hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
液体金属の固体金属中への高速浸透と液体金属脆化の多様性

本来延性である固体金属にある特定の液体金属を付着させて力を加えると,固体金属は延性を失い,脆性破壊するようになることは,液体金属脆化として知られている.アルミニウムと液体ガリウム,銀と水銀,銅と水銀など,特定の固体金属と液体金属の組み合わせでのみ液体金属脆化は起きる.本研究では,Al, Ag, Cu薄膜を蒸着でつくり,少量のGaまたはHgの粒を表面におき,粒界に浸透する速さを光学顕微鏡で測定した.また,引張試験片に低融点金属を一定時間付着し,除去してから引張試験を行い,最大応力,脆性破面の面積などを調べた.AlとGaの組み合わせでは温度を下げてGaが固体の場合も測定を行った.少なくとも本研究で対象にした3組の固体金属と低融点金属の組では,力をかけているときに表面に低融点金属があることは本質的ではない.付着させた金属が固体になった場合も含め,試験片に低融点金属を付着している時間が短いと試験片は延性であるが,ある時間以上の付着で試験片は脆化を始める.脆化を起こすまでに潜伏期間が存在し,潜伏期間は低融点金属の粒界への浸透速度の逆数に比例する.このことは,低融点金属(液体である必要はない)が固体金属の粒界に高速浸透し,粒界の強度を下げることで脆化が起きていること,浸透速度が脆化の速さを律速していることを示している.潜伏期間が存在することや,液体であることよりも浸透速度のほうが効くということは,液体金属脆性の特異性を議論する際に、時間ファクターも含めた議論が必要であることを意味する.本来延性である固体金属にある特定の液体金属を付着させて力を加えると,固体金属は延性を失い,脆性破壊するようになることは,液体金属脆化として知られている.アルミニウムと液体ガリウム,銀と水銀,銅と水銀など,特定の固体金属と液体金属の組み合わせでのみ液体金属脆化は起きる.本研究では,Al, Ag, Cu薄膜を蒸着でつくり,少量のGaまたはHgの粒を表面におき,粒界に浸透する速さを光学顕微鏡で測定した.また,引張試験片に低融点金属を一定時間付着し,除去してから引張試験を行い,最大応力,脆性破面の面積などを調べた.AlとGaの組み合わせでは温度を下げてGaが固体の場合も測定を行った.少なくとも本研究で対象にした3組の固体金属と低融点金属の組では,力をかけているときに表面に低融点金属があることは本質的ではない.付着させた金属が固体になった場合も含め,試験片に低融点金属を付着している時間が短いと試験片は延性であるが,ある時間以上の付着で試験片は脆化を始める.脆化を起こすまでに潜伏期間が存在し,潜伏期間は低融点金属の粒界への浸透速度の逆数に比例する.このことは,低融点金属(液体である必要はない)が固体金属の粒界に高速浸透し,粒界の強度を下げることで脆化が起きていること,浸透速度が脆化の速さを律速していることを示している.潜伏期間が存在することや,液体であることよりも浸透速度のほうが効くということは,液体金属脆性の特異性を議論する際に、時間ファクターも含めた議論が必要であることを意味する.本来延性である固体金属にある特定の液体金属を付着させて力を加えると、固体金属は延性を失い、脆性破壊するようになることは、液体金属脆化として知られている。アルミニウムと液体ガリウムは、液体金属脆化を起こす代表的な組み合わせである。多結晶Alの粒界に沿って液体Gaが8μm/s程度の速さで浸透することが、薄膜上に少量の液体金属をおき、薄膜中での浸透速度を測った実験、粒界のTEM観察、バルク試料のX線トポグラフィなどにより確認されている。液体金属原子の粒界への高速な浸透が、多結晶Alでの液体金属脆化の原因と考えられている。しかし、液体金属原子の固体金属中への高速浸透が、液体金属脆化をおこす固体金属と液体金属の組に共通するものかどうかは明らかではない。銅や銀は水銀によって脆化する。CuとAgの薄膜中へのHgの浸透速さをAlとGaの組と同様にして室温で測定し、これと、引張試験を行って求めたHgを付着してから脆化するまでの時間の関係を調べた。Ag薄膜中に浸透するHgの速さは約4μm/sであるのに対し、Cu薄膜の中には、0.01μm/sの速さでしかHgは浸透していかない。Agの場合にはHgをつけてから30秒程度のちには、破壊するまでののびに減少がみられ、破面観察でも脆性破壊していることが確かめられたが、CuにHgをっけた場合には、5分程度たってから徐々に破壊までののびの低下があらわれる。すなわち、Hgの浸透速さが速いほど、脆化するまでの時間は短い。以上の結果は、液体金属原子の固体金属中への高速浸透が、AlとGaの組以外にも、液体金属脆化を引き起こしている原因となっていると考えることができることを示している。多結晶のアルミニウムに液体ガリウムを付着するとアルミニウムは延性を失い粒界破壊を起こす現象は、液体金属脆化の代表例である。これは、アルミニウムの粒界にガリウムが浸透することによっておきる。アルミニウム薄膜を用いて、ガリウムの粒界への浸透速度の温度依存を測定した結果、つぎのことがわかった。1)温度の低下とともに浸透速度はわずかに低下する。

ガリウムは過冷却しやすい金属であるが、融点(30°C)、アルミニウムとの共晶点温度(26°C)でも、不連続は見られない。2)表面についているガリウムが固化しても、アルミニウムの粒界中への浸透は起きる。同じ温度で表面にいているのが液体の場合と比べ、速さは約1桁小さい。多結晶アルミニウムの表面にガリウムを付着して行った引張試験では、1)表面にガリウムをある程度の時間付着させておけば、引張時に表面のガリウムを取り除いても、アルミニウムの脆化は起きる。脆化がおきるまでの時間は、ガリウムの浸透速度にほぼ逆比例する。2)ガリウムが液体の場合、表面のガリウムを取り除かないで、引張試験を行うと、脆化が起きるまでの時間は大幅に短縮される。3)ガリウムが固体の場合、引張試験時に表面のガリウムが存在するか否かは、脆化を起こすまでの時間に影響を与えない。以上のことから、ガリウムによるアルミニウムの脆化は、ガリウム原子の粒界への浸透によって起こり、引張応力下では、その速度が加速されるものと思われる。また、粒界にはいってしまったガリウムは、-50°C付近までアルミニウムを脆化することから、液体金属脆化では、ガリウム原子が粒界に入る過程が律速過程になっていることもわかった。ほかに液体金属脆化を起こす組み合わせは多く知られているが、すべての組み合わせて、浸透速度が律速しているかどうかはまだ明らかではない。本来延性である固体金属にある特定の液体金属を付着させて力を加えると,固体金属は延性を失い,脆性破壊するようになることは,液体金属脆化として知られている.アルミニウムと液体ガリウム,銀と水銀,銅と水銀などの組み合わせも液体金属脆化を起こす組み合わせとして知られている.脆化は特定の固体金属と液体金属の組み合わせでしか起こらずに,液体金属脆化の特異性と呼ばれている.また,少なくとも上であげた3種類の金属-低融点金属の組み合わせでは,低融点金属が固体金属の粒界中に高速浸透し,粒界の強度を下げることにより脆化が起きていることが昨年度までの研究でわかっている.アルミニウムとガリウム,銀と水銀,銅と水銀の組み合わせについて,脆化のおきやすさを次のようにして測った.(1)試験片表面に低融点金属を付着し,一定時間保持した.(2)表面の低融点金属を除去したあと引張試験を行い,脆性破面の面積と最大応力を,低融点金属を付着していた時間を変えて測定した.(3)ガリウムは容易に過冷却するので,アルミニウムとガリウムの組み合わせでは,融点以下の液体状態,固体状態,両方での測定を行った.脆化が起きるまでの時間と,薄膜を使って測った粒界への低融点金属の浸透速度を比較した.アルミニウムとガリウム(35°C液体,20°C液体,20°C固体,10°C固体),銀と水銀,銅と水銀の組み合わせで,浸透速度は約3桁にわたって変化するが,大雑把に言って脆化開始までに必要な付着時間が浸透速度の逆数に比例しているということができる.このことから,液体金属脆化の組み合わせ特異性について議論する場合には,時間のファクターも考慮する必要があること,いくつかの論文で,脆化が起きるか起きないかについて異なる報告があるが,それは,時間のファクターを考えなかった可能性があることを指摘できる.
超音波応答性自己組織化型バブルリポプレックスの構築と新規遺伝子治療技術の創成

