hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グルタミン酸輸送体結合タンパク質欠損マウスにおける記憶力・運動能力向上の機序

神経保護物質であるグルタチオン(GSH)を脳内で増やすために、神経細胞においてGSH産生を抑制する蛋白質を欠損させた遺伝子改変マウスを作製した。欠損マウスの脳内においては神経細胞内GSH量の増加と酸化ストレスに対する抵抗性を認めた。さらに、行動解析実験にて記憶学習能力の向上を認めた。これらの結果は、本研究で標的とした蛋白質の発現制御が神経変性疾患の治療薬開発につながる可能性を示唆する。グルタチオン(GSH)は、グルタミン酸、システイン、およびグリシンから成るトリペプチドで、抗酸化作用をはじめ、酸化還元反応、神経伝達、酵素活性、分化・増殖、およびアポトーシスなどに関わる重要な細胞内物質である。神経細胞におけるGSH産生の律速段階は、グルタミン酸トランスポーターEAAC1を介する細胞内へのシステインの取り込みである。本研究では、EAAC1を抑制的に制御している小胞体蛋白質GTRAP3-18をノックアウト(KO)したマウスを用いて、第一に、神経細胞におけるGSH産生調節機構について検討した。今回、我々が作成したGTRAP3-18KOマウスにおいては、脳組織における形態学的な異常やグリオーシス、および神経変性所見は認められなかった。また、野生型(WT)マウスと比較しKOマウスにおいては脳内システイン及びGSH量の有意な増加を認めた。一方、WTマウスと比較しKOマウス脳においてはEAAC1以外のシステイントランスポーターの発現に変化は認められなかった。脳組織染色の結果では、WTマウスと比較しKOマウスにおいてはグリア細胞におけるGSH蛍光染色像には変化は認められなかったが、神経細胞においてはGSH蛍光染色像のシグナル増強と酸化ストレスに対する抵抗性を認めた。これらの結果からKOマウスにおける脳内GSH量の増加は神経細胞に由来することが示された。次に、KOマウスにおける記憶力・運動学習能力について行動学的な解析を行った。空間認知・学習機能評価のための水迷路試験や運動学習機能評価のためのロタロッド試験を用いた検討では、WTマウスと比較しKOマウスは有意に優れた空間認知・学習能力および運動学習機能を持つことが示唆された。これらの行動学的な変化がEAAC1の機能促進によるものか否かについては引き続き検討していく予定である。グルタチオン(GSH)は、神経細胞内において抗酸化作用を有する重要な神経保護物質であると同時に各種蛋白質機能の維持、細胞内シグナル伝達、および細胞の分化・増殖において重要な役割を担っているトリペプチドである。パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患では脳内GSH量の低下が認められており、神経細胞内GSH産生調節機構の解明は臨床的にも重要である。神経細胞におけるGSH産生の律速段階は、神経型グルタミン酸トランスポーターEAAC1による細胞内へのシステインの取り込みに依存している。また、EAAC1の細胞膜上への発現は、小胞体蛋白質であるGTRAP3-18により抑制的に制御されていることから、神経細胞内のGSH産生はGTRAP3-18に制御されていると考えられる。本研究では、GTRAP3-18ノックアウト(KO)マウスを作製し、神経変性に及ぼすEAAC1とGTRAP3-18によるGSH産生調節機構を明らかにすることを目的とした。我々が作成したGTRAP3-18KOマウスの脳サンプルを用いた検討では、野生型(WT)マウスと比較しKOマウスにおいてEAAC1の細胞膜上への発現増加と脳内システイン及びGSH量の有意な増加を認めた。一方で、その他のシステイントランスポーターの発現に変化はみられなかった。また、免疫組織染色の結果から、KOマウスにおける脳内GSH量の増加は神経細胞に由来することが示された。脳組織スライスカルチャーモデルを用いた検討では、KOマウスは酸化ストレスに抵抗性を示した。また、水迷路試験やロタロッド試験を用いた認知行動学的な検討では、WTマウスと比較しKOマウスが有意に優れた学習能力を持つことが示唆された。以上の結果から、GTRAP3-18を抑制的に制御することにより、内在的、かつ神経細胞選択的にGSH産生を促進することが明らかとなった。本研究では、GTRAP3-18ノックアウト(KO)マウスを用いて、加齢および神経変性に及ぼすEAAC1/GTRAP3-18のグルタチオン(GSH)産生調節機構を明らかにすることが第一の目的である。神経細胞におけるGSH産生の律速因子であるシステインの取り込みは神経型グルタミン酸トランスポーターEAAC1にのみ依存していること、システインがGSH生成に必要であること、加えてGTRAP3-18がEAAC1を選択的に抑制していることから、神経細胞内のGSH産生はGTRAP3-18に制御されていると考えられる。我々は、GTRAP3-18遺伝子のexon 1をNeo遺伝子で置換することによって作成したGTRAP3-18KOマウスを用いて実験を行った。固定後脳組織切片を用いた組織染色では、KOマウスにおいて神経変性所見は認められなかった。

また、脳組織において形態学的な異常やグリオーシスも認められなかった。脳サンプルを用いた検討では、野生型(WT)マウスと比較しKOマウスにおいて脳内システイン及びGSH量の有意な増加を認めた。一方、脳内グルタミン酸、グリシン、およびGABA量については両群間に差は認められなかった。GSH蛍光マーカーを用いた免疫組織染色の結果から、KOマウスにおける脳内GSH量の増加は神経細胞に由来することが示された。脳サンプルを用いたWesternBlot法による検討では、KOマウスにおいて細胞膜上でのEAAC1発現量の増加を認めた。この結果は、脳組織切片を用いた免疫組織染色においても確認された。脳組織スライスカルチャーモデルを用いた検討では、KOマウスは酸化ストレスに抵抗性を示した。また、水迷路試験やロタロッド試験を用いた認知行動学的な検討では、WTマウスと比較しKOマウスが有意に優れた学習能力を持つことが示唆された。ノックアウトマウスを用いた動物実験では、行動学的、組織学的、および生化学的手法を用いて当初の研究計画を十分に遂行することができた。動物実験に関する検討では、当初の研究計画を十分に遂行することができた。GTRAP3-18 KOマウスにおける行動学的解析結果をふまえ、学習機能におけるGTRAP3-18の役割についてさらに検討を進めていく。動物実験に関しては、KOマウスにおける脳内GSH増加の機序につきさらに生化学的および組織学的な検討を進めていく。スライスカルチャーを用いた実験では、Amyloid β1-42やMPP+などの神経毒に対する抵抗性についても検討する。初代培養細胞を用いた実験では細胞内シグナル伝達について検討を行う。GTRAP3-18KOマウスの維持・管理およびgenotyping費用、免疫染色に必要な各種抗体・マーカー、ELISA測定キットなどの購入費用および、実験用動物(C57BL/6マウス)、その他の試薬や器具類の購入費用として1,300,000円/年を要する。
食品の"組成成分複雑性"を重視したメタボロミクスによる新しい食品成分分析の確立

