hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新型インフルエンザ流行のコンピューター・シミュレーション

強い感染性を持った新型インフルエンザが生まれ、汎流行が生ずる可能性は常に存在する。日本では195758年にかけて新型インフルエンザによる「アジアかぜ」が夏の第一波と冬の第二波に分かれて流行した。本研究では「アジアかぜ」と同等の感染力を持った新型インフルエンザが冬期に日本に侵入した場合を予測した。伝染病流行の数理モデルにはKermack-McKendrick modelを用いた。感染力(λ)の推定に用いたデータは、「伝染病および食中毒統計年報」に記載された報告患者数と、人口動態統計からインフルエンザが原因とされた死亡数である。これらの統計値が時間的変化が感染者数の時間的変化を反映していると仮定し、その時間的変化に最も適合した流行をもたらすλを最尤法により推定した。第二波におけるλの推定は2つのモデルで行った。「分離モデル」では、第二波は既感染者が存在しない環境で流行すると仮定している。「混合モデル」では、第一波で新型インフルエンザに免疫を獲得した者のいる場所に第二波が再度流行すると想定した。第二波流行終了時の累積発病割合は「分離モデル」では報告患者数データ、死亡数データからそれぞれ日本人口の59%,44%、「混合モデル」では同じくそれぞれ49%,39%と推定された。観察値に最も近かったのは「混合モデル」を報告患者数にあてはめた場合であった。インフルエンザ流行期に一山型の流行を生じた場合を「混合モデル」を用いて予測すると、累積発病割合は64%から75%で、流行のピーク時には1週間で人口の23%から34%が発病する極めて大規模な流行が起こると推定された。流行の速度もウィルスの侵入からピークに達するまで810週間しか要しない程速やかであると予測された。汎流行への対策を考える場合に、このような急速で大規模な流行の可能性も排除せずに検討すべきであろう。今回のシミュレーションではその基礎となる数理モデルにKermack-McKendrick modelを採用した。このモデルは2元の微分方程式により記述されるものである。このモデルで感染性(infectivity)の大きさを表わすパラメーター(λ)を1957-'58のいわゆる「アジアかぜ」と1968-'69のいわゆる「香港かぜ」の記録から推定した。ただし、発病者総数の詳しい記録は得られなかったので、これらの流行期において死因がインフルエンザとされる死亡者の数の時間変化をもとにλを推定し、実際の流行での記録と比較してシミュレーションの妥当性を検討し、シミュレーションを行った。シミュレーションでは上記λが最も重要であるが、今回は上記2つの流行データから推定されたλと、ヨーロッパ第7回インフルエンザ会議(1993)での勧告で想定されたインフルエンザ汎流行での最小発病率である25%をもたらすλを用いた。均一な集団構造を仮定して新型インフルエンザの流行をシミュレーションしたところ、冬季に「アジアかぜ」級の新型インフルエンザが流行すれば、4700万人以上の発病者が発生し、8000人程度が死亡すると予測された。また、1日あたりの新規発病者発生数は最大約90万人と推定された。人口の25%の発病があった場合、1日あたりの新規発病者発生数は最大約40万人、死亡者の合計は4000人程度と推定された。新型インフルエンザの流行は医療機関のみならず、社会にも甚大なインパクトを与えると予想される。

数式モデルに用いるパラメーターの推定やモデルの適用方法を改善し,空間構造や年齢等の集団内構造を考慮したシミュレーションを行う事が今後の課題である。強い感染性を持った新型インフルエンザが生まれ、汎流行が生ずる可能性は常に存在する。日本では195758年にかけて新型インフルエンザによる「アジアかぜ」が夏の第一波と冬の第二波に分かれて流行した。本研究では「アジアかぜ」と同等の感染力を持った新型インフルエンザが冬期に日本に侵入した場合を予測した。伝染病流行の数理モデルにはKermack-McKendrick modelを用いた。感染力(λ)の推定に用いたデータは、「伝染病および食中毒統計年報」に記載された報告患者数と、人口動態統計からインフルエンザが原因とされた死亡数である。これらの統計値が時間的変化が感染者数の時間的変化を反映していると仮定し、その時間的変化に最も適合した流行をもたらすλを最尤法により推定した。第二波におけるλの推定は2つのモデルで行った。「分離モデル」では、第二波は既感染者が存在しない環境で流行すると仮定している。「混合モデル」では、第一波で新型インフルエンザに免疫を獲得した者のいる場所に第二波が再度流行すると想定した。第二波流行終了時の累積発病割合は「分離モデル」では報告患者数データ、死亡数データからそれぞれ日本人口の59%,44%、「混合モデル」では同じくそれぞれ49%,39%と推定された。観察値に最も近かったのは「混合モデル」を報告患者数にあてはめた場合であった。インフルエンザ流行期に一山型の流行を生じた場合を「混合モデル」を用いて予測すると、累積発病割合は64%から75%で、流行のピーク時には1週間で人口の23%から34%が発病する極めて大規模な流行が起こると推定された。流行の速度もウィルスの侵入からピークに達するまで810週間しか要しない程速やかであると予測された。汎流行への対策を考える場合に、このような急速で大規模な流行の可能性も排除せずに検討すべきであろう。
音声言語の韻律パタンの獲得過程に関する研究

本研究では、音声言語の韻律的側面の中でも特にアクセントに着目し、アクセントの生成データ及び知覚データを、05歳児を対象に横断的・縦断的に収集し、獲得過程における言語普遍的特性と個別言語的特性の相対的関係を検討する。アクセント体系の異なる、標準アクセント地域、京阪アクセント地域、二型アクセント地域(鹿児島)の乳幼児および日本語とは異なるストレスアクセントの英語話者の乳幼児を対象として実験を行ない、比較、対照データを収集する。本年度は、以下の実験により成果を得、研究の総括を行なった。(1)アクセント知覚実験:1年次に開発した実験装置、プログラムを改良して用い、東京方言、鹿児島方言の乳幼児および成人を対象に単語アクセントの同定知覚実験を行ない、比較対照データを収集した。その結果、年齢群によらず鹿児島方言話者はアクセントに対する知覚の閾値が低い、いわばアクセント知覚能力が弱いことが明らかとなった。前年度までの研究成果により、鹿児島方言話者の幼児において個別言語的特性を有するアクセントの獲得過程が観察されているが、この点は上記アクセント知覚能力に関連しているものと考えられた。(2)研究の総括:得られた実験データに基づき、獲得過程における言語普遍的特性と個別言語的特性の相対的関係、およびそれらに対する社会言語学的要因を解析した。解析の結果はイタリア・トリエステScuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati(国際先端研究所)認知神経心理部門にて報告され、国外の関連研究者との研究討論が行なわれた。国際会議(Language and Phonetics 2003;於・明海大学)および国内の諸学会においても報告された。これらの議論を含めた研究成果は関連国際学術雑誌へ投稿中である。
内耳カリウムイオンリサイクルに対する骨髄間葉系幹細胞移植の役割

