hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心的外傷経験が行動と情動に与える影響について:乳児院群と家庭群の比較

これらの尺度は、02歳児用、35歳児用、障害児用の3種作成されている。本尺度からは、心的外傷障害を疑う行動・情動の様子や愛着障害に関連する行動様態などが、抽出される予定である。なんらかの問題を持つ乳幼児の場合と、そのような問題を持たない乳幼児の場合とを比較できるようにも工夫されている。この尺度の最終的な目的は、一般的な保育所や幼稚園などで、早期に虐待を推測させる行動をとる乳幼児を、保育者が弁別できる項目を選定し、チェックリストを作成することである。2)2番目に行っている研究は、乳児院における保育者への介入的な活動である。乳児院保育者約25名に質問紙調査を行い、現在の労働形態、保育における問題や課題、疲労度などを尋ねた。被虐待児や他の問題を持つ乳児に対するかかわりにおいて、14年度の聞き取り調査からいくつかの課題があがってきていたが、それらが保育者自身の就労の状況に対する意欲や認識を抜きには考えられないことがわかったので、この調査を行った。そこから、疲労度が激しい保育者が数名いたこと、子どもの保育について乳児院独特の課題などを理解している者とそうでない者との差が大きいことなどがわかった。これらのことは、乳児がなんらかの心的外傷や愛着障害を持って入所した後に、それらの問題がうまく解決されないことを予測される。心的外傷や愛着障害の有無について、保育者が理解し、適格なかかわりをするというためにも、チェックリストの活用が必須であることがわかった。16年度においては、15年度に配布回収した質問紙データの分析を引き続き行った。虐待された乳幼児にとっては、PTSDの影響も確かにあるが、もう1つの重大な点である、関係性のゆがみや愛着障害についてはあまり分析されずにきていた。そこで、本研究はその後者を十分に取り入れた上で検討をしてきた。劣悪な孤児院などで見られる愛着未成立障害については、今回の家庭養育を受けている子どもを対象とした保育士による調査では、抽出されなかったのは当然といえば当然であろう。しかし、次の基準である、特定のアタッチメントは示すもののそれが深刻なまでに不健康な関係である安全基地行動の歪曲については、いくつかが因子として見つかった。特に明確な結果は、Self-endangerment(過剰な危険行動)やInhibition(抑圧)、あるいは、Vigilance/hypercompliance(親に対する警戒・過剰応諾)であった。また、無差別的友好態度も見られたが、これは、親を意識しながら行われているところで、いわゆる、愛着未成立障害の中の無差別的な友好性とは別個に考えられるものだろう。3番目の不健康なアタッチメント関係を示す「混乱性愛着障害」については、明確な結果が得られなかった。トラウマ反応については、0-2歳の群でも3-5歳の群でも、心理的な虐待をされているのではないかと疑われる子どもにもっとも多くの特徴が保育者によって認識されていることがわかった。たとえば、心理的虐待がない子に比べて、その虐待がある子には画一的な遊びをする、過去が今起こっているような感じを受ける、用心深い、集中できない、気になる癖がある、からだの引きつりがある、等が顕著であった。次には身体的に虐待されたと思われる子どもも、類似の行動特徴を示すと認識されていた。虐待は単発で起こるよりも複数のタイプが混在して起こるので、症状の重なりはそのような背景を示唆すると思われる。
グルタチオンを用いて植物に蓄積するカドミウムの量を減らす－その分子機構の解明

食の安全性に対する関心が高まりを見せている中、有害重金属元素であるカドミウムの含量が低い農作物を栽培する技術を確立することは喫緊の課題となっている。これまでの研究によって植物の根に部位特異的に与えたグルタチオンが植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を選択的に抑制する現象を見出している。この現象の分子メカニズムを解明し、応用展開することで、カドミウム蓄積量の少ない農作物の新しい栽培技術を確立することが期待できる。本研究では、この現象が起こる要因のひとつがグルタチオンによる植物の根からのカドミウムの排出の活性化であることが明らかになった。本研究の目的は、生物界に広く分布する生理活性物質であるグルタチオンを植物の根に部位得的に与えることによって植物体の地上部に蓄積するカドミウムの量が低減する現象の分子メカニズムを明らかにすることである。平成23年度は、それぞれの研究テーマにおいて平成24年度以降の研究を推進していくための研究基盤の整備を行った。グルタチオンを植物の根に部位特異に与えた場合に、植物の根におけるカドミウムの分布に変化が見られた。細胞質に存在するカドミウムの量が有意に減少し、その一方で細胞壁等に存在するカドミウムの量が増加していた。また、グルタチオン、ファイトケラチンをはじめとする含硫化合物をHPLC法を用いることで簡易に測定する実験系を構築した。今後は根に与えたグルタチオンがどのような挙動をしているのかを明らかにし、その作用機作を解明していく予定である。さらに、根におけるグルタチオンの合成能を強化した植物を創製する研究テーマでは、当該タンパク質を根で特異的に発現させるプロモーターにグルタチオンの生合成に関連する酵素タンパク質の遺伝子を繋いだコンストラクトを作成して、組換え体植物を創製することを試みている。ポジトロン放出核種画像化システム(PETIS)を用いて、非侵襲な状態でアブラナ体内のカドミウムの動態を可視化する実験では、根に部位特異的に与えたグルタチオンによってカドミウムの植物体の地上部への移行が抑制されている様子を再現性よく撮像することができ、今後の数的解析に向けてのデータを蓄積することができた。本研究の目的は、生理活性ペプチドの一種であるグルタチオンが植物の根において機能し、植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制する現象の分子メカニズムを明らかにすることである。これまでの研究によって、植物体の根に与えたグルタチオンが根からのカドミウムの排出を活性化していることが明らかになった。この植物根からのカドミウムの排出に対するチオール化合物の影響を調べたところ、これまでの実験ではグルタチオンが最も効果的であることを確認することができた。また、植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制する効果は、根に与えるグルタチオンの濃度によって異なることが明らかになった。この実験結果は、植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制するためには、植物根に一定量以上のグルタチオンを与える必要があることを示している。これまでのポジトロンイメージング実験の結果から、植物体内におけるカドミウムの移行では地上部の基部が重要な働きをしていることが明らかになっている。この部位はナトリウムなどカドミウム以外の物質の体内分配にも大きな影響を及ぼしている。そして、この部位においてもグルタチオンが機能して、植物体内におけるカドミウムの分配を抑制していることを示唆する実験結果が根分け実験によって得られた。このような実験結果はグルタチオンが植物の根におけるカドミウムの排出の活性化だけではなく、複数の場所で機能して植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制していることを示している。根におけるグルタチオン合成能を高めるためにグルタチオン合成に関連する酵素の遺伝子を導入した形質転換体の作成では、系統選抜を一層進めていくことができた。その結果、根におけるグルタチオン蓄積量が野生株と比較して有意に増加している系統を得ることができた。本研究の目的は、生物界に広く分布する生理活性物質であるグルタチオンを植物の根に部位特異的に与えることによって植物体の地上部に蓄積するカドミウムの量が低減する現象の分子メカニズムを明らかにすることである。平成24年度は、研究の初年度に得られた研究成果を踏まえてそれぞれの研究テーマを推進していった。グルタチオンを植物の根に部位特異的に与えた場合に、植物体の地上部に蓄積するカドミウムの量が減少する現象の要因のひとつが植物根からのカドミウムの排出がグルタチオンによって活性化されていることであることが明らかになった。また、根におけるグルタチオン処理を行った植物根におけるグルタチオンやファイトケラチン含量を測定したところ、その存在量は対照区の植物根のそれぞれの物質含量と比較して有意な差はみられなかった。

