hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト内在性レトロウイルスに対する単クロン抗体の作製と発現細胞の同定に関する研究

ヒト内在性レトロウイルスの生物学的および病理学的意義を明かとすることを目標に、本研究では1コピー型ヒト内在性レトロウイルスHERV-R(ERV3)のenv領域のopen reading frameを大腸菌発現ベクターpET22bに組み込み、組み換え蛋白を作製、これをマウスに免疫することによって抗HERV-R env単クロン抗体(1B7)を作製した。この抗体はHERV-R mRNA高発現臓器である胎盤や本研究で高発現臓器である明かとした副腎、副腎皮質腺腫で約170kDaおよび180kDaの分子と反応したが、Northernレベルで発現の確認されない褐色細胞腫では反応性は見られなかった。また、この抗体は種々のHERV-R mRNA高発現培養細胞と高い反応性を示し、HERV-Rの遺伝子産物を認識していると考えられ、HERV-Rの一部は蛋白まで翻訳されている可能性を支持した。一方、HERV-R env組み換え蛋白は一部のSLE患者血清と高い反応性を示し、HERV-R env領域の遺伝子産物が自己抗体の標的分子のひとつとなっている可能性が示唆された。HERV-R mRNA高発現臓器であることが判明した副腎ではその皮質での発現がin situhybridizationで確認され、胎盤以外での正常組織における特異的高発現細胞の存在を明かとした。さらに、一部の培養正常細胞におけるサイトカインによるHERV-R発現誘導が可能なことが明かとなった。以上、本研究でヒト内在性レトロウイルスHERV-R遺伝子産物に対する単クロン抗体の作製に成功するとともに、HERV-Rの正常組織での発現様式や自己抗原となりうること、さらにその発現の誘導が可能なことを明かとした。
低酸素虚血負荷後の脳循環と脳波測定による脳障害の重症度予測に関する基礎的研究（国際共同研究強化）

今年度は、早産羊4頭を用いて、実験を行った。母羊は、静脈麻酔下に気管内挿管、人工呼吸器管理とした後、全身麻酔下に母羊を開腹し、胎児羊の上半身を露出後、左正中神経を描出し、電気刺激用電極を上腕正中神経に(図2B)とりつける。また、右上腕動脈に動脈ラインを確保した(担当:Flora Wong、中村)。シンクロトロンによる撮影実験では、内頚動脈に造影剤投与用の動脈ラインを留置後、気管内挿管をし、人工呼吸器下に呼吸サポートを開始し、人工サーファクタントを投与後に、臍帯結紮を行い、児を娩出する。その後保温を行いながら、シンクロトロン撮影ハッチ内へ移動。大脳皮質感覚野の部位に左右対称に2対ずつNIRSプローブと脳波電極を頭部装着後、電気的刺激を与えて生じる脳内Hb変化を検討する。3種類の異なる長さの刺激(1.8, 4.8, 7.8秒)を無作為に行い、SEP反応やNIRSによる脳内Hb反応、synchrotronイマジングによる微細血管変化を調べた。SEP、脳内Hb変化は専用ソフトウェアによる加算平均し解析した。その結果、早産児羊では、より長い時間の刺激になると、OxyHbの増加が著名となり、その場合、毛細血管の拡張も顕著となることが分かった。さらに、血管径毎に、刺激前後での拡張有無があるかを調べたところ、血管径が小さいものほど、刺激によって拡張が多い事がわかった。内定年度:2015今年度は、次年度の実験に向けて行った先行実験結果の解析を行った。この先行実験では、胎児羊大脳皮質感覚野における感覚刺激による同部位での神経活動活性化と、それに伴う脳血流変化を、体性感覚誘発電位(SEP)と近赤外分光装置による酸素化Hb、脱酸素化Hb測定によって明確にとらえることができた。この解析結果より、胎児脳感覚野では、短時間刺激では刺激対側の酸素化Hbが増加するが、刺激時間延長により、酸素化Hbが減少する傾向がみられた。これは、胎児期では感覚刺激が持続する(長くなる)と、その未熟性により、神経活動活性化を維持するのが困難となり、その酸素消費が減少するために脳血流低下を示すこと、もしくは、脳血流による酸素供給がその消費に追い付かないことなどが、このような現象がみられると推察された。今年度行った先行実験結果の解析は、本年度の研究を行うに当たり非常に有用な情報であり、今後の研究遂行を促進するものであるため。本年度は、胎児羊10頭を用いて実験を行った。それぞれにNIRSとEEGを大脳皮質感覚野部位の頭部に装着し、正中神経に電気刺激を加えた。電気刺激は、1.8,4.8,7.8秒と3種類の長さの異なる刺激を与え、その刺激時間と脳循環反応の関係を調べた。その結果、胎児羊では、1.8秒刺激では全例、刺激後に酸素化Hbが増加したが、4.8、7.8秒では酸素化Hbが低下するものが多くみられた。これは、胎児脳では、短時間刺激では、感覚野における脳活動活性化に伴う酸素需要を酸素供給が満たすことができるが、刺激時間が長くなると、供給が需要を満たすことができないことを示唆する結果と考えられた。次に、母羊を人工呼吸器設定を変更させ、高二酸化炭素血症状態にした状態で、7.8秒の電気刺激を与え、感覚野の脳循環反応の正常時との違いを調べた。その結果、高二酸化炭素血症状態では、酸素化Hb反応は、正常時と比して増大した。これは、成人での報告と反する結果であった。胎児では高二酸化炭素血症状態では、感覚刺激後の脳循環反応は、yり増大することが初めて明らかにすることができた。胎児羊を用いた実験は概ね終了した。今年度は、新生仔羊10頭を用いて実験を行った。胎児羊同様に、それぞれにNIRSとEEGを大脳皮質感覚野部位の頭部に装着し、正中神経に電気刺激を加えた。その結果、短い刺激では、反応はほとんど見られなかったが、刺激時間の延長と共に、刺激後の酸素化Hb上昇が顕著にみられ、その上昇のピークと血圧上昇のピークは一致した。そのため、刺激による血圧上昇が、脳循環に影響を与えていることが考えられた。これは、胎児羊では認めなかった反応であることから、胎盤がつながっている胎児羊では、この反応が見られない理由として、痛みの経路が機能的に未発達である事、また、痛みを緩和する物質が胎盤から胎児へ流入する(ステロイドホルモンなど)ことが考えられた。このように新生児では、出生後に急速に痛みの経路が発達・確立することが示唆された。胎児羊と新生仔羊の感覚野における脳循環反応を調べ、それについてデータ解析並びに論文作成を行い、投稿・掲載まで行うことができた。