本特別研究員は昨年度までに、臨床応用実績のある安全な化合物のみを自己組織化させることで、高い遺伝子導入効果と生体適合性を兼ね備えた非常に有用な新規遺伝子導入キャリアであるバブルリポポリプレックスを構築した。本年度は、バブルリポポリプレックスの腎臓における遺伝子導入効果や組織障害性を詳細に評価した。この結果、バブルリポポリプレックスを静脈内投与しても超音波と併用しない場合には腎臓における遺伝子発現は認められなかったが、マウスの下腹部に向けて超音波を照射した結果、腎臓で選択的に高い遺伝子発現が観察された。また、バプルリポポリプレックスが腎臓の尿細管に遺伝子を導入していることを確認した。さらに、血液中尿素窒素や血清クレアチニン、腎組織中Kidney injurymolecule-1 mRNAやClusterin mRNAなどの腎障害時に上昇するバイオマーカーを用いてバプルリポポリプレックスの腎臓における組織障害性を評価した結果、バブルリポポリプレックスは超音波と併用してもこれらのバイオマーカーを上昇させず、高い安全性が示唆された。また、バブルリポポリプレックスにサイトメガロウイルスのエンハンサーとβ-アクチンプロモーター、β-グロブリンスプライスアクセプターを組み合わせたCAGプロモーターを有したpDNAを応用する事で、150日間を超える長期の遺伝子発現を得ることに成功した。さらに、癌の新生血管内皮細胞に強い親和性を示すシアリルルイスXという糖鎖を用いて修飾した糖鎖修飾バブルリポポリプレックスを構築した。この糖鎖修飾バプルリポポリプレックスを担癌モデルマウスに静脈内投与し、腫瘍に向けて超音波を照射した結果、腫瘍内で未修飾のバブルリポポリプレックスと比較して高い遺伝子発現が認められた。本研究では、新規遺伝子導入キャリアとして生体適合性材料のみからなるバブルリポポリプレックスを開発し、その安全性や生体内での挙動、遺伝子導入が可能な臓器や遺伝子を発現している細胞の同定など、バプルリポポリプレックスを遺伝子治療へ応用するために必要な情報の収集を行った。さらに、バブルリポポリプレックスの遺伝子導入期間の延長、糖鎖修飾による標的化に関する検討など、バブルリポポリプレックスの機能化にも成功していることから、2を選択した。(抄録なし)申請者はこれまで、数種の特殊な負電荷化合物を用いて遺伝子医薬品を自己組織化することで、安全性を向上し、かつ負電荷化合物に対応した特定の臓器へ選択的に遺伝子を導入しうる自己組織化型遺伝子ベクターの開発に成功した。しかしながら、この新規技術の臨床応用のためには、より選択性と遺伝子導入効果を向上させる必要があった。そこで、本年度は、申請者が開発した自己組織化型遺伝子ベクターに京都大学橋田研究室が有する超音波応答性バブルリポプレックスの技術を応用する事で、標的臓器へ選択的に遺伝子とマイクロバブルを送達する、生体適合性の自己組織化型バブルリポプレックスの開発とその物理化学的性質の評価を行った。また、タンパク質医薬品を自己組織化する技術開発にも取り組み、タンパク質ベクターの構築を行った。この結果、遺伝子医薬品に複数の正電荷化合物と負電荷化合物、及びマイクロバブルを組み合わせた新たな構造体の構築に成功した。この構造体は粒子径が約500nmの負電荷の微粒子であり、高い効果と生体適合性を示した。また、タンパク質医薬品を自己組織化する技術開発の結果、抗原タンパク質を抗原提示細胞に効率的に送達することが可能な新規ワクチンベクターの開発に成功した。このベクターはモデル抗原として卵白アルブミンを内包した微粒子であり、卵白アルブミンと、臨床で添加剤として用いられている塩化ベンザルコニウム、生分解性で安全な高分子であるpolyglutamicacidからなる。このベクターをマウスへ投与した結果、卵白アルブミン単独と比較して顕著に高い免疫誘導効果が得られた。さらに、免疫したマウスに卵白アルブミン発現癌細胞を移植した結果、癌の増殖を完全に抑制することに成功した。申請者は生体適合性材料からなる遺伝子導入用キャリアに超音波造影ガスを内包することによって超音波応答性の生体適合型遺伝子導入キャリア、バブルリポポリプレックスの開発を行った。本キャリアは全ての成分が医薬品ないしはその添加物として既に臨床使用実績のある安全な化合物のみから構成されており、速やかな医療展開への応用が可能であると考えている。このバブルリポポリプレックスの構成成分の最適化を行った結果、pDNAとカチオン性高分子であるプロタミン硫酸、DSPG(distearoylphosphatidylglycerol)を用いたアニオン性リポソームを用いた場合に、最も安全かつ効果的な遺伝子導入が可能であることを見出した。このバブルリポポリプレックスを細胞に添加した結果、細胞障害性をほとんど示すことなく、高い安全性が示唆された。さらに、超音波と併用しなかった場合にはほとんど遺伝子導入効果を示さず、超音波を照射した場合にのみ高い遺伝子導入効果を示した。また、静脈内投与後に特定の臓器に超音波を照射することで、照射した臓器選択的に高い遺伝子導入効果を示すことを見出しており、これまでに、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺、腫瘍において高い遺伝子導入効果を得ることに成功している。さらに、バブルリポポリプレックスに癌指向性のペプチドを応用することによって、血管内皮細胞での遺伝子導入効果を大幅に向上することにも成功しており、バブルリポポリプレックスはリガンドを用いて修飾することによって標的指向性を付与することが可能である。このように生体適合性材料のみから構成され、安全かつ高い遺伝子導入効果を示す標的指向型遺伝子導入キャリアについての報告は稀有であり、有用性が高い。