この実験結果は、根に与えたグルタチオンはファイトケラチン類の合成に利用されるよりも、根タンパク質の活性調節などに利用されている可能性が高いことを示唆している。根におけるグルタチオンの合成能を強化した植物を創製する研究テーマでは、グルタチオン合成に関与する遺伝子を根で高発現する組換え体植物(アラビドプシス)を得ることができた。ポジトロン放出核種画像化システム(PETIS)を用いて、非侵襲な状態でアブラナ体内のカドミウムの動態を可視化し、根にグルタチオン処理した植物と対照区の植物における画像データを比較した。その結果、植物体の地上部の基部が植物体の地上部へのカドミウムの移行のカギとなる部位であることが明らかになった。本年度は、申請研究の最初の年であったため、それぞれの研究テーマで計画された研究内容は2年目以降にそれぞれの研究を大きく進展させていくための土台作りとなるものであった。当初の実験計画に基づき、それぞれの研究者がそれぞれの研究テーマに着実に着手し、今後に向けての実験系を構築(データ採取)をすることができたため、上記のような目標達成度と判断した。25年度が最終年度であるため、記入しない。根に与えたグルタチオンが植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制する現象の要因の一つがグルタチオンによる植物根からのカドミウムの排出の活性化であることを明らかにすることができた。また、ポジトロンイメージング実験の結果によって、この現象の分子メカニズムを解明していく上での重要な検討課題を見出すことができた。また、根におけるグルタチオン合成能を強化した遺伝子組換体植物も作成することができ、平成25年度にはその植物の機能評価を行う段階に到達している。さらに、マイクアレイ実験に関しても現在詳細なデータ解析を行っているところであり、このデータ解析の結果によって根へのグルタチオン処理に応答して、発現量が変化する遺伝子を同定することができると考えている。以上の観点より、本研究はおおむね順調に推進することができているといえる。H23年度に得られたそれぞれの研究成果を元に、グルタチオンが植物体の地上部に蓄積するカドミウムの量を減らす現象の分子機構を明らかにすることを目指す。H23年度はおおむね研究計画通りに研究を推進することができたことから、その研究結果を踏まえて、それぞれの研究テーマをさらに推進していくことでグルタチオンがどのようにして植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制しているのかに迫る。平成24年度に行った実験結果によって得られた研究シーズ元に、平成25年度も実験を進めていき、根に与えたグルタチオンによる植物体の地上部へのカドミウムの移行と蓄積を抑制する現象の分子メカニズムを明らかにしていきたいと考えている。また、本年度は本研究課題の実施最終年度であることから、得られた研究成果を外部に向けて積極的に発信していくことにも注力していきたいと考えている。
痛み刺激の予測により誘導される不快がサルの大脳皮質活動に与える影響

三叉神経系の侵害情報は延髄の後角に存在する侵害受容ニューロンを経由し中脳、間脳を上行し大脳に至る。投射経路は外側および内側の2つの経路に分類される。外側系は主に痛みのべんべつ関与するのに対し、内側系は痛覚の情動的局面を担う経路とされている。外側系は大脳皮質第一次体性感覚野(SI)、大脳皮質第2次体性感覚野(SII)、内側系は前帯状回(ACCx)および島皮質(Insula cortex)であると報告されている。本研究は外側系としてSI、内側系としてACCxに注目し、それぞれの皮質領域に分布する侵害受容ニューロンの電気生理学的柱質をサルの熱刺激弁別行動との関連性から解明しようとしたものである。SIニューロンの多くは刺激強度増加と共にスパイク頻度を増加した。また、熱刺激弁別時間が長いほどスパイク頻度が低く、弁別時間が短いほどスパイク頻度が高い傾向を認めた。しかしながら、このスパイク頻度の変化と弁別時間の関係はT1刺激温度が47°Cと、非常に高くなると消失した。また、SIに分布する幾つかのニューロンは温度刺激だけでなく、光刺激に対してもスパイク頻度を増加した。さらに、我々はサルが温度から光に注意を移動させた時の反応の変化を検索した。多くのSI侵害受容ニューロンはサルが注意を温度から光に移動するとその活動性を低下させた。一方、ACCxニューロンの多くは受容野が不明確で、熱刺激増加に伴う反応の増強は顕著ではなかった。また、熱刺激強度弁別時間とスパイク頻度とは明らかな関係を示さなかった。しかし、注意を光刺激に移動すると、ほとんどのニューロンで反応性の低下を引き起こした。さらに、ACCxニューロンの多くはサルが熱刺激から逃避する時に非常に高いスパイク応答を示した。熱刺激強度弁別課題遂行中のサル前帯状回から単一ニューロン活動を記録し、神経活動と熱刺激弁別時間および逃避口頭誘発頻度との関係、および注意を光刺激に移動した時の熱刺激応答の変化等について、電気生理学的手法を用いて解析した。667個の前帯状回ニューロンについて検索した。その内、22個が熱刺激に応答しスパイク頻度を増加したのに対し、3個は熱刺激によりスパイク頻度を減少した。また、侵害受容ニューロンの多くは機械的体性感覚刺激に応答しなかった。前帯状回の侵害受容ニューロンの内刺激に対してスパイク頻度を増加するものはdynamic responseを示さず、温度刺激が持続いている間、徐々にスパイク頻度を増加し、T1刺激温度増加にともなってスパイク頻度を増した。逃避行動を誘発した時の方が弁別が成功した場合に比べ有意に高いスパイク頻度を示した。Thermal detection taskに比べLight detection taskの場合に、スパイク頻度が低い傾向を認めた。さらに、スパイク頻度はT2温度変化弁別時間と相関を示さなかった。以上の結果から、前帯状回に分布する侵害受容ニューロンは注意によりモジュレーションを受け、逃避に関係した働き有する可能性が示唆された。本年度は前年度の研究で明らかにされた痛覚受容性神経細胞が分布する領域に2%lidocaneを1-4μl微量注入し、痛覚受容性神経細胞活動を不活性化し、光刺激強度変化弁別速度に対する影響、警告信号に対する影響について行動学的に検索する予定であった。しかし、現在サルのトレーニングにトラブルが生じ、未だに温度刺激強度変化弁別課題を訓練中であり、麻酔実験には至っていない。この様な課題を訓練する場合、サルによって非常に早く課題をマスターできるものとそうでないものが出てくる。これまでに、2頭について従来と同様の課題について訓練を行ってきたが、これらのサルについては全く訓練の成果が現れていない。

