hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞ニッシェ可視化システムの開発

「成体哺乳類内の神経(あるいはその他の細胞種の)幹細胞ニッチの正確な同定」のためのパイロットツールとして、蛍光蛋白を利用して『神経幹細胞を取り囲む細胞』を標識するシステムの開発に挑戦した。簡単には、蛍光ペプチドを神経幹細胞から放出させ、それを速やかに周囲の細胞に取り込ませることにより、「神経幹細胞を取り巻く、すなわち、神経幹細胞ニッチを構成する細胞群に相当する細胞を蛍光によってラベルする」というアプローチである。その結果、神経幹細胞を取り巻く細胞が想定通りに蛍光でラベルされ、同定可能であることを確認できた。しかしながら、その蛍光の強度は予想よりも低く、今後更なる改良を要することも判明した。本研究では、蛍光蛋白を用いて『神経幹細胞を取り囲む細胞』の標識を目指している。使用するレポーターコンストラクトの準備はほぼ完了した。具体的には以下の通りである。I.バックボーン:一般的なプラスミド発現ベクターに加え、レンチウイルス発現ベクターも使用する。本研究のストラテジーに合うよう、若干の改造を施した。II.遺伝子発現制御領域:当初の(1)ラットnestinエンハンサー+プロモーター及び(2)マウスSox2プロモーター、の2つに加え、将来のがん幹細胞研究への応用を見据え、(3)ヒトCD44プロモーター及び(4)ヒトCD133プロモーターの2点を追加した。4つとも最終組み込みのためのエントリークローン化が完了している。III.融合ペプチドコーディングシークエンス:レポーター融合ペプチド(通称『RelCat』)のコーディングシークエンスが完成した。なお、赤色蛍光蛋白は当初Katushka 1.3(=TurboFP635)を使用する予定であったが、その誘導体であり、細胞毒性がより低い単量体・FusionRedに変更した。完成後速やかに発現コンストラクトをヒト293T等の培養細胞株に導入して上記融合ペプチドの生成を確認し、その後の実験を進める。「哺乳類生体内の神経幹細胞ニッシェの正確な同定」という将来的なゴールのためのパイロットツールとして、本研究では『神経幹細胞を取り囲む細胞』を蛍光蛋白を利用して標識するシステムの開発を目指している。まず、異なる2色の蛍光タンパクから成る融合ペプチド『RelCat』のコーディング・シークエンス(CDS)を、赤色蛍光蛋白FusionRed及び緑色蛍光蛋白EGFPの組み合わせで作製し、それをヒトEFプロモーターを含む哺乳類発現ベクターに組み込み、ヒト胚性腎臓細胞・293Tで評価した。その結果、(1)細胞内において、2つの蛍光タンパクから成る融合ペプチドが生成されること。(2)その融合ペプチドが細胞内で2つの蛍光ペプチドに切断されること。(3)片方の蛍光ペプチドは細胞内に残り、もう一方が細胞外に排出されること。(4)細胞外に排出された蛍光ペプチドが、培養液から再度細胞に取り込まれること。等の、当システムが備えるべき基本的性質を確認できた。次に、このCDSをレンチウイルス発現ベクターに組み込み、ヒト胚性神経幹細胞株のニューロスフェアでも機能検定したが、残念ながら、細胞外への排出後に取り込まれた赤色蛍光蛋白の強度が予想よりもかなり低かった。そのため、追加で5種類の蛍光蛋白コンビネーションのCDSを準備し、それらを同様に評価した。その結果、上記オリジナルのものよりも蛍光強度が有意に高いベストなバージョンを決定することができた。並行して、レポーター遺伝子EGFPを用いて、4種類の遺伝子発現制御領域(ラットnestinエンハンサー+プロモーター、マウスSox2プロモーター、ヒトCD133プロモーター、ヒトCD44プロモーター)の上記ヒト胚性神経幹細胞株内での活性を調べた。それらの中から、当該細胞種において最も活性の高い遺伝子発現制御領域を決定した。当研究所は本年度の4月1日に正式発足したが、研究室及び細胞培養室の工事の遅れに加え、研究費使用ルールの策定や、物品の発注から検収、納品に至る事務手続きの流れの制定等々、サポート体制の確立に時間を要し、研究を本格的にスタートするまでにひと月ほどのタイムラグが生じた。また、当初使用予定だったバージョンのRelCat融合蛍光ペプチドのヒト胚性神経幹細胞株内における性能が予想よりもかなり低いことが判明し、5種類のバージョンを追加作製するという想定外の作業が加わった。更に、評価すべきコンストラクトが計6種類へと増加したことにより、それらの中からベストなものを選び出すための作業が加わった。それら想定外の要素により、当初の研究計画より若干の遅れが生じているが、当プロジェクトの最もクリティカルかつハードなパートは無事に通過したものと考えられるので、今後は格段のペースアップが期待できる。幹細胞の維持や分化制御におけるニッチの重要性が少しずつ明らかになっている。本研究では、「成体哺乳類内の神経(あるいはその他の細胞種の)幹細胞ニッチの正確な同定」という将来的なゴールのためのパイロットツールとして、蛍光蛋白を利用して『神経幹細胞を取り囲む細胞』を標識するシステムの開発に挑戦した。簡単には、蛍光ペプチドを幹細胞から放出させ、それを速やかに周囲の細胞に取り込ませることにより、「幹細胞を取り巻く、すなわち、その幹細胞のニッチを構成すると思われる細胞群を蛍光によってラベルする」というアプローチである。まず、幹細胞そのもの、及び、幹細胞を取り巻く細胞群、のそれぞれをラベルする2色の蛍光蛋白の組み合わせを6つ準備し、蛍光強度や蛍光色の分離等のパラメターからベストなコンビネーションを選んだ。次に、4種類の遺伝子発現制御領域(プロモーター、エンハンサー)をヒト神経幹細胞株を用いて評価し、活性及び細胞種特異性の最も高いものを選択した。その後、これらのベストな遺伝子発現制御領域と蛍光ペプチドコンビネーションを組み合わせ、ヒト神経幹細胞株を用いてこのシステムを検証した。

