hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
記憶の制御機構(分子から行動まで)

これらをマウスのヒートショック蛋白、hsp68遺伝子のプロモーター下流に繋いだコンストラクトをトランス遺伝子としてゼブラフィッシュ受精卵のマイクロインジェクションした後、熱ショックを加えることでレポーター遺伝子の発現を誘導して、24時間胚の初期神経回路を形成する神経細胞全体の形態の観察に成功している。特にtauBD-EGFPが神経細胞の微細構造の観察に非常に有効であることを証明した。さらに、このEGFPの代わりにEGFPの新たな変異体であるEnhanced Yellow Fluorescent Protein(EYFP)とEnhanced Cyan Fluorescent Protein(ECFP)を、異なる神経細胞の標識に用いようと考え、オリンパス光学工業株式会社との共同研究によってEYFPとECFPの両者の蛍光を分離できる顕微鏡フィルターの開発に成功した。次にこの両者を免疫組織学的に識別できるようにECFPにはエビトーブタグを繋ぐことを考えた。6xHisおよびFLAGをECFPに繋いだレポーター遺伝子をゼブラフィッシュの胚で一過性に発現させたところ、6xHis-ECFPは蛍光強度が弱いのに対して、FLAG-ECFPはその波長特性が変化せず、蛍光強度が十分強いたけでなく、個体発生に及ぼす影響も認められなかった。このことからEYFPとFLAG-ECFPは蛍光のみならず、免疫組織学的にも互いに区別できる大変有用なレポーター遺伝子であることを明らかにした。神経細胞において膜脱分極によってその発現が誘導される最初期遺伝子のうち、c-fos、junB、zif268、nur77のプロモーターの下流にtau-GFPを繋いだレポーターベクターを構築、これを導入したトランスジェニックゼブラフィッシュに対して学習・記憶の行動実験を行い、記憶の形成された個体の脳についてレポーター遺伝子の発現を指標に記憶制御部位のマッピングを行うことを目指している。まず、活動する神経細胞の形態をモニターするためのレポーター遺伝子としてそのニューロンの細胞体のみならず神経突起までを含む形態の解析を目的として神経突起の微小管に結合する蛋白、tauに注目した。ウシ由来のtauの全長およびtauのうち微小管に結合するドメインそれぞれをオワンクラゲ由来の発光蛋白、Green Fluorescent Protein(GFP)のコドンをヒト型にして蛍光強度を高めたEnhanced GFP(EGFP)に融合遺伝子として繋いだレポーター、tau-EGFPおよびtauBD-EGFPを構築した。さらにtau-EGFPおよびtauBD-EGFPには発現量を高めるためにリボゾーム結合部位であるKozakの配列を導入した。予備実験としてゼブラフィッシュで構成的に発現するプロモーターとしてマウスのヒートショック蛋白68のプロモーターをこれらのレポーターの上流に繋いだコンストラクトを構築、これをゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションして、24時間胚の初期神経回路を形成する単一のニューロン全体の形態をトレーサーを用いずに観察している。活動する神経細胞、すなわち膜脱分極によってその発現が誘導される最初期遺伝子のうち、c-fos、junB、zif268、nur77のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を繋いだベクターを構築し、これを導入したトランスジェニックゼブラフィッシュに対して学習実験を行い、記憶の形成された個体の脳についてレポーター遺伝子の発現を指標に記憶制御部位のマッピングを行うことを目指している。ウシ由来のtauの全長およびtauのうち微小管に結合するドメインの部分(tauBD)をそれぞれオワンクラゲ由来の発光蛋白、Green Fluorescent Protein(GFP)のコドンをヒト型にして蛍光強度を高めたEnhanced GFP(EGFP)に融合遺伝子として繋いだレポーター、tau-EGFPおよびtauBD-EGFPを構築した。さらにtau-EGFPおよびtauBD-EGFPには発現量を高めるためにリボゾーム結合配列であるKozakのコンセンサス配列を導入した。予備実験としてマウスのヒートショック蛋白68のプロモーターをこれらのレポーターの上流に繋いだコンストラクトを構築、これをゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションした後、熱ショックを加えることでレポーター遺伝子の発現を誘導し、24時間胚の初期神経回路を形成する単一のニューロン全体の形態をトレーサーを用いずに観察している。また、突起を伸長しつつある神経細胞の微細な形態を観察するのにtauBD-EGFPがレポーターとして非常に有効であることをその遺伝子の一過性の発現によって証明した。現在、c-fosをはじめとするゼブラフィッシュ由来の最初期遺伝子のクローニングの準備を進めているところである。このことからEYFPとFLAG-
環境応答システム群・異物排出ポンプの統合による日和見感染菌の自然免疫回避の解析

1)緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa):acyl-HSL誘導体によるエラスターゼ合成遺伝子(lasB)およびラムノリピッド合成遺伝子(rhlA)の発現を比較したところ、緑膿菌が産生するacyl-HSLでの発現が最も高かった。mexBの欠失はC814の3-oxo-Cn-HSLに応答したlasBの発現を異なる割合で増加させた。各遺伝子の発現とピオシアニンやエラスターゼの産生量の変化は一致した。以上の結果から、緑膿菌では、MexAB-OprMが多剤耐性に関与しているだけではなく、応答すべきacyl-HSLsを選別し、QSを制御し、ヒトに対する病原性の発現に寄与していることが明らかとなった。2)セラチア菌(Serracia marcescens):約8,000クローンのTn挿入変異株ライブラリーを構築し、全てのクローンについて血清感受性試験を行った結果、79個の血清感受性変異株が得られた。得られた変異株におけるTn挿入遺伝子を解析したところ、リポ多糖体のコア領域やO抗原の合成に関する遺伝子の変異株が顕著な血清感受性を示すことがわかった。このことより細胞表面の構造変化が血清に対する抵抗性に重要であることが示唆された。また、これら変異株の菌体表面の構造変化を解析したところ、ヒト自然免疫因子のひとつである補体とリポ多糖(lipopolysaccharide)との結合性が抵抗性に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。当該年度は、血液環境下で発現する緑膿菌およびセラチアの遺伝子群の検索をゲノムレベルで行うことを目標として研究を行い、次の成果を得た。1.緑膿菌のヒト血液内防御因子への作用(1)緑膿菌の病原因子であるエラスターゼ、アルカリプロテアーゼ、エキソトキシン、および膜小胞について感染時の発現制御と病原性への寄与の解析を行なっている。今年度は重要な病原因子と考えられる膜小胞の定量系を確立した。さらに、膜小胞の試験管内での産生について調べたところ、Quorum sensing(QS)すなわち細胞間情報伝達機構により制御されていることがわかった。これらのことから、膜小胞は他のQS制御下病原因子と同様に感染部位で発現し、自然免疫を撹乱している可能性が強く示唆された。(2)緑膿菌ゲノムにコードされた排出システムがQS発現因子の選別に働いていることが明らかとなった。これは、排出システムが緑膿菌の病原因子発現に関与するメカニズムを明確にする端緒となると期待される。(3)臨床分離緑膿菌のMLST分子系統解析から、多剤耐性緑膿菌には明らかな系統が存在することを示した。2.セラチアのヒト血液内防御因子への作用(1)セラチアゲノム・マイクロアレイを用いた臨床分離株の比較ゲノム解析から、セラチアのメタロプロテアーゼであるセラリシンが血液環境下での生育に重要な因子であることを、白血球減少マウスおよびカイコ感染モデルを用いて明らかにした。緑膿菌およびセラチアのTn挿入変異株バンクの構築はほぼ終了した。これらのバンクを利用してヒト血液に抵抗性に関与する遺伝子群を明らかにし、両菌種の血液感染における病原性発現機構を明らかにすることを行っている。また、臨床材料中に存在する他菌種とのクロストークの機構を実験的に示すことを計画している。緑膿菌の幾つかの病原因子の発現は、acyl-homserine Iactone誘導体(acyl-HSL)を含めたautoinducers(Als)を介したQuorum Sensingシステム(QS)によって制御されている。「緑膿菌は生育環境から細胞内に透過したacyl-HSLをRND型排出システム(Mexシステム)で選別し、必票なacy1-HSLに対してQS制御を行なっている」という作業仮説の検証を行い次の結果を得た。

