hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛍光・発光イメージングによる神経－免疫シナプスの分子機能解析

当初は、これまで通り、プラスティックまたはガラス基板上で神経ー免疫シナプスの機能解析を行う計画であった。しかし、研究を進める過程で、より生体組織の硬さに近い環境下で細胞機能の計測を遂行することが重要であると考えるに至った。それには、発光イメージングでは、厚みのある細胞外マトリックス上での開口放出の検出が可能であることが分かったことも理由の一つになっている。今年度はハイドロゲル上での細胞応答を中心に解析を進めており、神経ー免疫シナプスの追究には至っていない。神経ー免疫シナプス形成過程における分子群の局在解析、および、マスト細胞の脱顆粒に果たす神経ー免疫シナプスの役割の追究を行い、神経原性炎症疾患に対する治療薬の新規標的分子の探索につなげる。ハイドロゲルなどの生体組織の硬さに近い細胞外マトリックス上での神経ー免疫シナプス形成過程における分子群の局在解析、および、マスト細胞の脱顆粒に果たす神経ー免疫シナプスの役割の追究を行い、神経原性炎症疾患に対する治療薬の新規標的分子の探索につなげる。他の研究と共通性の高い試薬・器具・用品などに関して、無駄のないように効率的に使用した結果である。翌年度も効率的に使用し、翌年度分と合わせて円滑な研究の遂行に活用する。翌年度は最終年度でもあり、集大成として、国際学会や原著論文での研究成果の公表に使用したい。
分子計算を用いた学習アルゴリズムの設計と応用

分子計算理論の構築として,DNA分子の濃度とDNA計算中のノイズやエラーとの関係を調べて,理論的な解析を行った.具体的には,DNA分子の濃度を適切に調節することにより,ノイズに頑強な近似的アルゴリズムが構築可能であることを理論的に証明し,それに基づいて近似的アルゴリズムの設計方法を開発した(Sakakibara,2001).帰納的学習アルゴリズムの設計として,ブール式の帰納的学習を効率よく行う分子計算アルゴリズムの開発した.具体的には,ブール式のDNA分子への符号化の方法と分子生物学実験操作を用いたブール式の評価方法を開発し,この方法とあわせてDNA計算の超並列性を用いることによって学習問題が効率よく解けることを示した(Sakakibara,2003).さらに,無細胞タンパク質合成系を用いたまったく新しい分子コンピュータの方式を提案した(Sakakibara & Hohsaka,2003).この方式は,有限オートマトンという計算モデルをタンパク質合成系と拡張コドンを用いて実現し,試験管の中でその計算を実行する新しいタイプのDNAコンピュータを提案するものである.タンパク質合成系を用いることにより,従来のDNAコンピュータにおいて最大の問題となっていた,DNA分子の水素結合を用いたハイブリダイゼーションという演算による精度の低さとエラーの多さを解決することができる.分子計算理論の構築として,DNA分子の濃度とDNA計算中のノイズやエラーとの関係を調べて,理論的な解析を行った.具体的には,DNA分子の濃度を適切に調節することにより,ノイズに頑強な近似的アルゴリズムが構築可能であることを理論的に証明し,それに基づいて近似的アルゴリズムの設計方法を開発した(Sakakibara,2001).帰納的学習アルゴリズムの設計として,ブール式の帰納的学習を効率よく行う分子計算アルゴリズムの開発した.具体的には,ブール式のDNA分子への符号化の方法と分子生物学実験操作を用いたブール式の評価方法を開発し,この方法とあわせてDNA計算の超並列性を用いることによって学習問題が効率よく解けることを示した(Sakakibara,2003).さらに,無細胞タンパク質合成系を用いたまったく新しい分子コンピュータの方式を提案した(Sakakibara & Hohsaka,2003).この方式は,有限オートマトンという計算モデルをタンパク質合成系と拡張コドンを用いて実現し,試験管の中でその計算を実行する新しいタイプのDNAコンピュータを提案するものである.タンパク質合成系を用いることにより,従来のDNAコンピュータにおいて最大の問題となっていた,DNA分子の水素結合を用いたハイブリダイゼーションという演算による精度の低さとエラーの多さを解決することができる.平成13年度の研究計画は,分子計算理論の構築とそれに基づく帰納的学習アルゴリズムの設計である.分子計算理論の構築として,DNA分子の濃度とDNA計算中のノイズやエラーとの関係を調べて,理論的な解析を行った.具体的には,DNA分子の濃度を適切に調節することにより,ノイズに頑強な近似的アルゴリズムが構築可能であることを理論的に証明し,それに基づいて近似的アルゴリズムの設計方法を開発した.本手法は,重みつき多数決アルゴリズムを基本に用いるものであり,正しい計算を行うDNA分子を増幅するというきわめて単純な戦略を用いる.また,この戦略を用いる近似的アルゴリズムが誤った出力を計算する確率を解析し,その確率が非常に小さいものであることを示した.帰納的学習アルゴリズムの設計として,ブール式の帰納的学習を効率よく行う分子計算アルゴリズムの基本的な設計を行った.具体的には,ブール式のDNA分子への符号化の方法と分子生物学実験操作を用いたブール式の評価方法を開発し,この方法とあわせてDNA計算の超並列性を用いることによって学習問題が効率よく解けることを示した.さらに,分子計算理論の構築で開発した,ノイズに頑強な近似的アルゴリズムを設計する手法を適用することにより,ノイズやエラーに頑強なブール式を学習する帰納的学習アルゴリズムの開発にめどが立った.また,膜の分割と結合による並列分子計算の方式や,新しいタイプの制限酵素を用いたDNA計算方式を開発し,分子計算理論の体系を充実した.平成14年度の研究計画は,平成13年度に引き続き,分子計算理論の構築とそれに基づく新しい分子計算アルゴリズムの設計である.まず,膜の分割と結合による並列分子計算の方式や,新しいタイプの制限酵素を用いたDNA計算方式を開発し,理論的解析を行った.さらに,DNAコンピュータの計算機シミュレータを開発し,これらの分子計算アルゴリズムの正当性を検査し,その時間的効率についても解析を行った.とくに,膜の分割と結合による並列分子計算の方式は,SATと呼ばれるNP完全問題を効率的に解くことが可能なことを確認したが,実際に分子生物学的実験手法を用いて実現するには,解決しなければならないいくつかの問題があることも判明した.次に,今年度から,転写,翻訳,代謝などの細胞内分子反応メカニズムを用いた新たな分子計算機構の開発を試みる研究を始めた.ポリメラーゼやリボゾーム,制限酵素などの細胞内のタンパク質合成メカニズムやリン酸化などの分子間反応を用いて,従来のDNA分子だけを用いた計算方法にとらわれない新しい計算手法を設計し解析することを目標とする.この研究により,従来のDNAコンピュータにおいて最大の問題となっていた,DNA分子の水素結合を用いたハイブリダイゼーションという演算による精度の低さとエラーの多さを解決することができる目処がたった.平成15年度は,最終年度にあたるため,3年間で得られた研究成果を論文としてまとめるとともに,昨年度より開発をはじめた無細胞タンパク質合成系を用いた分子コンピュータの方式の設計と実験を行った.そして,有効な結果が得られた.まず,無細胞タンパク質合成系を用いたまったく新しい分子コンピュータの方式を提案した(Sakakibara & Hohsaka,2003).