本研究では、食品の成分多様性の評価に重点を置いた食品成分分析について、質量分析計を用いた方法で行った。植物性食材である様々な野菜について分析を行い、その成分組成について比較解析を行った。すべての野菜のうち、葉野菜のほうが根菜や果実より成分組成が複雑な傾向を示した。葉野菜ではダイコンやホウレンソウが、果実ではピーマンが複雑な成分組成を示していた。各野菜とも、部位による組成の違いが大きく、特にナバナなどは、花序と茎・葉では相当組成が異なっていた。セリ科野菜は、それぞれ特徴的な成分が多い傾向があった。また、野生種と栽培種トマト果実の成分組成の違いについても調べた。野生種トマト果実の違いには、ステロイドアルカロイド類の組成の違いの影響が大きかった。食品は、薬品と違って数多くの成分から成る“成分複雑系"であるが、各食品に含まれる成分情報は乏しいのが現状である。本研究では、食材として野菜に着目し、野菜の成分複雑性がどれほど異なるのかを調べるため、最新の精密質量分析計とコンピュータ解析システムを用いた一斉成分分析をすることで、品種および産地の判別が可能な32種の野菜について、可食部を部位別にわけてサンプルとした。各凍結サンプルをメタノールで細胞粉砕器を用いて粉砕抽出し、フィルター後、分析には液体クロマトグラフィー・フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計を用いて分析した。エレクトロスプレーイオン化法によるポジティブおよびネガティブ両モードで分析を行い、MS/MSデータおよびPDAも自動取得した。データ処理およびデータアライメントは、我々が開発した解析ソフトウエア(成分ピークピックアップ、サンプルによる成分アライメント)で解析を行った。本分析の結果、各野菜よりそれぞれ数百成分の存在が確認でき、その数は野菜の種類、部位によって大きく異なっていた。葉野菜ではホウレンソウが、果実ではピーマンが複雑な成分組成を示し、各野菜とも部位による組成の違いが大きく、特に菜の花やブロッコリーなどは花と葉で大きく組成が違った。また、セリ科野菜は、他の科の野菜よりも、それぞれ特徴的な成分が多い傾向にあった。本年度は、昨年に引き続き液体クロマトグラフィー・フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計を用いてサンプルの成分分析を進め、合計で33種の野菜について可食部に分け(葉・茎・果実など)、解析を行った。葉部・茎部で比較できた野菜をみてみると、いずれも葉部の方が茎部の2倍以上の成分を検出することができ、葉部のほうが複雑な組成であることが分かった。また、緑色葉野菜と淡色葉野菜を比べると、緑色葉野菜のほうが圧倒的に多くの成分が検出された。葉部のなかでは、ダイコンが最も組成が複雑であり800種の成分が検出された。次いでホウレンソウやセリ科野菜であるミツバ、セリ、パセリが多く、一般に健康のイメージの強い野菜が成分組成も複雑である傾向があった。特に、野菜の機能性寄与成分として知られるフラボノイドについて着目し、その種類を見たところ、ホウレンソウが最も多く、46種のフラボノイドの存在が確認された、次いで、ダイコン(32種)、ニラ(31種)の順に多かった。また、根野菜、イモなどでは検出成分は少なかった。これは、植物の生態では根部は貯蔵でんぷん、タンパク質などが多いこと、各種成分の生合成があまり行われていないことから、成分数が少なくなっていると考えられる。各野菜独特な成分に着目し比較すると、セリ科野菜がもっとも特徴があることが分かった。果実野菜については(キュウリ、トマト、ピーマン、ナス、イチゴ)、いずれも200種ほどの成分の存在が確認できた。ピーマン、トマト、ナスは同じナス科に属するが、一次代謝物以外はほとんど共通する成分は見いだされなかった。
発育不良牛の原因遺伝子の解明および遺伝子診断法の確立

マイクロサテライトDNAマーカーを用いた解析から,本疾患の原因は一つの遺伝子に起因するのではなく,複数の遺伝子が関与することが示唆された。また,マイクロアレイ解析およびリアルタイムPCRの結果,脂質代謝,コレステロール代謝,ステロイド代謝に関連する遺伝子において,正常牛に比べて発育不良牛で2倍以上有意に発現量が上昇していた。この結果,発育不良の発症にはこれらの遺伝子が関わっていることが示唆された。牛の発育不良の原因は,慢性的な肺炎や下痢,先天的な遺伝性疾患,飼育環境など様々である。これまでに、先天的な遺伝性疾患が原因と思われる発育不良牛が臨床現場から、大学に搬入されることが少なくなかった。そこで、先天的な遺伝性疾患が原因であると思われる発育不良牛の発生状況の把握と、発育不良牛と血縁関係にある牛の血液を採材する目的で、疫学調査を実施した。まず、発育不良の原因を精査し、それから原因別に整理し、先天的な遺伝性疾患が原因と思われる発育不良牛を検索した。その結果、黒毛和種牛の特定家系に発育不良が頻発することがわかった。しかしながら、はっきりとした発育不良の共通祖先牛は特定できなかった。また、発育不良牛の家系図を作成して、遺伝様式の検索を試みたが、決定には至らなかった。いっぽう、特定家系の発育不良牛および正常牛の血液あるいは臓器を採材して核酸を抽出した。これを検体として、発育不良牛と正常牛との間で、遺伝子レベルの差を検索し始めた。マイクロサテライトDNAマーカーを用いて、発育不良牛と正常牛との間で、30対の染色体上にある遺伝子配列の違いを検索しているが、まだ明らかに異なる機能的遺伝子は見つかっていない。マイクロサテライトDNAマーカーを用いた原因遺伝子の検索方法は、原因遺伝子が単一の場合しか検索できない。遺伝子様式が決定できなかった理由として、複数の遺伝子が関与している可能性がある。このため、今後、マイクロアレイを用いて、発育不良牛と正常牛との間で、43,000個余りの遺伝子発現の差をスクリーニングする予定である。牛の発育不良の原因は、慢性的な肺炎や下痢、先天的な遺伝性疾患、飼育環境など様々である。このうち、特定の遺伝性疾患が原因と考えられる発育不良の原因遺伝子を同定することを研究の目的とした。特定の遺伝性疾患が原因と考えられる発育不良牛から、血液および肝臓を採取し、DNA、RNAを抽出した。これらをもとに、牛の30の染色体上にある200個あまりのマイクロサテライトDNAマーカを用いて、正常牛と発育不良牛との間で、その繰り返し回数の違いを検索した。その繰り返し回数と正常牛あるいは発育不良牛との間で連鎖解析し、原因遺伝子が存在する染色体を探した。しかし、現在のところ特定できていない。その原因の一つとして、特定の遺伝性疾患が原因であると考えた発育不良牛の中に、他の原因の個体が混入していることが考えられた。連鎖解析の結果に誤差が生じて、連鎖スコアの高いマイクロサテライトDNAマーカが出現しないのである。また、マイクロサテライトDNAマーカを用いた原因遺伝子の検索法は、原因遺伝子が単一の場合にしか検索できない。このため、複数の遺伝子が関わっている場合も考慮し、正常牛と発育不良牛との間の遺伝子発現の違いから、候補遺伝子を検索するマイクロアレイ法も実施した。しかし、この方法についても、まだ特定の候補遺伝子は見つかっていない。この方法は、遺伝子発現の違いから、統計的に候補遺伝子を選出する。このため、マイクロサテライトDNAマーカによる検索と同様、特定の遺伝性疾患が原因であると考えた発育不良牛の中に、他の原因の個体が混入している場合、有意差が出ず、候補遺伝子が検索できない。これらの結果から、再度、検体である発育不良牛の原因を精査し、引き続き、原因遺伝子の検索を進める予定である。マイクロサテライトDNAマーカを用いて原因遺伝子を検索したが、候補遺伝子は検索できなかった。この検索法は、原因遺伝子が単一の場合にしか検索できない。このため、発育不良には、複数の遺伝子が関わっている可能性が示唆された。そこで、正常牛と発育不良牛との間の遺伝子発現の違いから、候補遺伝子を検索するマイクロアレイ法を実施した。マイクロアレイ法を用いて、正常牛と発育不良牛との間の遺伝子発現の違いを見た。その結果、正常牛に対して発育不良牛で2倍以上発現が減少していた遺伝子は954遺伝子あり、反対に正常牛に対して発育不良牛で2倍以上発現が上昇していた遺伝子は666遺伝子あった。発育不良の病態については、これまでの研究で、肝臓のエネルギー代謝が低下していることが明らかとなっている。このため、肝臓のエネルギー代謝に関連する遺伝子をこれら遺伝子群から検索した結果、脂質代謝、コレステロール代謝、ステロイド代謝に関連する遺伝子が複数見つかった。