マウス骨髄間質細胞(KUSA-A1細胞)を分化誘導後、同系統マウスおよび音響外傷マウスへ移植し移植細胞の生着を認めた。聴力保存の可否の検討には至らなかったが、特に音響外傷により障害をうけた領域への生着が顕著であった。生着した細胞は骨分化が認められ、病理組織学的な解析で正確な細胞移植モデルを作成可能であることが示された。臨床応用に向けヒト間葉系幹細胞から分化させた幹細胞を内耳に移植した。幹細胞の採取は手技上の問題があるが、骨髄幹細胞は臨床応用されている技術であり実行性が高い。また今回、臨床応用され安全性が高い薬剤Risovist【○!R】を移植細胞に貪食させ、組織学的に動態検出可能であることを認めた。鉄を含んでいる細胞が内耳に生着機能した場合、幹細胞の内耳内の存在をMRIで検出可能となることが期待される。動物モデルで移植細胞は生着が認められ、骨分化していた。線維芽細胞へ分化するヒト細胞の探索・選択も重要だが、移植前分化誘導条件、移植後環境について検証をする必要がある。他方、現存臨床手術手技上の過程で得られる細胞を脱分化させ、再移植する事ができればそれも望ましく、手術手技へのそのような目的での評価検討も必要と思われる。内リンパ腔への骨髄幹細胞移植にて生着を確認したことは一定の成果であったが、現時点では内耳内で線維芽細胞への完全な分化・再生の確認には至っていない。本研究を発展させ(1)難聴・耳鳴等の内耳障害患者でのイオンリサイクルに対する自家・同種他家細胞移植再生法の確立(2)移植ヒト骨髄間葉系細胞の寿命延長、増殖法等の現存バイオインフォマティクスの整理、蓄積及び(3)現在の臨床世界に照らした施行方法の安全性、科学性、倫理性の確立をこれからの課題とし研究を続けたい。動物難聴モデルに対する骨髄幹(KUSA-A1細胞)の内耳蝸牛へ直接投与を行い、内耳線維芽細胞への生着を観察する事を試みた。その結果、骨髄幹細胞は内耳や中耳にわたって細胞が生着したが、多くの細胞は骨に置換されていた。生体内で線維芽細胞へ分化していたかどうかは今後の検討課題としたい。今後実験動物において間葉系幹細胞から分化させた内耳幹細胞を投与し、細胞の着床を含めたnetworkの形成と内耳の機能再生について検討する事も視野に入れたい。まとめとして、我々は有毛細胞の存在する内リンパ腔に骨髄幹細胞を投与したが、現時点では内耳線維芽細胞の完全なる分化や再生には至っていない。しかしながら、これらを基盤に本研究を推進することにより(1)有毛細胞が消失した部位に移植された幹細胞が着床することによる、聴力低下のある患者に対する自家ないし同種他家細胞を用いた内耳再生法の確立(2)ヒト骨髄間葉系細胞の寿命延長、増殖法の研究から得られる結果に基づくバイオインフォマティクスからの情報の蓄積、それらの方法の安全性、科学性、倫理性の確立を今後の課題としたい。投与した細胞が分化あるいは再生しやすい環境についても検討を加えていく必要があるだろう。いままで内耳再生の視点で骨髄幹細胞の投与について論じたが、視点を変えてみると、中・内耳は骨で囲まれた組織であり、骨髄幹細胞が骨細胞に分化し、骨組織に変化することは内耳再生とは別に、慢性中耳炎や真珠腫性中耳炎などの中耳疾患に対するアプローチには有用であるかもしれず、この知見は中耳の再生医療として新たなる選択肢になりうるかもしれない。
表題構造分析と内容提示項目に基づく技術文書からの表題自動生成に関する研究

本研究では,対象を技術系論文と新聞記事に絞り,原文を言い換えたり,合成したりすることによって,表題を自動生成する手法を考案する.技術論文の表題には,ある種の構文的構造が存在し,多くの場合は名詞句となることが多いといわれる.研究代表者は,研究・開発の内容を具体的かつ簡潔に表現しなければならないという表題の性質に着目し,表題中にはいくつかの内容提示項目(研究の目的や対象,方法)が必須情報として含まれるべきである仮定する.また,重要文抽出に基づく生成手法では内容提示項目が含まれない可能性が高い.そこで,本文を形態素レベルでとらえることで,より小さな単位から表題を生成することが有効であると考えた.平成15年度は,学術論文から表題を自動生成する方法を考案した.まず,タイトルを生成するためのベースとなる重要文抽出法を考案した.提案手法は,定型表現と手掛り語,TF-IDFにより重要文を抽出する.実験により,約73%の精度で重要文を抽出することを示した.次に,抽出された重要文から内容提示項目(目的,方法,長所,対象,動作,形態,主旨)をベースにタイトルを生成する手法を考案した.提案手法は,「形態」要素を起点にして,必要な内容提示項目を係り受け情報を基に獲得する.提案手法の有効性を確認するために,2000-2002年度の情報処理学会自然言語処理研究会報告359件の論文概要から40件を無作為に抽出して,自動生成したタイトルを以下の指標で評価した.(1)タイトルとして成立する;(2)タイトルして許容できる;(3)タイトルとして物足りない;(4)タイトルとして成立しない.結果として,(1)のみ精度は約32%であったが,(2)まで含めると約73%の精度でタイトルが生成できることを確認した.以上の研究成果は,国際会議や年次大会などで報告した.今後は,重要文に頼らないタイトル生成法へも拡張し,提案した技術をより明確にアピールできるタイトルの自動生成を実現する.本研究では,対象を技術系論文と新聞記事に絞り,原文を言い換えたり,合成したりすることによって,表題を自動生成する手法を考案する.技術論文の表題には,ある種の構文的構造が存在し,多くの場合は名詞句となることが多いといわれる.研究代表者は,研究・開発の内容を具体的かつ簡潔に表現しなければならないという表題の性質に着目し,表題中にはいくつかの内容提示項目(研究の目的や対象,方法)が必須情報として含まれるべきである仮定する.また,重要文抽出に基づく生成手法では内容提示項目が含まれない可能性が高い.そこで,本文を形態素レベルでとらえることで,より小さな単位から表題を生成することが有効であると考えた.平成14年度は,技術論文・解説・報告書の表題と技術系新聞記事の見出し分析を中心に行った.まず,技術論文の表題と要約を抽出し,表題に使われやすい構文構造の分析を行った.これを基に,副詞的表現や形容詞的表現なども考慮した構文パターンの作成を行った.特に,パターンの記述には研究代表者が考案したパターンマッチング手法を用いた.パターン記述には,多属性の情報が自由記述可能であるため,パターンの抽象化も容易に実現できる.内容提示項目とは,表題を形成するために必要不可欠な情報であると仮定した,研究の目的や対象,方法などの情報である.論文の要約と表題を分析し,内容提示項目の体系化を行った.特に,構文パターンに含まれる定型表現「による」,「のための」を手がかりに項目を分類した.以上の研究成果は,現在,国際会議に投稿中である.現在は,内容提示項目を文書中から自動抽出するための方法を考案中である.また,スタイルに応じた表題を生成するため,新聞見出しを分析し,技術文書の構文構造や内容提示項目との違いを洗い出している.平成15年度は,表題の自動生成法を中心に取り組む予定である.本研究では,対象を技術系論文と新聞記事に絞り,原文を言い換えたり,合成したりすることによって,表題を自動生成する手法を考案する.技術論文の表題には,ある種の構文的構造が存在し,多くの場合は名詞句となることが多いといわれる.研究代表者は,研究・開発の内容を具体的かつ簡潔に表現しなければならないという表題の性質に着目し,表題中にはいくつかの内容提示項目(研究の目的や対象,方法)が必須情報として含まれるべきである仮定する.また,重要文抽出に基づく生成手法では内容提示項目が含まれない可能性が高い.そこで,本文を形態素レベルでとらえることで,より小さな単位から表題を生成することが有効であると考えた.平成15年度は,学術論文から表題を自動生成する方法を考案した.まず,タイトルを生成するためのベースとなる重要文抽出法を考案した.提案手法は,定型表現と手掛り語,TF-IDFにより重要文を抽出する.実験により,約73%の精度で重要文を抽出することを示した.次に,抽出された重要文から内容提示項目(目的,方法,長所,対象,動作,形態,主旨)をベースにタイトルを生成する手法を考案した.提案手法は,「形態」要素を起点にして,必要な内容提示項目を係り受け情報を基に獲得する.提案手法の有効性を確認するために,2000-2002年度の情報処理学会自然言語処理研究会報告359件の論文概要から40件を無作為に抽出して,自動生成したタイトルを以下の指標で評価した.(1)タイトルとして成立する;(2)タイトルして許容できる;(3)タイトルとして物足りない;

