hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Magnetized Fast Ignitionの原理実証

これは,従来の高速点火レーザー核融合と衝撃点火のハイブリッドのような手法であり,従来の高速点火方式よりも効率的にイオン温度が上昇させることが出来るというメリットがある.今年度の研究によって,キロテスラ級の外部磁場と高速点火を組み合わせたMagnetized Fast Ignition法によって,高密度プラズマを効率的に数千万度にまで加熱出来ることを実証出来た.強磁場とレーザー核融合高速点火を組み合わせることで,効率的なプラズマ加熱を実証することが本課題の最終目標である.レーザー駆動キャパシターコイルターゲットで生成した強磁場を印加した状況下で圧縮した高密度プラズマに,短パルス高強度レーザーを照射することで,高温度にプラズマを加熱出来ることを実証出来ており,初年度で,本手法の有用性を実験的に明らかにすることが出来た.また,二次元の放射流体シミュレーションコードと高速電子の輸送伝播シミュレーションコードを用いて,実験結果の再現を試みた.高密度プラズマ中を伝播する求心衝撃波が,磁力線を圧縮し,圧縮された磁力線に沿って流れた高速電子が,衝撃波の上流を選択的に加熱し,その結果として求心衝撃波の圧力が上昇する.圧力が上昇した求心衝撃波が,高密度プラズマの中心で衝突する時に,高密度・高温プラズマが形成されることが,シミュレーションで確認された.初年度で,Magnetized Fast Ignitionの有効性を実験的に実証すると共に,シミュレーションを用いて,実験結果を説明する加熱機構を明らかに出来るなど,初年度で重要な部分を実証し,当初の計画以上の進展が得られていると断言出来る.上記の成果は現在論文化に向けて,更に詳細な解析を行い,実験とシミュレーションの定量的な比較を進めている.レーザー核融合における高速点火方式は,米欧中等で進められている中心点火とは異なる経路で,核融合エネルギーの発生を実現することが可能である.高速点火方式の実現には,高強度レーザーによって加速された高速電子ビームを,高密度の核融合燃料に向けて効率的に誘導することが不可欠であることが近年明らかにされた.本研究では,レーザー駆動方式によって生成した強磁場を,高速電子ビームの伝播経路に平行に印加し,核融合燃料に向けて,高速電子ビームを効率的に誘導し,加熱効率の向上を実証するのが目的である.平成30年度の研究では,磁場を印加することによって,磁場を印加しない場合と比べて,2倍高い効率でプラズマを加熱出来ることを実験的に実証した.最大で約8%の効率で,高強度レーザーから高密度プラズマにエネルギー付与出来ることを示した.理論・シミュレーションを用いて,本実験結果の解析を行い,加熱効率の向上に至る詳細な物理過程を明らかにしている.この成果は,当該分野で最大の国際会議であるIFSA2017や,米国物理学会のプラズマ分科会において,それぞれプレナリー講演,招待講演に選ばれるなど国際的に高く評価されている.加えて,強磁場下における高エネルギー密度プラズマの流体運動について実験を行い,外部磁場下においてはプラズマ中でのエネルギー輸送が非等方になる結果,流体不安定性の成長が加速されることを実験的に示した.実験結果を説明するための理論モデルを構築し,定性的な理解に至っている.高速点火方式では,中心点火方式とは異なり,中実球と呼ぶ燃料を用いることが可能である.核融合エネルギー実現の為の,核融合燃料の大量生産・供給において,中実球は複数の利点を有している.
pHとイオン強度に応答したハイドロゲルマイクロカプセル膜の構造変化

近年、我々は両性高分子電解質膜を持つpoly(L-lysine-alt-terephthalic acid)マイクロカプセルが外部のpHとイオン強度に応答して、その粒子径と膜の物質透過速度が変化することを報告してきた。この現象はマイクロカプセルの膜がゲル構造を持ち、その構造が外部のイオン濃度に応答して変化することによると考えられる。粒子径が減少あるいは増大する時、膜厚も減少するのか、又逆に増大するのかはこの構造変化を知る上で重要である。そこで、本年度はphとイオン強度及びマイクロカプセルの粒子径と膜厚の3つの関係を明らかにする事を目的として種々のpHとイオン強度の溶液中にマイクロカプセルを分散して膜厚の測定を行った。膜厚の測定には音波測定法を用い、膜の密度と断熱圧縮率、水和量を求めた。同時にこの条件下での膜の粘弾性をハ-ケの粘度計を用いて測定した。マイクロカプセルサスペンションは最も粒子径の小さい領域(pH4)ではニュートン流動を示し、断熱圧縮率は小さかった。マイクロカプセル膜がゲル構造を持つpH6以上の領域では非ニュートン流動を示しpHが増加するとともに降伏値が増加し、断熱圧縮率も増加した。こうして、膜が電荷を持ち、負の電荷密度が大きくなると膜の粘弾性が増加することが示された。pHを変化させた時、膜密度の変化は粒子径の変化と逆の傾向を示した。即ち、pH6以上で粒子径が大きくなると膜密度は低下し、pH4で粒子径が最小の時膜密度が最大になった。膜の水和量の測定の結果マイクロカプセル膜が固体からゲル化する領域(pH4-pH6)で膜の水和量が劇的に増加することが明らかになった。しかし、よりアルカリ性の溶液中では水和量は減少した。これは高分子の電荷密度が非常に高い領域では膜内に存在する水分子であっても、その多くが結合水ではなく自由水として存在するためと考えられる。
電気関連技術に関わるマルチメディア技術史アーカイブの情報発信方法の高度化の研究

