hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白質ホメオスタシスの維持における熱ショック転写因子ＨＳＦ４の役割

本研究課題では、新規に同定されたHSF4と相互作用のある蛋白質(#7)がHSF4の転写活性制御をどのように調節しているかを検討し、HSF4-蛋白質(#7)複合体の機能を明らかにする。本研究課題の成果として、蛋白質(#7)は、HSF4のリン酸化を介した転写活性制御に関わることが示唆された。また、蛋白質(#7)は、足場蛋白質としてHSF4のキナーゼによるリン酸化制御を行っている可能性が示唆された。前年度に引き続き、本研究課題では、新規に同定されたHSF4と相互作用のある蛋白質(#7)がHSF4の翻訳後修飾と転写活性制御をどのように調節しているかを検討し、HSF4-蛋白質(#7)複合体の機能を明らかにする。また、shRNAによりSDCCAG3或いはHSF4遺伝子の発現をノックダウンしたヒトおよびマウス細胞系を用いたDNAマイクロアレイを行い、HSF4-SDCCAG3複合体により発現制御を受けている標的遺伝子を同定する。蛋白質ホメオスタシスの維持の指標としてポリグルタミン凝集体形成の実験系を用い、SDCCAG3とHSF4、同定された標的遺伝子の発現を調節することによるポリグルタミン凝集体抑制効果を検討する。さらに、同定された遺伝子の機能解析を行うことで、蛋白質ホメオスタシスに関わる新たな経路を明らかにする。SDCCAG3とHSF4を含む複合体が、この経路を制御することでコンフォメーション病の病態を改善することを細胞とマウスモデルで明らかにする。これまでの研究成果で、SDCCAG3はHSF4のリン酸化に影響を与えていることがわかり、HSF4のリン酸化部位を同定するために、リン酸化されると推定されるセリン/スレオニン残基のアラニン置換による点変異HSF4を追加作製し、HSP70プロモーターを用いたレポーターアッセイを行った。その結果、複数個所のリン酸化部位の制御が必要であることが示唆された。また、HSF4をノックダウンしたMEF細胞を用いて網羅的遺伝子発現解析を行い、HSF4の新規標的遺伝子群を同定した。今回の結果から、HSF4は正常な条件下のMEF細胞においても、多くの標的遺伝子の制御に関わっていることが示唆された。当研究成果を、第86回日本生化学会大会においてポスターで発表した。本研究課題では、新規に同定されたHSF4と相互作用のある蛋白質(#7)がHSF4の翻訳後修飾と転写活性制御をどのように調節しているかを検討し、HSF4-蛋白質(#7)複合体の機能を明らかにする。HSF4のリン酸化部位を同定するために、さまざまな領域を欠損させた変異型HSF4を作製し、HSF4のリン酸化を含む領域を絞り込んだ。更に、絞り込んだ領域内においてリン酸化されると推定されるセリン/スレオニン残基のアラニン置換による点変異HSF4を作製し、HSP70プロモーターを用いたレポーターアッセイを行った。点変異HSF4のみを発現させた細胞ではS298Aを除いてHSF4の転写活性にほとんど影響は見られなかったが、蛋白質(#7)と共発現させた細胞では、いくつかの点変異HSF4の転写活性が野生型HSF4にくらべて低くなる傾向がみられた。蛋白質(#7)はその機能が未知で、酵素活性を持つ領域は構造上存在していない。そこで、Flag標識した蛋白質(#7)をHEK293細胞に発現させ、蛋白質(#7)と共沈降したところ、4種類のキナーゼを同定した。これらの結果から、蛋白質(#7)は、HSF4のリン酸化を介した転写活性制御に関わることが示唆された。当研究成果を、第35回日本分子生物学会年会においてポスターで発表した。当初の実験計画に従って研究を遂行できている。HSF4と蛋白質(#7)の相互作用の解析については、両蛋白質が互いに結合している部位をかなり絞り込むことができた。HSF4のリン酸化部位の解析については、当初予定していた変異型HSF4はすべて作成解析を行い、これまでに報告されていない新規のHSF4リン酸化部位を同定することができた。マイクロアレイ解析については、HSF4遺伝子のノックダウンしたMEF細胞の解析が終了し、複数の標的遺伝子を同定した。以上の経過から、当研究課題はおおむね順調に進んでいるいえる。前年度に引き続き、新規に同定されたHSF4と相互作用のある蛋白質(#7)がHSF4の翻訳後修飾と転写活性制御をどのように調節しているかを検討し、HSF4-蛋白質(#7)複合体の機能を明らかにする。同時に、shRNAにより蛋白質(#7)或いはHSF4遺伝子をノックダウンしたヒトおよびマウス細胞系を用いてDNAマイクロアレイを行い、蛋白質(#7)とHSF4に共通な標的遺伝子群を同定する。

これらの遺伝子の発現ベクターを作成し、ポリグルタミン凝集体形成の抑制活性を指標とした機能スクリーニングを行う。同定された遺伝子の機能解析を行うことで、新しい蛋白質ホメオスタシスの経路について検討する。さらに、蛋白質(#7)とHSF4の複合体が、この経路を制御することでコンフォメーション病の病態を改善するかを細胞とマウスのモデルで検討する。マイクロアレイ解析消耗品費、ChIP解析消耗品費、生化学的実験用試薬・消耗品費、細胞培養用試薬・消耗品費、学会の旅費として使用する。
転移性脳腫瘍におけるWT1ワクチン療法・分子標的治療併用新規集学的治療法の開発

