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地方自治体の管轄行政区域における環境改善とコストの測定に関する研究

平成16年度から継続して政府・自治体による環境会計および環境報告の国際比較研究を行った。具体的には、オーストラリアとわが国との比較研究を中心とするが、そのほか、ヨーロッパ諸国における展開状況について研究した。その中から、特に、国際環境自治体協議会(ICLEI-Local Governments for Sustainability)が提唱したエコバジェット(ecoBUDGET【○!R】)と呼ばれる手法に着目した研究を行った。エコバジェットは、自治体への導入を志向した環境予算手法であるが、これまでにドイツ、スウェーデン、イタリア、ギリシャおよびイギリスのいくつかの自治体において試行プロジェクトが行われている。これらのプロジェクトから得られた成果を踏まえ、特に環境会計との関係を考慮した研究を行った。そして、エコバジェットと環境会計という2つの制度をわが国の自治体に適用することを考慮し、その適用を促進する要因と阻害する要因の分析を行った。当該研究の成果は、7月に日本大学経済学部開催された19th Pacific Regional Science Conferenceにおいて"The Applicability of Environmental Budgeting to Japanese Local Governments"として報告した。現在、自治体の管轄行政区域における環境改善の状況と、その改善を達成するための活動とそれに関わるコストとの関係を明らかにするために、エコバジェットのフレームワークと、環境会計によるコストと効果の測定のフレームワークとを統合することを検討している。当該2つのツールを上手に統合することによって、環境政策の結果を明らかにし、次年度以降の地域の環境改善の計画立案を可能にするシステムへと展開できるよう模索している。また、マクロ環境会計分野の研究成果であるSEEA(環境・経済統合会計)と地域の環境会計との連携に関しても、目下、研究継続中である。本年度は、わが国およびオーストラリアにおける環境会計ならびに持続可能性会計について、現状を分析することに重点をおいた研究を行った。具体的には、横須賀市、岩手県および山口県における環境会計の事例について、追跡調査し、比較研究を行った。また、オーストラリアにおける連邦政府機関ならびにニューサウスウェールズ州とビクトリア州における持続可能性報告について調査を行った。これらの事例において課題とされている点として、環境会計における効果の貨幣的測定がある。環境会計においては、コストをかけた結果としての効果の測定が重要であることを踏まえ、環境会計における効果の貨幣的測定に関する論点整理を行うとともに、プライベート・セクターにおける先行事例を検討し、その課題と展望を明らかにした。当該研究の概略としては、まず、わが国環境会計の進展に多大な影響を及ぼした環境省による「環境会計ガイドライン」(2000年、2002年および2005年)における環境コストと効果の取り扱いについて整理し、当該ガイドラインにおいては、効果の貨幣的測定について詳細な指針が提示されていないことを課題として識別した。当該ガイドラインの影響により、環境会計における効果の貨幣的測定の結果を開示する企業はあまりないものの、一部の先進的な企業では、積極的に取り組んでいる。そのため、これらの先進的事例を分析し、その課題を明らかにした。さらに、現在、環境経済学の分野において研究が蓄積しつつある環境の経済評価法について、主としてCVM(仮想的市場評価法)とコンジョイント分析を用いた研究をレビューし、その課題を明らかにした。なお、これらの手法は、岩手県や横須賀市の環境会計においても利用されている。そこで、環境会計における効果の貨幣的測定に関して、外部性の評価の一手法である維持コスト評価法に着目するとともに、エコ・バジェットという自治体の予算管理手法を援用し、効果の貨幣的測定を行い、開示することを提案した。本年度における以上の研究は、自治体の管轄行政区域における環境政策の良否を判断するためのツールとして環境会計が機能するための、予備的考察として位置づけられる。本年度完結しなかった研究としては、SEEA(環境・経済統合会計)2003年版のレビューと、その自治体環境会計への援用がある。当該領域については、引き続き研究を実施し、本年度行った効果の貨幣的測定に関する研究と突き合わせ、自治体の管轄行政区域における環境改善の貨幣的測定へと結びつける予定である。
二相嫌気性消化と固液分離装置の組合わせによる下水汚泥中の重金属除去

下水汚泥の安定化に用いられる嫌気性消化は、実務上、酸生成とメタン生成という二反応から成るとみなせる。本研究は、有機酸生成とpHの低下が可能なこの嫌気性酸生成反応に固液分離装置を組合わせ、汚泥を処理しながら重金属を除去する方法を実験的に検討した。実験は、10l完全混合型リアクター(運転温度30°C)を用いて回分および連続式で実施し、Hg、As、Cd、Cr、Cu、Ni、PbおよびZnを対象重金属とした。実験の結果、Cd、NiとZnについてはpHをやや低下させることによって、AsについてはORPをやや上昇させることによって約50%あるいはそれ以上の溶出率が得られた。Hg、Cr、CuおよびPbについては常にそれより低い溶出率しか得られなかった。Crを除くと、この結果は硫化物と沈殿形成しやすい順に溶出されにくくなっていることを示している。なお、空気を吹き込むことによりORP制御を行うと、有機物が好気的に分解されてしまい、後段のメタン発酵に回される有機物が減少することが観察された。一方、酸生成の分解物は、錯体形成によって重金属を化学平衡から計算される溶解性濃度より数桁も高く保つと考えられた。これは特に終沈汚泥(すなわち、余剰活性汚泥)について明確に現れ、遠心分離液中の重金属濃度と有機酸を除く有機物濃度の間に高い相関が見られた。この酸生成を利用した汚泥処理改良法は、重金属除去を単独に行うより経済的にメリットがあると考えられる。今後、この研究をさらに発展させるためには、重金属と有機物の錯体形成、各重金属の挙動の相違など水質化学的側面の解明と有機酸生成を促進させる条件のより詳細な検討が課題であると思われる。下水処理場から採取した混合生汚泥を使用し、重金属を溶出させるための酸生成実験を10l完全混合型リアクターを用いて実施した。本年度は、リアクターの水理学的滞留時間と温度はそれぞれ20日、35°Cに固定し、硫酸塩還元とメタン生成を抑制する目的で、二つのリアクターのうち一つはpH(4あるいは5、塩酸を使用)、もう一つはORP(-100あるいは-300mV、ばっ気による)を制御して運転する方法を採用した。また、効果を比較するために、強酸による化学的薬品処理(硫酸を使用)も実験に付け加えた。まず、薬品処理の結果、主要な重金属のうち大半はpHが約2あるいはそれ以下にならないと溶出率が50%以上に達せず、効果は大きいが低pHに関わる設備やコストの面に問題が残されていると思われた。酸生成実験の場合、CdとNiについては、pHを45に低下させることによって50%前後の溶出率が得られた。Cu、Pb、ZnおよびAsについてはORP制御により、pHが8前後と高かったにもかかわらず1540%程度とそこそこの溶出率が得られた。Crについては溶出率が10%程度未満とほとんど溶出されなかった。ORP制御は上記のように空気を吹き込むことにより行ったが、好気性消化が進行して3040%の有機物が分解されてしまい、後段のメタン発酵に回される有機物が減少することが観察された。以上のような知見より、平成8年度は空気吹き込み量を絞りながらpHとORPを同時に制御する方法を試してみるつもりである。汚泥の酸生成に伴う重金属の溶出について、本年度は下水処理場から採取した初沈汚泥と終沈汚泥を用いて無制御、pH4制御、ORP-150mV制御、およびpH4とORP0mV(初沈)またはORP+100mV(終沈)同時制御の4条件で回分実験により検討した。

