hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導法の確立

【目的】骨髄血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)骨髄血よりautoMACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。(5)この細胞を既知の種々の増殖因子で刺激し、心筋分作を観察した。【結果】(1)骨髄血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞は,in vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)CD29陽性、CD45陰性、CD44陽性、CD34陰性、CD13陰性、CD49e陽性であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。(5)この細胞はIGF-1,FGF, TGFb, LIF, EGF, PDGF,エンドセリンでは心筋分化の誘導活性は無かった。しかし、Wntにより心筋特異的転写因子の一部が誘導された。【結論】骨髄血細胞中の間葉系幹細胞はある種の増殖因子により心筋分化が誘導されると考えられた。(1)細胞増殖因子を用いたCMG細胞の分化誘導法の開発これまでマウス、アフリカツメガエルの受精卵の中胚葉系の細胞から心筋を誘導する際にはTGFβ、IGF-1、アクチピン、PDGF、LIF等の細胞増殖因子やレチノイン酸、DMSO等が用いられてきた。これらの因子のあるものは胚性癌細胞や胚性幹細胞を心筋に分化誘導する作用を持つ。間葉系幹細胞は中胚葉由来の組織に分化するが、CMG細胞は心筋細胞により分化が進んだ心筋芽細胞であることが明らかとなっている。間葉系幹細胞を心筋細胞により効率的に分化させうる条件を見出すため、いずれの因子が心筋細胞への分化に有効かを検討した。増殖因子存在下にCMG細胞を培養し心筋分化への効率を比較した。その結果、種々の濃度のTGFβ、IGF-1、アクチピン、PDGF、LIF等の細胞増殖因子やレチノイン酸ではCMG細胞を心筋細胞に分化誘導できないことが明らかとなった。また、DMSOはCMG細胞を一部心筋細胞に分化できることが明らかとなった。CMG細胞をさまざまな細胞と共培養することにより、心筋細胞に分化できるかを検討したところ、心筋細胞との共培養すると心筋に分化できるが、心線維芽細胞との共培養では心筋に分化できないことが明らかとなった。今後どのような因子が細胞を分化させ得るのかに関し、検討して行く予定である。骨髄幹細胞由来のCMG細胞は心筋細胞に分化しやすい性質を有している。新生児ラットの心筋を初代培養し、パーコール法にて心筋細胞と心線維芽細胞とを分離培養した。

この各々の細胞の上にCMG細胞を重層し、一定期間共培養を行った。共培養後、細胞をトリプシン処理し、autoMAXにてCMG細胞細胞だけを分離回収した。CMG細胞はマウスの細胞であり、CD44を発現している。抗マウスCD44抗体はラットに反応しないため、抗マウスCD44抗体を用いるとCMG細胞は心筋、心線維芽細胞と容易に分離培養することが出来る。その結果、CMG細胞は心筋細胞と共培養したときにのみ、心筋分化が見られたが、心線維芽細胞と培養したときには心筋分化が得られなかった。心筋分化の方向は、抗心筋ミオシン抗体による免疫染色や、心筋細胞特異的遺伝子の発現により、定量化した。このため、心線維芽細胞で発現していないが、心筋細胞、CMG細胞に共通の細胞接着因子が関与すると考え、DNAチップ解析を行った。その結果、いくつかの候補遺伝子が発見された。現在、その細胞接着因子の特異的阻害薬やアンチセンスプラスミドを用い、心筋分化を促進する因子の探索を行っている。まだ、確定的ではないが、少なくともある細胞接着因子の阻害剤はCMG細胞の心筋分化を抑制する方向に働いていることが推測されるデータが観察された。今後、この因子を培養皿に固定した特殊培養皿を作製し、心筋分化を特異的に促進させる培養系の確立を開発する予定である。【目的】骨髄血より心筋分化能を有する可能性のある細胞を単離し、増殖し、分化誘導を試みた。【方法】(1)骨髄血よりautoMACSを用いて、CD45陰性、CD29陽性、CD34陰性、CD44陽性の細胞群を単離し、ファイブロネクチン塗布培養皿上に接着させた。(2)この細胞を培養し、細胞の増殖曲線を作成した。(3)この細胞の表面抗原をFACS解析した。(4)この細胞をインスリン存在下で培養し、脂肪細胞への分化を観察した。(5)この細胞を0.1mMデキサメサゾン、0.05mMアスコルビン酸-2リン酸、10mMβ-グリセロフォスフィト存在下で培養し、骨芽細胞への分化を観察した。(5)この細胞を既知の種々の増殖因子で刺激し、心筋分化を観察した。【結果】(1)骨髄血より上記表面抗原の抗体を利用することにより、付着系の間葉系幹細胞が回収できた。この細胞はin vitroである程度増殖させることが可能であった。(2)CD29陽性、CD45陰性、CD44陽性、Cn34陰性、CD13陰性、CD49e陽性であった。(3)インスリン存在下ではこの細胞は脂肪細胞に分化した。(4)デキサメサゾン、アスコルビン酸-2リン酸、β-グリセロフォスフィト存在下ではこの細胞は骨芽細胞に分化した。フォンコッサ染色陽性の細胞が観察された。(5)この細胞はIGF-1,FGF,TGFb,LIF,EGF,PDGF,エンドセリンでは心筋分化の誘導活性は無かった。しかし、Wntにより心筋特異的転写因子の一部が誘導された。【結論】骨髄血細胞中の間葉系幹細胞はある種の増殖因子により心筋分化が誘導されると考えられた。
パーキンソン病におけるMn Superoxide Dismutase遺伝子

MnSODはミトコンドリアに限局して存在し、ミトコンドリアストレス下で生じるfree radicalを消去するが、それと同時にこの酵素は新たなfree radicalの発生を招く。MnSODの持つこのような特質はこの酵素のin vivoでの生理学的役割を定義する事を難しくしている。我々はこの問題に対処するために,本蛋白のミトコンドリア輸送に関わるsignal peptideをコードするgenomic fragmentをクローニングし,その全塩基配列を決定した。そしてこの部分にミトコンドリア輸送に重要なamphiphilic(両親媒性)alpha-helix構造の形成を完全に阻害するmissense変異を見出し,それがco-dominantに遺伝する多型性変異であることを明らかにした。これはMnSODのミトコンドリア輸送のefficiency levelつまりミトコンドリアのoxidative stressに対するtoleranceにhereditary variationが存在する事を示唆する。そこで蛍光プライマーによるPCR-SSCP解析により,この多型の遺伝子頻度とパーキンソン病との間の関連分析を行ったところ,amphiphilic alpha-helix構造を保持する変異がパーキンソン病群において有意に多く、特に家族歴を有するパーキンソン病群において多かった。これはMnSODのミトコンドリアへの輸送率が高い事がパーキンソン病発症のriskを高める可能性を示唆しており,またもう一つの可能性として,まだ未知のパーキンソン病発症関連遺伝子が本遺伝子とその近傍に密に連鎖して存在する可能性を示唆している。我々はすでにこのマーカーを使いさらに多くのサンプルでの関連分析とともその家族性パーキンソン病におる家系連鎖分析を開始している。いずれにしても今回同定したミトコンドリア輸送に関わるsignal配列の変異は,神経変性を含む様々な状況下でその真の役割が問題となっているMnSODの病理学的および生理学的意義を評価する上で,今後極めて有用な情報を与えてくれる事が期待される。
気体・液体・固体が複雑に運動する移動境界流れに対する3相系LBMの開発

