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西洋磁器の製造における柿右衛門様式磁器が与えた影響

1.柿右衛門様式磁器土型の調査研究赤絵町遺跡から出土した柿右衛門様式磁器色絵婦人像の土型の調査(撮影及び計測、所見の記録等)を行った。併せて赤絵町遺跡出土の陶片、近隣の幸平遺跡出土の色絵人形の土型も調査した。土型を使用した成形は現在行われておらず、この調査によって不明確だった成形方法が明らかとなった。2.土人形の調査及び柿右衛門様式磁器との比較研究土人形と柿右衛門様式磁器人形には、成形方法が類似していることから関連性があると考え、全国の土人形の元祖といわれる京都の伏見人形窯元丹嘉(寛永年間創業)と、輸出港であった長崎の古賀人形窯元小川家(伝文禄元年創業)を訪問し、丹嘉及び小川家の歴史や製作について、ヒアリング調査を行った。比較研究では、柿右衛門様式磁器人形と土人形を技術面から比較し、その結果、柿右衛門様式磁器人形と土人形は土型自体の成形方法が異なりそれぞれの源流は異なることが判明した。また、柿右衛門様式磁器人形は早くに分割して制作していたことから、当時特徴的な人形であったことが分かった。3.柿右衛門様式磁器の資料収集柿右衛門様式磁器の資料収集を行なった。柿右衛門様式磁器を所有する、個人、九州陶磁文化館、栗田美術館、ボストン美術館、メトロポリタン美術館、バークコレクション、フリーア美術館の調査(撮影及計測、所見の記録等)を行なった。柿右衛門様式磁器人形の再現製作上記12の研究をもとに、3の柿右衛門様式磁器人形の再現製作を行った。モデルを九州陶磁文化館の「色絵葡萄文婦人立像」とし、原型製作に本学柿右衛門様式陶芸研究センターの非接触3次元デジタイザとNC加工機を使用した。その原型をもとに、土型(雄型・雌型)製作、型押し成形、素焼、釉薬調合、施釉、本焼焼成を行い人形を完成させた。本研究は、柿右衛門様式磁器の中でも型物製品に着目し、これらの輸出先であった西洋に型物がどのような影響をもたらしたのか技術的な観点から考察するものである。本年度は、柿右衛門様式磁器の型物である特に人形の型成形方法について調査研究を行った。柿右衛門様式磁器の人形の型成形方法は現在使用されておらず、その方法についての詳細は明らかではない。そのため、有田町歴史民俗資料館、酒井田柿右衛門家、佐賀県立九州陶磁文化館、福岡市美術館、大阪市東洋陶磁美術館、愛知県陶磁資料館等の諸機関へ赴き、有田町出土の土型や陶片、日本に遺る伝世品の資料調査を行った。さらに、現在でも柿右衛門様式磁器の人形と同じ成型方法を用いて製作する土人形も調査し、柿右衛門様式磁器の人形の成形方法の分析を行った。又、九州陶磁文化館蔵の「色絵葡萄文婦人立像」を元にNCを使用した再現製作に取り組み、本年度は、原型の製作、土型の製作まで実施した。その結果、柿右衛門様式磁器の人形は、頭部・胴部・手部に分割し成形されていたことが判明した。これは、同成形方法である当時の土人形には見られない特徴であり、柿右衛門様式磁器の人形が他の型成形による日本人形にも見られないため、日本人形史において当時の新しい技法であったことが明らかとなった。又、柿右衛門様式磁器の人形の衰退理由を色絵婦人像の変遷から考察した結果、西洋人にとって色絵婦人像の形状は変化に乏しく、そのため、装飾華美を好む西洋において衰退していった一因であるという結論に至った。しかしながら、西洋では17世紀後半に日本から多数の人形を輸入し西洋において磁器生産が始まってから現在に至まで、磁器人形が盛んに生産され続けている。そのため、次年度は柿右衛門様式の型物が西洋の型物に与えた影響について、今年度の調査研究を基に再現製作と併せ、西洋の技術について研究を行う。

モデルを九州陶磁文化館の「色絵葡萄文婦人立像」とし、原型製作に本学柿右衛門様式陶芸研究センターの非接触3次元デジタイザとNC加工機を使用した。その原型をもとに、土型(雄型・雌型)製作、型押し成形、素焼、釉薬調合、施釉、本焼焼成を行い人形を完成させた。
非コードRNA Xistを制御するタンパク質複合体の探索

本研究では哺乳類雌におけるX染色体不活性化に着目し、この現象の必須因子であるノンコーディングRNAの一種、Xist RNAの制御機構解明を通じ、新たな側面からエピジェネティクスを理解することを目指した。昨年度までに研究代表者は、Xist RNA局在制御因子としてRNA結合タンパク質hnRNP Uを見出しており、分子生物学的手法を用いてhnRNPUとXist RNAとの相互作用を検証し、hnRNP UがX染色体不活性化に必須であることを明らかにした。これらの研究成果はDevelopmental Cell誌に発表した。本年度はXist RNAとhnRNP Uの相互作用のより詳細な解析を行った。また、siRNAライブラリを用いて新奇Xist RNA制御因子の探索を行った。研究成果について、以下に示す。1.XistRNA上のhnRNPU結合領域を絞り込んだ2.hnRNP UのRNA結合ドメイン内のXist RNAとの相互作用に必要な領域を絞り込んだ3.エピジェネティックな遺伝子発現制御に関わることが示唆されている他の長鎖ノンコーディングRNAについて、Xist RNAと同様にhnRNP Uによる制御を受けていることを明らかにした4.siRNAライブラリによるノックダウンとqPCR法を組み合わせたスクリーニングにより、RNAヘリカーゼの一種がXist RNAの量的制御に関与している可能性を見いだした3の研究成果については特に特筆すべきであり、これはhnRNP UによるXistRNA制御機構がX染色体不活性化のみならず、他の生命現象に対してもより一般的に使われている可能性を示唆するものである。本研究は、ノンコーディングRNAを通じたエピジェネティックな遺伝子発現制御機構の詳細解明に大きく貢献したものと考える。本研究は哺乳類雌におけるX染色体不活性化に着目し、この現象の必須因子として知られる非コードRNAであるXistの制御機構の解明を通じてエピジェネティクスの理解への貢献を目指したものである。研究代表者は、これまでにXist RNA制御因子の候補としてRNA結合タンパク質hnRNP Uを見出しており、本年度はhnRNP UによるXistRNA制御槻構の詳細、ならびにX染色体不活性化への関与について解析を行った。本年度の研究成果について、以下に示す。(1)Xist RNAとhnRNP Uとの相互作用をCLIP(Crosslinking and Immunoprecipitation)法を用いて明らかにした(2)ES細胞においてXist RNAのX染色体への局在化がhnRNP Uに依存することを明らかにした本成果は非コードRNA Xistの局在制御に開わるタンパク質の同定としては初めての報告であり、X染色体不活性化を担う分子機構の新たな側面を明らかにした。長鎖非コードRNAによるエピジェネティックな遺伝子発現制御に開する報告は近年増加傾向にありX染色体不活性化に留まらず、より多様な場面において生命現象を支えていることが予想される。本研究成果は非コードRNA制御機構の一端を明らかにしたことに特色があり、当該分野の理解の進展に大きく貢献することが期待される。
戦前日本の外米輸入―米不足の構造と輸入補填（明治初年～戦時の実証的・総合的研究）