初沈、終沈汚泥を別々に用いたのはそれぞれ性質が異なるからであり、また、回分式で実施した理由は条件を数多くとれるからである。その結果、(1)pH制御のCdとZn、ORP制御のAsに約50%あるいはそれ以上の除去効果があった。(2)HgとCuに対してはほとんど効果が見られなかった。(3)CrとNiのpH制御においては、実験上の問題として塩酸の添加に伴うこれら重金属の汚染が確認された。(4)初沈汚泥と終沈汚泥については性質、重金属含有量が異なるが、除去率で見るとほぼ同様な結果を示した。(5)酸生成の分解物は、錯体形成によって重金属を化学平衡から計算される溶解性濃度より数桁も高く保つと考えられた。これは特に終沈汚泥(すなわち、余剰活性汚泥)について明確に現れ、遠心分離液中の重金属濃度と有機酸を除く有機物濃度の間に高い相関が見られた。今後は、重金属に関する水質化学や有機酸生成、汚泥分解を促進させる条件等をより詳細に検討し、それと伴にさらに効率的な除去方法を模索していくことが課題である。
ヒト由来肝細胞を用いた人工肝補助システムの開発〜デジアルフロー型バイオリアクターを用いて〜

平成8年度におけるこのプロジェクトにおける成績は、申請者らが樹立したヒト由来肝細胞を、ガラス担体(シラン)を用いたラジアルフロー型バイオリアクター(RAD)で培養すると、担体の内部や表面に細胞が3次元的配列を保ちながら増殖した。これは走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡で観察可能であった。酸素消費量やグルコース消費量から算定し10^8cells/ml-matrix以上の高密度培養が可能で、200ml容量のRADで総細胞数は2.88×10^<10>個となった。他の重要な肝機能としてのアンモニア代謝や、薬物代謝としてナファモスタットメシレートやアンチピリンについて検討し、機能していることを確認した。RAD本体の改良は、坦体の粒子や孔の大きさ、表面のコーティングなど検討したが現在の坦体に勝るものは見つかっていない。体外循環量の減量には、50ml容積のリアクターの作成と回路チューブの狭小・短縮により総体外循環量を200ml以下に減量した。また体外循環回路の改良は血漿への酸素の供給やRADの血漿流速のコントロールが必要である。協同開発者の旭メディカルとエイブルによりフォローファイバー薄膜による酸素供給システムと、RADへの流速を維持するための血漿リサイクル回路を作成した。、その制御システムの基本的設計の終わり、実用化への開発を行っている。一方RADを生体に装着した際の安全性確認のために、ブタを用いて検討を加えた。実際のヒトへの応用を考え、頚静脈にカテーテルを挿入し毎分30mlの血漿を分離、これをRADに環流した。5時間の還流経過中ブタのvital signは安定していた。一般に体外循環システムで問題となる血管拡張、降圧作用のあるbradykininの血中濃度を測定したところ、細胞培養の有無に関わらず、増加傾向を認めなかった。このシステムの生体への安全性が明らかとなった。平成7年度に行った研究内容は1:ラジアルフロー型バイオリアクターの性能評価:ラジアルフロー型バイオリアクターによる肝由来細胞培養は極めて高密度培養が可能で、電子顕微鏡での観察では細胞の3次元配列と、細胞内小器官の極性をもった分布が観察された。これにともないアルブミンを始めとする肝特異蛋白の産生量も従来の単層培養法に比べ10倍から100倍の産生量を示した。またその他の肝特異機能である、アンモニア代謝や薬剤代謝活性も有している事を確認した。2:ヒト血漿の潅流実験:血漿潅流による培養細胞障害の程度や、血漿潅流による回路内へのフィブリン析出に対する抑制法を検討した。3:動物実験:ブタを用いた動物実験では、頚動脈カニュレーションによる血流量の確保、血漿分離装置の作動状況、リアクター内への血漿潅流による細胞障害の程度を検討し、システムとして機能する事を確認した。4:ラジアルフロー型バイオリアクターの改良:リアクターの小型化については50mlタイプのリアクターを試作し、従来型のリアクターにと同に効率で機能する事を観察した。また体外循環で使用する際の温度確保についても加温モジュールを試作し作動している。以上のように7年度に予定の研究計画については全般にわたり進行中ですでに成果が得られている。一方平成8年度施行予定であった動物実験も開始している。すでに正常ブタでのラジアルフロー型バイオリアクターシステムの作動状況の確認まで終了し、今後は不全肝ブタでの研究に移る予定である。肝硬変や劇症肝炎などの肝不全に対する治療は、血漿交換療法が主体で救命率は20%に満たず、本邦でも欧米の如く肝移植を進める必要がある。

しかしドナーに比し、患者数はあまりにも多い。ドナーが見つかるまでの生命維持や劇症肝炎時の肝細胞再生補助として、人工肝臓補助装置の開発が急務である。申請者らが樹立したヒト由来肝細胞を、ガラス坦体(シラン)を用いたラジアルフロー型バイオリアクター(RAD)で培養すると、坦体の内部や表面に細胞が3次元的増殖が電子顕微鏡で観察された。酸素消費量やグルコース消費量から算定し10^8 cells/ml-matrix以上の高密度培養が可能で、200ml容量のRADで総細胞数は2.88x10^<10>個となった。このRAD(ヒト肝の1/6容)でアルブミン産生量15g/dayと正常ヒト肝臓と同等の値を示した。他の重要な肝機能としてのアンモニア代謝や、薬物代謝としてナファモスタットやアンチピリンについて検討し機能していることを確認した。RAD本体の改良は、坦体の粒子や孔の大きさ、表面のコーティングなど検討したが現在の坦体に勝るものは見つかっていない。体外循環量の減量には、50ml容積のリアクターの作成と回路チューブの狭小短縮により達成している。体外循環回路の改良は血漿への酸素の供給やRADの血漿流速のコントロールが必要である。協同開発者の旭メディカルとエイブルにより薄膜による酸素供給装置とRADへのリサイクル回路の追加、その制御システムの基本的設計を終わった。さらに実用化への開発を行っている。RADを生体に装着した際の安全性確認のために、ブタを用いて検討を加えた。RADを装着し5時間の検討を行ったが、ブタのvital signは安定しており、bradykininの血中増加も認めず、このシステムの生体への安全性が明らかとなった。
ミトコンドリアDNA多型が老人性難聴に及ぼす影響に関する研究

