hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
公共交通機関を利用した移動環境の評価手法の開発

本研究では,平成9年度において(1)駅での乗り換え行動の把握,(2)移動手段別の負担感の比較,(3)乗り換え行動の負担の算出について調査および分析を行った.平成10年度では,これらの成果を踏まえた上で,分析対象とする行動を自宅を起点とした外出行動に拡大し,検討項目を追加した.そして2箇年の成果を総合化することで公共交通機関を利用した移動環境の評価を試みた.具体的にはまず,大阪府豊中市全域を対象として,市民の外出行動の状況を訪問回収方式のアンケート調査により把握した.この調査の中では,個人の社会的属性以外に,公共交通利用環境(例えば,主に利用する経路,利用交通機関,交通費など)を調査すると同時に,現在の経路を選択する理由,代替経路の有無,現状の施設整備・運賃制度・情報提供に対する不満・問題点を調査した.そして,これらの調査結果を分析することで,乗り換え行動に影響を及ぼす施設面の問題に加えて,金銭的な負担や情報収集の問題と外出行動との関係を明らかにした.さらに,施設利用面,金銭負担面,情報収集面からの評価指標の相互関係を考慮した上で外出行動(主として外出頻度)との関係をモデル化することで,総合的な公共交通機関利用環境評価を行った.(1)調査対象駅の選定・調査対象駅での乗り換え行動の把握本研究では、大阪の主要な駅の一つである阪急電鉄梅田駅(以下、阪急梅田と略記)を調査対象として選定した。すでに予備調査として、1995年12月に阪急梅田駅改札口付近にて調査票を配布(1950票)し、426票の有効回答を得ているが、データ数が十分でないため追加調査を実施した。調査は、阪急梅田から先に挙げた五つの駅へ乗り換えるときのルートを問うものであり、予備調査結果から抽出したルートを地図上に示し、その中から選択してもらう形式とした。また、同時にルート選択の理由についても設問した。(2)移動手段別の負担感の比較-等価時間係数の適用-本研究では、等価時間係数の概念を用いて、移動手段(状態)別の移動時の負担感を指標化した。今回は、(1)水平歩行、(2)階段上り、(3)階段下り、(4)エスカレータ上り、(5)エスカレータ下り、(6)エレベータ、(7)動く歩道、(8)待ちからなる移動(手段)状態を対象とした。この結果、ルートを選択するにあたって、選択の傾向は同様であるのに対して、属性別に見たときにその負担の感じ方に大きな差があることを把握した。(3)乗り換え行動全体の負担(一般化時間)の算出(2)の結果を用いて、乗り換え行動全体の負担(一般化時間)を算出した。一般化時間は、(一般化時間)=Σ[(通行リ-ト中の各移動手段の等価時間係数)×(各移動手段の所要時間)]で定式化される。この結果、ルートの移動負担総量を示すとともに、整備に当たっては、ルートの特性を明確にし、設置効果が最大になるような事前の検討が重要になることを明らかにした。さらに、一般化時間を所要時間で除すことで、移動抵抗を算出し、ルートの整備状況を比較すると同時に、講ずるべき対策の方針検討が可能であることを明らかにした。本研究では,平成9年度において(1)駅での乗り換え行動の把握,(2)移動手段別の負担感の比較,(3)乗り換え行動の負担の算出について調査および分析を行った.平成10年度では,これらの成果を踏まえた上で,分析対象とする行動を自宅を起点とした外出行動に拡大し,検討項目を追加した.そして2箇年の成果を総合化することで公共交通機関を利用した移動環境の評価を試みた.具体的にはまず,大阪府豊中市全域を対象として,市民の外出行動の状況を訪問回収方式のアンケート調査により把握した.この調査の中では,個人の社会的属性以外に,公共交通利用環境(例えば,主に利用する経路,利用交通機関,交通費など)を調査すると同時に,現在の経路を選択する理由,代替経路の有無,現状の施設整備・運賃制度・情報提供に対する不満・問題点を調査した.そして,これらの調査結果を分析することで,乗り換え行動に影響を及ぼす施設面の問題に加えて,金銭的な負担や情報収集の問題と外出行動との関係を明らかにした.さらに,施設利用面,金銭負担面,情報収集面からの評価指標の相互関係を考慮した上で外出行動(主として外出頻度)との関係をモデル化することで,総合的な公共交通機関利用環境評価を行った.
On/Off状態におけるタンパク質脱リン酸化酵素カルシニュリンの溶液構造

蛋白質脱リン酸化酵素カルシニュリン(CaN)の溶液構造をX-線溶液散乱(SOXS)法で解析した。不活性な状態(Off状態)にあるCaN単独あるいはCaN/Mg^<2+>の慣性半径(Rg)はともに43.1Åであった。一方活性化された状態(On状態)にあるCaN/Ca_<2+>のRgは57.4Å,活性化因子であるカルモデュリン(CaM)が結合するとRgは64.3Åであった。SOXSデータの対距離分布関数解析の結果,CaN単独,CaN/Mg^<2+>で分子長約93Åの楕円体,CaN/Ca^<2+>で分子長約102Åの2ドメインモデル,CaN/CaM/Ca^<2+>では分子長107Åの3ドメインモデルに近似できた。蛍光ラベルしたCaMを用い,CaN分子に存在する4残基のトリプトファン(W)からCaMへのエネルギー移動が証明でき,前述の3ドメインモデルと併せるとCaMはCaNのAサブユニット近傍に新たなドメインを形成して存在すると解釈できる。SOXSデータのクラツキ-法による解析結果はCaN分子のコンパクトさ(3次構造)はOn,Off状態でほぼ同一であることを示し,Ca^<2+>や結合に伴うCanのW残基近辺の科学的環境は変化しないという紫外部吸収差スペクトル測定の結果とよい一致を示した。以上の実験結果より,溶液内でCaNはドメイン構造を維持した状態で,ドメインの相対的位置を変化させOn,Off状態を調節していると結論できた。(紫外部吸収スペクトルは当該研究補助金により購入した紫外・可視分光解析システムを用いて測定した。SOXS測定は高エネルギー加速器研究機構物質科学研究所における共同利用実験として行った。)蛋白質脱リン酸化酵素カルシニュリン(CaN)の溶液構造をX-線溶液散乱(SOXS)法で解析した。)牛脳より抽出・精製した蛋白質脱リン酸化酵素力ルシニュリン(CaN)はカルモデュリン(CaM)存在下でNi^<2+>添加によりCa^<2+>添加の場合より約4倍高い活性を示した。Ni^<2+>存在下でCaNの活性化はCaM濃度依存的であり、添加モル比1で最大活性の90%に達した。この結果をNi^<2+>がCaMに結合することによりCaNを活性化すると考えた。Ni^<2+>添加に伴い、CaMの紫外部吸収スペクトルに変化が誘起され、Ni^<2+>結合を確かめた。ただしこの変化はCa^<2+>添加で誘起される変化の約20%であった。CaNのCaM結合部位モデルペプチドを用いて、CaMの溶液構造をX線溶液散乱(SOXS)法により解析した。ペプチド存在下でCa^<2+>添加に伴いCaMの慣性半径(Rg)は減少したが,Ni^<2+>添加の場合にはRgは殆ど変化しなかった。対距離分布関数(P(r))による分子形状解析の結果Ca^<2+>系でCaMは楕円体であるが、Ni^<2+>系ではCaMが亜鈴形のままであると結論できた。以上の結果からNi^<2+>/CaMとCa^<2+>/CaMによるCaN活性化の分子機構は異なることが示された。CaNの溶液構造をSOXS法で解析した。CaNの活性が高い条件下でのRg値は低い条件下での値に比べ約10Å大きく,活性化された状態(On状態)では非活性化状態(Off状態)に比べてCaN分子がより伸びた形状をしていることが示唆された。On状態とOffではCaNの紫外部吸収スペクトルにも差が見られた。