この方式は,有限オートマトンという計算モデルをタンパク質合成系と拡張コドンを用いて実現し,試験管の中でその計算を実行する新しいタイプのDNAコンピュータを提案するものである.タンパク質合成系を用いることにより,従来のDNAコンピュータにおいて最大の問題となっていた,DNA分子の水素結合を用いたハイブリダイゼーションという演算による精度の低さとエラーの多さを解決することができる.具体的には,入力文字をあるRNA部分配列にコード化し,有限オートマトンの状態もRNA部分配列にコード化する.これらのコード化された配列の最後に,受理されたか否かを検出するためにGFPレポート遺伝子を加える.次に,転移RNAがもつアンチコドンを用いて,有限オートマトンの状態遷移関数をコード化する.このように,入力文字列をコード化したRNA配列をメッセンジャーRNAとして,また拡張アンチコドンをもつ転移RNAを無細胞タンパク質合成系に加えて,タンパク質合成反応を実行する.このとき,入力文字列が正しい場合には,タンパク質合成が最後まで実行され,GFPタンパク質が合成されることにより発光が検出され,よって有限オートマトンはその文字列を受理したことを確認する.本提案手法の有効性を確認する実験を,大腸菌の無細胞タンパク質合成系と拡張コドンを用いて行った.そして有限オートマトンの実装システムが正しく動作することを検証した.一方,論理演算を実行するDNAコンピュータアルゴリズムの設計と解析を行った(Sakakibara,2003).具体的には,DNA計算の超並列的探索を用いて,計算論的学習における未解決問題であるブール式の学習問題を解く方法を提案し,理論的な解析を行った.
膵島の不均一性に基づく膵島機能制御機構の解析

膵島は均一な集団ではなく、形態的にも、さらにインスリン分泌能や膵β細胞増殖能においても不均一であり、それらは膵臓の解剖学的な空間的位置により規定されていることを見出した。膵臓の頭部と尾部の組織を比較したところ、通常食および代償性の膵β細胞増殖を認める高脂肪食負荷マウスの両者において、尾部の膵島では頭部の膵島に比べて膵α細胞の割合が3倍程度に有意に増加していることを見出した。また、体部の膵島は、尾部の膵島と同様の形態を示すことが明らかとなった。ソマトスタチンを産生するδ細胞を、頭部、体部、尾部でそれぞれ検討したところ、各膵島でδ細胞の割合に有意な変化は認めなかった。次に、pancreatic polypeptideを産生するPP細胞について解析を行った。PP細胞はα細胞とは逆に、尾部の膵島と比較して頭部の膵島で有意に増加していることが明らかとなった。さらに、通常食マウスならびに高脂肪食マウスのどちらにおいても、膵島のインスリン含量は有意な差は認めないものの、尾部の膵島では頭部の膵島に比べて有意にグルコース応答性インスリン分泌能が増加していることも観察した。膵島のサブタイプが膵β細胞の代償ならびに障害・治療反応性の過程における挙動について、高脂肪食負荷後における代償性の膵β細胞の量および増殖を解析したところ、尾部の膵島でのみ有意に増加し、頭部の膵島では有意な差は認めなかった。これより、高脂肪食負荷によるインスリン抵抗性により誘導される代償性の膵β細胞増殖は、尾部と頭部では異なることが示唆された。この時の膵島における遺伝子発現を解析したところ、CyclinD2やFoxM1等の代償性膵β細胞増殖に関与する遺伝子発現上昇も尾部の膵島特異的であった。上記の解析結果に加え、膵島機能の不均一性に関する分子基盤を明らかにすべく、同一マウスから採取した頭部および尾部の膵島を用いて、遺伝子発現マイクロアレイおよびプロテオミクス解析を施行した。頭部および尾部で特異的に発現上昇・発現低下する遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群の検証を単離膵島のqPCRで行ったところ、95%以上の高い再現性が得られた。頭部と尾部の膵島にて有意に発現変化のあった分子群でpathway解析を行ったところ、電子伝達系、酸化的リン酸化、TCAサイクル、解糖系、カルシウム制御等のインスリン分泌にかかわる経路の発現変化を認めた。さらには、インスリンシグナリング、EGFR経路、エストロゲン、セロトニン、MAPKと膵β細胞増殖にかかわる経路の発現変化も同時に認められた。さらに、アポトーシスやサーカディアンリズムの経路への関連性も示唆された。膵β細胞の分化や成熟化に関与する、MafAやNeurog3の発現が頭部と尾部で異なっていることから、膵β細胞の可塑性に頭部と尾部で差があることが考えられた。そこで、膵β細胞の可塑性について、トレーサー実験を検討を開始している。タモキシフェン誘導性に膵β細胞特異的(Ins1-Cre)にROSA26プロモーター下で安定的にGFPを発現する、膵β細胞トレーサーマウスを用いて、GFP陽性の膵β細胞が、非膵β細胞へ分化転換する際の膵島における不均一性を解析していく。

頭部と尾部の膵島にて有意に発現変化のあった分子群でpathway解析を行ったところ、電子伝達系、酸化的リン酸化、TCAサイクル、解糖系、カルシウム制御等のインスリン分泌にかかわる経路の発現変化を認めた。さらには、インスリンシグナリング、EGFR経路、エストロゲン、セロトニン、MAPKと膵β細胞増殖にかかわる経路の発現変化も同時に認められた。さらに、アポトーシスやサーカディアンリズムの経路への関連性も示唆された。膵β細胞の分化や成熟化に関与する、MafAやNeurog3の発現が頭部と尾部で異なっていることから、膵β細胞の可塑性に頭部と尾部で差があることが考えられた。そこで、膵β細胞の可塑性について、トレーサー実験を検討を開始している。タモキシフェン誘導性に膵β細胞特異的(Ins1-Cre)にROSA26プロモーター下で安定的にGFPを発現する、膵β細胞トレーサーマウスを用いて、GFP陽性の膵β細胞が、非膵β細胞へ分化転換する際の膵島における不均一性を解析していく。
リチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータの構築

