hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連続した四級不斉炭素を有する天然物の効率的合成法の開発

連続した四級炭素を有する天然物プラテンシマイシンとシマラクトンのビシクロラクトン部分の合成に着手した。前者では、ジエン部分にはシクロペンタン環、ジエノフィル部分に3置換アルケンを有する環化前駆体を合成し、200°Cに加熱することで、望む四級炭素を有する三環性化合物を高い選択性で得ることが出来た。後者では、ラクトン体に対して渡間的環化反応により望む立体化学を有するシクロペンタン環化合物を単一化合物として得ることが出来た。連続した不斉四級炭素を有する天然物の効率的合成法の開発を研究課題として、有機合成上およびバイオケミストリー上重要な二つの天然物の合成に着手した。(1)プラテンシマイシンの合成研究:既知のシクロペンテノンにジアステレオ選択的マイケル付加反応によりジエノフィル部分に対応する側鎖を導入し、ケトンのカルボニル基を増反させジエンへと変換しDiels-Alder反応前駆体を合成した。途中過程で、ケトン基にHorner-Wadsworth-Emmons反応で用いられる求核剤を種々の条件で作用させると脱離反応が進行する問題が生じた。ビニルマグネシウムを原料の溶液に滴下させることで付加反応を進行させ、転移を伴う3級アルコールの酸化などを経て問題を解決した。分子内Diels-Alder反応は、前駆体の溶液を200°Cまで加熱することで進行し、四級炭素を有する三環性化合物を高い選択性で与えることを明らかにした。(2)シマラクトンのビシクロラクトン部分の合成:近年ユニークな反応性やキラル配位子を用いた不斉触媒的反応への応用の観点から、再注目されているジアゾ化合物からのカルベン錯体の形成とその反応を利用した方法を適用し検討した。α-アゾ-β-ケトエステルに種々の条件で環化反応を検討した結果、2価の銅のヘキサフルオロアセトアセテート錯体が適していた。収率および選択性の向上を目指し、『フェニルチオ基の硫黄原子の電子密度あげることで、イリド形成が促進される』という仮説を立て、ベンゼン環上に電子供与基を有する化合物を合成し環化反応を精査した。意図に反し、興味深いことに、シクロプロパン化が主として進行する結果を与えた。連続した不斉四級炭素を有する天然物の効率的合成法の開発を研究課題として、有機合成上およびバイオケミストリー上重要な二つの天然物の合成を継続した。(1)プラテンシマイシンの合成研究:昨年度までに、シクロペンタン環を有するジエン部分と、β位に側鎖とメチル基を有するジエノフィル部分、を併せもつDiels-Alder反応前駆体を合成した。さらに熱条件下で環化反応を試みた結果、四級炭素を有する三環性化合物を高い選択性で与えることを明らかにした。本年度は、課題として、前駆体の幾何異性を制御しながら合成することで環化反応の選択性および収率の改善を検討した。その結果、3つの炭素炭素二重結合の幾何異性を制御する上で、満足できる結果を得られなかった。とりわけ、末端ビニルエーテルの形成では、1:1の幾何異性体の混合物を与え、それらの単離も困難であり改善には至らなかった。(2)シマラクトンのビシクロラクトン部分の合成:昨年度までは、α-ジアゾ-β-ケトエステル類のカルベン形成を介した硫黄イリドの形成とシグマトロピー転位による反応を検討した。収率を向上させることが出来なかったので、本年度は主としてβ-ケトエステルのα位でのアリル化反応を選択し、アリルエステルをエレクトロファイルとした分子内環化反応を種々検討した。その結果、渡間的アイルランドクライゼン転位反応により低収率ながら望む立体を有するシクロペンタン環化合物を単一化合物として得ることが出来た。
糖脂質ミクロドメインにおけるシグナル伝達機構の解析

SDF-1αによる血小板膜を介するシグナル伝達機構の解明を目的として、脂質ミクロドメインである脂質ラフトの関与について解析を行った。SDF-1αはAkt活性化と血小板凝集を惹起した。Akt活性化はCXCR4アンタゴニストAMD3100およびAkt阻害剤MK-2206で抑制された。SDF-1αによるAkt活性化および血小板凝集は、メチルβシクロデキストリン前処理でラフトを破壊すると阻害された。ショ糖密度勾配遠心法によりCXCR4は脂質ラフト画分に存在することがわかった。以上のことから、SDF-1αは脂質ラフトを介してPI3キナーゼ/Akt経路を活性化し血小板凝集を引き起こしていると考えられた。ケモカインSDF-1αは血小板α顆粒中に貯蔵され血小板の活性化に伴い放出されると、SDF-1α受容体CXCR4を発現している血管内皮や平滑筋などの前駆細胞が遊走され、血管修復が促されることが知られている。また血小板表面にもCXCR4が発現し、血小板活性化の促進にも働いている。私はSDF-1αによる血小板膜を介する細胞内シグナル伝達機構の解明を目的として、スフィンゴ脂質ミクロドメインである脂質ラフトの関与について解析を行った。(1) SDF-1αはプロテインキナーゼAktの一過性活性化と血小板凝集を惹起した。(2) SDF-1αによるAkt活性化は、CXCR4アンタゴニストAMD3100およびPI3キナーゼ阻害剤Wortmannin, LY294002で抑制された。(3) SDF-1αによるAkt活性化および血小板凝集は、メチルβシクロデキストリン前処理でラフトを破壊すると阻害されたことから、脂質ラフトの関与が示唆された。(4)ショ糖密度勾配遠心法によりCXCR4は血小板の脂質ラフト画分に存在することがわかった。以上のことから、SDF-1αは脂質ラフトを介してPI3キナーゼ/Akt経路を活性化し血小板凝集を引き起こしている可能性が考えられた。その結果、昨年度はSDF-1αによるAkt活性化に伴う血小板凝集は脂質ラフトを介していることを見出した。今年度は、SDF-1αは血小板の凝集だけでなく接着を引き起こすこと、CXCR4アンタゴニストAMD3100で抑制されることを見出した。その際に、Aktシグナル伝達経路の上流分子、下流分子であるPDK1(Ser241)リン酸化、GSK3(Ser9)リン酸化がおこることを見出した。血小板の脂質ラフトにおけるAktを介するシグナル伝達経路について解析を進めている。その結果、昨年度までにSDF-1α/CXCR4による血小板凝集は脂質ラフトにおけるAkt活性化を介していることを見出した。今年度は、SDF-1αによる血小板凝集がsrcファミリーキナーゼ阻害剤PP2で抑制されること。さらに血小板においてSDF-1α刺激でsrcが活性化することを見出した。この結果は、SDF-1αによる血小板凝集は脂質ラフトにおけるAkt活性化のみならす、srcファミリーキナーゼの活性化も関与している可能性を示している。srcファミリーキナーゼも血小板脂質ラフトに局在するシグナル伝達分子であるが、SDF-1α刺激によるsrc活性化のメカニズムは不明である。血小板をSDF-1αで刺激することによりsrcファミリーキナーゼがどのように活性化するのか?さらにその活性化シグナルが血小板凝集にどのように関与しているかを明らかにすることが今後の研究課題である。血小板の脂質ラフトにおけるAktを介するシグナル伝達経路の全体像について解析を進めている。2. SDF-1αによるAkt活性化および血小板凝集は、Methyl-beta-cyclodextrin(MβCD)前処理で脂質ラフトを破壊すると阻害されたことから、脂質ラフトの関与が示唆された。3.ショ糖密度

