hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝癌細胞障害性T細胞の生検材料よりの誘導(IL-1,2,4,6を用いて)

計画では、肝生検材料より、浸潤リンパ球を分離・増殖させ、当該肝癌細胞に対するキラー活性を測定するものであったが、この方法では、必要量の細胞を得ることができなかったため、手術切除肝癌あるいは癌性腹膜炎腹水を材料として用いた。材料より分離したリンパ球をIL-2のみ(コントロール)あるいはIL-1,2,4,6で刺激増殖させ実験に用いた。肝癌細胞は株化し、実験に供した。その結果、1.浸潤リンパ球に含まれるT cellについて、(1)無刺激(2)IL-2刺激(3)IL-1,2,4,6刺激各々のリンパ球を材料に、TCRレパートリーをPCR法で解析したが、各群間に有意な差は見られなかった。2.上記(2)(3)各群において、増殖率は(3)群の方が良好であったが、含まれるCTLの比率はFACS解析の結果差はなかった。3.(2)(3)各群リンパ球の当該肝癌細胞に対する障害活性をMTTアッセイにより解析したが、明らかな差は見出せなかった。4.1症例については、末梢血より得たリンパ球に同様のIL刺激を加えたものとも障害活性を比較したが、明らかな相違はなかった。以上の結果より、肝癌浸潤リンパ球をIL-1,2,4,6で刺激し、肝癌障害T細胞を効率よく得ようという今回の試みは、従来のLAK療法と比べてもあまり有効なものではないと思われた。しかしながら、今回の実験中に得られた肝内胆管癌細胞株は、肝細胞の前駆細胞としての性格を有するような分析結果が得られており、今後、肝癌発生の研究に有用であると考えられる。現在その細胞株を用い実験中である。
社会情報学的視点からの集合的知識・決定の理論構築と政策形成への応用に関する研究

スマートフォンの普及によりインターネットへのアクセシビリティが格段に向上したこんにちでは、社会的・集合的な知識のサービス応用が活発に行われてきている。本研究では、集合知の構成要素についての事例に基づく理論的な検討を行った。その結果、集合知の一つの基盤的要素として、「観測・観察」に代表される社会的計量技術が重要であることがわかる。かつては、政治経済分野における観測・観察技術としてサンプリングに基づく社会調査法が重視されたが、情報環境下ではユーザの履歴データが活用できることから、いわゆるビッグデータの活用が産業面で普及を見せつつある。そのような事を背景にして、集合知メカニズムへの社会的期待は再度高まりつつあるが、その中でも投票と市場メカニズムにおける価格形成が代表的な情報の集約技術であることは変わらず、社会の正当性も依然としてこれらの技術に強く依存している。そこで、本研究では投票と市場での取引メカニズムを理論的観点から再定義した、新しい集合知システムを開発し、2011年8月より実験を開始していた。概ね既存の取引方式との比較において遜色ない特性が得られたため、その後の活用を行う予定である。また、それと同時に2012年総選挙においても、各政党マニフェストのテキスト分析に基づく投票レコメンデーション実験を行った。また、その際の分析システムをAPIとして一般に開放するなどの取り組みを同時に行った。近年スマートフォンに代表される身近なインターネット環境の普及に伴い、個人の様々な知識を集合的に活用する様々なアプリケーションに対する期待が高まっている。そこで、本研究では、集合知の構成要素についての事例に基づく理論的な検討を、最初のステップとして設定している。その結果、集合知の一つの基盤的要素としては「観測・観察」に代表される、社会的計量技術が重要であることがわかる。これまで、社会的計量技術としては、投票と市場メカニズムにおける価格形成が代表的な技術として君臨しており、それぞれ社会的意思決定における正統性を担保する技術として活用されている。言うまでもなくそれらは投票は政治分野で、また市場メカニズムにおける価格は経済分野で利用される技術ではある。もっとも、今日の情報化社会の文脈では、様々な個人や組織の行動がネット上で観測される(例としてはfacebookのオープングラフ技術)ことから、それらの技術の融合分野における様々な新手法が期待されている。そこで、投票技術と価格形成プロセスを融合させた新しい集合知実験を2011年8月より展開しており、その実証に向けた作業を平成24年度は実施している。ただし、現在のところ実験は不調である。取り組んでくれるユーザが少ないために、満足な実験としては成立していない。そのため、現在は多数のユーザを持つサイトやゲームサイトにてかかる実験に協力してくれるよう調整を行なっている。また、2012年は予想に反して、12月に総選挙が行われたため、総選挙向けのいくつかの実験を行った。その実験中に政策テキストを分析する技術の開発なども並行して行った。言うまでもなくそれらは投票は政治分野で、また価格は経済分野で利用される技術ではあるが、今日の情報化社会の文脈では、様々な個人や組織の行動がネット上で観測される(例としてはfacebookのオープングラフ技術)ことから、それらの技術の融合分野における様々な新手法が期待されている。そこで、投票技術と価格形成プロセスを融合させた新しい集合知実験を2011年8月より展開し、その有効性を検証している。現在のところ、その結果わかったことの一つは、いくら理論的に正しく、新しく簡便な計測技術が開発されたとしても、それを受容して利用するユーザ側に理解されるまでが大変でありあまり利用が進まないという点が問題である。

その点で、投票や市場メカニズムのような動作原理に対する理解が進んでいる仕組みは参加者に対する説明が不要であるため、強い技術であるということが言える。また、今年度の後半には、それらの計測技術とは別に、アイディアの融合・発達分野での集合知の実験として、政策形成を促進させるアプリケーションの開発に取り組んでいる。2012年度にはこれらの実験を実施できる見込みである。投票と価格形成のメカニズムの両方の性質を持ちながら、世論や雰囲気の計量を行う新方式のシステムについては、2011年より実施を進めてきているが、2012年に入り、アルゴリズムの改良を行うなど、一定の範囲で実験の精度を高めてきている。しかし、ユーザ数の獲得に至らず、実験としてはまだ途上の段階にある。また、株式市場型の予測市場技術については、継続して実験の推進に努め、事例としてのデータ収集を取り組んでいる。それらの実験の成果を踏まえた、集合知モデルの理論化については、様々な観点での事例収集に努め、成果としてまとめている段階である。集合知の構築に関する理論化における検討を着実に行なっている。また、いくつかの実証的な実験にも取り組んでいる。従来の世論計測システムに関する実験を継続的に実施する。特に、先に述べた投票と市場の両方の性質を兼ね備えた実験については、ユーザ獲得が可能となるよう、大手のサイトなどとの協力により、大規模な実験を考えている。さらに、有権者の意識集約に向けた新しい技術のシードが散見される自体となってきており、その対応を含めた研究開発を行う予定である。特に、最近のトピックとしては、電話による調査、TVRシステムのネット技術との融合が影響のある技術としてあげられる。それらの技術をウエブ側から簡単に操作できることで、今までネットの中で閉じていたさまざまな世論集約手法が、ネットの枠を超えて実施できるようになった影響は大きいと考えられる。それらの新技術への対応を踏まえて、選挙や政治分野での意識計量技術の進展がこれまで以上に求められると考えている。その課題の対応を行う予定である。基本的には当初の計画のとおりに推進する予定である。ただし、いくつかの応用的な集合地実装技術については、対象となる社会現象が求められることもあることから、適宜望まし実験タイミングを図りながら推進していくことになる。該当なし当初の計画のとおりである。
休日交通の時空間分布推計システムの構築

