hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児期発症の神経筋疾患における心拍変動解析の臨床応用

心拍変動解析を用いて、神経筋疾患における予後指標を見出すことが本研究での究極の目標である。今回は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを対象とし、生命予後を予測する因子について検討した。死亡例で生前に施行されていた24時間ホルター心電図、15人分計77データを解析対象とした。不整脈、心拍変動の各パラメーターを解析し、生命予後との関連を検討した。心拍変動の各パラメーターはすべて、死亡日に近くなると有意に低下する傾向を認めた。不整脈の出現に関しては有意な傾向はなかった。これらの結果は心筋梗塞における生命予後予測と類似する。心拍変動解析は、神経筋疾患の生命予後を予測できることが示唆された。24時間ホルター心電図を用いて、小児神経筋疾患患者における心拍変動の特性を見出し、心合併症の治療評価指標を見出すことが本研究での目的である。平成25年度は19例の小児神経筋疾患患者(デュシェンヌ型筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、先天性筋ジストロフィー)で解析を行った。そのうち、15歳以上の患者のデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者5例(15歳3例と17歳2例)で比較検討を行った。1日の平均総心拍数は進行の早い例16.3万:その他4例12.7±0.8万(中央値±SD)、SDNNは65.5:115.4±19.6、pNN50は0.5:16.3±10.6、r-MSSDは23.9:45.7±13.4、DCは5:8.2±1.8であった。心拍変動スペクトル分析とHRTは明らかな違いを認めなかった。進行の早い例では1日の平均総心拍数が高く、SDNN、pNN50、r-MSSD、DCが低い傾向にあった。これらの傾向は心筋梗塞における生命予後予測と類似する。今後、さらに多くの症例を解析することにより、心拍変動解析を用いた予後予測ができる可能性がある。24時間ホルター心電図を用いて、小児神経筋疾患患者における心拍変動の特性を見出し、心臓合併症の治療評価指標を見出すことが本研究の目的である。H25年度の検討では、進行の早い例で、平均総心拍数が高く、SDNN、pNN50、rーMSSD、Deceleration capacityが低い傾向にあった。平成26年度は、2施設(国立病院機構鈴鹿病院、国立精神・神経医療研究センター)の共同研究施設を加えた。デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者32人、79データを解析した。このうち10人は死亡例を後方視的に解析し、死亡例について特に検討した。10人の死亡年齢は1638歳であった。後方視的検討であったため、各々のホルター心電図記録はばらつきがあった。1例は死亡する1週間前の記録で、SDNN、pNN50、r-MSSD、Deceleration capacityがいずれも著明に低値であった。死亡1か月間に記録した1例では、SDNN、r-MSSD、pNN50が著明低値でDeceleration capacityが比較的低値であった。死亡3年前に最終記録された例では、SDNNとpNN50が著明低値でr-MSSDとDeceleration capacityは比較低値であった。SDNNとpNN50は死亡する数年前から著明低値となり、死亡直前にr-MSSDとDeceleration capacityの著明低値をとることが示唆された。症例を増やし更なる特性を見出していく。平成25年度の検討では、進行の早い例で、平均総心拍数が高く、SDNN、pNN50、rーMSSD、Deceleration capacity(DC)が低い傾向にあった。デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者32人、79データを解析し死亡例10人について検討した。平成27年度はさらに症例を追加し、85人、356データを解析した。うち、死亡例15例につき検討を行った。10例は複数回のデータ解析ができた。15人の死亡年齢は1338歳であった。DCが高値の症例は、心機能が保たれているにもかかわらず突然死した症例であった。心筋症が進行して死亡した症例は、SDNN、pNN50、r-MSSDが進行性に低下している傾向にあった。DCは顕著に低下していた。24時間ホルター心電図を用いた心拍変動解析は、神経疾患の心臓合併症予後予測ができることを示唆している。共同研究施設を増やすことにより、対象症例を増やすことができた。85人の患者における24時間ホルター心電図356データを用いて、Hayanoのコンピュータ解析ソフトで順調に解析を行えている。平成25、26年度に候補とした予後予測因子を裏付ける結果が出てきている。【背景】非侵襲的人工呼吸器療法が普及してから、神経筋疾患では呼吸合併症より心合併症が予後に重要な役割を果たすようになった。しかし、側彎などの影響で心臓超音波検査はしばしば困難で、心臓MRIや核医学検査は限られた施設でのみしか施行できず、BNPは病状を反映しないことをよく経験する。

どの施設でも施行可能である24時間ホルター心電図を用いて、神経筋疾患における予後指標を見出すことが本研究での目的である。【方法】対象は死亡したDMD患者15例(1341歳、平均25.8歳)。生前に24時間ホルター心電図を個人あたり115回(平均4.6回)行っており、計77データを解析対象とした。心室性期外収縮、心拍変動の各パラメーター(SDNN、pNN50、r-MSSD、HRVTI、Deceleration capacity of heartrate、心拍変動スペクトル分析)を解析し、生命予後を予測できるか検討した。【結果】心拍変動の各パラメーターはすべて、死亡日に近くなると有意に低下する傾向を認めた。特に、HRTVI、SDNN、rMSSD、pN50、DCは相関が高かった。一方で心室性期外収縮では有意な傾向を認めなかった。【考察】第一報ではDMD5例について検討し、進行の早い例ではSDNN、pNN50、rMSSD、DCが低い傾向であることを報告した。今回の結果でもこれらは死亡日が近くなると低下する傾向を認めた。これらの傾向は心筋梗塞における生命予後予測と類似する。今後、さらに多くの症例を解析することにより、心拍変動解析を用いて詳細に予後予測ができる可能性がある。心拍変動解析を用いて、神経筋疾患における予後指標を見出すことが本研究での究極の目標である。今回は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを対象とし、生命予後を予測する因子について検討した。死亡例で生前に施行されていた24時間ホルター心電図、15人分計77データを解析対象とした。不整脈、心拍変動の各パラメーターを解析し、生命予後との関連を検討した。心拍変動の各パラメーターはすべて、死亡日に近くなると有意に低下する傾向を認めた。不整脈の出現に関しては有意な傾向はなかった。これらの結果は心筋梗塞における生命予後予測と類似する。心拍変動解析は、神経筋疾患の生命予後を予測できることが示唆された。共同研究施設を増やすことにより、対象症例を増やすことができた。32人の患者における24時間ホルター心電図79データを用いて、Hayanoのコンピュータ解析ソフトで順調に解析を行えている。平成25年度に候補とした予後予測因子を裏付ける結果が出てきている。定期的に共同研究施設よりデータを得て、解析データを増やしていく。平成28年度は、同一個体内での心拍変動解析の経時的変化と治療や臨床症状の関連性を検討し、生存例との比較検討も行う。遂行するに当たり支障となるのは、共同研究施設までの移動距離である。研究協力者を派遣することによりまかなう予定である。小児科定期的に共同研究施設よりデータを得て、解析データを増やしていく。平成27年度は、同一個体内での心拍変動解析の経時的変化と治療や臨床症状の関連性を検討していく。研究協力員を派遣することによりまかなう予定である。19例の患者における24時間ホルター心電図を用いて、Hayanoのコンピューター解析ソフトで順調に解析を行えている。平成25年度は同一疾患で年齢も限ったため例数が少ないが、候補となる予後予測因子を見出せることができた。一方で、研究協力施設での研究を開始することができなかった。平成27年度は、共同研究施設との連携を行った。
発達期バレル皮質の神経回路形成におけるカンナビノイド依存性シナプス可塑性の役割

