hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子標的超音波造影剤を用いた非侵襲的分子イメージング法の開発

本邦で臨床使用可能な超音波造影剤Sonazoidを基盤とした分子標的気泡の作成の可能性について検討した。Annexin V、アビジン-ビオチン結合を仲介させることにより、Sonazoidの表面にIgG抗体を付加できることが明らかとなった。今後、Sonazoidを基盤とした分子標的気泡を利用した超音波分子イメージングの臨床応用が期待できる。本年度は、ボスファチジルセリン(PS)を殻成分に含有する微小気泡(Sonazoid)の表面にAnnexin V、アビジンービオチン結合を介して抗体を接着できるか否かについて検討した。Annexin VはCa^<2+>依存的にPSを認識する分子として知られているため、始めにCa^<2+>添加がSonazoidに影響を及ぼすか否かについて検討した。その結果、Ca^<2+>を添加することでSonazoid気泡は安定性を失い、明らかな気泡数の減少が観察された。これは、陰性に帯電し安定しているSonazoid表面がCa^<2+>により電気的に中和されることで気泡としての安定性を失った結果だと考えられる。そこで、気泡数の減少が最低限になるようなCa^<2+>濃度を実験的に見出し、抗体を接着させる実験へと移行した。Annexin V、アビジンービオチン結合を仲介させることにより、Sonazoidの殻表面に抗体を接着させることが可能であった。しかしながら、SonazoidとAnnexin Vの結合保持のためにはCa^<2+>が必要不可欠であり、その結果出来上がった分子標的気泡の気泡数は非常に少数であった。これらの結果より、PSとCa^<2+>依存的に結合するAnnexin VはSonazoidを基盤とした分子標的気泡の作成には不適である可能性が示唆された。そこで、Ca^<2+>非依存的にPSと特異的に結合する分子であるLactadherinに着目し、Lactadherinを用いた分子標的気泡の作成に着手している。予備的検討の結果から、Lactadherinを介した令子標的気泡の作成可能性が示唆された。今後in vitroやin vivoにおける検討へ移行していく予定である。本年度は、Annexin V及びアビジン-ビオチン結合を介した、ボスファチジルセリン(PS)を殻成分に含有する微小気泡(Sonazoid)を基盤とした分子標的気泡の開発の実現可能性を明らかにした(Otani K and Yamahara K. Mol Imaging Biol 2011; 13 : 250-6)。同時に、この検討によりAnnexin Vを介して作成した分子標的気泡はCa^<2+>の添加による気泡数の著しい減少など、臨床応用が困難であることが判明した為、Annexin Vの代わりにCa^<2+>非依存的にPSを認識する分子であるLactadherinに着目し、Lactadherinを用いた分子標的気泡の作成に着手した。Annexin Vと同様に、LactadherinはSonazoid中のPSと結合することが明らかとなった。また、Annexin VとPSの結合は脆弱であり、攪拌することでその結合が容易に外れたのに対して、Lactadherinは攪拌後においてもPSとの結合が保たれることが明らかとなった。これらの結果より、Sonazoidを基盤とした分子標的気泡の作成において、LactadherinはAnnexin Vよりも有用な分子であることが示唆された(Otani K. Ultrasound Imaging 2011, in press)。LactadherinはPSと結合すると同時に、血管新生と密接に関連する分子であるインテグリンαvβ3とも結合することが知られていることから、Lactadherinを介した分子標的気泡の新生血管特異的超音波造影剤としての可能性についてin vitroやin vivo実験にて現在検討中である。
改良V型成形爆破線による鋼板侵徹試験

研究目的バングラディシュやインドの海岸に多くの廃船が集められ、現地の人々が手作業で解体している実情があり、現地でも材料さえあれば簡単に製作できる簡易型のV型成型爆破線(LSC)を作製し、侵徹試験と数値解析による性能の評価を目的とした。研究方法簡易型LSCは、銅製のアングル板に爆薬を設置しただけの簡単なものであり、爆発によって金属同士が激しく衝突する仕組みになっている。衝突点からは指向性をもった金属の高速連続体(金属ジェット)が発生する。侵徹現象は、この超高温高圧の金属ジェットよって起こるものであるが、金属ジェットの発生やそれによる侵徹の現象を数値解析によって解く事は非常に難しく、汎用解析ソフトLs-Dynaによって解かれた事例はない。研究成果実験では、簡易型LSCによる侵徹試験を20mm厚の軟鋼板に対して行った。ジェットが成長するまでに適切な距離(時間)が必要であるとされているので、実験条件では、LSCと軟鋼板までの距離(10, 20, 30mm)を変化させた。それぞれの条件における侵徹深さは、14mm、20mm、20mmとなった。数値解析ではSPH法と呼ばれる大変形を得意とする手法を用いた。今回の試験では、ジェットの速度観測が出来なかったため、数多くの実験によって証明されたジェットの速度を求める公式を利用した。まずは、この公式によって導かれたジェットの速度と数値解析による速度の比較を行い、格子サイズやタイムステップ等を変化させ適切な解析モデルを作製した。その後、実験による侵徹深さと数値解析による侵徹深さの比較を行い、良好な一致を確認した。このことにより、Ls-Dynaによる数値解析の有効性が明らかとなり、この解析ソフトによるLSCの設計も可能であると考える。
ミツバチライフログ解析システムの開発

