hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レプリカ系の統計力学

本年度は、大きく分けて二つの研究を行った。一つは、新たなマルコフ連鎖モンテカルロ法の開発、もう一つは実験などによって得られた画像データから、元の物理パラメータを推定する手法の開発である。1.疎なランダムグラフ上で機能するマルコフ連鎖モンテカルロ法マルコフ連鎖モンテカルロ法は、統計力学において非常に重要な手法の一つであり、様々な場合に適応可能な汎用性の高い手法である。本研究では、疎なランダムグラフ上で機能するマルコフ連鎖モンテカルロ法の開発を行った。疎なランダムグラフは、平均場のスピングラス模型などの問題のみならず、低密度パリティ検査符号などの通信の問題や制約充足問題などの計算機科学の問題に対するアプローチとしても重要であり、これを研究する意義がある。本手法では、信念伝搬法(Belief Propagation)と呼ばれる手法を、模型に対して部分的に適用する方法を提案した。この方法によって、原理的に厳密なマルコフ連鎖モンテカルロ法の長所を崩すことなく、信念伝搬法による高速な周辺化の技法を取り込むことに成功した。結果として、スピングラス模型において積分相関時間を10倍近く短縮することができ、従来法の改良の一つとして有望であることが確認できた。2.実験データのベイズ推定法による解析従来の実験データの解析では、実験データから物理パラメータを決定する場合には、解析者の直観や画像同士の比較など、定義されない方法によって決定されることが多い。本研究では、この問題を、理論モデルと観測ノイズによって構成された統計モデルによって記述されるとすることによって、一般的な統計解析のフレームワークに基づいた議論をすることを可能にした。特に今回は、マルコフ連鎖モンテカルロ法による厳密な尤度比計算を行うことで推定を行った。それを通じて、最も推定を行いやすい温度などを決定するなどの実験へのフィードバックを可能にした。当該年度は、疎結合スピングラス模型におけるレプリカ対称性の破れの問題について理論的な考察を行った。特に1.コンプレキシティ概念の拡張、2.制約充足問題に対する平均場近似の性能評価および解空間の探索、を行ってきた。1.は、コンプレキシティと呼ばれる、対象のエネルギー地形の複雑さを表した統計量に関する研究である。従来の研究では、一段階レプリカ対称性の破れと呼ばれるタイプの相転移が起こる場合にしかこの統計量は評価できなかったが、今回の研究でそれが一般の揚合に拡張された。これによって、より包括的な枠組みを提供できた。2.では、計算機科学において重要な問題である制約充足問題に対する統計力学的アプローチとして、平均場近似と呼ばれる近似手法の適用を試みた。このような方向性の研究は従来から存在するが、本研究の新奇的な着眼点は、その平均場近似の結果表れるアルゴリズムや方程式を、再び制約充足問題とみなし、その統計力学的解析を行った点である。特に今回の研究では、マルコフ連鎖モンテカルロ法によって、解空間の探索を行った。これによって、平均場方程式の解空間もまた、元の問題と同様のタイプの相転移を持つことや、解くべき問題の難しさに応じて、平均場方程式の解空間もまた影響を受けることが明らかになった。この結果を深く解釈することで、現存するアルゴリズムの改良に結びつけられる可能性がある。またこのような補助模型の解析をすることが、問題の性質をより深く知るための手法になりうることを示唆できた。
明治期における北海道移住に伴う物質文化の変容に関する考古学的研究

本研究は北海道における士族屯田兵の事例を中心に、彼らが移住の際に母村から持ち込んだ墓標等の文化を考古学的に実測・調査し、彼らの物質文化に見られる母村からの影響、士族的な特徴や平民屯田との比較から見た階層性、移住の前後での変容等を明らかにすることを目的とする。研究の最終年度に当たる平成19年度は北海道伊達市営尾幌内墓地、有珠善光寺墓地、伊達市営有珠墓地、室蘭市イタンキ浜墓地、室蘭陣屋裏墓地等で墓標の悉皆調査を行い、前年度までに行ってきた屯田兵のものと比較することとした。その結果、伊達亘理藩の集団移住に伴う一群の墓標は、東北地方の型式的特徴を極めてよく残しており、集団移住による文化伝統の保持がなされていたことが明らかとなった。また、有珠善光寺墓地の状況は、17年度に調査した厚岸国泰寺墓地の状況と酷似しており、江戸後期の蝦夷地支配に伴う、本州文化の流入状況が明らかとなった。さらに、室蘭陣屋裏墓地の状況は、トカチ詰所の状況と似ていた。以上のことから、三年間の総括として、江戸後期の蝦夷地支配に伴う、北方警備のために渡航した下級武士や北方交易をおこなった商人、亘理藩に代表される明治初期の集団移住、さまざまな出身地からなる士族屯田兵のいずれもが、異なる形で本州文化を北海道に持ち込んでおり、移住形態の差はその後に彼らが北海道で形成する文化の違いとなって表れていることがわかった。北海道における士族屯田兵の事例を中心に、彼らが移住の際に母村から持ち込んだ陶磁器などの生活財や墓標等を考古学的に実測・調査し、彼らの物質文化に見られる母村からの影響、士族的な特徴や平民屯田兵との比較から見た階層性、移住の前後での変容等を明らかにするため、調査・分析している。平成17年度は主に実地踏査と、現地調査を重点的に進めた。具体的には、平成16年夏の私費による予備的調査(踏査)の成果を活かし、厚岸町太田などで、陶磁器・民具など生活財の調査を行なった。また、初期の屯田兵墓地(太田南墓地・太田北墓地・報国寺墓地)や国泰寺墓地(アッケシ場所寄留者の墓地)など古い墓標が残る場所で悉皆調査を行い、墓標形態について母村からの影響を考察した。さらに、近世考古学の成果に照らしながら、陶磁器の品質など生活財に見られる階層差について比較検討を行った。また、収集した生活財や墓標のデータをデータベース化し、北海道移住者の物質文化について統計的分析を行った。その結果、屯田兵は士族に相応しい高価な生活財を持つ一方で、墓標は専門の石工を介さず現地の石材で調達していた。逆に、官寺であった国泰寺とその周辺からは高価な生活財は出土しないが、墓標には本州の影響が強く看取され、北海道移住者の物質文化には「食い違い」が認められた。なお、この研究成果の一部は『釧路市立博物館館報』392に投稿し掲載された。また、GPS測位システムとGIS(地理情報システム)の連動について、今年度は研究代表者所有の設備機器とソフトウエアとの不適合があったため、現地調査においてはGPSを使用せず、次年度以降に使用することとした。あわせて、当該の不適合を修正したソフトウエアなどを導入した。平成18年度は主に実地踏査と、現地調査を重点的に進めた。具体的には、平成17年度の調査成果を活かし、根室市和田、厚岸町太田などで、陶磁器・民具など生活財の調査及び聞き取り調査を行なった。また、初期の屯田兵墓地(和田墓地、和田旧墓地)など古い墓標が残る場所で悉皆調査を行い、墓標形態について母村からの影響を考察した。その結果、根室市和田でも太田の場合と同様に屯田兵は士族に相応しい高価な生活財を持つ一方で、墓標は専門の石工を介さず現地の石材で調達していた。北海道移住者の物質文化に前回同様の「食い違い」が認められた。なお、この研究成果の一部は平成19年7月刊行予定の『近世・近現代考古学入門』慶応義塾大学出版会(共著)の一部に「民俗学・民具学・物質文化研究と近現代考古学」として収録される予定である。また、2006年12月に開催された第31回日本民具学会大会においても「近代北海道移住者の生活財と墓標」として口頭発表を行った。研究の最終年度に当たる平成19年度は北海道伊達市営尾幌内墓地、有珠善光寺墓地、伊達市営