本研究は、戦前期の日本において、東南アジアからの「外米」輸入が断続的に活発化した現象を対象にして、(a)主食である米の需給構造とその特質、(b)外米取引の展開とその担い手、(c)質的に国内産米と異なる外米の消費の実態、についての実証的考察とを目的とする。本年度の研究実績は次の通りである。1.資料の調査・収集:上記(a)について、前年度より継続し、東京とその周辺の資料所蔵機関において、統計資料、農業・食糧・貿易政策の関係資料等を調査・収集した。(b)について、国内では、前年度に引き続き、(a)と同様の諸機関において関係資料等を、デジタル化資料も含め調査・収集した。また海外では、英国ロンドンの国立公文書館National Archivesにおいて、外米産地の英領ビルマや、取引の拠点香港など東アジアの英国外交官の報告書等を、また大英図書館British Libraryにおいて、「インド省文書」などから、ビルマの米生産・流通関係の諸資料を調査し撮影により収集した。(c)戦前期の米・小麦等をめぐる国内の主食消費の特質やその変化、地域性等について、新聞記事、経済雑誌記事等を調査・収集を継続した。2.収集資料の整理・分析:海外収集資料については、撮影データをリストを作成するほか、収集資料のスキャニングによる電子化・整理、文字・数値データの入力作業を行った。また、1880年代90年代を中心に、外米輸入の本格化について、収集資料の整理・分析をすすめた。3.研究成果の公表:米穀輸出が活発化した1890年代末からから輸入が急増する1890年代初頭の変化に注目し、米穀輸入の急増が可能になった諸条件を解明するため、当時の貿易統計、経済雑誌、政府関係の諸刊行資料などにより論文を作成して公刊した。本研究は、戦前期の日本において、植民地(朝鮮・台湾)からの米移入と比較し研究が手薄な、東南アジア諸地域からの「外米」輸入が断続的に活発化した現象について、(a)主食(米)需給の構造とその特質、(b)外米取引の展開とその担い手、(c)質的に国内産米と異なる外米の消費の実態、について考察することを目的とする。1.資料の調査・収集:上記の(a)について、東京・大阪周辺の資料所蔵機関において、米生産・貿易・輸送等の基本的な統計資料、及び農業・食糧・貿易政策に関する関係資料等を調査・収集した。(b)について、国内では、(a)に記した機関所蔵において、公文書・外交文書・調査報告書・同時代刊行資料等を、デジタル化資料も含めて調査・収集し、海外では、英国ロンドンの英国国立公文書館National Archives、大英図書館British Libraryが所蔵する、植民地ビルマ等の東南アジアの米産地、米貿易に関する公文書・外交文書・調査報告書等の一次資料、同時代の活字資料・刊本等を調査・収集した。(c)戦前期の主食米・小麦等をめぐる国内の食生活の特質や変化、地域性について、同時代の新聞記事、官庁・団体等の行政文書・調査報告書、同時代の刊本・雑誌等を調査・収集した。2.収集資料の整理・分析:海外で収集した資料について、1件ごとに撮影リストを作成した。統計数値・基本資料等については入力作業を行った。文献複写等で収集したものは多量であり、電子化(スキャニング)等により、デジタル化資料とともに整理した。収集した諸資料について総合的に分析した。3.研究成果の公表:1920年代において、海外産の外米・外麦(小麦)の対日輸入を主導した日系商社の具体的活動を、小麦取引等についてを実証的に検討し、論文を作成して公表した。資料調査について、本年度、米国国立公文書館の所蔵資料の調査・収集を予定したが、日程等の都合により、次年度に実施することとした。研究成果の公表について、本年度執筆予定の論文1本については、執筆の準備を整えたが、完成・公開を次年度とした。それ以外は、順調に進展している。本研究は、戦前期の日本において、東南アジアからの「外米」輸入が断続的に活発化した現象を対象として、(a)主食(米)需給の構造とその特質、(b)外米取引の展開とその担い手、(c)質的に国内産米と異なる外米の消費の実態、についての実証的考察とを目的とする。本年度の研究実績は次の通り。1.資料の調査・収集:上記(a)について、前年度より継続して、東京およびその周辺の資料所蔵機関が所蔵する統計資料、及び農業・食糧・貿易政策の関係資料等を調査・収集した。(b)について、国内では、(a)の諸機関において、公文書・外交文書・報告書・同時代刊行資料等を、デジタル化資料も含め、それぞれ前年度から継続して調査・収集した。また海外では、米国議会図書館Library of CongressのAsian Divisionが所蔵する東アジア関係資料、米国国立公文書館National ArchivesのRecord Group 166に収められた、外米産地に駐在する外交官の報告書、外務省との往復書類等を調査・収集した。(c)戦前期の米・小麦等をめぐる国内の主食消費の特質やその変化、地域性等について、新聞記事、報告書、雑誌記事等を調査・収集した。2.収集資料の整理・分析:海外収集資料については撮影データをリストを作成して整理し、統計数値・基本資料等についても収集資料の整理と入力作業を進めた。特に、外務省外交史料館に、1910年代末の外米輸入について、産地側政府との交渉に関する外交文書が多数存在することが判明した。収集・整理した諸資料について総合的に分析した。

