hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発癌プロモ-ション過程における上皮・間葉間の認識制御機構に関する研究

1.上皮細胞と間葉系細胞のcoーcultureによる相互作用の解析ラット培養肝細胞と血管内皮細胞をco-cultureすると、正常肝組織に類似する構築を示し肝細胞の形態や索状配列が2週間以上維持された。また、毛細胆管様構造の速やかな出現や細胞間コミュニケ-ションの速やかな回復が認められ、血管内皮細胞との接触が培養肝細胞の分化形質の発現と維持に重要であることが示された。肝癌細胞株HuH7,肝芽腫細胞株HuH6を用いて内皮細胞および線維芽細胞とのco-culture実験を行なった。HuH7には内皮細胞との接触による分化誘導は認められなかったが、co-cultureにより内皮細胞の誘導がみられた。このことからHuH7が内皮細胞増殖因子を産生している可能性が示された。一方、HuH6と線維芽細胞BALB3T3をco-cultureするとc-AMP処理と同様desmosomeやgap junctionなどの細胞接着装置の再構成と細胞間コミュニケ-ションがみられ、HuH6の分化形質の誘導がおこることが示された。2、発癌過程における細胞接着分子の変化細胞間の認識制御機構を研究する上で、細胞間接着分子についての解析が重要である。gap junctionは細胞間コミュニケ-ションに極めて重要な役割を果している接着装置である。肝細胞のgap junctionを構成しているコネクシン32(C×32)蛋白の細胞質ドメインのペプチドを合成し、これに対するC×32特異抗体を作製した。さらに毛細胆管膜成分を抗原としてtight junctionを認識する単クロ-ン抗体を作製した。これらの抗体を用いてdiethylnitros awine投与により誘導したラット前癌肝病変,肝癌病変における接着装置の変化について検索した。いずれの病変でもこれらの接着装置の減少と局在の変化が認められた。したがって、発癌過程では少なくとも接着装置を介する細胞間の認識制御機構に異常のあることが示唆された。発癌のプロモ-ション過程における上皮と間葉の相互作用を明らかにする目的で、肝発癌の系を用いco-culture法により実験を行なった。コウグナ-ゼ潅流法によって得られたラット初代培養肝細胞(10^5個/dish)をウシ動脈由来の内皮細胞(10^3個/dish)と一緒に、10%FCSを含むWilliamsE培地でco-cultureした。培養肝細胞間には、内皮細胞と接触することによって24時間以内に多数の毛細胆管様(BC)構造の出現が認められた。一方、肝細胞単独培養では24時間を経過しても少数のBC構造がみられるのみであった。ヒト肝癌細胞(HuH7)と内皮細胞とのco-cultureでは、長期培養後も肝癌細胞にはBC構造の出現は認められなかった。しかし、内皮細胞はco-culture1週目位から著明な増殖を示し、また、紡錘状の形態変化も認められた。このような内皮細胞の増殖と形態変化は、肝癌細胞の培養上清添加では誘導されず、接触因子の関与が考えられた。以上の結果から、正常培養肝細胞は血管内皮細胞との接触により、速やかに分化(極性)が誘導され、それが長期間維持されることが示された。しかし、肝癌細胞は内皮細胞によるこのような分化誘導には反応せず、逆に内皮細胞の増殖を促進することがわかった。

このことは、正常肝組織では、肝細胞と内皮細胞の相互作用により分化が維持されているが、癌化の過程でこのような相互作用に異常が起こり、癌組織では血管内皮細胞の増殖など癌細胞の増殖に敵した間質環境が誘導されている可能性を示唆している。現在、毛細胆肝管に対するモノクロ-ナル抗体やアルブミン、AFPなどのcDNAを用い、内皮細胞による肝細胞分化の制御について研究を進めている。また肝癌細胞の内皮細胞増殖因子についても検討中である。細胞間の認識制御機構を研究する上で、基質・細胞間および細胞間同士の接着分子についての解析が不可欠である。我々は細胞接着装置の一つで、細胞間コミュニケ-ションに関与するギャップ結合に対する抗体を作製し、上皮・間葉間の相互作用の解析に応用した。1)抗ギャップ結合抗体の作成:上皮細胞のギャップ結合の多くは、コネクシン32(C×32)蛋白から構成されている。C×32のアミノ酸一次構造から細胞質ドメインのペプチドを合成し、これを用いてポリクロ-ナル抗体を作製した。この抗体の特異性は免疫電顕およびWestern Blot法により確認した。2)発癌プロモ-ション過程におけるC×32の変化:発癌剤(DEN)投与により誘導された前癌病変・肝癌組織をC×32抗体で検索すると、これらの病変でギャップ結合が著明に減少していることが明らかとなった。従って癌化の過程では上皮間・上皮間葉間の細胞間コミニュケ-ションに異常をきたしていることが示唆された。3)線維芽細胞とのcoーcultureによるヒト肝芽腫細胞HuH6の形質発現の制御:HuH6はcーAMPで処理すると、癌胎児蛋白であるAFP産生の減少やアルブシンの産生など分化形質の誘導がみられた。同時にC×32抗体で検索するとギャップ結合の再構成や細胞間コミニュケ-ションの回復がみられた。HuH6を線維芽細胞BALB3T3とCoーcaltureすると、CーAMP処理と同様.細胞間のギャップ結合の出現と細胞間コミニュケ-ションの回復が認められ、線維芽細胞が肝芽腫細胞の分化を誘導することが示された。4)線維芽細胞によるヒト乳癌細胞MCF7の造腫瘍性の制御:10^6個のMCF7をヌ-ドマウス脾内へ注入すると、5/6のマウスに脾内腫瘍の形成をみた。一方、MCF7と同数のヒト線維芽細胞を混合して脾内へ注入すると脾内腫瘍の形成が抑制された。以上の結果から、癌化の進展に伴ない細胞接着装置に異常が認められること、また腫瘍細胞の形質が線維芽細胞により修飾される事が示された。
トキイロヒラタケの色素タンパク質の構造と光合成機能

