hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南都七大寺所蔵青銅製容器の形態と製作技術に関する編年的研究

(1).法隆寺所蔵青銅製容器約100点を実測し、材質分析やX線透視による製作技術を検討した.(2).日本・中国・韓国の古代から近世に至る青銅製容器の集成を行い、東アジアにおける器形の変遷をほぼ明らかにした.(3).材質分析からは大きくみると古代、中世、近世で明確に区分できることを発見した.(4).研究成果は平成15年度に『日本・中国・韓国古代青銅器容器の研究』(奈良文化財研究所学報)として刊行予定である.(1).法隆寺所蔵青銅製容器約100点を実測し、材質分析やX線透視による製作技術を検討した.(2).日本・中国・韓国の古代から近世に至る青銅製容器の集成を行い、東アジアにおける器形の変遷をほぼ明らかにした.(3).材質分析からは大きくみると古代、中世、近世で明確に区分できることを発見した.(4).研究成果は平成15年度に『日本・中国・韓国古代青銅器容器の研究』(奈良文化財研究所学報)として刊行予定である.1、基準資料である法隆寺所蔵青銅製容器の補足調査。(1)古代の鋺,中世の水瓶など10点を実測,写真撮影(2)同上資料のX線透視,蛍光X線分析2、法隆寺に関する史料から、金属製容器にかかわる記事の集成。集成をほぼ終了し、現在は一覧表作成中3古墳出土青銅製容器の調査。茨城・群馬・千葉・北海道・福岡の15例について実測,X線透視,蛍光X線分析4法隆寺宝物(東京国立博物館)の青銅製容器の調査。調査前の打合せは終了。次年度早々に本調査を行い、法隆寺における古代から近世に至る総合的編年案を確立する予定1.東京国立博物館・法隆寺宝物室にて飛鳥奈良時代の青銅製容10余点を調査。実測国の作成と写真撮影を実施2. 1の結果と,前年度の研究成果を踏まえて,平成10年7月に専門家による法隆寺青銅製容器の形態を製作技法・材質に関する研究会を開催(奈良国立文化財研究所にて)3.古代から近世に至る法隆寺所蔵青銅製容器の変遷案を確立し,報告書(奈良国立文化財研究所史料)の編集にかかっている(平成11年秋刊行予定)
喫煙誘導マウスモデルにおける肺がん発生機序

前年度までに我々は、A/Jマウスに対してタバコ煙中の主要な発癌誘導物質であるNNKを投与後にタバコ煙曝露を行い、喫煙誘導性に肺癌と肺気腫が生じるモデルを世界で初めて作製した。本モデルは簡潔に喫煙曝露を行うことで、肺腫瘍・肺気腫が形成されるモデルである。本年度は同プロトコールを施行した、空気曝露群、連続喫煙群、間歇喫煙群の気管支肺胞洗浄液、組織学的な評価、全肺のPCR等による間歇喫煙が肺気腫・肺腫瘍を増強する機序の解明に着手した。間歇喫煙群は連続喫煙群、空気曝露群と比較して気管支肺胞洗浄液の炎症細胞、特にマクロファージの増加などの炎症の増加、組織学的なM2マクロファージの浸潤を特に腫瘍近傍に認めた。本研究結果から炎症の増強が間歇喫煙曝露に伴う肺気腫・肺腫瘍の増強の機序の一つと考えられた。本研究期間前提として、喫煙に伴う肺気腫・肺腫瘍を評価できる世界で初めての実験モデルの確立、機序の一つの発見、今後の実験への足掛かりにつなげることができた。肺癌と慢性閉塞性肺疾患(Chronic obstructive pulmonary disease: COPD)は世界の主たる死因であり、喫煙はこの両者の主要な危険因子として知られている。肺気腫は不可逆的であり、またCOPD患者において肺癌発症のリスクを上昇させる。喫煙による発癌と気腫発生の双方に関わる機序は未解明であり、肺癌と肺気腫の両病態を同時に評価可能な動物モデルは存在しなかった。そこで我々は、A/Jマウスに対してタバコ煙中の主要な発癌誘導物質である4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)を投与後にタバコ煙曝露を行い、喫煙誘導性に肺癌と肺気腫が生じるモデルを作製した。またタバコ煙曝露の総量と総期間を同一にしたうえで、曝露パターンを変化させることにより、肺腫瘍形成と肺気腫形成の程度に影響が及ぶかを検討した。その結果、3か月間のタバコ煙連続曝露により、NNKにより誘導された肺腺腫と肺腺癌の形成は抑制された一方、肺気腫は進行した。次に1か月おきに3か月間曝露を実施した間歇曝露群では、3か月間の連続曝露群に比し、肺腺癌の形成が促進し、肺気腫も進行した。また1か月おきに3か月間曝露を実施した間歇曝露群をさらに4か月間禁煙状態で飼育し、喫煙曝露前・5か月経過時点・9カ月経過時点におけるマイクロCTを撮影し、5か月経過時点で形成された腫瘍が4か月の経過観察期間に増大することを確認した。タバコ煙曝露を間歇的に繰り返すプロトコルを用いることで、NNK投与後A/Jマウスの肺癌と肺気腫の形成は促進した。本研究結果は直ちにヒトの喫煙行動パターンを模したものとはいえないが、気腫を背景肺とした肺癌の病態生理ならびに治療の検討に有用な動物モデルを供するものと考える。喫煙曝露を断続的に行うことにより高率に肺癌・肺気腫を発生させることができるモデルマウスを確立した。肺気腫と肺癌の両者が断続喫煙で悪化するため、両者に共通する病態があるだろうとことが推察できる結果であった。以上から順調に進展していると考えている。腫瘍の免疫染色等により腫瘍の性質(M2マクロファージの浸潤や、腫瘍の発生期限)、全肺のPCR等、気管支肺胞洗浄液(BALF)の炎症細胞の分画やELISAなどにより1非喫煙群、2連続喫煙群、3間歇喫煙群の差異を検討する。上記を検討することにより、肺癌と肺気腫の共通の病態、将来の両者の化学予防の候補薬の選定につなげたい。
移植マウス乳癌におけるリンパ節転移とリンパ管再生