3.研究成果の公表:外米輸入が急増した1910年代末において、外米産地駐在の外交官が展開した対日輸出の実現・促進をはかる交渉等について、主として日本側の外交文書等により実証的に検討し、論文を作成して公表した。資料調査について、本年度予定した米国国立公文書館、米国議会図書館の所蔵資料の調査・収集を実施した。関係資料の点数が予想以上に多かった議会図書館については、2回(8月、3月)調査を実施した。研究成果の公表について、前年度執筆予定の論文を、今年度執筆の論文と一体化させて構成し公刊した。全体として、ほぼ予定どおりに進捗した。本研究は、戦前期の日本において、東南アジアからの「外米」輸入が断続的に活発化した現象を対象にして、(a)主食である米の需給構造とその特質、(b)外米取引の展開とその担い手、(c)質的に国内産米と異なる外米の消費の実態、についての実証的考察とを目的とする。本年度の研究実績は次の通りである。1.資料の調査・収集:上記(a)について、前年度より継続し、東京とその周辺の資料所蔵機関において、統計資料、農業・食糧・貿易政策の関係資料等を調査・収集した。(b)について、国内では、前年度に引き続き、(a)と同様の諸機関において関係資料等を、デジタル化資料も含め調査・収集した。また海外では、英国ロンドンの国立公文書館National Archivesにおいて、外米産地の英領ビルマや、取引の拠点香港など東アジアの英国外交官の報告書等を、また大英図書館British Libraryにおいて、「インド省文書」などから、ビルマの米生産・流通関係の諸資料を調査し撮影により収集した。(c)戦前期の米・小麦等をめぐる国内の主食消費の特質やその変化、地域性等について、新聞記事、経済雑誌記事等を調査・収集を継続した。2.収集資料の整理・分析:海外収集資料については、撮影データをリストを作成するほか、収集資料のスキャニングによる電子化・整理、文字・数値データの入力作業を行った。また、1880年代90年代を中心に、外米輸入の本格化について、収集資料の整理・分析をすすめた。3.研究成果の公表:米穀輸出が活発化した1890年代末からから輸入が急増する1890年代初頭の変化に注目し、米穀輸入の急増が可能になった諸条件を解明するため、当時の貿易統計、経済雑誌、政府関係の諸刊行資料などにより論文を作成して公刊した。本研究課題の「研究計画調書」において、次年度に実施予定の仏国国立海外文書館の調査については、本年度末までにその必要性を判断するとしていた。本年度に実施した資料調査・収集(特に海外の資料調査・収集)の実績、及び仏国同文書館の資料所在状況の調査をふまえて、次年度の海外の資料調査先として、米国国立公文書館を優先することとした。米国同文書館において、1920年代30年代の、東南アジアの農業事情に関する報告書等を調査・収集する予定である。基本的には、研究計画書に従って本研究を続ける。次年度は最終年度であり、海外・国内ともに資料の補充調査・収集を行う。特に、研究計画の(i)の時期(明治前期)の資料が限られており、所在調査を促進して収集をはかりたい。また、研究目的が達成されるよう、収集した資料の分析を進めて、論文を作成する。
TAK-1を標的とした骨破壊抑制と骨形成誘導活性を併せ持った新規抗腫瘍療法の開発

多発性骨髄腫は骨破壊を来す難治性悪性腫瘍であるが、腫瘍抑制と骨病変に骨再生をもたらす治療法の開発が喫緊の臨床課題である。申請者は、骨髄腫の腫瘍進展と骨破壊・喪失をもたらす細胞内シグナルに関わる枢軸的な因子としてTAK1を見出し、TAK1阻害により腫瘍抑制のみならず、TAK1阻害薬は骨芽細胞分化を促進させ、破骨細胞分化を抑制することから、骨病変形成も抑制することが明らかとなった。今年度は、それらの結果についての詳細な機序の解析を行い、以下の結果が得られた。1.骨髄腫患者組織アレイの結果を詳細に解析した結果、再発例になるほどTAK1のリン酸化が亢進しており、TAK1のリン酸化の程度と予後とに関連性があることが示唆された。2.腫瘍細胞のTAK1を阻害するとVEGFの発現が顕著に抑制された。3.腫瘍細胞のTAK1を阻害するとβ-1インテグリンの発現が抑制されることが前年度明らかとなったが、実際に骨髄間質細胞を用いてadhesion assayを行ったところ、顕著に腫瘍細胞の骨髄間質細胞への接着が抑制されていた。4.前年度には骨髄腫モデルマウスを用いてTAK1阻害剤の抗腫瘍効果と骨再生効果が認められた。骨への作用が直接的かを検討するために、骨粗鬆症モデルマウスを用いてTAK1阻害剤の治療効果を検討したところ、各種骨バラメータの回復が認められた。また、関節リウマチモデルにおいても治療群において骨破壊の抑制が認められた。現在、骨形態計測による詳細な解析を行っている途中である。当初の予定より早く、予想どうりの結果が得られ、既に学術論文への投稿を済ませた。また、TAK1は通常リン酸化されると速やかに脱リン酸化されるが、本研究により、腫瘍細胞では恒常的にリン酸化されていることが明らかとなった。そこで申請者は脱リン酸化酵素の活性の減弱によりTAK1が恒常的にリン酸化しているのではないかと考え、新たに研究を進めている。ほぼすべての項目について解析が終わったが、骨系細胞への直接作用を検討する必要が生じたため、TAK1の骨芽細胞分化および破骨細胞分化の役割をin vitroのみならず、in vivoで詳細に解析する必要がある。したがって、関節リウマチモデルや骨粗鬆症モデルを用いてTAK1阻害剤の治療j効果と、骨系細胞へ及ぼす影響について、組織学的解析を中心に行う。また、タンパク質脱リン酸化酵素に焦点を当て、TAK1の恒常的なリン酸化の機序の解明を行う。口腔癌の骨転移や多発性骨髄腫は骨破壊を来す難治性悪性腫瘍であるが、腫瘍抑制と骨病変に骨再生をもたらす治療法の開発が喫緊の臨床課題である。申請者は、とりわけ広範な骨破壊を来たす骨髄腫の腫瘍進展と骨破壊・喪失をもたらす細胞内シグナルに関わる枢軸的な因子としてセリンスレオニンキナーゼTAK1を見出した。そこで本研究では、TAK1の腫瘍の進展と骨破壊・喪失における役割を分子生物学的に明らかにするとともに、TAK1を標的とすることにより新規の機序で腫瘍抑制を図りつつ、骨吸収を抑制するとともに骨喪失部に骨再生を誘導するというこれまでに開発されることのなかった画期的な作用を発揮する治療法を開発し、動物モデルで実証することを目的として、研究を遂行している。平成28年度は以下の事象が明らかとなった。1.腫瘍細胞においてTAK1の発現とリン酸化が亢進していた。また、TAK1阻害薬LLZ1640-2 (LLZ)やTAK1ノックダウンにより、腫瘍細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導した。2. TAK1阻害により腫瘍からのVEGF産生や生存に重要なBCMAやTACIの発現を抑制した。3. LLZは、in vitroにおいて腫瘍細胞培養上清の添加下で抑制された骨芽細胞分化を回復した。4. TAK1阻害はRANKLによる破骨細胞形成を抑制した。これは、TAK1がRANK/RANKLシグナルを媒介する重要な因子であることが考えられた。5. LLZはマウス骨髄腫モデルにおいて腫瘍の縮小と骨破壊病変形成を抑制した。本研究の検討事項は1.骨髄腫による骨吸収の亢進と骨形成の抑制におけるTAK1の分子生物学的役割の解明とTAK1の阻害の破骨細胞と骨芽細胞分化に及ぼす影響2.骨髄腫の腫瘍進展・薬剤耐性におけるTAK1の分子生物学的役割の解明とTAK1の阻害の抗腫瘍効果の検討3.TAK1阻害で誘導した成熟骨芽細胞の腫瘍抑制活性の検討とその分子機序の解明4.TAK1阻害薬の骨髄腫動物モデルでの抗腫瘍作用と骨病変の進展防止・骨再生作用の検討であるが、各検討事項の基軸となる結果はほぼ得ることができた。申請者は、とりわけ広範な骨破壊を来たす骨髄腫の腫瘍進展と骨破壊・喪失をもたらす細胞内シグナルに関わる枢軸的な因子としてセリンスレオニンキナーゼTAK1を見出し、前年度は本研究課題の基軸となる結果を得ることができた。1.骨髄腫患者の組織アレイを作成し、免疫染色でTAK1のリン酸化を検出したところ、50例中42例にTAK1リン酸化の亢進が認められた。2.TAK1阻害薬LLZ1640