有珠墓地、室蘭市イタンキ浜墓地、室蘭陣屋裏墓地等で墓標の悉皆調査を行い、前年度までに行ってきた屯田兵のものと比較することとした。その結果、伊達亘理藩の集団移住に伴う一群の墓標は、東北地方の型式的特徴を極めてよく残しており、集団移住による文化伝統の保持がなされていたことが明らかとなった。また、有珠善光寺墓地の状況は、17年度に調査した厚岸国泰寺墓地の状況と酷似しており、江戸後期の蝦夷地支配に伴う、本州文化の流入状況が明らかとなった。さらに、室蘭陣屋裏墓地の状況は、トカチ詰所の状況と似ていた。以上のことから、三年間の総括として、江戸後期の蝦夷地支配に伴う、北方警備のために渡航した下級武士や北方交易をおこなった商人、亘理藩に代表される明治初期の集団移住、さまざまな出身地からなる士族屯田兵のいずれもが、異なる形で本州文化を北海道に持ち込んでおり、移住形態の差はその後に彼らが北海道で形成する文化の違いとなって表れていることがわかった。
優良解集合探索手法に基づく統合的最適化システムの構築と電磁機器最適設計への応用

優良解集合の概念と決定変数の離散構造を考慮した新たな統合的最適化システムの構築と電磁機器最適設計への応用を目的として,研究期間内に以下の課題の検討を行う。(1)優良解集合の概念と決定変数の離散構造を考慮した統合的最適化システムの構築。(2)統合的最適化システムの実用化と性能向上のためのサンプル点追加戦略の検討。(3)構築した統合的最適化システムの電磁機器(モータ等)最適設計問題への適用。
フッ素体内動態の修飾因子とその骨髄細胞,血液性状に及ぼす影響

特定病態下(骨粗鬆症,腎炎,糖尿病)ならびに日常よく用いられる薬剤ないし嗜好品(カフェイン,エタノール,ニコチン,アスピリン,ワルファリン)との併用経口投与時における,マウスへのNaF投与(5.26mM=100ppmF,10日間)に関して,飲水量,体重変化,血中フッ素濃度,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現,細胞表面抗原Mac-1,Gr-1,MOMA-2,F4/80の発現,また,細胞生存率,NBT還元能,LPS刺激によるNO産生(NO_2生成),LDH,β-glucuronidase, acid phosphatase(ACP)活性,貪食能,付着/浮遊細胞数比,核/細胞質比,ライト・ギムザ染色像,位相差像などの検索を行った.血中フッ素濃度は飲水中のフッ素により有意に上昇したが,LDH,β-glucuronidase, ACP活性を除く他のマーカーに顕著な変化を認めなかった.しかし,疾患動物における所見は不安定であった.マウス骨髄細胞を,1,25-dihydroxyvitamin D_3とNaF存在下において培養したところ,1,25-dihydroxyvitamin D_3ではなくNaF量に依存してMac-1,Gr-1,クロロアセテート・エステラーゼが発現し,非特異エステラーゼは影響されなかった.細胞生存率とNBT還元能は0.5mMにおいて損なわれ,NO産生,LDH,β-glucuronidase, ACP活性は0.2ないし0.6mMにおいて極大を示した.貪食能,付着/浮遊細胞数比,核/細胞質比,ライト・ギムザ染色像,位相差像には顕著な変化を認めなかった.特定病態下(骨粗鬆症,腎炎,糖尿病)ならびに日常よく用いられる薬剤ないし嗜好品(カフェイン,エタノール,ニコチン,アスピリン,ワルファリン)との併用経口投与時における,マウスへのNaF投与(5.26mM=100ppmF,10日間)に関して,飲水量,体重変化,血中フッ素濃度,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現,細胞表面抗原Mac-1,Gr-1,MOMA-2,F4/80の発現,また,細胞生存率,NBT還元能,LPS刺激によるNO産生(NO_2生成),LDH,β-glucuronidase, acid phosphatase(ACP)活性,貪食能,付着/浮遊細胞数比,核/細胞質比,ライト・ギムザ染色像,位相差像などの検索を行った.血中フッ素濃度は飲水中のフッ素により有意に上昇したが,LDH,β-glucuronidase, ACP活性を除く他のマーカーに顕著な変化を認めなかった.しかし,疾患動物における所見は不安定であった.マウス骨髄細胞を,1,25-dihydroxyvitamin D_3とNaF存在下において培養したところ,1,25-dihydroxyvitamin D_3ではなくNaF量に依存してMac-1,Gr-1,クロロアセテート・エステラーゼが発現し,非特異エステラーゼは影響されなかった.細胞生存率とNBT還元能は0.5mMにおいて損なわれ,NO産生,LDH,β-glucuronidase, ACP活性は0.2ないし0.6mMにおいて極大を示した.貪食能,付着/浮遊細胞数比,核/細胞質比,ライト・ギムザ染色像,位相差像には顕著な変化を認めなかった.1980年代における北米の歯牙フッ素症増加は,カフェインを含有する飲料のせいではないか(Chan JT etal : Med Hypotheses33,21-22,1990)と言われる一方,カフェインは血中フッ素濃度,腎での再吸収,尿中への排泄に影響しないとも言われる(Chen X etal : Archs Oral Biol 44,33-39,1999).本実験(10日間の摂取)において飲水量,体重変化,血中フッ素濃度は飲水中のフッ素濃度,カフェイン濃度に影響されないように見え,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現も影響されなかった.フッ素イオンはヒト白血球細胞膜におけるホスホリパーゼD/ホスファチジン酸依存性,非依存性にdiradylglycerol,スーパーオキサイド産生を促し,エタノールはそのフッ素イオンの働きを抑制する(Olson SC et al : FEBS Lett 272,19-24,1990).その他にもこうしたフッ素イオンとエタノールの相互関係の報告は血液細胞に限っても数多い.したがって,それらから,骨髄幹細胞においても何らかのフッ素イオンとエタノールの相互関係を類推させるが,上述の実験条件における飲水量,体重変化,血中フッ素濃度は飲水中のフッ素濃度,エタノール濃度に影響されないように見え,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現も影響されなかった.T-細胞に及ぼすニコチンの影響は免疫抑制を懸念させる(Geng Y etal : Immunol 15