(4)タイトルとして成立しない.結果として,(1)のみ精度は約32%であったが,(2)まで含めると約73%の精度でタイトルが生成できることを確認した.以上の研究成果は,国際会議や年次大会などで報告した.今後は,重要文に頼らないタイトル生成法へも拡張し,提案した技術をより明確にアピールできるタイトルの自動生成を実現する.
根寄生雑草ストライガの宿主養水分収奪戦略におけるアブシジン酸の重要性の解明

根寄生雑草ストライガは気孔閉鎖に関わるアブシジン酸(ABA)濃度が宿主よりも高く、ストライガ寄生により宿主ABA濃度は増加する。本研究では、ストライガがABAを合成し宿主へ輸送しているかを調べた。ストライガ独立個体のABA濃度はソルガムに寄生したストライガと同様であったことから、ストライガ自身がABAを合成していることが分かった。ストライガ独立個体のABA濃度は浸透ストレスの影響は受けなかった。一方、重水素で標識されたABAをストライガの葉に塗布して宿主ソルガムへの輸送を調べたが、分析データのばらつきが大きく、ストライガからソルガムへのABAの移動を確証するには至らなかった。根寄生雑草ストライガは、ソルガムやミレットに寄生することからアフリカの乾燥地の作物生産に多大な被害を及ぼしている。これまでの研究で、気孔応答に関わるアブシジン酸(ABA)濃度は、宿主のソルガムよりもストライガでは約10倍も高く、ストライガの寄生によりソルガムで増加することが分かった。ストライガ自身がABAを合成し、宿主へ輸送することにより宿主からの養水分収奪に関わる蒸散流を能動的に制御している可能性がある。そこで本年度は、ポットおよびライゾトロンで栽培した個体を用いて、ストライガの葉にd6-ABAを処理し、4時間後にソルガムの葉をサンプリングしてd6-ABAが輸送されているかどうかを調べた。ライゾトロンでは3個体中0個体、ポットでは12個体中4個体でソルガムの葉からd6-ABAが検出された。ストライガとソルガム間のABAの輸送については、今後、d6-ABAの処理時期やサンプリング時期等を検討し、さらに調査する必要がある。また、ライゾトロンで栽培した個体にポットと同様の水ストレスをかけるための潅水量について調査した。ライゾトロンで培地に用いたロックウールは13倍(g/g)水を含むことができた。ライゾトロンの水量がロックウールの乾物重の5倍を下回ると、ソルガムの気孔コンダクタンスは減少した。また、水量がロックウールの乾物重の1倍になると、水ストレスが強くかかりすぎ、完全に葉が巻いてしまった。この結果から、処理区の水分量は、湿潤区ではロックウールに対し5-13倍、乾燥区では1-5倍の範囲とすることとした。なお、本年度はライゾトロンで栽培したソルガムとストライガの気孔応答やABAの測定を計画していたが、ストライガの寄生率が悪く、測定に用いる個体を得ることができなかった。来年度はストライガの接種率を上げ、過剰に寄生が生じた際には間引くことで調整を行いたいと考えている。根寄生雑草ストライガ(Striga hermonthica)は、ソルガムやミレットに寄生することからアフリカの乾燥地の作物生産に多大な被害を及ぼしている。これまでのポット栽培実験で、気孔閉鎖に関わるアブシジン酸(ABA)濃度は、土壌水分条件に関わらず宿主のソルガムよりもストライガでは約10倍も高く、ストライガの寄生によりソルガムで増加することが分かった。本年度は、ストライガの寄生率を均一にできるライゾトロン法によりロックウールを詰めたシャーレで栽培したソルガムとストライガの葉の気孔コンダクタンスを調査した。ロックウールの最大含水量の70-100%の含水量を維持した湿潤条件に比べて30-60%に維持した乾燥区では、ソルガムの気孔コンダクタンスが大きく低下したのに対し、ストライガでは低下が小さく、これまでのポット実験の結果を支持する結果が得られた。また、ライゾトロンで栽培したストライガの葉にd6-ABAを処理し、4、8、12時間後にソルガムの葉をサンプリングしてd6-ABAがストライガからソルガムへ輸送されているかどうかを調べた。その結果、いずれのサンプリング時期においても、ソルガムの葉からd6-ABAが検出された。今後、ソルガム葉内のd6-ABA濃度の経時変化を調査する。MS寒天培地で栽培したストライガ独立栄養個体について、異なるポリエチレングリコール(PEG)濃度処理および明・暗処理を行い、ABA濃度を調べた。その結果、ストライガ独立栄養個体でも、ソルガムに寄生したストライガと同程度のABA濃度であることが分かった。PEGによる浸透圧ストレスのABA濃度への影響は認められなかった。また、暗条件下のほうが明条件に比べてABA濃度が高かった。根寄生雑草ストライガは、ソルガムなどに寄生することからアフリカの乾燥地の作物生産に多大な被害を及ぼしている。これまでに、気孔閉鎖に関わるアブシジン酸(ABA)濃度は宿主ソルガムよりもストライガで約10倍も高く、ストライガの寄生によりソルガムで増加することが分かった。本年度は、ライゾトロン法によりロックウールを詰めたシャーレでストライガとソルガムを栽培し、ストライガの葉にd6-ABA(0, 0.1, 1μmol)を含む50%アセトン水溶液50μlを塗布し、6時間後のソルガムおよびストライガの葉中のd6-ABAを調べた。

