hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軟体動物行動制御における末梢神経系のニューロン機能解析

アメフラシの鰓運動をモデルとした行動制御の神経機構の研究は主に中枢神経節内のニューロン回路について行われて来た。しかし鰓の神経系は中枢神経節の他、末梢神経系、すなわち鰓に内在する鰓神経節、およびごく末梢の神経集網からなる階層的構築を示す。本研究では、これらの末梢神経系ニューロンとこれらと中枢神経系との連関を解析し、行動制御における末梢ニューロンの役割を調べた。従来、鰓の運動はL7などの腹部神経節内の運動ニューロンの出力を神経節内で制御することにより修飾されると仮定されて来たのに対し、本研究で、1.L7は鰓筋肉を直接支配するばかりでなく、鰓神経節ニューロンの他、更に末梢に存在するニューロンに興奮性シナプス結合する末梢回路を持つことを明らかにした。2.また新たに腹部神経節で発見したニューロンAnti-L7はL7のインパルス活動自身には影響せずにL7が惹起する鰓運動を抑制する。水管への接触刺激に対する鰓引き込め反射の修飾として知られている「感作」の発現とAnti-L7の活動との相関を解明するために、インタクト動物での埋め込み電極によるニューロンの活動記録を行ったところ、「感作」を起こす刺激である頭部への機械的刺激がAnti-L7の抑制を惹起している事が示された。この事から鰓運動の感作機構にAnti-L7の活動の抑制が含まれていると考えられた。3.Anti-L7は抗セロトニン免疫陽性反応を示し、また鰓神経集網のニューロン細胞体上に免疫陽性プロセスが観察された。セロトニン投与およびAnti-L7の刺激により活性化される神経集網ニューロンの活動が記録されたことから、セロトニン性Anti-L7の抑制作用は末梢ニューロンに介在されると考えられた。アメラフランの鰓を支配する神経系は中枢神経系の一部である腹部神経節と、鰓に内在する末梢神経である鰓神経節、およびごく末梢の"神経集網"の3段階から成り、神経系の階層的構築のモデルとみなせる。本研究では、末梢神経系のニューロン構築を免疫細胞化学的に調べ、鰓運動の神経制御における中枢神経系と末梢神経系との連関を電気生理学的に単一ニューロンレベルで解析した。従来、アメフラシの鰓の運動は腹部神経節で同定されているL7などの運動ニューロンの出力を中枢内で制御することで調節されると考えられてきた。しかし、我々が新たに腹部神経節で発見、同定したニューロン、Anti-L7はL7のインパルス活動に影響せずにL7が惹起する鰓運動を抑制した。このことは、Anti-L7による抑制作用機構が末梢に存在することを示唆する。神経ヘプチドSmall Cardioactive Peptide B(SCP_B)が鰓運動に抑制作用を持つことが知られているがAnti-L7自身はSCP_B作動性ではないことを抗SCP_Bモノクロナール抗体により免疫細胞化学的に確かめた。一方、鰓末梢神経系においてSCP_B様免疫陽性反応の分布を調べたところ、鰓血管筋肉節束間で多数の免疫陽性ニューロンのクラスターを観察した。これらの末消ニューロンの活動を細胞外誘導により記録することに成功した。Anti-L7と末梢ニューロンとの同時誘導により、Anti-L7の活動により興奮する末梢ニューロンを発見した。これらのことから、Anti-L7の抑制作用にはSCP_B様物質含有の末梢ニューロンが介在すると推測された。1.我々がアメフラシの中枢神経節(腹部神経節)で発見したニューロン、Anti-L7は同神経節の鰓運動ニューロンL7のインパルス活動自身には影響せずにL7が惹起する鰓運動を末梢抑制するニューロンである。

水管の刺激に対する鰓引き込め反射で知られている「慣れ」と「慣れの解除」ないし「感作」などの運動修飾機構におけるAnti-L7の寄与を明らかにするために、水管神経のくり返し刺激と側-腹縦連合神経の刺激とを組み合わせ、Anti-L7の活動の変化を調べた。水管神経への刺激は始めAnti-L7の活動抑制を引き起こしたが、「慣れ」を惹き起こす繰り返し刺激により、この抑制は徐々に起きなくなった。「慣れの解除」や「感作」を起こす側-腹縦連合神経刺激はAnti-L7の活動を数分にわたり停止させる強い抑制を惹起した。2.鰓の神経系は腹部神経節と、鰓に内在する末梢神経系(鰓神経節とごく末梢の"神経集網"のニューロンを含む)から成る。腹部神経節や鰓神経節の同定ニューロンの神経回路の解析は行われていたが、本研究で初めて神経集網ニューロンの活動の記録に成功し、Anti-L7の活動により活性化される神経集網のニューロン活動を記録した。これらの結果から、鰓運動の修飾にAnti-L7が末梢ニューロンを介して寄与している可能性が示唆された。鰓運動は行動修飾機構研究のモデル材料として研究が進められているが、従来の研究の殆どは中枢、腹部神経節内のニューロン回路についてなされていた。鰓運動の修飾において中枢運動ニューロンの出力だけでは説明不十分であった実際の行動変化を、今回提示したAnti-L7と末梢ニューロンを含めた回路で説明する事が可能となる。アメフラシの鰓運動をモデルとした行動制御の神経機構の研究は主に中枢神経節内のニューロン回路について行われて来た。しかし鰓の神経系は中枢神経節の他、末梢神経系、すなわち鰓に内在する鰓神経節、およびごく末梢の神経集網からなる階層的構築を示す。本研究では、これらの末梢神経系ニューロンとこれらと中枢神経系との連関を解析し、行動制御における末梢ニューロンの役割を調べた。従来、鰓の運動はL7などの中枢神経節(腹部神経節)内の運動ニューロンの出力を神経節内で制御することにより修飾されると仮定されて来たのに対し、本研究で、1.L7は鰓筋肉を直接支配するばかりでなく、鰓神経節ニューロンの他、更に末梢に存在するニューロンに興奮性シナプス結合する末梢回路を持つことを明らかにした。2.また新たに腹部神経節で発見したニューロンAnti-L7はL7のインパルス活動自身には影響せずにL7が惹起する鰓運動を抑制する。水管への接触刺激に対する鰓引き込め反射の修飾として知られている「感作」の発現とAnti-L7の活動との相関を解明するために、インタクト動物での埋め込み電極によるニューロンの活動記録を行ったところ、「感作」を起こす刺激である頭部への機械的刺激がAnti-L7の抑制を惹起している事が示された。この事から鰓運動の感作機構にAnti-L7の活動の抑制が含まれていると考えられた。3.Anti-L7は抗セロトニン免疫陽性反応を示し、また鰓神経集網のニューロン細胞体上に免疫陽性プロセスが観察された。セロトニン投与およびAnti-L7の刺激により活性化される神経集網ニューロンの活動が記録されたことから、セロトニン性Anti-L7の抑制作用は末梢ニューロンに介在されると考えられた。
青少年における怒りの発現メカニズムに関する研究