その結果、(1)神経幹細胞とそれを取り巻く細胞が想定通りに2つの異なる色の蛍光でラベルされた、(2)しかしながら、後者(ニッチ構成細胞に相当する細胞群)の蛍光の強度は、前者のそれに比べると著しく低いこと、が判明した。今後は、蛍光ペプチドをタンデム化することで蛍光強度を上げる、最新の蛍光蛋白リストから更に蛍光強度の高いと思われるものを選び検証する、蛍光蛋白に結合してある各種の機能ペプチドを変更あるいは改良し、幹細胞からの放出や周囲の細胞への取り込みの効率を上げる、より活性の高い遺伝子発現制御領域を探索、使用する、等の改良を施し、このシステムのパフォーマンスをセルソーティングに使えるレベルまで上げることに注力する。「成体哺乳類内の神経(あるいはその他の細胞種の)幹細胞ニッチの正確な同定」のためのパイロットツールとして、蛍光蛋白を利用して『神経幹細胞を取り囲む細胞』を標識するシステムの開発に挑戦した。簡単には、蛍光ペプチドを神経幹細胞から放出させ、それを速やかに周囲の細胞に取り込ませることにより、「神経幹細胞を取り巻く、すなわち、神経幹細胞ニッチを構成する細胞群に相当する細胞を蛍光によってラベルする」というアプローチである。その結果、神経幹細胞を取り巻く細胞が想定通りに蛍光でラベルされ、同定可能であることを確認できた。しかしながら、その蛍光の強度は予想よりも低く、今後更なる改良を要することも判明した。平成26年度のおおまかな予定として・レポーターコンストラクト作製・培養細胞を使ってのその発現チェックの2点を挙げた。うち、前者はほぼ完了しており、ロードマップ通りの進捗と言える。申請者の平成26年8月1日付けでの異動、及び、新研究室の完成の遅れに伴い、平成26年度末日現在、細胞培養実験の開始には残念ながら至っていないが、培養室は平成27年度はじめに稼働予定であるので、プロジェクト全体にとって致命的な遅れがあるとは(少なくとも現時点では)とらえていない。これまでの評価作業の結果、今後の実験に使用予定であるヒト胚性神経幹細胞株におけるベストな(1)遺伝子発現制御領域、及び、(2)RelCatバージョン、を決定することができた。その組み合わせを当該細胞株に用いて、当システムのin vitro系での最終検定を行うと共に、遺伝子改変マウスを作製し、当システムのin vitroでの有用性を評価する。なお、本プロジェクトはこの段階までは当研究所単独で遂行できたが、当研究所は設立間もないことから各種機器が不足しているため、今後は外部研究機関の協力を仰ぎつつ研究を遂行する。まず、上記細胞株のニューロスフェアを使い、上記組み合わせの当システムのパフォーマンスを詳細に評価する。当研究所が所有する蛍光顕微鏡はコンベンショナルタイプのものであるため、三次元蛍光シグナルの解析には適していない。
大脳皮質視角野の臨界期可塑性におけるMAPキナーゼのin vivoでの機能解析

平成19年度はまず平成18年度中に発現量や発現部位から選別した系統の大脳皮質に優勢不能型MEK1を発現するトランスジェニックマウス(以下、dnMEK1 Tgマウス)を交配により増やした。次に眼優位性の変化を検出するため、光刺激により発現誘導パターンが変化することが知られている初期応答遺伝子Arcに対するin situハイブリダイゼーションを行った。まずコントロールとして、野生型のマウスで片眼摘出を7日間行つた後、摘出してない眼に光刺激したところ、光刺激した眼と同側の視覚野に置いてArc mRNAの発現量が増加した。dnMEK1 Tgマウスで同様の片眼摘出の実験を行ったところ、野生型と同じように光刺激した眼と同側の視覚野に置いてArc mRNAの発現量が増加した。この事から、MAPキナーゼ経路は、眼優位性可塑性のうち、開いた眼からの入力が増強する機構には関与しない事が示唆された。次にマウスの片眼を遮蔽してから明暗条件で一週間飼育した後、再び遮蔽した眼を開眼し光刺激する実験を行つたところ、野生型、dnMEK1 Tgマウス共に、片眼遮蔽した眼と同側の視覚野におけるArcの発現量が減少した。この事から、MAPキナーゼ経路は、閉じた眼からの入力が減弱する機構にも関与しない事が示唆された。以上のことからMAPキナーゼ経路は、Arcの発現量を指標とした眼優位性可塑性には関与しないことが示唆された。MAPキナーゼ/ERKは、真核生物に普遍的に存在し、細胞内シグナル伝達の様々な局面において中心的な役割を担っている。近年、Maffei(伊)らはMEK1/2の阻害剤を用いた実験から、MAPキナーゼ経路が大脳皮質視覚野の臨界期可塑性に必要であること示した。しかしながら、大脳皮質視覚野の臨界期可塑性におけるMAPキナーゼの機能は未だ不明である。本研究では、MAPキナーゼの大脳皮質視覚野の臨界期可塑性における機能をin vivoで明らかにするため、大脳皮質に優勢不能型MEK1(以下、dnMEK1)を発現するトランスジェニックマウスを作製、解析する。テトラサイクリン遺伝子発現誘導系を用い、Tetオペレーター配列の下流にHAタグつきのdnMEK1を挿入したTRE-HA-dnMEK1のトランスジェニックマウスを独立に12系統作製し、Mayford(米)らが作製した前脳特異的にtTAを発現するCaMKII-tTAマウスと交配することによりTRE-HA-dnMEK1/CaMKII-tTAの二重トランスジェニックマウス(以下、二重Tg)を作製した。平成18年度はまず抗HA抗体による免疫組織化学やin situハイブリダイゼーションによりHA-dnMEK1が嗅球、海馬、大脳皮質に発現していることを確認した。更に二重Tgに前脳にERKの活性化を引き起こすことが知られているカイニン酸を腹腔内注射し、dnMEK1の発現によりERKの活性化が抑制されていることを抗リン酸化ERK抗体によるウェスタンブロッティングにより確認した。またドキシサイクリンを4週間投与することによりHA-dnMEK1の発現が停止し、ドキシサイクリンの投与を止めてから6週間後にはHA-dnMEK1の発現が再び誘導されることをウェスタンブロッティングや免疫組織化学により明らかにした。
マルチフェロイクスからなるマイクロ・ナノスケール構造体設計のための数理熱弾性解析

圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料を取り上げ、圧電材料と磁歪材料を線形圧電磁熱弾性として統一的に定式化する。熱弾性場、電場、磁場の連成を考慮し、非フーリエの法則を用いた熱伝導解析と非局所弾性理論を導入した。ボクセル有限要素法を用いて、マルチフェロイクス材料からなる平板状のナノスケール構造体におけるスケール効果を調べた。また、均質等方性の中空円筒のモデルにおいて、非フーリエの法則を用いた温度解の厳密解を導出し、数値計算により非フーリエ効果が温度分布や熱応力分布に及ぼす影響を調べた。1.スケール依存性を考慮しない熱弾性解析:解析モデルとして、区分的指数関数の不均質特性を有する傾斜機能長方形板が全周単純支持され、表面が非一様に加熱された非定常熱弾性問題を三次元問題として理論解析し、厳密解を導出した。また、半径方向に区分的冪関数の不均質特性を有する中空円筒と中空円板が非軸対称加熱される場合の非定常熱弾性問題および中空球が軸対称加熱される場合の定常熱弾性問題を理論解析し、厳密解を導出した。数値計算を行い、不均質特性が温度、変位および応力に及ぼす影響を調べた。2.スケール依存性を考慮しない圧電材料の有限要素解析:圧電材料の圧電弾性解析のために、ボクセル有限要素法によるプログラムを作成した。作成したプログラムを用いて、片持ちはり型平板の形状制御を目的とした圧電材料の配置の設計問題に適応した。3.スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料の有限要素解析:圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料の圧電磁弾性解析のために、ボクセル有限要素法によるプログラムを作成した。片持ちはり型平板に荷重が作用した場合の数値計算を行った。作成したプログラムは、荷重のみが作用した理論解析結果との比較に用いる。4.スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料の圧電磁熱弾性解析:解析モデルとして、等方性構造材料と圧電材料・磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料層からなる積層中空円筒が表面から一様に加熱された軸対称圧電磁熱弾性問題を理論解析し、厳密解を導出した。5.スケール依存性を考慮した長方形板の熱弾性解析:材料の寸法効果を考慮するため、non-local弾性理論を用いて、均質等方性の長方形板が全周単純支持され、表面が非一様に加熱された非定常熱弾性問題を三次元問題としての理論解析を検討中である。1.スケール依存性を考慮しない熱弾性解析:解析モデルとして半径方向に区分的に冪関数の不均質特性を有する中空円筒が非軸対称加熱される場合の非定常熱弾性問題を一般化平面ひずみ問題として理論解析し、厳密解を導出した。一般化平面ひずみ状態と平面ひずみ状態との数値計算結果を比較し、その相違について調べた。半径方向に区分的に冪関数の不均質特性を有する中空球が軸対称加熱される場合の非定常熱弾性問題を理論解析し、厳密解を導出した。半径方向に区分的に冪関数の不均質特性を有する円筒パネルが表面から非一様に加熱される場合の非定常熱弾性問題を理論解析し、厳密解を導出した。解析モデルとして区分的指数関数の不均質特性を有する傾斜機能長方形板が全周単純支持され、表面が非一様に加熱された場合の定常問題を古典板理論を用いて解析し、応力比(=応力/強度)が最小になる傾斜組成分布を求める最適化問題を取り扱った。2.スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料の有限要素解析:圧電材料と磁歪材料からなる傾斜機能マルチフェロイクス材料の圧電磁弾性問題をボクセル有限要素法を用いて解析した。片持ちはり型平板に厚さ方向に磁界が作用する場合を想定して数値計算を行い、圧電材料と磁歪材料からなる2層のマルチフェロイクス材料の数値計算結果と比較し、傾斜機能化の有効性を検証した。3.スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料からなる円筒パネルの圧電熱弾性解析:解析モデルとして、圧電材料・磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料層からなる積層円筒パネルが表面から非一様に加熱された圧電磁熱弾性問題を平面ひずみ問題として理論解析し、厳密解の導出を試みた。1.スケール依存性を考慮しない熱弾性解析:解析モデルとして、任意の材料組成の不均質特性および板厚変化をもたせるため、半径方向に区分的に冪関数で表された特性を有する傾斜機能変厚回転円板を考え、内外圧、遠心力、および円板表面の加熱を受ける場合の定常熱弾性問題を平面問題として厳密に解析し、数値計算により不均質特性および板厚の影響を調べた。さらに、この傾斜機能変厚回転円板に生じる応力比(応力/強度)を最小にする材料組成および板厚の最適化問題を取り扱った。最適化手法として、準ニュートン法を用いた。2.スケール依存性を考慮しない圧電材料の有限要素解析:慣性項を考慮した動的問題の解析ができるように、圧電材料の圧電弾性問題におけるボクセル有限要素法の解析プログラムを作成し、性能向上を目的とした振動発電デバイスの構造解析を行った。

3.スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料からなる多層中空円筒の圧電磁熱弾性解析:解析モデルとして、圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料層からなる積層中空円筒が内外表面から熱伝達を伴い加熱された多層中空円筒の圧電磁熱弾性問題を一般化平面ひずみ問題として解析し、厳密解を導出した。導出した厳密解を用いて数値計算を行い、平面ひずみ問題による結果と比較した。4.スケール依存性を考慮したマルチフェロイクス材料の有限要素解析:圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料の圧電磁弾性問題を非局所弾性理論を用いてボクセル有限要素解析を行うプログラムを作成中である。5.非フーリエ熱伝導則により温度解析:均質等方性の中空円筒における非フーリエ効果を考慮した熱伝導問題を考え、内外表面が温度指定された場合の厳密解を有限ハンケル変換を用いて導出した。スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料からなる長方形板の三次元圧電磁熱弾性解析や円筒パネルの二次元圧電磁熱弾性解析は思った以上に複雑なる。現在、スケール依存性を考慮した均質等方性材料からなる長方形板の三次元磁熱弾性解析を検討中であるが、解析がかなり複雑である。1.スケール依存性を考慮しない熱弾性解析:解析モデルとして、任意の材料組成の不均質特性を持たせるため、厚さ方向に区分的に指数関数で表された特性を有する傾斜機能平板を考え、表面が一様温度の媒体により熱伝達を伴い加熱される場合の非定常熱弾性問題を物性値の温度依存性を考慮して解析した。解析手法は時間に関して差分法を、厚さ方向の領域に関してが厳密解を用いた。2.スケール依存性を考慮しない圧電材料からなる多層中空円筒の圧電熱弾性解析:フーリエ熱伝導則を用いて導出した非定常圧電熱弾性問題を厳密に数理解析し、温度解に含まれるベッセル関数をそのままの形で表現できる積分型の特解を導出した。これに伴い、従来よりも加熱初期の非常に短い時間における熱応力挙動の計算が可能となる。3.スケール依存性を考慮したマルチフェロイクス材料の有限要素解析:圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料の圧電磁弾性問題を非局所理論を用いてボクセル有限要素解析を行うプログラムを作成した。圧電材料と磁歪材料を混合した材料を想定して表面から電気的入力を与えた場合について数値計算を行なった。4.非フーリエ則による温度解析および熱弾性解析:均質等方性の中空円筒における非フーリエ効果を考慮した熱伝導問題を考え、内外表面が一様温度の媒体により熱伝達を伴い加熱される場合の厳密解を変数分離法を用いて導出した。また、加熱・冷却過程を想定した場合についても、厳密解を導出した。以上の温度解を用いて、熱弾性問題をエアリーの熱応力関数を用いて数理解析を行い、厳密解を導出した。数値計算を行い、熱緩和時間が非定常状態における温度分布および熱応力分布に及ぼす影響を調べた。圧電材料と磁歪材料からなるマルチフェロイクス材料を取り上げ、圧電材料と磁歪材料を線形圧電磁熱弾性として統一的に定式化する。熱弾性場、電場、磁場の連成を考慮し、非フーリエの法則を用いた熱伝導解析と非局所弾性理論を導入した。ボクセル有限要素法を用いて、マルチフェロイクス材料からなる平板状のナノスケール構造体におけるスケール効果を調べた。また、均質等方性の中空円筒のモデルにおいて、非フーリエの法則を用いた温度解の厳密解を導出し、数値計算により非フーリエ効果が温度分布や熱応力分布に及ぼす影響を調べた。スケール依存性を考慮しないマルチフェロイクス材料からなる長方形板の圧電磁熱弾性問題の解析は、3次元問題となり解析がかなり複雑である。そのため、円筒パネルの2次元問題の解析から行うことに変更した。
OMP25と関連タンパク質のミトコンドリアの形態と細胞内分布調節における役割