そのため、新たに2頭を追加して訓練を行っている。その内の1頭については、ほぼ訓練が終了した。また、このサルについては前帯状回の麻酔の影響をより明確にするため、可逆的な痛覚過敏を起こさせることも計画した。現在までに、この可逆的痛覚過敏モデル動物に関するプレリミナリーな実験結果が得られているので報告する。この痛覚過敏モデルは顔面皮膚にカプサイシンを塗布することにより作成する。カプサイシン処理動物においては侵害的(46°C)および非侵害的(44°C)熱刺激共に、有意に逃避行動の増加を誘発した。また、刺激強度弁別速度はカプサイシン処置により有意に短くなった。この様な可逆的痛覚過敏モデルを用いることにより、前帯状回の機能不全による、サルの温熱刺激弁別速度への影響および温熱刺激に対する逃避行動の出現率に対する影響を、より明確に検出することが出きると考えられる。来年度はさらにこのサルを用いて、前帯状回の麻酔および微小刺激の影響について詳細に検索していく予定である。今年度は2頭のサルについて熱刺激強度弁別課外を訓練できた。しかし、本年度用いた2頭のサルは訓練に時間がかかり、帯状回の局所麻酔の実験には至っていない。そこで、本年度はカプサイシンを顔面皮膚上に塗布し、痛覚過敏モデルサルを作成し、熱刺激強度弁別速度を測定した。さらに、このモデルにL型カルシウムブロッカーおよびギャバベンチンを経口投与し、熱刺激弁別速度の対する影響を調べた。痛覚過敏モデルサルは顔面皮膚の熱刺激に対してカプサイシン未処理サルに比べ、温度変化弁別時間が有意に減少した。このサルに小野製薬株式会社で最近開発されたL型カルシウムブロッカーONO2921を経口投与した。すると、T1が44°Cの時有意に短縮した熱刺激強度弁別時間は延長した。さらに、ONO2921をラットの脊髄後角に作用させると、神経損傷による痛覚過敏が抑制された。また、ギャバベンチン投与においても、同様の結果が得られた。このことから、カプサイシン塗布によって発症する痛覚過敏には脊髄後角に分布する侵害受容ニューロンのL型カルシウムチャンネルが関与する可能性が示された。また、ギャバベンチン投与により、痛覚過敏が抑えられたことから、ギャバベンチンは痛覚過敏の治療薬として、使用できる可能性が示された。しかし、ONO2921投与による、痛覚過敏抑制効果はT1が46°Cの時にはカプサイシン未処理サルの熱刺激強度弁別時間も短縮した。この結果はL型カルシウムチャンネルが侵害受容ニューロンそのものの活動に関与する可能性を示している。以上本年度は、主にサルの痛覚過敏行動に対する上記薬物の作用について検索したが、今後はさらに、帯状回ニューロン活動に対する各種薬物の作用、あるいは延髄後角ニューロン活動に対する作用等についても、覚醒サルを用いて研究を進めていく予定である。
製品機能ベースの物質ストック・排出量と複合機能製品の普及による省資源化効果の評価

複合機能製品の普及が物質使用量にもたらす影響を定量的に計測するため,製品機能に着目した機能ベースの物質ストック・排出量を推計する手法を開発し,いくつかの製品を事例に分析を行った。例えば,洗濯乾燥機は洗濯機と衣類乾燥機の大部分を代替しており,機能の複合化が省資源化に寄与していた。一方,スマートフォンは,携帯電話機能については従来型の携帯電話を代替していたが,音楽再生やデジタルカメラ機能については単機能製品をほとんど代替せず,機能の追加的保有に結びついていた。このように,複合機能製品の普及は必ずしも省資源化に寄与せず,社会全体としてはかえって物質使用量を増加させるケースも存在することを示した。平成25年度は,洗濯乾燥機とスマートフォン(多機能携帯電話)を例として平成24年度確立した方法を用いて推計した機能ベースの保有台数について,各種製品の製品重量データや組成データを整理し,保有台数推計値に乗じることで物質ストック量の推移を推計した。また,多機能製品の機能利用実態をふまえて推計結果の考察を行った。洗濯乾燥機については,製品重量は単機能の洗濯機や乾燥機と比べて大きいが,洗濯機と衣類乾燥機の両方を代替していることから,その普及によってこれら製品に係る物質ストック量は減少していると推計された。これより,洗濯乾燥機という多機能製品の普及は物質量で見ても社会における物質ストック量削減に貢献していることがわかった。一方,スマートフォンについては,従来型の携帯電話よりも製品重量が増加しており,またその他の単機能製品を全く代替していないことから,社会の物質ストック量はむしろ増加する方向に寄与していた。スマートフォンの普及は各機能の保有水準を押し上げており,機能へのアクセス性が高まったという点で消費者には好ましい状況とも解釈できる。しかし,音楽再生やデジタルカメラ機能の利用実態を見てみると,ユーザーの2割から3割がこれらの機能を使用していなかった。この結果から,製品機能を統合・追加した多機能製品の普及が不要な機能の提供と引き換えに物質利用量の増加を招いているケースも存在することが示唆された。研究期間を通じて,製品機能に着目した機能ベースの耐久消費財ストック量・排出量の推計方法を確立し,いくつかの製品を事例に多機能製品の普及が単機能製品の代替を含む耐久消費財の物質ストック量・排出量の削減に寄与したか否かを推計,考察した。本手法は他の製品にも同様に適用可能であり,製品機能の統合・追加と社会の脱物質化の関係を定量的に計測することが可能となった。機能ベースの保有・排出台数推計の基礎データとして,ある単位機能を持つ製品の出荷台数データを出荷台数統計データと店頭販売(POS)データに基づいて作成する方法を検討し,携帯音楽再生機能,インターネット接続機能,デジタルカメラ機能,携帯電話機能,衣類洗濯機能,衣類乾燥機能を対象にデータの作成,整備を行った。具体的には,機種ごとの販売台数データを収録するPOSデータを用いてある単位機能を有する製品とそれ以外の製品の販売比率を求め,携帯電話などの製品カテゴリごとに整備されている出荷台数統計データに乗じて機能ごとの出荷台数データを作成した。次に,使用年数(寿命)分布モデルと出荷・保有の台数収支を組み合わせた保有・排出台数推計手法を援用し,ある単位機能を持つ各種製品の保有・排出台数を推計し,それらを積み上げて機能ベースの総保有・排出台数を推計する方法を検討した。先に整備した機能ごとの製品出荷台数データを用いてこの方法の適用可能性を示し,機能ベースの保有・排出台数の推計方法として確立した。これらの方法を用いて,洗濯乾燥機とスマートフォン(多機能携帯電話)を例にその普及による機能ベースの保有台数の推移を試算した。洗濯乾燥機の普及によって単機能の洗濯機と乾燥機の保有が減少しており,洗濯乾燥機という複合機能製品はそれぞれの単機能製品を代替していた。一方,スマートフォンについては,その普及によって従来型の携帯電話の保有こそ減少しているものの,音楽再生機能やデジタルカメラ機能等の他の機能については従来の単機能製品の保有が顕著に減少していなかった。このケーススタディより,複合機能製品の普及はその主機能については従来の単機能製品を代替するものの,他の機能については必ずしも単機能製品を代替せず,機能の保有水準を押し上げる結果となることがあることがわかった。初年度に計画していた製品機能の有無ごとの出荷台数データ作成方法および単位機能に着目した場合の機能ベースの保有・排出台数の推計手法開発に加え,洗濯乾燥機およびスマートフォンという複合機能製品を対象にこれらの持つ複数機能についての機能ベースの製品保有台数を時系列的に試算し,複合機能製品の普及による従来型単機能製品の代替効果を定量的に示すことができた。スマートフォンによる従来型単機能製品の代替効果の推計の中で,携帯音楽プレーヤーやデジタルカメラの保有台数の推計における保有台数の推計値と統計値や市場調査値の整合性を確認しつつ,推計の修正を行う。