PAO1株からacyl-HSLsの合成遺伝子を欠損させたKG7004(Δlasl Δrhll)及び、さらにMexAB-OprMの内膜ゴンポーネント遺伝子mexBを欠損させたKG7050(Δlasl Δrhll ΔmexB)を作成した。また、lasBやrhlAのプロモーター領域を個別にe-gfp遺伝子と融合させたレポーター株の培養液に、合成したacyl-HSLsを添加し、QS応答をGFP蛍光強度として測定した。同時にQSによって発現制御されるピォシアニンとエラスターゼの産生量を測定した。acyl-HSL誘導体によるlastBおよびrhllAの発現を比較したところ、緑膿菌が産生するacyl-HSLでの発現が最も高かった。mexBの欠失はC814の3-oxo-Cn-HSLに応答した治lasBの発現を異なる割合で増加させた。各遺伝子の発現とピオシアニンやエラスターゼの産生量の変化は一致した。さらに、Vibrio anguillarumとの共培養では、排出システムの欠失によってlasBの発現量が増加した。これらのことから他の菌種の産生するAlsの選別に緑膿菌の排出システムが関わっていることを示している。以上の結果から、緑膿菌では、MexAB-OprMが多剤耐性に関与しているだけではなく、応答すべきacyl-HSLsを選別し、QSを制御していることが示された。
低強度運動は加齢による海馬の特異的萎縮や機能低下を防ぐか

本研究では、海馬下位領域の構造や機能的な変化をより詳細に解析可能であるイメージングする手法と海馬歯状回特異的認知機能であるパターン分離課題を導入し、低強度運動が高齢者の認知機能改善に有効であるかとその脳内機構解明を目指す。3年計画の3年目である平成30年度は実験3を実施した。実験3では、短期間の低強度運動介入は健常高齢者の海馬可塑性を高めるかを明らかにすることを目的とした。まず、被験者は地域情報紙などの媒体に通じて被験者を募集し、MMSEやGDSなどの質問紙のスクリーニングにより精神・神経系の疾患に罹っておらず、運動習慣のない49名の健常高齢者を集めた。介入前に、有酸素性運動能力や海馬下位領域(海馬歯状回とCA3, CA1, SUB )の体積を測定した。運動介入には、参加同意を得た17名が参加した。介入期間は、6週間とし、被験者は、週3回、運動教室に来室させ、30分間の自転車運動を行なった。運動強度は、個人の最高酸素摂取量の35%の運動負荷とした。運動終了後には、ポスト測定を行い、低強度運動介入による海馬の構造的な変化を検討した。加齢により有酸素性運動能力が有意に減少し、側頭葉の他の領域に比べ、海馬歯状回とCA3の特異的な萎縮がみられていることを確認したが、6週間の低強度運動介入後、海馬歯状回とCA3の体積(Volume)が介入前に比べ有意に増加していることが明らかになった。これらの結果は、定期的に行う軽い運動は、加齢による海馬歯状回の特異的な萎縮を防ぐ改善効果をもたらす可能性を示唆する。海馬下位領域の構造・機能的な変化の解析に必修であるfMRI技術や海馬歯状回特異的な機能であるパターン分離能課題をUniversity of California, Irvine校から導入することで、本研究の目的を達成するための基盤技術を確保した。さらに、加齢による海馬萎縮の影響がない若齢成人を対象に、一過性の低強度運動が海馬パターン分離能を高める神経基盤を明らかにするため、課題中の海馬内のrCBVを神経活動の指標とし、その変化を検討した。その結果、低強度運動により、課題成功時の海馬(DG/CA3, CA1, SUB)及び嗅内皮質(EC)、海馬傍皮質(PHC)の神経活動が高まることが明らかとなった。特に、低強度運動により高まった海馬歯状回(DG)の神経活動が、複雑な物体を詳細に分別・記憶する機能を担う角回(angular cortex)、海馬傍皮質(PHC)、紡錘状回(Fusiform gyrus)の神経活動と同調していることとともに、課題成績の向上と有意に相関していることが明らかとなった。これらの結果は、軽い強度の運動で海馬歯状回を中心とした脳内ネットワークを強化される可能性を示唆し、本研究課題への応用が期待される。本研究を遂行するうえで必要なfMRI解析の技術を習得し、実際のfMRIデータ解析を行うことが可能となり、当初の計画通りに進展しているといえる。地域情報紙などの媒体を通じて多くの健常高齢者を確保し、高解像度MRI装置を用い、軽い運動習慣が加齢による海馬歯状回特異的な萎縮や機能低下を防ぐことに寄与するかを検討する。また、軽い運動習慣が加齢による海馬萎縮や機能低下に及ぼす影響に関する実験から募集した被験者を対象に、fMRI技術を用いて、一過性の低強度運動が健常高齢者の記憶形成に有効であるかを検討する。fMRI分析技術の学習や関連研究動向把握などに平成28年度は注力したため、実験用の消耗品や被験者謝金を支出せず未使用額が生じた。高解像度MRIデータの分析
性染色体XO型の絶滅危惧種アマミトゲネズミ生殖細胞の性スペクトラム