1.OMP25とシナプトジャニン2Aによるミトコンドリアの形態・細胞内分布調節機構の解析テトラサイクリン誘導性にOMP256を発現する細胞株を樹立して、培養細胞におけるOMP25の過剰発現が細胞内小器官へ及ぼす影響を検討した結果、細胞内小器官のうちミトコンドリアと小胞体の形態が特異的に変化し、ゴルジ体、リソソーム、アクチンおよび微小管細胞骨格など他のオルガネラの分布は影響を受けないことが観察された。2.OMP25に結合する小胞体膜タンパク質の解析OMP25に結合する新しいタンパク質として、ラット肝臓からp200を同定した。p200のリコンビナントタンパク質を作製してOMP25との生化学的結合を検討した。また、p200の単離ミトコンドリアとの結合を検討した。その結果、p200はOMP25への結合を介してミトコンドリア外膜に結合することが示された。p200の異なったエピトープに対する特異的抗体を作製し、これを用いて各組織における発現を検討した結果、p200にはalternative splicingにより異なった分子量のアイソフォームがあり、脳、肺、精巣などでは主に200kDa型、肝臓、腎臓、筋肉などの組織では主に120kDa型として発現していることが明らかになった。また、p200とOMP25を介するミトコンドリアと小胞体との結合の生理的意義を明らかにするため、p200とOMP25との結合を阻害するレコンビナントタンパク質を培養細胞に導入し、脂質やイオンの移動に対する影響を検討する予備的実験を行った。1.OMP25とシナプトキャーニン2Aによるミトコンドリアの形態・細胞内分布調節機構の解析OMP25を介するシナプトジャーニン2Aのミトコンドリア外膜へのリクルートと、それによるミトコンドリアの形態および細胞内分布の変化の機構を解析するため、テトラサイクリン誘導下にOMP25を過剰発現するChinese hamster ovary(CHO)細胞を樹立した。現在、このCHO細胞株からのミトコンドリアの単離と形態観察を試みている。2.OMP25に結合する小胞体膜タンパク質の解析OMP25に結合する新しいタンパク質として、ラット肝臓からp200を同定し、cDNAクローニングによって一次構造を決定した。部位特異的変異リコンビナントタンパク質を作製して生化学的結合実験を行った結果、p200のOMP25への結合はp200のカルボキシ末端モチーフに依存することが明らかになった。OMP25とp200の局在、生理的な結合を解析するため、OMP25およびp200のフュージョンタンパク質を作製し、これを免疫原として抗体の作製を行った。その結果、OMP25およびp200に対する特異的なウサギポリクローナル抗体およびマウスモノクローナル抗体を得ることができた。特異的抗体を用いた組織分布を検討した結果、OMP25およびp200は調べた全ての組織に広く発現していたが、特に肝臓と脳に高い発現が認められた。現在、作製した特異的抗体を用いて、OMP25とp200の電子顕微鏡による詳細な細胞内局在の解析を進めている。1.OMP25とシナプトジャニン2Aによるミトコンドリアの形態・細胞内分布調節機構の解析培養細胞におけるOMP25の過剰発現による細胞内小器官への影響を検討した結果、ミトコンドリアと小胞体の形態が特異的に変化し、ゴルジ体、リソソーム、アクチンおよび微小管細胞骨格など他のオルガネラの分布は影響を受けないことが観察された。2.OMP25に結合する小胞体膜タンパク質の解析昨年度OMP25に結合する新しいタンパク質として、ラット肝臓から同定したp200について、リコンビナントタンパク質を作製してOMP25との生化学的結合を検討した。また。p200の単離ミトコンドリアとの結合を検討した。

その結果、p200はOMP25への結合を介してミトコンドリア外膜に結合することが示された。p200の異なったエピトープに対する特異的抗体を作製し、これを用いて各組織における発現を検討した結果、p200にはalternative splicingにより異なった分子量のアイソフォームがあり、脳、肺、精巣などでは主に200kDa型、肝臓、腎臓、筋肉などの組織では主に120kDa型として発現していることが明らかになった。また、p200とOMP25を介するミトコンドリアと小胞体との結合の生理的意義を明らかにするため、p200とOMP25との結合を阻害するレコンビナントタンパク質を培養細胞に導入し、脂質やイオンの移動に対する影響を調べる予備的実験を行った。
糖鎖シグナルによる細胞間コミュニケーションの制御