転移性脳腫瘍に対してWT1免疫療法を行う妥当性を、動物モデル研究、ヒト免疫反応の研究を通して、治療前後の細胞性免疫反応を中心に解析した。担脳腫瘍マウスモデルでは、脳腫瘍細胞のWT1発現を確認し、限局性であったが免疫担当細胞の集族を明らかにした。しかしながらWT1ペプチドに治療よる効果発現は軽度であった。ヒトにおいて、乳癌の転移性脳腫瘍に対し分子標的治療時の免疫担当細胞の動態解析を行った。腫瘍細胞表面抗原WT1の発現は軽度でありWT1特異的キラーT細胞の変化も軽度であった。しかしながらWT1ペプチドの投与局所皮下組織においてCD4およびCD8免疫担当細胞が集族していることを確認した。ラット脳腫瘍モデルおよびヒト脳腫瘍においてWT1ワクチン治療前後の局所での獲得性免疫動態を明らかにし、転移性脳腫瘍における抑制系および促進系免疫機序の解明とWT1ワクチン療法と分子標的療法併用集学的治療の開発を本研究の目標としている。I:Wisterラットをモデルとして用い、(i)正常ラット、および(ii)担脳腫瘍(Walker 256 carcinomaー由来)ラットを作成した。それらに対して脳組織でCD4陽性細胞、CD8陽性細胞を免疫組織学的に同定し、その集簇や時間的動態を明らかにした。コントロールとして行った正常ラット脳に対して、担脳腫瘍ラットの脳では、限局性であったが免疫担当細胞の集簇は認められ、局所獲得免疫細胞として評価した。II:ヒトにおいて、転移性脳腫瘍の外科手術による腫瘍摘出時に再手術した腫瘍組織および辺縁組織を用いて検討した。それぞれの転移性脳腫瘍組織においてWT1の発現およびCD4、CD8を免疫組織学的に同定し、その免疫担当細胞の集簇を明らかにした。すべての腫瘍細胞でWT1は発現されていたが、肺癌細胞に強く、乳癌細胞に弱い傾向があった。初年度の研究実績として、研究責任者の所属が変更したため、研究共同者の変更追加などを要し、実験系を再構築する必要があったため、時間を要し、満足のいくものではなかった。しかしながらWT1免疫治療の継続実績があり、初年度からWT1の治療に関連した英語論文2編が出版された。今までに悪性グリオーマを含めほとんどのすべての固形癌でWT-1が高発現していることを報告し、WT1癌ワクチン療法の第I/II相試験を行い十分な安全性と有効性があることを明らかにした。本研究ではラット転移性脳腫瘍モデルおよびヒト脳腫瘍においてWT1ワクチン治療前後の局所での獲得性免疫動態を明らかにし、転移性脳腫瘍における抑制系および促進系免疫機序の解明とWT1ワクチン療法と分子標的療法併用集学的治療の開発を目標としている。初年度から継続してWT1ペプチド療法の動物モデルを研究し以下の研究結果を得た。I:(i)正常ラット、および(ii)担脳腫瘍(Walker 256 carcinomaー由来)ラットを作成した。それらに対して局所獲得免疫細胞を免疫組織学的に同定した。しかしながら、動物モデルWT1ペプチド治療実験は、WT1ペプチドとしてマウスMHC class I拘束性(H-2Db)ペプチドDb126(a.a.126-134 RMFPNAPYL)(Oka et al. J Immunol, 2000)が明らかになっていることを優先し、マウス担脳腫瘍モデルを作成した。すなわち、マウスとしてC(H-2Db)57BL/6を用い、その種に合うマウス癌細胞3LLおよびB16メラノーマ細胞を用いた。その結果、正常マウス脳に対してそれらの担脳腫瘍マウスでは、ラット・Walker 256 carcinoma移植脳と同じく、限局性であったが免疫担当細胞の集族を明らかにした。またそれらの細胞はWT1を発現していることを確認した。II:ヒトにおいて、WT1ペプチドを皮内投与したのち、局所皮下組織においてCD4およびCD8免疫担当細胞が集族していることを確認した。それらはワクチン治療継続4年後でも維持されており、ワクチン治療は長期治療にも有効であることが確認できた。今後治療実験を展開する。昨年度から研究責任者の所属が変更し、実験系を再構築する必要があったため時間を要した。正常マウス脳に対してそれらの担脳腫瘍マウスでは、ラット・Walker 256 carcinoma移植脳と同じく、限局性であったが免疫担当細胞の集族を明らかにした。(1)動物モデルWT1ペプチド治療実験は、ラットから変更し、マウスとしてC(H-2Db)57BL/6を用い、正常マウスおよび担脳腫瘍(3LLおよびB16メラノーマ細胞由来)マウスを作成した。それらに対してマウスMHC class I拘束性(H-2Db)WT1ペプチドDb126(a.a.126-134 RMFPNAPYL)を投与し、その免疫反応、組織反応を検討した。

その結果、正常マウス脳に対してそれらの担脳腫瘍マウスでは、ラット・Walker 256 carcinoma移植脳と同じく、限局性であったが免疫担当細胞の集族が認められた。またそれらの細胞はWT1を発現していることを確認した。しかしながらWT1ペプチドによる効果発現は軽度であった。(2)ヒトにおいて、膠芽腫に対しWT1ペプチドを皮内投与したのち、局所皮下組織においてCD4およびCD8免疫担当細胞が集族していることを確認した。それらはワクチン治療継続4年後でも維持されており、WT1テトラマーアッセイによるWT1特異的キラーT細胞も認められた。ワクチン治療は長期治療にも有効であることが確認できた。(3)転移性脳腫瘍の外科手術による腫瘍摘出時に再手術した腫瘍組織および辺縁組織の蓄積がある。それらに対し、a)担癌患者の分子標的療法治療時、腫瘍抗原に対する免疫応答の解析を行った。すなわち、WT1特異的CTLをCD27/CCR7/CD11aの各抗細胞表面抗原抗体を用いて染色を行い、ヒトでの細胞性免疫応答の動態を把握した。今までの検討では固形癌患者で治療前すでに血中WT1特異的CTLは量的に増加しており、癌細胞表面のWT1抗原によって体内で感作されていることを証明している。そのなかで脳転移が認められた段階で、同様に免疫応答の解析、同じくWT1特異的キラーT細胞の動態解析を行ったが有意な変化は認められなかった。転移性脳腫瘍に対してWT1免疫療法を行う妥当性を、動物モデル研究、ヒト免疫反応の研究を通して、治療前後の細胞性免疫反応を中心に解析した。担脳腫瘍マウスモデルでは、脳腫瘍細胞のWT1発現を確認し、限局性であったが免疫担当細胞の集族を明らかにした。しかしながらWT1ペプチドに治療よる効果発現は軽度であった。ヒトにおいて、乳癌の転移性脳腫瘍に対し分子標的治療時の免疫担当細胞の動態解析を行った。腫瘍細胞表面抗原WT1の発現は軽度でありWT1特異的キラーT細胞の変化も軽度であった。しかしながらWT1ペプチドの投与局所皮下組織においてCD4およびCD8免疫担当細胞が集族していることを確認した。I:Wisterラットをモデルとして用い、(i)正常ラット、および(ii)担脳腫瘍(Walker 256 carcinomaー由来)ラットを作成した。それらに対して脳組織でCD4陽性細胞、CD8陽性細胞を免疫組織学的に同定し、その集簇や時間的動態を明らかにした。コントロールとして行った正常ラット脳に対して、担脳腫瘍ラットの脳では、限局性であったが免疫担当細胞の集簇は認められ、局所獲得免疫細胞として評価した。今後WT1ペプチド投与下での局所獲得免疫細胞を同定する。II:ヒトにおいて、転移性脳腫瘍の外科手術による腫瘍摘出時に再手術した腫瘍組織および辺縁組織を用いて検討した。それぞれの転移性脳腫瘍組織においてWT1の発現およびCD4、CD8を免疫組織学的に同定し、その免疫担当細胞の集簇を明らかにした。
不妊治療の終結をめぐる夫婦の意思決定支援に有用な看護アセスメントガイドの開発

