hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハマダラカFurrowedによるマラリア原虫認識メカニズム

ショウジョウバエを蚊の代替生物として用いることにより、蚊の体内における新規のマラリア原虫認識分子Furrowedの同定を行い、ハマダラカ中腸におけるパターン認識分子としてマラリア原虫排除因子として機能していることを明らかにした。また、吸血時に、腸内細菌数の一過性の急激な増加が起こることが明らかになり、これはFurrowedの発現上昇パターンと高い相関性を示し、ハマダラカにおけるマラリア原虫の排除には腸内細菌が関与している可能性が示唆された。本研究は、マラリアを「マラリア媒介蚊が有する寄生虫認識メカニズム」という着眼点から解析し、マラリア原虫-ハマダラカの相互作用の全体像を明らかにするものである。申請者は、ショウジョウバエを蚊の代替生物として用いることにより、蚊の体内における新規のマラリア原虫認識分子furrowedの同定に成功し、この遺伝子が蚊体内からのマラリア原虫の排除に働いていることを明らかにしてきた。本研究では、furrowed遺伝子産物が蚊の体内でどのようにマラリア原虫を認識し排除へと導くのか、その詳細を明らかにすることを目的として研究を行った。大腸菌によるタンパク質発現システムを用い、組換えハマダラカFurrowedタンパク質を回収、精製した。マラリア原虫感染マウスの血液を培養することにより、マラリア原虫オーキネートを回収・精製し、組換えFurrowedタンパクを添加した培地で培養後、ウエスタンブロット法により、Furrowedタンパクのマラリア原虫オーキネートに対する結合能の評価を行った。その結果、Furrowedタンパクの補体様ドメインがマラリア原虫に対して結合能を有することを明らかとした。また、抗Furrowedタンパクモノクローナル抗体を作製し、マラリア原虫感染時におけるFurrowedタンパクの発現変動を、免疫染色により解析した。その結果、Furrowedタンパクはマラリア原虫感染血液の吸血時に平常時と比較し数倍量発現上昇することが明らかとなった。以上の結果より、Furrowedはハマダラカにおけるマラリア原虫感染において、感染初期において直接的な原虫認識分子として機能することで、ハマダラカ体内からのマラリア原虫排除へと導いていることが示唆された。その結果、Furrowedはハマダラカ中腸におけるパターン認識分子としてマラリア原虫排除因子として機能していることを明らかにした。また、Furrowedの発現パターンの解析の結果、吸血時、一過性に急激な発現上昇が起きることが明らかになった。より詳細な解析の結果、ハマダラカ中腸において吸血時に腸内細菌数の一過性の急激な増加が起こることが明らかになった。また、この増加はFurrowedの発現上昇パターンと高い相関性を示すことが示唆された。以上の結果から、ハマダラカにおけるマラリア原虫の排除には腸内細菌が関与している可能性が示唆された。以上の結果より、ハマダラカ中腸内細菌とマラリア原虫の間には明らかな相互作用が存在することが明らかとなり、ベクター・病原体・腸内細菌の相関関係メカニズムを解析することは感染現象を理解するうえで、大きな知見をもたらすことが示唆された。
ポリコーム遺伝子群による細胞周期と細胞死のバランス調節機構

遺伝子発現の調節において、「発現維持調節因子」という、新しい概念による細胞のメモリー機構の解明を目的としている。細胞がいかにして,決定(コミットメント)された状態を維持しているのかを遺伝子レベルで問い掛けることを主眼としている。ポリコーム・グループ(PcG)遺伝子群は、クロマチン構造に作用し、いったん決定された遺伝子状態を維持していることが、主にDrosophilaの研究で明らかになってきた。そのメンバーはDrosophilaでも3040個存在すると考えられているが哺乳類ではまだ8個しか同定されていない。これらは細胞の多様な遺伝子発現制御のメモリー機構として作用しているが、今までは主にホメオボックス遺伝子群の制御がDrosophilaで研究されていたのみであった。最近、哺乳類のPcG遺伝子であるmel-18が直接c-mycを介して細胞周期を調節しているカスケードを発見した。さらにこのmel-18は、免疫グロブリンやリンパ球の抗原リセプターの遺伝子再構成、さらに細胞死(Apoptosis)をも制御していることが判明した。これらの遺伝子カスケードをトランスジェニクやノックアウトマウスを用いて解析・証明することを目的とした。現在までに、mel-18遺伝子が、(1)in vitroで、がん抑制遺伝子としての活性を持つこと、(2)c-myc遺伝子の発現を調節することにより、c-myc/cdc25カスケードを介してCyclin-CDK複合体の活性を制御し、細胞周期を調節していること、(3)BCL-2ファミリーの発現調節を介して細胞死・細胞生存を制御していること、等を明らかにしてきており、さらに詳細な検討を現在行っている。
精子品質管理の分子基盤：男性不妊治療戦略への挑戦的研究