シンデカン-4のノックアウトマウスの解析から、シンデカン-4上のヘパラン硫酸プロテオグリカン鎖は胎盤での血液凝固の防止と腎臓での生体防御に役立つことが判明した。ヘパリン結合性の成長因子ミッドカインの受容体の1つはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである受容体型プロテインホスファターゼ(PTPζ)であるが、ミッドカインが識別するコンドロイチン硫酸鎖はE鎖でしかもデルマタン硫酸ドメインをもつことがコンドロイチン硫酸Eとの反応性およびコンドロイチナーゼB消化の結果判明した。ミッドカインとPTPζの識別は神経細胞の移動のみならずその生存、そして骨芽細胞の移動においても重要であった。ホルモン糖タンパク質の糖鎖合成に関与するN-アセチルガラクトサミン-4-スルホトランスフェラーゼをcDNAクローニングした。従来のN-アセチルグルコサミン-6-スルホトランスフェラーゼとは基質特異性の異なるN-アセチルグルコサミン-6-スルホトランスフェラーゼをcDNAクローニングした。ヒトのEXTのホモローグである線虫のrib-2遺伝子はヘパラン硫酸の糖鎖合成の開始と伸長に関与する新しいα-1、4-Nアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであることを明らかにした。コンドロイチン硫酸E(コンドロイチン-4、6-ジ硫酸)の合成を司るスルホトランスフェラーゼを用いて硫酸化度の異なるコンドロイチン硫酸Eを作り、その機能解析の基盤を作った。ブタからヒトへの異種移植の拒絶において最も大きな障害となるα-ガラクトース抗原を除去するエンド-β-ガラクトシダーゼCを発現させ、精製した。精製酵素をブタに静脈注射すると、一時的にではあるが、α-ガラタトース抗原を除去できた。糖タンパク質などのN-アセチルグルコサミン残基に硫酸を転移するN-アセチルグルコサミン-6-〇-スルフォトランスフェラーゼのヒトおよびマウスcDNAをクローニングした。このmRNAはリンパ節の高内皮細静脈に強く発現し、クローニングしたスルフォトランスフェラーゼはL-セレクチンのリガンド糖鎖の生合成に関与すると示峻された。実際、このスルフォトランスフェラーゼ(GlcNAc-6ST)とフコシルトランスフェラーゼVIIのダブルトランスフェクションで血管内皮細胞がL-セレクチン発現細胞と接着性を獲得した。GlcNAc-6STは成体マウスの神経系、そして発生途上のマウスの諸組織(たとえば歯芽の間充織)に部位特異的に発現し、L-セレクチン以外の識別分子と反応する特異な硫酸化糖鎖シグナルの形成にも関与すると示唆された。コンドロイチン4硫酸の生合成に関与するコンドロイチン-4-スルフォトランスフェラーゼは均一な状態にまで精製され、分子クローニングの準備が整った。コンドロイチン6硫酸の生合成に関与するコンドロイチン6-スルフォトランスフェラーゼ遺伝子、さらにヘパラン硫酸プロテオグリカンの一種であるシンデカン-4(リュードカン)のノックアウトマウスも作成された。これらのマウスは正常に出生し、生殖能も異常はないが、詳しい解析の結果、異常が認められる所があり、詰めの解析を急いでいる。糖鎖識別分子についても研究が進み、ホヤの卵一精子結合に関与する精子フコシダーゼがクローニングされ、またGT1b結合タンパク質に対するモノクロール抗体も作成された。細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンの一種、シンデカン-4(リユードカン)のノックアウトマウスが作成された。このマウスの解析から、胎盤においての血栓形成を妨げるヘパラン硫酸鎖の重要部分がシンデカン-4に担われていることが判明した。コンドロイチン6-スルホトランスフェラーゼ遺伝子の欠失マウスの解析からは、コンドロイチン6-硫酸はnaiveT細胞の分化に関与していることが示唆された。ヘパリン結合性成長分化因子ミッドカインに結合するプロテオグリカンとしてPG-Mバーシカンが同定された。この糖鎖の解析から、ミッドカインに結合するコンドロイチン硫酸鎖はデルタマン硫酸の系列に属する多硫酸化体であることが判明した。ミッドカインのシグナル伝達にはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである受容体型チロシンホスファターゼ・ゼ一夕が関与しているが、このコンドロイチン硫酸鎖へのミッドカインの結合も同様の機作によるのであろう。コンドロイチン4硫酸を合成するコンドロイチン4-スルホトランスフェラーゼもcDNAクローニングされた。さらにコンドロイチン4,6-ジ硫酸の合成を司どるスルホトランスフェラーゼも高度に精製され、その部分ペプチドシークエンスが決定された。ヘパラン硫酸6-O-スルホトランスフェラーゼの3種のアイソマーについて、基質特異性が決定された。ガングリオシドGM3合成酵素のcDNA導入により、マウス肺癌細胞のチロシンリン酸化能と形態が変化し、このガングリオシドのシグナル伝達への関与が裏付けられた。

ホルモン糖タンパク質の糖鎖合成に関与するN-アセチルガラクトサミン-4-スルホトランスフェラーゼをcDNAクローニングした。従来のN-アセチルグルコサミン-6-スルホトランスフェラーゼとは基質特異性の異なるN-アセチルグルコサミン-6-スルホトランスフェラーゼをcDNAクローニングした。ヒトのEXTのホモローグである線虫のrib-2遺伝子はヘパラン硫酸の糖鎖合成の開始と伸長に関与する新しいα-1、4-Nアセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼであることを明らかにした。コンドロイチン硫酸E(コンドロイチン-4、6-ジ硫酸)の合成を司るスルホトランスフェラーゼを用いて硫酸化度の異なるコンドロイチン硫酸Eを作り、その機能解析の基盤を作った。ブタからヒトへの異種移植の拒絶において最も大きな障害となるα-ガラクトース抗原を除去するエンド-β-ガラクトシダーゼCを発現させ、精製した。精製酵素をブタに静脈注射すると、一時的にではあるが、α-ガラタトース抗原を除去できた。
再生原理の理解にもとづいて四肢再生を惹起する