平成11年度にはCaNのOn状態とOff状態における溶液構造の差異を更に詳細に解析する。(紫外部吸収スペクトルは当該研究補助金により購入した紫外・可視分光解析システムを用いて測定した。SOXS測定は高エネルギー加速器研究機構物質科学研究所における共同利用実験として行った。)蛋白質脱リン酸化酵素カルシニュリン(CaN)の溶液構造をX-線溶液散乱(SOXS)法で解析した。不活性な状態(Off状態)にあるCaN単独あるいはCaN/Mg^<2+>の慣性半径(Rg)はともに43.1Åであった。一方活性化された状態(On状態)にあるCaN/Ca^<2+>のRgは57.4Å,活性化因子であるカルモデュリン(CaM)が結合するとRgは64.3Åであった。SOXSデータの対距離分布関数解析の結果,CaN単独,CaN/Mg^<2+>で分子長約93Åの楕円体、CaN/Ca^<2+>で分子長約102Åの2ドメインモデル,CaN/CaM/Ca^<2+>では分子長107Åの3ドメインモデルに近似できた。蛍光ラベルしたCaMを用い,CaN分子に存在する4残基のトリプトファン(W)からCaMへのエネルギー移動が証明でき,前述の3ドメインモデルと併せるとCaMはCaNのÅサブユニット近傍に新たなドメインを形成して存在すると解釈できる。SOXSデータのクラツキー法による解析結果はCaN分子のコンパクトさ(3次構造)はOn,Off状態でほぼ同一であることを示し,Ca^<2+>やCaM結合に伴うCaNのW残基近辺の化学的環境は変化しないという紫外部吸収差スペクトル測定の結果とよい一致を示した。以上の実験結果より,溶液内でCaNはドメイン構造を維持した状態で,ドメインの相対的位置を変化させOn,Off状態を調節していると結論できた。)
中近世における神杜と神祇信仰の総合的研究

神祇信仰及び神社制度の実態の全面的な解明・考察をするために、歴史学・宗教学の接点を求める学際的研究方法を用いて、史料の蒐集と厳密な検討を行い、時代背景、それぞれの地域の状況を念頭におきつつ、研究を進めた。まず、第一に個別神社の研究、基礎的研究を蓄積した。この課題の前提作業として、史料の蒐集という作業がある。ここで、神社関係文書の存在形態を把握した。第二は、中世における神社の基本的性格の把握を行った。第一の課題の成果の上に立ち、中世の神社の基本的性格や機能を明確にして、神社の社会的位置付け並びに地域的・歴史的特徴を明らかにした。また、中世後期から近世への展開過程も視野に入れた。第三に神社の神主・社務組織の実態把握を行った。神主の活動の実態を在地領主・幕府との関連から明らかにすることは、神社の性格を知る上にも重要な視点である。また、宗教者としての教化活動、社殿造営、神社運営、祭祀の維持など社会との接点を明らかにした。これは、神社の社会的機能の解明につながる作業となった。第四に中近世の神道研究における神社への認識についての把握である。特に中世から近世にかけての変遷過程を神道研究を行っている文献を中心にして明らかにした。また、神道研究の方法や内容の変遷過程も検討課題とした。最期に総合的な課題として、前述の課題の成果の上に立って、中近世における神社の歴史的位置付けと社会的機能及び宗教的性格の解明及びその変遷過程、さらに神祇信仰の内容や宗教的性格について基本的部分を明らかにした。本年度は、特に基礎的な資料の把握とフィールドワークによる情報・資料の収集に主眼をおいた。本年度の具体的な研究業績内容は、以下の通りである。(1)神道・神社関係の調査・資料収集神社関係資料の所在確認調査・収集のため神社へ赴き実地調査を行った。また、神事祭礼など祭司の現場にも赴きフィールドワークを行った。実施調査に赴いた神社・地域は、主なところをあげると、新潟県弥彦神社・長岡市周辺、山陰地方・出雲大社・美保神社・倭文神社・宇部神社・物部神社・国庁裏神社、三重県伊勢神宮・神宮文庫・皇學館大學神道研究所、千葉県香取神宮・国立歴史民俗博物館、長野県北部・中部地域・穂高神社・生島足島神社・仁科神明宮などである。これらの資料・実施調査の具体的な結果として、香取神宮を事例とした論考をまとめた(「中世における神社修造-鎌倉期・香取社を事例として-」)。この他、神道を含む祭祀関係について南北朝期から近世末期まで編年的に記した資料である『歴朝要紀』を調査し、このうちの善本を校注・翻刻し、財団法人神道大系編纂会より、朝儀祭祀編として『歴朝要紀』(一)・(二)・(三)として刊行した。この作業は、現在も進行中であり、『歴朝要紀』によって中世から近世にかけての神道関係祭祀の実態・変容が明らかにされると考える。また、中近世の在地の信仰を伝える史料として起請文に注目して、その神名の分布について検討し、研究発表を行った(財団法人神道大系編纂会神道古典研究所第128回研究例会)。(2)神道・神社関係資料の分類・項目の仮設定上記の資料収集とフィールドワークに並行して、収集した資料の整理を進めている。上記の(1)の調査の状況から、神社関係資料調査の前提としての方法論と分類・項目論について論考をまとめた(「神社関係史料の特徴とその整理・調査」)。また、従来の神道・神社資料の分類の体系の基礎を作った宮地直一氏の書庫の調査を行い、従来の分類項目の設定状況の把握を進めている。また、神道・神社の歴史的研究である神道史学の基礎を築いたのも宮地氏であり、その研究方法についても調査し、神道史学の研究史・方法論の一部について論考をまとめた(「神道史についての研究史小考-宮地直一を中心として-」)。この他、中世的な神社システムの端緒である神社神階制についても論考をまとめた(『古代諸国神社神階制の研究』)。本年度は、昨年度に引き続き、基礎的な資料の調査、フィールドワークによる情報・資料の収集などを行いながら、調査・収集した資料の分類と個別具体的な基礎研究も行った。(1)神道・神社関係資料の調査・収集及び翻刻と個別具体的研究神社関係資料の所在確認調査・収集のため、神社へ赴き現地調査を行った。また、神事祭礼など祭祀の現場にも赴きフィールドワークを行った。実地調査に赴いた神社・地域は、主なところをあげると、北海道・松前地域の神社(神職日記調査)、福島県会津若松地域・塔寺八幡、茨城県水戸藩神社関係資料、新潟県弥彦神社、長岡市周辺神社、山陰地方・出雲大社・美保神社・物部神社・国庁裏神社、三重県伊勢神宮・神宮文庫・皇學館大學神道研究所、千葉県香取神宮、国立歴史民俗博物館、長野県北部・中部地域神社、穂高神社、生島足島神社、仁科神明宮などである。