まず,劣化していないリチウムイオン二次電池を対象として,種々の温度と充電状態のもとで交流インピーダンス特性を測定し,それを等価回路にフィッティングすることにより,等価回路の回路定数を決定し,劣化していない電池の過渡動作特性シミュレータを完成させた.次に,劣化も考慮したリチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータを完成させ,完成させたシミュレータによる計算結果をそれと対応する実験結果と比較することにより,本シミュレータは劣化電池に対しても十分な精度を有することを確認した.リチウムイオン二次電池を使用したハイブリッド自動車や小型分散電源用の蓄電装置の制御系を開発するためには,電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータが必要となる.しかし,リチウムイオン二次電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータについては,まだ開発されていないのが現状である.さらに,実用的なシミュレータであるためには劣化の影響も考慮されていることが必須であるが,そのようなシミュレータは構築の試みすらこれまでのところ皆無である.そこで,本研究では,リチウムイオン二次電池の劣化を考慮した過渡動作特性シミュレータを構築する.具体的には,以下の研究を行う.(1)劣化していないリチウムイオン二次電池を対象として,種々の温度と充電状態で交流インピーダンス特性を測定し,その過渡動作特性を模擬する等価回路を決定する.(2)測定した交流インピーダンス特性を等価回路にフィッティングすることにより,等価回路の回路定数を決定し,劣化していないリチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータを完成させる.(3)リチウムイオン二次電池の加速劣化試験を行い,劣化にともなう電池の特性変化を詳細に測定し,電池の簡便な劣化度判定試験手法を確立する.(4)劣化度判定試験の結果から劣化時の電池等価回路を推定する手法を確立し,劣化も考慮したリチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータを完成させる.まず,劣化していないリチウムイオン二次電池を対象として,種々の温度と充電状態のもとで交流インピーダンス特性を測定し,それを等価回路にフィッティングすることにより,等価回路の回路定数を決定し,劣化していない電池の過渡動作特性シミュレータを完成させた.次に,劣化も考慮したリチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータを完成させ,完成させたシミュレータによる計算結果をそれと対応する実験結果と比較することにより,本シミュレータは劣化電池に対しても十分な精度を有することを確認した.リチウムイオン二次電池を使用したハイブリッド自動車や小型分散電源用の蓄電装置の制御系を設計、開発するためには,電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータが必要となる。このことを考慮して,本研究では,リチウムイオン二次電池の劣化を考慮した過渡動作特性シミュレータを構築することを最終目的としており,本研究の初年度である今年度は,そのシミュレータの構築に必要となる電池の過渡動作特性を模擬する等価回路を,劣化していない電池を対象として決定した。具体的には,以下のことを行った。電池に微小な交流電流を加えて,それに対する端子電圧の応答を測定すると,電池内部の複素インピーダンスが計算できる(端子電圧に微小な交流電圧を重畳させて電流の応答を測定してもよい)が,その測定と計算を高周波から低周波まで種々の周波数で行い,複素平面上に軌跡を描いたものを電池の交流インピーダンス特性という。この軌跡中には抵抗と容量の並列回路で等価的に表現できる半円がいくつか重なったような部分があり,それが電極の反応抵抗と電気二重層容量を表しているので,本特性の詳細な分析により電極の良否が判定できる。そのため,この交流インピーダンス特性は,電池メーカーの開発者の間では従来から測定されていたが,それ以外の目的で使用されることはなかった。しかし,等価回路によりこの電池の交流インピーダンス特性を詳細に模擬することができれば,その回路は電池の過渡応答シミュレータとして使用することができる。このことを考慮して,本年度は,劣化していないリチウムイオン二次電池を対象として,種々の温度および充電状態のもとで交流インピーダンス特性を測定し,その結果を総合的に判断してリチウムイオン二次電池の過渡動作特性を模擬する等価回路を決定した。リチウムイオン二次電池を使用したハイブリッド自動車や小型分散電源用の蓄電装置の制御系を設計・開発するためには,電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータが必要となる.このことを考慮して,本研究では,リチウムイオン二次電池の劣化を考慮した過渡動作特性シミュレータを構築することを最終目的としている.本研究の2年目である本年度は,前年度に劣化していないリチウムイオン二次電池を対象として行った,種々の温度と充電状態のもとでの交流インピーダンス特性の測定により得られた結果と,やはり昨年度に形状を決定した電池の等価回路を利用して,劣化していない電池の過渡動作特性シミュレーションコードを完成させ,その妥当性の検証を行った.具体的には,以下のことを行った.まず,種々の温度と充電状態におけるリチウムイオン二次電池の交流インピーダンス特性の測定結果を,等価回路にフィッティングすることにより,等価回路中の各素子の値を温度と充電状態の関数として決定し,その等価回路に基づいて劣化していない電池の過渡動作特性を計算するシミュレーションコードを作成した.次に,電池の充電状態がほぼ一定の場合と徐々に変化していく場合について,電圧過渡応答のシミュレーション結果を実際の電池を用いて行った測定の結果と比較することにより開発したシミュレーションコードの精度についての検証を行った.その結果,充電状態の変化の有無に関わらず,電池端子電圧の過渡応答のシミュレーション結果は測定結果とよく一致し,今回開発したシミュレーションコードは劣化していないリチウムイオン二次電池の端子電圧の過渡応答を十分な精度で計算可能であることを確認することができた.

リチウムイオン二次電池を使用したハイブリッド自動車や小型分散電源用の蓄電装置の制御系を設計・開発するためには,電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータが必要となる.このことを考慮して,本研究では,リチウムイオン二次電池の劣化を考慮した過渡動作特性シミュレータを構築することを最終目的としている.前年度までの研究により,劣化していないリチウムイオン二次電池の過渡動作特性をシミュレートするための等価回路およびシミュレーションコードはほぼ完成したが,電池の性能は劣化により大きく変化するため,開発を目指しているリチウムイオン二次電池の過渡動作特性シミュレータには,この劣化の影響も考慮する必要があるしそこで,本年度の研究では,高温状態で電池の充放電を繰り返すことにより,電池の加速劣化試験を行い,劣化にともなうリチウムイオン二次電池の交流インピーダンス特性の変化を詳細に測定し,その結果を総合的に判断してリチウムイオン二次電池の簡便な劣化度判定試験手法を確立することを目的とした.具体的には,まず,電池を50°Cの高温環境下において定電流とパルス電流の2種類のモードで繰り返し充放電する加速劣化試験を行った.その際,劣化試験を途中で何度か中断し,その劣化状態での電池の容量と種々の温度と充電状態の場合における交流インピーダンス特性を測定した.この試験により,電池の劣化にともなう等価回路の変化は電池をどちらのモードで劣化させるのかに依存せずほぼ同じとなることを確認するとともに,温度と充電状態により決まる電池の状態ごとに,劣化にともなう電池の交流インピーダンス特性がどのように変化するのかを明らかにすることができた.さらに,得られた電池の交流インピーダンス特性の測定結果を精査することにより,リチウムイオン二次電池の簡便な劣化度判定試験手法を提案した.リチウムイオン二次電池を使用したハイブリッド自動車や小型分散電源用の蓄電装置の制御系を開発するためには,電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータが必要となる,しかし,リチウムイオン二次電池の過渡応答を考慮に入れた動作特性シミュレータについては,まだ開発されていないのが現状である.さらに,実用的なシミュレータであるためには劣化の影響も考慮されていることが必須であるが,そのようなシミュレータは構築の試みすらこれまでのところ皆無である.これらのことを考慮して,本研究では,リチウムイオン二次電池の劣化を考慮した過渡動作特性シミュレータを構築することを目的とし.平成21年度までに,以下の研究を行ってきた.(1)劣化していない電池を対象として,種々の温度と充電状態のもとで交流インピーダンス特性を測定し,電池の過渡動作特性を模擬する等価回路の構成を決定した.(2)測定した交流インピーダンス特性を等価回路にフィッティングすることにより,等価回路の回路定数を決定し,劣化していない電池の過渡動作特性シミュレータを完成させた.(3)電池の加速劣化試験を行い,劣化にともなう電池の交流
製鋼スラグと腐植様物質による藻場再生技術の確立とその導入設計手法に関する研究

