hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多機能AAAタンパク質p97の機能解析～各ドメインの生体内機能と生化学的機能

p97は細胞内の様々な反応に関与している必須なAAA ATPaseであり,優性進行性疾患である骨パジェット病と前頭側頭葉型認知症を伴う遺伝性封入体筋炎の原因因子である。p97には2つのAAAドメインがあるが,疾患を引き起こす変異はN末端側半分に集中している。本研究では,各ドメインのATPase活性を失った変異体を作製し,その機能を調べた。その結果,C末端側のAAAドメインはp97の機能に必須であり,その活性はN末端側のAAAドメインによって調節されていることが分かった。出芽酵母Cdc48pは細胞の増殖に必須であり, C末端側のAAA ATPaseドメイン(D2)のATPase活性は必須であるが, N末端側のAAA ATPaseドメイン(D1)のATPase活性はdispensableであった。例外的に, D1ドメインにATPは結合できるが加水分解できないWalker B変異体(E315Q)を発現する酵母株は致死であった。そこで, E315Qの致死性の分子内抑圧変異体のスクリーニングを行った。その結果, D1ドメインだけでなくD2ドメイン内の変異によってもその致死性が抑圧されることがわかった。一方,線虫のCdc48pホモログのin vitroATPase活性解析の結果,野生型のD2ドメインのATPase活性は協同性を示すが, E315Qに相当する変異体は協同性を失っていることがわかった。そこで,さまざまな抑圧変異体についてATPase活性を測定したところ,解析を行った全ての変異体において協同性が回復していた。さらに,協同性の指標となるHill係数と酵母の増殖速度には,非常に高い相関性が見られた。ATPase活性自身の程度と酵母の増殖速度にはあまり相関性が見られないことから, Cdc48pの機能にはD2ドメインのATPase活性の協同性が非常に重要であることがわかった。これまで,協同的なATPase活性はいろいろなタンパク質で観察されているが,協同性が機能に必要であることを示した例はほとんどなく,当研究成果は重要な発見である。p97/Cdc48pは,AAA ATPaseドメインを2つ持つAAAファミリータンパク質である。p97ホモログは,細胞内の様々な反応に関っている多機能タンパク質であるが,今回新たに,ミトコンドリアの形態形成にも関与していることが明らかとなった。出芽酵母のCdc48pについて,N末端側のD1 AAAドメインのATPase活性は細胞の増殖に必須ではないが,C末端側のD2 AAAドメインのATPase活性は細胞の増殖に必須であり,特にその協同性が非常に重要であることを,われわれはすでに明らかにしている。そこで,D1ドメインまたはD2ドメインのATPase活性を失った変異体,またはD2ドメインの協同性を失った変異体を発現する酵母について,その細胞内構造変化を観察した。その結果,D1ドメインのATPase活性を失った変異体では,ほとんどの細胞内構造は正常であるが,cisゴルジ体の形態異常が起こることが分かった。一方,D2ドメインのATPase活性を失った変異体およびその協同性のみを失った変異体では,小胞体およびゴルジ体全体の構造異常が起こった。さらに,D2ドメインのATPase活性を失った変異体ではミトコンドリアの形態異常がやや観察されたが,D2ドメインの協同性を失った変異体ではミトコンドリアの著しい凝集が観察された。これまで,p97/Cdc48pホモログがミトコンドリアの形態や生合成に与える影響は報告されておらず,また,ATPase活性そのものよりもその協同性が特に重要であるということは非常に興味深い。現在,Cdc48pのターゲットとなっているミトコンドリアタンパク質の同定を試みており,Cdc48pによる形態制御機構を明らかにしていきたい。
ヒトゲノム構造解析ツールとしての高密度genomic DNAマイクロアレイの開発

現在の豊富なゲノム情報と資源のもとで、ヒト疾患のゲノム一次構造のhigh-throughputな検出ツールとして重要となる、高精度・高感度のゲノムDNAマイクロアレイの開発研究ならびに、これを用いたヒト疾患のゲノム一次構造解析を推進し、以下の結果を得た。1.実用レベルのゲノムDNAマイクロアレイの作製と解析技術開発これまでに収集・単離したBAC・PACなどのゲノムDNAをもとに、アダプターPCR法を利用してスポット用のDNA断片を大量に作製し、これらをスライドグラス上にインクジェット方式のスポッターによりアレイ化した実用レベルの高密度ゲノムDNAマイクロアレイの作製を引き続き進めた。これまで、(1)癌関連遺伝子を主とする800種類のクローンからなるアレイ、(2)1p36のコンティグを含む特定の染色体領域の詳細な解析を行う高密度アレイ、(3)4500種類のクローンで300Mbのヒトゲノムをカバーするゲノムワイドなコピー数の異常のスクリーニング用アレイの作製と改良(バージョンアップ)を行うとともに、これらを用いた解析技術・分析方法などの整備をおこなった。さらにX染色体専用あるいは遺伝疾患診断用など、他の用途のアレイ作製のためのクローン収集・単離などのリソース準備やゲノム情報解析などを進めた。2.実用レベルのゲノムDNAマイクロアレイの精度管理、ならびにヒト疾患におけるゲノム異常解析作製した実用レベルのゲノムDNAマイクロアレイは、実際の検体を用いた解析によりアレイの精度・分解能・定量性・再現性などの評価を行っている。さらに、ヒト癌細胞株やヒト臨床検体(癌ならびに遺伝疾患)を対象にコピー数異常の検出を行った。従来のCGH解析や試作レベルのDNAマイクロアレイでは検出できなかったホモ欠失や増幅あるいは微細なヘミ欠失や重複などを検出し、どのアレイにおいても1コピーの変化の検出が可能であることを確認するとともに、これまで知られていなかった異常を検出した領域については、個別に解析を行い病態に関連する遺伝子の同定を進めている。
高エネルギーイオン励起不安定性を介したバルクイオン加熱の実験的検討