本特別研究員は昨年度までに、臨床応用実績のある安全な化合物のみを自己組織化させることで、高い遺伝子導入効果と生体適合性を兼ね備えた非常に有用な新規遺伝子導入キャリアであるバブルリポポリプレックスを構築した。本年度は、バブルリポポリプレックスの腎臓における遺伝子導入効果や組織障害性を詳細に評価した。この結果、バブルリポポリプレックスを静脈内投与しても超音波と併用しない場合には腎臓における遺伝子発現は認められなかったが、マウスの下腹部に向けて超音波を照射した結果、腎臓で選択的に高い遺伝子発現が観察された。また、バプルリポポリプレックスが腎臓の尿細管に遺伝子を導入していることを確認した。さらに、血液中尿素窒素や血清クレアチニン、腎組織中Kidney injurymolecule-1 mRNAやClusterin mRNAなどの腎障害時に上昇するバイオマーカーを用いてバプルリポポリプレックスの腎臓における組織障害性を評価した結果、バブルリポポリプレックスは超音波と併用してもこれらのバイオマーカーを上昇させず、高い安全性が示唆された。また、バブルリポポリプレックスにサイトメガロウイルスのエンハンサーとβ-アクチンプロモーター、β-グロブリンスプライスアクセプターを組み合わせたCAGプロモーターを有したpDNAを応用する事で、150日間を超える長期の遺伝子発現を得ることに成功した。さらに、癌の新生血管内皮細胞に強い親和性を示すシアリルルイスXという糖鎖を用いて修飾した糖鎖修飾バブルリポポリプレックスを構築した。この糖鎖修飾バプルリポポリプレックスを担癌モデルマウスに静脈内投与し、腫瘍に向けて超音波を照射した結果、腫瘍内で未修飾のバブルリポポリプレックスと比較して高い遺伝子発現が認められた。当初の計画では、本年度は超音波応答性自己組織化型バブルリポプレックスの構築と超音波照射条件の最適化を行う予定であった。この結果、計画通りに遺伝子を内包した超音波応答性自己組織化型バブルリポプレックスの構築に成功した。また、タンパク質を内包した超音波応答性自己組織化型バブルリポプレックス構築の為にタンパク質の微粒子化法の開発を行い、安定な微粒子を形成することに成功している。今後、速やかな超音波応答性自己組織化型バブルリポプレックスへの応用が期待できる。当初計画では新規に開発した超音波応答性の生体適合型遺伝子導入キャリア、バブルリポポリプレックスの遺伝子導入特性の解明と最適化を行う予定であった。実際には、この製剤に用いる化合物の最適化を行い、最適な組成と混合比を見出した。また、最適化した製剤の遺伝子導入特性について検討し、さらに製剤のリガンド修飾を行った。以上のように、本年度は計画通りの研究成果が得られており、おおむね順調に進展している。本研究では、新規遺伝子導入キャリアとして生体適合性材料のみからなるバブルリポポリプレックスを開発し、その安全性や生体内での挙動、遺伝子導入が可能な臓器や遺伝子を発現している細胞の同定など、バプルリポポリプレックスを遺伝子治療へ応用するために必要な情報の収集を行った。
近代日本における産婆教育制度成立過程に関する研究

平成45年度の計画は以下の通りである。1.内務省衛生局と東京府、内務衛生局と各県および東京府と各県の産婆行政に関する情報の流れ、その結果としての各府県の産婆に関する布令達、規則等の制定を明らかにする。(1)東京府庶務課、衛生課の文書より、東京府庶務課と内務省および各府県間で交わした照会および回答、通達等の発掘、解読と整理。(2)各県布令達集または広報、警察署の文書より、布令達規則および通達類の発掘、解読と整理。県は福島県、宮城県、岩手県、青森県、秋田県、山形県と中心とする。2.東京府病院産婆教授所の教育方針の各県への伝播と定着の経緯を明らかにする。(1)産婆講習所、産婆学校等の所在、教育の状況に関する史料の発掘、解読と整理。(2)元産婆の個人および家族所蔵の史料の収集、整理。以上の計画の中、1-(1)は史料収集は終了したが、写真撮影した史料の解読、整理はまだ終了していいない。1-(2)は史料収集はほぼ終了したが、山形県、宮城県以外は史料整理の途中である。2-(1)(2)は講習所の存在と活躍した個人を特定できたが、訪問しての史料収集にはいたっていない。したがって、個人所蔵の史料以外の史料収集はほぼ終了したが、解読、整理が終了していないため、近代日本の産婆教育成立過程の特質を考察するには至っていない状況である。1.内務省衛生局と東京府、内務省衛生と各県、東京府と各県の産婆行政に関する情報の流れ、その結果としての各府県の産婆に関する布令達ならびに規則類の制定とその変遷を明らかにするために、史料の発掘、解読と整理を行う。1)東京府病院産婆教授所の成立に関して、東京都公文書館保管の東京府庶務課及び衛生課の文書より、史料収集を進め、史料の解読と整理の作業が進行中である。2)東京府庶務課と内務省及び各府県間で交わした産婆に関する照会、回答、通達等に関して、1)と同じく進行中である。3)産婆関係の布令達規則及び通達類の発掘に関して、山崎佐文庫の産婆関係法律により史料収集を進め、史料の解読と整理の作業を進めている。これによると、全国的に地域格差がなく東京府とほぼ同時に布令達が出されている事が明らかになった。実施状況はこれからの課題となる。2.東京府病院産婆教授所の教育方式の各県への伝播と定着の経緯を明らかにするために、産婆教授所・産婆講習所の所在、教育内容と教育方法に関する史料の発堀、解読と整理を行う。1)各府県内の産婆講習所、産婆教授所等の史料の発堀に関して、東京府庶務課の文書と各地方庁の行政文書、山崎佐の収集した産婆関係法律、新聞等により、史料収集を進めている段階である。2)東京府病院産婆教授所の第1回生と第2回生の産婆生徒の募集に関する東京府と長谷川泰の往復文書の解読より、産婆教授規則、産婆教授方法、教科書、募集人員と応募状況、学期と開講期日等が明らかになった。この事により、東京府病院産婆教授所の教育の内的事項と外的事項の一部が確認でき、さらに、明かになった。I.内務省衛生局と東京府,内務省衛生局と各県,東京府と各県の産婆行政に関する情報の流れ、その結果としての各県の産婆に関する布令達ならびに規則類の制定とその変遷を明らかにするために、史料の発掘と整理を行う。II.東京府病院産婆教授所の教育方式の各県への伝播と定着の経緯を明らかにするために,産婆講習所・産婆教授所・産婆学校の所在,教育内容と教科書に関する史料の発掘,解読と整理を行う。Iに付いて,「醫制」「産婆規則」制定までの山形県の産婆規則の制定と改正の経緯について史料収集を行った。

