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高周波静電容量法によるコンクリート打込み中の欠陥の新規定量評価手法に関する研究

欠陥が無い状態の試験体の大きさを変化させた実験により、端子間の距離が大きくなるのに比例して奥行き方向の測定可能範囲が大きくなることが明らかとなった。模擬的な空洞の大きさを変化させた実験により、端子間の距離が大きくなるのに比例して端子間の距離を変えた方向に空洞の測定可能範囲が大きくなること、奥行き方向には測定範囲は変わらないことが明らかとなった。空洞の大きさおよび深さ位置を変化させた実験により、空洞の深さ位置が20mm以下であれば異なる端子間距離の測定値から、空洞の大きさや位置が推定できる可能性が得られた。1、測定対象に接して高周波電流を印加して測定する接触端子の間隔を数種類に変えた高周波静電容量センサーについて、研究協力者とともに仕様を検討して製作を行った。センサーの端子間の距離は、標準的な間隔40mmを基準とし、40mmよりも狭い20mmおよび10mmの場合と、40mmよりも広い60mmと80mmの場合を設定した。2、接触端子の間隔を10mm、20mm、40mm、60mm、80mmとした高周波静電容量センサーを用いて、センサーがもつ平面的な測定範囲、および奥行き方向への測定範囲と測定感度に関する実験を行った。測定対象として取り上げたのは、誘電率が異なるモルタル・アクリル・ガラスとし、所定の寸法に調整した試験体による室内実験とした。実験の結果、モルタルでは端子間隔が20mmから60mmまで大きくなるに従い測定範囲はほぼ線形に広くなることが分かった。誘電率が小さいアクリルでも端子間隔が20mmから60mmまで大きくなるに従い測定範囲はほぼ線形に広くなることが分かった。測定範囲は、測定対象の誘電率によって異なるが、端子間隔によって測定範囲が変化する傾向はほぼ同じであることが分かった。なお、奥行き方向の測定範囲については端子間隔による有意な差はみられていない。また、端子間隔が狭い10mmと20mmの場合では、測定値が安定しない状況がみられた。3、接触端子の間隔が異なるセンサーを用いて、模擬試験体の型枠中に充填したコンクリート中に大きさの異なる欠陥(発泡スチロール)を設置した状態として、高周波静電容量センサーの空洞に対する平面的な測定範囲および奥行き方向への測定範囲と測定感度に関する実験の計画を行った。1、高周波電流を印加する接触端子(電極)の間隔を数種類に変えた高周波静電容量センサーがもつ平面的な測定範囲、および奥行き方向への測定範囲と測定感度に関する実験を行った昨年度の結果から、センサーの改良の必要性が生じたため、新たな仕様のセンサーを製作して測定を行うこととした。新たなセンサーでは、電極間の距離を15mmから65mmまで10mm間隔とし、電極の長さも25mmから100mmまで25mm間隔で設定した。また、ノイズ対策として、接続ケーブルの仕様等の改良を併せて行った。2、昨年度、高周波静電容量センサーの平面的な測定範囲と感度および奥行き方向への測定範囲と感度に明確な傾向が得られなかった状況を踏まえて、再度確認実験を行った。実験の結果、電極間の距離が大きくなるのに比例して奥行き方向の測定可能範囲が大きくなることが分かった。電極間の距離を変えた方向では測定可能範囲は35mm以上の電極間の距離では変わらなかった。また、電極の長さを変えた場合には、電極が接触する面積が大きいほど測定可能範囲が大きくなることが分かった。3、コンクリート等の中に空洞が存在する状態において、空洞に対する高周波静電容量センサーの測定範囲と感度を確認する実験を行った。実験の結果、電極間の距離が大きくなるのに比例して電極間の距離を変えた方向に空洞の測定可能範囲が大きくなることが分かった。奥行き方向では、電極間の距離を変えても測定可能範囲は変わらなかった。電極の長さを変えた場合には、空洞が電極に接触する面積よりも15mm程度大きい測定可能範囲が確認できた。これらの内容は、本研究の成果は2015年度日本建築学会大会(関東)学術講演梗概集への発表投稿を行った。4、型枠中に充填したコンクリート中に存在する鉄筋の直径や位置、型枠の締付け金物等の影響に関する実験を計画した。本研究の目的は、高周波静電容量センサーの接触端子(電極)の距離等による測定範囲の可変性を実験的に検討し、複数の端子間距離で測定した測定値と欠陥の位置および大きさとの関係式を導いて欠陥を定量的に特定する基礎を確立することであった。高周波電流を印加する端子の距離は15mmから65mmまで10mm間隔とし、また端子の長さを25mmから100mmまで25mm間隔で変化させた高周波静電容量センサーを試作し、センサーの特性、コンクリート中の欠陥の位置および大きさの違いによる測定値への影響を実験的に把握した。1.欠陥が無い状態の試験体の大きさを変化させることにより、高周波静電容量センサーの平面的な方向および奥行き方向への測定範囲と感度に関する実験を行った。実験の結果、端子間の距離が大きくなるのに比例して奥行き方向の測定可能範囲が大きくなること、端子の長さを変えた場合には、端子が接触する面積が大きいほど測定可能範囲が大きくなることが分かった。2.模擬的な空洞の大きさを試験体中で変化させることにより、空洞に対する高周波静電容量センサーの測定範囲と感度を確認する実験を行った。実験の結果、端子間の距離が大きくなるのに比例して電極間の距離を変えた方向に空洞の測定可能範囲が大きくなること、奥行き方向に対する測定可能範囲は変わらなかった。

3.空洞の大きさおよび深さ位置を変化させた実験により、空洞の深さ位置が20mm以下であれば、空洞の深さと測定値の関係式は端子間の距離によって異なること、この関係式は空洞の大きさにも影響を受けることが分かった。これらの結果を整理することで、測定値から空洞の大きさや位置が推定できる可能性が得られた。欠陥が無い状態の試験体の大きさを変化させた実験により、端子間の距離が大きくなるのに比例して奥行き方向の測定可能範囲が大きくなることが明らかとなった。模擬的な空洞の大きさを変化させた実験により、端子間の距離が大きくなるのに比例して端子間の距離を変えた方向に空洞の測定可能範囲が大きくなること、奥行き方向には測定範囲は変わらないことが明らかとなった。空洞の大きさおよび深さ位置を変化させた実験により、空洞の深さ位置が20mm以下であれば異なる端子間距離の測定値から、空洞の大きさや位置が推定できる可能性が得られた。1、接触端子(電極)の間隔を変えた高周波静電容量センサーについて、昨年度の実験結果を踏まえて研究協力者とともに装置の仕様を改良して試作品を製作することができた。センサーの電極間の距離は、15mmから65まで10mm間隔で設定した。電極の大きさは、25mmから100mmまで25mm間隔で設定した。実験の結果、昨年度の問題点は解決され、測定範囲や感度に関する実験でも十分な測定結果が得られた。2、電極の間隔を変えた高周波静電容量センサーを用いて、誘電率が異なる材料での、センサーがもつ平面的な測定範囲、および奥行き方向への測定範囲と測定感度に関する実験を行った。中実(モルタル等が充填された)状態の試験体では、電極間の距離が大きくなるのに比例して奥行き方向の測定範囲が大きくなることが分かった。電極間の距離を変える方向では、測定範囲は電極間の距離と関係がなかった。測定対象の誘電率によって奥行き方向の測定範囲が明確に異なる傾向はなかった。したがって、当初の目的であった、奥行き方向に異なる位置で存在する空洞は、電極間の距離を変えたセンサーを用いることによって、その位置を推定できるといえる。3、誘電率が異なる材料での、空洞に対するセンサーの平面的な測定範囲、および奥行き方向への測定範囲と測定感度に関する実験を行った。電極間の距離が大きくなるのに比例して電極間と同じ方向の空洞の測定範囲が大きくなることが分かった。電極の長さを変えた場合では、電極長さに15mm程度を加えた範囲まで測定されていることが分かった。したがって、電極内の範囲で空洞が接しているかどうかが測定範囲の境界であるといえる。4、高周波静電容量の測定値に影響を及ぼすと考えられる金属材料の影響について、鉄筋の直径や位置、締付け金物等の影響は、過去に実施している実験の状況を参考にして、試験体の大きさや鉄筋の仕様等の実験を計画した。
モダニスト期における女性の身体とアメリカ詩の関係

