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放射性物質によって汚染された幼稚園環境の回復に向けた活動と保護者連携

東京電力福島第一原子力発電所過酷事故は、東日本に放射性物質の汚染をもたらした。被害が深刻な福島・宮城県の保育所・幼稚園のほとんどは放射線感受性の高い乳幼児への影響を考慮して保育活動に多くの制限を加えることとなった。我々は、協力が得られた福島、宮城の18園を訪問し、1保育活動の制限内容、2それを補う工夫、3園と保護者との連携活動、4園の放射線量について調査した。その結果、1屋外保育活動(特に自然物との触れ合い)の量的、質的低下、2それを補うための室内運動遊具(クライミングウォール、サイバーホィール)等の導入、3保護者参加の学習会や除染活動の組織、3基準値超え計測値を示した園の存在、が判明した。放射線に対する感受性の高い乳幼児を保育する保育所・幼稚園は東日本大震災に伴う原子力発電所事故により生じた放射能汚染によって大きな影響を受けている。その影響は放射線による生体への直接的な被曝被害だけではなく保育活動の制限によって「通常の保育」を受ける権利から遠ざけられている点にある。我々は福島県浜通り、中通りにあって調査協力を得た9箇所の保育所・幼稚園を現地調査し、園庭等の空間放射線量の測定、子どもが手を触れることの多い果実や草花等いくつかの植物の放射能測定を行った。また、保育活動の制限事項を聴き取り・記入調査を行った。全ての園で除染活動が実施されていた。その結果、各園に設置されているモニタリングポストが示す空間放射線量で見ると、文部科学省が基準値としている0.23μSv/hを超す園は無かった。しかし実際園敷地内のいくつかの箇所で基準値越えの値が検出された。また年間被曝の基準となる1mSv/hに相当する0.114μSv/hを超す園が5園あり、今後とも活動上の配慮を必要とする汚染水準にあることが判明した。また多くの園活動の一翼を占める畑活動は一切行われて居らず、プランターによる栽培が散見されたのみであった。砂場も使用禁止から、国外から寄贈された砂を使用する例まで見られた。屋外活動には多くの制限が加えられており、中には遠方園を訪問しての野外活動など、保育活動の停滞を克服するための様々な工夫が見られた。なお、飲料水は水道水使用が皆無で、全て市販水を用いている現状であった。保護者とは放射線に関する講演会を開いたり、除染に参加する園もあり、園の汚染状況やその改善を知らせるなど、ともに歩みながら保育活動を行ってきたことが判明した。前年度訪問した福島県内浜通り、中通り12園を再訪問しその後の放射能汚染状況と保育活動について調査した。加えて、浜通り2園、会津3園、宮城県内気仙沼地区1園、仙北2園を訪問し、他園との状況の違いを検討した。福島県内の園では会津の1園と浜通り休園中の1園を除いて園敷地内除染を行っていた。その結果、文科省提示の追加汚染基準値0.23μSv/hを超す園は調査園中休園の1園のみであった。しかし、発ガンが統計学的に有意に増加すると認められる基準値年間1mSv、すなわち0.114μSv/hを上回る園が数園あった。また、園敷地外の隣接地では基準値の数倍で、こうした環境下で保育が行われていることが判明した。その上、園庭や側溝など除染が比較的容易なエリアはともかく、樹木やその周囲、畑などは除染が困難で結果として伐採、畑活動の停止が目立った。結局福島県内調査園では畑活動は全く行われていなかった。部分的にプランター栽培が始まっていたが、その収穫物の喫食についても保護者の承認待ちであった。園児への安全対策としては除染を筆頭に、砂場砂の入替、室内遊具の装備、飲料水の市販水化、頻回の園内清掃など多様であった。しかし中には園庭の土を覆った人工芝、園周囲の裸地をすべてコンクリートで塞ぐなど、土と隔絶した環境下で保育が行われている現状があり、自然との接点を失ったまま成長する子どもたちに対する長期的な支援の必要性が明らかであった。この他保育者集団の疲弊と保育観の弱体化、保護者の分断やそれをつなぎとめる役割を園が果たすことなど多様な分析を行いながら研究を進めている。子どもの活動拠点である幼稚園・保育園において環境の安全は最優先の課題である。東日本大震災で続発した原子力発電所事故で拡散された放射性物質による環境汚染は東北地方の保育を根底から揺るがした。我々は2013年から'15年まで汚染のより深刻な福島県を中心に宮城県内の協力の得られた延べ21の幼保施設について以下の四点を調査した。1.園及び周辺の空間放射線量、土壌、園菜園収穫物、自生野草の放射線量測定。2.放射能汚染によって引き起こされた保育活動制限の実地調査と保育者への聴き取り。3.前項の制限を補いあるいは克服するために工夫された遊具・環境・保育活動の実地調査と保育者への聴き取り。4.最終年度では汚染の初年度にあたる'11年の保育状況と'15年の保育状況の変化をアンケート調査により比較検討。汚染で閉園に追いこまれた園が多数あり、調査対象に出来なかった。空間放射線量は'11年段階で園ごとの把握はできていないが周辺モニタリングポストから類推して文科省の除染基準値0.23μSv/hを超える値であった。