これらの資料・現地調査の具体的な結果として、近世における神社研究・神道研究に注目して、特に水戸藩の社寺史料調査についての論考(「近世における社寺史料調査」)、地域社会における神祇信仰の実態についての論考(「地域社会における神々への信仰」)、香取神宮の祭祀・神職の構造についての論考(「中世における神主の一形態香取神宮を事例として」)、地方神社における神仏習合の実態についての論考(「地方神社における神仏関係」)などをまとめた。また、昨年度に続いて、神道を含む祭祀関係について南北朝期から近世後期まで編年的に記した資料である『歴朝要紀』の調査を行い、このうちの善本を校注・翻刻して財団法人神道大系編纂会より、朝儀祭祀編として『歴朝要紀』(四)・(五)・(六)として刊行した。この作業は、来年度に刊行完了予定であり、『歴朝要紀』によって中世から近世かけての神祇関係祭祀の実態・変容が明らかになり、基礎資料として重要なものになると考えられる。この他、中世から近世への転換期における在地の神社や神職層の動向と幕府との関係の状況に注目して、神職層・神社構造の近世的展開について分析し、研究発表を行った(「近世前期における地方神職層の動向」)。(2)神道・神社関係資料の分類・項目の仮設定と資料構造論・伝来過程論上記の資料収集とフィールドワークに並行して、収集した資料の整理を進めている。従来の神道・神社資料の分類の体系の基礎を作った宮地直一博士の書庫の調査を行った結果、従来の分類項目の設定状況の把握を進めるとともに宮地博士の典籍類への書き込みや写真資料の分析も進めた。収集した神社関係資料の分類・項目設定にしたがって、特に宗教的な記載の多い塔寺八幡宮の「長帳」を具体的な調査対象として注目し、その内容から中近世の神社への信仰、特に在地の神仏習合の神社構造の実態の分析を行った(「地方神社における神仏関係」)。また弥彦神社関係資料の調査をした結果、仮項目・仮分類を行いながら史料の伝来過程や資料の状況・内容から、弥彦神社の社内構造と神職の活動について分析して研究発表を行った(「弥彦神社の構造と高橋光頼」)。神祇信仰及び神社制度の実態の全面的な解明・考察をするために、歴史学・宗教学の接点を求める学際的研究方法を用いて、史料の蒐集と厳密な検討を行い、時代背景、それぞれの地域の状況を念頭におきつつ、研究を進めた。まず、第一に個別神社の研究、基礎的研究を蓄積した。この課題の前提作業として、史料の蒐集という作業がある。ここで、神社関係文書の存在形態を把握した。第二は、中世における神社の基本的性格の把握を行った。第一の課題の成果の上に立ち、中世の神社の基本的性格や機能を明確にして、神社の社会的位置付け並びに地域的・歴史的特徴を明らかにした。また、中世後期から近世への展開過程も視野に入れた。第三に神社の神主・社務組織の実態把握を行った。神主の活動の実態を在地領主・幕府との関連から明らかにすることは、神社の性格を知る上にも重要な視点である。また、宗教者としての教化活動、社殿造営、神社運営、祭祀の維持など社会との接点を明らかにした。これは、神社の社会的機能の解明につながる作業となった。第四に中近世の神道研究における神社への認識についての把握である。特に中世から近世にかけての変遷過程を神道研究を行っている文献を中心にして明らかにした。また、神道研究の方法や内容の変遷過程も検討課題とした。最期に総合的な課題として、前述の課題の成果の上に立って、中近世における神社の歴史的位置付けと社会的機能及び宗教的性格の解明及びその変遷過程、さらに神祇信仰の内容や宗教的性格について基本的部分を明らかにした。
複合散逸呉の非線形現象とパターン形成

本総合研究(B)は、パターク形成に関する組織的な研究を目指した重点領域の申請を行なうための事前調査、企画準備、組織構成のために計画されたものである。研究調査は次のような諸点を中心とした。(1)複合系や散逸系に見られるパターンの非線形発展,(2)時間に依存したギンヅブルグ-ランダウ方程式に呈するパターンと動力学,(3)欠陥、界面などの局在化したパターンの分岐現象とその記逆,(4)欠陥の発生とその乱流化(欠陥乱流)の特徴と発生メカニズムの討議,(5)複合系に発生する非線形波の分岐と乱流への転移,(6)化学反応系にみられる巨視パターンのダイナミックス,(7)振幅方程式、位相力学方程式が我々に与える情報と将来展望について、また、動向調査として(a)巨視方程式の研究に関する新しい動向について,(b)パターク形成における日本での新しい実験的研究の調査,(c)コンピューターによる理論解析の可視化の動向,(d)物性物理から他分野、特に物理化学的現象でのパタークの研究動向,(e)今後期待されるあるいは計画すべき重要なパタークの研究の調査,(f)静的、動的情報の縮約の将来動向について、が計画された。その結果は、研究計画、企画と申請領域の研究現状の調査分析は計3回の企画会議と研究会議で討論され、諸外国及び国内研究の進展状況から、重点的に研究することによって、(1)パターク形成を記述する方法論が確立される可能性があること、(2)非平衡パターンの機構や記述が理解されるとその他の分野への波及効果が大きいこと、(3)拡散・反応パターンや電気流体力学的パターンの物理機構の研究レベル及びその画像計測手段が国際的にトップレベルにあること、などが認識された。以上、最終的に重点領域申請書が作成され、現在、申請されている。
昆虫IGF様ペプチドの生理機能の解明

