hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超短赤外パルスを用いるポンプープローブ法による吸着水素のダイナミクス

ゼオライト上表面水酸基と水分子の吸着を取り扱い、吸着した水分子のうちゼオライト水酸基と相互作用していないO-H結合を振動励起し、その振動寿命の温度依存性を測定した。その結果,ゼオライト酸性水酸基自身の振動励起寿命の温度依存性と比べ、吸着水分子は非常に異なった依存性を示すことが明らかにした。得られた振動励起寿命の温度依存性をNitzan and Jortnerのモデルによって解析した結果,吸着水分子の振動緩和はゼオライト水酸基と相互作用しているO-H結合への分子内での振動エネルギーの移動ならびに80cm^<-1>程度のフォノン2量子を励起することにより行われることが示唆された。さらに,重水素置換したゼオライト上表面水酸基に吸着したD2O分子において、吸着重水分子のうちゼオライト水酸基と相互作用していないO-D結合を振動励起させた時に過渡スペクトル上に観測される複数の過渡的なバンドについて研究を行った。その結果,得られた過渡的なバンドは,表面吸着種の分子内振動緩和の結果現れたホットバンド及びコンビネーションバンドであることを見出した。ゼオライト水酸基と相互作用していないO-D結合の振動励起寿命が約43psであったのに対し,コンビネーションバンドの寿命は15ps以下と著しく短いことを見出した。また,得られたdecay profileを綿密に検討した結果,緩和速度の違う二種類の水酸基の存在を明らかにした。これらはゼオライト中での環境の違う二種類の水酸基(large cage及びsmall cage中水酸基)と対応させることで解釈されることを示した。今年度はまず赤外超短パルス発生システムの改良を行った。具体的にはモードロック式ピコ秒Nd:YAGレーザーの第2高調波を励起光として、BBO結晶を2個使用した光パラメトリック発生・増幅(OPG・OPA)システムに回折格子を組み込むことにより、スペクトル線幅の狭い近赤外ピコ秒パルス(1.21.4μm)を発生させた。次に得られた近赤外パルスとピコ秒Nd:YAGレーザーの基本波との差周波光をAgGaS_2結晶(AGS結晶)により発生させ、多層膜フィルターとGeフィルターによりYAGレーザーの基本波と近赤外パルスを除去することで中赤外パルスを抽出した。得られた赤外超短パルスのパフォーマンスは、波長可変領域が38μm、時間幅24ps以下、スペクトル線幅3.5cm^<-1>で出力エネルギーが6μm付近で約40μJであった。また、赤外パルスの波長の掃引は、コンピューターを用いて2個のBBO結晶、回折格子、AGS結晶の各々の角度を同期して回転させることにより行った。また、酸化物であるゼオライトのブレンステッド酸点水酸基に水素結合して水分子(H_2O)のOH伸縮振動の振動励起状態の寿命をピコ秒赤外パルスを用いたポンプープローブ法により測定した。その結果、123Kにおける振動励起寿命が75psであった。さらにこの振動励起寿命は著しい温度依存性を示し、223Kにおいては40psとなることを見出した。得られた寿命の温度依存性から、振動エネルギーの緩和には80cm^<-1>近辺の低波数フォノンモードが関与していることが明らかになった。その結果、ゼオライト酸性水酸基自身の振動励起寿命の温度依存性と比べ、吸着水分子は非常に異なった依存性を示すことが明らかにした。

得られた振動励起寿命の温度依存性をNitzan and Jortnerのモデルによって解析した結果,吸着水分子の振動緩和はゼオライト水酸基と相互作用しているO-H結合への分子内での振動エネルギーの移動ならびに80cm^<-1>程度のフォノン2量子を励起することにより行われることが示唆された。さらに,重水素置換したゼオライト上表面水酸基に吸着したD2O分子において、吸着重水分子のうちゼオライト水酸基と相互作用していないO-D結合を振動励起させた時に過渡スペクトル上に観測される複数の過渡的なバンドについて研究を行った。その結果,得られた過渡的なバンドは,表面吸着種の分子内振動緩和の結果現れたホットバンド及びコンビネーションバンドであることを見出した。ゼオライト水酸基と相互作用していないO-D結合の振動励起寿命が約43psであったのに対し,コンビネーションバンドの寿命は15ps以下と著しく短いことを見出した。また,得られたdecay profileを綿密に検討した結果,緩和速度の違う二種類の水酸基の存在を明らかにした。これらはゼオライト中での環境の違う二種類の水酸基(large cage及びsmall cage中水酸基)と対応させることで解釈されることを示した。
エンザイムイムノセンサーを用いる医薬品の高感度計測

血中の薬物濃度の経時的な測定が必要であるテオフィリンおよびジゴキシンのセンサーを開発することを目的とし,前年度に引き続きリポソームを利用するメンブレンイムノアッセイを検討した.研究代表者(鈴木)は,蛍光色素カルセインの自己消光を利用するフルオロイムノアッセイを取り上げ,特にリポソーム膜の素材を比較検討した.また研究分担者(芳賀)は,化学発光酵素イムノアッセイとリポソーム膜破壊反応とを組み合わせる高感度化の研究を行った.I.メンブレンイムノセンサーに使用するリポソーム膜素材リポソーム膜の主構成脂質をDilauroyl phosphatidyl choline(DLPC)とするがさらに再現性と感度の向上を図り,副素材としてcholesterol analogueを合成し,その添加効果を比較検討した.各種analogueの添加モル比を変えて封入された蛍光色素の抗体による遊出率を比較した結果Triethoxycholesterolのみが有意にimmunolysisの効率を増加させることが明らかとなった.特に添加モル比DLPC:chol:triethoxycholesterol-111のときその効果は最も顕著であった.この組成で得られたリポソームは極めて安定であり,一ヶ月以上の保存を行っても膜破壊などが観察されない.また本法によってテオフィリンは10^<-8>M10^<-10>Mの範囲で定量が可能であった.II.化学発光を利用するリポソームイムノセンサー本年度においてはリポソーム内にグルコースオキシターゼ(GOD)を封入し, sensitizerとしてメリチンウアバイン複合体を利用し,反応の結果遊出するGODにグルコースを加えたときに発生するH_2O_2をペルオキシターゼとイソルミノールによる化学発光として測定した.本法により10^<-〓>M10^<-8>Mのシゴキシンが定量可能であった.なお一層の感度の上昇が期待できるのでその条件を検討中である.血中の薬物濃度の経時的な測定が必要であるテオフィリンおよびジゴキシンのセンサーを開発することを目的とし,前年度に引き続きリポソームを利用するメンブレンイムノアッセイを検討した.研究代表者(鈴木)は,蛍光色素カルセインの自己消光を利用するフルオロイムノアッセイを取り上げ,特にリポソーム膜の素材を比較検討した.また研究分担者(芳賀)は,化学発光酵素イムノアッセイとリポソーム膜破壊反応とを組み合わせる高感度化の研究を行った.I.メンブレンイムノセンサーに使用するリポソーム膜素材リポソーム膜の主構成脂質をDilauroyl phosphatidyl choline(DLPC)とするがさらに再現性と感度の向上を図り,副素材としてcholesterol analogueを合成し,その添加効果を比較検討した.各種analogueの添加モル比を変えて封入された蛍光色素の抗体による遊出率を比較した結果Triethoxycholesterolのみが有意にimmunolysisの効率を増加させることが明らかとなった.特に添加モル比DLPC:chol:triethoxycholesterol-111のときその効果は最も顕著であった.この組成で得られたリポソームは極めて安定であり,一ヶ月以上の保存を行っても膜破壊などが観察されない.また本法によってテオフィリンは10^<-8>M10^<-10>Mの範囲で定量が可能であった.II.化学発光を利用するリポソームイムノセンサー本年度においてはリポソーム内にグルコースオキシターゼ(GOD)を封入し, sensitizerとしてメリチンウアバイン複合体を利用し,反応の結果遊出するGODにグルコースを加えたときに発生するH_2O_2をペルオキシターゼとイソルミノールによる化学発光として測定した.本法により10^<-〓>M10^<-8>Mのシゴキシンが定量可能であった.なお一層の感度の上昇が期待できるのでその条件を検討中である.
自閉症のイメージングジェネティクスによる病態解明の試み