これまでにキノコ類に存在する色素については多数の報告があるが,その機能については全く未知であった。ハラタケ目ヒラタケ科ヒラタケ属のトキイロヒラタケ(Pleurotus salmoneostramineus L.Vass.)は,1973年にシベリアの沿海州地方で新種のキノコとして発見され,現在ではロシア極東,日本、ニューギニアなどに分布していることが知られている。この食用キノコは,傘の表も裏も美しいピンク色をしているが,発茸後一週間ほどで色あせて白っぽくなるため,天然のものを見つけることは極めて困難である。最近,共同研究者の稲葉らが,このキノコの人工栽培に成功したので、我々は,全く解明が進んでいなかったこのキノコのピンク色の色素の構造と機能に関する研究を展開した。その結果,この色素物質は,分子量48900の新しい色素タンパク質で,分子量25200と23700の二組のサブユニットから構成されていることが判った。さらに,この色素本体として4nπ(n=2)系の新しく且つ特異な芳香族化合物の3H-インドール-3-オン(1,インドロン)を見い出した。この色素タンパク質は1と金属(Fe)-糖(ガラクトース鎖)タンパク質から構成され,その電子スペクトルの最長極大吸収波長は496nmにある。なお,地球上で観測される太陽光線の波長分布の極大値は約500nmにあることや,このキノコの成長には光が必要不可欠であることなどから,この色素タンパク質は何らかの機能をもつ光受容体であることが強く示唆された。
鉄筋コンクリート部材のひび割れからの透水量および透気量の予測方法に関する研究

鉄筋コンクリート部材のひび割れからの透水量および透気量の予測において,ひび割れ内の流れに対してポアズイユの法則を適用した式を用いることは合理的であるが,解決すべき問題はその中に含まれているひび割れ内部の形状に関する項を定量的に評価することである。そこで本研究は,ひび割れ内部の形状を決定するものとして,1)ひび割れ表面の曲がりと凹凸,2)鉄筋の配置による部材表面と鉄筋近傍までのひび割れ幅の変化,の2つに着目した。平成13年度はひび割れ表面の曲がりや凹凸などに影響を及ぼす要因としてコンクリート強度を取り上げ、強度の異なるコンクリートを用いて、ひび割れからの透気試験およびひび割れ面の表面形状測定を実施し、そして、ポアズイユ流れに基づく評価式に含まれている補正係数とひび割れの表面形状との関係について検討した。得られた結果をまとめると以下の通りである。(1)コンクリートの圧縮強度が高くなると、ひび割れ表面は相対的に滑らかになり、移動平均を用いてひび割れのうねりおよび表面粗さを評価することができる。(2)同じひび割れ幅の場合、水セメント比が小さい方がひび割れからの透気量は大きい。(3)ひび割れからの透水量は経時的に減少するが、圧力作用から2時間後および1日後の透水量はどちらも透気量と相関性がある。(4)ポアズイユ流れに基づくひび割れからの透気量の評価式に含まれる補正係数には作用圧力の大きさはほとんど影響しない。(5)補正係数はひび割れの表面粗さと関係し、平均粗さが小さくなると、すなわち圧縮強度が高くなると小さくなる。(6)ひび割れ幅が約0.050.2mmの範囲では補正係数を一定としてひび割れからの透気量を評価するととができるが、約0.05mm以下ではやや過大評価となる。
在宅看護実習における遠隔カンファレンスの効果的運用

本研究では、分散・拡大した地域看護実習において、テレビ電話を活用した遠隔カンファレンスを実施し、その効果的な運用と教育効果について明らかにした。平成11年度は本学と臨地実習地3地点を結び,ISDNを利用したテレビ電話で遠隔カンファレンスを実施した。画像・音声・内容理解・操作の簡便性は良好で実用に適しているとの評価が得られた。運用の工夫点は機器を常時受信可能にする、学生が操作を習得する、会話スペースを確保することの3点であった。また、実習における遠隔カンファレンスの教育効果として(1)体験したことを振り返り、考察を深める機会となる(2)2カ所の小規模のグループメンバーがつながることによりグループダイナミクスが高まる(3)学生個人の体験をメンバー間に共有できる(4)教員の形成的評価がより充実する(5)現場のスタッフなどの参加により事例についての具体的な指導や助言が可能となる(6)学生の主体的な実習準備に活用できることがあり、テレビ電話による遠隔カンファレンスを地域看護実習に活用していく基盤づくりができた。平成12年度は、平成11年度の結果を踏まえて、在宅看護全実習地にテレビ電話を設置し、全実習期間を通じて遠隔カンファレンスを取り入れた。テレビ電話による遠隔カンファレンスの紹介ビデオやトラブルシューティングの作成によるオリエンテーションにより、学生が自主的に使いこなすことは可能であり、日常の教育方法として定着した。今後、これらの成果から、遠隔カンファレンスを在宅看護実習に継続活用し、多施設・機関及び遠隔地における実習の特性を生かすための教育開発を行おうとしている。本研究では、分散・拡大した地域看護実習に対してより効果的な教育方法を開発することを目的としている。平成11年度は本学と臨地実習地3地点を結び、ISDNを利用したテレビ電話による遠隔カンファレンスを試み、次のような結果が得られた。1.カンファレンスの実用性として,音声の聞きやすさ,画面の見やすさは良好と評価され,内容理解も図られた。教育的コミュニケーション手段としての働きを行うのに十分な機能を備えており,操作の簡便性についても,良好と評価された。今後の普及・拡大を考える上で期待でき,実用的である。2.運用の工夫点は,機器を常時受信可能にする,学生が操作を習得する,会話スペースの確保の3点である。3.時間と距離の物理的な制約が解消されることの効果は,学生個人の限られた体験を最大限共有できること,教員による形成的評価が可能になること,現場の人的資源が活用できること,学生の主体的な準備に活用できることの4点である。4.新たなメディアとしての関心も高く,教育方法としての期待が持たれる。これらのことから,テレビ電話による遠隔カンファレンスの機能・有効性は実用に適しており,地域看護実習に取り入れ活用していくことは,実習方法・学習支援の一つとして有効な手段となり得ることが示唆された。
トリレンマ克服を可能とする分散型エネルギーシステム用次世代高安全二次電池の創製