シンクロトロンによる撮影実験では、内頚動脈に造影剤投与用の動脈ラインを留置後、気管内挿管をし、人工呼吸器下に呼吸サポートを開始し、人工サーファクタントを投与後に、臍帯結紮を行い、児を娩出する。その後保温を行いながら、シンクロトロン撮影ハッチ内へ移動。大脳皮質感覚野の部位に左右対称に2対ずつNIRSプローブと脳波電極を頭部装着後、電気的刺激を与えて生じる脳内Hb変化を検討する。3種類の異なる長さの刺激(1.8, 4.8, 7.8秒)を無作為に行い、SEP反応やNIRSによる脳内Hb反応、synchrotronイマジングによる微細血管変化を調べた。SEP、脳内Hb変化は専用ソフトウェアによる加算平均し解析した。その結果、早産児羊では、より長い時間の刺激になると、OxyHbの増加が著名となり、その場合、毛細血管の拡張も顕著となることが分かった。さらに、血管径毎に、刺激前後での拡張有無があるかを調べたところ、血管径が小さいものほど、刺激によって拡張が多い事がわかった。在胎128日前後の胎児羊を10頭、その比較対象として、正期産新生仔羊(生後1週間前後)を10頭、用いて実験を行う。すなわち、両群において、刺激時間の長さを変えて、正中神経へ電気刺激を与え、その感覚野におけるの循環反応を調べる。また、高二酸化炭素血症の状態にし、その状況下で、その脳循環反応がどのように変化するのかも検討する。今年度は、新生仔羊を用いて胎児羊と同様の研究を行っていく予定である。今後は、週数を若くしていった新生仔羊ではどのような感覚野の脳循環反応を示すのかを調べる予定である。
多元情報の客観的複合解析を応用したしゅう動初期不安定要因の解析

潤滑下でのしゅう動において、ごく初期にしゅう動面に固着した凝着物がその後の現象を長期にわたって支配することに着目した。しゅう動初期において凝着物が固着する場所と凝着物の規模を支配する要因の解明を試みた。しゅう動前の影響因子である表面粗さと残留応力の分布、しゅう動中の影響因子である衝撃荷重を調査対象として取り上げた。金属表面への表面粗さの付与と残留応力付与は、いずれも常時摺動試験片上での凝着物の生成を助長する傾向と、相手試験片への凝着物の移着を妨げる傾向が確認された。また、衝撃荷重については凝着物の移着等への有意な影響は見られなかった。凝着物の発生・成長とその固着を制御できる可能性が示された。平成26年度の計画通り、摩擦試験機の改造を行い、試験片の位置決め精度と試験片解析位置分解能の向上を行った。位置分解能の向上はハードウェアの改造とソフトウェアの開発の二つの側面から実施した。ハードウェアの改造に関しては、ディスク試験片を回転させるモータをサーボモータに変更した。ソフトウェアの開発は、サーボモータのコントローラのプログラミングと、試験機全体をコントロールするパーソナルコンピューターのプログラミングの両面から行った。これにより、サーボモータの回転軸を、内蔵するロータリーエンコーダの0(ゼロ)点で精度良く停止させることが可能になった。また、ディスク取り付け治具を新たに設計・制作し、ディスク試験片に付与した0点マーキングと回転軸の0点を精度良く合わせて固定することを可能とした。また、そのための観察手段として、ピン取り付け位置にUSBタイプの小型顕微鏡を設置し、位置合わせの確認が容易になるよう工夫した。ディスク試験片の解析用位置決め装置の開発も行った。上述の0点を起点としてステッピングモーターによりディスク試験片を回転させ、顕微鏡による観察、硬度や粗さの分布測定を可能とした。測定装置の観察ステージ上に設置できるよう、薄型の駆動装置を設計・作成した。ディスク試験片の物性データと摩擦・摩耗データの位置情報による紐づけの妥当性検証に用いる試験片は、オーステナイト系ステンレス鋼を用いることとした。表面に部分的に異なる物性を付与する方法を検討し、形状に関しては化学腐食あるいはレーザー加工による方法を、硬さなど物性に関してはショットピーニング法によることとした。また、平成27年度に計画している加重速度変更機能付与について前倒しで実施し、従来のエアシリンダー方式からモータ駆動方式とする改良を行った。さらには、衝撃荷重付与技術などに関する概念設計を開始した。平成26年度は研究計画をやや前倒しに遂行することができた。平成27年度は、平成26年度に得られた成果(表面粗さを変化させた試験片による調査)を基に、当初計画の内、試験片表面の状態を意図的に変化させた調査を先行して行った。計画当初は表面酸化膜の調整を予定していたが、その後の研究成果により、長期しゅう動においてはそれよりもやや深い基材の材質変化の影響が大きいことが分かった。そのため、新たにショットピーニング法による金属表面近傍組織への歪付与方法を採択し、潤滑下のしゅう動に及ぼす影響の調査を行った。意図して部分的にショットピーニングによる表面改質を施したディスク試験片を用いた試験により、初期摩耗期間(慣らし運転に相当すると考えられる)が短縮され、短期間に境界潤滑に基づく定常摩耗状態に到達できることが示された。またショットピーニングによる表面改質が過度になると、長期間しゅう動した後であっても平滑な表面を得ることができず、良好な境界潤滑状態が達成しづらくなることも明らかとなった。これは長期間しゅう動後であっても十分なΛ値(潤滑膜と表面粗さの比)が得られなくなったと解釈できる。これらは新たな知見であり、ショットピーニングの強度と慣らし運転期間の関係を明らかにすることは、実用的な観点から重要な研究課題であると考える。ただし、本研究の目的である凝着の拠点を明らかにする観点からは、明確な結論が得られなかった。しゅう動試験中に条件を変化させる調査については、しゅう動中に衝撃荷重を与える機構を導入準備した。昨年度に前倒しで行った調査により、試験片表面の状態を意図的に変化させた調査を先行させた方が良いと判断した。そのため、予算執行の観点からは遅れが生じた。つまり、今年度中に実施予定であった摩擦試験機への衝撃荷重付与の機能追加の優先順位を下げたため、その分の予算執行が遅れている。衝撃付与の方法と、付与した衝撃が各種センサーに及ぼす影響に関する検討、概念設計を完了して機構作成のための詳細設計を開始しており、来年度の早い時期に導入する予定となっている。以上から、研究内容としては「おおむね順調に進展している」と判断した。ただし、予算執行上は遅れが生じている。潤滑下でのしゅう動において、ごく初期に摩擦面の特定位置に発生した凝着物がその後の現象を長期にわたって支配することに着目した。本研究はしゅう動初期における「凝着の発生場所」と「凝着の規模」を決定する支配要因の調査を目的とした。材料起因の因子に関しては、摩擦情報の摩擦面内分布を解析することができるピンオンディスク試験機を用い、試験前の粗さなどの分布と摩擦・摩耗データの分布との比較検討を試みた。また運転条件起因の因子に関しては、しゅう動試験中に衝撃荷重を付与し、当該位置と摩擦・摩耗データを紐づけた解析を行った。準備段階として、新調した試験片(オーステナイト系ステンレス鋼)と潤滑油で従来の試験と同等の試験結果が得られることを確認した。

