hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
咀嚼筋機能異常における低反応レベルレーザー照射の影響

そこで、来年度から硬組織に対する影響を研究し、今後に繋げて行きたいと考えている。昨年度、レーザーによるLLLTが実際の診療でどの様な効果をあげられているかの検証を行い、これまで出されたLLLTの疼痛抑制効果についての報告と同様の結果が得られた.また、周囲組織へのLLLTの影響を考慮しなければならないことも判明し、本年は硬組織へのレーザー照射(CO2)の影響を観察してきた。XY軸エナメル質への照射出力差による影響は焦点距離4ミリでCW、SP1、SP2を0.5W、1W、1.5W、2Wでの盛り上がり量、蒸散した穴の直径と深さ、白濁したエリアの直径を求めた。X軸は、0.5Wではエナメル質の蒸散はなく白濁したエリア(100μm以下)のみ観察されたが、他は盛り上がりと蒸散が認められた。これに対しY軸では、0.5WであってもCW以外ではわずかな蒸散が認められた。XY軸象牙質への照射出力差による影響は、X軸で0.5WであってもCW以外でははっきりとした蒸散が認められた。この結果はY軸でも同様であったが、エナメル質と象牙質では蒸散されずに残存した歯質に違いが見られた。これは、エナメル質と象牙質の組成や構造の違いだけでなく、吸収線量の違いがあるのようにも考えられる。次に照射距離の違いによる象牙質への影響はCW、2Wで011ミリの範囲で観察した。蒸散深さは照射距離4ミリ、穴の直径は照射距離7ミリ、炭化部位の直径は照射距離11ミリが最大であった。しかし、蒸散深さと穴の直径は最大となる照射距離を中心に前後は減少しているが、炭化部位の直径は照射距離5ミリを最低とし、前後で増大していた。これらのことから照射条件により歯牙組織に与える影響には差が大きく、照射出力や距離や組織によって変わることが明らかとなった。今後さらに詳しい検討を行い、LLLTの条件設定を行いたい。
自然発生アポE欠損高脂血症マウス系統の樹立と新しい脂質代謝異常遺伝子の探索

日本産野生マウスの近交系化の途上で自然発生のアポE欠損高脂血症(SHL)マウスが発見された。アポE欠損マウスとしてはすでにノックアウトマウスが報告されているが,両マウスを詳細に比較した結果,遺伝子型はいずれもアポE欠損で共通しているにもかかわらず表現型としての血清総コレステロール(TC),皮膚黄色腫の程度,粥状動脈硬化の部位および寿命などが大きく異なっており,SHLマウスは普通食飼育下においてもTCは1,000mg/dlを超え,4週齢時から皮膚黄色腫が認められ,動脈硬化は大動脈弁基部に限局していた。これらのことからアポE以外の脂質代謝に関連した未知の遺伝子が日本産野生マウスのゲノム中に存在することが示唆された。SHLマウスの近交系化はヘテロ雌とホモ雄との交配によって行っており,F11に至った。また本変異遺伝子の遺伝的背景による脂質代謝の系統差を検討するために,SHLの変異遺伝子を動脈硬化の感受性の異なるC57BL/6,BALB/c,C3H/HeおよびSL/Niの4系統マウスに導入したコンジェニック系を作成中であり,SHLマウスとともに高脂血症の新しいモデルマウスのセットとして完成が待たれる。ヒトアポE遺伝子の同位体は一般にE2E3,E4が認められ,E2は高脂血症と関係し,E4はアルツハイマー病の危険因子として注目されているが,本研究に置いてマウスアポEに多型が発見された。すなわち等電点電気泳動とイムノブロットによって検出されるマウスアポEはC57BL/6,BALB/cおよびC3H/HeとSL/Niとでは等電点が異なることがわかった。仮にC57BL/6,BALB/cなどをE1,SL/NiをE2と命名した。またSHLの発生した日本産野生マウスのKor系はE1であり,これらの変異はアポE遺伝子のアミノ酸の点突然変異による荷電の差によって検出されたものと産出された。これらの系統差は本変異遺伝子および脂質代謝に関連した未知の遺伝子を検索する手掛かりとなる可能性が示唆された。日本産野生マウスの近交系化の途上で高脂血症マウスを発見した。血清総コレステロール値は生下時に1,800mg/dlを示した。また電気泳動によるリポタンパク像ではVLDLの増加,HDLの減少および正常マウスには認められないIDLが発現していた。さらにアポE抗体を用いたウエスタンブロットおよびアポEのcDNAをプローブにもちいたノンザンブロットなどの結果から本突然変異マウスの高脂血症の原因は,アポE遺伝子の完全欠損であることを明らかにした。これまでにアポE欠損マウスは,ジーンターゲッティングにより作成されたノックアウトマウスが報告されている,しかし本自然発生アポE欠損高脂血症マウスと比較した結果、血清総コレステロール値,トリグリセライド値,黄色腫の進展などいずれもノックアウトマウスのほうが軽度であり,アポE欠損のみでは本高脂血症の説明の付かないことがわかった。また,本高脂血症遺伝子をラボラトリ-マウスに導入したコンジェニックマウスを作出中であるが,その過程においても日本産野生マウスに,脂質代謝に関連した新しい遺伝的原因の存在が示唆された。これまでに自然発症の高脂血症マウスの報告は国内外にもなく,モデル動物として確立するために遺伝育種学的検索を行った。その結果,本高脂血症は常染色体性の劣性遺伝によって遺伝し,劣性ホモ個体の雌雄に発症することを明らかにした。外見的には腹部,前肢部,眼瞼周囲において黄色腫の進展が著しく,雌では乳頭部の肥厚が認められ,保育性が悪かった。そこで,継代維持方法を検討した結果,正常ヘテロ雌と異常ホモ雌との交配によって,安定した継代と実験用個体の供給が行えることがわかった。現在F7代に至っている。

すなわち等電点電気泳動とイムノブロットによって検出されるマウスアポEはC57BL/6,BALB/cおよびC3H/HeとSL/Niとでは等電点が異なることがわかった。仮にC57BL/6,BALB/cなどをE1,SL/NiをE2と命名した。またSHLの発生した日本産野生マウスのKor系はE1であり,これらの変異はアポE遺伝子のアミノ酸の点突然変異による荷電の差によって検出されたものと産出された。これらの系統差は本変異遺伝子および脂質代謝に関連した未知の遺伝子を検索する手掛かりとなる可能性が示唆された。
石英の格子欠陥及び結晶化度を物質移動指標として用いるための物理的基礎の確立