カイコガのIGF様ペプチド(BIGFLP)と機能的に相同なショウジョウバエのペプチド(DILP6)を同定し、それをコードする遺伝子の機能阻害実験および機能回復実験により、同ペプチドが変態期特異的に働く成長促進因子であることを証明した。また、BIGFLPの網羅的発現解析により、同ペプチドが主要産生組織である脂肪体だけでなく、脳内の神経分泌細胞や精巣・卵巣でも時期特異的に発現することを明らかにした。インスリン様成長因子(IGF)はヒトの成長を調節する重要なホルモンである。本研究の目的は、最近われわれが昆虫で初めて発見したIGF様ペプチド(8K-BLP)の産生組織、分泌調節、生理機能の解析を進め、昆虫の変態(成虫発育)における同ペプチドの生理機能を解明することである。これまでの解析により、同ペプチドはカイコガにおいて、蛹期特異的に主に脂肪体で産生され、成虫組織原基に対し成長促進作用を示すことが明らかになっている。本年度は、カイコガにおける同ペプチドの産生組織と産生時期の網羅的解析、微量測定法の開発と血中濃度の測定、RNAiを使った生理機能解析、ショウジョウバエの相同ペプチドの検索を行った。以下は主な研究成果とその意義である。1)免疫組織化学とin situハイブリダイゼーションによる解析により、8K-BLPは脂肪体の他、卵巣小管膜、精巣鞘膜および脳において時期特異的に産生されることが示された。これらの器官での産生は8K-BLPの局所的作用と広範な機能を示唆するものである。2)8K-BLPの微量測定法を開発し血中濃度を測定した結果、蛹化前日に上昇し始め、蛹化後は数100nMに達することが明らかとなった。この結果は、8K-BLPが蛹期のみならず前蛹期にも重要な機能を果たしている可能性を示唆する。3)カイコガ前蛹にdsRNAを注射しRNAiによる遺伝子ノックダウンを試みたが期待する効果は観察されなかった。鱗翅目昆虫でのRNAiは例外を除き困難と言われているが、その定説を追認する結果であった。4)ショウジョウバエで同定されている7種のインスリン族ペプチドの中の一つDILP6の遺伝子が、8K-BLPと同様に変態期特異的に脂肪体で高発現することが明らかとなった。DILP6は8K-BLPの機能的相同ペプチドと考えられ、IGF様ペプチドが昆虫界に広く分布することが強く示唆された。本研究の目的は、無脊椎動物で初めて発見されたIGF様ペプチドであるカイコの8K-BLPの生理機能を解明し、さらにIGF様ペプチドの昆虫での普遍的機能を明らかにすることである。昨年度までの研究により、8K-BLPが変態期の組織の成長に関わることが強く示唆されたが、生体内での成長促進機能を結論づけるには遺伝学的証明が必要である。そこで本年度は、分子遺伝子学的解析が容易なショウジョウバエを材料として研究を進め、以下の成果を得た。1.8K-BLPと機能的に相同と考えられるDILP6の遺伝子発現解析を行い、8K-BLP遺伝子同様に変態期特異的に主に脂肪体で発現することを明らかにした。2.DILP6遺伝子発現がエクジステロイドにより誘導されることを、脂肪体の培養実験およびエクジソン受容体遺伝子の脂肪体特異的ノックアウト・ノックダウン実験により証明した。3.DILP6遺伝子欠損突然変異系統を作製して表現型を解析し、突然変異系統の成虫では体サイズが減少し、また翅の面積の減少は細胞数の減少に起因することを示した。また、体重の変化は幼虫が摂食を停止した後、すなわち変態期に表れることを明らかにした。4.突然変異系統において変態期特異的かつ脂肪体特異的にDILP6を強制発現させると、体重低下の表現型がレスキューされることを示した。以上の結果より、昆虫のIGF様ペプチドはカイコ以外の昆虫に存在すること、変態期の成長を調節する機能を持つことが証明された。本研究の目的は、最近われわれが昆虫(カイコガとショウジョウバエ)で初めて発見したIGF様ペプチド(IGF-like peptide : IGFLP)の産生組織、分泌調節、生理機能の解析を進め、昆虫の変態(成虫発育)における同ペプチドの生理機能を解明することである。これまでの解析により、昆虫IGFLPは変態期特異的に主に脂肪体で産生され成虫の成長を促進する他、機能は不明ながらカイコガの精巣や卵巣でも時期特異的に産生されることが明らかになっている。本年度はこれらの組織が分泌するIGFLPの個々の生理作用と作用様式の解明を目指し、組織培養系を用いた以下の研究を行った。1.脂肪体が分泌するIGFIPの標的組織の一つと推定される生殖器原基のin vitro

培養系を確立した。最適化された培養条件では48時間で培養開始前の約3倍の組織ナイズの成長が認められた。同原基の最大成長にはエクジステロイドも必要であることが明らかとなった。2.精巣壁が産生するIGFLPは精巣に繋がる輸精管の成長を促進する(傍分泌的作用)と予想し、輸精管のin vitro培養実験を行った。同組織の最大成長は、エクジステロイドの存在下で精巣壁と共培養した時に観察された。精巣壁の効果をIGFLP添加により完全に再現することは今のところ成功しておらず、精巣壁はIGFLP以外の成長因子を分泌する可能性もある。これらの結果は、IGFLPの成長促進作用はエクジステロイドやその他の因子の存在下で最大化することを示している。今後は、今回確立した培養系を活用し、IGFLPと他因子との相互作用の詳細を解析していく予定である。
回転カゴでの自発的走行により引き起こされる味覚嫌悪学習に関する研究

ラットを被験体とした前年度までの研究により、自発的回転カゴ走行を無条件刺激とした味覚嫌悪学習の基本的性質を明らかにした。さらに、自発的回転カゴ走行だけでなく、強制遊泳を用いた場合にも味覚嫌悪学習が成立することを発見した。平成16年度は、(1)自発的回転カゴ走行と強制遊泳について、味覚嫌悪学習の無条件刺激としての強さを比較すること、(2)これら運動性味覚嫌悪学習の手続きの臨床応用性を探ること、(3)「自発的回転カゴ走行」が真に「自発的」であるかどうかを確認すること、の3点を実験的に検討した。まず、味覚嫌悪学習研究において一般的に使用されるサッカリン溶液をラットに摂取させた後、自発的回転カゴ走行または強制遊泳を行わせたところ、運動時間が等しければほぼ等しいサッカリン嫌悪が形成された。また、アルコール溶液を摂取させた後、15分間の自発的回転カゴ走行または強制遊泳を行わせた場合に、同程度のアルコール嫌悪の形成を確認した。これは、15分間の断続電撃を無条件刺激に用いて形成されるアルコール嫌悪の強さと等しかった。この知見は、人間のアルコール依存症患者の味覚嫌悪療法において、催吐剤の代わりに「運動」を使用できるかもしれないことを示唆している。しかし、電撃や運動によって生じる味覚嫌悪は催吐剤を使用した味覚嫌悪よりも弱いことや、ラットと人間との種差の問題などがあり、実際の臨床応用には今後さらに検討が必要である。また、側室のあるモーター駆動の回転カゴを用いて、味覚嫌悪学習を最大にする走行の性質を明らかにしようと試みた。その結果、「自発的に高速で走っては止まる、しかしカゴからは出られない」という状況において最も味覚嫌悪学習が大きいことを示唆する結果を得た。ラットに味覚溶液を摂取させてから回転カゴで自由に走行させるという手続きを繰り返すと、当該味覚溶液の摂取量が徐々に減少していく。これは、味覚刺激を条件刺激、回転カゴ走行を無条件刺激とした古典的条件づけによる味覚嫌悪学習だと考えられている。この学習現象の性質について検討するため、毒物を無条件刺激に用いた典型的な味覚嫌悪学習において報告されている諸現象が、この手続き場面でも確認されるかどうか検討した。具体的には、味覚嫌悪学習の強さに影響を及ぼす変数として知られている、(1)無条件刺激の強度(この場合、走行時間の長さ)の効果、(2)条件刺激-無条件刺激間隔(この場合、味覚溶液摂取から走行までの間隔)の効果、(3)無条件刺激の先行呈示(この場合、回転カゴ走行の先行訓練)の効果を精査した。その結果、長く走行させるほど嫌悪学習が強く、味覚溶液摂取から走行までの間隔が長くなるほど嫌悪学習が弱く(ただし、この間隔が1時間であっても嫌悪学習が形成可能)、回転カゴ走行の先行訓練を長く行うほどその後の嫌悪学習が弱くなる、ことが明らかとなった。これらは、毒物を無条件刺激とした典型的な味覚嫌悪学習で確認されている特徴に一致し、回転カゴ走行が毒物投与と同様の機能を有している可能性を示唆している。なお、上記結果のうち、(1)と(2)は、1種類の味覚刺激を用いた単純条件づけ手続きに加えて、2種類の味覚刺激の1つだけを回転カゴ走行と対呈示するという分化条件づけ手続きでも確認した。また、走行不能な回転カゴ内に置くことは嫌悪学習を引き起こさないことから、自発的走行が無条件刺激になっていることを実証した。ラットに味覚溶液を摂取させてかち回転カゴで自由に走行させるという手続きを繰り返すと、当該味覚溶液の摂取量が徐々に減少していく。前年度(平成14年度)に引き続き、一般的な古典的条件づけ事態で確認・研究されているさまざまな現象を、自発的な回転カゴ走行により生じる味覚嫌悪学習の事態において再現できるかどうか、実験的検討を続けた。具体的には、消去・自発的回復・隠蔽の3つの現象を確認できた。しかし、阻止と過剰予期効果については、それぞれ複数の実験を行ったが確認できなかった。用いた操作変数が不適切であったことも考えられるため、さらに検討する必要がある。また、回転カゴでの自発的走行を無条件刺激に用いた場合、塩化リチウム投与を無条件刺激にした場合と同様に、味覚刺激よりも視覚刺激と結びつきやすいことを確認した。回転カゴ走行時のストレス指標の計測は行えなかったが、強制遊泳によっても味覚嫌悪学習が生じることを複数の実験で確認した。このことから、運動ストレスが味覚嫌悪学習を成立させている可能性が示唆される。