1自閉症児の1H-MRS所見:100名超の自閉症児を対象に頭部MRI、1H-MRSを施行している。まず自閉症児での1H-MRSでの異常所見がどの程度あるかをコントロール群(頭痛などでMRIを施行したが正常であった定型発達児や軽度知的障害児)との比較で判定した。主要所見は次の2点である。(1)自閉症児では前部帯状回のGABA/Crが有意に低値であった。(2)自閉症児では左小脳半球のGlu/Crが有意に高値でGABA/Crが有意に低値であった。2自閉症遺伝子解析:約30例での既知自閉症関連遺伝子群のターゲットリシーケンスでは、リダンダントな変異が検出されず、多型や変異による病態分類が困難であった。1中間表現型としての各種検査、臨床症状や家族歴・既往歴などの問診:徳島大学小児科を受診している自閉症スペクトラム障害(ASD)児に中間表現型としての各種検査、臨床症状や家族歴・既往歴などの問診を行った。各種検査時にはインフォームドコンセントを保護者と、説明の理解が可能であればASD児本人から得た。A)中間表現型の各種検査として、以下を行った。(1)頭部MRI、1H-MRS:前部帯状回・小脳に関心領域をおき、関心領域内の各種代謝物質濃度を測定した。(2)脳波: ASDの約2-3割で脳波異常を認めるので異常の種類と出現部位を確認する。(3)ABR:ASDにおけるコミュニケーション障害に難聴が関係していないことの確認と脳幹機能評価。(4)血液検査:ASDの基礎疾患の検索。B)臨床症状や家族歴・既往歴などの問診について以下を行った。(1)WISC-III・IV、遠城寺式発達検査:知能指数・発達指数の測定。(2)AD/HD-RS:ASDによく合併するAD/HD症状のスコアリング。(3)CBCL:多項目の設問により、詳細な行動上の問題点の評価。(4)問診:父母の年齢、家族歴、既往歴、発達歴、てんかんの有無など。2ASD感受性遺伝子多型解析対象患者のノミネートとインフォームドコンセントの取得および末梢血中ゲノムDNA採取:保護者と説明内容理解可能であれば児からもインフォームドコンセントを得て各種ASD感受性遺伝子多型の解析(SNV、CNV)用に末梢血あるいは唾液を採取しゲノムDNAを約30例原則トリオで(トリオで合計約90検体)抽出している。特に表現型から遺伝的な変異の関与を強く疑う患児を中心に、自閉症関連遺伝子候補を含む約4000遺伝子の疾患関連遺伝子のターゲットリシーケンスによるゲノム解析を開始した。1中間表現型としての各種検査、臨床症状や家族歴・既往歴などの問診徳島大学小児科を受診している自閉症スペクトラム障害(ASD)児に中間表現型としての各種検査、臨床症状や家族歴・既往歴などの問診を行った。当院の3 Teslaの高磁場強度を有するMRI装置は、神経細胞の活動性および密度を反映するNAAの測定に加えて脳内GABAおよびグルタミン酸濃度も正確に測定することが可能で、神経細胞障害の程度やGABAおよびグルタミン酸作動性神経系の活動性を評価できる。(2)脳波。(3)ABR。2ASD感受性遺伝子多型解析対象患者のノミネートとインフォームドコンセントの取得および末梢血中ゲノムDNA採取保護者と説明内容理解可能であれば児からもインフォームドコンセントを得て各種ASD感受性遺伝子多型の解析(SNV、CNV)用に末梢血あるいは唾液を採取しゲノムDNAを約50例原則トリオで抽出している。

特に表現型から遺伝的な変異の関与を強く疑う患児を中心に、自閉症関連遺伝子候補を含む約4000遺伝子の疾患関連遺伝子のターゲットリシーケンスによるゲノム解析を開始している。小児神経学テストケースを当初80例を想定していたが、実施の中で、インフォームドコンセント取得が可能でかつ本人と両親検体を全て確保できる例が限られることがわかり、特に両親検体については唾液からのDNA抽出をオプションとして追加することにした。臨床症状の問診、知能検査、AD/HD-RS、CBCLなどもできており、イメージング検査も実施できている。症例のリクルート、臨床症状・検査、ゲノムDNA収集を継続し、予定症例数を達成する。中間表現型として、MRI、1H-MRS、脳波を集中的に収集する。中間表現型と臨床所見から、遺伝的な要因が強く推定される群を中心に、順位付けすることで、効率よくゲノム解析を進め、遺伝的背景を検討する。特にイメージングと遺伝情報から特定の表現型やその程度の予測を目指して、検討を進める。ASD感受性遺伝子多型解析キット等の購入内容について一部保留している。結果をだすためのより有効な製品を考慮している最中である。主としてASD感受性遺伝子多型解析キット等の購入にあてる。
上流ORFによる新規の時間依存的な翻訳制御

概日時計は昼夜間での環境変化や季節の変化に適応する機能をもつ環境応答システムであり,固着性の生物である植物にとって非常に重要な意義をもつ。概日時計に関する研究は転写レベルの解析が精力的に進められている一方で,近年の研究により転写後制御の重要性が示されているもののいまだ不明な点が多い。本研究ではシロイヌナズナの概日時計の制御に,上流ORFによるリボソーム停滞を介した時間依存的な翻訳制御が関わっている可能性を見出しており,その分子メカニズムと生理学的意義を明らかにする。
S化1本鎖DNAとその類似物質によるDNA-PK活性阻害と放射線増感

DNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)活性をS化1本鎖DNAとsuraminが抑制するかどうかについて実験を行った。S化1本鎖DNAによるDNA-PK活性阻害効果はS化1本鎖DNAの長さに依存し、36-merで最大を示した。1本鎖DNAの塩基構成は直鎖状であれば塩基構成によらず一定であった。S化1本鎖DNAによるDNA-PK阻害効果は同じ長さの非S化1本鎖DNAによる阻害効果に比べ200倍有効であった。抑制効果は精製されたDNA-PKに対しても同様に認められることから、S化1本鎖DNAはDNA-PKに直接作用しているものと考えられた。S化1本鎖DNAによるDNA-PK活性抑制効果は2本鎖DNAと競合しないことから、S化1本鎖DNAはDNA-PKの2本鎖DNA結合部位とは別の部位に結合していることが示唆された。suraminは処理濃度依存的に細胞を放射線増感した。また、suraminによる処理時間が長い程増感効果は大きかった。suraminのdose-modifying factorはLM217細胞で1.18、MDA-MB-468細胞で1.37であった。suraminはDNA-PK活性を持たないscid細胞を放射線増感しなかった。suraminはin vitroとin vivoにおいてDNA-PK活性を阻害した。DNA-PK活性をin vitroで50%に抑制するのに必要なsuraminの濃度はLM217細胞で1.7μM、MDA-MB-468細胞で2.4μMであった。suraminはLM217細胞とMDA-MB-468細胞のUV感受性を増感することはなかった。suraminは50Gy照射後のDNA2本鎖切断修復を阻害した。これらのsuraminの作用は細胞周期に対する影響によるものではなかった。放射線によりDNAには様々な損傷が生じるが、付着細胞の生死(増殖死)を決定するのはDNA2本鎖切断とその修復であることがわかっている。DNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。ヒトの細胞おいて主に非相同的末端再結合機構によりDNA2本鎖切断が修復されていることを明らかにした。これまでに、PI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninが非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)活性と放射線高感受性遺伝病ataxia-telangiectasiaの原因遺伝子ATMの活性を阻害して、癌の放射線感受性を高めることを報告した。wortmanninの放射線増感作用は非常に強力であるが、DNA-PKやATMだけではなく、PI3-キナーゼを阻害してしまうため副作用が強く臨床的に用いることはできない。siRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチド等を用いDNA-PKやATMの転写や活性を抑えることはin vitroでは可能であるが、技術的問題から現時点では臨床的な手法とはなりえない。S化1本鎖DNAとその構造的類似物質suraminがDNA-PK活性を阻害し、放射線によるDNA2重鎖切断の修復を阻害することを報告した。pulsed-field gel electophoresisによりS化1本鎖DNAとsuraminは共に放射線照射により生じる2本鎖DNA切断の修復を阻害していることを明らかにした。suraminは、培養上清に投与することにより細胞の放射線感受性を高めた。suraminはDNA-PK活性の無いscidmouse由来の細胞の放射線感受性を高めなかった。これらのことから、suraminはDNA-PK活性を阻害し放射線感受性を高めることが示唆される。放射線により生じるDNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。

ヒトの細胞おいて主に非相同的末端再結合機構によりDNA2本鎖切断が修復されていることを明らかにした。これまでに、PI3-キナーゼ阻害剤の1つwortmanninが非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)活性と放射線高感受性遺伝病ataxia-telangiectasiaの原因遺伝子ATMの活性を阻害して、癌の放射線感受性を高めることを報告した。さらに、S化1本鎖DNAとその構造的類似物質suraminがDNA-PK活性を阻害し、放射線によるDNA2重鎖切断の修復を阻害することを報告した。本研究では、suraminが放射線感受性に与える影響とその機序を検討し、臨床適応可能なDNA2本鎖切断修復阻害剤・放射線増感剤であるかどうか検討行っている。suraminが放射線感受性を高めることを報告したが、その作用機序をさらに検討するためにsuraminが紫外線感受性を高めるかどうかを調べた。ヒト培養線維芽細胞LM217ではsuraminは紫外線に対して細胞を抵抗性にし、ヒト乳癌細胞MDA-MB-467ではsuraminは紫外線に対しる感受性に影響を与えなかった。また、DNA-PKを構成する蛋白質量に与える影響では、suraminはKu70、Ku80蛋白質量に影響を及ぼさなかったが、DNA-PKcsの蛋白質量を増加させた。suraminを培養液に添加することにより、細胞のDNA-PK活性は抑制された。これらの事から、suraminはDNA-PK活性を抑制することにより細胞の放射線感受性を高めているものと考えられる。放射線により生じるDNA2本鎖切断は非相同的末端結合機構と相同的組換えにより修復される。S化1本鎖DNAとその構造的類似物質suraminが非相同的末端結合機構の最初のステップであるDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)活性を阻害し、放射線によるDNA2重鎖切断の修復を阻害することを報告した。本研究では、suraminが放射線感受性に与える影響とその機序を検討し、臨床適応可能なDNA2本鎖切断修復阻害剤・放射線増感剤であるかどうか検討した。suraminは、培養細胞の放射線感受性を高めたがUV感受性には影響を与えなかった。また、DNA-PKにmutationを持つscidマウス由来の細胞の放射線感受性には影響を与えなかった。これらのことから、suraminはDNA-PK活性を抑制することにより細胞の放射線感受性を高めることが明らかとなった。さらにsuraminがepidermal growthfactor (EGF)受容体の活性に及ぼす影響を検討した結果、suraminはEGF受容体を一過性に活性化し、その後不活性化することが明らかとなった。EGF受容体の一過性の活性化はSrc阻害剤PP2により抑制されたが、GPCR阻害剤によっては抑制されなかった。
非アルコール性脂肪肝炎における核内受容体転写共役活性化因子ＰＤＩＰ１の役割