マイクロ波によって保持された低密度プラズマに高エネルギーイオンを入射した時に励起されるトロイダルモード数がゼロの不安定性の同定を行い、それが測地線音響モード(GAM)であることを明らかにした。また、この不安定性が励起された時に観測されるイオン温度上昇現象について解析を行い、それがGAMによるプラズマイオンの加熱であると考えるのが最も確からしいという結論を得た。大型ヘリカル装置においては、トロイダルモード数がゼロである高速イオン励起不安定性が発生したときに、バルクイオンのエネルギー帯を観測する接線視線の中性粒子分析装置によって、イオン温度が上昇する現象が観測されている。H25年度の結果から、この不安定性が高速イオン励起測地線音波モード(Energetic particle driven Geodesic Acoustic Mode:EGAM)であることが示唆された。今年度は、従来行われていた磁場揺動のポロイダル方向成分(δB_θ)計測に加え、径方向成分(δB_r)の計測を実施し、そのポロイダル構造を調べた。その結果、磁場揺動のポロイダル構造には定在波的な特徴を示す節が存在し、その節の位置がδB_θ成分とδB_r成分では、約45度ずれていることが明らかとなった。理論的に予測されるGAMの磁場揺動成分のポロイダル構造と一致する。この結果から、観測されている不安定性がEGAMであることが明らかとなった。重イオンビームプローブ法(Heavy Ion Beam Probe:HIBP)で、プラズマ内部の静電ポテンシャル揺動成分を調べたところ、静電揺動はプラズマ中心部に存在し、そのポロイダル成分がゼロであることがわかった。また、イオン温度の変動が見られ場合においては、静電揺動の振幅が大き過ぎて計測範囲を逸脱し、従来は揺動強度を正確に観測することが出来なかった。そこで、HIBPのイオン源及びその電源を改良し、観測可能な状態にした。その結果、イオン温度の変動が見られる時の静電揺動強度が10kVに及ぶことが明らかとなった。また、この時のイオン温度上昇のメカニズムとして、加熱の増加或いは、閉じ込め改善に起因するものが考えられるが、パワーバランス解析を行い、これがイオン加熱の増加であることを明らかにした。本研究は、LHDにおいて高速イオンによって励起される周波数が上方(高周波側)に掃引されるトロイダルモード数のゼロの不安定性と、それの発生に伴って観測されている低エネルギーの中性粒子束の変動の振る舞いについて調べている。この不安定性は、測地線音響モード(Geodesic Acoustic Mode:GAM)であると推測されていた。しかしながら、不安定性の電子温度(Te)依存性に着目すると、通常の理論的に予測されるGAMと同質でTeの0.5乗に比例するものと、それとは異なり、電子温度には依存せず、プラズマ中を周回する高速イオンのポロイダル周回周波数と同じになるものが観測されていた。このモードは、プラズマの中心部において発生するのに対して、これまでの観測はプラズマ周辺部に配置したピックアップコイルを用いていたため、周波数が変動し、かつ揺動強度が小さい初期の周波数を正確に把握していない懸念があった。そこで、今年度はプラズマ中心部での周波数を正確に把握する為に、マイクロ波干渉計を用いた揺動計測システムを、既設計測システムを改造することで構築した。この結果、ピックアップコイルによる揺動初期の周波数計測が、きちんとプラズマ中心部の情報を反映していることがわかった。また、これと並行して高速イオン励起GAM不安定性の周波数に関する理論的な考察を進め、高速イオンのエネルギー分布関数が正の勾配を持つ場合においては、その周波数の電子温度依存性がなくなり、高速イオンのポロイダル周回周波数によって決まり得ることも明らかにした。当初予定していたとおりに、ピックアップコイルを用いたプラズマ周辺部における磁場揺動計測と、マイクロ波干渉計によるプラズマ中心部における密度揺動計測を同時に行うことに成功し、観測対象としているプラズマ揺動に対して、その周波数に差異が存在しないことを明らかにすることが出来たため。今回整備したプラズマ中心部における密度揺動計測システムと、重イオンビームプローブ(Heavy Ion Beam Probe:HIBP)計測による静電ポテンシャル及び密度揺動計測を組み合わせて、揺動の径方向分布計測を試み、その構造の解明を目指す。また、磁場揺動計測についても、これまではポロイダル方向の磁場揺動のみの計測を行っていたが、今年度より径方向の磁場揺動計測を行い、磁場揺動成分の空間構造の解明を目指す。これらの計測と、低エネルギー領域の中性粒子計測によるバルクイオン計測を併用し、本研究で対象としている不安定性が発生している際に、バルクイオンの振る舞いに注目する。不安定性励起に伴って、バルクイオンの応答がみられる時のモード構造の相関を明らかにする。本年度の研究費を次年度の研究費と組み合わせ、磁場揺動のポロイダルモード構造を明らかにする為の計測システムの増強を行う。通常は、磁場揺動のポロイダル成分(δB_θ)のみを計測していたが、次年度では、磁場揺動の径方向成分(δB_r)を計測する。LHDにおいては、ピックアップコイルそのものは既に、δB_r

成分が計測出来るようになっていたが、アナログデジタル信号変換器が不足していた為、計測されていなかった。そこで、同信号の計測が可能なようにする為に、本研究費を用いて信号変換器を購入する。また、これと並行してHIBP装置の改造を行い、計測システムの感度向上を目指す。
地方自治体における人的資源管理戦略