カーボンを含まないミクロンサイズ(平均>7μm)のLiFePO_4の電気化学特性が、新規な窒素ドーピングにより改善された。窒素ドープLiFePO_4(LiFePO_4-N)は1mAcm^<-2>,20°Cの条件下で、C-free LiFePO_4の約1.5倍の放電容量(90mAhg^<-1>)を示した。これは、LiFePO_4中のOがNで一部置換されたことでフレームワークの共有結合性が強くなり、間接的に結晶格子中のLi^+イオン拡散性が向上した結果だと考えられた。LiFePO_4系他元素置換材料の合成を行うにあたりまず、元素置換の効果を明確化するために、基準となるピュアなLiFePO_4を合成した。合成方法としては、合成過程で炭素が形成される可能性のある炭素を含む従来の原材料(例えばシュウ酸鉄[Fe(COO)_2・2H_2O]や酢酸鉄[Fe(OOCH_3)_2])は使用せず、リン酸リチウム(Li_3PO_4)およびリン酸第1鉄(Fe_3(PO_4)_2・8H_2O)を原料として用いて炭素フリーなLiFePO_4を不活性ガス中で焼成合成した。ピュアなLiFePO_4であることは、X線回折による結晶構造解析により確認し、これをコントロール品とした。得られた粉末は、電子顕微鏡により、平均粒径2-3μm程度の一次粒子が凝集した二次粒子径10μm程度の凝集体であることがわかった。また、同上の原料を用いつつLiFePO_4のLiの一部をAl等の多価カチオンで各々1%置換したLiFePO_4系他元素置換材料を合成し、上記ピュアLiFePO_4とともに交流2端子法で電子伝導度を測定したが、今回行った炭素フリーLiFePO_4においては、置換による導電性の向上は認められなかった。更に、LiFePO_4のアニオン置換材料合成に取り組み、ピュアLiFePO_4パウダーの管状炉内熱処理で窒素置換LiFePO_4を合成した。この際、LiFePO_4への窒素の導入置換を確実なものとするために、非常に活性な発生基の窒素を加熱時に放出するアンモニアガス流通下で合成を行った。得られたサンプルのX線回折ピークは、ピュアLiFePO_4と比較して全体的に若干低角度側にシフトしており、窒素置換により格子定数が変化していることが示唆された。合成条件を確立したピュアLiFePO_4をコントロール品として、昨年度に得られた結果を元に、新規なアニオン置換(PO_4ユニット中の酸素の一部窒素置換)によるリチウムイオン伝導性向上に向けて、窒素ドープLiFePO_4(以下、LiFePO_4-Nと表記)の合成条件詳細検討ならびに窒素ドープ効果の検証に注力した。LiFePO_4-N合成手法として、(1)窒化したLiPO_3(LiPO_3-N)を出発原料の一種に用いた窒素雰囲気中合成(原料窒化)および、(2)ピュアLiFePO_4のアンモニア気流中焼成による窒化(直接窒化)を採り、熱処理条件依存性を検討しながら、ラマン分光、エネルギー分散型X線分光(EDX)による元素分析、X線回折(XRD)、レーザ回折・散乱式粒度分布測定などによる物性評価を行った。その結果、いずれのサンプルも狙い通り炭素が含まれておらず、窒素がドープされた平均粒径5ミクロン以上のLiFePO_4-Nに改質されていることが明らかとなった。またこれらのLiFePO_4-Nを正極活物質としてLi金属を対極とするコインセルを作製し、定電流充放電試験によりその電気化学特性を評価した結果、上記(1),(2)の手法で合成したLiFePO_4-Nはコントロール品であるピュアLiFePO_4をはるかに凌ぐ放電容量を示し、当初目的の窒素ドープ効果が確認された。更に上記検討と並行して、粉末表面電子伝導性向上を図るべく、スクロース・NH_4-CMCなどの炭素含有有機物をLiFePO_4粉末と混合して不活性ガス中で焼成して粉体表面への導電性炭素皮膜被覆を行い、その効果を検証した。熱分析測定(TG/DTA)から求めた被覆炭素量は約3wt.%であり、炭素被覆による粉末表面電子伝導性向上によって、その正極活物質特性が向上することが明らかとなった。今年度は、本研究で新たに見出されたLiFePO_4への窒素ドープ効果(放電容量の増大など)の発現要因を明らかにするために、化学分析により窒素ドープLiFePO_4(以下、LiFePO_4-Nと表記)の組成ならびにFeの価数を決定し、これらの結果を元にX線リートベルト解析を行ってその結晶構造を詳細に解析した。

化学分析の結果、Li、Fe、Pが化学量論比で存在し、LiFePO_4-N(窒化処理温度:600,550°C)のFeは2価であり、NがFeに対してモル比でおよそ1%、バルクとして存在していることを確認した。これらの結果から、Nがドープされるとチャージバランスを取るために0が一部欠損し、LiFePO_4-N(600,550°C)の化学組成はLiFePO_<3.9865>N_<0.009>と表すことができると考えられた。この化学組成を元にしたX線リートベルト解析からは、窒素ドープにより格子定数はさほど変わらぬ一方、LiFePO_4-NにおいてNはO_1、O_3サイトにドープされ、またOの欠損はO_1サイトにおいて生じていることが示唆された。また、原子間距離から導出したFeO_6およびPO_4多面体の体積は、窒素ドープにより収縮していることが分かった。これらの解析結果から、Nがフレームワークに置換導入されたことで、O_1サイトにおける酸素欠損の存在も相俟って、狙い通りLi^+イオン拡散パスが拡がり、Li^+イオン拡散性が向上したことによってLiFePO_4への窒素ドープ効果が発現した可能性が高いことがわかった。
レーザーモアレ干渉法によるセラミックス基複合材料の繊維架橋効果に関する研究