研究代表者は、研究成果促進の科研費の支援により、電気関連の5学会(映像情報メディア学会、情報処理学会、照明学会、電気学会、電子情報通信学会)と国立情報学研究所(NII)の協力を得て、戦後日本の技術開発が世界的レベルで高揚し、世界に影響を与えた我が国の電気電子・情報関連卓越技術のデータベースの構築を進あご2008年3月、その成果を「電気のデジタル博物館」(日本の電気電子・情報関連卓越技術データベース、DB-JET)として、Web上に公開した。この成果を踏まえて、本研究では、2008年度から2009年度にかけて、対象とする時代を戦後から現在に拡大してゴンテンツの整備をするとともに、中学生を含む一般の社会人が理解しやすい情報発信を推進した。卓越技術は、原則として各学会での表彰案件を基本として学会が認めるものとしている。2008年度からは、卓越技術として対象とする表彰案件を絞り、原則として、学会が表彰してきた適切な特定の賞を全て選定し採録することにした。情報処理学会については、同学会の「コンピュータ博物館」に収録されている技術・製品から選定することにした。その結果、2009年度末までに収集した卓越技術について、技術者・研究者を対象とした「専門向け」内容を1405件公開し、そのうち、中学生を含む一般の人々を対象とした「入門向け」内容を851件、海外に発信するための「英語専門向け」内容を151件、それぞれ公開した(http://dbjet.nii.ac.jp)。また、収録した図表件数は2005件、文献件数は2075件に及ぶ。本研究によって、戦後から現在に至る我が国の電気電子・情報関連の卓越技術をほぼ網羅することが出来た。本研究は戦後日本の卓越技術を収録したのみならず、科学技術の理解促進に大きな貢献をするものと考えられる。研究代表者は、研究成果促進の科研費の支援により、電気関連の5学会(映像情報メディア学会、情報処理学会、照明学会、電気学会、電子情報通信学会)と国立情報学研究所(NII)の協力を得て、戦後日本の技術開発が世界的レベルで高揚し、世界に影響を与えた我が国の電気電子・情報関連卓越技術のデータベース構築を進め、2008年3月、その成果を「電気のデジタル博物館」(日本の電気電子・情報関連卓越技術データベース、DB-JET)として、Web上に公開した(http://www.dbjet.jp)。この成果を踏まえて、本研究では、対象とする時代を元層拡大してコンテンツを整備するとともに、中学生を含む一般の社会人が理解しやすい情報発信を推進した。この卓越技術は、原則として各学会での表彰案件を基本として学会が認めるものとしている。2007年度までに、業績賞や論文賞などの表彰案件を含む572件の卓越技術の収集を行った。本研究では、学会が表彰してきた適切な特定の賞を選定し全て採録することにした。その結果、戦後から現在にいたる、587件の卓越技術を収集し、2008年度以前の572件と合わせて、全体で1159件に達した。これらを、中学生を含む一般の人々を対象とした「入門向け」内容や技術者・研究者を対象とした「専門向け」内容でWeb上に公開し、「専門向け」の元部は「英語専門向け」として英語で発信している。情報処理学会については、同学会の「コンピュータ博物館」へのリンクを計画している(約450件)。本研究によって、戦後から現在に至る我が国の電気電子・情報関連の卓越技術をほぼ網羅することができた。今後、「入門向け」をはじめとするコンテンツの一層の充実をはかる予定である。
病原性大腸菌産生ベロ毒素治療薬の開発

病原性大腸菌の産生する治療薬としての応用を目指して、ベロ毒素の細胞内侵入を阻害する糖鎖受容体アナログの化学合成とその生化学的評価を行った。ベロ毒素が細胞内に侵入する際には、腸内細胞に多く発現しているGb3セラミドを認識結合することが知られている。そこで、Gb3の糖鎖部分α-Gal-1,4-β-Gal-1,4-β-Gulとセラミド部分に化学修飾を加え、最も結合の強い化学修飾体を探索することとした。ベロ毒素とその細胞膜糖鎖受容体であるGb3セラミドとの結合を表面プラズモンセンサーにより検出するため,ベロ毒素の代替として細胞毒素abrinCをセンサープリズム上に固定化し、Gb3糖鎖をリガンドとして注入して、そのセンサグラムより結合-解離の速度定数、および、解離定数を求めた。その結果、結合反応速度定数k_A=7.24×10^3、解離反応速度定数k_B=7.59×10^<-4>、結合平衡定数K_A=9.53×10^6、解離平衡定数K_B=1.05×10^<-7>と言う値を得た。SPRセンサーの感度はリガンドの分子量に比例するため、Gb3糖鎖の分子量が504、Abrin Cの分子量は約60,000であることを考えると、今回の結果は、仮に、Gb3糖鎖をセンサープリズム上に固定化し、Abrin Cの検出を行った場合、10^<-9>(ナノモル)レベルのAbrin Cが十分に検出可能であることを示している。表面プラズモン共鳴装置を用いた解析から、Gb3糖鎖の細胞毒素への結合能評価ができ、10^<-9>(ナノモル)レベルのAbrin Cが十分に検出可能であるという有望な結果を得た。糖鎖受容体アナログは毒素やウイルスの検出装置としてのみならず、医薬や機能性高分子素材(除菌フィルターなど)への応用も可能で、その方面の検討も視野に入れて研究を進めている。そこで、Gb3の糖鎖部分α-Gal-1,4-β-Gal-1,4-β-Galとセラミド部分に化学修飾を加え、最も結合の強い化学修飾体を探索することとした。糖鎖部分はα-Gal、α-Gal-1,4-β-Gal、α-Gal-1,4-β-Gal-1,4-β-Galの3通り、セラミド部分にはL-トレオニンから由来するアミノジオール、6-ヘキサノラクトンとエチレンジアミンとの反応から得られるアミノアルコールとの2通りを合成し、これらの組合わせにより、計6通りの糖鎖受容体アナログを化学合成した。これら6種類の糖鎖受容体アナログのアミノ基にはさらにビオチンを結合させ、これらの細胞毒素への結合を表面プラズモン共鳴解析装置を用いて解析を行った。プリズム上に蒸着した金表面にストレプトアビジンを共有結合で固定化し、そこへビオチンラベル化体を結合させた。これら化学修飾糖鎖受容体とベロ毒素B鎖との結合の強さを評価するためにベロ毒素と同じ作用機構をもつ細胞毒素(abrin C)を用いて評価した。その結果、糖鎖部分にα-Gal、α-Gal-

1,4-β-Galをもつ修飾体はあまり強い結合を観測することができなかったが、糖鎖α-Gal-1,4-β-Gal-1,4-β-GalにL-トレオニンから由来するアミノジオールを結合した修飾体(解離定数2.56x10^<-6>M)が、天然のGb3セラミド(解離定数1.05x10^<-7>M)に匹敵する強さで結合することがわかった。今後、セラミド部分の化学修飾体や糖鎖部分のさらなる最適化を行い、治療薬としての応用を計っていく予定である。ベロ毒素とその細胞膜糖鎖受容体であるGb3セラミドとの結合を表面プラズモンセンサーにより検出するため、べロ毒素の代替として細胞毒素abrinCをセンサープリズム上に固定化し、Gb3糖鎖をリガンドとして注入して、そのセンサグラムより結合-解離の速度定数、および、解離定数を求めた。センサグラムより、結合反応速度定数k_A=7.24x10^3、解離反応速度定数k_B=7.59x10^<-4>、結合平衡定数K_A=9.53x10^6、解離平衡定数K_B=1.05x10_<-7>と言う値を得た。SPRセンサーの感度はリガンドの分子量に比例するため、Gb3糖鎖の分子量が504、Abrin Cの分子量は約60,000であることを考えると、今回の結果は、仮に、Gb3糖鎖をセンサープリズム上に固定化し、Abrin Cの検出を行った場合、10^<-9>(ナノモル)レベルのAbrin Cが十分に検出可能であることを示している。表面プラズモン共鳴装置を用いた解析から、Gb3糖鎖の細胞毒素への結合能評価ができ、10^<-9>(ナノモル)レベルのAbrin Cが十分に検出可能であるという有望な結果を得た。さらに結合能の強い糖鎖アナログを探索し、目標であるピコモルフェムトモル濃度以下の検出を達成したい。糖鎖受容体アナログは毒素やウイルスの検出装置としてのみならず、医薬や機能性高分子素材(除菌フィルターなど)への応用も可能で、その方面の検討も視野に入れて研究を進めている。また、より簡便な検出法として、蛍光ラベルした糖鎖受容体アナログと結合した毒素をタンパク質吸着能の高いメンブレンフィルターで吸着し、蛍光分光光度計で検出する手法を検討中である。病原性大腸菌の産生する治療薬としての応用を目指して、ベロ毒素の細胞内侵入を阻害する糖鎖受容体アナログの化学合成とその生化学的評価を行った。ベロ毒素が細胞内に侵入する際には、腸内細胞に多く発現しているGb3セラミドを認識結合することが知られている。そこで、Gb3の糖鎖部分α-Gal-1 4-β-Gal-1,4-β-Gulとセラミド部分に化学修飾を加え、最も結合の強い化学修飾体を探索することとした。ベロ毒素とその細胞膜糖鎖受容体であるGb3セラミドとの結合を表面プラズモンセンサーにより検出するため,ベロ毒素の代替として細胞毒素abrinCをセンサープリズム上に固定化し、Gb3糖鎖をリガンドとして注入して、そのセンサグラムより結合-解離の速度定数、および、解離定数を求めた。その結果、結合反応速度定数k_A=7.24x10^3、解離反応速度定数k_B=7.59x10^<-4>、結合平衡定数K_A=9.53x10^6、解離平衡定数K_B=1.05x10^<-7>と言う値を得た。
急性・慢性関節炎におけるバゾプレッシンの生理的役割解明:遺伝子改変動物を用いて