本研究第一年目の活動としては、学会発表、海外調査、展示会企画準備が主に挙げられる。学会発表は、2007年度英文学会の「多重化するジャンル」というシンポジウムにて、マリアン・ムーアの詩と映像表象についての考察を行った。海外調査としては、NY市立図書館内バーグ特別資料室で、エリノア・ワイリーの書簡と、当時のVogueやVanity Fairといったファッション雑誌を閲覧した。アメリカ議会図書館では、エドナ・セント・ヴィンセント・ミレイの特別資料を調査した。さらに、ローゼンバーク博物館・図書館では、マリアン・ムーアの特別資料から書簡や映像資料を調査した。ローゼンバーク博物館・図書館が2009年に開催する展示会「マリアン・ムーアとファッション」の学術企画者(academic curator)の仕事を引き受けることになった。これは、当博物館が所蔵するムーア資料を使用して、本研究課題である「女性詩人と身体の関係」を学術的に追究する企画である。以上の研究が明らかにするのは、20世紀初頭モダニスト期に活躍した女性詩人の間には、服飾表現において大きな相違があり、その違いは、詩の内容、文体、社会情勢への姿勢、フェミニズム、生い立ち、階級、教育と密接な関係を持つということである。例えば、大卒の中流階級出身者で生涯未婚であったムーアと、個人教育を受けた上流階級出身、そして離婚経験者のワイリーの間には、文化的社会的相違のみならず、身体表現においても相違が明らかである。この違いは、各々の詩の表現にも顕著である。その際、服飾による身体表現は、単なる実用的所作ではなく、自己を社会的そして文学的に定義する効用をもつと考えられる。今後は、この論旨を論文で発表してゆく計画である。朝日出版社から近日中に出版予定の『アメリカ文学案内』に執筆し、モダニスト期の詩人、マリアン・ムーア、エリノア・ワイリー、E.E.カミングズ、H.D.などの詩人・作品紹介の項目を担当した。
海馬シナプス非対称性の分子基盤と左右差を引き起こすメカニズム

本研究は、マウス海馬のCA1錐体細胞シナプスにおけるNMDA受容体サブユニットNR2Bの左右非対称分布の機能的意義および非対称性を引き起こす分子基盤とそのメカニズムを解明することを目的とした。まずVHCTマウスから作成した海馬標本を用い、postembedding法によって同側入力を受ける錐体細胞シナプスに存在するNR2BとNR1やAMPA受容体の濃度を左右の海馬で定量的に比較した。その結果CA1 stratum oriensとstratum radiatumにおいてNR2B特異的に海馬シナプスにおける密度の非対称性が認められ、しかもstratum oriensとstratum radiatumでその方向性が逆転していた。stratum radiatumにおいて介在神経細胞に対するシナプスに対しても同様の解析を行ったところ、全く左右差は検出されず、NR2Bの左右非対称分布は錐体細胞シナプスに特異的であることが明らかとなった。またNR2B以外に左右非対称に存在する分子を検索したところNR1とPSD95については、左右差が全く見られないという結果を得たが、その他の分子でいくつかの候補を見出すことができた。今後はこれをもとに、関係する機能分子を重点的に検索する。また非対称性を引き起こすメカニズムを解明するアッセイ系として海馬スライスカルチャーを作成し、左右の海馬からの混合培養でシナプス反応を記録することに成功した。今後は生体内での非対称性がスライスカルチャーで再現されるかどうかを検証する。また、各種遺伝子変異マウスを用いて左右非対称分布を検討したところ、非対称が増強しているミュータントと消失しているミュータントを発見した。これらの動物は非対称性を引き起こすメカニズムを解明する上で極めて有用であるばかりでなく、今後、左右非対称分布の機能的意義を海馬の関与する行動実験を使って追及する道を拓くものである。我々は、マウス海馬のCA1錐体細胞シナプスにおいて、NMDA受容体サブユニットNR2Bが左右非対称に分布していることを機能的および生化学的方法により見出した。海馬交連を脳の正中において切断したマウス(Ventral Hippocampal Commissure Transected mouse ; VHCTマウス)の海馬スライスを作成し、左右海馬のSch-CA1シナプスが存在する層のみをそれぞれ切除し、PSD画分を調整した後、ウエスタンブロッティングを行った。現在までに明らかになった左右非対称性は、CA1 stratum oriensの同側錐体細胞の入力を受けるシナプスにおいて、NR2Bサブユニットの量比が右側:左側=1.5:1であるのに対しstratum radiatumでは右側:左側=1:1.5と逆転しているいうことである(投稿中)。VHCTマウスでは反対側海馬からの交連線維(Commissural fiber ; Com)を含まない、同側のシナプスのみが残存した海馬標本を得ることができる。VHCTを行っていない通常のマウスでは、このようなシナプスの左右非対称性がこれまで見い出されていないことから、同側入力と反対側入力の形成するシナプスにおけるNMDA受容体サブユニット構成は、相補的関係になっていることが推定される。また左右非対称性を引き起こす分子基盤を探るためにNMDA受容体の関連分子の局在左右差を検討中で、現在までにNR1とPSD95については左右差が全く見られなかったが、他の関連分子の中に候補を見出している。また形態学的な観点からVHCTマウスから作成した海馬標本を用い、postembedding法によって同側入力を受ける錐体細胞シナプスに存在するNR1とNR2Bの標識密度を左右の海馬で比較したが、バラツキが大きく現在のところ一定の結果が得られていない。これについては、より効率的な定量解析のために凍結割断レプリカ法を検討中である。