ストライガに0.1μmol d6-ABAを処理したソルガムの葉から最も高いd6-ABAが検出された。しかし、0μmol d6-ABA処理区のソルガムからもd6-ABAが検出されたことから、本方法ではABAがストライガからソルガムへ輸送されていることを確証することができなかった。そこで、トウモロコシのABA生合成遺伝子欠損変異体(vp14)を用いて、ストライガの接種により変異体のABA濃度が増加し気孔が閉鎖するかどうかを検証した。Maize Genetics Cooperation Stock Centerから分譲された種子から得た個体を自家受粉させ、登熟前に収穫して過湿状態に置き、穂発芽した種子をライゾトロンに移植して育てた。ABA濃度が極めて低く、乾燥条件下でABAが増加せず、気孔が閉じない個体を選抜し、ストライガ発芽種子を接種した。ストライガの寄生によりトウモロコシの気孔は閉鎖したがABA濃度は個体間差異が大きく、ストライガ接種によるソルガムの気孔閉鎖の結果がABA濃度の増加に原因するかどうかは検証できなかった。根寄生雑草ストライガは気孔閉鎖に関わるアブシジン酸(ABA)濃度が宿主よりも高く、ストライガ寄生により宿主ABA濃度は増加する。本研究では、ストライガがABAを合成し宿主へ輸送しているかを調べた。ストライガ独立個体のABA濃度はソルガムに寄生したストライガと同様であったことから、ストライガ自身がABAを合成していることが分かった。ストライガ独立個体のABA濃度は浸透ストレスの影響は受けなかった。一方、重水素で標識されたABAをストライガの葉に塗布して宿主ソルガムへの輸送を調べたが、分析データのばらつきが大きく、ストライガからソルガムへのABAの移動を確証するには至らなかった。これまで屋外のポット実験で確認されていたソルガムとストライガの水ストレスに対する気孔応答の差異が、人工気象器内のライゾトロン法でも確認できた。これにより、ポット実験より均一な環境条件の人工気象器で、ストライガの寄生率およびソルガムとストライガの生育を揃えることのできるライゾトロン法による実験系を確立することができた。また、d6-ABAを用いたトレーサー実験により、4-12時間でストライガからソルガムへABAが転流されていることが確認された。今後は転流されたABAの濃度の経時変化を調査する。ストライガ独立栄養個体のABA濃度に関しては、浸透圧ストレスの強度および明・暗処理期間の影響について、さらに検討が必要である。作物生理学ライゾトロン法でソルガムとストライガを栽培し、ストライガの葉にd6-ABA処理を行い、ソルガムの葉でのd6-ABA濃度の経時変化を測定する。また、ライゾトロン法で栽培したソルガムとストライガに湿潤、乾燥、ABA葉面散布処理を行い、気孔コンダクタンスおよび内生ABA濃度の葉位別の調査を行う。ストライガ独立栄養個体については、PEG処理強度および明・暗処理の処理期間が気孔応答とABA濃度へ与える影響について調査する。さらに、寄生関係にあるソルガムとストライガ、およびストライガ独立栄養個体の水耕栽培法の確立に取り組む。本年度はライゾトロンで栽培したソルガムとストライガの気孔応答やABAの測定を計画していたが、ストライガの寄生率が悪く、測定に用いる個体を得ることができず、培地の水分レベルの決定までしか行うことができなかった。
mi転写因子(MITF)によるマスト細胞の分化制御

転写因子MITFがマスト細胞の分化にどのように関係しているのか総合的に調べる計画を立てて4年間研究を行い以下の成果を得た。1)MITFをコードするmi遺伝子座には多くの突然変異が知られている。突然変異の構造と転写因子としての機能の間にはどのような関係があるのか調べた。MITFのDNA結合部分であるbasic領域の点突然変異の結果、DNA結合能を欠くMITFは転写能を欠くばかりでなく他の転写因子の機能を妨害する(inhibitory mutation)。一方MITFを全く産生しないか、構造上きわめて大きな異常を持つMITFを産生する突然変異の場合、MITFの転写能が存在しないだけであり、ホモ・マウスの症状はinhibitory mutationの場合より軽い(null mutation)。2)MITFを発現していないtg/tgマウスを、マスト細胞の最も重要な増殖因子stem cell factor(SCF)の受容体であるc-kit receptor tyrosine kinase(KIT)の機能喪失性突然変異マウスW/Wvと同じ遺伝的背景で作成した。このtg/tgマウスはほぼ正常に成長するのでin vivoの実験を容易に行うことができた。X線照射したW/Wvマウスの静脈内に+/+マウスの骨髄細胞を注射すると赤血球、好中球、マクロファージ、B細胞、T細胞は+/+マウス由来の細胞に置き換わり、W/Wvマウスで欠損していたマスト細胞も全身の組織で出現する。一方tg/tgマウスの骨髄細胞をW/Wvマウスに注射した場合には、赤血球、好中球、マクロファージ、B細胞、T細胞はtg/tg由来の細胞に置き換わるものの、マスト細胞はどの組織でも出現しない。MITFは成熟したマウスの組織内でマスト細胞がその前駆細胞から分化するために必須の転写因子であると考えられた。mi転写因子(MITF)はマストの分化を制御する重要な転写因子である。本研究においては、1)種々のMITFミュータントマウスの特徴づけ。2)マスト細胞においてMITFが転写因子に関与する遺伝子の同定。3)MITFの作用機構。4)プロテアーゼ遺伝子の転写という4個の研究項目を設定して研究を開始した。MITFをコードするmi遺伝子座には、人工的につくられたものを含めて多くのミュータントが知られているので、MITF遺伝子の異常とマスト細胞の表現形の関係についてしらべた。mi遺伝子座で最初にみつかったmi突然変異遺伝子をホモに持つmi/miマウスの皮膚のマスト細胞とmi/miマウスの脾臓細胞を培養して得た培養マスト細胞の表現形は多くの異常を示す。最初はmi突然変異遺伝子がコードするMITF(mi-MITF)の転写活性性を失われるためであると単純に考えていたが、mi遺伝子自身のプロモーター領域にトランスジンが挿入されたためにMITFが全く産生されなくなったtg/tgマウスの皮膚マスト細胞あるいは培養マスト細胞の表現形と比べてみると、mi/miマウスのマストの異常の方が程度が大きいことが分かった。mi-MITFは転写活性を欠くのみならず、他の転写因子の転写活性を制御していると考えられる。mi,tg以外の突然変異について、そのミュータントのマスト細胞の表現形がmi/miとtg/tgのどちらに似ているか調べてみると、mi-ce/mi-ceマウスと、mi-ew/mi-ewマウスのマスト細胞の表現形は、mi/miよりtg/tgに似ていた。mi-ce突然変異遺伝子で欠損しているzipper領域の1部、mi-ew突然変異遺伝子で欠如しているbasic領域の1部は、正常MITFの転写活性化能にも、またmi-MITFでみられる転写抑制能にも必須を考えられた。