腫瘍のリンパ節転移には、腫瘍周囲にリンパ管が形成され、腫瘍細胞がリンパ管に浸潤することが必要である。移植マウス乳癌を用いて検討した結果、高転移性の乳癌細胞はリンパ管内皮増殖因子を分泌しリンパ管が多数形成されることが転移の要因となっている。また、ヒアルロン酸レセプター(CD44)を発現しているため、運動性が増し、腫瘍組織からヒアルロン酸がリンパ管に吸収されるに伴い、リンパ管に浸潤することがわかった。本研究は転移性の異なる二種類のマウス乳癌細胞を用いて、腫瘍におけるリンパ管の再生と腫瘍細胞のリンパ行性転移の機序を明らかにすることを目的とする。BJMC338とBJMC3879乳癌細胞株についてVEGF-C、CD44の発現を確認した後、それぞれ雌性BALB/cマウス鼠径部皮下に移植し経時的に屠殺、摘出した腫瘍、リンパ節・肺を検討した。VEGF-C・CD44の発現はBJMC338細胞で弱く、BJMC3879細胞で中程度の発現を認めた。移植8週後、BJMC338移植マウスではリンパ節・肺に転移は認められなかったが、BJMC3879移植マウスではすべてのマウスで肺・リンパ節に転移を認めた。移植腫瘍においてもVEGF-CはBJMC3879腫瘍で強かった。リンパ管はBJMC338腫瘍では常にBJMC3879腫瘍より有意に少なかった。一方、BJMC3879腫瘍ではリンパ管は2週より認められ、8週で最大数となり10週まで持続していた。リンパ管内皮前駆細胞は両腫瘍中に存在し、BJMC3879腫瘍で多い傾向を示した。また、CD44陽性細胞はBJMC338腫瘍では散在性に認められた。一方、BJMC3879腫瘍ではすべての腫瘍細胞が強く発現していた。BJMC338腫瘍のリンパ節ではLYVE-1,CD44,ヒアルロン酸の発現は弱かった。BJMC3879腫瘍ではリンパ節が肥大しており、リンパ洞にはCD44陽性の細胞が充満し、かつLYVE-1陽性のリンパ洞が多数認められた。BJMC3879腫瘍ではVEGF-Cをより強く発現しているためにリンパ管内皮前駆細胞からリンパ管再生が亢進しておりリンパ行性転移の一因になると考えられた。また、腫瘍細胞は自らが発現するヒアルロン酸レセプター(CD44)を用いて組織内のヒアルロン酸がリンパ管に吸収されていくに伴い、リンパ管に侵入し、リンパ節へと転移することが示唆された。本研究は、発生は同じであるが転移性の異なる2種類のマウス乳癌細胞(肺・リンパ節への転移が稀なBJMC338と高転移性のBJMC3879)を移植して作成した乳癌におけるリンパ管の再生と腫瘍細胞のリンパ行性転移の機序を明らかにすることを目的とする。前年度はBJMC3879乳癌細胞ではリンパ管内皮増殖因子VEGF-Cの分泌が高いので、リンパ管内皮細胞前駆細胞からリンパ管が多数再生されることがリンパ節転移の要因になっていることを明らかにした。リンパ節転移には腫瘍細胞がリンパ管に浸潤することが必須である。正常組織には大量のヒアルロン酸が存在し、ヒアルロン酸レセプター(LYVE-1)を発現するリンパ管に吸収されリンパ節で大部分が分解されている。われわれはこのヒアルロン酸の腫瘍組織からリンパ管への流れが腫瘍細胞のリンパ管浸潤に関与しているのではないかと考えた。BJMC3879細胞はヒアルロン酸レセプターのCD44を発現しており、細胞周囲にはヒアルロン酸結合タンパクが豊富に存在していた、一方BJMC338細胞はCD44を発現していない。さらに、BJMC3879細胞はヒアルロン酸への結合能・反応性がBJMC338細胞より優れていた。以上のことから、腫瘍細胞は自らが発現するヒアルロン酸レセプター(CD44)で組織内のヒアルロン酸がリンパ管に吸収されていくに伴い、リンパ管に侵入し、リンパ節へと転移することが示唆された。
環境配慮型圃場整備を行った農業排水路における魚類保全効果の検証

対象地の圃場整備事業後5年分のデータが蓄積された工区を対象に、5年間の魚類の個体数・種類数の推移をとりまとめた。その結果、排水路に施工された環境配慮施設は魚類の越冬場、退避場として一定の効果を発揮しているものの、繁殖場としてはほとんど機能しておらず、現状では水路に生育した雑草や寄洲がミナミメダカの貴重な繁殖場となっていること、これらの産卵基質は維持管理により除去されており、繁殖環境がぜい弱な状況であることが明らかとなった。また、農業水路に施工されている生態系配慮施設である「魚溜工」の堆積土砂の排出を促進するため、水理模型を用い、施設下流端に角スロープをつけて出水時の土砂の洗掘実験を行った。スロープ角を10度、20度、30度に設定し、スロープ無しの場合と比較した結果、スロープを付けた場合は無しの場合よりも有意に多くの土砂が洗掘され、スロープ角間には有意差が見られなかった。このことから、排水路の組み立て柵渠の1スパン分に相当する施設長約5mの魚溜工には、30度のスロープを付けることが妥当と判断された。一方、組み立て柵渠の2スパン分に相当する約10mの模型で実験を行った際には、スロープ角30度ではスロープ無しの場合と土砂洗掘量に有意差が認められなかった。そのため、施設長とスロープ長の比が洗掘の効果に関係するのではないかと考え、最終年度に実験を行うことにした。魚溜工のスロープ角度を変えた実験を、予定のところまで完了することができたため。また、圃場整備後、最大5年分のデータの蓄積のある工区についてデータのとりまとめが完了し、学会発表の見通しがついたため。魚溜工の施設長とスロープ長の比が洗掘に影響するかを模型実験により解明し、最適な魚溜工のモデルを明らかにする。また、最大6年分のデータを元に対象地において行われた圃場整備事業における環境配慮の評価を行い、必要に応じて改善策の提案を行う。平成28年度には、灌漑期の7月、非灌漑期の3月に、三重県松阪市朝見上地区の農業排水路を対象として、魚類を中心とする生物の生息状況を調査した。その結果、最も整備が早かった工区については3年分のデータを蓄積することができた。2種類の環境配慮施設「魚溜工」と「環境配慮型合流桝」では、魚溜工の方が土砂による埋没傾向が強いことが確認され、一部の施設では深み部分がほとんど埋没し、特に非灌漑期に魚類の生息状況が著しく悪化していることが確認された。また、事業対象地区に隣接する未整備の水路区間についても、物理環境条件および生物の生息状況を把握する調査を行った。また、魚溜工2地点、環境配慮型合流桝1地点を選定し、およそ月1回の頻度で土砂の堆積高を測定し、年間の堆積量の変化を把握した。イベントと堆積量の関係を解明するため、魚溜工の上流に自動採水器を設置し、採水試料中のSSおよび強熱減量の測定、粒度試験を実施することにより、年間を通じて施設に流入する土砂の供給量を把握した。その結果、代かき・田植え期に流入した土砂のD50粒径は4.9±3.6μmで水田由来と考えられ、降雨時に流入した土砂のD50粒径は56.6±39.7μmと大きく、畦畔由来と推定された。また、SSから強熱減量を差し引いた土粒子量から土砂供給量を算出し、年間堆積量に占めた割合を算出した結果、代かき・田植え期の寄与は18.3%、降雨時の寄与は66.9%となり、降雨時に畦畔から流入する土砂が堆積量に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。よって、生態系配慮の視点からも、畦畔植生に着目する必要があると考えた。魚溜工について、土砂の堆積を抑制する施設形状を解明するため、施設の1/4スケールの水理模型を作製し、現地調査から推定された洪水時流量を与えた場合の水路内の流速分布を3次元電磁流速計により測定した。研究の目的に示した13の3点について、以下に進捗を述べる。1施工後最大6年間のモニタリングデータ(生物+土砂)から環境配慮工法の魚類保全効果を評価すること、については、予定通り灌漑期および非灌漑期の調査を調査対象地の全地点において実施することができた。また、魚溜工に対する土砂供給量を推定することができ、順調に進展している。2現地での標識再捕獲調査および模型実験により魚溜工と合流桝の退避場としての効果を検証すること、については、計画では平成29年度に着手する予定であったが、予備的な水理模型実験を行うことができたため当初の計画以上に進展している。3模型実験および水理シミュレーションに基づくより効果的な環境配慮施設の形状を提示すること、については、当初想定していた2次元の解析では施設形状について十分に評価できないことが分かった。そのため、1の土砂供給量の推定に注力することとし、3では1形状についてのみ模型の作成と洪水時流量を与えた場合の水路内の流速分布の測定を行い、概ね順調な進展となった。産前・産後休暇および育児休暇取得により研究は実施しなかった。平成29年度は、産前・産後休暇および育児休暇取得により研究を実施できなかったが、前年度までに行っていた現地調査と模型実験で研究の方向性は明らかになっているため。

