hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スギゲノムの連鎖地図並びに制限酵素断片長多型の連鎖地図作成の支持研究

1.致死遺伝子を考慮した連鎖分析計算手法の開発:致死遺伝子座と標識遺伝子座、RFLP座およびRAPD座との組換価の推定に2座を組み合わせた分離比の各座の集計値で解析方法を用いた。遺伝子の優劣・共優性などを考慮した6通りの組合せごとに各セル、集計値の期待分離頻度を求め、最尤法による組換価の推定式をまとめた。パーソナルコンピュータによる計算プログラムを作成した。2.スギのゲノム地図の作成:クモトオシ(♀)とオキノヤマスギ(♂)を両親とした3世代家系についてゲノム解析を行い、128個のRFLP座、33個のRAPD座、アイソザイム遺伝子2座および矮性遺伝子1座の計164座について、13連鎖群、総延長1,190cMの連鎖地図をまとめた。13連鎖群の内8連鎖群において、分離比が異常な座がクラスターを形成していた。また、スギ精英樹の種子の胚乳を使用し、作成した175個のRAPD座について、14連鎖群、総延長2,212.3cMの連鎖地図を作成した。3.致死遺伝子座とアイソザイム遺伝子座、RFLP座あるいはRAPD座間の連鎖分析:先述のクモトオシとオキノヤマスギの3世代家系の連鎖地図での異常分離比の座について、致死遺伝子座の検出を試み、6連鎖群について12座の致死遺伝子座の位置を決定した。また、これらの致死遺伝子座を組み込んだ場合、地図距離が長く推定されることを示した。4.スギゲノムの構成染色体の個別識別:スギの花粉母細胞にrDNAをプローブとしてin situ hybridizationをしたが、シグナルが弱かった。染色体の分染法の改良と共にレーザー光による染色体断片の切り出しとその回収ができた。(1)胚致死遺伝子を考慮した連鎖分析計算手法の開発:劣性標識遺伝子ヘテロ個体の戻し交雑と自殖とに大別し、胚致死遺伝子との連鎖の有・無に細区分して分離の期待頻度を求めた。それにより組換価推定の計算方法を求め、ついで共優性遺伝子2座と胚致死遺伝子1座とが関係した場合の分離比、期待頻度の誘導および組換価の推定計算方法を検討した。(2)色素・形態変異等の劣性標識遺伝子ホモ個体の作出:ヨレスギ(針葉よれ:優性遺伝子)、ミドリスギ(冬期の緑色針葉:劣性遺伝子)白子・黄子・淡緑色苗・形到異常苗等を生じる劣性遺伝子について劣性ホモ個体作出の交雑を行った。(3)標識遺伝子座とアイソザイム遺伝子座、アイソザイム遺伝子座間の連鎖分析:標識遺伝子のヨレスギおよびミドリスギをそれぞれ片親とした交雑F_1の自殖後代について両標識遺伝子座における期待分離比3:1に適合した家系、また不適合の家系についてAap-1、Est-1、Lap、Mnr、Px、Shd-2のアイソザイム分析をした。ヨレスギ遺伝子座と連鎖しているアイソザイム遺伝子座は検出されなかったが、Shd-2とLapの遺伝子座近傍にそれぞれ胚致死遺伝子座の存在が推定された。(4)スギ核DNAのRFLPプローブおよびRAPDマーカーの作製:RFLP解析およびRAPD解析のためオキノヤマスギとクモトオシ、G-5と佐賀3号の両親、F_1、F_2(合計8家系、627個体)の新葉からDNAを抽出した。RFLP解析用として制限酵素Hind IIIで切断したDNAを大腸菌プラスミドベクターpUC19でクローニングし、RFLP解析に適した約400個のプローブを選定した。前記3品種について、RAPDマーカー開発のため218種のプライマーを検定した。RCR増幅の結果、132種のプライマーで増幅が確認され、多型がみられた約90種のプライマーを選定した。(5)スギゲノムの構成染色体の個別識別:

スギ根端の体細胞染色体に、rDNAをプローブとしたinsitu hybridizationにより、二次狭窄部に弱いながらも反応があった。1.胚致死遺伝子を考慮した連鎖分析計算手法の開発:アイソザイムなど共優性標識遺伝子の交雑家系における分離比からの組換価の推定方法をまとめた。ついで連鎖検定目的の両標識遺伝子座ごとの集計した分離比での胚致死遺伝子との連鎖の有・無に細区分して分離の期待頻度を求め、組換価推定の計算方法をまとめた。2.色素・形態変異等の劣性標識遺伝子ホモ個体の作出:ヨレスギ(針葉よれ:優性遺伝子)、ミドリスギ(冬期の緑色針葉:劣性遺伝子)戻し交雑による分離後代の育成、ヨレスギおよびイワオスギなどの自殖により劣性遺伝子について矮性および淡緑色の劣性ホモ個体作出の育苗を行った。3.標識遺伝子座とアイソザイム遺伝子座、アイソザイム遺伝子座間の連鎖分析:Est-1とDia-3が相引で0.305、Dia-3と胚致死遺伝子1とが相反で0.262の組換価が推定された。また、別の胚致死遺伝子がいずれも相反で、Lapと0.209、G6pと0.170の組換価が推定された。4.スギのゲノム地図の作成:クモトオシ(♀)とオキノヤマスギ(♂)の両親、F_1、F_2の1家系家系を用い、RFLP、RAPD、アイソザイムおよび形態(矮性)の連鎖地図の作成をした。79のRFLP遺伝子座(74のcDNAおよび5つのジェノミッククローン)、53のRAPD遺伝子座、2つのアイソザイム遺伝子座(Lap,Aco)および1つの矮性遺伝子の分離をF_2で確認した。合計135個の遺伝子座の内、100個を21の連鎖群に、内75個は18連鎖群に地図化した。5.スギゲノムの構成染色体の個別識別:スギの花粉母細胞にrDNAをプローブとしてin situ hybridizationをしたが、シグナルが弱かった。染色体の分染法の改良と共にレーザー光による染色体断片の切り出しとその回収ができた。1.致死遺伝を考慮した連鎖分析計算手法の開発:致死遺伝子座と標識遺伝子座、RFLP座およびRAPD座との組換価の推定に2座を組み合わせた分離比の各座の集計値で解析方法を用いた。遺伝子の優劣・共優性などを考慮した6通りの組合せごとに各セル、集計値の期待分離頻度を求め、最尤法による組換価の推定式をまとめた。パーソナルコンピュータによる計算プログラムを作成した。2.スギのゲノム地図の作成:クモトオシ(♀)とオキノヤマスギ(♂)を両親とした3世代家系についてゲノム解析を行い、128個のRFLP座、33個のRAPD型、アイソザイム遺伝子2座および矮性遺伝子1座の計164座について、13連鎖群、総延長1,190cMの連鎖地図をまとめた。13連鎖群の内8連鎖群において、分離比が異常な座がクラスターを形成していた。また、スギ精英樹の種子の胚乳を使用し、作成した175個のRAPD座について、14連鎖群、総延長2,212.3cMの連鎖地図を作成した。3.致死遺伝子座とアイソザイム遺伝子座、RFLP座あるいはRAPD座間の連鎖分析:先述のクモトオシとオキノヤマスギの3世代家系の連鎖地図での異常分離比の座について、致死遺伝子座の検出を試み、6連鎖群について12座の致死遺伝子座の位置を決定した。また、これらの致死遺伝子座を組み込んだ場合、地図距離が長く推定されることを示した。
KCNQ2ノックインマウスを用いた予後不良型BFNCの病態解明