Mieapはミトコンドリア品質管理機構に重要な役割を果たす。Mieap欠損マウスは、精子の運動能異常や形態異常を示す。そこで本研究においては、Mieapの精子形成及び成熟における役割を、網羅的プロテオーム解析と電子顕微鏡解析を行うことによって調べた。結果として、精子の形態異常はMieap欠損マウスの精巣上体頭部から尾部にかけて認められた。一方で、ある種のキナーゼや解糖系関連タンパク質の発現異常が、Mieap欠損マウスの精巣・精巣上体(頭部から尾部)において認められた。このことからMieapは精巣での精子形成過程において精子ミトコンドリアの品質管理に重要な役割を果たす可能性があると示唆された。本研究はMieapノックアウトマウスの解析から明らかとなった、Mieapのミトコンドリア品質管理機構の精子ミトコンドリア・酸化ストレス制御の役割について、そのメカニズムの詳細を明らかとし、ミトコンドリア由来酸化ストレスに起因する男性不妊に対する革新的な治療戦略を確立することにある。不妊は我が国の社会問題として深刻であるが、精子に起因する男性不妊の治療法はおろか、その病理も未解明のままである。本研究は、がん研究で新規同定されたミトコンドリア品質管理機構を制御する蛋白質Mieapが、予期せず精子運動能を明瞭に制御することを端緒とした萌芽的研究であり、精子無力症の分子病理にはじめて迫る可能性が極めて高く、精子におけるMieapの分子機能を明らかにするとともに、精子運動能改善という男性不妊の根本的な革新的治療戦略基盤を確立することを目的としている。今年度は研究実施計画に従って、精子におけるMieap相互作用分子の同定を試みた。野生型(WT)及びMieap欠損(KO)マウスの精子溶解液を用いて抗Mieap抗体によって免疫沈降実験を行った。沈降物に対して網羅的プロテオミクス解析を行っている。沈降物に対して網羅的プロテオミクス解析を行い、WT及びKOの2群間においてWTにおいてのみMieapとの結合が確認できた蛋白質を候補として抽出する事で、精子において特異的にMieapが結合する相互作用分子の特定を進めている。沈降物に対して網羅的プロテオミクス解析を進めている。当初の研究実施計画に従って、精子におけるMieap相互作用分子の探索を試みたが、精子において特異的にMieapが結合する相互作用分子の同定には至らなかった。そこで、野生型及びMieap欠損マウスの精巣・精巣上体頭部・精巣上体体部・精巣上体尾部のそれぞれから蛋白質を抽出し、網羅的なプロテオミクス解析によって2群間の比較検討を行った。興味深いことにある種のセリンスレオニンキナーゼや解糖系関連代謝酵素がMieap欠損マウスの精巣上体頭部・体部・尾部において発現レベルの有意な上昇を認めた。また複数の抗酸化物質がMieap欠損マウスの精巣・精巣上体頭部・精巣上体尾部での上昇傾向を示した。これらの結果は、Mieap欠損マウスにおける精子ミトコンドリア由来酸化ストレスの増加とそれによる精子運動能低下の原因に関連する変化と推察された。今後はこれら分子の関与についてさらに詳細な解析を進める予定である。当初計画では、精子のみを解析対象としていたが、その後のMieap KOマウスの解析から、精巣における精子の分化・成熟過程におけるMieap制御性ミトコンドリア品質管理機構の役割の重要性が示唆されるデータが得られたため、Mieap WT及びKOマウスの精巣全体を用いた蛋白抽出液に対する抗Mieap抗体による免疫沈降実験と沈降物に対する網羅的プロテオミクス解析を行うことを追加する。病理学解析対象を精子のみから精子及び精巣に拡大し、免疫沈降物に対する網羅的プロテオミクス解析を行うことになったためMieap WT及びKOマウスの精巣の蛋白抽出液を用いて抗Mieap抗体による免疫沈降実験を行い、網羅的プロテオミクス解析を行う。
転移形成に関わるがん微小環境の解明とその分子機構を標的とした治療法開発

Merm1やAggrusなど転移関連分子のがん微小環境による活性制御機構の解析とこれら分子を標的とした転移抑制剤開発を行なった。具体的には、(1)Merm1はがん抑制遺伝子p53の機能を抑制することで血管内のがん細胞の生存を促進し、その結果として転移形成を助長していることを見いだした。また、がん転移抑制遺伝子候補を複数同定することに成功した。また、(2)血小板ががん微小環境を構成する因子であり、血小板より放出されるPDGFをはじめとする増殖因子ががん細胞の増殖を促進していること、これら血小板を凝集させるAggrusを標的とした阻害薬は抗腫瘍薬として有望であることが示唆された。転移性がん細胞は異常な運動能・接着能・細胞外基質の破壊能など様々な性質を兼ね備えているが、これに加え転移先臓器の微小環境ががんの転移巣形成に重要な役割を果たしていることが知られている。本研究課題では、研究代表者が有している血行性転移モデルを用いたin vivoスクリーニングにより同定・命名したMerm1の解析を中心に、転移関連がん微小環境を解明し、その微小環境を制御するがん転移抑制剤開発につなげることを目標として研究を進めている。高転移性メラノーマ細胞より調製したcDNAライブラリーを低転移性CHO細胞に遺伝子導入し、この遺伝子導入細胞を尾静脈より移植した結果生じた肺転移結節を回収し、そこに含まれると予想されるがん転移促進分子を解析し同定された遺伝子がMerm1である。この遺伝子は多臓器障害を特徴とするウィリアムズ-ビューレン症候群で欠失している7番染色体の7q11.23上に載っている遺伝子であるが、疾患、特にがん化との関連は報告されていない。本年度、CHO細胞にMerm1を過剰発現させた細胞株を樹立しin vivoにおけるがん転移促進活性を検討した結果、Merm1発現に伴い、肺や肝臓などへの血行性転移が促進されることが確認された。さらに、Merm1の一次アミノ酸配列より類推されているメチルトランスフェラーゼ活性を欠失させた変異Merm1遺伝子を作製し、同様にCHO細胞に高発現させたが、この変異Merm1遺伝子導入細胞株にはがん転移促進活性が認められなかった。また、組織アレイを用いてMerml1発現腫瘍の探索を行なった結果、浸潤能が高い浸潤性乳管癌においてMerm1の発現が高いという正の相関が認められた。よって、Merm1のメチルトランスフェラーゼ関連活性が、何らかの形でMerm1のがん転移促進能に関わっていることが示唆された。転移性がん細胞は異常な運動能・接着能・細胞外基質の破壊能など様々な性質を兼ね備えているが、これに加え転移先臓器の微小環境変化も転移形成に重要な役割を果たしているため、がん微小環境を標的にした抗転移薬の開発も進められつつある。研究代表者らは、高転移細胞株より調製したcDNAライブラリーを低転移細胞に遺伝子導入し、その細胞をin vivoでスクリーニングすることにより、新規がん転移促進遺伝子Merm1をクローニングすることに成功した。Merm1遺伝子は、がん微小環境により誘導されるがん細胞の細胞死を抑制することによりがん転移を促進することがこれまでに明らかとなっている。Merm1を標的にしたがん分子標的治療薬の創成の為に、まず対象となるがん腫の検索を行なった。ヒト腫瘍cDNAアレイを用いて網羅的に検索した結果、これまで見いだしていた乳管がんだけでなく、メラノーマでもMerm1が過剰発現していることを見いだした。公的細胞バンクより入手したメラノーマ細胞株でもMerm1過剰発現を確認した。また、市販のメラノーマ組織アレイを用いてMerm1発現を免疫組織化学的に検討した結果、Merm1高発現をメラノーマ臨床サンプルでも確認することができた。またMerm1の機能解明に向けて、shRNAを用いたMerm1発現抑制メラノーマ細胞株の樹立を行なった。また、Merm1の発現制御機構の解析のため、Merm1遺伝子のプロモーター部位約2500bpをクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子上流につないだレポーターコンストラクトの作製を行なった。Deletion mutantを作製することで、Merm1遺伝子転写に関わるcis-elementの同定に成功した。このcis-elementに結合する転写因子は、Merm1発現が低下している細胞株で減少しているものが含まれており、この転写因子がメラノーマにおけるMerm1発現に深く関与していることが示唆された。研究代表者はこれまでに、新規がん転移促進遺伝子であるPodoplanin/AggrusとMerm1などを同定してきた。Podoplaninは血小板凝集促進因子であり、その血小板上の受容体であるCLEC-2と結合することにより血小板凝集を誘導し、血管内における腫瘍塊の形成促進ならびに免疫担当細胞からの攻撃の回避によりがんの血行性転移を促進する。Podoplaninの機能を阻害して血小板凝集を阻害する中和抗体の作製に成功した。