対象地の圃場整備事業後5年分のデータが蓄積された工区を対象に、5年間の魚類の個体数・種類数の推移をとりまとめた。その結果、排水路に施工された環境配慮施設は魚類の越冬場、退避場として一定の効果を発揮しているものの、繁殖場としてはほとんど機能しておらず、現状では水路に生育した雑草や寄洲がミナミメダカの貴重な繁殖場となっていること、これらの産卵基質は維持管理により除去されており、繁殖環境がぜい弱な状況であることが明らかとなった。また、農業水路に施工されている生態系配慮施設である「魚溜工」の堆積土砂の排出を促進するため、水理模型を用い、施設下流端に角スロープをつけて出水時の土砂の洗掘実験を行った。スロープ角を10度、20度、30度に設定し、スロープ無しの場合と比較した結果、スロープを付けた場合は無しの場合よりも有意に多くの土砂が洗掘され、スロープ角間には有意差が見られなかった。このことから、排水路の組み立て柵渠の1スパン分に相当する施設長約5mの魚溜工には、30度のスロープを付けることが妥当と判断された。一方、組み立て柵渠の2スパン分に相当する約10mの模型で実験を行った際には、スロープ角30度ではスロープ無しの場合と土砂洗掘量に有意差が認められなかった。そのため、施設長とスロープ長の比が洗掘の効果に関係するのではないかと考え、最終年度に実験を行うことにした。魚溜工のスロープ角度を変えた実験を、予定のところまで完了することができたため。また、圃場整備後、最大5年分のデータの蓄積のある工区についてデータのとりまとめが完了し、学会発表の見通しがついたため。生物の生息状況および物理環境についてのモニタリングを引き続き継続し、最大6年分のデータの蓄積を目指す。施設への土砂供給量の把握については、28年度の結果から畦畔植生が重要であることが示唆されたため、29年度以降に施工される工区を対象に畦畔植生の条件を変えた対照実験的な調査が実施できないか地元と検討する。また、植生について評価できる研究者に協力を依頼したい。魚溜工と合流桝の退避場としての効果の検証については、現地での調査よりも模型実験による評価の方が優先度が高いと判断されたため、十分な供試魚を確保し、適切な時期に模型実験を行って施設形状の違いが退避場としての特性にどのように影響するのかを解明する。また、土砂の堆積抑制および出水時の退避場として効果の高い環境配慮施設の形状を提案するために必要となる水理シミュレーションについては、3次元解析可能なソフトを使えるようにする。具体的には、iRICのNaysCUBEを考えている。平成29年度に圃場整備事業が行われた工区では生態系配慮施設の施工はなかったことから、通常の合流桝の位置を確認して調査対象とするかを検討し、灌漑期および非灌漑期の魚類採捕および物理環境調査を行う。魚溜工における土砂の堆積抑制については、上流端を段落ち、下流端をスロープとした形状で水理模型実験を行った結果、スロープ角が30度では土砂の洗掘効果が見られなかったことから、20度および10度で実験を行う。魚溜工の施設長とスロープ長の比が洗掘に影響するかを模型実験により解明し、最適な魚溜工のモデルを明らかにする。また、最大6年分のデータを元に対象地において行われた圃場整備事業における環境配慮の評価を行い、必要に応じて改善策の提案を行う。高速道路料金などクレジットカード支払いの項目について、引き落としまで時間差が生じるため、公用車ガソリン代をなどを支払う際に一旦残額がゼロになったタイミングがあり、学内の精算手続きの後に残額が生じていた。平成29年度は、産前・産後休暇および育児休暇の取得により研究を実施しなかったため。平成30年度の現地調査および模型実験において使用する。
肝臓造血と造血微細環境-三次元構築とCDマーカーによる免疫組織化学的研究-