非アルコール性脂肪肝炎(NASH)を生じさせるために確立された食餌性NASHモデルであるMCD diet (メチオニン・コリン欠乏食)負荷によってPPARγDNA-binding domain-interacting protein1 (PDIP1)ノックアウトマウスでは、血清ALTや中性脂肪が、肝組織において、肝脂肪沈着、肝組織炎症、肝線維化が有意に軽度であった。また肝組織における脂質関連遺伝子の発現が変化し、炎症性サイトカイン及び肝線維原性遺伝子の発現が野生型マウスと比較してノックアウトマウスで有意に低下しており、PDIP1ノックアウトマウスでは、脂肪肝炎が軽快することが示唆された。1.佐藤哲郎講師からご供与いただいたPDIP1ノックアウトマウスとそのコントロールマウスを繁殖させ、マウスの尾からRNAを抽出し、野生型とノックアウトマウスのプライマーを用いてRTーPCRにてホモかヘテロかphenotypeを確認し、確実にPDIP1ノックアウトマウスの繁殖を行うことに成功した。2.非アルコール性脂肪肝炎を生じさせるために確立された食餌性NASHモデルであるMCD diet (メチオニン・コリン欠乏食)を野生型マウスとPDIP1ノックアウトマウスに同時に投与して経時的に観察を行った。MCD dietに対するコントロール食を用いて2種類の食事に対する2群のマウスで計4群の比較を行った。4.投与開始後4、12週においてPDIP1ノックアウトマウスとそのコントロールマウスを同時に屠殺し、肝重量/全身体重比を測定し、肝組織で、PDIP1の発現をreal-time PCRで確認した。また組織標本としてHematoxylin-Eosin染色、oil red O染色の陽性面積計測と肝組織脂質定量を行った。12週で屠殺したマウスにおいてSirius red染色やαSMA染色及び肝組織でのhydroxyprolineの定量を行った。5.肝線維化マーカー遺伝子の発現をreal-time PCRで確認した。また炎症性サイトカインのreal-time PCRや免疫染色を行った。肝組織で酸化ストレスマーカーも検討した。6.不死化肝星細胞LX-2においてPDIP1を過剰発現させ検討を行った。非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の病態は未だ不明な点が多く、脂肪肝に種々の刺激が加わり発症するとされる後述の2nd hit theoryがメカニズムのモデルとして提唱されている。一方、転写共役因子は、核内受容体による転写調節機構において必須の役割を果たし、生体内エネルギー代謝調節系におけるmetabolic switchまたはsensorとしての機能が近年注目されている。連携研究者が単離したPPARγに結合する転写共役活性化因子PDIP1(PPARγDBD-interacting protein1)のノックアウトマウスが高脂肪食負荷により脂肪肝形成が著明に抑制された結果に基づき、実験的NASHモデルを用いて、PDIP1のNASHの病態形成における役割ひいては、脂質代謝と肝線維化の病態の解明を目的として研究を行った。非アルコール性脂肪肝炎を生じさせるために確立された食餌性NASHモデルであるMCD diet (メチオニン・コリン欠乏食)負荷によってPDIP1ノックアウトマウスでは、血清においてALTやTGが、肝組織において、肝脂肪沈着、肝組織炎症、肝線維化が有意に軽度であった。また肝組織における脂質関連遺伝子の発現が変化し、炎症性サイトカイン及び肝線維原性遺伝子の発現や酸化ストレスなどが野生型マウスと比較してノックアウトマウスで有意に低下しており、PDIP1ノックアウトマウスでは、脂肪肝炎が軽快することが示唆された。したがってPDIP1はNASH治療戦略において分子標的と考えられるため、今後は肝疾患の病態連携においてのPDIP1の意義について幅広く検討を行い、トランスレーショナルリサーチとして臨床応用も視野に入れて研究を進めて行く予定である。3.投与開始後4、12週においてPDIP1ノックアウトマウスとコントロールマウスを同時に屠殺し、同時に採血して、肝逸脱酵素(ALT)、脂質(total cholesterol, triglyceride、血糖を測定し比較検討した。

12週で屠殺したマウスにおいてSirius red染色やαSMA染色及び肝組織でのhydroxyprolineの定量を行った。医歯薬学平成24年度科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)交付申請書に記載した通りのロードマップに沿って実験の遂行が行えており、おおむね順調の進捗状況といえると思われる。平成23年度科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)交付申請書に記載した通りのロードマップに沿って実験の遂行が行えており、おおむね順調の進捗状況といえると思われる。交付申請書に記載した通りのロードマップに沿って実験の遂行を行う予定である。現象に対するメカニズムの分析のための研究を継続し、in vitroの実験もさらに進めていく。現象に対するメカニズムの分析のための研究が主体になると考えられ、in vitroの実験なども考慮していく必要がある。平成24年度分を計画通り使用したが、約14万円残額が出て、平成25年度分を併せて、追加実験のためのマウス購入などに費用を充てる予定である。上記に記載したロードマップを実現ための遺伝子発現及び蛋白発現の実験や炎症・線維化のマーカーなどの検討を行う。GeneChip Expression解析等も行う予定である。したがってこれらに必要な試薬等の消耗品の購入や解析依頼費用などに使用する。
廃用性筋萎縮を惹起するメカノ・ニュートリション・シグナル

近年、我々は、無重力や寝たきりによる筋萎縮(廃用性筋萎縮)では、筋細胞内に蓄積した酸化ストレスが、ミトコンドリア関連小胞体膜(Mitochondria-associated ER membrane:MAM)構造を破綻させ、萎縮を誘導する可能性を示した。本研究では、この酸化ストレスの発生源がMAM上に存在するNADPHoxidase (NOX)であることを明らかにする。つまり、機械的ストレス(メカノ)や過栄養(メタボ)による酸化ストレスの蓄積からミトコンドリア関連小胞体膜(MAM)の破綻に繋がるシグナル、いわゆる“MAM-ROS signaling"とも呼ぶべき新規の筋萎縮シグナルを同定する。
ミニマリスト・プログラムにおける文生成コンピュータプログラム構築と統語理論の開発