熱性けいれん患者96人の遺伝子スクリーニングを行い、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性チャネル(HCN) 2の変異(S126L)を発見した。熱性けいれんの病態に近づけるため灌流温度を室温から38度に上昇させると、変異型のV_1/2が野生型と比べ有意に大きく脱分極側に移動し、開口速度が短縮した。サイクリックAMP(cAMP)に対する反応性は野生型と変異型で有意差は認められなかった。以上のことからこの変異は発熱によって神経の興奮性を変化させることが示唆された。良性家族性新生児けいれん(Benign Familial Neonatal Convulsions,以下BFNCと略す)は生後23日のけいれん発作にて発症する疾患である。BFNCは脳内の電位依存性カリウムチャネルの遺伝子であるKCNQ2とKCNQ3の変異によって発症する、いわゆるチャネル病であることが遺伝子解析により発見されている。このうち、予後不良なBFNC患者の遺伝子変異は、主にKCNQ2遺伝子のS5,S6,C末領域に集中していることが報告されている。そこで我々はKCNQ2遺伝子S5領域に変異(S247W)を持つ予後不良症例に着目し、変異遺伝子を作成し、この変異遺伝子と遺伝子組み換え技術を用いてノックインマウスを作成した。今年度は、ノックインマウスから、脳発達期の幾つかの異なるタイムポイントにおいて脳組織を採取し、酵素処理による神経細胞の単離・初代培養を行う。あるいは、脳スライス標本を作成する。これらにパッチクランプ法を適用して、単離細胞レベルおよび神経ネットワークが保存された状態の単一細胞における膜電流やシナプス電位・電流の測定・解析を行い、正常組織から得られた結果と比較検討する。更にノックインマウスに見られる変化が、活動電位発生閾値低下や興奮性/抑制性シナプス伝達のバランスの変化を説明しうるかについて、"Neuron v.6.2"などのシミュレーションモデルを活用して検討する。また、当教室のてんかん患者遺伝子スクリーニングにおいて、HCN2遺伝子の変異が発見された。我々は前年度、HCN2遺伝子変異体を作成した。今年度はRCN2変異体遺伝子を培養細胞に導入・発現させ、電気生理学的検討をする実験を上記の計画と並行して行うことにした。今年度は以下の実験を行った。1.前年度に作成したKCNQ2遺伝子S5領域に変異(S247W)を持つノックインマウスから、脳組織を採取し、酵素処理による神経細胞の単離・初代培養を行った。2.これらにパッチクランプ法を適用して、単離細胞レベルおよび神経ネットワークが保存された状態の単一細胞における膜電流やシナプス電位・電流の測定を行ったところ、正常組織から得られた結果と比べ変化が認められた。また、前年度より引き続き、熱性けいれん患者から発見されたHCN2遺伝子変異より作成した変異体の機能解析を並行して行い、以下のような実験を行った。1.遺伝子変異蛋白を培養細胞に発現させ、パッチクランプ法による室温での電気生理学実験を行い、野生型と変異型の電気的性質を比較した。両者で活性化電位に変化が認められた。2.還流液の温度を上昇させて同様の実験を行い、野生型と変異型を比較した。少なくとも時定数と電流密度において両者に違いを確認することが出来た。以上の内容を第87,88回日本生理学会にて発表した。今年度は前年度に引き続きKCNQ2遺伝子S5領域に変異(S247W)を持つヘテロノックインマウスの機能解析を行ったが、比較対照と同時に検討を行っていたHCN2について興味深いデータを発見したので最終年度の今年はHCN2について記述する。熱性けいれん患者から発見されたHCN2遺伝子変異より作成した変異体の機能解析を並行して行い、還流液の温度を上昇させて温度依存性に変化が認められるかを野生型と変異型について比較した。解析の結果、温度上昇時には活性化曲線が変異型において有意に脱分極側に移動していた。また主に脱分極電位に近い値で、変異型における時定数の速い成分が野生型と比べ有意に速くなっていることを明らかにした。以上の結果から、このHCN2遺伝子変異は熱性けいれんの発症に関係することが強く示唆された。以上の内容を第89回日本生理学会、The 1st international symposium of research institute for the molecular pathomechanisms of epilepsyにて発表した。現在熱性けいれん患者において、HCN2遺伝子異常の報告は日本国内では皆無であり、世界的にも現在までに発見・解析されているのは2例のみである。

また熱性けいれんとHCN2の直接的な因果関係を明らかにするために温度感受性の実験を行った研究は世界的にも報告がない。以上から今回の研究は非常に意味があるものと考えられる。
制約付マルコフ決定過程への遺伝アルゴリズムの適用に関する研究

複数の評価規範を持つマルコフ決定過程(Markov Decision Process:略してMDP)を制約付MDPとしてとらえ、定常純政策の範囲で解析を行った。制約付MDPにおける厳密な最適政策の導出方法は未だ提案されていないし、これからも良い結果は期待出来ないと判断した。そこで、本研究では、組み合わせ最適化問題に対する近似解法として研究されている遺伝アルゴリズム(Genetic Algorithm:略してGA)による制約付MDPの近似解法の開発とその応用を目的とした。2.貯水池放流量決定問題:一貯水池の最適放流量決定問題を取り扱った。時間平均渇水頻度および渇水継続時間を制約に持つ渇水による時間平均コスト最小化問題を考え、はじめに2制約付MDPとして定式化した。この問題のGAによる近似解法として、世代の更新において1ステップの政策改良法を用いるハイブリッド型のGAを提案し、厳密解を求め得ないサイズの大きな例題に適用しその有効性を検証した。この結果は、「ハイブリッド型遺伝アルゴリズムによる複数の信頼性制約を含む貯水池操作設計ルールの解法」の題目で水文水資源学会誌に投稿の予定である。
カテキン三量体を創薬シードとした新規アルツハイマー病治療薬の開発