またしゅう動初期における凝着物の生成・成長・移着について、環境因子の影響について検討を進め、現象を定量的に説明できる初歩的物理モデルの構築を行った。しゅう動試験前に特性分布を持たせる試験では、表面粗度とショットピーニングによる残留応力を因子として取り上げた。ショットピーニングは全面に施した場合と部分的に施した場合の比較も行った。いずれの因子もピン上での凝着物の生成を助長する傾向と、ピンからディスクへの凝着物の移着を妨げる傾向が確認された。衝撃荷重を付与する試験では、しゅう動試験中に付与した場合と、事前に付与した場合を比較した。いずれの場合も衝撃荷重はディスク上に塑性変形を生じさせたが、それが移着の拠点となる現象は観察されず、さらには、ディスクへの移着が妨げられる傾向が認められた。移着拠点の形成については明確な支配因子を見出すことができなかったが、表面への粗度や残留応力などの部分的な付与、衝撃荷重の付与が凝着物の移着を妨げる効果をもたらす様子が見いだされた。移着を妨げる原理を解明することで、安定的な慣らし運転条件の設定指針を導くことが期待される。潤滑下でのしゅう動において、ごく初期にしゅう動面に固着した凝着物がその後の現象を長期にわたって支配することに着目した。しゅう動初期において凝着物が固着する場所と凝着物の規模を支配する要因の解明を試みた。しゅう動前の影響因子である表面粗さと残留応力の分布、しゅう動中の影響因子である衝撃荷重を調査対象として取り上げた。金属表面への表面粗さの付与と残留応力付与は、いずれも常時摺動試験片上での凝着物の生成を助長する傾向と、相手試験片への凝着物の移着を妨げる傾向が確認された。また、衝撃荷重については凝着物の移着等への有意な影響は見られなかった。凝着物の発生・成長とその固着を制御できる可能性が示された。本課題の研究計画調書の平成26年度計画に記述した内容は、研究実績の概要に記述した通りすべて達成している。課題遂行に関する問題は特に発生していない。また装置の改良・改善については部分的に翌年度計画内容も前倒しで実施している。従って、「研究の目的」に照らして、凝着の発生する位置と凝着の規模を精度良く、また定量的に測定するための準備は整いつつあり、計画はおおむね順調に進展していると判断できる。研究内容の観点からは順調に遂行できているので、当初計画通り、しゅう動中衝撃荷重付与装置を導入し、その影響について調査を開始する。具体的には、与える力積を変化させて、衝撃的荷重を受けたしゅう動位置において特異なトライボロジー現象、特に凝着が生じるかを実験的に調査する。表面状態を意図的に変化させる調査については、引き続きショットピーニング法を用いて継続する。ただし、表面改質の程度に関する調査は必ずしも本研究案件の範囲とならないため、別な機会に譲り、部分的なショットピーニングによる表面状態の分布と、凝着の発生位置の関係調査を重点的に行う。本年度は本研究の最終年度にあたるため、上記二つの観点からの調査結果を総合的に検討し、必要であれば両方の実験技術を統合した実験を行い、報告をまとめる。
マクロライド系抗生剤がマクロファージ系細胞のサイトカイン産生に及ぼす影響

歯周病は歯周組織における、細菌による感染性疾患であり、その発症や進行には宿主の生体防御機能が大きく関わる。15員環のマクロライド系抗生剤(azithromycin)は、歯周組織への移行性が高く、歯槽骨や歯肉で血中の数倍20倍以上の移行が見られる。また、14、15員環のマクロライド系抗生剤は、歯周病関連細菌の一部に高感受性を示し、抗炎症作用やバイオフィルムの形成阻害作用を有することが明らかとなっているほか、マクロライド系抗生剤は、抗菌作用以外の新作用があることが知られている。そこで、マクロファージ系細胞であるTHP-1細胞を用い、LPS刺激による細胞の活性化やサイトカイン産生にazithromycinが及ぼす影響を検討し、歯周疾患における初期感染防御機構に抗生剤がどのような修飾作用を示すかを解明することを目的とする。これまで我々は、Listeria monocytogenes経口感染モデルマウスの腸管上皮間リンパ球(i-IEL)の活性化における上皮系サイトカインの関与を検討し、IL-15がL.monocytogenes経口感染においてi-IELの活性化に関与する可能性が示唆された。また、口腔上皮細胞株KB細胞を用いて、LPSによる上皮系サイトカインの発現とT細胞の活性化を検討し、T細胞の活性化に口腔上皮細胞由来のIL-15が重要な役割を果たす可能性が示唆された。本研究では、THP-1細胞を用い、LPS刺激による細胞の活性化やサイトカイン産生にazithromycinが及ぼす影響を検討し、現在までに遺伝子レベルおよびタンパクレベルでazithromycinによるIL-12やIL-6の発現変化を示唆する結果を得ている。今後さらなる検討が必要であるが、これまでの結果より、LPS存在下においてazithromycinによるTHP-1細胞のTh1応答への誘導が示唆された。近年、我が国においても使用され始めた15員環のマクロライド系抗生剤(azithromycin)は、歯周組織への移行性が高く、歯槽骨や歯肉で血中の数倍20倍以上の移行が見られる。これまで我々は、Listeriamonocytogenes経口感染モデルマウスの腸管上皮間リンパ球(i-IEL)の活性化における上皮系サイトカインの関与を検討し、感染後早期に腸管上皮(i-EC)からIL-15の産生がみられたのと一致して、i-IELのinterferon-γ(IFN-γ)産生が増加していることを見いだし、IL-15がL.monocytogenes経口感染においてi-IELの活性化に関与する可能性が示唆された。本研究では、THP-1細胞を用い、LPS刺激による細胞の活性化やサイトカイン産生にazithromycinが及ぼす影響を検討し、現在までにazithromycinによるIL-12やIL-6の発現変化を示唆する結果を得ている。
免疫チェックポイント阻害薬および血管新生阻害薬併用療法における線維細胞の機能解析

肺癌治療において免疫チェックポイント阻害薬は中心的な役割を果たしており、分子標的治療薬を含めた既存治療薬との併用効果についても注目を集めている。血管新生阻害薬である抗VEGF抗体との併用効果も報告されているが、その詳細な作用機序については不明な点が多い。近年申請者は線維細胞(fibrocyte)が抗VEGF抗体投与下の腫瘍組織へ集積し、治療耐性化に寄与することを報告した。本研究では腫瘍局所におけるfibrocyteの抗腫瘍免疫への機能を解析することで、免疫チェックポイント阻害薬および血管新生阻害薬併用治療の作用機序と新規バイオマーカー、治療標的の探索を行う。
運動主体感，身体所有感を増強させる身体機能再建BMIデバイスの開発研究