担がんマウスモデルに本中和抗体を投与すると、当初の目的である血行性転移の阻害だけでなく、Podoplanin陽性がん細胞のin vivoにおける増殖を抑制した。その作用機作として、抗体自身のADCC活性に加え、血小板凝集時に放出される血小板からの増殖因子の減少が原因であることを明らかにした。また、PodoplaninとCLEC-2の結合を阻害する低分子化合物のスクリーニングに成功しており、その誘導体を100種類以上合成した。以上の成果は、血小板との相互作用並びに血小板を含む微小環境が、腫瘍の転移や増殖に関与していることを示唆している。Merm1は、微小環境下でのがんの細胞死を抑制することで、がん転移を促進する。Merm1の発現制御機構の検討を行うために、Merm1遺伝子のプロモーター部位をルシフェラーゼ遺伝子上流につないだレポーターコンストラクトを作製した。部位欠失変異体を多数作製することにより、Merm1発現に必須なシスエレメントの同定に成功し、そのシスエレメント周辺に存在するMerm1遺伝子発現に関わる新たな転写関連因子の同定に成功した。また、LC-MS/MSによる分析の結果、Merm1に結合する複数のタンパク質の同定に成功した。以上の成果は、Merm1の機能を阻害するための新たな分子標的(転写因子ならびに相互作用分子)が同定できたことを示唆している。研究代表者らはこれまでに、独自の転移モデル系を用いることで、新規がん転移関連遺伝子(PodoplaninやMerm1など)を同定してきた。そこで本年度は、(1)宿主微小環境を構成する血小板が、がんの増殖・転移をどのように促進しているのか、その分子機構の解析を行なった。血小板凝集促進因子Podoplaninを発現しているがん細胞を用いて検討した結果、血小板凝集を引き金として血小板よりPDGFが放出され、そのPDGFが腫瘍増殖を促進していることを見出した。しかし、PDGF受容体阻害剤あるいはその下流のAkt阻害剤では、血小板凝集を引き金とする腫瘍増殖を十分に抑制できず、血小板凝集時に放出される他の増殖因子も腫瘍増殖に関わっている可能性が示唆された。よって、血小板凝集自体を阻害することが腫瘍増殖の抑制にはより効果的である可能性が示唆された。これまでにスクリーニングして得られたPodoplanin阻害低分子化合物を元に合成展開を行うことで、これまでとほぼ同じ活性を示す6種類のヒット化合物を取得することに成功した。(2)Merm1のプロモーター部位に、p53/p73ファミリー転写因子が結合するコンセンサス配列が存在したため、p53/p73ファミリー転写因子によるMerm1発現制御の可能性を検討した。残念なことに、p53阻害剤の結果とレポータを用いた検討結果が一致せず、Merm1阻害剤候補としてのp53阻害剤の更なる検討は断念した。Merm1の出芽酵母ホモログであるBud23がリボソーム合成に関わるとの報告が最近なされたことから、Merm1との相互作用因子を質量分析計で解析したと。
ペプチドグリカンに共有結合したポリアミンの生理機能に関する研究

本研究代表者は上記研究課題について、Veillonella alcalescens及びSelenomonas ruminantiumを用いて研究し、次の事実を明らかにした。V.alcalescensは、本来、その生育にスペルミジンではなく、カダベリンもしくはプトレシンを絶対的に要求することが知られていたが、スペルミジンなどの合成の基質として要求されるのか、カダベリン,プトレシンそのものが特異的に生理的役割を演じているのかは未知であった。放射能標識カダベリン及びプトレシンの本菌における取り込み実験から、菌体に取り込まれた上記ポリアミンの全てがペプチドグリカン画分に取り込まれ、化学構造解析の結果、そのままの形でペプチドグリカンに共有結合し、その構成成分になっていることが明らかになった。添加するカダベリンの分子数を制限して本菌を生育させ、生育度とペプチドグリカン中のカダベリンの分子数を対比すると、正常な菌でカダベリンが飽和された状態では、1個の細胞に7.2×【10^5】分子のカダベリンがペプチドグリカンに共有結合している。これが1×【10^5】分子に減少すると、菌の生育阻害が見られる。さらに2.8×【10^4】分子以下になると、菌の生育はほとんど不可能になる。すなわち、ペプチドグリカンのD-グルタミン酸残基がカダベリンで40%以上飽和されていると、正常な生育が可能となる。6.4×【10^4】分子以下のカダベリンがペプチドグリカンに結合している菌をカダベリンもしくはプトレシン欠損条件下にしておくとS.ruminantiumにおけるジフルオロメチルリジン処理菌と同様に異常形態及び異常細胞分裂面が観察される。以上の実験結果から、異常な細胞分裂はペプチドグリカンへのカダベリンもしくはプトレシンの供給が断たれ、ポリアミン欠損ペプチドグリカンが合成されたために起ったことに起因していると結論された。
RC造建築物の室内乾燥による力学特性変化の実証

鉄筋コンクリート造構造物は,一般的な環境においても乾燥が進み,強度・剛性(力学特性)の経時変化が生じる。しかし,その力学特性変化に関する知見は乏しく,それを考慮していない現行の耐震設計法に基づく建物は想定し得ないリスクを内在している。そこで,本研究では,乾燥の有無をパラメータとした大規模骨組みの静的載荷実験を実施し,取得データをもとに,建物の剛性や降伏点変化のメカニズムを数値解析により解釈し,乾燥がRC造架構の力学特性変化に与える影響を定量的に把握する。本研究は、乾燥の有無をパラメータとした、鉄筋コンクリート大規模骨組みの静的載荷実験によって、乾燥が建物へ与える力学特性の変化を抽出し、地震応答時に鉄筋コンクリート造架構が受け得る乾燥を考慮した変形と偏心のメカニズムを解明し、リスクを明らかにするものである。更に、部材形状、鉄筋比、部材間の剛性比及び収縮ひび割れ箇所が架構の剛性と耐力に及ぼす影響を評価する。鉄筋コンクリート造建物の乾燥による経時的な力学特性変化は、建物の耐震安全性評価において地震応答変形量に大きな影響を与える可能性があるが、定量的データは乏しい。本研究は、そのデータを収集評価することにより、乾燥のリスクを考慮していない現行の耐震設計法の改良への道筋をつけるものである。
高エネルギーギャップ混晶半導体の光電物性の研究