アルツハイマー病(AD)の原因は高い凝集能と強力な神経細胞毒性を有するアミロイドβタンパク質(Aβ)であると考えられている。カテキンなどの天然の抗酸化物質はAβの凝集を阻害する。我々はカテキンの立体構造を化学修飾により平面に固定化した「平面型カテキン」が、強力な抗酸化作用とAβの凝集阻害作用を示すことを明らかにした。カテキンの重合体であるプロシアニジンは抗酸化作用や動脈硬化抑制作用を示し、その作用は重合度が増すほど強くなる。そこで本研究では、近年ADにおける認知障害の改善作用が報告されたカテキンの三量体について、構成単位のカテキンの立体構造を平面に固定化した誘導体の設計・合成を行い、Aβ凝集阻害作用、神経細胞毒性抑制作用を明らかにする。優れた作用を示した化合物については、ADモデルマウスに対する予防・治療効果を明らかにして、ADの根本的な治療薬としての有用性を評価する。平成30年度はカテキン三量体の合成中間体であり、天然にも存在して様々な活性を示す二量体(プロシアニジンB3: Cat-Cat)とその平面固定化体(Cat-PCat, PCat-PCat)について高収率・高立体選択的な合成方法を確立した。また、合成した化合物のラジカル消去作用およびAβ凝集阻害活性を明らかにした。カテキンの二量体は単量体と比べるとラジカル消去活性が大きく増強した。二量体の環を固定化した化合物はさらに強力な活性を示した。Aβの凝集に対しても、単量体よりも二量体が強く凝集を阻害し、さらに平面に固定化することで凝集阻害活性が増強することがわかった。本研究結果はカテキン三量体の合成と活性を評価する上で有用な情報となる。本研究ではAβの凝集過程に作用する新たなAD治療薬の開発を目的として、カテキンの重合体の立体構造を平面に固定化した化合物の設計・合成を行う。また、合成した化合物についてアミロイド仮説に基づく生物試験を行い、治療薬としての有用性を検討する。H30年度は、本研究で目的とするカテキン三量体の平面固定化体の合成を行うために、まず、合成中間体となる二量体(プロシアニジンB3: Cat-Cat)と、Cat-Catの一方および両方のカテキンを平面に固定化したCat-PCatとPCat-PCatの高収率・高選択的な合成方法について検討を行った。Cat-Catは一方のカテキンのC環の炭素ともう一方のA環の炭素がS配位で結合している。そこで、立体選択的に反応が進行するようにC環の反応部位に適切な脱離基を導入したカテキンをもう一つのカテキンとルイス酸で反応させることで、高選択的に二量体を合成することができた。Cat-PCatは、脱離基を導入したカテキンに平面型カテキン(PCat)を反応させて合成した。また、PCat-PCatはCat-Catに平面固定化反応を行うことで合成することができた。これらの化合物とカテキンおよびPCatの抗酸化活性をガルビノキシルラジカルに対するラジカル消去反応について速度論的解析を行うことで検討した。その結果、ラジカル消去反応速度定数は、Cat < PCat < Cat-Cat < Cat-PCat < PCat-PCatの順で大きくなった。また、Aβの凝集に対する阻害活性をチオフラビンT法を用いて解析したところ、ラジカル消去活性と同様の順で凝集阻害活性が増強し、特にPCat-PCatは強力にAβの凝集を阻害することがわかった。以上、ほぼ計画通り研究が進行している。1.カテキン三量体とその平面固定化体の合成本研究で確立した二量体の合成方法を利用してカテキン三量体(Cat-Cat-Cat)とその平面固定化体の合成を行う。Cat-Cat-CatはCat-Catに脱離基を導入したカテキンを付加して合成する。カテキン三量体の平面固定化体は平面化されるカテキンの数と位置の違いで多くの異性体が考えられる。今回はその中で最も簡便に合成可能と考えられる、全てのカテキンを平面固定化した化合物(PCat-PCat-PCat)を合成する。2.抗酸化活性、アミロイドβ由来神経細胞毒性の阻害活性の評価a)抗酸化活性:活性酸素のモデル化合物に対するラジカル消去反応を用いて速度論的解析を行う。b)凝集阻害活性:チオフラビンT法を用いて、Aβの凝集反応に対する阻害効果を明らかにする。強力な凝集阻害効果を示した化合物については,円偏光二色性スペクトルを測定して、Aβの立体構造への化合物の相互作用を解析する.c)神経細胞毒性抑制効果: Aβは凝集の過程で活性酸素を発生して神経細胞(SH-SY5Y)にアポトーシスを誘導する。この系に化合物を添加して神経細胞毒性に対する抑制効果を評価する。3.構造活性相関の検討と新規カテキン三量体の設計合成した化合物について分子軌道計算を行い、最安定化構造、HOMO軌道、イオン化エネルギー、LogP等を求める。これらの物性値と生物活性との相関について検討を行い、アミロイドβ由来神経細胞毒性の阻害活性発現に必要な構造的特徴を明らかにし、これらの情報を基に新規カテキン三量体の設計を行う。

我々はカテキンの立体構造を化学修飾により平面に固定化した「平面型カテキン」が、強力な抗酸化作用とAβの凝集阻害作用を示すことを明らかにした。カテキンの重合体であるプロシアニジンは抗酸化作用や動脈硬化抑制作用を示し、その作用は重合度が増すほど強くなる。そこで本研究では、近年ADにおける認知障害の改善作用が報告されたカテキンの三量体について、構成単位のカテキンの立体構造を平面に固定化した誘導体の設計・合成を行い、Aβ凝集阻害作用、神経細胞毒性抑制作用を明らかにする。優れた作用を示した化合物については、ADモデルマウスに対する予防・治療効果を明らかにして、ADの根本的な治療薬としての有用性を評価する。平成30年度はカテキン三量体の合成中間体であり、天然にも存在して様々な活性を示す二量体(プロシアニジンB3: Cat-Cat)とその平面固定化体(Cat-PCat, PCat-PCat)について高収率・高立体選択的な合成方法を確立した。また、合成した化合物のラジカル消去作用およびAβ凝集阻害活性を明らかにした。カテキンの二量体は単量体と比べるとラジカル消去活性が大きく増強した。二量体の環を固定化した化合物はさらに強力な活性を示した。Aβの凝集に対しても、単量体よりも二量体が強く凝集を阻害し、さらに平面に固定化することで凝集阻害活性が増強することがわかった。本研究結果はカテキン三量体の合成と活性を評価する上で有用な情報となる。本研究ではAβの凝集過程に作用する新たなAD治療薬の開発を目的として、カテキンの重合体の立体構造を平面に固定化した化合物の設計・合成を行う。また、合成した化合物についてアミロイド仮説に基づく生物試験を行い、治療薬としての有用性を検討する。H30年度は、本研究で目的とするカテキン三量体の平面固定化体の合成を行うために、まず、合成中間体となる二量体(プロシアニジンB3: Cat-Cat)と、Cat-Catの一方および両方のカテキンを平面に固定化したCat-PCatとPCat-PCatの高収率・高選択的な合成方法について検討を行った。Cat-Catは一方のカテキンのC環の炭素ともう一方のA環の炭素がS配位で結合している。そこで、立体選択的に反応が進行するようにC環の反応部位に適切な脱離基を導入したカテキンをもう一つのカテキンとルイス酸で反応させることで、高選択的に二量体を合成することができた。Cat-PCatは、脱離基を導入したカテキンに平面型カテキン(PCat)を反応させて合成した。また、PCat-PCatはCat-Catに平面固定化反応を行うことで合成することができた。これらの化合物とカテキンおよびPCatの抗酸化活性をガルビノキシルラジカルに対するラジカル消去反応について速度論的解析を行うことで検討した。その結果、ラジカル消去反応速度定数は、Cat < PCat < Cat-Cat < Cat-PCat < PCat-PCatの順で大きくなった。また、Aβの凝集に対する阻害活性をチオフラビンT法を用いて解析したところ、ラジカル消去活性と同様の順で凝集阻害活性が増強し、特にPCat-PCatは強力にAβの凝集を阻害することがわかった。以上、ほぼ計画通り研究が進行している。1.カテキン三量体とその平面固定化体の合成本研究で確立した二量体の合成方法を利用してカテキン三量体(Cat-Cat-Cat)とその平面固定化体の合成を行う。
ヒルベルト空間における不変部分空間の問題とその周辺