胎生11-19日のICRマウス胎子と新生子の肝臓を用い,肝臓造血発達の計量的な解析を試み,さらに造血の変動に伴う肝細胞の配列の変化を三次元細胞構築と電顕レベルで観察した.肝臓造血の発生から終了までは造血巣の形態を中心に4つのステージにわけられる.すなわちStage I:造血細胞定着・増殖期<胎生10日>,Stage II:造血巣の形成期<胎生1112日>,Stage III:造血巣の拡大期<胎生13-14日>,Stage IV:造血の衰退期<胎生15日>.Stage IIIIで肝臓は造血器官として機能し,Stage IVでは肝細胞は消化器系器官としての特徴が顕著となる.造血はStage IIIでは赤血球生成が主体であるが,Stage IIIIVでは果粒球に加え,リンパ球様細胞が散在するようになる.肝芽細胞は胎生11-13目すなわち肝臓造血のStage IとIIにおいて,約870μm3のほぼ一定の細胞体積を有する.多角形状肝芽細胞にはE-カドヘリンによる接着性結合のみが認められる.胎生12-13日で連結面にはデスモゾームが出現する.胎生13日以降肝細胞体積値は急速に増加し,胎生13-19日の間に体積値は約3.2倍となる.Stage IIIで肝芽細胞は立方状となり,細胞側面の毛細胆管の周囲に密着結合と細隙結合が出来始め,接着性連結,デスモゾーム,密着性結合と細隙結合が出現する.Stage IV以降では肝細胞板が次第に明らかになる.造血退縮期に出現するリンパ球について,赤芽球との鑑別,サブグループの確定を目的として,CDマーカーの検出を試みた.成熟マウス脾臓白脾髄では,T細胞とB細胞とは明確に識別可能であったが,胎生後期並びに出生直後の肝臓はリンパ球を始めとして,各造血系細胞に特異的な陽性反応は認められなかった.抗マウスCDモノクロナール抗体による免疫染色の胎児への応用は今後の課題である.胎生11-19日のICRマウス胎子と新生子の肝臓を用い,肝臓造血発達の計量的な解析を試み,さらに造血の変動に伴う肝細胞の配列の変化を三次元細胞構築と電顕レベルで観察した.肝臓造血の発生から終了までは造血巣の形態を中心に4つのステージにわけられる.すなわちStage I:造血細胞定着・増殖期<胎生10日>,Stage II:造血巣の形成期<胎生1112日>,Stage III:造血巣の拡大期<胎生13-14日>,Stage IV:造血の衰退期<胎生15日>.Stage IIIIで肝臓は造血器官として機能し,Stage IVでは肝細胞は消化器系器官としての特徴が顕著となる.造血はStage IIIでは赤血球生成が主体であるが,Stage IIIIVでは果粒球に加え,リンパ球様細胞が散在するようになる.肝芽細胞は胎生11-13目すなわち肝臓造血のStage IとIIにおいて,約870μm3のほぼ一定の細胞体積を有する.多角形状肝芽細胞にはE-カドヘリンによる接着性結合のみが認められる.胎生12-13日で連結面にはデスモゾームが出現する.胎生13日以降肝細胞体積値は急速に増加し,胎生13-19日の間に体積値は約3.2倍となる.Stage IIIで肝芽細胞は立方状となり,細胞側面の毛細胆管の周囲に密着結合と細隙結合が出来始め,接着性連結,デスモゾーム,密着性結合と細隙結合が出現する.Stage IV以降では肝細胞板が次第に明らかになる.造血退縮期に出現するリンパ球について,赤芽球との鑑別,サブグループの確定を目的として,CDマーカーの検出を試みた.成熟マウス脾臓白脾髄では,T細胞とB細胞とは明確に識別可能であったが,胎生後期並びに出生直後の肝臓はリンパ球を始めとして,各造血系細胞に特異的な陽性反応は認められなかった.抗マウスCDモノクロナール抗体による免疫染色の胎児への応用は今後の課題である.肝臓造血発達の計量的な解析を試み,さらに造血の変動に伴う肝細胞の配列の変化を三次元細胞構築と電顕レベルで観察した.胎生11-19日のICRマウス胎子と新生子の肝臓を用いた.肝臓の1mmエポン切片で造血部と非造血部を区別し,それぞれの面積比をNIH imageを用い胎生各期で計測した.また,30-50枚のエポン連続切片で肝細胞の輪郭をトレースし,画像解析ソフトVoxel View(Vital Image,USA)で肝細胞構築を観察した.肝臓重量は胎生13日11.7mg,14日29.8mg,15日50.5mg,17日70.4mg,19日96.3mgとほぼ直線的に増加する.造血細胞は胎生10日で肝臓内に定着,主として赤芽球や巨核球が急速に増加し,造血巣の肝臓実質内面積比率は胎生13日でピークの77%に達する.以後,造血巣の面積比率は減少し,胎生15日で約50%,胎生19日で20%以下となる.胎生10-11日で造血細胞は肝細胞間に散在し,隣接する肝細胞は短い細胞質突起を連結させ幼弱な造血細胞を取り囲む.

肝臓造血の発生から終了までは造血巣の形態を中心に4つのステージにわけられる.すなわちStage I:造血細胞定着・増殖期<胎生10日>,Stage II:造血巣の形成期<胎生1112日>,Stage III:造血巣の拡大期<胎生13-14日>,StageIV:造血の衰退期<胎生15日>.StageIIIIで肝臓は造血器官として機能し,Stage IVでは肝細胞の配列は消化器系器官としての特徴が顕著となる.造血はStageIIIでは赤血球生成が主体であるが,Stage IIIIVではリンパ球様細胞が造血巣内に散在するようになる.細胞表面マーカーを認識するCDモノクロナール抗体を利用して,リンパ球を初めとする各血球系の出現を肝臓造血の推移と関連して検討する計画である.造血微細環境を形成する肝芽細胞の形態と細胞間連結の変化を,超微形態レベルと免疫組織化学的に観察した.肝芽細胞は胎生11-13日すなわち肝臓造血のStage IとIIにおいて,約870μm3のほぼ一定の細胞体積を有する.肝芽細胞は多角形状で,隣接する細胞連結面にはE-カドヘリンを接着タンパクとする接着性結合のみが認められる.胎生12-13日で連結面にはデスモゾームが出現する.胎生13日以降肝細胞体積値は急速に増加し,Stage IIIの15日で1280μm3,19日には2796μm3となり,胎生13-19日の間に体積値で約3.2倍に増加する.StageIIIの胎生14日で肝芽細胞はその形態が立方状に変化し,細胞側面では毛細胆管の周囲に密着結合と細隙結合が形成され始め,成熟マウス肝細胞の接着性連結,デスモゾーム,密着性結合と細隙結合の4種の連結装置がすべて出現するようになる.Stage IVすなわち胎生15日以降の肝臓では,隣接する肝細胞は広い細胞側面で連結し,肝細胞板の形態を呈するようになる.肝芽細胞の変化と平行して,肝臓内の造血細胞系の種類は著しく変化する.肝臓造血の退縮期に赤芽球や果粒球に混じって出現するリンパ球について,赤芽球との鑑別,サブグループの確定を目的として,細胞表面のCDマーカーの免疫染色を試みた.使用抗体は抗CD3 ε,抗CD19,抗CD34,抗CD41,抗CD45RA,抗CD45RC,抗CD49d,抗CD90(Thy-1)である.陽性コントロールで,成熟マウス脾臓白脾髄を染色すると,T細胞とB細胞とを明確に区別可能であった.胎生後期並びに出生直後の肝臓で免疫染色を行ったが,いずれの抗体に対しても,好中球のごく一部とマクロファージ様細胞の一部が陽性であった以外,リンパ球を始めとして,各系に特異的な陽性反応は認められなかった.抗マウスモノクロナール抗体によるCDマーカー検索は,骨髄系もリンパ系いずれもマウス胎生期造血細胞の検出には問題があり,胎児への応用は今後の課題といわざるを得ない.
OCTと分光SDF撮像法を統合した微小循環のマルチモーダルイメージング