光電物性を評価するための高エネルギーギャップ混晶半導体結晶の作製条件、結晶性、伝導型制御性、ヘテロ界面および表面モルフォロジー等の検討を行なった。MOVPE法によりAlGaN三者混晶をサファイヤおよびSi基板上に、又LPE法によりInGaAsP四元混晶をGaAs基板上にエピタキシャル成長させることに成功した。1.MOVPE法によりサファイヤ(0001)面およびSi(111)面上にAl×【Ga_(1-x)】N膜の結晶成長を行なった。有機金属化合物とN【H_3】との寄生反応を抑制することにより、Alx【Ga_(1-x)】N膜の組成はTMGおよびTMAの供給量比によってほぼ完全に制御できた。気相一固相分配関係を実験的に求め、Alの分配係数が約1であることを見出した。サファイヤ上では基板温度1020°Cで、Si基板上では1050°Cでx=0.4まで単結晶が得られた。格子定数Cの組成に対する依存性はVegard則に従った。又、電子濃度はxの増加に従って減少する傾向を示したが、その移動は4089【cm^2】/V・Sの程度でほぼ一定となった。なお、ホール測定には補助金により購入した電磁石を使用した。2.二相溶液法を用いたLPE法により、GaAs(100)面上にInx【Ga_(1-x)】Asy【P_(1-y)】(0<y<0.55)の成長が再現性よく行なえることを確かめた。混合不安定領域内の組成であっても、短時間(数秒程度)成長によりエピタキシャル成長が可能であることが判明した。この理由は、成長層が基板と格子整合しているため、固液界面でのスピノーダル分解が抑制されたことによることが示唆された。しかしこの安定化の効果は短時間(数秒程度)しか作用せず、時間とともに結晶性、表面形態等が悪化した。又、混合不安定領域の中心に近い組成ほど、速く悪化することが分かった。悪化の原因は、固液界面で時間とともにスピノーダル分解が除々に進行していくためであると推測される。
視聴覚刺激を用いた時空間知覚表象の体制化に関する研究

視聴覚刺激の呈示時間パターンが,その空間パターンの知覚に影響するかを心理実験で確かめた。その結果,時間パターンが変わると,同じ位置から呈示されている音の定位位置が変化することが分かった。これは,時空間情報に相互交換作用が生じることを示している。さらに,聴覚刺激と視覚刺激とで,その傾向は似ているものの,定量的なモデルは異なることが分かった。これは,モダリティに特有の時空間知覚表象の体制化過程が存在することを示している。本研究の目的は聴覚と視覚の時空間知覚表象の統合過程を明らかにすることである。21年度は,19個のスピーカを円弧上に2.5°間隔で配置したスピーカアレイを作成し,マルチチャンネルのオーディオボードを搭載したPCですべてのスピーカを完全に同期して制御可能か刺激呈示装置を構築した。さらにLEDを各スピーカに取り付け,同じオーディオボードからの出力で明滅させることで,視聴覚刺激の同期呈示を可能にした。この装置を使って,三つの短音を継時的に異なるスピーカから呈示し,これらの音の空間パターンが呈示時間間隔によってどのように変化するのかを確かめた。その結果,短い時間間隔で呈示された音の間の距離が長い時間間隔で呈示された音の間の距離よりも短く感じられる現象を発見した。これは,すでに他のモダリティにおいて知られている時空間情報の相互作用(Tau効果)と効果の方向としては同様の傾向を示しているが,効果の生じる条件において他のモダリティとは異なった傾向を新たに発見した。この現象の生じる原因を探るために,三つの短音の空間定位位置を測定したところ,ある音の時間的前後両方に音を呈示することでその音の定位位置が変化することを発見した。ただし,この実験についてはまだデータが少なく22年度にも継続して実験を続ける必要がある。平行して,視聴覚刺激を同時,もしくは継時的に呈示した時のクロスモーダルた時空間パターン表象の測定を行うための予備宝験を開始した。先の実験で明らかになった時空間情報の相互作用における視覚と聴覚の違いをうまく活用することで,マルチモーダルな時空間マップの形成過程を記述できると考えている。本研究の目的は,視聴覚の時空間知覚表象の統合過程を明らかにすることである。22年度は,21年度の研究で発見した,短い時間間隔で呈示された音の間の距離が,長い時間間隔で呈示された音の間の距離よりも短く感じられる知覚現象(聴覚におけるTau効果)が生起する原因を探るために,刺激音の定位位置を定量的に測定する実験を行った。その結果,ある音の時間的前後両方に異なる方向からの音が存在する場合に,その音の定位位置が三つの音の呈示時間パターンによって5゚程度左右にずれることが分かった。このずれの角度は,聴覚におけるTau効果の効果量をうまく説明しており,Tau効果はこの定位誤差によって生じていると考えられる。これまで視覚をはじめとする他の感覚様相における時空間情報の統合は,高次の知覚過程において生じると考えられてきた。上記の結果は,聴覚においては,比較的低次の知覚過程で形成される音の定位知覚に時間パターンが影響することを示しており,視覚と聴覚とでは異なる時空間統合がなされている可能性がある。さらに,時間パターンの知覚的なまとまりの強度を操作した刺激パターンを用いて,知覚される空間パターンおよび個々の刺激の定位位置を心理実験によって測定した。その結果,時間パターンの知覚的なまとまりが弱くなってもTau効果の生じる効果量がほとんど変化しないことが分かった。この結果から,聴覚におけるTau効果が非常にロバストな現象であることも分かった。23年度には,視聴覚におけるTau効果の生じ方の違いを手がかりに,マルチモーダルな時空間統合過程の解明を目指す。本年度は,昨年度まで検討していた聴覚におけるTau効果が,視覚におけるTau効果と同様の現れ方であるのかを検討するために,聴覚実験で用いたスピーカアレイの上にLEDを設置し,聴覚実験と同じ条件で視覚におけるTau効果の測定を行った。その結果,特に視覚刺激の偏心度が大きくなった場合に異なる傾向が現れた。この原因を解明するために,周辺視野における聴覚刺激,視覚刺激それぞれの定位位置と視聴覚刺激の相対的な位置関係を実験によって測定したところ,視聴覚刺激を全く同じ場所から呈示しているにもかかわらず,定位位置が異なって知覚されていることが分かった。さらに,刺激の偏心度によらず,定位位置の違いを示す主観的等価値がほぼ一定の値を示しており,周辺視野においては,視覚空間と聴覚空間との間にある一定(約5度)のずれが生じることが分かった(視聴覚定位不斉)。この結果は,視野の周辺方向での視聴覚空間知覚を議論する際に,正面方向で多く行われているこれまでの研究成果をそのまま適応することが危険であることを示唆する重要な知見である。