気体,液体,固体の3相が複雑に運動する移動境界問題に適用できる,2相系格子ボルツマン法(2相系LBM)と埋め込み境界ー格子ボルツマン法(IB-LBM)とを組み合わせた新しい3相系LBMを開発した.本手法は複雑な気液界面の変形や複雑形状の物体の運動を直交格子を用いて計算することができ,また,圧力に対するポアソン方程式を解く必要がなく完全陽解法であるため,大規模並列計算機に適した数値計算法である.検証例題として,気液界面に物体が衝突する場合やミルククラウン現象に適用し,物体に働く衝撃力,液面表面の跳ね上がりや微小液滴の分裂,気泡の巻き込みなどに関して,既存の実験結果と比較して妥当な結果が得られた.1ポアソン方程式を用いない新しい気液2相系LBMの開発界面が自由に変形する気液2相系LBMは,大きな密度比の気液2相流に対しても安定に計算できる数値計算法として世界的に評価の高い方法であるが,圧力場の計算にポアソン方程式を用いるためアルゴリズムが複雑になり並列計算に適さないことが欠点である.本来,LBMの特徴は,圧力計算にポアソン方程式を用いる必要がないために並列化効率が優れていることである.そこで,H26年度にポアソン方程式を用いない気液2相系LBMを開発した.具体的には,LBMによる圧力計算の部分に「過緩和法」と「半陰解法」を組み合わせたスキームを用いて擬似音速の低下(一般に,2相系LBMでは液体領域で擬似音速が小さくなり,連続の式が満たせなくなる)を抑えることを検討した.2埋め込み境界法(IBM)と新しい気液2相系LBMの組み合わせ埋め込み境界法(IBM)は,直交格子を用いて複雑な形状をした物体や自由に運動する物体を表わす方法である.したがって,直交格子を用いて流れ場を計算するLBMとの相性は良く,IBMとLBMとを組み合わせたIB-LBMが,流体中を自由に移動する複雑形状の物体まわりの流れの数値計算法として有望視されている.例えば,3次元羽ばたき翼の自由飛翔をIB-LBMを用いて計算した場合,羽ばたき翼が作る複雑な流れ場が計算できるだけでなく,翼に作用する流体力が容易に計算することができ,羽ばたき翼の自由飛翔の計算が可能である.H26年度では,このIBMと1で開発した新しい2相系LBMとを組み合わせて3相系LBMを開発した.これにより2相流の中で自由に運動する物体まわりの流れや物体に作用する流体力を容易に計算することができるようになった.3数値粘性の低減方法の検討H26年度に開発した新しい2相系LBMは,従来の2相系LBMの問題点を解決する新しい方法であるが,従来法と同様にレイノルズ数が大きな流れに適用する場合,数値粘性が大きくなる問題点を含んでいる.この原因は,粘性項の差分法(ただし,LBMは通常のN-S方程式の差分法とは異なることに注意)にあると考えられている.最近,Asinariらは数値粘性の小さいLBMの粘性項の新しい差分方法を提案して成功を収めている.そこで,H26年度に開発した新しい2相系LBMにこの新しい差分法を導入して,高レイノルズ数の計算を行い,数値粘性が低減できるかどうかを調べた.数値粘性の大きさを調べる例題としては,薄い液面に衝突する液滴(いわゆる,ミルククラウン)を取り上げた.ミルククラウンの数値計算は,『計算科学の夢』と言われており,薄い界面や微小液滴を正確にとらえるには数値粘性による誤差の影響を極力抑える必要がある.既存の実験結果にあわせた様々な計算を行い,微小液滴の飛散の様子などを比較して計算精度を確認した.研究実績の概要に記述した通り,H27年度の研究実施計画をほぼ達成できた.4濡れ性およびSlippage問題の検討2相の界面が物体に接する3相の接触線では,濡れ性あるいは接触角が重要になってくる.2相系LBMにおいて静止壁にこの接触角を導入することは,すでに実績があり問題はないが,移動物体をIBM(埋め込み境界法)で表わしたときに接触角を導入する方法を検討した.さらに,3相の接触線では,物体表面上での流体のno-slip条件と気液2相界面の移動が両立しないSlippage問題がある.2相系LBMでは,このSlippage問題は2相の移動度を考慮することにより解決できる.そこで,3相系LBMについても移動度がうまく考慮できてSlippage問題が解決できるかどうかを調べた.5開発手法の実用性の検討気液界面に物体が衝突する場合に,物体の働く衝撃力,液体表面の跳ね上がりや微小液滴の分裂,球が沈むときの気体の巻き込みなどを調べ,既存の実験結果と比較し,開発手法の実用性を検討した.さらに,その他の実際的な3相問題にも適用した.3年間で行った研究により,今後の研究課題を抽出し,次段階の研究へ発展させる.

