hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高年者白血病に対する同種抹消血幹細胞移植に関する基礎的臨床的研究

高齢者に達していない50-60歳の高年者白血病に対する治療戦略は確立しておらず、同種骨髄移植より安全性が高く、造血回復の早い同種末梢血幹細胞移植は治癒的治療法となる可能性が期待される。移植前処置を軽減化し、移植片拒絶防止のための免疫抑制療法を工夫することによって、早期治療関連毒性を低下させることにより、高年者においても同種末梢血幹細胞移植は実施可能と考えられる。高年者白血病症例では、ドナーも高年であることが予想されるが、今回の検討では50歳以上の高年ドナーにおいても、G-CSF10μg/kgを5日間皮下投与し、投与後4、5日目に処理血液量200ml/kgのアフェレーシスで、安全に、また十分量の末梢血幹細胞を採取することが可能あった。さらに、移植前処置の軽減化を目的として、cyclophosphamide 60mg/kg×2日とAra-C2g/m^2×2日の併用療法(CA/CY療法)を試みた結果、CA/CY療法でも移植片の生着がみられ、また、骨髄・非骨髄毒性は通常の移植前治療と比較して格段に低下し、高年者にも応用可能であると考えられた。また、移植後のキメラ状態をDNAの多型性(VNTR)を利用して検討した結果、CA/CY療法によっても、移植後早期から、完全なドナー型になることが明らかとなった。こういった基礎的検討により、高年者にも同種末梢血幹細胞移植は実施可能と考えられ、当施設では、すでに数例の症例の選定を終え、同種末梢血幹細胞移植に向けて準備中である。高年者に対する同種末梢血幹細胞移植の実行可能性、安全性が示されれば、高年者白血病に対する治癒的治療法の適応拡大が期待される。
核内ネットワークを制御する天然変性タンパク質の機能発現

石野計画班はDNA複製、修復、転写を制御する因子とクロマチンとの関係に焦点を当て、そこに関わる天然変性タンパク質について、構造と機能を詳細に調べてその役割を解明するという共通の目的をもって研究を展開した。実際に解析したタンパク質は、DNA複製と協調した修復機構に関わるhuman Hefとarchaea Hef、出芽酵母の転写制御因子Ume6、テロメア結合因子TRF1、ウイルスクロマチン制御因子Nucleophsomin/B23、ヒストンシャペロンNAP1である。これらのタンパク質に存在する天然変性領域が、相互作用因子との結合制御にとって、極めて重要な役目を果たしていることを示した。複製フォークの進行停止を修復する過程で重要な働きをすることがわかっているHefタンパク質は、N-末端側のヘリカーゼドメインとC-末端側のヌクレアーゼ様ドメインを繋ぐ機能未知の領域が天然変性状態であり、その機能解明を本研究のテーマの一つとしている。21年度はこのタンパク質を調製するための組換えタンパク質発現系の構築を行った。ヒト由来のhHef調製のために、昆虫細胞とバキュロウイルスを用いた発現系を構築した。またアーキア由来のHefはThermococcus kodaraensisから遺伝子をクローニングし、大腸菌を用いて多量産生系を構築した。高純度に精製したTkoHefを高速原子間力顕微鏡で観察した結果、予想される構造であることが確認できた。また同時に、高次構造解析実験系構築のためのモデルとして、複製フォーク複合体をアーキア由来の関連タンパク質を用いて進めた。出芽酵母の減数分裂初期遺伝子の発現を制御するクロマチン関連転写因子Ume6とRme1の天然変性領域の機能解析を進めた。構造予測からUme6では50残基以上の4領域、Rme1では転写抑制ドメインの88残基が天然変性領域であり、それらの各領域に変異を導入した。作製した変異体について転写抑制能をアッセイする系を確立し、Ume6とRme1の機能に重要な、最少の天然変性領域の同定を進めている。核小体ヒストンシャペロンNucleophosmin/B23の機能解析を行った。B23はN末端側の多量体形成に必要なコア領域とC末端のRNA結合領域の間に長い天然変性領域を有し、この領域を介してピストンと相互作用してクロマチン構造の変換にかかわる。本年度はB23がRNA結合依存的にクロマチン構造変換にかかわることを見出し、その分子機構の解析を進めた。DNA複製フォーク停止の修復に大変重要なタンパク質因子Hef/FancMのN-末側ヘリカーゼ用ドメインとC-末側ヌクレアーゼ用ドメインの間に存在する領域が本当に天然変性状態であることを、NMR,CD,高速AFM観察の手法を用いて調べた。さらに、この部分にPCNAが結合すること、そして、実際に結合する部位を同定した。同時にこの領域と相互作用するタンパク質因子を酵母two-Hybrid法で網羅的にスクリーニングをし、候補タンパク質を選定した。これらのタンパク質間の相互作用を確認中である。出芽酵母の減数分裂開始を制御するクロマチン関連転写因子Ume6とRmelの機能解析を進めた。Ume6は転写活性化と抑制の両方の機能を持つが、それぞれの機能発現にはN末側とC末側の異なる天然変性領域が関与していることを見出した。Rmelによる転写抑制には分子中央の天然変性領域が重要であると考えられた。一方、クロマチンとのネットワーク解明に向けて、天然変性タンパク質ヒストンから構成されるヌクレオソームの構造多様性の要因についても解析を進めた。核小体ヒストンシャペロンNucleophosmin/B23タンパク質に関して研究を進めている。B23は天然変性状態にある酸性アミノ酸領域を介してヒストンシャペロンとして機能する。また、B23のN末端領域を介した多量体形成は、ヒストンシャペロン活性に非常に重要である。本年度はB23とそのファミリータンパク質NPM3の多量体形成がその機能発現には重要であることを明らかにした。以上のように三つの実験系で天然変性領域が直接関与する相互作用の機能解析が進んできたので、構造解析グループと協力し合いながら、天然変性領域の相互作用様式の共通性と多様性について調べて行こうとしている。アーキアのHefとそのヒトホモログであるFANCMの天然変性領域と相互作用するタンパク質を網羅的に探索した結果、DNA修復に関係すると予想されるヌクレアーゼ(RecJ様、RNaseH1様)や損傷乗り越えDNAポリメラーゼなどが候補タンパク質として得られた。現在、これらのタンパク質を精製し、特異的な結合を調べながら、これらの相互作用の生理的な意義付けを考えてモデルを構築した。また、アーキアのHefを用いて、昨年度に引き続いて本領域内の複数の研究室とNMR,AFM,MD-SAXSなどの構造解析を進めた。出芽酵母において、Ume6はクロマチンを介して、減数分裂初期遺伝子群の転写を制御している。