ただし,Tau効果に現れた時空間パターンの知覚様相の違いは,この視聴覚定位不斉だけでは説明できないものであり,時空間パターンを統合する際に,視覚と聴覚それぞれでモダリティに固有の知覚的体制化過程が存在することを示している。本課題から得られた,聴覚,視覚それぞれにおける時空間知覚表象の体制化と,それらの違いに関する成果は,異なる時空間体制化を行っている二つのモダリティの知覚表象の統合過程の解明の基礎となる貴重な知見であるといえる。
iPS細胞の分化パターンによる頭蓋縫合早期癒合症の分類と病態メカニズム解明

頭蓋縫合早期癒合症には症候群性と非症候群性を併せて約60の遺伝子に原因となる変異が報告されているが、頭蓋縫合早期癒合症全体の20%程度の症例を説明するにすぎず、また、環境要因が関与する割合も明らかでない。病態としては、骨芽細胞の分化亢進と考えられているが、症候群ごと、すなわち遺伝的要因が明らかになっている頭蓋縫合早期癒合症で特徴的な表現型があることから、この分化亢進にはパターンがあると考えられる。病態推移の予測が可能になると、治療方針が立案しやすいだけでなく、新規治療の開発も行いやすくなる。現在、遺伝的要因にのみで患者を分類することが不可能であることから、骨芽細胞分化マーカーの発現パターンによって頭蓋縫合早期癒合症の分類ができるのではないかと考えるにいたった。しかしながら、頭蓋冠骨においては、その骨芽細胞は年齢とともに骨化能力が変化することが知られており、患者由来の骨芽細胞間および正常骨芽細胞での骨芽細胞分化マーカーの発現パターンを比較するのは困難であると考えられる。iPS細胞は、その由来する体細胞組織に特徴的なエピジェネティクス状態を維持し、それゆえ由来する元の組織の細胞へと分化しやすいことが報告されている。この特徴を利用し、患者頭蓋冠骨芽細胞をiPS細胞化して未分化状態へと誘導してから骨芽細胞へと再分化させる系を確立して骨芽細胞分化マーカーの発現パターンを比較し、患者を分類する。連携医療機関にて採取した頭蓋骨手術切削片より骨芽細胞を単離法を確立した。症候群性の癒合症患者由来骨芽細胞間および正常骨芽細胞での骨芽細胞分化マーカーの発現パターンの比較を行った結果、群間での骨芽細胞分化マーカーの発現量に優位に差を認めた。iPS細胞の樹立作業も並行して行っている。各施設での倫理審査を受け、検体の採取が開始された。検体から骨芽細胞の単離も行われており、それと並行してiPS細胞樹立作業を行っている。また、エピジェネティクス状態を解析するための条件設定を行っている。対照群および疾患患者頭蓋骨由来の骨芽細胞よりiPS細胞を樹立し、骨芽細胞へと再分化させる系を確立する。再分化させた骨芽細胞において骨分化マーカーの定量的解析を行う。ポリロタキサン(PRX)などの生体材料による患者の骨芽細胞分化の制御の評価も検討する。平成29年度は、頭蓋縫合早期癒合症患者の骨芽細胞を分離するための、外科手術時におけるヒト頭蓋冠骨の取得のシステムの確立を試みた。分担研究者の機関のみならず、複数の機関から協力が得られることとなった。ヒト頭蓋冠骨からの骨芽細胞分離について、安定した方法の確立を検討した。通法として提唱されている、骨片周囲の軟組織除去を目的とした酵素処理後、再度酵素処理して回収された細胞と静置した骨片から遊走した細胞を比較した。前者の方法で回収した細胞は細胞増殖活性が非常に低く、後者の方法で回収した細胞は石灰化誘導培地によって石灰化が誘導されたことから、後者の方法で骨芽細胞を分離することとした。マウス初代骨芽細胞の分離法を習得し、頭蓋縫合早期癒合症のモデルマウスの頭蓋冠から初代骨芽細胞の分離法を安定させた。ヒト頭蓋縫合早期癒合症の原因となる変異が同定された遺伝子群、ASXL1、CDC45、COLEC11、EFNB1、ERF、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IHH、IL11RA、MEGF8、MSX2、POR、RAB23、RUNX2、AKI、TCF12、TWIST1、WDR35、ZIC1について、マウスオーソログ遺伝子の発現を、分離したマウス初代骨芽細胞で検討を開始した。頭蓋縫合早期癒合症モデルマウス由来の初代骨芽細胞の分化段階において、原因となっている複数の遺伝子の発現レベルが野生型マウス由来の初代骨芽細胞と異なる結果が得られ、遺伝子発現レベルによって頭蓋縫合早期癒合症骨芽細胞の分類ができる可能性が示唆された。複数の施設でヒト由来の標本を扱うことから、連携がうまく取れていない部分があったが、昨年度中にその問題は解決したため、今年度の実施には影響はない予定である。

この特徴を利用し、患者頭蓋冠骨芽細胞をiPS細胞化して未分化状態へと誘導してから骨芽細胞へと再分化させる系を確立して骨芽細胞分化マーカーの発現パターンを比較し、患者を分類する。連携医療機関にて採取した頭蓋骨手術切削片より骨芽細胞を単離法を確立した。症候群性の癒合症患者由来骨芽細胞間および正常骨芽細胞での骨芽細胞分化マーカーの発現パターンの比較を行った結果、群間での骨芽細胞分化マーカーの発現量に優位に差を認めた。iPS細胞の樹立作業も並行して行っている。各施設での倫理審査を受け、検体の採取が開始された。検体から骨芽細胞の単離も行われており、それと並行してiPS細胞樹立作業を行っている。また、エピジェネティクス状態を解析するための条件設定を行っている。昨年度中に安定に標本が取得できるシステムを構築したので、今年度はヒト骨芽細胞を中心に実験を行う予定である。また、協力機関が増加したことで頭蓋縫合早期癒合症でない患者の骨片が取得できることとなったため、iPS細胞の作製よりも、初代骨芽細胞で実験を行う可能性を検討することとしている。頭蓋縫合早期癒合症の遺伝子原因が判明している患者および判明していない患者、および頭蓋縫合早期癒合症ではない(骨折など)患者の骨芽細胞で関連遺伝子の発現レベルを、なるべく由来患者の年齢が近いもので比較する。この比較により、原因遺伝子が不明な患者骨芽細胞が、原因遺伝子が明らかになっている患者骨芽細胞との関連遺伝子の発現パターンの関連性を明らかにし、患者分類への応用を検討する。さらにこの比較の中で、原因遺伝子が不明であり、かつ原因が判明している患者由来の骨芽細胞と同様もしくは大きく異なる遺伝子発現パターンを示す骨芽細胞を用いてChiP-Seqを行ない、頭蓋縫合早期癒合症の骨芽細胞に特異的なエピジェネティクス状態や遺伝子発現を明らかにする。対照群および疾患患者頭蓋骨由来の骨芽細胞よりiPS細胞を樹立し、骨芽細胞へと再分化させる系を確立する。再分化させた骨芽細胞において骨分化マーカーの定量的解析を行う。ポリロタキサン(PRX)などの生体材料による患者の骨芽細胞分化の制御の評価も検討する。
ヒト生体での耳小骨振動実測値に基づく骨導聴覚伝達経路の解明