本研究では、製鋼スラグと腐植様物質を利用した藻場再生技術の確立に向け、(1)腐植様物質(堆肥)が製鋼スラグからの鉄溶出と海藻生育に与える影響評価と(2)技術導入設計手法の確立に向けての検討を行った。(1)では、溶出試験と海藻培養試験を実施した結果、堆肥の種類によって鉄溶出特性は異なり、海藻生長に差が生じることが示された。(2)では、海藻群落形成モデルの改良と藻場再生が必要な海域への適切な技術導入に向けた海域環境調査を行い、事前評価から技術導入までのプロセスについて重要な知見が得られた。製鋼スラグと腐植様物質(鉄分供給ユニット)による藻場再生技術の確立に向けて、(1)異なる腐植物質での鉄溶出特性評価、(2)鉄の形態の違いによる海藻生育への影響評価、(3)海藻群落形成モデルの改良・確立の3項目に関する評価・検討を行った。(1)においては、アカシア、カラマツ、リンゴ、稲わらから作成した堆肥について、実証試験で使用されているバーク堆肥と合わせて鉄溶出試験を行った。試験では、溶存鉄、栄養塩(N,P)などの溶出量変化のほか、安全性の面から重金属の溶出に関する評価を人工海水を用いて行い、製鋼スラグに堆肥を添加することによる鉄溶出量促進に関するデータや鉄分供給ユニットからの鉄溶出量増加に向けた基礎的知見の蓄積をすることができた。(2)においては、フラスコを利用した海藻培養試験を実施し、人工海水および天然海水を用いて、Fe(III)-EDTAやFeCl_3、また上記の複数の堆肥を利用することによって、海藻生育への鉄形態の影響を評価した。実際の堆肥を利用した培養試験では種類による成長率の差がみられる結果も得られた。2年目の研究で更に検討を行うことで鉄形態の違いに関する定量的な評価ができると考えている。(3)については、栄養塩(N,P)と鉄の相互作用に関する評価を海藻培養試験などにより実施し、新たな知見を得ることができた。また北海道日本海側におけるモデル確立に向けて、(1)とも関連させて新たに北海道増毛町にて実海水を利用した水槽試験を行うこととし、その開始作業を実施した。一方で海域調査については、コンブ場以外の海域として三重と対馬を対象とすることを視野に入れて調査項目の検討を行い、実際に三重における海域調査を実施した。初年度は実験室内における基礎研究を中心とした結果が得られたが、これらを基に次年度以降の研究を実施することで本研究の目的達成に向けた成果が得られるものと考えている。藻場再生技術の確立に向け、(1)異なる腐植様物質での鉄溶出特性評価、(2)鉄の形態による海藻生育への影響評価、(3)海藻群落形成モデルの改良・確立の3項目について、初年度の研究成果を踏まえて評価・検討を行った。(1)においては、藻場再生実証試験が行われている海域の実海水を使った300Lの水槽での鉄分供給ユニット(製鋼スラグと腐植物質(堆肥))からの鉄溶出特性試験を実施した。この試験では、堆肥の役割を評価することを目的として鉄や栄養塩の挙動についてモニタリングしたほか、重金属の溶出についても評価・検討することで、環境基準値に照らした際の安全性についての確認を行った。(2)では、海藻生育への堆肥の添加効果を明らかにするために、実験室内における海藻培養試験を行った。試験では実際のユニットに使用されているバーク堆肥以外にもリンゴと稲わら由来の堆肥を製鋼スラグとの混合試料として利用したほか、フミン酸やサリチル酸などを標準鉄(塩化鉄(III))へ添加して培養試験を行った。その結果、堆肥ではリンゴが最もよい成長率を示したほか、鉄に添加する有機化合物の違いによって、海藻成長率に違いがあることが確認された。またこの試験では、(1)と関連させて鉄溶出と海藻成長の関係についてのデータ蓄積のために、培養前後の海水(培養液)中の鉄や栄養塩の分析も行った。(3)では、北海道日本海側海域での海藻群落形成モデルの適用に向け、特に栄養塩(N,P)と鉄の海藻生育への影響に関わる式やパラメータについての再検討とデータ収集を行った。その結果、N, Pと鉄の関係についてモデルの改良がなされたほか、モデルの確立に向けて必要な検討項目を整理することができた。一方で、三重県志摩市及び長崎県対馬市で海域環境調査を行い、北海道以外の海域へのモデルの適用や本技術の導入可能性についての基礎的知見を得ることができた。藻場再生技術の確立に向けて、「技術や効果に関する課題」と「導入設計手法に関する課題」に対して4つサブテーマに沿って研究を実施した。「技術や効果」の課題では、異なる腐植様物質を製鋼スラグと混合した際の鉄溶出特性と海藻生育への影響に関する評価を行った。