Ume6における転写活性化と抑制に関与する天然変性セグメントを同定した。それぞれのセグメントとIme1、Sin3との相互作用の解析を進めている。一方では、ATTCTとCTGリピートはin vivoでヌクレオソームの形成を促進すること、ヌクレオソームの微細構造はDNA配列によって多様性があることを見出した。さらに、CTGリピートを含むヌクレオソームの結晶構造を3.5Aで決定し、その詳細を解析している。アデノウイルスクロマチンの制御因子として同定したヒストンシャペロンNucleophosmin/B23について、そのファミリー因子であるNPM3との多量体形成を検討した。B23はホモ5量体を形成するが、NPM3が存在する場合は、B23:NPM3(4:1)の複合体を形成することを明らかにした。また、多量体形成はB23、NPM3のヒストンシャペロン活性に必須であることが明らかとなった。この点に関しては本領域の明石班との共同研究として進めた。複製フォーク進行停止の修復過程で重要な役割を担うヒトのhHef (FANCM)とアーキアのHefタンパク質について、それぞれの天然変性領域と相互作用するタンパク質を網羅的にスクリーニングして得られた候補タンパク質の解析を進めた。天然変性領域が複数のタンパク質因子と相互作用するためには、フレキシブルな構造変換が必要であり、それを実験的に証明するために構造解析を進めた。アーキア由来のHefについては結果をまとめて論文投稿した。ヒト由来のhHefについては、結晶化やNMR解析を行うための試料調製に多くの努力を払った。特に、ヒトHefとチェックポイント制御因子であるMDC1の相互作用に力を入れ、結合に伴うhHef天然変性領域の構造変化解明を目指した。多くの実験を重ねて、MDC1のhHef結合部位を可溶性タンパク質として精製する方法を見つけ出した。出芽酵母のテロメアリピートがヌクレオソームポジショニングを破壊することを示し論文発表した。ヒトのテロメアリピートにおけるヌクレオソーム形成とTRF1とTRF2の天然変性領域の機能を解析するための実験系を構築し解析を進めた。減数分裂初期遺伝子群の転写の活性と抑制を制御するUme6において、Ime1、Isw2クロマチンリモデリング因子複合体、Sin3-Rpd3ヒストン脱アセチル化酵素複合体との相互作用に関与する天然変性領域のセグメントを決定した。Nucleophosminは核小体に局在し、ヒストンシャペロン活性を有すること、クロマチン構造の制御に関わること、rRNA結合活性を通してリボソーム生合成に関わることを明らかにした。Nucleophosminは294アミノ酸からなるタンパクで、C末端領域は特異的なRNAに結合するのに必須であることがわかった。
ナノギャップでのエレクトロマイグレーションを利用した原子の移動操作制御手法の開発

本研究では、ナノギャップに発現するエレクトロマイグレーション現象を利用した原子の移動操作制御技術を開発し、強磁性単電子トランジスタやNiナノギャップ系抵抗スイッチング素子、Ni系量子ポイントコンタクトの作製を検討した。ナノギャップでの原子のマイグレーションを利用した本手法では、作製された数十nmの初期ナノギャップに対して、あらかじめ設定した電流値まで通電を行うことで、ナノギャップの構造や電気的特性を広範囲にわたってtuningすることができる。これより、ナノギャップでの原子移動を最適化することで、ナノスケールデバイスが容易に作製可能になるものと期待される。本研究では、通電にて誘起されたエレクトロマイグレーション現象による原子の移動・操作機構を利用したナノスケール構造制御技法を開発し、同種・異種の原子からなる原子スケールサイズの量子ドット構造体(原子スケールドット)の作製と、そこから発現される新しい物性の探索・制御と機能の集積化を目的とする。具体的には、ナノギャップ電極に高電界トンネル電流を誘起し、ナノギャップ間での原子のエレクトロマイグレーションを発生させる。この際、原子の移動における物理的・化学的素過程を「その場」制御し、原子スケールドットのサイズや位置、構成原子の種類などを精緻に調整しながらナノギャップ間へ配置することで機能の集積化を達成する。同時に、原子スケールドットから発現される諸物性をナノギャップ電極を利用して電気的にプローブすることで、新しい機能性の発揮やその制御技術(素子)の構築を目指す。初年度(平成25年度)では、アクティベーション法を用い、Niナノギャップでの原子接合(量子ポイントコンタクト: QPC)の形成を試みた。電子線リソグラフィーにより初期ギャップ幅が数10nm程度のNiナノギャップを作製した。これらのナノギャップに対し、数100μAの電流を通電することでアクティベーション法を実行した。その結果、通電電流を線形に増加させているにもかかわらず、素子のコンダクタンスが離散的に変化し、量子化コンダクタンスの0.5倍ごとにほぼ一定となる挙動(コンダクタンス量子化)が室温において確認された。さらに、FPGA(Field Programmable Gate Array)を利用したエレクトロマイグレーションの超高速計測制御システムを開発し、マイグレーションによる素子のコンダクタンス変化を1秒以内で量子化コンダクタンス領域まで制御することに成功した。これより、本手法は、高速で精緻な原子ナノスケール構造形成技法としての可能性が示唆される。最終年度(平成26年度)では、アクティベーション法を適用するナノギャップ電極でのナノギャップ間隔や通電電流量を適切に設定することで、室温動作可能な単電子トランジスタ(SET)の作製、SETの電気特性制御、およびSETの集積化を目指した。特に、本手法を適用して作製したSETの室温(299 K)と低温(18 K)における電気的特性の詳細な検討を行った。電子線リソグラフィーを用いて作製したNiナノギャップに対して、通電電流を1nA, 100nA, 300nA, 500nA, 700nA, 1μA, 3μAと順次増加させてアクティベーションを適用しSETの作製を行った。これより、本手法を用いることで簡便にSETが作製でき、アクティベーションでの各設定電流におけるStability Diagramのさらなる検討により、SETの特性制御手法の確立が期待される。ナノ・マイクロ科学Niナノギャップにアクティベーション法を適用することで、室温にて、原子単位の接合である量子ポイントコンタクト(QPC)の形成と制御に成功した。さらに、FPGA(Field Programmable Gate Array)を利用し、エレクトロマイグレーションの超高速計測制御に特化したカスタムハードウェアの構築に成功した。最終年度(平成26年度)では、これまでに開発してきたアクティベーション法とFPGAによる超高速エレクトロマイグレーション制御技術を融合させ、原子スケールドットの高速形成と諸物性制御を目指す。平成25年度は、政府の補正予算措置により、本学に整備されている電子線露光装置の更新が行われた。当該装置は本研究課題の遂行に必須の装置であるが、今回の更新措置作業により、平成25年11月から翌年3月にわたり当該装置を使用することが出来無くなり、研究計画の部分的な見直しが発生した。