また、アルコール溶液を摂取させた後、15分間の自発的回転カゴ走行または強制遊泳を行わせた場合に、同程度のアルコール嫌悪の形成を確認した。これは、15分間の断続電撃を無条件刺激に用いて形成されるアルコール嫌悪の強さと等しかった。この知見は、人間のアルコール依存症患者の味覚嫌悪療法において、催吐剤の代わりに「運動」を使用できるかもしれないことを示唆している。しかし、電撃や運動によって生じる味覚嫌悪は催吐剤を使用した味覚嫌悪よりも弱いことや、ラットと人間との種差の問題などがあり、実際の臨床応用には今後さらに検討が必要である。また、側室のあるモーター駆動の回転カゴを用いて、味覚嫌悪学習を最大にする走行の性質を明らかにしようと試みた。その結果、「自発的に高速で走っては止まる、しかしカゴからは出られない」という状況において最も味覚嫌悪学習が大きいことを示唆する結果を得た。
地球史海洋底断面復元プロジェクト：太古代から原生代への環境大変動解明

海底断面復元について,31億年前(オーストラリア・ピルバラ/Cleaverivlle Formation: DXCL掘削),23億年前(ガーナ・ビリミアン:GHB掘削),18億年前(カナダ・トランスハドソン:鉱山コア),7億年前(エジプト・東砂漠地域:陸上調査)の地層を選び,できるだけ精度の高い層序を復元し,新鮮な試料を取得してそれぞれの時代の地層断面を明らかにした.コアはそれぞれ200ー400mの層序復元ができ,有機物を含む黒色頁岩に着目して,全炭素濃度や同位体,そこに含まれる黄鉄鉱から硫黄同位体の変動を明らかにした.今回は初年度であり,原生代についての予察的調査を行った。7月カナダヒューロニアン層群(22億年前),カナダケープスミス帯(19億年前),8月ブラジル15億年前の鉄鉱層(Espinhaco超層群), 9月南アフリカバーバートン帯(32億年前),11月ガーナ(20億年前)ベリミアングリーンストーン帯, 3月エジプト(7億年前)ヌビアグリーンストーン帯について,それぞれ1ー2週間の地質調査を行い,鉄鉱層の中心とした地質図,柱状図,断面図を作成した。特に2015年度12月にガーナで掘削を行うことを決定し,業者の準備,掘削場所の設定,輸送準備などを行った。この掘削によりベリミアン層群内の層序が明らかになり,20億年前の海洋底環境が明らかになると考えられる。また,すでに掘削済みのDXCL掘削成果では,黄鉄鉱の分析が進み,非常に高い32Sの同位体比(=+10ー25‰)が検出されることがわかってきた。これは,当時の海洋底が現在に近い高濃度の同位体比を持っていた可能性があり,現在,掘削コアより下位の地層中のバライト層より当時の海水の硫黄同位体の測定を試みている。2016年度の夏にカナダ,ケープスミス帯への地質調査を予定している。12月にカナダ地質調査所wolter Breeker博士と打ち合わせを行い,カープスミス帯の比較的変成度が低い,西側地域の調査を行うことに決定した。2015年度は,1)22億年前の地質帯を掘り抜くガーナ掘削(GHBプロジェクト)のために,5月の連合大会でまず国内ミーティング,9月にGorge Tetteh博士を招き,地質学会で講演および掘削のための打ち合わせを行った.掘削のための業者の手配,コスト,日時などを決めて12月の掘削に望んだ.2)12月掘削は,ガーナ西部のケープスリーポイント地域,Ezil bay海岸で行われ,当初の計画日時よりも5日ほど延長されたが,無事195mの掘削に成功した.3)3月にはProject A会合にて,現状報告会と来年に向けての方針を議論した.4)3月は7億年前のエジプト地質調査を行い,詳細な地質図・断面図・柱状図の作成に成功した.新たに2カ所の不整合層を発見し,グリーンストーン帯が陸化後の2つの堆積盆が発達したことが明らかになった.現在までの進捗状況本年度は,ガーナにおける掘削を行うことが最大の目標であった.12月の掘削にて掘削会社との前金の振り込み証明が確認が取れず,なかなか掘削がスタートしなかったが,ガーナ大学のフランク教授の力沿いにより成功した.掘削コアも順調に運ばれ,現在博多港にて税関が通過することを待っております.今後予定通り5月より,半割を行い,試料配布により分析を開始していく.エジプト調査もほぼ全体の地層分布が明らかになり,新たに2カ所の不整合などが見つかっている.現在試料を送っており,持ち帰り試料について即年代測定およびREE分析を行っている.2016年度1)ガーナ掘削(GHBプロジェクト):コア解析のために,5月の連合大会でまず国内ミーティング, 6月2度のコアカッティングを高知コアセンターにて行い,層序柱状図を作成してきた.現在詳細な薄片作成作業を行っている.ここでは200mのコアが取得されており,海岸地域におけるベリミアン・グリーンストーン帯の最上部層に当たる.この地層は全体層序(オフィオライト)の中でも最上部の地層であり,GOE(大酸化事件)が起こったこの時代の海洋底状態を示している.この中に出てくる炭素・硫黄の同位体がどのように変化するかを明らかにする.2)カナダ・18億年前の海底環境復元:7月フリンフロン調査,8月ケープスミス調査を行い,連続コア試料についての記載およびサンプリングを行った.現在薄片作成を行い炭素,硫黄同位体の測定を行っている.フリンフロンでたトータルで400mのコア試料の記載およびサンプリングを行った.ケープスミスでは2カ所の大陸棚上で堆積した黒色頁岩層についての連続サンプリングを行った.3) 9月南アフリカでのIGCで成果発表,12月AGUで成果発表どもにガーナで掘削した岩相記載の成果発表を行った.4)3月第4回geoscience symposiumプレカンブリアンワールド2017を企画開催し,11カ国50人の外国人を含む150名の参加する国際シンポジウムを福岡で開催した.そこで,これまでの成果報告を行い,今後の計画およびプロジェクトを詰めた.16年度は1)ガーナプロジェクト:掘削コアが高知に到着し,半割することができた.薄片,分析を行っているが,岩石が硬いことなどで試料作成に時間がかかっている.2)カナダプロジェクト;フリンフロン