平成30年度は、ミツバチ領域検出の高精度化を目的として、深層学習の1手法である積層畳み込み自己符号化による、ミツバチ領域の教師なし学習を試みた。従来手法では十分な精度が得られなかったため、階層的に学習を行う、階層型積層畳み込み自己符号化器による表現学習手法を提案し、実験を行なった。得られた成果については平成31年度に発表する予定である。また平成30年度は、6月と9月の2回、約1ヶ月にわたり、ミツバチ巣内行動の自動記録を行なった。さらにはアルゼンチン・ブエノスアイレス大学のファリナ教授との共同研究として、事前の匂い学習に対する行動変化の観察実験を行うために、本研究のシステムを使用した。共同研究において得られた知見は後日公開する予定である。また、システム制御情報学会論文誌の解説論文ならびに月刊誌「昆虫と自然」の研究紹介記事を寄稿した。ミツバチ巣内行動自動観察システムの運用も4年目となり、種々の問題点も改善され、概ね安定して利用できており、これまでに数十TBのデータを撮りためることができている。これらの大量のデータから注目すべき時間帯・エリアを自動抽出する手法も確立したので、従来の目視による作業で要した労力を大幅に軽減することができた。現在は、さらに高精度な画像処理手法を検討している段階であり、最終年度での実現に向けて着々と進んでいる状況である。平成31年度は、階層型積層畳み込み自己符号化器による、ミツバチ領域の教師なし学習を大規模データに適用し、その有効性を示すことを試みる。さらにこれまで開発してきたシステムやプログラムの公開に向けて整備を進める予定である。これまで開発を進めてきた羽化後のミツバチの行動追跡手法の高速化を目的として,前処理による採餌関連行動区間の検出方法について検討し、切り出された区間に対して複数個体同時追跡手法を適用することを試みた。13時間分の映像データに対して実験を行い、大幅な実行時間の低減が可能であることを確認した。結果として長時間のデータからの行動抽出が可能となり、尻振りダンス軌跡だけでなく、振身ダンスの軌跡やダンス追随個体の軌跡も抽出できることが確認できた。またH29年度は9月末より11月頭までの約1ヶ月間にわたり、ミツバチ巣内行動自動記録システムにより動画撮影を行なった。撮りためたデータは約20TBである。H29年度の実験においては、RFIDタグに数字を印字したシールを貼り付けて個体識別を行なったが、印字された数字の視認に若干の問題が生じたため、改善が必要であることが示された。並行して採餌バチが持ち帰った花粉を採取し、色ヒストグラムにより花粉の種類を推定する手法について検討を行なった。これらをDNA分析することで種類を同定できるが、大量のサンプルを処理するには時間がかかりすぎるため画像処理による分類を試みた。予備実験の結果から、湿度や時刻等の花粉採取条件や撮影状況の違いが大きく影響するため、条件を一定にした上で撮影、分析する必要があることが分かった。これらの研究成果に関しては、電気情報関係学会九州支部連合大会等で口頭発表し、福岡大学工学集報に論文としてまとめた。当初予定していたARマーカによる個体識別は、撮影条件等の検討が必要であるため、引き続き検討することとした。一方、前処理による採餌関連行動区間の切り出しが有効であることが確認できたことから長時間の解析が可能となったため、当初予定のミツバチライフログの解析システム実現の見通しが立った。しかし採餌バチの識別のための紫外線画像撮影装置に関しては予備実験の域を出ておらず、今後引き続き検討が必要である。30年度は、深層学習の1手法である畳み込みニューラルネットワークを用いたミツバチ領域検出アルゴリズムを検討し、評価実験を行う予定である。すでに予備実験は済んでいるので実際の動画像に適用する。さらにARマーカの撮影条件の検討、紫外線画像撮影装置の検討を引き続き行う予定としている。最終年度の31年度には、それまでに開発・検討した手法を統合し、任意の時間・空間解像度による多角的な動画像観察ツールを開発し、その評価実験を行う。

平成31年度は、階層型積層畳み込み自己符号化器による、ミツバチ領域の教師なし学習を大規模データに適用し、その有効性を示すことを試みる。さらにこれまで開発してきたシステムやプログラムの公開に向けて整備を進める予定である。(理由)成果発表のための学会出張を3月に予定していたが、都合により日程があわず参加ができなかったことによる。(計画)30年度の成果発表の旅費に充てる予定である。(理由)成果発表のための国際会議での学会主張を予定していたが、都合により参加できなかったことによる。(計画)H31年度の成果発表の旅費に充てる予定である。
ソフトウェアの整合性証明情報を演繹的に用いた環境変化への妥協付き適応

本研究では、3つの問題の解決のための手法を開発する。第一に、「体系的に適切な適応を行うには?」という問題の解決のために、整合性を満たすような適応のパターンを定義する。第二に、「適応時に賢く妥協するには?」という問題の解決のために、パターンに基づいて仕様の証明情報の分析手法を提案し満たせる要求の判断を体系化する。第三に、「変化のあった側面のみに絞った適応を行うには?」という問題の解決のために、抽象化された仕様の上で行った適応を具体的な仕様に反映する手法を構築する。
「下請・系列取引」関係の変容と下請中小企業の自立的成長の課題

平成5年度平成7年度にわたる本研究は、バブル経済の崩壊とその後の景気低迷、急激な円高の進行、海外投資の急増と国内産業の「空洞化」、最近の円安と国内景気の回復基調といったいくつもの経済的環境条件の急変を刻印されたものとなった。その中で、機械系下請中小企業は需要の急激な低下とその後の回復といった目まぐるしい変化に晒されてきた。そのために、本研究の課題である「自立的成長」といった構造的問題が見えにくくなったことは確かである。しかし、日本経済の構造変化の下で機械系中小企業は、一方は自ら「自立化」の道を選択し、他方では発注政策の変化によってやむを得ず「自立化」の道を選ばされる、というふたつの選択に直面していた。そのどちらを選ぶのかは、機械系中小企業が保有する技術レベルにかかっていたといえよう。とりわけ、この技術は開発・設計にかかわるデジタル情報によるものであり、そのことが事例として金型製造業を選択した理由であもある。本研究では、金型製造業を事例に取り上げ、ことに企業間関係がデザイン・インからコンカレント・エンジニアリングへとシフトする中で、発注側大企業と受注側中小企業関係が変化する要因を「開発」の手法に求めた。そこから得られた知見は、機械系中小企業の「自立的成長」にとって技術レベルが、中でもデジタル技術での向上が不可欠だということである。そのことによって、機械系中小企業は発注側大企業のネットワークに参入し、高い技術レベルと独自のノウハウで持って対等な取引関係を築くことが可能となるの。平成5年度は研究目標に即して、主に自主研究として自責で行なってきた(91年より)ドイツでの下請・外注関係の整理を行ない、日本との比較研究を行なった。更に、日本における「下請・系列取引」の実態を「長期継続的取引」関係に重点を置き、既存の諸仮説を批判するという視点で事例的に明らかにした。(その場合、機械系工業を対象とした文献-資料に基づいた作業も導入した。)国内企業の下請・系列取引」の実態及びその変容については、ある程度経験調査を行なっているが、それを再度・本研究の目的に即して再構成し、必要な事例を追加調査して、更に確認をした。主な(研究)調査の対象は、家電・自動車、工作機械の最終完成品メーカーとその「下請・系列」中小企業部で、各階層に跨がる重点的な経験調査を実施した。又、調査対象に関連する人々の専門的知識の提供を求めるための個人的ヒアリングを行ない、実態調査・文献研究との融合をはかった。更に、既存の調査や私自身のこれまでの調査を再整理あるいは統計等の構成をするためにコンピューターを使って、統計的処理を行なった。平成5年度の研究は、本研究の目的に述べた仮説により、文献・資料分析、実態調査を通じて、日本の下請・系列取引関係の実態を把握しつつ、その変容過程と変容の論理を明らかにするという成果が得られた。本研究を企画した平成4年度はいわゆる「バブル景気」が崩壊し、日本経済が戦後まれな長期的でしかも深刻な不況を経験する出発年度となった。したがって、研究企画当初の見込みと研究対象の実態が大きく異なる面が生じてきた。たとえば、本研究の課題である「下請・系列取引」関係に関しては、日本経済がバブル景気から未曾有の不況に転じ、さらに円高の定着によって、むしろ「親企業」の側からの下請再編ともいうべき事態が、かつてない規模と質において行われてきた。この結果、中小企業の多くは否応なく「自立的」な発展方向を模索せざるを得なくなった。中小企業をめぐるこのような環境条件の変化は、本研究の出発段階では予想できなかったことである。そこで、平成6年度の研究においては、ことに中小企業の「自立的成長」を近年の海外直接投資、いわゆる「国際化」の動きと関連させて考察することを主眼に、研究・調査を進めた。平成6年度の本研究では、「下請・系列取引」関係にあった中小企業であって現在は国際的な生産展開を行っている事例を中心に分析研究を進めた。