第1段階は,明治九年「産婆営業規則」(明治九年十二月二十七日乙第三十九号)が制定された。「醫制」を踏襲した条文であるが,産婆志願者の年令を10才引き下げ,新規営業者のみならず従来営業者にも教育が必要としている。また、無鑑札営業を禁止して、醫制の実驗證書に加えて試験を行う資格制度を打ち出すなど山形県独自の見解も出されている。第2段階は,「産婆營業假規則」(明治十三年八月二十三日乙第百五十三號)が制定、同時に「山形県濟生館産婆教授所規則」と「山形県濟生館産婆生徒規則」(明治十三年九月六日乙第百六十五號)である。東京府病院産婆教授所の方式を踏襲した条文である。教育課程・教育方法・教育対象者を同所と全く同じ文面で明文化している。産婆試験を山形県知事が実施し,山形県濟生館病院医師および郡医を中心とした試験方法を確立し資格制度を樹立している。以上から,山形県に限定して言えば明治九年には醫制の影響を受け,明治十三年には東京府病院産婆教授所の影響を受け,比較的早い時期に教育制度・資格制度が成立していることが明らかになった。IIに付いて,宮城県と山形県に関して史料を収集し,整理中である。
薬物誘発性腎線維化に対する治療法の探索

薬物による腎障害は、一時的に腎機能を低下させるだけでなく、慢性的な腎機能低下につながることがある。また、薬剤による腎機能の低下は、治療に必要とする薬剤の選択肢を狭めるため、腎障害を事後に解消するような方策の開発が重要と考えられる。申請者はこれまでの研究から、抗がん薬であるシスプラチンが慢性腎臓病を惹起することを明らかにした。また、シスプラチンによる慢性的な腎機能低下は尿細管間質における線維芽細胞が主に関与することを示した。そこで本研究では、薬剤によって惹起された腎線維化の治療方法提示を最終目標とし、以下の2つの項目を具体的な目的とする。1.薬剤性腎障害のモデル動物を対象に腎障害発症後における線維芽細胞の機能変化を詳細に解析する。2.腎線維芽細胞を用いて治療薬の探索を試みる。平成30年度には、ヒト慢性腎臓病の腎臓における遺伝子発現情報および腎線維化動物モデルの遺伝子発現情報から、腎線維化の治療標的候補と考えられる遺伝子を抽出した。そこで、特に、これまで腎疾患との関わりが報告されていない遺伝子に注目し、腎疾患動物モデルにおける発現挙動を解析した結果、腎障害時に腎臓における発現が上昇する数個の遺伝子を確認した。また、腎臓由来の初代培養系を整備し遺伝学的な検討を行った結果、腎障害時に尿細管上皮細胞に発現亢進する遺伝子が線維化に関与する可能性と、その発現を制御するシグナル伝達経路および機能を明らかにすることができた。平成30年度には、腎線維化の治療標的候補として新たな分子を見出し、疾患動物モデルにおける発現挙動およびその機能の解析を行うことができた。これらの成果は当初の計画通りと考えられるため、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。平成30年度には、腎線維化の治療標的を絞り込むため、バイオインフォマティクスおよび培養細胞を用いた方法を整備するとともに、その応用により、具体的な治療標的を挙げるに至った。そこで次年度以降では、対象分子の細胞内局在を解析するとともに、阻害の方法を低分子および抗体を用いた方法から検討を行う予定である。次年度使用額が生じたが、その金額の割合は小さいものであり、概ね計画通りに使用されたと考える。
新規バイオインフォマティクス解析を用いた細胞の光生物学的活性反応メカニズムの解明

本研究での目的は、新たなバイオインフォマティクス解析ツールを用いてタンパク質相互作用を考慮した網羅的な遺伝子ネットワークを構築し、レーザー光による光刺激によって細胞増殖が促進する遺伝子調節機構を解明することである。平成30年度から4年間で、低反応レベルレーザー治療(LLLT;Low reactive Level Laser Therapy)を想定した一定条件下でのヒト正常歯肉線維芽細胞へのレーザー照射を行い、遺伝子発現や遺伝子調節機構を同定するためにDNAマイクロアレイ、バイオインフォマティクス解析ツールを用いた遺伝子ネットワークの構築を行っていく。2018年度は以下の研究を実施した。1. Nd:YAGレーザー装置を用いて一定照射条件でレーザー照射が可能であるステントを準備した。LLLTを想定したin vitroでのレーザー照射条件の検討を行い、WST-8の改良法を用いて生細胞数からレーザー非照射と比べ、細胞増殖能の増加が認められ、乳酸脱水素酵素活性の測定から細胞毒性が認められない条件に決定した。2.マイクロアレイ解析に可能なRNAサンプルの基準を満たすよう、total RNA抽出が行える方法を検討した。3.レーザー照射前とレーザーを照射した後6時間で、細胞の回収、total RNA抽出を行い、その後、マイクロアレイ解析を委託した。4.バイオインフォマティクス解析ツールを用いて、レザー照射6時間後のレーザー非照射群とレーザー照射群の解析を行った。以上の結果から、LLLTで用いられる低反応レベルレーザー照射は、歯肉線維芽細胞における細胞外マトリックスの形成、細胞の接着や遊走能、細胞周期に関与する遺伝子発現に影響を与えることが示唆された。2019年度から4年間で、LLLTを想定した一定条件でNd:YAGレーザー光を照射できる装置を作製、ヒト正常歯肉線維芽細胞(HGF)にレーザー光を照射、RNA抽出、DNAマイクロアレイを委託した後、バイオインフォマティクス解析ツールを用いて遺伝子ネットワークの構築し、遺伝子発現遺伝子調節機構を同定する。その後、リアルタイムPCR法による遺伝子発現解析とsiRNA、遺伝子過剰発現を用いた遺伝子の機能解析を行うことを予定していた。本年度研究遂行状況、変更点を以下に示す。1.自動でレーザーを一定照射できる機器に関しては製作が難しかったが、本研究で使用するために一定条件でレーザー照射可能なステントを製作することができた。2. LLLTを想定したin vitroでの照射条件を細胞増殖能、決定することができた。3.マイクロアレイ解析に必要な基準を満たしたRNA抽出を行うことが可能となり、当初の予定通りマイクロアレイ解析を問題なく行うことができた。4.複数のバイオインフォマティクス解析ツールを用いた解析を始めた。1.レーザー照射6時間後のマイクロアレイ解析を引き続き、バイオインフォマティクス解析ツールを用いて行っていく。解析に用いるソフトはフリーソフトが多数あるが、必要となるPCスペックが高いものがあった。そのため、そのスペックに対応した新たなPCを購入して解析を進めていく。2.解析の結果から、keyとなる遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCR法で確認していく。マイクロアレイ解析でRNA抽出を行っているため、スムーズに研究が遂行できると考えられる。3.経時的な変化を調べるため、照射後の複数タイムポイントでのマクロアレイ解析を委託する。4.経時的な遺伝子変化を調べるためフリー解析ソフトTimeXnetを用いた解析を進める。5.バイオインフォマティクスで解析した結果に基づき、siRNAを用いたloss-of-function、遺伝子過剰発現によるgain-of-functionを行い、特定した遺伝子の機能解析を行う。