CB(カンナビノイド)は従来、その精神的作用にのみ注目されてきたが、バレル皮質においては、4層→2/3層シナプスの長期抑圧(LTD)にCBが関与しており、臨界期の活動依存的な生理学的、形態学的可塑性に重要な役割を果たしていると考えられている。我々は、生後7-12日(P7-12)において、視床→2/3層にはLTDだけのSTDPがある事を見出し、このSTDP-LTDは、CB依存性であることを示した。同時に、カンナビノイド受容体欠損マウスでは、STDP-LTDが消失していること、VBの軸索投射に異常があることを確認した。バレル皮質においては臨界期開始にはL4→L2/3シナプスが重要であること、また、このシナプスはスパイクタイミング依存性可塑性STDPを示すことが知られている。視覚皮質では、GABA細胞の発達が臨界期開始に重要な働きをしていると示唆されていたが、そのメカニズムの詳細は不明である。我々は、まず視床ーL2/3のLTD-STDPの性質を正確に同定し、次にその生理的意義を検討し、以下を明らかにした。(1)生後2週令での視床→L2/3シナプス結合はカンナビノイド(CB1)感受性を示し、LTD-STDPはCB1受容体(CB1R)を介するものであること。本実験では、共同研究先のLu博士が所有するCB1Rのグローバルノックアウト、皮質興奮性細胞特異的CB1R及び、CB1Rのアゴニスト、アンタゴニストであるWIN、AM281等をを利用することにより判明した。(2)視床ーL2/3のCB1RをCB1R作動薬で活性化すると視床投射が退縮を起こすこと。腹腔内にWIN delta 9-tetrahydrocannabinol(9THC、マリファナの有効成分、CB1Rのアゴニスト)を投与すると視床皮質投射は強く抑制され、AM281の投与は視床皮質投射を増強した。delta 9THCは、Lu博士が利用免許を有しており、利用が容易であった。(3)内因性のCB1Rは視床皮質投射を制御し、正常な神経回路の形成に重要な役割を果たしていた。Lu博士の所有するCB1R-KOマウスを用いて、単一視床線維をDiIで染色し視床投射を調べた。その結果、CB1R-KOマウスでは視床皮質線維が野生型と異なり、2/3層、4層内に広く分布しており、内因性のCB1Rが視床投射を制御していることが判明した。以上より、生後2週目、CB1Rは視床ー2/3層投射にLTD-STDPを起こす一方で、退縮を起こしていたことが明らかであった。同時期、L4-L2/3終末のLTP-STDPはシナプス形成を促していると考えられるが、それぞれのSTDPは生理的変化と形態変化の両方を誘導している可能性が示唆された。体性感覚野のバレル皮質は、生後発達の一時期に入力依存性の可塑性を示す臨界期が存在するが、そのメカニズムについては、いまだ不明な点が多い。バレル皮質の臨界期(生後2週目)には、4層-2/3層(L4-L2/3)におけるスパイクタイミング可塑性(STDP)が重要であることが示されている。我々は、生後1週目の体性感覚野4層-2/3層間(L4-L2/3)において、臨界期開始以降とは異なり長期増強(LTP)だけのスパイクタイミング依存性可塑性(STDP)が働いていることを突き止めた(Itami J. Neurosci 2012 )。一方、この時期、視床-L2/3投射もCB1R依存性のLTDを起こす(現在投稿中)が、皮質細胞のCB1Rを介すかどうかは不明である。この2点を部位特異的CB1R-KOマウスを用いて明らかにする。次に、CB1R依存性LTDは投射の刈り込みをおこすことから(現在投稿中)、視床-L2/3のabberantな投射もCB1R依存的に退縮する可能性を検討する。視床細胞特異的にGFPを発現する遺伝子改変動物をもちいてCB1R活性化と視床軸索の退縮の関係を調べ、発達期の神経回路形成とCB1Rの局在の生理的意味を明確にする。Indiana大学のHui-Chen Lu博士らが作製した視床特異的カンナビノイド受容体欠損マウスを使用し、視床-皮質2/3層シナプスおけるカンナビノイド依存性長期抑圧の発現、及びCB1R活性化と視床軸索の退縮の関係を調べる予定であった。今のところ、既存Creマウスでは欠損マウスの作製がうまくいかず、別のCreマウスを使う必要が出てきた。もう少し時間がかかる予定である。CB(カンナビノイド)は従来、その精神的作用にのみ注目されてきたが、近年大脳皮質や海馬、小脳において短期的可塑性や長期抑圧を引き起こす伝達物質として、新たな注目を受けた。バレル皮質においては、4層→2/3層シナプスの長期抑圧(LTD)にCBが関与しており、臨界期の活動依存的な生理学的、形態学的可塑性に重要な役割を果たしていると考えられている。