これらの遺伝子は、どの遺伝子も、正常牛に対して発育不良牛で2倍以上発現が上昇していた遺伝子であり、正常牛に対する発現の有意差も高い遺伝子であった。この結果を別の方法で発現を検証する目的で、これらの遺伝子のうちいくつかをリアルタイムPCR法にて遺伝子発現量を確認したところ、やはり、マイクロアレイ法と同様で、正常牛に対して発育不良牛での発現量は高いと言う結果が示された。今後、複数存在する候補遺伝子から、正常牛と発育不良牛との塩基配列の相違を確認し、原因遺伝子を絞っていく予定である。
ヒトInterleukin-12受容体の構造と病態における発現解析

我々は近年強力な抗原提示細胞提示細胞として知られる樹状細胞における免疫担当分子の発現に注目してきた。そして多くのケモカイン受容体の発現を確認し、わけてもCCR-1およびCCR-3の発現が抗原提示において極めて重要でありまたT細胞増殖反応を制御できる可能性をみいだした。このことから樹状細胞の活性化とその制御に興味を持ちIL-12の樹状細胞に対する働きについて研究を企図した。研究課題であるIL-12受容体についても高レベルの発現を認め、その免疫生物学的意義を追究した。抗体として我々に樹立した抗IL-12R beta1抗体(TOS)を用い、FACSにて活性化および静止Tリンパ球、樹状細胞にて強い発現を認めた。さらにIL-12刺激によりすでに報告されているGM-CSF,TNF,IFN同様にIL-12の産生を誘導した。このとき様々な細胞内蛋白のリン酸化を引き起こしたがTリンパ球とは異なるパターンを示した。しかしながらJak蛋白、Stat蛋白のIL-12受容体への会合をTリンパ球と同様に認めた。これらからIL-12は直接にIL-12受容体を介して樹状細胞に働きシグナル伝達系を活性化の方向に動かしうると考えた。癌さらにはアレルギー疾患の免疫遺伝子治療、細胞療法の担い手として重要な樹状細胞の機能統御を試みる際に前述のケモカイン受容体を介する方法に加えて情報伝達分子を標的とする手法も可能とならしめることを今後の目標としたい。1シグナルトラップ法とハイブリドーマテクノロジーにより抗ヒトIL-12受容体(IL-12R)β1鎖に対する単クローン抗体(TOS)を樹立した。TOSは正常末梢血およびIL-12R導入細胞から等しく110kDの蛋白を共沈し、リガンド結合及びT細胞増殖反応における結果から中和性抗体であった。TOSを用いてIL-12刺激によって誘導されるT細胞系でのシグナル伝達系の解析を試みた。その結果、IL-12刺激により85kDの蛋白(p85)のリン酸化が速やかに誘導されることを見いだした。p85は細胞膜蛋白と考えられ、IL-12Rの一部を構成する可能性が示唆された。別に報告されているβ2鎖とは分子量が明らかに異なり、IL-12Rのサブユニットであるか否か今後の追及を必要とする。2さらにIL-12Rβ1鎖のT細胞以外の細胞における発現はこれまで一定の見解はなされていない。そこで、TOSにより検討した結果、末梢血単球由来の樹状細胞において強い発現を認めた。現在、樹状細胞における発現の意義を、リン酸化蛋白の同定を主眼として検討中である。3シグナルトラップ法を用いてトロンボポエチン受容体(c-mpl)に対する抗血清抗体の樹立に成功した。この抗血清はc-mpl結合により血小板の増殖を促した。今後、血小板減少、血小板増多の病態を解明するうえで手がかりとなりえよう。4ハイブリドーマテクノロジーによりケモカイン受容体であるCCR-1,CCR-3に対する単クローン抗体を樹立した。CCR-1,CCR-3とも樹状細胞に発現することを確認し、その生物学的意義を解析中である。研究課題であるIL-12受容体についても高レベルの発現を認め、その免疫生物学的意義を追及した。抗体として我々の樹立した抗IL-12R betal抗体(TOS)を用い、FACSにて活性化および静止Tリンパ球、樹状細胞にて強い発現を認めた。

このとき様々な細胞内蛋白のリン酸化を引き起こしたがTリンパ球とは異なるパターンを示した。しかしながらJak蛋白、Stat蛋白のIL-12受容体への会合をTリンパ球と同様に認めた。これらからIL-12は直接にIL-12受容体を介して樹状細胞に働きシグナル伝達系を活性化の方向に動かしうると考えた。癌さらにはアレルギー疾患の免疫遺伝子治療、細胞療法の担い手として重要な樹状細胞の機能統御を試みる際に前述のケモカイン受容体を介する方法に加えて情報伝達分子を標的とする手法も可能とならしめることを今後の目標としたい。
ベルギー象徴派研究-フランドルとワロニーの相克と共生