石英の格子欠陥等の物性物理学的な特性を電子スピン共鳴、熱ルミネッセンス測定によって定量化し、それを地球表層における物質移動の指標として用いることを試みた。測定手法を確立した後、日本列島への大気降下物、木津川現河床堆積物、黒部川現河床堆積物に応用した。大気降下物の年変動については、黄砂との相関がみられる地域と見られない地域が見出された。河川堆積物については流下する地域の地質との相関がみられた。これまでの研究で、最もよく用いられ、有効な指標と考えられる石英のE1'中心(酸素空孔の不対電子)のESR(電子スピン共鳴)信号測定の定量測定の精度向上のため、信号強度に与える要因について研究を進めた。石英が純化されないために試料に粘土鉱物が混入した場合、E1'中心の信号強度が過少評価されることがわり、石英をできるだけ純化することが重要であることがわかった。この原因は、鉱物に含まれるOH結合によるマイクロ波の吸収によって信号強度のマイクロ波強度依存性が変化するのみではないことが実験によって判明した。付近の磁性鉱物からの受ける磁場の影響について検討が必要である。木津川流域の堆積物試料については、支流の室生川について15試料を集中して分析した。その結果、E1'中心から求められる酸素空孔量、アルミニウム中心、チタン中心、ゲルマニウム中心についてそれぞれ10%のばらつきがあることがわかった。一方、他の支流については、このばらつきを越えた変動が観測されることから、これらの複数の信号を指標として用いることによって支流の堆積物を特徴化できる可能性があることがわかった。黒部川の現河床堆積物について熱ルミネッセンス分光測定を行った。100°Cから250°Cまでの低温の400550nmの青色発光、同じく低温の600750nmの赤色発光、250°Cから380°Cの範囲の高温の赤色発光の3つの主要な成分が見られた。現在5点の測定と数が少なく予備的な結果であるが、上流から下流にかけて高温赤色に対する低温青色の発光の比が小さくなっていくことが見いだされた。堆積物の運搬を明らかにする理化学的な手法の開発は、過去の気候変動や物質循環を再現において、大きな手がかりを与える強力な手法となることが期待できる。堆積物の主要な成分である石英中の電子スピン共鳴信号及びルミネッセンス特性が、これまでの指標とは異なった特性の起源地の情報を持っていることを示し、風送塵や河川堆積物の運搬の有効な指標として確立することを目的とする。風送塵については、最近50年間の福岡と米子の降下物に含まれる石英の酸素空孔量が黄砂の観測日日数と相関する一方で、秋田ではそのような傾向がなく、徐々に減少していることが明らかになった。一方、河川堆積物については木津川と黒部川について石英の電子スピン共鳴信号及びルミネッセンス特性を調べた。木津川については、支流との合流を2か所経て、ESR信号が変化することがわかった。流下する地域の地質との相関が示唆される一方で、それをはっきり証明できるには信号強度のばらつきが大きかった。しかし、2か所の合流地点の1か所については、堆積物の混合割合求められ、複数の指標を用いてほぼ一致した結果が得られた。粒径ごとに混合割合が異なることが明らかにできるという新しい知見を得ることができた。黒部川の河川堆積物について黒部川の現河床堆積物について熱ルミネッセンス分光測定を行った。100°Cから250°Cまでの低温の400550nmの青色発光、同じく低温の600750nmの赤色発光、250°Cから380°Cの範囲の高温の赤色発光の3つの主要な成分が見られ、上流から下流にかけて高温赤色に対する低温青色の発光の比が小さくなっていくことが見いだされた。また、2012年と2013年に採取した堆積物について大きく信号強度が異なり、年変動があることが明らかになった。地球表層における堆積物の運搬は、大気循環、河川の消長といった気候変動と直接関係するだけでなく、地域のテクトニクスやそれと関連した河川争奪など、地球科学のさまざまな現象を反映していている。本研究では、石英中の電子スピン共鳴信号、結晶化度、ルミネッセンス特性といった物理特性が、これまでの指標とは異なった特性の、起源地の情報を持っていることを示し、風送塵や河川堆積物の運搬の有効な指標として確立することを目的とする。本年度は、これまでに予備的な結果の得られている奈良県の木津川について、支流を含めて15か所において試料採取を行い、石英を抽出し、これらの試料中の石英にみられるESR信号の特性について検討を行った。ガンマ線照射を行ったところ、石英中には、不純物として含まれるアルミニウム、ゲルマニウム、チタンに関連した信号、また酸素空孔に関連したE1'中心の信号が観測された。

不純物中心についてガンマ線照射による線量応答曲線が得られたが、その飽和値と、飽和曲線の原点付近に直線を当てはめたその傾きとの間によい相関があることがわかり、4kGy程度照射した飽和値を取ることで簡便に特徴化ができることがわかった。それを用いて木津川全体について解析を試みたが、局所的にはそれぞれの各信号間に相関はみられるものの、全体として端成分が得られてその混合ですべてが説明できるという単純なモデルが適用できるものではないことがわかった。支流からの別の堆積物の混合がどのように記述できるのか、といった基礎過程の検討に戻る必要があると考えられるが、それには現時点では試料数が不足していると判断される。木津川及び黒部川の堆積物を採取し、石英について電子スピン共鳴及び熱ルミネッセンス発光特性を調べ、起源地との関連について研究を進めた。木津川については合流点における信号強度の変化についてESR信号の変化を調べた。合流後の堆積物に見られる信号強度が合流前2つの川の堆積物の信号強度の間にほぼ入ることはわかったものの、そのようにならない例もあり、近年の河川の工事による土砂の搬入にその原因があることが考えられ、こうした研究の限界が示された。黒部川については、中流域から下流にかけてのデータをほぼそろえることができた。電子スピン共鳴信号、熱ルミネッセンスの発光色ー発光温度特性の流路にわたっての変化が、流路の地質と関連して、流入堆積物によって影響される様子を解明することができた。また、下流域の堆積物については青色発光に特徴的に見られるように年変化があり、これが特定の地域からの堆積物の移動によって説明することができることがわかった。地球環境科学現在までに、木津川の流域の堆積物について、ESR信号を用いて支流を区別できる可能性が示されたほか、熱ルミネッセンスの分光測定が同様の目的のために有効である可能性が示された。本研究においては、試料採取、分析に使用する鉱物の抽出、ガンマ線照射、ESR及び熱ルミネッセンス測定というサイクルを繰り返していくことになるが、分析に使用する鉱物の抽出に当初の想定より時間がかかることが判明し、分析の遅れの原因となった。このために、次いで、次のサイクルの試料採取が気候上の理由のために遅れ、さらに次の解析が遅れを招いている。分析に使用する鉱物の抽出に当初の想定より時間がかかり、試料採取から分析までのサイクルが遅れた。木津川の堆積物については、ばらつきが大きく、解析を慎重に時間をかけて行ったこともあり、昨年度、このサイクルを2回行う予定が1回しかできなかった。黒部川については、年によって堆積物が変化するという新しい知見が得られた一方で、流域全体の傾向を見るための測定点数が不足することになり、この観点からの考察ができなくなった。木津川の堆積物について調べた結果、以前の結果と異なった部分があること、また、単純に端成分が得られて、その混合で堆積物が説明できるという単純な図式が当てはまらないことが判明した。木津川流域については5月末及び10月に、黒部川流域については8月にそれぞれ試料採取を予定している。現在までに得られたデータを精査し、目的を絞り込むことで、当初目指した流域全体の堆積物の起源地を明らかにすることまではできなくとも、より狭い流域で堆積物の供給割合の定量化といった一定の結論が得られるように研究を進める。本研究は、試料採取、分析に使用する鉱物の抽出、ガンマ線照射、ESR測定及び熱ルミネッセンス測定というサイクルを繰り返すことによって行われる。
山岳地の野営行為が植生の損失と裸地の拡大に及ばす影響