ヒトにおいては様々な脳の高次機能の左右非対称性(Laterality)の存在が知られているが、それを生み出す分子機構に関しては全く明らかになっていない。一方、ヒト以外の動物においては、Lateralityの存在そのものが確立されているとは言い難い。哺乳動物成獣の脳において機能分子の非対称性分布を初めて立証するこの成果は、シナプス可塑性をはじめNMDA受容体の関与する脳機能の左右差を初めて明確な分子基盤に基づいて明らかにする道を開くと考えられる。本研究は、マウス海馬のCA1錐体細胞シナプスにおけるNMDA受容体サブユニットNR2Bの左右非対称分布の機能的意義および非対称性を引き起こす分子基盤とそのメカニズムを解明することを目的とした。まずVHCTマウスから作成した海馬標本を用い、postembedding法によって同側入力を受ける錐体細胞シナプスに存在するNR2BとNR1やAMPA受容体の濃度を左右の海馬で定量的に比較した。その結果CA1 stratum oriensとstratum radiatumにおいてNR2B特異的に海馬シナプスにおける密度の非対称性が認められ、しかもstratum oriensとstratum radiatumでその方向性が逆転していた。stratum radiatumにおいて介在神経細胞に対するシナプスに対しても同様の解析を行ったところ、全く左右差は検出されず、NR2Bの左右非対称分布は錐体細胞シナプスに特異的であることが明らかとなった。またNR2B以外に左右非対称に存在する分子を検索したところNR1とPSD95については、左右差が全く見られないという結果を得たが、その他の分子でいくつかの候補を見出すことができた。今後はこれをもとに、関係する機能分子を重点的に検索する。また非対称性を引き起こすメカニズムを解明するアッセイ系として海馬スライスカルチャーを作成し、左右の海馬からの混合培養でシナプス反応を記録することに成功した。今後は生体内での非対称性がスライスカルチャーで再現されるかどうかを検証する。また、各種遺伝子変異マウスを用いて左右非対称分布を検討したところ、非対称が増強しているミュータントと消失しているミュータントを発見した。これらの動物は非対称性を引き起こすメカニズムを解明する上で極めて有用であるばかりでなく、今後、左右非対称分布の機能的意義を海馬の関与する行動実験を使って追及する道を拓くものである。
骨再生歯科治療への応用を目的としたナノポーラスファイバーシートの創製

骨形成を促進するケイ素イオンとカルシウムイオンが効果的に徐放される新しい生体吸収性材料として、シロキサン・ポリ乳酸・炭酸カルシウム複合材料を作製した。さらに電界紡糸法を用いて直径約10μmのナノポーラス構造を持つ繊維からなる100200μm厚の柔軟性のある不織布に成形した。細胞培養試験からこれらの設計は骨形成性細胞が三次元的に増殖できる場を提供するに好適であること、動物実験から骨形成に優れることを確認した。抜歯・脱落部の修復、顎骨部の炎症・腫瘍治療などに有効な骨再生誘導膜への応用が期待できる。1.骨形成を促進するイオン徐放性ハイブリッド材料の創製ポリ乳酸(PLA)にシランカップリング剤(APTES)を化学的に結合させハイブリッド化する方法を検討した。固体核磁気共鳴法、赤外吸収分光により、シロキサンとしてポリ乳酸とアミド結合を介してハイブリッド化していることを確認した。溶液へのシリコン溶出量はポリ乳酸の分解に依存しており、極めて小さかった(<0.1ppm/day)。一方、バテライト粒子を作製する際にAPTESを混在させておくと、得られる粒子にAPTES由来のシロキサンが混在できることを見いだした。この粒子をポリ乳酸と200°Cで混練して複合体を作製するとその混合量によって徐放量を制御できることを見いだした。現在のところ、0.5ppm/dayの徐放が可能である。また、バテライトにストロンチウムを含有させた粒子を作製することに成功した。今後、ポリ乳酸との複合化を進める。2.ナノ孔を有するファイバーからなるシートの作製法の確立1の複合体を溶媒に溶かした液の粘度とその誘電率を調整して、エレクトロスピニング法により、直径10μm程度の複合ファイバーからなるシートを作製する条件を見いだした。弱い酸で処理すると表面付近のバテライトが除去されて、数百nm径の気孔が形成されることを確認した。3.アパタイト被覆法の検討擬似体液浸漬法(バイオミメティック法)により、ハイブリッドファイバー上へ1μm程度のアパタイト層を生成させることができた。4.ハイブリッド材料の生体親和性評価1で作製した材料をフィルム状に成形し細胞培養試験により増殖性を評価した。シリコンを微量に徐放する材料は、徐放しないものに比べて有意に増殖性が高いことを確認した。エレクトロスピニング法により得られる不織布を形成する繊維は通常内部が密であるが、連通したナノ気孔を有することで、薬剤やタンパク質担持機能の付与が期待でき、高機能化がはかれる。これまでに開発したPVH(PLA(ポリ乳酸)/Vaterite(バテライト)Hybrid)不織布の繊維内部はバテライト粒子が密につまった状態である。今回、PVH中のバテライトを薄いリン酸溶液で処理することにより、多孔質繊維からなる不織布の作製が可能であることを見出した。さらに、細胞親和性に優れるアパタイト(HA)を、気孔内に生成させため、擬似体液に7日間浸漬したところ、繊維断面にHAと考えられる花弁状の物質がみられた。繊維内部に残存するバテライト表面にはリン酸カルシウム層が形成され、HAの生成を誘起したと考えられる。さらにP-Vの溶解とともにCa^<2+>イオン濃度が上昇し、かつ擬似体液からもCa^<2+>、HPO_4^<2->イオンが供給され、HAが成長したと考えられる。昨年度開発したCa,Siを溶出する不織布を用いて骨再生誘導(GBR)膜とすることを考え、強度を確保するためにPLA単体膜との二層膜構造を部分プレスして作製することに成功した。得られた二層膜は、多孔性を維持した部分と繊維が密となった部分との両方をもつ形状であった。7日間MC3T3-E1細胞を培養したところ、繊維が粗な部分においては細胞が内部まで進入している様子が見られ、密な部分の周辺では比較的多量の細胞が表面に接着しているのが見られた。動物実験結果より、開発膜層内部で旺盛な骨形成が見られた。骨形成にSr^<2+>イオンも有効である可能性があるため、SrとSiを含有するバテライトを作製し、これとPLAを複合した材料も作製した。これについては細胞培養による生体親和性評価を進めているところである。ケイ素含有バテライト粒子を1060%まで変化させて作製したポリ乳酸複合材料不織布(SiPVH)では、40%以上で脆性的となり、30%で最も高い機械的引張強度を示した。引張によるエネルギーは粒子周りにわずかな体積膨張を引き起こし、高強度化したと思われる。バテライト30%の複合材料でも擬似体液中で繊維上にアパタイトが生成することを確認した。しかし、20%ではその生成は極めて遅かった。