勾配遠心法により、CXCR4(35%)と三量体Gタンパク質Gαi1 (93%) , Gαi2 (91%) , Gβ(50%)およびPI3キナーゼp110β(4.0%) , Akt2(4.5%)が血小板の脂質ラフト画分に存在することが確認された。以上のことから、SDF-1αは脂質ラフトに局在するCXCR4/三量体Gタンパク質を介してPI3キナーゼ/Akt経路を活性化し血小板凝集を引き起こしていることがわかった。SDF-1αによる血小板膜を介するシグナル伝達機構の解明を目的として、脂質ミクロドメインである脂質ラフトの関与について解析を行った。SDF-1αはAkt活性化と血小板凝集を惹起した。Akt活性化はCXCR4アンタゴニストAMD3100およびAkt阻害剤MK-2206で抑制された。SDF-1αによるAkt活性化および血小板凝集は、メチルβシクロデキストリン前処理でラフトを破壊すると阻害された。ショ糖密度勾配遠心法によりCXCR4は脂質ラフト画分に存在することがわかった。以上のことから、SDF-1αは脂質ラフトを介してPI3キナーゼ/Akt経路を活性化し血小板凝集を引き起こしていると考えられた。当初の計画と内容が少しずれているが、血小板の糖脂質ミクロドメインである脂質ラフトにおける新しいシグナル伝達経路を見出した。ケモカインSDF-1αは血小板の凝集活性以外に接着活性も持つことを見出したので、その他にも活性も持つかどうか解析する。ケモカインSDF-1αは脂質ラフトに局在するシグナル伝達分子srcを活性化することを見出したので、脂質ラフトの関与について解析を進める。生化学脂質ラフトは均一な構造体ではなく、脂質組成と機能の異なるラフトが一つの細胞に存在することが知られている。今回見出したSDF-1αの脂質ラフトを介する血小板凝集が、どのようなラフトを介しているのかを明らかにする。SDF-1αが脂質ラフト局在シグナル伝達分子srcを活性化することを見出したので、脂質ラフトの関わりについてのさらなる解析が可能になったため。当初の計画の若干変更を加えて、新しいテーマを加えたため、研究の下地作りに時間を割いてしまった。SDF-1αの血小板接着活性など未知の活性を見つけ、糖脂質ミクロドメインにおけるシグナル伝達機構を解析する。スフィンゴ糖脂質ミクロドメインである脂質ラフトの中で、どのスフィンゴ糖脂質が関与しているか、などの解析を進める。研究の下地を完成させて、論文にまとめる。まとめるに当たって必要な試薬、英文校閲、論文投稿に使用する。
アモルファス・シリコンの中距離構造の制御と新機能創成

CA法によってa-Si:Hのバンドギャップを1.482.1eVまで制御幅を拡げることに成功した。1.52eVのバンドギャップを持つ膜を用いてテクスチャ基板上に太陽電池を試作し、昨年度までよりも長波長感度が改善されることを確認した。また、CA法で作製した高品質ワイドギャップ(Eg=1.9eV)a-Si:H膜を用いて、アモルファスシリコンによるアバランシェ増倍効果発現の試みを昨年度に引き続き行った。デバイス構造としては、正孔のブロッキング層として最適であったn型a-Si:H(PH_3/SiH_4=250ppm、膜厚200nm)を用いた。電子のブロッキング層としては、Ptを用いたSchottky障壁、p型a-Si:H、Sb_2S_3およびa-SiN:Hを用いてブロッキング特性評価を行った。最終的に、a-SiN:Hを用いることで逆バイアス印加電界を>8x10^5V/cmにまで向上させることに成功した。しかしながら、この場合でもPt、p-type a-Si:H、Sb_2S_3などを用いた場合と同様、高電界の逆バイアス印加による大きなリーク電流が認められ、その絶対値はほとんど変化していなかった。このことは、(1)CA法、220°Cに作製したi層上に作製するため、a-SiN:Hの作製温度が220°Cと低く、ブロッキング層として十分に高品質ではない、(2)暗電流のリークがa-SiN:H側界面によってのみ決定されているのではなく、n/i界面側にも原因が有るなどの可能性を示唆している。また、複数のブロッキング層を1製膜室で作製せざるをえないため、ブロッキング層に不純物が混入することで欠陥密度が比較的高くなっている可能性も残る。以上のことから、さらに高電界印加を可能にし、アバランシェ増倍を実現するためには、(i)正孔のブロッキング層の再検討、(ii)n/i界面の高品質化、(iii)3つ以上の製膜室を持ち、不純物混入を極力避けられる作製装置の検討が必要とか返えられた。
エネルギー作物の栽培とそのバイオガス化を導入した下水処理場のリ・デザイン

本研究では、未利用資源である下水、処理水と消化液を利用してウキクサと微細藻類を栽培し、そのバイオマスをバイオガス化することによって、エネルギー生産を最大化した未来型下水処理場をデザインすることを目標としている。目標達成のため、増殖促進細菌を利用した革新的なバイオマス生産促進技術の開発が研究の核である。本研究では、(1)未利用下水資源を用いたウキクサと微細藻類のバイオマス生産ポテンシャルの理解、(2)合理的な増殖促進細菌利用技術の確立、(3)未利用下水資源を用いたウキクサと微細藻類の生産に増殖促進細菌技術を導入した実証試験とエネルギー生産を最大化した下水処理場の新しいデザインの提案に取り組む。
貧栄養環境下でのPCB汚染除去のための新規光合成微生物の創出