平成12年度はベルギーのヴォルプスベーデと称され、ベルギー象徴派のなかで特異な役割を果たしたガン市郊外ラーテム・サン・マルタン村の芸術家コロニーを調査した。アルベール・セルヴェースの旧居に滞在し、同派の指導的な芸術家アルビン・フアン・デン・アベーレ、ジョルジュ・ミンネに関する遺跡遺稿を調査した。とくにガン市現代美術館、デインツ美術館、デュルル美術館の3館が同一テーマで開催したラーテム・サン・マルタン派に関わる総合的な展覧会は、未発表・未発掘のまま置かれていた資料を網羅して、画期的な展覧会であった。同展覧会を組織したスタッフとも接触を持つことができ、今後の研究に重要な素地を与えてくれた。平成13年はリエージュ美術館ならびにナミュール市美術館、とりわけ同市立フェリシアン・ロップス美術館において19世紀末ワロン派の美術・文学運動について調査することができた。とりわけロップス美術館は、リニューアルの作業にかかっていたが、新装なった部分もあり、学術的に一層組織整備された美術館に生まれ変わろうとしていた。本研究主題にもとづく調査研究によって、ベルギー象徴派運動の基礎的な概要は把握できたし、ジェイムズ・アンソール、フェルナン・クノップフ、コンスタン・モンタルド、ジャン・デルヴィル、フェリシャン・ロップス、レオン・スピリアールト、ドグーブ・ドヌンク、アントワーヌ・ヴィールツ、ジョルジュ、ミンネならびにラーテム・サン・マルタン派についてはほぼ記述を終えることができた。ひきつづき社会主義的傾向を強く見せるコンスタンタン・ムーニエ、レオン・フレデリック、アルベール・セルヴェースらについて調査を勧め、その運動と作品について分析を進めることを今後の課題としたい。ラーテム・サン・マルタン・コロニーの研究19世紀末ベルギー象徴派運動を、文学・絵画・彫刻およびその他の諸芸術との関連のなかで総合的に把握することを目的とし、フランドル(オランダ圏)とワロニー(フランス語圏)の歴史的文化的相克と共存という統合的視点からこの運動を観察することとした。フランドルの心情をフランス語で表現したメーテルランク、ヴェルハーレン、ローダンバックとガン・ブリュージュを中心に芸術活動を展開したフランドルの象徴派イデアリストをとりあげたが、とくに今年度はラーテム・サン・マルタンの芸術家コロニーを調査した。ベルギー象徴派運動において特異な集団として最近注目されるようになったラーテム・サン・マルタンの芸術家コロニーの成立と展開をたどることを目的に、8月6日から16日まで現地調査を実施した。20世紀初頭ジョルジュ・ミンネを中心に、ガン市郊外に形成された、いわばベルギーにおけるこのヴォルプスヴェーデには、詩人カレル・ファン・ウォスティーネとその弟ギュスターヴ、ヴァレリュスス・ド・サレル、アルビン・ファン・デン・アベーレ、さらにアルベール・セルヴェルらが加わり、特異な理想主義的芸術運動を展開した。第一次エコール・ド・ラーテムである。さらにコンスタン・ペルメーケ、グスターフ・ド・スメト、フリス・ファン・デン・ベルへらが第二次を形成する。時流の中心をなす印象主義から遠ざかり、ルイス・ブロークや、メーテルリンクを愛好し、ひたすら自己の内面化を求めるこの運動は、近年特に注目されるようになりガン市美術館には、ラーテム・サン・マルタン派室が特設され、またこの都邑には、19世紀末からのこの運動を遡行顕彰するとともに、新世紀の新たなラーテム・サン・マルタン派コロニーが成立しつつあることを明らかにすることができた。

フランドルの心情をフランス語で表現したメーテルランク、ヴェルハーレン、ローダンバックとガン・ブリュージュを中心に芸術活動を展開したフランドルの象徴派イデアリストをとりあげたが、とくに今年度はラーテム・サン・マルタンの芸術家コロニーを調査した。ベルギー象徴派運動において特異な集団として最近注目されるようになったラーテム.サン・マルタンの芸術家コロニーの成立と展開をたどることを目的に、8月6日から16日まで現地調査を実施した。20世紀初頭ジョルジュ・ミンネを中心に、ガン市郊外に形成された、いわばベルギーにおけるこのヴォルプスヴェーデには、詩人カレル・ファン・ウォスティーネとその弟ギュスターヴ、ヴァレリュスス・ド・サレル、アルビン・ファン・デン・アベーレ、さらにアルベール・セルヴェルらが加わり、特異な理想主義的芸術運動を展開した。第一次エコール・ド・ラーテムである。さらにコンスタン・ペルメーケ、グスターフ・ド・スメト、フリス・ファン・デン・ベルヘらが第二次を形成する。時流の中心をなす印象主義から遠ざかり、ルイス・ブロークや、メーテルリンクを愛好し、ひたすら自己の内面化を求めるこの運動は、近年特に注目されるようになりガン市美術館には、ラーテム・サン・マルタン派室が特設され、またこの都邑には、19世紀末からのこの運動を遡行顕彰するとともに、新世紀の新たなラーテム・サン・マルタン派コロニーが成立しつつあることを明らかにすることができた。
中性子ラジオグラフィによる木材中のホウ素系防腐剤分布の可視化