我々は、生後7-12日(P7-12)においては、臨界期とは異なり長期増強(LTP)だけのスパイクタイミング依存性可塑性(STDP)が働いており、LTDの獲得が臨界期開始のメカニズムである可能性を示した(Itami J. Neurosci 2012)。またこの時同時に、視床→2/3層にはLTDだけのSTDPがある事を見出した。視床皮質投射は発達期に一時的に表層まで広がるが、直ぐに4層までに退縮することが知られているが、そのメカニズムは知られていなかった。以上を踏まえて、我々は本研究において以下の点を明らかにした。1)P12以前において、L4-L2/3にLTDが起こらないのは、L4終末にCB1Rが発現していないためであること、2)視床ーL2/3のLTDは視床終末に局在するCB1Rによるものであること、の2点を明らかにした。この実験においては、皮質興奮性細胞特異的にCB1Rをノックアウトした遺伝子改変動物と、CB1Rのグローバルノックアウトの2種類の遺伝子改変動物を用いて明らかにした。さらに、視床細胞特異的にGFPを発現する遺伝子改変動物(ROR-GFP)を用いて、CB1Rのアゴニストとアンタゴニストを腹腔内投与し、視床ーL2/3への投射に与える影響を調べた。その結果、CB1Rアンタゴニストでは軸索支配領域の拡大が見られ、CB1Rアゴニストでは逆に軸索支配領域の縮小が見られた。これより、CB1Rは臨界期の生理学的、形態学的可塑性に重要な役割を果たす事が示された。CB(カンナビノイド)は従来、その精神的作用にのみ注目されてきたが、バレル皮質においては、4層→2/3層シナプスの長期抑圧(LTD)にCBが関与しており、臨界期の活動依存的な生理学的、形態学的可塑性に重要な役割を果たしていると考えられている。我々は、生後7-12日(P7-12)において、視床→2/3層にはLTDだけのSTDPがある事を見出し、このSTDP-LTDは、CB依存性であることを示した。同時に、カンナビノイド受容体欠損マウスでは、STDP-LTDが消失していること、VBの軸索投射に異常があることを確認した。神経の活動依存的変化(可塑性)は、脳の神経回路形成と記憶学習の基本メカニズムと考えられており、脳科学研究が明らかにすべき重要なテーマの1つである。発達期の神経回路形成は、遺伝的因子によってその枠組みが形成されるが、細部は経験的因子の作用によって環境に依存しながら完成していく。とりわけ臨界期は、経験的因子が神経回路形成を大きく左右する時期であり、そのメカニズムは近年次第に明らかにされてきた。発達期の視覚皮質では、GABA細胞の発達が臨界期開始に重要な働きをしていることが示唆されているが、抑制が臨界期を開始させるメカニズムはほとんどわかっていない。また、臨界期可塑性には皮質4層ー2/3層間の発火順序に依存した可塑性(spike timing-dependent plasticity、STDP)が重要な役割を果たす。これまでに我々は、臨界期前(生後2週目)の動物では4層-2/3層間に、臨界期中に見られるSTDPとは異なるタイプのSTDPが発現され、STDPのスイッチが臨界期開始を導いていること明らかにした(Itami et al. J. Neurosci. 2012)。同時に、生後2週目には視床から2/3層へ多くの投射があり、このシナプスは4→2/3層とはちょうど逆向きのSTDPを示すことを見出した。すなわち、2/3層へは4層と視床からと、異なるSTDPが集束している。そこで本実験では、1) STDPの集束が神経回路形成に及ぼす影響、2)視床→2/3層シナプスでは、STDPの発達に伴う変化はあるか、3)視床→4層シナプスではSTDPは見られるのか、またそれは発達に伴って変化するか、等を明らかにすることを目的とする。
二次差分形式に基づく動的システムの離散時間消散理論の構築とその応用に関する研究

本研究では,ビヘイビアアプローチの枠組みでのシステム解析に関する有用な基礎理論の開発を目的として,二次差分形式に基づく消散性理論の構築を行っている.本年は後半の1年であり,昨年に引き続き,この1年間で研究当初に計画した内容にほぼ従う形で研究を遂行することができた.大きく分けると以下の4つの成果を得ている.昨年,二次差分形式を用いた離散時間における消散性の基礎理論のさらなる構築として,システム内部に蓄えることができるエネルギーがシステムの状態の二次形式で表されるという性質は一般には成立せず,蓄積関数が準正定な場合にその性質が成立することを示したが,今年は,それに対していくつかの重要な修正を加えて完全なものにした.そしてその結果をまとめた論文に対してSIAM journal on Control and Optimizationへの掲載が決定した.次に,昨年,オランダのMaastricht大学のDr.Paolo Rapisardaとの共同研究により,離散時間消散性のシステム同定への応用であるH_∞規範に基づくMost Powerful Unfalsified Model(MPUM)について,そのモデルが存在するための必要十分条件およびモデルのパラメトリゼーションをスカラーの場合に関して求めることができたが,今年も引き続き行い、いくつかの重要な修正を行った.そしてその結果をまとめた論文に対してSystems and Control Lettersへの掲載が決定した.さらに,この延長として,行列の場合について,いくつかの考察を行い、重要な結果を得た.次に,離散時間二次差分形式の応用として.ビヘイビアアプローチのH_2制御問題を離散時間の場合について完全に解いた.なお,その基礎として連続時間の場合に関しても解くことができ,システム制御情報学会への掲載を決定させることができた.さらに,これらの結果の応用としてフィルタリング問題へも着手し,いくつかの基礎的な結果を得ている.また,離散時間二次差分形式のもう一つの応用として,離散時間リアプノフ方程式についてもビヘイビアアプローチの枠組みで考察し,いくつかの基礎的な結果を得た.具体的には,多項式で記述することにより,従来の結果を包含する形でより一般的な結果を得ることができた.本研究では,ビヘイビアアプローチの枠組みでのシステム解析に関する有用な基礎理論の開発を目的として,二次差分形式に基づく消散性理論の構築を行っている.この1年問で研究当初に計画した内容にほぼ従う形で研究を遂行することができた.大きく分けると以下の3つの成果を得ている.まず,二次差分形式を用いた離散時間における消散性の基礎理論として,蓄積関数の重要な性質を理論的に解明した.具体的には,連続時間とは異なる点として,システム内部に蓄えることができるエネルギーがシステムの状態の二次形式で表されるという性質は一般には成立せず,蓄積関数が準正定な場合にその性質が成立することを示した点である.そして,関連するいくつかの離散時間特有の性質も導出した.これらの結果は今後,消散理論を応用する場合の有益な性質になるのみでなく,二次差分形式を考案する元となったビヘイビアアプローチの分野においても,理論的な性質を提供している点で重要である.次に,この二次差分形式に基づく離散時間消散性のシステム制御理論への応用として,H_2制御、H_2/H_∞制御問題ををビヘイビアの枠組みで捉えることを試み,いくつかの結果を得た.この点については連続時間でも結果が得られていないので,離散時間への基礎として,連続時間の場合のH_2制御,H_2/H_∞制御問題を考え,結果として制御則が存在するための必要十分条件と,制御則の表現を求めることに成功した.また,数値例を通して従来のシステム制御理論にはない,ビヘイビア特有の性質も見出すことができた.これらの結果はビヘイビアアプローチの有用性を検証しているという点で非常に有益であるといえる.また,これらの結果は離散時間への拡張をする際にも,同様な証明方法が使えることから,その点でも非常に有益な結果を得たといえる.そして,オランダのMaastricht大学のDr.Paolo Rapisardaとの共同研究により,離散時間消散性のシステム同定への応用であるH_∞規範に基づくMost Powerful Unfalsified Model(MPUM)について,そのモデルが存在するための必要十分条件およびモデルのパラメトリゼーションをスカラーの場合に関して求めることができた.また,古典的な解析学の結果の一つであるCaratheodory Feijerの補間問題とも合致し,かつ再帰的な証明方法をあたえることにより具体的なアルゴリズムも得ることができた.アルゴリズムが与えられるということは,実用上の観点から非常に重要である.また,当初の目的であった離散時間消散性と補間理論の相互関係についても,ある性質を見出すことができ,理論的に見ても重要な結果である.本研究では,ビヘイビアアプローチの枠組みでのシステム解析に関する有用な基礎理論の開発を目的として,二次差分形式に基づく消散性理論の構築を行っている.本年は後半の1年であり,昨年に引き続き,この1年間で研究当初に計画した内容にほぼ従う形で研究を遂行することができた.大きく分けると以下の4つの成果を得ている.昨年,二次差分形式を用いた離散時間における消散性の基礎理論のさらなる構築として,システム内部に蓄えることができるエネルギーがシステムの状態の二次形式で表されるという性質は一般には成立せず,蓄積関数が準正定な場合にその性質が成立することを示したが,今年は,それに対していくつかの重要な修正を加えて完全なものにした.そしてその結果をまとめた論文に対してSIAM journal on Control and Optimizationへの掲載が決定した.

