hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広範囲作動抗原による複数HLA刺激システムの解明

通常HLA class I分子は8-10アミノ酸を、class II分子は15-24アミノ酸を提示し、それぞれCD8 T細胞、CD4 T細胞を刺激するとされてきた。本研究では全く新しい発想を元に、ウイルスや真菌由来の30mer以上のペプチドが、複数以上のclass I分子に会合し、またclass Iと共にclass II分子に会合することを証明し、それがミニスーパー抗原として働く可能性について検討し、検証することを目的とした。このようなペプチドを、shared broad-reactive antigen (SBRA)と呼称する。いくつかのペプチドは異なるclass I分子に会合することを、HLAが明らかになっている末梢血単核球と、class I拘束性予想プログラムを用いて検証した。さらにこれらのペプチドが実際に特定のclass Iあるいはclass Iに会合することを証明するために、単独HLA(A2402, A3102, B3501, B5101, DR0901, DR0405, DR1502など、日本人で高頻度のHLA)を発現したK562細胞を樹立した。これらの細胞をペプチドと共培養し、特異的T細胞を刺激し、FACSあるいはELISpotにて細胞内サイトカインを測定できることを確認した。また単一のペプチドがいくつかのclass I、class IIに会合する証左も得られたが、複数のclass Iあるいはclass I, class IIの両者に会合する可能性については、きれいなモデルが必須である。しかし、これをダイレクトに、また確実に示す手法は今までなかった。そこで、単独のclass I、単独のclass IIを発現するモデル細胞株を作成し、それを用いてHLA拘束性を証明することができたことは、2018年度の成果である。SBRAとなるペプチド候補は10以上上がっているが、この数をさらに増やすことにより、今後の自己抗原との相同性検証等に移行できるものと考えている。今後は検討を継続して、いくつかの領域に亘るペプチド候補をさらに数多く抽出し、class I拘束性予想プログラムを用いて、複数class Iにマップされるかを検証することを継続する。Class IIへの共刺激についてはCD4/CD8と細胞内サイトカインの染色を同時に行うことにより、CD4単独、CD8単独、CD4/CD8両者拘束のペプチドを抽出する作業を継続する。この作業によって少なくとも100前後のSBRAを抽出する予定である。これらを用いて、実際の細胞への多彩な影響(様々なヘルパーT細胞や細胞傷害性T細胞への刺激)、産生されるサイトカインなどを詳らかにする。さらに、得られたSBRAが自己抗原や、その他の既知の抗原と相同性を有するかどうかについては、in silicoでの解析を行う。また現在のところ単独発現させたclass I, class IIは頻度の高いものを中心に7種類であり、今までの会合class I, class II情報から、できるだけ多くの単独HLA発現K562細胞を樹立しておく予定である。これは今後の発展的な研究にも有用になると考えている。このようなSBRAの存在が明らかになった際に必要なことは、細胞をどのような形で刺激しているのかについての検討である。HLAのoutside grooveに結合する可能性、HLAに様々なaffinityで会合する可能性、同一あるいは異なる細胞のclass Iとclass IIをリンクするなど全く別の機構で会合する可能性が想定される。外溝に会合する可能性についてはスーパー抗原で検証された方法において検討し、共焦点レーザー顕微鏡などでの解析も考慮したい。ペプチドが直接HLAに搭載される可能性については、単一HLAとペプチドそのものの結合をBiacoreなどで検出する予定である。

Class IIへの共刺激についてはCD4/CD8と細胞内サイトカインの染色を同時に行うことにより、CD4単独、CD8単独、CD4/CD8両者拘束のペプチドを抽出する作業を継続する。この作業によって少なくとも100前後のSBRAを抽出する予定である。これらを用いて、実際の細胞への多彩な影響(様々なヘルパーT細胞や細胞傷害性T細胞への刺激)、産生されるサイトカインなどを詳らかにする。さらに、得られたSBRAが自己抗原や、その他の既知の抗原と相同性を有するかどうかについては、in silicoでの解析を行う。また現在のところ単独発現させたclass I, class IIは頻度の高いものを中心に7種類であり、今までの会合class I, class II情報から、できるだけ多くの単独HLA発現K562細胞を樹立しておく予定である。これは今後の発展的な研究にも有用になると考えている。このようなSBRAの存在が明らかになった際に必要なことは、細胞をどのような形で刺激しているのかについての検討である。HLAのoutside grooveに結合する可能性、HLAに様々なaffinityで会合する可能性、同一あるいは異なる細胞のclass Iとclass IIをリンクするなど全く別の機構で会合する可能性が想定される。外溝に会合する可能性についてはスーパー抗原で検証された方法において検討し、共焦点レーザー顕微鏡などでの解析も考慮したい。ペプチドが直接HLAに搭載される可能性については、単一HLAとペプチドそのものの結合をBiacoreなどで検出する予定である。(理由)実験試薬の物品購入の請求が、年度を超えて繰り越しとなってしまったため。(次年度計画)繰越金は、次年度の物品購入費に加え使用する予定である。Baylor大学のAnn Leen博士とは複数ウイルス特異的T細胞の培養手法について、継続的に情報交換を行っている。
ムスカリンtype2(M2)に対する全身麻酔薬の作用解析