本研究の主な目的はミニマリスト・プログラムの最新の統語理論を検証するためのコンピュータプログラムを構築することであり、2017年度に引き続き2018年度も目的を達成するために研究を続けた。2018年度は、文の樹形図をHTML形式で分かりやすく表示するすコンピュータプログラムの構築を行った。このプログラムは樹形図の線の間のスペースを効率よく計算し、深い埋込み構造をもった樹形図でもモニターや論文の1ページに収まる程コンパクトに表示できる。本研究を対象としているコンピュータモデルのアウトプットを分かりやすく示すためにこのプログラムは必要である。2018年度に行った研究は関係節に関するものであり、その成果を国際的な学術誌に投稿した。査読者のコメントをもとに本研究を対象としているコンピュータモデルに新しく比較関係節(例えば、the boy who Mike writes better than)と所有関係節(例えば、the boy whose friends bought the cake)を取り入れた。研究代表者が知っている限り、英語の関係節をこれほど扱っているコンピュータモデルは他にはない。コメントをもとに論文に修正を施した。2019年度にこれを学術雑誌に投稿する予定である。また、対象例文(主に疑問文、補文標識・痕跡効果を含む文、虚辞構文)のモデル化も進め、このテーマについての論文を国際的学術誌に投稿した。論文の査読者のコメントなどを元にモデルを更新して、論文を書き直した。前年度に引き続き、Chomsky (2013,2015)の提案する自由併合(free Merge)と呼ばれる統語操作(集合併合と対併合)をコンピュータプログラムに取り入れる方法についての研究も続けた。特に、同族目的語を含む構文に自由併合がどのようにうまく当てはまるのかを検証した。2018年度、データ収集と考察を続ける予定だった。予定通り、寄生空所構文と中間構文と関係節の例文データを収集できた。しかし、モデル作成に時間がかかり、新しく集めたデータの考察を予定どおり行うことができなかった。2018年度は、コンピュータプログラム作成と問題解決を行う予定であった。研究代表者は対象の例文(主に疑問文、補文標識・痕跡効果を含む文、虚辞構文)のモデル化を行った。また、海外協力研究者のSandiway Fongと一緒に関係節のモデル化を行うとともに、同族目的語を含む構文をどのようにモデルに取り入れるのかについて打ち合わせを行った。生成コストの研究を当初は予定していたが、現時点でどのようにコストを計算したらよいのかという疑問に直面し、今のところ研究が頓挫している。その代わりに、自由併合操作をモデルにどのように取り入れるのか検証した。本研究のコンピュータモデルのアウトプットを表示するために樹形図を描くプログラムが必要であり、最新のウェブ技術に合わせるため、プログラムを改良する必要があった。樹形図を明確に描写する新しいプログラムを作成できたが作成にかなり時間がかかった。2018年度は、主に寄生空所構文のモデル化を行う予定だったが、他のデータのモデル化と文の樹形図を描くプログラム作成に多くの時間がかかったため、予定どおり研究を行えなかった。2018年度は、研究成果を公表する予定だった。2018年6月に行われた関西言語学会第43回大会で自由併合に課される制限についての口頭発表を行った。また、2つの論文を国際的学術誌に投稿し、査読者のコメントをもとに論文(及びコンピュータモデル)の修正を行った。2018年の8月に、海外研究協力者Sandiway Fongを大阪教育大学へ招き、自由併合と同族目的語について研究分担者(松本マスミと寺田寛)と打ち合わせを行った。昨年度に引き続き、今後はコンピュータプログラム作成と査読者から示唆された問題の解決、そして研究成果公表を行う予定である。2018年度は、最新の統語理論の研究に基づいて自由併合を用いた統語計算方法を取り入れ、言語を制限している普遍的な(言語特有ではない)制限は何かという問いの答えを探りながら、コンピュータモデル構築に力をそそぎ続ける。モデル構築と問題解決に時間がかかったため、予定していた全ての種類のテータをモデルに入れるのは現時点で困難である。そのため、一部のデータの疑問文、補文標識・痕跡効果を含む文、虚辞構文をモデルに取り入れる。また、所有構文と同族構文は本モデルに適しているため、モデルに取り入れる研究を続ける。データのモデル化に伴い、新たな問題が生じ、問題解決に時間がかかる可能性がある。対策として、分担者(松本マスミと寺田寛)と海外研究協力者のSandiway Fongと頻繁に打ち合わせを行い、対策について話しあう。また、Fongと別々にモデルを構築することによりモデルのアウトプットや問題点を比較しながら、問題解決を行う。データ収集と考察について、主に、そのデータをどのようにモデル化を行うのかを考察する。本年度も研究成果を公表する。2019年5月末に、東京大学で行われるEvolinguistics Workshop(進化言語学ワークショップ)で言語と併合についての発表(Sandiway Fongとマサチューセッツ工科大学のRobert Berwickと共著)を行う予定である。また、他の国際学会に応募し、論文作成を行い、学術誌に投稿する予定である。本研究の主な目的はミニマリスト・プログラムの最新の統語理論を検証するためのコンピュータプログラムを構築することである。海外研究協力者のSandiway Fongがhtml形式で分かりやすい樹形図を自動的に形成し表示するプログラムを開発し、大阪教育大学のサーバを利用して一般公開した。本研究対処のコンピュータプログラムはこの樹形図の機能を利用している。

そして、一般公開により、他の研究者は簡単に利用することができる。生成理論のコンピュータモデル構築を我々が押し進めたことが平成28年度の主たる成果の一つである。特に、Chomsky (2013,2015)の提案する自由併合(free Merge)と呼ばれる統語操作(集合併合と対併合)をコンピュータプログラムに取り入れることに成功した。自由併合を利用すると一つの文を生成するために、無限の数の構造を排除する必要があるという重大な問題が生じる。しかし、自由併合に制限をもうけることにより、非文法的な英文を排除し、生成可能な文を特定することができた。自由併合を利用すると以前使っていた多くの統語上の制限を無くすことができるので利点が多い。現時点で所有構文(例えばmy friend, the friend of mine)の生成に成功した。特にdouble genitive(二重所有構文)では被所有者(possessee)が通常の位置に現れないため、この構文の実際の構造はどうなっているのかという疑問が生じる。例えば名詞句のmy friendにおける所有形のmyの後に現れるfriendは二重所有構文のthe friend of mineでは所有形のmineの前の位置に現れる。このような構造を本モデルで説明することに成功した。これから多くの種類の文のモデル化を行う予定である。平成28年度は、データ収集と考察を行う予定であった。学生の研究補助者に依頼して、寄生空所構文の例文データをある程度集めることができた。中間構文のデータも集める予定だったが、これができなかったので予定より遅れた部分もあった。収集されたデータを考察し、コンピュータプログラムに取り入れる予定だったが、モデル構築に時間がかかってしまい、研究の予定に遅れが生じた。また平成28年度は、コンピュータプログラム作成を主に行う予定であった。この一部をなすモデル構築はかなり進めることができた。本プロジェクトを始める前にすでに構築したコンピュータモデルでは、主に素性照合の制限などをもうけることで文の生成ができるようになった。しかし、最近の統語論研究(Chomsky 2013, 2015など)では文生成は自由併合操作と言語に特有でない第三要因原理にしたがって行われる。こういう自由併合を取り入れると素性照合の多くの制限を取り除くことができるため、従来のモデルを根本的に再構築する必要があった。自由併合を実施すると文の派生が無限ループに陥るという大きな問題点があったが、海外研究協力者Fongと協議を進めた結果、深さ優先探索のプログラミングアルゴリズムを利用することにより、この問題を解消することに成功した。名詞句(主に所有構文)をモデルに取り入れた。今後さらに多くのデータのモデル化を行う予定である。生成コストの研究を当初は予定していた。
黒鉛炉原子吸光における感度と原子化機構に関する基礎的研究