本研究は休日交通を考慮した交通網計画の策定に資することを目標とし、休日交通の時空間分布特性について、経年的な道路センサス休日調査データの比較を行い、道路整備と分布の関係について定量的に考察した。また、将来的な自動車交通需要を検討するうえでは、不確実な要因の影響を無視することが出来ないため、燃料価格と交通量とのヨ係について、時系列データによるモデルを構築し、短期的・長期的な影響について整理した。本研究は休日交通を考慮した将来の交通網計画の策定に資することを目標として、1)将来交通量推計における需要波動性の問題の解決および2)不確定要素の将来推計プロセスに対する新たな導入方法の開発を行おうとするものである。本年度行った研究についての成果は以下の通りである。(1)休日交通の時空間分析技法の開発休日における目的別交通の発生頻度や発生間隔、移動距離の上限性等の分析を行い、年間波動性を捉えることを目的として、数年間を対象としたweb調査アンケートを試みた。過去3年間の観光目的の交通行動に関する情報、および特定地域(箱根、熱海)を対象とした過去の来訪実績に関する交通調査データの収集を行った。これによって、各休日に行ったトリップ情報(目的地、移動目的等)の情報を得ることが出来ている。(2)不確定要因の将来推計プロセスへの導入休日交通の将来推計にあたって前提条件となる外的環境要因に関するデータの収集と、それらの将来値に関する情報の収集を行った。次年度以降さらに、それらの情報を示した上で、有識者(交通計画学、経済学、社会学等)に対して、ヒヤリング調査を行い、将来値に対する主観値分布を作成する。主観値分布を前提とした将来推計値を算出した上で、さらに前提要因の値についての修正を行い、主観値分布修正を行う。主観値分布を前提とした将来推計値を算出した上で、さらに前提要因の値についての修正を行い、主観値分布修正を試みている。本研究は休日交通を考慮した将来の交通網計画の策定に資することを目標として、1)将来交通量推計における需要波動性の問題の解決および2)不確定要素の将来推計プロセスに対する新たな導入方法の開発を行おうとしたものである。本年度の成果は以下の通りである。(1)休日交通の時空間分析技法の開発年間を通じたデータに基づき、休日における目的別交通の発生頻度や発生間隔、移動距離の上限性等の分析を行い、年間波動性を捉えた。分析データは、昨年度取得したweb調査アンケートデータであり過去の休日行動を回答してもらう形式で、各休日に行ったトリップ情報(目的地、移動目的等)の情報を得ている。このデータにもとついて、休日行動の特性を分析した結果、目的地の空間分布特性としての再訪行動を形成する要因として、個人の「習慣性」が大きな影響を与えていることが分かった。また旅行目的に関する変数,自動車免許有・自動車保有も比較的影響を与えていることが分かった.一方で,利用媒体,性別,年齢に関しては,それ程強い影響度はなく,傾向としてのみ示された.(2)不確定要因の将来推計プロセスへの導入交通需要の将来推計にあたって前提条件となる外的環境要因に関するデータの収集と、それらの将来値に関する情報の収集を行った。近年注目されているガソリン価格を対象として、価格弾力性の分析を行い、短期的、中期的な影響を把握するモデルによって、将来値とも言うべき長期的な需要変動への影響度を把握可能とした。
腫瘍内部環境に適応したＬＮＣａＰ細胞亜株の性状解析

前立腺癌細胞LNCaP-F10細胞は腫瘍内部環境の一つである細胞外低pH環境下においても生存可能なLNCaP細胞の亜株である.LNCaP-F10細胞の低pH耐性機序を明らかにする目的で,LNCaP-F10細胞に特徴的な発現遺伝子を解析した結果,いくつかの遺伝子発現量は親株のLNCaP細胞との間に差が認められた.その中で,TNFSF10, BIRC5およびCASP10について,細胞外低pHにより誘導されるアポトーシスに関与している可能性を明らかにした.前立腺癌LNCaP細胞の亜株である低pH耐性LNCaP-F10細胞について、本年度はLNCaP-F10細胞の抗癌剤感受性について解析した。LNCaP細胞とLNCaP-F10細胞に各種抗癌剤を処理した結果、エトポシド、ドセタキセル、パクリタキセルはどちらの細胞にも細胞生存率の低下を引き起こし、両細胞間で作用の差は観察されなかった。一方、抗アンドロゲン剤であるビカルタミド処理は、LNCaP細胞の増殖を有意に抑制したが、LNCaP-F10細胞に対しては増殖抑制を引き起こさなかった。LNCaP-F10細胞はビカルタミドに耐性を示したことより、LNCaP-F10細胞のアンドロゲン受容体の変異の有無について調べたものの、LNCaP細胞のアンドロゲン受容体の塩基配列と同一であった。LNCaP-F10細胞のアンドロゲン感受性について、ジヒドロテストステロンによるアンドロゲン応答性遺伝子発現量、アンドロゲン応答性転写活性、細胞増殖率により評価したところ、LNCaP-F10細胞はLNCaP細胞に比べてアンドロゲン感受性が低いことを認めた。ジヒドロテストステロンにより刺激されたアンドロゲン応答性転写活性のビカルタミドによる抑制はLNCaP細胞とLNCaP-F10細胞のどちらの細胞においても観察されたが、LNCaP-F10細胞はLNCaP細胞に比べより応答性が低かった。また、ホルモンの存在下もしくは非存在下のどちらの場合においても、LNCaP-F10細胞のアンドロゲン受容体発現量はLNCaP細胞の発現量に比べ低値を示した。アンドロゲン受容体共役因子の発現量に相違は観察されなかった。以上の結果から、LNCaP-F10細胞はビカルタミドによる細胞増殖抑制作用に対し抵抗性をもつ細胞であり、LNCaP-F10細胞のビカルタミド耐性はアンドロゲン受容体の低発現が関与しているかもしれないことが考えられた。前立腺癌LNCaP細胞の亜株である低pH耐性LNCaP-F10細胞について、本年度は親株のLNCaP細胞とLNCaP-F10細胞の間での発現量の異なる遺伝子の同定を行った。まず、発現遺伝子の網羅的解析をDNAマイクロアレイ法により行い、LNCaP細胞とLNCaP-F10細胞の間で発現量が2倍以上異なり、かつ低pH適応の面から興味深い遺伝子を抽出した。さらに、抽出された遺伝子について両細胞間での発現量の差の有無を定量的リアルタイムRT-PCR法にて確認した。その結果、アポトーシス関連因子であるTNFSF10、BIRC5、CASP10、プロトン感受性Gタンパク質共役受容体であるGPR68を見出した。すなわち、LNCaP-F10細胞ではTNFSF10およびCASP10の発現が著しく低いこと、BIRC5の発現が亢進していること、さらにはGPR68の発現はLNCaP-F10細胞においてほぼ認められないことを明らかにした。これらの遺伝子の細胞間での発現量の相違は通常の培養条件下だけでなく、低pHもしくは低栄養・低pHでの培養条件下でも同様に観察された。また、上述の遺伝子のうちアポトーシスに関連する因子については、細胞外低pH環境条件下において発現変動を来たすことを見出した。TRAIL(遺伝子名TNFSF10)について、低pHによる発現上昇は遺伝子レベルのみならず、タンパク質レベルにおいても観察された。TRAIL遺伝子上流約2000 bpを組み込んだレポータープラスミドを構築し、ルシフェラーゼアッセイを行った結果、低pHによるTRAIL発現変化は転写レベルでの調節であることを明らかにした。また、TRAIL抗体存在下、低pHで誘導されるLNCaP細胞の細胞生存率低下作用の抑制が観察された。これらの結果より、低pH条件で引き起こされるLNCaP細胞の細胞生存率低下にTRAILの発現誘導が関与している可能性が示唆された。前立腺癌細胞LNCaP-F10細胞は腫瘍内部環境の一つである細胞外低pH環境下においても生存可能なLNCaP細胞の亜株である.LNCaP-F10細胞の低pH耐性機序を明らかにする目的で,LNCaP-F10細胞に特徴的な発現遺伝子を解析した結果,いくつかの遺伝子発現量は親株のLNCaP細胞との間に差が認められた.その中で,TNFSF10, BIRC5およびCASP10について,細胞外低pHにより誘導されるアポトーシスに関与している可能性を明らかにした.前立腺癌LNCaP細胞の亜株であるLNCaP-F10細胞について、本年度はLNCaP-F10細胞の性質を明らかにするために以下の検討を行った。1. LNCaP-F10細胞は低pH/低栄養(pH6.3/0.5%FBS)環境下においても細胞生存率の低下は観察されなかった。一方、親株のLNCaP細胞は低pH/低栄養により細胞死が引き起こされた。