保有台数に加えて機能ベースの排出台数の推計を行うとともに,各種製品の素材構成比や金属含有量データを用いて保有・排出台数を素材や金属元素の使用量に換算し,複合機能製品の普及による物質・金属元素等使用量の推移,省資源化効果を定量的に示す。また,可能な範囲でケーススタディの対象機能を増やすことを検討する。次年度の研究費は,市場調査レポートの追加的購入に加え,成果発表のための国際学会参加費及び旅費,論文英文校閲に使用する予定である。
樹状突起スパインを可視化する生体システムの開発と認知症への応用

オートファジー上流分子であるAMBRA1は多系統萎縮症の封入体に発現しており、正常および異常αシヌクレインと結合し、その分解に関わることを明らかにした。AMBRA1はレビー小体病および多系統萎縮症の治療法開発における標的分子となる可能性がある。さらに、パーキンソン病の末梢血単核球におけるオートファジーの変化はパーキンソン病剖検脳におけるオートファジーの変化を反映していることを示唆した。パーキンソン病におけるオートファジーの異常は病早期より生じていると考えられ、末梢血のリキッドバイオプシーを行うことで、病態の進行度を簡易にモニターできる可能性がある。多くの神経変性疾患では疾患に特異的な分子が蓄積し、病態と密接に関連している。我々はシナプス蛋白であるαシヌクレインが蓄積し、運動障害や認知症を呈する疾患であるシヌクレイノパチー(パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症)の病態解析を進めてきた。その中で、細胞内分解システムの異常を見出し、このシステムを活性化させることにより、異常分子の蓄積を防ぐことを報告してきた。最近、自然糖であるトレハロースによる細胞内分解システム活性化の機序を明らかにするため、マイクロアレイ解析を行ったところ、樹状突起スパインの形成に関連する遺伝子群がトレハロース投与後早期に増加していることを見出した。そこで本研究では、シヌクレイノパチーにおける異常蛋白蓄積機構やオートファジー関連分子が病態に果たす役割を明らかにし、樹状突起スパインやオートファジーの活性化を可視化する方法の開発を行う。本年度は、レビー小体病と多系統萎縮症を対象にオートファジー上流分子の動態について検討した。その結果、複数のオートファジー上流分子(ULK1、ULK2、VPS34、AMBRA1)がレビー小体に発現していること、AMBRA1は多系統萎縮症のグリア細胞および神経細胞内封入体にも発現していることを明らかにした。さらに、AMBRA1は正常および異常αシヌクレインと結合し、その分解に関わることを明らかにした。AMBRA1はレビー小体病と多系統萎縮症の治療法開発における標的分子となる可能性がある。シヌクレイノパチー(パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症)の病態に複数のオートファジー上流分子が関与していることが示された。我々は自然糖トレハロースが脳内オートファジーを活性化することを既に見出しており、脳内オートファジーの活性化により異常分子の蓄積を防ぐことができれば、シヌクレイノパチーの治療法開発にも通ずる。以上より、研究計画はおおむね順調に進展している。神経変性疾患では疾患に特異的な分子が蓄積し、病態と密接に関連している。我々はシナプス蛋白であるαシヌクレインが蓄積し、運動障害や認知症を呈する疾患であるシヌクレイノパチー(パーキンソン病(PD)、レビー小体型認知症、多系統萎縮症)の病態解析を進めてきた。しかし、この細胞内分解システムの異常が、長い神経変性の結果起こったのか、病早期より生じているのかは明らかでない。そこで本年度は、PD患者(35例)および正常対照(23例)の末梢血単核球のオートファジーについて検討した。トランスクリプトーム解析では、PD群においてオートファジーの主要蛋白であるULK3、Atg2A、Atg4B、Atg5、Atg16L1、histone deacetylase 6のmRNAが有意に減少していた。ウエスタンブロット解析ならびに逆転写ポリメラーゼ連鎖反応では、オートファジーの開始に関わるULK1、VPS34、Beclin1、AMBRA1のうちULK1、Beclin1、AMBRA1が有意に上昇する一方で、VPS34、Beclin1、AMBRA1のmRNAは有意に減少していた。VPS34、Beclin1、AMBRA1はαシヌクレインのモノマーと正の相関を、ULK1、VPS34、Beclin1、AMBRA1はαシヌクレインのオリゴマーと正の相関を示した。さらに、αシヌクレインのオリゴマーはPDの重症度ならびに心臓交感神経の脱神経に相関した。PDの末梢血単核球におけるオートファジーの変化はPD剖検脳におけるオートファジーの変化を反映している可能性が示唆された。PDにおけるオートファジーの異常はPDの病早期より生じている可能性がある。今後もシヌクレイノパチーにおける異常蛋白蓄積機構やオートファジー関連分子が病態に果たす役割について研究を進める。さらに、脳内オートファジーの活性化は治療にもつながることから、効果的な脳内オートファジーの活性化手法(Brain Autophagy Activator)を開発中である。