長期不妊治療患者の増加が全世界的な時代の趨勢となっている.特にわが国においては,血縁重視といった文化的な背景,公には卵子提供が認められていない点などから,諸外国に比べてその増加は急激である.特に妊娠の可能性が極めて少なくなった時期に達した夫婦は様々な葛藤を抱き,揺れ動く気持ちの中で自分たちの治療の終結時期を模索している.その時間には個人差があるが,治療終結の決断は誰にとっても容易なものではなく,最終的に夫婦が納得のいく意思決定が出来るための効果的な看護介入方法の確立は喫緊の課題である.本研究は,不妊治療の終結をめぐる夫婦の意思決定支援に有用な看護アセスメントガイドの開発を目的とする.長期不妊治療患者の増加が全世界的な時代の趨勢となっている.特にわが国においては,血縁重視といった文化的な背景,公には卵子提供が認められていない点などから,諸外国に比べてその増加は急激である.特に妊娠の可能性が極めて少なくなった時期に達した夫婦は様々な葛藤を抱き,揺れ動く気持ちの中で自分たちの治療の終結時期を模索している.その時間には個人差があるが,治療終結の決断は誰にとっても容易なものではなく,最終的に夫婦が納得のいく意思決定が出来るための効果的な看護介入方法の確立は喫緊の課題である.本研究は,不妊治療の終結をめぐる夫婦の意思決定支援に有用な看護アセスメントガイドの開発を目的とする.
C型肝炎ウイルスコア蛋白質の転写制御能に関する研究

本研究では肝発がんに関わっていることが示唆されているC型肝炎ウイルス(HCV)のコア蛋白質がどのような種類の遺伝子の転写調節に関わっているかを明らかにすることを目的として、HCVに高感受性を示すヒト培養肝PH5CH8細胞にHCVのコア蛋白質を発現させ、コア蛋白質の転写調節能に関して分子生物学的手法を用いて解析し、以下に示すような結果を得た。(1)HCV感染ヒト肝PH5CH8細胞により得たHCVコア蛋白質をコードしているcDNAを基にコア蛋白質を発現するベクターを構築した。(2)コア蛋白質発現ベクターをPH5CH8細胞などに導入後、磁気ビーズ標識法を用いて発現細胞の濃縮単離システムを確立した。この方法により、コア蛋白質発現細胞の精製度を80%以上に上昇させることができた。(3)216通りのプライマーセットを用いたディファレンシャルディスプレイ法を施行し、コア蛋白質により発現量が変動する6種類の遺伝子(mRNA export protein(RAE-1)、bcl-2 associated athanogen、histone2Aおよび未知の3クローン)を得た。(4)新たに開発した定量的RT-PCR法を用いて、コア蛋白質により発現量が変動する既知遺伝子の探索を行い、IL8とMET mRNAレベルの高進が認められたが、2倍以上変動するものは得られなかった。(5)cDNA発現アレイ(1176種類の既知遺伝子)を用いて、コア蛋白質により発現量が変動する既知遺伝子を探索した結果、VEGF前駆体のmRNA量の低下が観察された。(6)各種シグナル応答配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子をつないだレポータープラスミドを用いたアッセイシステムにより、コア蛋白質はインターフェロンにより誘導される2 ́-5 ́オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターを活性化することを見い出した。現在、コア蛋白質によるこのプロモーターの活性化機構について解析中である。
ラジカル－金属錯体ハイブリッド触媒系によるアルカンからの有機金属活性種発生

本研究の目的は、豊富な炭素資源であるアルカンを原料として、抗癌剤などの高付加価値な有機分子を実践的に合成できるハイブリッド触媒系の創製である。ハイブリッド触媒系によるアルカンの炭素ー水素結合活性化を経る有機金属活性種の発生と分子合成オンデマンドへの展開を計画した。光触媒ーラジカル触媒ハイブリッドによるアルカンからの水素原子の引き抜きと、生じた炭素ラジカルの金属錯体触媒での捕捉により目的の変換を達成する。本研究では、強力な水素原子引き抜き能と迅速な炭素ラジカル捕捉能を兼ね備えたハイブリッド触媒系の創製により課題を克服する。アルカンから生成する有機金属活性種は、位置・立体化学制御をともなう選択的反応への適用が可能で、高付加価値な有機分子を合成するための有用な活性種である。本年度は、光触媒と不斉クロム錯体触媒からなるハイブリッド触媒系を見い出し、これが豊富な炭素資源であるアルケンを活性化することでキラル有機クロム種を発生させ、アルケンとアルデヒドの間での触媒的不斉アリル化反応が可能になることを見い出した。単純アルケンを用いるアルデヒドへのGrignard型の触媒的不斉付加反応は前例が無く、将来的に非常に有用な反応になる可能性を示した。特に、マグネシウム塩を添加することでアルカンから光触媒によって生成するラジカルカチオン中間体の濃度が上昇し、反応性を亢進できた。本業績は、A01公募研究の大久保教授(大阪大学)との共同研究であり、東大からプレスリリースをおこない、イギリス王立化学会や国内紙などで広く報道された。本業績は世界的に類を見ないものであり、極めて発展性が高い。当初は3年以上かかるであろうと考えていた地点に2年間で到達できたことになり、当初の計画以上に研究が進展していると評価できる。適用できるアルケンの種類の拡張と、より不活性であるアルカンを活性できるハイブリッド触媒系の開発へと研究を進める。本年度は、リガンドレス銅触媒とt-ブチルヒドロぺルオキシド、空気中の酸素の組み合わせにより、ベンジル位のsp3 C-H結合をC=O結合へと簡便に変換できることを見い出した。また、電子欠損リガンドを用いることでイリジウム触媒によるベンゼン環C-Hのホウ素化反応がオルト位選択的に進行することを見い出した。さらに、配位子を工夫することでアルデヒドと臭化アリールからケトンを合成できること、ニッケル触媒と光触媒、水素引き抜き触媒の三者混合ハイブリッド触媒系による炭化水素からの水素放出反応を見い出した。特にニッケル触媒を用いた水素放出反応は、来るべき環境調和型社会のエネルギー源供給の基盤となる可能性がある点で評価できる。元素戦略的に有利な汎用金属触媒を用いた炭化水素からの水素放出反応の開発は、将来的に水素社会の基盤となる化学触媒反応へと進展できることを示しており、特にハイブリッド触媒の強みの出た成果であると考えている。

上記の水素放出反応を実用的なレベルにまで向上させるために、機械学習を取り入れた更なる最適化を継続する。また、炭化水素を活性化して極性反応を進行させる触媒系の構築に力点を注ぐ。さらにはアルカンの活性化と反応への展開を開始する。適用できるアルケンの種類の拡張と、より不活性であるアルカンを活性できるハイブリッド触媒系の開発へと研究を進める。
液晶非線形現象の生体機能性に関する研究