山岳地の野営行為が植生の損失と裸地の拡大に及ばす影響を明らかにするために、大雪山国立公園内のヒサゴ沼キャンプ場において、利用状況(テントの設置位置)、植生(被度、出現種)、土壌(硬度、含水比、仮比重、三相分布、孔隙率、有機物含有量)の調査を行った。同じサイト内でもテントが常に設置される場所と、まれにテントが設置される場所、テントが設置されない場所があり、野営行為によるインパクトの量が異なることが推察された。テント設置位置から利用量により調査区を3段階(なし、小、大)に分類し、比較を行った結果、インパクトの程度に違いがみられた。植生に関しては利用量の大きい調査区では、被度が小さく、出現種が少ないことが示された。土壌に関しては、利用量の大きい調査区では硬度(支持強度)は大きく、含水比は低く、仮比重(容積比重)が大きくなることが示された。さらに、利用量の小さい調査区においても利用量の大きい調査区と同程度に気相が減少していることが示された。孔隙率も利用量の大小にかかわらず、利用が行われている調査区では低く、僅かな利用でさえも土壌の固結は生じることが示された。本研究の結果から、野営行為は僅かな利用でさえも土壌や植生に影響を及ぼしていることが明らかになり、柵の設置等により利用を集中させた方が現段階ではインパクトの軽減につながると予想された。今後の定期的に、利用による植生、土壌への影響についてモニタリングを行っていく必要があると考えられる。
シームレスイメージング解析により捉えた運動学習時の皮質運動野の動的神経回路の本質

脳が多様な機能を実現するには、その構造基盤としての“標準回路"のみならず、様々な学習によって可塑的に変化する“動的回路"が重要である。本研究では、電子顕微鏡による大規模電顕画像3次元再構築処理法と光学顕微鏡観察法を相関させ、マウスの運動学習に伴う大脳皮質第一次運動野の神経回路のダイナミックな変化を解析する。運動学習に伴い形成される新規のシナプス入力の由来が大脳皮質錐体細胞であるか視床の神経細胞であるかを明らかにし、それぞれが運動学習時にもたらす機能を推論する。この生体から超微細構造への“シームレスイメージング"により、運動学習を可能とする神経回路のリモデリングメカニズムを明らかにする。
癌細胞による細胞外マトリックスリモデリング受容機構の構造的基盤

細胞外マトリックスのリモデリングは癌細胞の遊走・浸潤を助長し、癌の進行に寄与する。本研究では、細胞外マトリックスのリモデリングを、癌細胞が膜レセプターCD44を介して分子認識し、細胞膜の微細構造変化による制御を受けることを明らかにした。本研究により、癌細胞による細胞外マトリックスリモデリング受容の基盤となる膜構造が明らかになった。癌細胞は、腫瘍組織に形成される細胞外マトリックスとの相互作用を通して、浸潤能を獲得し、転移する。研究代表者は、これまでに、癌細胞の細胞膜近傍における細胞外マトリックスのリモデリングが、癌細胞の浸潤・転移能において重要な役割を担っていることを見出した。特に、細胞外マトリックスの主要構成分子であるヒアルロン酸が、分解酵素の作用を受けて低分子化することが鍵であり、このようにして生じた低分子量ヒアルロン酸が、癌浸潤促進作用を有することをみいだした。本研究は、細胞外マトリックスのリモデリングを、癌細胞が膜レセプターを介して分子認識し、そして、細胞内へとシグナルを伝達する機構の解明をおこなうことを目的とする。タンパク質構造解析手法と、細胞イメージングを総合的に適用することにより、その構造的基盤を明らかにする。本研究により、細胞膜を介した接着シグナル伝達機構解明の道を拓くことを目指す。平成21年度は、上記目的のため、独自知見に基づいて、次の事柄をおこなった。癌細胞に発現する細胞外マトリックスレセプターについて、タンパク質精製をおこない、構造解析に供した。また、細胞外マトリックスの主要構成分子であるヒアルロン酸について、原子間力顕微鏡(Atomic Force Microscopy)観察により、濃度と分子量により構造を変化させることを見出した。さらに、そのレセプターであるCD44と会合する様を捉えることができた。がん細胞は、腫瘍組織に形成される細胞外マトリックスとの相互作用を通して、浸潤能を獲得し、転移する。本研究は、細胞外マトリックスのリモデリングを、がん細胞が膜レセプターを介して分子認識し、そして、細胞膜を介して細胞の内へとシグナルを伝達する機構の解明をおこなうことを目的とする。平成22年度においては、細胞膜におけるレセプター動態に焦点を当て、これまでの独自知見に基づいて次の研究をおこなった。がん細胞に発現し、浸潤・転移に関与する細胞外マトリックスレセプターCD44が、膜ミクロドメイン(脂質ラフト)に局在し、コレステロールの除去による生体膜の微細構造変化が、膜におけるCD44の局在と機能を変化させることを明らかにした。さらに、スタチン系コレステロール合成阻害薬が同様の効果を示し、細胞外マトリックスのリモデリングによるがん細胞の浸潤性亢進を抑制することを見出した。また、培養がん細胞に対して、膜レセプターCD44に対するプローブの投与をおこない、大気圧走査型電子顕微鏡(atmosphericscanningelectronmicroscope)による水溶液中での高分解能電子顕微鏡イメージングにより、膜レセプターの分布解析をおこなった。本結果から、がん細胞による細胞外マトリックスリモデリング受容の基盤となる膜構造が明らかになった。これは、がん浸潤・転移の分子機構の解明を通じて、その予防・治療法の開発に寄与するものである。がん細胞は、腫瘍細胞外マトリックスとの相互作用を通して浸潤能を獲得し、転移する。本研究は、細胞外マトリックスのリモデリングを、がん細胞が膜レセプターを介して分子認識し、そして、細胞膜を介して細胞の内へとシグナルを伝達する機構の解明をおこなうことを目的とした。細胞外マトリックスレセプターCD44は、がん細胞に発現し、浸潤・転移に密接に関与する。これまでに、CD44が膜ミクロドメイン(脂質ラフト)に局在し、コレステロールの除去による生体膜の微細構造変化が、膜におけるCD44の局在と機能を変化させることを明らかにした。平成23年度においては、様々な培養がん細胞について解析を進め、細胞膜微細構造が、浸潤に関わる細胞外マトリックスレセプターの機能と細胞動態を制御することを見出した。また、培養がん細胞に対して、膜レセプターCD44に対するプローブの投与をおこない、大気圧走査型電子顕微鏡(atmosphericscanningelectronmicroscope)による水溶液中での高分解能電子顕微鏡イメージングにより、膜レセプターの分布解析を進めた。本研究により、がん細胞による細胞外マトリックスリモデリング受容の基盤となる膜構造が明らかになった。
小児がんに対する新規細胞療法の開発:樹状細胞と好中球TRAILの利用

