hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機ニトロキシルラジカルをモチーフとする酸化ストレス防御活性薬剤の創製

本研究は、酸化ストレスから脳を保護する薬剤としてのアザアダマンタン型有機ニトロキシルラジカル(2-azaadamantne N-oxyl,以下AZADOと略記する)誘導体の潜在的機能性の開発と検証を企図したものである。本年度は、当研究室で開発した精密修飾アザアダマンタン合成法を活用して、昨年まで未検討となっていた1,4-ジ置換型有機ニトロキシルラジカル7種類ならびに、それらの還元型誘導体であるヒドロキシルアミン7種類を新たに合成することができた。また、その途上で、アザアダマンタン核5位を高効率で酸化修飾する新規知見を得て、これより5-置換AZADOを5種類合成することができた。そして、新たに合成したAZADO類の酸化還元特性について検討を行った結果、1,4-ジ置換型AZADO類は、TEMPOおよびAZADOよりも速やかに、種々の活性酸素(次亜塩素酸、一酸化窒素、スーパーオキシドアニオン)をクエンチする活性を備えていることを確認できた。しかし、被酸化体であるオキソアンモニウムイオンが無置換AZADOに比べて不安定となるためか、反応効率の経時的低下が観測された。上記成果は、水溶性AZADO誘導体の設計に有用な指針を与えるものと考えている。一方、5-ハロ-AZADOは、NOとO2存在下にアルコール類や糖類の触媒的酸化を顕著に促進することを確認し、5-ハロ-AZADO類の触媒的抗酸化剤としての可能性を新たに見出すことができた。本研究は、酸化ストレスから脳を保護する薬剤としてのアザアダマンタン型有機ニトロキシルラジカル(2-azaada mantne N-oxyl,以下AZADOと略記する)誘導体の可能性を検討するものである。AZADOは、TEMPO型有機ニトロキシルラジカル(2, 2, 6, 6-tetramethyl-1-piperininyloxy, free radical)をモチーフとして合成された超安定ラジカルであり、TEMPOより低い酸化還元ポテンシャルを示し、アルコール類の酸化触媒としてTEMPOを凌駕する触媒活性を発揮することが当研究室において見出されている。本年度は、当研究室で開発した修飾アザアダマンタン合成法を活用して、電子求引性置換基およびアルキル置換基を導入した合成有機ニトロキシルラジカルを15種類合成し、その標準酸化還元電位を測定した。その結果、電子吸引基を置換したAZADO類は、置換基の電気陰性度にほぼ比例して酸化還元ポテンシャルが上昇した。一方、アルキル置換AZADOでは、置換アルキル個数と位置に依存して酸化還元ポテンシャルが低下するという興味深い結果が得られた。また、これら修飾AZADO類は種々の活性酸素(次亜塩素酸、一酸化窒素、スーパーオキシドアニオン)を速やかにクエンチする活性を備えていることも確認された。
精子形成における雄性スプライシングネットワーク機構の解析

本年度は申請した計画書に従い、雄性特異的、生殖細胞特異的スプライシング機構を解析するために、RBMYが結合する標的Pre-mRNA群の検索を行った.精原細胞様細胞株NEC14において、エストロゲン投与によるRNA-タンパク質免疫共沈降法の条件検討、及び予備実験を行った。免疫沈降に有用なRBMY抗体群をスクリーニングした結果、十分量のRBMYタンパク質を沈降する抗体を得ることができた。このRBMY抗体を用い、NEC14細胞においてCLIPアッセイの条件検討を行った結果、約100クローンの結合RNAの塩基配列を解析し、現在12種類のRNA断片を得ることに成功した。さらにこのスクリーニングにより得られたRNA断片より、精子形成に関与するクローンを分析し選択的スプライシング部位の解析を行った。その結果、エストロゲン誘導性の遺伝子を見出すことた成功した。さらに標的Pre-mRNA群を網羅的に探索するためエクソンアレイの準備段階としてRBMYの抑制を担う有効なshRNAを構築し、その効果をNEC14細胞において検証した。アレイチップは既に購入し、現在予備検討を行っている。また来年度の計画に基づいてRBMY複合体の精製を行うために、小スケールにてRBMY複合体の精製条件の検討を詳細に行った。その結果、結合タンパク質の精製されたバンドを数種類見出すことに成功した。またILの培養スケールにおいて十分量の質量解析を行うことが可能であることが明らかとなった。本年度の計画目的の要であるRBMYタンパク質のスプライシング標的遺伝子の同定に成功した。この結果により精子形成における選択的スプライシングネットワーク機構の一端の解明が可能になるため、意義は大である。
剥離せん断層の時空間構造に関する研究

1.本研究の目的は,水路湾曲部の剥離領域に形成された組織構造に注目し,それらの諸特性を踏まえて剥離せん断層の構造を解明することである.対象とする流れ場は,当初,90度の単湾曲水路を想定していたが,水工学的な観点から,蛇行水路において各実験を行った.2.レーザ流速計を用いた平均流速および乱れの統計量の測定においては,蛇行水路の凸岸下流の剥離領域では、減速域となり主流速の乱れ強度(u),横断方向流速の乱れ強度(w)およびレイノルズ応力(-<uw>^^^-)の横方向分布が,直線水路の流れのそれらに比べて著しく増加することが明らかとなった.また,同領域における主流速,乱れの統計量の鉛直方向分布においても,水表面付近の顕著な減速やそこでの負のレイノルズ応力(-<uv>^^^-)の発生など,通常の壁乱流と異なる特徴が見られた.これらより,剥離領域はきわめて複雑な速度場の構造を有することが明らかとなった.3.剥離領域における組織構造をDPTVを用いて考察した.本手法は,組織構造の流脈形象と速度情報が同時に抽出できるものである.これを流れの縦断面および水平断面に適用した.その結果,剥離領域には流れの3方向に大規模なスケールを有する組織構造が形成され,その形成領域は,高せん断領域と対応することが明らかとなった.また,その組織構造は大規模な二次流れの形成にも重要な役割を果たしていることが明らかとなった.これらの成果をまとめ土木学会論文集に投稿した結果,掲載可となった.4.水平断面では,水平スリット光膜の光量の不足で,鮮明な可視化データを得ることができなかった.これについては,光源に強力なレーザー光を使うなど改良が必要である.この問題を克服し,水平断面におけるせん断構造と組織構造の解明が今後の重要な課題である.1.本研究の目的は,水路湾曲部の剥離領域に形成された組織構造に注目し,それらの諸特性を踏まえて剥離せん断層の構造を解明することである.対象とする流れ場は,当初,90度の単湾曲水路を想定していたが,水工学的な観点から,蛇行水路において各実験を行った.2.レーザ流速計を用いた平均流速および乱れの統計量の測定においては,蛇行水路の凸岸下流の剥離領域では、減速域となり主流速の乱れ強度(u),横断方向流速の乱れ強度(w)およびレイノルズ応力(-<uw>^^^-)の横方向分布が,直線水路の流れのそれらに比べて著しく増加することが明らかとなった.また,同領域における主流速,乱れの統計量の鉛直方向分布においても,水表面付近の顕著な減速やそこでの負のレイノルズ応力(-<uv>^^^-)の発生など,通常の壁乱流と異なる特徴が見られた.これらより,剥離領域はきわめて複雑な速度場の構造を有することが明らかとなった.3.剥離領域における組織構造をDPTVを用いて考察した.本手法は,組織構造の流脈形象と速度情報が同時に抽出できるものである.これを流れの縦断面および水平断面に適用した.その結果,剥離領域には流れの3方向に大規模なスケールを有する組織構造が形成され,その形成領域は,高せん断領域と対応することが明らかとなった.また,その組織構造は大規模な二次流れの形成にも重要な役割を果たしていることが明らかとなった.これらの成果をまとめ土木学会論文集に投稿した結果,掲載可となった.4.水平断面では,水平スリット光膜の光量の不足で,鮮明な可視化データを得ることができなかった.これについては,光源に強力なレーザー光を使うなど改良が必要である.この問題を克服し,水平断面におけるせん断構造と組織構造の解明が今後の重要な課題である.
聴覚障害児の言語感覚を磨く作文指導の研究