水や土壌中などに残留するポリ塩化ビフェニル(PCB)の汚染除去には、ビフェニル分解微生物を用いた生物的環境浄化が有効である.本研究では、PCB分解細菌Pseudomonas sp. KKS102株の分解酵素系タンパク質BphA1A4遺伝子を光合成微生物であるシアノバクテリア(ラン藻)に組み込んで、これまで困難であった貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてビフェニル化合物を分解できる新規光合成微生物を創出した.水や土壌中などに残留するポリ塩化ビフェニル(PCB)の汚染除去には、ビフェニル分解微生物を用いた生物的環境浄化が有効である.本研究では、PCB分解細菌Pseudomonas sp. KKS102株の分解酵素系タンパク質BphA1A4遺伝子を光合成微生物であるシアノバクテリア(ラン藻)に組み込んで、これまで困難であった貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてビフェニル化合物を分解できる新規光合成微生物を創出した.本研究では、PCB分解菌Pseudomonas sp.KKS102株のBphA4を蛋白工学的手法により改変してNADPH依存的なビフェニル化合物分解酵素系を構築し、これをシアノバクテリアや光合成細菌に組み込むことによって、貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてPCB等のビフェニル化合物を分解できる新規光合成細菌株を創出すことを目的としている。初年度である本年度は、本研究遂行に必要な機材の整備を進めながら、NADPH依存的高活性BphA4変異体の作製とスクリーニングを開始した。まず、Pseudomonas sp.KKS102株のビフェニル化合物分解酵素系に電子を供給する電子伝達系をNADPH特異的に改変するために、X線結晶構造解析の結果から明らかとなったBphA4のNADH結合部位の一部(175位と177位)にアミノ酸残基置換を系統的に導入し、NADPH依存的な高活性のBphA4変異体をスクリーニングしている。野生型BphA4はk_<cat>/K_m比で約2000倍NADH特異的である。BphA4の175位をGlnに、177位をLysに置換することによって基質特異性を逆転させ、k_<cat>/K_m比で約32倍NADPH特異的な変異体BphA4変異体を得ることに成功した。現在、ランダム変異導入法を用いてさらにNADPH特異的で高活性な変異体の探索を進めている。また、NADPH依存的電子伝達系構築の基礎データを得るために、野生型BphA4と、その生理的電子受容体タンパクであるBphA3について、酸化型に加えて反応中間体である還元型、およびBphA3-BphA4複合体の結晶化とX線結晶構造解析を進めている。複合体の解析結果から、変異導入部位がBphA3-BphA4間の接触部位から離れており、変異がBphA3の特異的認識に及ぼす影響が小さいことが示唆された。本研究では、NADH特異的なPCB分解菌Pseudomonassp. KKS102株由来BphA4を改変してNADPH依存的なビフェニル化合物分解酵素系を構築し、シアノバクテリアなどの光合成細菌に組み込むことによって、貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてビフェニル化合物を分解できる新規光合成細菌株を創出すことを目的としている。1.昨年度に引き続き、さらに高活性なNADPH依存的BphA4作製のために、BphA4の175位と177位に系統的アミノ酸残基置換を施した変異体の基質特異性と酵素機能の速度論的解析を行い、(1)175位負電荷の除去と177位への正電荷導入がNADPH依存的BphA4作製に有用であること、(2)高NADPH依存性変異体では律速段階がFADの還元過程から、青色セミキノン中間体の酸化過程に移動していること、を明らかにした。また、BphA4と特異的電子受容体(BphA3)との複合体のX線結晶解析を行い、電子伝達に伴う立体構造変化と分子認識機構を明らかにした。これらの知見は、さらに高活性なNADPH依存的BphA4変異体の作製と電子伝達系の再構築に有用であるだけでなく、BphA4が属するONFRファミリー酵素の構造・機能を理解する上で学術的にも意義深い。2.今年度からNADPH依存的ビフェニル化合物分解酵素系(BphA4,BphA3,BphA1A2)の再構築と、シアノバクテリア(ラン藻)への遺伝子導入を開始した。宿主としてSynechocystis sp. PCC6803株を用いて宿主ゲノムへの相同組換えによる遺伝子導入を行い、カナマイシン耐性遺伝子による形質転換体の選択を開始した。また、抗BphA4および抗BphA3ウサギ抗体を作製し、今後の形質転換体中での遺伝子発現の高感度な免疫化学的検出に十分な特異性と反応性を持つことを確認した。本研究では,NADH特異的なPCB分解菌Pseudomonassp.KKS102株由来ビフェニル化合物分解酵素系をNADPH依存的に改変し,光合成微生物に組み込むことによって,貧栄養環境下でもビフェニル化合物を効率的に分解できる新規光合成細菌株の創生を目的としている。

最終年度の今年度は,NADH特異的な酵素であるBphA4の175位と177位のアミノ酸残基にランダム変異導入を行い,96穴マイクロプレートを用いて効率的にNADPH依存的変異体発現株をスクリーニングする系を構築して,野生型の基質特異性を約3000倍逆転したNADPH依存的E175C/Q177G変異体を得ることに成功した。この変異体は,これまでに得られていたNADPH依存的E175Q/Q177K変異体よりも約5倍NADPH特異的であった。このスクリーニング系はランダム変異導入による変異体酵素の作製と解析に極めて有用である。また,NADPH依存的ビフェニル化合物分解酵素系(BphA4,BphA3,BphA1A2)遺伝子をシアノバクテリア(ラン藻)に導入した。シアノバクテリア内でシアノバクテリアの光合成関連psbE遺伝子のプロモータ制御下にBphA4,BphA3,BphA1A2遺伝子を共発現するプラスミドを自律的複製可能なプラスミドpVZ321を用いて作製してシアノバクテリアSynechocystis sp.PCC6803株に導入し,菌体内での光依存的BphA遺伝子群の発現を確認した。さらに,BphA4遺伝子としてNADPH依存的なE175Q/Q177KおよびE175C/Q177G遺伝子を用いることにより,光照射下,糖類を含まない貧栄養条件で培養した菌体がビフェニルの酸化的分解活性を示すこと確認し,目的の新規光合成微生物を創出することができた。今後,PCBのみならず,貧栄養環境下での他の芳香族性環境汚染物質の生物的環境浄化への応用と展開が期待される。
小腸細胞性レチノール結合たんぱく質TypeIIの遺伝子発現と生理作用に関する研究