-2 (LLZ)やTAK1ノックダウンによる腫瘍細胞の増殖を抑制やアポトーシスの誘導は、抗アポトーシス因子であるPIM2やsp1の発現低下により引き起こされることがわかった。3. TAK1阻害により腫瘍細胞の接着分子であるβ-1インテグリンの発現が抑制された。また、骨髄間質細胞に発現するそのリガンドであるVCAM-1の発現もTAK1阻害により抑制された。これらの分子を介した骨髄間質細胞と骨髄腫細胞との接着により腫瘍細胞はCell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR)を獲得するが、TAK1阻害薬との併用によりCAM-DRが顕著に抑制されることが明らかとなった。4.腫瘍細胞により抑制された骨芽細胞分化はTAK1阻害により回復することが前年度明らかとなったが、これはTAK1阻害により骨芽細胞分化抑制系のシグナルであるTNFやTGFシグナルを抑制化する一方、促進系のシグナルであるBMP2シグナルを亢進され、骨芽細胞分化を回復することが明らかとなった。5.前年度においてLLZの治療効果を確認したが、組織学的解析(骨形態計測)により抑制された骨形成を回復し、骨吸収を抑制することが明らかとなった。本研究計画での主な4つの検討事項のうち1.骨髄腫による骨吸収の亢進と骨形成の抑制におけるTAK1の分子生物学的役割の解明とTAK1の阻害の破骨細胞と骨芽細胞分化に及ぼす影響2.骨髄腫の腫瘍進展・薬剤耐性におけるTAK1の分子生物学的役割の解明とTAK1の阻害の抗腫瘍効果の検討3.TAK1阻害薬の骨髄腫動物モデルでの抗腫瘍作用と骨病変の進展防止・骨再生作用の検討についてははほぼ結果が得られている。一方、TAK1阻害で誘導した成熟骨芽細胞の腫瘍抑制活性の検討とその分子機序の解明については現在解析を進めており、結果も少しではあるが得られてきている。また、実際の臨床検体を用いたTAK1の発現解析も結果が得られたことから、当初の計画以上に進展していると判断した。多発性骨髄腫は骨破壊を来す難治性悪性腫瘍であるが、腫瘍抑制と骨病変に骨再生をもたらす治療法の開発が喫緊の臨床課題である。申請者は、骨髄腫の腫瘍進展と骨破壊・喪失をもたらす細胞内シグナルに関わる枢軸的な因子としてTAK1を見出し、TAK1阻害により腫瘍抑制のみならず、TAK1阻害薬は骨芽細胞分化を促進させ、破骨細胞分化を抑制することから、骨病変形成も抑制することが明らかとなった。今年度は、それらの結果についての詳細な機序の解析を行い、以下の結果が得られた。1.骨髄腫患者組織アレイの結果を詳細に解析した結果、再発例になるほどTAK1のリン酸化が亢進しており、TAK1のリン酸化の程度と予後とに関連性があることが示唆された。2.腫瘍細胞のTAK1を阻害するとVEGFの発現が顕著に抑制された。3.腫瘍細胞のTAK1を阻害するとβ-1インテグリンの発現が抑制されることが前年度明らかとなったが、実際に骨髄間質細胞を用いてadhesion assayを行ったところ、顕著に腫瘍細胞の骨髄間質細胞への接着が抑制されていた。4.前年度には骨髄腫モデルマウスを用いてTAK1阻害剤の抗腫瘍効果と骨再生効果が認められた。骨への作用が直接的かを検討するために、骨粗鬆症モデルマウスを用いてTAK1阻害剤の治療効果を検討したところ、各種骨バラメータの回復が認められた。また、関節リウマチモデルにおいても治療群において骨破壊の抑制が認められた。現在、骨形態計測による詳細な解析を行っている途中である。
Tetraodon属魚類の塩分適応に関わる分子進化学的研究

本年度はTetraodon属魚類の系統類縁関係をさらに詳細に調べるために、既報のフグ科魚類のmtDNA全長塩基配列に基づき作製した分子系統樹と、先に我々が決定した塩基配列を合わせてsupermatrix解析を行った。その結果、T. cutcutiaを除き、アジア淡水域、アジア汽水域、アフリカ淡水域の3系統に分類された。すなわち、Tetraodon属魚類が単系統では無いことが示され、それら3系統の分子系統関係は属レベルで異なる可能性があることが示唆された。続いて、タイ東部で採取されたアジア淡水産のTetraodon属魚類について分子系統解析を行った。全ての試料魚はT. cohinchinensisとされていたが16S rRNAの部分塩基配列(573bp)を決定した結果、その塩基配列はT. cohinchinensisのものとは異なり、解析した12個体中2個体はT. abeiもしくはT. baileyiの配列と同一であった。さらに、その形態的特徴からT. abeiであると同定された。決定した部分塩基配列に基づき分子系統樹を作製した結果、全ての試料はアジア淡水域系統に分類された。さらに系統樹とアジア淡水域系統の各魚種の生息域の関係から他の10個体はT. cambodgiensisであると推定された。最後に、昨年度同定した塩分依存的に発現変動を示すミドリフグT.nigroviridisのミオシン重鎖遺伝子(MYH)アイソフォームであるTnMYH_<M2528-1>について、in situハイブリダイゼーションによりその発現分布を調べた。本遺伝子は筋隔膜中の細い筋繊維で強い発現が見られたが、既報のトラフグMYH_<M2528-1>の発現分布とは異なり速筋内部には観察されなかった。トラフグMYH_<M2528-1>は成長に関わると報告されており、ミドリフグにおいても本遺伝子は細い筋繊維で強い発現が見られたことから同様の働きをする可能性が示された。本年度は、Tetraodon属魚類および関連フグ科魚類の分子系統関係をsupermatrix解析により詳細に解析した。その結果、Tetraodon属魚類が単系統では無いことが示され、それら3系統の分子系統関係は属レベルで異なる可能性があるという大変興味深い結果が得られた。さらに、現地採集したTetraodon属魚類を対象に行った分子系統解析では、DNA分析が形態形質の酷似するTetraodon属魚類の分類に有用であることを示した。塩分依存的に発現変動を示すTnMYH_<M2528-1>について、in situハイブリダイゼーションによりその発現分布を調べた結果、既報のトラフグMYH_<M2528-1>の発現分布とは異なり速筋内部には観察されなかった。トラフグMYH_<M2528-1>は成長に関わると報告されており、ミドリフグにおいても本遺伝子は同様の働きをする可能性が示された。しかしながら、環境中の塩分と筋成長の関係については、筋成長に関連する遺伝子のmRNA発現量等を指標として、今後詳細に検討する必要があると考えられる。申請者らはTetraodon属魚類17種を対象に、ミトコンドリアDNAの16S rRNA遺伝子およびシトクロムb遺伝子の塩基配列に基づき分子系統解析を行い、淡水起源の共通祖先からまず、アジア淡水域系続とアフリカ淡水域系統が分岐し、次いでアジア淡水域系統が汽水域にも生息域を拡大したことを示唆した。本研究ではTetraodon属魚類の塩分耐性に着目して、上述の種分化の機構を明らかにするため、まず、アジア淡水域系統および汽水域系統Tetraodon属魚類の塩分耐性を調べて比較した。次に、プロテオミクス解析からTetraodon属魚類の生体で機能している浸透圧調節機構に関わるタンパク質を同定することを試みた。塩分耐性試験は、アジア汽水域系統ミドリフグT.nigroviridisおよびアジア淡水域系統メコンフグT.cochinchinensisを対象に、両魚種を1週間程度淡水、25°Cで飼育し、その後1日10%ずつ100%海水まで徐々に水槽の塩分を上昇させることにより行った。その結果、メコンフグは海水50%以上では生存できなかったが、ミドリフグは100%海水でも生存し、両者の塩分耐性は明確に異なることが示された。次に、異なる塩分で発現変動を示すタンパク質を同定するため、ミドリフグでは淡水および100%海水、メコンフグでは淡水および40%海水で飼育し、各魚種から筋肉および肝臓を採取して二次元電気泳動を用いたプロテオミクス解析を行った。ミドリフグについては筋肉および肝臓ともに塩分変化に伴うタンパク質組成の変化は見られなかったが、メコンフグの肝臓では明確に発現量の異なるタンパク質が検出された。しかしながら、メコンフグについては解析した個体数が少ないため、この違いが個体差を反映したものである可能性もある。今後、メコンフグについては個体数を増やし解析を行い、異なる塩分で発現変動を示すタンパク質の同定を行う予定である。われわれはTetraodon属魚類17種を対象に、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の16S rRNA遺伝子およびシトクロムb遺伝子の塩基配列に基づき分子系統解析を行い、淡水起源の共通祖先からまず、アジア淡水域系統とアフリカ淡水域系統が分岐し、次いでアジア淡水域系統が汽水域にも生息域を拡大したことを示唆した。

