hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コムギにおける低温要求性と凍結耐性の適応的連鎖関係の解析

秋播き性パンコムギは出穂の低温要求性を決める遺伝子座であるVrn-1について全て劣性アリルを持ち、春播き性パンコムギはVrn-1について優性のアリルを持つ。また特に劣性のvrn-A1アリルを持つ系統は優性のVrn-A1アリルを持っ系統よりも冬期の凍結低温耐性に優れているとされる。低温凍結耐性を決める主働遺伝子Fr-1はVrn-1に連鎖して座乗する。この生育環境に対応した2つの遺伝子座(Vrn-1とFr-1)のアリル間に連鎖関係があるのか、あるとしてパンコムギの持つ3つのゲノムA,B,D全てにおいて言えるか、祖先野生種ではどうか、Vrn-1とFr-1がどの程度コムギの適応に重要なのか、これらに答えることが本研究の目的であり、本年度は特にFr-1の機能についての解析を行った。Fr-1が制御するFr-2座に座乗し転写因子をコードするWCBF2遺伝子について、これを恒常的に発現させた形質転換タバコを用いて凍結耐性発揮への直接的証明を行い下流のCor/Lea遺伝子のいくつかの転写を直接活性化することを明らかにすると共に、WCBF2がDゲノム特異的コピーであり他のCBF転写因子遺伝子と異なり進化的に中立であることを明らかにした。同様にFr-1に制御される転写因子WDREB2やWLIP19についてもそのス下レス耐性への関与と下流のCor/Lea遺伝子発現の活性化を示した。一方でWLIP19に相同性のあるWABI5についてはストレス耐性への関与と下流のCor/Lea遺伝子発現の活性化は示されたが、Fr-1とは独立に機能していると考えられた。この他にもミトコンドリアで活性酸素消去に関与するAOX遺伝子が凍結耐性に関与し品種間差異に貢献していることを示した。このFr-1とABAとの関係については総説にまとめ、Vrn-1の変異についてもコムギの栽培化と品種分化の観点から和文の論文にまとめた。秋播性パンコムギ系統は出穂の低温要求性を決める遺伝子座であるVrn-1について全て劣性アリルを持ち、春播性パンコムギ系統はVrn-1について優性アリルを持つ。また特に劣性のvrn-A1アリルを持つ系統は優性のVrn-A1アリルを持つ系統よりも冬季の凍結低温耐性に優れているとされる。この生育環境に対応した2つの遺伝子座(Vrn-1とFr-1)のアリル間に連鎖関係があるのか、あるとしてパンコムギの持つ3つのゲノムA,B,D全てにおいていえるか、祖先野生種ではどうか、これらの問題に答えることが本研究課題の目的である。今年度、まず凍結耐性能の異なる秋播性パンコムギ品種Mironovskaya 808と春播性品種Chinese Springを用いて、凍結耐性能の違いと低温誘導性遺伝子群およびその転写因子をコードする遺伝子の環境ストレスに対する遺伝子発現応答パターンの比較解析を行った。その結果、凍結耐性能に優れた秋播性品種の方で遺伝子発現応答が速く、発現量も多いことがわかった(Kume et al.2005;Egawa et al.2006)。次に、特にDゲノムの連鎖関係を明らかにするために、日本の在来品種を用いて出穂特性および低温凍結耐性能を比較調査した。在来品種の出穂開花特性は概ね播き性の指数に一致したが、4系統について詳しくVrn-1座の低温条件下における遺伝子発現パターンを調べたところ、Vrn-A1,Vrn-B1,Vrn-D1いずれの遺伝子座においても多様性を示した(未発表データ)。すでに報告されているようにパンコムギの栽培品種ではVrn-1遺伝子座のプロモーター領域と第1イントロン領域に大きな変異が蓄積されている。この遺伝子における変異を評価するため、同じく大きなイントロン配列を有するホメオボックス遺伝子Wknox1の3ゲノム間の構造と機能を比較したところ、変異の蓄積は見られるものの機能が保存的であるように選択がかかっていた(Morimoto et al.2005)。秋播き性パンコムギ系統は出穂の低温要求性を決める遺伝子座であるVrn-1について全て劣性アリルを持ち、春播き性パンコムギ系統はVrn-1について優性のアリルを持つ。また特に劣性のvrn-A1アリルを持つ系統は優性のVrn-A1アリルを持つ系統よりも冬期の凍結低温耐性に優れているとされる。この生育環境に対応した2つの遺伝子座(Vrn-1とFr-1)のアリル間に連鎖関係があるのか、あるとしてパンコムギの持つ3つのゲノムA、B、D全てにおいて言えるか、祖先野生種ではどうか、Vrn-1とFr-1がどの程度コムギの適応に重要なのか、これらの問題に答えることが本研究の目的である。本年度はまずWdreb2転写因子遺伝子(Egawa et al. 2006)などが、パンコムギのABA感受性変異系統で遺伝子発現レベルにある程度の変動を見せたが、これらのABA感受性の変異系統が示す凍結耐性レベルの変化を説明できるものではなかったことを明らかにした(Kobayashi et al. 2006; Kobayashi et al. 2007)。

また、ミトコンドリアのオルタナティブ経路を司るAOX遺伝子Waoxlaを高発現させたシロイヌナズナが低温条件下で活性酸素の発生を抑制することを見いだし、オルタナティブ経路の低温凍結耐性における一定の役割を明らかにした(Sugie et al. 2006 Sugie et al. 2007)。日本等の東アジアのパンコムギ在来品種はVrn-D1を持つことで春播き性を獲得していることが知られているが、この優性のVrn-D1アリルを持つパンコムギ品種の凍結耐性のレベルは多様性に富んでおり、Aゲノムにおいて観察されたVrn-A1とFr-A1のアリルの関係がDゲノムにおいては認められないことが明らかとなった(Ishibashi et al. 2007)。また、Vrn-1遺伝子のそれぞれの同祖遺伝子における発現パターンの多様性が認められた。以上のことからVrn-1とFr-1のアリル間に連鎖関係はAゲノムにおいては認められるが、Dゲノムにおいては必ずしも認められないことが明らかになった。Vrn-1とFr-1の環境適応に対する貢献は、A、B、Dゲノム間で等しいわけではなく、ABA応答性経路やミトコンドリアの呼吸経路の調節等の他の環境ストレスへの応答機構と補い合いながら、パンコムギの低温凍結環境への適応性を決めていることが示唆される。このような適応機構の祖先野生種における多様性を明らかにするために、Dゲノムの提供親であるタルホコムギからVrn-D1遺伝子と日長感応性を決定するPpd-D1遺伝子座のゲノム構造を決定し、いくつかの系統について比較解析を行うと共に、遺伝子発現パターンを解析した(unpublished results)。