麻酔薬は心伝導系に影響を及ぼすが、そのメカニズムは未だに不明である。最近、ムスカリンtype1(M1)受容体といったG蛋白共役型受容体が中枢神経系において麻酔機序に関与しているという報告がなされている。G蛋白共役型受容体にはGq蛋白共役型受容体だけでなくムスカリンtype2受容体(M2)を始めとしたGi蛋白共役型受容体も多く存在している。M2受容体は心筋に存在し特にその伝導系に大きな作用をもたらし、これらは麻酔薬による不整脈をはじめとした作用に大きく関与していると予想されている。しかし、M2への麻酔薬の作用について詳しい検討はなされていない。一方、アフリカツメガエル卵母細胞発現系は中枢神経系のGq蛋白結合受容体に対する薬剤の作用を検討する実験系として広く使用されている。最近、共同研究者の南らによってM2とGi/GqキメラG蛋白RNAを同時にアフリカツメガエル卵母細胞に注入して発現させ、Gq蛋白結合受容体と同じように細胞内Ca^<2+>の変動を利用した解析が可能になった。そこで、昨年現在までの研究においては、Gq/GiキメラG蛋白とM2をアフリカツメガエル卵母細胞発現系に同時に発現させた方法を用いてM2に対する麻酔薬(ハロセン、イソフルラン、セボフルラン、エンフルラン)の作用を電気生理学的に解析し、ハロセンなどはM2を抑制することを明らかにした。さらにその作用はリン酸化酵素プロテインキナーゼCを介していないことが明らかとなった。今年度はコントロールマウスとM2ノックアウトマウスの心筋スライスを用いてNaチャネルや電気依存性Caチャネルなどへの麻酔薬の影響を電気生理学的に検討を試みるために心筋の培養に着手した。また、細胞内Ca^<2+>の測定も試みている。来年度もこれらを検討し、M2への麻酔薬の作用が心筋の伝導系にどのように影響するかを検討し、麻酔薬の不整脈誘発機序を明らかにしたい。ハロセンをはじめとした麻酔薬は心伝導系に影響を及ぼして不整脈を誘発するが、そのメカニズムは未だに不明である。最近、ムスカリンtype1(M1)受容体といったG蛋白結合受容体が中枢神経系において麻酔機序に関与しているという報告がなされている。M2はG蛋白結合受容体であり心筋に存在し特にその伝導系に大きな作用をもたらし、これらは麻酔薬による不整脈をはじめとした作用に大きく関与していると予想されている。現在まで、申請者はアフリカツメガエル卵母細胞発現系を利用してM1といったGq蛋白結合受容体に対する麻酔薬の作用を検討してきた。また最近、M2とGi/GqキメラG蛋白RNAを同時にアフリカツメガエル卵母細胞に注入して発現させ、Gq蛋白結合受容体と同じようにPLCを介した細胞内Ca^<2+>の変動を利用した解析が可能になった。そこで、今年度の私の研究においては、Gq/GiキメラG蛋白を用いてM2をアフリカツメガエル卵母細胞発現系に同時に発現させた方法を用いてM2に対する麻酔薬ハロセンの作用を電気生理学的に解析し、Gq蛋白結合受容体への麻酔薬の作用と比較した。その結果麻酔薬ハロセンはM2を抑制することを明らかにした。さらに今後は、現在までハロセンはM1をリン酸化酵素プロテインキナーゼC (PKC)によって抑制することが報告されているため、M2の機能にも燐酸化酵素によって影響があるかどうか検討する。さらにアフリカツメガエル卵母細胞発現系において得られた結果が生体内でどの様に作用しているかを確認するために、麻酔薬がどのように影響するかを電気生理学的に比較検討する。これらを総合的に判断し、M2への麻酔薬の作用が心筋の伝導系にどのように影響するかを検討し、麻酔薬の不整脈誘発機序を明らかにしたい。

今年度はコントロールマウスとM2ノックアウトマウスの心筋スライスを用いてNaチャネルや電気依存性Caチャネルなどへの麻酔薬の影響を電気生理学的に検討を試みるために心筋の培養に着手した。また、細胞内Ca^<2+>の測定も試みている。来年度もこれらを検討し、M2への麻酔薬の作用が心筋の伝導系にどのように影響するかを検討し、麻酔薬の不整脈誘発機序を明らかにしたい。
E型ウエルシュ菌イオタ毒素の細胞障害機構の解析と治療薬の開発

腸性中毒症の原因であるE型ウエルシュ菌のイオタ毒素の細胞障害作用メカニズムを検討してきた。本研究では、毒素の腸管上皮に対する検討を行った。イオタ毒素は、IaとIbからなる二成分毒素で、Iaは酵素活性に関与し、Ibは細胞への結合に関与する。Ibが細胞膜のレセプターに結合後、オリゴマーを形成し、これにIaが結合して細胞内に侵入する。Ibの受容体として、Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR)が報告されている。本研究では、イオタ毒素の腸管に対する影響を検討した。さらに、回腸の病理組織標本を作成して観察すると、イオタ毒素の処理量に依存して、回腸ループでの液体貯留が毒素量依存的に増加した。腸管由来Caco2細胞の上皮バリアに対する影響を検討すると、イオタ毒素をトランズウエルで3週間培養したCaco2細胞に作用させると、本毒素は、この細胞のLSRに結合して、上皮バリアーを破壊することが、経上皮電気抵抗値の測定より明らかとなった。この時、イオタ毒素処理後のタイトジャンクションタンパクであるZO-1やクローディンの変化は認められなかったが、細胞骨格を形成するF-アクチンの減少が認められた。次にマウス回腸ループに対するイオタ毒素の作用を検討すると本毒素3時間処理で回腸の絨毛の破壊が観察された。以上より、イオタ毒素は、腸管上皮のLSRに作用して、バリアー機能を破壊し、腸管障害を示すことが明らかとなった。腸性中毒症の原因であるE型ウエルシュ菌のイオタ毒素の細胞障害作用のメカニズムを検討してきた。本研究では、本毒素の細胞レベルでの検討を行った。イオタ毒素はIaとIbからなる二成分毒素で、Iaは酵素活性に関与し、Ibは細胞への結合に関与する。Ibの受容体として、Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor(LSR)が報告されている。LSRは、N末側(270残基)が細胞膜に露出した膜一回貫通型の受容体である。そこで、IbがLSRのN末側のいずれの領域に結合するかを明らかにするため、LSRのN末側を削除した変異体を、LSRを発現していない細胞で発現させ、Ibの結合を観察した。その結果、Ibは、LSRのN末側25残基と結合することが判明した。さらに、siRNAでLSRをノックダウンした細胞では、Ibの結合作用が認められなかった。次に、イオタ毒素のエンドサイトーシスの初期を明らかにするため、エンドサイトーシスの初期に関与する酵素であるスフィンゴミエリナーゼ(ASMase)の役割を検討した。その結果、ASMase阻害剤やASMaseのノックダウンで、毒素の作用が抑制された。以上よりイオタ毒素は、LSRのN末側25残基に結合し、エンドサイトーシス時にASMaseを活性化して侵入することが判明した。本年度は、イオタ毒素のレセプターとの相互作用やエンドサイトーシス時にASMaseが活性化して作用することが明らかとなった。これまで、本毒素でLSRの詳細な相互作用を行った報告はなく、さらに、本毒素の侵入にASMaseが関与する報告もない。すなわち、本年度の結果は、新規な知見である。これまで本研究では、Ibは、LSRのN末側25残基と結合することを明らかにした。本研究では、LSRと相互作用して細胞の結合に関与するIbのCドメイン(D4)の役割を検討した。D4は、大腸菌で組換え体にして発現させ精製した。D4は、Wild-type Ibと同様、細胞に結合し、さらに、D4は、Ia+Ibによる細胞毒性を強く抑制した。すなわち、IbのC末ドメインは、LSRへの結合に関与し、本毒素のエンドサイトーシスの惹起に関与することが判明した。一方、D4は、トリセルラージャンクションに存在するLSRに作用して障害を示すことから、Ibの毒性の本態であると考えられる。本年度は、イオタ毒素のレセプターであるLSRとIbのD4ドメインとの相互作用を明らかにした。これまで、Ibのいずれの領域がLSRと特異的に相互作用するかを行った報告はない。