対象として取上げた中小企業は、必ずしも「下請・系列取引」から離脱し「自立化」の道を歩んでいるとは限らないが、いずれにしても従来的な下請型中小企業とは質的に異なった性格の中小企業として捉らえることが可能である。そして、そのこと自体が中小企業の「自立的成長」のひとつの経緯を示している。すなわち、それら国際展開を行っている中小企業に共通するのは、第1に生産に関して日本国内と国外の機能分担=分業化を進め、国内にはより高次の生産機能やあるいは企画開発・設計機能を残し、国外には量産機能を移管するといった対応を行っていることである。このことは中小企業の「自立化」に他ならない。本研究の実績は、このような共通性と「自立化」の可能性を、事例に基づき豊富に明らかにしたことにある。平成5年から3ヵ年間にわたり実施された本研究は、経済成長にとって多大の貢献をなし、またそれ故に欧米先進工業諸国から「日本経済成長の秘密」として注目を集めたわが国の中小企業を、主に中小製造業に焦点を当て、特に昭和60年のプラザ合意以降の急速な円高の下で生起し始めていた下請・系列再編成と中小製造業の「自立化」に即して実証研究を試みたものである。本研究の狙いは、「下請・系列取引」の下にあった中小製造業が、日本経済の成熟化、国際化を含む経済環境条件の大きな変動の中で、「親」企業の側からする下請・系列再編成に翻弄されるのではなく、中小製造業の側から主体的な「自立化」を果たすことによって、日本経済の新しい成長に寄与し、国民生活の福祉に貢献する道を探ることにあった。しかし、そのためには本研究において、中小製造業が如何なる経済環境条件の下で、どの様に企業内経営資源を活用し、また外部経済を利用して「自立化」を果たすべきであるのか、またそのための政策的な課題は如何にあるべきか、という諸点をわが国中小製造業の存立構造と「下請・系列取引」関係変容の実態分析に立脚して明らかにする必要があった。しかし、バブル経済崩壊以降の厳しい経済不況、急激な円高の進行、大手製造業の生産拠点海外シフト、逆輸入の増加、産業「空洞化」などといった新しい経済的環境の生起は、本研究の課題である中小製造業の「自立化」の実態を複雑なものにしていた。したがって、本研究最終年度に当たる平成7年度の研究においても、研究の構想当初には大きな比重をおいていなかったそのような新しい経済的環境を考慮に入れ、自立的な成長を遂げつつある中小製造業のヒアリングを行った。その際に留意したのは、とくに東アジア市場とそれら中小製造業との関連である。そこで、本調査では(1)典型的な中小企業であり、かつ下請型の受注産業である金型製造業に焦点を当て、金型製造業における「下請・系列取引」変容の実態を明らかにすること、(2)金型製造業の最終ユーザーである自動車、家電産業での海外生産シフトの実情、(3)金型製造業の直接のユーザーである各種成形産業の国内生産拠点の最配置と海外生産シフトの実情、(4)金型製造業におけるそれらユーザー産業の動向への対応、(5)金型製造業における経営資源動員の実態と海外シフトへの対応、などを企業ヒアリング、文献調査に基づいて明らかにした。そこで得られた知見は、経営資源に占める研究開発並びに技術競争力はもちろん、従来わが国の中小企業相互間の取引において多くみられた所謂「取引ネットワーク」を創り上げ得るか否かが、「自立化」と企業成長に大きくかかわっているということである。
ヒト由来肝細胞の3次元培養法による肝特異蛋白産生機構の解析と大量蛋白生産法の開発-ラジアルフロー型バイオリアクター(RAD)による-

肝臓は血漿蛋白の産生臓器として重要な機能を有している。特にアルブミンは血漿蛋白の50%を占める重要な蛋白である。従来よりヒト由来の肝癌細胞株を用いて、ビタミンやホルモンによるアルブミンやAFPの産生の変化について検討してきた。さらにこの細胞をラジアルフロー型バイオリアクターを用いて3次元培養した際の、両蛋白の産生量の変化を検討した。ラジアルフロー型バイオリアクターによる培養細胞の3次元構築は、SEM TEMで確認し、球形の細胞の配列と、相互の細胞の緩やかな接着(接着装置の存在を認める)、細胞小器官の極性の存在を認めた。FLC4細胞の3次元培養では単位細胞あたりのアルブミン産生量は単層培養の6.9倍に増加し、AFPは400分の1に減少した。またFLC7細胞では3次元培養により、AFP産生が優位であったものがアルブミン産生優位となり、より正常肝細胞に類似の機能を発現すると考えられた。以上より、これら肝細胞の機能発現には、ホルモン、ビタミン、その他の生理活性物質だけでなく、細胞組織の3次元的構築が大きく関与することが明らかとなった。また肝由来蛋白である、thorombopoietinも本研究に用いた肝由来細胞株において産生され、その産生量はラジアルフロー型バイオリアクターを用いた際には、細胞数の増加、アルブミン産生量の増加に一致して漸増し、ほぼヒト正常肝の1日産生量に近い量を400mlバイオリアクターで産生可能であった。ラジアルフロー型バイオリアクターによる肝特異蛋白の高産生能が示された。従来よりヒト由来の肝癌細胞株を用いて、ビタミンやホルモンによるアルブミンやAFPの産生のの変化について検討してきた。今後これらの変化のメカニズムを明らかにしていく予定である。