さらに、低栄養環境のみではLNCaP細胞の細胞死は観察されなかったものの、低pH環境のみにより細胞形態の変化と細胞死の誘導が認められた。また、細胞外の低pHによる細胞内pHの変化をpH感受性色素であるBCECFを用いて測定した結果、両細胞間で違いがなかった。2.定常状態および低pH/低栄養環境における両細胞のAkt、Erk1/2、p38、AMPK、mTORの細胞内シグナル系の活性について、リン酸化特異的抗体を用いたwestern blot法により評価した。その結果、検討した条件では何れの場合においても細胞内シグナルの活性に両細胞間での大きな違いを観察するに至らなかった。3. LNCaP細胞で観察される低pH/低栄養環境下での細胞死のタイプを判定する目的で、アポトーシスをDNA fragmentation assay、procaspase-3およびPARPの限定分解、オートファジーをLC3-IからLC3-IIへの変換を指標に判定した。その結果、LNCaP細胞で観察される低pH/低栄養環境下での細胞死はアポトーシスであることを明らかにした。以上の結果から、LNCaP-F10細胞は低pHによるアポトーシス誘導に対し抵抗性をもつ細胞であることが示唆された。前立腺癌LNCaP細胞の亜株である低pH耐性LNCaP-F10細胞について、親株のLNCaP細胞と比較してLNCaP-F10細胞において発現量が著しく異なる因子の中でアポトーシス関連因子に着目して検討した。すなわち、両細胞間での発現量が異なりかつ低pH条件下において発現変動を来たす因子として昨年度までに同定できたsurvivin(遺伝子名BIRC5)とcaspase-10(遺伝子名CASP10)について、低pHにより引き起こされるアポトーシスへの関与を解析した。1. Survivinについて、低pHによる発現低下は遺伝子レベルのみならず、タンパク質レベルにおいても観察された。Survivin遺伝子上流を組み込んだレポータープラスミドを構築し、ルシフェラーゼアッセイを行った結果、低pHによるsurvivin発現低下は転写レベルでの調節であることを明らかにした。2. CASP10には複数のvariantが存在している。Variant特異的なプライマーを作成し、低pH条件下発現上昇が引き起こされるvariantの同定を試みた。その結果、通常の培養条件下LNCaP細胞で発現しているvariantは増幅断片の大きさの違いより主にcaspase-10dであることが推察された。また、CASP10aおよび10dを増幅するプライマーを用いた場合、低pH条件下LNCaP細胞における発現上昇が観察された。また、CAPS10遺伝子上流を組み込んだレポータープラスミドを構築し、ルシフェラーゼアッセイを行った結果、低pHによるsurvivin発現低下は転写レベルでの調節であることを明らかにした。低pH条件で引き起こされるLNCaP細胞のアポトーシスにおけるsurvivinおよびcaspase-10の関与が興味深い。泌尿器科学,薬局薬学本年度は、「研究実績の概要」に記したように、おおむね当初の研究実施計画に沿った実験を遂行することができ、かつ、適切な実験結果を得ることができたため、「おおむね順調に進展している」と評価した。
酵母の冷凍障害と冷凍耐性機構に関する研究