平成26年度は当該装置も立ち上がり良好な性能を発揮している。これより、最終年度である平成26年度では、昨年度に生じた研究計画の修正部分を補うべく、素子作製にかかる実験プロセスの大幅な効率化に伴い必要とされる大量の各種消耗品類を購入するために当該助成金を使用する予定である。
お喋りする人工呼吸器の開発

気管内挿管下で人工呼吸中の患者の苦痛はお喋りできないことである。気管内挿管下の人工呼吸中の患者のquality of lifeを改善するには,会話でコミュニケーションができる人工呼吸器の開発が不可欠である。そこで,顔面頸部の表面上から,舌を含む上顎,下顎,咽頭,喉頭の筋肉群の運動を筋電図波形として捕らえ,この顔面頸部からの筋電図を解析し,五十音,例えば,"あいうえお"に一致した特有の波形を特定する操作を繰り返した。筋電図モニター機能を有するバイオアンプで顔面頸部の表面筋電図をモニターし,筋電図の波形をパワーラブを介してコンピュータに記憶させ,個々の"あ""い""う""え""お"にほぼ一致した特有の筋電図パターンを特定する操作を繰り返した。顔面筋肉の動きに応じて筋電図波形の基線のゆれを勘案しながら、電極の位置による電位パターンの解析を繰り返した。日本語は、母音と子音からなる。筋電図パターン解析だけではある特定の個々の発音に一致する筋電図パターンの特定化は難しかった。この研究結果から、今後の方針として、筋電図パターンと連携した画像解析、または、ある特定の訓練を受けた人は口の動きを見て言葉を理解できるように、カメラを用いて画像をコンピュータに取り込み、口の動きから言葉に変換するシステムの開発を考えている。気管内挿管下の人工呼吸中の患者のquality of lifeを改善するには円滑に会話ができることが不可欠であり今後も研究開発を継続したい。気管内挿管下の人工呼吸中の患者の苦痛はお喋りできないことである。気管内挿管下の人工呼吸中の患者のquality of lifeを改善するにはお喋りできる人工呼吸器の開発が不可欠である。そこで、人工呼吸中の人を対象に舌を含む上顎下顎筋肉の或る一定の運動を顎表面から筋電図波形として捕らえ、この顎表面からの筋電図を解析し、五十音、例えば"あいうえお"に一致した特有の波形を特定する操作を繰り返すことでお喋りする人工呼吸器の開発を開始した。先ず、4極の筋電図モニタ機能を有するバイオアンプで筋電図をモニタし、筋電図の波形をパワーラブを介してコンピュータに記憶させ、個々の"あ" "い""う""え""お"に一致した特有の波形を特定する操作を繰り返している。数人の人の検討では、まだ、解析に耐える十分な特有のデータを得るに至っていない。今後はコンピュータ解析を駆使し、先ず、特有の波形の検出に努力する。多くの人で同じ波形が確認できることを確認する。被験者を変え個々の"あ""い""う""え""お"に一致した特有の波形を特定する作業を繰り返す。特有の筋電図波形を明らかにするために、上顎下顎部の種々の位置で筋電図の波形解析を繰り返す。コンピュータを用い、4つの筋電図の波形解析を行い或る特定のパターンを認識する操作を繰り返す予定である。もし、この方法が不可能であれば、テレビカメラを用いた画像認識による"あ" "い""う""え""お"の認識も検討する。4極の筋電図モニタ機能を有するバイオアンプで顔面頸部の表面筋電図をモニタし,筋電図の波形をパワーラブを介してコンピュータに記憶させ,個々の"あ""い""う""え""お"にほぼ一致した特有の筋電図を特定する操作を繰り返した。日本語の母音は,使用する筋肉の違いによりほぼ一致する筋電図モニタは見いだせるが,子音の特定化が難しい。今後は,子音の特定化を行うために,筋電図モニタ機能の更なる多極化で対応できるのか,筋電図収集場所の変更特定化で対応できるのか検討する。

この研究結果から、今後の方針として、筋電図パターンと連携した画像解析、または、ある特定の訓練を受けた人は口の動きを見て言葉を理解できるように、カメラを用いて画像をコンピュータに取り込み、口の動きから言葉に変換するシステムの開発を考えている。気管内挿管下の人工呼吸中の患者のquality of lifeを改善するには円滑に会話ができることが不可欠であり今後も研究開発を継続したい。
ヒト細胞の再生医療における移植源としての有用性を評価する新規動物システムの確立

NOGマウスのiPS細胞を用いて樹立した免疫不全疾患モデルマウスに対して、ヒトの体細胞から誘導した神経細胞を移植し、治療効果を検証することが申請者の最終的な目標である。申請者は、平成23年度の一年間に移植治療に用いる神経幹細胞を樹立する培養系を確立した。申請者は成体マウス線維芽細胞に特定の遺伝子を導入し、胚葉体の状態を介さず神経幹細胞培地で培養を継続することで、iPS細胞の状態を介さずに神経幹細胞を樹立することに成功した。これらの神経幹細胞はiPS細胞から樹立した神経幹細胞と比較して未分化細胞の混入が少なく、遺伝子解析の結果、成熟神経幹細胞の特徴を有していることが明らかになった。申請者は、これらの細胞の安全性評価のためこれらをマウスの脳内に移植した。その結果、これらの細胞は移植後に神経系の各細胞に分化していることが明らかになった。これらの細胞の移植により神経疾患の症状改善効果が期待される。また、移植後の腫瘍形成の危険性が低いものと期待される。この方法は成体の線維芽細胞を用いて安全性の高い神経幹細胞を樹立することを可能とするものであり、成体の細胞が幼弱な線維芽細胞よりも樹立が容易であることを考慮すると、大きな意義があるものと考えられる。これらの成果は学会誌「Stem cells」に掲載された。申請者は、平成22年度の一年間に移植治療に用いる神経幹細胞を樹立する培養系を確立した。その結果、一部のマウスで腫瘍形成が見られたが、その確率は以前の方法で胚葉体から樹立された神経幹細胞を移植した場合と比較して有意に低かった。この方法で樹立された神経幹細胞は、NOGマウスを用いた本実験のほか、脊髄損傷の移植治療にも応用可能であり、今後ヒトの神経疾患治療に応用されていく可能性がある大きな成果と言える。
代謝型グルタミン酸・GABA受容体の相互連関とメタ・シナプス可塑