さらに、回腸の病理組織標本を作成して観察すると、イオタ毒素の処理量に依存して、回腸ループでの液体貯留が毒素量依存的に増加した。腸管由来Caco2細胞の上皮バリアに対する影響を検討すると、イオタ毒素をトランズウエルで3週間培養したCaco2細胞に作用させると、本毒素は、この細胞のLSRに結合して、上皮バリアーを破壊することが、経上皮電気抵抗値の測定より明らかとなった。この時、イオタ毒素処理後のタイトジャンクションタンパクであるZO-1やクローディンの変化は認められなかったが、細胞骨格を形成するF-アクチンの減少が認められた。次にマウス回腸ループに対するイオタ毒素の作用を検討すると本毒素3時間処理で回腸の絨毛の破壊が観察された。以上より、イオタ毒素は、腸管上皮のLSRに作用して、バリアー機能を破壊し、腸管障害を示すことが明らかとなった。今後の検討は以下の方法で行う予定である。1)イオタ毒素の細胞障害作用の機構を詳細に検討する。2)イオタ毒素の腸管毒性を調べるため、腸管上皮バリアに対する作用を検討する。3)イオタ毒素のLSR結合後の局在の変化を細胞レベルで検討する。今後の検討は、以下の方法で行う予定である。1)イオタ毒素のIbのD4の細胞障害作用機構を詳細に検討する。3)イオタ毒素のマウス回腸ループに対する毒性を検討する。使用器具、細胞培養、試薬等が、予定より安価で済んだ。さらに、予定していた旅費が、予想より下回り、次年度に使用額が生じた。(理由)使用器具、細胞培養、試薬等が、予定より安価ですんだこと、さらに、予定した旅費が予想より下回り、次年度に使用額が生じた。(使用計画)次年度は、イオタ毒素の作用を、動物や細胞生物学的な方法で検討する。そのため、多くの試薬や培地、動物飼育などの費用が必要である。さらに、成果発表のための学会出張費にも使用する。次年度は、イオタ毒素の作用を、動物や細胞生物学的な方法で検討を行う。ついては、多くの試薬や培地、動物飼育などの費用が必要である。
アクチン結合蛋白フィラミン－Aによる歯根形成メカニズムの解明

細胞骨格分子に結合し、細胞の機能や形態を制御すると考えられているフィラミンーAに関して、マウスの凍結切片を用いた免疫染色及び、ラット由来歯原性上皮細胞のmRNAを用いたRT-PCRにより、フィラミンーAの発現を確認した。また、フィラミンーAの遺伝子異常を伴うMelnick-Needles症候群患児では、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めた。歯根形成に関するメカニズム解明のため、shRNA-フィラミンーAを過剰発現させ、内因性フィラミンーA遺伝子発現を抑制したSF2細胞にて細胞移動の遅延を認めた。歯数や歯の形成異常の解析は、臨床における様々な症候群を含む全身疾患の有無及び、歯などの口腔組織だけでなく、全身の組織再生へと応用可能な有益な知見となりうる。これまで、増殖因子や細胞外マトリックス等の歯胚形成メカニズムにおける機能に関しての報告はあるが、細胞接着分子及び、細胞の骨格を決定する分子群の役割は未だ明らかではない。細胞骨格のリモデリングは細胞の形と移動の調節の中心である。フィラミンーAは、細胞接着分子インテグリン、膜内外受容体複合体、セカンドメッセンジャーと相互作用することによって、細胞骨格の再編成を調節するタンパク質である。フィラミンーAは、X染色体長腕の第2領域の8番目のバンドに位置している遺伝子FLNAによってコード化された二量体を呈し、細胞内のF-アクチンおよびインテグリンβ1の細胞内ドメインと結合している。そのインテグリンのβ鎖を介してラミニンなどの細胞外マトリックス(ECM)からのシグナルがFAK(focal adhesion kinase)やtailin(細胞骨格タンパク質)、Srcを介して細胞内に伝達されるとともに、フィラミンーAにも伝達され、細胞骨格の再編成や、細胞の増殖・分化に関わっている。このfilaminAの変異は、頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内臓、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動障害を引き起こすことが知られている。また、フィラミンーAの遺伝子変異による疾患はOPD spectrum disordersと呼ばれ、中でもMNSは極めて稀な疾患であり、全身的な症状や診断、治療等に関しては文献に記載があるものの、歯科的所見については歯列不正としか記載がないため、新たな発見が期待される。そこで、細胞接着分インテグリンと細胞内のアクチン結合性アダプター分子であり、細胞骨格を担う分子フィラミンに着目し、歯の形成過程における役割について明らかにする。歯の形成メカニズムの解析は、歯の形成異常を生じる様々な疾患の発症メカニズムの解析のみならず、全身の組織再生へ応用可能な基礎的な知見となりうる。これまで、歯の形成過程においては増殖因子や細胞外マトリックス等の機能に関する様々な報告はあるが、細胞接着分子や細胞骨格を決定する分子群の役割は未だ明らかではない。細胞接着分子や細胞骨格のリモデリングは細胞の形と移動の調節に重要であると考えられている。フィラミン-Aは、細胞接着分子インテグリン、膜内外受容体複合体、セカンドメッセンジャーと相互作用することによって、細胞骨格を再編成するタンパク質である。フィラミン-Aは、細胞内のF-アクチン及びインテグリンβ1の細胞内ドメインと結合しており、そのインテグリンのβ鎖を介してラミニンなどの細胞外マトリックスからのシグナルがFAK(focal adhesion kinase)やtailin(細胞骨格タンパク質)等を介して細胞内に伝達されるとともに、フィラミン-Aにも伝達され、細胞骨格の再編成や、細胞の増殖・分化に関わっている。このフィラミン-Aの変異は、頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内蔵、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動障害を引き起こすことが知られている。また、フィラミン-Aの遺伝子変異による疾患は、OPD supectrum disordersと呼ばれ、中でもMelnick-Needles症候群は極めて稀な疾患である。本疾患に関しては、全身的な症状や診断、治療法に関する文献はあるものの、歯科的所見については歯列不正としか記載がなく、未だ文献がない。東北大学病院小児歯科を受診したMelnick-Needles症候群の患児の口腔内所見として、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めた。そこで、歯の形成過程におけるフィラミン-Aの役割について明らかにする。フィラミン-Aの各歯胚組織発生過程における発現から、フィラミン-Aが発生段階初期よりエナメル質、象牙質、歯根の形成に関与していることは明らかである。また、フィラミン-Aの発現低下が細胞内におけるアクチン線維の再構成や局在に影響を及ぼし、細胞遊走能が遅延する可能性がある。このメカニズムが歯根形成時に働き、Melnick-Needles症候群の患児において結果的に短根になると考えられる。そこで、当教室で保有する歯原性上皮細胞株SF2にshRNA-フィラミン-Aを安定発現する細胞株をプラスミド遺伝子導入により作製し、細胞の移動能について検討を行った。フィラミン-A mRNAの発現が20%程度減少している細胞株SF2-FLNAshRNA1と、60%程度減少しているSF2-FLNAshRNA2の2種類の細胞株が得られた。これらの細胞を用いて、スクラッチ実験による細胞の移動能について検討した。その結果、遺伝子導入をしていないSF2細胞と抑制の程度が低いSF2-FLNAshRNA1細胞では、36時間では完全にスクラッチ部分が閉鎖するにも関わらず、SF2FLNAshRNA2細胞では完全に閉鎖するにはいたらなかった。このことから、Filamin-Aは歯原性上皮細胞の細胞移動に重要であることが示唆された。東北大学病院小児歯科において、フィラミン-A遺伝子に遺伝子変異を有するMelanick-Needles症候群の患児が受診し、著しい歯根形成異常とエネメル室形成不全を認めた。