高齢化社会の抱える問題の一つとして、老人性難聴によるコミュニケーション障害がある。老人性難聴は、従来から環境要因と遺伝的要因が関与していることが推測されているが、そのメカニズムはほとんど明らかになっていない。本研究では老人性難聴のメカニズムの推定を目的に老化に関わるとされるミトコンドリアDNA多型に着目した。今回われわれは、難聴とミトコンドリア遺伝子変異との関連について検討し、難聴患者384例に対してミトコンドリアDNAの全塩基配列を解析した結果、新たな病的変異を2種類同定した。近年、様々な加齢性疾患の原因として、ミトコンドリアより産生される酸化ラジカルによる酸化ストレスの蓄積が原因と成っていると考えられている。本研究では、老人性難聴の原因となるミトコンドリアDNA多型を同定するために、信州大学が中心となって実施している「熟年体育大学リサーチコンソーシアム」と連携して、参加者を対象に、インフォームドコンセントを取得の上、採血を行いDNAサンプルを得るとともに、聴力検査を行い、遺伝子相関解析を行っている。平成22年度は(1)老人性難聴患者のDNAサンプル収集、聴力検査の集計、(2)老人性難聴関連候補遺伝子の一塩基多型(SNP)解析、(3)ミトコンドリア遺伝子変異に伴う難聴の新規変異および多型検索を行った。いままで得られたサンプルを用いて、日本人に多く認められるミトコンドリアDNA多型A3010G/A8701G/A10398Gの遺伝子型と8000Hzの聴力の平均との関連を検討したところ、3010番目の塩基では遺伝子型により平均聴力に有意に差があり、老人性難聴の原因であることが考えられる。それに対し、A8701G/A10398Gの遺伝子型と聴力には相関を認めなかった。多型解析には十分なサンプル数が必要であるため、現在もDNAサンプルを得る作業を行っている。また、多型解析と共にミトコンドリア遺伝子変異および多型の検索を目的とするために、ミトコンドリアの全遺伝子配列16kbpに対して8kbp増幅用のPCRプライマーを用いてPCR増幅が可能かを確認しとこころ、LA Taqを用いることにより増幅が可能であった。現在、LA Taqを用いてミトコンドリア遺伝子を増幅後、直接シークエンス法により遺伝子解析を実施している。平成23年度は(1)老人性難聴患者のDNAサンプル収集、聴力検査の集計、(2)老人性難聴関連候補遺伝子の一塩基多型(SNP)解析、(3)ミトコンドリア遺伝子変異に伴う難聴の新規変異および多型検索を行った。今回我々は、老人性難聴の原因となるミトコンドリアDNA多型を同定するために、信州大学が中心となって行っている「熟年体育大学リサーチコンソーシアム」と連携して、参加者を対象に、インフォームドコンセントを取得の上、採血を行いDNAサンプルを得る作業および聴力検査を行った。いままで得られたサンプルをもとに日本人に多く認められるミトコンドリアDNA多型A3010G/A8701G/A10398Gの遺伝子型と8000Hzの聴力の平均との関連を検討したところ3010番目の塩基では遺伝子型により平均聴力に有意に差があり、老人性難聴の原因であることが考えられる。また、多型解析と共にミトコンドリア遺伝子変異に伴う難聴の新規変異および多型の検索を目的とするために、ミトコンドリアの全遺伝子配列16kbpに対して8kbp増幅用のPCRプライマーを用いてPCR増幅が可能かを確認しとこころ、LA Taqを用いた増幅をし電気泳動を行ったところはっきりしたバンドが出てきているため、現在LA Taqを用いてミトコンドリア遺伝子配について直接シークエンスを行った382例の難聴患者に対して解析を行った結果、新たに過去に報告がない2変異を同定した。
地域住民における運動器疾患の長期縦断研究と運動機能向上プログラムの開発