代表者らは、マウス小脳プルキンエ細胞樹状突起に代謝型グルタミン酸受容体mGluR1と近接して代謝型GABA受容体GABAbRと代謝型アデノシン受容体AIRが発現していることを見出した。免疫共沈によりGABAbRとmGluR1が直接あるいは他の分子を介して複合体化していることが分かっていたが、最近AIRとmGluR1についても同様の複合体化が見つかった。主としてマウス小脳ニューロン培養系を用いた電気生理学的実験により、GABAbRとAIRがmGluR1依存的シナプス可塑性である小脳長期抑圧の誘導効率や深度に対してどのような影響を及ぼすかを解析した。GABAbRは脳髄液レベルのカルシウムやGABAを受容すると、Gタンパク非依存的に小脳長期抑圧の誘導効率を高めた。またGABAbRは小脳皮質介在ニューロン・シナプス終末から漏出するレベルのGABAを受容すると、Gタンパク依存的に小脳長期抑圧の深度を増大させた。AIRは脳髄液レベルもしくは小脳皮質ニューロンが活発に興奮したときに局所蓄積するレベルのアデノシンを受容するとGタンパク非依存的に小脳長期抑圧の誘導を阻害した。これらの効果のうちGタンパク非依存的なものは、mGluR1のリガンド感受性を増減することに原因があると考えられた。一方、Gタンパク依存的な効果はmGluR1に連関する細胞内シグナリングの増強に原因があると考えられた。さらにマウス個体の小脳表面にGABAbRアゴニストを注入すると、小脳長期抑圧依存的なrota-rod運動学習課題の成績が向上する傾向が見られた。以上の結果は、GABAbRやAIRが相補的メタ・シナプス可塑性機構として働いている可能性を示唆している。ニューロン活動依存的なシナプス伝達強度の変化=シナプス可塑性は学習・記憶を支える生物学的メカニズムである。我々は運動学習を支える小脳長期抑圧(LTD、小脳皮質において平行線維→プルキンエ細胞シナプスの伝達効率が数時間以上にわたって減弱する現象)をモデルとして、その誘導機構を追求してきた。小脳LTDの誘導を主導するのはプルキンエ細胞に発現する代謝型(G_qタンパク共役型)グルタミン酸受容体mGluR1である。我々はこの受容体がG_<i/o>タンパク共役型受容体であるB型γアミノ酪酸受容体(GABA_BR)と複合体を形成していることを発見した。我々は、GABA_BR-mGluR1相互連関が小脳LTDに及ぼす影響を解析し、その生理的意義を解明したいと考えている。通常、脳髄液には数十nMのGABAや数mMの細胞外Ca^<2+>が含まれている。これら低濃度のリガンドを受容したGABA_BRはG_<i/o>タンパク非依存的にmGluR1のグルタミン酸感受性を亢進させ、LTDの誘導効率(起こり易さ)を高めることが示唆された。一方、小脳皮質の抑制性介在ニューロンが高頻度で発火すると、そのシナプス終末から高濃度(数μM)のGABAがspillover(漏出)する。高濃度のGABAを受容したGABA_BRはG_<i/o>タンパク依存的にmGluR1シグナルを増強し、LTDの深度(抑圧の度合い)を深めることが示唆された。またこのようなシグナル増強によるLTDの促進がin situ(小脳スライス)においても発生しうることが分かった。
膵臓癌におけるDNAアレイを用いた抗癌剤感受性の遺伝子学的検討

マイクロアレイを用いたパラフィンサンプルからの遺伝子網羅的測定は成功しなかったためreal-time RT-PCRを用いた遺伝子定量に切り替え、膵臓癌治癒切除症例81例を対象に、術後補助化学療法としてGemcitabine単独療法またはS-1単独療法が施行された症例の手術検体におけるmRNA発現量と予後の関係をレトロスペクティブに検討した。その結果、5-FUの分解酵素であるDPDと葉酸代謝関連酵素であるDHFR、FPGS、GGHが予後因子であることが見出された。本年度は当院における過去の膵臓癌症例の登録、抗癌剤感受性の検討、予後調査などの臨床データベースの整備をおこなった。当院で過去にS-1による化学療法を施行された膵臓癌患者は412人に上った。その中からデータベースをもとに適格症例を選別した。選別した症例のパラフィンサンプルからのRNA抽出、cDNAへの変換の過程の実験系の確立を行い、RNA抽出キット、逆転写酵素、PCR用試薬などの必要物品の購入をおこなった。また今回我々は、膵臓癌のプラチナ系抗癌剤に対する感受性を規定する因子として、ERCC1多型に注目した。ERCC1はDNA修復酵素であり、プラチナ系薬剤によって傷害されたDNAを修復する役目を果たしている。そのためERCC1高発現腫瘍はプラチナ系薬剤への抵抗性が強いことが報告されており、ERCC1多型との関係も知られている。我々は標題研究と平行して、同じ検体を用いてPCR-RFLP法を用いたERCC1遺伝子のCodon118多型の遺伝子型の解析と予後についての検討を行った。その結果、変異型遺伝子を持つ個体ではプラチナ系薬剤の感受性が向上していることを確認し、野性型遺伝子を持つ個体に比べ無増悪生存期間、全生存期間で有意差が認められることを確認した。この結果はすでにInternational Journal of OncologyにAcceptされており、近日publishされる予定である。来年度はこれらの検体を用いて実際のDNAアレイを用いた遺伝子発現測定を行う予定である。前年度に整備した臨牀データベースを用いて選択したサンプルを用いて、マイクロアレイによる遺伝子発現解析を実際に試みたが、結果的には成功しなかった。過去に胃癌、大腸癌、肺癌等では解析に成功していたが、膵臓癌の検体は繊維質に富み、癌細胞が集合して存在せず繊維の中にばらばらに存在するため、十分量の細胞数が採取できなかった。また他癌腫に比べ疾患の頻度が少ないため、症例数を確保するために、比較的古いサンプルまで検討に加えたが、古いサンプルではRNAの変性の度合いが強く、比較的長鎖のRNAを必要とするマイクロアレイでは質のよいRNAを抽出できなかったことも原因と考えられる。そのため方針を変更し、遺伝子のターゲットを絞って、Real-time RT-PCRを用いた遺伝子発現解析を行うこととした。この方法では比較的少量の、変性の進んだRNAからでも測定が可能であった。測定遺伝子は抗癌剤Gemcitabineの感受性に関連するといわれる遺伝子、フッカピリミジン系薬剤関連遺伝子、葉酸関連遺伝子を10種類選択した。昨年に報告した通り、マイクロアレイを用いたパラフィンサンプルからの遺伝子網羅的測定は成功しなかった。そのためreal-time RT-PCRを用いた遺伝子定量に切り替え、これまで膵臓癌治癒切除症例81例を対象に、術後補助化学療法としてGemcitabine単独療法またはS-1単独療法が施行された症例の手術検体におけるmRNA発現量と予後の関係をレトロスペクティブに検討した。さらに、S-1が術後補助化学療法として実施された症例においてはGGHが高い症例で予後不良であった。GGHはFPGSによってグルタメート化されたグルタミン酸の切断を行う酵素であり、GGHが高い細胞においては葉酸が細胞外に排泄されやすくなる。よって、膵臓癌症例においてもLeucovorin(LV)を付加することにより5-FUの効果増強作用が期待され、新たな治療法としての可能性が見出された。そこで我々は、葉酸併用による抗腫瘍効果への影響を検討するために、膵臓癌細胞株(PANC-1、MIA-Paca2)を用いて薬剤感受性試験を施行した。その結果、MIA-Paca2において5-FUにLVを併用することにより抗腫瘍効果が4.9倍増強することが確認された。さらに、これら2種類の細胞株について葉酸代謝関連酵素および5-FU代謝関連酵素のmRNA発現量を測定した結果、FPGSおよびDPDの発現量は高く、一方GGHの発現量は低い傾向が示された。よって膵臓癌の細胞内では葉酸量が低く、5-FUも分解されやすい可能性が示唆された。以上の結果から、膵臓癌ではDPD作用の抑制および5-FUへ葉酸を併用する化学療法が抗腫瘍効果増強作用に重要である可能性がin vitroの実験により示された。
妊娠・出産を契機とした働く女性の健康支援プログラムの構築と検証