本研究の目的は,ヒルベルト空間における不変部分空間の問題に関連して,自己共役でない作用素環の構造を詳細に調べると共に,それに関する不変部分空間の構造解析を行うものである.解析的接合積は接合積の自己共役でない部分環としてよく知られていて,これまでに多くの興味深い結果が得られている.その一方で解析的部分環はArvesonによるスペクトル解析の研究に動機付けられ,作用素環における解析性の研究を中心に不変部分空間の構造や分解性そして極大性など様々な研究が盛んに行われてきた.von Neumann環のある部分環を真に含む部分環は全体である場合,その部分環は極大であるという.解析的接合積におけるσ弱閉部分環の極大性の問題は1980年代から盛んに行われているがそれらの研究は全てsemigroupを固定して考えられてきた.我々は極大性の問題をsemigroupの性質と結び付けて捉え直すことにより,その構造をより深く理解することが出来るのではないかと予想した.Archimedeantotally orderを引き起こすsemigroupによる解析的接合積を考えたとき,そのdiagonalが因子環であることと解析的接合積が極大であることは知られていたが,一般のsemigroupに関して同様の結果が成立するかは興味深い問題である.そこで解析的接合積のdiagonalが因子環であるとき解析的接合積が極大なら,付随するsemigroupはどのような条件を満たさなければならないかを考え,archimedean totally orderを引き起こす場合に限ることを証明した.この解析に誘発されて接合積のdiagonalが因子環の場合,そのdiagonalを含む双対作用に関して不変なσ弱閉部分環とsemigroupとの間に一対一対応が付くことを突き止めて統括的に極大性の議論を論じることに成功した.この結果は極大性の問題だけに留まらず,部分環のガロア対応の理論をも含むものであり,多くの応用が期待される.またこれらの対応にある種の不変部分空間が対応すると予想され、今後不変部分空間の理論の発展にも期待が出来るが、これらは今後の研究課題である。本研究の目的は,ヒルベルト空間における不変部分空間の問題に関連して,自己共役でない作用素環の構造を詳細に調べると共に,それに関する不変部分空間の構造解析を行うものである.解析的接合積は接合積の自己共役でない部分環としてよく知られていて,これまでに多くの興味深い結果が得られている.その一方で解析的部分環はArvesonによるスペクトル解析の研究に動機付けられ,作用素環における解析性の研究を中心に不変部分空間の構造や分解性そして極大性など様々な研究が盛んに行われてきた.離散群による解析的接合積はLoeblとMuhlyによってその相対作用による解析的部分環になることが知られていたが,一般の場合はまだ未解決であった.そこでこの問題を解析的接合積と解析的部分環との同型問題と捉えて,解析的部分環が解析的接合積と同型であるための必要十分条件を与えた.この結果の系として一般の局所コンパクト群に対する解析的接合積もその相対作用による解析的部分環として表わされることが分かった.またこれらの結果の応用としてR作用による接合積における部分環の構造解析をおこなった.解析的部分環を含むσ弱閉部分環はある作用に関する解析的部分環として表すことができることは知られていたが,解析的接合積の場合にはこのタイプの結果は得られていなかった.そこで解析的接合積を含むσ弱閉部分環がある作用に関する接合積として表すことが出来るかを問題として考えて,一般的には成立しないことを示すと共に,III型因子環の接合積による連続分解を考えたとき,上の問題の否定的な例を与えることを示した.また,解析的接合積の極大性の問題をsemigroupの観点から捉えて見直した.Archimedeantotally orderを引き起こすsemigroupによる解析的接合積を考えたとき,そのdiagonalが因子環であることと解析的接合積が極大であることは知られていたが,一般のsemigroupに関して同様の結果が成立するかは興味深い問題である.そこで解析的接合積のdiagonalが因子環であるとき解析的接合積が極大なら,付随するsemigroupはどのような条件を満たさなければならないかを考え,archimedean totally orderを引き起こす場合に限ることを証明した.この解析に誘発されてsemigroupに着目した接合積の部分環の構造解析も行いその構造をより詳細に調べることに成功した.本研究の目的は,ヒルベルト空間における不変部分空間の問題に関連して,自己共役でない作用素環の構造を詳細に調べると共に,それに関する不変部分空間の構造解析を行うものである.解析的接合積は接合積の自己共役でない部分環としてよく知られていて,これまでに多くの興味深い結果が得られている.その一方で解析的部分環はArvesonによるスペクトル解析の研究に動機付けられ,作用素環における解析性の研究を中心に不変部分空間の構造や分解性そして極大性など様々な研究が盛んに行われてきた.Von Neumann環のある部分環を真に含む部分環は全体である場合,その部分環は極大であるという.解析的接合積におけるσ弱閉部分環の極大性の問題は1980年代から盛んに行われているがそれらの研究は全てsemigroupを固定して考えられてきた.我々は極大性の問題をsemigroupの性質と結び付けて捉え直すことにより,その構造をより深く理解することが出来るのではないかと予想した.Archimedeantotally orderを引き起こすsemigroupによる解析的接合積を考えたとき,そのdiagonalが因子環であることと解析的接合積が極大であることは知られていたが,一般のsemigroupに関して同様の結果が成立するかは興味深い問題である.