「不安」,「抑うつ」、「怒り」という人間の3大情動のうちで、最も研究が遅れている領域は「怒り」である。そこで、場面ごとに「怒り」を客観的に測定できる「怒り尺度」及び「怒り対処行動尺度」を開発し、青少年における「怒り」の発現メカニズムを解明することにした。被験者は、小学1年生から6年生849名(男子469名、女子380名)、中学1年生から3年生326名(男子167名、女子159名)、高校1年生から3年生251名(男子121名、女子130名)、大学1年生191名(男性61名、女性130名)である。まず、大学生を対象に予備調査を行い、「友人関係」、「自己不満」、「他者不満」、「学校生活」、「親子関係」という5つの下位尺度、計35項目から成る「大学生版怒り尺度」を開発し、その尺度を用いて、怒り水準と神経症傾向とには密接な関連性のあることを明らかにした。次に、大学生版と同様の手続きにより、信頼性、妥当性の高い「児童版怒り尺度」(25項目)、「中学生版怒り尺度」(30項目)、「高校生版怒り尺度」(30項目)を開発した。そして、その尺度を用いて、糖分中心の偏った食習慣や朝食抜きの生活、いじめを受けること、ストレスをためること、授業が理解できないことなどは、特に怒り水準を高める大きな要因になっていることが判明した。そして、怒り水準は、男子は年齢とともに徐々に上昇し中学3年生頃がピークであるのに対して、女子は小学6年生から中学1年生にかけて急上昇する傾向が見られる。さらに、怒り場面における対処行動を分析するために、「児童版怒り対処行動尺度」(25項目)、「中学生版怒り対処行動尺度」(20項目),「高校生版怒り対処行動尺度」(25項目)を開発し、年齢とともに、怒り場面において援助行動をより採るようになり、怒り水準と怒り場面における攻撃行動傾向との関連性がより大きくなることを明らかにした。これほど「突然キレる子供達」の問題が深刻化しているにもかかわらず、わが国の児童生徒の怒り水準を客観的に測定できる「怒り尺度」は、未だ市販されていないのが現状である。そこで、本年度は、一般大学生を対象にして、場面に応じて変化する怒り水準を測定できる「大学生版怒り尺度」を開発することにした。本研究の被験者は、大学1年生191名(男性61名、女性130名)である。調査は、大学の講義時間を使って、大学1年生に対して実施した「怒りやすい場面に関する自由記述調査」の結果、収集された50項目からなる「大学生版怒り尺度(暫定版)」と、深町ら(1959)によって開発された「CMI健康調査票」を実施する形で、行なわれた。次に、「大学生版怒り尺度(暫定版)」の回答に対して、0点から4点(全く腹が立たない-とても腹が立つ)を与え、各項目得点の平均値が1.5以下の明らかに怒り水準が低いと考えられる15項目を削除した。そして、項目分析の結果、削除されなかった35項目について、主因子法・バリマックス回転による因子分析を施したところ、「友人関係因子」、「自己不満因子」、「他者不満因子」、「学校生活因子」、「親子関係因子」という5つの因子が抽出された。以上の手続きを経て、5つの下位尺度、計35項目からなる「大学生版怒り尺度」が開発された。来年度は、本尺度を参考にしながら、「児童生徒版怒り尺度」を開発するとともに、発達段階を追って、怒りの発現メカニズムを解明していきたいと考えている。

さらに、怒り場面における対処行動を分析するために、「児童版怒り対処行動尺度」(25項目)、「中学生版怒り対処行動尺度」(20項目),「高校生版怒り対処行動尺度」(25項目)を開発し、年齢とともに、怒り場面において援助行動をより採るようになり、怒り水準と怒り場面における攻撃行動傾向との関連性がより大きくなることを明らかにした。
カスケード式頭首工の水理構造諸元の決定方法に関する研究

1.現地調査静岡県和田島頭首工において所期どおりの機能を発揮していることを確認した。また、和田島に引き続き施工された、宮城頭首工(興津川)、里在家頭首工(倉真川)においても現地調査を行った。両頭首工ともにカスケード部への土砂の堆積もなく、所期の機能を発揮していたが、宮城頭首工においては下流護床工上に不規則な土砂の堆積があり、湾曲部での施工の課題も明らかになった。2.水理模型実験平成12年度に引き続き、実験対象として、カスケード部が3段のステージからなる和田島頭首工を取り上げ、下流護床工の効果的な設置位置の決定方法を確立するために水理模型実験を行った。実験模型装置は、水路幅を200mmとし、その他の水理諸元はフルードの相似則により原型の1/10とした。第3ステージの流況が、常流から射流へと移行する流量が大きいほど効果的であるとした。流況の判定は目視によって行ったが、確認のために水位測定も行った。実験条件は、各ステージの体積と護床工の高さが違うことによって生じる水クッション部の体積との比を変えることによって設定し、水クッション部の深さは原型どおり600mmのほか、400mm、800mmについても行った。その結果、深さ800mmの場合には、第3ステージの流況が射流となると、露出射流のまま下流護床工上を水が流下するため水クッションの効果は見られなかった。一方、深さ400mm、600mmの場合は水クッションの効果が現れたが、その効果は、600mmの方が高かった。したがって、和田島頭首工のように、第3ステージのエンドシル天端と水クッション底床部との落差が1,000mmの場合には、水クッション部の深さが600mmで、ステ-ジと水クッション部との体積比が1:1.2程度となるように設計することが望ましいとの知見を得た。1.現地調査平水時においては所期どおりの機能を発揮していることを確認した。カスケード部と下流護床工との接続部もスムーズに流れており、さらに下流河床との接続部でも局所洗掘などの問題は生じていない。また、7月の調査においては、カスケード部からの鮎の遡上も観察でき、設計時の配慮の一端を見ることができた。2.水理模型実験実験対象として、3段のステージからなる和田島頭首工(静岡県)を取り上げた。(1)河川流量と各ステージ内の流況との関係を明らかにするために、下流側水路を堰上げ背水の影響を受けないよう自由流下の条件に設定した。その結果、上流のステージから順に常流から射流へと移行し、その流量はそれぞれのステージでほとんど変わらなかった。また、その流量は原型換算でおよそ100m^3/sであり、土地改良事業計画設計基準による水クッション設計方法から計算した流量35m^3/sよりも遙かに大きい値を示した。(2)次に、下流側護床工を設置して実験を行った。実験条件は、カスケード部のステージの体積と護床工の高さが違うことによって生じる水クッション部の体積との比を変えることによって設定した。なお、水クッション部の深さは原型どおり600mmを基準とした。ステージと下流水クッションの体積の比の変化に関わらず、第1ステージと第2ステージにおいて常流から射流へと変化する流量に差はみられなかった。一方、第3ステージにおいては、比が1:0より1:1に至るまでは、射流へと移行する流量は増大したが、それ以上大きくしてもほとんど変わらなかった。また、下流側護床工部での流況を観察すると、1:1のときには、跳水が高い方の護床工の角部で生じていることから、維持管理を考えると、1:1.2程度となるように設計することが望ましいとの知見を得た。