重金属を使用しない,環境負荷の少ない木材防腐剤として,ホウ酸やホウ酸塩を主成分とするホウ素系薬剤の実用化が期待されている。そこで本研究では,ホウ素系薬剤を注入した木材試料中のホウ素原子の分布を,中性子ラジオグラフィ法を適用することによって巨視的に可視化して評価するとともに,木材中へのホウ素系薬剤の固定化法について検討した。日本原子力研究所東海研究所内のJRR-3中性子ラジオグラフィ装置を利用して木材試料中のホウ素原子の分布を可視化し,さらに画像処理を行なうことによってホウ素分布を数値化して評価した。木材試料には針葉樹のスギと広葉樹のブナを使用し,ホウ酸をメタノールに溶解して木材試料に注入してその分布を調べた。その結果,スギでは木口面付近での濃度が明らかに高く局在していたのに対し,ブナではほぼ均一に分布していることが示された。これらの試料を褐色腐朽菌オオウズラタケおよび白色腐朽菌カワラタケによる腐朽試験を行なったところ,いずれも強い耐朽性を示し,ホウ酸の分布の違いによる顕著な差異は認められなかった。しかし溶脱処理を行なうとホウ酸は速やかに溶出してしまい,それにともない耐朽性も大幅に低下してしまった。そこで,ホウ素を木材試料内に固定化する方法について検討を行なった。固定化は,各種タンパク質(動物血清,カゼイン,乳由来タンパク(Whey Protein Isolate)など)とホウ酸の混合水溶液を木材に注入後,熱処理によってタンパク質を変性させることによって行なった。その結果,溶脱処理後でもホウ素のある程度の固定が可能となり,耐朽性の向上も認められた。しかしながら,特にオオウズラタケに対して,実用レベルの目標基準である質量減少率3%以下の達成には僅かながら及ばなかった。そこで本研究では,ホウ素系薬剤を注入した木材試料中のホウ素原子の分布を,巨視的に可視化して評価することを日的として,中性子ラジオグラフィ法を適用した。日本原子力研究所東海研究所内のJRR-3中性子ラジオグラフィ装置を利用して木材試料中のホウ素原子の分布を分析した。中性子線は,ホウ素によって特異的に散乱・吸収されることから,得られる木材試料の画像では,ホウ素の局在している部位の明度が高くなる(明るいグレーになる)ため,その分布を可視化することができる。さらに画像処理を行なうことによってホウ素分布を数値化して評価した。木材試料には針葉樹のスギと広葉樹のブナを使用した。ホウ酸をメタノールに溶解して木材試料に注入してその分布を調べたところ,スギでは木口面付近での濃度が明らかに高く局在していたのに対し,ブナではほぼ均一に分布していることが示された。また溶脱処理を行なうとホウ酸は速やかに溶出してしまい,それにともない耐朽性も大幅に低下していた。今後,ホウ素を木材試料内に固定化する方法について検討を行ない,得られた試料の耐朽性を評価する予定である。

日本原子力研究所東海研究所内のJRR-3中性子ラジオグラフィ装置を利用して木材試料中のホウ素原子の分布を可視化し,さらに画像処理を行なうことによってホウ素分布を数値化して評価した。木材試料には針葉樹のスギと広葉樹のブナを使用し,ホウ酸をメタノールに溶解して木材試料に注入してその分布を調べた。その結果,スギでは木口面付近での濃度が明らかに高く局在していたのに対し,ブナではほぼ均一に分布していることが示された。これらの試料を褐色腐朽菌オオウズラタケおよび白色腐朽菌カワラタケによる腐朽試験を行なったところ,いずれも強い耐朽性を示し,ホウ酸の分布の違いによる顕著な差異は認められなかった。しかし溶脱処理を行なうとホウ酸は速やかに溶出してしまい,それにともない耐朽性も大幅に低下してしまった。そこで,ホウ素を木材試料内に固定化する方法について検討を行なった。固定化は,各種タンパク質(動物血清,カゼイン,乳由来タンパク(Whey Protein Isolate)など)とホウ酸の混合水溶液を木材に注入後,熱処理によってタンパク質を変性させることによって行なった。その結果,溶脱処理後でもホウ素のある程度の固定が可能となり,耐朽性の向上も認められた。しかしながら,特にオオウズラタケに対して,実用レベルの目標基準である質量減少率3%以下の達成には僅かに及ばなかった。
ホウ素の植物体内での易動性の検討

ホウ素は高等植物の必須元素であり、ホウ素が欠乏すると根の伸長、新葉の展開が停止する。特に開花期には要求量が多く、欠乏すると花粉の形成不良や不稔を引き起こし、子実収量が激減する。さらにホウ素は植物体内での移動性が乏しく、常に土壌から供給されていることが必要である。従って、開花期に下位葉からホウ素が移動すれば、生殖器官はホウ素の供給を受けることができ、土壌のホウ素欠乏による影響を受けにくくなることが期待できる。そこで植物体内におけるホウ素の移動性を検討するため、^<10.8>Bを供給して栽培したヒマワリ幼植物の培養液に^<10>Bを与え、一定時間後の各葉位のホウ素の同位体比を測定し、ホウ素の移動度を推定した(実験1)。さらに水耕したヒマワリ幼植物の地上部を根際で切除し、根から地上部に移行する導管液を採取した。地上部切除と同時に培養液の^<10.8>Bを^<10>Bに切り替え、導管液中のホウ素の比活性の経時的変化を追跡した(実験2)。実験2から、導管液のホウ素の比活性は培養液交換後、6時間でほぼ外液のホウ素の比活性と等しくなった。ヒマワリの根の地上部に輸送されるホウ素のプールは半減期2時間程度の、すばやく外液と交換できるホウ素から構成されていた。実験1からは、最上位葉に運搬されるホウ素が根から導管を通って運ばれるホウ素ではないことが示された。すなわちホウ素の比活性が短時間で上昇するのは第2、3葉であって、第一葉の比活性は12時間遅れて上昇した。つまり、第一葉に運ばれるホウ素は下位葉を経由していることが示された。これらの検討から、ホウ素は体内で導管と師管の双方を経由して輸送されていることが明らかになった。そこで植物体内におけるホウ素の動性を検討するため、^<10.8>Bを供給して栽培したヒマワリ幼植物の培養液に^<10>Bを与え、一定時間後の各葉位のホウ素の同位体比を測定し、ホウ素の移動度を推定した(実験1)。

すなわちホウ素の比活性が短時間で上昇するのは第2、3様であって、第一葉の比活性は12時間遅れて上昇した。つまり、第一葉に運ばれるホウ素は下位葉を経由していることが示された。これらの検討から、ホウ素は体内で導管と師管の双方を経由して輸送されていることが明らかになった。ヒマワリ、ソラマメ、インゲンを用いてホウ素の体内での移動性をホウ素の安定同位体^<10>Bを用いて検討した。培養液のホウ素濃度0.03mg/Lとしてこれらの植物を第4葉展開まで栽培したのちホウ素を欠除した培養液に移した。ヒマワリでは移植後1週間程度で根の伸長が停止し褐色になった。地上部新薬の展開は10日目まで影響されなかったが第2葉に錆のようなスポットが出始め、2週間目には新葉の展開が停止した。このときの葉身ホウ素含有率は20ppmで、ほとんどすべてが細胞壁に結合したホウ素だった。^<10>Bを用いた検討から、ヒマワリ新葉へは第2葉、第3葉からホウ素が転流することが判明した。ダイズの場合には欠乏症状は4週間まで見られなかった。ソラマメの場合には2週間目で根の伸長が停止し褐色になったが地上部新葉の展開は2週間でも停止しなかった。また分げつもなかなか停止しなかった。ソラマメ新葉にホウ素欠乏症状が見られるようになったときのホウ素含有率を測定したところ、水溶性のホウ素はほとんど検出されず細胞壁に結合したホウ素含有率は3ppm程度であった。これらの結果はマメ科植物においてホウ素の供給が低下するとホウ素の結合部位であるRG-IIが減少することを示唆しており、マメ科植物のペクチンの組成についてさらに検討する必要がある。さらに、培養液からホウ素を欠除した個体でも脇芽が活発に展開しホウ素が体内で移動していることが示された。開花直前まで^<10>Bを与えて栽培したインゲンマメをホウ素欠除培養液に移して栽培を続け、莢のホウ素を定量した。莢の中には新葉と同じ組成で^<10>Bが検出され、開花以前に吸収されたホウ素が莢に転流していることが示された。一般にホウ素は植物体内であまり移動しないと報告されているがマメ科植物の場合には当てはまらないことが明らかになった。
サブミリ針入試験による煎餅テクスチャー計測とその確率モデリングによる解析法の開発