本研究では、樹状細胞または好中球によるがん免疫療法・細胞療法の可能性を検討し、難治性小児悪性腫瘍に対する新たな治療法を開発することを目的とした。1.樹状細胞療法樹状細胞(DC)療法を実施した症例のうち1例は長期間寛解を維持、2例では一時的に腫瘍の増大が抑制された。抗腫瘍効果の見られた例ではDC投与後に末梢血中のCD8陽性HLA-DR陽性T細胞数、IFN-γ産生性CD8陽性T細胞数の増加が見られた。試験管内における検討でも、腫瘍特異的ペプチドをパルスしたDCによって感作されたT細胞は腫瘍細胞を特異的に破壊した。DCの機能解析の一環として、免疫賦活能に差がある成人末梢血DCと臍帯血DCにおける遺伝子発現をマイクロアレイにより検討したところ、免疫寛容誘導に関与すると報告されているカルグラニュリンが臍帯血DCで高発現している、細胞周期関連遺伝子の発現が臍帯血DCで高い、Th1関連サイトカイン(IL-12B、IL-15、IL-18)の発現が成人末梢血DCで高い、両DCともに成熟とともに炎症性サイトカインの発現が増加する、などが明らかとなった。2.好中球TRAILによる抗腫瘍療法好中球をIFN-γで刺激することによりTRAILの発現が増強し、好中球の表面にTRAIL分子が発現されるとともに、培養液中へ可溶性TRAILが分泌された。TRAIL発現好中球は、白血病細胞株のJurkat細胞にアポトーシスを誘導し、この作用は抗TRAIL抗体により部分的に抑制された。即ち、好中球が従来知られた機序とは異なるメカニズムで抗腫瘍効果を持つことが明らかとなった。IFNは種々の癌腫に対する治療薬として臨床応用されてきたが、IFNの抗腫瘍効果はIFNの直接作用に加え好中球TRAILを介した作用である可能性が示唆され、IFNと好中球の組み合わせによる新たな抗腫瘍療法の開発が期待される。本研究では、樹状細胞または好中球によるがん免疫療法・細胞療法の可能性を検討し、従来の化学・放射線療法に抵抗性となった難治性小児悪性腫瘍に対する新たな治療法を開発することを目的とした。1.樹状細胞療法樹状細胞(DC)療法実施5例中、1例は42か月間寛解を維持、2例では一時的に腫瘍の増大が抑制された。4例においてDC投与後における末梢血中のCD8陽性HLA-DR陽性T細胞数、IFN-γ産生性CD8陽性T細胞数を測定したところ、抗腫瘍効果の見られた2例において両者の増加が見られ、腫瘍細胞に対する細胞傷害性T細胞が誘導されたことが示唆された。さらに、1例では合成ペプチドをパルスしたDCをIL-2存在下に患者末梢血Tリンパ球と共培養した後、患者由来の腫瘍細胞(対照)をターゲットとして細胞傷害性の有無を検討したところ、腫瘍特異的ペプチドをパルスしたDCによって感作されたT細胞は腫瘍細胞を特異的に破壊した。また、抗腫瘍効果のみられた3例では、DC投与後に末梢血中のNK細胞活性の上昇を認め、NK細胞による非特異的抗腫瘍活性がDC療法における抗腫瘍効果の一部に関与する可能性が示唆された。

2.好中球TRAILによる抗腫瘍療法好中球をインターフェロン-γ(IFN-γ)で刺激することによりTRAILの発現が増強し、好中球の表面にTRAIL分子が発現されるとともに、培養液中へ可溶性TRAILが分泌された。また、TRAIL発現好中球は、TRAILに対して感受性を持つことが知られている白血病細胞株のJurkat細胞にアポトーシスを誘導し、この作用は抗TRAIL抗体により部分的に抑制された。即ち、好中球が従来知られた機序とは異なるメカニズムで抗腫瘍効果を持つことが明らかとなった。以上より、樹状細胞および好中球TRAILの利用により、従来の化学・放射線療法とは異なる機序による抗腫瘍療法の実施が可能となる。1.樹状細胞療法悪性腫瘍に対する樹状細胞(DC)療法では、DC上に充分量の腫瘍特異抗原を提示させ、効率よく細胞障害性T細胞を誘導することが重要である。DCの機能解析の一環として、免疫賦活能に差がある成人末梢血DCと臍帯血DCにおける遺伝子発現をマイクロアレイにより検討した。その結果、免疫寛容誘導に関与すると報告されているカルグラニュリンが臍帯血DCで高発現している、細胞周期関連遺伝子の発現が臍帯血DCで高い、Th1関連サイトカイン(IL-12B、IL-15、IL-18)の発現が成人末梢血DCで高い、両DCともに成熟とともに炎症性サイトカインの発現が増加する、などが明らかとなった。臍帯血DCは成人末梢血DCに比べ免疫誘導能が低いと考えられるため、担がん患者に投与するDC調整時に、成人末梢血DCにおいて発現の高かった遺伝子群の発現をさらに増強する操作を加える、または臍帯血DCで発現の高かった遺伝子を抑制するなどの操作を行うことによって、より有効なDC療法が実施できるものと期待される。2.好中球TRAILによる抗腫瘍療法好中球TRAILによる抗腫瘍効果を増強させるために、種々のサイトカイン刺激によるTRAIL発現を検討した。好中球TRAILの発現はIFN-α刺激で4倍から10倍、IFN-γ刺激で2倍から4倍に増加した。一方、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、TGF-β刺激では増加しなかった。IFNの刺激により好中球表面に膜結合型TRAIL(45kD)が発現するとともに培養液中へも大量の可溶性TRAIL(24kD)が分泌された。これまでIFNは種々の癌腫に対する治療薬として臨床応用されてきたが、今回の結果によりIFNの抗腫瘍効果はIFNの直接作用に加え、好中球TRAILを介した作用であることが示唆され、IFNと好中球の組み合わせによる新たな抗腫瘍療法の開発が期待される。
環境汚染による疾病感受性の個人差を薬理遺伝学的に立証するための分析疾学的検討