その結果、深さ800mmの場合には、第3ステージの流況が射流となると、露出射流のまま下流護床工上を水が流下するため水クッションの効果は見られなかった。一方、深さ400mm、600mmの場合は水クッションの効果が現れたが、その効果は、600mmの方が高かった。したがって、和田島頭首工のように、第3ステージのエンドシル天端と水クッション底床部との落差が1,000mmの場合には、水クッション部の深さが600mmで、ステ-ジと水クッション部との体積比が1:1.2程度となるように設計することが望ましいとの知見を得た。
電磁因子と肺癌発生に関する病理・疫学的研究

肺ガン患者14例および肺ガン以外の患者11例の肺組織中の残留磁化強度を超伝導残留磁気測定装置(SQUID)により測定した。自然残留磁化強度(NRM)は、肺ガン患者の肺組織(8.00±13.11×10^<-7>emu)が、非肺ガン患者の肺組織(3.35±3.35×10^<-7>emu)より高い傾向だったが、有意差を認めなかった。空白対照と比べて、肺ガンと非肺ガン症例とも肺組織の磁化強度が有意に高く、肺組織の中に磁性物質が含まれる可能性が示唆された。また、肺ガン以外の患者11例の5種類組織を測定したところ、肺の磁化強度が一番高く、次いで、心、脾、腎の順で続き、肝の磁化強度が最も低かった。さらに五種類の組織の残留磁化は空白対照より高く、正常組織中にも磁性物質の存在が示唆された。また、肺組織の残留磁化が強かった2症例の肺組織各部位、他の器官組織(心、肝、脾、腎及び膵)、及び組織保存液の磁化強度を調べた。肺組織以外の他の器官標本とホルマリン保存液のNRMは10^<-8>emuのオーダーの値を示した。一方、肺組織について、症例Aは、右肺S2とS3の末梢部と右肺下葉中心部の強度が右肺S8と右肺S10より高かった。肺腫瘍部では10^<-5>emuのオーダーに達した。肺中の磁化物質の分布は上部のS2とS3の末梢部と下葉中心部で強く、下部のS8とS10の末梢部で弱い傾向が認められた。症例Bの各部位標本の磁化強度は症例Aより1桁高い値を示した。標本に含まれる磁性物質の特性について、等温残留磁化(IRM)の獲得と消磁曲線から得られるWohlfarth ratioでは、調査した試料の値は全て0.5以下となった。これは、磁性物質が組織内でクラスターとして、かなり局在していることを示唆している。更に、試料のS-ratioは全て0.96以上で、組織の中にマグネタイトのような低保磁力の磁性物質が存在することが示唆された。また、1982-1997年間発表された職業電磁場曝露と白血病の罹患に関する疫学のオリジナルの分析的研究に基づいて、メタ分析を行ったが、職業電磁場曝露と成人の白血病との関係について、一定の結論を得ることは出来なかった。富山医科薬科大学病理学教室に保管されているヒトの肺組織標本から肺癌および非肺癌例を各10例抽出し、それらの組織中における磁性物質の測定を行った。これらの標本を凍結処理しないでメスバウァ(Messbauer Spectroscopy)で測定したところ反応はみられなかった。

そこで超電導法(Superconducting quantum interference device;SQUID)によって測定したところ高値(磁化強度1.02E^<-05>4.29E^<-06>)を示す組織標本があり、それらについては肺のそれぞれの区域(上肺野のS-3区域および下肺野のS-10区域)においても同様に高値を示した。すなわちこれらの成績は肺野における磁性物質の特定区域の局在を示唆するものではなかった。これら磁化強度が高値であった標本には肺癌の症例も含れていたが、必ずしも工場労働者ではなかったので、職暦および居住暦などのふり返り調査との突合も必要となる。次の段階として磁化強度が高値を示した肺組織標本の交流消磁試験を行った。磁性物質の特性はこの交流消磁試験による磁化強度の減弱プロセスに影響を与えるが、今回の実験では、同じように磁化強度が高値を示す症例であっても、S-3とS-10の肺区域の消磁プロセスの違う場合がみられた。このことが磁性物質そのものの違いを示すのかあるいは物質が同じでも存在様態の差異によるのか今後の検討で結論する。本年度の研究により、ヒト肺組織標本の磁化強度をSQUIDで計測し、さらに交流消磁試験で物質特性の把握を行う方法を確立した。次年度は人工的磁場の強制暴露法を導入し磁性物質の特性を一層明らかにする.肺ガン患者14例および肺ガン以外の患者11例の肺組織中の残留磁化強度をSQUIDにより測定した。自然残留磁化強度(NRM)は肺ガン患者の肺組織(8.00±13.11×10^<-7>emu、範囲0.38223.95×10^<-7>emu)中で、非肺ガン患者の肺組織(3.35±3.35×10-7emu、範囲0.7312.20×10^<-7>emu)中より高い傾向だったが、有意差を認めなかった(P=0.2)。NRMの最高値は肺ガン患者の肺組織の223.95×10^<-7>だった。空白対照(組織空白の磁化強度は0.82±0.43×10^<-7>emu、機器空白は0.46±0.30×10^<-7>emu)の磁化強度と比べて、肺組織の磁化強度が有意に高く(P<0.05)、肺組織の中に磁性物質が含まれる可能性が示唆された。また、肺ガン以外の患者11例の5種類(心、肺、肝、牌、腎)の組織の磁化強度を測定したところ、肺の磁化強度(3.35±3.35×10^<-7>emu)が一番高く、次いで、心、牌、腎の順で続き、肝の磁化強度(1.24±1.42×10^<-7>emu)が最も低かった。人工的な磁化(ARM)はNRMより1桁磁化が強く現れた。さらに五種類の組織の残留磁化は空白対照より高く、正常組織中にも磁性物質の存在が示唆された。この11人の患者のそれぞれ組織の磁化強度を比較したところ、平均磁化強度は空白対照と同じ強度のものからより有意に高い症例まであり幅が広かった。また、本年度の研究では職域における電磁場曝露の測定を行った。工場内でアーク溶接作業時に溶接機から50cmの地点で3軸交流磁界測定器を用いて測定した。磁場は60-70Hzで1回目19.32mG、2回目14.05mGと高値を示した。超伝導残留磁気測定装置(SQUID)を用いて、昨年度に測定した肺組織の残留磁化が強かった2症例の肺組織各部位、他の器官組織(心、肺、脾、腎及び膵)、及び組織保存液の磁化強度を調べた。肺組織以外の他の器官標本とホルマリン保存液の自然残留磁化(NRM)は10^<-8>emu(10^<-11>Am^2)のオーダー値を示した。一方、肺組織について、症例Aは、右肺S2(1.46×10^<-6>emu)とS3(2.07×10^<-6>emu)の末梢部と右肺下葉中心部(1.10×10^<-6>emu)の強度が右肺S8と右肺S10より高かった。肺腫瘍部では10^<-5>emuのオーダーに達した。肺中の磁化物質の分布は上部のS2とS3の末梢部と下葉中心部で強く、下部のS8とS10の末梢部で弱い傾向が認められた。
新規循環がん細胞検出による肝細胞癌テーラメード治療法の確立