本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じられる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論の構築を目的とする.研究成果は以下のとおりである.(1)感覚フィードバック(FB)付BMI義手においてラバーハンド錯覚に類似した身体所有感を感じること,触覚FBや体性感覚FBが運動主体感を向上させることを脳活動計測や心理実験を通じて明らかにした.(2)上腕電動義手,手指伸展支援装置,麻痺した筋を制御する神経筋電気刺激デバイスを実現し,身体障碍を有する8名による臨床評価により有用性を示した本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じることのできる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論を構築し,ただの使いやすい道具ではなく,より身体に近づいた自然な操作感を実現する次世代の身体機能再建BMIデバイスの実現を目指す.平成27年度は,下記の3つの研究項目を実施した.(1)運動主体感,身体所有感を増強させる感覚Feedback(FB)の調査:BMI義手を対象とし,運動主体感を増強させる触覚および深部感覚FBで用いる振動刺激パターン(強度変化・刺激位置変化)を,二重課題法により調査した.その結果,感覚FBを付与することで把持に関する認知的な負担が減少し運動主体感が向上した.また,刺激点の増加が認知的負担を大きくし必ずしも運動主体感の向上に寄与しないことを明らかにした.また,身体所有感の調査では,義手のサイズ感より質のほうが大きく影響することが明らかにした.(2)自然な操作感の実現するためのBMIシステムの設計:BMI義手を対象とし,自然な操作感で操作可能にするため,眼電から把持に対する集中度を推定し,それに応じて義手制御パラメータを修正可能な眼電インタフェースを開発した.また,信号特性が不安定となる小さい操作力時の表面筋電から把持のプリシェイピング動作を推定し,その後の動作は義手に搭載された加速度・ジャイロ・圧力センサ情報と状態遷移モデルで自動的に判断する反射系を構築することで不自然な操作力を必要としないシステムを実現した.(3)身体機能再建BMIデバイスの開発:生体信号計測回路,電気刺激回路製作のため,新規に基板加工機を導入し,人に装着可能な交流増幅型眼電計測回路,筋電計測回路を新たに開発した.また,導電性ゴムを用いた柔軟な触覚センサを開発した.さらに,上肢BMI義手システムおよび簡易装着が可能な麻痺手リハビリ支援システムを開発した.平成27年度に予定していた研究計画について概ね順調に進展しているといえる.(1)運動主体感,身体所有感を増強させる感覚Feedback(FB)の調査については,刺激遅延の影響の調査は現在も進行中である.さらに脳活動解析の準備については,現在北海道大学病院と調整中であり,平成28年度の前半までかかる予定である.(2)自然な操作感の実現するためのBMIシステムの設計については,強化学習ベースの推定手法について,推定精度や応答性など改良が必要であるため引き続き研究開発を続ける予定である.(3)身体機能再建BMIデバイスの開発については,順調に開発が進んでいるが,電気刺激システムについては未着手となっているため,次年度以降引き続き開発をすすめる.本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じられる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論の構築を目的とする.今年度の成果は以下の3点である.(1)特定の脳活動から身体認知度を表すマーカを探索するため,電通大の協力の下,全脳計測が可能なMulti ch. NIRSを用いて,感覚FBを備えた身体機能再建BMIデバイス(筋電義手)使用中の脳機能解析を実施した.操作に同期した触刺激(振動)が付与されるとラバーバンド錯覚と同様な錯覚現象が起こること,その錯覚の強さが運動前野及び下頭頂小葉の活性に高い相関を確認した.さらに,操作に同期した触刺激(Cue)を与えても義手の運動主体感の向上しないこと,操作力に同期(比例)した触刺激を付与すると運動主体感が向上することを明らかにした.(2)自然な操作感で操作できるBMIデバイスを実現するため,その制御方法について1)TMR処置を利用した電動義手の制御手法2)深層学習を用いた再学習不要な操作習熟に合わせた動作推定手法の2つを検討した.前者では,上肢欠損者を対象に,手指運動に関連する運動神経を上腕部に移行し,上腕部の表面筋電から制御する方法を構築した.その結果2名の上肢欠損者に対してTMR処置し手指運動,手首運動,肘運動に関連する独立した筋電特徴が観察され,不自然な操作をすることなく運動推定が可能であることを示した.また,後者では熟練度の差等の個人差を含んだ筋電特徴データをビッグデータとみなし,深層学習を用いて推定関数の同定を行った.推定手法の構築までは至らなかったが,動作分離に有用な特徴抽出されていることを確認した.(3)人と親和性の高いBMI駆動型機械補助ロボットを実現するため,重量分布が体幹側に集中するような配置を設計し900gと軽い4DOF上腕電動義手を開発した.また,伸縮性外骨格を用いた簡易装着可能な手指リハビリ装置を実現した.本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じられる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論を構築することを目的とし,1)運動主体感および身体所有感を増強させる感覚FBの調査,2)自然な操作感を実現するためのBMIの設計,