特に、脳透明化技術とオートファジー可視化マウスを組み合わせた形態観察により効率的にBrain Autophagy Activatorをスクリーニングできるが、従来の透明化手法ではオートファゴソーム結合分子が透明化の過程で分解されることが判明した。今後、膜成分を保ったまま可視化する方法の開発を行う予定である。脳神経病理学当初の予定よりも試薬関係の予算が少なく済んだため。次年度に使用する5,466円は翌年度の研究費と合わせ消耗品費として使用する。
歯周組織における破骨細胞形成抑制因子および促進因子の機能的役割り

中高年が歯を喪失する原因の一つに歯周疾患(歯槽膿漏)が上げられるが、これらに対する予防法、治療法は十分確立されておらず充分な効果を上げていない。生涯自分の歯で噛める人を増やすためには、より効果的な予防法、治療法の開発、普及が望まれている。近年、骨芽細胞自身が、破骨細胞形成抑制因子(Osteoprotegerin ; OPG)、破骨細胞分化促進因子(Osteoclast Differentiation Factor ; ODF)を分泌し破骨細胞形成を制御していることが明らかになり,最近私たちは、歯根膜細胞自身がOPGを発現し、破骨細胞の形成を抑制し歯周組織の機能維持に関与していることを示唆する知見を得た。また歯周病による炎症性骨吸収の主役は、生体内で唯一硬組織を吸収できる破骨細胞であるが,今回、破骨細胞前駆細胞RAW264.7を用いた破骨細胞分化系でPCRによる分化マーカーの発現上昇を検討したところ,ODF用量依存性にTRAP,カテプシンK,カルシトニンレセプター等の分化マーカーの発現上昇と共にNFATc1の誘導が認められた。さらに共刺激シグナルのうちOSCARの発現上昇が認められたが,PIR-A,PIR-B,TREM2,TREM3,DAP12の発現量については,変化が認められなかった。破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の分化過程においてTRAP,カテプシンK,カルシトニンレセプター等発現量の上昇を伴うものとPIR-A,PIR-B,TREM2,TREM3,DAP12等の発現量に変化が認められないものが存在することが判明した。さらに最近,ヒートショックや細菌感染によって誘導されるストレスタンパク質MICAが,歯周組織に発現していることを明らかにした。これは歯周組織において,細菌感染によってストレスタンパク質MICAが誘導され,破骨細胞の分化誘導の端緒として機能している可能性を示唆するものと考えている。高齢化社会を迎える先進諸国において、歯の喪失はQOL(Quality of Life)を阻害する重要な問題であるが、残念ながら日本において現在80才の人の平均歯数は8本が現状である。近年、骨芽細胞自身が、破骨細胞形成抑制因子(Osteoprotegerin ; OPG)、破骨細胞分化促進因子(Osteoclast Differentiation Factor ; ODF)を分泌し破骨細胞形成を制御していることが明らかになった。最近私たちは、歯根膜細胞自身がOPGを発現し、破骨細胞の形成を抑制し歯周組織の機能維持に関与していることを示唆する知見を得た。また歯周病による炎症性骨吸収の主役は、生体内で唯一硬組織を吸収できる破骨細胞である。今回、破骨細胞前駆細胞RAW264.7を用いた破骨細胞分化系でPCRによる分化マーカーの発現上昇を検討した。RAW264.7細胞をODFにて刺激すると,用量依存性にTRAP,カテプシンK,カルシトニンレセプター等の分化マーカーの発現上昇と共にNFATc1の誘導が認められた。

破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化は,ODF-RANKシグナルの刺激により,マスター転写因子であるNFATc1の誘導,活性化にはOSCAR、TREM-2、PIR-Aといった免疫受容体からの共刺激シグナルが必要なことが知られているが,共刺激シグナルのうち,破骨細胞の分化過程において発現量の上昇を伴うものと発現量に変化が認められないものが存在することが判明した。このようなデータの結果を踏まえ最終年度となる来年度は,破骨細胞の分化過程での詳細な検討をPCR法を用いてさらに追求を行いたい。中高年が歯を喪失する原因の一つに歯周疾患(歯槽膿漏)が上げられるが、これらに対する予防法、治療法は十分確立されておらず充分な効果を上げていない。生涯自分の歯で噛める人を増やすためには、より効果的な予防法、治療法の開発、普及が望まれている。近年、骨芽細胞自身が、破骨細胞形成抑制因子(Osteoprotegerin ; OPG)、破骨細胞分化促進因子(Osteoclast Differentiation Factor ; ODF)を分泌し破骨細胞形成を制御していることが明らかになり,最近私たちは、歯根膜細胞自身がOPGを発現し、破骨細胞の形成を抑制し歯周組織の機能維持に関与していることを示唆する知見を得た。また歯周病による炎症性骨吸収の主役は、生体内で唯一硬組織を吸収できる破骨細胞であるが,今回、破骨細胞前駆細胞RAW264.7を用いた破骨細胞分化系でPCRによる分化マーカーの発現上昇を検討したところ,ODF用量依存性にTRAP,カテプシンK,カルシトニンレセプター等の分化マーカーの発現上昇と共にNFATc1の誘導が認められた。さらに共刺激シグナルのうちOSCARの発現上昇が認められたが,PIR-A,PIR-B,TREM2,TREM3,DAP12の発現量については,変化が認められなかった。破骨細胞前駆細胞から破骨細胞の分化過程においてTRAP,カテプシンK,カルシトニンレセプター等発現量の上昇を伴うものとPIR-A,PIR-B,TREM2,TREM3,DAP12等の発現量に変化が認められないものが存在することが判明した。さらに最近,ヒートショックや細菌感染によって誘導されるストレスタンパク質MICAが,歯周組織に発現していることを明らかにした。これは歯周組織において,細菌感染によってストレスタンパク質MICAが誘導され,破骨細胞の分化誘導の端緒として機能している可能性を示唆するものと考えている。
非培養脂肪由来幹細胞を用いたハイブリッド人工神経の開発