'13年の現地実測値では園内除染を終えていたため基準値を超す園は1園のみであった。しかし敷地の所々に基準値を上回るホットスポットが存在し、繰り返しの除染が必要であった。なお、園周辺環境の除染が進まず'15年に至っても基準値の70倍を超すスポットも検出された。'13年調査全園で園児の安全を考慮して園屋外活動に制限が加えられていた。ま'15年福島県内調査全園で畑活動は行わなれていなかった。土いじり、砂場活動も制限が加えられ、国の内外から贈られた砂、落ち葉などを使い園児と自然の接点を見いだす工夫がなされていた。運動不足を補うため室内にクライミングウォール等の設置も見られた。アンケートの結果では'15年で保育制限が解除されつつあるが、畑活動は回復していない。お泊まり会や散歩も依然制限が残った。東京電力福島第一原子力発電所過酷事故は、東日本に放射性物質の汚染をもたらした。被害が深刻な福島・宮城県の保育所・幼稚園のほとんどは放射線感受性の高い乳幼児への影響を考慮して保育活動に多くの制限を加えることとなった。我々は、協力が得られた福島、宮城の18園を訪問し、1保育活動の制限内容、2それを補う工夫、3園と保護者との連携活動、4園の放射線量について調査した。その結果、1屋外保育活動(特に自然物との触れ合い)の量的、質的低下、2それを補うための室内運動遊具(クライミングウォール、サイバーホィール)等の導入、3保護者参加の学習会や除染活動の組織、3基準値超え計測値を示した園の存在、が判明した。共同研究者が同一大学内で保育の研究者1名、自然環境研究者1名、放射能環境汚染研究者1名、幼稚園長で保育現場を知る研究代表者の計4名である。そのため、それぞれの専門性を発揮して本研究に当たり、定期会合、合同調査隊の派遣を行って精力的に研究を進めてきた。また研究協力者として福島をはじめとする東北各園の園長・教頭集団4名が随時この活動に加わり、臨時雇用学生によるデータ入力など、調査と記録・分析・学会発表が系統性を持って行える状況にある。本年度5件、累積で10件の研究発表が行えたことがその証左と考える。保育学放射線医学各園の果実、シロツメクサ、土壌など多量の測定サンプルがあり、これを高性能の放射線分析装置で測定しているため、時間コストが膨大で研究の進展にはなお長い経過を要する状況にある。これらの実測値とリンクさせながら保育状況の改善等を時系列で解析する予定である。原子力発電所事故という稀有な事象で生じた放射能汚染は乳幼児期保育活動に大きな影を落とした。この体験を科学的に解明記録する我々の研究成果は国内にとどまらず今後世界各国にとっても必要なものであろう。それを国際社会に公開する責務を感じている。今後海外規模で発信する上で研究資金の枯渇を愁いながら進めることとなり追加の出費を補う方策を努力している。調査協力園は放射能汚染環境下で厳しい園経営に明け暮れている。その中での調査協力を戴けた園に感謝すると同時に、この種の調査が園にとって有益なものになれるよう努力をすることが必要である。この点に関しては園収穫物や土壌の測定値の還元など、有用な情報を迅速に提供することが重要であったが、我々の力量不足で迅速な還元に至らなかった。しかし協力戴けた9園の情報は当初の我々の目標を十分達成できる有用なものであった。しかし福島県の広域に拡げて調査できていない難点がある。今後は会津地方も含めた寄り広汎な調査を目指したい。また、この汚染は長期化が避けられず、今後も経年的なフォローアップをしながら調査を続行する所存である。
災害看護支援ネットワークシステムの構築

各都道府県と都道府県看護協会が、災害看護協力協定を締結する要件を明らかにし、災害看護協力協定締結の障害の対応策を検討した。調査の結果、県と看護協会との災害看護協力協定は、全国で3割にも満たず、災害支援ナースを有効活用するための環境作りは、未だ不十分な状態であった。また、効果・効率的な災害看護活動を展開するためには、看護協会と県に加え市町村も協定の対象とすべきであり、看護協会の独自の判断による派遣体制を確立し、派遣先にて看護専門職として活動が展開できる体制づくりも進めるべきであることがわかった。新たに高知県災害看護支援ネットワーク会議を立ち上げ、以下の研究活動を行った。1.効果的な災害支援ナースの養成と活用災害支援ナースを活用するためには、十分な数の災害支援ナースの育成が必要である。県内の災害支援ナースの育成は、高知県災害看護支援ネットワーク会議のメンバーでもある高知県看護協会を中心に、定期的な災害支援ナース養成研修により行い、災害支援ナースの活用の機会を拡大した。2.地方自治体および都道府県看護協会の災害看護協力協定に至らない障害要因調査災害看護協力協定に至らない都道府県看護協会を訪問し、面接調査を実施した。その結果、予想以上に災害看護協力ができている自治体および看護協会と、できていないそれらとがあることが明らかとなり、全国の都道府県と都道府県看護協会を対象とするアンケート調査を実施することになった。その結果、当初予想していたよりも多くの災害看護協力協定が締結されていたこと、協定は締結はされているがあまり具体的な協力体制が築かれていないこと、あるいは地域により災害看護に関する考え方に温度差があること等が明らかとなった。3.災害支援ナースを効果・効率的に派遣するための情報提供と共有システム想定している携帯電話を用いた災害時の情報提供と共有を検討するために、通信業者からの聴き取り調査を実施した。その結果、想定していた情報提供・共有システムの実行可能性が確認された。災害看護協力協定が、都道府県と看護協会の間でなかなか締結されない状況を受け、全都道府県および各地元の看護協会を対象として、災害看護協力協定の締結に関し、以下の調査等を行った。1.都道府県看護協会と都道府県との災害看護協力状況看護協会と都道府県との災害看護協力は、会議の参加や防災計画等での登録にとどまり、具体的な活動における協力関係は、十分に築かれているとは言えないことが分かった。2.都道府県看護協会と都道府県との災害看護協力協定の内容看護協会と都道府県との災害看護協力協定は、全国で3割にも満たず、災害支援ナースを有効活用するための環境作りは、未だ不十分であることが分かった。また、効果・効率的な災害看護活動を展開するためには、看護協会と都道府県に加え市町村も協定の対象とすべきであることが示唆された。更に、看護協会の独自の判断による派遣体制を確立し、派遣先にて看護専門職としての意見を述べたり、それを尊重する等の体制づくりも進めるべきであることが指摘された。3.災害支援ナースを効果・効率的に派遣するための仕組みの検討本仕組みの中でどの様な情報を、災害支援ナースおよび派遣機関等で如何に提供し共有すべきか、以下の点で検討した。(1)独自に災害看護活動を開始する場合の、事前に共有すべき情報の内容と共有方法、(2)活動展開中に必要な情報の発信と共有方法平成22年度末に東日本大震災が発災し、行政および看護界における災害あるいは災害看護に関する考え方が大きく変化したことから、本研究は研究目的を維持しつつ、東日本大震災の災害看護活動を分析し、災害看護協力協定の締結を促進する要因を再度検討するために、全都道府県および各地元の看護協会を対象として、災害における協力状況に関し調査を行った。1.災害に対する協力状況:看護協会と県の間で災害看護協力協定を締結しているところは15ヶ所で、東日本大震災を経験し2ヶ所増加していた。全く協力関係に無いと回答のあったところは県のみの1ヶ所であり、協定には至らないものの、協力関係の構築が進んでいた。2.災害看護協力協定の必要性の認識:災害看護協力協定の必要性の認識は、県より看護協会が1.5倍多いものの、東日本大震災を経験したことにより、県の考える協定の必要性の認識もかなり高くなった。また、あまり必要でないという消極的な回答は、看護協会では全くなく、県は11.8%から3.1%となり、ポジティブな回答と同様に、両者の災害における協力の必要性の認識が高くなった。3.災害看護協力協定を締結していない理由:比較的多くの看護協会が県の防災関係の委員会に参加していることを理由に、協定を結ばなくても災害時に対応できると考えていた。県側の理由としては、医師会との協定締結、あるいはDMATの活動を通し、看護職との協働は十分であると考えていることは、前回の調査と同様であった。
ヒト未分化ＣＤ３４抗原陰性造血幹細胞の特性と分化経路・階層制の解明