ラジアルフロー型バイオリアクターによる肝特異蛋白の高産生能が示された。
硬骨魚類の陸生化に伴う飲水行動制御機構の進化

陸上動物や海生硬骨魚は乾燥や高浸透圧環境により、水分を失う。これを補うために、動物は飲水行動を行う。昨年度までの研究により、両生魚のトビハゼに哺乳類で見られるような、口腔の乾燥によって渇きが起こる機構があることがわかった。また、本研究によってトビハゼの口腔内で水を感知する機構が飲水行動の制御に重要であることがわかったので、その分子機構を解明することを試みた。淡水から海水まで異なる浸透圧環境の水を口に含ませられる水槽を製作し、その中でトビハゼがどの塩分の水を好んで吸水するか、すなわち塩分嗜好性を調べた。その結果、トビハゼは平均すると半海水の塩分濃度を好むことがわかった。次に、ホルモンによる塩分嗜好性の変化を調べたところ、アンジオテンシンによって塩分嗜好性が増加する一方、ナトリウム利尿ペプチドを投与しても塩分嗜好性は変化しなかった。同時にトビハゼの血中ナトリウム濃度の変化も調べたが、これらのホルモンの投与による有意な変化は見られなかった。これらのことから、トビハゼ口腔内に塩分を感知する機構があることが示唆された。近年、哺乳類やショウジョウバエにおいて塩味や酸味に関わるイオンチャネルが口腔内の水の受容にも関わることが示唆されているので、トビハゼにおいてもイオンチャネルが渇きの感覚に関与している可能性が考えられる。次なる課題としてはトビハゼが海水中のどのイオンに反応して吸水行動を行っているのかを調べる必要がある。また、口腔内に発現しているイオンチャネルなどの遺伝子を特定するためにトランスクリプトーム解析も現在行なっている。これらの研究から、トビハゼの飲水行動制御機構の全貌が明らかとなりつつある。本研究は、脊椎動物における陸生化にともなう渇きの進化を考える上で、ホルモンの脳に対する作用だけでなく、口腔内の水およびイオンの受容機構の重要性を示唆した点で意義深い。29年度が最終年度であるため、記入しない。脱水刺激で増加するアンジオテンシンIIというホルモンは、哺乳類で渇きを、ウナギで嚥下反射を惹起する。そこで、両生魚のトビハゼに、哺乳類のような渇きを惹起する機構があるのだろうか。このことを明らかにするため、アンジオテンシンIIをトビハゼの脳室内に投与したところ、陸から水への移動と嚥下(飲水)を促進した。アンジオテンシンIIの脳内作用部位を検討するため、トビハゼ脳における組織学的研究を行ったところ、アンジオテンシンIIは哺乳類の渇き中枢(第三脳室周囲器官)に相当する視索前野ではなく、嚥下中枢として知られる延髄最後野に作用し、飲水を促進することが示唆された。この結果と、トビハゼが陸上でも口の中に水を溜めるという習性に着目し、陸上滞在時における飲水量を測定したところ、アンジオテンシンIIは口腔内にためた水の嚥下を促進した。さらに口腔内の水を実験的に除去すると、直ちに水中への移動を促進した。また、トビハゼは陸上における摂食時に口腔内の水を利用することが知られているが、摂食により口腔内の水を失わせると水への移動が促進された。これらの結果から、口やのどの乾燥が感覚神経により知覚され、渇き様行動を惹起したことが示唆された。一方で、飲水を抑制するホルモンとして知られているナトリウム利尿ペプチド(ANP)はアンジオテンシンIIと拮抗的にはたらき、飲水を抑制した。その作用はアンジオテンシンIIと同様に延髄最後野を介することがわかったため、ANPも直接嚥下反射を調節することにより飲水を抑制することが示唆された。以上の研究から、トビハゼにおける飲水行動制御機構のうち、ホルモンによる制御の概略が明らかとなった。当初は、アンジオテンシンIIなどのホルモンが直接視索前野に作用してトビハゼの飲水行動を惹起するという仮説を立てており、脳内のホルモン作用部位とそこからの神経回路を解析することにより、トビハゼの「渇き」の神経基盤を明らかにする予定であった。しかし、そのような視索前野における作用機序は見つからなかった。そこで、トビハゼでは口腔内の水の嚥下が先におこり、口腔内の水がなくなると水場に移動するのではないか、という新しい仮説をたてた。その仮説のもとで新たに考案した行動学的実験を行うと、トビハゼの「渇き」は口腔内の乾燥情報が求心性神経を介して前脳に伝わることによって起こることが示唆された。このような神経性の渇きは哺乳類においても長らく軽視されてきたが、近年Nature誌にその神経回路にアプローチした論文が掲載されるなど、再び注目を集めている。このようにトビハゼを用いた本研究により、陸上動物における神経性の「渇き」の重要性が明らかとなった。すなわち、脊椎動物が陸上に適応するためには、ホルモンを脳内で感知することで起こる「渇き」よりも、口腔などの末梢において乾燥を感知することで起こる「渇き」の神経機構を獲得して飲水行動を発現させることが必須であるということが示唆された。この成果は研究計画時点では想定しておらず、順調に進んでいるといえる。

昨年度までの研究により、両生魚のトビハゼに哺乳類で見られるような、口腔の乾燥によって渇きが起こる機構があることがわかった。また、本研究によってトビハゼの口腔内で水を感知する機構が飲水行動の制御に重要であることがわかったので、その分子機構を解明することを試みた。淡水から海水まで異なる浸透圧環境の水を口に含ませられる水槽を製作し、その中でトビハゼがどの塩分の水を好んで吸水するか、すなわち塩分嗜好性を調べた。その結果、トビハゼは平均すると半海水の塩分濃度を好むことがわかった。次に、ホルモンによる塩分嗜好性の変化を調べたところ、アンジオテンシンによって塩分嗜好性が増加する一方、ナトリウム利尿ペプチドを投与しても塩分嗜好性は変化しなかった。同時にトビハゼの血中ナトリウム濃度の変化も調べたが、これらのホルモンの投与による有意な変化は見られなかった。これらのことから、トビハゼ口腔内に塩分を感知する機構があることが示唆された。近年、哺乳類やショウジョウバエにおいて塩味や酸味に関わるイオンチャネルが口腔内の水の受容にも関わることが示唆されているので、トビハゼにおいてもイオンチャネルが渇きの感覚に関与している可能性が考えられる。次なる課題としてはトビハゼが海水中のどのイオンに反応して吸水行動を行っているのかを調べる必要がある。また、口腔内に発現しているイオンチャネルなどの遺伝子を特定するためにトランスクリプトーム解析も現在行なっている。これらの研究から、トビハゼの飲水行動制御機構の全貌が明らかとなりつつある。本研究は、脊椎動物における陸生化にともなう渇きの進化を考える上で、ホルモンの脳に対する作用だけでなく、口腔内の水およびイオンの受容機構の重要性を示唆した点で意義深い。まずは得られた成果を数篇の論文にまとめるとともに、トビハゼの「渇き」のさらなる詳細な解析を行う予定である。具体的には、(1)口腔内の浸透圧環境を感知する神経回路、ならびに、(2)口腔内の浸透圧環境を感知する分子基盤の解析を目指す。(1)口腔内の浸透圧環境を感知する神経回路哺乳類においても、脳幹を中心として当該神経回路の解析がようやく進み始めている。それらの知見と、これまでトビハゼやウナギで調べられてきた延髄を中心とした飲水制御機構の知見を合わせ、脳神経や延髄から脳幹を介して情動を司る視床下部へと連絡する神経回路を調べる。解剖学的手法を用いたニューロンの投射領域の解析や、電気生理学的手法を用いた神経活動の変化の計測などを行い、「渇き」ニューロンを特定したい。(2)口腔内の浸透圧環境を感知する分子基盤口腔内の浸透圧環境、とくに水を感知する分子基盤は、脊椎動物においてまったく明らかになっていない。そこで手始めとして、トビハゼに異なるイオン環境の水を口に含ませたときの行動を解析することにより、水の組成変化に対する応答を調べる。その結果、特定のイオンに対する忌避行動や誘引行動が見られた際には、そのイオンの輸送に関わるチャネルに着目し、ノックダウン後の行動実験解析や、水チャネルであるアクアポリンとの相互作用について検討する。これらの実験により、口腔内の浸透圧変動を感知するために重要な受容器の実体を明らかにしたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。
B型肝炎ウイルスの感染機構の構造基盤