本年度は、繊維体積率V_f=20%のSiCウィスカー強化アルミナセラミックスについて破壊靱性試験を行い、レーザーモアレ干渉変位計測システムを用いて試験中に生じるき裂開口変位を計測した。そして、この計測したき裂開口変位と有限要素解析より計算された繊維架橋を考慮していない場合のき裂開口変位の比較を行った。その結果、計測したき裂開口変位は、有限要素解析より得られたそれより小さくなり、この材料が繊維架橋効果により高靭化されることが確認できた。さらに、有限要素モデルのき裂面部分にあたる節点の強制変として、本計測より得られたき裂開口変位を与えることにより、き裂面部に生じる繊維架橋応力を算出した。これにより、繊維架橋応力の分布は、き裂先端近傍で最大となり、き裂先端から離れるに従い減少する傾向を示すことがわかった。さらに、この結果を用いて、応力拡大係数の繊維架橋により増分ΔK_Cを破壊力学に基づき算出した。その結果、ΔK_Cと、負荷荷重および予き裂長さから算出した見かけの応力拡大係数Kとの比は、負荷レベルが大きくなるにしたがい、小さくなる傾向を示した。これは、荷重の増加に伴い、き裂面に架橋している繊維の破断や引抜けなどが多く生じるようになるためと考えられる。なお、この手法により算出した破壊時における応力拡大係数の増分ΔK_Cは、実験より得られた見かけの応力拡大係数の増分と良好に一致し、この手法の有効性が確認できた。本年度は、レーザーモアレ干渉計側システムを構築することを試みた。更に、この計測システムを用いて、四点曲げ負荷下におけるCMCのき裂開口変位(COD)を計測した。レーザーモアレ干渉法システムの構成は次のとおりである。20mWのHe-Neレーザーから発せられた光は、スペーシャルフィルターにより拡大され、更に、コリメーティングレンズを通過し並行光となる。そして、このレーザー光はビームスプリッターにより2つに分光され、これら2つの光が特定の角度を持って試験片に照射される。なお、この計測が振動の影響を受けないよう、これらの装置を除振台上に置いた。本研究で用いたCMCは母材をアルミナ、繊維をSiCウィスカーとしたものである。バルク材は、本研究室所有のホットプレス装置を用いて作成した。このとき、繊維含有率Vfは、5%および10%とした。そして、このバルク材を5×10×52mmの短冊状の試験片に加工した。また、試験に先立ちCMC試験片表面にはリソグラフィ技術を用いて600本/mmの回折格子を設けた。なお、試験片中央部にNoseの方法により長さ5mmの予き裂を導入した。試験には本研究室所有の引張圧縮負荷装置を用い、上支点間距離20mm、下支点間距離50mmの四点曲げ負荷を試験片に与えた。本年度得られた結果を以下に要約する。(1)本年度構築したレーザーモアレ干渉計測装置を用いて、CMCのCODを計測することが可能となった。このときの測定分解能は50nm以下であった。(2)負荷荷重が小さいとき、き裂先端から1mm程度までの範囲でCODが極端に小さくなった。これは、この領域で繊維の架橋効果が大きくなったためであると考えられる。この傾向は、Vfが大きいほど顕著であった。(3)負荷荷重が比較的大きい領域で、実験より得られたCODと、線形破壊力学より得られるそれとを比較した結果、前者が、後者より小さくなった。これより、負荷荷重が大きい場合でも、き裂先端部近傍の繊維架橋効果が大きいことが示された。当研究室が所有しているホットプレスを用いて繊維含有率V_f=5,10および15%のAl_2O_3基/SiCウィスカ材を作成した。そして、これらの材料について破壊靱性試験を実施し、繊維含有率の破壊靱性値に及ぼす影響について調査した。この破壊鞍性試験を行う際、昨年度構築したレーザーモアレ干渉法変位計測システムを用いて、負荷過程および破壊時におけるき裂開口変位を計測した。この計測を行うために、あらかじめ試験片にはリソグラフィにより1/600mm間隔のグレーティングを施した。これにより、1μm以下のオーダーの変位計測が可能となった。本研究では,特にき裂先端近傍の変位について詳細な計測を行い、この領域における繊維架橋効果について調査した。その結果、破壊靱性試験の負荷過程において、負荷が小さい領域では、荷重の増加に伴いき裂先端近傍の開口変位も増加する傾向にあった。しかし、ある程度負荷が大きい領域では、それ以上負荷を与えてもき裂先端開口変位はあまり増加しなかった。このことより、負荷が大きくなるに従いき裂先端近傍での繊維架橋効果が大きくなることがわかった。また、破壊時のき裂開口変位と破壊靱性値から算出した理論的なき裂開口変位との比較を行ったところ、繊維含有率が大きくなるにしたがい、両者の差異が大きくなる傾向が示された。これは、繊維含有率が大きいほど繊維架橋の程度が増すためである。なお、本研究ではレーザーモアレ干渉法によるき裂開口量の計測年加えて、走査型電子顕微鏡およびレーザー顕微鏡により破面観察を行った。そして、これら計測結果および観察結果から、この材料の破壊時における繊維架橋効果について知見を加えた。

本年度は、繊維体積率V_f=20%のSiCウィスカー強化アルミナセラミックスについて破壊靱性試験を行い、レーザーモアレ干渉変位計測システムを用いて試験中に生じるき裂開口変位を計測した。そして、この計測したき裂開口変位と有限要素解析より計算された繊維架橋を考慮していない場合のき裂開口変位の比較を行った。その結果、計測したき裂開口変位は、有限要素解析より得られたそれより小さくなり、この材料が繊維架橋効果により高靭化されることが確認できた。さらに、有限要素モデルのき裂面部分にあたる節点の強制変として、本計測より得られたき裂開口変位を与えることにより、き裂面部に生じる繊維架橋応力を算出した。これにより、繊維架橋応力の分布は、き裂先端近傍で最大となり、き裂先端から離れるに従い減少する傾向を示すことがわかった。さらに、この結果を用いて、応力拡大係数の繊維架橋により増分ΔK_Cを破壊力学に基づき算出した。その結果、ΔK_Cと、負荷荷重および予き裂長さから算出した見かけの応力拡大係数Kとの比は、負荷レベルが大きくなるにしたがい、小さくなる傾向を示した。これは、荷重の増加に伴い、き裂面に架橋している繊維の破断や引抜けなどが多く生じるようになるためと考えられる。なお、この手法により算出した破壊時における応力拡大係数の増分ΔK_Cは、実験より得られた見かけの応力拡大係数の増分と良好に一致し、この手法の有効性が確認できた。
火災高温時における建築鋼構造の鋼材ひずみ速度の詳細検討と耐火設計の高度化

本研究課題の主目的は、建築耐火分野において、今まで詳細な検討・評価されてこなかった「高温時鋼材のひずみ速度」と「鋼部材・構造全体の火災時終局強度」の関係を解明するために、ひずみ速度に着目した高温素材引張試験、鋼部材の高温載荷実験と数値解析を新たに実施し、これより火災時におけるひずみ速度変化が部材終局耐力・変形性能に及ぼす影響を検討し、ひずみ速度の視点から鋼材の高温時機械的性質部材実耐力・実変形性能の関係を新たに明らかにすることである。本研究成果は、建築耐火実務設計で利用可能な設計強度と各種部材耐力に反映させることで鋼構造耐火設計を高度化し、また部材崩壊までのひずみ速度の実態が解明されることで、JISに規定された現行高温素材試験の画一的なひずみ速度設定値が持つ工学的意味と問題点を明らかにし、現行試験法の抜本的改革も視野に入れた建築耐火向け新試験法の開発と提案を目指す。本年度においては、建築火災の対象部材温度(常温800°C)に対して、引張ひずみ速度を数段階に変化させた高温鋼材引張試験を実施した。本実験結果より、既往のひずみ速度依存型の応力ひずみ関係の一般的な定式化を図り、耐火設計でも利用可能な応力ひずみ関係式の新提案を行った。さらに荷重一定・温度漸増の模型鋼梁の3点曲げ載荷加熱実験を実施し、部材の崩壊温度を明らかにした。本実験では、荷重比、加熱速度をパラメータに設定し、加熱速度や荷重比が異なる場合の鋼梁の耐火性能(崩壊温度)を明らかにした。得られた実験結果については、ひずみ速度の影響を考慮した非線形弾塑性解析結果との比較を行った。解析結果と実験結果の傾向は概ね一致するものの、数値解析における鋼材応力ひずみ関係のモデル化が不十分な箇所もあり、全般的に解析の崩壊温度が低くなっている。これは次年度の検討課題となる。ひずみ速度の影響を考慮した高温時応力ひずみの定式化と素材試験が順調に進んだため、加熱部材実験を当初の計画から約半年前倒しで実施した。最初の1年で、鋼部材の耐火性能の解明、鋼素材の高温特性の定式化、および数値解析モデルの提案がほぼ完了することができた。前述の通り、数値解析における鋼材応力ひずみ関係のモデル化が不十分な箇所もあり、全般的に解析の崩壊温度は、実験結果と比べて低くなっている。今後はさらなる数値解析モデルの改良が必要と考えている。次年度は、模型鋼梁に対する温度一定・荷重漸増実験を追加で実施する。これにより載荷速度を変化させた場合の鋼梁の高温耐力・変形性能を明らかにする。さらに模型鋼柱の高温座屈実験を行うことで、ひずみ速度の検討を行う。加熱速度および荷重を変化させた鋼柱の座屈実験を行い、崩壊温度に対してひずみ速度がどのような影響を及ぼすかを検討する。さらに鋼柱の高温座屈に対する数値解析モデルを構築することで、実験結果と解析結果の比較を行う。