このフィラミン-Aはアクチン結合蛋白質であり、本遺伝子の変異は頭蓋顔面の構造や骨格、脳、内臓、泌尿器感覚に影響を与え、神経細胞移動障害を引き起こすことが知られている。そこで、フィラミン-Aの歯根形成メカニズムの解明を試みた。フィラミン-Aの歯胚発生過程における発現を解析するために、ICRマウスの凍結切片を用いた免疫染色法を行った。その結果、歯胚発生の初期において特に内外エナメル上皮に強く発現し、出生直後においてはエナメル芽細胞および象牙芽細胞、歯小嚢に限局していた。このことから、歯胚発生過程において、エナメル質、象牙質および歯根の形成に関与している可能性が示唆された。さらに、歯原性上皮細胞において、フィラミン-Aの細胞内局在について、F-アクチンと結合するファロイジンを使用し二重染色を行った。フィラミン-Aはこの細胞骨格タンパク質であるアクチンの細胞膜側で重なり、特徴的な局在パターンを示し、細胞膜直下において細胞外からの細胞接着刺激を細胞内に伝達し、F-アクチンの再構成に関与していることが考えられた。フィラミン-Aは、インテグリンβ1の細胞内ドメインと結合し、外部刺激をの伝達に重要と考えられているため、インテグリンβ1を欠損させたマウスを解析した結果、歯の形成遅延(第3大臼歯)とエナメル質形成異常を認めた。この過程で、フィラミン-A-インテグリンβ1の相互作用が関わっている可能性も示唆された。細胞骨格分子に結合し、細胞の機能や形態を制御すると考えられているフィラミンーAに関して、マウスの凍結切片を用いた免疫染色及び、ラット由来歯原性上皮細胞のmRNAを用いたRT-PCRにより、フィラミンーAの発現を確認した。また、フィラミンーAの遺伝子異常を伴うMelnick-Needles症候群患児では、著しい歯根形成異常とエナメル質形成不全を認めた。歯根形成に関するメカニズム解明のため、shRNA-フィラミンーAを過剰発現させ、内因性フィラミンーA遺伝子発現を抑制したSF2細胞にて細胞移動の遅延を認めた。フィラミン-Aの各歯胚発生過程における発現から、フィラミン-Aが発生段階初期よりエナメル質、象牙質、歯根の形成に関与していることは明らかで、また、フィラミン-Aの発現低下が細胞内におけるアクチン線維の再構成や局在に影響を及ぼし、細胞遊走能が遅延すると考えられる。このメカニズムが歯根形成時に働き、結果として短根になる可能性が示唆された。また、フィラミン-Aの上流分子である細胞接着分子、インテグリンβ1を欠損するコンディショナルノックアウトマウスは、毛の形成異常とともに歯の形成遅延を生じている。このように、これまでの研究成果で、それぞれの分子が歯の形成に重要な役割を演じていることがわかっており、今後はインテグリンβ1を始めとするフィラミン-A周囲の分子との関連をも含めた、より詳細な解析を行っていく。
大規模児童作文コーパスにおける埋め込み節の発達の計量的分析

国語教育への応用を目的として、文の統語的な複雑さを計量的に評価する手法の研究を行う。本研究では特に語や文節ではなく節を単位とする文構造の複雑性に注目し、並列節よりも埋め込み節(名詞節・連体節)の方が認知的負荷が大きいという仮定に基づき、150万語規模の児童作文コーパスに対する節情報などの付与と、統計的および質的分析を実施し、児童の言語発達と埋め込み節の頻度、深さ、機能などの関係を計量的に明らかにする。
ガスセンサータンパク質におけるガス分子認識および機能発現機構解明

野生型CooAの結晶化まず、野生型CooAを培養精製により大量に獲得し、純度をSDS-PAGEで確認後、酸化型および還元型に関して結晶化を行った。初期の結晶化条件検討には当研究室ですでに購入済みであった結晶化剤スクリーニングキットを用い、蒸気拡散法であるハンギングドロップ法によって行った。しかしながら、数十種の結晶化条件を検討したにも関わらず、酸化型、還元型のいずれにおいても微結晶すら確認できなかった。これは以前から言われていたように"ゆらぎ"の部分が存在するため、均一な二量体構造を保持できていないためと考えられる。この均一性を獲得するため、転写因子であるCooAの標的遺伝子配列cooFを結晶化する際に導入することが改善策として考えられた。cooF遺伝子に関してはすでに短鎖DNAを用いて獲得に成功しており、ベクターに組み込んでいるため要時調製が可能である。現在はこの遺伝子を用いた複合体の結晶化条件の検討段階にある。機能性変異体の調製変異体の調製には、Stratagene社のQuikchangeを用い、野生型CooAの配列について部位特異的変異を導入した。124位のメチオニンを塩基性残基のアルギニンに置換した変異体M124Rについて検討を行った。M124Rはすでに酸化型でも転写活性を示すことが報告されているが、その分光学的データは少なかったため、精製後に紫外可視吸収スペクトルを測定した。他の変異体に比べ、M124Rは発現量も少なく精製も困難であったため、高純度のタンパク質を得るためにはこれまでの変異体とは異なる精製段階を考える必要があり、現在はカラム樹脂の条件を検討している。なお、結晶化には用いることは出来ないが、精製後の分光学的あるいは転写活性能測定はすでに可能な段階にあり、結晶化のみでなく他の側面からも検討していく予定である。
新規誘電体材料Snドープチタン酸ストロンチウムの強誘電性発現のメカニズム