(1)種々のMITF突然変異マウスから培養マスト細胞を樹立して、各々の培養マスト細胞で発現しいる遺伝子を比較し、MITF突然変異をnull mutationとinhibitory mutationにわけた。培養マスト細胞ではMITFを全く発現しないmi^<tg>、basic領域に大きな欠失を持つmi^<ew>、Zip領域を完全に欠失するmiceはnull mutationであるのに対して、basic領域の1個のアミノ酸の欠失あるいは置換を示すmi, Mi^<or>はinhibitory mutationであった。(2)+/+培養マスト細胞のcDNAライブラリーからmi/mi培養マスト細胞のmRNAをサブトラクションすることで、マスト細胞で発現している遺伝子のうちMITFにより制御されているものを選んでいるが、本年度に得た遺伝子で最も興味深いのは、SgIGSF(spermatogenic immunoglobulin superfamily)の遺伝子である。SgIGSFは細胞膜貫通性のタンパクで細胞の接着・移動に関係すると考えられている。mi/mi培養マスト細胞は線維芽細胞との接着、線維芽細胞の産生する走化性因子に対する遊走能に欠陥を示すので、SgIGSFの産生低下によりmi/miマスト細胞の生物学的異常を説明できる可能性があるからである。(3)mi/miマウスは歯の生育不全のため離乳後すみやかに死亡するが、tg/tgマウスの歯の生育は正常であり、成長した個体を容易に得る事ができる。tg/tgマウスの皮膚ではマストが存在するが、他の組織はマスト細胞を欠損するので、部分的マスト細胞欠損マウスとして利用できる。tg/tgマウスは消化管寄生虫の感染が遷延し、急性細菌性腹膜炎による死亡率が高い。MITFミュータントマウスの皮膚では、マスト細胞が正常対照(+/+)マウスの1/2から1/3程度存在するが、MITFミュータントマウスの腹腔はマスト細胞を欠損する。MITFミュータントマウスの腹腔に+/+マウス由来培養マスト細胞を注射すると生存し続けるが、MITFミュータントマウス由来の培養マスト細胞を注射しても死滅してしまう。また+/+マウス由来培養マスト細胞を線維芽細胞と共生培養すると、+/+マウス由来マスト細胞は線維芽細胞に接着し生存を続けるが、MITFミュータントマウス由来の培養マスト細胞は、線維芽細胞に接着せず死滅する。これらの現象は培養マスト細胞が線維芽細胞と接着する際に必要とする因子の転写にMITFが関与していると考えると説明出来る。そこで、+/+マウス由来培養マスト細胞のcDNAライブラリーからMITFミュータントマウス由来培養マスト細胞で発現しているmRNAをサブトラクションし、接着因子をコードしていると考えられるクローン1個を得た。
イチゴ黒斑病菌の病原性を決定するCD染色体の構造と機能

Alternaria alternataには、それぞれ異なる植物に寄生する7種の病原性系統(病原型)が存在する。これら病原菌の病原性は、宿主植物にのみ毒性を示す宿主特異的毒素によって決定されている。先に、イチゴ黒斑病菌(AF毒素生産菌)NAF8株からAF毒素生合成遺伝子(AFT遺伝子)クラスターを単離し、このクラスターが培地上での成育には必要でない1.05Mbのconditionally dispensable (CD)染色体にコードされていることを見出した。本研究では、CD染色体の構造と機能の解明を目的として、EST (expressed sequence tag)解析による本染色体にコードされる遺伝子群の網羅的同定と、1.05Mb染色体の構造解析を行った。昨年度は、EST解析によって本染色体にコードされる100個の遺伝子を同定した。これら遺伝子の約半数は既知遺伝子と相同性が認められず、CD染色体に存在する遺伝子の多くが機能未知の新規遺伝子であることが明らかとなった。本年度は、CD染色体の構造解明を目的として、1.05Mb染色体のショットガンクローンとBACクローンの塩基配列を解析し、複数のコンティグを同定した。それらのうち最長のコンティグ(420kb)の構造を解析し、94個の推定読み枠を見出した.この領域にはこれまでに同定したAFT遺伝子は存在せず、またデータベース相同性解析によって毒素生合成に関与すると推定される読み枠も見出されなかった。以上の結果は、1.05Mb染色体には毒素生合成遺伝子領域と毒素生合成遺伝子を含まない領域が存在することを示唆した。また、420kbの領域からは、生存・成育に必要と考えられるハウスキーピング遺伝子の相同配列も見出されず、1.05Mb染色体がCD染色体であることがさらに確認された。Alternaria alternataには、それぞれ異なる植物に寄生する7種の病原型系統(病原型)が存在する。先に、イチゴ黒斑病菌(イチゴ病原型、AF毒素生産菌)NAF8株からAF毒素生合成遺伝子(AFT遺伝子)クラスターを単離し、このクラスターが培地上での生存・生育には必要でない1.05Mbのconditionarydispensable(CD)染色体にコードされていることを見いだした。本研究では、CD染色体の構造と機能の解明を目的として、EST(expressed sequence tag)解析によって本染色体にコードされる遺伝子群の網羅的同定を進めている。本年度の成果を以下に要約する。1.糸状菌の遺伝子数は約10000個、本菌のゲノムサイズは約30Mbであることから、1.05MbのCD染色体には350個程度の遺伝子が存在すると推定される。NAF8株のcDNAライブラリーから、CD染色体プローブを用いて463クローンを単離した。これらクローンの部分配列を決定し、それらを相互比較することによって、異なる遺伝子由来の149クローン(推定遺伝子数の約32%)を同定した。2.データベース相同性解析によって、149個の独立クローンを推定機能別に分類した。その結果、独立クローンのうち62クローン(42%)は既知配列との有意な相同性が認められず、CD染色体に存在する遺伝子の多くが機能未知の新規遺伝子であることが明らかとなった。独立クローンからは、先に同定したAFT遺伝子群のcDNAに加え、各種酵素遺伝子と相同なクローンも見いだされた。そこで、推定された酵素機能とA.alternataの他の病原型における分布様式に基づき、AF毒素生合成に関与する遺伝子を推定した。
ナノ空間材料への光機能ユニットの固定によるハイブリッド材料の合成