次に,昨年,オランダのMaastricht大学のDr.Paolo Rapisardaとの共同研究により,離散時間消散性のシステム同定への応用であるH_∞規範に基づくMost Powerful Unfalsified Model(MPUM)について,そのモデルが存在するための必要十分条件およびモデルのパラメトリゼーションをスカラーの場合に関して求めることができたが,今年も引き続き行い、いくつかの重要な修正を行った.そしてその結果をまとめた論文に対してSystems and Control Lettersへの掲載が決定した.さらに,この延長として,行列の場合について,いくつかの考察を行い、重要な結果を得た.次に,離散時間二次差分形式の応用として.ビヘイビアアプローチのH_2制御問題を離散時間の場合について完全に解いた.なお,その基礎として連続時間の場合に関しても解くことができ,システム制御情報学会への掲載を決定させることができた.さらに,これらの結果の応用としてフィルタリング問題へも着手し,いくつかの基礎的な結果を得ている.また,離散時間二次差分形式のもう一つの応用として,離散時間リアプノフ方程式についてもビヘイビアアプローチの枠組みで考察し,いくつかの基礎的な結果を得た.具体的には,多項式で記述することにより,従来の結果を包含する形でより一般的な結果を得ることができた.
新規高感度迅速起因菌同定法とNF-κB病態解析法を統合した敗血症検査システム構築

Eukaryotemade Taq DNA polymerseの安定した生産体制を確立し,子宮感染症に対して羊水中マイコプラズマ、細菌の迅速同定プロトコールを提案した。次に、16SリボソームDNAに対してリアルタイムPCRから各melting temperature (Tm)値を算出するTm mapping法を開発し、敗血症患者の血液から直接100菌種以上を同定し血液培養法と高い一致率を得た。次に、蛍光相関分光法(FCS)によるNF-kB活性化定量法を開発し、SIRS病態の早期診断有用性を明らかにした。Tm mapping法とNF-kB活性定量測定の組み合わせは敗血症早期治療に有用となる。Eukaryote made Taq DNA polymerseの安定した生産体制を確立し,子宮感染症に対して羊水中マイコプラズマ、細菌の迅速同定プロトコールを提案した。本敗血症検査システムを構築するために、1)検体サンプリング、2)安定したバクテリアフリー状態での起因菌迅速測定法、3)起因菌同定解析用データベース構築、4)SIRS迅速病態解析のためのFCS法を基盤にした迅速NFーκB活性化定量開発、5)臨床検体を用いた検証の各ステップを推進した。1)は、EDTA含有血液5mLからリンパ球と上清からの細菌由来DNAサンプリングのプロトコールを確立した。2)はバクテリアフリーのeukaryote-made Taq polymeraseの安定供給ができる体制を共同研究者である北海道三井化学株式会社が確立した。細菌由来16S ribosomalDNAをプライマーにテンプレートにeukaryote-made Taq polymeraseを利用したリアルタイムPCRを構築した。細菌からDNA抽出課程ならびにプライマーの細菌DNAコンタミネーションフリーシステムの構築が完成した。血中細菌数定量化について、検討したが16S ribosomalは細菌によりコピー数が大きく異なることより他の測定箇所の検討を行っている。3)は16S ribosoma7箇所のリアルタイムPCR増幅産物からTm値を算出するTmマッピング法を構築し、ATCC等から得られた細菌標準株のTm値を検討し、100菌種のデータベースを作成した。4)は、1分子蛍光相関法を利用したリンパ球からのNFーκB活性定量測定法プロトコールを作成しその成果を公表した(PLos ONE8(9)e75579,2013)。5)は敗血症症例約50例の解析と胎児子宮内感染症迅速診断を目的に羊水検体測定を病院検査に導入している。高感度かつ迅速に敗血症等の起因菌を同定するシステム開発を引き続き行った、1)16S ribosomalnested PCRを施行し、PCR産物のTm値より起因菌を同定するTmマッピング法の検出精度を向上させ、臨床検体からの評価を実施した。敗血症が疑われた患者全血液200検体を検討し、85.5%(171/200)検体がPCRによるTmマッピング解析と通常の血液培養結果(陽性と陰性両者)と一致した。130検体がTmマッピング法で陰性であり、そのうち128検体(128/130、98.5%)が培養法でも陰性であった。70検体がTmマッピング法で陽性であり、そのうち59検体が起炎菌を同定し、シーケンサーによる遺伝子配列解析と100%マッチしていた。以上より、本Tmマッピング法の検出精度の高さが確認できた。3)子宮内感染症において、羊水中の細菌、真菌、マイコプラズマ、ウレアプラズマに対して、本eukaryote made Taq plolymeraseを用いたリアルタイムPCR法による検出プロトコールを確立し、子宮内感染症が疑われた臨床検体で検討した。羊水300検体での解析結果は、検出レベル(陽性と陰性)は、マイコプラズマが93.3%(280/300)、ウレアプラスマが94.3%(263/300)、他の細菌が89.3%(263/300)で培養結果と一致した。228検体はPCR法で陰性であり、224検体(224/228,98.2%)が培養検査でも陰性であった。以上より、PCRを基にした羊水検査は、マイコプラズマ、ウレアプラズマが培養法が困難で時間がかかることを考慮すれば、感染症を迅速に否定できるという利点が高い。4)一分子蛍光相関法による転写因子NF-kB活性化定量測定法に関してオリンパス社MF20.機器を利用した解析プロトコールを構築し、膵臓手術等の大手術時におけるモニターとしての有用性のデータを蓄積している。臨床検査本研究計画になる敗血症検査システムを構築するために、1)検体サンプリング、2)安定したバクテリアフリー状態での起因菌迅速測定法、3)起因菌同定解析用データベース構築、4)SIRS迅速病態解析のためのFCS法を基盤にした迅速NFーκB活性化定量開発、5)臨床検体を用いた検証の5段階がいずれもバランスよく予定以上に進行している。すでの1)、2)は研究が完了している。