1.具体的内容得られたデータから、特に理由の表現に焦点を当てて、A :「からです」型, B :「なぜならからです」型, C :「理由はからです」型, D :「それはからです」型, E :「ので好きになりました」「から好きです」型, F :「このような理由で,がすきです」「だから好きです」等まとめ型, M :その他のマーカー(「きっかけはです」「て」「も理由の一つです」等), N :マーカーなし(「楽しいです」「いいです」等)に分け、聴覚障害児と健聴児の学齢毎の使用傾向を調べた。その結果、健聴児についてはA, B, Cのような定型的な理由の表現の使用率は学齢が上がるとともに減少し、表現に多様性が見られるようになり、明らかに理由の表現に分類される表現を使わずに理由を説明する表現力が中学生から高校生と段階を踏んで育ち、複数の理由や事情を説明し、最後にまとめるような文章構成もできるようになることがわかった。一方、聴覚障害児の場合も同じ傾向が見られはするが、表現力の発達は健聴児と比べて緩やかであり、定型的な表現への依存の割合も全体的に高かった。2.意義・重要性客観的なデータによって、健聴児と聴覚障害児は表現の習得状況に明らかな差があることが証明できた。よって、今後の聴覚障害児の作文指導においては、その弱点を克服するための指導内容を、健聴児の学齢毎の傾向に合わせて考えていくことができる。その意味で、本研究のデータは、目標設定をして指導していくための枠組を作るために、有用なデータとなったと言える。実際に、高3の作文指導において、そのデータを活用したところ、健聴児の書く作文と比較することで、生徒達も自分たちの作文を見直し、気付きも見られた。その場その場で生徒の誤用を直すだけではなく、表現や文章の型や構成を構造的に理解させ、文章力を上げていくような指導につなげられるような成果を得ることができた。
ニトリルヒドラターゼファミリー酵素の触媒中心形成と触媒機構の解明

鉄型ニトリルヒドラターゼの時間分割結晶構造解析を行い、反応中間体と思われる立体構造を得ることに成功した。また、同ファミリー酵素であるチオシアネートヒドロラーゼの基質ポケット変異体の解析から、基質ポケットのサイズと表面電荷が基質選択性の決定に重要であることを明らかにした。触媒中心形成機構に関しては、チオシアネートヒドロラーゼの活性化タンパク質が触媒サブユニットの立体構造形成、金属の結合、翻訳後修飾形成を促進し、その後解離した触媒サブユニットに他のサブユニットが会合するという成熟過程の概要を解明することに成功した。ニトリルヒドラターゼ(NHase)はアクリルアミドの工業生産に利用される重要な酵素であるが、その触媒反応機構は未解明である。本研究では、NHaseと類縁酵素であるチオシアネート加水分解酵素(SCNase)を材料に、その触媒反応機構と翻訳後修飾を含む金属触媒中心形成機構を明らかにすることを研究目的とする。今年度はNHase触媒中心を形成するセリン配位子と近傍に存在するチロシン残基の水酸基を除去した変異体を作成し、触媒機能に対する影響を構造科学的に解析した。その結果、セリン配位子は基質ポケットの水素結合ネットワーク形成に重要であるが、触媒反応に必須ではないことを明らかにした。更に、中性子構造解析に必要なNHase巨大結晶の作成条件を検討し、従来より体積比で20倍大きな結晶を調整可能な条件を見いだした。SCNaseに関しては、組換え体発現条件をコントロールすることにより、システインスルフィン酸(Cys-SO2H)とシステインスルフェン酸(Cys-SOH)の翻訳後修飾うちCys-SO2H修飾のみを有する酵素を調製して空気酸化させることにより、システインスルフェン酸(Cys-SOH)修飾が触媒活性に不可欠であることを明らかにした。また、金属触媒中心形成機構に関しては、SCNase成熟化に必要なアクセサリタンパク質が金属結合サブユニットと複合体を形成し、その後にコバルトイオンを結合することを明らかにした。今年度は以下の3つの研究を行った。1.NHase活性を1/1000程度に低下させたβR56K変異体を用いて、基質であるtert-butylnitrile水和反応の時間分割構造解析を行った。その結果、反応開始後3時間の測定データにおいて、酵素基質複合体と思われる構造を得ることに成功した。2.SCNase基質ポケットに存在する2つのアルギニン残基βArg90,γArg136をNHaseにおいて相当するアミノ酸残基であるフェニルアラニンとトリプトファンに置換した変異体を作製し、それらの置換の影響を調べた。いずれの変異体もSCNase活性を消失し、NHase活性を示した。γR136W変異体の結晶構造を決定したところ、基質ポケット表面の正電荷が大きく減少し、基質ポケットの容積が増大していた。これらの結果より、NHaseとSCNaseの触媒機構は本質的に同じであり、基質ポケットの電荷とサイズが基質選択性の決定に重要であることが示唆された。3.SCNase成熟化機構に関しては、金属結合サブユニットであるγと活性化タンパク質P15K複合体にコバルトを結合させたところ、複合体の解離は起こらないことがわかった。この結果は、γ-P15K複合体の解離を引き起こすドライビングフォースは金属の結合ではないことを示している。今年度は以下の研究を行った。(1)NHaseとSCNaseの触媒活性の差異を基質ポケットの変異体を用いて解析した。SCNase基質ポケット内部に突出している二つのアルギニン残基をNHaseの相当する部位に存在する疎水性アミノ酸に置換した変異体はSCNase活性を消失し、NHase活性を示す。NHase活性の反応動力学的パラメータを求めたところ、Km値は野生型のSCNase活性に比べて数倍にとどまるが、kcatも野生型酵素のSCNase活性の数倍まで増大することがわかった。そこで、それらの残基をリジン、アスパラギン、ヒスチジンに置換した変異体を作製したところ、いずれの変異体もSCNase活性、NHase活性ともに著しく低い値を示した。これらの結果から、両酵素は基本的に共通の触媒機構を有し、基質ポケットの電荷と大きさによって基質特異性が制御されることが示唆された。(2)SCNase活性化タンパク質であるP15Kによる成熟化機能の解析を行った。