6,2384-2390,1996)が,骨髄幹細胞における非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現は飲水中のフッ素濃度,ニコチン濃度に影響されないように見える.また,マウスの飲水量,体重変化,血中フッ素濃度も飲水中のフッ素濃度,ニコチン濃度に影響されなかった.本実験における骨粗鬆症マウスへの10日間のNaF経口投与では飲水量,体重変化,血中F濃度は飲水中のF濃度に影響されないように見え,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現も影響されないように見える.過剰の食塩摂取が骨粗鬆症発症と進行に対する危険因子として長い間疑われてきたが,その影響度は危惧されるほど重大なものではないと思われる.しかし,多くの検討課題が残され(Cohen AJ&RoeFJ:Food Chem Toxicol 38,237-253,2000),骨髄幹細胞への影響は当然考えられる.本実験においては,所見の不安定さから,食塩の影響を視野に入れることも今後検討すべきかも知れず,さらに症例を重ねる必要性が感じられる.Puromycinaminonucleoside(PAN)腎炎ラットにおいて,皮質集合管の(Na^+/K^+)-ATPase活性上昇が尿中へのNa^+排泄阻害の本態であると報告され(Deschlnes G&Doucet A:J Am Soc Nephrol11,604-615,2000),このことと上述のことに関わると思われるが,腎炎マウスにおいても所見の不安定さから,現段階においてはさらに症例を重ねる必要性が感じられた.本実験における腎炎マウスへの10日間のNaF経口投与では飲水量,体重変化,血中F濃度は飲水中のF濃度に影響されないように見え,骨髄幹細胞の非特異エステラーゼ,クロロアセテート・エステラーゼ発現も影響されないように見える.また,糖尿病ラットへのNaF投与時の血管拘縮がG蛋白を介するCa^<2+>チャンネル活性化に起因するとの報告(Hattori Y et al:J Pharmacol Ther292,761-768,2000)から,糖尿病におけるNaFの何らかの作用を予想させるが,糖尿病マウスへのNaF経口投与においても同様の所見を得た.こうした変化は基本的に1,25(OH)_2D_3には依存せず,NaF量に依存した変化であると考えられる.HL-60細胞においてNaFと1,25(0H)_2D_3の相乗効果が観察された(Kawase et al.,J Bone Miner Res 11:1676-1687,1996)が,骨髄細胞培養においてはIL-1ないしPGEによる前処理か,8-9日以上の培養が必要に思われる.
外部刺激に連動してプロトン移動－酸化還元を発現するクロミック錯体の創出

外部刺激により金属に配位したヒドラゾン化合物上の可逆なプロトンの付加・解離およびこれと連動した酸化還元が発現するクロミック錯体の創出を目指した。各種ヒドラゾン化合物を配位子とする新規Pd(II), Pt(II), Cu(I), Cu(II), Ru(II), Ru(III), Ag(I), Au(I)錯体を合成して構造を決定し,すりつぶしや加熱,光照射,塩化水素ガスへの曝露にともなうプロトンの付加・解離と酸化還元挙動,溶液中および固相における色と発光性の変化を明らかにした。有機ヒドラゾン化合物のN原子上に付加しているプロトンの酸性度は一般に極めて低く,容易なプロトン解離が起こりにくいのに対し,金属イオンへの配位にともなって酸性度が高くなり,ヒドラゾン配位子に可逆なプロトンの付加と解離が発現する。このプロトンの付加と解離に連動して金属錯体の電子状態や配位構造を変化させ,色変化・発光色変化(クロミック挙動)を発現させようというのが本研究の狙いである。昨年度,主にヒドラゾン配位子を有するPd(II), Pt(II)錯体を合成してその構造を決定し,溶液中で可逆なプロトンの付加・解離による色変化と発光のON-OFF,また,固相中でのすりつぶしや加熱による色変化の発現を確認した。この成果をもとに,今年度は溶液中および固相中におけるその反応メカニズムの解明を検討し,固相中でもプロトンの付加と解離が起こること,また,これに連動して配位構造の大きな変換が起こるという,興味深い固相反応を見出した。さらに,金属イオンの酸化還元が可能なCu(I)(II), Ru(II)(III)ーヒドラゾン錯体の合成を行い,ヒドラゾン配位子上のプロトンの付加・解離と連動した電子状態の変化を考察した。多様な配位様式が可能なヒドラゾン化合物を配位子とするRu(II)錯体については,反応条件と反応溶媒を調整して配位様式の異なる各種錯体を単離することに成功した。溶液中でこの配位様式の変換が起こること,また,ヒドラゾン配位子へのプロトンの付加と連動して,Ru(II)からRu(III)への酸化が進行することを明らかにした。Cu(I)ーヒドラゾン錯体については,多様な配位構造にもとづいて結晶状態で異なる色を呈する金属錯体を合成してその構造を決定した。これらの錯体のプロトンの付加・解離と,主に固相でのベイポクロミズムを検討した。ヒドラゾン化合物は,一般に窒素原子上のプロトンの酸性度が極めて低く,プロトンの解離は容易に起こらない。しかし,金属への配位によって酸性度が高くなり,酸や塩基の添加による可逆なプロトンの付加と解離が溶液中で容易に発現する。本研究では,このようなヒドラゾン化合物を配位子とする多様な金属錯体の新たな機能の開発と,外部刺激に対する応答性の発現に大きな興味を持っている。本研究では,主にプロトン移動や酸化還元と連動してクロミック現象を発現する新たな金属錯体の創出を目指した。本年度は,まず多座キレート配位が可能なヒドラゾン化合物を用いて,多様な配位様式が可能なPd(II)およびPt(II)錯体を合成し,これらの錯体の配位様式が,プロトン濃度変化や加熱,光照射により溶液中で変換されることを見出した。また,ヒドラゾン配位子上へのプロトンの付加・解離にともない配位様式変換のメカニズムが異なること,さらに固体状態でも配位様式が変換されるトリボクロミズムやベイポクロミズム,サーモクロミズム現象を明らかにした。従来から,溶液中のプロトン濃度変化(酸性度の変化)に応じてプロトンが付加解離して色変化する現象は,主に有機化合物を中心として様々な報告例があるが,プロトンの付加・解離と連動して固相中でも金属錯体の配位様式が色変化をともなって変換すること,また,溶液中における配位様式変換のメカニズムが,プロトンの付加・解離に連動して光あるいは熱で進行することを見出したことは極めて興味深い。次に,プロトンの付加・解離に連動した異性化とともに発光がON-OFFするPd(II)錯体を合成することに成功した。既にそれぞれの異性体の構造を明らかにし,現在は発光メカニズムの検討を行っている。本研究では当初の研究目的に沿った意義のある研究成果を得て,論文の執筆を進めるとともに,国内外の学会で研究成果の報告を行った。ヒドラゾン化合物のアミドのN原子上に結合しているプロトンの酸性度は,隣接するイミンのN原子による金属イオンへの配位にともなって大きく増大する。この点に着目し,金属に配位したヒドラゾン化合物上の可逆なプロトンの付加・解離およびこれと連動した酸化還元が外部刺激により発現するクロミック錯体の創出を,本研究の目的とした。