そこで解析的接合積のdiagonalが因子環であるとき解析的接合積が極大なら,付随するsemigroupはどのような条件を満たさなければならないかを考え,archimedean totally orderを引き起こす場合に限ることを証明した.この解析に誘発されて接合積のdiagonalが因子環の場合,そのdiagonalを含む双対作用に関して不変なσ弱閉部分環とsemigroupとの間に一対一対応が付くことを突き止めて統括的に極大性の議論を論じることに成功した.この結果は極大性の問題だけに留まらず,部分環のガロア対応の理論をも含むものであり,多くの応用が期待される.また現在これらの対応にある種の不変部分空間が関連しているものと予想して,勢力的に研究を進めている最中である.本研究の目的は,ヒルベルト空間における不変部分空間の問題に関連して,自己共役でない作用素環の構造を詳細に調べると共に,それに関する不変部分空間の構造解析を行うものである.解析的接合積は接合積の自己共役でない部分環としてよく知られていて,これまでに多くの興味深い結果が得られている.その一方で解析的部分環はArvesonによるスペクトル解析の研究に動機付けられ,作用素環における解析性の研究を中心に不変部分空間の構造や分解性そして極大性など様々な研究が盛んに行われてきた.von Neumann環のある部分環を真に含む部分環は全体である場合,その部分環は極大であるという.解析的接合積におけるσ弱閉部分環の極大性の問題は1980年代から盛んに行われているがそれらの研究は全てsemigroupを固定して考えられてきた.我々は極大性の問題をsemigroupの性質と結び付けて捉え直すことにより,その構造をより深く理解することが出来るのではないかと予想した.Archimedeantotally orderを引き起こすsemigroupによる解析的接合積を考えたとき,そのdiagonalが因子環であることと解析的接合積が極大であることは知られていたが,一般のsemigroupに関して同様の結果が成立するかは興味深い問題である.そこで解析的接合積のdiagonalが因子環であるとき解析的接合積が極大なら,付随するsemigroupはどのような条件を満たさなければならないかを考え,archimedean totally orderを引き起こす場合に限ることを証明した.この解析に誘発されて接合積のdiagonalが因子環の場合,そのdiagonalを含む双対作用に関して不変なσ弱閉部分環とsemigroupとの間に一対一対応が付くことを突き止めて統括的に極大性の議論を論じることに成功した.この結果は極大性の問題だけに留まらず,部分環のガロア対応の理論をも含むものであり,多くの応用が期待される.またこれらの対応にある種の不変部分空間が対応すると予想され、今後不変部分空間の理論の発展にも期待が出来るが、これらは今後の研究課題である。
ヘテロ双頭キネシンを用いた二頭間協調性の一分子観察

染色体分配に関わるキネシン5と、小胞輸送に関わるキネシン1という二種類の分子モーターを組み合わせた様々な変異体を作成し、その運動と構造の1分子観察を行った。その結果、ネックリンカーと頭部の相互作用を制御することによって必要に応じて運動モードを切り替えているという運動制御メカニズムを明らかにした。生体分子モーターは、如何にして化学エネルギーを運動エネルギーへと変換するのだろうか?微小管上を走るキネシン分子については、二つの加水分解部位を交互に動かしながら、歩行するように微小管上を連続的に運動することが明らかになったが、一方で、Eg5と呼ばれる紡錘体形成にかかわるモーターは、連続的な運動に加えて、拡散運動、非連続的な運動と、さまざまな運動モードを持つことが明らかになりつつある。本研究では、そのような運動モードの特性がどこから現れるのかを明らかにすることを目的に1分子計測による運動観察と、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)計測による分子内部での構造遷移の検出を行った。まず、Eg5のATP加水分解領域である「頭部」と、四量体形成部位である「茎部」をつなぐ「ネックリンカー」に着目し、ネックリンカーと茎部の間にグリシンを挿入したネックリンカー伸長変異体の運動観察を行った。その結果、ネックリンカー伸長変異体は、野生型に比べて連続歩行能が向上することを見出した。次に、1分子FRET観察を用いて、Eg5のネックリンカーの構造状態を調べた結果、従来型のキネシンではヌクレオチドフリー状態で非結合状態を取ることが知られていたが、Eg5では結合状態が支配的であり、従来型キネシンとEg5でATP加水分解過程での構造状態が異なることを明らかにした。これらの結果から、多分子で協調して染色体分配を担うEg5にとって、一分子で細胞内輸送を行う従来型キネシンのような高度な連続歩行能は必要ないため、両者はネックリンカーの構造変化の違いによってそれぞれの役割に最適化されている可能性が示唆された。今後はそれら二つの役割の異なる頭部によるヘテロダイマーを作成し、その運動特性から頭部間での協調作用を調べていく予定である。生体分子モーターは、如何にして化学エネルギーを運動エネルギーへと変換するのだろうか?微小管上を走るキネシン1については、二つの加水分解部位を交互に動かしながら、歩行するように微小管上を連続的に運動することが明らかになったが、一方で、Eg5(キネシン5)と呼ばれる紡錘体形成にかかわるモーターは、連続的な運動に加えて、拡散運動、非連続的な運動と、さまざまな運動モードを持つことが明らかになりつつある。まず、キネシン5の二量体形成に関わる茎部から二頭間をつなぐネックリンカーまでの残基を様々な長さにわたってキネシン1に置換したキメラタンパク質を作成し、その運動を確かめた。その結果、野生型キネシン5は低塩強度でほとんどが拡散運動を示すのに対して、茎部およびネックリンカーをキネシン1と置換した場合には多くの分子がキネシン1同様の一方向性の運動を示すように運動を変化させた。この結果はキネシン5の連続的運動能の制御にはネックリンカーと茎部が関わっていることを示唆している。また、ネックリンカーをキネシン1のものと置き換えたもの、および、ネックリンカーの長さや残基に変異を加えたキネシン5のネックリンカーの構造状態を1分子FRET法により観察したところ、キネシン5の連続的運動能は、ネックリンカーと頭部の相互作用により抑制されていると示唆された。これらの結果から、染色体分配に関わるキネシン5が、ネックリンカーと頭部の相互作用を制御することによって必要に応じて運動モードを切り替えているという運動制御メカニズムを明らかにした。
ホヤの胚発生と芽体発生における発生システムの比較解析