c-fos-mRFP1トランスジェニックラットにホルマリンあるいはTRPV4アゴニストを皮下注射し、脊髄後角ならびにバゾプレッシン産生ニューロンを含む視床下部室傍核の賦活化をc-fos-mRFP1融合遺伝子発現により可視化した。ホルマリンあるいはTRPV4アゴニスト注射後、mRFP1蛍光は著明に発現しており、本トランスジェニックラットが侵害受容機構を調べる上で有用な動物モデルであることを明らかにした。本研究課題では、遺伝子改変動物を用いて、急性疼痛ストレス負荷時の視床下部におけるバゾプレッシン系の生理的役割を解明することを目的とした。具体的にはc-fos-mRFP1トランスジェニックラットにホルマリンあるいはTRPV4アゴニスト(4α-PDD)を皮下注射することで急性疼痛ストレスを負荷し、脊髄後角ならびにバゾプレッシン産生ニューロンを含む視床下部室傍核(PVN)の賦活化を、mRFP1蛍光を指標にc-fos遺伝子の発現として観察した。また、注射後の後肢の腫脹や生体防御行動も併せて検討した。その結果(1)ホルマリン注射90分後、トランスジェニックラットでは脊髄後角ならびにPVNにおいてmRFP1蛍光が著明に発現していた。(2)ホルマリン注射後、野生型ラットにおける免疫組織化学的染色法によるFosタンパクの発現と比し、脊髄後角ではmRFP1蛍光はFosタンパクより2倍以上多く発現していた。また、脊髄後角およびPVNにおいて、トランスジェニックラットではmRFP1蛍光は注射3時間後をピークに6時間後まで増強していたのに対し、野生型ラットでは注射90分後から3時間後にFosタンパクの発現のピークがあり、6時間後にはほとんど消退していた。(3)生体防御行動はホルマリン注射後、それぞれのラットともに著明に増加したが、4α-PDDおよび生理食塩水注射後は、有意な増加を認めなかった。後肢の腫脹はホルマリン注射後著明であったが、4α-PDD注射後でも中程度認めた。4α-PDD注射後、野生型ラットではFosタンパク、トランスジェニックラットではmRFP1蛍光が脊髄後角およびPVNにおいて有意に増加した。以上の結果から、c-fos-mRFP1トランスジェニックラットは、急性疼痛ストレスに対して鋭敏に反応しており、中枢神経系での侵害受容機構を調べる上で有用な動物モデルであることが明らかとなった。遺伝子改変動物(c-fos-mRFPトランスジェニックラット)および野生型ラットを用いて、急性疼痛ストレス負荷をかけ、mRFP蛍光の発現と免疫組織化学的染色法によるFosタンパクの発現を脊髄および視床下部で比較した。さらに、これらを経時的変化で比較検討した。今回得られた結果は以下の通りである。急性疼痛ストレスとして5%ホルマリン液をc-fos-mRFPトランスジェニックラットならびに野生型ラットの両側後肢に皮下注射すると、下肢からの疼痛刺激を受容する第4腰髄レベルの脊髄後角ならびに視床下部室傍核において、定量性のあるmRFP蛍光およびFosタンパクの発現を認めた。さらに、これらを経時変化で比較すると(1)mRFP蛍光が脊髄後角第I、II層において、注射後90分から6時間まで増強していることを認めた。一方、Fosタンパクは、注射後90分から3時間まで、増加を認めた。さらに、脊髄後角におけるmRFP蛍光はFosタンパクより約3倍多く発現しており、疼痛刺激に鋭敏に反応していることが明らかになった。(2)室傍核ではmRFP蛍光は注射後3時間をピークに90分から6時間にかけて増強していた。一方、免疫組織化学的染色法によるFosタンパクは、注射後90分に発現が最も増加し、6時間後まで発現の増加を認めた。以上の結果から、急性疼痛ストレスを負荷されたc-fos-mRFPトランスジェニックラットで、ニューロンの活動性の指標として汎用されるc-fos遺伝子産物であるFosタンパクの発現動態が、mRFP蛍光で可視化されていることが明らかになった。Fosタンパク発現の有無を確認するには免疫組織化学的染色法を必要としていたが、c-fos-mRFPトランスジェニックラットを使用することで簡便に、さらに、c-fos遺伝子の発現を鋭敏で長時間持続する赤色蛍光として検出することに成功した。計画1年次においては、c-fos-mRFPトランスジェニックラットに急性疼痛ストレスを負荷し、mRFP蛍光の発現の経時的変化を免疫組織化学的染色法によるFosタンパクの発現の経時変化と比較検討を行った。今回の実験で、疼痛ストレスに対するc-fos-mRFPの発現は定量性があり、免疫組織化学的染色法によるFosタンパクと比べ、鋭敏であり、さらに長時間持続するという特性があることを見いだした。以上より、c-fos-mRFP