我々は、骨髄内直接移植法を開発することにより、ヒト臍帯血中に非常に未分化なCD34抗原陰性造血幹細胞(CD34-HSC)を世界で初めて同定した。最近、このCD34-HSCの高度純化法を開発し、その陽性分子マーカーとしてCD133抗原を同定した。加えて、CD133抗原がCD34+/-HSCの共通の陽性分子マーカーであることも明らかにしている。一連の研究により、CD34-HSCは、従来最も未分化と考えられていたCD34+CD38-HSCに比べてより未分化であることが示唆された。以上より、CD34-HSCが階層制上頂点に位置する最も未分化なヒトHSCであるという新たなモデルを提唱している。また、臍帯血由来CD34-CD133+細胞をDP MSCと共培養し、造血幹細胞(HSC)の増幅を行った。その結果、CD34+CD38-CD90+SRCsをex vivoで産生できることが確認された。未分化HSCにおけるCD34抗原のreversionに関しては、マウスと異なりヒトHSCではin vitro, in vivoにおいて認められなかった。今年度は、われわれが独自に開発した骨髄内直接移植(IBMI)法を用いて、ヒト臍帯血中に世界で初めて同定に成功した非常に未分化な造血幹細胞(HSC)であるCD34抗原陰性(CD34-)SCID-repopulating cell (SRC)(Blood 101:2924,2003)の更なる幹細胞特性の解明を行った。18Lin-CD34+/-分画におけるMPLの発現率は、各々42%、27%であった。CD34-MPL+細胞は、高い巨核球コロニー、赤血球+巨核球混合コロニー形成能を示した。次に、限界希釈法で18Lin-CD34+/-MPL+/-分画におけるSRCの頻度を測定した。その結果、CD34+MPL+分画(1/48)、CD34+MPL-分画(1/146)、CD34-MPL+分画(1/580)、CD34-MPL-分画(1/1597)であった。これらの4分画細胞をNOGマウスにIBMI法で移植し、6か月毎に1,2,3次移植を行って長期ヒト造血再構築能について検討した。その結果、CD34+/-SRC共にMPLを発現していない分画で3次移植マウスの生着が認められた。最終年度は、研究代表者が世界で初めて同定したヒト臍帯血由来CD34-HSCの更なる幹細胞特性の解明を行った。まず、すでに開発済みの18種類のlineage抗体を用いる新たな純化法(Exp Hematol 39:203,2011)を用いて、既知の膜表面抗原分子を網羅的にFACS解析し、CD133抗原がヒト臍帯血由来CD34-HSCの陽性分子マーカーであることを明らかにした(Leukemia 28:1308,2014)。興味あることに、CD133抗原はCD34+/-HSCの共通の陽性分子マーカーであり、すべてのSRC活性はCD133+細胞分画中に認められた。限界希釈実験(LDA)により、18Lin-CD34+/-CD133+細胞中のCD34+/-HSCの頻度は、各々、1/99, 1/142と計算された。また、ヒト骨髄細胞由来Lin-CD45-細胞より、抗CD271及び抗SSEA-4抗体を用いることにより、間葉系幹細胞(MSCs)を予期的に分離することに成功している(特願2013-170480)。中でも、CD271+SSEA-4+細胞に由来するDP MSCsが、高いCD34-SRC支持能を持つことを明らかにしている(Stem Cells 33:1554,2015)。次に、CD34-HSCsとDP MSCsの共培養系において、CD34+HSCの増幅を試みた。しかしながら、HSCの維持は可能であるものの、増幅には至らなかった。医歯薬学昨年度に同定したCD133抗原が、CD34-SRCの陽性分子マーカーであることをin vivo異種間移植実験で証明し、第55回米国血液学会で発表するとともに、Leuekmia誌(2013, in press)に報告した。

また、同時に同定した分子X(特願2014-090292)に関しても解析を進めており、CD133と分子Xを用いることにより、ヒトCD34-HSCを非常に高度(1/10以上の頻度)に濃縮純化できることが明らかになりつつある。並行して、臍帯血由来のCD34-CD133+細胞とDP MSCとの共培養系におけるHSCの体外増幅システムの開発研究も順調に進展している。本年度の研究計画1)ヒト未分化HSCの陽性マーカーの同定と純化については、MPLの発現について詳細に検討した。その結果、ヒト未分化HSC(SRC)のhierarchyは、CD34-MPL->CD34+MPL->CD34+MPL+> CD34-MPL+の順であることが示唆された。以上より、MPLはヒト未分化CD34-HSC(SRC)の陽性マーカーというよりは、機能性マーカーであることが明らかになった(第54回米国血液学会発表、投稿準備中)。並行して、18Lin-CD34-細胞分画における陽性分子マーカーについて網羅的な解析を行い、有望な分子マーカーを2つ(X, Y)同定した。ヒト臍帯血由来CD34+/-SRCは、すべてX+分画に認められ、18Lin-CD34-X+分画におけるCD34-SRCの頻度は約1/140であった。また、18Lin-CD34-X+Y+分画におけるCD34-SRCの頻度は、概算で1/10と推測され、18Lin抗体を用いるnegative selection法(CD34-SRCの頻度1/1000)に比較して、2つの陽性マーカーを用いることにより、約100倍の濃縮純化が可能になった(未発表)。本年度の研究計画2)に関しては、ヒト骨髄より樹立したDP MSCを用いて、ヒト臍帯血由来18Lin-CD34-細胞との共培養系で、CD34+CD38-CD90+SRCが産生されることを明らかにしている。現在、平成25年度以降の研究計画に記載した本共培養系を用いるヒト未分化HSCの対外増幅システムの開発にすでに着手している。これまでの研究でCD34-SRC (HSC)の陽性分子マーカーとして、CD133と分子Xを同定した。この2つの陽性分子マーカーを用いることにより、単一細胞移植系の開発・確立を進め、ヒトHSCの完全純化、階層制の解明に向けて研究を進展させる。ヒトHSCの維持・増幅系の開発には、HSCの増殖・分化の制御機構の解明が不可欠である。CD133と分子Xを用いることにより、SRC活性をもつ1個のHSCの遺伝子発現解析が可能となり、ヒトHSCの維持・増幅に重要な新たな機能分子の同定が可能になるものと期待される。これまでの研究で、CD34-SRCの有望な陽性分子マーカー(X,Y)を同定した。そこで、この2つの陽性分子マーカーを用いて、CD34-SRCを高度に純化(頻度1/10)することが可能になった。そこで、18Lin-CD34-X+Y+分画を用いて、NOGマウスへの単一細胞移植を用いるヒト造血再構築系の開発、確立に取り組む。本系の確立により、1個のCD34-SRC(HSC)の幹細胞特性(自己複製能、多分化能、可塑性など)のさらなる解明やヒト未分化HSCのhierarchyの解明が進展するものと期待される。また、高度に純化したHSC集団を用いるgene chip解析により、HSCの維持・増幅に重要な新たな機能分子の発見・同定も可能になるものと期待される。併せて、研究計画3)4)に記載したヒト未分化HSCにおけるCD34抗原のreversion、CD38抗原のreciprocalな発現、さらに、ヒト骨髄由来DPMSCを用いる共培養系によるヒト未分化HSCの体外増幅系の開発・確立に取り組む予定である。予定していたNOGマウスを用いる移植実験が次年度に繰り越して実施することになったため。NOGマウスを用いる移植実験を含めて予定通りに研究計画を遂行する。
派遣労働・請負労働その他の非典型就業に対する統一的規制のための法的・経済的研究