海藻連続培養装置を用いて海藻生育と鉄溶出特性の関係性を検討・評価したほか、前年度に引き続き北海道増毛町での鉄溶出(水槽)試験を行った。培養試験では、市販のフミン酸と製鋼スラグの混合割合を変化させた試料、更にリンゴ剪定枝由来の堆肥を添加した試料による培養および鉄溶出特性評価によって、鉄と錯形成する有機物質の存在とその種類が鉄溶出と海藻生育促進に重要であることが確認された。また標準鉄(塩化鉄(III))にフミン酸、サリチル酸、クエン酸を個別に添加した際の海藻生育の違いを評価した結果、有機物質の違いによる生長率の差が示され、鉄化学種の違いによって海藻生育促進に差が生じることが示唆された。「導入手法」の課題では、海藻群落形成モデルの改良と経済評価・導入設計手法の検討を実施した。モデルについては、北海道日本海側を対象として、実海域の栄養塩データや光合成試験の結果を踏まえて、栄養塩(N, P)と鉄の海藻生長への関係性を検討し、更なる改良を行った。また技術導入設計手法の確立に向けて、全国各地の藻場再生実証試験の効果に関する総合的な評価を行うための指標・項目を整理した。そして北海道増毛町での実証試験効果について、それらの項目に基づき、ウニの漁獲変化など経済評価も含めて、体系的な検討・評価を行った。また三重県志摩市および長崎県対馬市において、導入手法の確立と北海道以外の海域への技術適用に向けた海域環境調査を引き続き実施した。三重では、調査結果からその海域における最適な技術導入箇所を検討し、技術導入の事前調査として評価すべき項目のまとめを行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。環境化学工学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究においては初年度に「研究実績の概要」における(1)(3)の項目を遂行する計画であったが、(1),(2)についてはおおむね予定通りに実施できている。また(3)については、光合成試験は当初の実験計画を変更し年度後半より取り組んだが、それは必要なデータ蓄積を先に海藻培養試験により得ることにしたためである。また海域調査は若干の変更を伴ったが、水槽試験も新たに実施しており、全体としてはおおむね計画通りの研究の進展であると考えている。「研究実績の概要」に示した(1)(3)の各項目ともに概ね計画通りに進めることができたと考えている。(1)では、実海水を利用することで水質等の違いによる溶出特性について、鉄だけでなく、栄養塩及び重金属についてのデータを得ることができた。また(2)の海藻培養試験においては、製鋼スラグに添加する堆肥の違いによる試料からの鉄溶出挙動も評価していることから、鉄溶出特性と海藻生育の直接的な関係についての知見も得られた。なお(2)については、屋外水槽よりも実験室内での評価を続ける方が目的を達成できると判断されたため実験室内での実験を行ったが、それによって堆肥の種類、添加する有機化合物の種類による海藻生育の違いを体系的に評価することができた。特に精製されたフミン酸やサリチル酸などを使用した実験の結果については、鉄の形態による海藻生育への定量的評価に向けた重要なデータが得られたと考えている。(3)においては、鉄と栄養塩の海藻生育への相互作用についての評価を進めることができたことは、モデルの改良に向けた当初の予定に沿った成果であったと言える。またモデルの汎用化に向けた三重・対馬での海域環境調査も概ね予定通りに実施できている。これらの調査結果を踏まえて、実海域における海藻生育への鉄添加効果の検討を行うことが可能であり、次年度も引き続き調査・実験を実施する予定である。
AUTAC法による疾患原因のオートファジー分解

私たちの身体を構成する物質は、絶えず入れ替わる必要があり、細胞内分解の乱れや停滞は疾患や老化につながります。本研究では、細胞内に蓄積する有害物質を選択的にオートファジー分解する手法の開発を目指しています。これまでの研究で、AUTACと仮称する技術を確立しつつあり、本課題ではオルガネラの分解について重点を置いて研究します。また、次世代AUTACとなりうる優れた新手法の開発に挑戦します。
光プローブを用いたプラズマ中ラジカル粒子の空間分布の観察

受動的プラズマ診断法である発光分光分析法の短所である「測定領域がウインドウから観測できる範囲に限られる」という問題を解決した、光ファイバーケーブルと絶縁物細管により構成された光プローブを用いて、プラズマからの発光の空間分布の測定を試みた。発光の空間構造の測定原理は、従来プラズマ中の電子エネルギー分布関数を観測するために使用されている2ω法に準じた。すなわち、光プローブの位置を走引する際に、微少変動(x=xοsinωt)を重畳し二倍高調波成分を測定することにより微分波形(発光の位置分布)を観測する事を試みた。以下に、構築及び測定の際に発生した問題点を示す。1.光プローブは低気圧中に発生したプラズマ内を移動させる必要があるため、移動用真空ゲージポートとしてウイルソンシールを内蔵したゲージポートを作成した。このゲージポートは単に光プローブを移動させる際には問題はなかったが、振動を加えるとリ-クが発生してしまった。2.光プローブを振動させる際、プローブの先端がプローブの移動軸に平行に振動するだけでなく、垂直方向にも振動してしまい、微分波形の観測ができなかった。これはプローブの長さや材質を変質し、さらに移動用真空ゲージポートの遊びを無くす事により解決可能であると思われる。以上の問題により、2ω法を用いた空間構造の観測は行えなかった。そこで次善の方法として、光プローブを振動させることなしに走引して得られる出力を数値化し、計算により微分波形を得ることを試みた。測定の際のノイズが依然として多く数値微分は安定性に欠けているものの、リング型γfマグネトロン放電にこの方法を試みた結果、定性的には妥当と思われる結果を得ることができた。また、構築した発光分光分析システムは単にプラズマ中からの発光を測定するには有用であった。
チロシンキナーゼ阻害剤の感受性を予測するサロゲートマーカーの確立

本研究においでは、白血病に対するチロシンキナーゼ阻害剤の感受性を規定するサロゲートマーカーを同定し、かつ、臨床検体を用いて簡便・迅速に施行可能な検査系の確立を目的とした。中でも、我々が新規に開発したFLT3阻害剤を中心に検討を進めた。活性型FLT3変異を有するヒト白血病細胞株および臨床検体において、恒常的にSTAT5分子はリン酸化しており、このリン酸化状態は、抗リン酸化STAT5単クローン抗体によりウエスタンブロットのみならずフローサイトメーター(FCM)によっても定量化活性化可能であった。これら細胞株、臨床検体をFLT3阻害剤で1時間処理後、STAT5のリン酸化レベルの変化をFCMで定量化したところ、その減少率は細胞増殖抑制阻害作用と相関し、阻害剤の感受性を簡便・迅速に予測しうる事を明らかにした。更に、BCR/ABL陽性白血病細胞株やKITの活性化を示す細胞株においても、ABL阻害剤、KIT阻害剤で同様の検討を行うことにより、本検査系が有用であることを確認し、チロシンキナーゼ阻害剤の感受性を予測する上でSTAT5のリン酸化状態の変化は有力なサロゲートマーカーであることを明らかにした。しかし、臨床検体を用いた解析の中で、阻害剤単剤ではSTAT5リン酸化レベルの低下が不充分で増殖抑制効果も部分的であっても、他の異なるキナーゼ阻害プロフィールを有する阻害剤を添加することにより充分な増殖抑制効果を示す症例が存在する事を見出した。この結果は、白血病の治癒を得る上で、併用療法の必要性を強く示唆するものである。また、FLT3遺伝子変異の有無により白血病細胞におけるcKIT遺伝子や細胞の分化に関係するPU.1、C/EBPαの発現量を層別化してみると、多様な発現様式を示すと同時に一定度の傾向を示すことが明らかとなり、これらを組み合わせることにより、併用療法の選択における層別化の可能性を認識するに至り、更なる検討を加えている。
部位特異的組換え系を利用したビフィズス菌の腸内特異的発現遺伝子の探索