目的:遺伝薬理学と疫学の専門家による国際共同研究が、環境化学物質に起因する疾患の発生機序と遺伝因子の関係を解析するために有用であり、日本のmolecular epidemiologyの発展にも役立つと考えて本企画調査を行った。実績:4回のカナダ訪問と、各施設での資料収集、意見交換によって、1)サスカチュアン州を中心とした特定地域における、住民の健康、農業活動、環境汚染(特に農薬)に関する医学・化学・農学・地質水質学者による共同研究(Prairie Ecosystem Study)のデーター集積状況を確認した。2)バングラデシュにおける砒素汚染については、現在住民の戸籍作成の段階であり、本研究実施には時期尚早であると判断した。3)近年のgene-environment interactionに関するmolecular epidemiologyの論文を、遺伝薬理学と疫学の立場から収集・評価して、今後の研究計画を立案した。今後の展開:サスカチュアン州において本研究を実施するために、1)研究分担者の中川がサスカチュアン大学医学部のAdjective Professorに申請し、検体収集と解析を実行する留学生派遣を準備している。2)本企画を具体化して2001年のカナダ研究助成金に申請する予定である。3)その研究内容は、これまでサスカチュアン州で継続されてきた農薬曝露による気管支喘息・前立腺癌発症に関するコホート研究に、疾患(農薬毒)感受性遺伝因子としての薬物代謝酵素(Cytochrome P450(CYP)1A2,CYP3A4,CYP17,CYP19,N-acetyltransferase 2,Glutathione-S-transferase P1,Paraoxonase)の遺伝的多型調査を組み込んで今後2年間で多変量解析を行うものである。その後には、さらに焦点を絞った前向き調査も計画している。
実用的スプリントパフォーマンス診断システムの開発-直線走を対象として-

本研究は,レーザー速度測定器とビデオカメラを用いて得られるデータから,100m走における1歩毎のストライド・ピッチ・疾走速度を推定する簡易な解析処理システムを構築し,実用的なスプリントパフォーマンスの診断法を開発することを目的としている.研究最終年の今年度は,前年度開発した簡易な解析処理ソフトウエアにおける課題-[映像の拡大]「修正機能の充実」「一次的なファイル保存」を改善し,分析時間の短縮をさらに図るにとが出来た(約10分の処理を実現).また,解析精度の再確認は,実側値で高い精度が得られなかった(平均5cmの誤差)が,平滑化処理を行うと,スタート6歩以降は高い精度があること(平均2cmの誤差)が確認された.そして,それ以降を指数近似する関数を設定し,加速局面のストライドの増加特性を数量化して表せることを明らかにした.これを手がかりに,走者の加速局面のストライドの改善を行うスティック走の間隔を設定できるようになった.また,これまで蓄積したデータ(n=141)より100m走のタイムを最大疾走速度の関係式(Henry (1954)の近似式を活用)を確定した.スプリントパフォーマンスの診断としては,1)100m走のたいむから予測される最大疾走速度と実際に到達している最大疾走速度との近接性,2)最大疾走速度獲得時の身長比によるストライドの獲得性,3)ストライドの増加特性から,当該スプリントパフォーマンスの達成性を評価し,改善課題を設定するようにした.スプリントパフォーマンスの改善の手がかりは,ストライドの増加特性を変動させ,それを手がかりに加速局面のスティック走を実施し,加速局面のストライド,ピッチを変更し、最終的に最大疾走速度を変更うる方法を考案した.本研究は,2年間の研究期間で,直線スプリント走における1歩毎のストライド・ピッチ・疾走速度を推定するレーザー法の簡易な解析処理システムを構築し,実用的なスプリントパフォーマンスの診断法を開発することを目的としている.研究1年目である今年度は,「レーザー法の簡易な解析処理ソフトウエアの作成」を行い,その実用性を検討することであった.同時に,デジタルカメラとレーザー速度測定器の無線同期システムの小型化を図ることを目的とした.簡易な解析処理ソフトウエアの開発は,レーザー速度測定器,ビデオカメラ自体のハードやソフトに改良を加えず,取得されるデータをそのまま活用する点であり,ソフトウエア上で「時間-距離データ」と「時間-映像データ」を同期させて,接地瞬間を読み出すようにした.これにより解析処理作業の効率化,人為的操作によるミスを最小限にして,測定精度のアップを目指した.解析処理画面のイメージは,「時間-画像データ」を手がかりに,「時間-距離データ」に接地地点をプロットしながら,歩数毎の接地時刻,ピッチ,ストライド,速度の推定生データが算出されるようにした.その後,推定生データのフィルタリング処理を施し,パフォーマンス診断へと進むように作成した.なお,同期やゴールタイム等の時間補正もできるように配慮した.結果,解析・結果の出力までに時間が約60分から約10分へと大幅に短縮できた.しかし,映像の拡大機能不足,修正機能,一次的なファイル保存で改善すべき点が明確になった.なお,解析精度に関しては,ソフトウエアの開発の遅延等から次年度への課題として残った.また,無線同期システムは,BNC端子及びRS-S32C端子を備え,小型(100×65×35,mm)で,定常的な遅延時間(58msec)を有した同期が可能となり,実用性が高まった.本研究は,レーザー速度測定器とビデオカメラを用いて得られるデータから,100m走における1歩毎のストライド・ピッチ・疾走速度を推定する簡易な解析処理システムを構築し,実用的なスプリントパフォーマンスの診断法を開発することを目的としている.研究最終年の今年度は,前年度開発した簡易な解析処理ソフトウエアにおける課題-[映像の拡大]「修正機能の充実」「一次的なファイル保存」を改善し,分析時間の短縮をさらに図るにとが出来た(約10分の処理を実現).また,解析精度の再確認は,実側値で高い精度が得られなかった(平均5cmの誤差)が,平滑化処理を行うと,スタート6歩以降は高い精度があること(平均2cmの誤差)が確認された.そして,それ以降を指数近似する関数を設定し,加速局面のストライドの増加特性を数量化して表せることを明らかにした.これを手がかりに,走者の加速局面のストライドの改善を行うスティック走の間隔を設定できるようになった.また,これまで蓄積したデータ(n=141)より100m走のタイムを最大疾走速度の関係式(Henry (1954)の近似式を活用)を確定した.スプリントパフォーマンスの診断としては,1)100m走のたいむから予測される最大疾走速度と実際に到達している最大疾走速度との近接性,2)最大疾走速度獲得時の身長比によるストライドの獲得性,3)ストライドの増加特性から,当該スプリントパフォーマンスの達成性を評価し,改善課題を設定するようにした.スプリントパフォーマンスの改善の手がかりは,ストライドの増加特性を変動させ,それを手がかりに加速局面のスティック走を実施し,加速局面のストライド,ピッチを変更し、最終的に最大疾走速度を変更うる方法を考案した.
自己免疫疾患の新しい分子機構論:中枢性トレランスの破綻による自己への攻撃