秋播き性パンコムギは出穂の低温要求性を決める遺伝子座であるVrn-1について全て劣性アリルを持ち、春播き性パンコムギはVrn-1について優性のアリルを持つ。また特に劣性のvrn-A1アリルを持つ系統は優性のVrn-A1アリルを持っ系統よりも冬期の凍結低温耐性に優れているとされる。低温凍結耐性を決める主働遺伝子Fr-1はVrn-1に連鎖して座乗する。この生育環境に対応した2つの遺伝子座(Vrn-1とFr-1)のアリル間に連鎖関係があるのか、あるとしてパンコムギの持つ3つのゲノムA,B,D全てにおいて言えるか、祖先野生種ではどうか、Vrn-1とFr-1がどの程度コムギの適応に重要なのか、これらに答えることが本研究の目的であり、本年度は特にFr-1の機能についての解析を行った。Fr-1が制御するFr-2座に座乗し転写因子をコードするWCBF2遺伝子について、これを恒常的に発現させた形質転換タバコを用いて凍結耐性発揮への直接的証明を行い下流のCor/Lea遺伝子のいくつかの転写を直接活性化することを明らかにすると共に、WCBF2がDゲノム特異的コピーであり他のCBF転写因子遺伝子と異なり進化的に中立であることを明らかにした。同様にFr-1に制御される転写因子WDREB2やWLIP19についてもそのス下レス耐性への関与と下流のCor/Lea遺伝子発現の活性化を示した。一方でWLIP19に相同性のあるWABI5についてはストレス耐性への関与と下流のCor/Lea遺伝子発現の活性化は示されたが、Fr-1とは独立に機能していると考えられた。この他にもミトコンドリアで活性酸素消去に関与するAOX遺伝子が凍結耐性に関与し品種間差異に貢献していることを示した。このFr-1とABAとの関係については総説にまとめ、Vrn-1の変異についてもコムギの栽培化と品種分化の観点から和文の論文にまとめた。
身体的な活動の教育効果の評価とそれを用いた授業設計支援とアセスメント支援環境

大学生の身体的な活動の教育効果を明らかにするために、シーカヤックを使った授業と冒険教育の一つであるプロジェクトアドベンチャー(以下、PA)を取り入れた授業や取組を引き続き調査しつつ、その授業に参加した学生の追跡調査を行い教育効果の継続性を確認した。シーカヤックやPAは、その取組内容によっては、学生が巧まずして協同性を育む可能性を示すことができた。シーカヤックでは、流れの速い場所において、仲間との動作が自然にシンクロし、励まし合ったりする様子が観察できた。PAでも特に10m以上の高さで行う取組において、互いの協力がないと乗り越えられない状況が、協同性を育むことが示唆できた。さらに今年度は、合理的配慮が必要な学生が参加し、困難を乗り越えることの大切さをその学生から学び、挑戦する様子も確認できた。追跡調査においても、協力しあった仲間との関係性が継続していることがわかり、半年後の教育効果の継続を確認できた。このことから、仲間作りとしての有用性があると考えている。どの様な授業設計が良いか、教育効果を測定するにはどの様な指標を使えば良いかも併せて検討した。授業改善については、改善を支援をした期間、支援をしない期間の学生の状況を確認するために学習ポートフォリオを分析した。その結果、授業担当者がワークシートを本来の目的や種子を理解できず簡略化していた。そのため目標設定と振り返りが適切に行えず、学生によっては目標設定した内容と関係のない振り返りを行っていた。また学生に確認すると、教員の説明が不明瞭だったためワークシートを適切なタイミングで記入できなかったと言っていた。このことから2018年度は、事前学修において、丁寧な仲間作り、ワークシートの使い方やその意義、この授業で学ぶべきことを担当教員が説明できるように支援し、その結果、学生のワークシートの記述内容の質が向上し、記入漏れも減った。調査を実施するにあたり、調査対象の授業設計を改善することから始めた。特に、調査票を使った調査やインタビュー調査を極力行わなくて済むように、授業中に使うワークシートをあらたに作成し、学生の学修成果を可視化できるようにした。ワークシートは、授業全体の目標設定と振り返り、個々のワークに関しての目標設定と振り返りが行えるようになっている。また、それぞれ学生同士でコメントしあう仕組を取入れた。特に、社会人基礎力については、事前ワークで学生に各項目について検討し、自分の強みと弱みを意識させた上で、目標設定を行わせ、事後のワークでその振り返りを行うようになっている。授業終了後に事前事後のアンケートやワークシートをまとめた学習ポートフォリオの分析を行い、学生が自分の強みや弱みを意識しながら活動していることを確認できている。これに加えて、AAC&Uのバリュールーブリックのうちチームワークのルーブリックを使い、教員3名でパフォーマンス評価を試み、その教育効果も確認できている。教員から見た評価では、建設的なチームの雰囲気の醸成やチームの話し合いへの貢献において、成長の確認ができた。これは、あまり経験したことがない自然体験型の教育プログラムの提供(シーカヤックをつかったグループワーク)が豊かな学習経験になったと考えている。大学でのアクティブ・ラーニングを円滑に実施するために、高大接続の一貫として身体的な活動を含むアクティブ・ラーニング型授業を試行した。ここでは、仲間づくりワーク、アイディアの出し方等ついて、授業(4コマ×90分)を実施した。ここでは仲間づくりワークについて、事前事後に生徒に調査票を記入してもらった。その結果、「時間の他者との共有等の項目に有意差があった。また、高校側からは、日頃の生徒とは違う様子を見て、その効果を実感する声があった。他大学の事例調査については、Web上の資料を調査するにとどめた。現地調査については、調査できる時期等の兼ね合いもあり、今年度は断念した。そこで、創価大学の事例と岡山理科大学の事例調査を前倒して実施した。当初は、教育効果を測定するため、eポートフォリオを使うことを想定していたが、野外での活動のため、日々の入力が困難なため、どこででも記入できるようにワークシートを使ったポートフォリオの作成に切替えて実施した。また、クリッカーを野外に持ち出し、その都度、状況を確認することも計画していたが、予想以上に、ワークに集中する必要があることがわかり、今回は断念した。調査については、質問紙やワークシートを多用することで、その教育効果の測定が実施できた。しかしながら、研究倫理上の配慮もあり、成績との対応を行うことができなかった。当初は想定していなかったが、アクティブ・ラーニングを苦手とする学生の存在に気づき、高大接続の観点も意識して、プロジェクトアドベンチャーについては、高校での事例を調査した。これについても同様に、教育効果の測定を行うことができた。このように、状況にあわせて、研究方法を見直し、研究を進展させることができた。これまでの知見を踏まえて、分担者の大学において、プロジェクトアドベンチャーを活用した高大連携による入学前プログラムの開発と入学時の研修プログラムを開発した。この2つの取り組みについて、教育効果を測定するとともに、他の教員の見学も促し、その効果を複数の教員の視点から確認することができた。これら一連の調査や研究により、「目的1:身体活動を伴う研修の事例調査とその教育効果の評価」を達成することができた。また、これらのプログラムの開発に際して、授業設計を行うための基本的な研究も完了することができた。アクティブ・ラーニングへの適応状況を確認するために、分担者の大学において、精神的回復力尺度(レジリエンス)と協同作業認識尺度を使って調査を実施した。