これまでの研究で未解明であった金属結合サブユニットであるγとP15Kの複合体へのコバルトイオンの取込と、それに続くγ-P15K複合体の解離過程を解析した。その結果、γ-P15K複合体が1モルあたり1モルのコバルトイオンを結合すること、コバルトを結合したγ-P15K複合体に新生γサブユニットを作用させると、複合体の解離がおこることを明らかにした。これにより、P15KによるSCNase成熟化機構の概要を明らかにすることができた。
集合形態に依存したナノ粒子集合体の光特性に関する研究

本研究では、金ナノロッドの集合形態制御により可逆的な色変化挙動を示すナノ光材料の開発を目指して、集合形態に依存したナノロッドの光特性について調査した。リンカー分子として温度応答性高分子を採用した。ロッド集合体溶液において、リンカー分子の溶液を添加後の温度変化による光消失スペクトル変化を評価した結果、温度変化により紫外可視消失スペクトルが僅かに変化し、色変化挙動を示すナノ光材料の開発への基礎的知見を得ることができた。本研究では、金ナノロッドの集合形態制御による可逆的な色変化挙動を示すナノ光材料の開発を目指して、集合形態に依存したナノロッド粒子集合体の光特性について調査する。本年度は、実施計画に基づいて(1)表面修飾したナノロッドの集合体形成および(2)リンカー分子で架橋したナノロッド集合体の形成を実施した。(1)表面修飾したナノロッドの集合体形成...既報に従ってシリカで表面修飾したナノロッドの作製を行なった。表面を修飾することは可能であったが、収率が低くさらにシリカコートによりアスペクト比が減少することから集合体形成まで至らなかった。(2)リンカー分子で架橋したナノロッド集合体の形成...スペーサーとなるリンカー分子としてシンプルな分子構造を有する1, 9-ノナンジチオールを採用した。ナノロッド溶液にノナンジチオールを共存させて集合体形成を行なった。透過型電子顕微鏡(TEM)観察より、ノナンジチオール共存下においてもナノロッド集合体の形成を確認した。さらに、集合したナノロッドの再分散を行なうためにアセトニトリル添加により集合挙動の変化を評価した。UV-vis吸収スペクトル測定を行なった結果、ノナンジチオール無添加下で集合化した集合体の光吸収帯は長波長シフトした。一方、ノナンジチオール共存下で集合化した集合体の光吸収帯は変化しなかった。このことからノナンジチオール分子が集合したナノロッド同士を連結していることが示唆された。本年度は、実施計画に基づいて下記2項を実施した。1,外部刺激応答型リンカー分子で架橋したナノロッド集合体の集合体形成と可逆的光特性評価リンカー分子として分子内にS原子を有する温度応答性高分子ポリイソプロピルアクリルアミドを採用した。ロッド集合体溶液またはロッド溶液に対してリンカー分子の溶液を添加後、温度変化による光消失スペクトル変化を評価した。ロッド集合体溶液において、温度変化により紫外可視消失スペクトルが変化した。ロッド溶液については僅かであるが、温度変化による可逆的な光消失スペクトルの変化が観測された。2,作製したナノロッド集合体の理論計算との比較検討リンカー分子として1,9-ノナンジチオールを採用したナノロッド集合体について、Fossらの報告に基づいて理論計算を行なった。ナノロッド集合体の構造は電子顕微鏡観察から得られた凝集形態に基づいた。得られた結果は、定性的に紫外可視消失スペクトルと同様の傾向を示した。
コレラ菌の定着因子

コレラ菌の定着因子と防御抗原を解明するため、既にその可能性が報告されている菌体成分を検討した後、新たにその可能性を見いだした菌体成分、すなわちLPSの糖鎖、外膜蛋白OmpU、コレラ菌のFSHA、NAGV14線毛の4物質について検討した。その結果、コレラ菌の定着因子である可能性が報告されてきたTCPやMSHAなどの菌体成分については全てにおいて定着因子の可能性が否定された。新たにその可能性を見いだした成分のうち、菌体O-抗原の腸上皮付着性については、抗LPS Fabで菌体を前処理することによって付着阻止の有意差を示さず、O-抗原を保持している死菌が腸上皮へ付着しないこと、O-抗原を有するコレラ菌の中に付着能の無い株が有ることなどが明らかになった。精製した外膜蛋白OmpUは腸上皮への付着は確認出来たが、ブロックテストが陰性であり、OmpUは菌体表面に露出していないことが判明した。したがってLPS糖鎖およびOmpUは定着因子候補から除外した。コレラ菌のFSHAについては精製分画が得られなかったため遺伝子側からのアプローチとして、transposon(Tn5)の挿入変異体を作成し赤血球凝集能消失変異株をスクリーニングした。Tn5挿入位置の検索中に赤血球凝集能が復活するなどの問題が生じたため変異株の作成をやり直している。V.choleraeから見いだされた唯一の腸上皮接着性線毛であるNAGV14線毛については、その遺伝子解析からコレラ菌には存在せず、V.choleraeの特殊な株にのみ存在することが判明した。その特殊な株が、いわゆるenteropathogenic V.choleraeに相当するものか否かを検討中である。1.コレラ菌の細胞質液中からゲル内沈降法によって抗V14線毛抗体と反応する物質を明らかに検出できるため、その物質の単離精製を試みてきたが、各種クロマトグラフィーによる分析で沈降活性を有する分画には多くの類似蛋白が混在し、さらにその分画をSDS-PAGE,western blott法によってV14抗原に存在を調べると抗原活性はほとんど消失していることが多かった。一方抗V14抗体がコレラ菌を凝集させないことからV14抗原は菌体表層に発現していないものと考えられ、V14線毛の研究は暗礁に乗り上げた。そこで現在、菌体の蛋白性接着因子として候補を外膜蛋白OmpUおよびフコース感受性凝集素に絞って検討を開始した。現在OmpUの精製と抗体作成を完了し、付着阻止実験を行っている。フコース感受性凝集素についてはコレラ菌86B3のchromosomal DNAにTn5をinsertionするためのmatingまで終了し、これから赤血球凝集能の消失株をスクリーニングする段階にかかっている。2.菌体O抗原糖鎖がコレラ菌の腸上皮定着に対してどのような役割を示すかという課題については、抗加熱死菌血清から得たIgGのFab分画を用いて菌体を処理したところ菌株によっては有意に付着が阻止された。抗加熱死菌血清を用いたためそれが糖鎖阻害によるものか否かは断定出来ない。そのため抗LPSモノクローン抗体の作成を試みたがIgMのクローンのみでIgGのクローンが現れなかった。IgMからはFab分画にてこずり小休止の状態に入らざるを得なかった。従って現在はエルトール菌株82p7のLPSを抽出精製しそれを免疫原として抗体を作成し、Fab分画の精製を行っている。1.コレラ菌体O抗原糖鎖の腸上皮定着における役割については昨年までに、抗加熱死菌血清による菌体処理によって、ある株では付着が有意に阻止される結果を得た。しかしその後、被検株を増すにつれてその有意性を失った。