トランスジェニックラットに対する急性疼痛ストレス後のFosタンパクの発現動態をmRFP蛍光を指標に評価する手法を確立したことから、計画2年次においては、アジュバント関節炎(AA)などの慢性疼痛・炎症モデルや脛骨骨幹部骨折などの外傷モデルなど、さまざまな動物モデルを作成し、中枢神経系における神経内分泌反応をmRFP蛍光を指標に容易に観察、評価することが可能となった。また、計画1年次において、本研究の成果を、日本内分泌学会、日本リウマチ学会、世界整形外科学会などの国内学会や国際学会に積極的に発表し、国内外にアピールしてきた。以上より、「研究の目的」の達成度については、「おおむね順調に進展している」と考える。計画2年次においては、上述のc-fos-mRFPトランスジェニックラットに加え、アルギニンバゾプレッシン(AVP)遺伝子にeGFP遺伝子を導入したAVP-eGFPトランスジェニックラットを用い、慢性疼痛・炎症モデルとしてAAや、外傷モデルとして脛骨骨幹部骨折などを作成し、同様に視床下部神経核、脊髄後角およびDRGニューロンにおけるAVP-eGFP蛍光、c-fos-mRFP蛍光の変化を観察し、in situハイブリダイゼーション法を用いて定量評価し、疼痛受容と神経内分泌反応に関する分子基盤について考察する予定である。さらに、後根神経節ニューロンの単離・培養を試み、生細胞の状態でリアルタイムにその生理学的性質を検討する。本研究の成果は、日本整形外科学会、日本リウマチ学会、世界整形外科学会などの国内学会や国際学会に積極的に発表し、最終的には国際専門雑誌に英文論文として発表する予定である。次年度の研究費については、交配のための実験動物(ラット)の購入と上記2種類のトランスジェニックラットの飼育に必要な経費を使用する。主に使用する試薬類は、抗体を含む免疫組織化学的染色用試薬、in situハイブリダイゼーション用試薬等、であり、これらの購入に研究費を使用予定である。また、in situハイブリダイゼーション法に使用するラジオアイソトープ(35S)に必要な経費を研究費から使用する。本研究の成果は随時、日本整形外科学会、日本リウマチ学会、世界整形外科学会などの国内学会や国際学会に積極的に発表し、国際専門雑誌に英文論文として発表する予定である。これらに必要な経費を使用する。
甲状腺癌に対する甲状腺全摘-^<131>I内部照射療法の有効性を予測するための基礎研究

19661984年の19年間に甲状腺全摘-【^(131)I】内部照射療法を受けた27症例(乳頭癌10,濾胞癌17例)を対象とした。血行性転移として肺,骨,それら両者への転移がそれぞれ12,9,6例に認められた。24例については最低2年,最高20年,平均8年経過を追えたが、3例は追跡不能となった。4例が術後それぞれ2,4,10,10年で癌死した。この4例はいずれも40歳以上で、転移巣における【^(131)I】集積像陽性であった。27全症例の中で、【^(131)I】集積像陰性なのは4例のみであった。癌組織におけるTg,【T_4】及び【T_3】の有無の検索はPAP法にて行った。全例原発巣より標本を作製したが、15例においてはリンパ節から、また1例づつ皮膚と骨転移巣から標本を得ることができた。転移巣における染色結果は原発巣のそれにおおむね一致した。Tg,【T_4】,【T_3】はそれぞれ26,15,10例で陽性であった。Tgに関しては1例を除く全例で陽性であったことになる。一方、【T_4】及び【T_3】に関しては、それらが陽性の全例が良好な【^(131)I】の取り込みを示したが、【T_4】陰性12例のうち4例、【T_3】陰性17例のうち4例では【^(131)I】の取り込みはほとんど見られないという結果が得られた。免疫組織化学的に【T_4】あるいは【T_3】が証明されれば【^(131)I】の取り込みがあると予測できるが、証明されない場合にはその有無を予測できないことになる。なお、Tg,【T_4】及び【T_3】が癌組織において陽性に染色されるといっても、モザイク状に極めて限られた部分で陽性であったに過ぎない。この傾向は【T_4】及び【T_3】についてより強かった。一般に【^(131)I】内部照射療法の効果には限界がある。この理由の一つは、【^(131)2】集積像は陽性であっても、実際には【^(131)I】を取り込まない部分が癌の大半を占めていることにあることを、上記の事象は示唆している。
水パルス圧縮による高強度フェムト秒レーザー光の発生

前年度の位相計測系、及びパルス圧縮用水槽の整備を受けて、今年度は水圧縮パルスの位相計測及び分散補償を行う予定であったが、実験に使用する光パラメトリックレーザーシステムのポンプレーザー増幅部に不具合があり、実施期間中に改修が間に合わなかったため水圧縮パルスの出力増強ができず、位相計測に十分な光強度が得られなかった。他方水圧縮パルスレーザー光の特性評価として集光照射等の実用に耐えうるか確認するため水槽透過光の波面計測を行った。中心波長510nmのコリメートしたフェムト秒レーザー光に前年度作成した水槽を透過させ、波面センサーで受光することにより水槽の有無による波面歪みの変化およびレーザー光の揺らぎの影響を調査した。計測の結果水槽透過光の波面歪みはP-V値で0.24マイクロメートル(有効径2.4mmφ)と観測され、透過しない場合に対して0.09マイクロメートル(同)と10分の1波長程度の増加に留まった。このため透過による波面歪みは集光にほとんど影響をもたらさないことが分かった。また計測データからは少なくとも静置された水環境では水媒質自身の時間的ゆらぎ等は計測される透過波面にほとんど影響を与えていないことが分かった。よって水槽透過光はLIBS等水中レーザー光照射実験に十分利用可能な集光が得られることが判明した。本研究の実施期間は今年度で終了したが、今後ポンプレーザー増幅部の改修を行って光パラメトリック増幅の利得を高め、水槽によるアイドラー光パルス圧縮を実用化するとともに、他の生体媒質を用いたパルス圧縮研究へのステップとしていきたいと考えている。本研究課題では水の群速度分散を用いてパルス圧縮を行う高強度フェムト秒レーザー装置を実現する。光パラメトリック増幅で負チャープの500 nm波長帯増幅光パルスを発生させ、伝搬媒質である水自身の正分散でパルス圧縮を行うことで、照射点に高強度フェムト秒レーザー光を発生させることができる。本研究により従来到底不可能であった水中での高強度フェムト秒レーザー光直接照射が実現し、水中でのフェムト秒レーザーLIBSによる物質検知やフェムト秒レーザー加工による高効率な配管補修、材質改善等が可能になる。本研究ではまず平成28年度に光パラメトリックチャープパルス増幅で発生するアイドラー光の2倍波を発生させて位相計測を行い、分散補償に必要な水槽の長さを決定する予定であり、実験準備として圧縮パルスの分散補償及び位相計測に必要なテーパー型ガラスブロック対の設計及び制作を行った。再設計されたガラスブロック対は高屈折率ガラス(オハラ製S-TIH10)を用いており、光路長は約80mm130mmと可変域が当初より大きくなっている。レトロリフレクターを用いて同じガラスブロック対を光軸高さを変えて2回透過する構成とすることで装置のコンパクト化も実現できた。しかしながらその後パルス圧縮実験を行う量研所有のレーザー装置の発振器に不具合が見つかり、当初予定していた期間に実験を行うことが困難になった。このため平成28年度中は位相制御用空間光変調器及び位相計測器の整備までで、圧縮パルスの分散補償及び位相計測実験は平成29年度上期に行い、あわせて下期に当初から平成29年度行う予定の水槽透過によるパルス圧縮を行い、位相計測により残留高次分散計測及び補償等を行う予定である。本研究に使用するレーザーシステムの装置故障からの復旧に時間がかかり、また所属先での本務のレーザー装置開発に当初想定されたよりはるかに多くの期間拘束されたため、レーザーシステムの整備維持に従事する期間が確保できず、年間を通じてレーザーシステムで連続的に実験に取り組める期間が取れなかったため。今年度は前年度に整備した位相計測器を用いて波長500 nm帯の圧縮光パルスの位相計測を行った。今回用いた位相計測装置はPG-FROGと呼ばれる装置で、測定光の波長を変えずに位相計測が行うことができる。光パラメトリック増幅(OPA)に用いる中心波長510 nmポンプ光での位相計測ではパルス幅1.04 psが得られ、位相計測にはピーク出力で100 MW程度の測定光入力が必要と判明した。OPAでアイドラー光を発生させた。発生アイドラー光のエネルギーは空間光変調器の導入に伴うシグナル光のエネルギー、利得低下に伴い10 μJに届かず2倍波出力は数μJであった。このため今回発生させたアイドラー光2倍波ではピーク出力が10MW程度とPG-FROGによる位相計測が困難で、2段のOPAを行って発生アイドラー光のエネルギーを10倍程度に高めることで計測が可能になると考えられる。また前述のパルス圧縮に用いる水槽を準備した。水槽の長さは基本波位相計測から得られた分散を元に長さ47 cmに設定した。水槽は内径70 mm程度のSUS製フランジを用い、両端に取り付けた反射防止コートを施したウェッジ付き光学ウインドウを用いて中の純水を封じ切る構造になっている。水槽全体の透過率は87.2%と高く、水によるパルス圧縮の実用性を確認できた。入射光パルスのエネルギーを上げていくと水槽内部で自己収束が起こり、透過後の出力光ビームサイズが縮小した。自己収束から確認した非線形効果のしきい値は7.6 GW/cm2であり、今後の実験及び実用化の検討時に考慮すべきデータが得られた。位相計測器は極短パルス計測に有効に機能し、パルス圧縮用水槽の準備及び特性評価も完了した。OPAアイドラー光の出力が低く2倍波での直接位相計測ができていないが、空間位相変調器のシグナル