研究1:産後女性の心身の状態と生活・活動制限の実態を把握することを目的とし、都内保育園に01歳の児を預けて働く母親への質問紙調査を行い、産後復職後の健康問題、母乳栄養継続に関連する要因を明らかにした。研究2:育児自己効力感尺度(Karitane Parenting Confidence Scale:KPCS)の日本語版を作成し、妥当性・信頼性の検証を行った。研究3:産後女性に対する包括的健康支援プログラム(週1回合計12回:骨盤底筋体操、セルフケア、子育て)を開発・実施し、前後比較とランダム化比較試験により、実施可能性、参加率、骨盤底筋機能の回復、育児自信、心身の健康への効果検証を行った。本研究は、働く女性の産後の心身機能と活動や社会参加制限との関連を明らかにし、産後の心身の回復と健康増進を目的にした健康支援プログラムを作成し、実施、評価することを目的としている。研究は主に、研究1:産後女性の生活要因と心身の機能、社会参加・活動制限状況の把握、研究2:産後女性の心身の回復と健康増進のための健康支援プログラムの開発、研究3:上記健康支援プログラムの実施・評価の3つに分けて実施する。平成25年度に予定していた研究1での実態調査については、調査項目(属性、栄養、身体活動、生活習慣、生活リズム、産後うつ尺度、授乳状況、骨盤底機能、就労意図等)の選定、調査票の作成、調査プロトコールの作成を行った。研究2での健康支援プログラムの作成については、産後女性が社会復帰していく上での問題点を洗い出し、問題の焦点化を行った。また理学療法士からの専門的知識の提供を受け、妊娠・分娩による母体の変化を解剖学的・理学的見地から整理し、産後の時期に合わせた母体の身体機能の回復に有効な介入方法を理論的に組み立てる作業を行った。またこれまでの研究をもとに、有効であるだけでなく、臨床実践現場において実施可能な介入方法(内容・回数・時間)について検討し、より臨床導入しやすい介入方法についても開発し、アウトカム評価を行うこととした。また介入の評価の質を保証できるように、評価のプロトコール・マニュアルを作成し、介入実施施設のフィールドの検討も合わせて行った。研究1では、産後女性の心身の機能と障害による生活活動や社会参加制限状況を把握することを目的に以下を実施した。子育て自己効力感尺度の開発として、Karitane Parenting Confidence Scale(KPCS)の許諾を得て、日本語版の作成、内容妥当性の検討を行った。質問紙調査に向け、産後の就労女性の健康問題について文献レビューを行い、調査内容を検討した。文献レビューの結果、睡眠障害をはじめ、産後の生活や就労への影響があり、健康問題を生じるリスクが高い要因について抽出し、調査票を作成した。調査施設の検討を行い、倫理審査委員会への倫理審査書類を作成した。研究2では、産後女性に対する包括的健康支援プログラム(骨盤底障害予防・回復、セルフケア)を開発し、プログラムの継続率を調べ、身体的・心理的効果をランダム化比較試験により比較検証することを目的に以下を実施した。ベースライン調査の準備として、日常生活活動の制限やそれに伴う骨盤底機能障害のQOLやセルフエフィカシー等を含む質問紙の作成とプログラムや評価を実施するフィールド調整を行った。プログラム評価のための測定尺度、検査項目の設定し、超音波診断装置を用いた評価方法のマニュアル作成を行った。骨盤底筋機能回復の効果的な方法とされているバイオフィードバック法を併用した骨盤底筋体操プログラムの内容・方法について検討し、プログラム実施マニュアル・バイオフィードバックのアルゴリズムの最終版を作成した。倫理審査を経て、リクルート及び介入試験を開始した。産後女性の心身の状態と産後の生活・就労制限の実態を把握することを第一の目的とする。第二に産後女性に対し、就労・子育て・母乳育児といった産後の活動を円滑に行えるように心身の機能を回復させ、健康増進できるプログラムを構築し、効果を検証することを目的とする。これらの結果から、産後の女性に対する効果的な健康支援の方法と効果を明確にすることをめざす。研究1として、1)産後就労女性の生活習慣・活動状況とその関連要因について、都内40施設の保育園で、01歳児クラスの乳幼児の母親を対象に調査を実施し、母親の夜間の睡眠・昼間の眠気の状況と抑うつや児の睡眠状況との関連について知見を得た。さらにQuality of lifeとの関連の検討も行った。2)シングルマザー(パートナーからの暴力被害による離別後)の健康問題と就労状況についても支援と困難状況について調査をしているが、これまでの結果からも母親の健康問題のみならず、子どもの健康状態により就労や就労継続に困難をもたらしている状況を把握した。3)就労女性における子育て自己効力感と関連要因/子育て自己効力感尺度の開発については、日本語版を作成し、意味内容や表現の検討を行った。今後さらに妥当性・信頼性について検証を行うため調査を実施するところである。研究2として、産後の母体回復や子育てへの支援として、特に重要な骨盤底障害予防・回復を中心とし、さらに母親同士の交流のできるプログラムを無作為化比較試験で実施し、身体面ならびに心理面での効果の検証を行った。現在結果についてまとめており、今後さらに臨床で応用しやすいプログラムについて、検討する予定である。調査参加者のリクルートが予想以上に困難で時間を要した。またプログラム実施担当者が事情により継続が困難となり、研究実施体制の見直しが必要となり、予定していなかった計画の見直しと調整のための時間が必要となった。