しかもコレラ菌から精製したLPSを腸上皮に作用させ、付着の有無を酵素抗体法によって検討したが、LPSの付着はみられなかった。精製LPSで処理した腸上皮に対してコレラ菌が通常通り付着したことなどから、コレラ菌のLPSは菌と上皮細胞の結合には関与していないものと考えられ、定着因子の候補から除外した。Vibrio choleraeから唯一定着因子として証明されたV14線毛もその抗原物質がコレラ菌では菌体表面に発現していないため、研究対象から除外されたので、コレラ菌の定着因子候補は外膜蛋白のいずれかに絞られてきた。2.菌体の蛋白性接着因子としての候補を多くの外膜蛋白のうち、OmpUとフコース感受性凝集素に絞って検討を開始した。OmpUを精製して腸上皮細胞に作用させたところ付着が確認された。しかしOmpUによる腸上皮処理および抗OmpUによる菌体処理のいずれにおいてもコレラ菌の腸上皮付着を阻止することは出来なかった。抗OmpUがコレラ菌体を凝集させなかったことから、Ompuは菌体表面に現れていないと判断し、これも定着因子候補から除外した。フコース感受性凝集素についてはコレラ菌86B3のchromosomal DNAにTn5を挿入した赤血球凝集能消失株を得たので現在該当する外膜蛋白の検索を行っている。また同時に病巣で発現されるストレス蛋白検出のため、病巣中のコレラ菌収集を試みている。コレラ菌の定着因子を解明するため、菌体O-抗原およびVibrio cholerae non-O1の接着性線毛(V14)構成蛋白について検討した。菌体O-抗原の腸上皮付着性については、抗LPS Fabの菌体前処置によってある程度の阻止が見られたものの有意性を示すには至らなかった。また、O-抗原を保持している加熱死菌・ホルマリン死菌などが腸上皮への付着性を失うこと、更に正常の小川型抗原を有するコレラ菌の中に付着能の無い株を見いだすに至り、LSP糖鎖をコレラ菌の定着因子と見做すことは出来ない否定的な結果となった。V.choleraeから見いだされた唯一の腸上皮接着性線毛であるV14線毛はコレラ菌(V.cholerae O1)の菌体表面に存在しなかったが、菌体内からは抗原物質を検出することができた。コレラ菌体内におけるV14抗原物質の精製に難航したため、その本態は、遺伝子側から解析することにした。V14線毛蛋白のアミノ酸配列を63番目まで解析したところで、その塩基配列を推定しdegenerated PCRによってN-末63aaの塩基配列を決定した。そのDNA断片をprobeとして、V14遺伝子を有する1000bp染色体断片を得た。その断片を環状となし、inversePCRによってV14遺伝子の全塩基配列を決定しつつあるが、今年度中(平成12年3月末まで)には完了する予定。これが完成すると、組換えV14蛋白を用いてV14線毛の機能・コレラ菌におけるその遺伝子分布などが速やかに解明される。予定した研究計画の進捗は70%程度の到達度であった。
TRP受容体刺激を介した高齢者の誤嚥性肺炎の予防と摂食意欲低下の予防の確立

「温度感受性受容体(TRP)と高齢者誤嚥」の関係に従事した。「嚥下反射と食事の温度の関係」(J Am Ceriatr Soc 2004; 54)に基づき、熱温度刺激に反応するTRPV1の作動薬のカプサイシンの慢性刺激も上気道防御反射を改善した。冷感の温度受容体であるTRPM8作動薬のメンソールの嚥下反射改善効果は(Brit. J Clin. Pharmacol 2006; 62)、産学共同製品として2007年9月より、既に臨床現場で誤嚥予防食として使用されている。黒胡椒精油を用いた嗅覚刺激による上気道防御反射の改善効果を示したか(J. Am. Geriat. Soc. 2006; 54)、この成果を基礎に、新規のドラッグガスデリバリーシステムとして、この芳香成分を炭素に吸着させ、首周辺に貼るだけで24時間、誤嚥予防できるパッチシートを開発した(産学共同製品、H19年3月より実用化)。以上より、できるだけ最後まで、経口摂取を可能にする、食の楽しみを維持する「科学的見地に基づいた介護」的アプローチを見出した。また、円背や食道裂孔ヘルニア罹患の高齢者に多くみられる「胃食道逆流と誤嚥の関係」を明らかにした。嚥下反射はPHと負相関を持ち(Geriatr & Gerontol International 2007; 7)、咳感受性の亢進はプロトンポンプ阻害剤で正常化する(J. Am. Geriat. Soc. 2007; 55)。そして、胃切除例において、一年間の期間で、セロトニン受容体作動薬モサプリド内服群は非内服群と比較し肺炎発症を抑制した(J.Am.Geriat.Soc.2007;55)。以上より、胃切除例や食道裂孔ヘルニア有者の肺炎は、嚥下反射が正常でも胃酸の逆流が原因である可能性が高い。従来の誤嚥対策(ACE阻害剤、ドーパミン遊離促進剤)ではないアプローチが重要であることが示唆された。これまでの研究より、高齢者の嚥下反射はたとえ障害されたとしても温度依存性であり、温度感受性受容体の一つであるTRPV1刺激により効率的に改善されることが判明した。そこでTRPV1の持続刺激により嚥下反射が改善されるかどうか、同アゴニストであるカプサイシン含有トローチを作成してそれを嚥下反射遅延高齢者に投与し、その効果を調べた。また、嗅球など様々なところに存在する脳内TRP受容体に、同アゴニストのpiperineを含む黒胡椒精油による嗅覚刺激の効果を調べた。[方法]カプサイシントローチ及びそのプラセボを、施設入所中の高齢者をランダムに2群に分け投与し、一ヶ月の中期投与の効果をみる。また、別施設において、黒胡椒精油、およびラベンダー精油、匂いナシ群として蒸留水を嗅がせ、3群にわけて、その直接効果および一ヶ月間の中期投与効果を調べる。アウトカムとしては気道防御能としての嚥下反射、咳反射それとADL、認知機能、血中サブスタンスP量などを測定。嗅覚刺激による研究では、脳血流シンチも前後で撮影した。