イモリは変態後も四肢再生能力を維持するのに対し、カエルは変態後に四肢再生能力を失いスパイク状の構造しか再生できない。これは再生の第一段階の<先端化>は行われるが、第二段階の<インターカレーション>が遂行されないためと考えられた。すなわちFGFジナルは機能するものの、FGFシグナルとポジティブ・フィードバック・ループを作るためのShhシグナルが機能しないためと考えられた。本研究では、このポジティブ・フィードバック・ループを形成するのにShh遺伝子の四肢特異的エンハンサー配列MFCS1が鍵を握っているとの仮説のもと、カエルのMFCS1をイモリの配列へと置換することで再生能力を惹起することを目標としている。本年度においては、CRISPR/Cas9を持ちいてイモリのMFCS1をカエルのMFCS1に置換するためのイモリMFCS1を完全欠損するモザイク個体の作製に成功した。現在F1個体の作出を目指している。また、カエルのMFCS1をイモリの配列へと置換するためのカエル変異体についても、高効率に変異を引き起こすgRNA配列を3つ同定することに成功した。さらに、昨年度に大きく進展が見られた関節の再生をマウスで惹起するための細胞レベルの解析についても、炎症反応で血小板から出てくるPDGFと、<先端化>によって活性化されるFGFシグナルによって関節残存部の靭帯と腱の組織が反応し、関節再生に参画できる細胞が腱や靭帯から増殖・這い出してくること、残存部から放出されるBMPにそれらの細胞が反応して、関節軟骨の増殖・分化が誘導されることが推察された。関節再生に関して、これらの一連のモルフォゲンの作用と並行してメタロプロテアーゼも重要な因子の一つとして機能していることも判明したが、モルフォゲンとメタロプロテアーゼとの因果関係については、次年度の課題として残った。昨年度に作成したCRISPR/Cas9でMFCS1配列に変異を入れたイモリについて、性成熟して、さぁこれからF1個体を取ろうとする段階になって、それらを飼育していた学生のミスで死亡し振り出しに戻る結果となったことが研究の進捗にとって大きな痛手となった。また、昨年度にアフリカツメガエルからネッタイツメガエルへ実験動物のカエルを変更したもののネッタイツメガエルの取り扱いに慣れるまでに時間を要したこと、また研究代表者が基礎生物学研究所の所長に指名されドタバタしたことも想定より実験の進行が遅れた要因となつた。しかし、一方で、再度のトライヤルでイモリのMFCS1を完全欠損するモザイク個体の作製に成功したことで、カエルのMFCS1配列との完全スワッピング個体の作出が進展したことは大きな成果となった。さらに、GFPイモリ、DsRedカエル、GFPニワトリを用いた移植実験系が動くようになったことで培養J-cellの関節再生への参加能をin vivoで解析できるようになったことも大きな前進となった。まだ、クリアな結果は出ていないものの、4年目に向けて大きな成果が得られる状態まで辿り着けた点を鑑み、おおむね順調という自己評価を行なった。イモリやカエルの関節の再生については、関節部位切断時の炎症反応によってPDGFシグナルが活性化されるとともに、傷上皮形成によって放出されるFGFによって<先端化>が行われ、それらのシグナルに関節残存部の靭帯や腱に眠っている中胚葉系の細胞の増殖と移動が促進され関節の再生が実行されることがほぼ見えてきた。そして、そのような性質の細胞は、ニワトリやマウスの関節の靭帯や腱の中にも眠っていることがほぼ間違いない状況となってきた。今後においては、その事実を標識された細胞を用いたキメラ実験で完全証明することが課題の一つとして挙げられる。また、それらの一連の細胞反応を引き起こすシグナルの解明についても、役者は出そろいつつあるものの、それらの因果関係については未だ不明な点も多く、点と点をつないで線で結ぶ作業が今後の課題となった。再生過程における砂時計モデルを説得力のあるものにするためには、より大きいサイズの腕をもつ有尾両生類での再生実験や、再生芽を透明化して細胞数を数えて動物種を越えて一定の細胞数の時に再生パターンが形成されるのかを明らかにしたい。本研究に残された課題の一つに、ゲノムサイズがヒトの10倍あるイベリアトゲイモリの全ゲノム配列の決定が挙げられる。本年度に全トランスクリプトームに関する論文は出版したものの、今後の再生研究においてゲノム配列の決定と、単一細胞レベルでのトランスクリプトーム解析が挙げられる。再生芽を構成する細胞の単一細胞レベルでのトランスクリプトーム解析については、FACSでの単一細胞を分取してcDNA合成をするトライヤルまでは進んだので、次年度において結果を出せると期待している。ゲノム配列決定については基礎生物学研究所の新規モデル生物センターとの共同研究によって進める予定である。すなわちFGFシグナルは機能するものの、FGFシグナルとポジティブ・フィードバック・ループを作るためのShhシグナルが機能しないためと考えられた。本研究では、カエルを遺伝子操作することで変態後にもShhシグナルを活性化させて完全な四肢再生を惹起することに挑戦する。本年度においては、Shh遺伝子の四肢特異的エンハンサー(MFCS1)をイモリ2種、カエル2種とで詳細に配列比較するとともに、MFCS1から転写されるenhancer RNA(eRNA)を検出することに成功した。

このeRNAが変態前のカエル再生芽で検出されたものの、変態後の再生芽では検出されなかった。これは、変態ホルモン(チロキシン)によって、eRNAの転写阻害が起きることに起因すると予測された。一方イモリでは、チロキン受容体の結合認識配列候補に隣接する形で、イモリにのみ保存されている配列(CCG配列と命名)を見出し、そのCCG配列がnon-coding RNAを転写するコンセンサス配列と類似していることから、イモリでは変態後においてもCCG配列からノックアウトeRNAが転写されることでShh遺伝子が転写される可能性が示唆された。そこで、イモリのCCG配列をCRISPR/Cas9でターゲットして潰したイモリを作成し、四肢再生に与える影響を検証した。現在までに何匹かが変態するまで発生したので、今後イモリの四肢再生能力がカエル化するかどうかの検定を楽しみに待っている状態である。Shh遺伝子の四肢特異的エンハンサー(MFCS1)をイモリ2種、カエル2種とで詳細に配列比較したところ、イモリにのみ保存されている2つの配列を見出した(CCG配列とCAT配列と命名)。この配列の違いがイモリとカエルとの四肢再生能力の違いを生んでいる可能性について本年度は検証を行った。また、イモリとカエルの四種において良く保存されている配列内に核内受容体RXR/RAR/TRの結合候補配列を見出すことに成功した。すなわち、Shh遺伝子がレチノイン酸で発現誘導されるのは、Shh遺伝子の上流にRXR/RAR結合サイトがあるわけではなく、Shh遺伝子の四肢特異的な保存配列MFCS1のeRNAの転写によって発現制御されている可能性が示唆された。また、変態ホルモンであるチロキシンはその受容体RXR/TRがRXR/RAR結合配列と競合することで、変態後に転写活性を失うことが示唆された。この発見によって、カエルの四肢発生過程では、レチノイン酸がeRNAの転写を介してShh遺伝子の転写を促進するのに対し、変態後はチロキンによってeRNAの転写が阻害されることでShh遺伝子のサイレンシングが起き、四肢再生のインターカレーションがうまく行かないことが予想された。また、イモリではRXR/RAR結合サイトの横にイモリ特異的なnon-coding RNAの転写制御配列(CCG配列)を獲得したことで、変態後にもeRNAが転写され続けて、Shh遺伝子の発現が維持されていることが示唆された。本年度において、それらの仮説を証明する第一弾として、イモリ特異的なCCG配列をCRISPR/Cas9で破壊することで、eRNAの転写が変態後に抑制を受けて再生能力を失うかどうかの検証を広島大学との共同研究を開始した。現在、ゲノム編集したイモリが変態するのを待っている状態である。イモリは変態後も四肢再生能力を維持するのに対し、カエルは変態後に四肢再生能力を失いスパイク状の構造しか再生できない。これは再生の第一段階の<先端化>は行われるが、第二段階の<インターカレーション>が遂行されないためと考えられた。
中国対外政策決定の構造的特徴ーー「回転ドア」を手掛かりに