微小循環における酸素飽和度(SO2)のモニタリングは疾患の状態の把握や機序の理解をする上で重要である。そこで、我々はこれまでに微小循環イメージングを目的としてSidestream Dark-Filed (SDF)カメラを試作してきた。しかし、SDFオキシメトリの精度は組織表面から撮影対象までの深さ(撮影深度)に大きく依存している。そこでまず光伝搬モンテカルロシミュレーションに基づくSDFオキシメトリの撮影深度補正手法を考案した。光学ファントム実験を実施し、取得したSDF画像に対して提案手法を適用した結果、推定誤差が25%から3%に補正され、手法の有効性が示唆された。この結果は日本医用画像工学会において担当の大学院生が口頭発表を行い、奨励賞を受賞した。次に小動物を用いたSDFオキシメトリの妥当性検証を行った。まずラット背部微小循環を対象に、吸入酸素濃度(FiO2)の制御により誘発した急性低酸素刺激時のSO2の経時変化を観察した。FiO2の増減に対応したSO2推定値の変化が観察され、SDFオキシメトリにより微小循環の酸素状態の変化を観察可能であることが確認された。以上より、SDFオキシメトリの生体への適用可能性が示唆された。この結果を世界的に権威あるJournal of Biomedical Optics誌(IF=2.6)に投稿して、掲載に至った。Optical coherent tomography(OCT)に関してはOCTを小動物の微小循環に適用して映像から血管構造を抽出するアルゴリズムを開発した。さらにSDF撮影系と融合するためのハードウェアも整え、OCTから可視化した血管構造にSDF撮影で得た酸素飽和度マップを重畳することができるようになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。SDF撮影において、血管内酸素飽和度を推定する方法について詳細に検討した。理論面ではモンテカルロシミュレーションによって誤差要因を検討するとともに推定精度の見積もりを行った。さらに酸素飽和度推定値の修正方法を考案して、血管ファントム実験を通してその有効性を確認した。また、提案方法をブタ小腸の微小循環像に適用して、概ね妥当な酸素飽和度マップを得た。SDF撮影で得られた血流動画像に対して血流速を算出する画像処理手順も確立した。中でも取得した原動画像に対してロバスト主成分分析を適用することで血流を強調し流速の算出を容易にした点は新規かつ有用であった。さらにこれらの手法を小動物に適用した。この結果、敗血症モデルラットにおいて血流速が優意に減少し、その応答性は一般に指標として用いられている乳酸値よりも鋭敏である可能性が示唆され、医学的有用性も指摘することができた。腫瘍マウスを用いた小動物実験にも着手した。これまで未経験であった担癌マウスの生成のノウハウを獲得し、その腫瘍部分の血管新生を画像化することにも成功した。分光SDF撮影に関しては、まずワンショットマルチバンドカメラの諸特性を調査した。とりわけ、各バンドの分光特性の重なりの大きさを把握し、ウィナー推定によって重なりを除去する方法を試み、概ね良好初期結果を得ることができた。OCTに関しては機器の納期の問題から、稼働開始が年度末近くになったため、統合システムの構築は29年度に行うこととした。以下に示すとおり、AからDの4項目に分けて研究を進めている。Aの装置(ハードウェア)作成部分がやや遅れているものの他の項目は順調に進展しており、全体としては概ね順調と言える。【A撮像光学系の構築】SDF撮影系ではワンショットマルチバンドカメラの分光特性の把握とスペクトル推定を試行することができた。また、OCTと連動させるための機構の設計および部材の調達を行った。連動した装置の構築についてはやや遅れているが、29年度早期には実現できる見込みである。【B融合像生成・画像解析】異なる焦点位置で撮った複数のSDF画像から血管抽出を行うアルゴリズムを構築し、血管ファントムに適用、さらにファントム内血液に対する酸素飽和度推定も行うことができた。【C酸素飽和度推定法の構築】光伝搬シミュレーションやファントム実験を通して、概ね予定どおり酸素飽和度推定方法の構築を進めることができた。【D動物実験】予定通り担がんマウスの作成、腫瘍部の微小循環の撮影が可能になった。Sidestreamdark field (SDF)撮影において、血管内酸素飽和度を推定する方法について詳細に検討した。特に、血管の深さによって散乱の効果が異なるため、酸素飽和度の推定において深さに応じた補正を行う必要性を認識し、具体的な方法を考案した。方法の有効性をモンテカルロシミュレーションおよび牛血を用いた物理ファントム実験の両面から確認することができた。この結果を国際会議において口頭発表した。さらに、ラットを用いた実験において、窒素ガス量をコントロールすることによって酸素飽和度を変えられるよう実験系を整えた。この実験を実施したところ供給する酸素量の変化に応じて、SDF画像から算出される血管内血液の酸素飽和度が妥当に変化することが確認できた。この結果は米国の学会IEEEの国際会議EMBC2018にて発表すべく論文投稿を行った。Optical coherent tomography(OCT)に関しては当初想定した画質が得られず、納入業者に複数回改善を要請した。この作業に数か月要したが、これにより改善がなされた。OCTを小動物の微小循環に適用して映像から血管構造を抽出するアルゴリズムを開発した。SDF撮影系と融合するためのハードウェアも整えることができた。なお、さらに高性能のOCTを開発する国内のベンチャー企業との共同研究開発も開始した。

特に信号処理・パターン認識部分の開発を担当することにより、広くOCT信号に適用できる普遍的なアルゴリズム開発につながることが期待される。また、SDFは被写体に接触して撮影する方法であるが、偏光フィルタをクロスニコル配置して画像取得する光学系も同時進行で進めたところ、非接触で概ね類似の画像が得られることがわかった。SDFに関しては順調に研究が進んでいるが、OCTに関しては装置性能が不十分な事態が続き、遅れが生じていた。年度後半になってこれが改善し、その後実験を急ぎ、おおよそ挽回できている。微小循環における酸素飽和度(SO2)のモニタリングは疾患の状態の把握や機序の理解をする上で重要である。そこで、我々はこれまでに微小循環イメージングを目的としてSidestream Dark-Filed (SDF)カメラを試作してきた。しかし、SDFオキシメトリの精度は組織表面から撮影対象までの深さ(撮影深度)に大きく依存している。そこでまず光伝搬モンテカルロシミュレーションに基づくSDFオキシメトリの撮影深度補正手法を考案した。光学ファントム実験を実施し、取得したSDF画像に対して提案手法を適用した結果、推定誤差が25%から3%に補正され、手法の有効性が示唆された。この結果は日本医用画像工学会において担当の大学院生が口頭発表を行い、奨励賞を受賞した。次に小動物を用いたSDFオキシメトリの妥当性検証を行った。まずラット背部微小循環を対象に、吸入酸素濃度(FiO2)の制御により誘発した急性低酸素刺激時のSO2の経時変化を観察した。FiO2の増減に対応したSO2推定値の変化が観察され、SDFオキシメトリにより微小循環の酸素状態の変化を観察可能であることが確認された。以上より、SDFオキシメトリの生体への適用可能性が示唆された。この結果を世界的に権威あるJournal of Biomedical Optics誌(IF=2.6)に投稿して、掲載に至った。Optical coherent tomography(OCT)に関してはOCTを小動物の微小循環に適用して映像から血管構造を抽出するアルゴリズムを開発した。さらにSDF撮影系と融合するためのハードウェアも整え、OCTから可視化した血管構造にSDF撮影で得た酸素飽和度マップを重畳することができるようになった。【A撮像光学系の構築】SDF撮影系:28年度末に調達した高精細カメラを用いたSDF撮影系を新たに構築する。特に暗視撮影系を実現するための照明系を高精細撮影系に合ったジオメトリで設計・製作する。OCT連動撮影ステージの構築:SDFカメラと28年度終盤に納品されたOCT装置が同一の軸上をコンピュータ制御により移動可能な機構を構築する。広域収集ができるように、各装置ともXYZ軸の微細な移動を可能にする。【B融合像生成・画像解析】
一般超幾何関数の研究