3)についても完了し既に学会報告は終わり論文執筆中の段階にある。4)については論文として公表することができ、FCS法を利用した転写因子解析法についてのスタンダードプロコトールを供することができた。現在は高血圧患者や糖尿病、メタボリックシンドローム等の慢性疾患の病態解析の研究へと発展している。5)については、胎児子宮内感染症迅速診断としてマイコプラズマ、ウレアウラズマ感染と細菌感染を区別できる羊水検体測定の臨床治験を遂行している段階に至っていることは当初の研究計画以上の進展であると評価できる。平成25年度が予定の計画以上に進展できたため、このまま継続して2年終了時には予定以上の成果が期待できる。とくに、1バクテリアフリーの細菌感染診断システムが構築できた成果は大きい。すなわち、細菌感染存在の否定診断(細菌感染がないという診断)が下せることは臨床的意義が大きい。この診断システムは、飲料水や環境水、食品、さらに医療器具洗浄など敗血症診断以外の領域へ発展できる可能性を検討してゆく。具体的には、コンタクトレンズ洗浄水の細菌存在診断をすでに検討開始している。2)この検査システムは微量検体での検討が可能であるため眼科感染症とくに眼房水中のバクテリア感染診断の検討を予定している。3)細菌DNAコピー数から血液サンプル中の細菌数を定量化する検査法の開発を行う。そのためにはデータベースから全ての細菌に1コピーしか存在しない標的遺伝子を検索し、その領域を特異的に増幅するプライマー設定等を検討中である。以上、平成26年度には当初計画以上の内容を含め一層の研究を実施してゆく。
磁気分離複合光触媒を用いた下水処理水中医薬品の太陽光活用型除去技術の開発

高シリカY型ゼオライト(HSZ-385)と酸化チタン(TiO2)の複合材料を調製し、下水処理水中で複合材料はTiO2単独の場合より効果的に医薬品スルファメタジン(SMT)を除去できることを示した。次に、磁気分離複合光触媒(TiO2/HSZ-385/マグネタイト)を調製し、磁石での回収、HSZ-385と同程度の吸着容量、模擬太陽光による光触媒分解を確認した。以上より、磁気分離複合光触媒の開発および処理性能評価を完了できた。光触媒、吸着剤、磁性粒子を複合した磁気分離複合光触媒による太陽光活用型の医薬品処理技術の開発を目指し、合成抗菌剤スルファメタジン(SMT)を対象とした研究を行った。実験では太陽光活用を想定し、ブラックライトをUV光源とした。超純水および下水二次処理水を用いてpH7に調整したSMT溶液に高シリカY型ゼオライト(HSZ-385)、酸化チタン(TiO2)およびこれらの複合材料を適用し、SMTの吸着・分解特性を検討した。HSZ-385を吸着剤として使用した場合、二次処理水中のSMTは急速に吸着され、10分以内に吸着平衡に達した。TiO2によるSMTの分解速度は、超純水中と比較して二次処理水中では遅く、二次処理水中のイオンや有機物による阻害が示された。複合材料(10 mg)を適用した場合には、二次処理水中のSMT(10 μg/L、50 mL)の76%が2時間で光触媒分解された。SMTが複合材料中のHSZ-385に選択的に吸着されることにより、二次処理水中の共存物質による阻害影響は緩和され、その結果二次処理水中で複合材料はTiO2単独の場合と比較して効果的にSMTを除去できることが明らかになった。次に、磁気分離複合光触媒(TiO2/HSZ-385/磁性粒子)を調製し、これが磁石で回収できること、吸着容量も純粋なHSZ-385と同程度なことを確認した。超純水で調整したSMT溶液50 mL(10 mg/L)をpH7に調整後、複合光触媒50 mgを加え、UVを照射して吸着・光触媒活性を評価した。吸着により水中からSMTが除去された後に、UV照射にともない触媒中のSMT量は緩やかに減少し、6時間のUV照射で約75%のSMTが光触媒作用により分解された。以上より、太陽光活用型の医薬品処理技術の開発に向けた磁気分離複合光触媒の調製および処理性能評価を完了できた。光触媒による医薬品分解と共存物質の影響評価では、合成抗菌剤として使用され、下水二次処理水中での報告事例があるサルファ剤スルファメタジンを対象とし、酸化チタンによる分解を試みた。下水二次処理水中での処理を想定して低濃度(10 μg/L)の水溶液を処理し、光触媒反応による分解を確認した。また、二次処理水中のイオンおよび有機物が分解速度におよぼす影響を調査したところ、有機物による影響が明らかとなったが、酸化チタンによってほぼ分解可能であることが示された。吸着材選定では、高シリカ型ゼオライトを吸着材として用い、酸化チタンと同様に、共存物質や濃度による影響を調査した。低濃度のスルファメタジンに対しても吸着作用を示した他、吸着速度も極めて速く、約30分で平衡に達することも明らかとなった。また、二次処理水中で吸着試験を行い、イオンや溶存有機物は吸着に影響しないことを確認した。酸化チタン/ゼオライト複合触媒の合成では、上記2項で吸着効果が確認された高シリカゼオライト上に酸化チタンを合成し、酸化チタン/ゼオライト複合体を調製した。スルファメタジンの分解に供したところ、吸着材の効果により速やかにスルファメタジンを除去され、吸着されたスルファメタジンも光触媒効果によって分解されていた。また、酸化チタンと高シリカゼオライトを別々に併用した系より除去効率が高く、合成により酸化チタンとゼオライトが協奏的に機能していることが示唆された。磁性粒子合成では、酸化チタン存在下で磁性粒子であるFe3O4を合成した光触媒/磁性粒子複合体を調製した。酸化チタンに対して10wt%の磁性粒子を担持した複合体粒子を用い、磁石との間に作用する磁力を評価した。合成した複合体の光触媒活性を調査したところ、純粋な酸化チタンと比較して活性が若干低下していたが、これは合成時に粒子が合成したことに起因していると考えられる。交付申請書に記載の平成23年度研究項目のうち、1)各種複合材料の基本性能評価については、「ゼオライトへの吸着特性評価」、ならびに「酸化チタンによる光触媒分解と影響因子」のいずれもおおむね当初目的を達成した。