概ね順調な進捗であると考えている。本研究の肝となるのは雄のアマミトゲネズミからiPS細胞を樹立することであったが、これまでに計6ラインの雄由来iPS細胞株の樹立に至っている。これまで7年間に計20回以上、雄のアマミトゲネズミiPS細胞株の樹立に挑戦してきたが、ようやく樹立に至ったという点で大きな前進であると考えている。現在そのiPS細胞としての特徴を解析中である。これにより雌雄のアマミトゲネズミ由来iPS細胞が揃うことになり、染色体によらない雌雄決定機構の解析準備が整ったと言える。また、生殖細胞への分化誘導に関しては、領域内共同研究として、理研BRCの的場博士や奈良先端大学院大学の磯谷博士のお力添えもあり、異種間キメラ動物作製技術を土台とした、生殖細胞補完と生殖巣補完実験の準備が順調に進んでいる。私達の強みはマウスだけでなくラットも扱うことができるという意味で、選択肢の幅の広さであるが、それでもラットの生殖工学技術はマウスに比べて後れていたことから、少し遠回りではあるがラットの生殖工学技術の開発にも力を注いだ。その結果、「簡単」「高効率」「確実」なラットの体外受精法とKO/KIラット作出法の開発に至り、現在論文を投稿中である。これにより、ラットを宿主胚とした超高効率異種間胚盤胞補完法が可能となり、マウス以外の動物種としてラットからも遺伝子破壊宿主胚を活用できる。異種間キメラの作出には、用いるドナー細胞の動物種や宿主動物種によって、寄与率や寄与する組織に差があることが報告しており、アマミトゲネズミのiPS細胞をドナーとして異種間キメラを作製するにあたり、マウスだけでなくラットも活用できるのは大きな武器になると考えている。とうとう雄のアマミトゲネズミからiPS細胞を樹立することができただけでなく、領域内共同研究により、異種間生殖細胞補完だけでなく、異種間生殖巣補完についても大幅な進捗が見られていることが挙げられる。さらに、少し遠回りをしたがその成果としてラットの生殖工学技術の大幅な進捗に恵まれ、マウスだけでなくラットも胚盤胞補完法の宿主として活用できるようになった。以上の成果から、本研究は概ね順調に進展していると判断している。樹立した雄のアマミトゲネズミiPS細胞について、iPS細胞としての特徴を解析しながら、雌のiPS細胞との比較実験に進む。iPS細胞としての特徴を確認し、雌雄でのRNA-seqまでのデータが得られれば、そこで論文発表する予定である。また、同時並行でそれらiPS細胞を胚盤胞補完法のドナーとした実験を行う。この実験により、アマミトゲネズミの生殖細胞および生殖巣をマウスやラットの体内に生じさせることができると期待している。
伸線強化組織を持つ共析綱極細線の疲労強度と破壊機構

耐疲労特性を兼ね備えた共析鋼極細線の開発指針を得ることを目的として、疲労強度に及ぼす諸因子の影響を明らかにするための実験を行い以下の結果を得た。1.両振および片振疲労強度は伸線加工ひずみの増加(0-3.8)とともに800MPaまで単調に上昇する場合、製造条件によっては加工ひずみ2.5でピークを持つ場合などが見られた。フェライト鋼では増加の程度は小さく単調に上昇した。疲労強度は線径の減少とともに上昇するが、ラメラ間隔(0.010.02μm)に依存しない。2.加工ひずみに伴い、観察された高密度転位やラメラ間隔の減少と関連して表面の硬さおよび残留応力はHv=520および約1000MPaまで大きくなる。疲労に伴う硬さの増加は加工ひずみの大きなものの方が大きい。3.ブルーイングによる硬さの上昇は300°Cでピーク(Hv=650)となる一方,引張残留応力は温度の上昇とともに低下し,500°Cではほとんど消滅する.ブルーイングによって疲労限度は上昇し、400°Cで最高値900MPaに達する.この温度はひずみ時効および組織回復と残留応力の緩和から定まったものと考えられる.ショットピーニングにより硬さは増加し、残留応力は1000MPaから-300MPaに大きく減少し、最も高い疲労限度1200MPaが得られた。4.き裂はフェライト層に沿って、あるいは介在物を起点として発生・進展するが、パーライトコロニー境界で大きく方向を変える。疲労寿命に占めるき裂発生期間の割合は伸線加工によって増加する。5.下限界応力拡大係数幅は加工ひずみの増加、したがってパーライトコロニー寸法の減少とともに粗さ誘起き裂閉口率の減少によって低下する。また、加工ひずみの増加とともにパリス域のき裂進展抵抗は上昇し、ここでのき裂進展特性の勾配を示す“m"値は減少する。耐疲労特性を兼ね備えた高強度共析鋼の開発指針を得ることを目的として、伸線加工ひずみが4を越える領域に至る強加工した共析鋼極細線の疲労強度に及ぼす諸因子の影響を明らかにするため、熱処理と伸線加工を数回繰り返して得た系統的に異なる因子を持つ試料について疲労試験、硬さ測定や微視的観察を行い得られた結果は以下のとおりである。1.疲労限度および時間強度は伸線加工ひずみの増加とともに上昇するが、加工ひずみ2.5を越えると低下する。これはひずみの増加に伴う内部組織の強化と表面の引張残留応力の増加によって説明される。フェライト鋼ではそれらの増加の程度は小さいが、ひずみとともに単調に増加する。同一伸線加工ひずみの線材の疲労強度は線径の減少(0.20.4mm)とともに上昇するが、パ-ライトラメラ間隔(0.010.02μm)には依存しない。2.共析鋼の硬さは伸線加工ひずみの増加に伴って大きくなる。疲労に伴って若干の硬さの増加が認められ、その程度は加工ひずみの大きなものの方が大きい。3.下限界応力拡大係数幅はパ-ライトコロニー寸法およびラメラ間隔の減少、したがって伸線加工ひずみの増加とともに低下する。また、加工ひずみの増加とともにパリス域のき裂進展抵抗は上昇し、ここでのき裂進展特性の勾配を示すm値は減少する。4.き裂はパ-ライト中のフェライト層に沿って、あるいは介在物を起点として発生・進展するが、パ-ライトコロニー境界で大きく方向を変え、線材長手方向に沿うき裂の進展も認められる。疲労寿命に占めるき裂発生、初期進展期間の割合は伸線加工によって増加する。

5.加工ひずみの大きな板材のき裂先端近傍のフェライト層の中には非常に高密度の転位が密に絡み合っていることが観察され、ラメラ-間およびその内部でも大きな結晶方位の差が観察される。伸線加工ひずみが4を越える領域に至る強加工した共析鋼極細線の疲労強度に及ぼす諸因子の影響を明らかにするため、熱処理と伸線加工を数回繰り返して得た系統的に異なる伸線加工ひずみを持つ試料に低温熱処理(ブルーイング)やショットピーニング処理を施し、疲労試験、硬さおよび残留応力測定、微視的観察などを行い得られた結果は以下のとおりである。1.本年度に使用した線材の疲労限度は昨年度のものと異なり伸線加工ひずみの増加とともに単調に上昇した。結果が異なった理由は、製造条件の違いによる引張残留応力にあり、今年度のものに比べ昨年度の材料には2000MPa近い大きな残留応力のあることが判明した。片振疲労強度も加工ひずみの増加とともに単調に上昇し、平均応力の効果は通常の耐久限度線図を用いて表しうることがわかった。ブルーイングによって疲労限度は上昇し、400°Cで最高値900MPaに達する.これはひずみの増加に伴う内部組織の強化と表面の引張残留応力の増加によって説明される。ショットピーニングにより最も高い疲労限度1200MPaが得られた.2.共析鋼の硬さは伸線加工ひずみの増加に伴って大きくなる。ショットピーニングにより表面層の硬さはさらに増加する。ブルーイングによる硬さの上昇は300°Cでピーク(Hv=650)となり、高温では大きくない。3.ブルーイングによって下限界応力拡大係数幅は若干上昇するが、パリス域でのき裂進展抵抗は減少する。4.き裂発生および初期の進展はブルーイングによって抑制されるが、微視的な挙動は大きく変わらない。5.引張残留応力はブルーイング温度の上昇とともに低下し,500°Cではほとんど消滅する.ショットピーニングにより残留応力は1000MPaから-300MPaに大きく減少し、これらは疲労強度の改善に有効である。
百日咳菌における病原因子の作用機構の解析