近年新しい製パン技術として注目されいてる冷凍生地製パン法の問題点である酵母の冷凍障害に関して研究を行い,以下の知見を得た。酵母の冷凍障害は、凍結温度・期間によって著しい影響をうけるが,酵母の冷凍感受性の差異によってその影響の程度が明らかに異なった。また,0.51%エタノ-ル中で凍結融解した酵母は強い障害をうけ,ショ糖が共存すると障害が抑制される傾向が認められた。冷凍生地中においてもエタノ-ルの存在下で酵母は強い冷凍障害をうけるが,冷凍耐性酵母は感受性酵母よりも解凍後の生地発酵力が大きかった。小麦粉に存在する抗酵母タンパク質ピュ-ロチオニンが凍結融解後の酵母の発酵力,細胞内物質の漏洩量に及ぼす影響を検討した結果,冷凍感受性酵母において強い発酵阻害,物質漏洩の増大が認められたが冷凍耐性酵母ではその影響は少なかった。一方,凍結溶液中での酵母細胞からの物質漏洩は,溶液のpHによって著しい影響をうけ,いずれの酵母もpH34で漏洩速度は最大となった。また,細胞内物質の漏洩が細胞膜の損傷(酵素的分解)に起因すると考え,膜リン脂質の分解に関与する酵素ホスホリパ-ゼ活性を比較検討した結果、冷凍感受性および耐性酵母ともに反応の至適pHは3付近であり,細胞内物質の漏洩を促進するPHとほぼ一致した。さらに,冷凍感受性酵母のホスホリパ-ゼ活性はピュ-ロチオニンの存在下で著しく増大するが耐性酵母の活性はほとんど影響をうけないことを明らかにした。ピュ-ロチオニンによるホスホリパ-ゼ活性化作用が酵母の種類によって異なる原因を追求した結果,両酵母の細胞膜リン脂質組成の相違。すなわちホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシト-ル含量の差異がピュ-ロチオニンによるホスホリパ-ゼ活性化作用の違いを反映することを明らかにした。本研究は酵母の凍結障害機構を解明することを目的として行ったもので、本年度は冷凍耐性酵母および冷凍感受性酵母に対する凍結貯蔵温度ならびに貯蔵期間、エタノ-ル、ショ糖および小麦粉に含まれる抗酵母タンパク質ピュ-ロチオニン(PTN)の影響などを検討した。1.酵母の菌体懸濁液をー20ー80°Cで1週間凍結貯蔵したのち融解し、凍結貯蔵温度が酵母の生存率に及ぼす影響を調べた。その結果、冷凍耐性菌および冷凍感受性菌ともにー80°Cで凍結貯蔵した時が最も生存率が高く、ー30°Cで凍結した場合はいずれもその生存率は最低となった。また、ー80°Cで凍結したのちー20°Cで貯蔵した場合の生存率を比較した結果、感受性菌では1週間ですでに10%以下に生存率が減少したが、耐性菌では20%以上の生存率が維持されており、とくにー80°Cで貯蔵した場合、耐性菌はより高い生存率を示した。2.酵母の凍結障害に及ぼすエタノ-ルおよびショ糖の影響を検討した結果、0.51%の比較的低濃度のエタノ-ルの存在下で酵母の凍結障害が最大となること、ショ糖が共存するとエタノ-ル濃度の増加とともに障害の程度が増加することを見いだした。また、エタノ-ルの影響は、耐性菌よりも感受性菌において強く発現する傾向が認められた。3.小麦粉に含まれる抗酵母タンパク質PTNの存在下で酵母を凍結融解した場合、Saccharomyces cerevisiaeに属する冷凍感受性菌の発酵能はPTNの濃度の増加とともに減少し、反対に細胞内から漏洩する紫外部吸収物質量は増大した。これに対し、Torulaspora delbrueckiiに属する冷凍耐性菌の発酵能はPTNによってあまり影響を受けず、細胞内物質の漏洩量も比較的少ないことが明らかとなった。この結果から、酵母の凍結に対する感受性とPTNに対する感受性との間になんらかの相関関係があることが示唆された。

小麦粉に存在する抗酵母タンパク質ピュ-ロチオニンが酵母の冷凍耐性に及ぼす影響を検討した。冷凍感受性の異なる2種類の酵母をピュ-ロチオニン存在下で冷結すると,融解後の発酵力および細胞内物質の漏洩速度に顕著な差異が認められた。すなわち,冷凍感受性酵母では凍結融解後の発酵力,細胞内物質の漏洩速度ともにピュ-ロチオニン濃度の増加につれて増大したが,冷凍耐性酵母ではその影響は少なくピュ-ロチオニンによる障害をうけにくい性質をもつことが明らかとなった。酵母の細胞内物質の漏洩は,細胞膜の損傷と関連するので,細胞膜リン脂質分解活性(ホスホリパ-ゼ活性)に及ぼすピュ-ロチオニンの影響を調べた。その結果,冷凍感受性の異なる両酵母のホスホリパ-ゼ活性はいずれもpH34で最大となり,細胞内物質の漏洩を促進するpHとほぼ一致した。さらに,冷凍感受性酵母の膜画分が示す酵素活性はピュ-ロチオニンによって著しい活性化をうけるのに対し,冷凍耐性酵母の酵素活性はほとんどその影響をうけないことを見出した。冷凍感受性酵母ホスホリパ-ゼ活性化現象は,冷凍耐性酵母から得た膜画分の添加によって抑制される事実から,両酵母菌の細胞膜リン脂質組成の相違がピュ-ロチオニンによるホスホリパ-ゼの活性化に関係していると推定された。両菌の膜リン脂質組成を比較した結果,ホスファチジルイノシト-ルおよびホスファチジルセリンの含有割合に有意の差が認められており,これらの成分量の違いがピュ-ロチオニンによるホスホリパ-ゼの活性化の関与しているものと推論した。
ALS/FTLDにおけるポリグルタミン凝集タンパク質の解析