[結果]一ヶ月の毎食前のカプサイシン投与により、カプサイシン含有トローチ群においてプラセボ群と比べ、有意に両反射(嚥下・咳)が改善した。又、黒胡椒精油による嗅覚刺激では、大脳島部の血流増加及び、嚥下知覚および運動反射が有意に改善した。[考察]この研究を通して口腔および咽頭部のTRPV1の慢性刺激の咳・嚥下反射改善と、又、嗅覚刺激による大脳島部血流増加を介した嚥下知覚・運動反射改善が認められた。[結論]本トローチの投与は高齢者の誤嚥性肺炎の予防につながると考えられると同時に、口腔及び咽頭内の機能低下が著しい高齢者の嚥下機能リハビリにも有用と思われる。さらに、トローチ飲用が難しい高齢者や気管切開中、胃管挿入中の高齢者に黒胡椒精油による嗅覚刺激は非常に有用と思われた。高齢者誤嚥性肺炎の原因はドーパミン作動性神経系とその下位のサブスタンスP作動性神経系の障害に起因することが多い。別に、消化液や胃内容物の逆流性誤嚥もある。加齢により、食道裂孔ヘルニア罹患率増加、下部食道括約筋弛緩及び収縮不全、粘膜の酸クリアランス低下により、健常成人と比較して、胃酸・胃内容物の逆流現象が引き起こしやすい。胃酸逆流の存在と判定されるpH4以下の液体で、ヒト嚥下反射は有意に負相関を示す(GGI 2007;7:94-95)。胃酸逆流は、少量でも、誤嚥の機会を増やす。以上より、胃酸逆流の予防が重要である。胃切除症例のような胃食道逆流が起きやすい高齢者において、セロトニン受容体作動薬のクエン酸モサプリドが消化管運動を改善することにより、肺炎の発症率を抑制した(J.Am.Geritr.Soc.2007;55:247-248)。知覚神経終末に存在する温度感受性受容体TRPスーパーファミリーが近年同定され、私は嚥下反射と温度の関係を示した(J.Am.Geritr.Soc.2004)。TRPV1作動薬カプサイシンは濃度依存性に嚥下反射を改善させるが、TRPV1は熱い温度(70°C以上)にも反応する。又、20°C以下の冷温度も嚥下反射を改善するが、TRPM8作動薬メンソールも嚥下反射を用量依存性に改善する(Brit.J.Clin.Pharm2006;62:369-372)。誤嚥性肺炎罹患高齢者は、特に島皮質の活性低下が著しい(J.Am.Geriatr.Soc.2004)。そこで、この部位の活性増加させることが健常な嚥下運動を惹起させることができる可能性がある。黒胡椒の精油(匂い)がこのような作用を有することが判明した。近郊の老人保健施設の、この研究に適正な入所者105人を、35人ずつ黒胡椒精油を嗅ぐ群(以下、黒胡椒精油群)、ラベンダー精油を嗅ぐ群、蒸留水を嗅ぐ群の3群に無作為に割り付けた。黒胡椒精油群は、他の群と比較して有意に嚥下反射が改善するという即時及び慢性効果を示した。黒胡椒精油は島皮質の血流増加を示した。黒胡椒精油アロマテラピーは、島皮質の活性化を促して、嚥下反射および運動を改善することが判明した。(J.Am.Geriatr.Soc.2006;54:1401-06)。H17,18年度に引き続き「温度感受性受容体と高齢者誤嚥」について従事した。温度感受性受容体刺激と嚥下反射の関係を調べた「嚥下反射と食事の温度の関係」(J Am Geriatr Soc 2004;54:2143)に基づき、冷感の温度受容体であるTRPM8アゴニストであるメンソールの嚥下反射改善効果は(Brit. J Clin. Pharmacol 2006;62:369-371)、産学共同製品として2007年9月より、既に実際の臨床現場で誤嚥予防嚥下リハビリテーションの一環として使用されている。
近代日露文化交渉史の諸問題に関する実証的研究