現在までに我々は、「移植後2週までの時点で非培養ADRCsは末梢神経再生を促進する」ことを証明しています(Suganuma S, etal.J Orthop Sci., 2013)。そこで今回は、末梢神経の欠損長および経過観察期間を延長して実験を行いました。ラットの坐骨神経13mmの欠損をシリコンチューブで架橋しました。その際、チューブ内に生理食塩水のみを封入した群、アテロコラーゲンのみを封入した群、アテロコラーゲンとADRCsを混入した群の3群を作成し、それぞれ移植後12週の時点でチューブを採取して再生組織を評価しました。しかし、個体間のばらつきが大きく、期待していた結果が得られませんでした。そこで、シリコンチューブを使用した実験モデルには限界があると考え、チューブを国内で発売された生体吸収性の人工神経に変更し、再度実験を行いました。ラットの坐骨神経13mmの欠損に自家神経を移植した群(自家神経群)、人工神経単独で架橋した群(人工神経単独群)、人工神経内にADRCsを封入した移植したハイブリッド人工神経群の3群を作成し、移植後8, 12週の時点で再生組織を評価しました。その結果、ハイブリッド人工神経群は自家神経移植群には及びませんでしたが、人工神経単独群と比較して良好な軸索再生が得られました。また、移植したADRCsは2週の時点同様Schwann細胞への分化は確認されませんでしたが、移植後10週の時点でもわずかに生存が確認され、humoral factorを分泌することにより末梢神経再生を促進していることが示唆されました。以上の結果より、ハイブリッド人工神経は人工神経単独と比較すると優れてはいますが、現時点で自家神経に及ばず、臨床応用を目指すには細胞のmanipulationやチューブの素材等に関してさらなる改良が必要であると考えられました。
血管病変を形成する平滑筋細胞の起源の解明

近年、成体での血管内皮形成の際に、胎生期にみられる「脈管新生」の機構も作用するとの報告がある。我々は、血管中膜平滑筋細胞も血液中にその前駆細胞が存在し、血管新生の際に平滑筋細胞の供給源になるとの仮説を立てた。そこで、平滑筋細胞特異的な分子マーカーである平滑筋ミオシン重鎖(SM1/2)遺伝子プロモーターにLacZ遺伝子を接続した遺伝子を持つヘテロマウス(SM1/2マウス)を発生工学的手法で開発し、これを用いて血管平滑筋前駆細胞の存在について証明を試みた。SM1/2マウスでは、血管中膜や消化管の平滑筋層に特異的にLacZ陽性細胞がみられ、平滑筋細胞の分化、局在を示すレポーター動物としての特徴を有することが確認された。次に、マウスに血管内皮障害および血管新生モデルを作製し、新生平滑筋細胞が流血中の細胞に由来するか否かを検討した。SM1/2マウスより骨髄を採取し、10Gyの全身放射線照射を行った同系のC57BL/6J系マウスに骨髄移植した。このマウスに一重項酸素による大腿動脈の内皮障害、マウスB16メラノーマ細胞の移植による腫瘍周囲の血管新生、大腿動脈露出の際に切開する皮膚の創傷治癒過程での血管新生モデルを作製した。内皮細胞障害モデルと腫瘍による血管新生モデルでは、血管壁を構成する細胞にはLacZ陽性細胞はみられなかった。しかし、創傷治癒過程にある皮下組織や腫瘍周囲の組織中には、骨髄単核球に類似した形態をとったり、平滑筋細胞様の紡錘状の形態をしたLacZ陽性細胞が多数みられた。創傷治癒組織や腫瘍周囲の皮下組織では、SM1/2遺伝子が転写される細胞が血中から供給されると考えられた。すなわち、創傷治癒過程では、血液細胞が平滑筋細胞に分化し、再生に寄与すると考えられた。血液細胞から血管平滑筋細胞への分化の可能性については、今後もさらに解析を継続する予定である。
網羅的ペルオキシソーム機能解析による神経・代謝性疾患の病態解明

GC/MSとLC/MSを用いたペルオキシソーム脂質代謝解析システムを確立し、国内ペルオキシソーム病患者診断に応用した。研究期間の3年間に、8例のペルオキシソーム形成異常症、男性患者49例と女性保因者41例の副腎白質ジストロフィーを診断した。さらに患者線維芽細胞を対照との脂質メタボローム比較解析により新規のペルオキシソーム代謝機能の探索と既知の神経代謝病におけるペルオキシソーム代謝異常の解析を進めている。ペルオキシソーム病神経発生異常解明のためにペルオキシソーム欠損症患者細胞よりiPS細胞を樹立し、神経細胞へ分化させ、ペルオキシソームの神経発生への関与について解析を進めている。本研究では国内唯一のペルオキシソーム病診断システムをより高精度、より網羅的、そしてハイスループットに進化させることにより、脂質代謝産物を中心としたペルオキシソーム関連メタボローム解析とペルオキシソーム遺伝子の多型と発現を網羅的に解析できるペルオキシソーム機能解析システムの構築と、患者リソースおよびiPS細胞、さらに疾患モデル生物を用いてペルオキシソーム代謝機能を効率的かつハイスループットに解析することにより、新たなペルオキシソーム病の発見から病態解明、治療法の開発を目指している。今年度の成果として、(1)LC/MS/MSを加えたペルオキシソーム病の網羅的診断システムでは平成24年の1年間にペルオキシソーム形成異常症4例、副腎白質ジストロフィー(ALD)では小児大脳型5例、成人大脳型1例、AMN 1例、アジソン病1例、女性保因者12例、発症前患者4例を遺伝子診断するとともに、ハノイ小児病院への診断支援として、7例のALD患者と1名の女性保因者を遺伝子診断した。さらに本邦初の患者を発見した2つのペルオキシソーム病では、遺伝子レベルで病因を明らかにして論文に報告した。(2)ペルオキシソーム代謝異常症における発生異常の病態解明は以下の2つの方法で進めている。(1)ペルオキシソーム形成異常症患者の線維芽細胞より複数のips細胞を樹立し、現在、神経系を含めた各組織への分化を進め、次年度への網羅的遺伝子発現レベルでの比較検討に繋げている。(2)ゼブラフィッシュを用いて、ペルオキシソーム形成異常症の病因であるPEX遺伝子をモルフォリノやTALENによりノックアウトまたはノックダウンしてモデルフィッシュを作成する系を確率中で、その後、個体レベルでのペルオキシソーム代謝系の障害による発生異常の病態解明を進める。脂肪酸代謝を含めたペルオキシソーム代謝と病態との関係は、未だ発展途上であり、次年度以降に向けて、単一遺伝子病である先天代謝異常症の解明を通して、生活習慣病や神経疾患も対象にした広い意味での代謝病におけるペルオキシソームの関わりを明らかにしていきたいと考えている。平成25年度の成果として、1LC/MS/MSを加えたペルオキシソーム病の網羅的診断システムでは、新たにプリスタン酸の測定を可能にするとともに、平成25年の1年間にZellweger症候群1例、乳児型Refsum病1例、副腎白質ジストロフィー(ALD)のうち、小児大脳型5例、思春期大脳型1例、成人大脳型2例、AMN 3例、小脳脳幹型1例、アジソン病1例、女性保因者11例、発症前患者3例を遺伝子も含めて診断した。2ペルオキシソーム代謝異常症における発生異常の病態解明は、(1)ペルオキシソーム形成異常症患者の線維芽細胞よりiPS細胞を樹立し、アレイCGHによる精度確認、マウス精巣への移植によるテラトーマ作成による多能性の確認を終了し、現在、神経幹細胞への分化を進めてり、最終年度には神経細胞、グリア細胞に分化させ、神経発生異常の病態解明を進める。(2)ゼブラフィッシュを用いて、ペルオキシソーム形成異常症の病因であるPEX遺伝子をTALENによりノックアウトして、現在、ヘテロ変異体の作成まで進めており、最終年度には個体レベルでのペルオキシソーム代謝系の障害による発生異常の病態解明を進める。診断システムについては従来のGC/MSと25年度に確立したLC/MS/MSを組み合わせたペルオキシソーム代謝産物解析システムにより、極長鎖脂肪酸、フィタン酸、プラスマローゲンに加え、プリスタン酸の測定も可能にし、既存および研究期間中にペルオキシソーム病を疑われた未診断例を解析するとともに、26年度中に新たに43例のペルオキシソーム病患者を迅速に診断し、遺伝子解析により診断確定した。さらにZellweger症候群患者細胞を用いたLC/MS/MSによる脂肪酸分析により、Zellweger症候群患者では対照細胞に比べ、炭素鎖26以上の飽和並びに不飽和脂肪酸も蓄積していること、プラスマローゲン各分子種の低下の詳細も明らかにした。