平成24年度は,主にPd(II), Pt(II)錯体を中心にトリボクロミズム,サーモクロミズム,ベイポクロミズムの発現を検討し,平成25年度は,これに加えてCu(I), Cu(II)またRu(II), Ru(III)錯体について,プロトンの付加・解離と連動した中心金属イオンの酸化・還元を検討した。平成26年度は,さらにAg(I), Au(I)錯体についても,すりつぶしや加熱,光照射にともなう固相における発光性の変化を検討した。いずれの錯体も,溶液中で酸・塩基を添加すれば,ヒドラゾン配位子上でプロトンの付加・解離を発現するが, Pt(II)錯体では,結晶のすりつぶしと加熱により塩化水素ガスの脱離をともなうプロトン解離が固相で発現し,顕著な錯体の色変化が観測された。また,Pd(II)錯体では,プロトンの付加・解離とともにヒドラゾン配位子の配位様式の変換が,溶液中および固相で発現した。Cu(I)ーヒドラゾン錯体には様々な色を示す多様な配位構造が認められ,配位構造の変換と,Cu(I)⇒Cu(II)の酸化が,溶液中また固相中で確認された。予想されたように,固相で発光性を示すAg(I), Au(I)ーヒドラゾン錯体が単離された。プロトンの付加・解離をともなう発光性の変化だけでなく,Ag(I)錯体では光照射によりヒドラゾン配位子の異性化をともなう色変化,発光色変化が固相で発現した。以上の研究成果を国内外の様々な学会で発表し,現在執筆中のものも含め,国際的な学術雑誌へ投稿した。錯体化学本研究課題を推進するうえで,1)新規なヒドラゾン錯体の設計と合成,単離。2)構造の決定。3)プロトンの付加・解離とこれにともなうクロミック挙動の発現の確認。4)クロミック現象をもたらす反応メカニズムの解明。が必要な実験手順である。新規なヒドラゾン錯体の設計と合成については,昨年度のPd(II), Pt(II)錯体に加えて,新たに酸化還元が可能なRu(II)(III), Cu(I)(II)錯体の合成と単離に成功し,主要な多数の錯体についてX線結晶構造解による構造決定を行うことができた。また,いずれの錯体も,可逆なプロトンの付加・解離が可能であることを確認した。Pd(II), Pt(II)錯体については,今年度主に固相中のトリボクロミズム,ベイポクロミズムに注目し,興味ある固相中の配位構造変換のメカニズムを明らかにすることができた。Ru(II)(III)錯体では,溶液中でプロトンの付加にともないRu(II)からRu(III)への酸化がおこることが見出された。また,Cu(I)(II)錯体では,溶液中だけでなく固相中でもCu(I)からCu(II)への酸化状態の変化をともなう色変化を確認することができた。以上のように,昨年度の成果にもとづいて有効に研究を発展させることができている。特に,可逆な酸化還元が可能で,多様な配位構造をとり得るRu(II)(III), Cu(I)(II)錯体系に研究を展開できた意義は大きい。即ち,本研究課題で使用しているヒドラゾン化合物が特定の金属イオンのみに配位子として作用するのではなく,広く多様な金属イオンに対して高い配位能力を有していることが明らかになり,多様な金属を有する錯体系へと拡張して研究を展開することが可能となった。本年度当初の研究目的として,1)外部刺激に応答する金属錯体の合成・単離と構造決定2)可逆なプロトンの付加・解離にともなうクロミック現象の発現の確認3)トリボクロミズム,ベイポクロミズム,サーモクロミズム,フォトクロミズムなど,多様なクロミック現象の検討4)プロトン酸性度の異なる錯体間でのプロトン移動にともなう
ヒトのロイコトリエンB_4ω水酸化酵素の機能ならびに遺伝子構造

1)ヒト好中球ならびに肝臓に存在する2種のロイコトリエンB_4ω水酸化酵素のcDNAを用いて酵素タンパク質を酵母内で大量に発現させて精製を行った。その結果、好中球の酵素はSDS-PAGE上の分子量が55KDaの低スピン型のチトクロームP-450で、還元型一酸化炭素結合差スペクトルの吸収極大は449.5nmであり、再構成系によって活発なロイコトリエンB_4ω水酸化活性を示した。一方、肝臓の酵素はSDS-PAGE上の分子量は57KDaの低スピン型のチトクロームP-450で、還元型一酸化炭素結合差スペクトルの吸収極大は450nmであったが、精製により変成し、再構成系によって十分な活性は認められなかった。また、肝臓の酵素は強いチトクロームb5要求性を示した。2)cDNAより推定される蛋白質の一次構造より適当な配列を選び、抗ポリペプチド抗体を作成した。ヒト好中球の酵素の合成ペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより55KDaにバンドが見られ、さらに免疫組織染色により好中球内に酵素の存在を確認できた。3)ヒト好中球の酵素の遺伝子解析を行ったところ、サザンブロッティングにより少なくとも1つの類似した遺伝子が存在し、さらに肝臓の酵素に類似した遺伝子も数個存在することが示された。ヒト好中球の酵素の遺伝子の内、転写開始点を含む16KbpのゲノムDNAクローンを得、その中に9個のエクソンを確認したが全長は含まれていなかった。本クローンを解析した結果、開始コドンはエクソンII上にあり、転写開始点より上流1.1Kb以内にはCACCC結合サイトなどいくつかの転写調節因子の結合サイトが見られた。
ヒト骨髄間質細胞を用いた中枢神経再生、臨床応用にむけた新たなテクノロジーの研究