3)運動機能障害者への臨床試験と実用化に向けた検討の3つを実施する.現在までの研究進捗状況は概ね順調に進展してるといえる.しかし,予定していた1)で実施予定であったMRI計測に関しては,MRI計測環境でデバイスを使用するための実験系の構築や倫理委員会への倫理申請に時間がかかっており,平成28年度中の実施ができなかったため,次年度実施予定である.また研究成果の公表についても予定より公表できていないためこの点についても次年度成果公表を続けて行く予定である.本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じられる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論の構築を目的とする.今年度の成果は以下の2点である.1)自然な操作感の実現するためのBMIシステムの設計(加藤,横井)自然な操作感を実現するため,生体信号を制御信号とするのではなく,加速度センサや眼電などを併用したBMI上肢義手を開発した.これにより,手首回転角を装着部の傾きから,把持速度を眼電から推定・制御を行うことで,健常者に近い運動主体感・身体所有感の高い自然な操作感を実現した.また,手指麻痺リハビリのための神経・筋電気刺激装置による手指運動(母指を含む)支援装置を開発し,5指独立の運動補助とモーションセンサを併用することでこれまで問題であった刺激パラメータの探索のための時間を大幅に短縮することが可能となった.さらに,これまで上肢欠損など手指運動に関連する筋群が欠損した高位切断者のための軽量な筋電義手の開発を行った.標的化筋肉再神経分布(TMR)という神経移行手術を利用し,切断された手指神経を残存する上腕の筋群の神経に移行することで,移行後の筋群の筋電位から手指の開閉,手首の回内外,肘の屈伸の自然な操作が可能となった.この成果は,国際学会Ro-MAN2017においてTANIE KAZUO AWARDを受賞した.2)運動機能障害者への臨床試験と実用化に向けた検討(加藤,山村,生駒)身体機能再建BMIデバイス,特に筋電義手について運動主体感や身体所有感が見られるかまたリハビリ効果がみられるかを明らかにするため前腕・上腕切断者8名についてその臨床評価を行った.その結果,前腕・上腕切断それぞれ2名について身体所有感・運動主体感の向上や臨床スコア(Box and Block Test)が向上することを確認した.またその成果の一部は,厚生労働省補装具完成用部品に指定され実用化に至った.本研究では,運動主体感,身体所有感を強く感じられる身体機能再建BMIデバイスの開発とその方法論の構築を目的とする.研究成果は以下のとおりである.(1)感覚フィードバック(FB)付BMI義手においてラバーハンド錯覚に類似した身体所有感を感じること,触覚FBや体性感覚FBが運動主体感を向上させることを脳活動計測や心理実験を通じて明らかにした.(2)上腕電動義手,手指伸展支援装置,麻痺した筋を制御する神経筋電気刺激デバイスを実現し,身体障碍を有する8名による臨床評価により有用性を示した今後については,申請書に従い,触覚FB手法とBMIデバイスへの身体認知に関連する脳活動部位の特定と評価手法の構築,自然な操作感の実現するためのBMIシステムの設計,人の身体運動を表現可能な身体機能再建BMIデバイスの開発を実施する.また本システムは,健常者が用いるマンマシンインターフェースへの応用も可能であり,マスタースレーブ型5指ロボットハンドへの応用も検討する.
地震動予測精密化のための地下深部構造の研究

1.バイブロサイス反射法による調査(1)測線・調査方法過去の地学的データを検討し、北海道苫小牧-鵡川地域に測線をとることにし、現地調査の結果、苫小牧-厚真の道道14.85kmを選定した。発振点間隔50m;発振点数200;スイープ数,1発振点当り15回;重合数48にした他は、60年度と同じ仕様でバイブロサイス反射法による調査を実施した。最表層に火山灰層,草炭層が存在することが知られているので、屈折法による表層調査も併行して実施した。(2)調査実施時期昭和61年11月2日16日(3)結果相互相関,共通反射点編集,初動ミュート,利得補正,デコンボリューション,速度解析,CDP重合などの処理を施して、Filtered Stack構造断面を得た。6つの反射面が認められ、全体的に向かって深くなっている。測線中央部では反射が弱い所があり、連続的でない反射面もあり、断層が存在する可能性もある。最も深い反射面は、60年度では部分的であり、反射時間も約3秒にすぎなかったが、今年度の結果では反射時間が約5秒で、測線全体に追跡できる。得られた各層の速度は、2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.6km/sであり、最深の反射面は西端で約5km,東端で約9kmに達する。今後、Migration,表層補正などの処理を行ない、構造解析の精度をあげ深層ボーリング資料などとの対比を行なう必要がある。他に、観測点10点,測線付近2個所で長周期微動調査を行ない、その解析から基盤構造を求め、反射法の結果、ボーリング資料との対比をした。2.60年度長沼測線下で得られた地下構造については、測線周辺に存在する深層ボーリング資料などと対比し、古第3紀上部までの地層の対応を得ることができた。また、長周期微動測定から得られた基盤構造は、反射法による結果と調和的であった。本研究では地震動予測精密化のために、バイブロサイス反射法によって地下深部構造の詳細な研究を行なう。この方法は地下資源探査のために開発されたもので、陸上の調査方法としては最も精度高く効率がよいものである。本研究による調査は、わが国においてバイブロサイス反射装置を所有し調査の実績を持つ石油資源開発株式会社(以下SKと略す)に委託することによって、下記の通り実施した。1.調査地域および測線長北海道刻張郡長沼町国道274号沿いに17.5Km;この測線は地下構造の変化が予想される。平野から丘陵へかけての興味深い地域にあり、道路が真直ぐで、人家、交通量も少なく、SKの調査地に近いなどの観点から、予備調査を行なって選定した。2.調査実施時期昭和61年2月7日-20日3.調査の具体的方法1点では約17m間隔の13.5tのバイブロサイス4台が、843Hzに順次変化する地震動を20秒間発生させる。約2m間隔で地震動を発生させる。地震計は道路に沿って約2m間隔で約2300箇、約4.8Km間に設置し、24箇づつ1チャネルに収録する。バイブロサイスの移動に伴ない、測線に沿って地震計も移動させる。4.結果相互相関、フィルタリング、振幅・地形培正、共通反射点の記録編集、重合、速度解析だでのディジタル処理を行なった結果、測線の東約1/3は馬追丘陵であるが、反射面がみられず断層の存在が認められる。この断層の西側では少くとも4箇の反射面が認められ、東へ向かって浅くなっている。反射面の深さは1.1-1.3,1.8-1.3,2.8-1.7,4.8Kmであり、速度はそれぞれ、1.6-2.2,2.9,3.7,4.3, 5.9Km/sである。2番目より深い反射面は不連続でかなり線れている。

得られた各層の速度は、2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.6km/sであり、最深の反射面は西端で約5km,東端で約9kmに達する。今後、Migration,表層補正などの処理を行ない、構造解析の精度をあげ深層ボーリング資料などとの対比を行なう必要がある。他に、観測点10点,測線付近2個所で長周期微動調査を行ない、その解析から基盤構造を求め、反射法の結果、ボーリング資料との対比をした。2.60年度長沼測線下で得られた地下構造については、測線周辺に存在する深層ボーリング資料などと対比し、古第3紀上部までの地層の対応を得ることができた。また、長周期微動測定から得られた基盤構造は、反射法による結果と調和的であった。
ゾルゲル・テンプレート法による遷移金属酸化物ナノワイヤの創製とその構造及び光学特性評価の研究