病態解明については、PEX2遺伝子異常によるペルオキシソーム形成異常症患者細胞ならびに対照細胞よりiPS細胞を樹立し、神経幹細胞より神経細胞への分化、embryonal bodyからの神経細胞への分化系を確立した。この系により、正常幹細胞の神経系への分化過程におけるペルオキシソームの役割が明らかになるとともに、ペルオキシソーム形成異常症の神経発生異常の病態解明が期待される。さらにPEX2遺伝子をTALENにてゲノム編集したペルオキシソーム形成異常症疾患モデルフィッシュの作成も開始し、H26年度中に両アレルに異常を持つモデルフィッシュを獲得することが出来、個体レベルでのペルオキシソーム形成異常症発生異常の病態解析が可能になった。今後、本研究成果により確立した解析系を用いて、ペルオキシソーム病患者の病態解明からHTSも含めた治療法の開発に繋げていく。26年度が最終年度であるため、記入しない。先天代謝異常26年度が最終年度であるため、記入しない。LC/MS/MSによるペルオキシソーム代謝産物の解析法を確立し、GC/MSと併せてペルオキシソーム病診断システムを稼働し、本邦初の2疾患を論文報告している。定量PCRによるペルオキシソーム代謝関連遺伝子発現量の測定を可能にした。ペルオキシソーム形成異常症患者よりiPS細胞を樹立した。さらにゼブラフィッシュを用いてモルフォリノによるペルオキシソーム形成異常症モデルフィッシュ作成系を構築した。LC/MS/MSによるペルオキシソーム代謝産物の解析法では新たにプリスタン酸の解析を確立し、より精度の高い診断スクリーニングが可能になった。ペルオキシソーム形成異常症の発生異常の解明でも患者よりiPS細胞を樹立から神経間細胞経の分化、さらにゼブラフィッシュを用いてTALENによるペルオキシソーム形成異常症モデルフィッシュでもヘテロ変異体まで作成している。ペルオキシソーム病の診断については新たに確立したペルオキシソーム代謝機能の網羅的解析システムにより、さらに新たなペルオキシソーム病の探索、病態解明、治療法の開発を進める。患者iPS細胞およびモデルフィッシュを用いた病態解明についても、網羅的解析システムにより、発生過程における病態解明を進めていく。ペルオキシソーム病の診断については新たにLC/MS解析により確立したプリスタン酸などの代謝産物スクリーニングにより、さらに新たなペルオキシソーム病の探索、病態解明、治療法の開発を進める。患者iPS細胞およびモデルフィッシュを用いた病態解明についても、既に研究期間内での完成の目処はついており、網羅的解析等により、発生過程における病態解明から治療法の開発へと進めていく。24年度は比較的低予算で疾患モデルフィッシュの解析系を確立したため、25年度への次年度使用額と当初の直接経費を用いて、診断システムの展開、モデルフィッシュの作成表現型の解析、樹立した複数の患者ips細胞の組織への分化網羅的解析システムを用いた検討を進めていく。物品費の効率的な運用と、旅費については成果発表を招待講演にて行ったため。
マイコプラズマ・ジェニタリウム尿道炎の抗菌薬治療に関する検討