B型肝炎ウイルス(HBV)の感染により発症する慢性B型肝炎は、肝癌や肝硬変のリスク因子である。現在の治療薬は核酸アナログとインターフェロンのみであり、ウイルスを排除できないことが問題である。そこで本研究では、HBV感染の構造メカニズムを明らかにし、治療薬創製の構造基盤を得ることを目指した。感染に重要なHBVの外殻タンパク質であるpreS、preS1、preS2の大量調製法を確立し、NMRシグナルの帰属を行うことで、HBV受容体であるNTCPとの相互作用解析の準備が整った。NTCPは大腸菌での発現に成功した。B型肝炎ウイルス(HBV)に対する治療薬の開発は、全人類の課題である。HBVの感染は、HBVの外殻タンパク質が、肝細胞に特異的に発現しているNa+・胆汁酸トランスポーター(NTCP)と結合して細胞内に侵入することにより引き起こされる。したがって、HBVの外殻タンパク質とNTCPの結合様式を原子分解能で明らかにすることは、その結合の阻害に基づく画期的治療薬の開発に有用である。本年度は、NTCPとの結合に重要なHBVの外殻タンパク質のpreS領域の大量発現・精製法を確立した。PreS領域の1H-15NHSQCスペクトルを測定し、理論数とほぼ同じ数のNMRシグナルが観測されていることを確認した。また、NMRシグナルが1Hの化学シフト値で狭い範囲に分布したことから、preS領域は単独では立体構造を形成していないことが分かった。現在、NTCPとの結合に重要なpreS1のNMRシグナルの帰属を進めている。帰属を確立できれば、NTCPとの相互作用を原子レベルでの解析するための基盤を得られる。すなわち、NTCPの添加によるpreS1のNMRシグナルの変化を解析することで、NTCPとの結合に寄与するpreS1上の残基を特定することができ、また、NMR法により分子内・分子間NOEシグナルの検出を行うことで、複合体の立体構造情報を得ることができる。HBVのLタンパク質全長およびSドメインは発現系を確立し、目的タンパク質の発現をCBB染色で確認した。今後、精製法の確立・立体構造解析を進める予定である。NTCPは発現系を確立し、目的タンパク質の発現をウェスタンブロット法により検出した。立体構造解析に向けて、収量増大の検討・精製法の確立を進めている。HBV外殻タンパク質の調製に関して、preS領域は良好なNMRスペクトルの観測に成功しているため、NMRシグナルの帰属は比較的容易である。また、発現に困難が予想されたLタンパク質全長やSドメインについてはCBB染色で発現を確認できているため、構造解析に適したサンプルを調製できる可能性は比較的高いと考える。NTCPの調製については、申請者の所属する研究室では発現量の増大や精製法の確立が必要であり、困難が予想される。しかし、共同研究者が大量調製に成功しているため、情報や試料提供を受けることで、研究を進展させることが期待できる。慢性B型肝炎は肝癌や肝硬変のリスクを高める。現在のB型肝炎治療薬は核酸アナログとインターフェロンのみであり、B型肝炎ウイルス(HBV)を排除できないため、新規作用点を持つ治療薬の開発が求められている。HBVは、その外殻タンパク質が、Na+・胆汁酸トランスポーターであるNTCPと結合することで肝細胞に侵入する。そこで、HBVの外殻タンパク質とNTCPの結合様式を原子分解能で明らかにし、その結合を阻害することによる画期的治療薬の創製を目指した。NTCPとの結合に重要なHBV外殻タンパク質のpreSは、大腸菌発現系を用いた大量調製法を確立した。PreSは、preS1とpreS2に分けられる。PreS、preS1、preS2のそれぞれの1H-15N HSQC測定による溶液NMR解析を行ったところ、preSはpreS1とpreS2のスペクトルとよく重なった。このNMRシグナルは、1Hの化学シフト値で狭い領域に分布したことから、これらが単独状態では特定の立体構造を形成していないことが分かった。13C, 15Nで安定同位体標識したpreS1とpreS2を用いて、三重共鳴測定によりNMRシグナルの帰属を確立した。また、HBVの感染に重要なpreS1のN末端ミリストイル基について、ミリストイル基転移酵素を大腸菌発現系で調製し、in vitroにおいてミリストイル化を行う方法を確立した。ミリストイル化preS1(myr-preS1)は水溶性が低下しており、界面活性剤ミセルとの相互作用の溶液NMR解析から、preS1の残基番号2-78の領域が膜と相互作用することが示唆された。以上によりNTCPとの相互作用解析に向けた準備が整った。NTCPは大腸菌発現系での調製法確立を進めており、精製法確立に取り組んでいる。NTCP調製の報告がある無細胞発現系の利用にも着手したため、今後検討を進める。

HBV外殻タンパク質について、preS領域のNMRシグナルの帰属を行い、NTCPとの相互作用のNMR解析を行う。Lタンパク質全長やSドメインについては精製法を確立し、NTCPとの相互作用解析を行う。NTCPについては、発現・精製法の検討を進める。上述の解析に用いるサンプルは、調製が間に合わない場合には、共同研究先から入手して行う。構造生物学研究を進めた結果、一部の設備備品は購入が不要になったため。研究計画の遂行には、今後、予定よりも多額の界面活性剤や脂質などの消耗品が必要になることが分かったため、これらの消耗品を購入する予定である。
鶏のカンピロバクター感染に関する研究

現在、Campylobacter jejuniによる食中毒が問題となっている。原因食品が特定されない場合も多いが、感染源のひとつとして鶏肉が重要視されている。しかし、本菌の広範な疫学調査や鶏の保菌に至る要因の特定には培養検査が必要とされるが、多検体を処理することが難しく、問題の解明に至っていない。DNA-DNAハイブリダイゼーション法は検出感度が高く簡便で多検体処理が可能な方法とされているので、この方法が野外材料からのC.jejuniの検出に適用できるか否かについて基礎実験を行い、さらに同方法を用いて入雛から出荷までのブロイラーにおけるC.jejuniの保菌状態について調査し、保菌に至る要因を検討した。C.jejuni subsp.jejuni ATCC33560を用いてニックトランスレーション法によりビオチン標識DNAプローブを作成し、9種の細菌を対象にコロニーハイブリダイゼーションを実施してその特異性を調べたところ、わずかにC.coliと反応を示したのみで他種との交差反応は認められなかった。また、C.jejuni陰性の鶏糞便を用いた場合でも発色はみられず鶏糞便中の他の菌種とも交差しないことが明らかになった。C.jejuni陰性の鶏糞便の希釈系列にC.jejuni菌液を加えた試料を用いて検出感度を調べた結果、すべての希釈系列でそれぞれ期待した数の発色スポットがみられ、雑菌が倍地上一面に広がりコロニー判別が不可能な場合でも確実にC.jejuniを検出できることが明らかになった。さらにこの方法を用いてブロイラーにおけるC.jejuniの保菌状態を調査したところ、入雛直後の雛から陽性例が認められ出荷時にはほとんどの雛が陽性を示した。このことから、ブロイラーは早期にC.jejuniに汚染されていることが示唆され、本法が従来の培養法より高感度であることが明らかになった。今後、孵化場におけるC.jejuni汚染状況の調査や垂直感染の可能性についての再検討が必要と考えられる。
口腔扁平上皮癌におけるp27kip1蛋白発現とアポトーシスにおける検討

