hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
疎水性メタロシリケートの新規合成法の開発

ゼオライトを疎水化することにより過酸化水素水存在下,有機物の酸化に高い活性と選択性を示す触媒を合成した.TS-1の他に,Ti-β,Ti-MWWを合成し,疎水性,酸性と活性,選択性の相関を調べた.3次元12員環細孔からなるβ構造のTi-βでは,10員環MFI構造のTS-1では酸化し得ない嵩高な環状化合物を酸化できた.しかし,Ti-bでは生成したエポキシドは開環してジオールを与えてしまった.これはTi-βの持つ酸性によるものと考えられたので,酸性の低いTi-βを合成することを試み,特に焼成後,第4級アンモニウムカチオンでイオン交換することにより,高い活性と選択性を示すTi-βが得られた.アルカリでイオン交換すると酸化活性が抑制され,一方,アンモニウムでイオン交換したものでは酸化反応中にアンモニウムが酸化分解し,効果が消滅した.TiをMWW構造の骨格に挿入することは長い間不可能とされてきたが,ホウ酸を結晶化助剤とすることにより,Ti-MWWの合成に成功した.層状前駆体を酸処理後,焼成することによりほとんど骨格外のTi種のないTi-MWWが合成できた.焼成後の酸処理では生成したアナターゼを除去できないことから,Ti-MWWは過酸化水素を酸化剤とした鎖状アルケンのエポキシ化に対してTS-1よりも高い活性を示した.また,ヘキサメチレンイミンをSDAに用いて合成したTi-MWWは結晶径の小さな六角形平板状で,針状粒子が凝集した形状を示すヘキサメチレンイミンを用いて合成したTi-MWWよりも活性が高いことが分かった.その原因は前者の結晶径が小さいことによるものと推定した.液相酸化反応活性に優れた,疎水性が高く,酸性を抑制した,小さな粒子径のチタノシリケートを実現する方法論が構築できた.ゼオライトを疎水化することにより過酸化水素水存在下,有機物の酸化に高い活性と選択性を示す触媒を合成した.TS-1の他に,Ti-β,Ti-MWWを合成し,疎水性,酸性と活性,選択性の相関を調べた.3次元12員環細孔からなるβ構造のTi-βでは,10員環MFI構造のTS-1では酸化し得ない嵩高な環状化合物を酸化できた.しかし,Ti-bでは生成したエポキシドは開環してジオールを与えてしまった.これはTi-βの持つ酸性によるものと考えられたので,酸性の低いTi-βを合成することを試み,特に焼成後,第4級アンモニウムカチオンでイオン交換することにより,高い活性と選択性を示すTi-βが得られた.アルカリでイオン交換すると酸化活性が抑制され,一方,アンモニウムでイオン交換したものでは酸化反応中にアンモニウムが酸化分解し,効果が消滅した.TiをMWW構造の骨格に挿入することは長い間不可能とされてきたが,ホウ酸を結晶化助剤とすることにより,Ti-MWWの合成に成功した.層状前駆体を酸処理後,焼成することによりほとんど骨格外のTi種のないTi-MWWが合成できた.焼成後の酸処理では生成したアナターゼを除去できないことから,Ti-MWWは過酸化水素を酸化剤とした鎖状アルケンのエポキシ化に対してTS-1よりも高い活性を示した.また,ヘキサメチレンイミンをSDAに用いて合成したTi-MWWは結晶径の小さな六角形平板状で,針状粒子が凝集した形状を示すヘキサメチレンイミンを用いて合成したTi-MWWよりも活性が高いことが分かった.その原因は前者の結晶径が小さいことによるものと推定した.液相酸化反応活性に優れた,疎水性が高く,酸性を抑制した,小さな粒子径のチタノシリケートを実現する方法論が構築できた.型剤としてテトラエチルアンモニウムイオンを用い、シリカ源としてシリカゾル、煙状シリカ、アルコキシドを用いてTi-ベータを合成した。煙状シリカ、を用いて固相合成したTi-ベータは過酸化水素を酸化剤としたアルケンのエポキシ化ならびに不飽和アルコールからの環状エーテルの合成に高活性を示した。塑剤としてテトラメチルアンモニウムイオンを用いることによりTi-NU-1の新しい合成法を見出した。しかし、Ti-NU-1は結晶内細孔が存在しないゼオライトであるため酸化活性は低かった。塩基性条件とフッ素イオンを助剤とした中性条件の水熱合成、塩基性条件で生成したゲルによる固相合成によるTi-ベータ3種を比較したところ、疎水性はフッ素イオン存在下の合成がもっとも高く、次いで固相合成であった。これは高い結晶性に伴う欠陥密度の低さを反映したものであるが、フッ素イオン存在下ではTiの取り込まれる量が少なく触媒重量あたりのオレフィンのエポキシ化活性は低い。また、この場合もTS-1に比べるとオキシラン環の開環が十分抑制できなかった。水熱合成によるTi-ベータのテトラエチルアンモニウムの除去条件の工夫による疎水性の向上を検討した。硝酸アンモニウムによりテトラエチルアンモニウムイオンをイオン交換し低温で焼成することにより、酸化活性を大きく低下させることなくとエポキシド選択性を飛躍的に向上させることに成功した。このような低温焼成ゼオライトには有機カチオンあるいは高分子有機物が残留していることが観察された。アルカリ金属カチオンがエポキシド選択性を向上させるものの、酸化活性を低下させることは良く知られている。これに対して有機カチオンが酸化活性の抑制をすることなく選択性を上げるものと考えられる。有機基修飾による同様な効果はメソポーラスチタノシリケートでも見出された。

ゼオライトを疎水化することにより過酸化水素水存在下,有機物の酸化に高い活性と選択性を示す触媒を合成した.TS-1の他に,Ti-b,Ti-MWWを合成し,疎水性,酸性と活性,選択性の相関を調べた.3次元12員環細孔からなるb構造のTi-bでは,10員環MFI構造のTS-1では酸化し得ない嵩高な環状化合物を酸化できた.しかし,Ti-bでは生成したエポキシドは開環してジオールを与えてしまった.これはTi-bの持つ酸性によるものと考えられたので,酸性の低いTi-bを合成することを試み,特に焼成後,第4級アンモニウムカチオンでイオン交換することにより,高い活性と選択性を示すTi-βが得られた.アルカリでイオン交換すると酸化活性が抑制され,一方,アンモニウムでイオン交換したものでは酸化反応中にアンモニウムが酸化分解し,効果が消滅した.TiをMWW構造の骨格に挿入することは長い間不可能とされてきたが,ホウ酸を結晶化助剤とすることにより,Ti-MWWの合成に成功した.層状前駆体を酸処理後,焼成することによりほとんど骨格外のTi種のないTi-MWWが合成できた.焼成後の酸処理では生成したアナターゼを除去できないことから,Ti-MWWは過酸化水素を酸化剤とした鎖状アルケンのエポキシ化に対してTS-1よりも高い活性を示した.また,ヘキサメチレンイミンをSDAに用いて合成したTi-MWWは結晶径の小さな六角形平板状で,針状粒子が凝集した形状を示すヘキサメチレンイミンを用いて合成したTi-MWWよりも活性が高いことが分かった.その原因は前者の結晶径が小さいことによるものと推定した.液相酸化反応活性に優れた,疎水性が高く,酸性を抑制した,小さな粒子径のチタノシリケートを実現する方法論が構築できた.
植民地朝鮮における野球の受容と展開に関する歴史学的研究