帯では今まで途中までで残していたコア試料をすべて記載・サンプリングができた.ケープスミス帯でのコア試料も2カ所についてコアを取得することができ,試料も日本に送られてきた.現在,薄片・分析を行っている.3)3月に国際シンポを企画しており,これに関しても予想よりも多くの150人が参加し,海外からも11カ国から集まってもらえた.大成功であり,現在特集号の作成を企画中である.本年度は最終年度であるが,1)カナダ:トランスハドソン帯のコア取得および地質調査,2)ガーナ:ケープスリーポイント地域の掘削後処理とオフィオライト地域の地質調査,3)エジプト:東砂漠地域・Wadi Dahher鉄鉱層地域の地質調査(最終確認)を行った.1)トランスハドソン帯は,a)フリンフロン地域にて昨年とは違う場所の連続コア試料を取得した.b)ラブラドルトラフの鉄鉱層の調査をラブラドルシティーにあるRIO TINT鉱山で行った.ラブラドル地域では,南部は11億年前のグレンビル造山運動の影響で変成・変形が強いことがわかった.200kmほど北部の調査が必要である.2)ケープスリーポイントのオフィオライト帯について,蛇紋岩帯からガブロ分布地域の調査を行った.これらの岩体の両側に非常に厚い火山起源の堆積物が分布しており,島弧的な部分が付加している地質帯であると考えられ,掘削で得られた試料が,海洋性島弧ファシスであることが明らかになった.3)エジプトのWadi Dahher鉄鉱層地域については,地質図作成から,層序作成および年代測定を行って来た.今回の最終調査で年代測定した部分の確認を行い,縞状鉄鉱層は7億年前のスターチアン時代にできた地質帯であることが明らかになった.現在,時代別の海洋環境について分析,解析を行っている.現在の分析結果,太古代海底の無酸素状態と原生代前期の海底無酸素状態では,硫黄同位体が非常に類似した挙動,つまり生物を関しない重い値をとる.これは,太古代から原生代に関して海洋に硫酸が固結し,硫化水素海洋が続いていた可能性が示唆される.生物活動の活性化,光合成に伴う酸素供給,生物分解による還元作用が当時の海底でどのくらい行われているのか,現在考察中である.海底断面復元について,31億年前(オーストラリア・ピルバラ/Cleaverivlle Formation: DXCL掘削),23億年前(ガーナ・ビリミアン:GHB掘削),18億年前(カナダ・トランスハドソン:鉱山コア),7億年前(エジプト・東砂漠地域:陸上調査)の地層を選び,できるだけ精度の高い層序を復元し,新鮮な試料を取得してそれぞれの時代の地層断面を明らかにした.コアはそれぞれ200ー400mの層序復元ができ,有機物を含む黒色頁岩に着目して,全炭素濃度や同位体,そこに含まれる黄鉄鉱から硫黄同位体の変動を明らかにした.ガーナでの掘削地点,日程が決まった。ただし,現在円安が急激に進んでおり,当初予定がくより大幅な変化がみられている。現在これに関して調整中である。原生代の付加帯であり,非常に行くのが困難な,ケープスミス帯について,7月に調査を行う事ができた。かなり変形が進んでおり,地質帯の東側では当初の層序復元が困難であることがわかった。しかし,2017年度にはカナダ,ケープスミス地域への地質調査をカナダ地質調査所のWalter Bleeker博士との打ち合わせで決定した。西側はケープスミス帯の模式地でもあり,変形度が比較的緩いとされており,当時の海底層序復元には適している場所であると思われる。エジプトは7億年ごろと丁度雪玉地球事件の時代である。
腎不全におけるFetuin-Aのもたらす心、血管への影響とピスフォスフォネート

アデニン腎不全モデルラットは腎機能の低下に伴い血管石灰化が高度になり、Fetuin-Aの肝臓での産生が著しく低下した。しかし血中でのFetuin-Aの低下は非常に軽微であった。ここで我々はFetuinmineralcomplex(FMC)に注目し、各血清を遠心処理することで分離可能な血中FMCが、腎機能低下に伴い徐々に増加していることを、質量分析を用いることでつきとめた。腎不全における血管石灰化に対して血中FMCは重要な役割を果たしていることが予想され、引き続き石灰化とFMCの関係を明らかにすべく、アデニンラットにalendronateによる治療介入を行った。すると治療群では有意に血管石灰化が改善したが、肝臓でのfetuin-Aの産生も血中のtotalfetuin-A濃度にも差を認めなかった。しかし治療群においては、血清中のtotalfetuin-AのうちFMCの占める割合は非治療群に比し著しく減少していた。つまり血管石灰化ストレス下では、血中のFeuin-Aは石灰化の担体であるCa,リン,Mgを取り込むことでFMCを形成し血管石灰化に対して保護的に働いている可能性が示された。腎不全のヒト血清においても、ラットと同様の方法でFMCを分離することに我々は成功した。さらにELISAによる血中Fetuin-A濃度の検討では血清を遠心することで濃度が有意に低下しており、ヒトELISAkitはFMCとそれ以外のfreeのFetuin-Aをともに測定していることが分かった。約100名の保存期糖尿病性腎症の患者では、冠状動脈石灰化指数は、totalfetuin-Aの濃度とは全く有意な関係はなかったが、FMCとは有意な正の相関、freefetuin-A濃度とは有意な負の相関関係があった。このことより、fetuin-Aの存在様式をみることで、血管石灰化ストレスを評価できることが示唆された。以下の事項を確認した。1.正常ラット肝臓でmRNAおよびproteinレベルでfetuin-Aが発現している。2.アデニン腎症ラットでは2week, 3week, 5weekでmRNA, proteinレベルで肝臓fetuin-Aの発現が経時的に減少している。3.von Kossa染色にて4weekまで血管石灰化認めず(2-3匹ずつで評価)。5weekは石灰化が認められた。4.血清fetuin-A濃度を測定するため、western blotを用いた。血清に含まれる免疫グロブリンとwesternで用いる2次抗体とのcross reactを避けるため、2次抗体としてintactな免疫グロブリンのみを認識するtrue blotを用いた。5.Western blotで血清の総fetuin-A濃度を評価したが、有意な低下は認めなかった(ごく軽度は減少している可能性あり。少なくとも肝臓での発現変化ほどの差は無い)6.rat血清を16000g 2hour遠心すると、Vitamin D中毒モデルで報告されているのと同様、アデニン腎症血清でpelletが認められた。これをSDS-PAGEにて展開したところ50-60kDaに2本のメジャーバンドを認め、同バンドを質量分析で解析したところAlbuminとFetuin-Aであることが確認できた。一方で血清の上清をfetuin-Aの抗体でwestern blottingすると正常ラットと比べ、アデニンラットではfetuin-Aが減少していた。以上のことから、腎不全モデルラットでは、freeのfetuinは減少しているが、CaやMgとfetuin-Aが構成するcomplex (fetuin-mineral complex)はむしろ増加していることが示唆された。また、石灰化が生じる前から、このcomplexが上昇していることから、このcomplexの上昇は石灰化ストレスに対して保護的に働いている可能性がある。