百日咳症実験モデル作製後の解析において組織および細胞での壊死毒の消長の検索を容易にするため、壊死毒分子の細胞への結合と細胞内移行に関わる機能ドメインを解析した。その結果、壊死毒のN末端側から54位Gluまでのペプチド断片(B断片)に細胞への結合ドメインが存在することがわかった。壊死毒はB断片中の44位アミノ酸残基のC末端側で動物細胞由来プロテアーゼのfurinによって切断された。細胞に対する壊死毒の作用はfurin処理により100倍程度強くなり、逆にfurin認識部位に点変異を導入したDNTは細胞に対する作用が完全に消失した。Furin処理後も壊死毒のN末端領域とC末端領域は非共有的に結合していた。Furin処理壊死毒は人工脂質膜と結合しなかったが、壊死毒の細胞への結合ドメインを除いたdelta Bは脂質膜と結合した。さらに、delta Bは本来壊死毒に感受性のない細胞にも作用した。細胞内小胞輸送の諸過程を阻害する試薬(バフィロマイシン、ブレフェルディン、など)の存在下でも、壊死毒の細胞に対する作用は影響を受けなかった。以上のことから、壊死毒は標的細胞上の受容体と結合した後、1)furinあるいはfurin様プロテアーゼによって切断を受け、2)受容体結合部位を除く断片(delta B)が自働的かつ非特異的に細胞膜と相互作用して活性断片を細胞質内に転位させると考えられた。delta B断片には、ヒト免疫不全ウイルスのTatタンパクに存在する細胞膜通過シグナルと相同性のある領域が存在する。しかし、この相同領域を欠失したDNTは細胞に対する毒素活性を消失しなかったので、DNTの細胞内移行にはこのTat相同配列は関与しないことがわかった。現在、Tat配列の上流に存在する膜貫通ドメインのDNTの細胞内侵入機構における役割を解析している。
大気圧プラズマを用いたクリーンエネルギー循環システム

近年,日本では発電量が不安定な再生可能エネルギー発電を大量投入した低炭素社会に移行し始めている。そこで,電力系統の安定性の観点からも余剰に生産した電力を化学エネルギーに貯蔵し輸送する技術の必要性が高まっている。本研究では窒化マグネシウムを新しい固体のエネルギーキャリアとして提案し,再利用することで未来の低炭素社会に対応したクリーンエネルギー循環社会の実現を目指す。窒化マグネシウムは貯蔵・輸送に適しており,常温で水と反応して水素キャリアとして有望なアンモニアを生成する。本研究ではエネルギー循環社会実現のカギとなる窒化マグネシウムの大気圧プラズマ合成技術の開発を主な研究開発項目とする。
TLR4遺伝子多型が歯肉線維芽細胞の歯周病原細菌内毒素への反応性に及ぼす影響

歯周炎は、歯周病原細菌により引き起こされる炎症性疾患である。歯周病原細菌の菌体成分の中でも非常に強力な炎症誘導因子として知られる歯周病原細菌内毒素(LPS)は、生体細胞のToll-like receptor 4 (TLR4)によって認識される。申請者らは、TLR4遺伝子の3'側非翻訳領域に位置するrs11536889遺伝子多型が、慢性歯周炎と関連しており、これはrs11536889遺伝子多型が白血球のTLR4発現量に影響を与えているためであることを明らかにした。本研究では、このrs11536889遺伝子多型が歯周組織の主要な細胞である歯肉線維芽細胞のTLR4発現量にも影響を与えているかどうか検討する。併せて、歯肉線維芽細胞のLPSに対する応答性についても検討し、本遺伝子多型と歯周組織のLPSに対する応答の大きさとの関連、さらにその結果として生じる病態としての歯周組織の破壊の大きさとの相関関係について解析する。平成25年度に行った実験は以下である。1)ヒト歯肉線維芽細胞株の樹立:本研究における歯肉片の採取については、長崎大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会の審査を受け、承認を得た。倫理審査委員会の指針を遵守し、この実験の趣旨とその意義を十分説明し、インフォームドコンセントの得られた被験者から、歯周外科および抜歯時に余剰となった歯肉を採取した。採取した歯肉片から、歯肉線維芽細胞株を樹立した。現在、細胞株は19樹立している。2)ヒト歯肉線維芽細胞株のrs11536889遺伝子型による分類:ヒト歯肉線維芽細胞株からゲノムDNAを抽出し、各細胞株のrs11536889遺伝子型を決定している途中である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
酸化シスチンによる二次的生体酸化傷害機構の解析と食品因子によるその制御

1)酸化シスチン生成反応系の検討:金属-アスコルビン酸または金属-過酸化水素系(フェントン反応系)によるタンパク質中の酸化シスチン生成条件の検討を行った。反応中、インシュリンは不安定さのため凝集を生じたが、血清タンパク質は37°C-24時間の反応が可能であり、アミノ酸分析での酸化シスチン生成などを検出できた。2)酸化シスチン生成に関与する生体内酸化因子:酸化修飾タンパク質から酸化シスチン生成量が最大となったものは、フェントン反応系(銅イオン+過酸化水素)によるヒドロキシラジカル生成系であった。しかし、特定の疾病を除き銅イオンが生体内に多く存在するとは考えにくいことから、金属イオン非存在下における反応系にて酸化シスチン生成量を再検討した。その結果、脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)が最も効率良く酸化シスチンなど含硫アミノ酸の酸化を引き起こした。過酸化水素よりも約5倍の選択性で酸化シスチンと酸化メチオニン(=メチオニンスルホキシド)が生成した。3)酸化シスチンによる二次的生体酸化傷害:酸化シスチン含有の酸化修飾タンパク質は、グルタチオンなどのチオール存在下で未酸化タンパク質やDNAの酸化的断片化を引き起こし、そこには酸化シスチンからの活性酸素(スーパーオキシド)の生成が確認された。4)ワサビイソチオシアネートによる細胞内酸化ストレス制御:細胞内グルタチオンとの反応から活性酸素生成を引き起こす食品因子の探索を行った。ネギ属野菜類とアブラナ科野菜に強い細胞酸化ストレス能を認めた。特にワサビイソチオシアネート(6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート)による細胞内活性酸素生成量は大きく、ラット肝由来RL34細胞では高濃度で細胞死が、極低濃度では第二相解毒酵素誘導が起こった。タンパク質中の酸化シスチンモデルについて、酸化シスチン部のみを有するタンパク質の調製を目的として合成を行った。まず、金属-アスコルビン酸系または、金属-過酸化水素系によるフェントン反応を用いたところ、インシュリン自身の重合化と断片化が12時間で約半分以上進行してしまい、酸化シスチン部を有しただけのインシュリンは調製できなかった。ただ、希薄過酸化水素水とインシュリンを低温で反応させると、重合化や断片化を伴わない酸化インシュリンが調製できることを発見した。現在、LC-ESI-MS等の機器分析とアミノ酸分析を実行中で、その構造変化と部位を特定する予定である。同時に酸化力の強い過酢酸でもインシュリン酸化を行ったところ、常温では断片化が激しく進んでしまった。5°Cという低温での短時間処理にて、過酸化水素同様の酸化インシュリンを調製できる可能性が示された。同じく、機器分析とアミノ酸分析を実行中である。次年度はグルタチオン(GSH)との反応性、ラット褐色脂肪細胞に対する酸化インシュリンの作用を検討する予定である。ジチオラン構造を有した酸化シスチンのモデル化合物を合成し、SH化合物(GSHなど)との活性酸素生成系を利用し、各種食用植物抽出物の抗酸化活性評価を系統的に開始した(一部抽出物に抑制活性の強いものを認めた)。また、今回の大きな成果としては、生のネギ属植物の酢酸エチル抽出物には酸化を促進する傾向が強く、加熱処理したネギ属植物には抑制の傾向が認められた。ネギ属植物に多く含まれる含硫成分の組成の違いが、このような効果の相違をもたらしているのかもしれないと考え、現在、促進、抑制双方の原因物質を同定中である。1)酸化シスチン生成に関与する生体内酸化因子の特定:活性酸素種の中で酸化修飾タンパク質からの酸化シスチン生成量が最大であったものは、フェントン反応系(銅イオン+過酸化水素)によるヒドロキシラジカルであった。しかし、特定の疾病を除き銅イオンが生体内に多く存在することはないと考え、金属イオン非存在下における反応系にて酸化シスチン生成量を再検討した。