本研究は植民地期朝鮮における野球の受容と展開過程を解明し、なぜ今日の韓国野球は日本化しているのかを考察することであった。今日の韓国野球が日本化している要因は、植民地支配政策というよりも、朝鮮人が日本を経由して野球を導入したことに求められる。しかしその一方、そうした野球の導入背景には、韓国保護国化への抵抗運動や植民地化後の民族運動に活用する目的があった。したがって、技術的起源は日本だったかもしれないが、こうしたナショナリズムこそが朝鮮野球を発展させたといえる。近年、大韓民国において野球はサッカーと並ぶ韓国の国民的スポーツと評価されるようになった。しかし、「野球(Baseball)」という競技名から「安打(Hit)」といった専門用語に至るまで、韓国では明治以降に日本で翻訳された漢字の野球用語を使ってきた。韓国の野球が国内外で注目を集めながらも、かつての統治国である日本の野球用語を使い続けているという状況を克服するために、2000年代後半から韓国では野球用語の改訂運動が起こった。しかし、韓国野球の現在に関する議論が活発化する一方で、アメリカ生まれの野球が韓国ではなぜ日本化したのか、そもそも、朝鮮半島に野球はどのようにして伝わり、今に至っているのかという歴史的背景については、充分に明らかになっていない。本研究は、朝鮮にアメリカ起源の野球がどのように流入し、なぜ日本化したのかを歴史的に解明することを目的としている。初年度においては、20世紀初頭に朝鮮にアメリカからベースボールが伝わる一方、日本に留学していた朝鮮人が「野球」という用語をはじめ、各種のルールや戦略、道具などを日本経由で朝鮮にもたらしていたことを解明した。また、1910年の植民地以降、朝鮮では甲子園大会の予選が開催されるが、その経緯や朝鮮人にとっての甲子園大会の意味について検討した。いずれも、論文として発表した。また、韓国のシンポジウムでも発表し、韓国の現代文化研究者からも反応を得た。加えて、まだ分析途中ではあるが、1937年以降の戦時期朝鮮における野球の位置付けについても、学会で発表し、今後の課題などを発見することができた。近年、大韓民国において野球は、2008年の北京オリンピックでの優勝などを背景として人気が高まり、サッカーと並ぶ韓国の国民的スポーツと評価されるようになった。その結果、「防御率(Earned run avarage)」が「平均自責点」に変更されるなど、韓国独自の野球用語が増え始めた。つまり、日本式野球用語を使うことは「国民的スポーツ」となった韓国野球にはそぐわないものと認識され、そこからの脱却ー韓国野球の脱日本化ーが目下の韓国のスポーツ界の重要な課題となっているのである。本研究は朝鮮にアメリカ起源の野球がどのように流入し、なぜ日本化したのか。その歴史的経緯の解明を目的としている。初年度においては1900年代にベースボールの伝播ルートがアメリカ経由から日本経由に変わる経緯を解明した。それを踏まえて二年次は、1910年の韓国併合後の日本の朝鮮統治政策が朝鮮の野球に及ぼした影響を、日朝の民族対抗戦、部活動に対する総督府の措置などの観点から分析した。本研究は朝鮮に野球が伝わった1900年代初頭から1945年までを対象としている。初年度では1900年代と1920年代の分析を行ったが、その中間の時期にあたる1910年代を分析した。また、並行して1937年以降の戦時期についても資料収集が大幅に進展し、研究の完成に向けて順調に進んでいるといえる。

最終年度においては、本研究のとりまとめに着手し、1890年代の朝鮮における野球の流入、1900年代における野球の日本化、植民地期の支配政策と民族運動と野球との関係、そして戦時期における野球の統制と消滅のプロセスを解明し、著書として刊行した。本研究は植民地期朝鮮における野球の受容と展開過程を解明し、なぜ今日の韓国野球は日本化しているのかを考察することであった。今日の韓国野球が日本化している要因は、植民地支配政策というよりも、朝鮮人が日本を経由して野球を導入したことに求められる。しかしその一方、そうした野球の導入背景には、韓国保護国化への抵抗運動や植民地化後の民族運動に活用する目的があった。したがって、技術的起源は日本だったかもしれないが、こうしたナショナリズムこそが朝鮮野球を発展させたといえる。本研究は朝鮮に野球が伝わった1900年代初頭から1945年までを対象としている。初年度は、朝鮮野球の起源にあたる1900年代と、1920年代前半について分析を終えることができた。最終年度に取り組む予定の戦時期朝鮮の野球の展開についても、初歩的考察を行うことができ、次年度以降の研究計画がより明確となり、おおむね順調に進展しているといえる。三年次は、初年と二年次に発表した三篇の論文(1900年代、1910年代、1920年代)の続き、すなわち1930年代の満洲事変から戦時期についての分析を終え、研究成果を取りまとめる。戦時期については論文として発表することはせず、既発表の三篇の論文とあわせて、単行本として取りまとめる予定で考えている。朝鮮近代史二年次は、昨年度に発表した論文二篇(1900年代、1920年代)の中間の時期である1910年代における野球の受容と展開について分析を終えたいと思っている。また、戦時期の分析についても、引き続き研究を続けるとともに、韓国やアメリカなどで資料調査も行う。韓国出張の際、一部の図書館で資料の利用に関する制度が変更されていたため、複写できなかった資料があった。購入予定だった書籍の刊行が延期となった。また、韓国出張の際、複写できなかった資料があったため。上記の複写代にあてる。上記の書籍および複写代に充てる。
咀嚼筋活動によるAMPキナーゼの活性化はインプラントの骨結合を強化する