次年度は、模型鋼梁に対する温度一定・荷重漸増実験を追加で実施する。これにより載荷速度を変化させた場合の鋼梁の高温耐力・変形性能を明らかにする。さらに模型鋼柱の高温座屈実験を行うことで、ひずみ速度の検討を行う。加熱速度および荷重を変化させた鋼柱の座屈実験を行い、崩壊温度に対してひずみ速度がどのような影響を及ぼすかを検討する。さらに鋼柱の高温座屈に対する数値解析モデルを構築することで、実験結果と解析結果の比較を行う。
ブラストドレッシングの最適条件探索に関する研究

ブラストドレッシングによりワーク材料が削除される過程を計算機シミュレーションできるプログラムを作成した。4種類の研磨剤(WA♯80、C80、FB18S、FS180M)による10種類のワーク材料(S55C、S441、FC25、黄銅、銅、Al、アクリル、ソーダガラス、硬質ゴム、軟質ゴム)のブラスト試験とシミュレーションを実行し、両結果に基づいて本シミュレーション法の妥当性と信頼性を確認したところ、以下のことが判明した。1.研磨剤がWA砥粒またはC砥粒で、ワーク材料が金属材料の場合には、シミュレーション結果と実験結果は割合よく一致し、本シミュレーションが実用可能であることがわかった。2.ワ一ク材料が軟質ゴムの場合には、ゴムの弾性により研磨剤粒子が跳ね返されるため窪みは全く形成されない。また、合成樹脂の研磨剤により鋳鉄やアルミニウムの金属に窪みが形成される。このような意外な結果が本シミュレーションにより精確に予測できる。3.天燃ダイヤモンドの(111)面がWA砥粒を研磨剤とするブラスト試験により破壊して除去され、その窪みの深さはシミュレーション結果にかなり近い値である。4.平均粒経が6.08.5μmの微細粒研磨剤によるブラストの場合、窪みの最大深さの実験結果はシミュレーション結果より20200倍大きく求まった。その主な原因は、ノズルから噴射され霧状になった一個の水滴の中に数個数十個の研磨剤が含有されており、それらの研磨剤がワーク材料の同一箇所に同時に激突するためと推察できる。ブラスティグガンから噴射され、加速された研磨剤粒子が高速度でワーク材料に衝突した時、ワーク材料が変形し、除去されるメカニズムを説明するための理論を新に構築し、その理論に基づいて計算機シミュレーションするためのプログラム開発した。10種類(S55C、FC25、SS41、A1、銅、黄銅、アクリル、ソーダガラス、硬・軟質ゴム)のワーク材料に対してシミュレーションと実験を実施し、両結果を比較・検討したところ、6種類の金属材料と軟質ゴムについては両者が良く一致した。このことより、ブラストドレッシングによる材料の除去過程が理論的に説明でき、したがってブラストドレッシングの最適条件を探索する際に本計算機プログラム有効に活用できることが明らかとなった。今年度に研究を実施した内容は下記の通りである。1.Hertzの弾性接触理論、Finnieの高速粒子による材料除去の研究成果に基づいて、ブラストドレッシングにより材料が除去されるメカニズムを説明するための理論を新に構築した。2.新に構築した理論に基づいて、計算機プログラムを作成した。3.計算機プログラムの入力として必要となる、研磨剤粒子の総数と研磨剤粒子の分布状況については過去に研究された例がないので、実験装置を考案して実験的に求めた。その結果、分布は新規分布にしたがうことが分かり、ブラスト時間により決まる研磨剤総数と正規分布の標準偏差を入力すれば良いことが判明した。4.研磨剤をWA#80として、上記10種類のワーク材料についてシュミュレーションと基礎実験を行ったところ6種類の金属材料と軟質ゴムについては両結果が良く一致することが分かった。したがって、新に開発した計算機プログラムは「ブラストドレッシングの最適条件探索」のために有効に活用できることが判明した。昨年度は研磨剤がWA♯80の場合について試験したが、本年度は研磨剤をC砥粒(C♯80)、ガラスビーズ(FB80S)ならびに合成樹脂(FS180M)として、昨年度と同様の10種類(S55C、FC25、SS41、Al、銅、黄銅、アクリル、ソーダガラス、硬・軟質ゴム)のワーク材料に対してブラスト試験を実施し、昨年度開発したブラストドレッシング過程のシミュレーションの妥当性と適用限界について検討・考察した。さらに、研磨剤A♯200による天然ダイヤモンドのブラスト試験ならびに微細粒研磨剤による超硬合金、高速度鋼、S45Cのブラスト試験を実施し、シミュレーション結果と比較・検討した。得られた研究成果は以下のように要約される。