黒鉛炉原子吸光における原子化機構の解析に必要な原子化時の急速な炉内の1/60秒毎の温度測定は当申請費で購入した2色温度計で可能となった。本研究によって得られた新たな知見・成果は次の通りである。1.黒鉛炉原子吸光における原子化機構の解析(1)原子化効率1%吸収に相当するg数(m)を原子量(A)で割った対数値として定義したモル感度pM=-log(m/A)を物理的および科学的原子化効率に分離するモデルを提案した。それは理論的モル感度を計算し、吸光度プロファイルのtail部分より拡散損失のみに依存する物理的効率を求め、pMの実験値との差を科学的原子化効率として算出したものである。pMがZnで極大値、Geで極小値をもつ周期性は理論的pM、物理的および科学的効率でもみられた。Geに対してはNaNO_3などのマトリックス修飾剤を用いることによって科学的原子化効率を上げることが可能である。(2)スズの原子化機構有機溶媒を用いる有機スズの吸光度シグナルがダブルシグナルとなり、このような現像がスズの感度の不安定さの原因の一つであることを見い出した。この効果は有機溶媒の灰化の結果生じた活性炭素によって還元された一部の金属スズの原子化(第1ピーク)と酸化スズの原子化(第2ピーク)によることを明らかにした。またパージガスArに空気1%を混入することによって第1ピークが消失すると共に感度が大きく上がることを見い出した。2.原子吸光法における黒鉛炉の性状と感度との相関性:非コーティング:(NPG)にTaをコーティングした炉(TaNPG)を用いて第4周期の元素について感度と原子化機構を検討した。金属性の高いScはNPGに比べて感度が下がり、半金属のGe、Seでは感度が大きく増大したが、Scでは炭素による還元が充分になされないこと、Geではスポンジ状になったTaNPG表面に吸収保持され、逸散損失が少ないために感度が上がることを明らかにした。
自公転円板上の流体の流れ現象の解明と応用

静止している円板に自転および公転運動を付加し,円板に付着した液滴の流動臨界条件に関して,溶液の種類を変えて,液滴の体積,回転角加速度の影響について調査を試みた結果,実験の再現性を得る上で,円板の表面性状,温度や湿度環境,液滴の設置形状の影響だけでなく,溶液の種類によっては液表面の水分蒸発による影響が大きいことが判明し,そのばらつきが小さくなる条件で実験を実施した。その条件下で,直径300 mm(=2R )の円板上にシリコンウェハを貼り付け,サーボモータ制御装置を用いて円板に付加する運動を制御する。液滴が付着した円板に起動回転加速を与え,液の流動の様子を上方に設置した高速度カメラを用いて撮影し,液滴が動き出す回転加速度,液が動き出す際の半径方向外側の前進接触角および半径方向内側の後退接触角を求めて流動臨界条件について調査した。その結果,円板の回転角加速度が大きく,液滴の粘度が高くて液滴の体積が小さいほど,動き出しに必要な加速度が大きくなっていることを明らかにした。さらに,前進接触角と後退接触角の差が回転加速中にどのように変化するか(時間履歴)について,液体積と角加速度を変えて調査した結果,同一種類の液体であれば,液体積による依存性はみられないが,回転角速度が大きいほど前進接触角と交代接触角の差は高速回転域でも小さいことを示した。これは,回転角速度が液滴の半径方向の変形に大きく影響を与え,その角加速度が大きいほど液滴の変形はしにくいため,動き出しの加速度が大きくなっているといえる。また,感圧塗料により回転円板上の圧力分布を高精度に計測するための基礎研究を行い,変調光を寿命法に利用した感圧塗料による物体表面の圧力計測に成功した。直径300mmの円板を用いて高レイノルズ数での円板上に発達する気流の境界層流れに公転が与える影響について調査においては、ある公転位相角での速度場を熱線流速計で遷移現象,境界層の構造や流領域での速度場,乱れの特性について計測した結果、公転運動の影響による境界層遷移の促進のみならず、公転運動に伴う気流のせん断流によって境界層構造全体の移動や変形が生じていることを明らかにした。微小量の液体を付着させた静止円板に自転と公転運動を任意の角加速度の起動回転中における液体の軌跡に着目した挙動を調査においては、界面活性剤を含有する付着液を用い、円板表面は親水性の状態で、液体の挙動を高速度カメラによって撮影した。得られた画像を解析することによって、液体が動き出した円板表面位置の加速度や液体の軌道が変化する位置の加速度などを回転条件によって比較検討し、円板に与えた自公転の加速運動が円板に付着した液体の軌道に与える挙動について明らかにした。同方向と逆方向の公転運動を与えた場合で液体の流れに大きな違いがみられ、それらの違いは自公転速度の相対速度の大きさに依存し、その相対速度が大きいほど液体が動き出すための臨界速度は大きくなることを明らかにした。また、臨界加速度を超えると、公転中心からの距離が遠い位置にある液体ほど先に動き出し、コリオリ力の影響のみならず、そのときに応じた公転半径方向外向きの力を受けて偏向して流れていくことがわかった。熊本地震の影響で研究を実施できない期間があったり、既存の計測機器の一部が地震被害で使用できなかったり、装置改造予定の業者も復旧対応で、図面のすり合せなどの調整が遅れたため。これまで行ってきたアルミ円板での実験に加えて、使用したアルミ円板より円板面の性状の一様性が高く、親水性の高いウェハを用いて任意の自公転運動を付加した起動回転中の円板上を流れる液体の挙動を高速度カメラによって調査した。微小量の液滴を静止円板上に設置して回転運動を開始する実験においては、自公転運動の相対速度の大きさによって、液の軌跡は自転のみの場合の軌跡と異なり、その相対速度が小さい場合、液の軌跡は大きく湾曲し、その方向は相対速度の正負に依存することを明らかにした。液滴が動きだす回転加速度は液量や設置半径位置に依存する結果が得られ、その原因については今後調査していく予定である。ウェハ中心部に15mLの液体を盛った状態から起動回転を開始し、無次元半径0.5の位置にチップを想定した障害物を設置して液体の動きを動的に調査した。自転のみでは液体は円板中心部の液盛りが半径方向に広がってある位置からフィンガー状に半径方向に伸長して流れ、障害物後方へ回り込む流れはみられないが、自転に公転を付加した場合は相対速度の正負に関わらず公転の影響を受けて自転のみの場合に比べて障害物後方にも回り込む流れが観察され、相対速度が小さい場合、2つのタイプの回り込む流れがあることが明らかになった。相対速度が大きい場合は小さい場合よりも回り込む流れが減少し、相対速度が正の場合は負の場合に比べてさらに回り込む流れが減少する。相対速度が大きい場合は微小量の液滴の実験で得られた結果からは回り込まないことが予想されたが、液盛量が液滴よりも多いことにより液盛り内部での流れが影響したものと考えられる。自公転円板装置のシステム改良によって円板運動が高精度化され、液滴設置のための冶具の改良により液適量や液滴を設置したときの形状のばらつきを大幅に軽減できたため、再現性が高く系統的な調査結果が得られた。