プラスチックインプラントチタンコーティング動物実験1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの追加製作(前年度に続きラット顎骨および脛骨に埋入する実験用インプラントを追加製作し,改良を加えた。)[インプラント形状の決定]臨床で使用されている歯科インプラントに類似した形態が理想的であるが,ラット上顎骨および脛骨への埋入を考慮した形態を検討した.前年度と同様に製作および観察を容易にするため,スレッド構造は省略した.前年度製作した円柱形態のシリンダータイプに加えて,初期固定を向上させるため軸面にテーパーを与えた形態を追加採用した.[酸化チタンのスパッタリングおよびチタンコーティングの評価]前年度と同様に実験用ブラスチックインプラント表層に酸化チタン層をコーティングした.スパッタリングには表面構造制御装置を用いた.コーティング層の厚さ,組成,組織内での変化を電子顕微鏡およびX線マイクロアナライザー等で評価した.2)前年度と同様の手順でラット上顎骨および脛骨に透明プラスチックインプラントを埋入し、チタンー骨界面の超微細構造を観察した。また,ラットの上顎臼歯を抜歯し,2カ月の治癒期間を置き,抜歯窩の治癒後,上顎骨の歯の欠損部に顎骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを埋入した.インプラント体に荷重が加わらないように埋入深さは僅かに骨縁下とした.また,脛骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを左右脛骨に埋入した.ラットは,通常食を与える群(咀嚼群)とほとんど咀嚼の必要のない軟食を与える群(軟食群)に分け,それぞれ10匹ずつ実験を行った.1週後,3週後,6週後,顎骨の観察試料を採取した.30年度に予定していた研究内容1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの完成および2)ラット上顎骨および脛骨に埋入された透明プラスチックインプラント周囲組織の観察についておおむね終了したが,実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの改良に時間を要したので,AMPキナーゼの影響について実験の着手がやや遅れている.30年度に予定していた研究内容1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの完成2)ラット上顎骨および脛骨に透明プラスチックインプラントを埋入実験について,おおむね終了したが,実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの改良に時間を要したので,AMPキナーゼの影響について実験の着手がやや遅れている.31年度は,AMPキナーゼがインプラントの骨結合強化におよぼす影響について実験を進める.1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの製作(ラット顎骨および脛骨に埋入する実験用インプラントを製作した。)[インプラント形状の決定]臨床で使用されているインプラントに類似した形態ラット上顎骨および脛骨への埋入を考慮した形態をそれぞれ検討した.製作および観察を容易にするため,スレッド構造は省略し,円柱形態のシリンダータイプを採用した.[酸化チタンのスパッタリングおよびチタンコーティングの評価]実験用ブラスチックインプラント表層に酸化チタン層をコーティングした.スパッタリングには表面構造制御装置を用いた.コーティング層の厚さ,組成,組織内での変化を電子顕微鏡およびX線マイクロアナライザー等で評価した.2)ラット上顎骨および脛骨に透明プラスチックインプラントを埋入し、チタンー骨界面の超微細構造を観察した。また,ラットの上顎臼歯を抜歯し,2カ月の治癒期間を置き,抜歯窩の治癒後,上顎骨の歯の欠損部に顎骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを埋入した.インプラント体に荷重が加わらないように埋入深さは僅かに骨縁下とした.また,脛骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを左右脛骨に埋入した.ラットは,通常食を与える群(咀嚼群)とほとんど咀嚼の必要のない軟食を与える群(軟食群)に分け,それぞれ10匹ずつ実験を行った.1週後,3週後,6週後,顎骨の観察試料を採取した.29年度に予定していた研究内容1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの製作および2)ラット上顎骨および脛骨に透明プラスチックインプラントを埋入実験について,おおむね終了したので,進捗状況として,おおむね順調に進展している.プラスチックインプラントチタンコーティング動物実験1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの追加製作(前年度に続きラット顎骨および脛骨に埋入する実験用インプラントを追加製作し,改良を加えた。

また,ラットの上顎臼歯を抜歯し,2カ月の治癒期間を置き,抜歯窩の治癒後,上顎骨の歯の欠損部に顎骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを埋入した.インプラント体に荷重が加わらないように埋入深さは僅かに骨縁下とした.また,脛骨用に製作したチタンコーティングプラスチックインプラントを左右脛骨に埋入した.ラットは,通常食を与える群(咀嚼群)とほとんど咀嚼の必要のない軟食を与える群(軟食群)に分け,それぞれ10匹ずつ実験を行った.1週後,3週後,6週後,顎骨の観察試料を採取した.30年度に予定していた研究内容1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの完成および2)ラット上顎骨および脛骨に埋入された透明プラスチックインプラント周囲組織の観察についておおむね終了したが,実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの改良に時間を要したので,AMPキナーゼの影響について実験の着手がやや遅れている.光学顕微鏡,電子顕微鏡およびμCTデータの評価1光学顕微鏡試料の観察によって,皮質骨部と海綿骨部のそれぞれのインプラント表面と骨組織の接触率を測定する.骨接触率は,評価領域のインプラント表面の長さに対するインプラント表面と骨組織が接触している部の長さで表す.2透過電子顕微鏡によりインプラント表面と周囲組織界面の超微細構造を観察する.インプラント周囲骨内のコラーゲン線維の太さや無構造層の明瞭度を評価パラメータとする.3μCTデーによるタインプラント周囲の骨密度の評価皮質骨部と海綿骨部それぞれにおいてインプラントインプラント表面から一定距離に層状の関心領域をとり,骨密度を測定する.30年度に予定していた研究内容1)実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの完成2)ラット上顎骨および脛骨に透明プラスチックインプラントを埋入実験について,おおむね終了したが,実験用チタンコーティングプラスチックインプラントの改良に時間を要したので,AMPキナーゼの影響について実験の着手がやや遅れている.31年度は,AMPキナーゼがインプラントの骨結合強化におよぼす影響について実験を進める.組織切片の製作は,ほぼ予定通りであるが,わずかに一部が完成していない.かかる費用の請求が遅れたため,次年度使用額が生じた.使用計画は以下のとおりである.1光学顕微鏡試料の観察によって,皮質骨部と海綿骨部のそれぞれのインプラント表面と骨組織の接触率を測定する.ため,組織試料の作製費用と画像解析ソフトの購入する予定である.2透過電子顕微鏡によりインプラント表面と周囲組織界面の超微細構造を観察する.また,コラーゲン線維の太さや無構造層の明瞭度を評価パラメータとする.3μCTデーによるタインプラント周囲の骨密度の評価皮質骨部と海綿骨部それぞれにおいてインプラントインプラント表面から一定距離に層状の関心領域をとり,骨密度を測定する.以上の目的のため組織試料作製費用,画像解析ソフトの購入費用に使用する予定である.また,成果報告のための学会出張の出張費として使用する予定である.組織切片の製作がやや遅れており一部が完成していない.かかる費用の請求が遅れたため,次年度使用額が生じた.使用計画は以下のとおりである.1光学顕微鏡試料の観察によって,皮質骨部と海綿骨部のそれぞれのインプラント表面と骨組織の接触率を測定する.ため,組織試料の作製費用と画像解析ソフトの購入する予定である.2透過電子顕微鏡によりインプラント表面と周囲組織界面の超微細構造を観察する.
口腔癌の潜在性頚部リンパ節転移予測因子の研究