プロファイル研究を行うため、これまで取得していなかったクッキーについて、データを取得した。また、柔らかい食品でシグナル強度が弱い場合でも、信号を積算することにより、ノイズが平滑化されてなめらかな曲線が得られることが分かった。このことは、ノイズは確率的に互いに独立であり、特にピンクノイズと言われる周期的なノイズが残ると言うことがないことが明らかになった。このことは、確率モデリングによる解析に取って有利であると考えられる特徴である。(1)本研究を行うための、測定用の針の直径に関する検討。細い針を用いることにより、より微細な物性情報が得られるため、なるべく細い針を用いたいが、その場合、二つの困難が生じる1。細く、長い針を用いた場合、測定時に折れてしまい測定続行が不可能となる。2.針が細いほど、力が弱くなり、信号が減少し、ノイズに埋もれてしまう。これまで適切な針の形状に関する情報が無いため、様々な形状の針を作成し、カットアンドトライで適切な条件を決定する。太さについては0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mmまで、0.1mm間隔で耐久性及び、信号がノイズに埋もれないか否かを実験によって明らかにする。長さについては、煎餅の厚さを考慮し、1mmから2cmまでで、耐久性を明らかにする。(2)統計モデルの選択破壊に伴う応力変化に対しては、これまでの研究では、指数分布、正規分布、ワイブル分布といった理論統計モデルが対象によって使い分けられてきているため、この三つを選び、これにデータを当てはめ、適合度検定を行う。適合度検定としては、Shapiro-Wilkの検定と共に、情報量基準を用いたモデル選択の技術を用いる。また、力学試験データ中に見られる破壊の発生間隔と内部の気泡の大きさが関連していると考えられる。そこで。煎餅断面の光学写真の取得、また、MRI画像取得による非破壊評価を行い、近年パンに対して適用されている、気孔の大きさに関する解析を同室のMRI撮影の専門家、画像解析の専門家と共同で進め、破壊の発生間隔との定量的な比較を行う。同時に、調査対象のせんべいの種類を増やすことももちろんながら、クッキーやスナック菓子などより多くの菓子類を集め、煎餅と同一の解析を行うことで、煎餅物性の特徴を明らかにする。本年は、まず、針入試験において必要な、自動的にスライドするテーブルの開発を行った。そして、これまで用いてきたサラダ煎餅に対して針入試験を試みた。まず、煎餅全体に針を貫通させることを想定して、約1.5cmの長さで試験をした。材質は、電極用の銀-タングステンでは軟弱過ぎたので、剛性と靱性に優れる高速度鋼製を選んでその丸針を用いた。試験結果は、0.3mmの太さの針でも試験が行えることを見いだした。このことは、120回の自動針入試験を二つのサンプルに対して行うことによって確かめた。このデータの最大値の分布計は、比較的対称型であった。又、それよりも硬い七味煎餅において試験を行ったところ、同様の約1.5cmの長さの高速度鋼で、0.5mmの太さまで試験が行えることを見いだした。さらに、0.3mmの太さで試験を試みたが、測定開始後約30回で針が破壊してしまい、試験続行が不可能だることが示された。0.5mmの太さの時に記録された最大荷重は約25Nであり、0.3mmの時は10N程度であった。更に硬いおこげ煎餅の場合には、30Nを超えるような場合もあったが、0.5mmの針で100回の試験を行うことが出来た。一方のサラダ煎餅の時は、0.5mmの太さの時、荷重が最大で8N弱であった。このことから、七味煎餅やおこげ煎餅の場合は、深くまで侵入する試験は0.5mmの太さが必要であるが、更に細い針を使う場合には、より短い針で表面の硬さを調べた方がよいことが分かった。これらのデータを用いて、破壊の大きさ頻度関係を調べた方がよいことが分かった。これらのデータを用いて、破壊の大きさ頻度関係を調べたところ、サラダ煎餅の場合は、約1Nから指数関係に近い関係があることが分かった。一方、硬い煎餅の場合は、これまで得られてきた知見とは別に、べき乗関係に近い関係があることが分かった。このことは、堅焼きの煎餅のような場合とサラダ煎餅の場合では、破壊の親展が異なることを示唆しており、サラダ煎餅と堅焼き煎餅の食感の違いを考える上で重要な知見であると考えられる。当該年度は、日本の伝統食品であり、国民の嗜好性の高い煎餠について、その物性をさらに明らかにした。当該針人試験では、同一のサンプルから調密な調査地点を選ぶことによって、局所的かつ詳細な物性を得られることが出来るが、そのことは、位置によってその物性が当然変化するので、解釈の困難性を生んでいる。