ポリグルタミン(polyQ)凝集体蛋白質(PAIP)の一部は筋萎縮性側索硬化症(ALS)や前頭側頭葉変性症(FTLD)の責任遺伝子やタンパク質凝集に関与する因子であることが判明してきている。このことはALS/FTLDとpolyQ病の変性過程に共通メカニズムが働いている可能性を示している。剖検組織の病理学的検討で新規ALS病態関連分子同定を目的とした。我々はPAIPの一つであるMatrin3が孤発性ALSにおいて細胞質内封入体の構成成分であることを示した。Matrin3はその遺伝子変異が家族性ALSの責任遺伝子であることが判明したが、孤発性ALSの病態にも広く関わっていることが示された。ポリグルタミン凝集蛋白の一つであるmatrin3は新規家族性筋萎縮性側索硬化症(FALS)の原因遺伝子として発見された。孤発性筋萎縮性側索硬化症(SALS)について病理学的検討を行い、Matrin3のSALSにおける病態への関与を考察した。SALS剖検例10例とコントロール剖検例5例の腰髄パラフィン包埋切片を、抗Ubiquitin抗体、抗Matrin3抗体、抗リン酸化TDP-43(Pser409/410)抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。SALS例は全例で脊髄前角細胞にUbiquitin陽性、pTDP-43陽性細胞質内封入体(NCI)、グリア細胞に細胞質内封入体を認めた。コントロール症例ではいずれの細胞質内封入体にも陽性所見は認めなかった。抗Matrin3抗体では、SALS10例中6例で細胞質内封入体に陽性所見を認め、核の濃染像に関しては症例により異なる結果であった。コントロール症例では、Matrin3陽性NCIは認めなかった。SALS例におけるpTDP-43とMatrin3との二重染色ではMatrin3陽性、pTDP-43陽性の細胞質内封入体、pTDP-43陽性でMatrin3陰性の細胞質内封入体が認められ、pTDP-43陰性でMatrin3陽性の封入体はみられなかった。Johnsonらの報告では、SALS症例でmatrin3陽性の細胞質内封入体が認めているのは、C9orf72repeat伸長を持つ症例が提示されている。我々の検討では半数以上の症例でNCIにおける陽性所見を認め、TDP-43とのco-localizeを証明することができた。このことは、Matrin3が孤発性ALSにおいてもその疾患病態に関与していることの裏付けとなると考えられる。ポリグルタミン凝集蛋白のうち、Matrin3に関しては、孤発性ALSの細胞質内封入体に染色性を示していた。この結果よりTDP-43と相互作用し、孤発性ALSの病態生理に関与している可能性が高いことがいえる。この内容に関しては現在論文投稿中である。また、DDX-17についても孤発性ALSの細胞質で異常に凝集することを確認している。他のポリグルタミン凝集蛋白について孤発性ALSの病理検体を用いて免疫組織科学的検討をしたが、明らかな異常所見はみられていない。我々がポリグルタミン凝集体蛋白質(PAIP)として世界に先駆けて同定してきたFUS/TLS、EWS、TAF15、ubiquilin2などが、近年、筋萎縮性側索硬化症(ALS)や前頭側頭葉変性症(FTLD)の責任遺伝子またはタンパク質凝集に関与する因子であることが次々に判明してきている。このことはALS/FTLDとポリグルタミン病にRNA結合タンパク質凝集を介した細胞障害機構や凝集体の処理過程に共通のメカニズムが働いている可能性を示している。本研究は研究代表者らが独自に入手している未発表のPAIPについて、ポリグルタミン病、ALS、FTLDの剖検組織における免疫組織学的検討により、新規ALS病態関連分子を同定し、その封入体の病理学的形態や臨床経過の特徴をとらえるものである。凝集体プロテオーム解析により、ポリグルタミン凝集体結合タンパク質(PAIP)として我々が独自に同定してきたubiquilin2、matrin3、hnRNPH1/H2、hnRNP F、Matrin3、DDX5、DDX17に対する抗体を用いてポリグルタミン病、ALS病理組織の検索を行う。ポリグルタミン凝集タンパクのうち、Matrin3に関しては孤発性ALS15例のうち9例で抗Matrin3抗体陽性の細胞質内封入体を認めた。また、Matrin3抗体陽性の細胞質内封入体は抗TDP-43抗体との二重染色でco-localizeしていた。この結果よりTDP-43と相互作用し、孤発性ALSの病態生理に関与している可能性が高いと推測される。この内容に関しては現在論文投稿中であるまたDDX-17についても孤発性ALSの細胞質で異常に凝集することを確認している。他のポリグルタミン凝集タンパクについては孤発性ALSの病理検体を用いて免疫組織科学的検討をしたが、明らかな異常所見は得られていない。

Matrin3はその遺伝子変異が家族性ALSの責任遺伝子であることが判明したが、孤発性ALSの病態にも広く関わっていることが示された。matrin3以外のポリグルタミン凝集タンパク質について、ALS、FTLDのモデルマウス・ヒト剖検例において免疫組織科学的検討を行い、新規ALS病態関連分子を同定する。ポリグルタミン凝集蛋白のうち、TDP-43、FUS/TLS、uqiquilin2をコードする遺伝子は家族性ALSの原因遺伝子として判明しており、孤発性ALS患者においてポリグルタミン凝集蛋白をコードする遺伝子を解析する。神経内科平成28年度も27年度に引き続き免疫組織科学的検討の継続のため抗体の購入、またポリグルタミン凝集蛋白をコードする遺伝子の孤発性ALS患者での解析を行うための費用がかかるため。免疫組織科学的検討のための抗体、試薬の購入ポリグルタミン凝集蛋白のNeuro2Aを用いた機能解析を行う際の試薬購入ポリグルタミン凝集蛋白をコードする遺伝子の孤発性ALS患者における変異検索における費用
性教育におけるコミュニケーションのルールとモラルに関する国際比較研究