柔軟性をあげるため、ポリ乳酸に変えてポリ乳酸/グリコール酸共重合体を用いて複合材料を作製したところ、作製まま材の伸びについては飛躍的に向上したものの、擬似体液浸漬3日で脆化に転じ、強度も著しく低下した。分子量の急速な低下が原因と考えられた。したがって、ポリ乳酸を用いることが最も好ましいと考え、SiPVH中のポリ乳酸の分子量を調べたところ、ゆっくりとした低下傾向が示され、好ましい生分解性を示すと期待された。細胞培養試験により、繊維上での細胞接着は繊維同士のクロスリンクポイント周辺から始まる傾向が見られた。また、意図的に部分的にプレスして繊維間の空隙を塞ぐと、その部分での細胞の接着・増殖は抑えられたが、その周辺の空隙部分では旺盛な増殖が見られるようになった。部分的にこのようなプレスポイントを作ることで細胞の挙動を制御できる可能性が示された。そこでプレスポイントを導入したGBR膜を作製した。広い繊維間隙を有するSiPVH不織布と、軟組織など骨形成に寄与しない細胞の侵入を抑制する機能および機械的強度の付与を目的とした繊維間隙の狭いポリ乳酸不織布を局所的なホットプレスにて合着して二層構造膜とし、十分な引張強度も確保した。家兎を用いた動物実験の結果、骨欠損部への軟組織など骨形成に寄与しない細胞の侵入は観察されなかった。繊維表面にアパタイトを析出させたSiPVH層内にて石灰化組織の増加が観察された。
睡眠不足による心理的及び運動パフォーマンス低下のメカニズム追究

競技スポーツなど前夜の緊張や不安によって、一睡もできないまま試合に臨まなければならないことがある。本研究課題では、睡眠不足による心理的及び運動パフォーマンス低下の原因を体液量調節の観点から検討した結果、24時間断眠によって発汗による脱水症状が亢進するが、水分を多めに摂取するなどの体液維持対策によって、運動パフォーマンスの低下や暑熱環境下運動中の熱中症を予防できる可能性が考えられた。24時間以上の断眠によって心理的パフォーマンスは低下することが明らかにされている。一方、運動パフォーマンスは24時間以上の断眠状態でも、筋力、無酸素性運動能力に低下は認められないという報告がほとんどであるが、有酸素性運動能力は、漸増負荷テスト時の最大酸素摂取量、最大運動負荷が低下することが報告されている。有酸素性運動能力は脱水による体液の減少によって低下することから、本年度は、体液調節の観点から「睡眠不足による心理的及び運動パフォーマンス低下のメカニズム」を検討した。健常成人男性8名を対象とし、実験条件は7時間の十分な睡眠後と24時間断眠後の2条件で、睡眠と断眠の前後に体重測定と採尿による尿浸透圧分析を行い体液調節の変化を検討した。その結果、睡眠条件では発汗による体液の減少が認められたが、断眠条件では体重の変化に差がなく体液の変化が見られなかった。しかしながら、断眠時の飲水量、食事量を差し引いた発汗や尿による脱水量は睡眠時の体液減少量より大きかった。AMSスコアをはじめとする心理的パフォーマンスは断眠条件で明らかに低下が見られた。一方、睡眠条件と断眠条件で握力によって評価した筋力に差はなかった。自転車エルゴメータの漸増負荷運動テストによって評価した有酸素性運動能力は、各負荷の心拍数、血中乳酸値に2条件の差はなかったが、運動時間は睡眠条件で増加した。断眠によって明らかに脱水が亢進するが、水分を多めに摂取するなどの体液維持の対策によって運動パフォーマンスの低下を最小限にできる可能性が示唆されたが、断眠による心理的パフォーマンスの低下及び運動時間の減少と体液調節との関係については今後さらに検討が必要と考えた。24時間以上の断眠によって心理検査など心理的パフォーマンスは低下することが明らかにされている。一方、運動パフォーマンスは、筋力は低下しないという報告がほとんどであるが、有酸素性運動能力は低下することが報告されている。昨年度は、断眠による有酸素性運動能力の低下は、体液量の減少によるものではなかという仮説のもとに検証を行ったが、24時間断眠によって、体液量の減少、有酸素性運動能力の低下とも認められなかった。本年度は、心理的パフォーマンスとして全身反応時間、運動パフォーマンスとして運動時体温調節能の測定を加え、体液調節の観点から「睡眠不足による心理的及び運動パフォーマンス低下のメカニズム」を検証した。健常成人男性8名を対象とし、実験条件は7時間の十分な睡眠後と24時間断眠後の2条件で、睡眠と断眠の前後に体重測定を行い体液量の変化を検討した。その結果、昨年度と同様に睡眠条件では発汗による体液量の減少が認められたが、断眠条件では体重の変化に差がなく体液量の変化が見られなかった。しかしながら、発汗による断眠時の脱水量(412±41ml、平均値±標準誤差)は睡眠時(333±32ml)より大きく、有意な差が認められた。光刺激による全身反応時間は単純反応時間、選択反応時間とも2条件で差はなく、神経反応や選択反応による脳情報処理能力に差異を見出せなかった。また、運動時体温調節能は、自転車エルゴメータを用いて皮膚血管拡張閾値によって評価したが、睡眠条件(37.1±0.1°C)と断眠条件(37.1±0.1°C)の2条件に統計的な差は見られなかった。断眠によって明らかに発汗による脱水が亢進するが、被験者の体調管理のため任意摂取とした水分摂取(355±53ml)により体液量を維持する傾向が見られた。断眠時は水分補給による体液維持対策によって運動パフォーマンスの低下を最小限にできる可能性が示唆された。
アディポネクチンによる血管平滑筋細胞プロテオグリカングリカン代謝の制御