1.自動でレーザーを一定照射できる機器に関しては製作が難しかったが、本研究で使用するために一定条件でレーザー照射可能なステントを製作することができた。2. LLLTを想定したin vitroでの照射条件を細胞増殖能、決定することができた。3.マイクロアレイ解析に必要な基準を満たしたRNA抽出を行うことが可能となり、当初の予定通りマイクロアレイ解析を問題なく行うことができた。4.複数のバイオインフォマティクス解析ツールを用いた解析を始めた。1.レーザー照射6時間後のマイクロアレイ解析を引き続き、バイオインフォマティクス解析ツールを用いて行っていく。解析に用いるソフトはフリーソフトが多数あるが、必要となるPCスペックが高いものがあった。そのため、そのスペックに対応した新たなPCを購入して解析を進めていく。2.解析の結果から、keyとなる遺伝子の発現をリアルタイムRT-PCR法で確認していく。マイクロアレイ解析でRNA抽出を行っているため、スムーズに研究が遂行できると考えられる。3.経時的な変化を調べるため、照射後の複数タイムポイントでのマクロアレイ解析を委託する。4.経時的な遺伝子変化を調べるためフリー解析ソフトTimeXnetを用いた解析を進める。5.バイオインフォマティクスで解析した結果に基づき、siRNAを用いたloss-of-function、遺伝子過剰発現によるgain-of-functionを行い、特定した遺伝子の機能解析を行う。自動化したレーザー照射ステージは高額となるため、一定条件でレーザーが照射できるステントの作製に留めた。バイオインフォマティクス解析ソフトは、使用できるPCスペックが限定されている場合があるので、次年度以降にPCの購入を行いさらに解析を進めていく。
農業用管水路における圧力観測を用いた漏水検知に関する研究

近年,農業用管水路の漏水破損事故は増加傾向にあり,道路や宅地などの周辺地盤の陥没を引き起こすなど,社会に大きな損失をもたらしている。しかしながら,既存の漏水検知手法は多くの労力,時間を必要とし,一般的に検知精度も高くないという問題があり,農業用管水路において,漏水を簡便かつ正確に検知する新たな方法が求められている。本研究では,圧力計が安価で高精度,実装が容易という観点から,漏水による管路内の圧力変化を圧力計によって読み取り,漏水位置を特定する方法の開発に取り組んでいる。開発の実現にあたり,管内に発生させた圧力波形の減衰と漏水位置との関係について数値計算や模型管路を用いて解明する予定である。
遺伝的糖尿病マウスに作製したMRSA感染皮膚潰瘍の修復機序の解析

遺伝的糖尿病マウスの背部皮膚に作製した全層皮膚欠損創にMRSAを感染させることにより、慢性の感染皮膚潰瘍モデルの作製を試みた。また、この潰瘍に抗菌作用のある局所外用剤を投与してその効果を比較検討した。方法は糖尿病マウス(C57BL/KsJ db/db mice,Jackson Laboratory)の背部皮膚中央に円形の全層皮膚欠損創を縦方向に2個作製し、菌を接種して密封した。一定時間後マウスを屠殺して、病理組織標本を作製し、創傷治癒の評価を、再上皮化率(%)、肉芽組織面積(mm2)、について評価した。菌学的には、創表面の塗沫所見、菌数、培養所見を調べた。その結果、(1)開放創より密封創の方が感染実験として優れる、(2)創は直径3mmが良い、それ以上大きいと潰瘍は1ケ月を経ても全く治癒しない、(3)接種菌数は1X10^6が適切、(4)感染潰瘍成立には4日間を要する、(5)この潰瘍はさらに9日間を経ても治癒しない、(6)MSSA N315P株とMRSA N315 PZR株の間に慢性感染性皮膚潰瘍を作るとう意味では大きな病原性の差はない、などが判明した。次に、背部皮膚中央の直径3mmの円形の全層皮膚欠損創に、MRSA N315 PZR株1X10^5菌を接種して密封した。3日後、感染が成立していることを確認してから、ポビドンヨード白糖製剤を隔日に計4回投与した。菌投与9日目に菌数や組織学的変化を観察したところ、ポビドンヨード・白糖製剤投与群では有意に創が早く閉鎖し、検出されたMRSAの菌数もわずかであった。また形成された肉芽組織もコンパクトであった。一方、非投与詐では小膿瘍が多数形成され、創は厚い痂皮で被われて閉鎖しなかった。遺伝的糖尿病マウスに作製した全層皮膚欠損創の治癒過程は正常マウスのそれに比較して遅延していることを、我々はすでに報告した。従来、特定の細菌を短期間皮膚欠損部に密封し、さらに抗生物質を局所に投与してその効果を検討した報告はあるが、慢性感染潰瘍の修復過程や薬剤の長期的効果を検討したものはない。今回、糖尿病マウスにMRSAを感染させることにより、慢性の感染皮膚潰瘍モデルの作製を試みた。まず、いくつかの予備実験を行って条件設定を行った。その結果、(1)開放創より密封創の方が感染実験として優れる、(2)創は直径3mmが良い、それ以上大きいと潰瘍は1ヶ月を経ても全く治癒しない、(3)接種菌数は1X10^6が適切、(4)感染潰瘍成立には4日間を要する、(5)この潰瘍はさらに9日間を経ても治癒しない、

(6)MSSA N315P株とMRSA N315 PZR株の間に大きな病原性の差はない、などが判明した。また感染成立後、菌は無数に検出され、密封を続けると菌塊となった。しかし他の菌の侵入はなかった。来年度は治療剤の効果について検討する予定である。昨年度の実験では遺伝的糖尿病マウスの背部全層皮膚欠損創にMRSAを接種することにより、慢性の感染性皮膚潰瘍モデルを作製することができた。本年度はこの潰瘍に抗菌作用のある局所外用剤を投与してその効果を比較検討した。1.糖尿病マウス(C57BL/KsJ db/db mice)の背部皮膚中央に直径3mmの円形の全層皮膚欠損創を縦方向に2個作製し、MRSA N315 PZR株1X10^5菌を接種して密封した。3日後、感染が成立していることを確認してから、ポビドンヨード白糖製剤を隔日に計4回投与した。菌投与9日目に菌数や組織学的変化を観察したところ、ポビドンヨード・白糖製剤投与群では有意に創が早く閉鎖し、検出されたMRSAの菌数もわずかであった。また形成された肉芽組織もコンパクトであった。一方、非投与群では小膿瘍が多数形成され、創は厚い痂皮で被われて閉鎖しなかった。2. vancomycinやarbekacinなどの抗生物質を感染潰瘍部へ局所投与する実験を計画したが、抗生物質の局所投与は好ましくないとの指摘を受け、試薬が手に入らなかったので実施できなかった。3.軟膏基剤の治癒過程への影響を検討したところ、非感染性潰瘍に対しては、親水軟膏が創傷治癒を遅延させた。しかし、その他の基剤とくに白色ワセリン、白糖基剤、カーボワックスに顕著な差は認められなかった。
中学校理科天文領域における空間概念の発達と形成にかかわる実証的研究