2)磁気分離型複合光触媒の合成条件の検討に関しては、「対象医薬品に応じた酸化チタンーゼオライト複合材料の調製」を完了するとともに、「固液分離特性の評価」の基礎となる磁力の評価を完了していることから、現在までの達成度として「(2)おおむね順調に進展している。」と自己評価した。平成23年度に発注した固相抽出装置の納期が遅れ4月納品の予定となったこと、平成23年度3月分の研究員人件費は4月に支払われるために平成23年度に支出されなかったこと、3月に購入した消耗品の支払い手続きが4月になったこと、消耗品の使用量が当初予定より若干少なかったこと、等により上記の繰越しが生じた。平成23年度からの繰越額1588939円と平成24年度配分金額1100000円の合計2688939円を平成24年度に以下の用途に使用する計画である。年度当初に固相抽出装置を購入するとともに、消耗品類として、研究遂行に必要最小限な医薬品分析用固相抽出カートリッジ、LC/MS/MSの消耗品、試薬類、ガラス器具等を購入する。また、研究成果を論文発表するための論文校正、論文投稿料を計上している。国際学会発表および国内学会発表のための旅費を使用するとともに、研究推進のための人件費・謝金を支出する。
血管内皮細胞におけるチロシンキナーゼSykの機能解析

チロシンキナーゼSykは血球系・免疫系細胞に発現する免疫受容体の特異的な初期反応に関与するシグナル分子と考えられているが、Syk欠損マウスの解析の結果、成熟Bリンパ球の欠損のみならず、微小血管からの出血と浮腫および生後直後の致死が観察された。この現象は血球系細胞の機能不全のみでは解釈不能であり、現在、全く原因不明である。そこで、我々はSyk欠損で観察された微小血管からの出血と浮腫は、血管内皮細胞の機能不全によるのではないかと血管内皮細胞におけるSykの機能の解析を試みた。方法としては、Syk欠損マウスの微小血管における出血、血管拡張、浮腫などの原因と考えられる血管内皮細胞の電子顕微鏡レベルによる解析を前年度より継続して行った。その結果、Syk欠損マウスの血管内皮細胞の形態観察において野生型と比較して著しい発達異常および細胞死が認められた。さらに、血管内皮細胞の増殖・修復におけるSykの役割を解析を進めたところ、血管内皮細胞(HUVECs)の増殖刺激によりSykの発現誘導が観察された。、Syk並びにSykドミナントネガティブのアデノウイルスを作製し、HUVECsへのこれらの影響を調べたところ、Sykドミナントネガティブのアデノウイルス感染による過剰発現によりHUVECsの増殖および修復能への著しい抑制効果が認められた。以上の結果よりSyk欠損マウスで観察された微小血管からの出血、血管拡張、浮腫などの原因が血管内皮細胞であることが強く示唆された(Yanagi et al. Blood,2001)。Sykは血球系・免疫系細胞に発現する免疫受容体の特異的な初期反応に関与するシグナル分子と考えられているが、Syk欠損マウスの解析の結果、成熟Bリンパ球の欠損のみならず、微小血管からの出血と浮腫および生後直後の致死が観察された。方法としてまずSyk欠損マウスの微小血管における出血、血管拡張、浮腫などの原因と考えられる血管内皮細胞を電子顕微鏡レベルにて詳細に比較検討した。さらに、Sykドミナントネガティブのアデノウイルスを作製し、血管内皮細胞の増殖・修復におけるSykの役割を解析した。その結果、血管内皮細胞(HUVECs)の増殖刺激によりSykの発現誘導が観察された。また、Sykドミナントネガティブのアデノウイルス感染による過剰発現によりHUVECsの増殖および修復能への著しい抑制効果が認められた。これらの結果よりSyk欠損マウスで観察された微小血管からの出血、血管拡張、浮腫などの原因が血管内皮細胞であることが強く示唆された。今後、さらに血管内皮細胞におけるSykの役割を分子レベルで解析したい。
植物における光による核内転写誘導の分子機構の解明

1.光に応答した転写調節機構の解析前年度に引き続き、植物特異的に見出され、機能が不明であったTFIIB型の基本転写因子pBrpの機能解析について、単細胞紅藻シゾンを主に用いて進めた。その結果、pBrpは植物一般に、核においてRNA polymerase I(Pol I)と共に、rDNAの転写に正に貢献する基本転写因子である事を明らかにした[Imamura et al.,(2008)EMBO J.]。真核生物の祖先は、現在の古細菌の様に、1種類のRNAポリメラーゼとTFIIB型の基本転写因子を用いてrDNAの転写を行っていたと考えられている。しかし、真核生物の内、植物以外の酵母や哺乳類においては、Pol Iと機能するTFIIB型の基本転写因子は存在しない事が明らかになっている。よって、pBrpの機能を明らかにする事により、(i)真核生物におけるリボソーム合成酵素系の進化の道筋、そして(ii)植物独自の転写制御機構の一端を明らかにする事に成功した。2.窒素代謝に関わる転写因子の解析初年度に同定した、窒素枯渇下(-N)において、転写量と蛋白質量が顕著に誘導される転写因子CmMYB1についての機能解析を更に進めた。クロマチン免疫沈降・ゲルシフト解析の結果、CmMYB1が-N特異的に窒素同化遺伝子群のプロモーターに特異的に結合している事を明らかにした。また、CmMYB1遺伝子破壊株を作製し、-Nにおいて誘導される窒素代謝に関わる転写産物量を調べた結果、それらの転写産物の誘導は完全に消失した。これらの事から、CmMYB1が窒素代謝に関わる正の転写因子である事が明らかになった(Imamura et al.,submitted)。本研究は、植物において、窒素代謝に不可欠な転写因子を初めて同定したものである。本年度は、研究を進める上で基盤となる実験材料の調製や各種実験法を確立し、それらを用いて転写調節因子の機能解析を行った。1.基盤整備核ゲノムにコードされる転写因子の発現、局在、クロマチン免疫沈降実験、免疫沈降実験等の解析を行う目的で、全転写因子約80種に対する抗体の作製を目標に進め、現在までに41個の作製を完了、更に作製した抗体を用いた上記実験系の確立を完了した。また、単離した核・葉緑体・ミトコンドリアを用いたRun-on転写実験系の確立と5'-MPSS法を用いた転写開始点の網羅的な決定・データベース化を行った。2.光に応答した転写調節機構の解析光に応答した転写調節機構の解析においては、リボゾームRNAの転写制御に焦点を当てて解析を行っている。現在までに、核・葉緑体・ミトコンドリアにおける各新規リボゾームRNA合成が光照射により開始される事を見出し、更には核のリボゾーム合成に関わる新規転写調節因子を分子遺伝学・生化学的手法にて同定した。3.窒素代謝に関わる転写因子の解析窒素代謝に関わる転写因子を同定する目的で、窒素枯渇下から回収したRNAを用いてDNAマイクロアレイ解析を行なった結果、窒素枯渇条件2時間後においてMYB型転写因子遺伝子(MYB-1)の発現が誘導される事が明らかになった。また、MYB-1の蛋白質レベルも窒素枯渇条件下で顕著な誘導が観察され、それらの核への局在が観察された。クロマチン免疫沈降・ゲルシフト解析の結果、MYB-1が窒素枯渇下特異的に窒素同化遺伝子群のプロモーターに結合している事が明らかとなり、MYB-1が窒素代謝に関わる正の転写因子である事が明らかになった。本年度は、研究の基盤整備を前年度より続けると共に、既に確立した実験系を用いて、標的転写因子について、標的転写因子についての機能解析を行った。1.基盤整備前年度に引き続き、核ゲノムにコードされる転写因子の発現、局在、クロマチン免疫沈降実験、免疫沈降実験等の解析を行う目的で、全転写因子約80種の抗体作製を目標に進めている。現在までに、約70個の抗体作製が完了している。2.光に応答した転写調節機構の解析光に応答した転写調節機構の解析においては、リボゾームDNA(rDNA)の転写制御に焦点を当てて解析を行っている。現在までに、核においてRNA polymerase I (Pol I)と共にrDNA転写に貢献する、"植物特異的に見出される新規基本転写装置"を同定し、その特徴付けを行なった。酵母や哺乳類において、当該因子のホモログは、Pol IIとPol IIIと共に機能している事が明らかになっている。よって、植物に特異的に見出される当該因子の解祈結果は、植物独自の転写制御機構の-端を明らかにすると共に、進化的観点からも重要な知見であると考えられる。上記解析に加えて、核・葉緑体・ミトコンドリアにおける各新規rRNA合成が、どの様に統御的に制御されているかについての解析も行った。構築したRun-on転写解析系と各種阻害剤を用いた解析により、統御的な伝写制御に関わるシグナルや、中心的な制御因子の同定に成功しており、制御の全体像が明らかになりつつある。3.作製した抗体を用いた解析作製した抗体と、様々な環境条件から回収した蛋白質サンプルを用いて、ウェスタン解析を行った。そのスクリーニング実験の中で、細胞周期のM期特異的に誘導が認められる転写因子を同定する事に成功した。今後は、当該転写因子のM期特異的遺伝子発現への関与を解析する事を予定している。光に応答した転写調節機構の解析においては、リボゾームDNA(rDNA)の転写制御に焦点を当てて解析を行っている。