さらに、塩分耐性試験の結果、アジア淡水系統とアジア汽水系統の魚種間では塩分耐性が明確に異なることを示した。本年度はミオシン重鎖遺伝子(MYH)ファミリーに着目して研究を行い、塩分依存的に発現変動するMYHを探索することを目的とした。アジア汽水域系統ミドリフグT.nigroviridisを対象に、2週間程度、25°C、淡水および100%海水で飼育した後、両試験区の試料魚各5尾から筋肉を採取した。採取した筋肉から全RNAを抽出した後、市販のキットを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型としてリアルタイムPCRによりトラフグTakifugurubripesで同定されたMYH_<M1034>およびMYH_<M2528-1>の発現変動を調べた。その結果、MYH_<M1034>については淡水および100%海水の両試験区間で有意な違いはみられなかったが、MYH_<M2528-1>の発現量は100%海水試験区よりも淡水試験区で約2倍多かった。今後,in situ hybridizationを行いMYH_<M2528-1>の筋組織中の発現局在および0100%の種々の塩分での発現様式を調べる予定である。一方で、昨年度、タイの3地点およびマレーシアのボルネオ島3地点の計6地点で採取したミドリフグおよび近縁種サバヘンシスTetraodon sabahensisにつきmtDNAおよび核遺伝子を対象に分子系統解析を行い、形態的特徴や生息域との関係を調べた。mtDNA全長塩基配列に基づき作成した分子系統樹では、大斑点ミドリフグのグループは他の試料とは明確に分岐し、その遺伝的距離は小班点ミドリフグ中とT.sabahensis間のものより大きいことが示された。また、核遺伝子RAG1に基づき作成した分子系統樹でも、mtDNA全長塩基配列に基づき作成した分子系統樹とほぼ同様であることが示された。さらに両系統樹を比較した結果、T.sabahensisについては、同所的に2つ以上の系統が生息する可能性が示された。本年度はTetraodon属魚類の系統類縁関係をさらに詳細に調べるために、既報のフグ科魚類のmtDNA全長塩基配列に基づき作製した分子系統樹と、先に我々が決定した塩基配列を合わせてsupermatrix解析を行った。その結果、T. cutcutiaを除き、アジア淡水域、アジア汽水域、アフリカ淡水域の3系統に分類された。すなわち、Tetraodon属魚類が単系統では無いことが示され、それら3系統の分子系統関係は属レベルで異なる可能性があることが示唆された。続いて、タイ東部で採取されたアジア淡水産のTetraodon属魚類について分子系統解析を行った。全ての試料魚はT. cohinchinensisとされていたが16S rRNAの部分塩基配列(573bp)を決定した結果、その塩基配列はT. cohinchinensisのものとは異なり、解析した12個体中2個体はT. abeiもしくはT. baileyiの配列と同一であった。さらに、その形態的特徴からT. abeiであると同定された。決定した部分塩基配列に基づき分子系統樹を作製した結果、全ての試料はアジア淡水域系統に分類された。さらに系統樹とアジア淡水域系統の各魚種の生息域の関係から他の10個体はT. cambodgiensisであると推定された。
両生類におけるAR遺伝子の機能と転写因子の探索