口腔扁平上皮癌において、頚部リンパ節転移の有無は予後に非常に大きな影響を持つことは周知の事実である。特に頚部後発転位(潜在性転位)の早期発見と診断精度の向上は、比較的早期の口腔癌の治療成績の改善に大きな役割を果たす。特に口腔癌のなかでも半数以上を示す舌癌について、現在予後と関連が示唆されている血管内皮増殖因子(VEGF)やE-adherin、Flt-4、Ki-67について、免疫組織学的に検討しその予測因子について検討した。なお、免疫組織学的染色はホルマリン固定パラフィン包埋切片によるABC法およびSAB法を用いた。34例のstagel,ll症例のうち、8例に一次治療終了後、3ヶ月から2年において8例(23.5%)に頚部後発リンパ節転移が認められた。上記各因子について免疫組織学的にはその発現様式と後発転移との関連について検討しみると、VEGFの発現強度とは有意ではなかったが、後発転移と関連がある傾向に示した(p=0.0845)。また、Flt-4の免疫組織学的発現は有意に後発転移症例に高く認めれらた(p=0.0083)。しかし、Ki-67,E-cadherinの発現との関連性は明らかではなかった(E-cadherin : p=0.8091,Ki-67 : p=0.8218)。Flt-4はリンパ管内皮に主に発現することから、血管新生に加えて、リンパ管新生の状態がより頚部後発リンパ節転移に関連するものと考えられた。特に頚部後発転移(潜在性転移)の早期発見と診断精度の向上は、比較的早期の口腔癌の治療成績の改善に大きな役割を果たす。それらの命題を解決するべく、(1)臨床的因子、(2)病理組織学的因子、(3)細胞増殖関連因子、(4)癌(抑制)遺伝子、(5)局所浸潤、転移関連因子、について、転移予測因子の検討をおこなっている。今年度については、まず、1981年当科開設以来、現在までに経験した口腔扁平上皮癌一次症例にうち、初診時頚部リンパ節転移が認められなかったStageI、II症例についてのデータを集積し、各予測因子の中で、まず、(1)臨床的因子、(2)病理組織学的因子、を中心に検討を行なっている。現在までの検討では、臨床的因子の中では、Stage別や腫瘍の大きさ、腫瘍の口腔内での位置には、大きな関連性は見当らず、腫瘍の肉眼的発育状態、特に内向的発育を示している症例に、リンパ節転移頻度が有意に高いことが認められた。ついで、病理組織学的因子については、各生検組織のHE所見をもとに、Anner oth分類における角化度、核異型度、有糸分裂数、浸潤様式、浸潤程度、腫瘍の厚さなどとの関連について検討を行ったが、特に腫瘍先端部における浸潤様式の違いに強い差が認められ、腫瘍の厚さにおいても15mmを越える比較的厚いものに、頚部後発転移が多い結果を示した。現在は、これら有意差を示した各因子と細胞増殖因子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子や浸潤、転移関連因子との関連について、主に免疫組織学的に検討を行なっている。特に口腔癌のなかでも半数以上を示す舌癌について、現在予後と関連が示唆されている細胞増殖関連因子や細胞接着因子、血管新生因子、転移関連因子について、免疫組織学的に検討しその予測因子について検討した。

なお、免疫組織学的染色はホルマリン固定パラフィン包理切片によるABC法およびSAB法を用いた。34例のstage I,II症例のうち、8例に一次治療終了後、3か月から2年において8例(23.5%)に頸部後発リンパ節転移が認められた。これらについて、Ki-67,E-cadherin,vascular endothelial growthfactor(VEGF),Flt-4について免疫組織学的にその発現様式と後発転移との関連について検討しみると、各種因子のうちFlt-4の免疫組織学的発現は有意に後発転移症例に高く認められた。また、VEGFの発現強度にも関連が認められる傾向を示したが、Ki-67,E-cadherinの発現との関連性は明らかではなかった。Flt-4はリンパ管内皮に主に発現することから、血管新生よりリンパ管新生の状態がより頸部後発リンパ節転移に関連するものと考えられた。
環境・負荷変動に共振特性を追従させる電力フィードバック進行波型熱音響発電機の開発

ループ管型発電機の音響パワーの代わりに電力をフィードバックして自励発振する電力フィードバック進行波型熱音響発電機を世界で初めて実現した。そのために、熱音響コアが1段のシステムに対する従来の安定性解析手法を、多段コアの場合に拡張し、電力フィードバック部の直列抵抗値と発電電力の関係や、コイルによる発振余裕の拡大などが、安定性解析結果と発振実験で定性的に一致することを示した。負荷を動的に変化させるフィードバック制御により自励発振時の圧力振幅を目標値一定に維持できることを示した。当初、進行波型発電機に先行して定在波型発電機に運転周波数可変機構を組み込む計画だったが、電力フィードバック型の原理をできる限り早期に公表するため、周波数固定の場合に実際に自励発振を行う装置の開発を目指すこととした。ただし、リニアモータの効率改善が困難なため、熱音響コアの効率改善及び多段接続により発振を目指した。1.熱音響コアの効率改善:スタック周囲の単純熱伝導低減のため、(i)管厚を従来の1mmから0.2mmに薄くし、また高温側熱交換器の保守性改善のため、(ii)従来のシースヒーターをセメント固定する構造を、カートリッジヒーターを挿入してネジ固定する構造に変更したコアを設計・製作した。(i)により理想的な音響パワーの増幅度TH/TC(高温側温度/低温側温度)に近付くことを期待したが大きな改善は見られなかった。2.電力フィードバックと進行波音波の関係:コアを3段分製作し、従来品と合わせて全5段を直列接続した装置を構成した。多段コアが扱えるよう従来の発振解析手法を拡張した。コア1段の場合の解析結果が実際の発振状況に整合すること(発表[1])、コア5段の場合に管路長による位相調整を行い、電力フィードバックによりコアで音響パワーが増幅される方向の進行波圧力成分が強まり自励発振する発電機を実現した(発表[3])。3.振幅依存性を考慮した解析手法の開発:従来の解析手法を用いて発振する予測結果が得られても、実験では発振しない状況が観察された。解析の元となる周波数応答が高々数百Paの比較的小さい圧力振幅で取得されるのに対して、自励発振時の定常圧力は数kPaに達し、振幅依存性を考慮して解析を行う必要性が考えらることから、二次振動系モデルに基づいて振幅依存性を考慮する手法を検討した(発表[2])。今後、大振幅で周波数応答実験を行い、定常発振時圧力を含めて発振状況を推定する手法の開発を目指す。上記、研究実績の概要で述べた通り、電力フィードバックの原理の実証を優先したため、周波数可変型の定在波型熱音響発電機の設計・製作が大幅に遅れている。ただし、まだ研究発表を行う段階には達していないが、現時点までに、(a)ムービングマグネット方式のリニアモータを構成し、固定磁石間の距離を手動調整する機構を用いて共振周波数が実際に可変できること、(b)ボイスコイルに別系統のコイルを追加し、電気回路に共振特性を持たせることでリニアモータの共振周波数を可変する機構の検討を行っている。(b)について具体的には、追加した別系統のコイルにコンデンサを直列接続し、その容量を可変させることで共振周波数が変化する実験結果を得ている。この点は概ね当初計画通りに進んでいる。また、電力フィードバック進行波型発電機に関しては、基本原理(=電力フィードバックにより一方向の進行波圧力が増強され自励発振に有利に働く)を実証することができた。これは熱音響工学分野においては初めての報告であり、学術上の意義が大きいと考える。よって総合的にみて、「やや遅れている」とした。研究の目的「定数を電気的に可変できる共振回路」に関して、27年度の研究実施計画「ボイスコイルに別系統のコイルを巻く」対処法は、リニアモータの機械共振周波数を固定し、コイルとコンデンサによる共振特性を含む負荷の調整に相当することがわかった。よって負荷を動的に変化させる準備段階として、発振強度を一定に維持するよう負荷(抵抗値)を変化させる制御手法を開発・発表した(学会発表4)。これは27年度に提案した手法に基づいており、安定性解析を詳細に行い国際会議(学会発表1)で発表するとともに、論文(雑誌論文2)にまとめた。「運転周波数可変」については上述の通り、負荷の制御との関連で考えた方が見通しが良いことがわかったため後に回し、先に定在波型→進行波型システムの開発を進めた。コア5段で進行波優勢で発振する実験装置をベースに、電力フィードバック部の直列抵抗値を0(直結)∞(開放)の間で変化させ、電力フィードバックの効果を実験的に調べるとともに、同様の結果が解析できる手法をコア1段の場合の結果(雑誌論文1)を基に開発した:臨界温度比が低下すること(学会発表2)、音波増幅方向の進行波が強まること(学会発表5)、音響パワーと電力のループが形成されること(学会発表7)を示した。この結果、現有のスピーカを改造したリニアモータで音響パワー→電力の変換効率80%以上を達成したことがわかった。ただし逆方向の電力→音響パワーの変換効率は20%程度であり、この改善が喫緊の課題である。本結果は近日中に音響学会に論文投稿予定である。