本稿は、自治体行政組織の内部者の視点から書かれた組織エスノグラフィーである。ケース記述は内部者による自己エスノグラフィーの形式を取っており、自治体施設プロジェクト等のケースヒストリーに関わる「分厚い記述」が試みられている。ケースの記述と分析を通して現場の公務員の行動と意識が内部者の視点から説明され、また、公務員のモチベーション向上に自己エスノグラフィーが役立ちうることが示されている。行政組織、キャリア、人的資源、組織論などに関わる文献の調査を行った。特に文化、歴史の側面に着目し、日本史、日本政治思想史、建築史、宗教史、法制史など関連する多様な分野の文献にも幅広く目を配るように努めた。方法論の面では、エスノグラフィーを中心に質的研究法に関わる文献に当たるなど、本研究の方法論的な足場を固める作業を行った。フィールド調査としては、熊本県庁職員、九州電力社員などを構成メンバーとする研究会を立ち上げ、具体的な事例データの収集に取り組んだ。この研究会では毎月1回2回の例会を実施し、SECIモデルをはじめとする組織に関わる理論の学習に取り組んだほか、各メンバーから県庁、九州電力などの事例を報告してもらい、組織における人的姿源活用方策に関わる事例データの収集・整理に努めた。さらに福岡市、神戸市、兵庫県、岡山市など地方自治体を訪問し、職員研修・組織戦略などに関するインタビュー調査を行った。この調査は、平成22年度に実施予定のアンケートの分析視角を確立するために不可欠の調査であり、今後の研究の方向性を明確化させるうえで大いに役立った。平成22年3月20日には熊本県立大学においてシンポジウムを開催し、神戸大学大学院経営学研究科の加護野忠男教授をお招きし、「日本的経営の精神」をテーマに講演をしていただくとともに、県庁職員、地元企業関係者などをパネリストとするパネルディスカッションを実施した。日本の経営学研究をリードする研究者の一人である加護野教授の講演とそれに引き続くパネルディスカッションは200名を越える参加者を集め、成功裏に終了した。とかく自信を失いがちな現代日本にあって、日本的経営の精神を取り戻すことに組織活性化のための大きなヒントがあることを示したこのシンポジウムには大きな意義があったと考えている。昨年度に引き続さ、モチベーション、組織社会化などに関わる先行研究の読み込みと分析を行い、理論的な整理を行った。特に自治体職員の倫理観の形成や社会化の過程で、文化が重要な役割を果たしていることに鑑みて文化に関わる文献を幅広く渉猟した。また、神戸大学大学院の加護野忠男教授からは貴重なアドバイスをいただいた。この研究を通して、公務員の行動特性やパーソナリティについて、いくつかの仮説を発見した。合規性の尊重や慣例重視という自治体職員の行動特性は文字通り組織社会化のプロセスの中で形作られていることが明らかとなった。また、自治体の担当部局への聞き取り調査を行い、人材育成の体制や基本的な考え方の特徴を抽出する作業を行った。岡山県、香川県では、職員研修所の機能が縮小され、職員研修の相当部分がアウトソーシングされている状況が判明した。福岡県でも同様の傾向があり、都道府県レベルの人的資源管理の一つの傾向を捉えることができた。これに対して、市役所レベルでは、職員研修所などが直接研修などの企画に当たる体制をとっているところが多く、平成23年度には各自治体に対するアンケートを行うなどしながら、全国的な傾向を把握したい。研究成果の発表については、自治体職員向けの実践的な研修プログラムの試行を兼ねて熊本県下自治体の職員(34名)を対象に熊本県立大学CPD(Continuing Professional Development)講座を開講した。自治体現場の職員のニーズに応えることのできる研修カリキュラムとして、ワークショップ、シミュレーション・ゲームなどの参加体験型のプログラムを用意するとともに、関係教員の協力を得ながらマーケティング、企業戦略など組織経営に関わるプログラムも組み入れた。受講者からの評価は非常に高かった。この成果をもとに時代に即応できる自治体職員研修のモデル構築に取り組んでいきたい。昨年度から進めてきた先行研究のレビューを続行し、これまでの調査から導出した仮説を先行研究の理論に照らしながら彫琢した。併せて地方自治体{企業などを対象とするフィールド調査を継続し、データ内容の充実に努めた。これまでの先行研究レビューや収集したデータなどを総合し、事例データの整理を行いながら、研究方法論としてのエスノグラフィーについても考察を加えた。とくに平成23年度は、3ヵ年度にわたる研究の最終年次に当たるので、研究の進捗状況を検討し、研究の終結に向けて研究成果報告書の作成に注力した。平成24年2月10日には熊本県立大学において、関西大学政策創造学部の橋本行史教授を交えて自治体職員の人的資源管理に関する研究会を実施したほか、同年3月27日には、関西大学法学研究所において開催された地域主権研究会に参加し、研究方法としてのエスノグラフィーの理論と実際について報告を行った。また、熊本県市町村研修協議会が実施した研修の講師及び熊本市の地域振興担当職員向け研修などの講師を担当し、研修プログラムの実証試験を行った。これらの研修では、参加者の参画意識を高めることを目指したワークショップ手法を実際に用い自治体職員研修プログラムとしての可能性と課題を探った。

さらに昨年度から試行的に取り組んできた自治体職員向けCPD(Continuing Professional Development)講座を23年度も開講し、「協働のまちづくり」の現場で働く自治体職員を主な対象として実践的プログラムを実際に動かしてみた。この結果、ワールドカフェやクロスロードなどのワークショップ技法の有効性が改めて明らかとなり、標準的な自治体職員向けの実践研修プログラムのプロトタイプの策定に役立てることができた。そして、これまでの3ヵ年に及ぶ研究を振り返り、研究から得られた知見や含意を整理しながら研究成果報告書を完成させた。
製錬工場周辺環境中でのアンチモンの動態解析と汚染対策に関する研究

本研究によって得られた主な結論を以下に要約する。(1)アンチモン製錬工場周辺で種々の環境試料を採取し、アンチモン濃度を分析した。その結果、製錬工場周辺のアンチモン濃度は土壌、大気、地下水のいずれもが対照地域の濃度を上回っており、土壌については工場からの方角・距離によって大きく濃度が異なること、土壌から作物へのアンチモンの移行は少ないが、大気からの沈着影響が大きいと推定されること、大気については時間的な濃度変化がかなり大きく、雨の日は製錬工場からの粉塵の到達距離が小さいこと、地下水中アンチモン濃度は環境水質基準の指針値を上回ること、等を明らかにした。(2)製錬工場周辺住民のアンチモン曝露シナリオを4通り設定し、アンチモンの体内代謝モデルに各シナリオに基づく経口・吸入摂取量を代入し、製錬工場周辺住民の各臓器・組織中アンチモン濃度を数値シミュレーションした。その結果、製錬工場周辺住民の肺中濃度がシナリオによっては肺がん等の健康影響が発現しうる濃度にまで高められることを指摘した。その他の臓器中濃度についても疫学データ等と比較し、シナリオによっては健康リスクが高くなる可能性を示した。(3)土壌中でのアンチモンの移動性は、その酸化数により大きな違いが生じることは無いことを示した。(4)アンチモンは溶液中の共存イオンの影響によって容易にその存在形態が変化する。そのため、溶液中でのアンチモンの物理化学的存在形態を適切に把握するためには、アンチモンがどのような液性の溶液中で定性的・定量的に安定して存在するのかを直接的に確認する必要があることを指摘した。(5)様々なカルシウム化合物を用いて土壌からのアンチモンの溶出試験を行い、高pH域において水酸化カルシウムが土壌からのアンチモンの溶出を抑制していることを指摘した。本年度に得られた結果ならびに結論を以下に要約する。(1)アンチモン製錬工場周辺で各環境試料を採取し測定した結果、製錬工場周辺からの距離が近づくほど土壌中アンチモン濃度が高くなる傾向がみられた。土壌から作物へのアンチモンの移行は少ないが、大気からの沈着影響が大きいと推定され、作物種別ではより大気に曝されている葉菜、実菜、根菜の順に作物中アンチモン濃度が高く検出された。環境水中アンチモン濃度については、地下水では環境水質基準の7.5倍もの濃度が検出され、飲用には適さないといえる。地下水中のアンチモンの浸入機序については、今後さらに検討を加える必要がある。大気中アンチモン濃度については、屋外では製錬工場からの距離が50[m]地点と100[m]地点において比較的高い濃度を記録した。(2)(1)の測定結果より、製錬工場周辺住民の1日あたりのアンチモンの経口摂取量および大気からの吸入摂取量を推算した。その結果、製錬工場周辺住民のアンチモンの摂取量は決して低くはなく、場合によっては許容摂取量を超えることもありうることがわかった。(3)アンチモンの健康リスクに関する決定臓器といわれる心臓および肝臓への移行を考慮した、体内代謝を記述する数学モデルを構築した。パラメータ値の設定には、一般人の平均的組織中濃度を用いてパラメータフィッティングを行った。構築した代謝モデルを用いて製錬工場周辺住民のアンチモンによる健康リスクを評価したところ、製錬としての操業を停止してから16年を経た現在においても、周辺住民の健康リスクは無視することのできないレベルであるといえる。また、特に子供の偶発的な土壌摂取による健康リスクは高く、アンチモン濃度の高い土壌を摂取した場合には、大人が許容限界量を摂取した場合の各組織中濃度の計算値を超える可能性が高い。子供の方が大人よりもアンチモンに対する感受性が高ければ、子供の健康リスクはさらに高くなる可能性がある。本研究で得られた主要な結論を以下に要約する。