2018年度において、2つの作業を中心に研究を進めた。まず、外交部と中聨部の部長、副部長クラスのエリート層に焦点を当て、年齢、学歴などを中心に情報を収集し、データベースの構築を試みた。そして、2018年度は、党(中聨部)と政府(外交部)間の回転ドアの分析に焦点を当てた。当該年度の研究を通じて、以下のようなことが観察できた。1ボトムアップ型の対外政策形成において、中聨部に比べ、外交部の影響力ははるかに大きい。これは中国国内の組織構造に起因している。中聨部は中央レベルにしか組織が存在せず、地方レベルにおいて下部組織が置かれていないのが特徴である。他方、外交部は地方レベルの外事組織を管轄しているため、ボトムアップ型の政策形成において強い影響を及ぼすことができる。ただし、省によって、外交部の影響力は異なり、上海の地方外事弁公室のように外交部の直接管轄下に置かれている場合もあれば、少数民族地域においては外事弁公室そのものの役割は小さく、中央政府と地方政府の関係で対外関係を管轄しているところもある。2地方の外事組織に対する中央(外交部)の管理を強化する動きは冷戦終結後2度行われた。胡錦涛体制での国内政策調整機能強化の動きはほとんど効果が見られなかったが、習近平体制下で地方政府に対する外交部の管理能力が格段に上がった。3中聨部と外交部との間の回転ドアは、これまで外交部から中聨部への人事異動が一般的となっている。2018年度に行われた研究は、政府間の対外政策(外交部)と政党間の対外政策(中聨部)の決定プロセスの全貌を明らかにするうえでまだ不十分であり、今後さらに研究を深めていく必要がある。外交部と中聨部の関係について、データ収集と研究を1年で研究する予定であった。しかしながら、習近平体制下で、反腐敗運動や党の統制強化により、人事異動が頻繁に行われたため、データ収集により多くの時間が必要となった。来年度は、対外政策に携わるエリートにフォーカスした情報収集を引き続き進める。同時に党・政府・軍・国有企業・地方政府と学者との間の回転ドアに関する研究を行う。平成29年度は、対外政策にかかわるエリートにフォーカスを当てた情報収集とデータベースの構築を行いつつ、これまでの対外政策決定にかかわる先行研究のリサーチも行った。特に台湾国立政治大学やアメリカのジョージワシントン大学などの海外の研究者との交流を通じて、日本や中国の研究のみならず、アメリカ、台湾などにおけるこれまでの中国研究成果をリサーチすることもできたことは、大きな収穫である。また海外研究者との交流を通じて、研究成果の対外発信も積極的に行っている。台湾の国立政治大学での研究発表、アメリカのウィルソン・センターや南メソジスト大学での研究発表を行い、そして韓国の学術誌において研究成果を発表した。対外政策決定に関する研究においては、習近平体制下の対外政策に焦点を当てつつ、その政策の変貌にかかわる分析を行い、研究成果も公表している。こうした研究を通じて、近年生じている中国の対外政策決定のメカニズムにおける構造的な変化に対する理解を深めることができた。中国の対外政策決定は三つの段階を経て、大きな変貌を遂げてきた。毛沢東時代に構築された対外政策決定の在り方は、鄧小平の改革開放政策の流れのなかで取り組まれた「分権化」と「権力下放」によって、江沢民、胡錦涛時代の「分断化された権威主義体制」下の政策決定メカニズムへと変容した。しかし習近平体制に入ってから、中国共産党の指導が強調され、機構改革が行われるなか、中国の対外政策決定メカニズムは新たな段階に突入した。平成29年度の研究において、対外政策にかかわるエリートにフォーカスを当てた情報収集とデータベースの構築は着実に進んでおり、研究テーマにかかわる先行研究や海外の研究成果にかかわるリサーチも進展している。近年の中国の対外政策の変貌に関する研究を行い、研究成果を日本国内のみならず、海外へも積極的に発信している。こうした研究を通じて、近年の中国の対外政策決定にかかわる構造的な変化についての理解を深めることができた。

胡錦涛体制での国内政策調整機能強化の動きはほとんど効果が見られなかったが、習近平体制下で地方政府に対する外交部の管理能力が格段に上がった。3中聨部と外交部との間の回転ドアは、これまで外交部から中聨部への人事異動が一般的となっている。2018年度に行われた研究は、政府間の対外政策(外交部)と政党間の対外政策(中聨部)の決定プロセスの全貌を明らかにするうえでまだ不十分であり、今後さらに研究を深めていく必要がある。外交部と中聨部の関係について、データ収集と研究を1年で研究する予定であった。しかしながら、習近平体制下で、反腐敗運動や党の統制強化により、人事異動が頻繁に行われたため、データ収集により多くの時間が必要となった。平成30年度以降は、公開資料による文献のリサーチを進めると同時に、関係者のヒアリング調査も行っていく。同時に、次の三つの具体的な研究テーマを掘り下げて研究を進めていく予定である。1党と政府間の回転ドア、2地方政府と国有企業間の回転ドア、3党・政府・軍・国有企業・地方政府と学者間の回転ドア平成30年度は、党(中聨部)と外交部(政府)の回転ドアという研究テーマに特化して分析を行う予定である。中聨部と外交部との間の回転ドアは、これまで外交部から中聨部への人事異動が多かったが、習近平体制に入ってから、党の指導が強化されるようになったことに伴い、中聨部と外交部の関係に変化の兆しもみられる。平成30年度は、党と政府の回転ドアの変遷プロセスとその特徴を明らかにする。来年度は、対外政策に携わるエリートにフォーカスした情報収集を引き続き進める。同時に党・政府・軍・国有企業・地方政府と学者との間の回転ドアに関する研究を行う。
モンスーンアジア地域におけるリモートセンシングを活用した環境計画の評価手法の開発