目的は住民健診でロコモモテストと10m最大歩行、Timed Up and Go Test(TUG)を実施し、関連性について検討する。運動機能を評価するのに適した検査を同定すること。対象・方法は検診に参加した地域住民244名(男116名、女128名)で、平均年齢は全体が64歳、男性は64.8歳、女性は63.3歳。110m歩行2TUG340cm台立ち上がりテスト、42ステップテスト、5ロコモ指数25をおこなった。結果はTUGは2ステップテストと中程度の相関があり、ロコモ指数25とは弱い相関があった。TUGは立ち上がりテストと有意差があった。TUGは地域住民のロコモを評価するのに適した検査である19年間継続している研究である。横断的研究として毎年500-600名の検診結果からロコモティブ症候群・サルコペニア、重心動揺にかかわる運動器由来の危険因子の同定ができた。変形性膝関節症(膝OA)の病期と身体所見・機能・QOLについて検討した。膝OAは病期の初期から疼痛・圧痛や関節水腫、膝伸展障害、歩行障害が出現した。病気が進行すると膝屈曲制限や下肢運動機能低下、立位不安定性と身体的QOL低下が出現する。しかし重度OAでも精神的QOLは低下しなかった.サルコペニア肥満の有病率は男性12.5%、女性15.1%であった。サルコペニア肥満群では最大歩行速度、背筋力、握力、3mTUG、最大歩幅、ツーステップテストで有意な低下を認めた.2015年の15年間の縦断研究として重要な発見は、15年前に膝関節症(OA)や糖尿病(DM)と診断された場合OAの死亡のCoxhazard ratioは1.972 (95%CI:1.356-2.867)であり、DMは1.965(95%CI:1.146-3.368)となった.つまりOAはDMとほぼ同等の死亡の危険因子であった。更に危険因子であったのは喫煙習慣1.706 (95%CI:1.141-2.552)、骨粗鬆症1.614(95%CI:1.126-2.313)であり。この4つの因子は介入が可能であると考えた。さらに経年的に筋量は約2%減少する結果を得た。長期縦断研究では15年前に変形性膝関節症や骨粗鬆症があると生命予後が糖尿病と同程度に悪化することが分かった。サルコペニアの評価は2年分えられた。横断研究としては十分であり、今後縦断研究を行う。運動介入プログラムはパイロットとして行っているが、満足度は高いが有意な向上を得られていない。認知機能と運動機能の関連を検討した。高次脳機能では1注意力一文字消去のD-CAT1,注意力は同様に3文字消去のD-CAT3、2理論的記憶、3文字流暢性、カテゴリー流暢性について調査した。運動機能検査は110m歩行速度(走らないで最速で歩く速度)、2最大歩幅(右、左)またげる最大歩幅、340cm台昇降テスト、ロコモ検査(42ステップテスト、540cm踏み台テスト、6TUG=time up-and go testを行った。2転倒と関連する固有感覚受容について予備的研究を行った。転倒手帳を住民に配布して記録した。3スウエーデン・ルンド大学のDahlberg教授のもとで転倒予防、変形性膝関節症、変形性股関節症に対するWebを介した保存的運動療法の試験的検討を行った。結果は年齢を65歳未満100例、65歳以上96例の2群で検討した。相関分析では65歳未満群は運動機能と相関はなかった。65歳以上群は注意力D-CAT1はTUG、10m歩行速度と相関。D-CAT3はTUG、10m歩行速度と相関した。文字流暢性はTUGと相関した。カテゴリー流暢性は最大歩幅左、TUG、10m歩行速度と相関した。重回帰分析では目的変数を認知機能として説明変数を運動機能とし年齢、教育歴、性別による補正をおこなった。注意機能D-CAT1は65歳未満ではTUGが有意に関連した。65歳以上群は運動機能と関連がなかった。D-CAT3は65歳未満も65歳以上も運動機能と関連がなかった。論理的記憶は65歳未満も65歳以上も運動機能と関連がなかった。文字流暢性は65歳未満群は両脚立ち上がり、65歳以上群で最大歩幅右の関連が有意であった。カテゴリー流暢性(動物の名前など)は65歳未満群では運動と関連がなかった。65歳以上群では最大歩幅右が年齢、性別、教育を補正しても有意に関連した。運動機能・認知機能の15年以上の長期縦断研究はおおむね完成誠ている。運動機能介入についてはさらにデータを集積している。1997年から行っているYakumo studyを2017年度8月に約550名に対して実施した。各種運動機能評価とロコモ症候群の相関について研究した。今年度から柏原市でも70名に対して運動器健診を開始した。八雲町と柏原市の2つの研究対象ができた。八雲研究では21年間の研究蓄積をもとに縦断的研究をおこなっている。

柏原市は70歳以上の参加者が多いので今後増大すると考えられる75歳以上の運動器疾患の基礎データの集積が可能となる。スウエーデンルンド大学整形外科と国際共同研究「人工知能を用いた運動器疾患の教育啓蒙と治療」を開始した。Webによる遠隔治療を実験的に開始した。地域住民健診におけるロコモテストはTUGおよび歩行速度と相関することを検討した。〔目的〕地域住民健診においてロコモテストと10m最大歩行(10m歩行)、Timed Up and Go Test(TUG)を実施し、関連性について検討することである。地域住民の身体機能を評価するのに適した身体機能評価検査を検討することである。〔対象〕八雲町検診に参加した地域住民244名(男性116名、女性128名)で、平均年齢は全体が64歳、男性は64.8歳、女性は63.3歳であった。〔方法〕110m歩行、2TUG、340cm台立ち上がりテスト、42ステップテスト、5ロコモ指数25をおこなった。統計は、全体と男女別に各検査項目の関連についてPearsonの相関係数を用いて求めた。立ち上がりテストは各検査項目との有意差を求めた。ロコモテスト結果から非ロコモ群とロコモ群に分け、歩行時間およびTUGとの有意差を調べた。〔結果〕TUGは2ステップテストと中程度の相関があり、ロコモ指数25とは弱い相関があった。そしてTUGは立ち上がりテストと有意差があった。TUGは地域住民のロコモを評価するのに適した検査である。目的は住民健診でロコモモテストと10m最大歩行、Timed Up and Go Test(TUG)を実施し、関連性について検討する。運動機能を評価するのに適した検査を同定すること。対象・方法は検診に参加した地域住民244名(男116名、女128名)で、平均年齢は全体が64歳、男性は64.8歳、女性は63.3歳。110m歩行2TUG340cm台立ち上がりテスト、42ステップテスト、5ロコモ指数25をおこなった。結果はTUGは2ステップテストと中程度の相関があり、ロコモ指数25とは弱い相関があった。TUGは立ち上がりテストと有意差があった。TUGは地域住民のロコモを評価するのに適した検査である認知機能と運動器疾患の横断的縦断的研究をおこなう。運動機能向上のプログラムの作成実施をおこなう。2015年から2016年は転倒と関連する固有感覚受容についても結果のまとめを行う予定である。転倒手帳を住民に配布して記録している。転倒と栄養(血清カロテノイド、血清アルブミン)、遺伝子SNP、重心動揺、下肢筋力、変形性膝関節症、骨粗鬆症、生活習慣(喫煙、飲酒、運動)の関連を検討する予定である。運動機能の維持向上はすでに運動介入方法の検討は2004年、2012年に行った。介入期間が3カ月と短く、介入方法が洗練されていなかったために運動介入の有用性は見いだせなかった。この結果から2016年には6か月間の固有感覚受容を向上できる運動介入プログラムと認知症に対する運動介入プログラムも同時に開発している。今後は長期縦断研究の完成(変形性膝関節症の臨床・レントゲン評価、変形性脊椎症の臨床レントゲン評価)をおこなう。運動介入方法についてはWebを介した保存療法をスウエーデンと共同研究している。本年度中に日本語での介入プログラムを完成予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。整形外科、リハビリテーションWebを利用した有痛性運動器疾患(変形性膝関節症、腰痛症、変形性股関節症)の運動療法の開発をDahlberg教授と共同研究中である。
理系研究者のための科学コミュニケーション