ヒト骨髄間質細胞(BMSC)を利用した中枢神経再生を臨床応用させるため、その効率的な手法の確立と安全性の追求を目指した研究を行い、以下の成果を得た。(1)バイオマトリックスを用いたBMSC培養に成功した。(2)G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)を培養液中に添加すると、BMSCが活性化された。またヒトPL(血小板溶解物)を添加し、動物由来成分を排除した培養を行いその有用性を示した。(3)フィブリンマトリックスやメビオールジェルRはスキャフォールドとして有用であり、病変部へBMSCを効果的にデリバリーすることを示した。(4)移植後のヒトBMSCの挙動を、光イメージング技術やMRIにて非侵襲的、経時的にモニタリングできた。中枢神経疾患に骨髄間質細胞(BMSC)を移植する際に、バイオマテリアルをスキャフォールドとしてもちいることが有用であるか検討するために、まずフィブリンマトリックスを使った実験を行なった。BMSCはフィブリンマトリックスの中で培養を行なうと、長期間生存が可能であることを示した。またフィブリンマトリックスをスキャフォールドとして用い、ラット脊髄損傷モデルおよびラット脳凍結損傷モデルに対してBMSCを損傷部に移植すると、細胞単独移植に比べ、移植後の細胞生着や病変深部への遊走、神経系細胞への分化傾向などで良好な結果を示した。これらの実験結果はそれぞれ、Neuropathology誌(2008)およびJournal of Neurosurgery誌(2009)に掲載された。この結果を受け、バイオマテリアルとしてメビオールジェルを用いた実験を新たに開始した。細胞培養の結果はフィブリンマトリックスに比較して良好な細胞生存を示し、疾患モデルに移植した場合も良好な結果を示した。これらの結果の一部は、2009年3月に国内学会にて発表し、現在国際学術誌に投稿準備中である。また、BMSC移植後に脳内での細胞の挙動を追跡する目的で、近赤外線領域の蛍光を発するナノ粒子をもちいた光イメージング技術の開発や、さらにBMSC移植後の治療効果をモニタリングすることを目的にmicro PETを用いた研究についても、得られた研究結果の一部をそれぞれ2009年3月に国内学会にて発表し、国際学術誌に投稿準備中である。今年度は、中枢神経疾患に骨髄間質細胞(BMSC)を移植する際に、メビオールジェルをスキャフォールドとして用いた実験をおこなった。細胞培養では、前年度までにおこなったフィブリンマトリックスを使用した実験結果に比較して、良好な細胞生存を示した。またメビオールジェルを用いてラット脳梗塞モデルに対してBMSCを損傷部に移植すると、細胞単独移植に比べ、移植後の細胞生着や病変深部への遊走、神経系細胞への分化傾向などで良好な結果を示した。これらの実験結果は、Neurosurgery誌(in press)に掲載される。また、BMSC移植後に脳内での細胞の挙動を追跡する目的で、光イメージング技術の開発を行った。近赤外線領域の蛍光を発するナノ粒子を用いてBMSCを標識し、ラット脳梗塞モデルにその細胞を移植することで頭皮上から移植細胞を可視化することができた。これらの結果をNeurosurgery誌に投稿中である。さらに、効率的で安全なBMSC培養を達成するための新規なテクノロジーとして、サイトカインなどに着目した研究を行った。すなわち、老齢ラットのBMSCをG-CSFとともに培養することでその増殖や移植による治療効果を増強することができることを証明し(Cytokine誌2009)、かつ動物蛋白を用いない方法でヒトBMSCを培養して、ラット脳梗塞モデルに移植しその治療効果を証明した(Neurosurgery誌投稿中)。今年度は、中枢神経疾患に骨髄間質細胞(BMSCを移植する際に、安全かつ効率的にヒトBMSCを培養することを目的に、従来のウシ胎仔血清(FCS)に替えヒトPlatelet lysate (PL)をもちいた細胞培養の実験をおこなった。細胞増殖速度は、PL群とFCS群でほぼ同等であった。培養ヒトBMSCの表面マーカーや、神経保護作用などに関与すると考えられる神経栄養因子などの産生、神経系細胞への分化傾向を検討したが、いずれも両群に差はなく、PLを用いることで動物血清を使用せず安全に培養できることを明らかにした。(Transl Stroke Res誌に投稿中)また、PLを使用し培養したヒトBMSCを、ラット脳梗塞モデルに移植する実験もおこなった。これらはvehicle群に比べ有意に運動機能改善が得られ、FCSをもちいた細胞とほぼ同等の治療効果が得られた。同時にBMSC移植後に脳内での細胞の挙動を追跡する目的で、光イメージング技術やMRIをもちいた細胞追跡技術の開発もおこなった。

近赤外線領域の蛍光を発するナノ粒子やSuperparamagnetic ironoxide(SPIO)粒子を用いてBMSCを標識し、遊走する移植細胞を画像化することができた。(Neurosurgery誌に掲載、Cell Transplant誌に投稿中)さらに、脳梗塞ラットに対し発症7日後にBMSCを脳内に直接移植するモデルと、経静脈細胞投与をおこなったモデルを比較し、運動機能改善効果や細胞の生着について検討した。この比較では、脳内直接移植の有用性が明らかとなった。また、発症30日後に脳内に直接移植する移植する慢性期移植モデルを作製し、Therapeutic time windowの検討も行った。(Exp Neurol誌に投稿中)また、ラット慢性脳循環低下モデルや脳卒中易発症ラットをもちいて、BMSC移植による治療効果を検討した。これらの実験では、移植後に認知機能の改善や脳萎縮の進行を防ぐといった効果を実証した。(Dement Geriatr Cogn Disord.誌に掲載、Stroke誌に投稿中)
対麻痺者用ロボットを用いた安全な坂道歩行獲得に関する研究

本研究の目的は,脊髄損傷者の装着型歩行支援ロボットWPALを使用した坂道歩行における適切な歩行器操作時期を明らかにすることである.坂道歩行は,上りと下りの終始で歩行器と歩行者の床面の角度が異なる.この点は,平地歩行にはない坂道歩行特有のシステムを構築する上で考慮すべき課題である.初年度は,坂道歩行で計測可能な歩行器と歩行者との距離計測システムを構築する.次に初年度構築した計測システムを用いて,坂道歩行時の適切な歩行器の前方移動時期を明らかにする.最終年度には,同計測システムを用いて転倒につながる姿勢変化を再現して,坂道歩行時に行うべき練習課題を明らかにする.本研究の目的は,脊髄損傷者の装着型歩行支援ロボットWPALを使用した坂道歩行における適切な歩行器操作時期を明らかにすることである.坂道歩行は,上りと下りの終始で歩行器と歩行者の床面の角度が異なる.この点は,平地歩行にはない坂道歩行特有のシステムを構築する上で考慮すべき課題である.初年度は,坂道歩行で計測可能な歩行器と歩行者との距離計測システムを構築する.次に初年度構築した計測システムを用いて,坂道歩行時の適切な歩行器の前方移動時期を明らかにする.最終年度には,同計測システムを用いて転倒につながる姿勢変化を再現して,坂道歩行時に行うべき練習課題を明らかにする.
VEGF遺伝子導入による実験的自己組織移植法の開発