教室での性の学習において学習者のprivacyに触れる事柄を学ぶためのコミュニケーションのルールは確立できるのか、人間関係のモラルの面からどう評価・判断したらよいのか。この課題について授業観察・分析と実践者との対話によって探求しようとしたが、スウェーデンでは不調に終わった。ニュージーランドでは、Pakuranga College(高校)で10学年の性教育の授業を参観することができたがそれが唯一の観察機会であった。そこで日本の性教育実践記録の分析を基礎にして、教室における性に関するコミュニケーションの中でももっとも難しいと思われる「快楽追求」について検討し、成果をまとめた。平成26年度研究実施計画における目標は、「スウェーデンと他の2カ国(日本・ニュージーランド)の初等・中等教育学校において、教室における性に関するコミュニケーションの情報を記録・分析する研究手続きを確定する」ことであった。(1)9月1日ー11日に三重大学教育学部オークランド研修団の一員としてニュージーランドに渡航し、幼小中高訪問等に学生・他の教員と共に参加すると共に、従来から研究交流のあるオークランド大学Louisa Allen准教授に性教育の授業参観が可能な初等中等学校の紹介を依頼した。またOratia District School(小)、Pakuranga College(高)訪問時に性教育の実施状況について質問した。小学校校長によると、親の同意を得ることが困難であるため同校では性教育を実施していないとのことであった。果たしてこれがニュージーランドの全国的傾向であるのかについて、Allen准教授その他に照会中である。高校では、校長が性の授業を担当している教師(健康教育担当)を紹介して下さり、帰国後も連絡を取って平成27年度に授業参観を実現すべく交渉を進めていたが、同教師が同校を退職することとなり、交渉は頓挫してしまった。Allen准教授からは、小学校教育に詳しいオークランド大学教育学部の同僚教員を紹介していただき、その同僚教員達とコンタクトを取りながらニュージーランドの性教育について情報収集を勧めている。しかし、照会メールに返答がいただけなかったケースも複数あり、情報源は必ずしも多くないのが現状である。(2)スウェーデンについては、過去2回(平成13-16年度、平成19-21年度)の科研費研究以来研究交流を続けてきたスウェーデン性教育協会のHans Olssonに依頼して、新たにスウェーデン国内の性教育関係者を紹介していただいた。今後コンタクトを取っていく予定である。「平成27年度の研究実施計画」の到達目標は、「第1年度におけるスウェーデンを中心とした研究対象国への交渉・準備活動を踏まえて、第2年度には訪問を実施する」ことであった。スウェーデンにおける性教育調査研究については従来から研究交流を続けてきたスウェーデン性教育協会研究員のHans Olsson氏とコンタクトを取ってスウェーデン国内で精力的に性教育実践に取り組んでいる学校教師を複数紹介していただき、学校訪問・授業実践参観を依頼するメールを出したが返信を得られず、Olsson氏に再度仲介を依頼したが連絡が中途で途絶えたままで、現在もまでスウェーデンにおける調査研究を実施できる目処が立っていない。Olsson氏を通じて研究調査実現を引き続き打診し、平成28年度中に参観できる学校を確定したい。スウェーデンについては、過去2回(平成13ー16年度、平成19ー21年度)の科研費研究の実績があり、ニュージーランドについても本科研採択に先立つ平成23(2011)年度以来現地の性教育研究者との交流を行なってきている。ただ、本研究の主たる方法が現地に一定期間滞在しながら学校を訪問し授業を参観・分析することであるため、科研費による公費出張が可能であることが確定してからでないと本格的な研究調査の折衝は行なえなかった。スウェーデンについては本科研費研究ではまだ実践者と接触する段階まで到っていないが、ニュージーランドについては実践者または学校管理者との交渉の段階に入っている。しかし、参観受け入れを約束してくれていた教師が退職するなど、予想できない頓挫もあった。基本的には学校訪問のオファーが受け入れられれば1年のどの時期にでも海外主張を組む用意があるが、本務との関係で予め避けなければならない時期もあり、調査計画を組みにくい状況はある。交付申請書における「平成28年度の研究実施計画」の到達目標は、「引き続きスウェーデンの調査を実施する。また、ニュージーランドについても、Louisa Allenとの研究交流の進展を基礎にして、学校訪問調査を実施する。」であった。スウェーデンにおける研究調査については、残念ながら第3年度同様進捗がない。スウェーデン性教育協会研究員Hans Olsson氏と連絡を取ってスウェーデンにおける学校参観・「性と人間関係」の授業参観の実現のための交渉を行なおうとしたが、何度か途中で連絡が途絶えてしまい、他に関係者とのコンタクトがないため、頓挫したままとなっている。この状況に鑑み、本研究においては第2次科研費研究(2007-2009年度)を引き継いでのスウェーデンにおける「性と人間関係」実践の調査・分析の進捗を断念せざるを得ない。一方、ニュージーランドについては、2016年9月3日ー17日に5度目の三重大学教育学部Auckland大学教育研修団に参加した。2012年度以来研究交流を続けてきたAuckland大学教育学部所属の性教育研究者であるDr. Louisa Allenはたまたま我々の訪問期間に研究のためAustraliaに出張しており、今回は面会しての交流はできなかった。しかし、訪問団の一員として訪ねたPakuranga College(高等学校)において、初めてsexualityに関する授業の参観の機会を得た。訪問団の引率もあるため、1時間の授業の一部分(30分程度)であったが、ビデオカメラで記録し、現在分析を進めている。遅れは上記の通り、当初計画で予定したスウェーデンでの研究調査の実現見通しが立たないことである。

ニュージーランドに関しては、研究交流、実践観察・分析とも進捗しつつある。2018年2月に、以下の研究報告書(冊子)『性教育におけるコミュニケーションのルールとモラルに関する国際比較研究』を作成した。現在関係各方面に配付中である。構成は以下の通り。第1章研究の経過第2章研究の過程で公表した研究成果1.性教育において「快楽追求としての性行動」を教えることは必要/可能なのか?(中部教育学会第66回大会自由研究発表2017.6.17福井医療大学)2.性教育において「快楽追求」を取り上げることの意義と課題の検討ーニュージーランドの研究者Louisa Allenとの研究交流を通じてー(日本教育方法学会第53回大会自由研究発表2017.10.7千葉大学)3.性教育において「快楽としての性行動」を取り上げることの意義と課題(三重大学教育学部研究紀要第69巻(教育科学)2018.1)4.MM小学校教師用ニュースマガジン連載性(sexuality)を学ぶとは何をすることか(2016.11-2018.1)第3章New Zealand Auckland市Pakuranga College(高校)におけるsexualityの授業記録第4章研究の総括と今後の課題教室での性の学習において学習者のprivacyに触れる事柄を学ぶためのコミュニケーションのルールは確立できるのか、人間関係のモラルの面からどう評価・判断したらよいのか。この課題について授業観察・分析と実践者との対話によって探求しようとしたが、スウェーデンでは不調に終わった。ニュージーランドでは、Pakuranga College(高校)で10学年の性教育の授業を参観することができたがそれが唯一の観察機会であった。そこで日本の性教育実践記録の分析を基礎にして、教室における性に関するコミュニケーションの中でももっとも難しいと思われる「快楽追求」について検討し、成果をまとめた。スウェーデンについては過去2回(平成13-16年度、平成19-21年度)の科研費研究の蓄積があり、またニュージーランドについては、本科研費研究開始より2年前から現地の性教育研究者との交流は行なっている。しかし、本研究の主たる方法が現地の学校を訪問して授業を参観し分析することであるため、現地に渡航滞在を行なう為の公費が確保できない状況では、訪問についての交渉に入ることができない。従ってこの調査研究実施のための交渉実績については、科研費を得られなかった過去4年間(平成22-25年度)のブランクがあり、平成26年度の科研費交付決定を受けてようやく交渉再開に到った。1年を経て、現在も交渉継続中である。
高解像度イメージング法を用いた興奮性シナプスの構造解析