本研究では、特殊関数の統一的研究を目的とし、そのため多くの特殊関数の母関数となっている一般合流超幾何関数の解析を進めることを計画していた。一般合流超幾何関数のうち、一重積分表示を持つものを考える。これは指数関数に有理関数を代入したものと、1次式の巾積を掛け合わせて積分したものであり、有理関数の係数及び1次式の係数の関数となる。但し、有理関数の係数の表わし方に特徴があり、それは線形アーベル群の指標に由来していた。さて、このような超幾何関数に対し、積分表示における積分領域=cycleを、確定型の場合のtwisted cycleから、合流操作によって構成することが出来た。こうして構成されたcyclesが1次独立であることを示すため、周期行列の行列式を計算する必要がある。これは、確定型の場合のYarchekoの求めた周期行列式の合流として具体的に計算することが出来た。この結果は、上で注意した特徴的な係数の入れ方に負うものと考えられる。従って、このcyclesが1次元ホモロジー群の基底となることが分かり、この場合の一般合流超幾何微分方程式系の階数が求められた。また以上の結果は、既に得られているcocyclesの合流と併せると、関数の合流を与えることが分かる。即ち、級数展開等の局所解析的な研究と、接続係数を始めとする大域的研究への足掛りが得られたことになる。更に、一般合流超幾何関数と、多変数Whittaker関数等の不変微分作用素の同時固有関数、多変量統計学、保型関数論等に由来する行列Bessel関数、量子重力場の理論に関連して現れる行列Airy関数等との類似も認識されるようになってきた。このことは、一般合流超幾何関数の理論の豊かさを示唆するのみならず、その多様な研究の可能性を与えている。
「寄生胞」を介したトキソプラズマ―宿主間相互支配の“力学”の解明

トキソプラズマは寄生虫の一種です。ヒトには主にトキソプラズマが感染している肉を加熱不十分で食することによって感染し、エイズや抗癌剤治療下にある免疫不全患者に致死性の脳症や心筋炎を引き起こす他、妊婦が初感染すると流産または新生児の先天性疾患の原因になり、わが国でも症例数が増加しています。トキソプラズマに対してわれわれ宿主はインターフェロンガンマに依存した免疫反応を起こし対抗しますが、その免疫反応がどのように抑制(ブレーキ)されているのかについては全く不明でした。本研究で、1インターフェロンガンマによって誘導されるトキソプラズマを破壊する免疫反応が、宿主からRabGDIαを取り除くことによって著しく増強され、その結果、トキソプラズマ原虫数が少なくなること、2高力価トキソプラズマ感染でも、RabGDIα欠損マウスは生存率が高く、致死的な脳症の程度が軽いこと、3RabGDIαに存在する脂質結合ポケット(タンパク質の「穴」)が、そのブレーキ機能に必須であることを示しました。本研究成果は、RabGDIαの機能を阻害することによってトキソプラズマに対する免疫機能が大幅に増強し、トキソプラズマ脳症の重症度が改善されたことから、近年我が国においても症例報告が急増しているトキソプラズマ症に対して、RabGDIαという新たな分子を標的とした新規治療戦略を提供できるものとして大いに期待できます。27年度が最終年度であるため、記入しない。トキソプラズマは寄生虫の一種で、エイズや抗癌剤治療下にある免疫不全患者に致死性の脳症や心筋炎を引き起こす。十分加熱されていない肉(レアのステーキや生ハムでも)から感染する以外に猫のふんから感染することも確認されている。妊婦が感染すると流産、新生児の水頭症など先天性疾患の原因になり、わが国でも報告が増加しているが、トキソプラズマが持つどの病原性因子が局所から全身性に感染拡大に関与するかは全く不明であった。本研究で、1トキソプラズマが宿主細胞内に分泌するGRA6が宿主重要転写因子であるNFAT4を非常に強く活性化する能力を有すること2GRA6によって活性化されたNFAT4が、強力な免疫細胞遊走能を有するケモカインを感染局所でさらに誘導し、免疫細胞である好中球が感染局所に呼び寄せられ、トキソプラズマがその好中球に感染すること3好中球をまるで「トロイの木馬」のように利用して、トキソプラズマが局所から全身性に感染拡大していることを明らかにした。本研究では、トキソプラズマが宿主細胞内に分泌する病原性因子GRA6を使用して、宿主免疫機構を「ハイジャック」することにより病原性を最大化するメカニズムを解明したのと同時に、宿主因子NFAT4の活性化がトキソプラズマの病原性発揮に重要であることを示した。この点に関して、転写因子NFAT4を含めNFATの活性化を阻害する薬剤は、すでに別の用途で治療薬として広く世の中で使用されている。従って、トキソプラズマの感染初期において、全身性にトキソプラズマの伝播を阻止する目的でNFAT活性化阻害薬が使用されることにより、トキソプラズマ症の発病を食い止める新規の治療・予防戦略を提供できることが期待される。トキソプラズマが寄生胞に放出する病原性因子GRA6の新規宿主改変機構を同定し、学術誌に報告できたから。人工的なマトリョーシカ化をはかるために、強制的にEGTさせる遺伝子産物を宿主細胞内にて作らせる。しかしそれが「寄生胞」内の原虫に輸送されるとは限らない。「寄生胞」膜上に存在するタンパク質であれば、宿主細胞質側から供給可能である。実際にROPsを宿主細胞で発現させると自律的にROPsが「寄生胞」に局在し機能することが以前に報告されている。トキソプラズマが「寄生胞」内で増殖するためには、宿主から脂質を取り込まねばならない。その分子機構に関してトキソプラズマのゲノム上にいくつかの脂質トランスポーターが存在することが報告された。その中でABCG107は唯一「寄生胞」内及び膜上に存在することが示され、人工的EGTさせる候補分子としては最適であると考えた。

そこでABCG107が原虫内でどのような機能を有するかを調べる目的で、相同組換え法によりABCG107欠損原虫を作製し、哺乳動物細胞内での増殖や脂質の取り込みについて検討する。また通常の遺伝子欠損法で作製できない場合は、テトラサイクリン(Tet)依存的に遺伝子欠損する原虫を作製して解析する。またABCG107を哺乳動物細胞で発現させ、原虫感染時の「寄生胞」に局在化、そのトランスポーターとしての方向性が適切性を共焦点顕微鏡を使用し免疫染色法による細胞生物学的手法で検討する。またABCG107が遺伝子欠損しても表現型がない場合は、「寄生胞」形成に関与する候補分子としてROPsを中心に遺伝子欠損原虫を作製し必須分子を探索する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
複合型神経堤症候群PCWHの病態解明によるSOX10アレル親和性の分子基盤の解明