光への導入でOPAシード光エネルギー及び利得が以前に比べて低下したためで、OPA設計の見直しで出力が増強されれば今年度2倍波直接計測による水圧縮パルスの詳細な分散補償・制御等に進むことができると考えている。前年度の位相計測系、及びパルス圧縮用水槽の整備を受けて、今年度は水圧縮パルスの位相計測及び分散補償を行う予定であったが、実験に使用する光パラメトリックレーザーシステムのポンプレーザー増幅部に不具合があり、実施期間中に改修が間に合わなかったため水圧縮パルスの出力増強ができず、位相計測に十分な光強度が得られなかった。他方水圧縮パルスレーザー光の特性評価として集光照射等の実用に耐えうるか確認するため水槽透過光の波面計測を行った。中心波長510nmのコリメートしたフェムト秒レーザー光に前年度作成した水槽を透過させ、波面センサーで受光することにより水槽の有無による波面歪みの変化およびレーザー光の揺らぎの影響を調査した。計測の結果水槽透過光の波面歪みはP-V値で0.24マイクロメートル(有効径2.4mmφ)と観測され、透過しない場合に対して0.09マイクロメートル(同)と10分の1波長程度の増加に留まった。このため透過による波面歪みは集光にほとんど影響をもたらさないことが分かった。また計測データからは少なくとも静置された水環境では水媒質自身の時間的ゆらぎ等は計測される透過波面にほとんど影響を与えていないことが分かった。よって水槽透過光はLIBS等水中レーザー光照射実験に十分利用可能な集光が得られることが判明した。本研究の実施期間は今年度で終了したが、今後ポンプレーザー増幅部の改修を行って光パラメトリック増幅の利得を高め、水槽によるアイドラー光パルス圧縮を実用化するとともに、他の生体媒質を用いたパルス圧縮研究へのステップとしていきたいと考えている。昨年度で本務の装置開発は目処が立ったため、本年度は数ヶ月単位で2回本研究課題に取り組む期間を確保して、当初の予定通り水媒質によるパルス圧縮で超短パルス発生を実現する予定である。昨年度に分散補償用テーパー型ガラスブロック対の作成及び位相制御装置の準備は完了しており、実験に使用するレーザーシステムが実験期間に普通に運用できればガラスブロックでのパルス圧縮及び位相計測を1回目で、水槽を作成しての水媒質によるパルス圧縮を2回目で行うことは十分可能だと考えている。今年度はまずレーザーシステムの改修を行い、OPA出力エネルギーを10倍に増強して水圧縮光パルスの位相計測及び分散補償を行う予定である。ポンプ光レーザー出力を2倍程度増強し、OPA設計を2段増幅に見直すことで非線形増幅であるOPAでは10倍の利得は容易に得られる見込みで、水槽透過後のアイドラー2倍波を位相計測しながら空間光変調による分散補償・制御を行う。また水圧縮パルス光の波面及び集光特性についても実験から評価することで、本研究の実用時のスケーリングに必要な情報が取得できると考えている。分散補償用テーパー型ガラスブロック対の設計を見直したため当初の予定よりサイズが小型になり、ガラス材料代及び加工代金が安くなった。またレーザー装置の不具合で位相計測実験が次年度に延期されたため当該実験に必要な消耗品分が不要になった。今年度新規制作を予定していた水槽の作成が位相計測の結果、既存の物品の改造で済んだため。
胎仔期生殖腺の性スペクトラム