脊椎動物の性決定遺伝子はヒト、ツメガエル、メダカ、コイなどで報告されている。しかし、これらの遺伝子は転写調節因子や分泌蛋白質をコードしている。ステロイドとその受容体は雌雄差形成に重要であることはよく知られているが性決定に関わるという報告はない。ツチガエル(両生類)は同種に2つの性決定様式(XY型とZW型)をもつユニークな動物である。当研究室は、ツチガエルのアンドロゲン受容体(AR)遺伝子が性(X,Y,Z,W)染色体にあること、W染色体のW-AR遺伝子は逆位が原因で殆ど発現せず、Z-AR遺伝子導入雌(ZW)胚は卵精巣を形成する。また、アンドロゲンの閾値濃度(0.2ng/ml)以下では性転換せず、それ以上では雌が雄になる(Oike et al., 2016)。また、Z-AR遺伝子導入雌(ZW)胚は卵精巣を形成する。しかし、その胚を低濃度(0.2ng/ml)のアンドロゲン含水で飼育すると精巣を形成する(Oike et al., 2016)。次に、CRISPR/Cas9システムでZ-AR遺伝子をノックダウンした雌(ZW)胚を、性転換を引き起こすアンドロゲン濃度で飼育してもその胚は性転換せず、卵巣を形成した(Oike et al., 2017)。これらの結果を基に我々は、アンドロゲンとARがツチガエルの雄決定因子であると断定した。次にAR遺伝子の転写調節因子を探索するため、殆ど発現しないW-ARと正常に発現するZ-AR遺伝子の転写調節領域の塩基配列を比較することによって、塩基の変異で影響を受ける可能性がある転写因子結合部位を調べた。その結果、CREB, CDXA, SRY, GATA1, GATA2, MZF1, TATA, HFH2, P300E201, CEBPA, CAP等の結合が影響を受ける可能性を見出した。これらの成果から我々は、研究目的を達成したと考えている。脊椎動物の性は性染色体の組み合せ(雄へテロXX/XY型と雌へテロZZ/ZW型)、即ち、Y或はW染色体の性決定遺伝子で遺伝的に決まると考えられている。ところが、遺伝的に性が決定しても種によってはステロイドホルモンで性が転換する。この事実は、脊椎動物の性に可塑性があること、また、性転換する動物ではステロイドホルモンとその受容体が性決定の主役になり得ることを示している。日本のツチガエルには4つの地方集団が存在する。4集団では、東、中央、西の3集団がXY型、北集団はZW型である。我々は最近、ツチガエルのAR遺伝子は性染色体(X,Y,Z,W)にあること、また、W染色体のAR遺伝子(W-AR)の転写調節領域の塩基配列には多くの変異があり、それが原因で殆ど発現せず、その結果、雄(ZZ):雌(ZW)の発現比が2:1になることを見つけた。この発現比は、雌雄胚どちらの生殖腺形成においても都合がよい。そこで、雌(ZW)受精卵にアンドロゲン受容体(Z-AR)遺伝子を導入し、過剰発現させた。その結果、雌が性転換して卵精巣様を形成した。この事実は、ツチガエルの性がAR遺伝子の発現量によって決まる可能性を示している。本研究は、(1) AR遺伝子の発現量で性が決まる可能性を示すこと、更に、(2) AR遺伝子の転写因子を見出すことを目的としている。(1)については、広島大・山本教授との共同研究でTALEN法によるAR遺伝子導入用のDNAコンストラクトを構築し受精卵への導入を試みたが、ツチガエルの繁殖期がわずか2ヶ月であるため27年度は解析が可能な充分量の卵に導入できなかった。一方、(2)に関しては、Z-ARは普通に発現するが、W-ARは発現しないため、転写調節領域に生じた変異の可能性が高いと考え、中央集団XY型と北集団ZW型に属するできるだけ多くの地方集団を集め、塩基配列を解析中である。研究目的、(1) AR遺伝子の発現量で性が決まる可能性を示すことについては、研究期間の初年度におけるAR遺伝子の改変による解析は様々な条件検討と産卵期間が短かったため、AR遺伝子の導入卵数が少なく充分な解析には至っていないものの、今年度の解析の準備は完了しているので解析に充分な導入卵数を得ることが可能であるため、成果が得られると期待している。(2) AR遺伝子の転写因子を見出すことについては、X,Y,Z,W染色体上のAR遺伝子の転写領域を比較検討するため、中央及び北集団に属する多くの地方に生息するツチガエルを採集した。現在、2集団で30以上の系統を集めることに成功し、転写調節領域の塩基配列を解析中である。本年度も、別の20以上の系統を採集する予定である。脊椎動物の性決定遺伝子はヒト、メダカなどで報告されている。しかし、それらは転写調節因子や分泌蛋白質でステロイドとその受容体が脊椎動物の性決定に関わるという報告は無い。ツチガエル(両生類)は同種でありながらXY型とZW型の2つの性決定様式をもつ他の脊椎動物には類のないユニークな動物である。

当研究室は、アンドロゲン受容体(AR)をコードする遺伝子はX,Y,Z,W染色体にあること、W染色体に起きた逆位が原因でW-AR遺伝子は殆ど発現しないこと、アンドロゲンとその受容体(AR)がツチガエルの雌から雄への性転換に深く関与すること、Z染色体のZ-AR遺伝子を導入したZW(雌)胚は卵巣ではなく卵精巣を形成(不完全性転換)すること、などを見つけた。当研究室はアンドロゲンとARがツチガエルの性転換のみならず、性決定に関わると考え、AR遺伝子の機能を調べた。まず、性転換に必要なアンドロゲンの濃度(閾値; 0.2ng/ml飼育水)を決定した。閾値以下では性転換は起きず、それ以上の濃度では完全性転換が起きる(Oike et al., 2016)。Z-AR遺伝子導入雌(ZW)胚の性転換が不完全の原因はアンドロゲン量の不足と考え、アンドロゲン含水(閾値以下)で胚を飼育した。予想通り、雄個体と同じ精巣を形成した。次に、最新のCRISPR/Cas9システムを用いてZW胚のZ-AR遺伝子をノックダウンした後、野生雌(ZW)胚が完全性転換を引き起こすアンドロゲン含水(閾値以上)でその胚を飼育すると、AR-ノックダウン胚では全く性転換が起きず、生殖腺は卵巣のままであった。これらの結果は、アンドロゲンとARがツチガエルの雄決定因子であることを示している。この世界初の成果は一流国際誌に発表した(Oike et al., 2017)。これらの成果でAR遺伝子がツチガエルの雄決定に関与することを示し、当初の目標を達成した。研究は順調に進み、今年度の目標は達成された。一般的に脊椎動物の性は受精時の性染色体の組み合せ遺伝的に決まる。性決定様式には雄へテロXX/XY型と雌へテロZZ/ZW型の2型があり、Y或はW染色体の性決定遺伝子が性を決める。ところが、雌雄の性が決まっても、個体にステロイドホルモンを投与すると性が転換する。この事実は、ステロイドホルモンとその受容体が動物の性を決めることを示している。日本に棲息する両生類のツチガエルはミトコンドリアの12S及び16S遺伝子の塩基配列に基づいた分子系統樹と性関連DNAマーカーによって、East, West, North, Central及びWest-Centralの5集団に分けられる。East, West及びCentralの3集団がXY型、North集団はZW型である。我々は、ツチガエルのAR遺伝子は性染色体(X,Y,Z,W)にあること、W染色体のAR遺伝子(W-AR)の転写調節領域の塩基配列には多くの変異があり、それによって殆ど発現せず、雄(ZZ):雌(ZW)の発現比が2:1になることを示した。そこで我々は2つの研究計画を立てた。それは、(1)ツチガエルにアンドロゲン受容体(AR)遺伝子を導入したZ-AR導入雌(ZW)ツチガエル及びAR遺伝子をノックアウトした雄(ZZ)AR遺伝子欠損ツチガエルを作製してアンドロゲンとアンドロゲン受容体(AR)遺伝子がツチガエルの性決定因子であることを実証すること、及び(2) AR遺伝子の発現調節に関わる転写候補因子を見出すこと、である。(1)については、上智大・安増教授との共同研究でCRISPR/CAS9法によるAR遺伝子ノックダウンガエルを作製すると性が転換することを見出した。(2)に関しては、W-ARは殆ど発現しないため、転写調節領域の塩基配列に生じた変異による可能性が高いと考え、国内で多くの個体を集め、それらの塩基配列を解析している。研究目的(1)については、AR遺伝子の導入及び改変ツチガエルを作製した。ツチガエルはモデル動物ではなく野生種のため、研究開始当初は分子遺伝学的背景が乏しかったが、多くの方々に助けていただき、AR遺伝子の導入及び改変ツチガエルを作製することが出来た。Z-AR遺伝子の導入雌ガエルは卵巣ではなく、卵精巣を形成した。
内耳の選択的物質輸送機構に対する性ホルモンの影響