CDKインヒビターは,細胞周期の進行に重要な役割を果たすサイクリン/CDK複合体に結合し,そのキナーゼ活性を阻害する一連の細胞周期調節タンパク質で,G1期からG1/S移行期にかけての細胞周期の制御に関わるとされている.CDKインヒビターの一つであるp27kip1は細胞周期を負に制御する因子とされており,胃癌,食道癌,大腸癌,肺癌などでp27kip1蛋白発現の減弱が悪性度や予後と相関するとの報告がみられる.そこで今回,口腔扁平上皮癌におけるp27kip1蛋白の発現を免疫組織化学的に検討した.対象は当科で加療を行った扁平上皮癌症例55例で生検標本を用いた.方法はパラフィン包埋ブロックを用いて免疫染色を行った.用いた抗体は抗p27抗体(DAKO,100倍希釈),抗Ki-67抗体(Novacastra,400倍希釈)で,LSAB法にて行った.p27kip1のL.I.は正常粘膜上皮で51.8±8.5%,扁平上皮癌では30.1±17.4%(中間値30.2%)であり有意に減弱していた.逆にKi-67の発現率は正常粘膜上皮に比較し有意に増加していた.p27kip1の陽性率と腫瘍進展度,リンパ節転移,分化度,浸潤様式について検討したが,これら臨床病理組織学的因子との間に明らかな関連性は認められなかった.また,p27kip1とKi-67の発現との間にも明らかな相関関係は認められなかった.p27kip1の発現率について中間値30.2%を基準に陽性群と陰性群に分類し,5年累積生存率を検討したところ,陰性群が生存率がやや低い傾向にあったが統計学的に有意差はなかった.以上のことから,口腔扁平上皮癌では正常粘膜に比べp27kip1の発現が減弱してることから,細胞周期の制御に何らかの異常をきたしている可能性は考えられるが,さらに他の細胞周期制御に関わるタンパクとの関連性について検討する必要があると思われた.アポトーシスとの関連については現在検討中である.Cyclin dependent kinase(CDK)インヒビターは細胞周期の進行に重要な役割を果たすサイクリン/CDK複合体に結合し細胞周期の制御に関わるとされている.CDKインヒビターの一つであるp27は細胞周期を負に制御する因子であり,これまでに悪性腫瘍におけるp27蛋白の免疫組織化学的検討において予後との関連性が報告されており,今回,我々は口腔扁平上皮癌におけるp27蛋白発現の検討を行っている.対象は当科において加療を受けた扁平上皮癌症例55例である.パラフィンブロックより約4μmの切片を作製し,免疫染色を行った.一次抗体として抗p27抗体(DAKO100倍希釈),および抗Ki-67抗体(Novacastra400倍希釈)を用い,LSAB法で行った.両抗体ともに腫瘍細胞の核に反応が認められ,p27においては浸潤リンパ球にも反応を認めた.検索方法は腫瘍細胞約1000個における陽性細胞数の割合を算出した.p27蛋白の発現はすべての症例において発現が認められたが,正常粘膜に比較し全体に発現は弱い傾向にあった.その発現率は3.4%74.0%であった.現在,臨床病理組織学的因子,生存率およびKi-67との関連について検討中である.CDKインヒビターは,細胞周期の進行に重要な役割を果たすサイクリン/CDK複合体に結合し,そのキナーゼ活性を阻害する一連の細胞周期調節タンパク質で,G1期からG1/S移行期にかけての細胞周期の制御に関わるとされている.CDKインヒビターの一つであるp27kip1は細胞周期を負に制御する因子とされており,胃癌,食道癌,大腸癌,肺癌などでp27kip1蛋白発現の減弱が悪性度や予後と相関するとの報告がみられる.そこで今回,口腔扁平上皮癌におけるp27kip1蛋白の発現を免疫組織化学的に検討した.対象は当科で加療を行った扁平上皮癌症例55例で生検標本を用いた.方法はパラフィン包埋ブロックを用いて免疫染色を行った.用いた抗体は抗p27抗体(DAKO,100倍希釈),抗Ki-67抗体(Novacastra,400倍希釈)で,LSAB法にて行った.p27kip1のL.I.は正常粘膜上皮で51.8±8.5%,扁平上皮癌では30.1±17.4%(中間値30.2%)であり有意に減弱していた.逆にKi-67の発現率は正常粘膜上皮に比較し有意に増加していた.p27kip1の陽性率と腫瘍進展度,リンパ節転移,分化度,浸潤様式について検討したが,これら臨床病理組織学的因子との間に明らかな関連性は認められなかった.また,p27kip1とKi-67の発現との間にも明らかな相関関係は認められなかった.p27kip1の発現率について中間値30.2%を基準に陽性群と陰性群に分類し,5年累積生存率を検討したところ,陰性群が生存率がやや低い傾向にあったが統計学的に有意差はなかった.以上のことから,口腔扁平上皮癌では正常粘膜に比べp27kip1の発現が減弱してることから,細胞周期の制御に何らかの異常をきたしている可能性は考えられるが,さらに他の細胞周期制御に関わるタンパクとの関連性について検討する必要があると思われた.アポトーシスとの関連については現在検討中である.
大強度紫外線源を用いた光電離プラズマの研究

本研究の目的はプラズマを紫外線源として用い,光電離プラズマを発生させその物理過程を明らかにすることである。プラズマを紫外線源とするためには,電子密度1×10^<19>m^<-3>電子温度10eV以上のプラズマが必要となるが,従来のプラズマ生成法ではその実現は困難であった。本研究では,電子サイクロトロン波を採用して高密度プラズマを生成し,プラズマ電流によるジュール加熱入力も併用する方式を目指した。そのため,特殊な構造のマイクロ波ランチャーが必要で,その開発を行った。新しいランチャーを用いてプラズマ発生実験を行ない,高密度プラズマ(1×10^<19>m^<-3>)が生成される事を確認した。また,プラズマ中に電流を流す実験も行い,20A程度まで通電できることを確認した。現在,100A通電のために改良を行っている。
巨大分泌蛋白質リーリンによる、脳のレイヤー構造形成制御の分子機構