「労働市場の柔軟化」により就業形態が多様化し、また、労働者の就業意識にも変化がみられる。これに対して、諸外国の法制は、非典型就業が企業・労働者双方のニーズに合致していることから積極的に評価しつつ、常用雇用システムを不当に削減しないように一定の規制を加える方向を志向している。本研究は、ヨーロッパ諸国、欧州連合(EU)、ILO等の非典型就業(パート労働、派遣労働、請負労働、有期雇用等)に関する法制を研究し、日本における非典型就業、とりわけ、有期雇用と派遣労働の特徴を踏まえた統一的な規制の在り方を探っている。この研究により得た知見は、(1)非典型就業形態の拡大の背景には、「伝統的な理由」と「新たな理由」があり、従来の法制は前者を想定していたが、今後は後者に適合した法制が再編成されなければならない、(2)非典型就業が常用雇用システムの脅威となるかという論点に関しては、本研究は、「新たな理由」の一部と「労働者管理企業型」行動様式と定式化されたものが脅威となりうると論証したうえで、法制の課題として、常用雇用システムを優位に評価しつつ、それと非典型就業とが共存する方向を模索している。(3)国際的な法制との比較から、日本の有期雇用、派遣労働法制の特殊性を明らかにし、さらに、諸外国の基本的な動向に即した具体的な提案を行っている。提案の要旨は、(1)非典型就業をテンポラリーワーク型と専門職型に区分し、前者については規制の必要性があるが、後者については当事者の自治に委ねるべきだとした点、(2)テンポラリーワーク型有期雇用の規制の要点は、有期雇用の存続できる期間を更新を含めて3年に制限し、これから労働者が受ける不利益を緩和する措置を講ずるとした点、(3)テンポラリーワーク型派遣(業務限定をしない派遣)の容認とこの存続期間を3年に制限し、かつ、派遣先に補充的に使用者責任を負担させるとした点にある。1.1990年の欧州連合(EU)の「非典型労働に関する指令および指令案」の研究により、以下の点が明らかになった。すなわち、非典型就業が拡大する背景には、世界的規模で行われている「労働の柔軟化」があり、指令案は、派遣労働、有期労働を「テンポラリー労働」として一括し、ほぼ同一の規制を行っている。この政策は基本的にフランスの立場に類似しているが、これに対して、ドイツ、イギリスは派遣労働をテンポラリーワークとしてのみ捉えることに反対している。2.日本では、未だ非典型就業を統一的に理解する試みがなされていない。しかし、今後、テンポラリーワークとしての非典型労働規制の必要が高まると思われる。平成6年度に行った調査によれば、派遣労働においては、請負による労働者投入により労働者派遣が偽装されているという指摘が労働組合からなされている。このことは、請負労働が派遣労働の代替的機能を果たしていることが伺わせる。労働省調査によれば、テンポラリーワークとしての派遣が拡大していることが伺われる。ここから、テンポラリーワークとしての非典型労働が拡大していることが推測できる。現行法では、派遣は専門職派遣として定義され、テンポラリーワークとして制度化されていない。一方、テンポラリーワークとしての派遣と請負との区分はなされていない。また、有機雇用との関連性についても検討されていない。そこで、これらを法的に統一的に規制する必要性があると考える。

平成7年度は、(1)非典型労働には熟練・専門職型と非専門職型の二つの市場があり、不熟練型の非典型労働は主に市場の急激な変化及び需要の多様化に対応するために雇用労働力を円滑に調整する目的で利用されている、(2)非専門職型の派遣労働、請負労働、勇気労働は受入企業にとって相互に代替可能である。(3)この労働市場的分化に対応して、規制コンセプトを立てるべきである、の3点について研究を行った。このために、北海道の派遣元事業全事業所にアンケート調査と6社の聞き取り調査(これには本社に行ったものを含む)、また、労働省『平成6年度就業形態の多様化実態調査速報』、日経連レポート、労働白書及びトヨタ自動車への聞き取り調査等により、上記(1)を実証する。上記(2)については、データの分析に少し時間を要する。(3)については、ヨーロッパにおける有期雇用、派遣労働法制の研究、「標準的労働関係」をめぐるドイツの議論の分析等から、新たな知見として、ヨーロッパにおいては「労働市場の柔軟化」に伴って規制緩和の傾向にあるが、「非典型就業に対する常用雇用システムの優位性」を認め、テンポラリーワークに対して一定の規制を加える方向で統一化が図られつつある。本年度は、こうした動向に応じて日本に法制の課題を提案している。
元首政期ローマにおける「公衆衛生」の成立：その理念と実態