(1)アンチモン製錬工場周辺で種々の環境試料を採取し、過去の測定データと併せて解析した結果、土壌については工場からの方角によって大きく濃度が異なること、大気については時間的な濃度変化がかなり大きく、雨の日は製錬工場からの粉塵の到達距離が小さいこと、地下水中濃度については環境水質基準の指針値を上回る濃度のアンチモンが検出され、また試料採取の際の鉄サビにアンチモンが吸着する可能性を示唆した。(2)製錬工場周辺住民のアンチモン曝露シナリオを4通り設定し、アンチモンの体内代謝モデルに各シナリオに基づく経口・吸入摂取量を代入して製錬工場周辺住民の各臓器・組織中アンチモン濃度を数値シミュレーションした。その結果、製錬工場周辺住民の肺中濃度がシナリオによっては肺がん等の健康影響が発現しうる濃度にまで高められることを指摘した。(4)物理的・化合的存在形態の検討を行い、土壌溶液中でのアンチモンは、三酸化アンチモンを親化合物とするイオン叉は化合物として存在している可能性が高いことが分かった。(5)水酸化カルシウム・水酸化ナトリウムを添加したアンチモンの溶出実験、ポリ塩化アルミニウム・硫酸アルミニウム・塩化第二鉄を凝集剤とした凝集実験を行った結果、アンチモンによる土壌汚染の浄化法として、表層土壌に水酸化カルシウムを付加することがもっとも有効であることが分かった。しかしこの方法を採用する際には土壌pH上昇による作物への影響、環境水への影響を十分に考慮しなければならない。(6)現在技術的に選択可能な土壌の修復法と、それを製錬工場周辺に適用する場合のメリット・デメリットについて検討し、その結果、現在一般的に用いられている処理技術を製錬工場周辺土壌に安全に適用することは、現時点ではまだクリアすべきいくつかの問題があることを指摘した。本年度の研究によって得られた主な結論を以下に要約する。(1)製錬工場周辺土壌を用いた1ヶ月以上に渡る連続実験より、溶出実験を重ねるほど新たに土壌からアンチモンが溶出し、土壌溶出液中アンチモン濃度は環境基準における(旧)指針値よりも高い値であることを示した。また、製錬工場周辺土壌からのアンチモンの溶出挙動は溶出液pHに依存しており、酸性溶液においてもアルカリ性溶液と同程度の濃度でアンチモンが溶出することを示した。(2)Sb(III)はSb(VI)に比べて10倍程度生体毒性が強いと考えられている。製錬工場周辺における土壌溶出液中では、アンチモンは溶出液pHによらず主に五価として存在していることを明らかにした。また、地下水中でもアンチモンは五価として存在していることを明らかにした。(3)土壌中でのアンチモンの移動性は、その酸化数により大きな違いが生じることは無いことを示した。(4)60%濃塩酸もしくは王水を用いた湿式分解-ICP-MS法により、アンチモンによる土壌汚染の程度を簡便かつ迅速に評価できることを示した。(5)アンチモンは溶液中の共存イオンの影響によって容易にその存在形態が変化する。そのため、溶液中でのアンチモンの物理化学的存在形態を適切に把握するためには、アンチモンがどのような液性の溶液中で定性的・定量的に安定して存在するのかを直接的に確認する必要があることを指摘した。
酵素トランジスタに関する基礎研究

酵素トランジスタは,エフェクターによりその活性が制御される酵素の機能をモデルにした素子である.電気化学的手法に基づく酵素トランジスタは,エフェクター分子を検出する「ディテクタ」部とその結果に応じてある特定の酵素の活性を制御する「モジュレータ」部により構成される.1.モジュレータ電極を電気化学的に実現した.具体的な酵素反応系としては,グルコースデヒドロゲナーゼ(酵素)とNAD(補酵素),ヒドロキノン(電子の授受を媒介するメディエータ)の系を用い,これを白金電極反応とカップルさせることにより,酵素活性の電気的制御系を実現した.本システムは,分子情報担体としてグルコース(基質)を想定した場合のモジュレータ電極として機能することが実験的に確認された.すなわち,白金電極に与える電位によって電子伝達効率が変調され,等価的にグルコースデヒドロゲナーゼ酵素反応全体の速度が変動することが確認された.ディテクタ電極として,グルコースオキシターゼ酵素電極を用い,溶液中のグルコース濃度をモニターしたところ,白金電極電位によるグルコース濃度の変調が観測された.これにより,原理的には酵素トランジスタの機能が実現可能であることが判明した.2.前年度までに,均一系(溶液中の濃度分布に偏りのない系)で動作する酵素トランジスタ回路の解析および設計手法が確立されたが,この結果をもとに拡散過程を含む不均一な反応拡散場における酵素トランジスタのシミュレーション実験を行った.その結果,基質濃度の時空間パターンの形成・発展などの興味深い現象が発見され,これによる新しい信号処理の可能性が見いだされた.今後,酵素トランジスタによる反応拡散コンピューティングに関する新しい研究の展開が期待できる見通しを得た.酵素トランジスタは,エフェクターにより活性が制御される酵素をモデルにした素子である.平成8年度は,均一な溶液中において動作する酵素トランジスタ回路の系統的な解析法および設計法のついて検討した.1.均一系における酵素トランジスタ回路の動作解析プログラムを作成した.一般に,酵素反応はいくつかの酵素基質複合体を経由する多段階反応として記述される.このため,微分方程式を直接的に解いて動作シミュレーションを行った場合,解析できる回路規模が著しく限定されることが判明した.これを解決するために,酵素トランジスタの動作を1段階反応で近似することの妥当性について検討を行った.この結果,酵素トランジスタの動作がほぼ定常状態に近い状況においては,十分な精度での近似が可能であることを明らかにした.2.酵素トランジスタ回路の微小信号解析の手法を確立した.通常の電子回路の設計における微小信号解析と同様の手法に基づいて,酵素トランジスタ回路についても,ある一定濃度の動作点近傍で線形近似を行うことにより,微小な濃度信号を処理する各種分子回路の解析が可能であることを明らかにした.3.上記の解析・シミュレーション法に基づいて,種々の酵素トランジスタ回路を設計し,その動作を確認した.設計した酵素トランジスタ回路は,基質定フラックス型増幅回路,基質定濃度型増幅回路などのアナログ信号処理回路ならびにNOT回路,NOR回路,RSフリップフロップ回路などのディジタル回路であり,正しい動作をシミュレーションにより確認した.また,アナログ信号処理回路に関しては,微小信号等価回路によるゲインの解析結果とシミュレーションの結果が一致することを確認し,開発した設計手法の妥当性を示した.酵素トランジスタは,エフェクターによりその活性が制御される酵素の機能をモデルにした素子である.電気化学的手法に基づく酵素トランジスタは,エフェクター分子を検出する「ディテクタ」部とその結果に応じてある特定の酵素の活性を制御する「モジュレータ」部により構成される.1.モジュレータ電極を電気化学的に実現した.具体的な酵素反応系としては,グルコースデヒドロゲナーゼ(酵素)とNAD(補酵素),ヒドロキノン(電子の授受を媒介するメディエータ)の系を用い,これを白金電極反応とカップルさせることにより,酵素活性の電気的制御系を実現した.本システムは,分子情報担体としてグルコース(基質)を想定した場合のモジュレータ電極として機能することが実験的に確認された.すなわち,白金電極に与える電位によって電子伝達効率が変調され,等価的にグルコースデヒドロゲナーゼ酵素反応全体の速度が変動することが確認された.ディテクタ電極として,グルコースオキシターゼ酵素電極を用い,溶液中のグルコース濃度をモニターしたところ,白金電極電位によるグルコース濃度の変調が観測された.これにより,原理的には酵素トランジスタの機能が実現可能であることが判明した.2.前年度までに,均一系(溶液中の濃度分布に偏りのない系)で動作する酵素トランジスタ回路の解析および設計手法が確立されたが,この結果をもとに拡散過程を含む不均一な反応拡散場における酵素トランジスタのシミュレーション実験を行った.その結果,基質濃度の時空間パターンの形成・発展などの興味深い現象が発見され,これによる新しい信号処理の可能性が見いだされた.今後,酵素トランジスタによる反応拡散コンピューティングに関する新しい研究の展開が期待できる見通しを得た.
エチレンオキシド、プロピレンオキシドの生体影響解明の為の疫学調査研究