液晶異常過渡光電流の発生原因を、液晶の非線形光整流効果に基づく光起電圧により説明した。光整流効果は、液晶層への入射光の差周波数効果としてとらえられる。すなわち、光起電圧効果としての内部電圧の発生につながる。これが、液晶異常過渡光電流の発生機構である。実験的にも理論的にも、非線形光学効果により異常過渡光電流の発生機構を明確にすることができた。液晶媒質内の刺激伝搬機構の解明を試みた。まず、一般的なポリイミド配向膜を有する液晶セルの電気的過渡応答減少を明確にするための4定数回路(配向膜の静電容量と誘電損失、および液晶層の静電容量と抵抗分からなる等価回路)モデルを提案し、種々の外部印加電圧波形に対する、液晶層への実効電圧を解析的に明らかにした。また、本解析法に基づき、三角波の周波数変調方式による液晶光スイッチング動作が可能であることを実験的に確認した。さらに、ラビング処理に伴う、配向膜表面の誘起電荷と液晶分子の相互作用について理論的な解析を試みた。この結果、外場の存在しない場合、配向膜表面の摩擦電荷による誘電エネルギーと液晶層の弾性エネルギーの最小条件より、液晶の誘電率異方性の正負の値のいかんに拘らず、液晶分子は平行配向を取ろうとすることを明らかにした。次に、配向膜と液晶とのアンカリングエネルギーが分子配向に与える効果を詳細に検討した。すなわち、TN構造の液晶セルのフレデリクス転移を表す一般式を導出した。また、液晶単分子膜の膜圧縮過程における層転移現象を双極子配向モデルにより理論的に説明するとともに、実験結果との対応から理論の妥当性を明らかにした。最後に、変移電流の発生機構の解析結果より、液晶材料の回転粘性係数を測定できることを実験的に明らかにした。ネマチック液晶素子の種々の電気光学効果を調べる上で(特に非線形光学効果)、本年度は下記の項目に関して理論的・実験的に明らかにした。まず第1に、液晶分子の配向に用いるポリイミド配向膜の誘電的な効果について調べた。ポリイミド配向膜の誘電損失は、液晶素子の外部から印加した種々の電圧波形に対して、電気的な過渡応答に大きな影響を与えることを、新たな4定数等価回路の提案により明らかにした。本研究成果は、通常の液晶表示素子においても、液晶層に実効的に印加される電圧波形を調べるためにも有効である。また、本研究成果の新たな発展として、配向膜の誘電損失を積極的に利用した液晶表示方式を提案した。本方式は、外部印加三角波の周波数変調により光スイッチングを行うもので、配向膜誘電体層を外部印加電圧波形の微分回路として作用させた新たな成果である。液晶層内での電荷輸送機構に関する研究成果は、液晶内の空間電荷の再分布(外部印加電圧の極性反転に伴う)過程を計算機シミュレーションにより詳細に調べ、過渡的な電流発生を明確にした。第2は、ポリイミド配向膜による液晶分子配向機構を摩擦電荷の効果を基に理論的に明らかにした。配向膜表面のラビングにより、摩擦電荷が誘起される。この表面電荷が液晶層内に作るポテンシャルと液晶分子の相互作用により分子配向を説明した。本研究成果は、従来の分子配向機構の理論とは異り、統一的に種々の分子配向状態を説明している。以上の2点が当該年度の研究実績である。本研究課題の研究を進める上で、当該年度実績に示した種々の問題を段階的に明らかにして行く必要がある。

本研究課題で得た成果を示す。1.液晶の非線形現象としての異常過渡光電流の発生原因を、電圧印加に伴う液晶弾性歪(Freedericksz転移)に基づく液晶の非線形光整流効果により明らかにした。さらに、液晶の異常過渡光電流は、生体系における外部刺激に対する閾値信号特性を有することを実験的に明らかにした。2.バルク内での刺激伝搬特性を調べる基礎研究として、ポリイミド配向膜を有する液晶セルに対する4定数回路モデルを提案し、液晶層への実効的な電気的過渡応答を解析的に明らかにした。この解析結果に基づき、三角波の周波数変調方式による、新たな液晶光スイッチング動作が可能であることを実験的に確認した。3.バルク内での液晶分子配向に対する界面の影響を調べるために、配向膜表面の摩擦電荷と液晶分子の相互作用についての理論的な解析を試み、ラピング処理により液晶分子は、外場が存在しない場合、平行配向性を示すことを明らかにした。さらに、表面アンカリング強度が液晶分子配向に与える効果を理論的に取り扱い、外場とアンカリング効果、および弾性歪との一般化トルクバランス方程式を初めて示した。4.液晶バルク内でのイオン輸送機構について検討した。バルク内でのイオンのドリフト機構を、実験的・解析的に明らかにした。また、液晶の回転粘性係数を変位電流法で測定できることを実験的に明らかにした。以上の研究成果は、本研究課題の主題である、液晶への刺激の伝搬現象を明らかにするとともに、その生体機能性を明確にするまでは至らなかった。しかし、液晶素子への外部刺激の非線形光学的な発生機構と、その刺激伝搬機構を調べるための基礎的な現象については明らかにできた。本研究課題は、その目的達成のために、さらに継続研究が必要である。
シアリルルイス-X構造の高次認識に必須なコア糖蛋白質のcDNAクローニング

シアリルルイス-X(sLe^X)構造の高次認識には、その糖鎖構造が特定コア糖蛋白質上に発現していることが必須と推定されている。しかし、その特定コア糖蛋白質としてはE-セレクチンの場合マウスのESL-1以外報告されていない。我々は、ヒトのプレB細胞性白血病細胞株を用いて、ヒトのE-セレクチンリガンド糖蛋白質の同定を試み、それをコードするcDNAをクローニングすることを目標に掲げた。セレクチンリガンド糖鎖は、いくつかの糖転移酵素によって生合成され発現する。今までは、特にFucT-VIIこそが重要なキ-ステップであると信じられて来た。しかし、我々はセレクチンリガンドの発現制御がFucT-VIIによってではなく、O-glycanのコア2と呼ばれる基本構造を合成するN-アセチルグルコサミン転移酵素(Core2GnT)によってなされていることを明らかにした。ヒトBリンパ球系細胞では、特に未熟な分化段階のB細胞性白血病細胞株にのみsialyl-Le^Xが発現していて、E-セレクチンのみに依存する細胞接着を示す。その表面膜上にあるsialyl-Le^Xは殆ど唯一の150kDaの糖蛋白質(gp150)上に発現している。このsialyl-Le^Xに対する抗体の反応性はO-結合型糖鎖の生合成をブロックすることにより消失し、またホルボールエステル処理することによって同抗体の反応性は経時的に消失した。このgp150こそがE-セレクチンの糖蛋白質性リガンドであることが、放射標識E-セレクチンがカルシウム依存性に結合することから判明した。現在、既に調製済みのセレクチン-免疫グロブリン定常領域融合蛋白質を固相化したアフィニティーカラムなどを用いて、プレーB白血病細胞株の膜画分からgp150を精製中である。
モンゴルの地域制国立公園の協働的管理と社会生態的効果：砂漠化対策への応用に向けて