1)卵巣摘出術群では4週後および8週後ともに、コントロール群に比較して有意なABR閾値上昇が認められた。2)透過電顕による観察では、卵巣摘出群の血管条毛細血管基底膜の3層構造は認められなかった。血管条毛細血管基底膜のCationic polyethyleneimine(PEI)の数はコントロール群および卵巣摘出群(術後4週、8週)ともに少なく、両者に有意な差は認められなかった。一方、ラセン靭帯の毛細血管基底膜ではともにPEIの整列が確認された。3)コントロール群と卵巣摘出群の間で蝸牛におけるER alphaとER betaの発現に明らかな差はみられなかった。血液-内耳関門に対する加齢の影響が明らかになってきたが、加齢に伴って減少する女性ホルモンの影響については考慮されていない。本研究目的は、内耳における選択的物質輸送機構に対する女性ホルモンの影響を明らかにすることである。まずは女性ホルモンの分泌状態によるエストロゲンの局在の変化を調べた。実験には全身麻酔下に生後4週のC57BL/6メスマウスを用いた。蝸牛、前庭に対するEstrogenの効果を調べるために、実験群(女性ホルモン欠損群)に対しては両側卵巣を摘出し、卵巣を摘出しないSham手術を施行した群をコントロールとした。手術施行後2週間、4週間において両側蝸牛を摘出し、右蝸牛は10%ホルマリン溶液で固定後、10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液にて脱灰操作を行い、パラフィン包埋された。左蝸牛は摘出後ただちにRNAlater RNA Stabilization Reagentに浸漬し保存された。右蝸牛の蝸牛軸に沿って5 μmの厚さの切片を作成し、Estrogen receptor (ER) alpha、ER betaの局在を観察した。手術後2週間経過したマウスにおいては、コントロール群、実験群ともに血管条、内・外有毛細胞、ラセン神経節においてER alpha、ER betaの発現がみられ、両者の間に明らかな差はみられなかった。手術後4週間経過したマウスにおいては、コントロール群に比較してER alpha、ER betaの発現が弱く認められた。現在RT-PCR法を用いて、手術後4週間経過した実験群とコントロール群の右蝸牛内のERαおよびERβのmRNA発現解析を行っている。全身麻酔下に生後8週齢のICRマウス(雌)から両側卵巣を摘出し更年期モデルを作成する。コントロール群のICRマウス(雌)には皮膚切開のみのsham手術を施行する。全身麻酔下に手術前、術後4週、8週目にABR(tone bursts at 2k,4k,8k,16k,32k Hz)の反応閾値を測定し、聴覚機能に対する両側卵巣を摘出の影響を分析する。術後8週目で断頭を行って、両側側頭骨を摘出する。通常の固定および脱灰操作を経た後に、右側頭骨はパラフィンに左側頭骨はエポンに包埋する。1)去勢手術前後の蝸牛における性ホルモン受容体発現と局在の変化:パラフィン切片を作成し、蝸牛におけるエストロゲン(α,β)の受容体の局在の変化を免疫染色法によって観察する。2)去勢手術前後における蝸牛のNa,K-ATPase, Na+/Cl-/K+cotransporterとvasopressin type 2 (V2Rs)受容体の発現とその局在の変化および毛細血管基底膜におけるIgG沈着の観察:パラフィン切片を作成し、蝸牛外側壁おけるイオン輸送及び水輸送に関する影響をみるために、Na,K-ATPase, Na+/Cl-/K+cotransporteとvasopressinの各受容体の局在の変化を観察する。さらに更年期の影響によって組織の加齢性変化が加速される可能性が考え、蝸牛外側壁の毛細血管基底膜へのIgGの沈着状況も免疫染色法によって観察する。3)去勢手術前後の蝸牛の毛細血管の陰性荷電の変化:内耳毛細血管のcharge barrierの変化を観察するために、0,5% cationic polyethyleneimine(PEI)溶液内に側頭骨を浸漬した後、エポンで包埋し超薄切片を作成する。蝸牛外側壁(血管条、ラセン靭帯)の毛細血管基底膜上のPEI粒子の分布を透過電顕で観察し、PEI粒子の数を算定し基底膜上の陰性荷電の変化を比較する。全実験動物の術前・術後のABRの測定は終了し、sham手術群に比較して卵巣摘出群ではABR閾値の変化が優位に大きいことが確認されている。全実験動物から蝸牛を摘出し、左蝸牛はエポンで、右蝸牛はパラフィンで包埋が完了している。エポンで包埋された蝸牛の外側壁の超薄切片を作成し、血管条とラセン靭帯の毛細血管基底膜の陰性荷電の変化を透過電顕で観察した。sham手術群に比較して卵巣摘出群では陰性荷電の減少が顕著であると思われるが、現在陰性荷電の程度を算定し定量判定を行っている。右蝸牛に対しては、蝸牛外側壁(血管条、ラセン靭帯)において、Na,K-ATPase, Na+/Cl-/K+cotransporteとvasopressinの各受容体の局在と同領域の毛細血管基底膜へのIgG沈着状況を免疫染色法によって観察する準備をしている。卵巣が発育する時期を考え、全身麻酔下に生後8週のICRメスマウスを用いた。

蝸牛機能に対するEstrogenの効果を調べるために、実験群(Estrogen欠乏群)に対しては両側卵巣を摘出し、卵巣を摘出しないSham手術を施行した群をコントロールとした。卵巣摘出群のマウスは非卵巣摘出群に比較して背部の脱毛が多くみられた。卵巣摘出群において、手術1か月後(3か月齢)では32KHzで、また術後2か月後(4か月齢)では2,4, 8, 16,および32 KHzで非卵巣摘出群(コントロール)に比較してABR閾値の有意な上昇が認められた。透過電顕による観察では、卵巣摘出群・非卵巣摘出群ともに3か月齢・4か月齢ともに血管条毛細血管基底膜の3層構造は不明瞭になっていた。血管条毛細血管基底膜上のCationic polyethyleneimine (PEI)の分布は、3か月齢・4か月齢ともにほとんど認められず、血管条毛細血管基底膜の陰性荷電の著しい減少が示唆された。ラセン靭帯の毛細血管基底膜においては、術1か月後(3か月齢)および術後2か月後(4か月齢)でPEI粒子の整列が確認され、基底膜の陰性荷電が存在することが示唆された。卵巣摘出により影響を受ける因子として、ホルモンバランスの異常と加齢性変化の促進が予想される。そこで次に段階としては、蝸牛毛細血管特に血管条とラセン靭帯の毛細血管におけるIgGの沈着状況とエストロゲンアルファ、ベータ受容体の発現の変化を明らかにしてゆく。共同研究者とともに実験を行っている東京大学耳鼻咽喉科学教室が昨年6月に新たに移転したため、移転前後3か月程度は実験が行なえなかった。その影響により実験計画は大幅に遅れてしまい、研究期間の延長を申請した。生後8週のICRメスマウスを用いて、蝸牛に対するEstrogenの効果を調べるために、実験群(Estrogen欠乏群)に対しては両側卵巣を摘出し、卵巣を摘出しないSham手術を施行した群をコントロールとした。ABRの測定では、手術1か月後(3か月齢)の32KHzと術後2か月後(4か月齢)の2, 4, 8, 16,および32 KHzで、非卵巣摘出群(コントロール)に比較して卵巣摘出群において有意な閾値上昇が認められ、卵巣摘出によって難聴が進行する可能性が考えられた。蝸牛血液-内耳関門に対する卵巣摘出の影響を調べる目的で、蝸牛の外側壁の毛細血管の微細構造を観察した。血管条毛細血管基底膜上のCationic polyethyleneimine (PEI)の分布は、卵巣摘出群・非卵巣摘出群ともに3か月齢・4か月齢ではほとんど認められず、血管条毛細血管基底膜の陰性荷電の著しい減少が示唆されたが、両群間で有意な変化は見られなかった。ラセン靭帯の毛細血管基底膜においては、3か月齢および4か月齢でPEI粒子の整列が確認されたが、両群間で有意な変化は見られなかった。以上より蝸牛外側壁の毛細血管基底膜の陰性荷電の変化は加齢による影響であると考えられ、卵巣摘出による性ホルモンの急激な変化の関与を確認することはできなかった。パラフィン切片による免疫染色法でEstrogen receptor (ER) alphaとER betaの分布の変化を観察した。血管条辺縁細胞と内・外有毛細胞にER alphaとER betaの発現が認められたが、両群間で明らかな差は認められなかった。1)卵巣摘出術
血行性転移促進分子Aggrus依存的な血小板凝集の制御法開発