本研究の目的は、古代ローマにおいて、健康が公共の問題として捉えられていたのかを明らかにすることにあった。今年度は、先年度主に進めていた古代ローマの技術書に関する研究を、フロンティヌス『首都ローマの水について』における記述と整合的に解釈することを試みた。具大的には、第一段階として、ウァッロー、コルメッラらによる農事書や、ウィトルウィウスの建築書に確認される「不健康な場所」や飲料水に関する議論が、医学書にみられるそれと対象を同じくしつつも、異なる問題関心を有していたこと、すなわち環境自体の改善を志向したものであることを示した。そして第二段階として、「水について」の「首都の健康性」に関する議論が、かかる既存の技術書と同様に、大気や水の汚染に対して改善というアプローチを志向していたことを明らかにした。同時に、フロンティヌスが私的な農地や建築物ではなく、都市という公共の空間を問題化していること、かつそれを水道監督官の職務が及ぶものであると認識していることを明らかにした。それゆえ、彼は都市の不健全さが都市の公共設備の不適切な管理に由来するものであると主張するが、これもまた、自然環境を不健全さの原因と見做す農事書の記述とは異なる視点であるといえる。また、プリニウスの書簡集や「学説彙纂」内の「健康性」に関する記述を読み解き、上述のフロンティヌスの記述と同様に、都市の大気状態が政治的、法的問題として扱われている事例として示した。以上のことから、古代ローマにおいては、人間の営みによって汚染された大気や水による健康への負の影響を、建築物の配置や水道設備の管理などで抑制しようとする着想が存在していたことが示された。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、古代ローマの農事書における自然観、とくに自然の人間身体に対する影響と、それに対する措置に関する思想を中心に検討した。申請者の研究はローマの水道監督官であったフロンティヌスが用いる「首都の健康性」を対象とするものであるが、本年度の研究はこの概念がローマの文学、とりわけ技術を主題とする文書の中でどのような意味を担わされていたのかを明らかにすることを試みるものであった。論文「古代ローマの農事書における『健康的な場所』」では、主要な三つの農事書における「健康的な場所」について検討を行った。本論文ではとくに、通例古代医学史において言及される健康性に関する「ヒッポクラテス的伝統」と農事書で論じられる記述との間にある差異を描出することを試みた。そして、人間の治療を目指す医学書では自然と身体の因果関係、具体的症状、治療方法が重視されるのに対して、農地経営を論ずる農事書においてはむしろ自然現象そのものへの対処が主に論じられることを明らかにし、古代ローマの知識人たちが「ヒッポクラテス的伝統」とは別の形での自然観を有していたことを示唆した。12月に行われた九州史学会大会における報告「古代ローマの『農業論』における自然観ーVarro, Columella, Palladiusを題材にー」では、健康性」概念が農事書にみられるような自然観のなかでどのように位置づけられているかに着目した。農事書では自然環境に対応する為の知恵、出費、努力などが称揚され、その反対にそれらを怠ることが不作や疾病などの原因とみなされている。かかる文脈に位置づけられることで、健康性は改善の対象であると見なされるのである。上記の研究で示した、医学的テキストにおけるそれとは別の環境認識は、フロンティヌスの言説と整合的であり、『首都ローマの水について』はこうした技術書の伝統の下にあると推定することができる。本年度の研究では、フロンティヌスの思想をローマの思想史の中に明確に位置付けることに成功し、課題の一つであった医学的記述とフロンティヌスの思想の差異を指摘するための重要な研究を行うことができたからである。この結果、これまで医学的テキストやその流れを汲むものとしての技術書を基に行われてきた古代ローマの衛生観に関する研究に対し、そのような流れとは別の思想的潮流の存在を示すことができた。かかる研究は翻って、古代ローマの衛生問題や衛生政策を考察するうえでも意義を持つと考えられる。

また、プリニウスの書簡集や「学説彙纂」内の「健康性」に関する記述を読み解き、上述のフロンティヌスの記述と同様に、都市の大気状態が政治的、法的問題として扱われている事例として示した。以上のことから、古代ローマにおいては、人間の営みによって汚染された大気や水による健康への負の影響を、建築物の配置や水道設備の管理などで抑制しようとする着想が存在していたことが示された。来年度は第67回西洋史学会にて予定している報告「古代ローマの技術書における『健康性』概念」において、本年度行ってきた農事書の記述と他の技術書、とくにフロンティヌス『首都ローマの水について』における「健康性」概念との連続性と差異を確認する。本報告では農事書では私的な問題関心にとどまっていた「健康性」概念が、ウィトルーウィウスやフロンティヌスにおいて都市の統治に関わるものとされていくことを確認しつつ、そうした政治化の過程をテキストのおかれた政治的状況と関連させて論じる。この研究は論文として『西洋史学』に投稿する予定である。また、場所と健康性の関連についてより詳細に検討するために、後1-2世紀の医学思想家たち、とりわけガレノスとサビヌスの思想の分析を行う。後者は医学者の中でも例外的に都市計画について論じた医学者であり、こうした専門的医学についての研究を進めることで、非-医学的な思想の意義をさらに明確にすることを試みる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
地盤・建築構造物連成系の総合制震システム開発に関する実証的研究

本研究では、比較的中規模程度以下の建築構造物において、地震時におけるその動的挙動に大きな影響を及ぼす地盤連成作用に注目し、地盤-基礎-上部構造系の動的相互作用を考慮した制震システムの開発を検討して行くために、まずこの分野の研究の現況把握が重要であると位置づけ、文献資料を中心として収集し、現状の整理と分析を行った。これを参考とし、システムの基本的な構成要素を定量的に明らかにして行くために、各種免震動・制震(振)システムの利点や短所などの特性に対する性能評価を実施するとともに、地盤連成作用の研究を概観し、本研究における制震システムに適用するための手法について調べた。次に、地震動を想定した構造制御システムを構成する上で重要な問題となる地震外乱および構造物応答特性に関する検討を行った。すなわち、地盤および構造物系の動的構造特性などの制御系全体を構成する個々の要素を適切に評価するための同定手法の開発、地震動の上下動入力の影響を適切に評価するための解析モデル・解析手法の開発、ならびに耐力偏心、耐力不足箇所を有する構造物において、免震・制震構造システムの導入による耐震設計・耐震補強を可能とするための検討を行っている。さらに、これらの成果を集約し、地盤・構造物連成系を考慮した建築構造物の動的応答制御システムの開発に対する検討を行っている。すなわち、地盤・構造物の動的連成を考慮した建築構造物モデルについて、制御系の定式化、並びに検証を行い、制震構造システムにおける動的連成問題の取り扱いに対する評価を定量的に示している。また、地盤連成を考慮した建築構造物の制震システムについて、構造物模型を用いた実証的な開発研究を行うために、地盤動特性を組み込むことを可能とする加振装置の設計・開発を行った。これらの研究成果をふまえ、抽出された将来への研究課題を解明して行くために、さらに、継続して強力に研究を推進して行くことが重要と考えている。本研究では、比較的中規模程度以下の建築構造物において地震時の動的挙動に大きな影響を及ぼす地盤連成作用に注目し、地盤-基礎-上部構造系の動的相互作用を考慮した総合制震システムの開発を目的としており、今年度はシステムの基本的な構成要素を定量的に明らかにするための検討を行った。1.制震(振)システムの開発の現況についての資料を収集・分析した。(1)免震構造(2)受動型制震(振)構造(3)能動型制震(振)構造2.地盤連成作用を制震システムに適用するための手法について調べた。(1)理想化された地盤-基礎系に弾性波動論を適用して解析解を求める方法(2)地盤及び基礎の接触部分などを一部離散化して等価な解を求める方法(3)地盤及び基礎をそれぞれ離散化したモデルによって解を求める方法3.地盤動特性を組み込むことを可能とする加振装置の設計について検討を行った。(1)地盤の特性の組み込み-近似的にバネとダッシュポットの並列配置による機構で表実験用地盤モデルの試設計を行った。(2)取り扱いの簡便性-少人数での実験を可能とし、実験回数をより多く実施することにより、研究成果の内容を高め、研究の効率化を目指した。(3)位相差入力-本来(広義の)地盤特性に含まれるべき性格のものであり、上下2重方式振動台として位相差入力を可能とした。4.制震システムを組み込んだ構造物模型を含め、制御システムの全体構成について検討した。(1)構造物模型-1質点系から5質点系程度のモデルの検証が可能、また構造物模型の応答を1方向に制限したり、偏心のある場合を想定した検証を行うことが可能。(2)制御デバイスの検討-アクティブマスダンパ(AMD)、アクティブブレース。(3)制御アルゴリズム-最適レギュレータ、離散型最適制御法。

