD40を発現させた後、両分子の細胞表面における局在を共焦点レーザー顕微鏡で検討した結果、細胞の中には幾つかの箇所での強い局在を示したものがあり両分子が会合していることが示された。EBV関連のリンパ腫を初めとした疾患においてCD40とCD40Lの葬儀御作用を阻害することで増殖・アポトーシス抵抗性を阻害できる可能性が示された。
加速器BNCTの研究-しきい値近傍^7Li(p,n)直接中性子の標準照射モード-

治療現場からの要望が高まりつつある加速器中性子源を用いたホウ素中性子捕捉療法(BNCT)実現のため、照射場調整部が小型化できるため照射体系設定の自由度が高いという長所を持つしきい値近傍^7Li(p,n)直接中性子利用の研究を行った。まず、本研究に必要不可欠な中性子及びγ線の模擬計算手法の有効性は、中性子及びγ線の角度依存性に着目し、人頭ファントム内線量分布の形や、その強度の陽子エネルギー及びターゲット-ファントム間距離による変化に重点をおいて示した。次にこの計算手法により、BNCTに重要な^<10>B(n,α)^7Li反応線量の寄与を大きくするために導入したBoron-Dose Enhancer (BDE)を用いた場合の照射特性を検討した。具体的には、陽子ビーム径を変更した際の特性を、(1)治療線量条件を満たす生体内領域の深さ、(2)加速器に必要とされる陽子電流値、(3)それに対するLiターゲットでの発熱密度を指標として調べた。陽子ビームは1.900MeVと仮定した。その結果、LiターゲットアッセンブリーとBDEの距離38mmの体系において人頭ファントムと同程度までの陽子ビーム径について、陽子ビーム径が大きくなるほど、薄いBDEで治療線量条件を満たす領域深さを拡大でき、Liターゲット発熱密度が減少するという長所を見出した。一方必要陽子電流は大きくなり、都合が悪いことを明らかにした。このとき、例えば18cmφ陽子ビームに対して、Liターゲット発熱密度が139W/cm^2と冷却可能性が予想される値であるとの知見を得た。本研究で得たLiターゲット発熱密度は、システム設計において重要なターゲット冷却系を考える際の目安としても利用できる。また、必要な陽子電流は概ね1020mAで、陽子エネルギー広がりは±10keV程度まで許容できることを明らかにした。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)において治療選択性の決め手となる^<10>B(n,α)^7Li反応線量の寄与を大きくするために、しきい値近傍^7Li(p,n)直接中性子利用において導入したBoron-Dose Enhancer (BDE)による特性の検討を行った。具体的には、このうち陽子ビーム径を変更した際の特性を、(1)治療線量条件を満たす生体内領域の深さ、(2)加速器に必要とされる陽子電流値、(3)それに対するLiターゲットでの発熱密度を指標として調べた。ここで、陽子ビームは1.900MeVで、かつ、Liターゲットに一様な強度分布で入射すると仮定した。その結果、LiターゲットアッセンブリーとBDEの距離38mmの体系において人頭ファントムと同程度までの陽子ビーム径について、陽子ビーム径が大きくなるほど、薄いBDEで治療線量条件を満たす領域を拡大でき、かつLiターゲットの発熱密度が減少するという長所があることがわかった。実際の陽子ビーム径選択に当たっては、技術的に実現できる陽子電流と除熱能力を踏まえた上で、TPDを大きくする観点が現実的と考えられる。なおこのとき、例えば18cmφ陽子ビームに対して、Liターゲット発熱密度が139W/cm^2と冷却可能性が予想される値であるとの知見を得た。
ヘテロクロマチン構造の確立と維持を制御する分子機構