M. genitalium(MG)は男性の非淋菌性尿道炎の原因微生物である。近年MGによる尿道炎の治療失敗例が増加しており、薬剤耐性と遺伝子変異との関連を検討した。しかし、MGの臨床検体からの分離培養は極めて困難であり、本研究ではマクロライド、キノロンに耐性を示す多剤耐性株を、我が国ではじめて分離した。現在、マクロライド耐性は約40%を超える。マクロライド耐性株にはmoxifloxacin(MFLX)とsitafloxacin(STFX)が有効であるが、parC遺伝子のpoint mutationによりMFLX耐性となり、加えてgyrAの変異によりSTFX耐性となる可能性を、本研究で示した。Mycoplasma genitaliumの分離、培養を目指すため、非淋菌性尿道炎患者の尿を収集した。その中でも主にマクロライドまたはニューキノロン薬による治療失敗例を中心に、培養を開始している。採取した尿を遠心分離し、Vero細胞上に接種し、real-time PCRによりその増殖をモニターした。その後、増殖を確認後にSP-4マイコプラズマ培地で培養させているが、現在までSP-4培地に増殖した株は分離されていない。また、マクロライド耐性、ニューキノロン耐性遺伝子を検出するため、臨床検体からのM.genitalium遺伝子の検出を行い、23S rRNAおよびgyrA、parCのシークエンスを行った。キノロン治療失敗例ではgyrA, parCにおける遺伝子変異を観察しており、今後、最も耐性に関連のある変異部位を検討している。M.genitalium尿道炎ではキノロン耐性株に対する治療法が確立していない。キノロン薬の一つであるシタフロキサシンは、キノロン耐性株の有効である可能性がある。オーストラリア、北欧で分離されたキノロン耐性株に対するシタフロキサシンの薬剤感受性を測定しており、現在、解析中である。これらを検討すると、gyrA 259, 260遺伝子(Ser87)とparC239遺伝子(ser80)が最もキノロン耐性に関わると考えられた。現在、数個の臨床検体よりM.genitalium培養に施行しているところである。しかし、M.genitaliumの培養は極めて困難であり、数代の継代後に死滅する株が多く見られた。M.genitaliumの臨床検体からの培養を試行しているが、多くの株は継代数代で死滅し、MICを測定するまでに至っていない。しかし、保存株のなかにキノロン耐性株があり、MICと耐性遺伝子との関連を決定つけられたことは、今回の進歩であったと考えられる。23S rRNAではJensenの報告に従い、A2058、A2059の変異をマクロライド耐性変異とした。キノロン耐性に関して、変異部位と耐性との関連は決定されていないが、我々が保持するキノロン耐性6489株のシークエンスをもとに検討した。6489株はGyrAではAsp87→Asn、ParCではSer80→Ileの変異を認めており、この2か所に変異があればキノロン耐性変異とした。本株のキノロンに対するMICはMoxifloxacin 16 mg/L、levofloxacin >16mg/Lであった。2005-2009、2009-2016にそれぞれ87、67のM. genitalium遺伝子を保存しており、これらを遺伝子を用いて検討した。マクロライド耐性は2005-2009では3.4% (3/87)、2010-2016年では40.3% (27/67)に急増した。木尾論耐性ではGyrAに変異を持つものは1株のみであった。しかし、ParCでは2005-2009年で9.2% (8/87)、2010-2016年では26.9% (18/67)に増加した。M. genitaliumのマクロライド耐性の増加により、非淋菌性尿道炎をマクロライドで治療を行うことはできない。さらにキノロンによる治療も困難となる可能性が高く、遺伝子変異の確認を含めたM. genitalium検査の必要性が示唆された。2005年度から保存したM. genitalium遺伝子を用いて、薬剤耐性遺伝子の分離頻度を検討してきた。しかし、薬剤耐性を検討する上で最も重要な事項は、耐性株の分離である。臨床検体からのM. genitaliumの分離、培養は極めて困難である。国内で唯一分離技術を持つ本研究室では、臨床検体からの分離、培養をトライし続けてきたが、培養ができない状態が続いていた。2016年末に、ようやく1株のmoxifloxacinに耐性と考えられる耐性遺伝をもつキノロン耐性株の増殖が認められるようになり、新たな株が樹立できそうである。新たな株が増殖しなかった理由としては、輸送の際の冷凍技術、検体(初尿)採取のための技術、採取タイミングなどにより、検体中のM. genitalium数が減少して培養が困難になっていると考えられる。Mycoplasma genitaliumによる尿道炎に対する抗菌薬治療を確立するための基礎研究として、M. genitaliumの分離培養、薬剤感受性検査、薬剤耐性遺伝子に対する研究を行ってきた。本研究により、非常に興味深い2株を分離培養することに成功し、M. genitaliumのキノロン耐性、特にmoxifloxacin(MFLX)とsitafloxacin(STFX)に対する耐性に関わる遺伝子変異を、確認することができた。

2株は日本人の尿道炎患者から分離された株であり、1株はazithromycin(AZM)治療失敗後にSTFXを用いて、治療が可能であった患者から分離(OPSSP2株)、もう一株はAZM、STFX、MFLXを長期に用いても除菌ができなかった患者からの分離株である(IMC-1株)。さらにスウェーデンで分離されたMFLX耐性株(M6489株)のデータを比較した。3株はいずれもマクロライド耐性株であった。OPSSP2、IMC-1、M6489のMFLX,STFXのMICはそれぞれ、MFLX;2、4、16、STFX: 0.25、1、1であった。parCのキノロン耐性決定領域(QRDR)の遺伝子変異ではいずれもSer80→Ile(E. coli numbering)のアミノ酸変異を伴っており、本変異以外の変異を有する他の株ではMFLX耐性とはなっておらず、MFLX耐性とSer80→Ileの関連は明らかとなった。STFXはMFLXよりM. genitaliumに対する抗菌活性が高く、さらに3株ともgyrAのQRDRの異なった変異を伴っていた。parCの遺伝子変異にgyrAの遺伝子変異が加わることにより、MFLX耐性はSTFX耐性となる可能性が示唆できた。M. genitalium(MG)は男性の非淋菌性尿道炎の原因微生物である。近年MGによる尿道炎の治療失敗例が増加しており、薬剤耐性と遺伝子変異との関連を検討した。しかし、MGの臨床検体からの分離培養は極めて困難であり、本研究ではマクロライド、キノロンに耐性を示す多剤耐性株を、我が国ではじめて分離した。現在、マクロライド耐性は約40%を超える。マクロライド耐性株にはmoxifloxacin(MFLX)とsitafloxacin(STFX)が有効であるが、parC遺伝子のpoint mutationによりMFLX耐性となり、加えてgyrAの変異によりSTFX耐性となる可能性を、本研究で示した。現在までに、非淋菌性尿道炎患者の尿からM.genitaliumの検出を行っている。しかし、M.genitaliumの分離数は少なく、10検体程度に終わっている。このため、さらに検体の収集を継続する必要がある。また、臨床検体採取のため、倫理申請が必要であるが、当大学では他施設で検体採取を行うための倫理申請を行うことができず検体採取が遅れている。M.genitaliumの分離に関しては、Vero細胞では増殖が認められるものの、SP4培地での増殖は認められず、さらに培養を継続する必要がる。我々が保存している臨床検体から分離されたM.genitalium遺伝子約200検体分のマクロライド耐性キノロン耐性の遺伝子変異を検討することにより、わが国における耐性遺伝子の傾向、推移を見ることが予想される。わが国で得られた臨床検体(尿)には、多くの抗菌薬を投与しても消失しないM.genitaliumを含むものが数検体あり、これらの培養を進めることで新たな耐性機序の解明につながると考えている。新たなキノロン耐性株を得ることにより、薬剤耐性遺伝子の幅広い検討が可能となり、臨床像、治療法と耐性遺伝子の関連、薬剤感受性を検討することができるようになる。さらに、検体採取が可能な協力施設を増やすことにより、新たな株の樹立が期待できると考えている。