その結果、脂質ヒドロペルオキシド(LOOH)が最も効率良く酸化シスチンの生成を引き起こした。同じ過酸化物である過酸化水素よりも約5倍の選択性で酸化シスチンと酸化メチオニン(メチオニンスルホキシド)が生じた。故に、LOOHは含硫アミノ酸残基に選択的な生体内酸化因子であると考えられた。2)酸化シスチン含有タンパク質による生体成分の酸化障害:アミノ酸分析により酸化シスチンと酸化メチオニンを含有するインシュリン、ウシ血清アルブミンとヒト血清タンパク質を調製した。どの酸化タンパク質においても、単独では変化がなかったのに対し、グルタチオンなどのチオール存在下で各酸化タンパク質は断片化し活性酸素の生成が認められた。酸化含硫アミノ酸残基は、局所的な活性酸素の生成に関与する能動的な酸化ストレスマーカーであると示唆された。3)ワサビイソチオシアネートによる細胞内酸化ストレスと第二相解毒酵素誘導:細胞内グルタチオンとの反応から活性酸素生成を引き起こす食品因子の探索を行った。ネギ属野菜類とアブラナ科野菜に強い細胞酸化ストレス能を認めた。特にワサビイソチオシアネート(6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート)による細胞内活性酸素生成量は大きく、ラット肝由来RL34細胞では高濃度で細胞死が、極低濃度では第二相解毒酵素誘導が起こった。ニンニクの含硫化合物についても同様の結果が得られている。
ミニブタ体細胞クローン個体を用いたクローン胚由来胚性幹細胞移植モデル系の構築

本研究では高品質なミニブタ体細胞クローン胚を作製し,その胚よりGFP遺伝子導入した多能性胚性幹細胞を樹立するとともに,作出したクローン個体にその樹立した細胞を移植することで自家細胞由来胚性幹細胞移植モデルミニブタの開発を目的としている。研究最終年度は,高品質なミニブタ体細胞クローン胚盤胞期胚を作製すると共に,それに由来する多能性胚性細胞の樹立を目的とした。1)体外発生培地の改良において,ブタ体外発生培地として一般的に使用されているNCSU-23を用いた場合に比べ,ブタ卵管液の組成を基に作成した体外発生培地であるPZM-5にBSAを添加したmPZM-5を用いることで胚盤胞形成率およびアポトーシス出現率が改善されることを明らかにした。2)4細胞期においてミニブタSCNT胚3個を集合させることで内部細胞塊(ICM)および栄養外胚葉(TE)細胞数が増加し,更に未分化マーカーであるOct3/4発現細胞の割合が増加することを明らかにした。3)電気化学的細胞呼吸測定技術を開発し,その技術を用いた新規非侵襲的SCNT胚の品質評価技術を確立した。これにより,これまで不可能であったSCNT胚の生理学的アプローチによる高品質胚の選択を可能にした。4)今回開発しか技術により得られた高品質ミニブタSCNT胚に由来する多能性細胞の樹立を試みたところ,未分化状態を維持していると思われる細胞コロニーが出現し,そのコロニーは2継代目まで観察された。以上,本研究で開発したミニブタSCNT胚作出技術は高品質な胚を獲得するうえで極めて画期的な技術であること,さらにSCNT胚に由来する多能性胚性細胞の樹立には胚の品質が大きく影響することを明らかにした。本研究では高品質なミニブタ体細胞クローン胚を作製し、その胚よりGFP遺伝子導入した多能性胚性幹細胞を樹立するとともに、作出したクローン個体にその樹立した細胞を移植することで自家細胞由来胚性幹細胞移植モデルミニブタの開発を目的としている。研究初年度は,効率的に体細胞クローン胚由来胚性幹細胞を樹立するために,高品質なミニブタ体細胞クローン胚盤胞期胚を作製することを目的とした。1)体外発生培地の改良において,ブタ体外発生培地として一般的に使用されているNCSU-23を用いた場合に比べ,ブタ卵管液の組成を基に作成した体外発生培地であるPZM-3を用いることで胚盤胞形成率,発生速度,および細胞数が改善されることを明らかにした。2)続いて,更なる,発生培養条件の改善を目指し,ミニブタ体細胞クローン胚の代謝的特長を明らかにすることを目的とし,ミニブタ体細胞クローン胚のミトコンドリア機能に関して研究を行った。結果,ミニブタ体細胞クローン胚盤胞期胚は,体外受精(IVF)胚に比べ酸素消費が低レベルにあることが明らかになった。3)そこで,この低レベルな酸素消費がミトコンドリア機能に起因するか否かを解析したところ,ミニブタ体細胞クローン胚では,ミトコンドリアの電子伝達系を介した酸化的リン酸化能がIVF胚に比べ低下していることが明らかになった。一方,このミトコンドリア機能の低下に伴い,ミニブタ体細胞クローン胚では解糖系の機能が亢進し,グルコースの取り込みが増加していることを明らかにした。4)これらの知見から,ミニブタ体細胞クローン胚盤胞期胚の品質改善には解糖系を効果的に利用した培養系が必要であると考え,桑実期胚からの発生培地中の最適グルコース濃度の決定を行った。結果,ミニブタ体細胞クローン胚において桑実期胚からの発生培地に1.5mMのグルコースを添加することで細胞数が改善され,高品質なミニブタ体細胞クローン胚盤胞期胚の作製が可能になった。
人工細胞膜の再生医療への応用に向けた腫瘍原性肝幹細胞の選択的排除機構の解明