本研究は人口が急増し環境の悪化が大きな都市問題となっているアジア諸国の大都市のうち北京、バンコク、上海、大阪、東京を対象として、リモートセンシングを活用し現地気象データを調査し、緑地からの気温推定式を導出し、緑地計画前後の気温推定図を比較評価することで、緑地計画によるヒートアイランドの変化をシミュレーションの結果として示すことができ、諸都市のヒートアイランドの緩和に資する緑地計画の評価手法を開発することができた。本研究では、本研究期間(平成l921年)内に、リモートセンシングを活用しモンスーンアジア地域の当該都市における現地気象データを調査し、諸都市のヒートアイランドの緩和に資する緑地計画の評価手法を明らかにすることとしている。そこで、平成19年度は、以下のような研究成果を得ることができた。アジア地域の諸都市のうち、8月に北京、3月にバンコクに現地調査をおこないC現地の気象観測調査、スペクトルメーター調査、GPSによる高度、緯度調査をおこなった。それぞれ北京林業大学、タマサート大学の研究者の協力を得ておこなうことができた。北京での調査結果から、気温とリモートセンシングデータの地表面温度、緑地形態、標高との関係を解析し、気温の推定のためのモデル式を導き出し、緑地による気温推定図を作成することができた。そこで、その気温推定式により計画された緑地による気温推定図を作成し、その緑地計画による気温変化を明らかにした。すなわち緑地計画による環境評価を明らかにした。その研究成果を2月に(社)計測制御学会リモートセンシングフォーラムにて口頭発表をおこなった。また、バンコクでの調査結果から、地表面温度、緑地形態、標高との関係を解析したところであるが、これまでの諸都市とは、ヒートアイランドの特徴が異なる結果となった。すなわち、緑地の気温に与える影響範囲が非常に小さいことである。これは、バンコクの熱帯地域という地理的条件によるものか、それともデルタ地帯にあるという地形的要因によるものかと考えられるが、他の熱帯地域の都市を解析することで明らかにできるものと考えられる。本研究では、本研究期間(平成1921年)内に、リモートセンシングを活用しモンスーンアジア地域の当該都市における現地気象データを調査し、諸都市のヒートアイランドの緩和に資する緑地計画の評価手法を明らかにすることとしている。そこで平成20年度は以下のような研究成果を得ることができた。平成20年度は、平成19年度に調査した北京、バンコクの現地の気象観測調査、スペクトルメーター調査、GPSによる高度、経緯度調査の結果を取りまとめ、分析考察をおこなった。その結果、北京市における調査研究では、中国、韓国、日本の3力国の国際造園学会シンポジウム「第11回中日韓造園専門家会議研究発表会」が2008年10月15日(水)に中国の杭州市で行われ、学術論文として投稿し、審査結果の上、採用となった「A Study concerning evaluation of open space plan utilized Shanshui for Mitigating the heat island : ACase Study in Beijing」の口頭発表を行った。またバンコクにおける調査研究では、東南アジア国際農学会(ISSAAS)日本支部会(11月14日)にて「衛星データによるタイバンコク周辺におけるヒートアイランド現象の状況把握」の口頭発表を行った。また、アジア地域の都市のうち、上海のヒートアイランドの現地調査を行い、調査結果を取りまとめた。平成20年度ではバンコクにおける気象観測調査を「衛星データによるタイバンコク周辺におけるヒートアイランド現象の状況把握」としてとりまとめ東南アジア国際農学会(ISSAAS)日本支部会にての口頭発表を行ったが、その際課題となっていた緑地効果の強弱に関してデルタ地帯の地形的影響などが考えられたため、バンコクと同様な地形的特徴をもつアジア地域の諸都市でのケーススタディ研究が必要であるとしていた。そこで平成21年度は再度バンコクでの調査を予定していたが、新型インフルエンザによる海外渡航禁止の影響で夏調査を行うことができなかった。そのため低地部の多い大阪市と東京の臨海低地部を対象として気温観測調査を行い、ヒートアイランドの特徴を考察した。その結果緑地による気温低減効果だけでなく海風の影響があること、地形的要因による気温の違いが明らかになり、緑地のヒートアイランド緩和効果を大きくするには斜面上の緑地、風の道となる河川沿いの緑地を確保することが重要であることがわかった。
新しい低温活性酵素の探索とその応用

まず、低温活性を有するプロテアーゼのスクリーニングを行った。そこで、低温度で効率よく蛋白質分解活性を有する酵素を生産する菌を広く自然界から検索した結果、低温微生物Flavobacterium balustinum P104が菌体外に分泌する低温活性プロテアーゼを見い出した。この微生物は、サケの内臓から単離されたもので、これを、10°Cで通気攪拌培養し、培地中に分泌されたプロテアーゼを硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などにより精製した。精製した酵素をSDS-PAGEにより確認したところ、単一バンドに精製されており、分子量は約70kDaであった。この酵素の最適反応温度は40°Cであり、市販の常温菌由来の酵素に比べて約20°Cも低く、低温活性酵素であることが示唆された。この酵素の温度安定性は常温菌の酵素に比べて低く、50°C、10分間の処理により完全に活性を失い、低温菌の温度不安定性の特性を示していた。至適作用pHは8.0であり、pH6.5-10.0の範囲で安定であった。また、この酵素は、Phenyl methanesulphonyl fluorideにより著しく酵素活性が阻害されたことから、本酵素はセリンプロテアーゼであることが示唆された。さらに、本酵素のN末端アミノ酸配列を調べたところ、既知のプロテアーゼのアミノ酸配列と相同性がなく、新規なプロテアーゼであることが示された。次に、寒冷生物であるサケ・カニの内臓から肉汁寒天培地・10°Cで低温細菌を単離した。この低温細菌の中で、最もL-グルタミン酸酸化活性の高いL101菌株を選択した。この菌株は、15°Cで最適増殖を示す低温細菌であり、グラム陰性・桿菌・極鞭毛を持ち、シトクロムcオキシダーゼ・カタラーゼ・菌体外プロテアーゼなどを持ち、Vibrio選択培地上で増殖しなかった。陰イオン交換クロマトグラフィーから低塩濃度で溶出される酵素をさらに、硫安塩析・ゲル濾過クロマトグラフィー・陰イオン交換クロマトグラフィー(Q Sepharose)・疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを用いて精製を行った。精製した酵素は、NADやNADPや酸素と反応せず、酸化還元色素であるニトロブルーテトラゾリウムやシトクロムcを電子受容体とする新規のL-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GLDH)であった。また、牛肝臓由来のNAD依存性のGLDHと比較して、最適温度域が低温側にあり、5°Cにおいても最大活性(50°C)の40%の活性を残存しており、活性化エネルギーもほぼ半分の値を示した。さらに、フェロセン誘導体を電子メディエータとして、サイクリックボルタンメトリーにより酵素のキャタリティック電流も確認できた。すでにキャタリティック電流の基質濃度依存性なども調査しており、これらを用いてバイオセンサーを構築するための基礎資料を得ることができた。低温微生物は、常温菌が産生する酵素より、活性化エネルギーが低く、低温において活性の高い酵素を産生することが知られている。こうした低温活性酵素の低温適応性機構は不明な点が多く、研究材料として興味深い。そこで、本年度の研究では低温微生物Flavobacterium balustinum P104が菌体外に分泌する低温活性プロテアーゼに着目し、その特性を調べた。サケ(Oncorhynchus keta)の内臓から単離された低温微生物Flavobacterium balustinum P104を10°Cで通気撹拌培養し、培地中に分泌されたプロテアーゼを硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などにより精製した。そして、この酵素の分子量、温度特性、pH特性、基質特異性、阻害剤の影響などを調べた。さらに、本酵素のN末端アミノ酸配列も決定した。この酵素の温度安定性は常温菌の酵素に比べて低く、50°C10分間の処理により完全に活性を失い、低温菌の温度不安定性の特性を示していた。また、この酵素の阻害剤の影響を調べたところ、Phenylmethanesulphonyl fluorideにより著しく酵素活性が阻害されたことから、本酵素はセリンプロテアーゼであることが示唆された。