27年度研究実績の概要の「3.振幅依存性を考慮した解析手法の開発」について、スピーカを大振幅(ストローク約20mm)のものに置き換え、スピーカの駆動電圧振幅をパラメータとしてコアの周波数応答を取得し安定性解析を行った結果、電圧振幅が大きいほど安定余裕が大きくなる定性的に妥当な結果を得た(研究発表3)。定量的な議論を行うため、周波数応答計測時の共鳴を抑制し管内圧力振幅を一定に保つ制御則を開発し、その有用性を実験的に確認した(研究発表6,8)。しかし、共鳴の利用なしで得られる圧力振幅は100Pa程度と小さく、コアを自励発振時と同程度(数kPa)の大振幅で加振・計測し、定量的な議論を行うことはできていない。よって、「やや遅れている」とした。電力フィードバック進行波型熱音響発電機の実用化を目指して、(i)発振余裕を拡大しコアの段数低減・装置の小型化を図るため、電力フィードバック回路にコイルを追加する効果と、(ii)廃熱源の温度変動に対してロバストな熱音響発電機を実現するため、負荷抵抗を動的に変化する制御手法を検討した:まず(i)について、電力フィードバック回路に適当な容量(リアクタンス)のコイルを挿入すると、発振余裕が拡大され、発振時の圧力、音響パワー、電力が増大すること[音響学会2017秋]、発振余裕を最大化するリアクタンスの最適値が存在すること[音響学会2018春]を実験及び解析により示した。ただし、リニアモータの効率とリアクタンスの関係は実験と解析で異なる傾向を示しており、コイル中の抵抗を考慮して解析を行うこと等が今後の課題である。次に(ii)について、熱音響エンジンの臨界温度比推定に用いている定常発振制御系の安定性解析を非線形制御理論に基づいて厳密に示す[自動制御連合2017(小林)]とともに、振動発電において負荷を動的に変化させる定常発振制御系の安定性を示した[自動制御連合2017(永井他)]。これを熱音響発電機に応用し、温度変動に対して負荷を動的に変化させることにより、発振時の圧力を一定に制御できることを実験的に示した[機械学会2018(井上・小林)]。さらに振動発電において、振動体の振動が一時的に弱まった場合でも、エネルギー回生により振動体の振幅を目標値に維持できることを実験的に示した[機械学会2018(稲田他)]。ただし、回生は外部電源で模擬しており、LC回路を利用したエネルギーの貯蔵、熱音響発電機への応用が今後の課題である。最後に、電力フィードバック進行波型発電機の開発経緯について報告した[応用物理学会2018]。本発電機は長い導波管が不要で小型化が可能な新しい発電機として認知されつつある。ループ管型発電機の音響パワーの代わりに電力をフィードバックして自励発振する電力フィードバック進行波型熱音響発電機を世界で初めて実現した。そのために、熱音響コアが1段のシステムに対する従来の安定性解析手法を、多段コアの場合に拡張し、電力フィードバック部の直列抵抗値と発電電力の関係や、コイルによる発振余裕の拡大などが、安定性解析結果と発振実験で定性的に一致することを示した。負荷を動的に変化させるフィードバック制御により自励発振時の圧力振幅を目標値一定に維持できることを示した。1.発表[3]について:電力フィードバックにより実際に一方向の進行波圧力成分が強まる実験結果を得たが、その大きさは小さく、二箇所で計測された圧力信号の位相差は12度であった(理想とする完全な進行波圧力分布が実現できた場合は、圧力センサ間の距離に応じて数十度の位相差となる)。そこで、この進行波成分の改善を目指す。具体的には、コアを多段接続する連結部の凹凸や管の材質を変更(現在の塩ビ管を銅管に変更)し、管壁における音響パワーのロスを低減させる。
治療抵抗性頭頸部扁平上皮癌において活性化されている機能性RNA分子経路の探索