その結果、アクティブ・ラーニングに適応できない可能性のある学生の存在を確認することができた。また、授業見学も実施したところ、発達障害が懸念される学生やグループでの活動に困難を伴う学生の様子も観察することができた。シーカヤックを用いた取り組みの調査においては、教員が行うパフォーマンス評価、調査票による事前・事後での調査結果、学生が作成した学習ポートフォリオから、チームワークの向上、社会人基礎力の向上など、学生の教育効果を確認できた。半年後に、追跡調査を実施し、学生へのインタビューやアンケート調査から教育効果の持続についても確認することができた。この研究により、教育効果を持続させる要因の一部が判明したと考えている。ICTの活用した、身体的な活動の記録を行う仕組が構築できなかった。これ以外には、順調に研究を進めることができた。本研究では、プロジェクト・アドベンチャー(以下、PAという)とシーカヤックを用いた活動を対比しながら調査を進めている。本年度は、PAを活用した初年次教育の教育効果について検討するために、ある地方私立大で実施している入学時に行う新入生オリエンテーションを対象に調査した。その結果、事前と事後に調査票を用いて調査した結果、成長しようとする意識の向上、仲間を支えようとする意識、主体性の向上の項目が優位に向上していることを確認できた。また参加学生の98%が期待以上に楽しかった、期待通りに楽しかった、と答えている。さらに教員と学生間の距離が縮まったこと、友人を作るきっかけになったこと、友人と協力することの大切さを学生は感じていた。なお、パニック障害のある男子学生1名、身体的な接触が苦手な女子学生1名が参加していたが、困難な取組みにも果敢に挑戦する姿勢を確認できた。挑戦できないワークについてはグループの応援をすることでグループに貢献していた。教育効果の継続性について検討するため、半年後、教員やTA/SAへのインタビュー調査、参加学生への調査も実施した。その内容から教育効果の継続性を確認できている。PAのような活動の場合、目標設定とふりかえりを行わせないと、単に楽しかったというだけで終わってしまうため、学生に強みと弱みを認識させ、活動を行わせるためのワークシートの開発をおこなってきた。プロジェクトアドベンチャー用とカヤックを活用した活動の2種類をこれまでの調査を踏まえ、開発を終えることができたと考えている。ワークシートの種類は20種類以上にのぼり、まとめることで学習ポートフォリオを作成できる。その他、アクティブ・ラーニング型授業での実践(反転授業)を通して、アクティブラーニングを苦手とする学生の状況を確認し、そのことを研究に反映できるように準備を行うことができた。今年度は、プロジェクトアドベンチャーを対象に調査を行うとともに、その授業で活用することができるワークシートを開発し、試用してもらうことができた。このワークシートの分析が十分に行うことができていないのが課題である。
アイヌ民族文化の形成過程の解明に向けた総合的研究

本研究では、アイヌの集団的・文化的形成過程において海洋狩猟民文化の強い影響が社会文化伝統にも、集団的にも、存在したことを示唆する豊富な資料を提供することができた。浜中2遺跡の調査では、海獣儀礼の伝統が先行する先史文化から連続して継承、発展されアイヌ文化の中へ取り込まれていくことが考古学的に提示された。集団的な系統性については、先行研究で示唆されていたオホーツク文化の関与を補強する資料を得ることができた。提示されたアイヌ民族の集団形成性の複雑さは、集団のアイデンティティの形成過程や変遷についても、社会・経済・政治的文脈での検討の必要性を示唆している。今後も得られた資料の調査研究を進めていく。研究初年度の2012年度は、研究経費の配分が年度後半となり、実質的に11月から3月までしか研究実施期間がなかったため、研究計画の中心に位置づけたフィールド調査が実施できなかった。よって当初設定した研究計画の中でも、1既存の出土資料の分析作業と、2民族文化形成過程に関する考古理論からの検討、3共同研究会を開催し、これまでの研究課題の整理と、二年度目以降の具体的な研究項目の参加研究者間での調整と意見交換をおこなった。1の研究項目では、2011年度の礼文島での我々の調査グループによる調査において出土した家畜動物であるイヌとブタの計測データの取得と動物考古学的検討を行うとともに、古代DNAサンプルの抽出度行い、アイヌ文化形成に集団的、文化的に大きく関与していると想定されるオホーツク文化における家畜動物の系統性と動物地理学的基礎データの蓄積を図った。2の項目としては、ヨーロッパ考古学における民族形成、集団移動に関する事例研究に関する文献を系統的に収集し、またオックスフォード大学やアバディーン大学を訪問して、研究者との協議を重ねながら、中世温暖期以降の民族形成の世界的動向の中でアイヌ民族文化の形成過程を比較考古学的に議論する可能性について意見交換と共同研究の将来的報告性の検討をおこなった。3の研究会においては、すでに採取済みである礼文島北部に位置する久種湖の湖底堆積物の分析成果について、年代的側面からの報告があり、礼文島において更新世終末期から連続した気候環境変動の基礎的データが収集できる見通しが報告された。また出土先史人骨から推定される生活誌復元や古代DNA分析の予備的成果の報告が行われ、集団形成についての生物人類学(考古学)的課題についての意見交換をおこなっている。また研究成果の一般市民向けの公開の手法として市民講座との連携を図るパブリック考古学的手法の事業計画が報告された。平成25年度は以下の項目について研究活動を実施した。(1)夏季に礼文島において濃くフィールドスクールをかねた考古学調査を実施した。この調査の結果、浜中2遺跡は、3メートルを超える魚骨層が堆積する多層遺跡であり、上層には近世アイヌ文化期のアワビを主体とする貝層やトドなどを送った動物儀礼の痕跡が残されていることが明らかとなった。またオホーツク文化期の魚骨層は投棄単位をずらしつつも、オホーツク文化終末期の元地式段階から順次、沈線文期、刻文期まで層位的に堆積していることが明らかとなった。