ある同一の遺伝子内の異なる変異が、異なる表現型を呈する別個の疾患の原因となる現象をアレル親和性と呼ぶ。アレル親和性の分子基盤の理解には、各疾患の分子病態の解明が必要である。我々は、転写因子SOX10の変異が、アレル親和性効果によりWS4とPCWHの2つの異なる疾患を引き起こすことを明らかにし、in vitroでの分子病態解析により、SOX10におけるアレル親和性の分子基盤を明らかにしてきた。本申請では、さらにBACトランスジェニックマウスの手法を用いてPCWHの組織細胞レベルでの分子病態を明らかにし、in vivoでのSOX10アレル親和性の分子基盤を明らかにした。ある同一の遺伝子内の異なる変異が、異なる表現型を呈する別個の疾患の原因となる現象をアレル親和性allelic affinityと呼ぶ。本申請では、さらにBACトランスジェニック(Tg)マウスの手法を用いてPCWHの組織細胞レベルでの分子病態を明らかにし、in vivoでのSOX10のアレル親和性の分子基盤を解明することを目的とする。本年度は、Construction-PCWHマウスモデルの作成および、Evaluation-PCWHマウスモデルの評価の2点について研究を行った。PCWHマウスモデルの作成については、これまでに開始している1400del12延長型変異導入マウスの作成を行なった。その結果、解析用ラインとして2ラインを確立した。PCWHマウスモデルの評価については、トランスジーン発現パターンの評価を行なうとともに、PCWHに関与する表現型の評価、とくに中枢および末梢神経系の髄鞘における形態的な評価を中心に行なった。本年度は、Evaluation-PCWHマウスモデルの評価、およびDissection-PCWHマウスモデルの病態の解明の2点について研究を行った。PCWHマウスモデルの評価については、表現型がTgコピー数依存的に変化することを見いだした。PCWHマウスモデルの病態の解明については、胎生期の末梢神経系の発生期におけるシュワン細胞の分化の異常、生後の中枢神経系のオリゴデンドロサイトの成熟の遅延などの所見が得られ、本モデルマウスの神経学的な病態が明らかになった。また、末梢神経系の解析を開始し、髄鞘化の遅延を示唆する所見が得られた。本年度は、昨年度に引き続きPCWHマウスモデルの病態の解明について研究を行った。PCWHマウスモデルの病態の解明については、中枢神経系においては、Tgコピー数依存的にMBPの発現の低下が見られた。Oligo2陽性細胞数は変化ないことから、オリゴデンドロサイトの成熟の遅延が生じているものと思われた。また、末梢神経の髄鞘化の遅延も認められた。さらに脊髄からDRGへOligo2陽性細胞の異所性遊走を認め、中枢-末梢境界の破綻をきたしていることが示唆された。
低出力体外衝撃波を用いた慢性創傷に対する非侵襲性治療法の開発

西欧諸国では糖尿病性足潰瘍や慢性下腿潰瘍に対して低出力体外衝撃波治療が実際に用いられている国があるが、本邦での認可はされていない。糖尿病,重症虚血肢(閉塞性動脈硬化症など)が原因となる動脈性・虚血性潰瘍で血行再建が難しい症例において本法は最後の切り札としての役割も期待できる。動物実験を通じてその血管新生作用が明らかにされた。並行して、臨床応用のために準備を進めてきた。結石破砕に用いる出力の約10%程度の低出力体外衝撃波治療は、皮膚創傷に対して血管新生および組織の修復を促す効果があると考えられている。そのメカニズムは未だに解明されていない。糖尿病マウスを用いて難治性創傷モデルを作成し、創傷治癒過程における低出力衝撃波治療の影響について解析を行い、衝撃波が創傷部位におけるeNOS及びVEGFの発現を高め、血管新生を促進するとともに、創傷治癒に対する促進効果を示すことを確認した。さらに、衝撃波の創傷治癒促進効果にeNOSが関与するかどうかを検討するために、糖尿病状態のeNOS-KOマウスとWTマウスの皮膚に創傷を作成し、衝撃波の創傷治癒過程に対する促進効果について両群間で比較検討を行った。その結果、eNOS-KOマウスでは、WTマウスに比べて、衝撃波によるVEGFの発現の減少と共に、血管新生促進効果の減弱がみられ、さらに衝撃波による創傷治癒促進効果が有意に減弱することが明らかとなった。これらの結果から、衝撃波は、eNOSの発現誘導を介することで、VEGF発現とともに血管新生を増強し、創傷治癒の促進効果を示すことが明らかになった。eNOSの活性化は、VEGFの発現を誘導するため、血管新生において重要な過程である。このように、低出力体外衝撃波治療は創傷に対して血管新生を増強し、創傷治癒を促すと考えられる。今回、マウスの開放創に低出力の衝撃波を照射し、皮膚血流および創面の変化を評価し、有効性を確認できた。難治性皮膚潰瘍の新たな治療法の確立に繋がり、臨床的意義は大きい。使用する衝撃波発生装置はStorz社製Duolith SD-1である。78週齢の成熟雄マウス(C57BL/6J)とeNOSノックアウトマウス(eNOS-KO)を使用した。18時間の絶食後、STZ 150mg/kgマウス(0.15mg/g)投与9日後に血糖値が300mg/dl以上をSTZ誘発糖尿病マウスとし、直径8mmのデルマパンチを用いて背側皮膚に、脊柱から離れたところで、潰瘍創を1か所作成した。創作成3日目に、照射は創部に直接行い、創1ヶ所あたり毎秒4発で100発、0.25mJ/mm2の強さで一回行った。照射後3、5、7、10日目に安楽死させた後、組織をサンプリングし、組織学的検討および生化学的検討を行った。創面積の縮小率は野生型では対照群よりも照射群が有意に縮小したが、eNOS-KO型では両群の間に有意差はなかった。次に、創傷におけるVEGFおよびeNOSの発現をmRNAレベルおよびタンパク質レベルで調べたところ、野生型の照射群では確認できたが、eNOS-KO型の照射群では確認できなかった。そして、CD31およびCD34の免疫染色で血管密度(MVD)を計測したところ、野生型では対照群よりも照射群が有意に増加したが、eNOS-KO型では両群の間に有意差はなかった。低出力衝撃波治療が創傷部位におけるeNOS及びVEGFの発現を高め、血管新生を促進するとともに、創傷治癒に対する促進効果を示すことを確認した。eNOS-KOマウスでは、WTマウスに比べて、低出力衝撃波治療による創傷治癒促進効果が有意に減弱し、VEGFの発現の減少と共に、血管新生促進効果の減弱がみられることが明らかとなった。これらの結果から、低出力衝撃波治療は、eNOSの発現誘導を介することで、VEGF発現とともに血管新生を増強し、創傷治癒の促進効果を示すことが明らかになった。低出力体外衝撃波治療の創傷治癒促進作用は、eNOSを活性化させることによって血管新生を引き起こすことによりもたらされたと考えられた。正常のマウスは創傷治癒が早いため、慢性創傷モデルとして糖尿病マウスを用いた。遺伝的糖尿病マウスは費用面で高額なため、使用は避けた。そこで、文献的に報告もあるSTZ誘発糖尿病モデルを用いることにした。我々は、予備実験において300mg/dl以上を糖尿病マウスと定義した場合、STZの腹腔内注射により約45週ほど、高血糖(400600mg/dl)が持続されるのを確認した。このSTZ誘発糖尿病マウスの背部に8mmデルマパンチを用いて皮膚全層欠損創を作成すれば、創傷治癒が遷延した慢性創傷モデルの作成が可能と考えた。こちらも予備実験において20日間の創傷治癒の遷延が確認できた。