文化財等の病害虫防除に用いられるくん蒸であるプロピレンオキシド、エチレンオキシドの生物学的モニタリング手法の確立のために、尿中代謝物であるプロピレングリコールおよびエチレングリコールのヘッドスペース付きGC-MSを用いた分析方法を確立した。更に、ラットを用いてプロピレンオキシドの経口投与曝露実験を行い、尿中プロピレングリコールの濃度変化を測定するとともに、人のプロピレンオキシドに対する生物学的曝露指標を推定した。本研究は臭化メチルの代替剤としてくん蒸作業において使用されているプロピレンオキシド(PO),エチレンオキシド(EO)の生物学的モニタリング方法を確立するために下記4項目を2年間の研究期間内に実施する.1.動物実験による代謝経路と曝露指標の確立と,ヒトのPOに対する生物学的曝露指標を推定2. POの代謝産物であるポリエチレングリコールの簡便かつ十分な感度を持つ分析方法の確立3. EOの代謝産物について,適切な生物学的曝露指標とそれらの分析方法の確立4. EO曝露作業者の曝露濃度と尿中代謝産物濃度の調査平成20年度は研究項目2及び3に係るPO,EOの代謝産物の測定方法について検討を行い,また,研究項目1の実験準備を実施した.PO,EOの加水分解による尿中代謝産物ポリエチレングリコール,エチレングリコールについて,n-ブチルボロン酸およびペンタフルオロボロン酸を用いた誘導体化によるGC-MS分析を検討し,なお検討中である.また,POのグルタチオン抱合による主たる尿中代謝産物N-アセチル-S-2-(ヒドロキシプロピル)システインについてはメチル化およびトリメチルシリル化により50300mg/Lの範囲でGC-MS分析が可能であり,EOのグルタチオン抱合による主たる尿中代謝産物N-アセチル-S-2-(ヒドロキシエチル)システインについて同様の分析方法を検討し,なお検討中である.実験項目1については,実施のための曝露環境の作成等の準備を行った.本研究は臭化メチルの代替剤としてくん蒸作業において使用されているプロピレンオキシド(PO),エチレンオキシド(EO)の生物学的モニタリング方法を確立するために、下記4項目を2年間の研究期間内に実施する。1.動物実験による代謝経路と曝露指標の確立と、ヒトのPOに対する生物学的曝露指標を推定2.POの代謝産物であるポリエチレングリコールの簡便かつ十分な感度を持つ分析方法の確立3.EOの代謝産物について、適切な生物学的曝露指標とそれらの分析方法の確立4.EO曝露作業者の曝露濃度と尿中代謝産物濃度の調査平成21年度は上記13を実施し、4についてはEO取扱作業者との調整が付かず実施する事ができなかった。動物実験については、Fisher344ラットを用いてプロピレンオキシド溶液を用いた腹腔内投与実験を実施し、投与後7日間の尿中代謝産物を測定し、半減期を求めた。POの代謝物である尿中プロピレングリコールと、EOの代謝物である尿中プロピレングリコールについて、n-ブチルボロン酸アセトン溶液を用いてブチル化しヘッドスペースサンプラー付きガスクロマトグラフ質量分析計で分析をすることにより、簡便かつ高感度の分析方法を確立した。
細胞モデルを利用した自閉症の病態生理解明

自閉症は社会性の異常を呈する精神疾患であり、その発症機序の解明が期待されている。自閉症は、精神疾患の中では遺伝的関与が高い疾患として知られている。近年ヒトの遺伝的多形として、遺伝子コピー数多形(copy number variation: CNV)と呼ばれる新たな多形が発見された。我々はCNVを対象とした染色体の改変を行い、自閉症に関連するCNVについて網羅的ES細胞モデルを構築した。本研究では、その中で自閉症の発症機序に関与している可能性が高い株を選び表現型を解析する。次に、その染色体改変ES細胞から染色体改変マウスを作製、詳細な解析を行い、新しい自閉症発症機構の解明を試みる。
質量分析による血清ビタミンD代謝の包括的評価