オホーツク文化期の前半期に十和田式段階の生活面は、それ以降のほかのオホーツク文化期とは様相がことなり、海獣骨を主体とするボーンベット状の骨集中の様相を呈しており、これに集石土坑がともなう生活面で構成されていることが明らかとなっている。(2)オホーツク文化期の魚骨層からは、数多くの家畜動物遺体であるイヌとブタが出土した。これらについては、研究分担者により動物考古学的な視点からの形態計測を行い、その後、古代DNA分析をおこなっている。(3)オホーツク文化期の魚骨層中で発見されたオホーツク文化の埋葬事例については、良好な状態で人骨が残されていたことから、2体の時期の異なる遺体についてmtDNAの分析をおこない、とりわけ2号人骨のDNAの残りが良いことが確認されたため、ゲノム解析をおこなうべく分担者らによる解析処理作業がおこなわれている。平成26年度は以下の研究項目にそって研究活動を実施した。(1)礼文島における考古学調査:オホーツク文化前半期(刻文期)のクジラの送り場遺構を確認することができた。その下層に位置する続縄文文化期の文化層では、二枚の生活面を確認している。それぞれ石囲い炉を中心に石器製作址やクジラやイヌの遺存体の集中区が確認されている。またさらに下層に縄文文化後期の生活面を新たに確認することができた。これによって浜中2遺跡では縄文文化から近世アイヌ期にいたる長期的な人類の居住活動が4mを超える堆積層中に豊富な動物遺存体や墓をふくめて残されていることを確認することができた。(2)出土した人骨資料の分析:出土した人骨資料については、2013年に出土したオホーツク文化期終末期の2号人骨について年代測定を行うとともに、病理学的見地からの検討を実施している。これによって単に出土人骨から先史時代の人類の形質的特徴や年代を知るのみではなく、生前の生活の復元に迫る生活誌の検討という領域の開拓を図った。(3)出土人骨の古代DNAの解析:出土した人骨資料が良好な保存状態であることが判明したため、ゲノム解析をおこなうべく下処理を実施した。詳細な解析結果はまだ得られていないが、研究費の一定額を分析にまわし、分析結果の提示をおこなうべく取り組んでいる。(4)研究成果のパブリック考古学の手法を生かした地元への還元:礼文町の資料館施設を地元教育委員会の協力を得て利用し、発掘速報展を実施した。

また北海道アイヌ協会と協力して若手研究者の育成の一環として体験発掘事業を実施している。また市民向け、高校向けには国民との科学技術の対話事業に参加し、高校での出前講義を実施している。平成27年度の実績としては、以下のようになる。1.礼文島浜中2遺跡の考古学的調査:浜中2遺跡における文化層は、厚く堆積したオホーツク文化期の貝塚層の下に続縄文文化期、縄文文化期の炉跡と良好な遺存状態の動物骨を含む居住活動面重層化して堆積していることが確認できた。平成27年度に確認できた最下層は、縄文後期の活動面であり、さらに文化層は下層に続くようである。2.出土人骨の古代DNA解析とその考古学的意味:2013年度に出土した2号人骨は、人類学的な検討による40代の成人女性であり、また実施した年代測定と出土層位の所見とあわせてオホーツク文化最終末の元地式段階のものであることがほぼ確定した。また古代DNAの残存度を解析した結果、遺伝子の先史時代の人骨資料としては残存度が極めて良好で古代ゲノムの8割近くが復元できる可能性が明らかとなった。高精度の解析を進めることで個人の特徴を復元できる可能性をもつことが明らかとなり、はじめてオホーツク文化の担い手の実像に迫ることができる貴重な資料が入手できた。3.貝塚から出土した動物遺体についても、特に注目される家畜動物であるイヌとブタについて安定同位体分析を進めており、それぞれの食生態(餌)が異なることが提示されている。このことはオホーツク文化における動物飼育文化を考える上で重要であり、かつまたオホーツク文化からアイヌ文化へ移行においてイヌの家畜文化は継続しつつも、ブタの飼育文化が連続しない理由を考える上で重要な資料を入手したことになる。4.縄文文化晩期の生活面において平成27年度に確認されたアシカとトドの儀礼遺構ではアシカ側頭部に人為的な穴が開けられていることが確認された。北海道北部における動物儀礼の変遷、アイヌ文化との文化的系統性を考える上で重要な資料である。本研究では、アイヌの集団的・文化的形成過程において海洋狩猟民文化の強い影響が社会文化伝統にも、集団的にも、存在したことを示唆する豊富な資料を提供することができた。浜中2遺跡の調査では、海獣儀礼の伝統が先行する先史文化から連続して継承、発展されアイヌ文化の中へ取り込まれていくことが考古学的に提示された。集団的な系統性については、先行研究で示唆されていたオホーツク文化の関与を補強する資料を得ることができた。提示されたアイヌ民族の集団形成性の複雑さは、集団のアイデンティティの形成過程や変遷についても、社会・経済・政治的文脈での検討の必要性を示唆している。今後も得られた資料の調査研究を進めていく。オホーツク文化期の魚骨層中で確認された埋葬事例の出土人骨が、従来知られている以上に良好な状態でDNAが保存されていることは判明した。そのため当初予定していたミトコンドリアDNAの解析にとどまらず、ゲノム解析を進めることが可能であることが明らかとなった。これにより研究計画において予定していた生活誌の復元のみではなく、これまで知られていなかったオホーツク文化人の実像に迫るデータが得られる可能性が出てきた。
肝代謝系を導入した新規Bhas42細胞形質転換試験法の開発

Bhas42細胞形質転換試験法(Bhas42 CTA)は,国際認定された発がん活性予測のためのin vitro試験法である。本研究では,肝代謝による発がん活性への影響も考慮したBhas42 CTAを確立するためにBhas42細胞とヒト肝細胞株との共培養を検討した。その結果,両細胞の共培養系の構築に利用の可能性が示唆される改変Bhas42 CTA培地を作成できた。また,Bhas42細胞の代謝酵素CYPの発現をタンパク発現レベルおよび酵素活性で示し,3-methylcholanthreneによるフォーカス形成への寄与も提示する事が出来た。平成27年度は,Bhas42細胞形質転換試験法にトランスウエル共培養による導入が可能なヒト肝がん細胞株の検討を行った。まず,細胞形質転換試験培地において細胞増殖および細胞数を維持できるヒト肝がん細胞株の検討を行った結果,薬物代謝酵素であるCYP酵素を強制発現させたヒト肝がん細胞株が試験培地中で良好に細胞増殖および細胞数を維持できることが分かった。そこで、このCYP強制発現ヒト肝がん細胞株について試験培地によるトランスウエル培養条件下でのCYPタンパク質の発現とその活性を調べた結果,CYPタンパクの発現とその活性レベルはBhas42細胞試験における化学物質処理期間内で維持することが可能であった。