モンゴルのフスタイ国立公園とその周辺地域を対象とし、拡大傾向にある開墾・作物生産の持続性、および公園管理が周辺牧民の生計に与える影響について調査研究を継続した。コムギ畑とナタネ畑について、昨年度までは土壌水分量を比較していたが、作物を含む植物の水利用可能量の観点から、今年度はマトリックポテンシャルを比較した。その結果、コムギ畑は深度によらず永久シオレ点より湿っていた一方、ナタネ畑では根圏と考えられた深度30cmより深い場所で永久シオレ点より乾燥している傾向が確認された。これより、ナタネ畑では、土壌下部への浸透がほとんどなくなるほど、上部で水が使い切られている可能性が考えられた。昨年度までに報告している通り、コムギ畑では休耕の効果により土壌水分量の回復が見られたが、ナタネ畑では一貫して低下傾向にあった。よって、現状の天水型の栽培方式では、ナタネ生産の持続性は低いと考えられた。フスタイ国立公園は、周辺牧民の牧畜生産性の向上や生計の多様化を図ることで、家畜頭数の増加を抑えたいと考えており、彼らにソフトローンや各種トレーニングを提供している。そこで、周辺牧民94名に対し聞き取り調査を行い、それらの活動実施と牧民が家畜を増加させる意欲の関係について調べた。その結果、トレーニング受講者は家畜頭数を抑制する傾向にあったものの、ローン受給者はむしろ家畜頭数を増加させる傾向にあることがわかった。また、所有家畜頭数の少ない者や若年層が、比較的家畜を増やす意欲が高いことも確認された。さらに、ローンやトレーニングはまだ地域の大半の人々に対し未実施であり、多くの人々はそれらの活動自体よく知らないという状況であった。今後、活動内容の広報やローン提供の目的に関する指導の強化、ローン使途のモニタリング、所有家畜頭数の少ない者や若年層に対する啓蒙・支援強化といった対策が必要であると考えられた。本年度は、モンゴルのフスタイ国立公園を対象とし、1.公園管理におけるステークホルダーの役割と連携体制、2.公園管理による植生回復効果、2.公園周辺で進む大規模な開墾による土壌への影響、に関する調査研究を実施した。1.では関係者への聞き取り調査を行った。公園管理を担っているNGO“フスタイ国立公園トラスト"の代表、各部門長、公園がまたがる3つの行政区との調整役であるフォーカルポイントマネジャーのほか、周辺住民も対象として、公園管理におけるガバナンス構造やゾーニングに応じた実施状況、周辺住民との協力体制などについて明らかにした。2.に関しては、1990年から2015年までの計17枚のLandsat画像を用いて、公園設置前から現在までの公園内外のエリアにおける植生変動を明らかにした。さらに、フスタイ国立公園トラストから提供されたGISデータを重ね合わせ、公園内の規制レベルが異なる複数のゾーン、公園周辺のバッファーゾーン、3つの行政区といった区域ごとに解析を進めており、1.の結果とあわせて公園管理と植生変動の関係をより詳細に調べている。3.については、まず公園周辺で開墾を行っている人々(企業を含む)に対し聞き取り調査を行い、それぞれの耕作地における作物種、栽培の手法や履歴などを明らかにし、調査対象となる耕作地を選定した。続いて、選定した耕作地および隣接する草地(対照区)において、深度別に土壌をサンプリングし、体積含水率を測定した。さらに現在、土壌水中の各種イオン濃度の分析も進めており、拡大している開墾が土壌に与える影響を詳細に調べている。公園管理に関する聞き取り調査については、管理主体であるNGOから十分な協力が得られ、順調に進めることができた。一方、公園管理による植生回復効果については、当初計画ではまずフィールドでの植生調査のため、公園内外で調査地選定を行う予定だった。しかし、上記聞き取りの結果、公園内のゾーンごとの規制の違い、バッファーゾーン内外での公園管理の違い、行政区ごとの社会経済条件の違いなどが明らかになったことから、そういったより詳細な公園管理上の違いと植生変動の関係を捉えるため、衛星画像とGISデータを用いた広域解析を時系列で行うこととした。耕作地における土壌調査に関しては、当初の予定よりも調査地選定が順調に進んだため、計画を前倒ししてサンプリングまで行うことができ、現在土壌試料の解析を進めている。このように、当初計画からの一部変更はあったものの、研究目的に照らせば発展的な変更であり、全体的には計画以上に進捗したと言うことができる。モンゴルのフスタイ国立公園及びその周辺地域を対象とし、1.拡大傾向にある開墾・作物生産の持続性について調査すると共に、2.公園管理が周辺住民の生計に与える影響について調査を行った。昨年度選定し深度別土壌サンプリングを行ったコムギ畑、ナタネ畑、及びそれぞれの耕作地と隣接する草地(対照区)において、継続調査を実施した。なお、コムギ畑については耕作期間の異なる二つのサイトを対象にしている。この地域では、灌漑はおろか資金不足のため施肥もほとんど行われていない一方で、定期的に休閑は行われている。そのため、作物生産の持続性において休閑による回復効果が重要となる。調査サイトとして今年度休閑する予定の耕作地を選定してあり、実際に休閑していたため、昨年度との比較からその効果を分析した。休閑による土壌水分量の貯水効果が最も高かったのは履歴の浅いコムギ畑であり、履歴の長いコムギ畑でも一定の貯水効果が認められた。一方、ナタネ畑では貯水効果が見られず、むしろ草地に比べて減少していた。