例えば,「京」を中核とするHPCIシステム利用研究課題募集に「次世代流体シミュレーション法の開発およびその応用研究」として応募する.気体,液体,固体の3相が複雑に運動する移動境界問題に適用できる,2相系格子ボルツマン法(2相系LBM)と埋め込み境界ー格子ボルツマン法(IB-LBM)とを組み合わせた新しい3相系LBMを開発した.本手法は複雑な気液界面の変形や複雑形状の物体の運動を直交格子を用いて計算することができ,また,圧力に対するポアソン方程式を解く必要がなく完全陽解法であるため,大規模並列計算機に適した数値計算法である.検証例題として,気液界面に物体が衝突する場合やミルククラウン現象に適用し,物体に働く衝撃力,液面表面の跳ね上がりや微小液滴の分裂,気泡の巻き込みなどに関して,既存の実験結果と比較して妥当な結果が得られた.研究実績の概要に記述した通り,H26年度の研究実施計画はほぼ達成できた.今後,このままH28年度の研究実施計画を進める予定である.流体力学今後,このままH27年度以降の研究実施計画を進める予定である.CPUボード等の価格変動により,物品費の使用が計画より少なかった.CPUボード等の価格変動のため,物品費の使用が計画より若干少なかった.余剰分はH28年度に使用する計画である.剰余分はH27年度の物品費と合わせて有効に使用する計画である.
析出物／マトリックス界面構造制御による点欠陥消滅促進の機構論的解明

析出物/マトリックス界面は点欠陥のシンクとして働くことは知られているが、その構造とシンク効果の関係は不明な点が多い。本研究では、Cu-Cr系のCr析出物/マトリックス界面や、オーステナイトステンレス鋼の炭化物・シリサイド/マトリックス界面を3次元アトムプローブにより解析し、それらの照射下での点欠陥集合体の形成挙動から特定の方位関係にある析出物/マトリックス界面が強いニュートラルシンクとして働くことを見出した。析出物/マトリックス界面の点欠陥に対するシンク効果を調べる為に、Cu-Cr-Zr {Cu-0.9Cr-0.14Zr (wt.%)}合金とCu-Cr{Cu-0.9 (wt.%)}合金について超高圧電子顕微鏡によるその場観察を再度実施した。Cu-Cr-Zrについては873 K, 4 h、Cu-Crについては873 K, 1 h過時効しCrリッチ析出物を平均直径5 nm以上に粗大化した試料について、室温、373 K, 473 K, 673 Kの温度で加速電圧1250 kV、照射量2 dpa(損傷速度1 ×10-3 dpa/s)までの電子線照射その場観察を行った結果、両合金で室温から473 Kで主に格子間型の転位ループが形成された。Cu-Cr合金では、室温から473 Kで主に格子間型の転位ループが形成された。その核生成サイトは析出物/マトリックス界面であり、室温では析出物を挟むような2面で転位ループが形成した。室温および473 Kでは転位ループの一次元運動が観察された。673 Kでは転位線の運動のみが認められた。一方、Cu-Cr-Zr合金では、室温,373 Kで転位ループが主に析出物/マトリックス界面で核生成し、一次元運動を行いつつ、転位ループが格子間原子を吸収して成長した。その組織発達は、主に析出物近傍でみられ、0.1dpa程度の照射の後、転位がタングルし始めるとともに粗大化した転位ループもしくは転位線が格子間原子を吸収し、付近に積層欠陥四面体が高密度で生成された。200°Cでは積層欠陥四面体は形成されず、転位ループの生成、成長の後、転位線となり長距離の運動を行うのが観察された。これらの結果から、Cu-Cr,Cu-Cr-Zr合金ともに定性的に析出物/マトリックス界面が強い点欠陥および点欠陥集合体のシンクとして作用することが明らかになった。析出物/マトリックス界面の点欠陥に対するシンク効果を調べる為に、当初計画していたCu-Cr-Zr {Cu-0.9Cr-0.14Zr (wt.%)}合金とCu-Cr{Cu-0.9 (wt.%)}合金について加速器を用いた重イオン照射と超高圧電子顕微鏡によるその場観察を実施した。二段階熱時効(1233 K, 1 h後703 K, 4 h)してCrリッチ析出物を導入した試料を2.4 MeVのCu2+イオンで673 K, 10 dpaまで照射したが両合金ともボイドは形成されなかった。次に二段階熱時効後にCu-Cr-Zrについては873 K, 4 h、Cu-Crについては873 K, 1 h過時効しCrリッチ析出物を平均直径5 nm以上に粗大化した試料について、室温、373 K, 473 K, 673 Kの温度で加速電圧1250 kV、照射量2 dpa(損傷速度1 ×10-3 dpa/s)までの電子線照射その場観察を行った結果、両合金で室温から473 Kで主に格子間型の転位ループが形成された。Cu-Cr合金の473 K照射では、ループの核生成は特定の析出物/マトリックス界面(数%程度の析出物)のみで起こることが見出された。673 Kでは重イオン照射同様、転位ループもボイドも形成されなかった。Cu-Cr中のCr析出物は、マトリックスとK-SもしくはN-Wの方位関係をとることは知られているが、個々の析出物寸法や形状によってはシンク効果の低い界面が形成され、その場合はその領域を核生成サイトとして比較的低温では転位ループが形成されるが、空孔のモビリティーが十分高い温度では、界面が強いニュートラルシンクとして働き点欠陥集合体の形成を強く抑制することが示唆された。

二段階熱時効(1233 K, 1 h後703 K, 4 h)してCrリッチ析出物を導入した試料を2.4 MeVのCu2+イオンで673 K, 10 dpaまで照射したが両合金ともボイドは形成されなかった。次に二段階熱時効後にCu-Cr-Zrについては873 K, 4 h、Cu-Crについては873 K, 1 h過時効しCrリッチ析出物を平均直径5 nm以上に粗大化した試料について、室温、373 K, 473 K, 673 Kの温度で加速電圧1250 kV、照射量2 dpa(損傷速度1 ×10-3 dpa/s)までの電子線照射その場観察を行った結果、両合金で室温から473 Kで主に格子間型の転位ループが形成された。Cu-Cr合金の473 K照射では、ループの核生成は特定の析出物/マトリックス界面(数%程度の析出物)のみで起こることが見出された。673 Kでは重イオン照射同様、転位ループもボイドも形成されなかった。Cu-Cr中のCr析出物は、マトリックスとK-SもしくはN-Wの方位関係をとることは知られているが、個々の析出物寸法や形状によってはシンク効果の低い界面が形成され、その場合はその領域を核生成サイトとして比較的低温では転位ループが形成されるが、空孔のモビリティーが十分高い温度では、界面が強いニュートラルシンクとして働き点欠陥集合体の形成を強く抑制することが示唆された。当初予定していたCu-Cr-Zr系やCu-Cr系のCr析出物/マトリックス界面については、順調に照射実験を実施し、取得されたデータから界面シンクの機構論的な解明を進めている。それに加え、オーステナイトステンレス鋼(PNC316)の主要な照射誘起析出物とマトリックス界面の3DAP観察結果が得られている他、Cu合金と同じFCC金属の拡張転位の部分転位と積層欠陥部分およびその周辺の原子分布と偏析について原子マップを初めて取得した金属学会で発表した。転位組織は構造が正確に同定出来、電子顕微鏡でも容易に観察が可能であるため、これらの照射誘起偏析を調べる手法を開発した意義は界面シンク効果の定量化を進める上で各合金における標準のシンクとして用いることが出来る為大変有用である。これらの理由により本研究はおおむね順調に進展していると評価出来ると考える。それに加え、オーステナイトステンレス鋼(PNC316)の主要な照射誘起析出物とマトリックス界面の3DAP観察結果が得られている他、Cu合金と同じFCC金属の拡張転位の部分転位と積層欠陥部分およびその周辺の原子分布と偏析について原子マップを初めて取得した。これらの理由により本研究は当初の予定よりも進捗したと評価出来ると考える。超高圧電子顕微鏡観察結果より、定性的なCr析出物/マトリックス界面のシンク効果が明らかになりつつあり、それが強いニュートラルシンクとして作用することが示唆された。このことは、材料開発への応用において非常に重要な知見であるが、機構論的にこの現象を解明するためには、どのような条件で界面シンクの性質が変化するのかを調べる必要がある。解明の糸口としては、照射温度をより低温にし、空孔の移動度を下げニュートラルシンクを転位バイアスシンクに徐々に変化させた場合、欠陥が先ずどのような領域で形成するかを詳細に調べることである。
脂肪酸による血小板機能制御機構に関する生物物理化学的研究