レチノイン酸は、出芽ホヤの芽体において体づくり(成体体細胞の分化転換)の引き金をひく内在因子である。一方、ホヤの胚発生においてもレチノイン酸は重要な機能を持つことが示唆されているが、その機能解析は進んでいない。本研究では、レチノイン酸をキーワードとして芽体と胚の発生システムを比較解析し、「成体の体細胞における発生プログラムの再利用」の進化メカニズムを解明することをめざしている。1.我々はこれまでに出芽ホヤのレチノイン酸受容体(RARとRXR)、レチノイン酸標的遺伝子を複数単離した。今年度はそれらの遺伝子の機能解析を行った。標的遺伝子の1つはN末側に複数のタンパク結合ドメインを持つプロテアーゼ(TRAMPと名づけた)であった。リコンビナントTRAMPタンパクがホヤ由来の培養細胞の増殖を刺激することを明らかにした。また、活性中心に変異を導入したTRAMPにも増殖促進活性があったことから、TRAMPの増殖促進活性がプロテアーゼ活性と切り離せることもわかった。2.我々は、出芽しないカタユウレイボヤからもRARとRXRのcDNAを単離した。現在までのところ、細胞タイプ特異的な発現は確認できていないので、レチノイン酸処理胚における発現を調べる一方で上流調節領域の単離を試みている。3.胚発生におけるレチノイン酸の役割を知り、芽体発生との比較を行うために、カタユウレイボヤ胚のcDNAライブラリーから重複のない約10000クローンを選んでマイクロアレイを作製した。今後、これを用いてレチノイン酸標的遺伝子をはじめ、さまざまな発生制御遺伝子のスクリーニングを行う予定である。
細胞頂上膜面の細胞質突起３次元ダイナミクス -SICMによる新しい解析法の確立-

本研究は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SICM)を用いて、生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起のダイナミクスを解析し、そのダイナミクスと細胞運動の関係性を解明することを目的としている。本年度については以下に示す課題に取り組んだ。1.改良型SICMを用いた薬剤付加時における細胞質突起の構造変化観察および検証:昨年度、遺伝子導入により蛍光タンパク質と融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作成に成功し、改良型SICMと蛍光顕微鏡による細胞質突起微細構造の変動とその直下の細胞骨格タンパク質を観察することが可能となった。その上でEGFなどの薬剤を付加し、細胞質突起の構造変化を経時的に観察した。現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。2.細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作出および改良型SICMによる観察:細胞周期の各期および移行状態の細胞質突起のダイナミクスについて解析し検証を行うため、細胞周期の特定の時期にのみ存在するタンパク質に蛍光タンパク質を融合したプローブを細胞へ導入し、安定化細胞を作出した。これにより、細胞周期の進行の可視化に成功し、同細胞を用いて改良型SICMと蛍光顕微鏡による観察に成功した。また今年度は、長時間の経時的変化を観察することが可能になるように蛍光タンパク質が退色することを防ぐために顕微鏡光源の電動シャッターを顕微鏡システムに導入した。3.改良型SICMの分解能向上の検討:装置自体の空間分解能を改善するために、探針であるガラスピペットの改良を進めている。既存のものはシングルバレル型であるのに対し、ダブルバレル型のピペットを用いることで探針の開口径を小さくした。このダブルバレル型のピペットを用いて固定した組織切片表面の観察、計測することにより検討をおこなった。当初の計画通り、改良型SICMを用いてCalpeptinやEGFなどの薬剤付加時における細胞質突起の構造変化を経時的に観察することを計画し、実行した。薬剤の適正な濃度などの実験条件の検討をおこない、現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。また、細胞質突起は細胞骨格関連タンパク質が芯となっているため、細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を観察することが重要であると考えられた。一方で、細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作出において、当初の計画では3年目におこなう予定でいたが、昨年度に蛍光タンパクと融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作出に成功したことから続けて実施した。その結果、計画よりも前倒しで細胞周期の可視化が可能な安定化細胞を作出することができ、改良型SICMと蛍光顕微鏡の同時観察による細胞質突起微細構造の変動を観察することができた。また、前年度改善させた時間分解能だけではなく、空間分解能の改善も必要であると考え、ダブルバレル型のピペットを新たに導入し固定した組織切片表面の観察、計測することにより検討をおこなっている。これらを総合して、計画全体としてはおおむね順調に進捗している。今年度の検討結果により、当初予定していたCalpeptinやEGFなどの薬剤を付加し観察する検討方法から細胞質突起がよりドラスティックに変化するものと考えられる細胞骨格の重合誘導剤や脱重合剤などを付加した際の構造変化を経時的に観察する検討方法に切り替えることが必要であると考えている。これにより、細胞骨格の性状変化と細胞質突起の構造変化との関連を検討することで、細胞質突起微細構造の観察のみで細胞骨格の局在や状態を理解することが可能となる。また、ダブルバレル型のピペットを用いた改良型SICMの分解能向上の検討を今年度も引き続き継続しておこなっていく。本研究は走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SICM)を用いて、生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起のダイナミクスを解析し、そのダイナミクスと細胞運動の関係性を解明することを目的としている。1.装置のS/N比の改善:装置自体が実用化されてから初期段階であるため、S/N比が低く帰還制御がうまく行かずにサンプルに探針が接触することが多かった。そのため、装置のS/N比の改善に着手した。自作定電流回路を導入することで計測されたシグナルを平均化することなくデータを取得することが可能となったことから、画像取得平均時間を短縮でき、経時的測定において時間分解能を約150%強改善することに成功した。改良型SICMを用いて移動能の異なるヒト口腔上皮癌由来細胞の細胞質突起のダイナミクスを解析した結果、細胞質突起の変動を捉え、移動能と相関していることを明らかにした。よって細胞質突起は細胞機能の1つである細胞運動と関連していることが示唆された。2. SICMと蛍光顕微鏡の同時観察の検証:遺伝子導入を行うことで、蛍光タンパクと融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する細胞を作成し、サンプルとして用いた。細胞骨格構造の動的変化が経時的に確認可能であるか検討するために蛍光顕微鏡による経時的測定や光褪色後蛍光回復法(FRAP)を行い、細胞骨格の一つであるアクチン線維の動的変化の可視化に成功した。その後、同細胞を用いて改良型SICMと蛍光顕微鏡による観察に成功した。当初の計画では極低雑音の電流増幅器を購入し、既存のSICM内電気回路に導入する事を計画していた。