理系研究者は,1)予算的危機,2)若手育成,3)社会と論争がある科学テーマについて科学コミュニケーションの意義を感じるが,一方でこうした自ら参加しなければならないニーズがない場合に科学コミュニケーションに参加する意義を見出すのは難しい.理系研究者が,科学コミュニケーションに積極的に関わるには,社会の中における科学の位置づけを議論し動機を持つことが重要だ.理系研究者は,1)予算的危機,2)若手育成,3)社会と論争がある科学テーマについて科学コミュニケーションの意義を感じるが,一方でこうした自ら参加しなければならないニーズがない場合に科学コミュニケーションに参加する意義を見出すのは難しい.理系研究者が,科学コミュニケーションに積極的に関わるには,社会の中における科学の位置づけを議論し動機を持つことが重要だ.2008年度は,「トランス・サイエンス」をキーワードに研究を進めた.おもには,基礎科1学の研究者が直面する,社会と科学の問題をとりあげ共通する問題群があるかについて研究を進めた.3月17日には「トランス.サイエンスにどう立ち向かうか」という研究会を行い,地震学,感染症,素粒子実験,環境問題の4つの分野で社会と科学の関係について議論を行った.特に大型実験は社会的,経済的,軍事的状況によってその実現や運営が大きく変動する.過去の例と比較して(たとえば建設途中で中止が決まったSSC加速器など)現在の社会状況がどのように不安定なのか,それを踏まえたうえで研究者として何に注意を払ってプロジェクトを進めるべきなのか等についての議論,調査を深めた.また,情報発信をする際に,過去の例からどういったポイントに気をつけるべきであるかという議論を行い,実際に2008年9月にスタートしたCERN研究所の大型実験LHCにおいて,事前対策の検討,日本,世界での反響を調査した.これにおいて,社会の中で研究者の考えがより直接的に伝わる方法,丁寧な報道対応が重要であることが再確認された.総じて,理系研究者,なかでも基礎科学ベースにした研究者がどのような科学コミュニケーションを必要としているのか,考察が深まった. 2009年度では引き続き,各分野でのトランス・サイエンスを調査し,基礎科学の研究者が総合的にどのような力をもつべきであるのかを調査,研究していく.22年度は特に,科学者から発信した情報が,社会にうまく伝わらないケースについて議論を行ってきた.特に科学者から発信した情報が,どのような過程でゆがめられ,当初の意図をはずれた情報として社会に伝わるかについて議論を行った.また,科学者が意図的にデータに手を加えるなどする際に,何を目的としてそのような行動に走るかについても議論した.具体的には2009年11月に問題がおきたClimategate事件に関連して,気候変動,温暖化の情報が伝わる過程について調べた.問題は複雑で,大きく分けて(1)発信側(科学者)の問題,(2)メディアの取り扱い.(3)受けての傾向があり,特に(3)については社会心理学と共同の研究をしていく必要があることが明らかになった.また,(1)は意図的にデータを触るなどの問題の他に,科学者内に対立構造があった際に,問題が複雑になることがあきらかになった.具体的には(1)の中に対立構造があると,優勢がどちらであろうと,(2)によって対立構造を示されてしまうため,必然的に(1)の中の優勢の情報が,優勢さをたもって(3)に伝わらないことがわかった.また,(2)については,話題になることを好んで描く傾向,ポピュリズムに迎合する可能性等も否定できず,(1)と(3)の双方にとって好ましくない状況が否めないこともわかった.総じて,科学者に必要な科学コミュニケーションとは,一言でまとめることは困難であるが,(a)後継者となる若手を育てるコミュニケーション,(b)得られた知識を社会に還元するアウトリーチ,(c)社会と科学の間に横たわる問題を解決するためのコミュニケーションがあるが,特に(c)については,今年度の議論からわかるように,今後も対策を考え続けなければならないことが明らかである.
ＥｐＣＡＭ結合ペプチド提示金属内包フェリチンを用いたエクソソーム亜集団検出法

EpCAMに結合するペプチド・アプタマーEp114をウマ由来フェリチンL鎖遺伝子上流に融合し、Ep114ペプチドを提示するフェリチン組換え体を作製し、大腸菌を用いて精製する条件を確立した。得られたE改変フェリチンは、Ep114のもつEpCAM認識能力を失うことなくフェリチン分子上で発揮することを、ELISA実験で確認した。また、改変フェリチンの内部空間に、金属ナノドットを形成させた「金属内包標的化フェリチン」を調製する反応条件を確立した。「エクソソーム」は、ほとんど全ての細胞が放出する、直径100nm前後の小胞体で、血液、唾液、尿、髄液、精液、骨髄液、腹水、胸水などのあらゆる体液に多量に存在する。放出細胞由来のタンパク質、microRNA、mRNAなどをその内部や表面にもっていることから、エクソソームを「診断」や「治療」に用いる研究が急展開している。しかしながら、その大きさが100nm前後と、生物分野においては扱いにくい大きさの範囲にあるためか、未だに定量的な評価方法が確立していないという大きな問題を抱えている。特に、ヘテロな集団として存在するエクソソームの中から、特定亜集団の存在割合を定量化する方法の確立は、疾患対象を絞ったエクソソーム診断の確立には極めて重要である。本研究では、ヘテロな集団として存在する「エクソソーム」の中から、上皮性マーカーの1つEpCAM分子を発現するサブポピュレーションの割合を定量化する方法を確立することをめざした。具体的には、「EpCAM結合ペプチド・アプタマーを提示した金属内包フェリチン」を利用することで、EpCAM発現エクソソーム表面へ、金属ナノ粒子を結合させ、この結合に伴うエクソソーム表面の電荷特性の変化、反射率の変化を、抵抗パルス変化の測定やレーザー光による暗視野分散光の強度変化で識別する。血中や唾液中に含まれるエクソソームの集団中に含まれる、上皮細胞由来のエクソソームの割合を定量化することが可能となり、エクソソームを用いたがん診断法開発へとつながる基盤技術の開発である。本研究ではフェリチンに「EpCAM」に強く結合するペプチド・アプタマー「Ep114」を提示させ、金属を内包させた後に、EpCAM発現エクソソーム亜集団を特異的に標識し、これに伴うエクソソーム表面の電荷変位や光反射率の変化で、EpCAM陽性ポピュレーションを定量化することをめざした。得られたEp114発現フェリチン分子は、通常の精製プロトコールでは、十分な量が調製できないことが分かった。そこで、精製時に用いるバッファーの種類は、pHなどを多条件検討し、十分な量の精製Ep114発現フェリチン分子が調製できる条件を見いだした。さらに、Ep114提示フェリチン分子の内部空間に、予定通り金属内包フェリチンを調製することができた。コールターカウンターの一種「qNano」を用い、Ep114発現フェリチンとEpCAM陽性エクソソームの組合せに特異的なシグナルを探索したが、研究期間中には見いだすことはできなかった。共同研究で進めている電気泳動ベースのエクソソーム表面電位の一粒子計測機器と組み合わせることで、EpCAM陽性エクソソームの定量化をめざしていく。さらに、金属内包エクソソームのエクソソームへの結合により、エクソソームの屈折率が大きく変わることが予想された。この変化を、Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)法を原理とした「NanoSight」で捉える試みも進めたが、優位な差を見いだすことができなかった。金属ナノドットの表面をタンパク質が被うことで、強い屈折率の変化を抑えている可能性が示唆された。この研究の過程で、よりシンプルに、ナノ金粒子やナノカーボン粒子にアプタマーをつけたプローブが、エクソソームの表面性質を大きく変化させる可能性に気づき、現在、ナノ金属粒子を製造する日本企業と共同研究を進めている。このように、「アプタマー+ナノ金属粒子」を利用したエクソソーム亜集団の検出は、本研究の成果より、確実に一歩前進したと結論できる。分子生物学(1)ペプチド・アプタマーを提示するフェリチンの調製過去の研究でウマ由来フェリチンL鎖の組換え体を利用して、その表面にいろいろなペプチド・アプタマーを提示させる実験をおこなってきた。将来的な治療への展開を考えて、今回はヒトのフェリチンを用いたペプチド提示系を構築した。ヒトフェリチンを用いるもう1つのメリットとして、ヒト由来のフェリチンH鎖が、がんマーカーとして注目されているトランスフェリン受容体(TfR)をその受容体としていることである。そのため、今回はヒトフェリチンH鎖を用いた大腸菌発現系を作成した。組換えの構築過程で、読み枠を一にする上流翻訳開始コドン(ATG)の存在により、予想していた組換え体より、大きな(余分なN末ペプチドをもつ)タンパク質が得られてしまったので、部位特異的変異導入でこの問題を解決し、予定通り発現系を完成させた。