約100名の保存期糖尿病性腎症の患者では、冠状動脈石灰化指数は、totalfetuin-Aの濃度とは全く有意な関係はなかったが、FMCとは有意な正の相関、freefetuin-A濃度とは有意な負の相関関係があった。このことより、fetuin-Aの存在様式をみることで、血管石灰化ストレスを評価できることが示唆された。
自己細胞と吸収性ホリマーを用いた組織工学による、抗凝固を必要としない心臓人工弁の開発、基礎研究

実験動物として子犬を用い、大腿静脈を清潔化に採取し自己細胞の起源とした。通常の細胞培養手法を用いて単離された細胞の大量生産を行った。十分な細胞数を得た後、生分解性ポリマーにin vitroで播種し吸収性ポリマー上での培養を約一週間継続した。その後、細胞を採取した同一の動物に対して移植手術を行った。移植前日にホリマー上の細胞に対して蛍光色素を用いた細胞の追跡用マーキングを行い播種された細胞と自己細胞との鑑別を試みている。移植3-12ヶ月後に作成された組織に対して生化学的、生力学的、免疫組織学的検討を行う予定である。生化学検査として、組織中コラーゲン、エラスチン、カルシウム濃度の測定を行い、インストロン張力検査機を用いて作成された組織の最大張力を測定し自己の同じ部位の組織と比較検討する。組織学的には免疫染色の手法を用いて内皮細胞の指標である第八因子を染色すると共に細胞間隙の間質蛋白質を染色し自己組織と比較検討する。実験モデルとして肺動脈弁全置換モデルを使用し、人工心肺による体外循環下に肺動脈弁全置換を行った。現在、動物は生存しており、遠隔期に犠牲死させて、以上の評価を行う。同種細胞(allogenic)は拒絶反応の因子を排除できないため、細胞は全て自己(autologous)細胞を用いた。十分な細胞数を得た後、生分解性ポリマーにin vitroで播種しポリマー上での培養を約一週間継続した。移植前日にポリマー上の細胞に対して蛍光色素を用いた細胞の追跡用マーキングを行い播種された細胞と自己細胞との鑑別を試みている。実験モデルとして肺動脈弁全置換モデルを使用し、人工心肺による体外循環下に弁置換を行う。現在は細胞播種の段階で、今後実際に移植することになる。同種細胞(allogenic)は拒絶反応の因子を排除できないため、細胞は全て自己(autologous)細胞を用いる。
ドパミン系とグルタミン酸系との調節因子ＤＡＲＰＰのコントローラーＰｉｎ１の解析

統合失調症関連因子DARPP-32はフォスファターゼ1(PP1)の脱リン酸化活性およびプロテインキナーゼA (PKA)の活性化の抑制をリン酸化依存的に行っているが、そのリン酸化レベルの調節はドパミン刺激、グルタミン酸刺激によって拮抗的に調節されている。本研究ではDARPP-32がリン酸化依存的にPin1によってプロリン残基の異性化を受け、PP1/PKAに対する抑制活性が調節されていると予想し、リコンビナントタンパク質を用いた生化学的解析を進めている。また、in silico解析により細胞内シグナルカスケードにおけるDARPP-32,Pin1が相互作用する相手の因子の探索を行った。統合失調症発症の原因として中枢神経系の伝達物質の観点からドパミンおよびグルタミン酸を介したシグナル伝達系の異常が提唱されている。DARPP-32は蛋白質フォスファターゼ1(PP1)の脱リン酸化活性の抑制およびプロテインキナーゼA (PKA)の活性化の抑制をリン酸化依存的に行っているが、そのリン酸化レベルの調節はドパミン刺激、グルタミン酸刺激によって拮抗的に調節されている。DARPP-32には四ヶ所(T34, T75, S97, S130)のリン酸化サイトが存在し、T34, T75のリン酸化はそれぞれPP1, PKAの阻害に関与しておりS97,S130はT34, T75のリン酸化-脱リン酸化を調節しているものと考えられている。このようにDARPP-32はドパミン、グルタミン酸両経路の下流にあって双方のシグナルを集約してキナーゼ・フォスファターゼへとシグナルを伝達する脳内因子である。DARPP-32は統合失調症との関連において検討されており、我々も統合失調症患者死後脳サンプルを用いてDARPP-32, PP2B (DARPPを脱リン酸化する)の脳内における分布の解析をおこなっている(Kuniiら2011 a, Kuniiら2011 b, Nishiuraら2011, Wada, Hinoら2012)。Pin1はペプチジルプロリルーシストランスイソメラーゼの一種で基質蛋白質のセリンスレオニン残基のリン酸化に依存して異性化を行う蛋白質である。本研究ではPin1がリン酸化依存的にDARPP-32を異性化する可能性について解析を行なっている。現在は生化学的解析のためDARPP-32、Pin1のコンストラクトを作成し、リコンビナント蛋白質の発現を行なっている。同時にin silico解析をすすめ、DARPP-32上の予想されるPin1結合部位の配列解析を行った。DARPP-32は統合失調症との関連において検討されており、我々も統合失調症患者死後脳サンプルを用いてDARPP-32の脳内における分布の解析をおこなっている。Pin1はプロリルイソメラーゼの一種で、ー(リン酸化-Ser/Thr)ー(Pro)ー配列を特異的に認識し異性化する酵素である。これはMAPKやCDKファミリーのコンセンサス配列であることからPin1はこれらのキナーゼと協調してシグナル伝達に関与していると考えられている。