SrTiO3(STO)は非線形感受率が大きく、金属イオンのドープにより様々な物性を示す量子常誘電体である。本研究の対象物質Sn1-xSnxTiO3 (SSTO)はSnイオンのドープによる強誘電性の誘起と、それに伴う構造相転移の消滅が生ずるPbフリーの新規誘電体材料として注目されている。熱測定及び光散乱分光を用いて格子のダイナミクスの視点から強誘電相の出現と構造相転移の抑制メカニズムの解明を行った。SSTOの強誘電的相転移温度Tcを誘電率の測定から、構造相転移温度Toは比熱の測定から求めた。相転移に因る比熱の異常はSrSnTiO3がSnドープにより不均質な系となったことによるリラクサー化のために熱異常が極めて小さく、本研究では強誘電相転移に伴う比熱の異常は観測されなかった。一方、R点でのR25モードの凍結に伴う構造相転移は僅かであるが再現性および信頼性のある熱異常を観測することができた。散乱分光からはドープ量の増加に伴うリラクサー化、つまり系の不均一化のためにΓ点での赤外活性モードのソフト化は弱くなることが明らかとなった。結晶構造の観点から、SrO結合エネルギーに比べSnO結合エネルギーが大きく、SnドープによるTiO3八面体の回転に伴う格子変形が阻害され、八面体ネットワークの崩壊と局在化が原因となって構造相転移が抑制されることを明らかにした。これらの熱測定の結果と格子振動の温度依存性、および結晶構造の観点からの考察により、SSTOのSnドープ量をパラメータとする常誘電、量子誘電、強誘電の相図を明らかにし、構造相転移の抑制メカニズムを解明することが出来た。この成果は、日本物理学会で2018年秋の物理学会(同志社大学京田辺キャンパス)で発表した。比熱の異常が予想以上に小さく熱測定の信頼性と再現性を高めるために、異なるドープ量の試料の比熱の測定に多大な時間を必要とした。また、ラマン散乱の測定では、研究対象のSr1-xSnxTiO3(SSTO)試料がセラミックスであったため、20cm-1(約600GHz)以下のスペクトルにおける弾性散乱成分を除去するための測定装置の改良に多くの時間を費やした。この2点のために、当初の計画であった参照物質Pb1-xSnxTiO3(PSTO)に関する測定にあまり時間を割くことができず両試料の比較を十分に行えなかった。追加採択で研究期間が短かったにもかかわらず、SSTOに関しては、比熱の測定によるSSTOの相図が得られた。また、ソフトモードのソフト化の抑制および構造相転移の抑制メカニズムのモデルを作ることが出来た。光散乱分光装置の改良が進み、意味のない弾性散乱成分の寄与を排除できるようになったことより、本研究で残されている計画の低波数域でのラマン散乱スペクトルの精密な測定により、赤外活性モードのソフト化のメカニズムを明らかにする。日本物理学会で発表した構造相転移抑制モデルをジャーナルに投稿する予定であり、引き続き必要な測定と解析を行う。光散乱スぺクトルの情報だけでは格子振動の解析が困難であることを認識するに至り、計算機によるフォノンの計算を取り入れ、測定したスペクトルの解析を計画している。これにより複雑なスペクトル形状の解析が進展すると期待できる。また、今後、この分野でのスペクトル解析の標準となる手法の開発につながると期待している。計画調書中にある緩和モードとソフトモードの振舞いを明らかにするため、SnxS1-xTO3 (SSTO (x=0.02, 0.05 0.1)の試料について、低波数領域10cm-1から80cm-1までのラマンスペクトルの温度変化の測定を行った。転移温度の高い(Tc=180K)x=0.1の試料について緩和モードと3つの減衰振動子モードによる最小2乗法による解析を行った.その結果、ソフトモードの周波数がゼロとなる凍結は観測できなかった。また、緩和モードの温度変化は臨界現象の特徴を示す程の変化は観測されなかった。この結果は修士論文(研究協力者の小林)、日本物理学会(2017年3月)で一部報告している。緩和モードについては、低波数領域スペクトルに弾性散乱成分を十分に除去で来ていない可能性があるので、次年度計画に挙げたノッチフィルターに因る弾性散乱成分の除去のための測定系の改良が必要であることがわかった。母物質であるSrTiO3(STO)に存在するR点のソフトモードによる構造相転移(To)がSSTOにおいては笠谷らによるXRDの構造解析では観測されていない。この構造相転移の有無に関して、29年度の計画に挙げた比熱の測定を前倒しして、Snドープ試料とPbドープ試料について比熱の温度変化の予備的な測定を行った。Snのドープ量を上げるとToでの異常は観測できなくなった。また、計画調書に記した参照物質PbxSr1-xTiO3の比熱の測定においても、予想通りToでの異常は観測されなかった。追加採用であったために計画調書通りの進行ではなかったが、今年度計画していた計画調書中にある緩和モードとソフトモードの振舞いを明らかにするため、SnxS1-xTO3 (SSTO (x=0.02, 0.05 0.1)の試料についての低波数領域10cm-1から80cm-1までのラマンスペクトルの温度変化の測定を行った。

その結果、転移温度の高い(180K)x=0.1の試料について緩和モードと3つの減衰振動子モードによる最小2乗法による解析から、ソフトモードの周波数がゼロとなる凍結は観測できなかったこと、緩和モードの温度変化は臨界現象の特徴を示す程の変化は観測されないことを修士論文(研究協力者の小林)、日本物理学会(2017年3月)で一部報告している。母物質であるSrTiO3(STO)に存在するR点のソフトモードによる構造相転移(To)がSSTOにおいては笠谷らによるXRDの構造解析では観測されていない。この構造相転移の有無に関して、29年度の計画に挙げた比熱の測定を前倒しで実施した。Snのドープ量を上げるとToでの異常は観測できないことが分った。参照物質PbSrTiO3の比熱の測定においても、予想通りToでの異常は観測されないことを確認できた。また、計画調書の29年度計画に記した参照物質PbSrTiO3のPdドープ量を決めるための誘電率の温度変化の測定及び比熱の測定の測定も実施した。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。昨年度から引続き行ってきたAサイト低濃度(x=0.050.1)イオン置換のSnドープS1-xSnxTiO3と参照物質Pbドープsr1-xPbxTiO3試料に比熱の温度変化を構造相転移点と強誘電相転移温度近傍で測定を行った。置換イオンの種類とドープ量の異なる試料での比熱測定結果には、強誘電相転移点近傍ではSnドープには異常が確認できず、Pbでは顕著な異常が確認でき、明らかな違いが見られた。一方、構造相転移温度近傍では置換イオンの違いに因らず同様な振舞いが観測された。この結果から置換イオンの種類に因らないつまりイオンの半径の違いに因らずSrTiO3のゾーン境界のソフトモードによるTo構造相転移は低濃度ドープ量が約5%で消失することが明らかとなった。この結果は、構造相転移の消失はイオンの種類に因らず結晶構造の安定性によるものと考えられる。これまでトレーランスファクターによる考察で進めていたが、新たな考察の方向を見出すことが出来た。また、低濃度ドープ領域では、Snドープ資料では強誘電性の発現はリラクサー的であり、Pbドープ試料では強誘電的であり、この違いがSnドープ試料の強誘電性の特性を導いていると考えている。一方、Sr1-xSnxTiO3試料のラマンスペクトルではソフトモードと関係していると思われる強誘電相でのソフトモードのハード化は観測されているがソフトモードの明らかな凍結は観測されていない。また、分極揺らぎによる緩和モードの存在も決定的な実験的根拠は得られていない。参照物質、Sr1-xPbxTiO3試料のスペクトルの温度変化の比較を行うためにスペクトルの精密な測定と詳細解析が必要であることがわかった。不透明な酸化物セラミックスの場合、ソフトモードの測定は弾性散乱の影響が強くシグナル強度も弱い。29年度は、計画通り強誘電性の起源を明らかにする低波数領域(10100cm-1)の2次元の検出器とノッチフィルターを用いて時間を短縮する効率的な測定装置の構築を行った。低波数側が20cm-1まで測定が可能となった。28年度に実施した比熱測定の技術の修得を目的とする予備的な比熱の測定で得られた、SnおよびPbによるAサイト置換したSrTiO3の約105Kでの構造相転移近傍の比熱の測定により、高濃度のAサイトSn置換とPb置換では、置換原子のイオン半径に依らず、構造相転移が消失することを明らかにすることが出来た。
ネットワーク構造を精密に予測可能な高分子ゲルの合成