来年度、休閑明けの各サイトで継続的にデータを取得し、また現在進めている土壌水中の各種イオン濃度の分析もあわせることで、当該地域の作物生産の持続性をより詳細に明らかにする。公園管理が周辺住民の生計に与える影響については、周辺住民への聞き取りから、公園の支援の下、生計の多様化により経済状況を向上させている成功例が存在する一方で、生計向上への意識改革が困難で支援効果が見られない例もあり、さらに公園の管理・支援活動を認知していない人々も多い現状が明らかとなった。また、公園がまたがる三つの行政区の社会経済状況の変化について、公園管理主体であるNGOや関連団体が過去に作成した資料(モンゴル語)を複数入手することができた。現在、聞き取り結果をまとめると共に、それらの翻訳と分析を進めている。現在、当初予定していた1.フスタイ国立公園の管理におけるステークホルダー間の連携体制、2.ゾーニングによる植生回復効果、3.管理対象外の開墾拡大による土地劣化、4.公園周辺住民の生計変化、に関する調査・分析を全て実施中であり、継続モニタリングが必要な3.については初年度から取り組むことができている。よって、おおむね順調に進展していると言える。モンゴルのフスタイ国立公園及びその周辺地域を対象とし、拡大傾向にある作物生産の持続性について継続調査すると共に、公園設置前から現在までの公園内外の植生変動を、公園がまたがる3つの行政区(ソム)の外も含め、管理レベルの異なるゾーンごとに時系列衛星画像を用いて解析した。コムギ畑、ナタネ畑、及びそれぞれの耕作地と隣接する草地(対照区)において、土壌調査を実施した。その結果、コムギ畑では2016年の休閑により土壌水分量が増加し、栽培を再開した2017年でも隣接草地より高い状態が維持されていた。一方、ナタネ畑では同じく2016年に休閑したものの、その後も土壌水分量の低下傾向が確認された。昨年度報告した通り、この地域では作物生産を続ける上で休閑の効果が重要であるため、コムギに比べナタネ栽培の持続性は低い可能性があり、継続的なモニタリングが必要と考えられた。衛星画像解析では、公園内をコアゾーン、公園が牧民と協働管理を行っているバッファーゾーン、バッファーゾーン外で3つの行政区内であるソムゾーン(優先順位は落ちるが公園管理の対象内)、上記行政区外のアウターゾーン(公園管理の対象外)という4つのゾーンを設定した。結果として、ゾーン間で植生の変動傾向に顕著な差は見られなかった。コアゾーン内の植生量は比較的高かったものの、公園設置前から同じ傾向が続いていた。フスタイ国立公園はその比較的良好な自然環境状態により、絶滅したモウコノウマの再導入地として選定された場所であるため、コアゾーン内外の植生量の差は公園の管理効果によるものではなく、もともとの状態を反映していると考えられた。一方、コアゾーン以外のゾーン間でも植生量の差に変化が見られなかったことから、昨年度報告した通りまだ協働型管理の影響が局所的であり、ゾーンごとの平均値で検出できるほど広域に及んでいない可能性が考えられた。公園がまたがる三つの行政区の社会経済状況の変化について、公園管理主体であるNGOや関連団体が過去に作成した資料(モンゴル語)を複数入手し、現地の研究協力者に翻訳を依頼していたが、想定以上に時間がかかっており、まだ完了していない。
がん化学療法サバイバーが就労する「働きづらさ」の支障程度を示す枠組の開発

2年目は、計画書の倫理審査を受け、社会保険労務士への調査を開始した。2018年7月2019年1月に、研究協力者の社会保険労務士の紹介から開始するスノーボールサンプリングにより、がん患者への障害年金申請経験のある社会保険労務士8名の半構成的面接を行った。面接では、面接対象社会保険労務士の背景と属性(経験年数、専門分野、障害年金申請全体の経験数、がん患者の経験数)とがん患者の障害年金申請の特徴や困難と感じていること、そして支援した匿名化した23ケースについて、診断書、申立書、添付資料、実際の様子を聞いた。社会保険労務士8名の背景は、年齢は40代から60代、性別は男性3名、女性5名、社会保険労務士の経験年数は310年未満の中堅が6名、10名以上のベテランが2名であった。専門分野は、年金のみを専門にしている者が3名、5名は年金のほか、会社の人事労務管理や保険、成年後見、会社顧問契約の中の業務の一つとして携わっていた。障害年金支援ケース全体に占めるがん患者の割合は16割と対象者によって幅があった。「働きづらさの支障」の実態の一次分析を各自行った。次年度の研究会で、一時分析の共有、討議、指針の確認、二次分析を経て、指標案を作成する予定。1年目の文献検討の結果を9月に日本サイコオンコロジー学会で、2年目の今年度に行ったがん患者の障害年金支援支援を行う社会保険労務士の実態についての中間集計を3月にがん相談研究会年次大会で発表した。社会保険労務士調査の対象者が、スノーボールサンプリングのみで8名得られた。10名程度としていたが、ケース数が23名と予定数を得ることができた。社会保険労務士を通して、当事者にインタビューする方法が現実的ではなかったため、抗がん剤治療に伴うしびれ症状を経験したサバイバーを対象とした他の研究結果を、指標案を作成する際には、参考資料に加える。指標作成後に、臨床現場で試使用するための研究協力者を募集するため、がん化学療法看護認定看護師の集まる研究会で、本研究計画と中間発表を行い、研究協力者を集めるアナウンスをする。初年度は3つの柱で資料収集と検討を行った。1がん化学療法患者の症状と治療法については、しびれを伴う化学療法後は単純労働者よりも管理・事務職、専門・技術職等が継続していた。またしびれは治療終了1か月後には半数が仕事に支障があったが、1年後にはなくなっていた(Zanvilleら,2016)。また、日本ペインクリニック学会(2016)と日本サポーティブケア学会(2017)のガイドラインでは、しびれへの薬物治療は、ベンラファキシンの有効性を示していた(Durandら、2012;Kusら,2016)。他にもデュロキセチン、プレガバリンと牛車腎気丸等が試みられていたが、一定した効果は示されていなかった。また、生活上の工夫当のケアでは、保温や冷却、転倒や刃物使用時の注意喚起、ボタンのない服を選択するの提案のみで、就業作業とは乖離していた。2がん患者の就労継続に関する研究では、de Boer AGEMら(2015)が定量的RCTs研究の系統的レビューから、心理教育ケアと運動療法の介入は低い効果が、多職種協働の職業的介入のみに中程度の効果を報告した。またGreidanusら(2018)の質的論文のレビューから、雇用主の「支援の意向」と「支援能力」、「雇用主との効果的なコミュニケーション」が重要であり、「がん知識の向上」、「労働能力の適切な把握」の必要性を示唆した。そして、3がん化学療法患者の作業能力の評価指標に関しては、FACT-GOG-Ntx、SF36-CIPN、Tofthagenら(2011)とKautio ALら(2011)が有用とされた。就労支援時のコミュニケーション枠組みに関しては、高橋ら(2017)が、がん治療による症状で困ったときの職場での対応ヒント集、「事業場における治療と職業生活の両立支援のためのガイドライン」で企業と医療機関間で情報共有するための様式が試作されていた。資料収集と議論は予定どおり進んでいる。