テロメスキャンという新たな手法を用いて、肝細胞癌患者の血液中に循環するテロメラーゼ陽性細胞を検出した。同細胞は、癌転移の指標となる循環癌細胞であると確認された。この細胞は早期肝細胞癌症例でも発現が認められ、単に循環癌細胞が存在するのみでは転移は成立せず、他の因子の関与が必要であると考えられた。一方,テロメスキャンにより検出されない癌組織や白血球による偽陽性の細胞を完全に除外するには至らず、今後の課題と考えられた。これまでの臨床検体を用いたテロメスキャンによる研究により、肝細胞癌患者の血中に、GFP陽性のhTERTを発現している癌細胞と考えられる細胞が検出されることが判明した。肝細胞癌症例の循環血液中にGFP陽性細胞が検出され得るという事実は非常に重要であり、既存の方法では評価し得なかった転移能などの、腫瘍の質的診断に寄与する可能性があると考えられる。現在までに、10症例の検討を終了しているが、これらの症例において、テロメスキャンで検出しうるGFP陽性細胞数に加え、すでに肝細胞癌患者での検出が報告されている血清中のhTERTのmRNA発現が、臨床データとどのように相関しているかを検討している。また、GFP陽性細胞が検出された症例については、治療後の再発、特に今後の転移性病変の出現の有無に関与するかどうかについて追跡調査中である。近年、肝細胞癌の新たな治療として、ソラフェニブなどの分子標的治療薬が開発され、その延命効果が期待されているが、投与により多くの血中サイトカインが変動し、治療後一定期間の後に治療抵抗性の癌細胞が再進展するとの知見がある(Cytokine 2011;53:115-129)。そこで、ソラフェニブ投与前、及び投与開始後早い段階でGFP腸性細胞を測定することにより、その治療反応性や予後の予測が可能ではないかとの仮説をたて、その検証を試みている。これらの結果が明らかとなれば、至適治療法の選択や予後延長に寄与することが期待される。本年度は初年度であり、研究成果についての再現性の確認が不十分と考えられるため、当該研究については発表を行っていない。癌の悪性度や転移能を評価する方法として患者血液中の循環癌細胞をとらえる方法がある。本研究は、細胞の不死化に関与しているテロメラーゼの活性を規定している蛋白を発現している細胞を蛍光色素により標識するテロメスキャンを用い、肝細胞癌患者の血中のテロメラーゼ陽性細胞を同定し、臨床応用の可能性を探ることを目的としたものである。テロメラーゼ陽性細胞は原発巣から血管内に侵入した癌細胞である可能性があり、既存の方法では評価し得なかった転移能などの、腫瘍の質的診断に寄与する可能性があると考えられる。テロメラーゼ陽性細胞が治療後の再発や転移性病変の出現などの臨床データとどのように相関しているかを検討するため、現在までに30症例の新規肝細胞患者、および健常者に対してテロメスキャンを施行したが、非担癌健常者の血液中にもテロメラーゼ陽性細胞が検出されることが判明したため、その原因を探索した。これらの細胞は白血球由来のテロメラーゼ陽性細胞であることが想定されたため、肝細胞特異的マーカーを用いた2重染色を行い、肝細胞由来のテロメラーゼ陽性細胞と非肝細胞由来のテロメラーゼ陽性細胞に分類できることを見出し、現在この肝細胞由来のテロメラーゼ陽性細胞を安定的に検出する実験手技の確立を試みている。血液中に循環している肝癌細胞を特異的に検出できれば、肝癌転移・再発の高リスク患者の選別につながるとともに、癌細胞の遺伝子情報を、採血するだけで同定できる新たなモダリティーとなると考えられ、適切な治療・経過フォローが可能となり、患者の生命予後改善に寄与するものと期待される。現在までに30症例の新規肝細胞患者、および健常者に対してテロメスキャンを施行したが、非担癌健常者の血液中にもテロメラーゼ陽性細胞が検出されることが判明した。これらの細胞は白血球由来のテロメラーゼ陽性細胞であることが想定されたため、肝細胞特異的マーカーを用いた2重染色を行い、肝細胞由来のテロメラーゼ陽性細胞と非肝細胞由来のテロメラーゼ陽性細胞に分類できることを見出した.テロメラーゼ陽性細胞に対して、癌抗原として肝細胞癌で同定されるCytokeratin,HepPar1,EMTマーカーとしてVimentin,Osteopontnに対する染色を行ったところ、これらの抗原をもつテロメラーゼ陽性細胞は検出されなかった。一方,白血球抗原であるCD45でも染色したところ、CD45陰性テロメラーゼ陽性細胞が検出され、これらは循環癌細胞であることが示唆された。

しかし,テロメスキャン陽性CD45陰性細胞の出現頻度は非常に低率であり、検出感度を高める必要性が示唆された。テロメスキャンは、Hep3B、HepG2などの肝癌細胞株に対してはほぼ100%感染し、GFPを発現させる.一方,原発巣肝癌組織10検体で調べると,8検体にGFPの発現が認められたが、2検体ではGFP発現は明らかではなかった。GFP発現を認めない肝癌組織では、テロメスキャンの感染に必要なCoxsackie-adenovirus receptorの発現を認めず、Coxsackie-adenovirus receptor発現がテロメスキャンの感度が低いことに関連していると考えられた。担癌患者のみならず、健常者の血液中にテロメラーゼ陽性細胞が検出され、癌特異的細胞を同定する実験系の確立を追加で行う必要があったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在、新規の症例に対してはテロメスキャン後に複数の上皮マーカー、上皮間葉移行マーカー、肝細胞特異マーカーを用いて免疫染色を行っている。これにより、テロメスキャンで検出された細胞が癌細胞であることが証明され、さらに、上皮間葉移行マーカー発現などの転移に関連する細胞表現型を評価することが可能であると考えられる。また、将来的にはフローサイトメーター等を用いた細胞選別により血液中から癌細胞を直接取得することを目標としており、これにより、侵襲性の低い組織診断が可能になると期待される。
シュレディンガー方程式の準古典解析