頭頸部扁平上皮癌の進行症例や遠隔転移をきたした症例の予後は極めて不良であり、これら症例に対する有効な治療法が求められている。上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とした分子標的治療薬(セツキシマブ)が、頭頸部扁平上皮癌の新たな治療選択として使用可能となり治療効果を上げている。しかしながら、治療効果が乏しい症例や、治療後に再発をきたす症例も少なからず存在する。治療抵抗性を解除して、再び癌細胞の増殖・転移を抑制するためには、治療抵抗性の分子メカニズムの解明が必要である。マイクロRNAとよばれる19-23塩基の小さなRNAは、機能性RNA(タンパクコード・非タンパクコード遺伝子)の翻訳阻害や直接分解によりその発現を制御している。1つのマイクロRNAは、極めて多くの機能性RNAの発現を制御するため、細胞内ではマイクロRNA-機能性RNAの複雑な分子ネットワークが形成されている。ヒトゲノム中の60%のタンパクコード遺伝子は、マイクロRNAによる発現制御を受けているため、マイクロRNAの発現異常は、ヒト癌を含む様々な疾患に関与している。本研究では、セツキシマブ併用放射線治療後に再発した頭頸部扁平上皮癌組織から、「頭頸部扁平上皮癌・治療抵抗性マイクロRNA発現プロファイル」を作成した。本プロファイルは、次世代シークエンサーを用いた、全ゲノムを対象とした解析のため、これまで頭頸部扁平上皮癌において報告のないマイクロRNAが多数含まれており、研究を遂行するにあたり、大きなアドバンテージである。本プロファイルから、発現が抑制されているマイクロRNA(miR-145-3pおよびmiR-144-5p)に着目し、これらマイクロRNAの機能解析を施行し、癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。また、これらマイクロRNAが制御する癌促進型遺伝子を探索した。近年、頭頸部扁平上皮癌の新たな治療戦略として、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)阻害剤が登場した。しかしながら、治療過程において、癌細胞は治療抵抗性を獲得し再発や遠隔転移をきたす。頭頸部扁平上皮癌の治療において、遠隔転移の制御を含めた治療抵抗性の克服は非常に重要な課題である。この課題に対し、治療抵抗性に至った癌細胞を最新のゲノム学的手法で解析し、治療抵抗性および遠隔転移の分子メカニズムを解明し理解する事が必要である。ヒトゲノム中には、マイクロRNAに分類される19-23塩基の低分子RNAが存在している。マイクロRNAは、機能性RNA(タンパクコード・非タンパクコード遺伝子)の翻訳阻害や直接分解によりその発現制御をしている。1つのマイクロRNAが複数の機能性RNAの発現を制御する事が特徴で、細胞内ではマイクロRNA-機能性RNAの極めて複雑な分子ネットワークが形成されている。そのため、癌に関与するマイクロRNAを見出し、マイクロRNAが制御する分子ネットワークを探索する事により、癌細胞の特徴を理解する事が出来る。本研究では、分子標的薬(セツキシマブ)併用放射線治療に対して、治療抵抗性を獲得した頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、RNA-sequenceにより、頭頸部扁平上皮癌・マイクロRNA発現プロファイルを作製し、頭頸部扁平上皮癌の機能性RNAネットワークの探索を行った。これまでに、miR-26a/b, miR-29a/b/c、miR-218が、頭頸部扁平上皮癌において、癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。更に、ゲノム科学的手法により、これらマイクロRNAが制御する癌遺伝子を複数見出した。分子標的薬(セツキシマブ)併用放射線治療後に再発した頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、頭頸部扁平上皮癌・マイクロRNA発現プロファイルを作製した。このプロファイルに基づき、癌組織で発現が抑制されているmiR-26a/b, miR-29a/b/c、miR-218を見出した。マイクロRNAの機能解析から、これらマイクロRNAは、頭頸部扁平上皮癌において、癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。更に、ゲノム科学的手法により、これらマイクロRNAが制御する癌遺伝子LOXL2(Lysyl oxidase homolog 2)を探索した。LOXL2は、ECM(Extracellular Matrix)の生合成に関与しており、LOXL2の高発現は、癌細胞の遊走・浸潤に関与する事を証明した。現在、LOXL2が制御する分子ネットワークの探索を継続中である。しかし、治療過程において癌細胞は治療抵抗性を獲得し、再発や遠隔転移をきたす。治療抵抗性に至った癌細胞を最新のゲノム学手法で解析し、治療抵抗性および遠隔転移の分子メカニズムを解明し理解する事が必要である。マイクロRNAは機能性RNAの発現制御をしており、細胞内では、マイクロRNA-機能性RNAの極めて複雑な分子ネットワークが形成されている。そのため、癌に関与するマイクロRMAを見出し、マイクロRNAが制御する分子ネットワークを探索する事により、癌細胞の特徴を理解する事が出来る。本研究では、EGFR阻害剤併用放射線治療後に治療抵抗性を獲得した頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、RNA-sequenceにより、頭頸部扁平上皮癌・マイクロRNA発現プロファイルを作製し、頭頸部扁平上皮癌の機能性ネットワークの探索を行った。発現が抑制されているマイクロRNAから、miR-26a/b、miR-29a/b/c、miR-218に着目し、これらの機能解析を実施した。

マイクロRNAを頭頸部扁平上皮癌細胞に核酸導入する事により、癌細胞の遊走能、浸潤能を顕著に抑制する事が明らかになった。更に、これらマイクロRNAが制御する分子ネットワークを探索した結果、ECM(Extra cellular matrix)の生合成に関与するLOXL2(Lysyl oxidase-like 2)や細胞外マトリックス受容体であるITGB1(integrin β1)を抑制する事が明らかになった。最近の研究から、細胞外マトリックスの発現異常は、癌細胞の増殖や浸潤に関与する事が示されている。分子標的薬(セツキシマブ)併用放射線治療後に再発した頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、頭頸部扁平上皮癌・マイクロRNA発現プロファイルを作製した。このプロファイルに基づき、癌抑制型マイクロRNAの探索に成功している。更に、マイクロRNAが制御する分子ネットワークの探索を行い、頭頸部扁平上皮癌における癌促進型遺伝子を見出した。頭頸部扁平上皮癌・マイクロRNA発現プロファイルより、癌組織で発現が抑制されている、miR-26-a/b、miR-29a/b/c、miR-218に着目し、癌抑制機能と、これらマイクロRNAが制御する分子ネットワークを探索した。頭頸部扁平上皮癌細胞株にこれらマイクロRNAを導入する事により、癌細胞の遊走能、浸潤能を抑制した事から、これらマイクロRNAは、癌抑制型マイクロRNAである事を証明した。更に、これらマイクロRNAが制御する分子ネットワークを探索した結果、ECMの生合成に関与するLOXL2を抑制する事を明らかにした。miR-29a/b/cが制御する分子ネットワークを再検討し、Focal adhesion経路に含まれる細胞外マトリックス受容体であるITGB1を、標的遺伝子として抑制している事を見出した。ITGB1は頭頸部扁平上皮癌で高発現しており、癌促進機能を有する事が明らかになった。また、ITGB1のノックダウンにより、AKT,FAK,ERK1/2のリン酸化が阻害された事を確認した。この経路は、今後の治療標的になり得ると考えられる。頭頸部扁平上皮癌の進行症例や遠隔転移をきたした症例の予後は極めて不良であり、これら症例に対する有効な治療法が求められている。上皮成長因子受容体(EGFR)を標的とした分子標的治療薬(セツキシマブ)が、頭頸部扁平上皮癌の新たな治療選択として使用可能となり治療効果を上げている。しかしながら、治療効果が乏しい症例や、治療後に再発をきたす症例も少なからず存在する。治療抵抗性を解除して、再び癌細胞の増殖・転移を抑制するためには、治療抵抗性の分子メカニズムの解明が必要である。マイクロRNAとよばれる19-23塩基の小さなRNAは、機能性RNA(タンパクコード・非タンパクコード遺伝子)の翻訳阻害や直接分解によりその発現を制御している。1つのマイクロRNAは、極めて多くの機能性RNAの発現を制御するため、細胞内ではマイクロRNA-機能性RNAの複雑な分子ネットワークが形成されている。ヒトゲノム中の60%のタンパクコード
神経芽細胞腫における微小残存病変の定量的検出とその臨床応用