また、ペプチドアプタマーであるminTBP-1を提示させ、ウマフェリチンと同様に機能的なペプチド提示がおこなわれていることを確認した。(2)フェリチンへの金属ナノドットの導入大腸菌で精製したウマ由来L鎖フェリチン分子の内部空間に、バイオミネラリゼーションを利用して、水酸化鉄、金、マグネタイドのナノドットを形成させる条件を確立した。特に金のナノドットの形成には、条件の至適化に困難が伴ったが、新しい金粒子作製法を採用することにより、金特有のプラズモン吸収をもったナノドット含有フェリチンの調整条件の確立に成功しつつある。現在、ペプチド提示フェリチンの、ペプチドの標的タンパク質を発現した「細胞」「エクソソーム」との相互作用を、暗視野顕微鏡や、共沈殿などで評価している。今後の研究の方向としては、今年度で確立したヒトフェリチン組換え体、およびその内部への機能性ナノドットの封入技術を利用して、「フェリチンサブクラスの凝集化」「フェリチンサブクラスの特異的標識」実験を進めていきたい。この実験の条件確立のために必要な蛍光タンパク質でひょうしきされたエクソソームの準備も着々と進んでおり、定量的な評価をおこなうための環境が整いつつある。エクソソーム研究にとっては、ヘテロな集団の中から、いかに特製のサブクラスを同定、あるいは分離するかが極めて重要な要素技術となる。本研究で動き出したフェリチンを用いた方法を深化させ、ユニークな差分かシステムを開発していきたい。平成25年11月に、フェリチンへの金内包に関しての新たな、より効率の良い方法が確立された。研究遂行上、この新方法の検出感度への影響を見極めることは不可欠であるため、従来の方法での必要最低限のデータを取り終えた後、新たな方法での追加実験をおこなうことにしたため。新たなフェリチンへの金内包方法の実験に必要な試薬、プラスチック機器の購入に使用。
中枢無傷ならびに脊髄損傷における仙髄排尿中枢の情報処理機構

橋排尿中枢(Barrington核)はこれまで仙髄節前ニューロンに直接結合すると考えられてきた。しかし今回記録した仙髄節前ニューロンの全例において、Barrington核の電気刺激による単シナプス性EPSPは観察されなかった。誘発されたEPSPは多シナプス性であり、Barrington核は膀胱を支配する仙髄節前ニューロンと多シナプス性結合していることが明らかにされた。この多シナプス性EPSPは排尿収縮時に著明に誘発されたが、膀胱弛緩時には殆ど誘発されず、膀胱収縮依存性であることを明らかにした。またBarrington核の電気刺激は、骨盤神経膀胱枝の電気刺激によって節前ニューロンに誘発される脊髄性IPSPを抑圧した。これらの結果は、Barrington核は介在ニューロン群の賦活化あるいは抑圧の解除により排尿収縮を起こすという研究代表者の仮説を裏付けた。なお、仙髄排尿中枢の介在ニューロンには、排尿収縮時に活動が増大するニューロンの他に、排尿収縮時に活動が減少するニューロンがあることを見いだしている。一方、外尿道括約筋運動ニューロンの細胞内記録法により、膀胱-外尿道括約筋反射は脊髄性には興奮、上脊髄性には抑制であること、上脊髄性経由核であるBarrington核は膀胱節前ニューロンを多シナプス性に興奮させるとともに、仙髄後灰白交連ニューロンを介して外尿道括約筋運動ニューロンを抑制し、排尿を円滑に遂行させることを確証した。さらに本研究は、脳幹から仙髄節前ニューロンへの下行路はBarrington核以外に2経路存在することを示唆した。一つは橋・延髄網様体ニューロンからの単シナプス性興奮性結合であり、もう一つの経路はBarrington核近傍の橋吻側網様体逆相ニューロンからの多シナプス性抑制性結合である。排尿における両者の機能的な役割については今後さらなる検討が必要と思われる。1.Barrington核と仙髄節前ニューロンの結合および制御様式。(1)膀胱を支配する仙随節前ニューロンを前根の逆行性電気刺激、伝導速度および記録部位(中間外側核)により同定した。Barrington核の単発電気刺激で節前ニューロンにEPSPが誘発された。このEPSPは単波形では観察されにくく、加算によって明瞭に検出された。またこのEPSPは連発刺激により促通された。(2)このEPSPは膀胱弛緩期の前半には小さく、弛緩期の後半および収縮期に著明に誘発された。これらの結果は、排尿収縮はBarrington核からの単シナプス性経路よりむしろ多シナプス性経路により制御されていることを示し、Barrington核は下行路の介在ニューロン群を賦活化することにより排尿収縮を起こすことを示唆した。またこれらの結果は、膀胱弛緩期にBarrington核を電気刺激しても膀胱が収縮しにくい理由を説明するものと考えられた。2.Barrington核と外尿道括約筋ニューロンの結合および制御様式。(1)Barrington核の電気刺激により、逆行性刺激で同定した外尿道括約筋運動ニューロンにIPSPが誘発された。単発刺激の効果は弱く、連発刺激でIPSPが著明に促通され、多シナプス性結合であることが示された。(2)仙髄中心灰白質の近傍、腹外側を連発で電気刺激すると、外尿道括約筋が弛緩した。(3)排尿収縮関連ニューロンは仙髄後灰白交連に見いだされた。