Resonancesの準古典分布に関する研究をWKB法を用いて行った.特に本年度は多次元の問題に着手した.Schrodinger作用素のある意味での複素固有値として定義されるresonancesは,対応する古典力学系の捕捉された軌道と密接な関係がある.その捕捉された軌道の集合が一つのhomoclinicな軌道で構成されている場合のresonancesの準古典分布の研究を,J.F-.Bony氏,T.Ramond氏,M.Zerzeri氏と共に試みた.方法としては,一次元の場合に有効なexact WKB法に代わって,超局所的なWKB解析を用いる.すなわち相空間で超局所的にWKB解を構成し,homoclinic軌道に沿ってこのWKB解を接続する.軌道を一周して同じ点に戻った時,元の解と一致するという条件からresonancesの量子化条件を導く.本科学研究費による研究では,特に平衡点の近傍でのWKB解の接続問題を考察した.ポテンシャルの非退化な最大点の近くでのWKB解の挙動は,対応する古典力学系の平衡点の近傍でのHamilton流の構造と深く関わっている.ところが平衡点はHamilton流の特異点であるから,ここでは相関数,振幅関数が特異性をもち,WKB解は漸近解としての意味を持たない.そこでわれわれは時間に依存するScrodinger方程式のWKB解のLaplace変換として解を積分表示することを考えた.すると,この時間に依存したWKB解は,空間変数に関しては平衡点の近傍で解析的である.この積分の漸近展開を計算することによって,平衡点からはなれた軌道上で定義された時間に依存しないWKB解の間の接続公式が得られた.研究の概要研究内容は主に次の二つである.散乱位相は散乱行列の行列式の対数を2πiで割ったものである.散乱行列がunitary作用素であることから,これは実エネルギーEを変数とし,h(Planck定数)を漸近パラメータにもつ実数値関数である.エネルギーEがHamiltonianのcritical valueでないとき,散乱位相に関して,固有値の個数関数の漸近挙動に関するWeylの公式と類似の公式が成り立つことが知られている.本科学研究費による研究では,一次元の場合にexact WKB法を用いて,Hamiltonianの鞍点の近傍における散乱位相,およびそのエネルギーに関する導関数であるtime delay functionの非Weyl型漸近公式を導いた.Homoclinic軌道が生成するresonancesの漸近分布散乱行列の極であるresonancesは,本質的に,Hamiltonianから定義される古典軌道のうち閉であるものによって生成される.その閉軌道がhomoclinicである場合のresonancesの漸近分布を,一次元の場合にexact WKB法を用いて明らかにしたT.Ramond氏との共同研究があるが,本科学研究費による研究では,これを多次元の場合に拡張することをM.Zerzeri氏と共に試みた.多次元ではexact WKB法は使えない.その代わりとして,複素相関数のFourier積分作用素であるFBI変換を用いるのが有効であるとの考えに至った.それは,位置と運動量の空間である相空間を位置の複素空間に正準変換し,その上に変換された閉軌道上で解が一価正則であるという条件が,resonancesの量子化条件を与えるという超局所解析のアイデアである.Resonancesの準古典分布に関する研究をWKB法を用いて行った.特に本年度は多次元の問題に着手した.Schrodinger作用素のある意味での複素固有値として定義されるresonancesは,対応する古典力学系の捕捉された軌道と密接な関係がある.その捕捉された軌道の集合が一つのhomoclinicな軌道で構成されている場合のresonancesの準古典分布の研究を,J.F-.Bony氏,T.Ramond氏,M.Zerzeri氏と共に試みた.方法としては,一次元の場合に有効なexact WKB法に代わって,超局所的なWKB解析を用いる.すなわち相空間で超局所的にWKB解を構成し,homoclinic軌道に沿ってこのWKB解を接続する.軌道を一周して同じ点に戻った時,元の解と一致するという条件からresonancesの量子化条件を導く.本科学研究費による研究では,特に平衡点の近傍でのWKB解の接続問題を考察した.ポテンシャルの非退化な最大点の近くでのWKB解の挙動は,対応する古典力学系の平衡点の近傍でのHamilton流の構造と深く関わっている.ところが平衡点はHamilton流の特異点であるから,ここでは相関数,振幅関数が特異性をもち,WKB解は漸近解としての意味を持たない.そこでわれわれは時間に依存するScrodinger方程式のWKB解のLaplace変換として解を積分表示することを考えた.すると,この時間に依存したWKB解は,空間変数に関しては平衡点の近傍で解析的である.この積分の漸近展開を計算することによって,平衡点からはなれた軌道上で定義された時間に依存しないWKB解の間の接続公式が得られた.
中央構造線に沿うプル・アパ-ト型堆積盆の研究

中央構造線(MTLと略称)に沿う和泉層群堆積盆(ISB)は典型的な横ずれ堆積盆として注目されている。本研究,発達し長さ300kmにもおよぶISBの形成機構および変形様式を明らかにすることを目的とした。この研究で明らかになった点及び試みた点を以下に述べる。1.ISBの地域区分:MTL断層系・和泉層群(上部白亜系)分布図を作成し,両者の特徴から,ISBを5つのセグメント(AE域)に地域区分した。A域(四国西部)D域(和泉山脈)は和泉層群の分布が連続する地域である。しかし,これは複合して1つの堆積盆をなす可能性(作業仮説)もあり,和泉層群の形成年代の再検討を試みた。D域西部で77ー72MaのF.T.年代を得た。また,E域(五条以東)では微化石を分析し,Archaeodictyomitra等の放散虫化石を発見した。【発表予定】.2.ISBの形成構造:MTLの五条屈曲(奈良県五条市付近)より西域の構造図を作成し,MTLの横ずれ運動に伴う断層デュ-プレスク構造を明らかにした。ISBがMTLの屈曲部における横ずれデュ-プクレスの形成に起因するプルアパ-ト型堆積盆であることを論じた【Geology,v.18,p.392ー394,1990;構造地質,no.35,p.65ー70,1990】.さらに,プルアパ-ト型堆積盆について,その形成機構を論じた【構造地質,no.36,1991,印刷中】.3.ISBの変形様式:D域のタ-ビダイト相の和泉層群にみられる層面すべり起因する変形構造(非調和褶曲・ステップ状断層構造)を計測し,層理面に沿う剪断ひずみを試算し(γ=0.3ー1.4),層面すべりの鏡肌を走査型電子顕微鏡で観察し,地層の運動方向を明らかにした。地層の運動方向及び堆積中心の移動方向から上述のMTLデュ-プレクス構造の断層ブロックの傾動方向を推定した【地質学会関西支部報,no.109,p.7,1990;日本地質学会第97年会講演要旨,p.346,1990;投稿論文準備中】.中央構造線(MTLと略称)に沿う和泉層群堆積盆(ISB)は典型的な横ずれ堆積盆として注目されている。地層の運動方向及び堆積中心の移動方向から上述のMTLデュ-プレクス構造の断層ブロックの傾動方向を推定した【地質学会関西支部報,no.109,p.7,1990;日本地質学会第97年会講演要旨,p.346,1990;投稿論文準備中】.中央構造線(以下MTLと略称)に沿う和泉層群(上部白亜系)の主な形成地域は和泉層群堆積盆地(以下ISBと略称)と呼ばれ、MTLの横ずれ堆積盆として最近注目されてきた。本研究では、今年度MTLのstrikeーslip duplex(横ずれ複合断層)を被覆した和泉層群の変形様式の調査・研究を行い、ISBの形成像を検討した。この研究で明らかになった点及び試みを以下に述べる。1.和泉層群の変形様式:和泉層群(タ-ビダイト相)の非調和褶曲を解析し、その形成機構を解明した〔1990年1月に口頭発表、日本地質学会関西支部報、no.109(印刷中)〕。