悪性疾患の予後の改善をはかる一つの方策として微小残存病変(minimal residual disease ; MRD)の検索が臨床応用されるようになり、未だ予後不良疾患である進行期神経芽細胞腫においても定性的な検索が行なえるようになった。これをさらに発展させて定量的に検索することにより継時的な治療効果の評価などに有効利用しようとするのが本研究の目的である。検索の対象としたMRDはneuroendocrine protein gene product(PGP9.5)である。本研究の主旨に賛同を得て試料提供に同意をいただいた症例より末梢血、骨髄、末梢血幹細胞、生検検体などの試料を可能なかぎり継時的に提供いただいた。各種試料からRNAを抽出しreal time PCR法でPGP9.5の定量を行なった。試料の状態が不良でないかぎりRNAの抽出には影響はみられなかった。これを鋳型としてreal time PCR法によりPGP9.5を定量した。初期には手技の安定性の確立のため同一サンプルで複数回行なった。続いて臨床経過との対比を行なった。継時的に観察すると化学療法の経過とともに末梢血、骨髄でのPGP9.5の発現量の減少傾向が認められた。また末梢血幹細胞移植術施行のために回収された末梢血幹細胞中の腫瘍細胞の混入の確認のため同様の検索を行ない、極力発現量の少ない、すなわち腫瘍細胞の混入の少ない移植細胞を選択することが可能であった。移植後の経過はまだ短期間であるため再発予測としての有用性はまだ不明である。検索症例をさらに増やし本法の有用性をさらに確立していきたい。インフォームド・コンセントの得られた進行神経芽細胞腫症例の骨髄、末梢血あるいは腫瘍生検検体について微小残存病変(MRD)の定量を行なった。腫瘍生検検体は検索できた例が少なく現在のところ評価はできていない。経時的に検索が可能であった症例では、初診時の検体ではMRDは最大値を呈しており臨床的に治療が有効であった場合は並行してMRDの減少を認める傾向であった。また経過中MRDが上昇した症例がみられたがこの中には再発に至った症例があり、総合的にみてMRDと臨床経過の相関傾向がみられている。造血幹細胞移植術を予定した症例では移植前に回収した移植片に含まれるMRDの検索を行なった。一般に複数回の回収が行なわれるため移植に際しできる限りMRDの少ない移植片を選択することが安全な移植を成功させるため重要である。長期観察の行なえた例はまだ無いが少なくとも1年近く再発せず経過している。これらの症例では定期的に検索し、臨床的には検出できない再発兆候を早期に発見できるものと考えている。しかしながらMRDが低値を示しながら臨床的に増悪した例もあり、また逆にMRDが上昇傾向にありながら臨床的にはなんら問題のない例も存在している。この意義については今のところ不明である。今後の方向としては神経芽細胞腫のマス・スクリーニングで陽性となった症例について検索を検討しており、より明確な基準設定と評価の手段を確立したいと考えている。
メタンの部分酸化による合成ガス製造のための高活性触媒の開発

メタンの部分酸化反応にイリジウムを酸化チタンに担持した触媒を用いることにより高いメタン転化率と合成ガスへの選択性を得ることができることを明らかにした。このときイリジウムの担持率が比較的たかいときに高い活性が発揮されたので、第一周期の遷移金属とイリジウムを複合化し低いイリジウム担持率で活性を発現させる可能性を検討した。ニッケルをTiO_2に担持した触媒を用いると,600°Cではほとんど活性を示さず、水素還元した時にメタンの部分酸化に活性を示した。この触媒に0.5wt%のイリジウムを添加すると水素還元を行わなくても活性を示し、このときメタンの転化率はそれぞれの金属を単独で用いるた時より高くなり、相乗効果が認められた。担体としては、イリジウム単独触媒の時最大の活性、選択性を示したTiO_2よりLa_2O_3を用いたときの方が活性、選択性が高くなった。この触媒はNi単独の触媒と同様に炭素析出が起こり、SEM観察によれば繊維状炭素が生成していた。実使用条件を考慮しSV=30,000と高流速で反応を行っているが、さらに流速をSV=120,000まで上げてもメタンの転化率は低下せずに反応が進行した。本触媒の極めて高い活性があきらかになった。このとき、炭素析出量はメタンの反応量に対して相対的に低下した。Ni-Ir複合触媒はIrの触媒作用によってメタンからの合成ガス生成反応が起こり、生成したCO,H_2によってニッケルの還元が起り、相乗作用が発揮されたものと考えられた。
成熟視床下部における神経新生機構の解明：胚性幹細胞を用いたアプローチ