脳・神経組織における機能としてはPin1は樹状突起スパイン、突起幹に存在し、グルタミン酸作動性シグナル伝達により誘導されるタンパク質合成を抑制的に調節することで長期記憶形成に関与している。本研究ではDARPP-32がリン酸化依存的にPin1によってプロリン残基の異性化を受け、PP1/PKAに対する抑制活性が調節されていると予想しこの仮説のもとに統合失調症発症メカニズムにおけるDARPP-32の役割をPin1の視点から解析する。現在までに生化学的解析用のリコンビナントタンパク質発現コンストラクトを作成している。また、in silico解析を進めており、DARPP-32上のPin1結合部位の配列予想や細胞内シグナルカスケードにおけるDARPP-32, Pin1が相互作用する相手の因子の探索を行っている。統合失調症発症の原因として中枢神経系の伝達物質の観点からドパミンおよびグルタミン酸を介したシグナル伝達系の異常が提唱されている。DARPP-32はプロテインフォスファターゼ1(PP1)の脱リン酸化活性の抑制およびプロテインキナーゼA (PKA)の活性化の抑制をリン酸化依存的に行っているが、そのリン酸化レベルの調節はドパミン刺激、グルタミン酸刺激によって拮抗的に調節されている。DARPP-32は統合失調症との関連において検討されており、我々も統合失調症患者死後脳サンプルを用いてDARPP-32の脳内における分布の解析を行っている。Pin1はプロリルイソメラーゼの一種で、-(リン酸化-Ser/Thr)-(Pro)-配列を特異的に認識し異性化する酵素である。これはMAPKファミリーやCDKファミリーによるリン酸化のコンセンサス配列であることからPin1はこれらのキナーゼと協調してシグナル伝達に関与していると考えられている。本研究ではDARPP-32がリン酸化依存的にPin1によってプロリン残基の異性化を受け、PP1/PKAに対する抑制活性が調節されていると予想し、この仮説のもとに統合失調症発症メカニズムにおけるDARPP-32の役割をPin1の視点から解析する。現在までに生化学的解析のリコンビナントタンパク質発現コンストラクトを作成している。また、統合失調症患者死後脳内のPin1発現量の解析を行っている。また、in silico解析を進めており、DARPP-32上のPin1結合部位の配列予想や細胞内シグナルカスケードにおけるDARPP-32,Pin1が相互作用する相手の因子の探索を行っている。統合失調症関連因子DARPP-32はフォスファターゼ1(PP1)の脱リン酸化活性およびプロテインキナーゼA (PKA)の活性化の抑制をリン酸化依存的に行っているが、そのリン酸化レベルの調節はドパミン刺激、グルタミン酸刺激によって拮抗的に調節されている。本研究ではDARPP-32がリン酸化依存的にPin1によってプロリン残基の異性化を受け、PP1/PKAに対する抑制活性が調節されていると予想し、リコンビナントタンパク質を用いた生化学的解析を進めている。また、in silico解析により細胞内シグナルカスケードにおけるDARPP-32,Pin1が相互作用する相手の因子の探索を行った。
HBZ特異的CTLの作製とその機能評価

新たな抗HTLV-1療法の開発の為にHBZ抗原を発現するrecombinant vaccine virus (rVV)を用いて特異的CTLを誘導し、機能評価を行った。そのrVVを接種したマウスではHBZ特異的CTLの誘導が確認され、そのCTLはHBZ発現細胞に対して細胞障害機能を有していた。それらの結果はRhesus macaqueにrVVを接種した際も観察された。それらのHBZ特異的CTLはHBZ157-176ペプチドに反応した。HBZ157-176はin vitroでCD8T細胞からHBZ特異的CTLを誘導した。この研究でHBZがHTLV-1療法の標的になりうることを示した。ヒトT細胞白血病ウイルス1型(human T-cell leukemia virus type1: HTLV-1)は長い潜伏期間の後に成人T細胞白血病(ATL)や慢性炎症性疾患を惹起する。日本ではHTLV-1キャリアは南九州を中心に108万人存在し、その約5%がATLを発症すると推定されている。これまでの研究で細胞の腫瘍化にはTaxとHBZ(HTLV-1 bZIP factor)が重要な役割を持つことが示唆されている。生体内でTax発現細胞は細胞障害性T細胞(CTL)の標的となり、排除される。HTLVー1の長期潜伏感染後、最終的にTax発現が低下した細胞がクローン性増殖し、ATLを発症すると考えられている。一方でHBZは恒常的に発現している。これまで成人T細胞白血病(ATL)に関する治療として血液幹細胞移植が一定の治療成績を上げてきたが、血液幹細胞移植は適応が限られており新たな治療法の確立が急務とされてきた。これまでにATLに対する新たな治療法としてはHTLVー1抗原であるTaxを用いた樹状細胞療法やATL細胞で発現が増加するケモカインレセプター(CCR4)に対するヒト化抗体療法などが開発されてきた。本研究では新たな標的治療としてHTLV-1抗原であるHBZを用いる。同じHTLVー1抗原であるTaxはATL患者の約半数で発現が消失している為に全例での治療効果を期待することは難しかった。一方でCCR4はTh2や制御性T細胞も同様に発現する為に生体への悪影響も懸念される。本研究では全ATL患者で発現が確認されるHBZをHTLV-1抗原として用いて、腫瘍免疫で重要な役割を持つ細胞傷害性T細胞(CTL)が認識するHBZ epitopeを探索することを目的としている。成人T細胞白血病(adult T cell leukemia: ATL)はヒトT細胞白血病ウイルス1型(Human T cell leukemia virus type1: HTLV-1)によって引き起こされ、キャリアの約5%がATLを発症すると推定されている。また、HTLV-1は慢性炎症性疾患(HAMやぶどう膜炎など)も惹起する。日本国内でのHTLV-1キャリアは約108万人と推定されており、多くが南九州を中心に存在する。生体内でHTLV-1は宿主の免疫応答を回避し、最終的にはクローン性増殖をした感染細胞によってATLが引き起こされることが想定されている。HTLV-1のウイルス蛋白の中でHBZ(HTLV-1 bZIP factor)は細胞の不死化に重要な役割を担うことが報告されている。また、他のHTLV-1蛋白と異なりHBZは感染細胞で恒常的に発現することが知られている。しかしながら、生体内でのHBZに対する免疫応答に関する報告は少ない。これまでATLの治療には化学療法や幹細胞移植などが行われてきた。最近では宿主免疫能を利用した樹状細胞療法やヒト化CCR4抗体(モガリズムマブ)による抗体療法などが行なわれている。本研究ではHBZに対する免疫応答を人工的に惹起する方法を開発することで新たな抗HTLVー1療法と予防法を示すことを目的としている。また、HBZをHTLV-1抗原として用いることでATLに対する腫瘍免疫に重要な役割を持つ細胞傷害性T細胞(CTL)やヘルパーT細胞が認識するHBZエピトープを探索する。これまでの研究で組換えワクシニアウイルスを用いた動物実験でHBZ特異的CTLが認識するepitopeの候補としてHBZ61-80、HBZ109-128、HBZ145-164、HBZ157-176を同定している。本年度は特にHBZ157-176に関する詳細な解析を行った。それらの候補ペプチドはHBZ免疫マウスでのCD8T細胞を活性化させた。次にそれらのペプチドによるCD4T細胞活性化の誘導能に関して調べた。HBZ発現ワクシニアウイルスを免疫したC57BL/6の脾細胞はCD8T細胞を除去後、それらの候補ペプチドで刺激した。