1研究のねらい中学校理科天文領域では、地球の自転、公転に伴う運動や、惑星の満ち欠け等、三次元空間を扱うが、それらは相対的な運動であるため、生徒の理解、認識は、困難である。本研究は、これらの課題を解決するため有効な立体モデルと、指導プログラムを開発するとともに、その有効性を実証する。2成果の概要(1)天体の立体モデルでは、発泡スチロールを用いた地球モデル、惑星の満ち欠けモデル、月の自転モデル及び天球の星座モデルの4種を作成した。地球モデルでは、地軸の傾き、ある地点の水平面、東西南北を立体的に示すことができる。惑星モデルでは、スチロール球を黄、黒に半球ずつに塗り分けたものを、ビデオカメラをとうしてテレビに映すことで、形の変化とともに大きさの変化を具体的に示すことができる。月の自転モデルは、月の自転周期を示すもので、半球とし、月面の模様を入れ、フェライト磁石で黒板に自由に張ることができる。天球モデルは、透明なビニル板に、黄道12星座を白色塗料で描き、その外側に半分を白、半分を黒のビニル板で作った昼夜板を設けた。星座板または昼夜板を回転することで季節によって見える星座を変えることができる。(この天球モデルの製作者である本研究協力者の佐川教諭は、平成6年度発明協会より文部大臣賞を戴いた。)(2)これらの天体モデルを効果的に利用するために、それぞれにワークシートを作成し、OHPで正答を示し、自己採点、自己評価を取り入れた。(3)これらのモデルや指導の方策が有効であるかを実証するため、筑波大付属中、水戸赤塚中、秋田醍醐中で、プレテスト、授業、ポストテストを実施してもらった。その結果、学習の前後で有意の差を見ることができた。さらに、2年生との比較に於いても有意の差を認めることができた。
二言語使用者のコード・スイッチングに関する社会言語学的研究

萌芽的研究として、まず、文献研究を行った。その結果、バイリンガリズム研究に関して分野、話題ごとに基本文献一覧を作成し、専門用語を整理し、日英語の対訳表を作成した。とりわけ、C.ベーカー(1993)の邦訳を完成したことは、日本においてバイリンガリズム研究を確立する上で大きな貢献をするものと期待される。カナダ、ウェールズに出かけ、社会的バイリンガリズムとバイリンガル教育に関する調査を行い、生のコード・スイッチングのデータを収集し、専門家と意見・情報の交換をした。それぞれの成果については、論文の形で発表している。また、日本でもバイリンガル教育やイマージョン教育を実施している学校を視察し、教育上の問題点や子供のバイリンガルの発達に関して考察した。とくにコード・スイッチングに関しては、上のようなフィールド・ワークで収集したデータに加え、実際にインフォーマントを使って面接をしたり、かれらの自然な言語生活の中から資料を集めた。それらをもとに分析に取り組み、語用論的なアプローチを採用し、言語的、社会的、心理的要因に分類した。そこから、バイリンガルの言語使用の認知、情緒面を探り、「コード・スイッチング文法」の解明という形でバイリンガルの脳のメカニズムに迫った。上述のバイリンガリズム、コード・スイッチングに関する研究成果は論文として公にしたと同時に、大学英語教育学会(JACET)のシンポジウムなどにおいて口頭発表した。第1に、文献研究をもとに、バイリンガリズム研究に関する専門用語を整理し、英語と日本語の対訳一覧を作成した。それに加えて、さらに、解説つきのグロッサリ-の作成に取り組み、第一次原稿ができあがった。また、コード・スイッチングに焦点を合わせ、その研究の問題点に関して考察し、その議論を著書「コード・スイッチングをめぐる諸問題」で発表した。第2に、フィールド・ワークによってコード・スイッチングに関するなまのデータ収集を行った。まず、大学生、高校生の帰国生を対象にインタビューを実施し、基礎的な資料を集めた。それをもとに、コード・スイッチングに関する調査書の作成に向けて、その枠組みを検討している。また、多言語話者を対象に、実際の多言語使用の実態を録音し、書き取って記録した。そのなまのデータをもとに、コード・スイッチングの要因を抽出し、社会的・心理的要因にもとづく分析を行った。その中から、バイリンガルの言語能力に関して、古いモノリンガルの尺度を乗り越えて、新しい見方が生まれてきたことは新しい発見である。また、コード・スイッチングにおいて、言語間の普遍性と同時に、日本的な特異性も浮かび上がってきたことは大きな収穫である。これらの一部は論文「バイリンガリズムの観点からみた外国語能力」に発表した。第3に、当研究から得られた知見をもとに、「バイリンガル教育」および「バイリンガリズムの研究方法」に関する国際研究集会において、それぞれ、口頭発表を行ったり、学術討議を主宰した。まず第一の成果は、世界的に一流の文献(Baker,1993,総ページ数318)を完訳したことである。現在印刷中であるが、この出版によって、日本においてまだ萌芽的なバイリンガリズム研究に貢献するところは大きいと確信している。この分野における最先端の知見を紹介することによって、学問分野として確立させ、今後の研究に方向性を与えることにつながろう。第2に、前年度に引き続き、日本におけるコード・スイッチングの資料を収集することに努め、その語用論的な分析にたずさわった。それに加えて、カナダを訪れる機会があり、そこで生のデータを収集する機会に恵まれた。それによって、言語の切り替えという現象を狭く個人の問題に限るのではなく、社会的な仕組みとしてとらえるという視点が生まれてきた。そのようなより広い枠組みに関する考察を、論文(裏面の2番目の英文のもの)にまとめている。今後とも、このような広い枠組みで分析を行い、コードスイッチングにかかわる複雑な要因を解明したい。第3に、文献研究に加えて学校視察(例えば横浜のDeutsche Schule)などを通して、バイリンガル教育や二言語の習得の実際を観察し、資料と情報を入手した。その中で特に、二言語の発達にかかわる知的、文化的な要因を探っていった。