(1)研磨剤がC砥粒(C♯80)によるブラスト試験結果はSS41材以外の5種類の金属材料については、実験結果がシミュレーション結果より2.53.0倍大きく求まった。これはC砥粒の角が切れ刃として作用する切削効果がシミュレーションには考慮されていないためと考えられる。(2)研磨剤がガラスビーズの場合には、FC25材以外の5種類の金属材料についてはシミュレーション結果の方が210倍大きく求まった。これは、ガラスビーズの研磨剤がワーク材料に衝突する瞬間に細かく破壊してワーク材料を除去する能力が低下するためと理解できる。(3)研磨剤が合成樹脂の場合には、ワーク材料がFC25、Al、アクリルの場合にだけブラスト試験により窪みが形成され、シミュレーションによっても同様の結果が確認された。(4)世の中で最も硬い物質である天然ダイヤモンドが研磨剤A♯200によるブラスト試験で破壊され、シミュレーションによっても同様の結果が確認された。(5)微細粒研磨剤によるブラストの効果については、さらなる実験・研究が必要である。
新しいサイトカインIGIFによるアレルギー治療の試み

B細胞は抗原とヘルパーT細胞で刺激されると抗体を産生する。最近、我々は抗CD40抗体で活性化されたB細胞をIL-12とIL-18で刺激すると、B細胞自身がIFN-γを産生して、IL-4で誘導されるIgE産生を抑制することを明らかにした。このことは、B細胞が調節性細胞としても機能することを示すものであった(PNAS,1997)。B細胞はIL-12で共刺激された時にのみIL-18に反応してIFN-γを産生することから、IL-12で刺激されたB細胞上のIL-18Rの発現を調べた。その結果、IL-12で刺激されたB細胞が高親和性と低親和性のIL-18Rを発現していることが明らかとなった(投稿中)。次に、IL-12とIL-18をマウスに投与したところ、T,B,NK細胞からIFN-γの産生が誘導され、この因子の作用で生体内でのIgE産生が抑制されることも明らかになった(PNAS,1997)。このように、IL-12とIL-18は、生体内でのTh1とTh2のバランスを決定し、ひいては、免疫応答に伴って産生されるIgE抗体の量をも決めることとが明らかとなってきた。次に我々は、先天的にIgE産生能が低下しているマウス(SJL)を用いて、その脾臓細胞からT細胞を陰性除去(抗Thy-1,抗Lyt-1抗体を用いた)して得たB細胞濃縮分画を、LPSとIL-4で刺激すると、混入していたマクロファージから産生されたIL-12とIL-18の作用で、SJLのB細胞はIgEを産生しないことを明らかにした。更に、LPSで刺激されたマクロファージが産生するIL-12とIL-18がCD4-CD8-CD3+IL-2Rβ+のT細胞を刺激し、IFN-γの産生とFasリガンドの発現増強を誘導することで、IgE産生を抑制することを明らかにした(J.Immunol,印刷中)。このように、マクロファージから産生されたIL-12とIL-18は、Th1/Th2のバランスを決定する上で極めて重要な役割を果たすことが考えられる。更に、IL-12とIL-18を投与する方法は、アレルギー疾患の治療方法としてユニークな手段を提供するものと考えられる。IGIF(IFN-γ-inducing factor)は活性化マクロファージが産生する。我々の研究からIGIFは前駆体で存在し、LPSがマクロファージに作用すると、活性型のIGIFとして産生されること、そしてこの前駆体から活性型への変換に、ICE(IL-1βconverting enzyme)が関与することが明らかになった。また活性型のリコビナントIGIFをクローン化NK細胞に作用させるとFasLの発現が増強させることが明らかになった。更にIL-12とIGIFをT細胞あるいはB細胞に作用させると、T細胞だけでなくB細胞もIFNγ産生細胞に分化することも明らかになった。

従って、抗CD40抗体とIL-4でB細胞を刺激してIgE産生を誘導する時にIL-12とIGIFを共存させた場合、B細胞自身がIFNγを産生する様になり、このIFNγがオートクラインまたはパラクラインにB細胞に作用してIgE産生を完全に抑制することも明らかになった。更にIL-12とIGIFを生体内に投与することで、寄生虫感染によって誘導されるIgE産生が抑制されることも明らかになった。その抑制機序は、IL-12とIGIFで刺激されると、in vivoでもT細胞とB細胞がIFNγ産生細胞に分化するからである。更にIL-12とIGIFはTh2細胞の誘導に必要と考えられるCD4^+NK1.1^+T細胞の数を著しく減少させることも今回の研究で明らかになった。我々は既にCD40L刺激がB細胞上にFas抗原を誘導することを明らかにしているが、IGIFがNK細胞やTh1細胞のFasLの発現を誘導することが今回の研究で明らかになった。この結果から、FasLを介したIgE産生抑制の系の存在も予測させるものとなった。今後はヒトのB細胞を用い、in vitroの方で同様の実験を行っていきたいと考えている。IL-18は発見当初、T細胞やNK細胞に作用して強いIFNγを誘導することから、IFNγ誘導因子IFNγ-inducing factor(IGIF)と呼ばれた。しかしその後、この因子が多彩な生物活性を持つことが明らかになったため、インターロイキン18(IL-18)と呼ばれるに至った。我々は平成8年度に、IL-18とIL-12の存在下でB細胞を抗CD40抗体とIL-4で刺激すると、B細胞はIFNγを産生し、IL-4で誘導されるIgEとIgG1産生が抑制されることを示した。更に、線虫を感染させたマウスでは大量のIgEが産生されるが、このようなマウスにIL-12とIL-18を投与すると、IgE産生は完全に抑制されることも示した。平成9年度は、先天的にIgE産生能が低下しているマウス(SJL)を用いて、その低下にIL-12とIL-18がどの様に関係するかを検討した。BALB/cとSJLの膵臓細胞からT細胞を陰性除去(抗Thy-1,抗Lyt-1抗体を用いた)して得たB細胞濃縮分画を、LPSとIL-4で刺激すると、BALB/cのB細胞はIgEを著明に産生するが、SJLのB細胞はIgEを産生しないことを明らかにした。ところが、抗IL-12抗体とIL-18抗体の存在下でSJLのB細胞を刺激すると、著明なIgE産生が誘導されること、あるいは、SJLのB細胞濃縮分画からマクロファージを除去後、LPSとIL-4でSJLのB細胞を刺激すると、著明なIgE産生が誘導されることを明らかにした。更に、SJLのB細胞濃縮分画にはCD4^-CD8^-CD3^+IL-2Rβ^+のユニークなT細胞が多数存在することも明らかにした。今回の我々の研究から、LPSで刺激されたマクロファージが産生するIL-12とIL-18がCD4^-CD8^-CD3^+IL-2Rβ^+のT細胞を刺激し、IFNγの産生とFasリガンドの発現増強を誘導することで、IgE産生を抑制することが明らかになった。
水稲不耕起栽培による環境保全型生産技術の創出に関する研究