ビフィズス菌はヒトの健康に対して様々な有用効果を持つことが広く知られている腸内細菌であるが,それらの効果の分子レベルでの発現機構については,いまだ不明な点が多い.この機構を解明することを目的として,本研究ではビフィズス菌の染色体上への遺伝子導入技術の確立を行い,それを基盤として,腸内で特異的に発現するビフィズス菌の遺伝子を同定する系の構築を行った.本研究成果は,ビフィズス菌の持つ健康への有用効果に分子レベルでの根拠を与える上で重要であると考えられる.平成24年度は,Cre/loxP系を利用したR-IVET法の確立を目指して以下の実験を行った.1) loxP-SpR(スペクチノマイシン耐性遺伝子)-loxP配列のビフィズス菌染色体への導入:loxP-SpR-loxP配列の両端にB. longum 105-A株染色体上の遺伝子間領域の相同部位を付加した断片を,昨年度に構築したエリスロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドに連結し,染色体導入用ベクターを構築した.このベクターと昨年度確立した遺伝子導入法を用いて,元株であるB. longum 105-A株の染色体の標的領域にloxP-SpR-loxP配列の導入を試みた.結果として,二重相同組換えによりloxP-SpR-loxP配列が標的領域に導入された105-A::SpR株を構築することが出来た.導入した株の生育は元株と同等であり,当該配列の導入による生育への影響はないことを確認できた.2) Creリコンビナーゼ発現用プラスミドの構築:プロモーター領域の無いCre ORFを,ビフィズス菌シャトルベクター(クロラムフェニコール耐性:CmR)にクローン化した.さらに,ビフィズス菌ゲノムDNA断片の挿入が無ければCreが発現しないように,Cre ORFの上流には転写ターミネーターを挿入した.構築したCre発現用プラスミドを1)で構築した105-A::SpR株に導入し,得られた株においてCreが発現せず,2つのloxP配列間で部位特異的相同組換えが起こっていないこと,すなわちSp耐性が失われていないことを確認する.また,既知のプロモーターを連結したCre強制発現プラスミドも構築し,105-A::SpR株に導入する.これによりすべての導入株でSp耐性が消失していれば,Cre/loxP系が105-A株内で十分機能していることを確認できる.これらの検証を現在行っている.ビフィズス菌はヒトの健康に対して様々な有用効果を持つことが広く知られている腸内細菌であるが,それらの効果の分子レベルでの発現機構については,いまだ不明な点が多い.この機構を解明することを目的として,本研究ではビフィズス菌の染色体上への遺伝子導入技術の確立を行い,それを基盤として,腸内で特異的に発現するビフィズス菌の遺伝子を同定する系の構築を行った.本研究成果は,ビフィズス菌の持つ健康への有用効果に分子レベルでの根拠を与える上で重要であると考えられる.平成23年度はR-IVET法の確立に向けた予備検討とビフィズス菌染色体への遺伝子導入法の確立を行った.1.野生株Bifidobacterium longum 105-A株のマウス腸内での生存試験:野生株B. longum 105-Aがマウス腸内で生存可能であるかを明らかにするため,BALB/cマウスへ105-A株を経口投与し,糞便中の105-A株の生菌数を経時的にモニターした.10の9乗cfuの105-A株を経口投与したところ,105-A株は投与後6時間目に最も多く糞便中に検出され,その後24時間目まで糞便中に継続して検出された.この結果から,105-A株はマウス腸内で死滅せずに腸内を通過できることが明らかとなった.2.相同組換えによるビフィズス菌染色体上への遺伝子導入法の確立:R-IVET法の確立に向けて,親株であるB. longum 105-A株の染色体上へloxP-スペクチノマイシン耐性遺伝子(SpR)-loxP配列を導入する必要がある.そのため,二重相同組換え法による染色体上への遺伝子導入法を検討した.実際に2種類のベクターを用いて,染色体上の遺伝子に欠損変異を導入できたことから,105-A株の染色体上への遺伝子導入が可能であることが示された.3.新たな薬剤耐性マーカーを持つシャトルベクターの構築と評価:R-IVET法の確立に必要なCreリコンビナーゼ発現プラスミドを構築するためには,前述のSpR以外の薬剤耐性遺伝子が選択マーカーとして必要である.そのため,クロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)およびエリスロマイシン耐性遺伝子(EmR)を保持するシャトルベクター2種を新たに構築した.構築したベクターを105-A株に導入し,薬剤耐性を評価したところ,どちらの薬剤耐性遺伝子も105-A株にそれぞれの薬剤に対する耐性を付与できることが明らかになった.

平成23年度の研究の推移としては,おおむね順調に推移していると考えている.本研究では交付申請書の「研究目的」に記載した「R-IVET法の技術構築」の項目が最も重要な研究項目であるが,この技術構築の成否を分けると言ってもよい重要な基盤的技術である,ビフィズス菌染色体への遺伝子導入技術を平成23年度に確立することが出来た.二重相同組換え法を用いたこの遺伝子導入技術は,ビフィズス菌においてこれまで確立されていなかった技術であり,本研究によってこの技術の確立が達成できたことは大きな前進であると考える.また,親株として使用するB. longum 105-A株のマウス腸内での生存の確認,新たな薬剤耐性遺伝子としてCmRおよびEmRが使用可能であることを明らかにするなど,R-IVET法の技術構築において懸念されていた問題点を,平成23年度に行った研究により解決することが出来ている.平成24年度は,R-IVET法の確立と腸内特異的に発現する遺伝子の同定を目指して以下の実験を行う.1) loxP-SpR-loxP配列のビフィズス菌染色体への導入:昨年度に構築したEm耐性遺伝子を持つプラスミドをベースに,loxP-SpR-loxP配列の両端にビフィズス菌染色体の領域をクローニングした染色体導入用ベクターを構築する.このベクターと確立した遺伝子導入法を用いて,loxP-SpR-loxP配列を親株であるB. longum 105-A株の染色体に導入する.2) Creリコンビナーゼ発現プラスミドの構築:Cm耐性遺伝子を持つプラスミドをベースに,Creリコンビナーゼ発現プラスミドを構築する.Cre ORFの上流にB. longum 105-A株のランダムな染色体DNA断片を挿入したライブラリーを作成し,1)で構築したloxP-SpR-loxP配列導入株に導入する.3)腸内特異的発現遺伝子の同定:作成されたライブラリーの株を,マウスへ経口投与し,糞便から回収した投与株のSp耐性を調べる.これにより,Sp耐性を失った株を腸内特異的に発現するプロモーターを保持するクローンとして同定する.クローンに挿入されているDNA断片の塩基配列と,B. longum 105-A株のゲノム情報から,最終的に腸内で特異的に発現する遺伝子を導入する.研究を遂行する上での課題としては,CmおよびEm耐性遺伝子を持つベクターのビフィズス菌への形質転換効率が低い点があげられる.実際に1)および2)の系を効率よく確立するためには,CmおよびEm耐性遺伝子を持つベクターの形質転換効率を上昇させる必要がある.ゆえに昨年度作成したベクターについても,余分なDNA領域の削除やマーカー遺伝子の改良などの工夫を行う必要を視野に入れている.平成23年度に実施した遺伝子導入用ベクターの作成に使用した分子生物学試薬の購入費用の支払いに使用する.
量子ドット増感型次世代超高効率太陽電池用材料の創製