a)水熱合成法によるチタニアナノチューブの作製アナターゼ型の酸化チタン粉末1.92gに対して10M-NaOH溶液を160ml加えて撹拌し、150°C-40時間オートクレーブ内にて水熱処理後、得られた沈殿を分離した後に1M-HClと蒸留水を用いて、中和洗浄を行った。その時P.H.値を8に調整することにより内径3-5nm、外径7-10nmのナノチューブが得られた。XRD及び高分解TEMによりチューブはアナターゼ型チタニア及びNa_2Ti_3O_7であることが判明した。ヘリコンスパッタ法を用い銀粒子とチタニアを基板上に同時スパッタし、Agナノ粒子を担持したアモルファスチタニア微粒子薄膜を作製した。銀粒子は球形、楕円体形、多角形体等を示し、そのサイズは5-100nmの広い範囲にまたがる。そのためプラズマ吸収帯は可視から近赤外まで拡がる。本試料が光クロミック現象を示すことをNd-YAGの二倍波の照射及び着色後のUV照射によって確認した。また、照射波長に対応したホールの生成も確認できた。この光クロミックの色変化原理は、銀微粒子の表面プラズモン吸収による励起電子がチタニア膜上の吸着酸素に蓄積(スパーラディカル化)され銀粒子が正にイオン化することによるものと考えられた。c)ZnOナノ構造の作製とその構造・光学特性評価低真空加熱炉に150ml/minの酸素ガスを流入させ、ZnO粉末と炭素の混合原料を加熱し、熱還元反応及び蒸気輸送蒸着法により炉の非加熱部に設置した基板上にZnOのナノ構造を形成した。ZnOナノロッドが融合してあたかも蜂の巣構造の壁(厚:80-100nm、深さ:1700nm)を形成し、かつ20-200nm径の空洞が層を通して穿かれている構造では、Nd-YAGの3倍波(355nm)の照射によって紫外光領域でランダムレーザ発振が閾値0.38MW/cm^2で確認された。a)チタニアナノチューブの作製とその構造評価TiO2粉末を強酸で溶解し、その後純水及びアンモニア水で中和し、さらに尿素を中和液に加えたものをゾル液として利用するという新しいゾル-ゲル法とテンプレート法を組み合わせた方法によって、陽極酸化アルミナテンプレート(孔径0.02μmを有するメンブレンフィルター)の細孔中にアナターゼ相のTiO2ナノチューブの作製を試みた。得られたTiO2の試料の結晶構造の評価は、主にX線回折法(XRD)で行い、アルミナテンプレートの細孔中に結晶が成長したかどうかについては走査型電子顕微鏡(SEM)観察から判断した。更に試料のマイクロな結晶形態や構造については必要な場合、透過型電子顕微鏡(TEM)で行い以下の結果を得た:(1)XRDの結果からアナターゼ構造に起因するピークが確認できた。(2)アルミナテンプレート細孔中に成長した物質を抽出し、TEM観察した結果、外径16nm内径5nmのアナターゼ相のTiO2ナノチューブと確認できた。この結果はXRDの結果と一致した。(3)作製に当たって、重要なパラメーターは上記化学物質のモル比、テンプレートをゾル液中にディップコーティングする時間及びゾル液の温度、その後の加熱温度と加熱スピード及び到達温度で保持する時間等であることが判った。b)ZnOナノワイヤーの作製とその構造・光学特性評価レーザー蒸発法によりZnOのナノワイヤーを低圧封着ガラス管壁に形成した。ナノワイヤーの構造をTEMで観察し、直径10-30nmで長さ2-4μmのナノワイヤーあるいは「筍状」ナノワイヤーを確認した。後者はZnOで初めて観察されたナノ形態であった。高分解能TEM観察の結果、得られたナノワイヤーはZnとOの規則的積層を有すること、成長方位は[001]で有ることが確認された。また、「筍状」のワイヤーの「節」の形成には、ZnとO層の劈開や積層欠陥が密接に関連することが明らかに出来た。またこれらのPLは390nmを中心とする強く狭いUVバンドと515nmを中心とする弱くて幅広の緑色バンドから成ることを得た。

この光クロミックの色変化原理は、銀微粒子の表面プラズモン吸収による励起電子がチタニア膜上の吸着酸素に蓄積(スパーラディカル化)され銀粒子が正にイオン化することによるものと考えられた。c)ZnOナノ構造の作製とその構造・光学特性評価低真空加熱炉に150ml/minの酸素ガスを流入させ、ZnO粉末と炭素の混合原料を加熱し、熱還元反応及び蒸気輸送蒸着法により炉の非加熱部に設置した基板上にZnOのナノ構造を形成した。ZnOナノロッドが融合してあたかも蜂の巣構造の壁(厚:80-100nm、深さ:1700nm)を形成し、かつ20-200nm径の空洞が層を通して穿かれている構造では、Nd-YAGの3倍波(355nm)の照射によって紫外光領域でランダムレーザ発振が閾値0.38MW/cm^2で確認された。
MET誘導物質の探索とがん治療薬への開発