【実験1】HE染色による組織所見は、皮下投与群で投与後3日目まで皮下毛細血管の拡大と増加を認めた。手術時皮弁皮下注入群の横型有茎ソケイ皮弁では、術後7日目の生存面積が60.0±0.002%(対照群48.3±0.19%)と増加したが、統計的優位差を認めなかった(t=0.67)遊離複合組織移植の場合には投与群では18.4±0.12%(対照群24.7±0.09%)で移植組織片の肉眼的生着率がより小さかったが優位差はなかった(t=0.40)。[実験2]シリコン留置VEGF皮下注入群のHE染色による組織所見は、シリコンの周囲に炎症性細胞と線維細胞による皮膜層を形成し、その周囲で皮膚側においてのみ毛細血管拡張と増加を認めた。毛細血管所見は留置シリコンの中央でも認められた。手術時皮弁皮下注入群の縦型有茎ソケイ皮弁では皮下生存面積が60.0(±0.001)%で対照群(59.6±0.16%)に比べ広かったが、統計的優位差を認めなかった。遊離複合組織移植の場合には10.3%(対照群3.4%)で組織移植片の生存率は大きかった。大学動物実験施設内、生物学的封じ込めレベルP2実験室内において、遺伝子組換え、動物個体への遺伝子導入設備の整備を完了した。実験1.Wildマウス(成体)に対して、liposomeを用いて直接局所投与し、当該ベクターによる動物個体の標的細胞への遺伝子導入効率、有効持続時間、最大効果時間と安全性を明らかにする。細胞導入効率評価: 7日後まで連日に皮弁の経過をデジタルカメラで撮影した。7日後に麻酔下で組織を採取し10%ホルマリンで固定、H&E連続切片10枚を作成し、40倍にてデジタルカメラで撮影した。撮影画像はデジタル画像データとして、画像解析ソフトにて計測、面積を算出した。有効注入組織層と部位別効果、最大効果時間を検討した。結果最大効果時間は3日であった。手術日のみに皮弁内外の皮下に注入した群で、7日目の面積で最大60.1%の生着を認め、対照に対して1.01倍の増加を認めた。VEGF plasmid-liposome複合体の投与による副作用と考えられる所見を認めなかった。生着面積および組織切片の血管内腔総長、面積の統計解析については現在解析中である。[実験1]継続実験Wildマウス(成体)に対して、VEGFh165-pBLAST plasmid (Invirtogen) 6μgとLipofectin (invivogen) 24μ1によるDNA-liposome複合体を直接局所投与した。全身麻酔下に保定し、手術術3日前、手術時に、8mm間隔でソケイ部に皮弁の内外皮下、皮弁下筋肉内に直接注入した。細胞導入効率評価:7日後まで連日に皮弁の経過をデジタルカメラで撮影し、デジタル画像データを画像解析ソフト(ImageJ, NIH)にて計測、生存面積を算出した。結果;遊離複合組織移植の場合には18.4%(対照群24.7%)で移植組織片の生存率が減少したが、縦型有茎ソケイ皮弁では60.1%(対照群48.4%)と増加した。生存面積には動物個体によるばらつきが大きく統計的有意差が認められず、予定していた組織切片の解析に進むことができなかった。[実験2]マウスに作成するソケイ部の皮弁下に0.3mm厚のシリコンプレートを留置し、細胞導入効率評価を、[実験1]と同様に行い、DNA-liposome複合体による移植組織片への効果を検討した。結果;遊離複合組織移植の場合には10.3%(対照群3.4%)で組織移植片の生存率が増大したが、個体差が大きく、予定していた組織解析が出来なかった。両実験におけるばらつきの原因としてマウスソケイ部皮膚の薄さと機弱さが影響している可能性が推測された。海外共同研究者と打ち合わせを行ない、来年度は組織切片解析を試み、その結果をもとに実験法の修正を行なうことを検討している。

【実験1】HE染色による組織所見は、皮下投与群で投与後3日目まで皮下毛細血管の拡大と増加を認めた。手術時皮弁皮下注入群の横型有茎ソケイ皮弁では、術後7日目の生存面積が60.0±0.002%(対照群48.3±0.19%)と増加したが、統計的優位差を認めなかった(t=0.67)遊離複合組織移植の場合には投与群では18.4±0.12%(対照群24.7±0.09%)で移植組織片の肉眼的生着率がより小さかったが優位差はなかった(t=0.40)。[実験2]シリコン留置VEGF皮下注入群のHE染色による組織所見は、シリコンの周囲に炎症性細胞と線維細胞による皮膜層を形成し、その周囲で皮膚側においてのみ毛細血管拡張と増加を認めた。毛細血管所見は留置シリコンの中央でも認められた。手術時皮弁皮下注入群の縦型有茎ソケイ皮弁では皮下生存面積が60.0(±0.001)%で対照群(59.6±0.16%)に比べ広かったが、統計的優位差を認めなかった。遊離複合組織移植の場合には10.3%(対照群3.4%)で組織移植片の生存率は大きかった。
オーエスキー病ウイルスによるゼノーシスの可能性について

前年度に作成した、数種類の動物由来の細胞株で増やしたオーエスキー病ウイルス粒子のうち、ウサギ由来細胞およびブタ由来細胞で増やしたウイルスを用い、各種の動物がもつ自然抗体によるウイルス中和について検討した。本年度の研究により、α1. 3Gal抗体を持たない動物間でも各種動物が持つ自然抗体が異種動物で増えたウイルスを選択的に中和することを明らかにした。またこの中和には補体古典経路の活性化が必要であることも突き止めた。ウイルス中和に寄与する自然抗体はウイルスが増えた宿主動物の抗原を認識する抗体であった。このため、ウイルス粒子上に取り込まれた宿主由来抗原に自然抗体が反応するものと予想された。また、これらの自然抗体は主としてIgMでありアフィニティーは比較的弱いものと推察された。ヒトの自然抗体はα1. 3Gal抗体が大部分であるがそれ以外にも微量の自然抗体が存在する。本年度の成果により、α1. 3Gal抗体にくわえてこれらの微量の自然抗体も動物由来オーエスキー病ウイルスの人体への感染防御に寄与してしいる可能性が示唆された。前年度より引き続き試みている、ブタ抹消血細胞からヒト由来細胞へのオーエスキー病伝播の有無については期間内た明確な答えを得ることができなかった。しかしながら15年度に確立したオーエスキー病ウイルスの検出系のさらなる改良は進展が見られているため、今後多くのブタ抹消血サンプルを用いて研究を行うことで明確な答えを得るめどはついた。数種類の動物種由来の細胞株で増やしたオーエスキー病ウイルス粒子を精製し、ウイルス粒子上にGal-1-3Gal分子が存在するか否か確認したところ、ブタ細胞で増やしたウイルスでは検出されたが、ヒト由来細胞で増やしたウイルスでは検出されなかった。また、ブタ・ヒトだけではなく多くの動物種由来の細胞株でウイルスを増やし、得られたウイルスのヒト血清への感受性を比較したところ、Gal-1-3Galを表面上に多く持っている細胞で増やしたウイルスが感受性であることを確認した。また、ヒト血清によるウイルス中和は精製Gal-1-3Gal添加によって抑制され、補体不活化により完全に喪失した。このことから、ヒト血清中に含まれるいわゆる自然抗体(抗Gal-1-3Gal抗体)が補体古典経路を介してオーエスキー病ウイルス中和にかかわっていることが示された。また、宿主細胞のちがいにょって、オーエスキー病ウイルスがヒト血清によるウイルス中和に対して耐性を持つことも明らかとなった。加えてブタ細胞で増やしたウイルスはブタ血清では中和されないが抗Gal-1-3Gal抗体を添加するとブタ血清でも中和されること、宿主細胞に反応する自然抗体を事前に除いたヒト血清はウイルス中和活性を失うことも確認した。これらの実験結果は、ヒト・サルだけが持つとされている抗Gal-1-3Gal抗体のオーエスキー病ウイルス感染阻止における重要性を示唆している。ブタ末梢血細胞からヒト由来細胞へのオーエスキー病ウイルス感染の有無については15年度中に明確な結果が得られなかったが、15年度中にPCRに代わるより鋭敏な感染検出系の作成に成功し、この系を用いて検討を重ねているところである。
高齢者の主体的で生き生きした発達を支援する生活環境づくりへの発達環境学的接近