次に試験培地を用いたCYP強制発現ヒト肝がん細胞株とBhas42細胞のトランスウエル共培養について検討を行った。初めに,CYP強制発現ヒト肝がん細胞株のCYP発現とその活性に対する共培養の影響を調べた。その結果,CYP発現とその活性に対してBhas42細胞との共培養の影響は確認されなかった。一方,Bhas42細胞の細胞増殖は,CYP強制発現ヒト肝がん細胞株の導入により抑制された。また,Bhas42細胞形質転換試験で化学物質の発がん性の予測指標となる形質転換フォーカスの形成も抑制される可能性があることが分かった。初年度は,Bhas42細胞形質転換試験法に共培養による導入が可能なヒト肝がん細胞株を決定することを計画していた。本研究では既存のBhas42細胞形質転換試験法のプロトコールを改変することなくBhas42細胞培養系へヒト肝がん細胞株を導入しなければならない。このヒト肝がん細胞株の導入において解決するべき課題としては,1ヒト肝がん細胞株との直接的な接触がBhas42細胞に与える影響を軽減するために,非接触的な共培養法により,ヒト肝がん細胞株をBhas42細胞培養系に導入すること,2Bhas42細胞形質転換試験の培地で培養可能なヒト肝がん細胞株を選択することである。これらの課題は,トランスウエル共培養を用いて,CYP強制発現ヒト肝がん細胞株をBhas42細胞培養系に導入することにより解決することができた。以上から研究は、おおむね当初の計画通りに順調に進展していると考えられる。H28年度前半は,昨年度に構築したCYP強制発現HepG2とBhas42細胞とのトランスウエル共培養系について,HepG2導入によるBhas42細胞の細胞増殖抑制効果の軽減および試験系として評価を行った。しかし,CYP強制発現HepG2の薬物代謝機能が非常に低いことから現段階では試験系への適用はできないと判断した。そこでH28年度後半は,CYP強制発現HepG2よりも高い薬物代謝機能を有するヒト肝細胞株AとBhas42細胞との共培養系の構築を検討した。培養条件を検討した結果,ヒト肝細胞株Aの薬物代謝機能(CYP活性)をBhas42細胞試験培地中で長期間維持できた。一方,Bhas42細胞自身が有する薬物代謝機能についても検討を行った。発がん物質であり,CYP1Aの発現誘導物質である3-メチルコラントレンにより処理したBhas42細胞についてCYP酵素タンパクの発現をウエスタンブロッテイング分析により検討した結果,CYP1A1およびCYP1A2タンパクが発現誘導されることを明らかにした。また,誘導物質の有無にかかわらずCYP2B6タンパクが発現していることも確認した。以上の検討から,肝代謝系を導入したBhas42細胞形質転換試験法の構築に向けて,Bhas42細胞培養系に導入可能なヒト肝細胞株とその肝代謝機能を試験培地中で維持できる培養方法を見出した。さらに,試験系構築に向けて基礎となるBhas42細胞のCYP酵素に関する情報も得ることができた。当初の研究計画では,H28年度は前年度で確立したヒト肝細胞株とBhas42細胞との共培養技術を用いて,ヒトiPS肝細胞とBhas42細胞との共培養系の構築を行う予定であった。しかし,iPS細胞から肝細胞への分化誘導,および分化させたiPS肝細胞の機能維持には煩雑な工程が必要であること,また,iPS肝細胞の性能や供給が安定していないことなどから,別の肝代謝機能が高いヒト肝細胞株Aを用いることにした。検討の結果,ヒト肝細胞株Aについても,Bhas42細胞との共培養系の構築が可能であった。したがって,iPS細胞の替わりに別のヒト肝細胞株を用いることにした以外は,おおむね計画通りに進んでいる。

H29年度は,ヒト肝細胞株の薬物代謝機能(CYP3A4活性)をBhas42細胞形質転換試験法(Bhsa42 CTA)のプロモーション試験における被験物質処理期間である10日間で維持可能であり,かつBhas42細胞のフォーカス形成に対する影響を最小限にできる培養条件を検討した。その結果,ヒト肝細胞株のCYP3A4活性を10日間培養後でも検出可能なレベルに保つことができる改変Bhas42 CTA培地を作成した。さらに,被験物質非処理条件下,この改変CTA培地を用いたBhas42細胞の単独培養では,改変培地への変更に起因するBhas42細胞のフォーカス形成数の有意な増加は見られなかった。Bhas42細胞の薬物代謝機能に関する研究では,イニシエーション試験における3-methylcholanthreneによるBhas42細胞のフォーカス形成に対するCYP活性阻害剤の影響を検討した。その結果,Bhas42細胞で発現が確認されたCYP1A1,1A2および2B6のうち,主にCYP1A1およびCYP1A2が3-methylcholanthreneによるBhas42細胞のフォーカス形成に寄与をすることが分かった。ヒト肝細胞株との共培養系を用いたBhas42 CTAの開発には,Bhas42細胞に対し低毒性かつフォーカス形成への影響が少ない,さらにヒト肝細胞株の代謝機能を10日間維持できる培地が必要であり,これらの条件を満たす培地の探索が研究の律速となってきた。本年度の研究により,それらの条件に近づく改変Bhas42 CTA培地を作成できた。今後,この改変培地について,実験結果の再現性,さらにBhas42細胞とヒト肝細胞株の共培養下における両細胞での相互影響を検討することにより生体内代謝を考慮したBhas42細胞形質転換試験法の確立が期待できる。Bhas42細胞形質転換試験法(Bhas42 CTA)は,国際認定された発がん活性予測のためのin vitro試験法である。本研究では,肝代謝による発がん活性への影響も考慮したBhas42 CTAを確立するためにBhas42細胞とヒト肝細胞株との共培養を検討した。その結果,両細胞の共培養系の構築に利用の可能性が示唆される改変Bhas42 CTA培地を作成できた。また,Bhas42細胞の代謝酵素CYPの発現をタンパク発現レベルおよび酵素活性で示し,3-methylcholanthreneによるフォーカス形成への寄与も提示する事が出来た。次年度は,該当年度に構築したCYP強制発現ヒト肝がん細胞株とBhas42細胞とのトランスウエル共培養系について,ヒト肝がん細胞株の導入によるBhas42細胞の細胞増殖および形質転換フォーカスの形成抑制作用の軽減について検討し,化学物質の代謝により発現する発がん性を予測可能なヒト肝がん細胞導入Bhas42細胞形質転換試験法の開発を行う。次年度は,当該年度に構築した培養ヒト肝細胞株AとBhas42細胞との共培養系について,ヒト肝細胞株のCYP酵素発現や薬物排出機能などの薬物代謝機能を試験培地中で維持するための培養条件の最適化を行う。また,発がん性の発現に肝代謝が関与していると疑われる化学物質を用いて,構築したヒト肝細胞株導入Bhas42細胞形質転換試験法の実用性を検討する。環境毒性学海外出張にかかる費用が為替相場(レート)の関係により当初想定していた額と変わったため。次年度に速やかに使用する