これまでに我々は、ほ乳類性決定遺伝子SryのH3K9メチル化修飾の除去酵素(H3K9メチル化"eraser")がJmjCドメイン含有タンパク質Jmjd1aであることを明らかにしていた(Kuroki et al., Science 2013)。マウスでJmjd1a欠損させるとSryの発現が大幅に低下し、XY個体のうちの約半数が性転換してメスになる。Jmjd1aを欠損させるとSry遺伝子座のH3K9メチル化が亢進することから、Jmjd1aに拮抗して作用するH3K9メチル化酵素(H3K9メチル化"writer")が存在することが考えられた。これらの知見のもと、平成29年度はSryのH3K9メチル化writerの同定を試みた。まず、H3K9のジメチル化に寄与する酵素であるGLP/G9a複合体が性決定の時期(受精後12日)のマウス胎仔生殖線の体細胞で発現していることを明らかにした。GLP/G9a複合体のうち、GLPはその量的制御に関わっている。よってGLPのヘテロ欠損をJmjd1a欠損の遺伝子背景下に導入し、Jmjd1a欠損による性転換のレスキュー実験を試みた。GLPのヘテロ欠損では予想通りGLP/G9a複合体のタンパク質量が低下していた。GLPヘテロ欠損の導入効果は以下の通りであった。1.GLP変異によってJmjd1a欠損によるSryの発現低下がレスキューされた。2.GLP変異によってJmjd1a欠損によるH3K9メチル化の亢進がレスキューされた。3.GLP変異によってJmjda欠損による成体マウスの性転換がレスキューされた。また、主にH3K9のトリメチル化に関わっている酵素であるEsetの変異マウスも作製した。Esetのへテロ変異をJmjd1a欠損の遺伝子背景に導入しても、その性転換の表現型をレスキューしなかった。以上の事実はSryのH3K9メチル化writerがGLP/G9a複合体であることを示すものであった。これらの実験結果をまとめ、Kuroki et al., PLoS Genetics 2017で報告した。平成29年度の研究計画には、Sryエピゲノムによる胎仔期生殖腺の性スペクトラム定位のメカニズムを明らかにすること、すなわちSry遺伝子座におけるH3K9メチル化“eraser"に拮抗して働くH3K9メチル化"writer"を明らかにすることが大きな目標の一つであった。生殖線体細胞で発現が認められたH3K9メチル化酵素はSuv39h1、Suv39h2、GLP/G9a複合体、Esetなどがあり、これらがSryのH3K9メチル化writerの候補であった。酵素反応の生成物特異性、発現する細胞のプロファイル、核内局在パターンなどの観点から、これらの酵素のうちGLP/G9a複合体をSryのH3K9メチル化writerの第一候補と考えた。研究の結果、GLP/G9aは確かに性決定時期の生殖線体細胞のSryに集積し、Jmjd1aによるH3K9脱メチル化に拮抗して作用することを明らかにした。これらの成果を平成29年度内に論文にまとめることができたことは大きな進捗だったといえる(Kuroki et al., PLoS Genetics)。一方で、Jmjd1aの類似分子であるJmjd1b胎仔期の生殖線体細胞で発現していることも明らかにした。この事実は、Jmjd1aのみならずJmjd1bもSryのH3K9メチル化eraserとして機能している可能を示唆した。この点については30年度以降に詳細に解析を進める予定である。研究計画その2)「栄養・代謝変動によるSryのエピゲノム制御機構について」の研究を中心に進める。これまでの研究により、受精後12日の胎児期生殖線の体細胞では代謝関連遺伝子の発現が高いことが分っている。すなわち、解糖系ではHK1、Ldha、Ldhb、脂質代謝ではCpt1a、Hmgcs2、TCAサイクルではIdh1などである。これらの酵素の活性の変動はアセチルCoAや2-KGの産生の変動に大きく影響すると考えられる。アセチルCoAはヒストンアセチル化酵素、2-KGはDNAのハイドロキシメチル化酵素やヒストンの脱メチル化酵素に必須の因子であるため、これらの代謝酵素がエピジェネティックにSry遺伝子の制御に関わっている可能性を追求する。CRISPR/Cas9によるゲノム編集でこれらの酵素の欠損マウスを作製し、性分化への影響を観察する。

まず、H3K9のジメチル化に寄与する酵素であるGLP/G9a複合体が性決定の時期(受精後12日)のマウス胎仔生殖線の体細胞で発現していることを明らかにした。GLP/G9a複合体のうち、GLPはその量的制御に関わっている。よってGLPのヘテロ欠損をJmjd1a欠損の遺伝子背景下に導入し、Jmjd1a欠損による性転換のレスキュー実験を試みた。GLPのヘテロ欠損では予想通りGLP/G9a複合体のタンパク質量が低下していた。GLPヘテロ欠損の導入効果は以下の通りであった。1.GLP変異によってJmjd1a欠損によるSryの発現低下がレスキューされた。2.GLP変異によってJmjd1a欠損によるH3K9メチル化の亢進がレスキューされた。3.GLP変異によってJmjda欠損による成体マウスの性転換がレスキューされた。また、主にH3K9のトリメチル化に関わっている酵素であるEsetの変異マウスも作製した。Esetのへテロ変異をJmjd1a欠損の遺伝子背景に導入しても、その性転換の表現型をレスキューしなかった。以上の事実はSryのH3K9メチル化writerがGLP/G9a複合体であることを示すものであった。これらの実験結果をまとめ、Kuroki et al., PLoS Genetics 2017で報告した。平成29年度の研究計画には、Sryエピゲノムによる胎仔期生殖腺の性スペクトラム定位のメカニズムを明らかにすること、すなわちSry遺伝子座におけるH3K9メチル化“eraser"に拮抗して働くH3K9メチル化"writer"を明らかにすることが大きな目標の一つであった。生殖線体細胞で発現が認められたH3K9メチル化酵素はSuv39h1、Suv39h2、GLP/G9a複合体、Esetなどがあり、これらがSryのH3K9メチル化writerの候補であった。酵素反応の生成物特異性、発現する細胞のプロファイル、核内局在パターンなどの観点から、これらの酵素のうちGLP/G9a複合体をSryのH3K9メチル化writerの第一候補と考えた。研究の結果、GLP/G9aは確かに性決定時期の生殖線体細胞のSryに集積し、Jmjd1aによるH3K9脱メチル化に拮抗して作用することを明らかにした。これらの成果を平成29年度内に論文にまとめることができたことは大きな進捗だったといえる(Kuroki et al., PLoS Genetics)。一方で、Jmjd1aの類似分子であるJmjd1b胎仔期の生殖線体細胞で発現していることも明らかにした。この事実は、Jmjd1aのみならずJmjd1bもSryのH3K9メチル化eraserとして機能している可能を示唆した。この点については30年度以降に詳細に解析を進める予定である。研究計画その2)「栄養・代謝変動によるSryのエピゲノム制御機構について」の研究を中心に進める。これまでの研究により、受精後12日の胎児期生殖線の体細胞では代謝関連遺伝子の発現が高いことが分っている。すなわち、解糖系ではHK1、Ldha、Ldhb、脂質代謝ではCpt1a、Hmgcs2、TCAサイクルではIdh1などである。これらの酵素の活性の変動はアセチルCoAや2-KGの産生の変動に大きく影響すると考えられる。アセチルCoAはヒストンアセチル化酵素、2-KGはDNAのハイドロキシメチル化酵素やヒストンの脱
耐塩性シロイヌナズナが有する塩馴化機構の解明