この問題は専門的には「しきい理論」、「共有基底言語能力」と結びついてくるが、世界的にもいまだに課題となっている。二言語の発達において、日本語との関連で転移はどこまで可能なのか、バイリンガルの体験をプラスのものとするためには認知的にどのレベルをクリヤーしておかなければならないのか、というような次の研究課題が浮かび上がってきた。本年度は、研究の3年目の完成年度として、これまでの研究の総まとめを目ざした。まず、その意味において一番大きな業績は、主要文献の翻訳の完成であろう。それは『バイリンガル教育と第二言語習得』(大修館書店)という形で刊行された。これまでこの分野には総合的な専門書が存在しなかったので、この訳本が日本におけるバイリンガリズム研究の確立に貢献するものと確信している。それは関連して、大学英語教育学会(JACET)の全国大会において、「バイリンガリズムはプラスかマイナスか」と題してシンポジウムを開催し、大きな反響をえた。また、これまでに収集したコード・スイッチングの資料をもとに、言語の切り替えにおける社会的・心理的要因について要因分析をした。その結果、これまでのモノリンガルの尺度をそのまま当てはめるというやり方では不十分で、バイリンガル能力に対して新しいアプローチが必要なことが明らかになってきた。その新しいバイリンガル能力像について、JACET月例会で「バイリンガリズムと外国語教育」と題して発表した。外国語能力をただ伝達技能としてとらえるのではなく、“functional literacy"(機能的識学)の問題としてとらえるのでる。さらに、調査資料収集の目的で、夏にウェールズにかけた。そこの複雑な社会的・歴史的な言語事情に接すると、バイリンガル社会、教育、個人という複雑な関連が浮かび上がってくる。バイリンガリズムの研究は緒についたばかりで、今後ますます研究を深め、発展させていきたい。
高効率・高機能赤外伝送システムの構築

赤外波長帯で高いエネルギーと大きな光電力を伝送する医療用の高効率・高機能伝送システムの構築を目的とし、研究を行った。主要な研究成果を以下に示す。1.国際研究集会の開催と生体医療光学の推進共同研究者と共同し、ヨーロッパ、アメリカで4回の赤外伝送装置に関する国際会議のセッションを開設し、生体医療光学の研究の発展を図った。2.赤外波長帯に於けるポリマーの光学定数の測定可視から中赤外波長帯で分散性を有するポリマーの屈折率、消衰係数を同時に計測する手法を開発した。これを基に、薄膜化可能な多くのエンジニアリングプラスチックの光学定数を導出した。3.ポリマー内装中空導波路の低損失化の研究内装用のポリマーのペレットを溶かす溶媒、溶媒の濃度、送液速度は、均質な膜の形成にとって重要な因子であることを見出した。長さは2m、内径1mmから540μmの低損失ポリマー内装銀中空ガラス導波路を製作することに成功した。4.レンズ付きテーパー型高効率入射結合器に関する研究レンズ付きテーパー型入射結合器を考案し、実験的にその有効性を確認し、装置の低損失化を行った。5.多波長同時伝送赤外中空導波路の製作内装誘電体として、環状オレフィンポリマーを用い、その膜厚を適当に選ぶことにより、炭酸ガスレーザ光、エルビウムヤグレーザー光、エイミング光としての赤、あるいは緑の光を同時に伝送できる中空ファイバの開発を行った。6.中空導波路の封止技術に関する研究中空導波路先端を封止する単純な手法を開発すると同時に、エルビウムヤグレーザ光に対する封止フィルムの電力容量を明らかにした。封止膜厚に最適値があることを見出した。環状オレフィンポリマーあるいはポリイミドを内装した中空導波路を、歯科治療機システムへ応用した。また、眼科への治療への予備実験も行った。波長が220um帯の赤外波長帯では、近赤外波長帯での石英ファイバのような伝走路が存在しないため、伝送装置の構築にあたっては、多くの解決しなければならない問題が山積している。本研究では中空導波路に基礎を置き、高いエネルギーと大きな光電力をフレキシブルに伝送することを目的とし、生体医療、あるいは工業加工分野をターゲットにしながら高効率でしかも高い機能性を有する赤外伝送システムを構築することを最終的な目的として研究を行った。そのための基礎として、低損失中空導波路の高効率な制作法について、国際的な研究協力のもとにその技術を開発した。次に得られた伝走路を実際の医療現場、あるいは工業加工現場へ導入し、その有用性を実証した。またさらに、それらの伝送装置の新たな応用分野についても調査研究を行い、新しい工業分野の創成についてその可能性を調査した。具体的実績の概要は以下のとおりである。1.国際研究集会への出席ならびに生体医療光学の調査イタリアで開催されたBios Europe '97、アメリかでのBios'98国際会議に出席し、この分野の研究の一層の発展を図った。また、他の研究者との討論等も行い、生体医療光学に関する現状を調査した。2.誘電体内装中空導波路の超低損失化、高効率製作法、高機能化の研究赤外波長帯での伝送装置の超低損失化と送液法に基礎を置いた高効率製作法を開発した。また、赤外多波長光を同時に伝送できる装置、各種応用に適する入射光学装置、出射光学装置の研究を行った。3.赤外中空導波路の各種応用に関する研究

中空導波路の工業加工への応用、医療への応用についての調査、ならびに放射温度計測への応用についての調査を行った。波長が220μm帯の赤外波長帯では、近赤外波長帯の石英ファイバのような、フレキシブルで超低損失、且つ安定な伝送路が存在しないために、信頼性を有する伝送装置の構築に当たっては、多くの解決しなければならない問題が山積していた。本研究では、誘電体内装中空導波路をベースとし、主に医療へ応用することを念頭に置き、赤外波長帯で、高いエネルギーと大きな光電力をフレキシブルに伝送する高効率・高機能伝送システムの構築を最終目的とし、国際的な共同チームを組み、研究を行った。先ず始めに、そのための基礎として、送液法に基礎を置く低損失中空導波路の高効率な製作法を開発した。次に、得られた中空伝送路を実際の医療現場へ導入し、歯科治療分野において、その有用性をを実証した。更に、それらの伝送装置の新たな応用分野についてち調査研究を行い、新しい応用分野の創成についての可能性を見出した。本研究での、主要な具体的な実績の概要は以下の通りである。1.国際研究集会の開催と生体医療光学の調査スウェーデンではBiOS Europe'98を、米国においてはBiOS'99を共同研究者と共に開催し、多くの研究者を一堂に会し、生体医療光学の研究の一層の発展を図った。そしてまた、国際的な視野に立ち、レーザ治療についての問題について討論を行い、国際共同研究の更なる発展を図った。2.誘電体内装中空導波路の低損失化、高効率製作法、高機能化の研究赤外波長帯での伝送装置の超低損失化を行うと共に、送液法に基礎を置いた伝送装置の高効率製作法を開発した。また、幾つかの赤外波を同時に伝送できる装置、単純で且つ高効率なレンズ付きテーパー型入射光学装置を実現した。更に、中空導波路の端面シーリング法等についても新たな考案を行った。
HLA提示抗原ペプチドのカタログ化