ビタミンDは骨代謝や免疫調節に関連した様々な作用を持ち、その不足は乳幼児の骨疾患だけでなく、成人の免疫性疾患、悪性腫瘍などのリスクとも関連するため、代謝物を含めた精確な定量が必要である。ビタミンD代謝物は分子構造によってその生物学的活性が大きく異なり、代謝動態の正確な評価には精密定量法の構築が不可欠である。本研究ではビタミンD代謝物の精確な定量の為に、LC/MS/MSによる高精度ビタミンD代謝物分析法を構築することを目的とする。加えて、ビタミンD代謝や生物学的活性にはビタミンD結合蛋白質、ビタミンD受容体、各種水酸化酵素などの遺伝子多型も密接に関与している為、これらビタミンD代謝関連遺伝子の遺伝子多型解析を含めた包括的なビタミンD代謝動態の把握を目指す。本年度は、ビタミンD代謝関連遺伝子の多型についてデータベースを用いて検索を行い、最初にビタミンD結合蛋白質(GC)の遺伝子多型解析を行った。GC遺伝子には近接した2つの一塩基多型(rs7041およびrs4588)の組み合わせにより3つの遺伝子型(GC*1F, GC*1S, GC*2)が存在する。それらを同時にタイピングする為、融解曲線分析を用いたhigh-throughput genotypingの構築を目指した。通常のDNAを用いたプローブを設計したが、GC*1SとGC*2の分離が悪かった為、分離能を改善することを検討した。架橋化核酸(LNA)はPerfect matchとmismatchのTm値の差を上昇させ結果的にミスマッチ分離能を改善することが知られている。今回我々もプローブ中にLNAを導入することで、GC*1SとGC*2の分離を改善することに成功した。これらの結果について、英文誌(査読あり)に発表した(Clin Chim Acta. 2018; 487: 126-132)。今年度の計画通り、融解曲線分析を用いたGC遺伝子のhigh-throughput genotyping法を構築することができた。最終年度は、GC遺伝子型と各種ビタミンD代謝物の血清濃度の関係、PTHとの関連などを解析していく予定である。これまでに構築してきた、LC/MS/MSによるビタミンD代謝物の分析法やGC遺伝子のhigh-throughput genotyping法を用いて多数の検体を分析していく。得られた結果を総合的に解析しビタミンD代謝物の包括的な理解を目指す。本年度は、血清・血漿中の活性型ビタミンD[1α,25-dihydroxyvitamin D; 1,25(OH)2D]を定量するため、LC/MS/MSによる分析法の構築およびバリデーションを行なった。検体前処理法にimmunoextractionを用いることで、濃度の非常に低い1,25(OH)2Dを効果的に濃縮することができた。構築した方法について、採血管の違い、溶血・乳び・リウマチ因子、保存温度といった解析に影響を与える要因について検証を行ない、いずれも1,25(OH)2D分析には影響を与えないということを確認した。また、1,25(OH)2Dは従来法であるRIAではLC/MS/MSに比べて高値傾向を示し、抗体のみによる検出では交差反応によりその他のビタミンD代謝物を測り混んでいる可能性が示唆された。これらの結果について、英文誌(査読あり)に発表した(Clin Chim Acta. 2017; 473: 173-179)。今年度の計画通り、LC/MS/MSによる1,25(OH)2Dの分析法を構築することができた。現在、次年度の計画である、ビタミンD代謝関連遺伝子の多型についてデータベースを用いて検索を行い、最初にビタミンD結合蛋白質(GC)の遺伝子多型解析を行っていく予定である。

GC遺伝子には近接した2つの一塩基多型(rs7041およびrs4588)の組み合わせにより3つの遺伝子型(GC*1F, GC*1S, GC*2)が存在する。それらを同時にタイピングする為、融解曲線分析を用いたhigh-throughput genotypingの構築を目指した。通常のDNAを用いたプローブを設計したが、GC*1SとGC*2の分離が悪かった為、分離能を改善することを検討した。架橋化核酸(LNA)はPerfect matchとmismatchのTm値の差を上昇させ結果的にミスマッチ分離能を改善することが知られている。今回我々もプローブ中にLNAを導入することで、GC*1SとGC*2の分離を改善することに成功した。これらの結果について、英文誌(査読あり)に発表した(Clin Chim Acta. 2018; 487: 126-132)。今年度の計画通り、融解曲線分析を用いたGC遺伝子のhigh-throughput genotyping法を構築することができた。最終年度は、GC遺伝子型と各種ビタミンD代謝物の血清濃度の関係、PTHとの関連などを解析していく予定である。ビタミンD代謝関連遺伝子の多型解析方法の構築を行う。ビタミンD結合蛋白質(GC)には近接した箇所に2つの遺伝子多型が存在する。それらを同時にタイピングする為、融解曲線分析を用いたhigh-throughput genotypingの構築を検討している。これまでに構築してきた、LC/MS/MSによるビタミンD代謝物の分析法やGC遺伝子のhigh-throughput genotyping法を用いて多数の検体を分析していく。得られた結果を総合的に解析しビタミンD代謝物の包括的な理解を目指す。
制度改革の政治経済学的研究

1.制度改革の政治経済学理論に関する文献調査を行い、関連単行書、論文の収集・検討を行った。2.社会経済構造の変化と制度改革に関する文献調査を行い、関連単行書、論文の収集・検討を行った。3.制度の創設に関するゲ-ム論のモデルの検討から、制度改革に関するモデルを次の点で拡張した。(1)囚人のジレンマゲ-ムだけでなく、チキン・ゲ-ム、調整ゲ-ムによる制度改革モデルの提出(2)不確実性を考慮した制度改革実現条件の検討(3)行動主体の構成を変化させることによるモデルの変型4.制度改革の傾向とその成否に影響をあたえる諸条件を次の側面から検討した。(1)制度の成熟にともなう安定要因と不安定要因(2)社会経済構造諸条件の変化のゲ-ム論への取り込み(3)政治的意思決定に参加する主体の構成の差異5.立憲的政治経済学の主張する全員一致モデルによる立憲的改革の議論と実証的公共選択論の主張するレント・シ-キング・モデルの接合点を検討した。6.日本とアメリカの政治制度のちがいに注目して、行われる制度改革がそれぞれにどのようなちがいをもたらすかを検討した。3.制度改革が行われる諸条件を、公共選択理論から検討し、制度改革の当事者の観点から、選択可能集合の拡大・縮小、選択対象の生起する確率分布の変化、当事者自身の選好変化等に分類し、立憲的政治経済学、ゲ-ム理論との接合を行った。4.社会経済構造の変化と政治的支持の変化の関連について以下の点を中心に検討した。(1)社会経済構造をあらわす諸要因の数量化(2)政治的支持をあらわす諸要因の数量化(3)上記両要因の関連の計量的な推定と、両要因のマクロ的な関連のモデルを試みた。5.行政改革、金融自由化、税制改革などの制度改革のケ-ス・スタディ-に加えて、外国の主体が国内政策に影響をあたえるケ-スを検討するために日米構造協議、地球温暖化対策をとりあげ、社会経済的要因の関連、特定の利害関係にある集団の範囲、政治的意思決定にかかわる主体の範囲等の特定化を試みた。1.生度改革の政治経済学理論に関する文献調査を行い、関連単行書、論文の収集・検討を行った。(1)囚人のジレンマゲ-ムだけでなく、チキン・ゲ-ム、調整ゲ-ムによる制度改革モデルの提出(2)不格実性を考慮した制度改革実現条件の検討(3)行動主体の構成を変化させることによるモデルの変型4.制度改革の傾向とその成否に影響をあたえる諸条件を次の側面から検討した。
肌素材直接検出による人感センサの研究開発