高次生体における免疫システムは、外来抗原に対して排除応答を示すが自己抗原に対しては応答しない。この抗原特異的に不応答を示すトレランスは免疫系の重要な特徴で、自己抗原に対するトレランスの破綻は、免疫系による生体自己組織への攻撃と破壊すなわち自己免疫疾患をもたらす。申請者らは、代表的な自己免疫疾患であるシェーグレン症候群(SS)のモデルマウスであるIQI/JicマウスではSSに特徴的な涙腺炎や唾液腺炎などに加え、加齢に伴い膵臓、腎臓、肺などに病変が拡大することを示すとともに、その原因となる自己抗原が臓器特異的なカリクレイン(Klk)13であることをつきとめた。さらに、その発症における末梢性トレランスの関与を調べる目的で、生後3日目に胸腺を摘出して末梢性トレランスを担う制御性T細胞を除外したところ、唾液腺の病変に変化が見られなかったことから、本マウスのSS様病変の形成は末梢性トレランスの破綻によるものではないことを示した。また本マウスではマイトージェン刺激に対するIL-2の産生が顕著に低下しており、これがIL-2遺伝子発現の低下に起因することを確認した。IL-2はin vivoにおいて自己抗原に対する免疫寛容の維持に重要な役割を果たしていることが知られており、これらの結果からT細胞活性化に伴うIL-2の産生低下が本マウスにおける自己寛容の破綻を引き起こし、自己免疫疾患の発症に直接関与している可能性が考えられた。本研究の結果をまとめると、IQI/JicマウスではT細胞の活性化に伴うIL-2産生不全が制御性T細胞とは異なる自己寛容機構を破綻させ、制御性T細胞に依存しない自己寛容の破綻がKlk-13を含む自己抗原に対する持続的な自己反応性T細胞の活性化を引き起こし、唾液腺から他の標的臓器への炎症波及に関与して全身病態の形成に重要な役割を果たすと考えられた。高次生体における免疫システムは、外来抗原に対して排除応答を示すものの自己抗原に対しては応答しない。我が国で樹立されたIQI/Jicマウスは、代表的なヒト自己免疫疾患であるシェーグレン症候群(SS)の患者と極めてよく似た病態を示すことから、そのモデルマウスとして期待されている。申請者らは、本マウスではSSに特徴的な涙腺炎や唾液腺炎などに加え、加齢に伴い膵臓、腎臓、肺などに病変が拡大することを示すとともに、その原因となる自己抗原が臓器特異的なカリクレイン13であることをつきとめた。さらに、その発症における末梢性トレランスの関与を調べる目的で、生後3日目に胸腺を摘出して末梢性トレランスを担う制御性T細胞を除外したところ、唾液腺の病変に変化が見られなかったことから、本マウスのSS様病変の形成は末梢性トレランスの破綻によるものではないことを証明した。従来、自己免疫疾患の発症は、主に"末梢性トレランスの破綻"によると考えられてきたが、折しも最近Gotterらによって、それまで個々の組織で合成されると考えられていた組織特異的抗原の遺伝子が、胸腺上皮細胞に多数発現していることが示された。これは胸腺上皮細胞がネガティブセレクションを担う可能性を示唆するものであり、これらのことから、IQI/Jicマウスにおける自己免疫病は、自己抗原であるカリクレイン13が胸腺上皮細胞によって抗原提示されず、カリクレイン13反応性T細胞の排除ができないために発症する可能性が浮上する。

そこで本研究では、まず、新生子胸腺においてカリクレイン13遺伝子が発現していないことを示し、胸腺内に自己抗原反応性T細胞が存在することを証明することから着手している。高次生体における免疫システムは、外来抗原に対して排除応答を示すが自己抗原に対しては応答しない。この抗原特異的に不応答を示すトレランスは免疫系の重要な特徴で、自己抗原に対するトレランスの破綻は、免疫系による生体自己組織への攻撃と破壊すなわち自己免疫疾患をもたらす。申請者らは、代表的な自己免疫疾患であるシェーグレン症候群(SS)のモデルマウスであるIQI/JicマウスではSSに特徴的な涙腺炎や唾液腺炎などに加え、加齢に伴い膵臓、腎臓、肺などに病変が拡大することを示すとともに、その原因となる自己抗原が臓器特異的なカリクレイン(Klk)13であることをつきとめた。さらに、その発症における末梢性トレランスの関与を調べる目的で、生後3日目に胸腺を摘出して末梢性トレランスを担う制御性T細胞を除外したところ、唾液腺の病変に変化が見られなかったことから、本マウスのSS様病変の形成は末梢性トレランスの破綻によるものではないことを示した。また本マウスではマイトージェン刺激に対するIL-2の産生が顕著に低下しており、これがIL-2遺伝子発現の低下に起因することを確認した。IL-2はin vivoにおいて自己抗原に対する免疫寛容の維持に重要な役割を果たしていることが知られており、これらの結果からT細胞活性化に伴うIL-2の産生低下が本マウスにおける自己寛容の破綻を引き起こし、自己免疫疾患の発症に直接関与している可能性が考えられた。本研究の結果をまとめると、IQI/JicマウスではT細胞の活性化に伴うIL-2産生不全が制御性T細胞とは異なる自己寛容機構を破綻させ、制御性T細胞に依存しない自己寛容の破綻がKlk-13を含む自己抗原に対する持続的な自己反応性T細胞の活性化を引き起こし、唾液腺から他の標的臓器への炎症波及に関与して全身病態の形成に重要な役割を果たすと考えられた。
遺伝子ノックアウトを用いたmiRNAの機能及び生成機構の解析