高分子ゲル中の高分子ネットワーク構造は力学特性などに大きく影響するが、その制御は困難である。本研究では、無限周期構造を有する結晶中に、結晶の構成成分としてモノマーと架橋剤を固定したまま重合することで、設計通りの三次元高分子ネットワーク構造を合成する手法の開発を目指す。規則的に配列したモノマーと架橋剤を重合すれば、生成する網目構造はボンドパーコレーションにより高い精度で予測可能になると期待される。さらに、様々な構造の結晶や超分子集合体中に固定したモノマーと架橋剤の重合により、多様な構造の高分子ネットワークを作製し、その構造と物性の相関を調べる。
明治日本の国家形成と国際法秩序の変容

本年度は、近代日本の国家構造を明らかにするために、日本における立憲制度の歴史を概観する研究をおこなった。戦後の日本で憲法に対するシニシズムがついてまわってきた最大の原因は、日本国憲法が国際法との関係で、その最高法規性が問題となったことである。戦後の憲法論議が第九条に集中してきたことは、そのもっとも顕著なあらわれである。日米安全保障条約と日本国憲法第九条とが矛盾するとすれば、いずれが尊重されるべきなのか、といった問題が長く問題とされてきた。国際政治の常識や国際協調主義を持ち出す主張に対して、護憲派は日本国憲法の普遍性と先駆性を理由にして、これに抗した。このようなことが問題になること自体、戦後の日本では、憲法と日米安保条約の二つの最高法規があった、あるいは日本国憲法の最高法規性に対する疑念を払拭することができなかったことを示している。戦後の憲法論議に欠けている視点は、戦前と戦後を通じた憲法上の課題は何かを考えることである。その最も大きな課題は、議院内閣制をめぐる問題であった。帝国憲法では内閣に関する規定は存在していなかった。議院内閣制を説いた美濃部憲法学がしばしば解釈改憲と呼ばれるのは、そのためである。戦後の日本において国民主権と矛盾するはずの官僚主導がしばしば問題になってきたのは、実は日本国憲法に規定されている国民主権が官僚主導との親和性を有しているためであり、日本において国民の代表を選出するという発想が、強くなかったためである。事実、戦前の日本では、国民の要望や選好を吸収したうえで公論を編成するという作業をおこなうシステムを日本の政党は、つくられなかった。また、大日本帝国憲法発布前より、政党政治を主張する者も、それに反対する者も、政党に有能な人材がいないことを前提としていたのである。本年度は、研究論文を一本雑誌に公表したほか、研究会での口頭報告を一本おこなった。前者は、戦前日本における国際法と国内法の関係をめぐる議論について分析したもので、前年度からの研究をまとめたものである。戦前の帝国憲法においては、条約締結権は天皇大権の一つとされていた。政府は慣行上、国内法に関係する条約であっても、直接国内的効力を有するものとし、立法権への協賛が帝国憲法に規定されている議会が条約の締結に関与することは、認められていなかった。しかしながら、条約をはじめとする国際法と国内法との間に抵触が生じた場合、どちらが優越するかについては、見解がわかれていた。その結果、重要な論争が発生したが、それは単に国際法と国内法の関係のみならず、国際社会と国家主権との関係をも問うものであった。今回発表した論文では、政府の実行ではなく、戦前日本の代表的な国際法学者と憲法学者との論争を分析し、なぜこのような論争が展開されなくてはならなかったのかを論じた。後者の口頭報告は、第一次世界大戦後の国際連盟中心主義がなぜ大東亜国際法へ変化したのかを考察することによって、第二次世界大戦後の国際連合中心主義の性格を考えるための基礎作業を試みたものである。第二次世界大戦後の日本では、国際連合中心主義というべき主張が説かれつづけており、現在そのような主張に対する批判がなされている。しかし、そもそもなぜ戦後の日本では国際連合中心主義が、多くの論者によって説かれたのかを問題にした研究はない。そこで、戦前にさかのぼって考察したのが、今回の報告である。近い将来、論文化する予定である。本年度は、美濃部達吉『憲法講話』復刻版の解説と日本国憲法に関する論文(4月刊行予定)を執筆し、口頭報告を1本おこなったほかは、史料収集とその整理・分析に専念した。口頭報告は、日露戦争と戦時国際法に関するものであり、近代東アジア史学会の例会にて報告した。近代日本における戦時国際法の歴史に関する研究は、十分な蓄積があるとはいえない。主に当時の国際法学者の学説の紹介か中立法規の歴史的発展との関係で言及がなされてきた程度である。そこで、本報告では、海戦法規に焦点をしぼり日露戦争のさいにいかなる戦時国際法の問題があったか、を捕獲審検所の書類や外務省記録などを使って具体的に明らかにした。具体的な論点とは、(1)開戦の時期をめぐる問題、(2)韓国を中立国とみなすか否かの問題、(3)敵性をめぐる問題、(4)国際法と国内法の関係をめぐる問題である。さらに、日露戦後ハーグにおいては第二回万国平和会議が、ロンドンにおいて海戦法規に関する国際会議が開催されたが、これらの国際会議に日露戦争における日本の経験がどのように影響したのかを探った。日露戦後、日本においては、海上捕獲事件調査会が設置され、日露戦時中に制定された関連法規の検討と海戦法規に関する諸外国の先例に関する調査がなされた。そこでなされた議論は、日露戦争のさいに発生した問題を受けてのものであった。第二回万国平和会議を経て列強は海戦法規に関するロンドン会議を開くが、日本側は日露戦時中の経験と海上捕獲事件調査会における検討をふまえて会議に参列し、みずからの見解を主張した。この口頭報告の成果については、次年度論文化する予定である。

戦後の憲法論議が第九条に集中してきたことは、そのもっとも顕著なあらわれである。日米安全保障条約と日本国憲法第九条とが矛盾するとすれば、いずれが尊重されるべきなのか、といった問題が長く問題とされてきた。国際政治の常識や国際協調主義を持ち出す主張に対して、護憲派は日本国憲法の普遍性と先駆性を理由にして、これに抗した。このようなことが問題になること自体、戦後の日本では、憲法と日米安保条約の二つの最高法規があった、あるいは日本国憲法の最高法規性に対する疑念を払拭することができなかったことを示している。戦後の憲法論議に欠けている視点は、戦前と戦後を通じた憲法上の課題は何かを考えることである。その最も大きな課題は、議院内閣制をめぐる問題であった。帝国憲法では内閣に関する規定は存在していなかった。議院内閣制を説いた美濃部憲法学がしばしば解釈改憲と呼ばれるのは、そのためである。戦後の日本において国民主権と矛盾するはずの官僚主導がしばしば問題になってきたのは、実は日本国憲法に規定されている国民主権が官僚主導との親和性を有しているためであり、日本において国民の代表を選出するという発想が、強くなかったためである。事実、戦前の日本では、国民の要望や選好を吸収したうえで公論を編成するという作業をおこなうシステムを日本の政党は、つくられなかった。また、大日本帝国憲法発布前より、政党政治を主張する者も、それに反対する者も、政党に有能な人材がいないことを前提としていたのである。
ハプトグロビンとヘモグロビンの特異的相互作用機構の解明