本研究は以下に挙げる論点に沿って、精密な書誌を作成しつつ行われた。1.ゴンチャローフの「日本渡航記」にうかがわれる、ロシア人の観た幕末の日本及び日本人観2.二葉亭四迷、川上俊彦、嵯峨の屋お室など、東京外国語学校魯語科出身者のロシアとの関わり3.森鴎外、田山花袋、島崎藤付、国木田独歩らによる、重訳を通じてのロシア文学の受容4.千島樺太交換条約と日露戦争の有する文化史的意義5.コレンコ、グレー、ケーベルといった東京外国語学校、東京帝国大学のロシア人教師や、B.ピウスツキ、マトヴェーエフ、N.ラッセルのような亡命ロシア人、ポーランド人の日本での事跡と日本観6.日本におけるロシア語教育の歴史7.日本の環日本海地域と極東ロシア、サハリンとの関わり8.北洋漁業と日露関係9.1917年のロシア革命の後来日した白系ロシア人の事跡調査10.近・現代日本文学の作品に表れたロシア及びロシア人のイメージ4年間に論文をわが国で10本、ロシアで5本、カナダで2本、ポーランドで1本発表し、ロシアとポーランドの国際会議で計3回報告した。また国内各地の図書館、史料館はもとより、神戸市立外国人墓地、静岡県富士市、外国ではハワイ大学ハミルトン図書館、チェコ共和国スラブ図書館(プラハ)、ロシア文化博物館(サンフランシスコ)、スタンフォード大学フーバー研究所(米国・パロ=アルト)で調査と資料収集を行った。平成11年度は以下の諸点に取り組んだ。1.プチャーチン提督の秘書として長崎に来航したゴンチャローフの『日本渡航記』にうかがわれる、ロシア人の観た幕末の日本及び日本人観2.二葉亭四迷、嵯峨の屋お室など、東京外国語学校魯語科出身者によるロシア文化紹介の仕事3.森鴎外、田山花袋、島崎藤村、国木田独歩らによる、重訳を通じてのロシア文学の受容4.コレンコ、グレー、ケーベルといった東京外国語学校、東京帝国大学のロシア人教師や、B・ピウスツキ、マトヴェーエフのような亡命ロシア人、ポーランド人の日本での事跡と日本観5.日本の環日本海地域と極東ロシア、サハリンとの関わり6.1917年のロシア革命の後来日した白系ロシア人の事跡調査程度の差はあれ、以上六点のいずれにおいても研究の進展が見られた。具体的には、三点に関して日本語論文を日本国内で2本、ロシア語論文をロシアとカナダで1本ずつ発表、ロシアとポーランドで開催された国際会議でそれぞれ報告を行い、諸外国の研究者と情報交換をした。また東京の外務省外交史料館と北海道大学で調査と資料収集を行った。平成12年度は以下の諸点に取り組んだ。1.プチャーチン提督の秘書として長崎に来航したゴンチャローフの『日本渡航記』にうかがわれる、ロシア人の観た幕末の日本及び日本人観2.二葉亭四迷、川上俊彦など、東京外国語学校魯語科出身者のロシアとの関わり3.森鴎外、田山花袋、島崎藤村、国木田独歩らによる、重訳を通じてのロシア文学の受容4.明治期に来日したコレンコ、グレー、ケーベルといった東京外国語学校、東京帝国大学のロシア人教師や、B・ピウスツキ、N・ラッセルのような亡命ロシア人、ポーランド人の事跡と日本観5.1917年のロシア革命後来日した白系ロシア人の事跡調査6.日本におけるロシア語教育の歴史7.現代日本文学の作品に表れたロシア及びロシア人のイメージ第1点についてはロシア科学アカデミー版『ゴンチャローフ全集』の注釈と日本語のエッセイを発表、第4点はロシア語論文(サハリンで発表)と翻訳が各1本、第5点はロシア語論文1本(カナダで発表)と日本語論文2本、第6点は日本語論文1本、第2、3、7点は講義で取り上げた。またハワイ大学図書館で資料を大量に収集し、同大学の研究者たちと情報交換を行ったし、広島市立大学の国際会議に参加して、日露の研究者と意見交換を行った。さらに東京の外務省外交史料館、北海道大学図書館、静岡県下田市の外ケ岡交流館図書館などで調査と資料収集を行った。

平成13年度は以下の諸点に取り組んだ。1.明治期に来日したコレンコ、グレー、ケーベルといった東京外国語学校、東京帝国大学のロシア人教師や、B・ピウスツキ、N・ラッセルのような亡命ロシア人、ポーランド人の事跡と日本観2.二葉亭四迷、川上俊彦など、東京外国語学校魯語科出身者のロシアとの関わり3.日本の環日本海地域と極東ロシア、サハリンとの関わり4.日露関係史に直接もしくは間接に必然的に関わってくる、千島樺太交換条約と日露戦争の有する文化史的意義5.1917年のロシア革命後来日した白系ロシア人の事跡調査6.北洋漁業と日露関係7.近・現代日本文学の作品に表れたロシア及びロシア人のイメージ第1、2、4点についてはロシア語論文(サハリンで発表)が1本、第2、3、4点は日本語論文1本(投稿中)、第5点は日本語の編著書1冊と日本語論文1本、第3、6点は翻訳・解説が1本、第7点は大学の講義で取り上げた。また市民学会「日本とロシア」(2001年6月24日、東京外国語大学)と日本ロシア文学会の総会(2001年9月30日、新潟大学)でそれぞれ第5点と第3点に関して公開講演を行い、国際会議「日本におけるロシア文化の受容<過去から未来へ>」(2001年10月6日、早稲田大学)では第5点について報告した。さらにプラハ(チェコ)のスラブ図書館、東京の外務省外交史料館、早稲田大学図書館、新潟県立図書館、神戸市立外国人墓地、北海道大学図書館、静岡県富士市などで調査と資料収集を行った。平成14年度は以下の諸点に取り組んだ。1.明治期に来日したコレンコ、グレ、ケーベルといった東京外国語学校、東京帝国大学のロシア人教師や、B・ピウスツキ、N・ラッセルのような亡命ロシア人、ポーランド人の事跡と日本観2.二葉亭四迷、川上俊彦など、東京外国語学校魯語科出身者のロシアとの関わり3.日本の環日本海地域と極東ロシア、サハリンとの関わり4.日露関係史に直接もしくは間接に必然的に関わってくる、千島樺太交換条約と日露戦争の有する文化史的意義5.日本におけるロシア語教育の歴史6.1917年のロシア革命後来日した白系ロシア人の事跡調査7.近・現代日本文学の作品に表れたロシア及びロシア人のイメージ第1・2点についてはロシア語論文(サハリンで発表)が1本、第3・6点、第5点、第5・6点、第6点についてはそれぞれ日本語論文1本、また第6点について書誌1本、第4・7点は大学院と大学の講義で取り上げた。さらに日ロ交流協会主催の第3回「日ロ歴史認識」シンポジウム(2002年9月19日、日本プレスセンタービル10階ホール)で第6点に関して講演を行い、「来日ロシア人研究会」でも第6点に関して2回報告を行った。さらにサンフランシスコのロシア文化博物館とスタンフォード大学フーバー研究所、東京の外務省外交史料館、早稲田大学図書館、国立国会図書館、函館市立図書館、北海道大学図書館などで調査と資料収集を行った。
遠距離介護と仕事の両立を可能にするワーク・ライフ・バランス施策 についての研究