仙髄後灰白交連ニューロンは排尿収縮および外尿道括約筋弛緩に先行して発火活動を減少させた。以上の結果は、Barrington核は膀胱節前ニューロンを多シナプス性に興奮させるとともに、これと協調的に仙髄後灰白交連ニューロンを介して外尿道括約筋運動ニューロンを抑制し、排尿を遂行させることを示唆した。(1)[膀胱求心路から仙髄節前ニューロンおよび外尿道括約筋運動ニューロンへの脊髄性経路]膀胱を支配する仙随節前ニューロンは前根の逆行性電気刺激、伝導速度および記録部位(中間外側核)により同定し、外尿道括約筋運動ニューロンは陰部神経尿道枝の逆行性電気刺激により同定した。骨盤神経膀胱枝の電気刺激により節前ニュー0ンに潜時13-14msのEPSP、引き続く潜時18-25msのIPSP、潜時51-88msのEPSPが誘発された。短潜時のEPSPは一部のニューロンで誘発され、IPSPは全てのニューロンで誘発された。このIPSPは促通実験より多シナプス性であることが示された。短潜時のEPSPはIPSPに比べて振幅が小さく、また直後に誘発されるIPSPのため持続時間が短く、骨盤神経膀胱枝で記録した実験においては反射電位は見いだしにくいものと考えられた。潜時から考えて単潜時のEPSPと引き続くIPSPは脊髄性に誘発されたことが示唆された。一方、骨盤神経膀胱枝の竜気刺激により外尿道括約筋運動ニューロンには潜時6.5-9.3msのEPSPが誘発された。このEPSPは促通実験より多シナプス性であること、および脊髄性に誘発されたことが示唆された。また短潜時の後シナプス電位は主としてBarrington核の刺激効果とは逆であり、脊髄性反射は上位性制御とは異なった役割を担っているものと考えられた。(2)[脊髄性経路に対するBarrington核の制御様式〕膀胱求心路から膀胱支配仙髄節前ニューロンに誘発されるIPSPはBarrington核の電気刺激により振幅が減少し、介在ニューロンレベルで抑圧があることが示唆された。以上の結果は、Barrington核は下行路の介在ニューロン群を賦活化するとともに脊髄反射性介在ニューロンを抑圧することにより排尿収縮を円滑に遂行することを示唆した。(1)仙髄介在ニューロンによる膀胱収縮-弛緩の制御様式。(1)仙髄前根の電気刺激で逆行性に同定された節前ニューロンは全て排尿収縮時に活動が増大するニューロン(同相ニューロン)であるのに対し、逆行性に誘発されない介在ニューロンと考えられるものには、同相ニューロンの他に、排尿収縮時に活動が減少するもの(逆相ニューロン)がみられた。逆相ニューロンはBarrington核からの仙髄投射ニューロンには存在しないことから、Barrington核以外の入力により活動パターンが生成されるものと考えられた。同相性介在ニューロンにおいても節前ニューロンとの種々の相違点が見られた:介在ニューロンの多くは低圧時にも発火活動を示し、排尿収縮に先行する発火活動増大の開始は節前ニューロンより早く、膀胱弛緩開始に伴う活動減少の開始は節前ニューロンより遅い傾向にあった。(2)脳幹と仙髄節前ニューロンの結合様式。(1)Barrington核の連発刺激により、仙髄節前ニューロンに長潜時(15-49ms)のEPSPの他に、短潜時(4-6ms)の多シナプス性IPSPが誘発された。
神経回路構築におけるアクチン足場蛋白質の選択的スプライシングの時空間制御機構

我々のこれまでの研究で、発達過程での神経軸索形態や軸索投射の制御を担う、軸索ガイダンス分子の細胞内情報伝達機構を解明し、低分子量G蛋白質の1つR-Rasの活性が様々な外界因子の駆動で共通に制御され、R-Rasの軸索内での活性制御が軸索形態制御において普遍的役割を果たしていることが明らかになっており、神経細胞を取り囲む外界因子のシグナルハブと位置づけられる。R-Rasにシグナル統合された後、キナーゼ系、細胞骨格制御系などの中核を担う様々なエフェクター分子に分配され、軸索形態が多角的に調節されている。その1つとして、アクチン足場形成を担う蛋白質であるafadinを同定しており、afadinは培養ニューロンにおいて、そのC末端のF-actin結合ドメインを介したアクチン足場構築を介し、軸索分枝形成を担う(MBoC., 2012)。afadinにはC末端の有無の大きな違いの長短の選択的スプライシングが存在し、それらの発現量が神経細胞発達過程で変化し、短いバリアントが長いバリアントに対してドミナントネガティブ体として働くことで、L体の細胞膜での集積によるアクチン足場形成を阻害し、負の調節を行う(MBoC., 2015)。それを踏まえ、「選択的スプライシングが脳構築の場で時空間的に制御され、afadinの各アイソフォームの発現が制御されることで、的確な神経分化・神経回路形成を引き起こされている」という新奇システムの存在を想定し、その機構の解明並びに可視化と操作を目的として研究を進めている。今回、軸索間細胞接着因子との関係性の観点から分子メカニズムの検証を進め、アクチン足場分子の選択的スプライシングが脳梁通過までに必要な軸索束化、その後の対側で軸索が上行し皮質内投射するのに必要な脱束化のタイミングを制御することで、脳梁軸索のガイダンスが規定されることが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で、軸索ガイダンス因子の細胞内情報伝達機構を解明し、低分子量G蛋白質の1つR-Rasの活性が様々な外界因子の駆動で共通に制御され、R-Rasの軸索内での活性制御が軸索の動的形態制御において普遍的役割を果たしていることが明らかになっている。また、R-Rasの結合分子として、PI3-kinase (J. Cell Biol., 2006, J. Biol. Chem., 2007)やアクチン抗キャッピングタンパク質Ena/VASPのリガンドタンパク質であるLamellipodin (J. Neurosci., 2012)、そしてアクチン足場蛋白質であるafadinを同定しており(MBoC., 2012)、そのうち、afadinは、初代培養大脳皮質神経細胞において、そのC末端のF-actin結合ドメインを介し、軸索分枝形成を担う。最近の誌上成果で、afadinの選択的スプライシングが、神経細胞発達過程で変化しており、さらに、短いバリアント(S体)が長いバリアント(L体)に対してドミナントネガティブ体として働くことで、L体の細胞膜での集積によるアクチン重合足場形成を阻害するという報告をした(MBoC., 2015)。本研究提案ではそれを踏まえ、「選択的スプライシングが脳構築の場で時空間的に制御され、afadinの各アイソフォームの発現が制御されることで、的確な神経分化・神経回路形成を引き起こされている」という新奇システムの存在を想定し、その機構の解明並びに可視化と操作を目的として研究を進めている。その結果、マウス大脳皮質2/3層神経細胞の発達過程で、S体の発現量が適切に制御されることが的確な脳神経回路の構築に必要であるということを明らかにした。マウス大脳皮質において、発達時期普遍的に発現しているL体に対し、内在性のS体タンパク質の発現量は胎生期には低く抑えられており、出生後に急峻に発現が増加する。そこで、胎生期からCAGプロモーター下でS体を過剰発現させることで、脳梁軸索の脱束化、対側皮質内での層特異的な分枝の抑制等が観察された。共同研究者として申請書に掲げていた大学院生の全員が就職活動で長期不在になってしまったため。