本研究課題では,量子ドット増感型太陽電池用材料として,半導体ナノ粒子と酸化物(またはセレン化物)から構成されるナノ複相薄膜材料の創製を目的とした.その結果, Ge/Nb_2O_5およびPbSe/ZnSe薄膜を提案し,一括して成膜された当該薄膜は良好に相分離し,半導体ナノ粒子の量子サイズ効果による可視光吸収性を発現する.また, Si基板上に成膜されたPbSe/ZnSeナノ複相薄膜は光電変換機能を発現し, PbSe濃度の減少と共に分光感度領域が可視光領域に拡張することを明らかにした.本研究課題では,量子ドット増感型太陽電池用材料として,半導体ナノ粒子と酸化物(またはセレン化物)から構成されるナノ複相薄膜材料の創製を目的とした.その結果, Ge/Nb_2O_5およびPbSe/ZnSe薄膜を提案し,一括して成膜された当該薄膜は良好に相分離し,半導体ナノ粒子の量子サイズ効果による可視光吸収性を発現する.また, Si基板上に成膜されたPbSe/ZnSeナノ複相薄膜は光電変換機能を発現し, PbSe濃度の減少と共に分光感度領域が可視光領域に拡張することを明らかにした.本年度は,半導体ナノ粒子およびマトリクスとして,様々な材料の組み合わせによる薄膜作製を系統的に行った.すなわち,材料設計として,スパッタリング法における生成熱離散型複合構造材料に加え,真空蒸着法における相分離型複合構造材料を考案した.具体的には,熱平衡バルク状態においてPbSeおよびZnSeは相分離することから,両化合物の一括同時成膜においても相分離型複合構造薄膜を形成することが予想される.そこで,量子ドット増感型太陽電池用材料として,PbSe/ZnSe複合構造材料を新規に提案し,熱平衡状態に近い真空蒸着法であるホットウォールデポジション(HWD)法を用いて,ガラス基板上に当該薄膜の作製を行った.この際,抵抗加熱用蒸発源としてバルク状PbSeおよびZnSeを用いた.その結果,PbSeおよびZnSeは薄膜中において良好に相分離することが確認された.また,薄膜中のPbSe濃度の減少と共に光吸収端が高エネルギー側にシフトすることから,PbSeの量子サイズ効果の発現が示唆されると共に,当該光吸収領域において光電流が生じることを確認した.また,スパッタリング法により,半導体ナノ粒子としてGe,マトリクス用材料としでWO_3から構成される複合構造材料の作製を行った.成膜時にはアモルファス構造を形成し,約723Kにおける熱処理によりマトリクスは結晶化する.成膜時の酸素分圧の増加と共にマトリクスはWO_2とWO_3の混合相からWO_3単相化する.さらに,量子ドット増感型太陽電池用の電極材料としてスパッタリング法による鉄酸化物薄膜の作製を行い,可視光領域において光吸収端を有するヘマタイト(α-Fe_2O_3)などの各酸化物相がGe微量添加により単相化することを明らかにした.本年度は,生成熱分離型および非固溶体型の材料設計により、半導体ナノ粒子およびマトリクスとして各種材料の組み合わせによる薄膜作製を行うと共に、前年度において得られた有望材料について光電的評価を行った。その結果、PbSe-ZnSe系非固溶型材料をホットウォールデポジション法により一括成膜した際、25-50nmサイズのPbSe粒子がZnSeマトリクス中に孤立分散し、明瞭に相分離する複合構造薄膜を形成するが明らかになった。また、p型Si基板上に作製したn型(PbSe/ZnSe)複合構造薄膜は光電変換特性を発現し、300-1100nmにおける光電流スペクトルは、PbSe濃度の増加と共にピーク位置が長波長側にシフトすることが明らかになった。また、成膜法としてスパッタリング法を用い、ナノ粒子としてGe,マトリクスとしてNb酸化物から構成される生成熱離散型複合構造薄膜を作製した。その結果、Ge濃度が約2.5at%において、Nb酸化物はNb_2O_5に単相化すると共に光透過率は向上する。すなわち、添加したGeは、マトリクスとして好適なNb_2O_5の生成を促進する効果を有する。また、Ge濃度の増加と共に光吸収端は長波長側にシフトし、太陽光スペクトルの最大強度付近に光学バンドギャップを制御可能であることを明らかにした。したがって、複合構造薄膜におけるGeは、マトリクス構造の最適化と量子サイズ効果発現の役割を同時に果たす。さらに,電極材料として,可視光領域に光吸収端を有するヘマタイト(α-Fe_2O_3)などの鉄酸化物相が、Ge微量添加および成膜中の酸素分圧によりナノ複合構造化することを明らかにした。本年度は,生成熱分離型および非固溶体型の材料設計により合成された,半導体/マトリクス複合構造薄膜について微細構造および光電評価を行った.先の研究において,ホットウォールデポジション法により作製されたPbSe/ZnSe薄膜は,PbSeナノ粒子がZnSeマトリクス中に孤立分散していることを微細構造観察により明らかにしている.そこで,本年度はp型Si基板上に当該薄膜を作製し,詳細な光電的評価を行った.その結果,300-1100nmにおいて測定された光電流スペクトルはブロードな形状を有し,PbSe/ZnSe層およびSi基板からの寄与が示唆された.また,膜中のPbSe濃度の減少と共に光感度は可視光領域に拡張する傾向を示した.