研究1として、産後女性の心身の状態と産後の生活・就労制限の実態を把握することを目的とし、都内保育園に01歳の児を預けて働く母親に対して、無記名自記式質問紙調査を実施し、743名より回答を得た。就労形態、職種、就労時間、職場環境、授乳の希望、授乳の実際、母乳栄養に関する知識と情報源、卒乳に関する情報、母乳外来の利用について、人工乳を用いる母親へのケアの満足度等についてたずねた。その結果、産後4か月までの復職が母乳栄養の継続を難しくしていること、搾乳に関する知識があること、母乳栄養へのポジティブな態度と意欲を持つ母親は母乳栄養を継続しやすいことが示された。復職後の母乳栄養継続に関する具体的な知識を提供することが産後に就労する母親の母乳栄養率の上昇に関して有用である可能性が示唆された。研究2として、産後の女性の復職前の時期に行える母体回復・子育て支援を目的としたプログラムを作成し、効果を検証している。予備研究を元に必要なサンプルサイズを確保するために、より母親が参加・継続しやすく臨床応用しやすいプログラムに改変し、新たなフィールドで介入研究を開始した。プログラムの中でも骨盤底筋機能障害の予防・回復については、超音波診断装置を用いたバイオフィードバック法による骨盤底筋体操を実施し、無作為化比較試験にて効果の検証を行っている。研究3として、子育て自己効力感尺度(KPCS: Karitane Parenting Confidence Scale)の日本語版を作成し、0歳児を子育て中の女性316名を対象に調査を行い、尺度の妥当性・信頼性の検証を行った。さらに子育て自己効力感に関連する要因についても調査を行い、論文にまとめている。調査で得られたデータに関しては、順次解析を行い、まとめを行い、調査対象者への結果概要の報告、論文作成を行っている。介入研究については、プログラムの改変と新たなフィールドを確保できたことで、順調に進展している。研究1:産後女性の心身の状態と産後の生活・就労制限の実態を把握することを目的とし、都内保育園に01歳の児を預けて働く母親に対して実施した無記名自記式質問紙調査(743名より回答)のデータをもとに、復職後の母乳栄養継続に関する要因の検討を行い、妊娠中からのサポートや柔軟な労働環境などの重要性を明らかにし、その結果を学会・論文での発表を行った。研究2:子育て自己効力感尺度(KPCS: Karitane Parenting Confidence Scale)の日本語版として作成した尺度について、0歳児を子育て中の女性316名を対象にした調査データを用いて、妥当性・信頼性の検証を行い、論文にまとめた。研究3:産後女性に対する包括的健康支援プログラムについて、より母親が参加・継続しやすく臨床応用しやすいように改変したプログラム(週1回合計12回:骨盤底障害予防・回復、セルフケア、子育て支援)を前年度から当該年度にかけて継続して実施した。プログラムの中でも骨盤底筋機能障害の予防・回復については、超音波診断装置を用いたバイオフィードバック法による骨盤底筋体操を実施し、ランダム化比較試験にて効果の検証を行った。産後女性96名の参加があり、プログラムを実施し、データを得た。
代数力学系の手法による離散可積分系とセルオートマトンの研究

本年度は離散力学系を定義する際に生じる特異点分布を研究した。特に、1次元の発展をもつQRT写像(Quispel-Roberts-Thompson mappings)および、2次元格子状の発展をもつ離散KdV方程式について、無限大や不定性がどのような場所に出現するかを調べた。定式化のため、クラスター代数理論におけるローラン現象(Laurent phenomenon、ある種の離散方程式について、方程式の解が初期変数のローラン多項式になるという現象)と、可積分性の関係を利用した。取り扱った方程式は双線形形式においてはローラン現象をもつので、一般項のローラン多項式の因数分解を行い、相異なる2つの項が共通因子を持つかどうかを調査した。この結果、QRT写像(の一種)と離散KdV方程式について、その一般項が既約なローラン多項式であり、従って相異なる2項は、互いに素である(つまり初期変数の単項式以外の共通因子を持たない)ことを証明できた。本年度の主たるテーマはこのような「互いに素」(co-prime条件)を調査し、離散力学系の可積分性との関連を研究することであった。2項が互いに素である性質によって、その2項は同時に特異点には成り得ないことが分かるため、従来の可積分性判定基準「特異点閉じ込めテスト(singularity confinement test)」の代数的な定式化であることがわかった。一方、本手法で既約性を証明するには、方程式ごとに個別の議論を行う必要があり、離散系の形によらない手法の発見が今後の課題である。26年度が最終年度であるため、記入しない。
陰部神経移植を伴なった有茎腹直筋弁による肛門括約筋再建に関する実験的研究