アディポネクチンは脂肪細胞から特異的に産生されるタンパク質で,抗動脈硬化活性を持っている。プロテオグリカンはコアタンパク質にグリコサミノクリカン糖鎖が結合した高分子で,動脈硬化進展において鍵となる分子である。本研究では,アディポネクチン処理後の培養ヒト冠動脈血管平滑筋細胞からの産生されるプロテオグリカンを生化学的に分析した。その結果,アディポネクチンは血管平滑筋細胞にデルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種であるデコリンの産生を誘導することを明らかにした。さらに,アディポネクチンによる調節は,デコリン分子中の糖鎖のグルクロン酸のエピマー化を減少させていた。本研究で,血管平滑筋細胞のプロテオグリカン合成のアディポネクチンによる調節を明らかにした最初の報告である。その他に,TNFαについても血管平滑筋細胞プロテオグリカン産生について検討した。その結果,TNFαはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの大型分子種バーシカンの合成を促進するが,糖鎖の短縮が生ずることを明らかにした。さらに,動脈硬化症の危険因子として知られているホモシステインについて血管平滑筋細胞プロテオグリカン合成への作用を調べ,アディポネクチンの作用と比較した。その結果,ホモシステインがデルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種ビグリカン/デコリン画分の合成を阻害すること,そのときにはデルマタン硫酸糖鎖の4-ο-硫酸化が促進されることが分かった(Fujiwara, et. al.,2008)。アディポネクチンならびにTNFαについては現在論文を準備中である。TNF-αおよびアディポネクチンによるプロテオグリカン合成の調節を検討するために,培養血管平滑筋細胞をTNF-αあるいはアディポネクチン存在下,[^<35>S]硫酸で代謝標識し,細胞層と培地に蓄積したプロテオグリカンの特性を解析した。1.TNF-αが血管平滑筋細胞のプロテオグリカン合成を以下のように調節することが明らかになった。(1)コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの大型分子種バーシカン(V0およびV1バリアント)コア蛋白の合成を誘導する。(2)そのコンドロイチン硫酸糖鎖の伸長を抑制する。(3)コンドロイチン硫酸糖鎖の二糖組成を変化(GlcA-GalNAc(4S)の選択的増加)させる。これらは特に細胞密度が高い場合に細胞傷害性や蛋白合成の全体的な上昇をともなうことなく起こった。2.アディポネクチンが血管平滑筋細胞のプロテオグリカン合成を以下のように調節することが明らかになった。(1)デルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種デコリンのコア蛋白合成を選択的に誘導する。(2)そのグリコサミノクリカン糖鎖の伸長には影響を及ぼさない。(3)しかしながら,そのデルマタン硫酸糖鎖のグルクロン酸の割合を増加(イズロン酸の割合の減少)させる。これらは細胞密度に非依存的に起こった。以上の結果より,TNF-αによるプロテオグリカン合成の調節は,動脈硬化病変の進展に係るバーシカンの量的増加と構造の変化,およびそれに基づく血管平滑筋細胞の機能異常に寄与するものと推察される。一方,アディポネクチンによる,血管平滑筋細胞プロテオグリカン合成の調節は,その抗動脈硬化作用に含まれることが示唆された。昨年度,すでにアディポネクチンが血管平滑筋細胞のプロテオグリカン合成を調節することを明らかにしている。すなわち,アディポネクチンに曝露した血管平滑筋細胞ではデルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種デコリンのコアタンパク質合成が誘導されており,そのデルマタン硫酸糖鎖の形成過程においてもグルクロン酸のイズロン酸へのエピマー化が阻害されることを見いだした。デコリンは抗動脈硬化作用を示すプロテオグリカンであることから,アディポネクチンの抗動脈硬化作用の一つにデコリン合成が含まれることが示唆された。

平成19年度は,動脈硬化症の危険因子として知られているホモシステインについて血管平滑筋細胞プロテオグリカン合成への作用を調べ,アディポネクチンの作用と比較した。その結果,ホモシステインがデルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種ビグリカン/デコリン画分の合成を阻害すること,そのときにはデルマタン硫酸糖鎖の4-O-硫酸化が促進されることが分かった(Fujiwara, et. al., 2008)。以上の結果は,これまで知られているコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの大型分子種バーシカンの合成調節だけでなく,ビグリカン/デコリンの合成調節が動脈硬化進展あるいは進展防御にきわめて重要であることを示唆している。アディポネクチンは,そのようなデルマタン硫酸プロテオグリカンの小型分子種の合成調節因子であることが示されたことに,本研究の大きな意義がある。
イネおよび馬鈴薯の形質転換体による昆虫伝搬性ウイルス病の防除

イネおよび馬鈴薯の昆虫で媒介される重要病害イネ萎縮ウイルス、イネラギッドスタントウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス、ジャガイモYウイルスの遺伝子やウイルス抗体遺伝子を導入し、形質転換植物のウイルス抵抗性を評価した。1。イネ萎縮ウイルスとイネラギッドスタントウイルスの外被蛋白質で形質転換したイネにそれぞれのウイルスを接種した。どれも抵抗性や病徴の軽減を示さず、ウイルス増殖量の減少も観察されなかった。2。ジャガイモ葉巻ウイルスの外被蛋白質遺伝子とRNAポリメラーゼを組み込んだ馬鈴薯にジャガイモ葉巻ウイルスを接種した。感染率は非形質転換体と同じであったが、ウイルス増殖量が抑制されている形質転換体を得た。3。ジャガイモYウイルスの外被蛋白質に対する抗体遺伝子を組み込んだタバコにジャガイモYウイルスを接種したが、抵抗性を示す形質転換体は得られなかった。4。ジャガイモYウイルスの外被蛋白質遺伝子を組み込んだ形質転換タバコにジャガイモYウイルスを接種したが、抵抗性を示す個体は得られなかった。5。以上の結果から、昆虫媒介生ウイルスの場合、ウイルス由来の遺伝子で形質転換した作物に、完全な抵抗性を賦与するのは難しい事が明らかになった。今後は、宿主が本来備えている、抵抗性遺伝子を探索する必要が有ると結論した。1。2。3。4。5。I.ウイルス病抵抗性を付与すると思われる遺伝子をcDNAクローニングして,導入ベクターに挿入した。1)イネ萎縮ウイルスの外被蛋白質と非構造蛋白質、ジャガイモYウイルスとジャガイモ葉巻ウイルスの外被蛋白質の遺伝子についてcDNAを合成し、pUC119プラスミドに挿入してクローニングした。2)イネ萎縮ウイルスについて、昆虫伝搬性ウイルス株と非伝搬性株を媒介昆虫に混合感染されてから、ウイルスの単一株の分離を行ない、合の子ウイルスを作成した。これらの合の子ウイルスゲノムの由来の調べ、伝搬に関与するウイルス遺伝子の同定を試みている。II.発現効率を高める為に、ベクターの開発を行なっている。1)幾つかのウイルスの5′末端非翻訳領域をcDNAクローニングして、Tiプラスミドの35Sプロモーターとウイルス外被蛋白質遺伝子の間に挿入した。現在これらを用いて、ジャガイモを形質転換している。2)イネツングロ病ウイルス(rice tungro baciliform virus)ゲノムのプロモーター領域を持つベクターを構築した。現在このプロモーターの下流にGUS遺伝子を挿入して、イネとジャガイモの形質転換体を作成している。1.昨年度cDNAクローニングした抗ウイルス遺伝子をイネおよび馬鈴薯に導入した。1)イネ黒条萎縮ウイルスのP8および10遺伝子とイネラギッドスタントウイルスP9遺伝子でイネを形質転換した。導入遺伝子はゲノミックPCRとノーザンハイブリダイゼーションによるmRNAの検出で確認した。2)ジャガイモ葉巻ウイルスの外被蛋白質遺伝子の上流にジャガイモXウイルスの5'末端非翻訳領域を組み込んだものと組み込まないベクターを構築して、馬鈴薯を形質転換した。3)ジャガイモYウイルスの外被蛋白質に対する抗体遺伝子でタバコと馬鈴薯を形質転換した。タバコについてはゲノミックPCRで遺伝子が導入されたことを確認した。4)ジャガイモ葉巻ウイルスのRNAポリメラーゼ遺伝子で馬鈴薯を形質転換した。導入遺伝子はノーザンハイブリダイゼーションでその発現を確認した。5)ジャガイモYウイルスの外被蛋白質遺伝子をタバコと馬鈴薯に導入した。2.発現効率を高める為のベクターの開発を試みた。1)イネツングロー病ウイルス(RTBV)のプロモーターをGUS遺伝子の上流に組み込んだベクターを開発した。このプロモーターは篩管部細胞で良く発現する事が分かった。最終年度に当たり、抗ウイルス遺伝子を組み込んだ馬鈴薯、イネ、タバコのウイルス抵抗性をELISAで検定した。1。イネ萎縮ウイルスとイネラギットスタントウイルスの外被蛋白質で形質転換したイネにそれぞれのウイルスを接種した。2。