しかしながら、予備実験により劇的な改善は見込めなかったことから、ノイズを抑える事の可能な定電流回路を自作することとし、本装置を導入する事でS/N比を改善することに成功した。その結果、探針がサンプルにアプローチする際の速度を上げる事が出来、かつ計測されたシグナルを平均化することなくデータを取得することが可能となった。よって画像取得平均時間を従来より約60%抑え、短時間で画像取得することができ、経時的測定において時間分解能の改善につながった。一方で、遺伝子導入により蛍光タンパクと融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作成において、当初計画していた条件では安定化細胞を作成することが出来なかった。そのため条件検討に時間を費やしてしまったが、最終的に作成することができ、改良型SICMと蛍光顕微鏡による細胞質突起微細構造の変動とその直下の細胞骨格タンパク質を観察することが可能となった。これらを総合して、計画全体としてはおおむね順調に進捗している。本研究は、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SICM)を用いて、生きた細胞の頂上膜面の細胞質突起のダイナミクスを解析し、そのダイナミクスと細胞運動の関係性を解明することを目的としている。本年度については以下に示す課題に取り組んだ。1.改良型SICMを用いた薬剤付加時における細胞質突起の構造変化観察および検証:昨年度、遺伝子導入により蛍光タンパク質と融合している細胞骨格関連タンパク質を発現する安定化細胞の作成に成功し、改良型SICMと蛍光顕微鏡による細胞質突起微細構造の変動とその直下の細胞骨格タンパク質を観察することが可能となった。その上でEGFなどの薬剤を付加し、細胞質突起の構造変化を経時的に観察した。現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。2.細胞周期の可視化が可能な安定化細胞の作出および改良型SICMによる観察:細胞周期の各期および移行状態の細胞質突起のダイナミクスについて解析し検証を行うため、細胞周期の特定の時期にのみ存在するタンパク質に蛍光タンパク質を融合したプローブを細胞へ導入し、安定化細胞を作出した。これにより、細胞周期の進行の可視化に成功し、同細胞を用いて改良型SICMと蛍光顕微鏡による観察に成功した。また今年度は、長時間の経時的変化を観察することが可能になるように蛍光タンパク質が退色することを防ぐために顕微鏡光源の電動シャッターを顕微鏡システムに導入した。3.改良型SICMの分解能向上の検討:装置自体の空間分解能を改善するために、探針であるガラスピペットの改良を進めている。既存のものはシングルバレル型であるのに対し、ダブルバレル型のピペットを用いることで探針の開口径を小さくした。このダブルバレル型のピペットを用いて固定した組織切片表面の観察、計測することにより検討をおこなった。当初の計画通り、改良型SICMを用いてCalpeptinやEGFなどの薬剤付加時における細胞質突起の構造変化を経時的に観察することを計画し、実行した。薬剤の適正な濃度などの実験条件の検討をおこない、現在、特徴的な変化を捉える測定条件の最適化をおこなっている。また、細胞質突起は細胞骨格
プライバシー保護のための映像の変換・加工処理

本研究では、サーベイランス映像中の人物像や背景に対して、プライバシーを保護するための映像・画像処理の技術を確立することを目的とする。本年度は以下のサブテーマに従って検討を進めた。1.プライバシー保護のための全域型処理の考察と実現サーベイランスカメラの存在する地点とそこから得られた映像を観察する地点は異なることが一般的であり、映像コンテンツがネットワーク上を流通することになる。サーベイランス映像流通におけるセキュリティを高めるため、情報ハイディング技術を利用し、プライバシー情報(顔や全身の画像)を画像フレームに埋め込み復元する画像処理手法を実現した。2.状況に応じた局所型処理の考察と実現状況を観察者と被写体の組と捉え、状況に依存したプライバシー保護のための視覚的抽象化オペレータ(透明化、ドット化、シルエット化、モザイク化など12種)を実時間画像処理として実装し、システム化した。オペレータごとに処理時間を計測し、高速化を図った。3.メンバー階層とプライバシーポリシーの設定観察者が様々なメンバー種別のユーザ(登録、権限有、匿名)であるときに、被写体のメンバー種別に応じたプライバシーポリシーをXMLにより記述する体系を与えた。また、ICタグと画像照合によるメンバー同定・認証方式を考案し、評価した。4.実験システムの作成と問題点の整理操作性の高い視覚的インタフェースを装備した実験システムを構築し、定量・定性的評価を行い、サーベイランスシステムとしての得失を整理した。1.プライバシー保護のための全域型処理の考察と実現サーベイランス映像がオープンなネットワークを流れるとき、その映像にはプライバシー情報が存在するため、盗聴者が不正に映像にアクセス・取得した場合にも対処する必要がある。本研究では、画像の全域的な保護法として、情報ハイディングに着目し基礎的な考察を行った。特に人物や顔の部分画像を画像全域に埋め込む際に、適切なハイディング法を考察した。2.プライバシーの主観的性質の考察プライバシーは個人ごとに保護したい範囲が異なるという主観的性質を持つ。ここでは、ユーザスタディにより人物像に対する視覚情報の開示範囲と主観性・個人性の関係を心理学的観点から調べ、映像サーベイランスイシステムの概念設計に反映させた。3.映像の加工と隠ぺい情報の見え方との関係の明確化プライバシーを保護する自然な方法として、視覚的抽象化という画像処理オペレータ群を人物像に作用させる方策を検討した。ここでは、抽象化オペレータにより開示される視覚情報の多さに従う、オペレータ間の順序関係を規定した。4.状況に応じた局所型処理の考察と実現画像フレームを前景と背景、さらに前景を複数の人物像に分離するアルゴリズムを各々時変背景推定に基づく前景抽出アルゴリズム、前景層状化アルゴリズムとして実現し、アルゴリズムの有効性を実験的に検証した。また、プライバシー保護のための視覚的抽象化オペレータ(透明化、ドット化、シルエット化、モザイク化など12種)を実時間画像処理として実装した。
Candidaフェノミクスによる抗真菌剤開発への展開