申請した研究課題について以下の成果を得たので報告する。1.『差標識化学修飾法によるハプトグロビン(Hp)のヘモグロビン(Hb)結合部位の同定』......申請書『研究方法』に従ってHp-Hb複合体をまずアセトアミジン化した。次にSDSを加えて両者を解離させた後、Hp上の未修飾アミノ基をトリニトロフェニル(TNP)化した。その結果、H鎖に2.5ケのTNP基が導入された。一方、L鎖はほとんどTNP化されず、Hbとの結合に直接関与しないことが確かめられた。TNP化H鎖をキモトリプシン消化し、消化物を逆相系高速液体クロマトにかけることによって3種のTNP化ペプチドを得ることができた。それらを分析した結果、TNP基はIle-1のα-アミノ基、Lys-136およびLys-218のε-アミノ基にそれぞれ導入されていることが分かった。一方、上記『修飾法』を遊離のHpに適用した『対照実験』を行った所、H鎖へのTNP基の導入個数は0.6ケへと減少し、しかもそれはもっぱらIle-1のα-アミノ基に導入されていた。従って、以上の結果から(1)HpのHb結合にはH鎖上のLys-136とLys-218の2残基が関与すること、(2)H鎖Ile-1のα-アミノ基は遊離の状態においても分子内に埋れて存在すること、が明らかになった。2.『免疫化学的方法によるHpのHb結合領域の同定』......項目1の差標識実験からHbとの結合に関与することが明らかとなったLys-136を含むペプチド(124138)及び“extraloop"に含まれるペプチド(159175)を合成し、均一なペプチドを単離した。予備的検討では、これらのペプチドがHpのHb結合反応を阻害するという結果は得られなかった。今後はより低濃度のHpとHbの使用が可能な高感度結合活性測定法の開発と、より長鎖のペプチドの調製を検討し、差標識法によって明らかにした2つのリシン残基のHb結合における具体的な役割(どちらのリシン残基がHbα又はβサブユニットとの結合に関与するのか)を明らかにし、Hp-Hb間相互作用を分子レベルで解明していきたい。
胎児嗅上皮の発生・成熟過程の形態学的解析 走査電子顕微鏡による検討

マウス胎児への実験的操作を用いて、神経細胞の発生促進効果が報告され、神経細胞産生のkeymoleculeの一つであると考えられているleukemia inhibitory factor(LIF)による嗅上皮の発生成熟促進を試みた。方法は、マウス妊娠14日目の羊水腔にLIFを子宮外発生法によりマイクロインジェクションした後、24時間後に母獣にbromodeoxyuridine (BrdU)を腹腔内投与して、2時間後に安楽死させる。なお、LIFの濃度は1×10^6 unit/mlであり、投与量はコントロール群、LIF 1 μl(羊水中の濃度6×10^3unit/ml)、LIF 10 μl∂(羊水中の濃度6×10^4 unit/ml)を設定した(E14における平均羊水量を0.162mlと算出した)。胎児を摘出し、BrdUで標識したDNA合成期(S期)の細胞を抗BrdU抗体を用いた免疫染色により検出する。定量的な解析を行うために、系統的かつ無作為に選出した組織切片上で、鼻中隔側の嗅上皮のBrdU陽性細胞数をカウントした。対照群には同胞の胎児羊水にLIF抜きの溶媒をタイクロインジェクションし、同様にBrdU陽性細胞数をカウントする。結果は、コントロール群のBrdU陽性細胞数(細胞数/mm)は115.6±28.5、LIF 1 μlでは、128.7±30.2、LIF 10 μlでは149.8±26.1であり、コントロール群とLIF 10 μl群との間に有意差(P<0.01 (Dunnett法)による)を認めた。以上より、LIFは胎生期の嗅上皮発生の成熟促進因子である可能性が示唆された。今後は嗅上皮分化過程のどのレベルに作用するかどうかなどの詳細を検討する予定である。嗅上皮の発生・成熟過程をヒト胎児標本の微細形態学的解析により明らかにするべく、嗅上皮の発達過程を走査電子顕微鏡において観察した。結果は、CRL100mm大の胎児は嗅上皮表面に部位によりむらがあるが、20から30個/1000μm^2認めた。しかしこの時期の嗅小胞は、大小不同の小球状で孤立性に分布しており、嗅線毛は嗅小胞1個に1から2本程度で、嗅腺毛の長さは短く、全体の表面構造上は未熟である印象であった。CRL150mm以上になると嗅小胞の数が増加し単位面積あたり30個以上の嗅小胞を認めるようになった。その大きさは大小不同であるが3から6個程度にグループを形成し分布するようになり、嗅小胞から伸びる嗅腺毛は、長さ、数ともに増加した。CRL200mm以上になる、嗅小胞数の多い胎児に比べ、グループ形成していた嗅小胞の分布状態が孤立して存在する嗅小胞が観察された。そのような個体では、嗅小胞数が減少し、嗅小胞の大きさの差が少なくなる傾向がみられた。さらに、嗅腺毛数、長さもさらに増加する傾向を認めている。成熟状態では嗅小胞は孤立して存在し、非常に多く、かつ長い線毛が各嗅小胞に確認されるようになる。以上より、SEMによる嗅上皮表面構造のみ所見では、CRL200mmから300mmごろの胎児期に成熟段階にはいるのではないかと推察する。
珪酸塩メルト蒸発のカイネティクスと同位体分別

非平衝条件下で珪酸塩メルトおよび固体鉱物からの蒸発による元素および同位体の分別は、メルトの構造、鉱物の構造や結晶内部の元素の拡散が反応を支配すると考えられ、温度・圧力・雰囲気(fO2,fH2など)をコントロールした実験が必要である。さらに、太陽系星雲は水素ガスからなっており、蒸発速度は平衝、非平衝条件下とはまた異なったものとなることが推定され、実験的に反応速度を求める必要がある。そのため、東京大学理学部5号館に既存の真空装置を改良して、タングステンメシュ炉を導入した。それを用いて、様々な水素圧力条件下でのかんらん石の蒸発速度を求めた。その結果をHashimoto(1990)による蒸発エンタルピーを用いて低温に外挿し、珪酸塩メルト蒸発時における同位体元素分別の可能性について検討した。コンドリュールメルトの蒸発による界面後退距離を求め、拡散距離と比較してラフにコンドリュール加熱時における蒸発残渣の同位体分別の可能性を考えた。ほとんどの圧力、温度領域で元素の拡散距離はコンドリュールメルトの蒸発距離より大きいことが判明した。コンドリュールの融解時間はかなり瞬間的に近いと考えられているので、この温度ではコンドリュールメルトは融解時に十分内部は均質化され、蒸発に際し同位体分別が可能であるということである。天然のコンドリュールおける同位体分別を2次イオン質量分析計を用いて測定したところ、Mgについてのみわずかな分別がある可能性が示唆された。しかし本研究はメルトからの蒸発過程でコンドリュール形成時の同位体分別の可能性は低く、もし分別があるなら、コンドリュール形成以前に存在していたものが融解をうけずに残っていることを表している。
HABP2を介した膵癌悪性進展メカニズムの解明による膵癌新規治療戦略の開発