リノ-ル酸やα-リノレン酸等のシス型多価不飽和脂肪酸は、ADP等の刺激に伴なって生じる細胞内Ca2^+濃度上昇を抑制することによって血小板の凝集を阻害する。そこで細胞内Ca^<2+>の調節物質の一つであるサイクリックAMPの濃度に及ぼすシス型多価不飽和脂肪酸の影響をテオフィリンの存在下で観察した。その結果、これらの脂肪酸は凝集阻害作用と呼応して、サイクリックAMP濃度を増大させることがわった。すなわち、血小板凝集をほぼ阻害する濃度で脂肪酸はサイクリックAMP濃度を正常値に比べて、1.61.8倍に増加した。飽和脂肪酸は影響を及ぼさなかった。一方、他のCa^<2+>調節物質であるイノシト-ルリん脂質代謝物のイノシト-ル-1,4,5-三りん酸(IP_3)の刺激に伴なう産生に対してシス型多価不飽和脂肪酸は影響を及ぼさないことがわかった。さらに、これらの脂肪酸の血小板に対する作用はアラキドン酸代謝の修飾にはよらないことも結論された。サイクリックAMPの産生を行なうアデニル酸シクラ-ゼは細胞膜の流動性に鋭敏な酵素として知られている。蛍光プロ-ブ、ジフェニルヘキサトリエン(DPH)による観察はシス型多価不飽和脂肪酸による血小板膜の流動性増大とサイクリックAMP濃度の増加との相関性を示した。またDPHのトリメチルアンモニウム誘導体TMA-DPHによる観察はこれらの脂肪酸によって流動性の増大が膜の広範囲で生じていることを示した。以上の結果、シス型多価不飽和脂肪酸による血小板機能阻害は、膜の流動性の増大に伴なうアデニル酸シクラ-ゼ活性化によって生じていることが明らかになった。また血小板を活性化するアラキドン酸が高濃度では逆に凝集を抑制する作用やトランス型多価不飽和脂肪酸による凝集阻害作用も同様な機構で生じていることが推定された。リノール酸やリノレン酸等の不飽和脂肪酸は、血小板の凝集、放出反応を阻害する。これらの脂肪酸は膜の流動性を増大し、刺激に伴なう細胞内Ca^<2+>濃度上昇を抑制することによって血小板機能を阻害することを、著者はin vitroにおいてすでに明らかにしている。本研究では、脂肪酸の作用機構に関してさらに詳細な研究を行なった。そこでまず細胞酸の影響を検討した。その結果、不飽和脂肪酸は凝集阻害作用ならびに膜流動性増加作用と呼応して、サイクリックAMP濃度を増大させることがわかった。以上の結果より、不飽和脂肪酸は血小板膜の流動性増大を介してアデニル酸シクラーゼの活性を増大し、細胞内のサイクリックAMP濃度の増大を介して刺激に伴なう細胞内Ca^<2+>濃度上昇を抑制し血小板の凝集を阻害することがわかった。一方、脂肪酸の膜流動性への影響の詳細を明らかにするために、まず血小板膜の流動性の不均一性の解明を試みた。実験は、蛍光偏光度法により、荷電の異るジフェニルヘキサトリエン誘導体を用いて行なった。その結果、血小板膜は、構成りん脂質の分布に関して非対象的であること、つまり酸性りん脂質が細胞質膜内層あるいは顆粒膜にのみ存在することばかりでなく、膜の流動性に関しても非対称的であることがわかった。すなわち、細胞質膜の外層は、内層あるいは顆粒膜外層に比べて流動性が低いことがわかった。不飽和脂肪酸は、この相対的に硬い脂肪質膜の外層の流動性を増大し、血小板機能を抑制していることが結論づけられた。

今後は、さらに酵素活性の変化を導く流動性の増大に伴う膜蛋白質の動態変化をスピンラベル法等により明らかにしたい。なお、この研究の遂行に際し、補助金により購入した位相差顕微鏡を用いて血小板数の測定を行ない、一定濃度の血小板懸濁液を調製した。リノ-ル酸やα-リノレン酸等のシス型多価不飽和脂肪酸は、ADP等の刺激に伴なって生じる細胞内Ca^<2+>濃度上昇を抑制することによって血小板の凝集を阻害する。昭和63年度の研究結果より、シス型多価不飽和脂肪酸は凝集阻害作用と呼応して、テオフィリンの存在下でサイクリックAMPの濃度を増加させることがわかった。サイクリックAMPを産生する酵素アデニル酸シクラ-ゼは膜の流動性に鋭敏な酵素であると考えられているが、サイクリックAMP濃度を増加させる濃度範囲でシス型多型不飽和脂肪酸は血小板膜の流動性を有意に増大させることがわかった。そこで平成元年度はまず他の細胞内Ca^<2+>調節物質の産生に及ぼすシス型多価不飽和脂肪酸の影響について検討した。細胞内Ca^<2+>貯蔵庫よりCa^<2+>の遊離を生じる物質として知らせるイノシト-ルりん脂質代謝物のイノシト-ル-1,4,5-三りん酸(P_3)の産生は、血小板活性化因子(PAF)の添加によって約3倍に増大したが、この産生増大に対してα-リノレン酸等のシス型多価不飽和脂肪酸は影響を及ぼさなかった。さらに、これらの脂肪酸の血小板に対する作用はアラキドン酸代謝の修飾にはよらないことも結論された。以上の結果、シス型多価不飽和脂肪酸による血小板機能阻害は、膜の流動性の増大に伴なうアデニル酸シクラ-ゼ活性化によって生じていることが明らかになった。一方、血小板を活性化するアラキドン酸が高濃度では逆に凝集を抑制する作用を示すことやトランス型多価不飽和脂肪酸による凝集阻害作用が報告されている。蛍光プロ-ブによる観察結果は、アラキドン酸もこの濃度範囲では宥意な膜流動性の増加を生じること、トランス型多価不飽和脂肪酸もりん脂質膜の相転移温度を低下させる作用があることを示しており、これらの脂肪酸も上述のシス型多価不飽和脂肪酸と同様な機構で作用発現していることが推察された。
大規模株式会社に対する監査・監督機能の法構造に関する理論的研究