脳は神経細胞がシナプスを介してネットワークを構築することで様々な高次機能を実現する。神経回路の結合様式をシナプスレベルで解析するためには広範囲に亘る高分解能イメージング法の確立が必要である。本研究では光学顕微鏡技術と電子顕微鏡技術の融合的手法による神経回路解析法の実現を目指し、Array Tomography法による神経組織の三次元再構築およびシナプス構成分子の分子局在解析の技術的基盤を確立した。さらに走査型電子顕微鏡によるシナプス解析法を確立した。これらの技術的基盤を用いて発達期における興奮性シナプスの形態および分子局在解析を行った。本研究では広範囲に亘る高解像度イメージング法の技術的基盤を確立し、脳の広い範囲において興奮性シナプスの局在を明らかにし、神経細胞ネットワークを3次元再構築することで脳を構成する神経ネットワークの全貌に迫ることを目的としている。本年度は、昨年度に導入した超薄連続切片自動回収機ATUM (Automated Ultrathin-sectioning machine)を用いて光学顕微鏡観察用に作成した超薄連続切片を作成し、自動で超薄連続切片を回収するシステムを構築した。さらに光学顕微鏡のステージを自動制御することで広範囲からの画像を自動取得するシステムを構築した。さらに、得られた画像をつなぎ合わせることでマウス脳の大脳皮質の全層をカバーする広い領域に亘った高解像度イメージの作成に成功した。また興奮性シナプスのシナプス前膜の分子マーカーであるVGluT1,VGluT2やシナプス後肥厚部の分子マーカーであるPSD-95に対する抗体を用いて興奮性シナプスを可視化することにも成功した。さらにATUMで回収した超薄連続切片の電子顕微鏡での観察にも成功している。今後は子宮内穿孔法により各種蛍光タンパク質を導入して、特定のスパインを可視化し、電子顕微鏡での観察と光学顕微鏡での観察とを並行して行い、さらに超薄連続切片からの画像取得による3次元再構築により脳の広い範囲における興奮性シナプスの分布・特徴抽出を行う。脳は膨大な神経細胞が互いにシナプスを介して結合し、ネットワークを形成することで様々な機能を実現する。したがって脳の機能を理解するためには、脳がどのようなネットワークから構成されるのかを理解することが重要であるが、未だにその全貌は解明されていない。その理由の一つとしては、神経細胞は長い突起を伸ばして遠くの神経細胞と結合する一方で、シナプスは極めて微細な構造であるため、広範囲に亘る高解像度のイメージングを必要とする点が挙げられる。そこで本研究では、広範囲に亘る高解像度イメージングを実現するための技術的基盤の確立を目指している。本年度では、広範囲に亘る高解像度イメージング法の一つであるArray Tomography法を導入し、さらにこれを改良することにより、より広範囲に亘る高解像度イメージングを目指した。特に、従来は複数視野から取得した画像をつなぎ合わせる際、高解像度で取得した画像の場合にはつなぎあわせにミスを生じることが多く、結果として広範囲に亘る神経細胞ネットワークの三次元再構築には至らなかったが、本年度はこの問題点を改善することに成功した。脳は膨大な数の神経細胞がシナプスを介してネットワークを構成することで、多彩な高次機能を実現する。個々の神経細胞がどのように回路を形成しているかについて網羅的に記載することは神経回路レベルからの脳の理解を深める上で重要であるが、神経細胞間の結合様式を網羅的に明らかにするには、広い範囲をカバーすると同時に微細な構造であるシナプスを可視化するイメージング技術が必要である。本研究では電子顕微鏡技術と光学顕微鏡技術の融合的手法を確立し、脳の広い範囲における興奮性シナプスの局在について解析することを目的としている。昨年度までに、超薄連続切片自動回収機ATUMを用いた切片回収および広範囲からの光学顕微鏡像の自動取得システムおよび得られた画像の三次元再構築化法を確立した。最終年度は微細形態解析のための電子顕微鏡による画像取得に関する技術的基盤を確立した。一連の研究を通じて、ナノレベルでのシナプス観察と大脳皮質全層をカバーする広範囲での神経組織構築の観察が可能となった。今後は本研究により確立された技術を適用して興奮性シナプス結合を介した神経回路に関する詳細な解析に役立てると共に、抑制性シナプスを介した神経回路やニューロンーグリア相互作用に関する研究にも役立てる。さらに二光子顕微鏡を用いたin vivoイメージングと組み合わせることで、神経細胞の活動やシナプスの可塑性と神経細胞の結合様式との関連についても役立てる。神経解剖学これまでにArray Tomography法を確立し、中枢神経系の興奮性シナプスのイメージングに成功している。また、ATUMの導入により超薄連続切片の自動取得にも成功しており、さらに得られた超薄連続切片を自動化されたステージ上で画像取得する光学顕微鏡のシステムの構築にも成功している。これらにより、広範囲に亘る中枢神経系の興奮性シナプスの高解像度イメージング法の技術的基盤の確立を達成することができた。

またATUMを用いて回収された超薄連続切片の電子顕微鏡による画像取得にも成功した。本年度は主にArray Tomography法の導入および改良を目的として研究を行い、その結果当初通りの予定を達成することができた。しかし、当初予定していたSTORM法などの超解像度顕微鏡を用いての画像取得については、実施したものの当初期待したほどの効果を得ることはできなかった。その原因としては、Array Tomography法では試料を超薄切片化することで解像度の向上を実現するが、あまりに切片が薄いためにシナプスが分断されてしまい、その全体像を収めることが困難である点が挙げられる。今後は試料作製法の見直しと共に、超解像度イメージングについては当初の計画を見直す必要性があるものと考えられる。今後は子宮内穿孔法により蛍光タンパク質を神経細胞に導入することにより、スパインの光学顕微鏡による観察と、同一スパインの電子顕微鏡による観察、さらに超薄連続切片からの画像取得による3次元再構築により、nascent synapseにおけるシナプス局在分子の分布を明らかにする。今後は本年度に確立されたイメージング法を更に改良・発展させ、実際に神経細胞ネットワークの広範囲に亘る三次元再構築を実現するための技術的基盤の確立を目指す。Array Tomography法では、抗体染色により分子・構造を可視化するが、電子顕微鏡用樹脂に包埋された試料を用いるため、抗体が抗原分子にアクセスしづらく、その結果、使用できる抗体の種類がきわめて限られるという問題点がある。そこで今後はこの問題を解決することで、Array Tomography法の汎用性を高めていく必要性がある。また神経細胞ネットワークの三次元再構築のためには、目的とする神経ネットワークを何らかの形で標識することが必要となる。今後はこの手法についても検討を重ねる予定である。前年度の研究費を用いて購入した実験動物や消耗品等を使用することで、予定よりも少ない額で研究を遂行することができたため。次年度は本研究課題の最終年度にあたり、これまでに確立した技術的基盤を用いて膨大な量の試料を作成・解析する必要があるため、本年度の次年度使用額と次年度予算とを合わせて技術補佐員の雇用を検討している。次年度は主としてArray Tomography法の汎用性を高めるために、試料作製法の改良を試みる。具体的には、電子顕微鏡用樹脂への包埋方法の検討を重ね、抗原性がより保たれ、かつ抗体が抗原分子にアクセスしやすくなるような手法の開発を試みる。これにより、使用できる抗体の種類が増えれば、神経細胞および神経機能素子となる分子のバリエーションが増え、より多彩な神経回路の三次元再構築および神経ネットワークの理解につながるものと考えられる。
ウシ主要組織適合遺伝子領域に存在する疾患責任遺伝子の同定