安全な再生医療のためには幹細胞の培養過程で生じる腫瘍原性細胞を排除する必要がある。これまで我々は、正常ヒト胎児肝細胞を酪酸ナトリウム(SB)処理することで幹細胞の一種である肝芽細胞が誘導され、その過程で腫瘍原性肝幹細胞(悪性形質転換細胞)の出現することを確認している。そこで、本研究では正常細胞に作用せずがん細胞のみに細胞死(アポトーシス)を誘導するハイブリッドリポソーム(HL)を利用して、腫瘍原性肝幹細胞の排除を試みた。下記の成果を得ることが可能となった。(1)ヒト胎児肝臓細胞に対して、SB処理することで肝芽マーカー(EpCAM, ICAM)の発現が顕著に増大し、肝芽細胞へ誘導されることが示された。(2)SB単独処理では腫瘍原性細胞の出現が確認されたが、HL処理することで腫瘍原性細胞は有意に減少した。(3)HL処理後に肝臓細胞を継代培養しても腫瘍原性細胞の再出現を抑制していた。(4)SB処理により誘導された腫瘍原性細胞の細胞は、がん細胞と同様に細胞膜の流動性が増大している可能性が示された。(5)腫瘍原性細胞へのHLの融合・蓄積に関し、蛍光リン脂質を含有したHLは、SB処理した肝臓細胞に対して、蛍光蓄積率が顕著に増大した。(6)肝機能(CYP3A4活性)測定では、HL処理した細胞は、SB単独と比べ、高いCYP3A4活性を維持していた。以上のことより、HLは腫瘍原性幹細胞を選択的に排除し、その後の培養でも腫瘍原性細胞の再出現を抑制しつつ、正常な幹細胞が残存している可能性が示された。再生医療では、幹細胞を生体外で増殖させた後に、細胞移植法により治療を行うことが考えられているが、もし形質転換を引き起こした細胞が混入した場合、細胞移植した後に、生体内で異常増殖してがん化するリスクがある。これを未然に防ぐためには、移植前の形質転換幹細胞の選択的排除方法の開発が必要である。そこで、本研究課題ではこれまで申請者らが行ってきた“ハイブリッドリポソーム(HL)を用いたがん治療への応用に関する知見"と“肝幹細胞の誘導法"とを組み合わせた「HLを用いた形質転換肝幹細胞の除去法」の医用工学的応用に関する知見を得、これをiPS細胞等に応用するものである。H28年度は、肝幹細胞の一種である肝芽細胞を用い、HL(DMPC/10mol%C12(EO)23)による形質転換幹細胞の除去効果について、下記の成果を得ることができた。1)悪性形質転換マーカー(Ki67)に関し、HLを1mMで48時間処理したところ、未処理の細胞と比べてKi67の低下が示され、悪性形質転換細胞の排除が示唆された。2) in vitro腫瘍原性試験により、HLを1mMで48時間処理することで、1mM SB処理で誘導されたコロニー形成を完全に抑えることが明らかになった。3) HL処理後の継代による腫瘍原性への影響について、HLを1mMで48時間処理し、さらに再度48時間培養した結果、未処理の細胞と比べ、コロニー形成がほぼ完全に抑制されることが明らかになった。以上のことより、HLがSB処理により誘導される形質転換肝幹細胞を排除することが示唆された。1)形質転換細胞の同定にKi67(異常増殖の指標)をマーカーとして用い、8日間酪酸ナトリウム(SB)処理することで陽性を示す割合が18%まで上昇した。さらにHLを処理したところ、Ki67陽性細胞が3%まで低下し、Ki67が悪性形質転換マーカーとしての可能性が示唆された。2) HL処理条件について、DMPC濃度が1mMで48時間処理することで、1mMSB処理で誘導されたコロニー形成数を完全に抑えることが明らかになった。3)今後、実際の再生医療への応用を目指した場合、HLにより形質転換細胞を除去した後、移植に必要な細胞数を確保するため、再度細胞を培養することが想定される。そこで、HLで48時間前処理した後、SB存在下で、肝芽細胞を再度48時間培養した結果、HL前処理によりコロニー形成数をほぼ完全に抑えることが明らかになった。本研究により、HLの処理条件が最適化されたことにより、HLがSB処理により誘導される形質転換肝幹細胞を排除することが示唆された。そこで、本研究課題ではこれまで申請者らが行ってきた“ハイブリッドリポソーム(HL)を用いたがん治療への応用に関する知見"と“肝幹細胞の誘導法"とを組み合わせた「HLを用いた形質転換肝幹細胞の除去法」の医用工学的応用に関する知見を得、これをiPS細胞に応用するものである。

H29年度は、肝幹細胞の一種である肝芽細胞を酪酸ナトリウム(SB)により誘導し、HL(DMPC/10mol %C12(EO)23)による腫瘍原性肝幹細胞の除去効果について検討し、下記の成果を得ることができた。1)胎児肝臓細胞(Hc)に対して、SB処理により、EpCAMおよびICAM陽性を示す細胞がControl(SB未処理)と比べて約1218倍に増大し、肝芽細胞へ誘導されることが示された。2)SB処理単独ではコロニー形成数が増大し、腫瘍原性幹細胞の出現が確認されたが、HL処理することで、コロニー形成数が有意に抑制し、腫瘍原性幹細胞を排除することが示された。3)HL処理した細胞を継代して、再度HL処理を行わずとも腫瘍原性幹細胞の再出現を抑制していた。4)薬物代謝酵素(CYP3A4)活性測定では、SB単独処理した細胞よりもSBとHL処理した細胞の方が高いCYP3A4活性を示した。以上のことより、HLは腫瘍原性幹細胞を排除し、その後の培養でも再出現を抑制しつつ、正常な幹細胞が残存して機能も保持している可能性が示された。H29年度は、肝幹細胞の一種である肝芽細胞を酪酸ナトリウム(SB)により誘導し、HL(DMPC/10mol %C12(EO)23)による腫瘍原性肝幹細胞の除去効果について、検討し、下記の成果を得ることができた。(1)胎児肝臓細胞(Hc)に対して、SB処理により、EpCAMおよびICAM陽性を示す細胞がControl(SB未処理)と比べて約1218倍に増大し、肝芽細胞へ誘導されることが示された。(2)SB処理単独ではコロニー形成数が増大し、腫瘍原性幹細胞の出現が確認されたが、HL処理することで、コロニー形成数が有意に抑制し、腫瘍原性幹細胞を排除することが示された。(3)HL処理した細胞を継代して、再度HL処理を行わずとも腫瘍原性幹細胞の再出現を抑制していた。(4)薬物代謝酵素(CYP3A4)活性測定では、SB単独処理した細胞よりもSBとHL処理した細胞の方が高いCYP3A4活性を示した。安全な再生医療のためには幹細胞の培養過程で生じる腫瘍原性細胞を排除する必要がある。これまで我々は、正常ヒト胎児肝細胞を酪酸ナトリウム(SB)処理することで幹細胞の一種である肝芽細胞が誘導され、その過程で腫瘍原性肝幹細胞(悪性形質転換細胞)の出現することを確認している。そこで、本研究では正常細胞に作用せずがん細胞のみに細胞死(アポトーシス)を誘導するハイブリッドリポソーム(HL)を利用して、腫瘍原性肝幹細胞の排除を試みた。下記の成果を得ることが可能となった。(1)ヒト胎児肝臓細胞に対して、SB処理することで肝芽マーカー(EpCAM, ICAM)の発現が顕著に増大し、肝芽細胞へ誘導されることが示された。(2)SB単独処理では腫瘍原性細胞の出現が確認されたが、HL処理することで腫瘍原性細胞は有意に減少した。(3)HL処理後に肝臓細胞を継代培養しても腫瘍原性細胞の再出現を抑制していた。(4)SB処理により誘導された腫瘍原性細胞の細胞は、がん細胞と同様に細胞膜の流動性が増大している可能性が示された。(5)腫瘍原性細胞へのHLの融合・蓄積に関し、蛍光リン脂質を含有したHLは、SB処理した肝臓細胞に対して、蛍光蓄積率が顕著に増大した。(6)肝機能(CYP3A4活性)測定では、HL処理した細胞は、SB単独と比べ、高いCYP3A4活性を維持していた。以上のことより、HLは腫瘍原性幹細胞を選択的に排除し、その後の培養でも腫瘍原性細胞の再出現を抑制しつつ、正常な幹細胞が残存している可能性が示された。
多言語社会台湾の日本語人ナラティブに見られる言語混用と日本語人フレーム調査の試み