わが国の大規模株式会社に見られる特徴は、第1に、株主より従業員の利益を重視した企業経営、第2に、環状的株式相互保育による法人企業支配の浸透の2点に集約できる。これらの特徴は、バブル経済崩壊に伴い、若干緩和したとはいえ、欧米の企業システムに比べると、閉鎖的で特殊な構造的要因と受け取られかねず、改善を要する課題として位置づけられる。これらの課題に的確に対応するためには、監督・監査機能の細目を類型化し、それらに対応した機能的機関権限分配の法的再編を図り、経営監督機構の充実を具体化する必要がある。監督・監査機能の細目は、(1)advice,(2)cousel,(3)monitor,(4)consult,(5)review,(6)supervision,(7)audit,(8)invesitigation等に類型化され、それらは、わが国の会社法上、(1),(2)が主に取締役会、(7),(8)が監査役(会)、(3)ないし(6)がその両者に係る機能として分類ができる。これらの機能を的確に作動させるためには、single-board systemを採用しながら監督機能の再編を図る米国法制を参考にしつつ、ドイル法制のtwo tier systemのメリットを継受できる方向が模索される。具体的には、一方では、取締役会内に、機能細目(たとえば(5),(6)等)に応じた委員会組織を導入し、必要に応じて監査役(会)との連携を図ること、他方では、(7),(8)の機能を充実させるために、監査役会・社外監査役の権限の強化・明確化や監査制度を補強する補助機構の設置、等の検討が肝要となる。さらに、株主による最終的なcheck & control機能を充実する必要があり、そのためには、情報開示規制の徹底および単独あるいは少数株主の監督・是正権の拡充を図る必要がある。これらにより、国際的市場メカニズムに適合する透明性の高いコ-ポレート・ガバナンスを達成することが重要である。以上の諸点は、基本的には、持株会社にも当てはまる。
ペルオキシソームの形成と機能発現制御を司るPEX遺伝子システムの解明

1)私たち独自に分離したCHO変異細胞ZPG208に対しラットcDNA libraryを用いた機能相補活性スクリーニング法によりペルオキシソームの形成異常を相補するPEX3遺伝子のクローニングに成功した。ついでZPG208細胞と同じ相補性群であるペルオキシソーム欠損症相補性群G群の患者由来細胞にPEX3を発現させたところペルオキシソームの形成障害が相補された。さらにこの患者細胞のPEX3遺伝子をRT-PCR法により解析したところ、1塩基置換によるエクソン11の欠質をホモ接合型として有しており,この変異型PEX3は相補活性を有していないところから、PEX3がG群の病因遺伝子であると結論した。またPEX3遺伝子変異細胞ではペルオキシソームの膜形成にも異常を有することから、ZPG208細胞は膜形成の分子機構を解明するうえでも有用性が高い。2)私たちは、PTS1レセプターであるPex5pには哺乳動物系ではアイソフォーム、Pex5pSおよびPex5pL(S型内部に37アミノ酸配列の挿入が認められる)が存在することを先に見出している。両者の機能に関し、新たに分離した特異的表現型(PTS2タンパク質の輸送のみに異常を示すが変異遺伝子はPTS1レセプターをコードするPEX5であった)を示すCHO変異細胞ZPG231の分子細胞生物学解析から、PTS1タンパク質輸送に関わる一方、Pex5pLはPTS2タンパク質の輸送をPTS2レセプターPex7pと結合することにより担っていることを見出した。またこれらのカーゴ・レセプター複合体はPex14p,Pex13pを主体とした膜透過装置を経てペルオキソーム内へ局在化されることも見出した。今後これら諸因子を用いることにより膜透過過程の詳細な解析が可能になると考えられる。3)ペルオキシソーム膜透過装置の構成因子の一つと考えられるPex12pについて、まずPEX12異常CHO変異細胞ZP104およびZP109の変異部位を決定、ついでPex12pの構造と機能に関し検討した結果、C-末端部に存在する亜鉛フィンガーRINGはPex12pの機能に必須であることを明らかにした。またPex12pは他のペルオキシンPex5p,Pex10pなどと相互作用することも見出した。今後、カーゴタンパク質のオルガネラマトリックス側での解離機構や両レセプターの細胞質へのシャトル機構などの解明が待たれる。
MAPON法を用いた原子核の電気的四重極子能率の測定

強磁性体中の不純物には、強い内部磁場以外に弱い電場勾配ができる。この影響を従来のNMR-ONの方法で共鳴線から分離できない場合、MAPONの新しい方法によ原子核の電気四重極モ-メントを測定する可能性がもてる。まずこの方法の確立のため試料を^<57>Coと鉄の単結晶を用いて製作した。水素ガス中850°Cの温度で約20分間^<57>Co鉄の単結晶に熱拡散させて作成した。この試料を3He/4He希釈冷凍機で7mKに冷却して、外部磁場2kGで293.8MHzで幅約0.3MHzの共鳴スペクトルを得た。これは従来報告されているものと一致した。MAPONの実験のためにシンセサイザ-のRF信号fに別の信号源からの変調信号dfをダブルバラスドミキサ-を用いては±dfの信号をを発生させた。この信号を共鳴領域292.3294.3MHzを2.2秒でスイ-プさせて、^<57>Coの136keVのγ線強度変化を観測した。MAPONのデ-タはこの強度変化を、変調周波数を150kHzに変えることにより得た。これによりν_Q=3eqQ/2I(2I-1)の値を9kHzと得た。これは今までオ-ストラリアのグル-プが報告している値18kHzの半分の値である。このくい違いは現在検討中であるが、つぎのことが考えられる。試料の対称軸(〈100〉を用いた)が違っているか、断熱パラメ-タ-の変化に対して違っているか、RF信号によるスプリアスの問題かが考えられる。RF信号はスペクトルアナライザ-で常時監視しているが信号のレベルで微妙な点もある。平行して行なわれたオックスフォ-ドグル-プとのMAPONの実験ではν_Qが300kHz以上の広い領域に分布していて不純電子の4d領域ではかなり電場勾配が広がっていることが考えられる。
顕微赤外光弾性装置の試作