ウシMHC(BoLA)クラスIIは高度に多型に富むDR分子とDQ分子から構成され、液性免疫や炎症反応を引き起こす。本研究ではDRB3およびDQA1の多型性を迅速、正確に識別可能なPCR-sequence based typing (SBT)法を世界で初めて開発し、それを用いて、近年爆発的に蔓延している牛白血病ウイルス(BLV)誘発性地方病性牛白血病および年間1000億円以上の経済的被害を出している乳房炎の発症に抵抗性または感受性を示すアリルを検索した。乳房炎発症牛を原因菌別に4群に分類し、各個体のDRB3とDQA1アリルをPCR-SBTにより同定した。120頭の乳房炎発症牛から15種類のDRB3アリルと12種類のDQA1アリルが検出された。原因菌別にDRB3とDQA1アリルのヘテロ接合度を算出し、アリル頻度から推定される理論値と比較した結果、DRB3では理論値と実測値の剥離は見られなかったが、DQA1ではの実測値が理論値と比較して連鎖球菌および大腸菌群由来群で大きく下回っており、DQA1がヘテロ接合である個体ではこの2群を原因菌とする乳房炎の発症リスクが抑えられる事が明らかとなった。また、BLV誘発性牛白血病の発症とDRB3アリルとの相関性をホルスタインと黒毛和種の2品種で検証したところ、黒毛和種には明らかな感受性アリルが存在した。一方、ホルスタインでは疾患感受性アリルは検出されなかったが、発症牛ではDRB3遺伝子のヘテロ接合度が低い傾向にある事が示された。現在BoLAが疾患感受性を規定する機序を詳細に調べるため、リアルタイムPCRを用いたBLVのウイルスロードの測定法の開発を行っている。BoLAの多型性がウイルスロードの減少を規定している事が明らかとなれば、特定のアリル頻度を高くする事で、BLVが蔓延を軽減する事に繋がり、非常に有用な牛白血病対策を提唱が可能となる。ウシMHC (BoLA)遺伝子領域に存在するMHC遺伝子のうち、未だ単離されていないTAP1,TAP2,クラスIのcDNAの単離を行い、TAP1およびTAP2のcDNAクローニングに成功した。TAP1は高度に保存されていて多型が存在しない可能性があること、およびTAP2には多数の多型が存在することをはじめて明らかにした。TAPの多型の簡便な検出法を今後開発することで、クラスIIb領域も視野に入れたM且C全体の疾患との相関性を検出することが出来るようになり、新たな疾患の原因遺伝子の特定につながる可能性がある。また、高度な多型性を有することが明らかになっていながら、未だタイピング法の確立されていない、BoLA-DQA1およびDQA2遺伝子のPcR-Sequence based typing (PcR-SBT)法の確立をめざし、DQA1のタイピング法を完成させた。この方法を用いて、牛白血病および乳房炎の発症と抵抗性を規定する対立遺伝子を見いだし、それぞれ特許出願を行った。また、代表的なウシ品種におけるDQA1の対立遺伝子頻度を明らかにし、BoLAクラスIIハプロタイプの品種間の類似性の程度を示すことができた。これは、様々な疾患と関連するMHCハプロタイプを検出するための基盤情報となる。さらに、DQA1遺伝子のヘテロ接合度が著しく低く抑えられている事を見いだした。このことは、ウシ集団の多様性を減少させる結果となる可能性があり、今後注意が必要である。BoLA-DRB3はBoLAクラスIIの中でもっとも多型に富み、機能的な遺伝子であり、我々はこの遺伝子のPCR-SBT法を世界に先駆けて開発した。この方法が大規模タイピングを行うために有効に機能するために、さらなる改良を加えている。

BoLAの多型性がウイルスロードの減少を規定している事が明らかとなれば、特定のアリル頻度を高くする事で、BLVが蔓延を軽減する事に繋がり、非常に有用な牛白血病対策を提唱が可能となる。
単一分子分光法を用いた光線力学療法の反応機講の分子レベルでの解明

平成26年度には、本研究課題である「単一分子分光法を用いて光線力学療法の反応機構の分子レベルでの解明」の実行のため、光線力学療法中で発生する細胞内一重項酸素を近赤外領域で蛍光検知できる新規プローブ合成に着手した。その結果、ケイ素を含んでいるローダミンとジメチルアントラセンになっている一重項酸素蛍光プローブ(Si-DMA)を開発し、細胞内で光増感剤により発生する一重項酸素を検出することに成功した。この研究成果を2014年6月に特許出願し、2014年7月にJ. Am. Chem. Soc.誌に論文発表、3件の国内学会で口頭発表した。2014年秋からは、医療現場でより簡便に一重項酸素の発生を観察するため、色変化により一重項酸素を検知できる色素の開発を行った。現在、色素とアントラセンを用いたダイアドを利用し、比色分析に応用できる色素に関する基礎研究を終了し、その結果を特許申請及び論文投稿している次第である。本研究課題で得られた結果は、光線力学療法の反応機構を理解するかつ治療効率の向上につながる重要なものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。光線力学療法は、組織の中に導入した光増感剤を照射し、励起状態の光増感剤の消光過程で発生する活性酸素種により、効果的にがん組織を破壊する抗がん治療法である。本研究は、励起状態の光増感剤から形成された一重項酸素の検出、さらにその拡散や反応機構について単一分子レベルで明らかにすることを目指している。したがって、本格的な細胞実験を行う前に、一重項酸素検出に使える最も効果的な蛍光プローブを選ぶことが非常に重要である。平成25年度は、市販の一重項酸素プローブであるSinglet Oxygen Sensor Green (SOSG, Molecular Probe)の物性評価と新しい一重項酸素プローブ開発に取り組んだ。SOSGは発色団のfluorescein誘導体に一重項酸素を捕獲する9,10-dimethylanthracene (DMA)が共有結合によってつながっている分子であり、一重項酸素センサーとして最もよく使われてきた市販品である。我々は時間分解分光法を通じて、SOSGの光化学的な性質を定量的に調べた。その結果、市販品であるSOSGの中では、約0.5%の無修飾fluorescein誘導体、そして空気中の酸素との反応により、すでにDMAが酸化されているものが微量含まれており、その'不純物'の三重項励起状態が一重項酸素を生成する原因であることを過渡吸収測定によって究明した(一重項酸素生成の量子収率=0.06)。また、SOSGは紫外線励起(355mm)によって光イオン化されたfluorescein誘導体ラジカルカチオン種になることがわかった(光イオン化の量子収率=0.003、レーザー強度=24mJcm^<-2>)。続いて、得られた結果をもとに、細胞内の一重項酸素検出に適している新しい蛍光プローブの開発を行った。SOSGは自己酸化の問題ではなく、細胞内への透過性が低く、細胞内で発生する一重項酸素の検出に向いてないことが以前から指摘されてきた。そこで、我々は優れた光安定性や細胞内への高い透過率、かつ、細胞内場所選択性を有する発色団を用い、新しい一重項酸素の蛍光プローブの開発と細胞内の一重項酸素のイメージングに成功した。計画したとおり、平成25年度に光線力学療法中に発生する細胞内一重項酸素を検出することに成功した。平成25年度に合成したプローブを用い、平成26年度は細胞内で発生する一重項酸素や他の活性酸素種の単一分子蛍光検出に成功することを目指している。