機能粉体の表面にナノポーラスシリカの被覆を施すことで耐酸性、分散性などの改善の可能性と、表面の機能化が期待でき、また場合によっては粉体を取り除いて中空ナノポーラスシリカ粒子を得ることにもつながることを期待した。また層状複水酸化物(ハイドロタルサイト)の六角板状結晶を形態の鋳型として用い、メソポーラスシリカの六角板状粒子を合成した。この方法を応用して、他の粒子表面へのメソポーラスシリカの析出を試みた。具体的には酸化チタン、酸化亜鉛などを核としてメソポーラスシリカと複合化したハイブリッド粒子を合成し、その構造/機能を評価した。酸化亜鉛粉体を被覆したときの変化をSEMで観察した結果を図1に示す。酸化亜鉛(図1a)表面にナノポーラスシリカが析出した様子が見られ、これはIR、熱分析などでも確認できた。ナノポーラスシリカ部分の比表面積は数百平方メートル毎グラムであった。このようにして調製したナノポーラスシリカ被覆酸化亜鉛を酸処理することでナノポーラスシリカの中空粒子を得ることもできた。(細孔サイズは約2nm、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩化物を鋳型として使用)図2に得られた中空粒子のTEM像を示す。酸化亜鉛は多様な形態のものが合成できるのに加えて、酸で容易に分解できるのでナノポーラスシリカの形態鋳型としても有用である。酸化チタン粒子についてもナノポーラスシリカで被覆することに成功した。合成条件を工夫することで被覆の厚さをある程度制御することも可能である。現在のところ厚さ数十nm程度の被覆を形成させることができ、比表面積はこの場合も数百ナノメートル毎グラムであった。界面活性剤の集合体を鋳型とした反応によりその合成が報告されて以来、メソポーラスシリカの合成、評価、応用に関する多くの研究が行われるようになった。その細孔サイズからゼオライトには吸着し得ないバルキーな化合物の吸着剤、触媒としての展開が期待され、金属クラスターや錯体など触媒活性点の担持に関する研究も行われている。一方固定化する活性点の分布や拡散は反応を制御する重要な因子と考えられるのにも関わらず、それらに関する検討は実験的に困難なこともあり、行われていない。本研究では超分子鋳型法により得られるメソポーラスシリカ細孔への光機能ユニットの固定を試みている。本年度はメソポーラスシリカ粒子の形態設計について、膜、球に加え板状粒子の合成に成功した。またアルミニウムオキシン錯体をゲストとしてメソポーラスシリカに包接することを試みた。メソポーラスシリカへのアルミニウムオキシン錯体の固定アルミニウムオキシン錯体の吸着したメソポーラスシリカ(細孔径3.1nm、BET表面積1000m2/g)のPLスペクトルにおける470と520nmに極大を持つ発光の強度比を観察したところ,吸着量の増加に伴い520nmの発光が強くなる様子が見られた。これは吸着量が増えるのに従って隣接錯体間の相互作用が強くなっていることを反映しているものと考えられる。蛍光顕微鏡で吸着の様子を観察したところ、時間の経過に伴い発光波長が変化する様子が確認でき、はじめはメソポーラスシリカ細孔表面との相互作用で吸着がおこり、吸着が進むのに従い、錯体間相互作用が強くなって行くものと思われた。細孔径、温度などの影響も興味深く、引き続き検討中である。
養殖ウナギの血管内皮壊死症の原因ウイルス(JEAdV)の核酸解析