自公転円板装置の稼働時に異音が発生し始めたため、その場所の特定や原因解明と部品交換などによる改善ならびに試運転などのメンテナンスに2カ月ほど要したため、やや遅れている。静止している円板に自転および公転運動を付加し,円板に付着した液滴の流動臨界条件に関して,溶液の種類を変えて,液滴の体積,回転角加速度の影響について調査を試みた結果,実験の再現性を得る上で,円板の表面性状,温度や湿度環境,液滴の設置形状の影響だけでなく,溶液の種類によっては液表面の水分蒸発による影響が大きいことが判明し,そのばらつきが小さくなる条件で実験を実施した。その条件下で,直径300 mm(=2R )の円板上にシリコンウェハを貼り付け,サーボモータ制御装置を用いて円板に付加する運動を制御する。液滴が付着した円板に起動回転加速を与え,液の流動の様子を上方に設置した高速度カメラを用いて撮影し,液滴が動き出す回転加速度,液が動き出す際の半径方向外側の前進接触角および半径方向内側の後退接触角を求めて流動臨界条件について調査した。その結果,円板の回転角加速度が大きく,液滴の粘度が高くて液滴の体積が小さいほど,動き出しに必要な加速度が大きくなっていることを明らかにした。さらに,前進接触角と後退接触角の差が回転加速中にどのように変化するか(時間履歴)について,液体積と角加速度を変えて調査した結果,同一種類の液体であれば,液体積による依存性はみられないが,回転角速度が大きいほど前進接触角と交代接触角の差は高速回転域でも小さいことを示した。これは,回転角速度が液滴の半径方向の変形に大きく影響を与え,その角加速度が大きいほど液滴の変形はしにくいため,動き出しの加速度が大きくなっているといえる。また,感圧塗料により回転円板上の圧力分布を高精度に計測するための基礎研究を行い,変調光を寿命法に利用した感圧塗料による物体表面の圧力計測に成功した。研究協力者および連携研究者の吉川氏とH28年度の進捗状況を踏まえてH29年度計画を見直し、常に研究状況に関する情報交換を行って研究の推進を図る。また、半導体製造装置メーカーである東京エレクトロン九州の研究協力者とも情報交換を行い,実用上の面での相談も行う。国内および国際学会での口頭発表や論文発表により研究成果を発表することも念頭に計画的に研究計画を遂行する。安全面と機器の不具合による研究の停滞を回避するために定期的な点検やメンテナンスを実施し、今後の研究を円滑に実施する。熊本地震の影響で研究遂行に遅れが生じ、計測センサや液剤などの物品、必要な加工に係る経費が次年度使用額として生じた。装置の不具合によるメンテナンスに時間を要して研究の進捗が遅れたため、使用計画にも遅れた生じた。次年度に持ち越して合わせて使用する。計測センサや液剤などの物品、必要な加工に係る経費として、翌年度分の使用予定内容に加えて使用する計画である。
正準変換と比較原理の手法による分散型方程式の解の諸性質の解明

フーリエ積分作用素の大域的な有界性の理論を整備することにより、偏微分方程式の解の様々な評価式を導出する際に標準形へと変換してから考察する手法を確立し、さらには二つの偏微分方程式の表象の比較からそれぞれの解の評価式を比較する新しい手法も整備して、非線型問題にアプローチした。この研究は、偏微分方程式をその表象の座標変換により標準形へと変換してから考察する古典的手法(正準変換)と、二つの偏微分方程式の表象の比較からそれぞれの解の評価式を比較する新しい手法(比較原理)を組み合わせることにより、解に対する様々な評価式を導きかつ偏微分方程式論の諸問題にそれらを応用することを試みるものである。これに関して、本年度は特に以下の課題に取り組んだ。1.比較原理を用いた非分散型方程式に対する平滑化評価式の導出:分散型方程式の場合に威力を発揮した比較原理が、非分散型の場合にまでも応用されることを示した。この成果に関する論文は現在執筆中である。Ruzhansky (Imperial College London)氏との共同研究による。2.ポテンシャル項を持つシュレデインガー方程式に対する比較原理:これまではポテンシャルがない場合にのみ比較原理が定式化されていたが、スペクトル理論を用いることにより、ポテンシャル項がある場合にも同じ原理が成立していることを確認した。この研究は、次年度に継続して行う予定である。Ruzhansky (Imperial College London)氏およびBen-Artzi (Hebrew University)氏との共同研究による。3.モジュレーション空間論の基礎研究:Riesz変換がモジュレーション空間で有界であるための指数の関係を決定した。この成果はMathematische Nachrichiten誌に掲載された。また、擬微分作用素がモジュレーション空間で有界となるためのシンボルクラスについて考察した。この成果はThe Journal of Fourier Analysis and Applications誌に掲載された。これらは、冨田直人(大阪大学)氏との共同研究による。この研究は、偏微分方程式をその表象の座標変換により標準形へと変換してから考察する百典的手法(正準変換)と、二つの偏微分方程式の表象の比較からそれぞれの解の評価式を比較する新しい手法(比較原理)を組み合わせることにより、解に対する様々な評価式を導きかつ偏微分方程式論の諸問題にそれらを応用することを試みるものである。これらの研究はまだ途上にあり,最終的成果に関しては今後の進展に期待したい.1.標準形への変換を実現する大域的なフーリエ積分作用素の構成法の発見に向けての試金石として、M. Ruzhansky氏(Imperial College London)との共同研究により,双曲型方程式に対する初期値問題の時間大域的な解の構成法を研究した。その際,アイコナル方程式の大域的な解の構成が最も困難な部分であるが、これに対してさまざまなアイデアでアプローチした。2.剰余項をともなう標準形に対する評価式の導出に向けてのテストケースとして、ポテンシャル項を持つ分散型方程式に対する平滑化評価式をスペクトル理論を用いて考察した。特にM. Ben-Artzi氏(Hebrew University)との共同研究により、スペクトルが比較できる二つのポテンシャルに対しては平滑化評価式が比較できるという比較原理の理論整備につとめた。3.L^p-空間においてはフーリエ積分作用素が有界ではないために、その替わりとして、相空間において均質的な取り扱いをするモジュレーション空間に着目した。この空間は比較的新しく提唱されたものであり、その基本的性質は未だ完全には解明されていない。今年度は冨田直人氏(大阪大学)とモジュレーション空間の基礎理論(特にそこでの非線形作用)についての研究を行い、さらにB. Wang氏(北京大学)とはその非線形問題への応用に関する研究を行った。これらの研究はまだ途上にあり,最終的成果に関しては今後の進展に期待したい.1. M.Ruzhansky氏(Imperial College London)との共同研究により,双曲型方程式に対する初期値問題の解の時間大域的な構成法に関する研究を継続した。相関数の大域的な構成に関しては、アイコナル方程式を解くのではなくラグランジュアン多様体が同じとなる別の相関数を構成する方法が有効であることを見出した。これをもとに解の時空間評価式を導出するのが次の課題である。2.シュレディンガーおよび波動方程式に対する発展作用素は、Lp空間上では有界ではないがモジュレーション空間上では有界になることが知られている。