1.少腸CRBPII遺伝子発現に対する、高脂肪食摂取による制御機構の解明を行った。高脂肪食摂取によるラット空腸CRBPII遺伝子発現量の増大は、転写レベルで調節されこの時空腸においてPPARαmRNA量の増大およびPPARδmRNA量の減少も見られた。また、ラットCRBPII遺伝子の核内レセプター応答領域に対するラット空腸の核タンパク質結合量も高脂肪食摂取群で増大を示し、この領域にはPPAR-RXRヘテロ二量体の結合も見られた。この高脂肪食摂取によるCRBPII遺伝子発現の増大量は、脂肪酸代謝酵素阻害剤により有意な低下を示さなかったことから、摂取した脂肪酸により直接発現誘導を受けるものと示唆された。また、トランスフェクション実験の結果、ラットCRBPII遺伝子は、脂肪酸によりPPAR-RXRヘテロ二量体を通じて、発現誘導されることが証明された。2.ラット小腸におけるCRBPIIおよびL-FABPの遺伝子発現の日内変動について調べた。ラット空腸のCRBP(II)およびL-FABP mRNA量は、食餌摂取後に転写レベルで増大し始める日内変動パターンを示し、さらにこれらの日内変動は、食餌中の脂肪の摂取によって起こることが明らかとなった。3.絶食によるラット空腸のCRBP(II)、L-FABPおよびI-FABPmRNA量への影響を調べた結果、いずれの発現量も絶食1日目には減少し、3日目には増大した。これらの変動は空腸細胞におけるトリグリセライドの変動と対応しており、血中より吸収細胞へ流入した脂肪酸の量を反映したものと推察される。4.ラット空腸のβ-カロテン(BC)開裂酵素活性はBC剰量摂取により増大した。一方、BC摂取過剰でレチナール還元酵素活性は低下した。従って、BC過剰摂取時ではレチナールからレチノールへの転換が抑制されることが示唆された。1.脂肪酸代謝関連核内レセプターPPARの活性化を主体とするCRBP(II)遺伝子発現のin vitro証明:レチノイドXレセプター(RXR)はsilentに働き、食事由来の脂肪酸によるペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体PPARαの活性化が主力となって細胞性レチノール結合タンパク質タイプII(CRBP(II))の転写活性化を、Caco-2細胞を用いたin vitro実験系による証明を試みた。Caco-2細胞をアラキドン酸アナログのETYAで処理するとCRBP(II)遺伝子の転写が促進されることにつきrun on assayにより精度の高い証明が得られ、前回報告のアクチノマイシンD処理による結果と一致した。現在、CRBP(II)のプロモーターにレポーター遺伝子を結合させた発現ベクターならびに、RXRαとPPARαの発現ベクターをCaco-2細胞に導入しcontransfectionを行っており、間近く完成する見通しであるが、計画より遅れている。CRBP(II)遺伝子発現にはPPARαの関与が考えられ、そのPPARαの標的リガンドの探索を試みた。脂肪酸からプロスタノイドへの代謝の阻害剤と、ペルオキシゾーム増殖因子により活性化する情報伝達経路に関する阻害剤として、ABT(ω酸化の選択的阻害剤)とインドメタシン(シクロオキシゲナーゼの阻害剤)の影響を調べた。Caco-2細胞のCRBP(II)mRNA増大はABTにより抑制されたが、インドメタシンは抑制されなかった。高脂肪食摂食ラットの空腸CRBP(II)mRNA量はABTやインドメタシンにより低下傾向を示した。CRBP(II)mRNAは脂肪酸の代謝産物ではなく、取り込まれる脂肪酸により発現誘導されることが明かとなった。3.ラット小腸におけるCRBP(II)とFABP遺伝子発現量の日内変動:1. CRBPII

遺伝子の転写制御におけるPPARαやPPARδの役割を検討:高脂肪食摂取によりラット空腸のPPARαmRNA量は増大したが、PPAR,δmRNA量は減少した。これらのPPARの発現ベクターおよびCRBPII遺伝子核内レセプター応答領域を結合させたルシフェラーゼレポーター遺伝子をCV-1細胞にco-transfectionしたところ、いずれのPPARでも長鎖脂肪酸(リノール酸およびアラキドン酸)によりレポーター遺伝子の発現量が増大した。2. CRBPIIとFOPs遺伝子発現に働く共通メカニズムの究明:高脂肪食摂取によりラット空腸のCRBPIIおよびL-FABPの転写速度が増大した。これに伴いラットCRBPIIおよびL-FABP遺伝子上の核内レセプター応答領域に結合する空腸核タンパク質量も増大していた。これらの領域にはPPAR-RXRのへテロ二量体も結合し、その結合活性は、長鎖脂肪酸の存在により増大することが明らかとなった。3.絶食ラットの空腸CRBPIIとFABPsの遺伝子発現の動態:絶食によりラット空腸のCRBPII、L-FABPおよびI-FABP遺伝子発現量は、いずれも平行して変動し、絶食1日目には減少し、3日目には増大した。この変動は空腸におけるトリグリセライドの量と対応しており、血中より吸収細胞へ流入した脂肪酸の量を反映したものと推察される。4. β-カロテン過剰摂取に対するラット空腸のβ-カロテン開裂酵素活性とレチナール還元酵素活性の応答:ラットにβ-カロテン(BC)をラットBC所要量の10倍過剰量摂取させると、ラット空腸におけるBC開裂酵素活性は増大。一方、摂取するBCが過剰になるに従いレチナール還元酵素活性は低下した。従って、BC過剰摂取時にはレチナールからレチノールへの転換が抑制されることが示唆された。
MHC結合性ペプチドモチーフを応用した免疫学的分子擬態の解析

本研究は、我々によって明らかにされたHLA-ペプチド及びTCR-TCTリガンドの結合に関する法則性を利用することにより、ヒト成熟T細胞における免疫学的分子擬態の生理的、病理的意義を解明することを目的とした。そのために先ず、BCGa蛋白の第84-100残基(EEYLILSARDVLAVVSK)をHLA-DR14拘束性に認識する3種類のヒトTh0クローンBC20.7,BC33.5,およびBC42.1を樹立した。1残基置換アナログペプチド、および交叉反応性を示す可能性のある自己ペプチドをデータベースより検索して合成し、それを用いて抗原提示細胞(APC)の存在下にT細胞クローンを刺激し、その応答を観察した。また、クローン化されたT細胞のみならず、末梢血T細胞レベルでもpartial agonismやTCR antagonismが存在することを確認するために、すべてのポジションが19種類の残基から構成される9-19merのdegenerate peptides(X9,X11,X13,X15,X17,X19)を合成し、PBMCに対するそれら自体の刺激効果、ならびにpolyclonalな末梢血T細胞応答に対する効果を観察した。その結果、(1)第93残基AspをTyrに置換したアナログペプチドD93Y、および自己コネキシン26ペプチド断片(IMILVVAAKEVWGDEQA)は、それ自体では増殖誘導活性を示さなかったが、サイトカイン産生を誘導すると同時に、in vitroでそれぞれBC33.5およびBC20.7の寿命をクローン特異的に延長させた。この現象に伴って、Bcl-xLの発現増強が認められた。(2)Xnペプチドは、末梢血T細胞に対してpartial agonism活性を有しており、同時にpolyclonalな応答に対するantagonism活性も有していた。これらの結果より、成熟T細胞レベルでも部分アゴニストペプチドによる寿命延長は起こりうる、すなわちpositive selectionは胸腺外でも継続的に起こりうると考えられた。
Ｇａｓ６による自然免疫制御が大腸癌に及ぼす影響