ジャガイモ葉巻ウイルスの外被蛋白質遺伝子とRNAポリメラーゼを組み込んだ馬鈴薯にジャガイモ葉巻ウイルスを接種した。感染率は非形質転換体と同じであったが、ウイルス増殖量が抑制されている形質転換体を得た。3。ジャガイモYウイルスの外被蛋白質に対する抗体遺伝子を組み込んだタバコにジャガイモYウイルスを接種したが、抵抗性を示す形質転換体は得られなかった。4。ジャガイモYウイルスの外被蛋白質遺伝子を組み込んだ形質転換タバコにジャガイモYウイルスを接種したが、抵抗性を示す個体は得られなかった。5。以上の結果から、昆虫媒介生ウイルスの場合、ウイルス由来の遺伝子で形質転換した作物に、完全な抵抗性を賦与するのは難しい事が明らかになった。今後は、宿主が本来備えている、抵抗性遺伝子を探索する必要が有ると結論した。
激震後の高層建築物群からの同時一斉避難による街区群集の制御に関する研究

地域避難シミュレーションモデルに、屋内ネットワークモデルを追加することで、屋内外を連続的に扱える建物群・街区一体モデルに改良し、建物内と街路を一体として扱うことのできる新たな避難シミュレーションシステムの開発を行った。人口集中地区である東京都中央区東京駅東部において激震後の避難者の動向に関してのケーススタディ行った結果、街区、建物内での群集による滞留状況を把握することができることが明らかになり、今後の高層建築物群を有する人口集中地区での群集制御のための避難性状予測を可能とした。激震時の高層建築物等における調査として、2011年3月11日に発生した東北地方太平洋沖地震は勤務時間内に発生した激しい地震として着目し、震度6弱6強であった仙台市の高層建築物の商業用途を対象として、防火設備・防火区画等の被害状況、激震時の在館者の挙動、防災センター要員等の情報収集・対応行動、及び、地上における広域移動の傾向を調査した結果を整理し、傾向を明らかとした。大都市圏在勤・在学者の地震時広域移動指向の解明として、研究分担者の廣井が既に実施した東日本大震災における首都圏の帰宅困難現象に関する社会調査の調査結果を基に、曜日・時間帯別、及び、在勤・在学者の属性別の街区レベルでの広域移動指向を明らかとした。高層建築物群における群集流動シミュレーションモデルの開発に向けて、研究分担者の野竹が、これまでに構築したモデルをベースとして、各種用途の建築物群の在館者についての群集流動状況を再現できるように、シミュレーションのモデルを構築した。街区における群集流動シミュレーションモデルの開発として、研究分担者の西野が開発したポテンシャル法に基づく地震火災時の地域における避難シミュレーションモデルをベースとして、街区への建築物からの流入、街区内での誘導による流動、街区外への流出、及び、建築物への再収容を扱って街区での群集流動状況を把握できるモデルを構築した。1激震時の高層建築物等における調査:2011年3月11日に発生した東北地方太平洋沖地震は勤務時間内に発生した激しい地震として着目し、震度6弱6強であった仙台市の高層建築物及び長周期振動の影響を受けた首都圏の超高層建築物を中心として、事務所用途、商業用途、高層マンションを対象として、防火設備・防火区画等の被害状況、激震時の在館者の挙動、防災センター要員等の情報収集・対応行動、及び、地上における広域移動の傾向を、平成24年度に引き続き調査した。2大都市圏在勤・在学者の地震時広域移動指向の解明:研究分担者の廣井が既に実施した東日本大震災における首都圏の帰宅困難現象に関する社会調査の調査結果を基に、曜日・時間帯別、及び、在勤・在学者の属性別の街区レベルでの広域移動指向を平成24年度に引き続き明らかとした。3高層建築物群における群集流動シミュレーションモデルの開発:各種用途の建築物群の在館者についての群集流動状況を再現できるように、シミュレーションのモデルを開発する。その上で、各階の避難階段の振り分け方のより効率的な方策や、本検討において提案した避難誘導方策が実際に有効に機能するかどうかの実証等を含め、激震後に有効な全館避難シナリオの提案に関する検討を行った。4街区における群集流動シミュレーションモデルの開発:研究分担者の西野が開発したポテンシャル法に基づく地震火災時の地域における避難シミュレーションモデルをベースとして、街区への建築物からの流入、街区内での誘導による流動、街区外への流出、及び、建築物への再収容を扱って街区での群集流動状況を把握できるモデルを24年度に引き続き開発した。激震時の高層建築物等における調査として、事務所・商業用途を対象として、激震時の在館者の挙動、防災センター要員等の情報収集・対応行動、及び、地上における広域移動の傾向を把握し、激震後の高層建築物等における在館者の全館避難シナリオの構築に関する考察を行った。また、大都市圏在勤・在学者の地震時広域移動指向の解明として、曜日・時間帯別、及び、在勤・在学者の属性別の街区レベルでの広域移動指向を解明し、人口集積地区の混乱の可能性を指摘した。高層建築物群における群集流動シミュレーションモデルを構築し、各階の避難階段の振り分け方として順次避難、及び、一斉避難について避難時間の検討を行った。また、高層建築物における避難誘導計画の担当者に対して、アンケート調査を実施し、ほとんどの高層建築物では,全館避難という事態に対しては順次避難を行う計画を有しているが、順次避難を行う際の避難フェーズ別の待機時間や避難対象階を決める方法が不明であるなどの課題が残されていることがわかった。街区における群集流動シミュレーションモデルの開発については、激震後の人口集中地区における建物内及び街区を一体として扱う避難シミュレーションモデルを構築し、同時一斉避難時の建物内及び街区の滞留状況に関して東京駅周辺地区を対象としてケーススタディを行った。このモデルは、ポテンシャル法に基づく避難シミュレーションモデルをベースとして、街区への建築物からの流入、街区内での誘導による流動、街区外への流出を扱って街区での群集滞留状況を把握できるモデルとした。

今後、様々な人口集中地区において、高層建築物群からの全館避難シナリオ、順次避難の手順について、多様な設定条件の下で建物内及び街区を一体として扱う避難シミュレーションを行い、激震時後、街区に群集が集中することによる混乱が起こらないための手法を確立していく必要がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。防火・避難計画26年度が最終年度であるため、記入しない。激震時の高層建築物等における在館者の挙動調査、大都市圏在勤・在学者の地震時広域移動指向調査、高層建築物における群集流動シミュレーションの開発、及び、街区における群集流動シミュレーションの開発の各項目について、一定の進捗状況となっているため。激震時の高層建築物等における在館者の挙動や広域移動指向性を基とした建物からの群集流動、及び、地上における群集流動を統合したシミュレーション手法を概ね開発しており、予定していた研究計画に沿って研究を実施している。激震時の高層建築物等における在館者の挙動調査、防災センター要員等の情報収集・対応行動調査、防火設備・防火区画等の被害状況調査、大都市圏在勤・在学者の地震時広域移動指向調査、高層建築物における群集流動シミュレーションの開発、及び、街区における群集流動シミュレーションの開発を行う。本年度は最終年度であるので、これまでに開発した激震時の高層建築物等における在館者の挙動や広域移動指向性を基とした建物からの群集流動、及び、地上における群集流動シミュレーション手法を用いて、地震後火災による在館者安全確保を行った上での建物内滞留方策を含めた適切な群集誘導等による街区群集の制御方策の検討を行う。分析に必要なデータの購入費用が予想よりも下回ったため。次年度のデータ購入費用にあてる。
蒸気圧制御によるP形セレン化亜鉛の気相エピタキシャル成長