さらに、非調和褶曲に伴う雁行状断層構造を用いて、層理面に沿う剪断ひずみを試算し(最大0.5)、この層面すべりと横ずれ複合断層の断層ブロック及び被覆和泉層群の傾動との関係を明らかにした〔1989年12月の構造地質研究会で口頭発表、現在投稿準備中〕。2.ISBの形成像:和泉山脈淡路島東部地域の地質構造図を作成し、ISBがMTLのreleasing bendにおけるextensional strikeーslip duplexingによって形成されたプル・アパ-ト型堆積盆である可能性を指摘した。〔28th IGC,Abstracts,V.2,P.447,1989;Geology,V.18,1990(in press);構造地質、no.35(印刷中)〕。あわせてその形成年代を明らかにするために、酸性凝灰岩のF.T.年代を一部検討した〔72Ma,1989年4月の日本地質学会年会で口頭発表〕。3.今後の展望:MTLのような大断層では、そのセグメントによって異なるタイプの横ずれ堆積盆が形成されている可能性もあり今後検討を要する。さらに、典型的なプル・アパ-ト型堆積盆と考えられているDead Sea Basinとの比較検討も重要であると思われる。中央構造線(MTLと略称)に沿う和泉層群堆積盆(ISB)は典型的な横ずれ堆積盆として注目されている.本研究は,発達し長さ300kmにもおよぶISBの形成機構および変形様式を明らかにすることを目的とした.この研究で明らかになった点及び試みた点を以下に述べる.1.ISBの地域区分:MTL断層系・和泉層群(上部白亜系)分布図を作成し,両者の特徴から,ISBを5つのセグメント(AE域)に地域区分した.A域(四国西部)D域(和泉山脈)は和泉層群の分布が連続する地域である.しかし,これは複合して1つの堆積盆をなす可能性(作業仮説)もあり,和泉層群の形成年代の再検討を試みた.D域西部で77ー72MaのF.T.年代を得た.また,E域(五条以東)では微化石を分析し,Archaeodictyomitra等の放散虫化石を発見した[発表予定].2.ISBの形成機構:MTLの五条屈曲(奈良県五条市付近)より西域の構造図を作成し,MTLの横ずれ運動に伴う断層デュ-プレクス構造を明らかにした.ISBがMTLの屈曲部における横ずれデュ-プレクスの形成に起因するプルアパ-ト型堆積盆であることを論じた[Geology,v.18,p.392ー394,1990;構造地質,no.35,p.65ー70,1990].さらに,プルアパ-ト型堆積盆について,その形成機構を論じた[構造地質,no.36,1991,印刷中].3.ISBの変形様式:D域にタ-ビダイト相の和泉層群にみられる層面すべりに起因する変形構造(非調和褶曲・ステップ状断層構造)を計測し,層理面に沿う剪断ひずみを試算し(γ=0.3ー1.4),層面すべりの鏡肌を走査型電子顕微鏡で観察し,地層の運動方向を明らかにした.地層の運動方向及び堆積中心の移動方向から上述のMTLデュ-プレクス構造の断層ブロックの傾動方向を推定した[地質学会関西支部報,no.109,p.7,1990;日本地質学会第97年会講演要旨,p.346,1990;投稿論文準備中].
ニホンナシのS不和合遺伝子型同定法の確立

ニホンナシの自家不和合性は、一遺伝子座S複対立遺伝子系で説明されており、現在までにS_1S_7の7個の複対立遺伝子(S遺伝子)が確認されている。しかし,S遺伝子型が決定されているニホンナシ品種はごく一部であり、現在栽培されている主要品種でも不明なものが多い。このような背景から本研究では、S遺伝子またはその産物であるタンパク質(Sタンパク質)を利用して、ニホンナシの不和合遺伝子型を同定する方法の確立を目的に、いくつかの観点から検討したものである。S_1S_5遺伝子に対応する花柱タンパク質が等電点電気泳動法により同定され、これを用いて新品種を含む数品種のS遺伝子型を確立した。これらの遺伝子型は、圃場における受粉試験からも確認された。また、それぞれのタンパク質は糖鎖を持つことが明らかとなったため、泳動したタンパク質をCon-A染色することにより、遺伝子型の同定がより明確となることが示された。なお、各Sタンパク質のモノクローナル抗体を作成しようとしたが、1)それぞれのSタンパク質同士が互いに混入し合うこと、2)完全精製しようとすると回収率が極めて低下すること(10%>)から、抗体作成は行えなかった。S_4遺伝子のPCR増幅に関し、上流プライマーとして、5' TTTACGCAGCAATATCAG 3'、また下流プライマーとして、5' G(C/T)GGGGGCA(A/G)T(T/C)TATGAA 3'配列の有効性が示され、これをニホンナシの若葉を用いて検討し、この一部からプローブを選定しようとした。S_4遺伝子を持つほとんどの品種ではS_4遺伝子と推定される825bpのDNAが増幅されたが、'新水''(S_4S_5)と'清玉'(S_3S_4)では増幅されなかったため、プローブの確定はできなかった。また、花柱のmRNAまたはrRNAを用いてRT-PCRによりcDNAを合成し、このcDNAからのS遺伝子のスクリーニングを試みた。RAPDマーカーを用いることにより数種のバンドが候補として挙げられたが、それらを同定してプローブを得るまでにはいたらなかった。現在までに、Sタンパク質の分離・精製が硫安分画およぴFastsystemを用いたイオン交換カラム(HiTrap SPカチオン交換樹脂)により、ほぼ行えるようになった。しかし、まだ不純物の混入が認められ、もう少し分析条件の検討が必要である。DNAプローブの作成に関しては、数種のプライマーを用いて各種PCR条件下で調査中であるが、まだ特異的なブロープは得られておらず、プライマーの選定とPCR条件についてさらに研究中である。しかし、S遺伝子型が決定されているニホンナシ品種はごく一部であり、現在栽培されている主要品種でも不明なものが多い。

これらの遺伝子型は、圃場における受粉試験からも確認された。また、それぞれのタンパク質は糖鎖を持つことが明かになったため、泳動したタンパク質をCon-A染色することにより、遺伝子型の同定がより明確となることが示された。なお、各Sタンパク質のモノクローナル抗体を作成しようとしたが、1)それぞれのSタンパク質同士が互いに混入し合うこと、2)完全精製しようとすると回収率が極めて低下すること(10%>)から、抗体作成は行えなかった。S_4遺伝子のPCR増幅に関し、上流プライマーとして、5 ́TTTACGCAGCAATATCAG 3 ́、また下流プライマーとして、5 ́G(C/T)GGGGGCA(A/G)T(T/C)TATGAA 3 ́配列の有効性が示され、これをニホンナシの若葉を用いて検討し、この一部からプローブを選定しようとした。S_4遺伝子を持つほとんどの品種ではS_4遺伝子と推定される825bpのDNAが増幅されたが、'新水'(S_4S_5)と'清玉'(S_3S_4)では増幅されなかったため、プローブの確定はできなかった。また、花柱のmRNAまたはrRNAを用いてRT-PCRによりcDNAを合成し、このcDNAからのS遺伝子のスクリーニングを試みた。RAPDマーカーを用いることにより数種のバンドが候補としてあげられたが、それらを同定してプローブを得るまでにはいたらなかった。
樹木年輪による歴史洪水のピーク水位復元とその洪水頻度分析への応用