本研究の主な目的は以下の3項目である.(1)気導音に対する耳小骨振動の解析結果を基に,骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測を実施し,骨導刺激による頭骨や軟組織の振動がどのように内耳を刺激しているのかを明らかにする.(2)気導加振の解析で用いた耳小骨振動モデルを骨導加振に対応できるように拡張してシミュレーションを行い,振動計測では得られない骨導刺激の蝸牛への伝達力を明らかにする.(3)生体での計測結果とあわせて骨導刺激の伝達経路を明らかにする.本年度は,主に上記(2)を実施した.骨導加振に対する耳小骨および耳小骨周辺の側頭骨の振動解析は,鼓膜の音圧加振入力が蝸牛に伝達される特性を明らかにするために作成した鼓膜および耳小骨の振動モデルに頭骨モデルを追加し,骨導加振に対する耳小骨および耳小骨周辺の側頭骨の振動をシミュレーションにより解析した.この結果,骨導による加振力が耳小骨を振動させていることが明らかとなり,耳小骨を介して蝸牛に伝達される加振力を求めることができた.上記(1)のヒト生体での振動計測は,本年度より鳥取大学医学部倫理委員会の審査方法が大きく変更され,より厳密な審査に対応するための準備に時間を要した.次年度に申請を行い予定通り振動計測を実施する.今後は,上記(2)で得られたシミュレーション結果を,上記(1)の実測結果と比較検討し,計算モデルの精度を随時向上させるとともに,数値計算結果から得られた知見をもとにヒト生体での計測箇所の検討も行い,より有効な骨導補聴器開発への指針を得られるよう骨導刺激の伝達経路を明らかにする予定である.本研究の主な目的は,(1)骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測,(2)耳小骨振動モデルを用いたシミュレーションによる骨導刺激の蝸牛への伝達力推定,(3)骨導刺激の蝸牛への伝達経路解析,である.この中で,(2)は現時点で十分な成果が得られており,次年度に成果を公表する予定である.(1)は倫理審査方法の変更で準備に時間を要したが,次年度実施にむけて進めている.初年度の実施状況に基づき,引き続き耳小骨振動モデルを用いたシミュレーションを実施するとともに,骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測を実施する.シミュレーション結果を実測結果と比較検討し,計算モデルの精度を随時向上させるとともに,数値計算結果から得られた知見をもとにヒト生体での計測箇所の検討を行い,ヒト生体での実験の効率化を図るとともに実測個所を拡大し,骨導刺激の伝達経路を明らかにする予定である.本研究の主な目的は以下の3項目である.(1)気導音に対する耳小骨振動の解析結果を基に,骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測を実施し,骨導刺激による頭骨や軟組織の振動がどのように内耳を刺激しているのかを明らかにする.(2)気導加振の解析で用いた耳小骨振動モデルを骨導加振に対応できるように拡張してシミュレーションを行い,振動計測では得られない骨導刺激の蝸牛への伝達力を明らかにする.(3)生体での計測結果とあわせて骨導刺激の伝達経路を明らかにする.本年度は,主に上記(2)を実施した.骨導加振に対する耳小骨および耳小骨周辺の側頭骨の振動解析は,鼓膜の音圧加振入力が蝸牛に伝達される特性を明らかにするために作成した鼓膜および耳小骨の振動モデルに頭骨モデルを追加し,骨導加振に対する耳小骨および耳小骨周辺の側頭骨の振動をシミュレーションにより解析した.この結果,骨導による加振力が耳小骨を振動させていることが明らかとなり,耳小骨を介して蝸牛に伝達される加振力を求めることができた.上記(1)のヒト生体での振動計測は,本年度より鳥取大学医学部倫理委員会の審査方法が大きく変更され,より厳密な審査に対応するための準備に時間を要した.次年度に申請を行い予定通り振動計測を実施する.今後は,上記(2)で得られたシミュレーション結果を,上記(1)の実測結果と比較検討し,計算モデルの精度を随時向上させるとともに,数値計算結果から得られた知見をもとにヒト生体での計測箇所の検討も行い,より有効な骨導補聴器開発への指針を得られるよう骨導刺激の伝達経路を明らかにする予定である.本研究の主な目的は,(1)骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測,(2)耳小骨振動モデルを用いたシミュレーションによる骨導刺激の蝸牛への伝達力推定,(3)骨導刺激の蝸牛への伝達経路解析,である.この中で,(2)は現時点で十分な成果が得られており,次年度に成果を公表する予定である.

(1)は倫理審査方法の変更で準備に時間を要したが,次年度実施にむけて進めている.初年度の実施状況に基づき,引き続き耳小骨振動モデルを用いたシミュレーションを実施するとともに,骨導音に対するヒト生体での耳小骨,耳小骨周辺の側頭骨さらに蝸牛骨包の振動計測を実施する.シミュレーション結果を実測結果と比較検討し,計算モデルの精度を随時向上させるとともに,数値計算結果から得られた知見をもとにヒト生体での計測箇所の検討を行い,ヒト生体での実験の効率化を図るとともに実測個所を拡大し,骨導刺激の伝達経路を明らかにする予定である.本年度より鳥取大学医学部倫理委員会の審査方法が大きく変更され,計画段階では必要なかった審査に関わる経費が1件につき50万円程度必要となった.ヒト生体での実験は,3種類の実験を計画しており多額の審査経費が必要となった.このため,当初計画していたオージオメータの購入を中止して審査経費に充てることとした.次年度に倫理審査経費として使用する.また,シミュレーションに必要なソフトの購入費の支出が年度ごとの契約となったため,次年度使用額が生じた.
運動遊びが幼児の心理的発達に及ぼす影響