養殖ウナギに発生するウイルス性血管内皮壊死症の原因ウイルスゲノムの全塩基配列を決定した。ウイルスゲノムは環状DNA構造でその塩基数は15, 131bpであった。このゲノムのオープンリーディンフレームを他のウイルスと比較すると、相同性はポリオーマウイルスのlarge T-antigen領域しか認められないことから、新しいウイルス科に属することを示した。このゲノムの異なる領域から作成した3種類のPCRプライマーはいずれも本ウイルスを特異的に検出した。また、ホルマリン不活化ワクチンによる予防効果が認められた。【目的】本年度の研究では、ウナギのウイルス性血管内皮壊死症の原因ウイルスの遺伝子構造解析のためウイルスの精製過程を必要としないでウイルスの塩基配列を決定できるRDV法や密度勾配超遠心法などによるウイルスの精製とクローニングにより本ウイルスの核酸の塩基配列を決定することを主な目的とした。【方法】JEE細胞で本ウイルスを4日間培養後その培養上清からQIAamp Mini DNA抽出キッとを用いてDNAを抽出した。このDNA試料からRDV法によってウイルスDNA断片を増幅後、ダイレクトシークエンスによって塩基配列を決定した。RDV法で得られた塩基配列からプライマーを設計して、自然感染魚の鰓などの組織から本ウイルスの検出、さらにReal-time PCRによってJEE細胞内でのウイルスDNA量の挙動を解析した。【結果】RDV法によって本ウイルスDNAの塩基配列を5.300bpまで決定した。この塩基配列をBlast検索すると既知のウイルスとは相同性は認められなかった。これは未知のウイルスである可能性が高く、全塩基配列を明らかにする必要があると考えられる。この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳すると、わずかにPolyoma virusのLarge T antigenの一部に相同性があった。この部分の塩基配列から240bpを増幅するプライマーを設計し、これを用いて自然感染魚の鰓などの組織からPCRによって本ウイルスの検出を試みた結果、目的のサイズのDNA断片が増幅された。一方、正常魚からは検出できなかった。JEE細胞内のウイルスDNAは接種後2時間から検出され、2448時間の間に著しい増加が見られ、144時間経過後にはウイルスDNAのコピー数1.23×10^7に達した。これらの結果から、今回設計したプライマーは本ウイルスを検出するためのプライマーとして有効であると考えられる。[目的]昨年度の研究で、RDV法やゲノムウオーキングによってウナギのウイルス性血管内皮壊死症の原因ウイルスゲノムを5,300bp塩基配列まで決定した。本年度は、次世代シークエンサーやOverlapping PCR及びサザーンブロット法よって本ウイルスの全塩基配列を明らかにし、遺伝子構造解析を行うことを主な目的とした。[方法]JEE細胞に本ウイルスを4日間培養した後、その培養上清30mLからDNAを抽出した。このDNA試料から次世代シークエンサーを用いて本ウイルスの全塩基配列を決定した。得られた塩基配列やOverlapping PCR及びサザーンブロット法によってDNA構造を解析した。Blast検索して既知のウイルスとの相同性を比較した。また、ウイルス検出用ための4種類のPCRプライマーを設計し、感染細胞、自然感染魚、実験感染魚から抽出したDNAをTemplate DNAとしてこれらのプライマーとAmphilTaqGold(ABI)を用いてアニーリング温度55°C、サイクル数70回でPCRを行った。[結果]次世代シークエンサーよって本ウイルス(JEECV)の全塩基配列15.131bpを決定した。JEECVは2本鎖の環状DNAウイルスであった。この中には、15のORFが存在していた。全塩基配列をアミノ酸配列に翻訳してBlast検索すると、PolyomavirusのLargelT-antigen領域の一部に相同性が認められた。しかし、JEECVのこの領域をPolyQmavirus群とneighbor-joining methodによって得られた分子系統樹を作成して比較した結果、JEECVは新しいウイルス科に属することを示した。JEECVのPolyomavirusのLarge T-antigen-like領域から2カ所(プライマーA,024)、他の領域から2カ所(プライマーB,C)計4カ所から作成したPCRプライマーによってJEECVの検出を行った結果、プライマーA(270bpを増幅)の特異性や検出感度が高かった。また、自然感染魚では鰓組織からの検出率が高いことから、PCRによる本症の診断には鯉組織が適していると思われる。また、Taq polymaraseとしてGo Taq(Promega)、アニーリング温度55°C、サイクル数3040回によるPCRでも同様の結果が得られている昨年度までの研究により、ウナギのウイルス性血管内皮壊死症の原因ウイルスのゲノムの全塩基配列を解読し、その塩基数は15,131bpで2本鎖の環状DNAウイルスであることを明らかにした。ゲノム中には15のORFが存在していた5全塩基配列を基にしたアミノ酸配列によるBlast検索によりPolyomavirusのLargeT-antigen領域の一部に相同性が認められるものの、既知のウイルスとは異なる新しいウイルス科に属することを明らかにした。

さらに、この領域から作成した270bpを増幅するPCRプライマー(Primer A)を作成し、PCRによる本ウイルス(JEECV)の検出法を示した。そこで本年度は、養殖場のウナギからのJEECVの保有状況を調べるために静岡県浜松市内の養鰻場から4月12月までの期間、月2回各5尾の鰓および肝臓からJEECV検出を行った。また、本症の予防対策としてのワクチンの有効性について検討した。静岡県浜松市内で、例年本症の被害の多い養鰻場(A養殖場)と本症の発生が希な養鰻場(B養殖場)の未発症魚からのJEECV検出率はそれぞれ平均50.0%および35.0%となり、養殖場で飼育されているウナギは高い割合でJEECVを保有していた。しかし、検査したいずれの個体のPCRで検出されたDNAバンドの濃さは病魚のそれと比較すると非常に薄いバンドがほとんどであり、本症を発症するウイルス量には達していなかった。A,B養殖場のいずれも本症が発生した時期には、JEECVの検出率は66.750%に上昇したことから本症の発生の予測の可能性が示唆された。また、臓器別に見ると鰓からのからのJEECV検出率が平均70.064.7%を示した。JEECVのホルマリン不活化ワクチンの有効性に関しては、ワクチン接種後28日目と56日目にJEECVの腹腔内接種による攻撃試験によりその有効性を調べた。その結果、ワクチン接種後28日目では死亡率は14%、一方対照区では66.0%に達し、ワクチンの有効率(RPS)は89.9%となった。ワクチン接種後56日目でもRPSは66.0%を示した。さらに、ワクチン接種後28日目にワクチンを再接種して56日経過した実験魚でも、そのRPSは72.2%を維持していた。ワクチン接種魚の血中抗体価は28日目で16であった。これらの結果から、本症の予防対策に対してワクチンが有効であることが示唆された。
赤外帯域画像検査法の基礎研究

赤外線画像は,臨床では現在まで熱画像としての遠赤外線画像のみが利用されてきた.医学では遠赤外線画像のみしか使われていないのは,生体体表から放射される電磁波の波長が10ミクロンの近辺にあったからで,受動的な探査法ではそれ以外の利用法が考えられなかったからにすぎない.本研究では赤外領域をもう一度帯域に分けて分光画像を作り分析してみる価値を検討することにある.赤外線検知器のうち近赤外線の領域は一般のシリコンのCCD素子を利用する.一般のCCD素子は可視光線の550nm(緑)付近から880nmの近赤外線の領域までほぼ平坦な検知特性を示し,感度を上げれば400nmから1000nmまでの可視光線全域と近赤外線画像を検知可能である.最初は民生用のCCDカメラの760nm以上の波長の赤外線カットフィルターを外し,820nm以下の可視光線をカットオフする一般赤外線写真用のフィルターを取り付け,白色光のフラッドランプと830nmの自家製レーザーダイオードを光源として使用した.ついで,特定の波長帯域の画像を得るために,検知器の感度を向上させる必要から冷却型のCCD素子を利用した(検知素子は157万画素のKAF-1600:Kodakを使用).光源には赤外領域まで比較的広範な波長を持つハロゲンライトを用い,カットオフフィルターには730,766,800,830,880,1064nmを用意した.遠赤外線画像及び可視光線画像を同時に撮影するために,既に開発がされている赤外線画像重畳法を用いた.実験対象は健常人の手指と足先部とした.820nm以下の帯域をカットオフした赤外線画像では反射光線で皮下の静脈像が描出される.透過光画像では,光線の射出側で皮下3mm程度までの静脈像が明瞭に描出される.この状態で帯域フィルターをかけてcooled CCDで画像計測を行うと,830nmの波長帯で血管像を描出することができた.各帯域の画像の意味は現在精査中である.赤外線画像は,臨床では現在まで熱画像としての遠赤外線画像のみが利用されてきた.医学では遠赤外線画像のみしか使われていないのは,生体体表から放射される電磁波の波長が10ミクロンの近辺にあったからで,受動的な探査法ではそれ以外の利用法が考えられなかったからにすぎない.本研究では赤外領域をもう一度帯域に分けて分光画像を作り分析してみる価値を検討することにある.赤外線検知器のうち近赤外線の領域は一般のシリコンのCCD素子を利用する.一般のCCD素子は可視光線の550nm(緑)付近から880nmの近赤外線の領域までほぼ平坦な検知特性を示し,感度を上げれば400nmから1000nmまでの可視光線全域と近赤外線画像を検知可能である.最初は民生用のCCDカメラの760nm以上の波長の赤外線カットフィルターを外し,820nm以下の可視光線をカットオフする一般赤外線写真用のフィルターを取り付け,白色光のフラッドランプと830nmの自家製レーザーダイオードを光源として使用した.ついで,特定の波長帯域の画像を得るために,検知器の感度を向上させる必要から冷却型のCCD素子を利用した(検知素子は157万画素のKAF-1600:Kodakを使用).光源には赤外領域まで比較的広範な波長を持つハロゲンライトを用い,カットオフフィルターには730,766,800,830,880,1064nmを用意した.遠赤外線画像及び可視光線画像を同時に撮影するために,既に開発がされている赤外線画像重畳法を用いた.実験対象は健常人の手指と足先部とした.820nm以下の帯域をカットオフした赤外線画像では反射光線で皮下の静脈像が描出される.透過光画像では,光線の射出側で皮下3mm程度までの静脈像が明瞭に描出される.この状態で帯域フィルターをかけてcooled CCDで画像計測を行うと,830nmの波長帯で血管像を描出することができた.各帯域の画像の意味は現在精査中である.
木造住宅における多様な内外装材に対応した層間変位追従性能の検証法の開発