染色体大領域欠失と骨髄異型成を結びつける新規評価システムの構築

CRISPR/Cas9システムを用いて7番染色体上の広範囲の領域を欠損させたヒトiPS細胞(7q-iPS)を樹立し、造血細胞へ分化させてin vitroモデルで骨髄異形成症候群を再現する、造血細胞異形成評価システムの確立を目的に検討を進めた。その結果、HL60細胞株とマウス受精卵、iPS細胞を用いた変異導入実験の最適化を経て、7q-iPSの樹立に成功し、現在造血細胞への分化実験を進めている。本研究は、染色体研究の新ツールになり得るゲノム編集技術を駆使し、複数遺伝子同時欠損ヒトiPS細胞の樹立を進め、これを造血細胞へ分化させてin vitroでMDSを再現する、造血細胞異形成評価システムを確立することを目的とする。平成28年度は、1) CRISPR/Cas9システムを用いての7番染色体大領域欠失ヒトiPS細胞株(7q-iPS)の樹立、2)サイトカイン培養により各種造血細胞に分化させて形態や増殖能を評価する手技の確立を目指した。まずはじめに1)を樹立するため、理化学研究所で提供している健常人の上皮細胞から樹立されたiPS細胞であるSB201細胞を入手し、7q21バンド近辺のヒトのMDS症例で高頻度に欠失が見られる領域を標的に欠失変異の導入を試みた。iPS細胞への欠失変異の導入には、CRISPR/Cas9システムのツールであるgRNAオリゴ挿入部位とCas9の配列を連結させたpX330プラスミド(Addgene)を使用した。欠失させたい領域の両端を標的とする2種類のguide RNA/Cas9プラスミドと、約1kbずつの相同領域の間にCre-loxPで薬剤耐性遺伝子を挟んだターゲッティングベクターの計3種類をNeonシステムによるエレクトロポレーション法で細胞に導入し、現在薬剤セレクションを行いクローン化を試みている。また、2)のために、まずiPS細胞(SB201細胞)をEmbryoidbody形成法により各種造血細胞に分化させる系を立ち上げ、細胞形態の確認、表面マーカー解析、コロニーアッセイを試み、細かい手技の安定化を行った。実験準備が順調に進んだため、機材等による大幅な遅れもなく、実験は順調に進展している。本研究は、CRISPR/Cas9システムで7番染色体の広範囲の領域を欠損させたヒトiPS細胞を樹立し、これを造血細胞へ分化させてin vitroで骨髄異形成症候群を再現する、造血細胞異形成評価システムを確立することを目的としている。最終年度である平成29年度は、平成28年度に引き続き、7番染色体大領域欠失ヒトiPS細胞株(7q-iPS)の樹立と、サイトカイン培養によりiPS細胞を各種造血細胞に分化させる手技の確立を進めた。平成28年度に、健常人の上皮細胞由来のiPS細胞であるSB201細胞に、ヒトのMDS症例で高頻度に欠失が見られる7q21バンド近辺を標的にしたターゲットベクターとCRISPR/Cas9エレメントをエレクトロポレーション法(Neonシステム)で導入する系の立ち上げを進めたが、今年度はその手法を用いて、7q21バンド近辺の数カ所の欠失を標的としたターゲットベクターと対応するCRISPR/RNAを作製し、SB201細胞に導入したのち薬剤セレクションを試みたところ、標的箇所ごとにそれぞれ数種類の7q-iPS細胞のクローンを得ることができた。現在、欠失領域部位間や7q-iPS細胞クローン株間での差異を評価するべく、野生株のiPS細胞を用いてEmbryoidbody形成法で造血細胞に分化させる系の安定化を継続して進めるとともに、細胞形態の確認や表面マーカー解析、コロニーアッセイなどの評価法で違いが明らかになるかどうか検討を進めている。平成29年度は樹立した7q-iPS細胞をサイトカイン培養により各種造血細胞に分化させ、形態異常や増殖能、分化能を指標に、欠失領域の造血細胞異形成への関与について評価する。特にMDSで観察される過分葉型好中球やPheud-Pelger核異常、MK細胞の核形態異常を注視し、7q- iPS細胞と野生型iPS細胞を比較検討する。また、7q-iPS細胞のオフターゲット切断について検討を行う。CRISPR/Cas9システムは手軽に利用できる反面、切断標的配列の認識が甘いという悪い点があり、意図しない変異が挿入される可能性が高い。そのため、オフターゲット切断を鋭敏に検出する低コストのシステムの開発と、オフターゲット切断が低頻度な人工ヌクレアーゼへの変更が必要である。オフターゲット欠失の検出するシステムはマイクロアレイCGH法が簡便であるが、クローンをひとつずつ解析するのはコスト高であるので、多数のクローンより抽出したDNAを混合して解析し、コスト減をはかれるか検討する。オフターゲット切断が高頻度に生じる場合、オフターゲット切断が生じにくいPlatinam-TALENシステムへの切替えを検討する。

さらに、正常iPS細胞と比較して細胞形態異常や分化能の抑制などのMDS様表現型が観察された7q-iPS細胞は、ヒト化マウスに骨髄移植を行い、生着の可否や末梢血中の各種造血細胞の比率、形態確認について継時的に観察し、造血系構築機構への影響や白血病発症への寄与について正常7q-iPS細胞を移植したマウスと比較検討を試みる。マウス移植モデルでの結果から、造血系への影響がより強く観察される7q-iPS細胞を選択し、欠失領域内に存在する遺伝子群の探索を通じて、MDS発症に関与する新規関連因子の同定を目指す。血液内科学一部実験計画の遅れによる。実験に使用予定の試薬の金額が差額を生じた。実験の進行に伴い、差額を使用する。
B型肝炎における遺伝子型分布の変遷および分子生物学的検討