HLA(human leukocyte antigens:ヒト白血球抗原)遺伝子は、さまざまな免疫系疾患の感受性遺伝子であり、自己免疫疾患、感染症、腫瘍免疫、薬剤副作用(薬疹)等と強く関連する。HLA遺伝子型に基づいた個別化医療を実現するためには、HLAと疾患との関連の機序解明、そして、治療法開発につながる要素技術の開発が必要である。HLAは自己・非自己ペプチドを提示し獲得免疫応答に関わり、遺伝子多型の多くがペプチド結合溝に見られることから、HLAが提示する抗原ペプチドの同定・予測手法を確立することにより、個々の疾患機序の解明が大きく進展すると期待される。これまでHLAクラスIIについては、結合モチーフを基にした結合ペプチド配列予測法が複数提唱されているものの、実際の測定値や結合パターンとの乖離は大きく、今後改良出来る余地は大きい。HLA結合ペプチド予測をより精度高く行うためには、まず、定量性、再現性に優れたアッセイ法を確立し、そのような測定系でHLA-ペプチド相互作用を大規模に解析する必要がある。本研究では、申請者が開発したHLA発現アッセイの手法改良、多数のHLAアリル・抗原の組み合わせへの応用、T細胞予測能の検証に向けた解析を行った。手法改良についてはオートサンプラーを用いたフローサイトメトリーを用いることにより解析の労力を低減したが、自動化は達成しておらず今後、継続して取り組む必要がある。多数のHLAアリル・抗原の組み合わせでの応用は、外来抗原、内在抗原を対象とした解析を行った。手法開発については現在、論文投稿準備中である。本研究では、申請者らが既に開発したHLA発現アッセイを応用することによりHLAクラスIIとペプチドとの相互作用測定を多数のHLAアリルおよびペプチドについて網羅的に行う。H28年度は、測定系の高速化のための検出系の検討およびHLA結合ペプチドアッセイを複数の自己抗原・外来抗原を対象として行った。本研究では、HLAへのペプチドの結合を、細胞表面HLA発現系(Miyadera et al. (2015) J Clin Invest)により測定する。この方法は、HLAとペプチドを融合タンパク質として培養細胞表面に発現させ、HLAの細胞表面発現量を定量することによってペプチドの結合性を推定する方法である。本法は従来法と比較して定量性、再現性が高く、アッセイ間の誤差が小さいため、HLA提示ペプチド探索を大規模に実施する際の標準的手法となりうる。しかし、現時点では本方法は多大な労力を伴い、一定時間に測定できる解析数が限られている。そのためH28年度は測定系の高速化に取り組んだ。まず、フローサイトメータに代わる検出系として、イメージングサイトメーターによる測定を試みた。この方法では、細胞の検出までに要する労力を削減できるため、アッセイ系の高速化は実現できたが、必要となる試薬(抗体)量が増加し、機材(測定用培養プレート)が大量に必要であることから、アッセイ当りのコストが高くなることが分かった。また測定値の定量性はフローサイトメータでの測定の方が高かった。これらの結果から、イメージングサイトメーターでの測定は、目的のHLAアリル産物に結合するペプチドをスクリーニングする目的では非常に有用であるが、結合予測を行うための基礎データ収集という目的には最適ではないと判断するに至った。HLA(human leukocyte antigens:ヒト白血球抗原)遺伝子はさまざまな免疫系疾患の感受性遺伝子であり、自己免疫疾患、感染症、腫瘍免疫、薬剤副作用(薬疹)等と強く関連する。HLAは自己・非自己ペプチドを提示し獲得免疫応答に関わることから、HLA遺伝子の多様性は個人間の疾患感受性の違いを生み出す主要因の一つであると考えられている。しかし、HLAとペプチドとの相互作用の強さをアリル間で定量的に比較することは従来のHLA-ペプチド結合アッセイでは困難であった。そこで本研究では、HLA-ペプチド発現アッセイ系(Miyadera et al. (2015) J Clin Invest)を用いて、多数のHLAとペプチド間の相互作用を体系的に解析し、各HLAアリル産物のペプチド結合プロファイルと、そのアリル間の違いを明らかにすることを目的として研究を進めている。この過程でHLA-ペプチド発現アッセイの高速化にも取り組んできた。平成28年度はアッセイを高速化するためフローサイトメータによる測定とイメージングサイトメーターによる測定とを比較した。その結果、定量性という点でフローサイトメータの方が優れていたため、平成29年度はフローサイトメトリーを用いた解析を行うこととした。

平成29年度にアッセイを効率化するためにオートサンプラー付のフローサイトメーターを導入し、主に外来抗原を対象としたHLA結合アッセイを行った。また、HLA-ペプチド発現アッセイを評価・検証するため、既知のT細胞エピトープを含む外来抗原(9種類のペプチド)と、HLA-DRB1 (9種類), DRB3,4,5 (5種類), DQ(7種類)との結合性を網羅的に測定し、このアッセイ系によってT細胞エピトープ領域を検出できることを確認した。これらの結果について論文投稿を準備中である。複数の自己抗原、外来抗原についてHLAとの網羅的結合解析を実施し、一定の成果を得た。一方、研究開始当初予定していた、がん抗原の網羅的解析には着手できていない。HLA(human leukocyte antigens:ヒト白血球抗原)遺伝子は、さまざまな免疫系疾患の感受性遺伝子であり、自己免疫疾患、感染症、腫瘍免疫、薬剤副作用(薬疹)等と強く関連する。HLA遺伝子型に基づいた個別化医療を実現するためには、HLAと疾患との関連の機序解明、そして、治療法開発につながる要素技術の開発が必要である。HLAは自己・非自己ペプチドを提示し獲得免疫応答に関わり、遺伝子多型の多くがペプチド結合溝に見られることから、HLAが提示する抗原ペプチドの同定・予測手法を確立することにより、個々の疾患機序の解明が大きく進展すると期待される。これまでHLAクラスIIについては、結合モチーフを基にした結合ペプチド配列予測法が複数提唱されているものの、実際の測定値や結合パターンとの乖離は大きく、今後改良出来る余地は大きい。HLA結合ペプチド予測をより精度高く行うためには、まず、定量性、再現性に優れたアッセイ法を確立し、そのような測定系でHLA-ペプチド相互作用を大規模に解析する必要がある。本研究では、申請者が開発したHLA発現アッセイの手法改良、多数のHLAアリル・抗原の組み合わせへの応用、T細胞予測能の検証に向けた解析を行った。手法改良についてはオートサンプラーを用いたフローサイトメトリーを用いることにより解析の労力を低減したが、自動化は達成しておらず今後、継続して取り組む必要がある。多数のHLAアリル・抗原の組み合わせでの応用は、外来抗原、内在抗原を対象とした解析を行った。手法開発については現在、論文投稿準備中である。H28年度の結果を受け、H29年度はHLAペプチド結合アッセイをフローサイトメータを用いて行う。フローサイトメータで測定を行う場合はアッセイ系の大幅な高速化は困難だが、オートサンプラーを導入することにより労力を削減し、より効率的に測定を行う。この方法で、日本人集団で主要なHLAクラスIIアリルおよび、HLAとの関連が確立されている自己免疫疾患に関わる抗原を対象としたHLA結合ペプチドアッセイを行う。また、がん抗原、感染症に関わる外来抗原を対象として、多数のHLAクラスIIアリル(ハプロタイプ)との相互作用解析を行う。