現時点では遠距離介護支援する企業は少なく、多くの労働者は有給休暇の使用や同僚の理解を得た上での勤務時間の調整などによって遠距離介護を実践している。そして、企業による遠距離介護支援を積極的に求めていこうという労働者側の意識や動きもまた、強くない。その原因として、労働者は実際に当事者になるまで、介護と仕事の両立について漠然とした不安しか持っておらず、当事者になる前の段階では労働者の明確なニーズとしては現れにくいことが挙げられる。今後、企業の人事戦略としての遠距離介護支援を充実させていくためには、企業側だけでなく、労働者に対しても、遠距離介護支援の必要性についての理解を促していく必要がある。当該年度の研究実施計画は大きく二つあり、(1)ワーク・ライフ・バランス(以下、WLBと略す)の先行研究から日本のWLBの特殊性の明確化と、(2)仕事を持ちながら遠距離介護をする別居子へのインタビュー調査の実施である。まず、(1)については文献研究および日本における政策策定にかかる資料収集とその分析をおこなった。そこから、日本のWLB施策が少子化対策と男女共同参画(女性労働支援)という視点から始まったものの、超高齢化する社会において、高齢者介護と労働の両立問題や、高年齢者雇用の問題など、男女という性別を超えた根本的な労働問題として強調されつつあるという日本におけるWLBの特徴を明確にした。研究成果はWLBに関する講演会などにおいて発表した。また、(2)の聞き取り調査については、実際に仕事をしながら遠距離介護をおこなっている労働者だけでなく、遠距離介護支援をしているNPO法人、並びに、そのNPO法人の法人会員になり、従業員への遠距離介護支援サービスを提供している民間企業の人事担当者へのインタビュー調査も実施した。そこから明らかになったのは、まず、労働者の立場では、遠距離介護支援があってこそ今の仕事が継続できているというサービス利用についての満足感の高さである。一方、特別な遠距離介護支援を利用していない実践者の場合、親の住む地域にいる親類や友人関係に頼っていたり、自分の労働時間との折り合いで悩みながら遠距離介護を継続していた。次に、遠距離介護支援サービスを従業員に提供している民間企業については、福利厚生ではなく、人事戦略や人材マネジメントの一貫として、早くからWLBに取り組んでおり、その中で育児だけでなく介護と仕事の両立という現実問題に対処するために遠距離介護支援を取り入れたという経緯が明らかになった。しかし、サービス利用はまだ少なく、今後の推移に注目しているという段階であった。研究成果については論文にて発表した。仕事を持ちながら遠距離介護をしている別居子へのインタビュー調査、および、子どもと離れて暮らす高齢者へのインタビュー調査を実施し、特に遠距離介護支援のあり方について、考察を深めた。その結果、柔軟な勤務態勢や休暇のあり方など、自分がつとめている企業からの支援提供を望む声はほとんどなく、自分が購入することができる支援サービスや、老親が住む地域におけるサービスに対する期待が大きいことがわかった。また、子どもと離れて暮らす高齢者へのインタビューにおいても、子どもの職業生活に負担を強いることは回避したいという意識が強く、老親にとっても、別居子にとっても、高齢者が住む地域で使える遠距離介護支援サービスの存在が最も望まれるものであった。このようなインタビュー調査による遠距離介護の実態や、望ましい支援体制と併せて、何故、現在の日本では遠距離介護に注目が集まり、今後、どのような介護体制を考えていかなければならないのか、という問題について、スウェーデンのヨーテボリで開かれた、世界社会学会議で報告をおこなった。そこでの討論の結果、これまで家族介護中心で進められてきた日本の高齢者介護体制の今後を考える際、欧米諸国における関心の中心が専門職によるケアのあり方であるのとは異なり、「家族がどのような新しいかたちで高齢者のケアに関わっていくのか」という問題が重要であるとの認識で一致した。特に、家族ケアの新しいあり方を考える際に、男女の生き方の違いや、職業生活との両立問題=ワーク・ライフ・バランスとの関連で広く考察していかなくてはならないことを確認した。【具体的内容】子どもと離れて暮らす高齢者へのインタビューと、遠距離介護支援機器を利用しながら遠距離介護を継続している別居子へのインタビューを実施した。また、企業労働者に対するアンケート調査も実施して、ワーク・ライフ・バランスに関する労働者の意識と企業の取り組みの現在について明らかにした。【意義】昨年あたりから、ワーク・ライフ・バランスに関するシンポジウムや書籍などでは、ワーク・ライフ・バランス政策を進める意義として、仕事と育児だけでなく、仕事と介護との両立が強調されるようになってきた。こうした社会的背景の中にありながら、いまだに高齢者介護の必要に直面した個々の労働者のみが、個人的に対応することで仕事と介護との両立は続けられているのが現状である。そのために、老親介護への危機感をまだ感じていない労働者にとっては、介護と仕事の両立のための方策や働き方というのは、関心のない事柄であり続けている。

「いつかくるかもしれない危機」を労働者全体のリスクと捉え、社会や企業が対策を整備していくためには、企業が人事管理として仕事と介護の両立を可能にするワーク・ライフ・バランス制度を整えるか、もしくは、労働組合が労働者に対する啓発活動をおこない、ワーク・ライフ・バランスの必要について周知することが必要であるという考察をおこなった。【重要性】超高齢社会の日本において喫緊の課題である高齢者介護を、家族との関連から読み解く本研究は、若い世代にとっても生涯にわたる自分自身の問題であり、高齢者ケアのあり方だけではなく、労働政策や家族政策、地域福祉政策を考えるうえでも、非常に重要である。また、遠距離介護という新しい介護形態に着目し、丁寧なインタビュー調査の蓄積をすることによって、高齢者ケアにとっての家族の役割や企業のワーク・ライフ・バランスの日本的展開を明らかにするうえでも、非常に有意義な研究である。【具体的内容】当該研究の最終年度として、これまで積み上げてきた複数の視点からの考察(遠距離介護をおこなう子ども、子どもと離れて暮らす高齢者、仕事と介護の両立支援をおこなう企業、高齢者の住む地域)を総合的に分析しつつ、これから、仕事と介護の両立支援に理解を示し、実際に支援をおこなう企業や地域を増やすためにはどうすればいいのかについての結論を導いた。【意義】仕事と介護の両立という視点でのワーク・ライフ・バランス研究をおこなうという当該研究の実施年度中に、それまでもっぱら少子化対策として、仕事と育児との両立が中心的に語られていたワーク・ライフ・バランス論に明らかな変化がみられ、ワーク・ライフ・バランス政策を進める意義として、仕事と育児だけでなく、仕事と介護との両立が強調されるようになってきた。本研究がおこなった労働者に対する調査によっても、労働者自身が老親介護についての漠然とした不安を抱えており、介護と仕事の両立に対して明るい展望は持っていないという事実が明らかになったものの、まだ、労働者が持つ潜在的な介護と仕事の両立のニーズと企業側の支援策の間の乖離は大きい。こうしたなかで、遠距離介護を続けている労働者やそれを支援する企業の取り組みなどについて個々のケースを拾い上げ課題を抽出できたことは、非常に有意義である。【重要性】社会政策としての高齢者介護を考えるとき、特に日本においては家族の役割を除外して考えることはできない。そのために、遠距離介護と老親を抱える子どものワーク・ライフ・バランスという視点からの研究は、労働政策や家族政策、地域福祉政策を考えるうえでも、非常に重要である。今後は、企業や社会による遠距離介護支援の促進という側面と同時に、高齢者を抱える地域社会にとって、別居子をどのような形で地域福祉に活かすことができるのか、という視点での研究につなげていきたい。研究計画はおおむね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。
シングルセルクローニング法を応用した口腔がん幹細胞の基礎的研究