八郎潟中央千拓地(D14圃場)の低湿重粘土水田内に設けた不耕起田と耕起・代かき田(慣行田)の試験圃場において実施した調査・実験は順調に進展し、次のような知見を得ることができた。1.試験田の地温深度5cm、10cm、20cm、30cmの地温は、年間を通じ不耕起田が慣行田より高めに推移することがわかった。とくに田植え直後から活着期の地温が高めに推移したことは、水稲の初期生育の確保のうえで有利であった。2.土層の酸化還元電位(Eh)深度3.5、10、17.5、25、40cmの酸化還元電位(Eh)は、潅漑期のEhは不耕起田が慣行田に比べて高い数値で推移し、不耕起田の土層は酸化が進行していることがわかった。3.降下浸透水中の鉄(Fe)、マンガン(Mn)濃度降下浸透水中のFe濃度は、作土層の上部で高く、下層では低下する傾向がみられた。とくに不耕起田に比べて慣行田の値が極めて大きい値となった。Mn濃度分布についてもFe濃度と同様な傾向を示した。4.電気伝導度(EC)降下浸透水の電気伝導度(EC)は深度3.5cmでは慣行田のECの不耕起田に比べて大きい値を示した。深度40cmでは両試験田共に下層のECが上昇する傾向にある。5.田面水および小排水路排水のSS濃度田植え直後の田面水のSS濃度は不耕起田が20.8mg/l、慣行田が78.4mg/lであった。また、小排水路排水のSS濃度は不耕起田が28.8mg/lに対し、慣行田では159.2mg/lと高い値を示した。6.蒸発散浸透量(減水深)水田1筆の蒸発散浸透量は、不耕起田は12.6mm/dであるのに対して、慣行田は5.7mm/dであった。八郎潟中央干拓地(D14圃場)の低湿重粘土水田内に設けた不耕起田と耕起・代かき田(慣行田)の試験圃場において実施した調査・実験は順調に進展し、次のような知見を得ることができた。1.試験田の地温深度5cm、10cm、20cm、30cmのいずれの地温も、灌漑期、非灌漑期の年間を通じ、不耕起田が慣行田より高い地温を示した。水稲の不耕起栽培の導入により、地温上昇効果とその保持機能がみられたことは、水稲栽培に有利な土壌条件になりうることが期待できる。2.降下浸透水中の鉄(Fe)、マンガン(Mn)濃度降下浸透水中のFe濃度は、作土層の上部で高く、下層では低下する傾向がみられた。この現象は、酸化還元電位(Eh)が不耕起田において高いことと対応している。3.電気伝導度(EC)降下浸透水の電気伝導度(EC)は深度3.5cmでは不耕起田が0.50.9ms/cmに対して、慣行田は0.91.1ms/cmと慣行田のECが不耕起田に比べて大きい値を示した。深度40cmでは不耕起田が2.42.6ms/cm、慣行田は2.62.9ms/cmであった。両試験田共に下層のECが上昇する傾向にある。これは八郎潟干拓地はかつて半鹹湖であったことによるナトリウムイオン濃度の影響のためと考えられる。4.蒸発散浸透量(減水深)水田1筆の蒸発散浸透量は、活着期から幼穂形成期まで不耕起田は13.218.7mm/dの平均15.8mm/dであるのに対して、慣行田は4.04.8mm/dの平均4.6mm/dであった。また、畦畔浸透量は不耕起田が平均9.3mm/d、慣行田が平均0.9mm/dであった。

4.電気伝導度(EC)降下浸透水の電気伝導度(EC)は深度3.5cmでは慣行田のECの不耕起田に比べて大きい値を示した。深度40cmでは両試験田共に下層のECが上昇する傾向にある。5.田面水および小排水路排水のSS濃度田植え直後の田面水のSS濃度は不耕起田が20.8mg/l、慣行田が78.4mg/lであった。また、小排水路排水のSS濃度は不耕起田が28.8mg/lに対し、慣行田では159.2mg/lと高い値を示した。6.蒸発散浸透量(減水深)水田1筆の蒸発散浸透量は、不耕起田は12.6mm/dであるのに対して、慣行田は5.7mm/dであった。八郎潟中央干拓地(D14圃場)の低湿重粘土水田内に設けた不耕起田と耕起・代かき田(慣行田)の試験圃場において実施した調査・実験は順調に発展し、平成8年度は次のような知見を得ることができた。1.試験田の地温深度5cm、10cm、20cm、30cmの地温は、年間を通じ不耕起田が慣行田より高めに推移することがわかった。とくに田植え直後から活着期の地温が高めに推移したことは、水稲の初期生育の確保のうえで有利であった。2.土層の酸化還元電位(Eh)深度3.5、10、17.5、25、40cmの酸化還元電位(Eh)は、潅漑期のEhは不耕起田が慣行田に比べて高い数値で推移し、不耕起田の土層は酸化が進行していることがわった。3.降下浸透水中の鉄(Fe)、マンガン(Mn)濃度降下浸透水中のFe濃度は、作土層の上部で高く、下層では低下する傾向がみられた。とくに不耕起田に比べて慣行田の値が極めて大きい値となった。Mn濃度分布についてもFe濃度と同様な傾向を示した。4.電気伝導度(EC)降下浸透水の電気伝導度(EC)は深度3.5cmでは慣行田のECが不耕起田に比べて大きい値を示した。
組換えウイルスを用いた筋萎縮性側索硬化症病変の発症進展機序の解明