皮膚領域における体外衝撃波の至適エネルギー条件を検討した結果、0.10.25mJ/mm^2の照射エネルギーで良好であったので、本実験は照射は創1ヶ所あたり毎秒4発で200発、0.25mJ/mm2の強さで行うことにした。そして、照射日、照射後3日目と10日目の創床の面積をスキャナーでコンピュータ入力した後、画像解析システム(Axio Photo C-5310 Zeiss(株))によって測定し、経時的に創面積の変化を観察したところ、照射群で有意に創収縮を認めた(88.2 ±14.5% vs. 71.1 ±13.6% in LE-ESW-treated [n = 11]and untreated WT mice [n = 8])。当初の計画通り実施し、低出力体外衝撃波治療の創傷治癒促進作用は、eNOSを活性化させることによって血管新生を引き起こすことによりもたらされることを初めて明らかにした。当初計画していた動物モデルの改良として、慢性皮膚創傷モデルの確立を行うことができた。また、体外衝撃波治療のが創傷治癒に与える影響として、治癒が促されることが実証できた。体外衝撃波治療のプロトコールを作成し、臨床応用を考える。使用する衝撃波発生装置はストルツ社製Modulith SLCを予定している。Energy flux density 0.005-0.50mJ/mm2、Frequency 1-5Hz,focal size 2.4mm×25mm Focal distance 50mm,超音波内臓で深部組織の描出が可能である。評価期間は原則として照射後8週間とし、早期に癒合した場合にはその時点で終了し、最終評価を行う。介入前の創収縮率と介入後の1週間当たりの平均創収縮率を比較する。前年度の実験で、体外衝撃波治療は創傷治癒を促すことが実証された。したがって、次年度は体外衝撃波が創傷に与える影響と創傷治癒を促すメカニズムについて網羅的に検討していく。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成23年度請求額とあわせ、次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。前年度の実験を発展させて、低中エネルギーで体外衝撃波治療を行った場合、生体に与える影響として血管新生が知られている。これらを病理組織学的かつ分子医学的に評価し、検討する。具体的には、照射後3日目と10日目にエーテル深麻酔により安楽死させた後、組織をサンプリングし、CD31抗体による免疫染色を用いる。光学顕微鏡で観察し、組織写真を撮影し、創縁における真皮中の血管数をカウントし、単位面積当たりの血管数として血管新生の程度を評価する。また、分子医学的評価としては血管新生に関係するサイトカインとしてVEGFの発現やその産生を誘導するeNOSの発現などを調べる。サイトカインのmRNAの発現確認は、サイトカインの一部を増幅するプライマー(センス鎖とアンチセンス鎖)を用い、RT-PCR法によって行う。同様に創傷治癒に関係する炎症性サイトカインについても調べ、その関連性を探る。
EB-PVDによる耐剥離界面を持つ耐熱コーティングの研究

EB-PVD法により作製した遮熱コーティング(TBC)の高温・大気中静的熱暴露および繰り返し酸化に伴う組織変化を観察するとともに、熱成長層(TGO)層中の応力を測定し、微細組織の変化との相関性を明らかにした。まず、TBCを大気中で1100°C、0100hの範囲で熱暴露試験を行った。また繰り返し酸化は保持温度1100°C、保持時間45分とした。熱暴露前後のTBC試料の組織観察を行った。TGO中の応力は蛍光分光法により測定した。測定時の面分解能は1.5μmおよび660μmとした。その結果、トップコート(TC)層にはTCとボンドコート(BC)界面に対し、垂直な方向に成長した柱状ZrO_2が形成され、熱暴露時間の増加に伴いTC層中の空隙が少なくなっていた。また、TGO層の厚さは増加するものの厚さに不均一性が生じた。断面上での応力測定から、TGO層には全体として圧縮応力が働き、その応力はBC側よりもTC側の方が大きいことが確認された。TC側から測定した、TGO層の平均応力は熱暴露前には2.6Gpaであり、TGO層の厚さに伴い平均応力は増加した。応力の実験値との比較から、TBC材料の損傷と応力との間に密接な関係がることが見出された。EB-PVD法により作製した遮熱コーティング(TBC)の高温・大気中熱暴露に伴う組織変化を観察するとともに、熱成長層(TGO)層中の応力と微細組織の変化との相関性を明らかにした。まず、TBCを大気中で1100°C、0100hの範囲で熱暴露試験を行なった。トップコート(TC)層にはTCとボンドコート(BC)界面に対し、垂直な方向に成長した柱状ZrO_2層が形成され、熱暴露時間の増加に伴いTC層中の空隙が少なくなっていた。また、100hの試料ではTC/TGO界面近傍にTC層中での微視クラックの発生が観察された。一方、BC層中には、Ni_3Al相が均一に分布しており、熱暴露時間の増加に伴いNi_3Al相の存在比は減少し、Ni_3Al相欠乏層の厚さが増加していた。また、50h以上の熱暴露では基材側の欠乏層にカーケンドール効果の影響と見られるボイドが多数生成されていることが確認された。熱暴露時間の増加に伴うTGO層の厚さの変化については、その厚さをh_<TGO>とすると、h_<TGO>【approximately equal】h^0_<TGO>+k・t_h^<0.4>に従っていた。ここで、h^0_<TGO>、kはそれぞれ熱暴露前のTGO層の厚さ、速度定数である。TGO層の応力は顕微蛍光分光法により測定した。TGO層中には3GPaの平均圧縮応力が働いていた。また、TGO中に凹凸が生じた部分では、応力がTC側、BC側で異なることが明らかになった。TC層中に生じた微視破壊とTGO層中の応力分布を考えると、TC層中ではTGO層が下に凸の場所の上部でTC層中で割れた面に垂直方向に引張応力成分が働き、これが微視破壊を引き起こす要因であると考えられた。