それを踏まえ、「選択的スプライシングが脳構築の場で時空間的に制御され、afadinの各アイソフォームの発現が制御されることで、的確な神経分化・神経回路形成を引き起こされている」という新奇システムの存在を想定し、その機構の解明並びに可視化と操作を目的として研究を進めている。今回、軸索間細胞接着因子との関係性の観点から分子メカニズムの検証を進め、アクチン足場分子の選択的スプライシングが脳梁通過までに必要な軸索束化、その後の対側で軸索が上行し皮質内投射するのに必要な脱束化のタイミングを制御することで、脳梁軸索のガイダンスが規定されることが明らかになった。現在、S体の発現調節の破綻によって引き起こされる各異常の原因について、ガイダンス因子などの細胞外因子や、軸索間の細胞接着因子との関係性の観点から検証を進めるとともに、S体の発現のタイミング制御メカニズムの解析も行っている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
二重共鳴法による高励起状態の電子緩和過程の研究

衝突による励起分子の電子緩和過程を明らかにするには、励起状態間の相互作用を衝突第三体を含めた分子間ポテンシャル曲面上の問題として扱う動力学的な考察が必要である。ところが、高エネルギ-領域では、一般に励起状態密度が高いため、その電子構造や分子間ポテンシャルを正しく記述する実験デ-タが非常に得難い。本研究では、ハロゲン分子のイオン対状態への光励起過程に二重共鳴の技術をとり入れ、その電子励起状態の構造を分光学的に詳しく解析するとともに、ハロゲン分子のレ-ザ-発振機構を理解する上で重要なイオン対状態間の緩和過程を明らかにするこを目的とした。ハロゲン分子を基底状態(×^1Σ^+_g)から中間状態(B^3ΠCO^+_u)またはA^3Π(1u))を経由する二重共鳴遷移により、光励起の状態選択性があがり近接したイオン対状態の分光学的観測が可能となった。また、通常の方法では遷移則等の制約のため測定困難な励起状態も観測できるようになった。例えば、Cl_2分子のイオン対状態のうち258nmのレ-ザ-遷移に関与する励起状態をこの方法で測定したところ、この領域には4つの異なる励起状態間の遷移が含まれることを見いだした。しかし、これらイオン対状態のうちエネルギ-的に最も低い2g(3P_2)状態への衝突緩和が非常に速いため、2g(3P_2)-A^3Π(2u)遷移がCl_2のレ-ザ-発振に大きな寄与をしていることを見い出した。また、その電子緩和過程てを希ガスとの相互作用で生じるイオン対状態の非等方的な分子場ポテンシャルをイオン対状態の回転緩和速度を再現するように決定して、その断熱ポテンシャルをもとにその緩和機構を論じた。
子宮頸癌発生過程におけるHPV感染と内因性癌遺伝子発現との関係についての研究

1)HPV感染症の有無を簡易に検索しうるFilterhybridizationを試みたが,汚染が多く判定困難なものが多かった。RNAプロ-ブを用いたViraPAP法によると判定が容易でスクリ-ニングとしては優れていることが判明した。本法によると頸部病変例の59%に陽性であるのに対し,正常対照群では2.5%が陽性であった。2)CIN例にinsituhybridizationを施行〓した所,1度64%,2度90%,3度56%,計68%がHPV陽性であった。16/18型が44%,31/33/35型が21%と多く,6/11型は3%と僅少であった。追跡調査を行うと,16/18型感染例に増悪するものが多い傾向があり,6/11型のものはすべて退縮した。3)頸癌24例についてサザンブロット法で調べると,16,18型,その他がそれぞれ25,4,17%にみられた。PCR法によると16,18型が50.8%と倍増した。すなわち,PCR法によらないと検出できないくらいにウィルスDNAの少い浸潤癌が多数存在することを示している。4)浸潤癌のDNAを検索するとCーmyc遺伝子の増幅を4%に認めノ-ザンブロット法で調べるとRNAの過剩発現を30%に認めた。しかし,HaーrasおよびerbB遺伝子については増幅も過剩発現もみられなかった。5)酵素抗体法によるとCーmyc蛋白,rasp21およびEGFRは浸潤癌の8,14,5%に陽性であった。ras陽性の癌は陰性のものに比し,リンパ節転移が多かった。1)摘出子宮または試切標本について、扁平上皮癌に高率に発現されているとされるras遺伝子の産生蛋白であるp21に対して、モノクローナル抗体を利用して、免疫組織化学的研究を行った。抗体はY13-259を用いABC法によった。子宮頚癌組織において強く陽性所見が認められたのは、32例中6例(18.8%)であった。rasp21陰性26例中骨盤リンパ節転移を認めたものは5例(19.2%)であるのに対し、陽性例では6例中4例(66.7%)と高頻度にリンパ節転移を認めた。そのうち、2例はリンパ節において染色陽性であったが、染色強度は原発巣に比して、やや低下していた。このように、rasp21陽性例では悪性の性格が高く、癌細胞の生物学的悪性度を反映していると考えられた。2)上記と同一の症例に対し、HPV・DNAのビオチン化試薬を用いてIn situhybridizationを行った。切片の固定、ビオチンの発色などの手技に種々困難な点があり、最近、安定して染色可能になったため、未だ症例数が少く、一定の傾向を得るには至っていない。3)HPV感染症の有無を簡易検索のしうるFilterhybridizationに着手した。細胞診持取の綿棒をガラスに塗抹後、小試験管内の緩衝液中にて洗い、細胞浮遊液を得る。蛋白分解酵素などを添加して細胞を破壊した後、ナイロンフィルターに濾過させ、DNAを吸着させた。HPV・DNAプローベを用いて、放射性同位元素によりHPVDNAの有無を検索した。現在までのところ、陽性例は強く検出され、sensitvityは良いが、specificityに問題があるため、手技について検討を続けている。1)HPV感染症の有無を簡易に検索しうるFilterhybridizationを行った。細胞診採取のブラシをガラスに塗抹後、小試験内の緩衝液中にて洗い、細胞浮遊液を得る。