障害年金支援ケース全体に占めるがん患者の割合は16割と対象者によって幅があった。「働きづらさの支障」の実態の一次分析を各自行った。次年度の研究会で、一時分析の共有、討議、指針の確認、二次分析を経て、指標案を作成する予定。1年目の文献検討の結果を9月に日本サイコオンコロジー学会で、2年目の今年度に行ったがん患者の障害年金支援支援を行う社会保険労務士の実態についての中間集計を3月にがん相談研究会年次大会で発表した。社会保険労務士調査の対象者が、スノーボールサンプリングのみで8名得られた。10名程度としていたが、ケース数が23名と予定数を得ることができた。社会労務士を対象として、実際の傷病手当申請時の内容、申請時の困難の実際の聞き取り調査を進める。この結果と、初年度の資料収集を踏まえて、評価指標の試作版を作成する。社会保険労務士を通して、当事者にインタビューする方法が現実的ではなかったため、抗がん剤治療に伴うしびれ症状を経験したサバイバーを対象とした他の研究結果を、指標案を作成する際には、参考資料に加える。指標作成後に、臨床現場で試使用するための研究協力者を募集するため、がん化学療法看護認定看護師の集まる研究会で、本研究計画と中間発表を行い、研究協力者を集めるアナウンスをする。資料収集目的の学会参加旅費予算が、学会開催地が関東近隣が多かったために旅費がかからず、残金が生じた。むしろ、次年度は地方開催が多くなるため、調査および学会参加旅費に使用する予定である。調査対象者のリクルートを、近距離在住者で行うことができ、調査のための旅費を予定より縮小して行うことができた。次年度の分析および指標作成のための研究会議、学会発表時の参加者数を増やし、積極的な議論と次期調査準備を行う。
リン酸化プロテオミクスに基づくリン酸化神経病態学の確立

成長円錐のリン酸化プロテオミクスに基づいて得られたリン酸化特異的部位に関する抗体を作って以下の解析を行った。すなわち、軸索成長・成長円錐の古典的分子マーカーであるGAP-43の2種類のリン酸化特異抗体はいずれも培養成長円錐および伸長軸索を発生・再生のそれぞれにおいて強く認識した。また同定した活性型リン酸化酵素と局在も同じであった。これらに対するリン酸化不活性化マウスの作製に成功したが、このうち1つは明らかに培養系で定量したところ、神経成長の異常が認められ、軸索の長さが短く、分岐も異常であった。同様に軸索成長に深くかかわっているMAP1Bの新規リン酸化抗体2種類を作成して同様の免疫染色を行ったところ、やはり発生時期の軸索を強く認識した。また軸索成長に関する再生可能なマウスとして、CSGalNAcT1欠損(T1ーKO)マウスの作製に成功した。このマウスは完全に表現型として脊髄損傷時に歩行を回復し、軸索が損傷部よりも尾側に伸長していた。このマウスでの伸長軸索はいずれもGAP-43リン酸化特異抗体で強く認識された。このマウスではT1の産物であるコンドロイチン硫酸(CS)の30%程度の賛成現象があり、損傷部位は縮小していたが、それ以外に神経成長を促進するヘパラン硫酸(HS)合成酵素群の強い誘導があり、HS合成は20倍以上に上昇した。またHSを分解すると軸索再生は野生型と同じレベルに低下した。この結果は、CS/HSバランスがリン酸化酵素を活性化して最適な軸索内のリン酸化環境を保持することを意味すると解釈された。25年度が最終年度であるため、記入しない。1.リン酸化抗体の作成:神経成長、及び神経変性に直結するのは微小管であるため、微小管関連分子のリン酸化抗体を、リン酸化プロテオミクスに基づいて頻度の高い者から作成を行った。このうち、MAP1Bは微小管を安定化させる因子であるが、MAP1Bのリン酸化抗体数種のうち、2種類が明確な抗原特異性を示し、組織化学的解析も可能であった。さらにそのうちの1つは、これまで報告がない部位であり、マウス成熟脳のリン酸化プロテオミクスに関するデータベースにも掲載されていないため、神経成長に特異的であることが示唆された。確かに成長期の神経繊維が強く認識された。2. GAP-43リン酸化の解析とリン酸化酵素同定:インフォマティクスを駆使し、リン酸化の酵素を割り出した。すなわち、リン酸化部位の特性からMAPK系の酵素でのリン酸化が推定され、阻害剤と分子種局在からリン酸化酵素がjnkを主体するものであることを推定した。また末梢神経再生のみならず、報告者が作成したコンドロイチン硫酸合成酵素欠損マウスで生ずる脊髄損傷からの回復時に、当該のリン酸化が再生繊維を特異的に認識することを証明した。これによって、これらのリン酸化酵素特異抗体は、神経の成長と再生を認識できることが明らかとなった。3.神経細胞の形態形成に関与する遺伝子のトランスジェニックマウス(TG)作成:神経細胞の形態形成に関係することを見出したM6aの遺伝子のTG作成に、着手した。これは同タンパク質のヒトSNPがヒト精神疾患の中間表現型に関係することを見出したためである。既にヒト型遺伝子TGのF0作出をジェノタイピングによって確認した。軸索再生に関する研究では、コンドロイチン硫酸合成酵素の遺伝子改変マウスの脊髄損傷モデルで、既に論文投稿に到達している。一方、GAP-43のリン酸化についてもリン酸化キナーゼの同定に成功し、戦略的に大変多くのリン酸化データに適応できる方法論を確立した。

新規のリン酸化抗体作成については、まだ次年度にも継続する予定であるが、作成したリン酸化抗体の意義の検討について、一定の方法論を確立したので、それに基づいて先に進めることにする。トランスジェニックマウス、リン酸化不活性化ノックインマウスの作成についても、今年度の結果については予定通りに進んでいる。試行錯誤のプロセスがあったが、24年度に大体の状況が把握できたので、今年度はリン酸化プロテオミクスによるリン酸化特異抗体の作成とその応用を効率化して研究を進める。またヒト病理組織標本への応用は、現在専門家と打ち合わせてどのような疾患に適応するのが効率的な検出につながるか、見当を進めているが、間もなく試行データの結論が出るため、25年度中に解析が進められる予定である。トランスジェニックマウスも25年度上半期に活用可能となる予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
セラミド増加作用に着目した造影剤腎障害の回避策の確立と造影剤腎症評価系の臨床応用

【研究目的】ヨード造影剤は造影剤腎症と呼ばれる急性の腎障害を高頻度で引き起こすが、造影剤腎症に対する有効な予防策は未だに確立していない。本研究では、造影剤の腎細胞セラミド増加作用に着目し、in vitroならびにin vivo評価系を用いて、発現機序に基づく造影剤腎症の回避策について検討した。【研究方法】in vitro評価系は培養腎尿細管細胞(LLC-PK1)を使用し、細胞生存率はWST-8法にて検討した。造影剤の浸透圧は、浸透圧計にて測定した。in vivo評価系はマウスを使用し、造影剤を静脈内投与後24時間の尿中N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG)活性を腎細胞障害の指標とした。細胞内セラミド含量は、特異的な抗体を用いて免疫染色法により評価した。【研究成果】各種非イオン性造影剤(100mgI/mL)の浸透圧は、イオジキサノール(IDX,305mOsm/kg)およびイオトロラン(ITL,304mOsm/kg)において同様に低かったが、ITL(25-100mgI/mL)処置群では濃度依存的なLLC-PK1細胞障害が認められた一方で、IDX群に顕著な障害は認められなかった。マウス尿中NAG活性は、ITL(1-4gI/kg)投与により濃度依存的に上昇したが、IDX投与では影響されなかった。ITL処置により、in vitroおよびin vivo評価系において、抗セラミド抗体陽性細胞が顕著に増加したが、IDX群では認められなかった。ITLによる腎細胞障害は、セラミド合成阻害剤のfumonisin B1およびL-cycloserineにより保護された。以上の結果から、造影剤による腎細胞障害は、浸透圧ではなく、セラミド増加作用に起因することが示唆された。加えて、セラミド合成阻害剤が造影剤腎症の発現を顕著に抑制することが明らかとなった。
裂手裂足症およびその類縁疾患を招く遺伝学的機序の解明