腸管常在菌叢と自然免疫応答は、生体の恒常性維持に重要である。Growth arrest specific gene 6 (Gas6)は、NFkBの活性化を抑制して自然免疫を制御する。AOM/DSSを投与したGas6ノックアウト(KO)マウス、およびGas6 KO; ApcMinマウスでは、間質の炎症が亢進し、腸腫瘍が多かった。その結果、Gas6をKOした腸腫瘍モデルマウスの生存期間は野生型マウスよりも短縮していた。ヒト大腸癌組織で、Gas6の発現と炎症細胞浸潤は逆相関し、Gas6の低発現群では生存期間が短縮していた。本研究で自然免疫応答の制御による大腸癌治療へ向けた基礎的知見が得られた。大腸には膨大な数の常在菌叢が存在し、自然免疫を介して恒常性維持に重要な役割を果たしている。近年、自然免疫の制御によって大腸癌進行が抑制される可能性が示され、注目を集めている。Growth arrest specific gene 6 (Gas6)は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞で、Toll-like受容体を介したNFkBの活性化を抑制し、過剰な自然免疫を制御する。本研究では、Gas6による大腸の自然免疫の抑制が大腸癌進行を抑制するか否かを、Gas6ノックアウト(Gas6 KO)マウスを中心として解析する。これにより、大腸癌の新規治療法開発への基礎的知見を得ることを目的とする。そのため平成24年度には、以下の研究を行った。1.平成23年度に引き続き、Gas6 KOマウスへAOM/DSSを投与して形成された腸腫瘍において、間質への浸潤細胞におけるSocs3は低下し、NFkBシグナルは亢進していることを確認した。これにより、Gas6が腫瘍局所に浸潤するマクロファージの活性化状態を抑制することを確認した。2.平成23年度から作出を開始したGas6 KO; ApcMinマウスの腸腫瘍の数、サイズ等を組織学的に検討した。その結果、同マウスでは、腸腫瘍の数とサイズが増加することが確認された。3.リコンビナントGas6投与によって、マクロファージからの炎症性サイトカイン分泌は亢進した。4.大腸癌患者手術標本を用いて、Gas6の発現を検討した。定量的PCRおよび免疫染色によりGas6の発現を検討した。症例を前年度に加えて更に集積し、統計学的解析を行った。腸管に存在する大量の常在菌叢は、自然免疫を介して腸管の恒常性維持に重要な役割を果たすことが示唆されている。そのため近年、自然免疫の制御によって大腸癌の進展を制御する可能性が注目を集めている。Growth arrest specific gene 6 (Gas6)は、抗原提示細胞でToll-like受容体を介したNFkBの活性化を抑制し、過剰な自然免疫を制御する。平成25年度には、Gas6の存在下で大腸の自然免疫応答が制御される結果、大腸癌の進行を抑制するか否かを、Gas6ノックアウト(Gas6 KO)マウスを中心に解析した。AOM/DSSを投与したGas6 KOマウス、およびGas6 KO; ApcMinマウスでは、間質への炎症細胞浸潤および炎症性サイトカインの発現が野生型マウスよりも亢進していた。それにともなって、これらGas6 KOマウスの腸腫瘍では腫瘍上皮細胞の増殖も亢進しており、腸腫瘍の数と大きさが増加していた。その結果、これらGas6をKOした腸腫瘍モデルマウスの生存期間は野生型マウスよりも有意に短縮していた。さらにヒト大腸癌臨床検体においてGas6の発現を免疫染色で検討したところ、癌上皮におけるGas6の発現と間質の炎症細胞浸潤は逆相関しており、Gas6の高発現群では有意に生存期間が短縮していた。これらの検討を通じて、腸内常在菌叢の解析や上皮・間質のクロストークを考慮しなければ、腸管という特殊な臓器において、in vitroで得られたデータをそのまま外挿することの危険性が示された。また、ヒト大腸癌でもGas6が病態の進展や予後に影響を及ぼす可能性が示されたことから、自然免疫応答の制御による大腸癌治療へ向けた基礎的知見が得られた。Growth arrest specific gene 6 (Gas6)は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞で、Toll-like受容体を介したNF-kBの活性化を抑制し、過剰な自然免疫を制御する。

本研究では、Gas6による大腸の自然免疫の抑制が大腸癌進行を抑制するか否かを、Gas6ノックアウト(Gas6 KO)マウスを中心として解析する。これにより、大腸癌の新規治療法開発への基礎的知見を得ることを目的とする。そのため平成23年度には、以下の研究を行った。1.Gas6 KOマウスへAOM/DSSを投与して炎症性腸発癌を作成し、腸腫瘍の数とサイズを検討した。その結果、Gas6 KOマウスではコントロール・マウスに較べて腸腫瘍の数が多かった。また、Gas6 KOマウス腸腫瘍から単離したマクロファージは、炎症性サイトカインを多く分泌していた。2.リコンビナントGas6投与によって、大腸癌培養細胞株の増殖は変化しなかった。上記1.の結果と総合すると、Gas6は癌細胞の増殖に直接の効果をもたず、腸管間質等における炎症を抑制して二次的に癌進展を抑制することが示唆された。3.Gas6 KOマウスと多段階腸発癌モデルであるApcMinマウスを交配し、次年度のGas6 KO; ApcMinマウス解析に備えている。4.大腸癌患者手術標本を用いて、定量的RT-PCRおよび免疫染色によりGas6の発現を検討した。更なる症例の集積に努め、次年度以降の解析に備えている。Gas6 KOマウスを用いた炎症性腸発癌モデルおよび多段階腸発癌モデルの解析を通じて、Gas6が生体腸管において抗炎症および抗腫瘍効果をもつこと確認した。また、Gas6の作用標的が、上皮細胞ではなく、腫瘍間質に浸潤する炎症細胞、とくにマクロファージであること確認した。これらのデータにより、腸管in vivoにおいてはGas6が腫瘍細胞の増殖に直接の促進効果をもたず、腸管間質等における炎症を抑制して二次的に腸腫瘍の進展を抑制する可能性を改めて確認出来た。生体内では腸管内常在菌叢と間質の炎症細胞とのクロストークが、腸腫瘍の進展過程に大きく影響を及ぼすことを確認し、研究代表者らの仮説が正しいことを示すものである。また、ヒト大腸癌臨床検体を用いた解析も、順調に症例数の集積が進んでおり、Gas6発現と大腸癌の進展程度、また予後との相関関係に関する検討も進捗が見られる。したがって、本研究は平成24年度において当初の計画通り、おおむね順調な進捗状況を示しているものと考えられる。Gas6ノックアウト(Gas6 KO)マウスを用いた炎症性腸発癌モデルの解析を通じて、Gas6が生体腸管においては抗炎症および抗腫瘍効果をもつことを初めて示した。さらにヒト大腸癌細胞株に対するGas6の効果が、従来他の臓器の細胞種で報告されてきたよりも小さいことを示した。これら生体腸管と培養細胞系のデータを総合的に解析して、腸管においてはGas6が腫瘍細胞の増殖に直接の促進効果をもたず、腸管間質等における炎症を抑制して二次的に腸腫瘍の進展を抑制する可能性を示した。このことは、生体内では腸管内常在菌叢と間質の炎症細胞とのクロストークが、腸腫瘍の進展過程に大きく影響を及ぼすことを示唆するものである。さらに、腸腫瘍進展のメカニズムを解析するためには、上皮・間質のクロストークを考慮しなければ、誤った結論に至る危険性があるという、腸管固有の性質・注意点をも明らかにしたものである。このように申請者らは、計画初年度にして早くも大腸腫瘍の病態解明と新規治療法の開発へ繋がる重要な基礎的知見を得ることが出来た。
協調型機械学習による犯罪発生を頑健に自動検知する次世代型高精度知的防犯カメラ