そこで、Lp空間からモジュレーション空間への作用素としては有界かという疑問が生じるが、この問題はLpソボレフ空間とモジュレーション空間の間の包含関係を決定することと同値となる。小林政晴氏(東京理科大)との共同研究により、この包含関係を完全に決定することができた。また、Wang氏(北京大学)および冨田直人氏(大阪大学)との共同研究により、モジュレーション空間において非線形作用が閉じているかという問題について考察した。これは非線形分散型方程式の初期値問題においてモジュレーション空間論を用いる際に重要となる性質であるが、代表的な非線形項に対しては応用可能な部分的な解答を得ることができた。この研究は、偏微分方程式をその表象の座標変換により標準形へと変換してから考察する古典的手法(正準変換)と、二つの偏微分方程式の表象の比較からそれぞれの解の評価式を比較する新しい手法(比較原理)を組み合わせることにより、解に対する様々な評価式を導きかつ偏微分方程式論の諸問題にそれらを応用することを試みるものである。これに関して、本年度は特に以下の課題に取り組んだ。これらの研究はまだ途上にあり、最終的成果に関しては今後の進展に期待したい。1.ウィーナー・アマルガム空間とソボレフ空間との間における包含関係の決定2.分散型方程式の解の平滑化評価式における最良定数の決定課題1に関しては、相空間において均質的な取り扱いをするモジュレーション空間とソボレフ空間との包含関係を小林政晴氏との共同研究により完全に決定しているが、モジュレーション空間の派生物であるウィーナー・アマルガム空間に対しても引き続き同種の考察を行った。この研究を通じて、ウィーナー・アマルガム空間がモジュレーション空間に比べてかなり異質な空間であることが次第に明らかになってきている。課題2に関しては、シュレディンガー方程式に対するある特別のタイプの平滑化評価式におけるB.Simonの与えた最良定数が知られていたが、N.Bez氏との共同研究により、一般のタイプの平滑化評価式に対してもその最良定数を決定するとともに、最良を実現する関数の存在・非存在に関するひとつの判定法を与えることができた。類似の研究はこれまでには知られておらず、ここでの成果はかなり独創的であるとともに、今後の発展・応用も大いに期待される。最終年度である本年度は、Ben-Artzi氏との共同研究により、特に「広範なクラスの分散型方程式に対する平滑化評価式の導出」に重点的に取り組んだ。
軟骨細胞分化、組織形成に関わる新規プロテインキナーゼの探索とシグナル機構の解明

軟骨組織は骨格の支持・成長に重要な役割を果たす。軟骨組織は、未分化間葉系細胞から軟骨細胞へと分化し、この分化過程が正常に進行することで骨格の伸長を伴う内軟骨骨形成により形成される。なかでも骨形成因子BMPはSmad分子のリン酸化を誘導し、強い骨・軟骨形成促進作用がある。しかし、その下流に存在する骨・軟骨形成を決定づけるシグナル分子やその伝達機構の詳細についてはほとんど分かっていない。従って、リン酸化に着目し、BMPにより誘導されるキナーゼ関連分子を網羅的に探索し、軟骨細胞分化に重要な因子の同定と機能解析を行った。未分化間葉系細胞を多く含み、多分化能を有する胎生12日目のマウス肢芽細胞を用いて、BMP2を処理することで発現の上昇するプロテインキナーゼ遺伝子をAffimetrix社のGenechipを用いたマイクロアレイにより遺伝子発現解析を行った。その際、絞り込みの条件としてBMPによって発現上昇が顕著かつ機能が全く未知であるものを検索し、新規のセリンスレオニンプロテインキナーゼを同定した。引き続き培養細胞を用いた解析を行い、肢芽細胞に新規プロテインキナーゼを過剰発現またはshRNAにて遺伝子ノックダウン後、骨・軟骨誘導培地にて分化能を検討した。その結果、新規プロテインキナーゼを過剰発現させると骨形成に必須である転写因子Runx2, Osterixの発現上昇が観察された。またshRNAによる遺伝子ノックダウンした肢芽細胞で石灰化の著明な抑制が観察された。さらに、マウス個体における新規プロテインキナーゼの機能解析を行うため、CRISPR/Cas9法を用いて遺伝子ノックアウト(KO)マウスを作製した。このKOマウスの骨表現系を解析すると、胎生14日目の上腕骨に軽微な変化を認めた。従って新規プロテインキナーゼは間葉系幹細胞から軟骨細胞分化の制御に関与している可能性が示された。本研究計画では、未分化間葉系細胞から軟骨分化に重要な因子を同定し、同定したプロテインキナーゼの細胞レベルでの解析を通じて機能的役割を明らかにすることを初年度の計画目標としていた。本年度の実際の成果は、新規プロテインキナーゼを同定し、細胞レベルで軟骨細胞の石灰可能を制御することや、骨形成に必須の転写因子Runx2, Osterixの発現制御にも関わっているデータを得ることができた。さらにマウス個体における解析を進めるため、CRISPR/Cas9法による新規プロテインキナーゼのノックアウトマウス作成も完了し、骨表現系の解析も完了している。従って、当初予定していた研究計画よりも順調に進展していると考えられる。本年度の研究実績では、新規プロテインキナーゼのin vitroでの解析でRunx2, Osterixの発現を制御することを示すとともに、マウス個体レベルでの機能解析を行った。特にin vivoモデルにおける個体解析を行うために、遺伝子ノックアウトマウスを作成し、その骨表現形を解析した。しかしながら、新規プロテインキナーゼのノックアウトマウスの骨表現形は野生型と比較して非常に軽微な変化であった。本研究で同定した新規プロテインキナーゼは複数のファミリー遺伝子が存在することが知られており、それらのファミリー遺伝子は構造的にも類似しているので、機能的に代償している可能性が考えられる。そのため、単純に新規プロテインキナーゼを一つ遺伝子ノックアウトしただけでは解析が不十分であるため、今後の研究方策として同一ファミリー遺伝子の複数のノックアウトマウス作成を行い、骨表現形の解析を通して新規プロテインキナーゼの骨軟骨分化に与える影響について更なる検討を重ねる予定である。