国内で認可されている深在性真菌症の治療薬は、4系統8種類と少ない。そのため、新しい作用機序を持つ抗真菌剤の開発が待たれている。しかしながら、真菌がどのように感染し致命傷を与えるのか、その感染現象も不明な点が多く、薬剤開発の遅れを助長している。そこで本研究では、遺伝子操作が比較的容易なCandida glabrataをモデルとして、1)感染現象の一端を明らかにすること、2)その知見を元に抗真菌リード化合物を設計すること、以上2つを目的とした。1)DNA修復に関わる遺伝子の機能解析DNA修復システムは、相同組換え(HR)や非相同末端再結合(NHEJ)などの経路からなり、遺伝子情報を次の世代に正確に伝承するために不可欠なシステムである。また近年では接着因子などの病原因子の発現調節に関与することが指摘されていることから、感染現象の一翼を担っていると推定されている。昨年度までに、特に重要と考えられた20個の遺伝子について1遺伝子破壊株,2遺伝子破壊株を体系的に作製し、in vitroアッセイ系における表現型を解析した。今年度は、それらの破壊株が実際にどの程度の感染性があるのかを動物実験により解析した。しかしながら、これまで、C.glabrataを使った感染実験系は十分に確立していなかったことから、先ずその実験系を構築した。今年度の研究で1)カイコ血液感染モデル2)マウス血液感染モデル3)マウス腸管感染モデルを構築することができた。さらにこれらの実験系を利用して、保有の破壊株ライブラリーを解析したところ、病原性が有意に低下する二つの変異体ΔIMI-3とΔIMI-4を同定した。2)コンピューターを活用した抗真菌リード化合物の設計本課題は、創薬研究における重要性に加えて、基礎研究と応用研究の連携を可能にする方法論としての重要性がある。昨年度までに、先に同定されていた標的タンパク質Pfylをモデルとして、立体構造の予測方法、リガンドの設計方法、その評価方法を確立した。今年度は、それらの成果をまとめ査読付きの国際論文に発表した。さらに、国際学会でもその成果を報告し、当該研究領域に対して重要な情報を提供することができた。国内で認可されている深在性真菌症の治療薬は、4系統8種類と少ないために、新しい抗真菌剤の開発が望まれてる。そこで我々は、「病原性真菌の病原性を解明すること」と「新規抗真菌剤を開発すること」を目標として以下の二つの研究を遂行したので、本年度の成果を報告する。(1)DNA修復に関わる遺伝子の網羅的機能解析本項目は、病原性を研究する上で意義があるだけでなく、新しいDNA修復システムの探索や抗真菌剤の標的蛋白質探索という別の重要な側面も含んでいる。病原性真菌(Candia glabrat)のDNA修復システムを体系的に理解するために、二本鎖切断DNAの修復に関わる21遺伝子を選抜した。また、遺伝子破壊株や発現抑制株を合計55株構築した。さらに、取得した組換え体を用いて、表現型(生育速度、変異原に対する感受性、病原性因子の分泌)を観察し、各遺伝子の重要性や機能について多くの知を得た。特に今年度は、C.glabrataのDNA修復において、NHEJよりもHRやRecQヘリケースの経路が重要であることを明らかにした。我々の知る限り、病原性真菌においてDN修復に関する知見は少なく、体系的に解析した事例はないこから、上述の成果は重要な意義がある。(2)コンピューターを活用した抗真菌リードペプチドの設計本項目は、新しい抗真菌剤の開発に直結する可能性が高いことから、重要性がある。本解析に着手するために、当研究室で実施されたCandidaフェノームプロジェクトに基づいて、5種類の標的蛋白質TP-1TP-5を選定し、それらの立体構造を予測した。次に、Peptidesign[富士通]を利用し阻害剤の設計を行った。今年度は、TP-1に結合する3種類のペプチドを設計・合成した。現在、これらペプチドの活性を評価するために、表面ラズモン共鳴法による相互作用解析を進めている。上述のように、標的蛋白質の分子情報を蓄積し、創薬研究の基盤整備できたことは本研究分野において意義深い。今後、設計した阻害剤が実際に効果を示せば、創薬研究において大な進展が期待できる。そのため、新しい作用機序をもつ抗真菌剤の開発が望まれている。そこで我々は、(1)病原性メカニズムの一端を明らかにすること、(2)新規抗真菌剤を設計すること、を目標として以下の研究を遂行したので、本年度の成果を報告する。(1)DNA修復に関る遺伝子の体系的機能解析DNA修復システムは、相同祖換え(HR)や非相同末端再結合(NHEJ)などの経路から成り、遺伝子情報を正確に伝承するために生物には必須なシステムである。また近年、本システムは、接着因子など病原性因子の発現調節を担っていることが指摘されている。このことから本課題は、生物学の研究として意義があるばかりでなく、病原性解析としても意義がある。本課題について、本年度の成果は次のとおりである。(1)病原性真菌Candida glabrataにおいて、HRやNHEJに関る遺伝子について、10種類の遺伝子二重欠損株を取得しその変異原感受性を評価した。この解析から、二本鎖切断修復における各経路の優先度を明らかにした。

(2)C.glabrataに特有の遺伝子RecQ-shortについて、機能解析の結果、TOP3との相互作用やNHEJとの関わりについて新しい知見を得た。(3)保有している組換え体について、その病原性因子の発現を評価するアッセイ系を構築した。我々の知る限り、病原性真菌に於けるDNA修復の知見は少なく、体系的に解析した事例がないことから、上述の成果は意義がある。また、DNA修復と病原性因子の発現調節を関連づけて解析するにあたり、組換え体とアッセイ系の両方を構築することは、本研究分野を先導できる可能性があり、重要な成果であったと考えられる。(2)コンピューターを活用した抗真菌リードペプチドの設計本課題は、上述のゲノム機能解析から創薬研究へ展開させる上で、重要な課題である。本課題について、本年度の成果は次のとおりである。(1)当研究室で選定された標的蛋白質TP1に対して、3種類のペプチドリガンドを設計し合成した。次いで、表面プラズモン共鳴法やELISA法を用いて、TP1とペプチドの相互作用や親和性を評価した。その結果、今回設計したペプチドは、Kd=10^<-4>程度の親和性で、TP1の活性表面に特異的に結合することが確認された。(2)当研究室で選定された標的蛋白質TP2に対して、6種類のペプチドリガンドを設計し合成した。うち3種類は、真菌細胞内の標的に結合できるように、細胞膜透過能を有するシグナルペプチドを連結して合成した。これらペプチドの活性については、現在評価中である。今年度の成果は、本手法の妥当性を証明する事が出来たという点で、大きな成果と言える。今後、設計したペプチドリガンドが真菌細胞内でも活性を示し、ほ乳類細胞への低毒性が確認できれば、創薬研究において大きな進展が期待できる。国内で認可されている深在性真菌症の治療薬は、4系統8種類と少ない。そのため、新しい作用機序を持つ抗真菌剤の開発が待たれている。しかしながら、真菌がどのように感染し致命傷を与えるのか、その感染現象も不明な点が多く、薬剤開発の遅れを助長している。そこで本研究では、遺伝子操作が比較的容易なCandida glabrataをモデルとして、1)感染現象の一端を明らかにすること、2)その知見を元に抗真菌リード化合物を設計すること、以上2つを目的とした。1)DNA修復に関わる遺伝子の機能解析DNA修復システムは、相同組換え(HR)や非相同末端再結合(NHEJ)などの経路からなり、遺伝子情報を次の世代に正確に伝承するために不可欠なシステムである。また近年では接着因子などの病原因子の発現調節に関与することが指摘されていることから、感染現象の一翼を担っていると推定されている。昨年度までに、特に重要と考えられた20個の遺伝子について1遺伝子破壊株,2遺伝子破壊株を体系的に作製し、in vitroアッセイ系における表現型を解析した。今年度は、それらの破壊株が実際にどの程度の感染性があるのかを動物実験により解析した。しかしながら、これまで、C.glabrataを使った感染実験系は十分に確立していなかったことから、先ずその実験系を構築した。今年度の研究で1)カイコ血液感染モデル2)マウス血液感染モデル3)マウス腸管感染モデルを構築することができた。