オプトエレクトロニクス・超高速エレクトロニクスのデバイス・集積回路の作製に必要不可欠なIII-V族化合物半導体ウェーハ中に残留する歪みの二次元分布を、光弾性法を用いて微視的に定量評価する二種類の顕微赤外光弾性装置を試作することを目的した。その一つは高感度・高精度を目指して、一点毎に測定する走査型光弾性装置で、もう一つは高速測定を目指して、多数点を同時に測定するマルチチャンネル型光弾性装置である。走査型顕微赤外光弾性装置に関しては、心臓部である回転偏光子・検光子の製作を種々試みるとともに、新しい測定方法を考案した結果、測定精度、測定時間ともに実用に供する装置を完成した。空間分解能に関しては、赤外半導体レーザを用いることにより、数10μmまでの分解能を得た。試作した走査型光弾性装置を用いて、種々の化合物半導体ウェーハ(LEC-GaAs、LEC-InP、VCZ-GaAs、VCZ-InP、HB-GaAs)の残留歪みを評価した結果、結晶成長技術の向上のための実用的な評価装置として極めて有用であることを示した。また、デバイス作成のための熱処理時のスリップ転位発生問題などにも残留歪みの評価が有用であることを示した。さらに、高空間分解能で測定することによって、ウェーハのキズや結晶内部にあるボイドようのものまで明確に観測できることを示した。一方、マルチチャンネル型光弾性装置に関しては、マルチチャンネル検出器から出力される多量の画像データを光弾性効果に基づいて高速処理し、残留歪み分布を計算するシステムとプログラムを開発するとともに、可視光領域でのマルチチャンネル型光弾性装置を試作し、高空間分解能で高速測定できることを示した。この方式の欠点であるダイナミックレンジを向上するため、光源として発光ダイオードをパルス動作させる新たな手法を考察した。オプトエレクトロニクス・超高速エレクトロニクスのデバイス・集積回路の作製に必要不可欠なIII-V族化合物半導体ウェーハ中に残留する歪みの二次元分布を、光弾性法を用いて微視的に定量評価する二種類の顕微赤外光弾性装置を試作することを目的とし、今年度は高感度・高精度を目指した走査型のものの試作を行った。具体的には、走査型光弾性装置の心臓部である回転偏光子・検光子として、タイミングベルトでグラムトムソンプリズムをパルスモータで駆動する形式Aのものと薄板状のポーラコア偏光板を穴空きシャフト付きパルスモータに直接取り付ける形式Bのものの設計試作と両者の性能比較、これらの回転偏光子・偏光子およびXYステージと計測・制御用パソコンとのインタフェース回路の設計製作、駆動制御コードの開発、さらに、赤外光源と検出回路部分の設計製作と自動測定用の制御アルゴリズムの設計製作を行い、走査型赤外光弾性装置を試作した。試作した装置は空間分解能向上の余地はあるが、次頁に示すように化合物半導体ウェーハの残留歪みの評価を実際に行い、その実用性を示す研究成果の発表を行った。また,可視領域のCCDカメラを用いて、次年度に試作を予定しているマルチチャンネル型光弾性装置を仮組みし、GaP単結晶の残留歪みを微視的に評価できることを確認し、先行して平成6年度の研究の主目的が達成できる目処を立てた。次頁に示すようにこの研究成果も国際会議で発表した。オプトエレクトロニクス・超高速エレクトロニクスのデバイス・集積回路の作製に必要不可欠なIII-V族化合物半導体ウェーハ中に残留する歪みの二次元分布を、光弾性法を用いて微視的に定量評価する二種類の顕微赤外光弾性装置を試作することを目的とし、今年度は高感度・高精度を目指した走査型の改良と高空間分解能で高速測定できるマルチチャンネル型のものの試作を行った。

走査型光弾性装置は、測定時間の短縮化を改良の中心課題とし、従来のpoint-by-point測定(PPM)方法に変えて、新たに螺旋走査測定(SSM)方法を考案した。SSM方法を用いることによって、2インチウェハで200×200の格子点数を測定するのに、従来PPM方法では約30時間の測定時間を要していたのを約4時間に短縮でき、ほぼ実用に供する装置となった。この装置の仕様や性能を次頁に示す国際会議にて公表した結果、多くのウェハ製造企業やデバイス製造企業の研究者に高い評価を受けた。マルチチャンネル型光弾性装置の試作では、マルチチャンネル検出器として用いるTVカメラ(可視域:CCDカメラ、赤外域:ビジコンカメラ)から出力される多量の画像データを光弾性効果に基づいて高速処理し、残留歪み分布を計算するシステムとプログラムを開発した。可視領域のCCDカメラを用いたマルチチャンネル型光弾性装置を試作し、GaP単結晶の残留歪みを評価した。一様残留歪み分布を高空間分解能で高速測定できることを示したが、実用化には測定のダイナミックレンジをさらに向上することが今後の重要な課題であることが明らかとなった。オプトエレクトロニクス・超高速エレクトロニクスのデバイス・集積回路の作製に必要不可欠なIII-V族化合物半導体ウェーハ中に残留する歪みの二次元分布を、光弾性法を用いて微視的に定量評価する二種類の顕微赤外光弾性装置を試作することを目的し、その一つは一点毎に測定する走査型のもので高感度・高精度を目指し、もう一つは多数点を同時に測定するマルチチャンネル型のもので高速測定を目指して試作した結果を、本年度は以下のように両者の試作結果を比較検討するとともに、実用化を計る上で問題となる点を解明した。1.平成5年度に試作した走査型顕微赤外光弾性装置と平成6年度に試作を試みているマルチチャンネル型光弾性装置に関して、実用的観点からマン・マシンインターフェイスに関連する制御データ入力プログラム、測定データ出力プログラムを開発するとともに、両装置を用いて種々の化合物半導体ウェーハの残留歪みを定量評価し、両装置の性能比較評価試験を行った。2.平成5年度から始め、本年度の上記研究計画で得られる研究結果に基づいて、化合物半導体ウェーハの残留歪みを測定するための顕微赤外光弾性装置の実用モデルの設計仕様・性能を公表し、本装置の普及を計るため、関連学会で研究発表するとともに、研究成果報告書としてまとめた。
肺癌とHAI-1及びLRP11の発現に関する研究