琵琶湖岸沿いの地域を踏査し、過去の洪水時に水位上昇による浸水の影響を受けた可能性のある12地区から、クロマツを中心にケヤキ・ヒノキなどを含め計29個体の年輪標本を採取した。それぞれ年輪測定器により年輪幅を測定し、琵琶湖で未曾有の大洪水が生起した1896年(明治29)前後の期間について測定した早材・晩材幅の変動に現れた影響を検討した。その結果、1896年まで遡ることのできたクロマツ6個体について見ると、うち2個体については翌年の1897年に早材幅が急激に狭くなっており、1個体は189798年の2年分の晩材幅が極端に狭くなっていた。これとは別に1897年のみ年輪幅が狭くなっているものが1個体あった。1896年洪水は5月頃から水位が上昇し9月にピーク水位を記録しているため、これらの個体については数ヶ月間の長期に亘る浸水が樹木にダメージを与え、翌年の成長を阻害した可能性が考えられる。これとは別に、1個体のエノキについて、洪水翌年の1897年に早材の導管径と孔圏幅が異常に小さい「洪水輪(flood ring)」が見られた。特に環孔材について、早材形成期に長期間浸水した場合に浸水期間中形成された導管にこのような異常が見られる事例は、他国の研究に見られるが、このエノキが浸水したのは1896年9月頃であり、このように前年秋の浸水が洪水輪を形成したという事例はこれまでに見られない。今後さらに標本数を増やし、このような洪水輪が早材形成期以外についても洪水履歴を復元する手法となりうるか、検証していく必要がある。琵琶湖岸沿いの地域を踏査し、過去の洪水時に水位上昇による浸水の影響を受けた可能性のある9地区からマツ・ケヤキ・ヒノキなど計23個体の年輪標本を採取した。それぞれ年輪測定器により年輪幅を測定し、琵琶湖で未曾有の大洪水が生起した1896年(明治29)前後の期間に着目し、測定した早材・晩材幅の変動に現れた影響を検討した。その結果、1896年まで遡ることのできたマツ5個体について見ると、うち2個体については翌年の1897年に早材幅が急激に狭くなっており、1個体は189798年の2年分の晩材幅が極端に狭くなっていた。他の個体については洪水生起年の前後でこうした明瞭な年輪幅の変動は見られなかったが、これらの個体は比較的水はけの良い砂浜に生育していたことから、浸水による影響が比較的小さかったとも考えられる。しかし、こうじた推測の当否を確かめるためには未だ標本数が不足しており、また本研究の所期の目的である江戸時代の洪水復元が可能となるような200年以上の年輪数をもつ標本が未だほとんど得られていない。次年度も踏査を継続してさらに多数の標本を得るとともに、水準測量により個々の樹木の標高を測定し、年輪幅に残る浸水の影響とその樹木の立地条件との関係についてさらに詳細に検討する必要がある。琵琶湖岸沿いの地域を踏査し、過去の洪水時に水位上昇による浸水の影響を受けた可能性のある9地区から、クロマツを中心にケヤキ・ヒノキなどを含め計26個体の年輪標本を採取した。こうした推測の当否を確かめるため、さらに踏査を継続してさらに多数の標本を得るとともに、特に本研究の所期の目的である江戸時代の洪水復元が可能となるような200年以上の年輪数をもつ標本を探す必要がある。また、水準測量により個々の樹木の標高を測定し、年輪幅に残る浸水の影響とその樹木の立地条件との対応関係について検討するとともに、将来的には長良川など他の湖川についてもこの手法を試みたい。

その結果、1896年まで遡ることのできたクロマツ6個体について見ると、うち2個体については翌年の1897年に早材幅が急激に狭くなっており、1個体は189798年の2年分の晩材幅が極端に狭くなっていた。これとは別に1897年のみ年輪幅が狭くなっているものが1個体あった。1896年洪水は5月頃から水位が上昇し9月にピーク水位を記録しているため、これらの個体については数ヶ月間の長期に亘る浸水が樹木にダメージを与え、翌年の成長を阻害した可能性が考えられる。これとは別に、1個体のエノキについて、洪水翌年の1897年に早材の導管径と孔圏幅が異常に小さい「洪水輪(flood ring)」が見られた。特に環孔材について、早材形成期に長期間浸水した場合に浸水期間中形成された導管にこのような異常が見られる事例は、他国の研究に見られるが、このエノキが浸水したのは1896年9月頃であり、このように前年秋の浸水が洪水輪を形成したという事例はこれまでに見られない。今後さらに標本数を増やし、このような洪水輪が早材形成期以外についても洪水履歴を復元する手法となりうるか、検証していく必要がある。
胆汁うっ滞性肝障害に対する肝細胞防御機構に関する研究

研究者は胆汁うっ滞における胆汁酸誘導性の肝細胞障害に対する防御因子の存在とその遺伝子発現調節機構を解明することを目的とし、ヒト培養肝細胞(HLE)を胆汁酸存在で培養し、防御因子の誘導について検討した。結果(1)ヒト培養肝細胞をケノデオキシコール酸(CDCA)存在(10250μM)・非存在下で36時間培養した後、24時間CDCA非存在下で培養後の高濃度の胆汁酸(CDCA500μM)による細胞傷害の程度を検討し、CDCA前処理によって細胞生存率の有意に上昇することが認められた。(2)培養肝細胞をCDCA存在(10250μM)・非存在下で培養し、細胞内thioredoxinの変化を検討したところ、CDCAは濃度依存性に24時間後のthioredoxin mRNA量及び、36時間後のthioredoxin蛋白量を有意に増加させた。(3)ルシフェラーゼ発現ベクターにthioredoxinのプロモーター領域を導入したキメラプラスミドを作製し、培養肝細胞に遺伝子導入後、CDCAの転写活性を検討したところ、CDCAの濃度依存性に転写活性の亢進を認めた。(4)thioredoxinを恒常的に過剰発現する培養肝細胞を作成し、高濃度の胆汁酸による死細胞率を測定したところ、thioredoxin発現量に依存性に死細胞率の低下を認めた。以上の検討から胆汁酸の細胞障害に拮抗して内因性還元物質であるthioredoxinが誘導されることが明らかとなり、その発現が肝細胞防御因子が肝細胞の庇護に働くことが示唆された。以上の検討から胆汁酸の細胞障害に拮抗して内因性還元物質であるthioredoxinが誘導されることが明らかとなり、これらの肝細胞防御因子が肝細胞の庇護に働くことが示唆された。現在、肝細胞防御機構及び、これら防御因子の遺伝子発現調節機構を明確にするため、thioredoxinを恒常的に過剰発現する培養肝細胞、上記キメラプラスミドのプロモーター領域のdeletion mutantを作製中である。
無視できない灌漑水由来の放射性Cs：その水田内挙動とイネへの移行メカニズムの解明