モデル植物シロイヌナズナは、日本にも自生種が数種類あるように、世界中の様々な地域に生息し、そのエコタイプ(accessions)は1000以上に上る。先行研究により、高い浸透圧ストレス耐性を示すシロイヌナズナは、生育に影響を及ぼさない程度の塩ストレスを一定期間経ることで、海水と同程度の塩(浸透圧)にも耐性を示す「塩馴化後浸透圧耐性」に優れていること、さらに200種のシロイヌナズナを用いたGenome wide association studyにより、塩馴化後浸透圧耐性が1遺伝子座に制御されていることを明らかにした。昨年度までに、塩馴化後浸透圧耐性を有するaccessionと、欠損したaccessionの掛け合わせにより、Near isogenic lines (NILs)を作出し、原因遺伝子座をおおよそ特定し、さらに、塩馴化後浸透圧耐性を欠損した突然変異株の単離に成功した。本年度はこれらの実験材料を用いて、耐性メカニズムの生理学的解析、シグナル伝達経路の解明を試みた。耐性メカニズムの解析については、理化学研究所環境資源科学研究センターの榊原均博士との共同研究により、塩馴化能を獲得する過程における全植物ホルモンの定量解析を行った。その結果、浸透圧耐性に重要な役割を果たすアブシジン酸には、塩馴化後浸透圧耐性を有するaccessionsあるいはNILと、欠損したaccessionとの間に差が認められず、一般に知られている浸透圧耐性とは異なるメカニズムで塩馴化後浸透圧耐性に至ることが示唆された。塩馴化後浸透圧耐性を欠損した突然変異株については、マッピングを実施し、昨年度実施したゲノムシークエンス解析と合わせて遺伝子座の絞り込みを行った。その結果、浸透圧耐性とは異なる表現型から、極めて可能性の高い原因遺伝子を特定することに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。モデル植物として広く利用されているシロイヌナズナは、日本にも自生種が数種類あるように、世界中の様々な地域に生息し、その数は1000以上に上る。これまでの研究により、浸透圧ストレスに耐性を示すシロイヌナズナは、生育に影響を及ぼさない程度の塩ストレスを一定期間経ることで、海水と同程度の塩(浸透圧)にも耐性を示す「塩馴化能」が優れていること、さらに200種のシロイヌナズナを用いたGenome wide association studyにより、塩馴化能が1遺伝子座に制御されていることを明らかにした。この塩馴化能を制御する遺伝子座の同定と併せて、塩馴化能獲得に至るシグナル伝達経路を明らかにするため、塩馴化能を欠損した変異株のスクリーニングを行った。塩馴化能を制御する遺伝子座の同定については、昨年度の同遺伝子座のシークエンス解析により明らかとなった17 kbpの欠損領域付近について、塩馴化能を有するaccessions、塩馴化能を欠損したaccessionsの同遺伝子座における遺伝型の決定、すなわちシークエンス解析を合計100 accessionsを目標に行っている。一方、塩馴化能を有する浸透圧耐性シロイヌナズナ種子にイオンビームを照射することにより突然変異を誘導し、その次世代種子を用いて、塩馴化能を欠損したaccessionsと同様、浸透圧耐性を示さない変異株をスクリーニングしている。これまでにいくつかの候補株を単離し、1つについては次世代においても浸透圧耐性を欠損した変異株を取得した。この次世代への遺伝が確認できた変異株については、次世代ゲノムシーケンサーを用いたリシークエンスによって変異箇所の同定を行った。その結果、非常に効果的に候補原因遺伝子を絞り込むことに成功した。合計100 accessionsを目標に行っている、塩馴化能原因遺伝子座の遺伝型解析については、これまでに約50 accessionsについて20 kbp間のシークエンスを終了した。

塩馴化能との関連解析により、原因遺伝子が明らかになりつつある。またこの解析をaccessionsが収集された地図上に落とし込むことにより、塩馴化能の進化的な議論をすることが出来つつある。また上述のように、塩馴化能を有するシロイヌナズナに突然変異処理した種子を用いて塩馴化能欠損変異株のスクリーニングを行っている。1つの目的変異株については、ゲノムシークエンスの結果、原因遺伝子の候補が明らかとなった。マッピングを含めた遺伝学的解析の他、候補遺伝子を用いた相補試験により、原因遺伝子の特定を行っている。この変異株の他、いくつかの候補株が単離できており、順次、遺伝性の確認を行っている。また、塩馴化能を欠損している野生株に変異を導入した種子を作成して、逆に塩馴化能を獲得する変異株のスクリーニングも同時に行っている。これまでの遺伝学的な解析により、どの遺伝子が塩馴化の制御に関わっているのかが明らかになりつつある。しかしながら、その遺伝子を介してどのように極めて高い浸透圧ストレス耐性の獲得に至るのかについては明らかになっていない。先行研究によって、塩馴化能を有するaccessions、欠損したaccessionsの他、これらを掛け合わせることによって作出したNear isogenic lines (NILs)、塩馴化能を欠損した変異株を保有している。これらを用いることにより、塩馴化していく過程でどのような転写レベルの変化が起こるのかをRNA-seqを用いて明らかにする。また現在、理化学研究所環境資源科学研究センターの榊原均博士との共同研究により、塩馴化能を獲得する過程における全植物ホルモンの定量解析を行っている。これらの結果と合わせることにより、メジャーな科学雑誌への論文投稿を行う。塩馴化能欠損変異株についても、1つの変異株については、先の論文と同時に別論文として投稿を行う。
TACEはTREM1のsheddingを介してmonocyteの活性を調節する