直腸癌術後のQuality of Lifeを指向して、肛門括約筋を含めた直腸切断術後に、本来の機能を有した肛門括約筋を新しく再建することにより、永久人工肛門の苦痛を取り除くことを目的として以下の実験を行った。1)ラットの外肛門括約筋と、体制筋である薄筋を酵素組織化学的染色であるATPーase染色により検討すると外肛門括約筋はType1筋繊維が0.9%、Type2筋繊維が99.1%を占めており、一方、薄筋はType1筋繊維が55.8%、Type2筋繊維が44.2%と極めて異なった分布をしていることが判明した。そこで、薄筋に脱神経処置を行い、外肛門括約筋を支配している陰部神経をdirect neurotization法により移植すると、2週後にはほとんどの筋繊維が未分化で、分化能を有するType2c筋繊維に変化し、8週経過するとType1筋繊維が96.6%、Type2筋繊維が3.4%と外肛門括約筋とほぼ同様の分布に変化し、移植陰部神経の電気刺激に反応して薄筋が収縮することが確認された。2)ラットにおいては、薄筋は解剖学的にも、形態的にも直腸切断術後の会陰部に移動させ、ひきおろされた結腸の周囲にまきつけることが困難であった。そこで、片側の腹直筋を全長にわたり遊離し、栄養血管をつけたまま皮下を通して会陰部に移動させ、結腸断端周囲にまきつけ周囲組織に固定すると、本来の外肛門括約筋と同様の形態を有する肛門を再建することが可能となった。さらに、1)の実験と同様に、腹直筋を脱神経し、陰部神経を移植した後、酵素組織化学的に腹直筋筋繊維の変化を経時的に観察しながら、内圧検査、筋電図検査により再建肛門の機能を検討中である。
メタン湧水帯に棲息する進化系統学的に極めてユニークな培養困難細菌のメタゲノム解析

Planctomycetes門に属する細菌群は、近年の16S rDNA配列に基づいた分子生物学的解析によって、広範な環境中に存在していることが知られている。しかしながら、本微生物グループの培養は非常に困難な特性のため、学術的な知見がほとんど得られていない。そこで、メタゲノム解析により、Planctomycetes門細菌のゲノム配列を決定した。この結果、芳香環代謝遺伝子のほか炭素固定、窒素代謝など中心的な代謝経路が確認された。さらに、嫌気的な安息香酸の分解や、糖代謝など二次代謝に関する遺伝子群の存在も明らかになった。申請者は、前年度までに、すでにメタン湧水帯バイオマットより環境DNA(メタゲノムDNA)を抽出し、メタゲノムライブラリの構築している。そこで26年度は、構築したメタゲノムフォスミドライブラリの全てのDNAインサートの両末端の塩基配列(約500bp)をキャピラリー型DNAシーケンサー(ABI 3730xl:現有機器)により決定した。次に、DNAインサートのゲノムDNA配列決定を行うわけであるが、通常のメタゲノム解析では、ライブラリ中の全てのクローンをひとまとめにして、それらを細かく断片化し、次世代シーケンサーを用いてシーケンシングを行う。次に、得られた短いDNA配列の共通な配列をつなぎ合わせること(アセンブリ)により、インサートDNAの全長を再構築する。しかしながら、通常は、多種多様な微生物種のゲノム配列が混在しているため、アセンブリの精度は低く、ミスアセンブリが起こる可能性も高い。本研究(選択的メタゲノミクス)においては、あらかじめ配列決定した全てのDNAインサート末端の塩基配列情報を基に、そのインサートDNAの由来微生物を推定し、目的微生物のPlanctomycetesのみを選別した。この解析には、研究協力者が開発したバイオインフォマティクス手法に基づく系統分類法(Science, 336:608-611, 2012)を利用した。このようにして選別した約100のフォスミドクローンについて、次世代シーケンサーを用いたDNA塩基配列の決定を行った。昨年度までに、メタン湧水帯バイオマットの環境DNAから構築したメタゲノムライブラリより、バイオインフォマティクス手法に基づく系統分類法を利用して、目的微生物(Planctomycetes属細菌)由来のDNA断片を含むと推測されるフォスミドクローンを選別した。そしてさらにそれらのDNA塩基配列の決定を行った。そこで27年度は、これらDNA断片のアセンブリ作業を行った。まず、次世代シーケンサー(454 Life Science)で得られた配列のクオリティチェックやアダプター配列の除去等の前処理作業を終えた。同時に、フォスミドクローンのシーケンシングを行っているので、ベクター部分の配列の除去作業も行った。次に、これらをアルゴリズムが異なる2種類のアセンブラーを用いてアセンブリ作業を行った。事前に詳細にアセンブリ条件検討を行った結果、長さや品質において十分なコンティグを得ることができた。さらに、アセンブリの結果得られたコンティグに対して、別のバイオインフォマティクス手法を用いて、由来微生物を推測した。この結果、再度Planctomycetes属細菌として推測されたコンティグのみを分類し、遺伝子解析に供した。現在までのところ、芳香環代謝遺伝子のほか炭素固定、窒素代謝など中心的な代謝経路が確認されている。現在、これらのコンティグについて、遺伝子機能の推定や代謝経路の構築を行っているところである。アセンブラーの選定と条件の確定に時間を要したものの、予定通りアセンブリ作業を終了した。通常の環境まるごとのメタゲノム解析、アセンブリ作業に比べるとはるかにDNA塩基配列の量が少ないため、その処理や計算もはるかに少ない手間と時間で終えることが可能であった。昨年度までに、微生物マット環境試料より構築したメタゲノムライブラリより、Planctomycetes属細菌由来と予測されるフォスミドクローンを選別し、その塩基配列の決定を行った。この結果、炭素固定、窒素化合物の代謝など一次代謝経路が以外にも、嫌気的な安息香酸の分解や、糖代謝など二次代謝に関する遺伝子群の存在も明らかになった。はじめに、16S rDNAのデータベースであるSILVA database (https://www.arb-silva.de)およびARBプログラム(http://www.arb-home.de/home.html)を用いて、Planctomycetes属細菌に特有な配列を持つオリゴヌクレオチドプローブを設計した。蛍光標識したプローブを作成し、蛍光顕微鏡を用いて検出した。ここで、実験に使用した環境試料については、通常のFISH法においては、十分なシグナルが検出できなかったため、HRP(Horseradish peroxidase)の触媒作用を利用してシグナルを増幅するTSA(Tyramide Signal Amplification)反応を用いたCARD(Catalyzed Reporter Deposition)-FISH法を用いた。この結果、本環境においては、地球上における他の環境よりも、はるかにPlanctomycetes属細菌の存在量の多いことが確認された。環境資料中における分布の状態および代謝パスウェイの遺伝子解析の結果より、黒海のメタン湧水帯に棲息するPlanctomycetes属細菌群は、海底付近の嫌気的な環境下において、窒素循環に関与していることが示唆された。ただし、ANAMMOX(嫌気性アンモニア酸化)細菌とは、系統学的にも代謝反応においても異なる微生物群に属することが明らかになった。