本研究では、インテリジェント防犯カメラの高性能化を実現するために映像情報等から適切な特徴量群を抽出し、路上におけるひったくりの発生を自動検知する技術について検討した。特に機械学習システムとその協調処理に基づく高度なAI型映像処理メカニズムの構築を図り、ひったくりの発生を正確に自動検知するとともに自動通報と証拠記録を実行可能な高性能次世代型知的防犯カメラシステム、ならびに要素技術の開発を目的として行う。本年度はひったくりなどの犯行の自動検知を効果的に行うため,人工知能システム・機械学習システムの学習フェーズの改良・改善を目的とした実験システムを構築し検証した.その結果,新たな学習スキームとして代替学習法(Alternative Learning)を開発し、その効果と性能を検証した。これにより従来の機械学習の大きな課題の一つであった学習データの収集作成において、機械学習アルゴリズムの実行フェーズに関する学習データ整備の効率化を実現する可能性がある手法を得た。なお、代替学習についてもさらなる効率化と性能向上のための改善・研究が必要である。また、実験によって検知対象とするオブジェクトを高精度に自動検知出来ることを示した。また,自律移動する防犯ドローンのようなカメラ移動を伴う状況についても高精度なオブジェクト検知実現を試み、良好な結果を得た。さらにノイズに頑健かつ追加学習可能な新しいLazy Learning型学習アルゴリズムの構築を試みた。これらの成果をいくつかの査読論文として公表した。犯行状況の多様性に対応可能な知的防犯カメラシステムを構築・検証するため、システムチューニングと性能検証を行う。また、多方向からのマルチビュー映像と協調型機械学習システムを使用して犯罪行動の自動検知性能の向上を図り、実用化に向けた試験を行う。一方、映像特徴量の収集と精錬プロセスを追加することによって、行動検知の一般性と正確性の両立が可能と期待されるので映像特徴量の詳細分析手法を検討し、知的防犯カメラシステムの前処理機構に組み込む作業を行う。また、高性能なLazy Learningアルゴリズムの開発と機能検証および応用を進める。これらの開発プロセスを実施し、知的防犯カメラシステムの性能向上と頑健性の向上を図る。特に機械学習システムの協調処理に基づいて、ひったくりの発生を正確に自動検知するとともに自動通報と証拠記録を実行可能な高性能次世代型知的防犯カメラシステムおよびその要素技術の開発を目的として行われる。本年度は犯行の自動検知を効果的に行うため,人工知能システム・機械学習システムの学習フェーズの改良・改善を目的とした実験システムを構築し検証した.その結果,機械学習アルゴリズムの実行フェーズにおいて学習データ整備の効率化に結びつく可能性がある手法の手がかりを得た。合わせて,カメラ移動を伴う状況についても高精度なオブジェクト検知実現を試み、良好な結果を得た。これらの成果をいくつかの発表として公表した。実験および学習データ整備にかかる作業を比較的スムーズに行えたため、本年度に必要とする成果を順調に得られた。また、成果の発表も行えたため概ね順調に進展していると判断した。本年度はひったくりなどの犯行の自動検知を効果的に行うため,人工知能システム・機械学習システムの学習フェーズの改良・改善を目的とした実験システムを構築し検証した.

その結果,新たな学習スキームとして代替学習法(Alternative Learning)を開発し、その効果と性能を検証した。これにより従来の機械学習の大きな課題の一つであった学習データの収集作成において、機械学習アルゴリズムの実行フェーズに関する学習データ整備の効率化を実現する可能性がある手法を得た。また、実験によって検知対象とするオブジェクトを高精度に自動検知出来ることを示した。また,自律移動する防犯ドローンのようなカメラ移動を伴う状況についても高精度なオブジェクト検知実現を試み、良好な結果を得た。さらにノイズに頑健かつ追加学習可能な新しいLazy Learning型学習アルゴリズムの構築を試みた。これらの成果をいくつかの査読論文として公表した。新年度は誘拐に関するデータの収集と分析、およびH29年度に開発した新しい学習手法の検証、および知的防犯カメラシステムの精度向上を進める。「ひったくり」や「拉致誘拐」は、高齢者・女性・子供など社会的弱者が被害者となりやすい犯罪である。その大きな問題点は、これらの犯罪は人気の無い路地裏や夕方・夜間において発生することが多いため目撃者が少なく、即時通報や被害者救助が容易ではない点にある。これに対し、防犯用ロボットUAVや防犯ドローンを用いた新しい遠隔防犯システム等が研究されている。今後も、防犯カメラの映像情報等から適切な特徴量群を抽出し、路上における犯罪の発生を高精度に自動検知する知的防犯カメラシステムの開発を目指す。犯行状況の多様性に対応可能な知的防犯カメラシステムを構築・検証するため、システムチューニングと性能検証を行う。また、多方向からのマルチビュー映像と協調型機械学習システムを使用して犯罪行動の自動検知性能の向上を図り、実用化に向けた試験を行う。一方、映像特徴量の収集と精錬プロセスを追加することによって、行動検知の一般性と正確性の両立が可能と期待されるので映像特徴量の詳細分析手法を検討し、知的防犯カメラシステムの前処理機構に組み込む作業を行う。また、高性能なLazy Learningアルゴリズムの開発と機能検証および応用を進める。これらの開発プロセスを実施し、知的防犯カメラシステムの性能向上と頑健性の向上を図る。本来、論文掲載料として充当する計画であったが、当該論文の投稿〆切が延びたことから査読などの手続きが遅れ、2018年度以降の発行予定となった。そのため差額が生じた。従って、当該差額は2018年度以降において投稿論文が掲載された時点に掲載料として充当する予定である。
妊娠マウス子宮への一過性遺伝子導入システムを用いた早産治療の分子標的薬の開発