口腔がんにおいて、抗癌剤を用いた治療で奏功するがんと抵抗性を示すがんがあり、この違いのひとつの原因はがん幹細胞の存在といわれている。本研究は、がんの根源となるがん幹細胞を含む、癌を構成するすべての細胞を根絶することを目標としている。そこで、抗癌剤の一つであるシスプラチンに対する感受性の異なる細胞株を樹立して、その違いに着目することで抗癌剤抵抗性のメカニズムを調べた。シスプラチンに抵抗性を示すがん細胞ではPTP4A1遺伝子の発現が亢進し、それによってAKTタンパク質が活性化してシスプラチンによるアポトーシスに対して抵抗性を示すメカニズムが明らかとなった。本研究は口腔がんにおいて、がん幹細胞を含む腫瘍を構成する全ての細胞を根絶することを目的としている。口腔癌細胞株HSC-3からシングルセルクローニング法を用いて、シスプラチンに対する抵抗性が異なる数種類の細胞株を得た。それぞれの細胞からcancer stem cell(以下CSC)を取り出すためにside population(以下SP)に相当する細胞群をFACS解析にて抽出した。申請者がシングルセルから細胞株を樹立した際には、播種したシングルセルの約10%から細胞株を樹立できたが、SPに相当する細胞は解析した細胞の0.6%であり予想に反して少なく、また細胞株間での差はなかった。このことは、培養細胞においてシスプラチンの抵抗性はSP、つまりCSCの細胞の数に依存しているわけではないことと、シングルセルクローニング細胞がSP細胞とは異なることを示唆している。CSCは、薬剤の細胞外への排出能が優れていることから、抗癌剤に抵抗性を示すことが知られている。そこで、細胞膜に局在し耐性株で強く発現するタンパク質のうち、PTP4A1に着目して研究を進めた。実際にEGFPタグを付加したPTP4A1は細胞膜に局在した。PTP4A1を強制発現させた細胞はシスプラチンに抵抗性を示し、これらの細胞はAKTの活性が亢進していた。またこれらの細胞をシスプラチンで処理するとPARPの活性が低下した。逆にPTP4A1をsiRNAにて発現を抑制すると、シスプラチンに対する感受性が増した。これらのことからPTP4A1の高発現している腫瘍ではシスプラチンに対して抵抗性を示し、またその発現を抑制するとシスプラチンの効果が増大することが示唆された。本研究は口腔がんのがん幹細胞を含む、腫瘍を構成する全ての細胞を根絶すること、あるいは抑制することを目標とし、そのためにがん幹細胞の性状を明らかにすることを目的としている。口腔癌細胞株HSC-3からシングルセルクローニング法を用いて数種類の細胞株を得た。成長の速度やシスプラチンの感受性が細胞間で微妙に異なったことから、それら細胞株は性質の異なった数種の細胞株と考えられた。申請者はシングルセルから細胞株を樹立した際に、播種した細胞の約10%から細胞株を樹立できたことから、HSC-3細胞におけるCSCの割合はその程度と見積もっていた。しかし、どの細胞株もSPに相当する細胞は解析した細胞の0.6%であり、予想に反して少なかった。このことは、培養細胞においてシスプラチンの抵抗性はSP、つまりCSCの細胞の数に依存しているわけではないことを示唆している。またシングルセルクローニングによって拾い上げたひとつの細胞は、確率的に考えてCSCとは限らないと考えられた。そしてCSCでない一つの癌細胞ーcancer cell(以下CS)から増殖した細胞はCSCにも分化できる可能性が示唆された。また培養細胞をシスプラチンで処理したときには、生存した細胞を0.6%以下になるようなシスプラチン濃度を使用して初めてCSCの耐性を調べることができることがわかった。また申請書の通り、CSCのシスプラチン耐性遺伝子をマイクロアレイで同定しても、それが本当に責任遺伝子であるかを判断することは困難を極めると考えられた。これらをシスプラチンにて処理し、それぞれの薬剤耐性を調べた。またHoechest33342にてFACS解析を行い、Side populationを選別したが、その割合は予想をはるかに下回る割合であった。しかしこの結果はとても示唆的で、上に記したようなことが考えられた。特にCSCの薬剤耐性を解析する実験系において、シスプラチン濃度の指標が明らかになったことは今後の実験に大きく寄与すると考えられる。当初の計画からは外れており方向修正を余儀なくされている状態ではあるが、独立したクローンから樹立した細胞の、シスプラチン感受性が異なること、そしてそれらは同程度のCSCを含んでいることが明らかとなった。さらに、先に示したFACSの実験においてABCトランスポーター阻害剤であるVerapamilを併用するとSPが消失することが明らかとなった。

これはVerapamilがCSCの薬物排泄能を阻害したことによると考えられた。それらを総合して(2)おおむね順調に進展していると自己評価を行った。Cancer stem cell(CSC)は排出能が亢進しているため、抗癌剤に抵抗性を示すと考えられている。Verapamilは抗不整脈薬の一つで、Ca2+チャネルを阻害するものと考えられており、マルチドラッグトランスポーターを阻害すると考えられている。実際、FACS解析においてVerapamilで処理した細胞はSide populationを消失した。このことから、シスプラチンとVerapamilを同時に使用することで、CSCの働きを抑制して抗がん剤の効果を高めることができると予想された。申請者はこれまでシスプラチンに対する内因性耐性遺伝子を幾つか同定しており、それらの発現をsiRANで抑制するとシスプラチン感受性が上昇することを明らかにしている。これらの効果をVerapamilがさらに増強するのかを調べる予定である。細胞を目で確認しながらシングルセルクローニングを行えるpico pipetは本年度購入予定であったが、購入前に実際にその機械を用いてデモを行ったところ、シングルセルから細胞株を樹立することが不可能であったため、購入を見送ることにした。そのぶんは細胞培養にかかる培地やプラスチック類、verapamilやトランスフェクション試薬などの薬品類を購入する予定である。またmRNAを抽出するためにRNeasy Mini kit (qiagen) cDNA逆転写酵素(toyobo)、リアルタイムPCR用ポリメラーゼ(toyobo)、免疫組織学的検討に用いる抗体を購入予定としている。今回の成果を発表するための学会参加も予定している。