本研究では、裂手裂足症およびその類縁疾患における疾患成立機序の解明、遺伝カウンセリングの向上に貢献することを目的とした。成果として、BHLHA9遺伝子を含むduplication/triplicationは、四肢・指趾形成不全を招く量効果を有する強い感受性因子であることが解明された。日本人創始者duplicationsがFoSTeS/MMBIRで生じ、染色体間/姉妹染色分体間の組換えによりtriplicationや重複領域内のゲノム構造の多様性を獲得していると考えられた。表現度の多様性、浸透率の不完全性には複数の因子が関与することが判明した。本年度における主たる成果は以下の通りである。集積された全51家系のアレイCGH解析、重複融合点のシークエンス解析、およびqPCR解析を終了した。151家系中27家系において、17p13.3領域のBHLHA9を含む同一融合点を有する210,050 bpの2コピーあるいは3コピーのタンデム重複を同定した。このコピー数増加は、四肢形成不全を有する27家系中の患者42例全例のみならず、一見正常表現型の家族47例中22例においても同定された。特に、両親が共に正常表現型のときには、必ず両親のいずれかが保因者であった。さらに、一般集団1000名中2名において同定された(発端者対一般集団、P=3.5×10-37)。重複領域内のハプロタイプパターンは多様で、重複融合点のゲノム構造に相同性はなく、1つの融合点周辺は複製異常を生じやすい構造に富んでいた。罹患患者において、指趾異常は手に多く(P=6.2×10-9)、長管骨の異常は下肢に多く(P=4.1×10-5)かつ3コピーのタンデム重複患者に多かった(P=0.047)。マウスBhlha9は、胎児期の肢芽において明瞭に発現していた。これらの結果は、BHLHA9遺伝子重複が量効果を有する種々の四肢形成不全の顕著な感受性因子であることを示す世界初のデータである。複製期のエラーで生じた日本人創始者重複が、その後の組み換えを介してコピー数増加やハプロタイプパターンの多様性を獲得しながら保因者を介して広く分布し、特定の遺伝的背景を有する個体において四肢形成不全発症を招いていると推測される。本年度における主たる成果は、次のとおりである。前年度に、51家系中27家系において、17p13.3領域のBHLHA9を含む同一融合点を有する210,050bpの2コピーもしくは3コピーの重複を同定した。このBHLHA9遺伝子の変異解析を行ったが有意な変異は同定されなかった。その他の原因遺伝子の解析を行い、3例においてWNT10B遺伝子の変異が同定された。Modifier遺伝子の解析を行ったが、これについても今のところ有意な変異が同定されず、現在も解析中である。集積したすべての家系の解析、BHLHA9の指趾形成における役割の検討については、ほぼ予定通りに進展している。Modifierの解析については、現在も解析中である。裂手裂足症は、出生2万人当たり1人程度の発症率で認められる先天性四肢末端形成異常であり、中央列(第2-4指・趾)欠損によるV字形の裂隙形成を特徴とする。現在までに、少数の患者においてTP63およびWNT10B遺伝子変異や染色体コピー数異常が同定されているが、多くの患者において発症原因は不明である。これに関し、われわれは、現在までに集積した52家系中25家系の裂手裂足症およびその関連疾患を有する患者・家族の解析を終了し、12家系において染色体17p13領域における約200 kbの同一の重複を見出し、さらに、この重複上のBHLHA9が責任遺伝子であるというデータを得ている。本研究では、この先行研究を推進し、裂手裂足症およびその類縁疾患における疾患成立機序の解明、新規治療法の開発、遺伝カウンセリングの向上に貢献すると共に、日本人創始者効果として形成されたと推測される17p13重複の形成機序や伝搬様式の解明を目指す。最終年度は、Modifierの同定について、重複していない染色体上のBHLHA9が関与する可能性をBHLHA9発現量解析、プロモーター領域の構造解析およびエクソン領域のtag-SNPを用いた関連解析により、全く別の因子が関与する可能性を重複陽性の罹患患者、非罹患保因者、健常者を用いたゲノムワイド関連解析およびエクソーム解析により検討し、さらに、重複内のマイクロサテライト解析およびBHLHA9周辺のtag-SNP解析をもとに検討した。解析した結果、modifierについては同定されなかった。以上の結果からmodifierは環境因子を含め複数存在すると考えられた。以下の成果が挙げられていることによる。(1)BHLHA9遺伝子重複が量効果を有する種々の四肢形成不全の顕著な感受性因子であることを示す世界初の成果である。

(2)複製期のエラーで生じた日本人創始者重複が、その後の組み換えを介してコピー数増加やハプロタイプパターンの多様性を獲得しながら保因者を介して広く分布し、特定の遺伝的背景を有する個体において四肢形成不全発症を招いていると推測される。Modifierの解析を中心に、BHLHA9遺伝子に関する裂手裂足症についてさらなる解析を進める予定である。臨床遺伝学今後は以下を重視して行い、裂手裂足症およびその類縁疾患における疾患成立機序の解明を目指す。(1)BHLHA9の指趾形成における役割の検討のため、メダカを用いたモルフォリーノノックダウン解析を行い、ヒトの指趾に該当するヒレの形態変化を観察する。(2)重複陽性罹患患者、重複陽性保因者、健常者において、ゲノム関連解析を行い、Modifierの同定を目指す。研究代表者が平成26年度に産前産後休暇および育児休暇を取得し、計画に遅延が生じたため。平成26年度に予想していた研究成果はほぼ計画通り十分得られたが、代表者は、平成26年度の4月1日から6月30日まで、産後休暇と育児休暇を取得したため、BHLHA9の指趾形成における役割の検討におけるメダカのモルフォリーノノックダウン解析実験およびModifierの同定におけるtag-SNP関連解析においては十分な実験をすることができなかったことが考えられる。本年度は、遅延が生じたModifierの解析のために主に助成金を使用する予定である。本年度において、モルフォリーノノックダウン解析実験およびtag-SNP関連解析を重点的に行う予定である。さらに、今回の研究成果で得られた知見に基づいて、全国よりさらなる検体が集積されている。その検体においても、アレイCGH解析、遺伝子変異解析を精力的に行う予定である。