リーリンは脳のレイヤー構造形成に必須の分泌蛋白質であるが、その詳細な機能及び情報伝達機構は不明である。我々は、リーリンのC末端領域が、リーリン受容体とリーリンの間の相互作用を安定化させること、これによりレイヤー構造形成制御に関わることを見出した。また、リーリンを特異的に分解する酵素の同定に成功した。最後に、リーリンがいつ・どの細胞に受容されるのかについて解析し大脳・小脳ともに、移動神経細胞の初期からその機能を発揮していることが示唆された。3,461アミノ酸残基からなる巨大分泌蛋白質リーリン(reelin)は脳のレイヤー構造の形成を司る分子であり、その遺伝子変異は脳の形成異常を引き起こす。一般にリーリンは、移動神経細胞上に存在する受容体(リポ蛋白質受容体ファミリーに属する、ApoE受容体及びVLDL受容体)に結合して、細胞内蛋白質Dab1のリン酸化を引き起こし、それが下流シグナル活性化へつながるとされている。リーリンは分泌シグナルを含むN末端領域、8回の繰り返し構造(リーリンリピート)、及び塩基性アミノ酸残基に富むC末端領域(CTR)からなる。CTRは32アミノ酸残基であり、その一次構造は爬虫類以上の全ての動物種で完全に保存されている。本研究では、CTRの機能に着目して解析した結果、意外なことにCTRの一次構造や、CTRが高度に塩基性であることはリーリンの分泌に必ずしも必須ではないことが明らかとなった。その一方で、CTRは、リーリンの受容体を介した下流情報伝達系の効率的な活性化に必要であることが強く示唆された。この点では特にCTRが塩基性アミノ酸残基に富むことが重要であると考えられる。さらに、小脳におけるリーリン受容体の局在について、アルカリフォスファターゼとリーリンの融合蛋白質を作製して検討した。その結果、少なくとも生後の小脳においては、リーリン受容体は従来考えられていたようにプルキンエ細胞に発現しているのではなく、主に内顆粒細胞層に存在していることが明らかとなった。本研究では、CTRの機能に着目して解析した結果、意外なことにCTRは分泌に必ずしも必須ではないことが明らかとなった。一方でCTRは、リーリンの受容体を介した下流情報伝達系の効率的な活性化に必要であること、これはおそらく細胞膜上に存在する何らかの共受容体への結合によるものであることがわかった。さらに、機能的なリーリン受容体の局在について、アルカリフォスファターゼとリーリンの融合蛋白質を作製して検討した結果、生後の小脳においては、リーリン受容体は従来考えられていたようにプルキンエ細胞に発現しているのではなく、主に内顆粒細胞層に存在していること、大脳皮質では、比較的移動初期にある細胞が高く受容体を発現していることが明らかとなった。哺乳動物の大脳皮質及び小脳にはそれぞれ特徴的なレイヤー(層)構造があり,脳の正常な機能発現に極めて重要な役割をもつ。巨大分泌蛋白質リーリンはこのレイヤー構造形成に必須である。しかし現在に至るまで,リーリンの寿命や拡散制御のメカニズム,シグナル伝達機構の全容は明らかではなく,これらの現象の包括的理解には至っていない。リーリンのC末端領域(CTR)は塩基性アミノ酸に富む特徴的な構造を持っており,その成熟蛋白質における有無はalternative splicingによって決定される。CTRは従来,分泌に必須であると信じられてきたが,我々はCTRが分泌には直接必須ではないことを明らかにした。そして,CTRは細胞膜上にあるリーリン受容体とリーリンの間の相互作用を安定化させることを新規に見出した。以上の結果から,CTRはおそらく陰性荷電の細胞外基質に結合し,リーリンと受容体との結合(または拡散)を制御していることが示唆された。リーリンには二種類の受容体が存在し,リーリンがいつ・どの細胞に受容されるのかについては現在なお決着していない。そこで,リーリンの受容体結合部位とアルカリフォスファターゼの融合蛋白質(APリーリン)を利用して,リーリン受容体の機能的発現部位同定を目指した。その結果,大脳では,脳室に近い層が強く染色され,表層側はほとんど染色されなかった。リーラー(リーリン欠損)マウスでは逆に,表層にいくほど濃い染色が観察された。

さらに,リーラーマウスとほぼ同じレイヤー形成異常を呈するDab1欠損マウスの大脳皮質を染色したところ,むしろ野生型に近い染色像を示した。以上の結果から,リーリン受容体はリーリンに結合することでダウンレギュレーションを受けることを意味しており,リーリンの機能を考える上で極めて重要である。大脳皮質及び小脳にはそれぞれ特徴的なレイヤー(層)構造があり、脳の正常な機能発現に極めて重要な役割をもつ。リーリンはこのレイヤー構造形成に必須の分泌蛋白質である。我々は、リーリンのC末端領域(CTR)が、細胞膜上にあるリーリン受容体とリーリンの間の相互作用を安定化させることを既に見出した。そこで、CTRを特異的に欠損する遺伝子改変マウスを作製し、その生理定義を検討した。その結果、このマウスでは、遅生まれの神経細胞のレイヤー構造が特異的に障害されていることが判明した。CTRは、表層付近での「強いシグナル」を介して、レイヤー構造形成制御に関わることが示唆された。また、リーリンの分解機構についてはほとんど判っていなかった。我々は、リーリンを特異的に分解する酵素の同定を目指し、大脳初代培養神経細胞の培養上清から精製を行い、その候補分子の同定に成功した。現在、この候補分子について、さらなる解析を続けている。また、リーリンがいつ・どの細胞に受容されるのかについて解析した結果、大脳では、脳室に近い層で受容されること、リーラー(リーリン欠損)マウスではリーリン受容体のダウンレギュレーションが起きず、受容体が過剰に発現していることを見出した。さらには、リーリンがエンドサイトーシスされた後、N末端を含む断片だけが再放出されることも見出した。これらの知見は、リーリンの機能が様々なレベルで複雑に制御されていることを意味しており、その機能を考える上で極めて重要であると推察される。そこで、CTRを特異的に欠損する遺伝子改変マウスを作製し、その生理的意義を検討した結果、CTRは、「強く局在したシグナル」を介して、レイヤー構造形成制御に関わることが示唆された。このとき、標的細胞は少なくとも2種類あることを見いだしまた、CTRに特異的に結合する分子をスクリーニングし、その候補分子を得た。現在、その妥当性の確認を進めている。分泌されたリーリンによるシグナルのスイッチオフ機構については今までほとんど判っていなかった。我々は、リーリンを特異的に分解する酵素の同定を行い、ほぼこれに成功した。また、今まで知られていなかった新規分解部位をC末端領域内に見いだした。この分解を担うプロテアーゼの一群も同定し、さらに、この分解によってリーリンの拡散が制御されている可能性を見いだした。最後に、リーリンがいつ・どの細胞に受容されるのかについて解析した。
経営品質の構造化と評価方法に関する研究