今回は、その不均一性を二次元的に表示することによって、その不均一性を視覚的に捉えることが出来、依リ、食感について本試験の限界の解像度(5mm)よりも荒い解像度依りも大きなスケールにおいて、煎餠の物性の空間変動が見聞された。この強度は2倍を超えており、このような変動が煎餠の物性、引いては食感において大きく影響を与えていろ可能性が示唆された。新たに、柔らかめの食品の最たる物として、煎餠より軟らかいパンの測定を行ったところ、1mmの太さの針で、感度を最大にして、針入速度を遅くした場合には、信号が採取できることが分かった。しかしながら、糖類を多く含み粘性の高い検体の場合には、針め上昇時に、検体が付着してしまうことで、自動側定が不可能であった。高速度鋼は、研磨してあり、表面は平滑であったため、こめ解決には、表面検体の固定方法についてさらに検討していく必要が示された。又、S/N比は2-3程度であり、さらに測定条件を詰めていくことも必要である。しかしながら、パンのように軟らかい物に対してそのテクスチャープロファイルが取得できれば、当該測定法の応用がさらに広がる。また、計画書に示されていた、針の太陽試験は高速度鋼0.5mm直径で2mmの長さをシャンクから延ばしても、固焼き煎餠に対して、100回以上の針入に耐えることが分かった、しかしながら、現状では力学測定装置に位置検出機能がないため、サンプル外に至った場合に、針の破損などの問題が生じることが明らかになった。しかしながら、この結果は、更なる高密度な測定が可能であることを示されている。今年度は、これまでに取得したデータの統計的解析法を検討しい近距離に相関が見られるかどうかについて明らかにする方法がいくつか候補としてあげることができた。また、さらなる高精度なデータの取得のため、さらに高精度かつ高感度なロードセルの開発を行った。その結果、1g程度のデータも取得することが出来、これまでよりもさらに細い針を用いてより多数の試験を行い、より高解像度な堅さマップを入手することが出来るようになった。さらに副次的な効果として、パンの堅さの2次元マップの取得の可能性も明らかになり、このパンも、小麦粉のパンだけではなく、米粉パンについてもはかることが出来、まだ多数のサンプルを測定し低無いことからはっきりしたことは言えないものの、実際に違いが出る可能性があることが分かった。食品物性装置の標準化に必要な除法の収集も行った。開発中の食品の分析機械の、国際標準化のためには、まずは、内部精度管理や外部精度管理などの精度管理が必要であると言うことが分かった。また、リファレンスサンプルも必要になっていくことが、調査から明らかになった。食品の化学的な性質、すなわち濃度や状態を調査するためには、これまで特に国際対応が必要な輸出入時の検査などで必要になるため、これまでいくつか行われてきたが、食感などの分析においてはまだそのようなことは考えられておらず、権威ある試験所による測定のデータという方法によってデータを権威付けしていた所であるが、これからはされに加えて、分析法の標準化が必要であることがさらに裏付けられた。今年度は、ブロファイル研究を行うため、これまで取得していなかったクッキーについて、データを取得した。また、柔らかい食品でシグナル強度が弱い場合でも、信号を積算することにより、ノイズが平滑化されてなめらかな曲線が得られることが分かった。
基質特異性の「ゆるい」酢酸菌キノプロテイン脱水素酵素による新しい酸化的物質変換系

酢酸菌は,他の微生物にはあまり見られない酸化的物質変換能を持ち,古くから酢酸発酵やビタミンC生産におけるソルボース発酵などに用いられてきた。これらは,細胞質膜の外側に存在する,ピロロキノリンキノン(PQQ)を補欠分子族とするキノプロテイン,フラビン(FAD)を補欠分子族とするフラボプロテイン,モリブドプテリン(MCD)を補欠分子族とするモリブドプロテイン脱水素酵素による酸化反応である。本研究では,本菌のキノプロテイン脱水素酵素が低い基質特異性(ここでは,以下「ゆるい」と表現)を持つことを利用して,新しい物質酸化系の構築を目的とした。当該年度は,グルコース脱水素酵素(GDH)を用いたラクトースからのラクトビオン酸生産を試みた。グルコースと比べると,GDHはラクトースに対して1%程度の酸化活性しか示さない。そこで,GDHを過剰発現する菌株を作製し,この休止菌体を用いて物質変換反応を行った。ラクトビオン酸生産能の優れた菌株と比べて,約5倍の高速度で行うことができた。100 mMのラクトースから,24時間で65 mMのラクトビオン酸を生産した。また,基質との親和性を表すKM値の測定を試みたところ,測定不可能なほど親和性が低い事がわかった。このように,酵素の高発現によって物質変換速度を上げることで,本来反応性が悪い基質を効率良く利用して物質生産できることを示した。加えて,グルコノバクター属酢酸菌を用いて,形質転換効率を上昇させる試みを行った。酢酸菌で行われていると考えられるDNAのメチル化を,大腸菌の中で再現させることで,その大腸菌から抽出されるDNAが高い形質転換効率を示すと考えた。ゲノム情報を基に,制限酵素遺伝子を近傍に持つメチル化酵素遺伝子を3つ選び検討したところ,一つだけ高い形質転換効率を示すものを見いだした。グルコノバクター属酢酸菌のGDHの基質特異性を再検討し,特に二糖であるラクトースとの反応性を詳細に検討した。結果として,新しい酸化的物質酸化系を提案することができた。それと同時に,親和性が低いことによると考えられる,低い物質変換効率という問題も新しい課題として見えてきた。一方,形質転換の検討については,効率上昇の兆しが見えてきたと評価する。今後,いくつかの検討を重ねることにより,安定な実験系が構築できると期待している。今後の展開も含めて,「概ね順調」と評価した。既知のキノプロテイン脱水素の解析については,GDHの解析を進めるとともに,アルコール脱水素酵素(ADH)の解析も開始する。ADHも高濃度の時にのみグリセロールを酸化することができるといった特徴を持ち,「ゆるい」基質特異性を示す。ADHは結晶構造解析も進めているので,基質結合に直接関わるアミノ酸残基の同定など,より詳細な検討ができると期待している。破壊株の作製については難航しているが,メチル化酵素遺伝子の利用により,改良の兆しが見えてきた。まずは再現性の確認を行い,実験系の安定性を見きわめる。効果を示したメチル化酵素遺伝子を持つプラスミドは,特異性タンパク質をコードする遺伝子も同時に持たせているため,この特異性タンパク質の必要性も検討する。ゲノム解析の進展に伴って,基質が明らかでない脱水素酵素候補遺伝子が多く報告されている。加えて最近,キノプロテイン脱水素酵素の基質特異性が比較的厳しくなく,寛容な(ここでは「ゆるい」と表現)ことがわかってきた。すなわち,基質未知の「オーファン」キノプロテイン脱水素酵素だけでなく,これまでに知られている酵素についても,一つ一つ発現系を作りその基質特性を調べることによって,「ゆるい」基質特異性を活用する新しい酸化反応系を見つけることができる可能性がある。この目的のために,可能な限り脱水素酵素を持たない酢酸菌変異株を構築する。私たちは,耐熱性を示すGluconobacter frateurii CHM43株を,有望な物質生産株と位置づけており,この菌株を基に多重遺伝子欠損株を構築する。ここで構築する変異株を宿主とすることで,発現させるキノプロテインの活性を特異的に検出する。さらに,その反応産物の構造を決定することによって,当該酵素による反応機構を考察する。最終的には,新しい酸化反応を用いる効率の良い酸化的物質変換系を構築する。耐熱性Gluconobacter frateurii CHM43株の,キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素(GLDH)複合体をコードするsldBA遺伝子を破壊した変異株を用いて,GLDHの基質特異性を再検討した。その結果,GLDHがL-リボースを基質とすることを見いだした。また,反応産物の構造を解析することでそれがL-リボン酸であることを明らかにした。sldBA遺伝子に加えて,キノプロテイン・アルコール脱水素酵素(ADH)の脱水素酵素サブユニットとチトクロムサブユニットをコードするadhAB遺伝子を破壊した二重破壊株を宿主として,広宿主域ベクターを用いてsldBA遺伝子の過剰発現を行った。このGLDH高発現株からGLDHを精製し,精製酵素を用いた物質酸化を行った。