本研究の目的は、膵癌におけるHABP2(Hyaluronan Binding Protein 2)の生物学的役割(悪性形質への関与)を、とくに低分子ヒアルロン酸との相互作用から明らかとすることである。これまでに以下の実験を行い、新たな知見を得た。すでにpreliminaryではあるが実験データが得られており、国内学会での報告を済ませていることより、おおむね順調に進展していると考えられる。今後は、膵癌におけるHABP2の悪性化メカニズムについて、低分子ヒアルロン酸との関係を調べる。さらに、HABP2をターゲットにした新たな治療戦略を考案する。このため、膵癌細胞のHABP2のノックアウトクローン、強制発現クローンの腫瘍成長・進展(浸潤、転移)をそれぞれマウスの同所性自家移植モデルを用いて調査する。一部、試薬の購入が遅れたため年度内に助成金を使用しなかったが、本年度の試薬購入に使用する予定である。
保健師による育児支援の機能を取り入れた乳幼児健康診査実施モデルの構築

本研究の目的は、「育児支援」の機能を重視した乳幼児健康診査としていくために、各地の乳幼児健康診査の実態および保健師の役割を明らかとし、「育児支援」の機能を取り入れた乳幼児健康診査実施モデルを構築することである。本年度は、全国の乳幼児健康診査における「育児支援」の取り組み状況の実態を調査する。方法は、郵送法による自記式質問紙調査を行った。対象は、全国の保健所409ヵ所の母子保健担当の保健師に対し、管内市町村において、「育児支援」機能を取り入れている乳幼児健康診査を実施している市町村12ヵ所の推薦を依頼した。その後、保健所から推薦のあった市町村および政令市・特別区・中核市383ヵ所の母子保健担当の保健師に対し、質問紙を配布した。調査期間は、平成18年13月である。本研究は、所属研究機関の「疫学倫理委員会」の承認を得た上で実施した。結果、市町村の推薦を依頼した保健所からの回収率は44%であった。推薦のあった市町村、政令市・特別区・中核市からの回収率は36%(現在、回収中)であった。具体的な育児支援の工夫として、「乳幼児健康診査実施中の工夫」は、問診票の工夫(虐待予防スクリーニングの活用、育児姿勢・育児不安・心のヘルスチェックの把握)、音楽の活用、絵本の読み聞かせ、スタッフ構成や方法の充実、母親の友達づくりの機会、離乳食・幼児教室の同時開催などであった。「乳幼児健康診査実施後の工夫」は、健診の満足度を聴取し声を繁栄した健診体制の整備、未受診者への育児支援家庭訪問の実施などであった。「乳幼児健康診査の体制整備の工夫」は、妊娠時から就学までの一貫した体制、健診と中高生の赤ちゃん体験との同時開催による虐待予防と思春期保健の推進、児童虐待予防対策委員会などの設置による関係機関との連携などであった。全国各地における創意工夫のある「育児支援」機能を取り入れた乳幼児健康診査の実態が明らかとなった。
アデノウイルスベクターによる神経芽腫に対するN-myc遺伝子の導入と抑制

N-myc蛋白は、胎生期の神経芽細胞に強く発現し、その細胞分裂を促進し分化を抑制していると理解されている。神経芽腫におけるN-mycの機能の解明は、高悪性度の神経芽腫の本態を明らかにすることになり、治療戦略の根本的な再構築に結びつくことになる。本研究では、N-myc発現アデノウイルスを神経芽腫培養細胞に感染させ、N-mycが神経芽腫の増殖、分化、細胞死に働く機構を解析する。本年度は、昨年度に作成した組み換えN-myc発現アデノウイルスAXCACHN-mycを用い、神経芽腫の分化に深く関わるNGF(神経成長因子)のシグナルとN-mycとの関与を検討した。NGFの受容体であるtrk Aの発現に対するN-myc発現の影響について、β2-Microgrobulineをインターナルマーカーとした定量的RT-PCRにて検討した。神経芽腫細胞株RT-BM-1をレチノイン酸で処理することによりtrk Aの発現が速やかに上昇するが、N-mycを導入したRT-BM-1においては、レチノイン酸によりtrk Aの発現は上昇するが、その発現量はコントロールに比べて低い事が明らかになった。このことから、N-mycはtrk Aの発現を抑制している可能性が示唆された。さらに、N-mycが神経芽腫の分化に及ぼす影響を知るため、レチノイン酸を用いてRT-BM-1を分化させる系で実験を行った。この分化誘導の際、N-mycの発現が著明に抑制されるがことが知られている。そこで、AxCACHN-mycを用いてN-mycを導入し、N-myc発現が抑制されない状態を作り、レチノイン酸による分化が抑制されるか否かを検討した。しかし、この結果、N-mycを導入した細胞でもレチノイン酸によりに分化が誘導され、レチノイン酸の系では、分化におけるN-mycの役割がNGFシグナルとは異なっていることが示唆された。その具体的機能は核内蛋白としてE-box motifに結合する転写因子であるとされているが、詳細は不明である。本研究では神経芽腫の中で機能するN-myc蛋白の働きを明らかにするため、N-myc cDNAをアデノウイルスベクターに組み込み、N-myc発現アデノウイルスを作成し、N-mycの増幅のない神経芽腫培養細胞に感染させ、N-mycが神経芽腫の増殖、分化、細胞死に働く機構を解析する。平成11年度は、まずアデノウイルスベクターの作成を行った。当教室でクローニングしたヒト全長N-myc cDNAをアデノウイルス・コスミッドカセットpAxCAwtに組み込み、大腸菌に感染させシングル・クローンを得た。各クローンの制限酵素消化パターンにより、N-mycの組み込みの順方向、逆方向を確認した後、順方向のクローンを親ウイルスAd5 dIXと共に293細胞に感染させ、組み換えアデノウイルスAXCACHN-mycを作成した。次に、N-myc遺伝子の増幅の無い神経芽腫培養細胞SK-N-SHにN-myc発現アデノウイルスをmoi=1,5,20で感染させたところ、N-myc遺伝子が増幅した神経芽腫培養細胞IMR32を凌ぐN-myc蛋白の発現が、moi=20において誘導されることがWestern blottingで確認された。また、遺伝子導入後の細胞形態と増殖動態を解析したところ、moi=1,5では、細胞の形態が丸みを帯び、神経突起の短縮が観察された。しかし、細胞増殖に影響は見られなかった。moi=20で感染させると、1週間前後より細胞死が観察され、この現象はコントロールアデノウイルス(LacZ)では認められなかった。