木造住宅の内外装材の留め付けに用いる接合具を対象として、接合具単体の引抜き試験とせん断試験を実施し、引抜き耐力とせん断剛性、終局耐力、終局変位をデータベース化する。そして、これを利用して、各種内外装材の層間変位追従性能を検証する方法を開発する。また、開発した方法を利用し、大きな層間変位に追従できる新しい内外装の構法を開発する。
DPC4およびSmadファミリー遺伝子の消化器癌における異常とその役割

(1)ショウジョウバエの新規SmadであるMedeaおよびdSmad2を同定した。これらのSmadの機能を生化学的に解析することにより、Smadによるシグナル伝達はショウジョウバエと哺乳類との間で保存されていることを明らかにした。(2) Smad2およびSmad3はTGF-β刺激の無い状態では単量体として存在し、TGF-βレセプターによりリン酸化されるとホモ多量体およびSmad4とのへテロ複合体を形成した。Smad3のホモ多量体およびSmad3-Smad4のへテロ多量体のいずれもDNAへの結合能を示した。(3) Smad2およびSmad3はTGF-βの刺激に応じて転写コアクチベーターであるp300と結合した。p300はTGF-βによるレポーターの活性化を促進した。一方、p300と結合するアデノウイルス蛋白であるE1AはTGF-βの転写活性化を阻害した。以上よりTGF-βによる転写活性化にはp300(あるいはCBP)が必要であると考えられた。(4)大腸癌で見出されているSmad2の変異をSmad3に導入した。変異型Smad3はレセプターに強固に結合し、野生型のSmad2あるいはSmad3のリン酸化を阻害し、TGF-βによる転写活性化およびHaCat細胞の増殖抑制を抑制した。以上より、この変異は、単にSmadの機能を喪失させるのみならず、dominant-negativeな作用により、発癌に積極的に寄与している可能性が示唆された。(5) RER-negativeのHNPCCにおいてもTGF-βII型レセプターのgermline mutationを見出し、TGF-βが大腸癌発生に抑制的に作用していることをより一般的に示した。(1)大腸癌由来のDPC4/Smad4に異常のある細胞株を用いて、そのTGF-βに対する反応性、遺伝子レベルでの異常の解明、さらに、外来性にDPC4/Smad4を導入したときのTGF-βに対する反応性の回復等について現在検討を進めている。また、肝癌および膵癌由来の細胞についても、そのSmad遺伝子の異常の検索を進めている。(2)Smadファミリーの新しいメンバーとしてSmad6を同定した。生化学的解析からSmad6はTGF-βレセプターと安定に結合し、TGF-βのシグナルを伝えるSmad2のリン酸化を抑制することを明らかにした。Smad6はさらに、Smad2のSmad4との複合体形成、TGF-βによる転写活性化を抑制した。一方、Smad6はTGF-βスーパーファミリーに属するBMPのシグナル伝達も抑制するとともに、BMPによりその発現が誘導されることが見い出された。したがって、Smad6はBMPのシグナル伝達においてnegative feedbackループを形成していることが明らかとなった。これまで、Smad2とSmad3はそれぞれがSmad4と複合体を形成し、独立にシグナルを伝えると考えられていたが、われわれはSmad2とSmad3がTGF-βに依存して結合することを示し、これらが共同してTGF-βのシグナルを伝える可能性があるこを明らかにした。また、Smad2をbaitにしたtwo-hybridスクリーニングから複数のクローンを同定しており、現在その機能の解析を進めている。(3)Smad遺伝子のターゲッティングも進行中である。(2) Smad2およびSmad3はTGF-β刺激の無い状態では単量体として存在し、TGF-βレセプターによりリン酸化されるとホモ多量体およびSmad4とのヘテロ複合体を形成した。

Smad3のホモ多量体およびSmad3-Smad4のヘテロ多量体のいずれもDNAへの結合能を示した。(3) Smad2およびSmad3はTGF-βの刺激に応じて転写コアクチベーターであるp300と結合した。p300はTGF-βによるレポーターの活性化を促進した。一方、p300と結合するアデノウィルス蛋白であるE1AはTGF-βの転写活性化を阻害した。以上よりTGF-βによる転写活性化にはp300(あるいはCBP)が必要であると考えられた。(4)大腸癌で見出されているSmad2の変異をSmad3に導入した。変異型Smad3はレセプターに強固に結合し、野生型のSmad2あるいはSmad3のリン酸化を阻害し、TGF-βによる転写活性化およびHaCat細胞の増殖抑制を抑制した。以上より、この変異は、単にSmadの機能を喪失させるのみならず、dominant-negativeな作用により、発癌に積極的に寄与している可能性が示唆された。(5) RER-negativeのHNPCCにおいてもTGF-βII型レセプターのgermline mutationを見出し、TGF-βが大腸癌発生に抑制的に作用していることをより一般的に示した。