多重遺伝子欠損株の構築は,現在,sldBA遺伝子とadhAB遺伝子に加えて,フラボプロテイン・グルコン酸脱水素酵素(GADH)複合体をコードするgndFGH遺伝子の3遺伝子について完成した。ADHに関して詳細な解析を行うために,3つのサブユニットの内,チトクロムサブユニット遺伝子だけを破壊した株を構築した。ADHの小サブユニット遺伝子の破壊プラスミドを構築し,破壊株の構築を試みたが,現在までに完成には至らなかった。同様に,キノプロテイン・グルコース脱水素酵素も破壊用プラスミドの構築は完成したものの,破壊株の取得には至らなかった。以上のように,特定の酵素に関する機能解析は,技術的な面も含めてある程度成果を得ることができたが,多重遺伝子欠損株の構築については難航しているところもある。理由としては技術的な問題を考えている。今後の展開も含めて,「概ね順調」と評価した。酢酸菌は,他の微生物にはあまり見られない酸化的物質変換能を持ち,古くから酢酸発酵やビタミンC生産におけるソルボース発酵などに用いられてきた。これらは,細胞質膜の外側に存在する,ピロロキノリンキノン(PQQ)を補欠分子族とするキノプロテイン,フラビン(FAD)を補欠分子族とするフラボプロテイン,モリブドプテリン(MCD)を補欠分子族とするモリブドプロテイン脱水素酵素による酸化反応である。本研究では,本菌のキノプロテイン脱水素酵素が低い基質特異性(ここでは,以下「ゆるい」と表現)を持つことを利用して,新しい物質酸化系の構築を目的とした。当該年度は,グルコース脱水素酵素(GDH)を用いたラクトースからのラクトビオン酸生産を試みた。グルコースと比べると,GDHはラクトースに対して1%程度の酸化活性しか示さない。そこで,GDHを過剰発現する菌株を作製し,この休止菌体を用いて物質変換反応を行った。ラクトビオン酸生産能の優れた菌株と比べて,約5倍の高速度で行うことができた。100 mMのラクトースから,24時間で65 mMのラクトビオン酸を生産した。また,基質との親和性を表すKM値の測定を試みたところ,測定不可能なほど親和性が低い事がわかった。このように,酵素の高発現によって物質変換速度を上げることで,本来反応性が悪い基質を効率良く利用して物質生産できることを示した。加えて,グルコノバクター属酢酸菌を用いて,形質転換効率を上昇させる試みを行った。酢酸菌で行われていると考えられるDNAのメチル化を,大腸菌の中で再現させることで,その大腸菌から抽出されるDNAが高い形質転換効率を示すと考えた。ゲノム情報を基に,制限酵素遺伝子を近傍に持つメチル化酵素遺伝子を3つ選び検討したところ,一つだけ高い形質転換効率を示すものを見いだした。グルコノバクター属酢酸菌のGDHの基質特異性を再検討し,特に二糖であるラクトースとの反応性を詳細に検討した。結果として,新しい酸化的物質酸化系を提案することができた。それと同時に,親和性が低いことによると考えられる,低い物質変換効率という問題も新しい課題として見えてきた。
粒状供試体の6自由度試験数値シミュレータの関発とその応用

本研究では、申請者が従来提案した粒状要素法を拡張し、粒状供試体モデルの要素試験を行うための静的および動的シミュレータとしてプログラムのコーディングを行った。粒状要素法は静的或は動的平衡条件式を逐次解析により求める方法であり、陽解法である個別要素法に比べて、誤差が蓄積し難い特性を有するものである。本研究ではさらに、開発したシミュレータを用いて、粒状体の塑性流動則ならびに動的単純せん断特性に関する研究を行った。静的シュミレータの応用により、粒状供試体における滑りの統計的表現方法の提案と、それを用いた粒状体の塑性流動則理論の誘導を行った。滑りの統計的分布特性は滑り面の外向き単位法線ベクトルの4個のテンソル積の平均化として定義される滑動接触テンソルで表される。一方、粒状供試体に応力増分を与えたときの粒子間散逸エネルギーのは、統計的考察より、散逸応力テンソルと呼ばれる係数によるひずみ増分テンソルの線形結合式として表現される。なお、散逸応力は滑動接触テンソルを自然な形で含んでいる。散逸エネルギー増分は応力テンソルと塑性ひずみ増分テンソルの複内積としても表現されるので、両者を等値して得られる拘束条件の下で、散逸エネルギー増分を最大化させる条件により、塑性ひずみ増分の方向が決定される。この塑性流動則に基づく塑性ひずみ増分の方向は実際にシミュレーションにより求まったものと極めて良い一致を見ている。つぎに、動的シミュレータの応用により、粒子密度およびせん断速度をパラメトリックに変化させてシミュレーション解析を行った結果,粒子密度によって、粘性流体的挙動および2体衝突流的挙動を示す結果を得た。動的活性度を調べるために、微視的考察からレイノルズ応力を誘導し、密度の低下とともに、レイノルズ応力が飛躍的に増大すること、および、密度が高い場合は境界で観測されるせん断応力に等しくなるという知見を得た。本研究は、粒状材料の微視構造を導入した「粒状供試体の6自由度試験数値シミュレータ」の開発と、これを用いた静的および動的状態にある粒状材料の構成モデルの検討を目的としている。この目的のため、本年度は、まず、研究代表者がこれまで開発した静的コード「粒状要素法」を発展させ,小規模ワーキングステーション上で粒状体一般載荷試験シミュレーションを実施するための静的シュミレータを完成させた。このシミュレータを用いて、球状領域に充填した粒子集合体モデルの多方向載荷試験シミュレーション、および、各載荷方向の一定せん断応力レベルにおける応力プローブ試験シミュレーションを実施し,粒状体の弾塑性応答の考察を行った。その結果、従来の塑性論により説明できる塑性応答とは一般に異なる塑性変形挙動が観察され、従来の塑性論の限界が明らかとなった。このことから、粒状体の一般的構成則は塑性挙動に寄与する多重メカニズムを考慮した増分非線形モデルを導入する必要があることが結論として得られた。一方、動的シミュレータに関しては、静的解析アルゴリズムに慣性項と粘性項を加えた動的解析アルゴリズムの検討を進め、3次元小規模要素に対して動的せん断流れを解析するためのコードを試作し、応用を試みた。境界条件はせん断壁間の距離を一定に保ち、流れに直交する残りの一つの方向の距離を変化させるタイプとせん断壁間の距離を変化させ、残りの一つの方向の距離を一定に保つタイプの2種類のコードを試作した。