現在、日本企業に求められている持続的成長と競争力向上のためには経営品質を的確に評価し、その結果に基づき、経営改善や革新を行わなければならない。本研究はこのために経営品質の構造化を行い、経営品質の評価方法を開発した。具体的な研究実績は以下の通りである.(1).経営システムモドルの作成経営品質を評価するためには経営品質を構造化し、経営品質の構成要素を明らかにし、その構成要素を的確に評価する必要があるが、本研究では経営をシステム的に把握し、経営システムとしての構造化を行った。その結果、経営システムはドライバー、イネーブラー、結果系の3クラスターから構成され、それぞれを階層的に構造化できた(経営システムモデル)。(2)経営品質の評価方法の調査経営品質の独自の評価方法を確立するためにMB賞、日本経営品質賞など既存の評価方法を調査し、それぞれの特徴と問題点を明らかにした。(3)経営品質の評価方法の開発上記の経営システムモデルに基づき、構成要素の評価項目についてそれらの評価方法、評価基準を考案した。これらの評価方法は既存の評価項目や評価方法の問題点を改善し、将来の持続的成長に必要な経営品質の評価方法である。(4)評価モデルの構築考案した評価方法を具体化し、評価基準も開発し、自己評価可能な評価モデルを構築した。この構築にあったっては定量的な5段階のスコアリング評価手法を確立し、具体的なチェックシート(評価表)を作成した。(5)評価方法の検証と完成構築した評価モデルの妥当性を検証し、実用化を図るためにいくつかの企業で本評価モデルを検証し、その結果を踏まえ評価方法を改善し、実用化した。今、日本企業に求められている持続的成長と競争力向上のためには経営品質を的確に評価し、その結果に基づき、経営改善や革新を行わなければならない。本研究はこのための評価方法の開発を目的とする。今年度の研究実績は以下の通りである.1.企業経営の今後の環境の変化を予測し、直面している経営課題を整理し、明らかにした。2.経営品質を評価するためには経営品質を構造化し、経営品質の構成要素を明らかにし、その構成要素を的確に評価する必要がある。本研究では経営をシステム的に把握し、経営システムとしての構造化を行った。その結果、経営システムはドライバー、イネーブラー、結果系の3クラスターに分割でき、それぞれカテゴリー、要素などに階層的に構造化できた。3.経営品質の独自の評価方法を確立するためにMB賞、日本経営品質賞など既存の評価方法を調査し、それぞれの特徴と問題点を明らかにした。4.上記の調査結果に基づき、独自の評価方法のコンセプトを考案した。以上の研究成果を次節で述べるように日本品質管理学会、アジア品質管理シンポジウムで発表した。またこれらを取り入れた著書(単行本)を出版した。昨年度は経営品質の構造化を行い、独自の評価方法コンセプトを構築したが、それを受けて今年度の研究実績は以下の通りである.(1)経営品質の評価方法の開発昨年度の研究成果である経営品質の構造化(モデル化)とその基本的な評価項目についてそれらの評価方法、評価基準を考案した。(2)評価モデルの構築上記(1)で考案した評価方法を具体化し、評価基準も開発し、自己評価可能な評価モデルを構築した。(3)評価モデルの検証と完成上記

(2)で構築した評価モデルの妥当性を検証し、実用化を図るためにいくつかの企業で本評価モデルを用いた評価を実施する。また学会等で本評価モデルを発表し、有識者、関係者からの評価コメントを求めた。それらの結果を踏まえ評価モデル、評価表を改善し、実用的なものとした。
蝸牛外有毛細胞細胞膜モーター蛋白質のクローニング

モルモット蝸牛より、顕微鏡下に主に外有毛細胞と周辺の支持細胞からなる細胞塊を採取した。PCRを行わず菫接二重鎖cDNAを作製した。これを平滑末端にてプラスミドベクターpKF3に連結し、大腸菌に形質導入しコロニーを採取した。1567個のコロニーを解析したところ、1028個にcDNAの挿入が確認された。挿入断片の長さは様々であったが、おおよそ200bp以上のクローンを解析することとした。結果として175個の塩基配列を解読した。ベクター由来の配列は7個、rRNA由来の配列は18個であり、そのほかの150個がモルモットcDNA由来の配列と考えられた。ホモロジー解析の結果、ベータグロビン遺伝子と思われるクローンが最も多く検出された。150個のうち58個はオープンリーディングフレームを持ち、蛋白質コード領域の可能性があった。これらの中でモチーフ解析を行い、膜蛋白の可能性を有するクローンは8個であった。クローンの多くは非翻訳配列であると予想されるため、オープンリーディングフレームを持たないクローンも解析していく必要があると考えられた。この点についてはRT-PCR法にて解析中である。現在の段階では外有毛細胞モーター蛋白質cDNAを同定することはできなかったが、それに繋がる有益な情報を多く得ることができた。このような蝸牛のショットガンクローニングは海外で行われているがmRNAが少量のためcDNAをPCRで増幅している。そのため、蝸牛での発現量を正確に反映しているとはいえない。今回の研究ではPCRを用いていないためより正確なmRNAの発現状況に関するデータを集めることができた。
高等植物の雌雄性分化における植物ホルモンの作用機作

我々は、キュウリの茎頂部より雌雄性を制御している可能性のある新規ACC合成酵素遺伝子(CS-ACS2)をクローニングした。一方、Trebishらにより、別のACC合成酵素遺伝子(CS-ACS1)が単離された。この遺伝子は混性型キュウリでは1コピーで存在するのに対し、雌性型キュウリにおいてはCS-ACS1以外に性発現性御遺電子(F遺伝子)とリンクするCS-ACS1Gが存在することが明らかにされている。そこで、キュウリの雌花発現へのこれらの遺伝子の関与の有無を検討するために、雌性型(FF)と昆性型(ff)の準同質遺伝子系統の茎頂部におけるCS-ACS1(CS-ACS1G)とCS-ACS2の発現パターンをRT-PCR法により調べた。その結果、CS-ACS1(CS-ACS1G)の発現が雌性型の茎頂部より検出された。この結果より、CS-ACS1GがF遺伝子自身であり、雌性型は茎頂部でCSACS1Gが発現しているために雌花のみを形成すると考えられた。一方、混生型の茎頂部ではCS-ACS1の発現はほとんど検出できないのに対し、CS-ACS2の茎頂部での発現は性発現パターンと相関を示した。以上の結果は、混生型キュウリではCS-ACS2が雌花発現に関与している可能性を示唆している。さらに、茎頂部内において、CS-ACS1とCS-ACS2は将来雌花になる花芽において発現しており、花芽におけるACC合成酵素遺伝子の発現が、エチレン生成を介して、雌花発現を誘導する可能性が示唆された。キュウリ性発現機構におけるエチレンの作用機構を解明するために、下位節に雄花のみをつけるキュウリ(霜不知)の茎頂部にEthephon(エチレン発生剤)を処理することで雌花を誘導しこの際に発現の変化する遺伝子をDifferential(DD)法により単離し、雌花化誘導時に発現が変化する遺伝子17個確認できた。
窒素および酸素をドナー原子として有する混合金属クラスターの合理的合成法の確立

窒素や酸素を配位原子とするハードな配位子を含む後周期遷移金属多核錯体は、機能性材料などへの利用の可能性から合成法開発が望まれている。本研究では特徴ある三次元構造と高い機能とを持っ混合金属クラスターを精密合成する方法を開発することを目指して、シアナミドおよびホスホナト架橋錯体の新規合成と特性の開発を検討した。