本研究は、我々の開発した子宮局所における一過性遺伝子導入法を用いて、早産を誘発する分子の探索を研究の目標としている。早産の病態として上行性感染によって引き起こされた絨毛羊膜炎によって子宮内で炎症を起こし、その後に陣痛発来・前期破水の形態をとることが知られている。これまでに我々が確立してきたHVJ-E vectorを用いた妊娠後期マウス子宮局所への一過性遺伝子導入法は、妊娠中後期マウスの子宮内・卵膜外において目的とする遺伝子を強制発現させることが可能であり、早産の病態をin-vivoで再現するには非常に適した手法である。早産の病態解明・発症予知・治療戦略を最終目的として、まずは早産モデルマウスの作成と解析を研究目的とした。この研究が早産の病態解明への一助になるとともに、早産を回壁させうる分子標的治療の開廃が期待できる。さらにこの治療法を開発することにより、日本の切迫した周産期医療や新生児医療の改善に寄与するであろう。早産に関与する可能性のある分子には炎症性サイトカイン・ケモカインであるMIP-2(マウスのIL-8)・IL-6・IL-1・TNF-αや、その転写因子であるNFκBなどが候補として挙げられた。具体的な実験方法として、MIP-2・IκB-αの分子をcodeしているcDNAをそれぞれ発現ベクターであるpcDNA3にサブクローニングし、pcDNA3-MIP-2(etc)/HVJ-Eベクター懸濁液を作製した。これをマウスの妊娠後期にあたる交配後14.5日目のICRマウス子宮内に導入した。コントロール群としてはpcDNA3/HVJ-Eベクター懸濁液のみを遺伝子導入した。残念ながらMIP-2およびIκB-αを遺伝子導入した妊娠マウスは早産に至らなかった。遺伝子導入後のマウス子宮を24時間後に摘出し、Western-Blotting法にて遺伝子導入した蛋白が発現しているのを確認した。
特殊機能を付記した衣料品の表示および広告の実態とその着衣効果について

"健康・快適"をキャッチフレ-ズとして,様々な特殊機能を付記していることを誇大な表示と広告で示した衣料品について,平成元年度に実態調査を行った結果,着用効果が確認されていないものや弊害が考えられるものが含まれていた。広告の実態が,果して表示通りの機能を有しているかどうかを,また人体生理に与える影響について,実験室及びフィ-ルドにおける着用実験で,平成2年度から3年度に調べ,得られた主な実見は女下の通りである。登倉はウォタ-ベットについて,使用時には通常のベット使用時よりも深い睡眼が得られるが水温設定には注意を要することを報告し,飯塚は睡眼実験によって,特殊機能を付記した部位別温度制御可能電気毛布の問題点をあげ,伊藤は拘束衣服の着心他と整容効果は数gf/cm^2の被服圧によって影響を受けることを,大野は女子大生約50名について,サポ-トタイプパンストの使用実態,着用感のアンケ-ト調査結果と,市販のサポ-トタイプパンストを収集分類して10種を選んで行った着用実験の結果を,奥窪は成人女子被験者及び発汗マネキンによるサウナス-ツ着用実験の結果をス-ツ下に着用する肌着素材及び発汗量レべルとの関連について,田村は,パンストによる過度の身体圧迫は血流を抑制することを,出口は健康サンダルには明確な仕様書や品質表示がないこと,またサンダル底面の刺激点と使用者の土踏まずとの適合性は個人差が大きいことを,栃原はー5°Cの人工気候室内で一般のスキ-ウエアと,特殊加工し保温性に優れると称しているスキ-ウェア-とを着用した実験結果を,緑川は寒冷環境において特殊下半身加温用足温器を着装時には非着装時よりも作業能率低下が少なくなることを,中谷は衛生加工は洗濯によりその効力が失われることなどを,綿貫はハイサポ-ト型パンテイストッキングを着用すると心臓への静脈還流量が増し血行が改善された可能性があることを報告した。昨今痩身を目的とするサウナス-ツやハイサポ-トパンティストッキング、優れた保温機能を付記した肌着や遠赤外線による保温機能を唱うセラミックコ-ティング服など特殊機能を付記した衣料品が現れた。また一方ではそれらの商品についての苦情も増加している。しかし、これらの衣料品の評価については被服学の立場から科学的検討は行われていない。そこで我々は、平成元年度にこれらの衣料品の実態調査をおこなった。特殊機能を付記した衣料品の表示及び広告の実態について調べるために、これらについて記載されている雑誌新聞等印刷媒体を1988-1989年に渡って集め、商品名、効能、原理、キャッチフレ-ズ、素材、価格販売方法、メ-カ-、販売店等に関する調査をおこなった。広告内容と広告媒体とは密接な関係があって、女性を読者対象とするものには痩身用衣服、シェイプアップファンデ-ション、ハイサポ-ト・パンティストッキングが多くみられた。また、一方これらの衣料品に対する消費者の衣生活実態を知るためのアンケ-トも行った。全国の10代以上の女性2443名から得られた回答から、消費者の衣料品に対する知熟度は非常に高いことが判明した。しかし、関心度、期待度、購入率に関しては順次低下し、着用効果があるという回答は少なかった。購入実態について自覚疲労症状などとの関係から解析した。これらの衣料品を購入した消費者の回答から、購入品目、価格ならびに商品に対する意見等について検討を加えた。平成2年度には実験室やフィ-ルドでの着用実験による解析、平成3年度には補足の調査と実験をおこない3年間の成果を集大成したい。

"健康・快適"をキャッチフレ-ズとして,様々な特殊機能を付記していることを誇大ではなかろうかと疑われる表示と広告で示した衣料品が,広く宣伝販売されている。これらの衣料品について,平成2年度に計画された実験室・フィ-ルドに於ける着用効果の実験結果を平成2年度1月に開かれた班会議で発表討議した。すなわち,登倉はウォタ-ベットの性能評価を実験検討し,ウォタ-ベッド使用時には通常のベッド使用時よりも深い睡眠が得られることを報告し,飯塚はメモリ-チェッカ-(ヴァインVAM1ー001)を用いた睡眠実験によって,特殊機能を付記した部位別温度制御可能電気毛布の問題点をあげ,伊藤は拘束衣服の着用効果についてデ-タ-コレクタ-及びプロッタ-を使用して解析した温熱効果を,大野は女子大生約50名について,サポ-トタイプパンストの使用実態,着用感のアンケ-ト調査結果と,市販のサポ-トタイプパンストを収集分類して10種を選んで行った着用実験の結果を,奥窪は成人女子被験者及び発汗マネキンによるサウナス-ツ着用実験の結果をス-ツ下に着用する肌着素材及び発汗量レベルとの関連において,田村は,パンストによる過度の身体圧迫は血流を抑制することを,田口は健康サンダルには明確な仕様書や品質表示がないこと,またサンダル底面の刺激点と使用者の土踏まずとの適合性は個人差が大きいことを,栃原はー5°Cの人工気候室内で一般のスキ-ウェアと,特殊加工し保温性に優れると称しているスキ-ウェア-とを着用した実験結果を,緑川は冬期に寒冷環境において特殊下半身加温用足温器を着装した場合にはそれを着装しない場合よりも直腸温が低くなることを,中谷は衛生加工は洗濯によりその効力が失われることなどを,綿貫はハイサポ-ト型パンティストッキングを着用すると心臓への静脈還流量が増し血行が改善された可能性があることを報告した。これらの衣料品について,平成元年度に実態調査で明らかにした広告の実態が,果して表示通りの機能を有しているかどうかを,また人体生理に与える影響を実験室及びフィ-ルドにおける着用実験をおこなった。すなわち,登倉はウォタ-ベットの性能評価を実験検討し,ウォタ-ベッド使用時には通常のベッド使用時よりも深い睡眠が得られるが,水温の設定には注意を要することをことを報告し,飯塚は睡眠実験によって,特殊機能を付記した部位別温度制御可能電気毛布の問題点をあげ、伊藤は拘束衣服の着心地と整容効果は数gf/cm^2の被服圧で変化することを,大野は女子大生約50名について,サポ-トタイプパンストの使用実態,着用感のアンケ-ト調査結果と,市販のサポ-トタイプパンストを収集分類して10種を選んで行った着用実験の結果を,奥窪は成人女子被験者及び発汗マネキンによるサウナス-ツ着用実験の結果をス-ツ下に着用する肌着素材及び発汗量レベルとの関連において,田村は,パンストによる過度の身体圧迫は血流を抑制することを,田口は健康サンダルには明確な仕様書や品質表示がないこと,またサンダル底面の刺激点と使用者の土踏まずとの適合性は個人差が大きいことを,栃原は-5°Cの人工気候室内で一般のスキ-ウエアと,特殊加工し保温性に優れると称しているスキ-ウェア-とを着用した実験結果を,緑川は冬期に寒冷環境において特殊下半身加温用足温器を着装した場合にはそれを着装しない場合よりも作業能率の低下が少なくなることを,中谷は衛生加工は洗濯によリその効力が失われることなどを,綿貫はハイサポ-ト型パンテイストッキングを着用すると心臓への静脈還流量が増し血行が改善された可能性があることを報告した。
神経発生期に存在する細胞外電位勾配：軸索ガイダンスにおける役割とイオン機序の解明