本研究では、高齢者は主体的で生き生きした発達を成し遂げる存在であり、その発達を支援する生活環境を提供すべきであるという考え方に立って、1)生活環境心理学、2)生活環境論、3)環境生理学、4)バイオメカニクスの4つのアプローチを実施した。1)では、施設関係者と共同して「主体的で生き生きとした発達を支援する生活環境づくりの基本指針」を提案した。2)住環境では住環境の改善によって動作の改善や生活意欲が向上するかを、食分野では味覚のメカニズムを、衣分野では高齢者おむつと生活意欲との関係から検討した。3)では、高齢者の環境移行にともなう身体・心理社会的能力がどのように変化するかを明らかにし、転倒予防や環境移行のあり方を探った。4)では、主体的な発達を促進する福祉機器の工学的工夫に関する研究を行った。本年度は以下の5点にわたって、研究を展開した。1.事例収集と発達支援環境研究の枠組みづくり:諸外国や国内の高齢者の発達支援環境に関する先行研究や事例を収集し、居宅や施設の生活調査やヒアリング等を行いながら、これまでの環境研究の成果や議論を整理した(全員)。2.研究会の実施:2008年7月から2009年1月まで、7回にわたって摂津市内の福祉施設と摂津市福祉協議会との共催で、「高齢者の発達を支援する環境づくり」研究会を開催し、本研究の各分野の専門家を招き討議を深めた。3.発達を促す生活環境心理学的研究:大阪府内にある介護付き高齢者住宅やユニットケア型特別養護老人ホーム、及び地域に根ざした多機能施設などにおいて参与観察を行いながら、施設関係者と共同して「主体的で生き生きとした発達を支援する生活環境づくりの基本指針」を検討した。同時に高齢者の環境移行にともなう身体・心理社会的能力がどのように変化するかを明らかにし、転倒予防や環境移行のあり方を探った(城・近藤・岡田)。4.発達支援環境づくりと生活意欲の研究1:イギリスでの高齢者医療と介護の動向を調査して、高齢者の生活ケアの現状を把握するとともに、認知症に遅延効果があるとされる環境づくりの現状を視察した(城、井上、矢野)。また、福祉機器の工学的問題点を洗い出し、主体的な発達を促進する福祉機器の工学的工夫を検討した(矢野)。5.発達支援環境づくりと生活意欲の研究2:住分野では、住環境や住宅材料などの変化にともなってどのように動作の改善や生活意欲が向上するかを検討した。食分野では、食環境と生活意欲との関連を、衣分野では、衣服行動と生活意欲との関係を検討した(青木・白杉・井上)。1.発達支援環境研究の枠組みづくり:昨年度に引き続き、諸外国や国内の高齢者の発達支援環境に関する先行研究や事例を収集し、居宅や施設の生活調査やヒアリング等を行いながら、これまでの環境研究の成果や議論を整理した(全員)。2.研究会の実施:2009年5月から2009年11月まで、7回にわたって高知県南国市の老人保健施設と南国市福祉協議会との共催で、「高齢者の主体的で生き生きとした発達を支援する環境づくり」研究会を開催した。研究資料「do forからdo withへ」を用いて施設関係者と専門討議を深めた(全員)。3.発達を促す生活環境心理学的研究:神戸市内の福祉施設6施設404名を対象に施設入所者のADLと水分摂取に関する調査を実施し、水分摂取量の違いがADLの違いに大きく関与している事実を確認した。生き生きと生活するためには毎日の十分な水分摂取が不可欠であることを明らかにした。(城、近藤)。4.発達支援環境づくりと生活意欲の研究1:ドイツのデュッセルドルフで開催された福祉機器展において日独フォーラムREHACARE2009に参加し、福祉用具の認可システムや安全性とその評価に関する日独比較を通じて、福祉用具を取り巻く環境の違いを討論した(城、矢野、岡田)。また、福祉機器の工学的問題点を洗い出し、主体的な発達を促進する福祉機器の工学的工夫を検討した(矢野、岡田)。総括年度にあたり、本年度は以下の5点にわたって研究を総括した。1.発達支援

環境研究の枠組みづくり:諸外国や国内の高齢者の発達支援環境に関する先行研究や事例を整理し、居宅や施設の生活調査やヒアリング等を行いながら、これまでの環境研究の成果や議論を整理した(全員)。2.研究会の実施:2010年3月から2011年3月まで、7回にわたって京都府綾部市の第二松寿苑との共催で、「高齢者の主体的で生き生きとした発達を支援する環境づくり」研究会を開催した。研究資料「do forからdo withへ」を用いて施設従事者と専門討議を深めた(全員)。3.発達を促す生活環境心理学的研究:昨年に引き続き施設入所者のADLと水分摂取に関する調査を実施し、水分摂取量の違いが入所者の生き生き度の違いに大きく関与している事実を確認した。生き生きと生活するためには毎日の十分な水分摂取が不可欠であることを再度確認した(城、近藤)。この研究成果を日本心理学会に発表した(城)。4.発達支援環境づくりと生活意欲の研究1:2010年9月15日18日において中国青島市内にある2つの高齢者福祉施設を訪問し中国における福祉サービスの現状を視察した。さらにこれまでの研究成果を長崎大学との共同研究会で発表し、高齢者の発達に環境的支援がいかに重要であるかを協議した(城、青木)。また、フットウェアによる転倒予防方策や主体的な発達を促進する福祉機器の工学的工夫に関する研究を論文や学会で発表した(矢野、岡田)。5.発達支援環境づくりと生活意欲の研究2:食分野では、味覚のメカニズムを、衣分野では高齢者おむつと生活意欲との関係を検討した(白杉・井上)。
筋衛星細胞自己複製機構の解明およびＲＮＡ干渉による筋衛星細胞自己複製促進法の開発