近年、制がん剤耐性を獲得した悪性がん細胞ではEMTが誘導されていることが報告されているが、そのEMT誘導メカニズムについては不明な点が多く残っていた。本研究ではまずシスプラチン持続暴露によってEMTが誘導されたがん細胞を樹立することに成功した。さらに樹立した細胞に対し、ケミカルゲノミクスの手法を用いて以下の事を明らかにした。すなわち、制がん剤耐性の獲得に伴うEMT誘導のメカニズムの一つとして、シスプラチンを添加することでTGF-β産生の増加によるTGF-βシグナルが亢進し、これによってEMTが誘導、そして制がん剤耐性を獲得する、というモデルを提唱した。EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition)とは上皮がん細胞が間葉系細胞へとその形質を転換する現象で,EMTが誘導されたがん細胞は高い運動能や薬剤耐性などの悪性度を獲得するため,がん治療を困難にする.よって,EMTの逆プロセスであるMET誘導物質はがん細胞の悪性度を減衰させる新しいタイプの抗がん剤として期待できる.そこでまずは,抗がん剤耐性とEMTの関係に着目したMET誘導物質の探索系の構築を行った.これまで抗がん剤耐性になったがん細胞ではEMTが誘導されていたとの報告があるため(1),まずは様々ながん細胞に様々な抗がん剤を長時間暴露して薬剤低感受性細胞の樹立を試みた.その結果,シスプラチン(CDDP)をヒト大腸上皮がんLoVo細胞に約3ヶ月暴露し続けることでCDDP低感受性なLoVo細胞(LoVo-CDDP細胞)を複数クローン得た.これらクローンの多くは細胞間接着が失われて間葉系細胞様へと形態変化し,さらに上皮マーカーE-Cadherinの発現が減少するとともに間葉マーカーN-cadherinやVimentinの発現が増加していたことから,これらのクローンでは期待通りEMTが誘導されていた.さらにLoVo-CDDP細胞では,EMTを促進させる転写因子TWISTも高発現していた.また,EMTが誘導されて間葉細胞の形質を示したクローンほどCDDPに対する感受性も低かったことから,EMT誘導とCDDP感受性が相関していると示唆された.以上より,LoVo-CDDP細胞にMETを誘導して上皮細胞の形質に戻す物質はCDDP感受性を増強することが期待でき,抗がん剤耐性を克服するシーズ薬になること考えられる.EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition)とは上皮がん細胞が間葉系細胞へとその形質を転換する現象で,EMTが誘導されたがん細胞は高い運動能や薬剤耐性などの悪性度を獲得するためがん治療を困難にする.よって,EMTの逆プロセスであるMET誘導物質はがん細胞の悪性度を減衰させる新しいタイプの抗がん剤として期待できる.これまで我々は,抗がん剤耐性とEMTの関係に着目し,シスプラチン(CDDP)耐性大腸がんLoVo細胞を樹立した(LoVo-CDDP細胞).そして種々のEMTマーカータンパク質の発現を評価したところ,LoVo-CDDP細胞は間葉系の形質を獲得した細胞であること明らかにした.そこでこのLoVo-CDDP細胞にMETを誘導させる物質を,上皮マーカーE-cadherinの発現回復及び間葉マーカーN-cadherinの発現減少を指標に文科省・化学療法基盤支援活動班が配布している標準阻害剤キットSCADsから探索した.その結果,TGF-β受容体を阻害するSB431542,TGF-βRI kinase inhibitorII,およびPP1 analogの3化合物にLoVo-CDDP細胞にMETを誘導する活性があることを見出した.TGF-βは代表的なEMT誘導因子の一つとして知られていることから,LoVo-CDDP細胞はTGF-βシグナルが亢進しており,このことがEMT誘導された原因と考えられる.実際にLoVo-CDDP細胞ではTGF-β産生量が亢進していることがわかった.さらに,LoVo細胞にCDDPを添加すると72時間後に培養液中に含まれるTGF-β量が上昇することも見出した.以上の結果より,CDDPを持続暴露することで取得したLoVo-CDDP細胞ではCDDP添加によってTGF-βが産生されてTGF-βシグナルが亢進しており,これによってEMTが誘導・維持されていること,また今回ヒットしたTGF-β&#61522;阻害剤はLoVo-CDDP細胞で亢進しているTGF-βシグナルを阻害することでMETを誘導していることが示唆された.本年度の大きな目標は,より病理モデルに近いLoVo-CDDP細胞が間葉系の形質を示すメカニズムを明らかにすることだった.そして文科省・化学療法基盤支援活動班が配布している標準阻害剤キットを用いた解析により,抗がん剤耐性を獲得する過程でTGF-βシグナルの活性化を見出した.この知見は抗がん剤耐性に伴うEMT誘導機構の解析に有用であると考えられる.EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition)はがん細胞の遊走・浸潤のみならず,薬剤耐性やがん幹細胞形成にも関与し,がんの悪性化と密接に関わっていることが明らかになりつつある.しかしながら,悪性化の過程でどの様にEMTが誘導されるのかその分子機構については不明な点が多いのが現状である.

したがって,EMTを制御する化合物はEMT誘導機構を解明するための良いバイオプローブになるばかりでなく,悪性化したがんに対する新しいタイプの制がん剤になることも期待される.本研究では,ヒト大腸がんLoVo細胞に制がん剤シスプラチンを3ヶ月持続暴露するとEMTが誘導された悪性がん細胞にその形質が転換することを見出したので(CDDPr/LoVo細胞),CDDPr/LoVo細胞の形質を再び上皮の形質に戻す化合物を探索した.その結果,SB431542やTGF-βRI kinase inhibitorIIなどいずれもTGF-β受容体を阻害する化合物がヒットした.これらのことから,CDDPr/LoVo細胞ではTGF-βシグナルが亢進していることが考えられ,実際にCDDPr/LoVo細胞の培養液中のTGF-β量はLoVo細胞よりも増加していた.さらには,LoVo細胞にシスプラチンを添加すると3日後には培養液中のTGF-β量が優位に増加していた.これらのことから,シスプラチンを添加するとTGF-β分泌が亢進し,その結果EMT誘導とシスプラチン耐性を獲得したことが示唆された.近年、制がん剤耐性を獲得した悪性がん細胞ではEMTが誘導されていることが報告されているが、そのEMT誘導メカニズムについては不明な点が多く残っていた。本研究ではまずシスプラチン持続暴露によってEMTが誘導されたがん細胞を樹立することに成功した。さらに樹立した細胞に対し、ケミカルゲノミクスの手法を用いて以下の事を明らかにした。すなわち、制がん剤耐性の獲得に伴うEMT誘導のメカニズムの一つとして、シスプラチンを添加することでTGF-β産生の増加によるTGF-βシグナルが亢進し、これによってEMTが誘導、そして制がん剤耐性を獲得する、というモデルを提唱した。本年度の大きな目標は,より病理モデルに近いMET誘導物質の探索系構築であった.この点について,目標は達成出来た.また一方で,構築したLoVo-CDDP細胞が何故故に間葉系の形質を示すのか,そのメカニズムの可能性の一つとして,文科省・化学療法支援班が配布している標準阻害剤キットを用いた解析よりTGF-βシグナルの活性化を見出した.この知見は抗がん剤耐性に伴うEMT誘導機構の解析に有用であると考えられ,研究方策を定めることが出来た点で前進である.現在までに構築したLoVo-CDDP細胞を用いて,引き続きMET誘導物質の探索を行う.スクリーニングソースは,当研究室が保有する放線菌ライブラリーおよび擬似糖ライブラリー(小川誠一郎慶大名誉教授が合成)を用いる.また,放線菌サンプルの場合,細胞毒性物質が含まれるためにMET誘導活性が隠れてしまう可能性がある.その場合はサンプルをフラクション化してアッセイすることも視野に入れている.さらにこれまでに,構築したLoVo-CDDP細胞を用いて標準阻害剤キットからMET誘導物質をスクリーニングした結果,TGF-β受容体阻害剤以外にもROCK阻害剤がヒットしている.ROCK阻害剤によるMET誘導機構も解析する計画である.以上,これまでのTGF-β受容体阻害剤によるMET誘導機構の解析結果と併せて抗がん剤耐性によるEMT誘導機構の全容を明らかにする計画である.ケミカルバイオロジー現在までに構築したLoVo-CDDP
多因子疾患の先駆けと17の1型糖尿病遺伝子のクローニング