研究代表者が同定したがん転移促進に関わる血小板凝集促進因子Aggrusに対する抗体作製を行ない、別々のエピトープを認識する5種類のモノクローナル抗体作製に成功した。そのうち1種類の抗体にAggrus阻害活性を認めた。また、Aggrus阻害活性を示すAggrus結合分子としてTetraspaninファミリー分子であるCD9を同定し、その結合ドメインならびに阻害機構を明らかにした。個体レベルでのCD9の転移抑制効果を、イメージング技術により可視化することに成功した。血小板凝集はがんの血行性転移を促進する。研究代表者は、がん細胞膜上に発現している新規血小板凝集促進因子(Aggrus)の遺伝子クローニングに世界で初めて成功していた。1、抗ヒトAggrusモノクローナル抗体の作製マウスにヒトAggrusリコンビナントタンパク質を免疫する事で、ヒトAggrusの細胞外ドメインを認識するモノクコーナル抗体を7種類樹立した。残念な事に、血小板凝集活性に必須なPLAG2ドメインを認識する抗体は、該当ドメインペプチドを免疫しても十分なタイターが得られず、樹立できなかった。樹立できた抗体のエピトープを同定するために、Aggrus断片分子を大腸菌に発現させ、その断片に対する反応性を検討する事で、30-36番目または64-82番目のペプチド部位を認識する事を明らかにした。2、Aggrus結合分子による血小板凝集阻害機構の解明研究代表者はこれまでに、Aggrus結合分子としてTetraspaninファミリー遺伝子の1つであるCD9を同定していた。CD9はTetraspanin Webと呼ばれる膜上の高分子複合体形成のオーガナイザーとして機能するが、AggrusもCD9と結合することでTetraspanin Webに取込まれ、その結果、取込まれたAggrusはその血小板凝集促進活性を失う事が明らかとなった。さらに、CD9上の膜貫通ドメイン1と2がAggrusとCD9の結合に関与しているが、この部位を欠失したCD9には血小板凝集抑制活性が認められず、転移抑制効果も認められなかった。この理由を検討した結果、膜貫通ドメイン1と2を欠失したCD9は、AggrusをTetraspanin Webへとリクルートする事ができず、その結果血小板凝集抑制活性や転移抑制活性を示さない事を明らかにした。CD9はがん転移促進分子Aggrusの血小板凝集誘導活性を阻害する事を既に明らかにしている。そこで、CD9の断片タンパク質発現ベクターを構築し、Aggrusタンパク質との結合アッセイを行なった。その結果、CD9の膜貫通部位1と2を欠失したCD9はAggrusとの相互作用が認められないことが、免疫沈降法ならびに共焦点レーザー顕微鏡による共局在アッセイの結果確認された。Aggrusのプロモーター部位にはCpGアイランドが存在するため、Aggrus発現はメチル化により制御されている可能性が示唆されている。低転移細胞に脱メチル化剤5-aza-2'-deoxycitidineを処理することにより、Aggrus発現が亢進することを確認し、がん転移形成におけるメチル化の関与の一端が明らかとなった。リアルタイム遺伝子発現計測装置を用いることにより、長期にAggrus発現を抑制するsiRNAを検証したが、マウス転移モデル系に用いることが可能と考えられる長期抑制効果を示すsiRNAのデザインを得ることはできなかった。Aggrus遺伝子5'末端にEGFP遺伝子を付加したfusionタンパク質発現プラスミドを構築し、CHO細胞に遺伝子導入することで、細胞表面のみ蛍光を発する細胞株を樹立した。この細胞を用い、Aggrus依存的な肺へのトラップをin vivo imaging技術で可視化することに成功した。この肺へのトラップは、抗血小板薬で抑制されることが確認され、Aggrusは血小板凝集誘導によりがん転移を促進していることが確認された。抗ヒトAggrus抗体樹立を目的に、大腸菌で発現させたヒトAggrus全長タンパク質、あるいはAggrusの血小板凝集誘導活性に必須なPLatelet AGgregation-stimulating domain (PLAGドメイン)を含むリコンビナントペプチドをマウスに免疫した。その結果、様々なエピトープを認識するモノクローナル抗体を5種類作製することに成功し、そのうちのYM-1抗体という1種類のモノクローナル抗体が、中和活性発揮に必須であることが示唆されているPLAG2ドメインを認識していることを見いだした。Aggrusの各種deletion mutantを作製することで、YM-1抗体のこれら変異タンパク質認識能を検討することにより、詳細な認識エピトープを同定した。さらに、Aggrus依存的な血小板凝集を測定するアッセイ系を用いて、YM-1抗体の血小板凝集中和活性を確認することに成功した。ただし、この抗体を産生するハイブリドーマの安定性が悪いために、安定した抗体取得が非常に難しく、新たな中和抗体の作製が必要とも考えられた。また、血小板凝集を伴ったがん転移機構解析を目指して、HT1080細胞にAcGFP発現プラスミドを導入し、細胞内がGFPの蛍光を発する細胞株の樹立を行なった。

樹立されたHT1080/AcGFP細胞を移植したマウスでの転移をin vivoで観察したが、転移先臓器である肺は皮膚表面から深く、そのままでは観察できなかった。そこで、肺を取り出して観察するex vivo法を検討した結果、肺にトラップされているがん細胞の蛍光を観察することに成功した。このex vivo系で、定量的に肺転移を観察することにも成功した。さらに、移植から摘出までの時間を変化させることで、転移初期過程の肺への物理的なトラップの時間変化を観察することに成功した。