骨格筋の修復や再生は骨格筋幹細胞である筋衛星細胞によって行われる.本研究ではマウス筋衛星細胞由来の細胞株C2C12の培養によって生じるリザーブ細胞を休眠状態の筋衛星細胞のモデルとして使用し,リザーブ細胞形成に関与する因子を探索した.アダプタータンパク質Grb2,Sos1,Rasがリザーブ細胞形成に必要であること,Grb2の強制発現はリザーブ細胞形成を促進し,恒常活性型Sos1およびRasの強制発現はリザーブ細胞形成を抑制することを明らかにした.これらの結果はGrb2-Sos1-Rasはリザーブ細胞形成に必須であるが,過剰なシグナルはリザーブ細胞形成に対して抑制的に働くことを示唆している.骨格筋の修復や再生は,骨格筋幹細胞である筋衛星細胞によって行われる.筋衛星細胞は厳密な制御機構によってその数が維持されていると考えられているが,その分子機構は不明である.本研究では主に低分子量Gタンパク質Rasとそのエフェクタータンパク質に注目して筋衛星細胞の自己複製に関与する因子を探索するとともに,自己複製の抑制性制御因子をRNA干渉によって機能阻害することで生体内の筋衛星細胞を増加させる方法の開発を目指す.平成23年度には,マウス筋衛星細胞由来の細胞株C2C12の培養によって生じるリザーブ細胞を休眠状態の筋衛星細胞のモデルとして使用し,アダプタータンパク質Grb2がリザーブ細胞形成に必須であることを示す実験結果を得ることができた.Grb2の下流で機能する低分子量Gタンパク質Rasの関与が考えられたものの,siRNAによってH-Ras,K-Ras,N-Rasの発現を阻害した場合にはリザーブ細胞数に顕著な変化は見られなかった.そこで平成24年度にはRasタンパク質の過剰発現を試みた.なお,その際には目的遺伝子の発現量および時期を制御することが必要と考え,まずリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を安定的に発現するC2C12細胞株(C2C12-TetOn細胞)を樹立した.その結果,テトラサイクリン応答因子プロモーター制御下で目的遺伝子を発現するベクターの導入により人工的に目的遺伝子の発現を制御することが可能になった.そして,ドミナントネガティブ型N-Rasの筋分化促進的に働くのに対して,恒常的活性型N-Rasは筋分化を抑制し未分化な単核細胞の産生を促進することを見いだした.これまでにRasが筋分化に対して抑制的に機能することは報告されているものの,筋衛星細胞の自己複製に関連づけた研究はなく,筋衛星細胞自己複製機構の解明に向けて前進することができた.骨格筋の修復や再生は骨格筋幹細胞である筋衛星細胞によって行われる.筋衛星細胞は厳密な制御機構によってその数が維持されていると考えられているが,その分子機構は不明である.本研究ではマウス筋衛星細胞由来の細胞株C2C12の培養によって生じるリザーブ細胞を休眠状態の筋衛星細胞のモデルとして使用し,リザーブ細胞形成に関与する因子を探索した.そしてアダプタータンパク質Grb2をノックダウンするとリザーブ細胞形成が顕著に抑制されること,リザーブ細胞数は野生型Grb2の過剰発現により増加し,ドミナントネガティブ型Grb2の過剰発現によって減少することを明らかにした.Grb2はグアニンヌクレオチド交換因子Sos1との相互作用によって情報伝達に関与することからSos1のノックダウンを行ったところ,Grb2のノックダウンと同様にリザーブ細胞数の減少が見られた.その一方で,恒常的活性型Sos1であるcSos/CAAXを過剰発現した場合には未分化な細胞の増殖が強く誘導されたものの,この細胞はリザーブ細胞ではなく増殖中の筋芽細胞と同様の性質を持つものと考えられた.Sos1の下流で機能する低分子量Gタンパク質Rasの過剰発現を試みたところ,恒常的活性型H-Rasおよび恒常的活性型N-RasはcSos/CAAXと同様に筋芽細胞の増殖を促進した.以上の結果はGrb2-Sos1-Rasはリザーブ細胞形成に必須であるが,過剰なシグナルはリザーブ細胞形成に対して抑制的に働くことを示唆している.今後,人工的に外来遺伝子の発現量を調整することや,ノックダウンのタイミングを詳細に検討することによって,リザーブ細胞形成そして筋衛星細胞の自己複製を促進する培養条件が確立できると考えている.骨格筋の修復や再生は骨格筋幹細胞である筋衛星細胞によって行われる.本研究ではマウス筋衛星細胞由来の細胞株C2C12の培養によって生じるリザーブ細胞を休眠状態の筋衛星細胞のモデルとして使用し,リザーブ細胞形成に関与する因子を探索した.アダプタータンパク質Grb2,Sos1,Rasがリザーブ細胞形成に必要であること,Grb2の強制発現はリザーブ細胞形成を促進し,恒常活性型Sos1およびRasの強制発現はリザーブ細胞形成を抑制することを明らかにした.これらの結果はGrb2-Sos1-Rasはリザーブ細胞形成に必須であるが,過剰なシグナルはリザーブ細胞形成に対して抑制的に働くことを示唆している.骨格筋の修復や再生は,骨格筋幹細胞である筋衛星細胞によって行われる.筋衛星細胞は厳密な制御機構によってその数が維持されていると考えられているが,その分子機構は不明である.本研究では主に低分子量Gタンパク質Rasとそのエフェクタータンパク質に注目して筋衛星細胞の自己複製に関与する因子を探索するとともに,自己複製の抑制性制御因子をRNA干渉によって機能阻害することで生体内の筋衛星細胞を増加させる方法の開発を目指す.

平成23年度には,マウス筋衛星細胞由来の細胞株C2C12の培養によって生じるリザーブ細胞を休眠状態の筋衛星細胞のモデルとして使用し,アダプタータンパク質Grb2およびその下流に位置する低分子量Gタンパク質Rasの機能阻害がリザーブ細胞形成に与える影響を検討した.RasサブファミリーにはH-Ras,K-Ras,N-Rasをはじめとするさまざまなメンバーが含まれるため,それぞれについてRNA干渉による発現抑制を行った.発現抑制はウェスタンブロットによって確認し,リザーブ細胞は抗アポトーシスタンパク質Bcl-2を発現し,筋分化制御因子であるMyoDを発現しない細胞として同定した.その結果,H-Ras,K-Ras,N-Rasを単独でノックダウンした場合にはリザーブ細胞数の顕著な減少は起こらなかった.これは別のアイソフォームのRasが代償的に働いたために生じた結果である可能性が考えられるため,平成24年度には2種類あるいは3種類の同時ノックダウンを行う予定である.また,リザーブ細胞形成に関与するタンパク質を探索する過程で,プロテインキナーゼC阻害剤Go6976によってリザーブ細胞形成が抑制されること,プロテインキナーゼCを活性化するホルボールエステルによってリザーブ細胞形成が促進されることを明らかにし,プロテインキナーゼCがリザーブ細胞形成を正に制御する可能性を見いだした.リザーブ細胞形成がGrb2ノックダウンおよびファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤によって著しく抑制されることから,初年度には配列特異的なsiRNAを用いたRasノックダウンによりリザーブ細胞形成が抑制されると予想し,H-Ras,N-Ras,K-Rasそれぞれのノックダウンを行った.しかし,いずれのアイソフォームをノックダウンした場合にも期待したような結果は得られなかった.これは一つのRasアイソフォームを単独でノックダウンした場合には別のアイソフォームが代償的に作用したためと考えている.平成25年度には2重あるいは3重ノックダウンを行うことでこの問題を解決することができると考えている.なお, C2C12細胞へのsiRNA導入条件を体系的に検討したことにより,安定的に高効率のノックダウンを実現することが可能になったため,今後は迅速な進展が期待できる.平成24年度には所属研究室での遺伝子導入実験系の本格的な立ち上げに取り組んだ。各種条件の最適化に試行錯誤が必要となったため,当初に予定していた計画よりも時間がかかってしまったものの,リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子を安定的に発現するC2C12細胞株(C2C12-TetOn細胞)を樹立することができた.このことによって任意の量およびタイミングで目的遺伝子を発現させることが可能になったため,平成25年度には遺伝子導入実験を効率的に進めることができると考えている.