1.開管法:(1)前年度、ZnとSeを原料とした水素輸送法により、PをドープしたZnSeをGaAS基板上に気相成長させて、P形が得られることを報告した。その後の実験により、P形を得るためにはPのほかにLiが必要であることが判明した。P形ZnSeは予めLiをP用の石英ボートに含ませておくか、Seに数%混合させ、Zn過剰の状態で基板温度が450500°Cのときに得られた。PまたはLiを単独にドープするときは高抵抗率であった。(2)ダブルドープ条件を検討するために、Pのみをドープした膜を作成し、それにLiを拡散させる実験を行なった。Pのみをドープした場合、Tp=150330°Cに対して、Tp=240°C以下でエピ成長をした。PLはTp=150°Cでもバンド端発光がアンドープ膜の場合と異なっており、低温のTpでもかなりのPがドープされている。この膜にLiを拡散した場合は実験中である。2.閉管法:(1)前年度に引き続きZnSeの輸送速度の封入ガス圧依存性を調べた。本年度はAr(10^<-3>50Torr)とH_2(10^<-3>3Torr)による違いを調べた。Arの場合、0.5Torr以下ではほぼ一定の輸送速度であり、0.550TorrではAr圧の-0.5剰で減少するのに対し、H_2の場合、-0.2剰(0.021Torr)と-1剰(13Torr)で減少する。輸送の機構の詳細については不明であるが、H_2の場合、ZnSeとの反応が関係していると考えられる。(2)気相成長で育成したバルクのZnSe単結晶にPを拡散させた(515°C)。PLにおいて500nm付近に新たな発光が観測された。このピークはZn雰囲気、Se雰囲気および真空中の熱処理によっては観測されない。3.今後の計画:(1)開管法;P-Liのダブルドープの最適条件を検討しPn接合を形成する。青色発光ダイオードについて検討する。(2)閉管法:封入ガス圧に対して育成単結晶の特性を評価する。アクセプタ不純物のドープ条件について実験検討する。
フタトゲチマダニの吸血、発生及び生態とタイレリア原虫の生活環

1.両性生殖系(2n)の雌は交尾しないと飽血離脱及び正常産卵しなかった。交尾は早いものでは吸血開始後34日で起こった。産卵数と吸血雌体重との間には正の相関があり、体重が重いほど産卵数は多かった。2.吸血に伴って発達し始めた卵母細胞は吸血開始後4日目に卵巣表層から血体腔に突出し、卵巣上皮細胞由来の索状細胞によって支えられるようになった。卵黄形成と卵殻合成は飽血離脱日に開始された。卵黄形成期には核窩を持つ大きな卵核は索状細胞側に位置するようになり、よく発達した微絨毛と活発な飲作用が形質膜上に認められた。成熟した卵母細胞は索状細胞間隙を通過し、卵巣腔へと排卵された。多数の精子は排卵時には卵巣腔に達しており、それらの幾つかは卵巣上皮細胞の微絨毛と接し、あるいは索状細胞形質膜の嵌入部に侵入していた。排卵された卵には特徴的な卵核がもはや認められなかったので、精子は卵巣腔において卵母細胞を受精させると考えられた。3.フタトゲチマダニ若虫における宿主血液消化を飽血離脱から脱皮後5日目まで調べた。中腸に含まれる総蛋白質量は離脱から脱皮直前まで急激に、その後は非常に緩慢に減少した。中腸に含まれる蛋白質の大部分は多量のヘモグロビンと少量のアルブミンであり、これらの消化速度は前者で後者よりも速かった。ヘモグロビン消化の残余物ヘマチンはヘモグロビンの減少につれて増加し、脱皮後15日目に急激に排泄された。4.電顕的観察によって、中腸は末吸血期には栄養貯蔵器官として、吸血期及び前脱皮期には宿主血液の上皮細胞内消化器官として、脱皮後には再び栄養貯蔵器官として機能した。1.フタトゲチマダニ雄の唾液腺III型腺胞の形態変化と機能との関係を調べた。III型腺胞は顆粒性のc及びd細胞と非顆粒性のe細胞、反腔間細胞、及び腔面間細胞の5種類から成り、セメント物質の前駆物質を分泌するcとd細胞は吸血期間中、高い分泌活動を示した。e細胞と反腔間細胞には水分輸送上皮に特徴的な著しい細胞膜嵌入が認められたが、大量の吸血と水分排泄を要する雌ダニに比して、細胞容積は余り増加しなかった。2.フタトゲチマダニ雌の吸血様式と産卵性との関りを調べた。両性生殖系(2n)の雌は雄不在の場合、吸血期間が延長されたにも拘らず大きくなれず、飽血離脱できなかった。交尾は早いものでは吸血開始後3-4日(体の容積10mm^3)で起こった。非産卵と産卵との臨界体重は28.4mgであった。単為生殖系(3n)の雌における飽血体重及び吸血期間の長さは、2nと同じであった。3.フタトゲチマダニの卵黄と卵殻形成に関して電顕的観察を行なった。本種の卵母細胞は血体腔からの卵黄前駆物質を吸収し、細胞内で卵黄を再合成すること、また卵殻は卵母細胞自身によって形成される第一次卵膜であることが明らかにされた。4.フタトゲチマダニ若虫の飽血離脱以降の期間における体重減少と排泄との関連を調べた。