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は運動ニューロンの選択的な変性脱落により死に至る最も過酷な神経変性疾患であり,ニューロン,グリアにリン酸化TDP-43蛋白を含む細胞質凝集体が出現する.我々はこれまで,ヒト正常TDP-43とそのC末断片を発現する組換えアデノウイルスをプロテアソーム阻害条件下で培養ニューロンや成体ラット・マウス運動ニューロンに感染発現させると,ALSに特徴的なリン酸化TDP-43を含む不溶性の細胞質粗大凝集体が高率に形成されることを報告した(Watabe et al., 2014).一方,培養タイムラプス解析により,正常およびC末断片DsRed/TDP-43組換えアデノウイルスをニューロンに感染発現させプロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると,DsRed陽性TDP-43凝集体が細胞質に徐々に充満し,細胞膜の破綻とともに細胞死に至り,細胞外に放出された不溶性凝集体が培養液中に長時間残存する像を観察した.この凝集体はリン酸化TDP-43を含む不溶性の顆粒状構造物からなり,隣接する細胞に取り込まれ,時間とともに細胞質で増大し,凝集シードとして機能することを見出し,ALSにおけるTDP-43凝集体の形成および細胞間伝播を反映するものと考えられた(Ishii et al., 2017).さらに,この培養TDP-43細胞質凝集体形成モデルに対して,熱ショック応答のマスター制御転写因子であるheat shock transcription factor 1 (HSF1)を発現する組換えウイルスを共感染させたところ,TDP-43凝集体形成が顕著に抑制された.そこで現在,cDNAマイクロアレイを用いてHSF1の下流で働くTDP-43凝集体抑制候補分子についての発現および機能解析を行っており,ALSに対する新規治療法開発の糸口に繋げていきたいと考えている.我々はこれまで,TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット,マウス末梢神経に混合接種し,ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した.さらに,より長期間安定した遺伝子導入発現が可能な組換えアデノ随伴ウイルス9型(AAV9)を用いて運動ニューロン細胞体に同様の凝集体形成を認めた.そこで,ヒト正常TDP-43をEGFPとともに発現する組換えAAV9を1日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し,脳脊髄における外来性TDP-43の長期発現を検討したところ,接種2,4週6ヶ月後にわたって大脳,脳幹,脊髄に瀰漫性にEGFP陽性ニューロンを認めた.今後,このマウスにヒトTDP-43および蛋白分解系阻害shRNA組換えアデノウイルスを追感染させて局所の運動ニューロンにヒトTDP-43凝集体を形成させ,凝集体が周囲の細胞にヒトTDP-43を介して伝播していくか否かを経時的に観察する予定である.一方,培養ラット神経幹細胞由来ニューロン,アストロサイト,オリゴデンドロサイトに,ヒト正常またはC末断片TDP-43をDsRedとともに発現する組換えアデノウイルスを共感染させ,プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると,タイムラプス蛍光撮影で12時間後よりDsRed陽性TDP-43凝集体が細胞質に徐々に充満し,やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至り,残存した不溶性の凝集体が長時間浮遊する像が観察された.この凝集体はsarkosyl不溶性の顆粒状構造物からなり,リン酸化TDP-43を含んでいた.また細胞外に放出された凝集体が隣接する細胞に取り込まれる像も観察された.現在,凝集体の細胞間伝播の可視化に関しても検討を行っている.1.組換えアデノウイルス,AAV9,レンチウイルスの作製:1ALS関連遺伝子のクローニング;ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43,正常および変異FUS, SOD1, VCP, UBQLN2をそれぞれDsRed発現ベクターにクローニングした.2shRNA発現ベクターの作製;蛋白分解系に関与する遺伝子(PSMC1,VPS24,ATG5, ATG7)の発現を阻止しうるラット・マウスshRNA配列をshRNA/EGFP発現ベクターにクローニングした.3組換えウイルスの作製;上記12のcDNA/DsRed, shRNA/EGFP断片を発現する組換えアデノウイルス,AAV9,レンチウイルスを作製した.2.培養運動ニューロン・グリア細胞における凝集体形成と細胞死の解明:マウスES細胞,ヒトiPS細胞から分化させた運動ニューロンに,上記組換えウイルスを感染させた.一方,ラット成体神経幹細胞由来分化ニューロン・グリアにも感染を試みた.感染細胞はDeltaVision (GE)により15分ごと72時間のタイムラプス蛍光撮影を行い, DsRed陽性凝集体の形成過程と細胞死を観察した.感染細胞は随時固定または回収し蛍光免疫染色,ウェスタンブロット解析を行った.3.成体マウス・ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明:成体マウス・ラットの顔面神経,坐骨神経に上記組換えウイルスを単独または複数の組み合わせにより注入接種し,組換えウイルスの逆行

輸送による運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を確認し,細胞質凝集体の形成に成功した.また,ヒト正常TDP-43を発現する組換えAAV9を1日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し,脳脊髄における外来性TDP-43の長期発現を認めた.我々はこれまで,TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット,マウス末梢神経に混合接種し,ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した.そこで,より長期間にわたって凝集体形成を観察するため,組換えアデノ随伴ウイルス9型(AAV9)を用いた運動ニューロン細胞質内凝集体形成モデルを作製検討している.一方,ヒト正常およびC末断片DsRed-TDP-43組換えアデノウイルスを培養ラット神経幹細胞由来分化ニューロン,グリアに感染発現させ,プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると,タイムラプス蛍光撮影でDsRed陽性TDP-43凝集体が細胞質に徐々に充満し,やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至り,残存した不溶性凝集体が放出される像が観察された.この凝集体はsarkosyl不溶性の顆粒状構造物からなり,リン酸化TDP-43を含んでいた.この不溶性TDP-43凝集体は隣接する細胞に取り込まれ,時間とともに細胞質で増大し,凝集シードとして機能することを確認した.本実験系はTDP-43凝集体の細胞間伝播を解析する上で有用と考えられ解析を続けている.さらに,上記の培養TDP-43細胞質凝集体形成モデルに対して,ヒトheat shock transcription factor 1 (HSF1)を発現する組換えアデノウイルスを共感染させたところ,リン酸化TDP-43不溶性凝集体形成が顕著に抑制された. ALSを含む神経変性疾患に対する熱ショック応答の治療応用が近年大いに注目を集めている.本研究の培養TDP-43凝集体形成モデルにおいても熱ショック応答のマスター制御因子であるHSF1の凝集抑制効果が認められ,現在,その下流候補分子の効果について順次検討を行っている.1.組換えアデノウイルス,AAV9,レンチウイルスの作製:1ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43,正常および変異FUS, SOD1, VCP, UBQLN2をそれぞれDsRedとともに発現する組換えウイルス,2蛋白分解系に関与する遺伝子(PSMC1,VPS24,ATG5, ATG7)の発現を阻止しうるshRNAをEGFPとともに発現する組換えウイルスを順次作製している.2.培養細胞における検討:ラット神経幹細胞由来分化ニューロン・グリア,またはマウスES細胞,ヒトiPS細胞由来分化運動ニューロンに,上記組換えウイルスを感染させ,凝集体の形成過程と細胞死を観察した.この凝集体形成がHSF1組換えウイルスの共感染により顕著に抑制されることを見出した.3.成体マウス・ラット運動ニューロンにおける検討:成体マウス・ラットの顔面神経,坐骨神経に上記組換えウイルスを混合注入接種し,組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンにおける細胞質凝集体の形成に成功した.また,ヒト正常TDP-43を発現する組換えAAV9を1日齢ICRマウスの側脳室に注入接種し,脳脊髄における外来性TDP-43の長期発現を認めた.4.研究代表者は平成28年3月に前職(東京都医学総合研究所)を定年退職し,同年4月に現職に着任したため,新たな実験研究環境の整備に時間を費やし,進捗状況にやや遅れが生じている.