昨年度までにトリBリンパ細胞株DT40から得たmiR17-5P(miR91),miR17-3P(miR17),miR18,miR19a, miR20,miR19b, miR92の7種類のmiRNA遺伝子が密集して存在する遺伝子クローンについて、miRNA遺伝子群を含む1.9kbpをpuromycinおよびblasticidin S耐性遺伝子で置き換えたノックアウトコンストラクトを構築し、エレクトロポレーション法によってDT40細胞に順次導入し、それぞれの抗生剤の存在下培養することにより、これらのmiRNA遺伝子を完全に欠失した細胞株を得ることに成功した。変異遺伝子を導入した親株は野性株であることから、この遺伝子群は細胞の増殖には必須でないことが明らかになった。得られたノックアウト細胞株と親株(野性株)とを比較すると、形態的には殆ど変わることはなかった。一方、細胞の増殖速度はノックアウト細胞株で有意に遅くなっていた。各細胞株から全RNAを抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、各miRNAに対するプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ノックアウト細胞株ではmiR17-3P及びmiR20の発現が完全に消失していた。しかし、他の5種類のmiRNAの発現は野性株と比較して減少しているものの、完全に消失するまでには至らなかった。これはそれぞれのmiRNAと類似した、あるいは完全に一致した塩基配列を持つmiRNA遺伝子が他に存在することによるものと考えられる。本研究により、2種類のmiRNAの発現が完全に押さえられた細胞株が得られた。この細胞株および野性株で発現しているタンパク質を、二次元マッピングなどで比較することにより、これらのmiRNAのターゲットを特定することができるものと考えられる。現在ヒト細胞では175種類のmiRNAが同定されている。このうち、miR91,miR17,mR18,miR19a, miR20,miR19b, miR92の7種類の遺伝子は、13番染色体の約800bpの中に密集して存在することから、これらは一つの大きな前駆体RNAとして転写され、そこからそれぞれ切り出されて生成すると考えられる。従って、これらのmiRNAは特定の生命現象に関与する複数の蛋白質の発現を制御していると考えられ、その機能解明は非常に意義のあることである。そこで、この遺伝子群のトリのホモログをクローニングし、ノックアウト細胞作製を試みた。まず、DT40 DNAを鋳型としてヒトmiR17プライマーとmiR18,miR19aあるいはmiR20プライマーでそれぞれPCRを行った結果、ヒトの場合と同様の長さのPCR産物が得られ、それらの塩基配列を決定したところ、対応するヒト遺伝子と類似の配列であった。そこでmiR17/miR20PCR産物をプローブとして、トリDT40細胞の遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。得られた遺伝子クローンの制限酵素地図を作製するとともに、miRNA遺伝子群を含む約7.5kbpの塩基配列を決定した。miRNA遺伝子群の部分を見ると、ヒト染色体13番のmiR91からmiR92の7種類のmiRNAが全く同じ順序で存在し、これらを含む800bpの塩基配列をヒトのものと比較すると、77.2%の相同性を示した。中でも各miRNAの前駆体部分では相同性はさらに高く、miRNAそのものの塩基配列はヒトとトリで全く同一であった。しかし、この800bpの前後の塩基配列を比較すると、相同性は余り見られなかった。このことは、これらのmiRNAが細胞内で非常に重要な機能を果たしていることを想像させる。miRNA遺伝子群を含む1.9kbpをpuromycinおよびblasticidin S耐性遺伝子で置き換えたノツクアウトコンストラクトを構築し、現在ノックアウト細胞を作製中である。
植物タンパク質の液胞局在性を制御する新規なメカニズムの解明と応用

本研究では,ポルフェノールオキシダーゼ(PPO)のホモログであるオーロン合成酵素(AS)のキンギョソウ花弁細胞内での細胞内局在性や輸送経路を明らかにし,オーロンを代謝工学的に合成するたあの基盤を構築した.密度勾配遠心によるキンギョソウ花弁細胞オルガネラの分画実験や,オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質(GFP)と酵素前駆体中の推定シグナル配列との融合蛋白質をコードする遺伝子を用いたトランジエントアッセイにより,ASが液胞局在性であることを明らかにした.これまでに知られているPPOは例外なくプラスチド(葉緑体)に局在することから,本酵素の細胞内局在性はPP0としては極めてユニークなものである.また,酵素前駆体のN末端に液胞輸送シグナルがコードされていることを示すとともに,この配列中に既知の植物液胞輸送シグナルの条件を満足する配列(N^<48>SLAY^<53>)を見いだし,その機能を変異解析により評価した.また,N末端推定シグナル配列とGFPの融合蛋白質遺伝子を,ドミナントネガティブ型のAtSarIミュータントと共発現させてトランジエントアッセイを行うことにより,この酵素前駆体が小胞体からゴルジ体を経由して液胞に運ばれることを明らかにした.さらにN末端推定シグナル配列のミュータントを用いたトランジエントアッセイにより,本酵素前駆体がmultivesicula body pathwayを経由して液胞に運ばれることに関する証拠を得ることができた.こうした知見に基づいて,フラボノイド生合成経路の代謝工学的制御によりオーロンを花弁に蓄積させる技術を確立した.本研究において明らかにしたASの細胞内局在性やその輸送経路は,ASを用いて代謝工学的にオーロンを合成するための重要な基盤を提供することができた.本研究では,ポルフェノールオキシダーゼ(PPO)のホモログであるオーロン合成酵素(AS)のキンギョソウ花弁細胞内での細胞内局在性や輸送経路を明らかにし,オーロンを代謝工学的に合成するたあの基盤を構築した.密度勾配遠心によるキンギョソウ花弁細胞オルガネラの分画実験や,オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質(GFP)と酵素前駆体中の推定シグナル配列との融合蛋白質をコードする遺伝子を用いたトランジエントアッセイにより,ASが液胞局在性であることを明らかにした.これまでに知られているPPOは例外なくプラスチド(葉緑体)に局在することから,本酵素の細胞内局在性はPP0としては極めてユニークなものである.また,酵素前駆体のN末端に液胞輸送シグナルがコードされていることを示すとともに,この配列中に既知の植物液胞輸送シグナルの条件を満足する配列(N^<48>SLAY^<53>)を見いだし,その機能を変異解析により評価した.また,N末端推定シグナル配列とGFPの融合蛋白質遺伝子を,ドミナントネガティブ型のAtSarIミュータントと共発現させてトランジエントアッセイを行うことにより,この酵素前駆体が小胞体からゴルジ体を経由して液胞に運ばれることを明らかにした.さらにN末端推定シグナル配列のミュータントを用いたトランジエントアッセイにより,本酵素前駆体がmultivesicula body pathwayを経由して液胞に運ばれることに関する証拠を得ることができた.こうした知見に基づいて,フラボノイド生合成経路の代謝工学的制御によりオーロンを花弁に蓄積させる技術を確立した.本研究において明らかにしたASの細胞内局在性やその輸送経路は,ASを用いて代謝工学的にオーロンを合成するための重要な基盤を提供することができた.ドミナントネガティブ型のAtSar1遺伝子をを用いて,オーレウシジンシンターゼ前駆体の輸送経路の全体像を解析し,前駆体がER→ゴルジ体→液胞という経路で液胞に運ばれることを示した.また酵素前駆体中の液胞輸送シグナル配列の必要領域ならびに機能要素を解析するため,、推定シグナル配列とGFPの融合タンパク質を植物細胞内で発現させ,その細胞内移行・局在性を蛍光顕微鏡にて観察するトランジエントアッセイ系を構築した.構築した発現コンストラクトには次のような特徴を付与した.1.推定液胞輸送シグナル配列NSLAYに変異を導入した.2.酵素前駆体がMulti-vesicular body(MVB)経路に乗って輸送されると考えられたので,推定シグナル配列のN-末端側に存在しMVB経路におけるユビキチン受容部位と推定される三つのリシン残基をアルギニンに変えた.3.推定シグナル配列あるいはその変異体を,積み荷タンパク質のC-末端側に連結した発現コンストラクトも作成した.これらのコンストラクトをタマネギの表皮細胞やキンギョソウ花弁細胞などに導入して一過的に発現させ,GFPの蛍光シグナルの行方を共焦点レーザ顕微鏡にて観察した.その結果,推定液胞輸送シグナル配列NSLAYに変異を導入したコンストラクトでは液胞輸送が著しく阻害され,推定シグナル配列のユピキチン受容部位と推定される三つのリシン残基をアルギニンに変えたコンストラクトでも液胞輸送が著しく阻害されることがわかった.また,推定シグナル配列を積み荷タンパク質のC-末端側に連結した場合には,積み荷タンパク質は正しく液胞に輸送されたが,その推定ユピキチン受容部位に変異を導入したコンストラクトでは積み荷タンパク質は液胞膜に移行した.