前脱皮期間と脱皮後の期間における体重減少、運動性及びグアニンとヘマチンの排泄量変化から、雌雄とも前者は三つの、後者は二つの生理学的な相に分けられることを示した。また、ヘマチンの排泄パターンから、脱皮に関与した急激なヘモグロビン消化の期間を推定した。5.その他として、恒温下(30°C)におけるフタトゲチマダニの発育と成長に及ぼす湿度の影響、及び沖縄県を含む九州の野生哺乳類に寄生していたダニ相を調べた。以上の詳細については、次頁の発表論文リストを参照願いたい。1)吸血に伴って発達し始めた卵母細胞は吸血開始後4日目に卵巣表層から血体腔に突出し、卵巣上皮細胞由来の索状細胞によって支えられるようになった。卵黄形成と卵殼合成は飽血離脱日に開始された。卵黄形成期には、多数の電子密度の高い顆粒が細胞質表層に集積し、よく発達した微絨毛と活発な飲作用が形質膜に認められた。成熟した卵母細胞は索状細胞間隙を通過し卵巣腔へと排卵された。多数の精子が排卵日に卵巣腔に達し、それらの幾つかは卵巣上皮細胞の微絨毛と接し、あるいは索状細胞形質膜の嵌入部に侵入していた。排卵された卵にはもはや特徴的な大きな卵核が認められなかったので、精子は卵巣腔において卵母細胞を受精させると推察された。交尾によって雌性生殖道内に搬入された精子による受精のタイミング、受精場所及び受精のメカニズムについては目下鋭意、追究中である。2)フタトゲチマダニ若虫における宿主血液消化を飽血離脱から脱皮後5日目まで調べた。中腸に含まれる総蛋白質量は離脱から脱皮直前まで急激に減少し、その後の減少は非常に緩慢であった。中腸に含まれる蛋白質の大部分はヘモグロビンとアルブミンであり、これらの消化速度は前者で後者よりも速かった。ダニの中腸に含まれる消化酵素はin vitroの実験からアルブミンよりもへモグロビンを速く分解することが知られ、本実験において認められた消化速度の差異は、カテプシンDと思われる酵素の基質特異性に起因すると推定された。ヘモグロビン消化の残余物ヘマチンはヘモグロビンの減少につれて増加した。ヘマチンは脱皮後15日目に急激に排泄された。更に、宿主血液特にヘモグロビンは、吸血中及び飽血離脱後における生理的に異なった諸相に同調して出現する新生中腸上皮細胞により細胞内消化され、ヘマチンとして排泄されることが電顕的にも裏付けられた。
ＨＴＬＶ－１因子Ｔａｘが引き起こすエピゲノム異常の実態及び腫瘍化への影響の解明

前年度に引き続き成人T細胞白血病(ATL)におけるエピゲノム異常の包括的な解析を行った。昨年度に行ったEZH2依存的なヒストン修飾であるH3K27me3の解析に加え、本年度は転写の活性化に寄与するヒストン修飾H3K4me3のゲノムワイドな分布に注目し、正常T細胞とATL細胞の差異、H3K27me3とH3K4me3の変化について統合解析を行った。H3K4me3の変化は、H3K27me3と比べると箇所が少なく、全体はATLにおいて減少傾向であった。メチル化の統合解析の結果、正常T細胞において低H3K27me3、高H3K4me3である遺伝子領域がATLにおいて高H3K27me3、低H3K4me3となっていることがわかった。この結果は転写抑制性のH3K27me3の増加と、転写活性性のH3K4me3の減少が協調して起こることを示しており、ゲノムワイドなエピゲノムの変化が遺伝子発現を抑制する方向へと傾くことが示唆された。一方で個々の遺伝子に注目すると、H3K4me3の大幅な増加を伴う発現上昇を示す遺伝子も多数見られた。この結果から、それぞれの遺伝子領域に特有のcisに作用する制御メカニズムの重要性が示唆された。2昨年度に明らかにした、ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)感染細胞におけるH3K27me3の増加についてより詳細に検討を行った。HTLV-1感染者末梢血由来のCD4陽性T細胞を、HTLV-1感染細胞と非感染細胞に分離し、ATLにおいて異常なH3K27me3の蓄積が見られる遺伝子プロモーターのH3K27me3の蓄積レベルを比較した。その結果、HTLV-1感染細胞において非感染細胞よりも高いH3K27me3の蓄積が起こっていることが明らかとなり、ATLを発症する前のHTLV-1感染細胞においてもATL様なエピジェネティックな変化が存在することが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。成人T細胞白血病(ATL)におけるエピゲノム異常の実態の解明と、その背景にあるヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-1)の関与について解析を行った。1ChIP-on-chipを用いてEZH2依存的なエピゲノムを明らかにした。EZH2依存的なエピゲノムは、正常T細胞とATL細胞で大きく異なり、これらのメチル化の変化は遺伝子発現の変化と負に相関していることが明らかとなった。また、メチル化の変化は、転写開始点(TSS)から3000bpほど上流のプロモーター上に高頻度に起こっていることがわかった。メチル化の変化が腫瘍細胞に与える影響を解明すべくGene Ontology解析を行った結果、ATL細胞では転写制御因子が高頻度にメチル化による抑制を受けることがわかった。2HTLV-1因子Taxがエピゲノムに与える影響を網羅的に明らかにするために、Taxを健常者由来のT細胞に遺伝子導入し、EZH2阻害条件下で培養した。その結果、EZH2阻害はTaxによる不死化を抑制することが明らかとなり、EZH2依存的なエピゲノムの異常が不死化に必須である可能性が示された。Tax導入によるメチル化の変化を明らかにするため網羅的な解析を行い、上述の正常T細胞、ATL細胞の結果を比較した。その結果、Tax導入細胞のエピゲノムはATL細胞のものと類似していた。メチル化の変化は、細胞周期制御因子やアポトーシス抵抗性に関与する遺伝子に高頻度に起こっており、これらの抑制を介してTaxによる細胞の不死化に寄与していることが明らかとなった。3Taxによりエピゲノム異常が誘導されることから、HTLV-1感染細胞においてもそのような異常が存在すると仮説をたて、HTLV-1感染者の末梢血由来のHTLV-1感染細胞におけるメチル化の蓄積を調べたところ、HTLV-1感染細胞では、非感染細胞よりメチル化の亢進が見られた。HTLV-

1感染者末梢血由来のCD4陽性T細胞を、HTLV-1感染細胞と非感染細胞に分離し、ATLにおいて異常なH3K27me3の蓄積が見られる遺伝子プロモーターのH3K27me3の蓄積レベルを比較した。その結果、HTLV-1感染細胞において非感染細胞よりも高いH3K27me3の蓄積が起こっていることが明らかとなり、ATLを発症する前のHTLV-1感染細胞においてもATL様なエピジェネティックな変化が存在することが示唆された。腫瘍細胞におけるエピゲノムの解明とウイルスによる影響の解析を同時に進行させることで、1年目に計画していたエピゲノムの実態の解明と、2年目に計画していた腫瘍化への影響の解明に着手することができており、計画通りに研究を遂行できていると考えられる。当初の計画では、1年目に17-DMAG処理によるTax及びEZH2の局在への影響を解析する予定であったが、検討の結果、17-DMAG処理は今回の目的に不適であることがわかり、現在はshRNAを用いて検討を行っている。これについては2年目に引き続き検討を行う予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度までにエピゲノムの解析は完了しており、今後はこのデータを用いて分子生物学的な検討を行う。1TaxがEZH2に及ぼす影響の解析。Taxに対するshRNAを用いて、EZH2の局在に与える影響をChIP assayにより検討する。新たなレポーターを作成し、live cell imagingによりTaxがEZH2の局在に与える影響を検討する。2EZH2が生存、増殖に寄与するメカニズムの解明。昨年度までに明らかにしたEZH2依存的なエピゲノムの変化が、実際の細胞の生存、増殖に寄与するメカニズムを検討する。メチル化の増加のみならず、腫瘍細胞特異的なメチル化の減少についても注目し解析を行う。3EZH2阻害の有効性。EZH2特異的阻害薬によりHTLV-1感染細胞を特異的に減少させられるのか検討を行う。