しかしながら、本微生物グループの培養は非常に困難な特性のため、学術的な知見がほとんど得られていない。そこで、メタゲノム解析により、Planctomycetes門細菌のゲノム配列を決定した。この結果、芳香環代謝遺伝子のほか炭素固定、窒素代謝など中心的な代謝経路が確認された。さらに、嫌気的な安息香酸の分解や、糖代謝など二次代謝に関する遺伝子群の存在も明らかになった。キャピラリーシーケンサーによるDNAインサート末端の塩基配列解析については、多少時間を要したものの、次世代シーケンサーによるライブラリDNAインサートの塩基配列決定については、予定どおり終了した。アセンブリの過程においては、複数のアセンブラーを用いて成果物の比較検討を行っている。使用するアセンブラーによって、得られる成果物が全くことなっており、その評価法についても検討を行っている。その中で最も良質な結果ついて選別する予定である。昨年度計画していた、ゲノムウオーキングについては今年度は行っておらず、コンティグの由来微生物の推測を優先した。本実験については次年度以降に検討を行う。このようにして可能な限り完全長に近いゲノム断片の再構築を行う。並行してゲノム解析も進め、Planctomycetesの生態系における役割を推察する。環境微生物アセンブリの結果得られた配列をさらに連結するために、ゲノムウオーキングを行う。その結果必要であればフォスミドクローンのDNA塩基配列決定を再度行う。本年度において予定していたDNAシーケンシングの優先度を下げ、来年度以降に順延したため。次世代シーケンサーによる塩基配列決定作業を、当初は外注作業で行う計画であったが、共同研究機関が保有しているシーケンサーを使用することが可能となったため。前年度に未実行のDNAシーケンシングを次年度に遂行する。次年度において、共同研究機関が保有していないシーケンサー(例PacBio)を用いて外注作業を行う計画を予定しており、その費用に充当する計画である。
体外受精排卵誘発でのprolactin投与による卵成熟促進効果の研究

排卵誘発法bromocriptine-rebound methodがrebound現象で内因性のprolactin(PRL)を増加させることにより、ヒト体外受精での卵成熟と妊娠率を改善することを、我々は報告してきた。本研究では、gonadotropin(Gn)とPRLの併用投与による排卵誘発法をマウスで検討し、卵成熟法に関して効果を解析した。8週齢マウスにGnRH agonistで下垂体を脱感作した後、pregnant mare serum Gn(PMS)、hCG投与で排卵誘発を行った。この際、hCG投与の72時間前(n=141)、48時間前(n=99)、24時間前(n=71)または当日同時(n=34)に、0、0.01、0.1、0.3、1、3、10または30単位のPRLを腹腔内に併用投与した。その後交配し、排卵後に採卵し、排卵総数、受精卵数を比較した。さらに胞胚期まで培養し、胞胚形成率も比較した。hCGの72時間前(PMSの24時間前)のPRL投与では、PRL0.3単位投与群/対照群の排卵数は、19.3±2.2(SEM)/12.6±1.3、受精卵数は15.1±1.6/9.5±1.1、胞胚数は9.7±1.3/5.9±1.2でありPRL投与群で有意に多かった。hCGの48時間前(PMSと同時)のPRL投与では、PRL0.1単位投与群/対照群の胞胚数は11.5±0.9/7.8±1.2でありPRL投与群で有意に多かった。hCGの24時間前(PMSの翌日)のPRL投与では、PRL投与群の成績が対照群より良い値だった。hCGとPRLの同時投与群では、どのパラメーターも対照群と差を認めなかった。今回の研究により0.1単位から0.3単位のPRLをhCG投与前72時間から24時間前に投与すると初期の卵胞発育・成熟を促進させた。この事から、初期の胞胚発育にPRLが重要な生理的意義がある事が示唆された。pregnant mare serum gonadotropinおよびhuman chorionicgonadotropin(hCG)投与による過排卵誘発時にprolactin(PRL)を同時投与し、マウス卵管より採卵し、その採卵総数、受精卵数、胞胚数を比較検討し、PRL投与の最適時期と至適濃度を調べた。PRL投与の時期によりHCG投与24時間前群(n=92)、48時間前群(n=61)、72時間前群(n=21)の各群に分け、それぞれPRL濃度:0(対照群)、0.01、0.1、0.3、1、3、10、30単位のPRLを腹腔内投与した。結果として、PRL投与濃度に関してはPRL投与群は対照的に比し、投与時期に関わらず採卵数、受精卵数、胞胚数共に上昇した。特に、胞胚数の全てにおいてPRL濃度0.3単位投与群で有意(p=0.05p=0.004)であり、48時間前投与においてはPRL濃度30単位投与群で有意(p=0.05p=0.03)であった。PRL投与時期に関しては24時間前投与群では有意は出ておらず、hCG投与72時間前が有効と推定された。

今回の研究により0.1単位から0.3単位のPRLをhCG投与前72時間から24時間前に投与すると初期の卵胞発育・成熟を促進させた。この事から、初期の胞胚発育にPRLが重要な生理的意義がある事が示唆された。
カルボニル還元酵素及びラクトナーゼの基質認識機構の解析と生物活性物質合成への応用

(1)Sporobolomyces salmonicolorのアルデヒドレダクターゼ:標記の酵母菌体の粗抽出液より精製したアルデヒドレダクターゼは、(R)ー4ーハロー3ーオキソブタン酸などのβ-ケトエステル類に作用し、対応する(R)ーアルコール(100%ee)を生成した。また本酵素はp-ニトロベンズアルデヒドやグリセルアルデヒドなどのアルデヒド類を良い基質とした。(2)アルデヒドレダクターゼの1次構造:遺伝子レベル,ペプチドレベル両方から本酵素のアミノ酸1次配列の解析を行った。その結果、ヒト肝臓由来のアルデヒドレダクターゼやアルドースレダクターゼと相同性が極めて高いこと(約50%)が判明した。両者は互に類似した酵素と考えられた。(3)S.salmonicolorのアルデヒドレダクターゼとNADPH再生系酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼを共役させた反応系では、約100g/lの4ークロロー3ーヒドロキシブタン酸エチルエスタルがモル収率90100%で得られた。(4)Fusarium Oxysporumのラクトナーゼ:標記の糸状菌より各種のアルドン酸ラクトン類を立体選択的に加水分解し対応する酸を生成する酵素を精製した。本酵素は各種アルドン酸ラクトンの2位の水酸基定認識し、ハワース式で示した場合に水酸基が下向きの方向に出ているラクトンのみを選択的に水解した。(5)上記ラクトナーゼ反応によりパントラクトンの光学分割が可能なことを示した。