神経細胞は出生後は再生しないという通説の例外として海馬領域の成人神経再生が知られているが、近年視床下部でも脳室周囲細胞のタニサイトから神経新生が起こることが注目を浴びている。本研究では、マウスES細胞から分化誘導した視床下部組織を解析することで、成熟視床下部に内在する神経幹細胞の維持機構および神経新生機構の解明を目指した。ES細胞の分化誘導過程で、視床下部幹・前駆細胞マーカーであるRax遺伝子の発現をモニターしたところ、神経・グリア細胞の分化後も少数のRax陽性細胞が残存することを見出した。これらの細胞は遺伝子発現、細胞形態、増殖活性などの特徴から、成熟視床下部の神経幹細胞に類似することが分かった。さらにRax発現を指標とした培養条件の検討から、形態形成シグナルの一種であるヘッジホッグシグナルが、神経幹細胞の維持および分化抑制に働いている可能性が示唆された。上記の様にマウスES細胞からタニサイト様細胞の誘導に成功した。この成果は自律神経中枢である視床下部機能が老化を含む疾病により機能低下した場合、再生医療により改善しアンチエイジング効果をもたらす可能性を示すものである。今後はタニサイト様細胞の特異的表面抗原を探索し、同細胞の表面抗原を用いた低侵襲性純化方法の確率を目指している。これにより未分化細胞を除去した安全な治療用細胞を得ることが可能となる。この細胞を再生医療用の細胞として薬効確認する予定である。近年、間脳視床下部領域における神経新生現象が見出され、摂食行動やエネルギー代謝を調節することが示唆されている。本研究では、マウスES細胞から視床下部組織を分化誘導する培養系を用いて、in vitroで神経新生現象を再現し、その生理的な調節因子の解明を目指す。計画初年度である本年度は、まず神経新生現象を再現しうる分化培養系の検討を行った。マウスES細胞を用いた視床下部分化誘導では、約1ヶ月で胎生期および新生児期の神経発生が完了することから、1ヶ月以上の長期培養において神経新生のソースである神経幹細胞が維持される必要がある。そこで視床下部神経幹細胞のマーカーであるRax遺伝子にGFPをノックインしたES細胞株(Rax::GFP株)を用いて長期分化培養を行ったところ、50日間の培養後でもGFP陽性細胞が維持されることを確認した。さらに、ソニックヘッジホッグシグナルを活性化することで腹側視床下部を選択的に誘導すると、より多くのGFP陽性細胞が維持されることを確認した。成熟視床下部の神経幹細胞は腹側領域に多く存在し、この領域で神経新生は活発に生じることから、分化培養系においてもこの領域特異性を再現できたと考えられる。Rax::GFPの発現は幹細胞期に一過性であることから、新生細胞を永久的に標識するために、Rosa26遺伝子座にloxP-stop codon-loxP-tdTomato配列をノックインしたES細胞株を新たに作製した。現在、このES細胞由来の神経幹細胞にCreリコンビナーゼを時期特異的に発現させることで、新生細胞のみを蛍光標識する準備を進めている。これにより新生細胞の定量評価や機能解析が可能となる予定である。当初の研究計画ではEdUなどの細胞分裂標識試薬を用いて、免疫組織化学的な手法により新生した神経幹細胞および神経細胞を定量する予定であった。しかしながらRax::GFP株を用いた解析から、分化培養したES細胞塊において神経幹細胞はクラスターを形成し不均一に分布していることや、細胞塊によっても神経幹細胞の存在率はまちまちであることが分かり、組織学的な解析手法のみでは新生細胞の定量化が困難であると予想された。そこで次年度の研究計画を前倒しし、新生細胞のみを蛍光標識することで、フローサイトメトリーによる解析が可能なシステムの構築を目指した。具体的には、(1)Rosa26遺伝子座へのloxP-stop codon-loxP-tdTomato配列の挿入、(2)Rax遺伝子座へのCreERT2配列の挿入を行ったダブルノックインES細胞株の作製を計画した。現在までに(1)のステップは完了しており、Creリコンビナーゼ依存的にtdTomatoを発現することや、細胞増殖能および分化能に問題が無いことを確認している。しかしながら陽性クローンを得るのに時間を要したことから、(2)のステップは未だ継続中であり、進捗状況としてはやや遅れていると判定した。近年の研究から間脳視床下部領域において神経新生現象が見出され、摂食行動やエネルギー代謝を調節することが示唆されている。本研究ではマウス胚性幹細胞(ES細胞)から視床下部組織を分化誘導する培養系を用いて、in vitroで神経新生現象を再現し、その生理的な調節因子の解明を目的とする。前年度までに、視床下部神経幹細胞マーカーであるRax遺伝子にGFPをノックインしたES細胞株(Rax::GFP株)を用いることで、分化誘導した視床下部組織においても一定数の神経幹細胞が維持されることを見出した。本年度は、これらのGFP陽性神経幹細胞がin vivoの神経幹細胞と同様の性質を有しているかどうかを検討した。成熟視床下部では、第三脳室の上衣細胞の一種であるタニサイトが神経幹細胞として機能すると考えられている。分化誘導した視床下部組織において免疫組織化学的解析を行った結果、Rax::GFP陽性細胞はタニサイトに発現が認められる各種幹細胞マーカーを発現しており、神経細胞やグリア細胞のマーカーはほとんど発現していないことを見出した。さらにRax::GFP陽性細胞はタニサイトに類似する細胞形態を示すことも分かった。

次に、これらのタニサイト様細胞の幹細胞活性を検討するため、チミジンアナログであるEdUを用いて分裂細胞を標識した。分化培養35日目から50日目にかけてEdU処理を行ったところ、Rax::GFP陽性細胞の数%程度がEdUで標識された。すなわち大部分のタニサイト様細胞は静止状態にあり、一部のみが増殖活性を持つことから、成熟脳における神経幹細胞の一般的特性を再現していると考えられる。さらにEdU陽性細胞の一部は神経細胞マーカーを発現していたことから、タニサイト様細胞は神経新生能を持つ可能性が示唆された。これまでの研究から、ES細胞を用いた分化誘導系においても成熟視床下部に存在する神経幹細胞が再現されることを見出し、着実に進捗していると言える。一方でこれらの幹細胞が神経新生を生じ得るかどうかについては、未だ実験的証明はできていない。本年度はこの点を明らかにするために、Rax陽性幹細胞のGenetic lineage tracing(細胞系譜追跡)を行う予定であったが、これに必要なES細胞のゲノム編集に時間を要している。当初計画したゲノム編集の工程において細胞死が誘導されることが判明したため、ベクター類の再設計を行い、別の手順で現在作業を進めている。来年度中にゲノム編集が完了し、神経新生の解析を実施できる予定である。神経細胞は出生後は再生しないという通説の例外として海馬領域の成人神経再生が知られているが、近年視床下部でも脳室周囲細胞のタニサイトから神経新生が起こることが注目を浴びている。本研究では、マウスES細胞から分化誘導した視床下部組織を解析することで、成熟視床下部に内在する神経幹細胞の維持機構および神経新生機構の解明を目指した。ES細胞の分化誘導過程で、視床下部幹・前駆細胞マーカーであるRax遺伝子の発現をモニターしたところ、神経・グリア細胞の分化後も少数のRax陽性細胞が残存することを見出した。これらの細胞は遺伝子発現、細胞形態、増殖活性などの特徴から、成熟視床下部の神経幹細胞に類似することが分かった。さらにRax発現を指標とした培養条件の検討から、形態形成シグナルの一種であるヘッジホッグシグナルが、神経幹細胞の維持および分化抑制に働いている可能性が示唆された。上記の様にマウスES細胞からタニサイト様細胞の誘導に成功した。この成果は自律神経中枢である視床下部機能が老化を含む疾病により機能低下した場合、再生医療により改善しアンチエイジング効果をもたらす可能性を示すものである。今後はタニサイト様細胞の特異的表面抗原を探索し、同細胞の表面抗原を用いた低侵襲性純化方法の確率を目指している。これにより未分化細胞を除去した安全な治療用細胞を得ることが可能となる。この細胞を再生医療用の細胞として薬効確認する予定である。前述の方法に基づき、新生細胞のみを蛍光標識できるES細胞株を作製する。フローサイトメトリー法により新生細胞を定量化することで、種々の増殖因子や栄養シグナル分子(グルコース、レプチン、インスリンなど)が神経新生に及ぼす影響を定量的に評価する。また免疫組織化学的解析により、新生した神経細胞における視床下部ペプチド類の発現を検討することで、新生細胞の分化指向性を評価する。