本研究は、統制群を持つ事前・事後計画により、運動遊びが自己概念の形成とパーソナリティに与える影響を実験的な手法により明らかにする目的で計画された。最終年度である本年度は、年長児を対象に約半年間、有能感を高めるよう工夫された運動遊びを実施した実験群と実施しなかった統制群での「幼児の運動有能感尺度」、「教師による行動評定」、「親から見た子どものイメージ」の各調査項目の変化量に関して比較分析を行った。その結果、実験群の方が統制群より運動に対する有能感が高くなるという傾向はあったが、統計的には有意でなかった。しかしながら、教師による行動評定では、男児と女児で項目は若干異なるものの統計的な有意差が認められ、実験群の方が統制群より運動行動と一般的な行動における積極性・強調性が大きく向上したことが明らかになった。ほぼ同様の結果が、事前測定において運動有能感が低かった対象においてもみられた。以上の結果は本研究の仮説を全面的に支持するものではないが、大筋では支持するものであった。以上の結果を踏まえ、運動遊びが与えていた影響を総合的に考察し、報告書を作成した。平成7年度は、実験群として、年長児を対象に有能感を高めるように工夫された運動遊びを指導し、その前後での有能感とパーソナリティの測定、指導中での活動量の測定を行い、それらがどのように変化するかを多角的に調査することを目的とした。本年度は甲府市内の幼稚園の年長児を対象に6月に運動に関する有能感、教師による幼児の行動評定、親から見た子どものイメージに関してのプレテストを実施した。その後、10月から11月にかけて運動遊びの指導を行い、12月にポストテストを実施し、運動指導実施前後での各調査の得点の変化を検討した。また、活動量として運動指導実施中に降園から登園までの歩数と登園から降園までの歩数を計測した。その結果、幼児の中に運動に関する有能感の高い幼児、低い幼児が存在していることが認められた。また、プレテストに関して有能感と親から見た子どものイメージにおいては「精神テンポ」の項目に、また、教師による行動評価に関しては「運動の消極性」の項目との間に有意な相関が認められた。さらに、活動量と他の検査との関連に関しては、登園から降園までの歩数では親のイメージの「健康」の項目の間に、また、降園から登園までの歩数に関しては、教師評価の中との「運動の積極性」の間に有意な正の低い相関が認められ、「運動の消極性」の項目と親のイメージの「健康」の項目の間に有意な低い負の相関がとみめられた。運動指導実施前後での各検査の得点に関しては、教師評定の5項目、全項目とも実施前より実施後の方が有意に得点が高くなっていた。しかしながら、他の検査に関しては変化は認められなかった。本年度は統制群として、通常の保育を受けている3園の年長児を対象に、下記の調査を実験群と同じ約半年を隔てて2回実施した。1運動の有能感の調査:絵をみせながらの面接、幼児1名約15分2幼稚園での行動調査:担任教師による行動評定3幼児のイメージ調査:母親による子どものイメージ評定4ビデオによる行動観察:運動有能感の調査結果に基づき、有能感の高い幼児と低い幼児それぞれ4名を対象に、幼稚園での遊びを録画なお、この他に1園だけ10日間ペドメーターを装着して園と家に帰ってからの活動量を測定した。その結果、昨年実施した実験群では。プレテストとポストテストの半年間で園での行動の積極性が有意に向上したが、今年度の統制群では有意な変化は見られなかった。なお、母親による子どものイメージ評定では、いくつかの項目で評定が有意に変化していた。計画書に記載したように、来年度の研究で昨年実施した実験群と今年度実施した統制群のデータを統合して分析し、詳しい結果を出す予定である。

最終年度である本年度は、年長児を対象に約半年間、有能感を高めるよう工夫された運動遊びを実施した実験群と実験しなかった統制群での「幼児の運動有能感尺度」、「教師による行動評定」、「親から見た子どものイメージ」の各調査項目の変化量に関して比較分析を行った。その結果、実験群の方が統制群より運動に対する有能感が高くなるという傾向はあったが、統計的には有意でなかった。しかしながら、教師による行動評定では、男児と女児で項目は若干異なるものの統計的な有意差が認められ、実験群の方が統制群より運動行動と一般的な行動における積極性・協調性が大きく向上したことが明らかになった。ほぼ同様の結果が、事前測定において運動有能感が低かった対象においてもみられた。以上の結果は本研究の仮説を全面的に支持するものではないが、大筋では支持するものであった。以上の結果を踏まえ、運動遊びが与えていた影響を総合的に考察とし、報告書を作成した。
自然免疫・獲得免疫スイッチング機構の構造生物学的解析に基づく抗アレルギー薬開発

アレルギー疾患,慢性炎症性疾患に対する治療ターゲット分子として,自然免疫を惹起するための病原体構成成分特異的認識受容体であるToll like receptor(TLR)とIL-18を含むIL-1受容体ファミリーに共通の細胞内シグナル伝達アダプター分子MyD88の蛋白立体構造及び機能解析を行った。安定同位体元素ラベルの15N-硫酸アンモニウム及び13C-グルコースを用い,標識されたMyD88リコンビナント蛋白を作成し,高濃度の単量体蛋白サンプルを調整,核磁気共鳴法(NMR)を用いた手法で,精密な溶液タンパク立体構造を決定することに成功した。決定した構造情報は,Protein Data Bankに登録した。得られたMyD88TIRドメイン構造とすでに報告のある他のTIRドメイン結晶構造と比較を行なったところ,LPS不応性マウスの遺伝子変異部位やTLR2の変異体結晶構造と機能解析からTIRドメイン間のシグナル伝達に重要とされ保存性の高いBBループ部分の構造にも大きな差異を認めた。さらにTIRドメイン構造は全体としてかなり類似しているが,表面電荷ポテンシャルは,それぞれで大きく異なる。そこで構造情報から重要と思われる荷電極性アミノ酸残基についてアラニン置換変異体を約40種類作成し,培養細胞を利用したin vivoの機能解析により,IL-18とLPS/TLR4シグナルの両者間でMyD88内の必須残基の相違を見出した。この情報を元にIL-18シグナルを遮断することなく,TLR4刺激を遮断しうる新規タンパク分子として,特許を出願した。また,MyD88とアダプター分子TIRAPの直接相互作用について,in vitroの結合実験から新たなTIR-TIRヘテロ相互作用様式を決定した。本研究で得られたタンパク構造,機能,新規変異分子の設計情報から免疫異常疾患への応用へと今後展開する。アレルギー疾患、慢性炎症性疾患に対する治療ターゲット分子として、自然免疫を惹起するための病原体構成成分特異的認識受容体であるToll like receptor(TLR)とIL-18を含むIL-1受容体ファミリーに共通の細胞内シグナル伝達アダプター分子MyD88の蛋白立体構造及び機能解析を試みている。構造計算は、溶液NMR法にて行なうが、すでに帰属の終了したアミノ酸主鎖、側鎖の帰属情報から、新たに測定したNOESYスペクトルの帰属を行ない、この情報を元にして構造計算を行なった。距離制限情報が5Å以上の部分を重点的に見直し修正、再び構造計算を行なうという作業を繰り返しつつ構造情報の精密化を行なっている(現在Back boneRMSD:約0.5Å)。またNOESY以外の構造情報として、残余双極子相互作用(residual dipolar coupling(RDC))の測定を行なった。このRDCは蛋白質の配向軸に対する角度の情報に変換でき、RDC由来の構造情報は曖昧さを含まないのでNOE由来の情報とは独立して扱える。この情報を構造計算に組み込む事でさらなる構造の精密化が期待できる。現在得られているMyD88TIRdomain構造とすでに報告のあるTLRITIRdomain結晶構造と比較を行なった。すでにIL-1APLの結晶構造及びTLR2TIRdomainの変異体実験からTIRdomainの二量体形成に重要な部分とされるαHelix C'の配向がMyD88とTLR1では異なっていた。またLPS不応性マウスの遺伝子変異やTLR2の変異体結晶構造と機能解析からTIRdomainのシグナル伝達に重要とされTIRdomain間で保存性の高いBBloop部分の構造にも差異がみられた。これらTIRdomain間の構造の差異が、シグナル伝達の特異性に寄与している可能性は高いと推測される。安定同位体元素ラベルの15N-硫酸アンモニウム及び13C-グルコースを用い、標識されたMyD88リコンビナント蛋白を作成し、高濃度の単量体蛋白サンプルを調整、核磁気共鳴法(NMR)を用いた手法で、得られた蛋白の各アミノ酸のシグナルを帰属し、各原子間の距離情報を得たのち立体構造を計算し、精密な溶液立体構造を決定することに成功した。この成果はすでに、第56回日本アレルギー学会秋期学術大会(2006年11月)、第8回創薬ビジョンシンポジウム:「膜分子の構造・機能・相互作用解析と創薬・創剤」(2007年1月)、タンパク3000総合シンポジウムタンパク3000の成果と今後のタンパク研究展望(2007年2月)にて報告している。得られたMyD88TIRdomain構造とすでに報告のある他のTIRdomain結晶構造と比較を行なったところ、LPS不応性マウスの遺伝子変異部位やTLR2の変異体結晶構造と機能解析からTIRdomain間のシグナル伝達に重要とされ保存性の高いBBloop部分の構造にも大きな差異を認めた。さらにTIRdomain構造は全体としてかなり類似しているが、表面電荷ポテンシャルはそれぞれで大きく異なっている。そこで構造情報から重要と思われる極性アミノ酸残基について変異体を約40種類作成し、in vivo及びin vitroでの蛋白間相互作用機能実験を通じて、IL-18受容体蛋白またはTIRとの結合様式の特異性をの決定を目指している。アレルギー疾患,慢性炎症性疾患に対する治療ターゲット分子として,自然免疫を惹起するための病原体構成成分特異的認識受容体であるToll like receptor(TLR)とIL-18を含むIL-