1. HAI-1は気管支気道上皮および肺胞上皮の細胞膜、特に側-底部にかけて発現していた。2.傷害された気管上皮では線毛円柱細胞のHAI-1の局在が内腔側に変化していた。3. LRP11は、ヒト臓器において脳・前立腺・精巣および肺に遺伝子発現が認められた。4. LRP11の発現は非小細胞性肺癌において正常組織と比較して亢進していた。5.肺腺癌では、臨床病理学的進行度とLRP11遺伝子発現との相関関係が示唆された。6.肺扁平上皮癌では、LRP11遺伝子発現が高値である傾向にあった。肺癌の発生率は年々増加傾向にある。肺癌の早期発見は予後の改善に関する重要な因子が考えられ、肺癌の浸潤・転移機構に対する様々な因子の解析や新規腫瘍マーカーの開発が進められてきたが、その生物学的機序については未だ不明な点が多い。このため、肺癌における浸潤・転移機構と肝細胞増殖因子Hepatocyte Growth Factor (HGF)系およびその制御の要であるHGFactivator inhibitor type-1 (HAI-1)およびHAI-1類似蛋白であるLow density lipoprotein receptor-related protein 11 (LRP11)がどのように関わっているかを明らかにすることは、肺癌の分子学的病態の一側面を解明することにつながり、また新規分子標的治療薬の標的にもなりうる可能性がある。われわれが行ったノーザンブロットを用いた予備実験では、ヒト正常臓器において脳・前立腺および精巣にLRP11の遺伝子発現がみられ、肺ではその遺伝子発現が軽度認められた。LRP11に関する文献的報告は全くなく未知の新規蛋白質であることから、抗LRP11抗体は市販されていない。このため、ヒト抗原LRP11をアジュバントとともに免疫したマウスから脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合し、抗ヒトLRP11モノクローナル抗体を作製した。抗ヒトLRP11モノクローナル抗体は、その精製過程でIgMであることが分かった。作製した抗体の精度を確認するため、CHO細胞にヒトLRP11を過剰発現させたCHO-hLRP11細胞を作成した。CHO-hLRP11細胞からRNA抽出しRT-PCRで、LRP11の遺伝子発現を確認した。その後RT-PCRでLRP11の遺伝子発現を確認したCHO-hLRP11細胞株から蛋白抽出(Cellytic溶液またはSTEN bufferを用いて蛋白抽出)を行い、westernblotでLRP11の蛋白発現を現在確認している。一次抗体がIgMであるため、現在一次抗体の希釈率、ブロッティングの溶液など各種条件設定を行っている。またヒト肺癌組織を用いた免疫染色では、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌において、癌細胞膜および細胞質に陽性像が得られた。このため、肺癌における浸潤・転移機構と肝細胞増殖因子Hepatocyte Growth Factor (HGF)系およびその制御の要であるHGFactivator inhibitor type-1(HAI-1)およびHAI-1類似蛋白であるLow density lipoprotein receptor-related protein 11 (LRP11)がどのように関わっているかを明らかにすることは、肺癌の分子学的病態の一側面を解明することにつながり、また新規分子標的治療薬の標的にもなりうる可能性がある。ノーザンブロットでの予備実験では、ヒト正常臓器において脳・前立腺および精巣にLRP11の遺伝子発現がみられ、肺ではその遺伝子発現が軽度認められた。作製した抗体の精度を確認するため、CHO細胞にヒトLRP11を過剰発現させたCHO-hLRP11細胞を作成し、RT-PCR法でLRP11の遺伝子発現を確認した。その後RT-P-CRでLRP11の遺伝子発現を確認したCHO-hLRP11細胞株から蛋白抽出を行い、western blotでLRP11の蛋白発現を現在確認している。

肺癌の早期発見は予後の改善に関する重要な因子が考えられ、肺癌の浸潤・転移機構に対する様々な因子の解析や新規腫瘍マーカーの開発が進められてきたが、その生物学的機序については未だ不明な点が多い。このため、肺癌における浸潤・転移機構と肝細胞増殖因子Hepatocyte Growth Factor (HGF)系およびその制御の要であるHGFactivator inhibitor type-1(HAI-1)およびHAI-1類似蛋白であるLow density lipoprotein receptor-related protein 11(LRP11)がどのように関わっているかを明らかにすうことは、肺癌の分子学的病態の一側面を解明することにつながり、また新規分子標的治療薬の標的にもなりうる可能性がある。ノーザンブロットでの予備実験では、ヒト正常臓器において脳・前立腺および精巣にLRP11の遺伝子発現がみられ、肺ではその遺伝子発現が軽度認められた。LRP11に関する文献的報告は全くなく未知の新規蛋白質であることから、抗LRP11抗体は市販されていない。このため、ヒト抗原LRP11をアジュバントとともに免疫したマウスから脾臓を摘出し、ミエローマ細胞と融合し、抗ヒトLRP11モノクローナル抗体を作製した。作製した抗体の精度を確認するため、CHO細胞にヒトLRP11を過剰発現させたCHO-hLRP11細胞を作成し、RT-PCR法でLRP11の遺伝子発現を確認した。その後RT PCRでLRP11の遺伝子発現を確認したCHO-hLRP11細胞株から蛋白抽出を行い、western blotでLRP11の蛋白発現を現在確認している。またヒト肺癌組織を用いた免疫染色では、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌において、癌細胞膜および細胞質に陽性像が得られた。
概日リズムのDECODEシステムの解明