我々は、これまでの全国調査によりB型急性肝炎における遺伝子型Aの割合が経年的に増加していること、遺伝子型Aによる急性肝炎終息後には他の遺伝子型ではほとんど認めない慢性化を7-8%の症例で認めることを明らかにしてきた(Hepatology 2014, J Gastroenterol Hepatol 2016)。本研究において、前回調査から5年が経過した2016年度にB型肝炎の全国調査を行うことにより、B型急性および慢性肝炎における遺伝子型分布の変遷を明らかにした。これまでに全国でB型急性肝炎127例、B型慢性肝炎4,419例の臨床情報を収集した。最終集計結果を以下に示す。B型急性肝炎において遺伝子型解析の結果、遺伝子型Aが61例(48.0%)、Bが15例(11.8%)、Cが50例(39.4%)、Eが1例(0.8%)という結果であった。2011年の前回調査時には遺伝子型Aが47%であったため、前回調査時と遺伝子型Aの割合はほとんど変化していなかった。B型慢性肝炎に関しては、遺伝子型Aが188例(4.3%)、Bが714例(16.2%)、Cが3,480例(78.8%)、Dが31例(0.7%)、その他の遺伝子型は6例(0.1%)という結果であった。こちらも前回2011年の集計では、遺伝子型Aは4.1%であったため、B型慢性肝炎における遺伝子型Aの割合は微増にとどまっていた。B型急性肝炎の増加および慢性化率からするとB型慢性肝炎において遺伝子型Aの割合がさらに上昇するものと予想されたが、今回の調査では前回調査と比較して遺伝子型Aの増加はほとんど認められなかった。これは、成人感染のB型急性肝炎の遷延例を慢性肝炎に含めてしまっている可能性や母子感染や幼児期の感染と比較して成人感染で慢性化した症例は核酸アナログによりHBs抗原の消失を認めやすいといった要因が関連しているものと考えられた。我々は、これまでに2000年、2005年そして2010年と5年毎にB型肝炎のgenotypeに関する全国調査を行ってきた。今回、前回調査より5年経過した時点での全国調査を行うことにより国内のB型肝炎のgenotypeの変遷を調査している。2016年10月よりHBVワクチンが定期接種化され、将来的なgenotypeごとのワクチンの有効性の違いや定期接種開始後のgenotype分布の変化を評価する上で、我々のデータは極めて重要なものとなる。さらには、B型急性肝炎および慢性肝炎の血清を収集し、血清中のB型肝炎ウイルス(HBV)の遺伝子や分泌蛋白に関して、ウイルス表面および分泌蛋白上の糖鎖修飾と病態との関連を解析中である。我々は、これまでにHBVのエンベロープ蛋白α-loop内146番目のアスパラギンにN型糖鎖が結合し、ウイルスの分泌に必須であることを報告してきた。エンベロープ蛋白の免疫原性となるα-loop内の免疫エスケープ変異によりウイルスの分泌量が低下し、これらの変異によるウイルス分泌量の低下に対して新たな糖鎖結合部位がα-loop内に形成されることによりHBVの分泌量がレスキューされることも明らかにした我々は既にHBVの再活性化症例と急性肝炎症例の血清からDNAを抽出し、Next Generation Sequencing (NGS)を用いたdeep sequencingを行い、HBV再活性化に関連するウイルスの遺伝子変異を明らかにしつつある。これまでの解析により、国内のHBV再活性化症例において糖鎖結合に関連する特徴的な変異が検出されており、さらに解析を進めていく予定である。さらには、我々の開発したWFA+-M2BPを用いて各症例の肝線維化の程度を測定しており、genotype毎の肝線維化の進展速度の傾向を解析中である。我々は、2010年の前回調査から5年目にあたる2011年から2015年の5年間のB型急性肝炎、および2015年に病院を受診したB型慢性肝炎症例の臨床情報および保存血清の収集を全国の研究協力施設とともに開始した。臨床情報からHBV genotypeが不明な症例に関してはEIA法を用いてgenotypeを測定中である。また、HBs抗原が低力価等の原因によりEIA法によりgenotypeが決定できない症例においては、HBVの塩基配列を決定し系統解析を行うことによりgenotypeを決定した。我々はHBV再活性化症例と急性肝炎症例のHBV DNAを抽出し、NGSを用いて塩基配列を決定し再活性化症例および急性肝炎症例との間で塩基配列を比較し、HBV再活性化発症に関連する特徴的なウイルス側因子の発見を試みた。その結果、HBV表面に結合する糖鎖構造に関連する特徴的な遺伝子変異とHBV再活性化症例との関連が明らかとなってきた。病態に関連する遺伝子変異に関しては、必ずしもHBVのmajor cloneの変異が関与するわけではなく、minor cloneとして存在するウイルスの遺伝子変異が病態と関連することが海外から報告されており、我々は国内の症例においても同様の遺伝子変異を認めることを明らかにした。これらの結果より糖鎖修飾に関連する遺伝子変異がたとえminor cloneとして存在していたとしても、B型肝炎の病態に影響を与える可能性が出てきた。このように我々は既に検体収集および臨床情報の収集を進めている。さらにはHBVの遺伝子変異と病態との関連の解析まで進展しており、これまでのところ研究はおおむね順調に進展している。

我々は、これまでの全国調査によりB型急性肝炎における遺伝子型Aの割合が経年的に増加していること、遺伝子型Aによる急性肝炎終息後には他の遺伝子型ではほとんど認めない慢性化を7-8%の症例で認めることを明らかにしてきた(Hepatology 2014, J Gastroenterol Hepatol 2016)。本研究において、前回調査から5年が経過した2016年度にB型肝炎の全国調査を行うことにより、B型急性および慢性肝炎における遺伝子型分布の変遷を明らかにした。これまでに全国でB型急性肝炎127例、B型慢性肝炎2,248例の臨床情報を収集した。また、保存血清は486本収集しており、HBV遺伝子型不明例に関してはELISA法もしくはdirect sequencing後に系統解析を行うことにより遺伝子型を決定した。一部の症例においてエンベロープ蛋白の糖鎖結合部位に関連するアミノ酸配列を決定し、アミノ酸変異と病態との関連を解析中である。現在までの中間集計結果を以下に示す。B型急性肝炎において遺伝子型解析の結果、遺伝子型Aが61例(48.03%)、Bが15例(11.81%)、Cが50例(39.37%)、Eが1例(0.79%)という結果であった。2011年の前回調査時には遺伝子型Aが47%であったため、前回調査時と遺伝子型Aの割合はほとんど変化していなかった。B型慢性肝炎に関しては、遺伝子型Aが99例(4.38%)、Bが473例(20.93%)、Cが1,659例(73.41%)、Dが26例(1.15%)、Fが2例(0.09%)、Gが1例(0.04%)という結果であった。こちらも前回2011年の集計では、遺伝子型Aは4.1%であったため、B型慢性肝炎における遺伝子型Aの割合は現在までの中間集計では微増にとどまっていた。これまでに全国でB型急性肝炎127例、B型慢性肝炎2,248例の臨床情報およびB型肝炎の遺伝子型を明らかにした。また、アミノ酸変異と病態との関連解析も進行中であり、研究は概ね順調に推移している。これまでに全国でB型急性肝炎127例、B型慢性肝炎4,419例の臨床情報を収集した。最終集計結果を以下に示す。B型急性肝炎において遺伝子型解析の結果、遺伝子型Aが61例(48.0%)、Bが15例(11.8%)、Cが50例(39.4%)、Eが1例(0.8%)という結果であった。B型慢性肝炎に関しては、遺伝子型Aが188例(4.3%)、Bが714例(16.2%)、Cが3,480例(78.8%)、Dが31例(0.7%)、その他の遺伝子型は6例(0.1%)という結果であった。こちらも前回2011年の集計では、遺伝子型Aは4.1%であったため、B型慢性肝炎における遺伝子型Aの割合は微増にとどまっていた。