現在までに、核においてRNA polymerase I (Pol I)と共にrDNA転写に貢献する、"植物特異的に見出される新規基本転写装置"を同定し、その特徴付けを行なった。酵母や哺乳類において、当該因子のホモログは、Pol IIとPol IIIと共に機能している事が明らかになっている。よって、植物に特異的に見出される当該因子の解祈結果は、植物独自の転写制御機構の-端を明らかにすると共に、進化的観点からも重要な知見であると考えられる。上記解析に加えて、核・葉緑体・ミトコンドリアにおける各新規rRNA合成が、どの様に統御的に制御されているかについての解析も行った。構築したRun-on転写解析系と各種阻害剤を用いた解析により、統御的な伝写制御に関わるシグナルや、中心的な制御因子の同定に成功しており、制御の全体像が明らかになりつつある。3.作製した抗体を用いた解析作製した抗体と、様々な環境条件から回収した蛋白質サンプルを用いて、ウェスタン解析を行った。そのスクリーニング実験の中で、細胞周期のM期特異的に誘導が認められる転写因子を同定する事に成功した。今後は、当該転写因子のM期特異的遺伝子発現への関与を解析する事を予定している。1.光に応答した転写調節機構の解析前年度に引き続き、植物特異的に見出され、機能が不明であったTFIIB型の基本転写因子pBrpの機能解析について、単細胞紅藻シゾンを主に用いて進めた。その結果、pBrpは植物一般に、核においてRNA polymerase I(Pol I)と共に、rDNAの転写に正に貢献する基本転写因子である事を明らかにした[Imamura et al.,(2008)EMBO J.]。真核生物の祖先は、現在の古細菌の様に、1種類のRNAポリメラーゼとTFIIB型の基本転写因子を用いてrDNAの転写を行っていたと考えられている。しかし、真核生物の内、植物以外の酵母や哺乳類においては、Pol Iと機能するTFIIB型の基本転写因子は存在しない事が明らかになっている。よって、pBrpの機能を明らかにする事により、(i)真核生物におけるリボソーム合成酵素系の進化の道筋、そして(ii)植物独自の転写制御機構の一端を明らかにする事に成功した。2.窒素代謝に関わる転写因子の解析初年度に同定した、窒素枯渇下(-N)において、転写量と蛋白質量が顕著に誘導される転写因子CmMYB1についての機能解析を更に進めた。クロマチン免疫沈降・ゲルシフト解析の結果、CmMYB1が-N特異的に窒素同化遺伝子群のプロモーターに特異的に結合している事を明らかにした。また、CmMYB1遺伝子破壊株を作製し、-Nにおいて誘導される窒素代謝に関わる転写産物量を調べた結果、それらの転写産物の誘導は完全に消失した。これらの事から、CmMYB1が窒素代謝に関わる正の転写因子である事が明らかになった(Imamura et al.,submitted)。本研究は、植物において、窒素代謝に不可欠な転写因子を初めて同定したものである。
微細構造表面を誘起するスキン層の科学の開拓

申請者は、アニオン性高分子によるキトサンフィルム表面のイオン架橋で生成する『イオン架橋型スキン層』が、様々な形態やサイズのリンクル表面を誘起することを発見した。リンクルの形態とサイズは、スキン層の特性(構造、弾性率、厚み)に依存することが知られているが、この系でのこれらの関連性は未解明である。そこで、本研究ではイオン架橋型スキン層が誘起するリンクルの形態とサイズを制御する方法論の確立を目的に、『スキン層の弾性率と厚みがリンクルサイズに及ぼす影響』と『スキン層の構造がリンクル形態に及ぼす影響』を解明する。
質量顕微鏡による高空間分解能分子動態解析