また,高周波スパッタリング法により作製されたNb-Ge-O薄膜は可視光吸収性を発現し,かつ,当該用途に好適なNb_2O_5が形成されることを先の研究において明らかにしている.そこで当該薄膜のHAADF-STEM(高角度散乱暗視野走査型透過電子顕微鏡)観察およびナノスケールEDS(エネルギー分散型X線分光)マッピングを行い,微細構造の検討を行った.その結果,Geナノ粒子がNb酸化物中に孤立分散していることが明らかになり,当該薄膜が発現する可視光吸収性は,Geナノ粒子の量子サイズ効果により発現していると考えられる.さらに,電極材料として,可視光領域に光吸収端を有するヘマタイト(α-Fe_2O_3)などの鉄酸化物相が,添加元素の酸化に要する自由エネルギー値に応じて相転移することを明らかにした.したがって,太陽電池の低コスト化に寄与する極めて簡便な複合構造薄膜作製法として,独自のワンステップ物理合成法を確立した.
シングルセルRNAシークエンス法を用いた新規抗癌剤耐性誘導遺伝子の探索と機能解析

難治性である転移・再発性尿路上皮癌に対する新規治療アプローチとして腫瘍内不均一性(Intratumor heterogeneity)に着目した。近年の遺伝子網羅的解析技術の発展に伴い、細胞形質を変化させる新たな遺伝子変異や、酸化ストレス、低酸素刺激など、癌微小環境が促すエピジェネティック変化が腫瘍内で不均一に生み出されることがわかっている。本研究はシングルセルトランスクリプトーム解析を用いて、転移・再発性尿路上皮癌における薬剤耐性獲得に関わる治療標的を1細胞レベルで明らかにすべく検討を行った。独自にGFPを導入したヒトおよびマウス尿路上皮癌細胞株を樹立、これらGFP標識癌細胞を用いて同所性および異所性マウス腫瘍モデルを作成した。1細胞毎の解析を行うべく、そのプロトコールの確立を試みている。またこれまで機能解析がほとんどなされていないlong non-coding RNAに関して、保存ヒト組織検体を用いたin situ hybridizationのプロトコールを確立した平成30年度はまず、GFP遺伝子を導入したヒトおよびマウス尿路上皮癌細胞株を用いた同所性および異所性膀胱癌モデルを作成した。現在、このモデルマウスを用いた腫瘍細胞の回収し1細胞レベルでの解析を行うためのプロトコールの最適化をすすめている。ヒト組織検体を用いてlong non-coding RNA(lnRNA)のin situ hybridizationの最適なプロトコールを確立した。これまで膀胱癌との関連していると報告されているMALAT-1, UCA1, NEAT1といったlnRNAが実際に組織検体上で染色されることを確認した。(1)CDDP耐性を誘導する遺伝子発現機構を1細胞レベルで検討:本年度作成した同所性および異所性膀胱癌モデルマウス、および現在確立を試みているプロトコールを用いて、抗癌剤投与前後での1細胞レベルでの遺伝子発現の変化を比較検討する。(2)(1)で得られたシングルセルRNAシークエンスはProtein-coding gene以外に, Micro RNAやLong non-coding RNA(lnRNA)も含む。特にlnRNAに関しては既に確立されたプロトコールを用いて、保存ヒト組織検体のin situ hybridization等を行い、抗がん剤耐性に関わる機能解析を行う予定である。1細胞毎の解析を行うプロトコールの確立に時間がかかり、実験計画に遅延が生じたことが原因である。翌年度の助成金とともに次年度使用額を用いて、確立されたプロトコールを用いたシングルセル解析を行う予定である
パプアニューギニアの高地に住む人々の低タンパク食適応における腸内細菌叢の役割

研究の背景と目的近年、メタゲノム解析から、腸内細菌叢が、炭水化物を効率良く分解し、生じたエネルギーを宿主に提供することで、肥満と痩せに関係していることが示されているが、窒素代謝に関する腸内細菌叢の役割は明確ではない。そこで申請者が専門とする細菌学的な手法を応用して腸内細菌の低タンパク食適応への関与を検討した。得られた成果を以下に記す。(1)本申請者は、2011年度において、パプアニューギニアの高地に住む人々(タリ地域)から窒素固定遺伝子を持つ細菌を見出した。(2) 2010年度に開発した窒素固定能確認試験培地(無窒素培地)上での生育を確認した。(3)水素ガス検出法による窒素固定能を確認し、分離した細菌が窒素固定能を有していることを確認した。(4)また37°Cにおいても窒素固定能を有することを見出した。生体内におけるこれらの株のふるまいを解析することで、腸内細菌叢とヒトの食生態の多様性について、生物学的実験に基づいた考察が可能になると考えられる。〈当該年度に実施した研究の成果〉1)本申請者は、2010年度において、パプアニューギニアのサツマイモ、ならびにヒト(日本人)由来サンプルから、窒素固定遺伝子を持つ細菌を見出した。2)窒素固定遺伝子を保有する細菌を選択的に生育させることができる新規選択培地を開発した。3)本申請者が分離した窒素固定遺伝子保有株、ならびに窒素固定遺伝子のない株も含め、現在4株についてドラフトシーケンスの取得を行った。以下に、上記知見の発展性、意義、ならびに重要性等について述べる。1)本申請者が見出した窒素固定遺伝子を保有しかつその機能を有するものについては、全ゲノム塩基配列取得後、さらに詳細な解析(他の株との比較:進化系統)を行う。2011年度以降においては、本菌の属する様々な菌を集め、系統的な解析を行い、由来・系統・表現型の間に相関が見られるかどうかについて、ゲノム解析を行い、研究を発展させる。2)またパプアニューギニアの高地に住む人々からも上述の細菌を本申請者が前年度開発した選択培地を用いて分離する予定である。加えて、標的細菌の解析のみならず、低タンパク食に適応した人々の腸内細菌叢の解析(メタゲノム解析)も行う予定である。3)2011年度以降には、本申請者が分離した窒素固定遺伝子を保有しかつその機能を有するものを用いて、動物実験を行い、哺乳動物における窒素固定細菌の役割を検討する。本検討は世界的に見ても例はなく、極めて重要な知見をもたらすものと期待される。2011年度に関しては、これらの菌を用いて、予備的検討を行い、本目的に適した実験条件の決定を行う予定である。研究の背景と目的近年、メタゲノム解析から、腸内細菌叢が、炭水化物を効率良く分解し、生じたエネルギーを宿主に提供することで、肥満と痩せに関係していることが示された。しかしながら、タンパク質の代謝に関する腸内細菌叢に関する研究例はほとんどなく、その詳細は明らかではない。本研究では人類生態学で大きな問題とされてきた低タンパク食適応について、申請者が専門とする細菌学的な手法を応用してこの問題を明らかにする。そのような腸内細菌叢の進化と現生人類の食生態の多様性から人類進化の一側面を明らかにすることを目標とする。研究実績の概要1)本申請者は、2011年度において、パプアニューギニアの高地に住む人々(タリ地域)から窒素固定遺伝子を持つ細菌を見出した。2)前年度に開発した窒素固定能確認試験培地(無窒素培地)上での生育を確認した。3)水素ガス検出法による窒素固定能を確認し、分離した細菌が窒素固定能を有していることを確認した。4)また37°Cにおいても窒素固定能を有することを見出した。これらの知見はヒトの窒素固定細菌による窒素固定が行われている可能性が高いと考えられる。今後、これらの知見を踏まえ、本申請者が分離した窒素固定遺伝子を保有しかつ窒素固定能を有する株を用いて動物実験を行うことで、哺乳動物における窒素固定細菌の役割を検討することが可能になると考えられる。