本研究では、台湾在住の日本語使用者(日台国際結婚家庭のバイリンガル、日本統治時代に日本語教育を受けた先住民など)のナラティブ・データに見られる日本語と中国語、台湾語、台湾原住民言語(布農語)との混用に関する言語構造的特徴について談話分析の理論を用い、両者の相関を中心に統合的分析を行った。言語使用の選択、または言語混用の背景にある日本語人意識(以下、日本語人フレーム)とアイデンティティとの関わりの探求を目的とした。具体的には、台湾における母語を異にする日本語使用者の日本語人意識やアイデンティティについて認知的フレームによる談話分析を行い、言語混用の特徴と日本語人フレームの相関について質的分析を行い統合的な分析も試みた。また、比較対照として日本とオーストラリアのバイリンガル・データの調査も行った。平成28年度;ナラティブ・データ(日本語、中国語、台湾語、布農語、またはこれらの混用)の収集、文字化を行い、言語混用の構造的分析、日本語人フレーム分析試論を試した。日豪バイリンガルの調査、分析も同様に行った。平成29年度;ナラティブ・データ(日本語、中国語、台湾語、布農語、またはこれらの混用)の収集、文字化の継続、言語混用の構造的分析、日本語人フレーム分析を行った。調査中に分野を超えた理論の展望に関する以下の研究会(平成29年1月20日テーマ:言語の復権:Metroethnicity(メトロエスニシティ)への視座)を開催。日豪バイリンガルの分析も継続。平成30年度:研究成果の発表、および総括として研究会(平成31年2月8日テーマ「多言語社会台湾の「日本語人」に見られる言語混用と分析」)を開催。日台国際児のナラティブ・データを談話分析のポジショニング理論による分析から、台湾在住の日本語人が重層的なアイデンティティを有しているという知見が得られ、それらの分類基準作りに貢献した。本研究の目的は、台湾在住の母語を異にする日本語話者(日本人配偶者、台湾人日本語使用者、日台国際児)のナラティブ・データについて、言語混用に関する言語学的分析、日本語人フレームという認知言語学的分析という2つの観点から分析し、両者の相関について総合的研究を行うことである。台湾には、日本統治時代に日本語を学んだ日本語使用者、および台湾に長く在住する日本人の配偶者や、国際結婚家庭に生まれた国際児など、日本語使用者が3つに大別される。彼らに聞き取り調査を行い、ナラティブ・データを収集し、言語混用、日本語人意識、またそれらの相互の関連について総合的に分析を行う。データ収集方法、ならびに分析の詳細は以下の通りである。1言語混用に関する分析:インフォーマントのナラティブ音声データによる文字化資料をもとに、使用言語の混用について、語、文、談話の各レベルにおいて言語学的に分析する。2日本語人フレームに関する分析:ナラティブ・データい見られる日本語人意識(あるいは台湾人意識、中国人意識、先住民意識など)について、認知的フレーム、ポジショニング分析を参考に主に認知的な視点で分析する。3使用言語、コードスオイッチングと日本語人フレームとの関連について、言語的特徴と認知的フレームやマーカーとの相関関係について統合的に分析し、上記3つの異なる位相における異同についても明らかにする。2016年度は、主に日本人配偶者、および日台国際児(高校生)への聞き取り調査を実施した。また、2017年1月には本研究の分析の方向性への示唆となる講演会を開催した。1年目は、2016年11月および2017年3月の2回台湾で調査を行った。11月の出張では以下の調査を行った。1台湾における日台国際結婚家庭の状況ならびに日本と台湾の人物往来や移民の現状について聞き取り調査。2台北在住の日本人配偶者に、日本統治時代に台湾に嫁いだ婦人の会(こけし会)について聞き取り調査を行った。3大同中学李秋ケイ氏、台湾大学教員より、日本と台湾の高校生交流と国際児童の現状について聞き取りを行った。その他、淡江大学教員より日本文化と関連する台湾文化の復興運動について聞き取りを行った。3月の出張では、台湾人と日本人の国際児童(高校生)5名、および一部はその母親に対して中国語と日本語によるナラティブ・ヒストリー調査を行った。さらに、2017年1月には、本研究の課題の方向性に関連して、言語の復権をテーマに、バスク研究者、およびイギリスにおける少数言語の復権に関する研究で名高く、少数言語使用のステイタス向上(metroethnicity)を提唱するJohn.C.Maher教授を招き、講演会を行った。講演内容の言語のステイタス向上については、台湾人にとっての日本文化継承のみならず、日本人にとっての台湾ブームの現状を理論的に説明し得る貴重な講演会であった。昨年度に続き、日台国際結婚家庭に生まれた国際児に対して日本語と中国語で聞き取り調査、および同じ事柄の記述について両言語によるナラティブデータを収集を行った。8月27日から8月30日まで台湾に出張し、27日に国際児である姉妹にインタビューを行った。分析途中ではあるが、両親の出自の組み合わせや家庭環境により、それぞれの言語に対する思い入れの違いが異なることが明らかになりつつある。また、それと日本語能力との相関関係はないこともわかった。また、場面や立場に応じて言語アイデンティティを使い分けることもあることが観察された。さらに、日台の国際児童と比較対照を行うため、オーストラリアで日英バイリンガルの調査を実施した。11月23日にメルボルン大学の教員と面会し、オーストラリアにおける言語混用の在り方や言語同士の力関係についてに話を聞いた。