従来、レーザーを用いた質量顕微鏡測定は動物組織内での代謝物・糖類・脂質類・タンパク質類などの空間分布を計測することに用いられており、植物組織に対して適用することは難しかった。本研究課題では、植物組織に質量顕微鏡技術を適用することを目的として、高分解能高精度質量顕微鏡装置(ハードウエア及び制御ソフトウエア)の開発を実施した。その結果、植物組織切片だけでなく、これまでに適用がさらに難しかった肉厚の植物組織を直接分析することに成功した。質量顕微鏡測定から生ずる数百GBにも及び巨大なデータをプロセスし、そこから代謝物などの分布と種類に関する情報を抽出するためのソフトウエアの開発にも成功した。本研究において開発を行う質量顕微鏡のベースになる顕微MALDI-FTMS装置は12T超電導磁石に組み込まれていたが、このマグネットが使えなくなったため、これを隣の9.4T超電導磁石の裏側に移動し、既存の9.4T-FTMSと切り替えて使用できるようにセットアップした。顕微MALDI-FTMS装置では、装置内部の真空下に置いた薄切試料にビデオ顕微鏡下で小さく絞った紫外レーザー光をピンポイント照射して、生成したイオンを超高分解能・超高精度質量分析することが出来るが、これを質量顕微鏡として動作させるため、薄切試料を水平XY方向に微小精密スキャンする必要があった。本年度、このためのハードウエア及びソフトウエアの改造を行った。試料ステージ位置をクローズドループ制御する「サーボモーターステージ」に改造し、試料の位置をサブミクロンオーダーで精密に制御できるようにした。また、レーザースポットの面積を劇的に縮小化するために原子間力顕微鏡プローブを利用するが、検出感度を大幅に向上させるためにプローブ制御システムを電気的に他の部位と電気絶縁し、プローブ表面の電位を高電圧にフロートさせるための装置改造を実施した。この他、植物組織を凍結下でサブミクロンの厚みに薄切するための凍結ミクロトームシステムを導入し、質量顕微鏡測定に適した試料調整法に関する研究を開始した。以上のとおり、本年度は、質量顕微鏡装置実現に向けてのハードウエア・ソフトウエア開発及び凍結ミクロトームによる薄切試料作製及びマトリクス噴霧条件の詳細な検討を行う環境整備を実施した。シロイロナズナの葉をテスト試料として、質量顕微鏡観察のための試料調製法を確立した。植物組織には細胞壁があり、細胞壁を取り除かないと細胞内部の物質にアクセスが出来ない。しかし常温下で細胞壁を取り除くと膨圧によって細胞が破裂してしまう。このため植物組織を急速凍結固定して極低温下で薄切し、細胞壁を取り除き細胞内部を露出させた状態で乾燥試料を作成する必要がある。本年度はこのための手法、つまり(1)急速凍結法、(2)極低温薄切法、(3)氷温凍結乾燥法に関して検討を行い、シロイロナズナの葉の40ミクロン厚の乾燥切片を作成することに成功した。この乾燥切片にネガティブモードで有機酸を検出することが出来ることが報告されているマトリクス物質を吹きかけて乾燥させたのちに質量顕微鏡測定を行うが、マトリクス塗布法に関しても蒸着法、スプレー法を様々な条件で適用し評価を行った。質量顕微鏡装置に関して、試料ステージを微小精密制御するための改造及び制御ソフトウエアの開発を行い、11mm×11mmのITO導電性コートを施したスライドガラス状に張り付けた植物組織切片の光学画像上で質量顕微鏡観察を行う領域を指定し、自動的にスキャンして質量分析を行うための制御ソフトウエアを開発した。これにより、より簡便な操作で質量顕微鏡測定を行うための環境整備に成功した。全固体紫外線パルスレーザー(波長355nm)を光ファイバーに入射し、反対端から出射されるパルス光を大口径カセグレン鏡に入射し、ファイバーコア径の約4分の1のスポット径にレーザー光を集光できる光学系を用いているが、よりコア径の小さい特殊な光ファイバーを用いることで、レーザー集光スポット径を格段に小さくすることに成功し、高精密化した試料ステージと組み合わせることで、1020ミクロンの空間分解能で質量顕微鏡測定を行う事に成功した。質量顕微鏡装置の測定スループットを大幅に向上させる目的で、これまで使用していた100Hz発振の紫外パルスレーザーを1KHz発振できるタイプのレーザーに置き換えた。これに伴い、これまで用いていた光ファイバーとカセグレン鏡を用いた紫外パルス光伝達及び集光光学系が全く使えなくなってしまったため、新規に空間伝搬系及びUV用対物レンズを用いたパルス光伝搬及び集光光学系を設計し、実装することに成功した。紫外パルスレーザー及び伝搬・集光光学系を新規に実装するために、質量顕微鏡用イオン源制御ソフトウエアの大幅な改変にも取り組んだ。これによって、これまで10000点の質量スペクトル測定及びデータ取得におよそ24時間かかっていたところを、約3分の1の8時間程度で質量顕微鏡測定を終えることができるようになり、測定のスループットを大幅に向上することに成功した。

改良したハイスループット質量顕微鏡装置を用いて、計画研究班、公募研究班との有機的な共同研究を大幅に促進することができた。シロイヌナズナをはじめとした様々な植物試料にたいして、地上部、地下部など異なる組織の質量顕微鏡測定を実施した。ハイスループット質量顕微鏡装置により、短時間に生み出される膨大なデータを解析するためのデータ解析ソフトウエアの開発・改良も積極的に実施した。一回の測定で得られる200GB以上の生データを加工してファイル容量を500分の1程度まで減少させたデータを読み込み、様々な質量を持つ分子イオンごとの二次元分布を表示し、特異的な局在性を示すイオンを探索するためのソフトウエアの開発に成功した。○質量顕微鏡装置の改良による測定スループットの大幅な向上を行った。平成25年度までに開発を行った質量顕微鏡装置のイオン源部分を改造し、従来は真空中に一枚しか入れることのできなかった植物サンプルを貼り付けた導電性ガラススライド(11mmx11mmx0.7mm)を、一度に8枚まで入れることができるようにした。これによりサンプルの入れ替えのたびにイオン源の真空を落とし、再度真空を立ち上げることなく、8枚のサンプルを切り替えながら質量顕微鏡測定を行うことができるようになった。これに伴い、質量顕微鏡の制御用ソフトウエアの改良も実施した。8枚のサンプルはアルミで作成した円盤状のプレートの円周部分に装着され、プレートを、エンコーダー付きの超音波モーターで正確に回転させたのち、サンプルステージを測定位置まで挿入し、質量顕微鏡測定を実施する。測定終了後、サンプルステージを抜き、プレートを正確に回転させて次のサンプルに切り替えた後、再度サンプルステージを測定位置まで挿入して質量顕微鏡測定を行う。超音波モーターはグランド電位で動作するが、円盤状プレートに装着した導電性ガラスの表面には約300ボルトの静電圧を印加しなければならず、超音波モーターと円盤状プレートの間を完全に絶縁したうえで円盤状プレートの静電圧を印加する方式を開発した。この装置改造により、これまでサンプル交換時にかかっていた真空たち下げおよび真空立ち上げの時間(約数時間)を短縮することにより、多くの共同研究者が持ち込む測定サンプルの測定スループットを大幅に向上させることに成功した。これにより、他研究班との有機的な共同研究を促進し、植物生理学分野で有用な様々な研究を実施した。当初は波長3ミクロンの赤外レーザーを質量顕微鏡装置に組み込み、IR-MALDIによるマトリクスレス・イメージングを実現する計画であったが、使用予定であった赤外レーザーが故障し出力が大幅に低下したため修理を試みたが、メーカーから修理不能と判断された。紫外パルスレーザーをそのまま用いてマトリクスを塗布していない植物体の分析を試みたところ、細胞壁の薄い植物体の場合には切片を作らずにマトリクスレスで直接分析することが可能であることを発見した。これにより、凍結切片の作成が困難な植物体の直接分析に対する可能性が開けた。