これらの研究成果をふまえ、抽出された将来への研究課題を解明して行くために、さらに、継続して強力に研究を推進して行くことが重要と考えている。本研究では、地震時における建築構造物の動的挙動に大きな影響を及ぼす地盤連成作用に注目し、地盤-基礎-上部構造系の動的相互作用を考慮した総合制震システムの開発を目的としており、今年度は、総合制震システムの有効性を実証的に検討するために総合制震実験用加振装置を用いた検証を行った。1.各種制震(振)システムの特性・性能についての定量的検証を行った。(1)免震構造(2)受動型制震(振)構造(3)能動型制震(振)構造2.地盤-基礎-上部構造連成系の地震動伝達特性に対する検討を行った。(1)地盤・構造物連成系の入力模擬地震動特性の検討(2)地盤・構造物連成系の動的応答特性の同定に関する検討3.総合制震システムにおける連成系制御アルゴリズムの検証を行った。(1)連成系の制御アルゴリズムの妥当性の数値解析による検証-最適レギュレータ、離散型最適制御法(2)総合制震システムの制震効果に関する数値的・理論的検証4.総合実験用構造物模型・制御装置の設計・製作を行った。(1)地盤・構造物連成系の入力模擬地震動特性の再現性に関する定量的検証(2)地盤・構造物連成系の実験用装置全体の特性に関する定量的検証(3)連成系の制御アルゴリズムに基づく所要制御力を最も効率良く実現可能な装置の仕様の検討-アクティブマスダンパ(AMD)、アクティブブレース地盤・構造物連成系の総合制震システムに対する総合実験を実施した。(1)総合制震システムにおける制御パフォーマンスの評価(2)各種制御デバイス・制御アルゴリズムの特性ならびに性能の定量的評価6.総合実験により得られた知見をもとに本研究の総括を行った。(1)総合制震システムとしてさらに検討すべき点、並びに問題点の明示。(2)追加実験ならびに追加数値シミュレーション解析の実施(3)解析・実験データの整理、ならびに、その妥当性の検討
時間制御型遺伝子発現ベクターの開発

本研究では、生体リズムの分子制御メカニズムを応用し、蛋白あるいは遺伝子をリズミカルに発現できるリズム発振ベクターを作製した。まずプロモーター上流域に時計遺伝子応答配列を含む合成レポーターベクターを作製した。挿入配列は、時計遺伝子の5'上流域に存在する時計遺伝子応答配列を基に設計した。次にルシフェラーゼレポーターベクターをC6細胞ヘトランスフェクトし、36-48時間後にDexamethazone(DEX)刺激により細胞を同調した。同調後、基質であるルシフェリンを添加し、細胞から発せられる化学発光強度を微弱発光検出器で経時的に測定した。その後、ルシフェラーゼレポーターベクターを各時計遺伝子の発現ベクターと共に、C6細胞またはHepG2細胞ヘトランスフェクトし、48時間培養後ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。既存の時計遺伝子のレポーターベクターのリズム発振機能を検討したところ、それぞれのベクターから発せられる化学発光強度には約24時間周期のリズムが認められ、バイオルミネセント法によるリズム機能評価系の妥当性が確認された。次に、時計遺伝子応答配列を含む合成レポーターベクターを作製し、デュアルルシフェラーゼアッセイにより時計遺伝子への反応性について検討した。その結果、転写促進因子による転写活性の上昇と転写抑制因子による転写活性の低下が確認され、さらに、バイオルミネセント法によって各合成ベクターは既存の時計遺伝子と同様のリズム発振機能を有することが明らかになった。本研究では、時計遺伝子応答配列を基に、リズムを発振するベクターの作製に成功した。今後、目的とする遺伝子のリズミカルな発現について更に詳細な機能評価を行うことで、時間薬物送達システムへの応用が期待される。
被修飾タウ分子の病理的視点からの分子構造論:繊維性凝集と環境相互作用を中心に

タウ分子のアミロイド型凝集におけるリン酸化効果を分子レベルで明らかにするため、タウ由来部分ペプチドとリン酸化を含む種々の修飾体の凝集特性と凝集体構造を詳細に研究した。そのために用いる様々な手法(正確な凝集臨界濃度決定法や、X線回折法と計算機シミュレーションの併用)を確立した。その結果として、リン酸基上の電荷やペプチド上での位置、凝集体内での特定の分子内・分子間の相互作用の重要性が明らかになった。本年度は、タウ蛋白由来の部分ペプチドを合成し以下の研究を行った。(1)まず、1つの部分ペプチドを選び、そのリン酸化が、凝集体の安定性、凝集速度、凝集構造などにどのように影響するかを、臨界濃度測定、蛍光法による凝集過程解析、電子顕微鏡法によって検討した。次に、その変化の分子メカニズムがペプチド上の電荷配置に依存することを証明する為に、リン酸化以外の変異体ペプチドを作成し同様の実験を行った。その結果、リン酸化の凝集への効果は、ペプチド分子内及び凝集状態で隣接する分子間の電荷間相互作用によって、少なくとも大半は説明可能であることが明らかとなった。その成果は、論文として公表した。(2)次に、上のリン酸化の効果が、ペプチド上の位置によってどのように影響されるかを検討するため、別の部分ペプチド配列について(1)と同様の解析を進めた。その際に、凝集体の安定性評価を改善するために、新しい臨界濃度の測定手法を検討し、また、凝集体上でのリン酸化部位を同定するために電子顕微鏡観察の手法を拡張する試みを検討した。(3)我々の用いたペプチド種の形成する凝集体の原子レベルでの構造を解明する目的でX線結晶構造解析を計画した。その第一段階として、ある典型的なペプチド種について微結晶作成を進め、部分的に成功した。他方、非結晶状態の凝集産物を対象に、βシート構造に対応するX線回折像を得た。(4)過去に報告されたアミロイドの原子レベルでの構造を骨格として、計算機シミュレーションの手法を用いて、上記(2)の場合に用いたペプチド種の場合に予想される凝集構造を理論的に構築した。21年度は、20年度に作成したタウ蛋白由来の部分ペプチドに加えて、さらに幾つかの変異体ペプチドやこれまでとは異なる部位の部分ペプチドを合成し、以下の研究を行った。(1)20年度の研究結果より、ペプチドのアミロイド凝集がリン酸化によって影響を受けるメカニズムとして、少なくともその一部が静電的なものであると予測された。そこで、ペプチド上の様々な部位にリン酸化とは異なる変異によって電荷を導入し、その結果とリン酸化の結果を比較検討した。また溶液のイオン強度を変えた検討も行った。これらの試みにより、リン酸化がアミロイド凝集を左右する静電的機構が明らかになった。(2)(1)におけるアミロイドの安定化メカニズムを分子構造レベルで議論するために、リン酸化体を含む様々な変異体ペプチドの形成する凝集体の構造を、まずナノスケールでの形態を電子顕微鏡と原子間力顕微鏡で詳細に記述し、続いてより微細な規則構造をX線繊維性回折で解析した。後者については、凝集体繊維を一定方向に配向させる様々な試みを行うことで、繊維軸方向の規則性とそれに垂直な方向のものとを詳しく分離して解析をおこなった。(3)(2)における実験結果を解釈するために、コンピュータ上で作成した様々な分子モデル構造をもとにして、理論的に予測されるX線回折パターンを計算し、それを実験結果と比較した。これによって、リン酸化がどのような原子間の相互作用に影響を与えるかを詳しく議論することが可能となった。例えば、リン酸化が影響を与えるのは、基本繊維内部での原子間の相互作用だけでなく、基本繊維同士の界面でのそれにも寄与することが明らかとなった。この繊維間相互作用は、電子顕微鏡などで観察されたナノスケールでの形態変化を生み出していることも浮き彫りにされた。繰り越しも含めた平成22-23年度は、研究の総括を頭に置きつつ、以下の研究と論文作成を行った。(1) 20-21年度の研究で主な対象としたタウの部分とは異なる部分をターゲットとした合成ペプチドとそのリン酸化体を用いて、リン酸化のタウ分子凝集に対する効果の別の側面を明らかにする解析を行った。それにより、速度過程での影響を顕著にクローズアップするなどの結果を得た。(2) (1)の解析には、これまでの研究で用いた解析法を、異なるペプチドの凝集においても適用できるように拡張した。そのために、まず凝集速度解析法と臨界濃度決定法を、凝集特性が全く異なり扱いにくいペプチドの場合でも、より効率的に行う手順を確立した。そのために、凝集の誘導条件、プレートリーダによる蛍光測定、超遠心法の改善などを行った。(3)また、電子顕微鏡と原子間力顕微鏡で得た凝集体像からサイズ・長さ・螺旋のピッチなどの構造情報を抽出する手段を、自動検出プログラムの作成を含めて構築した。