現在までに照明条件に影響を受けるという欠点を回避するために人の目には感じない近赤外光を照射し利用する方法が提案されシステムが作られてきた。しかしながら近赤外では肌色を用いた人物検出ができないため、色を用いるという利点が生かせず膨大な計算時間を必要としてきた。そこで本研究では、「肌色」の代りに「素材としての肌」を複数の近赤外光を用いて直接抽出するシステムを実現するため、近赤外発光源IR-LEDと近赤外領域をセンシングするCCDカメラの組み合わせによって人の肌を高速で検出する人感センサの開発を行った。現在までに照明条件に影響を受けるという欠点を回避するために人の目には感じない近赤外光を照射利用する方法が提案されシステムが作られてきた。しかしながら近赤外では肌色を用いた人物検出ができないため、色を用いるという利点が生かせず膨大な計算時間を必要であった。そこで本研究では、「肌色」の代りに「素材としての肌」を複数の近赤外光を用いて直接抽出するシステムの開発を行っている。本研究では、セキュリティ性向上のために近赤外発光源IR-LEDと近赤外領域をセンシングするCCDカメラの組み合わせによって人の肌を高速で検出する人感センサの開発を行っている。肌色ではなく肌の素材が異なる近赤外周波数で特徴ある反射特性を示すことに注目することによって、素材としての肌を直接抽出することが可能となる。本研究では、これら研究してきた基礎技術を基にリアルタイムで動くシステムの研究開発を進めている。ハードウェア的にはシンプルな構成が可能となり、高いセキュリティ性を保ちながら高速な検出システムが実現できる。さらに、開発されたシステムを実際の場面において評価し、個々の適用場面を想定した実験によりその有効性、およびアルゴリズムの改良など、より安定した肌判別手法の確立を目指す。また、最終目標として、本システムの1ボード化を目指す。これにより、更なる利用範囲の拡大を模索し、セキュリティ技術の向上のみならず、ロボットとの共存など人間センシングの応用分野に利用範囲を広げることを目標としている。そこで本研究では、「肌色」の代りに「素材としての肌」を複数の近赤外光を用いて直接抽出するシステムの実現を目指し、近赤外発光源IR-LEDと近赤外領域をセンシングするCCDカメラの組み合わせによって人の肌を高速で検出する人感センサの開発を行った。本システムは、肌色ではなく肌の素材が異なる近赤外周波数で特徴ある反射特性を示すことに注目することによって、素材としての肌を直接抽出することが可能である。本研究では、研究成果により実現されたアルゴリズムによりリアルタイムで動くシステムを開発した。PC上で構築された基礎原理に基づき、FPGAによる小型人感センサの開発を行った。本ハードウェアはシンプルな構成で、高いセキュリティ性を保ちながら高速な検出システムが実現できる。近赤外光照射装置内には複数の近赤外LED(IR-LED)を設置し、なめらかな光を出すために拡散フィルタを装着した、またカメラには近赤外光のみを透過する近赤外透過フィルタ(IR-Pass-Filter)を取り付けることにより安定した光源環境での画像が取得できることを確認した。
生命保険契約における遺伝子情報をめぐる諸問題

遺伝子情報と生命保険契約に関しては、世界各国の法状況を調査した結果、原則的に、保険会社が遺伝子情報を保険引受に際して要件としたり、既知の遺伝子情報の開示を求めることは否定的に解されている。制定法をもって禁じている例も多いが、国によっては既知の遺伝子結果の利用を将来の検討に委ねている例もある。いずれにせよ、法理論的には、遺伝子情報を生命保険契約の締結に際して保険者は利用できるか、つまり、遺伝子検査を要求できるか、また、保険契約者に既知の自己の遺伝子情報を告知することを要するかが最重要となる。その際に決め手となるのは、遺伝子情報の有する当該個々人への影響である。遺伝子情報は、個々人の生命設計図としてプライヴァシーに関わる。従来、プライヴァシーの保護としては、自己の情報を他人に利用されないことに力点が置かれたが、遺伝子情報においては、自身がこれを知らないでいる権利を人格権(一身専属権)として保護されることが重要となる。これが、情報上の自己決定権であって、個人の尊厳として憲法上保障されるべきものである。これは、幸福追求権としての憲法13条、私法上も民法1条の2にその根拠を求めることができる。さらに、保険制度の目的、差別化の面も考慮に入れると、保険契約締結に際して、遺伝子検査を要求することは認められないといえる。他方、保険契約者側の逆選択の問題については、当面は、特別事由に基づく特別解約権の活用に委ねるのが妥当と考えられる。制定法をもって禁じている例もみられるが、イギリスではイギリス保険協会の実務規約でもって対処している。そして、保健省との合意で、2001年11月1日から一定額以下の生命保険につき5年間、保険者による遺伝子検査結果の利用を停止している。このような取り扱いは興味を惹くが、いずれにせよ、法理論的には、遺伝子情報を生命保険契約の締結に際して保険者は利用できるか、つまり、遺伝子検査を要求できるか、また、保険契約者に既知の自己の遺伝子情報を告知することを要するかが最重要となる。既に、2000年6月の「ヒトゲノム研究に関する基本原則について」第14は知らないでいる権利を明定しているし、私法上も民法1条の2にその根拠を求めることができる。他方、保険契約者側の逆選択の問題が生じる。この点、既知の遺伝子情報の開示をどのような場合に認めるべきか、それとも、一切否定すべきかについては、さらに、私企業としての保険制度の目的も視野に入れる必要がある。遺伝子情報は科学的にはデータといえるが、そのデータ操作又はその内容開示によって、当該個人の情報上の自己決定権が大きく侵害される。ことに、従来のプライバシー侵害からの保護という側面のみではな<、自身についての情報を知らないでいることが重要となる。これを「知らないでいる権利」として、一般的人格権として法認する必要は非常に大きい。この点は、ドイツ基本法1条、2条の研究によって、わが国でも幸福追求権として根拠づけることができる。なによりも、そこには人間の尊厳の発露があるといえる。