本研究では、真核生物の染色体機能やエピジェネティックな遺伝子発現制御に重要なヘテロクロマチンが、どのように確立・維持されるのか、そのメカニズムの解明を目指した。クロマチン研究の優れたモデルである分裂酵母を用いた遺伝学的なスクリーニングによって、新規RNAi関連因子としてErs1とDsh1を単離し、詳細な解析からそれらがRNAi経路のエフェクター複合体をリクルートし、siRNAの産生を促進することでヘテロクロマチン形成に関与している事を明らかにした。本研究では、優れたモデル生物である分裂酵母を用いて、RNAi因子の機能解析とヒストンメチル化酵素複合体CtRCの解析を進め、ヘテロクロマチン構造確立の分子メカニズムを解明することを目的とし以下の研究を遂行した。【1】新規RNAi因子の機能解析:先行して実施した研究によって、機能未知のRNAi因子であるers1の変異体を単離し、この変異体の表現型がhrr1とclr4の発現によって抑圧されることを見出していた。本年度は、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法によって三者の関係を解析し、実際にErs1がHrr1と結合する事を明らかにした。また、Ers1はClr4とは直接相互作用しないが、その下流で働くSwi6/HP1と結合することを明らかにした。さらにChlP解析によって、Ers1とHrr1のヘテロクロマチン局在にSwi6が重要な役割を果たす事を明らかにした。以上の結果より、Ers1はSwi6とHrr1を含むRDRC複合体を結びつける仲介的な役割を果たす因子であることが強く示唆された。【2】CLRC複合体の機能とRNAi:ヒストンメチル化酵素であるClr4は、ユビキチン化に関わるCul4とともにCLRC複合体を形成しているが、そのユビキチン化活性がClr4の機能とどのように関連するのか、実際の標的分子も含めて明らかにされていない。本研究ではまずタグを付加したヘテロクロマチン関連因子を電気泳動で分離、検出し、その分子泳動度の変化からユビキチン化の候補となる因子をスクリーニングした。また実際にclr4やriklの変異によって候補因子のユビキチン化が変化するかどうか解析を行った。現在までに約50のヘテロクロマチン関連因子を検討し、複数の候補因子を同定した。これら候補因子が実際にCLRCによってユビキチン化されているかさらに検討を進める。【1】新規RNAi因子の機能解析遺伝学的なスクリーニングによって単離した2つの新規RNAi因子であるErs1, Dsh1について、酵母ツーハイブリッド法によって相互作用する因子を探索し、Dsh1と相互作用する因子としてRNAポリメラーゼIIの転写終結因子として知られているSeb1/Nrd1を同定した。この知見をさらに検証するため、酵母内でタグ付きのDsh1とSeb1を発現させ結合できるか調べたが、両者の強い相互作用を再現する事は出来なかった。また、Dsh1と結合する領域と推測されたSeb1のC末端側の領域に、ランダムに変異を導入して温度感受性変異株を単離してヘテロクロマチンとの関連を調べた。その結果、温度感受性変異株とサイレンシングの解除に強い相関は確認できなかった。以上の結果より、RNAポリメラーゼIIの終結因子であるSeb1がRNAi経路に関与する可能性は考えられるものの、ヘテロクロマチン構造形成への直接的な寄与は少ないことが示唆された。【2】CLRC複合体の機能とRNAiヒストンメチル化酵素であるClr4は、Rik1、Cul4とともにCLRC複合体を形成している。Cul4はユビキチンリガーゼ活性を有しているがその基質は未だ同定されていない。これまでの網羅的なスクリーニングによって、ユビキチン化される基質としてRNAポリメラーゼIIのサブユニットを含む複数のクロマチン因子を同定している。この知見をさらに検証するため、今年度はin vitroのユビキチン化反応系の開発を進めた。TAPタグを付加したRik1を酵母内で発現させ、アフィニティー精製法によってCLRC複合体を精製することができた。実際に精製CLRCをE1、E2と反応させる事で、in vitroのユビキチン化反応系の構築に成功した。【1】新規RNAi因子の機能解析セントロメアヘテロクロマチンのサイレンシング解除を指標にした遺伝学的なスクリーニングによって、昨年度までにヘテロクロマチン形成に関わる新規因子として、ers1+とdsh1+の変異体を単離した。本年度はそれぞれの因子の解析を引き続き行うことで、両者がRNAi経路に関わりsiRNA産生に重要な役割を果たす事を明らかにした。またRNAi経路におけるこれら新規因子の役割を解明するため、両者と相互作用する因子を酵母ツーハイブリッド法によって探索した。その結果、Dsh1がRNAポリメラーゼIIの転写終結に関わる因子と相互作用することを見出した。