さらに、X線回折により得たデータを、分子モデリングした凝集体構造から予測した回折像と詳細に比較する手法の確立を進め、顕微鏡法で得た情報とも突き合せて、凝集体構造の分子構造解析の標準的方法とすることを企図した。(4)他方で(2)-(3)で発展させた手法を、20-21年度に扱った第一のペプチド領域の解析にフィードバックし、この研究を完成させて、2件の論文発表を行った。そこでは、凝集を左右する因子として個別の分子間力がどのように寄与するかを提案することができた。(5)部分ペプチドで得た結果を全長タウの場合に拡張する研究手段の一つとして、細胞内で全長タウの凝集を観測する人工タンパク質を作成し、その細胞内発現等に成功した。
構造物へ付着する塩分量の部位別予測と広域的かつ効果的な維持管理への適用

申請者らによる円筒型飛来塩分捕集器のほか,土研式タンク法やドライガーゼ法を用いた飛来塩分計測を行った.いずれの装置も概ね同様に塩分環境を評価することができたので,円筒型飛来塩分捕集器は一定の性能を有することが明らかとなった.さらに,観測値が豊富なドライガーゼ法による捕集塩分量を利用し,大気中塩分濃度を精度よく評価することを目的に,風洞実験によって捕集装置周りの流れの特性を調べた.捕集装置周りの流れ場は接近風速や風向に依存することが明らかとなったので,ドライガーゼ法の塩分捕集効率についても,風況への依存性を考慮することが必要である.一方,領域気象モデルWRFを用いて,任意地点の気象要素・大気中塩分濃度を算出することに成功した.観測を行うことなくこれら情報を獲得することが可能なので,維持管理実務上得るところは大きいと思われる.しかし,WRFは風速を過大評価する傾向にあるので,より細かな起伏を勘案するための流れ場計算をCFDによって行い,その結果,風速の過大評価を改善可能であることを明らかにした.結露で生じた水分が部材表面を流下する際の塩分洗浄効果を,数値計算・実験に基づき検討した.WRFで得られた対象橋梁地点の温湿度や日射量を利用し,桁表面温度と発生水量を算出する一方,室内実験により,ある水量の水滴の流下条件と,流下時の洗浄効果を測定した.この手法により,表面付着塩分量の推定値は明確な減少傾向を示し,かつ付着塩分量の観測値に近づくことが明らかとなった.飛来塩分は,構造物断面周りに形成される流れ場に従って橋梁各部位へ付着することから,適当な付加部材を構造物に設置することで,橋梁断面周りの流れを変化させ,付着塩分量を減らすことが可能かを調べた.結果として,適切な箇所に適切な形状の部材を設けることで,少数の付加部材でも,付着塩分量の低減に大きく寄与することが明らかとなった.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
カエルのオタマジャクシと成体の骨格の解析により骨粗鬆症の病態像を再考する試み

骨組織は脊椎動物の進化の過程で様々な変化を遂げ,種々の形態と機能を獲得してきた。特に,脊椎動物が水中から陸に上がる過程で,骨格は体内のカルシウム貯蔵庫としての機能と重力に抵抗する強靭な支持組織としての機能を獲得したと考えられている。我々はカエルのオタマジャクシと成体の骨格を解析する過程で,生涯水中で生活するカエルと陸上で生活するカエルの骨格の差違が骨粗鬆症の病態に関連している可能性を考えている。今年度は両生類としてアフリカツメガエル,ウシガエル,爬虫類としてミドリガメ,ニホントカゲ,哺乳類であるマウスの骨における骨形成と骨吸収について解析した。その結果、アフリカツメガエルとウシガエルでは骨形成が哺乳類であるマウスに比べて非常に遅く,骨吸収もマウスより不活性であることが明らかとなった。そして,爬虫類であるニホントカゲにおける骨形成と骨吸収の活性はカエルとマウスの中間と考えられた。これらの結果は,カエルにおける骨代謝回転はマウスに比べると非常に遅いことを示唆している。また,これらの結果より,カエルにおいては,マウスのように骨組織はカルシウムの貯蔵庫としての機能を有しておらず,爬虫類になってから骨組織がカルシウムの貯蔵庫として機能することも示唆された。今年度はアフリカツメガエル,ヒキガエル,ウシガエル,アマガエルカエル、トウキョウダルマガエルなどのオタマジャクシと成体の長管骨骨幹端部を形態学的に解析した。その結果、全てのカエルで長管骨骨幹端部の軟骨骨化がほとんど見られないか、軟骨骨化が著明に遅延していることを見い出した。その原因としてHedgehog遺伝子の関与が考えられたので、アフリカツメガエルのBanded hedgheog(ほ乳類のIndian hedgehogの相同遺伝子)の発現をin situ hybiridization法とRT-PCR法で解析した。その結果、この遺伝子は軟骨部で発現している事が確認できた。現在、遺伝し組み換えBanded hedgheogを作成しており、ほ乳類のhedgheogとカエルのhedgheogの機能の差を解析する準備を進めている。また、アフリカツメガエルの軟骨細胞の培養系の確立を検討しており、カエルの軟骨細胞に及すヒトSonic hedgheogの作用を解析する予定である。
糸状菌におけるクエン酸生産関連酵素の遺伝子工学を利用した機能解析