本研究では,灌漑水から流入する溶存態および懸濁態放射性セシウム(rCs)の水田内での水平移動のシミュレーションモデルを現地調査に基づいて作成し,また各化学形態のrCsのイネへの吸収メカニズムを解明することを通して,水田における「水→土壌→イネ」に至るrCsの動態を仔細に明らかにすることを目的とする。そのために初年度からの2年間においては,1灌漑水由来rCsの水田内挙動の調査とモデル化,および,2灌漑水由来rCsのイネへの移行メカニズム解明,を試みる。その結果を踏まえ,最終年度は灌漑水由来rCsのイネへの移行を防ぐ栽培管理技術について検討し,本研究から得られる知見の社会への還元を目指す。
2次元液状化解析に基づく地盤の震害発生機構の研究

地盤の震害を考える上で重要な2次元的な広がりを考慮した液状化のメカニズムについて、理論的な解析を中心として研究を進めた。本研究においては、先ず、研究分担者の一人が提案した2次元粒子モデルにより液状化のシミュレーション解析を行い、液状化のメカニズムについて考察した。次に、液状化現象を解析するための一般的な構成則の検討を行った。更に、傾斜基盤を有する地盤についてFEMによる液状化解析を行い、基盤傾斜の影響について調べた。以下に得られた結果の概要を示す。1.新しいシミュレーション解析法は、適合条件を満す粒子の相対的移動と各粒子の力の釣合式、粒子間の単純な構成則に基づいており、一般の構成則に見られるような数多くの材料定数は必要としないものである。間隙圧は、境界移動の中の体積変化に水の圧縮係数を乗ずることにより求め、これにより、粒子に作用する有効接触力を求める方法を用いた。シミュレーションの結果は、3次元的な砂の繰返し試験と良い対応を示すものであり、これに基づく散逸エネルギーの計算等を通して、詳細な考察を行った。2.液状化のような繰返し載荷の解析のために等方硬化及び異方硬化を組み合せた一つの非関連流動モデルを提案した。等方硬化は塑性仕事を体積変形部分と偏差部分とに分けて対応させ、異方硬化はツィーグラー則を考慮して一般性のあるものとした。この構成則を非排水繰返し試験に応用した結果、従来の実験結果を良くシミュレートすることがわかった。3.地盤変化部における液状化現象に着目したFEMによる液状化解析を行った。側方基盤の傾斜角を鉛直、60°、45°、30°と変化させて解折した結果、いずれの場合にも、傾斜基盤近傍で、浅い部分に液状化が集中した。但し、鉛直の場合に液状化の広がりが最も狭く、また中間的傾斜角の場合に周辺部に集中する傾向が見られた。
真核細胞が有する異常タンパク質識別機構に基づく有害物質評価系の確立

化学物質の有害性を新たな指標で評価するため、細胞内タンパク質の異常度を反映するポリユビキチン化タンパク質の蓄積に着目した。6種類の株化細胞を用いて各被験物質の曝露による難溶性ポリユビキチン鎖の変動を解析したところ、有害物質は、その毒性発現に伴い細胞内異常タンパク質を(1)増やすもの(2)細胞の種類に依存して増やすもの(3)変化させないもの以上3種類に分類された。本評価系は毒性機序の理解に基づく化学物質の安全管理に有用である。神経芽細胞腫Neuro2A、線維芽細胞NIH 3T3、腎近位尿細管上皮HK-2の各株化細胞を用いて、パラコート、メチル水銀(MeHg)、カドミウム(Cd)の細胞毒性を比較した。24時間曝露で生存能が50%低下するEC_<50>を求めたところ、Cdは50μM近傍に収束したが、MeHgでは0.58μM、パラコートでは3204,000μMの範囲に分布した。また、EC_<50>下24時間曝露の半致死条件での難溶性ユビキチン(Ub)化タンパクの細胞内量を調べたところ、Cdでは全細胞において、メチル水銀ではHK-2細胞で顕著に増加したが、他の組合せでは明確な変動を認めなかった。従って、化学物質による細胞内タンパク質の異常化の検出に現時点ではHK-2細胞が最適と判断される。今後、肝細胞系細胞での検討を加味し、最終的なモデル細胞株を選定する。難溶性Ub化タンパクの測定法に関しては、試料調製時の過剰SDS除去作業の簡略化に着手し、2日間の工程を1日に短縮した。ELISAの迅速化が今後の課題である。また、Ub化タンパクの新規標準品を設定するため、各種Ub鎖『RP1(旧標品)、K48-Ub_5(Ub 5分子のK48型鎖)、K63-Ub_8(Ub 8分子のK63型鎖)、Ub_<10>直鎖(Ub 10分子の直鎖)』の交差反応性を解析した。その結果、8分子以上のUbで構成される何れのUb鎖も1100ng/mlの範囲で検出され利用可能と判断されたため、性状が明確で入手も容易なUb_<10>直鎖を標準品とするプロトコールを作成し、定量値の定義を明確化した。LC-MS/MS分析においては,ペプチド断片化酵素としてトリプシンやリシルエンドペプチダーゼ等の比較、磁気ビーズ抗体法を用いた試料中の主要夾雑物除去など試料前処理の検討を進め、数μgの試料から50種以上のタンパク質成分の同定を可能した。モデル株化細胞の評価においては、近位尿細管上皮由来HK-2細胞,神経芽細胞腫由来Neuro2A細胞,繊維芽細胞由来NIH/3T3細胞に加え、肝細胞癌由来FLC-4細胞と神経芽細胞種SH-SY5Y細胞の単層培養系を加え、塩化カドミウム(Cd)、メチル水銀(MeHg)、パラコート、および過酸化水素のEC_<50>濃度域での細胞毒性を比較した。その結果、Cdに関しては、すべての細胞でユビキチン化タンパク質の顕著な量的増加が観察された。MeHgでは、HK-2細胞において明確に同様の現象が再現された。一方、パラコートおよび過酸化水素の曝露では、何れの細胞においてもユビキチン化タンパク質の細胞内量は一定に推移し有意な変動を認めなかった。これらの結果より、細胞内タンパク質の異常化は、重金属系有害物質の評価に有用と推定される。また、この評価系に用いるモデル細胞として、HK-2細胞の有用性が再確認された。Cd曝露がもたらす細胞内現象を個体レベルで検証するため、3週間に渡って連日Cd(kg体重あたり23mg)を投与したマウスの腎臓および肝臓のユビキチン化タンパク質を定量したところ、ユビキチン化タンパク質の量は腎臓においてのみ投与量依存性に増加し、臓器特異的な現象であることが示唆された。ユビキチン化タンパク質の定量に用いるポリユビキチン鎖ELISAに関しては、新規標準品(Ub_<10>直鎖)に基づく測定値と従来の標準品(MUCRP1)によるものとの比較のため換算係数を求めた。その際、凍結保存下のMUCRP1には脱ユビキチン化による部分的な分解が認められた。Ub_<10>直鎖の保存安定性は今後の検討課題である。この他、組織中のユビキチン化タンパク質の定量分析を環境評価に応用するため、金沢大学と東京大学の各臨海実験所においてムラサキイガイの定期的サンプリングを開始し継続中である。哺乳類由来の各種培養細胞を用いた昨年度までの検討から、ポリユビキチン鎖の細胞内量はカドミウムによる細胞毒性の強度に対応して遷延性に増加した。