同日にメルボルン大学日本語倶楽部のリーダーである学生に日英バイリンガルの言語使用や日本語学習者に関して話を聞いた。24日午前に日英バイリンガルの若者2名にそれぞれ聞き取り調査を行い、録音データを収集した。現在、フレーム理論により分析を進めている。日台国際児と異なり、オーストラリアでは日頃、英語使用の場面が圧倒的に多いが、人格形成期が過ぎると日本語に興味を持ち日本語学習を望む国際児も出てくることがわかった。研究協力者との連携については、8月28日に台湾の研究協力者、清華大学教員3名と研究内容、分析の担当、研究発表の方法について打ち合わせを行った。8月29日は同じく研究協力者である元智大学副教授と分析の手法について打ち合わせを行った。現在までに5名の日台国際結婚家庭に生まれた国際児にインタビュー調査を行っている。また、比較対照のために、オーストラリアにおける日英国際結婚家庭の国際児2名にもインタビュー調査を行った。日英国際結婚家庭の子供との比較対照は、当初の予定ではなかったが、日台の国際結婚家庭に生まれた国際児のアイデンティティや言語使用の特徴を観察するためには、異なる国際結婚家庭に生まれた国際児を比較対照することが肝要と考え、良い結果が出ている。現在、文字化作業も7割程度終了している。分析の枠組みの精緻化を進めつつ分析も始めている。また、研究協力者たちと最終年度に行う研究発表会について具体的な話し合いを行った。本研究では、台湾在住の日本語使用者(日台国際結婚家庭のバイリンガル、日本統治時代に日本語教育を受けた先住民など)のナラティブ・データに見られる日本語と中国語、台湾語、台湾原住民言語(布農語)との混用に関する言語構造的特徴について談話分析の理論を用い、両者の相関を中心に統合的分析を行った。言語使用の選択、または言語混用の背景にある日本語人意識(以下、日本語人フレーム)とアイデンティティとの関わりの探求を目的とした。具体的には、台湾における母語を異にする日本語使用者の日本語人意識やアイデンティティについて認知的フレームによる談話分析を行い、言語混用の特徴と日本語人フレームの相関について質的分析を行い統合的な分析も試みた。また、比較対照として日本とオーストラリアのバイリンガル・データの調査も行った。平成28年度;ナラティブ・データ(日本語、中国語、台湾語、布農語、またはこれらの混用)の収集、文字化を行い、言語混用の構造的分析、日本語人フレーム分析試論を試した。日豪バイリンガルの調査、分析も同様に行った。平成29年度;ナラティブ・データ(日本語、中国語、台湾語、布農語、またはこれらの混用)の収集、文字化の継続、言語混用の構造的分析、日本語人フレーム分析を行った。調査中に分野を超えた理論の展望に関する以下の研究会(平成29年1月20日テーマ:言語の復権:Metroethnicity(メトロエスニシティ)への視座)を開催。日豪バイリンガルの分析も継続。平成30年度:研究成果の発表、および総括として研究会(平成31年2月8日テーマ「多言語社会台湾の「日本語人」に見られる言語混用と分析」)を開催。
近世故実家による公家住宅研究の実態ならびにその学史的意義に関する研究

本研究の目的は、おもに近世後半における有職故実家による公家住宅研究の全体像の解明ならびに、その学史的意義の実態解明にあった。裏松固禅の代表的な研究業績である『院宮及私第図』に詳細な検討を加えた。巻三冒頭「本槐門新槐門図」に新たな写本の存在を確認し、「槐門図」との呼称で通行する同史料の重要性を指摘した。また同書巻三の「寝殿図」の由来や成立の経緯について考察し、九条家の屋敷に関する指図で、固禅が元史料をもとに作成したものである可能性が高いこと、九条良経邸との固禅の誤認には、近世九条家における強固な復古の伝統が背景にあることなどを明らかにした。さらに沢田名垂『家屋雑考』の寝殿造鳥瞰図のもとになった図2点、すなわち巻三に収められる「古図両中門」「両中門図」についても、先の本槐門新槐門図との関連をめぐって検討を加え、両図とも固禅以前の時代に遡る図であって、固禅作成ではないこと、しかし固禅が早くに両図に注目したことが、名垂の寝殿造鳥瞰図につながったという点に、研究史上の意義が見いだせることなどを明らかにした。ほかに、『宮室図』についても詳細な検討を加え、複数の写本の分析によって、『院宮及私第図』と『宮室図』は内容的にも密接な関係にあることを突き止めるとともに、それらの書写には狩野派の奥絵師狩野養信や、伊藤仁斎の息男東涯といった広範な人物が関与していたことを明らかにし、近世住宅研究では、故実家はもとより、幅広い分野からのアプローチがあったことを解明した。また、名垂の寝殿造鳥瞰図にも間接的に関わることになった松岡辰方について、著書の一つである『都城院宮之図』が『院宮及私第図』と重複する内容をもつことを明らかにした。『院宮及私第図』を辰方が所持したことから推して、辰方は固禅の研究を次代へ継承するとともに、寝殿造の概念形成にも大きな役割を果たしたことを明らかにした。裏松固禅の研究業績に関する史料の収集に集中的に取り組んだ。とくに穂久邇文庫蔵『院宮及私第図』の閲覧が叶い、詳細な調査が行えたことは大きな収穫であった。同史料が『院宮及私第図』巻三冒頭に収められる本槐門新槐門図と同じ内容をもつことから、「槐門図」との呼称で通行していた同史料の重要性があらためて確認できた。『院宮及私第図』については、巻三に収められる「寢殿図」の由来や成立の経緯について詳細に検討を加え、九条家の屋敷に関する指図であること、固禅が元史料をもとに作成したものである可能性が高いこと、九条良経邸との固禅の誤認には、近世九条家における強固な復古の伝統が背景にあることなどを明らかにした。

また、沢田名垂が描いた寢殿造鳥瞰図のもとになった図2点、すなわち巻三に収められる「古図両中門」「両中門図」についても、先の本槐門新槐門図との関連をめぐって検討を加え、両図とも固禅以前の時代に遡る図であって、固禅作成ではないこと、しかし固禅が早くに両図に注目したことが、名垂の寢殿造鳥瞰図につながったという点に、研究史上の意義が見いだせることなどを明らかにした。以上の考察結果などを含む『院宮及私第図』に関する調査研究の成果として、『裏松固禅「院宮及私第図」の研究』を編集・執筆した。これを足がかりに、研究最終年度にあたる次年度は、裏松の他の研究、また関連する他の故実家による住宅研究の実態解明に取り組む予定である。本研究の目的は、おもに近世後半の有職故実家による公家住宅研究の全体像を明らかにし、それらが当時の社会をいかに反映し、後の住宅史研究にどのような影響を及ぼしたのかを解明することにあった。前年度は裏松固禅の研究業績に関する史料の収集に集中的に取り組み、『院宮及私第図』に関して広範かつ詳細な調査検討を加えた。今年度は継続して固禅の住宅研究の実態にさらに深く切り込んだ。その過程で、「本槐門新槐門図」(槐門図)について新たな写本の存在を確認し、同史料の重要性を再確認した。また『院宮及私第図』とならぶ固禅の住宅研究に関する成果として、『宮室図』に詳細な検討を加えた。複数の写本を比較検討した結果、『院宮及私第図』と『宮室図』は内容的にも密接な関係にあることを突き止めた。またそれらの書写では、狩野派の奥絵師狩野養信や、伊藤仁斎の息男東涯といった広範な人物が関わっていることを明らかにし、近世住宅研究をめぐっては、故実家はもとより、幅広い分野からのアプローチがあったことを解明した。また、『家屋雑考』における寝殿造鳥瞼図にも間接的に関わることになった松岡辰方について、著書の一つである『都城院宮之図』が『院宮及私第図』と重複する内容をもつことを明らかにした。『院宮及私第図』を辰方が所持したことから推して、辰方は固禅の研究を次代へ継承するとともに、寝殿造の概念形成にも関わったという点で、住宅研究に大きな役割を果たしたことを明らかにした。