本研究課題名にあるTREM1のsheddingに関しては,生体内で観察した結果を生化学的手法にて再現できなかったため,対象遺伝子をIL-1受容体に変更し,立案計画に沿って解析を続行した.IL-1は炎症および感染防御において重要な機能を有するサイトカインであり,その活性は極めて高度に調節されている. IL-1の受容体には2種(IL-1RI, IL-1RII)存在するが, IL-1RIIは細胞内領域を欠損しており, IL-1シグナルを負に調節すると考えられている.さらに,これらの受容体は細胞膜上にて蛋白質分解作用(以下, shedding)をうけ,可溶型蛋白質としても存在することが報告されている.昨年度は,各種蛋白質分解酵素阻害剤, TACE遺伝子改変マウスおよびTACE欠損細胞を用いて生化学的な評価を試みた.その結果, IL-1受容体のうちIL-1RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受け, TACEはIL-1RIIのsheddingを介して細胞内のIL-1シグナルを正に制御していることが示された.本年度は, TACE遺伝子改変マウスの骨髄細胞を用いてFACS解析を行い, IL-1RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受けることを確証,さらにIL-1RII変異体を作成しIL-1RIIは細胞膜近傍で切断されることを確認した.またヒト細胞やTACE欠損細胞を用いてIL-1シグナル解析を行った.炎症性疾患・免疫に極めて深く関与しているIL-1シグナルの調節機構を解明することは,臨床応用へのフィードバックの一助となると考える.本研究課題名にあるTREM1のsheddingに関しては,生体内で観察した結果を生化学的手法にて再現できなかったため,対象遺伝子をIL-1受容体に変更し,立案計画に沿って解析を続行した.IL-1は炎症および感染防御において重要な機能を有するサイトカインであり,その活性は極めて高度に調節されている. IL-1の受容体には2種(IL-1RI, IL-1RII)存在するが, IL-1RIIは細胞内領域を欠損しており, IL-1シグナルを負に調節すると考えられている.さらに,これらの受容体は細胞膜上にて蛋白質分解作用(以下, shedding)をうけ,可溶型蛋白質としても存在することが報告されている.昨年度は,各種蛋白質分解酵素阻害剤, TACE遺伝子改変マウスおよびTACE欠損細胞を用いて生化学的な評価を試みた.その結果, IL-1受容体のうちIL-1RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受け, TACEはIL-1RIIのsheddingを介して細胞内のIL-1シグナルを正に制御していることが示された.本年度は, TACE遺伝子改変マウスの骨髄細胞を用いてFACS解析を行い, IL-1RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受けることを確証,さらにIL-1RII変異体を作成しIL-1RIIは細胞膜近傍で切断されることを確認した.またヒト細胞やTACE欠損細胞を用いてIL-1シグナル解析を行った.炎症性疾患・免疫に極めて深く関与しているIL-1シグナルの調節機構を解明することは,臨床応用へのフィードバックの一助となると考える.本研究立案にあるTREM1のsheddingに関しては,生体内で観察した結果を生化学的手法にて再現できなかったため,対象遺伝子をIL-1受容体に変更し,立案計画に沿って解析を続行した,IL-1は炎症および感染防御において重要な機能を有するサイトカインであり,その活性は極めて高度に調節されている.IL-1の受容体には2種(IL1-RI,IL1-RII)存在するが,IL1-RIIは細胞内領域を欠損しており,IL-1シグナルを負に調節すると考えられている.さらに,これらの受容体は細胞膜上にて蛋白質分解作用(以下,shedding)をうけ,可溶型蛋白質としても存在することが報告されている.上記IL-1受容体(IL1-RI,IL1-RII)のshedding活性を,各種蛋白質分解酵素阻害剤およびTACE欠損細胞を用いて生化学的な評価を試みた.その結果,IL1-RIIのみがTACE特異的に切断を受けることが明らかとなった.さらにTACE遺伝子改変マウスを利用し,LPS投与後の可溶型IL1-RIIの濃度を検討したところ,野生型に比較しTACE遺伝子改変マウスにおいて著明な濃度低下が認められた.TACEを欠損したマウス骨髄細胞はIL-1受容体の下流に存在するJNKのリン酸化が野生型と比べ抑制されており,このことからTACEの欠損によって細胞膜上のIL1-RIIが相対的に上昇し,IL-1シグナルが抑制されていると推測された。今回の解析でIL-1受容体のうちIL1-RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受け,またTACE欠損細胞の解析から,TACEはIL1-RIIのsheddingを介して細胞内のIL-1シグナルを正に制御していることが示された.炎症性疾患・免疫に極めて深く関与しているIL-1シグナルの調節機構を解明することは,臨床応用へのフィードバックの一助となると考える.本研究立案にあるTREM1のsheddingに関しては,生体内で観察した結果を生化学的手法にて再現できなかったため,対象遺伝子をIL1受容体に変更し,立案計画に沿って解析を続行した.IL1は炎症および感染防御において重要な機能を有するサイトカインであり,その活性は極めて高度に調節されている.

IL-1の受容体には2種(IL1-RI,IL1-RII)存在するが,IL1-RIIは細胞内領域を欠損しており,IL-1シグナルを負に調節すると考えられている.さらに,これらの受容体は細胞膜上にて蛋白質分解作用(以下,shedding)をうけ,可溶型蛋白質としても存在することが報告されている.昨年度は,各種蛋白質分解酵素阻害剤,TACE遺伝子改変マウスおよびTACE欠損細胞を用いて生化学的な評価を試みた.その結果,IL-1受容体のうちIL1-RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受け,TACEはIL1-RIIのsheddingを介して細胞内のIL1シグナルを正に制御していることが示された.本年度は,TACE遺伝子改変マウスの骨髄細胞を用いてEACS解析を行い,IL1-RIIのみがTACEにて選択的にsheddingを受けることを確証,さらにIL1-RII変異体を作成しIL1-RIIは細胞膜近傍で切断されることを確認した.またヒト細胞やTACE欠損細胞を用いてIL1シグナル解析を行った.炎症性疾患・免疫に極めて深く関与しているIL-1シグナルの調節機構を解明することは,臨床応用へのフィードバックの一助となると考える.
Paneth細胞が担う腸内環境制御とその修復による炎症性腸疾患の新規治療戦略

Paneth細胞が分泌するα-defensinが腸内細菌叢の組成を制御することに着目し、B6マウスより得た単離小腸陰窩をMatrigelで包埋した培養enteroidとmicroinjection法を用いて、共焦点レーザー顕微鏡time-lapse観察によりPaneth細胞の顆粒分泌応答を可視化し、定量法を確立した。この系を用いて、神経伝達因子およびリポポリサッカライド刺激の加わる方向(基底膜側または内腔側)によるPaneth細胞の顆粒分泌応答の選択性を明らかにした。また、一度分泌したPaneth細胞の顆粒が再形成され、さらに再形成された顆粒は第二の刺激にも分泌応答できることを示し、腸管自然免疫、共生および再生におけるPaneth細胞の重要性を明らかにした。これにより、Paneth細胞が様々な腸内環境を認識してダイナミックに機能している可能性を示した。腸内環境を構成しているLactobacillus等の常在菌および非常在菌に対するPaneth細胞の顆粒分泌応答を定量化し、分泌されたα-defensinの殺菌選択性に加えて、Paneth細胞が個々の腸内細菌を識別して分泌応答・非応答を選択することで、腸内細菌叢を制御することを示した。Paneth細胞の新たな腸内環境の恒常性維持機構を見出した。クローン病モデルSAMP1/YitFcのα-defensinについて、電気泳動法を駆使した高次構造評価およびsandwich ELISAでの定量により、病態進展に伴う質と量の両面での異常を見出した。さらに、腸内細菌叢の破綻との相関が示唆されたことから、Paneth細胞α-defensinによる腸内環境統御という視点に立った炎症性腸疾患の病態解明と治療戦略策定の重要性を確認した。本年度の研究計画すべてで進展が認められた。Paneth細胞の顆粒分泌応答評価システムを確立し、これまでできなかった様々な機能評価を行うことで、2000年最初にPaneth細胞が細菌刺激等によってα-defensinを分泌することが明らかになって以来ディベートが続いていたPaneth細胞の顆粒分泌応答性に関する大きな課題に回答を与えて、決着を付けることができた。これによって、腸内環境の恒常性維持におけるPaneth細胞の重要性を示し、さらに全く新しい機能の可能性を見出したことから当初の計画以上に進展している。本年度の計画を完遂したことから、今後は最先端の精密画像解析、独自に開発してきた生化学的および免疫学的解析を組合せて、Paneth細胞分泌応答様式を含めた分泌メカニズムを明らかにする予定である。また、細胞内Ca++動態を検証し、Paneth細胞内のシグナル伝達経路を詳細に解析する。さらに、疾患モデルおよびインフォームドコンセントを得た炎症性腸疾患患者の臨床検体を用いて、Paneth細胞形態、α-defensinの量と質、腸内細菌叢の組成から炎症性腸疾患の病因・病態解明に迫り、治療戦略を多角的に評価する。

さらに、疾患モデルおよびインフォームドコンセントを得た炎症性腸疾患患者の臨床検体を用いて、Paneth細胞形態、α-defensinの量と質、腸内細菌叢の組成から炎症性腸疾患の病因・病態解明に迫り、治療戦略を多角的に評価する。