遺伝因子と環境因子の相互作用により発症し、しかも遺伝因子が複数の疾患感受性遺伝子により構築されている多因子疾患である1型糖尿病の遺伝子解析を効率よく進めることを目的として、従来単一遺伝子疾患に用いられてきた手法とは異なる新たな解析ストラテジーをモデル動物・ヒトの両面から構築し、糖尿病の疾患感受性遺伝子の解析に応用した。1型糖尿病のモデル動物であるNODマウスで第17染色体上にマップしたIdd16のコンジェニックマッピングを進め、領域を局在化させるとともに、候補遺伝子であるTnfの機能解析を行った結果、Idd16そのものである可能性は低いことを明らかにした。第3染色体上にマップされているIdd3の候補遺伝子インターロイキン2(II2)に関して、NODと同一の変異を有し、かつ周辺の遺伝マーカーがNODと異なる組換え染色体をNODに導入したコンジェニックマウスをスピードコンジェニック法を用いて作製した結果、NODと同等の表現型を再現したことからII2がIdd3そのものである可能性を示した。1型糖尿病は遺伝因子と環境因子の相互作用により発症し、しかも遺伝子が複数の疾患感受性遺伝子により構築されている多因子疾患である。このような多因子疾患の遺伝子解析を効率よく進めることを目的として、従来単一遺伝子疾患に用いられてきた手法とは異なる新たな解析ストラテジーをモデル動物・ヒトの両面から構築し、糖尿病の疾患感受性遺伝子の解析に応用した。1型糖尿病のモデル動物であるNODマウスで第3染色体上にマップされているIdd3の候補遺伝子インターロイキン2(I12)に関して、NODと同一の変異を有し、かつ周辺の遺伝マーカーがNODと異なる組替え染色体を有する系統(IISマウス)をNOD関連系統の中に見出した。IISマウスの第3染色体をNODに導入したコンジェニックマウスをスピードコンジェニック法を用いて作製し、表現型を小生に解析した結果、NODと同等の1型糖尿病発症率を示したことからI12がIDD3そのものである可能性を示した。また、我々が新たに見出し、その局在を解析しているMHC領域の1型糖尿病遺伝子の第2のコンポーネントIDD16に関して、ヒト対応領域に存在する候補遺伝子の検索を進めた結果、class I HLA領域に存在しNK cellの活性化に関与するMICA(MHC-class I chain-related gene A)の多型が1型糖尿病の多様性、特に発症年齢に関連することを見出した。
解糖系を標的とした頭頸部癌に対する新規治療法の実現可能性の検証

癌の糖代謝では解糖系が亢進しており、解糖系は癌の治療標的となる可能性がある。我々は解糖系の最終経路で乳酸を細胞外に排出するMCT4に着目し、MCT4を標的とした治療の可能性を検証した。MCT4ノックアウトマウスを作製したところ運動能の低下など重篤な表現型を認めず、MCT4標的治療は許容されることが示された。一方、頭頸部扁平上皮癌培養細胞株を用いMCT4の発現をCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いてノックアウトした実験系を現在開発中であり、今後この系を用いてMCT4を抑制すると放射線感受性が高まるかなど様々な検証を行う予定である。頭頸部扁平上皮癌の皮下移植腫瘍モデルにsiRNAを投与してMCT4のノックダウンを行う実験系の開発が難航した。そこで、頭頸部扁平上皮癌培養細胞株を用いMCT4の発現をCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いてノックアウトした頭頸部扁平上皮癌培養細胞株を樹立し、in vivo実験を行う方針とした。間もなくノックアウト株が樹立できる見込みである。MCT4コンディショナルノックアウトマウスおよびノックアウトマウスの作製にあたりMCT4のスタートコドンを含むexonはexon3であったためexon4を挟む領域を認識するようgRNAを設計した。MCT4 exon4をターゲットとしたCRISPR/Cas9とflox配列を含んだ1本鎖DNA断片を2分裂期の胚細胞に同時にマイクロインジェクションしMCT4 exon4をターゲットとしたfloxノックインマウスを作製した。また、同領域がlarge deletionされたMCT4 exon4ノックアウトマウスも作製した。F0マウスとして12 line作製したが、F1マウスのジェノタイピングによりfloxノックインマウスは1 line、ノックアウトマウスは1 line得ることができた。他の10 lineはすべてmosaicマウスであった。matingを継続し、現在homoノックアウトマウスを5匹得ることができた。homoノックアウトマウスに関しては、SPF管理環境化ではWTマウスと比較して特に著変なく成長している。floxノックインマウスに関しては現在mating中であるが、安定してhomoノックインマウスが得られるようになればUBC Cre-ERT2マウスを交配しMCT4コンディショナルノックアウトを作成する予定である。頭頸部扁平上皮癌の皮下移植腫瘍モデルにsiRNAを投与してMCT4のノックダウンを行う実験系の開発が難航したが、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いてMCT4をノックアウトした頭頸部扁平上皮癌培養細胞株を樹立する方針とし、その作製は概ね順調に推移している。また、MCT4ノックアウトマウスについては既にhomoノックアウトマウスが得られており、今後十分な数が得られる見込みである。MCT4コンディショナルノックアウトマウスの作製は中途であるが、順調に推移している。我々はこれまでにFDGの取込みで規定されるmetabolic tumor volume (MTV)が頭頸部扁平上皮癌の独立した予後因子であることを明らかにしてきた。我々は更にグルコースを細胞内に輸送するトランスポーターであるGLUT1をノックダウンすると癌細胞の増殖が抑制され放射線感受性が高くなることを確認した。これは糖代謝が癌治療の標的となることを示唆するものであるが、GLUT1は正常細胞でも広く発現することから、これを治療標的とすることは不可能である。そこで癌細胞で亢進している解糖系に着目し、その最終経路で乳酸を細胞外に排出するトランスポーターであるMCT4に着目し本研究を計画した。本研究では、1)頭頸部扁平上皮癌の皮下移植腫瘍モデルにsiRNAを投与してMCT4をノックダウンして腫瘍の増殖が抑制され放射線感受性も高くなること、2)MCT4ノックアウトマウスを作製して表現型を解析し、MCT4を治療標的としても問題が無いこと(MCT4標的治療で重篤な合併症が出ないこと)、を証明することを目的とした。皮下移植腫瘍モデルの実験系は開発が難航したため、頭頸部扁平上皮癌培養細胞株を用いMCT4の発現をCRISPR/Cas9遺伝子編集システムを用いてノックアウトした実験系の開発を行った。ベクターをlipofectinで導入し数千例のスクリーニングを行ったがクローンを樹立することは困難であったため、現在electroporationの条件最適化を完了し、スクリーニングを進める予定である。一方、MCT4ノックアウトマウスのホモ個体は問題無く作製することができた。予想された運動能の低下などは認めなかった。現在はメタボローム解析の準備を進めている。こうしたことからMCT4を治療標的とすることは合理的と考えられるが、更なる研究の継続が必要である。homoノックアウトマウスの各臓器におけるMCT4のタンパク・mRNAの発現を評価し、表現型の解析を行っていく。

更に、乳酸産生が誘導される環境下でどのような表現型が表出されるか解析を行う。floxノックインマウスに関してはhomoノックインマウスが得られるようになればUBC Cre-ERT2マウスを交配しMCT4コンディショナルノックアウトを作製した上で、同様の解析を行う。耳鼻咽喉科siRNAを投与するin vivo実験系の変更に伴い、試薬の購入額が減少したため。本来、配分額だけでは不足する研究内容なので、その充足にあてる。