DNAマイクロアレイ法及びChIP (Chromatin immunoprecipitation)-chip(GeneChip)法によるヒト時間変動遺伝子群の解析を行うことにより、網羅的に遺伝子発現の時間的変動の分子機構、すなわち、時計転写因子の複合体ダイナミクス、また時間によりこれらがどう変動するかを明らかにしようとするものである。さらに、同定した時間変動遺伝子群に関しては、最近研究代表者らが確立したin vitro real-time oscillation monitoring system (IV-ROMS)を中心とした一連の時計遺伝子解析法を用いて、詳細な解析を行うことにより、ヒト時計遺伝子の転写制御「デコード」を目指す。BMALl抗体を利用して、ラージスケールでヒト繊維芽細胞由来のゲノムDNAを用いてChIPを行うための種々条件検討を行い、さらにChIP-Chipのための準備を整えた。一方、既に確立したIV-ROMSを用いた解析として、我々は、細胞自律的な時計遺伝子の概日転写に必要なシスエレメントを新しく同定した。この新規エレメントはE-box及びその6塩基下流にE-box様配列を有する新規EEエレメントである。我々は、EEエレメントの両方のE-boxが細胞自律的な振動を形成するのに必要であり、2つのE-box間の決まった長さ(67塩基)が顕著な振動には決定的であることを明らかにした。さらに、ゲノムワイドの網羅的解析により、他の時間変動遺伝子の中にもこのEEエレメントが存在することを示した。以上の事から、概日転写制御には、従来のE-boxではなく、EEエレメントが重要であると示唆される。また、NPAS2のプローモーター解析により、核内受容体ROR及びREV-ERVの結合部位RORエレメントがNPAS2の概日リズム発現に必要であることを明らかにした。本申請研究では、DNAマイクロアレイ法及び、ChIP(Chromatin immunoprecipitation)-chip(GeneChip)法によるヒト時間変動遺伝子群の解析を行うことにより、網羅的に遺伝子発現の時間的変動の分子機構、すなわち、時計転写因子の複合体ダイナミクス、クロマチン構造、また時間によりこれらがどう変動するかを明らかにしようとするものである。さらに、同定した時間変動遺伝子群に関しては、最近研究代表者らが確立したin vitro real-time oscillation monitoring system(IV-ROMS)を中心とした一連の時計遺伝子解析法を用いて、詳細な解析を行うことにより、ヒト時計遺伝子の転写制御「デコード」を目指す。BMAL1抗体を利用して、ラージスケールでヒト繊維芽細胞由来のゲノムDNAを用いてchIPを行うための種々条件検討を行い、さらにchIP-Chipのための準備を整えた。一方、既に確立したIV-ROMS(in vitro real-time oscillation monitoring system)を用いた解析として、我々は、細胞自律的な時計遺伝子の概日転写に必要なシスエレメントを新しく同定した。
メディア発達を背景とした「唱歌」から「芸能科音楽」への展開

本研究は、1920年代1940年代の時期において「メディアの大衆化が、教育実践の主体的担い手の量的拡大と、初等音楽教育の領域拡大及び質的変容を促進する一因になった」との仮説のもとに、当該時期の初等音楽教育の形成過程とその特質の解明を目指すものである。1)制度、2)実践者、3)メディアの活用、の3視点から分析を進める中で2018年度は2)、3)に関わる実践者の動きについて2件を取り上げた。一つは、1920年代からの京都市の音楽家・教育音楽家たちの研究団体の活動が、戦後の音楽教育改革の牽引力の一つとなったことを文献資料に基づき辿った。「京都唱歌教育研究会」は、戦前には授業研究、児童音楽会の主催、教科書編纂(『京都小学唱歌』柳原書店)等の研究活動を展開した。戦後には、「京都市音楽教育研究会」(後に近畿音楽教育連盟)として連合国軍第一軍団軍政部教育課、市教育行政と協働し、私立人文学園内の音楽科設置を経て新制堀川高等学校音楽課程の創設、教育委員会の予算原案送付権に基づく幼・小・中学校への楽器予算措置を実現した。また教科書編纂(『わたくしたちのおんがく』中央書籍)も手掛け、京都市の音楽教育改革の推進母体になったことを指摘した。もう一つは、1930年代に生まれた絶対音感教育、和音感教育が「唱歌」から「芸能科音楽」への制度改変に際し「輪唱歌及ビ重音歌」、「鋭敏ナル聴覚ノ育成」等内容拡大に影響を与え、また国防教育の一翼と位置づけられていく経緯を文献資料並びに聴き取り等を通して辿った。特に堺市の和音感教育を主導した佐藤吉五郎は、公立幼稚園・小学校での簡素な和音感訓練法の徹底、和音笛という教具や具体的な楽曲教材を著書・SPレコード等のメディアを使って発信し、一般教師たちによる指導可能性を顕示した。そのことが制度改変に少なからず影響を与えていった経緯を明らかにした。本研究では、【研究実績の概要】で示した目的を検証するために3点の課題を設定した。2018年度の進捗状況は次の通りである。1)制度改革による「唱歌」拡大とその影響について:これについては、2018年度作業に着手することができなかった。研究計画は次の事項である。11926年小学校令改正による尋常・高等小学校の「唱歌」必修化とそれによる唱歌教育の実質的変化の有無、並びにその内容についての把握、2「唱歌科専科訓導」や「視学」等音楽教育の専門家任用の実態とそれによる変化の有無についての把握。これらの作業は今後の課題である。2)教師たちの教育研究団体の台頭と「唱歌」教育の改革に及ぼした影響について:2018年度は、「京都唱歌教育研究会」を母体とした研究団体が戦後に連合国軍第一軍団軍政部教育課、市教育行政等と協働して京都市の音楽教育改革を進めていった経緯を辿り、論文としてまとめた(菅2018)。しかしながら1戦前に尋常・高等小学校で始動していたハーモニカ合奏やリズムバンド等の実際、2戦後の各学校での器楽教育の実際(授業案、楽曲教材、指導者の音楽教育観等)や器楽教育関係者のその後の動向については作業途中であり、今後の課題である。その他、教育音楽家・音楽家たちが中心となって編集発行した雑誌類の出版状況や研究会等の動向調査も今後の課題である。3)メディアによって発信された各地の教育実践例と他の実践に及ぼした影響について:堺市の和音感教育実践が学校関係者とともに軍部から注目され制度改変の動因の一つとなった経緯を探った。これについては資料収集並びに関係者の聞き取りを集積しているところであり、論文としてのまとめは次年度の課題である。その他、全国での音感教育をめぐる普及あるいは批判的議論の状況を把握すること、これをメディアとの関わりも含めて今後の課題として検討する。本研究の今後の推進方策について、3つの課題に則して述べる。1)制度改変による「唱歌」拡大とその影響について:【現在までの進捗状況】で述べた通り次の2点について進める。11926年小学校令改正による尋常・高等小学校の「唱歌」必修化とそれによる唱歌教育の実質的変化の有無やその内容についての把握、2「唱歌科専科訓導」や「視学」等音楽教育の専門家任用の実態とそれによる変化の有無についての解明。このことについては、大都市や地方都市などいくつかの自治体の教育関係資料、各学校所蔵の資料の収集を通して分析を行う予定である。ただし近年、個人情報保護の観点から各学校の資料閲覧が難しい場合がある。閲覧困難な場合には、音楽教育関係の雑誌資料の収集分析によって補完していきたい。2)教師たちの教育研究団体の台頭と「唱歌」教育の改善に及ぼした影響について:これまで扱った団体の他、唱歌、音感教育、器楽、鑑賞、作曲、音楽劇等領域の中で、戦前から戦後初期に活躍した教師たちのグループ、研究団体、代表的実践者を雑誌記事等から把握し、それらの基本的動向を探る。全領域を網羅することは難しいため唱歌、器楽、音感教育を中心に資料収集・分析を行う。