本研究では,ポルフェノールオキシダーゼ(PPO)のホモログであるオーロン合成酵素(AS)のキンギョソウ花弁細胞内での細胞内局在性や輸送経路を明らかにし,オーロンを代謝工学的に合成するための基盤を構築した.密度勾配遠心によるキンギョソウ花弁細胞オルガネラの分画実験や,オワンクラゲの緑色蛍光蛋白質(GFP)と酵素前駆体中の推定シグナル配列との融合蛋白質をコードする遺伝子を用いたトランジェントアッセイにより,ASが液胞局在性であることを明らかにした.これまでに知られているPPOは例外なくプラスチド(葉緑体)に局在することから,本酵素の細胞内局在性はPPOとしては極めてユニークなものである.また,酵素前駆体のN末端に液胞輸送シグナルがコードされていることを示すとともに,この配列中に既知の植物液胞輸送シグナルの条件を満足する配列(N^<48>SLAY^<53>)を見いだし,その機能を変異解析により評価した,また,N末端推定シグナル配列とGFPの融合蛋白質遺伝子を,ドミナントネガティブ型のAtSarIミュータントと共発現させてトランジェントアッセイを行うことにより,この酵素前駆体が小胞体からゴルジ体を経由して液胞に運ばれることを明らかにした.さらにN末端推定シグナル配列のミュータントを用いたトランジエントアッセイにより,本酵素前駆体がmultivesicula body pathwayを経由して液胞に運ばれることに関する証拠を得ることができた.本研究において明らかにしたASの細胞内局在性やその輸送経路は,ASを用いて代謝工学的にオーロンを合成するための重要な基盤を提供することができた.
数式自動点訳システムに関する研究開発

現行数学点字規則に従った「LaTeXを用いた数式自動点訳システム」が完成した。このシステムを使って理工系の大学・大学院で使用されている教科書・参考書、原著論文等の点訳を行った。点訳した書籍、論文等のリストは研究成果報告書に掲載する。このシステムの評価を行うため、まず、短期雇用者に対して(1)LaTeXによる数式記述法の説明、(2)点字表記法の説明、(3)基本的な点字指導、(4)平成10年度に購入したOCRの使用法の説明、および(5)このシステムの使用法の説明等を行った後、点字教科書を試作した。この際、実際にシステムを使用した短期雇用者の意見を聞いてシステムの使用法についての改良を行った。点字教科書が部分的に完成した後、全盲学生に教材の触読を依頼し、本システムにおける点字表記法、特に数式の点字表記法のチェックを厳密にして、点字表記のエラーの修正を行った。その後、さらに現行の数学点字規則の一般性、リーダビリティ(可読性)等のチェックを試みた。その結果、(1)大学の物理学の教科書に使われている記号のなかには現行の数式点字規則では定義されていないものがある、(2)現行の数学点字規則に従った表記法だと誤読の可能性があるため例外的な書き方をしなければならない、(3)例外的な書き方についての規則が正式に定められていないため点訳者がローカル・ルールを作って点訳を進める、(4)その結果、そのローカル・ルールを知らない読者には読みにくいことがある等の事実が判明した。今後とも本システムの改良を進める予定である。これらの問題点を解決するためには、統一日本語点字(UJBC)の採用が必要であるとの観点から、UJBC規則に基づいた自動点訳システムの開発も行った。現行日本点字における数式記号とUBC点字における数式記号との相違を明確化、ならびに英語圏におけるUBCの動向の把握を行った。基礎調査と並行し、実用化システムとして数式自動点訳システムの開発を行い、現行日本点字規則に従ったものと、UBC点字規則に従った2つのシステムのプロトタイプを作成した。本研究では、数式自動点訳の対象として、大学教育で使用される物理学の図書を中心とし、天文学、地質関係の図書を選び、これらの図書を入力データとしてシステムの検証と共に、実際の利用者である全盲学生による評価も行っている。本研究では市販図書である理数系図書を入力データとし、本件で作成される数式自動点訳システムを使用し、利用者である全盲学生の評価が必要であるため、研究メンバー以外に、入力データ作成から、自動点訳、評価を行って頂くボランティアと全盲学生の協力グループ組織した。現段階では、本組織は有効に機能しており、協力者からの意見を本研究にフィードバックできる体制にした。現行数学点字規則に従った「LaTeXを用いた数式自動点訳システム」のプロトタイプがほぼ完成した。このシステムの評価を行うため、物理学の教科書の点訳を試みた。まず、短期雇用者に対して(1)LaTeXによる数式記述法の説明、(2)点字表記法の説明、(3)基本的な点字指導、(4)前年度に購入したOCRの使用法の説明、および(5)このシステムの使用法の説明等を行った後、点字教科書を試作した。

点字教科書が部分的に完成した後、全盲学生に教材の触読を依頼し、本システムにおける点字表記法、特に数式の点字表記法のチェックを厳密にして、点字表記のエラーの修正を行った。今後とも本システムの改良を進める予定である。その後、さらに現行の数学点字規則の一般性、リーダビリティ(可読性)等のチェックを試みた。その結果、(1)大学の物理学の教科書に使われている記号のなかには現行の数式点字規則では定義されていないものがある、(2)現行の数学点字規則に従った表記法だと誤読の可能性があるため例外的な書き方をしなければならない、(3)例外的な書き方についての規則が正式に定められていないため点訳者がローカル・ルールを作って点訳を進める、(4)その結果、そのローカル・ルールを知らない読者には読みにくいことがある等の事実が判明した。これらの問題点を解決するためには、統一日本語点字(UJBC)の採用が必要であるとの観点から、UJBC規則に基づいた自動点訳システムの開発も進める予定である。現行数学点字規則に従った「LaTeXを用いた数式自動点訳システム」が完成した。このシステムを使って理工系の大学・大学院で使用されている教科書・参考書、原著論文等の点訳を行った。点訳した書籍、論文等のリストは研究成果報告書に掲載する。このシステムの評価を行うため、まず、短期雇用者に対して(1)LaTeXによる数式記述法の説明、(2)点字表記法の説明、(3)基本的な点字指導、(4)平成10年度に購入したOCRの使用法の説明、および(5)このシステムの使用法の説明等を行った後、点字教科書を試作した。この際、実際にシステムを使用した短期雇用者の意見を聞いてシステムの使用法についての改良を行った。これらの問題点を解決するためには、統一日本語点字(UJBC)の採用が必要であるとの観点から、UJBC規則に基づいた自動点訳システムの開発も行った。