動脈硬化を伴う敗血症の病態と治療法の確立；プロスタグランジンＤ合成酵素の動態

ICUに入院となった重症患者より血中L-PGDS濃度を測定し、敗血症群および非敗血症群に分けて比較したところ、敗血症群で有意に上昇していることが分かった。血中L-PGDS濃度と有意に相関を示したのは、急性期DICスコア、SIRS項目数、クレアチニン、乳酸値、Dダイマー、Log IL-6、Log IL-10であった。また、重症敗血症症例に血液浄化療法を施行した場合、血中L-PGDS濃度は治療前後で有意に低下したが、CHDF、PDF法の治療法の違いによる低下率の差は認めなかった。今回の研究では血液浄化療法を施行した症例が少なかったため、今後症例を増やしてさらなる検討が必要であると考えられた。敗血症は感染症を基盤とした全身性炎症反応症候群であり、近年、動脈硬化を伴う重症化例が増えている。敗血症治療のひとつとして、血液浄化療法であるPDF法は、サイトカインやその他の中分子量物質を除去することで循環動態を改善すると考えられる。一方、リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)は動脈硬化巣の血管内皮細胞に発現しており、血管拡張作用などに関与している。敗血症においても血管内皮細胞からL-PGDSが分泌されていることが予測される。本研究では、敗血症において分泌されたL-PGDSが、PDF法で除去されることで、血行動態が改善すると考え、L-PGDSの血中濃度を測定し、各種パラメーターとの相関を検討し、敗血症における循環不全の新たな機序を解明することを目的とする。当院・集中治療室に入室となった重症患者のうち、同意を得られた35例より血中L-PGDS採血を行った。このうち、敗血症群(n=11)と非敗血症群(n=24)に分けて比較したところ、血中L-PGDS濃度はそれぞれ、149.7±103.1μg/dl、94.6±10.4μg/dlと敗血症群が有意に高かった(p=0.016)。また、このうち8例については血液浄化療法を行い、治療前後の血中L-PGDS濃度は有意に低下した(p=0.008)。血液浄化療法はCHDF(n=4)、およびPDF法(n=4)であったが、各浄化法の違いによる血中L-PGDS濃度の低下率には有意差は認められなかった。今回、敗血症において血中L-PGDS濃度は有意に上昇しており、敗血症病態にL-PGDSが関与していることが示唆された。また、血液浄化療法により血中L-PGDS濃度は低下することが分かったが、PDF法のL-PGDS除去効果と血行動態改善との相関は見られなかった。症例が少なかった為、今後、症例を重ねて更なる検討が必要であると考えられた。敗血症(sepsis)は感染症を基盤とした全身性炎症反応症候群であり、近年、動脈硬化を伴う重症化例が増えている。ショックをともなうSepsisに対し、血液浄化療法であるPDF法は、サイトカインの除去だけでなく、それ以外の物質を除去することで循環を改善すると考えられる。一方、リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素(L-PGDS)は動脈硬化巣の血管内皮細胞に発現しており、血管拡張作用などに関与しているため、Sepsisにおいても循環不全に関与することが予測される。本研究では、Sepsisにおいて過剰に分泌されたL-PGDSが血行動態に影響すると考え、L-PGDSの血中濃度と、動脈硬化やサイトカインなどのパラメーターとの相関を検討し、またPDF法の効果との相関も検討することで、Sepsisにおける循環不全の新たな機序を解明することを目的とする。平成24年度には、Sepsisにて、当院・集中治療室に入室となった患者より採血を行い、血中L-PGDSを測定し、Sepsisの重症度と血中L-PGDS濃度との相関を検討した。また、頸動脈エコー法により、動脈硬化度を評価した。現在のところ、統計学的検討に十分な症例に数には至っておらず、引き続き症例を集めている。また、臨床データの裏付けとして、敗血症モデルマウスによる心血管系でのL-PGDSの発現を検討した。マウスに対しlipopolysaccharide(LPS)を30mg/kg腹腔内投与し、対照群と比較した(n=4)。翌日、心臓、大動脈を摘出し、L-PGDSのmRNA発現の変化を検討した。L-PGDSの発現は、大動脈では有意差はないがLPS投与で増加する傾向にあった。心臓では、LPS投与で低下した(P<0.0497)。このように、LPS腹腔内投与マウスでは心血管系におけるL-PGDS発現の変化をみとめ、血行動態に関与することが示唆された。

研究計画として、重症Sepsis症例のうち、ビリルビン上昇を伴う臓器不全を合併した症例において、PDF(Plasma Dia-filtration)法による血液浄化を行い、その前後で血中L-PGDS濃度の測定を行い、PDF法治療による血中L-PGDS濃度の影響を検討、また、PDFカラムの前後の血液中、および濾過排液中のL-PGDSをそれぞれ測定し、PDF法によるL-PGDSのクリアランスを測定する予定である。当初予定した十分な症例数には至っていないため、統計学的解析を含め、十分な検討に至っていない。引き続き、症例を集めている。Sepsisにて当院・集中治療室に入室した患者より採血を行い、血中L-PGDSおよびサイトカイン測定、炎症、感染マーカー、凝固・線溶マーカーを測定する。頸動脈エコーにて内・中膜肥厚(IMT)を測定し、動脈硬化の程度を評価する。重症度スコアおよび各マーカーと血中L-PGDSとの相関を検討して、L-PGDSとSepsis重症度との相関を検討する。また、血漿交換の適応となる重症のSepsisにおいて、PDF治療を行った症例に、PDF法によるL-PGDSのクリアランスを測定、また、治療前後の血中L-PGDSおよびサイトカインを測定し、PDF法の治療効果との相関を検討する。以上の検討ができるように、引き続き症例を重ね、データを集める。さらに、敗血症モデルマウスによる検討では、LPS腹腔内投与の濃度を変えて、L-PGDSのmRNAの発現がどのように変化するか検討する。これには心臓、大動脈に加えて、その他の主要臓器(肺、肝臓、腎臓、脳など)での変化も検討してみる。また、各臓器でのL-PGDSの免疫染色を行い、組織学的にどのような変化が生じるか検討する。また、炎症性サイトカインなどのmRNA発現についても検討して、L-PGDSのmRNA発現との相関を検討し、組織学的な変化も合わせて検討する。該当なし