発生初期の網膜には周辺部から腹側部へ向かう電位勾配が形成される。この電位勾配の方向は網膜神経節細胞の軸索伸長方向と一致する。本研究では、細胞外電位勾配による軸索ガイダンスの分子メカニズム、及び、細胞外電位勾配の起源となるイオン機序の解明を目的とした。鶏胚網膜から網膜切片を作製し、本研究において開発した定電場培養システムにおいて24時間培養した。その結果、1)電気的軸索誘導に細胞外カルシウムイオンが関与すること、2)細胞接着分子であるインテグリンが関与すること、及び、3)細胞外電位は上皮型ナトリウムチャネルを介すること、を明らかにした。中枢神経系の発生過程で最も初期に分化するニューロンは伝導路の起始細胞である。これらの軸索は、あるベクトルに従って同時多発的に軸索伸長を開始する。この方向性を決定するメカニズムは現段階では不明である。本研究では、軸索のガイダンスキューとして細胞外電位勾配に着目する。本研究代表者は、発生初期胚の網膜において、網膜の領域間に細胞外電位勾配が存在することを発見した。その電位勾配の方向は、最初に分化するニューロン(網膜神経節細胞)の軸索伸長方向と一致し、さらに、この細胞外電位勾配の起源となるイオンチャネルを阻害すると、軸索の走行が擾乱を受けることを報告した(Yamashita, M. Electric axon guidance in embryonic retina: Galvanotropism revisited. Biochem. Biophys. Res. Commun. 431: 280-283, 2013)。本研究の目的は、細胞外電位勾配により軸索の伸長方向が制御される分子メカニズムの解明である。平成25年度では定電場培養システムの開発をおこなった。電場の効果を定量的に評価するためには、培養液中での細胞外電位勾配の値を一定にする必要がある。実際の胚発生過程における網膜組織中には、15 mV/mmの電位勾配が存在する(Yamashita, 2013)。そこで、電場の強度を、0.1 mV/mmから20 mV/mmの範囲内で設定できる培養システムの開発を目指した。そのためには、培養液中の2点に電極を置き、その電極間電位を常にモニターし、フィードバック回路により通電電流量を変化させる必要がある。これまでに、培養チェンバー、培養器、及び、通電電流供給用フィードバック回路の試作を実施した。それらの成果を第91回日本生理学会大会(平成26年3月、鹿児島)において発表した。申請者は発生初期鶏胚の網膜において、中枢神経の幹細胞である神経上皮細胞のイオン輸送により網膜の領域間に細胞外電位勾配が生じることを発見した。さらに、この電位勾配により網膜神経節細胞の軸索が将来の視神経乳頭へ誘導されることを明らかにした。細胞外電位勾配はイオン流を起こし、軸索の細胞膜表面でのイオン環境が非対称になると考えられる。本研究は、このようなイオン環境の非対称性により軸索の伸長方向が制御される分子メカニズムの解明を目的とする。平成26年度では、軸索の伸長方向に対する細胞外電場の効果を定量的に評価するために、一定の細胞外電位勾配を設定できる培養システムを開発した。培養液に直流電流を供給し、網膜切片をはさむ培養液の2点間の電位差を常時記録した。この電位差が予め設定した電位勾配となるようにフィードバック回路を用いて通電電流量を制御した。このフィードバック回路の帰還抵抗を変えることにより電位勾配の値を、0.0005 mV/mmから10.0 mV/mmまで変化させることができた。この培養システムにおいて鶏胚の網膜切片を24時間培養し、電場の方向、及び、強度と、網膜神経節細胞の軸索の伸長方向との関係を解析した。網膜神経節細胞の軸索、及び、細胞体の染色には、生細胞の染色に利用される蛍光色素(calcein-AM)を使用し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて軸索の走行を撮影した。網膜切片から伸長する軸索は、人工的に設定した電場中では細胞外電位勾配に沿って陰極方向へ向かうことが明らかになった。このような電気的効果は、電場の強度が0.001 mV/mmで生じ、2.0 mV/mmの強度で十分な効果が観察された。これらの結果から、網膜組織中に存在する電位勾配(15 mV/mm)は、網膜神経節細胞の軸索を正確に誘導するのに充分な強度であることが示唆された。申請者は、発生初期鶏胚の網膜内に正の直流電位が存在し、その振幅は網膜の周辺部で大きく、中央部から腹側へ向かう電位勾配が形成されることを発見した。さらに、網膜神経節細胞の軸索はこの電位勾配に従って伸長することを明らかにした(Yamashita, M., BBRC 431: 280-283, 2013)。これを再現するために、平成27年度では定電場培養システムを開発し、網膜神経節細胞の軸索伸長を電気的に誘導することに成功した。平成26-27年度では、網膜神経節細胞の軸索を誘導する電場強度を求めるために、一定の電位勾配が設定できる培養システムを開発した。孵卵6日目の鶏胚網膜から、視神経乳頭より背側の部分を切り出し、この網膜切片を、軸索伸長の足場となる基底膜分子(ラミニン・コラーゲン)を含むMatrigelに包埋して24時間培養した。網膜切片を挟む2点の電位差を常時記録し、この電位差が一定となるようにフィードバック回路を設計し、培養液に直流電流を通電した。