この理論を生命保険契約に展開すると、生命保険は経済的リスクを分散するものであるから、危険選択として遺伝子情報による差別化を回避することが重要となる。従来の危険選択としての健康状態、家族の病歴の告知という質問事項とは質的に異なり、遺伝子情報は当該人のみならずその構成家族の青写真でもあることから、告知義務として遺伝子分析を求めることは比較法的にも否定されており、妥当といえる。これを認めることは保険制度自体の基本構造を変えてしまうといえる。既に自己の遺伝子情報を得ている者が積極的に開示するか、または、既得の遺伝子情報を保険者へ告知・通知する義務を定めることについては、逆選択の関係で問題となる。遺伝子情報に関する権利は一身専属性を有するとはいえ、その情報開示の影響は広範囲に及ぶから、人間であることの利益及び幸福は、社会又は学問の利益に優先すると解すべきであり、基本的に消極に解される。国によっては、一定額以上の保険金額については既知の遺伝子情報の開示要求を肯定している。この解決策を採用するとなると、生命保険の定額保険性を再検射する必要があり、定額保険であっても社会通念上合理的を解される限度が存することになり、モラル・リスク理論と関連し、その一環としてさらに考察する必要があることになる。
カイコにおける人工飼料中のタンパク質成分の消化吸収特性

カイコにおける人工飼料中のタンパク質成分の消化吸収の最終段階で、中腸組織の膜結合型アミノぺプチダーゼが機能していることを明らかにする目的で、1)中腸組織における本酵素の部位別局在性、2)本酵素の精製方法を検討し、3)オカラタンパク質含量を異にする人工飼料を与えたカイコの本酵素の活性をカイコの発育経過を追って測定した。その結果、1)酵素の部位別局在性については、カイコの中腸組織は形態学的に前、中、後部の3つに区分できる。活性は前部と中部が同等であるのに対して後部は約3倍の活性を示した。このことは、中腸組織の内腔で消化液中のプロテアーゼの働きで人工飼料中のタンパク質が消化されて産生されたペプチドを中腸後部で分解する能力が高いことを示すものであり、中腸後部がタンパク質の消化産物の吸収に寄与していることを示唆する。2)本酵素の精製方法を確立した。中腸組織の膜からの可溶化はフォスファチジルイノシトール特異的フォスフォリパーゼCを用いる酵素的可溶化法を用いた。可溶化酵素を酸沈殿処理した後、イオン交換、金属キレート、ゲルろ過のカラムにかけて電気泳動的に単一のタンパク質を得た。3)オカラタンパク質含量を6.4%と13.2%になるように調製した人工飼料で飼育したカイコの5齢幼虫の中腸組織の酵素活性はほぼ同様の水準と活性消長を示した。発育の進行につれて活性は上昇し、5齢8日に極大に達した後、減少に転じ、5齢12日に吐糸開始となった。オカラタンパク質を全く含まない飼料で飼育したカイコの酵素活性は、はるかに低い水準で推移し、5齢12日でも吐糸開始とならず、更にすべての幼虫は幼虫態で死亡した。以上の結果は、本研究で用いた人工飼料のうち、オカラタンパク質はカイコの飼育にとって必須タンパク質素材であること、また中腸組織の膜結合型アミノペプチダーゼは飼料タンパク質によって誘導されることを示す。1カイコの5齢幼虫の中腸組織に局在するアミノペプチターゼ、以下酵素という、の組織内局在性を組織を磨砕した後、段階的分画遠心を行って酵素活性の各画分への分布を調査したところ、ほとんど全ての酵素が沈殿画分に回収され、本酵素は膜結合型であることを明らかにした。2酵素の膜からの可溶化にフォスファチジルイノシトール特異的フォスフォリパーゼ(PIPLC)処理が有効であることを明らかにした。3可溶化された酵素は大別して2種類の酵素から成り立つこと、つまり酵素の溶出に要する食塩濃度にして0.1Mと0.2Mの2種類の酵素が存在することを、担体としてDEAE-セファロースを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーならびに反応動力学的性質の調査、とりわけpHと活性の関係ならびにKm値の決定によって明らかにした。4 2種類の酵素は中腸組織の前部、中部、後部という部域によって存在量を異にして局在していることを明らかにした。5酵素を精製する方法を種々試みることによって、0.2Mの食塩濃度で溶出されるものについて、かなりの純度の精製標品を得る方法を確立した。しかし、完全精製標品を得る方法の確立には至っていない。その方法は、(1)PIPLC処理による酵素の可溶化、(2)DEAE-

セファロースを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー、(3)ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、(4)銅イオンを用いた金属イオンアフィニティークロマトグラフィーである。6今後、5の精製法の改良を行い、0.2Mの食塩濃度で溶出される酵素について完全精製標品を得る精製法を確立する。7今後、6で得られた完全精製標品の部分アミノ酸配列を決定し、cDNAを得て酵素の一次構造を明らかにする。カイコにおける人工飼料中のタンパク質成分の消化吸収の最終段階で、中腸組織の膜結合型アミノペプチダーゼが機能していることを明らかにする目的で、1)中腸組織における本酵素の部位別局在性、2)本酵素の精製方法を検討し、3)オカラタンパク質含量を異にする人工飼料を与えたカイコの本酵素の活性をカイコの発育経過を追って測定した。その結果、1)酵素の部位別局在性については、カイコの中腸組織は形態学的に前、中、後部の3つに区分できる。活性は前部と中部が同等であるのに対して後部は約3倍の活性を示した。このことは、中腸組織の内腔で消化液中のプロテアーゼの働きで人工飼料中のタンパク質が消化されて産生されたペプチドを中腸後部で分解する能力が高いことを示すものであり、中腸後部がタンパク質の消化産物の吸収に寄与していることを示唆する。2)本酵素の精製方法を確立した。中腸組織の膜からの可溶化はフォスファチジルイノシトール特異的フォスフオリパーゼCを用いる酵素的可溶化法を用いた。可溶化酵素を酸沈殿処理した後、イオン交換、金属キレート、ゲルろ過のカラムにかけて電気泳動的に単一のタンパク質を得た。3)オカラタンパク質含量を6.4%と13.2%になるように調製した人工飼料で飼育したカイコの5齢幼虫の中腸組織の酵素活性はほぼ同様の水準と活性消長を示した。発育の進行につれて活性は上昇し、5齢8日に極大に達した後、減少に転じ、5齢12日に吐糸開始となった。オカラタンパク質を全く含まない飼料で飼育したカイコの酵素活性は、はるかに低い水準で推移し、5齢12日でも吐糸開始とならず、更にすべての幼虫は幼虫熊で死亡した。以上の結果は、本研究で用いた人工飼料のうち、オカラタンパク質はカイコの飼育にとって必須タンパク質素材であること、また中腸組織の膜結合型アミノペプチダーゼは飼料タンパク質によって誘導されることを示す。