糸状菌Aspergillus niger(クロコウジカビ)において、クエン酸シンターゼとNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼはクエン酸生産に重要な役割を果たす酵素である。本研究では、これらをコードする遺伝子をクローニングして塩基配列を初めて明らかにした。クエン酸シンターゼのcDNAは、l,425bpの塩基対から成り、475アミノ酸から構成される分子量52,000Daのタンパク質をコードしていた。当該cDNAを大腸菌の発現ベクターpKK223-3に連結してクエン酸シンターゼ欠損株(グルタミン酸要求性)に導入して栄養要求性の相補試験を行った。形質転換体が原栄養要求性となることと酵素活性の検出により当該cDNAの機能を確認した。サザンハイブリダイゼーションにより、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子は染色体上に1コピーのみ存在することを明らかにした。染色体遺伝子についても調節領域を含めて塩基配列を決定し、染色体遺伝子では読み取り枠の領域が6つのイントロンで分断されており、調節領域にはTATA配列やCAAT配列がなくCTに富む領域が存在することを明らかにした。一方、NADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼのcDNAは、1,494bpの塩基対から成り498アミノ酸から構成されるタンパク質をコードしていた。当該cDNAを大腸菌の当該酵素欠損変異株に導入して相補試験を行い、形質転換体が原栄養要求性となることと活性の検出により機能を確認した。当該遺伝子は染色体上には1コピーのみ存在し、全領域をカバーする約3kbpの染色体断片について全塩基配列を決定した。cDNAとの比較から、染色体遺伝子では読み取り枠の領域が49241bpの比較的長いものを含めて7つのイントロンにより分断されており、さらに開始コドンとプロモーター領域の間にも1箇所イントロンの挿入が認められた。調節領域にはCAAT配列と類似する構造が2箇所に認められた。糸状菌Aspergillusnigerにおけるクエン酸の大量生産と密接に関係する酵素は、トリカルボン酸回路のクエン酸シンターゼとNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼであることが判明している。しかし、両酵素の性質については不明な点も多く、他生物起源の酵素との相違点は明らかでない。そこで、本申請研究は、遺伝子工学を利用してクエン酸生産関連酵素の性質を明らかにすることを目的とした。本年度は、とくにクエン酸シンターゼ遺伝子に関する研究を進めた。1.クエン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列決定A.nigerにおいて当該酵素は精製されていないため、ゲル濾過や液体クロマトグラフィーにより単一に精製し、N末端アミノ酸配列を決定することを試みた。しかし、酵素が不安定なためか精製途中で活性が消失し、完全精製には至らなかった。そこで、真核生物起源の当該酵素に関して保存されているアミノ酸配列をデータベースをもとに決定し、これに相当するDNAプローブを合成し、cDNAライブラリーと染色体DNAライブラリーから当該酵素の遺伝子をクローン化して塩基配列を決定した。クエン酸シンターゼをコードするcDNAは、1,425bpから成り、当該酵素前駆体は475アミノ酸から構成されるタンパク質と考えられた。ミトコンドリア移行シグナルの存在も確認された。2.クエン酸シンターゼ遺伝子の染色体上における存在状況の確認クローン化した遺伝子の染色体上における存在状況を明確にすることを目的として、パルスフィールド電気泳動とサザンハイブリダイゼーションを組み合わせた解析を行った。コントロール・モジュール(バイオラッド社製)を購入し、CHEF-DR2システムにより解析し、染色体の1箇所に当該遺伝子が局在することを明らかにした。クエン酸生産糸状菌Aspergillus

niger(クロコウジカビ)について、クエン酸生産関連酵素をコードする遺伝子に関する研究を進めている。本年度はNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をクローニングして、遺伝子構造を明らかにした。最初に、A.nigerのNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼの精製を試みたが、N末端アミノ酸配列の決定は困難であった。そこで、他起源の生物で決定されている当該酵素遺伝子の共通配列(保存領域)を調べ、相当するDNAプローブを合成して、cDNAライブラリーから陽性のクローンを取得した。陽性クローンが保持するcDNAを大腸菌の当該酵素欠損変異株(グルタミン酸要求性)DEK2004株に導入して栄養要求性の相補試験を行い、形質転換体が原栄養要求性となることを確認した。また、当該形質転換体をM9最少培地にして生育させた場合にNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性が検出された。以上より、取得したcDNAがNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしていることを確認した。当該cDNAは、1494bpの塩基対より成り498アミノ酸から成るタンパク質をコードしており、アミノ酸レベルでは酵母のNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼと72.6%、ラット、ブタ心臓、ダイズのものと68.066.0%の相同性が認められた。さらに、取得したcDNAをプローブとして染色体DNAライブラリーから約7kbpの染色体断片を取得し、その中に含まれるNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする領域約3kbpの全塩基配列を決定した。構造遺伝子中には49241bpから成るイントロン7個が存在し、開始コドンより上流485bpおよび592bpにはCAAT配列、450bpにはTATA配列と類似する配列が存在した。糸状菌Aspergillus niger(クロコウジカビ)において、クエン酸シンターゼとNADP-イソクエン酸デヒドロゲナーゼはクエン酸生産に重要な役割を果たす酵素である。本研究では、これらをコードする遺伝子をクローニングして塩基配列を初めて明らかにした。クエン酸シンターゼのcDNAは、1,425bpの塩基対から成り、475アミノ酸から構成される分子量52,000Daのタンパク質をコードしていた。当該cDNAを大腸菌の発現ベクターpKK223-3に連結してクエン酸シンターゼ欠損株(グルタミン酸要求性)に導入して栄養要求性の相補試験を行った。形質転換体が原栄養要求性となることと酵素活性の検出により当該cDNAの機能を確認した。サザンハイブリダイゼーションにより、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子は染色体上に1コピーのみ存在することを明らかにした。染色体遺伝子についても調節領域を含めて塩基配列を決定し、染色体遺伝子では読み取り枠の領域が6つのイントロンで分断されており、調節領域にはTATA配列やCAAT配列がなくCTに富む領域が存在することを明らかにした。