1受容体ファミリーに共通の細胞内シグナル伝達アダプター分子MyD88の蛋白立体構造及び機能解析を行った。安定同位体元素ラベルの15N-硫酸アンモニウム及び13C-グルコースを用い,標識されたMyD88リコンビナント蛋白を作成し,高濃度の単量体蛋白サンプルを調整,核磁気共鳴法(NMR)を用いた手法で,精密な溶液タンパク立体構造を決定することに成功した。決定した構造情報は,Protein Data Bankに登録した。得られたMyD88TIRドメイン構造とすでに報告のある他のTIRドメイン結晶構造と比較を行なったところ,LPS不応性マウスの遺伝子変異部位やTLR2の変異体結晶構造と機能解析からTIRドメイン間のシグナル伝達に重要とされ保存性の高いBBループ部分の構造にも大きな差異を認めた。さらにTIRドメイン構造は全体としてかなり類似しているが,表面電荷ポテンシャルは,それぞれで大きく異なる。そこで構造情報から重要と思われる荷電極性アミノ酸残基についてアラニン置換変異体を約40種類作成し,培養細胞を利用したin vivoの機能解析により,IL-18とLPS/TLR4シグナルの両者間でMyD88内の必須残基の相違を見出した。この情報を元にIL-18シグナルを遮断することなく,TLR4刺激を遮断しうる新規タンパク分子として,特許を出願した。また,MyD88とアダプター分子TIRAPの直接相互作用について,in vitroの結合実験から新たなTIR-TIRヘテロ相互作用様式を決定した。本研究で得られたタンパク構造,機能,新規変異分子の設計情報から免疫異常疾患への応用へと今後展開する。
羊水細菌叢の網羅的解析による早産予防治療戦略構築のための基礎的研究

平成30年度は、既に採取している切迫早産未破水症例20例の羊水について、次世代シークエンサーを用いたバイクロバイオームの遺伝子網羅的解析を行った。解析には、バクテリアの必須遺伝子である16SrDNAの中で、可変領域V1-V4をPCR法で増幅し、次世代シークエンサーで増幅三筆の塩基配列決定を行った。シークエンス後の細菌叢解析には、QIIMEパイプラインを用いて行い、OUT解析し、既知のレファレンスゲノムデータベースに相同性検索を行い、菌種の同定や菌叢組成を解析した。mycoplasma, ureaplasmaについては、別途mycoplasma, ureaplasma特異的primerを用いて、検出を行った。まず、先行して行ったパイロット研究から得られた未破水症例の羊水細菌叢の再現性について検証を行った。しなしながら、パイロット研究で認められた細菌叢とは異なっていた。パイロット研究では、羊水細菌培養にて既に細菌が同定されている検体を中心として実験系の検証を行ったが、平成30年度に解析を行った検体は、細菌培養では検出できなかった(即ち臨床的には無菌と判断される)症例であった。パイロット研究結果との乖離の原因として、羊水中に解析可能性な細菌の菌量が極めて少なかったことが一因と考えている。従って、今後は解析すべき検体の再検討の必要に迫られている。具体的には、後述する様に、検体内に十分量の菌量が確保されている対象(検体)を解析することが必要だと考えている。前述したように、未破水症例における羊水には、菌量そのものが少なく、解析の対象として、必ずしも適切でないと考えている。令和元年度以降は、細菌が多く含有していると考えられる検体、即ち前期破水症例における羊水、および切迫早産ないし前期破水症例における膣分泌物を対象として解析することとした。破水症例における羊水中には、未破水症例と比較して菌量が極めて多いことが予想され、既に採取している破水症例の羊水細菌叢の解析に着手したところである。他方、未破水症例における絨毛膜羊膜炎、前期破水の原因として、腟からの上行性感染の関与があることは周知のことであり、このような症例を対象として経時的に腟分泌物を採取し、膣内細菌叢の解析も併せて行うべく、既に検体の採取を行っているところである。令和元年度では既に採取している破水症例における羊水細菌叢の解析を開始した。切迫早産症例における腟内分泌物採取は既に平行して行っており、年度内に同様にバイクロバイオームの遺伝子網羅的解析を行う予定である。平成30年度は予想された結果が得られなかったため、当初の計画通りの支出ができなかった。前述した様に実験計画の見直しを行っており、令和元年度はそれに沿って支出していくつもりである。